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文明としての「北方」-異文化共存の可能性

モンゴルが、一方では北方文明、文化の独自性、及びとくにその生態環境に起因する特性を保ちながら、他方グローバル化情報化に予想以上に適応していること、また北東アジアの国際関係のなかで、ひとつの調停要因として、いわば「モンゴリアン・イニシアチブ」としての機能を将来得るであろうことも明らかとなった。モンゴル大学歴史学科、国立戦略研究所との研究討議、意見交換を実施したことも記しておく。13年度の成果として、国内では上記の研究を行ったが、特に「北方」をめぐる文化交流について実態と問題の全容がかなりの程度明らかとなった。しかしながら国際、経済、開発に関してはいまだ十分な進歩には足らぬところがある。また、海外に関しては、モンゴルの初段階な実態調査としては充分な成果を得たと考えているが、前年度の成果を含めて、全体的な構図を得るという点では、平成14年度の研究の完了を待つところがある。平成14年度は、海外実地調査として、ウズベキスタン(平成14年8月)、サハリン(平成15年3月)で実態調査を行った。国内では、北方関連の政策調査、北方圏交流の実情調査、北方と関連した識者、関係者との集中的インタビューを実施し、文献資料調査もあわせて継続した。如上の調査研究の結果、得られた知見は以下の通りである。1.「北方」を地理的に定義するのではなく、わが国との関わりを中心に文明論的に、そして近年の国際関係、地域連繋の点から定位すると、極東ロシア、北東アジア、中央アジアを含む、北西ユーラシアの拡がりに21世紀的な意味を見出すことができる(「北方」といえば北米、スカンディナヴィア、極北、ロシア北部等を含むが、ここでは上述の積極的な定義が重要である)。2.1で定めた「北方」地域に関しては、その大半が社会主義の洗礼を受けたことも含め、ロシア語、ロシア文明のきわめて強い影響下にある(学術制度から日常生活にも到る)。3.しかしながらこうした文明・文化の状況は現在あくまでグローバル化の渦中にあり、いわゆる従来のロシア文明ととらえることは妥当でない。4.中央アジア、極東ロシアにおける韓国の存在は極めて大きい。それに反し、歴史的にはさまざまな関わりがあるもののわが国の存在感は弱い。5.上述の域内でのヒト・モノの移動は想像以上に進行している(アゼルバイジャン、チェチェン人が極東ロシアに多数移住していること、またスターリン時代の強制移住による中央アジアの朝鮮人の存在など)。6.この地域を概観すると、周辺地域である日本、韓国などの相対的な経済先進地域が北方中心域に刺激を与えているようにみえるが、こうした経済的インパクトが社会変化を支配するところまではいっていない。7.ユーラシア鉄道計画等の北方地域に関わるプロジェクトに対し、日本の関心と関与が圧倒的に少ない。
希土類と白金族元素を秩序化させたペロブスカイトのデザインとf-d電子の示す磁性

希土類は遷移金属と比べ、サイズが大きいため、ペロプスカイト型酸化物ABO_3を形成すると、物性を決定するBサイトに入らず、Aサイトに入るため、希土類が物性の主役とならない。一方、ペロブスカイト型構造は極めて高い化学組成に関する自由度を持ち、適当な組成および合成条件を選択することにより、結晶構造および金属元素の原子価状態を制御することが可能である。そこで前年度に引き続き本年度の研究では、ペロブスカイト型酸化物ABO_3で希土類を物性の表舞台に立たせるため、サイズの大きく異なる白金族元素と組み合わせることにより、(1)ペロプスカイトABO_3のBサイトに、希土類を入れることができ、しかも希土類と白金族元素は構造的に秩序化したペロブスカイト化合物を系統的に新規合成した。(2)すべての化合物は低温で反強磁性転移し、その磁気的性質を中心に、これら2つの元素の相互作用に伴うf-d混合電子系の示す新しい物性を探索した。さらに今年度の研究では、結晶中で希土類のみが秩序配列し、しかも物性を決定する以下の化合物を合成し、その構造とf電子、f-d電子の挙動に伴う磁性を明らかにした。1.価数、イオン半径が適度に異なる+5価の白金族元素と組み合わせることにより、希土類が1次元に並んだ化合物Ln_3MO_7を合成した。磁気的にはM、2つの希土類サイトLn(1)、Ln(2)は独立に振舞う。2.希土類を含む4元系複合酸化物Ba_6Ln_2Fe4O_<15>では、磁場誘起によりスピン再配列・強磁性配列が起こることがわかった。この化合物では、Ba_6Ln_2Fe_4O_<15>のBaサイトをSrに部分置換することにより、サイズの小さな希土類Ln=SmLuまで合成可能で、その構造解析と磁性測定を通してLn(f電子)-Fe(d電子)相互作用に伴う特異な磁気挙動を見い出した。ペロブスカイト型酸化物ABO_3で希土類を物性の表舞台に立たせるため、サイズの大きく異なる白金族元素と組み合わせることで、Bサイトに入る元素がNaCl型に規則配列した"ダブルペロブスカイト"A_2BB'O_6構造をとることを見い出した。希土類(4f電子系)とルテニウム(4d電子系)やイリジウム(5d電子系)が構造的に秩序化したことにより、f-d電子の相互作用に起因する特異な物性を発現させることができた。A_2LnRuO_6(A=Sr,Ba)ではLnとRuが規則配列するが、イオンサイズがLnに近いA=Caになると、サイト置換(Ca【tautomer】Ln)と、それによるf-d電子間相互作用経路の変化が起きると期待される。Lnサイズが大きくなると、Caと置換してAサイトを占めるようになり、LnイオンのAサイト占有率は、そのLnイオン半径に依存することがわかった。いずれのCa_2LnRuO_6化合物においても反強磁性転移が観測され、その転移温度は1018Kであるが、Ln=Ybでは最も高く34Kであった。Ca_2YbRuO_6の磁化率、比熱測定からBサイトにあるYb^<3+>とRu^<5+>の磁気モーメントは共にこの温度で反強磁性転移を示したことがわかり、高い磁気転移温度はこのことによると考えられる。一方、希土類がAサイトに入ったNd化合物(CaNd[CaRu]O_6)では2段階で反強磁性転移が起こる。すなわち11.5KではRu^<5+>の磁気モーメントのみが磁気秩序し、さらに温度が下がり、1.6Kになって初めてNd^<3+>の磁気モーメントは秩序化することがわかった。全てのA_2LnRuO_6(A=Ca,Sr,Ba)で反強磁性転移が見られた。同じ希土類を含む化合物では、その磁気転移温度に明瞭な傾向T_N(A=Ba)>T_N(Sr)>T_N(Ca)つまり、Aサイトに位置するアルカリ土類金属のイオンサイズが小さくなるにつれ、転移温度が減少することが見られた。これはBa_2LnRuO_6ではLn-O-Ruがほぼ直線状に並んでいるが、AサイトがBaからSr,Caに変わると、Ln-O-Ruの並びが180°から大きく逸脱するため、酸素原子を介するf-d電子間の磁気的相互作用が弱くなることを反映したと考えられる。

(2)すべての化合物は低温で反強磁性転移し、その磁気的性質を中心に、これら2つの元素の相互作用に伴うf-d混合電子系の示す新しい物性を探索した。さらに今年度の研究では、結晶中で希土類のみが秩序配列し、しかも物性を決定する以下の化合物を合成し、その構造とf電子、f-d電子の挙動に伴う磁性を明らかにした。1.価数、イオン半径が適度に異なる+5価の白金族元素と組み合わせることにより、希土類が1次元に並んだ化合物Ln_3MO_7を合成した。磁気的にはM、2つの希土類サイトLn(1)、Ln(2)は独立に振舞う。2.希土類を含む4元系複合酸化物Ba_6Ln_2Fe4O_<15>では、磁場誘起によりスピン再配列・強磁性配列が起こることがわかった。この化合物では、Ba_6Ln_2Fe_4O_<15>のBaサイトをSrに部分置換することにより、サイズの小さな希土類Ln=SmLuまで合成可能で、その構造解析と磁性測定を通してLn(f電子)-Fe(d電子)相互作用に伴う特異な磁気挙動を見い出した。
路面すべり摩擦予測による防滑材湿式散布の適正化手法の構築

積雪寒冷地において、防滑材は冬期道路の路面すべり抵抗値HFNの改善を目的に散布されるが、風や車両通過に伴う飛散によって短時間で路面上から消失する場合がある。本研究では、水分の凝固を利用して防滑材の路面定着性を高める加熱水と防滑材の混合散布(防滑材加熱水混合散布HWS)に着目する。本研究目的は、HFNを用いてHWSを最適化することにある。そのために、(i)加熱水の温度と混合割合が防滑材の路面定着性に及ぼす影響の評価、(ii)通過車両による防滑材の飛散特性の解明、(iii)路面上の防滑材質量とHFNの関係の解明、(iv)HFN推定モデルの構築および検証、を行った。本研究では、防滑材(路面凍結に起因したスリップ事故防止のために路面に撒かれる砂・砕石)と加熱水の混合散布(防滑材湿式散布)を考慮した路面滑り摩擦係数(μ)予測モデルの構築を目的とする。本研究は、研究1「防滑材湿式散布の路面定着性を明らかにする室内実験」、研究2「防滑材湿式散布のμ改善効果を評価するための野外実験」、研究3「これらの実験成果を反映させた防滑材湿式散布を考慮したμ予測モデルの構築と検証」、で構成される。以下に平成26年度における上記の研究13の実施内容とその成果を記述する。研究1では、寒地土木研究所(札幌市)内の低温恒温室にてタイヤ走行模擬試験器を用いた室内実験を実施した。その結果、加熱水の温度を高くするにつれて、また防滑材に対する加熱水の混合割合を増やすにつれて、防滑材の路面定着性はべき関数的に高まることが分かった。また、通過台数と残留防滑材率(=路面上の残留防滑材量/散布した防滑材量)の関係を明らかにできた。研究2では、苫小牧寒地試験道路(苫小牧市)にて野外実験を実施した。野外実験では、氷膜路面を形成させ、防滑材湿式散布後にすべり抵抗値HFN(μへの換算可)と残留防滑材量の計測を実施した。また、研究3で使用する気象条件も併せて計測した。実験の結果、HFNと残留防滑材量の関係を明らかにできた。室内実験と野外実験より、走行速度や輪荷重は限定されるものの、時間交通量と散布量から、防滑材湿式散布後の残留防滑材量とHFNの推定が可能になった。研究3では、研究1、2で得られたHFNと残留防滑材量の関係および通過台数と残留防滑材率の関係を組み込んだ予測モデルを構築した。今後、実測値と計算値の比較を行い、モデルの妥当性検証する。本研究では、防滑材(路面凍結に起因したスリップ事故防止のために路面に撒かれる砂・砕石)と加熱水(湿式剤)の混合散布(防滑材湿式散布)を考慮した路面滑り摩擦係数(μ)予測モデルの構築を目的とする。以下に平成27年度の実施内容とその成果を記述する。1.研究1では、低温恒温室にてタイヤ走行模擬試験器を用いた室内実験を実施した。実験目的は、湿式剤の温度、混入率、塩濃度、軸荷重が防滑材の路面定着性に及ぼす影響を明らかにすることにある。今年度は塩濃度と軸荷重に着目した。軸荷重について、軸荷重を2000Nから4000Nに2倍にすると、防滑材の路面残留率が約1/2に低下することが分かった。塩濃度に関しては、僅か(本実験では塩濃度2%)でも塩分を湿式剤に混入すると防滑材の路面定着性が著しく低下することが分かった。2.研究2について、科研費の予算は投入していないが、別予算で野外実験を実施した。しかし、残念ながら天候に恵まれず、期待したデータは得られなかった。3.研究3では、昨年度に研究2で得られたデータを用いて、HFNと防滑材の路面残留量の関係および車両通過に伴う防滑材の飛散特性を明らかにし、これらを組み込んだ防滑材湿式散布後のμ予測モデルを構築した。また、研究2で得られたμおよび防滑材の路面残留量の変化についてモデルによる計算結果を比較し、モデルの妥当性を検証した。その結果、計算結果はμおよび防滑材の路面残留量の変化を概ね再現し、モデルの妥当性が得られた。研究1に関して、昨年度に立てた研究推進方策のとおり実験を実施し、湿式剤の塩濃度が防滑材の路面定着性に与える影響を明らかにできた。今回の実験での最も低い塩濃度は2%、室内温度は-8°Cであり、さらに低濃度かつ低温下での検討は残されている。しかしながら、低濃度かつ低温度の条件は湿式剤が散布車のタンク内で凍結・膨張し、水循環器を破損する危険性を高めるため、低濃度かつ低温下での検討は本研究で実施しないことにする。研究2に関して、天候に恵まれず結果として野外のデータ数が乏しいが、悪天延期ができない実験のためやむを得ない。ただし、モデルを構築・検証するための最低限のデータは得ることができている。

研究3に関して、予定のとおりモデル構築に必要な知見を数式化することができ、モデルに組み込むことで防滑材湿式散布後のμを計算することが可能になった。また、計算結果は実測結果と概ね一致しており、モデルの妥当性を証明できた。以上より、本研究は「おおむね順調に進展している」と判断した。本研究は、研究1「防滑材湿式散布の路面定着性を明らかにする室内実験」、研究2「防滑材湿式散布のμ改善効果を評価するための野外実験」、研究3「これらの実験成果を反映させた防滑材湿式散布を考慮したμ予測モデルの構築と検証」、で構成される。この内、平成28年度は、データの乏しい野外実験の優先度が高いと判断し、研究2と研究3を実施した。研究2について、冬期の4日間、北海道苫小牧において野外実験を実施した。野外実験の手順と内容について記載する。気温が氷点下になった直後に散水車を用いて路面に散水し、氷膜路面を作成した。次に、規定量の防滑材を路面に設置し、そこに規定の温度と量(防滑材散布量との混合割合)の加熱水を供給した。加熱水が凍結した後、防滑材の上を車両通過させ、通過台数50台毎に防滑材の残留量を計測した。加熱水の温度は、20、40、60および80°Cとし、混合割合は0.10、0.18、0.25、0.31、0.40および0.47とした。加熱水温度20°Cの実験において、混合割合0.10では9割の防滑材が車両50台通過後に無くなった。混合割合0.18では車両50通過後に防滑材は半分になった。混合割合0.31以上では、車両300台通過後でも約8割の防滑材が路面に留まった。加熱水温度40°Cの実験においては、混合割合0.31以上で車両300台通過後に9割の防滑材が残った。加熱水温度60°Cでは、混合割合0.10であっても車両300台通過後に9割の防滑材が路面に存在した。このように加熱水温度が高いほど、また混合割合が多いほど、防滑材ー路面定着性は高いことが分かった。これまでの室内および野外実験の知見を組み込んでμ予測モデルを改良した。また、実測値との比較よりモデルの計算精度を検証し、良好な計算結果を得た。積雪寒冷地において、防滑材は冬期道路の路面すべり抵抗値HFNの改善を目的に散布されるが、風や車両通過に伴う飛散によって短時間で路面上から消失する場合がある。本研究では、水分の凝固を利用して防滑材の路面定着性を高める加熱水と防滑材の混合散布(防滑材加熱水混合散布HWS)に着目する。本研究目的は、HFNを用いてHWSを最適化することにある。そのために、(i)加熱水の温度と混合割合が防滑材の路面定着性に及ぼす影響の評価、(ii)通過車両による防滑材の飛散特性の解明、(iii)路面上の防滑材質量とHFNの関係の解明、(iv)HFN推定モデルの構築および検証、を行った。研究1に関して、当初の予定していた全ての条件で室内実験を実施することはできなかったが、室内実験の目的であった通過台数と残留防滑材率の関係を明らかにできた。また、最適な加熱水の温度と防滑材に対する加熱水の混合割合を明らかにすることができた。研究2に関して、2日間の実験の内、天候不良により1日しか期待していたデータを取得できなかったものの、野外実験の目的であったHFNと残留防滑材量の関係を定式化できた。研究3に関して、モデルの検証を完了させることはできなかったが、検証のためのデータを取得し、モデルを改良した。今後、モデルの検証を実施する。以上、モデルの検証が残されているものの、当該年度に予定していたモデルの構築に必要な知見を良好に得ることができた。研究1に関して、3年目は室内実験を実施しないこととする。
軟X線領域XAFSを用いた機能材料中の典型元素活性種の構造制御法の構築

セラミックス系材料の主成分元素であるMg・Al・Siの典型元素をターゲットとして,その局所を構造制御することによる触媒的機能性の制御を目指し,その手段として新規な軟X線領域XAFSによる局所構造解析を中心とした構造因子の解明を行いその応用法を構築することを目的とした。とくに触媒機能の解明として,第一に地球温暖化ガスとして問題となっているメタンを有効利用するためのMgO系材料による酸化カップリング触媒,第二に排ガス中のNOx分解触媒として遷移金属格子置換型新規ゼオライトを中心としたシリカアルミナ系材料,これら二つの系における触媒材料をそれぞれ対象とし,各触媒における活性成分の局所構造をXAFSを中心に検討する。これにより,対象原子周辺の局所構造と機能発現時の構造および電子状態の変化について明らかにし,それらの結果に基づく機能性因子の追跡とその制御のための知見を得た。XAFSの測定はいずれもKTP二結晶分光を用いた,分子科学研究所UVSOR, BL1Aにて全電子収量法にて得た。まず,MgO系材料による酸化カップリング触媒における構造解析からは,MgO岩塩型構造中に形成される表面近傍の格子酸素欠陥種はメタン酸化カップリング触媒活性点として寄与し,その形成のためにLiやNaなどのアルカリイオン修飾が有効であること,加えてそれらの安定化のために硫酸イオンの共存が有効であることが結論づけられた。この活性種を与える格子欠陥種はXANESによって観察され,その存在状態と触媒活性の間に密接な関係があることが示唆された。一方,NOx分解触媒のための格子置換型ゼオライトにおける活性種構造は,格子内に挿入したFeおよびGaイオンによって与えられるが,同時にゼオライト全体の骨格構造も変化し,とくにFeの格子置換後にはFe周辺の欠陥形成,およびSi四面体構造の変化に伴うゼオライト局所構造の変化が,活性種のみならず結晶構造全体の安定度を高めることが結論付けられた。軟X線領域XAFSを用いた機能材料中の典型元素活性種の構造制御法の構築を目的として、以下2つの系における軟X線領域XAFS分光法からの典型元素をターゲットとする活性構造の解析を行った。軟X線XAFSの測定は岡崎国立共同研究機構分子科学研究所UVSORにおいて行い、適当な処理を施した後の触媒検体を全電子収量法で測定、表面近傍の構造を励起電子放出から観察しスペクトルを解析、評価した。まず、リチウムなどアルカリイオンを修飾した酸化マグネシウムおよびマグネシウム-ランタン複合酸化物を触媒とし,特異な活性種を要するメタン酸化カップリング反応での活性構造評価より、MgK端のXAFSよりメタン活性化を引き起こす活性種の構造因子は修飾アルカリイオンと酸化マグネシウムとの相互作用、とくに岩塩型構造を安定に存在し表面近傍に低濃度の欠陥が形成されたときに高い活性を導くことを示唆した。とくに表面およびバルク相の欠陥種の役割を今後検討する計画である。一方、3次元ミクロ細孔構造を有するシリカアルミナ組成のゼオライトにおけるケイ素のK殻XAFSによる局所構造の解析からは、ゼオライト中のSi-O_4四面体構造からの歪みはその骨格構造内の多員環局所構造を反映し、とくにH-MFIのように5・6員環構造を骨格内に有する場合にXANESにおける1s-3p励起(XANESにおける主ピーク)のエネルギー分散度の増大を示すことが明らかとなった。この傾向は他のゼオライトとの比較からも示され、局所構造が直接XAFSスペクトルに敏感に反映することが示唆された。以上のように、高い分解能を有する軟X線XAFSからの構造評価が既存にない局所構造の情報を与え、他の構造解析法と合わせて多面的なミクロ構造を評価出来ることが結論づけられた。
植物プロテアーゼの機能と活性制御に関する研究

植物組織中のシステインプロテアーゼ(CP)の活性制御機構の解明のため食用ヒマワリをモデルに次のような研究を行なった。1)ヒマワリ種子由来CP(SCP)の遺伝子発現:各SCPの遺伝子発現について検討した。その結果、SCP1、2、5はいずれも種子の登熟と発芽の際に多く発現し、完熟種子中には、そのmRNAは存在しないことが明らかになった。2)プロ領域の酵素活性への関与:SCPはそのN末端に100残基程度、さらにC末端に10100残基程度のプロ領域を有する。SCP成熟領域とともに発現した実験ではN末端プロ領域はSCPの立体構造の巻戻しや活性化において重要な役割を果たしているのに対して、C末端側のプロ領域は、その存在が酵素の活性化を抑制し、その有意な機能を明らかにできなかった。更にこのプロ領域の機能を更に検討するため、この領域のみを大腸菌で発現し、その特徴について調べた。その結果、各SCPのN末端プロ領域は、その活性型SCPの酵素活性を強く阻害することが明らかになった。そしてその強さは、成熟体自身が本来有するプロ領域(SCP1であればSCP1Npro)によってより強く阻害される傾向にあることが明らかになった。一方、C末端プロ領域(ここではSCP1Cpro(21112残基目)についてのみ検討)は、N末端プロ領域が示したような阻害活性を有してはいなかった。以上の結果から、SCPはその前駆体合成後、C末端プロ領域の切断を受けた後に正確に巻き戻され、そして高pH環境下ではN末端プロ領域と安定な複合体を形成するのに対し、リソソームのような低pH(45)環境下ではその複合体の安定性が減少し、解離することによってプロテアーゼが活性化する機構が考えられた。また、偶発的に起きるプロテアーゼの活性化に対しては内在性インヒビターのScaやScbが活性を制御しているものと考えられた。植物組織中のシステインプロテアーゼ(CP)の活性制御機構の解明のために、これまで2種のシステインプロテアーゼインヒビター(シスタチン)タンパクと3種のCPcDNAの存在が確認されている食用ヒマワリをモデルに次のような研究を行なった。1)CPの大腸菌における発現:3種のヒマワリ由来CP(SCP1、2、5)のタンパク的性質を検討するために、SCPタンパクをpETベクター大腸菌BL21(DE3)を用いて発現した。その際に、N末端およびC末端プロ領域の役割を検討するために、その領域を含むような組み換え体も発現した。その結果、すべての場合で封入体として大腸菌内で発現されたので、グアニジン塩酸をもちいてタンパク質を可溶化し、透析法によって巻戻しを行ない、組み換えタンパク質を得た。2)SCPの諸性質:前項によって得た可溶化タンパク質の酵素活性について検討した。その結果、N末端側プロ領域を持たずに発現したものは、全く酵素活性を示さなかった.一方、N末端側プロ領域のみを持つ組み換え体のうちSCP1はpH4、40°Cで30分間処理する事によってプロテアーゼ活性を示した。しかし、これにさらにC末端側のプロ領域を有するSCP1Cは全く酵素活性を示さなかった。よって植物CPのN末端側プロ領域はプロテアーゼの構造の巻戻しや活性化において重要な役割を果たしているのに対して、C末端側のプロ領域は巻戻しや活性化のどちらか、もしくはその両方を阻害するように機能していることが推察された。次に内性のシスタチンScaとScbのSCP1に対する阻害活性を検討した結果、SCPlはScaによって強く阻害された。このことから植物内でSCPlはScaにより強く活性の制御を受けていることが示唆された。現在、SCPの植物内局在性を検討するため、杭血清を作製中である。

一方、C末端プロ領域(ここではSCP1Cpro(21112残基目)についてのみ検討)は、N末端プロ領域が示したような阻害活性を有してはいなかった。以上の結果から、SCPはその前駆体合成後、C末端プロ領域の切断を受けた後に正確に巻き戻され、そして高pH環境下ではN末端プロ領域と安定な複合体を形成するのに対し、リソソームのような低pH(45)環境下ではその複合体の安定性が減少し、解離することによってプロテアーゼが活性化する機構が考えられた。また、偶発的に起きるプロテアーゼの活性化に対しては内在性インヒビターのScaやScbが活性を制御しているものと考えられた。
分割した転写因子の機能回復によるタンパク質相互作用検出法の開発

タンパク質は、細胞内で相互作用して機能していることが知られている。タンパク質-タンパク質相互作用の解析は、細胞内においてタンパク質の機能を理解する上で極めて重要である。しかし、既存の解析法として用いられる酵母のTwo Hybrid Systemは、煩雑な操作を要し、検出するまでに長時間を要した。そこで、本研究では迅速かつ簡便なタンパク質相互作用解析法の開発を試みた。本研究は、無細胞タンパク質合成技術を用いタンパク質を試験管内で発現し、発現したタンパク質間で相互作用が起きた時のみ蛍光強度が変化する機構を利用した解析系を確立することを目的とした。このため、転写因子(RNA polymerase:RNAP)の立体構造に着目して転写活性が失活するよう酵素を2分割し、分割したRNAPにそれぞれリンカーを介して候補タンパク質を連結した構造を有する2種類の鋳型DNAを構築した。鋳型DNAにはそれぞれプロモーター配列が付加されており、無細胞タンパク質合成反応液中で2種類の融合タンパク質を同時に発現できるよう工夫してある。構築した鋳型DNAを無細胞タンパク質合成反応系に滴下した結果、発現した候補タンパク質間で相互作用が認められた場合のみRNAPの転写機能が回復し、このとき回復した転写機能により蛍光タンパク質を発現することで、蛍光測定によるタンパク質の相互作用解析ができることがわかった。既存のタンパク質相互作用検出とは異なり、本法はPCR(Polymerase Chain Reaction)産物などからクローニング、タンパク質大量発現や固定化する過程を経ることなくタンパク質相互作用の解析ができる。相互作用解析したいタンパク質のcDNAから相互作用解析に必要な時間は3時間程度であった。本研究は、迅速、簡便かつハイスループット解析に適したタンパク質相互作用検出法の開発をおこなうことを目的とする。初年度は、無細胞タンパク質合成技術を用いたタンパク質相互作用検出系を構築することを目標とした。そこでまず、転写酵素(T7 RNA polymerase : T7 RNAP)の立体構造に着目して転写活性が失活するよう酵素を2分割した。つぎに、分割したRNAPにそれぞれ候補タンパク質を連結した構造を有する2種類の鋳型DNAを構築した。鋳型DNAはそれぞれT3プロモーター配列、リボゾーム結合配列、転写ターミネーター配列を有しており、無細胞タンパク質合成反応液中にT3 RNAPを添加すると2種類の融合タンパク質を試験管内で同時に発現させることができる。これら融合タンパク質は、それぞれ単独ではT7 RNAPの転写活性を持たない。しかし、発現した候補タンパク質間で相互作用が認められた場合のみT7RNAPの転写機能回復が起こり、このとき機能回復したT7RNAP活性によりレポータータンパク質としてT7プロモーター配列の下流に配置した蛍光タンパク質(GFP : Green FluorescentProtein)を発現させることができると考えた。この結果、候補タンパク質として相互作用が認められない2種類のタンパク質を融合タンパク質として発現させた場合、蛍光シグナルは確認できなかった。一方、相互作用することがわかっている2種類のタンパク質を発現させた場合、GFP由来の蛍光タンパク質の発現が認められた。これは、候補タンパク質の相互作用により転写活性を持たない分割したRNAPの機能回復によるものと示唆された。これらの結果から、無細胞タンパク質合成反応を応用した新たなタンパク質相互作用解析系の構築ができたと考える。
熱プラズマ・フラッシュ蒸発法による高Jc高温超伝導酸化物膜の高速堆積

[1.精密温度制御式水冷基板ホルダの開発]高Jc膜の堆積やその堆積機構解明の基礎実験のためには充分な装置安定性と再現性が要求される。しかし、熱プラズマプロセスにおいては、プラズマの基板に与える熱量が膨大なため、精密な温度制御が困難であった。今回新規開発した水冷式回転基板ホルダ-は、基板温度を水冷面と基板間の熱拡散層の厚みを変えることによって約200°C800°Cまで粗調整でき、水量調節により熱拡散層の厚み650°Cの場合で、約60°Cの範囲を数°Cのオ-ダ-まで微調整可能になった。[2.パウダ-フィ-ダ-の開発]原料粉供給の定常性はプラズマの安定性に大きく影響を及ぼす。今回新しく開発したパウダ-フィダ-は、粒径数μの2次粒子凝集性が非常に高い超伝導微粉末を、完全に分散した状態で供給速度60μg/sec600μg/secで可変供給可能である。実際にプラズマ中に導入した時の定常性をBa^+の発光強度により評価した場合、20分間で変動は7%以内であることが確認された。[3.高Jc膜の高速堆積と膜評価]プラズマ形状として、基板温度制御性が良く大面積化が容易な分散型プラズマと反応性が高いビ-ム型プラズマに分けて実験を行なった結果、いずれもc軸配向した鏡面膜が得られ、前者ではY系にて堆積速度0.04μ/min,Tc=92K,Jc=3x10^5A/cm^2(77K,OT)の膜、Bi系で堆積速度0.03μm/min,Tc=75K,Jc=9x10^4A/cm^2(25K,OT)の膜が、後膜では堆積速度>0.5μ/minにてTc=90K,Jc=6x10^4A/cm^2の膜が得られた。後者では前者より膜の全体組成がより原料組成に近づいていた。
高機能型低分子二重特異性抗体への革新的がん特異的構造変換デザイン

がん細胞とリンパ球間の架橋による強力な治療効果と、高いがん組織への浸透性を兼ね備えた低分子二重特異性抗体は魅力的な人工抗体である。本研究では、がんで亢進しているプロテアーゼの認識配列を用いることで、がん特異的な高機能型への構造変換デザインを目指している。今年度は特に、半減期の長い高分子量型から腫瘍組織への高浸透型へ、すなわち高分子量型から低分子量型へのがん特異的な構造変換デザインを重点的に検討した。これまでに、Fc融合Ex3のヒンジ領域に、多くのがん細胞で亢進しているプロテアーゼであるMMP-2、およびMMP-9によって認識される配列を導入した分子を作製し、さらに安定産生CHO細胞株の樹立にも成功している。そこで、まずMMPの認識配列を導入したことによる機能への影響を、フローサイトメトリーによる結合活性評価、およびがん細胞傷害活性試験により調べた。結果、結合活性、がん細胞傷害活性共に十分保持していることが確認された。続いて、MMPの消化条件検討を行った後、切断効率の高い条件を用いて低分子量型のEx3の調製を目指した。切断後に未切断のFc融合Ex3と切断されたFcをプロテインAカラムにより取り除いた後、電気泳動を行った結果、十分に精製度の高い低分子量型のEx3を調製することに成功した。続いて、切断前のFc融合Ex3との活性比較をがん細胞傷害活性試験により行ったところ、同等の活性が認められた。さらに、MMP産生がん細胞株を用いて、がんが産生するMMPによりデザインした分子が切断されるかを評価した結果、MMP認識配列の導入により、切断が進行している様子が確認できた。今後、さらに詳細な評価を行う必要があるが、本研究によりがんで亢進しているプロテアーゼの認識配列を利用した高分子量型から低分子量型へのがん特異的な構造変換デザインの可能性が示された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、がんで更新しているプロテアーゼの認識配列を用いることで、がん特異的な高機能型への構造変換デザインを目指している。diabody型低分子二重特異性抗体Ex3をモデルに、まずプロテアーゼの認識配列のリンカーへの挿入、および切断による構造的自由度の向上の有無を検証するため、GSTタグにより酵素そのものの除去が容易なPreSicssion Proteaseの認識配列の挿入を行った。Ex3はリンカー配列を2つ含むため、それぞれに挿入した分子を作製し、大腸菌発現系により調製後、機能評価へと進めた。結果、興味深いことにプロテアーゼの認識配列を挿入することで、挿入前に比べがん細胞傷害活性が向上することが明らかになった。これは、細胞間架橋に於いてより有利な結合角度を有することができたためと考えられるが、一方で実際にPreSicssion Proteaseでリンカーを切断したところ、期待するような自由度の向上に伴う活性の向上は見られなかった。しかしながらリンカー改変の意義は認められたため、Matrix metalloproteinase-2(MMP-2)やMMP-9など実際に多くのがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列を導入したEx3の作製へと進めた。文献等を参考に、候補配列を4種類選定し、同様にEx3の2つのリンカー配列に挿入した分子を計8種類デザインし、それぞれ発現ベクターを構築した。今後詳細な機能評価へと進める予定である。一方、新規低分子二重特異性抗体の網羅的な作製を効率的に行うためには、形態と活性に関して学術的に理解する必要があるため、Ex3とは異なる抗EGFR抗体を用いた低分子二重特異性抗体の機能評価も合わせて進めた。diabody型低分子二重特異性抗体Ex3をモデルに、まずプロテアーゼの認識配列のリンカーへの挿入、および切断による構造的自由度の向上の有無を検証するため、市販のプロテアーゼの認識配列の挿入を行ったところ、興味深いことに活性の向上が認められる一方で、期待するような自由度の向上に伴う活性の向上は見られなかった。しかしながらリンカー改変による機能向上の可能性、およびプロテアーゼの認識配列のリンカーへの挿入方法が適していなかった可能性を考え、本来の目的であるがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列を導入したEx3の作製へと進めた。MMP-2およびMMP-9によって認識されるプロテアーゼの認識配列を選定すると共に、よりリンカー部位でのフレキシビリティを向上させるため、両端に構造的自由度の高いアミノ酸をさらに付加したリンカーを、計8種類デザインし、それぞれ大腸菌用発現ベクターを作製した。以上の様に、当初予想されたものとは異なる結果が得られ、また進捗に応じて少し修正しているものの、研究全体としては大きな遅れは生じていないためおおむね順調に進展しているとした。前年度に引き続き、Db型Ex3をモデルに、がん細胞特異的に高活性型へと構造変換する新規デザインの開発を進めた。

多くのがん細胞で亢進しているプロテアーゼであるMatrix metalloproteinase-2(MMP-2)やMMP-9によって切断される認識配列を、リンカーに組み込んだ複数のDb型Ex3の大腸菌用発現ベクターを用いて、それぞれ組換え体を調製、機能評価へと進めた。結果、MMPの認識配列を導入することによるがん細胞傷害活性の低下はみられなかったため、続いて市販のMMPを用いた切断検討へと進めた。電気泳動により期待通り、MMPの認識配列特異的な切断が確認されたため、がん細胞傷害活性試験へと進めたが、期待に反し活性の低下が認められた。プロテアーゼ消化が分子の不安定化をもたらしたと考えている。一方、半減期の長い高分子量型から高浸透型へ、すなわち高分子量型から低分子量型へのがん特異的な構造変換デザインも平行して進めた。まずFc融合Ex3をモデルに、同様にがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列のFc融合部位への導入を行った動物細胞用発現ベクターを作製した。続いて、CHO細胞に遺伝子導入を行い、抗生剤によるスクリーニング後、安定産生株を樹立した。がん細胞傷害活性試験により、培養上清から精製したMMPの認識配列を導入したFc融合Ex3が活性を有することが確認されたため、今後より詳細な機能評価を進めると共に、市販のMMPを用いた切断検討へと展開させる予定である。本年度は前年度に引き続き、Db型Ex3をモデルに、がん細胞特異的に高活性型へと構造変換する新規デザインの開発を進めた。MMPの認識配列を導入したDb型Ex3の大腸菌用発現ベクターを用いた、組換え体の調製に成功し、予定通り機能評価へと進めることが出来た。MMPの認識配列を導入することによるがん細胞傷害活性の低下はみられず、また市販のMMPを用いた部位特異的な切断が確認されたため、がん細胞傷害活性試験へと進めたが、活性が向上するとの期待に反し活性の低下が認められた。Fc融合Ex3をモデルに、同様にがん細胞で亢進しているプロテアーゼの認識配列のFc融合部位への導入を行った動物細胞用発現ベクターの作製は予定通り進行した。しかしながら、CHO細胞に遺伝子導入を行い、抗生剤によるスクリーニング後、安定産生株の樹立を行ったが、機能評価に足る収量を得ることが出来なかった。このため、予算を繰り越して発現量の高い安定産生株を再樹立する必要が生じため、やや遅れているとした。がん細胞とリンパ球間の架橋による強力な治療効果と、高いがん組織への浸透性を兼ね備えた低分子二重特異性抗体は魅力的な人工抗体である。本研究では、がんで亢進しているプロテアーゼの認識配列を用いることで、がん特異的な高機能型への構造変換デザインを目指している。今年度は特に、半減期の長い高分子量型から腫瘍組織への高浸透型へ、すなわち高分子量型から低分子量型へのがん特異的な構造変換デザインを重点的に検討した。
国際機講による「統治」-平和構築における暫定行政機構の取り組みを中心として-

本年度は、国連による「統治」の事例として、ボスニア・ヘルツェゴビナ共和国における上級代表事務所(OHR)の機能および役割について調査、研究を進めた。国際法学会、国際機構論研究会への参加を通じて、国際機構および条約によって設立された国際的な組織が現地において果たす役割、またその活動が.国際社会に与える影響についても理解を深めた。9月にはオーストリアおよびボスニア・ヘルツェゴビナにおいて調査を行い、OHRおよび関連地域の訪問、国際機関に勤務する専門家とのインタビューおよび意見交換を行った。本年度の研究によって明らかにされた主要な事項は以下の点である。(1)ボスニア・ヘルツェゴビナにおいて、上級代表事務所(OHR)は、同国の行政、立法、司法全てに関して権限を有しており、実質的に独立国を統治している。またその権限は、統治機構や制度を設立し改革することに加えて、それらが実効的な役割を行なうことをも含む。(2)上級代表事務所(OHR)によって体現される国際社会による統治は、国際社会によって確認されている規範としての民主制、法の支配、人権と基本的自由が、現地社会に定着することをもその活動の目標とする。とくに民族間の対立を背景とする社会では、これら規範が政治的に用いられ、民族間の分断を正当化し固定化することがないように、国際社会による監督や助言などの関与が引き続き求められるが、これは国家主権、民族自決との対立をもたらす。(3)ボスニア・ヘルツェゴビナにとって、これら規範の実施は、欧州連合への加盟に向けた前提条件となっている。以上のとおり、独立国においても国際社会によって統治が行われているボスニア・ヘルツェゴビナの事例は、国際社会における規範の確立、国際的な組織の権限の拡大と深化およびその問題点をも明らかとするものであった。また同時に、国際社会の活動と国家主権の対立をも浮き彫りとするものである。本年度は、国連による「統治」の事例として、東チモールにおける暫定行政機構に着目し研究を進めた。文献に基づいて「統治」に関する理論考察を行いながら、関係機関および講演会への出張/参加によって、国連の具体的活動について理解を深めた。8月には東チモールディリに出張し、国連東チモール支援団などの国際機関でのインタビューと意見交換を行い、東チモールにおける国連の「統治」の権限、機能および役割について調査した。現地調査に基づいて研究をさらに進め、12月には九州国際法学会において学会報告を行った。さらに3月には、国連大学/中央大学のワークショップに参加し、国連の活動および政策の観点から「統治」について、国連関係者および研究者と議論および意見交換を行った。本年度の研究を通じて以下の点が明らかとなった。(1)国際機構による「統治」は、理論上はさまざまな意味内容を包含しており、国連においては政策の枠組みとして用いられてきた。特に国連は統治のエージェントとして様々に関与する。(2)統治の形態は、当該地域の政治的状況、統治機構の権限や機能によって多様となり、一般化されない。(3)「統治」を行う機構の設立は、国連においては例外的な措置として捉えられている。(4)東チモールにおける国連の「統治」は、立法、行政、司法の広範な権限を持つ、東チモール暫定行政機構(UNTAET)によって実施されており、その機能は暫定行政官による規則制定による実質的支配に加えて、東チモールの独立に向けての現地化の一プロセスであり、UNTAETの内部組織の改変を通じて東チモール人を統治のプロセスに参加させることによって独立に向けた組織作りを担っていた。本年度は、国連による「統治」の事例として、セルビア・モンテネグロ共和国のコソボ自治州における、国連コソボ暫定統治機構(UNMIK)の機能および役割について調査、研究を進めた。欧州連合関係の研究会、日本国際連合学会への参加によって、コソボにおける国連の役割について理解を深めた。9月には、スイス、スウェーデン、セルビア・モンテネグロ(コソボ自治州を含む)に出張し、UNMIK施設への訪問、関係者のインタビューと意見交換を行った。(1)コソボ自治州においてUNMIKは行政、司法、立法を担う広範な権限を付与されている。同地域はセルビア・モンテネグロ共和国の一州であり、同共和国の主権および領土保全の尊重は国連によって確認されている。その一方でコソボ自治州の実質的自治も認められており、矛盾する状況でのUNMIKの行動の困難さが明らかとなった。(2)国連による「統治」の枠組において、UNMIKは、現地住民との協議機関の設置と同機関を通じての意思の疎通の促進、選挙を通じての自治政府、行政機関、司法機関の設置をはじめとする「政府」制度の構築を行ってきた。これは冷戦以前に国連が行っていた、「統治」と比較した場合、より発展した機能と捉えられる。(3)「統治」において、法の支配、民主制、人権の保護および促進は、達成される規範として国際社会において確認されている一方で、地域における定着は、共同体間の分断と政治権力構造が合致する場合には困難な状況となることも明らかとなった。

(1)ボスニア・ヘルツェゴビナにおいて、上級代表事務所(OHR)は、同国の行政、立法、司法全てに関して権限を有しており、実質的に独立国を統治している。またその権限は、統治機構や制度を設立し改革することに加えて、それらが実効的な役割を行なうことをも含む。(2)上級代表事務所(OHR)によって体現される国際社会による統治は、国際社会によって確認されている規範としての民主制、法の支配、人権と基本的自由が、現地社会に定着することをもその活動の目標とする。とくに民族間の対立を背景とする社会では、これら規範が政治的に用いられ、民族間の分断を正当化し固定化することがないように、国際社会による監督や助言などの関与が引き続き求められるが、これは国家主権、民族自決との対立をもたらす。(3)ボスニア・ヘルツェゴビナにとって、これら規範の実施は、欧州連合への加盟に向けた前提条件となっている。以上のとおり、独立国においても国際社会によって統治が行われているボスニア・ヘルツェゴビナの事例は、国際社会における規範の確立、国際的な組織の権限の拡大と深化およびその問題点をも明らかとするものであった。また同時に、国際社会の活動と国家主権の対立をも浮き彫りとするものである。
胎児型造血幹細胞の新しい純化法と遺伝子プロファイリング

申請者らが骨髄CD34^-KSL造血幹細胞を用いたシグナルシークエンストラップで同定したCD34様シアロムチン膜蛋白Endomucinの発現を抗体で検出することにより、成人型造血の発生を検討した。成人型造血幹細胞活性がはじめて検出される胎生10.5日の傍大動脈生殖腺中腎領域(AGM)領域の細胞を、血球マーカーであるCD45、胎児未分化血球マーカーであるCD41、および抗Endomucin抗体で解析したところ、0.04%がCD45^-CD41^+Endomucin^+細胞であった。重要なことに、この細胞分画に多能性前駆細胞が濃縮されており、この分画のみin vivoでの骨髄再建活性を示した。また胎生11.5日には造血活性・骨髄再建活性はCD45^-CD41^+Endomucin^+細胞に移ることが明らかとなり、AGMの造血幹細胞は^-CD41^+Endomucin^+分画に高度に濃縮されること、胎生10.5から11.5日の短時間の間にCD45の発現を獲得することが明らかとなった(Maeda A, et al,業績4)。一方TMTSPは申請者らがクローニングした新規I型膜蛋白であり、Tmtsp遺伝子の開始コドンに蛍光色素蛋白遺伝子Venusを挿入することによりTMTSP蛋白の代わりにVenusを発現するknock-in ES細胞とマウス個体を作出した(TMTSP^<Venus/+>)。ES細胞の分化誘導系における血液細胞の発生や、AGMの成人型造血幹細胞の発生の良いマーカーとなることが確認された(Takayanagi S, et al,業績1)。以上のEndomucin抗体とTMTSP^<Venus/+>マウスを用いることにより、造血幹細胞発生を忠実に追うとが可能となったことから、今後は各発生段階の遺伝子プロファイリングを行って胎児型造血における特異な分子機構を明らかにしていきたい。
過完備独立基底の内因性特徴に基いた分光顕微鏡画像のデータマイニング

顕微鏡画像から画像特徴を抽出する試みは数多い。しかし、ノイズのある条件下で、観測者の主観に依らず、測定対象についての事前の知識なしに、元信号の定量性を保ったまま、特定の画像特徴に相関する信号成分を取り出す方法は、従来限られていた。生物の視覚情報処理の数学的モデルとして提唱されたスパースコーディングは広義の独立成分分析の一種であり、過完備な独立基底の推定に用いられる。我々はこれを用いた新規の画像解析法を考案した。顕微鏡画像を画素毎に波長の情報を持つ3次元配列(x, y, λ)と捉えて、スパースコーディングを用いて線形過完備な独立基底の推定を行った。一般に、このとき得られる独立基底は3次元の配列となる。次に、この3次元の独立基底をその特徴(色・テクスチャー・形など)に基いて分類・弁別し、特定の特徴に相関のある独立基底のみを抽出した。抽出した独立基底を、特徴群毎に加算して元画像のdimensionに再構成することで、もともとの顕微鏡画像の信号の線形性を保ったまま、特定の画像特徴に相関する信号成分のみを抽出することができた。polystyrene(PS), polymethyl methacrylate(PMMA), polyurethane(PU)ビーズをプレパラート上で混合し、自発ラマン分光顕微鏡でイメージングした。二次元のラマン分光画像は、空間的な一ピクセル毎に一つの波長方向のスペクトルを持つ3次元配列のデータ構造を持つ。このデータを非負スパースコーディングを用いて8個の独立基底に分解した。求めた8個の独立基底を、in vitroで測定しておいたPS, PMMA, PUの三種類の物質のラマンスペクトルと比較し、最も相関の高い独立基底をそれぞれ一つずつ選択した。選択された独立基底単独の空間分布を、元画像の二次元座標上に再構成してみると、ビーズの形状・空間分布を得ることができた。当初の予定通りにプログラムの作成が完了し、ビーズを測定した分光画像を用いた開発解析手法の概念実証ができたため。実際の生体組織を測定したラマン分光画像を用いて、開発解析手法の性能を確認する。
口腔疾患と心疾患の関連性の解明―心不全の非薬物治療法開発の基礎的研究―

本年度(平成30年度)は、16週齢の雄性マウス(C57BL/6)を1コントロール群、2不正咬合群(下顎切歯に咬合挙上板を装着)、3propranolol(β受容体遮断薬)投与群(propranololを含む飲料水(1mg/mL)を自由摂取)、4不正咬合+propranolol投与群の4群に分けて2週間後に心臓を摘出し、不正咬合による口腔機能の低下が心臓に及ぼす影響を組織化学的ならびに分子生物学的手法を用いて詳細に解析した。まず、心重量/脛骨長比は4群間で有意な差は認められなかった。この結果は、不正咬合が心肥大を誘導しないことを示唆する。Masson-trichrome染色の結果、不正咬合群では心室の線維化(fibrosis)が観察された。その線維化はpropranolol投与により抑制された。また、TUNEL染色の結果、不正咬合により心室のapoptosis陽性細胞の有意な増加が認められた。そしてその増加はpropranolol投与により抑制された。さらに、心室から抽出したタンパク質を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、apoptosisの指標となるBax/Bcl-2比は、不正咬合群で有意に増加したが、その増加はpropranolol投与により抑制された。また、細胞内Ca2+ハンドリング因子であるホスホランバン(PLB)のリン酸化レベル(Ser16、Thr17)およびそのリン酸化酵素であるCa2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)のリン酸化レベルは、不正咬合群で有意に増加したが、その増加はpropranolol投与により抑制された。以上の結果は、不正咬合が慢性的に交感神経活動を亢進し、CaMKII/PLB活性化による細胞内Ca2+濃度の過負荷を介した心室の線維化およびapoptosisを誘導することを示唆する。計画通り作製したモデルマウスを用いて口腔機能障害が心臓に及ぼす影響を形態と機能の両面から詳細に解析し、その研究成果を学術論文(J Physiol Sci. 2019, PLoS One. 2019)および関連学会(第60回歯科基礎医学会学術大会、第9回アジア・オセアニア生理学会連合大会&第96回日本生理学会合同大会)にて発表しているため。今後(2019年度以降)は、本年度と同様に不正咬合モデルマウスを用い、口腔機能障害が心室の線維化およびapoptosisを誘導する分子機序について解析を進める。特に、心筋症の原因となるホスホランバンリン酸化によるCa2+ handling機能の慢性的な亢進が不正咬合により誘導されたことから、これに関連するシグナル伝達因子について詳細に解析する予定である。また、心室の線維化およびapoptosisに伴う心機能および心臓自律神経機能への影響もテレメトリーシステムを用いた心電図記録や心エコーを用いて解析を進める。得られた研究成果は、関連学会における発表と学術雑誌への論文投稿を通して発信する予定である。口腔疾患と心疾患の関連性は疫学調査から示唆されているが、その因果関係やメカニズムに関する詳細な報告は少ない。本研究では、モデルマウスを用い、口腔疾患と心疾患の因果関係およびその分子機序を解明することを目的とする。高齢化社会を迎え、近年増加傾向にある口腔疾患と、死亡原因第2位の心疾患との関連性を調べる本研究の意義はきわめて高い。本年度(平成29年度)は、16週齢の雄性マウス(C57BL/6)を1コントロール群、2不正咬合群(下顎切歯に咬合挙上板を装着)、3propranolol(β受容体遮断薬)投与群(propranololを含む飲料水(1 mg/mL)を自由摂取)、4不正咬合+propranolol投与群の4群に分けて2週間後に心臓を摘出し、不正咬合による口腔機能の低下が心臓に及ぼす影響を組織化学的ならびに分子生物学的手法を用いて詳細に解析した。以上の結果は、不正咬合が慢性的に交感神経活動を亢進し、心室の線維化およびapoptosisを誘導することを示唆している。計画通りモデルマウスを作製して、口腔機能障害が心臓に及ぼす影響を形態と機能の両面から詳細に解析し、その研究成果を関連学会(第59回歯科基礎医学会学術大会、第95回日本生理学会大会)にて発表しているため。

本年度(平成30年度)は、16週齢の雄性マウス(C57BL/6)を1コントロール群、2不正咬合群(下顎切歯に咬合挙上板を装着)、3propranolol(β受容体遮断薬)投与群(propranololを含む飲料水(1mg/mL)を自由摂取)、4不正咬合+propranolol投与群の4群に分けて2週間後に心臓を摘出し、不正咬合による口腔機能の低下が心臓に及ぼす影響を組織化学的ならびに分子生物学的手法を用いて詳細に解析した。まず、心重量/脛骨長比は4群間で有意な差は認められなかった。この結果は、不正咬合が心肥大を誘導しないことを示唆する。Masson-trichrome染色の結果、不正咬合群では心室の線維化(fibrosis)が観察された。その線維化はpropranolol投与により抑制された。また、TUNEL染色の結果、不正咬合により心室のapoptosis陽性細胞の有意な増加が認められた。そしてその増加はpropranolol投与により抑制された。さらに、心室から抽出したタンパク質を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、apoptosisの指標となるBax/Bcl-2比は、不正咬合群で有意に増加したが、その増加はpropranolol投与により抑制された。また、細胞内Ca2+ハンドリング因子であるホスホランバン(PLB)のリン酸化レベル(Ser16、Thr17)およびそのリン酸化酵素であるCa2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)のリン酸化レベルは、不正咬合群で有意に増加したが、その増加はpropranolol投与により抑制された。以上の結果は、不正咬合が慢性的に交感神経活動を亢進し、CaMKII/PLB活性化による細胞内Ca2+濃度の過負荷を介した心室の線維化およびapoptosisを誘導することを示唆する。計画通り作製したモデルマウスを用いて口腔機能障害が心臓に及ぼす影響を形態と機能の両面から詳細に解析し、その研究成果を学術論文(J Physiol Sci. 2019, PLoS One. 2019)および関連学会(第60回歯科基礎医学会学術大会、第9回アジア・オセアニア生理学会連合大会&第96回日本生理学会合同大会)にて発表しているため。今後(平成30年度以降)は、本年度と同様に不正咬合モデルマウスを用い、口腔機能障害が心室の線維化およびapoptosisを誘導する分子機序について解析を進める。特に、心筋症の原因となるホスホランバンリン酸化によるCa2+ handling機能の慢性的な亢進が不正咬合により誘導されたことから、これに関連するシグナル伝達因子について詳細に解析する予定である。また、心室の線維化およびapoptosisに伴う心機能および心臓自律神経機能への影響もテレメトリーシステムを用いた心電図記録や心エコーを用いて解析を進める。得られた研究成果は、関連学会における発表と学術雑誌への論文投稿を通して発信する予定である。今後(2019年度以降)は、本年度と同様に不正咬合モデルマウスを用い、口腔機能障害が心室の線維化およびapoptosisを誘導する分子機序について解析を進める。次年度に使用額が生じた理由は、当初の計画で購入予定であった心エコー記録用の超音波画像診断装置を他の予算で購入したためである。