hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オゾンマイクロバブルによる難分解物質の処理

高さ1.004.00m)の底部に加圧ポンプと特殊ラインミキサで構成したマイクロバブル発生装置を設置した.液配管には,液温度を一定とするために,熱交換器を備えた.気液には,物質移動性能の測定では空気-水,分解実験ではオゾン含有ガス-ジメチルスルフォン酸(DMSO)水溶液を用いた.塔高およびガス速度を変えて,工業用硬性鏡・UHP高輝度光源装置を組合せて塔内の気泡挙動を高速ビデオで撮影した.得られた写真を,図形解析ソフトにて二値化処理して,気泡径分布および平均気泡径を求めた.溶存酸素濃度の経時変化から物質移動容量係数を,分解実験におけるDMSO濃度の経時変化から分解速度定数を測定した.比較のために,ミリバブルを発生する焼結ガラス分散器も用いた.マイクロバブルが分散している塔内にミリバブルを共存させると,ミリバブルのウェーク(後流渦)にマイクロバブルが吸収され,塔の上方へ向かうほどマイクロバブルが少なくなった.本マイクロバブル発生装置での平均気泡径は30-40μmで,ガス速度が高くなるにつれて数百μmの気泡も発生した.同一ガス速度における容量係数は,マイクロバブルの方がミリバブルよりもかなり高くなったが,平均気泡径から求めたマイクロバブルの物質移動係数時ミリバブルの約1/10であり,このことから容量係数の増大は気液界面積の寄与が顕著であることが確認された.DMSOの分解実験では,ストリッピングは全く起こらず,分解速度定数は,マイクロバブルの方がミリバブルよりもかなり高くなった.また,分解速度定数は容量係数に強く依存することが明確になった.また,物質移動律速の領域ではマイクロバブルの優位性が認められ,これはマイクロバブル特有の現象と考えられた.
MIMO-OFDMシステムにおける位相追跡制御に関する研究

本研究ではMIMO-OFDMシステムにおける受信信号の周波数同期,および位相追跡制御システムの構築を目標としている.平成17年度は,MIMO-OFDMシステムにおける位相雑音を考慮した位相追跡に関する検討を行った。昨年度は,通常のOFDMシステムにおけるフィードバック制御を用いた位相追跡制御に関する検討を行ったが,本年度はその原理をMIMOシステムに拡張するものである.OFDMでは,FFT前の周波数同期で残留した周波数オフセットをさらに補正するために,パイロットサブキャリアを用いて位相追跡制御を行うが,パイロットサブキャリアにおいて検出される信号の位相は,残留オフセットに起因する隣接サブキャリアの信号との合成位相に位相雑音による変動が加わったものとなる.したがって,検出された位相から周波数オフセット量を求めて,FFT前の周波数同期回路にフィードバックする.フィードバック後に再び検出される位相変動量は,ICIによる隣接サブキャリアの影響が軽減されているはずである.これを繰り返すことによって,残留オフセットの成分と位相雑音の成分を分離して制御しようとするものである.しかし,MIMOシステムでは各アンテナに複数の信号が多重された形で受信されるため,信号の分離を行わなければならない.信号の分離の精度は,通常,パケットの先頭で推定された通信路情報に依存するため,オフセットが補正されていない時点での通信路情報を用いることとなり,このままでは精度は向上しない.したがって,本研究では,さらにオフセット補正された信号から再度,通信路情報を推定し,位相制御を行う方式を検討した.本研究で提案した位相追跡制御を用いたシステムでは,パケット誤り率において5dB以上の改善が得られることを明らかにした。研究成果は現在,論文誌に投稿中である.本研究ではMIMO-OFDMシステムにおける受信信号の周波数同期,および位相追跡制御システムの構築を目標としている.平成16年度は,まず通常のOFDMシステムにおいて,位相雑音を考慮した位相追跡に関する検討を行った.通常のOFDMシステムでは,FFT前の周波数同期において残留した周波数オフセットをさらに補正するために,パイロットサブキャリアを用いた位相追跡制御を行うのが一般的である.しかし,FFT後のパイロットサブキャリア信号の位相の検出によって行う通常の補正方法では,検出された位相そのものが残留オフセットによって生じるICI(サブキャリア間干渉)の影響を受けているために,補正精度には限界があった.さらに,受信機内部で信号のダウンコンバージョンに用いられる発振器の位相雑音を考慮した場合,受信位相は位相雑音による位相変動も受けているために,検出される位相は,残留オフセットによる位相のずれと位相雑音による位相変動の両方を含んだ形となり,通常の位相追跡制御による特性改善はそれほど見込めない.そこで,16年度はフィードバック制御を用いた位相追跡制御に関する検討を行った.前述の通り,パイロットサブキャリアにおいて検出される信号の位相は,残留オフセットに起因する隣接サブキャリアの信号との合成位相に位相雑音による変動が加わったものとなる.したがって,検出された位相から周波数オフセット量を求めて,FFT前の周波数同期回路にフィードバックする.フィードバック後に検出される位相変動量は,ICIによる隣接サブキャリアの影響が軽減されているはずである。これを繰り返すことによって,残留オフセットの成分と位相雑音の成分を分離して制御しようとするものである.本研究で提案した位相追跡制御を用いたシステムでは,ビット誤り率において5dB以上の改善が得られることを明らかにした.本研究ではMIMO-OFDMシステムにおける受信信号の周波数同期,および位相追跡制御システムの構築を目標としている.平成17年度は,MIMO-OFDMシステムにおける位相雑音を考慮した位相追跡に関する検討を行った。研究成果は現在,論文誌に投稿中である.
哺乳類脳幹神経回路網の機能形成過程の光学的解析:広範囲脱分極波による機能発生制御

脳幹は、生命活動に関わる多くの情報が直接入・出力し、処理・統合される重要な領域である。脳幹では、末梢からの情報の伝達回路と、脳幹に内在する自発興奮の伝達回路とが混在しており、これらは互いに影響をおよぼし合いながら機能的に形成・調節されていることが推察される。中枢神経系では、発生過程において、シナプス結合はいったん過形成され、後にrefinementされることが知られているが、この過程に自発興奮が重要な役割を果たしていることが示唆されており、脳幹内神経回路網の機能形成過程を明らかにすることは、中枢神経系における神経回路網形成の基本原理を明らかにすることにつながると考えられる。我々は、発生期の中枢神経系において、脳神経・脊髄神経を介した外来性入力、あるいは中枢神経系内に内在する自発興奮活動によって、大脳から脊髄にいたる中枢神経系のほぼ全領域にわたって広範に伝播する脱分極波(depolarization wave)が誘発され、それに引き続き、Ca waveが引き起こされることを見いだした。この脱分極波は、脳幹において神経核内のシナプス伝達が開始され、神経回路網が成熟していく時期に一致して特異的に出現することから、脳幹回路網形成に重要な役割を果たしていると考えられる。さらに、この脱分極波は、鶏胚に限ってみられる現象ではなく、ラット胚やマウス胚においても観察されることが明らかとなっている。本年度は、自発性脱分極波の発生段階の早い時期での起源を明らかにすることを目的として、哺乳類と比較して取り扱いが簡単な鶏胚を対象として実験を行った。発生初期の鶏胚中枢神経系標本に光学的イメージング法を適用し、脱分極波の起源を調べたところ、起源はまず上部頸髄に出現し、発生とともに起源の数と位置が多様化することが明らかとなった。我々は、脳幹の機能的構築・形成過程を明らかにする目的で、膜電位の光学的イメージング法を鶏胚に適用し、脳神経刺激に対する脳幹内での応答のマッピングを行い、一時中継核や二次中継核を同定し、それらのdevelopmentalな機能形成過程を明らかにしてきた。一方その研究過程で、脳神経・脊髄神経を介した外来性入力、あるいは中枢神経系内に内在する自発興奮活動によって、大脳から脊髄にいたる中枢神経系のほぼ全領域にわたって広範に伝播する脱分極波(depolarization wave)が誘発され、それに引き続き、Ca waveが引き起こされることを見いだした。さらに、この脱分極波は、鶏胚に限ってみられる現象ではなく、ラット胚やマウス胚においても観察されることが明らかとなって、その機能解明に遺伝子改変動物が使えるなど、これからまさに新しい展開を迎えるに至っている。本研究では哺乳類を主な実験対象として、光学的イメージング法とelectroporationによるin uterogene expression法および遺伝子改変動物を用い、(1)脳幹神経回路網の形成の時空間的ダイナミズムと(2)脱分極波の神経回路網形成における役割について解析した。その結果、depolarizafion waveのラット胚中枢神経系における出現パターンに関して明らかにすることとともに、自発性に起こるdepolarization waveの起源について、発生段階にしたがって変化することが明らかとなった。

発生初期の鶏胚中枢神経系標本に光学的イメージング法を適用し、脱分極波の起源を調べたところ、起源はまず上部頸髄に出現し、発生とともに起源の数と位置が多様化することが明らかとなった。
ブータンの民主化の実証的研究を通した個人の自由と公共性の折り合いの探究

ブータンでは国王や仏教が、「公共性」の観点に立った民主主義運営を促す役割を担う。こうした政治体制の意義と課題を検証することを目的として、本研究は行われた。世界各地では対照的に、民主主義は自由主義(社会的権威からの自由を称揚する考え方)と結びつけられがちであり、政治運営では「個人の自由」が先んじられやすい。その結果、社会の調和や自然環境に負の影響を与えかねない決定、つまり「公共性」に相容れない決定が下される余地が広まっている。こうした中、国王や仏教といった社会在来の権威に依拠しつつ「個人の自由」と「公共性」の折り合いを図るブータンの事例は、今日の民主主義のあり方に一石を投じ得る。平成20年実施の初めて政党が参加した国政選挙で政権の座に就いた与党は、いよいよ任期最後の年を迎えた。与党は公約を果たそうと全国各地で開発事業の実施を急いできたが、調査対象地のA村でも、電化、農道整備、ミルク集荷センター建設が実現した。さらには地区の開発委員会に交付金を配る制度が設けられ、A村の所在するB地区の開発委員会を通して、村でも歩道整備、寺院修復、学校建設などが実施された。このように民主化後、生活改善に資する開発事業が次々と村にやって来たので、この点では人びとも民主化の恩恵を感じている。同時に、与党は村でリゾート建設の計画を進めようとしている。景観や牧草地が損なわれかねないという理由で人びとが反対しているにもかかわらず、B地区の区長や副区長までもが、事業受け入れに熱心である。何らかの利権が絡んでいるのではないのか。そうした疑いの声が一部の住民の間にある。そればかりか、何らかの便宜と引き換えに事業受け入れを進めようとする人が、村の中にもいるようだという心配も聞かれた。こうした風聞の真偽のほどは明らかでないが、どうやら人びとは、こうした発話を通して、共同体の紐帯を大事にしたこれまでの暮らしを守ろうと声をかけ合っている様子であった。村の人たちに民主化についてインタビューしていて、しばしば引き合いに出されるのが、階級・民族・宗教間対立の目立つ近隣のインドやネパールである。両国のように政治家の自由が蔓延してしまうと無用な緊張対立が生まれかねない。ブータンも同じ道をたどるならば、これまで大事にしてきた共同体規範が台なしになるではないのか、という懸念である。政治家の決定が政治運営で幅を利かせるようになる中、大局的な公共利益の損なわれない政治運営がなされるのかどうか、またそのために人びとがどのように市民権・政治権を行使していくのか、引き続き調べていきたい。平成25年67月に2度目の国政(国民議会)選挙が行われた。その結果、民主政下の初政権を担ってきたブータン調和党(DPT)に代わって、第一野党の国民民主党(PDP)が政権に就いた。調査対象地のA村の選挙区でもPDPが議席を得た。村の人たちの大半がDPTに票を投じると当初は予想されていたが、多くの人がPDP支持にまわった。全国各地の公共事業に絡んで、同党リーダーが利権を享受しているという数々のメディア報道があり、ひいては、同様の噂が村内のある事業を巡って出てしまったためであった。この問題もあって、A村の人たちの間では、ブータンもいずれインドやネパールといった近隣諸国のように、民主政の進展とともに大物政治家の「自由」が幅を利かせるようになり、政治が民衆の手から離れたものになるのではないかと危惧されていた。ブータンがそうならないよう、また、大局的な「公共」利益が損なわれないようにせねばならない。そうした意識で投票したとのことである。他方、同様の懸念が他所でも見られたこともあり、政府は今回、選挙区ごとに集落(あるいは複数集落の中心地)に全候補者を集め、有権者に公約を順次披露してもらう会合を開くことにした。民主政の下で「個人の自由」が行き過ぎることのないよう、また、これまでブータンで大切にされてきた社会紐帯がゆさぶられないよう、ひいては、他国のように政治が民衆の手から離れないようにしようという意図からである。A村の人たちも概ね、候補者に直に接する機会ができたことで、誰に票を投じたら良いかをよく考えることができたと考えている。以上の通り、ブータンでも他国同様、民主政による「個人の自由」の増進とそのしわ寄せが見られ始めているが、人びとの間でも、政府の側でも、ブータンでこれまで大切にされてきた共同体意識を大事にしようという「公共性の観点」が意識されている。議会制民主主義への移行を軸とした憲法発布から3年が経ち、初の政党選挙で政権の座に就いた与党は、全国各地で開発事業の実施を急いでいる。

調査対象地のA村でもリゾート建設の計画が持ち上がっており、景観や牧草地が損なわれることを憂慮する人びとは反対している。近年ブータンでは若者の雇用問題が全国的に激化しており、その対策として進められている事業である。地域の暮らしと国総体の公共性の観点をどう折り合わせるのか、政府は難しい選択を迫られている。また平成23年6月には地方選挙が行われた。国政選挙とは違って政党参加は禁止されているが、A村の所在するB地区では、与党との結びつきを持った候補者が地区長に選ばれた。政権党が自らと関わりのある候補者を非公式に後押しする動きは止めようもなく、今後の地方政治では、政党の利害と地域の公共性の間の葛藤が一層問題になることが予想される。ブータンではこのように「個人決定」と「公的決定」の両立が、民主化の進展とともに課題となっているが、A村やB地区の民衆の間では、国王が自分たちの意志をくみ取った政治運営を保証してくれるであろう、という期待が高まっている。実際に憲法上も、国王は至高の権力者と位置付けられており、この民主政のあり方は従来の政治理論の前提(=絶対君主に代わって国民が主権者となることで民主主義は成り立つ)とは逆を向いている。こうした独自性の背景には、仏教的な国家観(=国王は仏法を守りながら民衆を苦しみから救う菩薩のような存在であり、そうした慈悲深い支配者がいることがグッドガバナンス実現に欠かせない)が見て取れる。政治家の決定が幅を利かせるようになる中、大局的な公共利益が損なわれることのないよう、今後、国王が政治運営においてどのような役割を果たしていくのか、引き続き調べていきたい。ブータンでは2008年の新憲法の公布で、議会制民主主義が始まった。以前の王政のもと、同国は目覚ましい経済発展を遂げたが、それでも豊かな文化や大自然は守られた。そうした国王の政治手腕は国際的に賞賛されてきた。それを支えてきたのが、周りの人や自然に対する顧慮を説く仏教である。そこで民主政のもとでも、国王と仏教はこれまで同様、持続可能で公正な発展・開発に資する政治運営の求心力と位置づけられている。実際、社会の調和や自然環境に負の影響を与えかねない政府政策・計画に対しては、国王は勅令を出すことで再考を促し、メディアや国会の議論でも同様の趣旨で、仏法が持ち出される。そうして歯止めが掛かり、当該政策・計画が修正される場合もある。他方、世界各地では民主政は自由主義(社会在来の権威からの自由を称揚する考え方)と結びつけられがちであり、政治運営では「個人の自由」、なかんずく有権者の声を上げる「自由」が先んじられやすい。その結果、政治家は有権者の声に合わせて、社会の調和や自然環境に負の影響を与えかねない政治決定を下す場合もある。ブータンの民主政では対照的に、国王や仏教といった社会在来の権威に「公共的な観点」に立った政治決定を促す役割が付されている。こうした同国の政治体制には、「個人の自由」が優先されがちな世界の政治情勢に、一石を投じる潜在性が見て取れる。最終年度の調査の結果、上記の結論に至るととともに、次のような課題も明らかになった。ブータンでは現在、村落外での雇用創出を求める有権者の声の高まりもあって、政権与党は経済・社会・環境の均衡のような「公共的な観点」の追求に拘泥するわけにはいかない。そうした現実政治と政治理念をどう折り合わせるべきかについては、地域共同体や市民社会の政治参加を通して、社会的な合意形成を図っていく必要がある。
実時間観察可能な陽電子顕微鏡の開発

電子線形加速器による高強度陽電子ビームを用いた再放出型の陽電子顕微鏡(PRM)の開発を行った。光電子顕微鏡の静電レンズ系を用いてPRMを構築するとともに、電子線形加速器で生成した低速陽電子ビームをPRMに適用するため、磁場終端デバイスを用いた陽電子ビーム集束システムを開発した。その結果、過去のPRM研究の方法と比較して、PRMへの陽電子入射ビーム強度を増大でき、PRMの画像取得時間を短縮できることを示した。原子レベルの空孔型欠陥分布の測定に関して陽電子顕微鏡は電子顕微鏡に比べて優位性があり、他の計測手法では観察できない顕微鏡像が取得できる。しかし、陽電子顕微鏡の一種である再放出型の陽電子顕微鏡(PRM)に関しては、過去の研究では陽電子源強度が不十分で、画像取得に長時間必要という問題があり、実用化がなされて来なかった。この技術課題を解決するため、本研究では、電子線形加速器による高強度陽電子パルスビームを用いたPRM装置の開発を行っている。本研究で開発するPRMの最大視野(0.3mm)に比べ、電子リニアックにより生成した低速陽電子ビーム径は直径約10mmΦと大きいため、ビームを集束して陽電子フラックス密度(e+/sec/mm2)を如何に増大できるかが重要な開発要素である。最終年度である本年度は、光電子顕微鏡の静電レンズをベースにPRM装置を構築するとともに、低速陽電子を輸送しているソレノイド磁場からPRMが設置されている無磁場空間にビームを引き出す時に引き起こされるエミッタンスの増大を抑制し、ビーム集束径を最小にする方法の開発を行った。ソレノイド終端磁場の集束ビーム径に与える影響が最小になる様に軟磁性体スリット(スリット幅0.1mm、スリット間隔2mm)で構成される磁場終端デバイスおよびビーム集束レンズを設計・製作し、PRM装置の入射部に設置した。電子線形加速器で生成し、ソレノイド磁場により輸送された低速陽電子ビームを静電レンズにより集束し、PRMの試料位置に設置した蛍光面付MCPによりビーム集束径を測定した。その結果、過去のPRM研究の方法と比較して陽電子フラックス密度が増大することを実証し、PRMの画像取得時間を短縮できることを示した。しかし、再放出陽電子顕微鏡(PRM)は、画像取得に長時間必要という問題があり、実用化がなされて来なかった。本年度は、1)PRM装置の設計および2)加速器により生成した低速陽電子ビームをPRM装置に導入するためのビーム輸送・集束系の設計と構築を行った。1) PRMの試料表面から再放出された陽電子が対物レンズ、投影レンズで構成される静電レンズを通過し、MCPに結像するまでの軌道をSIMIONコードにより計算し、各静電レンズへの最適な印加電圧を探索した。この計算を基にPRMの静電レンズの印加電圧を決定し、高圧電源の導入を行った。2)本研究を推進するため産業技術総合研究所・低速陽電子ビームラインにPRM専用のビームラインを建設した。更に陽電子ビームの輝度を増大させるため、陽電子集束レンズを設計した。陽電子ビームの軌道計算をField Precision社TriCompコードを用いて行ない、直径10mmφの低速陽電子ビーム(E=10eV)を輸送し、5 - 10keVに加速して試料表面上に2mmφ以下に集束させる磁気レンズの条件を探索した。1)PRMの設計を陽電子軌道計算に基づいて行い、静電レンズの電圧設定条件を決定することができた。また、PRM装置の高圧印加試験を行い、高空間分解能の顕微像を得るのに必要な10kVの耐電圧があることを確認した。2)PRM専用のビームラインを建設し、低速陽電子ビームをPRM装置の真空ポートへ磁気輸送できることを確認した。また、陽電子集束系の設計を行い、磁気レンズにより試料表面上に2mmφ以下に集束できることが分かった。陽電子集束レンズシステムを製作し、陽電子ビームラインに設置する。線形加速器で生成した低速陽電子ビームを試料まで輸送し、試料位置に設置した蛍光面付MCPにより陽電子ビーム径および位置を計測しながら、集束レンズのパラメータを調整する。ビームスポットサイズが最小になる様に最適化した後、PRM装置をビームラインに導入する。PRMの静電レンズの調整を陽電子ビームを用いて実施するのは、撮像時間が長時間かかるため現実的でない。そこで、PRM装置の電圧極性を反対にして光電子顕微鏡として動作させる。紫外線を試料に照射し、表面から放出される光電子像をモニターし、鮮明な像が得られるように各レンズのパラメータを選択する。

PRMと光電子顕微鏡の静電レンズの電圧の絶対値は同じであるので、この調整により、実験的にPRMの印加電圧を決定するとともに、当顕微鏡のシステムチェックを行う。次に、陽電子ビームを試料の背面から集束して照射し、試料反対側の表面から再放出される陽電子像を観察する実験を行う。評価用サンプルを用いてPRMによる観察を行い、当PRM装置の空間分解能および画像取得時間を評価する。・低速陽電子ビームの輝度を増大させるための「陽電子集束レンズシステム」に必要な磁気レンズおよび真空チャンバーを購入する。・PRM装置全体を絶縁し、高電圧(耐電圧10kV)印加が可能な架台を製作する。・当顕微鏡の評価用サンプルの金属試料や真空部品、高圧電源を遠隔操作するために必要な電子部品などの消耗品を購入する。
N-グリコリルノイラミン酸を含む複合糖質の機能に関する研究

近年、シアル酸の持つ機能が注目を集めているが、生体内には、複数のシアル酸分子種が存在していることはあまり知られていない。これらの分子種は、シアル種の5位の置換基に注目すると、N-アセチルノイラミン酸(NeuAc)と、N-グリコリルイラミン酸の2種に類別できる。このうち主要な分子種はNeuAcであり、NeuAcに酸素原子が一個導入されて新たに水酸基が生じたものがNeuGcである。この反応は、糖分子にとって最も重要な水酸基に係るものであり、生理的に意味を持つことが予想される。申請者はすでに、NeuGcの生合成を行うCMP-NeuAc水酸化酵素のcDNAのクローニングに成功している。本研究の目的は、この遺伝子を用いてNeuGcの発現を人為的に制御することで、これらシアル酸の分子種の存在意義を明らかにすることにある。具体的には、本酵素のcDNAを、高発現が期待できるアクチンのプロモーター及びサイトメガロウイルスのエンハンサーの下流に組み込んだ発現ベクターを構築した。このベクターを用いて、3T3細胞を形質転換した。得られた形質転換細胞のシアル酸分子種を測定したところ、コントロールの細胞のNeuGc量は全シアル酸の約3%であるのに対して本酵素のcDNAを組み込んだ細胞は約85%であり、NeuGu比の著しい上昇が認められた。これらの細胞を用いて、FDGF、EGF、FGF、Insulinに対する反応性について検討したところ、FGFに対する反応性に違いが見られた。すなわち、本酵素のcDNAを組み込んだ細胞は1%血清、及びFGF存在下で培養した場合、72hrで約2.2倍の増殖を示したが、他の2つは約1.2倍に留まった。即ち、NeuGc量の増加によりFGFへの反応性の増加が認められた。シアル酸を有する糖脂質であるガングリオシドは細胞の分化や神経突起の伸長、さらに増殖因子の刺激応答に対する調節など、生体内で種々の役割を演じていることが明らかにされている。これらの作用にはシアル酸が深く関与していることが知られているもののシアル酸の分子種の違いによる調節についてはあまり明らかにされていない。シアル酸の分子種の違いによる機能調節を探るために、本年度はマウス由来の3T3細胞を取りあげた。3T3細胞はFGFやEGFの刺激に対して応答することが知られており、これらの刺激応答の調節に細胞内のガングリオシドが関与していると言われている。そこで、NeuGcの合成を行うCMP-N-アセチルノイラミン酸(MeuAc)水酸化酵素を人為的に発現させることによって、ガングリオシドのシアル酸分子種をNeuAcからNeuGcに変換させた場合の増殖因子に対する刺激応答の変化について検討を加えた。既にマウス肝臓よりクローニングした水酸化酵素のcDNAを、高発現が期待できる哺乳動物発現ベクターに組込み、これを用いて3T3細胞を形質転換させた。次に、形質転換細胞を5個クローニングし細胞内のNeuGc量を測定した。親株は、培地に牛血清(全シアル酸中のMeuGc比約50%)を含む3T3基本培地では、細胞内NeuGc比は約30%、ウシ胎児血清(NeuGc比3%)を含む培地では約3%、さらに、NeuGcをほとんど含まない合成培地では約1%であった。これらの事実は、3T3細胞中のNeuGcはほとんど培地に依存していると考えられた。これに対し、形質転換株のうち2つは、いずれの場合での有意にNeuGc比が増加し、最も低い合成培地の場合でも約80%存在していた。

次年度は、これらの細胞を用いて増殖因子の刺激に対しての応答違いについて検討する予定である。近年、シアル酸の持つ機能が注目を集めているが、生体内には複数のシアル酸分子種が存在していることはあまり知られていない。これらの分子種は、シアル酸の5位の置換基に注目すると、N-アセチルノイラミン酸(NeuAc)と、N-グリコリルノイラミン酸の2種に類別できる。このうち主要な分子種はNeuAcであり、NeuAcに酸素原子が一個導入されて新たに水酸基が生じたものがNeuGcである。この反応は、糖分子にとって最も重要な水酸基に係るものであり、生理的に意味を持つことが予想される。申請者はすでに、NeuGcの生合成を行うCMP-NeuAc水酸化酵素のcDNAのクローニングに成功している。本研究の目的は、この遺伝子を用いてNeuGcの発現を人為的に制御することで、これらシアル酸の分子種の存在意義を明らかにすることにある。具体的には、本酵素のcDNAを、高発現が期待できるアクチンのプロモーター及びサイトメガロウイルスのエンハンサーの下流に組み込んだ発現ベクターを構築した。このベクターを用いて3T3細胞を形質転換した。得られた形質転換細胞のシアル酸分子種を測定したところ、コントロールの細胞のNeuGc量は全シアル酸の約3%であるのに対して本酵素のcDNAを組み込んだ細胞は約85%であり、NeuGc比の著しい上昇が認められた。これらの細胞を用いて、FDGF、EGF、FGF、Insulinに対する反応性について検討したところ、FGFに対する反応性に違いが見られた。すなわち、本酵素cDNAを組み込んだ細胞は1%血清、及びFDF存在下で培養した場合、72hrで約2.2倍の増殖を示したが、他の2つは約1.2倍に留まった。即ち、NeuGc量の増加によりFGFへの反応性の増加が認められた。
国際制度構築をめぐる多国間交渉における民間企業と先進国政府の行動の実証的研究

知的財産権や投資といった新たな通商分野をめぐる国家間関係に関して度々指摘されているのが、民間企業の影響力の拡大である。豊な実務知識や経験を得た民間企業は、政府の通商政策の決定に大きく関与するようになっており、特に、企業が国家間制度の形成や維持への関与や、企業同士の規律関係の形成によって公共的な機能を果たしている点は注目される。GATTウルグアイ・ラウンドにおけるTRIPs協定の締結は、知的財産権紛争を早くから経験してきた民間企業が政府間制度の構築に直接的に関与した事例として位置づけることができる。しかし先行研究の検証は米国に限られ、知的財産権関連企業のロビー活動の結果であるという従来的な説明にとどまっている。本研究は、TRIPs協定の形成過程の検証を通して、企業間関係が国家間制度の形成に与える影響についての理論的説明を試みている。本研究は、民間企業と国際制度の関係に関する国際政治経済学の先行研究をまとめると共に、先進国における民間企業同士のトランスナショナルな関係や、各国の企業と政府の関係の違いが、国家間制度の構築にどのような影響を与えているのかという問題についての一般的仮説を提示している。また事例検証では、米国のみならず日本、欧州における政府と企業の関係をも視野に入れることによって、その政治過程を明らかにしている。検証を進めるにあたって、政府関係資料に加えて、産業誌や社内誌をみることによって企業の動きを分析しており、また、内外の実務経験者へのインタビューを多数試みることによって、検証の裏づけを得ることに努めている。検証の結果、国際制度の形成は、米国企業の影響力の拡大という面のみによって簡単に説明できるものではなく、実質的な国際制度形成のためには先進国間の政策の相違を調整することが最も重要となってきており、その調整のために企業間のトランスナショナルな協力関係が影響力をもったことが示された。国際経済が急速に変化する中で、国際制度構築の多様化・法制化がどのように進められてきたのかという問題を、民間企業の関与という観点から分析してきた。まず、民間企業と国際制度の関係について、国際政治経済学における先行研究とその限界点をまとめた。また、民間企業と先進国政府の関係の変化や民間企業間のトランスナショナルの連携活動、更には、NGOの活動に対する企業の対応が、国際制度の構築をめぐる政府間関係に与える影響について一般的仮説を提示した。先行研究と一般的仮説は論文にまとめており、近日中に発表する予定である。また、事例研究として、知的財産権の国際的保護の強化と食料品安全の国際基準の設定という二つの問題を取り上げている。本年度は、前者、すなわちGATT/WTOにおける知的財産権保護に関する協定の締結とその展開に関する分析を進めてきた。当該問題に関する先行研究は法学または経済学の見地によるものが大半であるが、本研究では、国際政治経済学の見地からの分析に取り組んでいる。また、先行研究の多くは米国に関する分析にとどまっているが、本研究では、欧州と日本を分析対象に加え、日米欧企業の連携活動や各国政府との関係の変化を重点的に検証している。分析の焦点となっているのは、GATT/WTOにおける知的財産権協定(TRIPs)の締結について、先進国政府の積極的姿勢にもかかわらず、日米欧の民間企業、特に製薬産業やコンピューター産業がトランスナショナルの連携活動を続けているのはなぜかという点である。本年度は、既に入手していた米国および日本に関する資料をまとめると共に、欧州の関する分析を実現するため、英国に赴き、関連資料の収集や研究者との情報交換に努めた。現時点において、GATTにおける関連協定の締結までの分析を完了している。
気孔連通機構を持つハイドロキシアパタイト多孔体の生体内での優れた骨伝導能

平成14年度の研究は主に新規開発である人工骨;気孔連通構造を持つハイドロキシアパタイト多孔体(以下IP-CHA)の画期的な気孔連通構造を利用して(1)骨形成を促進するとされている骨形成因子(Bone morphogenetic protein ; BMP)のIP-CHAへの導入、(2)組織再生ひいては骨再生に必須とされている血管束をIP-CHA内に挿入した"血管柄付きIP-CHA"の開発に重点を置いた。平成15年度はIP-CHAの非常に優れた骨伝導能を利用した関節軟骨の修復の研究に重点をおいた。関節軟骨は、自己修復力に乏しくこれまでに関節軟骨修復にさまざまな手法が試みられてきたが、満足しうるものがないのが現状であり、軟骨下骨の早期の修復が軟骨修復の鍵とされている。家兎大腿膝蓋関節に、直径4mm、深さ6mmの骨軟骨欠損を作り、欠損部にインプラント(直径4mm、高さ4mmの円柱状IP-CHAに5mg PLA-PEG,20μg rhBMP-2を導入したHA/PLA-PEG/rhBMP-2コンポジット)を関節表面から2mm埋没するまで挿入すると移植後6週ではIP-CHA内部の骨新生及び軟骨下骨の骨再生が旺盛に起こり、欠損させた関節軟骨はII型コラーゲン陽性の硝子軟骨様で、周辺の正常軟骨との連続性も有していた。IP-CHAは緻密に制御された気孔間連通構造を有し、それゆえ非常に優れた骨伝導能を持つ。本年度では、三次元を制御するバイオマテリアルIP-CHAと、ポリマーを利用したrhBMP-2徐放システムとの組み合わせにより比較的早期に軟骨下骨、および軟骨再生を実現し得た。これらに関しては平成16年3月8日現在Osteoarthritis and Cartilageに投稿中である。今後これらの組織工学的手法が大動物、最終的には臨床に応用されることを最終目標にしたい。木年度(平成14年度)の研究は主に新規開発である人工骨;気孔連通構造を持つハイドロキシアパタイト多孔体(以下IP-CHA)の画期的な気孔連通構造を利用して(1)骨形成を促進するとされている骨形成因子(Bone morphogenetic protein ; BMP)のIP-CHAへの導人、(2)組織再生ひいては骨再生に必須とされている血管束をIP-CHA内に挿入した"血管柄付きIP-CHA"の開発に重点を置いた。(1)に関しては、吸収性合成ポリマーであるPLA-PEGをキャリアーとしてBMP10ugをIP-CHAに含浸させ、ラット皮下に移植した場合移植後3週にてIP-CHA内に旺盛な新生骨の再生が観察された。またその再生骨はIP-CHAのほとんどすべての気孔において観察することができ、気孔間連通孔がBMP誘導性の骨形成に非常に有利に働いたことを示唆した。(2)に関しては、ラット鼠径部に存在する大腿動静脈の分岐枝である下腹壁動静脈束を剥離し、円柱状のIP-CHA中心部に貫通させた状態で、そのままラット鼠径部皮下に置いておくと移植後6週間でIP-CHA気孔内部に繊維芽細胞を伴った旺盛な血管形成を認め、IP-CHAに血管を導入することにより三次元的な血管ネットワークを構築することに成功した。また、これらの血管ネットワークはIP-CHA内の骨の形成にも非常に有利に働くことが立証され(骨形態計測で新生骨の面積を算出すると血管非挿入群に比べて20倍以上の差を認め、統計学的にも有意差を認めた)、平成15年3月7日現在上記(1)、(2)に関してTissue Engineeringに投稿中である。今後これらのハイブリッド人工骨が、大型動物での広範囲にわたる骨欠損に対してどれだけの威力を発揮するかを検討する必要性が残されていると考える。

これらに関しては平成16年3月8日現在Osteoarthritis and Cartilageに投稿中である。今後これらの組織工学的手法が大動物、最終的には臨床に応用されることを最終目標にしたい。
アジア諸国に拡散する薬剤耐性マラリアのゲノム疫学研究

1.リアルタイムPCR法を用いたマラリア原虫ゲノム解析システムの構築(1)熱帯熱マラリア原虫(Pf)のクロロキン(CQ)耐性関連遺伝子pfcrt上の単塩基置換の定量的検出を試みた結果、サンプル中に混在する感受性型(FCR-3株)と耐性型(K1株)遺伝子の混合比に一致した定量値を、リアルタイムPCRの測定値から推定することができた。しかし、FCR-3株:K1株を8:2の比率で混合した場合では、in vitroではCQ感受性を示し、fcrt遺伝子のDirect SequenceではK1型が検出された。(2)FCR-3株とK1株を混合して低CQ濃度(80nM)下で培養すると、混合時のK1株の比率が低くても、やがてK1株が優勢になった。本成果は、定量リアルタイムPCR法の有用性を示し、薬剤耐性原虫の選択のメカニズムをin vitroの系で再現したといえる。2.海外調査研究で得られた分子疫学的知見(1)フィリピン・パラワン島のPf13検体の内6検体で、pfcrt耐性型と感受性型の両型の遺伝子が検出された。感受性型:耐性型の遺伝子量の比率(%)は8.7:91.3から44.5:55.5であった。患者血液中には、複数の原虫クローンが混合寄生していることが証明できた。また、タイ・ミャンマー国境での39分離株は、すべてK76Tの耐性型変異を有す一方、ベトナム南部の株では、CQ感受性型(K76)の頻度が69%と多く、CQ耐性型(K76T)の頻度が26%と少ない点が特徴的であった。(2)ベトナム株のPfCRTの72-76番目のアミノ酸配列を調べると、CVMNK(感受性型)が最も多かった。一方CQ耐性型では、CVIET、CVIDT、CVMDTの3種類が観察された。CVIETはタイK1株と同じであった。(3)ところが、pfcrt遺伝子近傍のマイクロサテライト(MS)DNAマーカー-3座位の解析を行ったところ、CVIETを示すベトナム株のMS DNAパターンは、タイK1株のそれとは異なっていた。本研究結果は、アジアの耐性株の起源はタイをその発祥として拡散していったという定説を一部覆すもので、原虫genotypeの疫学研究成果として新しい知見である。今後その証拠を固める新たな研究が必要である。1.リアルタイムPCR法を用いたマラリア原虫ゲノム解析システムの構築(1)まず、熱帯熱マラリア原虫のクロロキン耐性関連遺伝子pfcrt上の単塩基置換(single nucleotide polymorphism:SNP)の定量的検出を、TaqManリアルタイムPCR法で試みた。(2)すなわち、pfcrtが感受性型の原虫(FCR-3株)と耐性型の原虫(K-1株)を任意の割合で混合した培養血液材料を作製し、耐性型SNPを含む約15bpの塩基配列と同領域の感受性型塩基配列各々に特異的なプローブ、ならびに両型に共通配列のプライマーを用いてリアルタイムPCRをおこなった。

(3)その結果、サンプル中に混在する感受性型と耐性型遺伝子の混合比に一致した定量値を、リアルタイムPCRの測定値から推定することが可能であった。(4)さらに応用として、ヒトに感染する4種のマラリア原虫の鑑別を、それぞれの種に特異的なプライマーを設計してリアルタイムPCR法で鑑別することができた。2.海外調査研究タイとフィリピンの流行地で患者検体を採取することができた。(1)フィリピン・パラワン島の熱帯熱マラリア患者血液13検体のpfcrt耐性型と感受性型原虫の混合比率を測定したところ、6検体で両型の遺伝子が、5検体で感受性型遺伝子のみが検出され、残り2検体は検出限界以下であった。感受性型:耐性型の遺伝子量の比率(%)は8.7:91.3から44.5:55.5であった。2)また、タイ・ミャンマー国境での39分離株は、すべてK76Tの耐性型変異を有していた。以上より、マラリア患者の血液中には、異なる遺伝的形質をもつ複数の原虫クローンが混合して寄生していることが明らかになった。薬剤投与によって、その薬剤に耐性の遺伝的形質を持つ原虫が選択され、患者血液中の耐性原虫の比率が高まると考えられるが、耐性原虫と感受性原虫との比率が、個人または地域の薬剤耐性度を規定するかどうかは、今後の研究課題となる。なお、本疫学研究は、「疫学研究に関する倫理指針(文科省・厚労省告示第2号)」に十分留意している。第2年度も初年度から継続して、アジア諸国における薬剤耐性マラリアの拡散のメカニズムをゲノム疫学的に検証・解析することを目的に、以下の成果を得た。1.薬剤耐性マラリア原虫株の収斂・拡散のメカニズムFCR-3株(薬剤感受性):K1株(薬剤耐性)を8:2の比率で混合した場合、CQ感受性を示したが、pfcrt遺伝子のDirect SequenceではK1型が検出された。この結果からIC_<50>値が感受性値を示しても、Direct Sequenceでは耐性型を検出してしまう現象がin vitroの系で確認された。一方、低CQ濃度(80nM)下の培養でFCR-3株とK1株の混合比の変化を調べた結果、混合時のK1株の比率が低くても24時間後にはすでにK1株が優勢になった。これらのことから、ゲノム疫学手法による分布解析で、我々が報告した定量real time PCR法導入の意義を再確認するとともに、いわゆる薬剤耐性原虫の選択のメカニズムをin vitroの系で再現したといえる。2.海外調査研究で得られた分子疫学的知見タイ、フィリピン、ベトナム、ラオスの熱帯熱マラリア原虫株を得て、薬剤耐性関連遺伝子の変異型シークエンスを詳細に解析した。タイの多剤耐性マラリア流行地域(ミャンマーとの国境地帯)やフィリピンの流行地域(ルソン島、パラワン島、ミンダナオ島)では、CQ耐性型(K76T)の株の頻度が80%以上であったのに比べ、ベトナム南部の株では、CQ感受性型(K76)の頻度が69%と多く、CQ耐性型(K76T)の頻度が26%と少ない点が特徴であった。次にベトナム株のPfCRTの72-76番目のアミノ酸配列を調べると、東南アジア、アフリカ、南米で確認されている感受性型のCVMNKが最も多かった。一方CQ耐性型変異(K76T)を持つ株では、CVIET、CVIDT、CVMDTの3種類が観察された。CVIETはタイのK1株(CQ耐性株)と同じで、東南アジア諸国やアフリカ諸国からも報告されている。また、CVIDTは隣国のカンボジアから報告されている。
根面齲蝕関連菌Actinomycesの代謝様式とフッ化物作用機序の網羅的解析

根面齲蝕病巣から高頻度に検出される口腔Actinomycesは、日本において増加傾向にある根面齲蝕を予防する上でのターゲットとなる細菌である。齲蝕は、口腔細菌が糖代謝によって産生する酸により発症するが、Actinomycesの糖代謝経路は口腔Streptococcusとは大きく異なる。Actinomycesは、齲蝕予防剤としてのフッ化物に耐性を持つこと、唾液や歯肉溝浸出液などに含まれる窒素化合物が酸産生を促進させること、が明らかとなっているが、その代謝経路の詳細は不明である。本研究では、Actinomycesの代謝活性に対するフッ化物体制に着目したものである。本年度は、昨年度に引き続き培養サンプルのCE-MSによる中間代謝産物の評価を行った。う蝕関連菌として知られているStreptococcusよりもActinomycesの方がフッ化物耐性が高いことは説明されているが、そのメカニズムの解析は必須である。昨年度終了していなかった代謝産物評価のための条件検討を実施していたため他施設での解析も含めて検討を行う口腔Actinomycesは、口腔Streptococcusに次いで多く、根面齲蝕病巣からも検出されることから、根面齲蝕との関連が注目されている。齲蝕は、細菌の糖代謝により産生する酸により発症することが知られており、口腔Actinomycesも糖を代謝し酸を産生する。しかし、その糖代謝経路は、Streptococcus mutansなどの口腔Streptococcusとは大きく異なる。糖代謝は一般的に解糖系を経て乳酸等を産生するが、Actinomycesではこれに加え、唾液含有成分である重炭酸を固定してクエン酸回路の一部を利用し、コハク酸を産生する。フッ化物の齲蝕予防効果は広く知られており、そのひとつに糖代謝阻害による酸産生および増殖の抑制効果がある。口腔Actinomycesにおいてもフッ化物は酸産生と増殖を抑制するが、Streptococcusに比べActinomycesのフッ化物耐性は約5倍も高かった。しかし、そのメカニズムは不明である。一方、唾液等に含まれる窒素化合物がActinomycesの酸産生を促進することが明らかとなっており、クエン酸回路の一部を利用する効率的な代謝機構が存在することを示唆するが、詳細なメカニズムの解明には至っていない。本年度は、口腔ActinomycesおよびStreptococcusのフッ化物および窒素化合物による酸産生・増殖への効果に着目し、口腔内環境を模した嫌気グローブボックス内での検討を行った。解糖系およびクエン酸回路の利用評価のため、基質として糖以外にアミノ酸などの窒素源も利用し、基質やフッ化物の濃度を変化させながら、両細菌を様々な条件下で酸産生・培養し、経時的にサンプリングを行った。来年度予定している代謝産物の測定のため、本年度はサンプリングを進める予定であったが、基質の種類や濃度等のサンプリング条件の検討に時間がかかってしまい、予定量のサンプル数を集められなかった。口腔Actinomycesは、口腔Streptococcusに次いで多く、根面齲蝕病巣からも検出されることから、根面齲蝕との関連が注目されている。本年度は、昨年度に続き解析に必要なサンプルの収集を行った。また、収集した口腔ActinomycesおよびStreptococcusの培養サンプルを利用し、CE-TOFMSを用いて菌体内中間代謝物の評価及び最終代謝産物の評価方法の検討を行った。同機は代謝産物の網羅的解析に有用な機器であり、その解析のための前処理方法の検討や、解析条件の設定についての検討を進めた。昨年度終了しなかったサンプル収集の継続を行っていたため、本年度予定していた代謝産物測定のための条件検討が遅れてしまった。

本年度は、昨年度に引き続き培養サンプルのCE-MSによる中間代謝産物の評価を行った。う蝕関連菌として知られているStreptococcusよりもActinomycesの方がフッ化物耐性が高いことは説明されているが、そのメカニズムの解析は必須である。昨年度終了していなかった代謝産物評価のための条件検討を実施していたためサンプルの収集と並行して、代謝産物測定のための条件検討を行う予定である。代謝産物測定のための条件検討を進めるともに、測定経験のある共同研究者との打合せを行い早期のノウハウ習得を目指す。他施設での解析も含めて検討を行う条件検討に時間がかかり、予定していたサンプル数まで到達しなかったため。(理由)昨年度に引き続きサンプル収集をしていたため、代謝産物測定の条件検討が終了しなかった。(使用計画)今年度残額を使用し、解析のための条件検討を行う予定である。今年度実施予定であった中間代謝産物の解析に予定以上に時間がかかったため次年度への繰り越しが発生した。結果の評価方法の部分での新たな検討を進めている今年度残額を使用し、予定してるサンプル数を達成する予定である。
細菌プロテアーゼ抑制を基盤としたグラム陽性菌敗血症治療法の開発に関する研究

黄色ブドウ球菌放出病原プロテアーゼstaphopain AとBの立体構造に基づいて活性中心部の鍵穴に当てはまる化学物質を30万種類程度の試薬リストからコンピュータを使ってドッキング計算より選出し、阻害効果を調べた。Staphopain BについてはKi値が数10μM程度の阻害物質しか得られなかったが、Aに対して最も強い阻害効果をもつchemical #11は、Ki値1.3μMで拮抗型阻害を示し、本菌敗血性ショック発症に直結するstaphopain Aの血管漏出作用を20 μMでほぼ完全に抑制した。さらに他の細菌や細胞、血漿由来のプロテアーゼに対してもその種類や基質特異性とは無関係に阻害効果がみられたことから、プロテアーゼが関係する疾患への治療を含めた多方面への応用性が示唆された。黄色ブドウ球菌敗血症でのstaphopainsの作用を解析する前段階として、staphopainsの欠損株を作製し、培養液による凝固・線溶に対する作用を調べた。staphopain Aを欠損させた株(scpAB)の培養液では、内因系凝固反応を反映する活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の短縮作用が消失したが、線溶活性を表すトロンビン時間(TT)の延長はみられた。以上の結果から、staphopainsの欠損による凝固・線溶作用への影響がうかがわれ、黄色ブドウ球菌敗血症モデルでstaphopainsの役割をin vivoで探索するための基礎データが得られた。また、StaphopainのAとBの配列から、得られた1CV8と1PXVのX線解析のデータを参考にホモロジーモデリングをStaphopainのAとBの配列情報を利用して、作製した立体構造モデルに基づき、活性中心の鍵穴に当てはまる化学物質を30万個程度の試薬リストからドッキング計算より選定したところ、A阻害薬候補としてO-HYDROXY ATORVASTATIN, MONOSODIUM SALT等、B阻害剤候補としてN-{2{(methylsulfonyl)amino]ethyl}-2,5-bis(2,2,2-trifluoroethoxy)benzenecarboxamide等各々100種類が明らかとなった。これにより、各物質のstaphopains抑制活性を調べ、強力な数種を選別して敗血症モデル動物に投与して治療効果を検討する準備が整った。今後は、これらの阻害剤がstaphopainsの血漿タンパク質への作用(キニン産生やフィブリノーゲン分解など)に対する抑制効果を確認するとともに、阻害剤としての効果をより高めるための化学修飾を試みる。さらに、生体に投与し黄色ブドウ球菌感染症治療薬として応用することが最終目的であるので、半減期を含めた生体内での動態解析、および安全性の評価も必要であろう。黄色ブドウ球菌感染症の新たな治療開発の戦略として、その病原因子であるプロテアーゼstaphopainAおよびBの抑制剤を探索した。同じシステインプロテアーゼであるパパインとの構造類似性とstaphopainのアミノ酸配列の情報をもとにコンピュータで作製した立体構造モデルを使って、それぞれの活性部位に適合する既知の化合物を各々40種類と90種類選出した。その中からstaphopainAとBに対する抑制効果がみられた阻害剤候補化合物各3種類と4種類の情報をコンピュータにinputしてさらに抑制活性の強い可能性のある化合物を選出し、それぞれのリストの上位から入手可能な14と9種類を調べた。0.1M Tfis-HCI, pH7.6,150mM NaC1で希釈したA20nMに対し化合物2μM、あるいはB10nMに対し10μMになるように添加した。抑制効果は各staphopainが167μMの蛍光基質Z-Leu-Leu-Glu-MCAとZ-Phe-Arg-MCAをそれぞれ水解する活性で測定した。Aに対して13種類が抑制効果を示し、最も強力であった化合物#11は拮抗阻害でそのKi値1.3μMは前段階で選出された化合物のKi値7数10μMより良い結果が得られた。A病原作用である血管漏出作用に対して、#11は3μMで1/3までに抑制し20μMではほぼ完全に消失させたことから、in vivo応用への可能性が得られた。一方、Bの方では5種類で抑制がみられたもののKi値は数10μMで、前段階より抑制効果の強い化合物は得られなかった。今後は阻害剤としての効果をより高めるための化学修飾を試みる。
ALS2活性化因子同定によるALS2の生理的機能と運動ニューロン変性機構の解明

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、運動ニューロンの選択的変性を特徴とする神経難病である。本研究では、ALS原因遺伝子産物の1つであるALS2に焦点を当て、その機能的調節因子を同定するとともに、ALS2が制御する生理的機能を解明することを目指した。その結果、ALS2の上流活性化因子(Rac1)、ならびにALS2の細胞内での生理的役割(細胞内膜小胞融合調節)を特定することに世界ではじめて成功した。治療法の確立には、疾患発症のメカニズム解明は重要である。そこで私は、家族性劣性ALSの原因遺伝子産物(ALS2)の生理的機能の解明を通して神経変性機構の解明を目指し研究を行っている。すでに私達は、ALS2が低分子量G-タンパク質Rab5の特異的活性化因子(GEF)・であり、細胞内で膜輸送過程を制御することを明らかにしている。本年度の研究で私は、Rab5活性化因子であるALS2が、著名なG-タンパク質であるRac1に直接活性化されていることを明らかにした。重要G-タンパク質間のクロストークの存在が明らかになり興味深い。さらにALS2が、Rac1により細胞質から局在を変えて関わるようになる膜輸送過程は、マクロピノサイトーシスと呼ばれるエンドサイトーシスの一機構であった。つまり、運動ニューロンの生存や機能の維持にマクロピノサイトーシスを介したシグナル伝達機構が必須である可能性がある。しかしながら私達以外の研究グループは、ALS2は、Rac1のエフェクターではなく、その活性化因子であるとの我々の報告と矛盾する論文を報告している。最近、アミノ末端に1アミノ酸置換変異を有する2種の変異ALS2が、家族性の神経変性疾患の原因であることが報告された。この変異部位は、ALS2の機能部位ではなく、その機能喪失メカニズムに興味が持たれる。私は、この1アミノ酸置換を伴う変異ALS2(ALS2_C157Y, ALS2_G540E)が、Rac1に対する反応性を失っているとの仮説を立て、その実証を行った。2種の変異ALS2と野生型ALS2を、恒常的活性化型Rac1と共にHeLa細胞に発現させた結果、野生型ALS2は見事にマクロピノソーム局在を示したが、これらの変異ALS2は、全くマクロピノソームに局在しなかった。このことは、この変異ALS2が、1アミノ酸変異によりRac1のエフェクターとしての機能を失っていることを意味する。すなわち、ALS2が通常Rac1のエフェクターであるという我々の立場を強く支持する結果であった。本研究は、家族性筋萎縮性側索硬化症2型の原因遺伝子遺伝子産物“ALS2"に焦点を当て、ALS2の機能的調節因子を同定するとともに、ALS2が制御する細胞での生理的機能の特定を目指すものである。平成20年度は、以下のような成果が得られた。1.近年患者において見いだされたALS2のN末端RLD領域における1アミノ酸置換変異を有する2種類の変異ALS2分子(ALS2^<C157Y>、ALS2^<G540E>を用い、生化学的解析ならびに細胞生物学的解析を行なった。その結果、これらのALS2変異体は、野生型と同様にALS2の上流活性化分子であるRac1に結合するとともに、Rab5活性化能を有することが判明した。一方、細胞内でのRac1刺激反応性について解析した結果、ALS2変異体はRac1への反応性ならびにマクロピノソーム・エンドゾーム上への局在能が消失していることが判明した。従って、細胞内においてALS2分子が機能するためには、そのN末端RLD配列が必須であることが明らかとなった。2.エンドサイトーシスならびに膜動態に果たすALS2の分子機能を明らかにするため、Als2-KOマウス由来の初代培養細胞を用いて、血清刺激依存性のHRP取込み活性の定量的解析を行なった。その結果、ALS2の欠損により培養神経細胞でのHRP取込み活性が有意に低下したが、その活性の大部分は保持されることが判明した。従って、ALS2と重複した分子機能を有する分子が存在すると想定される。そこで、そのような分子群(Rab5GEF: VPS9ドメインを有するファミリー分子)を標的とし、RNA干渉法を用いて各々の遺伝子発現を抑制し、重複した生理的機能を有する分子の同定を試みた。本年度は、これら候補分子群のRNA干渉法の実験条件の確立を完了した。今後、これらの手法を用いて、重複した生理的機能を有する分子を同定する計画である。本研究は、家族性筋萎縮性側索硬化症2型の原因遺伝子遺伝子産物"ALS2"に焦点を当て、ALS2の機能的調節因子を同定するとともに、ALS2が制御する細胞での生理的機能の特定を目指すものである。平成21年度は、以下のような成果が得られた。