hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スパインにおける局所翻訳の網羅的解析による自閉症の病態解明

それによって、細胞質やリボソーム内に存在する各種RNAに対して、リボソームの動きをモニターし、翻訳状態をより詳しく調べることが可能になった。さらに、神経機能を調べるために、再現性の高い、マウスの行動解析プロトコルを確立させ、そのマウスを用いて、どのように神経機能の変化によって翻訳状態が変わるかを調べるための行動・翻訳解析実験系を確立させた。これらの手法を自閉症モデルマウスに応用したところ、様々なレベルにおける翻訳状態の変化を明らかにした。ライブラリーの作成および配列解析ともに、ほぼ当初の研究計画通りに研究が進んだため。これまで確立してきた翻訳解析手法を用いて、引き続き、神経細胞の細胞体と樹状突起において、神経刺激の前後で翻訳されている最中のmRNAとtRNAを同時に、かつゲノムワイドに調べることで、神経活動に依存したmRNA翻訳の全容解明を目指す。また、本年度に引き続き、マウスに対して神経刺激を誘発させる行動解析を行い、その直後に海馬を単離し、そこから特異的な神経細胞のみからリボソームを高度に精製して配列解析を行う。それによって、マウス個体を用いて、神経活動の実体をmRNAとtRNAの翻訳解析によって明らかにする。今後は特に、各tRNAコドンの使用頻度(コドン選択)、tRNA修飾や翻訳効率が神経刺激前後でどのように変わるか検討を行う。さらには、自閉症モデルマウスを用いて同様の翻訳解析を行い、分子レベルでの発達障害機構の解明に繋げていく。一方で今年度も引き続き、翻訳解析手法のさらなる効率化、高感度化、定量化を目指して、ライブラリーの作成法にも更なる改良を適宜、加えていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに確立してきた翻訳解析手法を用いて、引き続き、樹状突起部分と細胞体および神経刺激の前後で、翻訳されている最中のmRNAをゲノムワイドに調べることで、mRNA翻訳の実態解明を目指す。今後は、これまでにも用いてきた精神・神経変性疾患モデルマウスを用いた翻訳解析にも注力していく。加えて、より純粋に特異的なタイプの神経細胞のみからリボソームを単離するために、リボソームのサブユニットにタグをもつマウスを用いて、そこからリボソームに結合したRNAを高純度に単離し、ライブラリー化する手法を確立させる。これまでの予備的な実験では、上記の実験についてかなり良好な結果を得てきており、今後はそのライブラリー作成し、次世代シーケンサーで網羅的に解析する。以上から、より詳細に、神経細胞におけるnRNA翻訳の実態を解明し、自閉症モデルマウス脳由来の神経細胞における翻訳異常の分子レベルでの解明に繋げていく。
ブラジル,リオ・ドッセ湖沼群の陸水生態学的特性と湖沼類型に関する研究

本研究はブラジル,ミナスジェライス州のリオ・ドッセ湖沼群を研究対象とし,次の4点を解明する.1)熱帯湖の高い生産性の維持機構2)従来ほとんど知見のない南米中部の熱帯性草原地域の湖沼の特性3)熱帯湖における湖盆形態と生態学的特性の関係4)人類活動の熱帯湖沼生態系への影響今回はリオ・ドッセ湖沼群につき,これまでの乾季,雨季の2回の調査で明らかになった問題点,あるいは研究の不足している点について重点的に調査を実施した.その結果明らかになった興味ある諸点を列挙すれば次のごとくである.1.森林公園内外に分布する深度その他の性状の異なる15の湖について,水温の成層,光条件,水貭,クロロフィル量,動植物プランクトンの組成等を比較した.その結果,いずれの湖も堰止湖であるが,上流の浅い湖沼と下流の深い湖沼では上記の各種の性状が異なり,水の類型的な分類がこの湖沼群でも可能であることが示唆された.これは本研究の目的の一つとしていた熱帯湖の分類について,重要な知見となると考える.2.森林公園内の天然林中の湖と公園外の人工林の中の湖の比較も,本研究の重要課題である.ジャカレー湖は人工林中の湖で,とくに湖の付近で大規模な木炭の製造が行なわれており,その煙の湖水水貭への影響が危惧されている.これまでの調査でも,この湖の生物生産が異常に低いことが注目されていたが,今回の調査で水草に関し,ジャカレー湖だけでホテイアオイの生長が悪く,葉型もちがっており,葉の先端が茶色に枯れていることが観察された.3.天然林中のカリオカ湖に魚食性のトクナレが持ちこまれ,魚類組成に大きな変化が生じたらしいことは前回の調査で注目されていたが,今回の調査でさらにそれが確認され,第1回の調査の際に見られた多数の小魚がほとんど消失していた.4.カリオカ湖の主要な底生動物はフサカ幼虫であるが,今回の観測中にこのフサカ幼虫の羽化が新月の際に集中的に起るという新事実が発見された.これは水生昆虫の羽化がどのように制御されているかという同調機構の問題に,重要な知見を加えるものであると考える.本研究はブラジル,ミナスジェライス州のリオ・ドッセ湖沼群を研究対象とし,次の4点を解明する.1)熱帯湖の高い生産性の維持機構2)従来ほとんど知見のない南米中部の熱帯性草原地域の湖沼の特性3)熱帯湖における湖盆形態と生態学的特性の関係4)人類活動の熱帯湖沼生態系への影響今回はリオ・ドッセ湖沼群につき,これまでの乾季,雨季の2回の調査で明らかになった問題点,あるいは研究の不足している点について重点的に調査を実施した.その結果明らかになった興味ある諸点を列挙すれば次のごとくである.1.森林公園内外に分布する深度その他の性状の異なる15の湖について,水温の成層,光条件,水貭,クロロフィル量,動植物プランクトンの組成等を比較した.その結果,いずれの湖も堰止湖であるが,上流の浅い湖沼と下流の深い湖沼では上記の各種の性状が異なり,水の類型的な分類がこの湖沼群でも可能であることが示唆された.これは本研究の目的の一つとしていた熱帯湖の分類について,重要な知見となると考える.2.森林公園内の天然林中の湖と公園外の人工林の中の湖の比較も,本研究の重要課題である.ジャカレー湖は人工林中の湖で,とくに湖の付近で大規模な木炭の製造が行なわれており,その煙の湖水水貭への影響が危惧されている.これまでの調査でも,この湖の生物生産が異常に低いことが注目されていたが,今回の調査で水草に関し,ジャカレー湖だけでホテイアオイの生長が悪く,葉型もちがっており,葉の先端が茶色に枯れていることが観察された.3.天然林中のカリオカ湖に魚食性のトクナレが持ちこまれ,魚類組成に大きな変化が生じたらしいことは前回の調査で注目されていたが,今回の調査でさらにそれが確認され,第1回の調査の際に見られた多数の小魚がほとんど消失していた.4.カリオカ湖の主要な底生動物はフサカ幼虫であるが,今回の観測中にこのフサカ幼虫の羽化が新月の際に集中的に起るという新事実が発見された.これは水生昆虫の羽化がどのように制御されているかという同調機構の問題に,重要な知見を加えるものであると考える.
S1Pシグナリングによる癌炎症環境における悪玉エクソソーム成熟機構の解明

平成30年度は、引き続き生体細胞内局所でのS1P動態のリアルタイムイメージングを行うための、蛍光共鳴エネルキー移動(FRET)の原理を用いたS1Pセンサーの開発および改良を行った。平成29年度に作製したプロトタイプでは、蛍光光度計を用いた評価によりin vitroでのS1Pの検出に成功した。またさらにこのS1Pセンサーを培養細胞に遺伝子導入し、FRET蛍光イメージング顕微鏡システムを用いて評価を行ったところ、細胞内でのS1P検出にも成功した。世界に先駆けて細胞内でのS1P動態のイメージングに成功したことは画期的である。ただプロトタイプのS1Pに対する応答性は強いものではなく、生体の炎症環境における1細胞レベルでのS1P定量にはより高感度のS1Pセンサーが求められる。そこで平成30年度には、プロトタイプの最適化およびより鋭敏なS1Pセンサーの探索を行った。FRETによるS1PセンサーはS1P結合ドメインをシアン蛍光タンパク質(CFP)及び黄色蛍光タンパク質(YFP)でサンドイッチした構造となっており、高性能のS1Pセンサーの構築にはS1P結合ドメインのS1P結合強度および立体構造変化の大きさが重要となる。そこで、プロトタイプについてはS1P結合ドメインの立体構造情報を基にしてドメイン領域の長さを変化させ、S1P応答性の適正化を行った。その結果、より高感度なS1Pセンサーの取得に成功した。また、in silicoドッキングシミュレーションなどの解析により上記プロトタイプとは別のS1P結合ドメインを探索したところ、新たなS1P結合ドメインの候補を発見した。新規S1P結合ドメインについては、CFP、YFPを用いたFRETによるS1Pセンサーを新たに構築し、現在S1P応答性の性能評価を進めている。平成30年度は、本研究課題の最終的な目標の達成に向けて、「細胞内局所でのS1Pイメージング技術の開発」に関する研究を引き続き推進し、結果S1Pに応答するより高感度なS1Pセンサーの構築に成功した。ただS1Pの検出感度は最終的な目標である生体でのS1P定量のレベルには達しておらず、生体イメージングを実現する鋭敏なS1Pセンサーの完成に向けてさらなる開発および改良が必要である。令和元年度は、生体イメージングを実現するS1Pセンサーの開発を完遂し、転移前炎症領域における1細胞レベルでのS1P定量およびエクソソーム積荷ソーティング亢進細胞の同定を行う。これまでの研究によりS1Pセンサーの性能は確実に上がってきているため、引き続きS1Pセンサーの開発および改良を推進し、生体における1細胞レベルでのS1P定量の検出感度を実現する。その後、完成したS1Pセンサーに多胞体エンドソーム局在化タグを融合したコンストラクトを作製し、多胞体エンドソーム局所化S1Pセンサーを用いて、炎症環境において多胞体エンドソーム上でのS1P産生およびエクソソームへの積荷タンパク質のソーティングが亢進した細胞種の同定を行う。本研究課題では、申請者らが発見した生理活性脂質スフィンゴシン1-リン酸(S1P)によるエクソソームへの積荷タンパク質ソーティング機構の成果を発展させ、癌における転移候補先臓器の転移前炎症環境形成におけるS1Pシグナリングによる悪玉エクソソーム成熟機構の詳細を明らかにすることを目的としている。平成29年度は、「課題1」である「細胞内局所でのS1Pイメージング技術の開発」を行った。具体的には、生体細胞内局所でのS1P動態のリアルタイムイメージングを行うための、蛍光共鳴エネルキー移動(FRET)の原理を用いたS1Pセンサーの開発を行った。FRETによるS1PセンサーはS1P結合ドメインをシアン蛍光タンパク質(CFP)及び黄色蛍光タンパク質(YFP)でサンドイッチした構造とした。既知のS1P結合ドメインを数種類用意し、遺伝子組換え技術によりS1Pセンサーのプロトタイプを構築し、蛍光光度計を用いてS1P検出能力の評価を行ったところ、S1Pに対して有意な応答を示すS1Pセンサーが得られた。さらにこのS1Pセンサーを培養細胞に遺伝子導入し、細胞内でのS1P応答性についてFRET蛍光イメージング顕微鏡システムを用いて検討したところ、S1P添加によるS1PセンサーのFRET変化が観察された。S1P産生の細胞内での動態を観察した例はなく、今回世界に先駆けて細胞内でのS1P動態のイメージングに成功したことは画期的である。ただ現行のS1Pセンサー(プロトタイプ)のS1Pに対する応答性は弱く、課題2の遂行を視野に入れ、引き続きより鋭敏なS1Pセンサーの完成へ向けた研究開発が必要である。平成29年度は、本研究課題の最終的な目標の達成に向けて、「課題1」の「細胞内局所でのS1Pイメージング技術の開発」に関する研究を進め、結果S1Pに有意に応答するFRET原理によるS1Pセンサーのプロトタイプの構築に成功した。ただS1Pに対する応答性はまだ弱いものであり、現在より鋭敏なS1Pセンサーの完成に向けてさらなる改良を進めている。現在までのところ研究期間全体を通しておおむね順調に進展している。

世界に先駆けて細胞内でのS1P動態のイメージングに成功したことは画期的である。ただプロトタイプのS1Pに対する応答性は強いものではなく、生体の炎症環境における1細胞レベルでのS1P定量にはより高感度のS1Pセンサーが求められる。そこで平成30年度には、プロトタイプの最適化およびより鋭敏なS1Pセンサーの探索を行った。FRETによるS1PセンサーはS1P結合ドメインをシアン蛍光タンパク質(CFP)及び黄色蛍光タンパク質(YFP)でサンドイッチした構造となっており、高性能のS1Pセンサーの構築にはS1P結合ドメインのS1P結合強度および立体構造変化の大きさが重要となる。そこで、プロトタイプについてはS1P結合ドメインの立体構造情報を基にしてドメイン領域の長さを変化させ、S1P応答性の適正化を行った。その結果、より高感度なS1Pセンサーの取得に成功した。また、in silicoドッキングシミュレーションなどの解析により上記プロトタイプとは別のS1P結合ドメインを探索したところ、新たなS1P結合ドメインの候補を発見した。新規S1P結合ドメインについては、CFP、YFPを用いたFRETによるS1Pセンサーを新たに構築し、現在S1P応答性の性能評価を進めている。平成30年度は、本研究課題の最終的な目標の達成に向けて、「細胞内局所でのS1Pイメージング技術の開発」に関する研究を引き続き推進し、結果S1Pに応答するより高感度なS1Pセンサーの構築に成功した。ただS1Pの検出感度は最終的な目標である生体でのS1P定量のレベルには達しておらず、生体イメージングを実現する鋭敏なS1Pセンサーの完成に向けてさらなる開発および改良が必要である。平成30年度は、まず「課題1」の「細胞内局所でのS1Pイメージング技術の開発」を完遂し、「課題2」の「転移前炎症領域におけるエクソソーム積荷ソーティング亢進細胞の同定」までを行う。「課題1」のS1Pセンサーの開発については、現在平成29年度に作製したプロトタイプの改良に加えて、新たなS1P結合ドメインの検討を進めている。十分なFRET変化が得られるS1Pセンサーが完成した後、完成したS1Pセンサーに多胞体エンドソーム局在化タグを融合したコンストラクトを作製し、FRET蛍光イメージング顕微鏡システムを用いて多胞体エンドソーム上でのS1P産生のFRETイメージング評価を行う。また「課題2」では、「課題1」で作製した多胞体エンドソーム局所的S1Pセンサーを用いて、炎症環境において多胞体エンドソーム上でのS1P産生およびエクソソームへの積荷タンパク質のソーティングが亢進した細胞種を同定する。令和元年度は、生体イメージングを実現するS1Pセンサーの開発を完遂し、転移前炎症領域における1細胞レベルでのS1P定量およびエクソソーム積荷ソーティング亢進細胞の同定を行う。これまでの研究によりS1Pセンサーの性能は確実に上がってきているため、引き続きS1Pセンサーの開発および改良を推進し、生体における1細胞レベルでのS1P定量の検出感度を実現する。
建築的場所論の理論構築の基礎的研究

本研究は生活環境構成の実践に有効な理論的モデルを得ることにある。そのために。人間・環境に多大の関心を寄せ制作しかつ論述を残したル・コルビュジエの作品、とくに建築・環境の関連から意味深い数作品をル・コルビュジエの後期作品から選定し、その具体的な制作過程を示す図面、テキストの一次資料探索を昨年に継続して行い、データベース化を行った。一方では、歴史都市京都の生活の場としての場所的イメージの構造を、関連する近世の図絵類と詩歌を資料として抽出しデータベース化を継続して作業した。引き続いて、以上の基礎データを、制作の観点からと環境の空間知覚もしくは感覚の観点からの両面から分析、解釈を行った。これらの知見から理論化を試みるため、場所的論理、古代ギリシア思想に於けるkhoraから風土的現象の人間学的構造を記述し、生活環境の構成に関わる理論モデル構築を試みた。わが国の美意識において伝統的に言われる「見立て」や「型」を手掛かりに、ル・コルビュジエの制作における「型」、「プロトタイプ」を参照しつつ、型と原型概念を二律背反の論理から場所的論理にシフトして新たに規定し直し、一応の理論構成を得たと考える。さらに理論の一般化とその有効性を確認する作業と新しい論理性を追求し全体的に理解する努力は、今後の課題となる。平成8年度は、建築制作における「場所」の問題を、プラトン「ティマイオス」で理論的に考察される宇宙創造の第3の要素つまりknoraに比定することができるかどうかを、ひとまず純粋に理論的に考察することを試みた。始動者と質量hyleとの回互的作用を成立させる「乳母的」な場としてのkhoraは、ヴァレリーにおける[implexe(錯綜体)」としての純粋作用的な身体とどのように重なりうるか、また、メルロ-・ポンティにおける身体の「chaire encarne受肉」とどのように関わるのか、これらの問いを問うことが必然となった。この予備的な考察は、以下の研究報告において公表した。(′′L'Implexe valerienetkhora platoniciennea propos del'acte del'architecte′′(学術研究発表「建築家の行為を巡る、ヴァレリーの錯綜体とプラトンのコーラ」),communication faite au Colloque Internationalal'Universite d'Itotsubashi(Tokyo),′′Dialogues Orient et Occident sous le Regard de Pauk Valery(一橋大学主催国際シンポジウム「「東と西の対話」、ポール・ヴァレリーの眼差しの下に」,2427Septembre 1996.また他方具体的な建築的空間の現象において、どのように観察されうるかについて、従来から継続的に行っている歴史都市京都の周辺域の成立と変遷の事象の把握に努めている。その一端は日本建築学会近畿支部の研究報告として発表の予定である(小林史・加藤邦男・熊沢栄二、「建築・場所論に関する基礎的研究(IX)一歌枕から見た平安時代における嵯峨野の場所的構造」、日本建築学会近畿支部研究報告平成9年7月発表予定)。平成9年度の作業目標は、具体的な建築的事象の諸現象を統合的に説明可能な「場所」の理論構築を続け、年度末に一応の成果を得ることである。そのために。
ビュフォン『一般的個別的博物誌』に見られる自然概念と自然記述の形成について

本研究は、十八世紀フランスの博物学者ビュフォンの思想における理論的核を抽出することを目的としている。本助成を受けた研究を通じて、ビュフォンの『博物誌』における生物発生の理論と、修辞家としてのビュフォンの名を確かにした著作『文体論』とのあいだに理論的同形性が存在していることが判明した。生物の発生と人間の思考の両者に共通するこの発生論的アナロジーが、ビュフォンの思想のオリジナルな点であり、それによって生物学と文学とを架橋することが可能になっていることが明らかとなった。本研究は、18世紀フランスの博物学者ビュフォンの主著『一般的個別的博物誌』を主たる対象にして・ビュフォンの博物学の今日的意義を自然観とその記述という観点から分析することを試みるものである。本年度の成果は具体的には以下のようになる。1.文献研究,ビュフォンの著作『一般的個別的博物誌』の読解を先述した計画に従って進めた。とりわけ『博物誌』第二巻・第三巻を占める「人間の自然史」・「人間誌」を参照し、1749年当時のビュフォンの思想における人間の位置取りを確認することができた。夏期にフランスにおいて現地調査を行い、これに関連する多くの文献を参照し、入手することができた。2.他の協力者との連携:申請者は観洋一氏(中部大学)を代表とする科学研究費補助金基盤研究(B)「フランス『百科全書』研究、に研究協力者として参加していた。この研究によって集積された『百科全書』メタデータを活用することでビュフォンが『百科全書』に与えた影響の詳細を確認することができる。これらのデータを用いてビュフォンの記述にディドロが注釈を加えて編纂した項目「動物」に関する更に精緻なレベルでの読解が可能となる。この点に関しては18世紀学の国際的専門誌Recherche sur Didet etl'Encyclopedieに鷲見氏との共著論文を刊行し『百科全書』におけるデータ解析の基本作業を行うことができた。3海外での研究協力要請および文献収集:フランスでの在外調査において文献および史跡に関する調査を行い、また、ベルギーのブリュッセル自由大学哲学科、Benoit Timmermansとコンタクトを取り、研究上有効なアドバイスを得るのみならず次年度につながる研究協力体制を構築できた。今年度は引き続き、ビュフォン『博物誌』の概念的な骨子を中心に検討した。『博物誌』第1巻における「序言」におけるビュフォンの脱デカルト的な科学的探索の手法の分析から初めて、「動物誌」において展開された動物発生論、具体的には「内的鋳型」の名で知られるビュフォン独自の発生理論の仕組みと射程を再検討し、最終的に得られた成果をビュフォンが別の機会に執筆した「文体論」における文体の生成理論と比較検討することで、生物界の理論と修辞の理論とのアナロジカルな関係を抽出することができた。こうした手続きを経て、博物学的な視座から形成されたビュフォンの思想が有する生物学史上の意義および文学理論上の意義を明らかにすることができたと考えられる。とりわけ文体理論が彼の生物理論とはっきりしたアナロジカルな関係におかれていることは、従来まで指摘されてこなかった事項として特筆すべきものであると考えられる。上述の成果は国内外でそれぞれ発表され、多くの研究者から批判的に吟味する機会を設けることもできた。国内では十八世紀学会にて発表し、当時の生物理論との関係の詳細や、新プラトニズムとの関係についての教示を得ることができた。また海外では国際美学会にて発表し、十八世紀の博物学理論とアクチュアルな環境思想との接点を模索するきっかけについて多くの示唆を得ることができた。他にも、今年度に刊行した著書『ディドロの唯物論』内の補論においてビュフォンを論じた章を設けたが、執筆箇所の再検討に際して本研究の成果が適用され、確認された文体論と生物の発生理論との図式的な類似性についてそれを公表することができた。最終年度となる2011年度はビュフォン『博物誌』の前半部における動物の存在論と発生論を中心に検討し、動物と人間をめぐる当時の議論のなかに位置づけることを試みた。この課題自体は初年度から進められていたものではあるが、2011年度において具体的な進捗を見せ、論文を公刊するにまでいたった。具体的には今年度は、『博物誌』と刊行期日が近く、『博物誌』同様広い読者層に受け入れられたダランベールとディドロの編集による『百科全書』における「動物」項目との比較に重点を置いて研究を進めた。その結果として析出されたのは、理神論的な視座を保ちつつ、それが表面に出ることを慎重な仕方で避けようとしたビュフォンの思考と、そのような理神論的立場から離れてラディカルな無神論を打ち立てようとした両者の姿が、1750年前後に明白な対照として見いだされるという点である。

ビュフォン的理神論とディドロ的理神論が接合するテキストとして本研究が注目したのが、『百科全書』第1巻にある項目「動物」である。本項目はビュフォンの『博物誌』の引用の抜粋に、ディドロが独自のコメントを加えるという仕方で執筆されたものであり、両者の間テキスト性の検討を通じて、ディドロによるビュフォン注解の作業がもつ思想的な含意を詳細において測定することができた。上述の論点に関して、夏にオーストリア・グラーツでおこなわれた国際十八世紀学会において口頭発表を行った。また、それをもとにして日本語による論文一編を専門学術誌に掲載することができた。
(6-4)光産物からデュワー産物への異性化を指標とした太陽光紫外線線量計の開発

デュワー型光産物(DwP)は太陽光紫外線で誘発される二量体型損傷の一つであり、(6-4)光産物(64P)から太陽光紫外線に含まれる320nm前後の紫外線によって光異性化されて二次的に生じる。DwPは太陽光紫外線により細胞DNAに蓄積し、長く残存するためその変異原性が高いとされている。ヒトにおいてDwPに起因するリスクの推定には太陽光紫外線中に含まれる320nm付近の波長域の線量測定が必要である.しかし当該波長域(UVB-UVA境界域)の紫外線線量を測定する既存の機器は測定波長域の狭間にあるため無きに等しいのが現状である。従って本研究で開発する新しい太陽光紫外線線量計のリスク推定への寄与は大きいものと考えられる。1.64Pの光異性化の波長依存症の検討予め100J/m^2のUVCを勝者して64Pを誘発させておいたDNAに、国立岡崎共同研究機構・基礎生物学研究所に設置されている大型スペクトルグラフ装置(OLS)を用いて種々の波長の単色光紫外線を照射した。照射されたDNA標品を一本鎖化後、酵素標識免疫測定法(ELISA)にてDNA中の64P並びにDwPを測定した。64Pの測定には64M-2抗体を、DwP検出にはDEM-1抗体を一次抗体として用い検出した。その結果、DNA中に残存する64P量が低下するにつれてDwP量が増加する結果を得た。DwPの特異的誘発ピークは320nmにあり、64Pの示す特異的吸収波長に一致した。2.免疫ドットプロット法(IDB)を利用した定量的損傷検出系(太陽光紫外線線量計)の樹立Calf thymus DNAに100J/m^2のUVCを照射後、ナイロン膜(ロッシュ)にブロットし、フィルムバッジ様の太陽光受光器を製作した。次いでマイラーフイルターで300nm以下の波長をカットしたUVBランプ(東芝・FL-20SE)で種々の線量を照射した。線量測定には英弘精機のMI-2101を用いた。UVBを照射後、DwPを認識するDEM-1抗体でフイルターを処理し、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウス抗体で2時間インキュペートした.次にCDP-star(ロッシュ)を滴下して発色させた。ナイロン膜上の化学発光シグナルは富士フィルムのLAS1000で撮影して画像解析し、Science Lab 98-Image Guageversion 3によりバンド強度(band intensity)を定量化した.その結果、UVB照射線量に依存してバンド強度は直線的に増加することが明らかになった。3.フィルムバッジ型測定器の屋外試験上記のフィルムバッジ型受光器は軽量で携帯に便である。しかし曝露される線量が高すぎると累積線量が正しく示さない可能性があるため、特異的波長吸収を示さないブルーポリェチレンフィルターをフィルムにかぶせることにより線量率を低下させることに成功した。その結果、金沢における日照量の最高日(初夏から夏にかけて)の紫外線線量に匹敵する線量をも正確に測ることが可能となった。

ナイロン膜上の化学発光シグナルは富士フィルムのLAS1000で撮影して画像解析し、Science Lab 98-Image Guageversion 3によりバンド強度(band intensity)を定量化した.その結果、UVB照射線量に依存してバンド強度は直線的に増加することが明らかになった。3.フィルムバッジ型測定器の屋外試験上記のフィルムバッジ型受光器は軽量で携帯に便である。しかし曝露される線量が高すぎると累積線量が正しく示さない可能性があるため、特異的波長吸収を示さないブルーポリェチレンフィルターをフィルムにかぶせることにより線量率を低下させることに成功した。その結果、金沢における日照量の最高日(初夏から夏にかけて)の紫外線線量に匹敵する線量をも正確に測ることが可能となった。デュワー型光産物(DwP)は太陽光紫外線で誘発される二量体型損傷の一つであり、(6-4)光産物(64P)から太陽光紫外線に含まれる320nm前後の紫外線によって光異性化されて二次的に生じる。DwPは太陽光紫外線により細胞DNAに蓄積し、長く残存するためその変異源性が注目されている。従ってヒトにおけるDwPに起因するリスク推定のためには、太陽光紫外線中に含まれる320nm付近の波長域の線量測定が必要である。しかし当該波長域の紫外線線量を測定する既存の機器は、測定波長域の狭間にあるため無きに等しく、本研究で開発する太陽光紫外線線量計の意義は大きい。1.太陽光紫外線暴露により64PからDewarPが生成することの実証試験UVC(<290nm)はDNA中にシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)と64P等の損傷を誘発する。一方、様々な波長の紫外線(290nm400nm)を含む太陽光はCPD、64PとDwPを誘発する。本試験では、先ず始めに種々のUVC線量を照射したDNAに太陽光を4時間にわたって照射した。DNA中に残存している64Pと生成したDwPを損傷認識モノクローナル抗体を用いたECL(化学発光増感)-ELISA(酵素標識免疫測定法)で測定したところ、64Pの減少とDwPの増加が鏡像関係を示した。この結果は、太陽光紫外線が64Pを光異性化してDwPに変換したことを示すと同時に、64Pを誘発したDNA標品が320nm域の線量を測定する線量計となり得ることを示すものである。2.ECL法を用いたELISAの樹立3.免疫ドットブロット法(IDB)を利用した損傷検出系の開発plasmid DNAに各種の紫外線を照射し、種々の損傷修復タンパクで消化後、超螺旋型から開環型への変換を測定して検量線を求め、一方でECLを利用したIDB法を結合抗体の検出に利用して各種抗体が結合する損傷数を決定した。その結果、DwPは人工太陽光紫外線照射で多く誘発され流ことが判明した。しかもCHO細胞では64Pのそれとは異なり、CPDと同様にゆっくりと修復されることが分かった(24時間後に約50%の損傷が残存する)。従って太陽光紫外線に暴露された際の主たる損傷はCPDとDwPであり、それらは共に変異源性が高いことを示唆する結果を得た。また今後は64PからDwPへの光異性化が1分子から1分子への変換であることを何らかの方法で確認する必要がある。DwPは太陽光紫外線により細胞DNAに蓄積し、長く残存するためその変異原性が高いとされている。
荷電交換反応による２５Ｏの核構造研究

原子核は、核子数が「魔法数」を満たすと安定化する。魔法数は核構造を統べる最も基本的な秩序である。近年の研究により、放射性同位体は、地球上の長寿命核とは異なる魔法数に従うことがわかってきた。本研究では、新魔法数が創生する新秩序を理解するために、代表的な新魔法数16であるのギャップ・エネルギーを定量的に評価することを目指す。そのために、非束縛核25Oの共鳴状態を、重陽子標的の荷電交換反応により探索する。荷電交換後の陽子を精度よく測定するために、Time Projection Chamber (TPC)という軌跡測定用ガス検出器を開発する。19年2月に、放射線医学総合研究所重イオン加速器施設HIMACにおいて、TPCのテスト実験を行った。本研究で使用する検出器は、重陽子ガスで動作する特殊なTPCである。軌跡測定用のガスを、同時に重陽子反応標的として用いることで、標的中での軌跡とエネルギー損失を逐次記録し、分解能の低下を防ぐ。このTPCを動作させるには、荷電粒子の軌跡測定としての特性と反応標的としての特性を両立するように、動作パラメータ(ガス圧力、電子輸送速度、電子増幅率など)を調整しなければならない。テスト実験では、大強度の安定核ゼノン・ビームを用いて重陽子散乱を測定した。TPCと電子回路を安定的に5日間動作させることに成功した。また、ガス・パラメータを最適化することができた。測定を通して、次のような問題点が見つかった。(1)電子増幅領域で発生した電離イオンが電子ドリフト領域に逆流することにより、ドリフト電場が擾乱されていることがわかった。(2)角度分布を後方角度まで測定するには、有感領域を透過する高エネルギー重陽子を検出することが重要であることがわかった。2019年度は、これらの問題を改善することを目指す。当初の計画通り、重イオン加速器施設HIMACにおいてTime Projection Chamberのテスト実験を行うことができた。大強度の安定核ゼノン・ビームを用いた重陽子散乱を、安定的に5日間測定することに成功した。一方で、本測定を行う前に解決しなければならない改善点が見つかった。一つは、(1)電子増幅領域で生成された電離イオンによる電場の擾乱を抑えることであり、もう一つは(2)有感領域を透過する高エネルギー重陽子を検出することである。2019年度以降の推進方針を、これらの問題を改善する方向で修正する必要がある。引き続き、不安定核ビームの重陽子散乱実験に向けて、検出器システムの開発を進める。まず放射線医学総合研究所重イオン加速器施設HIMACで行った実験において明らかになった二つの問題点を解決する。(1)電子増幅領域で発生した電離イオンが、電子ドリフト領域へ逆流する現象を抑えるために、電子増幅領域の電場配位の最適化を行う。増幅領域に電極を設置し、電離イオンの流れを妨げる逆電圧を印加する。電離イオンの逆流率を定量的に評価するためのテスト・ベンチを作り、逆流率抑制の効果を評価し、電場配位を最適化する。(2)有感領域を透過する高エネルギー重陽子を検出するために、シリコン半導体検出器を開発する。理化学研究所が所有するシリコン検出器の中から最適な検出器を選定し、テストを行う。TPCのガス中に設置するためのサポートとフィードスルーを開発する。ハードウェアの開発と並行して、イベント・トリガーの生成方法のスタディを行う。エミッタンスの大きな不安定核ビームを用いる場合、反応イベントを選ぶ効率良いトリガー生成が常に問題となる。19年度上半期に、不安定核ビームを用いた重陽子非弾性散乱実験を、本課題の共同研究グループであるACTARコラボレーションと共にフランスGANIL研究所で行う。この実験は、本課題の目指す実験と、反応と手法の観点で類似している。トリガーの生成する上での改善点を、実際の実験から探る。

(1)電子増幅領域で発生した電離イオンが電子ドリフト領域に逆流することにより、ドリフト電場が擾乱されていることがわかった。(2)角度分布を後方角度まで測定するには、有感領域を透過する高エネルギー重陽子を検出することが重要であることがわかった。2019年度は、これらの問題を改善することを目指す。当初の計画通り、重イオン加速器施設HIMACにおいてTime Projection Chamberのテスト実験を行うことができた。大強度の安定核ゼノン・ビームを用いた重陽子散乱を、安定的に5日間測定することに成功した。一方で、本測定を行う前に解決しなければならない改善点が見つかった。一つは、(1)電子増幅領域で生成された電離イオンによる電場の擾乱を抑えることであり、もう一つは(2)有感領域を透過する高エネルギー重陽子を検出することである。2019年度以降の推進方針を、これらの問題を改善する方向で修正する必要がある。引き続き、不安定核ビームの重陽子散乱実験に向けて、検出器システムの開発を進める。まず放射線医学総合研究所重イオン加速器施設HIMACで行った実験において明らかになった二つの問題点を解決する。(1)電子増幅領域で発生した電離イオンが、電子ドリフト領域へ逆流する現象を抑えるために、電子増幅領域の電場配位の最適化を行う。増幅領域に電極を設置し、電離イオンの流れを妨げる逆電圧を印加する。電離イオンの逆流率を定量的に評価するためのテスト・ベンチを作り、逆流率抑制の効果を評価し、電場配位を最適化する。(2)有感領域を透過する高エネルギー重陽子を検出するために、シリコン半導体検出器を開発する。理化学研究所が所有するシリコン検出器の中から最適な検出器を選定し、テストを行う。TPCのガス中に設置するためのサポートとフィードスルーを開発する。ハードウェアの開発と並行して、イベント・トリガーの生成方法のスタディを行う。エミッタンスの大きな不安定核ビームを用いる場合、反応イベントを選ぶ効率良いトリガー生成が常に問題となる。19年度上半期に、不安定核ビームを用いた重陽子非弾性散乱実験を、本課題の共同研究グループであるACTARコラボレーションと共にフランスGANIL研究所で行う。この実験は、本課題の目指す実験と、反応と手法の観点で類似している。トリガーの生成する上での改善点を、実際の実験から探る。
錯視効果の交通システムへの活用

本研究は、音や衝撃などを付加し、錯視効果を活用した新型イメージハンプの開発およびラウンドアバウト交差点の進入口における速度抑制システムとして活用することを目的に研究遂行してきた。研究組織は心理学、交通工学、景観デザインの学際研究である。本研究では3種類のイメージハンプの研究開発、施工、走行実験検証を行った。一方、自転車道における速度抑制システムとしての研究開発も同時に行い、施工、走行実験検証を行った。これらの研究成果は、今後、導入されるラウンドアバウト交差点の進入口における速度抑制システム、中央島のシンボルサイン、誘導サインも含め、トータル交通システムとして活用されていくであろう。本研究は「錯視効果の交通システムへの活用」をテーマとして10人のメンバーによる研究組織でスタートした。11月23日には、本研究に関わる分担研究者全員を招集し協議会を開催した。研究代表者である星加は、複数の斜線が交差するジグザグパターンの凹凸効果を活かした新規デザインを含む3種類の原寸大実験モデルを公開し、研究チーム全体で施工した実験道路において走行検証実験を行った。それぞれの研究分担者による走行実験の検証、様々な角度からの検討を重ね、施工が容易で安価なライン表示によるイメージハンプに絞り、その詳細内容の特許申請を行い、2月末に受理された。デザインの主要素となるジグザグ集合パターンは、傾斜角が異なる線の集合体となることで面と同様な視覚的効果を演出し凹凸面が形成される。また視覚的効果に加え、センターライン等に使われる溶融型ラインを錯視ラインの一部に表示にすることで軽微な衝撃と音が加わり速度抑制効果が高められる。一方で、ジグザグ形状の見え方は走行速度によって異なるため、錯視ラインの幅や間隔、形状、本数に加え、設置場所(歩道手前、ラウンドアバウト手前の交差点、速度超過が予測される直線道路や曲線道路等)に応じたデザイン活用内容も盛り込まれている。それぞれの各研究分担者の成果として、本研究内容の学会等での論文発表等は本年度は出されていないが、それぞれの研究担当から以下の内容で報告を受けている。村上氏からは、メロディーロード等の騒音調査の結果報告書、古賀氏と和泉氏からは、実験道路での実走映像とVRを活用したシミュレーション映像との比較検証結果報告、松尾氏からは、ラウンドアバウトの調査研究報告、佐藤氏および藤本氏からは、自転車道に設置する速度抑制デバイス開発に向けた九州大学伊都キャンパスにおける社会実験の報告等を受け取っており、来年度発表に向けた準備は着々と進められている。信号機のない交差点であるラウンドアバウトはヨーロッパやアメリカでは多く設置されているが日本では馴染みのない交差点である。一昨年秋の法律改正に伴い円形内の車両走行が優先となり、今後、全国各地にこのシステムが広がる可能性が高くなった。平成27年8月に開催した科研メンバー全員参加による成果報告会を兼ねたシンポジウム後、平成27年度の研究計画協議でラウンドアバウト交通システム構築に特化した方向で研究遂行していく方針を定めた。研究代表者である私は9月初旬にラウンドアバウト先進国であるフィンランドに出向き複数のラウンドアバウトを調査し実測調査を念入りに行った。ラウンドアバウトは都市部より交通量が比較的少ない地方に点在している。平成28年3月に開催が決定しているエミールセーデル美術館(成果報告会会場)の周りに集中して点在することがわかり現地協力を得ることができたことも幸いした。帰国後図面作成を行いアイディア展開を進めていった。平成27年2月に仮申請したジグザグ形式イメージハンプをラウンドアバウト交通システムに組み入れた新たな内容で特許申請の内容を精査し平成27年11月に提出した。この間の研究成果発表は控えた。ラウンドアバウト円形内の造形形体は景観デザインの視点が重要なファクターとなるため、アイディアのベースとなる芸術表現としての実験制作にも主眼を置き、研究成果の発表の場として3月開催が決定している錯視芸術の展覧会開催の準備にも重きを置いた。特許申請受理後、芸術工学会秋季大会で発表を行った。エミールセーデル美術館での展覧会では、錯視効果をベースにした作品の展示に加え、応用展開として研究遂行してきたラウンドアバウト交通システムへの提案を展示会場の中で発信した。平成28年度5月開催予定の芸術工学会国際シンポジウムも同会場で行う予定であり、各分担研究者の協力体制のもとで順調に研究が進んでいる。〇平成26年度:速度抑制効果を目的としたイメージハンプの開発研究として3パターンのアイディアを学内の実験道路に施工し研究チーム全メンバーによる走行実験を行い2月に特許申請を行った。その後、熊本県警、熊本市道路局の専門スタッフ立会いで走行実験検証を行い協議した。〇平成27年度:8月に開催した科研メンバー全員参加による成果報告会を兼ねたシンポジウム後、平成27年度の研究計画協議に入り、ラウンドアバウト交通システム構築に向けた研究方針を決定した。研究代表者である私は9月初旬にラウンドアバウト先進国であるフィンランドに出向き複数のラウンドアバウトを調査し実測調査を行った。特にラウンドアバウト交通システム計画で重要になってくるのが、交差点進入手前の速度抑制方法である。そのため前年度に開発したイメージハンプを交差点手前に設置することを想定したリデザインを行った。さらに円形内に設置する立体造形物の設置計画として、従来の彫刻作品の設置ではなく誘導サインとしての役割を担う造形物のあり方を思案し総合的なデザインシステム案を打ち出した。その後、これらの提案内容を含めた特許申請内容に範囲を広げ最終提出を11月に行った。

具体的には凹凸錯視効果と容易な施工プロセス、イボ付きラインを用いた音と衝撃による速度抑制デバイスとしてのシンプルで錯視効果の非常に高いデザインとし、ラウンドアバウト交通システムへの活用を視野に入れた内容とした。特許申請受理後、九州大学で開催された芸術工学会で研究発表を行った。フィンランドのエミールセーデル美術館での展覧会(3月)では、錯視効果をベースにした作品の展示に加え、錯視の応用展開として研究遂行してきたラウンドアバウト交通システムへの提案を展示会場の中で発信した。平成28年度の5月開催予定の芸術工学会国際シンポジウムも同会場で行う予定であり、各分担研究者も発表予定である。本年度はラウンドアバウト交通システムの研究に重点を置いた研究計画に基づき研究遂行してきた。4月の熊本地震による道路の被害や家屋の被害等により様々な対応に追われる事態となったが、北欧のラウンドアバウト交通システム実地調査結果を反映した新たな提案内容がまとまり、国際学会、国際展(フィンランド)での発表を通し大きな反響を得た。また2月18日に研究組織全員による研究成果の報告会を行い、今年度の確認作業と次年度に向けた取り組みについて充実した話し合いができた。実施計画に掲げていたラウンドアバウト進入時の速度抑制効果を目的として開発した錯視効果を活用したジグザグ形式イメージハンプ(特許出願公開中)の学内実験道路における走行実験検証においても効果が確認できた。視覚面だけでなく視覚障害者への対応策である音の鳴るイボ付きラインの施工も有効であることが確認できた。またラウンドアバウト中央島に設けるシンボルサインの構築システムとして、進入口が明確に区別できる立体構成システムでは、地域の地名のイニシャル文字とシンボルデザインを組み合わせた多義立体的視点限定造形の構築方法、ならびに進入後の回転方向を示す誘導サインに視点移動造形の構築方法などを模索し、熊本県益城町を題材にした模型およびシミュレーションを作成した。この研究成果は芸術工学会フィンランド大会および日本基礎造形学会等に発表した。熊本地震では家屋だけでなく路面も膨大な被害を受け、停電による交通状況も麻痺した。ラウンドアバウトは、このような災害にも強く渋滞緩和や景観美に大きく影響する要素を多分に含んでいる。幸いにも益城町と隣接する嘉島町の工業団地内の信号機のない交差点が4箇所あり、来年度の社会実験に向けた計画が進んでおり、本研究が熊本地震で崩壊した益城町の復興のシンボルとして、熊本、日本、そして海外に向け大きく発信していきたいと考えている。本年度はラウンドアバウト交通システムの総合的な観点からのデザインシステムの構築を目標に研究遂行してきた。4月の熊本地震による道路の被害や家屋の被害等により様々な対応に追われる事態となったが、北欧のラウンドアバウト交通システム実地調査結果を反映した新たなアイディア展開が模型とシミュレーションの形でまとまった。
歯髄幹細胞及びｉＰＳ細胞の多分化能維持におけるＡＬＰの機能解明とその応用

ES細胞やiPS細胞の研究において多分化能の指標として使われているアルカリ性ホスファターゼ(ALP)の性質を調べた。歯髄組織幹細胞(DPSC)はALP活性を示さないが、DPSCから誘導されたiPS細胞は臓器非特異型のALP活性を示した。本研究に使用した腫瘍系細胞は、臓器の起源は異なるのに、いずれも臓器非特異型ALPの特徴を示した。腫瘍化することによりオリジナルの細胞のALPの型を喪失して臓器非特異型の性質を示すようになる可能性が示唆された。以上の結果は、細胞の初期化及び腫瘍化とALPの関連で興味深く研究を継続中である。1.平成25年度までに、岐阜大学の柴田研究室では、新たなヒト歯髄由来幹細胞を樹立して幹細胞性と分化能に関する検討を行い、鈴木研究室では、柴田研究室の細胞を用いて、細胞の初期化によってALP活性が発現し、そのALPのタイプを阻害剤に対する応答性から判定することが可能であることを示した。また、鈴木研究室においてもiPS細胞の培養を行える準備をした。さらに、腫瘍系のP19細胞をレチノイン酸処理して神経系の細胞に分化させ、そのALP活性の性質の変化を検出する研究を開始した。2.平成25年度には、腫瘍系のP19細胞を神経系の細胞に分化させても、ALPのタイプは変わらないがビスホスホネートに対する反応性に差が出ることを見いだした。また、その他の腫瘍系の細胞はいずれも臓器非特異型ALPの基質反応性を示すことを明らかにし、腫瘍化によりALPは特異性を失うことが示唆された。3.種々のALPを用いて、その基質特異性と阻害剤に対する感受性を広く検討した。その結果、ALPのタイプは異なっても基質に対する親和性と活性のpH依存性などALPの基質特異性はほとんど変わらないこと、また、各種の阻害剤に対する応答性はALPのタイプによって異なることを明らかにした。さらに、ALP活性の至適pHは測定時の基質によって異なりピロリン酸、リン酸化されたペプチド及びATPでは中性側にシフトすることから、生体内での基質に対してはより生理的なpHで機能することが示唆され、ALPに関する謎である、非生理的な至適pHに関して重要な情報が得られた。4.一連の研究から、iPS化した細胞及び腫瘍化した細胞のALPはいずれも臓器非特異型ALPの性質を示すことから,細胞の初期化及び腫瘍化との関連で興味深いが例数を増加させた検討が必要であり、研究を継続中である。1.岐阜大学の柴田研究室では、新たに約50ラインのヒト歯髄由来幹細胞を樹立して幹細胞性と分化能に関する検討を行った。2.iPS細胞作成に使用した、lining cell, original cell及び作成されたiPS細胞を使用して、それぞれの細胞破砕物を作成してアルカリ性ホスファターゼ(ALP)活性を測定した。lining cell及びoriginal cellの破砕物からはALP活性は検出されなかったがiPS化するとALP活性が検出されtetramizoleによって濃度依存的に阻害されることから、ALPは臓器非特異型の特徴を示した。細胞の初期化によってALP活性が発現することと、そのALPのタイプを阻害剤に対する応答性から判定するという、本研究計画の骨子となる研究成果を得ることができた。3.北海道大学の出山が岐阜大学の柴田研究室に行き、lining cell, original cell及び作成されたiPS細胞の培養及び解析法を修得し、北海道大学においても細胞培養を行える準備をした。4.ヒトの骨型、小腸型、胎盤型、肝臓型のアルカリ性ホスファターゼ及びHSC3, HSC4, Hella,Ca9-22, P19などの腫瘍系の細胞を使用してそれぞれの細胞のALP活性の阻害剤に対する応答性及びALP活性測定時の基質の性質などから、各タイプのALPの特徴を解析した。特にP19細胞は腫瘍系であるが、レチノイン酸処理することにより神経系の細胞に分化する。分化させたことによるALP活性の性質の変化について興味深い知見を得た。1.当初の計画では、iPS細胞の培養はすべて岐阜大学で行うことにしていたが、実際に研究を開始すると、すべての必要な細胞を輸送するのは困難な点があり、北海道大学でも培養行う必要が生じた。そのため、実績の概要に記載したように細胞培養と評価の方法の習得のために時間を要し、iPS細胞を使用した解析には遅れを生じた。2.しかし、岐阜大学における新たなヒト歯髄由来幹細胞の樹立と、組織発生段階の違いによる歯髄組織幹細胞の増殖能、分化能、継代の関係、iPS細胞の樹立効率、iPS細胞の増殖能、分化能、腫瘍化の解析は順調に進んでいる。

3.また、北海道大学においてはiPS細胞を使用したALP活性の解析は遅れたが、各種細胞を用いたALP活性の解析、特に阻害剤に対する応答性と基質の解析は順調に進み平成25年度に予定していた解析の一部を行っている。また、本研究計画でiPS細胞の解析と同様に重視していた腫瘍細胞を用いた細胞の増殖能・分化能とALP活性の解析は順調に進んでいる。従って、iPS細胞に関する解析の状況から「やや遅れている」としたが、その他の部分では順調に進んでいる。当初の計画どおり、平成25年度に予定していた計画と一部平成24年度に予定していたiPS細胞に関する研究を進める。具体的には、1.組織発生段階の違いによる歯髄組織幹細胞(DPSC)の増殖能・分化能及び継代とALP活性の関係、2.DPSCのALP活性とiPS細胞の樹立効率との相関の解析、3. iPS細胞の増殖能・分化能・腫瘍化とALP活性の関係、4.ALPの生理的基質となるタンパク質の同定、5.ALP阻害剤添加の培養液で培養した際のDPSC及びiPS細胞の増殖能・分化能の変化、を明らかにする。これらの研究により、ALP活性を指標に、再生医療の資源としての歯髄組織幹細胞と歯髄組織幹細胞から誘導されたiPS細胞の質を評価すること、ALPの機能を調節することにより幹細胞性を維持する方法を開発すること、ALPの基質を同定することにより細胞の初期化及び分化能のキーとなる物質を明らかにすることを目指す。1平成24年度未使用額発生の理由2月末日の時点では、発注していた物品の納入の遅れなどから、532,573円の未使用額が存在したが、3月中に、購入を予定していた物品が納入されたことから、3月末時点では残額はほとんどない。2平成24年度未使用額の平成25年度使用予定残額はわずかであるため、研究計画時の平成25年度使用予定に対する影響はない。
野兎病菌病原因子ＰｄｐＣタンパク質の機能解析

野兎病菌PdpCの変異株や相補株を用いて、野兎病菌の極めて高い感染性や病原性とPdpCの関係について検討を行った。これらの結果、野兎病菌PdpCタンパク質はマウスに対する病原性に必須であり、その病原性はC末端側の3つ(1303、1309、1324番目)のリシン残基が担っている可能性が示唆された。野兎病菌PdpCタンパク質の機能を推測する為に抗PdpC抗体で野兎病菌感染マクロファージの可溶化サンプルを免疫沈降を行ったところ、PdpCタンパク質が核酸結合性タンパク質である可能性も示唆された。また、強毒性野兎病菌がマクロファージで効率良く生育する為には、特定の遺伝子を抑制する必要性が示唆された。研究目的野兎病菌(Francisella tularensis)は極微量の菌数で宿主のマクロファージに感染・増殖後、致死性の敗血症を引き起こすグラム陰性桿菌である。本菌は極めて高い感染性と致死性を持つことから感染および発症機序を解明することは極めて重要である。これまでに野兎病菌SCHU株由来の弱毒株(マウス非致死性;SCHU P5)および強毒株(マウス致死性;SCHU P9)を作出した。両者の全ゲノム配列の比較解析の結果から、弱毒株はpdpC遺伝子中央に1塩基欠損が認められ、変異型PdpCタンパク質しか産生できない事が明らかとなっていた。この弱毒株はマクロファージにおける増殖が強毒株と比較して劣り、マウスに接種しても発症に至らなかった。そこで本研究は野兎病菌PdpCタンパク質が病原性に関与している事を明らかにすると共に、PdpCタンパク質の病原性領域を同定する事を目的とした。研究経過と成果(1)強毒株由来pdpC欠損株と弱毒株に野生型pdpC遺伝子相補した株(相補株)の作出および病原性に関する検討。野兎病菌pdpC遺伝子が病原性を規定しているのか否かを検討する為に、pdpC欠損株および相補株を新たに作出し、マクロファージおよびマウスを用いて病原性を評価した。この結果、pdpC欠損株は病原性が消失し、相補株は病原性を回復していた。これらの結果から、野兎病菌pdpC遺伝子は病原性に関与している事が明らかとなった。(2)野兎病菌PdpCタンパク質の病原性領域の決定。様々なC末端欠損PdpCタンパク質発現プラスミドで相補した株を新たに作出し、マクロファージにおける増殖を観察した。この結果、全てのC末端欠損株で増殖能の改善は見られなかった。この事から、PdpCタンパク質の1300-1328残基に病原性領域が存在する事が推測された。本申請では、動物に対する野兎病菌の極めて高い感染性や病原性と、野兎病菌PdpCタンパク質の関係について検討を行う事を目的とした。昨年度までに、(1)強毒性野兎病菌SCHU P9株のpdpC遺伝子を欠損させたΔpdpC株では、マクロファージにおける生育効率が1/10に悪化し、マウスに対する病原性が完全に消失していた。一方で、弱毒性野兎病菌やΔpdpC株に、全長をコードするpdpC遺伝子を相補すると病原性が復帰し、これらの相補株を接種したマウスは全て死亡した。この事から、野兎病菌PdpCタンパク質は病原因子である事を明らかとなった。(2)野兎病菌PdpCタンパク質の病原性を担う領域はC末端側にある事を明らかとなった。最終年度では、(3)野兎病菌PdpCタンパク質が病原性を発揮するためには、C末端側の1303、1309、1324番目の塩基性アミノ酸(リシン)が重要である可能性を示した。(4)野兎病菌PdpCタンパク質は、核酸結合性タンパク質である可能性が示した。(5)弱毒性および強毒性野兎病菌接種したマクロファージの遺伝子応答を解析を行った結果、遺伝子応答に有意な差があり、強毒性野兎病菌は免疫関連遺伝子を抑制していることが明らかとなった。以上の結果より、野兎病菌PdpCタンパク質は、マウスに対する致死性に必須であり、その病原性はC末端側の3つの塩基性アミノ酸(1302、1308、1328番目のリシン残基)に依存し、核酸結合性タンパク質である可能性が示唆された。