hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SSPEウイルス持続感染の分子機構

SSPE剖検例について、Reverse Transcription-coupled Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)法を用いてSSPEウイルス(変異麻疹ウイルス)遺伝子の塩基配列を解析した。凍結保存した大脳およびリンパ節組織よりtotal RNAを抽出し、reverse transcriptase (RT)を用いてcDNAを作製し、PCR法によりウイルス遺伝子を増幅した。Primerとして既知の麻疹ウイルスEdmonston株の塩基配列を合成して用いた。PCR産物は電気泳動により分離し精製した後、クローニングし、塩基配列を決定した。その結果、大脳およびリンパ節のいずれからもウイルス遺伝子が検出された。6種のウイルス構成蛋白のうち、Matrix protein (M)遺伝子についてはcoding領域全長の塩基配列を決定した。大脳由来の10クローンに共通の多数の塩基変異が認められた。また新たに終止コドンが生じており、塩基配列から推定されるアミノ酸配列は異常に短いものと推定された。リンパ節由来の12クローンには大脳由来のクローンと共通の塩基変異が認められ、さらに219カ所に塩基変異が追加されていた。うち4クローンでは大脳由来のクローンと同部位に終止コドンが見られたが、他の8クローンでは終止コドンの位置が変化していた。いずれのクローンでも推定されるアミノ酸配列は麻疹ウイルスのそれと比較して短いものであった。NP, P, F, H, L遺伝子についても同様の検索を行った。いずれの遺伝子も大脳およびリンパ節の両方で検出され、塩基変異が確認された。一般にSSPEウイルスは中枢神経系に持続感染すると考えられている。今回の研究の結果、ウイルスはリンパ節にも検出され、さらに大脳と比較して塩基変異がより高度であることはSSPEの持続感染を考察する上で極めて重要な所見と考えられた。当初の研究計画に沿って、Reverse Transcription-coupled Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)法を用いてSSPEウイルス遺伝子の塩基配列を解析した。SSPE剖検例の凍結保存組織よりtotal RNAを抽出し、reverse transcriptase(RT)を用いてcDNAを作成した。そのcDNAをtemplateとし、PCR法によりSSPEウイルス遺伝子を増幅した。麻疹ウイルス遺伝子には3'側(上流)からNP,P,M,F,H,Lの6種の構成蛋白がコードされており、約6.6kbのL遺伝子、約2.4kbのF遺伝子以外は2kb以下の長さである。L遺伝子以外はその全長を増幅できるようにprimerを設定した。L遺伝子では1kb程度のPCR産物が生成されるように設定した。こうして増幅したPCR産物を電気泳動により分離し精製した後、pUC118がベクターにクローニングし、dideoxy法にて塩基配列を決定した。既にMatrix protein(M)遺伝子についての解析は終了している。M遺伝子には高率に塩基置換が証明された。新たに終止コドンが生じており、そのM蛋白は異常に短いものと推定された。採取した数クローン中には基本的に同一の塩基置換が認められたが、クローン間で14塩基の相違も見られ、持続感染中に患者脳組織内で遺伝子変異が進行する可能性が示唆された。そのため、脳内の異なった部位でのウイルス変異の相違を知るために数カ所からRNAを追加採取し、現在塩基配列を解析中である。こうした解析はSSPEウイルス持続感染を考える上で重要と思われる。生鮮組織が得られた1剖検例を中心に検索を行っているが、我々の収集保存してきた症例の多くはフォルマリン固定パラフィン包埋組織である。そうした材料からの検索を可能とするために、パラフィン切片からの核酸抽出・RT-PCRを試みている。この方法が実用化されれば、極めて稀な疾患であるSSPE症例において、症例ごとのウイルス遺伝子変異の比較解析に有用と考えられる。生鮮組織の収集は今後も引き続き継続する予定である。同様の方法を用いて他の遺伝子についても解析が進行しており、研究期間内にSSPEウイルスの全塩基配列が決定され、ウイルス構成蛋白がSSPE脳内で果たしている役割を検討できるものと考えられる。

一般にSSPEウイルスは中枢神経系に持続感染すると考えられている。今回の研究の結果、ウイルスはリンパ節にも検出され、さらに大脳と比較して塩基変異がより高度であることはSSPEの持続感染を考察する上で極めて重要な所見と考えられた。SSPE剖検例について、Reverse Transcription-coupled Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)法を用いてSSPEウイルス(変異麻疹ウイルス)遺伝子の塩基配列を解析した。凍結保存した大脳およびリンパ節組織よりtotal RNAを抽出し、reverse transcriptase(RT)を用いてcDNAを作成し、PCR法によりウイルス遺伝子を増幅した。Primerとして既知の麻疹ウイルスEdmonston株の塩基配列を合成して用いた。PCR産物は電気泳動により分離し精製した後、クローニングし、塩基配列を決定した。その結果、大脳およびリンパ節のいずれからもウイルス遺伝子が検出された。6種のウイルス構成蛋白のうち、Matrix protein(M)遺伝子についてはcoding領域全長の塩基配列を決定した。大脳由来の10クローンに共通の多数の塩基変異が認められた。また新たに終止コドンが生じており、塩基配列から推定されるアミノ酸配列は異常に短いものと推定された。リンパ節由来の12クローンには大脳由来のクローンと共通の塩基変異が認められ、さらに219カ所に塩基変異が追加されていた。うち4クローンでは大脳由来クローンと同部位に終止コドンが見られたが、他の8クローンでは終止コドンの位置が変化していた。いずれのクローンでも推定されるアミノ酸配列は麻疹ウイルスのそれと比較して短いものであった。NP,P,F,H,L遺伝子についても同様の検索を行った。いずれの遺伝子も大脳およびリンパ節の両方で検出され、塩基変異が確認された。
マトリックス蛋白質LTBP2の機能と眼疾患への関与

申請者らは遺伝子ノックアウトマウスの解析により、これまで機能が不明であった細胞外マトリックスタンパク質Latent TGRβbinding protein-2 (LTBP-2)が眼球内の水晶体(レンズ)をつなぎ止める線維状構造体(毛様小体)の形成に必須であり、その欠損は水晶体脱臼を引き起こすことを明らかにした。またDBA2系統においてLTBP-2欠損マウスは野生型に比べて眼圧が上昇することを確認した。これらの結果はヒトの遺伝性眼疾患に見られるLTBP-2遺伝子変異の報告と一致しており、遺伝子ノックアウトマウスがヒトの眼疾患モデル動物となり得ることを示していた。申請者らはLtbp2ノックアウトマウスの表現型解析を行なっており、これまでにホモ変異体マウスでは毛様小帯の形成不全による水晶体脱臼が生じることを明らかにしているが、ヒトで報告されているような緑内障の表現型は確認することができなかった。本研究では一年齢以上経過した加齢Ltbp2ノックアウトマウスについて緑内障の表現型が現れるかどうかを解析した。また本研究で使用されているマウスは一般に研究で広く用いられているC57BL/6J系統のノックアウトマウスであるが、より緑内障の表現型が現れやすいとされるDBA/2J系統のバックグラウンドとしたLtbp2ノックアウトマウスも作成し、その緑内障に関する表現型を解析した。C57BL/6J系統で、生まれてから1年以上経過した加齢Ltbp2ノックアウトマウスについて眼圧の上昇や網膜神経節細胞の脱落などを調べたが、野生型の加齢マウスとの違いは見られず、少なくともこの系統のマウスではLtbp2に変異があっても緑内障とはならないものと考えられた。一方でC57BL/6J系統のLtbp2ノックアウトマウスをDBA/2J系統の野生型マウスに3代以上のバッククロスを行った後にホモ変異体としたLtbp2ノックアウトマウスでは8週のマウスにおける眼圧が約10 mmH2Oであり、野生型DBA/2Jマウスの眼圧8 mmH2Oよりも上昇していることが分かった。申請者らはヒトで見つかったLTBP2上の変異の多くは分泌されない異常蛋白質を産生させる変異であることを既に明らかにしている。最近新たなヒトのLTBP2変異が報告されその機能解析を行なったところ、この点変異LTBP-2は正常に細胞外に分泌され、しかも正常LTBP-2と同様に、毛様小帯の主要構成成分であるフィブリリン-1に結合する活性を有していた。このことはLTBP-2にはフィブリリン-1に結合する以外に毛様小帯の構築に重要な機能があり、新たに発見された点変異LTBP-2はその機能が失われていると考えられた。申請者らは細胞外マトリックスタンパク質LTBP-2の生物学的機能を解析する目的で、遺伝子欠損マウスを作成しその表現型を解析した。LTBP-2の遺伝子変異はヒトで先天性緑内障や水晶体脱臼との関連が報告されていることから、作成したLTBP-2欠損マウスで同様の表現型が見られるか調べたところ、変異マウスでは水晶体を保持する毛様小帯が形成不全となっており、水晶体脱臼の表現型が確認された。一方で緑内障の指標となる眼圧の上昇や網膜神経節細胞の脱落などは確認されなかったことから、LTBP-2の欠損により生じる一次的な疾病は毛様小帯形成不全による水晶体の脆弱化及び脱臼であり、緑内障は二次的に起こる現象であろうと結論された。ヒトのLTBP-2遺伝子変異による緑内障発症について、その後の研究で家族性緑内障の患者でLTBP-2遺伝子の変異が検出されないことからLTBP-2変異が直接緑内障を引き起こすのか、それとも他の疾病により二次的に緑内障が生じるのかという点について議論されていたが、申請者らの研究結果は後者の説を強く支持するものとなった。これらの研究結果はHum. Mol. Genet.に掲載された。マウスでの緑内障研究にはマウスの系統が強く影響することが知られており、DBA/2J系統のマウスが緑内障を発症する傾向にありよく研究に用いられている。そこで申請者らが作成したC57BL/6J系統のLTBP-2遺伝子変異をDBA/2J系統に移行させ、DBA/2J系統でのLTBP-2変異マウスを作成しその表現型を緑内障について調べたところ、DBA/2J系統では変異マウスは野生型に対して有意に眼圧が上昇しており、緑内障の兆候が見られた。現在網膜神経節細胞の脱落など、他の緑内障の症状について解析を進めている。申請者らは細胞外マトリックス蛋白質であるLTBP(latent TGFβbinding protein)の生物学的機能を研究している。これまでの研究でLTBPファミリー蛋白質の一つであるLTBP-2が、眼球で水晶体をつなぎ止めておく繊維状組織である毛様小体の形成に重要であることを明らかにした。ヒトにおいてLTBP-2遺伝子の変異が先天性緑内障や家族性水晶体脱臼に見られており、後者の病態がLTBP-2の機能不全による直接の症状であることが証明されたことになるが、LTBP-2と緑内障との関連については未だ不明な点が多い。そこで我々が作成したLTBP-

2遺伝子変異マウスのバックグラウンドを、基礎研究で最も一般に用いられるC57BL/6J系統(B6)から緑内障を発症しやすいとされる系統であるDBA2系統(DBA2)に移し、それぞれの系統で野生型と変異型のマウスの眼圧を計測した。B6では野生型とホモ変異型マウスにおいて眼圧に有意な差は見られなかったが、DBA2では一年齢の加齢マウスにおいて野生型マウスよりもLTBP-2ホモ変異型マウスの眼圧が有意に高かった。このことはLTBP-2の欠損が緑内障の一つの指標である眼圧の上昇に少なくとも間接的に関与していることが示され、しかもマウスにおける眼圧の上昇には系統による違いが見られることから、LTBP-2以外の別の遺伝子発現の影響が強く関与することが示唆された。また網膜神経節細胞の脱落も野生型マウスに比べLTBP-2ホモ変異体マウスに多く見られたが、水晶体の脱落により二次的に網膜神経節細胞が障害されている可能性も考えられるため更なる解析が必要であると結論された。これらの結果は我々の作成したDBA2/LTBP-2欠損マウスがヒトの緑内障のモデル動物となり得る可能性があるものと考えられた。申請者らは遺伝子ノックアウトマウスの解析により、これまで機能が不明であった細胞外マトリックスタンパク質Latent TGRβbinding protein-2 (LTBP-2)が眼球内の水晶体(レンズ)をつなぎ止める線維状構造体(毛様小体)の形成に必須であり、その欠損は水晶体脱臼を引き起こすことを明らかにした。またDBA2系統においてLTBP-2欠損マウスは野生型に比べて眼圧が上昇することを確認した。これらの結果はヒトの遺伝性眼疾患に見られるLTBP-2遺伝子変異の報告と一致しており、遺伝子ノックアウトマウスがヒトの眼疾患モデル動物となり得ることを示していた。DBA/2J系統のLtbp-2欠損マウスの作成のための交配に時間がかかったため。生化学作成されたDBA/2J系統のLTBP-2変異マウスについて緑内障関連の表現系の解析を進める。またヒトで発見されたLTBP-2変異蛋白質の機能の有無を培養細胞系で調べることでLTBP-2の機能に必須であるアミノ酸領域の同定を行う。さらには類縁のタンパク質であるLTBP-4との機能的な相違を調べる目的でLTBP-2/LTBP-4二重欠損マウスの作成及びLTBP-4を過剰発現させたLTBP-2欠損マウスの作成を行ってその表現型を解析する。Ltbp2ノックアウトマウスのバックグラウンドをC57BL/6JからDBA/2Jに変えるための掛け合わせに時間がかかったため。購入予定の物品を変更したため未執行額が生じた。当初の計画通り、DBA/2J系統のLtbp2ノックアウトマウスについて網膜神経節細胞の変化など緑内障と関連する表現型を解析する。また新たに発見された点変異Ltbp2蛋白質の機能的変化を正常Ltbp2と比較することでLtbp2の毛様小帯構築における、これまでに知られていない機能を明らかにする。実験試薬や研究成果発表のための旅費に使用する予定である。購入予定の物品変更のため、未執行額が生じた。実験試薬や研究成果発表旅費に使用する予定である。
『広告医学』を核とする疾病制圧へ向けた独創的コミュニケーション基盤の構築

人びとの健康行動の持続的誘発には、対象属性に応じたコミュニケーションが重要である。広告医学という新規概念を提案し、デザインやコピーライティングなどといった、わかりやすく、人々に影響を与える広告的視点を取り入れることで、生活する人々の行動変容を実現するコミュニケーション研究を進めている。本研究では、広告医学の基礎概念実証を目指し、運動量の増加を目指した介入施策を複数デザインし、それらによる歩行量の増加を実証した。本年度における成果を礎に、今後も広告医学の概念に基づくアイテム開発・実証実験を継続していくことで、疾病予防に大きく寄与する独創的なコミュニケーション手法が生み出されるものと期待される。本研究では、広告医学の基礎概念実証を目指し、大きく4つの事業を推進した。1企業における健康組合における課題調査および、グループインタビューの実施、2最も重要な健康課題の解消を目指すコミュニケーションデザインの開発、3企業従業員に対する効果測定の実施、4一般向けの公開講座の実施によるアウトリーチ活動の実施、の4点である。当初は、減塩行動を想定していたが、運動量の増加を目指し、メタボへの対応を目指す取り組みへの要望が強かったため課題設定は、歩行数の増加および、メタボの意識改善の2点に絞り込み事業を推進した。最も重要な成果としては、内臓脂肪の蓄積を簡単な手法で警告する衣服を開発し、知財を出願した。さらに、対象企業における動線分析を行い、階段の昇降を中心に歩行を促すPOP・ポスター、ステッカー、ウェブサイトなどをデザイナーとともに開発、効果的な配置で設置した。これらの介入効果をウェラブルデバイスにより定量評価をしたところ、一日あたり40歩程度の階段登りが上昇することが判明した。興味深いことにこの変化は、被験者の属性に応じて異なっているということも示唆された。以上の成果は、中間報告を兼ね、パシフィコ横浜にて一般の方向けの対話型セミナーを実施し、好評を得た。一部は、webニュースに取り上げられるなどの反響があった。再生医学、広告医学
生物の複合制御機構の解明とその工学的応用

研究成果の概要:生命のあらゆる場面で機能を発揮する制御は、生命現象の普遍的な発現の場と考えられるが、その役割、形態、構造は千差万別である。本研究では多様な生物制御の様相を「複合性」としてとらえ、生物全体に当てはまる普遍的な原理として確立した。複合制御機構が生物において用いられている代表的な場が細胞における遺伝子発現制御と脳における運動制御である。今年度は研究のスタートに当り、両者に研究の焦点をしぼった。前者に関しては遺伝子発現制御を制御理論の枠組で考察するための枠組を提案した。制御対象としてオペロンを、制御系として転写因子の回路を考える図式が多くの遺伝子の制御系を自然に記述出来ることを示した。この枠組で実際に遺伝子制御系を解析するために転写制御の生化学ダイナミックスを記述する普遍的な表現法を提案した。また、この枠組で複合制御を実際に実現する基本ロジックを解明し、その生物学的な意義を考察した。幾つかのオペロンを例にとってロジックの実際の動作を示した。一方、脳の運動制御に関しては、複合制御の重要な特徴のひとつである「一様な計算機構」を体現する等しい計算素子からなる一様なネットワークを構成した。これらの運動制御の計算原理は自己保存の要求とHebb則にもとづくのみで、正解や誤差信号は素子は直接用いていない。このような素子と回路を用いて様々な運動制御の実験を行った。その結果、環境との良好な相互作用を短時間で獲得する能力を保持することが分り、複合制御のアプローチが自然の学習方式として合理的であることを示すことが出来た。この方式で、単項動作としては最も困難と思われる歩行を実現する脚式機械を作製し、実際に歩かせることが出来た。<学習>による歩行の実現は世界でも初めてである。この方式は環境のモデルを必要としないので、不整地歩行など未知の環境における行動に大きな可能性をもたらすと思われる。今後、動作の複合性やさらに大きな不確かさをもつ環境における行動に挑戦しつつ、理論的な基礎の解明につとめたい。本年度は当初の研究目的の実現に向けて細胞、臓器、個体それぞれ大きく進歩することができた。細胞レベルでは複合制御のロジックを分類することを通して、その基本的構造を明らかにした。それによると、たとえば入力が2つの場合は複合制御として意味のあるパターンは4つに分類される。それぞれのパターンの生物学的意味も明らかにした。この結果はJournal of Theoretical Biologyへの掲載が確定した。また昨年度来行ってきた分子間相互作用にもとつく転写/代謝制御の基礎理論がJournal of Theoretical Biologyに掲載され、大きな反響を起こした。転写制御と代謝制御における複合性を議論する基本的な枠組ができあがったと思われる。臓器レベルではグルコース/インシュリンのダイナミックスにもとづく糖尿病のモデルを構築し、複合制御のメゾスコピックレベルでの構造を明らかにした。これについてはさらに拡張し、システム医療への応用を考察中である。個体レベルでは「下田モデル」にもとつく神経回路系の数学的構造がある程度明らかになり、それが適応制御として外界に対して適切に動作することが示された。これらの成果を概観すると、複合制御のもつ等質な計算媒体とそれにもとつく可複合性、可進化性が生物制御の中で重要な役割を果たしていることがますます明らかになりつつある。生物制御原理に迫るための共通概念「複合制御」に基づき,その理論的側面の強化,生物制御の実例に基づく解析,人工物制御への応用を3本柱として研究を遂行した.理論的側面の強化では細胞レベル・臓器レベル・脳レベルといった異なる制御対象から,タンパク質同士の反応・血液循環・神経細胞活動をそれぞれのレベルにおける計算媒体と考え,生物学の知見を基にそれぞれの制御の共通部分を抽出することで,制御対象に依存しない共通性を,これまでの概念的・抽象的レベルから解析・応用が可能なレベルへ掘り下げることに成功した.この結果を基にすることで,従来は個別に解析が行われてきた生物内の免疫系,循環系,脳制御系といった異なる制御系を共通したものとして考えることが出来るようになり,これまでは非常に困難であった異なる系の相互作用の影響が解析可能となった.その相互作用を統一した数学モデルへと発展させることで,これまでは解明されていなかった疾患原因を,系を超えたところに求め病原の解明に新たな光を当てることになった.生物制御を原理のレベルに書き下したことで,無機物の計算機を用いて生物制御の持つ重要な能力である「未知環境への適応」が実現可能であることを示し,複合制御に基づいた学習法Tacit learningを用いたヒューマノイドロボットのモデルを用いない歩行学習や効率的な動作の創発に成功した.この結果は家庭内や災害現場など,複雑な環境中で動作可能なロボット開発のための新たな機械学習の基礎となりうると考えている.また複合制御を応用し,人間のもつ制御能力を外部機器によりサポートすることが可能な制御則の構築し,実例として高齢者の転倒を防止するための制御則と実機の開発行った.これらの結果より,生物の持つ未知への適応という能力を制御という側面から解析することで,「制御」の可能性・有用性を広げる大きな一歩になったと考えている.
ドーパミン作動性神経細胞の発生・分化・生存維持に対する神経栄養因子の機能

新生マウスの全脳よりmRNAを調製し、既報のラットGDNFcDNAの配列をもとに合成したプライマーを用いて、RT-PCR法によりマウスのグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)cDNAを取得した。取得したcDNAより推定されるマウスGDNFのアミノ酸配列をラット及びヒトGDNFのアミノ酸配列と比較したところ、3者間で高い相同性を示した。特にマウスとラットではアミノ酸2残基が異なるだけであった。次にマウスGDNF cDNAをプローブにしてマウス遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、GDNFをコードする領域をすべて含む全長約50kbの遺伝子クローンを取得した。構造解析の結果、マウスGDNF遺伝子は2つのエクソンから成り、イントロンは約18kbであることを明らかにした。更にマウスGDNF遺伝子の転写開始点上流約7kbの全塩基配列を決定した。転写開始点付近にはTATA boxが存在し、これに隣接してSplが結合すると推測されるGC boxが存在した。またマウスGDNF遺伝子の5'上流領域には、転写調節因子APlが結合することで知られるTREコンセンサス配列(TGACTCA)が存在した。マウス脳では大きさの異なる2種のGDNF mRNAが存在することが認められ、小さなタイプのmRNAは、大きなタイプのmRNAのうち第1エクソン内の78塩基が欠失した形で存在した。これはスプライシングの5'donor siteが2カ所存在するためスプライシングの違いによって2つのタイプが存在するものと推測された。またRT-PCRによってGDNF mRNAは少なくともマウス胎生期85日目には発現していることが認められた。一方、ラットグリオーマ由来細胞株C6細胞においてGDNF遺伝子発現がTPA処理によって誘導されることが観察された。GDNF欠損マウス作製のため、GDNF遺伝子内にネオマイシン耐性構造遺伝子を挿入したターゲティングベクターを構築し、これをES細胞に導入して相同組み換え細胞を選択した。現在キメラマウスを作製中である。
自然放射能線源を利用した放射線教育「30分測定実習」法の開発と実践に関する研究

自然の放射性同位元素を含む材料をもとに製作した自然放射能線源を用いて「30分測定実習」法を開発した。この方法を円滑に進めるため、線源スタンドやデータシートを作成し、放射線業務従事者の新規教育や、家庭教育に適用して、有効性を確認した。さらに高校生を対象にした放射線教育では、分担測定法を併用して「30分測定実習」法を適用した結果、分担測定法には受講生の積極的な参加を促すなど、有用な教育効果のあることが分かった。平成22年度は、国内における放射線教育の実状を調査するとともに、実習教材を試作して性能評価を行い、その結果に基づいて、「30分測定実習」法の基本設計を進めた。実状調査では、中学・高校、一般を対象にした放射線教育は、比較的限られた地域や教育機関で実施されている事が分かった。その理由として、使用される放射線源が特定の地域でしか採取できない放射能含有温泉水であることや、実習教材が高価で、準備に手間のかかることなどが考えられる。そのため日本国内どこでも容易に手に入れることの出来る塩化カリウム、化学肥料、乾燥昆布などを材料にした放射能線源を使用するとして、「30分測定実習」法の基本設計を行った。また現在行われている多くの放射線教育は体験学習的な色彩が強く、そのため、基本設計に、放射線の性質と安全取扱、放射線利用を組み入れることにした。こうした設計思想のもとに実習手順を具体化し「30分測定実習」法として放射線業務従事者教育に適用した。その結果、各受講者の測定値に多少の差はあるが、それぞれが得たデータを用いて防護の3原則を理解できることが分かった。また本年度の研究で、測定シートの重要性が明らかになった。シートの出来・不出来で、実習が円滑に進むかどうかが決まる。今後、測定シートの重要性を考慮した基本設計の修正を行う必要がある。なお本研究で開発した複数の化学肥料を線源材料に用いる実習法が、日本放射線安全管理学会誌に技術論文として採択された。また塩化カリウムを用いる実習法を放射線業務従事者教育に適用し、実践経験として平成22年度の放射線取扱主任者年次大会で発表したところ、優秀ポスター賞を受賞するに至った。平成23年度は、福島第一原発事故関する新聞/テレビ等の報道により、日本国民の多くが、否応なしに放射線の教育を受けさせられた1年であったといえる。しかしながら、聞いて知るだけの概念的な知識の習得でしかなかった。本当に放射線を理解するためには、放射線を自分の5感で実感し、理解する必要がある。本研究で進めている自然放射能線源を利用した「30分測定実習」は、そうした放射線教育の要請に答えることができる。したがって当初の目的にはなかった福島原発事故を意識して、放射線教育の実践研究を進めた。昨年度から始めた「30分測定実習」法による放射線業務従事者教育を平成23年度も継続したほか、新たな取り組みとして、化学肥料および乾燥昆布で製作した自然放射能線源で家庭における放射線教育を実施し、有効性を確認した。またスーパーサイエンスハイスクールなどで来所する高校生に対し、同様の放射線測定実習を開始した。その結果、適切な実習手順とデータシートの重要性を再確認するとともに、改良を進めた。さらに核融合科学研究所主催の東京イベントで放射線実習のコーナーを設け、主に小学生親子を対象に、湯の華や乾燥昆布で製作した自然放射能線源での放射線測定実演のほか、あらたに開発した表面汚染模擬面線源(約30cm×30cmのプレート)を用いて、スクリーニングの体験測定を行い、小学生に対しても、測定にもとづく放射線教育が可能であることが分かった。また実習用具として廉価な測定装置を開発するための調査を開始し、検出器として半導体ダイオーや小型ガス計数管が有望であるとの結論に達した。福島原発事故以来、一般国民に対し、放射線についての正しい知識が、これまで以上に求められるようになった。そのため、本研究で進めている放射線の性質を実感して体得できる測定実習を開発することは有意義であり、今後ますます重要性が増すと考えられる。平成24年度は本研究3年間の最終年度である。従って、テーマである“自然放射能線源を利用した「30分測定実習」"の仕上げの年を意識して研究を進めた。「30分測定実習」を実現するためには、受講生を主体に考えた測定用具、放射線源、実習データシート、説明スライドなどを整備することが大事である。23年度までにその概要は大部出来ていたが、24年度は、特に高校生を対象に実践しながら、完成させた。この実践の中で、分担測定法を考案した。分担測定法とは、受講生を数グループに分け、一連の測定をグループで分担して行う測定法である。そうすることにより、測定に必要な時間を節約することが出来る。この方法を放射線業務従事者教育や高校生を対象にした環境放射線測定において実践した。その結果、「30分測定実習」を実現するために重要な手法であるほか、教育現場においてもっと大事な効果のあることが分かった。分担測定法では、複数のグループが協力して全員でデータをまとめる。

その結果、受講生どうしや講師との間に一体感が生まれ、実習への興味と積極的な参加を促すプラスの現象が見られたからである。これは、予想しなかった成果であったが、実習に親しみながら、積極的に放射線を理解するという点で、今後、さらに発展させる価値があると考えている。また平成24年度は、これまで以上に、自然放射能線源による放射線実習の普及に努めた。核融合科学研究所主催のオープンキャンパスや東京イベントでは、今年も継続して環境放射線測定のコーナーを設けるほか、新たに「信州環境フェアー」や「名古屋2012」などに参加して、主に小学生親子を対象に放射線と放射能のデモンストレーションを行い、好評を得た。また「自然放射能線源の利用に関する研究会(平成25年1月25日、核融合科学研究所)」を開催して、7件の演題発表を行うなど、最新の放射線教育について情報交換を行った。平成23年度は「30分測定実習」の教材と手順の完成を目指して、平成22年度に検討した教材や実習手順を放射線教育現場に適用して改良を進めた。この教育実践では受講者代表として家庭と高校生をとりあげたが、その結果、「30分測定実習」を実現するための合理的な方法として「分担測定法」を考案することができた。また新たな教材として表面汚染模擬面線源を開発することが出来た。以上のことより、放射線教育現場に存在する「経験がない、教材がない、十分な時間がない」という問題を解決するための本研究は「(2)おおむね順調に進展している」と考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。放射線教育に関する本研究の意義は、福島原発事故の発生後、さらに高まったと思われる。そのため、研究計画に大きな変更はないが、本研究で開発した放射線教育法を、当初の計画以上に、いかにして、多くの教育現場に広げてゆくかを、検討しなければならないと考えている。
想定外への対処を目指すアシュアランスネットワーク技術の研究

本研究では、異種でかつ変化する想定外の事象への対応能力を持つ、重要通信サービスを提供可能な通信制御技術を開発するため、(1)想定外の事象にタイムリーに対応可能なネットワーク階層の複数のサービスを併用するクロスレイヤ的アプローチに基づく技術、(2)ネットワーク仮想化技術に基づく強度輻輳にも耐える緊急重要通信技術、について検討した。また、評価実験の結果、提案技術は従来技術よりも有効なことを確認した。平成25年度では、想定外の事象へのタイムリーな対応を目指すアシュアランスネットワークの要素技術として、以下について検討した。(1)異なるプロトコル階層を協調動作させるクロスレイヤ制御の検討として、MAC制御を利用したQoS制御とトランスポート層のQoS制御を組み合わせた制御の通信特性を評価した。評価では、通信方向と制御強度の関係について詳細に考察した。その結果、通信方向の組合せにより、QoSを保証するために必要な制御強度の傾向が大きく異なることが分かった。(2)マルチレート無線LAN環境において、システム全体のスループットを向上するためには、アクセスポイントと端末の配置が重要となる。そこで、端末の分布を考慮したアクセスポイントのスループット予測法を検討した。提案方式を利用することで、災害時において無線LANにより通信可能な端末数の最大化を目指すことができる。(3)強度輻輳状態となった無線LAN環境において、TCP通信のスループットを保証する制御として、アクセスポイントにおいて各端末のスループットを制御する方式を検討した。本技術は、TCPの受信ウィンドウサイズのみ調整するため、パケットを廃棄する従来技術と比べてQoSを要求しない通常端末に対する影響が少ないという特徴を持つ。(4)緊急時における重要情報を高速に流通させるため、複数のネットワークインタフェースと複数の経路を同時に利用するダウンロード再生技術を提案した。また、SCTPマルチストリーム機能を用いたデータ送信における通信性能を、パケットが連続して損失するネットワークにおいて検討し、その効果を確認した。以下のように想定外の事象にタイムリーに対応可能な技術に関して検討した。(1)被災地における通信環境として想定される衛星回線と無線LANを組み合わせた環境において、衛星回線に適したTCP輻輳制御であるTCP-STARを実験的に評価した。超高速インターネット衛星WINDSを用いた実験の結果、衛星回線における遅延時間よりも無線LANアクセスポイントのMAC制御による遅延変動の影響を受け、スループットが安定しない場合があることが分かった。(2)ネットワーク仮想化による強度輻輳にも耐える緊急重要通信技術の低優先TCPに関して検討した。低優先TCPは、最低限のスループットを獲得する制御を行う。そのため、この技術は、災害時における緊急情報のように小さいデータ量ではあるが常時提供すべき情報を継続して送信する際に利用可能である。(3)無線LAN環境において想定外の動作をする可能性のあるMACパラメータを改造した端末(MAC改造端末)に対するQoS制御について検討した。無線LANのアクセス制御であるCSMA/CAでは、各端末が制御パラメータを持つため、自己のスループット向上を目的としてMAC改造端末が利用される可能性がある。そこで、アクセスポイントにおいてMAC改造端末の送信機会を制御する方式を提案した。シミュレーション評価の結果、提案方式はMAC改造端末のスループットを制御可能なことが分かった。(4)パケットロスの発生するネットワークにおいても性能を維持する技術について検討した。ランダムにパケットロスの発生するネットワークにおいて、パケットに信頼性を選択的に付与するPR-SCTPを用いてパケットロスの影響を緩和する技術を提案した。また輻輳のない場合にはパケットロス率の高いネットワークでも高い性能を維持し、強度輻輳の発生した場合には他のTCPと同程度に性能を抑える技術を提案した。平成26年度では、以下のように想定外の事象にタイムリーに対処可能な技術に関して検討した。(1)災害時の避難所のように複数の無線LANシステムが密集する環境において、無線LANシステム全体のスループット向上を目指す制御技術を検討した。本研究では、システムスループット向上のためにデータフレームの送信が衝突したとしても問題なく受信可能となる現象を示すキャプチャエフェクトを利用する制御を検討した。シミュレーション評価の結果、提案方式は、従来よりもシステムスループットを向上可能なことが分かった。(2)強度輻輳状態の無線LAN環境に対応可能なTCP制御として、FEC技術を利用したTCP制御の検討を行った。本研究では、前年度実施した最低限のQoSを保証するTCPの検討で得られた知見も利用し、より効率的な制御を検討した。シミュレーション評価の結果、提案方式は、パケットロス率が非常に高い環境において、従来技術よりも高いスループットを確保できることを確認した。(3)フローQoS保証を目指したクロスレイヤ制御に利用可能な新たなQoS保証MAC制御として、バックオフ時間制御を検討した。提案方式では、スループットの保証と合計スループットの向上を目指し、CSMA/CAにおけるバックオフ時間設定を従来技術よりも細かく制御する。シミュレーション評価の結果、提案方式は従来のクロスレイヤ制御と同様に特定端末のスループットを保証しつつ、合計スループットを向上可能なことが分かった。

(4)災害時などの通信経路が不安定な状況で発生するランダムロスを考慮し、複数のTCP接続を複数経路のそれぞれにおいて用いる分割ダウンロード再生方式の検討を行った。また高ロス率環境において、提案するPR-SCTPを用いたファイル転送方式を評価した。評価実験の結果、各提案方式の有効性を確認した。情報ネットワーク本研究では、異種でかつ変化する想定外の事象への対応能力を持つ、重要通信サービスを提供可能な通信制御技術を開発するため、(1)想定外の事象にタイムリーに対応可能な技術(2)ネットワーク仮想化による強度輻輳にも耐える緊急重要通信技術、の2つの技術について検討している。平成25年度は、輻輳状態を考慮したQoS制御を検討するとともに、システム全体のスループット向上に関する検討も行った。また、データ到達性向上が見込める複数インタフェース利用に関する検討も行った。その結果、(1)の成果の一部をまとめた論文が電子情報通信学会の和文論文誌に採録された。さらに、(1)(2)それぞれについて、成果の一部をIEEEの国際会議、および電子情報通信学会の研究会において発表しており、概ね計画通りに進捗していると考えられる。本研究では、異種でかつ変化する想定外の事象への対応能力を持つ、重要通信サービスを提供可能な通信制御技術を開発するため、(1)想定外の事象にタイムリーに対応可能な技術(2)ネットワーク仮想化による強度輻輳にも耐える緊急重要通信技術、の2つの技術について検討している。初年度は、開発技術の基盤となる技術についての検討および評価を行った。また、この成果に基づき、それぞれの技術の基礎的検討を行った。さらに、(1)(2)それぞれについて、成果の一部を電子情報通信学会の研究会において発表しており、概ね計画通りに進捗していると考えられる。(1)想定外の事象にタイムリーに対応可能な技術の開発有線・無線混在ネットワークに対する技術として、引き続きMAC制御を利用したQoS制御とトランスポート層のQoS制御を組み合わせたクロスレイヤ制御を検討する。前年度までに得られた知見を基に、通信方向の組合せ、および端末の位置を考慮することで、QoSを保証するたけでなくシステム全体のスループットを可能な限り向上する方式を検討する。(2)ネットワーク仮想化による強度輻輳にも耐える緊急重要通信技術の開発強度輻輳に対応可能な緊急重要通信技術として、前年度までに検討した最低限のQoSを保証するTCP、および、中継端末でTCPのウィンドウサイズを制御する技術を統合した通信技術の検討を行う。また、複数の無線インタフェースを同時、または、適宜切り替えながら通信の継続性を向上させる技術の検討も行う。
ガンマセクレターゼによるアミロイドベータタンパク質の産生機構

γセクレターゼは,アルツハイマー病で脳内に蓄積が見られるアミロイドβタンパク質(Aβ)を産生する酵素である。近年の研究から,γセクレターゼは,presenilin, nicastrin, Aph-1, Pen-2の4つのタンパク質の複合体であると考えられており,また,γセクレターゼの基質は複数箇所で切断を受けることが分かっている。このようなことから,γセクレターゼは,複雑な基質切断機序を持っていることが示唆されてはいるが,酵素学的な解析はまだまだ発展途上である。私はこれまでに,哺乳類培養細胞を用いてγセクレターゼの解析を行う過程で,γセクレターゼが基質をC末端側から3残基毎に,段階的に切断をするのではないか,という「トリペプチド仮説」を裏付ける結果を得てきた。本年度は,自身が中心となって樹立した酵母膜画分を用いたin vitro assay系を用いて,「トリペプチド仮説」の直接的な検証を試みた。特に,段階的な切断の際に産生されると予測される中間体を基質として用い,その中間体からγセクレターゼによるAβ産生反応が起きるかどうかの検証を行った。この中間体は哺乳類細胞内では不安定であり,遺伝子組み換えによって哺乳類細胞に発現させても,ほとんどタンパク質として得られないため,哺乳類細胞での検証は困難であった。しかし,酵母を用いた系では,この中間体が十分量得られるため,従来の方法では実現できなかった解析が可能となった。しかし,予想に反して,ここで用いた中間体はγセクレターゼによって切断されなかった。これらの結果は,中間体がγセクレターゼに基質として認識されていないと考えると説明が可能であり,γセクレターゼの基質認識には基質自身のC末端側の長さが重要であることが示唆された。今後,基質の長さに着目しての基質認識機構の解明が期待できる。γセクレターゼは、アルツハイマー病で脳内に蓄積が見られるアミロイドβタンパク質(Aβ)を産生する酵素である。近年の研究から、γセクレターゼは、presenilin,nicastrin,Aph-1、Pen-2の4つのタンパク質の複合体であると考えられており、また、この基質は複数箇所で切断を受けることが分かってきている。私は、これまでに、培養細胞を用いたγセクレターゼの解析の過程で、γセクレターゼが基質をC末端側から3残基毎に切断するのではないか、という仮説を裏付ける結果を得てきた。本年度は、γセクレターゼが培養細胞のラフト画分に存在することに着目し、このラフト画分を用いたinvitroassay系を樹立した。そして、この系を用いることで、46アミノ酸残基のAβ(Aβ46)が、6残基および3残基短い、Aβ40,Aβ43へと切断されるが、Aβ42には切断されないことを証明した。これは、γセクレターゼが基質を3残基ごとに切断するという仮説を支持するものである。さらに、私は、γセクレターゼと基質との関係を明らかにすべく、哺乳類の内在性因子の存在を考慮する必要のない系を樹立することを考えた。このような系を立ち上げることができれば、純粋に酵素と基質とのみの関係に焦点を絞ることができ、酵素学的な解析が飛躍的に進むことが期待される。そこで、実験の材料として、γセクレターゼの構成要素と相同性のある遺伝子を持っていない酵母を選択した。酵母に、γセクレターゼを構成する4種類のタンパク質とγセクレターゼの基質とを発現させ、それらの酵母から膜画分を採取した。そして、培養細胞の膜画分で行っていたときと同様に、invitroassay系を樹立した。現在までに、哺乳類細胞の膜画分を用いた実験系と矛盾しない結果を得ており、この新規assay系がきちんと機能していることを示すデータが得られている。近年の研究から,γセクレターゼは,presenilin,nicastrin,Aph-1,Pen-2の4つのタンパク質の複合体であると考えられており,また,γセクレターゼの基質は複数箇所で切断を受けることが分かっている。昨年度,哺乳類の内在性因子の存在を考慮する必要のない系として,酵母の膜画分を用いた無細胞アッセイ系を樹立した。今年度は,まず,新しく樹立したこの系で示されるγセクレターゼの性質が,哺乳類細胞を用いた従来のアッセイ系で見られるそれと同等であるかを主に検討した。界面活性剤,脂質,pH,γセクレターゼ阻害剤が,酵母に発現させたγセクレターゼの活性に与える影響について調べた結果,それらは哺乳類細胞におけるそれと同じであった。このようなことから,酵母を用いたγセクレターゼのアッセイ系は,正しく機能していると言えた。次に,γセクレターゼが産生するAβには,40残基のAβ40や42残基のAβ42,43残基のAβ43など,様々な長さのAβがあるので,この系でも,どのような長さのものができているかを探索したが,Aβ40,Aβ42,Aβ43の産生を確認することができた。この結果は,様々な長さのAβを産生するのに,上記4種類のタンパク質と基質とだけで十分であることを示していると言える。

このin vitro assay系は非常に簡便であり,酵素と基質との関係を探索する上で同様の系が利用されていくことが期待される。γセクレターゼは,アルツハイマー病で脳内に蓄積が見られるアミロイドβタンパク質(Aβ)を産生する酵素である。近年の研究から,γセクレターゼは,presenilin, nicastrin, Aph-1, Pen-2の4つのタンパク質の複合体であると考えられており,また,γセクレターゼの基質は複数箇所で切断を受けることが分かっている。このようなことから,γセクレターゼは,複雑な基質切断機序を持っていることが示唆されてはいるが,酵素学的な解析はまだまだ発展途上である。私はこれまでに,哺乳類培養細胞を用いてγセクレターゼの解析を行う過程で,γセクレターゼが基質をC末端側から3残基毎に,段階的に切断をするのではないか,という「トリペプチド仮説」を裏付ける結果を得てきた。本年度は,自身が中心となって樹立した酵母膜画分を用いたin vitro assay系を用いて,「トリペプチド仮説」の直接的な検証を試みた。特に,段階的な切断の際に産生されると予測される中間体を基質として用い,その中間体からγセクレターゼによるAβ産生反応が起きるかどうかの検証を行った。この中間体は哺乳類細胞内では不安定であり,遺伝子組み換えによって哺乳類細胞に発現させても,ほとんどタンパク質として得られないため,哺乳類細胞での検証は困難であった。しかし,酵母を用いた系では,この中間体が十分量得られるため,従来の方法では実現できなかった解析が可能となった。しかし,予想に反して,ここで用いた中間体はγセクレターゼによって切断されなかった。これらの結果は,中間体がγセクレターゼに基質として認識されていないと考えると説明が可能であり,γセクレターゼの基質認識には基質自身のC末端側の長さが重要であることが示唆された。今後,基質の長さに着目しての基質認識機構の解明が期待できる。
ウイルスの多粒子性DNAゲノム転写機構の解析と新規プロモーターの開発

レンゲ萎縮ウイルス(MDV)は複数の環状1本鎖DNAからなる分節ゲノムを持つ.本研究は,個々のMDV-DNAのプロモーターを解析することによりウイルス感染増殖サイクルにおける転写機構の解明と遺伝子組換え作物の作出に有用な新規プロモーターの構築を目的とする.11種のMDVのゲノムDNA(C1-C11)のプロモーター領域についてGUSレポーターに連結したコンストラクトを作製し,形質転換体タバコにおける活性をその転写活性を詳細に調査した結果,C4,C5,C6,C7,C8,C9の6種のプロモーターが分裂組織および維管束において強い転写組織を誘導することが判明した.MDVは自然条件下ではマメ科植物などの維管束に局在して感染するが,形質転換したイネ植物体においてMDVのC8プロモーターは,遺伝子組み換え植物の作出に広く利用されているカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと同等に,植物の維管束に限定せずに広い組織において転写活性を持つことが明らかとなり,MDV-C8プロモーターがイネなど食用作物の遺伝子組み換えにも実用上利用可能な活性を持つことが示された.また植物を形質転換する際には目的の導入遺伝子のほかに選抜用の抗生物質抵抗性遺伝子に連結させて植物へ導入し,カルス選抜を行なうが,C8プロモーターを35Sの代わりに選抜マーカー遺伝子に連結させて目的遺伝子を導入すると,より高率に形質転換体を得られることからが明らかになり,実用上高い有用性を持つことが示された.プロモーター活性の調査に加えて,MDVの宿主範囲を再調査した結果,既知のマメ科植物以外に新たにアカザ科のホウレンソウ,ナデシコ科のコハコベやブラナ科のArabidopsis thaliana等にMDVが全身感染することを確認した.こうした知見は未だ不明な点が多いMDVの生活環の解明に非常に有益であると考えられる.レンゲ萎縮ウイルス(MDV)は複数の環状1本鎖DNAからなる分節ゲノムを持つ.本研究は,個々のMDV-DNAのプロモーターを解析することによりウイルス感染増殖サイクルにおける転写機構の解明と遺伝子組換え作物の作出に有用な新規プロモーターの構築を目的とする.11種のMDVのゲノムDNA(C1-C11)のプロモーター領域についてGUSレポーターに連結したコンストラクトを作製し,形質転換体タバコにおける活性をその転写活性を詳細に調査した結果,C4,C5,C6,C7,C8,C9の6種のプロモーターが分裂組織および維管束において強い転写組織を誘導することが判明した.MDVは自然条件下ではマメ科植物などの維管束に局在して感染するが,形質転換したイネ植物体においてMDVのC8プロモーターは,遺伝子組み換え植物の作出に広く利用されているカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと同等に,植物の維管束に限定せずに広い組織において転写活性を持つことが明らかとなり,MDV-C8プロモーターがイネなど食用作物の遺伝子組み換えにも実用上利用可能な活性を持つことが示された.また植物を形質転換する際には目的の導入遺伝子のほかに選抜用の抗生物質抵抗性遺伝子に連結させて植物へ導入し,カルス選抜を行なうが,C8プロモーターを35Sの代わりに選抜マーカー遺伝子に連結させて目的遺伝子を導入すると,より高率に形質転換体を得られることからが明らかになり,実用上高い有用性を持つことが示された.プロモーター活性の調査に加えて,MDVの宿主範囲を再調査した結果,既知のマメ科植物以外に新たにアカザ科のホウレンソウ,ナデシコ科のコハコベやブラナ科のArabidopsis thaliana等にMDVが全身感染することを確認した.こうした知見は未だ不明な点が多いMDVの生活環の解明に非常に有益であると考えられる.計画初年度の平成15年は、11種のMDV-DNAに由来するプロモーターの内、特に植物体中で強い転写活性を持つC5およびC8について各々欠失を導入したコンストラクトを作製した。現在形質転換タバコにおけるこれら欠失導入体のGUSプロモーター活性の変化を解析中であり、次年度以降にかけて各プロモーター上に存在する既知の植物転写シスエレメントのうちどれが有効に作用しているかを同定する。一方、MDVの宿主は自然条件下ではマメ科植物に限られているが、人為的に接種した場合ナス科やアカザ科植物にも全身感染することが報告されていたが、こうした初期の知見は肉眼による病徴観察に基づいている。そこで本年度、MDVの宿主範囲を再調査した。ナス科のタバコやアカザ科のホウレンソウの他、数種検定植物にMDVの媒介ベクターであるマメアブラムシを用いてウイルス接種を行い、サザンハイブリダイゼーションおよびPCRにより検定した結果、タバコ、ホウレンソウ以外に新たにアブラナ科のArabidopsis thalianaやナデシコ科のコハコベにMDVが全身感染することを確認した。こうした知見は未だ不明な点が多いMDVの生活環(夏期の自然宿主)の解明に非常に有益であるのみならず、今後のプロモーター解析やひいては転写因子の解析を進める上で、タバコの他に、詳細な遺伝情報が得られているArabidopsis thalianaの利用が可能となったという点で大きな成果が得られたと考えられる。

計画2年目となる平成16年は、前年度に引き続き11種のレンゲ萎縮ウイルス(Milk vetch dwarf virus, MDV)のゲノムDNAに由来するプロモーター領域について各々欠失を導入したコンストラクトを作製し形質転換体タバコにおける活性を調査する一方、11種のMDVプロモーターの中で特に植物体中で強い転写活性を持つC8由来のプロモーター領域について、GUSレポーターに連結したコンストラクトを作製し、タバコの他、単子葉植物のイネにアグロバクテリウム法を用いて形質転換し、その転写活性を詳細に調査した。MDVは自然条件下ではマメ科植物などの双子葉植物の維管束(師部)に局在して感染するが、形質転換したイネ植物体においてMDVのC8プロモーターは、遺伝子組み換え植物の作出に広く利用されているカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと同等に、植物の維管束に限定せずに広い組織において転写活性を持つことが明らかとなり、MDV-C8プロモーターがモデル植物のタバコだけでなくイネなど食用作物の遺伝子組み換えにも実用上利用可能な活性を持つことが示された。また植物を形質転換する際には目的の導入遺伝子のほかに選抜用の抗生物質(カナマイシンなど)抵抗性遺伝子に連結させて植物へ導入し、カルス選抜を行なうが、C8プロモーターを35Sの代わりに選抜マーカー遺伝子に連結させて目的遺伝子を導入すると、より高率に形質転換体を得られることが明らかになった。これはカルスにおいてC8プロモーターが極めて高い活性を持つためであり、MDVプロモーターの実用上高い有用性を持つことが示されたという点で大きな成果が得られたと考えられる。レンゲ萎縮ウイルス(MDV)は複数の環状1本鎖DNAからなる分節ゲノムを持ち、ウイルスが持つ種々の遺伝情報は、約1kbのDNAコンポーネント上に個別にコードされている。本研究は、個々のMDV-DNAのプロモーターを解析することによりウイルス感染増殖サイクルにおける転写機構の解明と遺伝子組み換え作物の作出に有用な新規プロモーターの構築を目的とする。最終年度となる今年度は、11個のMDV-DNAコンポーネント(C1-C11)に由来するプロモーターのうち、特に活性が強かったC5とC8のプロモーター領域について、欠失を導入したコンストラクトを構築し、レポーター遺伝子とともにタバコ植物体へ形質転換し、組み替え体におけるプロモーター活性を調査した。その結果、C5(532bp)およびC8(643bp)のプロモーターの上流の領域を除いて約300bpとした場合でも、両者のプロモーター活性が保持されることが判明した。この300bpの領域内にはDofと呼ばれるシスエレメント(AAAG)が複数存在し、またC5およびC8以外のMDVコンポーネントのプロモーター領域にも存在することから、Dofまたはこれに関連した転写因子がMDVゲノムの発現に関与することが強く示唆された。一方、作製したMDV由来プロモーターとGUSレポーター構築物を導入した大腸菌とアグロバクテリウムについて、菌体内におけるプロモーター活性を調査した結果、C1やC11由来のプロモーターがアグロバクテリウム内で強い活性を持つ反面、C5はアグロバクテリウム内でほとんど活性を持たないことが明らかになった。C5プロモーターが持つこの性質は抗菌性タンパク遺伝子を植物体へ組み込む際には有用である。以上、MDV-DNA転写機構と実用化に向けたプロモーターの基本的特性が解明されたという意味で大きな成果が上げられたと考えられる。