hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒストンH3バリアントとその相互作用因子によるクロマチン形成機構の解析

本研究の目的は、ヒストンH3のバリアントやそれらと相互作用する因子群を、生化学的および構造生物学的手法を用いて解析し、H3バリアントおよびそれらの相互作用因子群によるクロマチン構造形成のメカニズムを明らかにすることである。これまでに、ヒト由来のH3について、8つのバリアントが報告されているが、それらのクロマチン形成に関する詳細な役割は未だ明らかにされていない。そこで、H3バリアントの生体内における特異的な機能発現は、それぞれの相互作用因子群によってなされていると考え、H3バリアントと相互作用する因子群を、リコンビナントヒストンを用いたプロテオーム解析法により探索した。その結果、新規ピストン相互作用因子としてヒトSPT2を同定した。ヒトSPT2は出芽酵母の転写因子SPT2と共通するSpt2ドメインを有するタンパク質であるが、機能未知のタンパク質であった。そこで、SPT2の機能解析を行うために、リコンビナントタンパク質として精製したヒトSPT2を用いた生化学的解析を行った。その結果、精製したヒトSPT2はコアヒストンと直接相互作用し、ヌクレオソームの形成を促進した。また、ヒトSPT2はDNAとも直接結合し、特に分岐したDNA基質に優先的に結合した。さらに、HeLa細胞を用いた免疫染色実験を行い、SPT2の局在解析を行った。その結果、SPT2は核小体領域に局在し、特にrRNAの転写を行うRNAポリメラーゼIと共局在した。次に、SPT2の生体内での機能を解析するために、SPT2欠損ニワトリDT40細胞を樹立し、細胞生物学的解析を行った。その結果、SPT2欠損細胞がRNAポリメラーゼIの阻害剤に対して著しく感受性を示した。以上の結果から、新規ヒストン相互作用因子として同定したSPT2が、これまで不明な点が多かった核小体領域のクロマチンのダイナミクスに関与することが考えられた。真確生物のゲノムDNAは、ヌクレオソームを基本単位としたクロマチンとよばれる高次構造体として核内に収納されている。ヌクレオソームの構成因子であるヒストンには、バリアントが存在することが知られている。このうち、H3バリアントは、生体内でそれぞれ異なる染色体領域に局在し、特異的な機能を果たしていると考えられている。しかし、H3バリアントのクロマチン形成における詳細な役割は未だ明らかにされていない。そこで、H3バリアントの生体内における機能発現は、それぞれ特異的な相互作用因子群によってなされていると考え、本年、申請者は、ヒト由来のH3バリアント/H4複合体をリコンビナントタンパク質として精製し、HeLa細胞抽出液を用いて、新規ヒストン結合因子およびH3バリアント相互作用因子群のプロテオーム解析を行った。プロテオーム解析の結果、H3バリアントと相互作用する因子の候補が、3404種類得られた。さらに、相互作用因子の候補から、NASP(Nuclear Autoantigenic Sperm Protein)を同定した。NASPは、これまでにヒストンと結合することが報告されているものの、その詳細な機能は明らかにされていなかった。そこで、申請者は、すべての体細胞での発現が確認されているsomatic NASP(sNASP)をリコンビナントタンパク質として発現させ、高純度に精製する系を確立した。精製タンパク質を用いた生化学的解析から、sNASPはすべてのH3バリアントと相互作用すること、そしてsNASPがヌクレオソームの形成を促進するヒストンシャペロン活性を有すること、さらに、その活性は,H3バリアントによって大きく異なることを明らかにした。また、欠失変異体を用いた生化学的解析から、sNASPのヒストンシャペロン活性に重要なドメインを同定した。これらの成果は、申請者が第一著者としてJournal of Biological Chemistryに受理され、4月に掲載される予定である(in press,2010)。本研究の目的は、ヌクレオソームの構成因子であるヒストンH3のバリアントやそれらと相互作用する因子群を、生化学的および構造生物学的手法を用いて解析し、H3バリアントおよび相互作用因子群によるクロマチン構造形成のメカニズムを明らかにすることである。申請者はこれまでに、H3バリアント相互作用因子群を同定する為に、プロテオーム解析を行い、H3バリアント相互作用因子としてNASP(Nuclear Autoantigenic Sperm Protein)を同定した。NASPは、これまでの報告から細胞周期の移行やDNA複製に重要な因子であると考えられている。そこで、NASPの詳細な機能を解析する為に、申請者はすべての体細胞での発現が確認されているアイソフォームであるsomatic NASP (sNASP)をリコンビナントタンパク質として高純度に精製を行い、生化学的解析を行った。その結果、sNASPはコアヒストンに直接結合し、ヌクレオソームの形成を促進する活性を有することが明らかになった。さらに、これらの活性はH3バリアントによって大きく異なることが明らかになった。これらを含めた成果は、申請者が第一著者としてJournal of Biological Chemistryに掲載された。また、精巣での高発現が確認されているものの、機能未知なH3バリアントであるH3Tを含むヌクレオソームを、試験管内で再構成した。再構成したH3Tヌクレオソームを用いた生化学的解析の結果、H3Tヌクレオソームは通常のヌクレオソームに比べて著しく不安定であることがわかった。さらに、H3Tを含むヌクレオソームの結晶化を行い、得られた結晶からX線結晶構造解析を行うことに成功した。これらの成果は、申請者が共著者としてProceedings of the National Academy of Sciencesに掲載された。

本研究の目的は、ヒストンH3のバリアントやそれらと相互作用する因子群を、生化学的および構造生物学的手法を用いて解析し、H3バリアントおよびそれらの相互作用因子群によるクロマチン構造形成のメカニズムを明らかにすることである。これまでに、ヒト由来のH3について、8つのバリアントが報告されているが、それらのクロマチン形成に関する詳細な役割は未だ明らかにされていない。そこで、H3バリアントの生体内における特異的な機能発現は、それぞれの相互作用因子群によってなされていると考え、H3バリアントと相互作用する因子群を、リコンビナントヒストンを用いたプロテオーム解析法により探索した。その結果、新規ピストン相互作用因子としてヒトSPT2を同定した。ヒトSPT2は出芽酵母の転写因子SPT2と共通するSpt2ドメインを有するタンパク質であるが、機能未知のタンパク質であった。そこで、SPT2の機能解析を行うために、リコンビナントタンパク質として精製したヒトSPT2を用いた生化学的解析を行った。その結果、精製したヒトSPT2はコアヒストンと直接相互作用し、ヌクレオソームの形成を促進した。また、ヒトSPT2はDNAとも直接結合し、特に分岐したDNA基質に優先的に結合した。さらに、HeLa細胞を用いた免疫染色実験を行い、SPT2の局在解析を行った。その結果、SPT2は核小体領域に局在し、特にrRNAの転写を行うRNAポリメラーゼIと共局在した。次に、SPT2の生体内での機能を解析するために、SPT2欠損ニワトリDT40細胞を樹立し、細胞生物学的解析を行った。その結果、SPT2欠損細胞がRNAポリメラーゼIの阻害剤に対して著しく感受性を示した。以上の結果から、新規ヒストン相互作用因子として同定したSPT2が、これまで不明な点が多かった核小体領域のクロマチンのダイナミクスに関与することが考えられた。
新規GLUT4結合蛋白による新たなインスリン依存性糖取り込み調節機構の解明

GLUT4のリサイクリング・トランスロケーション調節に関与すると予想される"GLUT4結合蛋白"のスクリーニングから始まった研究で、蛋白-蛋白結合に関与する"ANK構造"をもつ蛋白p61と、"GPIアンカー"蛋白p69が同定された。これらを3T3-L1脂肪細胞に過剰発現させると、インスリン依存性糖取り込みが促進すること等も明らかとなり、p61・p69のさらなる機能解析を進めている。3T3-L1脂肪細胞の免疫組織化学・共焦点顕微鏡観察では、p61は主に細胞質内に、p69は細胞膜上に存在し、いずれも部分的にGLUT4と共存していたが、p61・p69ともにインスリン刺激後の明らかな細胞内局在変化は認められなかった。p61を過剰発現すると、コントロールに比較してインスリン刺激15分後の細胞膜上GLUT4蛋白の発現量増加を認め、インスリン刺激除去後にも細胞膜上GLUT4蛋白発現量増加は持続していた。すなわち、p61過剰発現はGLUT4エンドサイトーシスに影響する可能性が示唆された。一方、p69を過剰発現すると、コントロールと比べてインスリン刺激後の細胞膜上GLUT4蛋白発現量に明らかな差はなかったが、Triton非可溶化"ラフト分画"のGLUT4蛋白発現量は増加していた。すなわち、p69は細胞膜上のアクティブサイトと想定されている"ラフト"にGLUT4を留め置く蛋白質である可能性が考えられた。また、肥満・インスリン抵抗性モデルマウスの精巣周囲脂肪細胞の解析では、p61・p69いずれもコントロールマウスに比べ発現量が低下していた。興味深いことに、インスリン抵抗性改善薬のピオグリタゾン投与により、p61蛋白発現量は改善した。以上より、p61とp69は異なる機序で細胞膜上のGLUT4蛋白発現量に影響し、インスリン依存性糖取り込みを調整する新たな分子である可能性が考えられた。また、これら蛋白質の発現量変化がインスリン抵抗性に関与する可能性も示唆された。さらに解析を継続中である。GLUT4のリサイクリング・トランスロケーション調節に関与すると予想される“GLUT4結合蛋白"のスクリーニングから始まった研究で、蛋白-蛋白結合に関与する“ANK構造"蛋白p61と、GPIアンカー蛋白p69が同定された。これらを3T3-L1脂肪細胞に強制発現させると、インスリン依存性糖取り込みが促進すること等も明らかとなり、p61・p69のさらなる機能解析を進めている。3T3-L1脂肪細胞の免疫組織化学・共焦点顕微鏡観察で、p61は細胞質内に、p69は細胞膜上に存在し、いずれも部分的にGLUT4と共存した。なお、p61・p69ともにインスリン刺激後の局在変化は明らかではなかった。次に、p61・p69とGLUT4とが各々どの部位で結合するかを検証するため、種々変異体発現ベクターを作製し、酵母two-hybridシステムへ再構築を行い、各変異体での結合の有無を検討している。一方、3T3-L1脂肪細胞を膜分画(Triton可溶化+非可溶化“ラフト"分画)、細胞質分画等に分画化し、ウエスタン解析を行ったところ、p69はラフト分画に存在した。インスリン刺激後は、ラフト分画のGLUT4発現量も増加していた。したがって、p69がラフト分画のGLUT4発現量を調節している可能性を考え、p69過剰発現(あるいはノックダウン)細胞で、各分画のp69とGLUT4蛋白発現量の検討を進めている。また、3T3-L1脂肪細胞p61をノックダウンすると、インスリン依存性糖取り込みが減弱した。同様の実験をp69でも行えるように試みている。さらに、インスリン抵抗性状態を示唆する高グルコース・高インスリン条件下で3T3-L1脂肪細胞を培養すると、p61発現量が減少することが、mRNAや蛋白質レベルで確認された。同様の検討をp69においても進めていて、肥満・インスリン抵抗性モデルマウスにおいて、p61・p69発現変化が起こるか否かも解析中である。

また、肥満・インスリン抵抗性モデルマウスの精巣周囲脂肪細胞の解析では、p61・p69いずれもコントロールマウスに比べ発現量が低下していた。興味深いことに、インスリン抵抗性改善薬のピオグリタゾン投与により、p61蛋白発現量は改善した。以上より、p61とp69は異なる機序で細胞膜上のGLUT4蛋白発現量に影響し、インスリン依存性糖取り込みを調整する新たな分子である可能性が考えられた。また、これら蛋白質の発現量変化がインスリン抵抗性に関与する可能性も示唆された。さらに解析を継続中である。
位相幾何学に現われる数理物理と数式処理の研究

平成7年度一般(C)位相幾何学に現われる数理物理と数式処理の研究の、研究実績内容は各分担について以下の通りである。(1)山口:最近話題となっているゲージ理論等で現われる接続のモジュライに関連した、Configuration-空間のトポロジーを研究した。とくに、(種数0の)リーマン球S^2上の自己正則写像の作る空間Hol_d(S^2,S^2)のホモトピー型に関する研究結果を論文に発表した。さらに以前に、Arnold達によって研究されてきた、重複度がn未満の複素数係数の多項式のなす空間のトポロジーが、S^2から複素射影空間への正則写像の作るHol_d(S^2,CP^<n-1>)にホモトピカルに密接に関連することを研究した。(これに関しては論文準備中である。)また、この応用としてVssiliev達が研究している特異点関連の分野や、またその数式処理についても研究した。(2)水野:代数曲線及び代数曲面から導かれる誤り訂正符号について、その構成、性能評価、その復号のアルゴリズムの研究を担当した。またグラフ理論においては有向対称グラフの被覆について、その同型類の個数を決定と特性多項式の構造を研究した。(3)吉岡:基点が有限個で、断面種数がデルタ種数より大きい偏極が与える有理写像が2対1の偏極多様体になるものでデルタ種数が5となるものについての(3次元以上の)、分類および構成について研究した。(4)安香:上記研究に関連したリーマン幾何学に関する話題についての研究を分担した。(5)大久保:常微分方程式の研究と、それに関連した数式処理の研究を担当した。(6)小島:保型形式の解析的研究および整数論へのその応用について研究を行った。
音楽演奏における感性情報の抽出と分析

ある一定水準以上の音楽の演奏を聴取したときの演奏に対する良さの評価(好み)は聴取者によって大きくばらつくことがしばしばある。このことは演奏のさまざまな側面に対する評価が聴取者によって異なるからであろう。音楽の心理的な評価は表現語対を用いて行われることが多いが、表現語対は主観的なものから客観的なものまで幅が広い。そこで演奏の印象表現語の客観性の階層構造(主観的-客観的)を調べた。その結果によれば、「好ましい」「幻想的な」「しゃれた」「暖かい」等が、最も主観的で、「テンポが速い」「響きが多い」「ゆれが多い」等が最も客観的であった。また、聴取者によって演奏の良さの評価は異なるが、聴取者は平均的には、かなり客観的な指標である、「響きの多さ」「テンポ感」「ゆれの大きさ」のそれぞれに対して異なった重みを掛けて演奏の良さを判断していることが示された。聴取者が感じ取る演奏者の演奏意図の伝達においては、聴覚だけでなく視覚的な要素も強く影響していると考えられる。そこで、身体の動きの多い打楽器を用い、プロの打楽器演奏者1名が、多様な解釈の可能な打楽器の曲を、「寂しげに」「楽しげに」「あっさりと」「勢いのある」「重々しく」その他の演奏意図で演奏し、14名の聴取者に対する演奏意図の伝達に関する心理実験を行った。その結果、聴取者が聴覚単独で判断した場合は、平均伝達度は65.6点(100点満点として)であったが、視覚単独では62.0点となった。しかし視聴覚情報を同時に与えると、伝達度は全体的に上昇し、平均伝達度も73.0点と大幅に上昇した。この結果は、演奏の印象に聴覚情報だけでなく視覚情報も重要な役割を果たしていることを示している。
片側発症一卵性双生児の網羅的ゲノム解析による胆道閉鎖症の遺伝的素因の解明

大阪大学のヒトゲノム研究審査を申請し、2018年12月に承認され予定していた3組の一卵性双生児とその保護者に研究内容を説明し同意を得た。同意を得た後に、それぞれの双胎から血液を採取し、PSS社のMagDEA Dx SVを使用してDNAを抽出し、大阪大学微生物病研究所に提出した。1組の解析結果は大阪大学微生物病研究所からすでに却ってきたため、胆道閉鎖症の発生に関与する遺伝子の有無について絞り込みをすすめている。残り2組の検体の解析結果を待機中であるまた、ホルマリン固定胆管組織中の胆管上皮細胞からDNAを抽出するための予備実験として、QIAGEN社のGene Read DNA FFPE Kitを使用して条件検討を行っている。さらに乾燥ろ紙血からのDNA抽出の予備実験として、QIAGEN社のDNA Micro Kitを使用して条件検討を行っている。患者家族からの同意取得、双胎からの血液検体の採取・配列解析提出は当初の実験計画通りに進行している。肝門部空腸術時の摘出胆道組織も回収できているが、組織中の胆管上皮細胞より特異的に抽出した遺伝子の配列を解析することにしたため、エクソーム解析に耐える質と量のゲノム遺伝子を採取する条件について検討中である。また乾燥濾紙血よりの良質な核酸の抽出法に関しても同時に検討している。すでに提出済みの血液検体に関しては、結果が揃い次第、双胎間のゲノム配列の相違を解析する。また胆管上皮細胞、乾燥濾紙血より高品質・必要容量のゲノムDNAが抽出できつつあり、条件検討が済み次第、患者検体を用いた解析を行う。また他施設で診療している一卵性双生児の胆道閉鎖症患者の特定を進めており、特定でき次第、多施設共同研究として、患者及び患者家族から同意を取得し、検体の採取・解析を開始する。対象外来患者の血液検体を全エクソーム解析に提出済みだが、一部支払い請求は2019年度に行われる予定である。また胆管上皮細胞及び乾燥濾紙血より採取したDNAの解析に関しては、DNAの抽出条件を検討中であり、実際に得られている検体の解析は今年度以降行う予定にしている。実験法、解析法について海外の施設との打ち合わせを計画していたが、検討会は2019年度以降に行うこととなったため旅費の申請も今後行う予定である。
高次高調波発生による高繰り返しの極端紫外光源の開発およびその応用

本研究では、赤外のレーザー光の高調波を発生することにより、高繰り返しの真空紫外光源の開発を目的とした。その際、真空紫外光発生に適した非線形光学結晶である、KBe_2BO_3F_2(KBBF)と呼ばれる結晶を入手できたので、それを用いて波長変換を行うことにした。具体的な方針としては、イッテルビウムをドープしたファイバーによる近赤外波長域でのレーザーシステムを開発し、それをLiB_3O_5(LBO)結晶およびKBBF結晶を用いて数回に分けて波長変換を行うことで、最終的に7次の高調波の発生を目指すことにした。まずはレーザーシステムの開発を行い、オシレーターおよび増幅システムの出力として、平均出力7Wで、中心波長1074nm、幅20psのパルスを33MHzの繰り返しで得ることができた。これをLBO結晶に集光することにより、第二高調波発生によって二倍波(537nm)を3.6Wの出力で得た。この二倍波と基本波の残りとを別のLBO結晶に集光して波長変換を行い、三倍波(358nm)を1Wの出力で得た。次にこの三倍波をKBBF結晶に集光し、三倍波の第二高調波発生で元の光の6倍波(179mn)を出力1mWで得た。なお、6倍波は空気中の酸素によって吸収されてしまう波長域にあるので、KBBF結晶を密閉容器に入れ、窒素で満たした環境で波長変換を行った。最後に、この6倍波を基本波と重ねて別のKBBF結晶に集光し、7倍波の発生を試みた。その際、チョッパーを用いて基本波に変調をかけ、基本波に感度のない紫外光用光電管を用いてロックイン検出を行った。その結果、波長153.4nmの真空紫外光である、7倍波の発生を確認することができた。検出器の特性や用いたフィルターの透過特性などから、発生した7倍波の出力は1nW程度と見積もられる。なお、この結果はOptics Letters誌に投稿し、受理された。
骨芽細胞における核小体型副甲状腺ホルモン関連ペプチドの新規作用

平成20年度は核小体型PTHrP cDNAを組み込んだtypeI collagen promoterenhancercassetteを受精卵にmicroinjectionしてトランスジェニックマウスを作製した。さらに、核小体型PTHrPに対して分泌型の正常PTHrPを過剰産生するトランスジェニックマウスもコントロール実験として同時に作製している。その結果、我々の予想に反して、核小体型PTHrPトランスジェニックマウスではダイナミックな組織異常を観察することができなかったことから、核小体型PTHrPは軟骨細胞(前々年度に報告)と骨芽細胞に対する作用が異なる可能性が示唆された。一方、分泌型PTHrPを骨芽細胞に過剰発現させた場合は新生仔は死産となり、組織解析を行うと軟骨が伸張する一方で軟骨内骨化が阻害されていること、さらには一部の軟骨原器が異常拡大していることが明らかとなった。原因として皮質骨や僅かに形成される骨梁の骨芽細胞から過剰量のPTHrPが産生されて、軟骨細胞の受容体に作用したと考えられる。この表現系についても我々の予想を超えており、従来、パラクライン的に作用すると考えられてきたPTHrPが、比較的離れた部位に影響を及ぼすことが明らかとなった。現在、核小体型PTHrPトランスジェニックマウスでの微細構造学的異常、および骨芽細胞系細胞の分化異常がないか検索していると共に、副産物的に得られた分泌型PTHrPトランスジェニックマウスにおける軟骨伸張の分子細胞メカニズムを引き続き解析している。
シェーグレン症候群発症の分子免疫学的解析と制御

本研究では、ムスカリン作働性アセチルコリン受容体3(M3R)に対する免疫応答がシェーグレン症候群(SS)の発症に関わっているか否かを明らかにする事を目的とした。その結果、1)M3R反応性Th1細胞よびTh17細胞が、SS類似の自己免疫性唾液腺炎を誘導すること、2)M3R自己抗原のT細胞エピトープがN1領域と第一細胞外ドメイン領域に存在すること、3)アナログペプチド(N1APL7)によりMISが抑制されること、を明らかにした。以上の結果から、SSの発症にM3R反応性Th1およびTh17細胞が関わり、その標的分子のAPLによりSSを抗原特異的に治療する戦略の開発が可能であることが示唆された。免疫難病の一つであるシェーグレン症候群(SS)の発症機序に、唾液腺に浸潤した自己反応性T細胞が重要な役割を果たしている。特に、ムスカリン作働性アセチルコリン受容体M3(M3R)に対するT細胞は慢性炎症および唾液腺破壊に関わっている。本研究では、1)M3R分子を標的とした免疫応答がシェーグレン症候群様の自己免疫性唾液腺炎を誘導するか否か、2)発症機構に関わるサイトカインは何か?3)抗原特異的な自己免疫性唾液腺炎の制御が可能か否か、を検討する事を目的とした。結果として、1)M3R-/-マウスにM3Rペプチドを免疫した後、その脾臓CD3+T細胞をRag-1-/-マウスに細胞移入することにより、SS様唾液腺炎を認めた(M3R induced sialadenitis, MIS)。このことから、M3R反応性T細胞が自己免疫性唾液腺炎発症に関わっている事を証明した。2)M3R-/-xIFN-γ-/-マウスおよびM3R-/-xIL-17-/-マウスを用いた解析により、MIS発症にIFN-γおよびIL-17がともに重要であることが判明した。3)M3Rの主要T細胞エピトープはN1と細胞外第一ドメインにあり、in vitroで選択したアナログペプチド(APL)のなかで、N1領域のAPL7(AA15S→N)投与によりMISがin vivoで抑制された。本研究成果より、SS様自己免疫性唾液腺炎は、M3R反応性Th1細胞およびTh17細胞により誘導され、N1領域のAPLにより抗原特異的に制御することが可能であることが示された。シェーグレン症候群発症(SS)の分子機構を明らかし、病因に関わる免疫細胞や免疫分子をターゲットとした新規治療戦略を開発することを目的とした。H24年度は、SSのモデルとして新規に開発した自己免疫性唾液腺炎(ムスカリン作働性アセチルコリン受容体3(M3R)誘導唾液腺炎、MIS)マウスおよびRORγtトランスジェニックマウスを用いて、以下の研究成果を得た。1) M3R-/-xIFNγ-/-マウスにM3Rを免疫し、その脾細胞をRag1-/-マウスに移入した結果、有意な唾液腺炎の改善が見られた。この事は、IFN-γがMISの発症に係わっていることを示している。現在、M3R-/-xIL-17-/-→Rag-1-/-マウスを作成中。両マウスの結果を踏まえて、MIS発症に重要なサイトカインを特定する。2) in vitroにおけるT細胞サイトカイン産生結果から、M3RのN1および第一細胞外ドメインがM3Rの主要なT細胞エピトープである事が判明した。2つのT細胞エピトープをそれぞれ単独でM3R-/-マウスに免疫し、脾細胞をRag-1-/-マウスに細胞移入することにより唾液腺炎を誘導することができた。この事実は、上記T細胞エピトープがMISを誘導する病因に直接係わっている事を示している。アナログペプチド解析を進める。3) CD2プロモーターを用いてT細胞にRORγtを過剰発現したRORγtトランスジェニックマウスを作成した。本マウスにおいては唾液腺炎を自然発症し、Rag-2-/-マウスに細胞移入した実験から、CD4+T細胞により唾液腺炎を誘導していることが判明した。さらに、in vitroの解析から、foxp3+CD4+Treg細胞の機能異常が生じていることも確認された。今後、本モデルマウスを用いて唾液腺炎発症機構の解明を進める。

我々の先行研究より、M3RペプチドをM3Rノックアウトマウス(M3R-/-)に免疫し、その脾細胞をRag1ノックアウトマウス(Rag1-/-)に細胞を移入し、シェーグレン症候群(SS)類似の唾液腺炎を発症するマウスモデル(M3R誘導唾腺炎、M3R induced sialadeniti, MIS)を樹立した。更に、CD3+T細胞の移入実験により唾液腺炎が誘導されることから、MISにおける自己免疫性唾液腺炎の発症機構は、M3R反応性T細胞により引き起こされていることを明らかにした。本研究では、MIS発症に関わるサイトカインの同定を試みた。方法は、M3R-/-xIFN-γ-/-およびM3R-/-xIL-17-/-マウスを作成し、M3Rペプチドを免疫した後にその脾細胞をRag1-/-マウスに細胞移入し、唾液腺炎の発症を検討した。その結果、M3R-/-xIFN-/-γ→Rag1-/-マウスおよびM3RxIL-17-/-→Rag1-/-マウスにおいて、それぞれ唾液腺炎の改善が認められた。以上より、MISの発症には、IFN-γおよびIL-17がともに発症に関わっていることが判明した。臨床免疫学1)我々が樹立したSSのモデルマウス(MIS)において、M3R反応性T細胞がMIS発症に重要である事を明らかにした。2) MIS発症機構として、IFN-γおよびIL-17がともに関与していることを明らかにした。3) APLを用いたMISに対する抗原特異的制御戦略を可能にした。MISマウスを用いて、自己免疫性唾液腺炎発症に係わるサイトカイン、T細胞エピトープを明らかにする事ができたため。RORγtトランスジェニックマウスを用いて、自然発症する唾液腺炎の発症機構の一部を明らかにすることができたため。1) MISの発症機構をさらに分子レベルで明らかにする。2) APLによるMIS抑制機序について、分子免疫学的アプローチで明らかにする。1)MISマウスにおいて、IL-17-/-xM3R-/-→Rag-1-/-マウスを作成し、MISにおける病因サイトカインを決定する。2)M3RのN1および細胞外第一ドメインのアナログペプチドを選定し、MISの抗原特異的制御戦略を確立する。3)RORγtトランスジェニックマウスにおいて、自然発症唾液腺炎の発症機構の全貌を解明する。該当なし
LCTFを活かした消化器癌新規イメージング法の開発

ヒトの消化器がん細胞株16種類、ラット胃がん細胞株、ラット胃由来正常細胞株を用いてin vitro PDDを実施した。In vitro PDDは、1mM 5-ALA処理4時間後に各培養細胞を遠心にてペレット化し、LCTF顕微鏡で紫外光を照射し、蛍光強度を経時的に測定することで実施した。その結果、630nmと670nmに付近にピークのある分光スペクトルデータが得られ、かつ630nm付近の螢光強度の減衰に比べると670nm付近の螢光強度の減衰は緩やかであるデータも得られた。この結果より、630nm付近と670nm付近の螢光を同時に測定することで感度を高められ、さらに多少のフォトブリーチングが起こっても検出できる可能性がある。ただし臨床検体においては腫瘍組織周辺の繊維芽細胞などが多く含むコラーゲンが670nm付近に自家螢光を持つことも報告されているため、コラーゲンの自家蛍光をカットするような工夫が必要であると思われる。そのためには今回用いた紫外光だけではなく、緑色光による励起できるシステムの開発が有用であると考えられる。また、ラット正常細胞でも同様の分光スペクトルデータが得られた。このラット正常細胞における螢光はラット胃がん細胞に比べると弱い螢光強度であったが、この違いが細胞の性質によるものか、あるいは単純に細胞数に影響を受けるものかについては更なる検討が必要である。660nm付近で得られる螢光が何によるもの解明していない。また、5-ALAの取り込み量と細胞数の関係を明らかにできていない。細胞数によって5-ALAの取り込みに影響があるかを確認する。緑色光による励起システムの開発は今後の課題である。胆道癌が疑われる患者1名と膵臓癌が疑われる患者2名に対して、ERCP(内視鏡的逆行性胆道造影)もしくはEUS-FNA(超音波内視鏡下針生検)検査の6時間前に5-ALAを投与し、内視鏡検査によって腫瘍部を生検し検体の蛍光を観察した。腫瘍部からの生検検体では、630nmに主ピーク、670nm付近に高いスペクトラムを持つ部位が確認された。胆道癌症例においては正常胆管も生検し、蛍光を観察したところ、630nm付近のピークは存在するが、670nm付近のスペクトラムは平坦であり、癌部と正常部で違いがある可能性が示された。蛍光スペクトラムの2次元マッピングと、病理検査結果との対比を行い、蛍光スペクトラムが630nmと670nmにピークを持つ部位は、病理検体で癌腺管に相当する部位におおまかに該当する可能性が示された。さらに、膵臓癌が疑われる患者1名に対して、同様の検査を施行した。15種の消化器がん細胞株を用いてin vitroPDDを実施した。In vitro PDDは、1mM 5-ALA処理4時間後に培養細胞を遠心にてペレット化し、LCTF顕微鏡で紫外光を照射し、蛍光強度を測定することにより行った。その結果、630nm付近と670nm付近にピークのある分光スペクトルデータが得られた。また、MIA PaCa-2細胞株を用いて検出できる細胞数の検討を行ったところ、10^5 cells以上であれば検出可能であった。同じく、MIA PaCa-2細胞株に対し、酸化剤として酢酸(0.1mg/ml, 4h)を用いて処理したところ、630nm付近のピークの減衰が認められたが、この機序はまだ明らかにできていないため、今後の検討課題である。さらに正常細胞でも630nm付近でピークが得られることが知られているため、660nm以下をカットするFilterで特異性を上げる検討も今後の課題としている。平成29年度の消化器悪性腫瘍生検の予定は30例であったが、実際の実施例は4例である。がん細胞株については15種において実施済みである。

また、5-ALAの取り込み量と細胞数の関係を明らかにできていない。消化器悪性腫瘍生検についての検討を、引き続き実施しデータの収集を行う。細胞数によって5-ALAの取り込みに影響があるかを確認する。緑色光による励起システムの開発は今後の課題である。
ネクロプトーシスを標的とした慢性肝不全急性増悪の病態解明と革新的治療法の創出

慢性肝不全急性増悪(Acute-on chronic liver failure [ACLF])は非アポトーシス型の細胞死と関連しており、短期死亡率が高いことが報告されている。ネクロプトーシスは炎症を励起するプログラム細胞死として近年報告され、急性肝障害において注目されている。しかしACLFにおけるネクロプトーシスの役割については十分に検証されていない。そこで本研究ではACLFの臨床検体およびACLF動物モデルを用いてACLFにおけるネクロプトーシスの役割を検証し、さらにはネクロプトーシス抑制剤の効果を検証し新規の治療法を模索する。
神経細胞におけるGAP-43の機能の解明

神経細胞の分化のメカニズムを解明するために、視神経細胞のモデルとして近年多くしようされているPC12細胞を用い、それらの細胞をnervegrowht factor(NGF)または、cAMPの膜透過性化合物である8-bwomo-cAMPの存在下に培養した。それらの処置により、PC12細胞に膜電位依存性ナトリウムチャンネル、カルシウムチャンネルさらにはセロトニン受容体が発現されることを認めた。これらのチャンネル、受容体の特性を電気生理学的に解析したところ、カルシウムチャンネルにおいてはomega-コノトキシン感受性チャンネルが多く発現され、セロトニン受容体はタイプ3受容体であることが明らかになった。さらに我々はPC12細胞をフォスフォジエステレース阻害剤であるrolipram存在下に培養したところNGFと同様なチャンネル、受容体の発現作用を有しているを示した。またNGF存在下に培養を続けたPC12細胞を、その後NGFを取り除いた条件下で培養し続けるとomega-コノトキシン感受性カルシウムチャンネルが選択的に脱落することが明らかになった。現在これらPC12細胞に認められた神経細胞分化の現像が哺乳動物の中枢神経細胞においても起こることであるか調べるために、ラット海馬の神経細胞を培養しこれらにNGF等の成長因子を投与して実験を行っている。またこれらの細胞分化においてGAP-43がどのような役割を果しているか検討するために、この蛋白質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて実験中である。
半導体三次元カイラルフォトニック結晶共振器による円偏光を介した単一スピン制御

本研究では、三次元カイラルフォトニック結晶共振器を利用して、カイラル構造による円偏光制御と円偏光による固体中のスピン制御を融合することにより、円偏光を介して幾何学的な構造カイラリティの左巻き右巻きによって単一スピンの上向き下向きを制御することを目的としている。3年目であった当該年度では、初年度から継続して、円偏光共振器のQ値を向上させる構造設計と単一量子ドットの結晶成長を行うほか、すでに作製に成功している円偏光共振器に単一量子ドットを導入し、共振器量子電気力学におけるパーセル効果の観測を目指した。異動後に新たに立ち上げた、低温での顕微フォトルミネッセンス測定系において、三次元カイラルフォトニック結晶を用いた円偏光共振器を実現し、InAs自己形成量子ドットから左回り円偏光に偏極した発光ピークを得ることに成功した。この成果は、当該年度に国内学会で2件発表したほか、次年度の国際学会でも発表予定である。また、元号が変わった最近になって、同様の円偏光共振器ピークに対して温度変化を観測したところ、ある温度においてピーク強度の著しい増加が観測された。これは、温度変化によって特定の量子ドットの発光波長と円偏光共振器モードの波長とが一致したことで起こったパーセル効果を示唆する結果であり、共振器に閉じ込められた円偏光光子と量子ドット内で対応するスピンをもつ電子とが弱結合状態にあると考えられる。一方で、カイラルフォトニック結晶の構造最適化設計に関しては、蘭国の教授と国際共同研究を行い、国際学会にて発表したほか、論文準備中である。また、初年度に当初計画を変更して取り組んだトポロジカルエッジ状態についての研究を論文として出版したほか、三次元フォトニック結晶作製技術の発展による光微小素子の集積化についても論文として出版した。以上の研究成果について、2件の国内学会、5件の国際学会で発表した。初年度から継続して行っている三次元カイラルフォトニック結晶の構造最適化設計に関して、当該年度より蘭国の教授と国際共同研究を開始し、国際学会にて発表した。現在、論文準備中である。一方で、昨年度までの構造設計に基づいて作製したカイラルフォトニック結晶については、異動後に新たに立ち上げた、低温での顕微フォトルミネッセンス測定系において、本研究で重要な役割を果たす円偏光共振器を実現した。すなわち、共振器構造を含む左巻きのカイラルフォトニック結晶において、内部に埋め込んだInAs自己形成量子ドットから左回り円偏光に偏極した発光ピークを観測することに成功した。以上の成果から、本研究は当初の研究計画に対しておおむね順調に進展している。前年度は、助教ながら独立した研究室の運営を始めたこともあり、研究の進捗に遅れがあったが、当該年度でこれを取り戻すことができた。次年度はまず、得られた円偏光共振器ピークに関して量子ドットの単一性を確認する。単一の量子ドットから単一の光子が放出されることを観測するために、HBT(Hanbury Brown and Twiss)光学実験系を構築し、光子の二次相関におけるアンチバンチングを測定することも検討する。また、強磁場印可装置を保有する研究者と協力して、円偏光共振器に外部磁場を印加して量子ドット内のスピン縮退を解き、円偏光とスピンの選択則が満たされる場合のみ、パーセル効果により発光が増強されることを観測する。以上と並行して、蘭国の教授との国際共同研究を推進し、カイラルフォトニック結晶円偏光共振器の構造最適化設計を行い、共振器Q値の向上に努める。その後、当初の計画どおり、高いQ値を有する円偏光共振器に閉じ込められた円偏光光子と、それに対応するスピンをもった電子との強結合状態の実現を目指す。初年度であった当該年度では、数値計算によって三次元カイラルフォトニック結晶を用いた高Q値円偏光共振器の設計を行い、それに基づいて試料を作製することも目指した。まず、カイラルフォトニック結晶の中央に平板を挟んだ面欠陥型共振器構造について、有限差分時間領域法による数値計算を行い、円偏光フォトニックバンドギャップ内に共振器モードが形成されることを見出した。得られた共振器Q値は6000程度であり、円偏光共振器の試作に向けては十分な値であると判断し、近赤外光を発する量子ドットを内部に埋め込んだカイラルフォトニック結晶共振器を作製した。この試料に対して極低温でフォトルミネッセンス測定を行ったところ、数値計算で予測された円偏光共振器モードの観測に成功した。これは、半導体を用いたカイラルフォトニック結晶において初めての結果となり、現在、論文準備中である。一方、数値計算の途中で、当初の予想に反して、光のスピン制御につながるトポロジカルエッジ状態の存在が明らかになった。

スピン制御を目的とした本研究の遂行上、このエッジ状態の本質を見極めることが不可欠であったため、当初計画を変更して、その理論構築を追加で実施した。この結果は、2件の国内学会での発表につながったほか、1件の国際学会での発表予定であり、論文も準備中である。当該年度では、数値計算によって三次元カイラルフォトニック結晶を用いた高Q値円偏光共振器の設計を行い、それに基づいて試料を作製することも目指した。まず、カイラルフォトニック結晶の中央に平板を挟んだ面欠陥型共振器構造について、有限差分時間領域法による数値計算を行い、円偏光フォトニックバンドギャップ内に共振器モードが形成されることを見出した。得られた共振器Q値は6000程度であり、円偏光共振器の試作に向けては十分な値であると判断し、近赤外光を発する量子ドットを内部に埋め込んだカイラルフォトニック結晶共振器を作製した。この試料に対して極低温でフォトルミネッセンス測定を行ったところ、数値計算で予測された円偏光共振器モードの観測に成功した。これは、半導体を用いたカイラルフォトニック結晶において初めての結果となり、現在、論文準備中である。一方、数値計算の途中で、当初の予想に反して明らかになった、トポロジカルエッジ状態の存在についても理論的に証明することに成功した。このように当初の計画を変更したにもかかわらず、予定どおり数値計算による高Q値円偏光共振器の設計とその試料作製に成功したことから、おおむね順調に進展していると言える。本研究では、三次元カイラルフォトニック結晶共振器を利用して、カイラル構造による円偏光制御と円偏光による固体中のスピン制御を融合することにより、円偏光を介して幾何学的な構造カイラリティの左巻き右巻きによって単一スピンの上向き下向きを制御することを目的としている。2年目であった当該年度では、前年度から引き続いて、円偏光共振器のQ値を向上させる構造設計と単一量子ドットの結晶成長を行うほか、前年度に作製に成功した円偏光共振器に単一量子ドットを導入することを目指した。ただし、前年度において、当初の予想に反して、光のスピン制御につながるトポロジカルエッジ状態の存在が明らかになった。まず、前年度から継続している円偏光共振器の構造設計については、有限差分時間領域法による数値計算によって、これまでに本研究で得られていたQ値6000(らせん周期数12)に対して、構造変調によって新たに同じらせん周期数でQ値25000が得られた。また、単一量子ドットの結晶成長も行い、強い発光を示す低密度量子ドット基板を得た。この他に、本研究と関連する円偏光発光素子に関する学術論文を執筆・出版し、国内学会での招待講演で報告したほか、奨励賞の受賞にもつながった。さらに、本研究には欠かせない共振器Q値の向上に関する学術論文など計4編を執筆・出版した。次に、当初計画を変更して取り組んだトポロジカルエッジ状態についても、国内の研究者との共同研究を行った結果、4件の国内学会、4件の国際学会で発表につながったほか、論文も準備中である。しかし、当初計画を変更したことや、研究代表者が研究機関を異動し、助教ながら独立した研究室の運営を始めたことで、当初計画に対してはやや遅れている状況である。
諡法に見られる人物評価意識の変遷

本研究の目的とするところは、周代から清代に至るまでの期間に使用された諡の贈与基準を通覧するするデータベースの作成と、諡法運用の変化を通史的に明らかにすることにある。まず第一点目のデータベースに関しては基礎資料の収集と分類とを完了した。これらには『春秋』三伝・『国語』・『戦国策』などの周代の贈与基準と贈与方法を伝える文献から、二十四史を中心とした歴史書、筆記に見られる諡法に関する記載、賀〓『諡法』・蘇洵『諡法』・清代の『皇朝諡法考』などの歴代諡法専著、『世本』・『白虎通』・『北堂書鈔』・『初学記』・『経世大典』等に載せられる諡法まで幅広い資料が含まれる。これら資料は、これまで一括して分類・分析されたことが無く、本研究による作成される予定の総合的なデータベースは、世界でも初の試みとなる。現在、調査結果のデータ入力を進めている段階である。また、第二点目の諡法の通史的分析に関しては、以下の諸点に関して資料の収集が終了し、現在、論文執筆の準備を進めている。(1)諡号『霊』の用法変遷(2)孔子の諡号の変遷(3)前漢期における諡法の変化(4)『逸周書』「諡法解」載録諡法の変遷(5)『史記正義』所載「諡法解」の異同諡法の通史的研究において究明が必要なこれらの事柄についての論文は、平成22年度より順次、研究誌に発表して行く。19年度は、研究の初年度であり、研究の礎石となる資料の収集と整理が中心的な活動となった。当初の計画通り『逸周書(汲冢周書)』「諡法解」の各版本の異同を比較する作業を進め、これを終了させた。この作業の一環として行った静嘉堂文庫蔵・元刊『汲冢周書』「諡法解」の調査では、これまで元刊の翻刻とされていた四部叢刊・史部所載の『汲冢周書』「諡法解」に、内容的にいくつかの異同のあることが確認された。これは、これまでの先行研究が全く指摘していない点である。すでに小職の発表論文(「唐代における諡号『文』について」)において言及するように、諡法は当時の人々の評価基準が如実に反映する鏡であり、時代・社会の変化に応じて贈与基準が変動する性質を持つものであることが、ここでも確認できた。また、静嘉堂文庫蔵・元刊『汲冢周書』が現存する最古の『逸周書』であろうと推測されるが、この点について次年度以降分析を深める。研究初年度の研究事項として、「孔子諡号の変化」を分析し、贈与基準の変化を通史的に確認する作業をあげたが、この点については周代春秋期から清代までの資料調査を終え、現在分析を進めている。現段階で留意すべき特徴として確認されている事柄は、前漢末に正式に礼法として贈与された「宣」が、漢代に入ってからほとんど用いられることの無かった特殊な諡号であることと、贈与に際して中心的な役割を担った人物が後に前漢を襲い新を建てた王莽であった点、および唐代贈与された「文宣」が後世一般化するのに呼応して「文」・「宣」が諡号の中でも特異なステータスを獲得していった点である。今後これらの特徴を踏まえながら、評価意識が変容して行く過程を明らかにする。研究の2年目に当たる20年度は、諡法資料として周代から宋代までの諡法研究に資する文献を調査し一覧を作成した。また、諡法の適用に関する是非を論議である「諡議」に関する調査・分析では、周代から唐代に到るまでの「諡議」を史書・経書を基本にして抜き出し、資料を集めた。この成果は、次年度以降に収集する宋代以降の資料と合わせて「諡議資料集」として総覧を作成する。研究初年度の研究を承けて進めていた「孔子諡号の変化」に関しては、王莽の儒家偏重政策が与えた影響を孔子の諡号が大きく受け、これが後世に引き継がれたことが判明した。そこで、前漢と後漢の諡法の差異を明らかにすることを優先し、孔子の諡号に関する研究成果の論文による発表を次年度に行うものとし、両漢の諡法についての分析を進めてきた。それはこれまでの先行研究では、新をはさんだ両漢期の諡法変遷は言及されることが少なかったからである。当該時代の贈与の実態を網羅的に明らかにすることによって、この時代におきた評価意識の変遷が具体的に把握できると予測される。この点における研究の進捗状況としては、現在、前漢の全贈諡例を概観できる資料を作成しており、この作業が終了し次第、後漢に関する同様の資料をまとめる。途中経過時点で判明したこととして、前漢期には、先秦時代には用いられることの無かった新しい諡号・諡法が運用されるようになった点を報告する。また、諡法データベース作成過程において、四庫全書所収、宋・金履祥撰『資治通鑑綱目前編』巻六所載の金履祥注引『逸周書』「諡法解」が、『史記正義』所載のそれよりも『逸周書』「諡法解」古い姿を伝える文献である可能性を発見した。これまで作成してきた『逸周書』諸系統本所載「諡法解」のデータベースと比較しながら、次年度にその来源を考察する。

本研究の目的とするところは、周代から清代に至るまでの期間に使用された諡の贈与基準を通覧するするデータベースの作成と、諡法運用の変化を通史的に明らかにすることにある。まず第一点目のデータベースに関しては基礎資料の収集と分類とを完了した。これらには『春秋』三伝・『国語』・『戦国策』などの周代の贈与基準と贈与方法を伝える文献から、二十四史を中心とした歴史書、筆記に見られる諡法に関する記載、賀〓『諡法』・蘇洵『諡法』・清代の『皇朝諡法考』などの歴代諡法専著、『世本』・『白虎通』・『北堂書鈔』・『初学記』・『経世大典』等に載せられる諡法まで幅広い資料が含まれる。これら資料は、これまで一括して分類・分析されたことが無く、本研究による作成される予定の総合的なデータベースは、世界でも初の試みとなる。現在、調査結果のデータ入力を進めている段階である。また、第二点目の諡法の通史的分析に関しては、以下の諸点に関して資料の収集が終了し、現在、論文執筆の準備を進めている。(1)諡号『霊』の用法変遷(2)孔子の諡号の変遷(3)前漢期における諡法の変化(4)『逸周書』「諡法解」載録諡法の変遷(5)『史記正義』所載「諡法解」の異同諡法の通史的研究において究明が必要なこれらの事柄についての論文は、平成22年度より順次、研究誌に発表して行く。
人眼及び動物眼のReal time,in vivoブドウ膜血流の測定

今年度は,レ-ザ-スペックル法によるブドウ膜血流測定機を改良,後眼部にも応用可能とし,正常白色家兎眼で前眼部,後眼部について各種条件下で末稍血流速度の変化を測定した。まず,前年度に引き続き,測定結果の安定性,再現性を検証した。後眼部での再現性は9.5%であった。ついで,前眼部については白色家兎眼で頚動脈結紮の影響,カルシウム拮抗剤の作用を検討した。測定側頚動脈の結紮では3%,両側の結紮で7%の末稍血流速度低下が示された。このとき,全身の血圧は10%前後増加した。従来の報告では測定側結紮で30%前後の血流量低下が示されており,本装置で測定した血流速度の挙動と一致しない。ここから,血流速度が血流量に比較してより高度に自己調節されていることが示唆された。カルシウム拮抗剤の動脈内投与でも,30%以上の全身の血圧低下に対し,局所血流速度は有意に変化しなかった。一方,後眼部については,結果の解釈上網膜と脈絡膜の信号の分離が問題となるため,主として脈絡膜循環に影響されると考えられる視神経乳頭面を対象とした。正常白色家兎眼で,炭酸脱水酵素阻害剤静注,アドレナリン製剤静注,交感神経β遮断剤点眼前後の各々で血流速度の変化を検討した。各条件とも30%15%の範囲で血流速度の増加が検出された。同時に測定した眼圧は相応して降下しており,眼圧の降下が眼内の潅流圧の上昇をもたらし,血流速度を増加させたと考えられた。(日本眼科学会総会,1992年,横浜,発表予定)。レ-ザ-スペックル法によるブドウ膜血流測定機の基礎的特性をin vitro及びin vivoで検討した。in vitroでの性能確認としては、一様な乱反射面をもつ灰色の円盤を定速で回転させ、これを測定した。測定値は測定面の運動速度と未稍循環の計測に必要な範囲で比例した。この過程で、測定値の直線性が得られる範囲が相対的なスペックルサイズ、即ち眼底カメラレンズの開口数と倍率、CCDの画素数に依存することが示された(応用物理学会秋季講演会、1990年,盛岡;眼光学学会,1990年,東京)。in vivoでの測定は白色家兎眼虹彩に対して行なった。まず正常眼を測定し、変動係数5%、再現性11%と、安定した測定が可能であることを確認した。ただし、測定結果は瞳孔径に依存して変化し、虹彩組織の厚さや瞳孔に対する神経刺激の影響など、種々の要素が測定値に影響していることが推定された。次いで、副交感神経ムスカリン受容体刺激剤であるピロカルピン製剤について、投与前後での測定を試みた。対照眼に対し5%の測定値の増加を得た。これはピロカルピンが虹彩血流を増加させるという従来の知見と一致し、このことから本法が虹彩血流に関して充分な感度を持つことが示唆された(日本眼科学会総会、1990年,岡山。)ここで、ピロカルピン投与前後の血流の増加量に一部従来の知見と一致しない点があり、in vivoでの血流量と測定値の直線性、線形性については、他法との比較によるなんらかの校正が必要であることが判明した。このため、既に確立された血流測定方法であるマイクロフェア法との同時計測を計画し、予備実験を開始した。
微生物による有機物中の脂質からのエチレン生成とその工業化

本年度に得られた研究成果は以下に示すとおりである。2)近年,食と農業に対する関心が社会的に高まっており,食の安全といった観点から,有機農産物への需要が急激に増加している。しかし,海外から輸入しているバナナなどの場合,必ず未熟の果実でなけばならないと植物防疫法で定められているため,国内で,石油から生成した工業用エチレンを用いて追熟処理が行われているのが現状である。日本で有機JASマークをつけて販売するためには,石油生成エレン以外の物質,例えばJAS規格で認められているエタノールなどの資材を高濃度で用いなければならなく,非常に危険であるため,早急に安全な果実の追熟技術を開発する必要がある。そこで,自作した200Lの培養槽を用いて,エチレン生成細菌が生産するブドウ枯葉からのエチレン(微生物生成エチレン)を用いてバナナの追熟促進効果を調査したところ,果実の追熟を充分に促進させることができた。以上の結果から,微生物による有機物,特にブドウ枯葉中の脂質からは大量のエチレンが生成するので,微生物生成エチレンの工業化は可能であることを明らかにした。今後,その生成メカニズムをさらに解明するとともに,効率的な生産方式や簡易な液化・濃縮技術の開発を検討する必要がある。これまでに得られた研究成果は以下に示すとおりである。2)1)項に加えて,さらに採取した土壌431種類およびぼかし肥3種類を用い,特に脂質からのエチレン発生量が多かった土壌やぼかし肥の中からエチレン生成能の高い糸状菌や細菌の探索を行った。その結果,エチレン生成能が高い新たな糸状菌12菌株および細菌26菌株を分離し,それらの同定を行った。なお,細菌によるエチレン生成量は,総じて糸状菌による生成量よりも23倍多かった。3)ブドウ枯葉以外にもワイン製造時に得られる絞り粕から抽出した脂質を用いて,糸状菌によるエチレン生成を調べた。その結果,いずれの絞り粕脂質添加区でも脂質無添加区の場合よりはエチレン生成量が多かったが,その生成量はブドウ枯葉脂質添加区の場合よりも著しく低かった。