hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マルチカラー酸素プローブ分子群を駆使した3次元細胞内の酸素濃度イメージング

本研究の目的は,イリジウム錯体を基軸としたマルチカラー発光酸素プローブ分子を設計・合成し,3次元培養された積層細胞内や細胞塊(スフェロイド)内の酸素濃度および濃度分布を,共焦点顕微鏡を用いて高感度,非侵襲的にリアルタイム計測・イメージングすることである。平成30年度は,芳香族配位子にジエチルアミノクマリン類,補助配位子にエチレンジアミン類を用いたカチオン性イリジウム錯体の合成を行い,スペクトル特性,光物理特性,電気化学特性に関する測定を行った。また,細胞移行性の実験からエチレンジアミンの窒素原子に結合した水素をアルキル鎖に置換した化合物において高い細胞親和性およびスフェロイド透過性が向上することを見出した。開発したイリジウム錯体はりん光寿命が長いため,市販のマイクロプレートリーダーの時間分解計測機能を用いることで,りん光寿命計測ができることがわかった。生細胞にイリジウム錯体を取り込ませ,細胞の呼吸活性を変化させる試薬を添加したところ,呼吸を活性化する試薬では,細胞内の酸素濃度が時間に依存して減少すること,一方,呼吸を阻害する試薬では,酸素濃度が増加することを定量的に示した。平成29年度に開発した共焦点蛍光・りん光寿命顕微鏡を用いることで,スフェロイド内部が低酸素状態になることを定量的に示した。また,平面培養細胞と同様に細胞の呼吸活性を変化させる試薬を添加したところ,スフェロイドにおいても細胞内の酸素濃度が時間に依存して変化することを定量的に明らかにした。平成30年度は,可視光から近赤外光領域にりん光を示し,また,りん光寿命が長いカチオン性イリジウム錯体の合成,および溶液中における物性評価を行った。開発したイリジウム錯体を用いて細胞内移行性や細胞内におけるりん光特性に関する実験を行った。その結果,高い細胞親和性を示すイリジウム錯体の構造やスフェロイド内における酸素濃度勾配について明らかにした。さらに,市販のプレートリーダーを用いることで,生細胞内の酸素化状態が検出できる方法論を確立した。以上の結果は,平成30年度に達成すべき目標であることからおおむね順調に研究が遂行できたと考えている。現在,成果を投稿論文にまとめている。平成29年度は可視光領域にりん光を示すイリジウム錯体の開発を行った。平成30年度は,近赤外光領域にりん光を示し,また,スフェロイド親和性を有するイリジウム錯体を設計・合成する。開発したイリジウム錯体および共焦点蛍光・りん光寿命顕微鏡を用いて,スフェロイド内部の酸素濃度に加えて,他のバイオイメージングプローブも併用して,酸素濃度と細胞の代謝過程の相関に関する研究を実施する。平成30年度は可視光から近赤外光領域にりん光を示すイリジウム錯体の開発を行った。平成31年度は,寿命計測法を用いることなく,細胞内の酸素レベルを明らかにするプローブ分子を開発する。具体的には,蛍光団とりん光団をオリゴアルギニンリンカーで結合させた分子を合成し,蛍光強度とりん光強度の比(レシオ)を計測する。開発した酸素プローブを用いて,スフェロイド内部の酸素濃度をレシオ法によって明らかにする方法論の確立を目指す。
H.pyloriの胃酸分泌機構に与える影響-プロトンポンプ遺伝子発現との関連より

H.pylori感染と胃酸分泌との関連については一定の見解はない。そこで、H.pylori感染の胃液pHに与える影響について検討した。H.pylori陽性の消化性潰瘍患者、及び、H.pylori陰性者を対照とした。内視鏡検査時に胃液採取し、pH及びアンモニア濃度を測定した。前庭部大彎及び体上部大彎より生検し、組織所見をシドニーシステムに準じて検討した。消化性潰瘍患者についてはPPIを68週間投与し、治療開始後の2週間に抗生剤投与を行い、治療の前後で血清ガストリン値とともに比較検討した。治療前の組織所見では、胃潰瘍(GU)、特に胃体部胃潰瘍は、十二指腸潰瘍(DU)に比して特に体部の萎縮が進行し、胃炎の活動性が高く、H.pylori数も有意に多かった。治療前の胃液pH、血清ガストリン値はGU、DU、健常群の準に高かった。消化性潰瘍群の胃液中アンモニア濃度は対照群より有意に高かったが潰瘍の部位別には有意差は認めなかった。除菌成功群では胃液pH、アンモニア濃度、血清ガストリンは有意に低下したが、非除菌群では有意な変化を認めなかった。除菌により胃炎の活動性、炎症所見の有意な改善を認めたが、非除菌群では有意な改善は認めなかった。粘膜萎縮や腸上皮化生には除菌の成否に関わらず有意な変化は認めなかった。今回の検討では、胃体部の胃炎の重症なほど胃液pHが高く、胃体部胃炎が胃酸分泌抑制に関わっていることが示唆された。特に除菌後の胃酸分泌に伴い、胃体部胃炎の内、H.pyloriの菌量、活動性、炎症性変化が最も大きく改善したのに対し、萎縮や腸上皮化生が十分改善しなかったことから、H.pylori菌体自身や、炎症性の変化が胃酸分泌抑制に関与していると考えられた。つまり、H.pylori感染があり、胃体部での菌量の増加や、胃炎の重症化が酸分泌能を障害し、そのため代償性にソマトスタチンの低下とガストリンの分泌増加を来すことが考えられる。そして、体部胃炎の進行、体部の菌量の増加と伴い高ガストリン血症で酸分泌低下は代償されず、GUの様に低酸を示すようになると考えられる。そして、H.pyloriの除菌によって、炎症の改善とともに酸分泌は改善してくるのである。H.pyloriと胃酸分泌の関連については一定の見解はない。そこで、H.pylori感染の胃液酸度に与える影響について検討した。H.pyloriの除菌の前後で、胃液pH、血清gastrinの変化を検討した。除菌成功群では血清gastrinは有意に低下したにも関わらず胃液pHがあ有意に低下したことから、H.pyloriは酸分泌を抑制し、その結果として血清gastrinが上昇している可能性が示唆された。

そして、除菌によってH.pyloriによる酸分泌抑制が解除されると代償性に上昇していたgastrinが低下すると考えられた。さらに、H.pylori感染胃粘膜ではPPI投与終了後の胃内pHが高く持続することから、H.pylori感染は壁細胞でのプロトンポンプの合成を抑制している可能が示唆された。そこで、胃体部大彎粘膜中のプロトンポンプmRNAを定量した。H.pyloriの除菌の前後で胃体部粘膜内プロトンポンプmRNAが増加したことより、H.pyloriの酸分泌抑制の機序として壁細胞のプロトンポンプの遺伝子発現を抑制する機序の関与が示唆された。H.pyloriの壁細胞に対する抑制作用の機序として、IL-1 beta及びTNF-αの酸分泌抑制性の炎症性サイトカインの関与が考えられている。そこで、胃粘膜内IL-1 beta及びTNF-αmRNA量を測定したところ、それらは胃液のpHと有意な相関を示し、こうしたサイトカインが酸分泌抑制に関わっていると考えている。また、H.pylori除菌前後で血清pepsinogen I/II比測定し、その変化率を除菌の成否別に検討したところ、治療前値に応じてカットオフ値を設けることによってPCR法に匹敵する高い感度・特異度を示す除菌のマーカーになることが明らかになった。H.pylori感染の胃酸分泌に与える影響について検討した。内視鏡的に病変が確認されたH.pylori陽性の消化性潰瘍患者及び、H.pylori陰性の健常者を対象とし、胃液のpH、アンモニア濃度、組織所見、血清ガストリン値を比較検討した。さらに、消化性潰瘍患者はLansoprazoleとAMPCで治療し、H.pyloriの除菌の成否別に変化を比較検討した。また、胃体部粘膜内interleukin1-beta(IL-1 beta)のmRNAを定量し、さらにスナネズミによるH.pylori感染モデルにおいても検討した。治療前の組織所見では、体部胃炎の活動性や菌量が多いほど胃液pHは高くなり血清ガストリン値も高値を示した。胃液pHとアンモニア濃度の間に有意な関連は認めなかった。また、除菌が成功すると胃液pH、アンモニア濃度、血清ガストリン濃度は有意に低下し健常対照群と同程度の値になったが、除菌失敗群では有意な変化は認めなかった。以上より、H.pylori感染は酸分泌に関して抑制的に作用し代償性に血清ガストリンが高値を示していると考えられた。また、除菌により胃炎の活動性、炎症所見の有意な改善を認めたが、粘膜萎縮や腸上皮化生には有意な改善は認めなかったことより、胃酸分泌抑制に関与するのは萎縮性変化よりも、H.pylori感染に伴う体部の炎症性変化であると考えられた。そこで、炎症性サイトカインの一つであるIL-1 betaと胃液pHとの相関を検討したところ、有意な正の相関が得られ、H.pylori感染に伴い誘導されるIL-1 betaが酸分泌抑制に関与していることが示唆された。また、スナネズミにH.pyloriを感染させると胃酸分泌低下、血清ガストリンの上昇を認めたが、IL-1 betaのアンタゴニストを投与することにより胃酸分泌の回復、血清ガストリンの正常化を認めた。以上より、H.pylori感染は胃酸分泌抑制に働き、その機序の一つとして、H.pyloriの胃体部感染によって誘導されたIL-1 betaの関与が示唆された。
迅速分離・濃縮・定量を目指した薄層液液界面電気化学セルの開発

液液界面イオン移動ボルタンメトリーにおいて水相と有機相を薄層にすると、短時間で効率よくイオンを分配させることができる。これによって、イオン性化学種の絶対定量や、濃縮・分離が達成できる。しかし、それぞれの相には電極を挿入する必要があるため、電極反応物が相を汚染するなどの理由で薄層化が困難であった。本研究では、水相には銀・塩化銀電極を、有機相には導電性高分子で被覆したITO電極を用いることで、水相と有機相を薄層化した電気化学セルの開発を行った。本研究の目的は、イオンの高濃縮およびクーロメトリー的定量を目指して、水相と有機相を薄層にした液液界面電気化学セルを開発することである。特に、薄層有機相用の参照電極および対極となり得る電極がほとんど提案されていないため、本年度は、薄層有機相用の電極の開発を行い、薄層有機相を用いた液液界面イオン移動ボルタンメトリーに適用した。薄層有機相用電極として、ポリチオフェン被覆ITO電極を作成した。ポリチオフェンには、疎水性支持電解質アニオンをドープした。作成したポリチオフェンは、ITO電極に対して良好な接着性を示し、ジクロロエタンなどの有機溶媒にも溶解しなかった。同電極の電位は、疎水性支持電解質アニオンのドープ・脱ドープを伴ったポリチオフェンの酸化還元によって決定されることを確認した。したがって、同電極は、電極反応が生じても電極反応物は、液液界面イオン移動ボルタンメトリーでの測定を妨害しない。同電極上に有機相を含浸させたテフロン多孔質膜を被覆することによつて、厚さ75μmの薄層有機相を形成し、薄層有機相と水相との界面で、イオン移動ボルタンメトリーを測定した。その結果、通常の電気化学セルで測定した液液界面イオン移動反応と同様に、イオンの界面移動が電気化学的に検出でぎることが分かつた。検出されたシグナルは、通常のセルで測定したものより、若干非可逆であった。これは、ポリチオフェン被覆ITO電極の非可逆性に起因する。この問題は、対極面積に対し液液界面面積を大きくすることによって解決できた。液液界面イオン移動ボルタンメトリーにおいて、微量イオンの絶対定量、濃縮・分離を行うためには、水相と有機相を薄層にした電気化学セルが必要である。有機相で用いる導電性高分子として、各種ポリチオフェン誘導体を検討した結果、ポリマーの酸化電位がそれほど高くなく、ジクロロエタンなどの有機溶媒にも溶解しないpoly(3, 4-ethylenedioxythiophene), PEDOT,を選択した。PEDOTに対して、有機相中の支持電解質アニオンをドープさせることで、有機相を汚染しないPEDOT被覆電極を作成した。PEDOT被覆電極は、電解重合によって作成したが、電極の応答性がもっともよい電解条件を検討した。その結果、充放電容量が7mC cm^<-2>で、有機相中の支持電解質アニオンの濃度に対して良好なNernst応答を示す電極を作成した。電極電位は、同じ条件で作成した場合、±10mV以内で再現よく一致した。同電極を有機相中の対極および参照電極として用い、2電極式の薄層液液界面電気化学セルを作成した。水相と有機相の厚さは、75μmである。同セルを用いて、液液界面イオン移動ボルタモグラムを測定した結果、可逆なイオン移動ボルタモグラムを得ることができた。したがって、作成した薄層セルは、十分に微量イオンの絶対定量・濃縮・分離に応用できる。
認知症高齢者の終末期ケアを担うケア専門職に対する実践能力育成システムの開発

認知症高齢者の終末期ケアにおいては、生活の場での認知症ケア経験の乏しい看護職・終末期ケア経験の乏しい介護職などケアに関わる専門職の認知症・終末期ケアの力量不足、ケア専門職の協働に関する課題、継続ケアに関する課題、医師の協力体制の促進など課題は多い。そこで、本研究では「認知症高齢者が住み慣れた希望の場所で最期まで生きること」を生活の場で支える機会の多いケア専門職に焦点を当て、認知症高齢者終末期ケア実践における現状と取り巻く課題を明らかにした上で、特に生活の場で認知症高齢者の終末期ケアを担う人材の実践力育成のあり方を検討することを目的とした。2018年度は、「認知症高齢者が住み慣れた希望の場所で最期まで生きること」を生活の場で支える機会の多い介護職に焦点を当て、2017年に実施した介護職を対象とした終末期ケアに対する認識調査の結果を踏まえて研修プログラムの内容を検討し、実施した。研修には1県の介護福祉士会に所属する会員のうち30名が参加し、評価として満足度は全体に高い傾向にあった。やや不満足と回答した者では、理解が難しかった、もっと専門的な内容を知りたかったという両極の意見が見られ、基礎的な内容から発展的な内容まで、対象の力量に応じた研修の選択が可能となるような系統立てた研修の必要性が示唆された。今回は、介護職のみの介入となったが、今後は、多職種合同で終末期における共通のテーマで研修会をするなど、本研究の結果を様々な方向に発展させていきたいと考えている。これまでの研究報告等では、ケア専門職の知識・技術習得のための勉強会・講演会、看取り後の事例検討など、課題解決に向けた単独のテーマに関する介入が報告されており、効果の検討がなされて来た。しかし、認知症高齢者の終末期ケアは、その多様性から知識・技術の習得のみでの実践は難しく、特に職員の入れ替わりの多い事業所においては、ケア専門職の経験実態に応じた支援内容が必要とされる。そこで、本研究では「認知症高齢者が住み慣れた希望の場所で最期まで生きること」を生活の場で支える機会の多いケア専門職に焦点を当て、認知症高齢者終末期ケア実践における現状と取り巻く課題を明らかにした上で、特に生活の場で認知症高齢者の終末期ケアを担う人材の実践力育成のあり方を検討することを目的としている。認知症高齢者ケアに精通し、実際に生活の場での認知症高齢者終末期ケアにかかわる専門職の人材育成に携わっていると考えられる対象に聴き取り調査を行う事で、より実践に即した課題の抽出と実践力育成のあり方の検討に向けた建設的な示唆が得られると考えた。実施計画として、2年に渡りインタビューを実施し、その後認知症高齢者終末期ケアにかかわる専門職を対象に質問紙調査を行う予定としている。1年目となる本年は、情報収集・インタビュー内容の検討とプレテストの分析を行った。当初の計画より、2年に渡り情報収集として聴き取り調査・質問紙調査を行う予定であった。1年目は、情報収集・インタビュー内容の検討に時間をとり、プレテストの分析に時間を当てた。次年度前期より聴き取り調査実施予定であり、当初の計画通り進行していると考えている。認知症高齢者の終末期ケアは、その多様性から知識・技術の習得のみでの実践は難しく、特に職員の入れ替わりの多い事業所においては、ケア専門職の経験実態に応じた支援内容が必要とされる。実施計画として、開始年度より2年に渡りインタビューを実施し、その後認知症高齢者終末期ケアにかかわる専門職を対象に質問紙調査を行う予定としている。2年目となる本年は、生活の場における認知症高齢者ケアに精通したケア専門職として、、1)認知症ケア専門士資格(認知症ケア学会認定資格)を持つ介護職、2)認知症ケア専門士資格(認知症ケア学会認定資格)を持つ看護職、3)勤務5年以上の経験を持つ訪問看護師、4)認知症認定看護師の看護職(認知症認定看護師)を対象としフォーカスグループインタビューを行った。今後、質的に分析を行い次年度の質問紙調査実施に繋げる予定である。当初の計画より、2年に渡り情報収集として聴き取り調査を行う予定であった。当初の計画通り進行していると考えている。

また、認知症高齢者の終末期ケアは、その多様性から知識・技術の習得のみでの実践は難しく、特に職員の入れ替わりの多い事業所においては、ケア専門職の経験実態に応じた支援内容が必要とされる。そこで、本研究では「認知症高齢者が住み慣れた希望の場所で最期まで生きること」を生活の場で支える機会の多いケア専門職に焦点を当て、認知症高齢者終末期ケア実践における現状と取り巻く課題を明らかにした上で、特に生活の場で認知症高齢者の終末期ケアを担う人材の実践力育成のあり方を検討することを目的としている。2017年度は、2016年度の聞き取り調査の結果を踏まえ、「認知症高齢者が住み慣れた希望の場所で最期まで生きること」を生活の場で支える機会の多いケア専門職の中でも直接生活にかかわる機会の多い介護職に焦点を当て、認知症高齢者終末期ケア実践における現状と取り巻く課題を明らかにするための質問紙調査を行った。調査は、郵送による自記式質問紙調査で、1県の介護福祉士965名を対象とし、2018年3月に実施した。内容は、対象者概要、職場の状況、認知症ケアに対する認識、終末期ケアに対する認識で構成した。分析の後、結果を踏まえて最終年度に実施予定の研修プログラム内容を検討する予定である。当初の予定通り、2017年度は、2016年度の聞き取り調査結果を踏まえた質問紙調査を行った。認知症高齢者の終末期ケアにおいては、生活の場での認知症ケア経験の乏しい看護職・終末期ケア経験の乏しい介護職などケアに関わる専門職の認知症・終末期ケアの力量不足、ケア専門職の協働に関する課題、継続ケアに関する課題、医師の協力体制の促進など課題は多い。そこで、本研究では「認知症高齢者が住み慣れた希望の場所で最期まで生きること」を生活の場で支える機会の多いケア専門職に焦点を当て、認知症高齢者終末期ケア実践における現状と取り巻く課題を明らかにした上で、特に生活の場で認知症高齢者の終末期ケアを担う人材の実践力育成のあり方を検討することを目的とした。2018年度は、「認知症高齢者が住み慣れた希望の場所で最期まで生きること」を生活の場で支える機会の多い介護職に焦点を当て、2017年に実施した介護職を対象とした終末期ケアに対する認識調査の結果を踏まえて研修プログラムの内容を検討し、実施した。研修には1県の介護福祉士会に所属する会員のうち30名が参加し、評価として満足度は全体に高い傾向にあった。やや不満足と回答した者では、理解が難しかった、もっと専門的な内容を知りたかったという両極の意見が見られ、基礎的な内容から発展的な内容まで、対象の力量に応じた研修の選択が可能となるような系統立てた研修の必要性が示唆された。今回は、介護職のみの介入となったが、今後は、多職種合同で終末期における共通のテーマで研修会をするなど、本研究の結果を様々な方向に発展させていきたいと考えている。今後は、当初の計画通り聞き取り調査を進める。得られた結果を参考に、実際に生活の場で高齢者終末期ケアに関わるケア専門職を対象とした質問紙調査を行い、認知症ケアに精通した者が求める力と、実務で困難感を抱いている者が得たいと考える力の差異など、現実の課題を捉えていきたいと考えている。その上で力量形成に向けた効果的な研修方法等について検討していく予定である。今後は、当初の計画通り聞き取り調査の分析を進める。
情報の受信・発信による若者の地方都市定着へ向けての社会学的研究

本研究は、「情報の受信・発信による若者の地方都市定着へ向けての社会学的研究」である。平成8年から9年度の2年間にわたり本研究テーマに沿った研究を別紙報告書記載の通り論じてきた。特に、社会学的研究という性格をふまえ学説研究としてのアプローチ、実証研究としてのアプローチをバランスよく取り入れることにした。学説研究としては、情報の受信・発信をメディアに求めた。それは映像による若者への影響を映画を媒体に考えた。それにはH・ブルーマ-の社会理論が適切であると考え、本研究の理論背景はブルーマ-の理論に負った。次にそれを実証するために、地方都市として国内と海外2つの都市を取り上げた。国内は、山形県北山形高瀬集落、海外はカナダ、プリンス・エドワード州をその対象地とした。この都市はいずれも映画の舞台となり多数の若者が集う場所でもあった。そこには女性分化としての性格が存在してそり、その視点も含めたヒアリングを実施することになった。その結果は、単なる流行りとする影響ではなく、生活様式まで取り入れた情報受容のスタイルがあった。学説研究、理論研究の2つのアプローチから若者の地方都市定着へ向けて、社会学が何をすべきかという課題にひとつの問題提起をなす結果として、情報の受信・発信がリアルに実施され、それが若者へ1次情報として認知される環境形成が不可欠なこと。これに応えられるべき環境の整理こそが若者を地方都市に定着させる処方箋に成り得ることなどが明らかにされた。その包括的な環境こそ若者がもっとも望んでいることであると考えられる。本研究は、地方都市から大都市に流出する若者をいかに地方都市に定着させるかを情報の受信・発信の視点から研究を施すものである。これまでの仮説から地方都市の若者が大都市の流出する大きな要因にひとつに情報量の問題があると考える。そして情報量の問題を解決するために、地方都市も大都市と同様にテレビジョンのキ-局すべてがリアルタイムで放映されることを第一に考えた。同時に地方都市に定着するためには映画や雑誌等の舞台になり、そこに若者のアイデンティティが共有されることにあると考えた。そこで、若者のアイデンティティ共有には10代から30代、さらに40代にもかかわる映画や雑誌の舞台となり、多くの人びとに影響を与えてきた、(1)スタジオジブリ。(2)L・M・モンゴメリ-の作品。そして(3)ビアトリクス・ポタ-。以上の3領域を対象にしてヒァリングを中心とした予備調査を実施してきた。スタジオジブリの作品では山形県高瀬地区。新潟県栃尾市。モンゴメリ-の作品ではカナダ。そしてポタ-の作品ではイギリスと国内外を訪れた。いずれも日本人女性に大きな影響を与えたものであり、そこには若者のみならず幅広い人びとのあこがれの地でもあった。予備調査の段階では、いずれも地方都市ならではの美しい風景が存在していること。そして映画や雑誌等にて紹介された以上の舞台であることが明らかになった。つまり地方都市といえどもそこに人びとのアイデンティティを共有するものが存在していることを意味している。本年度の実績としては以上の点である。最終年度は、いかに若者のアイデンティティの共有が可能かを模索し、ある本年度は、本研究の最後の年にあたるためにその成果をまとめるための作業を中心に行った。その結果は、別の研究成果報告書に詳細にまとめたのでそれを参照されたい。その他に本年度は、本研究テーマにある、情報の受信・発信という概念を明確にするため、取り上げたのが若者に影響を与える媒体のひとつである映画であった。映画はマス・メディアのひとつであるとともに、放送(TV)と同様に映像を中心としている。特に、映像に対する認知度が高いのは当然のように若者であった。その若者に映画が与えた影響を、学説研究であるH・ブルーマ-の実証研究を参考にした。その理論の背景にある模倣と受容過程を実際の映画に置き換え、検討を加えてみることにした。

そして、映画と人間行動として、今日映画が若者に与えた意思決定をいくつかの事例をもとに分析してみた。それに該当させたのが、日本におけるスタジオジブリの作品、海外においてはケヴィン・サリヴァンの作品であった。昨年に続いて、山形県北山形高瀬集落、カナダ、プリンス・エドワード州をたずね、そこに集う若者を中心として、女性文化の視点も含めたヒアリングを実施した。その結果は報告書に記してあるものの映像という媒体の影響力の根強いことを伺わせる結果も多く判明した。TVとはまた違った見方もできたことに興味をひかれた。いずれにせよ、本年度は昨年度の補充調査も実施し、学説的背景を研究成果にまとめあげることを中心に行うことができた。若者の地方都市定着へ向けて、社会学が何をすべきかという課題にひとつの問題提起をなす結果と考えてる。
環境変化の下での日本国債市場の改革とその提言

本研究では、semi-strongフォームの効率性仮説のテスト、すなわち、公開情報の影響を調べるイベント・スタディにより効率性の検証を行うとともに、市場の効率性を高めるための方策として特に個人投資家の参加を取り上げた。1996年から98年まで、あるいは96年から02年までの期間において、わが国の長期国債(現物)の利回り、あるいは長期国債先物のボラティリティがマクロ経済変数のアナウンスやニュースの影響をどのように受けているかを、現物のtickデータ、あるいは先物の日次データを用いて調べ、市場の効率性をテストした。tickデータによる分析では、期待形成を表す要素が平均回帰的であると仮定するアフィン・イールド・モデルを用い、日次データによる分析では、平均からの乖離で測ったアクチュアル・ボラティリティと・オプションから計算されるボラティリティとを用いて、マクロ指標の発表のうち中予想されない部分、つまりサプライズが利回りの変化に与える影響を計測した。得られた結果は一様ではないものの、いずれも市場に非効率性が存在することを示唆している。本研究とこれまでのテストの結果を合わせ考慮すると、国債流通市場では情報が効率的に取り込まれていないとみられ、その理由として、政府や中央銀行の保有割合が高く、情報を効率的に利用しようとする民間主体の行動が反映されにくいことが考えられる。そこで、本研究では国債市場に個人投資家を呼び込むための改革を取り上げ、今後の国債管理について持つ合意を探った。今年度は、研究課題のうち、semi-strongフォームの効率性仮説のテスト、すなわち、公開情報の影響を調べるイベント・スタディにより効率性の検証を行うとともに、市場の効率性を高めるための方策として特に個人投資家の参加を探った。1996年7月から98年3月までの期間において、わが国の長期国債(現物)の流通利回りが日銀と資金運用部のオペを含むマクロ経済変数のニュースの影響をどのように受けているかを、長期国債の最長期物に近い銘柄であそ182回債(05年9月償還)のtickデータを用いて調べ、市場の効率性をテストした。期待形成を表す要素が平均回帰的であると仮定するアフィン・イールド・モデルを用いて、マクロ指標の発表のうちの予想されない部分、つまりサプライズが利回りの変化に与える影響を計測した。得られた結果によれば、指標のグループにより影響の持続時間は異なっているが、いずれも市場に非効率性が存在することを示唆しているとの結果が得られた。本研究の結果とこれまでのテスト結果を合わせて考慮すると、国債流通市場では情報が効率的に取り込まれていない。このように市場の効率性が達成されない理由としては、政府や中央銀行の保有割合が高く、情報を効率的に利用して価格メカニズムを生かそうとする民間経済主体の行動が反映されにくいと考えられる。そこで、本研究では国債市場に個人投資家を呼び込むための改革とこれまでの経緯を取り上げ、それらが今後の国債管理について持つ含意を探った。今年度は、国債先物の日次データを用いてsemi-strongフォームの効率性仮説のテスト、すなわち、公開情報の影響を調べるイベント・スタディにより効率性の検証を行った。1996年、または97年から02年までの期間において、長期国債先物のボラティリティがマクロ経済変数の予定されているアナウンスや予定されていないニュースの影響をどのように受けているかを、先物の日次データを用いて調べ、市場の効率性をテストした。平均からの乖離で測ったアクチュアル・ボラティリティと、長期国債先物オプション・データから計算されるインプライド・ボラティリティとをそれぞれ用いて、マクロ指標の発表のうちの予想されない部分、つまりサプライズが利回りの変化に与える影響を計測した。得られた結果は次のとおりである。いくつかのマクロ指標アナウンスメントの公表時にボラティリティは即時的に反応している。アナウンスメントを予測してアナウンスメント前にボラティリティが大きくなる。予定されているアナウンスメントのみがある日の後のボラティリティの持続期間は、予定されていないニュースがある日の後の持続期間より短く、かつ、ニュースの全くない日の後の持続期間よりも長い。予定されているアナウンスメントのみのボラティリティの持続期間は、予定されていないニュースの後のそれよりも短くない。
ニワトリの抱卵期における自発的低エネルギー状態への適応戦略の解明

我々は、炎症の指標として知られるC-reactive protein (CRP)の遺伝子発現が抱卵中のニワトリ視床下部で増加することを見出した。近年、CRPが飽食ホルモン・レプチンの作用を阻害することが示され、エネルギー代謝との関連が示唆されている。また、抱卵中のニワトリは自発的に摂食を抑制し、低エネルギー状態へ適応する。このような背景から、本研究では、「エネルギー摂取量と脳内CRP発現の関連性」、「レプチン情報伝達に対するCRPの影響」、「脳内CRPの局在」を解析し、抱卵期のニワトリの摂食及びエネルギー代謝に対するCRP関与の可能性について明らかにする。
発現遺伝子解析によるベネズエラ糞線虫の感染機構の解明

ネズミ類に寄生する腸管寄生線虫であるベネズエラ糞線虫の感染幼虫の発現遺伝子を、コンベンショナルなESTライブラリと新型シーケンサによる大規模解析で分析した。感染幼虫特異的に発現している遺伝子の多くは機能不明であったが、複数のアスタシン様メタロプロテアーゼがあり、宿主侵入に際し機能していると考えられた。さらに、宿主侵入後に発現するメタロプロテアーゼも多数みられ、寄生適応におけるアスタシン様メタロプロテアーゼの重要性が示唆された。糞線虫や鉤虫などの腸管寄生線虫では、感染幼虫と呼ばれる感染型の幼虫が宿主の皮膚から侵入することが感染の最初のステップである。感染幼虫は外界の環境に耐え、宿主に接触すると直ちに侵入を開始する。感染幼虫による宿主侵入の分子機構の理解は、土壌媒介性寄生虫類の寄生適応の理解に貢献するだけでなく、感染制御の新手法を開発することにつながる。本研究では、感染幼虫の発現遺伝子を網羅的に解析し、宿主侵入に関与する遺伝子の発現を抑制し、侵入機構を明らかにする。最初に、従来法によりベネズエラ糞線虫感染幼虫のcDNAライブラリを作成してクローンの塩基配列を決定し、得られたEST塩基配列のアノテーションをおこなった。その結果、呼吸関連遺伝子、シャペロン遺伝子、神経筋関連遺伝子、プロテアーゼ遺伝子などが認められた。次に、より多種類のトランスクリプトの取得と発現の定量的解析のために、次世代型シーケンサによって感染幼虫のcDNA解析を大規模におこなった。その結果、383,553リードの塩基配列から、アセンブルによって4,966本のコンティグ(cDNA配列)を得た。各コンティグの厚みは発現量を反映していると考えられるので、厚みにしたがって発現量の多い遺伝子を調べたところ、アスタシン様40kDaメタロプロテアーゼ遺伝子の発現が圧倒的に多く、これにマダニ唾液腺タンパク相同タンパク質などが続いていた。わずかずつ塩基配列に違いのあるコンティグが多数出現することから、このメタロプロテアーゼ遺伝子はファミリーを形成している可能性がきわめて高く、RT-PCRによる発現分析から、おそらくそのすべてが全生活環の中で感染幼虫期においてのみ発現していると考えられた。アスタシン様40kDaメタロプロテアーゼの機能は宿主侵入と考えられ、ベネズエラ糞線虫の感染幼虫にとってもっとも重要なタンパク質であろう。糞線虫や鉤虫はいわゆる土壌媒介性の寄生虫であり、深刻な健康被害と社会的損失をもたらしている。しかしながら代表的な「顧みられない病気」であり、病原体に関する研究は少ない。糞線虫や鉤虫では「感染幼虫」と呼ばれる感染型幼虫が土壌中で宿主との遭遇を待ち、宿主に接触すると直ちに皮膚からの侵入を開始する。感染幼虫が効率よく宿主に侵入することは寄生虫として存在する上で必須であり、感染幼虫による宿主侵入の分子機構を知ることは土壌媒介性寄生虫類の寄生適応の理解に貢献するだけでなく、感染制御のあたらしい方法を開発することにつながる。本研究計画では、マウス・ラット類の腸管寄生線虫であるベネズエラ糞線虫を用いて、感染幼虫の生物学的な特性と宿主侵入機構を分子レベルで明らかにする。平成21-22年度の研究では、ベネズエラ糞線虫感染幼虫のコンベンショナルなcDNAライブラリを作製しESTデータベースを構築した。それにより、アスタシン様メタロプロテアーゼやL3NieAgなど、感染幼虫において特異的に発現している遺伝子の発現分析などをおこなった。さらに発現遺伝子をより詳細に検討するために、高速シーケンサによって60万リード以上のESTを分析した結果、アスタシン様メタロプロテアーゼやL3NieAgに加えて、感染幼虫特異的なタンパク質として、アセチルコリンエステラーゼ、グリセロールキナーゼ、コリンエタノラミンキナーゼなどが得られた。とくに興味深いのはアセチルコリンエステラーゼで、ベネズエラ糞線虫は、感染幼虫特異的なものと他のステージに特異的なアセチルコリンエステラーゼを何種類か持ち、これらを発育段階によって使い分けている可能性が示唆された。最終年度はこれらのタンパク質の詳細な解析を進める予定である。糞線虫や鉤虫は、世界的には深刻な健康被害と社会的損失をもたらしているが、代表的な「顧みられない病気」であり病原体に関する研究は少ない。糞線虫や鉤虫感染の最初のステップは、感染幼虫と呼ばれる感染型の幼虫が宿主の皮膚から侵入することである。本研究では、ラットの腸管寄生虫であるベネズエラ糞線虫をもちいて、感染幼虫の発現遺伝子を網羅的に解析し、宿主への侵入機構を明らかにすることを目的とした。発現遺伝子の解析は、従来法による感染幼虫期cDNAのクローンライブラリの作製とシーケンシング、次世代型シーケンサによる孵化直後の幼虫期、感染幼虫期、体内移行幼虫期、成虫期の大規模cDNAフラグメント解析の両方によった。

その結果、従来法で感染幼虫期に特異的な発現が観察されたアスタシン様メタロプロテアーゼは大きな遺伝子ファミリーを構成していることが次世代シーケンサによる大規模データから推測され、感染幼虫期のみに発現しているものだけでなく、体内移行期のみに発現しているものや全生活環を通じて発現しているものなど多数あることが明らかとなった。次世代シーケンサによる大規模シーケンシングでは、約250万のリードから9,843遺伝子がアセンブルされ、発現解析が実施された。興味深いことに、感染幼虫特異的に発現している遺伝子は、上述のメタロプロテアーゼ以外ではアセチルコリンエステラーゼなどがあったが、既知のタンパク質との相同性がないものが多く約半数が機能不明であった。現在のところ感染幼虫の遺伝子ノックダウンには成功していないが、これらの機能不明遺伝子の機能を何らかの手段により明らかにすることが、感染機構の解明に不可欠と考えられる。また、以上の研究過程において、糞線虫類は進化の過程でいったん失ったフェロケラターゼ遺伝子を、細菌からの遺伝子水平転移によって獲得したことを明らかにすることができた。
分裂期染色体の脱凝縮を制御する遺伝子の解明

M期の終了にはサイクリンBの分解に依存したMPFの不活性化が必要であり、サイクリンBはM期中期から後期の移行期に分解される。このサイクリンBの分解はユビキチン化に依存したプロテアソーム系を介して行われると考えられている。ユビキチン化はE1,E2およびAPC(Anaphase-promotingcompex)またはサイクロソームと呼ばれる複合酵素系で行われると考えられているが未だその酵素活性の調節機構は明らかになっていない。そこで哺乳動物細胞を用いたサイクリンBのユビキチン化の系の開発とともに、ユビキチン化酵素の同定を試みた。バキュロウイルス系で発現させたGST-サイクリンB融合蛋白質/cdc2複合体、ビオチン化ユビキチンを基質として、マウスユビキチン活性化酵素(E1)とHeLa細胞の抽出液を酵素源としたin vitroサイクリンBユビキチン化の系を確立した。この系に大腸菌で発現させた各種ヒトユビキチン輸送蛋白(E2)を添加したところUBC4とUBCH5はサイクリンBのユビキチン化を著しく促進したが、UBC3、E2-EPFには促進効果はなかった。一方最近、クラム、XenopusサイクリンB特異的E2-C,UBCxが単離された。我々はそのヒトホモログhE2-Cを単離し、サイクリンBのユビキチン化を調べたところ活性は分裂期抽出液存在下で高く、しかもサイクリンB単量体よりもサイクリンB/cdc2複合体が良い基質となった。そのことからここで単離したhE2-CはサイクリンB特異的E2として働き、M期特異的E3の存在下にサイクリンBのユビキチン化を行うと考えられた。一方染色体脱凝縮が温度感受性であるtsTM13細胞はこのユビキチン化酵素活性が低いとの結果が得られた。即ちこの変異細胞では高温でサイクリンBのユビキチン化が欠損していることによりM期からG1期への移行が行われないと考えられる。
飲料のおいしさ・香りの良さを検出する総合センサ系に関する研究

現在、飲料の安全性やおいしさを客観的に評価する装置の開発が望まれている。本研究では、液体の種々の物理量と香りを測定し、液体の総合評価を可能にするシステムの構築を目指し、そのための各種センサの開発を行った。飲料の導電率や比誘電率は電解質によって変化し、そこから塩味や酸味の情報を得ることができる。そこで、櫛形電極を液体い浸し、周波数を変えてインピーダンスを測定したところ、広い周波数領域で液体の導電率・比誘電率を求めることができる。また、電極に有機薄膜を塗布することにより、非電解質である糖を検出することができた。飲料の密度や粘性は、舌触りに影響する。SV(Shear Vertical)とSH(Shear Horizontal)の2種のモードの弾性表面波素子を用いて表面波の減衰定数を測定し、密度と粘度を別々に求めることができた。さらに、これら二つのモードの表面波を一つの基板で発生させるマルチモードセンサを開発し、システムの小型化が可能となった。匂いも飲料のおいしさを決める重要な要素であるため、感応膜を塗布した水晶振動子センサを用い、液体の匂い測定システムを製作した。基本サンプルを混合して被検サンプルと同じ匂いを作り出す能動センシング法を用い、混合液体の成分濃度を定量することができた。これらのセンサにおいて、感応膜は感度・選択性を決める重要な要素である。本研究では、発振回路が正しく共振周波数変化を検出する条件を検討し、感応膜の性質を系統的に調べた。また、膜材料だけでなく構造も重要であることを確かめた。そこで、self-assembly法および分子imprinting法を組み合わせた新たな成膜方法について検討した。同方法を用いればターゲット分子に適合する大きさの凹凸を持つ膜を作ることができ、高選択性を有する感応膜の作製が可能であることが確認された。以上のセンサを統合すれば、飲料の総合評価システムを実現できると期待される。本年度は、飲料、特に水の電気的特性および、音響的特性を測定するセンサについての基礎的な実験を行った。水の電気的特性については、ガラス基板上にくし型電極を設け、この電極の上に種々の水を負荷し、高周波電界を印加することでくし型電極のインピーダンスを測定した。このインピーダンスの周波数特性から水の導電率、および比誘電率を算出した。その結果、1100MHzの周波数領域においては、文献値に示される値(水の比誘電率:78)と同等の結果が得られた。また、今年度購入したインピーダンスマテリアルアナライザによりさらに高周波領域(1MHz1.8GHz)における測定を行った。しかし、数百MHz以上の領域ではリ-ド線、及び基板上線路のインピーダンスが大きく影響し、正確な比誘電率、導電率の導出は困難であった。このことについては今後電磁波解析などを行い、解決していく予定である。水の音響的特性については、SH-SAW(Shear Horizontal Mode Surface Acoustic Wave)デバイスを用いて、これに水を負荷し測定を行った。SH-SAWは固体と液体の界面を伝搬する際に液体中に僅かながらエネルギ(超音波)を放射する。この放射超音波を利用し液体中の超音波の速度を測定し、超音波放射によって生じる表面波の減衰から液体の粘性を算出した。測定試料には、粘性の測定が多く行われているグリセリン水溶液を用いた。

測定結果を他の測定法による結果と比較したところ、音速、粘性のどちらも精度よく(最大誤差は、音速:約3%、粘性:約2%)測定できることがわかった。本年度は、マイクロストリップライン構造を用いた水の誘電率、導電率測定プローブの作製・特性評価、および分子膜塗布くし型電極を用いた味センサの作製・特性評価を行った。前年度くし型電極を用いて1MHz40MHzの周波数範囲において、飲料水の比誘電率・導電率をインピーダンス測定結果から算出できることを報告したが、より高周波での測定は寄生インピーダンスの影響から困難であることが分かった。そこで本年度は、より単純な構造を持ち、計算による見積りが容易な純粋なマイクロストリップラインを比誘電率・導電率の測定プローブとして用いることにした。文献値などを用いマイクロストリップラインのインピーダンス計算を行い、実際の測定値と比較したところ、約1GHz程度まで、良い一致を得ることができた。味センサにおいては、くし型電極上に脂質、タンパク質、超分子膜等をLungmuir-Blodgett(LB)法により塗布して、味センサを作製した。作製した味センサは、電極上の膜のインピーダンス、および膜界面のインピーダンスを測定することによって味物質を件室使用と言うものである。ここでは、電極自体のインピーダンスと膜および界面のインピーダンスの大小関係が検出限界に影響してくる。そこで、電極形状、寸法を変えることにより、電極のインピーダンスを容易に変えることのできるくし型電極を用いた。実験では、味物質、特にこれまでの味センサでは測定が困難であった糖の検出を試みた。結果として、低濃度の糖を検出することは困難であったが、100mM以上の濃度であれば検出ができることを確認した。低濃度糖水溶液での糖検出は困難であったが、上述したように、電極自体のインピーダンスと膜および界面のインピーダンスの大小関係を突き詰めることで検出が可能になると考えている。その準備として、膜塗布くし型電極を等価回路で表わすことを検討した。その結果、等価回路で表わすことに成功し、等価回路の種々のパラメータが糖水溶液濃度に依存して変化することを確認した。このパラメータをモニタすることにより、水溶液のより詳細な情報を得ることができると考えている。両実験共、来年度引き続き検討を行っていく。今年度は、弾性表面波(SAW)素子による液体サンプル評価法、匂いセンサ用吸着膜の改良、液体フロー匂いサンプル測定系について研究を行った。味センサの開発に当たっては液体の粘性特性を測定・評価することは重要である。そこで、36°回転Y板X伝搬LiTaO_3基板上に種々の交差指電極を設けたSAW素子を作成し、基板表面に対して水平方向の粒子変位を持つSH(Shear Horizontal)モードの表面波を励振し、粘性液体を付加した場合の減衰変化より粘性を測定した。グリセリン水溶液(測定濃度範囲:0%-80%)、およびエタノール水溶液(測定濃度範囲:0%-100%)について測定したところ、前者については文献値から得た粘性変化と定性的に一致し、後者については濃度による微少な粘性変化を測定出来た。水晶振動子上吸着膜の設計は匂いセンサの特性向上には不可欠である。
PhysioDesignerのPDE開発

1)昨年はPhysioDesignerで用いているScriptベースのツールであるFreeFem++の心臓シミュレーションへの適応性、特に拍動による変形の計算に速度の面で問題がある事を指摘し、FEniCSプロジェクトで公開しているFEniCSツールが生体の変形を取り扱う非線形連続体力学に適している事を示し、FreeFem++と比べて評価を行った。心臓の計算では、心筋線維方向の伝導度の異方性の興奮伝播への影響と、その異方性を伴った非線形な変形を伴う拍動運動とその興奮伝播への影響を取り込む事が必要である。この定式化は多くの論文が出ているが、OgdenのPassiveな異方性モデルとActiveなモデルを加えたPezzutoのモデルをFEniCSで試してみたが、Passiveなモデルは計算できたが、Activeなモデルは動作しなかった。一方のFreeFem++は、開発元と協議したが、この分野での応用については改善が見られなかった事と、FEniCSでも不完全且つ、計算速度にも未だ不足する所があるので、もっとnativeなコードを生成できるツールを探した所、LifeVというEPFLが開発している有限要素ライブラリがnativeに近いコードを生成し、且つ心臓シミュレーションについても検討中なので、これを試す事にした。興奮伝播下での拍動の計算が目的なので、電気機械連成問題を解く事に帰するが、開発者のRossiのモデルをLifeVに載せた開発中のコードを評価している。これは評価が終われば公開予定なので、所期の計算目的はこれで達成できる事になる。PhysioDesignerへの搭載については、未だコードが複雑過ぎる事もあり、今後どこまでのレベルで可能か更に検討する必要がある。2)脳波計算については、有限要素法での計算の精度を上げる工夫、即ち双極子の位置依存を無くす工夫、をした。3)血栓の計算については、血栓中の反応式をできるだけ正確に解くSystems Biology的な手法を確立させた。26年度が最終年度であるため、記入しない。生体シミュレーションに有限要素法(FEM)を用いていますが、その適応を簡単にできる様にFreeFem++といったツールを用いてシミュレーションの環境を作成しています。1)心臓のシミュレーションに関しては、左心室の楕円形状に対して、心筋細胞の繊維の向きによる異方性を取り入れて、電気的な興奮伝播に伴う拍動計算を試みています。そこにはテンソル計算を伴う非線形連続体力学が必要になります。FreeFem++を用いてその定式化を試みましたが、この問題に対しては簡単に定式化する事が難しい事と計算速度が遅い事が障害となっています。そこで非線形連続体力学をもっと簡単に定式化が可能なFEniCSプロジェクトが提供しているツールを適用しています。基礎的な検討ではコード作成の容易さと計算速度の速さを確認できました。2)脳波のリアルな形状を用いて順問題を解く手法を試みました。興奮個所にダイポールを置く手法を検討し、精度の高い計算方法を実装しました。これに関して、PhysioDesignerでのImageViewerで脳の可視化の改良とダイポールを置くツールを開発しました。3)血流下における血栓の形成に関するシミュレーションをFreeFem++を用いて行いました。血管損傷部の血栓形成部での反応式を境界条件にし、血栓外では、血流中で血栓形成に関係する物質の反応式と血栓から出てくる反応物質の移流拡散を解きましたが、解の安定性の確保が重要で、風上差分に対応するFEMでの定式化の検討を行い、安定的に解ける様になりました。

26年度が最終年度であるため、記入しない。有限要素法を用いた計算手法の確立については適用分野各々について着実な進歩をしているが、心臓シミュレーションの関係はやや遅れている。PhysioDesignerについては、周辺のツールの機能拡張は行ってきているが、本体での偏微分方程式の取り扱いについては環境整備がやや遅れている。心臓のシミュレーションへのFEniCSプロジェクトの適用の検討を進める。これが使えるどうかの判断を早急に進めると同時に、使える目処がつけば、可視化も含めた利用環境をFreeFem++と遜色無い様に整備する。PhysioDesignerに取り込む方法について、今までと同じパーサー主体でいいのか、他の方法を考えるべきなのか、の検討を進める。
運動論的アルヴェン波の構造と沿磁力線電流の発生

(1)運動論的アルヴェン波を励起すべく、MPDアークジェットプラズマ源の調整を行い、最適のガス(ヘリウム)圧、タイミング等を設定した。(2)データ処理システムを整備し、空間構造の解析が可能なソフトを作成した。(3)運動論的アルヴェン波の電磁場構造及びそれに伴う沿磁力線電流の検証を、実験的に明らかにするために、まずヘリカルアンテナを2個用いてm=-1の定在波を励起し、磁力線方向の波数を決定し、シア(運動論的)・アルヴェン波が局在的に励起されることを確認した。(4)磁力線に沿ったイオン電流或いはプラズマ流を定量的に測定するために、マッハプローブを各種作成し、そのテストを行った。マッハプローブは最近各方面で幅広く使われ始めているが、まだその使用方法は試行錯誤であり、特に絶対値量はプローブの構造、サイズに依存しているため、我々は、(5)マッハプローブの磁力線方向のサイズを変えることにより、プレシースの影響でプローブへの電流量がどのように変わるかを定量的に測定した。さらにこのプローブを較正するため、我々は次の方法をとった。(6)アルヴェン波の圧縮波(速波)の分散がプラズマ流の影響を受けるのを利用し、上流から伝播させた場合と下流から伝播させた場合の差から流速を径の関数として求め、これによりマッハプローブをほぼ較正することができた。(7)今回の研究は、マッハプローブのテスト及び較正に時間がかかり、初めの目的まで到達できなかったが、沿磁力線電流の測定の見通しが立ったこと、さらに、電磁場構造を測定すべく、2次元のプローブ測定システムもほぼ完成したので、目的としている研究へ大きく一歩前進したといえる。
大腸菌におけるタンパク質細胞質膜挿入に関与する膜内在性新因子の構造と機能解析

本研究では、大腸菌におけるタンパク質内膜挿入機構について、膜挿入の再構成系を用いて解析した。その過程で膜挿入に関わる新因子を発見し、その構造と機能の相関関係について調べた。膜挿入の再構成系を構築するに当たって、タンパク質分泌装置SecYEGに依存して膜挿入するMtlAですらリポソームに自発的膜挿入することが問題となった。この自発的膜挿入は生理的濃度のジアシルグリセロール(DAG)をリポソームに混入することにより抑制された。さらには、20年以上にわたって自発的に膜挿入すると考えられてきたMl3ファージのコートタンパク質(Ml3 procoat)ですらDAG存在下では自発的には膜挿入しないことが判明した。すなわち、細胞は無秩序な自発的膜挿入を抑制する仕組みを備えており、DAGはその抑制に中心的な役割を果たすことが考えられる。DAG存在下では、MtlAの膜挿入にはSecYEGだけでなくSDS-PAGE上で約8kDaの新因子が必須であった。Sec因子を必要としないMl3 procoatの膜挿入もこの因子には依存した。この因子はプロテアーゼ処理により失活したが、分子の大部分は脂質、糖質であった。さらには、外膜主要因子、リボ多糖(LPS)の変異株ではこの因子の発現も影響を受けることが判明し、この因子の構造は、LPSの基本骨格であるLipid Aの誘導体であることが判明した。上記の結果以外にも、膜挿入反応には細胞質因子としてSecA/SecBやFfh/FtsY以外には必要ないことも明らかにした。また、リボソームタンパク質L36をコードするrpmJ遺伝子はSecYの発現調節に関わっていること、secG遺伝子の発現は直後のtRNAの発現と共役していることも判明し、タンパク質合成とそれに続く膜透過・膜挿入には密接な関係があることがSec因子発現の観点からも強く示唆された。大腸菌において膜内在性タンパク質は、その合成に共役して膜挿入することが知られている。疎水性の強い膜貫通領域はシグナル認識粒子(SRP)とSRP受容体(SR)により膜にターゲットされ、タンパク質膜透過装置(SecYEG)上で膜挿入が進行すると考えられている。我々はMtlA(膜を6回貫通)を膜挿入基質として膜挿入反応の再構成系を確立した。その結果、MtlAの膜挿入にはSRP/SRとSecYEGのみでは不十分であることが判明した。膜挿入反応に関与すると考えられているYidCの添加によってもMtlAの膜挿入は観察されなかった。再構成系を利用してMtlAの膜挿入に必要な因子を検索・精製したところ、SDS-PAGE上で約8kDaの因子を細胞質膜から得ることができた。すなわち、MtlAの膜挿入はSRP/SR、SecYEG、本因子により再構成することができた。この因子はプロテイナーゼK消化により失活するため、タンパク質であると考えられたが、ペプチド部分は分子の一部分であった。他の大部分は糖成分と脂質成分であることが判明した。因子の糖部分を弱塩酸処理で、脂質部分を弱アルカリ処理により分解したところ、膜挿入活性は完全に消失した。これらのことから、因子を構成しているペプチド、糖、脂質成分はすべて活性に必須であることが明らかとなった。大腸菌外膜の主要成分は糖脂質であるLPSである。LPSにはペプチド構造は存在しないものの、本因子との類似性が予想された。LPS合成系の変異株(Re変異株)を調べたところ、因子の分子量が大きく低下していた。さらに、この株から因子を精製したところ、膜挿入活性は大幅に低下していた。

また、この変異株には分泌タンパク質前駆体の蓄積が観察された。以上のことから、因子はLPS誘導体であり、in vivoでも因子は膜挿入反応に関与することが示された。大腸菌において膜内在性タンパク質はその合成に共役して膜挿入する。疎水性の強い膜貫通領域はシグナル認識粒子(SRP)とSRP受容体(SR)により膜にターゲットされ、タンパク質膜透過装置(SecYEG)上で膜挿入が進行すると考えられている。我々はMtlA(膜を6回貫通)を膜挿入基質として膜挿入反応の再構成系を確立した。その結果、MtlAの膜挿入にはSRP/SR、SecYEGと膜挿入新因子が必要であり、これらの精製因子のみから膜挿入活性が得られることが明らかとなった。また、膜挿入反応に関与すると考えられているYidCはMtlAの膜挿入には必要ないことも明らかとなった。さらにこの膜挿入新因子はLipid A誘導体であり、外膜主要成分であるリボ多糖(LPS)と一部生合成経路が重複していることを発見し、これらの知見を報告した(J.Biol.Chem.,2006)。今年度は、新因子の構造決定のためより高純度の因子の精製条件や可溶化条件を検討した。従来の精製方法では因子の可溶化に界面活性剤が必須であるため、NMRや質量分析といった機器分析が困難であった上、構造上類似しているLPSの混入を防ぐのも困難であった。可溶化条件の検討の結果、ブタノールーメタノールーテトラヒドロフランー水の混合溶媒で因子が効率よく可溶化できることを見出した。さらにこの溶媒を用いて、層分配や薄層クロマトグラフィー(TLC)で精製を進めた結果、SDS-PAGE上でもTLC上でも単一な標品として因子を精製することに成功した。現在、因子の構造を決定中である。