hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
父性発現インプリンティング遺伝子Ｐｅｇ１０の機能解明

これらの結果より、申請者はマウス受精卵には豊富なレトロトランスポゾンの逆転写活性により多量のcDNAが存在する状態であり、受精卵におけるDSB修復の際にmicrohomologyを介して鋳型として働くことでDSB部位に挿入されることを明らかにした。本研究の遂行に必要なPeg10の様々な変異マウスをゲノム編集技術「CRISPR/Cas9」を用いて作製に成功しており、またその機能解析も開始できているので、おおむね順調に研究計画が進展している。本研究より新たな発見が見つかったので、解析を行っていく。エピジェネティクス昨年度までに作製したPeg10の様々な変異マウスを用いて、機能解析を行う。次世代シーケンサーなどの大量のデータ解析は、非常に時間のかかる作業であるため、その間、物品費などが減ったため。学会に行かなかったので、旅費を使用しなかったため。引き続き、次世代シーケンサー関連の物品を購入し、解析を行う。旅費として使用する。
PACAPによる涙液分泌促進機構の解析

申請者はこれまでにPACAP遺伝子欠損(KO)マウスがドライアイ様症状を呈することを見出した。本研究課題において、マウス涙腺組織ではPACAPおよびその特異的受容体(PAC1R)が発現しており、PACAPの点眼投与により有意な涙液量の増加が認められた。さらにPACAPはPAC1Rを介してcAMP/PKA経路を活性化させ、さらにアクアポリン5のリン酸化を誘導することにより涙液分泌を促進していることが明らかになった。以上の結果から、PACAPが涙液分泌促進効果を有することが示唆された。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)は27または38アミノ酸残基からなる神経ペプチドである。我々はPACAP遺伝子欠損(KO)マウスを飼育・維持する過程において角膜表面を長期的に観察したところ、10週齢未満の若齢個体では角膜に変化は認められなかったが、20週齢以上の特に雌性個体において高頻度に角膜表面の角質化が認められた。そこで角膜角質化の原因として涙腺と涙液分泌量に着目した。PACAP KOマウスの涙腺は病理学的に正常であったが、涙液量を綿糸法により測定した結果、生後10週齢以前から涙液量の減少が認められた。以上の結果から、PACAP KOマウスでは角質化が生じる以前に涙液量が減少していることが明らかになった。そこでマウス涙腺組織におけるPACAPおよびその特異的受容体(PAC1R)発現をRT-PCR法により解析したところ、PACAPおよびPAC1R mRNAが涙腺組織に発現していることが確認された。さらにPACAPおよびその特異的受容体(PAC1R)の涙腺における組織分布を免疫組織化学的に観察した。PAC1R免疫陽性反応は涙腺腺房細胞の基底部に認められ、PACAP免疫陽性反応は腺房周囲の副交感神経に局在した。次にPACAPの涙液分泌に与える影響を評価するため、PACAPの点眼投与実験を行なった結果、PACAP点眼開始15分から45分にかけて有意な涙液量の増加が認められた。この反応はPACAP6-38(PAC1Rアンタゴニスト)前投与により抑制された。以上の結果から、PACAPは涙液分泌促進作用を有していることが明らかになった。よって次年度ではPACAPによる涙液分泌促進機構に関するシグナル経路と、水輸送に関わるチャネル分子であるアクアポリンに着目した解析を行う予定である。ドライアイは涙液の量的または質的な異常により引き起こされる角結膜上皮障害と定義される疾患である。現在、ドライアイ治療法として人工涙液や自己血清点眼治療などが行なわれているが効果は短期間あることから、より効果的なドライアイ治療薬の創出が切望されている。また、ドライアイの原因解明および治療薬を開発するためにはドライアイモデル動物を用いた解析が必要不可欠であるが、現在までに有用なドライアイモデル動物は十分に確立されていないのが現状である。申請者はPACAP遺伝子欠損(KO)マウスの飼育・繁殖の過程において、20週齢以上の特に雌性個体において高頻度に角膜表面の角質化と涙液量の減少が生じることを見出した。このようにPACAPKOマウスではヒトのドライアイと類似したドライアイ様症状が認められたことから、マウス涙腺組織におけるPACAPおよびその特異的受容体(PAC1R)発現を解析したところ、PACAPおよびPAC1Rが涙腺組織に発現していることが確認された。さらにPACAPの涙液分泌に与える影響を評価するため、PACAPの点眼投与実験を行なった結果、PACAP点眼開始15分から45分にかけて有意な涙液量の増加が認められた。さらにPACAP点眼後の涙腺組織を用いてシグナル伝達経路を解析した結果、PACAPはPAC1Rを介してcAMP/PKへ経路を活性化させ、さらにアクアポリン5のリン酸化を誘導することにより涙液分泌を促進していることが明らかになった。以上の結果から本研究課題により、PACAPKOマウスは新規ドライアイ様モデル動物であること、さらにPACAPが涙液分泌促進効果を有することが示唆された。
父親の適応過程と家族の関係性に着目した「障害児をもつ家族」への援助に関する研究

本研究の目的は、障害児をもつ家族への支援を検討するために障害児の父親の適応過程とニードを理解することである。研究協力の同意が得られた、障害児を持つ父親14名に半構造化されたインタビューを実施。1回のインタビューの時間は、1時間半から2時間半であり、質的研究の手法に乗っ取って分析された。1)父親の「子どもの障害の受容過程」では、心理的に辛い時にも人に頼ることが少なく、多くの父親が自分の中で整理し、乗り越えていた。2)子どもの成長のさまざまな段階で、家族で乗り越えなくてはならない課題が生じ対応をする様子があった。療育水準に地域差があり、子どもの療育環境を考えて転職や転居を決断するケースがあった。3)健常児の存在は、父親としての安定や家族の安定をもたらすことにプラスに働いていた。しかし、障害の程度が重い場合、余裕のなさ、介護力の低下をおそれて踏み切れない状況があった。4)夫婦の役割分担は、個々の家庭で違うが、相手に何を期待しているか、それをどれだけ了解できているかが関係性において重要であった。「家族に対する責任」や「妻への感謝といたわり」が重要と多くの父親が考えていた。また今後充実されるべき支援として、以下のことが挙げられた。1)役に立つ情報の整理と活用のためのガイド、専門職種の養成2)父親の交流の場の整備3)夫婦、家族を単位とした関係性への支援(相談)5)レスパイトケア等介護支援の充実特に必要な情報が手に入らないという不満は強くもっており、自分たちに合った支援や資源の活用ができるように、相談できる専門家の配置やアクセスできる情報の整理を求める声は高かった。障害児を持った家族の初期の心理の理解と家族支援の介入モデル作成のために障害児を持つ家族にグラウンデッド・セオリーの理論を用いた半構造化された面接法を継続して行っている。また、患者組織の国際会議に参加し、欧米の患者会の活動内容などを調査した。その過程で、以下の内容が示された。1)母親側には、「期待と失望と現状の受容」「母親の子への愛着の形成」「医療・制度に対する不満」「父親に対する大きな期待」が浮かび上がってきた。一方、父親側には、大きな役割期待を受けながら、子どもの障害受容に対するサポート体制が十分でなく、孤立しがちな状況があった。2)内外比較においては、欧米の父親は、「親権者としての責任」が強く、養育に関しても主体的に関わる傾向がみられるのに対し、日本の父親は、障害児の養育に関しては母親に任せる傾向にあり、「経済的安定による家族支援」、「障害児の兄弟への対応」等の側面支援が主であった。3)遺伝性疾患の場合、欧米では病気の保因者となることは誰しもあり得ることとして、マイナスにとらえず、そこからの策を講じようとするのに対し、日本においては負のイメージが大きく、オープンに語られないのが実情である。4)患者会組織において、欧米の活動では、「研究領域への寄付」、「制度改革への政治的活動」、「インターネットを通じての情報開示」というキーワーズが出てきた。日本では、情報提供や孤立化を防ぎ心理的サポートとしての役割があるが、父親の意識と参加は欧米に比べ高くない。以上の点は、まだデータ収集の途中経過での報告内容である。サンプル数に限りがあることを付け加える。今後も、データ収集を行い、理論の構築と介入モデル作成へとつなげていく。障害児を持った家族支援の介入モデル作成のために、障害児の父親の適応過程と家族の関係性に着目した質的研究を行った。

研究協力の同意が得られた障害児を持つ父親14名に半構造化されたインタビューを実施、内容はすべて逐語録におこされ、質的研究の手法に乗っ取って分析された。結果、「父親の子どもの障害の受容」に関しては、「認識、受容時期、受容過程の多様性」と、多くの父親が心理的に辛い時に人に頼ることなく、自分の中で気持ちを整理し「一人で乗り越えていく」傾向があること、日常の些細な出来事や、児の療育に伴う「転職や転居の必要性」、「障害児の次の子どもの出産」という事象で、悩みながらも前向きに「理想と現実の折り合い」をつけていること、夫婦の役割分担は個々の家庭で違い、「夫婦の関係性」においては、「相手への期待と双方の了解」、父親・夫として「家族に対する責任」や「妻への感謝といたわり」の大切さを実感していること、などが共通にみられた。障害児の父親およびその家族は、適応の過程で、直面する問題に対し主体的に情報収集し何をなすべきか判断していく存在であった。支援として最も重要なことは、対象者および家族の自律性が発揮されるように行われることと思われた。障害児を持つ父親への支援として今後充実されるべきものとしては、1)役に立つ情報の整理と活用のためのガイド、専門職種の養成2)父親の交流の場の整備3)夫婦、家族を単位とした関係性への支援4)レスパイトケア等介護支援の充実等が具体的に挙げられた。
細胞外電子移動を基軸とした生体電子移動論の開拓

細胞外電子移動ダイナミクスの追跡等を通してその分子機構を明らかにし、細胞外電子移動の制御による代謝の可逆制御と集団的活性化を実現した。さらに細胞外電子移動能を有する微生物が環境中に広く分布していることを見出すと共に、新しい電子伝達分子の開発により本来細胞外電子移動能を持たないヒト細胞等へその概念を拡張した。こうした細胞外電子移動を基軸とした生体電子移動論の学理構築を通して、体内時計やガン細胞活性の計測・制御、そして電気に支えられた新たな代謝・生態系の提唱など、多岐に渡る分野に対して新しい方法論や視点・切り口を提供した。研究課題1ー細胞内電子伝達経路の電極電位制御これまでに開発してきた生体親和型電子伝達ポリマーを用いて光合成細菌シアノバクテリアの代謝活性制御に挑戦した。その結果、このポリマー存在下において電気化学的周期摂動を与えることで、シアノバクテリアの概日時計が(一定照射光条件の下)制御可能であることが示された。研究課題2ー生体内電子移動のダイナミクスの追跡光ならびに電位による生物代謝の制御について検討を進めてきた。光制御に関しては、光合成生物Euglenaが示す光に応答した運動性に着目し、細胞が照射波長に依存して鋭敏に運動の方向を変えること、さらに照射波長を適切に選択することにより細胞集団の濃縮が可能であることを明らかにした。また、CO軸配位子交換反応を用いることで、aa3複合タンパク質の活性を特異的かつ可逆的に光で制御可能であることを実証した。さらに電位制御に関しては、腐食環境より採取した硫酸還元菌に対して適切なパルス電位変調を付与することで代謝経路が変わり、その結果、細胞外電子移動によって誘起される腐食反応を抑制できることを見出した。研究課題3ー細胞間情報伝達による集団同期能現象微生物代謝過程を活性化させるシグナル物質を他の微生物分泌物から単離するため、分離条件の検討を行った。目的とする物質は全くの未知分子であるため、親水疎水性カラムを用いてまず粗分離から行い、さらにリサイクルカラムよるピ-ク分離・精製を行った。その結果、単一物質に近い波形を有したシグナル物質を含むサンプルを得る事が出来た。研究課題1-細胞内電子伝達経路の電極電位制御電極呼吸するGeobacter菌の網羅的代謝解析を行った結果、炭素代謝経路が電極電位依存的に大きく切り替わることが示された。また、これまでに開発してきた生体親和型電子伝達ポリマーを改良し、酵母(真核生物)の代謝の電気化学制御に新たに成功した。さらに、光合成細菌の電気化学的代謝制御に関する研究も継続して行い、Euglenaにおいて電気化学的に制御された細胞外電子移動により強光阻害を緩和することができることを明らかにした。研究課題2-生体内電子移動のダイナミクス追跡光によるCO軸配位子交換反応を用い、鉄酸化細菌Acidithiobacillusの電気化学的炭素固定経路の追跡を試みた。その結果、Acidithiobacillusが電極から電子を獲得しCO2固定を行う能力を有すること、その際の電子伝達系がaa3複合タンパク質を介した鉄酸化代謝経路と類似していることが示された。研究課題3-細胞間情報伝達による集団同期能現象微生物の集団同期能に関与するシグナル分子の単離・同定において、単一物質とみられるサンプルを得て解析を進めたところ、当初の予想に反し当該サンプルに複数の物質が含まれることが判明した。研究遂行上この分子を単離・精製することが不可欠であるため、サンプル分離および構造解析の方法について再検討を行い、クロマトグラフィーを用いた分離条件の実験を進めた。「研究課題1ー細胞内電子伝達経路の電極電位制御」細胞膜外膜に電子伝達タンパク質シトクロム(OMC)を有するShewanella菌およびGeobacter菌において、その代謝活性が電気化学的に可逆制御可能であることを示した。また、この電極電位依存的代謝活性の詳細を調べるための網羅的代謝経路解析のプロトコルを完成させた。一方、OMCを有さない一般の微生物に電気化学培養法を適用するため、新しい生体親和型電子伝達ポリマーを開発した。この電子伝達ポリマーの使用により、光合成細菌の遺伝子発現様式が電気化学的に制御可能であることが示された。「研究課題2ー生体内電子移動のダイナミクスの追跡」直接電子移動能を有する鉄酸化菌の一種Acidithiobacillus ferrooxidansに対してCOを暴露し、光照射を行うことで還元電流の上昇を観測した。また、光電流の作用スペクトル解析よりCOがaa3複合タンパク質内のヘムに特異的に吸着し、プロトン駆動力の発生過程であるcyc2からrusを介したaa3複合タンパク質までの電子伝達が進行し、その活性を特異的かつ可逆的に光で制御可能であることを実証した。「研究課題3ー細胞間情報伝達による集団同期能現象」微生物代謝過程を活性化させるシグナル物質を効率よく取り出すため、培養法の最適化を行った。従来の電気化学セル上澄み液から採取する方法では構造決定を行うのに十分な量を取り出すのが難しい。そこで、電気化学セルを用いない大スケール且つ、簡易な培養条件を検討したところ、培養容器の形を工夫することで格段のスケールアップに成功した。研究課題1-細胞内電子伝達経路の電極電位制御これまでに開発してきた生体親和型電子伝達ポリマーを用いた光合成細菌シアノバクテリアの電気化学制御に取り組み、このポリマーが電子伝達系のプラストキノン(PQ)と電子授受することを突き止め、光合成系D1タンパク質のアイソフォームの発現パターンが電気化学制御可能であることを明らかにした。

さらに、昨年度開発した酸化還元電位の低い電子伝達ポリマーを用い、大腸菌への電極からの電子注入と、それによる人工的電子輸送経路の構築を実現した。研究課題2-生体内電子移動のダイナミクス追跡光によるCO軸配位子交換反応を用いて特定した鉄酸化細菌が持つ電気合成代謝経路のエネルギー論について検討を進めた。その結果、鉄イオンを電子源とした化学合成代謝と比較して、電気合成代謝条件では、より少ない電子数で細胞増殖が進行することが示された。この結果は、aa3複合体を介して生成するプロトン駆動力の利用効率が、化学合成代謝と電気合成代謝で異なることを示唆するものである。研究課題3-細胞間情報伝達による集団同期能現象微生物集団の代謝を同時的に活性化させるシグナル分子の同定へ向けて、引き続き単離・精製の条件検討を進めた。これまでは不安定だったクロマトグラフィーのピーク波形が安定したが、分子の精製度が未だ十分でなく、構造解析には至っていない。一方で、微生物表面酵素の電子移動速度を加速するフラビン分子の機能解明にも取り組み、分子設計により自在に電子移動速度を制御することに成功した。研究課題1に関しては、本年度はこれまでにあげた実績を元に、光合成細菌シアノバクテリアにおける電子伝達ポリマーを介した細胞外電子移動の機構を解明すると共に、新しく合成した酸化還元電位の低いポリマーを用いた大腸菌における人工的電子移動経路の構築に成功した。研究課題2では、今年度は、昨年度までに明らかにした生物学的炭素固定(電気合成代謝)経路の同定を目的とし研究を進めた。CO光応答性の付与、ならびに電子伝達阻害剤を用いた検討により、aa3複合体を介したプロトン駆動力の形成過程、ならびにbc1複合体・NDH1複合体を介した昇圧電子移動反応の追跡に成功した。その結果、電気合成代謝における電子利用効率の算出に成功した。研究課題3については、シグナル分子の精製が困難であり同定までに時間が掛かっているものの、条件検討は着実に進んでいる。また、微生物が分泌する電子移動を加速するフラビン分子の機構解明においては、得られた知見に基づいた分子構造の制御によって電子移動速度を自在に制御することに成功している。これら3つの研究課題の進捗状況を総合すると、全体としておおむね順調に進展していると言える。課題1 :これまで、細胞内の電子伝達経路を電気化学的に制御するツールとして、細胞親和性電子伝達ポリマーを開発してきた。この電子伝達ポリマーの分子構造が細胞外電子移動効率に及ぼす影響について大腸菌及び酵母をモデル細胞として調べた結果、ポリマーの分子量及び組成比に応じて代謝経路が変化することを見出した。また、プロトン移動とカップルして生細胞へ電子注入可能で、かつ好気条件下でも細胞毒性を示さない新規電子伝達ポリマーの合成に成功した。これらにより、電気化学及び高分子材料化学の知見を駆使することで、分子生物学的手法に依らず生きた細胞の代謝・遺伝子発現様式を変調できることを実証した。
高効率の硫黄同化能を付与した硫黄性環境汚染物質に耐性のトランスジェニック植物

[目的]高等植物における物質生産の遺伝子レベルでの人為的制御や有用形質の付与の目的のために、トランスジェニック植物には大きな可能性がある。今回、自然界の無機硫黄同化経路であるシステイン生合成反応の鍵酵素、システイン合成酵素(CSase)のcDNAを導入したトランスジェニックタバコを作出しその解析を行った。[方法と結果]ホウレンソウ(Spinacia oleracea L.)の細胞質局在性のCSaseAのcDNA翻訳領域を、植物発現型ベクターに、センスcDNA (pCSK3F)、アンチセンスcDNA (pCSK3R)、葉緑体に輸送するシグナル配列を融合したセンスcDNA (pCSK4F)、の方向に組み込んだ中間ベクターを構築した。このキメラ遺伝子をAgrobacterium-Tiプラスミド系をもちいてタバコ(Nicotina tabacum)に導入し、トランスジェニック再生植物体を得た。葉におけるCSase酵素活性の測定の結果、pCSK3FとpCSK4Fの形質転換体において非形質転換体よりも高い活性を示し、pCSK3Rの形質転換体ではCSaseの活性低下が見られた。さらにこれらの形質転換体の自殖によって後代を得た。このトランスジェニック後代植物についても、ウエスタンブロット分析によって外来CSaseタンパク質の発現を確認した。またCSase活性の増加に伴うシステイン、グルタチオンなどの含硫有機化合物の生産量の変化について検討している。また、硫化水素ガス暴露などの硫黄環境変化に対する応答についても調べている。[方法と結果]ホウレンソウ(Spinacia oleracea L.)の細胞質局在性のCSaseAのcDNA翻訳領域を、植物発現型ベクターに、センスcDNA(pCSK3F)、アンチセンスcDNA(pCSK3R)、葉緑体に輸送するシグナル配列を融合したセンスcDNA(pCSK4F)、の方向に組み込んだ中間ベクターを構築した。【目的】セリンアセチル転移酵素(SATase)は、システイン生合成系においてシステイン合成酵素(CSase)基質であるο-アセチルセリンの生成を行う酵素であり、生合成系全体の制御に関わっている。演者らは、既にホウレンソウのCSase cDNAのクローニングを行い、CSaseは、少なくとも細胞質および葉緑体に異なったアイソザイムとして局在している事を明らかにした。そこでSATaseについても異なるオルガネラに局在するアイソザイムの存在の可能性を考え、cDNAクローニングを行った。【方法と結果】λgt10により作製したホウレンソウ緑葉cDNAライブラリーについて、スイカSATase cDNAをプローブとして160,000クローンのスクリーニングを行った。その結果、6個の陽性クローンが得られ、これらはクロスハイブリダイゼイションによって4グループに分類された。そのうち最も強くスイカSATase cDNAとハイブリダイズするグループについて解析を進めた。その結果、このグループのクローンpSAT54のcDNAは、塩基配列において約70%、ORFのアミノ酸配列において約76%、スイカSATase cDNAとの相同性が認められた。

また、大腸菌SATase(cysE)との間にもC末端側のアミノ酸配列に相同性の高い領域が存在した。さらに、SATaseに特徴的なアセチルCoAの結合部位と予想されるアミノ酸配列も保持されていた。現在、他の陽性クローンについても検討中である。
オーストラリアの熱帯地域に集団発生している新しい単包虫症の調査研究

オ-ストラリアにおけるこれまでの調査研究により、クイ-ンズランド州熱帯地域の牛に感染が見られる単包虫は、野生動物の間に生活環を持つ単包虫の種内変異系である「野生型」であることが分かった。また、同様の現象は西オ-ストラリア州の野生動物の間でも見られた。そこで、本年度は西オ-ストラリア州、ニユ-サウスウエルズ州の南部と北部およびクイ-ンズランド州の南部と北部において、牛、めん羊および豚の単包虫の核酸、蛋白および酵素の電気泳動パタ-ンを比較したところ、クイ-ンズランド州北部熱帯以外の地域ではほとんどオ-ストラリア本土系牧場型(家畜型)であることが分かった。一方、キャンベラ南々東約45kmにある森林地帯における野生動物の調査では、野犬と狐の単包条虫(成虫)の感染率はそれぞれ86%と42%で、野犬の単包条虫の種内変異系は家畜型、野生型および両者の混合型がそれぞれ1/3を占め、狐からの虫体はすべて野生型であった。また、カンガル-類(オオカンガル-、アカクビワラビ-、オグロワラビ-)および野生豚の感染率はそれぞれ43%と31%であった。クイ-ンズランド州北部における野生豚の感染率は32%で今回は種内変異の同定はできなかった。クイ-ンズランド州北部での感染例を含む、20例の単包虫症患者の血清を各地から集め、めん羊由来の家畜型単包虫抗原を用い、ELISA法などの免疫血清学的検査をしたところ、すべて陽性反応を示した。しかし、野生型単包虫汚染地域であるクイ-ンズランド州北部住民の血清について、同様の免疫血清学的検査を実施したところ、すべて陰性であった。従って、平成3年度では、さらに調査地域を広げて例数を増やし、野生型単包虫抗原によるELISA法およびウエスタンプロッティング法などによる免疫血清学的検査を実施し、あわせて免疫診断法を改善し、確立する予定である。
認知症の種類別BPSD(入浴困難、徘徊、収集癖)の比較による看護援助開発

血管性認知症とアルツハイマー病の疾患が、収集癖(収集行動と称す)、徘徊、入浴困難時の認知症高齢者の言動や思いにどのように影響し、どのような違いが表れるのかを明らかにすることを目的に参加観察法で50名に調査した。重症度と年齢、性を合わせて分析した結果、血管性認知症高齢者はアルツハイマー病高齢者に比し、短期記憶や意味記憶、人の記憶が維持され、そのことが収集物品回収時の反応や徘徊タイプ、入浴時の攻撃言動の違いとして現われていた血管性認知症とアルツハイマー病の疾患が、収集癖(収集行動と称す)、徘徊、入浴困難時の認知症高齢者の言動や思いにどのように影響し、どのような違いが表れるのかを明らかにすることを目的に参加観察法で50名に調査した。重症度と年齢、性を合わせて分析した結果、血管性認知症高齢者はアルツハイマー病高齢者に比し、短期記憶や意味記憶、人の記憶が維持され、そのことが収集物品回収時の反応や徘徊タイプ、入浴時の攻撃言動の違いとして現われていた本研究1年目の平成18年度は、計画に従って、従来まで調査を行った入浴困難、収集癖、徘徊の事例についての研究結果を分析し、更に、先行研究の内容の検討会を行った。平成18年5月に、福井の病院において、今まで調査した入浴拒否9名(軽度2名、中等度5名、重度2名)に追加して、軽度4名と重度1名の追加調査を行った。そして、アルツハイマー病(以下、AD)と非アルツハイマー病(以下、non-AD)の入浴に関する行動の比較検討を行った。結果として、AD6名とnon-AD8名について重症度を合わせて比較してみると、拒否の理由の現れ方は、ADでは入浴日に誘導するたびに拒否理由が異なるのに対し、non-ADでは、かなり一致した拒否理由を示した。また、攻撃行動においては、中等度のnon-ADの対象者(3名)は、同じく中等度のADの2名に比し、攻撃行動が強かった。10月に、これらの結果を、ベルリンで開催された国際アルツハイマー学会で発表した。以上の入浴に関する調査から、ADとnon-ADにおいては、行動障害の現れ方に違いがあると結論付けられたことから、収集癖(既に、AD10名、non-AD1名が調査すみ)と徘徊(既に、AD6名、non-AD1名が調査すみ)の追加調査を計画した。施設との交渉と該当する行動を示す認知症高齢者の把握を行い、平成19年3月に収集癖(AD2名)、徘徊(AD2名)、入浴拒否(AD3名)の調査を完了した。今後は、調査結果から、収集癖、徘徊について検討し、さらに、目標人数(入浴困難20名、収集癖20名、徘徊20名)にむけて、追加調査を行う予定である。平成19年度は、福井市の1病院と広島県三原市の1施設で、入浴困難、収集癖、俳徊8名の調査を行った。内訳は入浴困難2名と、収集癖5名、俳徊1名(重度アルツ)である。昨年度の入浴困難の検討に引き続き、8月(神戸)に収集癖2例比較と入浴行動2例の比較、3月(神戸)に俳徊1例のデータ分析を行った。その結果、中等度・男性のADとnon-AD各2例の収集行動で共通した点は(1)収集物品はAD・VaDともに固定している、(2)保管場所はAD・VaDとも身近、であった。相違点は(1)収集物品の認識(使用目的)はADでは他者から見て不明瞭な場合もあるがVaDは明瞭である、(2)収集場所の認識はADは誤っているがVaDは正確であるの2点であった。入浴行動の軽度・女性の2例の比較では、共通点は(1)入浴拒否理由として施設入所の認識がないためか「お金がない」という、(2)大声あげて抵抗していても湯船に入ると「気持いい」であった。相違点は、(1)入浴拒否の理由としてnon-ADでは過去のいやな入浴経験が関連しているが、ADでは「家で入ってきた」など現実的に合わないことが理由となる、(2)non-ADではわからないことで混乱するが、ADではわからないままに行動したり、されるままになっていたり、聞いたりする、(3)non-ADは「いやだ」という気持ちを継続するが、ADは何気ない一言で気持ちが変わる、であった。このことから、non-ADでは、同じ重症度でもADに比べ現実的な理由による意味付けや行動認識が残されており、対応の時には話題をそらせるより納得のゆく説明が必要であるなどの援助方法が導き出された。平成20年度の課題は、今年度の検討過程で、重症度とともに性別の違いが行動に大きく左右することが示されたもののそれに該当したのは入浴1組、収集癖1組のみであったことから、対照比較できる対象者を追調査して検討することである。1病院と2施設で、入浴困難5名、収集癖1名、俳徊8名の調査を行った。また、平成18年5月から13年間の入浴困難21名、収集癖12名、俳徊18名を分析し、対象者家族との検討会と施設での検討会を行った。分析は、「重症度による違いが大きい(平成18年度結果から)」「性別による違いが大きい(平成19年度結果から)」を踏まえ、重症度及び性別、年代が合致する対象者の比較を行った。

入浴困難は中等度1組と重度1組、収集癖は中等度1組の分析をし、俳徊は合致せず全体で比較した。結果:入浴困難は、(1)ADに比べVDは語彙が多く会話疎通性が高いが、拒否のこだわりが強く説得困難。(2)拒否理由がVDには体験(入所後体験含む)が加わり説得困難、(3)ADは他者の行動やタイミングで誘導できるがVDは誘導が非常に困難、(4)ADは浴槽に入ると機嫌が良くなるがVDは強い誘導を記憶して不機嫌が持続する。収集癖は、共通点は(1)収集物品が固定、(2)収集物を「自分のもの」と認識、(3)保管は身近の3点で、相違点は(1)収集物品使用目的の表現がADは客観的妥当性がないがVDは妥当、(2)保管場所の記憶はADは誤りだがVDは誤っている場合と正しい場合があったの2点であった。俳徊の目的別のADとVD比較では、(1)VDでは「帰宅願望性」俳徊がない、(2)「親密性」目的の俳徊で、Aは家族など「いない人」に、VDはスタッフや調査者など「場にいる人」に親密性を求める、(3)「娯楽」目的の俳徊はADではなくVDで見られた。俳徊時の気持ちは、「無目的」の場合にADは否定的気持ちだったが、VDは「楽しい」気持ちを見せていた。以上から、認知症重症度が同レベルでもVDは短期記憶・理解力保持し認知症レベルが高くみられ「気難しい人」と捉えられる、ADは短期記憶障害が強度で理解力が低くみられる傾向が認められた。
ミュラー氏管型上皮への分化誘導因子に関する研究

胎生体腔上皮由来のミュラー管上皮は、卵管、子宮体部、頸部と上部腟組織を形成し、それぞれの場所でciliaを有する卵管上皮、子宮内膜上皮、ムチン産生細胞の頸管上皮、腟扁平上皮に分化し、同じ胎生体腔上皮由来の卵巣表層細胞はinclusionされてミュラー管型上皮に分化してそれぞれの細胞形態を有する上皮性卵巣腫瘍を形成すると考えられている。こうした胎生体腔上皮由来の細胞がいかなる要因下にこのようなミュラー管型細胞分化を遂げるのかを検討し以下のような結果をえた。まず、ミュラー管の発達過程の検討では、胎生20週頃を境にして固有の分化の差が見られ始め、卵管のcilia、内膜の分泌像、頸管のムチン産生細胞の順序の分化表出が見られ、それぞれの部位での分化発現時期に差が見られることが判明した。摘出病理標本の詳細な検討から、胎生体腔上皮由来と考えられる卵巣表層細胞、腹膜などの組織は、ある条件下ではミュラー管上皮とそれに伴う間葉細胞がたどる分化と同じ分化を遂げる能力を有し、これらの組織はsecondarymullerian systemなる概念を形成することが強く示唆された。ミュラー管にきわめて関連が深いとされる腫瘍関連抗原CA125のさまざまな検討において、CA125はミュラー管では胎生期に序々に発現し、成人では常に存在することからミュラー管の分化過程に密接な関係を有する抗原であることが判明した。家兎卵巣表層細胞の培養系を用いたミュラー管型細胞分化誘導実験では、ミュラー管型細胞への分化を誘導出来なかったが、estradiolと漿液性卵巣癌腫瘍内容液には、これらの細胞を増殖させる作用があることが判明した。今回の検討では卵巣表層細胞をミュラー管型細胞へと分化誘導する因子そのものを同定することは出来なかったが、CA125はその分化に深く関連した物質であり、これを含めた分化誘導因子に関する研究は、将来的に卵巣癌の治療にも応用出来るものであり、更なる研究が必要であると考えられた。ヒト胎児期のミュラー氏管上皮の発達過程の超微形態学的検討では,卵管では未分化な中皮細胞様の細胞が胎性14週頃から核下方にグリコーゲンを蓄積し, 20週頃からグリコーゲンの消失とともに,少数の線毛を細胞表面に突出させるが,その後,線毛は増加せず31週に至って再度細胞質内に大量のグリコーゲンの貯留がみられ, 40週に至ってこのグリコーゲンの消失とともに細胞表面一面に9+2の線毛が出現することが判明した.頸管上皮でも同様に胎生14週頃から核下方にグリコーゲンの蓄積がみられ,これが20週頃消失するとともに形態学的には細胞質の分泌像がみられるが,ムチンは存在しない.ところが, 40週に至って,成人と同様のムチン産生細胞への分化をとげる.内膜細胞でも同様に核下方のグリコーゲンの蓄積とその消失をへて分化した内膜細胞が観察されるようになる.即ち,これらミュラー氏管上皮は胎生14週頃まではいずれも区別しがたい形態をとっているが, 20週以降においてそれぞれの器官の細胞への分化の道をたどるものと考えられ, 20週前後になんらかの因子による分化誘導が司られている可能性が示唆された.ヒト

卵巣表層細胞の走査電子顕微鏡による検討では,卵巣表層細胞がすでに剥離してしまったものが多いために,その分布を断定しがたいが,基本的に,線毛細胞の頻度は極めて少なく,ムチン細胞の同定は今までの検討では明らかとなっていない.ヒト卵巣表層細胞の培養は,効率が悪いが,家兎卵巣表層細胞と腹膜中皮細胞は,培養可能であり,約4週間の期間,培養細胞を実験に供することが可能であることが判明した.また,ミュラー氏管上皮に極めて深い関わりを持つと言われる腫瘍関連抗原CA125は胎生初期のミュラー氏管に依存し, CA125を究明することは本研究に必須と考えられ,現在このCA125とCA19-9から豊富に含まれたfractionを羊水中からの抽出することに成功しており今後の実験に供することができる状態にある.ヒト胎児期ミュラー管上皮の発達過程の検討で、卵管、子宮体部、頸部の各上皮においては、卵管のCilia、内膜の分泌像、頸管のムチン産生細胞といった順の分化表出、またミュラー管の間葉細胞では卵管における平滑筋の分化が最も早いことが確認され、ミュラー管の上皮・間葉細胞の分化には、それぞれ発現時期に部位的異なりがあることが判明した。ミュラー管に極めて関連が深いとされる腫瘍関連抗原CA125の検討では、ミュラー管原基の胎生体腔上皮に由来する腹膜、心嚢膜、胸膜でCA125は胎生15週頃より、ミュラー管上皮では17週頃から発現を呈すること、また成人の卵管、内膜、頸管各上皮では常に発現していることが判明した。しかし、CA125は外胚葉由来の胎児皮膚のperidermや羊膜細胞では、9週以前から発現しており、CA125は胎生体腔上皮に関連した組織のみに発現するものではなく、極めてprimitiveな抗原であると考えられ、ミュラー管における発現は、その分化に従って発現してくるものであることが判明した。CA125の産生・分泌機序の検討では、羊膜細胞ではagingによって産生・分泌の減少が起こることを明らかとし、月経時と妊娠初期における一過性血中CA125上昇機序は月経内膜での脱落膜様細胞、妊娠中は絨毛の侵入による脱落膜細胞の破壊に起因することを明らかとした。また、頸部腺細胞から分泌される頸管粘液中のCA125に注目し、これと頸管粘液中のCEA、CA19ー9値を測定することで、頸部腺癌の補助診断が可能であることを明らかにした。また、CA125と同一蛋白上の異なる抗原決定基を認識するCA130ー22はCA125と同様に腫瘍マーカーとして利用できることを示した。家兎卵巣表層細胞の短期培養系で、この培養液中にestradiol(E)、progesterone(P)、漿液性卵巣癌内容液(T)を添加した実験群においては、EとTは表層細胞の増殖促進能力を有するものの培養細胞そのものの形態を変化させるだけの作用は確認できなかった。
近赤外利用有機太陽電池色素の開発研究

近赤外光を吸収する高共役有機化合物は、有機太陽電池の高性能化には欠くことの出来ない材料である。本申請の研究では、近赤外に吸収を持つ新規骨格色素を合成し、その電子状態を解明し、前駆体塗布変換法を用いて、有機太陽電池としての特性の検討を目指した。ポルフィリンなどの平面二次元的に広がったπ電子系をベンゼン環で融合させた場合、融合された長軸上の横遷移とポルフィリン単体に由来する短軸上の縦遷移が必ず存在する。このため、この融合法では長波長側の吸収を近赤外領域に持っていくことができても、可視領域に強い吸収が残る。一方、ボロンジピロメテン(BODIPY)のπ電子系は、ほぼ一次元に広がっており、500nm付近に1つだけ強い吸収帯を持つ。このπ電子系を長軸方向で融合してbisBODIPYとしたところ、横遷移に由来する近赤外領域だけに吸収をもつ色素の合成に成功した。さらに、電子吸引性基を導入することで耐酸化性の向上も達成し、大気下で安定な近赤外色素の開発に成功した。現在、協力企業において、近赤外特異フィルター、有機太陽電池などとしての利用を検討中である。近赤外利用有機太陽電池作成に必要な近赤外光を吸収する高共役化合物を創出するために、具体的な以下の課題化合物群を設定し、奥島准教授、森助教と協力して、高共役化合物前駆体の合成をおこなった。高共役化合物前駆体の熱反応性、光反応における波長依存性、結晶構造と分解特性、置換基と酸化還元特性との関係を重点的に検討し、最終でペリ環状分解反応を用いて目的の高共役化合物の合成を達成した。得られた高共役化合物は、三菱化学および山田教授(奈良先端大)と協力して太陽電池としての性能、JSRおよび日本触媒と協力して近赤外特性を評価している。具体的には以下の3つの課題について検討した。課題1:ベンゼン連結ビスBODIPYの共役拡張と光安定化:848nmに最長極大吸収をもつベンゼン連結BisBODIPYの合成にはすでに成功していた。しかしながらこの化合物は大気下光に不安定で、分解することが分かった。これを実用的なもとするために電子吸引性基の導入を検討した。電子吸引性基として、シアノ基、エステル基及びペンタフルオロフェニル基を導入することで安定化を図った。この化合物の中でシアノ基を導入したものについては、光照射下における大気安定性の獲得とともに、吸収極大波長は901nmに達し、吸収の裾野さえも可視光領域にない色素となった。このため、この色素は淡黄色でありながら近赤外領域に吸収を持つこれまでにない近赤外吸収色素であることが判明した。課題2:アセナフトピロールを組み込んだBisBODIPYの合成と物性評価:アセナフトピロールを組み込んだBisBODIPYの合成をおこなった。この化合物は安定ではあるが、アセナフト融合の深色効果はベンゾ融合の場合と比べて小さいことが判明した。課題3:ピロロインドール系色素合成の試み:ピロロイソインドール連結BODIPYとの比較を行うためピロロインドールの合成を開始した。得られた高共役化合物は、三菱化学および山田准教授(奈良先端大)と協力して太陽電池としての性能、JSRおよび日本触媒と協力して近赤外特性を評価している。課題(1):ベンゼン連結ビスBODIPYの共役拡張: 760 nmに最長極大吸収をもつベンゼン連結BisBODIPYの合成にはすでに成功していた。

この化合物にベンゾ縮環させて共役を拡張して、最長極大吸収を近赤外領域にシフトした化合物の合成に成功した。この物質の最長極大吸収波長は、848nmに達した。さらにこの色素は可視域ではほとんど吸収のない透明な近赤外色素であることも判明した。これら色素に可溶性置換基や、電子吸引性基を導入することに成功した。現在これらの物質を高分子ポリマーに分散させて性能を検討している。課題(2):テトラフルオロイソインドールを組み込んだBisBODIPYの合成と物性評価:申請者の開発したテトラフルオロイソインドール誘導体の合成法を用いて、テトラフルオロイソインドールを組み込んだBisBODIPYの合成をおこなった。この化合物は安定ではあるが、溶解性に乏しいため、可溶化基の導入が必須であることが分かった。課題(3):課題(1)(2)であげたBODIPYのメソ位に置換基を有する誘導体の合成:メソ位置換基としてペンタフルオロフェニル基、4-t-ブチルフェニル基、3,5-ジ-t-ブチルフェニル基を検討した。課題(1)として挙げた「ベンゼン連結ビスBODIPYの共役拡張」では、760 nmに最長吸収波長を有するベンゼン連結BisBODIPYの共役を拡張して、840nm以上に最長吸収波長をもつBisBODIPYの合成に成功した。このBisBODIPY色素の最長吸収波長帯の裾野は、760nm以上であり、完全に近赤外領域の吸収帯であった。これらの成果は現在論文投稿中である。しかし、この分子は不溶で、高分子分散性及び耐酸化性も悪かった。そこで、課題(3)で挙げたようにこの分子骨格に様々な置換基を導入したところ、溶媒分散性に優れかつ耐酸化性のあるBisBODIPYの合成に成功した。この成果については特許申請を行った。課題(2)のテトラフルオロイソインドールを組み込んだBisBODIPYの合成と物性評価については、目的化合物の合成に成功し、物性を検討した。この化合物では、耐酸化性については向上していたが、高分子分散性については改善の余地があった。現在は、さらなる誘導体化を目指している。以上のように、目的を達成したのみならず、高機能を持った物質の創出に成功し、特許申請まで行えたことで、当初の計画以上に進展していると判断した。平成23年度に合成に成功した化合物の近赤外フィルターや近赤外利用太陽電池特性を検討するとともに、新たな課題として(1)ベンゼン連結TrisBODIPYの合成と物性評価および(2)新規π拡張様式を有するBisBODIPY色素の創出に挑戦する。近赤外フィルターとしての機能については、JSRと日本触媒の協力のもとさまざまな色素の薄膜化と分散化を検討する。当研究室で行ってきた、前駆体合成法では、平面の広いπ電子系を有する化合物でも、前駆体法を駆使することにより合成できることを示してきた。課題(1)については、これまでの前駆体法を用いることにより達成できると考えている。前駆体としては熱による逆Diels-Alder法および光による脱カルボニル法の両方を検討する。課題(2)については、効率よくπ電子系を拡張できるアセナフテン骨格の導入を考えている。本プロジェクトでは、化合物合成に多大な費用と時間がかかる。このため大半の経費は試薬などの消耗品とアルバイトの人件費として支出する予定である。得られた成果は、まず特許として権利化したのち、論文や学会発表で社会に還元してゆく予定である。
垂直磁気異方性を有する強磁性細線中の磁壁電流駆動に関する研究

研究代表者(以下代表者)は平成23年度、申請課題である垂直磁気異方性を有する強磁性細線中の磁壁電流駆動に関する研究に従事した。研究の主な目的は、電流による磁壁移動メカニズムの解明を通して磁壁移動に必要な電流密度(閾電流密度)の低減を実現、および磁壁移動速度の評価を行うことである。昨年度は、閾電流密度の細線幅および外部磁場依存性を調べ、Co/Ni細線中の磁壁移動が断熱的スピントランスファー効果によって引き起こされていることを実験的に示すとともに、線幅をコントロールすることで閾電流の低減が可能であることを示した。最終年度である今年度前半は、申請書に記載した研究実施計画に基づき、磁壁移動速度の定量的評価を行った。本研究で使用した強磁性体は垂直磁化Co/Ni多層膜であり、具体的な研究方法は申請書に記載されている通りである。昨年度までに習得した微細加工技術を用いて、線幅150nmの試料を作製し、そのデバイスを用いて磁壁移動速度の印加電流密度依存性を調べた。その結果、電流密度とともに速度は増加し、電流密度1.3×10^<11>A/m^2において約60m/sとなることわかった。この値は断熱的スピントランスファーモデルから予想される値と定量的に一致することがわかった。また、外部から磁場を印加した状態において、磁壁移動速度は外部磁場の大きさ及び方向にほとんど依存しないこともわかった。以上の実験結果を詳細に理解するために、数値シミュレーション結果との比較を行った。その結果、外部磁場に対する速度の安定性は、ラフネスなどの構造欠陥によってもたらされていることが明らかとなった。この事実は応用上きわめて重要である。なぜなら試料作製上避けることのできない欠陥によって、安定な磁壁移動が可能になることを示しているからである。上記の物理的、応用上の重要性が評価され、本研究成果はApplied PhysicsLetters誌に掲載された。研究代表者(以下代表者)は平成22年度、申請課題である垂直磁気異方性を有する強磁性細線中の磁壁電流駆動に関する研究に従事した。今年度は、閾電流密度は細線の線幅および膜厚に依存する量であるという理論予測を踏まえ、申請書に記載した研究実施計画に基づき閾電流密度の細線幅および膜厚依存性の調査を行った。まず、代表者は微細加工時の条件を最適化することによって40nmレベルの幅を持つ微小細線を少ないラフネスで加工することに成功した。40nmから300nmまで細線幅を変化させたCo/Ni細線を準備し、それぞれの細線で閾電流密度を調べたところ、線幅が細くなるにつれて閾電流密度は減少していくが70nmよりも細くなると逆に増加することがわかった。さらに、閾電流密度の細線幅に対するこのようなふるまいは、安定な磁壁構造の変化に由来するものであることもわかった。以上の実験結果は、スピントランスファモデルに基づく磁壁移動理論で説明可能であるとともに、Co/Ni細線において磁壁が純粋なスピントランスファ効果で移動していることの強固な証拠を世界で初めて示したものであり、Nature Materials誌に掲載されている。また、膜厚の異なるCo/Ni多層膜を用いて閾電流密度を調べたところ線幅36nmの細線において1.6×10^<11> A/m^2という非常に小さな閾電流密度が得られた。この値はこれまで他の材料で報告されてきた値と比べて1桁小さく、微細化と低電流密度動作が両立可能であることを意味しており応用上極めて重要な結果である。

以上の実験結果を詳細に理解するために、数値シミュレーション結果との比較を行った。その結果、外部磁場に対する速度の安定性は、ラフネスなどの構造欠陥によってもたらされていることが明らかとなった。この事実は応用上きわめて重要である。なぜなら試料作製上避けることのできない欠陥によって、安定な磁壁移動が可能になることを示しているからである。上記の物理的、応用上の重要性が評価され、本研究成果はApplied PhysicsLetters誌に掲載された。
心臓弁膜症の病態・進行度における口腔内常在菌の関与

平成30年度は、1対象患者における摘出心臓弁組織からのDNAの抽出、216SrRNA配列用のユニバーサルプライマーを用いた細菌の検出、3次世代シーケンサーを用いたメタゲノムショットガンシーケンス解析をすすめた。心臓弁組織は30検体あり、順次DNAを採取した。DNAの収量、品質共に以降の解析に際して問題はなかった。16SrRNA配列用のユニバーサルプライマーを用いた細菌の検出については、PCRの条件検討に時間を要した。心臓弁組織から細菌が同定される候補を検索した。16SrRNA配列用のPCRで細菌の検出を認めた、心臓弁組織5症例を次世代シーケンサーを用いたメタゲノムショットガンシーケンス解析に提出した段階である。心臓弁組織からのDNA抽出にあたって収量と品質を上げることに時間を要した。次世代シーケンサーを用いたメタゲノムショットガンシーケンス解析結果を参照し、検出された細菌種を確認する。確認された細菌種の保有する遺伝子をDNA、RNAレベルで再度検証する予定である。そして、解析結果と心臓弁膜症の病態・臨床病理学的因子との関連の解析について解析し、心臓弁膜症の病態と口腔内常在菌との関連についてさらに明らかにしていく予定である。口腔内常在菌は、未同定の細菌を含め約700種類、1000億個以上あると言われており、そのほとんどが数種類のレンサ球菌属で占められている。これらの口腔細菌は、口腔内で病原性を発揮するだけではなく、抜歯等の観血的な処置によって血液中に侵入することが知られている。菌血症は、健常者では一過性であるが、ある種の心疾患を有する対象では心臓の弁膜や心内膜に血小板やフィブリンと細菌の塊を形成し、感染性心内膜炎の発症につながることがある。一方で、菌血症は侵襲的な処置だけではなく、日常の口腔清掃によっても度々生じている可能性があるとされており、口腔細菌の血液中への侵入は、一般に考えられているよりも高頻度であることが想定される。このことは、口腔細菌が血流を介して様々な組織や臓器に到達し、これまでに解明されていない影響を及ぼしている可能性を示唆している。近年、口腔内細菌と糖尿病、誤嚥性肺炎、低体重児出産、早産、関節リウマチなどの全身疾患との関連に焦点が当てられており、口腔細菌の及ぼす各種全身疾患への影響が注目されている(仲野和彦,小児歯科臨床, 2009.)。口腔内常在菌や細菌由来の内毒素が血管内に入り込むと、菌体やその成分による直接的な傷害作用やサイトカイン産生、免疫担当細胞の応答へ影響を及ぼし、全身の各種疾患の進行に関与すると報告されている。既に口腔内常在菌が糖尿病、誤嚥性肺炎、低体重児出産、早産、関節リウマチなどの全身疾患と関連があることが近年の研究で明らかにされつつあるが、遺伝子解析によるクローナリティーを証明した報告は少ない。本研究では、心臓弁膜症患者における手術時の摘出弁組織と口腔内・血中から検出された菌が同一クローンであるかの検討を行い、口腔内常在菌の心臓弁膜症の病態・進行度・病理組織学的因子への関与を明らかにし、周術期における口腔内管理の有効性を検証することを目的とする。平成29年度は、口腔内プラーク、心臓弁組織からのDNA抽出法について検討し、抽出方法を確立した。回収された臨床検体については順次、DNA抽出し、PCR解析を行う準備を行っている。また、免疫組織学的に検討する組織については、パラフィンブロックに包埋し、HE染色、免疫染色を行う準備を行っている。平成30年度については、心臓弁検体より採取したDNAをBroad-range PCR法を用いて16S rRNA遺伝子の配列を検索する。種々の細菌に共通な16S rRNAの保存領域にプライマー(大楠ら、日本微生物学会雑誌14:1-13)を設定しPCRを施行する.これらのプライマーで増幅される遺伝子断片は16S rRNAをコードする遺伝子のほぼ全領域(1,500bp)を含んでおり、これらの遺伝子断片の配列を決定し、可変領域の配列を比較することによりクローンを同定する予定である。また、得られたPCR産物を精製し、テンプレートとして遺伝子断片の増幅に用いたのと同一のプライマーをシークエンシングプライマーとして用い、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (ABI日本)を用いて反応を行なう。Applied Biosystems 3130

xlジェネティックアナライザー(ABI日本)にてキャピラリー電気泳動を行うことにより塩基配列を決定し、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)による相同性検索を行う予定となっている。次世代シーケンサーを用いたメタゲノムショットガンシーケンス解析結果を参照し、検出された細菌種を確認する。確認された細菌種の保有する遺伝子をDNA、RNAレベルで再度検証する予定である。そして、解析結果と心臓弁膜症の病態・臨床病理学的因子との関連の解析について解析し、心臓弁膜症の病態と口腔内常在菌との関連についてさらに明らかにしていく予定である。本年度は、臨床検体からのDNA抽出手技の確立が主な研究内容となっており、実験試薬や機材の購入が予想よりも低価格で済ませることが可能であった。平成30年度にかけて、順次採取された臨床検体からDNAを採取する必要があることと、PCR解析やシークエンス解析を行う予定であるため、使用額については、当初予定通りの使用額になることが予想される。次世代シーケンサーを用いたメタゲノムのショットガンシーケンス解析を行う、心臓弁候補の同定に時間を要したため、次年度使用額が生じた。平成31年に残りの臨床検体のシークエンス解析を順次進めていく予定である。