hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炎症性骨代謝における新規サイトカインIL-35の役割について

RAW 264.7細胞へのRANKLとIL-35での共刺激により、破骨細胞分化マーカー(MMP-9、Cathepsin K、TRAP)の遺伝子発現、破骨細胞形成、および破骨細胞活性がRANKL単独刺激と比較して有意に増加した。また、RANKLとIL-35の共刺激によりERKとp-38のリン酸化がそれぞれ単独刺激と比較して増加を認めた。さらに、ERK阻害剤による前処理によりRANKLとIL35の共刺激の破骨細胞数は未処理群と比較して有意に抑制された。これよりIL-35とRANKLが作用することで、主にERKを介したシグナル伝達により相乗的に破骨細胞形成を促進することが明らかとなった。新規サイトカインであるIL-35はTreg細胞から産生され、Th17細胞に対して抑制性サイトカインとして機能すると考えられている。しかしながら、骨代謝および歯周病病態におけるIL-35の役割は不明な点が多い。そこで今回、研究代表者は、骨再生もしくは骨破壊への影響について、IL-35の役割を明らかにすることを目的とし、骨芽細胞および破骨細胞の分化、活性化における抑制効果やそれらに関わる伝達経路および調節因子の同定に関して検討することにした。まず骨芽細胞におけるIL-35の役割を検討するため、骨芽細胞にリコンビナントマウスIL-35 (rIL-35)で刺激した後、total RNAをを抽出し、Real-time quantitative PCR (qPCR)法を用いて骨代謝に関連する遺伝子発現量の測定を行った。骨吸収に関連するRANKL、骨分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、骨シアロタンパク(BSP)、およびRUNX2の遺伝子発現量を測定したところ、各遺伝子発現ともに無刺激のコントロール群とrIL-35刺激群とで有意な差は認められなかった。そこで、歯周病の炎症状態を想定して、骨芽細胞にTumor Necrosis Factor-α(TNF-α)で前処置後、rIL-35で刺激し、qPCR法にて同様の遺伝子発現量を測定した。オステオカルシン、BSPの発現量はrIL-35刺激で有意に増加が認められた。そこで今回、研究代表者は、骨再生もしくは骨破壊への影響について、IL-35の役割を明らかにすることを目的として、骨芽細胞および破骨細胞の分化、活性化における抑制効果やそれらに関わる伝達経路および調節因子の同定に関して検討することにした。平成27年度には、IL-35刺激による石灰化能と細胞分化能を判定するため、Kusa A-1細胞にrIL-35で刺激した後にアリザリンレッド染色とアルカリフォスファターゼ染色を行った。アリザリンレッド染色とアルカリフォスファターゼ染色共に、rIL-35刺激と無刺激で有意な差が認められなかった。そこで、Kusa A-1細胞におけるIL-35のレセプターであるIL-12Rβ2、gp130の遺伝子発現をRT-PCR法にて確認した。gp130の遺伝子発現はrIL-35刺激の有無に関わらず恒常的に認められたが、IL-12Rβ2の遺伝子発現は刺激に関わらず極微量しか認められなかった。IL-35が影響を与える遺伝子を明らかにするため、Kusa A-1細胞にrIL-35で刺激した後、total RNAを抽出し、PCR Arrayによって骨代謝に関連する網羅的な遺伝子発現の解析を行うことを検討していた。しかし、まずKusa A-1細胞でのIL-35のレセプターの発現を確認することで、IL-35の刺激に対する細胞の反応性を調べることとした。結果、IL-35のレセプターのサブユニットの1つであるIL-12Rβ2の遺伝子発現が極微量であった。Kusa A-1細胞は石灰化能が非常に高く、一般的な骨芽細胞とは反応性が異なるためではないかと思われる。そこで今回研究代表者は、骨再生もしくは骨破壊への影響について、IL-35の役割を明らかにすることを目的とし、骨芽細胞および破骨細胞の分化、活性化における抑制効果やそれらに関わる伝達経路および調節因子の同定に関して検討することにした。平成27年度までに、骨芽細胞(Kusa A-1細胞)に腫瘍壊死因子(TNF)-αで前処理後、リコンビナントIL-35(rIL-35)で刺激し、Real-time quantitative PCR(qPCR)法を用いて骨代謝に関連する遺伝子発現の測定を行った。結果、オステオカルシンと骨シアロタンパク(BSP)の遺伝子発現はrIL-35刺激で有意に増加した。また、IL-35刺激による石灰化能と細胞分化能を測定するため、アリザリンレッド染色とアルカリフォスファターゼ染色を行ったところ、rIL-35刺激と無刺激で有意な差を認めなかった。平成28年度には、マクロファージ様細胞株RAW264.7(RAW)細胞を用い、RANKL刺激下でrIL-35を添加し破骨細胞形成への影響を検討した。破骨細胞分化マーカーの遺伝子発現をqPCR法にて測定し、TRAP染色にて多核の破骨細胞形成数を測定した。

結果、破骨細胞分化マーカーであるMMP-9、Cathepsin K、およびTRAPの遺伝子発現はrIL-35濃度依存的に有意に増加し、多核の破骨細胞形成数もrIL-35濃度依存的に有意に増加した。骨代謝におけるIL-35の役割を明らかとするために、骨芽細胞(Kusa A-1細胞)を用いて、IL-35刺激による石灰化能と細胞分化能を測定したが、rIL-35刺激と無刺激で有意な差を認めなかった。Kusa A-1細胞は石灰化能が非常に高く、一般的な骨芽細胞とは反応性が異なるためか、IL-35刺激に対する反応性が悪いと考えられた。したがって、石灰化能が異なる骨芽細胞(MC3T3E-1細胞)を用いて、再度、骨芽細胞の分化や活性化について検討を行ったため研究計画に遅れが生じた。新規サイトカインであるIL-35はTreg細胞から産生され、Th17細胞に対して抑制性サイトカインとして機能すると考えられている。しかしながら、骨代謝および歯周病病態におけるIL-35の役割は不明な点が多い。そこで今回研究代表者は、骨再生もしくは骨破壊への影響について、IL-35の役割を明らかにすることを目的とし、骨芽細胞および破骨細胞の分化、活性化における抑制効果やそれらに関わる伝達経路および調節因子の同定に関して検討することにした。RAW 264.7細胞へのRANKLとIL-35での共刺激により、破骨細胞分化マーカー(MMP-9、Cathepsin K、TRAP)の遺伝子発現、破骨細胞形成、および破骨細胞活性がRANKL単独刺激と比較して有意に増加した。また、RANKLとIL-35の共刺激によりERKとp-38のリン酸化がそれぞれ単独刺激と比較して増加を認めた。さらに、ERK阻害剤による前処理によりRANKLとIL35の共刺激の破骨細胞数は未処理群と比較して有意に抑制された。これよりIL-35とRANKLが作用することで、主にERKを介したシグナル伝達により相乗的に破骨細胞形成を促進することが明らかとなった。骨代謝に関連する遺伝子発現量を検討したが、rIL-35の刺激濃度や刺激時間等の条件設定を決定する時間がかかってしまった。また、遺伝子発現量に有意な差が認められるものの、発現量の差が1.52倍と少ないため、タンパク産生の検討で有意な差が認められるか不安な状態である。骨芽細胞としてKusa A-1細胞を使用していたが、石灰化能が異なる骨芽細胞(MC3T3E-1細胞とST2細胞)を用いて、IL-35のレセプター発現を確認を行う予定である。その後、骨代謝に関連する遺伝子発現量の測定、石灰化能と細胞分化能を確認する予定である。RAW細胞を用いて、IL-35における破骨細胞の分化、活性化に関わる伝達経路および調節因子の同定に関して検討する。細胞内伝達経路を確認するため、p38, ERK, JNKなどのリン酸化レベルをウエスタンブロット法にて測定する。歯周病学IL-35が影響を与える遺伝子を明らかとするため、骨芽細胞にrIL-35で刺激した後、total RNAを抽出し、PCR Arrayによって骨代謝に関連する網羅的な遺伝子発現の解析を行うことを検討している。PCR Arrayによってプロファイリングされた遺伝子発現から、IL-35の影響を受けた遺伝子を選択し、伝達経路および調節因子の同定を行う。
トリインフルエンザウイルスのヒトへの伝搬及び病原性獲得機構

全世界で2000万人以上のヒトを殺したスペイン風邪のように、新型インフルエンザウイルスの出現派は世界的な大流行を引き起こし、未曾有の大惨事を引き起こす。1997年に香港に出現したH5N1新型インフルエンザウイルスは、18名のヒトに直接伝播し、6名の命を奪った。幸いにもヒトからヒトへと伝播することはなかったが、病原性の強さはスペイン風邪に匹敵するほどであった。近年我々が開発したリバース・ジェネティクス法を用いることで、ウイルス蛋白質に任意の変異を導入し、哺乳類での病原性獲得メカニズムを明らかにすることが可能になった。本研究は、香港で分離されたH5N1ウイルスをモデルとして、トリインフルエンザウイルスがどのようにヒトに病原性を示すようになるのかを分子生物学的に解明することを目的とした。哺乳類に強い病原性を示すウイルス株と弱い病原性を示すウイルス株とのアミノ酸配列を比較すると、それらの間には数箇所しか違いがないことがわかった。各アミノ酸に点変異を導入しウイルスを人工合成することで、どのアミノ酸が哺乳類における病原性発揮に関与しているかを調べた。その結果、RNAポリメラーゼ蛋白質を構成するPB2蛋白質の627番目のアミノ酸の変異(グルタミン酸がリジン)が、トリインフルエンザウイルスが哺乳類で病原性を発揮するために必要であることが明らかになった。1997年香港でトリH5N1インフルエンザAウイルスがヒトに伝播し、18人が感染した。そのうち6人が死亡した。分離されたH5N1ウイルスはニワトリに対して全身感染と高い致死率を示すが、その哺乳動物に対する病原性発現の機構は未だ明らかにされていない。そこで我々は、マウスに対する病原性発現に関わる遺伝子要因の同定するために、リバースジェネティクス法を用いて、H5N1 Hong Kongウイルスを人工的に作出することを試みた。ウイルスは人より分離されたインフルエンザA/Hong Kong/483/97(H5N1)株(HK483)およびA/Hong Kong/486/97(H5N1)株(HK486)を用いた。各ウイルス遺伝子をクローンニングし、リバースジェネティクス法により、HK483ウイルスあるいはHK486ウイルスの各遺伝子分節を組み込んだ、あるいは遺伝子に変異を導入したHK483およびHK486変異ウイルスを作出した。HK483ウイルスはマウスに対して致死的全身感染を引き起こすが、HK486ウイルスは致死的感染を起こさない。リバースジェネティクス法により作出されたHK483ウイルスおよびHK486ウイルスはマウスに対して野性株と同様の病原性を示した。以上の結果は、野外株と遺伝的そして生物学的に全く同一のウイルスが我々の開発したリバースジェネティクス法を用いることにより作出可能であることを示しており、次年度は、H5N1 Hong Kongウイルス間の病原性の違いを本法を駆使して解析する予定である。1997年、香港で18人がトリH5N1インフルエンザAウイルスに感染し、そのうち6人が死亡した。ヒトから分離されたH5N1インフルエンザAウイルスはニワトリに対しては全身感染と100%の致死率を示す強毒ウイルスであったが、マウスに対する病原性には違いが認められた。すなわち、インフルエンザウイルスA/Hong Kong/483/97(H5N1)株(HK483)はマウスに対して致死的全身感染を引き起こすが、A/Hong Kong/486/97(H5N1)株(HK486)は致死的感染を起こさない。我々は昨年度までに、リバース・ジェネティクス法を用いて、これらマウスに対する病原性の違いがウイルスのヘマグルチニン(HA)およびポリメラーゼの一つ(PB2)によることを明らかにした。そこで本年度、我々はPB2のアミノ酸配列をHK483およびHK486間で比較検討し、病原性の違いを決定するアミノ酸の同定を試みた。HK483およびHK486のPB2キメラ蛋白質を持つウイルスを作出してマウスの病原性を調べたところ、627番目のアミノ酸(HK483はLys、HK486はGlu)または675番目のアミノ酸(HK483はLeu、HK486はIle)が重要であることが示された。

HK483およびHK486間でこれら2つのアミノ酸をそれぞれ置換したPB2を持つウイルスを作出し、マウスに対する病原性を調べた。その結果、HK483でPB2の627番目アミノ酸をLysからGluに置換したウイルスはマウスに対する病原性を失い全身感染を起こさなかった。また逆にPB2の627番目アミノ酸をGluからLysに置換したHK486は強毒化し、マウスに全身感染を起こした。これらの成績はPB2の627番目アミノ酸一つが、H5N1インフルエンザウイルスの病原性発現を左右することを示している。このPB2の627番目アミノ酸は、トリインフルエンザウイルスが哺乳動物の細胞で効率良く増殖するのに関与していることが分かっている。そこで次年度は、PB2の627番目アミノ酸の置換による宿主細胞由来致死毒性物質誘導能を比較する。1997年、香港でトリH5N1インフルエンザウイルスが18名のヒトに直接感染し、そのうち6名が死亡した。ヒトから分離されたH5N1ウイルスであるA/Hong Kong/483/97(HK483)株およびA/Hong Kong/486/97(HK486)株は、ニワトリに対して両株ともに全身感染を引き起こし100%の致死率を示したが、マウスに対する病原性は両株間で異なり、HK483のみが致死性を示した。我々は両株間のマウスに対する病原性の違いが、ウイルスポリメラーゼの1つであるPB2の627番目のアミノ酸の置換に由来することをリバース・ジェネティクス法によって明らかにした。さらにインフルエンザウイルスがトリからヒトへ伝播するメカニズムを明らかにするためのモデルとして、ヒトのウイルスであるA/Memphis/8/88(H3N2)(Mem/88)株とカモのウイルスであるA/mallard/New York/6750/78(H2N2)(Mal/NY)株のリアソータントウイルスをリバース・ジェネティクス法により作製し、カモの腸管内での増殖を調べた。その結果、カモのウイルスであるMal/NYにヒトのウイルスであるMem/88のMあるいはNS遺伝子を組み合わせてウイルスを作出した場合、カモの腸管内で増殖できたのに対し、他のMem/88遺伝子をMal/NYに組み込んだ場合はウイルスが作出されないか、あるいはウイルスは作出されたもののカモの腸管内で増殖することができなかった。このことはウイルス表面糖蛋白質、ポリメラーゼあるいは核蛋白質遺伝子が、感染可能な宿主域を制限していることを示している。以上の成績から、哺乳類に対するインフルエンザウイルスの病原性はひとつのアミノ酸の置換により左右されうること、ならびにウイルス遺伝子のリアソータントメントにより宿主域を超えてトリからヒトへ感染しうることが示された。
INFORUMモデルによる経済政策効果の国際比較分析

(1)日米独三ケ国INFORUMモデル作成のための準備作業本研究で計画する日米独三ケ国の産業構造変化およびそれが政策効果に及ぼした影響を考案するためのINFORUMモデルの作成に向けて(1)各国、とりわけ米国およびオーストラリアにおけるINFORUM研究の進展を調査し(2)日本およびドイツモデルを作成するための統計資料の収集とデータ・ベースの作成を行った。(2)日独産業構造変化の要因分析日本およびドイツの産業連関表をベースに、両国の19701980年代における産業構造の変化を追跡し、(1)衣長会計の手法による産業構造の要因分析(2)線形計画の手法による技術進歩の考察を行った。(3)最終需要項目の内生化(INFORUMモデルの推計)現在、日独両経済について、産業部門別の民間消費関数、民間設備投資関数の推計を行っている。INFORUMシステムにおいては従来広く採用されている共通の関数型があり、本研究においてもそれを基本としてモデルを推定したが、特にドイツに関する資料の一部が入手できていないことと、いくつかの部門について推定結果が良好でないため、数部門のグルーピングを行い、各産業部門への配分は産業連関表の最終需要項目から作成したコンバータによる方式をとった。*本研究の研究期間は当初2年を計画し、残余の作業は継続して行う予定である。
サイエンストレールの整備とその教材化に関する実践的研究-屋外での教員養成

宮城教育大学内に設置したバタフライガーデン、タナゴの飼育池、教材植物見本園などを中心として、教員を目指す学生あるいは、現職教員の教育のための「サイエンストレール」とすることを目的に統一的に整備するとともに、基礎的資料を収集した。また、サイエンストレールを活用して、教員を目指す大学生、現職教員等を対象とした教育活動を行い、教材を実践的に作成した。1宮城教育大学内に造成した人工ため池(通称たなご池)において水質ならびに生物(アカヒレタビラ、ヨコハマシジラガイ、ヨシノボリ)のモニタリング調査及び管理を行なった。またキャンパス内に直径2メートルの円形水槽を設置し、水中ウェブカメラを通して遠隔地からも中を泳ぐ魚を観察できるようにした。さらに、アカヒレタビラの飼育を地域の小学校の協力を得て大学院生に小学生に教室で行わせることを指導させるとともに、本来の繁殖地である河川に放流させるなどの活動を行った。この結果、大学院生の実践的教育力の涵養に資するとともに、自然保護に対する意識の高まりが小学生に見られた。2本学キャンパスに設置したバタフライガーデンに訪れるチョウの生態調査を実施した。その結果、ヤマトシジミ、キチョウ、ヒメウラナミジャノメ、ツバメシジミなど48種類のチョウが観察された。特に8月中旬から9月下旬にかけたは28種類が観察された。これらの成果を活用し、パンフレットなどの環境教育教材を作成した。3サクラを用いた染色に関する基礎的な資料を収集した。抽出に対するpHの影響や抽出液の放置と染色性の関係などについて特に研究を行った。これらの検討の結果、サクラの花びらのような赤みのある色に染色するための条件を明らかにできた。4小学校で扱われる代表的な植物を繁殖用識別に、種子繁殖を行うものを14種、球根で繁殖するものを7種展示した。同一の科・属でありながら人間が利用する部分の形状が大きく異なる例としてアブラナ科の野菜7つを並べて展示し、春化処理により形成させた花器の構造が類似であることを学生に認識きせた。1アカヒレタビラの教材化アカヒレタビラの教材化の活動を踏まえ、簡単に設置と撤収ができるビオトープなど、広く実践の場で活用できるような汎用性のある飼育、栽培の設備に関する基礎的な検討を行った。2教材植物花壇の充実・春秋サイエンストレールの一角である本学2号館前の花壇に、草花12種類(小学校生活の教材となるもの)を植栽し、展示した。・秋春パンジー(他品種)、遅咲き球根類(スイセン4品種、チューリップ3品種他)を展示した。・その他無性生殖を学ぶ教材として、コダカラベンケイソウを植え、教材としての基礎的な資料を収集した。3バタフライガーデンの充実トランセクト法を用いたチョウ類の生息調査を行い、ブッドレアの花による誘因効果が大きいことがわかった。1希少種であるアカヒレタビラ保全のためのビオトープ池を新設し、メンテナンスの煩雑さを解消し観察を容易にするなどの機能強化を図った。さらに、ビオトープなどの自然教材を用い、河川を核とした都市の在り方についての学習会を開催した。2枝打ちしたソメイヨシノの枝を草木染めに用いることにより、身近な材料を活用した草木染めが可能となる。ソメイヨシノから染色液を抽出する際のpHと色調の関係について検討し、教材作成のための基礎的な資料とした。3圃場を使わない多様な栽培方法についてはこれまでにも検討されてきたが、本研究では、教材植物の展示について、本学学生を対象とした授業での展開を含め、実践的に検討した。(1)袋栽培・・大型のビニール袋に土を入れて栽培することにより、ミニトマトのような大型の植物も栽培できた。(2)バケツイネ、ペットボトルイネ。バケツイネは、JAが勧奨するなど、よく知られた方法である。展示以外の期間は簡易プールにつけ、温度を安定させる方法を活用した。ペットボトルを用いた栽培方法で、「ひとめぼれ」や韓国の多収品種である「密陽21号」が、本学でも旺盛に生育することが確認できた。4本学に設置したバタフライガーデンで、2008年度と2009年度にルートセンサス調査により観察されたチョウの種、個体数を比較した。2009年の8月9月上旬に観察された個体数、種数とも少なく、盛夏での降水量が少なかったことが影響していることが考えられる。5タマネギの根、茎、葉を考える教師教育教材を、中学校の発展的な学習に活用することを実践的に研究した。
手動評価と自動評価を統合したモデルベース操作性評価手法の研究

本研究は,操作性の高いソフトウェア開発を支援するために開発の早期段階における操作性評価手法を確立することを目的とする.従来の操作性評価ではその専門家が,システムの想定する操作手順を理解して良し悪しを診断することや,エンドユーザの操作を観察することなどによって行われている.これらは,専門性の高い知識と作業を要求する方法であり,専門家不在時には利用することが難しい.この現状に対して,アクセスログや操作ログの記録および定量的な分析を支援する手法が研究されているが,結果として得られる数値の読み解きには,未だ専門性の高い知識が必要となる.この改善に向けて,本研究では操作性を「ミスが少なく,効率的な操作を行える性質」と捉え,分析・設計仕様に基づくシミュレーションなどによる操作性の自動評価と,同仕様から生成されたUIプロトタイプへの操作ログなどの記録・分析による手動評価を統合した手法を提案している.そして,自動評価と手動評価の両結果を突き合わせることで当該専門知識の少ない開発者でも操作性を改善すべき箇所を容易に特定できる手法の確立を目指す.最終年度では,エンドユーザが対象ソフトウェアを学習済みの状態で操作性を評価できるよう,エンドユーザの学習度合いを定量化する方法を提案し,妥当性を確認した.また,手動評価と自動評価のプロセスを合理化するために,シミュレーションによる自動操作性評価と,手動操作性評価のためのUIプロトタイプ生成の両方法を統合した.さらに自動操作性評価では,対象ソフトウェアに対するエンドユーザの知識に応じてシミュレーション内容を決定する方法を提案し,妥当性を確認した.また,操作性を高める機能のパターンモデリング方法を改善し,実サイトを事例に汎用性を評価した.以上を踏まえ,研究期間全体を通じて,本研究の目的を達成する手法の確立に重要な要素技術を実現できたといえる.本研究の目的は、操作性の高いソフトウェア開発を支援するための開発の早期段階における操作性評価手法の確立である。操作性は、ユーザインタフェース(UI)に係る、データの入出力方法やレイアウト、画面遷移構造、ユーザエラー防止や入力補完といった支援機能などの実に様々な要因が係る。この操作性を十分に評価することは、これらの様々な要因を踏まえた評価計画、評価用成果物の作成、ユーザビリティ専門家やユーザ、ペルソナなどを交えた評価、評価結果の分析、評価結果に基づくソフトウェアの仕様改善といった高負担なサイクルの繰り返しを開発者に強いる。一般に操作性の良し悪しはユーザに依るところが多いが、系統的な評価支援を実現する従来手法が数多く存在することも事実である。そのため、操作性評価を可能な限り自動化する手法と従来の手動評価手法を適切に組み合わせた評価手法を確立することには意義がある。本研究では、操作性を「ミスが少なく、効率的な操作を行える性質」と捉え、業務系GUIアプリケーションを対象として、機能開発者とUIデザイナが協業するモデル駆動開発プロセスを想定した操作性評価を切り口とする。本年度では、つぎの6つの手法またはツールの基礎の構築を行い、初期的な評価を行った。(1)Human Interface Guideline(HIG)による評価を見据えたレイアウトのモデル化手法(2)業務を達成する機能と操作性を向上する機能を分離した、画面遷移観点のモデル化手法(3)レイアウトモデルを利用したレイアウトエディタ(4)HIGに基づくレイアウト評価ツール(5)操作性を向上する機能を着脱できる、画面遷移モデルからの評価用Webプロトタイプの自動生成ツール(6)自動生成Webプロトタイプに対して、操作性評価に係る操作ログを取得・解析するツール。当初の研究計画において、本年度の予定でなかった内容(HIGに基づくレイアウト自動評価ツールの試作完了やHIGの評価項目への対応数に関するそのツールの評価実験、およびプロトタイプ自動生成ツールの試作完了やプロトタイプ開発の効率性に関するそのツールの評価実験)を先行して遂行しているが、各ツール・評価は未だ十分ではないため、ツールの洗練やそれに対する評価実験を行っていく必要がある。総じて、おおむね順調に進展しているといえる。本研究は,操作性の高いソフトウェア開発を支援するために開発の早期段階における操作性評価手法を確立することを目的とする.従来の操作性評価ではその専門家が,システムの想定する操作手順を理解して良し悪しを診断することや,エンドユーザの操作を観察することなどによって行われている.これらは,専門性の高い知識と作業を要求する方法であり,専門家不在時には利用することが難しい.この現状に対して,アクセスログや操作ログの記録および定量的な分析を支援する手法が研究されているが,結果として得られる数値の読み解きには,未だ専門性の高い知識が必要となる.この改善に向けて,本研究では操作性を「ミスが少なく,効率的な操作を行える性質」と捉え,分析・設計仕様に基づくシミュレーションなどによる操作性の自動評価と,同仕様から生成されたUIプロトタイプへの操作ログなどの記録・分析による手動評価を統合した手法を提案している.そして,自動評価と手動評価の両結果を突き合わせることで当該専門知識の少ない開発者でも操作性を改善すべき箇所を容易に特定できる手法の確立を目指す.本年度では,手動評価が非系統的に実施される場合に,その結果に大きなバラつきが生じる可能性があることから,手動評価の系統性向上をねらった具体的なプロセスを確立した.また,前年度の成果を踏まえて,より詳細かつ容易に操作ログを記録できるように操作ログ取得方法を改善した.

さらに,操作ログをどのように可視化すると専門知識の乏しい開発者が修正すべき箇所を特定しやすいかについての調査を実施した結果,開発者に益がある可視化方法は未だ不明であるが,評価対象のプロダクト・プロセスの要因を十分に捉え,評価項目の優先順位を順位付けし,そして,修正候補を推薦することが重要であることが示唆された.当初の研究計画からして,前年度の時点で必要なツールやプロトタイプの試作は完了していた.本年度では,それらの洗練と手動評価のためのプロセス提案が主であり,次年度実施予定の大規模な評価に向けた基盤構築を行い,提案したプロセスに関して国際会議にて発表を行った.総じて,おおむね順調に進展しているといえる.本研究は,操作性の高いソフトウェア開発を支援するために開発の早期段階における操作性評価手法を確立することを目的とする.従来の操作性評価ではその専門家が,システムの想定する操作手順を理解して良し悪しを診断することや,エンドユーザの操作を観察することなどによって行われている.これらは,専門性の高い知識と作業を要求する方法であり,専門家不在時には利用することが難しい.この現状に対して,アクセスログや操作ログの記録および定量的な分析を支援する手法が研究されているが,結果として得られる数値の読み解きには,未だ専門性の高い知識が必要となる.この改善に向けて,本研究では操作性を「ミスが少なく,効率的な操作を行える性質」と捉え,分析・設計仕様に基づくシミュレーションなどによる操作性の自動評価と,同仕様から生成されたUIプロトタイプへの操作ログなどの記録・分析による手動評価を統合した手法を提案している.そして,自動評価と手動評価の両結果を突き合わせることで当該専門知識の少ない開発者でも操作性を改善すべき箇所を容易に特定できる手法の確立を目指す.本年度では,今後の大規模な評価実験に向けて,操作性の高い分析・設計仕様の作成を効率化する方法ならびにその仕様から操作性の高いUIプロトタイプを自動生成する方法を確立するために,既存仕様からの操作性の高い機能(ユーザビリティパターン)の抽出方法,ならびに直感的なUIレイアウトを可能にするUIビルダーを用いて作成したWebUIと分析・設計仕様との連携方法を,既提案の方法を拡張・強化して実現した.当初の研究計画では,分析・設計仕様のシミュレーション方法を強化することを目標に掲げていたが,その強化には至っていない.その要因としては,研究を進める中でユーザビリティパターンの多様性やそれによる操作性評価方法の多様性を考慮する必要性が見えたため,主な方針をその課題解決に切り替えたためである.また,これにより大規模な評価実験の時期も計画よりもやや遅れているものとなっている.なお,ユーザビリティパターンの抽出方法や,UIビルダーにより作成したWebUIと分析・設計仕様との連携方法については国内外に発表を行ったものである.総じて,やや遅れているといえる.本研究は,操作性の高いソフトウェア開発を支援するために開発の早期段階における操作性評価手法を確立することを目的とする.従来の操作性評価ではその専門家が,システムの想定する操作手順を理解して良し悪しを診断することや,エンドユーザの操作を観察することなどによって行われている.
ホウ素を架橋コアとする新規遷移金属錯体の創製とその光化学機能性に関する研究

代表者はこれまで2つの目的を掲げ研究を行ってきた。1つはトリアリールホウ素化合物の励起三重項状態における電子スピン挙動の検討、もう1つは新規アリールホウ素置換基を有する遷移金属錯体の合成とその光化学特性の解明である。1に関しては、トリアリールホウ素化合物のりん光測定とESRによる電子スピン挙動の観測を昨年度行った。その結果、いくつかのトリアリールホウ素化合物に置いて、励起状態における電子スピンの挙動が明らかとなった。以上の結果をもとに共同研究先と議論を重ね、現在論文執筆中である。また、2に関してはこれまでに報告してきたアリールホウ素置換基を有する新規遷移金属錯体の溶液・固体状態における測定の結果をもとに、より特異な励起状態を示すと予想される、アリールホウ素置換基を有する遷移金属錯体の創出を試みた。分子設計としては、アリールホウ素化合物の興味深い発光特性を遷移金属錯体へ組み込んだ場合、発光状態がどのように変化するのか、また汎用性を広げることは可能かどうかの2点を調査できるような分子設計を行い、合成を行った。その結果、連結芳香環を変えることにより、これまでの錯体に比べ、より長波長側に発光が観測されるとともに、置換位置によって発光状態が大きく変化することが明らかとなった。この知見は、これまでの分子設計の指針を指示するものであり、今後さらに発展していく可能性を示唆する結果となった。1に関しては、基準物質であるTri(9-anthryl)borane(TAB)を用い、研究を進めることとした。その結果、ESRによる電子スピン挙動の観測には成功したものの、低温におけるりん光スペクトル測定において、TABの蛍光が強く、りん光測定にはいくつかの困難が生じた。そこで共同研究先と多くの議論を重ね、対象物質を増やすこととした。その結果、いくつかの化合物に関してりん光測定が可能である事がわかった。現在、これらの化合物を中心にESR、低温りん光測定の両面から研究を進めている。また、2に関してはこれまでに報告してきた新規錯体の溶液状態における測定は済ませたが、更に固体状態で興味深い光化学挙動を示すことを見出した。そこで、様々な条件下(低温・溶媒蒸気)での固体発光に関する検討を行うと同時に、様々な溶媒による単結晶作成を試みた。単結晶作成に関しては困難であったが、低温・溶媒蒸気下での固体発光測定の結果から、この新規錯体に関する様々な情報を得ることに成功した。この結果は今後の分子設計における指針となると考えられる。また、これまでの研究を更に展開すべく、アリールホウ素置換基を有する新規配位子の合成に着手したところである。
炎症を早期に定量予測できる新規のｍｉｃｒｏｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ評価システム

ICGと構造的に類似したを新規化合物TK1を開発した。ICG同様近赤外蛍光性質を有しつつも、ICGと異なり血清蛋白の影響を受けず水と一緒に血管内外を自由に移動できる性質を有していた。TK1は体内における水分移動をICGより正確に反映しうる可能性があり、これは臨床でしばしば問題となる臓器や四肢の炎症・浮腫といった血管透過性亢進状態を近赤外蛍光法による輝度として可視化できる可能性を示唆していた。炎症・浮腫は従来可視化が困難であるため、近赤外蛍光法によりこれを可能にすることが、本研究の目的であった。実験の概要を以下に述べる。方法:雄ラットを用いた。ICG群、TK1群(各n=9)後肢にカラゲニン誘発四肢炎症モデルを作成した。誘発前、誘発急性期(翌日)、1週間後でそれぞれICG、TK1を静脈投与し、後肢輝度を近赤外カメラPDEで計測した。輝度解析には解析ソフトROIsを用いて輝度対時間のグラフから曲線下面積AUC算出した。炎症の程度として疼痛閾値(Von Frey testとcat walk)を、浮腫の程度として足容積(water volumetory法)を調べ各時期の数値を比較検討した。結果:AUCはICG、TK1共に炎症誘発急性期に正常と比較して有意差を認めたが、1週間後に有意差を認めたのはTK1のみであった。足容積は炎症誘発急性期と1週間後共に正常時と比べ有意差を持って増加、疼痛閾値は有意差を持って低下していた。考察および結論:静脈投与されたICG、TK1は浮腫の際に共に間質へ流出しやすくなり、その結果輝度が上昇し持続時間も延長するがICGでは輝度の差としてそれらを捉えることは不可能であった。これに対してTK1は輝度差として1週間後も描出された。血管透過性の異常は炎症部位においてまだ残存していたと考えられ、TK1はこれを鋭敏に輝度変化としてとらえる事ができた可能性があった。
インターネット上における他者との比較を通じた消費者の意見形成過程に関する実証研究

前年度の実績報告書の最後に述べたとおり、今回の3年間の研究期間の2年目に実施した実証実験(以後「平成16年実験」と呼ぶ)では、事前に被験者の映画に関する関与度を測定する尺度が、信頼性、累積寄与率ともに不十分なものであった。また、実験中に被験者が回答したのは、「AとBの2本の映画のうち、どちらの映画がより好きか」、「AとBの2本の映画のうち、どちらの映画がより興行収入をあげたと思うか」と、その回答に対する確信度であった。しかし実験後のディスカッションの中で被験者の数名が、このような「確信度」を訊かれることは日常生活においてなく、不自然であったことを述べていた。また、この質問の形では、どちらの映画が好きかを回答しているだけであり、被験者が選択した映画自体に関する態度を測定できたわけではなかった。しかし、これらは、いずれも本実験が依拠している先行研究における実験設計を、そのまま踏襲したために生じた、事前に予測された問題点でもあった。3年目にあたる平成17年は、これらの平成16年実験の問題点をそのままに、さまざまに実験条件を変えて展開実験をやるのではなく、平成16年実験の問題点を従来の態度研究などにおける先行研究に照らして再検討を行い、さらに同実験では一切考慮されていなかった比較他者の信頼性の要因、および比較他者が単独ではなく、グループや集団である場合のプロセスなどを考慮した、新たなインターネット上の消費者情報探索モデルを提示した。まず、小規模な実験用Webサイトを試作し、新たな被験者の態度測定のための方法を開発した。最終的に開発されたモジュールは以下の特徴をもつ。(1)被験者が選択した1本の映画の情報だけが、以降の質問において提示される、(2)好意度、購買意図は、被験者がキーボードから数値入力するのではなく、画面上のスライドスイッチをマウスで左右に操作する、自然な形で回答することができる、(3)実験中に被験者に提示される架空の他者のプロフィール情報は、被験者との類同性だけでなく、被験者から見た信頼性に関する認知をも操作することができる。また、平成16年実験の1つの問題点であった、被験者の映画関与の測定尺度についても、新たな尺度の開発を行い、信頼性、累積寄与率ともに、より優れた尺度を開発した。以上の成果は、平成17年10月に『消費者行動研究』に投稿し、掲載が決定した。平成18年4月発行予定であり、現在印刷中である。本研究はインターネット上に開設されたコミュニティにおいて、消費者が意見や態度を形成するプロセスに関する実証研究を行うことを目的としている。当初の計画では、実験者のパソコンとネットワークで接続された被験者用の10台のパソコンの内部に、Webサイトに見せかけたプログラムを作成する予定であったが、予定を変更し、実際にインターネット上に実験用のWebサイトを作成することとした。初年度の予算の大部分は、この実験用Webサイトの構築費用として支出した。当初の実験計画のとおり、インターネット上にはまったく同じように見せかけられた4種類のWebサイトが作成され、被験者は全員が同じWebサイトを見ていると思わされた状態で、実際には類同条件・非類同条件、信念条件・価値条件の4群に分けられて、Webサイト上に表示される質問に順番に回答する仕組みとなっている。構築された実験用Webサイトは、例えば類同条件のページでは、「映画判断プロフィール」に関する質問において被験者が回答した内容にほぼ似通ったプロフィールをもつ架空の「他の回答者」のプロフィールが表示されるようにするなど、パールで記述された複雑なプログラムがhtmlインタフェースの裏で動く仕組みであり、この構築にかなりの時間と費用を要した。実際の実験用Webサイトの完成は2003年の12月後半の時期になり、その後若干の修正期間を経て、2004年2月に神戸大学経営学部にて、第1回のパイロット実験を実施している。この実験の結果、各被験者が回答した内容が、設計通りにサーバー内に保存され、これを取り出して分析することが可能であることが確認されている。この実験用Webサイトを使用して、2004年4月の新学期開始早々に、新潟大学の電算機室を利用して、150名程度の被験者に対して第1回の実証実験を行い、分析結果を論文にまとめて発表する予定である。前年度の科研費によりインターネット上に構築した実証実験用のWebサイトを使用して、今年度は実証実験による仮説の検証を行った。本年度春に提出した交付申請書において一部報告したように、実証実験は2004年2月および3月のプリテストを経て、本実験を2004年4月に実施した。実験デザインは、2要因(類同性と判断主題)において対応があり、1要因(被験者の関与レベル)において対応のない3要因による繰り返しのあるランダム・ブロックデザインであり、被験者数は84名、うち有効分析対象は81名であった。実験中に2回測定される被験者の映画に関する判断の確信度の変化値を従属変数とし、2(類同・非類同)×2(信念・価値)×3(高関与・中関与・低関与)の、3元配置分散分析を行った。

分析の結果、下位検定では類同性要因の主効果と類同性×関与レベルの交互作用効果がともに有意であり(それぞれp<.01、p<.001)、これは高関与の被験者は意見一致者が類同他者(すなわち類同一致者)である場合には自己の判断の確信度を大きく高めるのに対して、意見一致者が非類同他者(すなわち非類同一致者)である場合には、逆に自己の判断の確信度を大きく低下させることを示している。これに対して関与レベルが中および低レベルの被験者は、意見一致者が類同・非類同のいずれの場合も、自己の判断の確信度にそれほどの影響を受けなかった。このように本実験の結果からは、仮説が概ね支持されたものの、被験者の関与レベルによる違いが明白になった。本実験の問題点としては、事前に被験者の映画に関する関与レベルを測定するために開発した尺度が、最終的に抽出された4つの因子による累積負荷量が44%と低く、被験者の映画に関する関与レベルの半分以下しか説明できていないことである。2005年度は、さらに実験条件を変えて継続して実証実験を繰り返す計画であるが、その際には被験者の映画に関する関与レベルをより正確にとらえられる測定尺度を開発したい.前年度の実績報告書の最後に述べたとおり、今回の3年間の研究期間の2年目に実施した実証実験(以後「平成16年実験」と呼ぶ)では、事前に被験者の映画に関する関与度を測定する尺度が、信頼性、累積寄与率ともに不十分なものであった。また、実験中に被験者が回答したのは、「AとBの2本の映画のうち、どちらの映画がより好きか」、「AとBの2本の映画のうち、どちらの映画がより興行収入をあげたと思うか」と、その回答に対する確信度であった。しかし実験後のディスカッションの中で被験者の数名が、このような「確信度」を訊かれることは日常生活においてなく、不自然であったことを述べていた。また、この質問の形では、どちらの映画が好きかを回答しているだけであり、被験者が選択した映画自体に関する態度を測定できたわけではなかった。しかし、これらは、いずれも本実験が依拠している先行研究における実験設計を、そのまま踏襲したために生じた、事前に予測された問題点でもあった。3年目にあたる平成17年は、これらの平成16年実験の問題点をそのままに、さまざまに実験条件を変えて展開実験をやるのではなく、平成16年実験の問題点を従来の態度研究などにおける先行研究に照らして再検討を行い、さらに同実験では一切考慮されていなかった比較他者の信頼性の要因、および比較他者が単独ではなく、グループや集団である場合のプロセスなどを考慮した、新たなインターネット上の消費者情報探索モデルを提示した。まず、小規模な実験用Webサイトを試作し、新たな被験者の態度測定のための方法を開発した。最終的に開発されたモジュールは以下の特徴をもつ。(1)被験者が選択した1本の映画の情報だけが、以降の質問において提示される、(2)好意度、購買意図は、被験者がキーボードから数値入力するのではなく、画面上のスライドスイッチをマウスで左右に操作する、自然な形で回答することができる、(3)実験中に被験者に提示される架空の他者のプロフィール情報は、被験者との類同性だけでなく、被験者から見た信頼性に関する認知をも操作することができる。また、平成16年実験の1つの問題点であった、被験者の映画関与の測定尺度についても、新たな尺度の開発を行い、信頼性、累積寄与率ともに、より優れた尺度を開発した。以上の成果は、平成17年10月に『消費者行動研究』に投稿し、掲載が決定した。平成18年4月発行予定であり、現在印刷中である。
土壌インベントリ情報の空間解析による森林土壌機能の広域評価

日本全国の約800地点における森林土壌断面調査試料の土壌pH、塩基交換容量、交換性塩基含量、交換性アルミニウム含量を測定し、地球統計学的手法により地理的空間情報を整備し、基盤図として各測定値について森林域における値域の分布推定図を作成した。これらの基盤図に基づきAl毒性発現可能性等の土壌機能評価図を作成した。また、これらの土壌化学性におよぼす土壌型、火山灰付加程度の影響を明らかにした。造林樹種の生長の差異から火山灰付加程度評価の重要性を明らかにし、火山灰土壌の広域分布推定精度の向上を試みた。土壌情報を連続した数量的化学データとして地球統計学的手法により地理的空間情報に整備することで、森林の持つ炭素貯留等の機能評価の基盤情報を強化し、斜面から流域、地域、全国の各スケールにおける温暖化など環境変動・環境負荷への森林生態系応答解析の高度化やモデルパラメータの精度向上が期待でき、森林機能の高度な発揮に向けた森林管理技術の開発に寄与することができる。本課題では、全国の森林から収取された多点試料を分析することで、土壌の化学性のインベントリを構築し、地球統計学的手法により地理空間へと拡張し化学特性値の基盤図を整備する。これにより森林土壌機能評価マップを作成し機能発現条件を解明することを目的としている。当年度は、多点試料の土壌pHおよび交換性アルミニウム含有率を測定した。既存情報より酸性シュウ酸塩可溶アルミニウム含有率情報をインベントリに整備し、地球統計学的手法として逆距離解析法およびクリギング法の適用を検討した。現有データとこれらの手法の組み合わせでは全国スケールを粗い解像度で評価可能であるが、より細かな解像度で評価を行うためには地形等の立地条件との重回帰分析の結果を取り入れるなど手法の検討が必要であることが明らかとなった。本課題では、全国の森林から収集された多点試料を分析することで、土壌の化学性のインベントリを構築し、地球統計学的手法により空間的に拡張し化学特性値の基盤図を整備することで森林土壌機能評価マップを作成し機能発現条件を解明することを目的としている。当年度は、土壌型による土壌化学特性値の違いについて検討した。全国約830地点から得られた土壌断面試料の土壌タイプ(林野土壌の分類による)は、80%が褐色森林土群、12%が黒色土群であり、褐色森林土群、黒色土群とも典型亜群が約90%を占める。褐色森林土亜群は、適潤性50%、適潤性(偏乾亜型)30%、乾性(粒状構造型)10%、弱乾性5%、弱湿性3%、乾性(細粒状構造型)1%であった。黒色土亜群は、適潤性76%、適潤性(偏乾亜型)17%、弱湿性2%、乾性(粒状構造型)と湿性が各1%であった。褐色森林土亜群では、pHや交換性塩基、酸性シュウ酸塩可溶成分は斜面系列に沿って乾性から湿性へと高くなる傾向を示した。黒色土亜群では、褐色森林土とは反対に、酸性シュウ酸塩可溶成分が湿性側で低くなっており、このことから斜面下方では斜面上部からの土砂の移送および攪乱による基盤母材の混和により母材における火山灰の割合が低くなり、火山灰土壌としての性質が薄まっていることが示唆された。全国データによる土壌の化学性は土壌型に偏りが大きく多様な要因を含むものの、斜面系列に沿った傾向が認められた。当該年度に予定していた基盤図作成のための交換性塩基類および塩基交換容量の分析を完了した。土壌pHおよび交換性アルミニウム含有率についてインベントリ情報を整備し、基盤図の作成を完了し、クリギング法を用いた空間拡張とその問題点について明らかにした。森林の持つバイオマス生産や炭素貯留、水源涵養、水質形成あるいは酸緩衝能等の機能評価には基盤となる土壌情報が重要となる。土壌情報は、これまで土壌タイプという不連続なカテゴリカルデータであったが、連続した数量的化学データとして地球統計学的手法により地理的空間情報に整備することで、斜面から流域-地域-全国のあらゆるスケールにおいて温暖化や越境大気汚染など環境変動・環境負荷への森林生態系応答解析の高度化や、シミュレーションモデルにおけるプール・初期値の精度向上が期待でき、森林機能の高度な発揮に向けた森林管理技術の開発に寄与する。日本全土の森林域を対象とした土壌調査・分析データを用い、土壌の生成的特徴と地形要因との関係を明らかにし、標高や傾斜等のメッシュ情報を用いたアンドソルの分布域の推定を試みた。実測地点の分析値により判別した各地点でのアンドソルの出現に対して、地形および気象データを用いてパーティション分析を行いアンドソル出現確率の決定木を作成した。決定木における各パラメータの寄与率から、アンドソルの出現には標高、緯度、傾斜、経度の寄与が大きく、気象・気候要因の寄与が小さいことが示された。この結果を3次メッシュデータに適用しアンドソルの分布を推定した。この手法では、アンドソル出現確率が50%以上となる3次メッシュは森林域の27%であり、既往の火山性土壌の分布割合に近似した結果が得られた。使用した土壌情報は全国を網羅しているものの地点数が限定されているため、空間統計を用いた解析には十分ではない。そのため本研究で用いた手法は広域での評価は可能であるものの、大縮尺図での詳細な土壌機能の評価等への適用には注意が必要である。

森林域における既存土壌図のデジタル化が進めば、これを活用した解析が可能となり、詳細な機能評価手法の開発につなげられる。日本全国の約800地点における森林土壌断面調査試料の土壌pH、塩基交換容量、交換性塩基含量、交換性アルミニウム含量を測定し、地球統計学的手法により地理的空間情報を整備し、基盤図として各測定値について森林域における値域の分布推定図を作成した。これらの基盤図に基づきAl毒性発現可能性等の土壌機能評価図を作成した。また、これらの土壌化学性におよぼす土壌型、火山灰付加程度の影響を明らかにした。造林樹種の生長の差異から火山灰付加程度評価の重要性を明らかにし、火山灰土壌の広域分布推定精度の向上を試みた。当該年度に予定していた項目の分析を完了した。既存情報を用いて空間補間手法を検討し、低解像度での全国スケールでの土壌情報の評価を可能とした。異常値について再分析による確認を行う。分析により得られた化学特性値についてインベントリ情報として整備し、基盤図を作成し、土壌機能発現条件を解明するために土壌機能評価マップを作成する。森林土壌多点試料の交換性塩基類含有率および塩基交換容量を測定する。土壌pHおよび交換性アルミニウム含有率についてインベントリ情報として整備し、基盤図を作成する。設備工事に伴う実験室の使用不能期間の発生ならびに主要な分析機器である元素分析装置の故障、修理による使用不能期間の発生により、分析期間が短縮されたため分析補助にかかる経費が縮小された。分析機器の故障による分析スケジュールの遅延により、予定していた分析用ガス、試薬、分析補助のための人件費の一部が使用できなかった。当該年度までに得られた分析値を精査し再分析を行い、土壌化学性インベントリを完成させる。全ての分析項目に対応する基盤図を作成し、これらを組み合わせた土壌機能評価マップを作成する。この基盤図の作成および土壌機能評価マップの作成手法の検討のための情報収集を行うための学会参加の経費を支出する。今年度、分析スケジュールの遅延により生じた繰越金については、実施できなかった再分析に必要な分析用ガス、試薬、フィルター等の消耗品および分析補助のための人件費に使用する。次年度に計画している項目の分析のための試薬、消耗品、分析用ガスおよび分析補助のための人件費を支出する。また、成果の学会発表のための旅費、発表料ならびに成果の公表に必要な投稿料等の経費を支出する。
脂質を基盤とする情報伝達機序の解析

主に細胞膜の内葉に存在するイノシトールリン脂質のPI(4,5)P_2が関与する細胞機能は,細胞内情報伝達,エンドサイトーシス,細胞骨格調節など多岐にわたる.研究代表者は,急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を駆使することにより,細胞膜内葉に局在するPI(4,5)P_2のアゴニストあるいはイオノマイシン刺激による動態変化が,細胞膜の場所により異なることを免疫電顕で明らかにし,細胞膜中でPI(4,5)P_2は区画化されており,局所的にその量が調節される可能性を示唆した.主に細胞膜の内葉に存在するイノシトールリン脂質のPI(4,5)P_2が関与する細胞機能は,細胞内情報伝達,エンドサイトーシス,細胞骨格調節など多岐にわたる.研究代表者は,急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を駆使することにより,細胞膜内葉に局在するPI(4,5)P_2のアゴニストあるいはイオノマイシン刺激による動態変化が,細胞膜の場所により異なることを免疫電顕で明らかにし,細胞膜中でPI(4,5)P_2は区画化されており,局所的にその量が調節される可能性を示唆した.イノシトール燐脂質(PIs)は種々の細胞現象に関与することが報告されており,特にPI(4,5)P_2はシグナル伝達,小胞輸送,細胞骨格制御など関与する現象は多岐にわたる.同一分子が異なる機能を制御するためには,局所的にPI(4,5)P_2の量が緻密に制御されていると推測されているが,その詳細は明らかでない.PIsの局在は,PIs結合ドメインとGFPの融合蛋白質によるイメージングで解析されてきたが,この方法では空間分解能が低く二次元的分布の詳細な情報は得られない.一方,通常の免疫電顕法では化学固定できない脂質の局在を正確に決定することは困難である.そこで我々は凍結割断レプリカを用いて,PI(4,5)P_2の超微局在を検索する方法を開発した.凍結割断レプリカでは細胞膜分子は白金・カーボンの薄膜で物理的に固定されるため,生細胞での分子分布が超微形態レベルで維持される.本研究ではPI(4,5)P_2に特異的に結合するPLCδ1のPHドメインとGSTの融合蛋白質でレプリカを標識し,細胞膜上での二次元的分布を解析した.ヒト線維芽細胞の細胞膜では,PI(4,5)P_2標識はカベオラ開口部およびコーテッドピット周囲に集中する傾向が見られ,標識密度は平坦な領域に比べ有意に高かった.またangiotensin II(Ang II)刺激によって細胞膜のPI(4,5)P_2の量が減少し,平坦な領域の方がカベオラ開口部よりも早い段階で減少することがわかった.これに対しコーテッドピット周囲での集積はAng II刺激によって変化しなかった.さらに,ionomycinによっては逆にカベオラ開口部の方が平坦な領域の方よりも早い段階で減少することから,少なくとも細胞膜には3つの異なったPI(4,5)P_2のプールが存在することがわかった.このように凍結割断レプリカ標識法を用いることにより,PI(4,5)P_2のナノスケールレベルでの局在を検討できることが示された.ホスホイノシタイド(PIs)は,細胞内シグナル伝達,小胞輸送,細胞接着,オートファジーなど種々の細胞現象に関与することが知られる.同一膜上でのPIsの偏在は膜陥凹の形成,小胞の出芽・融合,細胞骨格などの局所的制御と直接リンクしていると考えられるが,その微細分布には不明な点が多い.すでに我々は凍結割断レプリカを用いて,細胞膜上のPI(4,5)P2の超微局在を検索する方法を開発した.凍結割断レプリカでは細胞膜分子は白金・カーボンの薄膜で物理的に固定されるため,生細胞での分子分布が超微形態レベルで維持される.しかしながら,これまでの方法では,細胞内を割断することが出来ず,細胞内オルガネラ膜でのPIsの微細構造を検討することが困難であった.そこで我々が開発した凍結割断レプリカ法をさらに改良し,加圧凍結装置を用いることにより,細胞内が割断され効率的に細胞内オルガネラを観察できる方法を確立した.現在,観察されるオルガネラ膜を同定するために,それぞれのオルガネラに特異的に局在するマーカーを細胞内に発現させ,レプリカ膜上で標識することを試みている.現在,一定の成果をすでに得ており,小胞体やエンドゾームの同定に成功している.今後,各細胞膜およびオルガネラ膜でのPIsの微細分布を明らかにし、膜トラフィッキング、オートファジー、癌細胞の浸潤などのPIsが関与する細胞現象に関して新しい知見の獲得を目指す.イノシトール燐脂質(PIs)は,細胞内シグナル伝達,小胞輸送,細胞接着,オートファジーなど種々の細胞現象に関与することが知られる.同一膜上でのPIsの偏在は膜陥凹の形成,小胞の出芽・融合,細胞骨格などの局所的制御と直接リンクしていると考えられるが,その微細分布には不明な点が多い.すでに我々は凍結割断レプリカを用いて,細胞膜上のPI(4,5)P2の超微局在を検索する方法を開発した.凍結割断

レプリカでは細胞膜分子は白金・カーボンの薄膜で物理的に固定されるため,生細胞での分子分布が超微形態レベルで維持される.しかしながら,これまでの方法では,細胞内を割断することが出来ず,細胞内オルガネラ膜でのPIsの微細構造を検討することが困難であった.そこで我々が開発した凍結割断レプリカ法をさらに改良し,培養細胞並びに生体内組織において細胞内が割断され効率的に細胞内オルガネラを観察できる方法を確立した.すでに膵臓の外分泌細胞の各オルガネラでのPI(4,5)P2の分布を明らかにし,培養細胞内で観察されるオルガネラ膜を同定するために,それぞれのオルガネラに特異的に局在するマーカーを細胞内に発現させ,レプリカ膜上で標識することを試みた.今後はオルガネラ膜の同定を含め,PIsの微細分布を明らかにし,膜トラフィッキング,オートファジー,癌細胞の浸潤などのPIsが関与する細胞現象に関して新しい知見の獲得を目指すことが必要である.