hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体内埋め込み型および皮膚貫通型医療機器の局所感染防御のための新規被覆材の開発

また本素材は適切な強度と柔軟性を保持し,様々な形状に加工することが容易で,耐久性にも優れている.今年度の研究では,この被覆素材の組織浸潤性を検討する目的で,様々な孔径に制御した円柱状の多孔体(孔径:約500,450,250,200,150,100,50μm)をシリコンチューブ内に挿入したものを作製し,これら試験片を成ヤギに皮下に埋め込み,一ヶ月後摘出,そしてこのチューブ両端から侵入した肉芽組織の浸潤長を測定することにより,新規被覆材の組織浸潤性とした.結果,ヤギ皮下に留置された被覆材の摘出時には,被覆材は生体組織と密に接着し,互いの分離は非常に困難で,被覆材内が器質化された組織で充満しているのが観察された.組織浸潤長は孔径の大きさにほぼ比例し,7.25,7.33,7.54,6.59,5.41,5.62,4.03mm(n=10)であり,我々の開発した新規被覆材は,従来人工臓器に使用されてきた多孔体より優秀な組織浸潤能を示し,さらに孔径の大きな2群においては,組織学的に膠原線維を主体とする結合組織浸潤が良好であった.また,被覆材内の網状構造内には,生体の異物に対する拒絶防御反応ないし炎症反応は極めて軽微であった.以上の結果より,我々の開発した新規被覆材は,埋め込んだ人工臓器と周囲組織を密に癒着させるために充分な組織浸潤性を有し,機械的な強度を保持できることが示され,その孔径を変化させることにより,多孔体内へ浸潤する組織の浸潤性を制御可能なことが示された.
膵癌間質の多様性制御に基づく新規治療法の開発

膵癌は抗癌剤抵抗性のため予後不良であり予後改善のボトルネックとなっている。近年の研究でCAFを促進性から抑制性にリプログラムさせることで抗がん剤抵抗性が改善されると示唆されている。しかしながら具体的な機序は明らかにされておらず未だコンセプトに留まっている。本研究は、Meflinを利用し「癌促進性CAF」から「癌抑制性CAF」にリプログラムすることで抗癌剤抵抗性を改善できるかどうかを明らかにし、間質をターゲットとした新規概念の治療方法の確立を目指す。
酢酸菌によるセルロースのナノ紡糸過程の直接観察

本研究では、酢酸菌により作り出されるセルロースのナノ紡糸過程の直接観察を試みた。得られた成果の概要を下記に示す。1.微分干渉光学顕微鏡にCCDカメラを接続し、さらに画像処理装置でコントラストを増強し、ビデオテープに録画する方法すなわちビデオマイクロスコピーシステム法を用いた。酢酸菌が約50nm幅のリボン状のセルロースを紡糸していく様子をリアルタイムで観察し、その紡糸速度が決定できた。rough colonyの場合は3.4μm/minで、smooth colonyの場合は2.4μm/minであった。この違いは、生成されるセルロースゲルの高次構造の違いに反映されていると推定される。2.酢酸菌を28°Cの標準培養条件下で培養すると、菌体の長軸の方向に右巻きにねじれたリボン状のセルロース集合体が押し出されるが、smooth colonyを用いて4°Cで培養すると、多数のstrand状のセルロースからなる帯状集合体が菌体の長軸に垂直な方向に押し出されること、またstrandの数の異なる「密な構造」と「粗な構造」が生成する事を明らかにした。制限視野電子回折測定を行った結果、「密な構造」の場合はセルロースIIの結晶に対応する3つの赤道反射(1-10、110、020)が観測できるが、「粗な構造」の場合は結晶性の反射は観測できなかった。3.培養液中に紡糸されてきたセルロースの構造をそのまま保持し、乾燥によるひずみなどの影響を避けるために、never-dryのセルロースを-179°Cの液体プロパン中で急速凍結して、ガラス状態の氷で包埋されたセルロースの構造を観測することを試みた。そのためにクライオトランスファーおよびクライオTEM(400kV極低温電子顕微鏡)を用いて4Kで測定した。しかし、氷の層が厚すぎたため電子線の透過性が悪く十分なコントラストがある像が得られなかった。今後、試料作製方法を詳細に検討する予定である。酢酸菌が生産するセルロース(バクテリアセルロースと呼ぶ)の特徴は、高結晶性、超微細繊維であり、網目構造を有することである。これらの特徴は、酢酸菌の特異な生合成および構造形成機構によってもたらされる。酢酸菌(楕円体状)は、その長軸方向に移動・回転することによりリボン状セルロースを生成すると言われている。しかし、ある酢酸菌は、低温で培養することにより菌の長軸に垂直な方向に帯状セルロースを生成することを見出した。これらの結果より、酢酸菌の運動性と構造形成機構は密接に関係していると考えられる。本研究では、生きたままの酢酸菌がセルロースを形成していく過程をリアルタイムでその場観察し、酢酸菌により作り出されるセルロースのナノ紡糸過程を明らかにするを目的とする。今年度は、無染色で生きたままの酢酸菌がセルロースを排出していく様子をリアルタイムで捉えるために、ビデオマイクロスコピーシステムを用いた。このシステムは微分干渉光学顕微鏡、CCDカメラ、画像処理装置、ビデオテープレコーダからなる。酢酸菌が約50mm幅のリボン状のセルロースを排出していく様子を観察することに成功した。今後は酢酸菌がセルロースを排出していく速度を観察する。また培地に水溶性高分子を添加した場合の酢酸菌のナノ紡糸過程に及ぼす影響について検討する。本研究は、酢酸菌により作り出されるセルロースのナノ紡糸過程を明らかにするを目的とする。昨年度に引き続き研究を行い得られた成果の概要を下記に示す。1.ビデオマイクロスコピーシステムを用い、酢酸菌が約50nm幅のリボン状のセルロースを排出していく様子をリアルタイムで観察し、その排出速度を決定する事が出来た。用いた菌株にはrough colonyとsmooth colonyが存在する。

rough colonyの場合はリボン状セルロースの排出速度は3.4μm/minで、smooth colonyの場合は2.4μm/minであった。この違いは、生成されるセルロースゲルの高次構造の違いに反映されていると推定される。2.酢酸菌を28°Cの標準培養条件下で培養すると、菌体の長軸の方向に右巻きにねじれたリボン状のセルロース集合体が押し出されるが、smooth colonyを用いて4°Cで培養すると、多数のstrand状のセルロースからなる帯状集合体が菌体の長軸に垂直な方向に押し出されること、またstrandの数の異なる「密な構造」と「粗な構造」が生成する事を明らかにした。制限視野電子回折測定を行った結果、「密な構造」の場合はセルロースIIの結晶に対応する3つの赤道反射(1-10,110,020)が観測できるが、「粗な構造」の場合は結晶の反射は観測できなかった。3.培養液中に排出されてきたセルロースの構造をそのまま保持し、乾燥によるひずみなどの影響をさけるために、never-dryのセルロースを-179°Cの液体プロパン中で急速凍結して、ガラス状態の氷の存在下での構造を観測することを試みた。そのためにクライオトランスファーおよびクライオTEM(400kV極低温高分解能電子顕微鏡)を用いて4Kで測定した。しかし、氷の層を非常に薄くしないと電子線が透過せず、また試料のコントラストが低いため測定が非常に困難であることが判明した。試料作製方法を十分検討する必要があることがわかった。
生物学的製剤及び分子標的薬投与下の重篤感染症、日和見感染症に関する薬剤疫学的研究

膠原病における免疫抑制療法下の肺感染症に関する前向き研究:膠原病に対し、免疫抑制薬の新規開始、変更または増量を受けた763例の治療開始時のデータを解析し、高齢、Brinkman index(400以上)、Cr濃度、プレドニゾロン最大量が肺感染症発症の有意なリスク因子として同定された。アダリムマブ(ADA)投与下のニューモシスチス肺炎(PCP)に関する薬剤疫学研究:関節リウマチに対してADAの投与中にPCPを発症した17例およびPCPを発症しなかった89例のデータを収集、解析しPCP発症危険因子として高齢、関節構造破壊(stage III以上)が同定された。「生物学的製剤および分子標的薬による免疫抑制療法下の膠原病患者における重症・重篤・日和見肺感染症に関する薬剤疫学的研究」として、平成24年度には、以下に記す2つの臨床研究を平成23年度に引き続き、継続実施した。第1は、「免疫抑制療法下の膠原病患者における重篤肺感染症、日和見肺感染症の前向きコホート研究」である。この研究おいては、患者の登録が完了した。Webシステムにて全登録例のデータを収集すると共に、欠損データを回収するため研究実施医療機関に出張しデータの収集を施行し、データベースを構築、完成させた。また、登録患者において発現した感染症について、各症例毎の臨床経過、画像所見を精査するための検討会を開催した。これらの結果を解析し、学会や研究会にて解析結果の発表を行った。第2は、「アダリムマブ投与下のニューモシスチス肺炎に関するケースコントロール研究」である。平成23年度に収集したアダリムマブ投与下にニューモシスチス肺炎を発現した症例の各種データに基づきデータベースを完成させ、解析を実施。その結果を学会にて発表すると共に、論文を作成、投稿し、掲載された。「生物学的製剤および分子標的薬による免疫抑制療法下の膠原病患者における重症・重篤・日和見肺感染症に関する薬剤疫学的研究」として、平成25年度には、以下に記す臨床研究を実施した。第2の研究は、「アダリムマブ投与下のニューモシスチス肺炎に関するケースコントロール研究」であったが、これは昨年度に、データ収集、データベース構築、データ解析が終了し、結果を論文にし、医学雑誌に掲載された。本年度は、この結果を踏まえて、免疫抑制療法を受けるリウマチ性疾患患者を対象としたより適切なニューモシスチス肺炎の予防投与方法を検討するための「ST合剤減量・漸増投与試験」を計画し、実施中であり、174例を目標登録数として、現在138例が登録されている。これら対象患者の登録を進めるとともに、データの収集を行っている。「生物学的製剤および分子標的薬による免疫抑制療法下の膠原病患者における重症・重篤・日和見肺感染症に関する薬剤疫学的研究」として、平成23年度には、以下に記す2つの臨床研究の実施にあたった。まず第1は、「免疫抑制療法下の膠原病患者における重篤肺感染症、日和見肺感染症の前向きコホート研究」である。この研究おいては、既に対象患者の登録、経時的な各患者のデータ収集のためのWebシステムを稼働し、該当患者の登録を開始していたので、登録患者のフォローアップデータの回収を実施した。登録時および経時的な各患者のデータはWebシステムのみでは収集困難な詳細な臨床データ、画像データも必要であったため、適切な時期に各施設に紙ベースのデータシートを送付し、必要な情報の収集にあたった。その後、収集したデータを基にデータベースの構築を開始した。この研究においては、アダリムマブ投与下にニューモシスチス肺炎を発現した症例を報告した医療機関に研究協力の概要を周知し、研究参加の要請をすると共に、他施設共同研究グループの結成、研究計画書、研究会会則を作成。研究参加の同意が得られた施設では必要であれば、倫理審査委員会の承認の取得を行い、各症例の詳細な臨床データ、画像データの収集にあたった。症例検討会を開催し、臨床データと画像データの詳細な解析を実施した。第1の研究である、「免疫抑制療法下の膠原病患者における重篤肺感染症、日和見肺感染症の前向きコホート研究」における平成24年度の到達目標は、患者登録の完了、全登録患者のデータ収集、感染症発現症例の詳細の検討、データベースの構築、データの解析であった。これらの作業はすべて完了し、完成したデータベースに基づき、免疫抑制療法下の膠原病患者における重篤肺感染症、日和見肺感染症の疫学的データの整理、リスク因子の同定を施行し、その結果を2012年11月のアメリカリウマチ学会やその他の研究会において発表した。

第2の研究である、「アダリムマブ投与下のニューモシスチス肺炎に関するケースコントロール研究」における平成24年度の到達目標は、アダリムマブ投与下にニューモシスチス肺炎を発現した症例の各種データ収集の完了、症例の詳細検討、これらによるデータベースの完成、データ解析であった。解析データは学会、研究会にて発表し、論文を作成し、2012年12月、Modern Rheumatologyに『Clinical characteristics and risk factors for Pneumocystis jirovecii pneumonia in patients with rheumatoid arthritis receiving adalimumab:a retrospectivereviewand case-control study of 17 patients.』として掲載された。更に、アダリムマブ以外のTNF阻害薬(インフリキシマブ、エタネルセプト)投与下のニューモシスチス肺炎の発現との比較検討を行い、2012年4月の第56回日本リウマチ学会にて発表した。以上に記載した平成24年度の到達目標はほぼ達成できたと判断している。第1の研究である、「免疫抑制療法下の膠原病患者における重篤肺感染症、日和見肺感染症の前向きコホート研究」における平成23年度の到達目標は、(1)研究協力施設の研究参加の同意、倫理審査委員会の承認の取得、(2)患者登録のWebシステムの整備、(3)該当患者の登録、登録後6ヶ月、12ヶ月のデータの収集であった。第2の研究である、「アダリムマブ投与下のニューモシスチス肺炎に関するケースコントロール研究」における平成23年度の到達目標は、他施設共同研究グループの結成、研究計画書、研究会会則の作成。さらに、該当する医療機関への研究協力の概研究参加の要請と同意、倫理審査委員会の承認の取得であった。以上に記載した平成23年度の到達目標はほぼ達成できたと判断している。第1の研究である、「免疫抑制療法下の膠原病患者における重篤肺感染症、日和見肺感染症の前向きコホート研究」における今後の研究の推進方策は、データ解析を精査した上で、結果を論文として完成させ、投稿することである。第2の研究である、「アダリムマブ投与下のニューモシスチス肺炎に関するケースコントロール研究」における今後の研究の推進方策は、TNF阻害薬3剤によるニューモシスチス肺炎のデータを統合した解析結果の精査した上で、論文を作成、投稿することである。さらに、これらの研究結果を踏まえて、今年度は免疫抑制治療を受けるリウマチ性疾患患者を対象に、より適切なニューシスチス肺炎の予防投与法に関するランダム化比較試験を開始する。第1の研究である、「免疫抑制療法下の膠原病患者における重篤肺感染症、日和見肺感染症の前向きコホート研究」における今後の研究の推進方策は、第1にデータベースの構築である。第2に本研究のエンドポイントである感染症発現報告例を解析し、症例固定を行う。これらを実施したのちに、本研究の目的の一つである肺感染症発現リスク因子の同定を行う。第2の研究である、「アダリムマブ投与下のニューモシスチス肺炎に関するケースコントロール研究」における今後の研究の推進方策として以下を予定している。ニューモシスチス肺炎発現症例の詳細な臨床データ、画像データの検討結果を基に論文を作成し発表する。これまで行ったTNF阻害薬3剤によるニューモシスチス肺炎のデータを統合して解析する。
高等植物における重金属に応答した細胞内空胞系の誘導機構の解析

昨年度より、ABC(ATP binding cassette)トランスポータの機能解析を行ってきた。ABCトランスポータは、生体異物や内在性代謝産物を細胞質から細胞外、あるいは液胞内腔に排出していることが動物細胞で明らかにされてきた。一方、植物では129種のメンバーからなるスーパーファミリーを形成しており、これらのいくつかは単なる解毒機構の役割だけでなく、細胞の成長や発生段階において、様々な役割を果たす事が明らかとなってきている。本研究では、ABCトランスポータの1つであるAtPGP4{ABC transporters of the multidrug resistance (MDR)-like p-glycoprotein (PGP)4}の機能解析を行い、以下の解析結果を得た。細胞膜に局在するAtPGP4は、根形成初期段階においてのみ強く発現しており、シロイヌナズナatpgp4変異体の根を顕微鏡下で観察したところ、側根および根毛の数が野生型と比べて34倍増加していた。側根や根毛形成がオーキシンによって制御される事は良く知られた現象である。また根におけるオーキシンの取り込み活性を測定したところ、atpgp4変異体では野生型と比べて低下した。さらにオーキシンを細胞内に過剰に蓄積することでオーキシン感受性変異体となっている酵母yap1-1変異体にAtPGP4を発現させ、オーキシン存在下において生育させたところ、コントロールとして用いたベクターのみを導入したyap1-1変異体と比較して、オーキシンに対する感受性がさらに上がった。以上の事から、AtPGP4が根形成初期段階においてオーキシン輸送を制御する事で、側根および根毛形成に重要な役割を果たしている事が明らかとなった。平成16年4月から8月にかけての研究成果登熟期の種子は一時期に大量の種子貯蔵タンパク質を合成し、PAC小胞(Precursor-Accumulating Vesicles)を介してタンパク質蓄積型液胞に蓄積することが知られている。我々はこの蓄積機構を分子レベルにて解明すべく、シロイヌナズナ登熟種子からのタンパク質蓄積型液胞単離系の確立、およびMALDI-TOF MSを用いたプロテオーム解析を行った。この結果、これまでオイルボディにのみ局在する事が知られている数種のオレオシシタンパク質が同定された。これらの特異抗体を作製し、蛍光抗体法により局在を確認したところ、確かにタンパク質蓄積型液胞にもオレオシンタンパク質は局在しているという結果が得られた。現在、免疫電子顕微鏡法による局在解析を行っている。平成16年9月から現在に至るまでの研究成果9月よりスイス・チューリッヒ大学のDr.Martinoia研究室において、MRPタンパク質(multidrug-resistance related protein)の機能解析を行っている。MRPタンパク質は細胞内に存在する有害物質の耐性機構に関わることが知られている。特にこれまでの知見から、カドミウムなどの重金属イオン耐性機構に関わることが予想される、MRP1が属するサブファミリー(MRP1、2、11、12)の機能解析を行っている。すでにMRP1およびMRP2遺伝子が欠損したシロイヌナズナ変異体のホモラインを得ているため、これらをカドミウム入り培地で生育させ、野生型と比較したが、今のところ生育に優位な差が見られていない。MRP1とMRP2は相同性が非常に高く、互いに機能を相補する事が予想される。MRP1/MRP2の二重変異体のホモライン固定が本年度中に終了するため、本変異体を用いて表現型解析を行う。MRP1に蛍光タンパク質であるGFPを、またMRP2にはDsRedをC末端側に挿入したクローンを得たため、これらを野生型および変異体へ導入し、局在性の確認および相補性実験を行っている。MRP1は液胞膜に局在する事が知られているが、未だ明らかにされていないMRP2の局在性を知る事で、細胞内での両タンパク質の関連を解明したい。
高性能氷蓄熱のための過冷却の基礎研究

純水中に過冷却が発生・解消するメカニズムを伝熱面の材質、機械的性質、冷却速度、自然対流と関連づけて基礎的に研究した。先ず、伝熱面表面の材質、機械的性質および冷却速度が過冷却解消温度に及ぼす影響を検討するための実験を行った。直径90φ程度の円盤状の銅製伝熱面の表面を電解研磨、バフ研磨、クロムメッキ、金メッキ、各種コーティング加工し、それらの伝熱面によって自然対流が生じないように純水を上方から、さまざまな冷却速度で冷却し、伝熱面上にデンドライト状の氷が発生する時の伝熱面過冷却度及びデンドライトの発生位置とを測定した。その場合、伝熱面過冷却度やデンドライトの発生位置は、同一面の同一冷却条件に対しても、必ずしも再現性のない統計的な値となるため、実験を繰返し行った。実験結果を統計的に整理し、過冷却解消を起こしやすい伝熱面性質を検討した。また、上記の結果の整理を行う上で、伝熱面に直接接触していない過冷却水の中から均質核生成によって氷の発生する確率を調べる必要が生じたため、四塩化炭素と油の2液界面に、直径の比較的大きい水滴を50個程度浮遊させ、下方から冷却して液滴中で過冷却が解消する時の温度を繰返し測定し、結果を確率の考え方で整理した。次に、直径91φの金メッキをほどこした水平円筒を冷却面として用いてその周囲の純水を冷却し、円筒周囲で自然対流が起っている状態での過冷却解消温度を測定した。円筒の一部に鋭いきづを付け、氷が必ずその部分から発生するように加工した後、円筒面上のきづが重力方向に対して、さまざまな位置なるように設定して実験を行った。その結果、過冷却解消温度に及ぼす自然対流の影響は、本実験の範囲では顕著でなかった。
海洋中における乱流拡散の機構解明とそのパラメータ化

成層海洋中における内部波の砕波は、等密度線を横切る方向の拡散・混合過程(diapycnal mixing)に主要な役割をはたすことにより、海洋大循環など大規模な海洋現象をもコントロールしていることが知られている。この内部波の砕波に伴う乱流混合・拡散過程は、低波数領域における大気擾乱から海洋中へのエネルギー流入に伴って行われていることは指摘されているものの、このエネルギーがどのような形で乱流拡散の行われる高波数領域まで輸送されてくるのかについては明らかにされていない。本研究では、実際に海洋の中・深層に存在する内部波の普遍平衡スペクトル(ギャレット・ムンクの平衡スペクトル)とそれを支える主要な機構と考えられる内部波の非線形相互干渉の力学に注目し、プリミティブのナヴィエストークスの方程式を直接に数値積分することにより、大気擾乱によって成層海洋中に加えられたエネルギーが内部波の3波共鳴を通じて次第に平衡スペクトルを形成していく過程を再現するとともに、こうして得られた平衡スペクトルが大気擾乱によって一時的に乱されたとき、その擾乱エネルギーがスペクトル内を乱流スケールまでどのような過程で輸送されていくのかを調べた。その結果、大気擾乱から与えられたエネルギーが内部波の「弱非線形干渉(3波共鳴)」を通じてまず高鉛直波数の近慣性周波数領域へと流れ、さらにその結果発達した近慣性流に伴う鉛直スケール10m程度の鉛直シア-との「強い非線形干渉(限界層吸収やシア-不安定)」を通じて高波数内部波が砕波するという一連のエネルギー輸送過程の存在していることが明らかにされた。さらに、大気擾乱など外力の働く「低波数領域」と乱流拡散の働く「高波数領域」との異スケール間を、この数値計算で直接見積もられる「エネルギーの流れ」で結びつけることにより、海洋中における乱流拡散過程のパラメータ化を試みた。
一酸化炭素とアデノシン受容体の相互作用による肺移植後拒絶反応軽減の基礎的研究

マウス気管移植モデルにおいてCORM-2を用いて移植後の拒絶反応を検討した。CORM-2投与群では炎症性サイトカイン、Tリンパ球の浸潤、気管上皮、気管上皮下層の肥厚が対照群に比して抑制されることが示された。CORM-2の放出する一酸化炭素が気管移植後拒絶反応を抑制していると考えられた。CORM-2投与群では同所気管移植モデルでepithelial layer、subepithelial layerの肥厚が軽減されていた(p < 0.05)。同所気管移植モデルでは気管内腔狭窄と線維化の抑制が認められた(p < 0.05)。グラフトでのIFN-γ、IL-2のmRNA発現はCORM-2投与群でコントロール群と比べて抑制されていた(p < 0.05)。しかしながらIL-10のmRNAについても検討したが、IL-10の発現は気管移植グラフト内での発現はCORM-2投与群と非投与群において有意な差を認めなかった。In vivoでのCORM-2投与によるアデノシンレセプターのドナー気管における発現はA2Aレセプターが非投与群に比べてmRNAの発現が亢進していた(p < 0.05)。さらなる追加の実験が必要であるが、現時点ではCORM-2によりアデノシンレセプターA2ARが誘導され、気管移植において拒絶反応を抑制している可能性が示された。またTリンパ球の移植気管での浸潤が検討された。CORM-2投与群で非投与群に比してTリンパ球の浸潤が抑制されていることが確認された(p < 0.05)。Tリンパ球のサブセット解析が必要であるが、現在のところCORM-2によるリンパ球浸潤減少は示された。血液中のCOHgb濃度の検討が課題となるが、経時的に今後検討することが必要であると考えられた。研究ではマウス気管移植モデルを用いて、CARBON MONOXIDE RELEASING MOLECULE(CORM)をマウスに投与して、BRONCHIOLITIS OBLITERANSが抑制されることを確認した。またCORMに移植気管上皮、上皮下へのT細胞の浸潤が抑制されることを証明できた。上記の結果は世界心肺移植学会で受理され、平成24年度に国際会議で発表の予定である。気管の閉塞も出るに関しては気管内腔の狭窄allograftでは認められたのに対し、CORM投与群では狭窄の軽減が確認できた。血液中のサイトカインをELISAで検討したが、これは有意差を認めなかった。また移植グラフトでの炎症性サイトカインの発現(IL-2 IFN-gamma)がCORMにて抑制されることもPCR法にて確認できた。しかしながらTH-2サイトカインであるIL-10はCORM投与群とコントロール群での差を認められなかった。またCORM投与により血液中のCOHbの濃度を検討したが、上昇は認められなかった。Adenosine 2AレセプターのBブロッカーの投与で炎症性サイトカインが移植グラフトで発現が抑制されていることも認められた。今後はin vitroでのT細胞の関与の実験、アデノシンレセプターのT細胞での発現の実験、また移植気管をもちいてフローサイトメトリーによるT細胞のsubsetでの気管移植への関わりを検討する。上記の結果は世界心肺移植学会で受理され平成24年度に発表の予定である。また最近移植グラフトでの炎症性サイトカインの発現がCORMにて抑制されることもPCR法にて確認できた。今後はin vitroでのT細胞の実験、また移植気管をもちいてフローサイトメトリーによるT細胞のsubsetでの気管移植への関わりを検討する。異種移植(allograft)のラット肺移植を行い、8週間後に犠牲死させる。以下の群に分類する。使用するラットはF344とWKYの2種類を使用する。(1)一酸化炭素250ppm下、投与薬剤なし(2)大気下、高発現したアデノシンレセプターのアゴニスト(3)大気下、高発現したアデノシンレセプターのアンタゴニスト(4)一酸化炭素250ppm下、高発現したアデノシンレセプターのアゴニスト(5)一酸化炭素250ppm下、高発現したアデノシンレセプターのアンタゴニスト(6)大気下、投与薬剤なし上記(1)から(6)を組織像、免疫染色によるT細胞の局在と数、フローサイトメトリーによるT細胞のサブセットを検討する。血液中のサイトカインも測定する。予定の通り動物、実験器具の購入、実験試薬の購入、また学会発表ならびに論文発表で使用する。
金属錯体界面活性剤による逆ミセル形成と錯体分子構造との関連性

本研究ではアルキル鎖を二本持つ金属錯体界面活性剤を新たに合成し,水/有機溶媒混合系での会合挙動を1H NMR自己拡散,蒸気圧降下,電気伝導度,イオンメーター,多核NMRなどによって調べた。ここで取り上げた金属錯体界面活性剤は,水/有機溶媒混合溶媒系で逆ミセルまたはマイクロエマルジョンを形成する傾向にあり,メゾスコピックレベル(数十ナノメーター)の微小水滴を形成する。3年にわたって,アルキルエチレンジアミン,アルキルアミノ酸,ならびにアルキルリン酸エステルを配位子として持つ亜鉛,パラジウム,銀,マグネシウムの金属錯体を合成・単離し,その水/有機溶媒混合系での会合挙動を上記の物理化学的な測定によって調べた。これらの錯体は,水/低誘電率有機溶媒混合系でかなり溶解度が高いことである。また,各種の金属イオンと対イオンとの組み合わせで,イオン間相互作用が溶解度ならびに会合挙動に大きく効いてくることを明らかにした。更に配位子のアルキル鎖を系統的に変化させ,分子の親水性-疎水性バランス・分子の形状を変化させ,それによって会合挙動がいかに変化するかを明らかにした。一方,パラジウムならびに銀のアルキルエチレンジアミン錯体からなる逆ミセル系について,微小水溶液内に金属が集積していることを利用して,これらの金属を還元して,金属ナノ粒子を生成させ,それらの形状ならびに粒子径分布と溶液構造との関係を明らかにした。配位子として一本のアルキル鎖を持つものが二個配位した両親媒性金属錯体は,親水性一疎水性バランス(HLB)が優れていて,水中または水/有機溶媒混合系で多様な集合体を広範に形成することを我々のグループが見いだして来ている。今年度は更に新たな幾種類もの同じタイプの錯体を合成して溶液の物理化学的性質を調べた。大きく分けて次の二つの成果をあげた。1)親水性の高いビス(ヘキシルエチレンジアミン)亜鉛(II)塩化物を合成し,水/メタノールならびに,水/クロロホルム混合溶媒系での溶解度ならびに会合挙動を調べた。その結果,親水性が高いにもかかわらず,クロロホルム中で逆ミセル会合体を形成することが分かった。また水中ならびにクロロホルム中での高い次元の会合度やサイズを拡散係数,粘度の測定から見積もった。2)パラジウムならびにカドミウムのビス(オクチルエチレンジアミン)錯体塩化物の水/クロロホルム混合溶媒中での会合挙動を1)と同様な手法で調べた。先に調べた亜鉛の塩化物と比べた結果,いずれの錯体も水にも油にも溶けにくいにもかかわらず,水/クロロホルムならびに水/メタノールの混合溶媒系によく溶け広範に会合体を形成することが分かった。親水性→疎水性はパラジウム錯体>亜鉛錯体>カドミウム錯体の順であった。パラジウムと塩化物イオンとの相互作用(共有結合性)は単純塩では一番強いのにもかかわらず,エチレンジアミンが四配位をとるために配位できなくなり,イオン結合性すなわち錯体としては強電解質になった。金属錯体界面活性剤の形成する分子集合体は,効率の良い反応場として期待できるが,系統的な研究はほとんどなされていない。研究代表者らは,比較的単純な金属錯体界面活性剤を用いて,集合体の物性,構造,ならびに反応場としての機能性の三者間の関連性を追及することを目的に研究している。特に本研究では,逆ミセルあるいはW/O型マイクロエマルジョンを形成しやすいアルキル鎖を二本持つタイプの分子を対象の中心に据え,その分子の結晶中での構造,集合体の構造,そして集合体の物性との間の関連性を追及する目的で研究を行った。具体的には,昨年まで主に研究対象とした,亜鉛(II)のオクチルならびにヘキシルエチレンジアミンのビス錯体に加えて,カドミウムやパラジウムなどの同じタイプの錯体を新たに合成して有機溶媒/水の混合系でその集合挙動を調べた。カドミウム錯体は亜鉛錯体と同様であるがやや疎水性が高いことが分かった。

しかし,パラジウム錯体はイオン性が高く,電気伝導度の水分依存性に異常が見られた。ただし,このプロファイルは典型的なW/OマイクロエマルジョンであるAOTの系と似ており,イオン性W/Oマイクロエマルジョンに特有なものと考えられる。また,溶質の自己拡散係数の水分依存性を測定したが,亜鉛錯体またはカドミウム錯体とパラジウム錯体との間で差が認められた。それぞれの錯体について電気伝導度の結果とある程度同様の傾向を示したが,電気伝導度の結果の方がより顕著な変化を示した。更に,これら金属錯体マイクロエマルジョン系に還元剤を添加すると,粒子径の揃った金属ナノ粒子が形成されることが分かりTEMを使って更に追及している。本研究ではアルキル鎖を二本持つ金属錯体界面活性剤を新たに合成し、その混合溶媒中での会合挙動を^1H NMR自己拡散,蒸気圧降下,電気伝導度,イオンメータ,多核NMRなどによって調べた。ここで取り上げた種類の界面活性剤は水/有機溶媒混合系で逆ミセルまたはマイクロエマルジョンを形成しやすく,会合系の中にメゾスコピック領域(数十ナノメータスケール)の微小な水滴を形成する。本年度は,エチレンジアミン,アミノ酸,そしてリン酸を極性基とする界面活性剤配位子を持つ亜鉛,パラジウム,白金,銀,マグネシウムなどの金属錯体界面活性剤を合成・単離し,その水/有機溶媒混合溶媒中での溶解度,会合挙動を上記の物理化学的な手法でもって調べた。これらの錯体一般に見られる傾向は,水あるいは低誘電率有機溶媒の単独溶媒には溶解度が極めて低いが,水/低極性溶媒の混合系では溶解度が高まることである。また,各種の金属イオンと対イオンの組合せで,イオン間相互作用が溶解度そして会合挙動に大きく効いてくることを明らかにした。更に配位子のアルキル鎖を系統的に変化させ,分子の親水性-疎水性バランス,分子の形状を変化させることに伴ういくつかの特異的な会合挙動を明らかにした。一方,パラジウムあるいは銀の逆ミセル系について,金属が微小水溶液内に集積していることを利用して,これらの金属を還元して金属ナノ粒子を創成し,それらの形状ならびに粒子径分布と溶液構造との関連性を明らかにした。
強相関絶縁層が挿入された新型層状有機超伝導体における新奇な電子状態の探索

有機超伝導体kappa-alpha'1-(BEDT-TTF)2Cu(CF3)4(TCE)は伝導層間にアニオン層・電荷秩序層・アニオン層が挿入された構造を有するTc = 9.4 Kの物質である。一方、強相関絶縁層であるalpha'層を含まないkappaL-(BEDT-TTF)2Cu(CF3)4(TCE)はTc = 4 K程度の超伝導体であり、アニオン層には結晶学的に乱れた構造を有する。角度依存性磁気抵抗の測定により、kappaL相には磁気抵抗のバックグラウンド反転が見られることや、伝導層平行近傍の磁気抵抗ピークが観測されないことから、この物質は層間相互作用が極めて小さいインコヒーレント層間伝導であることを明らかにした。また、量子振動の測定によりシリンダー状のフェルミ面をもつことを明らかにした。一方、電荷秩序層を包含するCu(CF3)4塩においても量子振動が観測され、フェルミ面の断面積から伝導層のバンド充填率は実効的1/2であり、低Tc相と同じであることを明らかにした。さらに、高Tc層で観測されるサイクロトロン質量は低Tc層のそれよりも大きいことは、強相関絶縁層の影響によると考えられる。また、ダイマーモット絶縁体kappa-(BEDT-TTF)2TaF6では、ドナー分子のダイマー間の2面角が103.8 degと超伝導を示すkappa-(BEDT-TTF)2Xの90 degとは大きく異なるため、ダイマーモデルにおけるトランスファー積分の比がt'/t=1.76と1次元鎖よりの値となる。t'/tが1から大きくずれているにも関わらず、スピン磁化率はあたかも2次元三角格子モデルにおいてJ = 110 Kのように振る舞う。さらに磁気トルク測定の結果1.6 Kにおいても常磁性体であることが明らかになった。さらなる低温での測定が必要であるが、この物質がスピン液体の候補であることを明らかにした。モット絶縁体は銅酸化物高温超伝導体の母物質であることから、研究対象として重要な位置づけがなされている。有機伝導体においては分子が井桁上に配列したkappa型とよばれる構造をもつ物質がモット絶縁体であると考えられている。しかしダイマーを1サイトと見なすダイマーモット絶縁体であり、近年ダイマー内での電荷の不均化と考えられるような実験結果が報告されていることから、単純なモット絶縁体ではない性質を示している。本研究ではダイマー構造を有さない真性モット絶縁体beta-(BEDT-TTF)TaF6の基底状態を明らかにするための実験を行った。低温での磁気トルクの測定において、0.9 T付近でスピンフロップ転移が確認された。この物質の基底状態はネール温度10 Kの反強磁性絶縁体であることが確定できた。また、低温でのX線回折において超格子反射が確認されないことから、構造は室温と同じであると考えられ、ダイマー構造を有さないユニフォームスタック構造が保たれていることになる。ただし、熱収縮の異方性から室温での疑似正方格子から比べるとかなり歪んだ四角格子へと変形していることが、低温構造に基づいたトランスファー積分の計算から明らかになった。delta-(BEDT-TTF)2TaF6の2種類の多形(単斜晶と斜方晶)が室温近傍で電荷秩序転移を示し、スピンシングレット状態になることを明らかにした。低温での超格子反射を取り入れた構造解析から、電荷がほぼ+1の分子と0の分子がそれぞれダイマーを形成していることが示された。また、単斜晶と斜方晶を区別するとdelta-(BEDT-TTF)2MF6 (M = P, As, Sb, Ta)の電荷秩序転移温度は陰イオン体積が大きいほど高くなることを明らかにした。多形が複数確認されている物質であり、マイナーな相である真性モット絶縁体beta-(BEDT-TTF)TaF6の基底状態を実験から解明できたことは重要な成果である。また、メジャーな相であるdelta型2:1塩の実験結果から、単斜晶と斜方晶を区別すると電荷秩序の転移温度が陰イオン体積が大きいほど高くなることを解明した。これは1984年から相関が見られないとされてきたことを覆す結果である。有機超伝導体(EtDTET)(TCNQ)はドナー・アクセプター型の純有機物質であり、常圧にてTc 5 K程度と報告されている。この物質の抵抗測定を行なったところ、試料依存性が強く超伝導転移が明瞭に見える試料が少ないことがわかった。これは報告されている結晶構造を有する物質が報告されている温度で超伝導を示すのかという疑問を呈するものである。そこでX線結晶構造解析が可能と思われる単結晶試料で磁気トルクを測定し、超伝導を示すことを確定させた試料の構造解析を行った。磁気トルクの結果から超伝導転移温度Tc = 4.3 Kの試料の存在を明らかにした。この試料のX線結晶構造解析を行ったところ、報告された構造と同型であることが明らかになった。ドナー分子をBEDT-TTFと同様にしてTTF骨格の結合距離から電荷移動量を見積もったところQ = +0.44(6)を得た。したがって、TCNQダイマーがモット絶縁体状態にあり、ドナー層が2次元的なフェルミ面をもつ金属で超伝導転移を示していると考えられる。

さらに抵抗測定において4.3 Kで抵抗が減少する物質以外に6.9 Kと4.8 Kの2段階転移を示した物質のX線回折実験も行った。格子定数は同じであったが、伝導層間方向に超格子反射と思われる反射が何点か観測されたが、試料の質が劣化しているため単結晶試料においてこれが現れているのかは明らかでない。また、真性モット絶縁体である(BEDT-TTF)TaF6の結晶成長過程において多形であるkappa-(BEDT-TTF)2TaF6を発見した。2種類のdelta型に加えて4つ目の構造である。この物質の抵抗測定や電子スピン共鳴の測定からダイマーモット絶縁体であり、スピン液体の可能性もあることを明らかにした。複数の試料を用いた磁化測定でのみ超伝導が報告されていた物質であるため、報告されている構造と超伝導を示す物質との対応が確実ではなかった。報告されている構造の物質はTc = 4.3 Kの超伝導体であることを、磁気トルクとX線回折の実験から確実なものにした。さらに、結晶構造解析の結果からドナー・アクセプター間の電荷移動量を明らかにした。また、新物質としてkappa-(BEDT-TTF)2TaF6を見出し、これがダイマーモット絶縁体でありスピン液体の可能性もあることを見出した。有機超伝導体kappa-alpha'1-(BEDT-TTF)2Cu(CF3)4(TCE)は伝導層間にアニオン層・電荷秩序層・アニオン層が挿入された構造を有するTc = 9.4 Kの物質である。一方、強相関絶縁層であるalpha'層を含まないkappaL-(BEDT-TTF)2Cu(CF3)4(TCE)はTc = 4 K程度の超伝導体であり、アニオン層には結晶学的に乱れた構造を有する。角度依存性磁気抵抗の測定により、kappaL相には磁気抵抗のバックグラウンド反転が見られることや、伝導層平行近傍の磁気抵抗ピークが観測されないことから、この物質は層間相互作用が極めて小さいインコヒーレント層間伝導であることを明らかにした。また、量子振動の測定によりシリンダー状のフェルミ面をもつことを明らかにした。一方、電荷秩序層を包含するCu(CF3)4塩においても量子振動が観測され、フェルミ面の断面積から伝導層のバンド充填率は実効的1/2であり、低Tc相と同じであることを明らかにした。さらに、高Tc層で観測されるサイクロトロン質量は低Tc層のそれよりも大きいことは、強相関絶縁層の影響によると考えられる。また、ダイマーモット絶縁体kappa-(BEDT-TTF)2TaF6では、ドナー分子のダイマー間の2面角が103.8 degと超伝導を示すkappa-(BEDT-TTF)2Xの90 degとは大きく異なるため、ダイマーモデルにおけるトランスファー積分の比がt'/t=1.76と1次元鎖よりの値となる。t'/tが1から大きくずれているにも関わらず、スピン磁化率はあたかも2次元三角格子モデルにおいてJ = 110 Kのように振る舞う。さらに磁気トルク測定の結果1.6 Kにおいても常磁性体であることが明らかになった。さらなる低温での測定が必要であるが、この物質がスピン液体の候補であることを明らかにした。真性モット絶縁体beta-(BEDT-TTF)TaF6の電気抵抗の圧力依存性を測定し、モット転移を観測することを目指す。また、その圧力近傍で低温にて超伝導が発現するか否かを明らかにする。
オートファジーの機能破綻による肝がんと転写因子Nrf2の活性化（国際共同研究強化）

転写因子Nrf2は抗酸化や解毒代謝に関わる酵素群の遺伝子発現を誘導する。我々はこれまでに、Nrf2欠失ラットを用いて、食品中に含まれるカビ毒アフラトキシンB1の解毒代謝にはNrf2が重要であることを示した。ヒトにおけるアフラトキシンB1の慢性曝露は肝臓がんを引き起こすことが知られており、これは実験動物としてラットにおいてよく再現される。そこで、アフラトキシンB1による肝臓がん発症におけるNrf2の必要性を調べるため、野生型ラットとNrf2欠失ラットにアフラトキシンB1の反復投与を行った。アフラトキシンB1の毒性は、曝露時の尿中や血中の代謝物で評価する。Nrf2欠失ラットは、野生型ラットでは毒性を示さない投与量に対して非常に脆弱性を示し、大半が数週間で死亡した。死亡を免れたNrf2欠失ラットでは、野生型ではみられない肝硬変の症状を示した。Nrf2欠失細胞はアフラトキシンB1曝露により死滅して、肝星細胞の活性化により線維化が進行したと考えられる。よって、野生型における肝臓がんの発症にはNrf2が必須であると考えた。実際に、多くのがん細胞ではNrf2の異常な活性化が観察されており、アフラトキシンB1による肝臓がんにおいても、Nrf2の遺伝子変異など何らかのNrf2活性制御システムの破綻が考えられる。そこで、アフラトキシンB1を投与した野生型ラットを長期飼育し、低容量で肝臓がんを発症するか否かを観察した。低容量のアフラトキシンB1でも野生型ラットでは肝臓がんを発症した。野生型ラットにおける腫瘍においてNrf2の発現に関わる遺伝子変異を解析している。内定年度:2015転写因子Nrf2は抗酸化や解毒代謝に関わる酵素群の遺伝子発現を誘導する。我々は最近、ゲノム編集技術によりNrf2欠失ラットを作製し、食品中に含まれるカビ毒アフラトキシンB1の解毒代謝にNrf2が重要であることを示した。一方、Solt-Farber肝発がんモデルにおける前がん病変の病巣では、Nrf2の遺伝子変異が高頻度に見出された。これまで、Nrf2欠失マウスを用いた化学発がんモデルにおいて、Nrf2は化学発がん物質の解毒代謝を促進して発がんを抑制することが報告されている。しかし、Solt-FarberモデルやアフラトキシンB1による肝発がんはマウスでは再現できないため、これらの肝発がんにおけるNrf2欠失の作用は検討されていなかった。そこで本研究では、Nrf2欠失ラットに2つの化学肝発がんモデル(Solt-Farber・アフラトキシンB1)を適用して、Nrf2による化学発がん剤の解毒代謝と、腫瘍におけるNrf2変異とNrf2の活性化を調べ、化学発がん剤による腫瘍形成におけるNrf2の役割を明らかとすることを目的とした。本年度、カリアリ大学・Columbano教授の研究室にて、Solt-Farberモデル作製において必要な実験技術(部分肝切除術、レーザーマイクロダイセクション顕微鏡)を習った。マドリード自治大学・Cuadrado教授の研究室では、Nrf2の活性制御に重要なβ-TrCPによるNrf2のユビキチン化分解系について議論した。ピッツバーグ大学・Kensler教授の研究室では、アフラトキシンB1による発がんラット長期観察実験について、そのプロトコール作成を行った。1年間で3つの渡航先を訪問し、それぞれの研究者とNrf2とがん研究について議論するができた。最初の訪問先であるカリアリ大学では、Solt-Farberモデルの一部である部分肝切除術と、レーザーマイクロダイセクション顕微鏡による凍結切片上の腫瘍部の切り出しからRNA抽出までを習った。早速この手法を取り入れて、肝臓がんモデルマウスの腫瘍部においてNrf2標的遺伝子であるNqo1の発現が上昇していることを明らかとした。マドリード自治大学では腫瘍におけるNrf2活性化メカニズムについて議論した。ピッツバーグ大学ではNrf2欠失マウスにおける門脈体循環シャントの判別方法について習った。ジョンズホプキンス大学ではアフラトキシンB1代謝物を解析する質量分析器を視察し、今後行うアフラトキシン長期投与条件と解析方法について議論した。我々はこれまでに、食品中に含まれるカビ毒アフラトキシンB1の解毒代謝にはNrf2が重要であることをNrf2欠失ラットを用いて示している。ヒトにおけるアフラトキシンB1の慢性曝露は、肝臓がんを引き起こすことが知られており、これは実験動物としてラットにおいてよく再現される。そこで、アフラトキシンB1による肝臓がんの発症におけるNrf2の必要性を調べるため、野生型およびNrf2欠失ラットにアフラトキシンB1を反復投与した。アフラトキシンB1の投与スケジュールは、Kensler教授(ピッツバーグ大学・ジョンズホプキンス大学)と議論の上、決定した。Nrf2欠失ラットは、野生型ラットでは毒性を示さない投与量に対して非常に脆弱性を示し、2週間の連続投与後に大半が死亡した。生存した個体を解析すると、野生型ラットとは異なり、Nrf2欠失ラットでは線維化が亢進して肝硬変を発症することが分かった。肝硬変は肝臓がんを引き起こす原因になることが知られており、ヒトにおけるアフラトキシンB1の慢性曝露は肝硬変を引き起こすことが知られている。しかしこれまでに、アフラトキシンB1を投与した野生型ラットでは肝硬変は観察されていなかった。

Nrf2欠失ラットの肝臓では、アフラトキシンB1を十分に解毒することができず、正常肝細胞が死滅して、肝星細胞の活性化により線維化が亢進したと考えられる。アフラトキシンB1を投与した野生型ラット肝臓におけるNrf2の活性化と合わせて、肝硬変を発症するNrf2欠失ラット肝臓の詳細も今後調べる予定である。アフラトキシンB1反復投与実験を行うことができた。転写因子Nrf2は抗酸化や解毒代謝に関わる酵素群の遺伝子発現を誘導する。我々はこれまでに、Nrf2欠失ラットを用いて、食品中に含まれるカビ毒アフラトキシンB1の解毒代謝にはNrf2が重要であることを示した。ヒトにおけるアフラトキシンB1の慢性曝露は肝臓がんを引き起こすことが知られており、これは実験動物としてラットにおいてよく再現される。そこで、アフラトキシンB1による肝臓がん発症におけるNrf2の必要性を調べるため、野生型ラットとNrf2欠失ラットにアフラトキシンB1の反復投与を行った。アフラトキシンB1の毒性は、曝露時の尿中や血中の代謝物で評価する。Nrf2欠失ラットは、野生型ラットでは毒性を示さない投与量に対して非常に脆弱性を示し、大半が数週間で死亡した。死亡を免れたNrf2欠失ラットでは、野生型ではみられない肝硬変の症状を示した。Nrf2欠失細胞はアフラトキシンB1曝露により死滅して、肝星細胞の活性化により線維化が進行したと考えられる。よって、野生型における肝臓がんの発症にはNrf2が必須であると考えた。実際に、多くのがん細胞ではNrf2の異常な活性化が観察されており、アフラトキシンB1による肝臓がんにおいても、Nrf2の遺伝子変異など何らかのNrf2活性制御システムの破綻が考えられる。そこで、アフラトキシンB1を投与した野生型ラットを長期飼育し、低容量で肝臓がんを発症するか否かを観察した。低容量のアフラトキシンB1でも野生型ラットでは肝臓がんを発症した。野生型ラットにおける腫瘍においてNrf2の発現に関わる遺伝子変異を解析している。アフラトキシンB1投与ラットを長期間観察して、野生型とNrf2欠失ラットにおける腫瘍形成の有無を評価する。グルタチンS-転移酵素P(GSTP)の発現は、化学発がんモデルラットにおける前がん病変マーカーとして利用される。GSTPはNrf2の標的遺伝子の1つであるため、Nrf2欠失ラットではGSTP陽性の前がん病変は出現しないことが予想される。そこで、GSTP陽性前がん病変と、実際の腫瘍形成に相関があるか否かを評価する必要がある。そのために、アフラトキシンB1の連続投与を開始して、1年後の腫瘍形成モデルラットを作製する。アフラトキシンB1投与中の尿サンプルを回収して、ジョンズホプキンス大学にてアフラトキシンB1代謝物を解析する。アフラトキシンB1投与ラットから採取した尿におけるアフラトキシンB1代謝物をジョンズホピキンス大学にて測定する。アフラトキシンB1投与後に出現するGSTP陽性前がん病変や肝臓がんにおけるNrf2遺伝子変異やNrf2の活性化を評価する。
CKBβに結合する新しい焦点接着局在タンパク質Hi-5の機能に関する研究

Hic-5の関与する細胞内シグナル伝達路を解明するために、Hic-5のチロシン残基リン酸化を検討した。Hic-5と共にタンパク質チロシンキナーゼCAKβあるいはFvnを細胞に共発現すると、Hic-5のチロシン残基リン酸化が亢進したが、FAKの共発現では亢進しなかった。共発現によるHic-5のチロシンリン酸化は、細胞を高浸透圧ストレスで刺激することにより更に亢進した。Hic-5のチロシン残基60をフェニルアラニンに変異するとチロシンリン酸化は起こらなく成った。チロシン残規60がリン酸化されたHic-5には、C末端Srcキナーゼ(Csk)のSH2ドメインが特異的に結合した。CAKβの変異体を共発現して検討した所、Hic-5チロシンリン酸化には、CAKβの活性化が必須であり、また、Hic-5とCAkβの結合も必要であることが明らかに成った。CAKβによるHic-5の特異的リン酸化の結果、Hic-5の特異的リン酸化の結果、Hic-5による下流シグナル路が活性化すると推定された。野生型の非受容体系タンパク質チロシンキナーゼ、CAKβ,は、核周囲に細胞質に存在しているが、SH3ドメインのリガンドとして働く859番のプロリンをアラニンに変えた点変異体は、核に局在した。タンパク質核外移送の阻害薬を細胞に作用すると、野生型CAKβのかなりの部分が細胞質から核に移行した。この事実は、野生型CAKβが細胞質と核との間を行き来している事を示唆する。CAKβに結合するHic-5もCAKβの核移行に伴いCAKβと共に核に集積した。核移行したCAKβの機能は、未だ明らかではないが、最近、Hic-5がandrogenreceptorのcoactivatorとして働き、androgen刺激に伴う転写を活性化すると報告されているので、CAKβはHic-5と共に核内における転写の制御などに関与すると推定している。1.Hic-5およびCAKβ/PYK2に結合・会合するタンパク質を酵母のtwo-hybrid系を用いた発現クローニングにより検索した。2.Hic-5はCAKβ結合タンパク質として同定したものであるが、そのチロシンリン酸化は、COS-7細胞でCAKβの共発現により亢進し、細胞を高浸透圧刺激するとチロシンリン酸化レベルが増強した。Y60F変異Hic-5の発現では、Hic-5のチロシンリン酸化が認められなかったので、Hic-5のTyr-60残基がこのリン酸化の主要な部位であると結論した。CAKβのHic-5結合部位欠失変異体は、共発現によりHiC-5のチロシンリン酸化を促進しなかったので、Hic-5のリン酸化には両者の結合が重要であった。リン酸化したHic-5はGST-CskSH2に結合したが、この結合は特異的であり、Fyn、Src、CskのSH2ドメインには結合しなかった。3.CAKβの種々の残基の1アミノ酸置換変異を作成し、これらの発現が細胞に与える影響を検討した。野生型CAKβは細胞質に局在するのに対し、A点変異を持つCAKβは核に局在した。A点変異CAKβ発現細胞では、核内チロシンリン酸化が亢進していた。

A点変異CAKβをHic-5と共発現した時のCAKβとHic-5の細胞内局在性を検討した。Hic-5は通常、焦点接着に局在するタンパク質であるが、CAKβと共発現すると主に細胞質に存在するようになった。A点変異CAKβとの共発現では、細胞質のみならず核内にも存在するようになった。A点変異CAKβとHic-5とを共発現した細胞をLeptomycin B存在下で培養すると、核内に光学顕微鏡下でも観察可能なCAKβとHic-5を含む凝集体を形成した。CAKβとHic-5の核における機能の解明は今後の課題である。Hic-5の関与する細胞内シグナル伝達路を解明するために、Hic-5のチロシン残基リン酸化を検討した。Hic-5と共にタンパク質チロシンキナーゼCAKβあるいはFynを細胞に共発現すると、Hic-5のチロシン残基リン酸化が亢進したが、FAKの共発現では亢進しなかった。共発現によるHic-5のチロシンリン酸化は、細胞を高浸透圧ストレスで刺激することにより更に亢進した。Hic-5のチロシン残基60をフェニルアラニンに変異するとチロシンリン酸化は起こらなく成った。チロシン残基60がリン酸化されたHic-5には、C末端Srcキナーゼ(Csk)のSH2ドメインが特異的に結合した。CAKβの変異体を共発現して検討した所、Hic-5チロシンリン酸化には、CAKβの活性化が必須であり、また、Hic-5とCAKβの結合も必要であることが明らかに成った。CAKβによるHic-5の特異的リン酸化の結果、Hic-5による下流シグナル路が活性化すると推定された。野生型の非受容体型タンパク質チロシンキナーゼ,CAKβ,は、核周囲の細胞質に存在しているが、SH3ドメインのリガンドとして働く859番のプロリンをアラニンに変えた点変異体は、核に局在した。タンパク質核外移送の阻害薬を細胞に作用すると、野生型CAKβのかなりの部分が細胞質から核に移行した。この事実は、野生型CAKβが細胞質と核との間を行き来している事を示唆する。CAKβに結合するHic-5もCAKβの核移行に伴いCAKβと共に核に集積した。核移行したCAKβの機能は、未だ明らかではないが、最近、Hic-5がandrogen receptorのcoactivatorとして働き、androgen刺激に伴う転写を活性化すると報告されているので、CAKβはHic-5と共に核内における転写の制御などに関与すると推定している。