hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌転移・浸潤にかかわる膜結合型MMP前駆体活性化酵素の発見と作用機序の解析

がんの転移と浸潤には、マトリックス蛋白質の分解の抗進が必須である。そのためプロテアーゼ群によるカスケードを形成しているが、我々は前駆体型膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ(Pro-MT-MMP)を細胞膜表面で活性化するプロテアーゼがプラスミン及びブラスミン様酵素群であることを発見した。本年度の研究においては、このプラスミン様酵素の実体をさらに詳細に検討した。その結果このプラスミン様酵素は、28kDaと14kDaがS-S結合で複合体を形成しており、各々のサブユニットのN末端からアミノ酸一次構造解析から、ミニプラスミンと同定された。ミニブラスミンは、プラスミンのL鎖の中で重要な機能領域であるクリングル14領域を欠く構造体である。塩基性アミノ酸を多く含み、血管新生抑制作用を示すL鎖のクリングル14番を欠くことは、全体として疎水性が増し、細胞膜表面に強固に結合して、Pro-MT-MMPを成熟型に容易に変換することが強く示唆された。さらにミニプラスミンが分子量が約36kDaの蛋白質で、プラスミンの分子量が約90kDaであるのに比較すると、分子サイズが小さくなることでPro-MT-MMP以外の多くの蛋白質と相互作用を持つことがうかがえた。今後ほかのマトリックスメタロプロテアーゼの活性化にもミニプラスミンがどのように関与するか明らかにしてゆく。
住教育に対する「小さな博物館」活動の提供するコミュニティ形成に関わる情報の検討

複数の小規模展示施設群による「小さな博物館」活動の一つの典型事例である墨田区の調査結果より、この活動を可能とした条件と、その提供するコミュニティ形成の意義を以下の8点にまとめる。(1)各地の「小さな博物館」活動は、地域密着の小規模施設群による、運営は住民の手による、集積した「小さな博物館」群の巡回を期待していること、が共通項となっている。(2)東京都墨田区の「小さな博物館」活動は、「モノづくりのまち」墨田の産業振興政策の一環として位置づけられて展開された点が、その活発な活動の保障となっている。(3)墨田区の行政誘導は、A)事前の各種調査を下敷きとしてた具体的イメージ作りによって住民の参加を容易にした、B)多様な宣伝普及活動によって住民のなかに「小さな博物館」の認識を確立した、など活動の立ち上げにおいて有効に発揮された。(4)産業振興政策の一環として、開館時、日常運営、更新時の3段階での補助金制度でより多くの参加を可能にしている。(5)また「小さな博物館」の立地する地域、同業者組合の直接間接の支援システムも加わって多様なパートナーシップがより一層の参加条件となっていた。(6)「小さな博物館」での地域に密着した資料の展示以上に施設を取り囲む周辺のまちなみもまた「景観・町の雰囲気」といった重要なコミュニティ学習の資料を提供している。(7)また展示物同様に館長の解説は、地域の歴史・産業・文化を知る重要な場を提供している。(8)現在墨田区では、館長の活動は「小さな博物館」の運営だけに限定されているが、「小さな博物館」の位置を考えると、地域のコミュニティ形成の核となる可能性がある。
地域活性化を目指した低利用ローカル資源の有効利用に関する学際的研究

本研究は,鹿児島湾の低利用資源,Plesionika semilaevis(以下,ジンケンエビ)を地域特産資源として有効利用し,漁村活性化をはかるために,水産資源生物学,食品加工・品質管理学,海洋社会科学それぞれのアプローチに基づく研究で得られた知見を統合・整理して地域に提供することを目的とする。各アプローチによる研究成果の概要は以下の通りである。水産資源生物学的アプローチ:鹿児島大学水産学部附属練習船南星丸を用い,同湾内に設定した8定点おいて定期定点試験底曳網調査を行い,分布の解明と可能供給量の模索を行った。本種は採集個体数と重量のどちらにおいても最優占種であった。周年にわたって湾中央の最深部付近に位置する2定点(水深180mと220m)に集中的に分布したが,両定点の間では性比や体サイズ組成に違いが見られた。抱卵個体の出現状況より,本種は湾内の分布域一帯で繁殖を行うと推察された。さらに,本種と同様に有効利用が望まれるサルエビTrachysalambria curvirostrisにも着目し,産卵期を明らかにした。食品加工・品質管理学的アプローチ:ジンケンエビを食材として利用する際の外骨格を軟化させるための手法が確立できた(特許公開中(特開2008-245624))。海洋社会科学的アプローチ:ジンケンエビのような地域特産水産資源の有効利用について,消費者への認知度を高めるブランド化の視点から検討した。水産物で,漁業協同組合等が自らの生産物が他より良いものであると消費者に認知される「個別ブランド」を確立することは,ベンチャービジネスを立ち上げるのと同様の困難な課題があると考えられた。また,単一の漁協では個別ブランドを新たに造る力がない場合には,近隣の異業種等と連携することにより「地域ブランド」を造ることが出来ると考えられた。今年度の各アプローチによる実績の概要は以下の通りである。水産資源生物学的アプローチ:鹿児島大学水産学部付属練習船南星丸を用い,同湾において定期定点試験底曳網調査を行って可能供給量の模索を行った。その結果,本種は採集された甲殻類の最優占種で,湾中央の最深部に集中的に分布することがわかった。曳網10分間当たりの採集個体数は6727452個体で,周年出現した。食品加工・品質管理学的アプローチ:本種は生食の他,加工用食材として有効利用が期待できるが,殻(外骨格)むき作業に手間がかかる上に,現在は安価で取り引きされている。また,殻付きのまま加工品の原料とした場合,食感はザラつき感がある。そこで,殻の軟化処理方法を試みた。その結果,殻の軟化が認められ,味覚への影響と,処理中に予想される生鮮度低下においても対処法を考慮することが可能となった。これらの詳細については,特許申請に向けて明細書作成中である。海洋社会科学的アプローチ:当該漁業者や漁協が主体的にマーケティングに参加し,地域資源の有効利用を達成する条件を探るために,各地でヒアリング調査を行った。

その結果,時間的制約により販売活動よりも生産活動を優先せざるを得ない小生産者の特質や,限られた流通業者が参加する競りでの価格以外の市場情報を得難い,流通システム上の問題の存在が明らかとなった。流通業者と漁業者のコミュニケーションシステムの実態把握が今後の課題である。来年度は,漁獲→加工→流通のシステム構築に向けて,実践的な研究を展開する予定である。本研究は,鹿児島湾の低利用資源,Plesionika semilaevis(ジンケンエビ)を地域特産資源として有効利用し,漁村活性化をはかるために,水産資源生物学,食品加工・品質管理学,海洋社会科学それぞれのアプローチに基づく研究で得られた知見を統合・整理して地域に提供することを目的とする。今年度の各アプローチによる実績の概要は以下の通りである。水産資源生物学的アプローチ:前年度に引き続き,鹿児島大学水産学部附属練習船南星丸を用い,同湾において分布調査を行った。P.semilaevisは湾中央部の2定点で顕著に採集密度が高かったが,水深の深い定点で大型個体の割合が多い傾向が見られた。また,定点問で性比にも違いが見られた。抱卵個体の出現,および胚の発生段階を調べ,繁殖水域の推定も行った。食品加工・品質管理学的アプローチ:前年度には有機酸と酵素を用いた本種外骨格の軟化処理実験を行ったが,本年度は新たにカルシウムイオンとキレート力の強い有機酸により更なる軟化と"酸味"の低減化を試みた。その結果,前年度に比べて殻の硬さを約13%減少することができた。さらに,官能評価においても"殻の硬さ","舌触り","酸味"および"エビの風味"の項目において優れていた。海洋社会科学的アプローチ:最近10年ほどは,本種は低価格ながら漁家で頭を除去して取引されているが,知名度は低く,需要が限られているために漁獲量が増えると価格が大幅に下がる傾向にあることが,現地調査により明らかとなった。今年度より,当該漁協の加工場で本種や小型のナミクダヒゲエビの殻剥きや真空パックをグループ共同で行い,外食産業に出荷すること等が計画されることとなった。本種のような低利用資源の活用には研究者,行政,漁協系統団体等が漁業者や消費者と情報交換を密にすることが重要と思われた。なお,成果の一部については特許申請中である。
認知症初期の人の介護者支援の介入研究-integrated careの視点から

認知症を持つ高齢者は年々増加しており、認知症の人の在宅介護に関連した事件がしばしば起こり、認知症の人の家族介護者の負担は深刻な社会問題となっている。認知症症状の増悪は、生活環境が左右しているといわれ、特に認知症初期からの家族介護者の対応が重要といわれている。申請者は認知症初期の介護者に対する支援策が急務と考える。本研究は、認知症初期の人の介護者に対して申請者が開発した「介護者支援のためのガイドライン」を用い、心理教育アプローチ法にintegrated careの視点を組み入れてプログラム介入し、コホートで効果検証することである。
グリア細胞不死化に関係する遺伝子のクローニング-ラットグリア不死化株を用いての検討-

ヒトグリオーマの悪性化過程は解明されつつある反面、初期の腫瘍性変化に関する知見は乏しい。細胞の不死化は細胞レベルでの前癌状態と考えられ、腫瘍化への初期段階であるされるが、グリア細胞の自然発生的な不死化に関する報告は今までなかった。私たちはエチルニトロソウレアで培養1型アストログリア細胞が癌化し、その過程のなかで癌抑制遺伝子p53の変化が癌化細胞の出現と密接に関連していることを見出した。また、継代培養にて自然発生した1型アストログリア不死化5株を樹立した。いずれの不死化株も接触抑制を有し造腫瘍性を示さず、形態も敷石状で正常の1型アストログリアに極めて類似していたが、細胞倍化時間は正常のアストログリアよりも短く、また癌胎児性の接着分子であるtenascinを分泌し、しかも正常細胞が運動能を示さないグリオーマ由来遊走因子(GMF)に対して強い運動能を有するなど、正常とは異なった性質も有していた。形態学的には極めて類似するこの両者間で、遺伝子レベルでは不死化はどのような変化であるのかを検討した。癌抑制遺伝子p53は、それ自体が不死化遺伝子とされるので本遺伝子の異常をまず検討した。しかし、突然変異を初めとした遺伝子異常はまったく発見されず、本細胞の不死化にはp53以外の遺伝子が関与していることが明らかとなった。そこで、正常のアストログリアと不死化細胞のcDNSライブラリー間でdifferntial hybridizationを行い約200の候補遺伝子をスクリーニングした。現在、これらのシーケンスを決定して既知の遺伝子との相同性を検索し、候補遺伝子を絞りつつあるところである。このように本研究によって、ヒトグリオーマでは認められない前癌病変に相当する不死化細胞を得たことは意義深く、今後不死化自体の機序が解明されることは、グリアの発癌機序の全体像を明らかにする上でも大変重要であると思われる。さらに、グリオーマ発生の初期のkey stepを見出そうとするこの研究はグリオーマの治療戦略を考える上でも重要な役割を持つものと思われる。(1)細胞の不死化は悪性腫瘍の初期腫瘍性変化と考えられているが、グリオーマに至る過程の中でその不死化に関する知見は乏しい。私たちは接触抑制を有し造腫瘍性のないラット胎児グリア不死化細胞5株を樹立した。その不死化に関してras,myc,c-sis,neuなどの既存の発癌遺伝子の異常を検討したが、それらの異常はみられなかった。(2)線維芽細胞の不死化に癌抑制遺伝子p53 alleleの部分的欠失、mRNAの消失あるいは発現低下、不活性型p53の産生等が関与していることが知られているが、私たちの不死化グリア細胞には、そのようなp53の変化はみられなかった。(3)そこで、これらのグリア不死化株から、グリア細胞不死化に最も関与する遺伝子を見出すことを第一の課題とし、それと相同性を有するヒトグリア細胞の遺伝子をクローニングすることをめざした。(4)正常の胎児グリア細胞と不死化グリア細胞のcDNAライブラリーを作成し、各々の間でdifferential hybridizationを行なった。(5)これらの細胞間で信号強度の異なる400余りの候補遺伝子サブクローンをスクリーニングし、順次これらのDNAシーケンスを行なっている。

(6)現在、これらのサブクローンのシーケンスを遺伝子バンクに登録された既知のDNAシーケンスと比較検討し、アストログリアの不死化の責任遺伝子を検討している。(7)平成6年度には、スクリーニング・解析後の検討で候補と考えられる遺伝子を各々の細胞に導入し、その発現結果(不死化の獲得あるいは解除など)を検討して、責任遺伝子を決定づける予定である。ヒトグリオーマの悪性化過程は解明されつつある反面、初期の腫瘍性変化に関する知見は乏しい。細胞の不死化は細胞レベルでの前癌状態と考えられ、腫瘍化への初期段階であるされるが、グリア細胞の自然発生的な不死化に関する報告は今までなかった。私たちはエチルニトロソウレアで培養1型アストログリア細胞が癌化し、その過程のなかで癌抑制遺伝子p53の変化が癌化細胞の出現と密接に関連していることを見出した。また、継代培養にて自然発生した1型アストログリア不死化5株を樹立した。いずれの不死化株も接触抑制を有し造腫瘍性を示さず、形態も敷石状で正常な1型アストログリアに極めて類似していたが、細胞倍化時間は正常のアストログリアよりも短く、また癌胎児性の接着分子であるtenascinを分泌し、しかも正常細胞が運動能を示さないグリオーマ由来遊走因子(GMF)に対して強い運動能を有するなど、正常とは異なった性質も有していた。形態学的には極めて類似するこの両者間で、遺伝子レベルでは不死化はどのような変化であるのかを検討した。癌抑制遺伝子p53は、それ自体が不死化遺伝子とされるので本遺伝子の異常をまず検討した。しかし、突然変異を初めとした遺伝子異常はまったく発見されず、本細胞の不死化にはp53以外の遺伝子が関与していることが明らかとなった。そこで、正常のアストログリアと不死化細胞のcDNSライブラリー間でdifferntial hybridizationを行い約200の候補遺伝子をスクリーニングした。現在、これらのシーケンスを決定して既知の遺伝子との相同性を検索し、候補遺伝子を絞りつつあるところである。このように本研究によって、ヒトグリオーマでは認められない前癌病変に相当する不死化細胞を得たことは意義深く、今後不死化自体の機序が解明されることは、グリアの発癌機序の全体像を明らかにする上でも大変重要であると思われる。さらに、グリオーマ発生の初期のkey stepを見出そうとするこの研究はグリオーマの治療戦略を考える上でも重要な役割を持つものと思われる。
マウスCD5遺伝子およびその機能と解析

CD5は分子量67,000の細胞表面糖タンパク質であり、すべてのT細胞と一部のB細胞上に発現する。CD5分子はCD72(B細胞上に存在)と結合して細胞内のセリンキナーゼ活性を持つ分子へシグナルを渡しているといわれ、またCD5分子の刺激はプロテインキナーゼCの活性化を誘導する。本年度はCD5分子を発現するトランスジュニックマウスの作製を計画し、CD5遺伝子がゲノムに組み込まれたと考えられるマウスを数系統樹立した。1.トランスジェニックマウスの作製SV40プロモータ、マウス抗体重鎖遺伝子エンハンサを用いてマウスCD5cDNA発現用DNAコンストラクトを作製した。このDNAコンストラクトをL細胞およびSP2/0細胞へトランスフェクトしてCD5分子を細胞表面上に発現することを確認した後、C57/BL6×C3H/HeN F1マウスの受精卵に顕微注入し偽妊娠マウスに卵管移植した。マウスのスクリーニング生まれてきたマウスの尾よりゲノムDNAを抽出し、ゲノムDNA上でイントロンをはさむと考えられる2カ所のエクソン部位より作製したプライマーを用いてPCR反応を行ない、イントロンを含まない短いバンドを検出したマウスを数匹選出した。このマウスは今のところ、外見的には同腹の他の仔とは変化が見られない。現在、このマウスを繁殖させており、一部の子孫では約半数に親同様のバンドがPCR法で認められるので、導入した遺伝子がメンデル遺伝していると考えられる。このマウスを用いて解析を進めて行く予定である。なお、本実験は東京大学農学部動物育種学教室および同応用遺伝学教室の協力を得て行なった。
高解像度画像システムを用いた小腸移植後拒絶反応の革新的診断法の開発

現在の小腸移植後の拒絶反応の診断法は定期的な人工肛門からの拡大内視鏡による観察と生検である。しかし、観察範囲は限られ、グラフト全体像の把握は不可能である。そこで本研究の目的は、三次元X線マイクロCTおよびFDG代謝イメージング法の併用による新規診断法の確立である。今回、まずは拒絶反応のモデル作成を行うにあたり、ラットで実際に小腸移植を行っていた。小腸移植の手技は難易度が高く、血管吻合は顕微鏡下に行う必要があるため、手技の習得のために修練を行っていた。しかし、当科の研究室移転に伴いラットの飼育が出来なくなったため、新たな小腸移植モデルの作成が必要となった。そこで、マウスを用いた小腸移植モデルの作成を行った。小腸を皮下や大網内に移植し生着した報告(周囲からの血管新生により)もあり、今回我々は小腸を血流豊富な腹壁に移植してモデル作成可能かどうかを検討した。新生仔マウスの小腸をレシピエントマウスの腹壁(腹直筋と腹膜の間)に移植し、1週間後にグラフトを観察すると、Allo移植では絨毛は委縮もしくは脱落していたが、Auto移植では絨毛高が保たれていることを確認した。また、1カ月後は、Allo移植では腸管構造が確認できなかったが、Autoでは確認可能であった。拒絶モデルとして使用できることを確認した。しかしながら、マウスの腸管は非常に小さい上に、新生仔を使用しているため、顕微鏡レベルでの確認しか難しいと考えられ、マイクロCTを用いた評価はできなかった。少なくとも新たな拒絶モデルは作成できたため、マウスではなくラットを用いた研究であれば、マイクロCTを用いた評価は可能であると考える。現在の小腸移植後の拒絶反応の診断法は定期的なストーマからの拡大内視鏡による観察と生検である。しかし、観察範囲はストーマから約30cm程度が限界でありグラフト全体像の把握は不可能である。まず、拒絶反応の研究を始めるにあたり、拒絶反応のモデルを作成しなければならない。そのため、小腸移植の手技を確立し、手技による死亡をなくし、拒絶反応が起こるまで100%の生存を目指す必要がある。ラットの小腸移植モデルではドナーはBNラットを使用し、レシピエントはLEWラットを使用することが文献的に多く、本研究でもその予定である。ドナーの手術では、顕微鏡下に空腸を摘出する必要があり、レシピエントの手術では、顕微鏡下に動脈吻合と静脈吻合を必要とする、非常に難しい手術である。血管吻合では9-0や10-0の非常に細い糸を使用するため、難易度が高い。現在、小腸移植の手技を安定させるため、手術の修練をしている。LEWラット→LEWラットの組み合わせて現在手技の習得を目指し、小腸移植を週に最低1回以上の頻度で行っている。ドナーのグラフト摘出は、死亡することなく100%摘出可能な状態となった。しかし、レシピエントの手術では、血管吻合の難易度が高いためまだ修練の途中である。依然として100%成功するまではいたっていないが、成功する回数も増加してきており、もう少しの修練が必要と思われる。手技習得に思いのほか時間を要しており、また研究棟改修に伴う移転により実験室を使用できなくなったことが遅れている要因に挙げられる。そこで本研究の目的は、三次元X線マイクロCTおよびFDG代謝イメージング法の併用により新規診断法の確立である。しかし、当科の研究室移転に伴いラットの飼育ができなくなったため、新たな小腸移植モデルの作成が必要となった。小腸を皮下や大網内に移植し生着した報告(周囲からの血管新生により)もあり、今回我々は小腸を血流豊富な腹壁に移植してモデル作成可能か調べた。新生仔マウスの小腸をレシピエントマウスの腹壁(腹直筋と腹膜の間)に移植し、1週間後にグラフトを観察すると、Allo移植では絨毛は萎縮もしくは脱落していたが、Auto移植では絨毛高が保たれていることを確認した。Allo移植とAuto移植で差が認めてはいるが、母数がまだ少ないため、現在さらなる実験を行い、マウスでの小腸移植モデルの確立を目指している。モデルが確立した後に、マイクロCTを含めた拒絶の評価を行っていく予定である。当初はラット小腸移植を用いた研究を行っていたが、研究室移転にともないラットの飼育が困難となったため、マウスの移植へ変更した。ラット小腸移植においても非常に手技習得が困難だが、マウスであればさらに困難である。そこで、血管吻合を用いない新たなマウス小腸移植モデル作成を行った。現在、新生仔小腸を腹壁内に移植することでモデル確立を目指している。上記のようにラット小腸移植の手技習得中に移転になった点、新たなモデル作成を確立するために時間を要した。

現在の小腸移植後の拒絶反応の診断法は定期的な人工肛門からの拡大内視鏡による観察と生検である。しかし、観察範囲は限られ、グラフト全体像の把握は不可能である。そこで本研究の目的は、三次元X線マイクロCTおよびFDG代謝イメージング法の併用による新規診断法の確立である。今回、まずは拒絶反応のモデル作成を行うにあたり、ラットで実際に小腸移植を行っていた。小腸移植の手技は難易度が高く、血管吻合は顕微鏡下に行う必要があるため、手技の習得のために修練を行っていた。しかし、当科の研究室移転に伴いラットの飼育が出来なくなったため、新たな小腸移植モデルの作成が必要となった。そこで、マウスを用いた小腸移植モデルの作成を行った。小腸を皮下や大網内に移植し生着した報告(周囲からの血管新生により)もあり、今回我々は小腸を血流豊富な腹壁に移植してモデル作成可能かどうかを検討した。新生仔マウスの小腸をレシピエントマウスの腹壁(腹直筋と腹膜の間)に移植し、1週間後にグラフトを観察すると、Allo移植では絨毛は委縮もしくは脱落していたが、Auto移植では絨毛高が保たれていることを確認した。また、1カ月後は、Allo移植では腸管構造が確認できなかったが、Autoでは確認可能であった。拒絶モデルとして使用できることを確認した。しかしながら、マウスの腸管は非常に小さい上に、新生仔を使用しているため、顕微鏡レベルでの確認しか難しいと考えられ、マイクロCTを用いた評価はできなかった。少なくとも新たな拒絶モデルは作成できたため、マウスではなくラットを用いた研究であれば、マイクロCTを用いた評価は可能であると考える。手技習得が困難なこと、実験室使用制限のため、新たな小腸移植モデルの作成を考慮する。現在、マウスの実験室を使用可能な状態であるため、マウスでの小腸移植モデルを作成する。過去に胎仔ラット空腸を腹壁内に移植し生着した報告があるため、同モデルをマウスに応用する。モデルが作成できれば、この方法は簡便であるため、研究は進んでいくと思われる。拒絶の判定に三次元X線マイクロCTを使用し、絨毛構造など評価可能かどうか判定する。マウス小腸移植モデルが確立した後に、マイクロCTを含めた画像診断を行っていく予定である。まずはモデルを確立していく予定である。新たな小腸移植モデルを作成し、拒絶を起こした小腸の絨毛構造を三次元X線マイクロCTを使用して判定可能かどうか評価するため。研究室移転に伴い、研究計画の変更を余儀なくされたため。マウス小腸移植モデルを確立するため、次年度に繰り越して使用する。胎仔小腸をマウス腹壁内に移植するという新しい小腸移植モデルを作成する。そして拒絶発症する場合には小腸の絨毛構造の変化を三次元X線マイクロCTを用いて評価する。
水道水及び水道原水からの自由生活性アメーバ分離と病原性の解析

大阪府内の水道原水として取水を行っている河川水から、平成17年度に分離・同定したNaegleria spp.、Acanthamoeba spp.について、PCR産物のdirect sequencingを行い、遺伝子解析を行った。分離したNaegleria属180株の遺伝子型解析を行った結果、動物に対し実験的にアメーバ性髄膜脳炎を引き起こすとされるN.australiensis、N.philippinensisなどを含むNaegleria属13種を検出した。分離したAcanthamoeba属74株について遺伝子解析を行った結果、A.castellaniiなど7種を検出した。その系統樹解析を行ったところ、アメーバ角膜潰瘍の原因となるA.castellaniiが属するType4遺伝子群に4株が属していた。さらに、水道水を対象に自由生活性アメーバの分離・同定を行った。建築物内で日常的に使用している蛇口栓(水道水質基準を満たしていることを確認している)から2試料、使用頻度の低い蛇口栓から28試料を採取した。分離・同定は、平成18年度と同様の方法で行った。採取した30試料のうち、20試料(66.7%)から自由生活性アメーバを検出し、Naegleria spp.22株、Vannella spp.2株、その他15株を同定した。日常的に使用している蛇口栓から採取した水道水からは自由生活性アメーバは検出されなかった。Naegleria属については遺伝子型解析を行っている。本研究により、水道原水中に病原性の高い種を含め多種類の自由生活性アメーバが棲息することが明らかとなった。水道水については、使用頻度の低い蛇口栓から採取した試料から自由生活性アメーバが高率に検出され、滞留が原因と考えられる自由生活性アメーバ汚染が示唆された。自由生活性アメーバ(Free-living amoebae)の中には、脳髄膜炎や角膜炎の原因となる強い病原性を有する種が存在する。また、レジオネラ属菌などの細菌類の宿主となることから、環境中における細菌増殖に深く関与している。そのため、自由生活性アメーバは、病原性の有無に関わらず公衆衛生上問題になっているが、環境中における分布実態は十分に明らかになっていない。本研究では、環境水、特にヒトが身近に接する水道水及び水道原水を対象とし、自由生活性アメーバの分布実態を明らかにすると共に、分離・同定された自由生活性アメーバの病原性の有無について解析を試みた。大阪府内の水道原水として取水を行っている河川水から374試料を採取した。自由生活性アメーバの分離は、無栄養の寒天培地に加熱処理した大腸菌を塗布した培地を使用し、フィルターろ過により捕集したアメーバを培地に貼付け、30°C及び42°Cで培養した。形成したプラークは、微分干渉機能付顕微鏡観察により形態学的に同定を行った。採取した374試料のうち、257試料(68.7%)から自由生活性アメーバを検出し、Naegleria spp.512株、Acanthamoeba spp.154株、Vannella spp.48株、Hartmannella spp.20株、Vahlkampfia spp.14株を分離・同定した。季節や地域差による検出率や検出種の偏りは見られなかった。今回の調査から、水道原水として取水している河川水中に自由生活性アメーバが広く分布していることが明らかになった。強い病原性を有する種が存在するNaegleria spp.及びAcanthamoeba spp.については、PCR産物のdirect sequencingを行い、解析を行っている。
出生前から養育期における稀な染色体異常児の母親の精神的変化とケアニーズ分析

本研究の目的は精神的経過に沿った母親のケアニーズを明らかにすることである.対象は染色体異常児を養育する母親14名で平均年齢36.7歳(25ー47歳).心理過程では14名全員に「ショック」の心理反応が出現した.不安反応は12名(85%)で最多だった.しかし,否認3名(21%),怒り2名(14%)と低頻度だった.7名(50%)の母親は悲しみの感情が5年以上持続していたため,早期からカウンセリングの必要性が示唆された.本年度は以下の目的に沿って研究を推進した.1)精神的経過に沿った母親のケアニーズの分析を行う.2)どの時期にどのような精神的変化が起こり,その時に母親にどのようなケアが必要なのかを明らかにする.母親の概要は平均年齢35.7歳(25ー47歳).子どもの染色体異常はプラダー・ウィリ症候群4名,13トリソミー1名,家族性18pー症候群1名, Wolf-Hirschhorn症候群1名,Ehlers- Danlos症候群(血管型)1名.心理過程では,8名全員に「ショック」の心理反応が出現した.不安反応は5名(63%)で最多だった.しかし,否認3名(37%),怒り(13%)と頻度は少なかった.それ以外に,自責の心理が3名(37.6%)みられた.同じ染色体異常によっても合併症に対して外科的治療が必要なケースと,内科的に治療するケースではケアニーズが異なっていた.プラダー・ウィリ症候群のように大多数が内科的治療であっても,成長ホルモン(GH)療法や糖尿病のインスリン療法に対する内科的イベントに相関して,母親のネガティブな心理(悲しみ・不安)は増加していた.これに合わせて,親管理のGH注射法,インスリン自己注射法の手技取得に対する教育的看護介入が必要だった.また,悲しみの感情は出生後から2ー3年経過しても消失しないことが確認できた.4名(50%)の母親は,医療者や教育者,親の会の同僚に,今までの経過や子どもの状況を話すごとに,悲しい気持ちになるという返答が5年近く続いていた.4名いずれも,カウンセリングは未経験の母親だった.このことから,悲しみの感情に対する,早期のカウンセリングの必要性が示唆された.本年度は以下の目的に沿って研究を推進した.1)精神的経過に沿った母親のケアニーズの分析を行う.2)どの時期にどのような精神的変化が起こり,その時に母親にどのようなケアが必要なのかを明らかにする.母親の概要は平均年齢35.7歳(25ー47歳).子どもの染色体異常はダウン症候群6名,プラダー・ウィリ症候群5名,13トリソミー1名,家族性18pー症候群1名, Wolf-Hirschhorn症候群1名,Ehlers- Danlos症候群(血管型)1名.心理過程では14名全員に「ショック」の心理反応が出現した.不安反応は12名(85%)で最多だった.しかし,否認3名(21%),怒り2名(14%)と低頻度だった.それ以外に,自責の心理が5名(36%)みられた.同じ染色体異常によっても合併症に対して外科的治療が必要なケースと,内科的に治療するケースではケアニーズが異なっていた.プラダー・ウィリ症候群のように大多数が内科的治療であっても,成長ホルモン(GH)療法や糖尿病のインスリン療法に対する内科的イベントに相関して,母親のネガティブな心理(悲しみ・不安)は増加していた.これに合わせて,親の管理のGH注射法,インスリン自己注射法の手技取得に対する教育的看護介入が必要だった.また,悲しみの感情は出生後から2ー3年経過しても消失しないことが確認できた.7名(50%)の母親は,医療者や教育者,親の会の同僚に対して,今までの経過や子どもの状況を話すごとに悲しい気持ちになるという返答が5年近く続いていた.7名いずれも,心理カウンセリングは未経験の母親だった.このことから,悲しみの感情に対する,早期のカウンセリングの必要性が示唆された.本研究の目的は精神的経過に沿った母親のケアニーズを明らかにすることである.対象は染色体異常児を養育する母親14名で平均年齢36.7歳(25ー47歳).心理過程では14名全員に「ショック」の心理反応が出現した.不安反応は12名(85%)で最多だった.しかし,否認3名(21%),怒り2名(14%)と低頻度だった.7名(50%)の母親は悲しみの感情が5年以上持続していたため,早期からカウンセリングの必要性が示唆された.本研究は我が国の小児医療・看護・保健領域において,通説として教書や論文に引用される「先天奇形を持つ子どもの出産に対する親の正常な反応に関するDrotarの仮説モデル」を使って母親の心理や精神的苦悩を理解し,看護(診療)に役立てることに限界を感じている.先天異常児を有する両親は,様々な心理的葛藤・悩みをもちながら療育しているが,心理反応の出現時期と強弱は多様であり,妊娠可能期のカップルに対する調査結果からも「世代を超えて病気が遺伝するか否か」によって精神的ダメージとその変化は異なることがわかっている.そのため,対象者を稀な染色体異常を有する児の母親に絞り込み,現在の医療実践に合わせて再検証し,現代の小児医療に合ったモデルを再提示することは看護する上で有用である.本年度は以下の4つの主目的に沿って本研究は推進した.

1.研究目的を達成するための調査内容の妥当性を検証し,インタビュー内容を検討する.2.半構成的面接法で調査する心理反応と精神的苦悩の種類を決定し,最終的なガイドラインを決定する.3.面接調査に協力できる小児科・産婦人科の医療施設へ協力の依頼を行う.4.調査可能対象が確保でき次第,調査を開始する.目的の1と2については,研究者間で半構成的面接法を用いて調査する心理反応と精神的苦悩の内容を合議の上で決定した.目的の3と4については小郡第一病院(山口県),みさかえの里(長崎県),いでんサポート・コンサルテーションオフィス(東京都)に勤務する臨床遺伝医の協力によって,対象者の確保に努めている.現時点でダウン症,プラダー・ウィリー症候群,4pー症候群など計7名の調査協力を得て調査を行った.途中であるが,その研究成果は国際学術集会での発表で承認を受けたので,報告を準備している状況である.対象者を「出生前診断の有無」「疾患の自然暦による予後良好群(報告された寿命が約10年以上)と不良群(10年以下)」に分類し,母親の心理反応の出現時期と強弱,持続期間を分析することを重要な目的と位置づけている.そのため,対象者確保が重要だが,協力を得られても面接日程が合わず,データ収集に時間を要している.対策として,新たに日本プラダー・ウィリ症候群協会の管理者と連絡を取り,対象者紹介と一部の研究協力の同意を得た.本年度も,データを積み重ねて結果の信頼性を向上させる.予算執行も次年度への繰り越しは必要なく,執行計画の大きな変更はなかった.対象者を「出生前診断の有無」「疾患の自然暦による予後良好群(報告された寿命が約10年以上)と不良群(10年以下)」に分類し,母親の心理反応の出現時期と強弱,持続期間を分析することを重要な目的と位置づけている.そのため,対象者確保が重要となる.小児臨床遺伝医による研究協力者を確保でき,対象者へのインフォームドコンセントも徐々に進んでいる.初年度は7名であるが半構成的面接を行え,プリミティブなデータを得て,分析を試みた.また,その成果は第23回Sigma Theta TauInternationalのResearch Conferenceで成果報告することが決まっている.予算執行も次年度への繰り越しは必要なく,執行計画の大きな変更はなかった.対象者の確保に努めながら,稀な染色体異常児を養育する母親の診断時(とくに出生前診断例に注目する)から幼児期までの精神的変化(ショック,否認,悲しみ,怒りなどの否定的心理反応と希望などの精神的再起や喜びの肯定的心理反応の両方)について分析を進めていく.目的達成を困難にするのは,対象となる母親の確保であるが,西日本地区での対象者確保に努めている.また,母親と医療者が抱く遺伝用語に対する感情が異なることが原因で,母親の不安感情が増幅するような事例を経験した.そのため,遺伝用語に対する感情変化についても,合わせてデータを収集する予定である.対象者の確保に努めながら,稀な染色体異常児を養育する母親の診断時(とくに出生前診断例に注目する)から幼児期までの精神的変化(ショック,否認,悲しみ,怒りなどの否定的心理反応と希望などの精神的再起や喜びの肯定的心理反応の両方)について分析を進めていく.目的達成を困難にするのは,対象となる母親の確保と予測する.中でも前方視的面接調査は調査回数が年間3回となるため,協力を得にくいかもしれない.その場合,関東方面の小児医療を行う遺伝科に協力を求める.対象者確保のためのインフォームドコンセントとその面接調査
開発途上国の理数科教育における科学的応用力に関する調査研究

本年は、カンボジア、ルワンダ、バングラデシュ、インドネシアの各地において調査を行い、その結果をまとめた。バングラにおいては、科学的応用力育成のため絵本の活用について実証的なデータのまとめを行い、一定の有効性を示せた。カンボジアについては、初等教員養成学校における探求型授業の効果を検証し、これについてもその科学的プロセススキルに伸長に対する効果が認められた。ルワンダについては子ども中心型の授業の普及度について調査したが、あまり普及していないことが明らかとなり、科学的応用力の育成は進んでいないものとみられることがあきらかとなった。一方、インドネシアにおいては、探求型授業の形跡がみられた。平成23年度は科学的応用力に関する文献を収集し、測定のためのテスト及び質問紙の開発を目的とした。この開発に当たっては、途上国の現状を授業レベルで理解するため、研究代表者、分担者及び協力者がザンビア、バングラデシュ、カンボジア、ガーナを訪問し、当該国の理科および数学のカリキュラムや教科書および授業ビデオを収集し、以下の観点から各国のカリキュラムおよび授業を分析する。その後、日本語による開発を行った後、英訳および現地語に翻訳し、現地にて調査を実施しテストの妥当性と信頼性を検討することを計画した。(1)理科における数学概念の応用力(2)理科における生活関連事象の応用(3)誤概念調査(4)科学的探究スキル(メタ認知能力・科学プロセススキル)の育成(5)論理的思考力の育成(6)実験・観察場面の提供(1)についてはザンビアにおいて比例概念について調査問題を作成した。(3)については、カンボジア王国にて地球温暖化に関する誤概念の調査をおこなった。(4)については、カンボジア王国およびバングラデシュ共和国にて科学的プロセススキルの調査を行った。(6)については、カンボジアおよびインドネシアにて実地調査を行った。尚、(2)および(5)については文献の収集については鋭意行っている。研究最終年度の本年は、カンボジア、ルワンダ、バングラデシュ、インドネシアの各地において調査を行い、その結果をまとめた。バングラデシュにおいては、科学的応用力育成のため絵本の活用について実証的なデータを収集したもののまとめを行い、一定の有効性を確認した。カンボジアについては、初等教員養成学校における探求型授業の開発の効果を検証し、これについても探求型授業の開発のための授業研究を行っている教員養成校では、科学的プロセススキルが高いことを示した。ルワンダについては、子ども中心型の授業の普及度について調査したが、あまり普及していないことが明らかとなり、今後の研究課題として残された。一方インドネシアについては、実際に数校訪問したが、そのほかの国にくらべると一定の探求型の授業がみられ、科学的応用力育成の萌芽がみられた。平成25年度は、開発途上国の生徒における科学的応用力について調査を行った。主たる対象国はカンボジア、ザンビア、バングラデシュ、ルワンダである。カンボジアにおいては、初等・中等学校の生徒および地方教員養成学校の学生に対してプロセススキルの調査を行った。さらに、ザンビアにおいては、生徒の自由研究から科学的応用力の実態を明らかにし、またバングラデシュにおいては、科学的応用力に関与する家庭的社会的要因の実態について明らかにした。いくつか未着手の項目もあるが、逆に当初の計画よりも進んでおり実際に調査している項目もあるため。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は前年度の成果に基づいて、科学的応用力の調査のいくつかを行うことができ、さらには研究発表をし、レビューを受けることができた。これは当初の計画通りであり、特に遅れは認められない。今後は、より調査対象国および調査内容を増やし、学会発表についても日本教科教育学会および科学教育学会を中心に積極的に行いたい。今年度はさらなる調査を進め、多種多様な科学的応用力の実態を明らかにしていきたい。
画質および線量評価に基づく被検者体型に適したCT撮影条件の検討

本研究では、画質および線量評価に基づいて、被検者体型に適したCT撮影条件を検討することを目的としている。今年度は、CT画質および線量評価について、主に以下の結果を公表した。画質評価について、従来法に基づいて評価したコントラストは、信号径の違いを反映しておらず、視覚的印象に合わない場合がある。また、CT画像上のノイズは、CT値の標準偏差(Noise SD)を用いて評価される場合が多いが、画像再構成関数や画像処理方法が互いに異なる画像を比較した場合、Noise SDは、視覚による主観的評価と一致しない場合がある。そこで、本研究では、移動平均フィルタを用いた画質評価方法を考案した。また、低コントラスト評価ファントムのCT画像に、この評価法を適用したところ、視覚による主観的印象とよく合っていた。これらの評価結果をまとめ、国内の関連学会で発表を行った。線量評価については、被写体サイズの異なる2種類のファントム(小児5歳および10歳児体型を模擬した人体ファントム)内の各組織・臓器位置に蛍光ガラス線量計を設置して、これを代表的なCT撮影条件で撮影することで、各組織・臓器の吸収線量を測定、評価した。また、小児5歳および10歳児体型を模擬した人体ファントムのCT画像からファントムのモデル(ボクセルファントム)を作成し、CT装置のジオメトリや撮影条件に関する各種パラメータを設定し、モンテカルロシミュレーションを行うことで、各人体ファントムの線量分布を求め、各組織・臓器の吸収線量を評価した。さらに、シミュレーション計算に基づいて評価した線量値と実測に基づいて評価した線量値を比較・評価し、シミュレーションにより評価した線量値の推定精度を評価した。これらの線量評価結果をまとめ、海外の学術雑誌に論文を投稿し、掲載された。CT検査を受診する被検者体型に即した撮影条件を検討するには、様々な被写体サイズを模擬した画質評価ファントムが必要であるが、そのようなファントムは市販されていない。そこで、本研究では、サイズの異なる2種類の低コントラスト評価用ファントムを作成している。このファントムを作成するため、診療目的で過去にCT検査を受診した小児および成人被検者のCT画像データを収集し、小児および成人体型の縦横径、周囲径、CT値などを解析し、ファントムのサイズ、ファントムのベース部(生体軟組織等価材質)のCT値を決定した。次に、ファントムのベース部やファントム内に設置する模擬腫瘤の材質を選定するため、素材の配合を変えたサンプル樹脂を複数作成した。また、ファントムサイズによって、同じ材質でも、線質硬化の影響により、CT値が異なると考えられるため、作成予定のファントムと等価直径を有する、2種類のサイズの水ファントムを作成し、この水ファントム内に、サンプル樹脂を設置した。これをCT装置で撮影し、CT画像を取得して、各サンプル樹脂のCT値を測定し、ファントムのベース濃度よりもCT値が10-20 HU程度高い樹脂素材を選定した。また、樹脂のサイズは直径3-10mm程度とし、この模擬腫瘤をファントム内に同一面内に等間隔に配置する。従って、平成30年度においてサイズの異なる2種類の低コントラスト評価用ファントムの設計および使用素材の選定は完了しており、当初の研究計画通り、本研究は、おおむね順調に進展していると思われる。今後の方針として、ファントムサイズの異なる2種類の低コントラスト評価用ファントムを完成させる予定である。また、作成した低コントラスト評価用ファントムを用いて、画像解析および線量評価を行う。画質評価については、臨床現場で使用されているCT装置を用い、撮影条件(管電圧、管電流、ピッチファクタ、ビーム幅等)や画像再構成条件を変えてファントムを撮影し、取得したCT画像を解析する。また、近年、開発された逐次近似応用再構成法に基づいた画像再構成により取得したCT画像を解析する。得られた各画像に対し、画像解析ソフトウェア(Image J、MATLAB等)を用いて、申請者らが考案した低コントラスト解析法に基づいて、コントラスト、画像ノイズ等を評価し、被写体のサイズによって、コントラスト、画像ノイズ等がどの程度異なるか評価する予定である。また、線量評価については、低コントラスト評価用ファントムの計算用モデルを作成し、CT装置とファントムを想定して線量計算体系を構築して、シミュレーション計算を行う。シミュレーション計算により得られた線量分布に基づいて、ファントムサイズによる線量の違いについて検討する。また、ファントム内の各模擬腫瘤位置での線量を推定し、画像ノイズ等の画質評価結果と線量評価結果から、線量と画質との関係性について検討する。そして、研究成果については、国内外で開催される学会や国際会議等で発表し、また、学術雑誌への投稿論文として国内外に発信する予定である。

線量評価については、被写体サイズの異なる2種類のファントム(小児5歳および10歳児体型を模擬した人体ファントム)内の各組織・臓器位置に蛍光ガラス線量計を設置して、これを代表的なCT撮影条件で撮影することで、各組織・臓器の吸収線量を測定、評価した。また、小児5歳および10歳児体型を模擬した人体ファントムのCT画像からファントムのモデル(ボクセルファントム)を作成し、CT装置のジオメトリや撮影条件に関する各種パラメータを設定し、モンテカルロシミュレーションを行うことで、各人体ファントムの線量分布を求め、各組織・臓器の吸収線量を評価した。さらに、シミュレーション計算に基づいて評価した線量値と実測に基づいて評価した線量値を比較・評価し、シミュレーションにより評価した線量値の推定精度を評価した。これらの線量評価結果をまとめ、海外の学術雑誌に論文を投稿し、掲載された。CT検査を受診する被検者体型に即した撮影条件を検討するには、様々な被写体サイズを模擬した画質評価ファントムが必要であるが、そのようなファントムは市販されていない。そこで、本研究では、サイズの異なる2種類の低コントラスト評価用ファントムを作成している。このファントムを作成するため、診療目的で過去にCT検査を受診した小児および成人被検者のCT画像データを収集し、小児および成人体型の縦横径、周囲径、CT値などを解析し、ファントムのサイズ、ファントムのベース部(生体軟組織等価材質)のCT値を決定した。次に、ファントムのベース部やファントム内に設置する模擬腫瘤の材質を選定するため、素材の配合を変えたサンプル樹脂を複数作成した。また、ファントムサイズによって、同じ材質でも、線質硬化の影響により、CT値が異なると考えられるため、作成予定のファントムと等価直径を有する、2種類のサイズの水ファントムを作成し、この水ファントム内に、サンプル樹脂を設置した。これをCT装置で撮影し、CT画像を取得して、各サンプル樹脂のCT値を測定し、ファントムのベース濃度よりもCT値が10-20 HU程度高い樹脂素材を選定した。また、樹脂のサイズは直径3-10mm程度とし、この模擬腫瘤をファントム内に同一面内に等間隔に配置する。従って、平成30年度においてサイズの異なる2種類の低コントラスト評価用ファントムの設計および使用素材の選定は完了しており、当初の研究計画通り、本研究は、おおむね順調に進展していると思われる。今後の方針として、ファントムサイズの異なる2種類の低コントラスト評価用ファントムを完成させる予定である。また、作成した低コントラスト評価用ファントムを用いて、画像解析および線量評価を行う。画質評価については、臨床現場で使用されているCT装置を用い、撮影条件(管電圧、管電流、ピッチファクタ、ビーム幅等)や画像再構成条件を変えてファントムを撮影し、取得したCT画像を解析する。また、近年、開発された逐次近似応用再構成法に基づいた画像再構成により取得したCT画像を解析する。
光学的手法に基づく新たな圧力計測システムの開発～広範囲を一台で高精度に計測～

圧力の絶対値を計測するためには、圧力計は標準器を用いて校正される必要がある。本研究では、将来の標準器の1つとするために、光学的圧力計測システムを開発している。気体の状態方程式および分子密度と屈折率の関係式を用いて、圧力は気体の屈折率と温度から求められる。光学的圧力計測システムを用いることで、1 Pa100 kPaの圧力範囲においては従来の標準器よりも小さな計測の不確かさを達成できる可能性がある。さらに、光学的圧力計測システムは、広い範囲の圧力値を高分解能に非接触かつ連続的に計測可能であるため、新たな分野に応用できる。初年度は新たな実験系の立ち上げとして、次の123の要素技術を確立した;1外部共振型半導体レーザとヨウ素安定化ヘリウムネオンレーザを用いて、ファブリ・ぺロ干渉計による屈折率計測システムの構築した、2恒温水を用いて真空チャンバの温調を行い、チャンバ内の温度を、24時間で標準偏差1 mKに安定させることに成功した、3圧力計を従来の標準器にトレーサブルに校正し、高い信頼性で圧力を計測した。その後、開発した光学的圧力計測システムの評価のために、まず、10 kPaから100 kPaまでの複数の圧力点に対して、従来の標準器で校正された圧力計と計測結果を比較した。次に、100 kPa ±9 kPaの範囲の圧力を連続的に計測した。各圧力点における繰り返し性も非直線性も、圧力計の校正の不確かさの範囲内であり、開発した光学的圧力計測システムが精確に圧力を測れていることが実証された。光学的手法の先端技術を圧力の計測に応用するために、産業技術総合研究所計量標準総合センター内の圧力真空標準研究グループと長さ標準研究グループの専門家の協力を仰いだ。結果として、光学的圧力計測システムのための、光学的な屈折率計測、温度の安定化と計測、圧力の安定化と計測、の基盤技術を迅速に立ち上げることができた。さらに、開発したシステムの評価実験を行った。繰り返し性0.1 Pa (標準偏差)、非直線性0.2 Pa (標準偏差)など、初期段階としては十分に高精度な結果が得られた。これまでに、屈折率計測システム・温度の安定と均一化・安定な圧力場の発生などの要素技術を統合し、新たに圧力計測の実験系を構築した。さらに、屈折率変化量と圧力変化量の間の直線性評価を行った。今後は、下記の研究により開発したシステムの高度化を図る;1レーザの多層膜ミラーへの浸み込み深さを計測する、2計測範囲を1 P 100 kPaに拡張し性能を評価する、3チャンバを改良することでアウトガス低減やヘリウムガスを安定的に利用可能にする。

実験系の立ち上げに必要な物品の調達および成果発表に予算を充てた結果、24円の次年度使用額が生じた。次年度の使用計画に関して、当初の予定通りに進める。
βカテニンチロシンキナーゼの同定

ヒトβ-カテニンのクローニングをPCR法を用いて行ったが、cDNAの塩基配列に異常を認めたためsite directed mutagenesis法にてより修正を行った。得られたβカテニンc-DNAを制限酵素で切断し、それらをGST-fusion proteinを発現するベクターであるpGEXベクターに組込んだ。それぞれのベクターで大腸菌DH5αをトランスフォーメーションし、IPTGの存在下に大腸菌を増殖させた。大腸菌をdetergentを含むlysis bufferにて溶解し、その可溶化液をpolyacrylamide gel(SDS-PAGE)に展開し、抗βカテニン抗体を用いたwestern blotにてGST融合蛋白質の発現を確認した。しかしながらからpGEXベクターへのサブクローニングに難渋し、また大腸菌の溶解条件が適切でなくwestern blotにて純度の高い融合蛋白質がなかなか得られなかった。諸条件を決定ののち、適切なpGEXベクターを有する大腸菌を培養し、途中でIPTGを加えさらに培養して大量に得た。これをlysis bufferにて溶解し、可溶化液をSDS-PAGEにて蛋白質の発現を確認した。次に融合蛋白質の精製のためaffinity chromatographyを行った。glutathione agarose beadsを大腸菌可溶化液とインキュベーションし、このビーズをPBSで数回洗浄ののちelution bufferでさらにインキュベーションした。elutionを数回行いSDS-PAGEを施行したが溶出効率が悪く、ビーズをsepharoseに変更しelution bufferも条件を変えた。今後は得られた融合蛋白質をSDS-Polyacrylamidegelとco-polymerizeさせる。胃癌細胞株MKN7、MKN28、MKN45、Kato-IIIよりそれぞれ細胞可溶化液を得て、それらを同ゲルに泳動する。ゲルを還元剤使用の後、泳動された蛋白質をグアニジン塩酸にて一旦変性させ、のち再生させて32Pとともにインキュベーションする。その後ゲルを洗浄、乾燥させ、オートラジオグラフィーに供する予定である。β-カテニンチロシンキナーゼの同定を目的に、始めにヒトβ-カテニンのクローニングを行っている。informed consentのうえ書面で承諾を得た後、healthy volunteerの肝組織のホモジュネートよりphenol-chloroform法にてtotal RNAを抽出した。引き続きpoly Aカラムを用いてメッセンジャーRNAを回収した。次に得られたメッセンジャーRNAより逆転写酵素にてcDNAを作製した。Gene Bankの情報に基づいてプライマーをデザインし、cDNAをtemplateとしてDNAポリメラーゼの存在下にPCR法を行い、β-カテニンcDNAの作製を試みた。しかしながらプライマーのデザインを含め、至適PCRの条件の決定に相当な時間を要した。当初、約2000塩基の連続したcDNAを得る計画であったが、PCR法の結果よりcDNAは4分割の状態で得られた。PCR法で得られたcDNAの塩基配列が正しいことを検証するためダイレクトシークエンスを行ったところ、数カ所に異常が発見された。このため現在site directed mutagenesis法により修正を行っている。今後は完成したβ-カテニンcDNAを制限酵素で切断し、GST-fusion proteinを発現するpGEXベクターに組み込み、これを大腸菌にトランスフォーメーションする。大腸菌をIPTG存在下に大量に培養し、アルカリ環境下でGST-fusion β-カテニンのみをGlutathion affinity chromatographyを用いて精製・分離し、in vitroキナーゼアッセイに供する予定である。