hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Micro RNAプロファイルを基にしたオーダーメイド歯周組織再生治療法の確立

歯周組織構成細胞および間葉系幹細胞(MSC)に特徴的に発現するmicro RNAを同定し、さらに、MSCにおいて、サイトカインなどの発現調節因子によって特徴的に変化するmicro RNAを同定した。この結果から、細胞を用いた歯周組織再生療法において、移植MSCのmicro RNA発現プロファイルに基づいた最適な調節因子の選択が移植局所における歯周組織構成細胞への分化促進につながり、最終的には効率的なオーダーメイド歯周組織再生療法の確立が期待される。歯周組織再生治療において、細胞移植に用いる間葉系幹細胞(MSC)と歯周組織構成細胞の細胞機能制御および移植前後の恒常性維持は、歯周組織再生の成否に重要な因子である。平成27年度における本研究では、歯周靭帯細胞(HPL cells)を含む歯周組織構成細胞およびMSCが特徴的に発現しているmicro RNAに焦点を当て、歯周組織構成細胞への分化に重要なmicro RNAを明らかにすることを最終的な目的として、移植に用いるMSCの未分化状態維持および歯周組織構成細胞への分化に対する方向付を制御することで最適な細胞機能の制御方法を確立するという観点から研究を推進した。平成27年度に行なった研究の具体的な内容として、1.歯周組織構成細胞およびMSCにおけるmicro RNA発現プロファイル:歯周組織構成細胞であるヒト歯肉線維芽細胞(HGF),HPL cells,ヒト骨芽細胞(HOB),ヒトセメント芽細胞(CEM)およびMSCにおけるMicro RNA発現の網羅的な解析を行なった。MSCと比較して、HPL cells:高発現1種,低発現1種; HGF:低発現13種;HOB:低発現125種; CEM:高発現2種,低発現15種のmicro RNAが特徴的な発現パターンを示した。MSCにおいては、全ての歯周組織構成細胞と比較して29種のmicro RNAが高発現を示した。以上の結果から、歯周組織構成細胞およびMSCに特徴的なmicro RNAおよびサイトカイン刺激により特徴的な変化を示すmicro RNAが同定されたことで、効率的なMSCを用いた歯周組織再生療法が期待される。平成27年度における研究により、1.歯周組織構成細胞におけるmicro RNA発現プロファイル:歯周組織構成細胞であるヒト歯肉線維芽細胞(HGF),ヒト歯周靭帯細胞(HPL cells),ヒト骨芽細胞(HOB),ヒトセメント芽細胞(CEM)およびMSCにおけるMicro RNA発現の網羅的な解析を行なった。得られた結果として、MSCと比較して、HPL cells:高発現1種,低発現1種; HGF:高発現0種,低発現13種; HOB:高発現0種,低発現125種; CEM:高発現2種,低発現15種のmicro RNAが特徴的な発現パターンを示した。2.間葉系幹細胞MSCにおけるmicro RNA発現プロファイル:MSCにおいて、全ての歯周組織構成細胞と比較して29種のmicro RNAが高発現を示した。4.Micro RNA発現調整に有効な因子の検討:Micro RNA発現調整因子として歯周組織再生療法に応用されているサイトカインに着目し、サイトカイン刺激時において特徴的に変化するmicro RNAを検出した。平成27年度においては、サイトカインは、FGF2, BMP2, BDNFおよび歯周組織再生療法に用いられるエナメルマトリックス蛋白の主成分であるAmelogeninを用いた。無刺激時と比較して特徴的な変化を示したmicro RNAは、FGF2:増加11種,減少3種: BMP2:増加16種,減少1種; BDNF:増加8種,減少15種; Amelogenin:増加9種,減少12種であった。これらの結果は、交付申請時の平成27年度研究実施計画をほぼ満たしており、また、一部平成28年度研究実施計画に及んでいるため、現在までの達成度は当初の計画以上に進展していると考える。歯周組織再生において、MSCと歯周組織構成細胞の細胞機能制御および移植前後の歯周組織恒常性維持は、歯周組織再生療法の成否に重要な因子であることが示唆されている。平成28年度における本研究では、歯周靭帯細胞(HPL cells)を含む歯周組織構成細胞およびMSCが特徴的に発現しているmicro RNAのうち、細胞機能制御および恒常性維持に関わるものに焦点を当て、歯周組織構成細胞への分化に重要なmicro RNAを明らかにすることを目的として、サイトカインなどの細胞機能に影響を及ぼす因子によって特徴的micro RNAの発現を調整することで、MSCの未分化状態維持および分化の方向付けを制御し、最適な細胞機能の制御方法を確立するという観点から研究を推進した。平成28年度に行なった研究の具体的な内容として、2.細胞分化および機能維持に重要なmicro RNAの同定:平成27年度において歯周組織構成細胞およびMSCにおける特徴的なMicro RNAが同定されたので、それぞれの細胞に対してmicro RNA導入によってmicro RNAの発現調整を行ない、必要な細胞機能を評価した。Osteoblast, HPL cellsおよびCementoblastsへの分化に対する検討を行ない、MSCにおける未分化状態維持に関する検討も行なった。3.Micro RNA発現調整細胞の未分化維持および分化の方向付けの検討:種々の刺激因子によってmicro RNA発現を調整したMSCに対し、プロファイリングで同定したmicro RNA群に対する分化の方向付けおよび未分化状態維持への影響を検討した。なお、分化の方向付けに関しては、MSC移植により再生が望まれる骨・セメント質および歯周靭帯の均整が保たれることに焦点を当てて検討した。

平成28年度における研究により、1.Micro RNA発現調整に有効な因子の検討:Micro RNA発現調整因子として歯周組織再生療法に用いられるサイトカイン刺激により特徴的に変化するmicro RNAを検出した。特徴的変化を示したmicro RNAは、1PDGF-AA:増加14種類、減少4種類,2TGF-β1:増加24種類、減少1種類,3TGF-β3:増加17種類、減少3種類,4IGF-1:増加22種類、減少11種類,5Noggin:増加1種類、減少9種類であった。2.細胞分化および機能維持に重要なmicro RNAの同定:平成27年度に同定された歯周組織構成細胞およびMSCにおける特徴的なmicro RNAのうち、miR-210およびmiR-628に着目し、MSCに対してそれぞれの発現調整を行ない、細胞分化および細胞機能に対する影響を評価した。Osteoblastへの分化に対しては共に抑制的に働いたが、ヒト歯周靭帯細胞(HPL cells)およびCementoblastsへの分化に対しては、miR-210が抑制的に働くのに対しmiR-628は促進的に働いた。MSC未分化状態維持に関しては、miR-210は多くの未分化マーカー発現を抑制した一方、miR-628はETV1およびKLF12の発現は促進させたが、SOX11発現は抑制した。3.Micro RNA発現調整細胞の未分化維持および分化の方向付けの検討:種々の刺激因子のうち、FGF2およびBDNFによってmicro RNA発現を調整したMSCに対し、分化の方向付けおよび未分化状態維持への影響を検討した。FGF2刺激によって、Osteoblast, HPL cellsおよびCementoblastsへの分化の方向付けが促進され、MSC未分化マーカーGATA6の発現も促進された。また、BDNF刺激によって、同様に歯周組織構成細胞の均整が保たれた分化の方向付けおよびMSC未分化状態維持が促進されたが、FGF2と比較すると、Cementoblastsへの分化の方向付けが早期に促進される傾向を示した。これらの結果は、交付申請時の平成28年度研究実施計画をほぼ満たしているため、現在までの達成度は順調であると考える。平成29年度の本研究では、昨年度同様、microRNA発現調整によるMSC分化に対する影響を検討することによって、MSCの歯周組織構成細胞への分化に対しての重要なmicro RNAおよび刺激因子を同定するという観点から研究を推進した。1. Micro RNA発現調整細胞の未分化維持および分化の方向付けの検討: IGF-1, PDGF-AAの刺激によって、Osteoblast(HOB), Cementoblasts(CEM)への分化が促進された。MSC未分化マーカーに関しては、IGF-1によってSOX11およびETV1発現が抑制された一方、PDGF-AAによってFOXP1発現は顕著に抑制された。
Cardiomyoplastyにおける人工二重心膜による骨格筋癒着防止と硬化

【目的・方法】Cardiomyoplastyにおいて心臓に巻き付けた骨格筋が胸骨,心膜に強固に癒着し,骨格筋が自由に動けず,心機能補助に制限があることが報告されている.これまでの我々の研究においても慢性期に開胸してみると,骨格筋が胸骨に強固に癒着しており,非開胸時より癒着剥離の為心機能が著明に改善することが観察されていた.骨格筋の癒着を防止しなめらかな自由な骨格筋運動をさせるために人工心膜を考案し,その有効性を検討した.人工心膜の素材としては今回はPTFEを用い二重構造のsacを作成し心臓をくるめるように形成し,中空に水,オリーブ油を充填した.Cardiomyoplastyのモデル作製.成犬雑種10頭を用い,全身麻酔下に左広背筋を遠位付着部位で剥離遊離し,第3肋骨切除部位から有茎に広背筋を胸腔内に誘導し,心臓に巻き付けるように心外膜に固定した.その外側に作製した人工心膜を心臓ならびに骨格筋を包むように固定した.骨格筋に電気刺激用のペースメーカーリ-ドを縫着し,連続刺激ペースメーカーを接続した.手術終了後2週間後からペースメーカーで広背筋を刺激し,2カ月トレーニングし,非疲労性の筋へtransformationさせた.2カ月後人工心膜の効果を評価した.【結果】人工心膜の中空状態の作成に難渋し,中に充填した生理食塩水,オリーブ油は2ヶ月後には消失していた.また内外のPTFE膜は癒着しており,初期の目的のなめらかな人工心膜作成には至らなかった.心エコーを用いても骨格筋の外面は周囲と癒着しており,人工心膜を巻かないコントロール群と比較しても差はなかった.以上の結果から人工心膜の素材の選択,確実に中空を保てるsacの作成方法に問題があった.cardiomyoplastyは充分臨床応用可能で,今後は如何に効率よく骨格筋駆動の効果を引き出すかが課題で,今回の人工心膜もその一つの解決方法と思われる.【目的・方法】Cardiomyoplastyにおいて心臓に巻き付けた骨格筋が胸骨,心膜に強固に癒着し,骨格筋が自由に動けず,心機能補助に制限があることが報告されている.これまでの我々の研究においても慢性期に開胸してみると,骨格筋が胸骨に強固に癒着しており,非開胸時より癒着剥離の為心機能が著明に改善することが観察されていた.骨格筋の癒着を防止しなめらかな自由な骨格筋運動をさせるために人工心膜を考案し,その有効性を検討した.人工心膜の素材としては今回はPTFEを用い二重構造のsacを作成し心臓をくるめるように形成し,中空に水,オリーブ油を充填した.Cardiomyoplastyのモデル作製.成犬雑種10頭を用い,全身麻酔下に左広背筋を遠位付着部位で剥離遊離し,第3肋骨切除部位から有茎に広背筋を胸腔内に誘導し,心臓に巻き付けるように心外膜に固定した.その外側に作製した人工心膜を心臓ならびに骨格筋を包むように固定した.骨格筋に電気刺激用のペースメーカーリ-ドを縫着し,連続刺激ペースメーカーを接続した.手術終了後2週間後からペースメーカーで広背筋を刺激し,2カ月トレーニングし,非疲労性の筋へtransformationさせた.2カ月後人工心膜の効果を評価した.【結果】人工心膜の中空状態の作成に難渋し,中に充填した生理食塩水,オリーブ油は2ヶ月後には消失していた.また内外のPTFE膜は癒着しており,初期の目的のなめらかな人工心膜作成には至らなかった.心エコーを用いても骨格筋の外面は周囲と癒着しており,人工心膜を巻かないコントロール群と比較しても差はなかった.以上の結果から人工心膜の素材の選択,確実に中空を保てるsacの作成方法に問題があった.cardiomyoplastyは充分臨床応用可能で,今後は如何に効率よく骨格筋駆動の効果を引き出すかが課題で,今回の人工心膜もその一つの解決方法と思われる.
日中朝をめぐる交流と日本古代文学についての研究-渤海使と文学・『聖徳太子伝暦』-

8世紀10世紀に日本にやってきた渤海使との交流の中で詠作された漢詩と、伏見宮本『聖徳太子伝暦』との読解作業をとおして、古代における日本と海外諸国(中国・朝鮮)との文化交流の諸相を多角的に検討した。渤海使関係詩の読解については、勅撰三詩集に掲載のそれはほぼ注釈作業を終え、研究書としての刊行準備段階に入った。詩の語句の解釈や典拠に関する点ばかりでなく、渤海使を受け入れる際の制度的な細部などについても、新たに判明した点が少なくない。またさらに、『田氏家集』『菅家文草』所収の作品についても鋭意読解作業を続けている。漢詩文読解のために索引類の充実は必須であることが実感され、日本漢文の総合的な電子検索システムを立ち上げる作業も開始した。伏見宮本『聖徳太子伝暦』の読解も、2006年度末の段階で、太子十人歳条まで読み進めた。いまだ十分になされたとは言えない『伝暦』の諸本論について、現存最古本に属する伏見宮本と他本との比校によって、かなり明確な傾向をつかむに至っている。歴史資料として扱われることの多い『伝暦』であるが、漢文としてのレトリックにも注目しつつ読解作業を進めている。判読の困難な資料を、写真(およびそのコピー)によって解読して行く作業は、なかなかはかどらないが、今後も作業を継続して行く予定である。それらの知見を含め、研究分担者がそれぞれの関心から得た新たな知見を、2005年・2006年の夏、それぞれ中国北京・同長春で開催された国際シンポジウムで発表し、内外の研究者との意見交換を図ることができた。特に2005年度の国際シンポジウムでの成果は、『日本・中国交流の諸相』(勉誠出版2006年)として刊行した。「日中朝をめぐる交流と日本古代文学についての研究-渤海使と文学・『聖徳太子伝暦』-」をテーマとして、早稲田大学文学部及び教育学部のメンバーに、他大学や中国・台湾・韓国の大学の研究者を交え、研究を進めている。日本文学・中国文学・日本歴史・東洋哲学など、専門を異にするメンバーが、それぞれの専門分野から、古代の国際交流、そしてそこから生み出された文学・文化の特性を明らかにすべく、意見を交換し、研究成果を発表してきた。具体的に平成15年度においては、以下のような成果を積み上げてきた。(1)「渤海使関連詩」及び『聖徳太子伝暦』をテーマとした研究会を発足し、月一回ごとに開催した。渤海使関連詩研究会では、渤海使及び渤海使に関係した日本側の作品も含めた漢詩について、注解を行い、問題を提起しながら研究を進めた。また、聖徳太子伝暦研究会では、未翻刻資料伏見宮本聖徳太子伝暦の翻刻・訓読・注解を行っている。両研究会とも、日中朝の交流と文学を問題意識として、幅広い議論を重ねている。(2)渤海使関連詩研究会の成果を、雑誌『アジア遊学』へ「渤海関連詩を読む」として連載している(54号、平成15年8月)(3)平成15年12月、韓国外国語大学校で国際学術大会「聖徳太子伝暦を巡る古典学」を開催した。(4)研究活動の一環として開催した国際シンポジウム、研究会の成果を『交錯する古代』(勉誠出版、平成16年1月)、『日本古代文学と東アジア』(同、平成16年3月)、『交流する平安朝文学』(同、平成16年3月)として刊行(予定)。(5)平成16年3月、中国北京・首都師範大学にて「比較文学の視野における日本文学」(仮)をテーマとして、中国の研究者と共に学術研究会を開催する予定。

研究活動は、ほぼ昨年度のそれを継続するかたちで進行した。6回開催した定例の研究会では、渤海使関係詩と伏見本聖徳太子伝暦の読解を引き続き行い、毎回、さまざまな分野の研究者が各地から集い、活発な意見交換がみられた。渤海使関係詩の読解成果については、各回の発表担当者によって議論の成果も取り込みつつ成稿され、『アジア遊学』(勉誠出版)に5回にわたって掲載した。伝暦の成果についても、公表を模索中である。これらの読解作業をとおして、従来の見解とは異なる新見や、通説の問題点が、少なからず明らかになってきている。いずれ得られた成果については、公刊することをめざし、その準備態勢も整いつつある。11月に中国浙江工商大学で開催された国際シンポジウム「道教と日本文化」に本プロジェクト共同研究員3名が参加し、これまでの研究成果の一部も取り込んだ研究発表を行い、各国の研究者との意見交流を行った。また、来年度以降に本研究プロジェクトが中心となって企画を予定している国際シンポジウムに関する打ち合せ・意見交換を、中国北京師範大学、東北師範大学の関係者とともに行いつつある。研究テーマに関する参考文献のデータ・ベースの構築も本プロジェクトの課題のひとつであるが、現在、仮名文献に比して構築が大幅に遅れている平安時代以前の漢文文献の電子テキスト化の実現についても、その可能性を探り、関係者の協力を得て具体的な実現に一定の見通しを得られるに至りつつある。研究活動は、基本的には昨年度のそれを継続するかたちで進行した。6回開催した定例の研究会では、渤海使関係詩と伏見本『聖徳太子伝暦』の読解を引き続き行い、毎回、さまざまな分野の研究者が各地から集い、活発な意見交換がみられた。渤海使関係詩の読解成果については、とりあえず勅撰三詩集収録分については検討を終えたので、単行書出版による公表を検討中である。実際の刊行は来年度ないし再来年度になる見込み。9月に中国北京師範大学で開催された国際シンポジウム「世界的視野における日中文化」に本プロジェクト共同研究員5名が参加し、これまでの研究成果の一部も取り込んだ研究発表を行い、各国の研究者との意見交流を行った。そこでの成果は『アジア遊学別冊』誌上に公表。このシンポジウムの前には、渤海の前身である高句麗関係の史跡踏査も吉林省集安において実施した。また、来年度に本研究プロジェクトが中心となって企画を予定している国際シンポジウムに関する打ち合せ・意見交換を、中国東北師範大学の関係者とともに行いつつある。平安時代以前の日本漢文文献の電子テキスト化の作業についても、今年度はデータの入力・校正を中心に具体化を進めた。また、将来のWeb上での公開に備えた検索システムに関する検討も行った。研究活動は、基本的にはこれまでのそれを継続するかたちで進行し、一方で、科研費支給対象最終年度であることから、これまでの成果をまとめる作業も進めた。渤海使関係詩の読解成果については、昨年度までに検討を終えた勅撰三詩集収録分については、単行書出版による公表を検討中である。実際の刊行は来年度になる見込み。定例研究会では、さらに『菅家文草』・『田氏家集』所載の関係詩の読解を進めた。こちらも着実に進行中である。
地方行政の産業振興政策の決定に資する地域イノベーションの分析・可視化ツールの開発

本研究は、特許データに基づき企業のイノベーション活動についての計量分析を行い、その結果を可視化することで、視覚的に地域の産業構造を分析することを支援するシステムを開発することを目的とする。本研究で提案する手法により地域企業のイノベーション活動を可視化することは、地方行政の地域産業に対する理解度を高めることを支援するものであり、地方行政の産業振興政策の立案に大いに役立つものであり、産学官連携によるオープンイノベーション型の地域産業基盤の形成にも寄与するものと考えている。分析対象地域を東京都日野市、府中市、八王子市とし、当該地域におけるイノベーション活動の可視化を試みた。3市は、大手企業の本社機能や研究開発拠点が数多くあり、それらを中心とした中小企業の産業基盤が形成された国内有数の産業集積地域である。出願時期が2004年から2014年の公開特許公報を対象とし、発明者の住所から研究開発が行われている事業所を推定し、1地域別特許出願数の推移、21事業所あたりの出願数、3ツリーマップによる地域別の事業者の多様性分析を行った。これらの分析の結果、地域別の出願推移(イノベーション活動の推移)とその特性が明らかとなり、どの地域においても減少方向であることが明らかとなった。また、1事業所当たりの特許出願数を地域別に比較したところ、他の2市に比べて、日野市が飛躍的に高い値を示していることが分かった。ツリーマップによる3市の事業所の多様性を分析したことにより、地域産業のイノベーション活動という視点になった各地域の産業構造を明らかにすることができた。また、それらの3市における2004年と2014年の比較を行った結果、年代の違いによる産業構造の変化を視覚的に明らかにすることができた。
巨大な軌道角運動量の自由度をもつ原子ビームの生成法の開発

研究の最終目標は、世界でも報告のない、波動関数(位相)の制御により「軌道角運動量をもつ原子ビーム」を生成することである。本研究では、その実現に必要な実験スキームを明らかにし、特殊な形状を有する回折格子等の光学素子の提案を行った。提案する光学素子の作製には、最先端の超微細加工技術、集束イオンビームを用いて試作に成功した。本研究は巨大な軌道角運動量の自由度をもつ原子ビーム生成実現への第一歩となるものである。本研究の目的は、ごく最近代表者により発見された「軌道角運動量をもつ電子ビーム」の研究(Nature, 2010)を踏まえ、波動関数(位相)の制御による「軌道角運動量をもつイオンビームの生成」を世界に先駆けて挑戦することである。初年度である本年度は、シミュレーションを含む生成法および検出法に対する詳細な検討を行い、国内外の原子ビームの先端研究者らとの情報交換、検出器発注予定先の技術者らと打合せを行った。検討の結果、原子ビーム波動関数の制御にはフォーク型回折格子による方法が、現状では最も適していることが分かり、光学系に最適な回折格子の設計およびテスト作製を行った。回折格子の作製には、現有する集束イオンビーム(FIB)装置を用いて行い、回折格子の評価は走査型電子顕微鏡(埼玉工業大学)および透過型電子顕微鏡(東京大学)を用いて行った。本研究の最終目標は、ごく最近代表者により発見された「軌道角運動量をもつ電子ビーム」の研究(Nature, 2010)を踏まえ、波動関数(位相)の制御による「軌道角運動量をもつイオンビームの生成」することである。そのために必要な計算およびシミュレーションを行った。この結果、原子ビーム波動関数の制御にはフォーク型回折格子による方法が、現状では最も適していることが分かり、光学系に最適な回折格子の設計および作製を行った。回折格子の作製は集束イオンビーム(FIB)装置を用いて行い、回折格子の評価はFIB、電子顕微鏡、および26年度本助成金で購入改造したデジタルイメージングシステムを用いて行った。また作製した回折格子をイオンビーム装置に組み込みイオンビーム照射のテスト実験も行った。本研究により、「軌道角運動量をもつイオンビームの生成」に必要な条件、回折格子作製条件などが明らかにされた。ビーム物理、超微細加工本研究は、軌道角運動量をもつ原子(イオン)ビームの生成を目的とする。初年度である本年度においては、最適なビーム生成法、検出法を検討し、回折格子の設計および作製を主要な目標とし、それらはほぼ予定通り達成されている。次年度は、予定通り、作製した回折格子を既存のイオンビーム装置に組み込み、原子(イオン)ビームを通す測定を行う。また2次元原子(イオン)検出器によって、原子(イオン)ビームの強度分布を測定することで、軌道角運動量をもつ原子(イオン)ビームの生成に挑む。今年度の計画として、2次元検出器の開発・購入に物品費を計上しており、物品費の繰越が生じているが、実際には既に購入手続き段階にあり、研究計画に沿ってほぼ研究費は使用されている。次年度使用額は、繰り越した額とあわせ、回折格子のイオンビーム装置への組み込み費および原子(イオン)検出器の開発費に使用する予定である。
形態形成遺伝子の分子進化

hedgehogにより翅原基の前後部区画の境界で、patched,dppの強い発現が見られた。またその翅原基前部区画での異所発現により、異所発現近傍にpatched,dppのectopicな発現が誘発され、前部区画の位置情報が鏡像対称的に重複するが分かった。この事は、hedgehog,winglessによる2次元直交座標系が、成虫構造形成に必須の第3軸、遠近軸の形成を直接コントロールしていることを強く示唆している。hedgehogの下流ではホメオボックス遺伝子BarH1/BarH2が発現していた。BarH1/BarH2は初期肢原基で円環状に発現し、その欠失変異で肢の先端の3節が欠落した。このBar ringをマーカーにしwingless温度変異株を利用し、Bar ringが前後区画境界と背腹区画境界の交点近傍を中心として形成される事を明らかにした。ショウジョウバエの翅肢形成の分子機構は、脊椎動物の四肢形成基本構造であり、ハエの翅肢と脊椎動物の四肢という進化的に無関係なしかし形態的にはむしろ等価な形態系で、"保存"されている事は、極めて興味深い。BarH1/BarH2は、肢以外にの組織でも発現し共エンハンサーにより発現調節されている。BarH1・BarH2間80kbの断片を個体レベルのエンハンサー・アッセイ・ベクターに導入し、複数のトランスジェニックハエのラインをつくり共エンハンサーの位置を特定した。その結果、進化の過程ではエンハンサーが重複され異なる組織特異性が獲得されると推定できた。エンハンサーの重複は、結果としてそれに至るシグナル伝達系の重複化とも連動しているはずで、このようなダイナミックな遺伝子制御系の変化の研究は、遺伝子進化の新しい側面を切り開くものである。細菌のFMN還元酵素遺伝子群及びニトロ還元酵素遺伝子群を調べ、この2種類の酵素の中には、互いに同一の祖先遺伝子由来と推測されるペアが存在し、しかも異なるペアに属する酵素間には、全くアミノ酸レベルの相同性がないことを見つけた。このシステムは、冗長遺伝子の進化を考える上で興味深い。
1分子蛍光イメージング法による分子シャペロニンの蛋白質折れたたみ機構解析

分子シャペロンは蛋白賃の折れたたみを手助けする酵素である。申請者らは1分子蛍光イメージング法を用いて分子シャペロンの一種であるシャペロニンGroELとGroESの結合解離過程を解析し、従来はATPの加水分解が唯一の律速過程と考えられていたシャペロニンの変性蛋白質折れ畳サイクルに未知の中間状態が存在する事を示した。本研究ではこれらの成果を発展させ、以下の成果を得た。1.チロシンの蛍光による構造変化の検出シャペロニンGroELはATPが結合することで大きく構造変化する。チロシン残基の蛍光強度を測定する事でGroELの構造変化をリアルタイムにモニターできる事がわかった。また、変異体を用いた解析により、この蛍光強度変化は、GroELのサブユニットに7残基あるチロシンのうち506番目のチロシン由来である事を特定できた。2.未知の中間体の解析未知の中間体の分子的実体の解明を目指して、より詳細な解析を行った。その結果、この中間体はATPの加水分解と密接に関連している事が明らかになった。また、この中間体の状態では変性タンパク質はGroELのヘリに結合したままで折れたたみ反応がさえぎられており、ふたであるGroESが結合した後一定時間を経ないと、GroELの空洞の中に放出されない事が分かった。この仕組みにより、変性タンパク質はGroELの中に確実に閉じ込められ、その結果、折れたたみ効率が向上していると考えられた。3.プレフォルディンとシャペロニンの相互作用の解析プレフォルディンは真核生物でアクチン等の折れたたみに必須な蛋白質であり、シャペロニンと相互作用することが知られている。本研究ではプレフォルディン、変性蛋白質、シャペロニンをそれぞれ蛍光標識し、蛍光顕微鏡下で観察を行い、平衡定数(kd)を実測した。また、プレフォルディンからの変性蛋白質の解離がシャペロニンによって促進される事を見出した。
真核生物におけるmRNA分解の負の制御とその抑制解除の分子機構の解明

細胞内環境の恒常性の維持機構の一つにmRNA分解が考えられる。これまでmRNA分解は細胞に対して毒性をもつと考えられる未成熟な蛋白質生成の抑制や、不要もしくは余剰のものに対して行われると考えられてきた。しかし、mRNA分解という反応の制御の詳細なメカニズムには、翻訳反応と分解の関係、分解の抑制など明らかにすべき点が多く残されている。先に私は、mRNA分解の過程で律速段階となる反応、キャップ構造の除去を行う脱キャップ酵素Dcp1が翻訳終結因子であるeRF3と相互作用することを見出した。この相互作用の意義を、Dcp1の欠失変異体及び様々な点変異体を用いた実験により検証したところ、Dcp1がeRF3と相互作用することで、効率のよい翻訳終結反応に関与することを明らかにした。本年度は、この詳細な分子メカニズムに対して検討を行った。脱キャップ反応はDcp1とDcp2という2つのタンパク質の複合体から担われている。このDcp2の欠失変異体を作製したところ、Dcp1同様翻訳終結反応の効率の低下が見られた。さらに、Dcp2欠失変異体では、eRF3の大部分が不溶性画分に移行した。以上のことから、Dcp2はeRF3の生化学的特性に何らかの影響を与える可能性が示唆された。今後は、この影響についてDcp1との関係も含め検討を加えていく必要がある。従来、mRNA分解は細胞に対して毒性をもつと考えられる未成熟な蛋白質生成の抑制や、不要もしくは余剰のものに対して行われることが主として考えられてきたが、分解の抑制も効率よい遺伝子発現を可能にすると考えられる。そこで私は、mRNA分解に対して抑制という面より考察を加えている。現在、出芽酵母細胞においてmRNA分解の調節因子群であるPat1-Lsm複合体の構成因子の破壊株が、DNA傷害剤存在下では生育不全になること、また、その感受性抑圧因子としてSml1を同定している。さらに、同定したSml1がmRNA分解を抑制し、Pat1-Lsm複合体がその抑制の解除に関わる可能性を見出している。本年度は、Pat1-Lsm複合体によるSml1のmRNA分解の抑制解除機構解明のために、Sml1の蛋白質分解という観点から研究を進めた。Sml1の蛋白質分解に関わる因子の取得を目的としてYeast two-hybrid法によるスクリーニングを行っている。また、Sml1とmRNA分解の関係を探る上で、新たに、脱キャップ酵素Dcp1が翻訳終結反応に関与する可能性を見出した。現在は、Sml1の相互作用因子の探索を進めるとともに、新たに見出したDcp1と翻訳終結反応との関係について解析を進めている。そこで私は、mRNA分解に対して抑制という面より考察を加えてきた。私はこの研究を進める中で、昨年度、mRNA分解の過程で律速段階となる反応、キャップ構造の除去を行う脱キャップ酵素Dcp1が翻訳終結因子であるeRF3と相互作用することを見出した。この相互作用は、Dcp1の翻訳終結反応への関与を想起させるものであった。そこで、Dcp1の欠失変異体を作製したところ、野生株と比較して終止コドンの読み飛ばしの頻度の上昇を認めた。さらに、Dcp1の脱キャップ酵素としての機能と翻訳終結反応への機能が異なるドメインにより担われているのか否かを検討する目的で、様々な点変異体を作製し検証した。その結果、脱キャップ活性を有したまま、翻訳終結反応に異常を生じる変異体の単離に成功した。この点変異が翻訳終結反応に与える影響を検討するために、翻訳終結因子eRF3との結合実験を行ったところ、野生株で確認された両者の相互作用が消失していた。以上の結果から、脱キャップ酵素Dcp1が翻訳終結因子eRF3と相互作用することで、翻訳終結反応に関与することを見出した。しかし、その詳細な分子機構は未解明であり、この点を明らかにすることが次の課題である。

以上のことから、Dcp2はeRF3の生化学的特性に何らかの影響を与える可能性が示唆された。今後は、この影響についてDcp1との関係も含め検討を加えていく必要がある。
PKD2L1カチオンチャネルによる苦味受容機構の解明

昨年度までに、二瓶選択嗜好実験、リック解析実験、カルシウムイメージング実験を用いて、III型味細胞に発現し、transient receptor potential非選択性カチオンファミリーに属するpolycystic kidney disease 2-like 1 (PKD2L1)が、キニーネによる苦味受容機構に寄与することを明らかにしてきた。そこで本年度は、野生型マウスあるいはPKD2L1ノックアウトマウスから単離した味細胞にパッチクランプホールセル記録法を適用し、キニーネ処理による電流応答の検出を試みた。しかし蛍光顕微鏡下でIII型味細胞が細胞同定に必要な蛍光強度を示さなかったことから、現在も細胞単離の技術改良を進めており、近く電流測定が可能になるものと考えている。一方、これまでにPKD2L1過剰発現細胞を用いたパッチクランプ実験や二瓶選択嗜好実験において、他の苦味物質であるデナトニウムはPKD2L1に作用しないことを見出していることから、単離III型味細胞を用いたカルシウムイメージング実験やリック解析実験におけるデナトニウムの効果についても検討した。カルシウムイメージングにおいて、野生型マウスあるいはPKD2L1ノックアウトマウスから単離したIII型味細胞のどちらにおいても、デナトニウムによるカルシウム応答が観測されなかった。またリック解析実験においても、野生型マウスとPKD2L1ノックアウトマウスの両方がデナトニウムを忌避した。これらの結果からもデナトニウムの苦味応答にPKD2L1は関与しないと考えられる。本研究結果から、PKD2L1がデナトニウムではなく、キニーネによる苦味受容機構に関与することが示唆された。Polycystic kidney disease 2-like 1 (PKD2L1)は、味細胞に発現している電位依存性非選択性カチオンチャネルである。これまでの予備的な実験において、PKD2L1チャネルが苦味物質であるキニーネを除去することで活性化することを見出しているので、PKD2L1チャネルに対する種々の苦味物質の効果を、PKD2L1を一過性に過剰発現させたヒト胎児腎臓HEK293T細胞にホールセルパッチクランプ法を適用し、検討した。その結果、PKD2L1チャネル電流はキニーネ(30μM)とカフェイン(10 mM)の除去により有意に増加したが、デナトニウム(500μM)とベルベリン(100μM)を処理してもPKD2L1チャネル電流は変化しなかった。in vivoにおけるPKD2L1チャネルの苦味受容における役割を明らかにするため、二瓶選択嗜好実験を行った。野生型マウスとPKD2L1ノックアウトマウスに水と30μMキニーネを含んだ溶液を提示し、2日間で摂取した総飲水量比を観測したところ、PKD2L1チャネルの発現に関わらず、これらマウスはキニーネ溶液を忌避した。次に、キニーネ溶液を飲まさせたマウスに、水とキニーネ溶液を15分間だけ提示する短時間二瓶嗜好実験を行った。この条件において、野生型マウスは水よりもキニーネ溶液を摂取する傾向が見られたが、PKD2L1ノックアウトマウスはキニーネ溶液よりも水を好んで摂取した。一方、水と500μMデナトニウム溶液を用いた短時間二瓶嗜好実験においては、野生型マウスとPKD2L1ノックアウトマウスは共に水の嗜好性が高かった。これらの結果から、PKD2L1チャネルがキニーネによる苦味受容機構に関与していることが示唆された。交付申請書の年度計画に沿って順調に進行しているため。本研究では、III型味細胞に発現しているpolycystic kidney disease 2-like 1 (PKD2L1)が苦味受容に寄与する可能性について検討している。我々は、これまでにマウスPKD2L1は電位依存性非選択性カチオンチャネルとして機能すると報告している。昨年度に行ったPKD2L1過剰発現細胞における電気生理学的実験とPKD2L1ノックアウトマウスを用いた短時間二瓶選択嗜好実験により、PKD2L1がキニーネによる苦味受容機構に関与している可能性が示唆されている。そこで本年度は、野生型マウスおよびPKD2L1ノックアウトマウスから味細胞を単離した後、III型味細胞のキニーネ感受性をそれぞれFura-2を用いたカルシウムイメージング法により比較した。III型味細胞は電位依存性カルシウムチャネルを発現しているため、脱分極刺激によりカルシウム応答を生じた味細胞をIII型味細胞とした。その結果、野生型マウスから単離したIII型味細胞では、キニーネの除去により持続的なカルシウム応答が観測されたが、PKD2L1ノックアウトマウスから単離したIII型味細胞では、そのようなカルシウム上昇は見られなかった。またこれらのマウスを用いたリック解析実験も行った。野生型マウスでは、キニーネ溶液を飲ませた直後に水を飲ませると、10秒間の飲水回数および飲水総時間が減少した。一方、PKD2L1チャネルノックアウトマウスでは、飲水回数および飲水総時間が増加した。これらの結果から、キニーネ暴露後のPKD2L1チャネルのオフ応答が苦味の持続性に関わることが示唆された。これまでにPKD2L1過剰発現系と単離味細胞を用いたin vitro実験および短時間二瓶選択嗜好実験とリック解析実験のin vivo実験を行う環境を順調に整えることができた。これら実験により、PKD2L1チャネルが苦味受容に寄与する可能性も得られており、順調に進展していると考えている。

昨年度までに、二瓶選択嗜好実験、リック解析実験、カルシウムイメージング実験を用いて、III型味細胞に発現し、transient receptor potential非選択性カチオンファミリーに属するpolycystic kidney disease 2-like 1 (PKD2L1)が、キニーネによる苦味受容機構に寄与することを明らかにしてきた。そこで本年度は、野生型マウスあるいはPKD2L1ノックアウトマウスから単離した味細胞にパッチクランプホールセル記録法を適用し、キニーネ処理による電流応答の検出を試みた。しかし蛍光顕微鏡下でIII型味細胞が細胞同定に必要な蛍光強度を示さなかったことから、現在も細胞単離の技術改良を進めており、近く電流測定が可能になるものと考えている。一方、これまでにPKD2L1過剰発現細胞を用いたパッチクランプ実験や二瓶選択嗜好実験において、他の苦味物質であるデナトニウムはPKD2L1に作用しないことを見出していることから、単離III型味細胞を用いたカルシウムイメージング実験やリック解析実験におけるデナトニウムの効果についても検討した。カルシウムイメージングにおいて、野生型マウスあるいはPKD2L1ノックアウトマウスから単離したIII型味細胞のどちらにおいても、デナトニウムによるカルシウム応答が観測されなかった。またリック解析実験においても、野生型マウスとPKD2L1ノックアウトマウスの両方がデナトニウムを忌避した。これらの結果からもデナトニウムの苦味応答にPKD2L1は関与しないと考えられる。本研究結果から、PKD2L1がデナトニウムではなく、キニーネによる苦味受容機構に関与することが示唆された。本年度は、野生型マウスおよびPKD2L1ノックアウトマウスの舌から味細胞を単離することで、PKD2L1を発現しているIII型味細胞が苦味物質を受容するかどうかを、カルシウムイメージング法およびパッチクランプ法を用いて検討する。またin vivo実験においては、短時間での水溶液をなめる回数およびその持続時間を解析するリック試験を行う。本試験において、野生型マウスおよびPKD2L1ノックアウトマウスにおける苦味物質のオン応答およびオフ応答がどのように影響を受けるかについて解析する。本年度は、単離味細胞においてカルシウムイメージングに加え、パッチクランプ法を適用し、単離味細胞でのPKD2L1チャネル活性を詳細に解析する。また過剰発現実験において、キニーネ以外の苦味物質が、PKD2L1チャネル活性に影響を与えることを明らかにしているので、単離味細胞を用いた実験やin vivo実験においても、様々な苦味物質に対する感受性について検討する。端数のため、次年度の経費と合算して使用した方が有益であるため。端数のため、次年度の経費と合算して物品購入した方が効率的であると考えたため。次年度の消耗品購入費として使用する。消耗品費の一部として使用する。
意見分類システム構築に向けた市民参画型計画の意見分析

近年,市民参画は,道路計画のパブリック・インボルブメント(以下PIと記す)を始め,コンセンサス会議や裁判員制度に見られるように社会的な潮流である。とくに道路計画では,平成17年9月に国土交通省道路局から構想段階におけるPIの位置付けをより明確化した市民参画型プロセスのガイドラインが改訂通知される等,制度の確立が進められている。しかし,制度的な参画は認められつつも意見が計画や政策に十分反映される状況には至っていない。このような状況は,参画に対する満足度の低下と同時に,形式的参加との認識による行政や専門家へのさらなる不信を招くものである。この悪循環を改善するためには,収集した意見とともに行政や専門家の回答や対策案を併せて示すフィードバックの仕組みによる真の情報・知識共有ならびに意思決定の協同を支援するシステム構築が必要である。本年度は,平成18年度に作成した横浜環状北西線の計画に対する意見データのコーパスに,那覇空港の空港計画に対する意見データを追加し,このコーパスの具体的利用として,機械学習による対話型アンケートシステムを構築した。このシステムは,自由回答アンケートなどの意見収集とは異なり,市民ユーザーの意見入力に対して,問い返しを行い,より具体的なユーザーの関心を得ることをねらっている。システム開発と併せて,那覇空港の実際のPI調査における実装対話実験を行った。調査期間において得られた意見数は,36件と少数であったが,併せて行った100件の実験的なモニター調査で得られた意見および満足度調査の分析から,次の4点が明らかになった。1)対話型アンケートシステムは,PIの現場で利用することができる,2)対話の過程でシステムが問い返しをすることにより,ユーザーの関心を得ることができる,3)対話の過程でユーザー本人に意図を確認することにより誤解を回避することができる,4)システムとの対話によりユーザー自身も考えを整理しながら深めることができる。今後は,さらに対話設計を洗練する予定である。近年、市民参画は、道路計画のパブリック・インボルブメント(以下PIと記す)を始め、コンセンサス会議や裁判員制度に見られるように社会的な潮流である。とくに道路計画では、平成17年9月に国土交通省道路局から構想段階におけるPIの位置付けをより明確化した市民参画型プロセスのガイドラインが改訂通知される等、制度の確立が進められている。しかし、制度的な参画は認められつつも意見が計画や政策に十分反映される状況には至っていない。このような状況は、参画に対する満足度の低下と同時に、形式的参加との認識による行政や専門家へのさらなる不信を招くものである。この悪循環を改善するためには、収集した意見とともに行政や専門家の回答や対策案を併せて示すフィードバックの仕組みによる真の情報・知識共有ならびに意思決定の協同を支援するシステム構築が必要である。このような研究動機から、本年度は具体的なPI事例として、横浜環状北西線の計画のホームページに公開されている「みなさまの声」という市民の意見約2000件を対象に、1)データベース化、2)意見の分析、3)意見タグの検討を行った。また、試行的に作成した意見タグおよび意見タグ付きコーパスをもとに、東京工業大学奥村研究室の協力を得て、機械学習システムにより妥当な意見分類が行えるかどうかを実践的に検証した。2007年度は、この結果をもとに、意見タグを見直し、より分類精度を高めるような、意見タグの設計および意見タグつきコーパスの作成を行っていく予定である。
RNAの高速構造変化と機能の関係

本研究では、最近接塩基対モデル(Nearest Neighbor Model)を基に、核酸構造に関与する相互作用として水素結合とスタツキングを考慮して、ワトソン・クリック型RNA塩基対の安定化エネルギ-△G°を実験的に決定した。さらに、ワトソン・クリック型RNA塩基対からなるオリゴヌクレオチド二重らせんの△G°及びエネルギ-・パラメ-タの値から、リボザイム(機能性及び触媒性RNA)の最安定化構造のエネルギ-を算出した。例として、テトラヒメナ・リボザイムの二次構造についての成果を報告する。テトラヒメナ・リボザイムにおいては、ステムの鎖長と安定性の関係について、鎖長が延びれば安定性が増加するという一般的傾向が認められたが、この鎖長と安定性の関係は必ずしも成功するとは限らなかった。例えば、このリボザイムのP9.1とP9.2のステムは両方とも7個の塩基対をもつが、その安定化エネルギ-は前者が後者よりも5.3Rcal mol^<-1>も大きく、安定性に大きな差がある。P9.1aとP9.2aのステムに至っては、鎖長と安定性の関係が逆転した。このように、ステムの安定性を検討する上で従来から考えられていた鎖長との関係のみならず、塩基配列との関係も重要であることが明らかとなった。また、ステム以外の部位については、P5CとP9.1aなどのステムで閉じられているヘアピン・ル-プにはUGCAの同じ配列があり、両ステムの融解に伴いこの配列の三次元的相互作用の可能性が生じる。さらにこのことは、リボザイムが最適な(反応において)高次構造をとることに関連しており、反応点以外にも重要な部位が本研究によって示唆された。
溶液晶析による結晶製品の品質予測・制御を目的としたCFD晶析反応モデルの開発

本研究では、化学・医薬品工業での代表的な分離操作の一つである晶析操作について、結晶製品の高度な品質予測・制御方法の構築、生産性の向上を目指して数値流動解析およびモデル実験を行った。得られた知見は以下の通りである。(1)「撹拌翼・邪魔板・槽壁と結晶の衝突に起因する二次核(微結晶)の発生現象」に関して、数値流動解析により撹拌槽内の乱流状態・粒子挙動の定量的な評価を行った。その結果、結晶の衝突頻度、衝突エネルギーは撹拌翼の回転方向に対して前面側で大きな値となり、翼裏面や邪魔板、槽壁に対するそれらは無視できるほど小さいことがわかった。得られた衝突に関する統計データをもとに、結晶摩耗による粒径変化を確率論的に解析する手法を構築した。これにより通常の流動解析では再現が困難な数時間にわたる結晶摩耗現象を実用的に十分な精度で再現することが可能となった。(2)「溶質の局所的な過飽和度の増大に起因すると予想される一次核発生現象」に関して、適切な温度処理のもとでは、一次核の発生温度と撹拌翼回転数との間に正の相関関係があり、さらに撹拌所要動力との間に正の比例関係があることがわかった。これらの知見は、一定の温度条件下においては既存の晶析装置において何ら付加的な設備を用いずに核発生を制御できる可能性を示すものであり、今後実生産現場での応用が期待できる。(3)「高懸濁濃度条件における結晶の浮遊分散現象」に関して、ドラフトチューブ(DT,案内円筒)の最適操作条件の検討を行った。その結果、ドラフトチューブの内外水平断面積比が60%となるようにDT径を設定し、下吐出流れのプロペラ翼を組み合わせることで、大粒径、高懸濁濃度の条件においても低動力で良好な固体粒子の浮遊分散・循環を達成することができ、その動力は汎用されるディスクタービン翼と比較して6分の1にまで低減できることがわかった。これらの知見を活用することで、通常取り扱いが困難とされる重量濃度60%、平均粒径数百ミクロン程度の晶析条件においても粒径分布が狭い良好な結晶生産が達成できる可能性が示された。化学・医薬品工業での代表的な固液分離操作の一つである晶析操作は、主に(a)溶液中の溶質濃度が飽和濃度より大きくなる場合に起こる「一次核発生」、(b)結晶粒子と撹拌翼・槽壁との衝突により起こる「二次核発生」、(c)結晶表面への溶質物質の取り込みにより起こる「結晶成長」の三要素が乱流場中で重畳した非常に複雑な現象である。本研究では、撹拌槽を利用した冷却式溶液晶析操作における、結晶製品の高度な品質予測・制御を可能とする流動場・晶析反応場の数値流動解析手法の構築を目的とした。平成16年度は塩化カリウムの冷却晶析をモデルケースとした。(1)「結晶と撹拌翼・槽壁との衝突に起因する二次核(微結晶)発生」のメカニズムに関して、数値流動解析により撹拌槽内の乱流状態・粒子挙動の定量的な評価に基づいて、結晶の衝突頻度、衝突エネルギーの解析を行い、撹拌翼の上部で衝突頻度が大きくなることがわかった。また結晶摩耗現象の数値モデルの構築に必要な実測データを取得するための結晶摩耗実験の予備検討を行った。(2)「溶質の局所的な過飽和度の増大(局所的な低温度状態)に起因すると想定される一次核発生」のメカニズムに関して、一次核の発生温度(過飽和度)と撹拌翼回転数の間に相関性があることを明らかにした。また、レーザー光を用いて一次核の発生をin situに検出する計測システムを改良し、光学系・受光システムの変更・最適化により大幅な感度の向上を実現した。次年度は、今年度の実績をもとに、CFDに組込み可能な信頼性の高い核発生現象の数値モデルの開発を進める。

その結果、ドラフトチューブの内外水平断面積比が60%となるようにDT径を設定し、下吐出流れのプロペラ翼を組み合わせることで、大粒径、高懸濁濃度の条件においても低動力で良好な固体粒子の浮遊分散・循環を達成することができ、その動力は汎用されるディスクタービン翼と比較して6分の1にまで低減できることがわかった。これらの知見を活用することで、通常取り扱いが困難とされる重量濃度60%、平均粒径数百ミクロン程度の晶析条件においても粒径分布が狭い良好な結晶生産が達成できる可能性が示された。
ウニ類の成体原基形成機構の進化に関する研究

本研究は、棘皮動物の発生過程における体軸形成や成体原基形成機構に注目し、実験発生生物学的・分子生物学的アプローチにより研究を行った。その結果、サンショウウニ科のウニ類は非常に再生能の高い細胞塊を介した成体原基形成機構を導入したことで、発生の初期から成体原基形成を開始することを可能にし、環境圧にも耐えうる再生能を獲得したと考えられる。本研究では、棘皮動物の幼生から成体への体制変化機構の追跡から、動物の形態形成機構の進化多様性について解明していくことを目的としている。実験発生生物学的手法を駆使し、分子生物学的手法を取り入れながら、ウニ類を主体とした棘皮動物の発生過程でみられる体軸形成や、成体原基形成の機構に注目して、系統進化について解明していくことを目的としている。今年度は、体軸形成機構について、羊膜陥を介した成体原基形成を行うバフンウニを用いて、他種で左右極性を攪乱すると知られているNodal阻害により解析を進めた。その結果、羊膜陥の左右極性が攪乱され、その攪乱可能な時期を特定した。更に、近年、Nodalの上流因子として知られるDeltaの阻害も行い、羊膜陥の形成方向にNodalとは異なった攪乱が認められた。また、細胞塊を介して成体原基形成を行うサンショウウニに対するDelta阻害では、本来左側で形成される細胞塊が右側に形成される個体が増加した。本種についても、Delta阻害により細胞塊の左右極性を攪乱可能な時期を特定した。次に、サンショウウニの細胞塊形成に必要な領域の特定を試みた。ウニ類の胚葉分化が起こる16細胞期に注目して、様々な割球分離実験を行った。予定外胚葉領域である中割球のみからは、細胞塊は形成されなかった。染色した中割球と非染色の大割球・小割球とのキメラ個体は、細胞塊を形成し、細胞塊が染色されていたことから、外胚葉領域が植物極側からの何らかのシグナルを受けて、細胞塊を形成していることが考えられた。また、胚に存在する中割球が1個であっても、細胞塊は形成されることが明らかとなった。更に、山口県沿岸で採集可能なクモヒトデ類の1種について、変態に至るまでの発生過程を追跡することに成功した。本種は、これまで放卵・放精機構について知られておらず、今回その誘起法を見出した。本研究では、動物の系統間における形態形成機構の進化多様性、特に、棘皮動物の幼生から成体への体制変化機構ならびに系統進化を解明することを目的としている。特に、実験発生学的および分子生物学的手法を用いて、ウニ類を主とした棘皮動物の幼生期における成体形質の形成機構や体軸形成機構の解析を行い、系統進化を解明していくことを目的とする。まず、ウニ類各種における成体原基形成の追跡として、山口県沿岸で採集が可能なサンショウウニ科を含むウニ類の成体原基形成過程を詳細に観察し、羊膜陥あるいは細胞塊を介した、もしくは新たな成体原基形成様式をとるかについて確認した。その結果、サンショウウニ科のコシダカウニを含む3種が、細胞塊を形成して成体原基を形成することが明らかとなった。次に、細胞塊形成機構の解析を行った。細胞塊は幼生の左側で形成される左右非対称な形質の一つである。他種で左右極性を攪乱すると知られているNodal阻害および塩化リチウム処理や小割球除去により、細胞塊の形成方向に攪乱がみられるか調べた。その結果、この細胞塊の形成方向も、種特異的ではあるが、これらの処理により攪乱されることが明らかとなった。更に、羊膜陥を介した成体原基形成を行う種における羊膜陥形成機構の解析を行った。直接発生型ウニであるヨツアナカシパンでは、卵割期の予定外胚葉領域からなる部分胚や小割球除去胚からも、羊膜陥は正常個体と同様の時期に自律的に形成された。また、バフンウニ胚に対するNodal阻害剤処理を行ったところ、羊膜陥の形成方向に攪乱がみられた。加えて、他の棘皮動物における成体原基形成の追跡のための生態学的調査を行い、2種のクモヒトデ類の繁殖時期を特定した。本研究は、動物の形態形成機構がどのように進化してきたかについて、特に棘皮動物の幼生から成体への体制変化を追跡することにより、解明していくことを目的としている。実験発生生物学的・分子生物学的アプローチにより、ウニ類をはじめとする棘皮動物の発生過程における体軸形成および成体原基形成機構に注目して研究を進めている。今年度は、ウニ類の成体原基形成機構について、まず、細胞塊を形成する細胞運命を形態学的・実験発生生物学的に解析を進めた。卵割期から原腸胚期までの外胚葉領域の様々な除去実験および染色した予定外胚葉領域の移植実験により、an2領域が植物極側からの何らかのシグナルを受けて、細胞塊が形成されると考えられた。また、細胞塊が形成された後、マイクロマニピュレーションにより吸引除去したところ、新たに細胞塊が再生されることが明らかとなった。このとき、Nodal阻害剤により左右極性を攪乱された場合でも、攪乱された極性を保ちながら、細胞塊が再生されることが明らかとなった。次に、クモヒトデ類およびヒトデ類における成体原基形成とその左右非対称性について追跡した。