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天然生理活性ペプチドのヒト歯髄由来幹細胞培養・移植による骨再生能の解析

我が国では、2007年に65歳以上の人口の割合が21%を超え、諸外国に先駆けて超高齢社会に突入した。それに伴い、総人口の10%である約1,300万人が骨粗鬆症であるといわれている。QOLの維持・向上のため、骨折の予防・治療薬の開発は急務である。研究代表者はこれまで、牛海綿状脳症や口蹄疫などの人畜共通感染症のない魚の皮、骨、鱗から抽出精製された魚コラーゲンペプチド(FCP)を用いて骨再生に関する研究を行ってきた。昨年度の研究では、石灰化の三次元的テンプレートであり、骨質を評価する指標となるコラーゲンに着目し、ヒト歯髄由来幹細胞(HDPSCs)を用いて、コラーゲン架橋関連酵素であるリシルヒドロキシラーゼ(LH)1,2の遺伝子発現を検討した。その結果、0.2mg/mLという低濃度のFCPはLH2の遺伝子発現を増加させ、HDPSCsを骨芽細胞に分化させる能力を有する可能性を示唆した。今回は、さらにFCPのタンパクレベルでの骨芽細胞誘導能について、アリザリンレッドS染色により検討した。本実験ではこれまで同様、株式会社ニッピから供与されたFCPを使用した。智歯周囲炎により抜歯された第三大臼歯の歯髄から分離されたHDPSCsは長崎大学大学院医歯薬学総合研究科の倫理委員会により使用が承認された(許可番号;1286-7)。FCP不含のDMEMで培養したHDPSCsを対照群とし、TaKaRaClontech社から販売されている石灰化誘導(OI)培地で培養したHDPSCsをポジティブコントロールとした。6well皿に5×10^4個のHDPSCsを播種し、培養28日目に、各群の細胞をホルマリン液で固定後、25分間染色液に浸漬した。その結果、OI添加群が最も強く赤く染色され、FCP添加群、対照群と続いた。この結果から、低濃度FCPは、石灰化誘導培地には及ばないものの、単独で間葉系幹細胞を骨芽細胞に誘導する可能性が示唆された。ヒト歯髄由来幹細胞の増殖能が低下しているため、骨芽細胞分化段階までの期間が長くかかっている。魚コラーゲンペプチドによるヒト歯髄由来幹細胞の骨芽細胞分化への方向性をさらに証明するため、軟骨細胞や脂肪細胞などの他の細胞に誘導されていないことをアグリカンやリポタンパク質リパーゼなどの遺伝子発現の有無により確認する。ヒト歯髄由来幹細胞(hDPSCs)に対する魚由来コラーゲンペプチド(FCP)の細胞生活力への影響を調査するためMTT試験を行った。96穴皿にhDPSCsを播種しDMEMで培養を行った。翌日細胞の生着を確認後、総濃度が2,0.2,0.02mg/mLとなるようにFCP含有DMEMと交換して培養を行った。DMEMのみで培養したものをネガティブコントロール、Osteoblast Inducer(TaKaRa Clontech; OI)含有DMEMで培養したものをポジティブコントロールとした。24時間培養後吸光度測定を行ったところ、対照群に対する2,0.2,0.02mg/mLFCP群、OI群の吸光度比はそれぞれ1.1±0.1,1.1±0.1,1.2±0.0,1.3±0.1(n=3,平均±標準誤差)であった。OI群は対照群と比較して有意に高い細胞生活力を示したが(p<0.05)、各FCP群に関しては有意差がなかった。次にFCPの骨芽細胞分化誘導能の検討を行った。6穴皿にhDPSCsを播種しサブコンフルエント後、総濃度が2,0.2,0.02mg/mLとなるようにFCP含有DMEMとOI含有DMEMと交換し培養を行った。3日後、細胞を回収しアルカリフォスファターゼ(ALP)、オステオカルシン(OCN)、RUNX2の遺伝子発現をRT-PCR分析により比較検討した。その結果、対照群に対する2,0.2,0.02mg/mL FCP群とOI群のALPにおけるmRNAの発現比は、それぞれ0.5,2.1,0.4,1.4倍であった。OCNの遺伝子発現は、それぞれ0.5,2.2,0.4,1.6倍、RUNX2の発現は、1.0,1.1,0.8,1.2倍であった。以上のことから、FCPは0.2mg/mLという低濃度で、OIと同等の骨芽細胞誘導能を有することが明らかとなった。in vitroの系で、魚由来コラーゲンペプチドが幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する可能性を科学的に証明することができた。我が国では、2007年に超高齢社会に突入した。それに伴い、骨粗鬆症による骨折が問題となっている。日常生活に制限のない健康な生活を長く送るために、骨折の予防薬や治療薬の開発が急務となっている。研究代表者は、以前から、牛海綿状脳症や口蹄疫などの人畜共通感染症の報告のない魚に着目し、その皮、骨、鱗から抽出精製された魚コラーゲンペプチド(FCP)を用いて骨再生に関する検討を行っている。今回、ヒト歯髄由来幹細胞(HDPSCs)を用いてFCPの骨芽細胞分化への誘導能に関して、石灰化の三次元的テンプレートであるコラーゲンに着目し、コラーゲン架橋関連酵素であるリシルヒドロキラーゼ(LH)の遺伝子発現について検討を行った。

本実験で使用したFCPは株式会社ニッピから供与された。FCPの分子量は約2.8kDaであった。智歯周囲炎により抜歯された第三大臼歯の歯髄から分離されたHDPSCsは長崎大学大学院医歯薬学総合研究科の倫理委員会により使用が承認された(許可番号;1286-4)。まず、HDPSCsを6well皿に5×10^4個播種し、サブコンフルエント後、総濃度が2, 0.2, 0.02mg/mLとなるようにFCPを添加したDMEMで培養を行った。FCP不含のDMEMで培養したHDPSCsを対照群とした。培養3日目に細胞を回収し、total RNAを抽出、cDNAを合成後、LH1, 2のmRNA発現をRT-PCR法により分析した。その結果、2, 0.2, 0.02mg/mL FCP添加群のLH1遺伝子発現比は、対照群と比較して、それぞれ約0.5, 1, 0.2倍、LH2遺伝子発現においてはそれぞれ約1.2, 4.2, 2.2倍であった。今回、0.2 mg/mLという低濃度のFCPがコラーゲンの架橋形成を促進し環境が整うことでHDPSCsを骨芽細胞に分化誘導させる可能性が示唆された。ヒト歯髄由来幹細胞の増殖速度が、以前よりも遅延気味となっており、FCP含有培地を作用させるまでの日数が計画よりも長くかかってしまった。我が国では、2007年に65歳以上の人口の割合が21%を超え、諸外国に先駆けて超高齢社会に突入した。それに伴い、総人口の10%である約1,300万人が骨粗鬆症であるといわれている。QOLの維持・向上のため、骨折の予防・治療薬の開発は急務である。研究代表者はこれまで、牛海綿状脳症や口蹄疫などの人畜共通感染症のない魚の皮、骨、鱗から抽出精製された魚コラーゲンペプチド(FCP)を用いて骨再生に関する研究を行ってきた。昨年度の研究では、石灰化の三次元的テンプレートであり、骨質を評価する指標となるコラーゲンに着目し、ヒト歯髄由来幹細胞(HDPSCs)を用いて、コラーゲン架橋関連酵素であるリシルヒドロキシラーゼ(LH)1,2の遺伝子発現を検討した。その結果、0.2mg/mLという低濃度のFCPはLH2の遺伝子発現を増加させ、HDPSCsを骨芽細胞に分化させる能力を有する可能性を示唆した。今回は、さらにFCPのタンパクレベルでの骨芽細胞誘導能について、アリザリンレッドS染色により検討した。本実験ではこれまで同様、株式会社ニッピから供与されたFCPを使用した。智歯周囲炎により抜歯された第三大臼歯の歯髄から分離されたHDPSCsは長崎大学大学院医歯薬学総合研究科の倫理委員会により使用が承認された(許可番号;1286-7)。FCP不含のDMEMで培養したHDPSCsを対照群とし、TaKaRaClontech社から販売されている石灰化誘導(OI)培地で培養したHDPSCsをポジティブコントロールとした。6well皿に5×10^4個のHDPSCsを播種し、培養28日目に、各群の細胞をホルマリン液で固定後、25分間染色液に浸漬した。その結果、OI添加群が最も強く赤く染色され、FCP添加群、対照群と続いた。この結果から、低濃度FCPは、石灰化誘導培地には及ばないものの、単独で間葉系幹細胞を骨芽細胞に誘導する可能性が示唆された。ヒト歯髄由来幹細胞の増殖能が低下しているため、骨芽細胞分化段階までの期間が長くかかっている。石灰化に関連する遺伝子だけでなく、今後、石灰化の三次元的テンプレートとなるコラーゲンの架橋に関連する遺伝子にも着目し、これらの遺伝子発現の上昇を確認することで、魚由来コラーゲンが骨芽細胞への分化誘導に寄与することをin vitroとvivoの系で証明する。
ブラジルにおける日系既成宗教教団の展開に関する宗教社会学的研究

1.日系既成仏教教団のブラジル開教について、日本国内における各宗派の宗務庁(宗務院)の関係部局、元開教使(師)への聞き取り、文献収集とその整理と分析2006年3月から翌月にかけて1ヶ月、2007年2月から翌月にかけて1ヶ月、2007年9月の1ヶ月間実施したブラジル現地調査で収集した資料を整理し、ブラジルにおける日系既成仏教(開教)寺院の活動と特に現地日系社会との関わりについて考察した。ブラジルにおける各寺院の開教活動について、関連資料と開教使、信者への聞き取りから得られた情報を整理した。さらに、各宗派の宗務庁から海外布教に対する見解、今後の方針について聞き取り調査と、現地の各教団及び開教使の取り組みについて調査し、分析を進めた。2.ブラジルにおける日系既成仏教寺院と現地日系団体への訪問と聞き取り、資料収集2008年8月29日(出国)から2008年10月3日(帰国)まで、ブラジルのサン・パウロ州とパラナ州、首都ブラジリアにおける既成仏教宗派寺院を訪問し、住職(開教使)、職員、信者への聞き取り調査と日系団体への聞き取り調査を行い、関係資料の収集を行った。収集した資料を整理し、特に寺院の地域的特徴を分析するとともに、異文化環境での活動の課題と展望について考察を進めた。その結果、寺院の存在意義を明確にした上で、単に布教活動だけでなく社会的役割も担い、広く認知され、多様な信者を獲得することが、地域社会での寺院運営には不可欠である指摘されうる。3.ブラジルにおける日系既成仏教による福祉活動に関する学会発表収集した資料を整理、分析した結果の一部を、言語文化学会第22回大会(2008年12月6日、於甲南大学)にて発表した。1.日系既成仏教教団のブラジル開教について、日本国内で宗派の宗務庁(宗務院)、元開教使、専門家へ聞き取り、資料収集と整理前々年度末(2006年3月)から前年度はじめ(2006年4月)にかけてのブラジル現地調査で収集した資料を整理し、ブラジルにおける日系既成仏教(開教)寺院と日本における既成仏教寺院との成り立ちと活動の相違点について検討した。ブラジルにおける寺院の開教活動について、関連資料と開教使、信徒(護持会会員)への聞き取りから得られた情報を整理、分析した。さらに、各宗派の宗務庁から宗派の海外開教についての方針、取り組みについて聞き取り調査と関連資料の収集を行い、海外開教支援の特徴についても考察を行った。2.ブラジルにおける日系既成仏教寺院と現地日系団体への訪問、資料収集と整理2007年2月24日から2007年3月28日まで、ブラジルのサン・パウロ州とパラナ州における既成仏教宗派寺院を訪問し、住職(開教使)、仏教会(護持会)、婦人会への聞き取り調査と現地日系文化協会への聞き取り調査を行い、関係資料の収集を行った。収集した資料を整理し、現地寺院の特徴を分析するとともに、活動の課題と展望について考察した。3.日系既成仏教教団のブラジル開教に関する学会発表(2回)収集した資料を整理、分析した結果の一部を以下の学会にて発表した。2006年10月22日、多文化関係学会第5回大会(於立教大学)にて発表。題目は「浄土宗南米教団による開教活動-ブラジルにおける日系既成仏教の歴史と課題-」。2006年11月25日、言語文化学会第20回大会(於関西大学)にて発表。題目は「ブラジルにおける浄土宗の開教の歴史と展望-日系既成仏教のブラジル開教」。1.日系既成仏教教団のブラジル開教について、日本国内における各宗派の宗務庁(宗務院)、元開教使、専門家へ聞き取り、資料収集と整理2006年3月から翌月にかけて1ヶ月、2007年2月から翌月にかけて1ヶ月のブラジル現地調査で収集した資料を整理し、ブラジルにおける日系既成仏教(開教)寺院の活動と特に現地日系社会との関わりについて考察した。ブラジルにおける寺院の開教活動について、関連資料と開教使、信徒(護持会会員)への聞き取りから得られた情報を整理、分析し、さらに、各宗派の宗務庁から宗派の海外開教について現状に対する見解、今後の方針と取り組みについて聞き取り調査を進め、現地開教使の意見との比較、分析を進めた。2.ブラジルにおける日系既成仏教寺院と現地日系団体への訪問、資料収集と整理2007年8月30日(出国)から2007年10月4日(帰国)まで、ブラジルのサン・パウロ州とパラナ州、ブラジリアにおける既成仏教宗派寺院を訪問し、住職(開教使)、職員、信者への聞き取り調査と現地日系団体への聞き取り調査を行い、関係資料の収集を行った。収集した資料を整理し、特に寺院の地域的特徴を分析するとともに、異文化環境での活動の課題と展望について考察を進めた結果、非日系をも対象とする宗派の教義・精神(宗教文化)に基づく社会的貢献の重要性が指摘されうる。3.日系既成仏教教団のブラジル開教に関する学会発表と論文執筆収集した資料を整理、分析した結果の一部を、言語文化学会第21回大会(2007年12月8日、於福岡教育大学)にて発表、言語文化学会論集第28号(2007)に論文を執筆、公表した。

1.日系既成仏教教団のブラジル開教について、日本国内における各宗派の宗務庁(宗務院)の関係部局、元開教使(師)への聞き取り、文献収集とその整理と分析2006年3月から翌月にかけて1ヶ月、2007年2月から翌月にかけて1ヶ月、2007年9月の1ヶ月間実施したブラジル現地調査で収集した資料を整理し、ブラジルにおける日系既成仏教(開教)寺院の活動と特に現地日系社会との関わりについて考察した。ブラジルにおける各寺院の開教活動について、関連資料と開教使、信者への聞き取りから得られた情報を整理した。さらに、各宗派の宗務庁から海外布教に対する見解、今後の方針について聞き取り調査と、現地の各教団及び開教使の取り組みについて調査し、分析を進めた。2.ブラジルにおける日系既成仏教寺院と現地日系団体への訪問と聞き取り、資料収集2008年8月29日(出国)から2008年10月3日(帰国)まで、ブラジルのサン・パウロ州とパラナ州、首都ブラジリアにおける既成仏教宗派寺院を訪問し、住職(開教使)、職員、信者への聞き取り調査と日系団体への聞き取り調査を行い、関係資料の収集を行った。収集した資料を整理し、特に寺院の地域的特徴を分析するとともに、異文化環境での活動の課題と展望について考察を進めた。その結果、寺院の存在意義を明確にした上で、単に布教活動だけでなく社会的役割も担い、広く認知され、多様な信者を獲得することが、地域社会での寺院運営には不可欠である指摘されうる。3.ブラジルにおける日系既成仏教による福祉活動に関する学会発表収集した資料を整理、分析した結果の一部を、言語文化学会第22回大会(2008年12月6日、於甲南大学)にて発表した。
舌扁平上皮癌におけるリンパ節微小転移の検討

我々はリンパ管内皮細胞の診断マーカーであるPodoplaninがヒト口腔扁平上皮癌(ORSCC)に高率(約70%)に発現していることを見いだし、報告してきた。昨年度は、ORSCC細胞株を用いてin vitro実験によりPodoplanin発現がSmad2/3シグナル経路を介してTGF-βにより正の制御を受けていることを明らかにした。今年度はTGF-βが一部の口腔扁平上皮癌においてPodoplanin発現誘導と同時に、EMT(上皮間葉系移行)を誘導することが報告されており、PodoplaninとEMTとの間に何らかの連関が予想されたため、UMSCC81細胞を用いてEMT誘導について検討した。その結果、TGF-βにより確かにVimentin, Snailの発現が亢進し、これらはTGF-βType 1受容体阻害剤で阻害されることから、TGF-βがPodoplanin発現誘導と同時に、EMTを誘導することが判明した。別途、我々はUMSCC81細胞から分離した薬剤耐性株(UMSCC81-Fb)が典型的なEMT形質を示すことを見いだしたため、このUMSCC81-Fbについても詳細に検討した。その結果、UMSCC81-Fb細胞株ではVimentin, Snailは強発現するものの、Podoplaninを殆ど発現しないのみならず、他のstem cell markerとされるALDHも殆ど発現しないことが判明した。一方、UMSCC81細胞ではEMTはEGFによっても誘導されることを見いだした。以上のことから、本細胞においてはPodoplaninはがん幹細胞マーカーではあるが、浸潤やリンパ節転移等との関連が報告されているEMT誘導には直接的には関係しない可能性が示唆された。口腔領域において高頻度に発生する舌癌は早期にリンパ節転移をきたすことや、健側リンパ節への跳躍転移など転移経路に関して不明な点が多い。したがって、悪性腫瘍に分布するリンパ管を検索し、微小循環の特性を解明することが、きわめて重要であるといえる。しかし、これまで微小循環系を構成している末梢リンパ管は光顕的な鑑別が困難なため、詳細な報告はあまりない。したがって腫瘍組織におけるリンパ管の新生、構築を解析し、リンパ管内に侵入した腫瘍細胞が数々の免疫防御機構を回避して、定着・増殖していくのかを検討することにより腫瘍細胞のリンパ管浸潤・転移過程が解明できるものと思われる。免疫組織学的検討によりリンパ管内皮マーカーであるD2-40抗原が口腔扁平上皮癌細胞において高率に発現していることを明らかにした。比較のために検討した胃癌・大腸癌などの腺癌では1例もD2-40抗体染色陽性例がないことから扁平上皮癌に特異的と考えられた。リンパ管内皮細胞のライセートをD2-40抗体と抗Podoplanin抗体でウエスタンブロットすると同一分子量のバンドが共に染色されることからD2-40抗体のエピトープはpodoplaninと同一と考えられた。最近,大部分が扁平上皮癌である子宮頚癌でこのpodoplaninがリンパ管以外にも頭頚部癌細胞で発現していることが報告されており、今回の我々の観察結果と一致している。Podoplaninは低分化型口腔扁平上皮癌において発現が高い傾向が認められると同時に、正常の口腔粘膜扁平上皮でも基底細胞が陽性であることから,扁平上皮の増殖・分化と関連している可能性が示唆される。しかし現在、Podoplaninの口腔扁平上皮および癌における機能については全くわかっていない。我々は,多数の口腔扁平上皮癌細胞株をFlow Cytometryおよび免疫蛍光染色で検索した結果、Podoplanin発現細胞株を複数株見出している。今後,これらの細胞株を用いてin vitroにおいてその機能解析を行うことにより,腫瘍細胞ばかりでなく、リンパ管内皮におけるD2-40抗原、podoplaninの機能解明が進む可能性が期待できる。昨年度は免疫学的検討によりリンパ管内皮や中皮細胞マーカーであるPodoplaninが口腔扁平上皮癌細胞において高率に発現していることを明らかにした。比較のために検討した胃癌・大腸癌などの腺癌では50例中1例もD2-40抗体染色陽性例がないことから扁平上皮癌に特異的と考えられた。Podoplaninは低分化型口腔扁平上皮癌において発現が高い傾向が認められると同時に、正常の口腔粘膜扁平上皮でも基底細胞が限局して陽性であることから,扁平上皮の増殖・分化と関連している可能性が示唆される。しかしこれまで、Podoplanin口腔扁平上皮および癌における機能については殆どわかっていない。我々は多数の口腔扁平上皮癌細胞株をFlow Cytometryおよび免疫蛍光染色で検索した結果、Podoplanin発現細胞株を複数株見出したため、今年度はこれらの培養細胞株を用いてPpdoplininの発現制御機構にろいてin vitroで検討した。その結果、口腔扁平上皮癌細胞株HSC-3がTGF-betaにより発現誘導されるとを見出した。この発現はTGF-beta濃度および時間依存的で刺激後12-24時間で最大に達しだ。また定量RT-PCRを用いてPodoplanin mR-NAも検討したところ24時間後では約3倍の発現誘導が認められ、転写レベルでの発現調節の可能性が示唆された。現在、TGF-betiによる発現誘導にSMADジグナル経路が関与するか否かを検討中である,一方、TGF-beatによるPodoplaninの発現誘導にも関わらず増殖への明らかな影響は認めちれなかったことから、増殖以外の機能に関与する可能性が示唆される。

Podoplaninが幹細胞マーカーのひとつであるとする報告が昨年度なされており、この点についても今後検討してゆく予定である。我々はリンパ管内皮細胞の新しい診断マーカーであるPodoplaninがヒト口腔扁平上皮癌(ORSCC)に高率(約70%)に発現していることを見いだし、報告してきた。しかしORSCCにおけるPodoplaninの役割やその発現機序については殆どわかっていない。本年度は、Podoplanin発現制御におけるTGF-βの役割についてORSCC細胞株を用いて検討した。フローサイトメトリーによる検討では検索しだ4種類の細胞株のうち3株はPodoplaninを細胞膜上に高発現していたが、1株は低発現であり、細胞により発現強度に差異が認められた。TGF-βはPodoplanin高発現細胞では時間ならびに濃度依存的にPodoplaninを発現誘導したが、低発現細胞ではPodoplanin発現を誘導しなかった。このTGF-βによるPodoplaninの発現誘導はTGF-βType 1受容体阻害剤(SB431542)により有意に抑制された。またPodoplanin発現に呼応して、TGF-βの下流シグナルであるSmad2のリン酸化がTGF-β刺激により亢進し、SB431542処理により減弱することも判明した。以上の結果から、ORSCC細胞株の多くではPodoplanin発現はSmad2/3シグナル経路を介してTGF-βにより正の制御を受けていること、一部のORSCC細胞ではTGF-βに依存しない別の制御機構が存在する可能性が示唆された。最近、TGF-βが一部の口腔扁平上皮癌においてPodoplanin発現誘導と同時に、EMT(上皮間葉系移行)を誘導することが報告されている。今回明らかになった知見はPodoplaninががん幹細胞マーカーであるとする報告と矛盾せず、PodoplaninがORSCCの浸潤、転移(リンパ節)などの悪性化に関与する可能性を示唆している。我々はリンパ管内皮細胞の診断マーカーであるPodoplaninがヒト口腔扁平上皮癌(ORSCC)に高率(約70%)に発現していることを見いだし、報告してきた。昨年度は、ORSCC細胞株を用いてin vitro実験によりPodoplanin発現がSmad2/3シグナル経路を介してTGF-βにより正の制御を受けていることを明らかにした。今年度はTGF-βが一部の口腔扁平上皮癌においてPodoplanin発現誘導と同時に、EMT(上皮間葉系移行)を誘導することが報告されており、PodoplaninとEMTとの間に何らかの連関が予想されたため、UMSCC81細胞を用いてEMT誘導について検討した。その結果、TGF-βにより確かにVimentin, Snailの発現が亢進し、これらはTGF-βType 1受容体阻害剤で阻害されることから、TGF-βがPodoplanin発現誘導と同時に、EMTを誘導することが判明した。別途、我々はUMSCC81細胞から分離した薬剤耐性株(UMSCC81-Fb)が典型的なEMT形質を示すことを見いだしたため、このUMSCC81-Fbについても詳細に検討した。
光受容体フォトトロピンの光情報認識からキナーゼ活性化に至る分子機構の解明

青色光センサー蛋白質Phototropin (phot)は、光受容を担うLOVドメインと光依存的に活性化されるkinaseドメインからなる。その活性化機構を明らかにするため、緑藻クラミドモナス由来の全長photの精製を行い、過渡回折格子(TG)法により光反応の検出を行った。その結果、光依存的に二量体化する様子が観測され、同時に二次構造の変化も誘起されることがわかった。これらの反応は主にLOV1ドメインによって制御されることがわかり、LOV1とLOV2をつなぐhinge領域で顕著な動きがあることが示された。これらの結果は高等植物由来のphotと大きく異なり、photの多様性を示す結果となった。高等植物や藻類の様々な運動反応を制御する青色光センサー蛋白質phototropinは光受容を担う二つのLOVドメイン(LOV1、LOV2)と光依存的に活性化されるkinaseドメインからなる。その信号伝達機構を明らかにするため、クラミドモナスおよびオストレオコッカス由来の全長phototropinの光反応を過渡回折格子法により測定した。その結果、クラミドモナス由来のphototropinは光依存的に2量体化する様子が観測され、この会合反応はLOV1ドメインが制御していることが示唆された。一方、オストレオコッカス由来のphototropinでは会合状態の変化は観測されず、代わりにヘリックス構造の崩壊反応が観測された。この反応にはLOV2ドメインが支配的に関与しており、同じphototropinでも生物種の違いにより反応機構が大きく異なることがわかった。さらに遺伝子操作によりオストレオコッカス由来のphototropinからkinaseドメインを取り除いた試料を作製し測定した結果、ヘリックス構造の崩壊反応が観測されなかったことから、全長蛋白質で観測されたヘリックス崩壊反応はkinaseドメイン(あるいはLOV2ドメインとkinaseドメインを結ぶ領域)で起こっており、LOV2ドメインがこの反応に必須であるという結論を得た。これらは信号伝達機構の理解において重要な知見である。また分子レベルでの反応においても生物種の違いが顕著に表れるということは非常に興味深い。現在、信号伝達に重要と予想される部位に変異をかける実験も行っているが、Wild typeとは大きく異なる信号が観測されており、信号伝達経路に関する詳細な知見も得られつつある。Phototropin (phot)は、高等植物や藻類の様々な運動反応を制御する青色光センサー蛋白質であり、光受容を担うLOVドメインと光依存的に活性化されるkinaseドメインからなる。その活性化機構を明らかにするため、本研究では緑藻(クラミドモナス(Cr)やオストレオコッカス(Ot))由来の全長photの精製を行い、過渡回折格子(TG)法により光反応ダイナミクスの検出を行った。その結果、Cr-photは光依存的に2量体化する様子が観測され、同時に二次構造の変化も誘起されることがわかった。これらの反応は主にLOV1ドメインによって制御されることがわかり、kinaseドメインの活性制御に重要と考えられているLOV2ドメインの寄与は小さかった。全長蛋白質から各ドメインを切り出した試料を測定することで構造変化部位の特定を行ったが、LOV1とLOV2をつなぐhinge領域で顕著な動きがあることが示された。一方、Ot-photでは光依存的な会合反応は検出されず、代わりにヘリックス構造の崩壊反応が観測された。この反応はLOV2ドメインが支配的に制御しており、LOV2ドメインとkinaseドメインを結ぶlinker領域で起こっていることが示唆された。さらにATPを加えた系で測定を行う事により自己リン酸化過程の検出を行い、Ot-photでは拡散係数がリン酸化によって減少する様子を捉える事に成功した。以上の結果はkinase活性化機構を解明する上で重要な知見であり、また分子レベルでの光反応の様相が生物種によって大きく異なる、つまりphotの多様性を示す結果となった。生体分子科学当初の研究計画では1年目にクラミドモナス由来の全長phototropinの光反応解明を達成する予定であった。現在、その80%程度が完了し、また変異体の作製により信号伝達に重要な箇所の同定も進んでいる。一方、オストレオコッカス由来のphototropinの反応検出は2年目に行う予定であったが、サンプルの調達がスムーズに運んだため、既に着手しており多くの結果が得られている。これらの比較により最終目標であった異なる生物種間での蛋白質反応の違いに関する考察も進めており、トータルでみておおむね順調に進展していると評価する。2年目はまず全長蛋白質の光反応解明完了を目指す。詳細な解析のために全長蛋白質から各ドメインを切り取った試料の調整を行い、その測定結果を基に全長蛋白質の反応機構を議論する。

またkinaseの活性化機構の本質に迫るために、ATPを加えた系で同様の測定を行い、自己リン酸化過程や基質のリン酸化過程、さらにはリン酸化に伴う蛋白質の高次構造変化の追跡も行う。これによってphototropinが光を受容してから信号伝達を完了するまでのメカニズムを明らかにできると考えている。最後にクラミドモナスとオストレオコッカス由来のphototropinの反応を比較することで、進化の過程についても分子論的観点から考察する予定である。一定培地量に対する蛋白質の回収量が予想より多く、蛋白質試料調製に必要な消耗品経費を予定より低く抑えることができた。また変異体の作製数が研究計画より少なかったため、遺伝子操作に必要な試薬の節約およびシークエンス解析費用を抑えることができたため、当初の使用計画を下回った。2年目はより精力的に変異体の作製やドメイン単位で切り取った試料の調製を行う予定であり、1年目の繰越額をこれに充てる。またリン酸化過程を調べる上で、蛋白質を予め完全に脱リン酸化する必要があるが、そのための脱リン酸化酵素は比較的高額である。実験上この高額試料を大量に購入する必要があるが、これも繰越額でまかなう予定である。
MMP-7による大腸がんの肝転移促進機構解明とその肝再生医療への応用

(1)がん細胞表層に結合したMMP-7の基質タンパク質として、I型膜タンパク質であるHAI-1を同定した。MMP-7はHAI-1を細胞膜近傍の部位で切断し、その細胞外領域を可溶性HAI-1(sHAI-1)として遊離させることが判明した。(2)MMP-7の作用により遊離したsHAI-1は細胞凝集を誘導する活性を持っていた。また、HAI-1細胞外領域の141-249に相当するアミノ酸配列部分が細胞凝集誘導活性に重要であった。(3) sHAI-1が細胞凝集誘導活性を発揮するためには、MMP-7のプロテアーゼ活性によりHAI-1以外の膜タンパク質の切断修飾が必須であることが示唆された。これまでの研究から大腸がんの肝転移に深く関わるMMP-7がコレステロール硫酸を介してがん細胞表層に結合し、細胞表層タンパク質を切断することでがん細胞の細胞間接着能を高め、細胞凝集を誘導するとともに、その肝臓への転移能を著しく促進することを見出していた。また、MMP-7によって切断されるがん細胞表層のタンパク質としてI型膜タンパク質であるHAI-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1)を同定した。そこで本年度はまずHAI-1の切断に伴い、どのようにして、がん細胞の細胞凝集が誘導されるのかについて調べた。その結果、MMP-7によって切り出されたHAI-1の細胞外領域(sHAI-1)が細胞表層に結合し、細胞凝集を誘導することを明らかにした。また、sHAI-1のがん細胞表層への結合と細胞凝集誘導は二価金属イオン依存的であり、細胞をMMP-7処理することが必須であることが判明した。さらに、細胞凝集に関わるHAI-1分子内領域がセリンプロテアーゼインヒビター領域を含まない141-249に相当するアミノ酸配列中に存在することを同定した。HAI-1の141-249に相当する断片の中の幾つかのアミノ酸残基をアラニン残基に置換した種々のバリアントを作製したところ、細胞凝集誘導活性を失ったものが得られた。また、大腸がん細胞をMMP-7処理する際に、このHAI-1断片の誘導体を添加したところ、MMP-7が誘導する細胞凝集を効果的に抑制することが判明した。したがって、こうしたHAI-1断片の誘導体はMMP-7の酵素活性そのものには影響を与えないものの、MMP-7よるがん転移促進効果を選択的に抑制する薬剤として利用できる可能性があると考えた。当初の計画以上に進展した点と、やや遅れた点があったため、おおむね順調に進展しているとした。計画以上に進展した点は研究実績の概要で述べた通り、HAI-1分子内の細胞凝集誘導活性に関わる領域をアミノ酸残基レベルまで詰めるとともに、がん細胞の細胞凝集を効果的に抑制する分子の設計に成功したことであり、これががん転移抑制剤として応用できる可能性が見出された点である。やや遅れた点はHAI-1が誘導する初期の細胞凝集から強固なE-カドヘリン依存的細胞凝集への移行する分子機序の解明であるが、こちらについても種々のプローブ作りが進んでいる。昨年度までの研究において、MMP-7とコレステロール硫酸との相互作用に伴い、がん細胞表層のI型膜タンパク質であるHAI-1がMMP-7によって切断され、その細胞外領域が放出されることを見出した。また、HAI-1細胞外領域に細胞凝集を誘導する活性があることを明らかにした。さらに、HAI-1細胞外領域のうち、PKD (Polycystic kidney disease)ドメインを含むアミノ酸配列141-249に相当する部分に細胞凝集誘導活性が存在することを見出した。本年度はHAI-1細胞外領域の141-249部分を含む断片、HAI-1(141-249)の種々のバリアント分子を作製し、細胞凝集誘導に関わる機能部位を最小単位まで詰めることを試みた。その結果、HAI-1(141-249)内の数アミノ酸残基をアラニンに置換すると、がん細胞への結合能は保持されているものの、細胞凝集誘導活性を失うことを見出した。また、この断片を培養がん細胞に添加すると、MMP-7が誘導する細胞凝集が有意に抑制されることが判明し、HAI-1(141-249)のバリアントがアンタゴニストとして機能することが示唆された。さらに、細胞凝集誘導活性に重要なアミノ酸残基の周辺配列を含むオリゴペプチドが、同様にMMP-7が誘導する細胞凝集に対して抑制効果を持つことが判明した。これらの結果はHAI-1(141-249)の中に2つの機能部位が存在し、その両方が揃ってはじめて細胞凝集誘導活性を持つことを示唆している。その機序としてそれぞれの機能部位が細胞表層分子と相互作用し、細胞間を架橋することで細胞凝集を誘導すること等が考えられる。そのメカニズム解明には更なる解析が必要であるが、上記の細胞凝集阻害活性を持つHAI-1(141-249)バリアントおよびオリゴペプチドは新規がん転移抑制剤としての開発が期待される。

(2)MMP-7の作用により遊離したsHAI-1は細胞凝集を誘導する活性を持っていた。また、HAI-1細胞外領域の141-249に相当するアミノ酸配列部分が細胞凝集誘導活性に重要であった。(3) sHAI-1が細胞凝集誘導活性を発揮するためには、MMP-7のプロテアーゼ活性によりHAI-1以外の膜タンパク質の切断修飾が必須であることが示唆された。今後の推進方策としては、HAI-1誘導体をがん転移抑制剤として応用するための分子設計を進めるとともに、動物実験等によりその効果を検証することを計画している。また、HAI-1が誘導する初期の細胞凝集からE-カドヘリン依存的細胞凝集への移行する分子機序の解明を進めるとともに、こうしたMMP-7による細胞間接着誘導効果を肝幹・前駆細胞の生着への応用に着手することを計画している生体医工学・生体材料学次年度使用額が生じた理由として、平成28年度に研究室の学内移転があり、移転の前後の期間において研究および試薬等の購入を停止せざるを得なかったことがあげられる使用計画としては購入が遅れた試薬等を早期に購入し、研究の推進に充てる予定である。
18世紀ドイツの啓蒙主義政策と地域農村の宗教文化

本研究は、18世紀ドイツの農村地域を対象に、国家による啓蒙主義的政策に対して、農村住民がいかに対応したかを調査することにあった。19世紀前半期の封建制廃止の時期まで、農村住民は独自の伝統文化を保持し、生活していた。啓蒙主義的国家政策は、農村住民の文化、とりわけ彼らの信仰やその表出形態としての巡礼や祭り、風習を「迷信」とみなし、それを矯正することを試みた。国家はキリスト教会と手をたずさえて、民衆文化の破壊を強行しようとした。しかし、農村住民の伝統的宗教文化が、国家や教会の法令等によって、すぐさま矯正されたわけではなかった。本研究は、こういった農村住民の「上から」の圧力に対しての抵抗、恭順などさまざまな反応を探った。本年度は研究と初年として,資料収集とその整理を主な仕事とした。資料の大部分は,20年8月にドイツ,バオエルン州のショローベンハウゼン市立文書館で調査した。使用できる資料のコピーまたはマイクロフィルム化をおこなった。書籍の収集については,科研費では足りなかった,ので,校費および私費によってまかなった。収集した文書館資料は,当文書館所在のザンディツェル家文書の宗教,教会関係である。また,バイエルン州立文書館でも若干の調査を行った。20年度の後半は,資料の整理とその読解にほぼ費やした。現在も進行中である。私のテーマは,農村民衆レヴェルの信仰,文化を探ることにあるので,膨大な資料群から,それらの叙述をみつけることは難しい作業であるが順調に信仰している。具体的には,古文書を現代のドイツ語に直し,それをさらに,日本語にやくすという作業である。すべて,パソコンに取り込み,項目別に保存している。こういった,基礎的作業は次年度以降の仕事の準備であり,本年度は十分な仕事ができたと思っている。こうして、本年度は、研究の初年度として以上のような基礎的成果を得た。来年度は,その成果を論文として文章化する予定である。本年度は研究2年目である。自らに3つの作業を課し、それをおこなった。まず、昨年度に引き続いて資料の収集をおこなった。手稿資料は、21年6月にドイツ・バイエルン州のシュローベンハウゼン文書館およびアウクスブルクの司教区文書館で、撮影、コピー等で入手した。書籍や印刷論文は、ドイツの大学、古書店等から、その都度入手した。次に、フィールドワークをおこなった。バイエルン農村の祭り(聖体祭)に参加させてもらい、また、アルトエッティング巡礼地を訪問した(21年6月)。ドイツとの比較で日本の福井県の御幣行列も見学した。最後に、昨年以上に力を入れるのは、収集した資料の読解と論文の作成である。読解作業が非常にはかどったため、その結果として、論文1本と図書1冊を完成することができた。とりわけ図書の出版は、予想以上の大きな成果であった。昨年の報告書に約束した文章化の作業ができたことは、まことに意義深いものであった。このように本年度の成果は満足できるものであった。そもそも、19世紀前半期の封建制廃止の時期まで、農村住民は独自の伝統文化を保持し、生活していた。本年度は、まず、昨年度に引き続いて資料の収集をおこなった。資料は文献資料と手稿資料に分類される。前者は、物品費により、古書店や図書館で調達した。後者の手稿資料は、現地の文書館に赴いて、撮影、コピー等で入手した。本年度も昨年度同様、ドイツ・バイエルン州のシュローベンハウゼン市立文書館、アウクスブルク司教区文書館を中心に収集作業をおこなった。昨年度、すでに論文1本と著書1冊を書き、ある程度の文章化の作業をおこなった。今年度も著書1冊(共著)を上梓することになっている。
幼胚培養及び複二倍体作出による黄色花ツバキ品種の育成

1.雑種の幼胚培養系の確立:ヤブツバキとキンカチャとの交雑胚は発育の過程で退化するが、交配後100日前後の胚で発育が可能であった。胚の発育は、BA1mg/l、YE1g/l、ショ糖40g/lを添加した修正1/2MS培地が有効で、胚からの不定胚の誘導にはGA_31mg/lを添加したMS培地が適すると思われた。2.雑種性の早期検定法の確立と雑種個体の特性調査:育成されたヤブツバキとキンカチャとの交雑個体を材料に用い、形態及びPCR法から雑種性の早期検定法を検討し、葉の形態と3種のプライマーによる分析から雑種性の早期検定が可能となった。また、これらの雑種個体の形態特性を明らかにした。形態は両親の中間的なものとヤブツバキまたはキンカチャに近いものに区分された。雑種の花色は全て淡いクリーム色であり、雑種一代での濃黄色花個体の育成は困難であると思われた。3.交雑胚からの複二倍体の育成:不定胚形成期の幼胚を用い,in vitroにおいてコルヒチン処理を行ったところ、形態特性から倍加あるいはキメラ化したと考えられるシュートが多数得られ、現在分割増殖中である。今後は発根処理により染色体数を確定し、完全な複二倍体個体の育成をはかる。4.葉緑体DNAのPCR-RFLP分析によるツバキ属の分類とその応用:ツバキ属の分類と雑種性検定を目的として、葉緑体DNAの遺伝子領域のPCR-RFLP分析を行った結果、分類学上の節や種によるバンドパターンにはそれぞれ特徴があり、系統分類や雑種の検討に本手法が利用できることが明らかとなった。4.ツバキ属の特性調査と新種の確定:ベトナム北部の現地調査で採取した植物体および標本の詳細調査から、黄色花2種を含む3種について新種と同定した。また、分類学的位置が明らかでなかったCamellia petelotii(黄色花ツバキ)を現地調査で再発見し、その特性とともに公表した。1.雑種の幼胚培養系の確立ヤブツバキとキンカチャとの交雑胚は発育の過程で退化して稔実種子が得られないため,交配日から一定期間ごとに幼胚を摘出してin vitroで培養したところ,交配後100日前後の胚を用いることによって,交雑胚の発育が可能であった.幼胚の発育は,BA1mg/l,YE1g/l,ショ糖40g/lを添加した修正1/2MS培地を用いた暗条件培養が有効であり,胚からの不定胚の誘導にはGA_3lmg/lを添加したMS培地が適すると思われた.2.雑種性の早期検定法の確立過去に育成されたヤブツバキとキンカチャとの交配実生を材料に用い,形態及びPCR法から雑種性の早期検定法を検討し,葉の形態と3種のプライマーによる分析から雑種性の早期検定が可能となった.3.交雑胚からの複二倍体の育成

不定胚形成期の幼胚を用い,in vitroにおいてコルヒチン処理を行ったところ,形態特性から倍加あるいはキメラ化した可能性の高い変異シュートが多数得られた.現段階では染色体数の調査まで至らないが,これらの材料を節ごとに分割増殖を行い,発根処理により染色体数を確定し,複二倍体個体の育成をはかる予定である.4.ツバキ属キンカチャ節の系統分類黄色い花のツバキ品質育成のために用いられているツバキ属のキンカチャ節の種は分類学上の位置づけが不明確である.中国南部やベトナム北部の現地調査をもとに分類基準の明確化と種の特定を行ってきたが,その過程でベトナム産の3種を新種として発表した.前年度からのの研究を継続するとともに、本年度はとくに以下の項目について詳細な調査を実施した。1.雑種の幼胚培養系の確立ヤブツバキとキンカチャとの交雑胚の胚培養における摘出適期や培地条件については前年度に実施したが、本年度はその確認実験を継続するとともに、主として不定胚の誘導条件と発根条件について調査した。これらの結果、ヤブツバキとキンカチャとの雑種を確実に得ることが可能となった。2.雑種個体の特性調査雑種個体の形態特性調査を継続し、とくに気孔周辺構造や花粉の微細構造から雑種の特性を明らかにした。また、これらの結果をもとに種間交雑における形質遺伝の特性を明らかにした。3.葉緑体DNAのPCR-RFLP分析によるツバキ属の分類とその応用ツバキ属の分類と雑種性検定を目的として、葉緑体DNAの遺伝子領域のPCR-RFLP分析を行った結果、分類学上の節や種によるバンドパターンにはそれぞれ特徴があり、系統分類や雑種の検定に本手法が利用できることが明らかとなった。
非平衡環境を利用した開放量子多体系の状態制御

これまでの開放量子系の研究は、主に小さな量子系が環境と結合している状況を取り扱ってきた。しかし、近年の冷却原子系やイオントラップの実験の進展により、量子多体系と環境との結合を制御することが可能となり、制御された非平衡環境と結合した量子多体系がどのような量子状態に緩和するのかを理論的に明らかにすることが重要となってきた。本研究ではこの問いに理論的にアプローチして、非平衡開放量子多体系の理解を目指す。特に、環境の非平衡性を積極的に利用することで、興味深い量子状態の実現を目指す。
超格子系など超微細物質を含む系の電子的・光学的性質の研究

励起子の局在化は光学的性質に大きな影響を与える。この局在化には音響型のフオノンが大きな役割を果たすことは良く知られている。3次元結晶では、電子-フォノン、正孔-フォノン相互作用の大きさと符号の違いにより励起子は多様な様相を示すことは良く知られている。一方、量子井戸中の電子については、音響フォノンによる局在化は、井戸の次天性により大きく異なり、井戸の次元性が大きくなるにつれ局在性は大きくなる。従って、この系の光学的性質に大きな影響を与える励起子について、その局在化が、量子井戸の次元性によりバルクとどう異なり、次元性の違いを明らかにすることは、重要である。井戸の次元性をd(=0,1,3)とし、井戸幅をL(即ち、L=Lz for d=1,L=Ly=Lz for d=2,L=Lx=Ly=Lz for d=3)とし、無限障壁モデルを用いた。X(=x,y,z)方向の励起子状態の羽動関数をf(x)として、井戸に束縛されていない時は、電子、正孔ペアrに可能な様相を記述出来る形を選び、井戸に束縛されている時はそれと電子、正孔のサブバンド関数の積を用いることにする。井戸による効果はフォノンについては折りたたみ効果があるだけと考え、電子格子相互作用に対して連続道似を用いた。電子-格子相互作用の効果は断熱道似で考慮し、電子-正孔のクーロン引力はデルタ関数で道似する。系の物理的パラメターとして、系にバンド幅Bm,電子-格子相互作用の強さSac、正孔-格子相互作用の強さSacgacを変化させ、井戸の次元性の効果と励起子の局在性について種子の状次で調ベた。井戸の次元性が大きくなると励起子の局在性がおこりやすいが、gacの符号により井戸の次元性の効果は大きく異なることがわかった。
指示表現による相互理解の達成の解明：技能教授場面の分析から

本研究では、場所に言及する際に用いられる指示表現がやりとりの中でどのように選択され、そして理解されるのか明らかにするため、茶道稽古場面と自動車教習所の教習場面を録画・録音し、場所表現の収集を行った。この2種類のデータを空間参照枠の観点から比較したとき、前者は相対参照枠、後者は絶対参照枠が多く用いられる傾向が明らかとなった。この傾向の違いは、2種類のデータにおける参与者の位置関係の違いというよりも、位置づけられる対象や場所のバラエティーの豊富さが関わっていると考えられる。本研究は、場所に言及する際に用いられる指示表現が、人と人とのやりとりの中でどのように選択され、そして理解されるのかを、茶道稽古場面と自動車教習場面の録画・録音データを用い、会話分析の手法により解明することを目的としている。本年度は、助成開始から年度末までの期間が短いため、データの収録および書き起こし作業、データ分析に主眼を置いた。具体的には、研究課題1「茶道稽古場面における指示表現の研究」では、茶道稽古場面のデータ収録を行い、書き起こし作業を進めている。研究課題2「自動車教習場面における場所の指示表現の研究」では、京都にある自動車教習所の協力を得て、オートマチック車限定免許の限定解除の技能教習場面のビデオ撮影を行った。こちらに関しても書き起こし作業を進めている。本年度は、技能教授場面という点で共通するものの、性質の異なるこれら2つのデータをそれぞれ詳細に検討すべく、データの書き起こしおよび分析を行った。本研究の目的は、場所に言及する際に用いられる指示表現がやりとりの中でどのように選択され、そして理解されるのかを、茶道稽古場面と自動車教習所の教習場面の録画・録音データを用いて解明することである。話し手がどのような形式の指示表現を選択したかということには、話し手が聞き手の知識状態・知覚状態をどのように予測したのかが反映される。そのような指示表現を分析することにより、発話や振る舞いといった、利き手が発する様々な言語的要素・非言語的要素に対して、話し手がいかに機敏に反応し、指示対象の理解も含めた相互理解がいかに達成されるのかを明らかにすることが本研究の目的である。本年度は前年度に引き続き、収集した茶道稽古場面および自動車教習場面のデータの書き起こしを行い、特に場所表現に注目して表現の収集および分析を行った。研究代表者の不測の病気により本年度6月から2月頃まで研究の中断を余儀なくされたため、データ収集、書き起こし、分析、研究成果の取りまとめ、研究成果の発表等、本年度に計画していた内容の多くを遂行することが困難となったものの、茶道稽古場面と自動車教習場面の2種類のデータを「空間参照枠」の観点から比較したとき、前者は相対参照枠、後者は絶対参照枠が多く用いられる傾向が見られたということが明らかとなっている。この傾向の違いは、2種類のデータにおける参与者の位置関係の違いというよりも、位置づけられる対象や場所のバラエティーの豊富さがが関わっていると考えられる。参照枠の選択には様々な要因が働くことが指摘されているが、位置の描写か移動の描写かといった空間指示の種類が関与する要因についてはまだあまり分析が進んでいないようである(cf.松本ほか2010)。本研究で得られたデータはこの要因を明らかにするのに有効であると思われるため、今後、空間参照枠の観点からの分析をさらに展開する予定である。平成26年度は助成開始から年度末までの期間が短いため、データの収録および書き起こし作業、データ分析に主眼を置く予定にしていたが、おおむね当初の予定通り研究は進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。言語学場所を指示する表現がやりとりの中でどのように選択され、理解されるのかを解明するため、今後も引き続きビデオ撮影によるデータ収集を行い、得られたデータに基づいて、場所を指示する表現に注目して分析を行う。研究課題1では、昨年度に引き続き茶道稽古場面のデータを収録する。茶道経験者の稽古場面だけでなく、茶道初心者が茶道に触れる場面のデータも収録する予定である。研究課題2では、引き続き自動車教習所(京都)の協力を得て、ペーパードライバー教習および路上教習場面を収録する予定である。本年度もデータ収録を行い、書き起こし作業・データの分析を行うとともに、研究会や学会等で研究の成果を発表していく。
神経細胞の移動時におけるCaシグナル伝達系とC1-の相関関係

未熟な神経細胞は発達過程においてその細胞が最終的に位置取る特定の場所へ移動するが、その際に移動している細胞は移動に特異的な細胞内のシグナル伝達系を持つことが知られる。本申請課題では、大脳皮質の錐体細胞の移動時における細胞内シグナルとしての細胞内イオンの変化を調べることを試みた。異所性遺伝子産物により構成されるFRET型インディケーターは、遺伝子の発現している間、安定して長時間に渡り細胞内イオン変化塗捉えられることと考えられる。そこで、胎生14日齢のICRマウス胎仔の脳室内にFRET型Ca^<2+>インディケーターであるyellow-cameleon遺伝子あるいはCl^-インディケーターであるclomeleonを発現するプラスミドDNAを注入後、子宮内電気穿孔法を用いて脳室周囲の神経前駆細胞にDNAを導入し、移動中の大脳皮質・錐体細胞のイメージングを行った。胎生17日齢のマウスから前脳スライスを作製し、Yellow-cameleonを発現する神経細胞を経時的にFRET観察したところ、GABAに反応する様子を観察できたが(昨年度に報告)、細胞移動時における自発的な変化は微細なため解析することが困難であった。そこでYellow-cameleonによる未熟な神経細胞のイメージングは、GABAなどの細胞外因子の影響を調べる手段として用いて、自発的なCa^<2+>の変動については既存の蛍光指示薬を用いたイメージング法にて観察を行っている。また、Clolueleonを発現する細胞については未熟な神経細胞内でのCl^-変動を検出することができなかった。しかし、コントロール実験の中で、他の細胞の移動時に変化しうることを見出し、別の申請課題として研究が発展している。未熟な神経細胞でイメージングをするためには、よりダイナミックレンジの大きいインディケーターの開発も視野に入れて研究を行う必要がある。大脳皮質の錐体細胞の移動における細胞内シグナリングを調べるために、移動中の細胞に対して特異的にFRET型Ca^<2+>インディケーターであるyellow-cameleonを導入して、タイムラプスFRETイメージング法を用いて細胞内カルシウムレベルの変動を調べることを試みた。実際には、胎生14日齢のICRマウス胎仔の脳室内にyellow-cameleon遺伝子を発現するプラスミドDNAを注入後、子宮内電気穿孔法を用いて脳室周囲の神経前駆細胞にDNAを導入した。その後、時間経過(母体内で1-7日間育てた)と共にyellow-cameleon陽性細胞は大脳皮質の軟膜方向へと移り変わっていく様子が観察できた。これらのことは、yellow-cameleonが大脳皮質を移動している神経細胞に導入されていることを示す。同様にFRET型Cl^-インディケーターであるClomeleonも移動中の神経細胞に導入できた。次にFRET型Ca^<2+>インディケーターにより、脳組織内の細胞内カルシウムの変動を捉えられるかを調べるために、遺伝子導入4日後にyellow-cameleonを発現する脳スライスを用いて、GABAに対する応答性を調べた。その結果、yellow-cameleonを構成するCFPとYFPの輝度が相反して変化することを見出した。さらにそのFRET比の変動の様相は、蛍光指示薬のCa^<2+>インディケーターの導入時に認められるGABA依存性のCa^<2+>流入によるCa^<2+>オシレーションパターンと酷似したパターンを示した。今後、確立したFRETイメージングの系を用いて、急性脳スライス標本や培養標本を用いて、詳細に組織中を移動する細胞に見られる細胞内Ca^<2+>、Cl^-変動をより詳細に検討する予定である。