hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
現代アメリカ政党の「支持者連合」形成の変容：選挙過程の集票戦略を中心に

研究初年度は先行研究の文献調査による基礎研究を中心に行う予定であったかが、予定していたオバマ政権期の特質、2016年大統領選挙が政党に与えた余波の総括の双方をめぐる現地調査において、調査対象となる政党、活動家、利益団体などの聞き取り調査も円滑に進んだ。その成果の一部は2016年大統領選挙の総括として「選挙研究」論文等で発表した。これらの知見は海外での口頭報告にも反映され、国内外の研究者からフィードバックを得ることができた。2年度目は中間選挙年であることを踏まえ、トランプ政権と共和党の関係性、民主党内の支持者連合の形成に焦点を絞り、中間選挙前の現地調査も行なった。共和党の支持基盤に関しては、W・ブッシュ政権との比較において宗教保守派が、候補者本人の敬虔さよりも候補者の実行力を評価する変容期にあること、トランプ支持マシーンとしては宗教保守派を代表に「トランプ連合」が共和党の集票マシーンとしては伝統的な支持基盤に依存していることを明らかにした。具体的にはかつてパット・ロバートソン牧師の「キリスト教連合」の組織化に手腕を発揮したラルフ・リードが率いる「信仰と自由の連合」についてアイオワ州での現地調査も含めて詳細に分析した。宗教保守派と財政保守派の党内分断を抑制する「党内架橋」の争点選択が行われていることなど1990年代までの宗教保守派との差異も浮き彫りにした。事例研究として、最高裁判事指名問題と分極化の関係について、世俗派が保守的なキリスト教徒の政治的倫理観を理解していないことが判事指名をめぐる世論形成における方向性の背景にあったことを分析した。また、民主党側では民主党内で白人労働者票の取り戻しについては、労働組合を支持母体にする労組系のリベラル派が僅かにそれを唱えるに留まり、白人労働者票を放棄することはやむを得ないという気配が強い中、かつての中道系「ブルードッグ」の基盤だった文化的に保守的な地域がトランプ大統領に抱え込まれる過程で、1990年代にも増して西部ハイテク基盤に民主党が資金面で依存が深化し、穏健派の変質も変容を余儀なくされていることを明らかにした。リベラル派内で労働組合の影響力が縮小し、文化的リベラル派が台頭し、「アイデンティティ政治」の奥に控える別の層の分断としての学歴・所得の差についても明らかにした。中間選挙年における現地調査が、通常観察しにくい宗教保守派の集会に参加する形で遂行できたことの他、本研究の中間的分析を国際報告等でアメリカの専門家のみならずアジアの政治学者と幅広く討議することで多面的に検証できた。これにより、民主党の総リベラル化現象にも見える情勢の裏で、民主党内のリベラル派と穏健派の対立軸の性質が変容していることなど、過去の研究との連動性も今期において多々浮き彫りになった。また、これらの成果を複数の論文にまとめることができた他、トランプ支持母体の白人労働者層の文化的な系譜を詳述した原書の翻訳を行なう中で、貧困白人層を政治的に分析する解説論文も執筆した。政党の支持者連合に関係する選挙運動の変容をめぐる研究も進め、アメリカの選挙が資金面での選挙規模は増大の一途をたどっているが、キャンペーン規模の絶対量が勝利を約束しないことを2018年中間選挙の事例でも再確認した。
色素性乾皮症D群の相補遺伝子のクローニング

色素性乾皮症(XP)はDNA修復欠損、高率の突然変異と皮膚発癌を示し、8相補群からなる。XPDタンパクは分子修復機構上重要な役割を果たしている。まず大切なことはXPD細胞のUV感受性とDNA徐去修復能の欠損を相補するcDNA遺伝子をクローニングすることである。本研究も含めこれまで13人の日本人XPD患者を細胞融合法で確定した。XPDは、XPAに次いで、UVによるピリミジン2量体や(6-4)光産物のDNA損傷の修復能を80-90%欠損し、発癌が見られたが、欧米より神経症状をもつ例は稀であった。日本人XPD患者のXP59TO細胞をpSVOri^-で不死化した細胞株XP59TOpSVを樹立した。これに、ヒト正常cDNAのpcDおよびpCD2ライブラリー(G418耐性の選択マカーであるneo遺伝子を発現する)と、さらにλpCEV-cDNAライブラリーを導入して発現クローニングを試みた。pcD-cDNAとpcD2-cDNA導入とG418/UV選択によって得られたそれぞれ10個と21個のクローンにつき、UV生存曲線と不定期DNA合成(UDS)を検定したが、もっともUV抵抗性であったpcD2-D17クローンでも平均致死線量Do=15J/m^2、UDS=35-50%であり、いずれも親株XP59TOpSV(Do=0.7-1.2J/m^2,UDS=40 %)を十分に相補する結果が得られなかった。したがって、pcDとpcD2-cDNAの中に完全長のXPDcDNAがないことが示唆された。そこで、正常cDNAとLTRプロモター下流に一方向性に挿入し、かつneo遺伝子を持つλpCEV-cDNAライブラリー(10μg/ml)を大スケール(総数5x10^7細胞)でXP59TOpSV細胞に導入し、選択した。究極的に得られた2個の安定なUV抵抗性のクロ-ン(pCEV-D2,pCEV-D4:Do=1.5-2.0J/m^2)は、親株XP59TOpSV(Do=0.7J/m^2)の2-3倍の大きいDo値と70-80%UDSの部分相補した。修復能の高いpCEV-D2のゲノムDNAは、約9kbのMluIのplasmid制限酵素断片をもち、役2.5kbcDNAを含んでいた。このcDNAは、ERCC2cDNAを同じNotI部位とPCR増幅を示すので、XPDcDNAが発現クローニングされたことを示している。日本の3人XPD細胞のmRNAをRT-PCRすると、2細胞では予想のPCR産物が得られたが、少なくとも1例にmRNA量の異常が見られた。これを基礎にXPDの突然変異と修復への分子的関与を今後明かにしたい。

これを基礎にXPDの突然変異と修復への分子的関与を今後明かにしたい。色素性乾皮症のD相補群(XPD)は,世界的に頻度が高く,高発癌性で,紫外線(LIV)損傷をほぼ完全に欠損する.XPD細胞のLIV高感変性とDNA除去修傷欠損を相補する置伝子をクロ-ニングすることは、XPDの遺伝性突然変異を明らかにし,XPDタンパクの機能を知る上で大切である。本研究では,第一に日本人XPDのXP59TO線維芽細胞を複製原点の欠失変異をもつSV40断片(pSVΔOri)で形質転換し,不死化クロ-ンを得た。このクロ-ンのLIV感変性は親株と同一(n=1.0,D_1(平均致死線量)=0.75/m^2)の高感変性であった。第二に,ヒト正常cDNAライブリ-(pCD)およびネオマイシン耐性遺伝子を発現するpCD2ライブラリ-を数回大スケ-ルで導入した。コンプレキシティ-が低く,pCRで増巾できるcDNA組込み乾換株が得られなかった。そこで,正常cDNAが一方向に挿入され,LTRプロモ-タ-で発現され,かつneo遺伝子をもち,プラスシド回収ができるλpCライブラリ-を用いて,導入・形質転換実験を3回(10^8細胞)行った。その結果,二次選択で20個,さらにLIV生存曲線スクリ-ニングで3個(D_0=1.7,1.7,2.0J/m^2)を選択した。そのうち,1クロ-ンがneo断片をもつ安定なクロ-ンとして得られた。現在プラスシド回収を行うと同時に,そのゲノムDNAをcDNA挿入部の5'と3'ベクタ-配列の人工合成PCRプライマ-を用いて増巾した。このcDNAがXPD細胞を相補するかを知るために必要なクロ-ンを得るために,このPCR増巾断片を用いて,ネオマイシン耐性遺伝子を発現するpCD2ライブリ-から選択とクロ-ニングを行っている。今後cDNAがクロ-ニングできると,その構造解析が期待できる。色素性乾皮症(XP)のD相補群(XPD)は、XPAやXPCとともに、世界的に頻度が高く、高発癌性を示す。XPD群細胞はXPAに次いでUVによるピリミジン2量体や(6-4)光産物のDNA損傷の修復能を80-90%欠損する。まず大切なことはXPD細胞のUV感受性とDNA除去修復能の欠損を相補するcDNA遺伝子をクローニングすることである。これはXPDタンパクの分子修機構上での役割を知るためにも大切である。本年度は、pSVOriで不死化した日本人XPD患者由来のXP59TOpSV細胞にヒト正常cDNAのpcD2ライブラリー(G418耐性の選択マーカーであるneo遺伝子を発現する)の導入とG418/UV選択によって得られた21クローンにつき、UV生存曲線と不定期DNA合成(UDS)を検定した。その中もっともUV抵抗性であったpcD2-D17クローンでも平均致死線量Do=1.2J/m^<2、>UDS=35-50%であり、いずれも親株XP59TOpSV(Do=0.7J/m^2、UDS=40%)を十分に相補する結果が得られなかった。したがって、pcD2-cDNAの中に完全長のXPDcDNAがないことが示唆さされた。そこで正常cDNAをLTRプロモター下流に一方向性に挿入し、かつneo遺伝子をもつpCEV-cDNAライブラリー(10μg/ml)を大スケール(4回、総数5x10^7)でXPD群のXP59TOpSV細胞に導入し、選択した。究極的に2個の安全な部分的UV抵抗性のクローン(pCEV-D2,pCEV-D4)が得られた。これら2クローンは、Do=1.5-2.0J/m^2を示し、
生活空間におけるロボットの愛着行動とロボットの長期受容を可能にする方法論の確立

本研究では,ロボットの長期受容を可能にする方法論の確立を目指して,生活空間におけるロボットの愛着行動とその評価について取り組んだ。動物行動学的に獲得した犬の振る舞いをロボットへ応用し,社会的で簡便でロバストな人とロボットの相互作用を実現するアプローチとしてEtho-roboticsを提案している.本研究では特に,犬の愛着行動に着目してモデル化し,ロボットへの導入を行った.犬の愛着行動は,strange situation testと呼ばれる犬の飼い主と飼い主以外の人がいる未知環境において,様々な状況を生じさせて犬がどのように振る舞うかを観察し,動物行動学者により状況と振る舞いの組み合わせとして記述されたものである.この知見に基づき,本研究課題では,状況に応じたロバストな行動生成を要件としてロボットのための愛着行動モデルを実現した.具体的には愛着行動を引き起こす環境要因を記述するため3つの行動要因を導入した。飼い主との離別状態に対するストレス,飼い主以外の存在に対する不安感,未知環境に対する探索欲求の3つである.飼い主の位置付けとしてロボットのオーナー,オーナー以外の他者,そしてロボットの位置を計測し,3つの行動要因を数値化して,行動要因となるストレスとして空間的に仮想的なポテンシャル場として表現した.そして,愛着行動はこのストレスを下げるための行動であると位置付け,もっともストレスを下げるために効果的な位置をロボットの次の時刻の位置として行動生成する手法を実装した.この愛着行動に加え,ロボットを生活空間で使用することを想定して,環境に設置したセンサと協働して見守りを行う機能を追加した.最終年度には,愛着行動の有無が見守りをするロボット(技術)に対して人の評価がどのように異なるかを評価することにより,愛着行動の有無がロボットの受容性に及ぼす影響を評価した.本年度は,生活空間における愛着行動のモデル化に取り組んだ。日常生活環境での利用を考えたとき,先行研究で提案した愛着行動モデルは非常に限定的であった。そこで本研究では,日常生活環境に対応するために,以下の用件のもとに愛着行動モデルの再設計を行った。a)人との愛着関係及び社会的関係と周辺環境状況に応じた振る舞いを可能にするための行動要因パラメータを導入するb)ストレス要因の計測と行動要因パラメータとしての統一的に表現するc)人とロボットの関係を表す行動特性パラメータの更新メカニズムを導入する一つ目の要件に対して,観察される犬の振る舞いから,人物それぞれにポジティブなストレスとネガティブなストレス要因があるといる。そのため,環境内に存在する人それぞれに対して,行動特性パラメータ(なつき度)及び「寂しさ」と「不安」の二つのストレス要因を行動要因パラメータとして設計した。なつき度と状況に応じて二つの行動要因パラメータを更新する。またこの行動要因パラメータの考え方は人だけでなくモノ(おもちゃやおやつ)にも拡張できる。二つ目の要件に対して,人とロボットの距離の変化及び人とロボットが離れている時間をストレス要因として計測し,それに基づいた行動要因パラメータ更新ルールを設計した。これにより,「人が部屋を出た」のようはイベント発生時にのみストレス要因が計測されるのではなく,常時計測し行動要因パラメータとして反映することが可能となる。三つ目の要件に対して,ロボットが直接対象を観察する直接的探索と他者の対するオーナーの振る舞いから対象を解釈する社会的参照を,ロボットのなつき度を更新するルールとして導入した。最後に,イベントの発生時だけでなく,逐次的な周辺環境状況の変化に応じてロボットが行動できるよう,行動要因パラメータに基づくロボットの行動生成モデルを設計し,ロボットの愛着行動モデルとして実現した。上の「研究実績の概要」に示したように日常生活環境に適用可能な愛着行動のモデル化はおおむね順調に進展している。さらに,動作表現としてロボットの移動軌跡の設計,及びロボットへの実装についても順調に進展している。本研究課題でロボットの受容性を高めるため犬の愛着行動をロボットに実装し,人とロボットのコミュニケーションを実現している。昨年度は,ロボットの行動特性パラメータ(人へのなつき度としてみなすことができる)の更新にあたっては,ロボットのオーナー役の被験者と他者役の被験者間の距離に基づく社会的参照を導入したが,人の振る舞いそのものに関しては単にロボットとの距離を考慮したのみであった。本年度は,人のロボットへのリアクションをより適切にロボットの行動特性パラメータの更新へ反映するため,次の項目について観測と評価を行った:ロボットとコミュニケーションする人の姿勢,顔の向き,ロボットとの距離の変化,及びロボットとのコミュニケーション時におけるオーナーと他者距離。これらの項目を計測し,ロボットの振る舞いに対する人のリアクションとして評価した。これらの評価値に基づきロボットの行動特性を更新し,人とロボットのコミュニケーションの履歴をロボットの愛着行動へ反映させることを実現した。ロボットの行動特性パラメータの値を更新できたとしてもそれをロボットが振る舞いとして表現し,さらにそれを人が理解できなければならない。そのため,行動特性パラメータに応じたロボットの動作設計を行い,ロボットの振る舞いとして実装した。行動特性パラメータをコミュニケーションの履歴に応じて変更させ,さらに人がその変化が気づくことができた場合,人はロボットの行動特性を正しく推測することが可能であることを被験者による評価実験を通じて示した。行動特性パラメータが変化しない場合,ロボットの人へのなつき度状態の解釈には被験者間でばらつきがあり,ロボットの人へのなつき度を適切に推測されなかったことから,人とロボットのコミュニケーションにおいてロボットの行動特性は人とのコミュニケーションの履歴に応じて変更されることが望ましいことが示された。ロボットの振る舞いに対する人のリアクションを人のロボットへの関心の定量化と捉えれば,この点に関しては当初の計画以上に進展しているといえる。

また,ロボットの行動特性が変わった際,それをいかに人が把握可能にするかという点については当初計画していたよりも重大な問題解決が必要となったが今年度中に対応できたことは順調に進展していると判断できる。一方,被験者とロボットとのコミュニケーション実験においては,被験者の確保や実験期間の確保など,解決すべき課題がある。ロボットの愛着行動モデルの堅牢性に課題があり,長時間安定してロボットを動作させることが困難であることが実験の準備を通じて明らかになった。また,「なつき度」としてモデル化している人とロボットの関係性を,人とロボットのインタラクションの履歴から更新する処理が適切に計算されていないことがわかった。そのため,今年度は,長時間の実験実施に向けた愛着行動モデルの改良を行った。その結果,長時間安定して動作できることを確認し,愛着行動の有無によるロボットとのコミュニケーション実験を通じて,新しく改良した行動モデルによって,適切に愛着行動が示され,さらにロボットやロボットの振る舞いについて事前知識のない被験者であっても,ロボットが誰に対して懐いているかといった愛着行動の特徴を適切に理解していることを確認した。なつき度の適切な変化に関しては引き続き取り組んでいく。また,生活空間でのロボットの利用を考え,ロボットの愛着行動に加え,見守り機能を実装した。3次元測域センサによる人の位置,姿勢の計測,及びカメラとの統合による人の視野推定を新たに実現し,環境の構成と人,ものなどの動物体の移動履歴を表した環境地図を生成し,不審者,不審物,人の危険などを検出し,ロボットが人へ伝達する。この機能は,生活空間でのロボットの長期利用を想定しやすくするものと位置付けられる。さらに,不審物の存在などを非言語情報で伝達できることを確認し,また愛着行動をベースとして見守り行動を導入した際も被験者はロボットの愛着行動を理解していることを確認した。・研究者の家庭の事情により計画通りに研究を遂行できず,研究計画の見直しが必要になった。・研究実績の概要にも示したように,ロボットの行動モデルの見直しが必要となり,大規模な改良が必要となったことから想定したよりも時間を要した。・しかし,行動モデルの改良は概ね完了し,評価実験を行うことができた。また見守り行動の追加など新しい成果も得られたため,現状としては「やや遅れている」と判断する。本研究では,ロボットの長期受容を可能にする方法論の確立を目指して,生活空間におけるロボットの愛着行動とその評価について取り組んだ。
ハイパーブランチポリマーの嵩高さを利用した新規リビングラジカル重合の開発

連鎖縮合重合とそれに続くフォーカルポイントの修飾によって合成した分子量と分子量分布の制御されたハイパーブランチポリアミド(HBPA)を持つ高分子モノマーのラジカル重合を検討した。本研究期間を通じて、2,2'-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル) (V-70)を用いて重合温度を30°CでHBPAを持つ高分子モノマーのラジカル重合を行うと、高分子量で分子量分布の狭いグラフトポリマーが生成することを明らかにした。本研究では、分子量と分子量分布の制御されたハイパーブランチポリアミドを持つマクロモノマーのラジカル重合を検討し、ハイパーブランチポリマーが嵩高く、コンホメーションの変化がほとんどないことによって生長ラジカルの失活を抑制する新規リビングラジカル重合の開発を目的とする。今年度は、まず、開始剤存在下でAB2モノマーの連鎖縮合重合を行い、種々分子量(重合度)の異なるN-メチル基を有するハイパーブランチポリアミドを分子量分布狭く合成したのちに、ハイパーブランチポリマーのフォーカルポイントを官能基変換して、メタクリル酸エステル部位を有するハイパーブランチポリアミドマクロモノマーを得た。次に、ラジカル開始剤に2,2'-アゾビス-(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル) (V-70)を用いて30 °Cでハイパーブランチポリアミドマクロモノマーのラジカル重合を行い、ハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの重合度と生成するグラフトポリマーの分子量分布や重合度の関係について調べた。その結果、ハイパーブランチポリアミドの重合度が1のモノマーのラジカル重合では、分子量分布の広い(1.9-2.0)グラフトポリマーが生成したのに対し、ハイパーブランチポリアミドの重合度が8程度のマクロモノマーのラジカル重合では、比較的分子量分布の狭い(Mw/Mn = 1.28)グラフトポリマーが生成することを明らかにした。さらに、ハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの重合度を15、39、75程度にした場合もラジカル重合が進行し、いずれも分子量分布が1.3以下のグラフトポリマーが得られた。また、ハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの重合度が低くなるにつれて、生成するグラフトポリマーの重合度が高くなることがわかった。昨年度は、フォーカルポイントにメタクリル酸エステル部位を有するハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの合成法を確立し、ラジカル開始剤に2,2'-アゾビス-(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル) (V-70)を用いてo-ジクロロベンゼン中、30 °Cで重合すると、比較的分子量分布の狭いグラフトポリマーが生成することを明らかにした。今年度は、まず、上記マクロモノマーのラジカル重合における時間とモノマーの転化率の関係、時間と生成ポリマーの分子量および分子量分布の関係を調べた。その結果、時間が経過するにつれてモノマーの転化率は直線的ではないが上昇し、生成ポリマーの分子量は数万ずつ高くなり、分子量分布は常に狭い値を示した。次に、マクロモノマーの濃度を43 wt-%から21 wt-%、11 wt-%に薄くして同様に重合を検討したところ、濃度を薄くするにつれて時間経過に対してモノマーの転化率の上昇が遅くなった。また、時間経過に伴う生成ポリマーの分子量上昇は見られなかった。このことから、本重合はモノマー濃度によって挙動が異なることがわかった。これらのことから、リビング重合ではないが、濃度を濃くした場合にハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの単独重合によって、分子量分布の狭いグラフトポリマーが得られることを明らかにした。種々分子量(重合度)が異なる、N-メチル基を有するハイパーブランチポリアミドマクロモノマーのラジカル重合によって、いずれも比較的分子量分布の狭いグラフトポリマーを得ることができた。これらの結果と次年度に行う予定の分岐度の異なるハイパーブランチポリアミドマクロモノマーのラジカル重合の結果を比較して、マクロモノマーの分子量(重合度)や構造の最適化を行うことで、新規リビングラジカル重合の開発が達成されると思われる。高分子合成化学、多分岐高分子次年度は、まずAB2モノマーのN-アルキル基を変えて、分岐度の異なるハイパーブランチポリアミドマクロモノマーを合成し、N-メチル基を有するハイパーブランチポリアミドマクロモノマーと同様の条件でラジカル重合を行い、結果を比較し、マクロモノマーの構造の最適化を行う。また、重合挙動についても調べる。次に、最適化したハイパーブランチポリアミドマクロモノマーのラジカル重合を行った後に、続けてセカンドモノマーを加えることでブロック共重合体が得られるか検討する。実験器具、機器の部品、試薬の中にキャンペーン価格で購入できたものがあり、予定より安価になったため、次年度使用額が生じた。経費の節減によって生じた使用残に関しては、次年度の研究費と合わせて必要な試薬や実験器具の購入に使用する。
虚血変性アルブミンとParaoxonase-1による脳血管障害の血中マーカー開発

気管支喘息や慢性気管支炎など、慢性的な呼吸不全患者において、長年の闘病生活の末、突然の容態急変はよく遭遇する現象である。容態急変の予知、あるいは予防には、過去の一定期間を反映した呼吸不全状態マーカーが求められてきた。呼吸不全の重症度評価には、血液ガス(PaO2)や酸素飽和度(SaO2)が広く用いられている。これらは「その瞬間」に限られた酸素濃度を示す指標である。喀痰の吸引処置等で呼吸状態が一過性に改善した場合、Pa02やSaO2の値は一時的な改善を見せるのみであり、患者の全身状態を反映する「長期的な低酸素状態にともなう身体のダメージ度を反映する指標」は存在しない。本研究では、組織虚血マーカーであるIschemia Modified Albumin (IMA)とParaoxonase-1 (PON1)の2つを候補と捉え、検討を行ってきた。このうちIMAは、虚血状態においてN末端アミノ酸8個に非可逆的変性をきたしたアルブミンである。アルブミンの血中半減期は約1週間であるため、糖尿病における血糖値とグリコアルブミンの関係の如く、IMAが過去1週間の低酸素状態の指標に使える可能性がある。我々の検査法は、「比色法」という非常に簡単な原理で実施できるため、将来は自動分析機に搭載し緊急検査にも応用できる。今後は実際に多くの症例の検討を行い、慢性呼吸不全患者のQOL向上に貢献したい。虚血変性アルブミン(ischemia-modified albumin:IMA)は、人体組織の虚血状態において、N末端アミノ酸8個に非可逆的変性をきたしたアルブミンである。心筋梗塞初期での血中濃度上昇が報告されており、組織虚血のマーカーとして各種疾患での動態が着目されてきた。一方、脳卒中や脳梗塞といった脳血管障害は、我が国の死亡統計で上位5番以内にランクされる「国民病」である。現在、国内に広く普及している頭部CT撮影は、脳出血急性期の検出に優れているが、脳梗塞では変化に乏しいため、診断は必ずしも容易ではない。もし血液マーカーで診断できるようになれば、混雑を極める救急医療の現場に大きく貢献できる可能性がある。そこでIMAと関連マーカーに注目し、脳血管障害での応用が出来ないかを検討した。今までの研究からIMAに加え、血清paraoxonase1 (PON1)活性、soluble receptor foradvanced glycation end-product (sRAGE)が有望な候補として浮上していたため併せて検討した。PON1とはリポ蛋白であるHDLの粒子内に存在する抗酸化酵素で、動脈硬化疾患での活性低下や、血液浄化での活性回復を我々は過去に報告している。またsRAGEは、脳を始めとする組織の壊死において、その進展に伴い血中への漏出が推定される蛋白である。測定方法は申請者の既報によった。同意の得られた被験者より血液1mlを採取し、比色定量する簡便な分析法である。sRAGEはELISA法で測定した。15名の脳血管障害患者で検討した結果、IMA、PON1活性は健常者にくらべ有意な変動がみられなかったが、sRAGEでは発症早期より上昇傾向をみとめ、加療により低下する症例がみられた。現時点ではまだ症例数が限られるため、さらに症例を集め応用の可能性を探っている。虚血変性アルブミン(ischemia-modified albumin:IMA)は、虚血状態においてN末端アミノ酸8個に非可逆的変性をきたしたアルブミンである。一方、高齢人口の増加に伴い患者が増えつつある呼吸不全では、病状のアセスメントに血液ガスや酸素飽和度がルーチンに測定される。これらは、その「瞬間」での酸素濃度を示す指標であり、長期間の低酸素状態を反映するものではない。アルブミンの血中半減期は約1週間であるため、糖尿病における血糖値とグリコアルブミンの関係の如く、IMAが過去一週間の低酸素状態の指標となるかもしれないと申請者は推定した。同意の得られた被験者より血液1mlを採取し、比色法で定量する簡便な分析法である。種々の慢性呼吸不全患者で臨床経過との対応を検討した結果、平成25年までの検討範囲では有意な変動を認めることはできなかった。その原因として、採血から分析までの経時的変化、検体保管条件の関与が推定された。呼吸不全で測定される血液ガスや酸素飽和度は、その瞬間での酸素濃度を示す指標であり、長期間の低酸素状態を反映するものではない。呼吸不全患者は慢性的な低酸素状態に置かれた後、急変することがまれでないため、長期低酸素状態を反映するマーカーの考案が待たれてきた。そこで、同意の得られた被験者より血液1mlを採取し、比色法で定量する簡便な分析法である。種々の慢性呼吸不全患者で臨床経過との対応を検討した結果、平成25年度までの検討では有意な変動を認めることはできなかった。その原因として、採血から分析までの経時的変化、検体保管条件の関与が推定されるため、現在、検体採種条件などを変えて再検討行っている。

平成26年度に大学の意向により、主たる研究場所である臨床検査室の改築移転が行なわれ、別棟への移転が急遽とり行われた。この結果、研究機器等の稼働スペース並びに研究材料保管場所の確保が困難となり、一時的ではあるが研究遂行が困難な状況が生じている。検体の収集、臨床背景の追跡などは引き続き順調に行なわれているが、実験場所の確保を夜間日常業務後に行なわねばならないなど調整が必要な状況となっており、研究遂行に若干の遅延が生じている状況である呼吸不全は慢性、急性を問わず死亡の原因となる重大な病態である、呼吸が維持されている患者において、重症度評価の目的で測定される血液ガスや酸素飽和度は、その瞬間での酸素濃度を示す指標であり、長期間の低酸素状態を反映するものではない。呼吸器疾患患者において、患者の容態急変は稀ならず遭遇する現象であり、その予知には、長期間での呼吸不全状態を反映する指標が求められる。しかし現在の臨床現場にそのような指標は存在しない。そこで本研究では、組織虚血マーカーであるIschemia Modified Albumin (IMA)とParaoxonase-1 (PON1)の2つを候補と捉え、検討を行ってきた。IMAは、虚血状態においてN末端アミノ酸8個に非可逆的変性をきたしたアルブミンである。アルブミンの血中半減期は約1週間であるため、糖尿病における血糖値とグリコアルブミンの関係の如く、IMAが過去1週間の低酸素状態の指標に使える可能性がある。本研究では、同意の得られた被験者血をさまざまな保存条件で検討したところ、IMAがその候補となる可能性が再び示され、ようやくpreliminaryながら発表の段階に到達しつつある。採取後に分析に至るまでの時間短縮と検体の気密性確保が検体の劣化予防に有効である可能性が示されつつある。しかし臨床現場で実際に応用するには、多くの症例で検証が必要であり、現在検討が進められている状況である。我々の検査法は、比色法という非常に簡単な原理で実施できるため、自動分析機に搭載して緊急検査にも対応し得る分析法である。現在、最終年度に向け知見の集積を進めている。研究室である臨床検査室の引っ越しが2014年に行われ、検査体制の再構築に時間を要したため。また検体が思うように集まらなかったため。脳血管障害の重要な予後因子である呼吸不全は、慢性、急性を問わず死亡の原因となる重大な病態である、通常、呼吸が維持されている患者において、重症度評価の目的で測定される血液ガスや酸素飽和度は、その瞬間の酸素濃度を示す指標であり、必ずしも長期間の低酸素状態を反映しない。慢性的な呼吸不全患者において、患者の容態急変はよく遭遇する現象であり、その予知には、長期間での呼吸不全状態を反映する指標が求められている。本研究では、組織虚血マーカーであるIschemia Modified Albumin (IMA)とParaoxonase-1 (PON1)の2つを候補と捉え、検討を行ってきた。
炭素五員環含有型抗生物質パクタマイシンの生合成機構解明

パクタマイシン生合成遺伝子クラスター中には機能未知の酵素遺伝子が複数存在している。一昨年度までにピリドキサール5'-リン酸(PLP)依存型酵素であるPctVが一次代謝産物である3-デヒドロシキミ酸から二次代謝産物である3-アミノ安息香酸への変換を担う酵素であること、および、PLP依存型酵素であるPctCが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)依存型脱水素酵素PctPと共同して、N-アセチル-D-グルコサミンのグリコシドの糖部位の3位の水酸基をアミノ基へと変換する機能を有することを明らかにしている。昨年度は、未解明な部分が多いパクタマイシンの生合成経路を明らかにするために、PctPとPctCによるアミノ基導入反応の基質特異性を調べた。PctPの基質として、N-アセチル-D-グルコサミニル-3-アミノアセトフェノン(GlcNAc-AAP)などのアニリン類縁体のN-グリコシドや、アニリン類縁体と縮合する前の糖ヌクレオチドが考えられる。また、糖部位がメチル化などの修飾を受けたN-グリコシドも基質となり得る。そこで、種々のN-グリコシドや糖ヌクレオチドがPctPによって酸化されるかどうかを調べた。その結果、GlcNAc-AAPを基質とした場合に、効率よく酸化反応が進行することが明らかとなった。これにより、パクタマイシンの生合成において、まずは糖転移反応によりN-グリコシドが生成し、続いて糖部位の他の部位が修飾されるよりも前に3位の水酸基がアミノ基へと変換されることが強く示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。そこで、推定生合成経路を見直し、炭素五員環形成に直接関与し得る酵素と、炭素環形成の前に働き得る酵素を選出した。そして、これらの酵素の機能をin vitroで調べるために、大腸菌による異種発現を試みた。種々の条件検討の結果、これらの酵素を大腸菌にて発現させ、ほぼ単一の酵素として精製することができ、in vitroでの反応検討のための土台を整えることができた。また、これまでに、パクタマイシン生合成遺伝子クラスター中にコードされるピリドキサール5'-リン酸(PLP)依存型酵素PctVが3-デヒドロシキミ酸を3-アミノ安息香酸へと変換する機能を有することを明らかにしている。本反応は、1つの酵素によって一度のアミノ基転移反応と二度の脱水反応が触媒されるため、その多段階反応機構に興味を持ち、研究を行った。まず、活性部位に存在する種々の極性残基に対する点変異体を作製して酵素活性を調べた。その結果、PLP依存型酵素に広く保存されているリシン残基に変異を導入した場合にのみ3-アミノ安息香酸の生成が見られなくなることがわかった。また、このリシンをアルギニンへと変異させた変異体の反応溶液中には赤紫色の化合物が蓄積することがわかった。そこで、この変異体酵素を用いて結晶化を試みた結果、活性部位にキノノイド体が結合した結晶構造が得られた。このキノノイド体は3-デヒドロシキミ酸とピリドキサミン5'-リン酸とが結合したものであり、野生型酵素の反応液中にも一時的に現れる反応中間体であることがわった。また、変異体の結晶構造により、PctVの3-デヒドロシキミ酸認識機構も明らかにすることができた。以上の結果に基づき、PctVの酵素反応機構を解明した。一昨年度までに、炭素五員環形成に直接関与し得る酵素と炭素環形成の前に働き得る酵素を選出し、大腸菌による異種発現を可能にしていた。そこで昨年度は、それらの酵素のin vitroでの反応を検討した。炭素五員環の形成反応には酸化酵素が直接関与していると推定しており、候補となる酵素は2つあった。そのうちの一つであるPctPに関して、グリコシドの3位を酸化する活性を有することが種々の検討の結果明らかとなった。この酵素は、ピリドキサール5'-リン酸(PLP)依存型酵素であるPctCとともに酵素反応を行うことで、水酸基をアミノ基へと変換する役割を持つ。また、PctPとPctCによる反応を大スケールで行い、その反応生成物を単離して構造を明らかにした。これにより、炭素五員環形成酵素のもう一つの候補であるPctEが炭素環形成反応を担うことが強く示唆された。続いて、PctPとPctCによる反応生成物がPctEによって変換されるかどうかをin vitroの実験により調べた。PctEは酸素に不安定なラジカルSAM酵素であると推定されるが、グローブボックスを利用することで、活性型と考えられる状態の精製酵素を得ることができている。この酵素を用いてもPctPとPctCによる反応生成物は変換を受けなかったことから、更なる修飾を受けた後に炭素環が形成されることが示唆された。これらの結果より、炭素五員環形成を担う酵素とその基質を絞り込むことができており、炭素環形成機構のin vitroでの反応解析を行う土台が整った。本研究は、放線菌Streptomyces pactumが生産する抗腫瘍抗生物質であるパクタマイシンの炭素五員環骨格の形成機構の解明を目的として行っている。

この目的の達成のためには、炭素五員環形成に関わる酵素とその基質を特定する必要がある。平成27年度の研究においては、炭素五員環形成酵素の候補であった2つの酵素のうちの1つが別の役割を担っていることを明らかにした。また、炭素五員環形成前に働く2つの酵素を特定したことで、炭素環形成反応の基質の構造を絞り込めた。これらの結果により、炭素五員環形成反応を検討する土台が整ったため、順調に進展していると判断した。パクタマイシン生合成遺伝子クラスター中には機能未知の酵素遺伝子が複数存在している。一昨年度までにピリドキサール5'-リン酸(PLP)依存型酵素であるPctVが一次代謝産物である3-デヒドロシキミ酸から二次代謝産物である3-アミノ安息香酸への変換を担う酵素であること、および、PLP依存型酵素であるPctCが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)依存型脱水素酵素PctPと共同して、N-アセチル-D-グルコサミンのグリコシドの糖部位の3位の水酸基をアミノ基へと変換する機能を有することを明らかにしている。昨年度は、未解明な部分が多いパクタマイシンの生合成経路を明らかにするために、PctPとPctCによるアミノ基導入反応の基質特異性を調べた。PctPの基質として、N-アセチル-D-グルコサミニル-3-アミノアセトフェノン(GlcNAc-AAP)などのアニリン類縁体のN-グリコシドや、アニリン類縁体と縮合する前の糖ヌクレオチドが考えられる。また、糖部位がメチル化などの修飾を受けたN-グリコシドも基質となり得る。そこで、種々のN-グリコシドや糖ヌクレオチドがPctPによって酸化されるかどうかを調べた。その結果、GlcNAc-AAPを基質とした場合に、効率よく酸化反応が進行することが明らかとなった。これにより、パクタマイシンの生合成において、まずは糖転移反応によりN-グリコシドが生成し、続いて糖部位の他の部位が修飾されるよりも前に3位の水酸基がアミノ基へと変換されることが強く示唆された。本研究は、放線菌Streptomyces pactumが生産する抗腫瘍抗生物質であるパクタマイシンの炭素五員環骨格の形成機構の解明を目的として行っている。平成26年度の研究においては、炭素五員環形成酵素と想定する酵素と、炭素五員環形成前に働くと想定するいくつかの酵素を安定に発現させて精製する条件を見つけることができた。これにより、in vitroでの酵素反応の検討が可能となったため、順調に進展していると判断した。これまでに、炭素五員環形成に直接関わると推定する酵素を大腸菌にて発現させ、精製酵素として得ている。また、炭素環形成反応の基質の構造を絞り込んでいる。そこで今後は、炭素環形成反応の基質の候補化合物を有機合成し、炭素環形成酵素との反応を検討する。炭素環形成酵素とその基質を明らかにした後は、速度論解析や点変異体酵素の反応解析等により、酵素反応機構を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究により、炭素環形成酵素の候補酵素と炭素環形成前に働くと考えられるいくつかの酵素を大腸菌にて発現させ、精製酵素として得ている。
大規模架構を対象としたインテリジェント部分構造実験システムの開発

1.ハイブリッド部分構造載荷実験手法を用いて、インテリジェント載荷実験システムを開発した。このシステムの開発により、従来、実大全体模型に対する載荷実験の困難な大規模架構の弾塑性応答性状の研究について、非常に有用なツールを提供している。2.鉄骨ラーメン架構3種類を設定し、本載荷実験システムを利用して部分構造ハイブリッド地震応答実験を行った。実験結果と精密な純粋数値解析結果との比較によって、実験システムの適用性と信頼性を実証した。3.載荷実験の対象となる曲げせん断型骨組における柱の応力状態の特徴の一つは曲げモーメント勾配が変動するものである。このような応力状態を本実験システムに属する載荷実験装置で再現でき、鉄骨ビームカラムの弾塑性挙動を載荷実験で調べた。4.載荷実験中に部分構造試験体の非線形挙動によって発生する不釣合力を抑制するためのスキームを提案した。5.上記スキームに用いられる試験体復元力の予測子4種類を用いてハイブリッド地震応答実験を行い、不釣合力の抑制効果の比較を行った:(1)不釣合力の抑制について、最も優れた結果を得たのは、調整されたマルチスプリング型の弾塑性ジョイント予測子であった。(2)線形弾性予測子は剛性パラメーターの調整だけで良いという簡便性の反面、弾塑性範囲の応答では、かなりの不釣合力が発生している。(3)バイリニア型の塑性ヒンジ予測子は、発生した不釣合力の大きさとしては、両者の中間程度である。(4)ニューラルネットワーク予測子も、今回塑性ヒンジ予測子と同程度の不釣合力の抑制効果を実現し、力学的構造が未知の場合にも適用できるので、今後おおいに応用の可能性があることが明らかになった。本年度は、最大5自由度の載荷が可能な部分構造実験用の載荷システムを製作し、その制御方法について検討中である。(1)極値探索プログラムに確定構造解析ル-チンを結合させて近似信頼性解析手法を応用し、準静的に作用する外力に対して架構全体が塑性崩壊する状態を対象として、外力作用・部材耐力の不確定状況が既知の場合に、最尤破壊状況と重要部分構造を抽出するための解析プログラムを設備のエンジニアリング・ワ-クステ-ション上で開発した。(2)可変自由度(最大5自由度)の載荷機構と部分構造部の試験体を設計・製作した。(3)載荷機構と結合される5基の電気油圧式アクチュエ-タによって変位ないし荷重制御を行うための実験制御プログラムをパソコン上で開発した。載荷装置の性能に関しては2方向並変位制御、2方向回転変位制御、1方向軸方向荷重制御などの最大5自由度の組合わせで、どの程度精度良く載荷をコントロ-ルできるかを鉄骨柱試験体を用いて実験制御アルゴリズムを改良中である。(4)仮想架構としては多層多スパンの鉄骨立体架構を想定し、これが準静的外力を受けて塑性崩壊してゆくプロセスをインテリジェント載荷実験で調べる。大規模架構全体の挙動解析は計算能力の高いエンジニアリング・ワ-クステ-ションに担当させ、載荷装置の制御及びデ-タ計測はパソコンにて行う。エンジニアリング・ワ-クステ-ションとパソコンは、コンピュ-タ間のネットワ-クを利用して通信する。多数の構造部材からなる大規模架構全体の破壊挙動を電算機で追跡しながら、計算された部分構造の変位(または力)を部分構造模型に強制し、また載荷実験で測定された部分構造の挙動情報をリアルタイムで解析にフィ-ドバックさせるという実験システムを開発中である。

実験結果と精密な純粋数値解析結果との比較によって、実験システムの適用性と信頼性を実証した。3.載荷実験の対象となる曲げせん断型骨組における柱の応力状態の特徴の一つは曲げモーメント勾配が変動するものである。このような応力状態を本実験システムに属する載荷実験装置で再現でき、鉄骨ビームカラムの弾塑性挙動を載荷実験で調べた。4.載荷実験中に、部分構造試験体の非線形挙動によって発生する不釣合力を抑制するためのスキームを提案した。5.上記スキームに用いられる試験体復元力の予測子4種類を用いてハイブリッド地震応答実験を行い、不釣合力の抑制効果の比較を行った:(1)不釣合力の抑制について、最も優れた結果を得たのは、調整されたマルチスプリング型の弾塑性ジョイント予測子であった。(2)線形弾性予測子は剛性パラメーターの調整だけで良いという簡便性の反面、弾塑性範囲の応答では、かなりの不釣合力が発生している。(3)バイリニア型の塑性ヒンジ予測子は、発生した不釣合力の大きさとしては、両者の中間程度である。(4)ニューラルネットワーク予測子も、今回塑性ヒンジ予測子と同程度の不釣合力の抑制効果を実現し、力学的構造が未知の場合にも適用できるので、今後おおいに応用の可能性があることが明らかになった。
亜臨界・超臨界流体の溶媒循環システムの構築と装置化

本研究では、システムの性能評価法も含め、超臨界二酸化炭素を用いた高圧閉鎖系の熱駆動式溶媒循環システムの開発を行った。本システムは、流路内の加熱部および冷却部の密度差により流体が循環する。初年度は、装置の設計・製作・試運転を行った。2年目は、有機溶媒をトレーサーとした速度評価法を開発し、二酸化炭素の平均流速を測定することで、装置性能を評価した。条件は、圧力7.815MPa,温度1555°C、二酸化炭素初期密度は550800kg/m^3、加熱・冷却源間の密度差は62121kg/m^3とした。加熱部・冷却源間の温度差が38°Cでは、平均流速が4m/min程度であった。1次元有限差分法による解析をおこなった結果、ほとんどの条件において誤差35%以内で流速を予測可能であった。また、装置内流速は、グラスホフ数、プラントル数、加熱部・冷却部間の無次元密度の差を用いることで、誤差25%以内で相関できた。さらに、装置圧力、初期密度、加熱部・冷却部間の平均密度を用いた経験式を用いた結果、誤差10%以内で相関できた。最終年度は、実験的検討を継続するとともに、2次元での流体力学計算(CFD)によるシミュレーションを行った。装置を改良し内部加熱を行ったところ、擬臨界点を考慮した条件設定により流速は7m/min程度に向上した。CFDシミュレーションでは、温度分布の実測値から流速の予測が可能であった。邪魔板を導入しヒーター性能を向上させたCFDでの解析に基づき、新規加熱部の設計を行った。本研究で開発した自然対流循環システムは、抽出、試料調整、洗浄、分析等のアプリケーションに適用可能であり、低温熱源がある環境で運転可能であり、その意義は大きいと考える。本研究では二酸化炭素に着目し、超臨界CO_2溶媒をクローズドシステム中でポンプ等の加圧機器を使用することなく、温度分布に起因した蒸気圧差と密度差を駆動力として熱力学的に強制循環させる溶媒循環システムの構築を目的としている。本法は、高圧ソックスレー抽出に類似であるが、循環の過程で超臨界流体と液体との相変化エネルギーを蒸留機能として活用することによって、常にフレッシュな流体を被抽出物又は被洗浄物に接触させ、溶媒としての重要機能を引き出すとともに、環境保全の観点からは溶媒を系外に放出することなく、更に省資源と省エネルギー効果のある溶媒の循環・再利用する方法である。本年度は,まず研究分担者も含めて全員にて,基本設計を行いプロトタイプの装置を製作した.基本的には、市販の配管とバルブ、高圧継手を駆使することにしたが,抽出器と計測・制御系については,製作刷ることにした.重要な因子の温度分布については、配管に沿って、適切な間隔で曲り部、継手部で詳細に測定できるようした.循環経路中での溶質濃度のモニター用に観察窓を設け,ファイバーでの分光測定も可能なものとした.本装置を用いて,布の洗浄(汚染物質の抽出)を対象とした実験を実施しているが,温度分布(全8点)の経時変化から溶媒の循環は確認できた.しかし,系内への試料供給量の定量が容易でなく,条件間の比較が困難であることが判明した.なお,温度分布の測定により,相変化の様子も識別可能である.現時点までの結果では,洗浄効率は非循環型と比較すると向上する傾向が伺えているが,定量的解析については流量測定,試料供給量の定量法の確立とともに次の課題と認識している.

本研究では二酸化炭素に着目し、超臨界CO_2溶媒をクローズドシステム中でポンプ等の加圧機器を使用することなく、温度分布に起因した蒸気圧差と密度差を駆動力として熱力学的に強制循環させる溶媒循環システムの構築を目的としている。本法は、高圧ソックスレー抽出に類似であるが、循環の過程で超臨界流体と液体との相変化エネルギーを蒸留機能として活用することによって、常にフレッシュな流体を被抽出物又は被洗浄物に接触させ、溶媒としての重要機能を引き出すとともに、環境保全の観点からは溶媒を系外に放出することなく、更に省資源と省エネルギー効果のある溶媒の循環・再利用する方法である。本年度は,昨年度に製作した装置を用いて、操作条件である温度分布、圧力、仕込溶媒質量と流量(流速)との相関関係の把握を試みた。流量測定については、オリフィス型流量計、回転流量計などがあるが、高圧条件下かつ流動抵抗の小さなものはなかったため、本研究にて製作した。直接流量測定は困難と判断し、トレーサー計測による循環回路の循環時間測定から平均流速を算出した。トレーサー検出には、観測窓を介してのUV(紫外)吸収が簡便かつ高精度と考え、UV活性かつ高圧二酸化炭素と親和性の大きなアセトンを利用した。温度分布については、加熱部と冷却部の8点測定した。本装置の溶媒循環の駆動力は温度差により生じた密度差であるが、最高温度と最低温度での密度差を一定にした平均流速の結果は一定ではなく、高圧ほど高い流速であることが判明した。この点について、詳細な温度分布を調べた結果、単純な最高最低温度ではなく、加熱部での温度分布が実効的密度差を誘起していることが示唆された。本プロジクトでは、超臨界流体を用いた高圧閉鎖系の循環システムの解析を行った。本システムは、流路内の加熱、冷却にともなう密度差により稼動する。昨年度までは、有機溶媒をトレーサーとした速度測定法を開発し、C0_2の平均流速を測定することで、装置性能を評価した。条件は、圧力7.8-15MPa,温度15-55°C、C0_2初期密度は550-800kg/m^3、加熱部・冷却部間の密度差62-121kg/m^3とした。その結果、加熱部・冷却部間の温度差が3-8°Cでの平均流速は4m/min程度となった。また、1次元のシミュレーション解析では、ほとんどの条件において誤差35%以内で流速を予測可能であった。装置内流速は、グラスホフ数、プラントル数で相関でき、加熱部・冷却部間の無次元密度の差は25%以内であり、装置圧力の項を適用すると10%以内となった。平成15年度は、2次元での流体力学計算(CFD)によるシミュレーションを行い、前年度実験結果とほぼ一致し、加熱部での伝熱価値が溶媒循環のためには最も効果的であることが判明した。CFDでは、実験の温度分布を用いた流速計算が可能であった。またこの結果に基づいて、加熱器の性能を向上した場合の新規加熱部を提案した。伝熱面近傍でx方向の温度勾配が非常に大きくなっているが、これは浮力によって壁近傍の流れが急激に加速されたためである。実験面では、CFD計算に基づいて内部加熱実験が可能なように装置を改造し、その効果を確かめるとともに操作因子と循環流量との定量的相関方法を確立した。
末梢抵抗血管における新型電位依存性Ca^<2+>チャネルの遺伝子クローニング

末梢抵抗血管に優勢に発現し、既知の電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)とは全く性質を異にする、ニフェジピン非感受性VDCC(NICC)の遺伝子クローニングを試みた。(1)大動脈、腸間膜動脈、小脳動脈、脳組織からRNAを抽出して、T型VDCC遺伝子を中心としたPCRによる検索を行った。α1G遺伝子産物が、組織の種類に関係なく増幅されたのに対し、α1Hの発現には、組織による違いが見られた。一方、血管組織におけるα1Iの発現は全く認められなかった。(2)約3000本の腸間膜動脈(末梢部)からRNAを抽出し、cDNAライブラリーの作製を行った。その結果、挿入断片含有率33%、平均挿入断片長約1.7kbのライブラリーが得られた。このライブラリーを鋳型としたPCRによっても、α1G,α1Hに対応するcDNAの存在を確認することができた。(3)上記cDNAライブラリーを用いて、α1Hの野生型およびスプライスバリアントの検出を試みた。α1Hの全長を6つの領域に細分し、それぞれの配列に対してPCRによる増幅を行った。その結果、開始コドンを含む領域及びC末端部を除く4つの領域に相当するDNA断片が増幅された。これらの断片には複数の塩基配列の変異が認められた。(4)ヒト子宮平滑筋からクローニングしたα1Hスプライスバリアントを用いて、ラットcDNAライブラリーから得られたα1H様DNA断片の塩基配列との比較解析を行った。既に、ヒト子宮筋α1Hのスプライスバリアントの中には(III-IVリンカーに欠失変異のあるもの)、活性化・不活性化電位の脱分極偏移を示すものが見つかっており、これとカルモジュリン依存性キナーゼIIによるリン酸化を介したチャネル活性化制御の関係を明らかにすることによって、NICCの電気生理学的性質を説明できる可能性がある。現在この点について検討中である。末梢抵抗血管系には、従来報告されている電位依存性Ca^<2+>チャネルとは全く異なる生物物理学的・薬理学的性質を有する、ニフェジピン非感受性、高電位活性化型Caチャネル(NICC)が優勢に発現していることが、最近の我々の一連の研究から明らかになってきた。このCaチャネルが、既知の電位依存性Caチャネル遺伝子(α1A-H)いずれかのsplice variantである可能性は完全には否定できないが、幾つかの状況証拠から、これらとは全く異なる遺伝子によってコードされていることが強く示唆される。そこで、本研究では、その最初の段階として、まず、NICCが優勢に発現しているラット腸間膜動脈最終分岐部から単離した細胞から直接mRNAを抽出し、既知の電位依存性Caチャネルが発現しているかどうか、それぞれの特異的プライマーを用いて、単一細胞逆転写遺伝子増幅法(single cell RT-PCR)によって検討した。これまで行なった数回の実験では、腸間膜動脈末梢部平滑筋細胞からは、3種のT型チャネルを含むいずれの既知のCaチャネル遺伝子も検出できなかった。次に、20匹のラットから採取した、腸間膜動脈(近位側も含む)樹状組織標本約100本からmRNAを抽出し、cDNAライブラリーの作成を試みた。しかし、これらの中に存在すると思われるL型Caチャネルの遺伝子(機能的実験の結果から示唆されている)が確認できない段階にあり、現在、抽出法からライブラリー作成に至るまでのプロトコールを再検討して、確実に全長mRNAが取れてくる条件を検討中である。