hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
構造から解き明かす歯周病菌の病原因子分泌機構

代表的な歯周病原細菌がもつ病原因子分泌機構(9型分泌機構; T9SS)の分泌されるタンパク質がどのような共通性、特徴を持つのか解析を行った。T9SS分泌タンパク質の輸送タンパク質の特徴を知るために、P. gingivalisのT9SS分泌タンパク質である、HBP35全長タンパク質(プロ型)のX線結晶構造解析を行なった。これまでに報告のあるT9SS分泌タンパク質Gingipain (Kgp, Rgp)(分泌型)等の構造と、全長HBP35の構造を比較することにより、T9SS分泌タンパク質は、機能ドメイン、Ig-like domain、C-terminal domainを基本構造として持つことが示された。Ig-like domainを欠失したHBP35 (HBP35ΔIg)およびGingipain (KgpΔIg、RgpΔIg)をP. gingivalisにおいて発現させたところ、HBP35ΔIgおよびRgpBΔIgは、各々抗Hbp35抗体および抗Rgp抗体を用いたイムノブロットで検出されなくなった。これらは、菌体内で品質管理タンパク質の1つであるHtrAプロテアーゼによって分解されており、Ig-like domainを欠失したT9SS分泌タンパク質が、タンパク質凝集していることが示唆された。また、KgpとRgpBのIg-like domainを入れ替えた場合も同様に、細胞内でHtrAによって分解されていた。このことから、各々の機能ドメインに合わせたIg-like domainが必要となることが示された。一方、HBP35タンパク質の構造から、Ig-like domainは、機能ドメインとIg-like domain間のドメインの疎水性面を覆うことによって、菌体内での凝集を防ぐ役割があることが示唆された(Sato et al. 2018)。研究の目的は、T9SSを構成する個々のタンパク質について分子構造を明らかにするとともに、分泌されるタンパク質がどのような共通構造を持ち、T9SSに認識されて膜を通過するのかをその構造の面から明らかにすることを本研究の目的とする。<T9SSを構成する個々のタンパク質について> PorM結晶構造解析については、ネーティブタンパク質については解析可能な結晶が得られ、回折データを得た。< T9SS複合体の構造解析>PorK, PorN複合体が単離・精製され、電子顕微鏡撮影により構造を観察したところ、リング構造をとっていることが明らかとなった(PLoS Pathog. 10;12(8) (2016))。<T9SSから分泌されるタンパク質について>ジンジパインおよびHBP35の構造解析から、T9SS分泌タンパク質はβ-sandwich構造、CTD (C-terminal domain)を共通して持つことが明らかとなり、おそらくT9SS分泌タンパク質の基本構造は機能ドメイン、β-sandwich構造、CTDからなることが示唆された。β-sandwich構造の役割をみるためにHBP35に含まれるβ-sandwich領域の一部を欠失させたHBP35、およびβ-sandwich構造の疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸に置換したHBP35を歯周病菌内で発現させた。β-sandwich構造変異型HBP35は菌体内で分解されることから、β-sandwich構造がIX型分泌機構での輸送に必須であることがわかった。β-sandwich構造一部欠失に伴うT9SS分泌タンパク質分解は、HBP35の他にジンジパイン(Kgp, RgpB)においても確認された。この分解に関わるプロテアーゼは、変性状態のタンパク質を特異的に分解する、菌体内品質管理HtrAであることが明らかとなった。T9SSを構成する個々のタンパク質について分子構造を明らかにすることを研究の目的とする。具体的には、まず、T9SSのコア部分であるPorK, PorL, PorM, PorN各々の結晶構造解析を目指す。PorM結晶構造解析については、ネーティブタンパク質の解析可能な結晶が得て、回折データを得た。今後は位相決定を試みる。PorK, PorNは、可溶性タンパク質が得られておらず、巻き戻しも成功していない。PorLは可溶性タンパク質が得られているものの、結晶化スクリーニングで結晶が得られていない。< T9SS複合体の構造解析>T9SS構成タンパク質のコア部分であるPorK, PorN複合体がP. gingivalisから精製され、リング構造を取っていることが分かった。どのような共通構造を持ち、T9SSに認識されて膜を通過するのかをその構造の面から明らかにすることを研究の目的とする。ジンジパインおよびHBP35の構造解析から、T9SS分泌タンパク質はβ-sandwich構造、CTDを共通して持つことが明らかとなり、おそらくT9SS分泌タンパク質の基本構造は機能ドメイン、β-sandwich構造、CTDからなることが示唆された。β-sandwich構造の疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸に置換したり、β-sandwich構造を一部欠失させたりすると、T9SS分泌タンパク質は菌体内で分解されることから、β-sandwich構造がIX型分泌機構での輸送に必須であることがわかった。また、β-sandwich構造部分を他のタンパク質と入れ替えたところ、菌体内での分解は免れるものの、T9SSによって菌体表層へ輸送されなかった。このことから、T9SS分泌タンパク質は各々特有のβ-sandwich構造を持つことが分かった。

<T9SSを構成する個々のタンパク質について> PorM結晶構造解析については、ネーティブタンパク質については解析可能な結晶が得られ、分解能3.8Aの回折データを得たが、構造を解くためには高分解能の回折データが必要となる。< T9SS分泌タンパク質の構造解析>ジンジパイン、HBP35の構造解析から、T9SS分泌タンパク質は機能ドメイン、β-sandwich構造、CTD (C-terminal domain)を基本構造として持つことが示された。β-sandwich構造変異型RgpB, KgpおよびHBP35は菌体内のHtrAによって分解されることから、β-sandwich構造がIX型分泌機構での輸送に必須であることがわかった。機能ドメインとβ-sandwich構造はお互いの疎水性部分で向かい合う。β-sandwich構造の疎水性アミノ酸を親水性に置換したところ菌体内で分解された。また、Porphyromonas gingivalisのβ-sandwich構造をPseudomonas aeruginosaのVesBに変えたところ、菌体表層への輸送は行われなかったが、菌体内での分解を免れていた。β-sandwich構造は菌体内で機能ドメイン疎水面を覆うことにより、菌体内での分泌タンパク質の凝集を防ぐ機能があることが示唆された。さらに、それぞれの分泌タンパク質特異的なβ-sandwichを持つことが示された。「T9SSを構成する個々のタンパク質について」は「やや遅れている」。PorM結晶構造解析について、2018年に海外の研究室から報告が出された。その構造はPorMを2分子に分けて、構造を解いたものであり、本研究の全長PorMリコンビナントタンパク質から得られた回折データと比較すると、構造が異なることが示唆されている。現在、PorM結晶は非常に壊れやすく高分解能データが得られていない。凍結条件などを改善し、高分解能データ取得を目指す。「T9SS分泌タンパク質の構造解析」については、「計画以上に進展している」。計画していたことは終了し、分泌タンパク質についての基本的な特徴を捉えることができた。今後は、菌体表層での分泌タンパク質の存在様式(菌体表層に複合体の形で存在する)において、構造からわかることを解析していく予定。「T9SSを構成する個々のタンパク質について」の解析が遅れているために、「おおむね順調に進展している」の区分を選択した。代表的な歯周病原細菌がもつ病原因子分泌機構(9型分泌機構; T9SS)の分泌されるタンパク質がどのような共通性、特徴を持つのか解析を行った。T9SS分泌タンパク質の輸送タンパク質の特徴を知るために、P. gingivalisのT9SS分泌タンパク質である、HBP35全長タンパク質(プロ型)のX線結晶構造解析を行なった。これまでに報告のあるT9
生成物の分離を伴ったバイオリアクターシステムに関する研究

本研究では、溶媒抽出系および溶媒抽出を発展させた液膜系を反応槽に組み込んで効率良い生物反応操作を実現することを目的とした。このために、代表的なバイオ生産物であるアミノ酸、ペプチド、有機酸および抗生物質について、前年度は基礎となる抽出平衡関係を検討し、これを支配する因子を明らかにした。今年度はこれらの知見をもとに乳化液膜操作を行い、分離操作としての可能性を検討した。最後に乳酸発酵を例に発酵操作と抽出操作を組み合わせたプロセスの開発を行った。1アミノ酸及びペプチドの分離乳化液膜によるアミノ酸の透過速度について平面接触型攪拌槽を用いて検討した。実験結果は瞬間反応を伴う2重境膜モデルで良く表されることがわかった。2抗生物質の分離反応抽出の例が今まで知られていなかったβ-ラクタム系の抗生物質であるセファロスポリンCの反応抽出に、4級アンモニウム塩を抽出剤として用いて成功した。この系を用いると、抽出-逆抽出ともセファロスポリンCが比較的安定な条件下で行えることがわかった。3有機酸の分離実発酵液からの乳酸回収プロセスを検討するために、実際の発酵液を想定して抽出系の検討を行った。発酵終了後の濾液を対象とするのであれば、pHは2-3前後であるため溶媒和型の抽出剤が有効であった。一方in situな抽出分離を行うためには、発酵至適pHが6付近であるためイオン交換型の抽出剤が有効であった。しかしこの抽出剤は菌体に対する毒性が大きいため、発酵と抽出の至適pHを一致させることは困難であった。このため両者の中間pH3.5付近で抽出発酵を実際に試み、良好に運転できることを確認した。本研究はアミノ酸、ジペプチド、有機酸および抗生物質などのバイオ生産物の生成物分離を伴うバイオリアクタ-システムを開発することを目的としている。そのために本年度は上記バイオ生産物の抽出に関する基礎的研究を行ない、以下のような知見を得た。1.アミノ酸およびペプチドの抽出分離アミノ酸およびペプチドの分離の基礎的研究として、4級アンモニウム塩を用いた数10種類のアミノ酸およびジ-、トリペプチドの抽出を行ない、抽出平衡定数を求めた。この抽出平衡定数がアミノ酸およびペプチドの疎水性と良い相関があることを見いだした。また溶媒効果も検討し、抽出反応にとって最適の溶媒系を見いだした。2.発酵乳酸の抽出分離実際の発酵液からの乳酸の抽出分離を行なった。乳酸発酵の至適pHは6であり、この条件下で高い抽出率を与える抽出剤および溶媒を検討した。その選果、ジオクチルアミンーヘキサン系が最も適当であることがわかった。発酵乳酸を用いた抽出では、抽出剤濃度が高い場合には凝集物が見られるなどの問題があることがわかり、最適の抽出剤濃度を見いだした。3.抗生物質の連続分離"Vibro Mixer"を用いたペニシリンの連続抽出を乳化液膜法を用いて行なった。まず"Vibro Mixer"の中のW/Oエマルションの分散滴径、混合特性などを明らかにした。次に"Vibro Mixer"を用いて連続的な抽出実験を行なった。高い抽出率、良い相分離特性を示す操作条件を見いだした。

1アミノ酸及びペプチドの分離乳化液膜によるアミノ酸の透過速度について平面接触型撹拌槽を用いて検討した。実験結果は瞬間反応を伴う2重境膜モデルで良く表されることがわかった。2抗生物質の分離反応抽出の例が今まで知られていなかったβ-ラクタム系の抗生物質であるセファロスポリンCの反応抽出に、4級アンモニウム塩を抽出剤として用いて成功した。この系を用いると、抽出-逆抽出ともセファロスポリンCが比較的安定な条件下で行えることがわかった。3有機酸の分離実発酵液からの乳酸回収プロセスを検討するために、実際の発酵液を想定して抽出系の検討を行った。発酵終了後の濾液を対象とするのであれば、pHは2-3前後であるため溶媒和型の抽出剤が有効であった。一方in situな抽出分離を行うためには、発酵至適pHが6付近であるためイオン交換型の抽出剤が有効であった。しかしこの抽出剤は菌体に対する毒性が大きいため、発酵と抽出の至適pHを一致させることは困難であった。このため両者の中間pH3.5付近で抽出発酵を実際に試み、良好に運転できることを確認した。
メタボリック症候群を病理基盤とした過活動膀胱の病態解明と早期診断法の開発

メタボリック症候群から続く生活習慣病が放置されると、心筋梗塞、腎不全、脳血管障害等の致死的疾患がドミノ式に引き起こされる。そのため早期介入により、致死的疾患を予防し健康寿病を延ばし、膨大な医療費を削減することが喫緊の課題になっている。近年、急激な強い尿意を突然催し尿失禁を伴うこともある、過活動膀胱は骨盤の微小血管血流障害が一因であることが解明された。骨盤内の血流障害と高脂肪食により過活動膀胱を引き起こすラットの病態モデルの確立と、そのモデルを用いた研究により、膀胱の血流障害により引き起こされる酸化ストレスが膀胱機能障害の病因であり、マーカーの研究も進んでいる。本研究では、過活動膀胱モデルを用い、尿中のバイオマーカーを探求するとともに、食指の改善が膀胱機能障害与える影響について検証する計画である。今年度は、膀胱虚血ラットを作成、偽手術モデルと比較し、尿中バイオマーカーの同定まで予定していた。しかしながら、膀胱虚血モデルラットの安定化に難渋している。具体的にはこれまで報告されている、骨盤臓器の栄養血管である内腸骨動脈の内膜損傷と、外腸骨動脈の結紮手術を行い、高脂肪食を与えることにより作成する方法では、安定した膀胱機能障害のデータが得られない問題が生じた。モデル作成手術に修正が必要と判断し、修正モデルの作成中である。いったん安定した病態モデルが作成されれば、尿中バイオマーカーの同定や、食指の改善効果の判定についても、比較的順調に計画を遂行できると考えている。当該年度の経過では、ラットによる膀胱虚血モデルの確立と、そのモデルと偽手術モデルを用い、尿中バイオマーカーを同定することを予定していた。しかしながらこれまで報告されていた、病態モデルの作成方法では、安定した膀胱機能障害のモデル作成とならず、修正したモデルの作成法の確立が必要になった。この問題に対して、外腸骨動脈の手術操作の修正により、修正病態モデルの作成法は確立しつつある。本研究のプロトコールに沿った病態モデルの確立に時間が必要であったが、安定して病態モデルラットを作成する修正モデルの手術方法に目途が立ちつつある。この修正モデルを用いて、尿中バイオマーカーの同定に向けて、プロテオーム解析解析等により網羅的に探索することにより、効率的な同定を予定している。その後、食指の改善による、膀胱機能障害の変化への影響の評価に続けていくことを予定している。当該年度は病態モデル作成の修正に時間を要したため、試薬などの費用が必要な分子生物学的解析が遅れたため次年度使用額が生じた。次年度にバイオマーカーの探索を行う予定であり、プロテオーム解析等の分子生物学的解析に使用する予定である。
筋疾患マウスのM-CK遺伝子の解析とM-CK蛋白の動態に関する研究

本研究では、dystal myopathy、筋緊張性dystrophy及びカルニチン欠損症型筋萎縮症の疾患モデル動物であるB6CBA/J-cro系統マウスを用いて、これまでの研究によりcroマウスで欠損する蛋白について、アミノ酸配列の解析結果と特異抗体を用いた解析結果からこの蛋白が筋小胞体結合CKM鎖である可能性が強く示唆されているので、この点をさらに追求し、筋疾患発症機序及び、正常筋における筋小胞体結合型CKの生理学的意義について考察するために以下の実験を行ない成果を得た。材料に本講座で系統維持されているB6CBA/J-cro系統および市販ICR系統マウスを用いた。既報に従い、後肢筋ホモジェネート、血清はそのまま、筋小胞体分画は骨格筋より分画したペレットを溶解液で浮遊させた物を材料として、カラムクロマトグラフィー法を用いてCKM蛋白を精製し、10-20%nativeアクリルアミド濃度勾配ゲルを用いた移動度について各試料・分画間で比較検討した結果、明確な差異は検出されず、croマウスCKに筋小胞体での欠損を示唆すると考えられる変異や蛋白表面電荷に影響をもたらす変異は認められなかった。これらの結果と、同材料を用いて3領域に分けてPCR法を用いた直接配列決定法によるcroマウスゲノムのCKM部分の配列解析の結果から、筋小胞体分画におけるCKM欠損に由来するものと考えられる筋CK活性低下と筋収縮時の筋小胞体におけるエネルギー代謝の問題と筋脱力との関連について、および正常筋における筋小胞体結合型CKM鎖の生理学的意義について考察された。
現代アメリカ舞台芸術の理論と実践における被抑圧の文化ポリティクスの諸問題の研究

本研究の目的は、被抑圧の側から提起され、近年展開をみたクィア・セオリー、ポストコロニアリズム、ジェンダーおよびセクシュアリティの問題を、現代アメリカ演劇および舞台芸術における理論と実践の両面から検証し、文化に表象される権力と支配の構造と、ポリティクスという意味における政治意識と文化に対する意識を考察することで、演劇における新たな表象文化論の方向性を探ることにある。このため本年度は、前述のテーマに関する研究書、学術雑誌を収集、通読し、特に1960年代から、1970年代のフェミニズムの動きと呼応して、女性というジェンダーが、男性支配を強化するための、社会的、文化的構築物であると認識されるようになった過程が、身体のポリティクスとして、いかに舞台芸術において表象されるようになったか、という視点から捉え直す作業を行い、その成果を所属短期大学付属の「女性文化研究所」の叢書に論文として発表した。また、ポストコロニアリズム、クィア・セオリーに関しては、近年これらの問題が、主体対他者に加えて、主体そのものの位置の在処とその変化をめぐる問題を包含しつつ、複雑化する傾向にあることをつきとめた。具体的には、ス-ザン・ロ-リ・パークス、アドリアン・ケネディー、マリア・アイリーン・フォルネスらの活動に関する資料を収集し、ケネディー、フォルネスに関しては、翻訳を準備中である。近年のカルチュラル・スタディーズの台頭に伴い、アメリカの舞台芸術研究の学界も、大きく二分され、さらに動向を見守ってゆきたい。
薬物代謝酵素の立体構造および柔らかさは遺伝多型によってどのように変わるか？

本研究では遺伝多型によって生じた薬物代謝酵素変異体タンパク質の立体構造および動的性質を分子シミュレーションによって明らかにし、アミノ酸残基の変異が活性にどのような影響を与えているかを解明した。静的構造については変異箇所のみならず変異から遠く離れた部位にも影響が現れることがあり、水素結合ネットワークの組み替えなどが生じていることが観察された。またタンパク質の動的性質も変異によって変化することが示されており、電子伝達タンパク質や水分子、酸素分子など、薬物代謝酵素に影響を与える他の分子との相互作用に変化が生じている可能性が示唆された。本年度は、薬物代謝酵素シトクロムP450 (CYP)のいくつかの分子種に関して、遺伝多型が立体構造に与える影響を分子シミュレーションによって解析した。対象とした分子はCYP1A2およびCYP2D6で、いずれも多数の変異体が発見されており、かつそれら変異体が薬物代謝に影響を与えることが知られている分子種である。これらについてコンピュータ上でアミノ酸変異を加え、シミュレーションによってどのような構造をとるかを予測した。CYP1A2については少数のアミノ酸残基の変異、CYP2D6については複数のアミノ酸残基の変異が立体構造に与える影響について評価した。いずれにおいてもタンパク質主鎖レベルでの大きな構造変化は確認されていないが、それでも二次構造が崩れたり、あるいは逆に形成されたりといった変化は存在した。さらに水素結合ネットワークにも変化が生じており、アミノ酸残基の変化が立体構造に対して影響を与えていることが見てとれた。これは変異から近い部分に留まらず、遠い部位でも同様に観測されているが、これについても水素結合による相互作用ネットワークを介した変化の伝播などが推測された。立体構造の変化は複数の箇所で見られたが、リガンド結合部位や電子伝達タンパク質との結合面と推定される箇所でも構造変化が見られており、これらがCYPの代謝活性に影響を与えている可能性が示唆された。CYPに加え、N-アセチル転移酵素(NAT)についても同様に遺伝多型の影響をシミュレーションによって評価した。NATではシステインやヒスチジンのプロトン化状態の変化が代謝反応において重要であることが示唆されているが、本研究においても様々なプロトン化状態についてシミュレーションを行い、立体構造を推定した。本年度は、昨年度に引き続きシトクロムP450 (CYP)の遺伝多型がタンパク質立体構造および物性に与える影響について、分子シミュレーションを用いて解析した。今年度は主にCYP1A2について検討を行った。前年度においてはタンパク質全体の立体構造および物性について評価したが、今年度は活性部位の構造や分子認識機構に注目して解析を行った。CYPはタンパク質中央部に比較的大きな活性部位ポケットを有し、様々な基質を認識することが知られているが、実験的に得られた結晶構造の中にはこの部位に水分子を有するものもいくつかある。この水分子の役割について分子シミュレーションで評価し、基質認識に際しては重要な役割を果たしている可能性が示唆される一方で、阻害剤の認識に際しては必ずしも必要ではないことが示された。さらに同じようにポケット内に認識されるリガンドであっても、基質と阻害剤では認識機構に差があることを動的性質も交えて評価した。また、N-アセチルトランスフェラーゼ2についてもアセチル基が補酵素Aに付いている場合とシステインに付いている場合の両方についてシミュレーションを行い、遺伝多型が補酵素の認識や活性部位ポケットの形状に影響を与えることを評価した。さらにこのような検討をするためのツールであるタンパク質ーリガンドドッキングソフトウェアについて、設定を様々に変化させた場合のベンチマークテストについても行った。これによって目的に応じて適切な設定でドッキング計算を行うことが可能となった。これまでに、いくつかの薬物代謝酵素について、タンパク質単独での性質のみならず、基質や阻害剤、補酵素などを含んだ複合体としての構造および物性の推定に成功している。さらには薬物代謝のいくつかの段階を模したモデル構造でのシミュレーションも行っており、薬物代謝酵素について複数の視点で解析することができている。また、単に静止構造を見るだけでなく、構造の揺らぎによって相互作用ネットワークが生じたり消えたりする様子についても追うことができており、動的性質の重要性についても見出している。これらの点から、おおむね当初の予定通り順調に進展しているものと考えられる。本年度では、薬物代謝酵素の変異体タンパク質の立体構造および動的性質について、分子動力学(MD)シミュレーションを用いて検討を行った。薬物代謝酵素の変異体では多くの場合ごく少数の残基(1残基のみのことも多い)のみが変異しているが、その変異がタンパク質全体の動的性質を変化させることがしばしばある。本研究ではシトクロムP450 (CYP)やN-アセチルトランスフェラーゼ2 (NAT2)の変異体についてその動的性質を調査した。その結果、変異から大きく離れた箇所でも動的性質に変化が生じていた。CYPのヘム周辺やNAT2の触媒3残基周辺など、活性部位周辺に変化が生じている場合に加え、他のタンパク質との結合界面と考えられている箇所に揺らぎが生じている場合もあり、変異がタンパク質ータンパク質結合に影響を与えている可能性が示唆された。また、一般的なシミュレーション時間が経過した時点ではきわめて大きな揺らぎを示していた変異体もあり、構造が未だ収束していないのではないかと考えられた。このような変異体では主鎖構造のレベルで立体構造が変化している可能性があり、わずか数残基の変異がタンパク質の構造を根本的に変化させている様子が見てとれた。さらに、野生型に対してタンパク質ーリガンド複合体の立体構造を推定し、その構造的特徴を見いだした。

いくつかの複合体構造に対するシミュレーションを通じて、相互作用の保存やリガンドと活性中心との位置関係などから、妥当な構造とそうでない構造とをシミュレーションで判別できる可能性が示された。また、CYPには大きなリガンド結合ポケットが存在するが、ドッキングおよびMDシミュレーションを行うことでこの結合ポケットに水分子の進入が確認されており、相互作用の揺らぎに加えて周辺分子の挙動についても十分精査する必要があることがわかった。本研究では遺伝多型によって生じた薬物代謝酵素変異体タンパク質の立体構造および動的性質を分子シミュレーションによって明らかにし、アミノ酸残基の変異が活性にどのような影響を与えているかを解明した。静的構造については変異箇所のみならず変異から遠く離れた部位にも影響が現れることがあり、水素結合ネットワークの組み替えなどが生じていることが観察された。またタンパク質の動的性質も変異によって変化することが示されており、電子伝達タンパク質や水分子、酸素分子など、薬物代謝酵素に影響を与える他の分子との相互作用に変化が生じている可能性が示唆された。本課題では薬物代謝酵素の静的・動的構造が遺伝多型によってどのような影響を受けるか、分子シミュレーションを用いて評価することを目的としている。本年度では当初の予定通り野生型および変異型薬物代謝酵素の立体構造について分子シミュレーションで推定できた。また特定の分子だけではなく、CYPの複数の分子種やNATなど、多様な構造および変異をもつ酵素について計算を行っており、それらの結果を統合することによって活性部位や結合タンパク質との界面など、機能発現に重要な箇所の構造変化の重要性を推定することができた。変異体の種類についても変異の多いものから少ないものまで多数取り扱っており、遺伝多型が立体構造に及ぼす影響について様々なパターンを確認している。従って当初の予定通りおおむね順調に進展しているものと考えている。本年度の結果をふまえ、さらにいろいろな分子種を対象として分子シミュレーションを行う。また、これまでに計算を行った分子種に関しても、複数の基質や阻害剤を用いた計算を展開し、分子認識機構についての一般的な知見が得られないか検討する。特に水分子を介した相互作用ネットワークについては、本年度の研究でその重要性が示唆されたため、他の複合体についても同様のことが起こりうるかを調査する。遺伝多型においてはアミノ酸残基の変異が、その変異から遠く離れた部位にまで影響を及ぼすことを見出しているが、多様な分子種の多様な変異体について検討を行うことで、それら影響を分類することが可能であるかどうかについても検討する。それによって、莫大な数が存在する遺伝多型に関して統一的に評価するための基盤を構築できるのではないかと期待できる。計算化学本年度の結果を踏まえ、引き続き遺伝多型が薬物代謝酵素の動的性質に与える影響について評価する。
人工心肺における連続血液粘度モニタリングシステム：推定アルゴリズム提案と臨床応用

人工心肺中の血液粘度は,温度,ヘマトクリットレベル,血液pHなどの非生理的な変化,不十分な抗凝固,機械的なストレスなどによって影響されることは知られている.しかしながら,これまで,簡易的で,非接触で連続的に血液粘度を測定する技術は存在せず,臨床では血液粘度が人工心肺に及ぼす影響は調べられていない.本研究では,人工肺の圧力流量特性に着目して,新たな血液粘度モニタリング法を提案し,人工心肺中の血液粘度と神経学的合併症,人工肺の閉塞などの合併症の関連性を解明する.平成30年度の研究成果を以下に示す.(1)平成29年度に開発した連続血液粘度モニタリングシステムを使用して,血液粘度異常時に,正しく検出可能かを調査するため,ウシ血液を利用した粘度増加モデルの実験を行った.(2)提案アルゴリズムが粘度増加時に原因の特定ができない課題がでたので,粘度増加時に血液がどのような性状となっているか,電子顕微鏡での観察実験を追加した.(3)電子顕微鏡で観察した赤血球は粘度レベルが増加するにつれて,いが状から球状へと変形能が低下していることを発見した.人工心肺中の血液粘度は、温度、ヘマトクリットレベル、血液pHなどの非生理的な変化、不十分な抗凝固、機械的ストレスなどによって影響されることは知られている。しかしながら,これまで簡易,非接触そして連続的に血液粘度を測定する方法は存在せず,臨床現場には普及していないので、血液粘度が人工心肺に及ぼす合併症の影響は調べられていない。本研究では,人工肺の圧流量特性に着目して,新たな血液粘度モニタリング法を提案し、人工心肺中の血液粘度と神経学的合併症、人工肺の閉塞などの合併症の関連性を解明する。28年度の研究成果を以下に示す。(1)人工肺を灌流する流体の特徴から圧流量特性モデルを構築した。大人サイズの代表的な人工肺を対象に、ニュートン流体(グリセリン)および非ニュートン流体(ウシ血)を灌流させて、それらの圧流量特性を求めモデル化を行い、人工肺ごとのパラメータで対応可能なモデルを構築した。(2)圧流量特性モデルに基づく新しい粘度推定アルゴリズムを提案した。得られた圧流量特性モデルから、圧と流量を入力値とした粘度推定式を導出した。また人工肺と流体の種類に依存したパラメータを決定して、粘度推定方法として提案した。(3)提案アルゴリズムから、血液粘度モニタリングシステムの開発した。人工心肺装置から圧・流量信号を入力し、その信号から粘度推定式によって推定粘度を数値表示およびグラフ表示可能なプログラムを作成した。基礎実験および解析が予定通り進み、提案アルゴリズムを利用した臨床用システムも概ね完成している。人工心肺中の血液粘度は,温度,ヘマトクリットレベル,血液pHなどの非生理的な変化,不十分な抗凝固,機械的なストレスなどによって影響されることは知られている.しかしながら,これまで,簡易的で,非接触で連続的に血液粘度を測定する技術は存在せず,臨床では血液粘度が人工心肺に及ぼす影響は調べられていない.本研究では,人工肺の圧力流量特性に着目して,新たな血液粘度モニタリング法を提案し,人工心肺中の血液粘度と神経学的合併症,人工肺の閉塞などの合併症の関連性を解明する.平成29年度の研究成果を以下に示す.(1)平成28年度内に提案したアルゴリズムより,人工肺の圧と流量を入力値とする連続血液粘度モニタリングシステムを開発し,人工心肺装置との通信プログラムを作成した.(2)広島大学倫理委員会の承認のもと,人工心肺を用いる軽度低体温心臓手術の臨床症例に適用した.実臨床で得られたデータでは突発的な圧変化や流量変化により粘度データへのノイズ混入が確認されるなど課題を得た.臨床症例で得られたデータに基づいて,圧及び流量の入力時間およびウインドウ幅の解析を行い,4秒ごとの入力および演算がノイズを軽減する結果を得て,システムのプログラムを変更し,ロバストネスを改善させた.(3)改善したシステムにて,再度,人工心肺を用いる軽度低体温心臓手術および中度低体温心臓手術の臨床症例に適用し,データを蓄積しているところである.提案アルゴリズムより連続血液粘度モニタリングシステムの開発し,臨床用として使用可能な水準まで改善も行えた.正常範囲内の粘度値においては,従来法の粘度計と比較して,十分な精度であることも確認できた.人工心肺中の血液粘度は,温度,ヘマトクリットレベル,血液pHなどの非生理的な変化,不十分な抗凝固,機械的なストレスなどによって影響されることは知られている.しかしながら,これまで,簡易的で,非接触で連続的に血液粘度を測定する技術は存在せず,臨床では血液粘度が人工心肺に及ぼす影響は調べられていない.本研究では,人工肺の圧力流量特性に着目して,新たな血液粘度モニタリング法を提案し,人工心肺中の血液粘度と神経学的合併症,人工肺の閉塞などの合併症の関連性を解明する.平成30年度の研究成果を以下に示す.(1)平成29年度に開発した連続血液粘度モニタリングシステムを使用して,血液粘度異常時に,正しく検出可能かを調査するため,ウシ血液を利用した粘度増加モデルの実験を行った.(2)提案アルゴリズムが粘度増加時に原因の特定ができない課題がでたので,粘度増加時に血液がどのような性状となっているか,電子顕微鏡での観察実験を追加した.(3)電子顕微鏡で観察した赤血球は粘度レベルが増加するにつれて,いが状から球状へと変形能が低下していることを発見した.

・血液粘度モニタリングシステムのin vitroでの評価提案方法の正確性を評価するために、ウシ血などの流体を臨床で起こり得る血液温度・ヘマトクリットレベルの範囲内で変化させて人工肺に灌流して実験を行う。提案法と従来法の測定結果間の相関と誤差を調査する。また、灌流するウシ血の血液pHを極端にアルカローシスにすることや、抗凝固薬の不使用により赤血球の変形能異常や凝固状態を模擬可能である。この状態における提案システムの推定粘度からの異常検出の感度を評価することで、安全モニタとしての臨床応用の実現性を検討する。・血液粘度モニタリングシステムの臨床への適用臨床にて血液粘度モニタリングシステムを臨床症例に適用させる。人工心肺中、圧流量情報が、開始直後や手術手順によっては安定しないことが予想される。この場合、推定粘度値が急激に変化することになり、ユーザーがそのデータを信頼してしまうこと防ぐための対策として最適なウインドウ幅などを検討する。併せて臨床データを蓄積し。人工心肺手順や手術手技における粘度変化との関連性を分析する。・血液粘度モニタリングシステムにおける異常粘度状態の評価これまで,正常な粘度範囲におけるシステムの精度は確認できているが,異常な粘度値を引き起こす血球変形能異常や,血液凝固におけるシステムの有効性を確認できていない.ウシ血を使用してin vitroにて血球変形能異常モデルを作成し,実験を行ない,この状態の粘度の検出感度を評価し,人工肺の安全モニタとしての臨床応用の実現性を検討する.当該年度に実施した基礎実験時に使用するための粘度計などの購入予定の機材を借りることができたため、当該年度での購入を見送ることとした。人工肺を使用した実験が必要になったが,今年度,計画回数できなかったため,次年度に人工肺を購入し行う予定である.次年度は、粘度モニタリングシステムのin vitroでの評価を実施するため、人工肺などの医療材料、ウシ血などの試薬を購入し実験を行う。
単一素子でニュ-ロン機能を実現する新しいMOS型デバイスの研究

現存超LSI開発の指導原理は、単位素子の微細化とこれによる素子集積度の増加である。しかしこのアプロ-チは、素子寸法の微細化による様々な物理的限界と性能の劣化をもたらしている。さらに膨大な数のトランジスタを相互に結線し、回路としての機能を創り出す配線形成は、設計論的にも、プロセス技術的にも非常に因難なものとなっている。本研究の目的は、基本素子であるトランジスタに、単体で脳神系細胞にも匹適する高度な働きをさせることにより、極めて少数の素子と配線で、高度なLSI機能の実現をねらったものである。NMOS及びCMOSのプロセスで、二層ポリシリコンゲ-ト構造の新素子を試作した。この新しいトランジスタは、1つのフロ-ティングゲ-トと、フロ-ティングゲ-トと容量結合する多数の入力ゲ-トから構成されており、各入力ゲ-トの入力信号の重み付線形加算の結果が閾値を越えたときにトランジスタが導通する。トランジスタの導通をニュロンの発火に対応させれば正しくニュ-ロン上等しい機能をもっている。試作したニュ-ロンMOSトランジスタは正確にニュ-ロン動作をすることが確められた。また線形担抗や、1つのトランジスタで形成したDIAコンバ-タが理論通りの動作をすることも確めた。また,このニュ-ロンMOSトランジスタ(VMOS)を用いて従来の二値論理回路を設計すると素子数が1ケタ以上減らせることが分かった。4ビットのフラッシュAIDコンバ-タは従来398個のトランジスタが必要だったが、たった28個で実現できた。またコンピュ-タの心臓部である、全加算器も8個でできる(従来は50個)。これらの回路動作も実験的に確められた。さらに,外部信号の切り換えだけで、その論理機能を自在に切り換えることのできる,新しい論理回路も構成できることが分った。これは「やわらかいハ-ドウェア」の実現で,新しい回路概念である。本研究の目的は、単一素子で脳神経細胞のニュ-ロンと等価な働きをする全く新しい概念のMOS型デバイス,ニュ-ロンMOSFET(以下VMOSの略す)を研究開発することである。VMOSは、フロ-ティングゲ-トを有し、これと容量結合する多数の制御ゲ-トが信号入力端子となるMOSトランジスタで、入力信号電圧の線形加算をフロ-ティングゲ-トのレベルで実行できるという大きな特徴を持っている。フロ-ティングゲ-トの電位がMOSトランジスタの閾値を越えるとトランジスタは導通するが、これがニュ-ロン動作の基本となっている。本年度は、VMOSの基本機能を実験的に検証するとともに,より複雑なVMOS回路設計の研究を行った。基本動作検証のため、VMOSを通常のNチャンネルMOSプロセスで試作した。制御ゲ-ト電極は、結合容量を別途付与することにより様々な組合せの実験を行った。その結果,以下のような、予想通りの結果が得られた。即ち、各入力ゲ-トへの入力信号の線形和が所定の閾値を越えたときニュ-ロンは発火した。しかも、1つの制御ゲ-トの入力電圧を変化させることにより、発火の閾値を任意の値に設定できることも分った。2入力のVMOSで一方の電極を閾値調整電極とすることにより、閾値を電気信号で任意にかえられる「可変閾値トランジスタ」も実現できた。また,2入力VMOSの一方の電極をドレインと接続することにより,抵抗値可変の線形抵抗が実現できた。

さらに,VMOSをソ-スフォロワ回路として用いることにより,高速のD/Aコンバ-ジョン回路が簡単に実現できることも分った。以上のように,VMOSトランジスタの多才な性能が実験的に明らかとなったため、現在CMOS構成のVMOS回路を設計しており、これにより,さらに複雑なニュ-ラルネットワ-クへの応用を研究していく計画である。初年度のに行ったニュ-ロンMOSトランジスタの理論的解析並びに単体MOSに外付けのコンデンサ-を付けて行った実験結果に基づいてNMOS二層ポリシリコンプロセスによりニュ-ロンMOSトランジスタの試作を行いその基本特性の評価を行った。この試作においては、第一層目のポリシリコンでフロ-ティングゲ-トを形成し、その側壁部にCVDSiO_2によるスペ-サを形成したのち、入力ゲ-トを第2ポリシリコンで形成した。このスペ-サは、容量結合係数決定の精度向上、入力ゲ-ト電極の異方性エッチングの精度向上、さらにフロ-ティングゲ-ト内電荷の変動防止等、素子の性能向上、信頼性向上に大きな効果をもっている。試作サンプルの評価より、期待通りのトランジスタのニュ-ロン動作を確認した。また線形可変抵抗も予想通りの良好な特性を示すことを確めた。ニュ-ロンMOSの最も重要な応用である、可変閾値トランジスタや可変閾値インバ-タもすべて予想通りの動作をすることが実証された。さらに単一トランジスタで形成したD/Aコンバ-タも良好な特性を示した。これらの結果に基づき、CMOS二層ポリシリコンプロセスによるニュ-ロンMOS回路の設計、試作を行った。この結果、ニュ-ロンMOSを用いて従来のバイナリ論理回路を設計し直すと、素子数・配線数を激減させられることが分った。例えば4ビットのA/D変換器は従来のトランジスタでは398個必要だったが、ニュ-ロMOSではたった28個で実現できることが分かった。またコンピュ-タの心臓部の構成要素である全加算器もたった8個で構成できる(従来は50個)。これらの回路動作も実験的に確められた。さらに、外部信号の切り換えだけで、その論理機能を自在に切り換えられる新しい概念の論理回路も構成できることが分かった。これは「やわらかいハ-ドウェア回路」という新たな可能性を秘めた非常に重要な技術開発の成果である。
光励起プロセスを用いた強誘電体薄膜の成長と機能素子への応用

新しい強誘電体薄膜形成技術として光励起プロセスを提案し,チタン酸鉛(PbTiO_3)及びチタン酸ジルコン酸鉛(Pb(Zr,Ti)O_3:PZT)薄膜の成長を行った。Pb(C_2H_5)_4,Ti(iーOC_3H_7)_4及びO_2を原料に用いたPbTiO_3膜の光励起プロセス(XeーHgランプ)においては,600°Cでペロブスカイト(III)配向膜が得られた。酸素源としてNO_2を用いると,530°Cでペロブスカイト結晶膜が得らた。いずれの場合も光励起が低温成長化に有効であり,原料の分解や酸化反応に与える光照射効果の違いが成長速度やPb/Ti組成比の変化の原因になる事がわかった。NO_2を用いた場合,得られたPbTiO_3膜の比誘電率は50ー130,誘電正接は0.02ー0.05,抵抗率は10^<10>ー10^<12>Ωcmを示し、O_2を用いた場合より優れた特性を示した。光励起プロセスで得られたPbTiO_3膜はDーEヒステリシスカ-ブも観察されると同時に優れたステップカバレ-ジ特性も示した。PZT薄膜の成長には新たに開発した多元系光励起CVD装置を用いた。原料にはPb(C_2H_5)_4,Ti(iーOC_3H_7)_4,Zr)tーOC_4H_9)_4及びO_2を用いた。成長温度450ー500°Cでは,光照射の有無によらず得られた薄膜はアモルファスであった。しかし成長速度は150ー250/minとスパッタ膜の場合に比べ2ー3倍程度大きい。得られた薄膜を800°Cで3時間アニ-ルすると全てペロブスカイト単一相を有するPZTとなり,無配向の多結晶構造を示した。その結晶系は成膜時のZr/Ti供給比やPb供給量により再現性良く正方晶と菱面体晶系とに制御できることがわかった。アニ-ル後のPZT膜の比誘電率は300,誘電正接は0.002ー0.003であった。成長温度600°Cの場合,asーgrownでペロブスカイト構造の(III)PZT配向膜が得られた。Zr/Ti供給比が20/100以上では光照射が成長速度の増加をもたらした。またICP法による分析より,光照射がPb含有量の減少と同時にZr/Ti組成比の増加をもたらす事がわかった。
多様な英語に対するコンプリヘンシビリティを高めるための教材開発に関する研究

世界の諸英語(WE)や国際語としての英語教育(ELF)が注目されている中、多様な音声に対応できる学習者の育成を目標に、本研究では試行的教育を実践してその効果を検証した。まず、多様な英語で録画されたTEDトークを視聴し、聞き取り練習やコメント投稿が可能なムードル基盤の学習プラットフォームを構築した。その後、学習者に対して、馴染みのない英語の歴史的背景と音声学的特徴について講義し、学習プラットフォームを利用したアクティビティを行って、音声の理解度と受容態度への効果を調査した。短期間の授業実践は理解度に効果をもたらさなかったものの、受容態度にはある程度の影響を及ぼすことがわかった。国際共通語としての英語は言語学的に多様である。世界の諸英語(World Englishes)に対する認知が教育現場一般に広まってはいるが、具体的教授法研究は未開拓の分野である。本研究は、国際共通語である英語の多様性に対応できる学習者能力、とりわけ、なじみのない音声英語に対するコンプリヘンシビリティ(理解度)の向上をめざして、効果的教材開発につながる基礎研究及び応用研究を行うことを目的とする。27年度前半では、なじみのない英語を聞いて理解するということにはどのような学習者要因がかかわるのか、聞き手側が感じる英語訛りの強さ、英語力、多様な英語に対する受容態度などを変数に設定して分析した。結果、訛りの強さは必ずしも理解度に影響せず、下位レベルの学習者では、特に、語彙力文法力を含む読解力が影響することが確認された。また、年度後半には、学習者が世界の多様な英語音声に触れることのできるインターネット・サイト(WEnglishes)を試行的に構築した。これはMoodle基盤の学習プラットフォームで、サイト上にはアメリカ、イギリス、シンガポール、インド訛りの英語話者によるスピーチ(TEDトーク)、理解度テスト、トークの日英語スクリプト、トークの内容について学習者どうしが意見交換する場としてのForum、各英語変種の歴史的背景また言語学的特徴について記載したよみものを配置した。さらには、母語を異にする世界の英語話者によって吹き込まれた英語の聞き比べができるサイトへのリンクを張った。28年度以後、WEnglishesを利用した実証研究を予定している。27年度は日本人にとってなじみの薄い英語変種のコンプリヘンシビリティ(理解度)と学習者要因との関係を分析することを目標に掲げた。学習者の英語力下位グループにおいてはとりわけ語彙や文法の知識を含む読解力が、実際の理解度に大きく影響することが確認されたことから、おおむね初年度の目標は達成された。上位・中位グループについては今後さらなる要因解析を実施したい。また、次年度以降の実証研究で使用予定の学習プラットフォームWEnglishesを構築できたことから、研究がおおむね順調に進展していると考えられる。本研究の目的は、世界の多様な音声英語に対する学習者のコンプリヘンシビリティ(理解度)向上をめざして、効果的教材開発につながる基礎研究及び応用研究を行うことである。28年度は、前年度に構築したMoodle基盤の学習プラットフォーム(WEnglishes)を利用して実験を行った。プラットフォーム上には、アメリカ英語、イギリス英語、シンガポール英語、インド英語によるTEDトーク、その内容に関して学習者が意見を投稿するForum、各英語変種の歴史的背景及び言語学的特徴について記した読み物が配置してある。28年度は、一般的英語学習者に馴染みのないシンガポール英語を用いて、その歴史的背景や言語学的特徴に関する教授が、音声サンプルの理解度及び受容態度にどのような変容をもたらすのかを解明することを目標とした。具体的方法は次の通りである。日本の大学に在籍する英語学習者を3群(実験群1、実験群2、統制群)に分けた。(1)実験群1は、シンガポール英語の歴史的背景及び音声学的特徴について説明を受けたのちに、シンガポール英語話者によるTEDトークを視聴、(2)実験群2は、歴史的背景(音声学的特徴の解説はなし)について説明を受けたのちに、シンガポール英語のTEDトークを視聴、(3)統制群は、シンガポール英語に関する解説を一切受けないで、彼らに馴染みのあるアメリカ英語のTEDトークを視聴した。3群とも、TED視聴直後にトーク内容に関する多肢選択問題、ディクテーション、Forumへの英文投稿等のタスクを行った。この実験授業の前後には、シンガポール英語で吹き込まれた英文を3群の被験者に呈示、ディクテーションによってその理解度を、またSD法及び自由記述式アンケートによって受容態度を調査した。分析結果については国際会議ELF10で発表予定である。28年度は、前年度に構築した学習プラットフォームWEnglishesを利用して、被験者3群(明示的教授を受ける実験群1、暗示的教授を受ける実験群2、統制群)に実験授業を行い、アンケート調査やディクテーションテストによりデータを収集、英語に対する理解度と英語変種への態度の変容を分析することを目標とした。しかし、諸事情により実験群1に対する授業時間が不足したため、十分な数の被験者データが得られなかった。本研究は、国際共通語である英語の多様性に対応できる学習者の育成を目指して、効果的教材開発につながる基礎研究及び応用研究を行うことを目的としている。このため、学習者が様々な英語に触れることを可能にするムードル基盤の学習プラットフォーム(WEnglishes)を構築、これを利用して大学生を対象とする試行的教育を実践し、参加者の音声理解度と受容態度の変化に焦点を当てて分析した。29年度は、前年度に引き続き、明示的及び暗示的インストラクションの効果について検証した。

具体的には、シンガポール英語とインド英語を用いて、その歴史的背景と音声的特徴について教師が明示的に解説したのち、WEnglishes上に配されたTEDトークを学習者が視聴、各種アクティビティを通して、各英語変種を暗示的に学んでもらい、音声理解度の変化をクローズ・ディクテーションによって、受容態度の変化をSD法及び自由記述式アンケートによって測定するという手法をとった。結果、音声理解度については、シンガポール英語とインド英語の両方で、授業前後に有意な変化は見られなかったものの、受容態度についてはシンガポール英語に関する一部の項目について肯定的変化が観察できた。また自由記述式アンケートによる学習者の態度は肯定的、否定的な両側面に分かれた。補助事業期間中に行った短期間の教育実践から、インストラクションが学習者の受容態度に肯定的影響をもたらすことが示唆されたが、実際の理解度については有意な効果が認められなかったことから、長期的展望に基づく教授法の確立、及び効果の検証が今後の課題である。世界の諸英語(WE)や国際語としての英語教育(ELF)が注目されている中、多様な音声に対応できる学習者の育成を目標に、本研究では試行的教育を実践してその効果を検証した。まず、多様な英語で録画されたTEDトークを視聴し、聞き取り練習やコメント投稿が可能なムードル基盤の学習プラットフォームを構築した。その後、学習者に対して、馴染みのない英語の歴史的背景と音声学的特徴について講義し、学習プラットフォームを利用したアクティビティを行って、音声の理解度と受容態度への効果を調査した。短期間の授業実践は理解度に効果をもたらさなかったものの、受容態度にはある程度の影響を及ぼすことがわかった。27年度に構築した学習プラットフォームを利用した試行的教育を学習者に施し、英語変種の歴史的背景や言語学的特徴に関する明示的教授が、音声英語サンプルに対する理解度及び受容態度にどのような効果があるかについて解明する。具体的には、学習者を3グループ(統制群、実験群のうち明示的教授を受けるグループ、実験群のうち変種音声のみを聞かせる暗示的教授を受けるグループ)にわけ、理解度をディクテーションにより、受容態度をアンケートを用いて調査する予定である。29年度当初に追加的実験授業を行い、不足しているデータを補ったのち成果をまとめ、フィンランドのヘルシンキで開催される国際会議ELF10でその一部を発表する。また、年度後半には調査内容及び手順に修正を加え、WEnglishesを利用した新たな実験研究を予定している。英語教育28年度以降の実験に使用するMoodle基盤の学習プラットフォーム(WEnglishes)を27年度末に構築したが、レンタルサーバ代金を含む作成費用の支払いが28年4月以降となったため。29年度の実験授業に使用する学習プラットフォームWEnglishesの修正費用、レンタルサーバ使用料、学生登録料、保守点検費用の支払いが29年4月以降になったため。また、28年度末に予定していた国際学会発表プロポーザルが採択されなかったため、海外旅費が必要なくなった。