hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質メディエーターPTENの各種臓器における生理的・生化学的機能解析

種々の成長因子からの刺激はPI3Kを活性化し、PI3KはPIP2をPIP3に変換することによって下流のAktを活性化し、細胞増殖、アポトーシス抵抗性に働く。癌抑制遺伝子PTENはPIP3をその主な基質とし、この経路を負に制御する。PTEN欠損マウスは胎生早期に致死となることから、我々はPTENfloxマウスを作成し、B細胞、ケラチノサイト、生殖細胞における機能を解析した。B細胞特異的PTEN欠損マウスはBla細胞が増加し、自己抗体の産生が増強した。B2細胞では辺縁B細胞が増加し、濾胞性B細胞は減少していた。PTEN欠損細胞は増殖亢進し、アポトーシス抵抗性、細胞遊走性亢進を示した。生化学的にはAktの活性化を見た。また、免疫グロブリンのクラススイッチが障害され、これは組換酵素AIDの発現誘導の障害が示唆された。このようにPTENはB細胞の分化や恒常維持に必須であることを明らかにした。ケラチノサイト特異的PTEN欠損マウスは皮膚上皮や角質層の肥厚、硬化、毛髪の彎曲、毛嚢の形態形成の加速を認めた。また食道の角質層も肥厚し、嚥下障害による栄養不良のために90%が3週以内に死亡した。離乳期を越えたマウスは長期生存したが、生後8.5ケ月までに全例腫瘍を形成し、化学発癌も加速した。PTENが欠損したケラチノサイトは増殖亢進、アポトーシス抵抗性で、PKBやMAPKの活性化が見られた。このようにPTENは皮膚の分化や腫瘍抑制に重要な分子であることを明らかにした。生殖細胞特異的PTEN欠損マウスでは、未分化な細胞のマーカーを持つ生殖細胞が増加すること、始原生殖細胞からのEG細胞の形成率が著しく高いことから、PTENの欠損は生殖細胞においても未分化性を維持させていることを見出した。また、全例奇形腫を呈し、これは未分化性維持機構によるものと思われた。癌抑制遺伝子PTENはPIP3を主な基質とするホスファターゼである。これまで我々はPTEN欠損マウスを作成したが、胎生早期に致死であったために、各種臓器でのPTENの役割の解析は困難であった。そこで、B細胞、皮膚、心臓、始原生殖細胞特異的にPTEN遺伝子を欠損するマウスを作成し、これら臓器における機能を解析した。1.B細胞におけるPTEN欠損マウスにおいては、増殖亢進、アポトーシス抵抗性、細胞遊走能が亢進し、結果としてB1a細胞、辺縁B細胞が著増し、また免疫グロブリンのクラススイッチが障害されていた。2.皮膚におけるPTEN欠損マウスにおいても、増殖亢進、アポトーシス抵抗性を示し、結果として角化亢進、皮膚上皮の肥厚を呈した。また毛嚢形態形成が加速していた。さらに乳頭腫、扁平上皮がん、皮脂腺がんなど様々な皮膚腫瘍を呈した。3.心筋におけるPTEN欠損マウスは、心肥大、心収縮力低下をきたした。またこれらのマウスの表現系はPI3Kαをさらにおさえると心肥大が回復し、PI3Kγを遺伝子をさらに欠損させると心収縮力が回復した。4.生殖細胞におけるPTEN

欠損マウスは、オスでは分裂停止の障害、多分化能をもった細胞に脱分化することにより、生直後からテラトーマが発症した。このようにPTENが全身の種々の組織において、その発生、分化、発ガンに重要な役割をていしていることを始めて明らかにし、同時にその分子機構をも明らかにした。種々の成長因子からの刺激はPI3Kを活性化し、PI3KはPIP2をPIP3に変換することによって下流のAktを活性化し、細胞増殖、アポトーシス抵抗性に働く。癌抑制遺伝子PTENはPIP3をその主な基質とし、この経路を負に制御する。PTEN欠損マウスは胎生早期に致死となることから、我々はPTENfloxマウスを作成し、B細胞、皮膚ケラチノサイト、生殖細胞における機能を解析した。B細胞特異的PTEN欠損マウスはB1a細胞が増加し、自己抗体の産生が増強した。B2細胞では辺縁B細胞が増加し、濾胞性B細胞は減少していた。PTEN欠損細胞は増殖が亢進し、アポトーシス抵抗性で、細胞遊走性が亢進していた。生化学的にはAktの活性化を見た。また、免疫グロブリンのクラススイッチが障害され、これは組換酵素AIDの発現誘導の障害が示唆された。このようにPTENはB細胞の分化や恒常維持に必須な分子であることを明らかにした。ケラチノサイト特異的PTEN欠損マウスは皮膚上皮や角質層が肥厚、硬化し毛髪が彎曲していた。また毛嚢の形態形成が加速していた。マウスは食道の角質層も肥厚し、嚥下障害による栄養不良のために90%が3週以内に死亡した。離乳期を越えたマウスは長期生存したが、生後8.5ケ月までに全例腫瘍を形成し、化学発癌も加速した。PTENが欠損したケラチノサイトは増殖が亢進し、アポトーシス抵抗性で、PKBやMAPKの活性化が見られた。このようにPTENは皮膚の分化や腫瘍抑制に重要な分子であることを明らかにした。生殖細胞特異的PTEN欠損マウスでは、未分化な細胞のマーカーを持つ生殖細胞が増加すること、始原生殖細胞からのEG細胞の形成率が著しく高いことから、PTENの欠損は生殖細胞においても未分化性を維持させていることを見出した。また、おそらくこれら未分化性維持機構によって、全例奇形腫を呈することを見出した。
神経系における情報表現とその動的な変化を手がかりにした思考メカニズムの研究

思考における情報処理は、神経系による柔軟な情報表現と、表現される情報の動的で合目的的な変化に特徴がある。思考に深く関わる前頭連合野においては、異なるモダリティーの情報が様々に重複した形で時空間的に表現されると同時に、場面や状況に応じて動的にその表現を変化させていくことにより、情報処理が進んでゆくと考えられる。本研究では、視覚刺激が提示された位置へ3秒の遅延後に眼球運動をする課題(課題1)と、90度時計回り方向へ眼球運動をする課題(課題2)をサルに行なわせ、前頭連合野より単一ニューロン活動を記録し、分析した。課題2では視覚が提示される位置と眼球運動の方向が異なるため、遅延期間中に視覚情報から運動情報への変換が必要である。視覚情報から運動情報への変換プロセスを情報処理過程のモデルととらえ、その間にニューロン群が表現する情報をポピュレーション・ベクトル(PV)を用いて表現した。その結果、視覚刺激提示期間および眼球運動時のPVは、それぞれ視覚刺激の提示方向、眼球運動方向を向くことから、PVにより前頭連合野のニューロン群が表現する情報を表示できることがわかった。また、両課題の1試行を250msごとの区間に区切り、その間のニューロン群の活動をPVで表示し、課題の時間経過によりニューロン群によって表現される情報がどのように変化するかを検討した。その結果、課題2では、遅延期間の前半にはPVは視覚刺激の提示方向を向いているが、後半にはPVが視覚刺激の提示方向から眼球運動方向へゆっくりと回転するのが観察された。このことは、遅延期間の後半に、視覚情報から運動情報への変換が、前頭連合野のニューロン群によりゆっくりと行なわれることを示している。このように、PVを用いることによりニューロン集団によって遂行されている情報処理過程を可視化できることが明らかになった。今後は、どのような仕組によりPVの変化が生じるのかを明らかにしていきたい。そこで本研究では、前頭連合野ニューロンの活動を指標に、ある情報の表象は前頭連合野のニューロン群の時間的、空間的発火パターンにより表現されること、情報の処理や生成はニューロン群の時間的、空間的発火パターンの変化により表現されること、そして、このような変化はニューロン間相互作用の時間的変化に基づくという仮説をたて、これを検証した。遅延眼球運動課題を訓練したサルの前頭連合野から記録した単一ニューロン活動とその記録部位をもとに、課題の遂行に関連する情報の時空間的表象を調べた。そのため、記録されたニューロン活動の強さを課題の条件(眼球運動目標として提示した視覚刺激の提示位置のちがい)ごとにまとめ、さらに50msごとに課題を区切って、その期間の活動の強さを求め、それを記録部位に表示した。その結果、視覚刺激が提示される位置のちがい、眼球運動の方向のちがいにより、ニューロン活動の強さの空間分布が異なることが見いだされた。また、強いニューロン活動の現れる空間的な広がりやその中心位置が、課題の時間経過に従ってダイナミックに変化することが見いだされた。このことは、ある情報の表象はニューロン群の空間的発火パターンにより表現されること、情報の処理はニューロン群の時間的、空間的発火パターンの変化により表現されることを示唆している。

思考における情報処理は、神経系による柔軟な情報表現と、表現される情報の動的で合目的的な変化に特徴がある。思考に深く関わる前頭連合野においては、異なるモダリティーの情報が様々に重複した形で時空間的に表現されると同時に、場面や状況に応じて動的にその表現を変化させていくことにより、情報処理が進んでゆくと考えられる。本研究では、視覚刺激が提示された位置へ3秒の遅延後に眼球運動をする課題(課題1)と、90度時計回り方向へ眼球運動をする課題(課題2)をサルに行なわせ、前頭連合野より単一ニューロン活動を記録し、分析した。課題2では視覚が提示される位置と眼球運動の方向が異なるため、遅延期間中に視覚情報から運動情報への変換が必要である。視覚情報から運動情報への変換プロセスを情報処理過程のモデルととらえ、その間にニューロン群が表現する情報をポピュレーション・ベクトル(PV)を用いて表現した。その結果、視覚刺激提示期間および眼球運動時のPVは、それぞれ視覚刺激の提示方向、眼球運動方向を向くことから、PVにより前頭連合野のニューロン群が表現する情報を表示できることがわかった。また、両課題の1試行を250msごとの区間に区切り、その間のニューロン群の活動をPVで表示し、課題の時間経過によりニューロン群によって表現される情報がどのように変化するかを検討した。その結果、課題2では、遅延期間の前半にはPVは視覚刺激の提示方向を向いているが、後半にはPVが視覚刺激の提示方向から眼球運動方向へゆっくりと回転するのが観察された。このことは、遅延期間の後半に、視覚情報から運動情報への変換が、前頭連合野のニューロン群によりゆっくりと行なわれることを示している。このように、PVを用いることによりニューロン集団によって遂行されている情報処理過程を可視化できることが明らかになった。今後は、どのような仕組によりPVの変化が生じるのかを明らかにしていきたい。
ヒトｉＰＳ細胞作製過程におけるリプログラミング促進分子機構の解析

近年樹立されたiPS細胞は、様々な疾患に対する移植医療の細胞ソースとして大きく期待されている。しかし、iPS細胞を実際に再生医療に使用するまでには解決しなければならない様々な問題がある。具体的には1細胞作製効率の低さ、2外来遺伝子導入細胞の癌化の可能性、3目的の機能を保持した分化細胞への高効率分化誘導技術の不十分さ、が挙げられる。申請者はこれまでにiPS細胞作製時にOKSM遺伝子導入に加え、PI3キナーゼの抑制因子であるPtenの阻害剤bpV(HOpic)を用いて機能抑制しPI3K経路を活性化することで、iPS細胞樹立効率が有意に高まることを明らかにした。本研究では、bpV(HOpic)のヒトiPS細胞の樹立における有効性について検討した。OKSMをレトロウイルスベクターを用いてヒト線維芽細胞に導入し、ヒトiPS細胞作製過程で一時的にbpV(HOpic)を使用すれば、iPS細胞作製効率が高まることが確認された(約2倍)。ヒトbpV-iPS細胞は、アルカリフォスファターゼ陽性、未分化細胞マーカーであるNANOG、TRA-1-60とTRA-1-81陽性で未分化状態にあった。また、リプログラミングを促進する遺伝子群同定するために、センダイウイルスベクターをヒト臍帯血由来単核球に導入しbpV(HOpic)添加群と非添加群を経時的(10日及び14日目)に回収し、RNAを抽出後、マイクロアレイ解析を行った。10日目と14日目を比較したところ、様々な遺伝子群、特に細胞分化に関連する遺伝子(EGR1等)が上昇することを見だした。一方、iPS細胞形成初期10日目において、コントロールと比較しbPV(HOpic)添加群において発現が2倍以上上昇する遺伝子群はほとんど確認できなかった。続いて14日目においてコントロールとbPV(HOpic)添加群を比較したところ、ストレス関連転写因子ATF4等の高い発現を確認できた。ATF4はリプログランミングの制御することに寄与していると考えられる。そこで、ATF4に注目し、発現ベクターの構築に進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年、樹立されたiPS細胞は、様々な疾患に対する移植医療の細胞ソースとして大きく期待されている。これらは大きく分けて、1iPS細胞作製効率の低さ、2外来性遺伝子導入細胞の癌化の可能性、3目的の機能を保持した分化細胞への高効率分化誘導技術の不十分さ、が挙げられる。申請者はiPS細胞作製効率の低さを注目し、iPS細胞作製時にOKSM遺伝子導入に加え、PI3キナーゼの抑制因子であるPtenをその阻害剤bpV(HOpic)を用いて機能抑制し、PI3キナーゼシグナルを活性化することで、iPS細胞樹立効率が有意に高くなることを明らかにした。さらには、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬であるVPAとbpV(HOpic)を併用すれば、bpV(HOpic)単独使用時よりもさらにiPS細胞作製効率が高まることが明らかになった。本研究は上記の問題を解決に導くためには、分化した体細胞からiPS細胞が樹立されるまでのゲノムのリプログラミング過程における分子機構を理解することが不可欠であると考えております。これらの研究により、マウスiPS細胞においてそのiPS細胞の作成効率を比較的効率的に樹立することが可能となった。そこで、OKSMを、レトロウイルスベクターを用いてヒト線維芽細胞(BJ)に導入したところ、ヒトiPS細胞作製過程で一時的にbpV(HOpic)を使用すれば、iPS細胞作製効率が飛躍的に高まることが確認した(約7倍)。一方、マウス細胞で観察されたバルプロ酸の効果は認めなかった。ヒトbpV-iPS細胞は、アルカリフォスファターゼ陽性、ES細胞マーカーであるNANOG、TRA-1-60とTRA-1-81陽性で未分化状態にあった。現在in vitro及びin vivoで3胚葉への分化能を調べている。

10日目と14日目を比較したところ、様々な遺伝子群、特に細胞分化に関連する遺伝子(EGR1等)が上昇することを見だした。一方、iPS細胞形成初期10日目において、コントロールと比較しbPV(HOpic)添加群において発現が2倍以上上昇する遺伝子群はほとんど確認できなかった。続いて14日目においてコントロールとbPV(HOpic)添加群を比較したところ、ストレス関連転写因子ATF4等の高い発現を確認できた。ATF4はリプログランミングの制御することに寄与していると考えられる。そこで、ATF4に注目し、発現ベクターの構築に進めている。本年度では、マウスiPS細胞においてそのiPS細胞の作成効率を比較的効率的に樹立することが可能となった。そこで、OKSMを、レトロウイルスベクターを用いてヒト線維芽細胞(BJ)に導入したところ、ヒトiPS細胞作製過程で一時的にbpV(HOpic)を使用すれば、iPS細胞作製効率が飛躍的に高まる(7倍)ことが確認できており、ヒトリプログラミングされる際の分子メカニズムの同定することが可能になる。このことから次年度に向けての準備が進んだ終と評価し、全体研究は概ね順調に進展していると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの私達の研究により、マウスiPS細胞においてそのiPS細胞を比較的効率的に樹立することが可能となった。iPS細胞を作成する段階において、細胞のゲノムがOKSMによりリプログラミングされる際の分子メカニズムを明らかにし、その知見を利用した革新的なiPS細胞作製法の開発が必要である。フィーダー細胞を使用した方法ではリプログラミングされた細胞による影響があるので今後はフィーダーフリー培養法を用いてリプログラミング過程において活性化される因子の動態解析を行っていく。さらに、可能であれば同定されたリプログラミング促進因子(X)をOKSMと同時に発現させることのできるpLentiーOKSMXを作製し、BJ細胞に遺伝子導入することによりiPS細胞を作製し、その作製効率について検討を行う。新規に作製されたiPS細胞がES細胞と同様、未分化状態にあり、多能性と自己複製能を併せもっているかについて検討するため、まずOCT3/4などの内在性ESマーカーを発現しているのか、RT-PCR法及び免疫細胞染色法にて検討する。次に、in vitroにおける各種系列細胞への分化能を調べるとともに、免疫不全マウスへの移植によるテラトーマ形成実験を行う。
コメの成分組成をモジュレートする因子の探索とその作用機作の解明

本研究は,分子生物学的な手法を用いることで、コメの登熟途上の遺伝子発現変化から収穫種子内の成分変化を予測・紐付けし、コメの生産性と品質の向上を分子レベルで目指したものである。初年度ではコメの成分バランスが窒素集積側に傾くことで引き起こされる「多糖類の量的・質的変化」が品質低下の原因であるという新たな仮説を提示した。本年度では、さらに窒素追肥によって変動した遺伝子発現に関与する代謝産物を明らかにすることを目的とし、生体内で重要な役割を果たすことが報告されているTrehalose-6-phosphate (T6P)と、T6Pを含むTrehalose合成系における主要代謝産物に着目した。その結果、追肥群で登熟種子内のT6P蓄積量が顕著に増加し、Trehaloseが減少していること見出した。また、実際に追肥群の種子内でT6Pの代謝に関与する分子の絞込行った結果、Trehalose-6-phosphate phosphatase 7が細胞内の窒素シグナルに応答し、T6Pの蓄積量を調整している可能性を見出した。また、追肥群のイネ種子の細胞壁成分の減少から、胚乳の細胞壁形成に関わると考えられるBC1L6に着目した。BC1L6は登熟後期の種子で発現が高くなり、特に胚乳の外周部に発現がみられることを明らかにした。さらに、BC1L6のノックアウト変異体を用いた解析により、BC1L6の細胞壁合成への関与をin vivoで示した。胚乳細胞壁はコメの物性に与える影響は大きい。これまでに、細胞壁量が減少した変異体はいくつか得られているが、それらでは茎や葉に対する影響が大きくでるため、種子形成そのものへの影響を評価できなかった。本研究により、OsBC1L6の品質に果たす細胞壁の機能を明らかにすることで、コメの品質制御に関する更なる知見が得られるものと期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。食糧種実の構成成分は、種子登熟期の根圏の栄養条件に影響されることが知られており、その変動度合によっては品質特性にまで影響を及ぼす。イネの栽培においては、窒素肥料を過剰に与えるとタンパク質含有量が高まる一方でコメの食味が低下することが分かってきたため、特に出穂後の追肥は推奨されなくなった。しかし、種子において根圏の栄養状態がどのようなメカニズムによって感知され、品質特性に反映されているのかは明らかになっていない。申請者は登熟期に窒素施肥を行ったイネ種子におけるDNAマイクロアレイ解析により、追肥によって貯蔵タンパク質が増加する一方、細胞壁やデンプンといった炭素化合物の合成に関与する遺伝子の発現が抑制されることを明らかにした。そこでイネ種子内の窒素状態と多糖類合成調節機構との関連について明らかにするため、登熟種子における窒素シグナル機構の解明および細胞壁合成調節機構の解明を試みた。追肥によって変動した遺伝子はどのような化合物をシグナルとして発現変化したのか調べるため、開花後10日目の種子をGC-MSによるメタボローム解析に供した。その結果、グルコースやフルクトース、トレハロースなどの糖類は追肥区で減少したが、それらの中間代謝物であるグルコース-6-リン酸やフルクトース-6-リン酸は追肥区で増加傾向を示した。一方で、米の品質特性に影響を与えるとされる胚乳の細胞壁について、胚乳細胞壁の合成に関与すると予想されるBC1L6に着目した。BC1L6についてはRNAiを用いたBC1L6のノックダウン株をイネ胚盤由来のカルスから作製し、さらにレトロトランスポゾンを利用したノックアウト株を入手した。これらの株について表現型解析を行ったところ、各株においてセルロース含量の低下が認められた。また、GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在解析ではBC1L6細胞膜に局在することが明らかとなった。窒素施肥したイネ種子のマイクロアレイ解析では、デンプン合成関連遺伝子が抑制され、分解関連遺伝子は発現上昇している傾向がみられた。すなわち、窒素シグナルにより、貯蔵タンパク質が増えるだけでなく、デンプン合成・代謝に関わる遺伝子が発現制御されることで種子内のC/Nバランスが調整されている可能性が示唆された。そこで、今年度はマイクロアレイによって抽出された遺伝子はどのような化合物をシグナルとして発現変化したのか調べるため、開花後10日目の種子をGC-MSによるメタボローム解析に供した。GC-MS解析では糖、アミノ酸、有機酸などの高極性成分を対象とした428種の代謝成分データベースとの照合による同定、および全検出ピークを用いた多変量解析を実施した。その結果、追肥区と標準区はそれぞれ特徴的なピークパターンを示した。またSucroseの定量分析では標準区と追肥区では有意差はなかった。追肥を行うと光合成量が増加し、Sucrose生産量も上がる。しかし、種子中に存在するSucroseが標準区とほとんど変わらないことから、実際には種子に輸送されるSucrose量は調整されていると考えられる。また、糖類に関してはグルコースやフルクトース、トレハロースは追肥区で減少したが、それらの中間代謝物であるグルコース-6-リン酸やフルクトース-6-リン酸は追肥区で増加傾向を示した。胚乳細胞壁の合成に関与すると予想されるBC1L6についてはRNAiを用いたBC1L6のノックダウン株をイネ胚盤由来のカルスから作製し、さらにレトロトランスポゾンを利用したノックアウト株を入手した。これらの株についてカルコフロー染色による組織学的解析を行ったところ、各株においてセルロース含量の低下が認められた。

また、GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在解析ではBC1L6細胞膜に局在することを明らかにした。本研究は,分子生物学的な手法を用いることで、コメの登熟途上の遺伝子発現変化から収穫種子内の成分変化を予測・紐付けし、コメの生産性と品質の向上を分子レベルで目指したものである。初年度ではコメの成分バランスが窒素集積側に傾くことで引き起こされる「多糖類の量的・質的変化」が品質低下の原因であるという新たな仮説を提示した。本年度では、さらに窒素追肥によって変動した遺伝子発現に関与する代謝産物を明らかにすることを目的とし、生体内で重要な役割を果たすことが報告されているTrehalose-6-phosphate (T6P)と、T6Pを含むTrehalose合成系における主要代謝産物に着目した。その結果、追肥群で登熟種子内のT6P蓄積量が顕著に増加し、Trehaloseが減少していること見出した。また、実際に追肥群の種子内でT6Pの代謝に関与する分子の絞込行った結果、Trehalose-6-phosphate phosphatase 7が細胞内の窒素シグナルに応答し、T6Pの蓄積量を調整している可能性を見出した。また、追肥群のイネ種子の細胞壁成分の減少から、胚乳の細胞壁形成に関わると考えられるBC1L6に着目した。BC1L6は登熟後期の種子で発現が高くなり、特に胚乳の外周部に発現がみられることを明らかにした。さらに、BC1L6のノックアウト変異体を用いた解析により、BC1L6の細胞壁合成への関与をin vivoで示した。胚乳細胞壁はコメの物性に与える影響は大きい。これまでに、細胞壁量が減少した変異体はいくつか得られているが、それらでは茎や葉に対する影響が大きくでるため、種子形成そのものへの影響を評価できなかった。本研究により、OsBC1L6の品質に果たす細胞壁の機能を明らかにすることで、コメの品質制御に関する更なる知見が得られるものと期待される。トレハロースは広範囲の生物種に存在しており、貯蔵糖や血糖、あるいはストレス保護物質として機能している。高等植物においては蓄積量が極微量であることから、微生物や動物における機能とは異なっていると考えられている。イネのトレハロース生合成系遺伝子は9種類のTrehalose -6- phosphate synthase (TPS)、10種類のTrehalose -6- phosphate phosphatase (TPP)の存在が推定されている。追肥マイクロアレイの結果でもいくつかのTPSやTPPをコードする遺伝子がFDR< 0.05で発現変動したものとして抽出された。これら7つの遺伝子についてその発現パターンをGenevestigatorにより解析した。するとTPP1・TPP7はサイトカイニン処理により発現が減少することが示唆された。サイトカイニンは窒素栄養供給量により生合成が調節される植物ホルモンであり、窒素栄養存在下で増加する。TPP1は低温、乾燥、塩ストレスなど様々な環境ストレスに強い応答性を示すことが分かっているが、窒素栄養との関わりは報告されていない。
非線型分散型方程式に於ける散乱作用素の解析

本研究では、非線型分散型方程式に於ける散乱作用素の諸問題と、解の平滑化効果について考察した。関数解析的手法を用いることで、次の研究成果を得た:(1)空間1次元非線型ディラック方程式の非線型項がp乗冪である場合、pが3より大きければ散乱作用素が適当なヒルベルト空間の原点近傍上で定義できることを証明した。(2)空間3次元非線型ディラック方程式の非線型項が3乗冪である場合、重み付きソボレフ空間の或る原点近傍の散乱作用素による像は同じ重み付きソボレフ空間の部分集合となることを証明した。(3)ハートリー項を伴ったシュレディンガー方程式に於ける解析的平滑化効果に関する諸性質を証明した。平成25年度は空間3次元の非線型ディラック方程式における時間大域解の漸近挙動を中心に研究した。具体的に非線型項は、Solerが提唱した「4次の相互作用」に関連するもので、数学的には3次のオーダーを持つ。(背景)この方程式に関してはソボレフ空間Hs(s>1)に属する初期データに対して時間局所解が存在することがEscobedoとVegaにより証明され、更に「Hsの意味で十分小さい初期値u0」に対する時間大域解u(t)の存在が町原・中西・小澤によって示されている。またこのとき時間大域解u(t)は、或る自由解(非線型項を持たないディラック方程式の解のこと)へ時刻無限大で漸近する。その自由解の初期値をu+とおくとき、u0からu+へ写す写像を「逆波動作用素」と呼ぶ。逆波動作用素はHsの原点近傍で定義され、Hsを値域とする写像であるが、これを詳細に分析するのが今回のテーマである。ここでk>sとする。このとき初期値(u0)がHkに属し十分小さければ、それを逆波動作用素で写したもの(u+)も再びHkに属する。非線型項が滑らかである故、kは任意に与えることができる。即ち、滑らかで小さい初期データは、再び滑らかなデータとして写ることが分かる。滑らかさと同様に、「十分速く減衰するような初期データは、再び十分速く減衰するデータに写る」(性質Dと呼ぶことにする)ことが想像できる。性質Dは逆波動作用素の分析の上で重要な課題であるが、今まで厳密に証明されたことはない。(主結果)今回、性質Dが実際に成り立つことを厳密に証明した。具体的には、一定の条件を満たす任意の重み付ソボレフ空間Hswについて、「Hswの意味で小さいデータは、Hswのデータに写される」を示した。証明の際にキーとなるのは、「ディラック方程式と相性の良い微分作用素」の応用である。なおこの結果は学術論文として纏められ、近日国際学術雑誌に投稿する予定である。平成26年度は空間3次元以上の非線型シュレーディンガー方程式の初期値問題及び散乱問題における時間大域解の存在定理及び漸近挙動を中心に研究した。具体的に非線型項はハートリー型と呼ばれる非局所的相互作用に関連するものであり、数学的には未知関数と相互作用ポテンシャルVによって構成されている。(背景)自由シュレーディンガー方程式の初期値問題の場合、「初期値が指数関数的に減衰する場合、対応する時間大域解が(初期時刻を除いて)空間変数について解析的になること」は容易に示される。非線型方程式においても同様な状況が成り立つか否かを調べることは、本質的課題であり、数多くの研究成果が発表されている。これまでの結果では、「指数関数的に減衰する小さな初期値に対して、更に強い条件を与えることで、対応する解析的な解もその条件を満たすこと」に焦点が当てられている。一方、「更に強い条件」を課さない場合、即ち「小ささと指数関数的減衰のみしか課さない場合に、解がどうなるか」については未知な部分が多かった。(主結果)今回次のような定理を厳密に証明した。(1)或る正の値Aが次を満たすように存在する:「指数関数的に減衰する初期値のL2ノルムがA以下であれば、対応する時間大域解は解析的であり、滑らかさに関する評価式が成り立つ」(2)A以下の任意正数aについて、L2ノルムがaであり且つ指数関数的に減衰する初期値の中で、「初期値の減衰の速さ」と「対応する時間大域解の滑らかさ」が等しいものが存在する。この結果は(1)にある評価式が適切であることを指している。以上の結果を学術論文として纏め、国際学術雑誌に投稿した。平成27年度は、空間1次元の非線形ディラック方程式の初期値問題及び散乱問題における時間大域解の存在定理及び解の漸近挙動を中心に研究した。具体的に非線形項は、ボース・アインシュタイン凝縮におけるフェッシュバッハ共鳴に関連したもので、数学的には5次のオーダーを持つ。(背景)この方程式に関しては研究代表者によって、「ソボレフ空間Hs(s>3/4)に属する小さな初期データに対して時間大域解が一意に存在すること、及び逆波動作用素、波動作用素、散乱作用素がHsの或る0近傍上において定義できること」が示されている。これら逆波動作用素達を詳細に分析するのが今回のテーマである。以下説明する対象は「逆波動作用素」に絞り、k、w>sとする。このとき、初期データu0がHkに属し十分小さければ、それを逆波動作用素で写したデータu+も再びHkに属する。

非線形項が多項式タイプである故、このkは任意に大きくすることができる。即ち、滑らかで小さい初期データは、再び滑らかなデータとして写ることが分かる。滑らかさと同様に、「十分速く減衰するような初期データは、再び十分速く減衰するデータに写る」(性質Dと呼ぶことにする)ことが想像できる。性質Dは逆波動作用素の分析の上で重要な課題であるが、1次元についてはこれまで厳密に証明されたことがない(3次元については研究代表者による結果があるが、直接の適用ができるわけではない)。(主結果)今回、性質Dが実際に成り立つことを厳密に証明した。具体的には、任意の自然数wと、sとwより大きいkに対して、「重み付ソボレフ空間Hkwの意味で小さい初期データは、逆波動作用素によってHkwのデータに写される」を示した。証明のキーとなるのは「ディラック方程式と相性の良い微分作用素」及び「非線形項の評価」である。なおこの結果は学術論文として纏められ、国際会議報告へ投稿された。第三年度としてはおおむね順調に進展していると考える。当初の計画においては「空間1次元のp乗非線形ディラック方程式における散乱作用素を精密に解析する」という目標を設定した。上部の「研究業績の概要」において記載した結果は、散乱作用素の精密な解析と大いに関連があり、本来の目標達成に大きく寄与する可能性があるものである。平成28年度は「空間2次元以上の非線型シュレーディンガー方程式の初期値問題及び散乱問題における時間大域解の存在定理及び漸近挙動」に関連するものを中心に研究した。ここで、非線型項はハートリー型と呼ばれる非局所的相互作用に関連するものであり、数学的には未知関数と相互作用ポテンシャルV(x)によって構成されている。更に今回は、V(x)が斉次で「質量劣臨界条件」を満たすものとする。このとき、「スケール不変な斉次ソボレフ空間の意味で小さい初期値」に対する時間大域解の存在が知られている。摂動項のないシュレーディンガー方程式の場合、「初期値が指数関数的に減衰するとき、対応する解は(初期時刻を除いて)空間変数について解析的になること」(解析的平滑化効果という)が直ちに示される。今回の方程式でも解析的平滑化効果が起こることを証明した。(主結果)初期値はスケール不変な斉次ソボレフ空間の意味で小さいものとする。(1)このとき解析的平滑化効果が起きる。更に収束半径に関連する評価式が成立する。(2)終値データも指数関数的に減衰する。(3)「初期データの減衰の速さ」と「対応する時間大域解の滑らかさの指標」が合致する初期データの例を具体的に挙げられる。(4)V(x)に或る強い条件を課すことで、時間大域解の収束半径が無限大になるような初期値の十分条件が得られる。以上の結果を学術論文として纏め、国際学術雑誌に投稿した。また今回の問題に関連する内容を盛り込んだ国際会議報告が近日出版される予定である。本研究では、非線型分散型方程式に於ける散乱作用素の諸問題と、解の平滑化効果について考察した。関数解析的手法を用いることで、次の研究成果を得た:(1)空間1次元非線型ディラック方程式の非線型項がp乗冪である場合、pが3より大きければ散乱作用素が適当なヒルベルト空間の原点近傍上で定義できることを証明した。(2)空間3次元非線型
セルロースの酵素分解を促進する黄色色素の促進機構の解明および新規黄色色素の単離

セルロースを炭素源とする培地で培養したRuminiclostridium thermocellum菌体から抽出した黄色色素はカロテノイドであると予想された。R. josuiからも黄色色素が抽出された。前者の黄色色素を吸着したセルロースは対照セルロースに比べ、R. thermocellum及びR. josuiのセルロソームにより効率的に分解された。R. josuiの黄色色素を吸着したセルロースはR. josui酵素により効率的に分解されたがR. thermocellum酵素による分解高効は低かった。これらの結果は、両菌由来の黄色色素が異なる機構でセルロース分解を高めることを示唆した。本研究は、1C. thermocellum由来の黄色色素の化学構造の決定、2黄色色素のセルロース分解促進機構の解明、3C. thermocellum以外のセルロース分解菌からの黄色色素の単離と構造解析、4C. thermocellum由来の黄色色素と構造の類似した天然化合物または合成化合物のClostridiumおよび糸状菌由来のセルロース分解活性の促進効果の検討、5天然バイオマス分解への黄色色素の応用、を目的としている。C. thermocellum由来の黄色色素の化学構造を決定するため、精製法を検討した。菌体をアセトンで抽出することにより黄色色素画分を得た。濃縮方法やカラムの分離条件を検討した結果、シリカゲルカラムにより黄色色素を回収することが出来た。質量分析の結果、分子量は約407と予想された。また、1H-NMRの結果から、カロテノイドの一種であるが、既知の物質とは異なることが予想された。本物質は不安定であるため、構造決定のために安定な条件を見つける必要性がある。黄色色素のセルロース分解促進機構を解明するため、C. thermocellum由来のセルラーゼとキメラ骨格タンパク質からなる酵素複合体を形成し、黄色色素を吸着させた微結晶セルロース(フナセル)またはボールミルセルロースに対する分解活性を測定した。酵素としてCbh9A、Cel9KおよびCel9Rを用いたとき、それらの複合体は、黄色色素を吸着させたフナセルに対して、未処理のものに比べて約3倍の活性を示した。一方、Cel9Tでは、黄色色素の分解促進効果は見られなかった。Cel9Rなどはセロビオヒドロラーゼまたはプロセッシブエンドグルカナーゼであるのに対して、Cel8Aはエンドグルカナーゼであるため、黄色色素はプロセッシビティーの高い酵素に働く可能性が示唆された。βーカロテンにも黄色色素と同様の効果があることが見いだされた。本研究は、1C. thermocellum由来の黄色色素の化学構造の決定、2黄色色素のセルロース分解促進機構の解明、3C. thermocellum以外のセルロース分解菌からの黄色色素の単離と構造解析、4C. thermocellum由来の黄色色素と構造の類似した天然化合物または合成化合物のClostridiumおよび糸状菌由来のセルロース分解活性の促進効果の検討、5天然バイオマス(リグノセルロース)分解への黄色色素の応用、を目的としている。前年度に得られた結果より、不安定な物質であるため、より多くの分析試料が必要であると判断した。そのため、黄色色素の生産性を上げるための培養条件の検討を行った結果、基本培地にアセトンを添加した時に黄色色素の生産性が上がることを見出した。しかし、不安定性の問題は完全には解決されておらず、構造に関してはなお未同定である。セルロース分解酵素の分解活性に及ぼす黄色色素の効果を、X線解析、粒度分布解析、電子顕微鏡観察により調べた。その結果、未処理アビセル(微結晶セルロース)では、酵素処理後に結晶化度が上昇したが、黄色色素吸着アビセルでは変化がなかった。この結果は、セルラーゼは主に非結晶性領域に作用するが、黄色色素はセルロースの結晶化度が低下させることを示唆する。黄色色素の構造を明らかにする一助として、C. thermocellumゲノム内での合成遺伝子の検索とRNA-seq解析を行った。その結果、既知のカロテノイド合成遺伝子は見出されなかったが、黄色色素合成との関連性が考えられるポリケタイド合成酵素遺伝子が見出された。また、黄色色素を生産する株と生産しない株の両株におけるRNA合成量を比較し、黄色株で発現している2遺伝子を同定した。さらに、Clostridium josuiも黄色色素を生産すること、セルロース分解の促進作用があることを見出した。1については、黄色色素の不安定性の問題が解決しておらず、化学構造の決定に至っていない。化学構造を決定するための方策として、C. thermocellumゲノム中に存在する、黄色色素合成遺伝子の候補の検索を行った結果、黄色色素はカロテノイドではなく、ポリケタイドである可能性が示唆された。また、黄色色素を生産する株と生産しない株を対象としてRNA-seq分析を行ったところ、黄色色素生産株で高発現している遺伝子を2、非生産株で高発現している遺伝子を8、同定した。2については、黄色色素を結合させたアビセルを基質にしてセルラーゼ反応を行わせた後に、基質の粒度分布や結晶化度を分析することにより、黄色色素が、セルロースの結晶性を低下させる可能性があることを見出した。

3については、中温性セルロース分解性嫌気性細菌Clostridium josuiが黄色色素を生産すること、有機溶媒に対する溶解度が異なることを見出している。以上のように、一部難航している部分もあるが概ね順調に進展していると自己評価している。本研究は、1C. thermocellum由来の黄色色素の化学構造の決定、2黄色色素のセルロース分解促進機構の解明、3C. thermocellum以外のセルロース分解菌からの黄色色素の単離と構造解析、4C. thermocellum由来の黄色色素と構造の類似した天然化合物または合成化合物のClostridiumおよび糸状菌由来のセルロース分解活性の促進効果の検討、5天然バイオマス(リグノセルロース)分解への黄色色素の応用、を目的としている。前年度の研究において、C. thermocellumに加えて、中温性セルロース分解性嫌気性細菌の一つであるClostridium josuiが黄色色素を生産すること及びセルラーゼ活性を促進する作用を持つことを見出したので、本菌の黄色色素等の性質も合わせて検討した。C. thermocellum由来のセルラーゼは、C. thermocellum由来の黄色色素を吸着させたアビセルに対して、未処理セルロースに比べて、より高い活性を示したが、C. josuiのセルラーゼは逆に未処理のセルロースに対して高い分解活性を示した。一方、C. josui由来の黄色色素を吸着させたアビセルに対しては、C. josui由来のセルラーゼもC. thermocellum由来のセルラーゼも同様に高い分解活性を示した。これは比較的近縁な生物種間においても黄色色素と酵素の間の特異性が異なる可能性を示唆した。C. thermocellumの黄色色素は、天然基質(稲わら)に対しても、自身のセルラーゼ活性を高めることが初めて確認された。C. josuiのゲノム解析を行いドラフトゲノムの結果を得た。C. thermocellumの場合と同様に、カロテノイド合成合成遺伝子は確認されず、ポリケタイド合成遺伝子は存在した。C. josuiへの遺伝子導入系を確立し、改良した。1については、黄色色素の不安定性の問題は解決していないが、大量培養することにより、黄色色素の量を確保できる見通しが立ったという収穫が得られた。
日本人における薬物動態パラメータの母数推定と個別投与設計システムの開発

近年益々盛んになる血中薬物濃度モニタリングの臨床的意義をさらに高めることを目的として、日本人における薬物動態パラメータの母数推定と個別投与設計システムの開発を行い、以下に示す結果を得た。1)日本人における薬物動態パラメータの母数推定:population pharmacokineticsすなわち、薬物投与を受けた患者集団を対象として測定誤差・個体差を考慮しつつ薬物動態パラメータを推定する手法により、バルプロ酸、カルバマゼピン、フェニトイン、ジゴキシン、テオフィリンの母集団パラメータを推定した。またそれに伴い拡張最小二乗法を利用した解析プログラムを開発した。本研究による検討の結果、臨床で治療を目的として得られるモニタリング・データでも、母集団の数を増やし上述の解析法を応用するならば、十分信頼しうる薬物動態値が得られることが明らかとなった。さらに、併用薬物、合併疾患、腎・肝等の生理機能、年齢などの及ぼす影響を定量的に評価するることも可能であった。これらは、次項の個別投与設計システムを確立する上で重要なパラメータであり、個人の薬物動態値を推定する際の精度に大きく影響する。そこで本研究では、全国45の医療施設の協力を仰ぎ、全国的にデータを収集することにより日本人の薬物動態標準値としてふさわしい母数の推定を行った。2)個別投与設計システムの開発:ベイズ理論を応用した最小二乗法により、1点の血中濃度測定からでも患者の薬物動態パラメータを推定できることが明らかとなった。この個別投与設計システムは従来不可能であると考えられてきた、1点データからの薬物動態パラメータの推定、さらにそれに基づく血中濃度推移のシミュレーションおよび投与設計を可能とし、今後臨床に普及させることにより血中濃度モニタリングの意義はさらに高まると期待される。CLINICAL PHARMACOKINETICSの基本理念は個々の患者に対する安全な薬物療法の達成にある。近年の薬物血中濃度モニタリングの普及は本理念に沿うものであるが、測定データを有効に活用するためには、標準となるべき薬物動態パラメータが整備されていなければならない。本研究では、日本人における薬物動態標準値の推定と個別投与設計システムの開発を目標として、以下の検討を行った。1.臨床上得られる血中濃度データをPOPULATIONPHARMACOKINETICSの手法を用いて解析することにより、薬物動態パラメータの平均値と分散を推定し、ベイズ理論による個別投与設計法の母集団標準値とした。VALPROIC ACID、THEOPHYLLINE、LIDOCAINE、PROPRANOLOL等を用いた検討の結果、この個別投与設計システムは一点の血中濃度データからでも各患者の体内動態パラメータ及び血中濃度推移を予測することが可能であり、臨床上有意義であると認められた。2.その予測精度は欧米の文献値を用いるよりも本研究で求められた標準値を用いたときのほうが良く、日本人における標準動態値を設定する価値は十分にあると考えられた。3.ベイズ理論を応用した薬物動態推定プログラムは、実用性を考慮してパーソナルコンピュータ用に開発し、医療の場において容易に使用できるようにした。4.患者の病態的要因あるいは生理的要因によって体内動態が影響を受ける場合、各種要因によって層別化された母集団平均値を設定する必要があった。例えば、THEOPHYLLINEにおける検討では、肝疾患を併発した患者群ではクリアランスが有意に低下しており、肝機能の正常な患者群とは別の母集団標準値を設定する必要性が認められた。
脳内環境破綻時のNaxチャンネルの生理機能の解明

研究代表者は、これまでナトリウムチャネル分子Naxの研究を進め、脳室周囲器官において体液Naレベルセンサーとしての生理機能を有することを見出した。その過程で、脳傷害部位においてNaxの発現が高まることを見出した。しかし、Naxが脳傷害部位においてNaレベルセンサーとして機能するとは考えにくく、生理機能は不明なままであった。本研究では、脳傷害部位におけるNaxの生理的意義について解明を進めた。これまでの研究で、以下のことが明らかになった。(1)神経傷害部位においてエンドセリン濃度が上昇する。(2)神経傷害部位においてNaxの発現が誘導される。(3)NaxはエンドセリンB型受容体を介したシグナルによって開口する。(4)Naxが活性化されると細胞内の嫌気的糖代謝が活性化し、アストロサイトからの乳酸放出が起きる。(5)乳酸は神経細胞の生存に寄与し、神経傷害部位での細胞死が減少する。(6)末梢では、神経切断部位における軸索再伸長がNax依存的に増強される。(6)アストロサイトでは、足場タンパク質SAP97とPDZ配列を介して結合することにより、細胞膜上で安定化している。(7)大脳皮質及び扁桃体基底外側部においてNaxはニューロンに発現しており、足場タンパク質PSD95とPDZ配列を介して結合し、シナプス後部に存在している。(8)ニューロンに発現しているNaxも、グリア細胞に発現しているNaxと同様のNa感受性を示す。(9)Naxのイオン選択性はNa+ &#8776; Li+ > Rb+ > Cs+である。以上の成果をCell Metab誌、Eur J Neurosci誌、PLoSOne誌等に発表した。また、Naxの発現調節機構、乳酸による神経保護機構、NaxとTRPV4の機能的連関、本体性高Na血症の発症機序に関する新たな知見について、成果をまとめ、それぞれ投稿または投稿準備中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究で、NaxがエンドセリンB型受容体(ETBR)を介したエンドセリンシグナルによって開口することが明らかになった。過去の我々の知見から、Naxが活性化されると細胞内の嫌気的糖代謝が活性化し、アストロサイトからの乳酸放出につながることがわかっているが、乳酸には神経保護作用のあることが報告されている。本年度の研究では、Naxの調節機構の解明に取り組んでいる。本年度、新たにマウスNaxの一部配列を抗原にして抗体を作成し、その抗体を用いてマウスの脳における発現を網羅的に解析した。その結果、Naxは、平常時において、弱いながらも大脳皮質や扁桃体の一部の領域に発現していること、しかも、ニューロンにも発現していることが明らかになった。ニューロンにおけるNaxの機能特性を調べるため、新たにニューロン由来の株化細胞にNaxを異所性に発現させた。電気生理学的解析から、ニューロンにおいてもグリア細胞に発現したものと同様の機能特性を示すことが明らかになった。さらに、大脳皮質サンプルを用いて、Naxのカルボキシル末端にあるPDZ結合ドメインに結合するPDZタンパク質を探索したところ、シナプス後部タンパク質であるPSD95に結合すること、PSD95との結合には、ニューロン細胞膜上で安定化させる働きがあることがわかった。本年度、Naxが新たにニューロンに発現していることが明らかになるなど、予想外の研究成果が得られた(PLOS ONE in press)。

また、脳内の塩濃度が高くなる脳内環境の異常状態において、Naxやその他のセンサー分子が果たす役割についても、新たな事実が明らかになりつつある。しかし、その一方、当初計画していた、傷害部位においてNaxの発現が調節を受ける仕組み、Naxの働きにより神経回復が起きる仕組みに関する研究については、研究の進捗が遅れている。予想外の興味深いデータが出て来たために、そちらの方向に研究が展開してきたことが主な理由であるが、当初の計画からの遅れを取り戻すべく、努力している。27年度が最終年度であるため、記入しない。1、Nax発現調節に関わる因子の探索Naxの発現に出血性の傷害が必要か検討する。出血性の脳損傷としては、剃刀を用いた脳の部分的切断を実施する。非出血性の脳損傷としては、カイニン酸の腹腔投与を実施する他、脳内に留置した電極を介し、てんかん発作を誘発する。過去の知見からNaxの発現誘導に関与する可能性がある細胞内シグナル伝達系の阻害剤を傷害部位に投与し、Naxの発現に及ぼす影響を調べる。さらに、Nax発現細胞と他のグリア細胞、免疫細胞が出現する位置や時間の関係を調べ、それらから放出される因子がNaxの発現に影響する可能性を検討する。2、乳酸の神経保護作用機構に関する検討アストロサイトから放出された乳酸が神経保護や軸索再伸長の促進に関与するメカニズムは明らかになっていない。まず、乳酸がエネルギー源として利用されている可能性を探るため、神経傷害部位に乳酸を投与した場合とピルビン酸を投与した場合の死細胞の数を比較し、ピルビン酸にも乳酸と同様の神経保護作用があるか調べる。また、乳酸が局所的なアシドーシスを起こすことで周囲の神経細胞の保護を実現している可能性を検討するため、乳酸/H+シンポーターの阻害剤を投与し、神経細胞死に及ぼす影響を調べる。
日本近世近代移行期における公論の研究

幕末期ペリー来航を直接的契機として急速に政治的公共圏が形成されていく背景には、近世後期以降の海防への対応が深く関係していることが明らかになった。対外情報の厳しく管理された近世期において、それは直ちに世論の形成を促すものではないが、軍役・国役を通じた全身分の海防への動員は、「日本」という想像力を諸身分の中に醸成していく。これは当初徳川将軍家を頂点とした近世的な役負担システムとして機能する。しかし、嘉永初年の異国船の相次ぐ目撃情報、さらにペリー来航情報によって、萩毛利家は、徳川将軍家に対する諸役遂行義務よりも対外危機への対応を前面に掲げた海防強化のための宣伝を行なうようになる。武士身分の武装自弁の軍役負担者としての自立性・自律性は、海防政策も含め、そこから派生するあらゆる問題に対する発言権を要求する要素となる。また、実態として武装自弁出来ない武士身分が大量に発生している一方で、地域の中には自ら武装し得る財力を蓄え、その下に村民を指導し得る層が形成されている。近世後期の公論の担い手として、まず武士、そして豪農商層が登場してくる背景には、近世の身分制が深く関与しているのであり、その一つの指標となるのは、対外危機に対する貢献である。しかし、その過程で海防政策そのものに対する反対意見の結集も見られ、この問題はそこに動員される多くの階層を含みこんで、政治論議の場を形成することとなるのである。日本近世においては、寛政期以降対外的危機認識の緊張・弛緩を繰り返しつつ幕末を迎えるが、天保期には社会不安の増大や対外的危機認識の深化により、幕府は諸藩に海防をはじめとする軍備の強化を指示する。萩藩においてもこの幕府の触達を受け、軍役遂行のための軍事力再編に取り組み、家臣団の全階層を動員した大繰練を実施した。しかしこの時点では、藩政府は幕府に対する軍役励行を強調し、家臣団に対して直接対外的危機をアピールすることはない。しかし、嘉永6年(1863)のペリー来航による軍役動員とその後の相州警衛の拝命は、近世の平和の中で単に兵学の師家として存続していた軍法者のみならず平士にまで、軍役遂行のための意見を諮問することになる。その答申は、防御の作戦・軍事力の維持に留まらず、国家(藩)の維持に関わる諸問題に亘っていた。これは、諮問に答えた藩士層に形成されている政治的意見が、軍事問題に限らず広範な課題に渉っていたことを示している。諮問はその意見上達の回路を開いたものである。安政5年(1858)に兵庫警衛が命じられた際には、藩領域の防衛を理由に軍役拒否の意見が提出され、幕府の軍役体系の中からの意識的な逸脱がみられ始める。このことは、対外的危機を幕府の軍役を媒介としてではなく、国士防衛の観点から直接に思考する主体が現れてきていることを意味する。武士層の政治的意見は、軍事問題を契機として、やがてそれを超えて活性化していったのである。