hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動記憶の時間依存的変化の解明

本年度は、1.運動記憶を繰り返し想起したときに、時間経過依存性の忘却プロセスが止まり、その後再び動き出すこと、2.運動記憶の想起は運動記憶の時間依存減衰を食い止める効果を持つこと、の2点を明らかにした。1.腕到達運動中に新奇力場に適応する実験を行うと、形成された運動記憶は時間経過とともに減衰し、60秒程度経過すると一定値に達するというパターンを示す。佐々木氏は、この60秒間の間に、繰り返し運動記憶を想起すると、運動の繰り返しによる減衰が観察されるとともに、その後、本来見られないはずの時間経過依存性の減衰が観察されることを発見した。これは運動記憶を繰り返し想起することにより、時間経過依存性の忘却プロセスが止まっていたことを意味する。2.様々な時間(4, 20, 40, 60秒)の間、単純に待機、もしくは運動記憶想起を繰り返した後、さらに60秒間経過したときの運動記憶の減衰度合いを調べた。すると、待機をした場合と運動記憶想起を繰り返した場合を比較すると、繰り返し運動記憶想起をした方が、運動記憶は短期的には減衰しにくいことを明らかにした。運動を繰り返した場合には記憶の減衰が生じるにも関わらず、記憶想起を繰り返した方が時間経過で減衰しにくいという結果は、運動記憶の想起は運動記憶の時間依存減衰を食い止めるという仮説に対しての、直接的な証拠とみなすことができる。特に上記1の研究は、Motor Control研究会の若手奨励賞に選ばれるなど、高い評価を得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。そこで、ヒトの運動記憶が持つ時間依存動態を調べるため、腕到達課題を用いて実験を行った。このとき、ロボットマニピュランダム(KINARM End-point Lab, BKIN Technologies)を用い、実験条件を厳密に統制することで、運動記憶の忘却、形成それぞれに特徴的な時間依存動態を観察することに成功した。まず、運動記憶の忘却に関しては、予備実験で明らかになった通り、運動記憶の想起が、時間に依存した忘却を防ぐ効果を持つことを再度確認した。また、運動記憶の形成に関しては、時間に依存して記憶形成効果が線形に増加するのではなく(Huang & Shadmehr, 2007, JNP)、ある時間を境に、形成効果が失われることを明らかにした。この結果は、先の研究結果とは異なって、時間に依存した忘却を考慮したものであり、実験条件もより統制されたものとなっている。したがって、数理モデル化にも十分耐えうるデータであり、同時に、運動記憶の性質により良い理解をもたらすものと考えられる。成果は国際学会で発表を行ってきた。また、実験のブラッシュアップも十分に行い、数理モデルを構築するために必要なデータも揃っている。現在は論文執筆段階であり、したがって、おおむね順調に進展していると言える。十分に獲得した運動記憶であっても、その一部は60秒程度で失われることが知られている。先行研究では、この時間依存減衰は単調に進むとされていたが、昨年度までに申請者は、運動記憶の想起直後は、運動記憶の時間依存忘却が一時的に止まることを明らかにしていた。一方で、この一時的な時間依存忘却の停止は、運動記憶を想起したために起きるのか、それとも、元々の運動記憶の時間依存の振る舞いなのかは、昨年度までに明らかにできなかった。本年度は、運動記憶の想起が運動記憶の時間経過依存性忘却を食い止めることを、実験的に明らかにした。運動記憶形成のため、前方へ手先を動かす腕到達運動に、横向きの速度依存性の力場を印加した。その状態で、手先軌道を直線的に動かすような運動を被験者に覚えてもらい、運動記憶の形成を行なった。十分に運動記憶を形成したあと、運動記憶の時間依存忘却が始まった段階で、1度運動記憶の想起を行い、その後の運動記憶の時間依存動態を調べた。すると、運動記憶の時間依存性の忘却が始まった後でも、運動記憶の想起をすると、運動記憶の時間依存の忘却は止まり、単調減少を示さないことが明らかになった。

また、運動記憶の想起をしない場合には、先行研究通り、運動記憶は時間に依存して単調に忘却することも合わせて明らかとなった。以上より本年度は、陳述記憶の想起同様、運動記憶の想起は時間に依存した忘却を食い止める効果があることを確かめたと言える。運動記憶の想起が、運動記憶の時間依存忘却を食い止める効果を持つことを明らかにすることができたため。特に、時間依存忘却が始まった後に、運動記憶の想起の有無で、運動記憶の時間依存動態の違いを明らかにできたため。論文執筆、投稿を終えた後に、運動記憶の時間依存動態を司る脳部位を明らかにする。具体的には、運動記憶の忘却、形成の時間依存動態と相関するような脳部位を発見し、その部位に対する介入を行うことで、発見された脳部位と運動記憶の時間依存動態との因果関係の発見を目標とする。これにより、今まで明らかになっていなかった運動記憶の新たな側面に光を当て、よりよい運動記憶の理解を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。繰り返し記憶想起を行なった場合の運動記憶の時間依存動態を調べ、運動記憶想起と、時間依存忘却の進行との関係を明らかにする。
細胞膜局所構造解析による膜ドメイン形成メカニズムの解明

アミロイドβペプチド(Aβ)単量体はホスファチジルコリンのみから成る脂質膜に対しては、ラメラゲル相の場合のみ結合し、液晶相では結合しない。脂質分子が密にパッキングした膜はペプチドの非静電相互作用による膜結合および分子間会合の場を提供する可能性がある。一方、凝集してβシート構造を形成したAβはゲル層と液晶相の両方のホスファチジルコリン膜に対して結合する。凝集Aβの結合は液晶相膜の流動性を顕著に低下させる。膜ドメイン(脂質ラフト)は、細胞の標々な機能発現のために必要に応じて形成される動的かつ機能的な分子群であるが、アルツハイマー病の発病やウイルス感染においても重要な役割を演じていると考えられている。本研究は、膜ドメインがどのような分子機構に基づいて形成され、タンパク質の構造と機能を制御しているかを、構造生物学の立場から解明することを目的とする。21年度の研究実績を以下に記す。(1)膜ドメインの主成分であるスフィンゴミエリンのみからなる脂質二重膜に対するアミロイドβペプチド(Aβ)の結合を、チロシン残基の蛍光を利用して調べた。蛍光強度の対温度プロットの解析から、Aβは液晶相の膜とは結合しないが、ラメラゲル相の膜に対しては結合することがわかった。Aβが細胞膜の膜ドメインに集積するのは、膜ドメインにおいて、スフィンゴミエリン分子が密にパッキングされていることが原因のひとつである可能性がある。(2)スフィンゴミエリンとコレステロールの混合脂質膜存在下では、Aβの蛍光強度の温度依存性は、スフィンゴミエリン単一成分の脂質膜では見られなかった複雑な挙動を示し、Aβの結合が脂質膜の構造に影響を及ぼした可能性が示唆された。この組成の混合脂質膜は、細胞膜中の膜ドメインと同様に秩序液体相をとることができる。観測された蛍光強度の変化が、膜のどのような構造変化を反映しているかを明らかにすることは、Aβの膜ドメイン集積メカニズムのみならず、膜ドメイン形成メカニズムの解明にもつながると期待される。(3)ラマン分光法を用いて、細胞膜中の膜ドメインからの構造情報を選択的に得るための新規手法を開発するための基礎研究を行なった。本研究は、膜ドメイン(脂質ラフト)がどのような分子機構に基づいて形成され、タンパク質の構造と機能を制御しているかを、構造生物学の立場から解明することを目的とする。21年度に行なった研究により、アミロイドβペプチド(Aβ)は液晶相の膜とは結合しないが、ラメラゲル相の膜に対しては結合することがわかった。このことは、膜ドメインの主成分であるスフィンゴミエリンの脂質二重膜についても確認された。以上の結果から、Aβが脂質膜の膜ドメインに集積することは、膜ドメインにおいて、スフィンゴミエリン分子が密にパッキングされていることと関係している可能性が示された。上記の知見を踏まえて、22年度にはタンパク質の膜ドメイン集積のメカニズムを解明するための研究を行い、次の成果を得た。(1)膜ドメイン中の脂質膜はコレステロールを豊富に含むため、ラメラゲル相ではなく秩序液体相をとると考えられる。そこで、コレステロールを含む脂質膜に対するAβの結合をチロシン残基の蛍光を利用して調べた。蛍光強度の温度依存性の解析から、コレステロールを含む脂質膜であっても、脂質分子が密にパッキングされている方がAβペプチドに対して高い親和性を持つことがわかった。Aβが結合した膜が秩序液体相であるか否かについては、23年度の研究により明らかにする予定である。(2)脂質膜の相に依存する親和性の変化が、タンパク質側のどのような性質に起因するか調べるため、種々のタンパク質と脂質膜の相互作用の温度依存性を調べた。その結果、卵白リゾチームのような、通常は脂質膜に対して親和性を持たない球状タンパク質でも、ゲル相の膜に対しては結合する可能性が示された。さらにタンパク質の種類を増やし、得られるデータを多角的に解析することにより、タンパク質の膜ドメイン集積のメカニズムが明らかになると期待される。本研究は、脂質ラフトがどのような分子機構に基づいて形成され、タンパク質の構造と機能を制御しているかを、構造生物学の立場から解明することを目的とした。23年度の主な研究成果を以下に記す。(1)ホスファチジルコリン(PC)膜に対するアミロイドβペプチド(Aβ)の結合、および結合が膜の流動性に与える影響を調べた。Aβ1-40は液晶相のPC膜には結合せず、ラメラゲル相のPC膜に対してのみ結合する。これに対して、Aβ1-42は液晶相とゲル相のどちらのPC膜に対しても結合する。Aβ1-42の結合により、液晶相PC膜の流動性は顕著に減少し、特にペプチド高濃度ではゲル相膜の流動性に匹敵する程にまで低下した。次に、液晶相膜に対する親和性および流動性に与える影響がAβ1-40とAβ1-42とで大きく異なる原因を調べた。

その結果、Aβ1-40は水溶液中で不規則構造のモノマーとして存在するのに対し、Aβ1-42は溶解直後から分子間で会合し、βシートを形成していることがわかった。即ち、Aβモノマーは液晶相膜に対しては、膜表面に負電荷が存在しない限り結合しないが、オリゴマー化したAβは結合し、膜の流動性を低下させると考えられる。(2)Aβ1-42オリゴマーの結合が膜の構造に与える影響をラマン分光法により調べた。結合により、液晶相のPC膜の流動性がゲル相に匹敵するレベルまで低下することから、脂質炭化水素鎖のコンホメーション変化が引き起こされると予想されたが、Aβ1-42オリゴマーが結合しても、トランス型とゴーシュ型のコンホーマー比にほとんど変化は見られなかった。これらの知見は、アルツハイマー病の原因となる、脂質膜上におけるAβ集積・会合のメカニズムを解明するうえで、重要な鍵となると考えられる。また、本研究により、オリゴマーの結合による流動性の低下が脂質ラフト形成の契機となる可能性も示された。
山間農地の保全と再編整備に関する研究

本来、農業において最適な土地基盤である平坦地から農地が締め出されていく中、秩序ある食糧自給体質の強化を目途として山間傾斜地への農地の造成が行われ、また在来の傾斜地の存在意義が見直されるつつある。本研究は、山間開発農地における土壌侵食防止対策を、農地の開発が在来の農地に与える影響も加味した総合的観点から検討し、次に急傾斜地に存在する棚田や段畑の合理的な再編整備手法を、農地環境保全の視点から考察した。先ず、国営中国四国農政局広島中部台地開拓建設事業所管内における土壌侵食の実態把握調査とUSLE手法による解析の結果、一つは平畝裸地状態における土壌侵食防止対策として菰による圃場面被覆率が60%を越えれば年間流亡土量が許容値以下に削減できる事、流路に直交して簡易溝を10m間隔で設置した場合、流亡土量を大きく減少させうる事、さらには縦畝栽培での畝長の短縮及び畝間被覆の効果が大きい事等を明らかにした。これらは、中国地方におけるその他の開発農地の諸試験事例とも良く適合し、造成農地の保全管理は造成直後の土壌侵食防止対策の実施(例えば縦畝栽培や圃場末端での横畝や枕畝の設置、畝間への敷藁被覆等)のみならず、営農段階での関係農家のたゆまぬ土づくり及びその他営農努力によってなされるものであると言えよう。また、岡山県久米南町の棚田地帯での調査の結果、傾斜の上下方向を一体的に整備する必要のある急傾斜地では、傾斜度1/8程度を目安としてより急な部分はまちなおし整備と道・水路整備の柔軟な組合せを、またより緩やかな部分は余り高畦畔とはならない整形整備とする様な、傾斜の上下方向における整備方式の合理的組合せにより、保全を考慮した再編整備がはかれると考えた。
角膜アメ-バ症の基礎と臨床に関する研究

ミトコンドリアDNAによるタイピングにより角膜および土壌由来のアメ-バの分類をした。従来の方法による分類との異同について今後検討が必要と思われた。PCR法が本症の迅速診断に有用であることを示した。yeastーNN agar法でアメ-バを培養すると、寒天表面にほぼ円形のプラ-クが形成されるのを発見した。このプラ-クの大きさをコンピュ-タ解析すれば、迅速しかも簡便に相対増殖率の推測が可能で、本法を各株の温度耐性の決定に応用し得る事が判った。感染源として重視すべき土壌内のアメ-バの分布を札幌、東京、那覇で行い、各々70.5、73.9、57.6%に出現した。日本では外国以上にアメ-バが分布している事が判った。土壌内の垂直分布は10ー15cmの範囲では差がなかった。風によるシストの飛散については、高さ1m以上の木葉上からも高率に分離され、風により空中を移動する事が判った。温度による形態の変化は、10ー37°Cの範囲ではほぼ安定した結果が得られる。アカントアメ-バ角膜炎の患者7例を経験し、診断にはパ-カ-インクKOH法などによる直接鏡検が重要である事が判った。治療はトリアゾ-ル系抗真菌剤の内服、ミコナゾ-ル点眼、病巣掻爬の3者併用が現在では最も良い方法と考える。特に問題なくCLを装用している健常者96者のCL保存液の培養で約10%にアメ-バが分離された。このうち4%はアカントアメ-バであった。CL保存液の衛生管理の必要性があると思われた。CLの素材の違いによってアメ-バの接着にはあまり差がないと考えられた。動物モデルの確立には、動物の種類、接種法の改良、アメ-バの増殖時期など、かなりの検討が必要と思われる。分離したアカントアメ-バの角膜由来の4株、ソフトコンタクトレンズ由来の4株、および土壌由来の10株、合計18株についてミトコンドリアDNA(mtDNA)によるタイピングを行った。本原虫のmtDNAの大きさは40ー42Kbpで、稀れに50Kbp以上の大きなmtDNAを持つ株も得られた。角膜由来の株と土壌株の間に同一のタイプは認められなかったが、レンズ由来の株には角膜と土壌から得られたそれぞれのタイプと共通するものが認められた。株間相互の遺伝距離は土壌由来の極く一部の株を除き、ほぼ同一種として総括できるくらいの距離にあることが明らかとなった。YeastーNNAgar法でアメ-バを培養すると、寒天表面にほぼ円形のプラ-クが形成されるのを発見した。このプラ-クの大きさをコンピュ-タ解析すれば、迅速しかも簡便に相対増殖率の推測が可能で、本法を各株の温度耐性の決定に応用し得ることがわかった。シストの空中飛散状況の調査に樹木の葉からアメ-バを検出する新方法を開発した。培養条件の改善には溶存酸素がとくに重要である。札幌市内のコンタクトレンズ装用者84名のレンズとその保存容器146検体中6件にアカントアメ-バを検出した。夏期、東京都内の土壌80個所のサンプルのうち43件からアカントアメ-バを検出した。その分布は降雨、日照、pHとは関係なく、土壌表層の水平分布はもっぱらシストの空中飛散により平均化されることが示唆された。

本症の発症要因として重要なコンタクトレンズ装用との関連でレンズのコ-ルド滅菌法の効果、さらにレンズへのアメ-バの接着について研究が進行中である。アカントアメ-バ性角膜炎の診断にPCR法による迅速DNA検出法を検討した。標的DNAとして18Sリボソ-ムDNA(γDNA)領域を選び,その一定部分を合成するプライマ-を作製,温度,DNAの精製度などPCR反応の諸条件を検討した。またPCR増幅DNAを用いてアメ-バ分離株の制限酵素解析を行い、その迅速確定診断法としての有用性が示された。新たにアカントアメ-バ角膜炎の5症例を経験し,これらに対するイトラコナゾ-ルおよびフルコナゾ-ル内服の効果と,本症の初期と完成期における臨床所見の特徴について報告した。一方,各種コンタクトレンズに対するアメ-バの接着の様相とこれに対する洗浄効果の影響を検討した。患者が装用していたコンタクトレンズを走査電子顕微鏡で観察し,cystと思われる像を観察した。アカントアメ-バ角膜炎のウサギ実験モデルの確立にはもう少し時間がかかると考えている。札幌,東京,那覇の3地域の329カ所から得た土壤計987検体を検索し,70.5%からアカントアメ-バ属原虫が分離され,大部分はpolyphagidsグル-プであった。東京の土壤から分離した174株中からA.astronyxis,A.comandoni,A.castellanii,A.culbertsoni,A.hatchettiおよびA.polyphagaの6種を同定し,いずれもクロ-ン化した。シスト化した個体を30°Cで2カ月間維持したが、分類学的標徴の有意の変化はみられなかった。シストの微細構造について,A.astronyxisのシスト孔は4ー7個で,5個までの個体はすべてが赤道面上に配列し,それ以上では赤道と平行する別の平面上に開口する,また分類学的に重視されているostioleやoperculumの形状および相互関係の判定には光学レベルより走査電顕がより信頼できる,およびa.culbertsoniの外壁を構成する物質の構造密度は低いが,非常に厚い層であること,等が明かとなった。角膜炎患者6名よりアカントアメ-バを分離し,その同定を行なった。従来分離されたもの以外にA.culbertsoni.A.quindが得られた。感染源として重視すべき土壌内の分布を札幌,東京,那覇で行ない,各々70.5,73.9,57.6%に出現した。日本では外国以上にアメ-バが分布していることが判った。また土壌内における垂直分布についても調査した。しかし1050cmの範囲では差がなかった。さらに風によるシストの飛散の検討を行ない,風によって空中を移動していることが判った。高さ1m以上の木葉上からも高率に分離された。アメ-バ同定のための標準培養法の検討の一部として温度の影響を検討した。約1037°Cの範囲でほぼ安定した結果が得られた。しかし一部のものではこの範囲でシスト径が不安定になるものも見られた。さらにシスト化の要因についても検討したが温度がもっとも大きな要因であった。また脱シスト化については培地の成分のどれが影響を与えているか検討したが,これについてはさらに検討が必要と考えられた。現在コンタクトレンズの消毒について話題となっている過酸化水素水のシストに対する消毒効果を検討した。その結果,殺シスト用としては実用的でないと考えられた。アカントアメ-バ角膜炎の診断には病変部角膜擦過物の直接鏡検と分離培養が大事であることが,新たな3例の患者の経験より再強調された。本症の臨床所見としては初期,移行期,完成期に分けて考えるのが良いと思われた。
イムノグロブリンクラススイッチにおけるPI3Kによる制御機構の解析

本研究ではイムノグロブリンのクラススイッチ(CSR)制御機構におけるPI3K(p85α)と、関与するサイトカインシグナルとの関係について解析を行った。その結果、lipopolysaccharide (LPS)刺激によるIgG1、IgG3へのCSRがp85αノックアウトマウス由来のB細胞において著減することを確認し、CSRに必須であるgerm line transcription (GLT)、post switch transcript (PST)の形成、およびactivation induced cytidine deaminase(AID)の発現も減少していることを確認した。一方、LPS刺激にIL-4刺激を加える事により、p85αノックアウトマウス由来のB細胞にみられるIgG1、IgG3へのCSR不全が解除される事を見出した。以上の事はPI3Kが抗体のCSRの制御に深く関与している可能性を強く示唆するものであることに加え、その反応がサイトカインシグナルなどにより可逆的に制御可能であることが強く示唆された。これまでにクラスIA型フォスフォイノシタイド3キナーゼ(PI3K)の制御サブユニットであるp85αK0マウスにおいてIgEの産生亢進が見られる事を報告し、in vitroにおいてもPI3K阻害剤を用いる事でIgEへのクラススイッチリコンビネーション(CSR)が亢進する事を確認していたため、本研究ではp85αのCSR制御機構におけるp85αが制御する標的分子を明らかにし、CSRの人為的制御に繋げることを目的とし、PI3K依存的CSRに直接関与するサイトカインシグナルとPI3Kシグナルの関係について解析を行った。その結果、LPS刺激によるIgG1、IgG3へのCSRがp85αノックアウトマウス由来のB細胞において著減することを確認し、CSRに必須であるgerm line transcription(GLT)、post switch transcript(PST)の形成も減少していることを確認した。これまでにクラスIA型フォスフォイノシタイド3キナーゼ(PI3K)の制御サブユニットであるp85αKOマウスにおいてIgEの産生亢進が見られる事を報告した。in vitroにおいてもPI3K阻害剤を用いる事でIgEへのクラススイッチリコンビネーション(CSR)が亢進する事を確認し、p85αのCSR制御機構におけるp85αが制御する標的分子を明らかにすることを目的として、PI3K依存的CSRに直接関与するサイトカインシグナルとPI3Kシグナルの関係について解析を行った。その結果、LPS刺激によるIgG1、IgG3へのCSRがp85αノックアウトマウス由来のB細胞において著減する際に、CSRに必須であるgerm line transcription(GLT)、post switch transcript(PST)の形成も減少していることを確認できたことに加え、PI3Kシグナルの下流で鍵分子として働くことが想定されているAkt1/2がp85αノックアウトマウス由来のB細胞においてもリン酸化されることを明らかにした。このことにより、LPSシグナルはPI3Kを介さないAkt1/2の活性化を支配していることが示唆された。さらに、p85αノックアウトマウス由来のB細胞をLPS刺激した際、CSRに必須の分子であるAIDの発現も低下することが示唆された。転写因子の検索に於いて、NFkBおよび53BP1の関与が強く示唆された。一方、IgG2へのCSRの関与が報告されているT-betは、LPS刺激におけるPI3KとCSRの関連性において関連は見られなかった。これまでにクラスIA型フォスフォイノシタイド3キナーゼ(PI3K)の制御サブユニットであるp85αKOマウスにおいてIgEの産生亢進が見られる事を報告し、in vitroにおいてもPI3K阻害剤を用いる事でIgEへのクラススイッチリコンビネーション(CSR)が亢進する事を確認していたため、本研究ではp85αのCSR制御機構におけるp85αが制御する標的分子を明らかにし、CSRの人為的制御に繋げることを目的とし、PI3K依存的CSRに直接関与するサイトカインシグナルとPI3Kシグナルの関係について解析を行った。その結果、LPS刺激によるIgG1、IgG3へのCSRがp85αノックアウトマウス

由来のB細胞において著減することを確認し、CSRに必須であるgerm line transcription (GLT)、post switch transcript (PST)の形成も減少していることを確認した。一方、LPS刺激にIL-4刺激を加える事により、p85αノックアウトマウス由来のB細胞にみられるIgG1、IgG3へのCSR不全が解除される事を見出した。さらに、CSRに必須であるAIDの発現を調べたところ、p85αノックアウトマウス由来のB細胞においてLPS刺激で著減することを確認するとともに、LPS刺激にIL-4刺激を加える事により、AID発現の減弱が解除される事も見出した。また、NF-kB(p50)の発現もp85αノックアウトマウス由来のB細胞においてLPS刺激で著減するが、IL-4刺激を加える事によってその発現が改善することも明らかにした。以上の事はPI3Kが抗体のCSRの制御に深く関与している可能性を強く示唆するものであることに加え、その反応がサイトカインシグナルなどにより可逆的に制御可能であることが強く示唆された。活性化型Akt-MerをコードするDNAを導入したマウスを用いた実験に着手できていないため、Aktの非依存性に対して裏付けが終わっていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。Micro arrayによるPI3K依存性CSRを制御している転写因子およびサイトカインシグナルの同定をクラスター解析により、時空間的推移を解明する。それによりCSRの人為的制御に繋げるターゲットを洗い出す。
ハイペロン物質相と熱い中性子星

中性子星コアの高密度領域で存在しうるハイペロン物質の問題については相互作用の不確かさもあってなかなか現実的課題とはなって来なかった。しかし,最近では,中性子星の冷却問題に重要な役割をもつこと,ハイペロン-核子(Y-N),ハイペロン-ハイペロン(Y-Y)相互作用についての知見が増えていること,等を背景としてハイペロン物質への関心が急速に高まっている。本研究では(1)Y-N,Y-Y相互作用の今日的知見を生かしつつ,ハイペロン物質の現実的計算に適用しうる有効相互作用Vを構成すること,(2)ハイペロン物質相に於ける超流動の可能性を検討し,冷却問題への効果を調べること,及び(3)熱い場合を含むハイペロン物質相の計算(エネルギー,組成)を行い,この相が通常の冷たい中性子星や誕生時の熱い中性子星に及ぼす効果(状態方程式や熱的進化等)を議論すること,を課題としている。以下に研究成果の現状を述べる。(1)について:中性子物質にαの割合でハイペロンが混在した系を対象にG行列計算を行い,密度ρと混在度αに依存するY-N, Y-Y有効相互作用V(r;ρ,α)をハイペロン毎に構成する。Λハイペロンについてはほぼ結果を得ており,現在Σについて計算を進行中である。Λは核子よりもずっと大きい有効質量をもつこと(mΛ^^*0.8,m,mN^^*0.6)等,G行列計算結果の分析は既に日本物理学会にて報告している(′98秋の分科会)。(3)について: (1)の進行状況と連動しており,今年度前半期に遂行する計画である。
前立腺癌進展過程におけるプロリン異性化酵素Ｐｉｎ１に着目したシグナル伝達の解明

Pin1はプロリンの構造をcis体からtrans体に変化させることでタンパクの立体構造を変化させるプロリン異性化酵素の一種である。種々のプロリン異性化酵素の中で、Pin1はリン酸化Ser/THr-Proのmotifに結合するという特徴を有し、リン酸化と構造変化の架け橋を行う。前立腺癌の臨床検体におけるPin1の強発現は強力な再発予測因子であった。また去勢抵抗性前立腺癌細胞株を使用し、in vitroにおけるPin1阻害の有用性を示した。この結果は去勢抵抗性前立腺癌の治療において、Pin1を治療標的とすることの有用性が示唆された。当院で前立腺癌に対して根治的前立腺全摘術を施行し、かつ研究での使用に関して同意を頂けている100症例分の臨床検体におけるPin1の発現を免疫組織化学の手法を用いて評価した。組織の病理学的悪性度と比例してPin1の発現は亢進し、かつPin1の強発現は極めて強力な再発予後因子であることを確認した。同様に、去勢抵抗性前立腺癌に対して経尿道的前立腺切除術を施行した病理検体でのPin1の発現を評価したところ、一様にPin1の強発現を認めた。続いて、当科が保有する前立腺癌細胞株を用いてIn vitroでの研究を行った。当科で樹立したC4-2AT6は去勢抵抗性前立腺癌細胞株であるC4-2をアンドロゲン除去環境下で樹立した細胞株である。LNCaP、C4-2、C4-2AT6はアンドロゲン除去環境下での前立腺癌の増悪過程を模倣する。Pin1の発現をウエスタンブロットで評価したところ、LNCaP、C4-2、C4-2AT6と段階的に発現が増強することが判明した。このことは、癌の進展に伴いPin1の発現が亢進し、Pin1を標的とした治療戦略の有用性を示唆した。Pin1阻害剤であるJugloneを用いてPin1阻害による殺細胞効果を検討した。Jugloneは濃度依存的にC4-2AT6に対して抗腫瘍効果を示した。さらにドセタキセルとJugloneの併用効果について検討を行った。両剤の併用はさらに高い殺細胞効果を認めた。ドセタキセルは去勢抵抗性前立腺癌に対する標準治療である。これらの結果は去勢抵抗性前立腺癌に対するドセタキセルとのPin1阻害剤の併用療法の有用性を示唆した。当教室で前立腺癌に対して根治的前立腺全摘術を施行した86症例分の臨床検体におけるPin1の発現を免疫染色化学を用いて評価した。High GleasonscoreとPin1の発現は相関した。また多変量解析でPin1の発現はPSA再発の独立予測因子であった。この結果は、前立腺癌におけるPin1制御の重要性を示唆した。ヒト前立腺癌細胞株であるLNCaP、C4-2AT6に対してPin1阻害剤の効果を検討した。LNCaPはホルモン感受性、C4-2AT6は去勢抵抗性を示す。Pin1阻害剤としてJugloneを使用した。ウエスタンブロット法を用いてPin1の発現を評価した所、LNCaPと比較してC4-2AT6は優位にPin1の発現の亢進を認めた。JugloneはLNCap、C4-2AT6いずれのPin1発現を抑制した。Cellviability assayを用いてJugloneのC4-2AT6に対する殺細胞効果を検討した。Juglone単剤(30μM)の殺細胞効果が51.2 ±3.2 %であったのに対し、Jugloneとドセタキセル(5nM)の併用では34.9 ±3.8 %であった. Juglone単剤でC4-2AT6に対して抗腫瘍効果を示すが、ドセタキセルとの併用は優位に高い抗腫瘍効果を示した(p<0.05)。ドセタキセルへの曝露によってPin1の発現亢進を認めた。当教室ではこれまでに去勢抵抗性前立腺癌に対するPI3K/Akt pathway制御の有用性について報告してきた。Dual PI3K/mTOR阻害剤であるNVP-BEZ235とJugloneとの併用効果を評価したが、NVP-BEZ135とJugloneの併用効果はほとんど認めなかった。この結果はPin1がPI3K/Akt/mTOR pathwayのリン酸化の制御にも関与していることを示唆した。泌尿器臨床検体を用いた研究及び細胞株を用いた研究は順調に進んでおり、研究の結果はおおむね仮説に従っている。動物実験はPin1阻害剤であるJugloneが明確な毒性を有するため行えていない。今後、siRNAなどを用いての実験を検討している。
新資料・新研究に基づく、フッサール現象学国際的研究の新しい地平の開拓

新資料・新研究に基づき、フッサール現象学国際的研究の新しい地平を開拓しようとする我々の共同研究は、この3年間に、大きな成果を残した。まず最初に挙げられるべきは、この3年間のあいだに4回のフッサール研究国際会議を日本各地で開催し、海外の研究者を招待し、日本の研究者も交えた、研究発表と討議の場を持つことができたことであろう。招待した海外の研究者は、韓国、米国、中国、スイス、ドイツ、ベルギー、デンマーク、チェコの8各国、延べ15名の錚々たるメンバーであった。これらの国際会議では、目本人の発表も含めてすべて英語またはドイツ語で行われ、発表原稿が和訳原稿とともに『予稿集』として参加者に配布され、質疑応答もすべて共同研究者の司会と通訳により行われ、内外の研究者による実質のある共同討議が実現した。次に挙げるべきは、共同研究者たちが、世界各地のフッサール研究者達と電子メールによる学際的交流を保ちながら、直接海外に出かけて、海外での学会・研究会などに参加、発表してきたことである。これらの機会を通じて、海外の研究者たちとの学術交流を深め広げることができ、国際的なフッサール研究に一定程度の貢献をすることもできた。日本におけるフッサール研究のレベルの高さは、多くの海外の研究者の認めるところとなった。最後に忘れてならないのは、国内の活動との連動である。本研究共同研究者9人が呼びかけ人になって、国内の研究者を組織したフッサール研究会が設立され、年1回、これまでに4回の研究会が開催された。共同研究者9人が全員発表をした第1回から始まり、第2回には国際会議と連動させて内外の研究者との交流を促進し、第3回・第4回は、それらを踏まえて、国内若手研究者を中心とする活動の場を作ってきた。これら若手研究者の発表も、本研究の研究協力者として、『フッサール研究』第2号・第3号に収録された所以である。我々、この共同研究のメンバー9人は、補助金の交付が開始される前に、「フッサール研究会」を呼びかけ、2002年3月16日・17日(日)、大学セミナーハウス(八王子)にて、創立記念・第1回研究会を開催し、メンバー全員が、「新資料・新研究に基づく、フッサール現象学国際的研究の新しい地平の開拓」という研究課題に繋がるテーマで発表を行った。補助金の交付にあたっては、我々のメンバーを海外に派遣するととと海外の研究者を招聘して国際会議を開催することを計画した。2002年11月6日10日プラハ(チェコ)で開催されたIssues Confronting the Post-European World/A conference dedicated to Jan Patocka(1907-1977)on the occasion of the foundingof the Organization of Phenomenological Organizationsに、代表者である浜渦が参加し発表を行う一方で、2002年11月23日・24日には、海外(韓国、米国、中国、スイス)から4人の研究者を招聘して、第1回フッサール研究国際会議in Japanを静岡大学にて開催した。また、2003年3月14日16日に大学セミナーハウスで、第2回フッサール研究会に続けて、海外(ドイツ・ベルギー)から4人の研究者を招聘して、第2回フッサール研究国際会議in Japanを開催した。フッサール研究会では、ウェブサイトを開設し、研究会の案内とともに、関連情報を提供している(http://www.ipc.shizuoka.ac.jp/jsshama/j/hua-circle.htm)。

また、2回の国際会議では、対訳『予稿集』を作成して参加者に配布するとともに、第1回研究会および第1回フッサール研究国際会議の成果をまとめて、フッサール研究会の会誌『フッサール研究』創刊号という性格と、科学研究費補助金による共同研究の平成14年度『研究成果報告書』という性格とをあわせ持つ冊子を作成し、第2回フッサール研究会・第2回フッサール研究国際会議の参加者、およびその他の研究者に配布した。今年度の活動も、昨年度同様、共同研究のメンバーそれぞれが、自ら海外に出て調査・研究・発表をしてくること(山口がドイツに、和田がフランスにそれぞれ出かけた)と、海外からの研究者を招いて、共同研究とともに国際会議を開催することにあった。昨年度末になるが、2003年3月15日・16日に大学セミナー・ハウス(八王子)で開催された第2回フッサール研究国際会議には、海外から4人の研究者を招き(ドイツ3人、ベルギー1人)、我々のメンバーの一人(山口)も含めた5人の発表に基づき討議を行い、また、2003年11月23日・24日に京都大学で開催された第3回フッサール研究国際会議にも同じく、海外から4人の研究者を招き(ドイツ、デンマーク、ベルギー、米国、各1人ずつ)、我々のメンバーの一人(貫)も含めた5人の発表に基づき討議を行った。いずれも、ドイツ語あるいは英語での発表に、すべて原語と和訳を併せて掲載した予稿集『Proceedings』を参加者全員に配布し、招聘窓口になった我々の一人が司会と通訳を務め、海外研究者と日本人研究者の間で充実した討論をすることができた。また、上述第2回フッサール研究国際会議には、それに先だって同3月14日・15日に同所で行われた、国内研究者を中心とする、第2回フッサール研究会を接続させ、その最後の発表は、海外からの研究者にも聞いて頂くためドイツ語で発表が行われ、国内国外の研究者の交流の機会とすることができた。そして、これら三つの会合の記録として、昨年度に引き続いて、フッサール研究会の会誌『フッサール研究』第2号という性格と、科学研究費補助金による共同研究の平成15年度『研究成果報告書』という性格とをあわせ持つ冊子を作成し、2004年3月14・15日に大学セミナー・ハウス(八王子)で行われた第3回フッサール研究会の参加者、およびその他の関係研究者に配布した。最終年度の活動も、これまで同様、共同研究のメンバーそれぞれがもつ個々のテーマの研究(谷「間(柄)の可能性」、貫「ダンス」、榊原「反省と内的意識」、和田「時間意識」、宮原「言語カテゴリー形成」、野家「現象学とシステム理論」、山口「文化を生きる身体」、浜渦「現象学と自己組織性」)と並行して、それぞれが、自ら海外に出て調査・研究・発表をしてくること(山口がドイツに、宮原が米国に、浜渦と貫が香港にそれぞれ出かけた)と、海外からの研究者を招いて、共同研究とともに国際会議を開催することにあった。2004年11月20日・21日に東北大学文学部(仙台)で開催された第4回フッサール研究国際会議には、海外から3人の研究者を招き(スイス1人、米国1人、チェコ1人)、我々のメンバー2人(浜渦、和田)と研究協力者1人(岡本)を含めた合計6人の発表に基づき討議を行った。
近代フランスにおける旋法性概念の表れと理論的・実践的システムとしての伝播

本年度は博士論文の内容の一部について補足し、研究の新たな段階へと進むための整理を行った。4月には民族藝術学会大会にて口頭発表を行い、ブルゴー=デュクドレによる、主にブルターニュを中心としたフランス地万の民謡収集の動きが、いかに全国の「フランスの歌」収集の動きへと結びついていったかを辿った。本内容は論文として、『民族藝術』第26号に掲載されている。この「民謡から国の歌へ」という動きは、世界中で見られる現象であり、日本も例外ではない。旋法的音楽の代表とみなされる民謡を用いた、旋法性概念の伝播の過程を辿る上で、重要なケーススタディとなるであろう。また10月には日本音楽学会全国大会にて、「19世紀旋法再考」と題する発表を行った。これにより、19世紀ヨーロッパにおける「旋法」の理論的・概念的背景について整理をすることができた。2月から3月にかけて、パリへ資料調査に赴いた。ブルゴー=デュクドレが万博の委員会に宛てた手紙等を参照し、貴重な情報を得ることができた。これらの成果は、2010年5月16日に慶応大学にて行われた「国際若手音楽研究者フォーラム」での発表に盛り込んだ。「Mode as National Identity」と題する本発表は、19世紀フランスにおける旋法性概念の表れと広がりを、普仏戦争後のナショナル・アイデンティティ確立への動きと結びつけて論じるものである。これをもって、主に「モダリテ(旋法性)」と19世紀仏社会との関係を辿った博士論文に区切りをつけて、新たな段階-他国(ドイツ・アジア)との比較研究-へと進めたい。その第一歩となるのが、2010年9月に予定されている日本音楽学会関東支部例会での発表である。日本音楽研究者と協同のグループ発表を予定しており、フランスを中心とした「旋法」の事例が、日本近代の「旋法」整備の動きとどのように絡み合っているのかを解き明かしたい。
がん細胞パネルと計算機による3次元ファーマコフォアの抽出

本研究ではトポイソメラーゼ-・阻害作用をもつことがわかっている化合物の情報を用いたligand-based Drug Design手法を用いて、トポイソメラーゼ-・阻害化合物に関するリガンドの三次元ファーマコフォアの同定と基質認識に重要なアミノ酸の推定を行うことにより、創薬に有用な情報を提案することを目的とした。トポイソメラーゼ-Iとtopotecan(トポイソメラーゼ-I阻害薬)の複合体X線構造(pdbcode:1k4t)を用いて解析を行った。また、解析にはtopotecanに加えて5つのトポイソメラーゼ-・阻害化合物(LGZK69, PDC, acetomycin, Mel-1020, FM-02)を用いた。その結果、ligand-based Drug Design手法に基づくトポ-・阻害化合物の三次元ファーマコフォアの同定を成功裏に完了した。トポイソメラーゼ-I阻害作用をもつためには、分子中の官能基がメインファーマコフォアの種類や空間的配置を持ち、さらにそれらが平面的に配置していることが重要であると思われる。また、同時にサブファーマコフォアも持っていることがより好ましいと考えられる。さらに、トポイソメラーゼ-・阻害化合物のトポイソメラーゼ-Iとの複合体生成と構造最適化および相互作用アミノ酸の同定を行った。その結果、トポイソメラーゼ-I阻害作用を持つためには分子中のアニオン性官能基がLys532と水素結合することが重要であることが示唆された。以上、6つのトポイソメラーゼ-I阻害化合物を用いることで、トポイソメラーゼ-I阻害作用を持つために重要な特性を推定することができた。この情報はin silicoスクリーニングなど新規薬物の合理的な開発に有用であると思われる1.化合物の作用機作別分類がん細胞パネル評価で得たフィンガープリント情報(作用機作を反映)により化合物をクラスタリングし作用機作別に分類した。その中でTopoisomerase I (Topo I)を阻害する複数化合物(リガンド)のファーマコフォア解析を試みた。2.自動配座解析プログラムCAMDAS(分担者広野ら開発)による配座集団生成CAMDASプログラムは、高温分子動力学計算に基づきサンプリングした配座についてエネルギー極小化後、2面角の値によるクラスタリングでエネルギー極小配座の代表集団を自動生成する。Topo Iを阻害する5種のリガンド(PDC,FM-02,acetomycin,NF-1173,LGZK-69)の配座集団生成を行った。得られた配座数はPDC:10950:、FM-02:1、acetomycin:41、NF-1173:1568、LGZK-69:5665であった。3.重ね合わせプログラムSUPERPOSE(分担者広野ら開発)による結合配座決定SUPERPOSEでは、リガンド内の疎水性、水素結合供与/受容性の原子団ごとに特性球を置き、分子を特性球で表現する。三次元空間で異なる化合物の配座同士を重ね合わせ、同じ性質の特性球が重なったら加点、異なる性質の特性球が重なったら減点することで、高得点で重なる配座を抽出し、同一特性の原子団が最も良く重なる配座の組み合わせを求める。Topo I阻害剤であるtopotecanが結合したTopo IのX線解析による座標(PDB:1K4T)からtopotecanを抜き出し、これに対し上記2で得られた配座集団をSUPERPOSEで重ね合わせ、各リガンドの結合配座を推定した。各リガンドから最良の重ね合わせとなる待合配座をTopo Iのtopotecan結合位置に置くことで、各リガンドの結合様式が得られることになる。現在進行中である。この情報はin silicoスクリーニングなど新規薬物の合理的な開発に有用であると思われる
Smadによる細胞増殖制御機構の解明

(1)ショウジョウバエの新規SmadであるMedeaおよびdSmad2を同定した。これらのSmadの機能を生化学的に解析することにより、Smadによるシグナル伝達はショウジョウバエと哺乳類との間で保存されていることを明らかにした。(2) Smad2およびSmad3はTGF-β刺激の無い状態では単量体として存在し、TGF-βレセプターによりリン酸化されるとホモ多量体およびSmad4とのヘテロ複合体を形成した。Smad3のホモ多量体およびSmad3-Smad4のヘテロ多量体のいずれもDNAへの結合能を示した。(3) Smad2およびSmad3はTGF-βの刺激に応じて転写コアクチベーターであるp300と結合した。p300はTGF-βによるレポーターの活性化を促進した。一方、p300と結合するアデノウィルス蛋白であるE1AはTGF-βの転写活性化を阻害した。以上よりTGF-βによる転写活性化にはp300(あるいはCBP)が必要であると考えられた。(4)大腸癌で見出されているSmad2の変異をSmad3に導入した。変異型Smad3はレセプターに強固に結合し、野生型のSmad2あるいはSmad3のリン酸化を阻害し、TGF-βによる転写活性化およびHaCat細胞の増殖抑制を抑制した。以上より、この変異は、単にSmadの機能を喪失させるのみならず、dominant-negativeな作用により、発癌に積極的に寄与している可能性が示唆された。(5) RER-negativeのHNPCCにおいてもTGF-βII型レセプターのgermline mutationを見出し、TGF-βが大腸E発生に抑制的に作用していることをより一般的に示した。
糖尿病性血管障害に関する研究,血清中プロスタサイクリン産生刺激因子の基礎と臨床

血管内皮細胞より産生されるプロスタサイクリン(PGI_2)は、強力な血管拡張作用および血小板凝集抑制作用を有する。MacintyreらはPCI_2の産生を刺激する活性が流血中に存在することを報告しているが、その本態因子はいまだ不明である。我々は、培養ウシ血管内皮細胞による生物学的測定系を用い、流血中に本活性の存在を認め、しかも本活性の低下が糖尿病性血管障碍や動脈硬化症の発症、進展に関連している成績を報告してきた。一方、近年種々の生理活性物質が細胞の培養上清より精製されている。我々は、ヒト二倍体線維芽細胞の無血清培養上清(conditroned medium CM)中にPGI_2産生刺激活性を認め、本活性因子(PGI_2 production stimulating factor PSF)の精製を行った。約50L(総蛋白量2g)のCMを濃縮し、蛋白量1mg/mlに調整した。Wators社のHPLC装置に装着したDBAEー5PW(21.5×15)、HEPARINー5PW(7.5×7.5)、PROTEINーPAK300×2の各種HPLC用columnを用い、活性分画を粗精製した。SDSーPAGE上、非還元下でPSFは31kDaの単一バンド、還元下で35、27、8kDaのバンドとして認められた。31kDa蛋白をG4 reverseーphaseHPLCで分析すると、アセトニトリル濃度28%と31%の位置に2種類の蛋白が混在していることが判明した。アミノ酸シ-クエンサ-でそれぞれのN末端アミノ酸配列を分析した。Homology検索の結果、一方はinsulinーlike growthfactor(IGF)bindingprotein4と相同性が高いことが判明した。そこで、IGFー1に対するligandーaffinity columnを作製した。PSF活性はIGFー1 ligand affinitycolumnのflowーthrough分画に認められた。この分画をC4 reverseーphaseHPLCで分析すると、アセトニトリル濃度31%の位置に単一ピ-クとして認められた。従って、PSFはこの新しい蛋白と推定されている。現在分子生物学的手法を用いてPSFの構造を決定中である。(1)血清(PDS)中のプロスタサイクリン産生刺激活性(PSA)因子の分離、精製の第一段階として、硫酸アンモニウムによる塩析について検討した。100%飽和硫安をPDSに添加し、生じた沈澱の溶解、透析試料のPSAを我々の確立した生物学的測定系にて測定した。主たるPSAは、硫安の2045%での沈澱部分に認められた。まず、イオン交換クロマトグラフィ-にて分析を試みた。イオン交換体としてはDEAEとCM celluloseを用いた。PDS中のPSAは、CM celluloseには親和性を示さず、DEAE celluloseに親和性を示すことが判明した。吸着されたPSAの活性は、100150mMのNaClの濃度勾配の部分に溶出された。従って、PSAは陰性荷電の蛋白であることが示唆された。次に、アフィニティクロマトグラフィ-に関して検討した。Con-A、WGA、heparin agaroseの3種類を用いた。Con-Aカラムを0.4Mのα-methyl-D-mannosideで溶出した。PDS中のPSA活性は、Con-Aには親和性を示さなかった。同様にWGAカラムを100mg/mlのN-acetyl-glucosamineで溶出した。PDS中のPSA活性は、WGAには親和性を示さなかった。一方、heparin agaroseカラムでの検討では、PDS中のPSAは、heparinに親和性を認め、2MのNaClで溶出可能であった。そこで、0.15ー2.0MのNaClの直線濃度勾配で溶出すると、NaCl濃度1.0、1.5Mの部分に二相性のPSAを認めた(peak A、B)。Peak Aの部分は、SDS-PAGE分析にて分子量60KDa、すなわち、精製アンチトロンビンIIIと同一の部位にSigle bandを認めた。また、アンチトロンビンIIIの特異抗体によりPSAに抑制が認められることよりpeak AはアンチトロンビンIIIと推定された。しかし、Peak BがPSAの未知の本態因子と考えられた。しかもPeak BのPSAは糖尿病患者にて著明に低下していた。今後精製を完了させる予定である。ヒト血清試料を用いての、PGl_2産生刺激因子(PSA)の分離、精製は極めて困難であった。そこで、より精製操作が容易な試料の検索を行なった。ラットより採取した各種組織、あるいは各種in vitro細胞培養液中のPSA活性を測定したところ、ヒト二倍体線維芽細胞培養上清に特異的な高力価のPSA活性を発見した。次に、このPSAの基礎的性状に関して詳細に検討した。その結果、56°C30分で安定だが100°C3分で失活する、また、pH4以下あるいはトリプシン処理にて失活する分子量30KDa前後の蛋白因子と推定された。血清中のPSAと性状を同一にする因子であることが判明した。さらに、この培養液試料(CM)を用い、PSAの精製を試みた。CM試料を濃縮し、PSA因子をHPLC装置およびHPLC用各種カラムを用いて精製を検討した。

CM中のPSAをDEAEー5PWカラムに吸着させ、0ー1MまでのNaClの濃度勾配にて溶出させると、PSAは200ー250mMのNaCl濃度の分画に溶出された。次に、そのPSA活性分画をHEPARINー5PWに吸着させ、Gー1MまでのNaClの濃度勾配で溶出させた。PSAは340ー400mMのNaCl濃度の分画に溶出された。さらに、このPSA活性分画をG3000SW_<XL>でゲル濾過した結果、PSAは、SDSーPAGRの銀染色にて、37kDaと26kDaの位置に認められた。これらの蛋白の構造決定を試みたが、N端がブロックされており不可能であった。高濃度の精製蛋白を採取するために現在カラム容量を増加させ,精製のscale upを計画しております。結論:ヒト二倍体線維芽細胞培養上清中にPSAを認め、その性状について検討した。さらに、このPSAの粗精製を行なった。血管内皮細胞より産生されるプロスタサイクリン(PGI_2)は、強力な血管拡張作用および血小板凝集抑制作用を有する。MacintyreらはPCI_2の産生を刺激する活性が流血中に存在することを報告しているが、その本態因子はいまだ不明である。我々は、培養ウシ血管内皮細胞による生物学的測定系を用い、流血中に本活性の存在を認め、しかも本活性の低下が糖尿病性血管障碍や動脈硬化症の発症、進展に関連している成績を報告してきた。一方、近年種々の生理活性物質が細胞の培養上清より精製されている。我々は、ヒト二倍体線維芽細胞の無血清培養上清(conditroned medium CM)中にPGI_2産生刺激活性を認め、本活性因子(PGI_2 production stimulating factor PSF)の精製を行った。約50L(総蛋白量2g)のCMを濃縮し、蛋白量1mg/mlに調整した。Wators社のHPLC装置に装着したDBAEー5PW(21.5×15)、HEPARINー5PW(7.5×7.5)、PROTEINーPAK300×2の各種HPLC用columnを用い、活性分画を粗精製した。SDSーPAGE上、非還元下でPSFは31kDaの単一バンド、還元下で35、27、8kDaのバンドとして認められた。31kDa蛋白をG4 reverseーphaseHPLCで分析すると、アセトニトリル濃度28%と31%の位置に2種類の蛋白が混在していることが判明した。アミノ酸シ-クエンサ-でそれぞれのN末端アミノ酸配列を分析した。Homology検索の結果、一方はinsulinーlike growthfactor(IGF)bindingprotein4と相同性が高いことが判明した。そこで、IGFー1に対するligandーaffinity columnを作製した。PSF活性はIGFー1 ligand affinitycolumnのflowーthrough分画に認められた。この分画をC4 reverseーphaseHPLCで分析すると、アセトニトリル濃度31%の位置に単一ピ-クとして認められた。従って、PSFはこの新しい蛋白と推定されている。現在分子生物学的手法を用いてPSFの構造を決定中である。