hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペプチドアレイ解析技術を用いた免疫寛容誘導ペプチドの設計

ペプチドマイクロアレイは、多数のペプチドに対する相互作用解析を一度に実施できることから、抗体エピトープ解析等を行う上で有用である。本研究では、カゼイン免疫によりミルクアレルギーマウスモデルを作製し、血清中のIgE抗体エピトープをミルクタンパク質全6種類のアミノ酸配列に基づいて合成したミルクペプチドマイクロアレイを用いて解析することで、アレルギー応答を抑制する短鎖エピトープペプチドを設計した。本ペプチドを経口免疫療法における補助剤として添加し、アレルギー応答を抑制しながら円滑に治療を行う可能性について検討した。先進国における食物アレルギー患者数は急増しており、その治療法が広く求められています。初年度は、アレルギー寛解メカニズムに着目した解析を行うため、アレルギーマウスをアレルゲン免疫により作製し、産生される血清中IgE抗体エピトープをペプチドマイクロアレイ解析技術により明らかにしました。ペプチドマイクロアレイは、アレルゲンタンパク質のアミノ酸配列を基に断片化ペプチドライブラリーを合成し、スライドグラス上にアレイ化することで作製しました。さらに、得られたエピトープペプチド内の結合コア配列を解析するため、自由に配列設計が可能なセルロース膜へのスポットペプチド合成法を利用しました。これより、作製したアレルギーマウスのIgE抗体エピトープを詳細に解析することができました。このエピトープペプチドは、好塩基球を用いた細胞アッセイ系においてアレルゲン添加による脱顆粒を抑制する効果があり、抗原添加によるIgE抗体受容体の架橋反応を抑制する可能性が示唆されました。さらに、アレルギーマウスを用いた実験では、エピトープペプチドを添加した後にアレルゲンを投与することで、アレルギー反応の抑制効果が確認できました。これらの結果より、ペプチドマイクロアレイ解析技術を利用することでIgE抗体エピトープを明らかとし、アレルゲン投与時のアレルギー反応を抑制できることが示唆されました。このことは、エピトープペプチドを利用することで経口免疫療法などにおけるアレルゲン摂取時のアレルギー反応を抑制しながら治療を円滑に進められる可能性を示唆しており、ペプチドマイクロアレイ解析技術の有用性が明らかとなりました。ペプチドマイクロアレイ解析技術は、抗体エピトープ解析において有効な解析ツールであることが明らかとなってきました。本解析により得られる抗体エピトープ情報をアレルギー診断のみならず、アレルギー治療に活かすことができるか検討を進めています。初年度は、エピトープペプチドを用いることによりアレルギー反応を抑制できることが示唆され、ペプチドマイクロアレイ解析技術の有用性が明らかとなりました。このことは、経口免疫療法における補助剤としてエピトープペプチドを利用できる可能性を示唆しており、初年度としてよい成果が得られました。近年では、医師の指導の下で原因食物を徐々に摂取させてアレルゲンに対する免疫寛容を誘導する経口免疫療法も注目されており、アレルギー治療も従来のアレルゲン回避の考え方からどのように安全に免疫寛容を誘導できるかに移行しつつあります。ペプチドアレイ解析技術により得られるIgEエピトープ情報は、アレルギー症状の多様性や長期化などとの相関性が示唆されており、アレルギー症状の経過予測や治療指針の提供においても有用となると考えられます。そこで本研究では、アレルギー症状を抑制しながら円滑に治療を行うため、ペプチドアレイ解析により得られたIgEエピトープ情報をもとにエピトープペプチドを合成し、経口免疫療法における補助剤として添加することについて検討しました。3週令のBALB/cAJclマウスを1週間の予備飼育後に、カゼインナトリウムを腹腔投与により免疫することでアレルギーマウスを作製し、産生された血清中IgE抗体エピトープを解析しました。ペプチドアレイは16残基ライブラリーにより作製していますが、長鎖のエピトープペプチドは疑似抗原として作用することが懸念されるため、より詳細に解析することでアレルギー反応を抑制する短鎖エピトープペプチドを設計しました。血清を感作した好塩基球を用いた脱顆粒試験においては、短鎖エピトープペプチドを加えることで、抗原添加時のアレルギー反応を抑制することができました。また、アレルギーマウスに短鎖エピトープペプチドを添加後に抗原投与した際のマウスの直腸温およびかゆがる時間を測定したところ、エピトープペプチドを事前に投与してから抗原投与を続けることでアレルギー症状を抑制しながら抗原を摂取できることが示唆されました。ペプチドマイクロアレイ解析技術をさらに展開し、IgE抗体エピトープを用いた経口免疫療法について検討する他、免疫応答において重要な記憶B細胞についても解析することにより、アレルギー寛解メカニズムについて理解を深める。生物機能・バイオプロセス
プロテオグリカンによる血管障害発症機構の検討と治療への応用

近年、動脈硬化症での血管障害進展に細胞外基質の主要構成物質である糖蛋白質プロテオグリカンの重要性が示唆されている。今回我々は、血管壁に多く発現するプロテオグリカンであるバイグリカンの血管特異的過剰発現マウスを樹立し、その血管障害モデルを作成してバイグリカンの血管障害発症機構における役割を初めて明らかにした。ヒトバイグリカンcDNAを血管特異的プロモーターであるαSMAの下流に挿入してC57BL/6Jマウス卵にマイクロインジェクションしバイグリカン過剰発現マウスを樹立し(tg)、更にこれにアンジオテンシンII(AngII)を慢性投与して血管障害モデルを作成し、野生型マウス(wt)での血管障害モデルとの比較検討を行った。心重量比、血圧、血漿レニン活性でtgに変化は見られなかった。大動脈など血管組織ではAngII負荷前、後ともにtg群ではwt群に比して、血管壁厚さ、血管media/lumen比が有意に増加し、更にPCNA染色陽性となる増殖細胞が有意に増加していた。又、冠動脈においては野生型に比べ著明な新生内膜の増生による内腔閉塞を認め、ヒトの冠動脈疾患の病理像に類似していた。この新生内膜の免疫組織染色から新生内膜は血管平滑筋細胞の増殖から主になることが示された。この機序の詳細な検討をおこなうため、培養血管平滑筋細胞(VSMC)を用いたin vitroの実験を施行した。VSMCをバイグリカンで刺激することにより、VSMCの遊走および増殖能の促進が示され、ウェスタンブロット法から、バイグリカンの刺激によりVSMCの細胞周期調節因子であるCdk2の発現を増加させ、p27、p21を減少させることが示された。以上より、バイグリカンがVSMCの増殖・遊走に関与し、心血管障害発症に直接関与する増悪因子であることが示された。血管壁には細胞外マトリックスの構成成分であるプロテオグリカンが豊富に存在していることが知られており、また動脈硬化でその発現が亢進していることが示されているが血管における機能について不明な点が多い。今回我々は血管特異的プロモーターαSMAの下流にヒトバイグリカンcDNAを挿入し血管特異的にバイグリカンを過剰発現するトランスジェニックマウス(Tg)を樹立した。Tgマウスの心機能を心エコーを用いて評価したが、野生型マウス(Wt)に比して大きな差を認めなかった。次に血管障害モデルを作成するためにアンジオテンシンII(Ang II)をTg及びWtにミニポンプを用いて1ug/kg/minで14日間投与した。投与前後で血圧、心重量、血漿レニン活性を測定し、大動脈や心組織を各群より摂取し、抗PCNA、αSMA、CD38、CD61抗体を用いた免疫組織学的検討を行った。バイグリカンTgマウス血管ではWtに比して大動脈のPCNA陽性細胞は有意に増加しておりまた血管中膜の厚さ、M/L比も増加していた。Ang II投与によりこれらの作用が増強するとともに、冠動脈において著明な増生によるneointimaの形成・血管内腔の部分閉塞を認めた(Wt Ang II(-) 0.32+0.14、Wt Ang II(+) 2.97+0.25、Tg Ang II(-) 3.19+0.39、Tg Ang II(+) 6.96+0.88 (PCNA (+) cells x100/um))。また病変の免疫染色ではneointima形成部分に一致してPCNA、αSMA染色は亢進していたがCD38、CD61染色は陰性であった。以上より、バイグリカンが内皮細胞やマクロファージに影響せず、冠動脈血管平滑筋細胞の増殖亢進と遊走をもたらす可能性が示唆された。
近接場光技術を用いたナノ領域光化学反応

有機分子あるいは有機固体などの有機分子材料の光反応あるいは化学反応をナノ領域において行わせ、究極的には、これらの反応を超高密度光メモリあるいは超微細加工へ応用することを目的とした。本年度は、2光子吸収係数の大きいフォトクロミック分子および単一分子光メモリのためのフォトクロミック分子を合成し、それらの評価を行った。D-π-D型のダイマー構造をもつ2種のジアリールエテンを合成し、それらのフォトクロミック反応性と2光子吸収係数の測定を行った。この2種の化合物はともに効率の良いフォトクロミック反応性を示した。まだ絶対値は不確かであるが、これまで最大であったジアリールジシアノ誘導体よりも大きい2光子吸収係数をもつことが確認された。単一分子メモリに関しては、昨年、アントラセン基をもつジアリールエテン誘導体を合成し、単一分子状態において光スイッチ挙動を計測すると、溶液系においては見出されることのない、光反応量子収率の揺らぎが観測された。これには、(1)分子一つ一つが異なった分子環境にあるためと(2)分子固有の現象であるとの2つの解釈が成り立つ。どちらが主たる原因であるかを明らかにするために、ペリレン基をもつジアリールエテンを合成し、その光応答挙動を検討した。その結果、同一の分子においても光反応量子収率の揺らぎがみとめられ、揺らぎは、分子固有のものであることが示唆された。微小領域での光化学反応について研究をすすめた。共焦点顕微鏡あるいは近接場光学顕微鏡により、有機固体内部あるいは固体表面の微小領域において光反応を誘起し、その結果生じる蛍光特性の変化を位置選択的に検出し、光メモリへの応用を検討した。蛍光特性が光反応により可逆に変化するチオインジゴを主鎖に含むポリエステルを合成し、3次元光メモリの記録媒体とした。光反応には共焦点顕微鏡からの568nm光を用い、蛍光性のトランス体を無蛍光性のシス体へ変換して、その蛍光強度変化を同じく共焦点顕微鏡を用いて読み出した。スポットサイズは、幅300nmで、深さ方向は3μmの間隔で書き込むことが出来た。この記録は、しかし、長時間置くと消失する欠点を有している。次年度には、この欠点をもたない材料開発をすすめる。近接場光光学顕微鏡を用いたwrite-once光メモリについても検討をすすめた。光酸発生剤,増感剤,およびpHインジケータとしてそれぞれジフェニルヨードニウムヘキサフルオロリン酸(Ph2IPF6),アクリジンイエローおよびSeminaphthofluorescein(SNAFL)を用い、それらをポリビニルアルコール中に分散し,光メモリ媒体とした。Ar+レーザーの488nm光を書き込み光源に,514.5nm光を読み出し光源とした。それぞれの光を近接場光学顕微鏡に導入し,書き込み、蛍光読み出しを行った。488nm光照射に伴い,蛍光強度の増加がみられた。この系では514.5nm読み出し光による光メモリ媒体の劣化は認められなかった。有機固体の光化学あるいは化学反応をナノ領域において行わせ、究極的には超高密度光メモリあるいは超微細加工の実現をめざしている。光化学反応には共焦点顕微鏡あるいは近接場光学顕微鏡を用い、対象である有機固体にはフォトクロミック材料を用いている。1,2-bis(2,4-dimethyl-5-phenyl)perfluorocyclopentene単結晶表面の光誘起形状変化を、(100)面、(010)面それぞれについてAFMにより計測した。その結果、(100)面においては紫外光照射により1nmのステップが現れ、一方、(010)面では溝が形成された。これらの紫外光誘起形状変化は可視光照射により消滅した。(100)面と(010)面との形状変化の違いは、X線構造解析による分子の結晶内配置により説明された。1,2-bis(3-methyl-2-thienyl)perfluorocyclopentene単結晶への3Dメモリを検討した。この黄色結晶は紫外光を照射すると赤く着色し、可視光により元の黄色にもどる。黄色の状態では蛍光を発するが、赤色になると蛍光性は失われる。共焦点顕微鏡により、結晶の深さ方向の2層に、絞った紫外光により「光」と「子」と言う2字を書き込み、それらを蛍光強度変化として読み出した。スポツトの直径は、約200nmであった。深さ方向にも、3μmおきに書き込むことが出来た。近接場光メモリへの応用をめざして、100°C以上の高いガラス転移温度をもつアモルファスジアリールエテン材料の合成をすすめた。ナノ構造創成の一つのアプローチとして、有機分子あるいは有機固体などの有機分子材料の光反応あるいは化学反応を名の領域において行わせ、究極的には、これらの反応を超高密度光メモリあるいは超微細加工へ応用することをめざしている。ジアリールエテンは、繰り返し耐久性に優れたフォトクロミック分子である。この誘導体の一つである1,2-Bis(2,4-dimethyl-5-phenyl-3-thienyl)perfluorocyclopenteneと蛍光性分子である9,10-Bis(phenylethynyl)anthraceneとをAdamantyl基で結合した光スイッチ分子を設計・合成し、それらの超希薄溶液をZeonex高分子表面に分散させ、単一分子蛍光の光スイッチを共焦点顕微鏡により測定し、通常の溶液系での光応答との違いを検討した。その結果、溶液系においてのアナログ的な光スイッチが、単一分子系では、デジタル的光応答に変化することが明らかとなった。この結果は、究極の大容量・高密度光メモリへの第一歩となる。

エステル結合の形成・解離により蛍光強度が著しく変化するジアリールマレイミド誘導体を結合し、その蛍光強度を高分子フィルムの微小領域においてピペットからの試薬添加により制御することを試みた。しかし、スポット径を10μm以下にすることは困難であった。今後、微小化のためのデイプペン方式を検討する。有機分子あるいは有機固体などの有機分子材料の光反応あるいは化学反応をナノ領域において行わせ、究極的には、これらの反応を超高密度光メモリあるいは超微細加工へ応用することを目的とした。本年度は、2光子吸収係数の大きいフォトクロミック分子および単一分子光メモリのためのフォトクロミック分子を合成し、それらの評価を行った。D-π-D型のダイマー構造をもつ2種のジアリールエテンを合成し、それらのフォトクロミック反応性と2光子吸収係数の測定を行った。この2種の化合物はともに効率の良いフォトクロミック反応性を示した。まだ絶対値は不確かであるが、これまで最大であったジアリールジシアノ誘導体よりも大きい2光子吸収係数をもつことが確認された。単一分子メモリに関しては、昨年、アントラセン基をもつジアリールエテン誘導体を合成し、単一分子状態において光スイッチ挙動を計測すると、溶液系においては見出されることのない、光反応量子収率の揺らぎが観測された。これには、(1)分子一つ一つが異なった分子環境にあるためと(2)分子固有の現象であるとの2つの解釈が成り立つ。どちらが主たる原因であるかを明らかにするために、ペリレン基をもつジアリールエテンを合成し、その光応答挙動を検討した。その結果、同一の分子においても光反応量子収率の揺らぎがみとめられ、揺らぎは、分子固有のものであることが示唆された。
溶液反応における超高速ダイナミクスの分光計測

研究代表者らは,平成13年度に科学研究費特定領域研究(A)(2)の交付を受けて,「溶液反応における超高速ダイナミクスの分光計測」に関する研究を行った.本年度は,まず前年度に製作したフェムト秒時間分解近赤外分光システムの性能改善を行った.プローブ光発生法や検出法の改良によって、波長850nmから1450nmまでの近赤外領域で10^<-3>程度の吸光度変化を安定して検出できるようになった.これは前年度に比べて約10倍の高精度化である.改良したフェムト秒時間分解近赤外分光システムを用いて,次のような測定を行った.(1)9,10-ジシアノアントラセンを光励起し,1280nmを中心としたS_n-S_1吸収帯を観測した.ポンプ光によって与えられる余剰エネルギーに依存して,吸収帯の時間変化に差が出ることを見出した.数ピコ秒で起こる高速の振動緩和過程の存在を強く示唆した.(2)TiO_2微粒子を光励起し,生成した電子-正孔対による幅の広い吸収を近赤外領域全体で観測した.近赤外光を利用したために,微粒子状試料の分光測定を直接吸収法で行うことができた.その結果,電子-正孔対の生成および消滅のダイナミクスをフェムト秒の時間領域で測定することに成功した.1ピコ秒以内では電子-正孔対の消滅のダイナミクスが励起光強度に依存して変化することを見出した.フェムト秒時間分解近赤外分光法以外にも,時間分解けい光分光法,時間分解赤外分光法などを利用して溶液中の化学反応に付随した(i)反応分子同士の相対的並進・回転運動や,(ii)溶質-溶媒相互作用による分子間エネルギー移動過程,を観測した.これらの機構を考察することによって,(iii)溶液反応の定量的モデルの構築を試みた.本年度は以上の結果を4報の原著論文として発表した.また,国際会議における招待講演を1件行った.研究代表者らは、平成12年度に科学研究費特定領域研究(A)(2)の交付を受けて、「溶液反応における超高速ダイナミクスの分光計測」に関する研究を行った。2年間の研究計画の第1年目相当する本年度の第一の目標は、既存の装置を改良して本研究の目的に即した分光計測装置を構築することであった。この方針に沿って、InGaAsリニア検出器(256素子)1個を購入し、フェムト秒時間分解近赤外分光システムで昨年度以来用いていたシングルチャンネルのInGaAs検出器と交換した。検出系がマルチチャンネル化されたことで、従来の1/10以下の短時間での効率的測定が可能となった。本研究の遂行にあたっては、(i)ピコ秒・フェムト秒領域での反応分子同士の相対的並進・回転運動の実験的観測、(ii)溶質-溶媒相互作用による分子間エネルギー移動過程の観測とその機構の考察、(iii)溶液反応の定量的モデルの構築、の3点を目標としている。本年度は、このうちの(i)を解明するための分光計測と解析を主として行った。trans-スチルベンおよびビフェニルと四塩化炭素の超高速2分子反応に注目し、これらの反応の動力学をフェムト秒の時間分解測定を用いて明らかにした。さらに、その結果が、本来は希薄溶液における反応において成立する拡散律速反応のSmoluchowski理論やCollins-Kimball理論で説明されることを見出した。これは、1ピコ秒程度の時間が経過した段階での溶液中の分子の並進運動が拡散の概念で記述できることを示唆しており、拡散モデルの適用限界を実験的に示すことにつながる。これらの結果を論じた論文は、trans-スチルベンについての速報をすでに出版し(裏面に記載)、ビフェニルについての論文(2報)を投稿中である。また、本年度は、国際会議における招待講演を5件行った。研究代表者らは,平成13年度に科学研究費特定領域研究(A)(2)の交付を受けて,「溶液反応における超高速ダイナミクスの分光計測」に関する研究を行った.本年度は,まず前年度に製作したフェムト秒時間分解近赤外分光システムの性能改善を行った.プローブ光発生法や検出法の改良によって、波長850nmから1450nmまでの近赤外領域で10^<-3>程度の吸光度変化を安定して検出できるようになった.これは前年度に比べて約10倍の高精度化である.改良したフェムト秒時間分解近赤外分光システムを用いて,次のような測定を行った.(1)9,10-ジシアノアントラセンを光励起し,1280nmを中心としたS_n-S_1吸収帯を観測した.ポンプ光によって与えられる余剰エネルギーに依存して,吸収帯の時間変化に差が出ることを見出した.数ピコ秒で起こる高速の振動緩和過程の存在を強く示唆した.(2)TiO_2微粒子を光励起し,生成した電子-正孔対による幅の広い吸収を近赤外領域全体で観測した.近赤外光を利用したために,微粒子状試料の分光測定を直接吸収法で行うことができた.その結果,電子-正孔対の生成および消滅のダイナミクスをフェムト秒の時間領域で測定することに成功した.1ピコ秒以内では電子-正孔対の消滅のダイナミクスが励起光強度に依存して変化することを見出した.

フェムト秒時間分解近赤外分光法以外にも,時間分解けい光分光法,時間分解赤外分光法などを利用して溶液中の化学反応に付随した(i)反応分子同士の相対的並進・回転運動や,(ii)溶質-溶媒相互作用による分子間エネルギー移動過程,を観測した.これらの機構を考察することによって,(iii)溶液反応の定量的モデルの構築を試みた.本年度は以上の結果を4報の原著論文として発表した.また,国際会議における招待講演を1件行った.
デグロンを利用した蛍光性プローブによる細胞運命決定の可視化

多細胞社会のなかで生命現象はどのような時空間パターンで起こるのか?その包括的理解を目標に掲げ2013年度より当研究課題に取り組んできた。レインボーFucci、細胞ストレス、糖代謝動態など、細胞個々について状態を可視化し運命を予言するプローブの開発とその性能評価を進めてきた。その過程で、細胞の多様な個性を再認識する機会がたびたびあり「一細胞リアルタイムイメージング」の必要性を痛感した。今後の研究課題では、主にfloxマウスの作製と解析を通して、生命現象の時空間パターンをより生理学的な文脈で理解することを目指す。多細胞社会のなかで、生命現象の進行はどのような時空間パターンで起こるのか?これらを包括的に理解することを目的に、申請者らが2008年に報告した細胞周期可視化プローブ:Fucciのノウハウを応用し、E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発をすすめた。E3ユビキチンリガーゼは、細胞の恒常性維持に必須の酵素タンパク質である。これらの基質を材料に作製される機能プローブは、個々の細胞の中で起こる生命基本現象を可視化しながら、細胞集団のHeterogeneityを時空間的に描出することを可能とする。詳細を以下に示す。1、レインボーFucciの開発の一つとして、G0を同定するFucciプローブを共同研究で開発し論文発表した。2、低酸素環境[CUL2VHL-HIF1]およびストレス環境[CUL3Keap1-Nrf2]を可視化するE3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発を進め、FucciーS/G2/Mをマーカーとして、これらの生命現象を同時に理解するためのtricistronic vectorを構築した。現在、このtricistronic vectorをレンチウイルスのシステムにて種々の細胞に感染させ、恒常発現細胞を構築している。3、挑戦的萌芽研究(平成24年度・1年間計画)において開発を進めたエピジェネティクス動態を可視化するプローブを引き継ぎ、改良を試みたところ、期待する機能をもったプローブが得られつつある。4、運命決定スイッチを可視化する実験系の立ち上げとして、すでに発表されたfloxタイプのFucciマウスの導入を行い、性能評価を行った。さらに、in vivo imagingに適したマウスラインの作製を共同研究で進めた(論文投稿中)。5、in vitro3次元培養法の検討において、細胞の準備および、顕微鏡システムのセットアップを平行して進めた。1、レインボーFucciの一つ、Fucci3.2の応用研究をすすめた(論文投稿準備中)。2、低酸素環境[CUL2VHL-HIF1]およびストレス環境[CUL3Keap1-Nrf2]を可視化するE3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブを、FucciーS/G2/Mマーカーとともに発現するtricistronic発現系を構築した。レンチウイルスのシステムで種々の細胞に感染させ恒常発現細胞株を取得し、ライブイメージングを行った。これまでにNMuMG細胞では、・播種された密度によって細胞のストレス応答状態が異なること、・培養環境条件により、細胞集団が示すストレス応答にHeterogeneityが見られること、などが観察されている。引き続き、これら現象における細胞個々の個性を描出しながら、生命現象との関連を可視化し、新知見の理解・解釈へとつなげていく。3、挑戦的萌芽研究において開発を進めたエピジェネティクス動態を可視化するプローブを、実用レベルに改良した。他の生命現象と同時に観察することを視野に、プローブの多色化および局在操作を進めている。4、運命決定スイッチを可視化する実験系の立ち上げとして、すでに発表したfloxタイプFucci2マウスの性能を上回り、よりin vivo imagingに適したマウスラインflox-Fucci2aRの作製を共同研究ですすめ、論文発表を行った(Mort et al. 2014)。5、E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブのターゲットを糖代謝系に設定し、新規5種類のプローブ作製を開始した。多細胞社会のなかで生命現象はどのような時空間パターンで起こるのか?その包括的理解を目標に2013年度より研究を進めてきた。当初に計画した研究の内容については、2015年度の途中でほぼ達成が見込まれ、今年度の研究は11月で完了とした。当研究課題の成果は、平成28年度より交付をうける新学術領域・公募研究へ繋げていく予定である。・第4世代Fucci, Fucci4の性能評価を、培養細胞を用いて完了した。またFucci4のfloxマウスの作製・導入を完了した。今後、全身性および組織特異的Creマウスとの交配により得られる胎児や個体を材料にして、細胞周期とDNAダメージとの相関を解析していく。・低酸素+ストレス環境+細胞周期を同時に可視化するためのtricistronic発現系を用いて、恒常発現細胞株の作製をすすめた。細胞はNMuMG, MCF10A, 293Tなど。対数増殖期におけるストレス感知が細胞種によって異なること、また同じ細胞種でも、培養の密度や空間次元によって異なることが明らかになった。こうした知見をさらに個体レベルで解析するために、floxマウスの作製を計画する(次の科研費課題に引き継ぐ)。

・定性的観察が可能なエピジェネティクスプローブを完成させ、DNAメチル化を抑える薬物に対する培養細胞個々の反応をタイムラプスイメージングで観察することに成功した。・糖代謝のフローを可視化するプローブの作製を完了した。細胞個々の状態および運命を可視化するプローブの作製、性能評価を進めながら、細胞個性の多様性を再認識する機会がたびたびあり、一細胞リアルタイムイメージングの必要性を痛感した。当初の研究課題については、培養細胞レベルの研究内容がすべて完了した段階で終了とし、今後の研究課題では、主にfloxマウスの作製と解析を行いながら、生命現象の時空間パターンをより生理学的な文脈で理解することを目標に据える。多細胞社会のなかで生命現象はどのような時空間パターンで起こるのか?その包括的理解を目標に掲げ2013年度より当研究課題に取り組んできた。レインボーFucci、細胞ストレス、糖代謝動態など、細胞個々について状態を可視化し運命を予言するプローブの開発とその性能評価を進めてきた。その過程で、細胞の多様な個性を再認識する機会がたびたびあり「一細胞リアルタイムイメージング」の必要性を痛感した。今後の研究課題では、主にfloxマウスの作製と解析を通して、生命現象の時空間パターンをより生理学的な文脈で理解することを目指す。運命決定スイッチを可視化する実験系の立ち上げについて、主に昨年度に集中して行う事が出来たため、今年度は、E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発についてスピードアップを意識しながら積極的にすすめた。ストレス環境[CUL3Keap1-Nrf2]を可視化するE3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブをもちいて、興味深い細胞応答を観察しており、今後はこれら生命現象の理解、解釈へとつながる研究を行っていく。エピジェネティクス動態を可視化するプローブにおいては、多色化、局在操作を行っており、in vitro, in vivoの両方向からの検証実験へと進めている。E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブのターゲットを代謝系に設定し、新規5種類のプローブ作製を開始した。生物学E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発においては、代謝系に設定した新規5種類のプローブ作製を積極的に進める。生命現象を多角的に可視化・理解するために、複数プローブの同時使用を可能とするプローブの多色化や、局在操作を行っていく。非侵襲性かつ恒常的に発現する細胞の作製をすすめ、In vitro 3次元培養法を適用し、細胞個々の反応のheterogenityを可視化していく。これら細胞株を用い、ヌードマウスで造腫瘍実験を行う。in vivoにおける運命決定スイッチを可視化する。理想的Fucciプローブ;レインボーFucciの開発においては、共同研究による論文を発表し、すでに目標を達成しつつある。運命決定スイッチを可視化する実験系の立ち上げを行う事を先行したので、E3ユビキチンリガーゼ-デグロンプローブ開発においては、今後スピードアップしながら、積極的に開発をすすめる予定である。
グラフィティックカーボンナイトライドの配向制御に基づく新しい応用探索

カーボンナイトライドポリマー(以下GCN)薄膜の作成条件を検討していく中で、特定の条件下で作製された薄膜がアクチュエーター特性を示すことを見出し、本年度でNature Materials誌に筆頭著者として採択された。また高度に配向したGCN薄膜が可視、近赤外領域で2.0を超える面内方向の屈折率を有することを発見した。エリプソメトリーにより窒素雰囲気下で無塩ガラス基板上に作製した薄膜の屈折率を測定したところ、面内方向の屈折率は可視領域から近赤外領域(420 nm < λ< 1690 nm)において、2.14 < n平行< 2.76と非常に高い屈折率を示した。モルフォ蝶など、微細構造からなる構造色は角度依存性が小さいことが知られているが、人の手で人工的に再現するには複雑なプロセスを必要とする。一方で、GCN薄膜のように非常に大きい屈折率を有する薄膜の干渉色は、薄膜を形成するだけで同様の効果が得ることができる。例えばGCN薄膜コーティングされた炭素材料は、高屈折率からなる干渉色により鮮やかで均一な色を示すことができる。さらに編み込んだ炭素繊維上にも直接コーティングすることが可能であり、意匠性を失わないことが確認できた。また膜厚方向の屈折率は可視領域から近赤外領域の波長で1.43 < n垂直< 1.53であり、面内方向に比べて低い値であった。よって複屈折の絶対値は0.71 < Δn < 1.22であった。この絶対値は方解石、酸化チタン、高分子薄膜などの報告されている値の中で最も高い値である。本研究のGCN薄膜のような高い複屈折を有する薄膜を用いれば、非常に少ない層でも十分に偏光を分離することが可能であり、低コスト化などが期待できる。これらの研究成果をもとに特許を4報出願している。28年度が最終年度であるため、記入しない。申請者が開発したカーボンナイトライドポリマー(以下GCN)の配向制御方法は非常に簡便であるが、大気下で重合を行なっているため、酸素などが材料の電子物性に影響を与えている可能性がある。そこで、不活性雰囲気下で配向を制御したGCNフィルムの作製が可能な装置を開発した。石英ガラス製の筒の両端に窒素ガスフローを可能にするパーツを作製した。このガラスの筒に出発原料を入れた試験管をいれ、蒸着重合を行うと任意の基板上に薄膜が得られた。XPSスペクトルにより薄膜の構造を確認したところ、GCNであることが確認された。また不純物のカーボンに由来するピークが減少していることから、窒素ガスフロー中で作製する方法を用いれば質の高いGCN薄膜が得られることがわかった。また薄膜の作成条件を検討していく上で、特定の条件下で作製された薄膜はアクチュエーター特性を示すことがわかった。光、熱、湿度といった様々な刺激に薄膜が高速に応答した。特に紫外光を照射したところ、わずか50 ms程度で薄膜がロールアップすることが確認された。慎重に調査を行っていったところ、これらのアクチュエーター特性はすべて水の吸脱着をドライビングフォースにしていることが判明した。特筆すべきは低湿度下において薄膜付近に水が存在していると目に見えて自発的運動を示すことである。安定した雰囲気下では自発的な運動は観測されなかったため、これは空間の局所的な水分量のゆらぎによって引き起こされていることがわかった。薄膜の運動は突然止まったり急に動き出したりとランダムなものである。これは空気中の対流や水分子の拡散が一定ではないためと考えられる。薄膜のすぐ近くに高精度の湿度計を置いても、湿度計に変化は見られず、いかに小さな環境のゆらぎを駆動力にしているかが分かる。このような小さな環境の変化を駆動力とするアクチュエーターの開発に成功した。昨年度、カーボンナイトライドポリマー(以下GCN)薄膜の作成条件を検討していく上で、特定の条件下で作製された薄膜はアクチュエーター特性を示すことがわかった。本年度でメカニズム解明のために詳細な分析を続け、論文を投稿するにいたった。また高度に配向したGCN薄膜は非常に高い屈折率を示すことがわかった。現在より正確な値を評価すべく様々な測定を試みているが、屈折率はおおよそ2.42.7であることがわかった。また複屈折も0.81.0程度と非常に大きく、これらの値は報告されている有機薄膜の中でも高い屈折率である。加えて、非常に高い屈折率を有しているため、角度依存性の低い干渉色を実現することがわかった。従来の計画では触媒活性の評価を行う予定であったが、高い屈折率薄膜材料は基礎、応用の観点からも非常に興味深く、高屈折率を利用した有機ELの光取り出し向上などエネルギー問題に貢献できる可能性がある。そのため、当初の予定とは異なるが、研究方針を大きく変えて取り組んだ。研究室では昼夜問わず研究に励んでおり、自身で研究をリードしながら着々と実験をこなしている。また昨年発見した薄膜の新たな特性(アクチュエーター特性)のデータを揃え論文を投稿した(現在投稿中)。加えて、光学物性においても新たな知見が得られ、これらの結果は学術的に興味深いだけでなく実用的なアプリケーションにも新たな知見を与えると判断し、研究方向をシフトさせた。

カーボンナイトライドポリマー(以下GCN)薄膜の作成条件を検討していく中で、特定の条件下で作製された薄膜がアクチュエーター特性を示すことを見出し、本年度でNature Materials誌に筆頭著者として採択された。また高度に配向したGCN薄膜が可視、近赤外領域で2.0を超える面内方向の屈折率を有することを発見した。エリプソメトリーにより窒素雰囲気下で無塩ガラス基板上に作製した薄膜の屈折率を測定したところ、面内方向の屈折率は可視領域から近赤外領域(420 nm < λ< 1690 nm)において、2.14 < n平行< 2.76と非常に高い屈折率を示した。モルフォ蝶など、微細構造からなる構造色は角度依存性が小さいことが知られているが、人の手で人工的に再現するには複雑なプロセスを必要とする。一方で、GCN薄膜のように非常に大きい屈折率を有する薄膜の干渉色は、薄膜を形成するだけで同様の効果が得ることができる。例えばGCN薄膜コーティングされた炭素材料は、高屈折率からなる干渉色により鮮やかで均一な色を示すことができる。さらに編み込んだ炭素繊維上にも直接コーティングすることが可能であり、意匠性を失わないことが確認できた。また膜厚方向の屈折率は可視領域から近赤外領域の波長で1.43 < n垂直< 1.53であり、面内方向に比べて低い値であった。よって複屈折の絶対値は0.71 < Δn < 1.22であった。この絶対値は方解石、酸化チタン、高分子薄膜などの報告されている値の中で最も高い値である。本研究のGCN薄膜のような高い複屈折を有する薄膜を用いれば、非常に少ない層でも十分に偏光を分離することが可能であり、低コスト化などが期待できる。これらの研究成果をもとに特許を4報出願している。当初の予定どおり、不活性雰囲気下で配向を制御したGCNフィルムの作製が可能な装置を開発した。開発した装置を用い、窒素ガスフロー中で作製すると質の高いGCN薄膜が得られることまでわかっている。新たな物性の発見により予定外の実験も行っているが、従来の目標はすでに達成している。光学物性において新たな知見が得られたため、光学物性にフォーカスし研究を進めていく予定である。またこれらの結果を特許にまとめ始めている(5月末に投稿予定)。特許にまとめたのち、論文に投稿予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。1年目で開発した精密なフィルム合成の技術を用い、グラフェンなど基板との相互作用を最大限に利用し、水の完全分解に最適な薄膜の作成を目指す。またGCNフィルムの電子物性を制御する方法を開発し組み合わせることで、水の完全分解だけでなく、電子デバイスへの応用を試みる。さらに1年目で発見したアクチュエーター特性についてデータをまとめ、論文を投稿する予定である。
脳特異的なアロマターゼ遺伝子発現による脳の性的二型決定機構の解析

脳の性分化に関与するアロマターゼの神経細胞、性中枢領域、および時期特異的発現機構を明らかにする目的で、アロマターゼの脳特異的プロモーターの解析を行った。脳特異的なプロモーターに作用する複数の転写調節因子を単離・解析し、さらに遺伝子操作マウスを利用して、中枢神経系でのアロマターゼ発現神経細胞の詳細な解析を行った。本研究により、哺乳類における脳の性分化の形成メカニズムの解明のための重要な知見を得た。エストロゲン合成酵素であるアロマターゼは性腺や脳で発現している。各組織における転写は、異なるプロモーター領域により組織特異的な発現制御を受けている。申請者は、酵母ワンハイブリッド法を利用して、脳特異的プロモーターに存在するシスエレメントのうちaro-Bサイトに結合する核内因子、Lhx2を単離した。in vivoクロマチン免疫沈降法により、Lhx2は脳特異的アロマターゼプロモーターと相互作用していることが確認された。また、マウス胎仔間脳部の初代神経培養細胞系を利用し、siRNAを用いてLhx2の発現をノックダウンすると、アロマターゼの発現が低下する。これらのことよりLhx2は脳アロマターゼの発現に関与していることが明らかとなった。さらに酵母ツーハイブリッド法を用いて、Lhx2のコファクターとしてDEAF1を同定した。これらの転写因子がどの様なメカニズムで転写制御を行っているかをさらに詳細に調べるため、同様に酵母ツーハイブリッド法を用い、DEAF1をベイトとして、スクリーニングを行ったところ、DEAF1結合因子としてUbc9が単離された。Ubc9はSUMO化反応のE2酵素であることが知られている。Lhx2、DEAF1およびUbc9がアロマターゼの脳特異的プロモーター活性に、どの様な影響を及ぼすのか調べるため、培養細胞を用いてアロマターゼ脳特異的プロモーターのレポーターアッセイを行った。その結果、Ubc9は転写活性化に働き、aro-Bサイトに直接結合していると考えられるLhx2をアッセイ系から除くと、Ubc9の転写活性化能は認められなくなった。このように、脳特異的アロマターゼの転写制御とDEAF1のSUMO化の関連性は不明であるが、Lhx2、DEAF1による本遺伝子の脳特異的発現制御にはUbc9が関与している可能性が示唆された。脳の性分化に関与するアロマターゼの神経細胞、および時期特異的発現機構を明らかにする目的で、脳特異的プロモーターの解析を行った。マウス・アロマターゼの脳特異的プロモーター内には-100塩基付近にaro-AII、そして-190塩基付近にaro-Bと名付けたシスエレメントが存在する。これらのシスエレメントのうち、aro-AIIサイトにはARP1が結合して転写制御を行っていることを示している。この転写因子がどの様なメカニズムで転写制御を行っているかさらに調べるため、ARP1に相互作用するタンパク質を、酵母ツーハイブリッド法を利用して単離した。その結果、ARP1との相互作用がすでに報告されている転写因子、Ear2の他に、機能未知のタンパク質をコードするクローンが得られ、この未知のクローンを仮にC11と名付けた。Ear2やC11がARP1と相互作用することは、免疫沈降実験を用いて確認した。Ear2はARP1とホモロジーの高いオーファン型の核内レセプターである。ARP1はホモダイマーとしてaro-AIIに結合することができるが、Ear2とヘテロダイマーを形成して作用することで転写活性の制御に関わる可能性も考えられる。このような複数のシスエレメントが、異なる転写因子群を介して、どのようにプロモーター活性を制御しているのかについて解析した。COS7細胞を利用して、アロマターゼの脳特異的プロモーターをレポーターとしたプロモーターアッセイの系において、ARP1およびaro-Bに結合するLhx2などの転写因子とEar2やC11を種々の組み合わせで共発現させ、プロモーター活性への影響を調べたが、少なくとも今回用いた系ではEar2やC11は活性に大きな影響を及ぼさなかった。脳におけるアロマターゼの作用は、周生期に精巣から分泌されたテストステロンを基質として、脳内でエストラジオールを生合成することである。この時期にエストラジオールが脳内で作用することにより、性特異的な神経内分泌や行動性的二型が形成されると考えられている。申請者は、このような脳の性分化に深く関与するアロマターゼの発現機構を明らかとするために、本遺伝子の脳特異的プロモーターの解析を行っている。プロモーター領域に存在するシスエレメントのうち、aro-Bサイトに結合する因子として単離したlim、ホメオドメインを持つ転写因子であるLhx2を単離、解析し、さらにその結合因子としてDEAF1を単離した。Lhx2とDEAF1とのタンパク質-タンパク質相互作用を解析するため、培養細胞で様々な変異体を発現させ、免疫沈降法によりそれらの結合を調べた。その結果、野生型のLhx2はDEAF1と結合し、共沈することが確認された。

Lhx2のホメオドメインを欠損した変異体でも共沈するが、limドメインを欠損した変異体ではDEAF1と共沈しないことから、limドメインがDEAF1との相互作用に必要であることが示唆された。株化培養細胞を利用したルシフェラーゼアッセイにて、これらの転写因子が脳特異的なアロマターゼプロモーター活性にどのような影響を及ぼすのかを調べたところ、Lhx2が持つプロモーター活性化能をDEAF1が、さらに増強することが明らかとなり、DEAF1がLhx2のコアクティベーターとして働くことが示唆された。さらにDEAF1の様々な変異体を用いて行ったルシフェラーゼアッセイにより、DEAF1のLhx2に対する転写流性化増強作用は、DEAF1タンパク質の中心部に存在することが明らかとなった。
ゼロエミッション社会に求められるライフスタイルの模索

家庭内の化学物質,買い物袋,生ごみ(厨芥)に着目し,市民のライフスタイルの変更にともなう環境負荷について定量的に検討した。家庭内の化学物質として,電池類や小型家電製品,洗剤・漂白剤,農薬類などの化学薬品を対象に,使用の有無,年間購入量および使用量,廃棄方法などについて,市民にアンケートを行ったところ,捨て方がわからないために家庭で保管されている例も多く,適切な回収システムが求められていることがわかった。つづいて,買い物袋の持参運動に着目した。都市ごみの細組成調査により,ごみとして排出されている買い物袋は,容積で10.2%を占めており,買い物袋を持参し,レジで袋を断ることで,約1割のごみの削減が可能であった。さらに,生成時のエネルギー量や廃棄物処理に伴う温室効果ガスの排出量,買い物袋の原料の製造エネルギーおよび製品自体のもつエネルギー,製造時及び焼却処理時に発生するCO_2を算出し,市民一人一人が布製の買物袋を持ち歩いて5年間使う場合と比較したところ,廃棄物重量では年間285x10^3トン,CO_2発生量では年間421x10^6kg-C,エネルギー量では,原材料の持つエネルギー分まで加えると,年間5089x10^9kcalが削減可能であった。家庭ごみの40%(湿重量比)を占める厨芥について,細組成調査より調理くずと食べ残しに分類すると,厨芥中の食べ残しは35,7%を占めた。都市ごみの年間発生量が約5000万トンであることから,厨芥類は2000万トン,食べ残しの量は年間約710万トンとなり,一世帯あたり,一週間に平均3.2kgを食べ残しとして捨てていた。また食べ残しによるエネルギーの損失は,年間で3018x10^<10>kcal,また食べ残し自身のエネルギー,1314x10^<10>kcal/年は1800万人が生活できる食糧に相当した。
多発性硬化症のTCR-CDR3ワクチンの開発に関する研究

脳炎惹起性T細胞多ローン4b.14aの抗原受容体(TCR)アルファ鎖のCDR3領域に相当するペプチド(CDR3ペプチド)は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を含む各種自己免疫疾患を増悪させる(Yamamura et al.J.Neurosci.Res.45:706-713,1996)。これまでそのメカニズムは推測の域を出なかったが、今年度の研究でCDR3ペプチド特異的で疾患を増悪させる調節性T細胞の存在すること、この調節細胞が疾患の増悪に関与することが明らかになった。以上の結論は、CDR3ペプチド特異的T細胞の受け身移入実験によって証明された(Fazekas et al.論文準備中)。さらに前年度樹立されたCDR3ペプチド特異的T細胞ハイブリドーマ4株のTCR配列を決定した結果、いずれも同一のTCR配列(Vベータ14陽性)を共有することがわかり、この調節細胞集団はin vivoでclonal expansionを起こしている可能性が示唆された。この推測の正しさは、single strand conformation polymorphism(SSCP)法による解析により確認された。すなわち、正常なSJL/JマウスのCD25陽性T細胞分画をSSCP法で調べたところ、Vベータ14陽性細胞のclonal expansionが確認され、この増殖したクローンのTCRがCDR3ペプチド特異的T細胞ハイブリドーマのTCRと同一であることがわかった。以上の結果は、疾患誘導を調節するCDR3特異的T細胞を標的にする新しい治療法の可能性を示唆した。すなわち、この細胞を不完全に刺激してTh2サイトカイン産出を誘導する、などの方法が考えられる。マウスではここまで詳細が明らかになったので、今後サルやヒトにおける調節性T細胞研究を進める必要がある。脳炎惹起性T細胞クローン4b.14a抗原受容体(TCR)アルファ鎖のCDR3領域に相当するペプチドは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を含む各種自己免疫疾患を増悪させる(Yamamura T et al.J.Neurosci.Res.45:706-713,1996)。おそらくTCR特異的調節性T細胞に影響を与えた結果、疾患の増悪がみられたものと思われるが、まだ推測の段階にとどまっている。TCR CDR3ペプチドに特異的なT細胞レパトアを同定し、その抗原認識機構を明らかにし、さらに改変ペプチドによる疾患制御法の確立、霊長類における疾病抑制の確認が本研究の目的である。初年度は、以下の検討を終えた。1)CDR3ペプチドのアラニン置換アナログの合成を終了した。2)SJL-JマウスよりCDR3ペプチド特異的なTcell hybridoma約40株を樹立し、その大部分がCDR3ペプチドを認識してTh1およびTh2サイトカインを産生することを見いだした。3)国立感染症研究所筑波霊長類実験センターの協力を得て、カニクイザルのEAEの誘導を開始した。4)カニクイザルのTCRレパトアを明らかにするために、SSCP法を導入して確立した。現在Tcell hybridomaはさらにクローニングを行い、クローンのレベルでその性状を確認するところである。今後、マウスではペプチド・アナログとT cell hybridomaを使って、CDR3ペプチドのTCR結合部位を決定し、カニクイザルではCDR3ペプチドがEAEの増悪効果を持つかどうかを検証する。次年度の発展に向けて準備が進んでいる。脳炎惹芝性T細胞クローン4b.14aの抗原受容体(TCR)アルファ鎖のCDR3領域に相当するペプチド(CDR3ペプチド)は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を含む

各種自己免疫疾患を増悪させる(Yamamura et al.J.Neurosci.Res.45:706-713,1996)。これまでそのメカニズムは推測の域を出なかったが、今年度の研究でCDR3ペプチド特異的で疾患を増悪させる調節性T細胞の存在すること、この調節細胞が疾患の増悪に関与することが明らかになった。以上の結論は、CDR3ペプチド特異的T細胞の受け身移入実験によって証明された(Fazekas et al.論文準備中)。さらに、前年度樹立されたCDR3ペプチド特異的T細胞ハイブリドーマ4株のTCR配列を決定した結果、いずれも同一のTCR配列(Vベータ14陽性)を共有することがわかり、この調節細胞集団はin vivoでclonal expansionを起こしている可能性が示唆された。この推測の正しさは、singlestrand conformation polymorphism(SSCP)法による解析により確認された。すなわち、正常なSJL/JマウスのCD25陽性T細胞分画をSSCP法で調べたところ、Vベータ14陽性細胞のclonal expansionが確認され、この増殖したクローンのTCRがCDR3ペプチド特異的T細胞ハイブリドーマのTCRと同一であることがわかった。以上の結果は、疾患誘導を調節するCDR3特異的T細胞を標的にする新しい治療法の可能性を示唆した。すなわち、この細胞を不完全に刺激してTh2サイトカイン産生を誘導する、などの方法が考えられる。マウスではここまで詳細が明らかになったので、今後サルやヒトにおける調節性T細胞研究を進める必要がある。
アストロサイトのＰＭＡＴを介した新規モノアミン取り込み機構について

ニューロンに発現するモノアミントランスポーターは、シナプス間隙におけるモノアミン系神経伝達物質の濃度を調節し、神経活動の恒常性を維持する上で非常に重要な役割を持っている。事実、トランスポーターを標的とした薬剤は、精神疾患などの治療に広く用いられている。近年ニューロンだけでなく支持細胞であるアストロサイトがシナプス間隙におけるモノアミン系神経伝達物質の濃度調節に関与していることが分かってきたが、そのメカニズムは未だ不明なままであった。そのため、これらのメカニズムが明らかにすることで、更なる精神疾患の病態の解明や、新規治療標的の開発に繋がると考え、実験に着手した。まず、培養細胞を用いたin vitroの実験により、アストロサイトにおけるモノアミン取り込み能およびそのメカニズムを検討した。その結果、新規モノアミントランスポーターであるplasma membrane monoamine transporter (以下PMAT)が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。次に、生体におけるPMATの役割を明らかにするため実験を行った。まず、マウスを用い、脳部位ごとにPMATの発現量を定量PCRにより検討を行った。その結果、ほとんどの脳部位において、セロトニントランスポーターや、ノルエピネフリントランスポーターに比べ、PMATが非常に多く発現していることが明らかとなった。次に、imipramineやdecynium22といった阻害剤を投与し、マイクロダイアリシス法で細胞外モノアミン量を測定したところ、薬物投与群は対照群に加え、優位に細胞外セロトニン、ノルエピネフリン、ヒスタミン量が増加していることが明らかとなった。以上の結果から、PMATは生体においても細胞外モノアミンの除去に重要な役割を果たしていることが示唆された。これに加え、本研究ではPMAT欠損マウスの作製を行った。マウスの作製は完了したが、表現型の解析については今後の課題である。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年ニューロンの支持細胞であるアストロサイトが、シナプス間隙におけるセロトニンなどのモノアミン系神経伝達物質の濃度調節に関与していることが分かってきたが、そのメカニズムは不明なままであった。本研究では、初代培養細胞ヒトアストロサイトおよび、ヒトアストロサイトーマ由来細胞株1321N1にてモノアミンの取り込み実験を行った。その結果、新規モノアミントランスポーターであるPlasma membrane monoamine transporter (以下PMAT)がアストロサイトにおけるセロトニン、ドパミン、ノルエピネフリン、ヒスタミンの取り込みに重要な役割を果たしていることを明らかとした。次に、生体におけるPMATの重要性についてマウスを用いたin vivoの系で明らかにしたいと考えた。そこでまず、これまで明確にされていなかったマウスPmatの輸送能の評価を行い、既報のヒトPMATの輸送能と比較検討を行った。その結果、マウスPmatはヒトPMATと同様に高いモノアミン輸送能を持ち、イミプラミンやdecynium22により阻害されることが明らかとなった。次に、セロトニントランスポーターなどの基質選択性が高いモノアミントランスポーターと、PMATの発現をマウスの各脳部位において、定量PCR法を用いて比較した。その結果、ほとんどすべての脳の部位においてPMATが基質選択性の高いトランスポーターに比べ、非常に多く発現していることが明らかになった。最後に、イミプラミンをマウスに投与し、マイクロダイアリシス法を用いて細胞外液中のモノアミン量を測定すると、control群に比べ、薬物投与群において細胞外のモノアミン量が上昇する事が確認された。培養細胞を用いたin vitroの実験系において、アストロサイトにおけるモノアミン取り込みにPMATが重要な役割を果たしていることを十分に示す事が出来た。次に、マウスPmatが高いモノアミン輸送能を持つ事および、脳内で広範囲に非常に多く発現していることが明らかとなった。

これに加え、阻害剤とマイクロダイアリシス法を用いる事で細胞外モノアミンクリアランスにおけるPMATの重要性を示すデータも得る事が出来た。現在本研究では、PMATノックアウトマウスを作製しており、P1へテロマウスを得ている。27年度が最終年度であるため、記入しない。PMATノックアウトマウスを作成中であり、現在P1ヘテロマウスを得た。今後交配を重ね、必要数が確保され次第表現型の解析を行う予定である。具体的には、PMAT欠損により、ノックアウトマウスでは、脳内モノアミン量が上昇することが予想される。それを脳ホモジネートサンプルおよびマイクロダイアリシス法により検討する。次に、脳内モノアミン量の上昇から、モノアミン神経系の活動亢進を介した表現型の変化が予想される。そのため、行動薬理学的手法によりその表現型の解析を行う。これにより、モノアミンクリアランスにおけるPMATの重要性をより詳細に明らかにすることで、精神疾患に対して新たな視点や新規治療ターゲットとしての可能性を提供したいと考えている。さらにこのPMATノックアウトマウスは、PMAT遺伝子内にloxP siteを有しており、アストロサイト特異的にCre-recombinaseが発現するGFAP-creと交配させる事で、アストロサイト特異的にPMATを欠損させることが可能である。将来的にはこちらも同様に解析することでアストロサイト発現するPMATの重要性をより明らかにしたいと考えている。