hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IMCT法を用いたtransgenic mouse網膜プリン受容体機能の解明

1)マウス網膜凍結薄切切片標本を用いた免疫組織化学的検討P2X型プリン受容体サブタイプ抗体を用いた野生型マウス網膜の免疫染色から、コリン作動性アマクリン細胞にはP2X2型プリン受容体が存在していると考えられた。またP2X2型受容体は主にOFF型細胞に局在し、ON型細胞にはほとんど存在していなかった。またP2X2型受容体のコリン作動性アマクリン細胞における局在を確認するため、P2X2型プリン受容体抗体と抗choline acetyl transferase (ChAT)抗体との二重染色を行なったところ、両者の免疫反応が同一細胞にあることが確認された。2)IMCT法を用いたtransgenic mouse網膜コリン作動性アマクリン細胞の選択的消去京都大学医学部中西研究室の森島陽介先生との共同研究でimmunotoxinの眼球内注入を行い選択的なコリン作動性アマクリン細胞の消去を試みた。IMCT法を用いて他の網膜神経細胞を障害することなくコリン作動性アマクリン細胞を選択的に消去した網膜標本では、P2X2型受容体抗体に対する免疫反応性が消失していた。このことからP2X2型受容体はコリン作動性アマクリン細胞上に存在すると考えられた。3)マウス網膜コリン作動性アマクリン細胞からのスライスパッチ記録遺伝子改変マウス網膜薄切切片標本を作製し、GFPでラベルしたコリン作動性アマクリン細胞からパッチクランプ法を用いて、ON型、OFF型両方のサブタイプからATP応答を記録し、その大きさを比較検討した。その結果ATPはOFF型では応答を引き起こすが、ON型ではほとんど応答を引き起こさなかった。またGFP陰性の非コリン作動性アマクリン細胞ではATP応答がまったく生じなかった。また単離コリン作動性アマクリン細胞標本を作製し、パッチクランプ法を用いてプリン受容体応答のイオン特性や薬理学的特性を検討した。その結果、P2X2型プリン受容体にATP2分子が結合すると受容体が活性化すること、活性化に伴って陽イオン電流が発生し細胞に脱分極を引き起こすことが明らかとなった。2)コリン作動性アマクリン細胞シナプス前膜側に存在するP2X型プリン受容体マウス網膜薄切切片標本を用いた実験から、ATP受容体はシナプス前膜側にも存在する可能性が示唆された。シナプス前膜側に存在する受容体はON型OFF型いずれにも存在し、ATP投与によってGABA入力を増大させることが明らかとなった。また電気生理学的実験と免疫組織化学的実験結果から、シナプス前膜にはP2X7型が存在すると考えられた。1)マウス網膜凍結薄切切片標本を用いた免疫組織化学的検討P2X1,P2X2,P2X4,P2X7サブタイプに対する抗体を用いた野生型マウス網膜の免疫染色から、コリン作動性アマクリン細胞にはP2X2型プリン受容体が存在していると考えられた。

またP2X2型受容体のコリン作動性アマクリン細胞における局在を確認するため、P2X2型プリン受容体抗体と抗choline acetyl transferase(ChAT)抗体との二重染色を行なったところ、両者の免疫反応が同一細胞にあることが確認された。2)IMCT法を用いたtransgenic mouse網膜コリン作動性アマクリン細胞の選択的消去京都大学医学部中西研究室の森島陽介先生との共同研究でimmunotoxinの眼球内注入を行い選択的なコリン作動性アマクリン細胞の消去を試みた。IMCT法を用いると他の網膜神経細胞を障害することなくコリン作動性アマクリン細胞を選択的に消去することができた。コリン作動性アマクリン細胞がIMCT法で消去された網膜標本ではP2X2型受容体抗体に対する免疫反応性が消失していたことから、P2X2型受容体はコリン作動性アマクリン細胞上に存在すると考えられた。3)マウス網膜コリン作動性アマクリン細胞からのスライスパッチ記録遺伝子改変マウス網膜を用いて薄切切片標本を作製し、蛍光顕微鏡下にGFP陽性のコリン作動性アマクリン細胞からの記録を試みた。薄切切片中のコリン作動性アマクリン細胞は樹状突起等が失われているため、長時間記録を行うことができていない。現在まだpreliminaryな記録のみであるが、免疫組織化学的手法で得られたデータと同じ傾向が観察されている。現在長時間記録が可能な標本作製の条件を検討中である。1)コリン作動性アマクリン細胞に存在するP2X型プリン受容体コリン作動性アマクリン細胞は光応答の違いからON型とOFF型に分かれる。昨年度の免疫組織化学の結果からOFF型のみにP2X2型プリン受容体が存在することがわかっている。そこで遺伝子改変マウス網膜薄切切片標本を作製し、GFPでラベルしたコリン作動性アマクリン細胞からパッチクランプ法を用いて、ON型、OFF型両方のサブタイプからATP応答を記録し、その大きさを比較検討した。その結果、ATPはOFF型では応答を引き起こすが、ON型ではほとんど応答を引き起こさなかった。またGFP陰性の非コリン作動性アマクリン細胞ではATP応答がまったく生じなかった。次に単離コリン作動性アマクリン細胞標本を作製し、パッチクランプ法を用いてプリン受容体応答のイオン特性や薬理学的特性を検討した。その結果、P2X2型プリン受容体にATP2分子が結合すると受容体が活性化すること、活性化に伴って陽イオン電流が発生し細胞に脱分極を引き起こすことが明らかとなった。また単離細胞標本を用いた電位依存性イオンチャンネルの電気生理学的解析も行った。2)コリン作動性アマクリン細胞シナプス前膜側に依存するP2X型プリン受容体マウス網膜薄切切片標本を用いた実験から、ATP受容体はシナプス前膜側にも存在する可能性が示唆された。シナプス前膜側に存在する受容体はON型OFF型いずれにも存在し、ATP投与によってGABA入力を増大させることが明らかとなった。
先天色覚異常および保因者の遺伝子診断法の確立

目的:本研究は、日本人先天赤緑異常およびその保因者の遺伝子診断法を確立し、心理物理学検査と遺伝子型関連性を見つけ出すことを目的としている。方法:まず当科専門外来で、仮性同色表、Pane1-D15、アノマロスープで先天赤緑異常と診断された女子や男子と保因者であるその母親を抽出した。研究は、学内倫理委員会で承認された計画書に基づき行われた。インフォームド・コンセントを得た後、末梢静脈血より高分子ゲノムDNAを抽出した。発端者である第1異常8例(女子1例を含む)とその母親、第2異常5例とその母親に対し、PCR-SSCP法、Long-range PCR法および直接塩基配列決定法により遺伝子型を決定した。結果:第1異常男子の発端者全例で正常赤視物質遺伝子が緑視物質遺伝子に類似した赤緑融合遺伝子に置き換わっていた。絶対保因者においても、Long-range PCR法により赤緑融合遺伝子を検出した。また、第1異常女子の遺伝子型を第1色盲の弟と第1色弱の父親の遺伝子型の決定によって同定することができた。第2異常の発端者5例で正常赤視物質遺伝子に加え赤視物質遺伝子に類似した緑赤融合遺伝子の存在が確認された。その3例で正常緑視物質遺伝子も存在していた。2例では、正常赤視物質遺伝子のみが認められ、正常緑遺伝子や緑赤融合遺伝子は、検出されなかった。第2異常の保因者では、緑赤融合遺伝子を有するものではその存在を確認できた。考按:本法によって、第1異常とその保因者は100%検出可能であることが示唆された。一方。第2異常の遺伝子配列決定は可能であったが、遺伝子種類の複雑性から保因者の遺伝子型決定には、最末端の視物質遺伝子の同定が不可欠と考えられた。先天色覚異常女子の遺伝子型は、家系調査によって同定できる可能性がある。今後は、先天色覚異常女子の遺伝子型と表現型についても症例を重ね検討していきたい。目的:本研究は、日本人先天赤緑異常(遺伝形式はX連鎖劣性遺伝)およびその保因者の遺伝子診断法を確立し、心理物理学検査と遺伝子型の関連性を見つけ出すことを目的としている。方法:まず当科専門外来で、仮性同色表、Panel-D15、アノマロスコープで先天赤緑異常と診断された男子と絶対保因者となるその母親を抽出した。研究は、先天色覚異常の遺伝子解析をテーマに学内倫理委員会で承認された計画書に基づき行われた。インフォームド・コンセントが得られたものから末梢静脈血を採取し白血球分離後、高分子ゲノムDNAを抽出した。発端者である第1異常5例とその母親、第2異常3例とその母親に対し、Long-range PCR法および直接塩基配列決定法により遺伝子型を決定した。結果:第1異常の発端者全例で正常赤視物質遺伝子が緑視物質遺伝子に類似した赤緑融合遺伝子に置き換わっていた。一方、第1異常で検出されなかった正常赤視物質遺伝子は、絶対保因者では検出された。第2異常の発端者2例で正常赤視物質遺伝子に加え赤視物質遺伝子に類似した緑赤融合遺伝子の存在が確認された。その1例で正常緑視物質遺伝子も存在していた。残りの1例では、正常赤視物質遺伝子のみが認められ、正常緑遺伝子や緑赤融合遺伝子は、検出されなかった。第2異常の保因者では、存在する視物質遺伝子の数が多く遺伝子型の決定には至らなかった。一方、第2異常の遺伝子配列決定は可能であったが、遺伝子種類の複雑性から保因者の遺伝子型決定には、最末端の視物質遺伝子の同定が不可欠と考えられた。今後、第2異常においては、Long-range PCR法を改良し、遺伝子解析による保因者診断の確立を目指していきたい。

考按:本法によって、第1異常とその保因者は100%検出可能であることが示唆された。一方。第2異常の遺伝子配列決定は可能であったが、遺伝子種類の複雑性から保因者の遺伝子型決定には、最末端の視物質遺伝子の同定が不可欠と考えられた。先天色覚異常女子の遺伝子型は、家系調査によって同定できる可能性がある。今後は、先天色覚異常女子の遺伝子型と表現型についても症例を重ね検討していきたい。
文化が老年期の物語テキスト認知処理過程に及ぼす影響

本研究では、日本と米国における異文化間及び年齢群間比較研究を行い、文化が老年期の物語テキスト認知処理過程に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。その結果、両文化群において、表面的意味想起課題においては若年者が、解釈的意味想起課題においては、高齢者が、それぞれ高い遂行成績を示した。さらに、高齢者は、自分が属さない文化が反映された物語テキストが刺激として呈示されると、より深く統合的な解釈的意味想起をしていた。老年期において物語テキストの意味を想起する際、これまでの人生経験を通して培ってきた包括的な知識を次世代に伝えることが社会的認知ゴールであるため、命題には表現されていない象徴的な意味を深く、統合的に解釈することが明らかにされている。また、生涯発達理論によれば、発達は、文化、歴史、社会との関連や多様な因子の影響を受け形成される可塑性のものであるとされており、先行研究において老年期の認知処理過程には文化やライフスタイルが影響を及ぼすことが示唆された(Hosokawa & Hosokawa,2006)。本研究の目的は、先行研究での結果を踏まえ、日本と米国の高齢者と若年者を対象に物語テキストにおける認知処理過程を質的に明らかにすることを目的とした2部の実験から構成される。それぞれの実験では、異なった物語テキストを刺激として用いる。第1実験においては東洋の文化が反映された物語テキスト、第2実験においては西洋の文化が反映された物語テキストを用いることとした。平成19年度は、両文化群に対し、東洋の文化的内容が含蓄されたテキストを刺激として用いた第1実験を施行した。「せんだい豊禮学園」に在籍する高齢者20名と宮城大学に在籍する若年者20名から構成される計40名の日本人群と米国モンタナ州の「ミズーラシニアセンター」に在籍する高齢者20名とモンタナ大学に在籍する若年者20名から構成される計40名の米国人群、合計80名を対象に調査実験を施行した。以下の手続きにより面接形式で調査実験を施行した。1.大まかな実験手続きの説明を含むインフォームドコンセント、2.個人情報収集と健康状態の自己申告3.物語テキストの読解、4.挿入課題、5.物語テキスト想起課題、6.物語テキストの感想についての質問紙老年期において物語テキストの意味を想起する際、これまでの人生経験を通して培ってきた包括的な知識を次世代に伝えることが社会的認知ゴールであるため、命題には表現されていない象徴的な意味を深く、統合的に解釈すること力弐明らかにされている。また、生涯発達理論によれば、発達は、文化、歴史、社会との関連や多様な因子の影響を受け形成される可塑性のものであるとされており、先行研究において老年期の認知処理過程には文化やライフスタイルが影響を及ぼすことが示唆された(Hosokawa & Hosokawa, 2006)。本研究の目的は、先行研究での結果を踏まえ、日本と米国の高齢者と若年者を対象に物語テキ一ストにおける認知処理過程を質的に明らかにすることを目的とした2部の実験から構成される。それぞれの実験では、洋の異なった文化が反映された物語テキストを刺激として用いた。科研費採択課題2年目である今年度、平成20年度は、日本と米国の両文化群に対し、西洋の文化的内容が含蓄されたテキストを刺激として用いた第2実験を施行した。「せんだい豊禮学園」に在籍する高齢者18名と宮城大学に在籍する若年者20名から構成される計40名の日本人群と米国モンタナ州の「ミズーラシニアセンター」に在籍する高齢者20名とモンタナ大学に在籍する若年者20名から構成される計40名の米国人群、合計78名を対象に調査実験を施行した。1.大まかな実験手続きの説明を含むインフォームドコンセント、2.個人情報収集と健康状態の自己申告3.物語テキストの読解、4.挿入課題、5.物語テキスト想起課題、6.物語テキストの感想についての質問紙科研費採択課題最終年度である今年度は、海外の学会にて研究成果発表を行った。平成19年度および20年度における日米間の調査実験の結果、従来の研究結果と同様、両文化群で、若年者は表面的意味想起において、高齢者は解釈的意味想起において、それぞれ高い遂行成績を示した。しかしながら、以下の3点について新たな結果が示された。1.日米両国の高齢者は、それぞれ異なった文化の物語テキスト条件下において、その文化に属する群よりも深く、統合的な解釈をしていた(Hosokawa,2009)。2.米国人群において、東洋の意味を含有する物語テキスト条件下では、高齢者は異なった文化のテキストが刺激として提示されると、より深く統合的な解釈をした。3.米国の高齢者群の表面的意味想起成績は高い傾向にあった。これらの結果を考察すると、高齢者は異なった文化の物語テキストが刺激として提示されると、より深く、統合的な解釈をする。

それは馴染みのない刺激に接近するため、豊富な人生経験によって培われた知識とWisdomを適応させながら物語の要旨を解釈することに効果的に焦点を当てるためであると考えられる。また、これまでの先行研究においては、高齢者は解釈的意味想起において高い成績を示す一方で、表面的意味想起においてはあらゆる条件下で差異は認められず低い成績を示した。しかしながら、異なる文化的意味の物語を提示された米国人の高齢者群の表面的意味想起成績は高い傾向を示した.この結果は、豊富な人生経験によって培われた知識とWisdomにより深い解釈的意味想起をすることにより、表面的意味想起が促されたと考えられた。従って、これまでは高齢者にとって困難であった命題想起としての表面的意味想起成績が向上する可能性があることから、表面的意味想起そのものと表面的意味想起と解釈的意味想起の関係性について明らかにすることが今後の課題として示唆された。
超分子複合体の生体膜上における動態を探る:細菌べん毛モーターの構築・機能維持機構

べん毛モーター構成素子のGFP融合タンパク質の構築,およびそれらの全反射照明を用いた退色後蛍光回復(Eva-FRAP)を単一モーターで観察することで,細菌べん毛モーターの回転子構成素子が,機能的に回転しているモーターにおいて交換されていることが明らかにされた.またべん毛繊維に付着させた微小ビーズの回転を高速カメラで同時に計測することで,単一細胞上の複数べん毛モーターの回転方向転換が,受容体を基準とした時間差を伴って同調することが分かった.このことから細胞内シグナル伝達分子の濃度上昇および減少が細胞内を波状に伝播することが示唆された.べん毛モーター構成素子のGFP融合タンパク質の構築,およびそれらの全反射照明を用いた退色後蛍光回復(Eva-FRAP)を単一モーターで観察することで,細菌べん毛モーターの回転子構成素子が,機能的に回転しているモーターにおいて交換されていることが明らかにされた.またべん毛繊維に付着させた微小ビーズの回転を高速カメラで同時に計測することで,単一細胞上の複数べん毛モーターの回転方向転換が,受容体を基準とした時間差を伴って同調することが分かった.このことから細胞内シグナル伝達分子の濃度上昇および減少が細胞内を波状に伝播することが示唆された.細菌べん毛モーターは、細菌の細胞膜に埋まった巨大な膜上生物機械である.この生物機械はイオンによって駆動される回転モーターとして機能するが,直径50nmにも達する巨大タンパク質複合体が流動性に富んだ生体膜上でどのように構築され,どのように維持・管理されるのかは分かっていない.本研究は,各々のモーター構成素子をGreen Fluorescence Protein(GFP)を用いて蛍光標識し,流動性に富んだ生体膜上における巨大タンパク質複合体の構築機構,および体膜上での機能維持のための機構を明らかにすることを目的としている.平成21年度の研究では,モーター回転子構成素子のGFP融合タンパク質の発現系,および,課題の中心となる顕微鏡システムを構築した.またこの顕微鏡システムには当初の研究計画に先んじて,エバネッセント照明を用いた蛍光退色系を導入した.平成21年度に設置した顕微鏡システムおよびエバネッセント照明を用いた蛍光退色系を用いて,GFP融合タンパクが組み込まれたべん毛モーターに対して,退色後蛍光回復実験を行った.その結果,GFP融合タンパクが組み込まれた機能的なモーターにおいて,退色後の蛍光回復が観察された.生体膜上の生物機械である細菌べん毛モーターの回転子構成素子が,機能的に回転しているモーターにおいて交換されていることが明らかにされた.これらの成果はBiochem.Biophys.Res.Commun.2010 26 ; 394(1): 130-5.に掲載された.細菌べん毛モーターはイオンによって駆動される回転モーターであるが,このような巨大タンパク質複合体が生体膜上でどのように構築され,維持・管理されるのか明らかでない.本研究は,各々のモーター構成素子を緑色蛍光タンパク質(GFP)で蛍光標識し,生体膜上での巨大タンパク質複合体の構築機構,機能維持のための機構を明らかにすることを目的としている.平成22年度の研究では,以下の項目についての研究を実施した.1)べん毛モーター構成素子の分子数定量平成21年度に構築した顕微鏡システムを用い,モーター回転子のGFP融合タンパク質が組込まれたモーターの蛍光退色から,単一モーターにおいてGFP融合タンパク質一分子に由来すると期待される退色蛍光強度差を検出した.2)べん毛モーター構成素子の交換における外的要因(走化性シグナル等)の検討本項目の実施にあたり,外的要因の探索,及びべん毛モーターの新規回転計測系を開発していたとろ,大腸菌の複数のモーターの回転が走化性システムによって同調的に制御されていることが新規に明らかになった.この発見は,これまでの知見に一石を投じる非常に重要かつ全く新しい発見であったため,当初研究計画を変更し,大腸菌による複数べん毛モーターの同調制御についての研究を進めることとした.べん毛モーターはイオンで駆動される回転モーターであるが,この分子機械が生体膜上でどのように構築され,維持・管理されるのかは明らかでない.本研究は,モーター構成素子を緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識し,生体膜上でのモーターの構築・機能維持の機構の解明を目的としている.平成23年度の研究では,以下の項目について実施した.1)べん毛モーター構成素子の分子数定量モーター回転子のGFP融合タンパク質(GFP-FliG)が組込まれたモーターの蛍光退色から,1分子のGFP-FliGに由来する退色蛍光強度差を見積った.全反射蛍光顕微鏡と大腸菌の形状による蛍光強度差を補正し,機能的な単一モーターのFliG数を見積ったところ,過去の定性的な研究により想像されているものと同等の値が得られた.2)べん毛構造体の構築部位の検証本年度の計画では,べん毛の軸構造の遺伝子欠損株を作成し各欠損株においてべん毛構造体の拡散を解析する予定であった.各種変異体の作成の設計を進めていたが,3)の研究の進展が著しかったため,当初計画を変更し3)の研究の実施に重点を置くことにした.3)大腸菌複数べん毛モーターの同調的な制御についての分子機構の解明H22年度の研究で,複数べん毛モーターがリン酸化CheY(CheY-P)濃度増加/減少の方向性を伴った伝播(波状伝播)で同調的に制御されることを提唱し,H23年度にBiophys.J.(2011)100,2193に掲載された.本年度の研究で,CheY-Pシグナル消去を担う脱リン化

酵素CheZの細胞極局在が,方向性を伴ったCheY-P濃度減少の伝播に重要であることを明らかにした.本結果は学術雑誌への投稿を準備している.
『本朝無題詩』の諸本の研究

1.『本朝無題詩』の伝本二十種類をすべて収集・調査した。2.諸伝本を比較検討した結果、校本の底本にふさわしい善本として、学界未報告の新潟大学附属図書館蔵佐野文庫本を比定するに至った。3.『本朝無題詩』のすべての伝本のすべての校異を掲出する、第一次校本を作成した。4.本文校訂上重要と思われる伝本十種を選び、検討を加えて第二次校本を作成した。5.第二次校本の校異一つ一つを検討して、校訂本文を作成した。6.5の校訂本文を一字索引の依拠本文とし、これをデータ入力した。7.この一字索引を四角号碼によって検索できるよう、すべての出現漢字に四角号碼をふり、その順番にしたがって漢字(見出し字)を配列した。これは日本漢詩文の索引においては、初めての試みである。8.7のデータを6のデータに導入し、データベースソフトを使って出力することにより、『本朝無題詩』の一字索引を完成した。9.従来『本朝無題詩』の伝本は、三巻本一類・三巻本二類・十巻本の三系統に分類され、この順に編集が進み、最終的な完成形態である十二巻本は伝わらずに、編集過程の三段階それぞれの形態のものが流布したと考えられてきた。しかし本研究の過程で、『本朝無題詩』の三巻本二類は、江戸時代になって三巻本一類が盛んに書写され、当時の学者・詩人たちによって研究・享受される過程で、本文や体裁の改変が行われた結果生まれたものであることが判明した。1.第一回打ち合わせ会議により、諸本の調査・複写物の収集の分担を決定し、大曾根章介教授の講演による知見などを得て、その後ただちに作業に着手した。ついで第二回打ち合わせ会議において、本文の調査・入手状況を報告し、またその複写物を配布して、情報の共有をはかった。これに基づいて以後の研究方針について討議し、校合による比較・検討の分担を決定した。2.全国に散在する『本朝無題詩』の伝本の調査およびその複写物の収集が、実践女子大学蔵山岸文庫本を除いて、完了した。それらの中には、従来詳しい調査のなされていなかった伝本も含まれている。これら複写物の収集によって、『本朝無題詩』の現存伝本の状況がほぼ一望しうることとなった。3.収集された伝本について、各研究分担者がそれぞれの分担にしたがって、校合による本文の比較・検討作業を開始した。これによって、『本朝無題詩』の研究史においてこれまで詳しい研究のなされなかった、吉田幸一氏蔵本や宮城県図書館蔵伊達文庫本および新潟大学附属図書館蔵佐野文庫本などの本文が、注目すべき優秀性を有することなどが判明した。4.校合による本文の比較・検討作業に基づき、第三回打ち合わせ会議以降、ミセケチ・補入・異体字など、本文の具体的事実の報告がなされ、これらの処理についての討議が重ねられた。これによって従来指摘されることのなかった、漢詩文の本文研究の問題点が明らかになった。とくに異体字については詳しい検討がなされ、第五回打ち合わせ会議において、その合理的処理の方法を確定した。前年度に調査・収集した『本朝無題詩』の諸伝本に加え、実践女子大学蔵山岸文庫本を調査し、その写真版を入手した。これによって、現在知られ得る同書のすべての伝本(19種。ただし完本のみ)に対して、調査・収集を完了した。そのデータに基づき、諸本相互を比較検討した結果、研究史において従来未調査のまま放置されていた新潟大学蔵佐野文庫本を最善本とみなすに至り、同本を校本および一字索引作成の底本とすることを決定した。

ひきつづき研究分担者全員および研究協力者によって、『本朝無題詩』の校本を作成する作業を開始した。その過程で、頻出する特有の異体字の存在、およびその処理の問題をめぐって、さまざまな知見が報告された。その校本の作成は、本年度七月をもって完了した。これによって、従来本文研究のほとんどなされなかった『本朝無題詩』の諸本の状態が一望し得ることとなった。その校本の成果に基づき、ひきつづき直ちに校訂本文作成の作業を開始した。この校訂本文は、一字索引としてデータ入力するためのものである。本研究の当初計画では、前述の校本をそのままデータ入力する予定であったが、多様な研究目的に供するためには、それでは大部で煩瑣に過ぎるものになる虞れがあると判断したためである。この校訂本文は、個々の詩の読解や典拠の調査などを踏まえ、底本を校訂し必要最小限の校異を示したものであり、一字索引のデータとなるのみならず、『本朝無題詩』を解釈する上での、もっとも信頼すべき本文となるべきものである。研究分担者全員および研究協力者により、本年度一月十日をもって、全体の約半分の校訂本文が提出された。残りの半分は、来年度四月十日に提出される予定である。また提出された校訂本文の全体的統一をはかるため、あらたに校訂本文再検討委員会が結成され、本度二年十七日より検討作業を開始した。本研究では、平成三・四年度に伝本二十種による第一次校本を作成した。平成五年度には、その作業の過程で得られた諸伝本に関する知見に基づき、本文校訂上重要と思われる伝本十種を選び、もう一度それぞれ原本と照合して、校異掲出基準の統一を図ると共に、第一次校本の誤りを正し、新たに第二次校本を作成した。この成果をもとに、校異の一つ一つに検討を加えて、底本である新潟大学附属図書館本の誤写を正し、異文として採用すべき校異を付け加えて、校訂本文を作成した。そして、この校訂本文をもって、本研究の最終目的である一字索引の依拠本文とした。この校訂本文をデータ入力した。更に、この一字索引を四角号碼によって検索できるよう、全ての出現漢字に四角号碼をふり、その順番に従って漢字(見出し字)を配列した。これは日本漢詩文の索引においては初めての試みである。これまでに索引が作られた作品と違って、『本朝無題詩』は775首もの詩を収め、その異なり字数は約2800にものぼるため、従来使われてきた部首・音訓・総画などの検索方法ではかえって混乱を招くと判断したためである。この四角号碼のデータを校訂本文のデータに導入し、データベースソフトを使って出力することにより、一字索引を完成した。従来『本朝無題詩』の伝本は、三巻本一類・三巻本二類・十巻本の三系統に分類され、この順に編集が進み、最終的な完成形態である十二巻本は伝わらずに、編集過程の三段階それぞれの形態のものが流布したと考えられてきた。しかし、本研究の過程で、三巻本二類は、江戸時代になって三巻本一類が盛んに書写され、当時の学者・詩人たちによって研究・享受される過程で本文や体裁の改変が行われた結果生まれたものであることが判明した。これも本研究の大きな成果である。
痴呆高齢者に対する音楽と振動刺激が生活リズム同調に与える影響

1.対象者の好みの音楽をCDに編集して2ケ月間ボディーソニックを使用して聴かせた.影響を連続的携行型行動量計(アクティウオッチ;Actiwatch, Mini-Mitter Co. Inc.)により測定した.対象者は6名だった(78.7±5.4歳).対照群6名(84.3±9.5歳)は実験前後の行動量の測定のみを行い,音楽は聞かせなかった.好みの音楽の選定は昭和初期から昭和60年代にかけての流行歌の中から行った.聴覚に振動覚を加えた音楽刺激を与えた実験群は実験前の行動量平均は137540.1±80733.4,実験後は平均179363.7±104916.4で行動量は有意に増加していた(P<0.05).それに対して対照群では実験前の行動量平均は121503.5±74321.0,実験後は平均94269.3±67687.0で前後に有意差はなかった.音楽刺激を与えられた群は音楽を聴く時間を楽しみにしていて生活にはりがでたと答えていた.好みの音楽を聴覚に振動覚を伴わせて聞くことが行動を活性化していたものと思われる.2.痴呆性老人に聴覚刺激のみを与えた場合と聴覚に振動覚を伴わせた刺激を与えた場合の運動に与える影響を調べた.対象者は10名(87.3±4.6歳).両腕の上下動でプーリー(滑車につけられたロープを動かす装置)を動かした回数,動かしたロープの長さの総合,プーリーを動かしていた時間で比較した.同一被験者に聴覚刺激のみの場合と聴覚に振動覚を加えた場合の両方を行った.両実験はそれぞれ別の日に行った,各被験者にはできるだけ長く運動すること,ただし疲れたら運動は止めてもいいことを伝えて行った.10名のうち3名は短時間でロープから手を離してしまったり,他に気をとられて途中で動きを止めてしまったので課題の理解ができなかったものとして分析から除いた.7名の運動持続時間,回数,ロープを動かした長さの総長を対応のあるt検定で比較すると回数に有意差があった.振動を伴わせた音楽の方が痴呆老人には運動に対する動機付けが持続していたと考えられた.1.対象者の好みの音楽をCDに編集して2ケ月間ボディーソニックを使用して聴かせた.影響を連続的携行型行動量計(アクティウオッチ;Actiwatch, Mini-Mitter Co. Inc.)により測定した.対象者は6名だった(78.7±5.4歳).対照群6名(84.3±9.5歳)は実験前後の行動量の測定のみを行い,音楽は聞かせなかった.好みの音楽の選定は昭和初期から昭和60年代にかけての流行歌の中から行った.聴覚に振動覚を加えた音楽刺激を与えた実験群は実験前の行動量平均は137540.1±80733.4,実験後は平均179363.7±104916.4で行動量は有意に増加していた(P<0.05).それに対して対照群では実験前の行動量平均は121503.5±74321.0,実験後は平均94269.3±67687.0で前後に有意差はなかった.音楽刺激を与えられた群は音楽を聴く時間を楽しみにしていて生活にはりがでたと答えていた.好みの音楽を聴覚に振動覚を伴わせて聞くことが行動を活性化していたものと思われる.2.痴呆性老人に聴覚刺激のみを与えた場合と聴覚に振動覚を伴わせた刺激を与えた場合の運動に与える影響を調べた.対象者は10名(87.3±4.6歳).両腕の上下動でプーリー(滑車につけられたロープを動かす装置)を動かした回数,動かしたロープの長さの総合,プーリーを動かしていた時間で比較した.同一被験者に聴覚刺激のみの場合と聴覚に振動覚を加えた場合の両方を行った.両実験はそれぞれ別の日に行った,各被験者にはできるだけ長く運動すること,ただし疲れたら運動は止めてもいいことを伝えて行った.10名のうち3名は短時間でロープから手を離してしまったり,他に気をとられて途中で動きを止めてしまったので課題の理解ができなかったものとして分析から除いた.7名の運動持続時間,回数,ロープを動かした長さの総長を対応のあるt検定で比較すると回数に有意差があった.振動を伴わせた音楽の方が痴呆老人には運動に対する動機付けが持続していたと考えられた.1.痴呆高齢者に尋常小学校唱歌を聞かせて,聴覚刺激のみの場合と聴覚に振動刺激を加えた場合の反応の違いを検討した.対象者は3名だった(症例A:女性,74歳,HDSR13点.症例B:女性,71歳,HDSR2点.症例C:男性,81歳,HDSRO点).装置として体感音響装置(ボディーソニック;PIONEER RELACTIVE-1)を使用した.刺激は聴覚のみの場合と聴覚に振動覚を加えた場合を交互に与えた.症例に見られる身体的表現(音楽と一緒に曲を口ずさむ,微笑むなど)の持続時間をストップウオッチで測定した.結果としては,症例AとBは4回の測定でいずれの回も聴覚に振動覚が伴った場合の方が身体的表現の持続時間が長く集中して聞いていた.症例Cは曲による差の影響の方が大きかった.

聴覚は前庭系で処理される振動感覚から由来したものであるといわれている.高齢者,特に痴呆を伴った高齢者の場合には音楽刺激は聴覚だけでなく他の感覚,特に振動感覚を併用した方が効果的であると思われる.2.対象者の好みの音楽をCDに編集して約2ケ月間ボディーソニックを使用して聴かせた.影響を連続的携行型行動量計(アクティウオッチ;Actiwatch,Mini-Mitter Co.Inc.)により測定した.対象者は6名だったが,内2名は測定期間中に体調の不良などの原因により中断したため,4名を対象とした(平均年齢76.8±3.9).好みの音楽の選定は昭和初期から昭和60年代にかけての流行歌の中から行った.対象者4名の内3名は行動量の増加がみられたが1名は増加が認められなかった.増加が認められなかったケースは鬱の傾向が以前からあり,音楽は好んで聞いたが日常生活には変化が認められなかった.行動量に変化が認められた3名は音楽を聴く時間を楽しみにしていて生活にはりがでたと答えていた.好みの音楽を聴覚に振動覚を伴わせて聞くことが行動を活性化していたものと思われる.1.対象者の好みの音楽をCDに編集して2ヶ月間ボディーソニックを使用して聴かせた。影響を連続的携行型行動量計(アクティウオッチ;Actiwatch, Mini-Mitter Co. Inc.)により測定した。対象者は6名だった(78.7±5.4歳)。対照群6名(84.3±9.5歳)は実験前後の行動量の測定のみを行い,音楽は聞かせなかった。好みの音楽の選定は昭和初期から昭和60年代にかけての流行歌の中から行った。聴覚に振動覚を加えた音楽刺激を与えた実験群は実験前の行動量平均は137540.1±80733.4,実験後は平均179363.7±104916.4で行動量は有意に増加していた(p<0.05)。それに対して対照群では実験前の行動量平均は121503.5±74321.0,実験後は平均94269.3±67687.0で前後に有意差はなかった。音楽刺激を与えられた群は音楽を聴く時間を楽しみにしていて生活にはりがでたと答えていた。好みの音楽を聴覚に振動覚を伴わせて聞くことが行動を活性化していたものと思われる。2.痴呆性老人に聴覚刺激のみを与えた場合と聴覚に振動覚を伴わせた刺激を与えた場合の運動に与える影響を調べた。対象者は10名(87.3±4.6歳)。両腕の上下動でプーリー(滑車につけられたロープを動かす装置)を動かした回数,動かしたロープの長さの総合,プーリーを動かしていた時間で比較した。同一被験者に聴覚刺激のみの場合と聴覚に振動覚を加えた場合の両方を行った。両実験はそれぞれ別の日に行った。各被験者にはできるだけ長く運動すること,ただし疲れたら運動は止めてもいいことを伝えて行った。10名のうち3名は短時間でロープから手を離してしまったり,他に気をとられて途中で動きを止めてしまったので課題の理解ができなかったものとして分析から除いた。7名の運動持続時間,回数,ロープを動かした長さの総長を対応のあるt検定で比較すると回数に有意差があった。振動を伴わせた音楽の方が痴呆老人には運動に対する動機付けが持続していたと考えられた。
頭部神経堤の分化運命決定におけるＡＦ１０－Ｄｏｔ１ＬによるＨ３Ｋ７９ｍｅ機能解析

H28年度に、Af10ホモ変異胚の顔面正中の融合不全が鼻の原基(鼻隆起)内の神経堤細胞の増殖低下が一因であることが分かったが、Af10-Dot1L複合体が直接制御する遺伝子と、顔面正中の融合不全の原因となる神経堤細胞以外の組織に関しては不明であった。これをうけ、H29年度に以下の2点について解析し、論文(Ogoh H., et al., Scientific Reports, 2017)にした。(1)Af10-Dot1l複合体がAP2α遺伝子の発現制御を直接行っているかを調べるため、胎生10.5日目のAf10ホモ変異胚の鼻隆起を含む組織を用いてクロマチン免疫沈降を行った。その結果、Af10ホモ変異胚のAP2α遺伝子のプロモーター、エンハンサー、コーディング領域でH3K79メチル化の著しい減少が確認された。(2)胎生12.5日目のAf10ホモ変異胚の前脳の神経上皮で細胞増殖が増加していることから、神経前駆細胞の増殖異常が示唆された。胎生12.5日目のAf10ホモ変異胚の前脳では、両側の内側基底核隆起間の幅が広がり、内側基底核隆起と外側基底核隆起の境界が曖昧となっていた。この表現型は、頭部が外側へ拡がる表現型(ハイパーテルリズム)を示すマウスモデルで見られる。このことから、Af10ホモ変異胚では前脳の神経上皮にある神経前駆細胞の増殖異常により、ハイパーテロリズムを生じ、顔面正中の融合不全の一因なっている可能性が示唆された。以上の内容から以下の論部を投稿し、採択された。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は胚発生過程の頭部形成におけるヒストンH3の79番目のメチル化の機能をマウスを用いて解析することである。H3K79メチル化を行う酵素はDotLが唯一発見されており、脱メチル化酵素は見つかっていない。Dot1L欠損マウスは既に作製されおり、頭部の複雑な形成が開始する胎生10.5日目前後で死んでしまう。この結果からH3K79メチル化が胚発生に重要であることが示唆される。しかし、頭部形成におけるH3K79メチル化の機能は報告されていない。我々はDot1Lと結合しH3K79メチル化による遺伝子発現制御に関わるAf10が胎生10.5日目のマウス胚の頭部(鼻隆起や上顎、鰓弓等)で強く発現していることを明らかにした。また、作製したAf10ホモ変異マウスは胎生12.5日目で顔面正中の融合不全を生じることも明らかにした。これらの結果から頭部発生に関わる遺伝子群の発現がAf10を介したH3K79メチル化によって制御されている可能性が示唆された。顔面正中の形成には鼻の原基(鼻隆起)の発生に関わる神経提細胞が重要な働きをすることが既に知られている。そこで、頭部の神経堤細胞におけるAf10を介したH3K79メチル化による遺伝子発現の制御機構に焦点を当てて研究を進めている。神経堤細胞は神経管が閉鎖する時期に神経板と表皮外胚葉との境界から発生し腹側に向かって移動し、増殖・分化を経て末梢神経や骨に分化する特殊な細胞群である。特に骨(頭蓋骨)に分化するのは神経堤細胞の中でも頭部の神経提細胞だけであり、将来的な再生医療への応用の可能性からも、その誘導メカニズムの解明が期待されている。研究を進めて以下6点について解析し、全身性のAf10を欠損する胚(Af10ホモ変異胚)に見られる顔面正中の発症機構に関して概要を明らかにした。(1)Af10ホモ変異胚の顔面正中の融合不全が生じる時期が胎生11日目から11.5日目の間である事を特定した。(2)顔面正中の融合不全の原因として胎生10.5日目のAf10ホモ変異胚の鼻の原基(鼻隆起)内での著しい細胞増殖の低下が見られる事を明らかにした。また胎生11.0日目のAf10ホモ変異胚では左右の鼻隆起の間の組織で著しい低形成が生じ、左右の鼻隆起の間隔が広がり始めていることが明らかになった。(3)Af10ホモ変異胚の鼻隆起内でH3K79メチル化が減少していることが組織切片を使った免疫染色法とウエスタンブロッティングによる定量解析によって明らかになった。(4)Af10欠損によって発現が減少する遺伝子の探索を行い、神経堤細胞の発生に関わり、鼻隆起内の細胞増殖にも関与することが報告されているAP2α遺伝子の発現が低下していることが分かった。(5)Dot1L阻害剤によるH3K79メチル化の抑制によってAf10ホモ変異胚と酷似した顔面正中の融合不全が誘導出来ることを明らかにした。(6)神経堤細胞特異的なAf10欠損マウスの作製を行い、神経提細胞特異的なAf10欠損では全身でAf10を欠損したマウスで見られていた顔面正中の融合不全が生じない事が分かった。これらの成果によって、マウス胚の鼻隆起の発達にはAf10が関与するエピジェネティック制御、すなわちH3K79meを介した頭部神経堤細胞の増殖制御機構が働いている可能性を初めて示した。

一方、神経堤細胞特異的にAf10を欠損させたマウスでは、顔面正中の融合不全が生じない事から、顔面正中の融合不全には神経堤細胞以外の組織の機能異常も関与している可能性が示唆された。H28年度に、Af10ホモ変異胚の顔面正中の融合不全が鼻の原基(鼻隆起)内の神経堤細胞の増殖低下が一因であることが分かったが、Af10-Dot1L複合体が直接制御する遺伝子と、顔面正中の融合不全の原因となる神経堤細胞以外の組織に関しては不明であった。これをうけ、H29年度に以下の2点について解析し、論文(Ogoh H., et al., Scientific Reports, 2017)にした。(1)Af10-Dot1l複合体がAP2α遺伝子の発現制御を直接行っているかを調べるため、胎生10.5日目のAf10ホモ変異胚の鼻隆起を含む組織を用いてクロマチン免疫沈降を行った。その結果、Af10ホモ変異胚のAP2α遺伝子のプロモーター、エンハンサー、コーディング領域でH3K79メチル化の著しい減少が確認された。(2)胎生12.5日目のAf10ホモ変異胚の前脳の神経上皮で細胞増殖が増加していることから、神経前駆細胞の増殖異常が示唆された。胎生12.5日目のAf10ホモ変異胚の前脳では、両側の内側基底核隆起間の幅が広がり、内側基底核隆起と外側基底核隆起の境界が曖昧となっていた。この表現型は、頭部が外側へ拡がる表現型(ハイパーテルリズム)を示すマウスモデルで見られる。このことから、Af10ホモ変異胚では前脳の神経上皮にある神経前駆細胞の増殖異常により、ハイパーテロリズムを生じ、顔面正中の融合不全の一因なっている可能性が示唆された。以上の内容から以下の論部を投稿し、採択された。(1)AP2αは神経堤細胞の誘導、分化、増殖に関与するマスター遺伝子である。Af10を介したH3K79メチル化がAP2αの発現制御に直接かかわっているかを確かめる必要がある。そこで、AP2α遺伝子上のH3K79メチル化の変化の有無をAf10ホモ変異胚と野生型胚を用いたCHIP解析によって比較する。H3K79メチル化が変化していた場合、Af10-Dot1Lの結合領域をAP2α遺伝子上で探し、共免疫沈降法によって複合体構成因子の同定を行う。(2)頭部神経堤細胞で特異的に発現している唯一の遺伝子としてEts-1が同定されており、頭部神経堤細胞の発生に関与することが報告されている。しかし、Ets-1を体幹部の神経堤細胞に強制発現させても頭部神経堤細胞への運命決定、すなわち骨芽細胞の分化を誘導することは出来ない。その理由として、クロマチン修飾によりEts-1の標的遺伝子プロモーターへのアクセスが制限されている可能性が考えられる。この制限を解除することができれば頭部神経堤細胞への人為的な誘導を実現できる可能性が高い。そこで、生体での頭部神経堤細胞への直接リプログラミングの可能性を調べるため、胎生9.5日目の野生型胚にAf10、Dot1L、Ets-1の発現ベクターを導入し、子宮外全胚培養により胎生11日目まで培養する。また、Af10、Dot1L、Ets-1導入細胞を胎生13日目胚の顔面部に移植し、骨分化と組織生着能を検討する。(3)Af10欠損による顔面正中の融合不全に関わる組織・細胞種の特定を行うため、野生型胚とAf10ホモ変異胚の頭部を用いてDNAマイクロアレイ解析を行い、遺伝子発現変化のプロファイリングにより顔面正中の融合不全に関わる組織・細胞種を探索する。その後、組織特異的な欠損を誘導したマウスで顔面正中の融合不全が再現されるかを確認する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
低原子価金属ー炭素dπ共役系の光創製を鍵とするルイス酸触媒高度分子変換

本研究は、金属-ルイス酸結合と配位子π電子系を有する新規錯体を全く新しい光ルイス酸発生剤として用い、光で反応性が制御できるルイス酸触媒を開発することを目的として研究を行った。この錯体からのルイス酸の光解離により低原子価金属-配位子dπ共役系を有する錯体が生成すると考えられる。実際、研究代表者は有機金属ヒドリド錯体のヒドリド水素が可視光により効率良くプロトンとして解離して低原子価金属-配位子dπ共役錯体が生成することを見いだしている。この系のプロトンをルイス酸で置換することで、本研究で用いる錯体を合成した。これら新規錯体の励起状態におけるルイス酸解離能の評価を各種時間分解分光手法を用いて行い、金属-配位子dπ共役系錯体の光創製手法を得た。光照射時のみのルイス酸発生が可能になることで、光照射時間や光強度の制御により任意の反応時間で有効触媒濃度を適切に自在制御できる。この新しい光触媒の金属・配位子炭素dπ共役電子系の塩基性度を配位子の電子供与性やπ共役性を変化させることで制御し、光励起状態における光ルイス酸解離能を活かした新しい光化学プロセスおよび触媒開発を目指した。新規金属-ルイス酸錯体は、対応するアクア錯体にギ酸イオンを反応させて得た金属ヒドリド錯体と塩基との反応により低原子価錯体を得た。これをルイス酸塩と反応させる方法あるいは金属ヒドリド錯体とルイス酸塩やルイス酸ヒドリドとの光反応により合成した。同定は、NMR、IR、ESI-MS、TOF-MS等により行なった。新規に合成した各種金属-ルイス酸錯体について、レーザー時間分解分光測定装置(可視近・赤外ナノ秒、フェムト秒レーザー)、ストップドフロー分光法、光照射ESR等を用いた過渡種の観測とその反応速度論解析を行なった。
光合成集光装置の細胞内構築に関わる新規鉄硫黄タンパク質の構造と機能の解明

本研究では、細胞内で超分子複合体を構築する分子メカニズムの解明を目指した。特に、シアノバクテリアがチラコイド膜上に有する光捕集アンテナ複合体に着目し、その形成に関与するタンパク質の構造と機能を明らかにすることを目的として研究を行った。その結果、シアノバクテリア由来Ycf34タンパク質の発現プラスミドベクターを構築することができ、さらに、目的タンパク質の発現・精製にも成功した。そして、精製タンパク質には鉄硫黄クラスターが含まれていることが明らかとなった。また、変異導入実験によって、タンパク質内の5つすべてのシステイン残基が鉄硫黄クラスターの保持に関与していることが示唆された。初年度は、目的タンパク質の発現プラスミドの構築および精製系の確立を目的として以下の研究を行った。まず、2種類のシアノバクテリア由来のゲノムを用いた目的遺伝子の増幅を試みた。ゲノム情報をもとに4種類のプライマーを設計し、条件検討を加えながらPCRを行ったところ、目的遺伝子の増幅に成功した。その後、得られた増幅産物をタンパク質発現用プラスミドベクターに組込み、大腸菌のトランスフォーメーションを行い、遺伝子組換え大腸菌を作製した。この組換え大腸菌を用いて目的タンパク質の過剰発現を試したところ、驚くべきことに菌体が赤褐色を呈した。このことから、組換え大腸菌内で発現した目的タンパク質は、そのタンパク質内部に鉄硫黄クラスターを形成していることが示唆された。この結果を踏まえ、過剰発現大腸菌からの目的タンパク質の精製系の確立を試みた。まず、培養液から大腸菌を遠心分離によって集菌し、ペレットを得た。このペレットを超音波破砕・遠心分離したところ、赤褐色の上清を得た。分光学的解析により、精製タンパク質が鉄硫黄クラスターを保持していることが示唆されたが、その安定性は芳しくなく、精製工程が進むにつれて、そのクラスターが分解・解離してしまった。今後は精製方法の改善を行うことにより、鉄硫黄クラスターを保ったまま精製可能な条件を見出す。昨年度は、目的タンパク質の発現プラスミドの構築に成功し、目的タンパク質の精製を試みた。その結果、このタンパク質がその内部に鉄硫黄クラスターが含まれることを示唆したが、精製タンパク質の安定性が芳しくなかったため、精製工程が進むにつれて、タンパク質内部に保持されているとみられる鉄硫黄クラスターが分解・解離してしまった。今年度は目的タンパク質をより安定に精製することを目的として、以前の精製方法の改善を行った。一般的に鉄硫黄クラスターは、空気中の酸素に不安定である。このことを考慮し、嫌気ボックス内でのタンパク質精製実験を試みた。その結果、好気条件下よりも安定性が改善したため、今後は安定度の数値化、すなわち鉄硫黄クラスターの半減期を好気条件と嫌気条件で比較する。また、目的タンパク質内のどのアミノ酸が鉄硫黄クラスターのリガンド残基として機能しているかを明らかにするために、変異導入実験も行った。発現プラスミドに部位特異的変異を導入し、目的タンパク質内のシステイン残基をそれぞれセリン残基に置換した。その変異タンパク質を精製し、生化学的および分光学的解析を行ったところ、すべてのシステインが鉄硫黄クラスターの保持に関わることを見出した。これまでの成果をもとにして嫌気条件下での結晶化を試み、目的タンパク質のX線結晶構造解析を目指す。初年度の研究は、おおむね順調に進展したと考えられる。その理由は、目的タンパク質の発現プラスミドベクターの構築に成功し、さらにそのベクターを用いることによって、遺伝子組換え大腸菌から目的タンパク質を過剰発現することができたためである。また、その発現タンパク質の粗精製を行い、生化学的および分光学的解析によって、タンパク質内部に鉄硫黄クラスターを形成していることを示唆することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。初年度に得られた成果を踏まえて、以下の研究を進める。・精製条件の確立と鉄硫黄クラスターのリガンド残基の同定精製タンパク質の分光学的解析により、精製タンパク質が鉄硫黄クラスターを保持していることが示唆されたが、その安定性は芳しくなく、精製工程が進むにつれて鉄硫黄クラスターが分解・解離してしまっていた。今年度は精製方法の改善を行うことにより、鉄硫黄クラスターを保ったまま精製する。また、目的タンパク質内の鉄硫黄クラスターのリガンド残基を同定するため、Cysを始めとするアミノ酸残基に部位特異的変異を導入する。目的タンパク質内に存在する5つのCysは他の生物種由来のタンパク質においても完全に保存されているため、まずは各々のCysをSerに置換した変異体を作製する。これら5種類の変異タンパク質を発現・精製し、紫外可視吸光スペクトルから変異タンパク質の鉄硫黄クラスター保持能を検討する。・精製タンパク質の結晶化とX線結晶構造解析鉄硫黄クラスターを保持したタンパク質の結晶化条件をスクリーニングする。結晶化に成功した場合は、結晶化条件の最適化を行い、良質なタンパク質結晶を得る。