hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｂｉａｌｌｅｌｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ

約2万個の遺伝子が含まれるヒトゲノムの解析には、遺伝子ターゲティング法が有効である。しかし、ヒト染色体は2倍体であるため、ゲノム上の遺伝子の役割を理解するためには両方の対立遺伝子を改変しなければならず、新たな技術が求められている。これまでに本研究では、ヒトブルーム遺伝子(BLM)の改変を通じて両対立遺伝子に変異を導入する技術の開発を試みてきたが、この遺伝子以外にも主に染色体分配に必要な遺伝子の改変も目標としている。そして、ヒトiPS細胞における多能性と分化に関連する遺伝子の理解へと応用したいと考えている。昨年度は、単離したコンデンシンnon-SMCサブユニット変異体の表現型解析を行った。コンデンシンnon-SMCサブユニットの機能がどのような経路に関連するかを調べ、以下の結果を得た。1)non-SMCサブユニット温度感受性(ts)変異体は制限温度下で染色体凝縮および分配異常を示した。これは既存のSMCサブユニットcut3, cut14変異体の表現型と酷似していた。2) non-SMCサブユニット変異体とcut3-477, cut14-208変異体との遺伝的相互作用を確認した。3)微小管重合阻害剤TBZに感受性の変異体は、TBZ存在下で染色体不均等分配を示した。TBZ感受性変異体と動原体タンパク質変異体との遺伝的相互作用を検出した。分裂酵母は通常1倍体(半数体)ゲノムを維持して生きていますが、驚くことに、新しいcnd1, cnd3変異体は2倍体ゲノムをもち、細胞のサイズも大きくなっていることが判明しました。この結果から、コンデンシンHEATサブユニットはゲノムの倍数性を維持していることが強く示唆されます(Xu et al., PLoS One)。現在、コンデンシンがどのように倍数性維持に関与するのかを知るため、日夜研究に取り組んでいます。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、ヒトiPS細胞のモデル系として分裂酵母を用い、染色体分配に必要なコンデンシン複合体の解析を行った。コンデンシンは大腸菌からヒトまで高度に保存され、M期の染色体凝縮と分配に必須であり、近年では遺伝子発現制御やDNA損傷修復への役割も示唆されている。具体的な結果を以下に示す。1、コンデンシンの制御サブユニットであるnon・SMCタンパク質をコードする遺伝子の温度感受性、薬剤感受性変異体の取得を行った。2、3つのnon-SMC遺伝子すべての変異体候補株を各々1530株取得できた。3、各変異体の表現型は主に染色体分配異常を示し、進化的に保存されたアミノ酸残基の変異も多数同定できた。これまで分裂酵母で同定されたコンデンシン制御サブユニットの変異体は1つのみであり、遺伝資源の不足から機能の理解が十分に進んでいなかった。平成24年度の結果は、染色体分配に不可欠なコンデンシン複合体の機能を知る上で大変有望な遺伝資源を取得したと言える。また、iPS細胞での両対立遺伝子の改変に向けても有益な基礎データになると考えている。昨年度は、単離したコンデンシンnon-SMCサブコーニット変異体の表現型解析を行った。また、この解析を通じて、コンデンシンnon-SMCサブユニットの機能がどのような経路に関連するかを調べ、以下の結果を得た。1. non-SMCサブユニット温度感受性(ts)変異体は制限温度下で染色体凝縮および分配異常を示した。2. non・SMCサブユニット変異体とcut3-477, cut14-208変異体との遺伝的相互作用を確認した。3.微小管重合阻害剤TBZに感受性の変異体は、TBZ存在下で染色体不均等分配を示した。4. TBZ感受性変異体と動原体タンパク質変異体との遺伝的相互作用を検出した。

これまでに本研究では、ヒトブルーム遺伝子(BLM)の改変を通じて両対立遺伝子に変異を導入する技術の開発を試みてきたが、この遺伝子以外にも主に染色体分配に必要な遺伝子の改変も目標としている。そして、ヒトiPS細胞における多能性と分化に関連する遺伝子の理解へと応用したいと考えている。昨年度は、単離したコンデンシンnon-SMCサブユニット変異体の表現型解析を行った。コンデンシンnon-SMCサブユニットの機能がどのような経路に関連するかを調べ、以下の結果を得た。1)non-SMCサブユニット温度感受性(ts)変異体は制限温度下で染色体凝縮および分配異常を示した。これは既存のSMCサブユニットcut3, cut14変異体の表現型と酷似していた。2) non-SMCサブユニット変異体とcut3-477, cut14-208変異体との遺伝的相互作用を確認した。3)微小管重合阻害剤TBZに感受性の変異体は、TBZ存在下で染色体不均等分配を示した。TBZ感受性変異体と動原体タンパク質変異体との遺伝的相互作用を検出した。分裂酵母は通常1倍体(半数体)ゲノムを維持して生きていますが、驚くことに、新しいcnd1, cnd3変異体は2倍体ゲノムをもち、細胞のサイズも大きくなっていることが判明しました。この結果から、コンデンシンHEATサブユニットはゲノムの倍数性を維持していることが強く示唆されます(Xu et al., PLoS One)。現在、コンデンシンがどのように倍数性維持に関与するのかを知るため、日夜研究に取り組んでいます。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまで、温度感受性や薬剤感受性(またはその両方)を示すコンデンシン制御サブユニットの変異体取得に成功しているため。また、これらはコンデンシンの染色体分配における役割を研究するのに役立つと考えているため。これまでに多数のコンデンシンnon-SMCサブユニット変異体を単離し、動原体タンパク質の変異体でみられる大小核表現型を示すものを見出した。また、この新規コンデンシン変異体は、動原体タンパク質変異体と遺伝的相互作用を示した。これらの結果から、コンデンシンnon-SMCサブユニットの動原体機能への関与が強く示唆される。PCR法によるランダム変異導入を用いて得られた変異体の表現型が、本当にコンデンシン遺伝子の変異に由来するのか否かを確かめる。そのため、変異部位を導入したコンデンシン遺伝子断片をまずプラスミド上ヘクローニングする。その後、野生型分裂酵母株へ再導入し、染色体分配異常などの変異体と同一の表現型が見られることを確認する。今後は次の2つの側面に焦点を当てて研究を進める。1.コンデンシンが染色体の均等分配にどう寄与するか、そのメカニズムを明らかにする。2. non-SMCサブユニットの変異がどのようにコンデンシン複合体の形成や染色体上での機能に影響を与えるのかを、酵母ツーハイブリッド、スリーハイブリッド法、ウエスタンブロット解析などを用いて解析する。
単分子磁石精密複合化による分子スピンバルブ素子創生

本研究では単分子磁石を精密に集積する手法を開発し、その分子素子構造を分子スピンバルブ素子と位置付ける。有機合成的にポルフィリンを修飾し、単分子磁石の高次構造を精密に制御するという設計指針で、巨大磁気抵抗効果を再現性良く発現する革新的分子磁性材料を開発することを目指した。本研究では、フタロシアニンと同様の配位構造をとり、かつ有機合成的手法で分子修飾が容易なポルフィリン誘導体を用いて新規ダブルデッカー型テルビウム錯体を合成し、プロトンスイッチングや炭素材料上への配列などの機能を付与することに成功した。本研究課題では、研究代表者らが開発したポルフィリン単分子磁石を集積化し、巨大磁気抵抗効果を単分子スケールで発現させることを目指している。特に平成26年度は以下を目的に研究を展開した。1.末端チオール修飾ポルフィリン単分子磁石の合成と金電極との連結、2.各種炭素材料との複合化、3.外場応答性分子の開発。以下に得られた結果をまとめる。1の末端チオール修飾ポルフィリン単分子磁石に関しては、チオエーテル基を末端に有するポルフィリン単分子磁石の合成に成功し、その磁気特性を明らかにした。さらに、チオエーテール基を持たない分子に関しても比較対象として合成しその物性が変化しないことを明らかにすることに成功した。続いて、メカニカルブレイクジャンクション法により合成した単分子磁石の単分子電気伝導度を評価し、通常のポルフィリンと同程度の電気伝導度を有することを室温で確認した。2の各種炭素材料との複合化においては、新たにアルキル長鎖を有するポルフィリン単分子磁石を開発し、HOPG上に単分子膜を形成することを原子間力顕微鏡を用いることで明らかにしている。また、カーボンナノチューブ状に単分子磁石になる前のポルフィリンを基本骨格としたポリマーが、単純に混合するだけで複合化することを原子間力顕微鏡で確認しており、今後は単分子磁石との複合化を検討していく予定である。3の外場応答性分子の開発に関しては、アントラキノンとポルフィリンを鈴木カップリングにより共有結合的に連結する反応を設計し、合成を進め、反応スキームの最終ステップ直前まで合成を完了させている。1.各種炭素材料との新規複合化方法開発、2.プローブ顕微鏡を用いた単分子磁石のスイッチング、3.外場応答性分子の開発、4.金電極との連結による電気伝導度の評価。1の各種炭素材料との複合化においては、新たにアルキル長鎖を有する鋳型分子を用いて、オクタエチルポルフィリン単分子磁石の配列方法を制御することを試みた。走査トンネル顕微鏡を用いることで、HOPG上に単分子膜を形成することを明らかにしている。特に、分子の濃度を変化させることで分子密度を自在に制御可能である可能性を示すことができている。また、ポルフィリンを基本骨格とした長鎖含有分子がHOPG上に整列する様子を走査トンネル顕微鏡で観測しており、今後は単分子磁石化を検討していく予定である。2のプローブ顕微鏡を用いた単分子磁石のスイッチングについては、トンネル電流の磁性スイッチングを試みた。プロトンの脱離を確認することに成功しており、磁性の単分子レベルでの制御が可能であると期待される。また、印加電圧を変化させることで、誘起される現象に差異が観測されており、今後詳細な評価を行っていく予定である。3の外場応答性分子の開発に関しては、アントラキノンとポルフィリンを鈴木カップリングにより共有結合的に連結する反応の最適化を行っている。4の電気伝導度の評価に関しては、STM-BJ法により、単分子での電気伝導度を評価することに成功している。本研究課題では、研究代表者らが開発した分子磁性材料を集積化し、巨大磁気抵抗効果を単分子スケールで発現させることを目指している。当年度の研究成果は大きく分けて以下の2点である。1.テンプレート分子を利用した分子磁性体と炭素材料の複合化本研究では、自己組織化によりHOPG上にネットワーク構造を形成する分子を利用して、分子磁性材料を精密に配列することを目指した。特に、ヘキサゴナルポーラス構造を形成する含アルキル長鎖π共役系分子を利用することで、ポルフィリン単分子磁石の配列密度制御に成功している。配列構造は、走査トンネル顕微鏡により評価した。これらの成果を利用することで、グラフェンデバイス上に単分子磁石を精密に配列することが可能となると期待している。一方で、当年度に用いたテンプレート分子は、ポルフィリン単分子磁石を強く吸着するのに適した構造ではなく、ポーラス構造の最適化が更なる課題として存在している。そこで、新規含長鎖π共役系分子の開発を行い、テンプレート分子としての応用を検討した。特に当年度は分子合成に注力し、アルキル長鎖を系統的に変化させた共役分子の合成に成功している。2.走査トンネル顕微鏡による分子磁性材料のスイッチング特性評価本研究では、走査トンネル顕微鏡を利用して分子磁性材料の磁気特性評価を行っている。特に、これまでにポルフィリン単分子磁石はパルス電流により電子状態が変換されることを見出している。これを利用することで、単分子スケールでの分子磁性材料のパターニングが可能になることが期待される。

当年度はこれまでに得られている結果について、電子状態の変換が起きる際に観測されるSTM像の変化に関して解釈を行い、従来の実験結果のさらなる理解を目指した。本年度は、目的とする分子磁性材料の精密配列と単分子分解能での観測および評価を実現している。分子磁性材料を利用した単分子デバイス実現のための基礎的知見を順調に蓄積することに成功している。単分子磁石を集積化して、巨大磁気抵抗効果を発現するための研究を行った。特に、鋳型分子および分子フレームワークを用いて単分子磁石の精密配列を目指して研究を行い、新規テンプレート分子の開発に成功した。本研究で開発した新規テンプレート分子は、グラフェン表面上で規則配列構造を取ることが期待される、ヘキサアザトリフェニレン(HAT)誘導体である。この分子は、3つの長鎖アルキル基を有したC3対称性の分子であり、そのアルキル長鎖の長さに応じた細孔構造を形成する事が、走査トンネル顕微鏡測定から確認された。過去の研究から、HAT(CN)3(OCnH2n+1)3が強いπーπ相互作用に由来する異方性の高いカラムナー構造を取ることは報告されていた。本研究では、交互に導入された置換基が同一平面間での分子間相互作用に及ぼす影響と、本分子の集積構造を明らかにすることを目指した。本研究では、n=1115のアルキル長鎖を導入したHAT誘導体の熱分解高配向グラファイト(HOPG)基板上における二次元集積構造を走査型トンネル顕微鏡により観察した。この分子は、3本のアルキル長鎖を有しており、グラファイト表面と強く吸着することが期待される。測定では1,2,4-トリクロロベンゼン溶液をHOPG上に滴下し、固液界面を室温大気下で観測した。その結果、n=15の分子はHOPG上でカゴメ格子型に配列し、n=13の場合は1nm程度の細孔を有するポーラスネットワークを形成することを見出した。この細孔を単分子磁石の吸着サイトとして利用することで、単分子磁石の自在配列が可能となることが期待される。本研究では単分子磁石を精密に集積する手法を開発し、その分子素子構造を分子スピンバルブ素子と位置付ける。有機合成的にポルフィリンを修飾し、単分子磁石の高次構造を精密に制御するという設計指針で、巨大磁気抵抗効果を再現性良く発現する革新的分子磁性材料を開発することを目指した。本研究では、フタロシアニンと同様の配位構造をとり、かつ有機合成的手法で分子修飾が容易なポルフィリン誘導体を用いて新規ダブルデッカー型テルビウム錯体を合成し、プロトンスイッチングや炭素材料上への配列などの機能を付与することに成功した。本年度は単分子磁石の配列と単分子物性の評価を目指した研究を行った。分子の配列とSTM-BJ法による単分子特性の評価および新規分子の合成はおおむね順調に進行した。さらに、STMを用いだ単分子レベルでの磁性のスイッチングにも成功しており、これは当初の予想を上回る大きな成果であると言える。現在、研究は順調に進行していると考えている。特に、テンプレートを用いた磁性材料の精密配列に関しては、今後の重要な戦略と位置付け、研究を進展させていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。無機錯体合成現在、研究は順調に進展していると言える。
一次元三角格子系の電荷・軌道自由度の制御と新奇量子臨界相の創製と異常物性の開拓

幾何学的フラストレーション系CaV2O4におけるスピン・軌道秩序の臨界現象を研究した。CaV2O4はモット絶縁体で、110K付近で軌道秩序を生じ、その結果スピンフラストレーションが解消され、50K付近で長距離反強磁性を生じる。Vサイトにd電子が一つ多いCrを置換し電子ドーピングを行う事で、軌道秩序が消失し、同時にスピンフラストレーションが回復し長距離反強磁性秩序は消失した。このように、競合する軌道秩序とスピンフラストレーションの制御に成功した。また、スピン・軌道秩序の融解に伴い金属-絶縁体転移が生じ、その臨界点では強いスピン・軌道ゆらぎに起因した非フェルミ液体的な振る舞いが観測された。幾何学的フラストレーションを内包し、電荷・軌道のゆらぎが大きな一次元三角格子系CaFe2O4、CaMn2O4型構造を取る物質系を研究した。これらの系における電子の電荷・スピン・軌道の多自由度の秩序が生み出す新奇な電荷・軌道整列状態の電子状態を解明し、更に電荷・軌道秩序を融解させ、スピンフラストレーションが復活する量子臨界相を創製することが本研究の目的である。当該年度は、主にCaV2O4のVサイトへのCr置換効果を研究した。3価のCrではt2g軌道が全て電子で占有されているため軌道自由度がなく、軌道秩序を示す本系へのCr置換は、軌道秩序を抑制すると期待される。また、Crの3d電子数はVの電子数よりも多いため、Cr置換は一種の電子ドーピングを伴うことが期待される。Ca(V1-xCrx)2O4ではCr濃度x=00.4の範囲で、FZ法による単結晶試料の育成が可能であることが判明した。この単結晶の放射光X線による構造解析を行ったところ、x=0とx=0.05では150K付近で軌道秩序に伴う斜方晶から単斜晶への構造相転移が観測されたが、x=0.07付近で構造相転移は急速に抑制され、x=0.10以上の組成では構造相転移が消失することが判明した。これは軌道自由度を持たないCrを置換することで、軌道秩序が抑制されていることを示唆している。一方、母物質の50K付近で出現する反強磁性秩序は、Cr置換とともに急速に磁気転移温度が下がり、x=0.10以上の組成では10K付近にスピングラス相が出現することが判明した。これは、軌道秩序が抑制されたことに伴い、本系が元来持つスピンフラストレーションが復活し、低温まで長距離磁気秩序が抑制されたと考えることが出来る。また、この結果はCaV2O4では少しのCr置換により軌道秩序を抑制し、磁気ゆらぎの非常に強い状態を実現できることを示している。幾何学的フラストレーションを内包し、電荷・軌道のゆらぎが大きな一次元三角格子系の新規物質のCaFe2O4、CaMn2O4型構造を取る物質系を研究した。これらの系における電子の電荷・スピン・軌道の多自由度の秩序が生み出す新奇な電荷・軌道整列状態の電子状態を解明し、更にキャリアドーピングにより電荷・軌道秩序を融解させ、スピンフラストレーションが復活する量子臨界相を創製することが本研究の目的である。当該年度では、主にCaV2O4、CaMn2O4の単結晶育成と、Caを欠損させることによるホールドープを試みた。まず、母物質に関してはFZ法により大型の単結晶試料の育成に成功した。一方、Caの欠損はCaV2O4では20%程度までの欠損量までは可能であることが判明した。しかし、CaMn2O4では非常に微量しかCaを欠損させることができず、本系におけるキャリアドーピングの手法としてCa欠損は適切ではないことが判明した。放射光X線を用いて、作成したCaV2O4の単結晶の構造解析を行ったところ、150K付近で軌道秩序に伴う斜方晶から単斜晶への構造相転移が観測された。この構造相転移温度で電気抵抗率に顕著な異常が観測された。この結果は軌道秩序に伴い電子構造の変化が生じていることを示している。一方、反強磁性転移はより低温の50K近傍で生じている。Caの欠損を入れたCa1-xV2O4では、欠損量xを変化させても磁気相転移温度はあまり変化せず、一方、軌道秩序を伴う構造相転移温度はx=0.2において100Kまで下がることが判明した。これはキャリアドーピングにより局在していた電子が遍歴的になり、軌道秩序が不安定化していることを示唆している。また、この結果はCaV2O4ではキャリアドーピングにより軌道秩序を抑制し、電子自由度のゆらぎによる異常な金属状態を実現できる可能性があることを示唆している。

本研究課題では幾何学的フラストレーションを内包した一次元三角格子系を研究してきた。これらの系では、軌道秩序などによりスピンフラストレーションが解消され、長距離磁気秩序が発生する。本研究では、キャリアドーピング効果により磁気・軌道の長距離秩序を融解させ、スピンフラストレーションを復活させることを試みた。この融解した電子状態はスピン・軌道のゆらぎが非常に強く、新奇な量子臨界現象が発現すると期待される。本研究では、母物質が磁気・軌道秩序を示すCa(V1-xCrx)2O4を対象に研究を行った。軌道秩序が生じているV3+サイトへ、3d電子数が一つ多いCr3+を元素置換することにより、実効的な電子ドーピングが可能となる。FZ法で育成したCa(V1-xCrx)2O4の単結晶を用いて、x=0.1近傍の放射光単結晶構造解析、磁化測定を行ったところ、x=0.10において軌道秩序とそれに伴う構造相転移が消失し、同時に長距離反強磁性がスピングラスに変化することが判明した。これらは、x=0.10が軌道・磁気秩序の量子臨界点であることを示唆している。母物質のCaV2O4はモット絶縁体で、電気抵抗率は半導体的な振る舞いを示す。Cr置換に伴い電気抵抗率の絶対値は減少していき、磁気・軌道秩序の臨界点であるx=0.10で金属的な振る舞いを示す。この結果は本系では磁気・軌道秩序の融解とともに、キャリアの振る舞いは局在から遍歴的なものへと変化していることを意味している。このように、本系の金属-絶縁体転移は、スピン・軌道・電荷の自由度が互いに結合した現象となっていることが判明した。その臨界組成であるx=0.10の低温の電気抵抗率は、通常のフェルミ液体の温度の2乗に比例した振る舞いではなく、温度の0.5乗に比例した異常な振る舞いを示す。これは、スピン・軌道のゆらぎが強く作用した結果によるものだと予想している。物性物理当該年度では、初年度に引き続き一次元三角格子系のCaFe2O4、CaMn2O4型構造を取る物質系におけるキャリアドーピングの可能性を探ること、また単結晶育成の育成法を確立することを目標としていた。同時並行で、物性測定として輸送現象、磁化、放射光X線散乱による構造解析、反射率分光測定を行い、本物質系の結晶構造、電子状態を解明することを目指していた。元素置換効果および単結晶の育成面に関しては、Cr置換したCaV2O4のFZ法による大型良質の単結晶の育成に成功したことは、研究を大きく進展させた。これは現在進行中、また今後の物性測定、特に光学測定を行う上で重要な進展である。放射光X線散乱による構造解析と磁化率の測定により、CaV2O4へのCr置換効果が軌道秩序を伴う構造相転移を抑制し、同時に長距離反強磁性秩序を抑制することが判明した。これは本研究計画段階で予想していたとおり、軌道秩序を有する一次元三角格子系において、軌道秩序を抑制することでスピンフラストレーションが復活することを意味している。本申請の物理的な面に関しては、予想通りの結果が得られており、当初の目的を達成している。当該年度では、一次元三角格子系のCaFe2O4、CaMn2O4型構造を取る幾つかの物質系におけるキャリアドーピングの可能性を探ること、また単結晶育成の育成法を確立することを目標としていた。一方、物性測定面では輸送現象、磁化、放射光X線散乱による構造解析を行い、本物質系の結晶構造、電子状態を解明することを目的としていた。
FtsHと細胞質シャペロンによる遺伝子発現制御と膜の動態制御

ftsH欠失変異株の分離により、σ^<32>の量の調節と活性の調節をそれぞれ区別して解析することが可能になった。予想したように、ftsH欠失変異株では、σ^<32>は安定化し(半減期120分)、野生株の約20倍の蓄積が見られた。それにもかかわらず、熱ショックタンパク質(HSP)の合成は、野生株の23倍程度増加するだけで、温度シフトにより、、ほぼ正常な一過的なHSPの合成誘導が観察された。このことは、少なくともftsH欠失変異株においては、σ^<32>の不活性かが起こり、σ^<32>の活性調節によりHSPの合成が制御されることを示している。dnaK欠失変異株でも同様にσ^<32>の安定化・蓄積が観察されるが、σ^<32>は高い活性を示した。DnaK/Jの発現量を調節できる系を用いて、σ^<32>の不活性化にDnaKシャペロン系が必要であり、また、FtsHによるσ^<32>の分解にもDnaKシャペロン系が必要であるという結果を得た。FtsHは細胞増殖に必須の膜プロテアーゼであるが、その必須機能については不明であった。最近、ΔftsH変異の致死作用を抑制する変異sfhCが、リン脂質の合成経路で働くfabZ遺伝子に起こった変異であることをつきとめた。リン脂質はリポ多糖とともに主要な膜構成成分であり、これらは共通の前駆物質から生合成される。ftsH変異株ではリポ多糖の合成経路で働くLpxC(EnvA)酵素の量が増加し、リポ多糖を過剰生産することが分かった。実際に、LpxCがFtsHプロテアーゼの基質であることを明らかにした。さらに、FtsHによるLpxCの分解は、リン脂質の合成中間産物により負の制御を受けることも証明した。FtsHは膜蛋白質複合体のクオリティーコントロールにも関わることが示されており、これらを考え合わせると、FtsHは膜蛋白質、膜構成成分の両面から膜の動態を総合的に制御することが明かとなってきた。
水面上の二次元膜界面の性質と分子認識

本年度は以下の研究を実施した。1)カチオンあるいはアニオン性脂質単分子膜による水中のアニオンあるいはカチオン認識、2)キラル単分子膜の作製とその分子配列、および3)糖単分子膜による不斉認識。アルキルアミン単分子膜によるアニオン認識ジメチルステアリルアミン(Me_2NC_<18>)はpH79の領域で安定な単分子膜を形成するが、そのπ-A曲線は、サブフェーズに存在するハロゲンアニオンの種類に依存して系統的に変化する。F^-、Cl^-、Br^-、I^-の順にプロトン化されたアミンと強いイオン対を作っており、水和エネルギーの小さなF^-のπ-A曲線は、ハロゲンアニオン不在下のそれに近い。これは対象的に、水和エネルギーの大きなI^-の場合には、プロトン化されたアミンとの間に強いイオン対を形成しているため、膜が圧縮されてもHIの放出が起こらない。そのために、膜界面での二次元的な静電反発により、広がった単分子膜を形成するものと思われる。プロトン化アミノ単分子膜によるアニオンの認識が実現できたことになる。次に、アミン単分子膜によるAMP,ADP,ATPの認識について検討した。pH7の水中では、AMPはジアニオン、ADPはジアニオン、ADPはトリアニオン、ATPはテトラアニオンの状態にある。サブフェーズにこれらのアニオンをそれぞれ共存させた場合の、Me_2NC_<18>単分子膜のπ-A曲線を測定すると明らかに、AMP,ADP,ATPの順に膜が膨張した。この現象の機構はまだ解明していないが、膜との結合定数がAMP,ADP,ATPの順に大きくなっているのではないかと考えている。キラル膜成分の合成とその単分子膜特性光学活性単分子膜素材である1-[1-(6-ステアリル)ピレニル]エタノール(SP6E)および1-[1-(8-ステアリル)ピレニル]エタノール(SP8E)を合成しその単分子膜特性を検討した。SP6E単分子膜ではラセミ体と光学活性体のπ-A曲線に有意な差がみられ、光学活性体の単分子膜のほうがより蜜にパッキングした単分子膜を形成した。一方、SP8E単分子膜おいてはラセミ体と光学活性体にあまり差がないとう結果が得られた。糖による不斉認識1,12-dimethylbenzo[c]phenanthrene-5,8-dicarboxylic acid(1)とシクロデキストリンとの相互作用を^1H NMRから検討した。結合定数を求めると、(M)-1-β-CDxの結合定数は19600±3600M^<-1>で、この値は(P)-1-β-CDxの2200±100M^<-1>よりかなり大きな値である。この不斉認識は1のカルボンキシラートとβ-CDxの水酸基との間の水素結合形成により実現されているものと思われる。この水中での不斉認識を膜界面で検討する予定である。糖による不斉認識

1,12-dimethylbenzo[c]phenanthrene-5,8-dicarboxylic acid(1)とシクロデキストリンとの相互作用を^1H NMRから検討した。結合定数を求めると、(M)-1-β-CDxの結合定数は19600±3600M^<-1>で、この値は(P)-1-β-CDxの2200±100M^<-1>よりかなり大きな値である。この不斉認識は1のカルボンキシラートとβ-CDxの水酸基との間の水素結合形成により実現されているものと思われる。この水中での不斉認識を膜界面で検討する予定である。
がん細胞の浸潤・転移能獲得を決定するマスター因子の解明とその制御に基づく転移抑制

がんの転移は、非転移性の上皮系がん細胞が上皮-間葉転換(EMT)を経て線維芽細胞様の性質を獲得することを皮切りに、細胞周囲の細胞外マトリックス(ECM)の分解と細胞運動を協調的に行うことにより生じる。これまでに、EMTを中心とした転移能獲得機構については多くの研究がなされてきたが、元々が間葉系のがん細胞の浸潤・転移能獲得を決定する分子機構は未解のままである。研究代表者らは最近の結果から、アクチン細胞骨格の動態により直接制御される転写調節因子MKL1を種々の間葉系細胞に発現誘導すると、細胞運動能が著しく増加することを明らかにした。また、MKL1の発現を惹起した間葉系細胞をマトリゲルとともにマウスへ皮下移植すると、ほとんどの細胞がマトリゲルから遊走することも見出しており、MKL1が間葉系細胞において細胞運動性の獲得を制御するマスター因子として働くことを示唆している。次いで、MKL1がどのような分子機構を介して細胞運動性獲得を制御するのかを明らかにする目的で、マイクロアレイ解析を行い、MKL1の発現誘導によって変動する遺伝子セットを同定した。これらの遺伝子群のGSEA解析を行った結果、MKL1の発現誘導によって細胞外マトリックス、細胞浸潤及びTGF-βシグナルに関する遺伝子群が有意に増加することが明らかとなった。さらに、転写因子解析において、MKL1によって発現変動した遺伝子群は主にSmad2及びSmad3によって制御されていることも分かった。これらのことから、MKL1はTGF-βシグナルを動かすことで細胞運動性の獲得に寄与することが強く示唆された。間葉系細胞において転写調節因子MKL1がin vitro及びin vivoにおいて細胞運動性の獲得を制御するマスター因子であることを示せた。また、MKL1がTGF-βシグナルの制御に関わること、さらにはMKL1と共役する転写因子としてSmad2及びSmad3を見出しており、来年度のさらなる発展が期待できる。平成30年度において、MKL1が正常間葉系細胞の運動能の獲得に寄与することを見出したので、高い肺転移能を有するマウス骨肉腫細胞においてMKL1の発現を制御し、in vitro及びin vivoでの運動能及び転移能に及ぼす影響について検討する。また、MKL1がSmad2及びSmad3と相互作用することを明らかにするとともに、これらが直接結合することで発現が誘導される遺伝子と抑制される遺伝子をChip-seq解析により明確にする。
国家と市場の役割の変容と市民社会:EUにおける競争と公益

EUという超国家的組織が運用する競争法が、市場メカニズムを導入した公共サービス分野に対して適用されることにより、理論的にはこれまで国家が自由に決定してきたこれらの分野における政策について、規制がかかり、とることが可能な政策的な余地が縮減しうるといえる。とはいえ、実際には、EU機能条約106条2項(旧86条2項)に基づいて正当化が認められる可能性は極めて高く、このような分野における加盟国によるコントロールはいまのところはかなり維持されている状況にあるといえる。今年度は、資料収集を行いつつ、判例・立法の分析を通じて、具体的に国家の役割の縮減と市場メカニズムの導入の程度を明らかにすることを目標とした。とりわけ、経済活動としての性質が低く国家の役割が高いと考えられている分野(主に、ヘルスケア、年金基金等の社会福祉に関連する事業活動)に焦点をあてて、これらの分野についての競争法の適用に関する判例において、どのような場合に公益を理由として競争法違反について正当化が認められているかを精査した。また、これらの分野に関する先行研究に照らして、以上の判例の理解を意義付けを行った。中間的な結論として、上述のような国家の役割が重要だと考えられる分野においても競争法の厳格な適用がなされるようになっていることから、市場化が強くみられるようになっていると考察に至った。海外調査では、平成21年9月にHeike Schweitzer教授(欧州大学院大学(EUI)ロバートシューマンセンター)を訪問し、上述の論点についての意見交換を行い、また欧州における理論研究の状況について示唆をいただいた。また、本年度の研究成果を踏まえて、平成22年1月8-9日に開催されたThe European Union Studies Association Asia Pacific第5回研究大会において、"EU as a Social Market Model : Market Economy and Social Model"と題する学会報告を行った。これは、上述の本年度の研究から得られた考察を内容として報告を行ったもので、本研究の中間報告と位置付けられるものである。傍聴者からいただいた複数の質問の中には、今後の研究方針に対して間接的ではあるが示唆となるものもあった。また、高い関心を得たことから、本研究に現代的意義があることを再認識することができた。本年度は、経済活動としての性質が低く国家の役割が高いと考えられている分野(主に、ヘルスケア、年金基金等の社会福祉に関連する事業活動。これらは伝統的に競争法の適用対象ではないと考えられてきたが、EUでは競争法の事例がみられるようになった。)に焦点をあて、判例・立法を通じて具体的に国家の役割の縮減と市場メカニズムの導入の程度を明らかにすることを目的とする【第1段階:セクター別の実証研究】について、昨年度に資料分析や海外調査によって明らかにした成果を踏まえつつ、引き続き、追加的な資料収集とそれらの分析をした。また、【第2段階:理論研究】として、とりわけ、Franz Scharpfが指摘するように、自由化の進展および公益事業へのEC競争法の強力な適用を通じて実現した市場の役割の拡大を契機に、加盟国の政策の余地が縮減しているともみられる実情を検討の対象としながら、(1)国家と市場の役割の変容により生じる規範的問題を明らかにし、(2)効率性を追求し、市場化がすすめられたことによって市民社会もたらされた影響について理論的考察を加えるという作業を行った。以上の検討に基づく【第3段階:総括】として、研究成果としての論文執筆を開始した。第2段階でえられた各論を総括することにより、公益事業にかかわる規範的課題と解決策を立体的に描きだすことを目的として論文を執筆している状況である。平成23年度上期中に成果を論文として公表し、また、口頭での研究報告の機会をもつことを予定している。
ミリ波ファインセラミクス材料の高精度評価法に関する研究

本研究では,ミリ波に対して低損失性を有する、多結晶アルミナなどのファインセラミクス材料を正確にかつ能率的に評価するための測定システムを構築した。ミリ波専用の測定技術として、本研究代表者が提案、開発したウイスパリングギャラリモード共振器法において、測定装置の改良、誘電率算定方法の改良、測定手順の改良を加えることにより、セラミクス材のような高誘電率材料の誘電率を、従来より1桁以上高い精度で測定することを可能としたのが本年度の研究成果である。従来は、近似解析手法を用いて誘電率を算出していたが、高誘電率材の測定では解析誤差が増大し、しかもその程度が周波数によって異なるという問題点があった。さらに、誘電率算定のために共振モード次数を同定するのが有効としながらもその簡便な手法確立には至っていなかった。本研究では、先ず前者の問題に対して、モード展開法と呼ばれる電磁界解析手法をウイスパリングギャラリモード共振器に適用し、この課題を克服した。さらに後者の課題に対しては、モード次数判定のためのモードチャートを作成する方法を手順化した。実際に、数十種類に及ぶアルミナセラミクスサンプルに対し、50100GHz帯にわたる非常に広範囲のミリ波複素誘電率を測定し、測定値の試料寸法依存性、解析誤差の周波数依存性がほとんどを実証した。本研究で得られた測定結果は、学術誌での論文発表や学会での口頭発表により公表され、ミリ波用誘電体材料のさらなる開発を促進するための有用な情報として、ミリ波回路設計技術者に用いられている。本研究では,ミリ波用ファインセラミクス材料の電気特性を評価するための測定システムを構築した。このシステムでは、比誘電率が10程度の高誘電率アルミナセラミクスで作製した評価用円板共振器にWGモード共振を成起させ、その共振応答の測定結果より、材料の複素誘電率を算定する。本年度は、(1)高誘電率円板共振器に内に、効率的にWGモードを励振するための励振用線路の設計、(2)観測したWGモード共振応答に対するモード次数特定法の確立、(3)測定中、励振効率を最適に保つための自動調整機構を付加した共振特性測定装置の製作、に取り組んだ。さらに、構築した測定システムにより、50-110GHzの広範囲のミリ波帯において、アルミナ試料の複素誘電率測定を行い、測定結果に対して誤差解析を行った。現時点では、比誘電率に関して最大でも約1%、誘電正接に関して約10%の精度を確保出来ることを明らかにしている。この結果は、従来のミリ波誘電率測定法と比較しても充分優れているものであり、本評価法の有効性が実証された。来年度の研究計画では、さらに測定精度の改善に取り組む予定である。
自動車運転時における反応時間分布推定に関する研究

19年度に実施した研究の成果は以下の通りである.1.平成18年度の研究を元に,運転者の眼映像をリアルタイムで画像処理し,眼瞼の開き具合(開眼率と呼ぶ)を計測するシステムを開発した.この開発した開眼率測定装置を用いて,様々な覚醒状態での開眼率を夜の運転場面を模擬した環境下で計測した.また,この際,運転者の覚醒状態を客観的に調べるために,脳波計測も合わせて行った、その結果,開眼率の低下に伴って,運転者の反応時間が延長することが明らかになった.また,その反応時間の標準偏差も大きくなることが示された.一方,脳波の周波数分析結果と,運転者の反応時間との間には直接的な関係は見られなかった.これは,脳波の周波数分析による評価では,開眼率計測による評価よりも時間分解能が低いために起こったと考えられる.このことから,提案した開眼率を用いた反応時間推定は,非接触で計測できるという利点だけではなく,精度および時間分解能も高いことが明らかになった.2.開眼率および開眼度を計測する際のカメラの写角について検討した.運転時に運転者の頭部が動く範囲を, Driving Simulatorを用いて調べた.その結果,カメラの水平写角を5.23°(カメラと眼部までの距離を78cm,カメラの光軸と眼部の移動面とのなす角を60°とした場合)に設定することで,片眼の眼瞼裂を撮影範囲内で撮影できることが分かった.また,この撮影条件であれば,頭部を回転させる運動を行った場合や,一度降車し,再度乗車した場合でもカメラの撮影範囲内で眼瞼裂を撮影することが可能であることが明らかになった.3.自動車運転中に,自分の反応時間にどの程度の遅れが生じるのか,また,それがどの程度危険な状態なのかということを,リアルタイムで運転者に知らせるためのシステムを開発した.このシステムでは,車両の速度,車間距離,運転者の開眼率,個人特性などのデータに基づいて,運転席に設置したPDAの画面に現在の衝突確率(POC)を表示する.この装置をDriving Simulator上に設置し,その有効性を確認した.平成18年度の研究実績は以下の通りである。1.運転時の運転者の反応時間を推定するために,運転者の眼映像を実時間で画像処理することを考案した.眼に関する様々な情報を精度良く調べるためには,高解像度の眼映像を撮影する必要があった.また,覚醒低下時の条件を考慮するためには,被験者への負荷を減らすために非接触な測定装置が不可欠であった.このような問題点を解決するために,運転者の眼を自動的に追従しながら撮影するシステムを開発した.このシステムは,運転者の眼の位置を画像処理によって検出し,その位置情報に基づいて自動的にPan-Tilt方向にカメラの向きを制御する.この装置を用いることによって,反応時間と眼映像との関係を調べることが可能になる.2.運転者の反応時間を実車を用いて評価することは,非常に困難である.そのため,運転中の反応時間を計測するためのドライビングシミュレータを開発した.このドライビングシミュレータに1で開発した眼映像撮影装置を搭載し,運転中に実時間で運転者の眼映像を非接触で撮影できる機能を追加した.ドライビングシミュレータ内には,任意の台数の車両を走行させることが可能であり,先行車の挙動をプログラムによって自由に設定することも可能である.3.開発したドライビングシミュレータを用いて,運転中の会話が反応時間に与える影響について調べる実験を行った.その結果,話者が運転者に話しかけるタイミングによって,運転者の反応時間が大きく影響を受けることが明らかになった.特に話者が運転者に対して,話しかけるときが,最も反応時間が遅れやすいことが明らかになった.19年度に実施した研究の成果は以下の通りである.1.平成18年度の研究を元に,運転者の眼映像をリアルタイムで画像処理し,眼瞼の開き具合(開眼率と呼ぶ)を計測するシステムを開発した.この開発した開眼率測定装置を用いて,様々な覚醒状態での開眼率を夜の運転場面を模擬した環境下で計測した.また,この際,運転者の覚醒状態を客観的に調べるために,脳波計測も合わせて行った、その結果,開眼率の低下に伴って,運転者の反応時間が延長することが明らかになった.また,その反応時間の標準偏差も大きくなることが示された.一方,脳波の周波数分析結果と,運転者の反応時間との間には直接的な関係は見られなかった.これは,脳波の周波数分析による評価では,開眼率計測による評価よりも時間分解能が低いために起こったと考えられる.このことから,提案した開眼率を用いた反応時間推定は,非接触で計測できるという利点だけではなく,精度および時間分解能も高いことが明らかになった.2.開眼率および開眼度を計測する際のカメラの写角について検討した.運転時に運転者の頭部が動く範囲を, Driving Simulatorを用いて調べた.その結果,カメラの水平写角を5.23°(カメラと眼部までの距離を78cm,カメラの光軸と眼部の移動面とのなす角を60°とした場合)に設定することで,片眼の眼瞼裂を撮影範囲内で撮影できることが分かった.また,この撮影条件であれば,頭部を回転させる運動を行った場合や,一度降車し,再度乗車した場合でもカメラの撮影範囲内で眼瞼裂を撮影することが可能であることが明らかになった.

3.自動車運転中に,自分の反応時間にどの程度の遅れが生じるのか,また,それがどの程度危険な状態なのかということを,リアルタイムで運転者に知らせるためのシステムを開発した.このシステムでは,車両の速度,車間距離,運転者の開眼率,個人特性などのデータに基づいて,運転席に設置したPDAの画面に現在の衝突確率(POC)を表示する.この装置をDriving Simulator上に設置し,その有効性を確認した.
波動制御による弾性体の動的応力集中の緩和

実際の構造部材には,ミクロ的な切り欠き,すべり帯,界在物,き裂,空洞、転位等の損傷が存在し,これらの損傷近傍においては応力集中が認められるため破壊の起点となり易く,機械構造物の寿命を低下させる一因となっている.そこで,動的荷重を受けた損傷部を有する弾性体中に発生する応力集中を弾性波動によって緩和させるようなアクチィブ制御系の構築方法を研究した.円孔を有する無限薄板に無限遠方から調和せん断波が持続的に入力している場合を考えると,このときには円孔縁で動的応力集中が生じている.そこで,この調和せん断波を外乱と見なして円孔縁における動的応力集中と制御入力の大きさの自乗和が最小となるような制御入力を調和波動として与えることを研究した.制御入力の大きさ(波長)と位相をそれぞれどのように決めればよいのか,制御の結果,動的応力集中はどの程度緩和されるのか,そして,それらの結果は実用材料の疲労強度増進にどの程度寄与するのかを理論的に検討した.弾性論に基づいて数理解析を行い,動的応力集中係数と制御入力の大きさの自乗和(評価関数)が最小となるような制御入力を求めるために拡張カルマンフィルターを利用した.実際の構造部材には,ミクロ的な切り欠き,すべり帯,界在物,き裂,空洞、転位等の損傷が存在し,これらの損傷近傍においては応力集中が認められるため破壊の起点となり易く,機械構造物の寿命を低下させる一因となっている.そこで,動的荷重を受けた損傷部を有する弾性体中に発生する応力集中を弾性波動によって緩和させるようなアクチィブ制御系の構築方法を研究した.円孔を有する無限薄板に無限遠方から調和せん断波が持続的に入力している場合を考えると,このときには円孔縁で動的応力集中が生じている.そこで,この調和せん断波を外乱と見なして円孔縁における動的応力集中と制御入力の大きさの自乗和が最小となるような制御入力を調和波動として与えることを研究した.制御入力の大きさ(波長)と位相をそれぞれどのように決めればよいのか,制御の結果,動的応力集中はどの程度緩和されるのか,そして,それらの結果は実用材料の疲労強度増進にどの程度寄与するのかを理論的に検討した.弾性論に基づいて数理解析を行い,動的応力集中係数と制御入力の大きさの自乗和(評価関数)が最小となるような制御入力を求めるために拡張カルマンフィルターを利用した.
ADPリボシル化酵素C3のRhoGTPase認識機構の解明

RhoA特異的ADPリボシル化毒素C3酵素(毒素)と基質RhoAの複合体結晶を作成し、複合体の結晶構造を明らかにした(Toda et al, JBC 2015)。C3酵素(毒素)のRho GTPase認識機構を明らかにした。C3がタンパク質基質RhoA全体を認識し、さらにADPリボシル化するAsn41を特異的に認識する。特に後者の認識は重要で、C3のARTT-loopのQXEのGln183がRhoA Asn41と水素結合を作ることで、特異的なAsn41のADPリボシル化を保証する。ARTT-loopの修飾アミノ酸の認識を結晶構造で捉え、目で見える形で明らかにしたことは世界で初めてである。セレウス菌由来のRhoA特異的ADPリボシル化毒素C3(C3cer)とその基質タンパクRhoAの複合体結晶を作成し、結晶構造解析を進めた。C3-RhoA(GTP)結晶を用いて、この構造を決定、次にこの結晶にNADH(不活性な補酵素)をソーキングすることで、NADH-C3-RhoA(GTP)の構造を決定した。同様にC3-RhoA(GDP)の結晶を作り、これにNADHをソーキングすることで、NADH-C3-RhoA(GDP)の構造を解析した。C3ではNAD結合部位周りの4つの領域とC3cerに特異的と思われる1つの領域が結合に関与している。また、シグナルスイッチであるRhoAではswitch I、interswitch, switch IIからなる約50アミノ酸領域がその結合に重要であった。この複合体結晶構造から次の結果が得られた。(1)C3と結合することで、RhoA(GTP)もRhoA(GDP)も、この結合領域が同じコンフォメーションをとり、どちらもADPリボシル化の基質になることができる。(2)C3のARTTループのGln183が,基質RhoAの修飾アミノ酸であるAsn41を認識することで、基質のアミノ酸の特異性を出していることが予想されてきたが、この構造から実験的に初めてC3 Gln183とRhoA Asn41が塩橋を作り、基質認識、すなわち修飾アミノ酸の選択をしていることを明らかにした。(3)さらに複合体の構造を基に酵素基質改変を行った。C3はRhoA特異的であり、同じRhoファミリーでAsn41を持つRac1やCdc42は良い基質とならない。Cdc42の結合部位の4つのアミノ酸に着目して4重変異体を作ることにより、C3cerの良い基質とすることに成功した。C3 enzymeは1989年の以来、そのRhoAに対する特異性から、Rhoシグナルカスケードを知るための重要な道具として用いられてきた。C3およびRhoAそれぞれ単体の構造解析はなされてきたが、多くの情報をもたらす複合体のX線結晶構造解析は長く期待されていたが、なされていなかった。この研究で、その複合体構造を明らかにした。特に重要な点は、RhoAとのタンパク質特異性と修飾されるアミノ酸の特異性を明らかにした点である。上記の結果を、Journal of Biological Chemistry誌(J Biol Chem. 7;290(32):19423-32. (2015))に発表した。さらにEuropean Workshop on Bacterial Protein Toxins(ETOX17)で招待され口頭講演を行った。またC3とRhoAのお互いの認識するための構造柔軟性についてPathogen Disease誌(Pathog Dis. 73(9)(2015))にレビューをまとめた。近年日本で起きた食中毒で、ウェルシュ菌のエンテロトキシン(CPE)欠損株の関与が疑われ、新規の食中毒毒素が見出された。この毒素はClostridium perfringens iota-like toxin (CPILE)と命名された。CPILEはCPILE-a, CPILE-bの2つのコンポーネントからなるbinary毒素である。ウェルシュ菌のIota毒素(Ia,Ib)との相同性は50%程度であるが、その毒性に違いがあることが報告された。Iota毒素ではIaはアクチン特異的なADPリボシル化毒素、一方Ibは細胞膜上でオリゴマーを作り、Iaを透過するトランスポーターと考えられている。CPILEの食中毒原因毒素としてのアッセイすなわち腸管を用いたFluid accumulating活性は、CPILE-bのみでもあり、CPILE-aで増強することが示されている。我々は、食中毒毒素の作用機構解明のためCPILE-aの構造機能解析を行った。CPILE-aの結晶はPEGを沈殿剤として得られ、初期位相は水銀を用いたMAD法で得られた。この後、構造精密化し、最終構造を得た。今回得られた構造は3種類であり、基質なし、NAD+複合体(本来の基質であるNAD+が結合したもの)、NADH複合体である。Iaと構造を比較すると、Iaにはない2つのExtra Protruding Loop(PT-IとPT-II)が存在することがわかった。すでに我々のグループで研究が進んでいる、Iaと基質タンパクのアクチンとの複合体との結晶構造から、CPILE-a-actin複合体のモデルを構築し、アクチン結合部位と思われるアミノ酸の変異体を作成して、その役割を検討した。CPILE-aでは、loop-IIIVと領域外のPT-Iの変異体もαアクチンとの結合すなわち活性に影響することがわかった。

セレウス菌のC3毒素はRhoAを認識しADPリボシル化する。2015年、我々はC3-RhoAの複合体構造解析に成功しC3毒素の基質認識機構を明らかにした(JBC 2015:本科研費研究初年度)。この基質認識機構の解析から、RhoAとCdc42の多重変異体作成をして、後者を非常に良い基質とすることに成功した。またIaはウェルシュ菌のADPリボシル化毒素であり、我々は2008年にその基質アクチンとの複合体の構造を明らかにしている(PNAS 2008,PNAS 2013)。これら基質タンパク質複合体の解析により、相手のタンパク質が違う(RhoA vs actin)また修飾するアミノ酸が異なった(Arg vs Asn) ADPリボシル化毒素C3とIaの比較研究が大きく進んだ。今年、Iaと相同でヒト腸管感染に関わるCPILE-aの構造と機能を解析した。この研究により、更に研究の新たな目標が見えてきた。CPILEはIota毒素と相同であるが、ヒト感染症に関わるより重用なバイナリー毒素である。その毒性の理解を更に進めるにはADPリボシル化する酵素成分だけでなく膜透過成分からの検討が必要となる。前年までの研究により、セレウス菌由来のRhoA特異的ADPリボシル化毒素C3(C3cer)と基質RhoAの複合体結晶を作成し、複合体の結晶構造を明らかにした(Toda et al, JBC 2015)。C3酵素(毒素)のRho GTPaseの認識機構は(1)タンパク質基質RhoAを認識すること(2)またADPリボシル化するAsn41を特異的に認識することの2つが重要である。C3やアクチン特異的ADPリボシル化毒素で保存されているARTT-loopと呼ばれる領域がAsn41の認識に重要と提唱されたが、この認識については基質タンパク質との複合体の結晶構造解析が難しいために不明であった(他に明らかになっているのはIa-アクチン複合体(Tsuge et al. PNAS 2008)のみ)。この研究により初めてARTT-loopのQXEのGln183がRhoA Asn41と塩橋を作る姿を捉えた。一方IaではEXEのGlu(前者)がArg177を認識していると予想されるが、Ia-アクチン複合体ではこの結合は見えていない。Ia-アクチンの反応においてもこの認識が過渡的に形成されているかは興味深い。またウェルシュ菌から見つかった新たな食中毒関連毒素Clostridium perfringensiota-like toxin (CPILE)は、Iaと相同なアクチン特異的ADPリボシル化毒素CPILE-aを持ち、昨年度その構造を報告した(Toniti et al. PLoS ONE, 2017)。ARTT-loopの認識機構と修飾アミノ酸の特異性についての全容解明は次の研究課題となる。これはAsn,ArgだけでなくCys,Glu,Serやさらにタンパク質のみならずDNA,低分子も含めた様々な基質特異性を持つ事がわかってきたADPリボシル化分野で極めて重要な課題と考えている。RhoA