hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結晶構造をもとにした金属プロテアーゼ中の亜鉛による基質の活性化に関する研究

放線菌Streptomyces caespitosusが菌体外に分泌する亜鉛プロテアーゼ(ScNP)は分子量14,500と最も小型の亜鉛プロテァーゼで、これまでに見いだされている亜鉛プロテァーゼとは一次構造上の類似性は全く無い。芳香族アミノ酸側鎖、特にチロシン残基のN末端側を特異的に加水分解する。本研究ではScNPの構造・機能相関を1.6Å分解能の結晶構造(R値16.6%)を基に考察した。ScNPは5本鎖βシート、3本のαヘリックスとそれらをつなぐループからできており、2本目のヘリックス上に亜鉛プロテアーゼに共通に見られる配列H83E84XXH87が存在している。共通配列中のHis83とHiS87、Asp93の側鎖、水が亜鉛に対し4面体配位し、水分子にはさらにGlu84が水素結合している。Aspが配位子になっているのは亜鉛プロテアーゼでは初めての例である。このような配位構造は亜鉛に配位した水分子がGlu84の側鎖によって活性化され、基質中のカルボニル炭素を求核攻撃するというメカニズムを支持する。さらに、亜鉛の近傍には芳香族アミノ酸の側鎖がすっぽりと納まるようなポケットが存在している。このポケットに芳香族アミノ酸側鎖が入ることによってScNPは基質の加水分解部位を認識しているものと考えられる。また、ScNP中に存在しているカルシウムイオンが立体構造の安定化に果たす役割についても明らかにすることができた。ところで、蛋白質分子がどのような反応場を提供しているのか、その結果亜鉛はどのような役割を担っているのかをもっと精度良く知ること、反応に関わっている水素原子の位置を明らかにしそれをもとに反応のメカニズムを考察することを目的として、さらに高分解能の構造解析を目指した。その結果、実験質のX線発生装置で1.0Å、シンクロトロン放射光で0.8Å分解能のデータ測定に成功した。現在、このデータを使ってさらにScNPの立体構造精密化を行っているところで、水素原子が見え始めてきている。
慢性閉塞性肺疾患の認知機能障害とMRI画像による脳局所体積の定量的解析

慢性閉塞性肺疾患(COPD)で認知障害が報告されているが、認知機能と脳の構造変化の関連性の報告は少ない。本研究では、COPD患者と年齢を一致させた健常群に対し、MRI画像を用いて、海馬および扁桃体の体積を比較検討した。その結果、COPD患者の左海馬は対照群よりも小さかった。また、COPD患者では左扁桃体の体積と罹患期間に負の相関が認められ、長期間罹患している患者ほど左扁桃体が小さかった。海馬はストレス、低酸素によって萎縮し、扁桃体は情動の中心核である。長期の罹患による息苦しさ、不安感などのストレスが本結果をもたらした可能性がある。慢性閉塞性肺疾患(COPD)はタバコ煙を主とする有害物質を長期に吸入曝露することで生じる肺の炎症性疾患である。さらにCOPDは肺以外にも影響を与え、全身に多種の併存症を誘発する。最近ではCOPD患者の認知機能低下が指摘されるようになった。本研究の目的は、COPD患者において、脳MRI画像データを用いて海馬、扁桃体を中心とする脳の局所体積の変化を定量化し、健常人との比較によってCOPD患者の認知機能障害と脳の形態的変化との関連を明らかにすることである。それによって将来のCOPDの認知機能障害の治療展開に向けての神経生理学的な裏付けを得ることをめざす。さらには呼吸リハビリテーションを含むCOPDの治療では患者自身が疾患に取り組むセルフマネジメントの重要性が高まっており、患者の認知機能障害の存在に理解が深まれば、患者教育そしてCOPD治療の充実につながる。本研究では2015年4月より規定のマニュアルにそって脳内部位体積測定ソフトによる海馬、扁桃体の輪郭を抽出する技術の習得に努めてきた。昭和大学医学部の倫理委員会へ研究内容、同意文書、説明文書を提出し、承認を得た。これまでにCOPDの対照群としての高齢健常者群30例の嗅覚テスト、記憶テスト(MMSE、Moca)を終えた。また2016年3月より高齢健常者群でのMRI撮像を開始し、データの前処理をおこなっている。荏原病院でのCOPDにおけるMRI撮像の為、荏原病院呼吸器内科の奥田医師と頻繁にミーティングを行い、検査内容を確認するとともに、現在、荏原病院倫理委員会に承認を得るべく準備をし、現在承認待ちである。脳の内側面にある海馬、扁桃体の輪郭を抽出するのは非常に難しい技術であるが、20名の練習することにより技術が向上し、2名で同じ画像の海馬、扁桃体測定量を比較し、信頼性を確認した。また既に年齢が一致した高齢健常者において記憶テスト(MMSE、Moca)が終了しており、MRI撮像を開始した。COPD患者でのMRI検査前にどのような点において留意すべきかを研究者同士で確認し、より円滑に検査がすすめられるよう検討を重ねている。本研究の目的はCOPD患者において、脳MRI画像データを用いて海馬、扁桃体を中心とする脳の局所体積の変化を定量化し、健常人との比較によってCOPD患者の認知機能障害と脳の形態的変化との関連を明らかにすることである。COPD群の対照群である高齢健常者群30例にて、嗅覚テスト、記憶テスト(Mini Mental State Examination、Montreal Cognitive Assessment)、解剖画像撮像を完了した。現在は海馬および扁桃体の体積測定を目的とした画像前処理(頭部の位置補正、標準脳への重ね合わせ)を行っている。海馬、扁桃体の体積測定では手動により輪郭を抽出するが、主観によるバイアスを軽減させるため、ブラインド化された画像で体積測定を行い、また体積測定は2名にて行い信頼性テストを行う。体積測定手技の妥当性の最終確認を行っており、その終了後にただちに対照群30例の体積測定を実施する。COPD群での解剖画像撮像および体積測定については荏原病院倫理委員会の承認が得られ、COPD群の解剖画像撮像をまもなく開始する。理由として、荏原病院倫理委員会でのCOPD患者での研究承認を得るまでに時間を要したこと、MRI装置の入れ替え工事に時間を要したことが挙げられる。いずれもが完了しており、COPD患者でのデータ収集と解析を最優先に取り組む。高齢健常者群でのデータ収集は完了しており、本年度は集中して解析に取り組み、高齢者内での違い(記憶機能と肺機能検査との相関性、海馬体積と喫煙歴との関連性など)を明らかにする。またCOPD群においても解析を進め、高齢健常者群との比較を行う。本研究では慢性閉塞性肺疾患(COPD)のMRI画像から記憶と情動の中枢である海馬、扁桃体の体積を抽出し、年齢が一致した健常者と比較をした。またCOPDの生活習慣、認知機能検査、生理学的指標と体積がどのような関係性があるのかを検討した。

20名のCOPD患者のMRI撮像を完了し、解析前の処理(MRI画像の動き補正、標準化、画像のスムース化)を行い、画像をブラインド化した後、海馬、扁桃体の測定を2名で行った。測定後、海馬、扁桃体体積の2名での信頼性テストを行い、信頼性をSPSSより検討したところ測定者内信頼性、測定者同士の信頼性とも有意(> 0.7)であることから測定データの妥当性を得ることができた。COPDは健常者と比較し、左海馬体積の有意な減少を認めた(P < 0.05)。年齢、認知テスト、うつ尺度、活動性尺度、1秒率とそれぞれの体積との相関性をみたところ、上記のパラメーターと相関は認められなかった。左扁桃体に関してはCOPDの罹患期間に負の相関があり、罹患期間が長いほど左扁桃体の体積は小さいことが認められた(r = 0.51)。グループ比較でのCOPDの左海馬体積の有意な減少は他の要素、例えば低酸素、高二酸化炭素(有意ではないがPaCO2と海馬体積に負の相関の傾向がみられる)の影響が考えられる。また長期に渡る情動的ストレス(息苦しさなど)は扁桃体に影響を与えると考えられる。COPD発症の初期の段階で、どのような治療、行動療法、ストレスを軽減する情動的アプローチが海馬、扁桃体の体積減少の進行をとどめるのか今後の課題である。慢性閉塞性肺疾患(COPD)で認知障害が報告されているが、認知機能と脳の構造変化の関連性の報告は少ない。本研究では、COPD患者と年齢を一致させた健常群に対し、MRI画像を用いて、海馬および扁桃体の体積を比較検討した。その結果、COPD患者の左海馬は対照群よりも小さかった。また、COPD患者では左扁桃体の体積と罹患期間に負の相関が認められ、長期間罹患している患者ほど左扁桃体が小さかった。海馬はストレス、低酸素によって萎縮し、扁桃体は情動の中心核である。長期の罹患による息苦しさ、不安感などのストレスが本結果をもたらした可能性がある。高齢健常者の海馬、扁桃体体積測定を行う。MRI画像の動き補正、標準化、スムース化を行い、画像をブラインド化させ、輪郭抽出を開始する。また荏原病院での倫理委委員会承認後、COPDの患者において嗅覚テスト、記憶テスト(MMSE、Moca)を施行し、MRI撮像を開始する。海外において行われている文献の収集を行い、どのような点に特に着目し論文を作成するのが望ましいかを検討する。高齢健常者群、COPD群の記憶テストの結果、生活習慣、肺機能検査の結果と上記脳領域の体積との関連性を明らかにし、COPDに至る前にいかに健康状態を維持すべきかを明らかにし、提案していくことが重要と考える。とりわけCOPDと診断されていない高齢健常者の細かな解析結果(喫煙歴などで分類する群比較、生活習慣で分類する群比較)は、一般に向けて発信可能な情報となる。呼吸生理学、神経生理学、呼吸器内科学B-Aは138273円となった。その主たる理由は、当初は成果発表のための国内旅費10万円を見込んでいたが、成果を発表する段階ではないと判断し、国内旅費を使用しなかったためである。当初学会での研究発表のための旅費40万円を想定していたが、COPD群での研究進行が遅れたため、平成28年度は旅費として使用しなかった。途中経過を含めて成果発表を積極的に行います。そのための費用として使用します。
癒着性中耳炎の後遺症(真珠腫ならびに感音難聴)の成立機転に関する研究

過去に手術した16歳以上の癒着性中耳炎69例について骨導聴力値を正常者と比較したところ、全周波数において骨導値の低下が認められた。特に2KHz以上の高音部において聴力低下が著しいことから鼓膜の可動障害による見かけ上の骨導値の低下も存在すると考えられるが、それよりも内耳窓窩における長期にわたるは炎症(肉芽組織や黄褐色貯留液の存在)及び炎症産物が透過性の亢進した内耳窓膜を介して蝸牛に波及する(特に基底部に近い部位)可能性が示唆された。また癒着鼓膜の上皮下を組織学的に検討したところ1)炎症性肉芽型;鼓膜の著しい肥厚とリンパ球などの炎症細胞浸潤を伴う肉芽増殖、2)瘢痕組織型;線維芽細胞の増殖と弾性線維の増加を伴う、不規則な膠原線維の増主3)硝子様変性;膠原線維の崩壊、消失ならびに硝子様変性による無定型基質の沈着、4)混在型;これらの組織的変化が混在(とくに炎症肉芽型と瘢痕組織型)するもの、の4つに分類された。また表皮は一般的には上皮下の炎症の存在と密接な関係がある。表皮下の4つの組織学的所見に於ても、硝子様変性のタイプ炎症の終末像で安定した状態といえるが、線維芽細胞を主体とした瘢痕線維型は感染などにより容易に炎症細胞浸潤を主体とした炎症肉芽型に変わりうる可能性があり、癒着性中耳炎はすべて安定した病態ではなく、感染などの周囲環境の変化により真珠腫などに進展するポテンシャルを内在している病態であるといえる。耳管をブロックした動物実験において中耳腔に肉芽が形成され、鼓膜緊張部と鼓室岬部とが肉芽組織で接着しているものが観察された。これらの動物実験的観察より、癒着させるための条件として耳管機能障害に加えて、鼓膜線維層の変性に伴う菲薄化や肥厚、中耳腔粘膜の障害特に肉芽形成性の変化を惹起するような慢性炎症性刺激の特続が必要である。臨床的検討として過去に手術した16歳以上の癒着性中耳炎48例について、骨導聴力値を単純性中耳炎のそれと比較したところ、明かな骨導値の低下が認められた。とくに高音部での聴力低下が著しいことから、内耳窓窩における長期にわたる病変(肉芽組識、黄褐色の貯留液の存在など)による内耳窓膜を介しての炎症の波及による可能性が示唆された。また癒着性中耳炎の表皮および表皮下を光顕的に観察してみると、同一症例においても鼓膜の部位による違いがみられるが、線維性変化の強いものから上皮下の肉芽形成がみられる炎症像を示すものまである。そして一般的には鼓膜後上部においてリンパ球や単球浸潤を伴う慢性炎症像を示す例が多くみられた。このことは癒着性中耳炎から緊張部型真珠腫へ移行する要因の一つにあげられる。また上皮は数層の細胞からなる薄い上皮の例から、基底細胞の増殖が旺盛で厚い上皮を示すものまで様々あるが、これは上皮下の炎症の有無と密接に関係している。また殆どの例では鼓膜固有の線維層は消失し、新生したコラ-ゲン線維の増殖を認めるが、なかには鼓膜本来の線維層が残存している症例もあった。

この癒着性中耳炎の鼓膜固有層について電顕的に観察したところ、次の3つのタイプに分類された。1)炎症性肉芽型:鼓膜の著しい肥厚と炎症細胞浸潤および弾性線維の増生を伴う線維性肉芽増殖、2)癒痕組織型:鼓膜の肥厚と弾性線維増生を伴う不規則なコラ-ゲン線維増生、3)硝子型:鼓膜の菲薄化とコラ-ゲン線維の崩壊、消失ならびに硝子様変性による無定型基質の沈着。また基底細胞層には釘脚様構造の形成が認められた。そして表皮層の肥厚と角化亢進が見られた例では鼓膜内に埋没した表皮層の破片が極性を逆転して増殖している所見がみられ、真珠腫への移行の可能性も示唆された。この様に様々な変化がみられ、今後さらに継続して真珠腫への移行機序についても検討する。過去に手術した16歳以上の癒着性中耳炎72例について、骨導聴力値を慢性中耳炎や正常者と比較したところ、全周波数において骨導値の低下が認められた。とくに2KHZ以上の高音部において聴力低下が著しいことから、内耳窓窩における長期にわたる炎症(肉芽組織や黄褐色貯留液の存在)が内耳窓膜を介して蝸牛に波及する(とくに基底部に近い部位)可能性が示唆された。また癒着鼓膜の上皮下を組織学的に検討したところ次の4つのタイプに大きく分類された。1)炎症性肉芽型;鼓膜の著しい肥厚と炎症細胞浸潤および弾性線維の増生を伴う線維性肉芽増殖、2)瘢痕組織型;線維芽細胞の増殖と弾性線維の増加を伴う、不規則な膠原線維の増生、3)硝子様変性;膠原線維の崩壊、消失ならびに硝子様変性による無定型基質の沈着、4)混在型;これらの組織的変化が混在して認められるもの。また表皮は数層の細胞からなる薄い表皮をしめすものから、基底細胞の増殖が旺盛で厚い表皮を示す例までいろいろあるが、一般的には上皮下の炎症の存在と密接な関係がある。また表皮層の肥厚と角化亢進が見られた例では癒着鼓膜内に埋没した表皮層の破片が極性を逆転して増殖している所見が見られ、真珠腫への移行の可能性が示唆された。表皮下の4つの組織学的所見に於ても、硝子様変性のタイプは炎症の終末像で安定した状態といえるが、線維芽細胞を主体とした瘢痕線維型は感染などにより容易に炎症細胞浸潤を主体とした炎症肉芽型に変わりうる可能性があり、癒着性中耳炎はすべて安定した病態ではなく、感染などの周囲環境の変化により真珠腫などに進展するポテンシャルを内在している病態であるといえる。また内耳窓窩の病変の長期間にわたる存在は感音難聴発現の可能性を示唆している。
褥瘡に対する細胞療法の確立と創治癒メカニズムの解明に関する基礎研究

褥瘡は臥床患者のQOLを大きく阻害し、有効な治療法の開発が必要である。脂肪幹細胞は、筋前駆細胞である筋芽細胞への分化と増殖因子を誘導し、褥瘡組織の細胞治療源となり得る。また筋芽細胞の創部位への移植も有力な細胞治療源となり得る。本研究では、褥瘡に対する細胞療法の確立を目指して、脂肪幹細胞および筋芽細胞の移植による褥瘡の創傷治癒・回復に与える効果と創治癒メカニズムの一端を褥瘡モデルで明らかにする。
非線形光学プローブによる室温人工マルチフェロイック物質の開拓と新機能創出

本研究では、光の波長サイズ以下のナノ空間を人工的に設計・制御することで、多機能性と室温動作を兼ね備える革新的な人工マルチフェロイック物質の開発を行うことを目的とする。本年度は、数種類の人工マルチフェロイック薄膜を作製し、それを用いた磁気光ガルバノ効果の測定や光第二高調波発生の検出を行った。まず、垂直磁気異方性を持つ室温強磁性体に数百ナノメートル程度の人工構造を電子線描画により導入し、「空間反転対称性の破れ」と「時間反転対称性の破れ」を同時に満たす人工マルチフェロイック物質を作製した。試料の評価は原子間力顕微鏡などを用いて行い、設計通りの構造ができていることを確認した。また、試料の磁気特性の評価を磁気Kerr効果やFaraday効果を用いて行った。次に、フェムト秒レーザー(波長:690-1040nm、パルス幅:100fs、繰り返し周波数:80MHz)により対称性を制御した人工マルチフェロイック物質を励起したところ、外場を印加することなく光電流(スピン偏極電流)が流れることが分かった。また、光の偏光によりその流れる方向や大きさを制御できることが明らかになった。昨年度購入した一体型広波長域フェムト秒レーザーを用いた測定系の整備が終わり、予定通り研究を行うことができている。室温強磁性体に人工的な非反転対称構造を導入することで、「空間反転対称性の破れ」と「磁気(スピン)」を組み込んだ室温人工マルチフェロイック物質を作製する。また、そのような「空間反転対称性の破れ」と「時間反転対称性の破れ」に起因した新規光機能を探索する。具体的には、・イオンビームスパッタ装置、イオンビームエッチング装置、電子線描画装置などを用いた人工マルチフェロイック物質の作製・原子間力顕微鏡などを用いた試料評価・磁気カー効果やファラデー効果を用いた磁気特性の評価・フェムト秒レーザー励起による光第二高調波発生や磁気光ガルバノ効果の測定などを行う。本年度は、数種類の人工マルチフェロイック物質を作製し、それを用いた光第二高調波発生(SHG)の観測を行った。まず、室温強磁性体に非空間反転対称な構造を電子線描画により導入し、「空間反転対称性の破れ」と「時間反転対称性の破れ」を同時に満たす人工マルチフェロイック物質を作製した。次に、人工マルチフェロイック物質の機能を検証するために、SHGの検出を試みた。試料から発せられるSHGシグナルが微弱なため、今年度の予算で一体型広波長域フェムト秒レーザー(波長:690-1040nm、パルス幅:100fs、繰り返し周波数:80MHz)を購入し、さらにフォトンカウンティングシステムを構築した。これにより、Faraday・Voigtの両配置で、±200mTまでの磁場を印加した際の精密なSHG測定が可能になった。現状確認できているシグナルの強度はまだ小さいものの、明瞭な磁気ヒステリシスを持つSHGシグナルを観測することに成功している。このように、人工マルチフェロイック物質の作製とその機能を開拓するための測定環境が整った。計画通り、一体型広波長域フェムト秒レーザーを購入し、また、フォトンカウンティングシステムを構築することができた。これにより、微弱な光を検出するための測定環境を整えることができた。また、そのような「空間反転対称性の破れ」と「時間反転対称性の破れ」を非線形磁気光学効果を用いて検出する。

具体的には、・イオンビームスパッタ装置、イオンビームエッチング装置、電子線描画装置などを用いた人工マルチフェロイック物質の作製・原子間力顕微鏡などを用いた試料評価・フェムト秒レーザー励起による光第二高調波発生や磁気光ガルバノ効果の測定などを行う。室温強磁性体に人工的な非反転対称構造を導入することで、「空間反転対称性の破れ」と「磁気(スピン)」を組み込んだ室温人工マルチフェロイック物質を作製する。また、そのような「空間反転対称性の破れ」と「時間反転対称性の破れ」に起因した新規光機能を探索する。具体的には、・イオンビームスパッタ装置、イオンビームエッチング装置、電子線描画装置などを用いた人工マルチフェロイック物質の作製・原子間力顕微鏡などを用いた試料評価・磁気カー効果やファラデー効果を用いた磁気特性の評価・フェムト秒レーザー励起による光第二高調波発生や磁気光ガルバノ効果の測定などを行う。
標的分子との空間的相互作用のコントロールを指向したナノアセンブリー薬剤の分子設計

本研究は,ドラッグをデンドリマーの手法を用いて球の表面に一定方向で固定したナノアセンブリー分子を設計・合成し,そのドラッグが本来持つ生物活性がどのように変化するか,キラリティーを超えるドラッグを作り出すことができるか,の2点を明らかにすることを目的とする.この目的を達成するためのリード化合物としてブレフェルジンA,スワインソニン,免疫抑制剤FTY720を選択した.本年度(最終年度)は,前年度までに分子設計・合成した種々のナノアセンブリー分子の鶏胚漿尿膜(CAM)法による血管新生阻害活性について評価した.免疫抑制剤FTY720は,冬虫夏草から単離された免疫抑制作用を示すISP-1(myriocin)の化学修飾によって不斉炭素を除去した,つまりキラリティーをなくした合成化合物であり本研究の目標に適したリード化合物である.FTY720のアルキル側鎖をアセチレンに置換したTX-2148(モノイン),TX-2152(ジイン),TX-2256(トリイン)の血管新生阻害活性はそれぞれ42%,90%,60%(10μg/CAM)であり,TX-2152はFTY720(77%)と同等以上の阻害活性を示した.この結果より,FTY720のオクチル基に対するバイオアイソスターとして疎水性及び分子サイズの大きく異なるジイン(もしくはトリイン)構造が示された.その理由として,剛直なポリイン構造によって分子の自由度が制限されるとともに,標的分子との相互作用の際の方向性が規定されたためではないかと考えられる.以上より,一定方向で固定したナノアセンブリー分子の生物活性がプラスに変化する事例を見出すことに成功したといえる.本研究は,薬剤分子を一定方向に固定することで分子の一面のみを標的と相互作用させ,その薬剤が持つ薬理活性がどのように変化するかを調べ,キラリティーを超えるドラッグを作り出すことを目的としている.そのために,本年度は,薬剤分子を固定するための剛直かつ直線構造を持つポリイン(連続する三重結合)側鎖の合成について検討した.まず4位置換フェノールをトリフラート化したのちピロリジン中TMS-アセチレン,ジクロロビストリフェニルボスフィンパラジウム,ヨウ化銅を用いた園頭反応を行ったが,目的物の生成は確認できなかった.そこで,アセトニトリルを溶媒としてTMS-アセチレン,ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム,トリエチルアミンにより反応を行ったところ,目的とするアセチレン化合物(1)を78%の収率で得ることに成功した.次に,ポリイン側鎖構築のためにアセチレンの増炭の条件検討を行った.先に合成した(1)を脱シリル化,次いでブロモ化した後,TMS-アセチレンとのカップリング反応を行ったところ,目的とするジイン(2)を51%の収率で得た.これによりアセチレン増炭の反応条件が確立できたので,今後,目的とする長さのポリイン側鎖を合成していく予定である.薬剤分子のモデルとして我々が選択したブレフェルジンA(BFA)に関しては,4位及び7位ヒドロキシル基の選択的保護・脱保護の反応条件を検討しており,7位ヒドロキシル基選択的にポリイン側鎖を導入できる条件を現在検討中である.本研究は,ドラッグをデンドリマーの手法を用いて球の表面に一定方向で固定したナノアセンブリー分子を設計・合成し,そのドラッグが本来持つ生物活性がどのように変化するか,キラリティーを超えるドラッグを作り出すことができるか,の2点を明らかにすることを目的とする.この目的を達成するためのリード化合物としてブレフェルジンA(BFA)及びスワインソニン(SWA)を選択した.本年度は,前年度に引き続き,ナノアセンブリー分子の設計・合成について検討した.BFAの4,7位ヒドロキシル基及びSWAの5位を橋頭堡として直線構造を有するポリインリンカーの導入を試みた.BFAの4位水酸基をアセチル化,7位水酸基をメシル化し,次いで,4-ヒドロキシベンズアルデヒドの水酸基をシリル基で保護した後3工程で末端プロモアルキンへと変換し,TMS化後脱保護したものとカップリングしたが,目的物は得られず原料回収に終わった.現在,反応条件を検討中である.SWAに関しては,SWA合成中間体と4位アセチレン化アセトフェノンとの立体選択的Mannich反応により,SWAの5α位にアセチレンを導入した分子の合成に成功した.得られた分子のJack bean α-mannosidaseII阻害活性は,IC50=0.94μMであり,SWAに比べて1/4程度に低下した.現在,別の生物活性の評価系として,鶏胚しょう尿膜(CAM)法による血管新生阻害活性を検討中である.本研究は,ドラッグをデンドリマーの手法を用いて球の表面に一定方向で固定したナノアセンブリー分子を設計・合成し,そのドラッグが本来持つ生物活性がどのように変化するか,キラリティーを超えるドラッグを作り出すことができるか,の2点を明らかにすることを目的とする.この目的を達成するためのリード化合物としてブレフェルジンA,スワインソニン,免疫抑制剤FTY720を選択した.本年度(最終年度)は,前年度までに分子設計・合成した種々のナノアセンブリー分子の鶏胚漿尿膜(CAM)法による血管新生阻害活性について評価した.免疫抑制剤FTY720は,冬虫夏草から単離された免疫抑制作用を示すISP-1(myriocin)の化学修飾によって不斉炭素を除去した,つまりキラリティーをなくした合成化合物であり本研究の目標に適したリード化合物である.

FTY720のアルキル側鎖をアセチレンに置換したTX-2148(モノイン),TX-2152(ジイン),TX-2256(トリイン)の血管新生阻害活性はそれぞれ42%,90%,60%(10μg/CAM)であり,TX-2152はFTY720(77%)と同等以上の阻害活性を示した.この結果より,FTY720のオクチル基に対するバイオアイソスターとして疎水性及び分子サイズの大きく異なるジイン(もしくはトリイン)構造が示された.その理由として,剛直なポリイン構造によって分子の自由度が制限されるとともに,標的分子との相互作用の際の方向性が規定されたためではないかと考えられる.以上より,一定方向で固定したナノアセンブリー分子の生物活性がプラスに変化する事例を見出すことに成功したといえる.
ギリシア伝統音楽再編過程の研究：ポリティコ・ラウートを中心に

本研究はギリシアの伝統楽器ポリティコ・ラウートを中心にその実態調査をとおして、制度の外における自発的な動きを掬い上げ、伝統音楽の再編過程を明らかにしようとするものである。伝統音楽復興の動きのなかで同時期に再発見され、公教育に導入された楽器タブラスと比較し、ポリティコ・ラウートには多様性が観察される。両者の比較を通じて、伝統音楽を担う音楽家たちの創造的な取り組みがいかにその範疇の再定義、再編につながっているのかを、エコミュージコロジーや創造的実践としての演奏研究といった近年の研究動向の知見を取り入れて、つまびらかにする。
質量分析法による大きな糖質の構造解析,タンパク質との相互作用及び糖包接錯体の解明

1.質量分析法による糖質とタンパク質の構造解析:既に質量分析法により得られているコレラトキシンB-サブユニットとガングリオシドGM1aの水素結合性超分子は,非特異的な結合を有している可能性がある.そこて,質量分析法によると特異的結合機構解析を追究するため,糖結合活性が強いレクチンとその糖鎖を疎水性膜上で結合させ,非特異的結合を洗浄除去後,ESI法で測定した.その結果,会合体由来のピークのみが検出され,質量分析法による特異的結合性会合体検出の可能性が示された.また,タンパク質構造の溶媒依存性も質量分析法により確認できた.現在,MALDI法による解析も併せて検討中である.2.高度に複雑な複合糖質の構造決定:他の方法では分析が難しい超微量ガングリオシドや生理活性を有する共有結合性糖ペプチドについて,質量分析法を用いて解析した結果,非常に有用な情報がえられた.前者ではウシ脳より得られたDhol-1ガングリオシドはシアル酸がα-結合している極めて珍しい構造であることが判明し,後者からは共有結合性糖ペプチトの結合ドメインの解析に成功した.以上のように,タンパク質と糖鎖の構造解析及び特に生理機能が注目されている微量なガングリオシドや糖ペプチドの解析に,質量分析法は極めて有用な手法であることが分かった.3.コンドロイチン硫酸及びへパリン,ヘパラン硫酸系糖質の解析:正及び負FABMS CID-MS/MS法を用い,硫酸基の結合位置を決める手法を確立した.4.シクロデキストリン包接錯体の構造研究:ホスト及び光学異性体ゲスト超分子の質量分析法による識別など来年度の継続課題とする.1.質量分析法による糖質とタンパク質の構造解析:既に質量分析法により得られているコレラトキシンB-サブユニットとガングリオシドGM1aの水素結合性超分子は,非特異的な結合を有している可能性がある.そこて,質量分析法によると特異的結合機構解析を追究するため,糖結合活性が強いレクチンとその糖鎖を疎水性膜上で結合させ,非特異的結合を洗浄除去後,ESI法で測定した.その結果,会合体由来のピークのみが検出され,質量分析法による特異的結合性会合体検出の可能性が示された.また,タンパク質構造の溶媒依存性も質量分析法により確認できた.現在,MALDI法による解析も併せて検討中である.2.高度に複雑な複合糖質の構造決定:他の方法では分析が難しい超微量ガングリオシドや生理活性を有する共有結合性糖ペプチドについて,質量分析法を用いて解析した結果,非常に有用な情報がえられた.前者ではウシ脳より得られたDhol-1ガングリオシドはシアル酸がα-結合している極めて珍しい構造であることが判明し,後者からは共有結合性糖ペプチトの結合ドメインの解析に成功した.以上のように,タンパク質と糖鎖の構造解析及び特に生理機能が注目されている微量なガングリオシドや糖ペプチドの解析に,質量分析法は極めて有用な手法であることが分かった.3.コンドロイチン硫酸及びへパリン,ヘパラン硫酸系糖質の解析:正及び負FABMS CID-MS/MS法を用い,硫酸基の結合位置を決める手法を確立した.4.シクロデキストリン包接錯体の構造研究:ホスト及び光学異性体ゲスト超分子の質量分析法による識別など来年度の継続課題とする.
Wolfram症候群ヒト疾患iPS細胞による難聴の病態解明と革新的治療法の探索

小型霊長類コモンマーモセットを用いてWFS1遺伝子の霊長類蝸牛での発現パターンを同定した(Suzuki N, 2016)。マーモセットでは齧歯類と異なって血管条基底細胞にも認められ、WFS1遺伝子変異を伴う遺伝性難聴の病理組織学的報告における細胞萎縮部位と一致を見た。これまで遺伝子改変モデルではヒトの複雑なWFS1関連難聴が再現されておらず、ヒト難聴の理解には血管条基底細胞の解析が重要と考えられた。この結果を踏まえ、健常者由来iPS細胞からWFS1陽性内耳細胞を作成し、機能解析を行った。現在患者由来iPS細胞で同様の検討を行っており、その表現形から新規病態発見と治療法の探索を進めていく。Wolfram症候群は糖尿病、視神経萎縮、尿崩症、難聴、尿路異常、多彩な精神症状などを合併する劣性遺伝疾患で、その原因遺伝子として小胞体機能に必須の膜タンパクwolframinをコードするWFS1遺伝子が同定されている。本症候群の感音難聴は典型的には進行性の高音障害型感音難聴だが、変異によっては低音障害型を呈するとの報告もあり、なぜWolfram症候群患者において進行性難聴が生じるか、なぜ聴力型にバリエーションがあるかは明らかになっていない。そこで今回我々は、ヒトES/iPS細胞からの高効率内耳細胞分化系を用いて、Wolfram症候群患者から樹立された疾患iPS細胞より内耳細胞を分化誘導し、難聴発症の機序とその治療標的としての可能性を検討する。平成27年度はこの第一段階として、まずWFS1遺伝子発現の"霊長類パターン"を同定した。すでに本年度、我々はさまざまな難聴遺伝子の霊長類蝸牛における発現パターンを、小型霊長類コモンマーモセットを用いて検討し報告してきた(Hosoyaら、Sci Rep 2016, Neurosci Res 2016, in revision 2016, Suzukiらsubmitted)が、マーモセットでのWFS1の遺伝子発現パターンは齧歯類と異なって血管条基底細胞にも認められた。興味深いことにWFS1遺伝子変異を伴う遺伝性難聴の病理組織学的報告においては血管条の萎縮が報告されている。また渉猟し得る限りにおいて、WFS1遺伝子に関する遺伝子改変モデルではヒトの複雑なWFS1関連難聴が再現されていない。我々の結果は、WFS1難聴に関する種差の存在を示唆しており、特にヒト特異的な症候は、血管条基底細胞の異常に起因している可能性がある。この結果に基づいて、来年度からは血管条基底細胞に焦点を絞って疾患iPS研究を展開する予定である。マーモセットを用いた検討により、疾患iPS研究において血管条基底細胞が解析対象として重要であると示したことは、今後の研究の方向性を確定する意味で大きい。他方入手した疾患由来iPS細胞からの分析に難航しており、全体としてはやや遅れている。本症候群の特徴的な感音難聴の病態生理解析を目的に、ヒトES/iPS細胞からの高効率内耳細胞分化系を用いて、Wolfram症候群患者から樹立された疾患iPS細胞より内耳細胞を分化誘導し、難聴発症の機序とその治療標的の探索を行う。昨年度(平成27年度)はこの第一段階として、まずWFS1遺伝子発現の"霊長類パターン"を小型霊長類コモンマーモセット蝸牛を用いて同定し、報告した(Suzukiら2016)。興味深いことに、マーモセットでのWFS1の遺伝子発現パターンは齧歯類と異なって血管条基底細胞にも認められ、WFS1遺伝子変異を伴う遺伝性難聴の病理組織学的報告における細胞萎縮部位と一致を見た。これまでWFS1遺伝子に関する遺伝子改変モデルではヒトの複雑なWFS1関連難聴が再現されておらず、ヒト難聴の理解には血管条基底細胞の解析が重要と考えられた。平成28年度の解析で、健常者由来iPS細胞からWFS1陽性内耳細胞への分化誘導に成功し、本疾患における内耳疾患iPS研究が技術的に可能であることが示された。他方、共同研究先より入手した疾患iPS細胞から耳包様内耳前駆細胞の誘導を試みたが、残念ながら効率の良い誘導が困難だった。これまで当科で樹立したiPSラインではこのような経験はないことから、海外の供与元での樹立法と国内の樹立法の違いや、輸送による影響がその理由として考えられた。入手した疾患iPS細胞からは耳包様内耳前駆細胞の効率の良い誘導が困難だった。本症候群の特徴的な感音難聴の病態生理解析を目的に、ヒトES/iPS細胞からの高効率内耳細胞分化系を用いて、Wolfram症候群患者から樹立された疾患iPS細胞より内耳細胞を分化誘導し、難聴発症の機序とその治療標的の探索を行うこと目標とした。

本研究では、WFS1遺伝子発現の"霊長類パターン"を小型霊長類コモンマーモセット蝸牛を用いて同定し、報告した(Suzukiら2016)。興味深いことに、マーモセットでのWFS1の遺伝子発現パターンは齧歯類と異なって血管条基底細胞にも認められ、WFS1遺伝子変異を伴う遺伝性難聴の病理組織学的報告における細胞萎縮部位と一致を見た。これまでWFS1遺伝子に関する遺伝子改変モデルではヒトの複雑なWFS1関連難聴が再現されておらず、ヒト難聴の理解には血管条基底細胞の解析が重要と考えられた。次に、健常者由来iPS細胞からWFS1陽性内耳細胞への分化誘導に成功し、本疾患における内耳疾患iPS研究が技術的に可能であることが示された。他方、共同研究先より入手した疾患iPS細胞から耳包様内耳前駆細胞の誘導を試みたが、残念ながら効率の良い誘導が困難だった。これまで当科で樹立したiPSラインではこのような経験はないことから、海外の供与元での樹立法と国内の樹立法の違いや、輸送による影響がその理由として考えられた。血管条基底細胞でのWFS1の機能を、WFS1変異iPS細胞由来血管条基底細胞で検討する。現在まだ解析の途中であるが、引き続き解析をしていく。小型霊長類コモンマーモセットを用いてWFS1遺伝子の霊長類蝸牛での発現パターンを同定した(Suzuki N, 2016)。マーモセットでは齧歯類と異なって血管条基底細胞にも認められ、WFS1遺伝子変異を伴う遺伝性難聴の病理組織学的報告における細胞萎縮部位と一致を見た。これまで遺伝子改変モデルではヒトの複雑なWFS1関連難聴が再現されておらず、ヒト難聴の理解には血管条基底細胞の解析が重要と考えられた。この結果を踏まえ、健常者由来iPS細胞からWFS1陽性内耳細胞を作成し、機能解析を行った。現在患者由来iPS細胞で同様の検討を行っており、その表現形から新規病態発見と治療法の探索を進めていく。疾患iPS研究において血管条基底細胞を誘導して解析する。健常者由来iPS細胞からWFS1陽性内耳細胞への分化誘導に成功している。ゲノム編集によるisogenicラインを作成するアプローチと、WFS1難聴患者をリクルートし、iPS細胞を樹立するアプローチの双方から進めていく。耳科学iPS細胞を用いた研究の初期段階で予想外に時間がかかっており、費用を要するその研究の後半部分が開始されないため、今回用いられなかった分を次年度の研究に用いる必要があるため。疾患iPS細胞を樹立する患者のリクルートに難航しており、疾患研究が開始できなかった。疾患iPS研究に用いる。患者がエントリー次第、iPS細胞樹立を行う。
遺伝子破壊法によるヒストンバリアントの機能解析に関する共同研究

真核細胞における転写制御に関する研究は、様々な転写制御因子複合体の側面から数多く行われ、膨大な知識が蓄積してきた。しかし、その機構は極めて複雑で、いまだ不明な点が多い。一方、転写制御に関して、クロマチン構造自体の関与が期待されて久しい。私共は、ニワトリヒストン遺伝子群は合計44個から成り、そのほとんどが約110kbの一つのクラスターに局在すること、H4を除くH1,H2A,H2B,H3の各ヒストンサブタイプに、アミノ酸配列の異なる6種、3種、4種、2種の異型(バリアント)が存在することなどを明らかにした。これらの各バリアントが、ヌクレオソームの各サブタイプの位置に等価にカセッティングされ得るなら、ヌクレオソーム構造として数百数千の可能性がある。さらに、ヒストン分子はアセチル化、リン酸化などの修飾を受けるため、その構造の多様性はさらに高くなる。本研究課題で、これらのヒストン遺伝子およびヒストンバリアントの真の生理機能を明らかにすることを目的とし、ニワトリBリンパ細胞株DT40でジーンノックアウト法を用いて、種々のヒストン遺伝子欠失変異株を作製し、その性状を解析することによって、以下の成果を得ることが出来た。1、各ヒストンサブタイプの遺伝子群には、主要な12個の遺伝子が欠失しても、残りのメンバーの転写量が増加し、ヒストン量を一定に保つ自己補償機構が存在した。2、110kbのヒストンクラスターのonealleleを欠失しても、残りのalleleの遺伝子の発現量が増大し、全てのヒストンサブタイプは質的、量的に変化せず、結果的に細胞機能に変化が認められなかった。3、21個のヒストン遺伝子を含む57kbセグメントのtwo allelesを欠失した変異株で、残りの遺伝子の発現が増加し、ヒストン量は一定に保たれ、増殖速度、グローバルなクロマチン構造などは不変だった。しかし、4種のH1バリアント、1種のH2Bバリアントの消失を伴ったこの変異株の蛋白質の2D-PAGEパターンは変化していた。5、6個(12コピー)のH1遺伝子中、11コピーを欠失した変異株では、H1は約半量に減少し、逆にHMGは約2倍増加していた。増殖速度、グローバルなクロマチン構造に変化はなかったが、蛋白質の2D-PAGEパターンに変化が認められた。この結果は細胞の生存には1コピーのH1遺伝子、約半量のH1で十分であることを示している。6、6種のH1バリアントをそれぞれ欠失した変異株で、蛋白質の2D-PAGEパターンに特異的な変化が認められた。この結果は各H1バリアントは特定の遺伝子発現制御に係わっていることを示している。以上の結果に基づいて、今後さらに、ヌクレオソーム構造の多様性を規定するヒストンバリアント、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ遺伝子などを欠失したDT40変異株を系統的に作製し、これら一連のクロマチン改変細胞の核(あるいはクロマチン)機能を詳細に解析し、特異遺伝子の発現制御に係わる核蛋白質の機能を明らかにしたい。得られる結果は、各ヒストンバリアントが組織特異的出現パターンを示すこと等と合わせ、高等真核生物の組織特異的な遺伝子発現制御機構解明の手がかりに成り得ると思われる。5、6個(12コピー)のH1

遺伝子中、11コピーを欠失した変異株では、H1は約半量に減少し、逆にHMGは約2倍増加していた。増殖速度、グローバルなクロマチン構造に変化はなかったが、蛋白質の2D-PAGEパターンに変化が認められた。この結果は細胞の生存には1コピーのH1遺伝子、約半量のH1で十分であることを示している。6、6種のH1バリアントをそれぞれ欠失した変異株で、蛋白質の2D-PAGEパターンに特異的な変化が認められた。この結果は各H1バリアントは特定の遺伝子発現制御に係わっていることを示している。以上の結果に基づいて、今後さらに、ヌクレオソーム構造の多様性を規定するヒストンバリアント、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ遺伝子などを欠失したDT40変異株を系統的に作製し、これら一連のクロマチン改変細胞の核(あるいはクロマチン)機能を詳細に解析し、特異遺伝子の発現制御に係わる核蛋白質の機能を明らかにしたい。得られる結果は、各ヒストンバリアントが組織特異的出現パターンを示すこと等と合わせ、高等真核生物の組織特異的な遺伝子発現制御機構解明の手がかりに成り得ると思われる。ニワトリの各ヒストンサブファミリー遺伝子は612コピー存在し、合計44コピーと比較的少ない。さらに、これらのほとんどが約110kbの1つのクラスター内に存在するため、真核生物のヒストン遺伝子群の全体像を把握するのに最適の系である。本研究では、高頻度にターゲット・インチグレーションを起こすニワトリBリンパ細胞株DT40で、ジーン・ノックアウト法を用い、ヒストン遺伝子の機能に関して、以下の点を明らかに出来た。1、全H3mRNA量の約25%を占めるH3-IV/H3-Vを欠失した変異株で、残り全てのH3遺伝子の発現量が増大し、全H3mRNA量は一定に保たれていた。この結果、増殖速度に変化がなかった。2、11コピーのH3遺伝子のうち、4つに関してシス配列を同定したところ、個々の遺伝子に特異的な配列の他に、1つのCCAAT配列が共に必須であった。したがって、この配列が自己補償機能に関与している可能性がある。3、H2B遺伝子は8コピー存在する。全H2BmRNA量の約10%を占めるH2B-Vを欠失した変異株で、残りのH2B遺伝子の発現量が増大し、全H2BmRNA量は一定に保たれていた。この増大効果は残りのH2B遺伝子全てに共通であった。さらに、変異株の蛋白質の2次元電気泳動パターンは野生株のそれと異なっていた。4、6コピー存在するH1遺伝子の中の1つ(01H1)を欠失した変異株でも、残り全てのH1遺伝子の発現量が増大し、全H1mRNA量は一定に保たれていた。さらに、2次元電気泳動による分析の結果、変異株の蛋白質パターンが変化していることが示された。以上の結果から、全てのヒストン遺伝子群は自己の転写産物を一定に保つ自己補償機構を有していることが明らかになった。さらに、各ヒストンバリアントはそれぞれ特定の遺伝子の発現制御に関与していることも示唆された。私共は、ニワトリヒストン遺伝子群は、6個のH1,11個のH2A,8個のH2B,11個のH3,8個のH4で形成され、合計44個の中、39個は110kbの1つのクラスターに含まれていることを明らかにした。さらに、6種のH1バリアント、3種のH2Aバリアント、4種のH2Bバリアント、2種のH3バリアントの存在も明らかにした。
病院汚水中薬剤耐性菌の実態解明：汚水は薬剤耐性菌の拡散経路となっているのか？

本研究では薬剤耐性菌の環境中拡散を検討することを目的に、1病院(耐性菌の出現場所)、2下水・3下水処理場(耐性菌が病院から出ていく経路)、4処理場下流の河川水(耐性菌が流出するおそれのある野外環境)から耐性菌を分離し、その特徴を培養性状および遺伝子性状の両面から比較する。また、下水や野外環境に生息する繊毛虫(ゾウリムシに代表される原生生物)が耐性菌の生存に与える影響を明らかにするために、既に下水などから分離した繊毛虫と薬剤耐性菌の共培養を行ない、耐性遺伝子の伝達頻度を比較する。これらのデータから、病院から下水を介した耐性菌の拡散リスクを明確化し、今後の耐性菌対策に役立つ知見を得る。
遺伝子発現の変化による網膜神経保護と緑内障の治療研究

緑内障は我が国における最大の失明原因であり、眼圧降下以外の手法による神経保護療法の開発が期待されている。また視神経再生による視野の回復という夢の治療についても、iPS細胞等の登場以来、その実現を願う声は高まっている。そこで本研究では複数の緑内障モデル動物を用いて遺伝子治療や薬剤による細胞保護および視神経軸索再生療法の可能性を検討する。組織学的な解析に加えて、非侵襲的な光干渉断層計(OCT)や電気生理学的手法を用いることにより、構造と機能の両面からその治療効果を明らかにする。本年度は2つの正常眼圧緑内障モデル動物に対する既存薬(去痰薬やパラセタモールの過剰摂取に対する解毒治療薬であるN-acetylcysteine)の投与実験を行い、OCTや多局所網膜電位を用いることにより、その治療効果を同一眼において非侵襲的かつ経時的に確認した。酸化ストレスを主要な原因とするモデルには有効であったが、グルタミン酸毒性が強く関与する病態においては無効であることが明らかとなった。一方、網膜神経節細胞等の神経細胞から特異的に神経栄養因子受容体TrkBが欠損するTrkB ckit CKOマウスにおいては、加齢により、生後6ヶ月以降で正常眼圧緑内障様の神経変性が起きることを確認した。さらに、これまでに世界的に使用されてきた緑内障モデル動物について、その特徴や活用法を含めた総説を発表した。人工的な高眼圧モデル、遺伝子改変マウス、霊長類モデル等を網羅した上で、我々自身が活用、あるいは開発してきたモデルや、それらを用いた最近の研究成果についても総括を行なった。また視神経再生による視野の回復という夢の治療についても、iPS細胞の登場以来、その実現を願う声は高まっている。本年度は正常眼圧緑内障モデル動物に対する既存薬の投与実験を行い、OCTや多局所網膜電位を用いることにより、その治療効果を同一眼において非侵襲的かつ経時的に確認している。一方、網膜神経節細胞(RGC)から特異的に神経栄養因子受容体TrkBが欠損するマウス(TrkB ckit CKO)を用いた視神経外傷モデルを作成し、野生型マウスとの比較を行なっている。すでに逆行性ラベリングやヘマトキシリン・エオジン染色後の組織切片を用いて、TrkB ckit CKOマウスにおける強いRGC変性を確認済みである。さらに現在はTrkBがMullerグリア細胞から選択的に欠損するTrkB GFAP CKOを用いて、野生型マウスおよびTrkB ckit CKOマウスとの検討を開始している。これらの知見から細胞種特異的な神経保護メカニズムの解明を進める。既存薬投与に関するデータ収集や論文投稿を進める一方で、TrkB遺伝子改変マウスを用いた視神経外傷に関する研究にも進展が見られるため。本年度は正常眼圧緑内障モデル動物に対する既存薬(Rho/ROCK阻害点眼薬や脳梗塞に対する治療薬であるEdaravone)の投与実験を行い、OCTや多局所網膜電位を用いることにより、その治療効果を同一眼において非侵襲的かつ経時的に確認している。一方、網膜神経節細胞等の神経細胞から特異的に神経栄養因子受容体TrkBが欠損するTrkB ckit CKOマウスおよびTrkBがMullerグリア細胞から選択的に欠損するTrkB GFAP CKOマウスを用いた視神経外傷モデルを作成し、野生型マウスとの比較を行っている。すでに逆行性ラベリングやヘマトキシリン・エオジン染色後の組織切片を用いて、野生型マウスとの検討を開始している。また同様の検討を神経栄養因子としての機能を持つNeuritinの欠損マウスでも開始し、野生型マウスよりも強い神経変性を確認している。既存薬の投与実験に関して3報の論文発表を行い、それ以外にもすでに2報が投稿中である。さらにTrkB遺伝子改変マウスやNeuritin欠損マウスを用いた視神経外傷に関する研究にも進展が見られるため。

組織学的な解析に加えて、非侵襲的な光干渉断層計(OCT)や電気生理学的手法を用いることにより、構造と機能の両面からその治療効果を明らかにする。本年度は2つの正常眼圧緑内障モデル動物に対する既存薬(去痰薬やパラセタモールの過剰摂取に対する解毒治療薬であるN-acetylcysteine)の投与実験を行い、OCTや多局所網膜電位を用いることにより、その治療効果を同一眼において非侵襲的かつ経時的に確認した。酸化ストレスを主要な原因とするモデルには有効であったが、グルタミン酸毒性が強く関与する病態においては無効であることが明らかとなった。一方、網膜神経節細胞等の神経細胞から特異的に神経栄養因子受容体TrkBが欠損するTrkB ckit CKOマウスにおいては、加齢により、生後6ヶ月以降で正常眼圧緑内障様の神経変性が起きることを確認した。さらに、これまでに世界的に使用されてきた緑内障モデル動物について、その特徴や活用法を含めた総説を発表した。人工的な高眼圧モデル、遺伝子改変マウス、霊長類モデル等を網羅した上で、我々自身が活用、あるいは開発してきたモデルや、それらを用いた最近の研究成果についても総括を行なった。神経保護研究に関する論文作成を継続するとともに、視神経再生に関するテーマも進めていく予定である。神経保護研究や緑内障に関する論文作成を継続するとともに、視神経再生に関するテーマも進めていく予定である。研究経費の節約に努めた結果、わずかながらその成果が現れ、次年度使用額が生じたものである。(理由)研究経費の節約に努めた結果、わずかながらその成果が現れ、次年度使用額が生じたものである。(使用計画)次年度経費に組み入れて、特に物品費として使用予定である。次年度経費に組み入れて、特に物品費として使用予定である。
消化管間質腫瘍の悪性度を規定する長鎖non-coding RNAの探索

ノンコーディングRNAのうち、microRNA以外の長鎖ncRNAの機能はほとんど不明であったが、近年その機能のひとつとして、クロマチン修飾酵素複合体と相互作用することで標的遺伝子発現をエピジェネティックに制御する機能が提唱された。今回の検討で我々はmicroRNA-196aと長鎖non-coding RNA(ncRNA)であるHOTAIRの過剰発現がGISTの悪性度と強く相関することを明らかにした。細胞株を用いた詳細な検討の結果、これらの過剰発現にはヒストン修飾が関与すること、そしてHOTAIRの阻害がGIST細胞の浸潤能を抑制することがわかった。消化管間質腫瘍(gastrointestinal stromal tumor, GIST)治療の第一選択は原則として外科手術である。腫瘍径5cm以上のGISTは特に転移のリスクが高いため外科的切除が推奨されるが、25cmのGISTを全て切除すべきかどうかは未だ議論のあるところである。GISTの悪性度や予後を規定する遺伝子は不明であり、リスク予測に有用な分子マーカーの発見が待ち望まれている。これまでに我々は、GISTにおけるエピジェネティクス異常の解析から、ゲノムワイドなDNA低メチル化が悪性度と強く相関することを見いだした。さらにmicroRNA-196aと長鎖non-coding RNA(ncRNA)であるHOTAIRの過剰発現がGISTの悪性度と強く相関することを明らかにした。細胞株を用いた詳細な検討の結果、これらの過剰発現にはヒストン修飾が関与すること、そしてHOTAIRの阻害がGIST細胞の浸潤能を抑制することを明らかにしてきた。今回、我々は手術切除あるいは内視鏡下に生検された新鮮GIST検体をChIP-seq用、RNA-seq用、DNA抽出用に3分割して抗ヒストン抗体を用いて、クロマチン免疫沈降法(ChIP)を施行。ChIP-DNAの質(シグナルーノイズ比)をqPCRにて確認後、ChIP-seqライブラリを作成した。また本研究のワークフローが確立した後は、複数の検体(低リスク群GIST5例、高リスク群GIST5例)に対してChIP-seq実験およびRNA-seq実験を行い、主にH3K4me3に関するデータを収集した。これらの知見は、エピゲノム異常およびncRNAがGISTの性質を規定する上で重要な役割を担っていることを示唆している。HOTAIRの過剰発現は乳癌・大腸癌など様々な悪性腫瘍の独立した予後不良因子であることが明らかにされはじめ、ncRNAが悪性腫瘍において重要な役割を担っている可能性が急速にクローズアップされていることから今回のGIST症例を対象にした検討でHOTAIRがその悪性度と強く相関することを同定できたことは大変興味深い。消化器腫瘍これまでに同定し絞り込まれた長鎖ncRNAのリストに対し、3050例の臨床検体(DNAとRNA)を用いて、TaqMan-qPCRによる発現量の検討やpyrosequencingによるプロモーター部のDNAメチル化の定量等を施行する。突然変異や融合遺伝子の有無に関しては、長鎖ncRNA候補領域をPCR、増幅しIonPGMシークエンサーを用いて多サンプルの多領域を同時にスクリーニングする。また同定された長鎖ncRNAの異常に関して、より多数の検体(100例)を用いて確認を行う。臨床病理学的な特徴との関連、予後との関連、他の既知の異常(KIT3やPDGFR変異、ゲノムワイドな低メチル化など)との関連に関してより詳細な検討を行い、本研究の命題に対する答えを明らかにする。札幌医科大学では、次世代シークエンサーSOLiD4、半導体チップシークエンサー(Ion PGMシークエンサー)。連携研究者の研究室にはバイオインフォマティクス解析に必要な機器およびスタッフがおり、シークエンスデータの解析、公的データベースからダウンロードしたデータとの統合解析などが可能である。また申請者の研究室ではパイロシークエンサー、リアルタイムPCR装置を設置しているため、RNA発現、DNAメチル化およびヒストン修飾解析も行う予定。GIST症例のサンプル収集が当初の予定よりもやや遅れており、それらが揃うまで解析するのを待っていた。その結果、予定していた一部の試薬購入を先送りすることになってしまったため。内視鏡的あるいは外科手術で切除されたGIST症例のサンプル収集が無事終了したため、それらからDNAやncRNAを抽出するための試薬、また各種PCRのための試薬も合わせて購入する。更にGIST検体を用いたChIP-seq法およびRNA-seq法を確立し、安定したワークフローの構築を目指す。

次に低リスク群GISTおよび高リスク群GISTの臨床検体を用いて、ゲノムワイドなヒストン修飾およびRNA発現を解析し、その分布様式を網羅的に検討することで、GISTにおいて発現している長鎖ncRNAを同定する。臨床病理像と併せて検討し、悪性度に応じて発現変動の見られる長鎖ncRNAを同定する。さらにGISTにおいてそれらncRNAにジェネティック、エピジェネティックな異常が認められないか、多数の臨床検体を用いて検証する。