hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｂリンパ球が誘導する免疫寛容におけるクロマチン構造調整蛋白SATB1の機能解明

本研究は免疫寛容を誘導するIgD陽性Bリンパ球の機能調整、遺伝子発現調整においてSATB1の機能的役割を分子レベルで明らかにすることを目的とする。具体的には下記の実験を行った。(1)Bリンパ球特異的なMb1-CreマウスとSATB1 flox/floxマウスを交配させ、lox-CreシステムによってBリンパ球特異的SATB1ノックアウトマウス(KOマウス)を作製した。フローサイトメトリーの解析結果によって、脾臓B細胞においてIgD陽性IgM陰性B細胞分画が増加することが示された。リアルタイムPCRの結果ではIgDをコードするighd_mRNAの有意な増加を認めており、SATB1はIgDの発現調整に関与していることが示唆された。また、我々はIgDの発現タイミングが、脾臓B細胞が抗原刺激を受けて濾胞構造(Germinal Center)を形成していく段階であることに着目し、疑似的な抗原刺激である抗IgM抗体を脾臓B細胞に添加し、その表面マーカーの変化を確認した。その結果、KOマウスではCD83, CD86の発現が障害されることがわかった。CD83およびCD86が発現していないB細胞はGerminal CenterでもDark zone Bcellと言われ、増殖および免疫グロブリンのsomatic hypermutationを行い、B細胞の多様性を維持する働きがある。KOマウスの脾臓病理組織像では濾胞構造の増大を認めた。Germinal Center Dark zone Bcellが増殖したことに由来すると現時点で考えている。末梢血中のサイトカイン濃度(IgMなど)を測定しているが、KOマウスとWild typeのマウスでは有意な差は認められなかった。上記の結果は、2018年日本血液学会で発表した。また、2019年の欧州血液学会でも発表予定である。実験は順調に進んでいると考える。しかし、SATB1とIgDの関連を当初の着目点として解析をしてきたが、CD83やCD86とのSATB1との関連が示唆されるデータが得られてきているため、IgDとは別にCD83・CD86とSATB1の関連を調べていく必要がある。そのための追加実験が必要である。KOマウスの解析は順調に進んでいる。ただ、今までの知見から、免疫負荷をした状態でないとphenotypeの違いが生まれないことが分かったので、今後、抗原感作状態のマウス(immunized mouse)を作製し、解析を行っていく予定である。ELISA法によるマウス末梢血中のBリンパ球関連サイトカイン濃度の測定についても、IgEとCD83の関連を示す既報が散見されており、KOマウスでどのような発現になっているか、検討する必要があると考えている。IgM、IgD発現リンパ球の局在変化の有無を、免疫染色によって病理学的に解析することができておらず、今後行う予定である。SATB1tomatoレポーターマウスの解析において、BCR刺激を受けたB細胞ではSATB1が誘導されてくることが解っている。BCRのsignalにはNFκBとPI3Kの2つのカスケードが関与しているため、それぞれのblocking抗体を添加することによって、より詳細な制御機構を解明する必要がある。また、既に作製済みであるFlagタグ付きビオチン化SATB1発現マウスとSATB1レポーターマウスを交配し、SATB1発現量に応じたIgD陽性Bリンパ球を採取、抗Flag抗体およびstreptavidinによるChip-sequence assayを行うことでSATB1の制御を受ける遺伝子候補を抽出する。

しかし、SATB1とIgDの関連を当初の着目点として解析をしてきたが、CD83やCD86とのSATB1との関連が示唆されるデータが得られてきているため、IgDとは別にCD83・CD86とSATB1の関連を調べていく必要がある。そのための追加実験が必要である。KOマウスの解析は順調に進んでいる。ただ、今までの知見から、免疫負荷をした状態でないとphenotypeの違いが生まれないことが分かったので、今後、抗原感作状態のマウス(immunized mouse)を作製し、解析を行っていく予定である。ELISA法によるマウス末梢血中のBリンパ球関連サイトカイン濃度の測定についても、IgEとCD83の関連を示す既報が散見されており、KOマウスでどのような発現になっているか、検討する必要があると考えている。IgM、IgD発現リンパ球の局在変化の有無を、免疫染色によって病理学的に解析することができておらず、今後行う予定である。SATB1tomatoレポーターマウスの解析において、BCR刺激を受けたB細胞ではSATB1が誘導されてくることが解っている。BCRのsignalにはNFκBとPI3Kの2つのカスケードが関与しているため、それぞれのblocking抗体を添加することによって、より詳細な制御機構を解明する必要がある。また、既に作製済みであるFlagタグ付きビオチン化SATB1発現マウスとSATB1レポーターマウスを交配し、SATB1発現量に応じたIgD陽性Bリンパ球を採取、抗Flag抗体およびstreptavidinによるChip-sequence assayを行うことでSATB1の制御を受ける遺伝子候補を抽出する。
教育制度と教育機会格差の関連に関するシミュレーション研究

本研究の目的は、出身階層による教育機会の不平等発生のメカニズムを解明することである。複雑化した教育制度を包括的にとらえるため、昨年までに修得した高度な統計モデルおよびシミュレーションの技法をもとに、教育機会不平等構造の趨勢の記述、ならびに今後の変動予測を行った。第1に、教育機会不平等を捉える計量的なアプローチである「トランジションモデル」に対し、カテゴリカルな変数に対する統計アプローチを応用し、現代の日本において、昔よりも高校進学に関する不平等は減少し、一方で大学進学には出身家庭背景の影響がより強くなっていることが確認できた。第2に現在近年注目されている中学校段階の質的差異に着目したところ、国私立中学校進学に関する階層差は存在するものの、高校段階のそれと比較すると小さいものであることが分かった。中学校段階の階層間格差がどのように変化するのかを予測するため、コンピュータ上に人工社会をつくり出しエージェントベースシミュレーションを用いて分析した結果、国私立中学校の増加によって、教育機会全体の不平等は変化しないが、格差が発生するタイミングが早期にシフトする可能性が見いだせた。以上は教育機会の不平等と制度の関係を記述した「階層効果逓減現象」および「最大格差維持仮説」に異を唱える結果となった。本研究は、中学校等の早期段階も含めた教育機会不平等の構造を記述し、選抜の早期化が進行した未来を予測する手段を示した。今後の研究では、これらの方法をより精緻化し教育機会の質的な分化も射程に入れるような手法を確立する必要がある。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は,既存の社会調査データを用い,学校段階ごとの教育機会不平等の大きさを捉えるための分析を主として行った.本研究の第1段階として,既存の研究成果である高校・大学間での階層効果逓減現象の世代を通じての趨勢を分析した.分析には,最近の高度な統計手法を応用し,世代間比較が可能になるように展開した.その結果,階層効果逓減といわれる構造は,現代の日本では崩壊しており,高等教育段階での不平等化という現象が確認できた.またアメリカのデータを用い,格差構造の日米比較も行った.アメリカにおいても高等教育段階に関する不平等化という現象は見られるものの,依然として高等学校段階において大きな出身階層間の機会格差が存在し,階層効果逓減の構造は崩れていなかった.第2に中学校段階の質的分化に対する出身家庭背景の規定力を抽出するため,既存のデータを用いて基礎的な分析を行った.私立中学校に進学するための出身家庭背景の影響力は有意に認められ,これまで高校や大学段階で認められた出身家庭背景の規定力より大きいことが分かった.第3に,平成24年度までの研究成果を発展させて,個人の進学意思決定を数理モデルによって表現し,人工社会による進学シミュレ-ションを行った.「個人の能力」,「投資の量」,「周囲の影響」などをパラメータとして使用し,現実社会の進学における出身家庭背景の規定力を同等になるように調整した.調整されたパラメータのもとで,人工社会における早期選抜(中学受験)の規模を拡大して,投資の量の影響力(=階層効果)の変化を確認した.中学受験の規模の拡大により,一時的に出身階層の効果は増大し,相当程度の拡大を経た後にやがて平等化することが導かれた.さらに,規模拡大により,私立中学校に進学したことによる高等学校段階での質的差異への効果が増大し,よりトラッキングが強くなることが確かめられた.本研究は,教育制度の変化による教育機会不平等構造への影響を捉えることを目的とする.教育制度のなかでも選抜制度に着目し,選抜の早期化によって教育機会の階層間格差が助長されるのかを検証する.早期段階の選抜において出身階層の影響が強く,後期段階で小さくなるという「階層効果逓減」と呼ばれる現象は多くの国で確認されている.本研究では,進学における差異を,進学した学校のタイプという質的な差異に拡張し,さらに中学校段階での質的差異も考慮したうえでの階層効果逓減を検証する.本研究は,社会調査データを用いた計量分析と,数理モデルを用いた人工社会シミュレーションという2つの手法を用い,義務教育段階の選抜に出身階層は影響を与えているのか(移行ごとの階層効果),早期の教育機会不平等は後期の学校段階移行の不平等に影響するのか(経路依存),選抜の早期化により教育機会の階層間格差は拡大するのか,それとも縮小するのか(制度の効果)の3つの問いを検証する.平成26年度は,大きく3つの課題に取り組んだ。第1に、前年度に引き続き既存の社会調査データを用い,学校段階ごとの教育機会不平等の大きさとその世代変化を捉えるための分析を行った.第2に、比較的新しい教育制度である公立中高一貫校に着目し、制度発足以降の世代の教育達成プロセスをとらえるべく、若年世代に対するインターネット調査を企画、実施した。第3に、合理的選択理論に依拠し、個人の進学の意思決定を記述する数理モデルを作成し、教育機会不平等が生じる条件に付いて考察した。

第2に現在近年注目されている中学校段階の質的差異に着目したところ、国私立中学校進学に関する階層差は存在するものの、高校段階のそれと比較すると小さいものであることが分かった。中学校段階の階層間格差がどのように変化するのかを予測するため、コンピュータ上に人工社会をつくり出しエージェントベースシミュレーションを用いて分析した結果、国私立中学校の増加によって、教育機会全体の不平等は変化しないが、格差が発生するタイミングが早期にシフトする可能性が見いだせた。以上は教育機会の不平等と制度の関係を記述した「階層効果逓減現象」および「最大格差維持仮説」に異を唱える結果となった。本研究は、中学校等の早期段階も含めた教育機会不平等の構造を記述し、選抜の早期化が進行した未来を予測する手段を示した。今後の研究では、これらの方法をより精緻化し教育機会の質的な分化も射程に入れるような手法を確立する必要がある。1.高等教育の不平等化:本年度は、前年度に引き続き既存の研究成果である高校・大学間での階層効果逓減現象の世代を通じての趨勢を分析した。分析には、最近の高度な統計手法を応用し、同一の学校段階の質的差異を含んだ教育機会格差の世代間比較が可能になるように展開した。その結果、階層効果逓減といわれるこれまでの構造は、現代の日本では崩壊しており、高等教育段階での不平等化という現象が確認できた。現在この分析の結果をまとめ,社会学関連の学術雑誌への掲載が決定している.2.義務教育段階の不平等の検討:中学校段階の質的分化に対する出身家庭背景の規定力を抽出するため、若年世代を対象としたインターネット調査を行った。調査依頼、実査は民間の調査会社に委託し、私立中学校、公立中高一貫校などの出身者を対象にした分析に耐えうるように有意抽出を行った。現在、データは完成しており、分析中である。3.教育機会不平等の理論モデル構築:平成25年度までの研究成果を発展させて、個人の進学意思決定を数理モデルによって表現し、人工社会による進学シミュレーションを行った。まず、既存の意思決定モデル(相対リスク回避モデル)を、現在の日本の教育システムと整合的になるように改良し、そこから導かれる教育機会格差の発生条件に付いて数学的に定式化した。さらに、数理モデルが含むいくつかの仮定やパラメータの値の妥当性を確かめるべく、数理モデルによる社会をコンピュータ上に再現し、シミュレーションから得られる社会状態を現実データと比較した。シミュレーションと現実データの整合性を高めていった結果、既存のモデルのいくつかの仮定が成り立たないことが分かった。出身階層による教育機会不平等は、合理的選択のメカニズムよりは、資源制約の要因が大きいといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。直近の課題は,2.で得られたデータを解析し、比較的新しい制度変化である公立中高一貫校進学者の教育達成について検討することである。このデータ分析を通じて、近年の教育変動も含んだ教育システムと機会格差の関係について一般化する。また,人工社会におけるシミュレーションも発展しうる.平成25年度には、紀要行く機会の規模と格差の関連を考察した。
身心論の観点からみたアーラヤ識説の研究

Lambert Schmithausen教授のアーラヤ識起源論を踏まえつつ、その再検討を進め、その成果をJournal of Indian Philosophyおよび『日本仏教学会年報』に発表した。これはアーラヤ識が過去の経験を蓄積し、その結果として我々の認識世界を展開させる、表層心の基盤としての機能をもつのみならず、同時に身体の生命活動を維持する生理的基盤としての機能ももっていることに着目し、禅定の修行を通して身心の双方がそれぞれ麁重の状態から軽安の状態に転換するという行者の体験を通して、身心相関の要として人間の最深層ではたらいているアーラヤ識が見出されたのではないかという仮説を提起するものである。またアーラヤ識説と密接に関係する種子説の発展過程を分析し、瑜伽行派における種子(界・習気)の説が、アーラヤ識説を前提としない異時因果から、アーラヤ識説を前提とする同時因果説へと発展していったのではないかと論ずる論文をSravakabhumi and Buddhist Manuscriptsに発表し、またロンドン大学東洋アフリカ研究学院(School of Oriental and African Studies, University of London)において関係する内容の講演および演習を行なった。さらに、最初期瑜伽行派文献において「種子」と極めて近い概念である「種姓」の記述に現れる重要タームprakrtiおよびdharmataの分析を通して、松本史朗教授の「Dhatu-vada」論の再検討を行なう論文を、Critical Review for Buddhist Studiesに発表した。さらには、『摂大乗論』所知依分の解読作業を進め、長尾雅人『摂大乗論和訳と注解』上(講談社、1982年)に含まれるサンスクリット還元案の検討を行なった。研究課題と関係した数篇の論文を、Journal of Indian Philosophyを含む海外の複数の媒体に発表することができたことや、上記の通りロンドン大学東洋アフリカ研究学院で講演・演習を行なうことができたこと等からみて、本研究は海外でも一定の評価を得ていると考えてよいであろう。今後とも、アーラヤ識説に関する最初期のまとまった論述を含む『瑜伽師地論』および『摂大乗論』の解読を進め、他の瑜伽行派文献と比較しつつ、実践的な観点から初期アーラヤ識説の背景の解明を試みたい。またそれと併行して、2015年にウィーンで開催されたMarga学会で発表したアーラヤ識起源論に関する論文の刊行準備を進める予定である。さらに本年8月には西安で玄奘に関する学会が予定されているので、玄奘が世親の『唯識三十頌』に対する十師の註釈書を編纂・漢訳したと伝えられる法相宗の根本典籍『成唯識論』の成立問題を、アーラヤ識説を中心として論じてみたいと考えているLambert Schmithausen教授のアーラヤ識起源論を踏まえつつ、その再検討を進め、その成果をJournal of Indian Philosophyおよび『日本仏教学会年報』に発表した。さらに本年8月には西安で玄奘に関する学会が予定されているので、玄奘が世親の『唯識三十頌』に対する十師の註釈書を編纂・漢訳したと伝えられる法相宗の根本典籍『成唯識論』の成立問題を、アーラヤ識説を中心として論じてみたいと考えている本年度は当該研究に関係する海外出張が当初予想より少なく、またその出張旅費は先方により負担されるものであったため、旅費の執行額が当初予期したほどかからなかった。

また、大学院生に資料整理補助をさせて謝金を支払うことを想定していたが、適任と思われた学生に時間的余裕がなく、実際に業務を依頼することが出来なかった。この二つの理由により、当初予算より執行額が少ない結果となった。本年度はさらに精力的に文献解読を進めるとともに、より積極的に海外での成果発表を行ない、国際的な研究交流を推進していく予定である。
ストレス依存的な小胞体膜上での新生鎖品質管理機構の解明

新規合成タンパク質の多くは、翻訳後すぐに分解される。さらに、ポリソームの多くは小胞体に結合していることを併せ考えると、小胞体に結合したリボソーム上での新生鎖分解システムを明らかにすることは、真核生物の新生鎖品質管理機構の中心を明らかにすることに繋がる。細胞は、ストレス時に更なる小胞体負荷を避けるシステムとして、本来小胞体に挿入されるべきシグナル配列(SS)を持つ小胞体タンパク質を細胞質内で翻訳し直接分解する(Endoplasmic reticulum stress-induced pre-emptive quality control:ERpQC)。しかし、そのメカニズムは全く不明であった。本研究期間において、小胞体結合リボソームでの新生鎖品質管理機構(ERpQC)の分子メカニズムならびに生理的意義を明らかにすることが出来た。具体的には、ERpQCに関わるメカニズムとして、分泌タンパク質などの小胞体内腔への輸送がストレス時に阻害される分子機構と、その結果、細胞質において翻訳された分子が、AAA ATPaseであるp97とコシャペロンであるBag6を介してユビキチンプロテアソームシステムによって分解されることを明らかにした。また、ERpQCに重要な役割を担う分子Derlin-1の中枢神経系における欠失は、運動機能障害を引き起こすことを見出しており、ERpQCによる小胞体ホメオスタシス維持が中枢神経系において重要な役割を担うことを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。新規合成タンパク質の多くが、翻訳後すぐに分解されるといわれている。さらに、ポリソームの多くは小胞体に結合していることと併せ考えると、小胞体に結合したリボソーム上での新生鎖分解システムを明らかにすることは、真核生物の新生鎖品質管理機構の中心を明らかにすることに繋がる。細胞は、ストレス時に更なる小胞体負荷を避けるシステムとして、本来小胞体に挿入されるべきシグナル配列(SS)を持つ小胞体タンパク質を細胞質内で翻訳し直接分解する(pre-emptive quality control:pQC)。しかし、そのメカニズムは全く不明である。本研究では、小胞体結合リボソームでの新生鎖品質管理機構(pQC)の分子メカニズムならびに生理的意義とその破綻による疾患の病態メカニズムを解明することを目的とする。我々は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因タンパク質(変異型SOD1)が標的とする分子として、小胞体膜タンパク質Derlin-1を同定した。その機能解析の過程で、Derlinは小胞体タンパク質のうち、分泌タンパク質などの小胞体品質管理に関わらない分子を特異的に細胞質側で翻訳させることを見出した。さらにこの細胞質発現小胞体タンパク質(pQC基質)は、p97やBag6を介してプロテアソームで分解される。また、変異型SOD1はDerlin機能阻害を起こし、pQC基質を蓄積させることも見出し、論文として報告した。pQCに関しては、プリオンなどの疾患原因異常タンパク質を用いて、小胞体ストレスに曝された細胞で小胞体内腔への挿入が阻害され、細胞質側で蓄積する現象が報告されている。しかし、この現象の生理的意義と分子メカニズムについては、今なお不明な点が多い。とくにpQCに関わる責任因子についての報告は皆無である。そこで本研究では、pQC基質側とpQC装置側からアプローチすることで、メカニズムと生理的意義の解明を目指した。また、小胞体における新生鎖品質管理の生体における意義として、その破綻による病態をALSモデル実験により解析を進めた。具体的には、pQC基質の同定、pQC基質結合分子の同定を実施し一定の結果を得た。H28年度は、下記項目について検討をすすめる。pQC基質に関する研究:pQC基質認識一次構造の同定:同定されたpQC基質とそれ以外の小胞体タンパク質(シャペロンなど)について、SSとSS以降のアミノ酸一次配を比較し、基質振り分けに関わる特異的配列の特徴を見出す。さらに、シャペロンとpQC基質のキメラおよび特異的配列に変異を入れたタンパク質を解析することで、基質側の小胞体挿入とpQC分解の振り分けのメカニズムを明らかにする。pQC装置に関する研究:

pQC基質結合分子およびpQC-E3の機能解析:前年度に同定される結合分子に関して、刺激依存的な細胞内在性結合とともに、KDまたはCRISPR/Cas9システムを用いたKO細胞を作製しpQCにおける役割を明らかにする。E3に関しては、イヌ膵臓ミクロソームを用いたin vitro Ub化アッセイを構築し、pQC基質Ub化への直接の関与を検討する。pQCとALSに関する研究:ALSモデルマウスにおける検討:前年度に明らかになるin vitro ALSモデル初代培養脊髄において蓄積が認められた分子に関して、in vivoでの関与解明を目的としてALSモデル(SOD1G93Aトランスジェニック)マウスでの蓄積を、組織学的、生化学的に検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
遅れを持つ微分方程式における概周期解の存在定理の研究

本研究では、無限遅れを持つ関数微分方程式及び関数偏微分方程式の有界解の全安定性と一様漸斤安定性そしてそこから派生する周期解および概周期解の存在定理の研究を行った。その具体的目標は次の4つであった:[1]関数微分方程式および関数偏微分方程式の相空間による安定性の性質の分類とその相互間の関係。[2]全安定と一様漸近安定性の同値性とリアプノフ関数の構成および周期解・概周期解の存在。[3]無限次元におけるフロッケの定理の拡張、すなわちマセラ型定理の無限次元への拡張。[4]無限次元における積分微分方程式における安定性とそこから生じる概周期解の存在。これらの目標にあたり無限次元線形遅れ型方程式における定数変化法の公式の完成ができたことが大きな親展となった。従来までに公表されたこの問題における定数変化法の公式は誤りがあり不十分のものであった。これを一つの超関数的発想から解決することができた。この結果を用いて、微分方程式の相空間を安定多様態と不安定多様態に直和分解する。そしてそれぞれの多様態止に有界な解を射影しそれぞれの多様態が不変集合であることを利用し、それぞれの多様態止における概周期解の存在を議論した。その結果として相空間全体での概周期解の存在を議論した。この結果はいわゆるマセラ型存在定理の遅れを持つ微分方程式に対する理論を概周期解さらに一般的に概自己同型解まで拡張することができた。また無限次元の方程式に対しても全安定と一様漸近安定の同値性も証明することができた。線形系における全安定性は有界な解の存在を保証する大事な性質である。そしてマセラ型存在定理の無限次元への拡張が可能になった。本研究では、無限遅れを持つ関数微分方程式及び関数偏微分方程式の安定性と周期解・概周期解の存在定理の研究を行なった。その具体的目標は次の4つである:[1]関数微分方程式および関数偏微分方程式の相空間による分類。[2]全安定の同値性とリアプノフ関数の構成および周期解・概周期解の存在。[3]無限次元におけるフロッケの定理。[4]無限次元における積分微分方程式における概周期解の存在。今年度の大きな成果は抽象的空間上で定義された遅れを持つ線形微分方程式における相空間上での定数変化法の構築である。今まで多くの人が与えた定数変化法の公式は不十分であったり誤っていたりしてこの分野の研究の発展を阻んでいた。我々の与えた定数変化法の公式はこの分野における安定多様体や中心多様体の存在を議論することが可能になった意味においても大変満足のいくものである。この公式を用いて我々は概周期解の存在定理を議論した。それには相空間を安定多様体と不安定多様体の直和に分解することによって相空間上の議論を射影された二つの空間上で議論できたことである。特に不安定多様体は有限次元になることから、ここでは常微分方程式の知識を生かすことができた。当該研究課題に係る本研究では、無限遅れを持つ関数微分方程式及び関数偏微分方程式における概周期解の存在定理の研究を行った。各研究分担者には、それぞれの専門とする分野からの情報を提供してもらい、研究遂行にあたり大いなる助けとなった。今年度の研究を遂行するにあたっての目的は大きく分けて以下の4項目であった。[1]関数微分方程式および関数偏微分方程式の相空間による分類。当該年度の研究に係る大きな成果としては、遅れを持つ関数偏微分方程式において、摂動項が概周期解よりさらに広い意味を持つ概

自己同型的である時に概自己同型解の存在に関するマッセラ型定理の証明ができたことである。ただし元々の方程式は周期的という条件のもてであったことは最初の結果としてはやむをえなかった。というのは周期系を一般化してしまうと相空間における定数変化法の公式が未解決のため相空間の安定多様体と不安定多様体の分解ができずそれぞれの多様体における不変性を利用する事ができず大きな問題として立ちふさがっている。これに関しては今後のテーマとして取り組んでいきたいと考えている。いずれにしても上記の「3」及び「4」に関してはまずまずの成果があがったものといえる。
新口動物の中腸領域における機能・形態の分子的背景と進化機序

新口動物の消化管の中でも中腸領域には多様な構造・器官が存在し、消化や吸収等の消化管の基本的機能が担われている。本研究では、脊索動物の中腸領域の機能とそれを担う形態について新口無脊椎動物である尾索類ホヤや頭索類ナメクジウオに着目し、その中腸領域の機能・形態の分子的背景を明らかにし、その進化機序の解明を目指す。2018年度は、(1)尾索類カタユウレイボヤ吸収機能遺伝子の発現解析、(2)カタユウレイボヤPdx機能解析、(3)頭索類ナメクジウオ消化管関連遺伝子群の発現解析を行った。(1)について、前年度に発現解析を行った吸収機能遺伝子群について、本年度はさらに消化・免疫・粘液関連遺伝子との比較発現解析を行い以下の点を明らかにした。(i)胃では吸収機能遺伝子群と消化機能遺伝子の両者が発現し、部分的に発現が重複する。(ii)免疫関連遺伝子は吸収機能遺伝子と同所的に発現する。(iii)粘液関連遺伝子Mucinは吸収機能遺伝子と相補的な発現パターンを示す。これらの遺伝子群は吸収機能遺伝子群の発現を基盤とし協調的な機能的領域性を構成することが明らかとなった。(2)について、昨年度は消化酵素遺伝子群の発現を明らかにしたことから、本年度は吸収機能遺伝子の発現解析を行い、アミノペプチダーゼ遺伝子が中腸付近で発現することを見出した。(3)について、ゲノム編集技術TALENによるPdxのノックアウトを行った結果、予想と異なりPdxノックアウト個体の胃の形態には目立った異常はなく、また消化酵素遺伝子の発現も維持されていた。一方、Ptf1aのノックアウト個体では消化酵素遺伝子の発現は減衰・喪失したことから、当初PdxとPtf1aは同じシグナルカスケード上にあると考えていたが、両者は独立したシグナルカスケード上に存在する可能性がある。尾索類における発現解析によりその消化管における機能的領域性を明らかにすることができた。加えて、ゲノム編集TALENを用いたPdxさらにPtf1aの機能解析を行うことができ、そのノックアウト個体を用いた遺伝子発現解析に着手できた。今後、このノックアウト個体を用いた遺伝子発現解析を進めていけば、次年度には中腸領域におけるこれらの転写因子群の役割について知見が得られると考えられ、おおむね順調に進展していると判断した。2019年度は、発現解析によって得られた機能的領域性に関する知見をもとに、機能解析を中心に実験を進める。当初の予定のPdxの機能解析に加えて、Ptf1aについてもノックアウト実験を進める。そのノックアウト実験により得られたノックアウト個体を用いて消化機能・吸収機能に関連する遺伝子のin situハイブリダイゼーションによる発現解析を行い、発現パターンに変化が見られるか解析していく。そして、これまでの発現解析および機能解析における知見を統合し中腸領域の進化シナリオの構築を目指す。新口動物の消化管の中でも中腸領域には多様な構造・器官が存在し、消化や吸収等の消化管の基本的機能が担われているが、その新口動物の中腸領域の形態と機能の進化について明らかになっているとは言えない。そこで本研究では、新口無脊椎動物である尾索類ホヤや頭索類ナメクジウオを用いて、中腸領域の機能(消化・吸収)とそれを担う形態の分子的背景を解明し、中腸領域の機能・形態の進化機序の理解を目指す。2017年度は、まず尾索類カタユウレイボヤの中腸領域の機能と形態形成機構を探る目的で、(1)中腸領域における吸収機能関連遺伝子の発現解析、(2)Pdxの中腸領域における形態形成機能の解析を進めた。(1)について、カタユウレイボヤの幼若体と成体を用いて吸収機能関連遺伝子の発現解析を行った。カタユウレイボヤではこれらの遺伝子群が食道、胃、腸で発現し、これまでの先行研究と合わせて考えると、尾索類の胃では消化と吸収の両者が担われ、尾索類の「胃」は脊椎動物の「胃(前腸領域)」よりも「十二指腸(中腸領域)」にその分子的背景が類似している可能性がある。(2)について、まず機能解析を行うための遺伝子導入実験系の立ち上げを行った。その実験系を用いてPdxのプロモーターをGFP遺伝子につないだコンストラクトを導入したところ、GFPの変態後の幼若体の内胚葉性の胃上皮での発現を確認し、今後のPdxの機能解析に利用可能な遺伝子導入実験系を立ち上げることができた。さらに尾索類の解析に加えて、頭索類ナメクジウオの中腸領域の機能を探る目的で、(3)中腸領域における消化機能関連遺伝子の発現解析を行った。消化機能関連遺伝子である外分泌消化酵素遺伝子群は肝盲嚢と腸の広範な領域で発現し、肝盲嚢における外分泌消化酵素遺伝子の発現は、肝盲嚢が消化に寄与するとの考えを支持するものと考えられる。2017年度は尾索類を中心に解析を行い、カタユウレイボヤにおいて吸収機能関連遺伝子群の詳細な発現解析を行うことができ、それらの解析結果について第88回日本動物学会年会において発表した。さらにこの吸収機能関連遺伝子群の発現解析について現在論文の投稿に向けて準備中である。また、カタユウレイボヤのPdxの機能解析については、機能解析のための遺伝子導入実験系を整えつつあり、具体的なPdxの機能解析までには至らなかったものの今後行う予定の遺伝学的実験の基盤を築くことができたと考えている。

当初の計画では、2018年度に行う予定であった頭索類ナメクジウオの遺伝子発現解析について、その一部を2017年度中に行うことができ、頭索類の肝盲嚢を中心とする中腸領域の機能に関して知見を得ることができ、この結果についても第88回日本動物学会年会において発表した。以上から、Pdxの機能解析については今後本格的に解析を始めるものの、尾索類および頭索類の発現解析については予定通り、もしくは予定以上に順調に進展しており、2017年度の本研究全体としては「おおむね順調に進展している」と判断した。新口動物の消化管の中でも中腸領域には多様な構造・器官が存在し、消化や吸収等の消化管の基本的機能が担われている。本研究では、脊索動物の中腸領域の機能とそれを担う形態について新口無脊椎動物である尾索類ホヤや頭索類ナメクジウオに着目し、その中腸領域の機能・形態の分子的背景を明らかにし、その進化機序の解明を目指す。2018年度は、(1)尾索類カタユウレイボヤ吸収機能遺伝子の発現解析、(2)カタユウレイボヤPdx機能解析、(3)頭索類ナメクジウオ消化管関連遺伝子群の発現解析を行った。(1)について、前年度に発現解析を行った吸収機能遺伝子群について、本年度はさらに消化・免疫・粘液関連遺伝子との比較発現解析を行い以下の点を明らかにした。(i)胃では吸収機能遺伝子群と消化機能遺伝子の両者が発現し、部分的に発現が重複する。(ii)免疫関連遺伝子は吸収機能遺伝子と同所的に発現する。(iii)粘液関連遺伝子Mucinは吸収機能遺伝子と相補的な発現パターンを示す。これらの遺伝子群は吸収機能遺伝子群の発現を基盤とし協調的な機能的領域性を構成することが明らかとなった。(2)について、昨年度は消化酵素遺伝子群の発現を明らかにしたことから、本年度は吸収機能遺伝子の発現解析を行い、アミノペプチダーゼ遺伝子が中腸付近で発現することを見出した。(3)について、ゲノム編集技術TALENによるPdxのノックアウトを行った結果、予想と異なりPdxノックアウト個体の胃の形態には目立った異常はなく、また消化酵素遺伝子の発現も維持されていた。一方、Ptf1aのノックアウト個体では消化酵素遺伝子の発現は減衰・喪失したことから、当初PdxとPtf1aは同じシグナルカスケード上にあると考えていたが、両者は独立したシグナルカスケード上に存在する可能性がある。尾索類における発現解析によりその消化管における機能的領域性を明らかにすることができた。加えて、ゲノム編集TALENを用いたPdxさらにPtf1aの機能解析を行うことができ、そのノックアウト個体を用いた遺伝子発現解析に着手できた。今後、このノックアウト個体を用いた遺伝子発現解析を進めていけば、次年度には中腸領域におけるこれらの転写因子群の役割について知見が得られると考えられ、おおむね順調に進展していると判断した。2018年度は、尾索類カタユウレイボヤと頭索類ナメクジウオを用いて、以下のテーマを中心に実験および論文の執筆を進め、頭索類・尾索類・脊椎動物の中腸領域における分子的背景を比較し、脊索動物の中腸領域の機能・形態の進化について考察する予定である。(1)尾索類カタユウレイボヤ吸収機能関連論文の発表:2017年度において解析したカタユウレイボヤの吸収機能
抗菌性と石灰化誘導能を有するバイオアクティブ4-META系コーテイング材料の創製

本研究では、ブラケット周囲エナメル質の脱灰という問題に対して、高い歯質浸透性を有し樹脂含浸層を形成することで知られている4-METAに、イオンリリース・リチャージ能および抗菌性を有するバイオアクティブガラスを添加することにより、高い石灰化誘導能を有する4-META系コーテイング材料を開発することに加え、矯正臨床におけるブラケット周囲のエナメル質の脱灰や再石灰化挙動を評価するためのin vitroエナメル質再石灰化評価モデルの確立を行うことを目的として本研究を開始した。試料の作製として本研究では、原料を溶液に溶かし、溶液段階で反応させ、比較的低温で焼くことができる液相法(ゾル・ゲル法)によってバイオアクティブガラス(SiO2:45 %、Na2O:24.5 %、CaO:24.5 %、P2O5:6 %)の粉末を作製した。バイオアクティブガラス含有接着材料には、歯質浸透性を有する4-META系のモノマーにバイオアクティブガラスを数種類の配合比で混和した。バイオアクティブガラスを混合した粉末を、モノマー液およびキャタリストと混和し円盤状試料を作製後、試料を脱灰液(pH 4.5)に浸漬し、pHの経時的変化による緩衝能の分析を行った。また、1日および1週間蒸留水に浸漬後、ICP発光分光分析装置を用いて試作試料から溶出するイオンの測定を行った。バイオアクティブガラスを4-META/MMA-TBBレジン系接着材料に添加することにより、エナメル質の脱灰抑制と再石灰化促進の効果が期待できる。試料の作製として本研究では、原料を溶液に溶かし、溶液段階で反応させ、比較的低温で焼くことができる液相法(ゾル・ゲル法)によってバイオアクティブガラス(SiO2:45 %、Na2O:24.5 %、CaO:24.5 %、P2O5:6 %)の粉末を作製する。バイオアクティブガラス含有コーティング材料には、4-META系のモノマーにバイオアクティブガラスを数種類の配合比で使用する。重合開始剤としてcamphorquinone(0.005 mass %)を、重合促進剤として2-(dimethylamino)ethylmethacrylate(0.01 mass %)を配合し光硬化型とする。このバイオアクティブガラス含有コーティング材料を数種類の配合比で作製することとした。バイオアクティブガラス含有コーティング材料の試作に加え、現在市販されている歯面コーティング材料を比較検討するため、7種類の材料の性質を精査している。試作したバイオアクティブガラス含有コーティング材料を用い、耐摩耗試験や浸漬試験を行い市販コーティング材料と比較検討する予定である。消耗品等の購入が安価で行えたため。消耗品等の購入に充てる予定である。
アレルギーのための抗原特異的DNAワクチンの作用機序解析

従来、B細胞はIL-12を産生できず、Th1細胞を誘導できないと報告されていた。しかし、CpG ODNsはB細胞を刺激して、IL-12産生を誘導できることが今回の研究で明らかになった。B細胞から産生されるIL-12を抗原特異的Th1細胞誘導に応用するためには、CpGODNsをあらかじめ抗原と直接結合しておくことが重要であった。一つには、CpG ODNsによって活性化されるB細胞が補助刺激分子を発現するためである。さらに重要なのは、CpG ODNsがB細胞のODNレセプターに結合して細胞内に取り込まれる際に、CpG ODNsと結合した抗原も同時にB細胞に取り込まれ、効率よくT細胞に提示されるからである。この過程で、B細胞に発現されている免疫グロブリン(sIgs)は何の作用もしていない。つまり、CpG ODNsを使うことによって、抗原非特異的にB細胞をAPCsとして活用できるということである。この事実は、B細胞が効率よいAPCsとして働くには発現しているsIgsを介する抗原取り込みが重要という従来の見解とは異なる新しいB細胞の一面であった。このように、CpG ODNsと抗原結合体を用いると抗原非特異的にB細胞をAPCsとして動員できるのであるが、発現しているsIgsも同時に利用すると、APCsとしての活性が一層高まることも観察された。報告者はすでに、CpGDNAをアレルゲンと結合すると、抗原特異的な強力なアレルギー抑制作用を発揮する事を報告した。今回は、作用機序の解明を目的とした。その結果、CpGとアレルゲンを結合すると、抗原の樹状細胞への結合が著しく促進され、あわせて抗原取り込みとT細胞活性化が冗進することがわかった。抗原を提示する樹状細胞では、CpGによる共刺激物質の発現とIL-12産生も誘導された。Th1誘導に必要な三つの事象が各樹状細胞で同時に起こるために、約100倍効率の良いTh1細胞の分化誘導と活性化が引き起こされることが分かつた。また、以前報告したTGF-β産生の調節性T細胞が皮膚のアレルギー性炎症を抑制できるかどうかについて検討した。気道の高用量トレランスで誘導されたTGF-β産生細胞は、Th1あるいはTb2細胞で誘発された皮膚炎を抑制し、その機序はTGF-βとIL-10を介するものであることが分かった。気道と皮膚という外界とのインターフェースでの炎症が相互に調節機構を共有しているという知見であり、今後のアトピー性皮膚炎などの治療への展望を開くものである。B細胞から産生されるIL-12を抗原特異的Th1細胞誘導に応用するためには、CpG ODNsをあらかじめ抗原と直接結合しておくことが重要であった。

このように、CpG ODNsと抗原結合体を用いると抗原非特異的にB細胞をAPCsとして動員できるのであるが、発現しているsIgsも同時に利用すると、APCsとしての活性が一層高まることも観察された。
未知のポリADP-リボシル化タンパク質の同定、修飾部位決定と生物学的意義の解明

ポリADP-リボシル化は、細胞増殖、細胞死など様々な細胞内機能に関与している翻訳後修飾である。その機能解明により神経難病などの機構解明に役立てることを目的として、モデル生物のショウジョウバエを用いて生体におけるポリADP-リボシル化タンパク質の単離同定を試みている。その結果9-14個の候補タンパク質が2次元電気泳動法にて見出された。現在これらのタンパク質を質量分析装置にて同定を行っている。1.各組織からの未知のポリADP-リボシル化タンパク質の抽出法の確立についてポリADP-リボース分解酵素(PARG)の欠損変異個体であるショウジョウバエより、ポリADP-リボース抗体と反応する物質を抽出する条件として、6種類の抽出条件で調べたところ、Denaturation buffer2(0.5%SDS,50mM Tris-HCl,pH7.4,70mM2-mercaptoethanol)を加えた後、5分間の煮沸を行なう方法が最も抽出効果が良かった。SDSの濃度を0.1%に下げた場合は抽出効果は低下した。このことから、ショウジョウバエの変異体の脳に蓄積する天然のポリADP-リボシル化タンパク質の抽出は、293T細胞からの場合とは大きく異なり、改めて条件検討の必要があった。2.ポリADP-リボシル化タンパク質の単離方法の確立についてポリADP-リボースに対するモノクローン抗体(10H)の培養上清をProtein A-SepharoseカラムでIgG画分を精製した。精製10H抗体をCNBr-activated Sepharoseに結合させてポリADP-リボース抗体カラムを作製した。1,500匹の変異体から上記の方法により得た、ショウジョウバエの抽出液を20倍希釈し、10H抗体カラムに通して吸着させる試みを行なった。カラムに吸着し、溶出された画分をポリアクリルアミド電気泳動にて分離したところ、洗浄画分には見られないバンドとして300kDaおよび50kDa付近のバンドがタンパク染色で見られた。現在これを質量分析計で解析中である。これらの検討により、変異体のショウジョウバエより抽出されたポリADP-リボシル化タンパク質の単離法について一応の目処はついたといえる。しかし、10H抗体カラムに対しての吸着と溶出の条件は更に検討を要するといえる。1.ショウジョウバエからのポリADP-リボシル化タンパク質の抽出法の確立ポリADP-リボース分解酵素(PARG)の欠損変異個体であるショウジョウバエより、ポリADP-リボース抗体と反応する物質を効率よく抽出する条件を調べている。本年は、7MUrea,0.5%SDS,50mMTris-HCI(pH8.0),70mM 2-mercaptoethanol,10mM NaFの条件で大幅な改善がみられた。2.ポリADP-リボシル化タンパク質の単離方法の確立ポリADP-リボースに対するモノクローン抗体(10H)を精製し固相化させたアフィニティーカラムを用いて、PARG欠損ショウジョウバエからのin vivo抽出液中のポリADP-リボシル化タンパク質を吸着させている。しかし、吸着量が10%程度と少なく改善を要するが未だ条件を確立するに至っていない。3.ポリADP-リボシル化タンパク質の同定法の確立ショウジョウバエからの抽出液を、正常マウスIgGを固相化させたカラムに通すことで予め非特異的に吸着するものを除き、続く10Hカラムからの溶出液をアルカリ処理してタンパク質を遊離した後、質量分析の解析を続けている。4.ポリADP-リボシル化タンパク質の生理的役割を調べるためのポリADP-リボースELISA定量法の開発タンパク質から遊離したポリADP-リボースを測定するELISA法を開発した。補足抗体として前述の10H抗体を用い、ポリ(ADP-リボース)をウサギに免疫して作成したポリクローナル抗体を一次抗体として用いたもので現在の感度は、1ngであり、更に高感度の測定が可能なように改善していく予定である。ポリADP-リボシル化の機能をさらに明確化するために、ポリADP-リボシル化を受けているアクセプタータンパク質を同定し、その修飾部位を同定する必要がある。従来、2,3のタンパク質がin vivoでポリADP-リボシル化を受けるとの報告があるが、さらに多くのタンパク質がポリADP-リボシル化を受けている可能性があるにもかかわらず同定されていないのは方法的な問題がある。我々は、この問題を解くために、ポリADP-リボースに対するモノクローン抗体をカラムに固相化させ、生化学的方法によりポリADP-リボシル化タンパク質を単離しつつあり、本年度はその方法の最終確立と、ポリADP-リボシル化タンパク質の同定を行うことを目的とした。以下の成果が得られた。1)ポリADP-リボシル化タンパク質の抽出法の確立昨年度までの研究により、0.5%SDSの入った溶媒による抽出が効果的であることがわかっている。さらに抽出効率を上げるために、7M尿素を用いて抽出効果の大幅に改善することができた。

2)ポリADP-リボシル化タンパク質の同定3000匹のポリADP-リボース分解酵素のノックアウトショウジョウバエより上記の方法により抽出により得られた画分をポリADP-リボースに対する抗体カラムを用いて精製を行った。この画分を2つに分け、片方はそのまま、また片方は、1MNaOHで氷上で15分間処理を行った。それぞれを2次元電気泳動により分離した。アルカリ処理により移動度が変化したスポットを14個同定することができた。これを切り出し、質量分析装置にかけたが、シグナルが得られなかった。これは、質量分析装置の感度の問題もあるが、基本的にはショウジョウバエの使用量がまだ不足していると考えられた。そのため、さらに多くのショウジョウバエを用いた精製法を行えば、アクセプタータンパク質の同定が可能であるとの見通しが得られた。
有機化合物強相関電子系に対する第一原理有効模型構築：『物質差異』の定量化

第一原理乱雑位相近似計算に基づく光学スペクトル計算プログラムを作成した。とくに、低次元金属のスペクトルに対応可能なコードを作成した。低次元系金属では、低エネルギー領域(1eV以下)において、プラズモン励起(集団電荷励起)が低エネルギー素励起過程として出現することが実験的に知られている。この素励起のエネルギースケールは、バンド幅(1eV)に比べて小さいので、基底状態物性に大きく影響することが期待される。作成コードを用いて、代表的な有機化合物・擬一次元金属(TMTSF)2PF6の反射率を計算したところ、電場偏光をa軸に取った場合のプラズマ周波数は1 eV、ab面内でかつa軸に垂直な場合は0.2 eVであり、実験を再現することが分かった。これまで現象論的に導入されてきた有機導体の低エネルギー有効模型の定性的・定量的信頼性を第一原理計算の立場から評価することを試みた。代表的強相関電子系である\kappa-(BEDT-TTF)2Cu(NCS)2とEtMe3Sb[Pd(dmit)2]2に対して、多バンド模型と単一バンド模型の両方を導出した。多バンド模型から単一バンド模型に制限乱雑位相近似の範疇で縮約する際に無視されるバーテックス補正のオーダーを、「完全遮蔽クーロン相互作用W」の「消去バンドのフェルミ準位からの距離D」に対する比W/Dとして評価した。計算W/D値は0.4-0.5となり、通常単一バンド模型では考慮されない\kappa-(BEDT-TTF)2Cu(NCS)2のHOMO-結合バンドやEtMe3Sb[Pd(dmit)2]2のLUMO-結合および反結合バンドを介したバーテックス補正は無視できないことが分かった。24年度が最終年度であるため、記入しない。有機導体では、多くの擬一次元・擬二次元物質が存在し、低次元模型を用いて解析されることが多い。一方で、第一原理計算は常に物質を三次元系として取り扱うので、二つの手法を融合する場合、次元に関するミスマッチが生じる。我々は非経験的に、三次元系から任意の低次元有効模型を導出する方法論を開発した。この手法により、厳密に、模型導出過程と模型解析過程の次元が整合される。この手法を代表的擬二次元系k-(BEDT-TTF)2Cu(SCN)2(k-BEDT)およびEtMe3Sb[Pd(dmit)2]2(dmit)に適用した。両系共に、(1)三次元有効模型の段階でみられる長距離型クーロン相互作用(1/eps r)が、二次元模型では湯川型の短距離相互作用に変わること、(2)オンサイト相互作用の値自体も約25%の減少することが分かった。上で導出された有機化合物の第一原理有効模型の信頼性を調べるために、多変数変分モンテカルロ法(mVMC)による解析を行った。有効模型の相互作用項に対するスケールパラメータλを導入し、λを変化させて、転移を与える値を調べたところ、λ=0.78で転移が起こることが分かった。この物質は、実験から、金属絶縁体転移点近傍に存在していることが知られているので、理想的には、λ=1で転移が再現されることが望ましいが、この結果は、第一原理パラメータは相互作用を約20%過大評価していることを示している。k-BEDTでは、フェルミレベル(ef)から-0.5eVの位置に、HOMO結合バンドが存在している。先の解析はHOMO反結合バンドのみを考慮した単一バンド模型に基づくが、この模型のオンサイト相互作用Uは0.64eVであるので、電子相関の及ぶ範囲□U□に、HOMO結合バンド(単一バンド模型では消去された自由度)が存在していることとなり、ゆえに、系を単一バンド模型として解析したこと自体が不一致の原因として考えられる。よって、HOMO結合バンドも含めた二バンド模型の導出を行った。HOMO結合バンドよりさらに下のバンドは、efから約-1eVのところに存在し、一方、二バンド模型のUは0.83eVであるので、二バンドを模型対象自由度とすることは合理的である。現在、この二バンド模型について解析を進めている。多バンド模型から単一バンド模型に制限乱雑

位相近似の範疇で縮約する際に無視されるバーテックス補正のオーダーを、「完全遮蔽クーロン相互作用W」の「消去バンドのフェルミ準位からの距離D」に対する比W/Dとして評価した。計算W/D値は0.4-0.5となり、通常単一バンド模型では考慮されない\kappa-(BEDT-TTF)2Cu(NCS)2のHOMO-結合バンドやEtMe3Sb[Pd(dmit)2]2のLUMO-結合および反結合バンドを介したバーテックス補正は無視できないことが分かった。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の研究推進の中で、検討課題が見出されている。とくに、今年度導出した、単一バンド有効模型は実験との一致が不十分であり、より一般的な多バンド有効模型の導出が本質的であることが見出されている。今後はこれに注力する。また、本申請課題の、もうひとつの中心テーマである「制限GW計算コード」の開発にも努める。現在、このコードのためのアルゴリズムを完成した段階であり、今後、実装に移る。最終的には、「制限RPA計算コード」と同様、大規模並列化を行う。