hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局所麻酔薬が細胞内カルシウム濃度に与える影響についての研究

これまで健常者において、局所麻酔薬による骨格筋毒性の報告はあるが、悪性高熱症患者における骨格筋毒性の報告はほとんどない。当教室では、以前より悪性高熱症の素因診断(CICR)を行っており、その際の余剰筋を保存して培養したヒト培養骨格筋細胞とMH原因変異RYR1を導入したHuman Embryonic Kidney(HEK)293を用いて、Ca2+調節機能に対する局所麻酔薬の効果を分析し、MH素因者への安全な投与法と有用な併用薬剤の検討を行っている。それぞれの細胞に局所麻酔薬を負荷した際のCa2+動態を測定し、悪性高熱症素因の有無や局所麻酔薬の種類によりCa2+動態に違いが生じるかを求めた。ヒト培養骨格筋細胞はMH素因群(CICR亢進14名)と正常群(CICR非亢進群7名)、各局所麻酔薬の50%効果部位濃度(EC50)は、リドカインでMH群1.45 mM、正常群1.58 mM、レボブピバカインでMH群0.313 mM、正常群0.449mM、ロピバカインでMH群1.40mM、正常群1.45 mMで、いずれも群間で有意差はなかった。HEK293細胞においては、リドカインのEC50は、MH変異RYR1を導入した群では、1.64±1.12 mM、正常RYR1を導入した群では、3.88±1.51 mM、RYR1を導入しなかった群では、5.61±1.75 mM in the RYR- group (n=24)であり、群間差があった(P<0.0001)。これらのことから、局所麻酔薬は、RYR1に作用するが、それ以外の細胞内Ca2+を調節する機構に作用していることが考えられた。予定通り、ヒト培養骨格筋細胞とHEK293細胞での実験を行った。悪性高熱症は、骨格筋小胞体内の1型リアノジン受容体(RYR1)の変異による、カルシウムの過剰な放出が原因で発症するが、その詳細は明らかになっていない。当教室では、以前より悪性高熱症の素因診断(CICR)を行っており、その際の余剰筋を保存して培養したヒト培養骨格筋細胞(筋管細胞)を用いて、Ca2+調節機能に対する局所麻酔薬の効果を分析し、MH素因者への安全な投与法と有用な併用薬剤の検討を行っている。本研究では、筋管細胞に局所麻酔薬(リドカイン、レボブピガカイン、ロピバカイン)を負荷した際のCa2+動態を測定し、悪性高熱症素因の有無や局所麻酔薬の種類によりCa2+動態に違いが生じるかを求めた。対象は、MH素因群(CICR亢進群14名)と正常群(CICR非亢進群8名)であった。各局所麻酔薬の50%効果部位濃度(EC50)は、リドカインでMH群1.52 ±0.72 mM、正常群1.75 ±0.37 mM、レボブピバカインでMH群0.72 ±0.36 mM、正常群0.79 ±0.46 mM、ロピバカインでMH群1.21 ±0.35 mM、正常群1.62 ±0.57 mMで、いずれも群間で有意差はなかった。今回使用した筋管細胞において、局所麻酔薬により細胞内Ca2+濃度は上昇したがMH素因の有無で有意差はなかったことから、局所麻酔薬はRYR1に一部作用するが、それ以外の細胞内Ca2+調節機構にも作用していることが考えられた。これらのことから、MH素因者においても局所麻酔薬の使用を控える必要はないと考えられた。29年度は当初予定した通り、HEK293細胞における局所麻酔薬のEC50を求めることで、細胞内Ca2+濃度の上昇にRYR1が関与していることを証明する予定である。可能であれば、局所麻酔薬に対する反応が、RYR1の遺伝子変異部位によって異なるかについても追及したいと考えている。30年度は当初予定した通り、今回の研究成果を論文にする予定である。前年度までに購入していた備品があり、それらを使用したため、予定していた物品費より実際の使用額が減ったため。
心筋のCaチャンネルの開閉様式とその修飾

心筋のCa電流は種々の生体内活性物質や薬物で修飾される。臨床的に狭心症や不整脈の治療に汎く使用されているCa拮抗薬は、このCa電流を抑制するのがその作用機転である。本研究ではCa拮抗薬であるジルチアゼムおよびDHP-218のCaチャネル修飾機序をパッチクランプ法で研究した。モルモット心臓から単離した心室筋細胞を用い、全細胞型クランプで細胞全体のCaチャネル電流を記録し、細胞接着型クランプで単一Caチャネル電流を記録し、それらに対する薬物の効果を調べた。細胞全体のCaチャネル電流は無Na液を用いることによって深い維持電位からの脱分極でも記録可能であった。ジルチアゼムの細胞全体のCa電流またはBa電流に対する抑制は刺激依存性のものが主であった。脱分極の反復で次第に電流は減少し過分極レベルに維持することによって抑制からの回復が生じた。我々はBa電流が脱分極中にジルチァゼムによってより速く減少するのを見出した。この様な時間経過の変化を伴う減少が細胞接着型のBa電流記録でも確認された。単一Caチャネル電流では維持電位が脱分極されるとジルチアゼム下ではブランク数の増加が著しかった。多チャネル電流では刺激の反復時に次第に開口するチャネル数が減少した。ジルチアゼムは脱分極中にCaチャネルの不活性化の成立を促し、また不活性化からの回復を遅らせると結論される。これとは独立に活性化も軽度に抑制されたが刺激依存性に不活性化をましてCa電流を抑制するのが主たる機序である。DHP-218はジヒドロピリジン誘導体系のCa拮抗薬である。この抑制は刺激に関係することなく、維持電位の脱分極によって出現しえた。
Webベースの対話型可変スケールマップシステムのための並列分散計算機構

本研究では,可変スケールWebマップシステムの計算機構に関する研究に取り組み,次のようなシステムを開発し,評価実験により有用性を明らかにした.1)可変スケールWebマップ用道路データベースシステム:道路セグメントに対する認知的グルーピングと沿道の施設データとの紐づけにより道路ネットワークデータを質的に向上させる,2)Webマップサービス用道路ネットワーク総描システム:道路間の接続性と施設への到達性を損なわずに視認性を向上させるように重要な道路をオンデマンドで取捨選択して描画する,3)道なり経路探索システム:上記道路データベースを用いてストローク数最少の経路の中から最短経路を効率的に求める.地図の縮尺を小さくすると,道路や建物などの地物が密集して小さくなり,読みにくくなる.総描は,大縮尺の地図データから,地図を簡単化,抽象化して,読みやすい小縮尺の地図を作成する技術である.従来,道路や建物の形状の簡単化や集約などの幾何学的な変形により,読みやすい地図を生成する総描手法が多数開発されている.しかし,現状では,どのような地図データからでも要求された縮尺の地図を実時間で作成できる実用的な技術は存在しない.このため,多くのWebマップでは,事前に準備した縮尺の地図画像に位置コンテンツを重ねて表示する.この結果,携帯端末のような小さな画面に表示する場合や,位置コンテンツが大量にある場合などに,視認性が著しく低下することがある.このような問題を解決するため,本研究では,地図データと位置コンテンツを深く結びつけた解析に基づき,視認性と一覧性に優れた対話型可変スケールマップを生成する技術を確立する.本年度は,利用者が指定する,地図のエリアとサイズ,及び,検索のカテゴリに応じた案内マップをオンデマンドで作成するシステムを設計し,その基本機能を実現した.提案システムの特徴を,以下に示す.(1)実世界における人の動きを考慮して,従来の道なりに続く道路(ストローク)の概念を拡張し,実道路データに適用してストロークデータベースを構築する.さらに,ストロークと施設検索結果を結びつけたFatStrokeと呼ぶデータ構造を実現する. FatStrokeのデータベースを事前に作成しておくことにより,利用者の要求に応じた案内地図がオンデマンドで作成可能になる.(2)道路の長さだけでなく,検索結果やアクセスポイントなどを考慮して,ストロークの重要度を決定し,ストロークを順序付けする.(3)マップの縮尺とマップ内で道路が占める割合に基づいて,描画すべきストローク数を決定する.地図の縮尺を小さくすると,道路や建物などの地物が密集して小さくなり,読みにくくなる.総描は,大縮尺の地図データから,地図を簡単化,抽象化して,読みやすい小縮尺の地図を作成する技術である.従来,道路や建物の形状の簡単化や集約などの幾何学的な変形により,読みやすい地図を生成する総描手法が多数開発されている.しかし,現状では,どのような地図データからでも要求された縮尺の地図を実時間で作成できる実用的な技術は存在しない.このため,多くのWebマップでは,事前に準備した縮尺の地図画像に位置コンテンツを重ねて表示する.この結果,携帯端末のような小さな画面に表示する場合や,位置コンテンツが大量にある場合などに,視認性が著しく低下することがある.このような問題を解決するため,本研究では,地図データと位置コンテンツを深く結びつけた解析に基づき,視認性と一覧性に優れた対話型可変スケールマップを生成する技術を確立する.本年度は,以下の項目を中心に研究を推進した.(1)オープンストリートマップのデータを用いて,昨年度設計したストロークとFatStrokeのデータベースを構築し,オンデマンドWebマップシステムを実現した.このシステムを用いた評価実験により,施設検索結果に応じた案内地図を実時間で生成できることを示して国際会議W2GIS2015で発表した.(2)道路の密度に基づいてストローク数を決定することにより視認性の高いFocus+Glue+Contextマップを考案して実験システムを構築した.(3)ストロークデータベースを用いて,効率的な道なり優先経路探索を実現する方式を考案して実験システムを構築した.平成27年度は,オープンストリートマップを用いて実際の道路データを認知的な観点からグループ化したストロークとFatStrokeのデータベースを構築し,道路の密度に応じて効率的に道路を取捨選択して描画するシステムのプロトタイプを実現した.また,プロトタイプを用いた評価実験により,Webサービスとして許容できる応答速度で,道路選択可能であることを確認した.これらは,対話型可変スケールマップを実時間で作成するための計算手法とデータベース構成法の基盤となる技術である.地図の縮尺を小さくすると,道路や建物などの地物が密集して小さくなり,読みにくくなる.総描は,大縮尺の地図データから,地図を簡単化,抽象化して,読みやすい小縮尺の地図を作成する技術である.従来,道路や建物の形状の簡単化や集約などの幾何学的な変形により,読みやすい地図を生成する総描手法が多数開発されている.しかし,現状では,どのような地図データからでも要求された縮尺の地図を実時間で作成できる実用的な技術は存在しない.このため,多くのWebマップでは,事前に準備した縮尺の地図画像に位置コンテンツを重ねて表示する.この結果,携帯端末のような小さな画面に表示する場合や,位置コンテンツが大量にある場合などに,視認性が著しく低下することがある.このような問題を解決するため,本研究では,地図データと位置コンテンツを深く結びつけた解析に基づき,視認性と一覧性に優れた対話型可変スケールマップを生成する技術を確立する.本年度は,以下の項目を中心に研究を推進した.

(1)交通機関のアクセスポイントを考慮してFocusの形状と縮尺,及び,Contextの縮尺を定めることにより視認性と一覧性を向上させたFocus+Glue+Contextマップを実現した.(2)複数の基準長以上のストロークからなるネットワーク(ストロークネットワーク(SN))を有するデータベース(SNDB)を構築した.基準長の異なる複数のSNを合成して多層ストロークネットワーク(MSN)を構築するシステムを実現した.(3)MSN上で幅優先探索により,ストローク数最少の中で最短の経路を求める手法(SPMS法)を実現し,SPMS法を用いてMSNと従来の道路ネットワークとの比較評価実験を実施して,MSNにより探索時間を大幅に短縮できることを示した.本研究では,可変スケールWebマップシステムの計算機構に関する研究に取り組み,次のようなシステムを開発し,評価実験により有用性を明らかにした.1)可変スケールWebマップ用道路データベースシステム:道路セグメントに対する認知的グルーピングと沿道の施設データとの紐づけにより道路ネットワークデータを質的に向上させる,2)Webマップサービス用道路ネットワーク総描システム:道路間の接続性と施設への到達性を損なわずに視認性を向上させるように重要な道路をオンデマンドで取捨選択して描画する,3)道なり経路探索システム:上記道路データベースを用いてストローク数最少の経路の中から最短経路を効率的に求める.平成26年度は,道路ネットワークと施設検索結果とを結び付けて解析して総描する案内マップ生成システムを設計し,実験システムの一部を開発した.実験システムでは,道路ネットワークやFatStrokeなどの基本的なデータベースを構築した.また,予備実験により,FatStrokeのデータベースを事前に作成しておくことにより,Webサービスとして許容できる応答速度で,道路選択可能であることを確認した.これらは,対話型可変スケールマップを実時間で作成するための計算手法とデータベース構成法の基盤となる技術である.平成27年度に推進した研究を継続・発展させ,以下の研究に取り組む.(1)FatStrokeのデータベースを用いたオンデマンドWebマップシステムを構築して評価する.(2)ストロークデータベースを用いた実用性の高い道なり優先経路探索システムを構築して評価する.(3)ストロークデータベースを用いたFocus+Glue+Context型の対話方可変スケールマップを構築して評価する.空間データベース平成26年度に推進した研究を継続・発展させ,以下の研究に取り組む.(1)FatStrokeのデータベースを用いたオンデマンドWebマップシステムを構築する.(2)ストロークデータベースを用いた経路探索システムを構築する.(3)ストロークデータベースを用いたFocus+Glue+Context型の対話型可変スケールマップを構築する.
内耳有毛細胞に存在する機械電気変換イオンチャンネルの単離と機能解析

機械刺激電気変換チャネルMET channelの候補遺伝子としてASIC1bが有力であったため、ウサギを用いて特異的抗体を作製し、マウス内耳有毛細胞における分布を検討したところ、内・外有毛細胞の各感覚毛がクチクラ板と交差する箇所に発現していることが明らかになった。従来より、MET channelは感覚毛の先端付近に位置し、リンクによって機械的に開閉されると考えられていたが、最近になって、リンクを破壊した感覚毛においてもmechano-electrical transductionが起こることが証明され、このことは、MET channelが感覚毛の基部に存在することを意味している(さもなければ感覚毛の傾きにより生じた力はどこに伝わるというのか?)。ASIC1bの発現する位置がまさにこの部位であったため、ASIC1bの聴覚への関与を直接証明する目的で、ASIC1b KO mouseを作製した。ノックアウトマウスF3世代の聴力を生理学的に検査したところ、外有毛細胞の機能が完全に消失していることが判明した。この結果は、我々のIn situ hybridizationにより得られたデータ、すなわちASIC1bは外有毛細胞優位に発現しているという事実とよく一致するものであり、ASIC1bが外有毛細胞におけるMET channelの主要構成分子であることを裏付けるものである。また、ABR検査にても中等度重度の難聴所見が得られたので、内有毛細胞においてもMET channelの構成サブユニットとして機能している可能性がある。今後、ノックアウトマウスと野生型との交配を進めつつ、組織学的な異常の有無を検討していく予定である。マウス内耳有毛細胞cDNAライブラリーを作製し、TRPファミリーおよびASICファミリーと相同性を示す遺伝子を徹底的にスクリーニングしたところ、17個の遺伝子断片が単離できた。Saquence解析から、TRPファミリーに属するものが2種(ANKTM1とOTRPC4)、ASICファミリーに属するものが3種(ASIC1a、ASIC1b、ASIC3)含まれていることがわかった。In situ hybridization法にて有毛細胞におけるメッセンジャーRNAの発現を確認したところ、TRPファミリーに属するOTRPC4が内有毛細胞および外有毛細胞に発現していることが確認できた。この遺伝子は浸透圧刺激により活性化されることから、メカノレセプターとして機能している可能性が高い。そこでさらに詳細な分布をタンパクレベルで検討するため、OTRPC4の部分タンパクをバキュロウイルス発現系にて発現させ、これをウサギに免疫することで抗血清を得た。この抗血清をふたたび発現させたOTRPC4の部分ペプチドを用いて精製し、精製抗体を得た。Western blot法にて検討したところ、得られた抗体はOTRPC4と特異的に反応することがわかった。現在、内耳から抽出した膜タンパク分画を用いてWestern blot解析を行っているところである。同時に、surface preparation法にて単離した内耳を使って有毛細胞におけるタンパクレベルでのOTRPC4の局在を調べているところである。機械刺激電気変換チャネルMET(mechano-electric transduction)channelの候補遺伝子としてacid-sensing ion channel-1b(ASIC1b)が有力であったため、特異的抗体を作製し、マウス内耳有毛細胞における分布を検討したところ、内有毛細胞および外有毛細胞の各感覚毛のクチクラ板に挿入する部位、すなわち感覚毛の根本部分に発現していることがわかった。以前よりMET channelは、感覚毛の先端付近に位置し、リンクによって機械的に開閉されると考えられていたが、最近になって、リンクを破壊した感覚毛においてもmechano-electric transductionが起こることが明らかになり、このことは、MET channelが感覚毛の基部に存在することを意味している(さもなければ感覚毛の傾きにより生じた力はどこに伝わるというのか?)。ASIC1bの発現する位置が、まさにこの部位であり、ASIC1bの聴覚への関与を証明するために、ASIC1b KO mouseの作製に着手した。ノックアウトに用いるコンストラクトを作製し、ES cellに注入、年内にF1世代が得られる予定である。

また、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いてASIC1bが機械刺激に感受性を示すかどうか電気生理学的に検討したところ、ASIC1bの惹起する電流は低浸透圧刺激すなわち細胞膜の伸展刺激により増強することがわかった。このデータもASIC1bがMET channelであることを強く示唆するものである。機械刺激電気変換チャネルMET (mechano-electrical transduction)channelの候補遺伝子としてacid-sensing ion channel-1b (ASIC1b)が有力であったため、ウサギを用いて特異的抗体を作製し、マウス内耳有毛細胞における分布を検討したところ、内・外有毛細胞の各感覚毛がクチクラ板と交差する箇所に発現していることがわかった。従来より、MET channelは感覚毛の先端付近に位置し、リンクによって機械的に開閉されると考えられていたが、最近になって、リンクを破壊した感覚毛においてもmechano-electrical transductionが起こることが明らかになり、このことは、MET channelが感覚毛の基部に存在することを意味している(さもなければ感覚毛の傾きにより生じた力はどこに伝わるというのか?)。ASIC1bの発現する位置がまさにこの部位である。そこで我々は、ASIC1bの聴覚への関与を証明するために、ASIC1b KO mouseを作製した。ノックアウトマウスF3世代の聴力を生理学的に検査したところ、外有毛細胞の機能が完全に消失していることが判明した。この結果は、我々のIn situ hybridizationにより得られたデータ、すなわちASIC1bは外有毛細胞優位に発現しているという事実とよく一致するものであり、ASIC1bが外有毛細胞におけるMET channelの主要構成分子であることを裏付けるものである。現在、ノックアウトマウスと野生型との交配を進めつつ、組織学的な異常の有無を検討しているところである。
超高速艇の横安定性における不安定現象に関する研究

高速艇が十分な復原性を有している場合でもある船速以上になると横不安定現象を生じることはよく知られている。近年大型高速艇の出現と相俟ってこの現象に対する対策の必要性が高まってきた。この種の現象は複雑なことから重要であるにも拘らず今日まで国内外を問わずその解明の検討はなされていない。本研究では排水量型高速艇を対象に船底に作用する動圧に着目し,横不安定現象の発生メカニズムについて検討を行った。計算手法としては船速トリムや横傾斜角を既知として丸尾の細長体理論を適用して動圧を計算し船速と横傾斜の相関を求めると同時にその発生メカニズムを検討した。計算対象船型は船長3.6mの横型船で、横傾斜モーメントの計算値はフル-ド数0.8以上から増大しており,この船速を越えると横傾斜角が急に増大することを示した。これは膜型実験結果でも同様の傾向を示しており、ある船速以上で横傾斜角が増大しており従って横傾斜モーメントも増大したものと考えられる。即ち船速の増加に伴って動圧の分布が変化する。一度外乱等によって横傾斜した船体は動圧によって傾斜角を増大させる横傾斜モーメントが作用する。またこの横傾斜に伴い傾斜角を増大させる横傾斜モーメントが作用する。またこの横傾斜に伴い動圧の長さ方向分布も変化することになり回頭モーメントが発生することも分かった。以上の結果から横不安定現象の一つの原因は船速の増加に伴って造波流体力が現われ,これによる動圧が船底に作用するために生じること,また横傾斜の増加に伴って動圧分布が変わり,横傾斜角を増大させると同時に回頭モーメントも作用することになると言える。高速艇が高速航行をする場合,静止時に十分な復原性を有していても,ある船速以上になると横不安定現象を引き起こすことがある。本研究においては,この高速航行時における動的な横不安定現象の発生メカニズムについて,運動学的見地より検討を行なうことを目的とし,本年度は高速航行時の高速艇に生じる横傾斜の現象を把握するために,試験水槽において拘束模型試験を行なった。まず,surge,yawのみを拘束した試験を実施し,GMや船速の違いによる船体姿勢の変化を計測することにより,横不安定現象が生じる領域の特定を試みた。その結果、船速が比較的遅い場合には艇の横傾斜はある横傾斜角で静定し,艇は横傾斜したまま航走するが,さらに船速が速くなると横傾斜が静定せず横転に至ることが分かった。従って,高速艇の動的な横不安定現象は船速が速いほど生じやすいことが明らかになった。また、船速を一定としてGMの値を変化させた実験を行なった結果,GMが小さいほど横不安定現象は起こりやすいことを確認した。続いて,全運動を拘束した模型試験を行ない,船速と横傾斜角をパラメータとして,高速航行時に艇に作用する横傾斜モーメントの計測を行なった。その結果,横不安定現象を生じ始める船速付近においては,横傾斜角の値に関わらず横傾斜モーメントはほとんど0となった。これは何等かの外乱が作用して艇が横傾斜した時に,復原する力を持たないことを表わしている。また、さらに船速が速くなった場合には,横傾斜角が大きいほど横傾斜モーメントの値が大きくなることが分かった。従って,何等かの外乱によって艇が横傾斜すると,更に艇を傾斜させる方向のモーメントが作用するため,高速航行時における横不安定現象が生じるものと考えられる。単胴型の高速艇の場合,高速航行時に横不安定現象を起こすことがあり,船型によっては外乱によって生じた横傾斜が増大し復原しないという動的な不安定現象を起こし,転覆にいたる場合もある。この種の現象の解明は重要であるにも拘わらず,複雑なことから従来国内外を問わずこの問題の発生メカニズムの解明は検討されていない。

本研究は排水量型高速艇を対象に船底に作用する動圧に着目し,横不安定現象の発生メカニズムの解明を行なった。理論計算には船速,トリムや横傾斜を既知として丸尾による細長体理論を適用し船体に作用する動圧の計算を行ない,そのメカニズムの検討を行なった。計算対象船型は3.6mの模型船である。計算結果では横傾斜モーメントがある船速以上になると横傾斜が急に増加することを示した。これらは模型試験結果でも同様の傾向を示しており,ある船速以上で横傾斜角が増加することから,横径社モーメントも増大したものと考えられる。即ち船速の増加に伴って動圧分布が変化することが判明した。一度外乱によって横傾斜した船体は動圧によって,傾斜角を増大させる横傾斜モーメントが作用し,また横傾斜に伴い回頭モーメントが増大することも分かった。以上の結果から,横不安定現象一つの原因は,船速の増加に伴って造波流体力による動圧が船体に作用する為に生じること,また横傾斜の増加に伴って動圧分布が変わり,横傾斜角を増大させると同時に回頭モーメントも作用することになると言える。
コロイド粒子の認識応答過程に対する粒子表面水和層の影響に関するラマン分光学的研究

細胞膜および生体高分子間の認識応答過程に対する表面水和相の影響を解明することを目的として、(1)水溶性高分子および親水性ゲル中の水の構造のラマン分光学的研究、(2)特異的相互作用を有する細胞モデル粒子(リポソーム)間の会合過程の速度論的研究、(3)親水性溶質へのアルキル基の導入による疎水性水和殻の形成に関するラマン分光学的研究を行った。(1)水分子の協同的な0-H伸縮振動に伴うラマンバンドの強度変化から、水溶性高分子の周囲の水和殻中の水の構造を解析し、分子量およびモノマー単位の親、疎水性の効果を明らかにした。また高分子ゲル中の水の状態を解析し、1辺50Å程度以下の小空間中ではバルク水中より水分子間の水素結合数が小さいことを解明した。(2)多糖被覆リポソームと、レクチン担持リポソームを用い、多糖・レクチン間の相互作用に基づくリポソーム会合過程を観察した。リポソーム同士の会合速度定数は5x10^<-5>M^<-1>s^<-1>程度であり、コロイド粒子同士の接近および接触に際してのバルク水及びリポソーム表面の水分子の脱離にエネルギーを要するため(それぞれhydrodynamic effect,repulsive hydrationと呼ばれる)に遊離の多糖・レクチン会合系での値に比べて小さくなった。(3)N-置換ピロリドンの重水溶液においてカルボニル基の伸縮振動のラマンスペクトルは、窒素原子と重水分子との水素結合によるピロリドン環の転位にともなって変化する。その変化の温度依存性を検討することにより、ピロリドン環と重水分子間の水素結合によるエンタルピー変化を見積もった。エンタルピー変化は軽水中での値に比べて大きく、しかも置換基を長くするにつれその差は大きくなった。このことから疎水性溶質の周囲では重水分子による疎水性水和殻が形成されていることが判明した。ラマン散乱法は短時間における分子の相対的な位置の変化を鋭敏に捉えることができるため各種水溶液中での水分子の特性を解析することが可能である。本研究においてはコロイド粒子間の認識会合に伴う粒子表面の水和層の特性変化をラマン法により検討することを目的とした。まずコロイド粒子表面や高分子水溶液中における水の特性変化をみた。ポリマ-ラテックス粒子懸濁液や親水性高分子水溶液中においては、水のOH伸縮振動に由来する2つのブロ-ドなピ-クのうち、低波数(320cm^<-1>)のピ-クの強度の高波数(3400cm^<-1>)側のピ-ク強度に対する比が、バルク水での値に比べて増加していることが判明した。これは微粒子や高分子への水和に伴い、水の構造特に水素結合により形成される水分子のネットワ-ク構造の変化に由来するものと考えられる。さらに粒子の認識会合に伴う水の粒子間へのとり込みの影響をみるために、まず高分子ヒドロケル中の水のラマンスペクトルを検討した。その結果、狭い空間に水がとじこめられるために、上述の水分子のOH伸縮振動に由来するピ-クの比がバルクの水に比べかなり小さくなった。しかもその傾向は固濃度の親水性高分子水溶液系でのものに比べかなり顕著であった。偏光法を用いて水分子の集合的な運動モ-ドに由来する敬乱強度をとり出してみるとさらにこの傾向が明確となった。

上で述べた高分子の水和水とは異なりゲル中の水は単に空間的にとじこめられているものであり、その分光学的性質がバルク水と異なることは、粒子間会合による「隙間の水」の形成によっても同様の結果が得られるであろうことを強く示唆している。細胞膜および生体高分子間の認識応答過程に対する表面水和相の影響を解明することを目的として、(1)水容性高分子および親水性ゲル中の水の構造のラマン分光学研究、(2)特異的相互作用を有する細胞モデル粒子(リポソーム)間の会合過程の速度論的研究、(3)親水性溶質へのアルキル基の導入による疎水性水和殼の形成に関するラマン分光学的研究を行った。(1)水分子の協同的なO-H伸縮振動に伴うラマンバンドの強度変化から、水溶性高分子の周囲の水和殻中の水の構造を解析し、分子量およびモノマー単位の親、疎水性の効果を明らかにした。また高分子ゲル中の水の状態を解析し、1辺50A^^°程度以下の小空間中ではバルク水中より水分子間の水素結合数が小さいことを解明した。(2)多糖被覆リポソームと、レクチン担持リポソームを用い、多糖・レクチン間の相互作用に基づくリポソーム会合過程を観察した。リポソーム同士の会合速度定数は5x10^<-5>M^<-1>s^<-1>程度であり、コロイド粒子同士の接近および接触に際してのバルク水及びリポソーム表面の水分子の脱離にエネルギーを要するため(それぞれhydrodynamic effect,repulsive hydrationと呼ばれる)に遊離の多糖・レクチン会合系での値に比べて小さくなった。(3)N-置換ピロリドンの重水溶液においてカルボニル基の伸縮振動のラマンスペクトルは、窒素原子と重水分子との水素結合によるピロリドン環の転位にともなって変化する。その変化の温度依存性を検討することにより、ピロリドン環と重水分子間の水素結合によるエンタルピー変化を見積もった。エンタルピー変化は軽水中での値に比べて大きく、しかも置換基を長くするにつれその差は大きくなった。このことから疎水性溶質の周囲では重水分子による疎水性水和殻が形成されていることが判明した。
虚弱高齢者の在宅生活における生活の質と自己決定との関連に関する研究

本研究では、虚弱高齢者の在宅生活における生活の質と自己決定との関連について明らかにした。昨年度においては、主に文献研究を中心に研究を進めてきたが、今年度は、昨年の研究を踏まえて調査研究を実施した。調査対象者は、大阪府内3ヵ所のデイサービスを利用している在宅虚弱高齢者である。平均年齢は、約80歳で、性別では、男性が24.3%、女性が75.7%であった。自己決定に関する尺度については、本研究で新たに開発することとし、新たな文献研究を行い、岡田が以前に開発したものを改良して作成した。自己決定に関する項目は7項目で、受動的意思決定(2項目)と能動的意思決定(5項目)の2つの下位概念項目から成り立つ。この自己決定に関する尺度項目についての妥当性を確認するために、3名の施設長にレビューを依頼した。その結果、適切なものであると判断された。信頼性については、内的一貫性を示すクロンバッハのα係数を算出した。その結果、受動的意思決定と能動的意思決定のα係数は、それぞれ、0.68、0.75であり、尺度全体では0.69であった。これらは中程度のα係数ではあるが、ある程度の信頼性があると判断した。基本属性や生活満足度については、既存の尺度を活用した。意志決定(自己決定尺度)と人生満足度との関係を見るために、その2変数間の相関を見た結果、能動的意思決定と人生満足度との間に5%水準の有意な関連が見られた。従って、能動的な意思決定や積極的な自己決定する在宅虚弱高齢者は、そうでない在宅虚弱高齢者より人生満足度が高い傾向にあることがわかった。従って、援助専門職者は、従来より提案されている自己決定の原則を尊重するとともに、その虚弱高齢者個人にあった意思決定のスタイルをアセスメントし、意思決定プロセスの支援を行っていくことが重要である。本年度の研究では、生活の質および自己決定に関する先行研究レビューを中心に行った。先行研究レビューで明らかになったことは、次の3点である。(1)高齢期においては、身体的な変化(体力の減退・視力の低下など)などのために、高齢者自身の自己イメージが変化し、自己コントロール感や自己効力感が喪失しやすい傾向にある。自己コントロール感や自己効力感は、自己決定のプロセスと密接な関係がある。つまり、自己コントロール感や自己効力感の低下のために、社会生活での活動の選択の幅が狭まり、自己決定もできなくなる。(2)自己コントロール感や自己効力感は、高齢者を取り囲む環境要因との関係が強い。個人的な要因のみではなく、自己コントロール感や自己効力感は、環境要因との関係で低下のプロセスが異なる。身体障害があったとしても、生活支援の環境が整備されれば、自己コントロール感や自己効力感の急激な低下は防ぐことができる。(3)自己コントロール感や自己効力感を保持できるような社会的支援や環境を提供することができれば、高齢者の生活の質を保持することができ、また、主体的な社会生活を行なうことができる。来年度に向けての研究課題としては、本年度の先行研究レビューを踏まえて、自己コントロール感、自己効力感、生活満足度などの尺度開発を行い、その3つの概念の関係を明らかにする。そして、今後の居宅介護支援事業や居宅サービスでの支援上の課題について明示する。
高い電子授受能を有する有機配位子とヘテロ原子から構成される特異な電子系の創出

アズレンの2位にジフェニルホスホリル基を、6位にアミノ基を導入したpush-pull型化合物を合成した。X線結晶構造解析により、この分子では結合交替が明確に現れ、キノイド構造の寄与が顕著であることを明らかにした。また、ホスホリル基とアミノ基の間に分子間水素結合が存在し、これにより長鎖状構造が形成されていることを見出した。アズレニル基を配位子とする有機リン化合物の合成を行い、その構造特性ならびに反応特性について明らかにした。(1,3-ジクロロ-2-アズレニル)ジフェニルホスフィンと(1,3-ジブロモ-2-アズレニル)ジフェニルホスフィンを合成し、これらのリン原子を過酸化水素により酸化することで、高原子価状態のホスフィンオキシドへ誘導した。この酸化反応に伴い、顕著な呈色状態の変化(緑から青へ)が観測された。このことは、リンの酸化状態が変化することにより、アズレンのπ電子系に高度なπ分極が誘起されたことを示している。今後は、高度な呈色変化が観測されるように、分子設計を行う予定である。また、(1,3-ジブロモ-2-アズレニル)ジフェニルホスフィンは有機溶媒中で放置すると、予期せぬ脱ブロモ化反応を受け(1-ブロモ-2-アズレニル)ジフェニルホスフィンオキシドへと変化することを見出した。この知見は、2-置換アズレンの新規合成法として展開することができた。現在、この知見をもとに、2-置換アズレンの新規合成法の確立を行っている。アズレニル基を配位子とする有機リン化合物、(1,3-ジクロロ-2-アズレニル)ジフェニルホスフィンオキシドと(6-アミノ-1,3-ジクロロ-2-アズレニル)ジフェニルホスフィンオキシドを合成し、6位へのアミノ基の導入が呈色状態に及ぼす効果について検討を行った。その結果、顕著な呈色状態の変化(青色から赤色へ)が観測された。このことは、push-pull効果によりキノイド型構造が発現しアズレンのπ電子系に高度なπ分極が誘起されたことを示している。また、X線結晶構造解析により、これらの化合物の分子構造を明らかにすることができた。具体的には、アミノ基の導入により結合交替が明確化され、キノイド型構造の発現を示唆する結果が得られた。さらに、アミノ基とホスホリル基の間に分子間水素結合が形成され、これによりhead-to-tail型の長鎖構造を構築していることが判明した。今後は、より高度な呈色変化が観測されるように、6位にさまざまな電子供与性置換基を導入しながら分子設計を行う予定である。また、1,3位のクロロ基をプロモ基に変え、カップリング反応によりエチニル基やアリール基への変換も図りたい。アズレンの2位にホスホリル基を、6位にヒドロキシル基を有する誘導体は、分子間水素結合の形成により自己集合し、環状多量体を構築する可能性がある。さらに、多量体内部の空孔には様々なπ電子系化合物がπ-π相互作用により包摂される結果、アズレンの電荷移動状態に変化が生じ、これが呈色変化として現れると予想される。このようなホスト分子は、π電子系センサーとして作用するため、新しい有機機能性材料として期待される。このような2, 6-置換アズレンを合成するため、2, 6-ビス(ピナコラト)アズレンの合成法を開発した。さらに、それぞれのボリル基を段階的に官能基変換する方法も見出し、目的化合物前駆体の合成に成功した。今後は、残す最終段階の合成反応を達成し、目的化合物の合成を達成するとともに、機能性の評価を行う予定である。
高速で回転する細菌べん毛モータの分子軸受け構造と形成機構

細菌べん毛のPリングは、シャペロンタンパク質FlgAの補助を受けてペリプラズム領域で形成される。Pリングは細菌べん毛が回転する際にロッドを支える分子軸受けとして機能するサブ複合体である。これまで、Pリングを構成するタンパク質FlgIのX線結晶構造等の報告はなく、Pリングの詳細な分子機構についての理解は進んでいない。また、ペリプラズム領域でFlgAがFlgIと結合して、Pリングの形成を巧みにコントロールする仕組みについても不明な点も多い。そこで、べん毛を支える分子軸受けの仕組みを明らかにするためには、Pリングの構造情報は必要不可欠であると考えた。本研究ではPリングの構造基盤に基づいて、細菌べん毛が高速で回転する分子機構を明らかにすることである。初年度に引き続き、X線結晶構造解析による構造決定のためにサルモネラ菌のFlgIの結晶化と機能ドメイン構造の解析およびFlgAの機能ドメイン構造の解析を行った。これまでに、サルモネラ菌FlgI単独での結晶化には至っておらず、同定した機能ドメイン単位での結晶化にも成功していない。一方、サルモネラ菌FlgIとFlgAを共発現させて複合体として精製することには成功したが、これまでのところFlgI/FlgA複合体での結晶は得られていない。しかしながら、当初から計画していた好熱菌FlgIの発現系を構築して大腸菌内で発現させたところ、サルモネラ菌FlgIの場合に比べて、タンパク質の発現が良好であり結晶化に向けて十分に精製することができた。初年度に引き続き、サルモネラ菌FlgIの結晶化条件のスクリーニングを試みたが、これまでのところ結晶化の成功には至っていない。原因として、サルモネラ菌FlgIの発現量は限られており、最適なタンパク質発現条件であっても収量がそれほど期待できなかった点があげられる。これは、サルモネラ菌FlgI単独での結晶化を継続する上では問題であると思われる。また、精製したサルモネラ菌FlgIの溶解度はそれほど高くなく、結晶化が難しいことが予測されたので、今後さらに結晶を得るまでには相当の結晶化条件のスクリーニングが必要であると予想される。これまでの結果から、サルモネラ菌FlgIは単独では結晶化は難しいと判断し、サルモネラ菌FlgIのタンパク質構造の安定化を期待してFlgI/FlgAの複合体としての共結晶化を試みた。結晶化条件のスクリーニングを進めてきたが、これまでのところX線回折実験ができるような結晶は得られていない。サルモネラ菌FlgI単独の場合と同じように、FlgI/FlgAの複合体の溶解度もそれほど高くないことが本質的に結晶化を妨げている可能性があると思われる。FlgAがシャペロンタンパク質としてFlgIのタンパク質間相互作用を抑制する以外にも、FlgI自身の溶液状態の構造がPリングの形成を抑制していることも予想される。そこで、サルモネラ菌FlgIの結晶化が進まない場合として準備してきた好熱菌FlgIの結晶化を開始した。好熱菌FlgIは、精製用のアフィニティータグをN末端に融合させて大腸菌内で発現させたところ、サルモネラ菌FlgIのように大腸菌内で封入体を形成することもなく、可溶性のタンパク質して精製することができた。タンパク質の発現量もサルモネラ菌FlgIに比べて良好であり、好熱菌FlgIは結晶化用のタンパク質試料として、サルモネラ菌FlgIよりも適していることが期待されるこれまでに、サルモネラ菌FlgI単独やFlgI/FlgAの複合体として結晶化を試みた成功に至っていない。解決策として、機能解析によって明らかにしたFlgIのドメイン構造を参考にして、FlgIの結晶化を妨げる領域はできるだけ除きかつFlgAとの結合領域は含むような複合体としてFlgIの部分構造の結晶化を進める。同時に、好熱菌FlgIについても、サルモネラ菌と同様にFlgAとの複合体で結晶構造解析を進めるが、サルモネラ菌のFlgIの機能ドメイン解析で得られた情報から、FlgAとの結合には関与しない領域を除いた複合体を調製して結晶化を行う。さらに、好熱菌やサルモネラ菌FlgI/FlgAの複合体であっても結晶が得られない場合の手段として、好熱菌やサルモネラ菌のFlgIのPリングを形成する条件を検索してクライオ電子顕微鏡法による単粒子解析によってタンパク質構造決定の可能性を探る。X線結晶構造解析法のようにタンパク質結晶を必要とせずに、タンパク質の高分解構造をを可能とするクライオ電子顕微鏡法では、観察試料の調製は極めて重要な割合を占めが、これまで結晶化に向けて精製した好熱菌やサルモネラ菌FlgIのタンパク質試料は十分な純度もあることから、Pリング形成が可能であればクライオ電子顕微鏡法による構造決定が最適な手段であると言える。FlgI単量体での分子量は、クライオ電子顕微鏡法による構造が決定できるほど大きくはないが、理想的にFlgIがPリングを形成した場合には1 M Daを超すサブ複合体となることから、クライオ電子顕微鏡で撮影した画像での単粒子解析は十分可能であると思われる。早期に、サルモネラ菌や好熱菌FlgIがPリングを自発的に形成する条件を検索し、クライオ電子顕微鏡法による構造決定に取り組む。細菌べん毛のPリングはペプチドグリカンに結合し、高速で回転するロッドを支える分子軸受け、Pリングはシャペロンタンパク質FlgAに依存的に形成する。

フックやフィラメントが正しく構築されるためには、Pリングの形成は必須である。本研究では、Pリングを構成するタンパク質FlgIに特異的に作用するFlgAの構造機能解析から、Pリングの形成機構を分子レベルで明らかにし、Pリングの構造から高速で回転するべん毛モータの滑らかな回転機構を解明することを目的とする。初年度には、サルモネラ菌のFlgIの結晶化と機能ドメイン構造の解析およびFlgAの機能ドメイン構造の解析を計画した。FlgIと相同性が高いタンパク質は見つかっておらず、これまでにFlgIのX線結晶構造解析の例もないので、べん毛モータの回転機構を解明するためにはFlgIの構造機能解析が必須であると考えた。本来、FlgIはペリプラズムに移行して成熟型となりPリングを形成するが、FlgIは過剰に発現させると封入体として蓄積する。そこで、FlgIの安定性と生産性を向上させるために、FlgIのN末端にpelBタンパク質由来のペリプラズム移行シグナル配列と精製用のアフィニティータグを付加した。大腸菌で低温条件下で発現誘導を行うと、FlgIは可溶性画分から回収され、ペリプラズムに移行していることが示唆された。しかし、これまでのところFlgIの結晶化には成功していない。一方、FlgIの機能ドメインの解析のために、FlgIのNまたはC末端をそれぞれ欠失させた遺伝子を作成し、タンパク質の発現の有無を大腸菌で確認した。発現したFlgIを含む大腸菌の粗抽出液を電気泳動で分離後、膜上に転写させてファーウエスタンブロット解析法によってFlgAとの結合能を評価した。また、FlgAの変異導入によって、FlgAの機能を担う重要なアミノ酸残基の候補を同定した。FlgIは通常の培養温度で大腸菌で発現させると、封入体として細胞内に蓄積し、ペリプラズムへの移行はほとんどおこらない。FlgIのタンパク質発現条件は最適化したが、これまでのところFlgIの結晶は得られていない。本来、FlgIは環状化してPリングを形成するので、全長FlgIでは結晶成長よりも環状化が優勢になる可能性もある。そこで、FlgIとしての安定化を期待してFlgAとの共発現を試みた。FlgAは本来のシグナル配列を残したままFlgIと共発現させ、ペリプラムでの複合体形成を目指した。FlgIのN末端に付加したヒスチジンタグを利用してアフィニティー精製後、サイズ排除クロマトグラフィーによってFlgIとFlgAを含む画分を確認できた。今後、FlgI/FlgAの複合体として結晶化の検索をできるようになった。FlgIの機能ドメインの解析では、FlgIのN末端を欠失させてもFlgAとの結合に変化は見られず、FlgIのC末端側にFlgAとの結合領域があることが判明したので、全長FlgIでは結晶化が難しいので、FlgAとの結合領域の結晶化の道筋がついた。FlgAのC末端側を欠失させるとFlgIとの結合ができずシャペロンとしての機能が失われ、その結果べん毛はできない。FlgAのC末端側には、アミノ酸配列の相同性は低いが疎水性のアミノ酸残基が集まった部分があり、この領域のアミノ酸残基に部位特異的変異を導入し、サルモネラ菌のFlgA変異株を相補できない変異体を発見した。この疎水性アミノ酸に富む領域はFlgIとのタンパク質相互作用に関与する重要な領域であると予想している。細菌べん毛のPリングは、シャペロンタンパク質FlgAの補助を受けてペリプラズム領域で形成される。
水稲老化葉からの窒素転流に関与するアンモニア同化系酵素群の分子生物学的研究

本研究では、イネ老化葉における細胞質型グルタミン合成酵素(GS1)と窒素転流先でのNADH依存性グルタミン酸合成酵素(GOGAT)に着目し、イネの窒素転流におけるこれらの役割を、分子生物学的手法を用いて解明することを目的とし、以下の成果を得た。1.イネ老化葉におけるGS1ー1)イネ着生葉の老化に伴うGS1ポリペプチドの単葉内分布変化を、葉緑体GS(GS2)・FdーGOGAT・Rubisco・グルタミン酸脱水素酵素(NADHーGDH)ポリペプチドの分布と、それぞれ特異抗体を用いた免疫学的手法で比較した。その結果、GS1ポリペプチドは葉身の中央部に多く、その含量は老化後期でも大きな変化を示さず、先端部に多く存在し、老化に伴って著減する他の酵素タンパク質とは異なっていた。また、GS1mRNAは、葉身各部位において、老化に伴い微増していることが明かとなった。2)Tissue Print Immunoblot法によるGS1・GS2タンパク質のイネ葉組織内分布を検討した結果、GS1は維管束系に局在しており、葉肉細胞に局在していたGS2・FdーGOGAT・NADHーGOGATとは全く異なっていた。以上の結果は、GS1が老化葉でのGluからGluへの変換を担っていることを強く示唆しており、その成果をPlant Physiol.に投稿した。2.生長中の組織におけるNADHーGOGATー1)窒素の転流先において、GluからGluへの変換を担う可能性のあるNADHーGOGATを、世界に先駆けて生成し、その特異抗体を得た。2)この抗体を用いて、NADHーGOGATポリペプチド含量及びその活性が、イネ葉身の葉鞘に包まれた未展開葉身及び3)穂において、高いことが明かとなった。以上の結果は上記の可能性を強く示唆し、その成果を1)はPlant Physiol.に投稿し、現在印刷中である。また、2)と3)については現在投稿準備中である。
胎児、新生児の脳室周囲白室軟化に関する分子発生病理学的研究

1.超低出生体重児のPVL病理学的にPVLと診断した在胎23週から27週未満のヒト超低出生体重児13例について、同年齢の正常9例をコントロール群とし検討した。方法は、病変分布別にfocal(F)型、widespread(W)型、diffuse(D)型に分類し、さらに、グリアに関しては、アストロサイトの反応をGFAP抗体で、またPVL形成過程にミクログリアでその発現が認められたサイトカインとしてTNFα抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。軸索障害に関しては反応性軸索変化に特異的に発現するβ-amyloid precurcer protein(βAPP)抗体を用いた。結果は、超低出生体重児の白質軟化では壊死巣が広範で、そのグリア反応は深部から中間部白質で著しく認められた。また、TNFαの発現も早期の在胎23週から認められた。βAPPは、捉えにくい初期の軸索変化にも発現していた。これらから、超低出生体重児にPVLは少なく形成されにくいと考えられてきたが、超低出生体重児のPVLも、虚血などにより、早期から軸索変化が生じ、βAPPが発現する一方、活性化されたミクログリアから産生されたTNFαやアストロサイトの増生が白質軟化の形成に関与していると思われた。2.PVL病変分布と在胎週数との関係について対象は在胎22週から41週のPVL例85例に関し、神経病理学的、免疫組織化学的に検討した。上記のごとく在胎28週未満の超低出生体重児は全例W型であり、成熟するにともなって34週以降はF型が多くなる傾向にあった。これは血管、グリア、軸索の易傷害性、成熟度、可塑性やサイトカインの発現に関係していると考えられるが今後も検討が必要である。
DNAミスマッチ修復正常型高頻度変異大腸がんのDNAポリメラーゼ校正機能解析

本研究は、DNAミスマッチ修復機構(MMR)が正常(proficient-MMR: pMMR)でありながら高頻度の変異を呈する大腸がんの臨床・分子遺伝学的特徴を把握し、DNAポリメラーゼ校正機能異常がどのように高頻度の変異を誘導し、大腸がんの発育進展に関与するかを解明することを目的としている。また、DNAポリメラーゼ校正機能異常を呈するpMMR大腸がんの薬物療法感受性変化を検討することにより、今後のさらなる個別化を考えた有効で安全な大腸がん薬物療法や患者・家族ケアの推進に貢献することも目的とする。
血中循環腫瘍細胞を標的としたがん免疫療法効果予測バイオマーカーの開発と臨床応用

申請者らは原発巣や血液中の循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell: CTC)における免疫チェックポイント分子の発現に着目し、腫瘍悪性度や予後と密接に相関している事を見出してきた。本研究は血中CTCにおける新規免疫チェックポイント分子発現とがん免疫逃避機構との関係を分子生物学的に解明すると同時に免疫チェックポイント阻害剤の治療効果や副作用を予測可能な血中バイオマーカーを探索し、臨床応用する事を目的とする。本研究によって血液バイオマーカーに基づく効率的な個別化がん免疫療法が可能となり、リキッドバイオプシーによるモニタリングで繰り返し評価をする事で無駄な医療費の削減も期待される。