hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新生鎖合成と連動する葉緑体蛋白質包膜透過の分子メカニズムの解明

植物や藻類の葉緑体は外包膜および内包膜と呼ばれるの二重の生体膜に囲まれ、細胞質ゾルで合成される数千種類にもおよび葉緑体蛋白質前駆体の新生鎖はこの包膜を通過して運ばれる。本公募研究により、葉緑体蛋白質の新生鎖の内包膜透過は、内包膜の1メガダルトンのチャネル複合体TICと連動して膜透過を駆動する2メガダルトンのATPaseの輸送モーター複合体の働きによるものである事を明らかにし、この輸送モーター複合体の全構成因子を生化学的に同定する事に成功した。また、このATPaseは長い進化の過程を経て多様化して現在のようなヘテロな構成因子からなる複合体となってきた事が分かった。この事は、内共生による葉緑体進化の過程で、2000種類を越える多様な葉緑体蛋白質を葉緑体内部に効率良く引き込むために、すなわち基質認識に多様性を生み出すために獲得してきたものであろう事を示唆している。加えて、一連の研究を通して、外包膜のTOC内包膜のTICそして輸送モーターが物理的接触を持って機能している事を示す生化学的データを得る事に成功している。また、in vivo解析系構築のために、培養条件をコントロールしやすい単細胞性緑藻においても、解析のために必須な情報である、TOC TICモーター複合体の構成因子を、精製輸送中間体を用いた解析により、一括同定する事に成功している。この情報を基に、緑藻の輸送装置構成因子の抗体やタグを付加させ発現させた形質転換体の作成も進行し、in vivo解析系のツールを整えることもできた。28年度が最終年度であるため、記入しない。最近、我々は葉緑体内包膜の蛋白質膜透過装置TICの同定に成功し、さらにそれに付随して包膜のトランスサイドで働く新奇膜透過駆動モーター複合体の同定にも成功している。長年、葉緑体包膜には強力な前駆体蛋白質のアンフォールディング活性があると言われてきたが、このトランスサイドの輸送モーターが、ATPを消費しながら膜のシスサイドのアンフォールディングに重要な役割を果たしていると思われる。本研究では、特に、外包膜上で新生鎖合成装置と相互作用する因子の検索や、TOCとTICの機能連動、およびトランスサイドの輸送モーター複合体が前駆体と相互作用する時期とその作用様式、について詳細に解析する。今年度の解析では、特に輸送モーター中に同定された、必須因子(Aとする)についての詳細な解析を進めた。この因子Aは、他の輸送モーター構成因子がAAA型ATPaseであり、モーターとしての機能が類推されるのに対し、その一次構造上の特徴からは、直接モーターとして働くとは考えにくい。まず、この因子が枯渇するようなシロイヌナズナ変異体を取得し、ここから単離した葉緑体を用いる事で、その輸送過程への影響を調べる事ができた。その結果、この因子は、葉緑体の生理条件がある特定の条件の時に、モーターにエネルギーを供給するのに使われているのではないかとの作業仮説を立てるに至っており、これを現在検証中である。2重の包膜に囲まれた葉緑体の場合、細胞質ゾルで合成された葉緑体蛋白質の新生鎖は、外包膜と内包膜を連続的に通過する必要がある。この新生鎖の膜透過には、トランスサイドのモーター複合体が必須であり、これがATP加水分解エネルギーを利用して膜透過を駆動している。見積もりのよると、1分子の前駆体を膜透過するのに数万分子のATPを消費する。葉緑体は、光存在下では、光合成光リン酸化によりATPを供給する事が可能である。しかし、光合成があまり行われない生理条件においても、様々な蛋白質を輸送する必要がある。今回得られた知見は、このような生理的条件下での輸送の駆動に関する重要な発見であると考えている。この因子Aの役割を明確にするためには、この因子の機能を部分的に変化させたような、葉緑体を用いた解析が有効である。

しかしながら、この因子そのものが、シロイヌナズナ植物体にとって必須であり、その変異体取得には、条件発現抑制株の利用等の工夫が必要である。この方法にも挑戦していきたいと考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。
年齢や世代に基づく就業選択行動と所得課税・再分配政策

グローバル化の進展や非正規労働など雇用形態が多様化する一方,少子高齢化の進展で労働人口が減少する中で,就労可能な低所得者向けの所得課税・再分配政策を再考する必要がある。本研究は家計の労働供給行動として就業選択行動を採用した最適所得税モデルを構築し,誘因両立的な所得再分配政策を提示するための理論的分析を行う。具体的には,1年齢や世代に基づく政策の有用性と世代ごとの再分配政策のあり方,2労働需要側と非自発的失業者を考慮した再分配政策,3不確実な人的資本投資の下での所得課税・再分配政策のあり方,の3点について考察する。
教科「情報」における分散処理的モデルの教材化に関する研究

本研究の目的は分散処理的な考え方を基礎としたモデリングやシミュレーション技法の学習カリキュラムと指導法および教材を開発し、高等学校での実践可能性と有効性を明らかにすることである。教材体系として、コミュニケーション相互作用モデルを提案した。このモデルは次の5つのモデルで階層化されている。1.オブザーバーとエージェントや環境オブジェクトとのコミュニケーションモデル、2.環境オブジェクト同士のコミュニケーションモデル、3.エージェントと環境オブジェクトとのコミュニケーションモデル、(1)主として、環境オブジェクトがエージェントへ影響を与える場合(2)主として、エージェントが環境オブジェクトへ影響を与える場合、4.エージェント同士のコミュニケーションモデル、5.種(breeds)単位ごとのコミュニケーションモデル。各モデルに対応した具体的な教材を開発し、体系的に学習できる構成とした。学習環境はStarLogoを利用している。実験は普通高等学校及び専門高等学校の2校で行った。被験者は12名、授業時間は16時間であった。カリキュラムの評価は、事前・事後アンケート、事後の自由記述、及び作品発表により行われた。実験の結果、以下のことが明らかになった。1.開発したカリキュラムは高校生に対して16時間で十分に行うことができる。2.被験者は分散処理、生物・生態系、複雑系のモデルに興味が高まった。3.被験者は分散処理的な見方やモデルの構築に高い関心を持つようになった。研究のまとめと今後の課題として、1.分散処理的モデルの教材体系として提案したコミュニケーション相互作用モデルが有効である。2.高校生が学習できる内容構成を提案できた。3.今後は学校教育での利用を可能するために内容を精選して、広く普及させることが求められる。高等学校の教科「情報」及び専門高校の情報科の学習指導要領を参考にして、モデル化及びシミュレーションに関する具体的なカリキュラムの検討を行った。また、広く社会における情報のモデル化やシミュレーションの動向などを分析した。これらを背景として、高等学校の教育内容として期待されるモデル化やシミュレーションの教材の分析を行った。分析の結果、第一に、教育ではモデルの対象となる現象の分析やモデル化のプロセスの重要性を指摘した。第二に、従来の数理解析的なモデルに加えて、社会現象や生物生態系のモデルなど確率モデルや分散処理的モデルを取り入れる意味や意義を明らかにした。一般に複雑系モデルの範疇に属するこの種のモデルを教材として取り上げる意義とともに教育上配慮すべき事項を検討して、利用するソフトウェアをStarLogoに決定した。分散処理的モデルの理論体系を明らかにし、これを背景として教育として実践すべき内容を選定した。選定した内容に従って学習目標を段階的に設定した。学習目標を設定するに当たり、次の3つの科目を想定している。高等学校普通科における「情報B」、専門科目の「モデル化とシミュレーション」および総合的な学習の時間における活動内容である。カリキュラムの全体構成から、当面の指導計画を作成し併せて指導テキスト及び教材モデルの開発を行っている。現在、作成した指導計画を実験的に行うための準備を進めている。

被験者は12名、授業時間は16時間であった。カリキュラムの評価は、事前・事後アンケート、事後の自由記述、及び作品発表により行われた。実験の結果、以下のことが明らかになった。1.開発したカリキュラムは高校生に対して16時間で十分に行うことができる。2.被験者は分散処理、生物・生態系、複雑系のモデルに興味が高まる。3.被験者は分散処理的な見方やモデルの構築に高い関心を持つようになる。研究のまとめと今後の課題として、1.分散処理的モデルの教材体系として提案したコミュニケーション相互作用モデルが有効である。2.高校生が学習できる内容構成を提案できた。3.今後は学校教育での利用を可能するために内容を精選して、広く普及させることが求められる。
診察室外血圧の統合データベース構築と循環器リスクの比較評価

本年度は大迫研究コホートで、対象地区の住民に家庭血圧計HEM-7080ICを配布し、1ヶ月間の家庭血圧測定を実施した。その後、家庭血圧計を回収するとともに対象者より各種調査票、面談などで関連情報を収集し、得られた知見を家庭血圧の介入試験HOMED-BP研究の結果を照らし合わせるなどの形で国際学会等で発表した。一方、SONIC研究コホートでも、高齢者の家庭血圧測定を開始した。対象者の平均年齢が80歳台後半と極めて高齢であることから、事故等が起こらぬよう慎重に家庭血圧測定の適応を見定めて実施した。事前の予測に反して、当初年度中に必要人数に到達しなかったが、幸い大きなトラブルなく繰越期間中に対象者を拡大して測定を完了することができた。その結果は次年度研究計画に基づく測定結果と統合して発表する見込みとした。他の参加コホートである久山町研究、長浜コホートにおいても、それぞれ家庭血圧ならびに関連情報の収集と整理を行った。このうち長浜コホートからは、起立性血圧低下が朝の家庭血圧変動と有意に関連していることを報告した。新しい家庭血圧の測定とデータの収集は各コホートにおいて順調に進んだ。また、統合データベースの整備作業も順調であった。ただし次年度に実施予定の個人データの収集については法改正による対応を予め見極めることが困難であり、次年度研究計画の早期に対応することとした。今後も本研究のスキームで、参加各コホートに家庭血圧、診察室外血圧の測定と関連情報の収集を行う。また、早期に統合データベースの構築を完了させ、解析成果の公表を目指す。
尿中マイクロＲＮＡを指標とした非侵襲的な膀胱腫瘍の新規診断法および治療の試み

膀胱腫瘍におけるmicroRNA (miR)の発現解析から尿中の新規腫瘍マーカーの確立を目指した。まず膀胱腫瘍細胞株を用いたmiRマイクロアレイにて網羅的解析を行ない、膀胱腫瘍で発現が亢進している3種類の候補miRを見出した。膀胱洗浄液中のmiR発現量を定量したところ、3候補のうちmiR-Aは膀胱腫瘍群において有意に発現量が高く、健常群に上限値を設定し腫瘍群と明確に区別することができた。さらに臨床検体の自排尿では、尿細胞診陰性の癌症例をも検出できた。また組織学的悪性度と関連があり、膀胱腫瘍切除術後に低下することから、miR-Aは真に膀胱腫瘍と関連した有用な尿中マーカーであることが示された。現在、膀胱腫瘍の診断法としては膀胱鏡検査や感度の低い尿細胞診に頼らざるを得ないことから、新規の非侵襲的な腫瘍マーカーの開発が急務である。そこで体液中で安定して存在するmicroRNAについて膀胱腫瘍細胞株での発現をmicroRNAmicroarrayを用いた網羅的解析により検討し、現在までに3種類の候補microRNAを見出した。本年度は膀胱洗浄液を検体として用いたRT-qPCRによる検討を行った。健常対象者(健常群)9例、膀胱腫瘍患者(腫瘍群)20例の膀胱洗浄液よりRNAを抽出し、RT-qPCRを行った。3種類の候補microRNAのうち1種類はqPCRで半数ほどの検体しか増幅されなかったために今回の検討から除外した。発現量の比較検討にはcycle threshold(Ct)値を使用した。候補microRNA-AのCt値は腫瘍群で29.0±3.20(22.8ー32.5)であり、健常群の35.8±6.75(34.4ー36.7)に比較し有意に低値であった(P<0.0001)。候補microRNA-BのCt値も同様に、腫瘍群で30.1±4.13(23.3ー38.6)であり、健常群の36.4±3.96(30.0ー44.1)に比較し有意に低値であった。尿細胞診と各候補microRNAのCt値も有意に相関し、細胞診がclassIからVになるに従いCt値が低下した(microRNA-A : P=0.0005, microRNA-B : P=0.0920)。microRNA-Aにおいては健常群にカットオフラインを設定し腫瘍群と明確に区別することが可能であり、腫瘍マーカーとしての有用性が確認された。今後、臨床検体を尿サンプルとして症例数をさらに増やしてスクリーニングを行い、候補microRNAが膀胱腫瘍の尿中新規腫瘍マーカーとなり得るかを検討する。膀胱腫瘍は血中や尿中の有用なマーカーがなく、膀胱鏡検査や感度の低い尿細胞診に頼らざるを得ないことから、非侵襲的な早期診断や再発の早期発見が困難である。そこで、体液中で安定して存在するmicroRNAについて膀胱腫瘍での発現を網羅的解析することにより膀胱腫瘍の新規腫瘍マーカーを検索した。まずは、膀胱腫瘍の細胞株(RT-4,T-24)および腎移植ドナー尿管から剥離採取した尿路上皮からRNAを抽出した。RNA Integrity Number (RIN)を指標としてRNAの質を検定し、Agilent社microRNA microarray Version16.0にてマイクロアレイ解析を行なった。尿管20検体のうち、解析サンプルとして推奨されるRIN7以上であった6検体を正常対照群として、膀胱腫瘍細胞株のmicroRNA発現量を比較解析した。正常対照群の平均値と比較して、発現が2倍以上有意に亢進しているmicroRNAはRT-4で34種類、T-24で10種類であった。逆に発現が2倍以上有意に減少しているのはRT-4で158種類、T-24で169種類であった。これらのデータをもとに、膀胱腫瘍の尿中新規腫瘍マーカーが特定できる可能性が示唆された。膀胱腫瘍は再発率が高く、診断のための非侵襲的なマーカーの開発が必須である。そこで尿中で安定して存在するmicroRNA (miR)に着目し、検討を行ってきた。本年度はH25年までの検討で選定した膀胱腫瘍マーカー候補である2種類のmiR A,B(未発表のため仮称)について、臨床検体である自排尿を用いた検討を行った。良性疾患患者(健常群)19例、膀胱腫瘍患者(腫瘍群)19例の自排尿よりRNAを抽出し、RT-qPCRを行った。発現量の比較検討には目的のmiRのcycle threshold(Ct)値からhsa-miR-21-3pのCt値を引いた⊿Ct値を使用した。

miR-Bは尿検体における発現が安定しておらず、検出不能の検体が3割以上を占めるためマーカーとしての有用性は低いと考え検討から除外した。miR-Aの⊿Ct値は腫瘍群で-2.2±4.6であり、健常群の-0.5±1.3に比較し有意に低値であった(P<0.01)。同症例の術前後での比較では、術前(-4.1±5.1)に比較して術後(-0.4±1.8)で有意に低下した(P=0.04)。また、尿細胞診陰性の膀胱癌でも、健常群に比較してその値は有意に低下し(-2.1±4.8, P=0.02)、尿細胞診陰性の癌症例を検出できる可能性が示唆された。更に発現量と病理組織学的所見との相関も認められ、low grade (0.03±2.31)に比較しhigh grade (-5.37±5.21)にて発現が亢進し(P<0.01)、表在性膀胱腫瘍(-0.72±2.7)に比較し、深在性膀胱腫瘍(-5.4±5.4)でその発現が有意に亢進していた(P=0.02)。以上より、miR-Aは膀胱腫瘍マーカーとしての有用性のみならず、組織学的悪性度の予測因子としての有用性も確認された。泌尿器科学候補マーカーmiRNAとして予測されたmiRNA A,Bついて、膀胱腫瘍患者ならびに泌尿器系良性疾患患者の尿中における発現量をリアルタイムPCRにて定量し、個々のmiRNAについて膀胱腫瘍の検出感度・特異度を評価する。そして、単独あるいは複数のmiRNAを組み合わせて腫瘍患者と健常者を分類する評価基準を設定するという当初の計画はほぼ達成されている。交付申請書の実験計画のうち、1)細胞株を用いたmiRNAマイクロアレイ解析を行う。2)候補miRNAの尿中スクリーニング:マーカー候補として抽出された遺伝子を標的とするmiRNAをデータベースより検索、予測し、膀胱腫瘍のマーカーとなるmiRNAを10個程度に絞り込む。3)膀胱腫瘍患者のmiRNA収集:実際の臨床検体で候補miRNAを解析できように膀胱腫瘍患者の尿を取集し、miRNA抽出しておく。以上の3つの項目すべてを達成している。1. miRNA A,Bついて、膀胱腫瘍患者ならびに泌尿器系良性疾患患者、各100例の尿中における発現量をRT-qPCRにて定量し、スクリーニング法としての確立を目指す。2.miRNAを用いたin vitroにおける遺伝子発現の制御実験:miRNA A,Bの過剰発現ベクターを膀胱腫瘍細胞株にトランスフェクションする。培養後にマーカー遺伝子のmiRNA及び遺伝子産物のタンパク質レベルをreal time PCR法ならびにwestern blottingにより検出し、膀胱腫瘍細胞において遺伝子発現を制御できるmiRNAを選定し、治療法としての可能性を検討する。候補miRNAの尿中腫瘍マーカーとしての有用性の検討:候補マーカーmiRNAとして予測されたmiRNAのうち10個程度について、膀胱腫瘍患者50例ならびに泌尿器系良性疾患患者50例の尿中における発現量をリアルタイムPCRにて定量し、個々のmiRNAについて膀胱腫瘍の検出感度・特異度を評価する。そして、単独あるいは複数のmiRNAを組み合わせて腫瘍患者と健常者を分類する評価基準を設定する。・患者尿中miRNA抽出のためのキット5万円×2=10万円・その他実験用器具10万円
サルコペニアの早期発見バイオマーカーの探索と新しいトレーニング評価技術の確立

本研究は、主に部位別多周波生体電気インピーダンス分光法(S-BIS)を用いて、サルコペニアの早期発見バイオマーカーの探索を行うことを第一の目的として実施するものである。先行研究では、高齢者の骨格筋のトレーナビリティを二重X線エネルギー吸収法(DXA)や人体計測法を用いて検査すると、若齢者よりも筋肥大のタイミングが遅いという報告が散見される。しかしながら、高齢者においては、その骨格筋組織中の組成において、若齢者には見られない特徴を有しており、トレーニングによってその組成も変化する。S-BIS法によって得られる電気情報は、体肢においては主に骨格筋内の電気特性を反映している。つまり、S-BIS法を用いて骨格筋組織内部の情報を得ることで、従来の方法では評価が難しかった微細な筋肥大シグナルを評価することができるようになると考えられる。骨格筋内組成の変化について、感度の高い計測技術の確立は、新しいトレーニング評価技術につながると予想される。今年度は、実際に高齢者の筋内組成が加齢に伴ってどのように変化するかについて調査を行った。その結果、いくつかのS-BISパラメータが加齢と関連していることが明らかになり、また筋力との関連についても明らかになった。実際に、研究結果を複数の原著論文として発表することができた。さらに、英文書籍の1章にてこれまでの知見をまとめることができた。また、海外共同研究機関においてもその研究成果を発表することが出来た。これらの一連の研究により、従来の方法と比較した場合のS-BIS法の優位性についても明らかになってきた。翌年度以降、さらに規模を拡大してデータを得ることで、サルコペニアの早期シグナルを見つけること、および、そのパラメータに対する有効なトレーニングについて検討することとする。いくつかの研究成果について、論文として発表することができ、さらに来年度以降の予定についても順調に計画されている状況である。今年度の研究は、研究分担機関における研究も含め、おおむね順調に推移していると考えられる。翌年度以降については、核磁気共鳴画像法(MRI)との比較研究を若齢者・高齢者で大規模に実施する予定であり、その準備を少しずつ進めている。さらに、安定同位体トレーサー技術を用いた方法との比較研究についても、海外共同研究機関における研究成果が出てきており、それについても、翌年度以降、新たに進めていく予定にしている。
ミオシンーアクチン分子間相互作用エネルギ-の測定

筋収縮などの滑り運動をひきおこすミオシン分子とアクチン分子の相互作用力の性質を,その力の大きさの距離依存性を測定することによって,研究することを考えた。研究の方法は実験計測を主体にし,分子間力の観点からの理論的アプロ-チを実験の補助手段として用いた。ミオシンとアクチンとの滑り力は柳田ら,豊島ら,茶圓らによって測られているが,ミオシンとアクチンの間にどのような力が働いているかの詳細はわかっていない。その相互作用を調べるには,いろいろな方向での距離依存性を測る必要があると思われる。そこで,われわれはまず最初に,古くから行われている分子間力の測定法を用いることにより,滑り方向と垂直な方向の距離依存性を測ることにした。測定法にはいろいろあるが,われわれは現在発達しているピエゾやひずみゲ-ジの技術を利用することにした。向かい合った2枚の平面,球面あるいは円筒面状の石英板,ガラス板あるいは雲母板があり,片方の表面にミオシンを,もう一方の表面にアクチンをコ-トして,系全体を溶液に浸す。距離の粗調整はマイクロメ-タで,微調整はピエゾアクチュエ-タで行われる。片側の板は板バネを介して溶液槽に固定されている。板バネにはひずみゲ-ジが張り付けられていて板バネの曲がりに比例したひずみ計の出力が得られる。力の距離依存性を知るには力と距離の同時測定が必要であるが,力はバネの曲がりに比例するひずみゲ-ジの出力から求め,距離変化は予備的実験としてZステ-ジのマイクロメ-タとピエゾの変位量にバネの曲がりを加えた間接的な方法で求めた。将来的には光干渉による精度の高い距離測定が必要となるであろう。ミオシンーアクチン相互作用の予備的な実験を行ったが,まだ感度,精度が低いが,この装置で測定できる見通しがついた。
最新分類学大系に基づく植物系統進化学web版教科書開発のための研究

私は系統進化学の研究室に所属し、分子系統学の研究を支援している。近年、植物の分子系統学の研究が飛躍的に進展し植物の分類が大きく変った。これまでに、研究者向けには教科書やホームページで最新の分類体系が公開されている。しかし、これらの内容は全て英語で記載されており、専門用語による形態の説明は専門家以外には理解できない。そこで、日本語で解説された専門家以外の人でも理解できる教科書を作成し、webでの公開を目指した。1)日本語のテキスト作成のため、系統分類学の最新の知見に基づいた所属研究室の教授の講義資料を参考にした。web上でリンク、見出しをどのような構成にすれば日本語でわかりやすい教材になるかを研究した。対象とした被子植物の系統分類学の内容について、系統樹の階層である目→科→属の順に、系統樹と派生形質を関連づけながら、下の階層へ順次進む構造を作成した。2)各分類群を特徴づける形態形質の中には、立体的で通常の写真では表現しにくいものがある。そこで、焦点面を少しずつずらした写真を複数枚取得し、CombineZM(フリーソフト)を利用した多焦点重ね合わせ画像の作成を試みた。その結果、派生形質を立体的な画像で表示することができるようになった。この3Dイメージング技術は、パラフィン切片を作製し取得した内部構造画像にも利用した。3)ホームページ作成ソフト(Adobe Dreamweaver CS6 for Windows)を用いてホームページを開設し、日本語テキストと画像データをリンクし編集した。系統樹を「画像」データとして挿入したため、系統樹内の分類名をブラウザーのページ内検索できない問題が生じたが、系統樹とは別に分類名の「文字」情報を追加することで、目的の分類名を検索でき、さらにその分類名が系統樹のどの位置に存在するかを検索できるようになった。
線維筋痛症患者の認知行動療法による心理教育実践プログラムの開発

本研究は線維筋痛症患者への認知行動療法による心理教育実践プログラム開発研究の一貫として、線維筋痛症患者にみられる性格特性尺度を作成し、痛みに対する考え方・行動様式に注目した認知的変数との関連を検討した。その結果、線維筋痛症(FM)群では抑うつを示した患者群より生理的随伴症状の得点がより高く、特に抑うつ・不安による心理的ストレス反応が高い傾向がみられた。これらの結果をもとに、痛みが増悪し、悪循環をくり返す要因を手がかりとし、痛みに対する治療を妨げる二次的な症状の治療促進的な場を作り上げ、認知行動療法に基づく心理教育的介入プログラムを検討し、段階的に関わるシステムを提案した。本研究の目的は「線維筋痛症(Fibromyalgia Syndrome;以下FMS)患者への認知行動療法による心理教育実践プログラムの開発」であるが、本年度はFMS患者への効果的な治療介入プログラムを開発するための研究の一端として、FMS患者の性格・特徴に対する情報収集を行い、FMSの症状の悪化を引き起こす一つの要因として考えられている患者の性格特性を把握し(調査1)、FMS患者性格特性に関する尺度の作成(調査2)することを目的とした。調査3では痛みに及ぼす抑うつ・不安症状、心理的ストレスにおける媒介変数などの認知的変数との関連を検討した。【対象と方法】N病院にて通院治療を行っているFMS患者62名(平均年齢51.50、罹病期間7年3ヶ月)、FMS以外の疾患で抑うつを示す患者29名(平均年齢51.14、罹病期間5年4ヶ月)20代以上の健常者合計160名(平均年齢36.26)に対し客観的・主観的評価を行い、各群の特徴の比較及び抑うつ・不安の評価を行った。【結果】調査1に得られた項目に基づき、因子分析の結果、4因子(I強迫的な思考(α=.76):5項目、II過剰な努力(α=.75):6項目、III完壁さへのこだわり(α=.69):3項目、IV怒りの抑制(α=.66):3項目)合計17項目が抽出された(調査2)。以上の結果から、過去の出来事に対する患者特有の痛みを引き起こす性格特性が明確することにより、調査3では、FMS群とFMS以外の疾患で抑うつを示す患者の行動パターンおよび認知的変数との関連を検討した。FMS患者の性格特性因子別平均得点を比較すると、両群ともに「強迫的な思考」「過剰な努力」の得点には特徴的な差はみられなかった。抑うつを示した患者群では「完壁さへのこだわり」また、両群ともに、不安や抑うつに随伴する心理的症状の得点が高い。FMS群では生理的随伴症状の得点がより高く、特に抑うつ・不安による心理的ストレス反応の得点が高い傾向がみられた。平成21年度はこれらの結果のデータをもとに、認知行動療法の基本的発想に基づいた心理治療モデルを提案し、介入プログラムを作成する。本研究の目的は「線維筋痛症(Fibromyalgia Syndrome;以下FMS)患者への認知行動療法による心理教育実践プログラムの開発」研究の一貫として、前年度に作成されたFMS患者にみられる性格特性尺度および諸心理的指標を用い、認知的変数との関連を検討した。FMS群では生理的随伴症状の得点がより高く、特に抑うつ・不安による心理的ストレス反応の得点はコントロール群や抑うつを示した患者群より高い傾向がみられた。これらの結果をもとに、(1)痛みに対する執着、(2)痛みが増悪するたびに、心の葛藤が生じ、どうして自分がこのように苦しまなければならないのかという怒りなどの情緒的反応の出現、(3)「痛みによる活動量の低下」→「何も出来なくなる行動パターン」→「絶望感」→「痛みの増悪」などの悪循環を繰り返しているメカニズムを作り、今後起こりうる行動について予測できるようにした。また、痛みの発症前後の変化を具体的に把握し、抱えている問題解決に向けた介入方略を見出し、(1)これまでの患者特有の痛みに対する問題解決の取り組み方の把握、(2)痛みがピークになる前後の背景の環境要因、出来事と痛みに対する執着との関連を検討、(3)痛みに対する正しい知識や否定的な考え方への教育的アプローチ、(4)痛みによる習慣化された行動パターンに注目し、痛みが維持されている要因の手がかりとした。なお、患者のニーズや個人の学習能力に合わせて提案するために、(1)初回面接後の準備段階、(2)心理教育段階、(3)環境整理段階、(4)認知・行動変容段階、(5)自己管理の学習、(6)維持段階、(7)再発予防段階に構造化し、治療者が積極的に介入できるシステムづくりを行った。

本研究の目的は「線維筋痛症(Fibromyalgia Syndrome;以下FM)患者への認知行動療法による心理教育実践プログラムの開発」研究の一貫として、初年度は、FM患者にみられる性格特性尺度作成、および諸心理的指標を用い、認知的変数との関連を検討した。これらの結果をもとに、段階的な介入プログラムを作り、患者が訴える痛みの増悪の悪循環を繰り返している過程での要因を手がかりとし、患者のニーズや学習能力に合わせ、段階的に関わるシステムを提案した。最終年度では、患者個別状態の変化に合わせてプログラムの有効性が検討された。その結果、患者個人の日常生活習慣や家族の関わり方などが痛みを増悪させる悪循環が起こることがより明確化になった。特に認知・行動変容段階の介入を行う前に、痛みの起こるきっかけになった患者個人の状況を治療者が介入過程で充分に受け入れる事が、よい日常生活習慣の維持につながり、痛みの治療に重要な意味があることが認められた。また、罹病期間の長いFM患者にとって家族とのトラブルは怒りの抑制および、痛みを増悪する直接的な要因として関与することが示唆され、痛みの長期化はストレス耐性を変化させ、更に状況の悪さを痛みで訴えることが明らかになった。そこで、介入による相違点を探り、痛みに影響する諸問題を検討した結果、家族が病態を理解できず、拒否的な様子が見られる場合より、3年以上の罹病期間や、何らかの出来事に巻き込まれている患者が介入経過中や治療後の経過に痛みの増悪に影響を与える可能性が高いことがみられた。これらの結果を踏まえ、今後、認知行動的介入を行う際に留意すべき点としては、患者の生活リズムに応じ、(1)患者やその家族のこれまでの痛みに対する意識のズレを見直すとともに、(2)患者・家族間の情報の伝達や共有を強化することが、痛みに加えて治療を妨げる二次的な症状への治療促進的な場をつくることにつながる。そのことで、痛みの緩和とともに二次的治療への参加が容易になると考えられる。
神経障害性疼痛におけるレニン・アンジオテンシン系関与に対する分子生物的機序解明

臨床研究として、現在までに行ってきたACE遺伝子多型解析に加えてAGT遺伝子多型解析を同時におこないニューロパシックペイン患者における遺伝的多様性を検討した。Complex regional Pain Syndrome(CRPS)患者から静脈血を採取し、得られたPCR産物からエクソン2に存在するM235T多型(235番のコドンがメチオニン(M)からスレオニン(T)に変化する1塩基置換)とT174M多型について解析中である。この結果AGT遺伝子多型におけるスレオニンの出現頻度は日本人では約8割とされており、現時点ではCRPS患者の分布とほぼ同一である結果を得た。基礎研究としては、雄性SHR及びSD雄性ラットを用いて、疼痛側と非疼痛側の両下肢に熱刺激を加えて、両下肢足底の熱刺激に対する逃避時間を測定した。その結果、疼痛側では、1週目以降両群ともに有意に逃避時間が短縮した。末梢神経損傷後の疼痛過敏発現に対しては、SHRの血圧上昇を来たす遺伝的背景は影響しないことが推測された。次にSHRにアンジオテンシン2(ANG-2)1型受容体のmRNAに対するアンチセンスオリゴDNA(ODN)を脳内用い視床下部傍室核に微量注入して受容体の産生を阻止し、血圧と神経因性疼痛への影響を検討した。この結果各種刺激に対する疼痛閥値がODN投与のみでは変化しなかったことから、中枢内RA系は神経因性疼痛モデルの発症とは関連が薄かった。以上の基礎的、臨床的研究結果からレニン・アンジオテンシン系は末梢では神経障害性疼痛に対しては促進的に作用し、中枢内ではむしろ抑制的に作用している可能性が示された。今後は治療への応用を図る予定である。Complex regional Pain Syndrome(CRPS)患者11名(CRPS1型4名、2型7名)から静脈血を採取し、得られたPCR産物からエクソン2に存在するM235T多型(235番のコドンがメチオニン(M)からスレオニン(T)に変化する1塩基置換)とT174M多型について検討した。この結果M235T多型ではTT型は8名、TM型は2名、MM型が1名であり、スレオニン(T)のAlleleの出現頻度は82%であった。またT174M多型ではTT型が8名、TM型が3名であった。AGT遺伝子多型におけるスレオニンの出現頻度は日本人では約8割とされており、現時点ではCRPS患者の分布とほぼ同一であった。動物実験として末梢神経損傷による神経因性疼痛モデル(Bennettモデル)を作成し、熱刺激による痛み知覚の閾値を検討した。雄性SHR及びSD雄性ラット各7匹を用いて、各々右坐骨神経を結紮した。モデル作成前、およびモデル作成4、7、14日後に疼痛側と非疼痛側の両下肢に熱刺激を加えて、両下肢足底の熱刺激に対する逃避時間を測定した。1週目以降両群とも有意に逃避時間が短縮した。非疼痛側では、両群で疼痛閾値は変化しなかった。高血圧が生じるSHRでは、神経因性疼痛モデルを作成した際に疼痛閾値が変化することが予想された。今回の実験ではSHRとSDラットでは神経因性疼痛モデル作成後の熱刺激に対する応答には差がみられなかった。

臨床研究として、現在までに行ってきたACE遺伝子多型解析に加えてAGT遺伝子多型解析を同時におこないニューロパシックペイン患者における遺伝的多様性を検討中である。Complex regional Pain Syndrome(CRPS)患者から静脈血を採取し、得られたPCR産物からエクソン2に存在するM235T多型(235番のコドンがメチオニン(M)からスレオニン(T)に変化する1塩基置換)とT174M多型について検討している。この結果AGT遺伝子多型におけるスレオニンの出現頻度は日本人では約8割とされており、現時点ではCRPS患者の分布とほぼ同一である結果を得た。基礎研究としてレニン・アンジオテンシン系が亢進しているとされる自然高血圧発症ラット(SHR)を用いて、レニン・アンジオテンシン系のnociceptionへの影響を検討した。くも膜下腔にカテーテルを留置し、ナロキソンまたはplaceboを投与し機械刺激による疼痛閾値を測定した。この結果ナロキソン投与群では有意に疼痛閾値が低下した。さらにアンジオテンシンII I型受容体のmRNAの産生を阻止するために、雄性SHRを対象に脳定位手術により視床下部傍室核に慢性埋め込みしたカニューレからアンチセンスオリゴDNA50μgを計3回投与した。血圧低下後右坐骨神経不全損傷により神経因性疼痛モデルを作成した。この結果SHRの中枢内ODN投与は血圧低下を生じるが、神経因性疼痛モデルでのnociceptionには影響しなかった。これらの結果を総合すると末梢神経損傷後の疼痛過敏発現に対しては、SHRの血圧上昇を来たす遺伝的背景は影響しないことが推測された。臨床研究として神経障害性疼痛患者のレニン・アンジオテンシン系の各種遺伝子多型に関する解析を継続した。対象患者は、難治性慢性疼痛疾患の代表であるComplex Regional Pain Syndrome(CRPS)患者とした。この結果ACE遺伝子多型のなかでDD型遺伝子は約1/3ときわめて高頻度で観察された。またDD型を示した患者ではACE活性が他の二つの遺伝子群に比較して有意に上昇していた。CRPS患者では交感神経機能が亢進していることはよく知られており、DD型の多いCRPS患者では何らかの遺伝的な素因も疼痛発症機序に関与しているものと推察されたまたアンジオテンシノーゲン(AGT)の産生に関与しているAGT遺伝子多型解析を同時におこなったが、アンジオテンシノーゲン遺伝子発現に関しては疼痛患者と有意差がなかった。動物実験としては、雄性SHR及びSD雄性ラットを用いて、疼痛側と非疼痛側の両下肢に熱刺激を加えて、両下肢足底の熱刺激に対する逃避時間を測定した。その結果、疼痛側では、1週目以降両群ともに有意に逃避時間が短縮した。末梢神経損傷後の疼痛過敏発現に対しては、SHRの血圧上昇を来たす遺伝的背景は影響しないことが推測された。次にSHRにアンジオテンシン2(ANG-2)1型受容体のmRNAに対するアンチセンスオリゴDNA(ODN)を脳内用い視床下部傍室核に微量注入して受容体の産生を阻止し、血圧と神経因性疼痛への影響を検討した。この結果各種刺激に対する疼痛閥値がODN投与のみでは変化しなかったことから、中枢内RA系は神経因性疼痛モデルの発症とは関連が薄かった。以上の基礎的、臨床的研究結果からレニン・アンジオテンシン系は抹消では神経障害性疼痛に対しては促進的に作用し、中枢内ではむしろ抑制的に作用している可能性が示された。今後は治療への応用を図る予定である。
睡眠機能と形態の数理モデルを構築し，睡眠における矯正歯科治療の根拠を得る

下顎後方位に起因する骨格性2級を有する患者は,上気道断面積が小さく睡眠時の呼吸障害を併発しやすいことが報告されている.しかしながら,必ずしも下顎後方位が睡眠異常につながらないなど,睡眠の様相と形態の関連については不明な点が多い.そこで,本研究では睡眠の様相の変化と上気道・顎顔面の三次元形態の変化の関連を検討することで,矯正歯科治療による呼吸機能の変化を予測する数理モデルを構築し,入力と出力の関係の逆問題を解くことで,睡眠時呼吸機能の改善・悪化における矯正歯科治療の機序と根拠を得る.下顎後方位に起因する骨格性2級を有する患者は,上気道断面積が小さく睡眠時の呼吸障害を併発しやすいことが報告されている.しかしながら,必ずしも下顎後方位が睡眠異常につながらないなど,睡眠の様相と形態の関連については不明な点が多い.そこで,本研究では睡眠の様相の変化と上気道・顎顔面の三次元形態の変化の関連を検討することで,矯正歯科治療による呼吸機能の変化を予測する数理モデルを構築し,入力と出力の関係の逆問題を解くことで,睡眠時呼吸機能の改善・悪化における矯正歯科治療の機序と根拠を得る.
海洋性超好熱古細菌ゲノムの網羅的機能解析に向けた遺伝子操作系の開発

本年度も、前年に引き続き、より汎用性の高いベクター系の構築を目指し、新規のAeropyrum株の分離をおこなった。本年度は九州、小浜温泉においてサンプリングを行い、本菌の分離を試みた結果、新規のAeropyrum株を分離することに成功した。タイプストレインとのDNA-DNA交雑試験を行った結果、73%の値を得たことから、小浜株はA.pernixと同種であるものの、遺伝的に多様な変異を獲得している可能性が示唆された。また宿主ライブラリーの拡充には遺伝的多様の高い株を得ることが必須であることから、分離した株の多様性を瞬時に測ることができる分子マーカーの選択を行った。本年度はAFLPを用いて本菌の種内多様を解析することを目的とした。実験に供試した35株のAeropyrum pernixからゲノムDNAを抽出した後、市販キットを用いてAFLP解析を行った。なお、セレクティブプライマーは+A、+T、+Gを用いて信頼性の向上を図った。また、バンドの抽出にはGeneScan 3.1 software(Applied Biosystems, USA)を用いた。クラスター解析にはDice coefficientand the Wardalgorithmを用いてBioNumerics 3.0 software(Applied Maths, Belgium)にて行った。AFLP解析の結果、A.pernixは分離した地域ごとにクラスターを形成した。さらに同一の地域でも物理的な特性の違う泉源ごとに、さらなる変異が確認できた。この結果より、A.pernixは環境からの制約を大きく受け泉源ごとに種内変異を持つことが確認された。今後、これらの変異を有する株についてそれぞれ、遺伝子改変系を応用し、改変可能株であるかどうかのスクリーニングを行うことが望まれる。Aeropyrum pernix K-1株に対して実験的に確立している遺伝子破壊系に対するバージョンアップを行なうことを目的としてエレクトロポレーション時に細胞破砕を最小限に抑えるバッファーの検討を行った。細胞に対して有害性の認められなかった多糖の中から細胞破砕抑制効果あるもののスクリーニングを行った結果、リビトール、およびマンニトールにおいて著しい効果を認めた。またそれぞれの多糖の最適濃度を検討したところ双方において1M前後の濃度で抑制効果は最大となった。また実際に遺伝子破壊系への適用を試みるために他のAeropyrum属分離株についても本法が適用できるかを検討したところ、深海熱水孔から分離されたAeropyrum caminiについては、Aeropyrum pernix K-1株に見られる相同組換えを利用した遺伝子破壊は確認することができなかった。他のAeropyrum属分離株について本法が応用できなかったという結果は宿主の制限修飾系の違いが原因とみられた。そこでAeropyrum pernix K-1株をもとにした制限修飾系を逃れるためのメチル化酵素の選定を行ったところ、制限修飾酵素HaeIIIを用いて挿入する相同領域を修飾させると組変えの効率が大幅に増加することが確認された。今後は、他のAeropyrum属分離株についても本制限酵素が適用できるかを検討する予定である。より汎用性の高いベクター系の構築を目指し、新規のAeropyrum株の分離を行った。九州および北海道の海浜温泉サンプルから本菌株の分離を試みたが、新規のAeropyrum株を分離することができなかった。16年度も引き続き日本各地の海浜温泉より本菌株の分離を試み、宿主ライブラリーを確立する予定である。宿主ライブラリーの拡充本年度も、前年に引き続き、より汎用性の高いベクター系の構築を目指し、新規のAeropyrum株の分離をおこなった。日本各地の海浜温泉サンプル、または陸上温泉サンプルから本菌の分離を試みた結果、鹿児島県山川町の砂浜から新規のAeropyrum株を分離することに成功した。これまでに分離したAeropyrum山川株は70株程度におよんだが、これらの株の詳細な性状、および遺伝的多様度を調べたところ、酸素耐性および乾燥耐性がタイプストレインであるA.pernixに比べ非常に高く、コロニー形成能を有することがわかった。遺伝子改変系においては、改変株を得た際のスクリーニングに平板培養を用いることから、今後の遺伝子改変系の構築にふさわしい株を得ることができた。また、タイプストレインとのDNA-DNA交雑試験を行った結果、70から78%の値を得たことから、山川株はA.pernixと同種であるものの、遺伝的に多様な変異を獲得している可能性が示唆された。来年度はこれらの株の中から、制限酵素産生に関する変異株をスクリーニングし、DM取り込み能を強化した株を得る予定である。宿主の遺伝的多様を数値化するためのマーカーの探索宿主ライブラリーの拡充には遺伝的多様の高い株を得ることが必須であることから、分離した株の多様性を瞬時に測るととができる分子マーカーの選択を行った。その結果、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびグリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の1次構造が比較的高い多様度を持っており、分離源の違いを反映していることがわかった。また、それぞれの遺伝子ライブラリーを用いて得られた系統樹はトポロジーがほぼ相似しており、多様度を推定する上で信頼性の高い情報を提供できるツールとなり得ることが立証できた。来年度は大規模なゲノム情報と、これら個々の遺伝子の1次構造を組み合わせた包括的なAeropyrum属遺伝的多様解析を進める計画である。

タイプストレインとのDNA-DNA交雑試験を行った結果、73%の値を得たことから、小浜株はA.pernixと同種であるものの、遺伝的に多様な変異を獲得している可能性が示唆された。また宿主ライブラリーの拡充には遺伝的多様の高い株を得ることが必須であることから、分離した株の多様性を瞬時に測ることができる分子マーカーの選択を行った。本年度はAFLPを用いて本菌の種内多様を解析することを目的とした。実験に供試した35株のAeropyrum pernixからゲノムDNAを抽出した後、市販キットを用いてAFLP解析を行った。なお、セレクティブプライマーは+A、+T、+Gを用いて信頼性の向上を図った。また、バンドの抽出にはGeneScan 3.1 software(Applied Biosystems, USA)を用いた。クラスター解析にはDice coefficientand the Wardalgorithmを用いてBioNumerics 3.0 software(Applied Maths, Belgium)にて行った。AFLP解析の結果、A.pernixは分離した地域ごとにクラスターを形成した。さらに同一の地域でも物理的な特性の違う泉源ごとに、さらなる変異が確認できた。この結果より、A.pernixは環境からの制約を大きく受け泉源ごとに種内変異を持つことが確認された。今後、これらの変異を有する株についてそれぞれ、遺伝子改変系を応用し、改変可能株であるかどうかのスクリーニングを行うことが望まれる。
共役ポリラジカル磁性体の合成とそのマグネトクロミズム

本研究では、共役ポリラジカルの凝集に誘引される主鎖の共平面化によるクロミズムについて、磁場配向によってこの凝集を制御することでマグネトクロミズムを実現することを目的としている。この目的を達成するために、以下の手順で実施した。「新規なポリ(9,10-アントリレンエチニレン)型共役ポリラジカルを合成し、ソルバトクロミズムおよびサーモクロミズムを示す条件について整理する。」「上記の知見を基礎として、共役ポリラジカルがマグネトクロミズムを示す条件を探索する。」本年度は、オリゴ(9,10-アントリレンエチニレン)型ポリラジカル前駆体について合成を最適化し、そのクロミズム現象について詳細に検討した。1.オリゴ(9,10-アントリレンエチニレン)誘導体の合成と反応条件の最適化側鎖にフェノール残基を有する9-(3-ヒドロキシ-3-メチルブチニル)-10-ブロモアントラセン誘導体をPd(PPh_3)_4触媒存在下重合させた。リサイクル分取GPCを用いオリゴマーを分取して、触媒サイクル中で塩基が消費されることから、脱保護試薬でもあるKOHの添加量により、重縮合反応の理論モデルに従って分子量が制御できることを明らかにした。2.オリゴ(9,10-アントリレンエチニレン)誘導体の電子構造と立体構造の相関1で合成したオリゴマーについてソルバトクロミズム現象だけでなく、サーモクロミズム現象も観測した。クロロホルム中の二量体では昇温と共に共平面化により共役系の拡がった吸収(λ_<max>=520nm)が増大し、λ_<max>=488nmの吸収が減少した。一方、ヘプタン中ではスペクトルが先鋭化し、降温と共にλ_<max>=520nmの吸収が増大し、λ_<max>=488nmの吸収が減少した。クロロホルム中では、アントラセン間の共平面的な構造と捻れた構造の交換が速く、捻れた構造が基底状態であり、ヘプタン中では、共平面的な構造と捻れた構造の交換が遅く、共平面的な構造が基底状態であることが示唆された。トルエン中の紫外可視スペクトルからは、これらの中間的な構造が推測されたが、得られたポリラジカルのジアントリルアセチレン構造を介した磁気的相互作用はJ=34cm^<-1>と比較的大きな値となった。この目的を達成するために、以下の手順で実施している。」本年度は、オリゴ(9,10-アントリレンエチニレン)型ポリラジカル前駆体について合成し、そのクロミズム現象について整理した。1.単分散のオリゴ(9,10-アントリレンエチニレン)誘導体の合成側鎖にフェノール残基、末端に長鎖アルキルおよびヒドロキシメチル基を有する1、2量体オリゴマーを合成し、リサイクル分取GPCを用い、大量かつ単分散のオリゴマーを精製した。2.ポリ(9,10-アントリレンエチニレン)誘導体単分子の電子構造の解析1で合成したオリゴマーについてソルバトクロミズム現象を観測した。クロロホルム中でオリゴ(アントリレンエチニレン)構造のπ共役系に帰属される吸収(λ_<max>=496nm)を示した。クロロホルムに対し他の溶媒中(メタノール,THF,ヘキサンなど)では,新たに530nm付近に吸収の肩が出現した。貧溶媒中では,部分的な凝集による共平面化が促進されたためと考えられ,二量体ですら大きな分子間相互作用を有することが明らかとなった。また,水素結合可能なヒドロキシメチル基を有する誘導体では,ヘキサン中でこの傾向がより顕著であった。

2.オリゴ(9,10-アントリレンエチニレン)誘導体の電子構造と立体構造の相関1で合成したオリゴマーについてソルバトクロミズム現象だけでなく、サーモクロミズム現象も観測した。クロロホルム中の二量体では昇温と共に共平面化により共役系の拡がった吸収(λ_<max>=520nm)が増大し、λ_<max>=488nmの吸収が減少した。一方、ヘプタン中ではスペクトルが先鋭化し、降温と共にλ_<max>=520nmの吸収が増大し、λ_<max>=488nmの吸収が減少した。クロロホルム中では、アントラセン間の共平面的な構造と捻れた構造の交換が速く、捻れた構造が基底状態であり、ヘプタン中では、共平面的な構造と捻れた構造の交換が遅く、共平面的な構造が基底状態であることが示唆された。トルエン中の紫外可視スペクトルからは、これらの中間的な構造が推測されたが、得られたポリラジカルのジアントリルアセチレン構造を介した磁気的相互作用はJ=34cm^<-1>と比較的大きな値となった。
ユビキチンリガーゼ複合体APC/Cによるインナー制御機構の解明

多くのがん細胞は染色体の数の変化が高頻度で引き起こされる染色体不安定性と呼ばれる性質を有している。これまでの知見から、細胞分裂に重要なユビキチンリガーゼ複合体APC/C(分裂後期促進因子)の活性化因子Cdh1は染色体不安定性にも関わっている報告があり、染色体分配が正常な細胞においても、Cdh1の機能抑制によって染色体不安定性を示した。これまでの解析から、Cdh1の機能が低下すると、インナーセントメアの中心因子シュゴシンとコヒーシンの機能が低下することを発見した。Cdh1が分裂期に染色体に局在する事も発見しており、Cdh1がどのようにシュゴシンを制御しているか今後の解析が必要とされる。本研究計画は、ヒト細胞においてユビキチン付加酵素複合体APC/C-Cdh1によるインナーセントロメア制御機構を明らかにする事により、がん化抑制におけるAPC/C-Cdh1の知見を深める事を目的とした。平成27年度に得られて主な結果は以下の点である。1)ヒト培養細胞(HeLa細胞)において、Cdh1をRNAi法で抑制した細胞で染色体分配異常の指標であるLagging Chromosomeが高頻度で発生した。2)Cdh1を抑制した細胞では、インナーセントロメアの中心的な役割を果たすSGO1の局在量が低下していた。興味深い事に微小管に結合し張力がかかっている染色体でのみSGO1の局在量の低下が見られた。3)コヒーシンサブユニットであるScc1をmycタグ標識し細胞に発現させところ、Cdh1が抑制している細胞ではコヒーシンの局在量の低下が見られた。SGO1同様、張力がかかっている染色体でのみコヒーシンの局在量の低下が見られた。4)コヒーシンの負の制御因子であるWAPLをCdh1と共にRNAi法で抑制したところ、インナーセントロメアにおけるSGO1の局在量の低下が抑圧された。以上の結果から、APC/C-Cdh1は、SGO1-コヒーシン経路を通してインナーセントロメアの制御を行っている可能性が示唆された。今後は、Cdh1によるWAPLを介したインナーセントロメア制御の可能性の検証と、APC/C-Cdh1と相互作用するクロマチン因子の探索を行う。平成27年度の解析から、Cdh1抑制によるSGO1の局在量の低下が発見され、APC/C-Cdh1がインナーセントロメアに制御に関わる新しい可能性が示唆された。SGO1と結合する因子の中の一つであるコヒーシンの局在量が低下している観察結果から、Cdh1抑制によってこれまで報告されているインナーセントロメアにおけるSGO1ネットワークに異常が見られ、APC/C-Cdh1がインナーセントロメアに制御に関わるさらなる証拠となる。しかし、張力がはった状態でSGO1とコヒーシンの局在量が低下する理由までは示せていない。今後は、Cdh1抑制によるSGO局在量の低下とLagging Chromosomeの発生の因果関係を示す事が課題である。多くのがん細胞は染色体不安定性と呼ばれる性質を有しており、染色体の数的不安定性は細胞分裂期の染色体分配異常によって引き起こされる。分裂期の進行に必須なユビキチンリガーゼ複合体APC/C(分裂後期促進因子)の活性化因子Cdh1は分裂期の進行に重要な役割を果たすが、これまでの解析から染色体分配制御にも関わりあることが示唆されていた。そこで、Cdh1が正常な染色体の分配に重要な役割を果たすインナーセントロメアへの制御に関わっているか着目し解析を行った。1)Cdh1の活性を抑制したヒト細胞では、SGO1とコヒーシンの機能化低下していた。Cdh1がコヒーシン-SGO1経路の制御に直接関わっているかを検証するため、コヒーシンの負の制御因子であるWAPLとCdh1を抑制した所、Sgo1機能が回復した。しかし、コヒーシンの過剰発現ではSgo1機能が回復しなかった。Cdh1がコヒーシンを直接制御しているかはさらなる検証を必要とする。2)Cdh1のAPC/Cユビキチン化酵素活性化能とインナーセントロメア制御の関連性の解析。正常な染色体分配を示すHeLa-watanabe細胞に、野生型Cdh1と不活性型Cdh1(C-box変異体)の発現誘導を行える細胞株を作製し、RNAi干渉法によるCdh1活性抑制に体する相補実験を行った。野生型Cdh1では相補で来たが、C-box変異体では相補できなかった。この結果は、APC/Cのユビキチン付加酵素活性がインナーセントロメアの制御に必要な事を示唆する。3)Cdh1に結合する染色体・インナーセントメアタンパク質の探索。上記のCdh1発現誘導細胞株を用いて、核分画抽出液を調整して免疫沈降実験を行い、いくつかのタンパク質が供沈を行ったが、同定までには至っていない。今後、同定に向けた免疫沈降実験の条件設定が必要とされる。

Cdh1が分裂期に染色体に局在する事も発見しており、Cdh1がどのようにシュゴシンを制御しているか今後の解析が必要とされる。APC/C-Cdh1は基質にポリユビキチン化修飾を付加しタンパク質の分解を促進する因子である。このことから、APC/C-Cdh1は、SGO1-コヒーシンを制御する因子のタンパク質量の制御を通して、インナーセントロメアを制御している可能性を考慮し、APC/C-Cdh1の基質を探索する。コヒーシンを負に制御するWPALとCdh1をともに抑制するとSGO1の局在が戻る事から、Cdh1によるWAPLの制御があるか検証する。WAPLはこれまで知られているCdh1の結合配列を複数持っており、その部位に変異を導入した時に、Cdh1を抑制したときと同様インナーセントロメアにおけるコヒーシンとSGO1の局在量が低下するか検証する。これまでflagタグで標識したCdh1が、インナーセントロメアに隣接する動原体に局在することを観察している。クロマチン(染色体)画分から抗Flag抗体で3Flag-Cdh1を免疫沈降し、Cdh1に結合するクロマチンタンパク質を質量分析で同定し、解析の手がかりを得る。28年度が最終年度であるため、記入しない。染色体分配28年度が最終年度であるため、記入しない。