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プルーストのテクストにおける古典主義演劇

本研究では、プルーストが小説に古典主義演劇を取り込む手法を分析した。本研究の目的はプルーストの小説の特異性を明らかにすることである。そこで古典主義演劇を取り込んだ同時代の小説、たとえばアナトール・フランスやゾラの小説とプルーストの小説を比較した。当時の古典主義演劇に関する批評はプルーストが古典主義演劇を小説に取り込む手法に影響を与えていることを示した。草稿資料調査により分析を深化した。2013年11月に催された国際シンポジウム<<1913: latransgressiondes genres>>において、本課題「プルーストのテクストにおける古典主義演劇」に関する発表を行った。具体的には、プルーストの小説『失われた時を求めて』の中でも、1913年に出版された第一巻『スワン家の方へ』を中心として、プルーストの小説の中で演劇がどのような役割を果たしているのかという問題を考察した。この問題をめぐって、プルーストと同時代の作家アラン=フルニエをはじめ、他の小説家との比較によって、プルースト独自の手法を明らかにすることを目的とした。その際、小説以外のテクストも分析対象とした。3日間にわたるシンポジウムの中で、他の発表者や聴衆と意見交換をする貴重な機会が多く得られた。このシンポジウムにはプルーストの専門家だけでなく、アラン=フルニエの専門家が多く参加しており、重要なアドバイスを得ることができた。本発表においても、プルーストの小説の生成過程をたどりながら分析を行ったが、さらに草稿資料を分析対象とすることで、今後、考察を深めていくことが考えられる。まずは、すでに刊行されているプルーストの原稿帳の転写校訂版を参照して、分析を進めていく予定である。本年度は予定通り、本研究課題に関する研究分野において著名な専門家を九州産業大学に招き、講演会を開催した。講演後は質疑応答も活発に行われ、有意義な意見交換の場を設けることができた。出張などによる資料調査を繰り返し行い、プルーストの『失われた時を求めて』の草稿資料の転写版を読み進めた。小説の生成過程を丁寧にたどることで、主要な登場人物のイメージの変遷を追い、小説の結構との関連を分析した。この分析結果を学術論文(査読付き)として公表した。本論では、草稿も含め、これまでに分析されたことのない描写の細部に着目することで、新たな視点を示した。今後もさらに草稿資料を調査し、緻密に分析することで、考察を深めていきたいと考えている。また、本研究課題に関連する研究において著名な専門家を九州産業大学に招聘し、講演会を開催した。講演者は高度な専門的内容を参加者にわかりやすく伝えた。講演後の質疑応答も活発に行われた。パリの国立図書館やソルボンヌ大学の図書館、国内の他大学の図書館への出張により、研究課題に関する資料調査を行った。プルーストの小説『失われた時を求めて』の草稿資料とプレイアッド版を精読し、小説の主要な登場人物であるアルベルチーヌのイメージがどのように変化していくのかを分析し、そのイメージの変遷と物語の展開上、重要な要素であるモチーフがどのような関連を持つのかを考察した。今年度は『失われた時を求めて』の中でも特に、生成過程が複雑な巻を分析対象とし、近年刊行された草稿の転写校訂版を参照した。また、『失われた時を求めて』における古典主義演劇と『セヴィニエ夫人の手紙』の明示的な引用の役割に着目し、それぞれの引用と小説の主要なモチーフがどのように結びつけられているかという問題を考察した。そのために、小説の生成過程を綿密に辿ることで、引用箇所の異同を明らかにし、引用と小説のモチーフの関連をより明確にすることができた。以上の考察を学術論文(査読付き)として公表した。論文の他に本年度は、プルーストに関する重要な著書の書評を執筆した。その際にプルーストの草稿の中には作家の美学が読み取れる要素があることが確認できた。また、本研究課題に関する研究分野の複数の著名な専門家を招聘し、研究課題に関する講演会を主催した。講演者は専門的な内容を分かりやすく工夫して聴衆に伝え、講演後にも質疑応答が活発に行われた。講演前後の打合せも本研究課題を進める上で、有意義な議論をする機会となった。海外出張を予定通り行えなかったため。招聘を予定していた研究者と予定が合わず、開催が延期となった講演会があるため。研究期間全体を通して、フランスの古典主義演劇という主題をめぐって小説家プルーストがいかなる手法を用いているのかという課題に取り組み、プルーストの作品の独自性を明らかにすることを目的として研究を進めた。テクストの生成過程を分析し、最終稿までの変更点を確認することで、作家の手法が見えてくることが多く、綿密な資料調査が不可欠であった。最終年度は校務により、出張が認められなかった期間があり、コメンテーターとして参加予定だった研究会に参加できなかっただけでなく、資料調査が十分に行えないことがあった。今後も、草稿を含めた資料調査が必要である。国際シンポジウム「ジャンルの混淆1913ー1914」では、プルーストの小説における古典主義演劇について発表し、発表内容を論文として公表した。具体的には、『フェードル』をめぐって、プルーストが用いた手法と19世紀から20世紀の作家の手法を比較し、プルーストの手法の独自性を浮かび上がらせた。また、小説『失われた時を求めて』において主要な登場人物であるアルベルチーヌと古典主義

演劇の引用との関連を主な分析対象として、複数の論文を公表した。『失われた時を求めて』の中でも『花咲く乙女たちのかげに』、『ソドムとゴモラ』、『囚われの女』と『逃げ去る女』のテクストを中心に、草稿を含め、『失われた時を求めて』におけるアルベルチーヌのイメージの変遷を追い、それが小説の結構とどのように関連するのかという問題を考察した。最終年度は『花咲く乙女たちのかげに』を中心にテクストの生成過程を辿りながら、バルベックの浜辺で出会ったアルベルチーヌと少女たちが「私」にとっていかなるイメージの存在に変貌していくのかを考察した。最終年度も、本研究課題に関する専門家である複数の研究者に講演を依頼し、講演会を主催した。講演会は、本研究課題を進める上で、意見交換をする貴重な機会となった。本研究では、プルーストが小説に古典主義演劇を取り込む手法を分析した。本研究の目的はプルーストの小説の特異性を明らかにすることである。そこで古典主義演劇を取り込んだ同時代の小説、たとえばアナトール・フランスやゾラの小説とプルーストの小説を比較した。当時の古典主義演劇に関する批評はプルーストが古典主義演劇を小説に取り込む手法に影響を与えていることを示した。草稿資料調査により分析を深化した。校務などで、資料調査のための出張を予定通りに行えなかったため。また、講演を依頼する予定であった研究者と日程が合わず、予定していたにもかかわらず、開催することができなかった講演会があったため。今後もプルーストの『失われた時を求めて』の原稿帳の転写校訂版を精読し、生成過程を辿ることに重点を置きたい。フランス文学、演劇前年度に引き続き、プルーストの小説の最終稿だけでなく、草稿の転写校訂版を丁寧に読み進め、分析、考察を深めていきたい。口頭発表により研究成果を公表した。シンポジウムや講演会によって本課題について、有意義な意見交換ができた。海外出張を予定通りできなかったため。招聘を予定していた研究者と予定が合わず、開催が延期となった講演会があるため。校務などで予定通りの出張を行うことができなかったため。講演を依頼していた研究者と日程調整ができず、予定していたにもかかわらず行えなかった講演会があったため。分析対象としている作品の生成過程を綿密に調べるための資料調査を行う予定である。また、研究課題に関する専門的知識を提供できる研究者を招聘し、講演会を開催する予定である。プルーストのテクストの中でも、最終稿だけでなく原稿帳の転写校訂版を参照し、生成過程を視野に入れることで、分析を深める。本課題に関する資料収集のための出張を予定している。また、資料収集の作業に必要となる持ち運び可能なノートパソコンの購入を予定している。交付申請書に記載したとおり、本年度は本研究テーマに合致する研究分野において著名な専門家を招いて講演会、セミナーを開催したが、それに伴い講演会が終了する平成26年1月まで経費を抑える必要があり、国内での研究会参加や消耗品類の支出を控えたため、次年度使用額が生じた。
1894～1896年戦争の記憶に関する比較文学的調査・研究

本研究では、18941896年戦争に先行する18701890年代、当該戦争時期、および戦争終結以降における当該戦争をめぐる諸言説に注目し、その語られ方の比較検討を通して、東アジア各地域の歴史認識の対立を規定する構造的諸条件の一端を明らかにしようと試みた。その結果、研究期間を通じて、論文5本(共著の分担執筆2本を含む)、国際学会を含む学会・研究会発表計6回の研究成果を得た。本研究の問題意識の一部は、2018年度科研費助成事業(基盤研究C)の研究課題「「帝国日本形成の物語」(西南・日清・日露各戦争)の成立に関する調査・研究」(課題番号18K00317)に引き継がれている。2015年度は、当該研究テーマに即した2本の研究論文を執筆した。1本目は『「太平記」の明治』と題する論文であり、日清戦争に関する日本側の歴史叙述(『明治太平記』等)において『太平記』の枠組みが機能した状況についての考察を含んでいる。日清戦争は、『○○太平記』という名称が歴史叙述に関せられた最後の時代であった。2本目は『明治七年の「台湾危機」』と題して、1874年におきた日本軍の「台湾出兵」が引き起こした日清間の「危機」とそれに関する言説を検討したものである。研究代表者の考えでは、1894年におきた日清戦争は、1874年当時の「台湾危機」の延長線上で起きたものである。1874年においては戦争の危機はぎりぎりで回避されたが、その時に日本国内で起きた議論や、その「危機」を叙述した『台湾軍記』等のナラティヴは、明治初年の士族を中心とする膨張主義の熱気をかなりの程度反映している。日清戦争は、実際には1894年に起きたのではあるが、その可能性についてはすでに1874年前後の時点でかなりの程度予測され、論者によっては期待されもしていたということを分析検討した。これらの論文執筆のほか、2015年度は中国及び台湾における、18941896年戦争の記憶を語る資料を大量に収集した。また、韓国における甲午農民戦争に関する資料収集のめどもつけ、日本における日清戦争関連の小説群の収集・分析作業にも着手している。2015年度は上述のように、中国及び台湾における18941896年戦争の記憶に関する資料を一定程度収集することができた。日本における資料収集も進んでおり、また、韓国における資料収集に関してもめどをつけることができている。以上の理由により、おおむね順調に進展していると位置づけることができると考える。当該年度はまず、18941896年戦争の前哨をなす1874年のいわゆる「台湾出兵」をめぐる諸言説、特に、当時の日本国内における戦争熱に関する分析検討を行った「1874年の「台湾危機」」を公表した。この論において、1894年戦争を通して現実化する、帝国日本の中国・台湾に対する眼差しは、すでにこの1874年の時点で一定以上成立していること、1874年においては中国(清朝)との全面戦争は避けられたものの、その危うさに関する思考は回避されたことを論じた。次に、9月、東京の「歴史と文体」研究会にて、19世紀前半の歴史家・頼山陽が1890年代の日本の為政者に与えた思想的影響の射程距離についての研究発表を行った。また、11月末に韓国仁川で開催された東アジア日本研究国際シンポジウム(EACJS)において、「18941896年戦争における主戦論・非戦論再考」を発表した。これは、日清戦争勃発時の日本国内の言説状況を展望した上で、非戦論を唱えた勝海舟や、戦後の風潮を批判した西村茂樹、非国民を描いた泉鏡花、学校教育の現場における排外熱の暴力性を描いた中勘助等の言説を検討し、その意義と限界を論じたものである。また、2017年の年明け以降、この報告内容をもとに、論文「日清戦争と在留清国人表象」を執筆中である。この論文において、日清戦争地下に上演された歌舞伎『明治産会津組重』や、当時の新聞記事等を素材として、同時代の横浜・神戸を代表とする在留清国人に対するメディアの眼差しの諸相の分析を試みている。さらに、『日清戦争実記』等、戦争を契機として成立した雑誌媒体における諸記事の読解を通して、当該戦争下の言説の諸相の研究、さらには日中戦争下の諸状況との共通性と差異に関する検討を進めている。日本の言説状況に関する収集および分析検討・研究成果の公開は順調に進んでいる。韓国・台湾・中国の資料収集も一定程度の進捗はあるが、まだ(特に韓国に関しては)努力する必要がある。また、韓国・台湾・中国の資料の分析検討および研究成果の公開についてはまだ現在進行形である。一部は今年度中に学術論文等の形で公表する見込みである。2017年度はまず、2016年度に執筆した論文「日清戦争と在留清国人表象」を掲載した書籍(小峯和明監修・金英順編『シリーズ日本文学の展望を拓く』第1巻『東アジアの文学圏』が刊行された。また、同じく昨年度に執筆した論文「二十世紀の和泉式部伝説ー『かさぶた式部考』における「救済」についてー」も張龍妹・小峯和明編『東アジアの文学と女性と仏教』に掲載される形で刊行された。

後者は日清戦争前後の産業化の流れの中で形成されてきた20世紀東アジア(特に九州炭鉱地帯)の現実と、中世の和泉式部伝説を交錯させた秋元松代の戯曲『かさぶた式部考』に関する考察である。Ecocriticism in Japanに掲載した。これも日清戦争前後に起源をもつ日本の産業化の帰結である水俣病と正面から取り組んだ石牟礼道子のテクスト群とその語り口に、前近代日本における非定住民(非農業民)に関する「記憶」を読みこもうとする試みである。2017年9月には、ポルトガルのリスボンで開催されたヨーロッパ日本学会(EAJS)国際大会において、「境界のポリティクス」の彼方へー戦争叙述における複数的視点の可能性についてー」と題する発表を行い、前近代日本において東アジアの(感情移入できない)他者に対する対等な関係性の自覚に基づいた認識が蓄積されなかったことが、日清戦争以降の植民地主義の土壌をなしていることを指摘し、その傾向を克服する方向性等について具体的なテクストを通して論じた。今後は、本研究の研究成果等に依拠しつつ、20世紀前半の日本人の歴史的想像力のの在り方と前近代との潜在的な連続性の諸相について、探求を拡大していきたいと考える。本研究では、18941896年戦争に先行する18701890年代、当該戦争時期、および戦争終結以降における当該戦争をめぐる諸言説に注目し、その語られ方の比較検討を通して、東アジア各地域の歴史認識の対立を規定する構造的諸条件の一端を明らかにしようと試みた。その結果、研究期間を通じて、論文5本(共著の分担執筆2本を含む)、国際学会を含む学会・研究会発表計6回の研究成果を得た。本研究の問題意識の一部は、2018年度科研費助成事業(基盤研究C)の研究課題「「帝国日本形成の物語」(西南・日清・日露各戦争)の成立に関する調査・研究」(課題番号18K00317)に引き継がれている。2016年度は収集した中国・台湾における資料の分析検討を開始する。また、日本における資料収集を、特に昭和期の日清戦争叙述を中心に行い、その分析を開始する。さらに、韓国における資料収集を本格化し、その分析作業にも着手する。2016年度末の時点で、これらの研究成果を複数の論文にまとめることをめざす。今後は中国・台湾・韓国における18941896年戦争言説に関する分析検討および研究成果の公開を主に行う。それを通して、日本の言説をも含めた東アジア比較言説研究の視座を構築する。また、当該研究課題の探求を踏まえた上で、次の研究課題である、20世紀における東アジア規模の戦争であった1930年代の日中戦争に関する比較言説研究における論点の抽出・問題整理・検討・視座構築等の作業を開始する予定である。日本文学
細菌バイオフィルムの慢性皮膚潰瘍創における形態の分析とその制御に関する研究

近年、細菌感染症の難治化要因のひとつとして、生体表面や組織内に形成するバイオフィルムが注目されている。ラット皮膚潰瘍モデル(PAO1株)を用いてバイオフィルムを観察し、更にQuorum-sensing機構の構成遺伝子欠損株を観察し、比較した。また血流不全状態を作成しバイオフィルム形成について検討を加えた。遺伝子欠損株はPAO1株に比べて細菌定着が少なく、上皮化が比較的早く、バイオフィルム形成は少ない傾向にあった。今後このQuorum-sensing機構を阻害することがバイオフィルム形成を阻害し、創傷治癒促進につながる可能性を示唆した。平成18年度の研究目的近年、細菌感染症の難治化要因のひとつとして、生体表面や組織内に形成するbiofilmが注目されている。創傷治癒においてもbiofilmの形成により難治化が予想されている。in vivoにおける人工biofilm形成モデルの報告は多いものの、実際の動物皮膚潰瘍モデルにおけるbiofilmの研究は少数である。血流不全状態の皮膚潰瘍とbiofilm形成の関係を明らかにするために、今回我々はラット背部に作成した皮弁上に潰瘍を作ることにより、虚血性潰瘍(ischemia群)と非虚血性潰瘍(control群)におけるbiofilm形成について検討した。研究方法研究結果8時間後においてすでに、biofilmの形成が認められた。虚血性潰瘍に比べ、非虚血性潰瘍(control群)におけるbiofilmの形成が比較的多く認められる結果となり、創傷への好中球浸潤が何らかの形でbiofilm形成に関与している可能性が示唆された。今後、本モデルをさらに発展させ、虚血とbiofilm形成のメカニズムを解明する足がかりとなった。今後、本実験モデルを用い、細菌が創傷治癒に与える影響について検討していくとともに、バイオフィルム形成のメカニズムを究明する。加えて抗菌剤局所投与や感染抑制効果を有する物質(高浸透圧物質である蜂蜜やポリマーなど)とバイオフィルムとの関係を追求する。実験成果の発表平成18年度得られた結果のうち、皮膚潰瘍創における細菌バイオフィルムの形成と虚血に関して第36回日本創傷治癒学会学術集会で発表した。【研究目的】近年、細菌感染症の難治化要因のひとつとして、生体表面や組織内に形成するbiofilmが注目されている。【研究方法】雄S-Dラット背部の虚血部と非虚血部に皮膚潰瘍を作成し、24時間後にP. aeruginosa PAOl (FITC labeling)を潰瘍内に播種、8時間後、24時間後、40時間後に組織を採取し、Concanavalin Aにて染色し、観察した。更にQuorum-sensing機構の構成遺伝子欠損株(Las I、Rhl I遺伝子欠損)を観察し、比較した。【研究結果】8時間後においてすでに、biofilmの形成が認められた。遺伝子欠損株はPAOl株に比べて細菌定着が少なく、上皮化が比較的早く、バイオフィルム形成は少ない傾向にあった。【実験成果の発表】本件研究に関して第36回日本創傷治癒学会学術集会、第16回日本形成外科学会基礎学術集会で発表した。【目的】近年、細菌感染症の難治化要因のひとつとして、生体表面や組織内に形成するバイオフィルムが注目されている。創傷治癒においてもバイオフィルムの形成により難治化が予想されている。in vitroにおける人工バイオフィルム形成モデルの報告は散見されるが、実際の動物皮膚潰瘍モデルにおけるバイオフィルムの研究は少数である。以前より我々はラット皮膚潰瘍モデル(緑膿菌PAO1株)を用いて、潰瘍面に存在する緑膿菌バイオフィルムの観察を可能とし報告してきた。本モデルを発展させ、さまざまな条件下においてバイオフィルムを観察し、創傷治癒への影響を検討する。ラット皮膚潰瘍モデル(PAO1株)を角いてバイオフィルムを観察し、更にQuorum-sensing機構の構成遺伝子欠損株(Las I、Rhl I遺伝子欠損)を観察し、比較する。また血流不全状態を作成しバイオフィルム形成について検討する。【方法】

雄S-Dラット背部に皮弁を作成し、皮弁内外に潰瘍を作ることにより、虚血性潰瘍(ischemia群)と非虚血性潰瘍(control群)とした。潰瘍内に緑膿菌(PAO1株およびLas I、Rhl I遺伝子欠損株)を播種後、染色し、観察した。【結果・考察】8時間後においてすでに、バイオフィルムの形成が認められた。虚血性潰瘍に比べ、非虚血性潰瘍におけるバイオフィルムの形成が比較的多く認められる結果となり、創傷への好中球浸潤が何らかの形でバイオフィルム形成に関与している可能性が示された。また、遺伝子欠損株はPAO1株に比べて細菌定着が少なく、上皮化が比較的早く、バイオフィルム形成は少ない傾向にあった。今後このQuorum-sensing機構を阻害することがバイオフィルム形成を阻害し、創傷治癒促進につながる可能性を示唆した。
低分子化合物によるスプライス部位選択制御の分子機構解明と疾患原因変異への応用

遺伝性疾患やがん細胞においては異常なスプライシングが原因となることが多数報告されており、スプライシングが普段正確に行われる仕組みを解明し、異常となった場合にはそれを是正する方法論の可能性を検証することが重要である。これまでに化合物ライブラリーからの2段階のスクリーニングを経て、3'スプライス部位に変異を含むレポーター遺伝子のスプライシングを正常に戻す活性を示す化合物を同定した。これまでの解析からその作用標的はCDK9であることが示唆されているが、多数存在するCDK9阻害剤を比較すると、同様の活性を示すもの示さないものが存在しており、その作用機序の解明が課題である。本年度はRNA-seqによる陽性化合物の作用機序についてより詳細な検討を行なった。その結果、我々の陽性化合物はトランスクリプトーム全体で特定の遺伝子群の3'UTRの伸長やその伸長された領域でのスプライシングが増加していることを見出した。この伸長が起こる遺伝子群がどのように決まるのかは不明であるが、この遺伝子群で見られた変化を化合物作用の指標として、CDK9の他の阻害剤についてのRNA-seqの結果をメタ解析で比較したところ、化合物が2つのクラスに分かれることを発見した。同じ分子を標的にしながら作用に違いが出る理由として、CDK9のリン酸化ターゲットであるRNAポリメラーゼのC末端部のリン酸化の低下が、化合物ごとにその影響やパターンが異なる可能性を見出し、現在より詳細に検討を行っている。化合物の作用標的や作用機序の同定は困難であることが多いが、RNA-seqによる活性評価から、我々の化合物については作用機序の推定が進んでいる。またその過程で、他の同様の化合物との比較を行い、スクリーニングで得られた化合物が持つ作用の特質に着目して研究を進められている点は研究の大きな特徴となっている。現在、陽性化合物と他のCDK9阻害剤との違いについて検討を行っているところであるが、スクリーニングで得られた他の化合物にも3'スプライス部位の変異で起こる異常なスプライシングを是正する活性が見られるものもある。またそのような活性は見られないが、細胞内の膜を持たない構造体の形成を大きく変化させる化合物を複数得ている。これらはどれも細胞内のRNAの動態に影響する作用を示すことが明らかになりつつあり、1段階目のスクリーニングで指標とした、スプライソソームのサブユニットであるsnRNPの細胞内量がそれらの化合物によって変化した理由との関連も明らかになりつつある。そのため、これらの化合物の作用解析を進めることで、スプライシングを含めた、RNAの転写から成熟、輸送、翻訳という一連の過程が相互に繋がって協調的に細胞機能を調節している姿が見えると期待している。これまでの研究で同定、解析を行ってきた新規のスプライシング調節化合物について本研究ではその作用機序を理解して応用へつなげることを目的としている。スプライシング調節薬は近年転写産物の網羅的解析手法の進歩によりその有用性が理解され期待が高まっているが、その作用の広範さゆえに実用に至ったものはまだない。一方でこれらの化合物が核内で起こる全てのスプライシングイベントに影響を与えるわけではなく、それぞれの化合物の作用に応じてそれぞれ異なるグループの遺伝子群のスプライシングに影響を及ぼすことが明らかとなってきた。そのため、スプライシング調節薬の作用は広範囲に及ぶものの、その作用には一定のルールがあると予想され、そのルールを理解して各化合物の作用の方向性を予測できるようになれば、スプライシングの調節作用を示す化合物を薬として利用する方策につながると考えられる。そのため、我々の化合物についても転写産物の網羅的解析を行い、スプライシングパターンの変動の傾向を解析した。また得られた結果を元にいくつかの化合物応答性のスプライシング変動を示す遺伝子を同定することができ、これをモデルとすることで、これまでのレポーター遺伝子によるスプライシングの基質認識制御能の検討から、内在性遺伝子を用いた活性評価が可能になった。そのため、類縁化合物の活性評価がより簡便に行えるようになり、さらに化合物の作用標的と目されるタンパク質の活性評価法としてもその有用性が期待される状況である。我々の新規スプライシング調節化合物で処理した培養細胞のRNA-seq解析により、化合物処理後のスプライシングパターン変動の特徴を掴むことができた。これまではイントロン末端に変異を含むスプライシングのレポーター遺伝子をモデルとして、スプライシングの正確性維持機構の一側面を切り取ったより人工的な実験系で化合物の評価を行い、その活性を詳細に解析してきたが、このような方向性の研究とは全く異なる視点から化合物作用の理解をもたらした点で、今年度研究が大きく展開したと言える。本研究ではpre-mRNAスプライシングにおける基質認識の正確性が保証される仕組みについてケミカルバイロジーのアプローチで取り組んでいる。具体的には、イントロンの3'末端に変異を導入したレポーター遺伝子において、変異イントロンのスプライシングを促進する化合物をこれまでに取得しており、その作用解析を通じて、なぜ通常はその部位でのスプライシングが抑制されるのかを明らかにすべく研究を進めている。すでに化合物処理条件でのトランスクリプトーム全体の変動を検出するRNA-seqを行い、大まかな解析を行なっていたが、昨年度はさらに先進ゲノム支援の協力を受け、より詳細な解析を実施した。その結果、化合物で新たにスプライシングが誘導されるイントロンは化合物なしでスプライシングされる恒常的なイントロン同様、ある程度まではスプライソソームの組み立てが行われている可能性が示唆された。

また、類似の活性を示す化合物をデータベース解析から同定し、その解析結果からこれらの化合物処理で共通に変化する遺伝子群が同定され、その生理的な意義と化合物の標的との関係についての考察が可能となった。この標的候補分子が実際に細胞内で化合物作用の発揮に関わるかを調べるため、標的候補遺伝子群をノックダウンにより発現抑制した条件で化合物を作用させ、レポーター遺伝子のスプライシングへの影響を検討したところ、特定の遺伝子のノックダウン条件下では、化合物の作用が減弱したり、化合物の構造によっては活性が増加するなど興味深い現象が見られた。これらの実験結果は標的についての仮説と合致するものであり、次年度はこの点についてさらに詳しく解析を行う予定である。化合物の作用標的の同定は決まった方法がなく、どの化合物でも手探りで進む部分が大きいが、本年度は我々の化合物の作用標的をRNA-seqの解析結果と、公共データベースにある多数の化合物のRNA-seqの結果を同じ手法で再解析して比較することで、類似の作用を示す化合物群を同定することができた。これらの化合物が同一分子を標的としていることから、この分子が実際にレポーター実験で見られるような陽性化合物のスプライシングへの影響に関与しているかをノックダウン実験で調べるところまで行っている。これは予定した通りのストラテジーではなく、各時点で得られた結果をもとに次の方策へとつなげた結果であるものの、進捗状況としてはおおむね順調と考えている。遺伝性疾患やがん細胞においては異常なスプライシングが原因となることが多数報告されており、スプライシングが普段正確に行われる仕組みを解明し、異常となった場合にはそれを是正する方法論の可能性を検証することが重要である。これまでに化合物ライブラリーからの2段階のスクリーニングを経て、3'スプライス部位に変異を含むレポーター遺伝子のスプライシングを正常に戻す活性を示す化合物を同定した。これまでの解析からその作用標的はCDK9であることが示唆されているが、多数存在するCDK9阻害剤を比較すると、同様の活性を示すもの示さないものが存在しており、その作用機序の解明が課題である。本年度はRNA-seqによる陽性化合物の作用機序についてより詳細な検討を行なった。その結果、我々の陽性化合物はトランスクリプトーム全体で特定の遺伝子群の3'UTRの伸長やその伸長された領域でのスプライシングが増加していることを見出した。この伸長が起こる遺伝子群がどのように決まるのかは不明であるが、この遺伝子群で見られた変化を化合物作用の指標として、CDK9の他の阻害剤についてのRNA-seqの結果をメタ解析で比較したところ、化合物が2つのクラスに分かれることを発見した。同じ分子を標的にしながら作用に違いが出る理由として、CDK9のリン酸化ターゲットであるRNAポリメラーゼのC末端部のリン酸化の低下が、化合物ごとにその影響やパターンが異なる可能性を見出し、現在より詳細に検討を行っている。化合物の作用標的や作用機序の同定は困難であることが多いが、RNA-seqによる活性評価から、我々の化合物については作用機序の推定が進んでいる。
海溝型地震による強震動予測法開発と継続時間に依存する構造物の損傷メカニズムの解明

海溝型巨大地震を対象として、強震動予測法開発と、地震動の継続時間に依存する構造物の損傷メカニズムの解明に焦点を当てて検討した。震度予測式と,予測震度を条件とした継続時間の条件付予測式とを統合して、震度・継続時間の一貫した経験的予測体系を構築した。強震継続時間が長い地震動が作用した場合の河川堤防や道路盛土などの土構造物を対象として地盤の液状化を考慮した地震応答解析(有効応力解析)を行い、解析手法の適用性を検討した。また、骨組構造モデルを用いてT型コンクリート橋脚をモデル化し、強震継続時間が短い地震波と、長い地震波に対する応答計算を行った。研究初年度である平成26年度において、以下の研究実績が得られた。(1)我が国の3大都市圏のような地域の深い基盤構造の影響による地域固有の長周期地震動の特性を、研究代表者らによって提案されている強震動を加速度波形で予測する手法に適確に取り入れる方策を提案した。(2)線形1自由度系の速度応答包絡線を用いて、所定の固有周期において速度閾値を超過する継続時間をスペクトル表現した「閾値超過継続時間スペクトル」を提案した。(3)海溝型巨大地震による長時間継続する地震動を受ける鋼製橋脚を対象とし、繰り返し履歴による耐力低下に関して,数値解析的検討を行い、座屈パラメータが耐力低下に及ぼす影響を明らかにした。その他、RC部材を対象とした応答挙動への強震動継続時間の影響評価、2011年東北地方太平洋沖地震における地盤構造物の崩壊挙動の解析的分析等を実施した。研究の2年目にあたる平成27年度において、以下の研究実績が得られた。(1)これまでの研究成果を踏まえ,関東平野,東京湾周辺を対象に,地震動観測記録の収集と地震動特性の分析を行った。その結果,東京湾周辺において,当該地域固有と考えられる周期1秒程度以上の卓越傾向を確認した。また、震度継続時間を予測する簡便手法の確立を目的として、観測震度または予測震度を与件とした条件付予測式を提案した。(3)海溝型巨大地震による長時間継続する地震動を受ける鋼製橋脚を対象とし,数十回から百回オーダーにおよぶ繰り返し履歴による耐力低下に関して,数値解析的検討により検討した.その結果,座屈パラメータが耐力低下に及ぼす影響を明らかにした。(4)2011年東北地方太平洋沖地震によって,東日本各地で深刻な液状化被害を受け,長時間強震動に対する有効応力解析の精度向上が求められている。そこで,長時間強震動を模擬した多段階載荷の非排水繰返しせん断試験を対象として,砂の構成モデルを用いて要素シミュレーションを行い,従来の砂の構成モデルを修正した。また,液状化地盤上の盛土のモデルを対象として,有効応力解析を行い,修正した構成モデルの多段階載荷試験に対する有効性を検討した。(5)繰り返し載荷による除荷時剛性劣化と耐力低下を考慮可能な履歴復元力モデルを用い,塩害劣化していないRC部材と塩害劣化したRC部材との載荷実験結果を履歴復元力特性の包絡線として設定した。当初予定の内容に加え、研究代表者らが開発した強震動予測手法に、深い地盤構造に依存する地域特有の強震動特性を採り入れる手法を検討するなど、予定された計画以上に進展している。研究の最終年度である平成28年度においては、各研究分担者らによる研究成果をとりまとめた。以下に主な研究成果の概要を示す。(1)長い強震継続時間と地域固有の長周期地震動を含む地震動推定法の開発:関東、東海、関西地域において断層規模が大きな地震が発生すると、それぞれ固有の周期がある程度卓越する強震動となることをつきとめ、その影響を強震動予測に取り入れる手法を開発した。(2)実長大橋梁の耐震性検討のための強震動シミュレーション:大都市圏の深い基盤構造を有する堆積地盤に建設されている実長大橋梁の耐震性検討のため、上記の手法により強震動を算定した。2011年以降に道路橋示方書で規定された検討波形より大きな地震荷重となることが示された。(3)構造系の損傷度からみた強震動継続時間の定義に関する検討:骨組構造モデルを用いてT型コンクリート橋脚をモデル化し、強震継続時間が短い地震波と、長い地震波に対する応答計算を行った。その結果、最大応答値には有意な差が見られなかったが、履歴エネルギー吸収量は継続時間が長い方が大きくなった。エネルギー吸収量と損傷との関係を設計体系に取り入れる方策の検討が必要である。(4)震度・継続時間の一貫した経験的予測スキームの提案:震度・継続時間の一貫した経験的予測スキームを2014年長野県神城断層地震に適用し、予測精度に関する検証を行った。観測震度に基づく継続時間予測値は実測値と相関が高いことと、距離減衰式による予測震度に基づく継続時間予測値はばらつきが大きくなるが残差に偏りがないことを示した。また予測震度を介さない震度継続時間予測モデルを構築して予測結果を比較し、提案スキームの有効性を示した。

強震継続時間が長い地震動が作用した場合の河川堤防や道路盛土などの土構造物を対象として地盤の液状化を考慮した地震応答解析(有効応力解析)を行い、解析手法の適用性を検討した。また、骨組構造モデルを用いてT型コンクリート橋脚をモデル化し、強震継続時間が短い地震波と、長い地震波に対する応答計算を行った。研究実績の概要で示したとおり、当初計画の各項目において平成26年度に予定していた個々の研究分担者による研究成果が得られている。各分担者による研究成果を取り纏め、大規模地震を対象とした各種構造物の耐震化における強震動継続時間の影響を適切に採り入れる方法論を確立する。28年度が最終年度であるため、記入しない。地震防災、強震動予測、地盤震動解析海溝型巨大地震による地震動の特徴である「35分程度におよぶ非常に長い強震継続時間を有する地震動」について、その予測手法を確立し、スペクトル強度を設計外力とする設計指針に強震動継続時間の影響を定量的に組み入れる方法を提案するとともに、想定地震に対する地域防災の実務に活用できる被害関数モデルを提案する。平成27、28年度において、具体的に以下の検討を実施する。1断層の破壊伝播のパターン(ディレクティビティ効果等)と着目点との関係、表層地盤条件等の強震継続時間への影響、また、内陸直下地震による強震記録と比較して地震動強度と継続時間の2つの要素がどのように異なるのか等、地震工学的観点から検討する。2液状化地盤における土構造物と固有周期が長く減衰の小さい大規模なRCまたは鋼製橋梁等に的を絞り、破壊または応答値の進展が時刻歴でどのような挙動となるのかについて検討する。3(a)一般木造家屋構造、(b)RC構造、(c)鋼構造、(d)液状化地盤における土構造物、を対象とし、それぞれの構造形式の被害レベルを二つの地震動情報から簡便に推定する手法を検討する。4地震危険度解析の結果に上記検討結果を組み入れる方法論について検討する。次年度使用額は\57,280である。研究分担者が当初予定していた出張が一部必要でなくなり、また、購入予定していた一部の物品調達の必要がなくなったためである。残額(¥18,868)は少額であり、経費使用はほぼ当初の計画通りに進んだと考えている。次年度使用額の\57,280は、28年度において、適切に旅費、物品費等に充てる予定である。平成27年度においても、当初の計画通りに使用していく。
制限増殖型アデノウィルスを用いた悪性胸膜中皮腫の遺伝子治療

テロメラーゼプロモーター依存性制限増殖型アデノウィルス(Ad5/3hTERT-E1)によるin vitroでの殺細胞効果:ヒト悪性胸膜中皮腫細胞株H28、H226、H2052、H2452の4種の細胞株におけるテロメラーゼ活性をTRAPアッセイ法によって評価したところ良好な活性が認められた。これらの細胞株にAd5/3hTERT-E1を感染させ、その殺細胞効果をクリスタルバイオレットアッセイによって評価したところテロメラーゼ活性に依存した効果が確認された。上記の4種類の細胞株についてヌードマウス胸腔における腫瘍形成能をスクリーニングした。その結果、H226細胞は胸膜面に沿って腫瘍を形成することが確認された。経時的な観察では移植後2週間で顕微鏡的に腫瘍形成を認め、4週間後には肉眼的に確認された。そこで、H226細胞の移植2週間後にマウスを2群に分け、治療群ではAd5/3hTERT-E1を、コントロール群ではルシフェラーゼ発現アデノウィルスを胸腔内に投与し生存期間を比較した。コントロール群では移植後40日以内に全例が死亡したが、治療群では有意ではなかったものの生存期間が延長する傾向にあった。また、ウィルス投与後に経時的に胸腔内におけるウィルス量を定量した。その結果、コントロールウィルスは急速に減少したが、Ad5/3hTERT-E1は9日後でも初回投与時を上回るウィルス量が観察され、in vivoにおいても明らかなウィルスの増殖を認めた。しかしながら、胸腔内におけるウィルスの拡がりについてはマウス胸膜へのウィルスの感染性が低く評価が困難であった。
安定ゲーム概念に基づく自律分散型の交通システム制御法

本研究は,バスや鉄道システムに典型的に見られる運行不安定性(団子運転による運行遅延の増幅現象)を解消する自律分散的な制御スキームを提案する.提案スキームでは,各プレイヤ(列車,バス)は,局所的なリアル・タイム観測情報に基づく単純なルールに従って自律分散的に行動する.対象交通システムにおいて実現したい運行状態と「安定ゲーム」の均衡状態を対応付けることによって,提案制御スキームの安定性が保証されることを証明し,さらに,確率的な環境条件におけるスキームの頑健性を数値実験によって検証した.本研究の目的は,バスや鉄道システムに典型的に見られる運行不安定性を解消する「自律分散型制御」の設計法を示すことである.その方法の理論的基盤となるアイディアは,制御問題で実現したい状態(e.g.,定時隔運行状態)と「安定ゲーム」の均衡状態を対応付けることである.この提案理論を用いれば,システムの構成要素(e.g.,バス車両,鉄道列車,道路信号機)に課すべき「行動ルール」を系統的に設計できる.そして,その設定されたルールに基づいて各要素が自律分散・適応的に行動した集積的状態が,実現したいシステム状態に安定的に収束する.本研究では,このアプローチをバス・鉄道の運行安定化問題,および,道路交通における信号制御・混雑制御問題に適用し,各問題に対する自律分散型の制御法を開発する.そして,その制御法の効率性と頑健性を検証する.平成24年度は,平成23年度に開発した確定論的なプロトタイプ・モデルに確率論的な枠組を導入し,さらに路線条件等の前提条件をより一般化した理論を構築した.より具体的には,まず,バス・鉄道システム問題に対して,a)状態方程式に確率的ショック項を追加したモデルの定式化,b)確率論的な状態変化に対応した制御安定性条件の導入,c)複数路線での相互作用を考慮した最適制御問題の定式化;を行った.そして,その問題に対する安定性条件および最適制御ルールの特徴を明らかにした.また,道路ネットワークにおける通行権取引を用いた交通需要管理問題に対して,前年度までに開発された理論を確率論的な枠組に一般化した.より具体的には,利用者集合が日々変動する確率論的な状況下においても,観測情報に基づく自律分散・適応的な通行権配分スキームによって,効率的な交通流配分状態を頑健に実現できることが示された.本研究は,バスや鉄道システムに典型的に見られる運行不安定性(団子運転による運行遅延の増幅現象)を解消する自律分散的な制御スキームを提案する.提案スキームでは,各プレイヤ(列車,バス)は,局所的なリアル・タイム観測情報に基づく単純なルールに従って自律分散的に行動する.対象交通システムにおいて実現したい運行状態と「安定ゲーム」の均衡状態を対応付けることによって,提案制御スキームの安定性が保証されることを証明し,さらに,確率的な環境条件におけるスキームの頑健性を数値実験によって検証した.本研究の目的は,バスや鉄道システムに典型的に見られる運行不安定性(e.g.,団子運転による運行遅延の増幅現象)を解消する「自律分散型制御」の設計法を示すことである.その方法の理論的基盤となるアイディアは,制御問題で実現したい状態(e.g.,定時隔運行状態)と「安定ゲーム」(stable game)の均衡状態を対応付けることである.この提案理論を用いれば,システムの構成要素(e.g.,バス車両,鉄道列車,道路信号機)に課すべき「行動ルール」を系統的に設計できる.そして,その設定されたルールに基づいて各要素が自律分散・適応的に行動した集積的状態が,実現したいシステム状態に安定的に収束する.本研究では,このアプローチをバス・鉄道の運行安定化問題,および,道路交通における自律分散型の信号制御問題に適用し,その制御法の頑健性を系統的に検証する.平成23年度は,確定論的な状況に対する運行安定化問題と信号制御問題の各々に対して,プロトタイプ・モデルと理論を構築した.より具体的には,1)制御なし状態での対象システムのモデル構築(状態方程式の定式化),2)対象システム・モデルで実現したい状態を均衡解とするゲーム条件の設計,3)均衡解の(局所的)安定性条件を満たすプレイヤ(鉄道・バス車両/信号機等のシステム構成要素)の行動ルール(自律分散型制御法)の導出,を行った.また,運行安定化問題に対して,数値実験により,提案制御スキームの頑健性を検証した.研究目的および研究実施方法に記したH23年度の研究予定事項に関して,実際に成果が得られ,その成果を学会での研究発表および学術専門誌掲載(査読つき)の研究論文として公開している.当初の予定通り変更なし.当初の予定通り変更なし.
角膜輪部における角膜幹細胞と角膜神経の関与-ニューロトロフィンに着目して-

電流凝固により三叉神経を障害し、臨床での神経麻痺性角膜炎を反映した病状を作成することができた。更に角膜三叉神経障害後、角膜stem/progenitor細胞は著しく減少していた。これらの結果より角膜stem/progenitor細胞また角膜幹細胞をとりまく環境(niche)を維持するために角膜三叉神経は重要な役割を担っていると考察された。神経麻痺性角膜症は角膜の知覚低下および遷延性角膜上皮欠損を認める難治性疾患である。しかしながら、病態学的に現在においても詳細には解明されておらず、角膜幹細胞と角膜三叉神経との相互関与の有無については報告が少ない。我々はまず神経麻痺性角膜症のモデルマウスを作製し、モデルを用いて感覚神経である角膜三叉神経と角膜幹細胞との関連性を調査した。方法として電気凝固を利用し三叉神経の分枝である眼神経を障害したところ、瞬目反射が欠如し神経麻痺性角膜症様の所見を呈したマウスを作ることに成功した。障害7日後、障害側のみ神経マーカーであるbeta-III tubulinの完全な欠如を確認し、現段階で角膜stem/progenitor細胞のマーカーとして考えられているABCG2, p63, hairy enhancer of split 1 (Hes1)蛋白を免疫染色にて評価したところ発現が低下していた。またreal-time PCR法において、いずれのmRNA量も低下を示した。幹細胞の低下を具体的に定量するために、幹細胞の代替として用いられるside populationを用いてフローサイトメトリーで検出したところ、正常マウス角膜と比べて神経麻痺性角膜症のモデルマウスのside populationは約75%の低下を示した。以上より角膜神経障害後、角膜stem/progenitor細胞は著しく減少していることから、角膜幹細胞をとりまく環境を維持するために角膜三叉神経は重要な役割を担っていると示唆された。また神経障害の代表である糖尿病モデルマウスにおいてもやはり角膜stem/progenitor細胞は減少を示した。これらの結論を踏まえ、糖尿病性角膜症やヘルペス性角膜炎などの重症例に対する治療のアプローチを考える上で、角膜幹細胞をとりまく環境の整備が重要であると考察した。神経麻痺性角膜炎のモデルとして、electro-coagulationを用いてマウス三叉神経の分枝である眼神経を障害したところ、瞬目反射が欠如し神経麻痺性角膜症様の所見を呈したマウスを作ることに成功した。障害7日後、障害側においてのみ神経のマーカーであるbeta-III tubulinの完全な欠如を免疫染色にて確認した。障害側と反対側は、免疫染色において正常眼と同様なbeta-III tubulin陽性所見を認めた。また、現段階で角膜幹細胞のマーカーとして考えられているATP-bindingcassette subfamily G member2 (ABCG2), p63, hairy enhancer of split 1 (Hes1)蛋白を免疫染色にて評価したところ発現が低下していた。また、real-time PCRにおいてもいずれのmRNAも低下を示した。特にABCG2は著しく低下していることが認められた。また幹細胞の低下を具体的に定量するために、幹細胞の代替として用いられるside populationを用いてフローサイトメトリーで検出したところ、正常マウス角膜と比べて神経麻痺性角膜症のモデルマウスのside populationは約75%の低下を示した。また、同時に角膜幹細胞の機能評価をcolony-forming-efficiencyを用いたところ、神経麻痺性角膜症のモデルマウスでは、正常のおおよそ50%しかcolonyを形成できなかった。以上より、結論として角膜神経障害後、角膜幹細胞は著しく減少し、また機能においても低下していることがわかった。角膜幹細胞をとりまく環境を維持するために角膜三叉神経は重要な役割を担っているとこのことから示唆された。2011年度の研究計画で予定した、神経麻痺性角膜炎モデルマウスを用いることで角膜三叉神経と角膜stem/progenitorとの関連性を確認できた。研究成果を学会、論文にも報告することができ2012年度の研究計画を更に現在進めている最中である。前年度の研究結果である角膜三叉神経と角膜stem/progenitor細胞との間に相互作用があることを踏まえ、次年度は臨床で診療機会が多い糖尿病と神経関連因子の関与を調査していく。前年度の三叉神経障害モデルマウス作成において、手技が安定するためのかなりの経費が予想された。現段階も過剰な炎症を引き起こさないようにするなど、まだ改良を要する点も多々あるが、ある一定は作成可能となった。次年度の重症2型糖尿病モデルマウス、p75遺伝子欠損マウスは経費がかなりかかることが予想されるため繰り越していき、引き続き三叉神経障害モデルの現方法を改善しつつさらに研究を推進していく。今後は、重症2型糖尿病モデルマウスであるC57BLKS/J 1/1 Lepr Db (db/db)に対して角膜幹細胞障害を外的剥離後、コントロール群(I群)、外的剥離後、神経系幹細胞自己増殖に関与しているといわれる繊維芽細胞増殖因子

bFGF(basic fibroblast growth factor)(II群)、外的剥離後ニューロン分化を補助するレチノイン酸(RA)(III群)、神経成熟を促す神経栄養因子(NGF,substance P,BDNFを中心に) (IV群)、もしくはそれぞれの群を組み合わせて投与後、角膜stem/progenitor細胞とp75,TrkA受容体等の神経因子の経過変化を追っていく。重症2型糖尿病モデルマウスであるC57BLKS/J 1/1 Lepr Db (db/db)の購入に次年度の研究費を使用することを主体としていく。また角膜stem/progenitor細胞とp75,TrkA受容体等の神経因子の経過変化を追っていくことを踏まえニューロトロフィンの受容体で代表的な低親和性受容体(p75)と高親和性受容体(trk)の遺伝子欠損マウスも購入していく予定である。
オートファジー機能異常による心不全発症機構を制御標的とする創薬をめざした研究

本研究では、心不全の発症および病状進展に深く関わっているオートファジーの機能不全はBeclin1の賦活化により改善させることが可能であることを踏まえて、Beclin1を活性化できる新規化合物による心不全治療法を確立することを目的とした研究を行った。Beclin1のBH3ドメインに結合しうるBcl-xLのHis117周囲の構造に類似した、Beclin1とBcl-2/xLのタンパク質間相互作用を標的とした阻害低分子化合物を複数見出したが、そのうちのひとつの低分子化合物Xが効果的にBeclin1とBcl-2/xLのタンパク質間相互作用を阻害しオートファジーを効果的に促進する作用があることを見出した。疾患モデルを用いて評価する実験に使用するTg-Beclin1(Tet-on)マウスの導入が遅れたために繰越(翌債)を必要としたが、研究計画の遅れを取り戻すことができた。デスミン心筋症マウスモデルである心筋特異的点変異(R120G)α-βクリスタリン過剰発現マウス(Tg-CryAB-R120G)とTg-Beclin1(Tet-on)マウスを交配させて、テトラサイクリン投与によりBeclin1の活性を上昇させることでオートファジーが賦活化され、心筋内のアグリソームが除去されて心機能が改善するかどうかについて検討した。具体的には、テトラサイクリン投与6週間後に心機能や血行動態を評価して屠殺し、心筋の病理学的変化につき評価した。血中バイオマーカーも評価を行った。Beclin1を賦活化することでオートファジーを活性化することが不全心筋における蛋白品質管理を改善して心機能の改善につながるのではないかと想定し、そのような低分子化合物の取得を目指してBcl-xLのHis117周囲の構造に類似した化合物を化合物ライブラリーから探索した。具体的には、Beclin1のBH3ドメインに結合しうるBcl-xLのHis117周囲の構造に類似した化合物を予測して収集したフォーカスライブラリーからin silicoスクリーニングを経てin vitroにおけるBeclin1のBH3ドメインに対する結合性について表面プラズモン共鳴法および3Hにより標識した低分子化合物を用いた結合アッセイにより検討し、候補となる分子を複数見出した。平成28年度は平成27年度の遅れを取り戻して本研究応募時の申請書に記載した研究計画通り、順調に計画が進行している。デスミン心筋症のモデルマウスである低分子ストレスタンパク質α-βクリスタリン(CryAB)の点変異タンパク質CryAB (R120G)を心筋細胞特異的に発現させたトランスジェニックマウスTg-CryAB(R120G)マウスとTg-Beclin1(Tet-on)マウスを交配させて、テトラサイクリン投与によりBeclin1の活性を上昇させることでオートファジーが賦活化され、アグリソームが除去されて心機能が改善するかどうかについて検討した。具体的には、テトラサイクリン投与6週間後に血圧・脈拍・心機能評価を行い屠殺し、心筋の病理学的変化につき免疫染色法などを用いて検討した。心機能については心エコーにて経時的に観察し、最終的には観血的に左室内圧曲線を求めて、収縮・拡張機能を測定した。血漿BNP値など血中バイオマーカー測定による評価も行った。Beclin1を賦活化することでオートファジーを活性化することが不全心筋における蛋白品質管理を改善して心機能の改善につながるのではないかと想定し、そのような低分子化合物の取得を目指してBcl-xLのHis117の構造を模した化合物を東京医科歯科大学医療機能分子開発室の有する化合物ライブラリーから探索した。具体的には、Beclin1のBH3ドメインに結合しうるBcl-xLのHis117の構造を模した化合物を予測および収集したフォーカスライブラリーから、in silicoスクリーニングを経て、in vitroにおけるBeclin1のBH3ドメインに対する結合性について表面プラズモン共鳴法および3Hにより標識した低分子化合物を用いた結合アッセイにより検討し、候補となる分子を複数見出した。昨年度はやや遅れていたが、本年度はその遅れを取り戻して本研究応募時の申請書に記載した研究計画通り、順調に計画が進行している。Beclin1のBH3ドメインに結合しうるBcl-xLのHis117周囲の構造に類似した、Beclin1とBcl-2/xLのタンパク質間相互作用を標的とした阻害低分子化合物を前年度までに複数見出したが、の有効性について、クロロキンやBafilomycin A1などオートファジー阻害剤を添加した培養心筋細胞を用いて検証した。具体的には、細胞生存率、アグリソームの定量、長寿命蛋白分解アッセイ、脂質キナーゼ活性測定の4つの指標を用いて新規低分子化合物の効果判定を行った。その結果、ひとつの低分子化合物Xが効果的にBeclin1とBcl-2/xLのタンパク質間相互作用を阻害し、オートファジーを効果的に促進する作用があることをみいだした。この低分子化合物Xのin vivoにおける有効性について、心不全モデルマウス(圧負荷モデルマウス)を用いて検討した。6週間後に血圧・脈拍・心機能評価を行い屠殺し、心筋の病理学的変化につき電子顕微鏡、免疫染色法やウエスタンブロッティング法を用いて検討した。心機能については心エコーにて経時的に観察し、観血的に左室内圧曲線を求めて収縮・拡張機能を測定した。血漿BNP値測定による評価も行った。

その結果、低分子化合物Xは心不全モデルマウスにおいて、非投与の心不全モデルマウスと比較して有意に心機能の低下や心不全の悪化を抑制することが判明した。また、低分子化合物Xはin vivoモデルにおいてもオートファジーを効果的に促進することを確認した。今後は、デスミン心筋症心不全モデルマウスや心筋梗塞モデルマウスでも同様の事象が確認できるかどうか検討する予定である。本研究では、心不全の発症および病状進展に深く関わっているオートファジーの機能不全はBeclin1の賦活化により改善させることが可能であることを踏まえて、Beclin1を活性化できる新規化合物による心不全治療法を確立することを目的とした研究を行った。Beclin1のBH3ドメインに結合しうるBcl-xLのHis117周囲の構造に類似した、Beclin1とBcl-2/xLのタンパク質間相互作用を標的とした阻害低分子化合物を複数見出したが、そのうちのひとつの低分子化合物Xが効果的にBeclin1とBcl-2/xLのタンパク質間相互作用を阻害しオートファジーを効果的に促進する作用があることを見出した。今後も本研究応募時の申請書に記載した研究計画に沿った研究を継続していく方針である。29年度が最終年度であるため、記入しない。循環器内科学29年度が最終年度であるため、記入しない。