hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞分化における体細胞ｐｉＲＮＡの機能解明

私たちの研究グループは、その分子実体を特定し、Trimmer分子がpiRNAの3'末端形成機構に置いて中心的な役割を果たすことを示し、Cell誌に発表した。piRNAは主に生殖巣において機能すると考えられているが、近年、体細胞においても機能することが示唆されつつある。本研究ではpiRNAを発現する卵巣由来のカイコ培養細胞(BmN4)を脂肪細胞様に分化させ、生殖細胞から体細胞に分化する際のpiRNA動態を捉えるための実験基盤の構築を目的とした。また、BmN4細胞を用いた人工piRNA産生系の確立を試みた。1. piRNAの多くはゲノム上のpiRNAクラスタと呼ばれる領域に由来する。BmN4細胞における脂肪細胞分化誘導時のmRNAおよびpiRNAの変動を調査したところ、piRNAクラスタの一部から発現するmRNAおよびpiRNAは、脂肪細胞分化によって顕著に変化した。カイコ胚子期の発達段階別のpiRNAライブラリとの比較を行った結果、これらのpiRNAクラスタは、胚子の発達に伴っても類似の発現変動を示すことが分かった。この結果は、本研究で用いた誘導系がpiRNAクラスタの発現調節の観点で胚子期の変動を模倣している可能性を示唆している。この結果は平成29年度蚕糸・昆虫機能利用学術講演会において発表した。2. piRNAはping-pong cycleと呼ばれる増幅経路によって増幅すると考えられている。しかし、ping-pong cycleはバイオインフォマティクス解析から想定されたモデルであって、堅固な実験的証明は存在しなかった。本研究では、BmN4細胞を用いて人工的にping-pong piRNAを産生する系を構築し、ping-pong cycleの実証に成功した。さらに、この実験系を利用することによって、piRNA-PIWIタンパク質による認識には17塩基の相補が必要であり、22塩基の相補があれば充分であることを示した。この結果は、RNA誌に発表するとともに、国際学会においても発表を行い、学生優秀発表賞を受賞した。1.細胞分化時のpiRNAの役割の解析【(1)体細胞分化誘導に関わる分子の同定】1年目に同定した体細胞分化に関わる分子がpiRNAのターゲットであることを確かめる。具体的にはカイコpiRNA経路の中核分子であるSiwiをsiRNAでノックダウンし、その後、体細胞系に分化させた際のmRNAの挙動の変化を調査する。さらにmodified RACE法や生化学的な解析、およびpiRNAインヒビターを用いた解析を行うことで、対象のmRNAがpiRNAによって切断されていることを確認する。以上の結果から、体細胞のみ、または生殖細胞のみでpiRNAによって抑制されているmRNAの同定を試みる。【(2)体細胞分化に関わる分子の個体における役割の解明】候補分子が昆虫個体における細胞分化に関与することを、カイコの胚子、または幼虫・蛹へのsiRNAインジェクションもしくはTALENなどのゲノム編集技術などを用いて証明する。
第一原理に基づく画期的定量モデリングによる析出分散強化型耐熱超合金の理論設計

本研究の目的は、耐熱合金であるニッケル基合金の基本となる二元系合金・NiAl合金を例に取り、実用温度領域(1473K)におけるγ(FCC)相中へのγ'(L12)相整合析出物分散による強化機構の定量理論予測可能なモデルを、電子論に基づき構築することである。本年度は、ポテンシャル繰り込みの手続きにより、第一原理を格子モデルを経てフェーズフィールドモデルへ連結する手法の検討を行った。このような第一原理計算のフェーズフィールドモデルへのマッピングの基礎基盤構築は、本課題申請当初の予定には無いものであったが、これが実現すれば、経験的な熱力学パラメータを用いる事なく、微細組織時間発展の理論予測が可能となる。今年度は、繰り込みを数値的に行うための計算条件を詳細に検討した。さらに、FCC格子を有するモンテカルロ(MC)法のプログラムコードについては、スーパーコンピュータで実行するために並列化を行い、各計算条件で熱平衡状態が実現する長時間シミュレーションを実行中である。本MCプログラムコードに、繰り込みポテンシャルを多体相互作用として用いる事で、相転移の情報を定量的に評価する。今後は、統計精度をあげるため異なる疑似乱数初期値を使用した複数サンプルの計算を行い、熱平衡状態が得られるまでの長時間シミュレーションを遂行し、熱力学的特性の定量評価を行う予定である。更に、本年度までに構築した二元系モデルを拡張する事により、他系への適用の検討を始めている。本研究で扱う耐熱合金であるNixAl1-x系について、FCC格子への繰り込みの手順の整備を行った。つまり、純金属(純Ni,純Al)、Ni3Al, NiAl, NiAl3という5つの規則相について、第一原理計算により繰り込みポテンシャルテーブルの作成をおこなった。2x2x2個のセル(32個の原子を含む)から構成されるスーパーセルを導入し、その中心位置にある原子について、格子点を中心としてその周囲を1000点近いグリッドに分割し、原子位置を変えながら第一原理計算を行った。得られた結果を用いて部分状態和に関する積分を行う事で、繰り込みの効果の温度依存性を求めた。今年度は、数値的積分を実行する際の計算条件の検討を詳細に行った。はじめに格子モデルにマッピングするため、テスト計算により5つの相の格子定数を決定した。次にグリッドの点数およびグリッド間隔の決定を行い、可能な限り精度が良い数値的積分を行った。空間の対称性に基づいて既約領域を求めるプログラムを作成し、繰り込みの膨大な計算量の軽減を図った。得られた繰り込みポテンシャルを用いて、モンテカルロシミュレーション(MC)を行った。その際、実用上興味深い高Ni濃度側(0.75≦x≦0.90)において、1300KにおけるMCを検討した。この濃度領域においては、γ'単相領域γ/γ'二相共存領域の相転移、およびγ/γ'二相共存領域γ単相領域の相転移が実験的に観察されている。更に、本繰り込みの手法を空孔を含む擬三元系へ拡張し、同様の手続きを行った。得られた局所的な自由エネルギーをCahn-Hilliard方程式に利用することで、実験パラメータフリーのフェーズフィールド計算を遂行した。TTP図やフェーズフィールド法など、古典的な描像に基づく連続体モデルに対する一般的な問題として、計算に必要なパラメータの正当化、実験との定量的な議論や特性予測の困難さが挙げられる。本研究により、これらの問題点を抜本的に解決し、整合析出物分散による耐熱超合金強化機構の、世界最高水準の精度を有する理論定量予測モデル構築を目指す。今後は計算精度を挙げた解析を行い、本年度までに構築した二元系モデルを拡張して、他の系への適用などを考えている。本研究の目的は、航空機のジェットエンジンなどで幅広く使用されるニッケル(Ni)基耐熱超合金に的を絞り、実用温度領域(1473K)におけるγ(FCC)相中へのγ'(L12)相整合析出物分散による強化機構の定量理論予測可能なモデルを、電子論に基づき構築することである。そのため、第一原理計算の繰り込み操作による粗視化(スケール変換)の手続きを経て、組織自由エネルギー法に基づく等温析出曲線図(TTP図)までをシームレスに繋ぐ新規階層モデルを開発する。第一原理計算結果を基に、繰り込みの手法で格子振動や歪みの効果を取り込み格子モデルの多体相互作用を決定した。一方、FCC格子を有するモンテカルロ法のプログラムコードについては、スパコンで実行するために並列化をおこない、現実的な時間内に結果が得られることを確認している。本プログラムコードに、繰り込みポテンシャルを多体相互作用として用いる事で、相転移の情報を定量的に評価する。今後は、統計精度をあげるための計算をおこない、熱力学的特性の定量評価をおこなう予定である。TTP図やフェーズフィールド法など、古典的な描像に基づく連続体モデルに対する一般的な問題として、計算に必要なパラメーターの正当化、実験との定量的な議論や特性予測の困難さが挙げられる。本研究で注目しているFCC格子を有するNiAl二元系合金について、繰り込みの手順の整備をおこなった。つまり、純金属(純Ni,純Al)、Ni3Al, NiAl, NiAl3という5つの相について、第一原理計算により繰り込みポテンシャルテーブルの作成をおこなった。

2x2x2個のセル(32個の原子を含む)から構成されるスーパーセルを導入し、その中心位置にある原子について、格子点を中心としてその周囲を1000点近いグリッドに分割し、原子位置を変えながら第一原理計算をおこなった。得られた結果を用いて部分状態和に関する積分をおこなうことで、繰り込みの効果の温度依存性を求めた。その際、空間の対称性に基づいて、既約領域を求めるプログラムを作成し、膨大な量の計算を減らすことをおこなった。次に、この繰り込みポテンシャルを用いて、モンテカルロシミュレーション(MC)をおこなった。その際、今回は例として、実用上興味深い高Ni濃度側において、1300KにおけるMCを検討した。この濃度領域においては、γ'単相領域γ/γ'二相共存領域の相転移、およびγ/γ'二相共存領域γ単相領域の相転移が実験的に観察されている。はじめに1コアで動作するMCコードを作成し、動作確認をおこなった。概ね実験値を定量的に再現することが確認された。本プログラムコードを並列化処理できるように修正をおこなった。これにより、(ある程度高温側においては)熱平衡状態が実現されるほどの長時間シミュレーションをおこなう事が可能となった。本研究の目的は、耐熱合金であるニッケル基合金の基本となる二元系合金・NiAl合金を例に取り、実用温度領域(1473K)におけるγ(FCC)相中へのγ'(L12)相整合析出物分散による強化機構の定量理論予測可能なモデルを、電子論に基づき構築することである。本年度は、ポテンシャル繰り込みの手続きにより、第一原理を格子モデルを経てフェーズフィールドモデルへ連結する手法の検討を行った。このような第一原理計算のフェーズフィールドモデルへのマッピングの基礎基盤構築は、本課題申請当初の予定には無いものであったが、これが実現すれば、経験的な熱力学パラメータを用いる事なく、微細組織時間発展の理論予測が可能となる。今年度は、繰り込みを数値的に行うための計算条件を詳細に検討した。さらに、FCC格子を有するモンテカルロ(MC)法のプログラムコードについては、スーパーコンピュータで実行するために並列化を行い、各計算条件で熱平衡状態が実現する長時間シミュレーションを実行中である。本MCプログラムコードに、繰り込みポテンシャルを多体相互作用として用いる事で、相転移の情報を定量的に評価する。今後は、統計精度をあげるため異なる疑似乱数初期値を使用した複数サンプルの計算を行い、熱平衡状態が得られるまでの長時間シミュレーションを遂行し、熱力学的特性の定量評価を行う予定である。更に、本年度までに構築した二元系モデルを拡張する事により、他系への適用の検討を始めている。本研究で扱う耐熱合金であるNixAl1-x系について、FCC格子への繰り込みの手順の整備を行った。つまり、純金属(純Ni,純Al)、Ni3Al, NiAl, NiAl3という5つの規則相について、第一原理計算により繰り込みポテンシャルテーブルの作成をおこなった。2x2x2個のセル(32個の原子を含む)から構成されるスーパーセルを導入し、その中心位置にある原子について、格子点を中心としてその周囲を1000点近いグリッドに分割し、原子位置を変えながら第一原理計算を行った。
癌の浸潤形質獲得過程におけるArf6の活性化機序の解明

はじめ幾つかの癌において、レセプター型チロシンキナーゼであるEGFレセプターの高発現と、癌の悪性度との間に相関があることが知られている。しかし、癌の浸潤形質獲得に特異的なシグナル伝達経路があるか否かについては、不明のままであった。申請者らの研究成果から、シグナル分子GEP100がEGFレセプターを介したシグナル伝達経路と、乳癌の浸潤形質獲得に必須な低分子量G蛋白質Arf6の活性化とを結び付ける新規のシグナル伝達経路の存在が明らかとなった。さらに、病理学的解析から、このGEP100-Arf6経路が浸潤性乳癌の約80%に存在することが示唆されたはじめ幾つかの癌において、レセプター型チロシンキナーゼであるEGFレセプターの高発現と、癌の悪性度との間に相関があることが知られている。さらに、病理学的解析から、このGEP100-Arf6経路が浸潤性乳癌の約80%に存在することが示唆された本研究は、細胞浸潤を制御する基本的分子機構を明らかにし、どのような制御の破綻が癌細胞の常軌を逸した浸潤性をもたらすのかを解明することを目的としている。申請者は、これまでに、低分子量G蛋白質Arf6が浸潤性の高い乳癌細胞において正常乳腺細胞での高発現をしており、それらの浸潤活性に重要であること、浸潤におけるArf6のエフェクターがAMAP1であり、その発現も乳癌の浸潤形質や悪性度と良い相関を示すこと、さらに、AMAP1が浸潤活性に必須の複合体を形成すること、その中でAMAP1とcortactinとの結合インターフェースは特異な構造を示し優れた分子標的となることを例示して来た。本研究期間において、癌細胞の浸潤においてArf6を活性化するGEF(guanine nucleotide exchange factor)の同定を行った。浸潤性の高い乳癌細胞であるMDA-MB-231細胞をモデルとし解析を行った結果、この細胞株で発現しているArfGEFの中でGEP100の発現を抑制した時のみ、有意な浸潤活性の抑制が認められた。GEP100は、リガンドにより活性化されたEGFRに直接結合することによってArf6を活性化すること,また、GEP100とEGFRとの結合様式も明らかにした。MCF7など非浸潤的乳癌細胞では、GEP100、Arf6共に殆ど発現していない。MCF7細胞にGEP100の強制発現を試みたところ、Arf6との共発現においてのみ、EGF刺激依存的な浸潤性の誘導を見出した。病理学的解析も進め、GEP100は原発性乳管癌の約7割に発現が認められ、それらの悪性度の高いケースで、特にEGFRとの共発現が見られた。乳癌をはじめ様々な癌種において、EGFRが高発現しており、このことと癌の浸潤・転移形質との間に相関があることが知られている。しかし、EGFRを介した、癌浸潤に特異的なシグナル伝達経路があるか否かについては、不明のままであったが、申請者らの研究結果から、GEP100がEGFRを介したシグナル伝達経路と、乳癌の浸潤形質誘導に必要なArf6の活性化とを結び付ける特異的な、新規シグナル伝達経路の存在の可能性が示唆された。本研究は、細胞浸潤を制御する基本的分子機構を明らかにし、どのような制御の破綻が癌細胞の異常な浸潤形質をもたらすのかを解明することを目的としている。申請者は、これまでに、低分子量G蛋白質Arf6、及び、そのエフェクターとして同定したAMAP1が浸潤性の高い乳癌細胞において正常乳腺細胞での高発現をしており、それらの浸潤活性に重要であること、さらに、AMAP1が浸潤活性に必須の複合体を形成すること、その中でAMAP1とcortactinとの結合インターフェースが特異な構造を示し優れた分子標的となることを例示して来た。平成19年度には、EGFRシグナル伝達経路を介した乳癌の浸潤形質獲得過程において、GEP100がArf6の活性化に必須であることを明らかにした。本研究期間において、マウスモデルの構築と構造解析を進めた。GEP100のConventional遺伝子欠損マウスは、胎生致死となる可能性があることが明らかとなった。現在、どの段階まで発生が進んでいたかの検討を進めつつある。乳癌の浸潤形質獲得との関連を明らかにするため、乳腺特異的GEP100遺伝子欠損マウスの作製を進めている。特に、既に所属する研究機関が保有する乳癌モデルマウス(MMTV-NeuTマウス)との掛け合わせにより、乳癌発生・悪性度の進行がGEP100遺伝子欠損により、どのような影響を受けるか検討を進める。関連事項として、ある種の乳癌細胞株において、GEP100がerbB2と相互作用し、浸潤形質誘導に関与することを示唆する結果を得ている。さらに、GEP100とEGFRとの結合インターフェースの立体構造についてオックスフォード大学のFeller博士のグループと共同研究を開始した。

それにより、結合阻害に関する構造的知見を提示し、阻害剤の基本デザインを試み、焦点を絞り込んだ阻害剤の探索を行う予定である。乳癌をはじめ様々な癌種において、erbBファミリーの高発現と癌の浸潤・転移形質との間に相関があることが知られている。我々の研究成果から、GEP100がerbBファミリーを介したシグナル伝達経路と、乳癌の浸潤形質誘導に必要なArf6の活性化とを結び付ける特異的な、新規シグナル伝達経路の存在すること、さらに、その分子機序から新しい視点からの分子標的となることの可能性が示唆された。
マスキング効果を利用した知的作業のための音環境デザイン

建造物による遮音・防音対策を施してもなお残る会話・電話などの有意味騒音に対して、音楽や自然音などの種々のマスキング音を付加することによって、騒音が知的作業に及ぼす影響をどの程度軽減できるかについて、生理・心理学的側面から調査した。騒音の意味性の違いにより、作業者の脳波や主観的反応および作業成績に有意な差異が現れ、マスキングによって有意味騒音を無意味騒音に質的変化させ得ることの可能性の一端が認められた。従来の研究では、作業空間内に存在する有意味な音声雑音をそれとは異なる別の音でマスクするといった雑音対策手法の有効性について確認されている。しかしながら、マスキング音として帯域制限ピンク雑音を用いており、音楽等の変動音を用いた場合については検討されていない。また、知的作業を比較的継続時間の短い作業に限定して考察されている。このような観点から本研究では、音声等の有意味雑音存在下で知的作業を行なっている作業者に対して、マスキング音として定常音や変動音を長時間にわたって放射した場合、作業者のうるささ、心地よさ、好み等の心理的評価値がどのように変化するか、さらには上記に起因して、作業成績がどの程度となるかを考察することを目的としている。本年度は、作業現場に存在する有意味な音声雑音を帯域制限ピンク雑音、BGM、自然音等の様々な音でマスクした場合の作業者の心理的印象や正答率・反応時間といった作業成績について心理実験により調査し、最適なマスキング音の候補の選定とそれらの提示方法について検討した。1.マスキング音に対するうるささ、心地よさ、好みなどの心理的評価の言語表現の設定と音響心理実験の方法を立案した。2.様々な音声信号を収録して周波数分析を行った。種々の音声を低レベル値で頑健にマスクするためのマスキング音のスペクトル形状の候補を決定した。3.2.で決定したスペクトル形状をもつようなBGM、自然音を収集してCD、DVDに収録した。4.防音室内において、3.で収集したマスキング音を放射した上で心理実験を行った。作業の種類や継続時間等を種々変更しながら測定を行った。5.心理実験の結果から、様々な音声雑音を頑健にマスクでき、しかも心理的印象を効果的に改善できるマスキング音の候補を決定した。周波数帯域を[1775656][Hz]で制限したピンク雑音を音声雑音とのSN比が3[dB]となるように放射した場合に特に大きな効果が得られた。これまでに,知的作業空間内に存在する有意味雑音をそれとは異なる別の音でマスクするといった音を積極的に活用した雑音対策手法の有効性を確認した。しかしながらこれらは,マスクキング音を定常音に限定しており,音楽や自然音等の変動音を用いた場合については検討していない。本研究では,上述の雑音対策手法を長時間にわたる知的精神作業時に適用した場合の作業者のうるささ,心地よさ,好み等の心理的評価値がどのように変化するか,さらには上記に起因して作業成績がどの程度となるかを考察することを目的とし,下記のようなマスキングの効果に対する生理学的側面からの初期的なアプローチを行った。1.聴覚に関連する様々な生理学的指標を調査・整理し,音環境評価に有効であると思われる脳波の測定を試みた。国際10-20法に従って作業者の頭皮上に皿電極を配置し,音環境下で脳波のリアルタイム計測・解析が可能なPCをベースとしたシステムをグラフィック型プログラミング言語LabVIEW(National instrument社)を用いて構築した。解析に当たり,自律的・背景的な電位変動である脳波のα波成分や前頭正中部θ波(Fmθ)成分など,さらにはN1,P1,N2,P2,P3a,P3bや頭頂部緩反応(SVR)などの中潜時・長潜時の聴覚誘発電位・事象関連電位に注目して,作業時に有意味雑音を「聞き流そうとしている」状態において,定常音または音楽・自然音等の変動音をマスキング音として放射した場合の脳波解析を行った。2.複数の被験者に対して上記の測定を行った結果,雑音の有意味性の違いにより前頭正中部におけるθ波に差異がみられ,主観的な心理評価結果との対応から,これらが知的精神作業への集中度や没頭と関係していると推察された。マスキングによって有意味雑音を無意味雑音に質的変化させ得ることの可能性の一端が認められた。前年度に実施した脳波測定実験により、種々の騒音が存在する知的作業空間内でマスキング音を放射した場合、選択的注意・集中に密接に関連すると考えられている前頭正中部Fmθ波や事象関連電位(ERP : Event related potential)中の刺激提示後約100ms後に観測される陰性成分(N100)および約250600ms後の陽性ピーク(P300)に差異が現れることを確認した。

本研究では、上記の結果の妥当性・信頼性を検証する目的で、騒音の音圧レベル値、作業の種類や継続時間等のパラメータを種々変化させて、多人数の被験者に対して追加測定を行った。1.聴覚や視覚を用いた様々な知的精神作業の課題出力・回答入力に柔軟に対応できる、PCをベースとした視聴覚作業評価用入出力インタフェース・システムをグラフィック型プログラミング言語LabVIEW (National instrument社)を用いて構築し、作業時に有意味雑音を「聞き流そうとしている」状態において、定常音または音楽・自然音等の変動音をマスキング音として放射した場合の脳波解析を行った。2.多数の被験者に対する脳波測定の結果、騒音の違いによりN100およびP300振幅に有意な差が認められ、主観評価結果や作業に対する正答率・反応時間との対応から、音声のスペクトル形状を模擬した定常騒音をマスキング音として用いることで有意味騒音による作業妨害を軽減できる可能性が示唆された。また、マスキング音に対する主観的好み・嗜好は、作業成績との関連性が小さく、個人差が大きいことがわかった。
家族性筋萎縮性側索硬化症の変異SOD1遺伝子導入による細胞障害の発生機序

家族性筋萎縮性側索硬化症患者に認められる四種類の変異型superoxide dismutase1(SOD1)遺伝子(G37R, G85R, G93A, S134N)および野生型SOD1遺伝子をそれぞれプロモーター活性強度の異なる二種類の発現ベクター(pcDNA3,pEF-B0S)にサブクローニングし、COS7細胞に導入した。約48時間後、発現効果の高いpEF-BOSを用いた系において核周囲に変異型SOD1蛋白質による凝集塊形成が認められた。この凝集塊は小胞体マーカーの局在と一致し、変異型SOD1の小胞体内での蓄積が示唆された。ゴルジ体の局在に変化は認められなかった。凝集塊形成に伴い、ミトコンドリアは核周囲に集簇し、一部は膨化像を呈していた。また抗チューブリン抗体陽性像も核周囲に集簇しており、微小管の障害によりミトコンドリアの細胞内局在に変化が生じたものと考えられた。一方、発現効率の低いpcDNA3の系では変異型SOD1の凝集塊は形成されなかったが、プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの添加により、核周囲に凝集塊が形成され、小胞体マーカーの局在と一致した。上記の変化は、野生型SOD1遺伝子(pcDNA3,pEFBOS)を導入したCOS7細胞では認められなかった。[結論]変異型SOD1はプロテアソームによる分解処理能力を超えて産生された場合に、小胞体内に凝集塊として蓄積することが示唆された。さらにSOD1の変異は、小胞体における蛋白質の品質管理機構およびユビキチン・プロテアソーム分解系と密接に関連し、凝集物形成に伴いミトコンドリアや他の細胞機能障害を多元的に誘発する可能性が示唆された。1.正常ヒト白血球から野生型SOD1遺伝子を抽出、サブクロー二ング後、Kunkel法にて4種の点変異(Gly37Arg,Gly85Arg,Gly93Ala,およびSer134Asn)を導入した。そして、正確に点変異が導入されていることを塩基配列を決定し確認した。2.神経疾患を認めない症例の剖検脳からニューロフィラメントL遺伝子を抽出、サブクローニングした。3.野生型SOD1遺伝子,変異SOD1遺伝子,およびニューロフィラメントL遺伝子を、各々、DEAE-dextran法にてCOS7細胞にtransfectionし、細胞内に蛋白を発現させた。野生型および変異SOD1遺伝子のいづれの導入によっても、細胞質内封入体が形成されたが、封入体の形態的差異、量的差異について検討中。1.正常ヒト白血球から野生型SOD1遺伝子を抽出、サブクローニング後、Kunkel法にて4種の点変異(Gly37Arg,Gly85Arg,Gly93Ala,およびSer134Asn)を導入した。3.野生型SOD1遺伝子,変異SOD1遺伝子,およびニューロフィラメントL遺伝子をpcDNA3ベクターに導入し、各々、DEAE-dextran法にてCOS7細胞にtransfectionし、細胞内に蛋白を発現させた。Transfectionされた細胞をWestern blotにて解析し、蛋白質として発現されていることを確認した。4.野生型SOD1遺伝子導入細胞および変異SOD1遺伝子導入細胞の間で光顕上、形態学的差異はみとめられなかった。

5.そこで、ベクターをpcDNA3からpEF-BOSに変えて同様の実験を行ったところ、野生型SOD1遺伝子導入細胞では野生型SOD1蛋白は細胞質内に均質に発現・分布したが、変異SOD1遺伝子導入細胞では変異SOD1蛋白は粗大な細胞質内封入体を形成した。6.ニューロフィラメントL遺伝子をco-transfectionさせたところ、野生型SOD1遺伝子導入細胞では野生型SOD1蛋白もニューロフィラメントL蛋白も細胞質内に均質に発現・分布した。しかし、変異SOD1遺伝子導入細胞では変異SOD1蛋白のみならず、ニューロフィラメントL蛋白も封入体を形成した。
白金錯体の結晶フォトクロミックシステムの構造論的解明

白金錯体単結晶で起こる特異なフォトクロミズムの仕組みを構造的な面から解明することを目指し,当該白金錯体を合成,単結晶を作製し,励起光照射下での構造解析を進めた.研究過程での結晶化,ならびに,フォトクロミズムの再現実験において,フォトクロミズムを示さない結晶が得られることが見つかり,調査の結果,結晶がフォトクロミズムを示すか否かは再結晶溶液のpHに依存することを明らかにした.具体的に述べると,フォトクロミズムを示す結晶は中性付近で得られる.ただし,中性付近でもフォトクロミズムを示さない結晶が得られることもある.さらに加えて,各結晶面がよく成長した単結晶では,このフォトクロミズムに,十字に領域を4分割したうち相対する2領域のみ色変化が見られる,ドメイン構造があることを明らかにした.ドメイン構造を持つフォトクロミズムばこれまで知られていなかった.当初計画の励起光照射下での構造解析については,タングステンランプ(50W)光を照射しながらX線回折実験を行い,構造解析を行った.その結果,結晶学的データや結晶構造に,室内灯下での光定常状態での解析結果との差異が認められないことを明らかにした.しかし,この光照射下での実験から,問題点として,長時間励起する場合,弱い室内灯での励起と強い光源を用いた励起では,フォトクロミズムの挙動が異なることが新たに明らかとなった.前者は青色への色変化が維持されるが,後者は青くなった後,光照射下にもかかわらず徐々に無色に戻る.フォトクロミズムと励起光強度や励起波長との関係を,今後精査する必要がある.一方で,上述のまったくフォククロミズムを示さない結晶やドメイン構造を持つ結晶についても構造解析を行った.その結果,フォトクロミズムを示す結晶と比べて,特に結晶構造に違いがみられないことを明らかにした.フォトクロミズムが構造の変化を大きく伴う可能性が小さいことを示唆する知見が得られた.白金錯体単結晶で起こる特異なフォトクロミズムの仕組みを構造的な面から解明することを目指し,当該白金錯体を合成,単結晶を作製し,励起光照射下での構造解析を進めた.研究過程での結晶化,ならびに,フォトクロミズムの再現実験において,フォトクロミズムを示さない結晶が得られることが見つかり,調査の結果,結晶がフォトクロミズムを示すか否かは再結晶溶液のpHに依存することを明らかにした.具体的に述べると,フォトクロミズムを示す結晶は中性付近で得られる.ただし,中性付近でもフォトクロミズムを示さない結晶が得られることもある.さらに加えて,各結晶面がよく成長した単結晶では,このフォトクロミズムに,十字に領域を4分割したうち相対する2領域のみ色変化が見られる,ドメイン構造があることを明らかにした.ドメイン構造を持つフォトクロミズムばこれまで知られていなかった.当初計画の励起光照射下での構造解析については,タングステンランプ(50W)光を照射しながらX線回折実験を行い,構造解析を行った.その結果,結晶学的データや結晶構造に,室内灯下での光定常状態での解析結果との差異が認められないことを明らかにした.しかし,この光照射下での実験から,問題点として,長時間励起する場合,弱い室内灯での励起と強い光源を用いた励起では,フォトクロミズムの挙動が異なることが新たに明らかとなった.前者は青色への色変化が維持されるが,後者は青くなった後,光照射下にもかかわらず徐々に無色に戻る.フォトクロミズムと励起光強度や励起波長との関係を,今後精査する必要がある.一方で,上述のまったくフォククロミズムを示さない結晶やドメイン構造を持つ結晶についても構造解析を行った.その結果,フォトクロミズムを示す結晶と比べて,特に結晶構造に違いがみられないことを明らかにした.フォトクロミズムが構造の変化を大きく伴う可能性が小さいことを示唆する知見が得られた.
統合失調症感受性候補領域9q及び20qにおける関連解析による感受性遺伝子の同定

統合失調症感受性遺伝子を同定することを目的として、受入研究室の服巻らが属するJSSLG (Japanese schizophrenia Sib-pair Linkage Group)の研究により示された疾患と弱いながら連鎖する11カ所の染色体領域の中から、他のグループからも連鎖の報告がある5q33.1領域を選択し、関連解析を行った。まず、上記の染色体領域において、データベース検索により、40個の遺伝子を候補遺伝子とし、各々の遺伝子領域全体をカバーするように約30kbごとにSNPを選定した。これらのSNPについて、Direct Sequencing法を用い、日本人集団からなる罹患群・健常群各100検体のタイピングを行った。これまでに設定した119個のSNPのうち101個のSNPについてタイピングが終了した。その結果、罹患群と健常群の間に有意水準5%レベルでの差が認められたのは、単点での遺伝子型頻度およびアレル頻度においては、それぞれ8SNPと5SNPであった。また、ハプロタイプ解析の結果、1%および5%レベルでの有意差がそれぞれ5組および6組のハプロタイプで見つかった。これらの結果から、単点解析とハプロタイプ解析の両方で有意差が見られた3遺伝子については統合失調症との関連が示唆された。残りのSNPについてタイピングを行うのとともに、有意差が認められたSNPについては第二の日本人集団を用いて再現性の確認を行った。これらの結果がまとまり次第、論文として公表する予定である。
知識創出ツールに基づくことにより実利用可能となるテキストマイニング手法の開発

本研究の目的は全体の鳥瞰図を描くのではなく、企業の意思決定に利用可能な信頼性のある知識を持つために、ピンポイントフォーカス型テキストマイニング手法の確立を目指すことである。そのためにテキストを5文ごとに切り分けた「テキストブロック」を作成したうえで、(1)テキストブロックを単位とした語の共起関係を解析し、(2)テキストブロックから構文関係を有する基本句を作成し、(3)文書の類似性を基準としてテキストブロック間の結びつけをおこなうことによって、精度の高い知識の獲得が可能となることを論じた。本研究は2つの柱から成っている。第1の柱は(1)コンピュータパワーの飛躍的進歩、(2)デジタル化されたテキストデータの増加の二つに支えられて、研究が急速に進みつつあるテキストマイニングのための手法を開発すること、第2の柱はその手法を検証するために近年のグローバル化の進展を背景として大きな注目を浴び始めながら、日本企業の取り組みが欧米から大きく遅れているBOP(Base of Pyramid)ビジネスを事例として取り上げ、日本企業のBOPビジネスが成功するための条件や逆に阻害要因をテキストデータの解析を通じて発見することである。第1の柱のためには、まずなによりも優れたテキストデータを収集することが重要であるが、しかしそれだけでは不十分であり、そのテキストを解析に適した形式に編集することが不可欠である。この編集作業は「知の構造化」と言われる作業であるが、この構造化を的確におこうことを重視しそれに依拠して解析を進め、多次元尺度法などの多変量解析の手法、ネットワークの密度分析などの各種の統計解析手法を分析目的に応じて適用する。第2の柱はフィリピン、ベトナム、バングラデシュなど、BOPビジネスが注目されている国を対象として、現地調査と国内での企業に対するヒアリング等を通じてマイニングに適したテキストデータを収集するとともに、BOPビジネスの成功要因と阻害要因を発見ことを目的とする。この二つの柱を有機的に結びつけることによって、企業の実践に資することができるだけの優れた知識の獲得を可能とするテキストマイニング手法を得るとともに、グローバル展開が遅れている日本企業の新しい戦略をBOPビジネスに焦点を当てて解明する。今年度は3年計画の研究の第一年度であるので、二つの柱のいずれも準備作業が中心となった。まず、第1の柱については、BOPビジネスを検証するために役立つテキストデータを収集することが必要である。そのためにまずウェブデータを網羅的に収集する手法を検討し、ウェブクローラーの開発を試みた。しかし結果的に、現在のウェブデータの多くはpdfファイル化されるようになっており、また著作権問題もあり、さらにはホームページの構造が各サイト毎に異なっている等々の理由から、多大な労力をかけたにもかかわらず、実用に耐えるだけのウェブクローラーは開発できなかった。したがって、網羅的に収集できるデータとして、日本経済新聞の記事およびJETROの報告書をダウンロードし、解析をおこないつつある。最終的な結果は未だ得られていないが、このマイニングからBOPビジネスの成功のためには「NGOの活用」「持続的なパートナーシップ」「流通システムの整備」等が重要であるという暫定的に結論を得ており、論文として刊行のための作業をおこなっている。第2の柱としては林、井口、荒井の3名が、2016年1月30日2月3日にフィリピンのSan Pablo市に本部が置かれているNGO組織のCARD(Center for Agricultural and Rural Development)、CARD Bankを訪問しヒアリング調査をおこない、さらにこの3名がバングラデシュのグラミン銀行を訪問しヒアリングをおこなった。目的はフィリピン、バングラデシュにおける貧困層対策やNGOの有効性を知ることである。さらに農村地区を訪ね、BOPビジネスの成功に不可欠と考えられるマイクロファイナンス現場で実体調査をおこなった。第一年度であることもあり、二つの柱は未だ連携がとれていないが、準備作業として第二年度の研究の基礎作りをおこなうことができた。本年度は前年度におこなった解析(『日本経済新聞』、JETROの報告書のBOPビジネス関連テキストデータを用いた解析)の精度を高めるため、「鳥瞰図描画型テキストマイニング」と「ピンポイントフォーカス型テキストマイニング」という概念を導入し、精度向上のためには前者にとどまるのではなく、後者にまで進んだ解析が必要であることを論じた。後者は重要な意味を体現していながら、出現頻度が少ないために膨大なノイズの中に埋没してしまい、解析から脱落しがちな「重要語」を含んでいる箇所に可能な限り的確にピンポイントで辿り着き、さらにまたこの「重要語」を文脈から切り離して抽出するするのではなく、構文を持つ基本句・基本文の中に位置づけて抽出するためのマイニング手法である。この「ピンポイントフォーカス型テキストマイニング」手法を開発し提起するために、日本経済新聞社の刊行する『日経ビジネス』誌、世界銀行の多数のスタッフが公開しているブログ、世界のBOPビジネスにかんする業界誌などのテキストデータをとりあげ、それを5文単位のテキストブロックに加工してラベリングし、これをマイニング単位とした。5文を単位としてテキストブロックを作成した理由は、文脈の最小単位は510文程度であると仮定するからであり、さらにまたこの文脈を表現する基本句・基本文を作成するにはこの程度の長さが最適であると考えられるからである。この手法を適用するために、(1)特長語を起点として構文を構成する諸先行研究、(2)重み布置多次元尺度構成法にかんする研究をはじめとする多くの諸先行研究等に依拠した。以上の結果は複数の論文として執筆され、刊行を予定している。さらに以上の分析結果が現実のBOPビジネスを的確に反映しているかどうかを知るために、昨年度に引き続いてフィリピン、ベトナム等のBOPビジネスの実態について調査し研究報告をおこなった。

本研究の基本的な目的はテキストマイニング手法の開発であるが、この手法の開発のための素材として発展途上国の経済開発に貢献できると期待されるBOP(Base of the Pyramid)ビジネスにかんするテキストデータを用い、解析結果の妥当性の検証をおこなうので、日本企業および欧米企業のBOPビジネスの実態の現地調査と分析をおこなう。したがって、その動向を知るという派生的な研究目的がある。昨年度はテキストマイニングについての研究は、テキストデータの収集、その解析のためのデータ加工などが中心になり、大きな進展はなかったのに対して、後者のBOPビジネスの実態調査についてはフィリピン、ベトナムなどの調査などを通じて研究の進展があった。本年度はテキストマイニング研究については、複数のテキストデータを用いて、マイニングから得られる意味・知識の精度を高めるという本来の研究目的を達成するための試みにかんして、かなりの進展が得られた。すなわち、出現頻度が少ないにもかかわらず重要な意味を含んでいる語にピンポイントで辿り着くための手法としてのテキストブロックの作成とそのラベリング、テキストブブロック間の類似性の発見等による重要なテキストブロックの発見、この類似性を利用した基本句・基本文の作成と進化のための手法を提示するための準備作業をおこなうことができた。さらにこのテキストマイニング手法をBOPビジネに適用し、東南アジア諸国のBOPビジネスの動向についての現地調査結果とすりあわせをおこなうこともできた。本研究の独自性は二つある。第一に多くのテキストマイニング研究がアルゴリズムのの研究に向かっているのに対し、本研究では企業の意思決定という実利用を目指しデータ解析手法の確立を目指す点である。第二にそのために従来の研究の多くが全体の鳥瞰図を描くことを主眼としているのに対し、本研究では企業の意思決定に必要な知識を持つために不可欠の部分を全テキストの中からピンポイントで発見し、それを結びつけることによって精緻な知識を得るための手法(ピンポイントフォーカス型テキストマイニング)の確立を目指す点である。企業の実利用に資するための研究の素材として、日経BPや日本経済新聞の記事、EBSCOに収録された業界レポート、世界銀行のスタッフが執筆したブログ、日本の特許公報などを選んだ。目的を達成するためにさまざまなアプローチを模索したが、最終的にテキストを5文ごとに切り分けて「テキストブロック」を作成し、これをマイニングの単位とするというアプローチを選択した。その理由は、5文程度が意味の「塊」となっているからであり、また「基本句」を作成するのに適していると考えられるので、膨大なテキストデータの中から必要な部分のみを抽出し意味を発見するうえで最も有効であるという結論に達したからである。
PD-L1を標的としたウイルス表面リガンド改変腫瘍溶解性ウイルスの開発

本研究は、PD-L1高発現腫瘍への指向性を獲得した新たな腫瘍溶解性ウイルスHF10の開発を目的とする。具体的には、ウイルス表面の糖たんぱく質(glycoprotein B;gB)に抗PD-L1抗体の一本鎖抗体(single chain antibody;scFv)を結合させることで、腫瘍表面のPD-L1を特異的に認識し、腫瘍に感染、破壊するウイルスを作製する。平成30年度は、抗PD-L1 scFvをウイルス表面に発現する腫瘍溶解性ウイルス(HF10αPD-L1)の構築を遂行した。HF10ゲノムgB遺伝子に抗PD-L1 scFv遺伝子を挿入することを計画した。抗ヒトPD-L1抗体の軽鎖可変領域(VL)と重鎖可変領域(VH)の遺伝子を人工合成し、この抗PD-L1 scFv遺伝子カセットの両端を各500塩基ずつgB遺伝子と同じ塩基配列で挟んだプラスミドベクターを構築した。このベクターと共にHF10ゲノムDNAをVero細胞にトランスフェクションし、相同遺伝子組み換えによりgBに抗PD-L1 scFv遺伝子を組み込むことを計画した。この予備実験として、別の遺伝子座にZsGreen1のみを発現するHF10の構築を試みたが、相同組み換えの効率の低さが問題となった。その対策として、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いたところ、相同組換え効率を向上させ得ることが示唆された。今後は、この技術を用いてHF10αPD-L1の開発を進める。HF10と抗PD-L1抗体とのマウス扁平上皮がん細胞SCC7皮下腫瘍モデルマウスにおける併用療法の検討を行った。その結果、HF10と抗PD-L1抗体併用群は強い抗腫瘍効果を示した。この結果はHF10αPD-L1の強い抗腫瘍効果を期待させる。抗PD-L1 scFv遺伝子導入用プラスミドの作製は計画通りに行うことができたが、抗PD-L1 scFv遺伝子が安定的にゲノムに挿入された遺伝子改変HF10の構築にやや時間を要している。HF10αPD-L1の作製及びPD-L1発現細胞への指向性、殺細胞効果および増殖能力の検討の確認までは平成30年度内に着手することができなかったため、やや遅れていると評価した。HF10αPD-L1の作製を直ちに行い、そのPD-L1発現細胞への指向性、殺細胞効果および増殖能力を検討する。具体的には、PD-L1を強発現または欠損させたマウス膵癌細胞株PAN02およびマウス口腔扁平上皮癌細胞株SCCVIIを用いて、親株PAN02およびSCCVIIと比較し、HF10αPD-L1の増殖能の違いを確認する。HF10又はHF10αPD-L1を1, 0.1, 0.01 MOIでPD-L1強発現または欠損PAN02とSCCVII細胞ならびにそれら親株に感染させ、経時的に培養上清中のウイルス力価を測定し、ウイルス増殖能を調べる。さらに各細胞を96 well plateに播き、HF10又はHF10αPD-L1を1, 0.1, 0.01MOIで感染させ、経時的にMTT assayにより細胞の生存率を調べ、殺細胞能力を確認する。PD-L1の恒常的発現が認められるヒト正常細胞株におけるHF10αPD-L1の増殖能を前述の方法を用いて親株HF10と比較しHF10αPD-L1の安全性の検討を行う。また、ICRマウスに経腹または経尾静脈で感染させ、マウスの生存率を確認する。さらに、マウスの肝臓、肺、心臓などの主要臓器からqPCRを用いてウイルスゲノムDNAを検出し、HF10αPD-L1の生体内分布を調べる。PD-L1高発現SCCVIIをC3Hマウス皮下に植え、背中に腫瘍を2つ作製し、7日後、片一方の腫瘍にMock(PBS)またはHF10αPD-L1もしくは親株HF10を注射する(3日おきに3回)。継時的に腫瘍サイズとマウス体重を測定し、HF10αPD-L1の治療効果を明らかにする。また、効果の検証だけでなく、関連する免疫の変化について詳細に探求する。特にMDSC、マクロファージ、T regマーカーにより腫瘍内の免疫抑制細胞の変化を確認する。

この予備実験として、別の遺伝子座にZsGreen1のみを発現するHF10の構築を試みたが、相同組み換えの効率の低さが問題となった。その対策として、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いたところ、相同組換え効率を向上させ得ることが示唆された。今後は、この技術を用いてHF10αPD-L1の開発を進める。HF10と抗PD-L1抗体とのマウス扁平上皮がん細胞SCC7皮下腫瘍モデルマウスにおける併用療法の検討を行った。その結果、HF10と抗PD-L1抗体併用群は強い抗腫瘍効果を示した。この結果はHF10αPD-L1の強い抗腫瘍効果を期待させる。抗PD-L1 scFv遺伝子導入用プラスミドの作製は計画通りに行うことができたが、抗PD-L1 scFv遺伝子が安定的にゲノムに挿入された遺伝子改変HF10の構築にやや時間を要している。HF10αPD-L1の作製及びPD-L1発現細胞への指向性、殺細胞効果および増殖能力の検討の確認までは平成30年度内に着手することができなかったため、やや遅れていると評価した。HF10αPD-L1の作製を直ちに行い、そのPD-L1発現細胞への指向性、殺細胞効果および増殖能力を検討する。具体的には、PD-L1を強発現または欠損させたマウス膵癌細胞株PAN02およびマウス口腔扁平上皮癌細胞株SCCVIIを用いて、親株PAN02およびSCCVIIと比較し、HF10αPD-L1の増殖能の違いを確認する。HF10又はHF10αPD-L1を1, 0.1, 0.01 MOIでPD-L1強発現または欠損PAN02とSCCVII細胞ならびにそれら親株に感染させ、経時的に培養上清中のウイルス力価を測定し、ウイルス増殖能を調べる。さらに各細胞を96 well plateに播き、HF10又はHF10αPD-L1を1, 0.1, 0.01MOIで感染させ、経時的にMTT assayにより細胞の生存率を調べ、殺細胞能力を確認する。PD-L1の恒常的発現が認められるヒト正常細胞株におけるHF10αPD-L1の増殖能を前述の方法を用いて親株HF10と比較しHF10αPD-L1の安全性の検討を行う。また、ICRマウスに経腹または経尾静脈で感染させ、マウスの生存率を確認する。さらに、マウスの肝臓、肺、心臓などの主要臓器からqPCRを用いてウイルスゲノムDNAを検出し、HF10αPD-L1の生体内分布を調べる。PD-L1高発現SCCVIIをC3Hマウス皮下に植え、背中に腫瘍を2つ作製し、7日後、片一方の腫瘍にMock(PBS)またはHF10αPD-L1もしくは親株HF10を注射する(3日おきに3回)。継時的に腫瘍サイズとマウス体重を測定し、HF10αPD-L1の治療効果を明らかにする。また、効果の検証だけでなく、関連する免疫の変化について詳細に探求する。特にMDSC、マクロファージ、T regマーカーにより腫瘍内の免疫抑制細胞の変化を確認する。
ゴルジ体構築原理の解明

ゴルジ体はいくつかの嚢が合わさった層板構造を有しており、小胞を介したタンパク質輸送の中継基地として働いている。小胞体からのタンパク質輸送に伴いゴルジ体へは膜が流入し、細胞膜などへの輸送のために膜が流出する。また、小胞体からの輸送に伴い運ばれた小胞膜タンパク質を小胞体にもどす時にも、ゴルジ体から膜が流出する。膜の出入が頻繁に起こっているにもかかわらず、間期の動物細胞のゴルジ体は常に層板構造を保っている。ゴルジ体の構築機構の解明を目指して研究を進め、本年度は以下の成果を得た。(i)ゴルジ体の構造形成におけるセラミドの影響長鎖セラミドはゴルジ体を不安定化させ、短鎖セラミドは安定化させることを見い出した。おそらくセラミドの物理的性質がゴルジ体の安定性に影響していると考えられる。昨年度、ゴルジ体の構造形成が三量体GTP結合タンパク質のGαz及びGαi2によって調節されていることを示した。本年度の研究で、GαzのGTPase活性を促進(すなわち不活性化)させるRGSZ1とRGSZ2を細胞内で発現させると、ゴルジ体の分解が起こることを明らかにした。現在、酵母two-hybrid法を用いて、Gαzと相互作用し、ゴルジ体形成に関与するタンパク質の検索を試みている。(iii)p125の局在とそのホモログの同定ゴルジ体の形成には小胞体からの膜の流入が必須であり、ゴルジ体の構築原理を考える上で、小胞体-ゴルジ体間膜輸送機構の解明は重要である。昨年度、小胞体由来小胞のコート成分と結合し、ホスホリパーゼA構造を持つタンパク質p125を同定したが、p125がp115(小胞とゴルジ膜の繋留に関わる)と同局在を示すことを明らかにした。また、p125のホモログとしてKIAA0725pを同定し、それがホスホリパーゼA活性を持つことをつきとめた。ゴルジ体は分泌タンパク質の選別と輸送において中心的な役割を担っているオルガネラである。動物細胞における間期のゴルジ体は小胞の出芽と融合を繰り返しながらも常に一定の膜構造(層板構造)を保っており、このことは小胞体からゴルジ体への膜の流入とゴルジ体からの膜の流出が平衡状態に保たれていることを意味している。ゴルジ体の構築機構の研究は近年開始されたが、まだ不明な点が多い。本年度の研究では以下のことを解明した。(i)ゴルジ体の構造維持に関与する三量体GTP結合タンパク質の同定我々は以前の研究において、ゴルジ体の構造が三量体GTP結合タンパク質(α、β、γサブユニットから成る)によって調節されていることを見い出していた。本年度の研究では、その分子種がGaz及びGai2であり、βγサブユニットは関与していないことを明らかにした。(ii)小胞体とゴルジ体の中間コンパートメント(ERGIC)に存在するp125の同定ゴルジ体の形成には小胞体からの膜の流入が必要であり、それゆえゴルジ体の構築原理を考える上で、小胞体-ゴルジ体間膜輸送機構の解明は非常に重要である。小胞体から出芽する小胞のコートタンパク質の成分(mSec23p)と相互作用する新規タンパク質としてp125を同定した。

このタンパク質はホスホリパーゼAに類似した構造を持ち、主にERGICに存在している。p125を過剰発現させるとERGICやゴルジ体は分解し、このことはp125がこれらのオルガネラの形成に関わっていることを示唆する。(iii)小胞体に存在する新規syntaxinの同定ゴルジ膜との融合に関与する膜タンパク質の一部は、輸送小胞に結合して小胞体からゴルジ体へと運ばれる。それゆえ、輸送を維持するためにはそれらのタンパク質を小胞体に回収する必要があり、この輸送はゴルジ体から小胞体への逆行輸送によって行われている。酵母のUfe1pは小胞体に存在し、逆行輸送経路に関与することが知られているが、そのホモログと思われる動物タンパク質をtwo-hybrid法を用いて同定した。ゴルジ体はいくつかの嚢が合わさった層板構造を有しており、小胞を介したタンパク質輸送の中継基地として働いている。小胞体からのタンパク質輸送に伴いゴルジ体へは膜が流入し、細胞膜などへの輸送のために膜が流出する。また、小胞体からの輸送に伴い運ばれた小胞膜タンパク質を小胞体にもどす時にも、ゴルジ体から膜が流出する。膜の出入が頻繁に起こっているにもかかわらず、間期の動物細胞のゴルジ体は常に層板構造を保っている。ゴルジ体の構築機構の解明を目指して研究を進め、本年度は以下の成果を得た。(i)ゴルジ体の構造形成におけるセラミドの影響長鎖セラミドはゴルジ体を不安定化させ、短鎖セラミドは安定化させることを見い出した。おそらくセラミドの物理的性質がゴルジ体の安定性に影響していると考えられる。昨年度、ゴルジ体の構造形成が三量体GTP結合タンパク質のGαz及びGαi2によって調節されていることを示した。本年度の研究で、GαzのGTPase活性を促進(すなわち不活性化)させるRGSZ1とRGSZ2を細胞内で発現させると、ゴルジ体の分解が起こることを明らかにした。現在、酵母two-hybrid法を用いて、Gαzと相互作用し、ゴルジ体形成に関与するタンパク質の検索を試みている。(iii)p125の局在とそのホモログの同定ゴルジ体の形成には小胞体からの膜の流入が必須であり、ゴルジ体の構築原理を考える上で、小胞体-ゴルジ体間膜輸送機構の解明は重要である。昨年度、小胞体由来小胞のコート成分と結合し、ホスホリパーゼA構造を持つタンパク質p125を同定したが、p125がp115(小胞とゴルジ膜の繋留に関わる)と同局在を示すことを明らかにした。また、p125のホモログとしてKIAA0725pを同定し、それがホスホリパーゼA活性を持つことをつきとめた。
日本中小企業による国際化が日本の企業組織に変革をもたらすプロセスの解明

本研究は、中小企業が有効なマネジメントによってどのように成長や発展を実現していくかという成長発展プロセスと、成長発展に寄与する国際化との2つの学術的視点から、メコン経済圏の南部経済回廊上にある諸都市において、事業展開を試みる日本の中小企業を対象に、そのケース・スタディを積み重ねることで、国際化による成長や発展のいくつかのパターンを把握し、そのパターンごとで日本の企業組織がいかに変革していくのかというプロセスを明らかにすることを目的としている。2018年度は、南部経済回廊上の諸都市のなかでもタイ・バンコクに出向き、機械金属業に従事する日本の中小企業を、またカンボジア・シェムリアップにも出向き、サービス業に従事する日本の中小企業を、それぞれ数社ずつ調査した。日本国内でも南部経済回廊上の諸都市にて事業展開を行っている中小企業(機械金属業、サービス業)を数社訪問した。また予算を前倒し請求し、英国や独国での研究者とも研究交流を図り、分析視点の精緻化について検討を行った。シェムリアップでの調査内容は、「中小サービス企業による海外事業展開プロセスーカンボジア・シェムリアップにおける日系飲食ビジネスをケースとしてー」という論題で研究成果を発表した。また、これまでのタイ・バンコクにおける調査活動の成果と、本研究での分析視点をそれぞれまとめたものを研究成果として発表した。2018年度に実施したバンコクでの調査活動については、2019年度にも継続して実施する予定の調査活動と合わせて、2019年度中にその成果を発表する予定である。予算を前倒し請求し、2019年度以降に実施する予定であった英国の研究者だけでなく、独国のアントレプレナーシップの研究者とも交流を重ねるなど、当初計画以上の進捗がみられた。しかしながら、その一方で、2018年度には学内公務を担っており、海外はおろか国内における調査活動を計画以上に行うことができなかった。早期に取り組めたものもある一方で遅れたものもあることから、「おおむね順調に進展している」とした。2019年度には、学校法人の組合の三役を担っていることから、前半には数日にわたる海外出張はしにくい状況になると思われるが、タイミングをみて、海外や国内などの出張を行い、調査活動を円滑的に行いたい。また、本研究の最終年度にあたる2020年度から、英国・オックスフォード大学への在外研究が決まった。そのため、2020年度は科研の研究テーマに基づく調査研究ができにくくなると推察されるため、南部経済回廊上の諸都市における調査活動は、2019年度中までに行うことに変更する。2020年度から、英国・オックスフォード大学での在外研究が決定したために、本研究のテーマである南部経済回廊上の諸都市における調査活動が、2020年度に実施することが難しい状況となった。このため、2018年度に、予算を前倒し請求し、2018年度・2019年度にかけて上記の調査活動を展開することにした。