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VEGF毒素融合蛋白による腫瘍血管内皮細胞を標的とした血管新生阻害剤の開発

固形腫瘍の発育は血管新生(angiogenesis)に依存しているとされており,血管新生を抑制することが抗腫瘍治療につながるとの観点から近年,腫瘍血管を標的とした分子標的治療薬が開発,実用化され注目を集めている。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は血管透過性を強く誘導もしくは血管内皮の遊走や増殖を刺激し、血管機能や血管新生の重要な制御する成長因子として知られている。また、VEGFは進行癌患者の胸水や腹水の形成に重要な役割を果たしていると考えられ、そのほか糖尿病性網膜症の新生血管にも関与している。肺癌の領域においてもVEGFに対するモノクローナル抗体であるBevacizumabが米国で切除不能再発・転移性非小細胞肺癌に対して適応が認可され,肺癌治療における血管新生の重要性が再び注目されている。今回我々は病理学的観点から肺癌手術検体を用い,診断が行なわれた症例について,血管新生に関わる因子としてリンパ管侵襲,血管侵襲に注目し検討を行った。【実施内容】1、VEGF-toxin蛋白製剤の安定的活性の確立。2、VEGF-toxin蛋白製剤の安定的作製法の確立。3、VEGF-toxin蛋白製剤を用いた動物実験への応用【結果】新規に作製したVEGF-toxin融合蛋白を精製し、血管内皮細胞に対する生物活性をヒト正常血管内皮細胞を用い、濃度依存性に増殖抑制効果があることを確認した。新規組み換え体を作製し、蛋白の再作製を成功した。生物活性の検討を行い、受容体への結合は確認した。【今後の課題】1、蛋白製剤の精製。2、非特異的細胞毒性の検討。3、融合蛋白は大腸菌由来であるためエンドトキシンの除出。4、融合蛋白の受容体へ特異的結合能を検討。5、胸膜中皮種同所移植モデル、肺癌多臓器転移モデルでの融合蛋白の単独或いは既存の製剤(抗癌剤や抗体療法)との併用による治療効果を検討。6、実験的肺転移モデルでの融合蛋白の抗血管新生効果を組織学的に検討。7、動物実験モデルの結果を基に前臨床試験への導入を企業の参画を得て実現を目指す。【展望】近年、過去の喫煙率増加の推移を受け、肺癌は男性死亡率の第一位となっている。また、日本でのアスベスト使用量との関連から今後数十年にわたり、悪性胸膜中皮腫は、増加すると予想されている。悪性胸膜中皮腫は、アスベスト曝露との強い関連性が証明されている。何れの癌腫も各種既存の治療に対して抵抗性であり、新規治療薬の開発が切望されている。肺癌、悪性胸膜中皮腫ともに腫瘍の進展に新生血管が関与することが知られており、新規抗血管新生治療薬の良い標的になると考えられている。【研究の概要】固形腫瘍の発育は血管新生(angiogenesis)に依存しているとされており,血管新生を抑制することが抗腫瘍治療につながるとの観点から近年,腫瘍血管を標的とした分子標的治療薬が開発,実用化され注目を集めている.肺癌の領域においても血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対するモノクローナル抗体であるBevacizumabが米国で切除不能再発・転移性非小細胞肺癌に対して適応が認可され,肺癌治療における血管新生の重要性が再び注目されている.今回我々は病理学的観点から肺癌手術検体を用い,診断が行なわれた症例について,血管新生に関わる因子としてリンパ管侵襲,血管侵襲に注目し検討を行った.【方法】平成20年1月から12月末まで人体病理部に提出された肺癌手術症例80例について,腫瘍部でのHE染色及びEVG染色を行い,肺癌の組織型の検討及びリンパ管侵襲,血管侵襲について臨床的意義を検討した.患者背景は男性42名,女性38名.平均年齢が68.7才(4586才).組織型の内訳は腺癌が40例,肺胞上皮癌が29例,扁平上皮癌が9例,腺扁平上皮癌が1例,大細胞癌が1例であった.リンパ節転移については13例について陽性であった.【結果】リンパ管侵襲はリンパ節転移との強い相関を認めた(p<0.001)が,脈管侵襲との相関は見られなかった.

腺癌と肺胞上皮癌の間ではリンパ管侵襲と脈管侵襲について以前の報告(JThorac Cardiovasc Surg. 1998115(3) : 652-8)と同じく,病理学的観点から腺癌が肺胞上皮癌より低分化と言われており,脈管侵襲,リンパ管侵襲は肺胞上皮癌が少ないとの有意差が得られた. 65才以上と若年者間や男女間での脈管侵襲,リンパ管侵襲については有意差が得られなかった.【意義】今後の追跡調査を行ない,予後,治療効果,再発との相関などについて検討を続けてゆく予定である.
ハイエントロピー合金新学術領域研究の連携的企画運営

新学術領域研究「ハイエントロピー合金:元素の多様性と不均一性に基づく新しい材料の学理」を構成する多様な研究者が行う研究を相互に有機的に関連付けて,多様な観点から共同研究を企画・管理することにより,各研究者の研究にさらなる進展とブレークスルーをもたらすとともに,これらの研究成果がハイエントロピー効果という新規な概念のもと,最先端のナノ解析実験研究,最先端計算科学,最先端材料創製研究を融合させて,「未開の多成分系状態図の中央近傍の組成を持つハイエントロピー合金が示す新規で特異な材料物性をハイエントロピー効果と言う新規な概念からその本質を明らかにし,多様な構成元素間の非線形相互作用(カクテル効果)に潜む新たな材料科学の学術領域を打ち立てる」という領域全体の目標に対して最大限の寄与が出来るよう各個別研究および共同研究の方向付けを行っている.具体的には,領域全体の管理運営を行う事務局体制を整備し,領域内の各グループで実施されている研究内容を把握し,異なる背景の研究者間の研究言語を咀嚼,翻訳,統一し,「何が明らかになったのか」また「何を明らかにすべきか」を明確にした上で,総括班会議,領域全体研究会,各研究項目内連携会議,各計画研究班内会議などを企画・組織を通して,構成メンバー全員の共通認識となるようその周知に努める.また,大型共通設備(SPring-8,J-PARC,金研スーパーコンピューターなど)について利用のための講習会を開催しその利用を支援し,国際活動支援班を設けることにより,国内だけでなく国際的にも各研究グループ間の人材交流についての調整・交渉の窓口を行っている.また,ホームページやシンポジウム,若手の研究会,さらには関連各学会での講演会を企画・運営し,領域の最新研究動向や成果を,学界をはじめ広く社会に発信している.領域採択とともに速やかに,事務補佐員1名を雇用,総括班事務局を総括班代表のもとに開設し,領域全体の運営を補佐する体制を整えた.総括班会議をただちに行い,領域全体会議の開催の準備,若手研究会の企画と予定の確定,具体的な共同研究を早急に立ち上げるための各研究項目内での連絡会議,および各計画班内での研究会議の具体的な予定,領域内外の共有設備の使用規程などの決定を行った.学会連携部門を中心に,各学会で強さと変形に関する研究企画を立ち上げ,研究成果の学界への発信を行うための計画案の策定も行った.また,領域のホームページ(日英2ヶ国語)の立ち上げを行った.平成30年度の領域全体国内研究会として,平成30年9月にスタートアップ会議を開催し,各計画研究班の研究目的,内容,および計画研究班間の共同研究の項目及びその進め方について議論を行った.さらに,平成30年9月に日本金属学会秋期講演大会で公募シンポジウム「ハイエントロピー合金の材料科学」を開催し,領域内外の研究者との活発な討論から,強さと変形に関する研究成果の学界への発信を行った.本年度の領域全体国際会議として,米国ボストン市で平成30年11月にMRS Fall Meetingのシンポジウムとして"High-Entropy Alloys"を開催した.本新学術領域を国際的にアピールし,人材交流を促進させる機会として,国際活動支援班の重要行事と位置づけて開催した.また,平成30年度の領域全体国内研究会として,平成31年3月に成果報告会を開催し,各計画研究班の研究成果および計画研究班間の共同研究の成果について議論を行い,今後の研究推進方針の確認を行った.研究計画書,研究成果報告書,ニュースレターを各1部刊行し,領域に参画する研究者間の研究計画と目的,方針の共有化を行った.領域に参画する研究者間の研究目的・計画,方針の共有化を更に確立し,共同研究を促進するための領域全体の国内及び国際会議だけでなく,計画研究班間の交流を促進するための班内,班間研究会を積極的に企画する.これを容易に可能とさせるため,ホームページの充実,研究計画書,研究成果報告書,ニュースレターの発刊を行う.

具体的には,領域全体国内研究会として,スタートアップ会議(5月)および成果報告会(3月)を開催するとともに,強さと変形に関する研究成果の学界への発信を行う目的で,日本金属学会講演大会で公募シンポジウム「ハイエントロピー合金の材料科学」を秋期大会,春期大会の年2回開催する.一般向けに10月には日本金属学会シンポジウム「ハイエントロピー合金の材料科学」を開催し,一般社会への研究成果の周知を行う.また,領域全体国際研究会として,12月に横浜市で開催されるMRM 2019国際会議でシンポジウムとを開催し,本新学術領域を国際的にアピールし,人材交流を促進させる.また,国際交流,人材育成活動を更に充実させ,若手研究会の設立,また,昨年設立した国際コンソーシアムを利用して,共同研究の推進,研究成果情報共有の推進,人材育成・交流の共同促進に努める.また,領域に参加する研究者を中心に学術書籍「ハイエントロピー合金」の刊行(令和2年3月)を予定しており,一般社会への研究成果の周知を行う予定である新学術領域研究「ハイエントロピー合金:元素の多様性と不均一性に基づく新しい材料の学理」を構成する多様な研究者が行う研究を相互に有機的に関連付けて,多様な観点から共同研究を企画・管理することにより,各研究者の研究にさらなる進展とブレークスルーをもたらすとともに,これらの研究成果がハイエントロピー効果という新規な概念のもと,最先端のナノ解析実験研究,最先端計算科学,最先端材料創製研究を融合させて,「未開の多成分系状態図の中央近傍の組成を持つハイエントロピー合金が示す新規で特異な材料物性をハイエントロピー効果と言う新規な概念からその本質を明らかにし,多様な構成元素間の非線形相互作用(カクテル効果)に潜む新たな材料科学の学術領域を打ち立てる」という領域全体の目標に対して最大限の寄与が出来るよう各個別研究および共同研究の方向付けを行っている.具体的には,領域全体の管理運営を行う事務局体制を整備し,領域内の各グループで実施されている研究内容を把握し,異なる背景の研究者間の研究言語を咀嚼,翻訳,統一し,「何が明らかになったのか」また「何を明らかにすべきか」を明確にした上で,総括班会議,領域全体研究会,各研究項目内連携会議,各計画研究班内会議などを企画・組織を通して,構成メンバー全員の共通認識となるようその周知に努める.また,大型共通設備(SPring-8,J-PARC,金研スーパーコンピューターなど)について利用のための講習会を開催しその利用を支援し,国際活動支援班を設けることにより,国内だけでなく国際的にも各研究グループ間の人材交流についての調整・交渉の窓口を行っている.また,ホームページやシンポジウム,若手の研究会,さらには関連各学会での講演会を企画・運営し,領域の最新研究動向や成果を,学界をはじめ広く社会に発信している.領域採択とともに速やかに,事務補佐員1名を雇用,総括班事務局を総括班代表のもとに開設し,領域全体の運営を補佐する体制を整えた.総括班会議をただちに行い,領域全体会議の開催の準備,若手研究会の企画と予定の確定,具体的な共同研究を早急に立ち上げるための各研究項目内での連絡会議,および各計画班内での研究会議の具体的な予定,領域内外の共有設備の使用規程などの決定を行った.学会連携部門を中心に,各学会で強さと変形に関する研究企画を立ち上げ,研究成果の学界への発信を行うための計画案の策定も行った.また,領域のホームページ(日英2ヶ国語)の立ち上げを行った.平成30年度の領域全体国内研究会として,平成30年9月にスタートアップ会議を開催し,各計画研究班の研究目的,内容,および計画研究班間の共同研究の項目及びその進め方について議論を行った.さらに,平成30年9月に日本金属学会秋期講演大会で公募シンポジウム「ハイエントロピー合金の材料科学」を開催し,領域内外の研究者との活発な討論から,強さと変形に関する研究成果の学界への発信を行った.本年度の領域全体国際会議として,米国ボストン市で平成30年11月にMRS Fall Meetingのシンポジウムとして"High-Entropy Alloys"を開催した.本新学術領域を国際的にアピールし,人材交流を促進させる機会として,国際活動支援班の重要行事と位置づけて開催した.また,平成30年度の領域全体国内研究会として,平成31年3月に成果報告会を開催し,各計画研究班の研究成果および計画研究班間の共同研究の成果について議論を行い,今後の研究推進方針の確認を行った.研究計画書,研究成果報告書,ニュースレターを各1部刊行し,領域に参画する研究者間の研究計画と目的,方針の共有化を行った.領域に参画する研究者間の研究目的・計画,方針の共有化を更に確立し,共同研究を促進するための領域全体の国内及び国際会議だけでなく,計画研究班間の交流を促進するための班内,班間研究会を積極的に企画する.これを容易に可能とさせるため,ホームページの充実,研究計画書,研究成果報告書,ニュースレターの発刊を行う.
視床下核長期電気刺激に伴うドーパミン神経回路可塑性の研究

ネコの購入が高額なこと、そして本研究と合わせて共同研究者の赤嶺がマイクロダイアリーシスによるラット脳内ドーパミンの定量を行っていることより本研究においてもラットを使用することとした。本研究年度はラット視床下核をタングステン電極による神経活動記録よりいかに正確に視床下核を同定するかに主眼が置かれた。Paxinos & Watsonのアトラスを用いターゲットを設定し、視床下核の直上に位置する三叉神経核を皮膚感覚刺激による誘発神経活動を記録することで同定することで相対的に視床下核が決定されることが判明した。正常ラットにおいては、視床下核の神経活動はパーキンソン病患者におけるような異常興奮活動は見られず、その神経活動パターンのみでは正確に同定できない。20匹のラットを用いた急性実験と脳標本より、ラットの視床下核を正確に効率的に刺激をするためには電極間距離1mmの同心円状電極で双極刺激を行う必要があることが判明した。次年度に向けては、視床下核刺激に伴う尾状核の電位変化にあわせて黒質緻密帯にマイクロダイアリーシスプローブを挿入しドーパミンの刺激による変化を計測する予定である。さらには尾状核のドーパミンの定量を行い、視床下核刺激による神経回路可塑性の変化に伴うドーパミン分泌の変化を追及する予定である。
相同組換え修復機構の異常と発がん

遺伝性乳がん遺伝子BRCAが相同組換え修復において重要な役割を果たすことが明らかにされて以来、発がんにおける相同組換え修復機構の異常の重要性が議論されている。そこでヒト細胞における相同組換え修復の分子機構の解明をおこなった。我々が新規相同組換え遺伝子として単離したRad54Bは生化学的解析によって二本鎖DNA依存性ATP分解酵素活性を有することが明らかとなったが、ヒトにおける欠損細胞の作製によってジーン・ターゲティングに必須であることが判明した。それに対して、Rad51パラログであるXRCC3は姉妹染色分体を介する相同組換え修復に必要とされることが明らかとなった。さらに、XRCC3はDNA再複製を制御することによって染色体倍加を抑制して染色体安定性を保つことが発見された。そして、発がんに関与する遺伝子多型T241Mは正常な相同組換え修復機能を有するにもかかわらず染色体倍加抑制機能に異常をきたし、これが発がんリスクに関与することが示唆された。同様の染色体倍加は修復中間体解消酵素Mus81欠損細胞でも観察された。この表現型の分子機構を検討した結果、DNA損傷に応答してChk2を介するG2チェックポイントが活性化されてCyclin B/Cdc2活性が低下することが原因であることが明らかとなった。このように相同組換え修復機構はDNA複製や細胞周期の調節機構と密接にリンクしていることが証明され、これらのネットワークの異常によって染色体不安定性が誘導されることが示唆された。本研究では、ヒト腫瘍における相同組換え遺伝子の構造解析の結果に基づいて、発がんにおける相同組換え異常の役割の解析を行った。ヒトRAD54Bはある種のがんにおいて構造異常をきたしていることが明らかとなったため、その機能異常と発がんとの関連性を分子レベルで解析するためにまずRAD54Bに対する抗体を作製した。RAD54とRAD51は直接結合して相同組換えに中心的役割をはたす蛋白質複合体を形成することが知られている。そこで、COS細胞においてRAD54BとRAD51を強制発現させ、免疫沈降によってそれらの結合を解析した。その結果、これら二つの蛋白質の結合が確認された。また、強制発現を行わず定常状態のマウス、ヒトの各種細胞株においてもこれらの結合が認められた。結合に関わる部位の同定はGSTとの融合蛋白質のin vitroにおける結合実験で行った。その結果、RAD54のRAD51との結合にはN末端側の配列が必要であると同様に、RAD54BのN末端側200アミノ酸からなる蛋白質が結合に重要であることが明らかとなった。RAD51をはじめとして相同組換えに関わる蛋白質は核内においてフォーカスを形成することが知られている。そこでRAD54Bの細胞内局在をその抗体を用いて共焦点顕微鏡により解析した。その結果、RAD54Bは核内でフォーカスを形成し、それらはRAD51,RAD54,BRCA1のフォーカスとほぼ一致した。しかし、RAD51などのフォーカス形成は電離放射線照射によって著明に誘導されるが、RAD54Bにおいては照射に関わらず形成がみられた。これらの結果より、RAD54Bは既知の相同組換え蛋白質と核内で複合体を形成していることが明らかとなり、相同組換えの異常とヒト発がんの関連性が示唆された。乳がん遺伝子蛋白質Brca1と蛋白質複合体を形成するRAD54Bの変異がヒトがんに存在することを我々はこれまでに報告したが、この遺伝子の機能は不明であるために、ヒト発がんにおける相同組換え異常の分子機構を解明することを目的として、RAD54Bの機能解析を行った。まず、ヒト細胞における機能を明らかにするために、ヒト大腸がん細胞株においてRAD54Bノックアウト細胞を作製した。この細胞では、野生株と比較して外来遺伝子断片による相同組換えの頻度が著しく低下していた。しかし、RAD54変異株で報告されている放射線感受性の上昇や姉妹染色分体交換の低下は観察されなかった。

この表現型は酵母の組み換え遺伝子Tid1/Rdh54の変異株の表現型に類似することにより、RAD54BはTid1/Rdh54の高等真核生物におけるホモログと考えられた。さらに、リコンビナント蛋白質を作製し生化学的解析を行った。その結果、RAD54BはDNA結合能及ぴ二重鎖DNA依存性のATPase活性を有することが明らかとなった。しかしTid1/Rdh54が結合するDmc1には結合しないことにより、RAD54Bの機能には進化上保存されていないものも存在することが明らかとなった。また、これらの機能は構造的に類似するRAD54とは明らかに異なるものであり、体細胞における相同組換えではRAD54とRAD54Bが各々独自の役割を果たすことも明らかとなった。相同組換え修復機構の異常による発がんの分子機構を明らかにする目的で、まだ詳細が不明であるヒト細胞における相同組換え修復機構の解析を行なった。相同組換えには姉妹染色分体によるものと相同染色体による二つの機構が存在し、マウスまでの哺乳動物では前者による修復の方が優位と考えられているが、ヒト細胞における実態は不明である。そこで、大腸がん細胞におけるノックアウト実験によってRad54B欠損細胞を作製し解析した結果、この遺伝子が相同染色体間の組換えに特異的な役割を果たすことが明らかとなり、酵母からヒトまでこの組換え修復機構が保存されていることが証明された。次に、もう一つの組換え機構である姉妹染色分体による相同組換え機構を解析するために、同細胞においてRad51関連蛋白質であるXRCC3のノックアウトを行なった。XRCC3欠損細胞はシスプラチンやMMCによるDNA障害に対して高感受性を示した。MMCの誘発による姉妹染色分体交換の頻度は欠損細胞において有意に低下していたが、外来遺伝子断片による相同組換え頻度の低下は観察されなかった。また、放射線照射後のRad51の核内フォーカス形成能は著しく低下していた。ノックアウト細胞に野生型cDNAを発現することによって、これらの表現型は完全に回復した。これらの結果によりXRCC3はヒト細胞において姉妹染色分体による組換え修復にRad51とともに必須の蛋白質であることが明らかとなった。相同組換え修復においてRad51は中心的な役割を果たすが、哺乳動物の体細胞にはRad51と構造的に類似したRad51パラログが5種類存在する。これらはRad51と協調して相同組換え修復の早期過程に重要な役割を果たしていると考えられるが、ヒト細胞における機能は全く不明である。そこでRad51パラログの一つXRCC3の生物学的機能を明らかにするために、ヒト大腸がん細胞株においてノックアウト細胞を作製した。DNA架橋剤に対する高感受性,姉妹染色分体交換の低下、放射線照射後のRad51フォーカス形成の低下、染色体切断増加などの異常が欠損細胞で観察され、これらはXRCC3がRad51とともに相同組換え修復の早期過程に重要であることを示唆する。さらには、染色体倍加の頻度が欠損細胞では野生株と比較して有意に増加していた。
画像表示デバイスを用いた微細任意パターン形成技術の汎用化と集積回路設計への応用

本研究は、画像表示デバイスを用いた微細任意パターン形成技術の汎用化と集積回路設計への応用を行うことを目的として実施しているものである。平成16年度においては、レチクルフリー露光技術において不可欠な画像表示デバイスを、広く一般的に使用されている投影露光装置において従来のレチクルと同様に取り扱える汎用性を持たせた"ユニバーサルレチクル"として設計・試作することを第一の目標として研究を進めた。まず、液晶ディスプレイのブラックマトリックス面と石英ガラス上のパターン面との距離を50um程度まで近接させるための接着工程に関して検討を行い、液晶ディスプレイ研削法およびガラス基板切削法の両者において実現可能であることを実際の試作を通して示した。その結果、投影プロジェクタ用に使用されている小型液晶ディスプレイをg線ステッパー装置における露光時に必要なパターンが予め書き込まれた石英ガラスの上に実装することで、実際にレチクルアライメントやウエハアライメントなどの機能を搭載したユニバーサルレチクルを作製できることを実証した。さらに、従来のガラスレチクルに対して透過率が低下するという課題に対して、その解決策に関しての基礎的な検討も行った。その結果、透過率低下の主要な原因である偏光光線の生成に関して、偏光変換光学系を採用することで光源の光利用効率を2.7倍まで大幅に向上させることが可能であることを示した。さらに、画素開口形状の微細化を同時に実現することで、従来の石英レチクルの光利用効率に近いユニバーサルレチクルを実現できることを明らかにし、技術の汎用化に向けての知見を得た。次年度においては、ユニバーサルレチクルを用いて実施する集積回路の試作プロセス結果を元に、集積回路の設計規則の体系化および設計した回路パターンの露光画像への変換アルゴリズムの策定を行い、本技術の集積回路設計への応用を進める。
多環式芳香族炭化水素の発がん機構におけるカルボカチオン中間体の特性

人類は、現代生活を営む上で多量の天然資源を消費し、また、多量の廃棄物を生み出している。石油や石炭、自動車の排気ガスやタバコの排煙に含まれる多環式芳香族化合物は、がんの原因物質とされている。その発がん機構では、体内においてカルボカチオン中間体を経由して、DNAと結合することが知られている。そのため、がん治療の効率的な対策を立てるために、中間体であるカルボカチオンの性質を調べる必要がある。そこで、多環式芳香族化合物から生じる短寿命カルボカチオンの電子構造や安定性について物理有機化学的手法を用いて調べた。本年度は、環を4つもつジャヌセン化合物やトロピオジャヌセン化合物、フッ素置換誘導体、非交互炭化水素化合物に関するカルボカチオンについて、電子構造や芳香属性と発がん性との相関関係を核磁気共鳴測定装置および理論化学計算法を用いて調べた。これらの化合物では、π-π相互作用が空間を通して作用することが提案されている。しかし、本研究の結果、芳香属性についてはほとんどその相互作用の影響がないことがわかった。また、フッ素置換誘導体の芳香属性を検討する場合は、σ環電流が大きいためにπ環電流のみを比較する必要があることがわかった。この結果は、がんの発生を抑制する薬の開発だけではなく、多環式芳香族化合物を用いた電導性材料の開発等、カルボカチオン中間体が関与する機能性材料の開発への応用が期待される。ベンゾ[a]ピレンに代表される発がん性あるいは変異原性の疑いのある多環式芳香族炭化水素の発がん機構で生じる中間体カルボカチオンに関して、分子構造や反応特性と発がん性や変異原性と関連および置換基の効果を物理有機化学的なアプローチによって定量的に解明した。特に炭化水素の中で、2から5個まで縮合環をもつピレン系、フェナントレン系、アズレン系、ベンゾ[a]ピレン系、フルオレン系等について調べた。すなわち、発がん性多環式芳香族炭化水素や代謝物およびそのモデル化合物を合成する方法を新たに開発した。そして、合成した種々の炭化水素誘導体から擬似代謝反応である超強酸との反応によって、中間体カルボカチオンを低温でのイオン安定条件下において発生させた。さらに、多次元NMRによって直接観測することによって、反応位置と反応選択性を解析し、シグナルの完全帰属を行った。そして、出発物質とのNMRケミカルシフト差からカルボカチオン陽電荷分布図を作成し、分子構造とDNA等の求核試薬との反応性や選択性の関連を詳細に調べた。また、理論化学的計算を行うことによって電子エネルギーと電子状態を明らかにし、DNA等との求核置換反応のエネルギー相関について検討を加え、反応エネルギーと発がん性や突然変異性との関連を調べた。本研究は、種々の多環式芳香族化合物の発がん性と変異性と中間体カルボカチオンの電子構造との関連について、新理論構築につながると考えられる。本年度は、環を4つもつピレン、アズピレン、ジシクロヘプタ[ed,gh]ペンタレン系化合物とベンゾフェナンスレン誘導体、3個から4個もつフルオレン系やスピロフルオレン系、シクロペンタフェナンスレン系化合物から生じるカルボカチオンに関して、電子構造や芳香属性と発がん性との相関関係を核磁気共鳴測定装置および理論化学計算法を用いて調べた。多環式芳香族炭化水素にベンゼン環が縮環するにつれて、陽電荷の非局在化は大きくなるが、新たな環への非局在化はあまり多くなかった。また、5員環構造をもつ場合、陽電荷は5員環部位に多く分布し反芳香属性を持つ傾向があることがわかった。

また、フッ素置換誘導体の芳香属性を検討する場合は、σ環電流が大きいためにπ環電流のみを比較する必要があることがわかった。この結果は、がんの発生を抑制する薬の開発だけではなく、多環式芳香族化合物を用いた電導性材料の開発等、カルボカチオン中間体が関与する機能性材料の開発への応用が期待される。
光エネルギ-の化学的変換のための新規可逆反応系の開発

本年度では初年度で得た、熱異性化の過程で化学励起を起こす高歪化合物の分子設計の指針に基づいて高歪原子価異性系の設計・合成を行なった。特に、化学励起を発光現象に結びつける目的で、生成物が蛍光を発し、しかも、異性化反応の遷移状態から生成物の励起一重項項状態への遷移がエネルギ-的に可能な系の探索を行ない、デュワ-ベンゾフェノン(1)、7,8,9ートリーtーブチルー1,4ーデュワ-ー5,12ーナフタセンキノン(2)、アクリジルデュワ-安息香酸メチル(3)などを合成し、それらの熱的芳香化反応を検討した。いずれの化合物も対応する生成物の励起一重項を与えるに十分な反応熱を示した。1の熱異性化をトランスースチルベン存在下で行なったところシスースチルベンの生成が認められた。シスースチルベンの生成量から、化学励起は0.6%程度と見積もられた。1からの生成物であるベンゾフェノンでは項問交差が速いのでこの値が励起状態生成の総量と考えられるが、励起一重項の生成量を決定するには至っていない。2からの生成物である7,8,9ートリーtーブチルー5,12ーナフタセンキノン(4)の励起一重項はππ^*性であり蛍光を発するので、励起一重項生成が直接観測される可能性があるが、2の熱異性化において4の蛍光の検出には至らなかった。しかし、この反応には、熱的には生成し得ない、ナフタセンキノバレン(5)の生成を伴った。5は4の光照射で得られる。5の光化学的生成は三重項消光剤の影響を受けない。一方、4の蛍光はN,Nージメチルアニリンで消光され、同じ条件で5の生成も消光されることより、5は4の励起一重項からの生成物と考えられ、2の熱的芳香化反応に4の励起一重項を生成する化学励起過程が伴っていることが分かった。3の熱反応では、化学励起は起こらない。これは、デュワ-安息香酸部位とアクリジル基が直交しているためと考えている。
先端的神経ネットワーク解析手法による大脳皮質―大脳基底核ループの構築様式の解明

本研究は、逆行性越シナプストレーサーである狂犬病ウイルス(RV)ベクターと、順行性トレーサーであるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを利用した双方向性多重蛍光トレーシング手法を確立し、線条体における特定の皮質からの入力部位と特定の皮質へ出力する部位を同時に可視化することで、大脳皮質ー大脳基底核ループ回路の入出力様式を明らかにすることを目的とする。まず、1双方向性トレーシング手法に適したAAVベクターとRVベクターの組み合わせの検討について、所属研究室で所持している複数の種類のAAVベクターについて、皮質線条体路の軸索を可視化に適したベクターの検討をラット脳でおこない、最適なベクターを特定した。このベクターは注入後3日程度でラットの皮質脊髄路を十分に可視化できることが分かった。また、2ラットを用いた運動に関連する大脳皮質ー大脳基底核ループの構築様式の解明について、ラットの一次運動野(M1)および二次運動野(M2)と大脳基底核の入出力様式を調べるためには、M1およびM2を同定し、それぞれに異なる蛍光タンパク質を発現するAAVベクターとRVベクターを注入する必要がある。当該年度は、M1およびM2の同定に必要な皮質内微小刺激(ICMS)をおこなうシステムの構築に取り組んだ。さらに3サルを用いた眼球運動に関連する大脳皮質ー大脳基底核ループの構築様式の解明について、上記の双方向性トレーシング手法をマカクザルの眼球運動関連領野(FEF、SEF、LIP)に適用し、これらの領域と大脳基底核の入出力様式を調べる。サル脳では解析する領域の大きさとラベルの数がラット脳よりも膨大になる。当該年度は、機械学習を利用することでこれらを効率的に解析するシステムの開発に取り組んだ。交付申請書の研究の目的および実施計画欄に記載した、双方向性トレーシング手法に適したAAVベクターの開発、ラットを用いた運動に関連する大脳皮質ー大脳基底核ループの構築様式の解明に必要な皮質内微小刺激(ICMS)をおこなうシステムの構築の2項目において当初見込んだ通りの成果を得ている。また、機械学習を利用して逆行性細胞ラベルを効率的に解析するシステムの開発など当初予定通り準備が進んでおり、研究が順調に進展していると考えられるため。研究は当初の予定通り順調に進展していると考えられるため、今後も当初の予定に従い研究を進める。詳細は以下のとおりである。本年度は、皮質線条体路の軸索を可視化に適したベクターの検討をラット脳でおこない、最適なベクターを特定した。このベクターは注入後3日程度でラットの皮質脊髄路を十分に可視化できることが分かったので、この二つのベクターを組み合わせた双方向性多重蛍光トレーシング手法を確立する。また、M1およびM2の同定に必要な皮質内微小刺激(ICMS)をおこなうシステムの構築に取り組んだ。今後は、このICMSを利用してラットのM1およびM2を同定し、1で確立した双方向性トレーシング手法を使用して、M1およびM2と大脳基底核の構成するループ回路の構築様式を解明する。上記に加えて、1で開発した双方向性トレーシング手法をマカクザルの眼球運動関連領野(FEF、SEF、LIP)に適用し、これらの領域と大脳基底核の入出力様式を調べる。

研究は当初の予定通り順調に進展していると考えられるため、今後も当初の予定に従い研究を進める。詳細は以下のとおりである。本年度は、皮質線条体路の軸索を可視化に適したベクターの検討をラット脳でおこない、最適なベクターを特定した。このベクターは注入後3日程度でラットの皮質脊髄路を十分に可視化できることが分かったので、この二つのベクターを組み合わせた双方向性多重蛍光トレーシング手法を確立する。また、M1およびM2の同定に必要な皮質内微小刺激(ICMS)をおこなうシステムの構築に取り組んだ。今後は、このICMSを利用してラットのM1およびM2を同定し、1で確立した双方向性トレーシング手法を使用して、M1およびM2と大脳基底核の構成するループ回路の構築様式を解明する。上記に加えて、1で開発した双方向性トレーシング手法をマカクザルの眼球運動関連領野(FEF、SEF、LIP)に適用し、これらの領域と大脳基底核の入出力様式を調べる。
ステロイド膜受容体の機能解析を中心とした卵成熟・排卵誘導機構の解明

新規ステロイド膜受容体mPRの4種類の遺伝子それぞれについてメダカ点突然変異体3-4系統を選択し、系統を樹立できた。それぞれの表現型解析の結果、mPR遺伝子には冗長性が見られ、一種類の遺伝子では異常を示さないことが明らかになった。さらに二重変異体を作出したが同様に異常は見られなかった。今後、mPRの初の生理機能の証明を目指して3重変異体の作出を目指す。排卵誘導遺伝子については明確な排卵特異的発現を示す、排卵誘導遺伝子候補3遺伝子が選択できた。今後、これらの遺伝子の変異系統を作出し、機能の証明を目指す。本研究は新規ステロイド膜受容体(mPR)を介したシグナル伝達の生理機能についての確証を得ること、さらにその反応が出発点となる排卵誘導に関わる遺伝子群を明らかにすることを目的とする。そこで本研究では近年確立されたTILLING法によりmPR分子の変異個体を作出し、その表現型の解析によりmPR分子の各種組織における生理機能の解明を目指す。また、申請者らの開発したインビボ卵成熟・排卵誘導法により排卵誘導した際に卵巣で引き起こされる遺伝子発現の変動を調べることで排卵誘導遺伝子を解明する。メダカゲノムにはmPRの4種類の遺伝子が存在するが、これまでに3種類の遺伝子α,β,α-2の変異系統を得ていた。25年度は4種類目の遺伝子mPRγについて、HRMスクリーニングを実施し、4系統を選別し、アミノ酸置換となる変異体候補4系統を選択した。これらについてはF3系統のジェノタイピングまで系統樹立を進めた。2重、3重変異体についても交配を進めた。mPRの機能解明についてはmPR安定発現培養細胞株にさらに改変ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞株を樹立し、ステロイドホルモン作用による細胞内cAMP濃度低下をリアルタイムに検出できる系を確立した。この細胞株の樹立によりmPRが抑制性Gタンパク質を介してステロイドホルモンの作用を伝達していることの確証を得た(論文投稿中)。排卵誘導遺伝子群の解明についてはマイクロアレイ解析によりリストアップされた遺伝子群の内、発現変動の大きかった4種類についてリアルタイムPCR(主要設備)による発現解析を実施し、確かに排卵特異的な変化を示すことを検証した。解析試料については新たに自然条件化での変化であることを確かめるため、自然排卵群からの試料調製も行い、同様の遺伝子発現変動を示すことを確かめた。本研究は遺伝子変異メダカを用いて新規ステロイド膜受容体(mPR)を介したシグナル伝達の生理機能についての確証を得ること、さらにその反応が出発点となる排卵誘導に関わる遺伝子群を明らかにすることを目的とする。メダカゲノムにはmPRの4種類の遺伝子が存在するが、昨年度までに4種類の遺伝子α,β,α-2,γの変異系統を得た。26年度はこれら4系統のゲノムクリーニング(目的変異以外の変異を野生型との交配により除く)を進めるとともに、mPRγ系統についてはホモ型を作出し、予備的な表現型解析を行った。他系統と同様、特に異常は見られずmPR遺伝子間には冗長性が見られることが確認できた。そこで様々な組み合わせの2重、3重変異体についても交配を進めた。この成果は論文として投稿し、掲載が受理された。排卵誘導遺伝子群の解明については、文部科学省科学研究費、新学術領域研究「ゲノム支援」に採択され、これまで行ったマイクロアレイ解析に加え、より精度の高いと考えられるRNA-seqによる解析が可能となった。そこでゼブラフィシュ新規排卵誘導法により調製した4種類の試料(未処理、卵成熟誘導2種、排卵誘導)さらに自然条件下での卵成熟誘導群、排卵誘導群からの試料調製も行い、RNAseqにより遺伝子発現解析を行った。その結果、マイクロアレイ解析とRNA-seqのデータの間には大きな相違がみられることが明らかとなった。今後、その原因を精査するとともに個々の候補遺伝子について定量PCRにより発現解析結果の検証を行い真の排卵誘導遺伝子を選択する。メダカゲノムには新規ステロイド膜受容体(mPR)の4種類の遺伝子が存在するが、本研究により4種類全ての点変異系統が樹立できた。さらに、それぞれの遺伝子の変異系統の内、最も表現型の期待される系統どうしを掛け合わせ2重、3重変異体の作出も進めた。3重変異のホモ個体については飼育中に死亡している可能性高く、今のところ作出には成功していない。今後、個別飼育など飼育環境を改善しすると伴に、死亡直前での形態観察、遺伝子型判定のためのゲノムDNA抽出を行うようにして変異との関係を究明していく。26年度にゲノム支援プロジェクトに採択されたことにより、新たにRNA-seqによる発現解析が可能になった。26年から27年にかけて合計4回の発現解析を実施した。驚くべきことにマイクロアレイ解析とRNA-seq解析では発現変動を示す遺伝子の種類が大きく異なっているとの結果であった。

また、RNA-seq解析で統計的に有為な発現変動を示したのは2つの遺伝子のみであった。これらの遺伝子についてリアルタイムPCR(主要設備)による発現解析を実施し、確かに排卵特異的な変化を示すことを検証した。今後、CRISPR/Cas9法によりこれらの遺伝子破壊系統を作出し、排卵誘導遺伝子であるかどうか検証する。新規ステロイド膜受容体mPRの4種類の遺伝子それぞれについてメダカ点突然変異体3-4系統を選択し、系統を樹立できた。それぞれの表現型解析の結果、mPR遺伝子には冗長性が見られ、一種類の遺伝子では異常を示さないことが明らかになった。さらに二重変異体を作出したが同様に異常は見られなかった。今後、mPRの初の生理機能の証明を目指して3重変異体の作出を目指す。排卵誘導遺伝子については明確な排卵特異的発現を示す、排卵誘導遺伝子候補3遺伝子が選択できた。今後、これらの遺伝子の変異系統を作出し、機能の証明を目指す。mPR遺伝子変異メダカ系統の樹立については掛け合わせ、ジェノタイピングによる遺伝子変異の確認と順調に進み、表現型解析に用いることができるF6世代以上までの継代は完了に近づいている。表現型が期待できる多重変異体の作出も開始し、計画通りにメンデルの遺伝法則に従い変異系統が得られている。細胞内cAMP濃度低下をリアルタイムに検出できるセルーベースアッセイ法については論文発表することができた。この培養細胞株を使ったアッセイ法が確立できたことによりmPRが予想通り抑制性Gタンパク質と共役していることが実証されたと言える。最終的にはノックアウトメダカによる表現型解析による証明が必要であるがmPRの機能についての否定的な見解を正す上で大きな意味のある結果であった。一方、「ゲノム支援」事業に採択され、排卵誘導遺伝子を解明するためにRNA-seq解析を実施できた。データの解析は今後の課題であるが重要なデータが得られた。生殖生物学脊椎動物間で保存されているmPRの3種類のサブタイプの内、mPRαとmPRβは比較的相同性が高く、これらには冗長性があると判断され、変異体の表現型を観察するためには多重変異体を作出する必要があると考えられる。実際にこれらを掛け合わせ、2重変異体を作出したが、表現型は見られなかった。メダカにおいてはさらにα遺伝子の重複遺伝子と考えられるmPRα-2遺伝子が存在するため、これらの3重変異体の作出が必要であると考えられる。mPRγについても変異系統を得たので、3重変異体にも変異が見られない場合は最終的に4重変異体の作出も試みる予定である。今後、何らかの変異形質が見られることを期待する。RNA-seqによる遺伝子発現解析の結果、マイクロアレイ解析とRNA-seqのデータの間には大きな相違がみられることが明らかとなった。今後、その原因を精査するとともに個々の候補遺伝子について定量PCRにより発現解析結果の検証を行い真の排卵誘導遺伝子を選択する。RNA-seqのデータについては試料間での誤差があまりみられず、極めて安定性の高いデータである。
新しい多孔質金属錯体の水素貯蔵材料としての研究

水素エネルギー社会の構築には、高効率水素貯蔵技術の確立が必要不可欠である。これまで、水素吸蔵合金、ケミカルハイドライド等各種水素貯蔵材料が検討されてきたが、重量・体積当たりの水素密度が低いこと、リサイクル性、反応速度、分離・回収技術等様々な問題が存在し、これら諸問題を克服するブレークスルーが期待されている。本研究では、細孔制御しやすく、水素等の小分子を吸蔵できる可能性が高い多孔質金属錯体高分子の持つ優れた性質に着目し、高性能可逆的水素貯蔵技術の確立を目的としている。6-イソキノリンカルボン酸(L^2)配位子を用いて、水素などの気体貯蔵性能を有する新規多孔性錯体高分子の設計と構築を試みた。水系溶媒中において、一連の低次元配位種のみが形成され、これは、金属センター周囲の配位サイトが水分子によって占有されたものと考えられる。この知見に基づき、水系溶媒をDMFに変え、硝酸銅と(HL^2)との反応により、新規層状錯体高分子{[Cu(L^2)_2]・(DMF)_2}_nの構築に成功した。本錯体は[Cu_2(COO)_4]2次構造基本単位は架橋配位子L^2によって連結され、末端配位子を両側に持つ層状フレームワークを形成する。さらに、このような配位層は末端配位子の層間芳香性スタッキング効果により集積し、[001],[011],と[011]方向に1次元チャンネルを持つ3次元多孔質結晶を形成する。BET表面積は33.2m^2/gであり、恒久多孔性を示す。本多孔質錯体は水素貯材料としての可能性を持つ。また、2-メルカプトニコチン酸(HL^3)(HL^3)と硝酸銅(II)をDMF/メタノール中で反応させると、新規な6核錯体[Cu(L^4)]_6・(H_2O)_2が形成される。この反応において、陰イオン性配位子、2-チオレート-N,N'-ジメチルニコチンアミド配位子、のin situ形成と銅(II)から銅(I)への還元が観測された。単結晶X線構造解析の結果、本錯体においては、それぞれの銅(I)センターは3つの独立したL^4配位子からの2つのチオレートと1つのピリジル配位子によって三角形を形成する。結果として、6つのCu^Iイオンは6つのμ_3-L^4の架橋によって6核のクラスターを形成する。これらの錯体についてガス吸着特性について検討を行った。硝酸銅、硝酸ニッケルや硝酸亜鉛などと配位子であるイソキノリン-3-カルボン酸(HL)を出発物として用いて、新規金属錯体{[Cu(μ-L)_2]・(H_2O)_4}_n(1),[Ni(L)_2(CH_3OH)_2](2),and[Zn(L)_2(H_2O)_2]・(H_2O)_2(3)を合成した。単結晶X線構造解析を行った結果、錯体1はCu^<II>イオンがカルボキシレートによって連結された1次元鎖配位高分子であり、錯体2と3は単核の金属錯体である。いずれの錯体においても、水素結合による超分子ネットワークが形成されている。特に、錯体1において、[100]方向にエッジを共有し、フレームワークによって安定化された四量体の水分子ユニットによって形成された1次元水のネットワークが観測された。結晶構造解析に加え、これらの錯体について各種分光法による解析を行い、安定性などについての評価を行った。ゲスト分子の脱離や、ガス吸着特性について検討を行った。

本錯体は[Cu_2(COO)_4]2次構造基本単位は架橋配位子L^2によって連結され、末端配位子を両側に持つ層状フレームワークを形成する。さらに、このような配位層は末端配位子の層間芳香性スタッキング効果により集積し、[001],[011],と[011]方向に1次元チャンネルを持つ3次元多孔質結晶を形成する。BET表面積は33.2m^2/gであり、恒久多孔性を示す。本多孔質錯体は水素貯材料としての可能性を持つ。また、2-メルカプトニコチン酸(HL^3)(HL^3)と硝酸銅(II)をDMF/メタノール中で反応させると、新規な6核錯体[Cu(L^4)]_6・(H_2O)_2が形成される。この反応において、陰イオン性配位子、2-チオレート-N,N'-ジメチルニコチンアミド配位子、のin situ形成と銅(II)から銅(I)への還元が観測された。単結晶X線構造解析の結果、本錯体においては、それぞれの銅(I)センターは3つの独立したL^4配位子からの2つのチオレートと1つのピリジル配位子によって三角形を形成する。結果として、6つのCu^Iイオンは6つのμ_3-L^4の架橋によって6核のクラスターを形成する。これらの錯体についてガス吸着特性について検討を行った。
心的外傷後ストレス障害における脂肪酸結合タンパク質とドパミン受容体の役割

脂肪酸結合タンパク質3 (FABP3)と心的外傷後ストレス障害(PTSD)との関連についての研究成果を共著者として学術論文を投稿し、国際学術誌Molecular Neurobiology誌へ掲載された。マウスへ電気刺激を与えると、恐怖記憶としてその情報が固定される。その後電気刺激を与えずに同じ環境へ野生型マウスを曝露し続けると、次第に恐怖記憶が消去されていく。一方FABP3欠損マウスではこの消去が起こらず、電気刺激後1か月経過しても恐怖記憶が保持されていた。すなわち、FABP3欠損マウスはPTSD様の表現型を示した。FABP3欠損マウスに対し、既存の睡眠薬でありメラトニン受容体のアゴニストであるラメルテオンを投与すると恐怖記憶の消去が促進された。ラメルテオンの改善効果における神経メカニズムとして、前帯状皮質および扁桃体の異常な神経活動の正常化を明らかにした。これらの脳領域における神経活動異常はPTSD患者においても報告されている。本研究により、PTSDモデルマウスとしてのFABP3欠損マウスの有用性と、治療薬としてのラメルテオンの有効性が示唆された。一方、FABP3とドパミンD2受容体(D2R)の相互作用がPTSDにおいてどのような役割を果たしているかは不明である。D2R欠損マウスでは不安行動の亢進が認められるが、共同研究者である東北医科薬科大学の山本由以博士は、FABP3欠損マウスも同様に不安行動が亢進すること、そのメカニズムとして前帯状皮質におけるGABA神経活動の亢進が関与することを明らかにした。従って今後、前帯状皮質におけるFABP3とD2Rの機能的役割について明らかにする必要がある。当初の目的であったD2R欠損マウスにおける恐怖記憶については本年度中に終了することができなかったため、次年度に継続して行う。一方、FABP3欠損マウスがPTSD様の恐怖記憶障害を示すことを見出し、その研究成果が本年度に国際学術誌へ掲載された。また、FABP3欠損マウスにおける恐怖記憶や不安などの情動行動において、前帯状皮質における神経活動が関与していることも共同研究者により発表された。本年度の研究により、FABP3が恐怖記憶に関与すること、そこに関与する脳領域として前帯状皮質が重要であることが示唆された。よって次年度はD2R欠損マウスの行動表現型のみならず、前帯状皮質におけるFABP3とD2Rの機能についても解析を進めたい。本年度に引き続き、D2R欠損マウスにおける恐怖記憶についての行動表現型の解析を進め、FABP3欠損マウスで認められるPTSD様の行動障害にD2Rが関与しているか明らかにする。また、前帯状皮質などのPTSDに関与する脳領域の神経活動やシグナルの変化を明らかにする。特に、FABP3欠損マウスでは前帯状皮質におけるGABA神経の異常が不安亢進に関与することが明らかとなったが、GABA神経系において具体的にどのような分子の変動が関与しているかは不明である。従って今後、FABP3欠損マウスやD2R欠損マウスにおける脳網羅的な遺伝子解析を行い、PTSD発症の神経メカニズムに関与する分子を明らかにしたい。

よって次年度はD2R欠損マウスの行動表現型のみならず、前帯状皮質におけるFABP3とD2Rの機能についても解析を進めたい。本年度に引き続き、D2R欠損マウスにおける恐怖記憶についての行動表現型の解析を進め、FABP3欠損マウスで認められるPTSD様の行動障害にD2Rが関与しているか明らかにする。また、前帯状皮質などのPTSDに関与する脳領域の神経活動やシグナルの変化を明らかにする。特に、FABP3欠損マウスでは前帯状皮質におけるGABA神経の異常が不安亢進に関与することが明らかとなったが、GABA神経系において具体的にどのような分子の変動が関与しているかは不明である。従って今後、FABP3欠損マウスやD2R欠損マウスにおける脳網羅的な遺伝子解析を行い、PTSD発症の神経メカニズムに関与する分子を明らかにしたい。
ミクシの理念を礎とした小学校英語ウェブ内在型ブレンディッドラーニング体系の構築

本研究では、小学校における英語教育の将来的な教科化へのシフトを見据え、そこに派生するであろう様々な問題点を洗い出すとともに、英語教育を専門としない小学校教員の科目担当に関わる負担軽減を促す意図からブレンディッドラーニング(BL)用教材の体系構築を推進した。ただし、単なるBL教材としての体系構築ではなく、生徒たちの「英語」という異質な言語への「気づき」を促したい意図から、フィンランドの教育、とりわけ初等教育で重視されているMIKSI(なぜ)の理念を拠り所として、教材開発を行いながら体系構築を行った。平成26年度前半にあっては、まず国内外の初等教育における英語教育としてのBlended Learning(以下、BL)の実際を明らかにするために、文献研究(Webリポートを含む)およびフィールドワークの両面から調査を行った。その結果、国内にあっては「小学校英語」において何らかの形でeラーニングを導入している学校が多く存在していることが明らかとなったが、同時に対面授業の補完としてeラーニングが組み込まれる形態が多いことも鮮明化し、その結果として、時に相互が独立した学習形態であるかのように解されるスタイルが定着し、いわゆる学習者に対する「躓きへの配慮」不足が露呈することとなった。その一方で、国外調査の一貫から訪問したフィリピンのマニラ市内にあるRosario Elementary SchoolやDe Castro Elemantary Schoolなどでの英語授業では、eラーニングをスタート台にして廊下などでの対面方式を利用してグループ学習を促し、いわゆる協働学習を推進するなど、BLの実質化が図られている点が興味深く見て取れた。その公用語としての英語の位置づけが為せる業と見なせなくもないが、一連の対面授業とeラーニングの連鎖を欠きがちな我が国の実情に対する大いなる示唆を得た思いであった。年度後半では、前述した参考知見を礎とし、担当する授業(共通教育としての英語)においてeラーニング教材を導入したところのBLを実施した。大学授業での実施という点では些か研究テーマから逸脱するよう思われるが、BLを推進していくにあたっての問題点を把握する意味では極めて有効な実験となった。また既成のeラーニング教材が、BLとしての授業に耐えるにはどのようなシステム上の解へと導く連鎖工夫が必要かなども判明し、次年度における小学校英語BL用ウェブ教材の試作への大きな手がかりを得ることができた。平成27年度においては、前年度の国内外の小学校英語教育現場における実態調査研究および文献研究で得た課題、すなわち旧来的な対面学習の補完としてのeラーニングに関わる非効率性を明らかにした。そして、その問題解決の一途として、ブレンディッドラーニング(BL)用英語学習教材の試作開発を行った。このBL教材にあっては、研究の最終年度(平成28年度)に開発を試みる小学校英語ウェブ内在型BL教材の試行的な位置づけにあったため、とりわけ筆者が日々直接関わる大学生を対象にTOEIC学習場面を設定して開発着手し、同時に実践場面分析を行った。システムプラットフォームの最大の特長としては、間違えた問題を苦手項目として自動抽出し、自動繰り返し機能により学習内容の定着を図れるよう配慮した点である。一定の実験を通して、本BL教材の有効性を得点上昇という形で検証するに至り、次年度への研究の弾みとすることができた。ただし、小学校英語段階へ下ろしたBL体系の構築が最終目標となるため、小学校英語にあっては、得点上昇という要素を直接的な達成目標としない点、また早期英語教育段階としての小学生に対してはかなりの度合いで興味関心を引く工夫としてのクイズ形式およびビジュアライズ対応などが求められる点、などを踏まえると、さらなる教材開発の検討の余地を残すこととなった。本年度の研究段階では、とりあえず紙媒体教材とeラーニング教材を独立させた形での試作開発となったが、最終的には両者の機能をウェブ内に一括包含させる意図を本研究が有していることから、平成27年度の研究の終盤は専ら、ウェブ学習教材にいかに理想的に学習項目素材の配置・配列を施し、そして「誤り」から「気付き」へのプロセスを辿れるかに特化して研究を行った。前段階として取り組んだ大学生を対象としたウェブ内在型英語ラーニング体系の構築に関しては比較的スムースに進捗したが、小学校英語ヴァージョンとして体系化を図るためには、予算枠との絡みも関係し、どうしても語彙習得の部分に特化せねばならない点が浮き彫りとなった。そこで、全体の研究の枠組みを狭める工夫が求められることとなり、当初より研究の遅れをとっているところである。ただし、当初計画からみると僅かな遅れにしかすぎないため、今後の研究にあっての支障は何ら生じてはいない。平成28年度は3ヵ年間の研究期間の最終年度であったことから、その研究内容は、研究の最終目的となる小学校英語に応用可能な「ウェブ内在型ブレンディッドラーニング体系の構築」を主眼とした。特に、フィンランドの教育のコア思想とも言える「MIKSI」(=Why)の発想をどのような形で学習教材に反映させるかがその焦点となった。そこで、eラーニング教材においての問いに誤答した場合にはオーラルリサーチの一貫からフィールドワークを通して正答へとたどり着くアクティブラーニング型の学習システムの併用を旨とした学習体系の確立に力点を置くこととした。すなわち、「誤答した場合には正しい理解を伴った正答へのステップ」をキーコンセプトとし、デジタル学習とアナログ学習の協調学習を本最終年度研究の主軸におき、Listening/Speakingの関係においてサンプルユニットプランを構築することとした。同時に語彙学習教材にあっても1970年代に米国の研究者であるMoskowitzが開発したHumanistic Techniquesの理念を参考に、同じくアクティブラーニングによる語彙学習を帰納的な形で促す手法を探索した。