hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオン液体を用いたエマルション電解液の創製と革新型蓄電池への展開

テトラグライムとLi塩からなる溶媒和イオン液体と様々な溶媒を混合することでエマルション電解液の調製を試みた。安定なエマルション状態を保つ電解液を調製することはできなかったが、カチオン構造に長鎖アルキル基を有する疎水性のイオン液体と溶媒和イオン液体を混合して電解液を調製した結果、長鎖アルキルが非イオン性ドメインを形成し、非イオン性ドメインとイオン性ドメインがナノレベルで相分離したエマルションに近い状態になることが示唆された。この疎水性の電解液は大気下でも水分をほとんど吸収せず、リチウム空気電池に適用すると、相対湿度28%程度の水分存在下でも放電・充電が可能であった。テトラグライム(G4)とLi塩からなる溶媒和イオン液体[Li(G4)][TFSA] (TFSA: bis(trifluoromethanesulfonyl)amide)を調製し、これと様々な溶媒を混合することでエマルション電解液の調製を試みた。[Li(G4)][TFSA]は様々な溶媒と相溶するが、ヘキサンやシクロヘキサンなどの誘電率の極めて低い溶媒とは相溶しないことが分かった。また、[Li(G4)][TFSA]とトルエンを混合した場合、[Li(G4)][TFSA]の濃度が1.2 mol/L以上の濃度の時には均一な溶液になるが、1.2 mol/Lよりも低濃度の場合には相分離が起きることが分かった。そこで、Tributyldodecylphosphonium TFSA ([P44412][TFSA])やTrihexyltetradecylphosphoniun TFSA ([P66614][TFSA])などのカチオン構造に長鎖アルキル基を有するイオン液体と、[Li(G4)][TFSA]を混合した電解液を調製した。これらのイオン液体は、カチオン構造に疎水性の長鎖アルキルを有しているため、長鎖アルキルが溶液中で非イオン性ドメインを形成し、ナノレベルではイオン性ドメインと非イオン性ドメインの相分離に近い状態になっていることが計算化学による研究から示唆されている。これらのイオン液体と[Li(G4)][TFSA]を混合すると、目視による観察では均一溶液となった。NMRで検討した結果、この混合液体中では、錯カチオン[Li(G4)]+の構造は保たれていることが示唆されたことから、液体中では[Li(G4)]+はアニオンに囲まれた状態でイオン性ドメインを形成し、非イオン性ドメインとナノレベルでエマルションに近い状態に近い状態になっていると考えられる。当初の計画では、溶媒和イオン液体とヘキサン、シクロヘキサン、トルエンなどの低誘電率溶媒を混合し、乳化させることで安定なエマルション状態を保つ電解液の創製を計画していた。しかしながら、安定なエマルション状態を保つ電解液の創製には至らなかった。そこで、エマルション電解液のコンセプトを生かし、長鎖アルキルを有する[P44412][TFSA]や[P66614][TFSA]などのイオン液体と、溶媒和イオン液体を混合することで、ナノレベルでイオン性ドメインおよび非イオン性ドメインを形成させたエマルションに近い状態となる電解液を開発した。よって、本研究はおおむね順調に進捗していると考えている。テトラグライム(G4)とLi塩からなる溶媒和イオン液体[Li(G4)][TFSA] (TFSA: bis(trifluoromethanesulfonyl)amide)および[Li(G4)][NFSA](NFSA: bis(nonafluorobutanesulfonyl)amide)を調製し、これをTributyldodecylphosphonium TFSA ([P44412][TFSA])、Trihexyltetradecylphosphoniun TFSA ([P66614][TFSA])、[P66614][NFSA]などのカチオン構造に長鎖アルキル基を有する疎水性イオン液体を混合した電解液を調製した。これらの疎水性イオン液体は、カチオン構造に疎水性の長鎖アルキルを有しているため、電解液への大気中の水分の混入を抑制すことが可能であることが分かった。例えば、[Li(G4)][NFSA]と[P66614][NFSA]を1:4のモル比混合した電解液では、温度30度、相対湿度90%の大気下であっても水分の吸収量は1wt%以下に抑制できる。溶媒和イオン液体[Li(G4)][TFSA]および溶媒和イオン液体[Li(G4)][NFSA]と疎水性イオン液体[P66614][NFSA]を混合して調製した液体をリチウム空気電池の電解液として適用し、相対湿度28%の大気下で放電・充電の試験を行った。[Li(G4)][TFSA]を電解液に用いた場合には、電解液が水分を吸収し、その水分が負極のLi金属と反応してLiOHになってしまった結果、放電・充電を繰り返して行うことは不可能であった。一方、[Li(G4)][NFSA]と[P66614][NFSA]を混合して疎水化した電解液を用いた場合、電解液の水分の吸収が抑制された結果、負極の劣化が抑制され、電池の放電・充電を数回程度繰り返して行うことが可能であった。

以上のように、溶媒和イオン液体と疎水性のイオン液体を混合することで、疎水性の電解液を調製することが可能であり、この電解液を用いることでリチウム空気電池を大気下で作動させることが可能になった。テトラグライムとLi塩からなる溶媒和イオン液体と様々な溶媒を混合することでエマルション電解液の調製を試みた。安定なエマルション状態を保つ電解液を調製することはできなかったが、カチオン構造に長鎖アルキル基を有する疎水性のイオン液体と溶媒和イオン液体を混合して電解液を調製した結果、長鎖アルキルが非イオン性ドメインを形成し、非イオン性ドメインとイオン性ドメインがナノレベルで相分離したエマルションに近い状態になることが示唆された。この疎水性の電解液は大気下でも水分をほとんど吸収せず、リチウム空気電池に適用すると、相対湿度28%程度の水分存在下でも放電・充電が可能であった。長鎖アルキルを有する[P44412][TFSA]や[P66614][TFSA]などのイオン液体と溶媒和イオン液体を混合した電解液を用いてリチウム空気電池などの革新型二次電池の開発を行う。電気化学
培養環境が不定胚形成に及ぼす影響の共焦点レーザー顕微鏡による観察

ニンジン培養細胞塊および不定胚内のカルシウムイオン濃度を共焦点レーザー顕微鏡で観察するために、蛍光プローブとして、fluo-3とFra Redを用いたレーシオイメージング法を適用した。また、カルシウムイオン濃度観察の必要上、細胞塊および不定胚内のpHを,carboxy-SNARF-1をプローブとしたレーシオイメージング法により測定した。カルシウムイオン濃度とレーシオの関係のキャリブレーションはin vivoで行った。その結果、次の諸点が明らかとなった。1.測定時の温度は培養時の温度と同一にしないと、カルシウムに関するレーシオが変化する。2.培地のpHを変化させると、細胞内あるいは不定胚内のpHは変化しないが、カルシウムに関するレーシオは変化する。すなわち、観察には培養液をそのまま用いる必要がある。3.不定胚誘導処理後、1日目を除いて、9日目までは、pHは6.8で一定であった。1日目は6.0と低い値であった。なお、10日目以降は、細胞が大きくなりすぎて、共焦点レーザー顕微鏡では観察できなかった。4.カルシウムイオン濃度は不定胚誘導処理前は0.10μmolL^<-1>であったが、誘導開始後徐々に低下し、5から7日目ころに0.04μmolL<-1>以下となり、その後、球状胚が出現してくる9日目に急激に0.4μmolL^<-1>まで上昇した。5.継体培養を繰り返し、不定胚形成能力を失った細胞塊のpHは、不定胚誘導開始前6.3、その後5.9で、7日目に6.4と、不定胚が誘導された場合に比べて低い値であった。カルシウムイオン濃度も、誘導開始後、0.04μmolL^<-1>以下と低い値であった。初年度は、植物細胞あるいは不定胚内のカルシウムイオン濃度分布を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する方法の確立を目的とした。既存の研究に、1プローブを用いた観察で、不定胚表面付近で濃度が高いという報告がある。しかし、プローブの分布の不均一性、蛍光の細胞塊・不定胚内での減衰などの問題があり、この結果の真偽には疑問が残る。プローブ分布の不均一性、蛍光の減衰などの影響を排除するために、レーシオイメージング法を試みた。アルゴンレーザー(488nm)によって、蛍光が励起されるfluo-3とFura Redを蛍光プローブとした。前者はカルシウムイオン濃度が高くなるほど515nm付近の波長で強い蛍光を発し、後者はイオン濃度が高くなるほど640nm付近の蛍光が弱くなる。したがって、両波長での蛍光の比はカルシウムイオン濃度に対応する。既存の研究のもう1つの問題点として、キャリブレーションができていないことを指摘できる。そこで、本研究では、ニンジンのプロトプラストを用いたin vivoキャリーブレーションをした。ニンジン不定胚誘導直後の細胞塊から10日までの不定胚を観察した。それ以降の不定胚は大きくなりすぎて、蛍光の減衰が激しく、レーシオイメージング法でも観察不可能であった。次の現象が観察された。細胞魂あるいは不定胚は細胞内カルシウム濃度分布の観点から3つに分類できる。1つは、ほとんどすべての細胞で、細胞壁付近に高いカルシウムイオン濃度が観察され、細胞の内側は低いグループである(グループA)。2つ目は一部の細胞はグループAと同様であるが、その他の細胞では、均一にカルシウムイオン濃度が高いグループである(グループB)。3つ目は、全ての細胞が均一に高い濃度を示すものである(グループC)。不定胚誘導開始からの日数の進行とともに、グループAの比率が減少し、グループCの比率が増加した。

昨年度の解析で、培養細胞内および不定胚内のカルシウムイオン濃度分布を共焦点レーザー顕微鏡によるレーシオイメージング法によって観察する基本的方法を確立した。しかし、昨年度の方法では、次の疑問点が残った。すなわち、細胞内に蛍光プローブ(fluo-3およびFura Red)を導入するために、それぞれのプローブのAM体とジギトニン(界面活性剤)の両者を使用したため、一端細胞内に入ったプローブがその後、細胞外に排出された可能性がある。そこで、本年度は、ジギトニンだけを用いることにした。また、不定胚が形成されない培養系での観察もあわせて行い、不定胚形成過程での観察と対比した。以下の結果が得られた。1.カルシウムイオンバッファーキットを用いたin vitroキャリブレーションを行ったが、細胞・不定胚の観察から得られたレーシオ値はキャリブレーションの範囲を逸脱するものもあった。2.不定胚形成過程のレーシオ値のヒストグラムは、培養日数の経過とともに、レーシオ値が高い方(濃度の高い方)に変化した。一方、不定胚が形成されない系ではヒストグラムに変化は認められなかった。3.不定胚形成過程の細胞塊内あるいは不定胚内のカルシウムイオン濃度分布は3つのタイプに分類できた。昨年の結果も3つのタイプに分類できたが、タイプの内容が異なる。これは、はじめに述べたように昨年度の結果はプローブが排出された可能性があるためである。タイプAは、全体に濃度が低いタイプ、タイプBは細胞壁の部分の濃度が低く、細胞質の濃度が高く、1つ1つの細胞が識別できるタイプ、タイプCは、全体に濃度が高いが特に核の濃度が高いタイプである。不定胚形成の進行ともに、タイプAからタイプBを経て、タイプCへと変化した。不定胚形成過程でのカルシウムイオンの分布の変化を観察するために、昨年度までに、様々な試みを行い、キャリブレーション法を含めて検討してきた。蛍光プローブとして、fluo-3とFura Redを用い、両者の蛍光の比からカルシウムイオン濃度を算定するレーシオイメージング法を採用した。昨年度までの結果では、観察されたレーシオがキャリブレーションで得られたレーシオの範囲を超え、結果に不確定性が残った。そこで、本年度はキャリブレーション法に改良を加え、不定胚形成過程でのカルシウムイオン濃度分布を観察した。キャリブレーションは、in vivoで行うことを基本とし、カルシウムイオン透過担体を用いて、培地の濃度と細胞内濃度を同じにして行う。昨年度までは、観察ごとにレーシオの値が0.2前後ずれるという問題があった。本年度は、透過担体の濃度を10μMから100μMにあげることによって、そのブレを解消でき、同時に、観察されたレーシオがキャリブレーションの範囲を大きく逸脱することもなくなった。不定胚形成過程でのカルシウムイオン濃度の観察では、以下の結果が得られた。1.昨年度までに観察された不定胚内のカルシウムイオン濃度の分布は今回は見られなかった。2.レーシオのヒストグラムは次のような得意な時間的変化を示した。すなわち、不定胚誘導開始からレーシオは減少し(カルシウムイオン濃度は減少し)、3日後に最低値を記録したあと、急に増加し、4日目には誘導前の値を超えた。この現象は本年度初めて観察されたものであり、今後、追実験で再確認する予定である。
超臨界二酸化炭素ドライクリーニング技術用界面活性剤の開発

1.CO_2中で優れた界面活性を持つがある一定量以上の水が共存すると液晶を形成し沈殿してしまうフッ素系二鎖型界面漕性剤8FS(EO)_2に,いくつかの助界面活性剤を混合することで,液晶形態をとりにくくさせかつ、水/超臨界CO_2マイクロエマルション(W/CO_2μE)形態を安定化させることを試みた。試験した4種の炭化水素系助界面活性剤は,8FS(EO)_2に混ぜられることにより,それらの単独系よりも高い気/水表面張力低下能力や,水/CO_2界面張力低下能力を引き出したが,そのような正の相乗効果は,W/CO_2μEの形成においてほとんど発現されず,液晶の形成を許していた。一方,フッ化炭素鎖と炭化水素鎖を有するハイブリッド助界面活性剤を8FS(EO)_2に混ぜた場合,W/CO_2μEの形成能力は低下してしまうものの,液晶相は出現しなかった。液晶相の代わりに現れた分離相(析出した水相と超臨界CO_2相)の透明な超臨界CO_2相(上層)には,溶解度以上の多量の水が存在することが確認された。すなわち,この相は,WinsorII型W/CO_2μE相であり,8FS(EO)_2/ハイブリッド界面活性剤の混合系で高いW/CO_2μE形成能力を発現させることに成功した。2.8FS(EO)_2に代わる新たなW/CO_2μE用主界面活性剤の開発に成功した。新しく開発された主界面活性剤は,WinsorII型W/CO_2μEの構築を達成するだけではなく,これまで報告される中でもっとも高い水分散量(対界面活性剤1mol)をもつWinsorIV型W/CO_2μEの構築をも達成した。このようなWinsorII型およびWinsorIV型のW/CO_2μEの構築は,超臨界CO_2ドライクリーニング技術の確立に大きな道筋を与える。1.水/超臨界CO_2混合物の相挙動観察装置を作製した。この装置について、400barまでの耐圧試験を行い、装置内容積を測定した。2.これまでに得られている超臨界CO_2用分子設計論とマイクロエマルション形成のチャンピオンデータを有する8FS(EO)_2の構造をもとに、数種の界面活性剤を設計し、合成を行った。なお、分子設計論の基礎となる因子は、界面活性剤分子の立体的構造(親水基に対してかさ高い疎水基(親CO_2基))と、水に溶けにくいような親水性/親CO_2性のバランス(Hydrophilic/CO_2-philic Balance(HCB))、界面吸着力を高める疎CO_2性の強い親水基、それに加えて液晶形成を阻害する構造の乱雑さ(親CO_2基への分岐構造の導入、エチレンオキシド導入による柔軟性の付与、2本の親CO_2基への非対称性の導入)である。次年度では、これら新規界面活性剤のマイクロエマルション形成能力を相挙動観察装置により評価する。3.マイクロエマルション形成能力に秀でる8FS(EO)_2に数種の助界面活性剤を混合し、その混合界面活性剤の界面張力低下能力を評価した。その結果、助界面活性剤を混ぜることで単独のものよりも遙かに高い界面活性効果が得られることが確認できた。4.8FS(EO)_2/助界面活性剤混合系のマイクロエマルション形成能力について評価したところ,ほんの数種については混ぜることで正の相乗効果を現した。これは、水/超臨界CO_2マイクロエマルション系でも界面活性剤の混合により正の相乗効果が得られることを実証した初めてのケースである。しかし、残念ながらその相乗効果の程度は低く、8FS(EO)_2単独の性能を超えるものはまだ確認できていない。これは,助界面活性剤が界面張力低下効果に貢献するものの,逆ミセル構造を不安定化させる効果(大きな液滴間凝集相互作用)も同時に現すためと考えられる。

新しく開発された主界面活性剤は,WinsorII型W/CO_2μEの構築を達成するだけではなく,これまで報告される中でもっとも高い水分散量(対界面活性剤1mol)をもつWinsorIV型W/CO_2μEの構築をも達成した。このようなWinsorII型およびWinsorIV型のW/CO_2μEの構築は,超臨界CO_2ドライクリーニング技術の確立に大きな道筋を与える。
分子電線として機能する新しい概念に基づいたソフトマテリアルの創製

N-(2, 4-ジニトロフェニル)-4-アリルピリジニウムクロリドとR-(-)-あるいはS-(+)-2-メチルピペラジンとの重合反応により、キラル2-メチルピペラジニウム環が共役トリエンでリンクされた構造を単位とするポリマーを合成した。紫外可視吸収スペクトルから、得られたポリマーは、2-メチルピペラジニウム環の二つの窒素原子上の電子の空間的相互作用により、高分子鎖に沿って共役系が拡張していることがわかった。N-(2,4-ジニトロフェニル)-4-アリルピリジニウムクロリド(1)を、置換基(Ar)をもつピリジン誘導体と1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンとの反応により合成した。1とピペラジン類との重合反応により、ピペラジニウム環が共役トリエンでリンクされた構造を単位とするポリマーを合成した。また、1とピペラジン類との反応のおいて、ピペリジンもしくはピペラジン誘導体を存在させることで生長を抑制し、両末端にピペリジン環もしくはピペラジン誘導体を持つオリゴマーを合成した。このオリゴマーの分子鎖長は、2とピペラジン誘導体の仕込み比により制御可能であることがわかった。合成したオリゴマー及びポリマーとモデル化合物の構造は、IR, NMR,元素分析などにより決定した。また、ポリマーの分子量はGPCにより、オリゴマーの分子鎖長は^1H NMRスペクトルの積分値やFAB-MSやTOF-MS測定により算出した。紫外可視吸収スペクトルから、得られたポリマー及びオリゴマーは、ピペラジニウム環の二つの窒素原子上の電子の空間的相互作用により、高分子鎖に沿って共役系が拡張していることを明らかにした。さらに、ポリマー及びオリゴマー中のピペラジニウム環は、溶液中で舟形からいす型へと自発的に異性化し、これに伴い共役長が減少することも分かった。また、得られたポリマー及びオリゴマーは、電気化学的酸化を受けることが分かった。1とR-(-)-あるいはS-(+)-2-メチルピペラジンとの重合反応により、キラル2-メチルピペラジニウム環が共役トリエンでリンクされた構造を単位とするポリマーを合成した。合成したポリマーの構造は、IR,NMR,元素分析などにより決定した。ポリマーの分子量はGPCにより決定した。得られたポリマー中の2-メチルピペラジニウム環は、溶液中で舟形からいす形へと自発的に異性化し、これに伴い共役長が減少することも分かった。また、R-(-)-あるいはS-(+)-2-メチルピペラジニウム環をもつポリマーのCDスペクトルは、それぞれ正と負のコットン効果を示したことから、両ポリマーが互いに逆向きのらせん構造を形成していることがわかった。さらに、2-メチルピペラジニウム環が舟形からいす形へと異性化するにつれて、らせんがほどけることもわかった。N-(2,4-ジニトロフェニル)-4-アリルピリジニウムクロリド(1)と(R)-(-)-もしくは(S)-(+)-I,I'-ビナフチルリン酸ナトリウムとのスニオン交換反応により、キラルリン酸アニオンを含むZincke塩(1)を合成した。1と2-メチルピペラジンとの重合反応により、2-メチルピペラジニウム環が共役トリエンでリンクされた構造を単位とするポリマーを合成した。紫外可視吸収スペクトルから、得られたポリマーは、2-メチルピペラジニウム環の二つの窒素原子上の電子の空間的相互作用により、ポリマー鎖に沿って共役系が拡張していることがわかった。また、紫外可視吸収スペクトルの経時変化測定により、得られたポリマー中の2-メチルピペラジニウム環は、溶液中で舟形からいす形へと自発的に異性化し、これに伴い共役長が減少することが明らかとなった。円二色性分光測定から、共役トリエン上に置換基をもたないポリマーは、キラルリン酸アニオンのキラリティーが主鎖に誘起されて、らせん構造を形成していることがわかった。このらせん構造は、2-メチルピペラジニウム環が舟形からいす形へと異性化するにつれて、徐々にほどけることもわかった。一方、共役トリエン上に置換基をもつポリマーでは、らせん構造を形成しないことがわかった。
心筋再分極異常に起因する心臓突然死の危険を回避する薬物治療戦略の構築

心筋再分極異常は致死的な不整脈を誘発する可能性が高いにも関わらず、このような危険を回避するアップストリーム治療法はこれまで十分に検討されていなかった。このような病態を反映するモデル動物を用いた本研究を遂行させた結果、抗高血圧薬シルニジピンはN型Ca2+チャネル抑制作用により心筋再分極異常を改善することが示された。N型Ca2+チャネルを選択的に抑制する新規薬物の創出は、心筋再分極異常を有する患者に対して血圧低下などの副作用がない薬物治療法として期待できる。心肥大突然死モデル犬の特徴を、イオンチャネルの発現レベルおよび心血行動態や神経体液性因子の挙動を心臓電気生理学的特性とともに解析した。心肥大突然死モデル動物の心室筋におけるイオンチャネルの発現を定量的PCR法にて計測したところ、遅延整流K^+チャネル、一過性外向きK^+チャネルおよび内向き整流性K^+チャネルのmRNAレベルが正常犬に比べて減少していた。本モデル動物の心血行動態の特徴はForresterの分類で1類に相当し、アドレナリン、アンギオテンシンII、アルドステロン、心房性ナトリウム利尿ペプチドおよび脳性ナトリウム利尿ペプチドの血中レベルの上昇が観察され、代償された慢性心不全の状態にあることが認められた。心肥大突然死モデル動物の心室筋再分極時間は極度に遅延しており、定量的PCR法で計測した心筋K^+チャネルのmRNAレベル減少を反映する結果であった。また、心室の興奮頻度が遅いほど心筋再分極時間は延長しており、致死性不整脈が発生しやすい電気生理学的特徴を有することが確認された。これらの実験結果は、心筋再分極異常に起因する心臓突然死の危険を回避する薬物治療戦略を構築する上で重要な情報であり、次年度は本動物モデルの心筋イオンチャネル発現、心血行動態、神経体液性因子および心臓電気生理学的特性に関するクロストークの機序を解明し、心臓突然死の危険を回避するアップストリーム治療法について詳細に検討する予定である。慢性房室ブロック術により作成した心肥大突然死モデル犬に選択的L型カルシウム拮抗薬アムロジピンおよびアンジオテンシン受容体拮抗薬カンデサルタンを、L/N型カルシウム拮抗薬シルニジピンと同じ処方(4週間内服)で投与し、これら薬剤の心筋再分極異常に対する改善効果を比較検討した。その結果、アムロジピンとカンデサルタンには心筋再分極異常に対する治療効果は認められず、シルニジピンの治療効果はN型カルシウムチャネル阻害作用に関連した本薬特有の作用であることが明らかとなった。このシルニジピンの効果は急性効果としては現れず、2週間以上の服用が必要であった。近年提唱されている催不整脈指標Beat-to-beat variability of ventricularrepolarization(心電図QT間隔の1拍ごとの変動の大きさ)を用い、不整脈誘発の危険度を薬物投与前後で比較した。この指標は致死性不整脈誘発の第一段階であるトリガー発生との間に相関性が認められている。その結果、アムロジピン群とカンデサルタン群では有意な変化は観察されなかったが、シルニジピン群ではQT間隔の変動値に有意な減少が認められた。この成績は、シルニジピンは致死性不整脈のトリガーが誘発される危険な状態を回避できることを示している。以上より、長期間のN型カルシウムチャネル阻害は、心筋再分極異常を示す患者に対して致死性不整脈発生の危険性を軽減する治療法として期待できることが示された。
シグナル伝達分子α4のコンディショナルジーンターゲティングによる機能解析

α4は、B細胞抗原受容体(BCR)からのシグナル伝達に関与する分子としてわれわれがクローニングした分子であり、ヒトから酵母までよく保存されている。α4遺伝子の発現はubiquitousであり、酵母のα4相同遺伝子Tap42の破壊が致死的であることよりマウスでもα4遺伝子の破壊が致死的であると考えられた。そこでα4のB細胞における機能を明らかにする目的でCre/loxPシステムを用いてコンディショナルジーンターゲティングを行なった。α4遺伝子のエキソン1、2の両側にloxP部位を持つα4floxマウスを作製した。α4遺伝子はX染色体上に存在するのでα4floxマウスのメスとB細胞特異的にCre遺伝子を発現するCD19-Creトランスジェニックマウスのオスを交配してB細胞特異的にα4遺伝子が破壊されたオスのB-α4ノックアウト(KO)マウスを得た。B-α4KOマウスではB細胞数が減少し、α4欠損B細胞の活性化シグナル(BCR/CD40/LPS刺激)に対する反応性が低下していた。免疫抑制剤ラパマイシンはリンパ球の増殖を抑制するが、α4欠損B細胞のラパマイシン感受性は低下することがらα4はラパマイシン感受性シグナル伝達経路に位置することが明かとなった。B-α4ノックアウトマウスはT細胞非依存性抗原のみならずT細胞依存性抗原に対する反応性も低下し胚中心形成も障害されていた。これまでのBCRシグナル伝達分子の遺伝子破壊ではT細胞依存性抗原に対する反応性の低下は認めない。従ってα4はBCRからのシグナル伝達のみならずT-B細胞相互作用にも関与する分子である可能性が高く、今後T細胞特異的にα4遺伝子を破壊したマウスも作製して解析を進めて行く。α4分子はB細胞抗原レセプター(BCR)からのシグナル伝達に関与する分子として私たちがクローニングした。これまでにα4はプロテインホスファターゼ2A(PP2A)と結合し酵素活性を調節すること、ラパマイシン感受性シグナル伝達経路に位置することを明かとしてきた。α4はubiquitousに発現しBCRシグナル伝達経路以外にT細胞活性化においても機能を有することを示してきた。本研究ではα4のB細胞活性化における役割をin vivoで明かとする目的でB細胞特異的にα4遺伝子を破壊することを試みている。本年度はまずα4と高い相同性を有する遺伝子を発見しクローニングしてα4-bと命名した。α4-bは脳、精巣特異的に発現しα4とアミノ酸レベルで60%相同性がある。α4と同じくPP2Aと結合することから脳、精巣でPP2Aの制御に関与すると予測される。次にB細胞活性化におけるラパマイシン感受性シグナル伝達経路について解析した。ラパマイシンはBCR刺激による増殖を抑制するのみならずB細胞活性化分子の代表の一つであるCD40刺激による増殖も抑制した。更にCD40シグナルによる抗体産生細胞への分化も抑制した。この結果はα4分子がBCRのみならずB細胞の他のシグナル伝達経路にも関与する可能性を示唆する。α4遺伝子破壊の研究では、α4遺伝子のエクソン1と2の両側にlox Pサイトを持つターゲティングベクターをES細胞に導入して相同組み換え体を得た。このES細胞由来のキメラマウスを作製しC57BL/6マウスと交配してα4遺伝子のエクソン1と2の両側にlox Pサイトを持つマウスα4 floxマウスを作製した。今後このマウスとB細胞特異的にCre遺伝子を発現するCD19-Creマウスを交配してB細胞特異的にα4遺伝子の破壊されたマウスを作製しα4分子のB細胞活性化における役割を明かとしていく。

α4は、B細胞抗原受容体(BCR)からのシグナル伝達に関与する分子としてわれわれがクローニングした分子であり、ヒトから酵母までよく保存されている。α4遺伝子の発現はubiquitousであり、酵母のα4相同遺伝子Tap42の破壊が致死的であることよりマウスでもα4遺伝子の破壊が致死的であると考えられた。そこでα4のB細胞における機能を明らかにする目的でCre/loxPシステムを用いてコンディショナルジーンターゲティングを行なった。α4遺伝子のエキソン1、2の両側にloxP部位を持つα4floxマウスを作製した。α4遺伝子はX染色体上に存在するのでα4 floxマウスのメスとB細胞特異的にCre遺伝子を発現するCD19-Creトランスジェニックマウスのオスを交配してB細胞特異的にα4遺伝子が破壊されたオスのB-α4ノックアウト(KO)マウスを得た。B-α4KOマウスではB細胞数が減少し、α4欠損B細胞の活性化シグナル(BCR/CD40/LPS刺激)に対する反応性が低下していた。免疫抑制剤ラパマイシンはリンパ球の増殖を抑制するが、α4欠損B細胞のラパマイシン感受性は低下することからα4はラパマイシン感受性シグナル伝達経路に位置することが明かとなった。B-α4ノックアウトマウスはT細胞非依存性抗原のみならずT細胞依存性抗原に対する反応性も低下し胚中心形成も障害されていた。これまでのBCRシグナル伝達分子の遺伝子破壊ではT細胞依存性抗原に対する反応性の低下は認めない。従ってα4はBCRからのシグナル伝達のみならずT-B細胞相互作用にも関与する分子である可能性が高く、今後T細胞特異的にα4遺伝子を破壊したマウスも作製して解析を進めて行く。
溶融塩ガス化／円筒型ＭＣＦＣ結合型高機能ダイレクトカーボン燃料電池の高性能化

HF-DCFC開発に向けて主要部品である円筒型MCFC(T-MCFC)の製造法の確立を目指し,今年度から来年度にかけて,1電池構成の最適化,2T-MCFC2セルスタックの試作・評価,3HF-DCFC用燃料のためのガス化条件の最適化を実施している.これまでステンレス管をカソード集電体・支持管としてT-MCFCを作成してきたが,これでは同一管でカソードの分割ができず2のスタック化が難しいということで,将来を見据えてアルミナ支持管に変更してT-MCFC短セルの電池構成材の最適化を目指した.その結果,ステンレス管と同形状のアルミナ管はなくφ20のアルミナ管で検証した結果,直径と電極厚みの比と正極と負極の焼結温度によって電極焼結時の収縮による割れが大きく影響していることが分かった.現状,その最適条件を検討している状況である.2に関しては,セラミックス支持管に変更することでスタック化は可能となり,各電池構成材を塗布してグリーンテープの状況まではできているが,上記の焼成条件決定を待っている状況である.また,セラミックス管をソケット型に加工し,電解質保持板をセラミックス管を兼用し,それを繋ぐことでスタック化を実現する方法についても検討し,概ね作成可能であるところまでは検証できた.3に関しては,醤油粕を燃料として溶融塩温度と燃料投入量について検討した結果,溶融塩温度が高い方がT-MCFCアノード極の劣化物質であるH2Sを溶融塩中に捕獲し,排出量を低減できることが分かった.また,COやCH4の発生が多いため,アノード極の表面で炭素析出が懸念された.そこで,水蒸気添加によりアノード電極表面で改質反応を生じさせることを検討し始めたところである.また,物質収支をとれるように反応容器を小型化する改造を行うことで,精度の向上を図っていく予定である.T-MCFCの支持管をスタック化に向けて変更したことにより,電池構成材の厚みや焼結温度の最適化を再検証しているためやや遅れているが,電極割れに起因する条件の割り出しはほぼできているため,この遅れは2019年度に挽回できると考える.一方,溶融塩ガス化の最適条件の検討については,おおむね順調に進んでいる.アルミナ管を用いた短セルの製造方法を確立した後,TーMCFCの基本性能を取得する.それと同時に,当初予定通りの2セルスタックの作成方法を検討していく.また,新しいソケット型のスタックについても製造方法を確立する予定である.本研究の最終目標であるHFーDCFCの基本特性について,まずはステンレス支持管を用いたTーMCFCによって把握することも行っていく.さらに,溶融塩ガス化用の評価装置を前年度に小型化し,物質収支の精度を上げることができているため,これを用いてHFーDCFC用のガス化条件の検討と,有機廃棄物燃料の多様化も検討していく予定である.HF-DCFC開発に向けて主要部品である円筒型MCFC(T-MCFC)の製造法の確立を目指し,今年度から来年度にかけて,1電池構成の最適化,2T-MCFC2セルスタックの試作・評価,3HF-DCFC用燃料のためのガス化条件の最適化を実施している.これまでステンレス管をカソード集電体・支持管としてT-MCFCを作成してきたが,これでは同一管でカソードの分割ができず2のスタック化が難しいということで,将来を見据えてアルミナ支持管に変更してT-MCFC短セルの電池構成材の最適化を目指した.その結果,ステンレス管と同形状のアルミナ管はなくφ20のアルミナ管で検証した結果,直径と電極厚みの比と正極と負極の焼結温度によって電極焼結時の収縮による割れが大きく影響していることが分かった.現状,その最適条件を検討している状況である.2に関しては,セラミックス支持管に変更することでスタック化は可能となり,各電池構成材を塗布してグリーンテープの状況まではできているが,上記の焼成条件決定を待っている状況である.また,セラミックス管をソケット型に加工し,電解質保持板をセラミックス管を兼用し,それを繋ぐことでスタック化を実現する方法についても検討し,概ね作成可能であるところまでは検証できた.3に関しては,醤油粕を燃料として溶融塩温度と燃料投入量について検討した結果,溶融塩温度が高い方がT-MCFCアノード極の劣化物質であるH2Sを溶融塩中に捕獲し,排出量を低減できることが分かった.また,COやCH4の発生が多いため,アノード極の表面で炭素析出が懸念された.そこで,水蒸気添加によりアノード電極表面で改質反応を生じさせることを検討し始めたところである.また,物質収支をとれるように反応容器を小型化する改造を行うことで,精度の向上を図っていく予定である.T-MCFCの支持管をスタック化に向けて変更したことにより,電池構成材の厚みや焼結温度の最適化を再検証しているためやや遅れているが,電極割れに起因する条件の割り出しはほぼできているため,この遅れは2019年度に挽回できると考える.一方,溶融塩ガス化の最適条件の検討については,おおむね順調に進んでいる.アルミナ管を用いた短セルの製造方法を確立した後,TーMCFCの基本性能を取得する.それと同時に,当初予定通りの2セルスタックの作成方法を検討していく.また,新しいソケット型のスタックについても製造方法を確立する予定である.本研究の最終目標であるHFーDCFCの基本特性について,まずはステンレス支持管を用いたTーMCFCによって把握することも行っていく.

さらに,溶融塩ガス化用の評価装置を前年度に小型化し,物質収支の精度を上げることができているため,これを用いてHFーDCFC用のガス化条件の検討と,有機廃棄物燃料の多様化も検討していく予定である.申請段階では燃料電池用インピーダンスメータやマスフローメータを購入し,新しい評価装置を作成する予定であったが,交付金額が減額されたことから上記装置の購入ができなくなり,既存装置のみで評価することなった.この差額で円筒型MCFC製造方法の検討で支持管が予定よりも多く必要になったこと,溶融塩ガス化用の反の容器の新設などに充てることにした.その他は概ね計画通りに購入しており,その差額として次年度使用額が生じた.
光格子時計の高精度化とその量子情報処理への応用

本研究は、新しい光格子時計の手法を考案し、その実現可能性・性能を明らかにすることを目的とするものである。昨年度は、位相同期による新しいレーザーの安定化手法と光格子時計からのレーザー発振についての理論的考察を行った。今年度の成果の一つが、浅い青方離調光格子時計における衝突シフトの検討である。これまでに中心となって研究されてきた赤方離調の光格子時計では、同サイトの原子間における衝突シフトの可能性が議論されてきたが、このような浅い青方離調光格子時計の場合、複数サイト間の原子衝突が支配的であることが分かった。そして、赤方離調の場合と同様に、時計遷移励起レーザーと光格子レーザーの光軸のずれによって衝突シフトが発生し、1次元と2次元光格子において角度のずれが10mrad程度の場合、その大きさが10-16程度となることが分かった。もう一つの成果が、3次元光格子中の原子(88Sr原子を想定)による、フォトニックバンド構造の構築の提案である。フォトニックバンド構造が生成されるか否かを決定づけるのは光格子の幾何学的配置と原子の分極であり、通常のBravais格子と2準位系では実現できないことが知られていた。そこで、本研究では新たに3つめの準位を導入することにより、単純立方格子・面心立方格子でも2つのフォトニックバンド構造が表れることを示した。さらには、フォトニックバンド構造の妨げとなっていた原子の共鳴による吸収の効果も、2つのフォトニックバンド構造によって抑制可能であることを示した。以上の2件の研究に加え、さらに1件の論文を公表した。本年度は、大きな光子散乱レートを持つ魔法波長の光格子中にトラップされた中性水銀原子を用いたレーザーについての研究を行い、ミリヘルツの超狭線幅が実現されることを理論的に示した。この実験は、極低温に冷却した水銀原子集団を、光格子に捕獲して用いる。ここで、光格子は2つの役割を果たしている。1つめは光格子時計の場合と同様、原子をラム・ディッケ領域に束縛し、かつ魔法波長の手法によってレーザー遷移の光シフトを抑制することである。2つめは、光格子レーザーにより基底準位からレーザーの上準位へのポンピングを行うことである。我々の計算によると、実現されるレーザー光の線幅はミリヘルツの領域であり、出力強度は10^<-9>Wとなると考えられる。また、周波数安定度は1秒で10-^<18>となることが期待され、これは現時点での最高水準の周波数安定度を2桁改善するものである。この超狭線幅のミリヘルツレーザーは、高分解能レーザー分光、量子情報科学や精密周波数計測といったさまざまな分野への応用が期待できるものである。例えば、光格子時計の基準発振器として川いることにより、レーザーの安定度で制限されている光格子時計の周波数安定度が1秒で10^<-18>にまで改善される。この実験の実現に向けた準備も進めており、水銀原子の初段の冷却に必要な、^1S_0→^3P_1遷移に共鳴な紫外光源の開発に成功した。昨年度は光格子中の水銀原子を用いた超狭線幅レーザーの実現可能性につて研究を行った。本年度は、新たに2つの理論的研究を行った。まず、昨年度行った研究を87Sr原子に対して適用した。得られるレーザーの出力は、レーザー発振に用いる原子のエネルギー準位が縮退していないために制限されており、10-14W程度にとどまるが、スレーブレーザーを位相同期するには十分である。レーザーの線幅は、主にレイトシフトの揺らぎによって決まり、ポンプ光の強度揺らぎを1%まで抑えることにより、mHzレベルで制御可能である。このmHz線幅のレーザーを最新の光格子に用いることにより、周波数安定度は2ケタ程度改善されると期待される。次に行ったのが、実時間位相同期を用いた新しい原子時計のモンテカルロシミュレーションである。この原子時計では、原子を透過した光の2つの直行位相振幅からエラー信号を得て、光を原子の共鳴に安定化する。今回は、安定化に用いる原子として、光格子中の87Sr原子を採用した。もともとの提案では、100秒の積算時間で1×10-17以下の安定度を得ることが可能とされ、熱雑音に制限されているプローブ光とそれ以上に安定な原子時計との間を結ぶ懸け橋となりうると期待された。しかしシミュレーションの結果、安定度は光のショット雑音によって制限されており、この手法を用いてもなお限界を決めているのは原子の物理系そのものではなく測定手法にあるということが分かった。スクイーズド光を用いる方法も考えたが、現在の光のスクイージング技術の限界である10dB程度では、原子のショット雑音を下回ることは難しいということがわかった。

これまでに中心となって研究されてきた赤方離調の光格子時計では、同サイトの原子間における衝突シフトの可能性が議論されてきたが、このような浅い青方離調光格子時計の場合、複数サイト間の原子衝突が支配的であることが分かった。そして、赤方離調の場合と同様に、時計遷移励起レーザーと光格子レーザーの光軸のずれによって衝突シフトが発生し、1次元と2次元光格子において角度のずれが10mrad程度の場合、その大きさが10-16程度となることが分かった。もう一つの成果が、3次元光格子中の原子(88Sr原子を想定)による、フォトニックバンド構造の構築の提案である。フォトニックバンド構造が生成されるか否かを決定づけるのは光格子の幾何学的配置と原子の分極であり、通常のBravais格子と2準位系では実現できないことが知られていた。そこで、本研究では新たに3つめの準位を導入することにより、単純立方格子・面心立方格子でも2つのフォトニックバンド構造が表れることを示した。さらには、フォトニックバンド構造の妨げとなっていた原子の共鳴による吸収の効果も、2つのフォトニックバンド構造によって抑制可能であることを示した。以上の2件の研究に加え、さらに1件の論文を公表した。
レジオネラエフェクターと宿主因子の相互作用とその機能

レジオネラによる肺炎は汚染された温泉などを原因とするアウトブレイクで問題となっている新興感染症である。レジオネラは宿主細胞が持つ貪食作用により侵入した後、ファゴソームを改変してつくりだしたオルガネラの内部で増殖する。このプロセスにはレジオネラの持つDot/Icm IV型分泌系が必須であり、これが宿主細胞内増殖を可能にするエフェクタータンパク質を輸送している。このようなエフェクタータンパク質の一つであるLubXは、E3ユビキチンリガーゼのモチーフの一つであるU-boxを二度繰り返す特徴的な配列を持ち、実際E3ユビキチンリガーゼとして機能する。我々はすでにLubXの標的分子として宿主Clk1キナーゼを同定している。今回、我々はLubXの新たな標的分子として別のエフェクターSidHを見いだした。SidHとLubXの遺伝学的関係は、ショウジョウバエin vivo感染系からも示唆された。ほ乳類細胞を用いたex vivo感染実験により、SidHは感染直後に宿主細胞内へ輸送されるが、遅れて発現・輸送されてくるLubXによりポリユビキチン化され、宿主プロテアソームにより分解されることを明らかにした。すなわち、エフェクターLubXは別のエフェクターSidHの宿主細胞内レベルを制御する、時間制御因子として機能している。このようなエフェクターを標的とし制御するエフェクターは、既存のエフェクターの定義を超えるものであり、我々はメタエフェクターと呼ぶことを提唱している。また、ユビキチン系に関与する細菌エフェクターは近年多数報告されてきているが、この中にはメタエフェクターとして機能するものがあるのではないかと考えられる。レジオネラは宿主細胞が持つ貧食作用により侵入した後、ファゴソームを改変してつくりだしたオルガネラの内部で増殖する。このプロセスにはレジオネラの持つDot/Icm IV型分泌系が必須であり、これが宿主細胞内増殖を可能にするエフェクタータンパク質を輸送していると考えられる。我々はレジオネラから宿主真核細胞内へ輸送される機能未知のエフェクターを20以上同定している。本研究ではこれらのエフェクタータンパク質と相互作用する宿主タンパク質の同定・エフェクターと宿主因子の機能の細胞生物学的解析等を通じて、これらエフェクターの宿主細胞内機能を明かにすることを目的とし、以下の研究を行った。1)酵母ツーハイブリッド系を利用したスクリーニングにより、新規エフェクターの一つと相互作用する宿主タンパク質一種を同定した。今後このタンパク質問相互作用を生化学的、あるいは真核細胞中で解析していきたい。2)このエフェクターの宿主細胞中での局在を検討したところ、細胞質中に局在していた。3)レジオネラ含有バキュオール(LCV)にユビキチン化タンパク質が集積することが知られているが、この集積が顕著に減弱するエフェクター欠失株を同定した。今後、このエフェクターと相互作用する宿主タンパク質を同定していきたい。4)E3ユビキチンリガーゼ活性を持つエフェクターLubXと相互作用する別のレジオネラエフェクターを同定した。今後、この相互作用の意義について検討していきたい。
パーキンソン病における神経細胞死の機序解明とその防御

劣性遺伝性パーキンソン病の遺伝子産物parkin,はミトコンドリア膜電位が低下するとミトコンドリア外膜に集積し、その集積はPINK1の存在が必須であった。また膵β細胞を用いた検討では第1相のインスリン分泌の低下が観察された。またPark9の遺伝子産物ATP13A2の局在検討では正常型はリソソームの外膜に局在するが変異型では小胞体に局在した。この局在の変化がloss-of-function効果を誘導すると考えられた。パーキンソン病は多様性の高い疾患と言える。患者の殆どは家族歴のない孤発型である。しかしながら、最近単一遺伝子異常に伴う遺伝性パーキンソン病の病態が孤発型パーキンソン病の病態に直接的にリンクすることが推定されている。パーキンソン病の神経病理学的マーカーであるレビー小体ユビキチン陽性封入体である。このことは蛋白分解系がその病態に関わっていることを示す。ユビキチンープロテアソーム系の代表格であるparkinとオートファジーの構成成分であるATP13A2がある。既にparkin KOマウスを作成し、行動異常を検討したが、明らかな行動異常は観察されなかった。しかしながら、ラット用ロタロッドを使った運動学習能力を検討したところ野性型マウスと比較して明らかにparkin KOマウスでは学習能力が低下していた。更にin vivoボルタメトリーによる検討でドパミン遊離の低下を見出した。今まで間接的な確証はあったものの直接的なドパミン遊離の低下は初めてである。更に通常ドパミン遊離が減少すると反応的にdopamine transporter(DAT)も低下するがparkin KOマウスではDATの十分な低下が観察されなかった。更にDAT阻害剤を投与することでドパミン神経細胞の反応が改善された。Parkin変異患者に診られる早期levodopa induced dyskinesiaの病態に少なくともinsufficient down-regulation ofDATが関与していることが推定された。またドパミンに遊離低下による学習能力の低下がparkin遺伝子変異の根本的な原因である可能性が示された。DAT阻害剤の治療戦略の可能性が出てきた。一方、オートファジー関連分子ATP13A2に関しては、変異型はERに留まりリソソームへ移動できないことが推定された。更にリソソーム病に観察されるfinger print様の封入体形成が観察された。ATP13A2は劣性遺伝性であることを考えるとリソソームへの移行破綻が病態の本質と考えられた。神経保護を考える上でERストレスの回避ではなくリソソーム機能の維持が新しい治療戦略と成りうると考える。<研究目的>Parkin(PARK2)とPINK1(PARK6)は常染色体劣性遺伝形式を呈する若年発症のパーキンソニスムの原因遺伝子であり、その臨床像は非常に類似している。これまでにParkinの機能としてはユビキチンリガーゼであることが判明しており、他方PINK1はキナーゼドメインを持つことからリン酸化に関与することが推測されてきた。近年ParkinとPINK1の新たなる機能として、ミトコンドリアの品質管理に関与することが注目されている。すなわちParkinとPINK1はともに障害を受けたミトコンドリアを認識し、そのクリアランスに関与することが指摘されているが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。そこで、ミトファジー現象に着目し、ParkinとPINK1がいかに関与するかを明らかにし家族性パーキンソン病の病態解明を目的とする。<方法>ミトコンドリア脱共役剤(CCCP)はミトコンドリア膜を高度に障害し、その結果イオン勾配を消失させ、膜電位を保てなくする作用を持つことが知られている。培養細胞ならびにMEFをCCCPで処理し、ParkinとPINK1の動態を生化学的に解析した。<結果>ParkinはCCCP処理により膜電位を消失した異常なミトコンドリアを認識して移行する。この反応はParkin特異的な反応であるが、ミトコンドリアへの移行にはPINK1が必須であることを見出した。さらにParkinが移行したミトコンドリアは次第に消化されていくことを観察した。<考察>Parkinは障害されたミトコンドリアのクリアランスに重要な要素であり、ミトコンドリアの品質管理に重要な役割を担っていることが推測された。クリアランスの詳細なメカズムは不明であるがオートファジーを阻害するとが抑制されることからミトファジーが有力である。以前より孤発性パーキンソン病の病態としてミトコンドリア機能異常が指摘されており、Parkinのこのようなミトコンドリアクリアランスの作用の解明は重要な課題である。
マルチプローブ微小力センサーの開発

本研究では、試料表面上の多点を同時に計測・加工が可能なマルチプローブタイプの走査型力顕微鏡(SFM)を実現するため、新たにマルチプローブ微小力センサーの開発を行った。具体的には、マルチプローブSFMシステムを実現する圧電微小力センサーアレイの設計および製作プロセスの開発を行うとともに、製作したセンサーアレイの特性の検証を行った。そして、2個所の同時測定が可能なマルチSFMシステムを実現した。○圧電薄膜マルチプローブ微小力センサーの設計・製作および評価マルチプローブ顕微鏡システムでは、各々のプローブ探針・試料間距離が独立に制御する必要があり、各々のプローブが従来のシステムの圧電スキャナの_z駆動性能を有する必要がある。そのため、本研究では、圧電ひずみ定数の高いチタン酸ジルコン酸鉛(PZT)薄膜を採用した。PZT薄膜の成膜には組成の制御が容易なゾル-ゲル法を用いることにより、長さ150μm,幅50μm,厚み3.5μmのPZT圧電薄膜微小力センサーが100μm間隔で10本並んだマルチプローブデバイスを製作することができた。センサーの変位変換効率(電流感度)は1.02.0A/mであり、駆動効率は100200nm/Vであり、若干の性能のばらつきはあるものの、いずれもSFMを構成するのに十分な特性を有していた。○マルチプローブ走査型力顕微鏡(SFM)の開発さらに試作したマルチプローブ微小力センサーを利用して、2つのセンサーが同時にダイナミックモードで動作するマルチプローブSFMを開発した。特に2つのセンサーの変位を探針・試料間距離が一定となるように独立にフィードバック制御するシステムを構築し、2点での40μm角範囲の同時測定を実現した。
癌関連糖鎖抗原の性質、発現機構および生物学的意義について

代表的な癌関連糖鎖抗原の1つであるTn抗原の構造及びT細胞系における同抗原の発現について明らかにした。ヒト腸癌由来細胞株LS180細胞を免疫原として単クロ-ン抗体を調製し、抗Tn抗体であるMLS128を得た。MLS128は羊顎下腺ムチン(OSM)とも反応することから、アシアロOSMを材料としてTn抗原の構造について解析した。アシアロOSMを種々のプロテア-ゼで処理し、その消化物をMLS128の抗体カラムに通し、素通り及び溶出画分を得た。トリプシン消化物の中でエピト-プを含む糖ペプチドGPーIは、抗体カラムに結合しない糖ペプチドに比して、3060倍高い抗原活性を有していた。さらにサ-モリシン消化によって得た糖ペプチドGPーIIはGPーIに含まれ、得られた糖ペプチドの中でエピト-プを含む最小の糖ペプチドであった。アミノ酸配列の解析より、GalNAcーSerー(GalNAc)TRrーGalNAc(FRr)がTn抗原活性に必須であることがわかった。同様の構造をもつグリコホリンAについても解析した。グリコホリンAにはペプチド鎖上にOーグリカンが連続して3個と6個結合している2つのクラスタ-構造が存在する。正常グリコホリンAをグリコプロテア-ゼにより理し、2つのクラスタ-構造の間を切断し、HPLCにより分離した。2つの糖ペプチドを固相化し、シアリダ-ゼ,βーガラクトシダ-ゼ処理後に抗原活性を測定したところGalNAc残基あたりの活性は3個のクラスタ-が約2倍であった。この結果はGalNAc残基のみからなるOーグリカンが3個連続して存在すれば、Tn抗原活性が発現し、4個以上は必要でないことを示している。また、T細胞系の培養細胞株JurkatのロイコシアリンにTn抗原活性が発現していることを見い出した。K562細胞のロイコシアリンの比較等より、Tn抗原の発現にはクラスタ-構造が必要であることを示した。ヒト結腸癌由来細胞株LS180細胞を免疫原として、単クロ-ン抗体MLS128を調製した。MLS128は、LS180細胞より調製したムチン型糖ペプチドや羊顎下腺ムチン(OSM)と反応した。この反応性はシアリダ-ゼ処理によっても変化しなかった。また、Tn赤血球を凝集すること、GalNAcにより反応の阻害が見られることから,Tn抗原を認識することが推定された。更に,抗Tn抗体とされているNCCーLuー35,CA3239と比較検討した結果、抗Tn抗体であることが明らかとなった。Tn抗原は、従来GalNAcーSer/TRrとされてきたが、OSMを用いて、詳細に検討した。アシアロOSMを種々のプロテア-ゼ処理した後、MLS128immunoaffinity colunnを用いて素通り画分及び溶出画分に分け、それぞれをHPLCで分離精製した。先ず、トリプシン処理によって得られた種々の糖ペプチド(素通り画分GP15、溶出画分GPI)の反応性及び構造について検討した。OSMを固相化したプレ-トに種々の濃度の糖ペプチドの存在下でMLS128の反応性を比較した。