hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
婚姻住居をめぐる法的紛争の日独比較法的研究

全体を通じて、日本とドイツの婚姻住居紛争を網羅的に拾い上げるという計画を実施し、それをもとに諸点の比較分析を相当程度進めることができた。しかし、成果を公表するという点では、計画どおりにいかなかった。この点について、本研究採択時の研究計画調書では、やむを得ずペースに遅れが出た場合は、論文の公表を先送りにして、研究計画の最終年度(平成26年度)先2年以内には、目標を達成する全考察の公表を目指す、とある。これを実行することが可能な段階まで研究は進んでおり、それを果たすことにより、予定どおりの研究目的を達成することになる。民事法(家族法)東日本大震災との関連で急務の案件を優先させたために、本研究が遅れてしまった。平成24年度後半には東日本大震災との関係で災害と法について学会報告をしたが、平成25年度に学会報告を論文集として公刊しなければならなかった。また、岩手県から災害関連死の弔慰金の審査を依頼されているが、依頼件数が数百件に上り、なおかつ、「災害関連死」の認定をめぐり訴訟も提起され、法的論点を整理する必要が生じたために、同問題についての論文執筆についても優先せざるを得なかった。同問題については、現在でも新聞等で度々取り上げられ、更なる論点整理・検討が必要とされており、新たな論文執筆の依頼もある。現実に起きている重要課題であるため、論文公表については本研究よりも優先せざるを得ない状況にある。平成24年度7月までは当初の研究計画以上に進展していたために、本研究とは異なる課題について秋の学会報告(11月3日)を予定した。学会報告をしても本研究は実施計画どおりに進めることができると想定していたが、学会報告準備に大幅に時間を割くこととなったばかりでなく、学会報告後の執筆準備にも時間を費やすこととなった。そのために、後半の実施計画がやや遅れてしまった。平成26年度の当初の具体的な研究実施計画は、以下のとおりである。1.前半は、ドイルにおける別居児の婚姻住居利用をめぐる紛争について分析を行い、その結果を論文にして公表する。夏の資料収集は、後半の研究にそなえて、日独の比較法的考察のために必要な補充的な資料探しを行う。2.後半は、これまでの各分析を踏まえて、総合的な日独の比較法的考察を行う。ただし、各分析を踏まえた考察はボリュームがあると予想されるので、平成26年度後半の公表は、小活として全体的な考察の概要を内容とし、引き続き、半年なり1年をかけて全研究を総括する論文公表に努める予定である。これまで、文献収集および文献整理については、ほぼ計画どおりに進んでいる。しかし、文献の分析およびその公表が遅れている。当初の研究実施計画でも、やむを得ずペースに遅れが出た場合は、論文の公表を先送りにして、研究計画の最終年度(平成26年度)先2年以内には、目標を達成する全考察の公表を目指す、としている。平成26年度においては、できる限り、これまでの遅れを取り戻すことに努め、関連の小括的な論文公表を目指すが、本研究期間が終了したのちも、本研究の全体の目標を達成するために、全考察の公表に取り組んでいく。平成25年度の具体的な研究実施計画は、以下のとおりである。
生体内3D器官再構築システムを用いた細胞周期制御分子異常による腫瘍形成機構の解析

癌は細胞の異常増殖と組織構築の破壊という特徴的な病理像を呈する疾患である。これまでの研究によって、癌遺伝子あるいは癌抑制遺伝子の異常により細胞周期や細胞死制御が破綻し、ゲノムの不安定化を経て腫瘍化が誘導されることが明らかにされてきた。しかしこれらの結果の多くは、2次元(2D)の培養細胞を用いた実験によって見出されたものであり、実際の正常細胞が組織中で発癌し悪性化する過程を正確に反映したシステムに基づくものではない。近年、マトリクス中で乳腺細胞などを3次元(3D)培養することによって、増殖と組織構築を同時にモニターできるシステムが開発され、様々な遺伝子の異常と発癌の関連を洗いなおす実験が行われつつある。本研究はマウスの前立腺あるいは乳腺から幹細胞を含む細胞を分取した後マウス皮下に移植し、前立腺組織あるいは乳腺組織を再構築するシステムを樹立することを目的とし、さらに細胞周期制御を行う分子の過剰発現や発現抑制をそれらの細胞に誘導した後、移植を行うことにより、それらの分子制御異常の増殖や組織構築への影響を経時的に解析することを目的として行った。以下に本年度の成果を挙げる。【1】マウス前立腺から分離した細胞10万個をマウス脂肪組織内に移植することにより、管腔構造を持つ前立腺組織を作ることに成功した。現在、さまざまな表面マーカーを用いて細胞を分取し、幹細胞となる分画を同定する作業を行っている。【2】マウス乳腺から分離した細胞からLin+細胞を除いた後、CD24+CD49f+細胞をフローサイトメーターによって分取しマトリゲル3D培養系に移したところ管腔構造を持つ球状細胞塊を形成することに成功した。現在それらの細胞をマウス脂肪組織内に移植する実験を実施中である。
石英粒子の表面形態を利用した後背地推定手法の構築

堆積物中の石英粒子の表面には、粒子の運搬過程や堆積環境を反映した微細形態が残されている。本研究ではこの特徴を利用し、石英粒子の表面形態の解析を日本の土の後背地推定に利用するための研究を行った。(1)海岸堆積物および河床堆積物について土試料を収集し、走査型電子顕微鏡で観察を行った。その結果、海岸堆積物の表面形態の多様性は、堆積物の供給源や母岩を反映している可能性が示唆された。本研究で採取した3河川の河床堆積物については、河川間で石英の形態的特徴は異なっていたが、1つの河川の上流域と下流域の試料では顕著な形状の変化は認められなかった。(2)電子顕微鏡で撮影した画像の解析により、粒子の円磨度Rおよびフラクタル次元FDを算出した。2種類の形状パラメータを用いることで、石英粒子の形状を客観的に評価することが出来た。(3)粒子の表面形態、特に後背地の推定に有用な指標であるV字衝突痕について、共焦点レーザー顕微鏡を用いて三次元形状を測定する手法を新しく開発した。この手法に基づき、海岸堆積物の粒子表面を測定したところ、堆積環境によって衝突痕の密度や深さが異なる可能性が示された。以上の結果から、日本においても土の堆積環境や供給源の違いにより、石英の表面形態に多様性が確認され、後背地の推定に有用であることが示された。また、表面形態の1つであるV字衝突痕の三次元形状測定法は、本研究で新たに開発した手法であり、海岸や河川の堆積物について、水中での堆積環境の解明に寄与できると考えられる。初年度は、石英粒子の表面形態と土砂試料採取地の関係性について知見を蓄積することを目標とした。海岸堆積物及び河床堆積物を収集し、電子顕微鏡により石英粒子の観察を行った。海岸堆積物を対象とした検討では、試料採取地によって石英粒子の外形や表面の微細形態に多様性が確認された。この微細形態の多様性は、石英が由来する母岩等の地質的背景と、海岸堆積物の供給源や堆積環境といった地理学的な背景を反映している可能性が示唆された。また、河床堆積物を対象とした検討では、河川の長さや河床勾配によって、微細形態の種類や出現頻度に差が出る可能性が示唆されたが、収集試料数が十分ではないため、最終的な結論を導くには至っていない。また、定量的な指標を用いて、粒子の観察結果を評価する手法の構築を試みた。粒子の外形については、ImageJを用いて円磨度を算出し、試料間の差異を表現する方法の構築を検討した。粒子の表面形態についての定量的評価法は、現在検討中である。海岸堆積物の結果についてはある程度の結論が得られたため、学会発表を行い、現在論文作成を行っている。河床堆積物については、今年度採取した試料の観察は完了したが、考察を進めるには更なる試料収集が必要であると考えられたため、来年度も引き続きサンプリングを行う予定である。観察結果の定量的評価法の構築は、粒子外形の評価法については一定の成果が得られたと考えている。表面形態の定量的評価法については、検討を進めている段階であるが、統計的手法を用いたグルーピングに一定の手応えを得ている状況である。試料採取地によって石英粒子の外形や表面の微細形態に多様性が確認され、微細形態の種類や出現頻度に差が出る可能性が示唆されたが、主に河床堆積物で収集試料数が十分ではないため、まだ最終的な結論を導くには至っていない。今年度は、産前産後の休暇及び育児休業の取得に伴い、1年を超えて研究を中断していたため、今年度実施予定であった試料収集や実験は来年度実施する予定である。河床堆積物については、採取した試料の観察は完了したが、考察を進めるには更なる試料収集が必要と考えられたため、来年度も引き続きサンプリングを行う予定である。表面形態の定量的評価法については、検討を進めている段階であるが、統計的手法を用いたグルーピングや、レーザー顕微鏡を用いた凹凸評価に一定の手応えを得ている状況である。初年度は、当初計画していた実験を実施することができ、現在検討中の項目についても、ある程度方向性は示されている状況である。今年度は、産前産後の休暇及び育児休業の取得に伴い、1年を超えて研究を中断したため、1年の補助事業期間延長を申請した。今年度実施予定であった研究は、来年度実施する予定である。

本研究で採取した3河川の河床堆積物については、河川間で石英の形態的特徴は異なっていたが、1つの河川の上流域と下流域の試料では顕著な形状の変化は認められなかった。(2)電子顕微鏡で撮影した画像の解析により、粒子の円磨度Rおよびフラクタル次元FDを算出した。2種類の形状パラメータを用いることで、石英粒子の形状を客観的に評価することが出来た。(3)粒子の表面形態、特に後背地の推定に有用な指標であるV字衝突痕について、共焦点レーザー顕微鏡を用いて三次元形状を測定する手法を新しく開発した。この手法に基づき、海岸堆積物の粒子表面を測定したところ、堆積環境によって衝突痕の密度や深さが異なる可能性が示された。以上の結果から、日本においても土の堆積環境や供給源の違いにより、石英の表面形態に多様性が確認され、後背地の推定に有用であることが示された。また、表面形態の1つであるV字衝突痕の三次元形状測定法は、本研究で新たに開発した手法であり、海岸や河川の堆積物について、水中での堆積環境の解明に寄与できると考えられる。河床堆積物のサンプル採取を進め、河川の石英の形態的特徴について知見を得る。また、観察結果の定量的評価法の構築については、多変量解析を中心に引き続き検討を行う。また、コア試料中の石英について観察を行い、後背地解析への有効性を検証する。観察結果の定量的評価法の構築については、多変量解析及びレーザー顕微鏡による凹凸評価を引き続き検討する。画像解析ソフトや統計解析ソフトの購入を来年度に延期したため。また、予定よりサンプリングが実施できなかったため。(理由)産前産後の休暇及び育児休業の取得に伴い1年間研究を中断していたため、画像解析ソフトや統計解析ソフトの購入を来年度に延期したため。(使用計画)試料収集、ソフトウェア購入、学会発表、論文投稿試料収集及びソフトウェア購入
薄膜成長技術を用いた対称性・不均一性の制御による非平衡臨界現象の実験的探求

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
第２初学段階のプログラムロジック構成躓き推定のためのソースフュージョン機構

本研究では,多くの学習領域における,より高度な学習段階に影響を及ぼす重要な存在と認められながらも,これまで有効な支援方法が確立されて来なかった第2初学段階の「思い描く処理像をプログラムとして如何に具現化するか(ロジック構成スキル)」に注目し,実効的指導のための支援実現を目指す.そのために,プログラミング演習における「ソースコード間の距離推移」と「学習者によるコンパイル作業の推移」という性質の異なるソース系から,ロジック構成面の躓きを推定し,教授者に提示する新たなメカニズムを開発する.その上で,分析の過程で,対象ソースとその分析戦略自体を動的に切替えるソースフュージョン機構を開発する.さらに,本機構を導入した支援システムのプロトタイプをデザインする.これにより,身近で性質の異なるソースを活かし得る,ロジック構成面の行き詰まり把握支援の新たな可能性を示す.2018年度は,主に,有望ソースからのロジック構成面の躓き候補群抽出手法の開発に取り組んだ.まず,プログラミング演習支援に関する最新動向を集中的に調査した.並行して,実際のプログラミング演習における躓きの様態を,着目ソースの状況と共に入念に観察・調査した.次に,ロジック構成面の躓き候補群抽出手法の開発に取り組んだ.具体的には,ソースコード間の距離推移,学習者によるコンパイル作業の推移,それぞれの分析に基づいて抽出方法を検討した.その上で,開発した各ソースの分析に基づくロジック構成面の躓き候補群抽出手法を,それぞれモジュールとして実装した.2018年度に予定していた「ロジック構成面の躓き候補群抽出手法の開発」を実施することができ,概ね予定通りのスケジュールで進んでいると考えられる.2019年度は,主に,ソースフュージョン機構・支援システム統合化開発に取り組む.まず,前年度に開発した抽出モジュールを連携させ,ソースフュージョンによるハイブリッド分析手法を開発する.次に,ここまでに開発したモジュールをサブシステムとする形で,分析システムを統合開発する.その上で,開発した支援システムを申請者らの大学における実際のプログラミング演習において実践試用し,提案手法を評価・検証する.本研究では,多くの学習領域における,より高度な学習段階に影響を及ぼす重要な存在と認められながらも,これまで有効な支援方法が確立されて来なかった第2初学段階の「思い描く処理像をプログラムとして如何に具現化するか(ロジック構成スキル)」に注目し,実効的指導のための支援実現を目指す.そのために,プログラミング演習における「ソースコード間の距離推移」と「学習者によるコンパイル作業の推移」という性質の異なるソース系から,ロジック構成面の躓きを推定し,教授者に提示する新たなメカニズムを開発する.その上で,分析の過程で,対象ソースとその分析戦略自体を動的に切替えるソースフュージョン機構を開発する.さらに,本機構を導入した支援システムのプロトタイプをデザインする.これにより,身近で性質の異なるソースを活かし得る,ロジック構成面の行き詰まり把握支援の新たな可能性を示す.2018年度は,主に,有望ソースからのロジック構成面の躓き候補群抽出手法の開発に取り組んだ.まず,プログラミング演習支援に関する最新動向を集中的に調査した.並行して,実際のプログラミング演習における躓きの様態を,着目ソースの状況と共に入念に観察・調査した.次に,ロジック構成面の躓き候補群抽出手法の開発に取り組んだ.具体的には,ソースコード間の距離推移,学習者によるコンパイル作業の推移,それぞれの分析に基づいて抽出方法を検討した.その上で,開発した各ソースの分析に基づくロジック構成面の躓き候補群抽出手法を,それぞれモジュールとして実装した.2018年度に予定していた「ロジック構成面の躓き候補群抽出手法の開発」を実施することができ,概ね予定通りのスケジュールで進んでいると考えられる.2019年度は,主に,ソースフュージョン機構・支援システム統合化開発に取り組む.まず,前年度に開発した抽出モジュールを連携させ,ソースフュージョンによるハイブリッド分析手法を開発する.次に,ここまでに開発したモジュールをサブシステムとする形で,分析システムを統合開発する.その上で,開発した支援システムを申請者らの大学における実際のプログラミング演習において実践試用し,提案手法を評価・検証する.(理由)2019年度は,支援システムのプロトタイプ開発を効率的に行い,関連する検証を入念に行う必要があると見込まれるため.(使用計画)システム開発,検証作業等に従事する研究協力者を雇用する予定である.
ヒト塩基除去修復酵素の遺伝子多型に基づく活性の個体差に関する研究

DNA中に生じた損傷塩基は突然変異の原因となる場合が多いため、その修復機構である塩基除去修復系の酵素遺伝子の一塩基多型(SNP)に基づく修復活性の差異は、各個人における遺伝子異常の起こりやすさを遺伝的に規定することになる。そこで、本研究は、塩基除去修復系遺伝子のSNPに基づく多型蛋白質の修復活性の差異を同定していくことを目的とする。本年度は、損傷塩基の一つである8-ヒドロキシグアニン(oh^8G)の修復に関わるヒトMYH,APEX遺伝子に注目し、11種類のSNPを同定し、その頻度を明らかにした。これらの多型のうち、7種類はアミノ酸の置換を伴うものであった。また、このうち、MYH遺伝子のQ324H多型の修復活性を(1)組替え蛋白質のアデニン除去能、(2)大腸菌での突然変異率制御能、の点で比較した。多型蛋白質間では有意な修復活性の差は見られなかったが、MYH-1型(ミトコンドリア型)は、MYH-2型(核型)に比ベ、活性が低いことを明らかにした。また、この検討を通して、MYH蛋白質は、生理的条件下では、DNA中のA:oh^8G塩基対を特異的に認識し、アデニンを除去修復する酵素であることを明らかにした。もう一つのoh^8G修復に関わる酵素遺伝子であるOGG1については、RT-PCR法および新規に作製した2種類の抗ヒトOGG1抗体を用いたウェスタンブロット法にて、そのアイソフォームを解析した。その結果、肺扁平上皮がんとの関連性が示唆されるSer326Cys多型の存在するOGG1-1a型が、ヒト細胞内での主要なアイソフォームであることを明らかにした。また、このOGG1-1a型蛋白質の活性調節機構をin vitroのニッキング法にて検討し、APEX蛋白質存在下では、OGG1蛋白質のAPリアーゼ活性が上昇することを示した。
植物と植物病原菌に係わる物質の化学的研究

昭和63年度、平成元年度、及び平成2年の研究成果を以上の項目に分類して述ベる。1:植物病原菌の生産する毒素の化学的研究(人江、上野、野原、藤多)植物病原菌により生産る宿種特異的毒素の単離、構造決定、その全合成、並びにその類緑体を合成し構造と毒性の関係を明らかにした。2:脂質に関連する抗菌薬の開発研究(津田)新しい抗菌剤の開を志向して、脂質の構造と活性の関係を解明するための合成研究を行った。3:フアイトアレキシン等の単離、構造、及びその植物生体係におりる役割の考察(真山)植物病原菌胞子と宿種との間のやり取りを解明するため、焦点をエリシタ-に置き研究を行った。4:海洋微小藻類に対する生理活性物質の化学的研究(上村)海洋天然物化学の専門を生かし、強力な毒素の単離と構造と構造決定を行った。5:キノコの生産するプロテア-ゼの研究(芳本)キノコ由来のプロテア-ゼにつき、遺伝子工学を利用してその酵考の量産に関する研究を行った。6:ペプチジ性抗生物質の合成研究(大船)生体内の情報交換に係わるペプチド性化合物の構造から、新たな分子を設計しそれからの合成を行った。7:植物の生産する超甘味物質の化学的研究(西沢)植物由来の甘味物質の研究を行った。その間に得た一つの反応は天然物化学に大いに寄与するものである。8:植物の運動を司どる化学物質の単離、構造決定、と合成(志津里)地球の緑化を目指して、葉の開閉運動から進展して気孔の開閉運動にもメスを入れた。9:その他の研究、主として生理活性物質の全合成を志向した合成化学に関する基礎的研究(柴崎、平間、冨岡、塩入、藤井、細見)昆虫が媒体となる植物病は多い。こりに関連して昆虫の摂食阻害物質の合成、不斉合反応の基礎研究、有機金属を用いた新反応の開発研究、ペプチド合成のための新しい保護基の開発研究等を行なった。本年度は研究賛交付の初年度にあたるので、主として本研究の分担者となっている研究者が現在行なっている研究を紹介し、それについて意見の交換を行ない、加えて今後の研究の進めかたについて討論するため当研究班の班会議を大阪において開催した。この班会議において互に有益な知見を得るとともに現在の植物病理学領域への有機化学者が寄与出来る問題について活発に討論した。なお、班会議において柴崎正勝教授(北海道大学)により[昆虫に対する植物の抵抗性物質アザディラクチンの合成研究]について、志津里芳一助教授(慶応大学)により[植物の就眠運動を支配する化学物質の単離とその構造]について、藤多哲郎教授(京都大学)により[シイタケ病害菌の生産するペプチド性物質の単離と構造]について、大船泰史(サントリー生有研)により[生理活性アミノ酸の合成]について、野原稔弘教授(熊本大学)により[桑の輪斑病菌の代謝する植物毒素の化学的研究]についてそれぞれ研究発表があり、引続いて植物病理学を専門とする真山滋志助教授(香川大学)より[植物病理学領域における最近の問題点]について講演があり、計5時間におよぶ班会議となり、班員にとって研究面のみならず相互の理解を深める意味からも非常に実り多い班会議となった。本年度は研究費交付の中間の年度にあたる。研究分担者は各自それぞれ基礎研究を中心にして研究を推進している。

そのため合成化学者は必ずしも植物病原菌関連化合物の合成を進めている訳ではない。しかし、(1)研究代表者、入江は病原菌アルタナリアキテクチア-ナにより生産され、二十世紀ナシに黒斑を引起こす宿主特異的毒素、Akitoxinのメチルエステルの全合成に成功し、この毒素の化学構造に含まれる二つの不斉炭素の立体化学が毒性発現に密接に関係している事を合成的に明らかにした。(2)上野は一種の植物病原菌、クロカビ病原胞子の持つ自己発芽抑制因子を単離し、その構造を推定した(未発表)。入江はその推定構造の化合物を合成したが、天然物と一致しない。現在その構造の再検討を行っている。(3)芳し本はキノコの生産するペプチダ-ゼ及びそのインヒビタ-の検索を行い、新しい酵素の単離に成功し、現在酵素のアミノ酸組成も明らかにしつつある。この他プロリン特異性ペプチダ-ゼとそのインヒビタ-に関する研究も行っている。(4)西沢は新しいグリコジル結合の形成法を開発し、これを応用して人工オリゴ糖の合成に向けて研究を進めている。この反応に依ってシクロデキストリンのエナンチオマ-の合成が可能になるであろう。不斉合成への寄与が期待される。平成元年12月9日、千里中央において班会議を開催した。ここに於いて班員4名、富岡(東大)西沢(徳島文理大)、芳本(長崎大)、および上野(京大)により最近の研究が発表され、また特別講演者として浜中(小野薬品)によりプロスタグランジン関係化合物の最近の進歩が紹介された。班会議は5時間に及んだ。昭和63年度、平成元年度、及び平成2年度の研究成果を以下の項目に分類して述べる。1:植物病原菌の生産する毒素の化学的研究(入江、上野、野原、藤多)植物病原菌により生産る宿種特異的毒素の単離、構造決定、その全合成、並びにその類縁体を合成し構造と毒性の関係を明らかにした。2:脂質に関連する抗菌薬の開発研究(津田)新しい抗菌剤の開発を志向して、脂質の構造と活性の関係を解明するための合成研究を行なった。3:ファイトアレキシン等の単離、構造、及びその植物生体系における役割の考察(真山)植物病原菌胞子と宿種との間のやり取りを解明するため、焦点をエリシタ-に置き研究を行なった。4:海洋微小藻類に対する生理活性物質の化学的研究(上村)海洋天然物化学の専門を生かし、強力な毒素の単離と構造決定を行なった。5:キノコの生産するプロテア-ゼの研究(芳本)キノコ由来のプロテア-ゼにつき、遺伝子工学を利用してその酵素の量産に関する研究を行なった。6:ペプチド性抗生物質の合成研究(大船)生体内の情報交換に係わるペプチド性化合物の構造から、新たな分子を設計しそれらの合成を行なった。7:植物の生産する超甘味物質の化学的研究(西沢)植物由来の甘味物質の研究を行なった。その間に得た一つの反応は天然物化学に大いに寄与するものである。8:植物の運動を司どる化学物質の単離、構造決定、と合成(志津里)地球の緑化を目指して、葉の開閉運動から進展して気孔の開閉運動にもメスを入れた。9:その他の研究、主として生理活性物質の全合成を志向した合成化学に関する基礎的研究(柴崎、平間、冨岡、塩入、藤井、細見)昆虫が媒体となる植物病は多い。これに関連して昆虫の摂食阻害物質の合成、不斉合性反応の基礎研究、有機金属を用いた新反応の開発研究、ペプチド合成のための新しい保護基の開発研究等を行なった。
肝移植後の学童後期から思春期の子どもと親のQOL向上のための看護援助モデル構築

本研究の目的は、学童後期から思春期の子どもと親のQOL向上のための看護援助モデルを構築し、課題解決を図ることである。今年度は、前年度に引き続き、作成した子どもと親のQOL維持・向上のためのモニタリング指標と看護援助モデルの評価・修正を行うことを目標とした。モニタリング指標および看護援助モデルを実践で用いるにあたり、パターン判別およびパターンごとの看護援助指針も一昨年度作成し、これらを用いて、継続的な実践を行い、評価のためのデータ収集を縦断的に実施した。今年度は、継続的な実践を行う中で、新たにデータ収集を行った。その上で、モニタリング指標および看護援助モデル、パターン判別およびパターンごとの看護援助指針の評価・修正を行った。データ収集は完了したが、評価・修正に時間を要している。また、作成した看護援助モデルについて、他者が活用しやすいよう、表現の工夫の必要性が見いだされた。昨年度の調査で明らかとなった、ドナーとなった母親への支援項目については、今後看護援助モデルに追加し、活用しやすいモデル作成に向けて、検討が必要である。したがって、次年度も継続して評価・修正が必要である。また、学童後期から思春期の子どもおよび家族への継続的な看護実践を継続し、分析結果の検討・評価・修正を行い、看護援助モデルの精度を高める必要がある。モニタリング指標および看護援助モデルについては、成果発表を行い、広く活用してもらうための方策を検討する必要がある。年度途中より、育児休業取得のためデータ分析、評価・修正が終了していない。研究期間の延長によって、終了していない分析および結果の評価・修正を行い、看護援助モデルの精度を高める。また、成果発表を行う。1.肝移植後の子どもと親の療養生活の実態調査肝移植後の子どもと家族の療養生活の実態を明らかにするために、学童思春期までの子どもとその親子11組に対し調査を行った。2.子どもと親のQOL維持・向上のためのモニタリング指標の作成のための文献検討肝移植後のQOL、QOLに関連するアドヒアランスや移植の体験に関する研究、また他の小児慢性疾患との相違等にも着目して国内外の文献より検討を行った。1,2より子どもと親のQOL維持・向上のためのモニタリング指標案を作成した。実態調査の結果では、子どもの療養生活の実態と療養行動上の問題が明らかとなった。特に、思春期の子どもでは、今回の対象は免疫抑制剤の内服以外は普通の生活を送っていたが、移植を受けた時期や移植・治療に対する捉えが、療養行動や疾患管理の捉えに影響していた。疾患管理の中心は、発達段階に関わらず、免疫抑制剤の内服であり、免疫抑制剤の内服の必要性を認識しているものが多かった。しかし、過去の体験、移植時期やその後の経過により、内服に対する捉えは異なり、服薬管理において、内服の有無の観察だけではなく、服薬を忘れた際の子どもの状況や対処、その時の子どもの背景までを含めた情報分析の必要性が考えられた。モニタリング指標の要素としては、子ども側の状況(身体状況や合併症の有無等、日常生活や学校生活、免疫抑制剤の内服を含む疾患管理といった療養生活状況、移植時期などの移植関連情報)と親側の状況(親の子どもの疾患管理に対する認識および行動や親の健康状態、家族状況等)が抽出された。次年度は、追加データの結果をふまえてさらに検討し、モニタリング指標を明確化し、看護援助モデルを作成する予定である。1.子どもと親のQOL維持・向上のためのモニタリング指標の作成肝移植後の子どもと親の療養生活の実態調査の追加データの収集、前年度の成果であるモニタリング指標の要素を基に、モニタリング指標を作成した。モニタリング指標は、子ども側については、身体状況、血液検査データ、免疫抑制剤の内服状況やその他の疾患管理状況、日常生活・学校生活状況を含めた。親については、子どもの疾患管理に対する認識および行動や親の健康状態、家族状況を含めた。具体的なモニタリング指標の内容の作成にあたっては、研究分担者とのディスカッションより指標内容項目を検討し精度を高めた。2.看護援助モデルの作成前年度行った文献検討および実態調査の結果、上記モニタリング指標より、子どもの発達段階や移植時期、経過の違いによる特徴を整理した。その結果、生体肝移植後の学童後期から思春期の子どもと親のQOLの特徴として、4つのパターン(パターン1:幼児期に移植を受けずっと親の管理下で問題なく過ごしているが、移植自体については理解できていない学童のパターン、パターン2:移植したことで体調が改善したことを自覚し、自分なりに対処しながらそれなりに管理している思春期のパターン、パターン3:移植を否定的に捉えたり、小さい頃に行った移植を覚えておらず、内服に対する不満や効果への疑問をもっている思春期のパターン、パターン4:肝機能の悪化が進行し現在再移植のための脳死肝移植登録をしているパターン)を明らかにした。この4つのパターンおよび文献検討で得られた知見を統合し、学童後期から思春期の子どもと親のQOL向上を目指した看護援助モデルを考案した。また、パターン判別およびパターンごとの看護援助指針を作成した。次年度は、考案した看護援助モデルを用いて、学童後期から思春期の子どもへの看護実践を行い、援助モデルの評価・修正を行う予定である。今年度の目標は、子どもと親のQOL維持・向上のためのモニタリング指標の作成および看護援助モデルの考案である。この2つの目標に対し、今年度はおおむね予定通りに進行している。

中断期間:平成28年3月8日平成29年3月31日理由:産後休暇および育児休業の取得のため産後休暇および育児休業の取得により研究を中断していたため本研究の目的は、学童後期から思春期の子どもと親のQOL向上のための看護援助モデルを構築し、課題解決を図ることである。今年度は、一昨年度作成した子どもと親のQOL維持・向上のためのモニタリング指標と看護援助モデルの評価・修正を行うことを目標とした。モニタリング指標および看護援助モデルを実践で用いるにあたり、パターン判別およびパターンごとの看護援助指針も昨年度作成した。今年度は、これらを用いて、継続的な実践を行い、評価のためのデータ収集を縦断的に実施した。実践を行う中で、ドナーとなった母親の次子の妊娠・出産に関する支援の必要性が考えられたため、ドナーとなった母親の調査も追加で行った。その中で、ドナーとなった母親は、多くは問題なくドナー手術後に妊娠・出産に至っていた。また、出生児も問題なかった。しかし、母親は、ドナー術後の妊娠・出産に関する不安だけではなく、レシピエントの不安も常に抱えており、心理社会面への支援の必要性が示唆された。今年度は、継続的な実践を行う中で、新たなデータ収集に時間を要した。そのため、モニタリング指標および看護援助モデル、パターン判別およびパターンごとの看護援助指針の評価・修正が完了しなかった。したがって、次年度は、学童後期から思春期の子どもおよび家族への継続的な看護実践を継続し、分析結果の検討・評価・修正を行い、看護援助モデルの制度を高めるとともに、成果発表を行う予定である。モニタリング指標および看護援助モデルを用いた、実践のための継続的なデータ収集に時間を要した。そのため、データ分析が終了しておらず、研究期間の延長を行った。本研究の目的は、学童後期から思春期の子どもと親のQOL向上のための看護援助モデルを構築し、課題解決を図ることである。今年度は、前年度に引き続き、作成した子どもと親のQOL維持・向上のためのモニタリング指標と看護援助モデルの評価・修正を行うことを目標とした。モニタリング指標および看護援助モデルを実践で用いるにあたり、パターン判別およびパターンごとの看護援助指針も一昨年度作成し、これらを用いて、継続的な実践を行い、評価のためのデータ収集を縦断的に実施した。今年度は、継続的な実践を行う中で、新たにデータ収集を行った。その上で、モニタリング指標および看護援助モデル、パターン判別およびパターンごとの看護援助指針の評価・修正を行った。データ収集は完了したが、評価・修正に時間を要している。また、作成した看護援助モデルについて、他者が活用しやすいよう、表現の工夫の必要性が見いだされた。昨年度の調査で明らかとなった、ドナーとなった母親への支援項目については、今後看護援助モデルに追加し、活用しやすいモデル作成に向けて、検討が必要である。したがって、次年度も継続して評価・修正が必要である。また、学童後期から思春期の子どもおよび家族への継続的な看護実践を継続し、分析結果の検討・評価・修正を行い、看護援助モデルの精度を高める必要がある。
インフルエンザウイルスゲノムRNAの構造学的研究と新規インフルエンザ治療薬の開発

本研究は、細菌感染症に処方されるアミノグリコシド系抗生物質を、その立体構造情報に基づいて分子改変することで抗インフルエンザ薬へと生まれ変わらせることを目的としている。インフルエンザウイルスは8つに分節された一本鎖ゲノムRNA(vRNA)をもっている。これら8つのvRNAと、複製の過程で作られるcRNの両末端にはプロモーター領域と呼ばれる互いに相補的で保存性の高い配列が存在しており、複製・転写の開始を制御している。本研究では、このプロモーター領域に作用して複製・転写を阻害するアミノグリコシドの探索・設計を行っている。平成30年度は、我々が開発予定の薬剤の標的となるvRNAおよびcRNAのプロモーター領域の立体構造およびその動的変化を明らかにすることを目指した。前年度に結晶化に成功したvRNAとcRNAについて共同利用放射光施設Photon Factoryの構造生物学ビームラインでX線回折実験を行い、良質なデータが得られたものについて構造解析を行った。その結果、vRNAについては合計9個、cRNAについては合計3個の構造決定に成功した。現在はこれら立体構造スナップショットの精密化を進めている。また、複数の天然および化学合成アミノグリコシドをライブラリーとして用いた薬剤探索を行った。その結果、一部の化学合成アミノグリコシドについてプロモーター領域への結合が確認できた。さらに、プロモーター領域に結合させるために設計・合成したフッ素化アミノグリコシドについての立体構造情報およびRNAとの結合様式を明らかにするために、アミノグリコシドが強く結合することが知られているリボソームRNAの特定の領域についてもモデル分子を作成し、アミノグリコシドとの共結晶化および構造解析を行った。これに加えて、本研究を円滑に進めるために、水銀・銀イオンを使ったRNA結晶化法・構造解析法を開発した。平成30年度は、インフルエンザウイルスゲノムRNAのプロモーター領域の立体構造解析と、これによって得られた立体構造スナップショットを用いた動画編集、さらにはプロモーター領域に結合する薬剤探索を計画していた。動画編集は完了していないものの、この素材となる立体構造スナップショットを複数得ることに成功した。また、プロモーター領域に結合する化学合成アミノグリコシドを探索することに成功した。さらに、この領域に結合するように設計・合成した新規アミノグリコシドについて、RNAとの相互作用様式を明らかにすることにも成功した。これに加えて、本研究を行う過程で、水銀・銀イオンを用いた新しいRNA結晶化法・構造解析法の開発にも成功した。以上を総合すると、本研究はおおむね順調に進展している。最終年度となる平成31年度は、現在取り組んでいるプロモーター領域の立体構造スナップショットの精密化を完了させ、これをつなぎ合わせて動画作成を行う。そして、薬剤探索によってプロモーターへの結合が示唆されたアミノグリコシドについて、vRNAおよびcRNAのモデル分子との共結晶化およびX線結晶解析を行う。また、これまでに得られたプロモーター領域の立体構造情報から、アミノグリコシド以外の低分子薬剤もこの領域に結合しうることが明らかになったため、ライブラリーの範囲を広げて薬剤探索を行う予定である。プロモーター領域の動画編集が完了した段階で論文執筆および学会発表を計画している。インフルエンザウイルスは8つに分節された一本鎖ゲノムRNAをもっている。これら8つのゲノムRNA(vRNA)と、複製の過程で作られる8つの対鎖RNA(cRNA)の両末端には、プロモーター領域と呼ばれる互いに相補的で保存性の高い配列が存在する。通常この領域は安定な二本鎖構造をとっているが、ここにRNAポリメラーゼが結合すると二本鎖が一本鎖にほどけ、複製・転写が開始される。したがって、薬剤によってプロモーター領域の二本鎖から一本鎖への構造変化を妨げれば、ゲノムRNAの複製・転写の開始を阻害してウイルスの増殖を抑えることができる。今年度はまず、我々が開発予定の薬剤の標的となるvRNAおよびcRNAのプロモーター領域の立体構造を明らかにすることを目指した。構造解析に用いるモデルRNA分子を設計・化学合成・精製し、当研究室で独自に開発した核酸分子結晶化用スクリーニングキットを用いて結晶化条件を検索した。その結果、vRNAとcRNAともに数種類の条件で良質な単結晶を得ることに成功した。このうちいくつかの単結晶について共同利用放射光施設Photon Factoryの構造生物学ビームラインでX線回折実験を行い、良質なデータを得ることができた。そして、vRNAとcRNAそれぞれについて、結晶形1種類ずつの構造解析に成功した。また、vRNAおよびcRNAプロモーターに結合させるアミノグリコシドについての立体構造情報およびRNAとの結合様式を明らかにするために、アミノグリコシドが結合することが知られているリボソームRNAの特定の領域についてもモデル分子を作成し、アミノグリコシドとの共結晶化および構造解析を行った(原著論文1件)。1年目の計画として、1構造解析用のモデルRNA分子の設計・合成、2薬剤探索、3結晶化実験を計画していた。このうち1と3については計画通り実験を遂行することができ、実験3で得られた単結晶を用いて、2年目以降に計画していた4X線結晶解析にも着手することができた。一方で、2薬剤探索については、実験手法や実験条件の検討を行うことはできたが、具体的な薬剤探索作業には着手できなかった。この実験と平行して、我々が開発を目指しているアミノ

グリコシドについての立体構造情報とRNAへの結合様式を明らかにするための実験を行ったが、これについては計画よりも早く構造解析に成功し、原著論文1報(Kanazawa et al., 2017, Nucleic Acids Res.)と国際学会口頭発表1件として報告した。現在、さらに2件の原著論文を執筆中である。以上を総合すると、本研究はおおむね順調に進展している。本研究は、細菌感染症に処方されるアミノグリコシド系抗生物質を、その立体構造情報に基づいて分子改変することで抗インフルエンザ薬へと生まれ変わらせることを目的としている。インフルエンザウイルスは8つに分節された一本鎖ゲノムRNA(vRNA)をもっている。これら8つのvRNAと、複製の過程で作られるcRNの両末端にはプロモーター領域と呼ばれる互いに相補的で保存性の高い配列が存在しており、複製・転写の開始を制御している。本研究では、このプロモーター領域に作用して複製・転写を阻害するアミノグリコシドの探索・設計を行っている。平成30年度は、我々が開発予定の薬剤の標的となるvRNAおよびcRNAのプロモーター領域の立体構造およびその動的変化を明らかにすることを目指した。前年度に結晶化に成功したvRNAとcRNAについて共同利用放射光施設Photon Factoryの構造生物学ビームラインでX線回折実験を行い、良質なデータが得られたものについて構造解析を行った。その結果、vRNAについては合計9個、cRNAについては合計3個の構造決定に成功した。現在はこれら立体構造スナップショットの精密化を進めている。また、複数の天然および化学合成アミノグリコシドをライブラリーとして用いた薬剤探索を行った。その結果、一部の化学合成アミノグリコシドについてプロモーター領域への結合が確認できた。さらに、プロモーター領域に結合させるために設計・合成したフッ素化アミノグリコシドについての立体構造情報およびRNAとの結合様式を明らかにするために、アミノグリコシドが強く結合することが知られているリボソームRNAの特定の領域についてもモデル分子を作成し、アミノグリコシドとの共結晶化および構造解析を行った。これに加えて、本研究を円滑に進めるために、水銀・銀イオンを使ったRNA結晶化法・構造解析法を開発した。平成30年度は、インフルエンザウイルスゲノムRNAのプロモーター領域の立体構造解析と、これによって得られた立体構造スナップショットを用いた動画編集、さらにはプロモーター領域に結合する薬剤探索を計画していた。動画編集は完了していないものの、この素材となる立体構造スナップショットを複数得ることに成功した。また、プロモーター領域に結合する化学合成アミノグリコシドを探索することに成功した。さらに、この領域に結合するように設計・合成した新規アミノグリコシドについて、RNAとの相互作用様式を明らかにすることにも成功した。
非晶質モリブデン酸塩のフォトクリスタリゼーション

申請者らは、最近、非晶質のモリブデン酸アルカリ塩の一種が光エネルギーにより結晶化することを見い出した。この現象は太陽光程度の光で起こり、現象的に非常におもしろい。この現象のメカニズムや現象の起こる構造を明らかにすることにより、光反応などに寄与できる新たな化合物の創製などに応用できる可能性がある。本研究では、フォトクリスタリゼーションに有効な構造上の特徴を明らかにすることとフォトクリスタリゼーションに適した非晶質試料の合成を行うことを目的とした。フォトクリスタリゼーションを起こすことがわかっている非晶質試料の構造をXANES(X線吸収端微細構造)スペクトルの測定などにより調べたところ、その骨格はオルトモリブデン酸塩などに見られるMoO4四面体構造からなるのではなく、三酸化モリブデンなどにみられるMoO8八面体構造からなることがわかった。また、その非晶質試料がフォトクリスタリゼーションを起こす条件を詳細に調べたところ、混合原子価状態をもつ化合物との共存がフォトクリスタリゼーションに非常に有効であることがわかった。これらの知見に基づいて、フォトクリスタリゼーションに適すると考えられる新たな非晶質試料の合成の検討も行い、フォトクリスタリゼーションを起こす非晶質試料と同様の構造をもち、しかも、それ自体が混合原子価状態をとる非晶質試料の合成にも成功した。このフォトクリスタリゼーションのメカニズムを明らかにするには平成9年度科学研究費補助金の申請書に示したような光の吸収に関する定量的な議論を行う研究が必要である。
ヒト人工心筋細胞の純化精製と機能的心臓の三次元再構築

本研究では、ヒト心臓内幹細胞とラット心筋細胞の細胞間融合を介した人工心筋細胞の大量精製後、ラット全心臓の脱細胞化による細胞外マトリックスで形成された足場の作成をした。脱細胞化した心臓への人工ヒト心筋細胞およびヒト心血管前駆細胞の再播種化することで、再構築した自家細胞由来バイオ人工心臓の機能解析及び移植検討した。細胞は5x107個の精製したヒト人工心筋細胞と5x107個のヒト心臓内幹細胞をPBSに希釈し、27ゲージの針使用し5回に分けて左心室内に注入する。回路内を密閉後、約8から10日間持続潅流させることで三次元培養を行い、全周性で均一な生存心血管細胞で覆われた心臓器官の形成に成功した。重症心不全に対する治療法として、機械的人工心臓の埋め込みや脳死心臓移植が目下のところ主流の先端医療であるが、前者は高額な医療費による経済・財政的負担、後者は生涯通じての免疫抑制剤の投与や様々な副作用による多臓器障害が報告されている。自家細胞用いたバイオ人工心臓の作成により、これらの問題点は着実に解決されると予想されるため、本研究目的は1.ラット全心臓の脱細胞化による細胞外マトリックスで形成された足場の作成。2.脱細胞化した心臓への人工ヒト心筋細胞およびヒト心血管前駆細胞の再播種化。3.再構築した自家細胞由来バイオ人工心臓の機能解析及び移植検討。上記の研究計画に基づき、脱細胞化したラットの細胞外マトリックスを用いて、ヒト心臓内幹細胞を大動脈基幹部より冠動脈内に順行性、左心室内に逆行性に循環還流させた。より生着性の高い再播種法として、0.1%のゲラチンを予備循環させることで対応した。この方法によって、細胞外マトリックスへの幹細胞の付着度が格段に増加した。次に再播種前に血管内皮細胞を前循環させることで、基幹となるヒト心臓内幹細胞やヒト人工心筋細胞の足場における生存度が向上した。さらに、マクロ所見としての再播種状況を確認する方法として、緑色蛍光蛋白であるeGFPリポーターに感染させた幹細胞と赤色蛍光蛋白であるm-cherryに感染させた血管内皮細胞を順次再播種させ、蛍光顕微鏡にて2色の細胞種が2層を形成して細胞外マトリックスに生着していることを確認できた。自家細胞用いたバイオ人工心臓の作成により、これらの問題点は着実に解決されるため、本研究目的は、1ヒト心臓内幹細胞とラット心筋細胞の細胞間融合を介した人工心筋細胞の大量精製。2ラット全心臓の脱細胞化による細胞外マトリックスで形成された足場の作成。3脱細胞化した心臓への人工ヒト心筋細胞およびヒト心血管前駆細胞の再播種化。4再構築した自家細胞由来バイオ人工心臓の機能解析及び移植検討。脱細胞化した心臓は、左房及び上行大動脈に18ゲージのカニューレを挿入し心尖部まで電気刺激リードを入れる。370C、5%CO2で酸素化された細胞培地を心房内流量20mL/min、冠動脈流量6mL/minで24時間心臓内に栄養を入れる。前・後負荷は圧センサー介してそれぞれ1-12mmHgと1-60mmHgに制御し、ペーシングリード用いて1Hz, 5-20V, 2msで周期的に心外膜側より刺激する。細胞は5x107個の精製したヒト人工心筋細胞と5x107個のヒト心臓内幹細胞を200&#61549;LのPBSに希釈し、27ゲージの針使用し5回に分けて左心室内に注入する。循環器内科学平成25年度は、計画内容通りに研究は進んでいる。ゲラチンコーティングを用いた細胞外マトリックスの表面加工法、また、血管内皮細胞を前循環させることによる足場での生着性の向上など、技術的に工夫した部分は成果にしっかりと反映されている。平成25年度に確立した細胞外マトリックスの表面加工を駆使して、1x108個オーダーのヒトiPS細胞由来心筋細胞及び血管内皮細胞の再播種を研究の主軸とする。同細胞は既にヒト末梢血由来Tリンパ球を用いて樹立に成功しており、大量の心筋血管細胞への分化誘導後、3次元構築目的の再播種に用いる。
脊髄後角シナプス伝達における生体内D-セリンの 機能解明

神経障害性疼痛は神経の障害、機能不全など様々な原因によって発症し、種種の痛みを生じる慢性疼痛であり、この痛みの多様性ゆえに治療を非常に困難にしている。我々は、マウスに神経障害性疼痛を発症した状態下では、N-メチル-D-アスパラギン酸型グルタミン酸受容体(NMDA受容体)のコ・アゴニストであるD-セリンの脊髄含有量が増加し、脊髄後角シナプスにおけるNMDA受容体を介した興奮性シナプス伝達が活性化されていることを明らかにしてきた。本研究ではD-セリンを合成する酵素セリンラセマーゼ(SR)のノックアウト(KO)マウスを用い、内因性D-セリン及びSRが生体内において痛みの発生機序に果たす役割を、行動学的、また電気生理学的に明らかにすることを目的としている。本年度は、SR-KOマウスの脊髄後角における興奮性シナプス伝達がどのように変化しているかを検討するため、一個の細胞の電気生理学的な活動を観察可能なホールセル(全細胞)パッチクランプ法を用いた解析を進めた。マウス脊髄切片標本を作成し、脊髄後角表層神経細胞から興奮性シナプス後電流(EPSCs)を記録した。EPSCsを薬理学的にNMDA成分と非NMDA成分とに分離し、それぞれのピーク値からNMDA/non-NMNMD比を算出した。また、NMDA-EPSCsの減衰相に指数関数を当て嵌め時定数を算出した。コントロールマウスとSR-KOマウスを比較すると、NMDA/non-NMNMD比およびNMDA-EPSCsの減衰相時定数に有意な違いがあることが見出された。本年度は、研究計画の一つであるホールセルパッチクランプ記録による脊髄後角興奮性シナプス伝達の解析を主に進めた。そして、コントロールマウスとSR-KOマウスを比較した解析から、SR-KOマウスの脊髄後角におけるNMDA受容体を介したシナプス伝達の変化を明らかにすることができ、本研究課題はおおむね順調に進展しているものと考える。SR欠損の侵害受容性刺激に対する応答への影響の行動学的解析や、行動学的表現型を裏付けるための電気生理学的解析を計画通り進める予定である。当該年度は、電気生理学的解析に使用する化学試薬やガスの使用量が当初の予定より少なかったため次年度使用額が生じた。次年度は、行動学的解析や電気生理学的解析を進展させるため、記録に必要な試薬や器具等の消耗品の購入に充当し研究を推進させる予定である。
PPY細胞の細胞系譜の解明ー新規糖尿病治療法開発に向けて

目的:糖尿病発症機構におけるβ細胞とPPY細胞間の分化転換の可能性を示し、その生理的意義を解明する。方法:RIP-Cre;Rosa26R-GFPマウスにHF+STZ負荷し、血糖値上昇、β細胞減少、PPY細胞増加が認められる2型糖尿病マウスを作製、β細胞の細胞系譜を追跡した。PPY-Cre;Rosa26R-YFPマウスを作製し、PPY細胞の細胞系譜追跡を開始した。結果:持続的高血糖により、β細胞ではPdx1発現が低下、PPY細胞への分化転換が誘導されることが明らかとなった。一方、正常な発生過程では、膵島内の一部のインスリン陽性細胞がPPY細胞を由来とすることを確認し、現在詳細な解析を進めている。一部の2型糖尿病モデルマウスでは、血糖値上昇に伴い、β細胞が減少し、PPY細胞が増加するが、生理的条件下でのPPY細胞の細胞系譜は明らかになっていない。本研究課題の目的は、β細胞からPPY細胞、PPY細胞からβ細胞など他の膵島細胞への分化転換の可能性を示し、糖尿病発症機構における生理的意義を解明することである。実験計画1「生理的条件下におけるPPY細胞の細胞系譜の解明」PPY遺伝子発現細胞の細胞系譜を解明するため、PPY遺伝子を追跡するPPY promoter-driven NLS-Creノックインマウス(PPY-Cre)を作製した。PPY-Creは、ROSA26-GFPマウスと交配する。そこから得られたマウスでは、一度でもPPY遺伝子を発現した細胞をGFPで標識し、細胞系譜を追跡することが出来る。平成25年度は、このマウスを用いて、膵発生過程、持続的高血糖条件下におけるPPY細胞の細胞系譜を組織学的に追跡する。実験計画2「β細胞からPPY細胞への分化転換の可能性の解明」1.高脂肪食負荷およびSTZ133mg/kg腹腔内投与(HF+STZ)により、持続的な高血糖、β細胞の減少、PPY細胞の増加などの条件を満たし、本研究課題の遂行に適当な2型糖尿病モデルを作製した。2.持続的な高血糖状態で減少するβ細胞の細胞系譜を追跡するため、一度でもインスリン遺伝子を発現した細胞ではGFPが発現し、β細胞の細胞系譜を追跡できるRIP-Cre; Rosa26R-GFPマウスで前述した2型糖尿病モデルを作製し、組織学的解析を行った。解析の結果、持続的高血糖が、β細胞でPdx1発現低下をもたらし、β細胞からPPY細胞へと選択的な分化転換を誘導することが明らかとなった。この結果は、申請者が第28回日本糖尿病・肥満動物学会で口頭発表し、若手研究奨励賞を受賞した。本研究課題の目的は、β細胞からPPY細胞、PPY細胞からβ細胞など他の膵島細胞への分化転換の可能性を示し、糖尿病発症機構における生理学的意義を解明することであった。1. β細胞からPPY細胞への分化転換の可能性の解明「高血糖で増加したPPY細胞はβ細胞を由来とする。」2型糖尿病モデルである高脂肪食及びストレプトゾトシンを負荷した(HF+STZ)マウスでは、血糖値が400mg/dL以上という高血糖をきたし、β細胞が減少する一方、PPY細胞が増加することを認めた。インスリン遺伝子を発現する細胞を追跡するため、Rat InsulinII promoter-driven Cre (RIP-Cre)とRosa26 promoter-driven GFP (Rosa26R-GFP)両トランスジーンを有する個体にHF+STZ負荷し、血糖値上昇、β細胞減少、PPY細胞増加が認められる2型糖尿病マウスを作製した。β細胞系譜追跡により、β細胞由来のPPY細胞が複数存在し、それらの細胞では特にPdx1の発現が低下していることを明らかにし、2014年10月第10回Diabetes Research Forum in Tokyoで発表した。以上の結果については現在論文準備中である。2.生理的条件下におけるPPY細胞の細胞系譜の解明細胞生物学実験計画1、2共に、申請者は、研究結果について研究室内で定期的なdiscussionを行いながら遂行した。実験計画1、PPY遺伝子を発現した細胞を標識するためには、PPY-CreとRosa26R-GFPの2種類のマウスが必要であり、これらを交配し得られたマウス(PPY-Cre; Rosa26R-GFP)を実験に用いる。新規にPPY-Creを作製するため、コンストラクトの作製、マウスへの遺伝子導入、ファウンダーマウスの作製など多段階のステップを踏み、PPY-Creの作製を試みた。結果、申請者らは、実験計画通り、PPY-CreのF1マウス11匹を得ることが出来た。

実験計画2、本実験計画を遂行するための2型糖尿病モデルの作製では、まず、本研究計画の遂行に適切なSTZ負荷量を決定する必要があった。申請者らは、数種類の濃度のSTZをマウスに負荷し、12週間後に膵組織を解析、比較し、血糖上昇だけでなく、膵組織におけるβ細胞数、PPY細胞数の変化が観察できる条件を決定した。この2型糖尿病モデルを、一度でもインスリン遺伝子を発現した細胞がGFP標識されるマウスで作製し、実験計画通り、β細胞の細胞系譜の追跡を行い、結果を得ることができた。実験計画1、平成24年度に作製したPPY-Creと、既存のRosa26R-GFPと交配し、PPY-Cre; Rosa26R-GFPを作製、PPY細胞の細胞系譜の追跡を開始する。実験では、PPY-Cre; Rosa26R-GFPを用いて、胎生初期から膵発生が完了するステージにおけるPPY遺伝子発現細胞の細胞系譜を免疫組織化学的に追跡する。予想される結果を以下に示す。胎生初期、未分化な内分泌細胞の中に、PPY遺伝子を発現するがインスリン遺伝子を発現しない細胞(GFP (+), PPY (+),インスリン(-))が出現する。申請者は、正常発生における胎生中期以降、この細胞には、以下のような細胞系譜をとる細胞である可能性が考えられ、本研究課題の遂行により、明らかにする。仮説1:胎生初期に発現していたPPY発現が低下し、インスリンのみを発現する細胞へと分化する。つまり、PPY遺伝子発現細胞はインスリン遺伝子発現細胞への分化能を有することを示す。仮説2:胎生初期にPPYを発現した細胞は、胎生中期以降もPPYのみを発現する。つまり、PPY遺伝子発現細胞はインスリン遺伝子発現細胞への分化能を持たないことを示す。実験計画2、実験計画の大部分は平成24年度に遂行できた。平成25年度は、平成24年度の解析結果の再現性、および2型糖尿病モデル作製に用いたSTZによる、β細胞からPPY細胞への分化転換への影響を明らかにする。具体的には、STZ負荷による高血糖誘導後、膵島移植により血糖改善させ、β細胞からPPY細胞への分化転換の有無を確認する。また、平成24年度に明らかにした、持続的高血糖条件において誘導されたPdx1発現低下を調節する転写因子を、細胞生物学的に明らかにする。