hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精度保証付き数値計算法を用いた反応拡散系の大域解の解析

本研究である「精度保証付き数値計算を用いた反応拡散系の大域解の解析」にはできる限り長い時間において解が検証できる手法を考察する必要がある.そのため今年度はその手法構築のための準備段階として「定数評価」をメインに研究した.精度保証付き数値計算法では計算されてでてきた値によって解の検証が成功するかしないかが決まってしまう.そのためただ上界を得るためだけの粗い評価式を提案するだけでは不十分であり,できる限り定数の上限値または下限値を計算できるようにうまく評価式を構築する必要がある.さらに境界条件や領域の滑らかさなどがその値を求める評価式の構築達成をより困難にしてしまうことも多々ある.よって対応する問題に応じて「定数評価」をどう構築し,上限(または下限)に近い値を計算できるようにするか考察することが重要となる.当該年度においてソボレフの埋め込み定数の値の評価を考察することにより「精度保証付き数値計算を実行に移す際に必要な「Lipschitz定数」の値を計算するための公式を提案した.まずは有界凸領域上の定数を算出する公式を提案した.さらにそれを応用することで色々な境界条件や領域の滑らかさに対してもそのLipschitz定数が計算できるようにした.そして反応拡散系の解と近似解との誤差評価を求めるのに必要な熱方程式の解と半離散近似解との誤差評価式を考えた.これまでも半離散近似解との誤差評価式は提案されてきたが,楕円型方程式の性質をうまく使えば先行研究で提案された評価式よりも誤差上限に近い値をだせることがわかった.現在はその誤差評価式の成果についてまとめているところである.当初の目的のとおり,少なくとも最初の2年は反応拡散系の精度保証付き数値計算法の解の精度保証付き数値計算法の構築に伴い,できる限り長い時間の解の存在検証ができる手法を生み出すための検討期間に割り当てる予定である.現状はその準備段階として精度保証構築するために必要な厳密な評価式を提案できた.さらに既存の常微分方程式の解の検証法との手法を組み合わせてかつその評価式を駆使することで,解の精度保証付き計算法の具体的道筋が見え始めてきた.よって今のところは順調である.上述の通り引き続き反応拡散系の精度保証付き数値計算法の解の精度保証付き数値計算法の構築に伴い,できる限り長い時間の解が検証できる手法を生み出すための検討期間に割り当てる予定である.その準備段階の誤差評価式は構築できたので次は実現可能な手法を形作りたい.具体的には有限次元部分と無限次元部分に分けて実装していく.有限次元部分は既存の常微分方程式の解の精度保証法を用いて長い時間の解を検証していき,無限次元部分は当該期間で構築した誤差評価式を使い検証をしていく.しかし有限次元部分における常微分方程式の解の検証の問題は既存の手法では検証が難しいタイプのものとなっており,この点を克服することを視野に色々手法を検討していきたい.本研究である「精度保証付き数値計算を用いた反応拡散系の大域解の解析」にはできる限り長い時間において解が検証できる手法を考察する必要がある.そのため今年度はその手法構築のための準備段階として「定数評価」をメインに研究した.精度保証付き数値計算法では計算されてでてきた値によって解の検証が成功するかしないかが決まってしまう.そのためただ上界を得るためだけの粗い評価式を提案するだけでは不十分であり,できる限り定数の上限値または下限値を計算できるようにうまく評価式を構築する必要がある.さらに境界条件や領域の滑らかさなどがその値を求める評価式の構築達成をより困難にしてしまうことも多々ある.よって対応する問題に応じて「定数評価」をどう構築し,上限(または下限)に近い値を計算できるようにするか考察することが重要となる.当該年度においてソボレフの埋め込み定数の値の評価を考察することにより「精度保証付き数値計算を実行に移す際に必要な「Lipschitz定数」の値を計算するための公式を提案した.まずは有界凸領域上の定数を算出する公式を提案した.さらにそれを応用することで色々な境界条件や領域の滑らかさに対してもそのLipschitz定数が計算できるようにした.そして反応拡散系の解と近似解との誤差評価を求めるのに必要な熱方程式の解と半離散近似解との誤差評価式を考えた.これまでも半離散近似解との誤差評価式は提案されてきたが,楕円型方程式の性質をうまく使えば先行研究で提案された評価式よりも誤差上限に近い値をだせることがわかった.現在はその誤差評価式の成果についてまとめているところである.当初の目的のとおり,少なくとも最初の2年は反応拡散系の精度保証付き数値計算法の解の精度保証付き数値計算法の構築に伴い,できる限り長い時間の解の存在検証ができる手法を生み出すための検討期間に割り当てる予定である.現状はその準備段階として精度保証構築するために必要な厳密な評価式を提案できた.さらに既存の常微分方程式の解の検証法との手法を組み合わせてかつその評価式を駆使することで,解の精度保証付き計算法の具体的道筋が見え始めてきた.よって今のところは順調である.上述の通り引き続き反応拡散系の精度保証付き数値計算法の解の精度保証付き数値計算法の構築に伴い,できる限り長い時間の解が検証できる手法を生み出すための検討期間に割り当てる予定である.その準備段階の誤差評価式は構築できたので次は実現可能な手法を形作りたい.具体的には有限次元部分と無限次元部分に分けて実装していく.有限次元部分は既存の常微分方程式の解の精度保証法を用いて長い時間の解を検証していき,無限次元部分は当該期間で構築した誤差評価式を使い検証をしていく.

しかし有限次元部分における常微分方程式の解の検証の問題は既存の手法では検証が難しいタイプのものとなっており,この点を克服することを視野に色々手法を検討していきたい.今年度は精度保証の手法を構築する足掛かりを見つけるうえで必要になりそうなあらゆる分野の書物や思いついた手法を実装するテスト用の高性能なpcを購入する予定であった.色々検証を重ねた結果,その有力候補として常微分方程式の精度保証を用いる方法に注目することとなった.そのため今年度はその常微分方程式の手法に対する書物に集中し,かつその常微分方程式の精度保証の実装は既存のpcでできたため,購入予定だった他の分野の書物やpcの購入を一旦保留とした.しかし,現在では手法構築の過程でその書籍やより高度な実装用のpcが必要になる可能性が再度でてきたため,必要になったとき手に入れられるように次年度に繰り越すことを決めた.よって研究段階に今のところ大きな支障はない.
大規模分散処理環境を革新する「フロントエンドコンピューティング」パラダイムの創出

大規模分散処理環境のフロントエンドコンピューティングコンセプトによる加速処理の一例として、Memccachedのネットワーク・インタフェースによる高速化手法とそのハードウェア化に取り組み、ソフトウェアに比べて最大3.5倍の性能向上を確認した。また、別の一例として、近似最近某探索アルゴリズムLSHに着目し、その一つであるExact Euclidean Locality Hashingのハードウェア向けアルゴリズムへの改良とそのハードウェア化に取り組み、ソフトウェアに比べて1/9のレイテンシ短縮と約25倍のスループット向上を確認した。今年度は、MemcachedのNIC Cacheによる高速化手法の改良とハードウェア実装を中心に研究に取り組んだ。Memcachedは大規模データセンターなどでウェブサーバの応答を高速化するために用いられるデータベース技術であり、昨年度はMemcachedサーバのデータと処理の一部を同じサーバのNetwork Interface Card(NIC)においてキャッシュすることでMemcachedを高速化するシステムの有効性をソフトウェアシミュレーションにより検証した。今年度の課題は、1NIC上のキャッシュ容量が小さい問題を解決することと、2ハードウェア実装を行うことの2点であった。1の問題は、FPGA上のハッシュテーブルを実装するためのBlock RAMの容量が少ないことが原因であった。そこでハッシュテーブルに保持するタグの幅を減らすことでハッシュテーブルのエントリ数を増やし、同容量のBlock RAMでキャッシュ容量を増やす方法を考案した。また2の問題に関してはFPGA搭載NIC上に実装を進め、通常のソフトウェアによるMemcachedと比較して最大3.5倍のレイテンシ改善を達成した。FPGA搭載NICは、20Gbpsのネットワークインタフェース、FPGA(Virtex-5)、1GBのDRAMメモリ、そして20GbpsのPCI Expressを備えたものである。また、NIC CacheのアーキテクチャをMemcached以外のアプリケーションに応用することを目指し、二つのアルゴリズムの処理アーキテクチャを検討した。一つはLocality Sensitive Hashing (LSH)と呼ばれる近傍探索アルゴリズムで、高速な画像検索に応用されている。もう一つは頻出アイテムセットのためのデータストリームマイニング(DSM-FI)と呼ばれるアルゴリズムで、購買履歴の分析などに用いられている。近年研究されている近似最近傍探索アルゴリズムLocality-Sensitive Hashing(LSH)に着目し、その一つであるExact Euclidean Locality-Sensitive Hashing(E2LSH)を元に、ハードウェア指向LSHアルゴリズムへと改良した。本研究で提案するアルゴリズムの特徴として、二重ハッシングとセットアソシアティブ方式を取り入れた「限定動的テーブル」というデータ構造を用いている。これにより限られたハードウェア資源をうまく使うことができ、実装が容易になった。アルゴリズムの精度としてRecall率を計測したところ、E2LSHと同様のテストにより、約82%を達成している。また、この改良アルゴリズムに基づくハードウェアアーキテクチャを提案した。提案するアーキテクチャでは、Liner Feedback Shift Register(LFSR)と、中心極限定理を用いて、回路内部で乱数を生成する方法を取った。これによりメモリ使用量を抑えつつ複数の乱数列を生成することが出来た。またパイプライン化により、データストリームを止めること無く処理することが可能になっており、高速なアーキテクチャといえる。結果として、CPUに比べ、レイテンシは1/9に短縮、スループットは24.4倍に増加させることが出来た。Memcachedに関して、計画通り、フロントエンドコンピューティングのアーキテクチャを明確化し、かつこれをFPGA搭載NIC上で実機動作させることができた。また、次年度に向けて、他のフロントエンドコンピューティングターゲット応用の検討を進めることができた。離婚フィギュラブルシステム次年度はMemcachedにおいて有効性を検証したNIC Cacheによるサーバアプリケーション高速化手法を汎用的に昇華させた「フロントエンドコンピューティング」に向けて、現在アーキテクチャ検討段階にあるLSHおよびDSM-FIの両アルゴリズムをFPGA搭載NICに実装し、有効性を検証する。基盤となるFPGA評価環境は前年度に引き続きグリーンプラットフォーム研究所から貸与頂く予定である。LSHは、類似したデータが近いハッシュ値となるハッシュ法であり、その特性から大量のデータを高速に分類できるため、ビッグデータの処理に応用できる。これまでにもLSHをハードウェア実装し活用する研究は存在したが、特定のアプリケーションを想定して、決まった入力データを効率良く演算するよう演算部を最適化されていた。したがって、特定の形式の入力データでしか使用できず、他のデータ形式に対応することが困難である。このような問題を解決するため、用途によって変わる様々な次元の入力データに容易に対応できる拡張性を持つLSHをNIC Cacheによって高速化する。DSM-FIはオンラインデータマイニングにおける最も重要で基礎的な課題の一つである。既存手法では多くのメモリアクセスを必要とするため、CPUでの処理において、メモリアクセスがボトルネックになりがちである。この課題の解決を目指しFPGAを用いて頻出アイテムセットマイニングをNIC Cacheを用いて高速化を行う。初年度は手持ちの物品で研究を進められることが予定より多かったため、若干の次年度使用額が生じた。次年度は、FPGA評価環境の充実により研究費を投入し、研究の加速に役立てていく所存である。
脳科学を応用した疼痛関連SNP解析技術の確立

手根管症候群で母指と中指刺激で体性感覚誘発脳磁場の推定電流源間距離は短いことが認められた。正中神経の2連続刺激により得られるSEFの回復曲線は手根管症候群で早期の回復が認められ、感覚皮質での抑制的神経活動が減少していることが示唆された。coherence解析で島皮質での周波数対応に差が認められ、脳内の接続性異常を検出することが可能になった。同様にCRPS患者においてVASと皮質間coherence値の相関を解析し、帯状回および島皮質、前頭葉などでVAS値とcoherenceが高い負の相関を示し、脳内の接続性異常を検出した。これらの検出結果と生化学的な結果についての相関解析を行った。上肢疼痛患者の脳皮質領域の活動を抽出し、異常感覚が生じる病態を明らかにすることを目的とし、手根管症候群患者に対し、手術前、手術後6か月において脳機能解析を行った。手根管症候群患者は患側の正中神経を手関節部で電気刺激し体性感覚誘発脳磁場を計測した。単発刺激に加え10,40,80,200msの刺激間隔の2発刺激により誘発された体性感覚誘発脳磁場より刺激後20msに出現する体性感覚誘発脳磁場成分(N20m)の振幅の回復曲線を算出し、年齢対照群と比較した。また感覚関連皮質相互の波の伝播を観察するため、刺激後0300msの間に生じた脳磁場について、感覚関連皮質間の連関を周波数帯域別にcoherence分析を用い数値化した。2連続刺激により得られる体性感覚誘発脳磁場の回復曲線は手根管症候群患者で早期に回復しており、感覚皮質での抑制的神経活動が減少していることが示された。手根管症候群患者は正中神経の皮膚感覚支配領域からの感覚入力が障害され、対応する皮質受容野内での機能構築が不明瞭となった。母指および中指の皮膚電気刺激によって得られる体性感覚誘発脳磁場の推定電流源間距離は手根管症候群患者で年齢対照群より短かかった。さらに波の伝播は、1次、2次体性感覚野、島皮質、前帯状皮質などでの周波数対応に対象群との差が認められた。脳内の感覚野や感覚関連野の自発性皮質活動に変化が生じていた。感覚皮質の機能変化は、異常な感覚や痛みが持続する病態を示している可能性があると考えられる。手根管症候群患者における脳機能解析を中心に順調に症例登録がすすんでいる。手根管症候群、疼痛患者、切断患者を中心に脳機能解析を行い、症例が蓄積されてきている。論文も作成した。今年度も複合性局所疼痛症候群、切断患者、手根管症候群などの神経障害患者などを中心に脳機能解析を行った。複合性局所疼痛症候群では対象とし安静閉眼時の脳波と脳磁図を測定した。脳磁図は研究実施機関(160チャンネル軸型脳磁計・名古屋大学)、脳波は国際10-20法・単極19誘導にて測定した。30秒間の脳活動記録について144の皮質小領域(Destrieux atlasによる)に分割した大脳皮質各部位の皮質時系列活動を推定した後、活動関連指数としてα帯域(9-12Hz)の皮質間脳活動のコヒーレンス(coherence)値を算出した。複合性局所疼痛症候群の臨床症状評価指数には疼痛のVisual Analogue Scale(VAS)用いた。患者と同年代の健常者(VASは0)からも同様に脳活動を記録し、患者と健常者を含めた測定群においてVASと皮質間coherence値の相関を解析した。脳波と脳磁図いずれにおいても、帯状回周囲と島皮質の神経活動連関指数が自覚的疼痛および複合性局所疼痛症候群の臨床重症度指数に相関を示した。脳波記録による結果は脳磁図記録による結果よりも計測値と相関のばらつきが大きかったものの、同様な結果を示した。このことからEEG記録と解析は、一般臨床施設で利用可能な複合性局所疼痛症候群の客観的かつ汎用性のある評価方法となりうると考えられた。機能MRIでは患者群は、側坐核ー海馬傍回、内側前頭前野ー脳幹部、角回ー脳幹部、外後頭皮質ー脳幹部、中側頭回ー小脳の機能的結合に変化が生じているなど機能的結合の特徴を見い出すことができた。引き続き症例登録を行い解析を行っていく。引き続き症例登録を行うとともに、難治例や治療抵抗例などの原因に対して統計解析も行っていく。整形外科以前に購入した試薬がまだ使用可能であったため、こちらを使用しているので物品用の費用が少なめになった。来年度試薬などが無くなり次第、物品購入にあてていく。
ナノ構造支援表面レーザーイオン化によるグリコプロテオームのブレークスルー

マトリックス補助剤を必要としないレーザー脱離イオン化のために開発したサブミクロンレベルの凹凸を形成した多孔アルミナの表面を金属で被覆した構造をもつ試料板について、その表面金属の役割を初年度に明らかにした。その成果を論文として発表するために、低分子を中心に糖、アミノ酸、脂質のデータを積み上げる一方で、この試料板が他の類似ナノ構造試料板と対比して優れた点であるクンパク質のイオン化についても、質量2万を超えるトリプシノーゲンの他、糖タンパク質であるリボヌクレアーゼBのデータを取得した。リボヌクレアーゼBについては、その高マンノース型糖鎖のプロファイルを忠実に再現する相対イオン強度で検出できることがわかった。以上の成果をもって、Analytical Chemistry誌に論文を掲載した。続いて、多孔アルミナ層の役割について研究を行った。試料板を60°C、120°C、280°Cで加熱すると温度依存性にイオン化性能を失うことを見出した。このことから、アルミナ表面に吸着している水分子がイオン化(=プロトン付加)に関与することがわかった。さらに、試料の溶媒に酸を加えることがイオン化を改善しないという、MALDIやDIOSなどと異なる点を明らかにした。後者の所見もアルミナ表面の水がプロトン源となっていて、従来から考えられていた試料添加前の溶液においてすでに存在しているイオンpreformed ionsが脱離するのではないことを明らかにした。すなわち、多孔アルミナ層において、露出するアルミナ面が広いほどイオン化性能が高いと推測されたので、細孔形態を工夫して露出面積を大きくしたところ、予想通りに性能を向上することができた。今後、薬物血中濃度の迅速定量や糖鎖解析など応用面での展開を計画しているが、この特異な試料板の基本情報を2年間の研究において得ることができた。(研究協力者:首都大学東京益田秀樹教授;神奈川科学技術アカデミー柳下崇研究員)ペプチドについて良好なマススペクトルを得ることを条件に、ナノサイズ多孔アルミナの細孔周期200-500nm、細孔深さ60nm-1μm、細孔径85-310nm、表面金属蒸着厚5-200nm、さらに蒸着する金属種について系統的に調べた。このようなナノ構造試料板上にアンギオテンシンIをマトリックスを加えることなく直接に塗布し、337nm窒素レーザーを用いた真空内レーザー照射によるイオン化で得られるシグナル強度あるいはシグナル近傍でのSN比を照射レーザー強度に対してプロットした。設定した構造範囲において、イオン化に必要なレーザー強度の閾値(下限値)はporosityに反比例し、検出されるプロトン付加分子のイオン量(あるいはSN)も同様の傾向であった。337nmレーザーに対して特異的な応答を示す構造はなかった。細孔深さについては60nmよりも180nm以上の深さで良好なマススペクトルを得た。また、蒸着する白金厚が薄い5nmあるいは20nmでは、イオンを検出できるレーザー強度閾値が低い一方で、白金厚50nm以上の試料板で見られるようなレーザー強度上昇につれてのイオン強度、SNの改善はなかった。白金をさらに厚く200nmにすると、イオンを観察できるレーザー強度閾値が上昇した。蒸着厚50nmにおいて金属種を変えたところ、白金と金では適度なレーザー強度範囲では同等のマススペクトルを得たものの、金は高いレーザー強度においてSN低下とイオン量の減少が目立った。タンタルは高いレーザー強度を必要とした。パラジウムはかろうじてペプチドをイオン化できたが、ニッケル、コバルト、モリブデンはできなかった。これらの結果から、porosityとイオン量の関係から、ナノ構造上面の平坦部分に存在する試料分子がイオンとなって検出されることが示唆され、また、イオン化に必要なレーザー強度閾値と構造や金属種との関係から、蒸着金属の融解がイオン化に関わるのではないかと考えられた。また、レーザー照射面における温度上昇と熱拡散がイオン化性能に関係すると推測された。

すなわち、多孔アルミナ層において、露出するアルミナ面が広いほどイオン化性能が高いと推測されたので、細孔形態を工夫して露出面積を大きくしたところ、予想通りに性能を向上することができた。今後、薬物血中濃度の迅速定量や糖鎖解析など応用面での展開を計画しているが、この特異な試料板の基本情報を2年間の研究において得ることができた。(研究協力者:首都大学東京益田秀樹教授;神奈川科学技術アカデミー柳下崇研究員)
環境汚染物質の神経毒性に関する生化学的研究

神経系に毒性を有する各種薬物は、その主な作用部位により幾つかのグループに分けることが出来る。各群の代表的な薬物につきモデル系を作成し、その作用機構をin vivoで解析し、以下の結果を得た。1.コルヒチンの神経毒性コルヒチンは微小管の構成蛋白であるチューブリンの輸送のみを選択的に阻害する。この阻害作用はチューブリンが細胞体から軸索へと積みだされる所にのみ作用すると考えられる。この作用機構につき更に検討を加えつつある。2.β,β-イミノジプロピオニトリル(IDPN)による神経障害:IDPNはニューロフィラメント(NF)構成蛋白の輸送のみを阻害する。この時NF蛋白の合成は阻害されないため軸索起始部にNFが蓄積する。IDPNを投与した直後にNF輸送は1週間たらず完全停止し、その後対照の約1/2の遅い速度で再び動き出し、約6週間後に正常の速度に回復する。IDPNの阻害作用には1.0g/kg体重付近に閾値があり、それ以上3.0g/kgまで投与量を増やしても阻害作用は変わらない。しかし投与総量は2.0g/kgであってもそれを一時期にではなく、1.0+0.5+0.5g/kgに分けて4日おきに投与すると一回で投与した場合に比べて阻害効果が増強される。投与間隔を1週間或は2週間にすると加算効果は殆ど見られない。この結果からもIDPNの投与直後にはNF輸送の完全停止期間があり、その長さは4日よりは長く、1週間よりは短いという推定が支持される。3.アクリルアミドによる神経障害:アクリルアミド中毒ラットでは遅い速度で輸送される蛋白の輸送速度が、同じ週齢の対照に比べて加速されている事を見出した。しかしこの変化はアクリルアミドによる直接作用によるものではないと思われるので、その直接作用を知るべく大量投与直後の軸索内輸送変化につき現在解析を進めつつある。
ヒト胃癌細胞におけるEts-1前癌遺伝子発現の検討

前年度の本研究ではEts-1の胃癌細胞への局在、特に癌の浸潤能との関連性を見出した。癌細胞の浸潤能の獲得にmatrix metalloproteinaseのひとつであるMMP-1の発現が重要であることが示唆されているが、Ets-1はMMP-1の転写調節因子である。本年度はEts-1の上皮細胞への局在と癌浸潤能との関連の普遍性を検討するために、ヒト大腸癌組織におけるEts-1の発現を免疫染色で検討し、さらに癌浸潤関連因子であるMMP-1の発現と比較した。大腸癌142例中108例(76.1%)にMMP-1の発現を癌細胞に認めた。一方、20例の大腸腺腫全例が陰性であった。浸潤癌に比べ粘膜内癌では有意に発現率は低かった。浸潤癌の中で、MMP-1免疫活性は腫瘍の深達度、腫瘍発育形態、リンパ管侵襲、静脈侵襲、神経浸潤、リンパ節転移、肝転移、とDukes分類の高いステージと有意な相関を認めた。これらの傾向はEts-1の発現と類似していた。MMP-1の局在は免疫染色において癌細胞とその周囲の間質細胞に認めたが、癌細胞へのMMP-1発現を確認するため、MMP-1オリゴプローブを用いin situ hybridizationを行い、またヒト大腸癌由来培養細胞より抽出したRNAを用いたRT-PCRにより、癌細胞へのMMP-1発現を転写レベルで確認した。以上の結果は、MMP-1発現は大腸癌において腫瘍浸潤および転移に何らかの機能を有することを示している。Ets-1発現は胃癌のみならず大腸癌細胞へも局在し、MMP-1の免疫活性と類似していて、MMP-1転写活性による浸潤能との関連性が示唆される。胃癌110例と胃腺腫10例を用いてEts-1の免疫組織化学を行い、陽性率を種々の組織学的パラメーターにより検討した。Ets-1免疫活性は胃腺癌の70例(63.6%)に陽性であったのに対し、非腫瘍部粘膜や腺腫では全て陰性であった。胃癌においてEts-1発現は腫瘍細胞の胞体内と核にみられ、陽性率は粘膜内癌で3/26(11.5%)であるのに対し、粘膜下層以下の浸潤癌では67/84(79.8%)と有意(p<0.001)に高かった。組織学的分化度では乳頭状腺癌が6/13(46.2%)、高分化管状腺癌が12/26(46.2%)、中分化管状腺癌が23/27(85.2%)、充実性低分化癌が11/14(78.6%)、非充実性低分化癌が12/13(92.3%),印環細胞癌が2/10(20.0%)、粘液癌が4/7(57.2%)と、中・低分化癌に比し高分化型および印環細胞癌、粘液癌に比較的発現が弱かった。リンパ節転移の有無でみた原発巣の陽性率は、有る症例で34/41(82.9%)であるのに対し、無い症例で26/56(46.4%)と有意差を認めた(p<0.001)。Ets-1特異的オリゴプローブを用いたIn situ hybridizationにおいて、免疫染色同様癌細胞内にシグナルを認め、さらにヒト胃癌培養細胞(MKN-1、MKN-45、KATO-III、NUGC-1)を用いたRT-PCRで、全ての株でEts-1の特異的バンドが検知でき、転写レベルでもEts-1の胃癌細胞における産生を確認できた。以上の結果より、胃上皮細胞におけるEts-1の過剰発現と癌化、特に腫瘍浸潤とリンパ節転移に密接な関連のあることが示唆される。Ets-1は間葉系細胞に発現する転写活性因子としての細胞の分化・成熟、増殖に作用することが示唆されていたが、本研究ではEts-1の上皮細胞への局在、特に癌の浸潤能との関連性を見出した。MMP-1の局在は免疫染色において癌細胞とその周囲の間質細胞に認めたが、癌細胞へのMMP-

1発現を確認するため、MMP-1オリゴプローブを用いin situ hybridizationを行い、またヒト大腸癌由来培養細胞より抽出したRNAを用いたRT-PCRにより、癌細胞へのMMP-1発現を転写レベルで確認した。以上の結果は、MMP-1発現は大腸癌において腫瘍浸潤および転移に何らかの機能を有することを示している。Ets-1発現は胃癌のみならず大腸癌細胞へも局在し、MMP-1の免疫活性と類似していて、MMP-1転写活性による浸潤能との関連性が示唆される。
プレーナ型磁性ナノ構造の作製と磁化反転の制御

プレーナ型磁性ナノ構造の作製方法の確立、ナノ磁性構造における磁気特性の制御方法の確立、及びプレーナ型磁性ナノ構造における通電電流による磁化反転制御の検証を実施した。その結果、磁性ナノ構造の作製に、原子間力顕微鏡(AFM)を用いたナノリソグラフィが有効であることを明らかにした。また、作製した磁性ナノ構造において、通電電流による磁化反転や狭窄化による磁気抵抗効果の観測に成功した。プレーナ型強磁性トンネル接合を作製し、そのスピン移行効果に伴う磁気特性を明らかにすることを研究目的とした。研究期間内に(1)プレーナ型強磁性トンネル接合の作製方法の確立(2)(1)に関連して原子間力顕微鏡(AFM)を用いた新しいナノリソグラフィ技術の確立とナノ磁性構造における磁気特性の制御方法の確立(3)プレーナ型強磁性トンネル接合におけるスピン移行効果の検証と物理的考察を実施することにより、3端子デバイスの適用を含めたプレーナ型強磁性トンネル接合の利点を明らかにすることを目指す。平成19年度は上記(1)の研究に関して、以下のような研究成果を得た。電子線蒸着法により成膜したNiFe薄膜を、フォトリソグラフィとドライエッチングを組み合わせ、細線状に加工した試料を作製した。基板にはSiO2/Siを用いて、NiFeの膜厚は2、4、8、10、20nmとした。原子間力顕微鏡(AFM)を用いた陽極酸化法により、NiFe細線を横切るようにNiFe酸化物ナノワイヤを作製し、NiFeの孤立部を形成することに成功した。この孤立部の磁区構造を磁気力顕微鏡(MFM)で観察し、その通電電流による磁化反転を観測するための試料構造を作製できる状況に到達した。また、NiFe酸化物ワイヤがNiFe薄膜の底面まで到達した際には微小プレーナ型2重強磁性トンネル接合が作製できるが、電流電圧特性の測定から、ダイオード特性を観測するに至った。今年度のこれら成果は次年度にスピン移行効果の実験を実施する上で、十分なものであり、所期の計画に基づいた研究が遂行されると期待される。平成20年度は上記(2)の研究に関して、以下のような研究成果を得た。○作製したプレーナ型強磁性トンネル接合の電流電圧特性の評価から、トンネル障壁が形成されていることを確認するとともに、プレーナ型ナノ構造素子の磁気抵抗効果の測定から、磁性ナノ構造の作製を反映した磁気抵抗効果を観測した。○磁化方向に影響を与える要因は外部からの印加磁界の他に磁気異方性がある。応用上、磁化方向となり易い磁化容易軸を設定することが多い。磁性ナノ構造における磁化容易軸の方向をAFM局所酸化加工により制御することを試み、磁気力顕微鏡(MFM)により観測した磁区構造から磁化方向を制御できることを検証した。最終年度である次年度にスピン移行効果の実験を実施する上で、今年度のこれら成果は十分なものであり、所期の計画に基づいた研究が遂行されると期待される。1.NiFe系微小プレーナ型2重強磁性トンネル接合の作製・評価電流電圧特性測定のための電極パッドに囲まれた領域にパターニング加工したNiFe薄膜を形成し、原子間力顕微鏡(AFM)を用いた局所酸化加工により、微小トンネル接合を作製することに成功した。2.フォトリソグラフィとAFMナノリソグラフィの併用によるNiFe細線の狭窄化フォトリソグラフィによりパターニングしたNiFe薄膜を基盤としたNiFe/NiFeO系微小プレーナ型2重強磁性トンネル接合を作製し、さらにAFMを用いたレジストスクラッチ・リソグラフィを施し、100nm200nm幅のNiFe細線狭窄化構造を作製した。AFMを用いてNiFe薄膜上に塗布したフォトレジストをスクラッチして、その後、ドライエッチングする微細加工方法に加え、NiFe薄膜を直接スクラッチして狭窄化する微細加工方法に関しても加工技術を確立した。両方法ともに探針圧や探針走査速度等の加工パラメータを最適化できた。これらの併用によりナノ構造デバイスの作製が可能であることを示した。3.プレーナ型強磁性トンネル接合及び狭窄化構造の磁気抵抗効果の測定2.で作製した狭窄化した磁性ナノ構造の電気的特性、及び磁気抵抗効果特性を評価した。

測定には極低温プローバを使用して17Kから室温までの測定を行ったところ、狭窄部分の磁壁の閉じ込め効果に起因した磁化反転過程での顕著な変化が観測できた。
心筋線維化抑制による心筋リモデリング心不全進展予防の試み

過剰な心筋線維化は高血圧心の心機能を阻害する。本研究ではTGF-βの心筋リモデリングと心機能障害における役割を、圧負荷ラットモデルを用いて検討した。Wistarラットにおいて腎動脈直上で大動脈を縮窄し、圧負荷ラットモデルを作成した。線維芽細胞の活性化(増殖および筋線維芽細胞への形質転換)は、術後3日目より7日をピークに認められ、その後心筋細胞肥大と心筋線維化が進展した。28日目に心エコー図法を用いて心機能を評価したところ、左心室のfractional shortningは正常であったが、左室流入波形のE/A比の低下が認められた。また左室拡張末期圧の上昇も認められた。即ち収縮機能は正常だが拡張機能低下所見が認められた。心筋TGF-βmRNA発現は第3日以降認められ、7日をピークとして28日目まで上昇が認められた。TGF-β中和抗体を縮窄手術前日腹腔内投与すると、線維芽細胞の活性化が阻害され、コラーゲンmRNA発現と心筋線維化が予防された。しかしながら心筋細胞肥大には効果が見られなかった。中和抗体は血圧と収縮能に影響を及ぼすことなく拡張機能障害を改善した。TGF-βは、圧負荷心において線維芽細胞活性化を通じ、心筋線維化と拡張障害に重要な役割を果たしている。本研究は、圧負荷心における心筋線維化と拡張障害を予防するための新たな治療戦略に有用な示唆を与えるものであり、研究結果を現在投稿中である。今後はこの結果を踏まえ、ヒト可溶性T βRll-lgGキメラ遺伝子を実際に導入し、心筋線維化・心筋肥大に及ぼす効果を検討する予定である。1.可溶性TβRII-IgGキメラ遺伝子組換えHVJ-リボソームの作成ヒト可溶性TβRIIのcDNA3'末端にヒトIgGのFc部分を結合させたキメラ遺伝子をPCR法により作成した。当初キメラ遺伝子をpCDMに組換えたが、このプラスミドではリポフェクション法によるヒト培養線維芽細胞への導入・筋注法によるラット下肢筋肉内への導入ともに効率がきわめて悪く発現が低いことから、現在、発現効率の良いプラスミドに新たに組換えを行っている。今後、導入効率の良いコンストラクトを用いて、ラット胎児心筋培養細胞・心筋線維芽培養細胞あるいはラット下肢筋肉内への導入を行う。2.圧負荷ラットモデルの作成ラット大動脈を縮窄し、著しい心筋線維化を伴う圧負荷肥大心モデルを安定して作成することに成功した。浅麻酔下で心エコー図法・カテーテル法を用いて心機能を評価する方法を確立した。また、組織学的・免疫組織学的に心筋細胞肥大・心筋線維化・炎症細胞浸潤を評価する方法、心筋における各種サイトカイン、TGF-βなどの成長因子発現をRT-PCR法により評価する方法を確立した。3.圧負荷心におけるTGF-βの関与についての検討ラット圧負荷肥大心において、圧負荷3日以降7日をピークとするTGF-β発現が認められ、28日まで持続していた。圧負荷3日に心筋線維芽細胞増殖がピークとなり、7日以降心筋線維化が進行性に認められた。今後、ヒト可溶性TβRII-IgGキメラ遺伝子導入による生体内TGF-β機能阻害が心筋線維化・心筋肥大に及ぼす効果を検討したい。【背景】過剰な心筋線維化は高血圧心の心機能を阻害する。【方法と結果】Wistarラットにおいて腎動脈直上で大動脈を縮窄し、圧負荷ラットモデルを作成した。

線維芽細胞の活性化(増殖および筋線維芽細胞への形質転換)は、術後3日目より7日をピークに認められ、その後心筋細胞肥大と心筋線維化が進展した。28日目に心エコー図法を用いて心機能を評価したところ、左心室のfractional shortningは正常であったが、左室流入波形のE/Aの低下が認められた。また左室拡張末期圧の上昇も認められた。即ち収縮機能は正常だが拡張機能低下所見が認められた。心筋TGF-βmRNA発現は第3日以降認められ、7日をピークとして28日目まで上昇が認められた。TGF-β中和抗体を縮窄手術前日腹腔内投与すると、線維芽細胞の活性化が阻害され、その結果コラーゲンmRNA発現と心筋線維化が予防された。しかしながら心筋細胞肥大には効果が見られなかった。中和抗体は血圧と収縮能に影響を及ぼすことなく拡張機能障害を改善した。【結論】TGF-βは、圧負荷心において線維芽細胞活性化を通じ、心筋線維化と拡張障害に重要な役割を果たしている。我々の結果は、圧負荷心における心筋線維化と拡張障害を予防するための新たな治療戦略に有用な示唆を与えるものであり現在投稿中である。今後はこの結果を踏まえ、ヒト可溶性TβRII-IgGキメラ遺伝子を実際に導入し、心筋線維化・心筋肥大に及ぼす効果を検討する予定である。
ヘリコバクターピロリ-の遺伝子多様性の機序解明・DNAポリメラーゼの解析

ヘリコバクターピロリ-の遺伝子多様性の機序を解明するために、この菌のDNAポリメラーゼの解析を試みた。1、H.pyloriDNAポリメラーゼ遺伝子をクローニングするためのプローブをDegenerated PCRにより作成した。このプローブ作成のためには、Gene bankを検索し、過去に発表されている大腸菌DNAポリメラーゼ遺伝子やTaqDNAポリメラーゼ遺伝子などのアラインメントを行いConserved regionを決定した。その部位を含む最適なPCR primerを選択しdegenerated PCRを行った。その結果、800bpのPCR産物を得た。このPCR産物が目的のものか確認するため塩基配列を決定し、Gene bankのデータベースを用いてホモロジーを検証したところ、大腸菌のDNAポリメラーゼと非常に高い相同性を示し、このPCR産物がDNAポリメラーゼであることが証明された。2、次に、このPCR産物をプローブとしてH.pylor遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。ライブラリーはUniversity of WashingtonのBerg博士が作成したコスミドライブラリーを用い、コロニーブロットでサザンハイブリダイゼイションを行い陽性のコロニーを探した。約3050KbのH.pylori遺伝子断片をもつクローンを70クローンほど検索した結果、目的遺伝子を含むクローンが見つかった。3.このクローンを数種類の制限酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い同一プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行って再確認したところ、XbaIフラグメント(約15-20Kb)に目的遺伝子が存在することをつきとめた。このクローンのサブクローニングと塩基配列の決定を行い、目的遺伝子の部分的な塩基配列決定がなされた。現在、全遺伝子配列の決定を試みている。
S(+)-ketamineの循環制御に対する作用選択性の検討

本研究の目的は、racemic ketamineと比べて強い鎮痛作用、睡眠作用を持つS(+)-ketamineの硬膜外投与と全身麻酔薬を同時投与した場合の循環に対する作用の機序を解明することである。Whole animal study(ウサギ)で1%(0.5MAC)イソフルレン麻酔下にracemic ketamine,S(+)-ketamineを0.5mg/kgおよび1.0mg/kg下胸部硬膜外投与すると、ともに動脈圧、心拍数、腎交感神経活動のは有意に低下したが、この投与量の範囲では用量依存性も異性体特異性も支持する結果は得られなかった。また、Muscarine M2受容体やNOの関与も否定的であった。ウサギ定流量ランゲンドルフ標本でracemic ketamineとS(+)-ketamineのdose-response curveを作成した結果では、IC_<50>はともに300μM前後の高濃度であり、2剤間で有意差を認めなかった。両者が持つナトリウムチャンネルの遮断作用が高濃度で神経周囲に分布したため差が出なかった可能性がある。当初、脊髄の中間質外側細胞柱の細胞を培養してパッチクランプ法で検討する予定であったが、分離・培養に難渋した。継代培養したラットのmicroglial cell lineが入手できたので、この細胞でPatch clampstudyでの実験を施行したところ、イオンチャンネル型ATP受容体のP2X7受容体の電流に対しては、臨床濃度のチオペンタールでは増強作用があったが、臨床濃度(100μM)のケタミンでは有意な作用を示さなかった。一方、高感度でリアルタイムに組織のATP濃度を測定できるバイオセンサーを用いて、細胞外伝達物質としてのATPの増減を脊髄で調べ、交感神経活動との伝達機構としてのATPの役割の検討を試みた。低酸素刺激をはじめとした神経障害誘発で脊髄のATP濃度と交感神経活動の変化を測定し、S(+)-ketamineとracemic ketamineの作用の検討を行った。しかしながら、さまざまな神経障害刺激を負荷しても脊髄の細胞外ATP濃度の上昇が観察されず、バイオセンサー自体のATP特異性反応にも疑問が持たれた。本研究の目的は、racemic ketamineと比べて強い鎮痛作用、睡眠作用を持つS(+)-ketamineの硬膜外投与と全身麻酔薬を同時使用した場合の循環に対する作用の機序を解明することである。Whole animal studyとしてイソフルレン麻酔下のウサギにracemic ketamine, S(+)-ketamineを1μg/kg静脈内投与または硬膜外投与したときの動脈圧、心拍数、His束心電図上のA-H伝導時間、腎臓交感神経活動の変化を調べた。薬剤投与前と投与後効果が最大となる約30分にnitroprusside, phenylephrineでそれぞれ人為的低血圧、高血圧を作成し圧受容体反射の感度の評価を行った。Racemic ketamine, S(+)-ketamineともに静脈内投与では約20%の腎交感神経活動減少を認めたが、S(+)-ketamineの硬膜外投与では約70%の減少が見られ、racemic ketamineの約1.5倍の交感神経抑制作用を示した。摘出潅流

心による実験ではウサギ摘出心をランゲンドルフ潅流システムに装着して左心室内に圧力測定用バルーンを挿入してdV/dtを測定し、心室にタングステン電極を刺入してQRS, QT時間を測定し、潅流液中に種々の濃度のracemic ketamine, S(+)-ketamineを投与しdV/dt, QRS時間,QT時間のdose-response curveを作成している。Patch clamp studyはラットの星状神経節ニューロンにおける麻酔薬とオピオイドがGABA_Aチャンネル電流に及ぼす影響を調べる予定であったが、細胞のコンタミネーションのため現在はmicro glia cellを用いてATP誘発電流を測定しており、インフルレン、recemic ketamine, S(+)-ketamineを潅流液中に加えた時の電流変化を検討中である。本研究の目的は、racemic ketamineと比べて強い鎮痛作用、睡眠作用を持つS(+)-ketamineの硬膜外投与と全身麻酔薬を同時投与した場合の循環に対する作用の機序を解明することである。Whole animal studyとして49羽のウサギで1%(0.5MAC)イソフルレン麻酔下にracemic ketamine, S(+)-ketamineを静脈内、および下胸部硬膜外投与したときの動脈圧、心拍数、腎交感神経活動の変化を調べた。1mg/kgの静脈内投与ではいずれの薬剤でも動脈圧、心拍数、腎交感神経活動に有意な変化はみられず、対照群と差はなかった。Racemic ketamine硬膜外投与では1mg/kgで動脈圧は15mmHg、心拍数は10bpm、腎交感神経活動は50%減少、0.5mg/kgで動脈圧は20mmHg減少、心拍数は有意変化なく、腎交感神経活動は15%減少した。S(+)-ketamine硬膜外投与では1mg/kgで動脈圧は30mmHg、心拍数は20bpm、腎交感神経活動50%減少し、0.5mg/kgで動脈圧は13mmHg減少、心拍数は有意変化なく、腎交感神経活動は20%減少した。Ketamine硬膜外投与による交感神経抑制にNMDA受容体拮抗を介したNO産生の抑制の関与を検討するため、L-arginine 10mg/kg脊髄くも膜下投与後に1mg/kgのracemic ketamineを投与したが、腎交感神経活動はL-arginineで著明に抑制されており判定できなかった。また、ムスカリンM1受容体を介して交感神経活動を増加させるneostigmine 10μg/kgの脊髄くも膜下投与後に1mg/kgのracemic ketamineを投与しても、非前処置群と同じく腎交感神経活動は50%の減少を示した。実験例数の増加に伴う統計処理の結果では、前年度の報告とは若干異なり2剤間に有意差を認めず、循環作用に異性体特異性を支持する結果は得られなかった。Patch clamp studyはラットのmicro glia cellを用いてATP誘発電流を調べたところ興味ある結果が得られたのでこの細胞で継続している。静脈内投与による臨床濃度の100μMでは有意な変化を示さないが、300μM以上でATP電流は1.5倍に増加し、濃度上昇に伴って濃度依存性の増加がみられた。硬膜外あるいはくも膜下投与ではketamineがサイトカイン放出あるいは神経修復に何らかの作用をもたらす可能性があると考えられる。
若年性パーキンソン病原因遺伝子産物がミトコンドリアを維持する分子メカニズムの解析

若年性パーキンソン病原因遺伝子産物であるプロテインキナーゼPINK1とユビキチンリガーゼParkinは、協働してミトコンドリアの機能維持に関与することが示唆されている。損傷を受け膜電位が低下したミトコンドリア外膜上にPINK1が蓄積・活性化することにより細胞質に局在するParkinがミトコンドリアへ移行し、オートファジー反応で損傷ミトコンドリアを除去する。しかし、その分子メカニズムは不明であった。PINK1結合タンパク質の同定、細胞生物学的解析、ショウジョウバエ遺伝学を組み合わせて、その分子メカニズムの解明に取り組んだ。損傷を受け膜電位が低下したミトコンドリア外膜上にPINK1が蓄積・活性化することにより、細胞質に局在するParkinがミトコンドリアへ移行する。本研究では、モデルショウジョウバエを用いたスクリーニングにより同定したPINK1結合分子PGAM5の機能喪失がPINK1の機能喪失による表現型を緩解する分子メカニズムの解析と、PINK1がParkinをミトコンドリアへ移行させる分子メカニズムの解明を行った。PGAM5の機能喪失は解糖系の活性を上昇させることが示唆され、ミトコンドリア不全でエネルギー供給が悪化したPINK1ノックアウトショウジョウバエのエネルギー供給を代償することが示唆された。一方、活性化PINK1依存的にParkinのユビキチン様がリン酸化されることを見出した。このリン酸化はParkinのミトコンドリア移行を促進し、さらにミトコンドリア外膜上のParkinの基質の効果的な分解に関与していることを明らかにした。ParkinのPINK1依存的なリン酸化の発見は、Scientific Reports誌に発表した。ショウジョウバエのさらなるスクリーニングより、PINK1の下流にmTOR complex 2 (TORC2)シグナルが関与することを明らかにした。TORC2の下流の分子としてプロテインキナーゼNDR1が関与することを示し、Genes&Development誌に発表した。若年性パーキンソン病原因遺伝子PINK1、parkinの機能喪失が神経変性を導く病理メカニズムを解明することを研究の大目的とする。ショウジョウバエにおいてPINK1、parkinの機能喪失は、ミトコンドリアの変性を導く。すなわち、PINK1、parkinが、ミトコンドリアの機能維持に関与することが示唆されている。我々は、PINK1とParkinが同一のシグナル伝達で働くことをショウジョウバエ遺伝学にて見出していたが、両分子がミトコンドリアの機能を制御するメカニズムの詳細は明らかとなっていない。本研究では、ショウジョウバエの遺伝学的スクリーニングにより、PINK1ノックダウンに起因するミトコンドリア変性を抑制する遺伝子をスクリーニングした。その結果、ミトコンドリアの順行輸送に関与するミトコンドリア膜上タンパク質Miroを同定した。Miroの発現を抑制するとPINK1ノックダウンショウジョウバエのミトコンドリアの変性が抑制された。Miroの発現抑制、PINK1の過剰発現は共に、神経細胞のミトコンドリアの軸索輸送を抑制し、一方Miroの過剰発現、PINK1の発現抑制は輸送を促進した。培養細胞を用いた分子レベルの解析において、膜電位の低下したミトコンドリア上のMiroがPINK1, Parkin依存的に分解されることが明らかとなった。以上の結果から、PINK1, Parkinは膜電位の低下した(不良)ミトコンドリアを神経終末へ輸送させない巧妙なメカニズムに関与していることが考えられた。不良ミトコンドリアの神経終末への集積は、神経終末においてのエネルギー不足、活性酸素種の発生の原因となり、ひいては神経変性の一因となると考えられる。本研究の意義は、PINK1-Parkin-Miro経路の同定とその調節によって神経変性を抑制できる可能性を示した点にある。PINK1-Parkin経路がミトコンドリアの機能維持に関与する新規分子メカニズムを明らかにし論文として発表することができた。本成果は日経産業新聞に掲載された。おおむね研究計画を達成したと考えられる。次年度は、PINK1結合タンパク質であり、PINK1経路に関与する分子PGAM5の解析、PINK1の安定性を制御するユビキチンリガーゼMuleの機能解析に関して進める。ショウジョウバエを用いた機能解析と培養細胞を用いた分子細胞生物学的、生化学的解析を組み合わせ、PGAM5とMuleのPINK1経路においての機能の解明を試みる。今年度に引き続き、ショウジョウバエの分子遺伝学的解析、培養細胞を用いた分子細胞生物学的、生化学的解析を進める。その解析に使用する試薬、成果を発表する旅費、技術補佐員への謝金、通信運搬費、論文掲載費などに使用する予定である。
抗腫瘍性環状ペプチド,Astin類のコンホメーション及び活性相関に関する研究

シオン(Aster tataricus)10kgをメタノールにて抽出し、S-180Aに対する抗腫瘍活性試験を併用しながら環状ペンタペプチド、Astin類の単離を行い、以下に示すようなコンホメーション及び活性相関を解明すると共に、新たなAstin類の構造を明らかにした。1.最も強い活性を示すAstin BをCHCl_3-MeOH中より再結晶し、X線結晶解析を行い、結晶中のコンホメーションを明らかにした。Astin BはAbu-Pro(Cl)_2及びSer-β-Phe付近でβ-turn構造を有し、類似ペプチドであるシクロクロロチンとは異なったコンホメーションが示された。3.溶液中のNOEのデータを基に、化学計算を行い、溶液中のコンホメーションを解明した。これより、Astin Bが有するコンホメーションが活性発現に関与していることが示唆された。4.クルルプロリンの塩素原子の活性への寄与を検討するため、n-Bu_3SnH用い脱塩素体及びジオール体、臭素体などへ変換した。その結果、いずれの誘導体も活性を示さないことから、クロロプロリンの塩素原子の存在が活性発現に必須であることが解明された。現在、天然とは異なる配位の塩素置換誘導体の合成を検討中である。5.また、Astin類の精製過程において、微量成分として、新たに、Astin F,G,H,I,Jを単離し、それらの構造を解明した。現在、活性試験を検討中である。
生殖補助医療の適応を決定する精子受精能評価法の確立に関する研究

効率よい不妊治療を行うためにはその原因を解明する必要がある。現在も確定できない原因に受精障害がある。現在の不妊治療はそれぞれの治療で妊娠できない場合、タイミング法、人工授精、体外受精の順に選択され進んでいく。顕微授精は体外受精の受精障害の時に選択される。このような背景から、精子受精能の基準を作成し、受精障害を事前に予測し、また、受精障害が起こった後の対策を明確にすることが重要である。この研究では、精子の受精能の指標を精液パラメーター、生存しているが運動していない精子の割合(精子の生存・死滅の評価はLive/Dead sperm Viability kitで評価)などについて、体外受精の受精成績から受精能の評価を行った。[結果]当初、不動生存精子の割合の分布を調べると17.8%±1.7SE(0-46)で、受精率との相関係数は-0.41となり相関を認め、不動生存精子の割合が多いほど、受精率が低値となった。しかし、その後症例を重ねると、相関係数が-0.1となり相関が消失した。運動性良好精子回収法を実施後の精子パラメーターについて、体外受精の受精成績を評価した結果、精子濃度は10×106/ml以上、精子濃度は80%以上、媒精時に添加する精子浮遊液量は20μl以下、Kruger's strict, criteriaは4%以上では体外受精の受精障害を認めなかったので、これらの条件を満たせば、体外受精を選択して実施するという基準を作成した。この基準で52例にIVFを実施し、正常受精率73.1%(MII卵に対しては86.8%)であり、受精障害例を認めなかった。また、初回体外受精での受精障害の発生頻度が15%と高いこと、一度受精障害が起こると次に体外受精を実施するとより高い頻度で受精障害が起こるので、初回体外受精実施者と前回の体外受精での受精成績率が30%以下の症例については、媒精後4時間30分で第2極体の有無で受精評価を行い、すべての卵子に第2極体が確認できない場合に、媒精6時間後に再評価し、必要があればrescue ICSIを行い、受精障害に対処する。原因不明不妊症の割合は不妊症の15%にあたるが、効率よい不妊治療を行うためにはその原因を解明する必要がある。現在も確定できない原因に受精障害を来す精子受精機能異常があり、精子受精能を評価する検査法を確立することがこの研究の目的である。具体的には、精子の受精能を精子の膜機能に着目した。生存しているが運動していない精子は精子の代謝系、細胞膜の活性度が損なわれているか、退行性変化に向う途中の精子と考えられる。生存しているが運動していない精子の割合が精子受精能のマーカーになりうるかを検討した。精子は精子運動解析装置(SMAS)で、精子運動率、精子濃度、精子速度、直進運動性を計測、精子の生存・死滅の評価はLive/Dead spermViability kitで行い、精子DNAの断片化はHalosperm法を行うこととした。リプロダクションセンターを受診した不妊症患者の精液検査、人工授精、体外受精実施時の精液検査で、不動生存精子の割合と実際の臨床成績とを検討した。不動生存精子の割合を、タイミング法を行っている患者の精液検査から、タイミング法と人工授精では実施時の精液サンプルからその割合を求めた。