hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザドップラ式瞬間流量計による燃料噴射パターンと噴霧特性の同時評価法

当該研究期間中に,レーザドップラ式瞬間流量計の実用化をすすめた.期間中に二度大きな設計変更を行い,データの信頼性に及ぼすいくつかの要因を突き止めることができるとともに,実用化のための基礎的な知見を得ることができた.本研究期間中に行った研究により,信頼性が向上した光学系の試作が完了し,実用レベルとしてのLDA流量計がほぼ完成したと考えている.一方で噴霧との同時計測を目標として研究開発を行ってきているが,統計的な計測と評価は十分に可能になったものの,各瞬間のデータを取得するためにはLDA流量計と噴霧計測の双方に,もうひとつの工夫が必要であることがわかった.噴霧計測は筒内直接噴射方式ガソリン機関用高圧燃料噴射弁を用いて,周囲空気の影響を詳細に計測した.噴霧液滴の粒径と流速が同時に計測できる位相ドップラ法(PDA)を用い,時間的な変化を考慮した解析法である時間分割法を用いることで噴霧の評価が行えた.得られた粒径は粒径分布関数を用いて評価することで,噴霧の発達に伴う粒径の変化を議論できることを明らかにした.さらに,各サイクルの噴霧性状と周囲空気流動を観察する目的で高速度ビデオカメラを用いることで周囲空気条件による周囲空気流動変化を捉えることができた.噴霧の広がりは周囲空気流動と密接に関係していることが明らかになり,噴霧形状の変化と周囲空気流動についての議論を行えるようになった.本研究により,噴霧の詳細な構造を知るとともに,影響因子の一部が明らかになり,さらに噴霧に対する新しい評価法が提案できた.当該研究期間中に,レーザドップラ式瞬間流量計の実用化をすすめた.期間中に二度大きな設計変更を行い,データの信頼性に及ぼすいくつかの要因を突き止めることができるとともに,実用化のための基礎的な知見を得ることができた.本研究期間中に行った研究により,信頼性が向上した光学系の試作が完了し,実用レベルとしてのLDA流量計がほぼ完成したと考えている.一方で噴霧との同時計測を目標として研究開発を行ってきているが,統計的な計測と評価は十分に可能になったものの,各瞬間のデータを取得するためにはLDA流量計と噴霧計測の双方に,もうひとつの工夫が必要であることがわかった.噴霧計測は筒内直接噴射方式ガソリン機関用高圧燃料噴射弁を用いて,周囲空気の影響を詳細に計測した.噴霧液滴の粒径と流速が同時に計測できる位相ドップラ法(PDA)を用い,時間的な変化を考慮した解析法である時間分割法を用いることで噴霧の評価が行えた.得られた粒径は粒径分布関数を用いて評価することで,噴霧の発達に伴う粒径の変化を議論できることを明らかにした.さらに,各サイクルの噴霧性状と周囲空気流動を観察する目的で高速度ビデオカメラを用いることで周囲空気条件による周囲空気流動変化を捉えることができた.噴霧の広がりは周囲空気流動と密接に関係していることが明らかになり,噴霧形状の変化と周囲空気流動についての議論を行えるようになった.本研究により,噴霧の詳細な構造を知るとともに,影響因子の一部が明らかになり,さらに噴霧に対する新しい評価法が提案できた.燃料噴霧の総合的な性状特性評価と制御の可能性の模索を目標として,今年度は燃料噴霧と燃料噴射率をそれぞれ独立して評価することとした.実験は,ガソリン用高圧燃料噴射弁を用いて,周囲空気の温度と圧力を変化させて行った.可視化実験から,燃料噴霧は周囲空気の温度と圧力の影響により到着距離,噴射角が異なることが明らかになった.画像から噴霧到達距離,噴射角を数値化することで,周囲空気の条件が噴霧性状に与える影響が明らかになった.さらに,噴霧液滴の粒径と流速が同時に計測できる位相ドップラ法(PDA)を用いて,流速分布,粒径分布を計測した.これにより,周囲空気の温度と圧力が流速分布および粒径分布に与える影響を明らかにできた.このとき,当研究グループ提案している間欠噴霧を時間的に評価する時間分割法が有効であることを示した.燃料噴射率計測に関しては,当研究グループで開発,改良を行っているレーザドップラ式流量計(LDA流動計)の小型化を行った,光学系の小型化を計画し,従来よりもさらに小型化した光学系がほぼ実用レベルになった.この小型光学系により,設置の自由度が増し,噴霧性状評価との同時計測が可能になると思われる.それに付随して,信号処理機の開発と改良を行っている.現在まで低速の振動流に関しては十分な計測精度があるものの,燃料噴霧に関しては信頼性が若干落ちることがあった.今回,信号処理のアルゴリズムを見直すことで,計測値の信頼性を向上するとともに,データレートの向上および設定パラメータの簡略化を行っている.今後,同時計測のための調整なども行う予定である.レーザドップラ式瞬間流量計の改良をすすめた.信号処理系は,従来どおりメインの取り込みボードと時間データ取り込み用ボードから構成されているが,平成18年度においてはドップラ信号から流速に変換する信号処理系のプログラムを大幅に改良し,データの信頼性を増すことができた.ただし,主要プログラムはFFTに頼っているために,FFTに依存するデータ信頼度の低下が指摘された.そこで,最近発表された新しい信号処理方法であるスロット相関法についても見当をはじめた.スロット相関法ではFFTよりも信号ノイズに対する安定度が高いことを示し,さらにデータ取得率が低い場合に特に両者の差が大きくなり,本レーザドップラ式瞬間流量計に有効なデータ処理方法になることが分かった.噴霧計測は平成17年度に引き続き,筒内直接噴射方式

ガソリン機関用高圧燃料噴射弁を3種類用意して行った.噴霧条件は一定とし,周囲空気の温度と圧力を変更することで,粒径と流速に与える影響を評価した.平成17年度よりも1サイクルあたりに噴射する燃料量を増加させたところ,周囲空気温度の影響はほとんど確認できなくなることが明らかになった.噴霧を時間的に分割することで,噴霧のそれぞれの部分に対する周囲空気の温度と圧力の影響が評価できることを示した.粒径分布関数を利用すると,温度の影響が評価できる可能性があることが分かった.今後,さらに精度を高めることで,温度と圧力が噴霧性状に与える影響を明らかにできると考えている.本年度はレーザドップラ式瞬間流量計の実用化をすすめた。詳細なデータ取得から,データの信頼性に及ぼすいくつかの要因を突き止めることができた。この結果,昨年までの方式よりもさらに信頼性をあげることが可能であることが示された。それとともに,現在までの方式とは大幅に異なる光学系の設計が可能になった。新設計した光学系では,測定部の選定では大幅に自由度が増した反面,光学系そのものの調整は簡略化することで調整が容易に行えるようになった。これにより,信頼性が向上した光学系で実用レベルにより近くなったと考えている。一方で噴霧との同時計測では,各瞬間のデータを取得するためにはもうひとつの工夫が必要であることがわかった。噴霧計測は筒内直接噴射方式ガソリン機関用高圧燃料噴射弁を用いて,周囲空気の影響を詳細に計測した。噴霧液滴の粒径と流速が同時に計測できる位相ドップラ法(PDA)を用い,時間的な変化を考慮した解析法である時間分割法を用いることで噴霧の評価が行えた。得られた粒径は粒径分布関数を用いて評価することで,噴霧の発達に伴う粒径の変化を議論できることを明らかにした。さらに,各サイクルの噴霧性状と周囲空気流動を観察する目的で高速度ビデオカメラを用いることで周囲空気条件による周囲空気流動変化を捉えることができた。噴霧の広がりは周囲空気流動ど密接に関係していることが明らかになり,噴霧形状の変化と周囲空気流動についての議論を行えるようになった。
視覚障害者の歩行安全を目的とした新たな高視認性衣服の開発

蛍光色生地と再帰性反射材を用いた高視認性衣服(high-visibility clothing)は、ユニフォームの工業規格であるが、運転者等から着用者を瞬時に発見可能であり、危険回避が困難な視覚障害者の交通安全に有用と考えられる。本研究の目的は、視覚障害者の交通安全に寄与するための新しい高視認性衣服・装備品の試作開発である。これまで、視覚障害者の交通事故の特徴分析、高視認性衣服のニーズ調査等を実施してきた。本年度は、昨年度作成した視覚障害者向け高視認性衣服・装備品のデザイン案10種類に対して、視覚障害者の介助者146名を対象に、インターネット調査によりデザイン案の評価を実施した。評価結果に基づき、ベスト、ボディーバッグ、帽子3種類(色は蛍光オレンジ)を試作品の候補に選定した。高視認性衣服製作の専門家の協力により、これら3種類の試作品を製作した。製作した試作品の効果を検証するため、北九州在住の視覚障害者11名、介助者7名を対象に、3週間の使用期間を設けて、視覚障害者による試作品3種類の使用評価を実施した。対象者は3週間後、28項目の質問紙に回答した。結果、視覚障害者からは、試作品の着用により、白杖だけの時よりも周囲からの声掛けが増えた、歩道のない道路で自動車が徐行したり、避けるようになった等の体験が報告された。視覚障害者においては、他者からの肯定的な言動・サポートや交通場面の状況変化を通じて、安全に対する効果を実感できたことが示唆された。試作品の交通安全に対する効果は、ベストが最も評価が高く、次いでボディーバッグ、帽子の順であった。一方「製品化するとしたらどれがよいか」の質問項目は、ボディーバッグの評価が高く、次いでベスト、帽子の順であった。全身にまとう衣服よりも、バッグのように身体の一部に着用する装備品が、視覚障害者のニーズにより適合することが明らかになった。高視認性衣服(high-visibility clothing)とは、着用者の安全確保のため、蛍光色生地と再帰性反射材を用いて視認性を高めた衣服である。高視認性衣服は、近年、危険作業従事者のユニフォームとして国際的に普及が進んでおり、日本でも2015年10月に日本工業規格JIS T 8127(高視認性安全服)が制定されたところである。また、今日では、法制度や社会基盤の整備により、就労、就学など視覚障害者の社会参加、外出の機会が増えているが、その一方で、視覚障害者が被害者となる交通事故や、他の歩行者との接触、衝突による事故などが増加している。交通場面などにおいて自力での危険回避が困難な視覚障害者の安全確保のためには、高視認性衣服を応用することによって、比較的簡便かつ低コストで効果を上げることが可能になると考えられる。本研究は、視覚障害者の歩行安全を目的とした新しい高視認性衣服(ないし装身具)の試作開発を目的としている。その前段階として、視覚障害者の歩行安全に対するニーズ、外出行動、被服行動など、日常生活における行動特性を把握し、視覚障害者の特性に配慮した高視認性衣服の要件について検討する。また、視覚障害者の交通事故、対人接触事故やヒヤリハット事例などに基づき、視覚障害者の事故防止に効果的な高視認性衣服の種類や具体的仕様について検討を行う。本年度は、交通場面などにおいて視覚障害者が被害を受けた事故の傾向や特性を把握する目的で、総合法律情報データベース(TKCローライブラリー)を利用して、過去の交通事故などの裁判事例の中から、歩行中の視覚障害者が被害者となった事故事例を抽出し、それら事故事例の特徴について検討を実施した。本年度は、既存の文献資料データベースを利用した視覚障害者の事故事例収集だけではなく、視覚障害者を対象としたインターネット調査を実施する計画であったが、年度途中での前所属機関の退職、それに伴う所属機関変更などの影響を受けて、本研究の遂行に費やす十分な時間や労力を確保することができなかった。その結果、調査対象の確保や調査内容の精査などが遅れて、当初予定していた調査を実施するまでに至らなかった。高視認性衣服(high-visibility clothing)とは、着用者の安全確保を目的に、蛍光色や再帰性反射材を用いて視認性を高めた衣服である。路上等での危険作業に従事する労働者のユニフォームとして、近年規格化が急速に進んでおり、2013年に国際標準化機構でISO 20471が制定され、日本でも2015年にJIS T 8127(高視認性安全服)が制定された。この規格は、視認性、誘目性の高い特定の蛍光色生地を一定面積以上用いることで、運転者等から瞬時に発見されるように配慮したものであり、自力での危険回避が困難な視覚障害者の交通安全にも応用可能である。本研究は、視覚障害者の交通安全ニーズに即した新しい高視認性衣服ないし装身具の試作開発を目的としている。それには、視覚障害者の交通事故の特徴を把握し、視覚障害者の事故防止に効果的な高視認性衣服ないし装身具の種類や具体的仕様について検討を行うことが必要である。また、視覚障害者の外出行動、被服行動等、日常生活における行動特性を把握し、それらに配慮した試作開発を行うことが重要である。本年度は、2015年に全国で発生した視覚障害者の交通事故統計データを対象に、既存の交通事故統計を用いた歩行者事故全般との比較、項目間のクロス集計に基づく統計解析を行い、視覚障害者の交通事故の特徴について検討した。

その結果、視覚障害者は、通常歩行時等の横断中以外のリスクが歩行者全般より高く、その傾向は歩道設置率の低い道路整備状況が遅れた地域でより顕著に認められた。また通常歩行時では車両の後退時に事故が多かった。白杖や盲導犬の不使用は、男性より女性に多く、死亡事故件数との関連が見られた。これらの結果から、視覚障害者の交通事故は、歩行者事故全般とは異なる特徴を有することが明らかになった。視覚障害者の交通事故統計データは極めて希少であり、本年度はその収集のために、当初の想定以上に時間と労力を費やしてしまった。そのため、交通事故統計に基づく視覚障害者の交通事故の特徴分析については、一定の研究成果をあげることができたが、当初予定していた視覚障害者のニーズ、外出行動、被服行動等、日常生活における行動特性を把握するための調査を実施する段階まで研究を進めることができなかった。高視認性衣服(high-visibility clothing)とは、着用者の安全確保を目的に、蛍光色生地と再帰性反射材を用いて視認性・誘目性を高めた衣服であり、路上作業者等のユニフォームの規格として、日本では2015年にJIS T 8127(高視認性安全服)が制定されている。この規格は、視認性、誘目性の高い特定の蛍光色生地を一定面積以上用いることで、運転者等から瞬時に発見されるように配慮しており、自力での危険回避が困難な視覚障害者の交通安全にも応用可能である。本研究は、視覚障害者の交通安全に寄与するための新しい高視認性衣服の試作開発を目的としている。それには、視覚障害者のニーズを把握するとともに、視覚障害者の心理・行動特性に配慮した試作開発を行うことが重要である。本年度は、高視認性衣服に対する視覚障害者のニーズについて把握するために、視覚障害者の同居家族で日常的に介助をしている成人146名(男性78名、女性68名)を対象にインターネット調査を実施した。その結果、高視認性衣服に対する一定のニーズが認められた。しかしながら、目立ち感の高さに起因する着用への拒絶・抵抗感が存在することも明らかになった。一方、衣服や持ち物の一部に視認性・誘目性の高い素材を使用した場合、利用の意思を示す介助者が多くみられた。これより、全身に纏う衣服以外に、バッグや帽子等の装備品類に蛍光色生地や再帰性反射材を取り入れた製品も視覚障害者のニーズに適していると考えられる。更に、高視認性衣服の専門家であるデザイナーの協力を得て、視覚障害者向けの高視認性製品の候補として、ベスト2種類、帽子2種類、ボディーバッグ1種類にオレンジ、イエローの蛍光色2色を配した10種類のデザイン案を作成した。今後、このデザイン案の評価結果に基づき、視覚障害者向け高視認性製品の試作品を決定する予定である。視覚障害者の介助者を対象とした調査の実施にあたり、調査方法、調査項目の選定や対象者の確保等の検討に相当の期間を要した。そのため研究の進捗に遅れが生じ、本年度はデザイン案の作成と評価を実施する段階までしか進めることができなかった。蛍光色生地と再帰性反射材を用いた高視認性衣服(high-visibility clothing)は、ユニフォームの工業規格であるが、運転者等から着用者を瞬時に発見可能であり、危険回避が困難な視覚障害者の交通安全に有用と考えられる。本研究の目的は、視覚障害者の交通安全に寄与するための新しい高視認性衣服・装備品の試作開発である。
生体由来3次元スキャフォールドを用いた再生肝臓による生存率改善とECM解析

脱細胞化肝臓に血液を安定的に環流するための装置を開発した。ラットの頸動脈にカニュレーションし、ペリスタポンプを間に挟んで脱細胞化肝臓の門脈に接続する。肝静脈より排出された血液をまたペリスタポンプを挟んでラット経静脈と通じて返血することで、脱細胞化肝臓に血液を環流させることとした。血小板沈着の評価を行うため、使用するラットの体重、血液循環速度、添加するヘパリンの濃度などを調整し、安定した実験系を確立した。次に、ラットに肝障害を加えて、体外に再細胞化肝臓を接続したが、ラットの体外に還流する血液量が多く循環血液量が不足しラットの血圧を維持することが困難な場合があることが判明した。そこで、一定量の補液、輸血を行うことで循環動態を安定化することでシステムを稼働させることとした。グラフトとして使用する脱細胞化肝臓は、鋳型としては全肝の脱細胞化組織を用いるが、再細胞化する細胞についても検討を行い、生体肝臓に含まれる肝細胞数の一部を用いることとした。今後、肝障害の方法については、肝切除モデルだけでなく、薬剤性障害モデルも併用しながら、肝機能をサポートするシステムを構築する。また、グラフト内に血小板が沈着し血栓を形成することで血液還流が阻害される問題については、抗血小板作用を有するポリマーを新たに開発した。この新規ポリマーを脱細胞化肝臓の内部をコーティングすることで、肝機能を向上させることを目的とした。コーティングの条件を最適化したうえで、血液還流の際の血小板沈着の抑制効果を評価しているところである。血小板沈着の評価を行うため、使用するラットの体重は400g以上とし、血液循環速度は1.0ml/min、添加するヘパリンの濃度などを調整し、安定した実験系を確立した。次に、90%肝切除による肝障害モデルラットを用いて実験を行った。この状態で回路を接続したところ、ラットは数時間で死亡し、長期生存を得ることができなかった。原因として、90%肝切除の侵襲に加え、循環血液量の不足が過大侵襲と考えられたため、10mlの輸血を行うこととしたところ、ラットの生存時間は著名に延長し、実験を継続することができると判断した。細胞を生着させていない脱細胞化肝臓(コントロール)と再細胞化肝臓を用いて比較実験を行ったところ、システムは問題なく稼働したが、2群間に有意な生存率の差を認めることができず、原因の一つとして、本システムを用いるにあたって、90%肝切除が過大侵襲である可能性を考えた。グラフト内に血小板が沈着し血栓を形成する問題については、抗血小板作用を有するポリマーを新たに開発することとした。東京大学工学部の研究室と共同研究契約を締結し、既に人工心臓に用いる金属に親和性のあるポリマーを生体に親和性を持つように側鎖を改変したポリマーを新たに作製する試みを始めた。血小板沈着の評価として、HE染色の他にCD42bによる免疫染色を用いることとした。肝細胞癌の発がんモデルであるトランスジェニックマウスについては、アメリカから譲り受けた受精卵から起こして、現在交配を進めているところである。まず、ラットの体外循環式人工肝臓のシステムが稼働することが確認できたが、90%肝切除モデルは過大侵襲であると考えられたため、肝障害モデルを変更する。70%肝切除モデルは、そもそも全例が生存するモデルのため、薬剤性肝障害モデルを採用することとし、ガラクトサミンを用いることとする。文献上は、1.4g/Kgによる腹腔内注射にて肝障害を加えることができるが、本実験では400g以上の比較的大きなラットを用いることもあり、まずは薬剤の投与条件を最適化することから始める。薬剤性肝障害モデルラットに体外式再細胞化肝臓を接続し、肝障害度マーカー(AST、ALT、ビリルビンなど)と生存率を指標にデータを収集する。また、血液を環流する際に血栓形成が問題となるが、新たに開発した、生体組織親和性を持つ抗血小板作用を有するポリマーの機能を評価する。新たな合成したポリマーに、FITCでラベルして、脱細胞化組織に対するコーティングの効率を様々な条件で行い、FITCの蛍光を指標にコーティングの最適な条件を絞っていく。次に、実際に血液を環流して血小板の沈着をHE染色と免疫染色(CD42b)にて評価したうえで最終的に最適なコーティング条件を決定する。

次に、ラットに肝障害を加えて、体外に再細胞化肝臓を接続したが、ラットの体外に還流する血液量が多く循環血液量が不足しラットの血圧を維持することが困難な場合があることが判明した。そこで、一定量の補液、輸血を行うことで循環動態を安定化することでシステムを稼働させることとした。グラフトとして使用する脱細胞化肝臓は、鋳型としては全肝の脱細胞化組織を用いるが、再細胞化する細胞についても検討を行い、生体肝臓に含まれる肝細胞数の一部を用いることとした。今後、肝障害の方法については、肝切除モデルだけでなく、薬剤性障害モデルも併用しながら、肝機能をサポートするシステムを構築する。また、グラフト内に血小板が沈着し血栓を形成することで血液還流が阻害される問題については、抗血小板作用を有するポリマーを新たに開発した。この新規ポリマーを脱細胞化肝臓の内部をコーティングすることで、肝機能を向上させることを目的とした。コーティングの条件を最適化したうえで、血液還流の際の血小板沈着の抑制効果を評価しているところである。脱細胞化肝臓に血液を安定的に環流するための装置を開発した。ラットの頸動脈にカニュレーションし、ペリスタポンプを間に挟んで脱細胞化肝臓の門脈に接続する。肝静脈より排出された血液をまたペリスタポンプを挟んでラット経静脈と通じて返血することで、脱細胞化肝臓に血液を環流させることとした。血小板沈着の評価を行うため、使用するラットの体重は400g以上とし、血液循環速度は1.0ml/min、添加するヘパリンの濃度などを調整し、安定した実験系を確立した。次に、90%肝切除による肝障害モデルラットを用いて実験を行った。この状態で回路を接続したところ、ラットは数時間で死亡し、長期生存を得ることができなかった。原因として、90%肝切除の侵襲に加え、循環血液量の不足が過大侵襲と考えられたため、10mlの輸血を行うこととしたところ、ラットの生存時間は著名に延長し、実験を継続することができると判断した。細胞を生着させていない脱細胞化肝臓(コントロール)と再細胞化肝臓を用いて比較実験を行ったところ、システムは問題なく稼働したが、2群間に有意な生存率の差を認めることができず、原因の一つとして、本システムを用いるにあたって、90%肝切除が過大侵襲である可能性を考えた。グラフト内に血小板が沈着し血栓を形成する問題については、抗血小板作用を有するポリマーを新たに開発することとした。東京大学工学部の研究室と共同研究契約を締結し、既に人工心臓に用いる金属に親和性のあるポリマーを生体に親和性を持つように側鎖を改変したポリマーを新たに作製する試みを始めた。血小板沈着の評価として、HE染色の他にCD42bによる免疫染色を用いることとした。肝細胞癌の発がんモデルであるトランスジェニックマウスについては、アメリカから譲り受けた受精卵から起こして、現在交配を進めているところである。まず、ラットの体外循環式人工肝臓のシステムが稼働することが確認できたが、90%肝切除モデルは過大侵襲であると考えられたため、肝障害モデルを変更する。70%肝切除モデルは、そもそも全例が生存するモデルのため、薬剤性肝障害モデルを採用することとし、ガラクトサミンを用いることとする。文献上は、1.4g/Kgによる腹腔内注射にて肝障害を加えることができるが、本実験では400g以上の比較的大きなラットを用いることもあり、まずは薬剤の投与条件を最適化することから始める。薬剤性肝障害
日本語諸方言の条件表現に関する対照研究

本研究の目的は、方言の文法的側面に関する対照的研究の一分野として、条件表現について要地方言を統一的に調査し、標準語も含めて比較・対照することにより、現代日本語の条件表現について総合的な分析を行うことである。最終年度である今年度は、この目的に沿って、条件表現のうち原因・理由表現についての調査をまとめ、『全国方言文法辞典《原因・理由表現編》』を作成した。以下は、その目次である。1原因・理由表現概説原因・理由表現とは/原因・理由表現形式の通時的分布概観/原因・理由表現形式の地理的分布概観/方言における原因・理由の接続詞概観/東北方言における原因・理由表現形式の分布2各地方言の原因・理由表現原因・理由表現調査項目一覧/青森県八戸市方言(若年層)の原因・理由表現/山形市方言の原因・理由表現/山梨県奈良田方言の原因・理由表現/岐阜市方言の原因・理由表現/美濃方言の原因・理由表現/富山方言の原因・理由表現/京都市方言の原因・理由表現/広島県三次市三和町方言の原因・理由表現/沖縄県那覇市首里方言の原因・理由表現2の各地方言の原因・理由表現の報告を対照させると、以下のことが指摘できる。(1)原因・理由表現の基本的な意味である、「事態の原因」「行為の理由」「判断の根拠」「発言・態度の根拠」については、どの方言にも、すべてを表し得る汎用の形式がある。(2)以下の用法については、各地方言の諸形式のなかには、使用に制限のあるものがある。・主節が要求文などの働きかけの強い文である用法:富山方言のガデ・モンデ等・主節が叙述文などの働きかけの弱い文である用法:岐阜市方言のニ・理由を表さない用法:富山方言のガデ、モンデ等・「XハYカラダ」のような述語用法:八戸市方言のスケ、富山方言のサカイ類、京都市方言のンデ・推量表現に後接する用法:八戸市方言のスケ、富山方言のサカイ類、京都市方言のサカイニ・サカイ・ンデ・文末用法:岐阜市方言のデ、富山方言のガデ・モンデ等、首里方言のシニチーテーなお、上記の研究成果は、用例に音声を付した形で、以下のウェブサイトにおいても公開している。今年度の研究成果の概要は、以下の通りである。(1)全国の要地における条件表現の調査前田を中心に、条件表現の調査項目を作成した。これに基づき、全国の要地における条件表現の調査を各自で行った。秋田方言について日高、山梨方言について吉田、岐阜方言について山田が調査を実施した。秋田方言には、沿岸南部(由利地方)にサカイ系の原因・理由表現がある。これまで、この地域のサカイ系の形式としては、「ハゲ(hage)」「サゲ(sage)」という形が報告されていたが、今回の調査では、「ヘゲ(hege)」「アゲ(age)」「ゲ(ge)」など、音声の弱化や脱落が生じた新しい形が確認された。この地域では、すでに本来の形である「サカイ」が意識されなくなっており、文法化が急速に進行していることが分かった。(2)既存の方言集の記述に基づく条件表現データベースの作成

『日本方言大辞典』(小学館)に収録されている各地方言の接続助詞について、当辞典が参照している原資料(各地で編纂された方言集等)にあたり、記述内容の確認作業を行った。『日本方言大辞典』は、必ずしも原資料の記述をそのまま採用しているわけではなく、また、内容が改変されている場合もあることが分かった。現在、各自で地域を分担し、『日本方言大辞典』以後に編纂された方言集も含めて、原資料に基づく条件表現データベースの作成を行っている。『日本方言大辞典』の原資料にあたる作業を大西、三井、吉田、小西、日高が行い、東北方言の新資料にあたる作業を竹田、鹿児島方言の新資料にあたる作業を舩木が担当して作業を進めている。今年度は各自の調査・研究を中心に、9月および1月の2回の全体会議を行い、次のような研究を行った。なお、今年度は、研究代表者・分担者7名に加えて、次の3名の研究協力者が参加した。研究協力者:竹田晃子(盛岡大学非常勤講師)、舩木礼子(京都光華女子大学非常勤講師)、高木千恵(神戸松蔭女子学院大学非常勤講師)(1)研究代表者(前田直子)を中心に、標準語における条件表現(原因理由表現)の枠組みを検討し、まとめた。さらに、昨年度作成した条件表現の調査項目に基づき、全国の要地における条件表現の調査を更に各自で行い、9月の全体会議において報告した。その結果を受けて、調査項目の検討を行い、必要な箇所につき、追加調査を行った。本年度の活動全体の報告を1月に行い、来年度の成果刊行に必要な作業を確認した。(2)調査地域およびその担当者は、秋田方言(日高水穂)、山梨方言(吉田雅子)、岐阜方言(山田敏弘)、山形方言(三井はるみ)、広島・山口(舩木礼子)である。(3)昨年度に引き続き、既存の方言資料の記述に基づく条件表現データベースの作成を引き続き行った(担当は大西拓一郎・小西いずみ・竹田晃子・高木千恵)。国立国語研究所所蔵の方言文献を中心に、以下の文献より原因・理由表現の記述内容の確認作業を行った。『野辺地方言集』『青森県方言訛語』『秋田方言』『九戸郡志』『米沢方言辞典』『山形県方言辞典』『御国通詞』『米沢言音考』『青森県五戸語彙』『青森県方言集』『北海道方言集』。以上本研究の目的は、方言の文法的側面に関する対照的研究の一分野として、条件表現について要地方言を統一的に調査し、標準語も含めて比較・対照することにより、現代日本語の条件表現について総合的な分析を行うことである。最終年度である今年度は、この目的に沿って、条件表現のうち原因・理由表現についての調査をまとめ、『全国方言文法辞典《原因・理由表現編》』を作成した。以下は、その目次である。1原因・理由表現概説原因・理由表現とは/原因・理由表現形式の通時的分布概観/原因・理由表現形式の地理的分布概観/方言における原因・理由の接続詞概観/東北方言における原因・理由表現形式の分布2各地方言の原因・理由表現原因・理由表現調査項目一覧/青森県八戸市方言(若年層)の原因・理由表現/山形市方言の原因・理由表現/山梨県奈良田方言の原因・理由表現/岐阜市方言の原因・理由表現/美濃方言の原因・理由表現/富山方言の原因・理由表現/京都市方言の原因・理由表現/広島県三次市三和町方言の原因・理由表現/沖縄県那覇市首里方言の原因・理由表現2の各地方言の原因・理由表現の報告を対照させると、以下のことが指摘できる。(1)原因・理由表現の基本的な意味である、「事態の原因」「行為の理由」「判断の根拠」「発言・態度の根拠」については、どの方言にも、すべてを表し得る汎用の形式がある。
分子ネットワーキングと共培養の統合アプローチによる藍藻からの抗藻ペプチドの探索

ラン藻の生物活性物質の生合成能力を最大限活用するために、自然条件あるいは通常培養条件下では生産していない生物活性物質を誘導する。具体的には、ラン藻同士、ラン藻と渦鞭毛藻の共培養によりこれまでに合成されていなかった化合物を生産させる。特に、抗藻物質の生産が期待される。さらに、探索を効率化するために分子ネットワーキングアプローチを用いる。新規分析手法を用いて培養条件による二次代謝産物の変化を可視化することで、これまでの方法では見いだされない化合物をラン藻から発見する。
抑制性神経伝達に関わる受容体の機能的構築に関する研究

脳、中枢神経系において、抑制性神経伝達の主要な部分を担うGABA_A受容体の細胞膜上での量的変化が、抑制性神経伝達の可塑性(ひいては脳、精神機能)を調節する上で非常に重要であると考えられている。我々は、現在までに、この動的平衡の制御にPRIP分子を介した受容体、リン酸化・脱リン酸化酵素、アダプター分子等の分子複合体形成が関与している事を明らかにしてきた。しかしながら、輸送に関与するモータータンパク質は未だに不明である等、その全貌の解明にはほど遠い状況である。そこで、本年度は、このPRIP分子を中心とした分子複合体形成を、より詳細かつ網羅的に解析するために以下の研究を行った。1.動物細胞においてGST-PRIPを高発現するプラスミドコンストラクトを作成し、様々な条件検討の結果、PRIPの大量精製系を構築した。これにより、翻訳後修飾を反映した全長PRIPを大量に精製することが可能となった。2.1)で得られた精製GST-PRIPとラット脳ホモジネートを用いて結合タンパク質の探索を行った結果、数種類の結合タンパク質候補を発見した。また、HEK293細胞に発現させたGST-PRIPを直接プルダウンする事により、数種類の内在性結合タンパク質候補を発見した。これらの結果は、前述した既知のタンパク質以外にも未知のタンパク質が、PRIPとの分子複合体形成、さらには、分子複合体形成を介したGABA_A受容体の細胞膜上での動的平衡の制御に関与している可能性を示唆している。抑制性神経伝達物質受容体(GABA_A受容体)の細胞膜上での動的平衡を制御する分子基盤を包括的に理解する事を目的に、本研究では、PRIPノックアウトマウスに見られるGABA_A受容体の量的、質的相違をモデルとして研究を行い、以下の成果を得た。PRIPノックアウトマウスでは、インスリン刺激によって惹起されるGABA誘導性電流の増加(細胞膜へのGABA_A受容体の輸送)がみられない。そこで、(1)インスリンシグナルの素過程に対するPRIPの影響を検討したところ、インスリン受容体の発現量、Aktの発現量、Aktの活性化共に変化は見られなかった。この結果は、インスリン刺激によって惹起されるGABA_A受容体の細胞膜発現調節において、PRIPはAktの活性化以降の過程で機能していることを示唆している。(2)インスリンによって惹起されるAktを介したGABA_A受容体βサブユニットのリン酸化を検討したところ、野生型ではリン酸化の上昇が認められるのに対し、ノックアウトマウスではリン酸化の上昇が認められなかった。この結果は、PRIPが、GABA_A受容体βサブユニットのリン酸化調節を介して、細胞膜輸送を制御していることを示唆している。(3)免疫沈降実験により、PRIPとAktの直接の会合は認められなかったが、PRIP存在下で、GABA_A受容体βサブユニットに結合するAkt量の増加が認められる。この結果から、PRIPは、PRIP/Akt/GABA_A受容体の三者複合体形成を促進、あるいは複合体を安定化させることによりGABA_A受容体の細胞膜発現調節を行っている事が示唆される。これらの結果から、PRIPを介したGABA_A受容体の細胞膜発現調節の一端が明らかとなった。この事は、抑制性神経伝達の可塑性(ひいては脳、精神機能)を理解する上で、非常に重要であると考えられる。脳、中枢神経系においては、GABA_A受容体が抑制性神経伝達の主要な部分を担っており、この受容体の細胞膜上での量的変化が、抑制性神経伝達の可塑性(ひいては脳、精神機能)を調節する上で、非常に重要であると考えられている。本研究では、GABA_A受容体の細胞膜上での動的平衡を制御する分子基盤を理解することを目的に、先に我々がGABA_A受容体の細胞内輸送に関与していることを報告したPRIP分子を中心に解析を行った。昨年までの研究により、PRIPノックアウトマウスでは、インスリン刺激によって惹起されるGABA誘導性電流の増加(GABA_A受容体の細胞膜への輸送)が見られないこと、この現象に、タンパクキナーゼAktによるGABA_A受容体のリン酸化が関与している事を明らかにしていた。そこで、1.PRIP/Akt/GABA_A受容体の三者複合体形成を解析したところ、三者複合体形成が確認された。また、この三者複合体形成がインスリン刺激によって増強されること、その分子基盤として、活性化型Aktのみが特異的にPRIPと結合することを明らかにした。2.PRIPペプチドを用いて、PRIPとGABA_A受容体の結合を阻害したところ、野生型ニューロンにおいて、インスリン刺激によって惹起されるGABA誘導性電流の増加が消失した。これらの結果から、インスリン刺激によって惹起されるGABA_A受容体の細胞膜への輸送の過程において、PRIPは、活性化型AktをGABA_A受容体近傍へとリクルートする足場タンパク質として働くことにより、GABA_A受容体のリン酸化、細胞膜輸送を制御している事が明らかとなった。

しかしながら、輸送に関与するモータータンパク質は未だに不明である等、その全貌の解明にはほど遠い状況である。そこで、本年度は、このPRIP分子を中心とした分子複合体形成を、より詳細かつ網羅的に解析するために以下の研究を行った。1.動物細胞においてGST-PRIPを高発現するプラスミドコンストラクトを作成し、様々な条件検討の結果、PRIPの大量精製系を構築した。これにより、翻訳後修飾を反映した全長PRIPを大量に精製することが可能となった。2.1)で得られた精製GST-PRIPとラット脳ホモジネートを用いて結合タンパク質の探索を行った結果、数種類の結合タンパク質候補を発見した。また、HEK293細胞に発現させたGST-PRIPを直接プルダウンする事により、数種類の内在性結合タンパク質候補を発見した。これらの結果は、前述した既知のタンパク質以外にも未知のタンパク質が、PRIPとの分子複合体形成、さらには、分子複合体形成を介したGABA_A受容体の細胞膜上での動的平衡の制御に関与している可能性を示唆している。
メタルナノ粒子を導入した幹細胞による新規放射線増感療法の基礎的検討

申請者らは独自に合成した過酸化チタンナノ粒子がX線照射により活性酸素種(ROS)を生成し、細胞・動物実験で放射線増感効果が得られることを報告した。そこで本研究では、過酸化チタンナノ粒子と金ナノ粒子を用いてその放射線増感効果を中心に検討した。Cell-free系(ナノ粒子と溶媒のみの系)での、双方のナノ粒子にX線を照射し、ROS特異性を持ついくつかの試薬を用いてROSの定量行った。金ナノ粒子では放射線照射によるヒロドキシラジカルの産生が認められたが、過酸化水素の発生は過酸化チタンナノ粒子でより多量に認められた。いずれのナノ粒子においてもスパーオキシドの発生は僅かであった。ナノ粒子の細胞内取り込みと増殖抑制の評価は、ヒト膵臓がん細胞株であるMIAPaCa2細胞を用いて放射線照射と併せて実施した。金ナノ粒子、過酸化チタンナノ粒子では共に細胞内の取り込みは認められたが、放射線照射によるアポトーシスの誘導は金ナノ粒子では僅かであり、過酸化チタンナノ粒子では増強が認められた。コロニーアッセイを用いた細胞増殖抑制効果に関してもアポトーシスの結果と一致して、過酸化チタンナノ粒子でより強く認められた。さらに、双方のナノ粒子をMIAPaCa2を用いたXenograftモデルの腫瘍に対して局注したが、X線照射併用による腫瘍増殖抑制効果は金ナノ粒子に比較して、過酸化チタンナノ粒子でより強く認められた。これらの細胞実験、動物実験の結果は、過酸化チタンナノ粒子による過酸化水素の発生と放射線照射による過酸化水素の更なる発生に起因すると考えられるが、それに反応するようにMIAPaCa2細胞にカタラーゼやグルタチオンなどの抗酸化系酵素の誘導が確認出来た。間葉系幹細胞への導入を試みたが、良好な導入は確認出来なかった。メタルナノ粒子は放射線増感剤として以前より注目され、当教室でも新たなメタルナノ粒子を開発し、特許を取得している(特許2010-032055、PTC/JP2011/53348)。本研究ではメタルナノ粒子の臨床応用への大きな課題であるドラッグデリバリーの問題の画期的な解決策として、メタルナノ粒子を導入した幹細胞による新たな放射線増感療法を提案し、臨床応用に向けた基礎研究を行う。難治癌に対してもメタルナノ粒子が到達すれば強力な放射線増感作用を発揮するが、現実には癌細胞の周囲には豊富な癌間質が存在し、薬剤の到達が困難であり、臨床応用がなされていない。強力な放射線増感効果を持つメタルナノ粒子として、医工連携共同研究により、二酸化チタンを原料として合成した過酸化チタンナノ粒子がX線照射によりヒドロキシルラジカルを始めとする大量のROSを発生させること確認でき、さらに担癌モデルマウスでの癌への直接注入モデルにおいて、過酸化チタンナノ粒子併用のX線照射が非併用の照射と比べて優位に腫瘍を縮小されることを報告している。過酸化チタンナノ粒子は持続的に過酸化水素を発生する事が実験的に証明できた。メタルナノ粒子を導入した幹細胞の作成に従事しているが、購買できる細胞の供給停止があり、保有する細胞で実験を実施できたが、詳細な検討は得られていない。今後は細胞の供給再開が得られる見込みなので、メタルナノ粒子の取り込みと、in vivoの実験系を用いての放射線増感効果が得られるかいないかの実証実験を実施する予定である。購買できる細胞の供給停止があり、保有する僅かな細胞のみでの実験となったため、実験計画に一部実施できない項目があった。
新規有機ケイ素ポリマーの合成と高機能性材料へのアプローチ

1ポリ[(ジシラニレン)オリゴフェニレン]、ポリ[(ジシラニレン)オリゴチエニレン]の合成と性質ポリ[(ジシラニレン)オリゴフェニレン]およびポリ[(ジシラニレン)オリゴフェニレン]を合成し、光反応性、導電性、耐熱性の評価を行った。興味深いことに、ポリマー主鎖中の連続するフェニレン、チエニレンの数を増やしてπ-電子系を長くしていくと光反応性が低下することが見いだされた。これらの実験結果はモデル化合物の分子軌道計算の結果と良く一致しており、ポリマーの最高被占軌道と最低空軌道はσタイプのものからπタイプへと変化しているためであるということが明らかとなった2ヘテロ原子を有するポリマーの合成ポリマー骨格にピリジン環を導入することに成功し、得られたポリマーの光反応性、導電性の評価をおこなった。3架橋型有機ケイ素ポリマーの合成ジエチニレンを主鎖に有するポリマーを合成し、それらを位置特異的ヒドロシリル化によって2次元化した架橋型ポリマーに変換することに成功した。本反応は構造を高度に制御した2次元型有機ケイ素ポリマーの数少ない例の一つである。また、架橋型ポリシランのモデルとして分岐状オリゴシランを合成し、光反応性を検討した。4その他のポリマー合成とそれらの性質環状化合物の開環重合によるシロール環骨格を含むポリマーの合成、H-Si結合を有する反応性有機ケイ素ポリマーの合成、オレフィン結合とケイ素-ケイ素結合の繰り返しを有するポリマーの合成、電気化学反応による有機ケイ素ポリマーの合成を行い、その結果得られたポリマーの光反応性、耐熱性、導電性を評価した。主鎖がπ-電子系と有機ケイ素基との繰り返しユニットで構成されているポリマーを各種合成し、その機能性を検討した。1.ポリ[(ジシラニレン)オリゴフェニレン]、[(SiR_2)_2(C_6H_4)_m]_n(R=Me、Et、Ph、m=1-4)を合成し、それらの光反応性を検討した。その結果、フェニレンユニットの拡張にしたがって光反応性が低下することが明らかになった。さらに、この光反応性の低下の原因を調べる目的で、ポリマーの電子状態の変化をポリマーの電子スペクトル及び、モデル化合物の分子軌道計算によって考察したところ、ポリマー主鎖中のフェニレンの数が増えるに従ってπ-π^*遷移は低エネルギーへσ-σ^*遷移は高エネルギーへと変化して行くことがわかった。2.ピリジン環を含むポリ[(ジシラニレン)ジエチニレンピリジレン]類の合成に成功した。これらのポリマーの薄膜を塩化鉄でドープすると高い導電性を示すことが明らかになった。その他、光反応性、耐熱性も検討し、ポリマーを不活性ガス中1400°Cで処理すると収率よくβ-シリコンカーバイドに変換できることを見いだした。3.その他、ジシラニレングループとオレフィン、チオフェン環の繰り返しユニットをもつポリマー、シロール骨格を有するポリマーを合成し、それらの光反応性、導電性を検討した。また、反応性のSi-H結合を有するポリマーや分岐状有機ケイ存否素ポリマーの合成に成功し、さらに、このタイプのポリマーの新しい合成法としてクロロシラン類の電極反応の検討も行った。1ポリ[(ジシラニレン)オリゴチエニレン],[(2,5-C_4H_2S)m(SiEt_2SiEt_2)]_n(m=1-4)を合成し、光反応性、導電性の評価を行った。前年度報告したポリ[(ジシラニレン)オリゴフェニレン]の系と同様に、ポリマー主鎖中の連続するチエニレンの数を増やしてπ-電子系を長くしていくと光反応性が低下することが見いだされた。

これらの実験結果は、やはり前年度報告したモデル化合物の分子軌道計算の結果と良く一致しており、ポリマーの最高被占軌道と最低空軌道はσタイプのものからπタイプへと変化しているためであるということが明らかとなった。2ジエチニルジシランとジブロモピリジンのパラジウム触媒存在下での脱HBr反応で、ピリジン環-エチニレン-ジシラニレン-エチニレンの繰り返しユニットを主鎖に有するポリマーの合成に成功した。得られたポリマーは光反応性を有し、ヨウ素、塩化鉄でドープすると導電性を示すことを明らかにした。3ジエチニレンを主鎖に有するポリマーを合成し、それらを位置特異的ヒドロシリル化によって2次元化した架橋型ポリマーに変換することに成功した。本反応は構造を高度に制御した2次元型有機ケイ素ポリマーの数少ない例の一つである。4その他、環状化合物の開環重合によりシロール環骨格を含むポリマーの合成、オレフィン結合とケイ素-ケイ素結合の繰り返しを有するポリマーの合成を行い、その結果得られたポリマーの光反応性、耐熱性、導電性を評価した。
疼痛抑制系の賦活と作用発現におけるGABAの役割

GABA_A受容体拮抗薬であるピクロトキシン(PTX)を痙攣が起こらない用量で静脈内投与すると、脊髄後角広作動域(WDR)ニューロンの侵害刺激に対する反応が抑制された。物理的侵害刺激(侵害性熱刺激と侵害性機械刺激)に対するスパイク発射数が減少し、侵害受容野が縮小した。その後、記録部位より吻側で脊髄を切断すると、侵害刺激に対する反応が回復した。PTXを全身投与すると、延髄大縫線核(NRM)へ投射する中脳の背側縫線核(NRD)および中心灰白質(PAG)ニューロンは自発発射数が増加した。PAG/NRDにPTXを微量注入すると、WDRニューロンの侵害刺激に対する反応が抑制された。逆に局所麻酔薬であるリドカインをPAG/NRDに微量注入すると、PTX全身投与後抑制されていた反応が回復した。免疫組織化学的手法により、PTXを全身投与すると、神経活動興奮のマーカーであるFos様タンパク陽性細胞が、NRDに集中して見出された。しかし脊髄後角広作動域(WDR)ニューロンの非侵害刺激、特に触刺激に対する反応は、PTXを全身投与すると増強した。非侵害刺激に対するスパイク発射数が増加し、非侵害受容野が拡大した。その後、記録部位より吻側で脊髄を切断しても、増強した非侵害刺激に対する反応は変化しなかった。PTX前投与後侵害刺激を加えると、脊髄後角第V層にFos様タンパク陽性細胞が増加した。脊髄後角WDRニューロンの侵害刺激に対する反応に及ぼすPTXの効果と非侵害刺激(触刺激)に対する反応に及ぼすPTXの効果は全く逆であった。前者はGABAによるNRD/PAGニューロンに対する抑制が取り除かれ(脱抑制)、下行性抑制系が活性化されたことによる可能性が示めされた。後者は脊髄内の低閾値機械受容線維終末部のシナプス前抑制が除去されたことによるもので、鎮痛とは正反対のアロディニアが引き起こされる可能性が示された。中枢神経系には警告信号としての痛みを伝える系とそれとは正反対の鎮痛系とが存在する。どのようなメカニズムで鎮痛系が活性化されるかを解明できれば、痛みの臨床治療に役立てる可能性がある。GABA受容体のクロライドチャネル遮断薬であるピクロトキシンの痙攣が起こらない用量を静脈内投与すると、脊髄後角広作動域(WDR)ニューロンの侵害刺激に対する反応が完全に消失し、低閾値受容(LTM)ニューロンに変化した。脊髄動物ではこの種の変換がみられず、触刺激に対する反応が選択的に増強した。この研究から、GABAは、下行性疼痛抑制系の起始核に抑制をかけていることが示唆された。そこで、次のターゲットを中脳の背側縫線核(NRD)および中心灰白質(PAG)として研究を進めた。NRDまたはPAGにピクロトキシンを微量注入すると、脊髄後角WDRニューロンがLTMニューロンに変化した。逆にこれらの部位に局所麻酔薬であるリドカインを微量注入すると、ピクロトキシン全身投与によるWDRニューロンからLTMニューロンへの変容が拮抗された。ピクロトキシンを全身投与すると、延髄大縫線核(NRM)へ下行する線維を送るNRDおよびPAGのニューロンの自発発射が増加した。また、NRDに多数のc-FOS陽性ニューロンが出現した。

これらのことからピクロトキシンの全身投与によって脊髄後角WDRニューロンがLTMニューロンに変容したのは、NRDおよびPAGニューロンに対するGABAによる抑制が取り除かれ、下行性抑制系が賦活されたことが証明された。通常は下行性抑制系は活性化されていないが、何らかの原因でGABAによる抑制が取り除かれる時に内因性の鎮痛系が活性化される可能性が示唆された。中枢神経系の内因性の鎮痛系がどのようなメカニズムで活性化されるかを解明できれば、痛みの臨床治療に役立てる可能性がある。平成7年度に、電気生理学的手法で、第一に『GABA受容体のCl^-チャネル遮断薬であるピクロトキシンを静脈内投与すると、侵害受容ニューロンが非侵害受容ニューロンに変化する現象』を示し、第二にこのメカニズムは『下行性疼痛抑制系の起始核である中脳背側縫線核(NRD)に対するGABAによる脱抑制である』ことを、(1)中脳へのピクロトキシン微量注入実験と(2)中脳ニューロンの記録から示した。今年度は平成7年度の結果を組織学的に裏付けるために、ニューロン活動の指標であるc-FOSの発現がピクロトキシン全身投与後に増加しているかを免疫組織化学的手法(ABC法)で、検索した。成熟ネコおよび成熟ラットを麻酔後、ピクロトキシン0.3mg/kgを静脈内投与し、2時間後潅流固定した。この用量は痙攣を誘発しない量である。麻酔及び静脈内投与用カテーテルの挿入を施した動物を対照とした。対照動物では、脊髄、延髄、中脳、視床にFOS陽性細胞はほとんどみられなかった。ピクロトキシン投与動物では、中脳のNRDに密な陽性細胞がみられ始め、この陽性細胞集団は、中脳から視床までの吻尾の広い部位に至っていた。中脳中心灰白質(PAG)の背側や外側部にも陽性細胞はみられたが、まばらであった。中脳の電気刺激によって鎮痛が得られる部位は、ネコではPAGの腹側部およびNRDが最も有効であるのに対し、ラットではPAGの背外側部が有効である。従って、ラットでは、FOS陽性細胞も背外側部に多くみられると予想していたが、ラットの場合もネコと同様に、FOS陽性細胞はNRDに密に分布していた。FOS陽性細胞は弧束核からもみられたが、下行性疼痛抑制系の中継核である延髄の大縫線核や脊髄後角から陽性細胞はみられなかった。GABA_A受容体拮抗薬であるピクロトキシン(PTX)を痙攣が起こらない用量で静脈内投与すると、脊髄後角広作動域(WDR)ニューロンの侵害刺激に対する反応が抑制された。物理的侵害刺激(侵害性熱刺激と侵害性機械刺激)に対するスパイク発射数が減少し、侵害受容野が縮小した。その後、記録部位より吻側で脊髄を切断すると、侵害刺激に対する反応が回復した。PTXを全身投与すると、延髄大縫線核(NRM)へ投射する中脳の背側縫線核(NRD)および中心灰白質(PAG)ニューロンは自発発射数が増加した。PAG/NRDにPTXを微量注入すると、WDRニューロンの侵害刺激に対する反応が抑制された。逆に局所麻酔薬であるリドカインをPAG/NRDに微量注入すると、PTX全身投与後抑制されていた反応が回復した。免疫組織化学的手法により、PTXを全身投与すると、神経活動興奮のマーカーであるFos様タンパク陽性細胞が、NRDに集中して見出された。しかし脊髄後角広作動域(WDR)ニューロンの非侵害刺激、特に触刺激に対する反応は、PTXを全身投与すると増強した。
ジフテリア毒素-IL-7融合蛋白によるIL-7受容体陽性細胞を標的とした治療戦略

本研究は、我々が独自に見いだした粘膜局所におけるIL-7を介した免疫調節機構およびIL-7レセプター陽性活性化CD4陽性腸管粘膜内リンパ球による炎症惹起機構の考え方を導入することにより、腸管局所免疫機構の特殊性を利用した炎症性腸疾患の新しい治療法を開発しようとする試みである。我々のグループでは胸腺骨髄において未熟なリンパ球の分化・増殖をmediateするとされてきたIL-7が腸管上皮(杯細胞)にても発現し、腸管粘膜内T細胞の増殖を調節する機構の存在を初めて明らかとし(J Clin Invest95:2945,1995)、さらに、慢性大腸炎を自然発症するTCRαノックアウトマウスにおいて粘膜IL-7機構の異常が認められ、TCRα-/-×IL-7R-/-のダブルノックアウトにおいて慢性大腸炎の発症が抑制されることより、局所のIL-7およびIL-7R発現異常が慢性腸管粘膜炎症を引き起こすことを証明した。我々はすでに、IL-7レセプター陽性の活性化粘膜内T細胞を標的とし、IL-7発現調節、即ちリコンビナントIL-7、投与、抗IL-7レセプター中和抗体の投与による治療を開発した。今回の研究ではジフテリア毒素を結合させたIL-7(DAB389IL-7)を開発し、IL-7トランスジェニックマウス、TCRαノックアウトマウスにおける慢性大腸炎に対する治療効果の検討を行うと同時に、生体に毒性のない腸管フローラ大腸菌を用いて、目的とする遺伝子組み換え蛋白を腸管内で産生させ、安価で腸管粘膜局所に高濃度でサイトカインやgrowthfactorをdeliverする新しい治療法を開発を試みた。これまでに遺伝子工学的にDAB389IL-7の発現ベクターを合成し、大腸菌に発現させ、DAB389IL-7蛋白を精製する技術の開発に成功し、in vitroにおいてIL-7レセプター陽性細胞に対してアポトーシス誘導効果を確認した。現在、このDAB389IL-7蛋白発現組換え大腸菌をTCRαノックアウトマウスに対して経口投与し、慢性大腸炎に対する治療効果を検討しており、今後、ヒト炎症性腸疾患治療に新しい道が開けると期待される。我々のグループでは胸腺、骨髄において未熟なリンパ球の分化・増殖をmediateするとされてきたIL-7が腸管上皮(杯細胞)にても発現し、腸管粘膜内T細胞の増殖を調節する機構の存在を初めて明らかとし(J Clin Invest95:2945,1995)、さらに、ヒト炎症性腸疾患におけるIL-7産生障害による活性化CD4陽性粘膜内T細胞のアポトーシス障害を証明した(submit for publication)。本研究では、これらの結果を受けて、IL-7トランスジェニックマウスを作製し大腸炎の発症とその炎症へのCD4陽性粘膜内T細胞の関与を初めて明らかとした(J Exp Med187:389,1998)(Proc Natl Acad Sci,USA,96:7451,1999)。