hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炎症性腸疾患の基盤的免疫学から臨床免疫内視鏡学の創成

我々はCD4+CD45RBhigh移入腸炎モデルを用いてRORgt+T細胞を介した新たなTh1(alternative Th1)への分化経路を明らかにした。このalternative Th1が腸炎惹起性を有し制御性T細胞はこの分化経路を抑制した。さらにClostridium butyricumがマウス腸炎モデルにおいて単菌で腸炎抑制効果を発揮することを見出し、その機序が制御性T細胞からではなく腸管マクロファージからのIL-10産生誘導によるものであることを示した。これらの結果は腸炎発症機序に新たな知見を与え、C. butyricumのプロバイオティクスとしての可能性を示唆するものである。natural occurring Th17(nTh17)細胞と腸炎惹起性のTh17細胞、In VitroでIL-6,TGF-bにより誘導されるTh17細胞、さらにIL-17Aを産生するILC17細胞の違いを明らかにしnTh17細胞についてはCD45RBhighのナイーブT細胞と共に移入を行うと腸炎を抑制する能力があることを発見した。驚くべきことにnTh17細胞はその細胞自身がTregとなっているのではなく、腸管にホーミングしたのちにNaive T細胞をTregに誘導することがわかり、現在現象のみしかとらえられていないが、今後そのメカニズムの解析が必要である。本研究はTh17細胞のPhenotypeを詳細に分析したとして2012年Gastroenterologyに掲載され、その後2013年Annual review of pathology, Nature immunologyなどで引用される論文となっている。2011年のGastroenterology掲載後、命題となっている、腸炎にはどのタイプの細胞は必要であるかについては、現在Th17を経由するAlternative PathwayおよびTh17細胞を経由しないClassical Pathwayのどちらが腸炎に必要な因子であるのかについて詳細な解析を行っており、論文投稿を予定している。さらに小腸にホーミングするTh17細胞と大腸にホーミングを行うTh17細胞には違いがあるが、詳細な解析は行われず、今後の検討となる。本研究成果は我々が独自に展開している腸炎惹起性Th1, Th17細胞の発生、分化、可塑性プロジェクトの一部でるが、慢性大腸炎発生過程でTh17→alternative Th1細胞の発見は、世界で複数のグループから報告があったが、我々の成果は、in vivoで完結して実証したものであり、Gastroenterology誌editorialに5ページにわたって紹介され注目を集め、高く自己評価するものである。さらに、Th17細胞に関して、病的細胞が防御細胞かの論争の中で、Th17細胞には2種類存在し、それぞれ異なった経路で発達するものであることを示した成果は論文受理後、高く評価されるものと確信している。Th17細胞の腸炎への関与を今後も検討していく。現在Th17を経由するAlternative PathwayおよびTh17細胞を経由しないClassical Pathwayのどちらが腸炎に必要な因子であるのかについて詳細な解析を行っている。Th17細胞の存在しないRORgtKOマウスのNaive T細胞をTh1細胞ににIn Vitroで分化させ免疫不全マウスに移入をすると腸炎を発症する。どのようなメカニズムで発症するのかについて検討をおこない論文投稿を予定している。試薬等の消耗品に80万円、実験器具等の修理に間接費24円を使用予定。また、H24年度の未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入に充てる予定である。
学校との連携による生徒の生活習慣病予防教育プログラムの開発

学校と地域の連携による生徒の生活習慣病予防教育プログラムとして、(1)血液検査、生活習慣質問紙調査、(2)血圧測定実習、(3)生活習慣病予防教育授業を実践した。その結果、生徒自身の健康に対する興味関心を引き出し、生活習慣病を自らの課題として捉えて、健康意識の変化と健康行動の変容をもたらし、適切な生活習慣の確立へと導く可能性が示唆された。また、血液検査結果から過体重とインスリン抵抗性の関連が明らかになり、特に過体重者ではインスリン抵抗性に注意する必要があることが示唆された。新たな生活習慣病予防教育プログラムを開発することを目的として(1)血液検査の結果から自分の健康実態を認識して関心を持たせる教育に加えて、(2)生徒相互での血圧測定実習を通してさらに自分の健康に対する興味関心を引き出し、生活習慣病を自らの課題として捉えさせて、(3)健康意識の変化と健康行動の変容をもたらして適切な生活習慣の確立へと導くことおよび(4)その健康意識の変化と健康行動の変容について追跡調査を行って評価する研究を計画した。本研究では、(1)血液検査の結果から自分の健康実態を認識して関心を持たせる教育に加えて、(2)児童生徒相互での血圧測定実習を通してさらに自分の健康に対する興味関心を引き出し、生活習慣病を自らの課題として捉えさせて、(3)健康意識の変化と健康行動の変容をもたらして適切な生活習慣の確立へと導くことおよび(4)その健康意識の変化と健康行動の変容について追跡調査を行って評価をするという新たな生活習慣病予防教育プログラムを開発することを目的として研究を実施した。本年度は、(1)児童生徒の血液検査および身体計測、日常生活習慣等質問紙調査による健康実態の基礎データの収集、(2)血圧測定の授業、(3)生活習慣病予防に関する意識調査および授業を行った。児童生徒の身長、体重、ウエスト周囲径を測定し、血液検査結果との関連について検討した結果、児童生徒の体格と空腹時インスリン、HOMA-R等との関連がみられ、小児においてもインスリン抵抗性を検討する必要があることが示唆された。血圧測定と生活習慣病予防の授業後のアンケートでは、「血圧測定の結果や生活習慣病予防の話を聞いて興味・関心を持った」小学生76.7%、中学生54.1%、「これからの生活で気をつけようと思うことがある」小学生93.3%、中学生76.7%であり、食生活、運動、生活リズム等に関する具体的な改善点・自己目標を記述していた。これらの結果から、今回の血圧測定実習とその実習を踏まえた生活習慣病予防に関する授業を行う生活習慣病予防教育プログラムは、自分の健康に興味・関心を持ち、自らの生活習慣を見直し、その改善策を自分自身で見出すことができだと考える。今後は児童生徒の健康実態のデータと生活習慣との関連について解析検討するとともに、健康意識の変化と健康行動の変容について追跡調査を行い、適切な生活習慣の確立に向けての継続的な支援活動のあり方について調査検討する予定である。本研究では,(1)血液検査の結果から自分の健康実態を認識して関心を持たせる教育に加えて,(2)生徒相互での血圧測定実習を通してさらに自分の健康に対する興味関心を引き出し,生活習慣病を自らの課題として捉えさせて,(3)健康意識の変化と健康行動の変容をもたらして適切な生活習慣の確立へと導くことおよび(4)その健康意識の変化と健康行動の変容について追跡調査を行って評価をするという新たな生活習慣病予防教育プログラムを開発することを目的として研究を実施している。本年度は,(1)平成18年度に実施した児童生徒の健康実態のデータと生活習慣との関連について解析検討し,(2)平成18年度に中学校2年生であった生徒の健康意識と健康行動についての追跡調査,(3)運動負荷前後の血圧、脈拍測定実習をとり入れた生活習慣病予防のための授業を行った。小学生の肥満児は適正体重児に比べて中性脂肪がやや高値で,HDLコレステロールがやや低値であったが有意差はみられなかった。しかし、中学生では有意差が認められ,小中学生ともに肥満者では「早食い」「満腹するまで食べる」という食事摂取傾向がみられた。また,中学生に実施した安静時及び運動負荷後の血圧、脈拍測定と生活習慣病予防の授業後のアンケートでは,「血圧測定の結果や生活習慣病予防の話を聞いて興味、関心を持った」66.4%(昨年は54.1%),「これからの生活で気をつけようと思うことがある」93.4%(同76.7%)であった。これらの結果から,安静時に加えて運動負荷後の血圧、脈拍測定実習とその実習を踏まえた生活習慣病予防に関する授業を行う生活習慣病予防教育プログラムは,より自分の健康に興味、関心を持ち,自らの生活習慣を見直し,その改善策を自分自身で見出すことができると考える。今後は生徒の健康意識と健康行動の追跡調査データの解析を行い,適切な生活習慣の確立に向けての継続的な支援活動のあり方について調査検討する予定である。

本研究では、(1)血液検査の結果から自分の健康実態を認識して関心を持たせる教育に加えて、(2)生徒相互での血圧測定実習を通してさらに自分の健康に対する興味関心を引き出し、生活習慣病を自らの課題として捉えさせて、(3)健康意識の変化と健康行動の変容をもたらして適切な生活習慣の確立へと導くことおよび(4)その健康意識の変化と健康行動の変容について追跡調査を行って評価をするという新たな生活習慣病予防教育プログラムを開発することを目的として研究を実施している。本年度は、昨年度までの研究成果を踏まえ、生活習慣病予防教育プログラムをさらに改善し、単に生徒自身の安静時および運動後の血圧・脈拍測定からの気づきだけではなく、グループの仲間同士のディスカッションの時間を設けたり、それをクラス全体に発表して「学びを共有」した。その結果、安静時及び運動負荷後の血圧・脈拍測定と生活習慣病予防の授業後のアンケートでは、「自分の血圧値に興味・関心を持った」97.7%(H.19年度92.8%、H.18年度84.3%)、「血圧測定の結果や生活習慣病予防の話を聞いて興味・関心を持った」71.6%(H.19年度66.4%、H.18年度54.1%)、「これからの生活で気をつけようと思うことがある」91.2%(H.19年度93.4%、H.18年度76.7%)であり、より生徒が自分自身の健康に興味・関心を持ち、自らの生活習慣を見直し、その改善策を自分自身で見出すことにつながったと考える。今後は生徒の血液検査、健康意識と健康行動の調査、生活習慣病予防教育等を行い、適切な生活習慣の確立に向けての継続的な支援活動のあり方についてさらに検討する予定である。平成21年度は、児童生徒の血液検査等を実施して生活習慣と血液検査結果等との関連について再検討した。さらに、生徒が自分の健康に興味・関心を持ち、自らの生活習慣を見直し、その改善策を自分自身で見出して行動変容につながるように生活習慣病予防教育プログラムを改善し、適切な生活習慣の確立に向けての継続的な支援活動のあり方について検討した。その結果、血液検査等については、児童生徒の体格とインスリン抵抗性の関連が明らかになった。過体重群では、心血管危険因子のリスク数が有意に増加し、インスリン、HOMA-IRは有意に高値になったが血糖、HbA1cは体格による差はみられなかった。収縮期血圧・拡張期血圧、中性脂肪、尿酸は、過体重群で有意に高値になり、HDLコレステロールは過体重群で有意に低値になった。小児期では体格により血糖やHbA1cの変化はみられないが、過体重者ではインスリン、HOMA-IRが有意に高値になっており、インスリン抵抗性に注意する必要があることが示唆された。さらに、生徒に対する生活習慣病予防教育プログラムを運動前後の血圧・脈拍測定実習に加えて、体温測定と生徒同士の意見交換も加えて実施した結果、授業後のアンケートでは「自分の血圧値に興味・関心を持った」95.3%、「自分の体温に興味・関心を持った」91.9%、「血圧測定等の結果説明や生活習慣病予防の話を聞いてわかったこと、気づいたこと、興味・関心を持ったことがある」70.6%、「これからの生活で気をつけようと思うことがある」85.1%で食生活、運動、睡眠、休養等に関する具体的な改善策を記述していた。
非接触型応力測定システムを利用した補綴関連分野の応力測定

当教室の非接触型応力測定システムに、今回の科学研究費によって導入されたデ-タ処理プログラムが加わったことにより一連の解析システムの精度が向上し、計測結果の表示方法も向上することができ、デ-タ処理のスピ-ド化と共に得られたデ-タの解析も詳細に検討することが可能となった。測定試料として選んだものは、基礎実験として、CoーCr製合金板縦50mm、横30mm、厚さ0.6mm質量8.4gを使用した。また、パ-シャルデンチャ-の構成要素の1つであるリンガルバ-の形態を、実際に臨床で使用されている3種類を想定し、その形態差が応力分布に与える影響を検討した。更に、補綴装置を受け入れる側として、従来その形状の複雑さから、応力解析が困難とされていた顔面頭蓋の下顎骨の表面応力の測定を試み、以下のような結果を得た。1新規導入したデ-タ処理ソフトプログラムは応力分布の表示、読み取り、解析やデ-タの保存に有用であった。等高点表示は、応力分布のエリア的読み取りに、ラインプロットは任意の2点間の応力値を連続的に知る上で、マウンテンプロットは発生している応力の部位、大きさ、位相差を立体的に観察する上で、各々有用であった。2今回の測定試料で、金属材料のような均一な等方性材料は応力分布も複雑ではなく、荷重点直下、試料固定部等に半波紋状の等比的応力集中が観察された。それに対して、下顎骨のような形状、構造の複雑なものは、荷重点直下で応力は急激に減少するものの、その後下顎下縁、下顎枝後縁等骨の形態的には隅角部や、くびれている部分に同位相の応力集中が見られた。非接触型応力解析システムによって、被験体の応力解析を行い、今回導入したデ-タ処理ソフトプログラムを解析システムに加えることによって、計測デ-タの立体的表示をカラ-CRT上に映像し、詳細な計測結果を得る。さらに三次元解析結果を表示する事によってモ-ダル解析との比較が容易に行える様になり、本年度はイ)パ-シャルデンチャ-の各構成要素の応力解析実験ロ)各欠損症例における義歯の応力解析実験、の実験計画を立て、その実行を精力的に行ってきたが、被験体の固定方法、測定方向を角度および形状などが実験値に与える影響が、当初の我々の予想を上回った。そこでデ-タの信頼性を獲得するためにも、まず形状が簡単な被験体で各条件における実験デ-タの比較検討が重要と考え、通常パ-シャルデンチャ-の連結装置に使用されているCoーCr合金板30×50mmを用い実験を行ったところ以下の様な結果を得た。1.片持ちの梁状の運動の支点には応力の集中があり、またアニメ-ションで観察されるうねりの変曲点では変位量が大きく応力値が小さいことがモ-ダル解析および応力解析によって観察された。2.応力の発生機構は、被験体の材質、形状、加振方向によりいくつかの固有振動数を有すると思われるが、それは必ずしもモ-ダル解析から得られる固有振動数と一致せず応力パタ-ンが観察される振動数はその内の一部の低い振動数である。今年度は、パ-シャルデンチャ-の構成要素の1つであるリンガルバ-の形態を、実際の臨床で使用されている3種類を想定し、その形態差が応力分布に与える影響を検討した。

更に、従来その形状の複雑さから、応力解析が困難とされていた顔面頭蓋の下顎骨の表面応力の測定を試み、今後いくつかの考慮すべき点はあるものの、以下のような結果を得た。1パ-シャルデンチャ-構成要素の応力解析パ-シャルデンチャ-構成要素のなかでも、連結装置は義歯安定に関与し、咀嚼機能向上のために重要である。下顎リンガルバ-の形状の違いが応力分布に与える影響を調査したところ、半円形、洋梨上などと比較してプレ-トタイプはその形状から等比的に現れ、バ-全体に応力が現れていた。2下顎骨の応力解析本実験システムで下顎骨の応力解析を行うには、その形状が複雑なことから、固定方法、加振条件など更に検討する必要性を認識するが、オトガイ隆起部に加振された衝撃は等比的応力分布を示し、距離減衰の様相を示していると考えられた。これは熊沢らの頭蓋におけるハンマ加振による衝撃減衰減向の測定結果とも一致した。
細胞内情報経路を標的としたハイスループット型リン酸化タンパク質分離材料の創製

リン酸化タンパク質を高速かつ選択的に精製するまでの研究プロセスとして、第1にリン酸化アミノ酸の分離、精製を行い、第2にリン酸化タンパク質を酵素で切ることによりリン酸化ペプチドとし、これらの分離段階での選択性を調査することで従来の精製剤よりも高精製な新規リン酸化タンパク質の調製を目指す。タンパク質を構成する20種類のアミノ酸のうちチロシン(Tyr)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)残基のみへのリン酸基の付加によって起きる。本研究ではモデルリン酸化アミノ酸としてリン酸化チロシンを使用した。多孔性中空糸型グラフト重合膜を用いて、Zr(IV)-リン酸複合体の構造調査およびZr(IV)-リン酸複合体に対するリン酸化チロシンの吸着性の調査を行った。また、多孔性中空糸型グラフト重合膜の官能基を簡便に変えることができる利点を用いて、官能基および金属をリン酸基とZr(IV)以外のものを使用し組み合わせをそれぞれ変えることで、リン酸化タンパク質の精製材料としてどの組み合わせのものが適しているかをリン酸化チロシンの吸着性能を調査することで評価した。NMG-Ga膜およびAHP-Ga膜についてはどの膜よりも高いリン酸化チロシンの吸着量を得ることができたため、Gaの固定化量を増やすことでより、リン酸化チロシンに対する高吸着能を期待できる。また、IDA-Zr膜について、金属1つあたりに対するリン酸化チロシンの吸着量が上がっていたため、Zr量を増やすことでリン酸化チロシンのより高い吸着性が期待されることが分かった。リン酸基と相互作用の強いZr(IV)イオンに着目し、W/O/W型界面鋳型重合法を用いて、樹脂孔表面にZr(IV)を固定させた新規金属固定化アフィニティークロマトグラフィー(Zr-Phos IMAC)を調製し、リン酸化タンパク質分離性能評価を行った。電気泳動法を用いたモデルタンパク質(BSA及びβ-Casein)の検出法では、従来のIMACよりもリン酸化タンパク質分離能が高いことが確認された。マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI-TOF/MS)を用いたモデルタンパク質の分離評価では、従来のIMACよりも非リン酸化ペプチドの検出を軽減させ、リン酸化ペプチドの検出感度を向上させることに成功した。今後は、モデルタンパク質以外のリン酸基の数および配置の異なるリン酸化タンパク質を、特異的に認識するように、樹脂内の表面構造および孔径を制御した樹脂を充填したカラムにおいて、試料添加条件、カラムの洗浄条件、リン酸化タンパク質の溶離条件等の最適化を検討する必要がある。
認知粒度からみた自閉症とコミュニケーション：脳が他者を理解するメカニズムを探る

本研究は,「認知粒度」の観点から,自閉症・コミュニケーション・言語や文化の成り立ちについて,統一的なモデル化を試みるものである。この目的のため,平成30年度では,ボンド大学(オーストラリア),岐阜大学,金沢大学,京都大学,情報通信研究機構などの研究者との定期・非定期的な意見交換をとおして,認知粒度に関する議論を整理・精緻化し,その成果を国際会議や書籍執筆をとおして発表した。具体的には,いままで認知粒度として一括していた概念を,知覚レベル(たとえば色彩や物体認識など)における粒度,言語レベル(基本語彙など)における粒度,そして他者理解レベル(いわゆる心の理論による行動予測など)における粒度という3つのレイヤーに分類して議論することで,それぞれのレイヤーにおいて操作可能な概念が見出され,具体的な心理実験に落とし込むことが可能になることを明らかにした。また,医学・生物学系の研究者との意見交換から,神経系の初期発生において,神経幹細胞の対象分裂による増殖フェーズから非対称分裂によるニューロン生成(同じ母細胞から分裂した娘細胞群がカラム構造を作り出すと考えられる)への切り替え時期の制御機構が,この変異を与えることが示唆された。以上の取り組みから,物理的・社会的環境を知覚・認識するための諸カテゴリの粒度の差異と,加えてミニカラム発生における密度の差異を,自閉症と定型発達を区別する差異(正確には,粒度という次元上に,自閉症や定型発達だけでなく,ウイリアムズ症候群を含めたさまざまな認知スタイルを射影したもの)とを関連づけ,新しい自閉症像として提案することができた。その最終的な成果をまとめた書籍「〈自閉症学〉のすすめ」は,この新しい自閉症像から始まる新しい学問領域を示唆するものとなった。本研究は,自閉症・コミュニケーション・言語や文化の成り立ちを「認知粒度」の観点から統一的なモデル化を試みるものである.この目標のため,平成27年度では,皮質にみられるミニカラム構造の解剖学的な粒度について文献調査等を進め,また,概念やカテゴリの分節化プロセスや自閉症者の認知スタイル(知覚・理解における特徴)との対応づけについてサーベイと理論的な考察を深めた.学会等においてその中間成果を報告し,当該分野の研究者との意見交換を行った.これと並行して,定型発達者・自閉症者を対象とした認知粒度に関する心理実験の準備として,情報提示デバイス(ロボット等)の準備を進めた.ミニカラムに関する考察では,自閉症者がミクロ(微視)的な認知スタイルをもつことの理由として,Casanovaらの報告するミニカラム数が多いことよりも,むしろ各ミニカラムの出力細胞が小さいためにミニカラム間の水平接続が短くなる傾向をもつことが重要であると考えた.概念学習する人工ニューラルネットにおけるユニット間の接続距離を制限した場合に,学習される概念(カテゴリ)の大きさがどのように変化するのかを調べることができる.このような見通しを立て,コンピュータシミュレーション等の準備を進めた.これら理論面の考察と並行して,心理実験の準備として,認知粒度の異なるロボット動作やアニメーション動作を生成するための技術的な準備を進めた.マクロ的(志向的)あるいはミクロ的(因果的)に予測・理解できるようなロボット動作や図形の動きについて検討し,それを生成するプログラムの試作等を行った.本研究は4年の研究期間を想定している.27年度は,ミニカラムと自閉症の関係を中心としたサーベイ研究を行った,28年度は,ミニカラムにおける情報表現について検討を進め,29年度は,情報表現モデルに基づく心理実験および「認知粒度モデル」の精緻化を行う.そして30年度は,この「認知粒度モデル」を,他者の心を想像する能力とその由来や,言語・文化の成り立ちまで含めた統一的なモデルに拡張する.初年度である27年度は,ミニカラムと認知スタイルの関係について網羅的なサーベイを行い,概念やカテゴリの分節化プロセスについて,また自閉症者の認知スタイルとの連関について検討することができた.加えて,日本発達心理学会,日本特殊教育学会,人間・環境学会等において,本研究の予備的な成果を報告することができ,関連する研究者との議論をとおして,本研究のもつ可能性・射程を見通すことができ,有意義であった.また,ミニカラムによる情報表現について,さまざまな知見を集めることができ,28年度以降の研究をスムーズに推進するための準備が整った.本研究は,自閉症・コミュニケーション・言語や文化の成り立ちについて,「認知粒度」の観点から統一的なモデル化を試みるものである。この目標に向けて,平成28年度では,この認知粒度とコミュニケーション発達の関係を,発達心理学および認知科学的な側面から考察し,その成果を学会等で発表し,関連する研究者との議論を深めることができた。発達的な側面からは,他者に対する意図スタンス,すなわち観察可能な身体動作や発語などを何らかの意図の表出であるとして解釈しようとする姿勢が,どのような生得的制約のもとで,どのような環境とのインタラクションを通して形成されていくのかを考察した。他者との身体的・情動的な「つながり」が先にあり,やりとりの中で生じる効果(これを「意味」と呼ぶ)が内部表象化されることで,他者の行為から意図(他者は何を予測=期待してその行為を行ったのか)を読み取れるようになると考えた。予測や期待については統計的学習理論によって十分にモデル化できそうだが,他者がどのような予測や期待をしているのかを,間主観的に捉えるプロセスについては,まだ十分なモデル化ができておらず,より深い考察や心理実験が必要であることが明らかになった。

認知科学(認知ロボティクス)的な側面からは,実際の子どもの観察(保育園や自閉症療育施設での長期縦断的観察)や実験をレビューし,また関連研究者による観察(その多くは横断的な研究)や実験との比較などを進めた。とくにフランス側の研究パートナーとの協働から,言語的な能力にあまり依存しない「心の理論」課題の実験方法について議論を深める機会があり,これまで以上により若い月齢での認知発達を実験的に調査する道が拓けつつある。初期発達における意図的スタンスの萌芽について,同じ枠組みで実験できる可能性があり,その方法論的な精緻化を進めた。本研究は4年の研究期間を想定し,28年度はその2年目にあたる。当初,28年度には,フランス側あるいはアメリカ側の研究パートナーを訪問し,実際的な議論や共同実験の準備を行う予定であったが,フランス側から(日本での国際心理学会大会に合わせて)来日していただく機会があり,日本で議論(とくに言語に依存しない「心の理論」課題の実験方法についての議論)を深めることができた。このため渡航しての協働は実施していないが,それを十分にカバーする有意義な成果を得ることができた。また,国際心理学会だけでなく,日本発達心理学会や認知科学会などの国内有力学会で中間成果を発表することができ,関連する研究者との密な議論をもつことができた。とくに臨床発達に関わる研究者と広く交流する機会が得られ,観察フィールドの拡張や心理実験の実施などに,より現実的な協力が得られる見通しを持てたのは,予想外のよい収穫であった。これらの進捗状況から,本研究はほぼ予定どおりの進度で,おおむね順調に進展していると言える。本研究は,なぜ自閉症者が他者の心(意図など)を理解できないのか,そして定型発達者はなぜコミュニケーションできるのかについて,「認知粒度」という観点から検討を深め,自閉症・コミュニケーション・言語や文化の成り立ちについて,統一的なモデル化を試みるものである。この目標に向けて,平成29年度では,国内外の研究者との密な意見交換をとおして,認知粒度による認識とコミュニケーションのモデルの精緻化を進めた。具体的には,認知粒度に関心をもつ研究者からなる研究会を立ち上げ,合宿形式を含めたディスカッションの場を複数回開催した。この研究交流から,これまで十分に検討できなかった,知覚レベルの粒度についてのモデル検討や,抽象度の異なる行動理解を調べる実験計画・予備実験へと進めることができ,また,ロボットを使った療育手法の提案に結びつく「外観と行為の粒度」への操作的介入というアイデアを得ることができた。とくに後者は,行為の粒度を,物理的身体動作から目的的行為までを特徴づける抽象度次元として捉えることで,認知粒度を実証的に扱う見通しが立った。加えて,認知粒度の生物学的マーカを探索するという取り組みへの示唆を得て,神経系の発達(大脳皮質の発生・分化のプロセス)についての検討も深めた。大脳皮質の層構造の発生についてはさまざまな知見が得られているが,本研究の注目するミニカラム構造の発生については,ほとんど研究がなされていない。今後,医学・生理学系研究とのコラボレーションする必要性が強く示唆された。本研究は4年間の期間を想定し,平成29年度はその3年目にあたる。
骨形成の調節機構における脂肪細胞の役割と老人性骨粗鬆症におけるその異常の解明

1.インターロイキン11(IL-11)による骨髄脂肪細胞と骨芽細胞の分化振り分け機序の解明(1)IL-11の骨髄脂肪細胞と骨芽細胞の分化振り分けへの関与を検討するために、脂肪細胞転写因子PPARγおよび骨芽細胞分化に必須の転写因子Smad1の活性化におけるIL-11の役割について、脂肪細胞と骨芽細胞の両者に分化誘導できる株化骨髄間質細胞ST2を用いて検討を行った。IL-11はPPARγ依存性転写活性を抑制し、Smad1依存牲転写活性を促進した。(2)IL-11の役割をin vivoで明らかにするために、ヒトIL-11トランスジェニックマウスの骨・骨髄組織、骨形態計測をコントロールマウスと比較倹討した。10週齢IL-11トランスジェニックマウスでは骨格系には変形や異常を認めなかったが、その大腿骨の骨密度は対照に比して高値であり、皮質骨の肥厚が観察された。骨形態計測では骨形成の亢進が認められた。(3)卵巣摘除により著明に骨量が減少するが、IL-11トランスジェニックマウスにおいても卵巣摘除後4週間でSham手術群に比べて有意な骨量の減少を認めた。しかし、卵巣摘除マウス同士の比較では、対照群に比べてトランスジェニックマウスにおいて骨形成の亢進と骨量の高値を認めた。この成績は、IL-11の骨に対する作用は卵巣機能とは無関係であり、卵巣機能不全状態においてもIL-11が骨形成を促進し、骨量を増加させることを示すものである。2.脂肪細胞と骨芽細胞の分化振り分けにおける転写因子PPARγの役割の解明PPARγの転写活性化能が骨芽細胞におよぼす影響を、PPARγのドミナントネガテイブ体を細胞に発現させて検討した。ST2細胞を用いて、PPARγ(P467L)変異体を恒常的に発現する細胞を複数選択し実験した。これらの細胞は、脂肪細胞への分化のみならず骨芽細胞への分化も抑制されていることが明らかとなり、PPARγが脂肪細胞への分化のみならず骨芽細胞への分化にも密接に関連することが示唆された。インターロイキン11(IL-11)による骨髄脂肪細胞と骨芽細胞の分化振り分け機序の解明(i)IL-11の骨髄脂肪細胞と骨芽細胞の分化振り分けへの関与を検討するために、脂肪細胞分化誘導転写因子PPAR_γおよび骨芽細胞分化に必須の転写因子Smad1の活性化におけるIL-11の役割について、脂肪細胞と骨芽細胞の両者に分化誘導できる株化骨髄間質細胞ST2を用いて検討を行った。PPARγ反応性領域(PPRE-luc)とSmad1反応性領域(BMPRE-luc)をそれぞれ含むルシフェラーゼレポータ遺伝子をST2細胞に導入し、これらの遺伝子の転写活性に対するIL-11の作用をルシフェラーゼ活性を指標に検討したところ、IL-11はtroglitazoneで誘導されるPPRE-lucの活性を抑制し、BMP-2で刺激されるBMPRE-lucの活性をさらに促進した。IL-11で活性化される転写因子STAT3およびそのdominant negative変異体を発現させると、BMPRE-lucに対するIL-11の促進作用は抑制された。(ii)IL

-11の役割をin vivoでも明らかにするために、Mxプロモータの下流に組み込まれたヒトIL-11遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨・骨髄組織、骨形態計測をコントロールマウスと比較検討した。このトランスジェニックマウスでは、各臓器でヒトIL-11遺伝子の発現が認められ、特に骨および骨髄での過剰発現が確認された。一方、骨髄培養液中のヒトIL-11は10pM程度であったが、血中のヒトIL-11レベルは測定感度以下であり、このマウスにおけるヒトIL-11の骨に対する作用は骨での局所作用であると考えられた。10週齢IL-11トラシスジェニックマウスでは骨格系には変形や異常を認めなかったが、その大腿骨の骨密度は対照に比して高値であり、皮質骨の肥厚が観察された。骨形態計測ではトランスジェニックマウスにおける骨形成の亢進が認められた。1.インターロイキン11(IL-11)による骨代謝調節機序の解明前年度に引き続きヒトIL-11遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスを用い、IL-11の骨代謝と骨髄脂肪に対する役割をin vivoにおいて検討した。マウスでは卵巣摘除により4週間で著明に骨量が減少するが、IL-11トランスジェニックマウスにおいても卵巣摘除後4週間でSham手術群に比べて有意な骨量の減少を認めた。しかしながら、卵巣摘除マウス同士の比較では、対照群に比べてトランスジェニックマウスにおいて骨形成の亢進と骨量の高値を認めた。この成績は、IL-11の骨に対する作用は卵巣機能とは無関係であり、卵巣機能不全状態においてもIL-11が骨形成を促進し、骨量を増加させることを示すものである。2.脂肪細胞と骨芽細胞の分化振り分けにおける転写因子PPARγの役割の解明IL-11がPPARγの転写活性化を抑制することを既に明らかにしている。PPARγの転写活性化能が骨芽細胞の分化・形成におよぼす影響を、PPARγのドミナントネガティブ体を細胞に導入することにより検討した。脂肪細胞と骨芽細胞の両者に分化し得るST2細胞を用いて、ヒトで報告されているPPARγ(P467L)変異体を恒常的に発現する細胞を複数選択し実験に供した。これらの細胞はいずれも、脂肪細胞への分化のみならず骨芽細胞への分化も抑制されていることが明らかとなった。この成績は、PPARγが脂肪細胞への分化のみならず骨芽細胞への分化にも密接に関連することを示唆するものである。
包括的アプローチを用いたグリシドール関連物質の新規リスク評価

食塩を添加した畜肉やアシルグリセロール類を用いたモデル系を用いて、グリシドール関連物質の生成に影響を与える要因や成分について調査した結果、食塩の添加により、食肉中で3-MCPD脂肪酸エステルの生成量の増加が確認した。アシルグリセロールを用いたモデル系において、3-MCPD脂肪酸エステルの生成にはCl及びFeの存在が影響することが示唆された。グリシドール関連物質の遺伝毒性を評価するためにFpg修飾コメットアッセイを用いてDNA損傷性を評価したところ、グリシドール及びオレイン酸グリシジルの投与により、肝臓、腎臓及び血液において有意なDNA損傷性が確認できた。Fpg修飾コメットアッセイにおいては、通常のコメットアッセイで検出できなかったDNA損傷性も高感度に検出することができたことから、グリシドール及びオレイン酸グリシジルのDNA損傷は、DNA付加体の形成や酸化的損傷に起因することが示唆された。グリシドールのヘモグロビン付加体量を変動させる物質を明らかにするために、各種化学物質をICRマウスに投与した。その結果、グリシドール及びオレイン酸グリシジルの投与により、濃度依存的な付加体生成が確認できた。しかし、関連物質として用いた3-MCPD、エピクロロヒドリン、プロピレンオキシド、1-ブロモプロパン、アリルアルコールの投与では付加体量は変動しなかった。したがって、付加体はグリシドール及びグリシドール脂肪酸エステルの暴露指標として、有用であることが確認できた。次に、食事由来のグリシドール脂肪酸エステルが付加体量を変動させるか検討した。300&micro;gのグリシドール脂肪酸エステルを含む炭火豚焼肉を5日間摂取させたところ、ヒト血中付加体量に変動はみられなかった。したがって、食用油や炭火焼肉以外のグリシドール脂肪酸エステルの摂取源の存在が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに我々は、グリシドール脂肪酸エステルを中心としたグリシドール関連物質に関して、その食品における摂取暴露源の探索から実験動物を用いた毒性評価についての研究を遂行してきた。本年度の研究では、これらの知見をヒトでのリスク評価に用いるために、生体内指標による個体間での摂取暴露量の推定を目指した。我々はヘモグロビンN末端のバリンと結合したグリシドール及び関連物質のヘモグロビン付加体を測定することで、暴露量の推定が可能となるか評価した。初めに、野生型ICRマウスにグリシドール、グリシドール脂肪酸エステル及び関連物質である3ーモノクロロプロパンジオール、エピクロロヒドリンを投与し、血中のヘモグロビン付加体をLC-MS/MSを用いて、定量した。ここでは、フルオレセインイソチアシアネートを用いて、誘導体化処理を行うことで、高感度な測定を実現した。グリシドール及びグリシドール脂肪酸エステルを投与したマウスでは、濃度依存的にグリシドールヘモグロビン付加体の形成がみられた。その他の物質では、実験動物上での付加体検出がみられなかったが、血液との反応性をみた試験では、グリシドールに比べ、3ーモノクロロプロパンジオールから1000倍程少ない量のグリシドールヘモグロビン付加体が検出され、これら物質がグリシドールヘモグロビン付加体量に与える影響は少ないことが明らかとなった。続いて、ヒトでの生活要因がヘモグロビン付加体量に影響を及ぼすか検討するため、アルコール摂取マウス及び糖尿病モデルマウスを用いて、ヘモグロビン付加体量が変動するか試験を行った。これまでにグリシドールと同様に加熱した食品中に含まれるアクリルアミドでは、生体内の代謝要因や糖化ヘモグロビン等の生成量によって、ヘモグロビン付加体量に影響を及ぼすことが示唆されている。この年度では、ヘモグロビン付加体量の測定に関して、バリンと関連物質からのヘモグロビン付加体の合成やGC-MS/MSをLC-MS/MSに変更する等の測定法の改良による感度の上昇に努めてきた。特にLC-MS/MSを用いた測定に関しては3社の質量分析器を比較検討したことで高感度を実現し、今後の行う予定であるヒト試験での測定限界の向上につながった。実験動物を用いた試験では、グリシドールは投与濃度依存的にヘモグロビン付加体を形成し、その脂肪酸エステル体はこれまでの生体内代謝の知見を報告する論文類と比較しても類似した代謝率及び反応性を示し、その代謝量に関しての知見を補足することが出来た。3-モノクロロプロパンジオールやエピクロロヒドリンによるグリシドールヘモグロビン付加体検出への影響はみられず、これらからもグリシドールの暴露指標としての有用性が評価できた。しかし、過去の文献では血液中に背景的に検出されていたエピクロロヒドリンヘモグロビン付加体やグリセルアルデヒド付加体に関して、今回我々のいずれの関連物質を投与した試験でも検出されなかったため、GC-MS/MSからLC-MS/MSへの変更に伴う誘導体化試薬やpHの変更等の測定への影響を精査するべきである。また、ヘモグロビン付加体の検出に関わる背景的な部分として、新たな変動要因を見出すことが出来た。これまでにグリシドールを投与した試験は未だ行っていないが、アクリルアミドを投与した際のアルコール摂取モデルマウス及び糖尿病モデルマウスにおけるヘモグロビン付加体量の変動が確認できたことは、ヘモグロビン付加体に関する研究全体を推し進める重要な知見となり得ると考えられる。これら研究を進めることで、生体内での反応性化学物質の解毒機構に関わる薬物代謝酵素の発現量等を含めて、毒性研究における重要な知見となることが期待できる。

食塩を添加した畜肉やアシルグリセロール類を用いたモデル系を用いて、グリシドール関連物質の生成に影響を与える要因や成分について調査した結果、食塩の添加により、食肉中で3-MCPD脂肪酸エステルの生成量の増加が確認した。アシルグリセロールを用いたモデル系において、3-MCPD脂肪酸エステルの生成にはCl及びFeの存在が影響することが示唆された。グリシドール関連物質の遺伝毒性を評価するためにFpg修飾コメットアッセイを用いてDNA損傷性を評価したところ、グリシドール及びオレイン酸グリシジルの投与により、肝臓、腎臓及び血液において有意なDNA損傷性が確認できた。Fpg修飾コメットアッセイにおいては、通常のコメットアッセイで検出できなかったDNA損傷性も高感度に検出することができたことから、グリシドール及びオレイン酸グリシジルのDNA損傷は、DNA付加体の形成や酸化的損傷に起因することが示唆された。グリシドールのヘモグロビン付加体量を変動させる物質を明らかにするために、各種化学物質をICRマウスに投与した。その結果、グリシドール及びオレイン酸グリシジルの投与により、濃度依存的な付加体生成が確認できた。しかし、関連物質として用いた3-MCPD、エピクロロヒドリン、プロピレンオキシド、1-ブロモプロパン、アリルアルコールの投与では付加体量は変動しなかった。したがって、付加体はグリシドール及びグリシドール脂肪酸エステルの暴露指標として、有用であることが確認できた。次に、食事由来のグリシドール脂肪酸エステルが付加体量を変動させるか検討した。300&micro;gのグリシドール脂肪酸エステルを含む炭火豚焼肉を5日間摂取させたところ、ヒト血中付加体量に変動はみられなかった。したがって、食用油や炭火焼肉以外のグリシドール脂肪酸エステルの摂取源の存在が示唆された。グリシドール関連物質の食品中の含有量や実験動物での毒性情報をヒトでのリスク評価に転じるために、これまでに構築した血中グリシドールヘモグロビン測定法を用いて、これら生体内指標の有用性について、検討する必要がある。静岡県立大学倫理委員会の承認を受けた後に、健常な被験者を募り、その血中に含まれるヘモグロビン付加体量を測定することで、個人間変動及び個体内変動に関しての知見を得る。その後、食用油を使用している若しくは加熱した食肉類を摂取してもらう介入試験を実施し、これら食事由来のグリシドール関連物質が生体内指標に影響を及ぼすか検討する必要がある。高感度の測定による有意な差が得られた場合には、これら付加体量から摂取量の概算を試みる。また、ヘモグロビン付加体の暴露指標としての有用性を検討するために、単体のヘモグロビンとグリシドール関連物質等の反応性化学物質をカロリメトリー測定により反応性を評価する。結果に応じて、バリン等やその他の成分との結合性を評価し、付加体検出の可能性を探る。前述した生体内の薬物代謝酵素を変動させる食事習慣や生活習慣病状態でのヘモグロビン付加体の変動に関しても、グリシドール関連物質を含むいくつかの反応性化学物質を検討することで、ヘモグロビン付加体の有用性に関する重要な知見を明らかにする。
ヒト染色体複製開始因子ORCの染色体分配・細胞質分裂における機能メカニズムの解明

本研究ではヒト細胞を用いて、染色体分配・細胞質分裂におけるORCの機能メカニズムをORCと相互作用する因子をプロテオミクスによる手法を用いて網羅的に明らかにすることを目的とした。本研究に得られた結果の概要は以下の通りである。1)ORC1の免疫沈降産物を解析したところ、ORC2、ORC3、ORC4、ORC5が検出された。さらに、テロメア結合因子であるTRF2、Rap1、それと関連した因子とした核膜因子Sad1/Unc84が同定された。また、WD40モチーフを持ち、これまでに機能解析がなされていない蛋白質(ORCBP1)が同定された。2)TRF2に関してはmybdomainを介してORC1と直接結合していることが示唆された。また、ORCおよびTRF2のテロメア領域への局在は、各々互いの活性に依存していること、ORCの活性がテロメア長に影響を及ぼすことが明らかとなった。3)ORCBP1については、N末端領域にLeu-rich repeatを中央領域からC末端領域にかけてWD40 repeatをもつ約80kDaの蛋白質である。ORCBP1は核に局在し、免疫沈降の結果から、ORCと強固に相互作用していると考えられた。また、ORCBP1の機能阻害によりG1期の進行が遅くなっていることが推測された。これらのことから、ORCBP1はORCと相互作用することにより、複製開始複合体の形成時期において何らかの動物特有の制御に関与する可能性が示唆された。このように、ORCを起点とした蛋白質のネットワークにより、ORCや複製開始機構と他の細胞機能との連携を分子レベルで解析するさまざまな手がかりが得られた。ヒトの複製開始因子ORCのサブユニットであるORC1について免疫精製を行った。精製産物について質量分析により同定作業を行ったところ、ORCの他のサブユニットであるORC2、ORC3、ORC4、ORC5が同定された。それに加えて、テロメア領域に結合する因子が同定された。さらに、分裂酵母でテロメア結合因子との相互作用が知られている中心体蛋白質が同定された。最近、米国のB.Stillman研を中心に、ORCが中心体に存在することが示されており、染色体分配や細胞質分裂に寄与している可能性が示唆されている。本課題の成果により、複製開始因子とM期イベントを結びつける分子のつながりが明らかになったと考える。これに加えて、染色体分配に関与する蛋白質ネットワークを解明することにより、S期とM期の連携を模索できないか検討した。具体的には、動原体蛋白質であるMis12蛋白質の複合体をHeLa細胞から精製し、構成因子を同定した。その結果、動原体の外層に局在し、微小菅との結合に関与するHEC1複合体およびZwint-1がMis12と相互作用していることが明らかとなった。それに加えて、新規の動原体蛋白質を4種類同定した。さらに、Mis12はヘテロクロマチン蛋白質の構成成分であるHP1と結合していることを見いだした。これらの知見からMis12は複合体を形成し、ヘテロクロマチン構造を足場として、微小管へとつながる動原体の中心的な構造を形成していることが示唆された。また、面白いことにHP1はORCと結合すること、ORCは動原体の両脇に存在するヘテロクロマチン領域に局在していることがショウジョウバエの系で報告されている。これらのことは、ORCとHP1と動原体蛋白質との連携を検討することが、本研究課題の達成に必要不可欠であることを示唆するものでる。

本研究課題はヒト細胞を用いて、染色体複製の開始に働くにORCが、染色体分配・細胞質分裂など、他の細胞周期イベントへの関与とその機能メカニズムを、ORCと相互作用する因子をプロテオミクスによる手法を用いて網羅的に明らかにすることにより解明する。本年度は、ヒトORC1と共精製したタンパク質を質量分析で検索する過程で同定したTRF2について、詳細に解析を行った。TRF2はテロメアで機能する因子である。免疫沈降法、プルダウン方によりTRF2とORCあるいはCDC6との結合が確認された。また、ORC1が直接TRF2と結合し、主にTRF2のmybドメインに介していることが示唆された。一方、CDC6はTRF2の塩基性ドメインに結合することが示唆された。今回の結果から、TRF2はORCやCDC6の結合を促進し、Pre-RC形成を行っている可能性が考えられた。一方で、テロメア領域の複製制御あるいは構造維持に関わっている可能性も示唆された。機能的な解析は十分ではないが、ヒト正常繊維芽細胞においてshRNAの発現によりTRF2の抑制を行ったところ、S期進入の遅延が認められ、複製開始あるいは他の細胞周期イベントへの関与を示唆する結果を得ている。ORCと直接結合しヘテロクロマチン形成に重要な役割をしているHP1について、動原体タンパク質Mis12複合体との結合を昨年度見いだした。これについて、2ハイブリッド法などを用いて、詳細にその相互作用を検討したところ、Mis12複合体はHP1のクロモシャドウドメインを介して結合すること、HP1との結合がMis12複合構築に影響を及ぼすことを示唆する結果を得た。ORCはクロモドメインを介してHP1と結合すること、分裂酵母のORCは動原体に局在することが知られていることから、ORCはHP1を介してMis12と協調して染色体分配に必要な機能的な複合体形成のステップに寄与している可能性が考えられた。平成17年度までの解析により、ORCのパートナーとしてテロメア結合因子であるTRF2とRAP1、中心体、核膜蛋白と関連が示唆されているSad1、機能未知のWD40モチーフを持つ蛋白質が質量分析によるプロテオミクスで明らかとなった。平成18年度はこれらのことを踏まえて、TRF2、RAP1、Sad1、HP1、WD40蛋白質とORC複合体の相互作用とその意味について、主にRNA干渉法により解析を進めた。TRF2に関しては、国立がんセンター研究所の藤田雅俊室長との協同研究により行った。TRF2のmybドメインを介してORC1と主に相互作用していることが明らかとなった。また、ORCを中心とした複製開始複合体がテロメア領域に細胞周期依存的に形成されることが明らかとなった。さらに、RNAiによる機能阻害実験により、ORCおよびTRF2のテロメア領域への局在は、各々互いの活性に依存していること、ORCの活性がテロメア長に影響を及ぼすことが明らかとなった。WD40蛋白質に関しては、タグを付加したORC1からの免疫沈降、ORC1特異抗体を用いた免疫沈降の両方から同定された。この蛋白質についてRNAiによる機能阻害を行ったところ、G1期が通常細胞の1.5倍ほどに増長することが明らかとなった。このことは、この因子がG1期におけるORCの機能を触媒していることを示唆するものであり、複製複合体の形成、細胞周期進行とのリンクが想定された。HP1に関しては、HP1側から網羅的に相互作用因子の検索を行ったが、有為な結合因子としてORCは同定されなかった。
面心立方遷移金属中の軽元素不純物と水素の相互作用

金属中の水素の固溶度や拡散挙動は不純物原子の存在により影響を受ける。ニッケル中の金属不純物が水素をトラップすることが種々の実験により明らかになっているが、炭素も水素をトラップして複合体を形成することを示唆する実験結果が報告されている。本研究ではニッケル中における炭素と水素の相互作用を明らかにすることを目的として、内部摩擦と磁気余効の実験をおこなった。まず、Ni-C-H希薄合金について周波数約1Hzの内部摩擦を測定した。161K付近に、以前報告されている磁気余効のピークに対する緩和型の内部摩擦ピークが見出された。新たにおこなった磁気余効の測定とあわせて緩和の活性化パラメーターを解析し、活性化エネルギーは0.34±2.02eV,頻度因子は1×10^<12>s^<-2>と求められた。次に、炭素濃度0.2-1.3at.%,水素濃度0.02-0.2at.%の範囲で内部摩擦むピークの大きさの濃度依存性を調べた。その結果、炭素濃度に対しては濃度の1次ないし2次に比例し、水素濃度に対しては濃度が低い範囲では1次に比例して大きくなることがわかった。しかし、水素濃度が炭素濃度の20-25%を越えるとピークの大きさはほとんど変わらなくなる。以上の結果より、観測された緩和ピークは以前の研究で推測されていたように炭素原子と水素原子が一対一の複合体の再配向、すなわち炭素原子近傍での水素原子の短範囲拡散によるものと考えられる。しかし、活性化エネルギーが純ニッケル中の水素の拡散の活性化エネルギーとほとんど等しいこと、またピークの大きさが水素濃度が炭素濃度よりも低い値で飽和することを考えると、水素原子と炭素原子の相互作用エネルギー(複合体の結合エネルギー)はかなり小さく、おそらく0.1eV以下であると推察される。今後、これを検証する実験が必要である。
心筋リモデリング(組織再改築)を抑制する非翻訳RNAの探索と機能制御

心筋リモデリングによる慢性心不全の病態解明のため、bFGFによる間質線維化抑制による心筋リモデリング抑制効果を検討した。bFGF投与による高血圧性Dahlラット心では間質線維化と心肥大を抑制し、同処理の培養心筋間質線維芽細胞ではCollagen type I, IIIとMMP-2,9の発現抑制、TIMP-1の発現増加やMMP-9の活性抑制を見出した。同処理培養心筋間質線維芽細胞を網羅的に解析し、bFGFで有意に増加し心筋間質に特異性の高いmiR-29c-3pを選定した。アンチセンス核酸分子の遺伝子導入実験により、mi29c-3pの標的分子の同定に努めている。【目的】非翻訳RNAのmicroRNAは標的mRNAに結合し翻訳抑制から蛋白発現を強力に制御する。今回心筋間質線維化で惹起される心筋リモデリング(組織再改築)による慢性心不全の解明のため、我々独自に確立したbFGF誘導性心筋リモデリング抑制系の網羅的解析から間質線維化抑制microRNAを探索する。同定されたmicroRNA投与実験から複数の標的遺伝子の発現制御から心筋リモデリング抑制を促進し、慢性心不全進行予防を目指すヒト臨床応用可能な実験系を確立する。【研究実施計画】1bFGF投与による心筋間質線維化抑制と心筋リモデリング抑制の検証:高血圧性Dahl rat心にbFGFを心筋内投与しbFGFによる心筋間質線維化抑制と心肥大抑制能を検証し、bFGFによる高血圧性心筋リモデリング抑制能を実証した。培養心筋間質線維芽細胞を用いてbFGFによるCollagen type I, IIIとMMP-2,3,9の発現抑制、TIMP-1の発現増加やMMP-2, 9の活性抑制を確認し、bFGFによる心筋間質線維化抑制をin vitroで実証した。2bFGFによる心筋間質線維化抑制microRNAの網羅的解析:bFGF投与48時間目の培養心筋間質線維芽細胞においてExiqon社のReal-time PCR arrayによるmicroRNAの網羅的解析を実施した。コントロール群に比べて投与群で有意に発現上昇するmiR-29c-3pを選定した。さらにDahl rat心筋間質における選定されたmiR-29c-3pの局在をin situ hybridization法で観察した。【目的】MicroRNAは標的mRNAに結合し翻訳抑制から蛋白発現を強力に制御する。本研究では心筋リモデリングによる慢性心不全の予防法創生のため、心筋リモデリングに重要な間質線維化の抑制過程で誘導されるmicroRNAを探索した。今回は我々独自に確立したbFGF誘導性心筋リモデリング抑制性の心筋間質細胞を網羅的に解析し、間質線維化抑制microRNA候補を選定し、そのmicroRNAの特異性を検討した。【研究実施計画】1bFGF投与による心筋間質線維化抑制と心筋リモデリング抑制の検証:高血圧性Dahl rat心にbFGFを心筋内投与しbFGFによる心筋間質線維化抑制を検証し、bFGFによる高血圧性心筋リモデリング抑制能をin vivoで実証した。さらに培養心筋間質線維芽細胞を用いてbFGFによるCollagen type I, IIIの発現抑制、TIMP-1の発現増加やMMP-9の活性抑制を確認し、bFGFによる心筋間質線維化抑制をin vitroで実証した。2bFGFによる心筋間質線維化抑制microRNAの網羅的解析: bFGF投与下培養心筋間質線維芽細胞においてExiqon社のReal-time PCR arrayによるmicroRNAの網羅的解析を実施した。3miR-29c-3pの局在をin situ hybridization法で観察した。Exsomeに集約するmiR-29c-3pが心筋間質に確認できた。さらにmiR-29c-3pは高血圧性Dahl rat心において正常血圧Dahl rat心に比べて有意な増加を示した。1bFGF投与による心筋リモデリングの抑制能を臓器レベルで実証した。2培養心筋間質線維芽細胞を用いてbFGF投与による組織修復蛋白の発現変化を解析し、培養細胞レベルでbFGFによる心筋間質の線維化抑制能を実証した。3bFGF投与における培養心筋間質線維芽細胞の網羅的解析を実施してmiR-29c-3pを選定した。4miR-29c-3pは高血圧心の血管周囲間質に発現し、正常血圧心と比較し有意な発現増加が認められた。今回心筋間質線維化で惹起される心筋リモデリング(組織再改築)の分子機構解明のため、網羅的解析からbFGF誘導性心筋リモデリング抑制のmicroRNAを探索する。探索microRNAの標的遺伝子の発現制御から心筋間質線維化抑制による慢性心不全進行予防を目指す基礎的実験系を確立する。【結果】1. bFGF投与による心筋リモデリング抑制効果:高血圧性Dahl rat心にbFGFを心筋内投与しbFGFによる心筋間質線維化抑制と心肥大抑制能を検証し、bFGFによる高血圧性心筋リモデリング抑制能を実証した。培養心筋間質線維芽