hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
稀な先天異常をもつ子どもと両親への効果的な看護介入に関する研究

先天異常をもつ子どもとその両親のケアニーズを理解し,看護介入の分析を行うために主に以下の2点について研究を行った.1)両親の杜会心理的変化と不案内容の分析(飯野ら他;遺伝看護研究会雑誌,2003)稀な先天異常児をもつ両親20組を対象に,母親・父親別に不安内容と相談者に関する調査を行った.その結果,外来受診可能な先天異常児をもつ両親の約8割が子どもに何らかめ不安をもち,その内容は子どもの将来の自立した生活への不安と子どもの身体に対する不安が最多だった.1歳未満の乳児をもつ父親の不安はすべて子どもの将来の自立した生活に対する不安で,子どもの誕生後早い時期から将来を心配する傾向を認めた.両親一人当たりの相談者数は約2人,母親の相談者数は父親と比較して1.5倍,9割以上の両親が身近な人か公的機関に相談をしていたが,身近な相談者,相談できる公的機関をもたない両親が約1割存在した.本調査から、相談相手・機関を持たない両親に対して児の成長・発達段階に沿った看護介入の重要性が強く示唆された.歌舞伎メーキャップ症候群患児と母親に関しては,インタビューから疾患名に関連した苦悩など具体的なケアニーズが明らかになった.(辻野ら他;遺伝看護研究会雑誌,2003)2)先天異常児をもつ両親の医療職,関連施設,行政に対するニーズ先天異常児を持つ両親30組を対象に医療職,関連施設,行放に対するニーズの実態を明らかにした.看護師に対しては応対・接遇への要望,医師には治療・処置,診療の説明に対する要望,保健師には情報提供に関する要望が最多だった.また,教育機関には教師の先天異常児への理解・尊重、いじめに対する対応策への要望が多かった.(飯野ら他;遺伝看護研究会プログラム抄録集,2003)以上のケアニーズの実情をベースに、両親の杜会心理的李化と児の成長・発達段階に沿った看護介入内容をマップしている.先天異常をもつ子どもとその両親のケアニーズを理解し,看護介入の分析を行うために,疾患・合併症別の成長・発達段階に沿った医療・看護ケアの分布と両親の社会心理的変化を明らかにするため,山口県内の場合は月1,2回の小児遺伝外来を拠点に追跡調査している.調査内容は患児の病状変化,状態観察,前回外来受診時から受けた詳細な看護ケア,検査,処置,その他の診療などである.【現時点までの結果】対象者(N=20)の概要は,子どもの平均年齢±SDは3.7±4.6歳(4か月-8歳),疾患は染色体異常または奇形症侯群11人,遺伝性疾患7人,その他1人(舌小帯短縮症1人),診断未確定1人.第一子が先天異常児だったケースは9人,第二子のケース9人,第三子のケース1人,第六子のケース1人.本年度は成長・発達段階に沿った医療・看護ケアの分布を追跡調査しながら,両親の心理的変化(特に不安内容の推移)を明らかにし,報告した.外来受診可能な先天異常児をもつ両親の約8割が子どものことで何らかの不安をもち,その内容は子どもの将来の自立した生活に対する不安と子どもの身体に対する不安が多くを占めていた.子どもの将来の自立した生活に対する不安をもつ両親は,比率としては子どもの年齢が6-8歳未満の両親が高かった.また,1歳未満の乳児をもつ父親の不安はすべて子どもの将来の自立した生活に対する不安で,子どもの誕生後早い時期から将来を心配する傾向を認めた.両親一人当たりの相談相手数は約2人で,母親の相談相手数は父親と比較して1.5倍で,9割以上の両親が身近な人か公的機関に相談をしているが,身近な相談者,相談できる公的機関をもたない両親が約1割存在することが明らかになった.以上の結果から,相談相手・機関を持たない両親に対しての看護介入の重要性が示唆された.先天異常をもつ子どもとその両親のケアニーズを理解し,看護介入の分析を行うために主に以下の2点について研究を行った.1)両親の杜会心理的変化と不案内容の分析(飯野ら他;遺伝看護研究会雑誌,2003)稀な先天異常児をもつ両親20組を対象に,母親・父親別に不安内容と相談者に関する調査を行った.その結果,外来受診可能な先天異常児をもつ両親の約8割が子どもに何らかめ不安をもち,その内容は子どもの将来の自立した生活への不安と子どもの身体に対する不安が最多だった.1歳未満の乳児をもつ父親の不安はすべて子どもの将来の自立した生活に対する不安で,子どもの誕生後早い時期から将来を心配する傾向を認めた.両親一人当たりの相談者数は約2人,母親の相談者数は父親と比較して1.5倍,9割以上の両親が身近な人か公的機関に相談をしていたが,身近な相談者,相談できる公的機関をもたない両親が約1割存在した.本調査から、相談相手・機関を持たない両親に対して児の成長・発達段階に沿った看護介入の重要性が強く示唆された.歌舞伎メーキャップ症候群患児と母親に関しては,インタビューから疾患名に関連した苦悩など具体的なケアニーズが明らかになった.(辻野ら他;遺伝看護研究会雑誌,2003)2)先天異常児をもつ両親の医療職,関連施設,行政に対するニーズ先天異常児を持つ両親30組を対象に医療職,関連施設,行放に対するニーズの実態を明らかにした.看護師に対しては応対・接遇への要望,医師には治療・処置,診療の説明に対する要望,保健師には情報提供に関する要望が最多だった.

また,教育機関には教師の先天異常児への理解・尊重、いじめに対する対応策への要望が多かった.(飯野ら他;遺伝看護研究会プログラム抄録集,2003)以上のケアニーズの実情をベースに、両親の杜会心理的李化と児の成長・発達段階に沿った看護介入内容をマップしている.
TGF-βシグナルの翻訳制御機構と顎・口腔癌における異常の解析

TGF-βは多様な生理活性を持つサイトカインであり、標的タンパクの発現調節を介してこれらが営まれている。近年標的タンパクの発現調節にはmRNAレベル以外にもmRNAの安定性や翻訳調節による制御が明らかになりつつあるため、本研究ではこのような背景を基に研究を進めている。Smad7はTGF-βによって早期に発現誘導されるタンパクの1つであり、TGF-βシグナルを抑制することによってネガチィブフィードバック機構を形成している。またSmad7は非常に長い5'UTRを有し、さらにこのUTR内には複数のストップコドンが認められることから、通常のcap依存的な翻訳の効率は非常に低いことが考えられた。そこで、IRES(internal ribosomal entry site)による翻訳制御の検討を試みた。まず、マウスの染色体DNAからSamd7の5'UTRを得、dicistronic-luciferaseを用いて検討すると、IRESの存在が考えられた。しかしながら、他のluciferaseによる解析から、これらの結果はIRESによるものではなく、これまで報告のなかったpromoterの存在を示唆した。従って、予想されたIRESの存在は否定されたが、smad7のpromoterにはFOXやSki等の転写調節因子が複雑に作用している結果を得ているので、現在smad7やTGF-βが誘導する遺伝子の転写調節に関す研究を進めている。まず、マウスの染色体DNAからSmad7の5'UTRを得、dicistronic-luciferaseを用いて検討すると、IRESの存在が考えられた。しかしながら、他のluciferaseによる解析から、これらの結果はIRESによるものではなく、これまで報告のなかったpromoterの存在による可能性を示唆する結果となり、現在詳細な解析を進めている(投稿準備中)。また、Smad7の,3'UTRも非常にユニークな構造を持つ事が判明し、現在この領域のクローニングを進めている。今度これらの構造解析を通じて、Smad7の発現制御機構とTGF-βシグナルとの関連を検討するとともに、多くの癌細胞がTGF-βに不応性であることから、Smad7の発現制御と癌との関連も検討していく予定である。
2型糖尿病患者へのNASH/NAFLD・肝癌予防のための看護支援に関する研究

近年、2型糖尿病の合併症として癌が注目されており、日本人の2型糖尿病患者では肝癌のリスクが高いことが報告されている。2型糖尿病患者では、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)/非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)から肝癌を発症することが指摘されている。2型糖尿病患者における肝癌発症予防の観点から、糖尿病患者のNASH/NAFLD予防のために、糖尿病を改善するための食事療法および運動療法が有用であるとされている。看護師は,患者が、診断後早期の段階からNASH/NAFLDを予防するために適切な食事療法・運動療法に関する自己管理を確実に実行・継続できるように支援することが重要である。しかし、これまでに、2型糖尿病患者がどのように食事療法・運動療法に関する自己管理を行えば、肝障害の改善やNASH/NAFLDの予防に効果を示すのかは明らかにされていない。そこで、本研究では、糖尿病とNASH/NAFLDおよび肝癌との関連に着目し、第3次予防の観点から、NASH/NAFLD予防のための自己管理支援に資するために、2型糖尿病患者が行っている自己管理行動とNASH/NAFLDとの関連を明らかにすることを目的とする。平成30年度は、2型糖尿病患者における肝機能障害と自己管理行動の関連を探索するためのベースライン1年後のデータ収集が完了した。加えて、ベースライン2年後のデータ収集も並行して実施した。また、がんと2型糖尿病をあわせもつ患者へのセルフケア支援について看護師を対象としたインタビュー調査を実施した。その結果、看護師が行うセルフケア支援として、【手術や複数疾患のセルフケア継続に対する不安の傾聴と多職種での情報共有】などの5カテゴリが抽出された。近年,糖尿病の合併症として癌が注目されており,日本人の2型糖尿病患者では肝癌のリスクが高いことが報告されている.2型糖尿病患者では,非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)/非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)から肝癌を発症する可能性が指摘されている.2型糖尿病患者における肝癌発症予防の視点では,糖尿病患者のNASH/NAFLD予防のために,糖尿病を改善するための食事療法および運動療法が有用であるとされている.したがって,診断後早期の段階から患者がNASH/NAFLDを予防するために適切な食事療法・運動療法に関する自己管理を確実に実行・継続できるように支援することが重要である.しかし,これまでに,2型糖尿病患者がどのように食事療法・運動療法に関する自己管理を行えば,肝障害の改善やNASH/NAFLDの予防に効果を示すのかは明らかにされていない.このような背景より,本研究では,糖尿病とNASH/NAFLDおよび肝癌との関連に着目し,第3次予防の観点から,NASH/NAFLD予防のための自己管理支援に資するために,2型糖尿病患者が行っている自己管理行動とNASH/NAFLDとの関連を明らかにすることを目的とする.平成27年度は,2型糖尿病患者における肝機能障害とその関連要因の探索のためのベースライン調査を行い,60名の対象者より協力を得た.今後、対象者数100例を目標に調査を進めるとともに,ベースラインより1年後の調査を行う予定である.2型糖尿病患者における肝機能障害とその関連要因の探索のためのベースライン調査により,60名の対象者より協力を得ることができた.近年、2型糖尿病の合併症として癌が注目されており、日本人の2型糖尿病患者では肝癌のリスクが高いことが報告されている。平成28年度は、2型糖尿病患者における肝機能障害と自己管理行動の関連を探索するためのベースライン調査を引き続き行い、120名の対象者をリクルートした。今後、アンケートが返送され次第、解析を行う予定である。また、同時に1年後の調査を行う予定である。計画通り、ベースライン調査を終えることができた。並行して、ベースラインから1年後の診療録調査を行っており、対象者75名の1年後調査を終えた。

看護師は,患者が、診断後早期の段階からNASH/NAFLDを予防するために適切な食事療法・運動療法に関する自己管理を確実に実行・継続できるように支援することが重要である。しかし、これまでに、2型糖尿病患者がどのように食事療法・運動療法に関する自己管理を行えば、肝障害の改善やNASH/NAFLDの予防に効果を示すのかは明らかにされていない。そこで、本研究では、糖尿病とNASH/NAFLDおよび肝癌との関連に着目し、第3次予防の観点から、NASH/NAFLD予防のための自己管理支援に資するために、2型糖尿病患者が行っている自己管理行動とNASH/NAFLDとの関連を明らかにすることを目的とする。平成29年度は、平成28年度から引き続き、2型糖尿病患者における肝機能障害と自己管理行動の関連を探索するためのベースライン1年後のデータ収集を行った。今後、2018年8月までデータ収集を行い、データ収集が終わり次第、結果をまとめる予定である。また、肝癌を発症した2型糖尿病患者へのセルフケア支援に関して、看護師を対象としたインタビュー調査を実施する計画である。ベースライン1年後調査をほぼ計画通りのスケジュールで実施できた。また、肝癌を発症した2型糖尿病患者への自己管理支援に関するインタビュー調査に向けた準備を行うことができた。近年、2型糖尿病の合併症として癌が注目されており、日本人の2型糖尿病患者では肝癌のリスクが高いことが報告されている。2型糖尿病患者では、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)/非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)から肝癌を発症することが指摘されている。2型糖尿病患者における肝癌発症予防の観点から、糖尿病患者のNASH/NAFLD予防のために、糖尿病を改善するための食事療法および運動療法が有用であるとされている。平成30年度は、2型糖尿病患者における肝機能障害と自己管理行動の関連を探索するためのベースライン1年後のデータ収集が完了した。加えて、ベースライン2年後のデータ収集も並行して実施した。また、がんと2型糖尿病をあわせもつ患者へのセルフケア支援について看護師を対象としたインタビュー調査を実施した。その結果、看護師が行うセルフケア支援として、【手術や複数疾患のセルフケア継続に対する不安の傾聴と多職種での情報共有】などの5カテゴリが抽出された。対象者数100例を目標に調査を進めるとともに,ベースラインより1年後の調査を行う予定である.ベースラインからの1年後調査を継続する。また、ベースラインでの血糖コントロール状況、肝機能障害の有無を従属変数、患者が実施している自己管理行動を独立変数とした解析を行う。
膵臓がん形成における（プロ）レニン受容体 の機能解析

本課題は、(プロ)レニン受容体[(P)RR]が膵臓癌形成に関与するかを明らかにすることである。ヒト正常膵管上皮細胞を用いて(P)RRを強制発現させると全ゲノムレベルにわたる体細胞突然変異数の増大および染色体再編成を生じることが判明した。また、(P)RR過剰発現細胞集団を免疫不全マウスの腎被膜に移植すると悪性腫瘍の生物学的特性である異型細胞の集積および核の異型性を持つ組織が形成された。さらに(P)RR過剰発現は、DNA複製および修復といったゲノムの安定性に関わるパスウェイの破綻を導くことにより、大規模なゲノム不安定性をもたらすことが判明した。本課題は、(プロ)レニン受容体【(P)RR】が膵臓癌形成に関与するかどうかを明らかにすることである。平成28年度は、膵臓がんの起源細胞であるヒト正常膵管上皮細胞を用いて1.(P)RR過剰発現ヒト膵管上皮細胞の樹立2. (P)RR過剰発現ヒト膵管上皮細胞を用いたヒト全ゲノム解析3.(P)RR過剰発現ヒト膵管上皮細胞を用いたDNA損傷の有無の検討を実施した。研究実績は以下のとおりである。1.エピソーマルベクターに(P)RRをコードする遺伝子ATP6ap2のストップコドンを除いたコーディングシーケンス領域のサブクローニングを実施した。さらに、各ドメインの機能解析を実施するため、それぞれ⊿NTF(N-terminal fragment)と⊿CTF (C-terminal fragment)の欠失突然変異体も作製した。ヒト正常膵管上皮細胞にそれぞれのコンストラクトを遺伝子導入し、安定発現細胞株を樹立した。2.ヒト全ゲノム解析のBcftoolによる変異コール解析により、(P)RR過剰発現細胞で約2倍量の体細胞突然変異(コントロール細胞:124,579; (P)RR過剰発現細胞:239,080;但し、dbSNPに登録されている多型を除いた点突然変異・挿入・欠失。)が同定された。さらに(P)RR過剰発現細胞では膵臓がん患者で体細胞突然変異が普遍的に認められる遺伝子(Nature, 2016)の体細胞突然変異数の増大が確認され、BreakDancerによる解析から転座や逆位といった大規模な染色体再編成が(P)RR過剰発現細胞のゲノム全体で著しく生じていた。3.(P)RR発現の亢進は、γ-H2AXとp53といったDNA損傷経路の不活性化を認めた。さらにDNA損傷応答を評価するコメットアッセイから(P)RR発現の増大は、DNA修復能力の喪失ををもたらすことが判明した。膵臓がんの起源細胞であるヒト正常膵管上皮細胞の(P)RR発現の亢進が、γ-H2AXとp53をコンポーネントに持つDNA損傷経路の不活性化および、DNA修復能力の喪失をもたらした。さらに、ヒト全ゲノムレベルの解析において(P)RRが過剰に発現した細胞では、体細胞変異数の増大や大規模な染色体再編成をもたらす事実が判明したことによって、(P)RR発現の亢進は、全染色体レベルでのゲノム不安定性をもたらすことが明らかになった。これらの成果はShibayama etal. Aberration of (pro)reninreceptor induces genomicinstability in humanpancreaticductal epithelialcells.AACR Annual Meeting 2017で発表する予定である。本課題の主軸となる(P)RR発現の亢進がゲノムの恒常性を破綻させる事実を見出せたことから、現在までの進捗状況を上記のように判断した。平成28年度では、(P)RRを過剰発現させたヒト膵管上皮細胞を用いてヒト全ゲノム解析を実施したところ、全ゲノムレベルにおける体細胞突然変異数の増大および大規模な染色体再編成をもたらすことが判明した。つまり、(P)RR発現の亢進はゲノム不安定性を生じることが明らかになった。平成29年度では、(P)RR過剰発現細胞集団のin vivoレベルにおける表現型の評価に注力した。(P)RRトランスジェニックマウスでは、癌の自然発症が認められなかったため、(P)RR過剰発現ヒト膵管上皮細胞集団を免疫不全マウスの腎被膜に移植し、癌組織の形成の有無を検討した。結果は、次のとおりである。1.(P)RR過剰発現細胞集団は、腎被膜下で組織を形成した一方、コントロール細胞集団では組織の形成が認められなかった。2.(P)RR過剰発現細胞集団で構成された組織は、悪性腫瘍の生物学的特性である異型細胞の集積および核の異型性、テロメアの機能不全によって生じるBFB(切断・融合・架橋)が認められた。このことから、(P)RR過剰発現は、膵臓癌形成に必須の分子メカニズムであることが判明した。さらに、(P)RR過剰発現によって生じるゲノム不安定性の分子メカニズムを明らかにするために、(P)RRの細胞質ドメインが局在する核ラミナやクロマチン結合タンパクから構成される難溶性核分画を用いてLC-MS/MS解析を実施した。(P)RR過剰発現は、DNA複製、DNA修復およびテロメア維持に関わる分子パスウェイの機能不全をもたらした。(P)

RRは、クロマチンリモデラーの1種であるSMARCA5との分子間相互作用を介してSMARCA5の発現を亢進し、ゲノム安定性に関わる複数の分子パスウェイの破綻を導くことが判明した。本課題は、(プロ)レニン受容体[(P)RR]が膵臓癌形成に関与するかを明らかにすることである。ヒト正常膵管上皮細胞を用いて(P)RRを強制発現させると全ゲノムレベルにわたる体細胞突然変異数の増大および染色体再編成を生じることが判明した。また、(P)RR過剰発現細胞集団を免疫不全マウスの腎被膜に移植すると悪性腫瘍の生物学的特性である異型細胞の集積および核の異型性を持つ組織が形成された。さらに(P)RR過剰発現は、DNA複製および修復といったゲノムの安定性に関わるパスウェイの破綻を導くことにより、大規模なゲノム不安定性をもたらすことが判明した。腫瘍生物学
不活性結合活性化を鍵とする不斉触媒反応の開発

1,1-二置換アルケン部位をもつ1,6-エンインに、カチオン性ロジウム/BINAP錯体触媒及び安息香酸触媒を作用させると、1,6-エンインの架橋鎖部位に存在するカルボニル基の配位により鎖状有機ロジウム中間体からγ位のC-H結合切断が進行し、ビシクロ[3.1.0]ヘキサン誘導体への不斉環化異性化反応が進行することを見出した。また、カチオン性ロジウム/BINAP錯体触媒を用いると、5-アレナールとアルキンとの不斉[2+2+2]付加環化反応が室温で進行し、対応するジヒドロピラン誘導体が中程度の収率ながら高いエナンチオ選択性で得られることを見出した。さらに、カチオン性ロジウム/Segphos錯体触媒を用いた分子内不斉[2+2+2]付加環化反応による、[11]ヘリセン誘導体の不斉合成にも成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。ヘテロクムレン構造を有するカルボジイミドおよび二酸化炭素とジインとの[2+2+2]付加環化反応を検討したところ、カチオン性ロジウム(I)/H8-binap錯体触媒を用いると、カルボジイミドとジインとの[2+2+2]付加環化反応が室温にて高収率で進行することを見出した。二酸化炭素との反応も、常温常圧条件にて高収率で進行した。また、我々が開発した新規電子不足シクロペンタジエニルRh(III)錯体をアニリドと内部アルキンとの酸化的[3+2]付加環化反応に適用したところ、室温空気下にて目的のインドール誘導体が高収率で得られることを見出した。この電子不足シクロペンタジエニルRh(III)錯体は、ベンジルアルコールと内部アルキンとの酸化的[4+2]付加環化反応にも有効であり、室温空気下にて目的のイソクロメン誘導体が高収率で得られることを見出した。さらに、当研究グループは最近、カチオン性パラジウム(II)および金(I)錯体触媒を用いた不斉分子内ヒドロアリール化反応による、軸不斉アリールイソキノリノン誘導体の合成を報告した。そこで、不斉分子内連続ヒドロアリール化反応による、らせん不斉アザヘリセン誘導体の合成を検討した。その結果、カチオン性金(I)/binap錯体触媒を用いると、目的の反応が室温にて高収率かつ高エナンチオ選択的に進行することを見出した4)。同触媒を用いると、らせん不斉S字形アザヘリセン誘導体も良好な収率かつ高いジアステレオおよびエナンチオ選択的で得られた。遷移金属錯体触媒を用いた不活性結合活性化を基軸とする数多くの触媒反応の開発に成功し、そしてそれらの不斉触媒反応への展開にも数多く成功した。また、研究成果はアメリカ化学会誌やドイツ化学会誌などのハイレベルな国際誌に数多く掲載された。今後はこれまでの研究成果を基盤とし、さらに独創的な研究を発展させることを目指す。特に遷移金属錯体触媒を用いたSP2C-H結合のみならず、SP3C-H結合の活性化とその不斉触媒反応への展開を目指す。
びわこ学園における重症心身障害児の発達保障ー「ヨコへの発達」の実証ー

本研究は、重症心身障害児の発達保障を,「ヨコへの発達」という視点から実践的に検証するものである。「ヨコへの発達」とは、人間の「発達」を諸能力の獲得である「タテ」の方向で捉えるのではなく、個性の拡がりや感情の豊かさを意味する発達の捉え方であり、日本の重症心身障害児療育・教育の歴史を切り拓いてきた近江学園および重症児施設びわこ学園(滋賀県)において約半世紀前に創出された考えた方である。本研究では、びわこ学園において超重症児を含めた重症児に対する実践と発達評価の在り方について調査し、「ヨコへの発達」という発達の視点が現在の療育実践においていかに実践化されているのかを質的に検討する。
中世キリスト教における神化概念の展開－東西教会における精神性の差異－

本年度は、東西キリスト教の精神性の差異を明らかにするために、1西方教会において『ディオニュシオス文書』を註解した著作家、エリウゲナとトマス・アクィナスの神化理解を研究し、更に2これまでの研究で得られた成果をもとに、神化概念を巡る東西教会の理解について比較研究を行った。1前年度に引き続きトマスの『神名論註解』及び『神学大全』の研究を進め、加えてエリウゲナの『ペリヒュセオン』と『天上位階論註解』の読解を通して、以下の新たな知見を得た。(イ)エリウゲナは、神化を神の知恵(=キリスト)の人間への下降と人間の神への上昇のダイナミズムおいて捉え、専ら知性の次元において生起する神人合一の事態として理解した。(ロ)トマスは神化を「恩寵によって人間の知性が神を分有すること」として捉え、人間の究極目的である「神の本質の直観」が成立するための条件とした。その際、神化は彼の「義化」や「聖化」の概念と接続するものとなっている。2以上の研究に前年度までの研究成果を綜合して比較考察を行い、以下の見通しを得た。(ハ)東西教会の著作家たちの神化理解はディオニュシオスを継承しつつ、大きく二つの傾向に分けることができる。一つは、神化における知性重視の傾向であり(西方)、いま一つは、神化を心身両面において生起するものと捉える傾向である(東方)。(ニ)こうした神化を巡る傾向の差異は、後の東西の神化概念の展開に密接に関わっている。西方では、神化は神認識という大きな問題系の中に埋もれ、救済概念としても、隣接する概念である義化や聖化に押されて後景に退き、神学的主題として固有の位置を与えられることはなかった。これに対し、東方における神化は、具体的な人間に生起しうることとして、今日でも修道の目的や儀礼の中心的な意味であり続けている。以上の成果は11月の中世哲学会等で発表され、次年度中に論文として刊行される予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、予定されていた約2か月間のフランスでの在外研究が、現地共同研究者たる中世キリスト教思想研究の第一人者ジル・ベルスビル教授の計らいによって大幅に延長されて49月の約6か月間にわたることとなったため、現地での中世キリスト教ギリシア語文献(偽ディオニュシオス・アレオパギテース『神名論』、『神秘神学』、『教会位階論』)およびラテン語文献(トマス・アクィナス『ディオニュシオス神名論註解』)の講読を大いに進め、十分な研究蓄積を築くことができた。これらの文献講読と並行して、本研究の中心となるディオニュシオスの神化思想の生み出された史的背景を理解する上で重要な56世紀の教会史とギリシア思想史を研究し、特に彼の思想に多大な影響を与えたとされる新プラトン主義哲学者プロクロスの思想を、その主著『神学綱要』と『プラトン神学』に基づいて考察して、以下に挙げる三点の重要な知見を新たに得た。1ディオニュシオスは、神の存在構造の理論化を巡る当時のキリスト論論争の思潮に対して、そもそも人間が絶対超越的な神を認識しうるのは如何にしてかという神認識についての方法論的反省を深め、神を認識し叙述する方法としての「神学」の体系(肯定神学・否定神学・象徴神学)を構築した。2彼は、神化を「能う限りでの神との一致と類似」と定義したが、その内の「神との一致」は否定神学によって、また「神との類似」は象徴神学によって、それぞれ果たされることが判明した。3この「神との類似」という言葉の原語は'άφομοίωσις'であり、元来はプロクロスの用いた術語であったことが分かり、ディオニュシオスの新プラトン主義との思想的繋がりがより明確になった。13で得られた成果については、中世哲学会と上智大学共生学研究会の学術大会において研究発表を行った。また、共生学研究会での発表については、学術論文として投稿し、同研究会の会誌に掲載される予定である。1.当初には、偽ディオニュシオスのシリア語写本資料収集と現地調査(エジプト等)が予定されていたにも拘らず、諸般の事情により予定変更を余儀なくされ、同現地調査が次年度に繰り越されたことは遺憾である。しかしながら、これに代わりフランスでジル・ベルスビル教授との面談の機会を得て、前年度に引き続き『神名論註解』の研究を進め、並行して行われたディオニュシオスの原典(『神名論』、『教会位階論』)講読を通して、以下の新たな見通しを得ることができた。(1)彼の「神学」体系の一つ、「肯定神学」と「神化」の関係において、神化とは「神」と「神化される者」、そして後者の「弟子」との三者間で生起する事態であること。(2)これら三者は「エロス」の関係にあること(ここでいうエロスとは、他者への終わりなき欲望故に、寧ろ自己を超えて他者を生かそうとするような、「生命」を巡る情動)。(3)教会の儀礼と神化の関係において、神化は人間の魂だけでなく、儀礼を授受する身体にも関わること、が解明された。これらの成果は、本報告書13欄に記した二つの学会発表と、一本の論文によって公にされた。

2.神化概念の東方キリスト教への展開の研究については、二人の代表的著作家、証聖者マクシモスとグレゴリオス・パラマスの各々の原典(『難問集』および『聖なるヘシュカストのための弁護』)を読解して、次の重要な見通しを得た。すなわち、前者は神化の表現において「〔人間の力に〕能う限りで」という文言を付加する傾向にあり、それによって神化における神と人間の働きの相互性を強調し、後者は神化を神的な光の体験として捉え、光の照明による魂と身体の神化を説いたが、両者にはディオニュシオスの神化の定義「能う限りでの、神との一致と類似」や、彼の神的光の理論からの多大な影響が見られる。以上の成果については現在論文を作成中であり、次年度に学術誌に発表される予定である。本年度は、東西キリスト教の精神性の差異を明らかにするために、1西方教会において『ディオニュシオス文書』を註解した著作家、エリウゲナとトマス・アクィナスの神化理解を研究し、更に2これまでの研究で得られた成果をもとに、神化概念を巡る東西教会の理解について比較研究を行った。1前年度に引き続きトマスの『神名論註解』及び『神学大全』の研究を進め、加えてエリウゲナの『ペリヒュセオン』と『天上位階論註解』の読解を通して、以下の新たな知見を得た。(イ)エリウゲナは、神化を神の知恵(=キリスト)の人間への下降と人間の神への上昇のダイナミズムおいて捉え、専ら知性の次元において生起する神人合一の事態として理解した。(ロ)トマスは神化を「恩寵によって人間の知性が神を分有すること」として捉え、人間の究極目的である「神の本質の直観」が成立するための条件とした。その際、神化は彼の「義化」や「聖化」の概念と接続するものとなっている。2以上の研究に前年度までの研究成果を綜合して比較考察を行い、以下の見通しを得た。(ハ)東西教会の著作家たちの神化理解はディオニュシオスを継承しつつ、大きく二つの傾向に分けることができる。一つは、神化における知性重視の傾向であり(西方)、いま一つは、神化を心身両面において生起するものと捉える傾向である(東方)。(ニ)こうした神化を巡る傾向の差異は、後の東西の神化概念の展開に密接に関わっている。西方では、神化は神認識という大きな問題系の中に埋もれ、救済概念としても、隣接する概念である義化や聖化に押されて後景に退き、神学的主題として固有の位置を与えられることはなかった。これに対し、東方における神化は、具体的な人間に生起しうることとして、今日でも修道の目的や儀礼の中心的な意味であり続けている。以上の成果は11月の中世哲学会等で発表され、次年度中に論文として刊行される予定である。当初の予定であったエジプトとイスラエルでの資料収集および現地調査が次年度に延期となったが、それに代えて、フランスでの現地研究者との共同研究や、残りの経費を活用して本課題に必要な文献資料を購入することで、本研究を十分に進めることができたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は、本年度までに得られた研究成果を踏まえつつ、ディオニュシオスの神化思想の西方教会への受容と展開を跡付ける。具体的には、カトリック教会の総本山、ヴァチカン市国での写本資料収集および現地調査を行うとともに、西方において「ディオニュシオス文書」を註解した二人の代表的著作家、エリウゲナとトマス・アクィナスに見られる神化思想の系譜を研究する。また、前年度に遂行できなかった、エジプトとイスラエルでの写本資料収集および現地調査を果たし、受入教官の指導の下、同文書のシリア語写本研究を行う。本年度に予定されていたフランスでの在外研究が大幅に延長されたことで、想定されていた以上にギリシア語およびラテン語文献の講読を進められたが、その反面、当初の予定であったロシアでの現地調査は次年度以降に延期となったため。
Si-N-C系非晶質複合粉末の結晶化過程にともなうナノ構造変化に関する研究

1.実験方法:ヘキサメチルジシラザン{(Me_3Si)_2NH,Me=CH_3}の熱分解によって合成された4種類の非晶質Si-N-C(C5:Si-35.8N-4.8C,C8:Si-32.8N-8.1C,Cl7:Si-29.0N-17.3C,C20:Si-24.2N-19.7C)微粉末の結晶化過程および結晶化後の微粉末の形態変化などについて調べた。これらの微粉末はAr中、1713-1803Kで、21.6KSまで、また、1743および1803Kで64.8ksまで熱処理された。2.結果:(1)熱処理前の微粉末の形態はほぼ球状であり、その大きさは直径100-500nmであった。結晶相はα-Si_3N_4(一部β-Si_3N_4を含む)およびβ-SiC(一部α-SiCを含む)であり、炭素量の増加とともにα-Si_3N_4は減少し、β-SiCは増加した。(2)β-SiCは熱処理の初期段階でSiと炭素の固相反応によって生成した。この形態は稈状および角状であり、C5およびC8粉末のβ-SiCの大きさは、いずれの熱処理条件においても、20-100nmであった。しかしながら、1803K、64-8ksでは、C17およびC20粉末のβ-SiCはそれぞれ50-1500nmおよび20-200nmに成長した。(3)α-Si_3N_4は、気相反応によって生成され、C5およびC8粉末におけるこの形態は、主として棒状であり、その大きさはβ-SiCより大きかった。一方、いずれの粉末においても、1803K、64.8ksでは、α-Si_3N_4の微細結晶および薄片状単結晶が観察された。この微細結晶および薄片状単結晶の生成は、Si_3N_4-SiC複合セラミックスのナノ構造を形成させ、機械的性質の向上に寄与するものと思われる。(4)熱処理による質量減少は、おおむね炭素量の増加とともに大きくなり、いずれの試料おいても、熱処理の初期段階で大きく、その後時間の経過とともに小さくなった。この質量減少は、熱処理の初期における遊離Cと微粉末中の酸素との反応によるCOおよびCO_2の放出、微粉末の結晶化に伴う過剰物質の放出およびSi_3N_4の分解によるものと考えられる。
水草ミズハコベをモデルとした異形葉形成機構の進化発生学研究

本研究では、オオバコ科の水草ミズハコベCallitriche palustrisをモデルとして、水草が沈水時に示す顕著な異形葉性がどのような発生メカニズムで制御され、どのように進化してきたのかを明らかにすることを目的とした。研究の結果、ミズハコベの異形葉性には種々の植物ホルモンが関与すること、また、本種、および異形葉性を示さない近縁種も用いた網羅的発現解析の結果、異形葉形成に重要な遺伝子群が明らかになった。本研究をとおして、異形葉性の進化を理解する上で基礎的な知見となる、異形葉の発生機構の一端を明らかにすることができた。本研究は、オオバコ科の水草ミズハコベCallitriche palustris L.をモデルとして、水草が沈水時に示す顕著な異形葉性がどのような発生メカニズムで制御され、どのように進化してきたのかを明らかにすることを目的としている。非モデル植物であるミズハコベでは、葉の発生メカニズムについての分子生物学的理解はまったく進んでいないため、本研究では特に網羅的解析を中心としたアプローチによって異形葉性に関わる因子の特定を目指す。昨年度は、本種の異形葉性を制御することが示唆される植物ホルモンジベレリンとエチレン、およびアブシシン酸による遺伝子発現制御の解明のため、沈水環境下でジベレリンとエチレンの阻害剤、およびアブシシン酸添加によって異形葉形成が阻害される状態下の解析を行なった。形態観察の結果、いずれの条件でも気中で育成したきとほぼ同様な葉形成がみられることがわかり、さらにmRNA-seqによってそれぞれの条件下で発生中の葉での網羅的発現情報を得ることができた。また、近縁種で異形葉性を失ったとかんがえられるアメリカアワゴケについても、水中と気中それぞれの条件で発生中の葉の発現情報を得た。現在のところ、これらの情報の解析から、ミズハコベにおいて異形葉性に関わりうるような因子を200程度まで絞り込むことができている。今後これらの情報に、別の条件での発現情報も加えて、さらなる解析を行う。一方で、ミズハコベを用いた形質転換系について、おおよそ安定的に形質転換体を得られる系を確立できた。これまでの実験で、予定していた網羅解析の約半分を行なうことができ、それらの解析からある程度、ミズハコベの異形葉性をコントロールしうるような因子を絞り込むことができた。また、近縁種のアメリカアワゴケについても、分子的な情報が全く未知のところから、葉の発生に関わる遺伝子群を特定し、それをミズハコベと比較することができる状態となった。さらに、ミズハコベを用いた形質転換実験については、効再現性高く形質転換体を得られるような実験系を構築できた。そこで今後この系を用いて、実際に本種において遺伝子のノックダウンや過剰発現を引き起こす形質転換体を作成する。本研究は、オオバコ科の水草ミズハコベCallitriche palustrisをモデルとして、水草が沈水時に示す顕著な異形葉性がどのような発生メカニズムで制御され、どのように進化してきたのかを明らかにすることを目的としている。ミズハコベの異形葉性にはいくつかの植物ホルモンが関わっていることがわかっていた。そこで、それら植物ホルモンを阻害または活性化する条件等で得た、発生中の葉における遺伝子発現情報を利用して、異なる葉発生の制御に関わる因子を絞り込んだ。さらに、近縁種で異形葉性を失ったと考えられるアメリカアワゴケC. terrestrisとの遺伝子発現比較から、絞り込んだ因子の多くがたしかに異形葉性に関わっているらしいことが示唆された。個別の遺伝子の時空間的発現解析からも、表現型とよく一致する遺伝子発現パターン示す遺伝子が見つかったため、本解析によって重要遺伝子が絞り込まれていることが支持された。この遺伝子群には有意に多くの転写因子遺伝子が含まれており、本種の異形葉性にみられる顕著な細胞形態の変化がこうした転写因子の発現によって調節されることが示唆された。現在、これらの遺伝子のノックアウト植物や、植物ホルモンのシグナル遺伝子の改変植物の作成を進めており、異形葉形成機構のより実証的な解明を進めている。また。ミズハコベの異形葉性に伴う微視的な表現型として、水中で作る葉では気孔数の顕著な減少が起こる。気孔形成の分子発生学的知見はモデル植物においてよく集積されているため、それを元に気孔減少のメカニズムをミズハコベについても検証するべく、予備的な観察、実験を開始した。その結果、アワゴケ属において興味深い気孔形成パターンの進化があったことが示唆され、今後の研究の展望を得ることができた。今後もミズハコベを用いた網羅的解析を中心に、本種の沈水による異形葉性のメカニズムに迫る。

気中で育成しているミズハコベに対して、エチレンガスやジベレリンを添加することで、不完全ではあるが水中葉のような細い葉の形成を誘導することができる。これらの条件での葉の発現解析を行なうことで、エチレンシグナルやジベレリンシグナルがどのように葉の発生に関わるかを検証する。さらに、葉の発生を34の段階に分け、サイズ、および部位(基部、先端部)ごとの発現量比較も行なう。これらのデータを統合して、共発現ネットワークを構築し、遺伝子間の共発現関係を明らかにする。これまでの研究で、育成条件間の比較や水中でのホルモン処理によって、それぞれの形態の葉形成時に特異的に働く遺伝子群が特定されているが、その数はいまだ数百と多い。そこで、それらの因子の中から、上記共発現ネットワーク上の特徴、異形葉性を示さないアメリカアワゴケにおけるオーソログの発現パターン、さらにはコードされるいタンパク質の分子機能などの情報をもとに、ミズハコベの異形葉性調節の中心となる因子を絞り込む。これらの遺伝子のin situ発現解析や、機能阻害形質転換体等の作成によって、本種の異形葉性の調節機構の実証的解明をめざす。また、それらの遺伝子のモデル植物におけるホモログの知見との比較により、本種の異形葉性がどのように進化してきたのかを考察する。29年度が最終年度であるため、記入しない。進化発生学29年度が最終年度であるため、記入しない。
HMGA2による神経幹細胞の増殖期からニューロン分化期への移行メカニズム解明

脳の高次機能をつかさどる大脳新皮質の幹細胞である神経幹細胞は、発生時期依存的にその性質を大きく変化させることが知られている。発生早期においては、盛んに増殖を繰り返すことで神経幹細胞の数を増やし(増殖期)、発生中期にはニューロンを産生する(ニューロン分化期)。その後、発生後期になるとニューロンは産生しなくなりアストロサイトなどのグリア細胞を産生する(グリア分化期)。この神経幹細胞の運命転換のタイミングを制御することは、最終的な脳の大きさや機能を決定するため、厳密に決定される必要がある。本年度は、Hmga2と関わりが深いポリコーム群タンパク質(PcG)の制御について検討を行った。ニューロン分化関連遺伝子は、ニューロン分化期の神経幹細胞においては分化刺激に応答して転写が可能な「一過的な抑制」を受けているが、グリア分化期に入ると分化刺激があっても転写が不可能な「永続的な抑制」に変化する。PcGはニューロン分化関連遺伝子の「一過的な抑制」と「永続的な抑制」の両方に重要であることを示してきていたが、それがどう使い分けられているかは不明であった。驚いたことにニューロン分化期の「一過的な抑制」にはRing1のH2Aユビキチン化活性が必要だが、グリア分化期の「永続的な抑制」には必要ないことがわかった。また、「一過的な抑制」から「永続的な抑制」に移行するためにはヒストン脱アセチル化が重要なこと、「永続的な抑制」にはRing1のユビキチン化活性ではなくPcGタンパク質同士の凝集が重要なことを示唆する結果を得た。このことから、神経幹細胞のみならず様々な幹細胞の分化運命制御に重要なPcGはその機能を使い分けることで、分化能を適切に制御している、という仮説を提唱した(Tsuboi, Kishi, Dev. Cell, 2018)。Hmga2と関わりが深いポリコームによる神経幹細胞の制御について明らかにし、論文報告することができた。また、Hmga2自身の制御についても、これまでの機能解析から、1,増殖期からノックダウンすると神経幹細胞のニューロン開始が遅れること、2,増殖期からノックダウンすると神経幹細胞の遺伝子発現プロファイルがニューロン分化期様にはならず、増殖期様のままになってしまうこと、3,増殖期からノックアウトすると生後直後の脳サイズが小さくなること、を見出している。このことから、Hmga2は神経幹細胞の増殖期からニューロン分化期への移行を正に制御していると考えている。また、同様に増殖期からニューロン分化期にかけての神経幹細胞の遺伝子発現プロファイルを単一細胞RNA-seqやATAC-seqなどで追跡する実験を行っている。ATAC-seqの結果からは、Hmga2が増殖期からニューロン分化期へのクロマチン構造変化を制御する可能性を示唆するデータが得られている。さらにこれらの網羅的解析から他にも増殖期からニューロン分化期への転換を司る遺伝子の候補をあげることができた。以上、2018年度は様々なポイントでの進展が見られた。2019年度は以下の2点について検討を行う。1, Hmga2が神経幹細胞の性質に与える影響について、さらに検討する。特にニューロン分化の開始に関わることはわかっているが、増殖期の特徴についても検討する。また、ノックアウトマウスが実験に使えるようになってきたので、増殖期からノックアウトした時の神経幹細胞の性質、遺伝子発現プロファイル、クロマチン構造について調べる。2, 2018年度に行った単一細胞RNA-seqやATAC-seqの結果を踏まえ、Hmga2以外にも神経幹細胞の運命を司る因子の道程を目指す。すでに20-30遺伝子まで絞り込んでいるので、これらについてそれぞれノックダウンウィルスを作製し、申請者が独自に開発したE8遺伝子導入法を用いてスクリーニングを実施する。

このことから、神経幹細胞のみならず様々な幹細胞の分化運命制御に重要なPcGはその機能を使い分けることで、分化能を適切に制御している、という仮説を提唱した(Tsuboi, Kishi, Dev. Cell, 2018)。Hmga2と関わりが深いポリコームによる神経幹細胞の制御について明らかにし、論文報告することができた。また、Hmga2自身の制御についても、これまでの機能解析から、1,増殖期からノックダウンすると神経幹細胞のニューロン開始が遅れること、2,増殖期からノックダウンすると神経幹細胞の遺伝子発現プロファイルがニューロン分化期様にはならず、増殖期様のままになってしまうこと、3,増殖期からノックアウトすると生後直後の脳サイズが小さくなること、を見出している。このことから、Hmga2は神経幹細胞の増殖期からニューロン分化期への移行を正に制御していると考えている。また、同様に増殖期からニューロン分化期にかけての神経幹細胞の遺伝子発現プロファイルを単一細胞RNA-seqやATAC-seqなどで追跡する実験を行っている。ATAC-seqの結果からは、Hmga2が増殖期からニューロン分化期へのクロマチン構造変化を制御する可能性を示唆するデータが得られている。さらにこれらの網羅的解析から他にも増殖期からニューロン分化期への転換を司る遺伝子の候補をあげることができた。以上、2018年度は様々なポイントでの進展が見られた。2019年度は以下の2点について検討を行う。1, Hmga2が神経幹細胞の性質に与える影響について、さらに検討する。特にニューロン分化の開始に関わることはわかっているが、増殖期の特徴についても検討する。また、ノックアウトマウスが実験に使えるようになってきたので、増殖期からノックアウトした時の神経幹細胞の性質、遺伝子発現プロファイル、クロマチン構造について調べる。2, 2018年度に行った単一細胞RNA-seqやATAC-seqの結果を踏まえ、Hmga2以外にも神経幹細胞の運命を司る因子の道程を目指す。すでに20-30遺伝子まで絞り込んでいるので、これらについてそれぞれノックダウンウィルスを作製し、申請者が独自に開発したE8遺伝子導入法を用いてスクリーニングを実施する。
灰色かび病菌における多犯性発現の分子機構の解明

本研究において,灰色かび病菌(Botrytis cinerea)の新たなGαタンパク質遺伝子としてbcg3を, Gβタンパク質遺伝子としてbcgb1を単離解析した結果、Bcg3はクラスIIIに属し、Bcgb1はF. oxysporumのFgb1やM. griseaのMgb1と高い相同性を示した.また、それらの遺伝子破壊による機能解析から, bcg3遺伝子はcAMP情報伝達系に制御された病原性発現に関与することが示唆された.本研究において,灰色かび病菌(Botrytis cinerea)の新たなGαタンパク質遺伝子としてbcg3を, Gβタンパク質遺伝子としてbcgb1を単離解析した結果、Bcg3はクラスIIIに属し、Bcgb1はF. oxysporumのFgb1やM. griseaのMgb1と高い相同性を示した.また、それらの遺伝子破壊による機能解析から, bcg3遺伝子はcAMP情報伝達系に制御された病原性発現に関与することが示唆された.本研究では、灰色かび病菌(Botrytis cinerea)の多犯性分子機構を解明する研究の一環として、環境からのシグナルをcAMP情報伝達系やMAPKカスケード細胞内情報伝達系へのシグナルに変換する分子スイッチとして機能するヘテロ三量体Gタンパク質遺伝子を単離・解析することを目的とした。先ず、本菌の新たなGαタンパク質をコードする遺伝子としてbcg3と、Gβタンパク質をコードする遺伝子としてbcgb1を単離し、解析を行った。これらの遺伝子の推定アミノ酸配列には、他の糸状菌のGαやGβタンパク質においてみられる典型的な保存領域が存在していることが確認された。サザンブロット解析より、B.cinereaのゲノム上に他のGα_5やGβ遺伝子は存在しないことが示され、bcg3及びbcgb1遺伝子が単一コピーであることが示唆された。RT-PCR試験により、bcg3及びbcgb1遺伝子が接種タバコ葉において非常に早い段階から発現していることが明らかとなった。これらの遺伝子の発現を定量的に解析したところ、感染時にbcg3遺伝子の発現は、他のbcg1やbcg2に比べて極めて低く、侵入時以降に限られていた。bcgb1はbcg1やbcg2と同様に高いレベルで発現していた。これら遺伝子の機能解析のために、本菌の日本分離株を対象にプロトプラスト-PEG法による形質転換法を検討した。本菌の相同組換えによる遺伝子破壊は困難であることが知られており、欧州分離株など成功例は一部の系統に限られている。検討の結果、標的遺伝子破壊が可能な日本分離株を見出し、bcg3遺伝子の破壊に成功した。現在までに、Bcg3欠損株が既報のイタリア分離株における同変異株と同様に過剰な菌核形成を示すことを確認している。今後は、Bcg3欠損株の表現型を詳細に解析するとともに、bcgb1遺伝子の破壊実験を行なっていく予定である。Botrytis cinerea日本分離株におけるGタンパク質αサブユニット遺伝子であるbcg3の欠失変異は,主な栄養源をグルコースに限定した接種条件での病斑伸展の減衰を引き起こしたことから,宿主における抵抗性反応の打破や細胞の殺生に関する因子が正常に機能していない可能性が考えられた.そこで,Bcg3に転写制御を依存している可能性のある病原性関連遺伝子について定量的RT-PCRにより発現解析を行なった.カタボライト抑制性の発現様式を示すセルラーゼ(Ce15A)とキシラナーゼ(Xyn11A)をそれぞれコードする遺伝子の発現はbcg3破壊株において僅かに上昇し,H_2O_2発生に関与するグルコースオキシダーゼ(BcGod1)遺伝子は僅かに発現が減少した.これら遺伝子の発現の変化はcAMPにより野生型と同程度に回復した.一方,グルコース濃度を変えた培地で本菌を培養した場合,グルコース濃度依存的に分生子内の核数が増加し,核数の多い株ほど病原性が強くなるという報告がある(Phillips et al.1987).Bcg3の核数の増加における役割については現在検討しているところである.チューリップ栽培において重要な病原菌の一つであるBotrytis tulipaeは,枯死した罹病個体および球根に多くの菌核を形成し,植物残渣とともに土壌中で越年した菌核が翌年の伝染源となることが知られている.本研究では,in vitroにおける菌核の形成条件を検討した.まず,培地のpHおよび栄養条件による影響を調べたところ,成熟した菌核の形成には糖類の枯渇が重要であることが明らかとなった.B.cinereaでは,cAMP経路の上流に位置すると予想されるGタンパク質αサブユニット(BCG3)が糖の認識に関与し,菌核形成を負に制御することが報告されている(Doehlemann et al.2006;長田ら2006).そこで,本菌の菌核形成におけるcAMPの影響を調査したところ,cAMPを添加した培地において菌核形成の遅延が見られた.さらに,bcg3と高い相同性を持つGα遺伝子(btg3)の存在が確認されたことから,B.cinereaと同様に,BTG3及びcAMP経路が菌核形成に関与している可能性が示唆された.Botrytis cinereaの病原性に関与するGαタンパク質BCG3とGβタンパク質であるBCGB1の相互作用を酵母two-hybrid法により調査したところ,それらが相互作用しないことが明らかとなった.

そこで,酵母two-hybrid法を用いてBCG3と相互作用するタンパク質の探索を試みた.様々な条件下でbcg3の発現を調査した結果,本菌を振とう培養あるいは静置培養して得られた菌体において本遺伝子の発現は認められなかったが,トマト葉またはタマネギリン片表皮に分生胞子懸濁液を接種後20時間以降に多く発現してくることが明らかになった.そこで,bcg3の発現が確認されたトマト接種葉から作製したcDNAライブラリーを酵母two-hybrid法に供試したところ,約150の陽性クローンが得られた.それらの塩基配列を調査したところ,Gβタンパク質であるBC1G_10054と相同な配列が確認され,これがBCG3と相互作用するGβタンパク質であると考えられた。B. tulipaeは、同属のB. cinereaにおいて,Gαタンパク質の菌類サブグループIIIに属するbcg3がcAMPシグナル伝達経路の上流に位置しており,菌核形成を負に制御することが報告されている.当研究室ではこれまでにbcg3のホモログであるbtg3をB. tulipaeから単離しており,本菌においても同様の経路によって菌核形成が制御されている可能性が考えられた.そこで,本研究ではプロトプラスト-PEG法によってbtg3遺伝子の破壊株を作出し,その表現形質について調査した.PDA培地上での菌糸生育について野生型と比較したところ,コロニーの生育に遅延が見られた.また,チューリップ葉に対する接種試験を行ったところ,野性株に比べて病原性の著しい低下が見られた.しかしながら,遺伝子破壊による菌核形成への影響は見られなかった.本研究では灰色かび病菌Botrytis cinereaの病原性株と弱病原性株を用いて、植物の初期抵抗反応を担う活性酸素種の一種である過酸化水素(H_2O_2)に対する感受性をin vitro下で試験した。その結果、弱病原性株はH_2O_2に対する感受性が高く、5mM以上のH_2O_2に対する感受性の増大が認められた。本菌のタンパク質抽出物を用いてH_2O_2代謝能力を調査した結果、病原性株の抽出物は弱病原性株よりも速やかにH_2O_2を代謝した。これらの結果から、H_2O_2を代謝・無毒化する能力の違いが今回供試した2菌株の病原性の違いを引き起こす要因の一つであると考えられた。植物生体内でH_2O_2を代謝する主な酵素であるカタラーゼについて、トマト葉への感染時における病原性株と弱病原性株のカタラーゼ遺伝子(CatAとCatB)の発現を経時的に調査した結果、2菌株間でカタラーゼ発現量に有意な差は見られなかった。このことから、弱病原性株のH_2O_2代謝能力の低下はグルタチオンペルオキシダーゼなどのカタラーゼ以外の酵素、またはグルタチオンのような抗酸化剤に起因する可能性が示唆された。B. cinereaの病原性に関与するヘテロ3量体Gタンパク質αサブユニットBcg3と相互作用するGβタンパク質Bclg_10054の機能を解析した。bclg_10054は静置培養では発現しないが、振とう培養24時間で発現するのに対し、bcg3は両培養で発現しなかった。また、タマネギりん片表皮に接種して、両遺伝子の発現を調べたところ、bclg_10054は接種8時間以降から一定レベルで発現したが、bcg3は侵入糸を形成する接種20時間以降に僅かに発現がみられた。Bclg_10054と相互作用するαサブユニットはBcg3以外に存在することが示唆された。