hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コンパクトシティ計画策定支援システム開発とその活用によるデザインガイドライン作成

平成30年度は主に1都市構造評価指標による都市の類型化、2都市構造評価モデルの作成を実施した。1都市構造評価指標による都市の類型化都市構造評価に関するハンドブックを参考に対象都市69市の都市構造評価指標(生活利便性、安心・安全、地域経済、行政運営コスト、エネルギー・低炭素(1人あたりのCO2排出量)、健康・福祉の6つ)を算出し、主成分分析によりそれらを低次元化した後、主成分得点を説明変数としたクラスター分析を行うことで都市を分類した結果、7つのクラスターに分類された。各都市の評価指標を人口規模別にみると、全体的に人口規模が大きくなるにつれて評価が高い傾向がみられ、人口規模により指標値に差がみられることから、ハンドブック内で提案されている同程度人口規模の都市間指標値比較による課題抽出には一定程度の妥当性があることが示唆された。しかし、一方でクラスター別の人口平均値を見ると同規模の人口を有する都市であっても別のクラスターとして分類されている都市も存在した。これは人口規模だけでなく、その他の基準による分類も重要であることを示していると考えられ、都市構造評価指標は人口分布に影響される項目が多いことから、実際の人口分布状況等を考慮する必要があることが示唆された。2都市構造評価モデルの作成広島県広島市を対象に都市構造評価に関するハンドブックの6つの評価指標と人口指標などの関連分析を行い、その結果をもとに都市内人口分布から対象都市全体に対する評価と同時にエリア別の評価が可能なモデルを作成した。また、その評価モデルと将来人口分布図を組み合わせることにより、将来の課題エリアを抽出し、その結果をもとに代替シナリオ(評価の低いと考えられるエリアを拠点エリアから除くシナリオ)を作成した。その後、再度作成した評価モデルでシナリオを評価することでコンパクト化の効果を定量化も行った。研究計画書に示した平成30年度の目的である「都市特性指標による都市の類型化」および「都市構造評価モデルの作成」を予定通り実施することができたため、「おおむね順調に進展している」と判断した。前年度(平成30年度)では、都市構造評価指標による都市の類型化および都市構造評価モデルの作成を行ったが、都市構造評価モデル内の生活利便性評価指標には民間生活利便施設の評価が不十分であると考えられることから、今年度(平成31年度)では、生活利便性評価モデルの作成を行う。加えて、コンパクトシティの具体像(人口配置シナリオ)を多面的にその効果を評価、予測できる計画策定支援システムを開発する。具体的には、都市構造の評価に関するハンドブック(国土交通省)を参考に作成した6つの評価モデル(生活利便性、安全・安心、地域経済、行政運営コスト、エネルギー/低炭素)と将来人口分布図を用いて、シナリオの効果を多面的に評価可能な計画策定支援システムを作成する予定である。
仮想現実技術と触覚技術を駆使した直感的な生体分子可視化・操作システムの実装

タンパク質をはじめとする生体分子の立体構造研究においては、人間による目視での観察が欠かせない。近年の構造決定技術やタンパク質工学の進歩に伴い、たとえば巨大な複合体の一部を取り外すなど「分子模型のように手を使って自由に分子を観察したい」というニーズが高まっている。そこで、本研究ではこれまでの成果と反響を踏まえ、更なる発展として触感技術(haptic technology)を用いた触感フィードバックを取り入れつつ、VRの特性を生かした機能も盛り込み「生体分子を人間の手で自由に触り自然に操作するための統合研究プラットフォーム」を開発することを目的としている。本年度はこれまでの成果を国際学会にて発表した他、関連技術の調査及び触覚技術の利用に着手した。具体的には、ISMB2018にてポスター発表と情報収集を行った他、日本バーチャルリアリティ学会年会およびIEEE VR2019に参加して情報収集を行った。特に、ISMBではイギリスの研究者が本研究と同様のコンセプトでVRを用いた分子表示についての発表を行っており、今後注視していく必要がある。また触覚技術については、アラクノフォース社のSPIDAR-GIIを購入し、力覚を伴った分子ドッキングの実装に取り掛かりつつある。分子ドッキングの実装はもともとの計画には含まれていないが、構造変化を伴わない分より簡便に実装が可能であるため、本来の計画にある動的な構造変化とその力覚提示の準備段階として適切であると考えている。本来、初年度は触覚技術には着手せず、あくまで仮想現実技術を用いた分子表示の周辺要素の拡充(基本的可視化機能の充実など)に取り掛かる予定であった。しかし、今年に入って本来想定していたよりも相当に安価なハプティクスデバイスとして、東京工業大学名誉教授の佐藤誠氏が開発したSPIDARが一般に入手可能となったことを受け、急遽触覚研究とその準備を優先させた。そのため、全体として研究内容の順番が前後し、若干の遅れが生じている。引き続き力覚提示デバイスを用いた分子ドッキングの実装を進め、最終的な目標である力覚を伴った簡易分子シミュレーションの開発へと繋げる。また、初年度に取り掛かることのできなかった、VRを用いた要素技術についても開発を進める。
非線形ハイブリッドシステムのための区間制約プログラミングにもとづくモデル検査技術

並列ロボットを非線形数値制約として簡潔にモデリングし,区間制約プログラミング技術(branch and pruneアルゴリズム)を用いて安全な可動範囲の内部近似・外部近似を自動的に計算,可視化する手法および実装を開発した.本年度はとくに求解ヒューリスティックの分析・改善,応用的なロボットの解析手法(アーム間の衝突検出,障害物との衝突検出等)の開発に取り組んだ.提案手法により複数の未解決問題を解くことができた.提案手法では,任意の等式・不等式制約を連立した形式で諸々の問題を記述でき,また実装した区間制約ソルバーを用いて高速・自動的に結果を得ることができるため,既存手法に較べ簡便かつ高信頼である.本研究はナント大学のA. Goldsztejn研究員およびC. Jermann准教授と共同で進めた.研究成果を国際会議CPで発表し好評を得た.上記研究と並行し,プログラム検証技術に基づくハイブリッドシステムの検証手法を開発した.提案手法はハイブリッドオートマトンの実行を有限ステップ展開,抽象解釈し,周期的な構造になっていることと安全性条件を確認し,帰納的に検証を行う.本年度は提案手法の理論面を整備するとともに,Mathematicaを用いてツール実装および実験を行った.非線形ハイブリッドオートマトンの無限ステップの実行に関する安全性検証を半自動的に行うことを可能にし,既存ツールでは扱えなかった複数の検証事例を示した.またプログラム検証技術の多くはユーザがツールを対話的に利用する必要があり自動的ではなかったが,提案手法によりその負荷を軽減した.本研究は国立情報学研究所の中島震教授およびINRIASaclayのG. Melquiond研究員と共同で進めた.研究成果を国際会議iFMに投稿し受理された.ハイブリッドシステムを区間計算および記号計算に基づき扱う統合的かつ実用的な枠組みの実現を進めている.当初の予定通り,存在量化子付き数値制約のための区間計算による求解手法およびロボティクスへの応用と,ハイブリッドシステムの実行の周期性を判定し,無限実行ステップの安全性検証を行う代数的手法を開発した.ロボティクス応用では,ロボティクス研究者からの要望を受け,アーム間の衝突検出等の追加実験を行った.その他に予定していた区間計算による周期性判定の方法と,線形制約求解の高速化については今後の課題とする.4月から12月にかけて仏パリの研究所INRIA Saclayを訪問し、当地およびナント大学の研究者と共同で研究活動を行った。帰国後は提案手法に関する実験作業および論文執筆に取り組んだ。従来行ってきたハイブリッドシステムと区間制約プログラミングの研究を進めるとともに、新たに演繹的プログラム検証技術を取り組み、統合的かつ実用的な枠組みの実現に向かっていると考えている。INRIA Saclayにて所属したProvalチームでは、演繹的なプログラム検証フレームワークWhy3を拡張した、ハイブリッドシステムの安全性を検証するための枠組みを開発した。線形ハイブリッドオートマトンの無限ステップの実行に関する検証が可能な実装を行い、複数の例題を検証可能であることを示した。現在、提案手法に関する論文を準備中である。提案手法により、線形系の範囲では、これまで主流であった到達範囲の近似計算に基づく手法より広い範囲の問題を扱うことができた。今後、提案手法をより広範な系に適用し、実用的なツールを実現したいと考えている。上記研究と並行し、区間制約プログラミングに関してナント大学と共同研究を行った。算術制約充足問題において、under-constrainedな場合(変数に対して制約が不足し、解が1点に定まらず集合となる場合)の解領域の射影を区間集合により精度よく近似する手法を提案した。提案手法では、従来手法に4点の改良を施し高速かつ汎用なソルバーを実現した。とくに、区間幅を増減させて区間内の解の存在保証を自動的に行う方法や、区間同士の重なりを考慮して探索空間を削減する方法等を提案した。提案手法を論文にまとめ、ジャーナルConstraintsに投稿した(条件付き採録の結果を得ている)。また、上記の枠組みを並列マニピュレータの可動範囲解析に応用した実験を行った。上記の研究に関して電子情報通信学会の研究会にて招待講演を行い好評を得た。並列ロボットを非線形数値制約として簡潔にモデリングし,区間制約プログラミング技術(branch and pruneアルゴリズム)を用いて安全な可動範囲の内部近似・外部近似を自動的に計算,可視化する手法および実装を開発した.本年度はとくに求解ヒューリスティックの分析・改善,応用的なロボットの解析手法(アーム間の衝突検出,障害物との衝突検出等)の開発に取り組んだ.提案手法により複数の未解決問題を解くことができた.提案手法では,任意の等式・不等式制約を連立した形式で諸々の問題を記述でき,また実装した区間制約ソルバーを用いて高速・自動的に結果を得ることができるため,既存手法に較べ簡便かつ高信頼である.本研究はナント大学のA. Goldsztejn研究員およびC. Jermann准教授と共同で進めた.研究成果を国際会議CPで発表し好評を得た.上記研究と並行し,プログラム検証技術に基づくハイブリッドシステムの検証手法を開発した.提案手法はハイブリッドオートマトンの実行を有限ステップ展開,抽象解釈し,周期的な構造になっていることと安全性条件を確認し,帰納的に検証を行う.本年度は提案手法の理論面を整備するとともに,Mathematicaを用いてツール実装および実験を行った.非線形

ハイブリッドオートマトンの無限ステップの実行に関する安全性検証を半自動的に行うことを可能にし,既存ツールでは扱えなかった複数の検証事例を示した.またプログラム検証技術の多くはユーザがツールを対話的に利用する必要があり自動的ではなかったが,提案手法によりその負荷を軽減した.本研究は国立情報学研究所の中島震教授およびINRIASaclayのG. Melquiond研究員と共同で進めた.研究成果を国際会議iFMに投稿し受理された.ハイブリッドシステムを区間計算および記号計算に基づき扱う統合的かつ実用的な枠組みの実現を進めている.当初の計画通り、ハイブリッドシステムの無限実行ステップの検証手法と、存在量化子付き算術制約のための区間計算による求解手法を開発した。成果のアウトプットは24年度に予定している(論文1件、学会発表2件を投稿中)。当初の予定通り,存在量化子付き数値制約のための区間計算による求解手法およびロボティクスへの応用と,ハイブリッドシステムの実行の周期性を判定し,無限実行ステップの安全性検証を行う代数的手法を開発した.ロボティクス応用では,ロボティクス研究者からの要望を受け,アーム間の衝突検出等の追加実験を行った.その他に予定していた区間計算による周期性判定の方法と,線形制約求解の高速化については今後の課題とする.計画通り、区間計算による求解手法をハイブリッドシステムの検証器に組み込み、非線形ハイブリッドシステムの多様な検証の実現を目指す。
FoxO1によるラ氏島内微小血管、及び代償性β細胞過形成の調節メカニズム

ラ氏島内血管が著明に増加する膵特異的FoxO1トランスジェニックマウスから単離したラ氏島においてVEGFの発現量が有意に増加していることを確認した。しかしながら、HIF1aの発現量は変化していなかった。さらにFoxO1とVEGFの関係をin vitroで検討する目的で、培養β細胞を用いたルシフェラーゼアッセイを行った。VEGFにはFoxO1の結合部位を含む領域が存在し、それを含むルシフェラーゼベクターを作製し、解析した所、FoxO1の用量依存性にVEGFプロモーター活性が上昇した。さらにクロマチン免疫沈降法により実際にFoxO1がVEGFプロモーターに結合していることを確認した。また、培養β細胞にアデノウイルスを用いて活性型FoxO1を過剰発現させた所、VEGFのmRNAレベルが有意に増加した。膵特異的FoxO1トランスジェニックマウスはβ細胞が著明に減少しているが、インスリン分泌は比較的保たれており、血糖値の上昇、糖負荷試験での耐糖能の悪化の程度は軽度である。その理由として、このマウスのラ氏島では微小血管が増加しているためではないかと考えられた。一方、膵臓特異的FoxO1ノックアウトマウスのラ氏島内血管は変化しておらず、ラ氏島におけるVEGFの発現レベルもコントロールマウスと同程度であった。膵臓特異的FoxO1ノックアウトマウスは膵管細胞からのβ細胞の新生が増加しており、高脂肪食負荷時の耐糖能はコントロールマウスに比べて良好である。しかし、ラ氏島内の微小血管の変化はないことから、ラ氏島細胞のFoxO1はいくつかの異なる機序でβ細胞の量と機能の調節に関与していると考えられた。まず高脂肪食飼育マウスとdb/dbマウスにおけるラ氏島内血管の量を検討した君、高脂肪食飼育ではラ氏島内血管が増えていたが、db/dbマウスでは減少していた。この違いが前者では血糖値はほぼ正常に保たれているのに対し、後者では著明な高血糖を示す理由ではないかと思われた。次に、ラ氏島内血管が著明に増加する膵特異的FoxO1トランスジェニックマウスから単離したラ氏島においてVEGFの発現量が有意に増加していることを確認した。しかしながら、HIF1αの発現量は変化していなかった。研究代表者が所属する研究室では膵特異的FoxO1トランスジェニックマウスの糖代謝機能を解析しているが、このマウスはβ細胞が著明に減少している割にはインスリン分泌は比較的保たれており、血糖値の上昇、糖負荷試験での耐糖能の悪化の程度は軽度である。その理由として、このマウスのラ氏島では微小血管が増加する結果、インスリン分泌が促進されている可能性が考えられた。今後は膵特異的FoxO1ノックアウトマウスについても、ラ氏島内血管とVEGFについて解析を進める予定である。

VEGFにはFoxO1の結合部位を含む領域が存在し、それを含むルシフェラーゼベクターを作製し、解析した所、FoxO1の用量依存性にVEGFプロモーター活性が上昇した。さらにクロマチン免疫沈降法により実際にFoxO1がVEGFプロモーターに結合していることを確認した。また、培養β細胞にアデノウイルスを用いて活性型FoxO1を過剰発現させた所、VEGFのmRNAレベルが有意に増加した。膵特異的FoxO1トランスジェニックマウスはβ細胞が著明に減少しているが、インスリン分泌は比較的保たれており、血糖値の上昇、糖負荷試験での耐糖能の悪化の程度は軽度である。その理由として、このマウスのラ氏島では微小血管が増加しているためではないかと考えられた。一方、膵臓特異的FoxO1ノックアウトマウスのラ氏島内血管は変化しておらず、ラ氏島におけるVEGFの発現レベルもコントロールマウスと同程度であった。膵臓特異的FoxO1ノックアウトマウスは膵管細胞からのβ細胞の新生が増加しており、高脂肪食負荷時の耐糖能はコントロールマウスに比べて良好である。しかし、ラ氏島内の微小血管の変化はないことから、ラ氏島細胞のFoxO1はいくつかの異なる機序でβ細胞の量と機能に関与していると考えられた。
学習理論を利用したテキスト情報からの知識護得に関する研究

概念形成、知識獲得などの知的創造機能を実現するためには、高度な学習メカニズムの開発が必要である。たとえば、新たな概念の護得には、以下のような段階的な学習メカニズムが必要である。まず、与えられた観測事例から、帰納的学習によって「種」となる初期の領域理論を形成する。これを理論形成と呼ぶ。つぎに、新たな事例が与えられるたびに、初期の領域理論を修正・管理しながら、領域理論を洗練化する。これを理論修正と呼ぶ。上記のステップを繰り返して、最終的に新たな概念を十分かつ完全に説明する領域理論が獲得される。本研究課題では、以上のような考え方に基づいて、以下のテーマの重点を研究を行なった。1)過去の事例集合から得られる統計的な特徴から、事例の属するカテゴリー概念を形成し、未学習の事例が与えられると、概念との距離(連想度と呼ぶ)をもとにして、適切な概念に分類する概念学習アルゴリズムを開発した本アルゴリズムをQuinlanのID3などと比較した結果、同等あるいはそれ以上の分類精度が得られることがわかった。現在は、本アルゴリズムの実数値データへの拡張、学習結果からのプロクションルームの抽出などを検討している。2)領域理論が不完全な場合には、それを補うための仮説を生成し、学習しようとする概念の説明を完成しなければならない。本研究では、生成された複数の仮説集合から一貫性(coherence)を考慮して最適な仮説を選択するシステムを開発した。3)事例ベース推論(case-basedreasoning)のアプローチを採用し、過去の理論修正で用いられた手法を事例として記憶しながら学習を行ない、新たに領域理論を修正する際には、過去の事例の修正法を利用するシステムを開発した。
高齢者の転倒防止を目的とした座位バランス能力評価・訓練装置の開発

本研究では,姿勢を崩す外乱として座面の角度を揺動させることで,体幹機能を強調したバランス能力を安全に評価する座位バランス能力評価装置を開発した.そして,装置に組み込んだセンサにより身体運動と座面反力ベクトルを計測することで,従来の圧力中心点の軌跡の評価に加えて身体重心や姿勢の変動,脊椎などの関節トルクの評価を行った.45歳以下を若年者,65歳以上を高齢者と定義して2群に分け,若年者は73名,高齢者群は58名の身体運動を計測した結果,高齢者は外乱刺激に伴うCOPの動揺が有意に大きく,姿勢保持能力が低いことが示された.また,活性型ビタミンD3製剤によるバランス能力の改善効果を評価した.本研究では安全な座位姿勢を用い,外乱で崩れた姿勢をリカバリーする総合的な身体能力を評価できる装置を開発した.本システムでは,姿勢を崩す外乱として座面の角度を変動させる.そして,そのときの身体運動と座面反力ベクトルを計測することで,従来の圧力中心点の軌跡の評価に加えて身体重心や姿勢の変動,脊椎などの関節トルクの評価を行うことができる.さらに,外乱に対する身体運動時の反応時間の遅れを定量的に評価するなど,新たな観点からのバランス評価を行った.本年度は,昨年度に製作した座位バランス計測装置により座面を傾斜させる反復運動を行い,新たに男女66名(15-85歳)の身体運動を計測した.このとき,45歳以下を若年者,65歳以上を高齢者と定義して2群に分け,若年者群は33名(男性14名,女性19名,平均年齢27.5歳),高齢者群は33名(男性14名,女性19名,平均年齢76.4歳)とした.その結果,これまでに実績のある立位の重心動揺から評価したバランス能力と,本研究で座位から評価したバランス能力には正の相関が確認された.また,昨年度に製作した座位バランス計測装置は,座面傾斜角度を変更出来ない構造であったが,本年度は新たに座面傾斜角度を任意に変更できる機構と,身体運動を3次元計測できる機械式モーションキャプチャ装置を製作した.本研究では,座位姿勢に動的外乱を与えることで,体幹機能を強調したバランス能力を安全に評価する座位バランス能力評価装置を開発した.本装置は,DCモータ使用で最大傾斜角3°で左右に傾斜し,座面下に3個の3軸力学センサを配置し,圧力中心点を算出することができる.そのため,外乱負荷時の動的な体幹動揺を圧力中心点COPの軌跡で測定し,外乱負荷応答能を評価することができる.本装置を用いて,これまでに若年者と高齢者のバランス能力を評価した.その結果,高齢者は外乱刺激に伴うCOPの動揺が有意に大きく,姿勢保持能力が低いことが示された.25年度は,本学医学部付属病院と共に,活性型ビタミンD3製剤によるバランス能力の改善効果を評価した.活性型ビタミンD3製剤はわが国で開発され,すでに20年間以上わが国では骨粗鬆症治療薬として最も多く用いられている.また,新たに骨折抑制,筋力,平衡感覚改善,転倒予防,など新しい作用や知見が報告されている.エルデカルシトールは2011年に臨床応用された新しい活性型ビタミンD3製剤であり,ビタミンDの転倒抑制作用あるいは筋力改善などを介する身体バランス改善作用を有する可能性が指摘されている.しかし,これまでの臨床試験ではいずれについても検討されていない.本研究では,開発した動的座位バランス計測装置を用いて,エルデカルシトールが筋力,バランス能力に及ぼす影響を定量的に評価し検討した.本研究に参加することに同意を得た60歳以上の未治療閉経後骨粗鬆症患者31名,平均年齢74歳(63-85歳)を対象とした計測により,エルデカルシトールは動的バランス能力,外乱負荷応答,近位筋力を改善することで転倒予防効果を発現する可能性が示唆された.本研究では,姿勢を崩す外乱として座面の角度を揺動させることで,体幹機能を強調したバランス能力を安全に評価する座位バランス能力評価装置を開発した.そして,装置に組み込んだセンサにより身体運動と座面反力ベクトルを計測することで,従来の圧力中心点の軌跡の評価に加えて身体重心や姿勢の変動,脊椎などの関節トルクの評価を行った.45歳以下を若年者,65歳以上を高齢者と定義して2群に分け,若年者は73名,高齢者群は58名の身体運動を計測した結果,高齢者は外乱刺激に伴うCOPの動揺が有意に大きく,姿勢保持能力が低いことが示された.また,活性型ビタミンD3製剤によるバランス能力の改善効果を評価した.本研究では安全な座位姿勢を用い,外乱で崩れた姿勢をリカバリーする総合的な身体能力を評価できる装置を開発した.体幹の動揺変位を計測するために,光学エンコーダと平行リンクを用いた姿勢計測装置を試作した.これは従来用いていた磁気式の計測装置よりも安価であり,ビデオカメラを用いた計測装置よりも高速にデータを処理できる.また,座面の圧力中心点と反力ベクトルを計測するために,小型の力センサを組み込んだフォースプレートを新たに製作した.本システムでは,姿勢を崩す外乱として座面の角度を変動させる.そして,そのときの身体運動と座面反力ベクトルを計測することで,従来の圧力中心点の軌跡の評価に加えて身体重心や姿勢の変動,脊椎などの関節トルクの評価を行うことができる.

さらに,外乱に対する身体運動時の反応時間の遅れを定量的に評価するなど,新たな観点からのバランス評価を行った.バランス能力の訓練・評価を行うためには,実測困難な生体内力を精確に推定するためのモデル解析手法の構築が求められる.そこで,CT,MRI画像をもとに,体幹の3次元筋骨格モデルを構築した.また,人間の座位バランス姿勢制御における前庭器特性を,未知パラメータであるフィードバックゲインや身体パラメータに関するLMIで記述する事によって同定した.開発した動的座位バランス評価装置の有効性を検証するために,秋田大学医学部および県内の高齢者施設において臨床実験を実施し,外乱刺激に対するバランス能力評価実験を実施した.本年度は新たに66名の若年者と高齢者に対してバランス能力を評価した.その結果,高齢者は,外乱に伴う身体動揺とCOPの変動が有意に大きく,座面傾斜に対して姿勢を維持できずに身体を振られていることがわかった.また,固有受容器の微細な姿勢制御機能が劣り,座面変動に対する反応も遅いことから,姿勢保持のためにより大きな体幹の筋力(関節トルク)を必要としていることが示された.また、これまでに実績のある立位の重心動揺から評価したバランス能力と,本研究で座位から評価したバランス能力には正の相関が確認されるなど,順調に基礎データを蓄積している.本研究にて得られたこれらの結果は,国内の医学系学術講演会(日本リハビリテーション医学会学術集会,日本脊髄障害医学会学術集会)において公表した.また,25年度にスペインで開催される国際会議(IFESS 2013)に応募してOral presentationに採択された.当初の計画通り開発した動的座位バランス評価装置の有効性を検証するために,秋田大学医学部および県内の高齢者施設において臨床実験を実施し,外乱刺激に対するバランス能力評価実験を実施した.本装置を用いて,若年者と高齢者のバランス能力を評価した結果,高齢者は,外乱に伴う身体動揺とCOPの変動が有意に大きく,座面傾斜に対して姿勢を維持できずに身体を振られていることがわかった.また,固有受容器の微細な姿勢制御機能が劣り,座面変動に対する反応も遅いことから,姿勢保持のためにより大きな体幹の筋力(関節トルク)を必要としていることが示された.さらに,座面揺動の周波数の違いによる評価結果への影響は見られないことから,高齢者を対象とした座位バランス評価の実施には,より安全な0.25Hzの周波数を選択した方が良いという知見が得られた.また,バランス保持制御が,いくつかのフィードバックおよびフィードフォワード制御要素によって行われていると仮定し,LMIに基づく同定手法を用いてそれぞれの制御要素のゲインを求め,実験データをよく近似するゲインを求めることが出来た.さらに,同定された制御則の特徴を調べるために,誤差や座面角度に対するモーメント値(比例制御的要素)と,それらの微分値に対するモーメント値(微分制御的要素)において,顕著な被験者間の差が現れた.本研究にて得られたこれらの結果は,国内の学術講演会において公表した今後は,計測した動的座位バランス能力の相違を用いることによって,バランス保持能力の優劣の定量化や,トレーニングや加齢によるバランス保持能力の改善・劣化の判定可能性について検討する.また,ビタミンeの摂取とバランス能力保持との相関性や,歩行機能や易転倒性との関係を明確にし,転倒防止への実用的かつ効果的な介入方法について検討していく.さらに,臨床現場で幅広く利用されているFunctional Reach TestやTimed Up and Go Testなどの易転倒性検査を同時に実施することで,転倒リスクを抱えた高齢者の座位バランス能力と歩行機能との関係を明確にし,本人の転倒リスクのレベルや訓練効果を高齢者にわかりやすく提示可能な座位バランス評価・訓練装置の実現を目指す予定である.
HPLC用の選択的化学修飾シクロデキストリン固定相の開発に関する研究

1.β-およびγ-シクロデキストリン(CD)の空洞開口部の3種類(2位、3位および6位)のヒドロキシル基を選択的にメチル化した(2位あるいは3位の一種類のヒドロキシル基をすべてメチル化したもの、2位と3位の二種類のヒドロキシル基をすべてメチル化したもの、2位、3位および6位の三種類のヒドロキシル基をすべてメチル化したもの)β-およびγ-CD誘導体の合成、単離する方法を確立した。2.未修飾および上述の選択的メチル化CDをシリカゲルに固定するときのスペーサーアームとなるアリルオキシエチル鎖を導入し、さらにジメトキシメチルシランと反応させ、シリカゲルとカップリングさせることにより目的とする未反応スペーサーアームがない新規なHPLC用の選択的メチル化CD固定相の合成に成功した。本固定化法により、β-およびγ-CD誘導体のどちらも十分な量をシリカゲルに固定できることが判明した。3.合成した選択的メチル化γ-CD固定相の性能を検討するために、モデル化合物としてダンシルアミノ酸を用いてそのキラル認識能について評価したところ、未修飾および3位のヒドロキシル基をすべてメチル化した3-MM-γ-CDでは、多くのダンシルアミノ酸がキラル分離されているのに対して、2位のヒドロキシル基をすべてメチル化した2-MM-γ-CDおよび2位と3位の両ヒドロキシル基をすべてメチル化した2,3-DM-γ-CDと2,3,6-TM-γ-CDでは全くキラル分離されなかった。これより、2位のヒドロキシル基がダンシルアミノ酸のキラル認識能に大きな役割を果たしていることが明らかとなった。本研究の当初目的のとおり選択的メチル化γ-CD固定相は高い不斉認識能をもつことがわかった。現在、β-CDについても同様の検討を行っている。1.β-シクロデキストリン(β-CD)の水酸基を選択的にメチル化する方法はすでに確立しているので、γ-CDの水酸基の選択的メチル化について検討した。その結果、2-位、3-位、6-位、2,3-位、2,6-位、3,6-位および2,3,6-位をそれぞれメチル化したγ-CD誘導体の単離とキャラクタリゼーションを行い、γ-CDの水酸基を選択的にメチル化する方法が確立できた。2.未修飾のγ-CDも含め、得られたメチル化γ-CD誘導体の分子認識能・不斉認識能をチェックするため、キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)によりダンシルアミノ酸およびその類似化合物の光学分割を行った。その結果、3-位および3,6-位のメチル化により不斉認識能が向上すること、さらに二級水酸基を全てメチル化した2,3-ジメチル-および2,3,6-トリメチル-γ-CDは全く不斉認識能を示さないことがわかった。これは、二級水酸基の全てをメチル化した2,3-ジメチル-および-2,3,6-トリメチル-β-CDでは不斉認識能の選択性が未修飾の場合と逆転するという結果と大きく異なる点である。さらに、検討した溶質全体の認識能はβ-CD誘導体よりγ-CD誘導体のほうが優れていることが判明した。3.上記の結果より、まず3-位および3,6-位をメチル化したγ-CD誘導体と未修飾γ-CDをシリカゲルに固定することにし、アリルオキシエチル鎖を導入した未修飾γ-CDを大量合成し、これの3-位および3,6-位の水酸基の選択的メチル化を検討している。一方、この未修飾γ-CD誘導体をシリカゲルにヒドロシリル化により固定した固定相には未反応スペーサーアームがなく、従来の未反応スペーサーアームが残っている固定相より高い光学分割能を示した。

1.アリルオキシエチル鎖を導入した未修飾のβ-シクロデキストリン(β-CD)およびγ-CDをハイドライドシリカと反応させる方法(A法)と、ジメトキシメチルシリルプロポキシエチル鎖を導入したβ-CDおよびγ-CDをシリカゲルと反応させる方法(B法)で、未反応スペーサーアームのない未修飾β-CDおよびγ-CD固定相を合成した。A法ではCD固定量が少なく、B法のほうがCDをはるかに多く固定できることが判明した。2.上記の結果より、まず未修飾のヒドロキシル基を全てメチル化したジメトキシメチルシリルプロポキシエチル-per-メチルβ-CDおよびγ-CDを合成し、B法によりper-メチルβ-CDおよびγ-CD固定相を合成することに成功した。現在、3-位および3,6-位を選択的にメチル化したβ-CDおよびγ-CD固定相の合成を検討している。3.合成した未修飾ならびにper-メチルβ-CDおよびγ-CD固定相の基礎的な性能(分子認識能・キラル認識能)を評価するため、ダンシルアミノ酸のエナンチオマー分離を行ったところ、未修飾β-CDおよびγ-CD固定相はともに高いキラル認識能を示すことがわかった。一方、per-メチルβ-CDおよびγ-CD固定相は、CD固定量がそれぞれ24.1μmol/gおよび43.5μmol/gと低く、さらにper-メチルCD誘導体はダンシルアミノ酸に対するキラル認識能がもともと低いため、per-メチルCD固定量の増大とダンシルアミノ酸エナンチオマー以外の溶質を対象に選んでキラル認識能を評価検討する必要がある。1.シクロデキストリン(CD)の両開口部には一級および二級の3種類(2、3および6位)のヒドロキシル基が存在する。とくに、広い開口部側の二級ヒドロキシル基(2および3位)が分子認識に大きな役割を果たしていると考えられ、それらを選択的にメチル化したβ-およびγ-CD(2あるいは3位の一種類のヒドロキシル基をすべてメチル化したもの、2と3位の二種類のヒドロキシル基をすべてメチル化したもの、2、3および6-位の三種類のヒドロキシル基をすべてメチル化したもの)の合成、単離を行った。2.未修飾および上述の選択的メチル化γ-CDにシリカゲルに固定するときのスペーサーアームとなるアリルオキシエチル鎖を導入、単離し、シリカゲルとカップリングさせることにより目的とする新規なHPLC用の選択的メチル化γ-CD固定相の合成に成功した。3.合成した選択的メチル化γ-CD固定相の性能を比較するために、モデル化合物としてダンシルアミノ酸を用いてそのキラル認識能について評価したところ、未修飾および3位のヒドロキシル基をすべてメチル化した3-MM-γ-CDでは、多くのダンシルアミノ酸がキラル分離されているのに対して、2位のヒドロキシル基をすべてメチル化した2-MM-γ-CDおよび2位と3位のヒドロキシル基をすべてメチル化した2,3-DM-γ-CDと2,3,6-TM-γ-CDでは全くキラル分離されなかった。このことから、2位のヒドロキシル基がダンシルアミノ酸のキラル認識能に大きな役割を果たしていることが明らかとなった。現在、β-CDについても同様の検討を行っている。
生体内遊離ヘムの濃度測定と動態解析

ヘムはヘムタンパク質の補欠分子族として種々の生体反応に関与する一方で,タンパク質と結合していない遊離ヘムが様々な生理活性や疾患に関わっている。我々はこれまでに、ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)に蛍光団を導入したヘム特異的センサーを開発し,ラット肝ミクロソーム画分中の遊離ヘムの定量を試みたが,遊離ヘムが生体物質に非特異的に吸着されることが示唆された。そこで,界面活性剤等を用いた遊離処理方法を検討した。また,HO-1と蛍光蛋白質との融合タンパク質を発現・精製し,ヘムセンサーとしての有用性を検討するとともに,この融合タンパク質を培養細胞内に発現し,細胞内遊離ヘムの定量に向けた基礎的な検討を行った。目的ヘムは分子補欠族として様々なヘム蛋白質の機能発現に寄与しているが,近年,遊離状態のヘムが転写制御因子の活性化に関与している事例が次々に明らかになり,細胞機能に対する調節作用も有していることがわかってきた。しかし,細胞内に遊離ヘムがどのぐらいあるのか,またどこにあるのかさえ未だ明らかにされていない。そこで,我々は独自に開発した蛍光ラベル化ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)をヘム特異的ヘムセンサーとして用いるヘム定量法により次のことを行う。1組織,細胞などの生体由来サンプルを用いてヘム濃度を計測できる測定系を確立する。2センサーを改良し,遊離ヘムが細胞内のどこにあるか,その動態を明らかにするためのプローブを開発する。それにより,遊離ヘムの細胞内動態を明らかにする。結果1現行センサーを用いた生体試料中のヘム濃度測定法の確立:生体由来サンプルとして,臓器不全モデルラット肝ミクロソーム画分(A)およびダール食塩感受性モデルラット血清(B),イヌ組織球肉腫株化細胞ライセート(C)を用いてヘム定量を試みた。その結果,Aについては総ヘムおよび遊離ヘムを定量することができた。一方,BとCでは,遊離ヘムがサンプル内タンパク質に非特異的に吸着していることが示唆されたため,界面活性剤を用いたサンプル処理方法を検討した。2遊離ヘム特異的蛍光プローブの開発と細胞内ヘムの動態観察:ヘムセンサーの細胞内での発現および細胞内遊離ヘムの観測を目指して,蛍光タンパク質(EGFP, BFP, hmKO2)融合型HO-1を調製し,ヘムセンサーとしての機能を検討した。その結果,いずれの融合タンパク質もヘム添加によりヘム-HO-1複合体に特徴的な吸収(405 nm)増大がみられ,ヘムと化学量論的に結合することが確認された。しかし,ヘム添加に伴う蛍光の消光が観測できなかった。既存のヘムセンサーを改良し,ヘム分解活性をもたず,野生型HO-1よりも10倍高親和性で,生体成分由来の紫外蛍光から妨害を受けにくいセンサーを開発した。そのセンサーを用いて,臓器不全モデルラット肝ミクロソーム画分中の総ヘムおよび遊離ヘム濃度を測定し論文として発表できた(Anal. Biochem. 489, 2015)。また,新規センサーの開発では,蛍光タンパク質融合型HO-1の発現ベクターを構築し、大腸菌BL21(DE3)株内で発現後、目的タンパク質を精製することができた。結果1現行センサーを用いた生体試料中のヘム濃度測定法の確立:各種界面活性剤またはカオトロピック剤を用いて、ヘムタンパク質への影響と薬剤処理濃度別ミクロソーム分画中のヘム検出量の増加を検討したところ、イオン性の界面活性剤やカオトロピック剤ではタンパク質の変性を伴ったヘム検出量の増加がみられたが、非イオン性界面活性剤ではヘムタンパク質を壊さずに選択的にヘムの非特異的な吸着の解消効果が示唆された。2遊離ヘム特異的蛍光プローブの開発と細胞内ヘムの動態観察:ラットヘムオキシゲナーゼ-1(rHO-1)のC末端への蛍光蛋白質の融合はヘム濃度に応じた蛍光強度変化を示さなかった一方で、N末端に蛍光蛋白質を融合したrHO-1の蛍光強度はヘム濃度に対応して変化することが示唆された。そこで、この融合蛋白質中のrHO-1のcDNAに対してヘム分解活性を失くす変異(D140H)を導入し、哺乳細胞内に発現させたところ、細胞内のヘム合成の亢進に対応した融合蛋白質の蛍光強度変化が認められ、細胞内ヘムプローブとしての応用が可能であることが示唆された。生体由来試料中の遊離ヘムを測定する場合,遊離ヘムが生体物質に非特異的に吸着し,測定に支障を来すことが示唆された。そこで,様々な添加剤を検討した結果,非イオン性界面活性剤が有効であることがわかった。

一方,蛍光蛋白質融合型HO-1を発現した細胞では,ヘム合成の程度によって蛍光強度の違いが確認され,細胞内ヘムプローブとしての応用が期待できる。また,連携研究者との共同研究により,フローサイトメトリーを用いた計測を開始した。さらに,特異的蛋白質相互作用を利用した発光型ヘムセンサーの構築を開始した。ヘムはヘム蛋白質の補因子として機能する一方で、ヘム蛋白質に結合していない遊離ヘムが、転写等の調節に関わることが明らかとなっており、ヘムのシグナル分子としての機能が注目されている。近年、ヘムに対して高い親和性を持つヘム蛋白質をベースとしたバイオプローブに関する報告が相次ぎ、細胞内の遊離ヘム分析におけるパラダイムシフトが起きつつある。我々はラットヘムオキシゲナーゼ1(rHO-1)を低分子量蛍光色素で化学的に修飾したヘムセンサーを用いて、センサー分子へのヘムの結合に伴う蛍光消光をもとにした生体サンプル中の遊離ヘム定量を試みてきた。本研究では、低分子量蛍光色素の代わりに緑色蛍光蛋白質(EGFP)をrHO-1にコンジュゲートしたキメラ蛋白質を細胞内に発現可能なバイオプローブとしてデザインし、細胞内遊離ヘムの定量評価に向けた基礎的な検討を行った。rHO-1のN末端にEGFPを融合したEGFP-rHO-1にヘムを添加していくと、ヘム濃度に対して化学量論的な蛍光消光を示した。rHO-1はヘム分解酵素であり、細胞内へのEGFP-rHO-1の発現は内在性ヘムを分解することが懸念されたため、細胞内への導入に向け、EGFP-rHO-1のcDNAに対し、潜在的ヘム分解活性を消失させる変異(D140H)を導入した(EGFP-D140H)。EGFP-D140Hのヘムに対するKd値(1.44 ±0.42 nM)は、疾患との関連が指摘される細胞内ヘムを検出する上で良好であると考えられた。EGFP-D140HをCOS-7細胞内に一過的に発現させ、10 microMのヘミン、またはヘムの生合成を亢進する2 mMの5-アミノレブリン酸で細胞を処理した際、ライセート中の総ヘム量の増加に対応したEGFPの蛍光消光が確認され、EGFP-D140Hが細胞内ヘムプローブとして利用可能であることが示唆された。ヘムはヘムタンパク質の補欠分子族として種々の生体反応に関与する一方で,タンパク質と結合していない遊離ヘムが様々な生理活性や疾患に関わっている。我々はこれまでに、ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)に蛍光団を導入したヘム特異的センサーを開発し,ラット肝ミクロソーム画分中の遊離ヘムの定量を試みたが,遊離ヘムが生体物質に非特異的に吸着されることが示唆された。そこで,界面活性剤等を用いた遊離処理方法を検討した。また,HO-1と蛍光蛋白質との融合タンパク質を発現・精製し,ヘムセンサーとしての有用性を検討するとともに,この融合タンパク質を培養細胞内に発現し,細胞内遊離ヘムの定量に向けた基礎的な検討を行った。臓器不全モデルラット肝ミクロソームにおいてはリポ多糖投与後の遊離ヘムおよび総ヘムの濃度変化を観測し,ヘム動態とショック症状との関連性について検討する。また,ダール食塩感受性モデルラット血清およびイヌ組織球肉腫株化細胞ライセート中のヘム測定では,条件の最適化をさらに進める。さらに,蛍光タンパク質融合HO-1では,ヘム結合に伴う蛍光消光が効率的に起こるように蛍光タンパク質とHO-1との位置を入れ替えた変異体を作製し,ヘム応答性を確認する。
甲状腺癌幹細胞の新規同定法とその標的薬の検索

当研究課題の主目的は、共同研究により開発した新規ツール使用により甲状腺癌幹細胞を厳密に分離すること、そしてそれによって得られた幹細胞がどのような薬剤、化合物に感受性があり抗腫瘍効果が得られるかを分析するという2つに要約される。当基金助成金申請時には、平成27年度に前者の分離した細胞が厳密な意味での幹細胞であるかの検証を計画していた。しかし、現時点までに造腫瘍能、未分化能、自己複製能、他分化能、抗癌剤耐性、放射線耐性という癌幹細胞の必要条件と言える特質について検証することができた。よって、その結果を持って、International Journal of Oncologyに現在投稿中である。
Pax1による転写制御を介した脊柱組織構築の分子メカニズム

硬節で発現する転写因子Pax1は、椎骨の軟骨形成が開始すると非軟骨性の椎間板領域に局在する。本研究では、椎間板細胞においてPax1が制御する遺伝子ターゲットの解析を行い、椎骨と椎間板の繰り返し構造の形成におけるPax1の役割について検討した。その結果、Pax1は特定の軟骨性基質分子の発現制御領域に結合し、軟骨細胞分化に必須の転写因子であるSox9による転写活性化を阻害することが明らかになった。本研究の成果から、Pax1により発現が制御される遺伝子が新たに明らかとなり、Pax1は軟骨性基質分子の発現を調節することで脊柱の組織構築に寄与していることが示唆された。脊柱の形成過程におけるPax1の発現局在を詳細に調べるため、マウス胚の組織切片においてin situ hybridization及び免疫染色を行った。その結果、硬節におけるPax1の発現は、胚発生13日目には椎骨間領域に局在し、この領域の細胞ではPax1とSox9が共発現していることが明らかになった。脊柱の組織構造が形成された胚発生16日目以降では、Pax1の発現は椎間板外線維輪に検出された。軟骨組織特異的にPax1を発現するCol2a1-Pax1トランスジェニックマウス胚を詳細に解析した結果、Pax1を過剰発現した軟骨組織では、Sox9とCol2a1の発現は維持されていた一方で、Agc1、Ihh、及びCol10a1の発現は著しく低下していた。また、Col2a1-Pax1トランスジェニックマウス胚では、初期の軟骨組織形成は認められたものの、内軟骨性骨化は完全に抑制されることが明らかになった。Agc1の転写制御におけるPax1の役割を明らかにするため、ゲルシフトアッセイにより解析した結果、Agc1の転写制御領域においてPax1が直接的に結合することが明らかになった。また、ルシフェラーゼアッセイの結果、Pax1単独ではAgc1の転写活性化を促進する傾向が認められた。椎間板外線維輪細胞の培養法を確立するため、マウス及びラットの外線維輪から細胞を分離し、培養方法を検討した。その結果、ラットの外線維輪から分離した細胞では、増殖、継代、及びトランスフェクションの効率において、良好な結果が得られた。また、培養椎間板外線維輪細胞において発現遺伝子を解析した結果、Pax1やCol1a2に加えてSox9、Col2a1、及びAgc1等の軟骨細胞マーカーの発現も検出され、生体内の椎間板外線維輪における遺伝子発現は、in vitroにおいても維持されている傾向が認められた。脊柱の形成過程では、椎骨の軟骨性骨原基と椎間板の非軟骨性組織の繰り返し構造が形成される。硬節の分子マーカーとして知られる転写因子Paired box gene 1 (Pax1)は、椎骨の軟骨形成が開始すると非軟骨性の椎間板に限局して発現するが、椎間板の形成過程におけるPax1の役割は不明である。研究代表者は、本研究の申請までにPax1が軟骨細胞の成熟過程に対して抑制的に作用することを見出しており、Pax1による転写制御は脊柱の繰り返し構造の形成にも寄与していると考えられた。そこで本研究では、椎間板細胞でのPax1の役割と分子ターゲットについて解析し、Pax1による転写制御が脊柱の組織構築においてどのように作用しているのかを検討した。まず、脊柱の形成過程におけるPax1の発現パターンを詳細に解析した結果、椎間板でのPax1の発現は、軟骨細胞分化に必須の転写因子であるSry box 9 (Sox9)の発現と共局在していた。また、軟骨でPax1を過剰発現するトランスジェニックマウス胚(Col2a1-Pax1 Tg)では、椎骨の軟骨形成が著しく抑制され、椎骨と椎間板の繰り返し構造も消失していた。Col2a1-Pax1 Tgの軟骨組織において顕著な発現低下が認められた軟骨性基質分子の発現制御領域を解析した結果、Pax1がその発現制御領域に直接的に結合すること、更にSox9による転写活性化がPax1により抑制されることが明らかになった。また、Pax1をノックダウンした椎間板細胞を軟骨分化誘導条件で培養すると、特定の軟骨性基質分子の発現がコントロールと比較して顕著に上昇した。本研究の成果からPax1が発現を制御する新規の分子ターゲットが明らかとなり、Pax1がSox9と共に軟骨性基質分子の発現調節の役割を担うことにより、軟骨形成期以降の脊柱の組織構築に寄与していることが示唆された。脊柱の形成過程におけるPax1の発現局在の解析、Col2a1-Pax1トランスジェニックマウス胚の解析、及びAgc1の転写制御に対するPax1の直接的な役割について、予定通りの解析を進めることができた。

また、椎間板外線維輪細胞の培養手法を確立することができたため、今後予定している分子生物学的な解析を進めるに当たって、大変有益であると考えられる。発生学前年度に培養法を確立した椎間板外線維輪細胞を用いて、Pax1の過剰発現及びノックダウンの効果を検討する。さらに、pellet cultureにより軟骨分化誘導下におけるPax1の役割についても検討する。Pax1が結合することが確認されたAgc1の転写制御領域において、Sox9結合部位との関係をゲルシフトアッセイにより詳細に解析する。さらに、Pax1とSox9の蛋白間相互作用について、免疫沈降により解析する。また、当初の予定には含まれていなかったが、TALENを用いたゲノム編集技術によりPax1欠失マウスを作製し、形成過程の脊柱における軟骨及び椎間板形成を詳細に解析する。良好な実験結果が得られ、実験の条件検討に使用する経費が当初の予定よりも抑えられたため。遺伝子改変動物の作出と維持、及び実験試薬の購入に使用する。
Gene Chipによって採取された体内時計中枢に発現する機能未知遺伝子の解析

我々は、Gene Chipでマウス視交叉上核において著明な振動を示した遺伝子について、in situ hybridizationを行い、実際、視交叉上核に明瞭なリズムを示す遺伝子を同定した。このうち、Id2、Dexras1、Hspa5遺伝子などの概日リズム制御機構への関与について検討を行った。その結果、Id2遺伝子がBmal1とClockによるPer1遺伝子の転写に対して抑制的に働くことを明らかにした。また、Id2ノックアウトマウスの行動解析により、Id2が位相の後退に関与する所見を得た。次に、Dexras1やHspa5遺伝子発現は、夜間に高く、主に視交叉上核の背内側部に認められた。そこで、これらの遺伝子は、概日周期の主観的夜における他の遺伝子の転写やタンパク発現などに関わり、概日リズムにおいて夜間の形成に関与する可能性が考えられた。また、我々は、時差ボケにおいて環境の時計と体内時計がずれを生じる仕組みを明らかにした。すなわち、体内時計の中枢である視交叉上核に、光によって迅速に位相を変化させる領域と、すぐには同調できない領域が存在する。そして、急激な明暗サイクルのシフトに伴って、この2領域の脱同調がおこり、再同調するまでに時間を要することが時差ボケの原因であると提示した。これにより視交叉上核に2つの機能領域(二振動体)が存在することが明らかになった。また、ラットを用いて体内時計の光による同調の時期についてin situ hybridization法で解析した結果、網膜からの投射が存在する細胞群が明期の始めと終わりの光刺激により、時計遺伝子の発現が誘導されることを明らかにした。現在、上記の遺伝子の光同調への関与について、これら遺伝子の光同調時期における視交叉上核の2つの機能領域での遺伝子及びタンパクの経時的発現、さらに時間依存的な反応の解析を進めている。我々は、マウス視交叉上核においてGene Chipで著明な振動を示した約100個の遺伝子のうち半数ほどについてin situ hybridizationを行い、実際、視交叉上核で明瞭なリズムがあるかを調べた結果、Stx5aやRikなど振動がほとんど認められない遺伝子もあった。一方、明瞭なリズムを示した遺伝子に熱ショックタンパク質(HSP)遺伝子が幾つか含まれていた。これらの遺伝子はHspa5、Hsp40、Hsapa105遺伝子で、マウスにおいて夜間に高く、昼間に低いリズミカルな遺伝子発現パターンを示し、概日周期の主観的夜におけるタンパク質発現などに重要な役割を果たしている可能性が考えられた。また、ラットではマウスの発現パターンと異なり、Hspa5遺伝子発現は、マウスでは夜間にピークを示したのに対し、ラットでは昼の後半から夜間の前半でピークを示し、DIGプローブを用いて発現部位を調べた結果、発現は視交叉上核の背内側部に集中し、腹外側郡にはほとんど認められなかった。また、Hspa105遺伝子発現は周期的振動は認められたが、振幅は小さいものであり、Hsp40遺伝子においては発現はほとんど認められなかった。このことからHSP遺伝子のうち、ラットではHspa5遺伝子が概日リズム形成に関与している可能性が考えられる。次に、Id2遺伝子はマウス視交叉上核で、明暗、恒暗条件下とも周期的発現が認められ、それぞれ主観的夜の後半に発現のピークを示した。この遺伝子発現のピークはPer1遺伝子とBmal1遺伝子のピークとの間にあたり、また、Id2遺伝子はHLHドメインをもつが、DNA結合ドメインはないことからPer 1遺伝子の転写におけるネガティブ因子として働く可能性が考えられた。なお、現在、Id2遺伝子ノックアウトマウスによる行動解析を行っている。また、他の遺伝子についても解析を進めている。

我々は、マウス視交叉上核においてGene Chipで著明な振動を示した遺伝子について、in situ hybridizationを行った。そして、視交叉上核で明瞭なリズムを示した遺伝子のうち、Id2,Dexras1,Hspa5遺伝子などの概日リズム制御機構への関与とその役割について検討を進めてきた。その結果、Id2遺伝子がBmal1とClockによるPer1遺伝子の転写に対して抑制的に働くことを明らかにした。また、Id2ノックアウトマウスの行動解析を行い、行動リズムでは、恒暗条件下でも概日リズムを示した。さらに、新たな明暗周期への同調を調べたところ、明暗周期を前進させた時には、Id2ノックアウトマウスと野生型では、同調に要する時間にほとんど差が認められなかった。しかし、明暗周期を後退させた時には、ノックアウトマウスは野生型に比べて同調に時間を要し、Id2が位相の後退に関与していることが考えられる。次に、Dexras1やHspa5遺伝子は、夜間に高く、昼間に低いリズミカルな遺伝子発現パターンを示し、また、発現は視交叉上核の背内側部に集中し、腹外側部にはほとんど認められなかった。そこで、これらの遺伝子は、概日周期の主観的夜における他の遺伝子の転写やタンパク発現などに関わり、概日リズムにおいて夜間の形成に関与する可能性が考えられた。また、我々は、ラットを用いて体内時計の光による同調の時期についてin situ hybridization法による解析で、網膜からの投射が存在する細胞群が明期の始めと終わりの光刺激により、時計遺伝子の発現が誘導されることを明らかにした。そこで、我々は上記の遺伝子の光同調への関与について解明を行うため、これら遺伝子の光同調時期における視交叉上核での遺伝子及びタンパクの経時的発現、さらに時間依存的な反応の解析を進めている