hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パイプライン処理の形式的並列設計検証手法に関する研究

本研究では、パイプライン処理方式の形式的な並列設計検証手法の研究を行なった。とくに、パイプラインプロセッサの制御方式の検証に着目し、二分決定グラフを用いた暗黙状態数え上げに基づき、命令をパイプライン処理するときのパイプラインの乱れであるハザードが生じるかどうかを判定する手法を示した。通常ハザードの検出はシミュレーションで行われているが、本手法はこのシミュレーションを記号的にすべての場合について網羅的に行う手法である。具体的には、連続する二つの命令を記号的に与えて記号実行を行う。着目している二つの命令以外はNOP命令にする。またそれと同時に二命令の間にNOP命令を適当な数だけはさんだ命令列を記号実行し、最初の命令列と比較を行なうことで、ハザードを生じるかどうかおよび、ハザードを消すためにどのような機構を備えているかを検出する。記号実行の部分は順序回路の暗黙状態数え上げ手法を用いている。実行はプログラムカウンタの値を除いて、すべてのレジスタの値が定常状態になるまで行なう。記号実行の結果は論理関数として表される。検証は、各命令列について定常状態になるまでのクロック数および定常状態の各レジスタの値が等しいかどうかを比較することで行なう。記号実行対象の回路の演算回路部分の簡単化のために剰余BDDと呼ばれる新しい二分決定グラフを提案した。また、並列化に関しては、暗黙状態数え上げの並列化手法を示した。本並列化手法は、二分決定グラフのグラフ自体をデータフローグラフと見て並列性を抽出するという新しい手法である。これにより、10CPUで4倍程度の高速化を達成した。今後は、本検証手法をスーパースカラプロセッサの検証に適用することや、二分決定グラフのグラフ構造を用いた並列化手法と通常の二分決定グラフの演算の並列化手法と組み合わせることなどが必要である。
薄形、低電磁雑音のプレーナ形磁気アクチュエータの研究

本研究は,小形メカニカル部品の一部としての数百μmからcmの移動可能な平面形(薄形化)に特徴をもつミヤンダ形コイルからなる平面形磁気アクチュエータの構成法とその特性を検討する研究である。平面形磁気アクチュエータの構成法については,永久磁石をム-バ,励磁コイルとしてミアンダ形コイルをステ-タとする基本構成を選び,平面形磁気アクチュエータを作成した。永久磁石には薄形ストライプ上に励磁したフェライト磁石を採用し,ステ-タには積層磁心を放電加工により作成することを選定した。これらの作成法は,極めて高度な加工技術を必要とした。次に製作した平面形磁気アクチュエータにより,静止推力を測定し従来のリニアパルスモータにおける推力/質量比,推力/体積比を比較し検討を行った。その結果は,当構成の平面構成による放熱性,吸引力特性を考慮すると,平面形磁気アクチュエータは推力/質量比,推力/体積比において従来のリニアパルスモータに匹敵する値を得ることができた。平面形磁気アクチュエータの構造の最適化について,磁気回路解析を行い最大推力を発生する形状について検討を行った。その結果,歯幅には最適値が存在し,その値を実験的にも証明することができた。また,2相リニアパルスモータを製作し過渡特性の検討を行った。本構成の磁気アクチュエータは,磁気回路を細分化することによるステ-タ磁心の磁路断面を極小にすることができ,平面形磁気回路の実現の可能性を持ち,かつ体積あたりの推力は従来の磁気アクチュエータと同等の値を得ることができることが明らかになった。また,磁気回路を細分化することにより磁路からの電磁雑音を抑制することも重要な利点である。
非線形波動及び非線形拡散の解析

本研究組織は多岐にわたる微分方程式の研究のうちで特に物理学・工学とのかかわり、あるいは応用を意識した研究課題を掲げ、その達成に努めた。研究代表者及び各分担者の研究成果は研究成果報告書に個別に、かなり詳しく記したが、そこにある通り、非線形波動及び非線形拡散の解析は相当の進展をみ、研究課題は達成されている。代表者の波動伝播問題の仕事は摩擦項の影響が解の挙動にどのような形であらわれるかを調べることで、線形、非線形の摩擦項による音響波、弾性弦の波動への結果が得られている。また拡散問題の仕事は多孔性媒質中の流れ、プラズマ中の熱拡散、反応拡散散系などに対する"外力"の影響が大域解の存在・非存在、大域解の漸近挙動、爆発時刻の評価などにどのようにあらわれるかを調べている。その他sturm-Liouirlle逆問題、Oscillating long-range potentialを併うSchrodinger作用素の連続スペクトルの研究等で一定の成果が得られた。各分担者もHamilton-Jacobi方程式の均質化理論、Hele-Shaw流の自由境界問題、変分問題、分岐現象の精度保証つき数値解析、非線形拡散の完全爆発条件などの研究があり、本組織の成果となっている。上記研究課題は3年計画であり、今回はその一年目の報告なので、研究代表者による研究実績について述べるにとどめる。代表者は波動伝播問題に対して、得られた結果を2つの論文に仕上げ現在投稿中である。それらは無限遠方にだけ摩擦項が局在する場合、それによって波のエネルギーがどのように減衰するかを研究しており、ひとつは線形波動方程式に対し、他は弾性弦の振動を記述する非線形のkirchhoff方程式に対して得られたものである。今年度の代表者による発表(予定も含む)論文6編は非線形拡散問題に関するものでそのうちの4編を次ページに載せた。対象とする方程式は多孔質媒質中の流れやプラズマ中の熱拡散を記述する追化放物型方程式(系)及び化学反応を記述する半線形放物型方程式系であり、局所解の存在、有限時間内の爆発、大域解の存在、大域解の時間経過にともなう漸近挙動などが研究されている。HuangーM.では準線形性が強い特異性を与え場合、その方程式系は熱源がどのようであっても初期データさえ小さければ解は大域的であることを示した。M-Suzukiでは進化する準線形放物型方程式について熱源の指数に関する臨界爆発を示し、最終結果とした。Mukai-M-Huangは同じ問題について初期データの減衰条件が解の爆発問題に影響することを見、減衰条件に対する臨界指数を求め、爆発解のlife span,大域解の漸近挙動を求めた。M-Huangでは同様の問題を反応拡散系について研究した。3年計画の2年目にあたる今回は代表者及び都立大内の分担者の研究実績を述べる。代表者の研究は波動伝播問題と非線形拡散に分けられる。第一の分野では摩擦項が局在する場合の時間大域解の存在とエネルギー減衰が研究された。代表者の開発した加重エネルギー法が弾性拡の振動を記述するKirchhoff方程式や音響波動の問題に効力を発揮し、期待される結果が得られている。第二の分野では化学反応を記述する半線形放物型方程式系や多孔値媒質中のガスの流れやプラズマ中の熱の拡散を記述する準線形退化放物型方程式の解の挙動を研究した。特に臨界指数での爆発やLife spanの精密な評価、大域解の漸近形などが得られている。分担者酒井は典型的な自由境界問題であるHale-Shawの流れについて、Green関数の性質をもちいて、定点から最先端までの距離の最良評価を得ている。分担者倉田は超伝導現象のモデルであるGinzburg-Landau方程式についてLiouville型定理を示すことにより超伝導現象は局在しないことを示している。分担者肥田野は非線形波動方程式に対し、大域解が存在する条件のもとでは散乱現象が起こることを空間次元4の場合に示している。3年計画の最終年である今回得られた主な結果を報告する。代表者の研究は1.Kolomogorov-Petrouskii-Piskunov方程式は物理、化学、生物等における拡散や燃焼、優性遺伝などの現象を統一的に記述する。この方程式を一般化し、解の時間の経過に併う漸近挙動を調べた。

2.化学反応やポピュレーションダイナミックスを記述する反応拡散方程式系、またプラズマ中の熱拡散や多孔媒質中の流体の運動等を記述する準線形放物型方程式の解の爆発寿命また大域解の漸近挙動を調べた。3.Sturm-Liouville作用素のスペクトル逆問題に新しい見知と結果を与えた。4.振動型ポテンシャルをもつSchrodinger作用素について極限吸収の原理を精密化した。分担者石井はHamilton-Jacobi方程式に対する均質化理論と曲面の曲率流の研究を行った。酒井はヘレショウ流の初期領域の形状による影響を研究した。倉田は重みつきFefferman-Phongの不等式を示し、その応用を考えた。肥田野は非線形波動方程式の散乱問題、自己相似性、また解の爆発を研究した。鈴木は爆発解を含むような準線形放物型方程式の解の性質について調べた。その他の分担者の研究は、研究全体の報告書を参習して欲しい。
味覚情報が咀嚼行動に及ぼす影響

咀嚼は、ヒトを含めた哺乳動物が、エネルギー源、栄養素を外界の食物から摂取するための食行動の第1段階である。従来、この食物の物理的性状(硬さ、テクスチャーなど)に応じて咬合力がいかに調節されているかに関する報告は、多々見られたが、化学的性状を検知する味覚がいかに咀嚼運動に影響を及ぼしているかの報告は、ほとんどされて来なかった。本研究は、食物に混入された味物質の違いにより、咀嚼運動がどのように変化するのかを、ラットを用いた動物実験により行動学的、および、筋電図学的に明かにしようとしたものである。行動学的実験の結果、ラットが満腹までに要する時間は、高濃度Quinineにおいて他の溶液より長くなり、摂食中および摂食後にはgapingなどの忌避行動が顕著に観察された。また、摂食時間中の、実際に咀嚼運動を行っている時間が、他の溶液混入飼料摂食時に比べ、有意に減少した。筋電図学的実験の結果,Quinine混合飼料摂食時における咀嚼筋のバースト放電が、他の溶液を混合した餌を与えた時よりも小さく、その周波数が高いことが明らかとなった。これらの結果は、飼料中に含まれる味物質が、咀嚼筋活動を含むラットの摂食行動に影響を与える可能性を示唆しており、食物の化学的情報が、物理的情報と同様に、咀嚼運動に重大な影響を及ぼしていることが明らかになった。咀嚼は、ヒトを含めた哺乳動物が、エネルギー源、栄養素を外界の食物から摂取するための第一段階として必須の動作である。本研究は、食物に混入する味の質や量などを変化させた種々の食餌を動物に与えた時の、顎・舌運動パターンを行動学的及び電気生理学的方法をもとに解析し、食餌中の味覚情報が咀嚼行動に及ぼす影響について解明することを目的としたものである。当該初年度では、4基本味を中心とした種々の味物質をラットが通常食餌として摂食している飼料(オリエンタル社製:MF)に同量混入し、その摂食前後での行動解析、及び、側頭筋、咬筋、顎二腹筋の筋電図パターンを解析した。その結果、行動解析においては、5mM塩酸キニ-ネのような高濃度の忌避物質が含まれている味物質を摂食する際に、GapingなどのAversive behaviorが、他の食餌摂食時に比べ、有意に多く観察されることがわかった。また、このような食餌を摂食する際には、満腹までに要する時間が長くなり、かつ、総摂食時間に対する実際に咀嚼している時間の割合が小さくなった。咀嚼筋筋電図の解析では、5mM塩酸キニ-ネのような高濃度の忌避物質が含まれている味物質を咀嚼する際には、そのチューイングサイクルが早くなり咀嚼筋のバースト放電の大きさが他の食餌咀嚼時に比べ、小さくなることがわかった。以上の、結果から、食餌中に含まれる味物質が、咀嚼を含めた摂食行動に大きく影響を与えていることを明らかにした。本研究は、食物に混入された味物質の違いにより、咀嚼運動がどのように変化するのかを、ラットを用いた動物実験により行動学的、および、筋電図学的に明らかにしようとしたものである。

行動学的実験の結果、ラットが満腹までに要する時間は、高濃度Quinineにおいて他の溶液より長くなり、摂食中および摂食後にはgapingなどの忌避行動が顕著に観察された。また、摂食時間中の、実際に咀嚼運動を行っている時間が、他の溶液混入飼料摂食時に比べ、有意に減少した。筋電図学的実験の結果、Quinine混合飼料摂食時における咀嚼筋のバースト放電が、他の溶液を混合した餌を与えた時よりも小さく、その周波数が高いことが明らかとなった。これらの結果は、飼料中に含まれる味物質が、咀嚼筋活動を含むラットの摂食行動に影響を与える可能性を示唆しており、食物の化学的情報が、物理的情報と同様に、咀嚼運動に重大な影響を及ぼしていることが明かになった。
膀胱癌におけるcisplatin，doxorubicin耐性機序の解明とその克服

2)ヒト膀胱癌培養細胞株KK47より樹立したcisplatin耐性株KK47/DDP10,KK47/DDP20において、amphotericinBの併用により細胞内cisplatin蓄積量は有意に増加し、cisplatinへの感受性は非併用時に比べ2-3倍に増強した。またGSH合成の律速酵素γGCSの阻害剤であるbuthionine sulfoximineの併用により細胞内GSH量は親株と同程度にまで減少し、cisplatinへの感受性は約5倍に増強された。3) Doxorubicin単独および多剤耐性克服剤verapamil併用膀胱内注入による表在性膀胱癌術後再発予防効果をrandomizedtrialにて比較検討し、verapamil併用群において有意な再発率の低下を認め、その有用性が明らかになった。
木材腐朽菌のタンパク質分泌機構の強化と新規機能の付与

白色腐朽菌ヒラタケの木質成分分解酵素の分泌系の各ステップについて解析し、ボトルネック解消による分泌系強化を目指して、木材腐朽菌では初めてとなる分泌型のレポータータンパク質発現系を開発した。この成果については、国内の学会および上海で開催された第9回きのこの生物学と生産物に関する国際会議にて発表を行った。現在、本レポーター系を用いて、様々な分泌タンパク質から分泌シグナルとして機能していると予想されるアミノ酸配列についてその分泌活性の測定と、細胞内貯留の有無について解析を進めている。また、細胞内の分泌系の各ステップに関わる細胞内小器官毎のマーカータンパク質の捜索を行っており、既に蛍光タンパク質により細胞内小器官を標識するマーカーの作成にも成功している。一方で、分子育種をより効果的、安全に進める研究ツールとして、木材腐朽菌にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集系の導入を進めており、国内外の学会で一般講演および招待講演により成果を報告した。研究は、計画通りに進んでいる。今後も当初の計画に沿うように、高発現に必要とされる分泌シグナル配列の同定、および細胞内分泌系のマーカータンパク質の捜索、分泌系滞留現象の解明と解決法の検討、ゲノム編集系の効率化について進めて行く予定である。
神経組織の微量ペプチドの分離分析法の開発

神経組織の微量ペプチドの分離分析法について、高速液クロ分析、質量分析およびシーケンス分析による方法を用いて検討した。生理活性ペプチドの高速液クロによる分離分析を試み、Diphenyl系Protesil300樹脂を用いることによって、P物質、ボンベシンなど10種の標準ペプチドが効果的に分離されることを示した。ウシ脊髄のペプチド画分をこの高速液クロ系で分画し、FAB-質量分析によって分析することにより、P物質の存在および分子量1256、1238の活性ペプチドの存在が示唆された。カルボキシ末端のアミド化されたペプチドの分析法を検討し、逆相系Divelosil C8-5カラムによる高速液クロによって、ダンシル化されたアミド化アミノ酸が高感度12pmolレベルで検出されることを明らかにした。更に、ウシ脊髄のペプチド画分を、キモトリプシンによって酵素分解、ダンシル化、アルカリ条件でのアミド化アミノ酸の選択的抽出、高速液クロ分析によって、カルボキシ末端にアミド化されたPro、Met、Leu、Serをもつペプチドの存在が示唆された。疎水性ペプチドの分離・分析について、膜内在性糖蛋白であるPo蛋白のトリプシン分解ペプチドの高速液クロによる分離条件を検討した。その結果、巨大網状型ポリスチレン樹脂(Hitachi 30130)による系によって、効果的な分離の出来ることが明らかとなった。分離されたペプチドを気相法シーケンサーで分析することにより、高感度にアミノ酸配列を分析することが可能であった。また、分離された疎水性ペプチドを短時間加水分解した後に、アシレーション、パーメチレーション処理を行い、SIL-5(Chrom pack)カラムによるガスマス分析を行うことにより、36残基のアミノ酸配列の分析が可能となった。この方法をウシ脊髄のペプチド画分の分析に利用が可能であることを示した。
RC橋脚の地震リスク評価とリスクファイナンスに関する研究

本研究は、鉄筋コンクリートを対象とした地震リスク解析手法の開発およびリスクファイナンスの適用法を検討するものである。また、開発したFramRiskにより、3例のRC橋脚に対する地震リスク解析を実行した。1.RC橋脚の地震損失を定量的に算定するため、以下の手順にて地震リスク解析手法の開発を行った。・Part1耐震性能解析:静的解析によるP-δ関係の算出・Part2地震損傷モデルの構築:復旧費用と復旧日数の算定モデル/Event&Flag Matrix法を提案。・Part3地震ハザード曲線の設定:従来からの地震ハザード曲線と複数震源モデルの2手法を採用。・Part4リスク諸量の解析:震損傷度曲線、地震損失関数、地震リスク曲線などの一連のリスク解析を実行する解析手法を構築。解析プログラムのプロトタイプ/FrameRiskを完成。2.リスクファイナンスに関する検討従来の地震保険に替わり、代替的リスク移転(ART:Alternative Risk Transfer)による金融対策が脚光を浴びている。RC橋脚を有する鉄道や道路施設の場合、補強等のハード対策が地震対策の主役と考えられてきたが、万全な補強対策は経済的合理性から乖離する可能性があり、リスク転嫁を追加策として設けることが重要である。・Part1:割引地震リスクカーブの評価方法の開発これまでのリスクカーブは、単年度を対象としたものであるが、ARTの多くは一定期間出資金が拘束される契約となるため、任意の期間を対象とした割引地震リスクカーブの評価方法を開発した。・Part2:金融対策に不可欠な財務影響分析と管理会計の調査地震対策の経済的合理性を検討するには、被災時に遭遇する事業主体者の財務状況の変化を予測する必要がある。そこで、財務影響分析に関する調査を行い、簡単な管理会計の方法を開発した。ただし、実務には必ずしも十分ではなく、今後の研究・開発が必要である。本研究は、鉄筋コンクリート橋脚(RC橋脚)を対象とした地震リスク解析を実施するものである。なお、本研究でのリスクとは、「なんらかの原因によって,損害を被る可能性」であり、「地震リスク=地震の発生確率×発生した時の重大性」にて明確に定義される狭義のリスクである。これにより、個々のRC橋脚の地震リスクとして、損害期待値、最大予想金額などを算定するのものである。初年度では、リスク解析に必要な要素技術の検討を行った。・・Part1:RC橋脚の耐震性能解析:鉄筋コンクリートの単柱式橋脚およびラーメン橋脚、ラーメン高架橋に対して、具体的な計算を実施した。ここでは、静的解析によりP-δ関係の算出、保有靭性の評価を行った。(市販の設計ソフトを用いた)。・Part2:RC橋脚の震害調査・ビアンリング:地震の被害として復旧費用、営業損失、不通日数などが必要である。今年度は、ゼネコン担当者より、これまでの復旧工事などの事例を聴取した。また、これまでの地震被害とその復旧の経験から、被害の程度(損傷程度)に応じた、復旧費用と復旧日数の算定モデルを構築し、計算プログラムを作成した。複数の対象建設地点に対する地震ハザード曲線の設定を行った。地震規模として、基盤最大加速度とした。本研究は,鉄筋コンクリート橋脚(以下,RC橋脚)を対象として,地震リスク解析手法,リスクファイナンスの適用法を検討し,RC橋脚の地震リスク解析(損傷期待値,最大予想金額などの算出)を実行することである。(なお,本研究でのリスクとは,「なんらかの原因によって,損害を被る可能性」であり,「地震リスク=地震の発生確率×発生した時の重大性」にて明確に定義される狭義のリスクである。)平成19年度:初年度にて実施したPan1Part4の業務により,地震リスク解析の要素技術に対する研究を実施し,解析事例を提示した。続く平成19年度では下記研究を行った。

・Part4の一環として,地震リスク解析プログラムの開発:Part1Part3の検討結果を基に,解析プログラムのプロトタイプ/FrameRiskを完成した。これは,対象構造物の耐震性能と損失モデルの入力により,構造物の地震損傷度曲線と地震損失関数を出力とするものである。加えて,地震ハザード情報を与えることにより,損失期待値関数,地震リスク曲線,予想最大損失(PML)を算出するものである。FrameRiskを用いて,鉄筋コンクリート橋脚3例について,リスクシミュレーションを実施した。・Part5:リスクファイナンスの適用次に,リスク麩嫁策としてのリスクファイナンスの適用法を検討した。とくに,転嫁策として地震保険の適用性を検討し,その有用性を確認した。ただし,地震保険の料率設定とRC橋脚の被害事例などデータベースの蓄積が必要である。研究の次へのステップとして,他のインフラ施設(鋼構造,土構造などの土木構造物)への適用へ拡張するとともに,総合的なリスクマネージメントとして,危機管理を含む企業継続性BCP,防災ポートフォリオ,など,さらなる展開・活用が期待できる。
膵β細胞およびα細胞の特性を規定する遺伝子獲得のための分子基盤研究

1.膵島β細胞に特異的に発現する遺伝子の解析マウス膵島β細胞由来の細胞株MIN6細胞より作製したcDNAライブラリーの塩基配列を決定することにより、膵島β細胞に特異的に発現していると考えられる遺伝子を単離した。ノーザン法で解析する限り、MIN6細胞および膵島に発現が認められた。他の内分泌腺由来の細胞株においても発現は認められなかった。構造的にはセリンプロテアーゼと構造が類似しているが、HDSモチーフを2箇所に有する点で他のセリンプロテアーゼとは異なり、isletasinと命名した。細胞内では、初期エンドソームの内腔に密接した状態で存在すると考えられる。ゲノム概要シークエンスより、ヒトおよびラットのホモログの構造を明らかにした。またプロテアーゼ活性化に必要な塩基配列を有さないこと、また本遺伝子産物は実際にプロテアーゼ活性を証明できないことより、他の機能を有していることが推測された。2.DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析計8734個のマウスcDNAをスポットしたアレイに対して、MIN6および膵島α細胞株α-TC1.6から抽出したRNAを用いて、両細胞間における遺伝子発現量を比較した。両細胞間で数倍の発現の差が得られたクローンについては、ノーザン解析にて発現量の差異を確認した。その結果、DNAマイクロアレイの結果とノーザン解析の結果がほぼ一致していることを明らかにした。さらに腸内分泌細胞株でproglucagon遺伝子を発現しているGLUTag細胞とMIN6細胞あるいはα-TC1.6細胞間の遺伝子発現の差異をDNAマイクロアレイで検討した。その結果、α-TC1.6の発現パターンは膵島細胞株であるMIN6細胞よりも同じproglucagon遺伝子を発現しているGLUTag細胞の発現パターンにより類似していることを明らかにした。インサートが一方向性を有するMIN6 cDNAライブラリーを作製した。2,700クローンの塩基配列を決定した。このうちdbESTとのホモロジー検索から膵β細胞に発現が限定されると予測される74クローンについてはノーザン法にて組織特異的発現を検討した。この1クローンに関しては、MIN6、α-TC1、NIH3T3、脳、肝、腎、腸、筋肉などを対象として、組織特異的発現をノーザン解析で検討したところ、MIN6細胞のみに発現が確認された。トリプシンと構造が類似しており、細胞内局在などについて検討中である。2.DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析計8,734個のマウスcDNAをスポットした既製のアレイ(Incyte社)に対して、MIN6および膵α細胞株α-TC1から抽出したpolyA RNAをそれぞれCy3およびCy5で蛍光標識し、ハイブリダイゼーション後、蛍光検出装置で両細胞間における発現量を比較した。両細胞間で数倍の発現の差が得られたクローンについては、ノーザン解析にて発現量の差異を確認した結果、DNAマイクロアレイの結果とノーザン解析の結果がほぼ一致していることを明らかにした。このうちESTとして報告されている遺伝子に関しては、マウスの複数の臓器におけるノーザン解析および塩基配列の解析を進めている。1.膵島β細胞に特異的に発現する遺伝子の解析膵島β細胞由来の細胞株MIN6細胞より作製したcDNAライブラリーの塩基配列を決定することにより、膵島β細胞に特異的に発現していると考えられる遺伝子を単離した。構造的にはセリンプロテアーゼと構造が類似しているが、HDSモチーフを2箇所に有する点で他のセリンプロテアーゼとは異なる。細胞内では、ゴルジ体、小胞体膜に密接した状態で存在すると考えられる。現在、1)本遺伝子産物が実際にプロテアーゼ活性を有するのか、2)抗体を作成して蛋白発現を確認する、3)ヒト膵島cDNAライブラリーよりヒト・ホモログの単離を進めている。

2.DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析計8734個のマウスcDNAをスポットしたアレイに対して、MIN6および膵島α細胞株α-TC1.6から抽出したRNAを用いて、両細胞間における遺伝子発現量を比較した。両細胞間で数倍の発現の差が得られたクローンについては、ノーザン解析にて発現量の差異を確認した。その結果、DNAマイクロアレイの結果とノーザン解析の結果がほぼ一致していることを明らかにした。さらに腸内分泌細胞株でproglucagon遺伝子を発現しているGLUTag細胞とMIN6細胞あるいはα-TC1.6細胞間の遺伝子発現の差異をDNAマイクロアレイで検討した。その結果、α-TC1.6の発現パターンは膵島細胞株であるMIN6細胞よりも同じproglucagon遺伝子を発現しているGLUTag細胞の発現パターンにより類似していることを明らかにした。1.膵島6細胞に特異的に発現する遺伝子の解析マウス膵島P細胞由来の細胞株MIN6細胞より作製したcDNAライブラリーの塩基配列を決定することにより、膵島β細胞に特異的に発現していると考えられる遺伝子を単離した。ノーザン法で解析する限り、MIN6細胞および膵島に発現が認められた。他の内分泌腺由来の細胞株においても発現は認められなかった。構造的にはセリンプロテアーゼと構造が類似しているが、HDSモチーフを2箇所に有する点で他のセリンプロテアーゼとは異なり、isletasinと命名した。細胞内では、初期エンドソームの内腔に密接した状態で存在すると考えられる。ゲノム概要シークエンスより、ヒトおよびラットのホモログの構造を明らかにした。またプロテアーゼ活性化に必要な塩基配列を有さないこと、また本遺伝子産物は実際にプロテアーゼ活性を証明できないことより、他の機能を有していることが推測された。
口腔癌に対する転写因子NF-kBを分子標的としたプロテアゾーム阻害剤療法の開発

当教室において樹立した口腔扁平上皮癌細胞であるBHY、B88、HNt細胞とSCC9細胞を用いて本研究は行った。プロテアソーム阻害剤(PS-341;USAにて多発性骨髄腫の治療薬として最近認可された分子標的薬)は濃度依存的に(0.1から100nM)癌細胞の細胞増殖能を抑制した。至適濃度を決定後、プロテアソーム阻害剤を本研究に用いた。プロテアソーム阻害剤は濃度依存的に癌細胞のNF-κB活性を抑制した。癌細胞を放射線照射(15Gy)することにより、Akt及びIKKはリン酸化され、それらのシグナルを介しIκBαはリン酸化、ユビキチン化とプロテアソームによる分解を受け、NF-κBは活性化されることをElectrophoretic mobility shift assay、Luciferase assay、Western blotting法および蛍光抗体法にて明らかにした。プロテアソーム阻害剤(1,5,10nM)で癌細胞を前処理後、放射線照射(15Gy)することにより、NF-κBの活性化は抑制された。それぞれの単独処理群に比較し、前処理することにより、in vitroにおける細胞増殖能は相乗的に抑制され、同時にアポトーシスの誘導も相乗的に増強された。また、癌細胞を放射線照射(15Gy)することにより、NF-κBの下流に存在するIL-1α、IL-6、IL-8及びTNF-αの産生をELISA法で測定した結果、放射線により増加したサイトカインの産生はプロテアソーム阻害剤の前処理により有意に抑制された。ヌードマウスの背部皮下に癌細胞を移植し、100mm^3の大きさになった後に、放射線(1.5Gy/day、3回/週)単独、プロテアソーム阻害剤(3回/週、iv)単独、或いは両者を併用し、経時的な腫瘍体積を測定した結果、それぞれの単独治療に比較し、両者を併用することで有意に相乗的な腫瘍体積の減少を認めた。以上より、口腔癌に対しNF-κBを分子標的としたプロテアソーム阻害剤治療及び放射線との併用療法が有効である可能性が示唆された。口腔扁平上皮癌に対するNF-κB活性を分子標的としたプロテアゾーム阻害剤治療の開発のために以下の解析を行った。口腔扁平上皮癌細胞であるBHY、B88、HNt細胞に放射線照射(RT)(7.5、15、30 Gy)を行うことにより、Luciferase assayでNF-κB活性は誘導され、Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)によりNF-κB結合能は増強した。また、癌細胞をRT後、経時的(0、5、15,30,45,60,120分)に蛋白を抽出し、IκBα蛋白、リン酸化IκBα蛋白及びリン酸化p65蛋白の発現をWestern blottingで検索した結果、経時的にIκBα蛋白は分解され、リン酸化IκBα蛋白とリン酸化p65蛋白の発現は増強された。RT後48時間で細胞の培養上清を回収し、NF-κBの下流の遺伝子であるIL-6、IL-8蛋白の発現をELISA法で測定した結果、有意にこれらのサイトカインの発現は増強された。プロテアゾーム阻害剤が癌細胞の細胞増殖能に及ぼす影響をMTT assayで検索した結果、すべての細胞において、110nMの濃度で癌細胞の増殖抑制効果を示した。更に、放射線で誘導される生存シグナルであるNF-κB活性をプロテアゾーム阻害剤の前処理にて抑制することにより、放射線による癌細胞の増殖抑制効果に相乗或いは相加作用を示した。以上の結果より、in vivoにおいてプロテアゾーム阻害剤と放射線照射を併用することにより、より高い治療効果が得られる可能性が示唆された。

ヌードマウスの背部皮下に癌細胞を移植し、100mm^3の大きさになった後に、放射線(1.5Gy/day、3回/週)単独、プロテアソーム阻害剤(3回/週、iv)単独、或いは両者を併用し、経時的な腫瘍体積を測定した結果、それぞれの単独治療に比較し、両者を併用することで有意に相乗的な腫瘍体積の減少を認めた。以上より、口腔癌に対しNF-κBを分子標的としたプロテアソーム阻害剤治療及び放射線との併用療法が有効である可能性が示唆された。
乳癌の薬物療法耐性への低酸素の関与についての研究

腫瘍内血流の不均一性やそれに起因する低酸素領域は癌の悪性度や浸潤・転移能と関連するとされている。純粋な腫瘍内血流を評価できる造影超音波検査は癌の悪性度を簡便に評価できる可能性があると推察される。薬物療法奏功例に関しては腫瘍縮小と同時に腫瘍内血流の均一化を認めた。乳癌の病理学的背景と腫瘍内血流の関連を解析し、エストロゲンレセプターの発現が陰性の症例においては腫瘍内血流の不均一さを多く認めた。エストロゲンレセプターの発現は治療標的となる可能性があるため、治療効果が超音波検査所見と関連する可能性が示唆された。乳癌における腫瘍内血流や低酸素状態の評価と薬物療法の効果の関連を検討するため、原発性乳癌に対して術前薬物療法を施行する患者に対して乳腺造影超音波検査を実施している。薬物療法前、薬物療法中、薬物療法後の検査結果を比較すると、薬物療法奏功例においては腫瘍縮小と同時に腫瘍内血流の均一化を認めた。非奏功例においては腫瘍内血流の変化が乏しく、腫瘍縮小がみられなかった。今後は検査の実施時期を変更することで、腫瘍内血流の変化する時期を模索する予定である。それが確認できれば治療効果を早期に予測することが可能となる可能性がある。乳癌の初期治療において薬物療法を施行する患者において、乳腺造影超音波検査を実施する患者の蓄積が進んでいない。そのため研究に必要な手術前後での病理標本の収集が進んでいない。過去の報告から腫瘍内血管の不均一性やそれに起因する低酸素領域の存在は癌の悪性度や浸潤・転移能と関連するとされている。ソナゾイドは他の検査モダリティーの造影剤と違い血管外漏出がないことから純粋な腫瘍内血管を評価できることから造影超音波検査が乳癌の悪性度を推測する上で有用ではないかどうかを検証した。2014年10月から2016年8月の間に造影超音波検査を施行された97例に関して、染影所見と臨床病理学的因子との関連性を解析した。病理学的因子は、乳癌の悪性度を規定するサブタイプ分類に用いられるエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、HER2蛋白の発現、増殖指標であるKi67labeling indexを免疫組織染色にて判定した。また病期分類に用いられるリンパ節転移の有無との関連も検討した。造影超音波における内部の染影は全例不均一な染影であった。エストロゲンレセプター発現が陰性の症例において内部不染域を認める腫瘤が有意に多かった。またリンパ節転移を伴う症例は内部不染域のある腫瘤が多い傾向であった。他のHER2発現の有無、Ki67値の高低では染影所見に差は認めなかった。血流の不均一性が強く、低酸素領域の存在が推測される内部不染域の所見は、エストロゲンレセプター陰性やリンパ節転移などの悪性度の高い乳癌や進行した乳癌と関連する可能性が示唆された。またエストロゲンレセプターは治療標的としての役割もあり、乳腺造影超音波検査で内部不染域を認める場合、内分泌療法が奏功しない可能性も示唆された。原発乳癌における乳腺造影超音波検査施行例は集積されてきており、乳癌の悪性度との関連も解析できているが、薬物療法前後で造影超音波検査を施行した症例の集積が遅れており、薬物療法に対する反応性と造影超音波検査所見との関連を解析できていない。薬物療法後の手術症例に対する造影超音波検査施行例が集積できていないため、組織学的検討が進んでいない。乳癌における腫瘍内血流と薬物療法の効果との関連を検討するため、原発性乳癌に対して術前薬物療法を施行する患者に対して乳腺造影超音波検査を施行した。非奏功においては腫瘍内血流の変化は乏しかった。薬物療法の効果は臨床病理学的因子との関連がみられるため、造影超音波検査所見と病理学的因子との関連を検討した。乳癌の悪性度と薬物療法の効果予測として用いられるエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、HER2蛋白の発現、細胞増殖の指標であるKi67labeling indexを免疫組織染色にて判定し、造影超音波検査所見との関連を解析した。また、腫瘍量を反映し、病期分類に用いられるリンパ節転移の有無との関連も解析した。エストロゲンレセプターの発現が陰性の症例においては腫瘍内血流の不均一さを多く認めたが、プロゲステロンレセプター、HER2蛋白発現、Ki67値との関連は認めなかった。また、リンパ節転移を伴う症例は、内部血流が不均一な腫瘤が多かった。内部血流が不均一な所見は、エストロゲンレセプター陰性やリンパ節転移などの悪性度が高い乳癌と関連する可能性が示され、エストロゲンレセプターの発現は治療標的となる可能性があるため、治療効果が超音波検査所見と関連する可能性が示唆された。

純粋な腫瘍内血流を評価できる造影超音波検査は癌の悪性度を簡便に評価できる可能性があると推察される。薬物療法奏功例に関しては腫瘍縮小と同時に腫瘍内血流の均一化を認めた。乳癌の病理学的背景と腫瘍内血流の関連を解析し、エストロゲンレセプターの発現が陰性の症例においては腫瘍内血流の不均一さを多く認めた。エストロゲンレセプターの発現は治療標的となる可能性があるため、治療効果が超音波検査所見と関連する可能性が示唆された。今後も積極的に薬物療法患者に対する造影超音波検査の実施を進めていく予定である。薬物療法終了後に手術を施行された患者が蓄積されてきているので、病理学的検討を進めていく。日常臨床における造影超音波検査の施行を積極的に行い、基礎的検討も含めさらに解析を進める必要がある。外科学一般研究計画では、実診療内において実施した検査のデータ収集とそれを元にした基礎実験であったが、当該年度において実施できた研究のほとんどは診療内におけるデータ収集と解析であり、研究物品などの支出が少なかったため。研究計画では解析に必要な検査症例が集積予定であり、それに基づいた検討が行われる予定であったが、実際にはまだ症例の集積が十分でなく、基礎的検討が進んでいない。そのため実験試薬などのための使用額が増えていない。次年度においては収集したデータを元にした基礎実験を継続していく予定であり、実験試薬などの支出が増加する予定である。集積した症例のデータを解析し、基礎的検討を行う予定であり、実験試薬の支出が増加する予定である
光線力学診断を利用した新しい肺区域同定法の開発

光線力学診断(Photodynamic diagnosis)用内視鏡システムおよびビタミンB2水溶液による蛍光法を利用した新しい肺区域同定法の確立を目指し、まず、ブタ心肺摘出ブロックを使用した肺区域切除モデルにおいて本手技の確立および有用性を評価し、有用性を証明した。ついでブタ生体における動物実験にて本法の有用性・安全性を評価し、十分な有用性・安全性を証明した。H23年度の研究にて実験計画通り、ブタの摘出肺(心肺ブロック)を使用し光線力学診断(以下PDD)用内視鏡システムおよびビタミンB2水溶液による蛍光法を利用した肺区域同定法を確立し、その有用性(蛍光による正確で十分な区域描出能、描出時間)を論文報告した。H24年度研究では、計画通り前年度に確立したPDD用内視鏡システムおよびビタミンB2水溶液による蛍光法のよりヒト臨床での想定に近づけるべく麻酔動物(ブタ)において本法の有用性・安全性の評価を行った。本年の研究では、有用性の評価として、1生体内でも十分な蛍光強度が得られるか、2区域切除を施行することを想定し十分な蛍光の持続時間が得られるか、3実際に施行された区域切除の精度を評価した。安全性の評価として1本法により施行された肺区域切除の合併症評価、2ビタミンB2水溶液を気道内投与し、投与後2週間の経過観察を行い、投与後の合併症評価、さらに犠牲死後の肉眼的病理学的評価を行った。本年度の研究では、3頭の予備実験の後、計6頭で本手技の評価を行った。結果として、6頭すべてで十分な区域の蛍光標識が可能で、精度の高い区域切除を施行可能であった。すなわち、生体内でも十分な蛍光強度・時間が得られ、正確な区域同定が可能であった。さらに、本法に伴う合併症は認めず、実験動物における安全性が確認できた。現在、本結果の論文報告の準備中である。また、現在、本結果を持ってヒト臨床への導入を計画している。肺区域切除を行う際には正確な肺区域同定は必要である。本研究の目的は、新しい肺区域同定法としてビタミンB2による光線力学診断(Photodynamic diagnosis;PDD)を利用した方法を確立し、有用性を検証することである。本年度は、実施計画通りブタ心肺摘出ブロックを使用した肺区域切除モデルにおいてPDDによる肺区域切除手技を確立した。具体的にはまず肺区域切除モデルとして肺区域同定が容易(区域同定面が1面)な右前葉における区域切除と難易度の高い(区域同定面が2面以上)右後葉における区域切除を設定した。ついで、手技はモデルにおける区域気管支を同定した後、シリンジによる用手的な蛍光物質の注入を選択、蛍光物質の条件は本実験においてはビタミンB2の生理食塩水による50倍希釈液が適していることを確認した。上記、肺切除モデル・条件にて右前葉10例・右後葉10例の切除を施行した。評価は計画通り、(1)PDDによる肺区域描出能の肉眼的評価(A:明確、B:明確ではないが肺切除可能、C:不明確で切除不能)、(2)録画画像から蛍光部の光量および持続時間を評価、(3)同定された肺区域間の病理学的評価を行った。結果として検討(1)では右前葉切除においてA:9、B:1、C:0、右後葉切除においてA:7、B:3、C:0と良好な区域描出能で考えられた。検討(2)において蛍光部の平均輝度142±13(非蛍光部は50以下)と十分な光量が得られており、注入後1時間経過しても光量の減少は認めなかった。検討(3)では、PDDにより認識された区域間面をH-E染色、Azan染色にて評価、区域間面に弾性繊維を認め、正確な区域が描出されていると考えられた。以上の結果より肺切除モデルにおいては、本手技は確立できたと考え、現在次年度計画にあるブタ生体での評価を進めている。H23年度に計画した内容、ブタ心肺ブロックを使用したPDDによる肺区域同定手技はほぼ確立し、良好な成績であった。現在、この結果からH24年度の計画通りブタ生体での本手技の確立および有用性・安全性の検証に取り掛かっている。計画通り本年度に確立したPDDによる肺区域同定手技を利用し、麻酔動物(ブタ)の使用した生体における本手技の確立、有用性・安全性の評価を行う。成豚(体重30Kg程度、12頭)に対し、右前葉における区域同定・切除6例、右後葉における区域同定・切除6例を予定している。評価は本年度と同様、(1)PDDによる肺区域描出能の肉眼的評価(A:明確、B:明確ではないが肺切除可能、C:不明確で切除不能)、(2)録画画像から蛍光部の光量および持続時間を評価、(3)同定された肺区域間の病理学的評価を行う。また本年度までの成果の学会発表・論文発表を行う予定である。今年度の未使用額は、情報収集及び成果発表の為の旅費が予定していたより少なかった点、また消耗品である薬剤費用が予想より低くなった点が挙げられる。

本年度と同様のPDD用内視鏡機材にかかる費用、次年度では新たに気管支鏡も併用するため同機材にかかる費用、ブタ生体を使用した手術実験となるためブタおよび必要な薬剤などにかかる費用など、次年度計画書に示した通りの使用予定である。また、成果の発表や情報の収集のための学会参加(国内・国際)が予定されており、こちらについても計画書に準じた使用予定である。
住宅周囲の植栽による微気象の変化を考慮した室内熱環境の予測・評価

住宅周囲の植栽による微気象の変化をとらえる手法として、熱放射解析と数値流体計算(CFD)の連成手法を提示した。本手法では市街地の表面近傍における詳細な乱流構造とキャノピー内の長波長放射の輸送プロセスを再現するために、非構造格子の有限体積法に基づくラージ・エディー・シミュレーション(LES)と放射強度の輸送方程式に基づく放射解析手法の導入を行った。また、表面の熱伝達と乱流場の相互作用を再現するために市街地表面の熱伝導計算とLESによる乱流解析の間での連成方法の検討を行った。LESの流入条件についてはメソ気象モデルに基づく夏季晴天日の温度の鉛直分布を考慮した大気境界層のLESを実施し、温度と風速の時空間データベースを作成した。次に、市街地における連成手法の有効性を確認するために、ドップラーライダーと地上における気温・風速の観測結果との比較を実施し、都市キャノピー内における風速と加熱された市街地表面からの気温の上昇のプロセスが再現されていることを確認した。さらに複雑な形状を有する実市街地において本連成解析手法を適用し、建物表面近傍に生じる詳細な渦構造が建物表面からの熱放散過程に及ぼす影響を示すとともに、屋外空間における風速・温度の変動特性を明らかにした。その結果、周囲の建物群によって形成された複雑な乱流場は市街地内の流れのパターンを非定常的に変化させるとともに、熱環境に12°C程度の瞬間的な気温の上昇・下降をもたらしていることを示した。住宅周囲の植栽による微気象の変化をとらえる手法として、熱放射解析とLESの連成手法を導入することにより、住宅周囲の微気象の微細な変化をとらえることが可能となり、微気象の空間分布のモデル化を行うための風速・気温の時空間データベースを取得できるようになった。本年度構築した熱放射解析とLESの連成手法に基づき住宅周囲の微気象に関するデータベースを整備したうえで、開口部近傍の微気象ゾーンモデルの提案と予測精度の向上を図る。夏季に良好な屋外微気象が得られる手法として開口部近傍の植栽に散水を行った場合に着目し、多点同時計測システムによる測定結果から気温・風速・湿度の空間分布特性を明らかにした。その結果、蒸発の駆動力である大気飽差と植栽前後における気温差との間に正の相関が見られ、大気飽差が3.0kPaとなる条件において開口部近傍気温が周囲より最大で3°C低下することを確認した。また、植栽の蒸発散効果による全熱の変化から,日中は顕熱を取得せずに窓を開放できる時間が3時間ほど増加し,一定のパッシブクーリング効果が得られる可能性を示した。また、開口部近傍に配置する植栽の熱収支の分析として、住宅の植栽として用いられることの多いキンメツゲ、シマトネリコ、シラカシを対象とし、多点同時計測システムの実測結果から植栽による風速減衰(抵抗係数)と対流熱伝達率を植栽全体の熱収支・運動量収支により同定した。その結果、風速と正の相関をもつ植栽の対流熱伝達率が得られた。植栽による冷却効果や風速の減衰の詳細については今後実施するCFD(数値流体力学)解析等の結果を踏まえ、予測精度の向上について検討を行う。さらに、実市街地における開口部近傍の微気象ゾーンモデルの適用性を確認するために低層建物が並ぶ市街地を対象として観測結果より屋外熱放射環境の実態を明らかにした。その結果、高層集合住宅や周囲の住宅によって日射遮蔽・蓄冷された地物により周囲よりも12°C低い気温場が形成されることを確認し、開口部近傍における気温の低下による建物熱負荷・室内熱環境への影響を明らかにした。今後この知見も活用し、開口部近傍の微気象ゾーンモデルにおける境界条件の設定方法やゾーンモデル内の微気象の空間分布のモデル化について検討を行う予定である。今年度は多点同時計測システムにより測定された植栽の周囲における気温・風速・湿度の空間分布特性から、植栽と蒸発冷却による開口部近傍気温の低下について気温や大気飽差などの気象条件との関係を整理することができた。一方で、植栽による風速低減効果および関連パラメータの同定には精度上現状でばらつきがあり、その評価方法について今年度実施予定のCFD解析による微気象の空間分布の把握とともに検討が必要である。

住宅周囲の植栽による微気象の変化をとらえる手法として、熱放射解析とLESの連成手法を導入することにより、住宅周囲の微気象の微細な変化をとらえることが可能となり、微気象の空間分布のモデル化を行うための風速・気温の時空間データベースを取得できるようになった。局所的な微気象の空間分布を考慮しながら室内における期間的な気温・湿度変化を予測する方法を構築するために、CFD解析により開口部近傍に形成される微気象の空間分布を把握したうえで、1植栽の表面積、形状などのパラメータに基づく冷気の生成効果を予測する方法の検討、2植栽から発生した冷気の室内への移流・拡散過程をマクロに予測するモデルの構築を実施する。本年度構築した熱放射解析とLESの連成手法に基づき住宅周囲の微気象に関するデータベースを整備したうえで、開口部近傍の微気象ゾーンモデルの提案と予測精度の向上を図る。
地震発生時長期予測モデルの研究

地震発生時長期予測モデル確立のため、まだその適用性が確かめられていない内陸地震に対し、タイムプレディクタブルモデル(以下TPモデルと略称)が成り立つかどうかを別府湾北西部の海底活断層を例として調べた。また同モデルと断層面上の変位量分布との関係、さらに近接断層の相互作用について予備調査を行なった。この結果、次の点が判明した。1.地震の繰り返し発生はTPモデルと調和的であり、同モデルは内陸地震に対しても適用可能と考えられる。2.断層面上の変位量は走向方向に2倍程度変化し、その分布は地震ごとに必ずしも同一ではない。よって断層上の各点でTPモデルが厳密に成り立つ訳ではない。3.併走し約2.5km離れた断層で互いに独立と考えられる地震発生歴が推定された。以上の点から、地震発生時長期予測モデルとして、TPモデルは妥当であると結論した。ただし、断層面上の局所的な変位量に対し同モデルを厳密に適用することは避けるべきで、ある程度の誤差を考慮しなければならない。また、近接断層では必ずしも相互作用が認められるとは限らないので、近接断層系の地震危険度推定については、今後十分な検討を必要とすることがわかった。今回の調査から別府湾北西部約4km×10kmの地域に断層密集地域があることが判明した。36枚の断層セグメントが認められた。いずれも東西走向の正断層で変位の累積性を持つ活断層である。ボーリング調査でTPモデルの適合性が確められた活断層は、断層分布域の北端に近く、走向:北110°東、傾斜:約70°南で、全長3.8kmのセグメントである。過去6000年間の累積上下変位量は、東端付近で最大となり、6.6mに達する。地震発生時は約5440年前、3930年前、1615年前と推定された。これに対し約2.5km離れた分布域南端付近の北落ち正断層では、約500年前、約4400年前に地震発生が推定され、両者の系列は独立なものと考えられる。
単一アクチンフィラメント直視による重合・脱重合ダイナミクス機構の解明

アクチンは全ての真核細胞に存在して柔らかい細胞骨格を担うが、フィラメント1本の動的メカニズムは明らかでない。アクチンフィラメント1本の重合・脱重合ダイナミクスのメカニズムを解明するため、純粋なアクチンフィラメント1本の重合過程を直視した結果、アクチンフィラメントは重合相においても定常相においても長さが揺らいでおり、解析から重合・脱重合過程はアクチン分子の結合・解離がフィラメントの両端で確率的に生じる拡散過程とみなせることを明らかにした。更に詳細な解析を行う為、蛍光染色したアクチンフィラメントの一部に集光レーザーを数秒照射し強制退色させ、目印をつける系:フォトブリーチングシステム:を導入した。この実験から、生理的条件下ではアクチンフィラメントには速く重合する端と遅く重合する端があり、どちらの端も時間が経っても殆ど脱重合しないことが観察され、世界に先駆けてトレッドミルを証明することが出来た。この系を利用して、アクチン調節タンパク質トロポミオシン、トロポニンを入れた重合・脱重合過程の直視を行った。この系によって過剰のトロポミオシンを添加するとアクチンフィラメントが束化するバンドル化現象のリアルタイム観察をすることができた(日本生物物理学会名古屋2002/11)。また、アクチン内部のヌクレオチドがADP-Piであるとき、フィラメントが安定化されることが報告されていることから、本実験系においても無機リン酸Piを添加し、フィラメントの両端での重合・脱重合が穏やかになるかどうかを検討した。(Biophysical Society 46th Anuual Meeting 2003/03 SanAntonio)ついで、東大医科研竹縄研の末次志郎氏との共同研究で、アクチン結合タンパク質であるArp2/3complexによる枝化アクチンフィラメントの重合実験を行った。リアルタイム観察から、Mother filamentのP端寄りに枝が形成されやすいことを示した。また光ピンセット系を用い、Arp2/3complexとVCAの問の破断力が約6pNであることと、ミシンS1から見積られる結合寿命を参考に、Arp2/3complexとVCAの間の結合寿命が100秒であることを示した。
バンコマイシンヘテロ耐性黄色ブドウ球菌の検出に関する研究

細菌は自然発生的に一定の割合で耐性細胞が出現する。この状態をヘテロ耐性をよぶ。一方で、バンコマイシン中程度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)が検出されているが、それ以上にヘテロVISAが多い。ヘテロVISAはVISA細胞を含む細胞集団であり既存の方法では検出できない。このヘテロVISAをMICで検出するには0.012%以上のVISA細胞が必要であることから、MIC測定菌量としては通常の10倍量が必要であった。さらにVISA株特異的蛋白の存在をMALDI-TOFで確認している。Hetero-VISA(Vancomycin intermediated-resistant Staphylococcus aureus)はバンコマイシンが効かなくなる前段階の細胞集団である。この細胞集団の中にはVISA(VCMのMICが4μg/mL以上もしくは2μg/mLより大を示すS. aureus)細胞が含有されており、この耐性細胞がVCMによって選択され、結果的にVCMが効かないVISA細胞集団へと代わっていく。よって、VCM耐性菌を増やさないためにも、VCMの効果を持続させるためにもhetero-VISAの段階で検出する事が必要である。このhetero-VISA中に含まれるVISA細胞数を人為的に変える事でVCMのMICの変化を確認した。その結果、0.1%程度の含有率で10倍以上のMIC値を示す事を突き止めた。その後、さらに詳細に検討した結果、0.006%程度のVISA細胞含有では感性株と大差ないMIC値だったが、その2倍である0.012%では4倍から8倍のMICの動きが確認された。つまり、0.012%程度のVISA細胞が含まれていれば細胞全体のMICが4倍以上になる事を見出した。Heteo-VISAの検出方法として、従来用いられているMIC法で検出できる可能性が示唆された結果から、本研究は順調に推移している。このMIC法での検出はpopulation解析によっても指示されており、今後の研究次第では有用な方法になると思われる。Hetero-Vancomycin intermediated-resistant Staphylococcus aureus (hetero-VISA)はバンコマイシンが効かなくなる前段階の細胞集団である。この細胞集団の中にはVISA(VCMのMICが2μg/mLより大、もしくは≧4μg/mLを示すS. aureus)細胞が含有されており、この耐性細胞がVCMによって選択され、結果的にVCMが効かないVISA細胞集団のみへと選択される。前研究ではVISA細胞が0.012%含有されていれば、既存の方法のMICでもある程度検知できることがわかった。今回はさらに研究をすすめ、VCM感性株と≧4μg/mLの株を、Matrix- assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOFMS)で検出されるピークの差を比較した結果、≧4μg/mLの株に特異的なピーク(蛋白)を見出した。平成26年度はGFP蛍光発光を応用してhetero-VISA中のVISA細胞を検出する計画を立てていたが、細菌に応用可能な蛍光試薬販売の中止と本研究担当者のリタイアによって蛍光発光による検出は断念せざる得ない状況となった。しかし、本質的な目的であるhetero-VISAの検出は別法によって実施できていることから、本研究は順調に進展している。Hetero-VISAの検出方法は、従来法の一つである寒天平板希釈法によって実施可能と考えられるが、現在幅広く普及している液体培地希釈法についての検討を推進する。さらに、Hetero-VISA中に含まれるVISA細胞の含有率と感染症への影響についての検討も推進する。感染症学細菌学平成26年度の研究結果から、hetero-VISA中に含まれるVISA細胞数とVCMのMICには強い相関がある事が分かった。この相関を利用して、より少数のVISA細胞が含まれる状態でもMICとして検出可能な培地の選択、もしくは開発を行う検討を推進する。本研究に使用する臨床分離株の収集を予定していたが、実施時期が遅れたため、それらに必要な消耗品費などに使用する予算を繰り越すこととなった。次年度には、予定している臨床分離株収集を進め、確立する検出方法の評価・検証に用いる。