hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単一がん細胞のセクレトームプロファイリング

はじめに、微細構造への抗体の固定化方法の最適化を試みた。研究分担者が開発したデバイス(Maeda Y. et al. Proc Chemical Sensor Symposium. 2015)への抗体の固定化を行った。物理吸着が安定して高密度に固定化できることを明らかにした。さらにこの抗体固定化デバイスを用いて、細胞が分泌するタンパク質も蛍光検出できることを示した。pmolからfmol程度細胞から分泌しているタンパク質であれば、このデバイスで検出することができた。次に、次世代シーケンサによるRNA-seqの単一細胞解析を実施し、特定の細胞集団で特異的に分泌しているタンパク質を同定した。作製したデバイスを用いて、これら分泌たんぱく質を単一細胞レベルで蛍光検出することができた。このたんぱく質は、TGF-β刺激によって分泌量が増加することがこれまでに分かっている。この分泌量の増加が、特定の細胞集団での分泌量の変化なのか、細胞株における細胞集団の割合の変化に由来するのかを、本研究で作製したデバイス上で明らかにすることを実施中である。最後に、合成ペプチドとトリプシン消化されたペプチド断片を用いてMSイメージングの性能評価を行った。そこから、このイメージングの検出限界は1ショット当たり10,00020,000分子であることが示され、5マイクロメートルピッチの解像度のイメージング画像を取得できることもわかった。MSイメージングの精度を向上するために、キャリブレーションの手法を検討した。標準物質とOrbitrapのlock MSを利用して測定エリア内の質量誤差を1-3 ppm以内に抑制することができた。これにより、目的タンパク質由来のペプチド断片を精度よく検出できる可能性が示された。現在、MSイメージングを用いて作製したデバイス上でのペプチド検出が可能かどうか試験中である。今年度ははじめに、微細構造への抗体の固定化方法の最適化を試みた。コントロール抗体として、すでに分泌が報告されているタンパク質を捕捉できる抗体を選択した。固定化方法として、共有結合を利用した手法と物理吸着とを検討した。結果として物理吸着が安定して高密度に固定化できることを明らかにした。さらに抗体固定化デバイスを用いて、細胞が分泌するタンパク質も蛍光検出できることを示した。次に合成ペプチドとトリプシン消化されたペプチド断片を用いてMSイメージングの性能評価を行った。最後にマトリックスの噴霧条件の検討も行った。特定の溶媒濃度でマトリックスを噴霧することで、直径3マイクロメートル程度の微小結晶を高密度に基板上に配置できることを明らかにした。現在は、検出感度の向上に向けて噴霧条件のさらなる最適化も行っている。今年度は、微細構造への抗体及びレクチンの固定化と微小流体技術を用いた分泌タンパク質捕捉方法の最適化を実施する計画になっていた。しかし、研究分担者と再検討した結果、微細構造への抗体の固定化と次年度実施予定の前処理方法を含めたMSイメージングの最適化を行うこととなった。これは、平行して研究を進めることができると考えたためである。結果、研究は順調に進んでいる。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。昨年度に微細構造への抗体の固定化方法の最適化を行った。そこから、モノリスシリカ上に物理吸着による固定化が安定して高密度に抗体を固定できることを示した。今年度は、そのデバイスを用いて、分泌タンパク質の検出感度の推定を試みた。pmolからfmol程度細胞から分泌しているタンパク質であれば、このデバイスで検出できる可能性を示した。実際に、作製したデバイス上で単一細胞由来の分泌性タンパク質の蛍光検出を達成することができた。今度、さらに検出感度の向上、並びに複数タンパク質を検出するための条件検討を行っていく。次に、モデル分子を決定するために、C1システムと次世代シーケンサを用いた大腸がん細胞の単一細胞解析を行った。具体的には、C1システムを用いて単一細胞の分離と増幅工程を含めた次世代シーケンサ用のライブラリの作成を行い、その後次世代シーケンサによるRNA-seqを実施した。その結果、大腸がん細胞株で常に発現している分泌タンパク質をコードする遺伝子を複数同定した。さらに特定の細胞集団にのみ発現している遺伝子も同時に同定することができた今後は作製したデバイスを用いてこれら同定分子の蛍光検出とMSイメージングを行っていくこととする。最後に、MSイメージングの精度を向上するために、キャリブレーションの手法を検討した。標準物質とOrbitrapsystemのlock MSを利用して測定エリア内の質量誤差を1-3 ppm以内に抑制することができた。今年度は、単一細胞の複数タンパク質の検出と、単一細胞の遺伝子発現解析を実施する計画になっている。単一細胞解析は計画通り達成することができた。それにより、コントロール分子の同定につながった。一方、作製したデバイスを用いた複数タンパク質の検出にはいたっていない。しかしながら、MSイメージングの精度向上を達成したことにより、今後複数タンパク質由来のペプチド断片を高精度に検出できる可能性が広がった。

はじめに、微細構造への抗体の固定化方法の最適化を試みた。研究分担者が開発したデバイス(Maeda Y. et al. Proc Chemical Sensor Symposium. 2015)への抗体の固定化を行った。物理吸着が安定して高密度に固定化できることを明らかにした。さらにこの抗体固定化デバイスを用いて、細胞が分泌するタンパク質も蛍光検出できることを示した。pmolからfmol程度細胞から分泌しているタンパク質であれば、このデバイスで検出することができた。次に、次世代シーケンサによるRNA-seqの単一細胞解析を実施し、特定の細胞集団で特異的に分泌しているタンパク質を同定した。作製したデバイスを用いて、これら分泌たんぱく質を単一細胞レベルで蛍光検出することができた。このたんぱく質は、TGF-β刺激によって分泌量が増加することがこれまでに分かっている。この分泌量の増加が、特定の細胞集団での分泌量の変化なのか、細胞株における細胞集団の割合の変化に由来するのかを、本研究で作製したデバイス上で明らかにすることを実施中である。最後に、合成ペプチドとトリプシン消化されたペプチド断片を用いてMSイメージングの性能評価を行った。そこから、このイメージングの検出限界は1ショット当たり10,00020,000分子であることが示され、5マイクロメートルピッチの解像度のイメージング画像を取得できることもわかった。MSイメージングの精度を向上するために、キャリブレーションの手法を検討した。標準物質とOrbitrapのlock MSを利用して測定エリア内の質量誤差を1-3 ppm以内に抑制することができた。これにより、目的タンパク質由来のペプチド断片を精度よく検出できる可能性が示された。現在、MSイメージングを用いて作製したデバイス上でのペプチド検出が可能かどうか試験中である。今後は、残りの研究計画通りに固定化できる抗体の種類を増やす検討を行う。また、MSイメージング最適化も引き続き行う。今年度実施しなかった、分泌タンパク質の捕捉方法の最適化も適宜開始する。今度は、残りの研究計画通りに固定化できる抗体の種類を増やすとともに、複数タンパク質の蛍光検出並びにMSイメージングを試みる。また、単一細胞解析とこの作製したデバイスで同定された分泌タンパク質が大腸がんFFPE組織切片でどのように発現しているかを調査する。今年度は、一部実施計画の順番を変更したために次年度使用額が生じた。変更した理由は「現在までの進捗状況」で述べたとおりである。今年度は、当初計画にあった複数タンパク質の検出の実施までには至っていない。そのため、次年度使用額が発生した。次年度は、複数タンパク質の検出を行うのでこの次年度使用額を割り当てる予定である。次年度に、実施予定の研究に使用する予定である。
髄液中マイクロRNAとメタボロミクス融合による新たな脳腫瘍診断・病態解析法の構築

質量分析器にて53例の髄液メタボローム解析を行うと同時に、IDH変異などの遺伝子解析を行い、IDH変異と髄液メタボロームとの関連を検討した。髄液中の2HGの濃度は、平均0.48mMであり、組織別での平均濃度は膠芽0.41mM、退形成星細胞腫0.46 mM、瀰漫性星細胞腫0.71 mMで、組織間での2HGの統計学的な差は認めなかった。IDH変異陰性群での2HG濃度は0.44±0.06mMであり、IDH変異陽性群での2HG濃度は0.61±0.2mMであった。P=0.23であり、両群に有意な差は認めなかった。以上の結果よりIDH変異グリオーマのマーカーとして髄液2HGは有用ではないことが判明した。髄液は脳内の病態を鋭敏に反映する体液である。申請者らは、髄液中のマイクロRNAと髄液メタボローム解析を組み合わせて、脳腫瘍の新たなバイオマーカーを探索し、脳腫瘍の新たな病態解析や診断感度の向上のための研究を計画した。まず、脳腫瘍患者の髄液を採取し、一般的な髄液検査を施行した。(LDH,蛋白、糖、細胞数など)その後、髄液の一部をガスクロマトグラフィー/質量分析器を用いて、代謝物を測定した。32例のグリオーマ患者の髄液メタボローム解析では、61個の代謝物が同定できた。IDH変異グリオーマでは一部の腫瘍で髄液中2HGの上昇が認められたが、IDH変異グリオーマの有用なバイオマーカーとなるほど感度、特異度とも高くはなかった。グリオーマの悪性度と髄液中乳酸、クエン酸、イソクエン酸の濃度は非常に良く相関し、またIDH変異グリオーマでは髄液中クエン酸、イソクエン酸の濃度が上昇していた。これらより、髄液メタボローム解析で、グリオーマの悪性度、IDH変異を予測する指標となる可能性が示唆された。髄液中マイクロRNAの発現に関しては、現在解析中であるが、preliminaryな解析では、miR-10bの上昇が確認できた。髄液中のマイクロRNAの網羅的発現解析がまだ十分行われていないためである。髄液中のマイクロRNAの抽出法を確立させ、internal controlを決めて、マイクロRNA量の定量化を早期に確立させなければならない。保存している髄液の量が不十分なものもあり、髄液の採取も引き続き行わなければならない。脳脊髄液(以下髄液)は脳内の病態を鋭敏に反映する体液である。グリオーマ患者の髄液を用いたメタボローム解析で、グリオーマの悪性度が上昇すると共にクエン酸、イソクエン酸、乳酸が増加し、IDH変異の存在によりクエン酸、イソクエン酸が低下することが判明した。これは、祖組織を用いたメタボローム解析と同様の結果であった。IDH変異によりグリオーマ細胞内では2HG(2-hydroxyglutarate)が増加することが報告されている。そこで、IDH変異を有するプラスミドをグリオーマ培養細胞に導入すると、グリオーマ細胞内で2HGの増加を質量分析器によるメタボローム解析で確認できた。次に、グリオーマ患者の腫瘍をMRスペクトロスコピーを用いてメタボローム解析を行うと、IDH変異陽性グリオーマでは2HGの上昇が認められ、腫瘍組織を質量分析器を用いて解析すると、IDH変異を有するグリオーマ組織では著明に2HGが上昇していることが確認できた。そこで、グリオーマ患者の髄液を用いて、LC/MSを使用して髄液中2HGの測定を行った。53例のグリオーマ患者のうち、IDH野生型グリオーマは44例であり、IDH変異型グリオーマは11例であった。IDH野生型患者の髄液中2HG濃度は平均0.452uMで、IDH変異患者髄液中2HG濃度は平均0.61uMで、有意な差は認めなかった(p=0.27)。また、抗悪性度グリオーマ患者髄液の2HG濃度は平均0.46uMで、低悪性度グリオーマ患者の髄液2HG濃度は平均0.55uMであり、これも有意な差は認めなかった(p=0.45)。以上より、髄液中2HGの濃度は、グリオーマのIDH診断および悪性度診断には有用ではなく、他の因子を検討する必要があることが判明した。また、髄液中マイクロRNAについては、現在解析中である。髄液中のマイクロRNAの抽出、網羅的発現解析を行い、様々な脳腫瘍で上昇あるいは低下している髄液中マイクロRNAを同定する。また、代謝物との関連性についても解析する予定である。

脳腫瘍髄液中マイクロRNAの測定を行う実験がまだ確立しておらず、検査試薬などを購入できなかったためです。また、メタボローム解析ができる保存されている髄液がまだ少なかったためです。解析できる髄液が集まりましたら、解析する予定です。髄液のマイクロRNA発現解析およびメタボローム解析に必要な試薬、キット、質量分析器使用料などに使用する予定です。
海運市況安定化のための造船受注及び建造能力システムの構築

国内主要造船所(23社)について1979年から1992年までに受注した約3、000隻の工事状況を示すデータベース(海事プレス社)から発注量・竣工量・手持ち工事量及びその期間等について、パーソナルコンピュータによるリレーショナルデータベース処理を行った。その結果、市況によって船種、及び造船所共に差が生じることが分析でき建造状況が明らかになった。相次ぐ造船不況により造船所は1980年・1988年の二度にわたりドック等の設備処理を行い建造能力を縮小した。しかし、設備縮小によって合理化が進み工数当たりのCGRTは増加する。さらに、作業効率化のための設備投資額と工数削減化との関係がデータより明らかになった。一般に造船能力をドックで処理できる大きさで示す傾向にたいして、作業効率を考慮した建造能力システムを構築する作業を現在行っている。次に、船種の発注する意志決定は、需要(リプレース・新規需要・投機)時に購入する船の採算(低船価・将来、その船の運行時に高運賃・低運行費)がどうかである。しかし、船価及び、運行時の運賃やバンカー代は不確定なものであるため意志決定が困難となる。一方、造船所側にとっても受注するかどうかの決定は、手持ち工事量・その時の受注船価等の不確定性を含む。そこで、本研究の目的は、不確定性の基で損のない様に意志決定する為のモデルを構築することである。そのために、手持ち工事量データ・運輸省資料等による船価内訳の推移・海運市況による運賃及びバンカー代等のデータから種々の状態に関する観測値データの確率分布を作成しそれを基にして、ある状態に対して損失を最小にする様な意志決定モデルを現在構築中である。これらの成果を本年中頃までに論文として海事産業研究所の論文集に投稿予定である。
生体系に作用する可視・近紫外域の増感剤の反応特性に関する基礎的研究

生体系とくにヒト皮膚に光線過敏を引起こす物質の光化学プロセスについて検討した.光線過敏を引起こす物質には光毒性物質と光アレルギー性物質があり,本研究では特に前者について検討した.主たる理由は光毒性物質は光化学療法用増感剤として利用される可能性があり,光化学プロセスの解明が新しい光化学療法の開発の手がかりとなり得ると考えるからである.昨年度,本研究グループは難治性皮膚病-乾癬の治療に経験的に適用され効果を挙げてきているPUVA光化学療法の光化学プロセスの必須前提条件を解明した.すなわち, PUVA光化学療法用増感剤ソラレン化合物がヒト皮膚細胞内の核・膜・質のいずれに局在するかを判別する蛍光顕微鏡観察手法を開発し,ソラレン化合物が細胞内DNAに取り込まれることを証明した.本年度はこの手法を更に,松尾が臨床的に見出した光毒性物質4種(アフロカロンAFQ・ピロキシカムPRX・クロルプロマジンCPZ・メキタジンMQZ)とレーザ治療用増感剤ヘマトポルフィリンHEPに適用し,これら医薬品の細胞内局在部位を明らかにした.我々の開発した手法に使用される細胞は培養細胞ではなく,ヒト皮膚口腔粘膜である.この口腔粘膜の構造と試料細胞としての適性はほとんど研究されていないので,本年度はこの点も検討した.本年度の主な成果を以下にまとめる.1)口腔粘膜細胞の構造をメチレンブルー,ギムザ,エオシン,ローダミン123の各染色より検討した.細胞核DNAの存在は昨年度明らかにしてあるが,質部のミトコンドリアの存在が明らかとなった.2)口腔粘膜細胞は生理的食塩水分散状態で200分以上生細胞として使用できると判明した.3)AFQとPRXは細胞核と膜部に, CPZ・MOZ・HEPは膜部のみに取り込まれ濃縮されると判明した.以上よりこれら物質の局在部位(細胞内)が明らかとなり,光毒性が発現される細胞内部位が推測された.生体系とくにヒト皮膚に光線過敏を引起こす物質の光化学プロセスについて検討した.光線過敏を引起こす物質には光毒性物質と光アレルギー性物質があり,本研究では特に前者について検討した.主たる理由は光毒性物質は光化学療法用増感剤として利用される可能性があり,光化学プロセスの解明が新しい光化学療法の開発の手がかりとなり得ると考えるからである.昨年度,本研究グループは難治性皮膚病-乾癬の治療に経験的に適用され効果を挙げてきているPUVA光化学療法の光化学プロセスの必須前提条件を解明した.すなわち, PUVA光化学療法用増感剤ソラレン化合物がヒト皮膚細胞内の核・膜・質のいずれに局在するかを判別する蛍光顕微鏡観察手法を開発し,ソラレン化合物が細胞内DNAに取り込まれることを証明した.本年度はこの手法を更に,松尾が臨床的に見出した光毒性物質4種(アフロカロンAFQ・ピロキシカムPRX・クロルプロマジンCPZ・メキタジンMQZ)とレーザ治療用増感剤ヘマトポルフィリンHEPに適用し,これら医薬品の細胞内局在部位を明らかにした.我々の開発した手法に使用される細胞は培養細胞ではなく,ヒト皮膚口腔粘膜である.この口腔粘膜の構造と試料細胞としての適性はほとんど研究されていないので,本年度はこの点も検討した.本年度の主な成果を以下にまとめる.1)口腔粘膜細胞の構造をメチレンブルー,ギムザ,エオシン,ローダミン123の各染色より検討した.細胞核DNAの存在は昨年度明らかにしてあるが,質部のミトコンドリアの存在が明らかとなった.2)口腔粘膜細胞は生理的食塩水分散状態で200分以上生細胞として使用できると判明した.3)AFQとPRXは細胞核と膜部に, CPZ・MOZ・HEPは膜部のみに取り込まれ濃縮されると判明した.以上よりこれら物質の局在部位(細胞内)が明らかとなり,光毒性が発現される細胞内部位が推測された.
東日本方言アクセントの変化過程の実験音韻論的研究

最終年度である本年度は、以下の活動を行った。1.成果報告アクセントによるF0語音との同期について、上昇位置が下降位置より安定していること、しかし、アクセントのあるモーラの始端と終端の二種類の同期パターンがあることを報告した。秋田方言に、アクセントあとのF0下降開始が東京方言よりも遅れる傾向があり、話者によっては「アクセント句終端まで高くして、それから下降を開始する」というF0制御がうかがえることを報告した。2.追加調査実験語の音韻と実験文の韻律に、より厳密な統制を施した改訂版調査票による追加調査。秋田県男鹿市・大雄村、岩手県雫石町で実施。3.情報公開残念ながら所期の目標をすべて達成することはできなかった。今後も、1)見出された問題点の研究、2)追加調査、3)情報公開を引き続き行っていく予定である。1本年度以前の研究成果の分析・報告1)秋田方言で進行中の無核型語のピッチパタンの変化(ML→LH)の個人内・個人間変異について検討。言語変化は離散的な語ごとのピッチパタンの置き換えに始まり、それが個人内変異分布全体のずれが起こり連続的変化の様相を呈する、というモデルを提示(LP2002にて発表、Proceedingsに論文寄稿)。また変化の進行を促進する要因として、単語の頻度よりも、語の音形(子音の有声・無声など)の方が重要であることも主張。2)母音の広狭によるアクセント型の分化がある秋田方言について、「広い母音がアクセント核の移動先になる」という日本語特有の傾向と、「狭い母音のほうがピッチが高い」という母音の固有周波数(IFO)との相互作用について検討。アクセント核が語頭にある場合に限って前者の傾向が後者を上回っているという結果を報告(日本音声学会にて発表)。2新規調査・分析1)2003年2月、3月に秋田県西仙北町で新規調査を実施。内容は(1)地域言語話者どうしの自然談話(DV録画、DAT録音)の収録、(2)多拍語・二音節助詞が後続する文など、さまざまな条件でのアクセント資料の収録。さらに地域的視野を拡大するため、秋田県内他地域での調査を申請、いくつかの町から承諾を得た。15年度内に調査実施予定。2)従来調査のデータと併せ、秋田方言のFOの音韻論的指定について分析(ICPhS2003で発表予定)。3)秋田県西仙北町に単語親密度調査を依頼し、承諾を得た。15年度内に語彙調査とあわせアンケート調査を実施予定。現在調査準備中。3実績報告の準備Webページ作成を予定より早く開始。まずは研究の進行状況報告を目指す。15年度内早期の公開に向けて準備中。1.新企画調査の実施今年度のまでの成果から得られた新たな課題を検討するために新しい調査を企画・実施した1)秋田南部(雄勝町)・西部(若美町)・北部(田代町)調査自由発話データ採取。名詞アクセント、助詞の母音によるアクセント実現の影響、アクセントによるFOレンジへの影響(ダウンステップ)、フォーカス条件下におけるFO実現などの項目、などの項目を調査。2)福島県北部(国見町)調査自由発話データ採取。名詞アクセント、助詞の母音によるアクセント実現の影響などの項目を調査。2.研究成果の報告以下の3つの分析結果の報告を行った。概要と共に記す。平板型に句の途中でのFO上昇がなく、「平板」ではなく「緩い下降」であることを定量的に示す。2)アクセントによるFO頂点の時間制御(日本音声学会全国大会)FOの頂点の時間実現に「アクセントのあるモーラ内」「東京方言などにも見られる程度の遅れ」「1モーラ分程度の大きな遅れ」の3種類があることを定量的に示す。3)秋田・西仙北町方言の名詞アクセント体系(国語学会秋季大会)3・4モーラ名詞のアクセント型とFO実現の記述を基に、先行研究の記述間の相違と問題点を検討し、L^*+Hのアクセント核をもつn+1型の体系という解釈を提示する。
リアルタイム仮想分子生物学による食道癌の内視鏡分子イメージング診断法の開発

食道扁平上皮癌における新規の異常メチル化遺伝子を同定・解析することおよびゲノムワイドな低メチル化の役割を明らかにすることを目的とした。ゲノムワイドなCpGアイランドメチル化は、正常粘膜、食道癌非癌部粘膜、食道癌の順で増加した。食道扁平上皮癌において腫瘍関連遺伝子、とくにLRFN5遺伝子のCpGアイランド過剰メチル化とともにゲノムワイドな低メチル化は、飲酒、喫煙習慣に関係なく、重要な役割をもつ事が示唆された。食道扁平上皮癌および隣接非癌部粘膜、健常者正常食道粘膜におけるジェネティック、エピジェネティックな異常、microRNA(miRNA)発現異常を解析した。昨年度、MCA microarray(MCAM)法により同定に成功した新規のメチル化遺伝子候補の中から新たに複数の遺伝子に関して、パイロシーケンスやMSP法等を用いて詳細に解析したところ、食道扁平上皮癌細胞株においてメチル化と発現低下の相関を認め、また、脱メチル化剤処理による再発現を認めた。食道扁平上皮癌組織においても高頻度のメチル化を検出した。早期の粘膜内癌の段階ですでに高頻度にメチル化を認める遺伝子や進行癌になるにつれメチル化の頻度が増す遺伝子も認めた。それぞれの遺伝子メチル化と飲酒歴や喫煙歴、背景粘膜(まだら食道の有無)との関連はさまざまであった。miRNA microarray法により網羅的にmiRNA発現変化を解析した結果、癌部のmiRNA発現異常が高頻度に認められた。また、隣接非癌部粘膜において既にmiRNA発現異常が認められた事から、背景粘膜におけるmiRNA発現異常が、食道扁平上皮癌の発症に深く関与している事が示唆された。発現異常を示したmiRNAの標的遺伝子候補も同定した。以上のように、リアルタイム仮想分子生物学による食道癌の内視鏡分子イメージング診断法開発へ応用できる、有望な臨床用分子マーカーが同定できた。食道扁平上皮癌および隣接非癌部粘膜、健常者正常食道粘膜におけるジェネティック、エピジェネティックな異常を解析した。MCA microarray(MCAM)法により網羅的にCpGアイランドメチル化を解析した結果、癌部の過剰メチル化が高頻度に認められた。また、非癌部において既に中等度のメチル化が認められた事は、背景粘膜におけるエピジェネティックな変化が、食道扁平上皮癌の発症に深く関与している事を示唆すると考えられた。また、MCAM法により新規のメチル化遺伝子の同定に成功した。同遺伝子に関して、パイロシーケンスやMSP法等を用いて詳細に解析したところ、食道扁平上皮癌細胞株において同遺伝子のメチル化と発現低下の相関を認め、また、脱メチル化剤処理による再発現を認めた。食道扁平上皮癌組織においても高頻度のメチル化を検出し、重要なことに早期の粘膜内癌の段階ですでに高頻度に発現低下を認めた。さらに興味深いことに、飲酒歴のない患者においてもメチル化が高頻度であった。一方、ゲノムワイドなメチル化解析として、Pyrosequencing法を用いて、LINE-1のメチル化レベルを測定したところ、癌部のメチル化レベルが非癌部より有意に低い(hypomethylation)ことが示された。さらに、飲酒歴のある患者に比べ、飲酒歴のない患者で有意に癌部におけるLINE-1のメチル化レベルが低かった。従って、食道扁平上皮癌においてCpGアイランド過剰メチル化とともにゲノムワイドな低メチル化が重要な役割をもつ事が示唆された。MCAM法により網羅的にCpGアイランドメチル化を解析した結果、背景粘膜におけるエピジェネティックな変化が、食道扁平上皮癌の発症に深く関与している事を示唆する知見を得る事ができただけなく、新規のメチル化遺伝子の同定に成功し、臨床応用が期待できる成果を得ることができた。遺伝子変異解析、microRNA発現解析などのその他の解析も順調に進展している。食道粘膜のエピジェネティックな変化が必ずしも喫煙・飲酒によらないことが示唆され、今後さらに発癌・進展経路を解明していく上で興味深い新知見が得られた点も、本研究の目的達成に向けた大きな成果である。順調に進展した23年度に引き続き、24年度も研究計画に基づき、研究を推し進めていく。特に有望な成果の得られたDNAメチル化異常に関して、さらに宿主側の要因等も解析し、診断法開発等の臨床応用研究を強化する。また、ジェネティック異常、エピジェネティック異常、miRNA異常、SNP等の各研究項目の連携を強化し、研究を展開する。23年度は、所有している試薬消耗品を使用して研究を開始し、途中、有望な研究成果を得る事ができ、その後も研究は順調に進展した。加えて、23年度の研究成果に伴い、24年度の試薬消耗品にかかる費用が当初予算を上回ることが予想されたため、24年度に繰り越した。24年度は、臨床応用に向け、研究項目が多岐にわたるため、繰り越し分を含め、試薬消耗品購入に使用する。
“心筋イオンチャネル結合タンパク異常"による突発性心筋症の確立

心筋カリウムチャネルI_<Ks>チャネルの活性化は、カルシウム過負荷を予防することにより心筋保護に働く。これは特にストレッチ・細胞内カルシウム流入の時の過剰なストレッチ・過剰なカルシウム流入を予防するのに働き、"mechano-electrical feedback機構"と呼ばれていており、その破綻は心筋症・心不全をもたらす。このメカニズムは長年不明であったが、ストレッチ・カルシウムによる内皮型一酸化窒素合成酵素eNOSの活性化、産生された一酸化窒素によるI_<Ks>チャネルの活性化によることが明らかにした(Bai et al. Circ Res. 2005)。一酸化窒素は一般的にcGMP依存性リン酸化により作用を示すと考えられているが、I_<Ks>チャネルに対しては直接のニトロ基付加により活性化することが判明した(Bai et al. Br.J.Pharmacol. 2004)。ストレッチ・カルシウムによるeNOS活性化にはタンパク間相互作用が重要であり、ストレッチによる活性化は、integrin→integrin-linked kinase→Akt→eNOSの経路を介しており、カルシウムによる活性化は、calmodulin経路を介している。後者に関しては、静止状態ではI_<Ks>チャネルとcalmodulinがタンパク結合をしており、eNOSとcaveolinがタンパク結合をしているが、カルシウム上昇によりcalmodulin-eNOS相互作用に変化しeNOSの活性化が引き起こされる(Bai et al. Circ.Res. 2005)。eNOSとの結合を障害するcaveolin変異ではヒト拡張型心筋症がもたらされが、そのメカニズムの一部として、I_<Ks>活性化の障害とこれに基づく心筋保護機構"mechano-electrical feedback機構"の破綻の関与が示唆された。心筋細胞では、ストレッチの状態をセンスして電気現象にフィードバックする防御機構mechano-electrical feedbackが存在し、この破綻は心不全をもたらすことが知られている。ところがその分子メカニズムは未だに不明である。申請者は予備実験で心筋カリウムチャネルサブユニットminKが収縮関連タンパクT-capが相互作用することを報告した(J.Mol.Biol.2002)。本年度は、(1)minKによりコードされるI_<Ks>チャネルがT管のカベオラにおいてCav3と相互作用すること;(2)同チャネルがストレッチならびに細胞内Ca^<2+>により活性化されmechano-electrical feedbackを担うチャネルの一つであること;(3)ストレッチ・細胞内Ca^<2+>による活性化はいずれもNO合成酵素(NOS)阻害薬・NO scavengerにより抑制されNOを介すること;(4)NOの下流経路としてcGMPを介する経路とタンパクのニトロ化を介する経路が存在するが、I_<Ks>は主にタンパクニトロ化により活性化されること;(5)NOはNOS13のうちNOS3により産生されること;(6)NOS3の活性化の経路としてCa^<2+>/calmodulin依存性の経路とリン酸化酵素Akt依存性の経路の2つが知られているが、Ca^<2+>によるI_<Ks>の活性化にはCa^<2+>/calmodulin依存性NO合成が、ストレッチによる活性化にはAkt依存性NO合成が関与するとと;(7)ストレッチによるNO合成はECM→integrin→ILK1 (integrin-linked kinase 1)→Akt→NOS3のシグナル伝達経路によることが判明した。これにより従来不明であった心臓mechano-electrical feedbackメカニズムの分子機構を明らかにすることができた。
塩味受容・応答機構の探究

塩味増強化合物の開発を目指し、塩の受容機構に関わる分子の探索を実施した。別々に存在する甘・苦・旨味受容細胞が消失し、その分酸味受容細胞が3倍に増加したSkn-1a(S-KO)マウスを作出した。このマウスを用いてRNA-seq解析を行い、Type I細胞特異的に発現するイオンチャネル候補遺伝子(数十個)を見い出した。これらの遺伝子の中でS-KOマウスと味蕾の組織染色からType I細胞にも発現するイオンチャネル(X-チャネル)を特定した。X-チャネルはマウスのみならずヒトにも存在した。現在、X-チャネルをHEKに発現させ、電気生理実験を実施している。その表現型を模索中である。味蕾には甘・旨・苦・酸・塩味を受容する味細胞は別々に存在する。我々は甘・旨・苦味受容味細胞が消失し、その分酸味受容細胞が増加したSkn-1a KO(KO)マウスを作出した。本研究では、KOおよびWTマウスの味蕾特異的に発現する遺伝子の解析・比較を行い、塩味受容味細胞に発現する塩味受容候補遺伝子を発見することを目的とした。具体的には、Skn-1 KOマウスにおいてはtype II細胞が消失し、type III細胞が増加しているので、遺伝子発現プロファイルにおいてもその特徴が反映されていることを利用し、塩味受容に関わる分子の探索を実施した。塩味受容細胞(Type I)はKOとWTでは変化がないことから、以下の遺伝子発現解析によりスクリーニングした。野生型マウスの有郭乳頭上皮(WT-CvP)、野生型マウスの乳頭外の舌上皮(WT-Np)、Skn-1 KOマウスの有郭乳頭上皮(KO-CvP)の3種のサンプルについて、DNAマイクロアレイおよびRNA-seq(次世代シークエンス)解析を行い、WT-Npに対してWT-CvPとKO-CvPにおいて有意に発現量がupする遺伝子で、かつWT-CvPとKO-CvPの間に発現量の有意差がなく、fold changeが0.7より大きく1.5より小さい遺伝子を数十個抽出した。これらの遺伝子の発現をWT-CvpとKO-Cvpを用いてin situハイブリダイゼーションを行った。WTおよびKOマウスの味蕾細胞で発現量が同じ遺伝子群の中から、塩味受容細胞(Type I細胞)に発現し、膜貫通ドメイン(少なくとも1つ以上)を持つ分子数個を絞り込んだ。本研究においては、我々が作製した甘・旨・苦味受容細胞が完全消失のSkn-1a-/- (KO)マウスを用いて解析した点が研究進捗の大きなアドバンテージである。すなわち、KOマウスとWTマウスの有郭乳頭味蕾をRNA-seq(次世代シークエンス)法で比較解析し、候補遺伝子群を抽出した。またこれらの遺伝子群の中で1膜貫通ドメインを持つトポロジーがあること、2in situハイブリダイゼーションにより一部の味細胞に発現していること、KOとWTマウスでの発現状態がほぼ同じであることなどから、塩味受容に関する候補分子を絞り込むことに成功した。この分子はげっ歯類のみならずヒトおよびサルなどにも発現していることがデータベース情報から明らかである。しかし、本分子が塩味受容機能分子かどうかについては報告がない。これまで、甘・旨・苦・酸味受容分子はいずれもそのmRNAの発現がin situハイブリダイゼーションにより観察されている。得られた候補分子においても、そのmRNAが発現しており、しかもチャネル分子の構造を持つことから、味蕾のType I細胞に発現する塩味受容チャネルの候補分子の可能性が高いと考える。食塩は食品の調味にかけがえのない重要因子の1つである。甘・酸・苦・旨味と相乗効果・相殺効果を示す。たとえば、甘・旨味の増強効果や酸味による塩味減縮が知られている。食品の嗜好性を高める上で、塩味を制御することは必要不可欠である一方、過剰摂取は高血圧、腎臓病などの生活習慣病の発症を招く。本研究では、塩味増強化合物の開発を目指し、塩の受容機構に関わる分子の探索を実施した。味蕾には甘・酸・塩・苦・旨味を受容する味細胞は別々に存在する。甘・旨・苦味受容味細胞が消失し、その分酸味受容細胞が3倍に増加したSkn-1a KO (S-KO)マウスを作出した。本研究ではこれらの遺伝子の中でS-KOマウスと味蕾の組織染色(in situハイブリダイゼーション)から、Type I細胞に高発現するイオンチャネル(X-チャネル)を特定した。また、X-チャネルホモログがナトリウムチャネルである可能性が示唆された。そこで、生理機能を解析するためHEK293T細胞にX-チャネル遺伝子を導入し、電気生理実験を行った。その結果、ナトリウムイオンには応答しなかったことから、他のイオンの流入に関与する可能性を解析している。また、X-チャネルの表現系解析のため、KOマウスの作成に着手した。CISPER/Cas9とTALEN法を用いて標的配列の決定などをデザインし作出中である。別々に存在する甘・苦・旨味受容細胞が消失し、その分酸味受容細胞が3倍に増加したSkn-1a(S-KO)

マウスを作出した。このマウスを用いてRNA-seq解析を行い、Type I細胞特異的に発現するイオンチャネル候補遺伝子(数十個)を見い出した。これらの遺伝子の中でS-KOマウスと味蕾の組織染色からType I細胞にも発現するイオンチャネル(X-チャネル)を特定した。X-チャネルはマウスのみならずヒトにも存在した。現在、X-チャネルをHEKに発現させ、電気生理実験を実施している。その表現型を模索中である。今後は以下の研究を行う計画である。1.塩味受容体候補分子の電気生理学的手法による機能解析1)卵母細胞を用いた機能解析:卵母細胞に候補遺伝子を導入し、NaCl濃度依存的なIVカーブを測定する。また、Na以外の陽イオンに対する応答と比較する。具体的には、卵母細胞内には、リボソームやtRNAが豊富に含まれるため、効率よく候補遺伝子がコードする膜タンパク質を発現させることが可能である。候補遺伝子が発現した卵母細胞に二電極を挿入し、細胞内外へのNa+ ,Cl-の流入を電流値として正確に測定する。またNa+ ,Cl-以外の陽イオン(K+,Mg2+,Li+,Ba2+,Ca2+)や陰イオン(F-,Br-,I-,AcO-)に対する応答と比較しスクリーニングを行う。2)培養細胞(HEK293)を用いた機能解析:HEK293細胞に候補遺伝子を導入し、培養液のNaCl濃度依存的なIVカーブを電気生理学的手法により計測する。選抜後の候補遺伝子を培養細胞の膜上に発現させ、膜タンパク質の機能を単一分子レベルでリアルタイムにかつ定量的に測定し、詳細な機能の解析を行う。スクリーニングに成功した遺伝子を用いて、このチャネルの開口確率をチャネル活性化の指標とし、アゴニスト獲得を目的としたリガンド探索を行う。2.塩味受容候補分子のKnockoutマウスの作製TALEN法あるいはCRISPR/CAS9によりKOマウスを作製する。味覚受容システム上述の通り、平成27年度において塩味受容チャネル候補分子を見い出すことに成功した。そのため、本年度は、この分子が実際に塩味受容機能を有するかの解析が必要であり、電気生理実験および塩味嗜好性試験(神経応答・二瓶選択)などを予定している。細胞および培養細胞を用いた電気生理実験とKOマウス作製、それを用いた嗜好性試験の使用額を計上する。
磁気マイクロアレイを用いた1細胞トラップ技術の開発

近年、1細胞レベルで分析するための要素技術の開発が行われている。レーザーや電気化学的な力を利用した技術が報告されているが、大型の装置を必要とするため、他の手法の開発も待望されている。本研究では、磁気誘導による1細胞トラップ技術を開発することを目的としている。磁性体をアレイ化した磁気マイクロアレイを作製し、抗体をアセンブルした磁気ナノ粒子を用いることで、磁気誘導によりターゲット細胞をトラップする。本細胞トラップ技術により作製された細胞アレイは、細胞間シグナル伝達物質解析における有用なツールとなることが予測され、創薬領域に大きく貢献すると期待される。シリコン基板上のマイクロサイズのホールアレイに無電解めっき法により、CoNiFe面内軟磁性体を導入し、磁気マイクロアレイを作製した。また、細胞の磁性化として、磁性細菌により合成されたProtein A発現磁気ナノ粒子を用いた。Raji細胞(B cell line)にマウス由来抗CD19抗体を導入した後、抗マウスIgG抗体固定化磁気ナノ粒子を導入し、細胞への磁性化を行った。この磁性化細胞を3種類の磁気マイクロアレイ上に導入し、洗浄後、基板表面の顕微鏡観察を行った。その結果、磁性ドットが基板面より突き出て埋め込まれた基板Aではその突き出た磁性ドットの側面に細胞がトラップされ、また基板面と同じ高さで埋め込まれた基板Bでは磁性ドットの上に細胞が観察された。一方、埋め込まれた高さが基板面に満たない基板Cでは細胞のトラップは観察されず、チェーン状の未反応磁気ナノ粒子の凝集体(1マイクロ程度)がドット内に突き刺さっているような形で観察された。以上の結果より、基板面と同じ高さで埋め込まれたCoNiFe面内軟磁性体の磁気マイクロアレイを用いることにより、1つの細胞のトラップが可能であることが実証された。
心臓死肝移植をめざしたDBcAMPによるドナー肝procurementの試み

近年の欧米における臓器移植の成績向上は、その症例数の増加に伴い深刻なドナー臓器不足をもたらしている。また、我が国を含む一部の国では脳死臓器移植がいまだに認められていない。このような状況を背景に、心臓死臓器移植の可能性が再検討されている。しかしながら、肝臓は特に温阻血障害に弱く、心臓死者からの摘出臓器では温阻血時間が長くことから、機能・形態の両面にわたる障害が発生しやすいとされる。Dibutyryl cyclicAMP(DBcAMP)は高い膜透過性を有し、細胞内cyclicAMP濃度の維持は臓器のviabilityを改善するとされている。本研究では、ラット温阻血肝障害に対するDBcAMP前投与の効果を検討した。温阻血肝障害は、体重250280gの雄性Wistarラットを用いて心停止後室温(22-25°C)に放置することによって誘導した。温阻血後の肝組織内cyclicAMP濃度、%ATPおよびトリパンブルー核陽性率を測定した。さらに、60分間Krebs-Henseleit溶液にて灌流中に灌流液中へのLDHおよびendothelin-1放出量を測定した。DBcAMP前投与の至適投与量および時期は、それぞれ15mg/kgB. W.および温阻血60分前であることが判明した。トリパンブルー核陽性率、灌流液中へのLDHおよびET-1放出量の測定結果は、温阻血がまづ内皮細胞、次に肝実質細胞に損害を与えることを明らかにした。DBcAMP前投与は、内皮細胞および肝実質細胞の細胞内cyclicAMP濃度を増加させ、さらに細胞膜を安定化させることことにより温阻血障害から肝臓を保護するものと考えられた。以上より、DBcAMPを用いた肝臓のprocurementは、心停止によって引きおこされる温阻血障害の予防に有用であり、脳死トナーからの摘出肝のviability改善、さらには心臓死肝移植の可能性を示唆すると考えられた。欧米における移植医療の定着は、移植臓器の深刻な不足を招ている。また、わが国においては、いまだに脳死臓器移植の再開のメドが全く立っていない。これらの深刻な状況を背景として、心停止後の摘出臓器の移植が検討され、腎臓などでは成功例も報告されている。しかし、肝臓は虚血に弱く、心停止前後に何らかのprocurementが必要である。本研究では、心停止前に細胞膜透過性のあるDBcAMPを投与し、移植前後の肝実質細胞および非実質細胞を機能と形態の両面から評価し、心停止ドナーからの摘出肝に対するDBcAMPを用いたoragan procurementの可能性を検討することである。1.^<31>P-MRSによるATPおよび肝組織内cAMP濃度の解析によって90分間温阻血肝に対するDBcAMPの投与量ならびに投与時期を検討した結果、心停止60分前に15mg/kg投与が至適であると判明した。2.トリパンブルー潅流による内皮細胞・肝細胞のバイアビリティーの検索では30分間の温阻血では内皮細胞のみに障害がみられ、90、150分間では内皮および肝細胞双方に障害が認められた。DBcAMPを用いたprocurementにより上記の障害は著明に抑制された。3.潅流液中の肝逸脱酵素量ならびに内皮細胞障害の指標であるendothelin-1量の測定の結果、内皮細胞・肝細胞いずれの障害も著明に抑制され、電子顕微鏡を用いた微細構造の検索においても、内皮細胞・肝細胞の形態は良く保たれていた。

以上より、DBcAMPを用いたprocurementは、機能・形態の両面において心停止によって引き起こされる温阻血肝障害の予防に有用であることが示唆された。これらの結果は、心停止ドナーからの肝移植の可能性をも示唆すると考えられた。欧米における肝移植成績の向上はめざましく、その一年生存率も90%にまで達している。このような成績向上は、適応疾患の拡大とそれに伴う深刻なドナー肝不足をもたらしている。一方、我が国では脳死者からのドナー臓器摘出はいまだに認められず、生体部分肝移植に頼らざるを得ないのが現状である。本研究の目的は、細胞膜透過性の高いDBcAMPを用いた肝臓のprocurementによる脳死ドナー臓器のviability向上、さらには心臓死肝移植の可能性を検討することである。1.30-150分間の持続時間の相違による温阻血肝障害を詳細に検討した結果、温阻血はまず内皮細胞障害をもたらし、障害された内皮細胞から分泌されるET-1などが微小循環障害を引き起こすことにより最終的に肝実質細胞障害に至ることが明らかとなった。2.30分の短時間温阻血で肝実質細胞の障害はみられないが、内皮細胞障害はすでに認められ、DBcAMPの前投与はこの内皮細胞障害の予防に有効であり、内皮細胞からのET-1の分泌を著明に抑制した。3.長時間の温阻血にさらされたDBcAMP投与群の肝臓では、内皮細胞障害の指標には差を認めないが肝実質細胞障害が有意に抑制されており、DBcAMPの肝実質細胞に対する直接効果が示唆された。以上より、DBcAMPは細胞膜を透過して内皮細胞および肝実質細胞内のcAMP濃度を上昇させて細胞内エネルギー状態を改善し、温阻血肝障害の予防に有用であることが判明した。
難防除植物RNAウイルスの伝搬機構の解明と感染系の確立

リンドウこぶ症の病原体と考えられているGKaVの感染経路特定と人工接種系の確立に向けて、これまで得られた土壌伝搬性の再現性試験を行った。野外のこぶ症発症圃場から採集された土壌に複数品種のリンドウ苗を植え、温室管理下で今冬に越冬させた。本年度はそれらリンドウ株の越冬後のこぶ症発症について調査予定である。また、以前にGKaVが土壌細菌から検出された結果を受け、こぶ症発症圃場の土壌および越冬芽から細菌相の調査を行なった。メタゲノム解析の結果、こぶ症株で存在比が上がっている候補菌株が少なくとも20種以上同定された。また、越冬芽もしくは土壌から単離された1000菌株以上のバクテリアについてGKaV検出を行い、Pseudomonas属菌やBurkholderia属菌等がこぶ症株で存在比が上がっていること、そのうちいくつかの菌株でGKaVが検出されることがわかった。これらの菌株を継代・培養後、培養リンドウ組織に接触させたがこぶ症発症とGKaV感染を再現するには至っていない。こぶ症発症圃場の土壌を用いたこぶ症発症試験では越冬後の株で初めて症状が認められたため、H30年度は同定した菌株についてもリンドウ苗に浸潤させ、土壌試験と同様に温室管理下で今冬に越冬させた。越冬後のこぶ症発症について調査予定である。並行して、弱毒形質を持つGKaVもしくはこぶ症耐性を持つリンドウ組織の単離を目指し、野外圃場からのGKaVが感染しているが症状が認められないリンドウ株(2品種)を10株同定し、収集を行なった。さらにこぶ症リンドウの培養組織からGKaVが感染しているが生育阻害が緩和しているリンドウ組織の選抜を実験室レベルで行い、現在候補株を1系統単離した。研究計画通り、GKaVの土壌伝搬性の再現性試験及びこぶ症発症株の越冬芽ならびにその周辺土壌の生物相の解析を行った。メタゲノム解析の結果、複数の細菌種でこぶ症発症株での存在比が増大していることが示唆されたほか、単離した1000菌株以上の細菌の解析から、Pseudomonas属菌、Burkholderia属菌を中心にこぶ症株での存在比の増大が確認され、そのうちいくつかの菌株ではGKaVが検出された。当該細菌を培養リンドウに接触させる感染実験を試みたが、こぶ症の発症とGKaV感染を確認するには至っていない。感染実験の条件検討が必要となっている。また、GKaV弱毒候補株もしくはこぶ症耐性リンドウの探索と作出を試み、野外圃場のこぶ症発症圃場からGKaVが感染しているが症状が緩和しているリンドウ株を10株以上同定し収集した。加えて実験室内でこぶ症の培養リンドウ株を継代維持している過程で生じる生育阻害緩和株に着目し、選抜した。単離した15系統のうち14系統はエスケープによりGKaV感染が認められなかったが、1系統はGKaVが感染しているにもかかわらず地上部の生育が良い系統(AS24)であった。AS24は症状は緩和しているが、健全株と比べると生育阻害やこぶ症状がいまだ認められるため、継続的な選抜を行なっている。こぶ症発症圃場の土壌を用いた土壌伝搬試験については、これまでの発症が越冬後の苗であったことを考慮し、越冬後に感染調査を行う。合わせて、各種土壌細菌、罹病株破砕液を用いた感染実験についても、越冬芽の使用、低温処理の影響などを視野に入れて条件検討を行う。こぶ症罹病株および発症圃場の土壌における生物相の解析については、一定の結果が得られたため、本年度はサンプル数を増やし、各サンプル間での特異性、共通性に関するデータの取得を目指す。野外から収集したこぶ症緩和リンドウ候補株については、その症状とGKaV感染の経年的な変化を調査するとともに、培養リンドウを用いたこぶ症緩和リンドウ株の実験室内での選抜を引き続き行う。すでに選抜されたこぶ症緩和リンドウ株(AS24)は、より症状が緩和した株の作出するための母本として用いる。本実験は培養時に自然に生じる培養変異に依存し、時間がかかるため、変異導入薬剤の利用を視野に入れ、研究の促進を図る。

こぶ症発症圃場の土壌を用いたこぶ症発症試験では越冬後の株で初めて症状が認められたため、H30年度は同定した菌株についてもリンドウ苗に浸潤させ、土壌試験と同様に温室管理下で今冬に越冬させた。越冬後のこぶ症発症について調査予定である。並行して、弱毒形質を持つGKaVもしくはこぶ症耐性を持つリンドウ組織の単離を目指し、野外圃場からのGKaVが感染しているが症状が認められないリンドウ株(2品種)を10株同定し、収集を行なった。さらにこぶ症リンドウの培養組織からGKaVが感染しているが生育阻害が緩和しているリンドウ組織の選抜を実験室レベルで行い、現在候補株を1系統単離した。研究計画通り、GKaVの土壌伝搬性の再現性試験及びこぶ症発症株の越冬芽ならびにその周辺土壌の生物相の解析を行った。メタゲノム解析の結果、複数の細菌種でこぶ症発症株での存在比が増大していることが示唆されたほか、単離した1000菌株以上の細菌の解析から、Pseudomonas属菌、Burkholderia属菌を中心にこぶ症株での存在比の増大が確認され、そのうちいくつかの菌株ではGKaVが検出された。当該細菌を培養リンドウに接触させる感染実験を試みたが、こぶ症の発症とGKaV感染を確認するには至っていない。感染実験の条件検討が必要となっている。また、GKaV弱毒候補株もしくはこぶ症耐性リンドウの探索と作出を試み、野外圃場のこぶ症発症圃場からGKaVが感染しているが症状が緩和しているリンドウ株を10株以上同定し収集した。加えて実験室内でこぶ症の培養リンドウ株を継代維持している過程で生じる生育阻害緩和株に着目し、選抜した。単離した15系統のうち14系統はエスケープによりGKaV感染が認められなかったが、1系統はGKaVが感染しているにもかかわらず地上部の生育が良い系統(AS24)であった。AS24は症状は緩和しているが、健全株と比べると生育阻害やこぶ症状がいまだ認められるため、継続的な選抜を行なっている。こぶ症発症圃場の土壌を用いた土壌伝搬試験については、これまでの発症が越冬後の苗であったことを考慮し、越冬後に感染調査を行う。合わせて、各種土壌細菌、罹病株破砕液を用いた感染実験についても、越冬芽の使用、低温処理の影響などを視野に入れて条件検討を行う。こぶ症罹病株および発症圃場の土壌における生物相の解析については、一定の結果が得られたため、本年度はサンプル数を増やし、各サンプル間での特異性、共通性に関するデータの取得を目指す。野外から収集したこぶ症緩和リンドウ候補株については、その症状とGKaV感染の経年的な変化を調査するとともに、培養リンドウを用いたこぶ症緩和リンドウ株の実験室内での選抜を引き続き行う。すでに選抜されたこぶ症緩和リンドウ株(AS24)は、より症状が緩和した株の作出するための母本として用いる。本実験は培養時に自然に生じる培養変異に依存し、時間がかかるため、変異導入薬剤の利用を視野に入れ、研究の促進を図る。一部ウイルス検定を安価な酵素で代用した。次年度以降における圃場サンプルの収集と解析のための人件費および消耗品費に当てる予定。