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糖分子の導入による新たな抗炎症魚肉ペプチドの創成とその作用メカニズムの解明

糖修飾したシロザケ筋原線維たんぱく質は,強い抗炎症作用を示す。その効果成分が産生ペプチド画分に集中することから,本研究では,等電点分画(IEF)を活用した抗炎症ペプチドの効率的調製」を目指している。昨年度はアルギン酸オリゴ糖(AO)修飾によって得た抗炎症ペプチドをIEFに供し,そこで得た酸性ペプチド画分が,強い抗炎症作用を示すことを確認したが,その効果は消化ペプチド全体で得た作用よりも弱かった。この問題の原因解明は目標達成に欠かせないと判断し,今年度は,IEFで20分画したMfペプチド(MfP)を各々AO修飾した後,マクロファージにおけるTNT-α産生の抑制効果を調べた。すなわち,各MfP画分にAOを混合・凍結乾燥し,60°C(相対湿度75 %)で0ー12時間保持してメイラード反応を介したAO修飾を行い,経時的にAO修飾ペプチド(以下MfP-AO)を得た。MfP-AOの抗炎症作用は,マウス・マクロファージ様細胞(RAW264.7)におけるTNF-α産生を抑制効果によって判断した。【結果】MfP-AO画分は,いずれもAO修飾4時間で最大のTNF-α産生抑制効果を示したが,この作用は,酸性ペプチド画分だけではなく,塩基性画分においても観察された。この知見の獲得は,昨年度の「酸性ペプチドを対象としたAO修飾が全消化ペプチドよりも抗炎症作用が劣っていた」という現象を,「AO修飾が酸性画分以外の消化ペプチドにも抗炎症作用を付与できる」という事実から説明できることを示している。そして各MfPーAO画分を詳細に検討すると,抗炎症作用が付与されない画分も存在した。以上の結果を総合すると,IEFを用いた抗炎症ペプチドの効率的調製は,単に酸性ペプチドのみを収集するだけでは十分でなく,機能付与が可能なMf-P画分の選択が必要であることを示唆している。今年度の結果によって,昨年度の学術的疑問点が解消し,(1)当初想定していた酸性画分ペプチドの収集だけでは効果的な抗炎症ペプチドの産生には至らず,機能付与が可能なペプチド画分を確実に選択する重要性を示すことができた。また(2)コラーゲンへのAO修飾法についても条件検討の目処がつき,来年度に向けた準備を終えることができた。さらに(3)昨年度,エンドトキシン混入によって抗炎症作用測定が損なわれたチョウザメコラーゲンについては,調製方法を改善するとともに,別の魚類材料から調製したコラーゲン試料を使用することで,問題点を回避する事ができた。これらのことから,研究は概ね順調に進展していると判断した。今年度の結果によって,IEFを用いた抗炎症ペプチドの精製は,AO修飾した試料にのみ有効であることがわかった。すなわち,酸性ペプチドの分別回収は,AO修飾のタイミングによっては有効でない場合があるといえる。この事実を踏まえて最終年度は,(1)コラーゲン・ペプチドへのAO修飾とIEFによる抗炎症画分の回収をおこない,機能を評価する。また同時に(2)魚類筋原線維由来の消化ペプチドをAO修飾し,これを用いて糖分子の導入が誘引する抗炎症作用の発現メカニズムについて細胞レベルでの解析をおこなう。そして,これらの活動と既に得た知見を用いることで,「糖修飾による水産物由来ペプチドへの抗炎症作用の付与」技術に関する学術的総括を目指す。1)はじめに等電点電気泳動を用いて魚肉タンパク質ペプチドを調製するとともに,その分画および各ペプチド画分へのアルギン酸オリゴ糖(AO)の導入を試み,酸性画分,中性画分およびアルカリ性画分への糖鎖の導入を確認した。その際の導入度合いについて,引き続いて調査する必要を認めた。また,消化ペプチドにアルギン酸オリゴ糖を混合してからAOを導入してから得た酸性ペプチド画分に,他の画分よりも強い強い抗炎症作用が得られることを細胞実験で確認した。しかし,その効果は消化ペプチド全体で検討した場合よりも弱い傾向であった。また,未反応のAOが酸性画分に多く移動することから,分画間の定量的な議論が困難という問題に至ったが,これを解決するため,等電点電気泳動の条件を調製することで未反応のAOと消化ペプチドが分離できる可能性を見いだした。2)コラーゲン・ペプチドへの糖分子の導入と抗炎症機能の付与について検討した。本研究では2型コラーゲンを多く含むチョウザメ(ベステル種)の脊索からコラーゲンを調製し,これ加熱してゼラチン化後に消化ペプチドを得てからメイラード反応によってアルギン酸オリゴ糖を付与する検討をおこなった。まず,ゼラチン化の条件をCDスペクトルとSDS-PAGEによって検討してから,ペプシンとトリプシン消化によってペプチドを調製した。このペプチドにメイラード反応を介してアルギン酸オリゴ糖が導入できることを確認した。アルギン酸オリゴ糖が導入できることをその結果,ゼラチン化によって消化が効率よく進行できる調製条件を決定した。H29年度は,酸性ペプチド画分への未反応AOの混入によって,ペプチド画ごとの正確な効果比較を議論できなかった。また「精製した酸性ペプチドに糖鎖を導入して抗炎症作用を評価する」という項目は,現在実験中であるが,検討の途中でH29年度を終えたので,やや遅れていると判断した。また,コラーゲンペプチドへの予期せぬエンドトキシンの混入によって,この部分の実験が大幅に遅れた。

これは当初予期していなかったことであるが,一定の解決策が得られたのでH30年度に結果を踏まえて検討したい。糖修飾したシロザケ筋原線維たんぱく質は,強い抗炎症作用を示す。その効果成分が産生ペプチド画分に集中することから,本研究では,等電点分画(IEF)を活用した抗炎症ペプチドの効率的調製」を目指している。昨年度はアルギン酸オリゴ糖(AO)修飾によって得た抗炎症ペプチドをIEFに供し,そこで得た酸性ペプチド画分が,強い抗炎症作用を示すことを確認したが,その効果は消化ペプチド全体で得た作用よりも弱かった。この問題の原因解明は目標達成に欠かせないと判断し,今年度は,IEFで20分画したMfペプチド(MfP)を各々AO修飾した後,マクロファージにおけるTNT-α産生の抑制効果を調べた。すなわち,各MfP画分にAOを混合・凍結乾燥し,60°C(相対湿度75 %)で0ー12時間保持してメイラード反応を介したAO修飾を行い,経時的にAO修飾ペプチド(以下MfP-AO)を得た。MfP-AOの抗炎症作用は,マウス・マクロファージ様細胞(RAW264.7)におけるTNF-α産生を抑制効果によって判断した。【結果】MfP-AO画分は,いずれもAO修飾4時間で最大のTNF-α産生抑制効果を示したが,この作用は,酸性ペプチド画分だけではなく,塩基性画分においても観察された。この知見の獲得は,昨年度の「酸性ペプチドを対象としたAO修飾が全消化ペプチドよりも抗炎症作用が劣っていた」という現象を,「AO修飾が酸性画分以外の消化ペプチドにも抗炎症作用を付与できる」という事実から説明できることを示している。そして各MfPーAO画分を詳細に検討すると,抗炎症作用が付与されない画分も存在した。以上の結果を総合すると,IEFを用いた抗炎症ペプチドの効率的調製は,単に酸性ペプチドのみを収集するだけでは十分でなく,機能付与が可能なMf-P画分の選択が必要であることを示唆している。今年度の結果によって,昨年度の学術的疑問点が解消し,(1)当初想定していた酸性画分ペプチドの収集だけでは効果的な抗炎症ペプチドの産生には至らず,機能付与が可能なペプチド画分を確実に選択する重要性を示すことができた。また(2)コラーゲンへのAO修飾法についても条件検討の目処がつき,来年度に向けた準備を終えることができた。さらに(3)昨年度,エンドトキシン混入によって抗炎症作用測定が損なわれたチョウザメコラーゲンについては,調製方法を改善するとともに,別の魚類材料から調製したコラーゲン試料を使用することで,問題点を回避する事ができた。これらのことから,研究は概ね順調に進展していると判断した。H29年度は試料調製において予期せぬ問題に直面したが,解決の方策がたっているので,予定通り研究をすすめる。まず,消化ペプチドを事前に分画してからAO修飾をおこなって抗炎症作用を画分ごとに調査する。このとき,H29年度に検討した等電点泳動法による未反応糖類の除去法を併用する試みも実施し,「酸性画分の活用」の重要性を明確にする。また,同様の実験をエンドトキシンを除去したコラーゲンペプチドにおいても実施し,H30年度末に当初の予定していた目標に達するべく研究をおこなう。今年度の結果によって,IEFを用いた抗炎症ペプチドの精製は,AO修飾した試料にのみ有効であることがわかった。
ヤマト政権と渡来人の基礎的研究

研究の目的古墳時代の渡来人は、ヤマト政権内部の技術変革と支配構造に影響を与えたこと知られる。古墳時代中期以降、須恵器・韓式系土器などの遺物・鍛冶遺構から技術系工人、横穴式石室などの群集墳に埋葬される固有性が顕著な事例では検証することが可能である。文献史学のミヤケ制を古墳群・遺跡・遺物などの考古資料を積極的に用い、渡来系氏族の存在を検証・新たな展望を示唆した。ヤマト政権の地域支配に渡来人が従来知られる以上に積極的に関わっており、本年度の研究費で下記の研究を実施した。視点と実施内容大型群集墳等の横穴式石室の実測調査は、平成20年7月3月に集中的に花田が単独で実施した。ミヤケ推定地の遺物精査を平成20年8月3月)に実施し、渡来人の墓制の実態と様相を、明らかにした。さらに、従来の韓式系土器などの遺物に加えて、私が専門に進めている大壁建物などの遺構を実査・確認することにより、渡来人集団の墓制の摘出を行った。平成20年11月に古代学研究会で、現状の成果を報告・要旨を一担整理した。平成21年1月以降は原稿の成稿に専念した。研究内容と成果基礎的資料の作成のため、渡来人の群集墳である大和の龍王山古墳群の開口する32基の実測調査を行った。平尾山古墳群の横穴式石室の実測は開口する10基の実測を行った。平尾山古墳群は、東洋文庫の梅原末治考古資料の目録調査を行い、消滅した20基の古墳石室図を確認した。群全体の石室間の規模格差・構築方法を考慮し実測を行った。画一化された横穴式石室の大群的な集約はヤマト政権の墓制へ規制とみた。渡来人が被葬者集団であり、墓制の実証的な横穴式石室のデーターを作成しながら、大型群集墳の形成の成因がミヤケ制と考えられるとの結論となった。畿内大型群集墳の中枢構造の渡来系氏族の高安・安宿郡の集落の把握、ミヤケ制の展開を知るため、畿内型横穴式石室の普及・確立過程を首長墓と併せて解明するため、福岡市那津ミヤケの設置された玄界灘沿岸、ミヤケの設置記事のある行橋市周辺の横穴墓、筑紫君磐井拠点地域の久留米市古墳など、渡来系資料の実査・古墳精査・報告書・論文の収集を集中的に行った。資料調査は、福岡・市埋文センター・宗像市・福津市・古賀市・那珂川町・前原市の渡来系遺物資料の実査と周辺の古墳の現地精査、飯塚市・行橋市・久留米などでも古墳の現地精査を行った。岡山県児島ミヤケや三宅里を調べるため岡山県総社市でこうもり塚・江崎古墳の精査を行った。渡来人の東海への渡来系資料精査のため、名古屋市の博物館の渡来系遺物実査を行った。ミヤケの設置は、畿内地域が渡来人集団に初源的な戸籍や編戸を伴った可能性が高く、大型群集墳は渡来系集団の造墓である可能性が高い。吉備ミヤケ周辺では古墳が当初地域的な特性を示す横穴式石室が形成されるが、7世紀初めには畿内型石室となる。筑紫の玄界灘沿岸には、那津ミヤケが設置されるが、墓制は福室の九州型石室であり、墓制の転換がなされていない。しかし、須恵器・製鉄遺跡は6世紀末以降にヤマト政権による直接的な生産支配が行われている。渡来系資料も数多く出土しており、渡来人の積極的な関与がなされている。欽明朝のミヤケ制は畿内・吉備は直接的であったが、他地域は、推古朝以降に制度的変革がなされているようだ。ヤマト政権の地域支配であるミヤケ制の解明は、墓制や渡来系遺物の様相より、渡来人の痕跡を明らかにすることにより、制度を考古学的資料から明らかにできた。また、畿内の横穴墓が豊前のミヤケ設置地帯から系譜を引くものであり、ミヤケ設置に伴う集団の畿内への移住が考えられる。史料から見ると秦氏の集住地帯である研究の目的古墳時代の渡来人は、ヤマト政権内部の技術変革と支配構造に影響を与えたこと知られる。

平成21年1月以降は原稿の成稿に専念した。研究内容と成果基礎的資料の作成のため、渡来人の群集墳である大和の龍王山古墳群の開口する32基の実測調査を行った。平尾山古墳群の横穴式石室の実測は開口する10基の実測を行った。平尾山古墳群は、東洋文庫の梅原末治考古資料の目録調査を行い、消滅した20基の古墳石室図を確認した。群全体の石室間の規模格差・構築方法を考慮し実測を行った。画一化された横穴式石室の大群的な集約はヤマト政権の墓制へ規制とみた。渡来人が被葬者集団であり、墓制の実証的な横穴式石室のデーターを作成しながら、大型群集墳の形成の成因がミヤケ制と考えられるとの結論となった。畿内大型群集墳の中枢構造の渡来系氏族の高安・安宿郡の集落の把握、ミヤケ制の展開を知るため、畿内型横穴式石室の普及・確立過程を首長墓と併せて解明するため、福岡市那津ミヤケの設置された玄界灘沿岸、ミヤケの設置記事のある行橋市周辺の横穴墓、筑紫君磐井拠点地域の久留米市古墳など、渡来系資料の実査・古墳精査・報告書・論文の収集を集中的に行った。資料調査は、福岡・市埋文センター・宗像市・福津市・古賀市・那珂川町・前原市の渡来系遺物資料の実査と周辺の古墳の現地精査、飯塚市・行橋市・久留米などでも古墳の現地精査を行った。岡山県児島ミヤケや三宅里を調べるため岡山県総社市でこうもり塚・江崎古墳の精査を行った。渡来人の東海への渡来系資料精査のため、名古屋市の博物館の渡来系遺物実査を行った。ミヤケの設置は、畿内地域が渡来人集団に初源的な戸籍や編戸を伴った可能性が高く、大型群集墳は渡来系集団の造墓である可能性が高い。吉備ミヤケ周辺では古墳が当初地域的な特性を示す横穴式石室が形成されるが、7世紀初めには畿内型石室となる。筑紫の玄界灘沿岸には、那津ミヤケが設置されるが、墓制は福室の九州型石室であり、墓制の転換がなされていない。しかし、須恵器・製鉄遺跡は6世紀末以降にヤマト政権による直接的な生産支配が行われている。渡来系資料も数多く出土しており、渡来人の積極的な関与がなされている。欽明朝のミヤケ制は畿内・吉備は直接的であったが、他地域は、推古朝以降に制度的変革がなされているようだ。ヤマト政権の地域支配であるミヤケ制の解明は、墓制や渡来系遺物の様相より、渡来人の痕跡を明らかにすることにより、制度を考古学的資料から明らかにできた。また、畿内の横穴墓が豊前のミヤケ設置地帯から系譜を引くものであり、ミヤケ設置に伴う集団の畿内への移住が考えられる。史料から見ると秦氏の集住地帯である
食育に強い保育者養成に向けた養成校の教育的試行

本研究による各専門科目における野菜の耕作体験の導入、食育に関する講義や実践活動体験演習の実施、卒業研究における食育実践活動を中心にした研究テーマの実施を通して、学科所属教員の食農教育に対する理解が大きく進んだ。その結果、各専門科目において学習内容に関連づけ積極的に大学農園における野菜栽培を授業で継続的に活用するようになった。現在では非常勤講師担当の専門科目においても栽培体験を年間を通じて導入するようになった他、授業で大学農園の存在を知った在学生が、積極的に課外で野菜栽培を希望する者が現れるようにもなった。以上から、本研究の目的は十二分に達成されたと考える。本研究で使用する農地について、本研究では多様な作物を年間を通して栽培する必要があるため、2年目の今年度(24年度)において、連作障害を回避するための輪作を行うには面積が不足となった。そのため一部周辺地を新たに開墾し本研究の用に供した。その結果、専門科目における履修者の農作業体験は前年度同様に実施できた。なお作柄は残暑が厳しさと厳冬の影響により、一部の秋冬野菜の生育・収穫に支障が発生したが、授業では時期的に苗の植え付け作業と除草作業に終始したため(10月12月)、体験活動内容には影響はなかった。今年度は昨年度(23年度当時3年次生)に本研究で食農保育教育を受けたゼミ履修生が卒業研究として大学立地市内保育所の協力を得て、昨年度試行したに食農保育をベースとした実践研究を継承して実施した。今年度は年間を通して1回/月実施した。この研究は前年度の試行段階が存在するものの、研究着手は学生の発意によるもので、本研究による食農教育の効果が現れたものと考えられた。実施の結果は児の保護者及び保育士から非常に高い評価を得た。研究成果報告は年度進行の都合により前年度のアンケート調査結果について今年度の全国保育士協議会研究会にて報告を行った。研究期間最終年度となる25年度で計画した全ての内容(栽培体験・講義/演習における食育授業)を実施することができた。栽培では4月初旬の高温と遅霜、5月の小雨でジャガイモの生育に支障が生じたが、秋植え、12月収穫の新品種の導入でこれを補った。トマトは実の病変に見舞われ8月の後半にかけて収量が半分に低下した。ここで事後対応で農薬散布を行うのではなく、病変を予期して事前の予防対策が低農薬栽培につながることを後期授業や卒業研究で関係の学生には周知した。25年度は新たに「食育(演習)」(通年授業/30回)を開講した(履修者**名)。内容は「日本の水田」「牧場体験」等の講義部分(全16回)と体験実習として「幼児への食育体験実習」(全4回)、「児童への食育体験実習」(全4回)、「保護者への食育体験実習」(全4回)、「行事食を作ろう(計画/作成)」(全2回)、演習として「和食はなぜグローバルスタンダードなのか(調査/報告)」(全2回)から構成される。その中核は体験実習全14回である。前年度までの各専門科目での対応は、栽培・収穫作業のみであったが、「食育(演習)」では新たに食育体験実習が多く導入した点が特徴である。24年度までは卒業研究で食育活動を導入・実施してきたが、これは対象が研究着手者に限られてしまうため、授業で行うことで履修者全員が体験学習できることは大変意義深い。これにより保育時間における食育活動とはどのようなものかを学ぶことができ、野菜栽培から食育活動までの全課程をカバーすることができた。本研究は25年度で終了したが、研究代表者が勤務する学科(こども学科)における保育者養成教育に残した本研究の足跡は大きく、学科所属教員の食農教育に対する理解が大きく進んだ。現在では各専門科目においては、学習内容に関連づけが可能な機会があるときは、積極的に大学農園を授業で使用するという状況となった。研究着手に当たり、研究代表者所属学科(こども学科)在学中の全学年学生に対して食に対する意識調査を行った。その結果、1年次生は一部、食生活の乱れが推測される事項が認められたが、学年が進むにしたがい専門科目で、食に関する知識を順次学習すること、当学科独自に学内農園で農作業に従事させてきたことで、保育者として食に対する意識が高まっていることが明らかとなった。次に1年次生履修科目の「フレッシュセミナー」でジャガイモ栽培・収穫、同「こども文化教育演習」でカボチャ、スイカ、蕎麦、麦の栽培を実施した。大型の作物や収量のある作物の収穫体験を与え、野菜栽培と収穫の喜びを実体験させた。講義での食育教育は、各科目に配分する授業内容・計画を案出中である。次年度には実行可能となる見込みである。

食農保育実践活動については、研究代表者が勤務する大学所在地市立保育所で夏から秋にかけて収穫可能な品種の野菜栽培を行うと同時に、4年次生が卒業研究の一環として独自に作成したマルチメディア教材を用いた野菜についての学習(主に5歳児対象)、及び実践活動を6-8月にかけて3回試行(ヨモギパン・カレーライス・野菜サンドイッチ)した。ヨモギは近隣の野原で採取し、児の散歩時に観察させて意識を高めた。カレーライスは使用する野菜に対する20分程度の簡単な説明を行い、サンドイッチは一部園庭で栽培し収穫した夏野菜を用いた。児も調理に携わり昼食に供した。各家庭へのアンケートでは本研究(実践活動)への期待が多く寄せられた。以上のように1年次生から学年進行で本研究の取り組み効果を順次検証していくには最短で4年間を要するため、初年度は適宜どの学年であっても順次本研究目的を踏まえた授業内容・活動の導入を図った。高学年生は本研究に対する参画が限られるが、学年間の差分を考察すれば本研究の教育効果検証は充分可能と考える。本研究の2年目として、4年制大学のため学年進行上は今年度は2年次生までが研究の対象となるが、上記のように昨年度3年次生だった者が、高い意識を持って卒業研究で本研究に沿った食農保育実践研究を学生自身の発意で実施できたことは注目に値する。この点では本研究の教育効果達成度は80%と考える。研究着手初年度として、全学年を対象とした食に対する単年度毎の意識調査は予定通り完了(達成度100%)したので、今後、毎年度繰り返し行い意識の変化を追っていきたい。野菜栽培に対する学生の農作業従事状況に関しては、初年度は種まき、苗の植え付け、栽培中の生育状況の観察(1回)、収穫作業という重要なポイントでの部分的な参加にとどまり、日頃の手入れ(除草、追肥、脇芽の管理、病害虫の発生状況の監視)、事前(農耕地の整備;土作り他)・事後(伐採物の焼却や農耕地整備)には従事していないため、正課の中での対応を順次拡充していく(達成度40%)。学外実習に多くの時間が必要な2年次生、3年次生前期までの対応をどうするか今後、関係教員と協議する必要がある。また学内農園は一部整備が必要であるが本研究に供するための初年度整備状況は50%である。食農保育実践活動については、4月より計画案出に着手し、夏期(8月)まで切れ目無く実施できたが、秋・冬期については夏期までの実践活動準備と実施に追われ、秋冬野菜の作付けに着手できなかったため、次年度以降の活動の通年化を図る(達成度50%)。最終年度となる次年度(25年度)は後期(9月1月)において本研究分担者が担当する「食育」講義を半期15回実施予定である。この講義では食物としての植物について、各種栽培法について、食育と食農保育について系統だった講義を行う予定である。この講義とこれまで実施してきた農作業体験は相互に補完関係があり、食、食育や食農保育について高い意識付けが可能となり、高い教育効果が期待される。卒業研究における食農保育実践活動の取り組みについては実施の結果は児の保護者及び保育士から非常に高い評価を得たため、次年度(25年度)も発展的に継続する。本研究でテーマ設定し実施予定である。卒業研究における食農保育実践活動の取り組みについては次年度(25年度)の全国保育士協議会研究会にて報告予定である。最も重点を置くのは講義における食育教育の実施である。各学年で計3科目程度2-3コマの時間を確保して食育の講義・演習を行い事後にアンケート調査を実施する。
T細胞におけるクローン除去の分子機構の解明

我々は以前、ハプテン特異的T細胞ハイブリドーマ2-45-12においてTCR/CD3複合体を介した刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇とアポトーシス誘導との間に相関があることを確認している。さらに、allo-reactiveT細胞ハイブリドーマであるS-37についてもレセプターを介した刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇とapoptosis誘導との間に相関があることを明らかにしたが、この細胞株においては2-45-12と比較してより長時間におよぶカルシウムイオン濃度上昇がdpoptosis誘導に関与していると考えられた。また、B細胞腫瘍WEHI231においては、抗原刺激および細胞内小胞体のカルシウムポンプ阻害剤であるthapsigargin刺激にともなう細胞内カルシウムシグナルとapoptosis誘導率との間に、定量的相関があることが示唆された。現時点では、細胞内情報伝達においてカルシウムイオンのみを特異的に抑制することが困難である。我々は、抗原刺激時に、細胞の核においてもカルシウムイオン濃度は上昇することを確認しており、核内のカルシウムイオンが転写調節に何らかの形で関与していることを予想しているが、このことを追求するため、核膜に対するモノクローナル抗体を調製し、核内でのカルシウムイオン濃度上昇に関与する因子の検索を行おうと考えた。数種類の抗体産生ハイブリドーマの作製に成功し、抗体を細胞内にマイクロインジェクションすることによりその機能を検討中である。また、同一のレセプターを介した刺激であっても、刺激に用いる抗体の種類などにより、細胞応答が全く異なる場合が見いだされ、細胞に対する刺激の定量化の重要性が示された。これに関し、現在レセプターの架橋に影響すると予想されるいくつかの因子を定量的に変化させる系を準備中である。
腎病変形成に関わるインテグリンシグナル経路における活性酸素の役割解明

腎不全に至る全ての小児腎疾患には、メサンギウム細胞(MC)増殖や細胞外基質(ECM)の構築異常、ポドサイト(Pod)の糸球体基底膜からの剥離(脱接着)、ボウマン嚢上皮細胞(PEC)増殖による半月体形成等の細胞生物学的特徴がある。腎炎の進行を左右する細胞動態を制御しているインテグリンシグナル伝達経路における活性酸素種(ROS)の役割を明らかにするために、培養細胞や腎炎モデルを用いて検討した。1)ラット進行性腎炎モデル(WKYマスギ腎炎)におけるNAD(P)Hオキシダーゼ活性の検討WKYマスギ腎炎の糸球体をDHE染色を用いてROS活性を検討したところ、半月体形成部位に強いROS産生が認められ、それはNAD(P)Hオキシダーゼ構成蛋白(Nox2)の発現増加や腎炎におけるメサンギウムECMのリモデリング異常やPEC増殖などの細胞反応の発生時期とも一致していた。2)NAD(P)Hオキシダーゼ由来ROSのインテグリン依存性のMC増殖、ECMリモデリング、半月体形成における役割の細胞生物学的検討腎炎半月体形成部位には、ILK,β1インテグリン、Nox2が共に強く発現しており、ARBなどのROS除去剤にて治療すると、病変は改善しILK,β1インテグリン、Nox2の発現も低下した。ROSシグナルとインテグリンシグナルを検討したところ、一部はILKシグナルを共通経路として用いており、focal adhesionにはNox2は異なるNox分子の発現の存在が示唆された。以上より、ILKとROSは腎炎の進行を左右する重要な分子でありインテグリンシグナルにNAD(P)Hオキシダーゼにより産生されたROSが影響していることが示唆された。今後、ROSシグナルの特異的阻害剤を用いて、腎炎進行に関与する特異経路の解明と薬剤による腎炎進展阻止法の可能性を検討する予定である。腎不全に至る全ての小児腎疾患には、糸球体メサンギウム細胞(MC)増殖やメサンギウム細胞外基質(ECM)の構築異常、糸球体ポドサイト(Pod)の糸球体基底膜からの剥離(脱接着)、ボウマン嚢上皮細胞(B-Ep)増殖による半月体形成等の細胞生物学的特徴がある。1)ラット進行性腎炎モデル(片腎Thy-1腎炎とWKYマスギ腎炎)におけるNAD(P)Hオキシダーゼ活性の検討片腎Thy-1腎炎とwKYマスギ腎炎の糸球体をDHA染色を用いてROS活性を検討したところ、糸球体NAD(P)Hオキシダーゼ構成蛋白(Nox2)の発現推移とパラレルであり、それぞれの腎炎におけるメサンギウムECMのリモデリング異常やPEC増殖による半月体形成などの細胞反応の発生時期とも一致していた。2)インテグリン依存性のMC増殖、ECMリモデリング、POD接着能、半月体形成におけるNAD(P)Hオキシダーゼ由来ROSの役割の細胞生物学的検討腎炎のECMリモデリング、半月体形成部位には、ILK,β1インテグリン、Nox2が共に強く発現していた。ROS除去剤にて治療すると、腎炎のそれぞれの病変は改善しILK,β1インテグリン、Nox2の発現も低下した。しかし、培養MC、培養PECを用いてILK,β1インテグリン、Nox2の局在を検討したところ、focal adhesion部位にはILK,β1インテグリンが共局在していたが、Nox2は異なる分布を示した。

以上より、ILKやROSは腎炎の進行を左右する重要な分子であり、インテグリンシグナルにNAD(P)Hオキシダーゼにより産生されたROSが影響していることが示唆された。今後、インテグリンシグナルとROSシグナルの関係を培養細胞を用いて検討する予定である。腎不全に至る全ての小児腎疾患には、メサンギウム細胞(MC)増殖や細胞外基質(ECM)の構築異常、ポドサイト(Pod)の糸球体基底膜からの剥離(脱接着)、ボウマン嚢上皮細胞(PEC)増殖による半月体形成等の細胞生物学的特徴がある。腎炎の進行を左右する細胞動態を制御しているインテグリンシグナル伝達経路における活性酸素種(ROS)の役割を明らかにするために、培養細胞や腎炎モデルを用いて検討した。1)ラット進行性腎炎モデル(WKYマスギ腎炎)におけるNAD(P)Hオキシダーゼ活性の検討WKYマスギ腎炎の糸球体をDHA染色を用いてROS活性を検討したところ、半月体形成部位に強いROS産生が認められ、それはNAD(P)Hオキシダーゼ構成蛋白(Nox2)の発現推移や腎炎におけるメサンギウムECMのリモデリング異常やPEC増殖などの細胞反応の発生時期とも一致していた。2)NAD(P)Hオキシダーゼ由来ROSのインテグリン依存性のMC増殖、ECMリモデリング、半月体形成における役割の細胞生物学的検討腎炎のECMリモデリング、半月体形成部位には、ILK、β1インテグリン、Nox2が共に強く発現しており、ARBなどのROS除去剤にて治療すると、病変は改善しILK、β1インテグリン、Nox2の発現も低下した。ROSシグナルとインテグリンシグナルを培養MC、培養PECを用いて検討したところ、一部はILKシグナルを共通経路として用いており、fbcal adhesionにはNox2は異なるNox familyの発現の存在が示唆された。以上よりILKとROSは腎炎の進行を左右する重要な分子でありインテグリンシグナルにNAD(P)Hオキシダーゼにより産生されたROSが影響していることが示唆された。今後、ROSシグナルの特異的阻害剤を用いて、腎炎進行に関与する特異経路の解明と薬剤による腎炎進展阻止法の可能性を検討する予定である。
網膜芽細胞腫に対する新治療法開発に関する研究

正常ヒト皮膚繊維芽細胞と血管内皮細胞の共培養を用いて、マーカーCD31の免疫組織化学的発現からin vitroの血管新生に対する内因性Sonichedgehogシグナルの抑制の効果をシクロパミンを用いて検討した。シクロパミンは,CD31陽性の管腔形成を抑制し、内因性Sonic hedgehogシグナルは血管増生に関与していることが判明した。in vivoでの網膜芽細胞腫の血管新生阻害による増殖抑制効果が示唆されたが、In vivoでの研究は今後の課題である。網膜芽細胞腫由来の細胞株を遠沈し、ペレット状にして、26G針でマウス眼の前房内に移植した。一定期間御に屠殺、眼球摘出し、パラフィン切片を作成した。腫瘍細胞の著しい増殖は観察されず、隅角に細胞が少数増殖していた。シクロパミンの全身投与に寄る実験的な眼内の腫瘍に対する治療効果の判定には、さらに、眼内で腫瘍細胞が増殖できるシステムを開発する必要があると結論した。扁平上皮癌細胞と同様に網膜芽細胞腫においてもSonic hedgehog/Gliシグナル経路の活性化が腫瘍増大に関与することが示された。また、増殖系グナルのマーカーが強発現していたことで腫瘍特有の細胞増殖が示された。網膜芽細胞腫培養細胞株(Y-79)を入手して、継体培養をおこなったのちに、MTTアッセイを用いてin vitroでのシクロパミンによる細胞増殖抑制の検討を行った。培養液にシクロパミンの添加群で、無添加群と比較して吸光度から増殖の抑制が証明された。現在、網膜芽細胞腫培養細胞株をヌードマウスに移植した細胞によるin vivo腫瘍モデルでの治療効果を確認中である。網膜芽細胞腫培養細胞株は浮遊細胞である為、遠沈して沈渣を眼内に投与しても、発育が難しい為に、皮下注においてこころみている。網膜芽細胞腫培養細胞株Y79を皮下に移植すると、腫瘍を形成した。予備的免疫染色では、Sonic HedgehogやGlilが検出された。Glilは一部の細胞で核内に検出された。一方で、研究計画にあった眼へのY79腫瘍細胞の移植については、マウス眼が小さいため、30G針を用いても手技に困難があった。そこで、Wistarラット眼にY79Y79腫瘍細胞を移植した。遠沈した細胞を30G針で前房、または硝子体内に注入した。前房内への移植では、組織学的に円形の腫瘍細胞がおもに隅角に増生していた。硝子体内では、網膜剥離を合併していたものの、Y79腫瘍細胞と思われる細胞が播種されていた。角膜や強膜、虹彩などに腫瘍細胞が浸潤している所見は観察されなかった。角膜に炎症所見は観察されなかった。本年度の実験では、残念ながら、同一細胞数の移植を、前房内、あるいは硝子体内に移植しても、個体毎に均一な細胞増殖を観察できなかったので、シクロパミン投与(全身または局所を計画していた)による治療効果の判定には至らなかった。手技の工夫が必要であると考えられた。並行して行った免疫組織化学的検索では、皮下移植での結果に類似して、Sonic HedgehogやGlilが腫瘍細胞に陽性であった。また、これらの細胞はトランスフォーミング成長因子ベータ(1、2)およびSmad2/3、さらに一部の細胞でC末端リン酸化Smad2に陽性であった。悪性細胞では、C末端リン酸化以外にSmad2/3のミドルリンカー領域のリン酸化が浸潤、転移に関与しているという所見(personal communication)があるので、そのの検出を行わなければならない。網膜芽細胞腫培養細胞株の浮遊培養でMTTアッセイを用いてin vitroでのシクロパミンの細胞増殖抑制の検討を行ったが、データにばらつきがあり、一定した成果を得られなかった。一方,固着培養の腫瘍細胞株である扁平上皮癌細胞株を比較実験として使用した。同細胞では、外因性のSonic hedgehogが腫瘍細胞のGli-1の核内移行と相まって増殖を促進すると同時に、シクロパミンが、Gli-1の核内移行を抑制することから考えて、内因性のSonic hedgehogシグナルを抑制していると考えられた。正常ヒト皮膚繊維芽細胞と血管内皮細胞の共培養による市販の血管新生キットを用いて、マーカーCD31の免疫組織化学的発現からin vitroの血管新生に対する内因性Sonichedgehogシグナルの抑制の効果をシクロパミンを用いて検討した。

血管内皮綿胞は、血管様の構造を形成するとCD31陽性となるので、それの長さと分岐数を測定することで血管新生作用を評価した。その結果、シクロパミンは,CD31陽性の管腔形成をよくせいし、内因性Sonic hedgehogシグナルは血管増生に関与していることが判明した。in vivoでの網膜芽細胞腫の血管新生阻害による増殖抑制効果が示唆されたが、In vivoでの研究は今後の繰題である。網膜芽細胞腫由来の細胞株を遠沈し、ペレット状にして、26G針でマウス眼の前房内に移植した。一定期聞御に屠殺、眼球摘出し、型どおりにパラフォルムアルデヒド固定、パラフィン切片を作成した。腫瘍綿胞の著しい増殖は観察されず、隅角に組胞が少数増殖していた。虹彩に付着増生下細胞は観察されなかった。シクロパミンの全身投与に寄る実験的な眼内の腫瘍に対する治療効果の判定には、さらに、眼内で腫瘍細胞が増殖できるシステムを開発する必要があると結論した。
科学理論の意味論的概念による科学哲学の諸問題の考察

科学的説明・因果性の分析,科学的方法論の分析,そして科学と疑似科学の線引き基準について新たな考察を試みた.まず,科学的説明は,従来広く受け容れられてきた説明理論である統合説や因果説の難点を指摘し,それに変わる新しい理論として「本質による説明理論」を提案した.それによると,科学的説明において,確かに統合は重要なのであるが,.その統合により明らかになった現象の本質を指摘することが本質的な点である,さらに,反事実的条件文による因果性の分析において問題とされる「遅いプレエンプション」を科学的説明の分析に用いた語用論的考察によって回避することができることも示した.同時に,これらの分析を通じて,科学的方法論の特徴を明らかにした.それによると,疑似科学的な説明は,形式的には上で示したような特徴を備えているのであるが(それゆえ一面において科学的なのである),説明のために要求される新しい要素を導入する際に問題があることが明らかになった.たとえば,科学では,未知の実体が存在すると仮定するとき,それはそのときの科学者集団内で受け容れられている観察手段によって観察可能であるか,その導入によって独立的な法則が統合できるかでなければならない.ところが,疑似科学的な説明において導入される要素はそういった特徴を備えていないのである.以上の成果は,京都科学哲学コロキウム,および科学基礎論学会において口頭発表され,『待兼山論叢』39号に論文として発表され,さらに『科学基礎論研究』106号に論文が掲載予定である.「科学的説明とは何か」という研究課題に関して,5月29日に京都大学コロキウムで,6月18日に科学基礎論学会で発表した.そこでの討論をもとに論文を仕上げ,現在『科学基礎論研究』という学術雑誌に投稿中である.この研究では,従来受け容れられてきた因果過程による説明理論や統合化による説明理論の難点を指摘した.特に焦点を当てたのは,これらの理論では「記述」と「説明」の違いが理解できないことである.この難点を克服する新たな説明理論である「現象の本質を示すことによる説明」を提案した.この理論では「科学理論の意味論的捉え方:SC」と呼ばれる考え方が用いられている.さらに,これまでの研究から科学的言明というのは必ずも真理を言い表しているわけではないと言うことを指摘し,一般に流布している「科学信仰」による弊害(疑似科学的言明よるものも含む)を警告し,科学者が社会に影響を与えるような科学的発言をする際にはどのような点に留意すべきかを議論した論文を大阪大学文学会発行の『待兼山論叢』に投稿した)「科学者の誠実さとはなにか」).8月25日に北大夏のセミナーにて,「科学理論の意味論的捉え方による実験の分析」という題目で発表した.ここでは,従来のSCの研究では理論分析が中心であったが,実験もまたSCをもちいることによってその特徴が明らかになることを議論した.この際,ハッキングのいう「現象の創造」という考え方が重要になることを指摘した.科学的説明・因果性の分析,科学的方法論の分析,そして科学と疑似科学の線引き基準について新たな考察を試みた.まず,科学的説明は,従来広く受け容れられてきた説明理論である統合説や因果説の難点を指摘し,それに変わる新しい理論として「本質による説明理論」を提案した.それによると,科学的説明において,確かに統合は重要なのであるが,.その統合により明らかになった現象の本質を指摘することが本質的な点である,さらに,反事実的条件文による因果性の分析において問題とされる「遅いプレエンプション」を科学的説明の分析に用いた語用論的考察によって回避することができることも示した.同時に,これらの分析を通じて,科学的方法論の特徴を明らかにした.それによると,疑似科学的な説明は,形式的には上で示したような特徴を備えているのであるが(それゆえ一面において科学的なのである),説明のために要求される新しい要素を導入する際に問題があることが明らかになった.たとえば,科学では,未知の実体が存在すると仮定するとき,それはそのときの科学者集団内で受け容れられている観察手段によって観察可能であるか,その導入によって独立的な法則が統合できるかでなければならない.ところが,疑似科学的な説明において導入される要素はそういった特徴を備えていないのである.以上の成果は,京都科学哲学コロキウム,および科学基礎論学会において口頭発表され,『待兼山論叢』39号に論文として発表され,さらに『科学基礎論研究』106号に論文が掲載予定である.
電気・光生体物性を利用した無侵襲循環情報多機能計測法に関する研究

本研究は,平成24年度に渡り,少ないセンサ技術で多くの循環情報を簡易且つ高信頼で取得できる無侵襲多機能計測の確立を意図し,その基礎的研究を展開してきた。以下,研究全般を通して得られた主な成果を概述する。1.無侵襲血圧・血流量計測法:報告者らが以前考案した容積振動法あるいは容積補償法と電気的アドミタンス法とを併用し,血圧と共に血流量を同時計測する方法を新たに提案した。この際,生体アドミタンス信号を高精度に検出する新しいvoltage clamp法を開発し,生体応用計測に世界で初めて成功した。2.無侵襲血圧・血管弾性特性計測法:容積振動法による血圧測定過程で,血管内容積を近赤外光電センサ,あるいはアドミタンス法で定量することにより,血管弾性を血圧の関数で評価する方法を開発し,in vitro及びin vivo試験を通して本法有用性が確認された。3.無侵襲血圧・血液酸素飽和度計測法:2.の光計測で,検出光を2波長分光すれば動・静脈血の酸素飽和度をも分離計測できることを実証し,各種実験的検討から本法精度と有効性が確認され,更に本法が汎用のパルスオキシメトリより優れていることを立証した。4.循環生理情報の多機能同時計測法:以上の研究を発展させ,先ず上記1.に基づく(a)心機能を含む全身循環動態多機能計測法,及び2.に基づき容積定量を高精度で得るアドミタンス・カフ法の考案を通し,(b)体肢末梢循環多機能計測法を新たに提案した。特に(b)では,毛細管圧,毛細管漉過率等の重要な末梢循環機能指標と血液性状をも同時計測できることを実証した。5.無拘束循環動態計測システムと臨床・在宅計測への応用:更に,4-(a)を進展させ,新規の無拘束循環生理計測システムを提案し,臨床及び日常生活下での試用とデータ解析から,従来法では得られない新しい種々の生理学的知見等を見い出した。以上,本研究を通して得られた様々な計測法が,今後多方面の分野に寄与できる基礎が築かれたものと考えられる。以下本年度(平成2年度)交付申請書に記した「研究実施計画」に沿って、本研究で得られた主な成果を箇条書きにする。<1.無侵襲血流計測の確立に関する検討>___ー:血液が他生体組織と比べ高導電性を持つことを利用し、血液容積変化を電気信号として捉える生体電気的アドミタンス法を以前開発したが、今回この生体アドミタンス信号をより高品質・高精度に検出するVoltageclamp法を新たに開発し、心拍出量、体肢動脈血流量計測の適応に成功した。更に、体内水分量バランスの評価に重要な生理学的情報である体肢毛細管濾過流量(CFR)と濾過係数(CFC)を高精度に求めるべく、体肢セグメントを弾性薄膜カフで覆い、その周囲を電解質溶液で満たして、体肢内水分量変化を電解質溶液変化に置換し、これをアドミタンス信号として検出するアドミタンス・カフ法を考案した。本法によりCFR、CFCが従来法と比べ、より高精度・高信頼で測出出来ることが実験的に確認された。<2.血圧、血管弾性特性及び末梢循環抵抗の無侵襲計測の検討

>___ー:前記1.で得た知見を更に拡張し、この方法と、申請者らが以前開発した容積振動法並びに容積補償法による無侵襲血圧計測法との同時併用を行い、循環生理情報(心拍出量、血圧、血管弾性特性、全身及び局所末梢循環抵抗、心臓の酸素消費量の指標であるrate pressure product(=瞬時心拍数×最高血圧)など)を無侵襲的に多機能計測する方法を提案し、実験的検討を通して本法の有用性と信頼性等について基礎的デ-タを得た。<3.血液物性の無侵襲計測に関する検討>___ー:前記のアドミタンス・カフ法に容積振動法を適用することにより、CFR、CFC以外に体肢血圧、体肢動静脈血管弾性特性、及び血液の電気物性を示す比抵抗と血球濃度を示すヘマトクリットをも同時計測可能であることを理論的・実験的に検証した。更に、容積振動法に2波長測光方式を適用することにより、血圧以外に動・静脈血液の酸素飽和度を分離計測できることを実証した。平成2年度の研究成果を踏まえ,以下本年度(平成3年度)交付申請書に記した[研究実施計画]に沿って,本研究で得られた主な成果を箇条書きにする。1.計測システムの再構成とその開発:平成2年度で得られた各種循環生理情報の無侵襲計測法を基礎に,(A)容積振動法と胸部電気的アドミタンス法とを併用した全身循環機能計測システム(測定対象量;血圧,心拍出量,脈波間隔,脈拍数,末梢循環抵抗,心室駆出時間,心臓酸素消費量指標(rate pressure product)),及び容積振動法をベ-スに末梢側体肢循環情報を多機能計測出来る(Bー1)電気的アドミタンス・カフ法による体肢循環機能計測システム(測定対象量;血圧,体肢血流量,体肢静脈血管容量特性,体肢動脈硬化度,体肢循環抵抗,ヘマトクリット,毛細管圧,毛細管漉過率,前後毛細管抵抗比)と(Bー2)^2波長分光法による計測システム(測定対象量;血圧,動・静脈血液酸素飽和度,動・静脈血管弾性特性)の設計開発を行った。更に,本システムの福祉・在宅医療への応用も加味し,日常生活の自由行動下でも循環情報を簡易に長時間取得できることを目標に,特に(A)のシステムを携帯型とする設計開発も実施し,無拘束循環情報モニタシステムの実現性を計った。2.健常人による試用とシステム評価:前記1.で得た各システムを健常人に対して試用したところ,各種循環生理情報が広い測定レンジで再現性良く同時計測出来ることが確認され,本法の有効性と本システムの有用性が確認された。特に,光を用いた(Bー2)のシステムに於ける血液酸素飽和度計測ついては,家兎による動物実験及び光学的に生体血管系を模倣したキュベット血液層モデルを作成し,ヘマトクリット,酵素飽和度を広範囲に変化させて本法誤差を調べたところ,従来のパルスオキシメ-タ法以上の高精度を有し,循環・呼吸・組織酸素代謝の同時計測として有効であることが検証された。本年度(最終年度)では、これまで得られた循環生理情報の無侵襲あるいは無拘束多機能計測法と、これに基づく実験用システムを多くの被験者に適用し、そのデータ分析を通して総合的評価の研究を展開した。以下,主な成果の概要を箇条書きにする。1.容積振動法と胸部電気的アドミタンス法との併用に基づく循環動態機能計測システムの試用とデータ解析から、血圧日内変動は末梢循環低抗調節に起因する場合と心機能調節に起因する場合とがあることを見い出し、循環器疾患によっては両者の因子が拮抗的に働き、通常見られる血圧日内変動がマスクされていまことを立証した。2.我々が以前開発した容積補償法と前記のアドミタンス法とを併用し、一心拍毎の循環諸情報を同時計測できる親規の方法を考案した。
修復と排除：ｐ５３誘導性タンパク質ＭＩＥＡＰによる新規ミトコンドリア品質管理機構

Mieap制御性ミトコンドリア品質管理機構は、従来のオートファジーとは全く異なるミトコンドリアの品質管理機能であり、マウスからヒトまでの細胞に存在する低酸素応答性の生理的細胞機能である。また大腸がんや胃がんなど、ヒト臨床がんで高頻度に機能異常が発生しており、結果的に生体内のがん細胞には不良なミトコンドリアが蓄積し、そこから発生するミトコンドリア由来活性酸素種が、がんの発生・増殖・浸潤・転移にきわめて重要な役割を果たしている可能性が強く示唆された。p53の新しいがん抑制機能といえる。以下の4つの研究項目について実験を行っている。(1)MALMの解析、及び(2)MIVの解析: IP-2DICAL法を駆使して、MALM及びMIVに重要な働きを有するMieap結合タンパク質を同定する。同定されたMieap結合タンパク質は、遺伝子工学や細胞生物学及び生化学的手法を用いて、その機能解析を進める。(3)実験動物を用いたin vivo解析:Mieapによるミトコンドリア品質管理機構が、個体の発生及び出生後の生命活動にどのような役割があるかを調べるために、マウスを用いた実験を行う。Mieapノックアウトマウスを作成し解析する。MieapノックアウトマウスよりMEFを樹立して、細胞レベルでのMieap制御性ミトコンドリア品質管理機構の生理的意義を明らかとする。Mieapノックアウトマウスと大腸がん・膵がん・胃がんモデルマウスとの交配を行い、大腸がん・膵がん・胃がんなどにおけるMieap制御性ミトコンドリア品質管理機構のin vivoでの役割を明らかとする。(4)臨床がん組織における解析:がん臨床検体の収集と解析を行う。大腸がん・膵がん・胃がんなど、様々ながん種に関して、国立がん研究センター中央病院や共同研究施設で治療を受けたがん患者の余剰検体から、それぞれのがん種について50例程度の臨床検体を選定し、ゲノムDNAを抽出し、Mieap及びBNIP3のプロモーターに関してメチル化PCRにてメチル化の有無を、p53に関しては直接シークエンス法にて変異の有無を調べ、p53/Mieap/BNIP3経路の臨床がん組織における異常を解析する。マウスMieap抗体を作成して、野生型マウスにおけるMieapタンパク質の各組織発現状況について調べる。また、マウスMieap遺伝子をクローニングし、ヒト細胞において発見されたMALM及びMIVの機能が、マウス細胞においても存在するのか確認する。p53ノックアウトマウスと野生型マウスにおいて、Mieapの発現及び発現誘導の状況に違いがあるのかを解析する。Mieapノックアウト(KO)マウスを作成し解析する。(4)臨床がん組織における解析:がん臨床検体の収集と解析を開始する。国立がん研究センター・バイオバンクの国立がん研究センター中央病院で治療を受けたがん患者の余剰検体から、それぞれの癌腫50例程度の臨床検体を選定し、ゲノムDNAを抽出し、Mieap及びBNIP3のプロモーターに関してメチル化PCRにてメチル化の有無を、p53に関しては直接シークエンス法にて変異の有無を調べ、p53/Mieap/BNIP3経路の臨床がん組織における異常を解析する。以下の4つの研究項目について実験を行った。(1)MALM、及び(2)MIVの解析: IP-2DICAL法を駆使して、MALM及びMIVに重要な働きを有するMieap結合タンパク質を同定する。(3)実験動物を用いたin vivo解析:Mieapによるミトコンドリア品質管理機構が、個体の発生及び出生後の生命活動にどのような役割があるかを調べるためにMieapノックアウトマウスを作成し解析する。Mieapノックアウトマウスと大腸がん・胃がんモデルマウスとの交配を行い、大腸がん・胃がんなどにおけるMieap制御性ミトコンドリア品質管理機構のin vivoでの役割を明らかとする。大腸がん

・膵がん・胃がんなど、様々ながん種に関して、国立がん研究センター中央病院や共同研究施設で治療を受けたがん患者の余剰検体から、それぞれのがん種について50例程度の臨床検体を選定し、ゲノムDNAを抽出し、Mieap及びBNIP3のプロモーターに関してメチル化の有無を、p53に関しては変異の有無を調べ、さらには免疫組織学的解析を行い、p53/Mieap/BNIP3経路の臨床がん組織における異常を解析する。以上の解析結果から、Mieap制御性ミトコンドリア品質管理機構は、マウスからヒトまでの細胞に存在する低酸素応答性の生理的細胞機能であること、またその異常は、ヒト臨床がんで高頻度に発生しており、生体内においてがんの発生・増殖・浸潤・転移にきわめて重要な役割を果たしている可能性が強く示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。(1)MALMの解析: Mieap結合タンパク質として、ミトコンドリア外膜タンパク質であるBNIP3・NIX及び14-3-3gammaを同定した。BNIP3・NIXはミトコンドリア二重膜におけるporeを誘導することで、MALMの誘導に極めて重要な役割を果たしていることが示唆された。14-3-3gammaは、Mieapと結合してミトコンドリア内へ移動し、酸化修飾タンパク質の分解・除去に重要な働きを有している可能性が示唆された。(2)MIVの解析: UVRAGは、Mieap-αと特異的に結合して、エンドサイトーシスを介してMIVの形成に重要な役割を果たしている事が示唆された。(3)実験動物を用いたin vivo解析:Mieapノックアウトマウスより樹立したMEFを用いた実験から、Mieap制御性ミトコンドリア品質管理機構は、低酸素ストレスによって活性化されるマウスからヒトまで保存された本質的な細胞機能であることが明らかとなった。大腸がんモデルマウスとの交配実験より、Mieapは大腸がんの発生・進展に抑制的な役割を有している事が明らかとなった。(4)臨床がん組織における解析:大腸がん及び膵がん患者検体において、Mieap制御性ミトコンドリア品質管理機構は7080%以上の症例において、不活性化されている事が明らかとなった。当初の予定より大幅な進展が達成できたと考えている。(1)MALMの解析: Mieap結合タンパク質として、ミトコンドリア外膜タンパク質であるBNIP3とNIXを同定した。BNIP3やNIXの欠損によって、MALMの誘導がほぼ完全に抑制されたことから、これら分子はMALMの誘導に極めて重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに、Mieap、BNIP3、NIXの3者の結合は、ミトコンドリア二重膜におけるporeを誘導すること、MALMはこのporeを介して発生する可能性が示唆された。(2)MIVの解析:Mieap結合タンパク質として、UVRAGを同定した。UVRAGは、Mieap-αと特異的に結合して、MIVの形成に重要な役割を果たしている事が示唆された。(3)実験動物を用いたin vivo解析:マウスMieap遺伝子をクローニングして、発現ベクターを構築した。
多環芳香族化合物の領域選択的な縮環π拡張反応の開発

縮環π拡張反応(APEX反応)は不活性な多環芳香族炭化水素(PAH)の炭素水素結合を直接的に変換して新たに縮環芳香環を構築する手法であり、ナノグラフェンやグラフェンナノリボンの一段階合成が行える手法である。従来のAPEX反応では、K領域、bay領域といったアームチェア端方向への拡張のみ可能であっため、合成できるナノグラフェンの構造多様性が乏しい問題点があった。本研究では、様々な遷移金属触媒やアリール化剤を駆使し、これまで開発されていなかったPAHのM領域、L領域いった領域での選択的APEX反応の新規開発を目指す。