hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リアルタイム画像認識向けの超高速ラベル付けとオイラー数計算の同時実現とその応用

本研究は連結体のラベル付けとオイラー数計算について以下の成果を上げた。(1)世界一高速のラベル付けアルゴリズムを提案した。(2)六角形画素のラベル付けアルゴリズムを提案した。(3)グラフ理論に基づいたオイラー数計算のアルゴリズムを提案した。(4)ビットコードに基づいてオイラー数計算のアルゴリズムを提案した。(5)ラベル付けとオイラー数同時計算のアルゴリズムを提案した。2値画像中の物体を認識するために、それぞれの物体を唯一のラベルを付ける操作、いわゆるラベル付けは画像分析、画像理解、パターン認識とコンピュータビジョンにおいて不可欠な処理である。また、2値画像のオイラー数は画像の変形、回転、拡大縮小の影響を受けないから、画像分析、画像理解、パターン認識とコンピュータビジョンによく利用している特徴である。本研究は、より効率的なラベル付けアルゴリズムとオイラー数計算アルゴリズムの提案を目指している。また、ラベル付けとオイラー数の計算がこれまで別々の処理で行ってきたが、本研究では、ラベル付けとオイラー数を同時に行う方法を提案する。これまでの研究で、より効率的なオイラー数計算、6角形画素画像のラベル付け効率手法を提案した。また、ビットコッド(bit-quad)に基づくラベル付けとオイラー数を同時に行うアルゴリズム、グラフ理論に基づくラベル付けとオイラー数を同時に行うアルゴリズムおよびラベル付けにラベル付けとオイラー数を同時に行うアルゴリズムを提案しました。2値画像中の対象物を認識することはパターン認識やコンピュータビジョンの分野において重要な処理である。2値画像中の対象物認識において,対象物の特徴量の抽出が必要である。よく利用されている対象物の特徴量には、円形度、周囲長、中心など対象物の幾何特徴量と回転、拡大・縮小、弾性変形において不変な位相特徴であるオイラー数がある。円形度、周囲長、中心など対象物の幾何特徴量の抽出には,2値画像中のそれぞれの対象物を唯一のラベルをつける処理、いわゆるラベル付け処理が必要であるが、オイラー数の計算は専門のアルゴリズムが必要である。本研究ではより効率なラベル付けアルゴリズムとオイラー数計算アルゴリズムの提案を目指す。また、これまでラベル付けとオイラー数計算が別々のアルゴリズムで処理したが、本研究では、ラベル付けとオイラー数計算を同時に実現可能なアルゴリズムを提案する。昨年度の研究では、より効率的なラベル付けアルゴリズムとオイラー数計算アルゴリズムを提案しました。さらに、ラベル付けアルゴリズムを分析し、効率的な孔数の計算方法を発見した。それによってで、ラベル付けとオイラー数計算を同時に行える効率的なアルゴリズムを提案した。申請者らは、ラベル付けやオイラー計算において、世界トップの研究レベルの実績をもっているため、本課題において、研究基礎が極めてよいのが主な要因であると思う。また、積極的に国際研究連携を行ったのも重要だった。パターン認識やコンピュータビジョンにおいて,2値画像中の対象物を認識するためには対象物の特徴量が必要である。円形度、周囲長、中心などの特徴量については,ラベル付け処理によって容易に求められるが,回転、拡大・縮小、弾性変形において不変な位相特徴であるオイラー数はラベル付け処理とは別処理によって計算しなければならない。そのため,リアルタイム性を要求する画像認識システムにおいては,致命的な処理遅延となり得る。本研究では,2値画像中の物体特徴計算に欠かせないラベル付けアルゴリズムの効率化、物体特徴のひとつオイラー数の計算の効率化およびラベル付けとオイラー数計算の同時実現について次の研究成果を上げた。(1)六角形画素画像の連結性を考慮した効率的な六角形画素画像のラベル付けアルゴリズムを提案した;(2)構造変換に基づいた効率的なラベル付けアルゴリズムを提案した;(3)画像を三行ずつ処理する効率的なラベル付けアルゴリズムを提案した。本アルゴリズムは現時点では、世界一高速のアルゴリズムである;(4)グラフ理論に基づいたオイラー数計算のアルゴリズムを提案した;(5)ビットコッドに基づいたオイラー数計算アルゴリズムの改良を行った;(6)ラベル付けとオイラー数を同時計算するアルゴリズムを提案した。問題をよく理解していることが最大の要因であると思います。また、国際研究連携、他研究者との連携も重要です。提案したアルゴリズムをさらに改良していく。また、新しいアルゴリズムも考案したい。パターン認識提案したアルゴリズムをさらに改良していきたい。また、提案アルゴリズムの応用も考えたいと思います。経費の使用は正確的に計画できなかった。共同研究のための出張は年度を跨いだため、会計手続きは年度内にできませんでした。論文発表などに使用する予定です。会計手続きできなかった経費が30万程度なので、関連の手続きしたら、次年度使用額がほぼなくなるかわずかになります。わずかに残る場合、論文の発表費用として使いたいと思います。
前立腺癌由来エクソソームを用いた癌進展機構の解明および新規尿中マーカーの開発

尿中エクソソームに着目し、プロテオミクスの手法を用いて高リスク前立腺癌の新規尿中バイオマーカの探索を行った。iTRAQ法を用いて尿中エクソソームより合計3520個のタンパクを同定した。11個のタンパクがGS8-9群で有意に上昇していた。これら複数のタンパクをバイオマーカー候補としてSRM/MRM法にて検証したところ、FABP5が有意にGleason scoreと関連し、また生検陰性群に比べ前立腺癌患者において有意に高値を示した。ヒト前立腺全摘標本でFABP5の発現を検討したところ、高グリソンスコア前立腺癌での高発現を認め、前立腺癌細胞株での検討でもエクソソーム中のFABP5の発現を認めた。正常上皮細胞や癌細胞は自らのタンパクや核酸などをエクソソームと呼ばれる膜小胞を形成して細胞外へ輸送し、離れた部位もしくは周囲の細胞に到達し影響を及ぼすことが明らかになりつつある。エクソソームは血液や尿中に安定に存在し、診断や治療への応用が期待されている。前立腺癌患者においては、直腸診後の尿中に前立腺癌由来のエクソソームが含まれていることが報告されており、直腸診後の尿を用いることにより、生体より前立腺癌由来のエクソソームを採取することが可能である。本研究では、直腸診後の尿から前立腺癌由来のエクソソームを分離し、プロテオミクスの手法を用いて高悪性度前立腺癌に特徴的なタンパクを同定し、新規の尿中バイオマーカーの開発を試みた。前立腺生検陰性患者(6名)、低悪性度前立腺癌(Gleason score 6:6名)、高悪性度前立腺癌患者(Gleason score8-9: 6名)の直腸診後の尿からエクソソームを超遠心法にて分離し、抽出したタンパクをiTRAQ法を用いて標識し、高分解能質量分析計(LTQ Orbitrap Elite)で網羅的にタンパクの発現を比較したところ3530個のタンパクを同定した。11個のタンパクが生検陰性または低悪性度前立腺癌に比べて高悪性度前立腺癌患者において有意に高値を認めた。これらのタンパクを含めた31種類のタンパクを別の30症例の尿検体において、多重反応モニタリング法(SRM/MRM)にて同時に定量分析を行ったところFatty acid binding protein 5が有意に悪性度の高い前立腺癌で高値を認めた。尿中のバイオマーカー候補を31個のタンパクから1個に絞り込んだ状態である。正常上皮細胞や癌細胞は自らのタンパクや核酸などを膜小胞(エクソソーム)を形成して細胞外へ輸送し、離れた部位もしくは周囲の細胞に影響を及ぼしている。エクソソームは血液や尿中に安定に存在し、診断への応用が期待されている。今回、直腸診後の尿中エクソソームに着目し、プロテオミクスの手法を用いて高リスク前立腺癌の新規尿中バイオマーカの探索を行った。前立腺生検前に直腸診後の尿を採取し、尿中エクソソームを分離した(生検陰性6名、生検陽性12名(Gleason score (GS) 6:6名、GS 8-9:6名))。エクソソーム由来タンパクをiTRAQ法にて質量分析(LC-MS/MS)を行った。複数の候補タンパクについて別のコホート(生検陰性11名、前立腺癌18名)で多重反応モニタリング法(SRM/MRM)を用いて検証した。11個のタンパクが生検陰性群及びGS 6群と比べGS8-9群で有意に上昇していた(p <0.05)。これら複数のタンパクをバイオマーカー候補としてSRM/MRM法にて検証したところ、Fatty acid binding protein 5 (FABP5)が有意にGSと関連し(p =0.011)、また生検陰性群に比べ前立腺癌患者において有意に高値を示した(p = 0.009)。ROC解析ではGS 7以上の検出に対するAUCは0.856 (95% CI 0.708-1.00, p = 0.002)であった。尿中エクソソーム中のFABP5は高リスク前立腺癌と関連し、新規の尿中高リスク前立腺癌バイオマーカーとなる可能性が示唆された。新規バイオマーカーを同定し、その検証を別コホートで行った。尿中エクソソームに着目し、プロテオミクスの手法を用いて高リスク前立腺癌の新規尿中バイオマーカーの探索を行った。前立腺生検陰性患者、予後良好前立腺癌患者(Gleason score 6)、予後不良前立腺癌患者(Gleason score 8-9)から得られた前立腺直腸診後の尿を用いて(各群6例)、尿中のエクソソームを超遠心法により抽出精製し、iTRAQ法を用いて標識し、高分解能質量分析計(LTQ Orbitrap Elite)で網羅的にタンパクの発現を比較したところ、尿中エクソソームより合計3520個のタンパクを同定した。これらのタンパクの中で、生検陰性群に比べ、前立腺癌群で有意に上昇しているタンパクを11個認めた。これら複数のタンパクをバイオマーカー候補としてSRM/MRM法にて別コホートで検証したところ、FABP5が有意にGleason scoreと関連し、また生検陰性群に比べ前立腺癌患者において有意に高値を示した。ROC曲線解析ではFABP5の前立腺癌診断能および高リスク前立腺癌の予測能はともにPSAよりも良い結果であった。

またFABP5以外にも、Granulin, AMBP, CHMP4A, CHMP4Cは高グリソン前立腺癌患者尿中のエクソソーム内で有意に上昇していた。前立腺癌に対して施行した前立腺全摘標本でFABP5の発現を免疫化学染色法にて検討したところ、高グリソンスコア前立腺癌でのFABP5の高発現を認めた。また、前立腺癌細胞株での検討でも、前立腺癌細胞株および、そのエクソソーム中にFABP5の発現を認め、前立腺癌の進展に重要な役割を果たしていることが示唆された。尿中エクソソームに着目し、プロテオミクスの手法を用いて高リスク前立腺癌の新規尿中バイオマーカの探索を行った。iTRAQ法を用いて尿中エクソソームより合計3520個のタンパクを同定した。11個のタンパクがGS8-9群で有意に上昇していた。これら複数のタンパクをバイオマーカー候補としてSRM/MRM法にて検証したところ、FABP5が有意にGleason scoreと関連し、また生検陰性群に比べ前立腺癌患者において有意に高値を示した。ヒト前立腺全摘標本でFABP5の発現を検討したところ、高グリソンスコア前立腺癌での高発現を認め、前立腺癌細胞株での検討でもエクソソーム中のFABP5の発現を認めた。今後このタンパクの発現を細胞株、動物モデルで確認を行い、前立腺癌の進展のメカニズムの解明を行う。またこのタンパクをハイスループットで定量する方法を開発し、臨床応用を目指す予定である。前立腺全摘除標本での発現の状況を確認を行てっている。また前立腺癌細胞株でのFABP5の発現を確認し、エクソソーム中での発現も行う予定である。それをもとにメカニズムの解明を行う。前立腺癌H29年度購入予定の物品予算が想定よりも増額したため、H28年度の支出を抑えた。H29年度購入予定の物品費に補填する。
日米間の代謝プロファイルに基づくBMIを表現する代謝マーカーの解明

これまで、BMIや腹囲、血清インスリンなどの生態指標で定義した肥満とメタボロームの網羅的測定技術による代謝物において、肥満の判別に寄与する代謝物が検討されてきた。本研究では、日本人一般集団における前向きコホートの繰り返し測定を用いて、BMIを表現する代謝物質の解明を目的とする。同時に、アメリカで行われている同様の地域疫学研究集団との比較を行い、日米間のBMIを反映する代謝物の詳細についても検討する。異なる遺伝背景や食生活を含む生活習慣を持つ集団間におけるBMIの増加を表現する代謝物を検討することで、より早期からの生活習慣病予防の一助になると考える。
バナジウム酸化物における酸素不定比性の制御と構造・物性

本年度では以下のような様々なバナジウム酸化物での研究を展開してきた。圧力安定化V_2O_3金属相および不定比化合物V_<2-y>O_3、(V_<1-x>Ti_x)_2O_3において高温超伝導体と良く似たスピンギャップ的挙動を発見し、また、伝導性物質LiV_2O_4においても異常な磁気挙動を見出した。絶縁体ZnV_2O_4との固溶系は金属から絶縁体に変化し、中間領域ではスピングラス転移を示すことや、ZnV_2O_4は50Kでスピネルら正方晶に構造転移すること、100K付近からゼロ磁場冷却と磁場中冷却では磁化率に差が観測され、これが磁気秩序と関係ないことなども見出した。伝導性物質CaVO_<3-δ>においては、Zrゲッターによる酸素不定比性の制御法を開発し、新たに3つの酸素欠損型化合物を見出した。酸素欠損の程度により構造が微妙に異なり、欠損量の少ない領域では欠損量に応じてキャリアーがド-ピングされるが、欠損量の多い相では、電荷の分離と極在化が生じている。CaV_nO_<2n+1>(n=2,3,4)のうち梯子型構造を持つCaV_2O_5においてはスピンギャップ挙動を見出し、同型のNaV_2O_5ではスピン・パイエルス転移を見出した。転移温度は34Kでこれはこれまでに発見されている化合物中最も高い。さらに、もう一つのスピン・パイエルス無機化合物であるCuGeO_3の単結晶合成を行い、核磁気共鳴によりナイトシフト、電場勾配テンソルの精密決定に成功した。高温超伝導体関係では、La-123でオーバード-ピングを実現し、そのスピンダイナミクスの解明を行ったことが特筆される。
湿式錯体および溶融塩法によるNOxおよびSOxの同時吸収除去

SOxおよびNOxの同時的な除去として、湿式錯体吸収法および溶融塩法について検討したが、それらはそれぞれ独立に実施されたので、研究の成果は別個に述べる。1.湿式錯体吸収法(佐田・熊沢)昭和5860年度の研究成果を基に鉄(【II】)-EDTA添加【Na_2】【SO_3】水溶液による同時脱硝・脱硫プロセスの概念図を提出した。そのプロセスでは【Fe^(II)】濃度をできるだけ高く安定に保つこと、そのための吸収液の煮沸還元再生と亜硫酸塩の補給、および【SO_2】共存の影響は【SO_2】吸収に伴う吸収液PHの低下を通して現われるので、PH制御が必要である点が重要である。同時除去プロセスの実用化に向けて、【O_2】共存下の長時間連続吸収実証試験と使用済み吸収液の煮沸還元再生実験を行い、以下の知見を得た。煮沸条件下でも2060°Cの反応温度での先に提案した還元速度則(【Fe^(III)】-【edta^-】およびH【SO(^_3)】に1次、【Fe^(II)】-【edta^(2-)】に-1次)は成り立つ。また使用済み吸収液の煮沸還元にもその速度式は適用できる。亜硫酸塩の濃度を0.20.25mol/【dm^3】程度に保てば、【O_2】,【SO_2】共存下でも【Fe^(II)】濃度(したがってNO除去率)は長時間現実的なレベル(NO除去率70%)で一定に維持される。【SO_2】が共存すると亜硫酸塩の補給量は低減できる。2.溶融塩吸収法(冨永)これまでに触媒成分を溶解した低融点溶融塩がNOx,SOxの同時除去に有効であることを見い出した。更に高性能な溶融塩媒体-触媒系の開発を目的として硝酸塩系溶融塩を用いて検討し、次の知見を得た。【SO_2】の酸化、吸収固定に対して高い活性を示したが、高濃度のNOxの発生を伴った。この系にNaOHを添加することにより脱硫率の大幅な向上がみられ、NOxの発生も抑えられた。脱硝反応は、NOと等モルに【NO_2】を同時に供給した場合には促進され、190°Cで24%の脱硝率が得られた。
内因性モノアミンオキシダーゼ活性阻害物質と病態との関連性

内因性神経活性物質イサチン(モノアミンオキシダーゼ活性阻害物質)と病態との関連性について前年度より研究を継続し以下の結果を得た.本年度は,イサチンが心房性ナトリウム利尿ぺプチド(ANP)受容体と結合し拮抗作用を示すとの報告に着目し,特にカテコールアミンと関連の深い高血圧について検討した.l.パーキンソン病患者の尿中イサチン濃度を継続検討した.尿中イサチン濃度は重症度(Hoehn&Yhar分類)が増すにしたがって上昇し,II度,III度,IV度の群において有意に上昇した.前年度までのデータに症例数を加えたがこれまでの結果と同様であった.2.高血圧や脳卒中のモデル動物である脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)の尿中イサチン濃度は正常血圧ラット(WKY)に比較して有意に高値を示した.SHRSPの血漿ノルエピネフリン濃度においてもWKYに比較して有意に高値を示した.3.専門医によって高血圧と判定された患者の尿中イサチン濃度は,正常血圧群に比較して有意に高値を示した.4.尿中イサチン濃度と同時に測定したANPおよび脳内ナトリウム利尿ぺプチドとの間には有意な相関は見られなかった.このことは心疾患患者の症状が発作性心房性頻拍症,心筋梗塞,発作性上心室頻拍症,大動脈弁狭窄症など複雑多岐であるために相関が見られなかったものと考えられた.今後は各分類で症例数を増やし検討が必要であると思われる.以上より,高血圧発症や高血圧進展の一部には生体内でのイサチンの増加が関与していることが示唆された.現在,イサチンとANPとの関連性について,一定の条件下で検討するためラットを用いて遂行中である.内因性モノアミンオキシダーゼ(MAO)活性阻害物質の生体内での役割を検討するためイサチン濃度測定法を開発し,パーキンソン病との関連性について検討し以下の結果を得た.1.これまで尿中や血液中のイサチン濃度測定法は,GC-MSやHPLC法で行われてきた.しかし,測定するイサチン濃度が高濃度になると回収率が悪くなるため一定濃度を超えると正確な値が得られなかった.そこで新しいイサチン濃度測定法の開発をHPLCを用いて試みた.回収率,日内変動および日差変動ともに良好な値が得られ,以後のイサチン濃度測定に有効であることが証明された.2.健常人から1日4回尿を採取しイサチン濃度を測定すると,個人差はあるが日常の生活では一定の範囲内にとどまることが示された.3.健常人の尿中イサチン濃度と性および年齢との間には相関は見られなかった.4.尿中イサチン濃度と血漿イサチン濃度との間には有意な相関が見られた.5.パーキンソン病患者の尿中イサチン濃度はHoehnとYahrの重症度分類のII度までは健常人と同程度の値を示したがIII度,IV度と重症度が増すにしたがって増加した.しかし,V度の群においては健常人のレベルまで低下する例が見られた.重症度II度の群において治療薬投与群は非治療群に比較して尿中イサチン濃度が低値をした.以上の結果より,尿中イサチン濃度測定がパーキンソン病患者の重症度しいてはドパミン含量を維持するにも有効であることが示唆された.内因性神経活性物質イサチン(モノアミンオキシダーゼ活性阻害物質)と病態との関連性について前年度より研究を継続し以下の結果を得た.本年度は,イサチンが心房性ナトリウム利尿ぺプチド(ANP)受容体と結合し拮抗作用を示すとの報告に着目し,特にカテコールアミンと関連の深い高血圧について検討した.l.パーキンソン病患者の尿中イサチン濃度を継続検討した.尿中イサチン濃度は重症度(Hoehn&Yhar分類)が増すにしたがって上昇し,II度,III度,IV度の群において有意に上昇した.前年度までのデータに症例数を加えたがこれまでの結果と同様であった.2.高血圧や脳卒中のモデル動物である脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)の尿中イサチン濃度は正常血圧ラット(WKY)に比較して有意に高値を示した.SHRSPの血漿ノルエピネフリン濃度においてもWKYに比較して有意に高値を示した.3.専門医によって高血圧と判定された患者の尿中イサチン濃度は,正常血圧群に比較して有意に高値を示した.4.尿中イサチン濃度と同時に測定したANPおよび脳内ナトリウム利尿ぺプチドとの間には有意な相関は見られなかった.このことは心疾患患者の症状が発作性心房性頻拍症,心筋梗塞,発作性上心室頻拍症,大動脈弁狭窄症など複雑多岐であるために相関が見られなかったものと考えられた.今後は各分類で症例数を増やし検討が必要であると思われる.以上より,高血圧発症や高血圧進展の一部には生体内でのイサチンの増加が関与していることが示唆された.現在,イサチンとANPとの関連性について,一定の条件下で検討するためラットを用いて遂行中である.
アデノウイルスベクターを用いた神経栄養関連因子導入による脊髄損傷遺伝子治療

アデノウイルスベクターにより脊髄圧迫損傷部位に神経栄養因子(glialcell line-derived neuro-trophicfactor : GDNF)発現ベクターを導入、遺伝子脊髄内発現を免疫組織学的に調べた。humanGDNF遺伝子を組み込んた非増殖型アデノウイルスベクター(AxCAhGDNF)をCOS-TPC法で作製した。14-16週齢Wister Ratを用い、脊髄圧迫損傷モデルを作製、圧迫部位への髄内投与を行い、免疫染色、RT-PCRで評価した。1)X-gal染色:損傷部を中心に広範囲に染色され、前角部、後索部にも、X-gal陽性細胞が観察された。これらの変化はベクター注入直後から認められた。X-gal染色と細胞マーカーによる二重染色では、micro tubleMAP2、Anti-Oligo.Ab、GFAP陽性細胞が観察され、それぞれの細胞への遺伝子導入、蛋白発現が確認された。2)GDNF、ChAT免疫染色の観察:損傷後約2週、4週のGDNF免疫染色では、コントロール(PBS群)に比べニューロンに特に強いimmuno reactivityが観察された。損傷後4週のChAT免疫染色では、コリン作動性ニューロンである前角ニューロンにも特に強いimmuno reactivityが観察された。3)ニッスル染色による前角部のcell count:細胞保護作用の確認はニッスル染色による前角部のcell countを行った。AxCAhGDNF群では特に2から4週においてPBS群に比べ有意に細胞数の減少が抑制されていた。アデノウイルスを用いた神経栄養因子遺伝子の導入は損傷された脊髄内における残存ニューロンの生存維持、再生能力の賦活化に役立つと考えられる。平成12年度(1)神経栄養因子発現ベクター(非ウイルスベクター)の作製(2)神経栄養因子導入アデノウイルスベクターの作製(3)損傷モデルラットの作製とベクター注入(4)組織化学的観察平成13年度損傷モデルラットの作製とベクター注入、組織化学的観察:損傷直後BDNF-Myc-His/pIRES-EGFPvectorベクターをLipofectAMINEと混合(lipofectin method)、損傷部位ヘマイクロシリンジで1μlmin-1(total 10μl)の髄内投与を行った。アデノウイルスベクターについても同様に注入した。1)BDNF-Myc-His/pIRES-EGFPvectorベクター:注入された試薬(GFP陽性領域)は灰白質内に停滞しており、経時的に減少していった。その周辺の灰白質、白質にはGFP陽性細胞が散在しており、その数は損傷後3、5日でピークでありその後減少していった。抗BDNF抗体陽性細胞は損傷後増加、以後プラトーとなっており、損傷後3、5では全GFP陽性細胞が抗BDNF抗体陽性となっていた(陽性率100%)。抗GFAP抗体陽性細胞も同様に損傷後3、5日で増加し8日目ではGFP陽性細胞よりも有意に増加、14日ではGFP陰性細胞が45%65%を占めていた。2)アデノウイルスベクター:抗BDNF抗体陽性細胞は損傷後、頭尾方向に増加していった。損傷後3、5日ではおよび14日目で2峰性の曲線となり、画像上(同一横断切片)での抗BDNF抗体陽性細胞数は非ウイルスベクターの約100倍以上となっていた。
制限修飾酵素による遺伝子発現制御と、その制限修飾遺伝子(病原体)・ゲノム(宿主)相互作用での役割

2型の制限修飾系は制限酵素とそれと別個の修飾酵素からなる。それらの遺伝子構成は多様である。それらは、外敵を攻撃するが、分離後細胞死の機構によってホストを攻撃することもある。それゆえ、制限修飾系の遺伝子の発現制御は、制限修飾系とホストの存続のために重要である。さらに、それらは制限修飾遺伝子の水平伝達にも重要である。しかし、制限修飾系の遺伝子の発現制御についてはほとんど分かっていない。本研究においては、EcoRI制限修飾系の発現制御を対象とした。制限酵素遺伝子は修飾酵素遺伝子の29bp上流にある。二つのプロモーター配列と制御因子を解析した。二つのlacZ融合レポーターを構築した。ecoRIR::lacZおよびecoRIM::lacZである。R.EcoRIのプロモーターがM.EcoRIよりも強い活性を示した。さらに、変異EcoRIたんぱくを作成し、精製し、プロモーターへの結合などを解析している。これらの結果はEcoRI制限修飾遺伝子の発現は、他の制限修飾系遺伝子の発現と異なることを示唆している。
T細胞のアポトーシスにおけるC1C-3Bの役割とその制御機構

1.外向き整流性を示すとされるC1Cチャネル(C1C-3、-4、-5)のヒトリンパ球における遺伝子発現をRT-PCR法により検討した。非活性化状態の場合、T細胞ではC1C-3とC1C-5が、B細胞ではC1C-3、C1C-4、C1C-5が発現していた。活性化状態の場合、T細胞ではClC-3が、B細胞ではC1C-3とC1C-4が発現していた。2.COS1細胞にC1C-3Bとp56^<lck>を共発現させると、C1C-3Bはp56^<lck>によるチロシンリン酸化を受けた。C1C-3Bのアミノ酸配列のうち、リン酸化を受ける可能性があるY342、Y689、Y859の3つのチロシン残基のうちの1つ、あるいは複数をフェニルアラニンに置換した変異株を用いた検討から、Y859がp56^<lck>により特異的にリン酸化されることがわかった。スプライシングバリアントであるC1C-3Aには対応するチロシン残基がなく、p56^<lck>によりリン酸化されなかった。3.HT-1080細胞を用いて免疫蛍光染色を行った。C1C-3Bは単独で発現させると主に細胞内領域に分布していたが、p56^<lck>を共発現させると細胞膜表面への発現が増加した。4.C1C-3ノックアウトマウス(C1C-3 KO)では野生型マウス(WT)と比較して、胸腺細胞数、脾臓T細胞数ともに減少していた。胸腺細胞の分化はClC-3KOで異常は無かった。TCR刺激による細胞増殖は、胸腺細胞、脾臓T細胞ともに、WTと比較してC1C-3KOで抑制されていた。活性化させたT細胞に抗CD3抗体や抗fas抗体を用いてアポトーシスを誘導した場合の細胞死は、WTとC1C-3KOの間で差はなかった。C1C-3KOのT細胞には比較的大きな電流密度のcharybdotoxin感受性K^+電流が発現しており、これがC1C-3チャネルの欠損を代償している可能性があると考えられた。1.ClC-3チャネル蛋白のチロシンリン酸化:T細胞のアポトーシスにおいて重要な働きをする細胞容積調節性Cl^-チャネルは、非受容体型チロシンキナーゼp56^<lck>によるリン酸化を受けて活性化するといわれている。COS7細胞に発現させたClC-3AおよびClC-3B蛋白は、いずれも共発現させたp56^<lck>によりチロシンリン酸化を受けた。さらに、ClC-3Bはsrc、fyn、lyn、sykなど他の非受容体型チロシンキナーゼによってもリン酸化を受けることが明らかとなった。現在、ClC-3Bに占変異を導入し、リン酸化を受けるチロシン残基の決定を試みている。

また、レトロウイルスベクターを用いて、FLAG-Tagを融合させたClC-3B蛋白を安定的に発現するJurkat T細胞株をすでに樹立しており、これを用いて実際にClC-3BがT細胞レセプター(TCR)刺激やfas刺激によりチロシンリン酸化を受けるか否か、およびその生理的意義を検討している。2.ClC-3ノックアウトマウス(ClC-3 KO)を用いた解析:ClC-3 KOの胸腺細胞の総数は、野生型マウス(WT)のそれと比較して有意に少なかった。また、脾臓T細胞の数もClC-3 KOにおいて有意に少なかった。TCR刺激による細胞増殖は、胸腺細胞、脾臓T細胞ともにClC-3 KOにおいて有意に抑制されていた。胸腺細胞の分化については、WTとClC-3 KOの間で差はなかった。活性化させたT細胞に抗CD3抗体や抗fas抗体を用いてアポトーシスを誘導した場合の細胞死は、WTとClC-3 KOの間で差はなかった。ClC-3 KOのT細胞には比較的大きな電流密度のCharybdotoxin感受性K^+電流が発現しており、これがClC-3チャネルの欠損を代償している可能性を考慮しつつ解析を進めている。1.ClCチャネル遺伝子群の中で、ClC-3、ClC-4、ClC-5は互いに相同性が高く、いずれも培養細胞を用いた発現系で外向き整流性のCI^-電流を通すことが知られている。ヒトリンパ球におけるこれらのチャネル遺伝子の発現をRT-PCR法により検討したところ、ClC-3Aおよび3Bはヒト末梢T細胞およびB細胞のいずれにも発現していた。ClC-4は主にB細胞に発現しており、ClC-5はT細胞、B細胞のいずれにも発現していた。活性化させたリンパ球では、ClC-3Aおよび3BはT細胞、B細胞のいずれにも発現していたが、ClC-4はB細胞にのみ発現が認められ、ClC-5はT細胞、B細胞のいずれにもほとんど発現が認められなかった。2.COS1細胞にClC-3Bとp56^<lck>を共発現させると、ClC-3Bはp56^<lck>によるチロシンリン酸化を受けた。ClC-3B蛋白のアミノ酸配列のうち、リン酸化を受ける可能性があるY342、Y689、Y859の3つのチロシン残基のうちの1つあるいは複数をフェニルアラニンに置換した変異株を用いて同様の検討を行なったところ、Y859に変異を加えるとチロシンリン酸化が起こらなくなった。このことから、ClC-3Bの859番目のチロシンがp56^<lck>によりリン酸化されることが明らかとなった。Y859はClC-3Bに特異的なアミノ酸配列の中のチロシン残基であり、ClC-3Aには存在しない。実際に、ClC-3Aはp56^<lck>によりリン酸化されなかった。3.HT-1080細胞にHA-tagをつけたClC-3B(HA-ClC-3B)とp56^<lck>を共発現させ、抗HA抗体を用いた免疫蛍光染色を行った。HA-ClC-3Bは、単独で発現させると主に細胞内領域に分布していたが、p56^<lck>を共発現させた場合には、単独で発現させた場合と比較して細胞膜表面への発現が増加していた。
哺乳類大脳新皮質の発生・進化のメカニズム

哺乳類の大脳新皮質は、多数のニューロンが整然と6層構造内に配置されている。この極めて特異な構造基盤を祖先型哺乳類が獲得したおかげで、ヒト脳への進化を可能にしたと考えられている。サブプレートニューロンは哺乳類の発生期大脳皮質に独特の神経細胞で、視床から皮質への最初期の神経回路形成に重要な機能をしている他、最近我々は放射状神経細胞移動制御にも重要な機能を果たすことを報告した(丸山ら、Science,2018)。本年度はサブプレート層におけるシグナル伝達をさらに解明するためにサブプレート層の細胞外基質に着目して解析を進めた。移動ニューロンの発現プロファイリングデータを解析した結果、シナプス関連以外に、細胞外基質関連のGOを持つ遺伝子も有意に変動していた。中でも細胞外基質プロテアーゼであるADAMTS2遺伝子がADAMTSファミリーの中でも移動につれてもっとも発現上昇することがわかった。そこで本プロテアーゼの移動制御への関与を調べるために、子宮内エレクトロポレーションを用いたノックダウン実験を行なったところ、移動が遅れることがわかった。次に大脳新皮質でのADAMTS2の発現領域について抗体染色及びIn situ hybridizationで確認したところ、サブプレートの下の中間帯に局在する移動中のニューロンで発現していることが明らかになった。現在ADAMTS2が、その下流のどのようなシグナル伝達経路を介して移動制御に関わっているのかについて検討を進めている。胎生期のサブプレートに存在する細胞外基質(ECM)の機能についてはこれまで不明だったが、移動ニューロン中にADAMTS2が発現していることから、サブプレート層におけるECMの再構築がニューロンの移動制御に重要であることが本研究から示唆された。また、ノックダウン実験によりADAMTS2プロテアーゼのニューロン移動制御への関与が明らかになった。今後はその下流にどのようなシグナル経路があるのかについてさらに解析を進めていく予定である。現在のところTGFbetaの結合タンパクであるLTBP1がADAMTS2の基質である可能性を示唆する報告があるため、TGFbetaシグナルを考慮に入れて解析を進めている。哺乳類の大脳新皮質は6層構造の中に多数のニューロンが精緻に配置され、高次脳機能の構造的基盤になっていると考えられている。サブプレートニューロンは大脳皮質で最も早く生まれ、成熟するニューロンで、生後は細胞死により失われることから、大脳皮質形成期にその機能を発揮していると考えらる。これまでは、視床からの軸索投射のガイド役としての機能は知られていたものの、胎生初期から中期における機能は不明なままであった。本研究によりサブプレートニューロンの新たな機能、すなわち放射状神経細胞移動における機能を明らかにした。サブプレートのニューロンの神経活動をGCaMPにより調べたところ、胎生15日の時点で盛んに活動してることがわかった。そこで、この神経活動を抑制したところ、新生移動ニューロンの多極性ー双極性変換が障害された。さらに詳細な解析によりサブプレートニューロンは移動多極性ニューロンに対してグルタミン酸シグナルをシナプスを介して送っていることが、電顕観察、及びタイムラプスイメージング実験により明らかになった。サブプレートニューロンは哺乳類独特であるため、原始羊膜類から哺乳類脳への進化の過程でサブプレートニューロンとそのシグナル伝達の獲得は6層構造の進化に寄与した可能性が示唆される。サブプレートニューロンの新規の機能解析が進み、論文を発表することができた。またその後の実験についても、細胞外基質と放射状神経細胞移動についての実験で、これに関与するプロテアーゼの解析が進んでいる状況であるため。今後はサブプレートニューロンと多極性細胞間のシナプス伝達の特性をより詳細に解析するために、チャネルロドプシンを用いたイメージングや電気生理的な解析も進めていく予定である。

また、サブプレート層に豊富に存在する細胞外基質の機能を解明するための実験も引き続き進めていく予定である。今後はその下流にどのようなシグナル経路があるのかについてさらに解析を進めていく予定である。現在のところTGFbetaの結合タンパクであるLTBP1がADAMTS2の基質である可能性を示唆する報告があるため、TGFbetaシグナルを考慮に入れて解析を進めている。繰越した分については、新たなマウス系統を管理するために実験補助のアルバイトが必要であるため、その謝金として使用する予定である。平成30年度分については予定通り実験に使う試薬、消耗品、学会参加のための旅費等に使用する予定である。当初計画していた消耗品の購入代金が、キャンペーン価格等の適用により予定よりも安価だったため次年度に回せることとなった。そこでその分を次年度の消耗品費に充てる予定である。抗体染色のための抗体購入代金、シングルセル解析の試薬費用に充てる。また、より多くの実験を行うために実験補助員の謝金に充てる。
加法的問題における特異級数の研究

昨年度に引き続き、加法的問題に円周法を用いる際の劣弧上の積分の評価に対する新しい方法を基にして、例えば5個の3乗数の和といった、指定された形の和で表せない自然数の分布についての成果を得た。この方法によって、例えばある一つの整数係数多項式がとり得る自然数値の集合という密度の薄い集合内における、上述のような例外の数の密度について、従来では自明でない評価が得られなかったり、あるいは非常に弱い評価しか得られなかったようないくつかの場合について、評価の質を向上させた。さらに、技術的には同じ方法に基づき、ある個数のべき乗数の和として表される素数の存在、およびそういう素数の密度に対する下からの評価についての結果を得た。これらの結果はまだ弱く感じられるもので不満な点もあるが、この方向の研究としては初めての結果といえるものである。以上の成果は、Stuttgart大学教授のBrudern氏とMichigan大学教授のWooley氏との共著の論文として発表しており、昨年度の実績報告書提出以降は2編が出版された。また、3乗数のワーリング・ゴールドバッハ問題に関して、その特異級数がある種の1次元の篩に付随する条件をみたすことを基に、篩の方法と円周法を用い、十分大きい自然数は、7つの自然数の3乗の和で表せ、しかもその7つの自然数は全て高々4個の素数の積と制限できることを示した。この方向の以前の最善の結果は、素因数の個数が4個の代わり69個であった。この論文はActa Arith.誌に受理されており、近く掲載される見込みである3つのべき乗数の和に関する問題については、2つの変数を素数に、残りのひとつの変数は概素数に限定できるという結果を得た。これはStuttgart大学教授のBrudern氏との共同研究として発表した。この際特異級数については、漸近的に等しいと予想される無限積を有限部分で切った有限積で近似することで、その下からの評価を与えることで処理した。3つのべき乗数の和に付随する特異級数に対して期待される無限積表示を与えることについてもBrudern氏と共同で研究を続けており、3つのべき乗数のうちの2つが平方数である場合と、平方数と2つの立方数の場合については成功している。残るのは、平方数と立方数と4乗数の場合と、平方数と立方数と5乗数の場合の2つの場合のみであるが、これらについては未完成であるため、この方向の成果についてはまだ発表していない。一方、4乗数と5乗数のワーリング問題にかかわる例外集合の評価に関して、Wooleyによる積分評価の方法とある種の特別な恒等式を利用することにより、成果を得た。これはMichigan大学教授のT.D.Wooley氏との共同研究として発表した。ここにおいては、9個及び10個の4乗数の和で表せない自然数のそれぞれの密度に対して、また15個及び16個の5乗数の和で表せない自然数のそれぞれの密度に対して、現在最良の評価を与えた。さらに素数の3乗に付随するワイル和に関する新しい評価を与えることに成功し、その評価と篩の方法を用いることにより、3乗数のワーリング・ゴールドバッハ問題に関する成果も得ている。これについては既に研究集会において発表しており、現在論文を作成している段階である。この論文はActa Arith.誌に受理されており、近く掲載される見込みである
腸内細菌による大腸腫瘍初期病変の異なる分子サブタイプ誘導に関する検討

大腸腫瘍初期病変である腺腫病変(n=250)の腫瘍部・背景粘膜に関して、内視鏡切除材料由来の組織サンプルよりゲノムDNAを抽出した。また、それらの症例に関する臨床情報(性、年齢、病変サイズ、肉眼形態、部位、病理結果)を取得した。抽出したゲノムDNAは遺伝子変異解析、メチル化解析を念頭に濃度調整を行い、一部をバイサルファイト反応を行い凍結保存している。細菌ゲノム解析の候補であるFusobacterium nucleatumに関して、リアルタイムPCRのプライマーを作成し、実験条件を確認した。候補遺伝子変異であるKRAS(EXON2)APC(EXON15) BRAF(V600E)に関して、プライマーをデザインし、実験条件を確認した。候補遺伝子メチル化であるMINTs, MLH1,などに関して、プライマーをデザインし、実験条件を確認した。現在は対象サンプルのDNA抽出、一部のバイサルファイト反応が行われたのみであり、大部分の実験が未施行の状況である。本研究の目的は大腸腫瘍初期病変の分子サブタイプごとの細菌プロファイルを行い、異なる大腸腫瘍の分子サブタイプを規定しうる細菌の同定を行い、さらに、因果関係を評価するために動物モデルを用い感染実験を行うことであり、当初の目的に比し遅れていると判断される。次年度に関しては収集した大腸腫瘍サンプルに関して、候補遺伝子解析をもとにした、分子サブタイプによる分類、細菌解析として、候補であるFusobacterium nucleatumに加え、セレクトしたサンプルに関して、次世代シークエンサーを用いた網羅的細菌解析を行う予定である。まずは、異なる大腸腫瘍の分子サブタイプを規定しうる細菌の同定動物モデルを用い感染実験へつながる知見を得たいと考えている。収集した大腸腫瘍サンプルに関して、候補遺伝子解析をもとにした、分子サブタイプによる分類を行う。また、細菌解析として、候補であるFusobacterium nucleatumに加え、セレクトしたサンプルに関して、次世代シークエンサーを用いた網羅的細菌解析を行う。異なる大腸腫瘍の分子サブタイプを規定しうる細菌の同定動物モデルを用い感染実験へつながる知見を得たいと考えている。当初予定より実験に遅れを生じ、実験器具、試薬に関する支出が少なくなった。
閉塞性腎症における腎線維化を抑制する新しい薬物治療の開発

抗酸化物質αリポ酸(ALA)が閉塞性腎症(UUO)の尿細管間質障害に与える影響について検討した。(方法)ラット14日間尿管閉塞モデルを用い、ALA (200mg/kg/day,連日)の効果について検討した。(結果)ALAの投与により間質線維化が抑制され、FSP1陽性細胞数も有意に低下した。組織TGF-β1濃度もALA投与で抑制され、尿細管アポトーシスもALA投与により有意に改善した。(結論)ALAは腎臓のTGF-β1の産生を抑え、腎障害を抑制する。UUO治療における新しい薬物治療となる可能性が示された。1.ラット閉塞性腎症モデルにおけるαリポ酸の効果(1)閉塞性腎症モデルの作成と薬剤の投与:SDラットを用いた。麻酔下に左尿管の結紮を行い閉塞性腎症モデルを作成した。尿管結紮後14日目に両側腎臓を摘出した。αリポ酸投与群は尿管の結紮の前日から経口投与を開始し連日投与した。またコントロール群も同様に作成した。(2)腎組織中のTGF-β1の測定:腎組織中のTGF-β1の測定をELISAキットで行なった。αリポ酸投与群において有意にTGF-β1の組織中濃度が低いことが確認された。(3)免疫組織学的検討:腎間質の線維化をMasson Trichrome染色で評価した。Point counting法で測定したところ、αリポ酸投与群において有意に間質の線維化が少ないことが確認された。また、FSP-1(fibroblast specific protein-1)染色を行い、αリポ酸投与群において線維芽細胞の発現が有意に少なくなることが確認された。2.ラット閉塞性腎症モデルにおけるエリスロポエチンの効果(1)閉塞性腎症モデルの作成と薬剤の投与:SDラットを用いた。エリスロポエチン投与群とコントロール群で実験を行った。(2)免疫組織学的検討:腎間質の線維化をMasson Trichrome染色で評価した。エリスロポエチン投与群において有意に間質の線維化が少なく、エリスロポエチンが間質の線維化を抑制することが確認された。(3)閉塞性腎症におけるエリスロポエチンおよび受容体の蛋白発現の変化:複数回の確認が必要であるが現在のところ閉塞性腎症により一時的にエリスロポエチンの発現が上昇する印象を得ている。今後、受容体の発現の変化も確認したい。(1)ラット閉塞性腎症モデルにおけるαリポ酸の効果a)閉塞性腎症モデルの作成と薬剤の投与:SDラットを用い閉塞性腎症モデルを作成。αリポ酸投与群(L群)は尿管の結紮の前日から経口投与を開始し連日投与した。またコントロール群(C群)も同様に作成した。b)腎組織中のTGF-β1の測定:腎組織中のTGF-β1の測定をELISAで行いL群において有意にTGF-β1の濃度が低いことが確認された。c)免疫組織学的検討:腎間質の線維化をMasson Trichrome染色で評価したところ、L群において有意に間質の線維化が少ないことが確認された。また、FSP-1染色を行い、L群において線維芽細胞の発現が有意に少なくなることが確認された。d)Real-time PCR:現在L群およびC群の腎組織からRNAを抽出した。今後RT PCRを行い、抗酸化作用のマーカーの変化につき両群で検討する。(2)ラット閉塞性腎症モデルにおけるエリスロポエチン(EPO)の効果a)閉塞性腎症モデルの作成と薬剤の投与:SDラットを用い、閉塞性腎症モデルを作成した。EPO投与群(E群)とコントロール群(C群)で実験を行った。b)免疫組織学的検討:腎間質の線維化をMasson Trichrome染色で評価した。E群において有意に間質の線維化が少なく、EPOが間質の線維化を抑制することが確認された。さらにFSP-1染色を追加する。今年度はssDNA染色におけるアポトーシスの評価と、炎症性細胞浸潤の評価を行う。c)閉塞性腎症におけるEPOおよび受容体の蛋白発現の変化:閉塞性腎症により一時的にEPOの発現が上昇する印象を得ている。EPOとEPO受容体の腎組織における発現の経時的変化をウエスタンブロットおよび免疫染色で確認する。閉塞性腎症(UUO)に対する新しい薬物治療の開発に関する研究を行った。

当初、αリポ酸に加え、エリスロポエチンを用いた研究も行う予定であったが、他施設から同様の研究成果が発表され、抗酸化物質αリポ酸(ALA)を用いた検討を行った。(目的)UUOでは酸化ストレス亢進が腎障害進行の一因となっている。我々は抗酸化物質ALAがUUOの尿細管間質障害に与える影響について検討した。(方法)SDラットを用いた14日間尿管閉塞モデルで検討した。Control群(n=10)では0.5% carboxylmethyl celluloseをUUOの1日前から連日経口投与した。ALA投与群ではALA 200mg/kgをcontrol群と同様の期間経口投与した。14日目に腎臓を摘出し、組織の保存とパラフィン切片の作成を行った。各種免疫組織学的検討、組織中TGF-β濃度の検討を行った。(結果)ALA投与群はコントロール群と比較し、間質の線維化(Maason Trichrome染色で検討)が有意に抑制(20.7±3.1 vs 57.4±6.0%)され、FSP1陽性細胞数(2.9±0.2 vs 7.3±0.2 cells/HPF)も有意に低かった。組織中のTGF-β濃度もALAの投与により有意に抑制された(5.7±0.4 vs 8.1±0.3 pmol/mg)。ssDMA染色で検討した尿細管アポトーシスもALA投与により有意に改善した(61.5±8.8 vs 91.8±8.7 apoptotic cells)。ED-1陽性マクロファージの浸潤に関しては、両群間に有意差はなかった(36.3±4.6 vs 41.2±4.2 macrophages/HPF)。(結論)αリポ酸はラットUUOモデルにおいて組織中TGF-βの産生を抑え、間質の線維化と尿細管アポトーシスを抑制した。αリポ酸を用いた研究はおおむね順調に進んでいるが、αリポ酸の抗酸化作用を証明することが難しく、その部分で多くの時間を費やしている。またエリスロポエチンを用いた研究においては、エリスロポエチンの抗線維化作用は証明できたものの、似かよった研究成果が医学雑誌に発表されたため、さらに新しい知見を得るために努力している。24年度が最終年度であるため、記入しない。αリポ酸を用いた研究は、抗酸化作用の証明ができれは完結できると考えている。免疫染色、ウエスタンブロットによる検討では現時点で良好な結果が得られていないが、研究分担者の尾田のラボにおいてはreal-time PCRによる実験系が軌道に乗っており、その手法を用いてαリポ酸の抗酸化作用を証明したい。エリスロポエチンを用いた検討では、ポジティブデータは得られているが、似かよった実験系の論文が最近、医学雑誌に掲載され、新しい知見を追加する必要がある。このための方法として、腎組織におけるエリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体の発現の経時的変化を検討に加えるととにより、この研究の完結への突破口としたい。
ジャガイモシスト線虫のふ化促進物質の単離・構造決定

過年度までに得られた知見より、ジャガイモシスト線虫のふ化促進物質は、極めて不安定であることが明らかとなっている。しかしジャガイモ根券滲出液は、水溶液の状態で比較的安定であることから、水和が安定化に寄与していることは判るものの、その不安定性の真の原因は未だ不明である。ふ化活性物質の分離・精製に当っては、多段階の濃縮乾固を繰り返すため、出来るだけ早く原因を見い出す必要がある。そこで、今年度は、保存中の失活を防止するため液体窒素冷却容器中、-196°Cにてサンプルを投入、活性低下があるかどうか調べた。この結果氷結状態および乾燥状態において、6ヶ月間ほぼ保存可能であることが分かった。ただし、濃縮に当っては30°C以下で操作しても失活であり注意を要した。今年度の原料として、トマト生根を用いた。前年度までトマト乾根を用いたものの、風乾、4ヶ月間室内保存後の活性値は変動が大きいためである。そこで原料入手先を札幌市福移、廃熱利用園芸団地に変更し、冬期(12月)に2トンの生トマト根を入手した。室内(0°C)に保存し水抽出を5°C以下で行った。濾過後活性物質をアンバーライトXAD-2に吸着、アセトン脱着、濃縮を30°C以下で行い、粗抽出物を10kg当り乾固状態で3g得た。活性値は10^<-4-5>g/mである。このものを-196°Cで保存し失活を除いだ。この一部を用い、アンバーライトXAD-2カラムクロマト、次いでセファデックスG-10カラムクロマトに付し、純化した。活性分画は、2ヶ所に表われ、活性値は10^6g/mまで上昇した。なお活性値は冬期のため一桁程低下していると考えられる。現在大量抽出を行い、粗抽出物として蓄積している。すでに前年度において活性値を10^9g/〓まで上昇させているので、その手順に沿い、今後大量の処理、分離・精精を行う。また、極低温保存中のサンプルについて、数ヶ月毎に活性試験を行い、定量的に失活原因を求明しながら単離を行う。
細胞表面B7分子による自己グリオーマ細胞特異的キラーT細胞誘導に関する実験-B7分子遺伝子導入による遺伝子治療の基礎実験-

抗原提示細胞には、その細胞表面にB7分子を発現しており、細胞傷害性T細胞(CTL)誘導に重要な分子であることが示された。B7分子を遺伝子導入されたメラノーマ細胞では、未処置の細胞に比し、高率にCTL誘導を起こすことが知られている。グリオーマ細胞とメラノーマ細胞とは発生母地を同じくし、今回我々が用いたマウスグリオーマ細胞、RSVMではB7の発現は認められなかった。そこで、この細胞にB7を遺伝子導入し、B7分子を発現するtransfectantを作成、in vitroでCTLを誘導させたところ、未処置RSVMに比し、高率にCTLを誘導することがわかった。我々が用いている実験系では、C3Hマウスと同系のグリオーマ株細胞であるRSVMを用いる。当大学免疫学教室の東が作成したB7plasmid vectorを用い、large prepにて増やした後にリポフェクチン法によりRSVMにtransfectし、B7分子の発現に関しては、FACS analysis(現有設備)にて発現量を計測する。adenovirusに関しては、まずshuttle vectorにB7分子を導入、それをlarge prepにて増殖させた。一方、adenovirusを含むcosmid vectorを同様の方法で増殖、それぞれを腎癌細胞にtransfectすることにより、B7分子をpackagingしたadenovirusを作成に成功した。次にC3Hマウスの脾細胞を摘出しリンパ球を採取、リンパ球と放射線にて不活化したRSVM細胞とを3日間cocultureすること(MLTR;mixed lymphocytetumor reaction)により、CTLを誘導したところ標的グリオーマ細胞に高いキラー活性をしめした。