hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラット青斑核神経細胞におけるNA,5-HT及びGABAの共存性に関する研究

ウイスターラットの青斑核でtyrosine hydroxylase(TH)とγ-aminobutyricacid(GABA)の共存性を4シリーズの6μm cryostat連続切片をZamboniの固定の上、交互にPAP法で免疫染色して、隣接切片を比較検討した(240pairs)。統計処理はtー検定によった。(1)総THergic neurons数と(2)総GABAergic neurons数との間に有意の差はなかった。これは単一の細胞群がnoradrenaline(NA)とGABAを含むことを意味する。グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD-LI)をABC法により、あらかじめ側脳室にcolchicine(100μg、48hr)を注入してからZamboni固定を施した群について検討した。GAD-LIはTH-LIとの交互切片からは32%(433/1367)の比で確認された。GADのGABAに対する比率は(433/1321)で低いがこの値は他の脳領域で得た値に似ており、むしろ、technical limitationsと思われる。GADで標識された細胞は類似の形態を示すものが1群をなす傾向を有し、全体としては三次元的網工を呈することが判明した。このGAD性の網工(network)は青斑核の背側部(dorsal division)に発達する傾向を示した。またGADmRNAの検出のためのin situ hybridizationのFITC螢光はGADよりも広くかつ多数の標識細胞が青斑核内分布を示したがTHmRNAよりも乏しかった。THmRNAとGADmRNAを現在は免疫螢光法により、青斑核の個々の神経細胞で共存するか否かを検討中である。なお、本研究は日本組織細胞化学会の公的機関誌であるActa Histochem.Cytochem.26巻3号(1993)8月号に掲載の予定である。ウイスターラットの青斑核でtyrosine hydroxylase(TH)とγ-aminobutyric acid(GABA)の共存性を4シリーズの6μm cryostat連続切片をZamboniの固定の上、交互にPAP法で免疫染色して、隣接切片を比較検討した(240pairs)。
満洲国における日本浪曼派の受容と変容

本研究は、日本浪曼派および満洲浪曼派を文学的事例として取り上げ、満洲という日本の傀儡国家が建設された地域における浪曼派的思想の機能と意味について考察する。これまでの「日本浪曼派」あるいは「満洲浪曼派」を扱った研究の多くは、その視点が一地域あるいは一国に限定されており、特に相互影響関係に基づいた研究はほとんどなされてこなかった。本研究は、昭和精神史の重要な内容としての「満洲叙述」あるいは「大陸想像」が如何なる意味が持つのかを問題意識として、日本浪曼派と満洲浪曼派の関連付けに基づいて、文学形態の移り変わりを歴史的に再現することで、国や地域の枠を乗り越える超域的研究の可能性を提示することを試みたい。
ポリメラーゼ連鎖反応に基づく豚流行性肺炎マイコプラズマの遺伝学的解析とその応用

豚の流行性肺炎は、発育の遅延および飼料効率の低下などに基づく経済的損失が甚大であるため、マイコプラズマを原因とする家畜疾病の中でも、最も警戒を要するものの一つとされている。本病は世界各地の養豚場で発生が知られており、わが国における近年の発生率は60%以上と報告されている。本病の原因となるマイコプラズマ・ハイオニューモニエは培養が困難であり、通常の培地を用いての初代分離は一般に成功しない。このため、本マイコプラズマの生物学的および遺伝学的性状に関する知見ははなはだ乏しく、その病原因子に関する研究は著しく立ち遅れており、本菌による病理発生機序も明らかでなく、また本病の診断・予防法も確立されていない。このような現状を踏まえて、本研究は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)を利用することにより、マイコプラズマの大量培養を行うことなく、そのDNAを大量に試験管内合成させ、これを用いて、本菌の生物学的ならびに遺伝学的性状を分子レベルで解析し、その応用に途を拓くことを目的としている。本年度は、本菌のリボゾームRNAオペロン領域をPCR法により増幅させ、その一次構造を決定し、他の真正細菌との比較を行った。その結果、本菌のリボゾームRNAオペロン内スペーサー領域には、(1)tRNA遺伝子が無いこと、(2)boxA類似構造が保存されていること、(3)入れ子様式のステム・ルール構造をとり得ること、(4)プロモーター様構造がみられること、(5)全体としてアンチターミネーターの構成をとることなどが初めて明らかにされた。また、本菌のリボゾームRNAオペロン内スペーサー領域は、他のマイコプラズマ種に比べ1.52倍の長さがあり、これをマーカーとして、菌種の同定や診断への応用が可能と思われ、これは今後の検討課題として残された。豚の流行性肺炎は,発育の遅延および飼料効率の低下などに基づく経済的な損失をもたらすため,マイコプラズマを原因とする家畜疾病の中でも,最も警戒を要するものの一つとされている。本病は世界各地の養豚場で発生が知られており,わが国における近年の発生率は60%以上と報告されている。一般にマイコプラズマは人工培地に発育可能な最小の原核生物であり,そのゲノムサイズは約80万塩基対と小さいことが知られている。しかし,本病の原因となるMycoplasmahyopneumoniaeは培養が極めて困難であり,通常の培地を用いての初代分離は一般に成功しない。このため,本マイコプラズマの生物学的および遺伝学的性状に関する知見ははなはだ乏しく,その病原因子に関する研究は著しく立ち遅れており,本菌による病理発生機序も明らかでなく,また本病の予防法も確立されていない。本年度は,はじめにポリメラ-ゼ連鎖反応(PCR)を利用することにより,マイコプラズマの大量培養を行うことなく,そのゲノムDNAを大量に試験管内合成させるための条件を整備した。このため,M.hyopoeumoniae DNAのゲノムライブラリ-の中からサザンブロッ交雑法により選択された,反復配列を含むクロ-ンについて,その塩基配列をサンガ-法により決定した。決定された反復配列は,本マイコプラズマのゲノム内に少なくとも8コピ-存在することがDNA交雑法により確認された。そこで,この領域を標的としたPCR法を開発することにした。その結果,この増復配列をはさむ約20塩基からなる合成プライマ-を用いることにより,本マイコプラズマを特異的に検出することが可能となり,その感度は10^2CFUの菌数を検出できるものであった。

さらに,現在では,改良された二段階PCR法を用いることにより,10CFUの菌数が検出できるまでに至っている。これは,本病の診断が感染初期に行える途を拓くものである。豚の流行性肺炎は,発育の遅延および飼料効率の低下などに基づく経済的損失が甚大であるため,マイコプラズマを原因とする家蓄疾病の中でも,最も警戒を要するものの一つとされている。本病は世界各地の養豚場で発生が知られており,わが国における近年の発生率は60%以上と報告されている。本病の原因となるマイコプラズマ・ハイオニューモニエは培養が困難であり,通常の培地を用いての初代分離は一般に成功しない。このため,本マイコプラズマの生物学的および遺伝学的性状に関する知見ははなはだ乏しく,その病原因子に関する研究は著しく立ち遅れており,本菌による病理発生機序も明らかでなく,また本病の診断・予防法も確立されていない。このような現状を踏えて,本研究は,ポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)を利用することにより,マイコプラズマの大量培養を行うことなく,そのDNAを大量に試験管内合成させ,これを用いて本菌の生物学的・遺伝学的性状を分子レベルで解析し,その応用に途を拓くことを目的としている。本年度は,本菌のリボゾームRNAオペロン領域をPCR法により増幅させ,その一次構造を決定し,他の真正細菌との比較を行った。その結果,本菌のリボゾームRNAオペロン内スペーサー領域には,(1)tRNA遺伝子が無いこと,(2)boxA類似構造が保存されていること,(3)入れ子様式のステム・ループ構造をとり得ること,(4)プロモーター様構造がみられること,(5)全体としてアンチターミネーターの構成をとることなどが初めて明らかとなった。また,本菌のリボゾームRNAオペロン内スペーサー領域は,他のマイコプラズマ種に比べ1.52倍の長さがあり,これをマーカーとして,菌種の同定や診断への応用が可能と思われ,これは今後の検討課題として残された。
一塩基多型(SNPs)検出のための修飾DNAアプタマーの創製

ミスマッチ、バルジ、インターナルループなど二重鎖核酸中の非ワトソン?クリック塩基対部位に特異的に結合する分子は、一塩基多型(SNPs)など遺伝子型の違いを検出するのに利用できる。例えば、患者のあるmRNAのcDNAとそれに対応する健常者のDNAをハイブリダイズ(結合)させると、塩基配列中に一塩基多型部位が存在するなら、その部位でシングルミスマッチ構造が生じる。これに蛍光物質などで標識化した「非ワトソン?クリック塩基対結合分子」を加えることでSNPsの存在を知ることができる。このような非ワトソン?クリック塩基対に特異的に結合する分子として修飾DNAアプタマーの創製を試験管内選択法によって試みた。ヒトステロイド5-αレダクターゼ(SRD5A1)遺伝子の一塩基多型領域をターゲットとしてアミノ基修飾DNAアプタマーの試験管内選択を進めたところ、ミスマッチ構造を含む二重鎖DNAターゲットに対して親和性を示すものの濃縮が確認された。そこで濃縮された修飾DNAライブラリをクローニングによって単離し、ターゲットに対する親和性をそれぞれアッセイしたところ、ミスマッチ構造を含むターゲットに対して優位に結合するいくつかのアミノ基修飾DNAアプタマーを見出した。ゲルシフト法(gel-shift assay)やSPR(表面プラズモン共鳴)法を用いて、ターゲットに対する結合解離定数や結合特異性の測定を行い、さらに円偏光二色性スペクトルや熱融解曲線の測定および一次配列解析によって、導入された修飾基が分子認識にもたらす効果について知見を得ることが期待できる。
シクロスポリン腎症に対するカルバミル化エリスロポイエチンの腎保護効果の研究

免疫抑制剤のシクロスポリンの導入により腎移植の成績は向上した。しかし、シクロスポリンはそれ自身、腎毒性を有しており長期使用することにより腎機能障害(シクロスポリン腎症)を来す。そこでシクロスポリン腎症に対するカルバミル化エリスロポイエチン長期投与の効果について検討した。シクロスポリン腎症モデルにエリスロポイエチン、カルバミル化エリスロポイエチンを加えることにより腎機能障害が軽減された。また、エリスロポイエチンは、Hbの上昇を来したが、カルバミル化エリスロポイエチンはHbに変化を与えなかった。この結果は、シクロスポリン腎症に対する新たな治療戦略となりうる。6週齢のSDラットをコントロール群、CsA群、EPO群、CEPO群の4群に分け、減塩食下で飼育した。CsA群、EPO群、CEPO群にはCsA 30mg/kgを連日皮下注射しシクロスポリン腎症を作成した。コントロール群にはCsAの溶媒のsesame oilを投与した。さらにEPO群、CEPO群にはそれぞれEPO、CEPOを1000単位/kgで週三回腹腔内注射した。コントロール群、CsA群には生理食塩水を投与した。4週間の投薬後にsacrificeし、各種samplingを行った。Sacrificeの際に採血し、EPO/CEPOによる腎機能への影響を検討すると共に、赤血球数への影響を調べた。治療4週後のヘモグロビン値は、CsA群が16.5±1.2g/dL、CEPO群が15.9士0.7g/dLであったのに対し、EPO群では20.4±0.9g/dLと有意に上昇を認めた。血清クレアチニン値については、Control群が0.21±0.02mg/dLであったのに対し、CsA群では1.17±0.24mg/dLと有意に腎機能の悪化を認めた。一方、EPO、CEPO投与によりEPO群では0.82士0.11mg/dL、CEPO群では0.73±0.21mg/dLと有意に血清クレアチニン値の上昇が抑制されていた。これらのデーターより、シクロスポリン腎症モデルにおいてCEPO、EPOには、腎保護効果を有することが証明された。また、CEPOではEPOとは異なり造血作用を有さずに腎保護作用を発揮することが証明された。低ナトリウム食飼育下の6週齢の雄性SDラットを4群に分類し、それぞれコントロール群、シクロスポリン(CsA)群、シクロスポリン+エリスロポエチン(EPO)群、シクロスポリン+カルバミル化エリスロポエチン(CEPO)群とする。PAS染色ではCsA群では尿細管の萎縮を認めたが、EPO/CEPO群では傷害が軽度であった。またマッソン・トリクロム染色においても、CsAによる間質の線維化が、EPO/CEPO群では有意に抑制されていた(Control群3.1±1.2%,CsA群12.2±2.0%,EPO群7.2±2.6%,CEPO群6.7±2.7%)。α-SMA染色で形質転換を評価したところ、EPO/CEPO投与群ではCsA群と比較し有意にα-SMA陽性面積が少なかった(Control群1.0±0.5%,CsA群9.7±2.9%,EPO群4.4±0.8%,CEPO群3.4±1.4%)。またED-1染色にてマクロファージの浸潤を評価したところ、EPO/CEPO群では、CsA群と比較し有意にマクロファージの浸潤が抑制されていた(Control群38±11cells/HPF,CsA群909±240cells/HPF,EPO群538±192cells/HPF,CEPO群486±191cells/HPF)。腎皮質におけるTGF-β1の発現をreal time RT-PCRで検討したところ、EPO/CEPO投与により有意にTGF-β1の発現が抑制されていた。下流のtypeI collagenのmRNAの発現も、同様にEPO/CEPO投与群で有意に抑制されていた。低ナトリウム食飼育下の6週齢の雄性SDラットを4群に分類し、それぞれコントロール群、シクロスポリン(CsA)群、シクロスポリン+エリスロポエチン(EPO)群、シクロスポリン+カルバミル化エリスロポエチン(CEPO)群とした。ハーベストした腎組織のTUNEL染色を行うことにより、EPO/CEPOによるシクロスポリン腎症に対する抗アポトーシス効果を検討すると共に、Western blot法により組織におけるPI-3 kinase、Aktのリン酸化を検討し、EPO/CEPOによる抗アポトーシス効果のメカニズムを検討した。

TUNEL染色を行い、アポトーシスについて評価したところ、CsA群ではControl群と比較し有意にTUNEL陽性細胞数は増加していた(Control群, 0.5 ±0.4 cells /HPF, CsA群, 16.3 ±7.4 cells /HPF)。一方、EPO/CEPO群では有意にアポトーシスは抑制されていた(EPO群, 6.6 ±2.4 cells /HPF, CEPO群, 5.4 ±1.7 cells /HPF)。アポトーシスに関連する因子として、生存シグナルであるPI3K、Akt経路についてWestern blotting法で検討したところ、CsA群に比較し、EPO/CEPO群ではPI3K、リン酸化Aktの発現が亢進していた。ほぼ予定通りに研究成果が得られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。虚血再還流モデルにおいて、EPOはHIF-1αを誘導し血管新生をもたらすことを報告した(Transplantation83:1371-1379,2007)。本モデルにおいても、同様にreal time RT-PCR法やWestern blot法を用いてHIF-1αやVEGFなどのmRNA、タンパクの発現を検討し、組織学的にもJG12などの血管内皮細胞マーカーによる免疫染色法を用いて検討する。
多文化共生社会の高齢化に対応した在宅ケアグローバル人材養成教育プログラムの開発

本研究は,多文化共生社会の観点から,多文化・多様化する高齢社会に対応できる,在宅ケア専門職を対象とした,グローバル人材養成教育プログラムを開発することを目的としている。戦後から長期在住により高齢化した旧来外国人はもとより,新来外国人も含め,日本で高齢期を迎えて介護を必要とする外国人が増加している。その国籍・在留資格・移住目的・コミュニティ形成過程・文化的背景は多岐にわたり,介護をめぐる諸問題が様々な形で顕在化し深刻化している。現場の教育ニーズに応じた実践的な教育プログラムを開発し,実践試行と振り返り討議を重ねて検討の上,完成と普及を目指すものである。
インターネット上で利用できる統計教育ソフトウェアの開発

最近のコンピュータ及びネットワーク環境の急速な発展に伴い統計分析ソフトウェアや統計教育も変わりつつある。統計分析ソフトウェアの使用においては、統計分析の知識は不可欠であるが、逆に、統計教育においても統計解析ソフトウェアを利用することで、その教育効果か高まるという事実が、様々な研究者より報告されている。すなわち、分析ソフトウェアと学習ソフトウェアの有機的結合が望まれている。このような背景をもとに、この申請研究ではインターネット上で利用可能な統計分析の初心者のための統計学習・分析ソフトウェアを実用化することを目的としている。昨年度に引き続き、統計計算ライブラリの作成、インターネット上のインタラクティブな統計の教科書のサイトの構築を行った。その成果の一部は、日本計算機統計学会学会誌「計算機統計学」に論文として採択され掲載された。また、残部についてもCOMPSTATや日中統計シンポジウム、日韓統計会議、ISM国際シンポジウムなどで成果発表を行い、国内外の研究者と討論を行った。さらに、国際統計協会ソウル大会では、招待講演セッションで発表を行った。なお、構築されたサイトについては、すでに運用を開始している。統計分析ソフトウェアの使用においては、統計分析の知識は不可欠であるが、逆に、統計教育においても統計解析ソフトウェアを利用することで、その教育効果が高まるという事実が、様々な研究者より報告されている。本年度は、統計計算ライブラリの作成、インターネット上のインタラクティブな統計の教科書のサイトの構築を行った。その成果の一部は、日本計算機統計学会学会誌「計算機統計学」に「DLLSA:Dynamic Link Libraryを用いた統計分析ライブラリ」という題目の論文として採択され掲載予定になっている。また、統計処理に関するライブラリや関連ソフトウェア構築についてはCOMPSTATや第7回日中統計シンポジウム、第10回日韓統計会議、ISM国際シンポジウムなどで成果発表を行い、国内外の研究者と討論を行った。教育面での効果については、千葉で開催された第9回国際数学教育者会議および台湾で開催されたコンピュータを利用した教育に関する国際会議で発表し、その面での評価について議論した。なお、これまでに構築されたサイトについては、すでに運用を開始している。
ソフトローの国内政策への影響メカニズムと実効性に関する実証研究

研究計画は、1ソフト・ローの機能や役割についての理論的枠組みの設定と、2ソフト・ローが国内で実際に影響力をもたらしているかどうかの実証的研究の、2段階構成とした。1の理論的段階では、国際法学だけではなく国際関係論の「リーガライゼイション(法化)理論」とEU法の「ニュー・ガバナンス論」に着目して検討した。2の実証研究の段階では、WTO法の食品安全の分野で問題となっていた、農産物の生産過程に関する基準に着目した。具体的には、`GLOBALG.A.P.'というソフトな基準・指標を扱い、それが日本・米国・タイの国内でどのように浸透・拡散しているか調査を行った。24年度はソフトローが影響していく「経路・メカニズム」の要因の理論的考察を続けると同時に、ソフトローの影響メカニズムの実証分析も始めた。年度の初めは、前年度から滞在したUniversity College London(UCL)に研究員として在外研究を6月まで続け、その間に、WTOとソフトローという観点からの理論的考察について論文・分担著書を執筆、24年度内に公表する機会を得た(「WTOにおける科学の役割ーSPS協定の限界と近年の体制内の変化」『国際法外交雑誌』第111巻1号、119頁(2012年5月);「国際法学との対話ーWTOと遺伝子組み換え産品をめぐって」『コンストラクティヴィズムの国際関係論』(大矢根聡編)所収、247270頁、有斐閣(2013年3月))。前者は、WTO内のSPS委員会によるソフトなガバナンスについて、後者は、グローバルガバナンスにおけるソフトローの役割について検討したものである。ロンドンを離れて、夏の期間はSingapore Management University(SMU)において在外研究を続け、その間は、第三者認証機関とソフトローという視点で実証研究およびそのまとめを行った。認証機関の具体的例としては、前年度からのGLOBALG.A.P.という欧州を拠点として農産物の認証を行う機関と、新しく調査を始めたアジアのバイオ燃料に関する認証制度を扱った。GLOBALG.A.P.については実証研究のまとめとして英語で論文を執筆し(現在、英文ジャーナルに投稿中である)、バイオ燃料については、シンガポールを拠点とする企業にインタビュー調査を行った。インタビュー調査の結果の一部については、「バイオ燃料をめぐる国際通商(一・二完)」『阪大法学』第62巻5号95113頁、第62巻6号2150頁(2013年1月、3月)に公表している。本年度は、これまでの理論研究を踏まえた実証研究のまとめの段階であり、それを英文雑誌に公表することまで視野に入れて取り組んだ。実証研究としては、主として、農産物の生産過程に関する基準(食品安全・環境保全・労働者保護などの包括的基準)を扱った。具体的には、WTOのSPS委員会でも議論されたことのある、`GAP(Good Agricultural Practice;農業生産工程管理)'とよばれるソフトな基準を取り上げた。それが日本・米国・タイの国内でどのように浸透・拡散しているかを分析し、まとめた。とりわけ、GLOBALG.A.P.という欧州を拠点としているプライベート・アクターが策定した基準と、政府レベルやローカルなレベルで取り組まれているGAP活動との関係性に注目しながら検討をおこなった。調査を行った日本・米国・タイにおいても、様々な形や場面で、GLOBALG.A.P.が受け入れられたり、あるいは拒否されたりした事情がみられた。世界的な普及の勢いがあるGLOBALG.A.P.であっても、各国の農産物の生産条件や環境が異なることから、ローカルな事情を考慮しなければ、GAPの理念やアイデアが広く普及しないことが分かった。本年度は、ソフトローの機能や役割についての先行研究をレビューし、近年の理論動向をまとめることを目的とした。具体的には、2つのソフトロー概念に注目して、レビューを行った。1つは、「リーガライゼイション(法化)理論」とよばれるソフトロー概念であり、2つ目は、EU法の「ニューガバナンス論」にみられるソフトロー研究である。10月よりロンドンのUniversity College London(UCL)にて研究員として在外研究を開始したことから、特に上の2つ目のEU研究における理論分析に力を入れることができた。とりわけ、ソフトローを中心としたニューガバナンスが、ハードローを中心とした既存の法制度とどのような関係にあるのかについて理論的なまとめを行った。その過程では、UCL法学部のJ.Scott教授との意見交換をしばしば行った。また10月に行われたイタリアのEuropean University Instituteにおける学会(Global Public Goods and the Plurality of Legal Orders)に参加して得た情報も役にたった。以上のサーベイを総合して、本研究の基礎となる分析枠組みを確定した。その一部は、学会において既に報告した(2011年春季国際法学会報告「WTOにおける科学の役割ー

SPS協定の限界と近年の体制内の変化ー」; Asian Intl Economic Law Network学会"The Role of Private Standards in Food Safety: How `Good Agricultural Practices (GAP)' in Europe Affect Asian Agricultural Markets")。理論的サーベイのまとめは、分担著書の1章分として現在、執筆中である(書籍は来年度に発行)。国際法24年度の目的は、ソフトロー研究に関する理論的レビューの継続とまとめ、さらに実証研究を始めることにあった。理論的枠組みについては、前年度からのレビュー結果を論文と分担著書にまとめる機会が得られ、目的を達成することができた。また、実証研究については、どのような実証的な研究が学問的に必要とされているかという点において、当初の計画ではWTOを対象にジュネーブでの委員会レベルの聞き取り調査を予定していたが、ロンドンとシンガポールでの在外研究、また海外の研究者との意見交換により、プライベート・レジームという第三者認証をめぐるソフトローという検討の視点を得て、研究の新規性を深めることができたのが収穫であった。さらに、ロンドンとシンガポールでの在外研究という場所的な利点を活かして、GLOBALG.A.P.に関するインタビュー調査を続けることができたし、さらにバイオ燃料に関する認証制度のアジアでの調査も開始できた点は進展であった。本年度の目的は、ソフトロー研究の理論的枠組みの設定であり、当初の予定どおり、(1)ソフトローにどのような機能があると考えられているのか、(2)ソフトローとハードローとの関係はどのように捉えられているのか、(3)どのような実証的な研究が求められ、その実証的研究においてどのような手法が用いられているのか、の3点に着目した分析を行うことができた。とりわけ、ソフトローの形成・機能の点において、WTO(世界貿易機関)のような公的機関だけではなく、非政府組織(いわゆるプライベートガバナンス)の役割が大きいことが分かり、プライベートガバナンスの動向も実証研究の中にいれていく必要性を認識できたことが大きな発見であった。さらに、ロンドンでの在外研究という場所的な利点を活かして、来年度に本格的に行うはずであった実証的研究の一部の聞き取り調査を行うことができた。ドイツ・ケルンに本部をおくGlobalGAPの農作物の生産工程基準を事例として、プライベートガバナンスによって形成されたソフトローがどのような「経路・メカニズム」によって国内政策に影響を与えるとされているのか、調査を始めることができた。当初の予定どおり、次年度は実証的研究のための聞き取り調査を中心に行う。同時に、ソフトローがどのような「経路・メカニズム」によって影響を与えるのか、という理論的部分について、見直しや修正の必要がないかに常に配慮し、実証研究をしながら、再検討することとする。
有機典型金属-アミン型触媒を用いる分子の集合化と新しい触媒作用の創製

近年の有機合成化学の発展は、低分子から高分子に渡る多彩な化学物質の合成を可能にした。しかし、出発原料から目的物のみを得るという理想的な反応の開発には、いまだ未踏の領域が多い。革新的な有機合成の発展に寄与する今後の研究には、学術的な興味のみならず、枯渇に瀕した金属・化石資源に対する意識も必然的に求められる。そこで、前年度に引き続き、ユビキタス元素からなる触媒の開発研究を行った。とくに、典型元素とアミン、そして水分子から成るアミノ有機ボラン-水型触媒や、その類似体であるアミノ有機シラノール化合物、およびテトラゾイルシラノール触媒の反応適用範囲の拡大を目指した。触媒作用の特徴としては、元素中心の内圏ではなく外圏を主に活用する点や、元素中心によって活性化さ媒は複数の酸と塩基が協同的に働く多機能性をもつが、同時に高機能性をも示す。これら触媒のひとつは、エポキシドの過溶媒分解において、TON=9700を記録した。ボランを中心元素としてもつ水分子触媒に関しては、ニトロアルドール反応のみならずDirectアルドール反応にも適用できることが証明された。アルコールの水酸基の酸性度を識別するアセチル化触媒としても機能する。この触媒を用いて、ニトロアルドール反応における詳細な速度論的実験を行った。その結果、「形ある水」分子がニトロ基を認識し、弱い相互作用をこの官能基と作るとともに、ニトロネートを可逆的に発生させることを突き止めた。また触媒とニトロアルカンそれぞれの濃度に対して1次反応であることを明確にした。触媒活性中心に存在するH_2O分子をD_2O分子に置換した触媒を用いてさらに反応速度を追跡したところ、D_2O分子がもつ、より高い触媒活性を確認できた。天然酵素は正逆両方の反応を促進するが、本触媒においても反応条件によっては逆ニトロアルドール反応も効果的に進行することが明らかとなった。まさに人工酵素ともよべる触媒系を構築できたといえる。そしてこの触媒のもつ水部位が触媒活性の発現に必須であることを証明した。金属酸化物は水の金属等価体である。従って、水を含有する有機典型金属化合物に触媒作用を賦与することができれば、原理的には水のプロトンは周期律表にあるすべての金属に置換可能であり、新型金属触媒創製へと即座に連動する。すなわち、最低でも金属三核中心からなる金属触媒へと容易に誘導できるという利点を持つ。このような新しい発想を機軸とし有機典型金属-アミン型触媒と水の集合体の合成研究を開始した。最初に、酸と塩基を併せ持つ新しい有機ボラン-アミン-水型クラスター触媒の開発に成功した。この触媒のもつ酸と塩基の連続構造が様々なエノール種(エノラート種ではない)の程よい安定化に寄与することで、その生成と反応を可能にすることを見い出した。特にニトロアルドール型反応において顕著な触媒活性を示した。触媒回転数(TON)は1000回転に達する。また各種同位体化合物を用いる実験によって、ニトロアルドール反応における触媒の作用機序をほぼ明らかに出来た。まず、この水クラスター化合物が含有する水分子(H_2O)を重水分子(D_2O)に変えるだけで、1.5倍程度反応速度が上がることを確認した(k_H/k_D<1)。また本触媒は、D_2O分子よりもH_2O分子をより強く含有・保持することが明かとなった。H_2O(あるいはD_2O)分子が水素結合を介してニトロメタンと相互作用し、この分子を活性化したと推測される。さらに、ニトロメタン-d_3を用いることで、k_H/k_D<1になる2次的同位体効果を更に観察した。これらの結果から反応の律速段階は、触媒がニトロメタンと相互作用する平衡過程と、エノール種とアルデヒドが分子間で炭素-炭素結合を生成する過程、これら2段階からなるといえる。これら重要な知見を統合すると、ボラン中心は反応に必要な相互作用形成に実質的には関わっておらず、水素結合のみが駆動力となり反応を進行させることが示唆された。本研究で追求する「触媒」とは、豊富な天然資源、かつ人為的に大量生産可能な糖類やタンパク質などのバイオマス群を「分子」として捉え、その活用に視点をおくものである。そして、個々のバイオマス分子を触媒として有効利用するうえで前提となる、化学的な基盤概念め端緒を見いだすことを目的とする。核酸や糖医薬,および液晶材料等の合成において有用な原料となり得るb-ヒドロキシニトロアルカン化合物やb-アミノニトロアルカン化合物を,金属を含有しない環境調和型触媒存在下効率よく合成することにも成功した。特に水素結合のみを推進力とし炭素-炭素結合を生成させる分子触媒的手法はこれまでほとんど皆無であったが、その実現を可能とするアミノ有機ボラン-水型クラスター触媒を開発した。触媒作用の特徴としては、元素中心の内圏ではなぐ外圏を主に活用する点や、元素中心によって活性化された水素結合によって反応が促進される点が挙げられる。また本触媒は複数の酸と塩基が協同的に働く多機能性をもつが、同時に高機能性をも示し、ニトロアルドール反応のみならずDirectアルドール反応やアルコールのアセチル化反応にも適用できることが証明された。そしてこの触媒のもつ水部位が触媒活性の発現に必須であることを見出した。すなわちこの触媒は「形ある水」触媒といえ、水分子を触媒として利用するための基盤概念をこのたび新たに提供できた。

水素結合を駆動力とする触媒作用を合理的にビルドアップできたことは学術的にも意義が深い。また、溶媒を用いない本合成手順は簡便かつ実用的であるといえ,将来的には不斉炭素-炭素結合生成反応のための新しい工業化戦略へと導かれることが期待される。近年の有機合成化学の発展は、低分子から高分子に渡る多彩な化学物質の合成を可能にした。しかし、出発原料から目的物のみを得るという理想的な反応の開発には、いまだ未踏の領域が多い。革新的な有機合成の発展に寄与する今後の研究には、学術的な興味のみならず、枯渇に瀕した金属・化石資源に対する意識も必然的に求められる。そこで、前年度に引き続き、ユビキタス元素からなる触媒の開発研究を行った。とくに、典型元素とアミン、そして水分子から成るアミノ有機ボラン-水型触媒や、その類似体であるアミノ有機シラノール化合物、およびテトラゾイルシラノール触媒の反応適用範囲の拡大を目指した。触媒作用の特徴としては、元素中心の内圏ではなく外圏を主に活用する点や、元素中心によって活性化さ媒は複数の酸と塩基が協同的に働く多機能性をもつが、同時に高機能性をも示す。これら触媒のひとつは、エポキシドの過溶媒分解において、TON=9700を記録した。ボランを中心元素としてもつ水分子触媒に関しては、ニトロアルドール反応のみならずDirectアルドール反応にも適用できることが証明された。アルコールの水酸基の酸性度を識別するアセチル化触媒としても機能する。この触媒を用いて、ニトロアルドール反応における詳細な速度論的実験を行った。その結果、「形ある水」分子がニトロ基を認識し、弱い相互作用をこの官能基と作るとともに、ニトロネートを可逆的に発生させることを突き止めた。また触媒とニトロアルカンそれぞれの濃度に対して1次反応であることを明確にした。触媒活性中心に存在するH_2O分子をD_2O分子に置換した触媒を用いてさらに反応速度を追跡したところ、D_2O分子がもつ、より高い触媒活性を確認できた。天然酵素は正逆両方の反応を促進するが、本触媒においても反応条件によっては逆ニトロアルドール反応も効果的に進行することが明らかとなった。まさに人工酵素ともよべる触媒系を構築できたといえる。そしてこの触媒のもつ水部位が触媒活性の発現に必須であることを証明した。
プロテインキナーゼを分子標的とする新しいコンジュゲイトの胃癌腹膜藩種治療力の応用

難治癌の一つである腹膜藩種性転移に対しては、従来行われてきた治療方法では効果が乏しいため、新しい発想による治療法が必要である。モノクローナル抗体を用いたimmunoconjugateは、ミクロのレベルで癌細胞のみを攻撃する事により、従来の治療法の持つ欠点を克服し、優れた治療効果を得る事の出来る画期的な手段になると考えられる。本研究では、胃癌を特異的に認識するモノクローナル抗体A7をヒト化したch-A7と、protein-tyrosine kinase(PTK)の強力な抑制物質であるgenistein(Gen)とを結合させたimmunoconjugate(ch-A47-Gen)を作成し、平成10年度に続いて本年度も基礎的に検討を加えた。その結果、以下の事実が明らかになた。殺細胞効果: ch-A7-Genは、コントロールに比し強い殺細胞効果を示した。ヌードマウス移植固定腫瘍に対する増殖抑制効果: ch-A7-Genはコントロールに比し腫瘍増殖を強くし抑制した。ヌードマウス腹膜藩種モデルを用いた治療効果の検討:ヌードマウス腹膜藩種モデルconjugateを投与した結果、腹膜藩種が抑制された。本年一年間で申請者は抗体とgenisteinの結合実験を行い、更に作成されたコンジュゲイトの生物学的活性について実験的に検討した。まず教室で所有のヒト化したモノクローナル抗体ch-A7の遊離アミノ基にheterobifunctional cross-linking agentのSANPATHを共有結合させた。その後SANPATHのもう一つの反応基とgenisteinをphotolyticに結合させた(ch-A7-Gen)。コンジュゲイトとgenistein抗体とgenisteinとの結合モル比を、1:2、1:3、1:5の三種類とし、作成されたch-A7-Genの抗体活性を計測した。すなわちch-A7-Genを125-Iで標識し、これとch-A7と強く反応する事がわかっている胃癌細胞株MKN45との結合活性をradioimmunoassayにて測定したところ、それぞれモル比1:2、1:3、1:5のコンジュゲイトの抗体活性は、元のch-A7の抗体活性の約80%、50%、30%であった。またコンジュゲイトのPTK活性を測定した。MKN45をch-A7-Genと4時間接触させ、細胞をNP 40に溶解し、これに^<32>Pを加えペレットを電気泳動し、autoradiographyにかけPTK活性を測定した。PTK活性は上記3種類のコンジュゲイトの内、1:2のものが、ch-A7単独,Gen単独、non-specific IgG-GEnに比し強い特異的活性を示した。in vitroにおけるこれらの結果は、ch-A7とgenisteinのモル比1:2のコンジュゲイトが最も優れた剤形である事を示した。次年度はin vitroのアポトーシスの計測、殺細胞効果を検討した後に、in vivoの実験に入る予定である。難治癌の一つである腹膜播種性転移に対しては、従来行われてきた治療方法では効果が乏しいため、新しい発想による治療法が必要である。本研究では、胃癌を特異的に認識するモノクローナル抗体A7をヒト化したch-A7と、protein-tyrosine kinase(PTK)の強力な抑制物質であるgenistein(Gen)とを結合させたimmunoconjugate(ch-A7-Gen)を作成し、平成10年度に続いて本年度も基礎的に検討を加えた。その結果、以下の事実が明らかになった。殺細胞効果:細胞の放射活性を計測したが、ch-A7-Genは特異性をもった強い殺細胞効果を示した。ヌードマウス移植固形腫瘍に対する増殖抑制効果:MKN45をヌードマウスに移植し、腫瘍増殖を経時的に計測すると、ch-A7-Genにおいて強い腫瘍抑制効果を示した。ヌードマウス腹膜播種モデルを用いた治療効果の検討:ヌードマウス腹膜播種モデルを用いて腹膜播種の治療効果を検討した結果、ch-A7-Genはコントロールに比し優れた腹膜播種抑制効果を示した。
糖ヌクレオチド輸送体による腸管機能制御の分子メカニズム

糖ヌクレオチド輸送体Slc35d1は、コンドロイチン硫酸(CS)、ヘパラン硫酸合成の基質を細胞質から小胞体・ゴルジ体内腔へ輸送する。時期特異的にSlc35d1遺伝子を破壊できるマウス系統(Slc35d1-iKO)を作製、成体マウスで遺伝子破壊を行うと、重度の下痢、著しい体重減少により、実験開始から10日後に死亡した。腸管組織を分析したところ、絨毛形態に軽微な異常が生じる段階でCS含量が30%程度減少し、その後、絨毛が急速に縮退することが判明した。以上の観察から、Slc35d1は腸管ホメオスタシスに必要であり、CS合成の減少が腸管絨毛の機能不全を引き起こす可能性が考えられた。目的本研究は糖ヌクレオチド輸送体SLC35D1の遺伝子破壊の誘導により引き起こされる腸管絨毛の崩壊現象を解析し、腸管機能発現におけるこの遺伝子の機能を明らかにする事を目的とする。方法SLC35D1遺伝子の組織特異的遺伝子破壊の可能なSlc35d1(flox/flox)マウス系統に、タモキシフェン(TXF)により活性化されるCreリコンビナーゼ遺伝子を導入、TXFの投与によりSLC35D1遺伝子の破壊を誘導した。TXF投与後、小腸を経時的に採取し、腸管絨毛の崩壊過程を追跡、遺伝子生化学的および組織化学的な解析を行い、糖鎖と細胞増殖能、遺伝子発現の変化について調べた。結果腸管組織標本を作製し、核酸アナログの取り込みを指標に細胞増殖能の変化を解析したところ、絨毛構造に異常が生じる前にクリプト領域での細胞増殖が著しく低下する事が判明した。クリプト領域の細胞増殖にインパクトのあるWntおよびNotchシグナル伝達系遺伝子の発現について、定量的PCRを用いて評価したところ、顕著な低下は認められなかった。また、絨毛崩壊が始まる前の腸管組織を生化学的に解析したところ、二割程度のコンドロイチン硫酸の含量低下が認められた。結論及び考察以上の観察から、Slc35d1遺伝子欠損の作用点が判明、この遺伝子欠損による腸管異常はクリプト領域でおこる幹細胞の分化増殖に起因し、Slc35d1は、恐らく既知の分化シグナル伝達系と異なるメカニズムで腸管ホメオスタシスの維持に貢献していると考えられた。目的成体マウスにおける糖ヌクレオチド輸送体SLC35D1の誘導的遺伝子破壊は、腸管絨毛の機能異常を引き起こし、下痢の発症による衰弱の後、個体死に至る。本研究は、この現象を解析することにより、腸管ホメオスタシスにおけるSLC35D1の機能を明らかにすることを目的とする。前年度の研究により、SLC35D1が欠損すると、腸管上皮幹細胞の増殖分化が欠損することが判明した。本年度は、引き続き個体レベルでの分析を行い、さらに、腸管組織から上皮細胞組織体(オルガノイド)を分化誘導し、in vitroでの分析を行った。方法SLC35D1フロックスマウス系統にタモキシフェン(TXF)により活性化されるCreリコンビナーゼ遺伝子を導入したマウス[SLC35D1(flox/flox)CreERT]の腸管より、クリプトを採取、マトリゲル内に封入、EGF、Noggin,R-spondinを含む培地でオルガノイドを誘導した。TXFの存在下の培養により、SLC35D1遺伝子の破壊を誘導、経時的にサンプルを採取し、遺伝子生化学的および組織化学的な解析を行った。結果TXF投与から4日後に、オルガノイドの細胞増殖は顕著に低下した。このサンプルを用いて糖鎖分析を行ったところ、20%程度のコンドロイチン硫酸含量低下が観察された。これらの結果は、マウス個体で行った観察とよく一致した。オルガノイド細胞増殖の低下について、モルフォゲンのシグナル伝達、細胞内ストレス、アポトーシス誘導の視点で分析を行った。しかし、いずれも細胞増殖低下の原因に直接つながる異常は観察されなかった。一方、マウス個体を用いた解析では、腸管絨毛の形態異常と並行して、炎症性サイトカインのIL6やTNFの発現が上昇することを見いだした。SLC35D1欠損により発症する下痢や絨毛構造の異常は、炎症により惹起、増悪される可能性が考えられた。生化学、遺伝学腸管組織のホメオスタシスは、種々の分子による機能的ネットワークにより支えられている。従って、腸管のホメオスタシスにおけるSlc35d1の機能を明らかにするためには、腸管組織の何処に焦点を当てるべきか判定する事が、重要なステップになる。

実験結果から、この遺伝子欠損による腸管異常はクリプト領域でおこる幹細胞の分化増殖に起因することが見いだされ、Slc35d1遺伝子欠損の作用点が判明した。また分化シグナル分析、糖鎖分析等も概ね計画通りに行っている。これまでは、小腸全体から組織を採取し分析してきたが、今後はクリプト領域に焦点をあて、より解像度の高い解析を行う。腸管クリプト領域での幹細胞の増殖・分化を指標として分析、Slc35d1の欠損がどのようにこの過程に影響を与えるのか、そのメカニズムを探る。腸管クリプト領域を顕微鏡下でレーザーにより切り出し、採取された組織について、遺伝子生化学的な分析を行い、糖鎖組成、遺伝子発現の変化を解析する。また、小腸から幹細胞を単離し、in vitroで腸管組織を分化させる実験系を導入し、Slc35d1の欠損時におこる異常を細胞レベルで分析する。申請者の実験実施施設の変更のため、マウスを移動した。これに伴い、分析に使用するマウス個体数を確保するための時間的遅延が生じたため、腸管蛋白質漏出などの分析に遅延が生じた。現在、マウス個体数を十分確保出来ているので、前年度の残っていた実験を行う予定である。
高出力・高安定レーザーの開発

国立天文台で建設中の20mファブリベロ-/マイケルソン干渉計形重力波アンテナに必要なレーザー光源を目標に周波数安定化の実験を行ってきたが、本年度の研究で、この目標を達成した。次の課題は、将来のkmクラスの大規模干渉計のために、kW級の量子限界レーザーを開発する基礎を研究することである。このようなことを目標に研究を行い、以下の実績を上げた。1)320Wの半導体レーザーを駆動し、独自のコンセプトに基づいた仮想点光源クラッド励起方式という拡大可能性の大きな励起方式で、YAGレーザーの発振を計画した。2)仮想点光源クラッド励起方式の3次元光線追跡シミュレーションによって、励起分布を予測し、光線入射角度を0.3°程度傾けるだけで、コア励起から均一励起まで、自由に励起分布を制御できることを理論的に示した。3)同時に、LDで励起した場合の励起強度分布を蛍光観測法で観測し、シミュレーション結果と良い一致が得られることを確認した。4)3次元光線追跡で求めた励起分布に基づき、レーザー結晶内の熱レンズ効果、熱誘起復析効果を計算し、それに基づく共振器設計の最適化を行った。5)レーザー発振実験を行い、マルチモード発振で、32W以上の出力、スロープ効率41.2%という側面励起では世界最高水準の結果を得た。6)発振実験から求めた熱錬図工か、熱複屈折効果を考慮して、TEM_<00>モード発振用に共振器を調整し、単一モード発振で、28.2W(ランダム偏光)26.5W(直線偏光)の出力を得た。M2値は1.03で、高出力レーザーでこれまでに観測されたことのないきれいな発振である。7)ポイティング安定度は20マイクロラジアンとすばらしい結果であった。8)超低損失モードクリーナー用ミラーを、国内メーカーと共同で開発し、1μm用としては世界で初めて100ppmを切った6ppm損失のミラーの開発、計測に成功した。9)ロシア科学アカデミー結晶学研究所カミンスキー教授と、固体レーザーの開発に関する共同研究を展開した。1.99.999%の反射率をもつ超低損失ミラーで透過帯域幅6.7kHzという高性能FP参照共振器を試作し、真空中でその特性を測定した。音響雑音が消滅し、昨年度に比べてさらに一層の安定化が実現された。2.LD励起YAGレーザーを高性能参照共振器を基準として安定化し、500μHz/√Hzのショット雑音レベルの周波数安定度を達成した。周波数安定度の計測をアラン分散などの手段で計測した。2台のレーザーを同時に安定化し、2つのレーザービーム間の周波数ビートを測定した。測定された193mHz/√Hzはビート周波数で初めてSchawlow-Townes limit以下に致達し、世界でもっとも狭いビート線副が実現された。LD励起YAGレーザーによる注入ロック実験を行い、マスター発振器による周波数安定化出力を雑音を増加させることなく、出力増大が図れることを実証した。5.100ミクロン厚さのYVO_4結晶を用いたアクティブミラーの解析で、自動的単一縦モード条件が広い範囲で可能なことを見い出し、発振実験装置を試作した。6.仮想点光源多重パスクラッド励起という新しい方法を提案、解析、試作を行い、その発振特性を測定した。予想通り、Optically thin materialに有効な励起が可能で、横モードの制御が容易であることを見いだした。8.LiLuF_4、La_3Ga_5SiO_<14>などの新しいレーザー結晶の発振に成功した。9.固体レーザーの周波数安定化に関係して、ロシア科学アカデミーの複数の研究所と共同研究を開始した。国立天文台で建設中の20mファブリベロー/マイケルソン干渉計形重力波アンテナに必要なレーザー光源を目標に周波数安定化の実験を行ってきたが、本年度の研究で、この目標を達成した。1)47mWモノリシックLD励起YAGレーザーのショット雑音限界であるδν/ν=1.5×10^<-19>/√<Hz>という安定度を実現した。2)8個のフォトダイオードによる光学分割計測を開発し、将来の高出力レーザーに拡大可能な低雑音、広帯域検知方式を提案、実証した。3)超高フィネス光共振器の狭帯域性と、サブヘルツまで安定化されたレーザー光源により、ミラー曲率の異方性や絶対値がミクロンオーダーまで計測できる新しい光学計測法を開発した。これは、将来のkm級干渉計の光学素子開発に不可欠の技術となるだろう。4)高出力単一モード発振のための新しいアイデア、仮想点光源クラッド励起レーザーのための、平行ビーム出力LDリング・アレイを設計、開発した。単一の10Wモジュールは、予定通り、出力10W、ビーム広がり角6ミリラジアンを実証した。5)320W出力を周波数安定化レーザーの励起に用いるための駆動電源、制御電源、変調部分などを、開発し、モジュール試験を実施した。

次の課題は、将来のkmクラスの大規模干渉計のために、kW級の量子限界レーザーを開発する基礎を研究することである。このようなことを目標に研究を行い、以下の実績を上げた。1)320Wの半導体レーザーを駆動し、独自のコンセプトに基づいた仮想点光源クラッド励起方式という拡大可能性の大きな励起方式で、YAGレーザーの発振を計画した。2)仮想点光源クラッド励起方式の3次元光線追跡シミュレーションによって、励起分布を予測し、光線入射角度を0.3°程度傾けるだけで、コア励起から均一励起まで、自由に励起分布を制御できることを理論的に示した。3)同時に、LDで励起した場合の励起強度分布を蛍光観測法で観測し、シミュレーション結果と良い一致が得られることを確認した。4)3次元光線追跡で求めた励起分布に基づき、レーザー結晶内の熱レンズ効果、熱誘起復析効果を計算し、それに基づく共振器設計の最適化を行った。5)レーザー発振実験を行い、マルチモード発振で、32W以上の出力、スロープ効率41.2%という側面励起では世界最高水準の結果を得た。6)発振実験から求めた熱錬図工か、熱複屈折効果を考慮して、TEM_<00>モード発振用に共振器を調整し、単一モード発振で、28.2W(ランダム偏光)26.5W(直線偏光)の出力を得た。M2値は1.03で、高出力レーザーでこれまでに観測されたことのないきれいな発振である。7)ポイティング安定度は20マイクロラジアンとすばらしい結果であった。8)超低損失モードクリーナー用ミラーを、国内メーカーと共同で開発し、1μm用としては世界で初めて100ppmを切った6ppm損失のミラーの開発、計測に成功した。9)ロシア科学アカデミー結晶学研究所カミンスキー教授と、固体レーザーの開発に関する共同研究を展開した。
マスト細胞の高親和性IgEレセプターに会合する細胞内シグナル伝達系の研究

当初の研究計画に基づき、ラットRBL-2H3細胞におけるCD45の発現の解析を行った。ラットCD45の8種類のアイソタイプに共通した部位を認識することが知られている抗ラットCD45モノクローナル抗体OX-1を用いて解析したところ、FACS解析においてRBL-2H3細胞はOX-1との反応性を示したが、発現量は非常に少ないことが判明した。RBL-2H3細胞に発現しているCD45をOX-1を用いて免疫沈降したところ、分子量180kDのバンドが認められ、発現しているCD45アイソタイプは最短のもの(CD45RO)であることが示唆された。このことはRT-PCR法を用いたmRNAの発現の解析においても確認された。FcεRIとCD45の会合の解析のためにはCD45をイムノブロット法で検出することが不可欠であるが、OX-1はこの解析には使えないことが判明した。他の市販されている抗体はすべてCD45RO以外のアイソタイプに特異的なものなのでRBL-2H3には用いることができない。そこで、ラットCD45に対するポリクローナル抗体を調製することにした。RT-PCR法でCD45の細胞外部分をクローニングし、これをQIAexpress pQE発現ベクターに組み込んでヒスチジンタグを結合した融合タンパク質として大腸菌に大量生産させて精製し、ウサギに免疫する予定である。現在までにCD45のクローニングは完了し、発現ベクターに組み込んで生産の確認を行っている段階であるが、抗血清ができしだいCD45とFeεRIとの会合やFcεRIの凝集に伴なうCD45のホスファターゼ活性の変動などについて解析する予定である。
低酸素・低グルコース下における末梢神経軸索内ミトコンドリアの動態解析

血流障害による低酸素・低グルコース(OGD)は末梢、中枢を問わず、神経細胞に重篤な障害を引き起こす。近年、神経細胞の障害に先立ち、ミトコンドリア(Mt)などの細胞内小器官に異常が生じる可能性が示唆されている。今回、我々は低酸素インキュベーターと無糖培地を使用し、ラット由来初代末梢神経培養細胞の軸索におけるMtの動態を観察した。神経細胞軸索内のMtはレンチウイルスベクターを用いて、蛍光タンパクをMtに発現させ、観察に用いた。通常の培地において軸索内Mtの動態をタイムラプス顕微鏡にて観察(OGD-Pre)した後、無糖培地に交換し、1%酸素に設定したインキュベーターにて30分、60分、90分後の同じ軸索のミトコンドリアの動態を観察した(OGD-30、OGD-60、OGD-90)。対照群として観察後、通常培地と95%空気+5%二酸化炭素の条件下で、Mtの動態を同様に観察した。その結果、軸索内の輸送Mtの数は、対照群は培地交換前および30分、60分、90分の各郡に変化はみられなかったが、OGD-90は輸送Mtの数がOGD-Preと比較し、約49%に減少し、輸送ミトコンドリアを全く観察できない軸索もみられた。DAPIによる核染色や透過型電子顕微鏡による観察では、核染色体の凝集など、細胞死などでみられる変化は観察されなかった。以上のことから、軸索内輸送Mt数の減少は、細胞死に先行して観察されると考えられた。ウイルスベクターの作成、軸索内のミトコンドリアの観察と一部のデータ取得ができ、当初の計画通りに進行していると判断した。引き続き、計画通りに実験を遂行する。ただし、中枢神経系におけるOGDの報告がなされ、有髄神経線維では停留ミトコンドリアの細分化が観察されると、報告されたため、髄鞘形成を誘導し、OGDと対照群による比較を試みている。低酸素発生装置および、低酸素インキュベーターが同時期に破損し、その間、培養実験を休止したため、その期間の培養関係の消耗品費が次年度使用額として発生した。次年度使用額は予定していた培養実験の消耗品購入に充てる。
マイクロコンピュータ組み込み結球野菜選択収穫機の試作

レタスを対象として、球頭の結球度と大きさを検出し、マイクロコンピュータで判別を行い、検出した2量がいずれも基準以上のものだけを収穫するという選択収穫機を試作した。試作機の構成は、結球度検出部、判別部のマイクロコンピュータ、収穫部である油圧駆動の切断刃であり、これらを台枠に組み、超小型の畑作用トラクタ3点リンクに装着した。選択収穫は条植えされているレタスを1条づつ行い、その作業速度は0.1m/sである。結球度の検出には、機械的に圧縮して球頭の硬さを計る方法と、静電容量を測定して球頭の見かけ密度を検出する方法の2方法を試みた。機械的圧縮による検出部の構造は、まず定荷重ばねで支えられた一対のロールでレタス外葉を球頭に達するまで圧縮して球頭の大きさを検出し、続いてコイルばねで荷重を与えられたロールにより球頭を圧縮して硬さを検出するものである。また、静電容量測定による検出方法は、一対の電極でレタスをはさみ、高周波を与えて静電容量を測定し、対応するレタスの誘電率すなわち見かけ密度を検出するものである。ほ場で選択収穫実験を行った結果、結球度検出部、マイクロコンピュータ、収穫部の作動は良好であり、試作機の選択精度はすべて検出部の精度に依存した。機械的圧縮の検出部においては、球頭の大きさ検出値は外葉をとり去った球頭のみの径に対して高い相関関係を示したが、硬さ検出値は、球頭のみの見かけ密度と一応の相関が認められたが、ばらつきが大きかった。また、静電容量の検出においては、電極の形状が検出値の安定性及び精度に大きく影響し、球頭形状に合致する円筒面形状の電極が、平板形状の電極よりも有効であった。円筒面電極の静電容量型検出においても、検出値は球頭の見かけ密度に対して、一応の相関が得られた。