hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極微量で個別認証を可能にする人工DNA結合微粒子情報素子の開発

自動車を初めとする工業製品は、盗難や製品の関わる事件などが起きた時に、当該物を特定できる情報がすぐに得られれば迅速な解決につながる。製品へ付加する除去困難な個別認証情報として増幅容易で配列決定も自動化できるDNAを利用することとし、昨年度に引き続き基礎的な検討を行った。架橋剤による架橋をほどこした実際の塗装の0.8mgの塗膜片からのDNA抽出を、昨年開発した方法で行い、抽出液をPCRにより、45サイクル増幅を行った。得られた産物をクローニング法(得られたDNAを大腸菌のDNAに組み込み、その菌を増殖させた後に組み込んだDNAを含んだDNAを回収し、その配列をDNAシーケンサーにより解読する方法)によって配列解読を試みた。その結果、最初に塗装に加えたDNAと配列が全て一致することが確認できた。このことより、塗膜片0.8mgに含まれるDNA 0.8fmolという極微量のDNAの配列を解読できたことになり、本手法が基本的には用い得ることが、上記検討により確認された。昨年度得られた結果として、100°Cに5週間置いたDNA含有超微粒子中には、検出できるDNAが80分の1に減少した結果を得ていたため、今年度は、DNAの熱安定性を高める化合物の開発を検討した。好熱菌に含まれる、DNAの熱安定性を高めていると考えられている化合物を参考にして、類似の新規な数種類の化合物の合成を行い成功した。それらを含有させたDNA含有超微粒子の耐熱試験を行い、現在結果の解析を行っている。また、熱、水接触、油接触の長期耐久試験を行ったDNA含有塗装板の作成も既に行い、そこからの検出を試みている。製品へ付加する除去困難な個別認証情報として増幅容易で配列決定も自動化できるDNAを利用することとし、基礎的な検討を行った。まず、DNAの設計は次のように、中央部分は所有者を特定するための情報対応部分で、その両側にはPCRによる増幅を可能にするためにプライマー対応部位を設けた。中央部分を15塩基数、プライマー対応部分を12あるいは18塩基として化学合成を行った。合成したDNAは、粒径50nm以下の入手した超微粒子(酸化亜鉛あるいはシリカコートの酸化亜鉛)に物理吸着させた。まずはじめは、DNAを含有する微粒子からDNAを抽出し、それをプライマーとDNAポリメラーゼを使ってPCRにより増幅を行った。その結果、プライマー対応部分が12塩基では増幅率が低く、低濃度からの検出に適さなかったが、18塩基にすることで期待通り十分な増幅が行えることが明らかになった。DNAを吸着させた超微粒子に熱負荷をかけ、100°C5週間の条件に置いたものからDNAを抽出し、PCRにより増幅を行ったところ、DNAは減少してはいたものの十分検出可能であった。さらに自動車の塗料に混合し、鉄板に実際の塗装を行い、140°C20分の重合処理を行って、塗膜化したものを作成した。この塗膜から様々な条件でDNAの抽出を検討した結果、塩基性の加熱条件で抽出し、増幅することによって検出できたことを確認した。また、増幅した51塩基のDNAの配列解読は、通常の解読より短いものの検討になったが、シーケンサーを用いることにより途中の配列からの解読が可能であることも明らかにした。
敗血症性脳症の発症メカニズム解明とIL-18をターゲットとした新規治療戦略

敗血症性脳症(SAE)は感染に続発したびまん性の脳機能障害で、重症敗血症患者の重度認知障害の発症に関与する。その発症には脳内のInterleukin (IL)や血液脳関門の破綻が関連すると示唆されるが、十分に解明されていない。本研究は、腹膜炎型マウス敗血症モデルにて11)脳内炎症メディエーター、2)血液脳関門の破綻、3)認知機能の観点から、SAE発症のメカニズムを詳細に解明すること、2新たな治療法を探索することである。中でも、IL-1βと同じスーパーファミリーに属するIL-18に注目し、この阻害がSAEに与える影響を解析、発症メカニズム明らかにする。
ファージを用いた水系中の微量物質の回収と除去

ファージディスプレイ法では、ターゲットを固定化しこれに結合するファージを選択するバイオパニングという操作が重要である。しかしターゲットが本研究で目的としたゲルマニウムオキソ酸などの場合には、ターゲットの修飾や固定化は困難である。そこで本年度は、固定化できない標的物質に対するバイオパニング法、すなわち無担体バイオパニング法の構築を試みた。無担体バイオパニングに用いるファージライブラリーとして、(1)M13ファージのpIIIコートタンパク質のN-末端近傍にファクターXaの切断部位を導入、ここが切断された場合には、再びN-末端と同様な配列が現れるようにし、(2)本来のN-端とプロテアーゼ認識部位との間にランダムペプチドを挿入したものを用いた。トリプシンなどのプロテアーゼにより切断されるランダムペプチドのうち、標的物質との結合により切断されにくくなるものがあれば、これはプロテアーゼ処理後も感染能を維持できるファージ上に呈示されているはずである。一方、このようにターゲット依存的にプロテアーゼ耐性になったペプチドは、ターゲットを加えない状態でプロテアーゼ処理することにより切断され、ファージは感染能を失う。この2回のプロテアーゼ処理をしたファージ群の中には、ターゲット非依存的にプロテアーゼ耐性をもつペプチドを呈示するものが存在するが、これをE.coliのLPSなどを用いて除去する。次に残ったファージをファクターXaで処理することにより、ターゲットと結合能を有するファージの感染能を復活できる。本年度は不飽和脂肪酸をターゲットとした無担体バイオパニングを行い、本法を行う上での改善点などを明らかにした。家庭用品からハイテク機器まで広く用いられているレアメタルのリサイクル技術の確立は、枯渇性の高い資源の延命のみならず、廃棄物の埋め立てに伴う漏出金属による環境汚染の阻止という観点からも、極めて重要な課題となっている。本研究では、ファージのコートタンパク質上に、現在捕集が難しいレアメタルなどをターゲットとするペプチドと、凝集性を高めるため疎水性残基を導入したペプチドを複合的に発現させることにより、ターゲットを結合したファージを容易に沈殿させ、水系から回収・除去する方法を確立することを目的としている。本年度は、本法に有効と考えられる効率的なファージシステムの検索を行った。従来のファージディスプレー法では、ファージコートタンパク質のN-末端付近に自由度の高い状態でランダムペプチドを呈示し、標的物質に対し親和性を示すものを検索する。我々はf1ファージのpIIIにペプチドを呈示する従来型のペプチドライブラリーと、ヒト膵臓トリプシンインヒビターの表面部分に両端を固定し自由度を減少させた状態で呈示した特殊なペプチドライブラリーを用いて、銀板を標的とするパニングを行った。その結果、後者のシステムを用いた場合の方がより特異性の高いファージが集積されることが認められた。また本年は、バックグラウンドとなる非特異的な吸着を阻止するため、ターゲットに対する親和性が減少した変異型pVIIIをもつヘルパーファージの構築を試みた。
膵島細胞シートを用いた複合型新生膵島組織の開発

まずブタ膵島を用いた膵島細胞シートを開発し、さらに血管内皮細胞と膵管上皮細胞を膵島細胞シートと積層化して移植することで、移植後の血流再分布および膵島機能向上を目的とした。温度応答性培養皿を用いて、ブタ膵島を用いた膵島細胞シートを作製した。血管内皮細胞シートは膵島細胞と積層化され、容易に安全に皮下移植し得た。ラット膵管上皮細胞を膵臓から分離することは困難であった。膵島細胞を血管内皮細胞や他の細胞と組み合わせることで、膵島細胞シートの糖尿病治療効果を高める可能性が示唆された。【目的】我々は、1型糖尿病に対する膵島移植研究において、組織工学の応用により膵島細胞シートを発明した(Biomaterials. 30:5943-9,2009)。これまで、ラット膵島細胞シートにおける免疫不全糖尿病マウスでの治療効果が証明されている。今後のヒトへの応用を視野に入れ、ブタ膵島を用いた膵島細胞シートの構築を行うと共に、移植後の血流再分布および膵島機能向上を目指し、血管内皮細胞および膵管上皮細胞を膵島細胞シートと積層化した複合型新生膵島組織の作成を目的とした。【方法】実験1:温度応答性培養皿上でconfluencyとなった膵島細胞を低温処理にてシート状に回収する。次いで、糖尿病化マウスの皮下へ移植し、血糖制御を評価する。実験2:ラット血管内皮細胞を温度応答性培養皿上に播種し、confluencyの状態で更にラット膵島細胞を播種する。培養2日後に積層化した両細胞をシート状に回収する。【結果】ブタ膵島細胞は、温度応答性培養皿上よりシート状に回収できた。そして糖尿病マウスの腹部に作成した皮下ポケットへ、容易に移植し得た。移植後、レシピエントにおける血糖制御は得られなかった。ラット血管内皮細胞シートはラット膵島細胞と積層化可能であり、積層化状態を維持したままシート状に回収し得た。【考察】膵島細胞のシート状再構築は、簡便かつ安全に皮下への膵島移植を可能とした。また、血管内皮細胞はシート状での回収が可能であるため、膵島細胞シートとの積層化において、膵島をさせる土台(足場)としての役割を果たせると期待された。【方法】実験1:ブタ膵臓より得た分離膵島を、トリプシン処理にて細胞へ単離し、温度応答性培養皿にて接着培養する。培養2日目に培養温度を20°Cに変化させることにより、膵島細胞をシートとして回収する。実験2:摘出したラット膵臓を培養し、培養皿表面に残存した紡錘状細胞を回収して、温度応答性培養皿へ継代しシートとして回収する。実験3:ラット血管内皮細胞を温度応答性培養皿上に播種し、confluencyの状態からシート状に回収する。【結果】ブタ膵臓から膵島へ分離し、その後膵島細胞へ単離し得た。また、培養後の低温処理にて細胞シートとして回収することが可能であった。一方、ラット膵臓の培養では、若干の紡錘形細胞が見られたが、シート化するまでの増殖は得られず、膵管上皮単離の確認は出来なかった。ラット血管内皮細胞は温度応答性培養皿上でconfluencyの状態が得られ、低温処理によりシート状に回収し得た。【考察】ブタ膵島細胞の分離・培養および、低温処理によるシート状回収が可能であった。膵管上皮細胞の回収には、分離および培養条件の更なる工夫が必要である。また、血管内皮細胞はシート化が確認され、膵島細胞シートとの積層化シートにおける重要な構成要素として期待出来ると考えられた。【目的】我々は、1型糖尿病に対する膵島移植研究において、組織工学の応用により膵島細胞シートを発明した。【方法】実験

1:温度応答性培養皿上で培養したブタ膵島細胞を、低温処理によりシート状に回収する。次に糖尿病化マウスへ皮下移植し血糖制御を評価する。実験2:ラット血管内皮細胞を温度応答性培養皿上に播種し、更にラット膵島細胞を播種する。培養2日後に積層化した両細胞をシート状に回収する。実験3:膵島細胞-血管内皮細胞の積層化シートを糖尿病マウスへ移植し、糖尿病治療効果を評価する。実験4:ラット膵管上皮細胞を分離培養し、膵管上皮細胞シートを作成する。【結果】ブタ膵島を用いた膵島細胞シートの作成および糖尿病マウスへ皮下移植に成功した。移植手技は容易であった。移植後の血糖制御は得られなかった。ラット血管内皮細胞シートはラット膵島細胞と積層化可能であり、積層化シートとして回収でき、容易に皮下移植し得た。移植後、同部位は血腫を形成しグラフトの生着は得られず、糖尿病治療効果が得られなかった。ラット膵管上皮細胞を膵臓から分離することは困難であった。【考察】ブタ膵島の内分泌機能が不良であり、糖尿病マウスの血糖制御は得られなかったと考えられる。血管内皮細胞シートは培養・回収が容易で、膵島細胞を支える足場としての役割を果たせると期待されたが、血腫形成に関しては血管内皮細胞の比率が関与していると考えられた。膵管上皮細胞の分離培養は困難であり、より簡便に分離培養出来る支持細胞を選定する必要がある。医学ブタ膵島から作製した膵島細胞シートは、培養皿からの回収および糖尿病マウスへの皮下移植が可能であると実証された。また、ラット血管内皮細胞シートとラット膵島細胞の積層化は問題なく、両者における細胞間接着は良好であった。温度応答性培養皿上で培養することで、低温処理のみにて積層化状態を維持したままシート状に回収し得た。ブタ膵島細胞から単離した膵島細胞は、温度応答性培養皿上で接着培養が可能であり、細胞シートの作成および回収も順調であった。一方、膵管上皮細胞の単離には多くの試行が必要とされる可能性があり、まずラットでの実験を行った。膵管上皮細胞の培養増殖を得るためには、培養条件、期間、観察および評価方法を、さらに詰めていく必要がある。血管内皮細胞も、膵管上皮細胞と同様の理由でラットでの実験を行った。血管内皮細胞は、温度応答性培養皿上で接着培養が可能であり、細胞シートの作成および回収も順調であった。移植したブタ膵島細胞シートの組織評価のため、マウス腹壁を採取し免疫染色を行う。膵島細胞と血管内皮細胞との積層化シートを糖尿病マウスへと移植し、糖尿病治療効果を評価する。また、膵管上皮細胞の培養条件について検討し、シート状再構築を目指す。ブタ膵島細胞シートと血管内皮細胞シートの積層化による移植実験が可能であると考えられる。培養条件、期間および積層化の手順を策定し、糖尿病マウスへの移植実験へつなげる。また、膵管上皮細胞の単離、培養においては、様々な条件下での培養実験を進め、シート化を目指す。経費削減に努めたため研究のさらなる充実のため、試薬や動物等の購入、旅費等に充てる該当なし
自然電位観測によるギリシャ式地震予知法の基礎と日本への適用

本研究課題の初年度(平成6年度)経験と成果を踏まえてギリシャにおいて約1カ月間にわたる観測機器を用いた野外調査を中心に研究を行なった.本研究課題は,ギリシャにおいて一定の成果を上げている地震予知方法(VAN法と呼ばれる)の原理を究明し普遍化するとともに,日本への効率的な適用の方法を探ることを目的にしている.このVAN法は地電流(自然電位)の連続観測記録に現れる特異な変化(地震前兆電気信号,Seismic Electric Signal : SESと呼ぶ)を判別し,地震予知に役立てると言うものである.これまでにギリシャ周辺で発生した幾つかの被害地震を予知し,警告を出し,実際的に地震防災にも成果を挙げてきた.原理は以上のようであるが,実際的にはSESは多数の雑信号の中に隠され,その判別は容易でなく,経験と注意深い分析を必要とされ,誰でもできるというものではない.さらに,どの場所で観測してもSESが検出されると言うものではない.多数の観測点の中からわずかに数観測点だけがSESを検出できる条件を備えているらしいことがギリシャ側研究者の長年の努力と経験から判明している程度である.このような状況であるから,ギリシャにおける自然電位観測点(VAN観測点)がどのような物理的,地球科学的条件を備えているかを解明することが,日本への効率的適用を考えるだけでなく,その物理学的原理を究明するためにも不可欠な研究課題である.このことについて,ギリシャ側研究者もこれまでに多大な努力を払ってきているが未だに解明されていない.この課題を,日本・ギリシャ共同で解明する意義がここにある.現在,ギリシャにおいて地震予知情報を提供しているいわゆる感度のある敏感な観測点は、基本的に3地点である.ギリシャ北西部のイオアンニナ近傍,北部のアシロス近傍,それに最近有効な情報を提供しだした中部のヴォロス近傍である.これらは数十箇所での長年の観測経験から判明したものである.これらの中でイオアンニナは最もよく活躍している観測点である.良い観測点の条件を明らかにするには,良くなかった観測点の立地条件と比較する必要がある.このような観測点の代表例としては長年にわたる観測点の歴史をもっているピルゴス近傍の観測点である.この観測点は現在も維持されているが,全く役に立たない分けではないけれども常にSES情報を提供する分けではないといういわゆる感度の良くない観測点である.前年度は,これらの事実を踏まえて,イオアンニナ観測点とピルゴス観測点周辺の地球物理学的調査を行なった.これら2地域の比較だけでは立地条件の違いを明らかにできないことは論理的に当然のことである.本年度は,事例を増やすべく,アシロス観測点周辺の地球物理学的調査,イオアンニナ観測点周辺での観測項目の追加,それにできるだけ多くのVAN観測点の地形・地質学的視点からの比較を行なった.このため,調査項目としては、重力,地磁気,電磁気,地質,地球化学など多項目にわたった.現地調査期間は1カ月弱であったが、前年度の経験と現地研究者の協力によって効率的な調査を行なうことができた.本研究では、多数の精密観測器材の運搬,通関作業,機器の調整,地形図の便宜供与,重量のある消耗品類の現地調達など,通常の野外調査とは別の問題を抱えており,現地研究者の協力がここでも不可欠であった.現地調査により,はじめて詳しく地下構造などが推定できるようになった地域は,イオアンニナ,ピルゴス,アシロスの3地域だけであり、論理的にもこれだけの事例からSESに対して敏感な観測点であるべき条件を明らかにすることは困難である.したがって,少なくとももう数地域のVAN観測点周辺(その多くは敏感でない)の詳細な調査を必要とする.しかしながら,この2年間の調査からも,それ以前に想定していた考えを改めなければならない事実が浮び上がってきている.その一つは,敏感な観測点は地質学的に特殊な場所,たとえば活断層とか貫入岩体の存在といった,ではないかという仮説があったが、そうでないことが明らかになった.それよりも,観測点周辺の地下水条件が重要な役割を果たしているのではないかという,新たな作業仮説が生まれた.これらの手がかりをもとにより科学的根拠を明らかにし、日本への効率的な適用法を考察するためにも,より一層の現地調査が必要である.本研究課題の初年度(平成6年度)経験と成果を踏まえてギリシャにおいて約1カ月間にわたる観測機器を用いた野外調査を中心に研究を行なった.本研究課題は,ギリシャにおいて一定の成果を上げている地震予知方法(VAN法と呼ばれる)の原理を究明し普遍化するとともに,日本への効率的な適用の方法を探ることを目的にしている.このVAN法は地電流(自然電位)の連続観測記録に現れる特異な変化(地震前兆電気信号,Seismic Electric Signal : SESと呼ぶ)を判別し,地震予知に役立てると言うものである.これまでにギリシャ周辺で発生した幾つかの被害地震を予知し,警告を出し,実際的に地震防災にも成果を挙げてきた.原理は以上のようであるが,実際的にはSESは多数の雑信号の中に隠され,その判別は容易でなく,経験と注意深い分析を必要とされ,誰でもできるというものではない.さらに,どの場所で観測してもSESが検出されると言うものではない.多数の観測点の中からわずかに数観測点だけがSESを検出できる条件を備えているらしいことがギリシャ側研究者の長年の努力と経験から判明している程度である.

このような状況であるから,ギリシャにおける自然電位観測点(VAN観測点)がどのような物理的,地球科学的条件を備えているかを解明することが,日本への効率的適用を考えるだけでなく,その物理学的原理を究明するためにも不可欠な研究課題である.このことについて,ギリシャ側研究者もこれまでに多大な努力を払ってきているが未だに解明されていない.この課題を,日本・ギリシャ共同で解明する意義がここにある.現在,ギリシャにおいて地震予知情報を提供しているいわゆる感度のある敏感な観測点は、基本的に3地点である.ギリシャ北西部のイオアンニナ近傍,北部のアシロス近傍,それに最近有効な情報を提供しだした中部のヴォロス近傍である.これらは数十箇所での長年の観測経験から判明したものである.これらの中でイオアンニナは最もよく活躍している観測点である.良い観測点の条件を明らかにするには,良くなかった観測点の立地条件と比較する必要がある.このような観測点の代表例としては長年にわたる観測点の歴史をもっているピルゴス近傍の観測点である.この観測点は現在も維持されているが,全く役に立たない分けではないけれども常にSES情報を提供する分けではないといういわゆる感度の良くない観測点である.前年度は,これらの事実を踏まえて,イオアンニナ観測点とピルゴス観測点周辺の地球物理学的調査を行なった.これら2地域の比較だけでは立地条件の違いを明らかにできないことは論理的に当然のことである.本年度は,事例を増やすべく,アシロス観測点周辺の地球物理学的調査,イオアンニナ観測点周辺での観測項目の追加,それにできるだけ多くのVAN観測点の地形・地質学的視点からの比較を行なった.このため,調査項目としては、重力,地磁気,電磁気,地質,地球化学など多項目にわたった.現地調査期間は1カ月弱であったが、前年度の経験と現地研究者の協力によって効率的な調査を行なうことができた.本研究では、多数の精密観測器材の運搬,通関作業,機器の調整,地形図の便宜供与,重量のある消耗品類の現地調達など,通常の野外調査とは別の問題を抱えており,現地研究者の協力がここでも不可欠であった.現地調査により,はじめて詳しく地下構造などが推定できるようになった地域は,イオアンニナ,ピルゴス,アシロスの3地域だけであり、論理的にもこれだけの事例からSESに対して敏感な観測点であるべき条件を明らかにすることは困難である.したがって,少なくとももう数地域のVAN観測点周辺(その多くは敏感でない)の詳細な調査を必要とする.しかしながら,この2年間の調査からも,それ以前に想定していた考えを改めなければならない事実が浮び上がってきている.その一つは,敏感な観測点は地質学的に特殊な場所,たとえば活断層とか貫入岩体の存在といった,ではないかという仮説があったが、そうでないことが明らかになった.それよりも,観測点周辺の地下水条件が重要な役割を果たしているのではないかという,新たな作業仮説が生まれた.これらの手がかりをもとにより科学的根拠を明らかにし、日本への効率的な適用法を考察するためにも,より一層の現地調査が必要である.本研究の目的はギリシャで行われている地電流を用いた地震予知法で物理機構不明の“地震前兆電気信号に対して感度の良い"観測点周辺の特徴を地球物理学的に明らかにし、日本への適用を図る際のガイドラインを確立することにある。今年度は2回に分けて現地調査を実施した。
脊髄損傷後の軸索再生におけるGAP-43の機能解明と新規脊髄保護療法の開発

成長円錐膜画分にて高頻度にみとめられた、MAP1Bリン酸化について特異抗体を用いて解析を行った。マウス胎仔大脳皮質初代培養細胞にて、MAP1Bそれ自体よりも、リン酸化は軸索でより高いレベルとなっていることが認められた。胎仔脳の切片にて、リン酸化は軸索が豊富にある構造に特異的に認められた。発生過程での発現過程の変化を確認した。マウス坐骨神経損傷モデルを作成し、損傷後にリン酸化レベルが高くなることが認められた。神経の発生過程、再生過程における関与が示唆された。GAP-43のリン酸化に関わる相互作用分子として、脱リン酸化酵素の同定を試みたがその同定に至らなかった。従ってターゲットタンパクを成長円錐部膜各分にて高頻度に認めれられたMAP1Bのリン酸化に注目し、軸索再生時の発現過程の変化を評価の容易なマウス坐骨神経損傷モデルを用いて解析を行うこととなった。脊髄損傷後のリン酸化レベルの変化について検証する。突起伸長時の機能的意義を検証する。上記内容について国際学会および論文にて発表予定。マウスGAP-43の172番目スレオニン(Thr172)のリン酸化(pT172)の機能を明らかにするため、GAP-43と相互作用する分子の候補を挙げることとした。Neuro2A細胞に、GAP-43の野生型(WT)あるいは非リン酸化型(Thr172をアラニン置換: T172A)を発現するプラスミドをそれぞれ別に導入、過剰発現させた。抗pT172-GAP-43抗体にて、WTのみpT172を認識することを確認した。GAP-43に対する抗体を用い免疫沈降し、それら沈降サンプルを、質量分析装置(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry: LC/MS)を用いて解析、GAP-43と共沈降した分子を検出した。WTとT172Aとで比較し、GAP-43のpT172を介した相互作用分子候補としてJunction Plakoglobin (=γ-catenin)が挙げられた。また、リン酸化に関わる相互作用分子として、脱リン酸化酵素Phosphataseの同定を試みた。阻害剤実験として、Neuro2A細胞にPP-1およびPP-2Aの阻害剤であるオカダ酸を、PP-2B(=Calcineurin)の阻害剤であるタクロリムス(=FK506)を添加し、ウエスタンブロットにてリン酸化の変化をみた。直接作用するPhosphataseを阻害すれば、リン酸化レベルの濃度依存的な上昇が観察されるが、いずれも十分な上昇は確認されず、責任Phosphataseは上記以外であることが示唆された。抗pT172-GAP43抗体を用いて、マウス大脳皮質初代培養神経細胞で免疫細胞染色を行い、神経細胞の成長円錐でのpT172の存在が確認した。C57BL/6Jマウスを用いて脊髄圧挫損傷モデル、坐骨神経損傷モデルを作成し、GAP-43, GAP-43pT172の発現を確認した。マウスGAP-43の新規リン酸化部位として確認された96番目セリン(Ser96)、172番目スレオニン(Thr172)があり、当初リン酸化Ser96に対する抗pS96-GAP-43抗体を用いた神経軸索再生評価を予定していた。しかし、ヒトGAP-43ではThr172のみがThr181として保存されており、リン酸化Thr172(pT172)の機能解析を優先することにした。Neuro2A細胞、マウス大脳皮質初代培養神経細胞を用いて、抗GAP-43抗体と抗Junction Plakoglobin抗体を用いて免疫染色を行い、細胞内での共局在を確認する。GAP43-T172Aノックインマウス(生化学教室にて胚作成し保存)より、大脳皮質初代培養神経細胞を採取し、軸索や成長円錐などの形態、Junction Plakoglobinの局在の差異を観察する。これらの局在、形態をWTマウスとT172Aノックインマウスとで比較し、機能的意義について検証する。C57BL/6Jマウス(6-8週齢)を用い、脊髄損傷モデルに比べ評価が容易な末梢神経損傷モデルをまず作成し、損傷後1週、2週、4週でのGAP-43-pT172, Junction Plakoglobinの発現をウエスタンブロットにて確認、非損傷側との発現量を比較する。併せてGAP-43, GAP-43-pT172, Junction Plakoglobinを免疫組織染色する。

行動学的実験による運動機能回復過程、疼痛を1回/週の評価を受傷後8週まで施行する(Basso mouse scale: BMSスコア, footprint analysis,足底熱刺激装置プランターテスト)。脊髄損傷後のリン酸化レベルの変化について検証する。突起伸長時の機能的意義を検証する。上記内容について国際学会および論文にて発表予定。次年度使用額(B-A)については、分生物学的実験に必要な消耗品費(試薬)として使用する予定。
3次元動的マイクロ力学刺激を用いる損傷細胞組織のアクティブ力学操作・再生治療法

ピエゾ素子を利用した微小振動子とマイクロ触覚プローブから成るセンサー,および立体ダブルL型カンチレバー状に加工した振動子に,直交3軸方向それぞれの変位が制御できるように複数のピエゾ素子を接着した3次元アクチュエータおよびそのコントローラーを開発した。本センサー・アクチュエータ複合デバイスを,高精度マイクロマニピュレータ・倒立型位相差顕微鏡に組み込むことによりシステム構築を行い,培養細胞に対する種々の力学刺激,評価等アクティブ力学操作の可能性および再生治療における有用性を確認した。ピエゾ素子を利用した微小振動子とこれに付随するマイクロ触覚プローブから成るシンプルな構造を有するセンサーを構築した。ついで,立体ダブルL型カンチレバー状に加工した振動子に,直交3軸方向それぞれの変位が制御できるように3枚のピエゾ素子を接着し製作した。これらのピエゾ素子に任意の信号を入力することによりアクチュエータ先端の変位を高精度に制御でき,3次元的に自由なアクチュエーションが可能となる。また,任意の振動数で励振させることも可能である。本センサー・アクチュエータ複合デバイスを,高精度マイクロマニピュレータ・倒立型位相差顕微鏡に組み込むことによりシステム構築を行った。次いで,力学物性が既知のシリコンマイクロゴムブロックを用いたデバイスの精度検証を行った。メダカの受精卵を用い,実際の人工授精あるいは遺伝子診断のための胚生検操作を想定し,これと全く同様の処置・操作を施す手法を確立した。すなわち先端直径数μmの極細ガラスニードルで卵細胞の一点を数μm程度穿刺してローカルな損傷を付与し,一定時間後,卵細胞に3次元マイクロアクチュエータを用いて動的力学刺激を付加する。次に、マイクロセンサーを用い,損傷の回復度を卵細胞の力学的コンプライアンス(やわらかさ)から定量的に評価検証する手法を開発した。これにより,受精卵細胞の損傷回復の可能性を確認した。また,培養ヒト骨芽細胞についても3次元的センサーアクチュエータの小型化改良により,同種の評価が可能であることを確認した。さらに,蛍光染色による細胞内部観察を行い,力学刺激との関連を評価可能であることを確認した。ピエゾ素子を利用した微小振動子とこれに付随するマイクロ触覚プローブから成るシンプルな構造を有するセンサー,および立体ダブルL型カンチレバー状に加工した振動子に,直交3軸方向それぞれの変位が制御できるように複数のピエゾ素子を接着し製作した3次元アクチュエータおよびそのコントローラーを開発した。次にCytochalasin Dを利用して生細胞の細胞骨格であるストレスファイバー量を制御し,その力学特性への影響を評価する手法を確立した。このシステムを利用し,種々の条件下において,力学刺激に対する細胞の力学応答を評価する実験をおこなった。その結果, 1)開発したセンサー・アクチュエータは,局所的細胞骨格強度をコンプライアンス(やわらかさ)として評価する能力を有していることを確認した。2)細胞は,単に入力した力学刺激を画一的な刺激情報として感知するのではなく,力学刺激の種類(静的,動的)を感知できる機構を備えていることがわかった。3)G-アクチン濃度が高く平衡状態に達していない細胞の場合,ストレスファイバー量が多い細胞の方が力学刺激に対する応答が大きくなる結果を得た。すなわち,ストレスファイバー量は細胞が示す力学応答に大きく関与していると考えられる。4)蛍光染色による細胞内部構造観察を行い,力学刺激との関連を投影面積およびスレンダーネスレシオにより定量的に評価可能であることを確認した。その結果,1)開発したセンサー・アクチュエータは,局所的細胞骨格強度をコンプライアンス(やわらかさ)として評価する能力を有していることを確認した。
シングルセル・ゲノミクスによる難培養微生物の機能解明と遺伝子資源化

シングルセル・ゲノミクスとは、1細胞のみを用いて、ある生物種のゲノムを解読する研究分野あるいは手法である。ゲノムとは全遺伝情報、すなわち設計図であり、その生物種を用いた基礎・応用研究上、最も重要なデータの一つである。細菌ゲノムの解読には10億個以上の同一系統の細胞が必要だが、培養すれば容易に集められる。ゲノムDNAの配列解析に要するコストも年々低下しており、これまでに、細菌を中心に1400以上の生物種・系統のゲノムDNA配列が決定されている。ところが、大多数の微生物種は、実は培養法が不明である。これらはゲノム解読が不可能なのはもちろん、従来の微生物学的研究手法が適用できないので、生理・生態なども未知のままである。微生物は生態系の基盤を形成するだけではなく、人類にとっては不可欠の生物資源でもある。しかし培養不能なために、生態系には大きなブラックボックスが残り、人類が利用可能な生物資源も、ごくわずかにすぎないのである。そこで本研究課題では、培養を介さずに、1細胞のみでゲノム解読を可能とする手法の確立に取り組んでいる。H22年度においては、まず1細胞を環境中から単離する方法の最適化を行ってきた。いくつかの細胞単離法を試し、また購入予定装置の選定を進めてきた。クリーンルーム、マイクロマニピュレーションシステム、結果を評価するためのリアルタイムPCR装置などの購入・設置を行い、次年度以降(最先端・次世代研究開発支援プログラムで継続)の本格的な研究への準備を完了することができた。
普通輝石斑晶中でのSr-Nd同位体交換

加賀白山で代表される両白山地の火山群の中で毘沙門岳の火山岩類だけがアダカイト質の岩石であることを示し、それが2種類以上のマグマの混合で生じたことを化学組成と^<87>Sr/^<86>Srと^<143>Nd/^<144>Ndの同位体組成から明らかにした。輝石斑晶のMg/Fe比に関する頻度分布が二峰性を示し、さらにシリカに富む岩石中ほどMg/Fe比の高い輝石の割合が高いことなどから、混合マグマの端成分の一つはデイサイトであるが、通例に反してMg/Fe比が高いと判断した。そしてまた、シリカに富む(即ちMg/Fe比の高い輝石の割合が高い)岩石ほどSr/Y比が高くYに乏しいので、毘沙門岳の火山岩類がアダカイト質な性質はこの特異なデイサイト端成分に由来すると言える。この端成分の同位体組成はMg/Fe比の高い輝石斑晶のそれで代表されるはずであるが、普通輝石斑晶の^<87>Sr/^<86>Srと^<143>Nd/^<144>Ndの同位体比は、普通輝石がmg♯(=100Mg/(Mg+Fe))=81.684.2の間は全岩のそれと誤差の範囲内で一致する。即ち輝石斑晶は混合後のマグマと同位体平衡に達していた。換言すれば、化学成分の拡散よりも同位体の平衡化の方が急速であろうとの研究開始前の予測が正しかったことが証明された。一方、mg♯が84.8の普通輝石は、全岩とは大きく異なり、基盤の白亜紀火山岩類のレスタイトと似た同位体比を有する。故にアダカイト質端成分マグマの成因に白亜紀火山岩類のレスタイトの再溶融が本質的な貢献したと考えられる。本研究ではさらに、マグマ発生場および地殻内でのマグマの同位体的変化を解明するために、初生マグマおよびそれからの派生マグマが噴出した二ヶ所の火山岩類(上野玄武岩類と瀬戸内高マグネシア安山岩)についてもケーススタディーを行った。2年計画の初年度にあたる本年度は、まずこれまでに蓄積していた研究成果を整理し、両白山地の白山南方の毘沙門岳(標高1386m)の安山岩類中に全岩と普通輝石斑晶とで^<87>Sr/^<86>Srと^<143>Nd/^<144>Ndの同位体比が異なるものが存在することを確認した。それに基づいて、毘沙門岳北部の峠沢支流の一露頭から約20kgの安山岩を採取した。通常の岩石学的研究目的で採取する試料は概略1kg(以下)であるが、今回は岩石中に少量しか含まれない斑晶を分離・抽出しなくてはならないので大量の岩石試料を準備したわけである。MgとFeの拡散速度に基づいてマグマ混合後の経過時間と普通輝石斑晶のMg/Fe比の関係を決定するために、普通輝石斑晶の累帯構造を明らかにすべく、X線マイクロアナライザー(EPMA)によって大量の普通輝石斑晶を分析し、また二次電子像を観察した。完全定量分析だけでも3000ポイント以上分析した。

その結果、普通輝石の化学組成は中心から周縁部に向かって単調に変化しているのではなく、幾つかのセクターに分かれているらしいことが判明した。また、毘沙門岳火山で活動した混合マグマの端成分が2つではなく3つ以上存在した可能性が示唆された。約20kgの安山岩試料を粉砕し、アイソダイナミックセパレータ(電磁分離器)を用いて普通輝石斑晶を分離・精選し、Mg/Fe比の異なる10種類ほどのフラクションに分取した。岩石粉砕時の最適粒度は試行錯誤であり、ヨウ化メチレン(重液)を併用した分離・精選にもかかわらず未だ十分に満足のいく純度の普通輝石斑晶は得られていないが、慎重に分離操作を繰り返せば、それぞれ100200mg程度のフラクションが得られる見込みである。二年計画の二年目にあたる今年度は、毘沙門岳(標高1386m)の安山岩デイサイト類がマグマ混合で生じたことを全岩化学組成および斑晶鉱物の化学組成から確認し、全岩および分離した普通輝石斑晶の^<87>Sr/^<86>Srと^<143>Nd/^<144>Ndの同位体比を求めた。全岩化学組成は、多くの成分が二成分変化図上で直線的トレンドを示し、ことにシリカに富む岩石ほどMg/Fe比が高い傾向にあることが注目に値する。このトレンドは単一マグマの分化では生じ得ないものであり、さらに仮にマグマ混合で形成サレタとすると、通例に反してその一方の端成分マグマはMg/Fe比が高いデイサイトということになる。この判断が正しいことが輝石の斑晶の化学組成の統計的処理によって確認された。すなわち、輝石斑晶はMg/Fe比に関して二峰性を示し、シリカに富む岩石中ほどMg/Fe比の高い輝石の割合が高いのである。故にシリカに富む液相とMgに富む輝石とからなるマグマが一方の端成分であり、もう一方は相対的にシリカに乏しい液相とMgに乏しい輝石とからなるマグマであると結論された。全岩と分離した普通輝石斑晶の^<87>Sr/^<86>Srと^<143>Nd/^<144>Ndの同位体比の差を普通輝石斑晶の平均mg#^l(=100Mg/(Mg+Fe))の関数としてみると、普通輝石がmg#=81.684.2の間はどちらの同位体比とも誤差の範囲内で一致し、輝石斑晶が同位体的に平衡に達していたことが示された。ところがmg#ga84.8の普通輝石の同位対比では、^<87>Sr/^<86>Srで0.00020(全岩の同比は0.70723)、^<143>Nd/^<144>Ndで0.00031(全岩の同比は0.51250)という著しい差異が認められた。残念ながら同位体の拡散速度の定量化には到らなかったが、明かにシリカに富む端成分マグマに由来すると考えられる斑晶輝石でも同位体的には既に混合後のマグマと再平衡に達しているので、化学成分の拡散よりも同位体の平衡化の方が急速であろうとの研究開始前の予測が正しかったことの証明には成功したと言える。
植物の栄養情報の伝達・応答機構の分子生理学的解析

硫酸欠乏処理のSEF4活性に及ぼす影響を検定したところ、処理によって活性の増加することが明かとなった。この結果はSEF4が硫黄欠乏におけるβサブユニット遺伝子の発現誘導に関わるトランス因子である可能性を示唆している。βサブユニットプロモーターGUS融合遺伝子をホモに持つ形質転換シロイヌナズナをEMS処理して得られたM1種子を通常の条件で育て、収穫したM2種子を通常濃度の硫酸を含む培地で発芽させ、子葉のうち一枚を切り取ってGUSアッセイし通常より活性の高いものを約100株選抜した。これらの植物を通常の硫酸条件で育て得られたM3種子についてGUS活性を検定し、通常より高いGUS活性を示すものを約25株選抜した。これらの種子を硫酸欠乏条件と通常条件で生育させ完熟種子のGUS活性を比較したところ、野性型の形質転換植物に比べて硫酸欠乏時のプロモータ活性の上昇が少ないか、見られないものが4株得られた。セレン酸耐性変異株の単離を試みた。EMS処理したシロイヌナズナM2種子を野生株が子葉展開できない濃度である200μMのセレン酸を含む培地に播種し、子葉展開する幼植物を66株得た。これらの植物から得られた種子についてセレン酸耐性を検定したところ、9株の個体について耐性が再現された。子実転流アミノ酸を硫酸欠乏処理したダイズについて調べたところメチオニンの大きな変動は認められなかった。それに対して、子実の遊離硫酸イオン濃度は大幅に減少していた。未熟子葉のin vitro培養系の培地のメチオニン、硫酸イオン濃度を変動させると、βサブユニットの蓄積量は硫酸イオンの減少により増加した。ダイズの硫酸欠乏の応答は根のさらされる硫酸欠乏状態が、子実の硫酸含量の低下として反映され、引き起こされていることが示唆された。
地球本位型社会形成への法的・政策的支援手法に関する研究

本年度は,平成5,6年度分の研究成果をもとりくみ,最終的なとりまとめを行った。まず第1に,地球本位型社会形成への法的・政策的支援手法の考え方について,国家間の環境政策の実現手段としての「誘導手法」を総合的に検討し,概念的整理を行った。その手法には,条約のみならずソフトロー(宣言や決議など),その他,資金・技術支援,情報提供,多国間の環境保全コストの移転などがあるが,本研究では,地球環境問題の類型別に誘導主体(国際機関,国家,地方自治体,NGOなど)が利用できる誘導手法をまとめ,整理した。第2に,南北間の誘導手法として特に重要な援助をとりあげ,多国間援助(世界銀行,アジア開発銀行)と二国間援助(日本のODA)について検討を行った。その結果,援助に際して環境配慮システム(環境行動計画,環境アセスメントなど)を援助機関のみならず被援助国の社会システムの中に内部化する必要性が指摘された。第3に,誘導主体として最近特にその重要性が注目されているNGOについて検討を行った。NGOは大衆の認識を向上させるとともに,国家,企業,個人などに積極的な行動を求め,その実施を監視する。NGOは,地球環境関連の条約体制を実体面のみならず法制度の両面においてバックアップし,条約の効果的な実施を促進していることが指摘された。第4に,以上の誘導手法の基礎になっている理念,つまり地域間公平(世代的公平)と世代間公平について検討を行い,地球環境関連の条約がそのような理念を法制度の中に具体的にとり入れていることを実証的に明らかにしたしたとえば,差別的義務,選択的インセンティブ,環境アセスメント,国際基金など)。
旧ソ連セミパラチンスク核実験場周辺地域の放射能汚染状況と住民の内部被曝線量評価

旧ソ連のセミパラチンスク核実験場では、1949年以来450回以上の核実験が行われ、それによって数十万とも言われる周辺住民が長期間にわたって低線量率で外部および内部被曝を受けてきた。この研究の最終目標は、セミパラチンスク核実験場周辺住民の放射線被曝線量体系の構築と健康影響研究で、データベース構築による長期の低線量被曝のリスク推定である。このため、被曝線量評価を重点的に行なった。本研究では,被害の最も大きいと言われているドロン村で、広範囲で土壌試料を採取し、最大の被害を及ぼした1949年の核実験の放射性雲のセンター軸、幅などを評価しモデルによる空気中線量を推定した。また、核実験場周辺集落で亡くなられた方の人体試料中の放射能の測定を行ない、以下のことを明らかにした。(1)ドロン村の空気中線量について、これまでモデル計算値(1-2Gy)と緒外国研究者らのレンガを用いたTL法での評価値(0.5Gy)で食い違いがあり、その原因が大きな問題となっていた。今回、ドロン村を中心に広範囲で採取した土壌試料について、残留しているPuおよびCs-137蓄積量の測定を行ない、その分布などから放射性雲の通過センター軸や幅の再検討を行なった。その結果、当時の放射性雲の広がりは狭く、ドロン村はセンター軸から約1km程度離れていることが明らかになり、これをベースにしたモデル計算によりドロン村集落内の空気中線量を0.5Gyと推定した。(2)人体試料については,骨中の全Puが1955年での一回吸入に由来すると仮定すると、40年間での実効線量当量は0.2mSvと試算された。またウラン(天然U由来)については、連続経口摂取の仮定で60年間の実効線量当量を0.1mSvと試算した。(3)劣化ウランに関連して、イラクで採取した幾つかの飲料水、尿試料中のウラン濃度および同位体比の測定を実施した。結果として、劣化ウランの明らかな汚染は検出できなかった。旧ソ連のセミパラチンスク核実験場周辺の住民被曝の特徴は,大気および地上核実験からの放射性降下物によって長期低線量率被曝で外部被曝(40-300cSv:1949-1992年間の総被曝線量)に加えてかなりの内部被曝(40-300cSv)を受けていることである。外部被曝は,数学的モデル計算,レンガを用いたTL測定法である程度評価が可能であるが,内部被曝については評価が困難であり,人体試料の測定がモデルの検証のためにも必須となっている。本所究では,数年前から核実験周辺で亡くなられた方の人体組織を収集し残留放射能,特にSr-90,Pu-239,240,U同位体などの放射性核種の測定とデーターの蓄積を図ってきた。今年度は以下のことを明らかにした。1)これまでにセミパラチンスク市を中心に収集した人骨(主に脊髄),約80試料(3086才,平均60±13才)についてPu-239,240およびU-238,234を測定した。

Pu-239,240およびU-238平均濃度は,それぞれ0.050±0.041mBq/g-ash,0.28±0.13mBq/g-ash(22.8±10.6μg U/kg-ash)であった。2)Puレベルは,Global falloutで汚染されたイギリス,ドイツ,アメリカ,日本の一般住民に対して1980年代に見出されてきた濃度の範囲内であった。セミパラチンスク核実験場周辺は,原爆級Pu濃度で日本と比べて数十数百倍高く汚染されているが,大部分のPuは融解したシリカや原爆材料物質に強固の取り込まれている。このことが,食品や人体への移行を低くしている主因であると考える。暫定値ではあるが,Puの被曝がすべて吸引によると仮定〔1955年に一度吸入〕すると40年間での実効線量当量は0.2mSv程度と試算された。3)Uの源は,同位体測定から原爆起源ではなくてすべて天然由来であることが判明した。骨のU濃度は,報告されているイギリス人の値とほぼ等しく,アメリカ人や日本人の約10倍高濃度であった。この高い濃度は,この地域の飲料水の高いU濃度に原因していると考えられる。経口でU(U-238,235,234)を摂取すると仮定すると,60年間での実効線量当量は0.1mSv程度と推定された。4)今回用いた試料の大部分は,慢性疾患や癌で亡くなられた方から提供されたものなので,今後は,事故などの突然死からの試料をもちいて,さらにデーターを蓄積する必要がある。Sr-90測定は,次年度計画している。旧ソ連のセミパラチンスク核実験場では、1949年以来450回以上の核実験が行われ、それによって数十万とも言われる周辺住民が長期間にわたって低線量率で外部および内部被曝を受けてきた。この研究の最終目標は、セミパラチンスク核実験場周辺住民の放射線被曝線量体系の構築と健康影響研究で、データベース構築による長期の低線量被曝のリスク推定である。このため、被曝線量評価を重点的に行なう。本研究では、被害の最も大きいと言われているドロン村で、広範囲で土壌試料を採取し、最大の被害を及ぼした1949年の核実験の放射性雲のセンター軸、幅などを評価しモデルによる空気中線量を推定した。また、核実験場周辺集落で亡くなられた方の人体試料中の放射能の測定を行ない、以下のことを明らかにした。(1)ドロン村の空気中線量について、これまでモデル計算値(1-2Gy)と緒外国研究者らのレンガを用いたTL法での評価値(0.5Gy)で食い違いがあり、その原因が大きな問題となっていた。今回、ドロン村を中心に広範囲で採取した土壌試料について、残留しているPuおよびCs-137蓄積量の測定を行ない、その分布などから放射性雲の通過センター軸や幅の再検討をおこなった。その結果、当時の放射性雲の広がりは狭く、ドロン村はセンター軸から約1km程度離れていることが明らかになり、これをベースにしたモデル計算によりドロン村集落内の空気中線量を0.5Gyと推定した。(2)人体試料については、骨中の全Puが1955年での一回吸入に由来すると仮定すると、40年間での実効線量当量は0.2mSvと試算された。またウラン(天然U由来)については、連続経口摂取の仮定で60年間の実効線量当量を0.1mSvと試算した。
調節的局所脳冷却を用いた運動機能の抑制性制御に関する研究

脳腫瘍、難治性てんかんなどの疾患に対する脳外科的治療(脳切除)において、脳機能局在を評価(脳機能マッピング)するため、電気刺激を行うが、けいれんを誘発してしまうなどの問題点があった。本研究では、局所脳冷却による脳機能への影響について調べた。その結果、局所脳冷却と脳機能の維持に関しては、機能脱落が引き起こされる冷却域の境界は、10°C15°Cである可能性が高く、部位特性よりも温度依存的に変化すると考えられた。また、機能脱落を引き起こさない15°Cでの冷却であれば、脳機能は破壊されず、局所脳冷却は可逆的な脳機能制御法であることが確認できた。サルを用いた冷却による機能脱落実験:昨年度に引き続き、左半球の運動野と体性感覚野の手領域を広く覆う冷却デバイスを留置したサルを用いて、覚醒下での運動課題を実施した。課題にはリーチング課題(RT)とDexterity課題(DT)を用いた。右上肢と左上肢それぞれを対象に運動機能を検査したところ、15°Cでの冷却では、RT、DTのいずれも機能は維持されていた。その後、冷却温度を10°C迄下げた。いずれの課題においてもDurationの延長はみられた。一方、成功率に関しては、DTに置いて有意な低下が見られた。二匹目のサルに対しても同様の実験を実施したところ、ほぼ同様の結果が得られた。脳表層の冷却によって、運動機能が一時的に抑制を受ける温度域は約10°Cであることが確認できた。ヒトを対象とした臨床研究:覚醒下種々における脳機能マッピングについては適応症例がなく実施に至らなかった。一方で、てんかん手術時における切除予定部位の冷却研究については引き続き実施できた。マイクロダイアリシスによる神経細胞の代謝産物の解析を実施し、これまでに確認してきた傾向と同じく、冷却は脳保護作用を有していることがわかった。運動機能に関しては、冷却によって影響を受ける。そして、その影響は、脳に悪影響を与えるというよりも脳を保護する方向で働いていることが確認できた。冷却による脳機能マッピングの安全性が高いことが証明できた。当初の予定では初年度に動物実験を優先的に実施する予定であったが、ヒト臨床研究についても実施した。ネコ実験:冷却の時間的影響を把握するために、セボフルラン麻酔下において体性感覚誘発電位(SEP)に対する局所脳冷却の影響を調べた。15°Cの冷却によってSEPの消失は見られなかったが、波形の形状に変化が見られた。また、冷却を止め、復温をさせていくことで、その形状の変化を確認した所、脳表温度の回復と形状の回復にはずれが見られた。砂割り、復温が慣用しても、形状はそれよりも遅れて回復を見せた。サル実験:左半球の運動野と体性感覚野の手領域を広く覆う冷却デバイスを留置したサルを用いて、覚醒下での運動課題を実施した。ヒト臨床研究:H24年度は脳機能マッピングが実施されなかったため、てんかん焦点切除術において、その焦点切除部位に対する冷却を実施した。冷却においては、脳波、脳血流、(マイクロダイアリシスによる)神経細胞の代謝産物の解析を実施した。特に、グルタミン酸とGABAの冷却による変動を解析した所、いずれにおいても冷却によって濃度の低下が起き、その影響は冷却後30分間維持された。動物モデルはすでに作成済みであったため、速やかに実験を開始できた。また、臨床研究に関しても、申請当初の内容を踏襲出来てはいないが、神経伝達物質の解析を正確に行うことで、脳機能マッピングに対する適用可能性について検討をすることが出来た。初年度の研究により、局所脳冷却は冷却後も機能低下や神経伝達物質の細胞外濃度に影響を及ぼすことが分かってきた。したがって、脳機能マッピングにおいては、冷却後の影響を最小に抑えるべく、冷却時間・間隔について、動物実験におけるムシモール注入実験と併せて検討する。また、マイクロダイアリシス研究に関して例数を追加するべく、引き続き実施する。マッピングプローブは試作品に関して、医療機器化を視野にいれるべく、医療機器メーカーとの協力を進める。当初は、備品として脳波フィルタリングソフトウェアや特注ハンドヘルドペルチェプローブを購入予定としていたが、いずれも自作により対応出来たため、高い金額には至らなかった。一方、その他の費用に関しては、投稿論文の別刷り費用が多めにかかったため予定額を超えた。

旅費に関しては一度の学会参加で予定よりも少ない額で済んだため、予定額を下回った。全体的には、物品費の購入が抑えられたことによって未使用額が生じた。この未使用額については、H25年度のマイクロダイアリシス関連の消耗品に充てる。
糸状菌CCAAT-box結合因子複合体のアセンブリおよびソーティング機構の解明

糸状菌の転写因子の一つ、CCAAT-box結合因子は真核生物に広く保存されており、3つのサブユニットHapB,C,Eからなる。本研究では以下のような成果が得られた。2.GFPとそれぞれのHapサブユニットとの融含タンパク質(3種)を糸状菌Aspergillus nidulansのHapサブユニット欠損株(3種)内の全ての組み合わせ(合計9通り)で発現させ、融合タンパク質の局在性を調べた結果、HapCとHapEは3つのサブユニット全てが存在しないと核移行しないことが明かとなった。3.HapB内に存在する核移行シグナルについての解析を行った結果、真核生物に高度に保存された中央領域とC末端側の非保存領域にそれぞれ少なくとも一つずつの核移行シグナルが存在し、両方の核移行シグナルが機能していることが明らかとなった。4.HapEはそれ自身で不溶化しやすい性質があることが見出された。この不溶化がHapCを添加することにより顕著に抑えられること、翻訳後の添加では効果が見られないこと、両サブユニットはヒストンフォールドモチーフを介したヘテロ2量体を形成することから、HapCがHapEに対して特異的なシャペロン様の働きをし、HapEの不溶化を防いでいることが示唆された。本研究では真核生物に普遍的に存在するCCAAT-box結合因子のアセンブリに依存した核移行のメカニズムを他の真核生物での研究に先駆けて明らかにすることができた。さらに、サブユニット数量の調節機構へと繋がるHapEサブユニットのHapCによる安定化の分子メカニズムを解明することができた。1)3量体形成に依存したCCAAT-box結合因子サブユニットの核内移行の解析ii)GFPを用いて各サブユニットの細胞内局在性を調べた。具体的にはGFPとそれぞれのHapサブユニットとの融合タンパク質(3種)を糸状菌Aspergillus nidulansのHapサブユニット欠損株(3種)内の全ての組み合わせ(合計9通り)で発現させ、融合タンパク質の局在性を調べた。その結果、GFP-HapBは単独で核に移行しうるが、GFP-HapCとGFP-HapEは他の2つのサブユニットが存在しないと核移行しないことが明らかとなった。HapEのΔhapC株内での安定性を調べるために、強力な誘導型のプロモーターであるアミラーゼプロモータ支配下にhapE遺伝子を置いて、ΔhapC株内で強制的にHapEを発現させ、減少していく過程をウエスタンブロット解析により調べた。その結果、HapEの蓄積は検出限界以下であり、ΔhapC株内ではHapEは非常に不安定であり、急速に分解されてしまうことが示唆された。我々は昨年度の研究で3量体が形成されて初めて全サブユニットが核内移行することを他の真核生物に先駆けて明らかにすることができた。本年度は以下のポイントに絞り研究を遂行した。1)麹菌HapB内に存在する核移行シグナルの同定:GFP-HapBをコードする遺伝子に関して部分欠失変異を作成しΔhapB株に導入後、蛍光顕微鏡によりGFPの蛍光を観察することにより変異GFP-HapBの細胞内局在性を調べた。その結果、真核生物に高度に保存された中央領域とC末端側の非保存領域にそれぞれ少なくとも一つずつの核移行シグナルが存在することが示唆され、コンピュータプログラムPSORTIIによる核移行シグナルの推定結果(中央領域に一つ、C末領域に一つ)と一致していた。部位特異的変異の導入により、それぞれの核移行シグナルを破壊したところ、両方の核移行シグナルが機能しており、同時に破壊すると核移行能が完全に消失することが明らかとなった。2)HapCとHapEのヘテロ