hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌細胞のEMT調節機構におけるZIPファミリー分子の解析

口腔癌細胞の浸潤・転移におけるEMT強度調節因子検索のため、あらゆる分子の発現を検討した。ATPを利用しないSLCファミリー亜鉛トランスポーターのZIPファミリー遺伝子発現をRT-PCR法で検索し、EMT強度調節因子として重要と考えられたLIV1と相反する発現様式を示したのはZIP2である。ZIP2の発現はSnail調節分子Slugの発現と連動し、Slug強制発現細胞OM-1_SlugにおいてZIP2をsiRNA法でノックダウンするとEMTが誘導された。上皮細胞の分化が進むにつれてZIP2の発現が上昇し、一方で、間質にはZIP2の発現は認めず、細胞内亜鉛濃度の分布は、上皮の分化とZIP2発現に合致する。そこで本研究では、SnailおよびSlugの核移行に関与するLIV1の調節因子としてZIP2が非常に重要であると確信し、本研究課題をスタートさせている。恒常的にSlugを発現するOM-1およびOM-1_SlugにおけるZIP2の局在を蛍光免疫細胞染色で確認した。そして、ZIP2発現細胞のポピュレーションをフローサイトメトリーを用いて細胞内亜鉛濃度で検索した。上皮細胞のアイデンティティの指標としてESAと比較したところ、段階的EMT誘導モデルにおけるEMT強度が最大となるOM-1_Snail clone2に至るまでESAのポピュレーションと細胞内亜鉛濃度は比例した。しかし、恒常的にEMT表現型が固定されたHOC313において、細胞内亜鉛濃度が上皮細胞と同程度を示す細胞がメジャーポピュレーションとなっていた。一方で、不死化線維芽細胞株GT-1においては上皮細胞レベルの細胞内亜鉛濃度を示すポピュレーションも存在し、幅広いレンジの細胞内亜鉛濃度を示した。したがって、現在のところ、ZIP2発現、細胞内亜鉛濃度およびEMT強度の関係性は単純なものではないことが示されている。現在のところ、想定内の範疇であるが結果が安定せず、再現性がまだ取れない状態であり、先へ進められない領域がある。再現性をとるため実験を重ね、研究ストラテジーを予定通りに進めていきたい。諸事情で実験があまり進まず、また実験用の消耗品はストックから用いるようにしていたため、消耗品費用はあまり掛からなかった。情報収集のために学会には多く参加し、旅費として使用した。次年度使用額はフローサイトメトリーによる細胞内亜鉛濃度測定の再検証など、分子生物学的実験キットを多く使用する実験ストラテジーに充てる予定である。
近代山陰地域の文化教養環境における漢詩文の位置 ─若槻克堂と剪淞吟社の学際的研究

近代山陰地域における漢詩文学と地域政治史の研究を、中国文学と日本史学の学際的共同研究として進めることにより、1漢詩及び漢詩結社が形成する人的ネットワークが、一方では山陰地域に全国的にも有力な漢詩結社である剪淞吟社を生み出すとともに、2他方では克堂若槻礼次郎ら、中国宋代の士大夫層にも比定される官僚出身政治家をめぐる文化教養環境となることによって、3政治的立場の違いを超えた人的文化的交流関係を形成していることを実証的に明らかにする近代山陰地域における漢詩文学と地域政治史の研究を、中国文学と日本史学の学際的共同研究として進めることにより、1漢詩及び漢詩結社が形成する人的ネットワークが、一方では山陰地域に全国的にも有力な漢詩結社である剪淞吟社を生み出すとともに、2他方では克堂若槻礼次郎ら、中国宋代の士大夫層にも比定される官僚出身政治家をめぐる文化教養環境となることによって、3政治的立場の違いを超えた人的文化的交流関係を形成していることを実証的に明らかにする
海底遺跡の深度と分布を海水量荷重効果理論値と掘削法に基づいて探査する研究

本研究代表者および研究分担者は、西九州の海底遺跡の分布をハイドロアイソスタシ-で説明でき、かつ海底遺跡の分布を予測できると考え、西九州の北緯33度線にそった地域やその周辺で掘削法(ボーリング)と14C年代測定、貝・珪藻化石、硫黄分析によって、過去1万年の海水準変動を明らかにしてきた。北緯33度線各地における海水準の観測値の結果は、ハイドロアイソスタシ-の理論計算値と一致し、海洋(東シナ海)側が沈降し陸(九州)側が隆起する傾向を示していることから、これらの地域の地殻変動はハイドロアイソスタシ-によると判断される。また、氷河性海水準変動モデルをもとに、各時代のハイドロアイソスタシ-の理論計算に基づく海面の高さと当時の旧汀線付近地形の分布を示した。これにより、各時代の遺跡分布の下限高度が明らかとなった。しかし、遺跡探査にはもっと大縮尺、例えば1/5万や1/2.5万の旧汀線分布図が必要であり、各調査地域ごとに作成中である。
遷移金属触媒による高選択的アリルカップリング反応の開発

遷移金属触媒を利用した末端アルキンの直接アリル化反応の開発に成功した。具体的には、触媒量の塩化銅(1)ならびに1,10-フェナントロリンと量論量のリチウム-t-ブトキシドの存在下、種々の末端アルキン(シリルアセチレン・脂肪族アセチレン・芳香族アセチレン)とZ体の第2級リン酸アリルの反応が極めて高いγ位選択性及びE体選択性を伴って進行することを見出した。本反応は生理活性化合部の合成等で重要な合成中間体となるスキップドエンイン類を容易に合成可能な画期的手法である。同種の変換反応はこれまで末端アルキンを直接用いることはできず、反応性の高い有機金属反応剤による事前活性化が必須であり、官能基許容性に問題を残していた。一方で本反応は、末端アルキンを直接原料として用いることができ、優れた官能基許容性を獲得している。エステルやハロゲンをはじめとした分子の機能発現に重要なものから更なる変換に応用可能なものまで種々適応可能であった。さらに光学活性なリン酸アリル類を用いた反応では1,3-synの立体化学を伴って光学活性な生成物が得られる。生成物である1,4-エンイン誘導体はヘテロ環構築をはじめとした様々な変換反応を実施することが可能であり、実際に本手法を用いたゴナドドロピン放出ホルモン拮抗剤(GnRH antagonist)の形式全合成を達成した。また本反応は、その位置選択性の傾向からヘテロクプラートを経由していることが強く示唆されている。このことは本反応の位置選択性の発現に関わる重要な知見である。遷移金属触媒を利用した電子不足アレーン類の直接アリル化反応の開発に成功した。具体的には、塩化銅(I)を触媒に用い量論量のリチウム-t-ブトキシド存在下、アゾール類・ピリジン-N-オキシド誘導体・フルオロアレーン類とZ体の第2級リン酸アリルの反応が極めて高いγ位選択性及びE体選択性を伴って進行することを見出した。本反応は生理活性化合物によく見られるヘテロ芳香環や機能性材料の重要な骨格となるフルオロアレーンを直接2級アルキル化できる画期的な手法である。C-H結合の直接官能基化法は短段階で効率的な理想的な有機合成を実現するためこれまで様々な研究がなされてきたが、一般に過酷な反応条件が必要なことから立体化学の制御に焦点が置かれたものはほとんどなかった。一方で本反応は、原料として光学活性なリン酸アリルを用いると、反応は立体特異的に進行して電子不足アレーン類のα位に立体中心を有する生成物を得ることができる。ヘテロ芳香環に対する立体化学を制御した2級アルキル基の導入はこれまで特定の基質に対する限られた例しか知られておらず、本反応はより一般性の高い合成手法である。さらに、温和な条件で反応が進行するため幅広い官能基許容性を達成している。エステルやハロゲンをはじめとした分子の機能発現に重要なものから更なる変換に応用可能なものまで種々適応可能であり、複雑な生理活性化合物の合成後期に応用可能である。また、反応機構を探索することで本反応はモノアリールヘテロクプラートを経由していることが示唆された。目的1の新規パラジウム錯体触媒の創製は早期に良い配位子デザインに到達することができた。また、本年度と来年も継続して研究予定であったヘテロアレーンのアリル化(目的2)は本年度中に一定の成果を出すことができた。今後は多成分カップリングの開発(目的3)に着手する。複数の反応剤を同時に使用するため選択性の制御が課題となる。触媒系、反応剤、反応条件等を精査してその達成を目指す。
ほ乳動物細胞における複製開始複合体形成とその染色体安定性への関与の分子機構

遺伝情報の本体である染色体DNAは、細胞増殖時に過不足なく正確に受け継がれなくてはならない。その異常は細胞死、あるいはがん化などを引き起こす。本研究では、細胞が二つに分裂する際にDNAを正確に一度だけ複製するための精緻なしくみ(分子機構)を明らかにした。特に、Cdt1分子が極めて厳密な制御を受けている事、そしてその制御が正確なDNA複製にとって必須であることを明らかにした。これらの知見に基づき、Cdt1を分子標的とした抗がん剤開発の可能性を見いだし、その検討も始めた。併せて、これらDNA複製制御蛋白質が他の染色体恒常性維持にも関与している事が明らかとなって来た。Cdt1はORC/CDC6と共に、複製ヘリカーゼであるMCM複合体のloading機構を形成している。S期以降は再複製防止のために、ORC/CDC6はCdkリン酸化により抑制される。Cdt1抑制は抑制蛋白gemininの結合によると考えられていたが、Cdkリン酸化後にSCF-Skp2ユビキチンリガーゼに認識される分解制御も受けていることを、藤田らは以前明らかにした。藤田と西谷らは本年度共同研究を進め、Cdt1がさらにCu14-DDB1ユビキチンリガーゼによっても分解制御されていることを明らかにした。またCdt1結合蛋白の探索から、Cu14-DDB1によるCdt1ユビキチン化をPCNAが仲介しているという、極めて興味深くホットな所見を得て報告した。さらに、藤田らは他の新規Cdt1結合蛋白について研究を進めると伴に、Cdt1の脱制御が再複製を誘導することなく染色体障害を引き起こしATM-Chk2系を活性化すること、そしてヒト正常繊維芽細胞に染色体不安定性を誘導することを明らかにした。Cdt1はがん細胞において過剰発現しており、またそれが発がんに関わっている可能性も報告されつつある。よって上記の知見は、発がんにつながる新たな染色体不安定性誘導の分子機構を明らかにしたものと言える。加えて藤田らは、ORCがテロメア結合蛋白TRF2と結合し、この結合が複製制御とテロメア構造の維持において重要な役割を演じている可能性を示唆するデータを得つつあり、検討を進めている。一方水野らは、ORCおよびDNAポリメラーゼαの機能解析を進めた。その結果、マウスORC1、2、3、4にはスプライシングバリアントが存在する事、そしてORC1のバリアントには、核移行、リン酸化、タンパク質分解に重要なドメインが欠失している事を明らかにした。その意味については現在検討中である。また、マウスポリメラーゼαの温度感受性変異株を用いた解析から,ポリメラーゼαの変異がクロマチン構造の変化をもたらし、テロメア鎖の伸長反応に影響を及ぼすことを明らかにした。Cdt1はORC/CDC6と共に、複製ヘリカーゼMCM複合体のloading機構を形成し、染色体複製の細胞周期制御を行っている。S期以降は再複製防止のために、Cdt1はgeminin結合に加えて、Cdkリン酸化依存性SCF-Skp2ユビキチンリガーゼ及びPCNA依存性Cu14-DDB1ユビキチンリガーゼによる分解制御を受けていることを、藤田と西谷は明らかにした。西谷はさらに、CDKインヒビターp21もPCNA依存的にCu14-DDB1により分解されることを明らかにした。PCNA依存性Cu14-DDB1によるこれらのタンパク質の分解は、重要なG1-S期移行制御機構の一つであろう。また藤田は、Cdt1がAPC/C^<Cdh1>ユビキチンリガーゼによる制御も受けていることを明らかにした。これらの厳密な制御から予想される通りCdt1の脱制御は染色体不安定性を誘導した。そしてCdt1の生理的・病態生理的機能に、Cdt1新規結合蛋白であるtopoisomerase及びSNF2が関与していることが示唆されつつある。加えて藤田は、ORCが主にテロメア結合蛋白TRF2との結合を介してテロメアに集積し、テロメアにpre-RCが細胞周期依存的に形成されること、そしてORCがテロメア恒常性維持に重要であることを明らかにした。これは、複製開始制御とテロメア制御と言う核内の重要なイベントを関連づける新しい視点の発見である。一方水野は、ほ乳動物細胞の複製前複合体の試験管内再構成に向け取り組んだ.マウスORC1-5,Cdt1,CDC6,MCM2-7を発現・精製し、ポリグルタミン酸脱凝縮カエル精子核を鋳型としてpre-RCを再構成させた。gemininにより不活1生化させたカエル卵抽出液中で標識dCTPの取り込みを測定し複製前複合体の活性を評価した。ORCに依存したdCTP取り込みが認められたことから、試験管内でのpre-RC構築に成功したものと考えている。

Cdt1はORC/CDC6と共に,複製ヘリカーゼMCM複合体の染色体へのloadingを行っている。S期以降は再複製防止のために,gemininに加えCdkリン酸化依存性SCF-Skp2ユビキチンリガーゼ及びPCNA依存性Cu14-DDB1ユビキチンリガーゼによる分解制御をCdt1は受けていることを,藤田と西谷は明らかにした。このことに一致して,Cdc2とgemininの発現を抑制すると再複製が高頻度で起こることがわかった(西谷)。さらに藤田は,Cdt1がG1/G0期にAPC/C^〈Cdh1〉ユビキチンリガーゼによる制御を受けていることも明らかにした。これら厳密な制御からも予想されるCdt1の強いMCM loading能力には,新規結合蛋白であるtopoisomerase,SNF2,及びGRWD1(新規ヒストン結合性WD-repeat蛋白質)が関与していることが明らかとなりつつある(藤田)。加えて藤田は,ORCが主にテロメア結合蛋白TRF2との結合を介してテロメアに集積し,テロメアにpre-RCが細胞周期依存的に形成されること,そしてORCがテロメア恒常性維持に重要であることを明らかにした。西谷はまた,CDKインヒビターp21もCdt1と同様にPCNA依存的にCu14-DDB1により分解されることを明らかにした。PCNA依存性Cu14-DDB1によるこれらのタンパク質の分解は,重要なG1-S期移行制御機構の一つであろう。水野は,ほ乳動物細胞の複製前複合体の試験管内再構成に向け取り組んでいる。N末欠失Orc1-5複合体を精製し,カエル精子核を鋳型とした試験管内複製系で活性を調べたが,十分な活性を持たずむしろ複製反応を阻害し,完全長のOrc1-5複合体が必要不可欠であると考えている。現在,バキュロウイルスでの完全なORCの精製が可能となりつつある。Cdt1はORC/CDC6と共に、複製ヘリカーゼMCMの染色体loadingを行っている。S期以降は再複製防止のためこれらの機能は抑制され、特にCdt1は複数の機構により厳密に制御されている(藤田、西谷)。さらに、Cdt1はG1/G0期にはAPC/C^<Cdh1>ユビキチンリガーゼによる制御を受けている(藤田)。その厳密な制御から予想されるCdt1の強いMCM loading能には、新規結合蛋白であるtopoisomerase、SNF2、及びGRWD1(新規ヒストン結合性WD-repeat蛋白質)が関与していることが明らかとなりつつある(藤田)。Cdt1制御は中心的ではあるが、正常ヒト細胞においてはその脱制御のみでは再複製は起こらず、少なくともCdt1とORC1あるいはCDC6の脱制御が必要である事を明らかにした(藤田)。このことからも、ライセンシング制御の重要性が一層明らかとなった。加えて藤田は、CDC6がATRと相互作用し複製チェックポイント制御にも関与している事を示した。西谷は、CDKインヒビターp21もCdt1と同様にPCNA依存的にCu14-DDB1^<Cdt2>により分解されることを明らかにした。組換えCu14-DDB1^<Cdt2>複合体を精製し、Cdt1とp21のin vitroユビキチン化系を確立した。
頭頸部癌におけるPGP9.5の脳腫増殖抑制メカニズムの解明と臨床応用

ゲノムに書かれた遺伝情報,つまり遺伝子の塩基配列が変化しないにもかかわらず個体発生や細胞分化の過程において遺伝子発現を制御する現象がエピジェネティックスである。癌におけるエピジェネティックな異常には, DNAメチル化の異常,ヒストン修飾の異常,そしてゲノムインプリンティングの異常などがあげられるが,特定の遺伝子や領域では高度にメチル化されており癌化に寄与していると考えられる。我々はエピジェネティックな変化に注目し、頭頸部癌において高頻度にDNAメチル化されている遺伝子、PGP9.5を同定した。これまでに治療を行った頭頸部癌患者の生検サンプルからDNAを抽出し、PGP9.5のDNAメチル化を解析した。具体的には抽出したDNAをBisulfite処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシン(5-メチルシトシン)は変換されない。その塩基配列の違いを利用してメチル化の有無をPCR(methylation specific PCR、MSP)で検出する。特に本研究ではリアルタイムPCRをもちいたQuantitative MSP(QMSP)にて遺伝子のメチル化の有無、程度を測定する。本法を用いることによりメチル化の定量的な解析を行うことができ、かつ感度、特異度の高い解析が可能となる。対象は、当科にて治療を行った頭頸部癌患者(78例)で、部位別の内訳は下咽頭癌32例、中咽頭癌19例、喉頭癌27例である。すべての症例が放射線治療もしくは化学放射線治療により加療された。PGP9.5のDNAメチル化解析は、生検サンプルから型の如くDNAを抽出し行った。PGP9.5のメチル化は下咽頭癌では18例(56.3%)、中咽頭癌では7例(36.8%)、喉頭癌では14例(51.9%)に検出され、臨床的に悪性度の高い下咽頭癌で最も高頻度に認められた。またp53の遺伝子変異との関連を検討すると、PGP9.5のメチル化とp53の遺伝子変異は逆相関する傾向が認められた。臨床因子との関連では、PGP9.5のmethylation indexは病期が進行するにつて、高い値を示していた。以上のことから、PGP9.5のメチル化と頭頸部癌の悪性度との関連が示唆された。これまでに当科にて治療を行った頭頸部癌患者(82例)を対象にPGP9.5のメチル化を検討した。部位別の内訳は下咽頭癌32例、中咽頭癌20例、喉頭癌30例で、病期はI:7例、II:11例、III:10例、IV:28例であった。抽出したDNAをBisulfite処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシン(5'-メチルシトシン)は変換されない。その塩基配列の違いを利用してメチル化の有無をPCR(methylation specific PCR、MSP)で検出した。特に本研究ではリアルタイムPCRを用いたQuantitative MSP(QMSP)を行った。

本法を用いることによりメチル化の定量的な解析を行い、かつ感度、特異度の高い解析が可能であった。PGP9.5のメチル化は下咽頭癌では21例(65.6%)、中咽頭癌では9例(45.0%)、喉頭癌では16例(53.3%)に検出された。臨床因子との関連を見てみると、Tステージが進むにつれてDNAメチル化の程度もより高い値を示していた。病期やNステージとの関連は認められなかった。また観察期間は短いが、PGP9.5メチル化を伴った症例の予後が不良である傾向が認められた。以上のことから、PGP9.5のメチル化と頭頸部癌の局所浸潤および化学放射線療法に対する治療抵抗性との関連が示唆された。我々はエピジェネティックな変化に注目し、頭頸部癌において高頻度にDNAメチル化されている遺伝子、PGP9.5を同定した。これまでに治療を行った頭頸部癌患者の生検サンプルからDNAを抽出し、PGP9.5のDNAメチル化を解析した。具体的には抽出したDNAをBisulfite処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシン(5'-メチルシトシン)は変換されない。その塩基配列の違いを利用してメチル化の有無をPCR(methylation specific PCR、MSP)で検出する。特に本研究ではリアルタイムPCRをもちいたQuantitative MSP(QMSP)にて遺伝子のメチル化の有無、程度を測定する。本法を用いることによりメチル化の定量的な解析を行うことができ、かつ感度、特異度の高い解析が可能となる。対象は、当科にて治療を行った頭頸部癌患者(78例)で、部位別の内訳は下咽頭癌32例、中咽頭癌19例、喉頭癌27例である。すべての症例が放射線治療もしくは化学放射線治療により加療された。PGP9.5のDNAメチル化解析は、生検サンプルから型の如くDNAを抽出し行った。PGP9.5のメチル化は下咽頭癌では18例(56.3%)、中咽頭癌では7例(36.8%)、喉頭癌では14例(51.9%)に検出され、臨床的に悪性度の高い下咽頭癌で最も高頻度に認められた。またp53の遺伝子変異との関連を検討すると、PGP9.5のメチル化とp53の遺伝子変異は逆相関する傾向が認められた。臨床因子との関連では、PGP9.5のmethylation indexは病期が進行するにつれて、高い値を示していた。以上のことから、PGP9.5のメチル化と頭頸部癌の悪性度との関連が示唆された。ゲノムに書かれた遺伝情報,つまり遺伝子の塩基配列が変化しないにもかかわらず個体発生や細胞分化の過程において遺伝子発現を制御する現象がエピジェネティックスである。癌におけるエピジェネティックな異常には,DNAメチル化の異常,ヒストン修飾の異常,そしてゲノムインプリンティングの異常などがあげられるが,特定の遺伝子や領域では高度にメチル化されており癌化に寄与していると考えられる。我々は頭頸部癌において高頻度にDNAメチル化されている遺伝子、PGP9.5を同定した。対象は頭頸部扁平上皮癌82例(下咽頭癌32例、中咽頭癌21例、喉頭癌29例)で、メチル化の検出はMethylation specific PCR(MSP)法を用いて行った。
研究者に対するインセンティブ設計と知的生産性に関する研究

本研究では、(1)企業レベルや発明者レベルの分析に、特許の書誌情報を利用できるように、出願人情報の名寄せを行い、製造業に属する上場企業1683社について名寄せデータベースを作成した。その上で、(2)発明者情報を用いて、企業が導入している発明報奨制度が企業内研究者のインセンティブ付与に貢献したのかどうかを発明者レベルのマイクロデータを利用して明らかにした。分析結果では、金銭的インセンティブの付与は非常に限られたシチュエーションでのみ有効であることが明らかとなった。知的財産研究所より提供されている特許書誌情報データベース『IIPパテントデータベース』と『平成14年度民間企業の研究活動に関する調査』の企業別の個票データと接続するために必要となった、書誌情報の企業名の名寄せ作業を実施した。特許データベースにおける企業名の表記揺れは世界的な問題であり、現在、ヨーロッパ特許庁や米カリフォルニア大学ブラウニーホール等によっても作業が進められている。精密な作業により時間を要しているが、特に古い年代についてはほぼ作業が終了している。今後2002年以降の最新の特許データについて新たに追加された表記揺れについて作業を実施する。名寄せ作業の結果完成した表記揺れ修正データベースについてはできるだけはやく公開することを考えている。また、文部科学省から『平成14年度民間企業の研究活動に関する調査』の個票データの利用許可が下りたため、現在データベースを整理している。企業や研究者の研究成果を測る上で特許データの利用が近年盛んになっているが、本稿では利用上の問題となっている企業名の名寄せ作業を実施した。具体的には、本分析で利用する製造業に属する上場企業について、単純な表記揺れだけでなく、合併や企業内のリストラクチャリングに伴う企業名の変遷を考慮した名寄せを行った。データは外部に無料で公開されているIIPパテントデータベースの基となっているPAT-R0811を利用した。また名寄せの精度を担保するために、外部データベースとの比較を行った。このような特許データの名寄せの必要性は、近年研究者の間で共有されておりTrajitenberg et al.(2006)やRaffo and Lhuillery(2009)、Thoma etal.(2010)等の論文で方法論等について議論されているが、近年問題として取り上げられているのが、名寄せの精度である。名寄せには、正しい企業名なのに異なると判断すると間違った企業名を正しいと判断してしまうという2つの誤差がある。このような誤差をいかに小さくするかが大きな課題であるが、本研究では、その誤差を最小にするために、プログラミングによるマッチングではなく、目視による識別を実施した。また必要に応じて特許書誌情報記載の企業に問い合わせを行い精度の向上につとめた。さらに、外部データベースとの比較により、その精度を確認した。このような精度の高い名寄せデータベースは、今後の自動名寄せの精度のベンチマークに利用できる可能性がある。特許データを利用しない部分では、企業の研究者が発明報奨制度という成果賃金にどれ位反応するかのを発明者レベルのデータを利用して実証分析を行った。その結果、金銭的賃金に魅力を感じる研究者において、報奨制度は有効に機能することを明らかにした。当初より実施している特許書誌情報データでの出願人名に対する同名企業や表記揺れを統一するための名寄せ作業を完了させた。具体的な手順として、合併や社名変更に伴う企業名の変遷を調査し、それらに該当する出願人をサーチした後、本社等の所在地住所データを用いて、同名企業を排除するという作業を目視で実施した。また、名寄せの精度を確認するために、公表されている特許書誌情報データベースでの出願人別特許件数と比較し、統計的に精度の信頼性を確認した。その結果、名寄せ作業の実施企業のうち、6割程度の企業で統計的に信頼できる精度であるという結果を得た。この結果は、一方で、出願人名の名寄せ精度の確保が非常に困難であることも明らかになったと思われる。本内容については、ディスカッションペーパーにまとめている。また、他研究者が利用できるように、名寄せ結果についてもインターネット上に公開している。企業研究者の分析については、名寄せデータの結果を用いて、発明者レベルの発明ライフサイクルに関する分析を行っている。現時点では、(1)学歴が高くなるにつれて、生涯を通じての発明生産性も高まる、(2)発明生産性は経験に対して逆U字型の傾向が見られる、(3)博士課程を経る等の高学歴化による就業機会の遅延がもたらす潜在的な生産のロスは、就業後早期に解消される、等のことが明らかとなってきている。この結果は、大卒等による企業内訓練よりも博士課程を経る方が生涯にわたり高い生産性を維持することを示しており、企業のイノベーション活動の面においても、博士課程出身者の増加はプラスの影響をもたらす可能性を示唆している。
悪性胸膜中皮腫に対するオートファジー誘導薬物療法の開発

悪性胸膜中皮腫は、治療抵抗性の悪性腫瘍であり、新規治療法の開発が求められている。これまで、スタチンの悪性胸膜中皮腫に対するin vitroでの抗腫瘍効果に関する報告はあるが、その詳細な作用機序については検討されていない。我々は、スタチンがin vivoで悪性胸膜中皮腫に対して抗腫瘍効果を持つこと、またオートファジー誘導がその機序に関与していることを明らかにした。本研究の目的は、メバロン酸回路阻害薬であるロバスタチンを用いて、その抗腫瘍効果・オートファジー誘導機序を明らかにすることである。【ロバスタチンの殺細胞効果】ロバスタチン10μMはヒト悪性胸膜中皮腫ACC-MESO1細胞のcell viabilityを40%低下させ、その効果はメバロン酸回路代謝産物であるGGPPの同時投与で完全にレスキューされた(MTTアッセイ)。【ロバスタチンの遊走・浸潤抑制効果】Wound healing assayにてロバスタチン10μMは投与48時間後にACC-MESO1細胞の遊走を有意に抑制し、その効果はGGPPの添加でレスキューされた。【ロバスタチンのオートファジー誘導効果】ロバスタチン投与によってACC-MESO1細胞に細胞死が起きているにも関わらず、代表的なアポトーシス評価法でアポトーシス誘導を認めなかった。一方、ロバスタチン10μM投与48時間後に、ウェスタンブロットにてLC3BII(オートファジーのマーカー)の有意な増加と、GGPP添加によるレスキューを認めた。またオートファジー阻害薬の同時投与によりロバスタチンの殺細胞効果は有意に抑制された。さらに電子顕微鏡的検討によりロバスタチン10μM投与により、ACC-MESO1細胞内にオートファゴソームが形成されていることを確認した。ロバスタチンによる細胞死はオートファジー細胞死である可能性が高い。【メバロン酸回路阻害薬のオートファジー誘導機序】オートファジー誘導機序については、各シグナル経路をウェスタンブロットで検討した。ロバスタチンを投与したACC-MESO1細胞ではmTORおよびその下流因子のリン酸化状態に変化はなかった。ロバスタチンの抗腫瘍効果がオートファジーによるものであること。さらに、その誘導機序がmTOR independentであることがこれまでに明らかになった。悪性胸膜中皮腫は先進国で急増している悪性腫瘍であるが、従来の集学的治療の有効性が低く、新機序による治療が求められている。我々は高脂血症治療薬HMG-CoA Reductase Inhibitorであるロバスタチンの抗腫瘍効果に着目した。超免疫不全マウスであるNOD/SCID/γnull(NOG)マウスの左胸腔内にヒト悪性胸膜中皮腫ACC-MESO-1細胞を移植すると、8週間後に左胸腔内に原発巣、右胸腔内およびリンパ節に転移巣を形成した。ヒト悪性胸膜中皮腫が多発転移巣を形成するマウスモデルはこれまでにほとんど報告がない。このマウスに、ロバスタチン12,5mg/kgを週3回・8週間投与したところ、原発巣・転移巣ともに腫瘍増殖は抑制された。また腫瘍組織の免疫組織染色を行ったところ、オートファジーマーカーであるLC3とBECLIN陽性細胞が、ロバスタチン投与群において有意に多かった。また、In vitroにて、ロバスタチンはACC-MESO-1細胞のviabilityおよび遊走を抑制した。In vitro、in vivoでロバスタチンの作用機序を検討した結果、ロバスタチンによる抗腫瘍効果にはアポトーシスではなく、オートファジーが関与していることが明らかになった。またそれが代表的なオートファジー誘導経路であるmTOR経路ではなく、Rho/phospholipase C/inositol triphosphate経路を介するものであることをin vitroで明らかにした。これはスタチンの抗腫瘍効果の機序としては新規のものであり、抗癌治療の新しい標的経路となりうる。
土壌腐植酸中の螢光成分の化学的特性と起源に関する研究

植物炭化物が土壌腐植酸中の蛍光成分の給源となっているか否かを検討するため、実験室内で調製したススキ炭化物および野焼き跡地で採取した植物炭化物から酸化処理後に抽出した腐植酸をセファデツクスゲルクロマトグラフィーにより蛍光画分と腐植画分に分画し、3次元蛍光スペクトルを測定したところ、蛍光画分の蛍光強度は腐植画分と比べて高く、土壌腐植酸の蛍光画分と類似した蛍光特性を示した。さらに、土壌試料から炭化物を分離するとともに、腐植酸を抽出してサイズ排除クロマトグラフィーにより蛍光成分の量を推定し、土壌の炭化物量と腐植酸中の蛍光成分量との関係を検討したところ、炭化物が多い黒ボク土および褐色森林土の腐植酸で蛍光成分の量が多く、炭化物の少ない沖積土で蛍光成分が少ないことが認められた。同時に、植物遺体の分解過程において蛍光成分が生成するかどうかを検討するため、土壌に植物遺体を添加して培養し、抽出した腐植酸をサイズ排除クロマトグラフィーにかけるとともに3次元蛍光スペクトルの測定を行ったが、新たな腐植酸蛍光成分の生成は認められなかった。以上のことから、土壌腐植酸の蛍光成分は、植物遺体の腐植化過程では生成せず、植物炭化物がその給源となっていると考えられた。さらに、蛍光成分のサイズ排除クロマトグラムが土壌生成環境を解析する際のフィンガープリンティングとして利用できるかどうかを検討するため、土壌タイプの異なる各種の土壌試料から抽出した腐植酸についてサイズ排除クロマトグラフィーを行ったところ、黒ボク土、褐色森林土、沖積土では明らかに異なる溶離パターンを示し、土壌腐植酸の蛍光成分の組成が土壌生成環境により異なることが判明した。したがって、蛍光成分のサイズ排除クロマトグラムは土壌生成環境を解析する際のフィンガープリンティングとして利用可能であると考えられた。土壌腐植酸中の蛍光成分に富んだ画分(蛍光画分)は芳香族性が著しく強いが、類似した^<13>C-NMRスペクトルが埋没黒ボク土腐植酸においても認めれられる。そこで、土壌腐植酸の蛍光成分の起源を検討するための第一段階として、母材の堆積年代の異なる埋没黒ボク土から腐植酸を抽出し、セファデックスクロマトグラフィーによって蛍光画分とそれ以外の画分(腐植画分)に分画後、高速サイズ排除クロマトグラフィー、紫外可視吸収スペクトル、3次元蛍光スペクトル、CP-MAS ^<13>C-NMRスペクトル、MALDI-TOF MSにより化学的性状を解析した。埋没黒ボク土の腐植酸は、堆積年代が古くなるほど分子サイズが小さくなると同時に芳香族性が強くなり、蛍光画分と腐植画分は非常に類似した^<13>C-NMRスペクトルを示すようになった。しかし、^<13>C-NMRスペクトルは似ていても、蛍光画分と腐植画分とが厳然と区別でき、腐植画分の蛍光は蛍光画分と比べて微弱であったことから、埋没によって土壌腐植酸の側鎖が脱離して芳香族性が強くなっても蛍光成分に転化するするわけではないことが示唆された。一方、土壌中に含まれる植物炭化物も腐植酸の蛍光画分によく似た^<13>C-NMRスペクトルを示すことから、土壌腐植酸の蛍光成分が植物炭化物に由来する可能性についても検討した。市販木炭、実験室内で調製したススキ炭化物および野焼き跡地で採取した植物炭化物について酸化処理後に腐植酸を抽出し、上記と同様の手段で化学的性状を解析したところ、炭化物腐植酸が土壌腐植酸の蛍光画分と同じく芳香族性の非常に強い構造をとっていることが判明した。ただし、3次元蛍光スペクトルの測定から、土壌腐植酸の蛍光画分と同一波長の蛍光ピーク以外に異なった波長にも蛍光ピークが存在したため、炭化物腐植酸が土壌腐植酸の蛍光画分の給源であるとは断定できなかった。この点については、今後の検討が必要であると考えられた。

さらに、蛍光成分のサイズ排除クロマトグラムが土壌生成環境を解析する際のフィンガープリンティングとして利用できるかどうかを検討するため、土壌タイプの異なる各種の土壌試料から抽出した腐植酸についてサイズ排除クロマトグラフィーを行ったところ、黒ボク土、褐色森林土、沖積土では明らかに異なる溶離パターンを示し、土壌腐植酸の蛍光成分の組成が土壌生成環境により異なることが判明した。したがって、蛍光成分のサイズ排除クロマトグラムは土壌生成環境を解析する際のフィンガープリンティングとして利用可能であると考えられた。
3色FISH法を用いた運動能良好ヒト精子の染色体異数性に関する研究

【方法】4人の健康男性から採取した精液をm-BWW(modified Biggers,Whitten and Whittingham)液で洗浄した後1時間Swim-upし、上層の運動良好精子(A群)と下層の精子(B群)を分離回収した。両群精子および原精液の精液パラメーター(精子濃度、運動率、精液量)を検査した後、両群の精子をスライドグラス上に固定しdithiothreitolで前処理してFISH(Fluorescence in situ hybridization)法に供した。FISH法はOncor社のD17Z1、D18Z1の2種類のDNAプローブを用いたdual color法で行い、蛍光顕微鏡下に各々最低6000個の精子核について二人の検者による二重盲検でスポット数を算定した。【結果】いずれの例も原精液パラメーターはWHOの基準を満たす正常値で、A群精子はB群精子より良好な運動率を示した。FISH法では、総数48582個の精子のうち48512個(99.9%)で判定可能なスポットが得られた。その結果、17番、18番のdisomy精子の頻度はA群では平均0.11%(0.08-0.12%)、0.08%(0.05-0.15%)、B群では平均0.12%(0.08-0.15%)、0.10%(0.07-0.17%)で両群間に全く差異を認めず、一方diploid精子の頻度は、各々0.11%(0.06-0.18%)、0.21%(0.12-0.40%)でA群で低い傾向が見られたが、いずれも両群間に統計学的には有意差を認めなかった。【結論】FISH法は多数の精子についての数的染色体異常の検討に有用であることが確認された。Swim-up法は運動良好精子の分離には有効でdiploid精子の分離にも多少関与しているが、しかしdisomy精子の分離には直結しないことが示唆された。
動脈硬化の早期発見に向けた新たな頸動脈エコー動画解析による動脈硬化度の定量

【目的】現在,患者の血管年齢の推定は心臓足首血管指数(CAVI)を用いて行っている.我々は,血圧変動に伴う頸動脈壁の動きを頸動脈エコー動画に記録し,その画像解析から血管年齢を推定する新たな方法を開発した.この方法で得られた血管年齢をCAVIによるそれと比較し,本法の信頼性を明らかにする.【方法】書面で同意が得られ,CAVIの計測と左右の頸動脈エコー検査を連続して行った330名の患者のうち,医療面接や血液検査で動脈硬化のリスクを評価できた269名(女性158名,平均67±11歳)を対象とし,CAVIと頸動脈エコーのそれぞれから血管年齢を左右別々に求めた.それぞれの検査において実年齢より5歳以上血管年齢が高かった患者を血管年齢進行群,それ以外を正常群とした.動脈硬化リスク因子(喫煙,高血圧症,糖尿病,脂質異常症)のうち3つ以上ある患者,または動脈硬化性疾患の既往のある患者を動脈硬化高リスク群,それ以外を正リスク群とした.2つの方法それぞれでの動脈硬化高リスク群に対する感度,特異度,正確度を求めた.【結果】CAVIと頸動脈エコーから推定した血管年齢にはR=0.357、後者と頸動脈内膜中膜厚(IMT)との間にもR=0.255と,いずれも弱い相関が認められた.実年齢との差はCAVIでは-2.0±12.0歳,頸動脈エコーでは0.8±12.6歳(P=0.001)であったが,2群の分散には差が認められなかった.動脈硬化高リスク群に対する検査の有用性は,CAVIでは感度35%,特異度85%,正確度73%,頸動脈エコーでは感度46%,特異度61%,正確度58%であった.【結論】頸動脈エコーから推定した血管年齢の信頼性は,CAVIのそれと比較し同等もしくはやや劣っていた.硬化度を推定している動脈が2つの方法で異なることが一因と考えられる.IMTなどとの組み合わせによる正確度の向上や臨床的有用性の検証が今後の課題である.現在臨床応用されている動脈硬化の定量的指標として、頸動脈エコー検査による平均内膜・中膜厚(mIMT)、プラークの存在、四肢の血圧同時測定による心臓足首血管指数(CAVI)がある。我々は、動脈そのものの硬化度に注目し、頸動脈エコーでの経時的な壁の動きから動脈壁(主として外膜)の硬さを測定する新たな動脈硬化指標(動脈硬化係数:Eth)を開発した。本法では年齢との関係が直線的であり、他の方法と比較して若年層での動脈硬化の検出感度が高いのが特徴である。本研究では、(1)動脈硬化係数(Eth)の性・年齢別正常範囲の設定、(2)Ethと他の動脈硬化指標(IMTとCAVI)との相関、(3)Ethと関連する生活習慣因子や疾患の解析、の3点を明らかにすることを目的としている。今年度は、種々の疾患を持つ外来患者109名(2390歳、男性41名、女性68名)を対象に、本人の同意を得てCAVIと頸動脈エコー検査をほぼ同時に行い、8秒間の頸動脈長軸でのエコー動画画像を解析してEthを算出し、既存の正常対象者から得られた年齢別の正常範囲から血管年齢を求め、CAVIでの血管年齢との比較を行った。2名は撮像不良のため解析できなかったため107名で解析を行った。EthとCAVIから得られた血管年齢には、右が相関係数R=0.176、左がR=0.149と両者には明らかな相関は認められなかった。CAVIからは実年齢に比較して非常に若い血管年齢が示されることがしばしばあったが、頸動脈エコーからの血管年齢では実年齢との著しい乖離なかった。また、頸動脈エコーでの血管年齢とmIMTとの相関は右R=0.200、左R=0.207で、CAVIでの血管年齢とmIMTとの相関は右R=0.143、左R=0.032で、頸動脈エコーの方がCAVIよりもmIMTとの相関はやや強かった。目標としていた年間100例の頸動脈エコー動画の撮像とそれによる血管年齢の算出が達成できた。ただ、疾患別の解析などの詳細なデータ解析は現在進行中である。現在,血管年齢の推定は主にCAVIを用いて行っている.今回,我々が開発した頸動脈エコー動画像を用いて血圧変動に伴う頸動脈血管壁の動きから推定した血管年齢の妥当性を,心臓足首血管指数(CAVI)によるそれと比較した.連続してCAVIの計測と左右の頸動脈エコー検査を行った147名の患者(平均年齢67±12歳、男性62名、女性85名)を対象とし,それぞれから血管年齢を推定した.それぞれの検査において実年齢より5歳以上血管年齢が高かった患者を動脈硬化進行群,それ以外を正常群とした.一方,動脈硬化のリスク因子が3つ以上ある患者,または動脈硬化性疾患(脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、閉塞動脈硬化症)の既往のある患者を動脈硬化高リスク群,それ以外を低リスク群とした.2つの方法での動脈硬化高リスク群に対する感度,特異度,正診率を求めた.CAVIでは、右4名、左5名で閉塞性動脈硬化症のため血管年齢推定が正確にできなかった。頸動脈エコー検査では、左4名で血管年齢推定ができなかった。実年齢とCAVIの関係はR=0.747、実年齢と頸動脈エコーとの関係はR=0.416であった。

CAVIと頸動脈エコー動画像から推定した血管年齢にはR=0.354と弱い相関が認められた.年齢に比して動脈硬化が進行しているという診断に関しては,CAVIでは感度29%,特異度85%,正診率62%,頸動脈エコー動画像では感度49%,特異度71%,正診率62%であった.以上の結果から、頸動脈エコー動画像から推定した血管年齢は、CAVIから推定したものと正診率ではほぼ同等であると考えられる.この2年間で約250例の患者の頸動脈エコー検査とCAVIを同時に行うことができた。これによって、この2つの検査方法の関係を明らかにできる予定である。また、10歳程度の生命予後が悪いと言われている糖尿病患者やリウマチ患者でのデータの収集も順調であるが、予定数には至っていない。一方、人間ドックによる正常者での頸動脈エコー検査が数名程度しか収集できていない。【目的】現在,患者の血管年齢の推定は心臓足首血管指数(CAVI)を用いて行っている.我々は,血圧変動に伴う頸動脈壁の動きを頸動脈エコー動画に記録し,その画像解析から血管年齢を推定する新たな方法を開発した.この方法で得られた血管年齢をCAVIによるそれと比較し,本法の信頼性を明らかにする.【方法】書面で同意が得られ,CAVIの計測と左右の頸動脈エコー検査を連続して行った330名の患者のうち,医療面接や血液検査で動脈硬化のリスクを評価できた269名(女性158名,平均67±11歳)を対象とし,CAVIと頸動脈エコーのそれぞれから血管年齢を左右別々に求めた.それぞれの検査において実年齢より5歳以上血管年齢が高かった患者を血管年齢進行群,それ以外を正常群とした.動脈硬化リスク因子(喫煙,高血圧症,糖尿病,脂質異常症)のうち3つ以上ある患者,または動脈硬化性疾患の既往のある患者を動脈硬化高リスク群,それ以外を正リスク群とした.2つの方法それぞれでの動脈硬化高リスク群に対する感度,特異度,正確度を求めた.【結果】CAVIと頸動脈エコーから推定した血管年齢にはR=0.357、後者と頸動脈内膜中膜厚(IMT)との間にもR=0.255と,いずれも弱い相関が認められた.実年齢との差はCAVIでは-2.0±12.0歳,頸動脈エコーでは0.8±12.6歳(P=0.001)であったが,2群の分散には差が認められなかった.動脈硬化高リスク群に対する検査の有用性は,CAVIでは感度35%,特異度85%,正確度73%,頸動脈エコーでは感度46%,特異度61%,正確度58%であった.【結論】頸動脈エコーから推定した血管年齢の信頼性は,CAVIのそれと比較し同等もしくはやや劣っていた.硬化度を推定している動脈が2つの方法で異なることが一因と考えられる.IMTなどとの組み合わせによる正確度の向上や臨床的有用性の検証が今後の課題である.来年度は患者150名の他に人間ドックでの正常対象者50名を含めて、200例での解析を目標としている。患者では、70名を新たな患者を選び、今年度行ったと同様にCAVIでの血管年齢やmIMTとの相関に加えて解析をする。一方、80名を昨年度と同一患者とし、頸動脈エコーおよびCAVIでの血管年齢の1年での進行を確認する。疾患別の解析を行う。たとえば、関節リウマチに代表されるような慢性炎症性疾患では高サイトカイン血症によって血管年齢が正常者よりも進んでいることが予想される。また、糖尿病、高血圧症、脂質異常症、喫煙者でも同様なことが予想され、頸動脈エコーおよびCAVIでの血管年齢と実年齢との比較を疾患別に行う。頸動脈エコーとCAVIではそれぞれ測定している部位が異なる関係もあって、計測が正確にできない場合があることが判明した。今後はその要因を明らかにしてゆく。
mTORを介した心筋保護作用　ー虚血再灌流障害に対する新しい治療法の提案ー

心血管疾患は生活習慣の変化に伴い近年急増しており,心合併症発生予防とその治療は患者予後にとって重要な因子となっている。とりわけ心疾患と食生活との関連は深く,高脂肪食摂取による血清脂質レベルの上昇,その結果誘導される肥満との因果関係が明らかにされている。しかし一方で,心疾患における栄養療法については古くから国内外ともに水分と食塩制限以外に何ら記述がなく,予防的あるいは治療的に効果的な栄養介入はまだ十分に行われていないと考えられる。近年,申請者らはアミノ酸投与が心筋梗塞サイズを減少させ,予防的に心筋保護作用を示すことを動物モデルにおいて見出した。そこで,特にロイシンに注目し虚血前に投与することにより心筋保護作用が認められ,また,その作用がインスリンシグナル非依存的であることを明らかにするため実験を行った。前年度に引き続き,遊離単一心筋細胞を用い低酸素再灌流モデルにて研究を行った。ロイシン刺激の細胞に対しイムノブロットを用いてシグナル経路の活性化を調べた結果,ロイシンはインスリン受容体シグナルの下流シグナルには影響を与えることはなかったが,mTORやS6Kなどのシグナル活性を誘発することが明らかとなった。さらに,ミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響を明らかにするため,Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入,トランスフェクションさせた細胞を用い,ロイシンの心筋保護作用がどのように変化するかを調べた。その結果,Opa-1をノックダウンさせることでロイシンの心筋保護作用が棄却されることが明らかとなった。申請書に記載した研究目的に対し,平成30年度の低酸素時にミトコンドリア機能についてロイシンが与える影響に関する実験およびミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響に関する実験の進捗度合いはほぼ予定通りであり,おおむね順調と思われる。ミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響を明らかにするため,Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入,トランスフェクションさせた細胞を用い,ロイシンの心筋保護作用が棄却するかを調べた。Opa-1をノックダウンさせることでロイシンの心筋保護作用が棄却されることが明らかとなった。最終年度は,in vivo虚血再灌流実験を行うことで現在までの結果をより強固なものとする予定である。マウスを人工呼吸下に開胸,血行動態を測定しながら,心臓冠動脈を30分間閉塞し,2時間の再灌流を行う(コントロール群)。再び冠動脈を閉塞,Evans Blueを注入し心臓を取り出す。心臓をスライスし,再染色後心筋梗塞サイズを測定する。ロイシン群は,虚血再灌流前にロイシン(200 mg/kg i.v.)によるプレコンディショニングを行う。同様の実験をmTORノックアウトマウスを用いて行うことで,ロイシンのmTORを介するシグナルへの影響が明らかとなる。心血管疾患は生活習慣の変化に伴い近年急増しており,特に糖尿病を基礎疾患にもつ患者は発症率が高い。申請者らはこれまでに,アミノ酸投与が心筋梗塞サイズを減少させ,予防的に心保護作用を示すことを動物モデルにおいて明らかにした。そこで本研究では,アミノ酸,特にロイシンに応答するmammaliantarget of rapamycin(mTOR)に注目し,ロイシンの心筋保護経路にmTORがどのように影響するかを検討した。摘出心をランゲンドルフ酵素法にて灌流,得られた遊離心室筋細胞をディッシュに接着させたのち,通常培養液を「グルコースなし」のものに置き換え,特殊チャンバーを用い,1時間低酸素状況(95%N2, 5%CO2)に曝露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだした。その後1時間通常の培養状態に戻すことで再灌流状態とした。細胞をトリパンブルー染色することで死亡細胞と正常細胞を区別し,生存率を割り出した結果,ロイシンであらかじめ2時間刺激を与えた場合,心筋細胞保護効果が認められた。mTORinhibitorであるrapamycin,PI3K inhibitorであるwortmanninを用いて同様の実験を行うと,rapamycinは心筋保護作用が棄却されたが,wortmanninを加えてもロイシンの心筋保護作用は有意に変化することはなかった。これらのことより,ロイシンの心筋保護作用にmTORの経路が影響していることが示唆された。次に,ロイシン刺激の細胞に対しイムノブロットを用いてシグナル経路の活性化を調べた結果,ロイシンはインスリン受容体シグナルの下流シグナルには影響を与えることはなかったが,mTORやS6Kなどのシグナル活性を誘発することが明らかとなった。さらに現在,低酸素灌流モデルを用いてミトコンドリア機能についての研究を行っている。In vitro遊離心筋細胞を用い,低酸素モデルにて心筋細胞死亡率がロイシン刺激により低下することが明らかになった。また,これらのシグナルメカニズムについて各種ブロッカーを用いた実験で,ロイシンの心筋保護作用にmTORの経路が影響していることが示唆された。さらにロイシンはインスリン受容体シグナルの下流シグナルには影響を与えることはなかったが,mTORのシグナル活性を誘発することが明らかとなった。以上のように研究実施計画の平成29年度【実験1】がプロトコール通り順調に進んでおり,現在【実験2】にとりかかっている。

しかし一方で,心疾患における栄養療法については古くから国内外ともに水分と食塩制限以外に何ら記述がなく,予防的あるいは治療的に効果的な栄養介入はまだ十分に行われていないと考えられる。近年,申請者らはアミノ酸投与が心筋梗塞サイズを減少させ,予防的に心筋保護作用を示すことを動物モデルにおいて見出した。そこで,特にロイシンに注目し虚血前に投与することにより心筋保護作用が認められ,また,その作用がインスリンシグナル非依存的であることを明らかにするため実験を行った。前年度に引き続き,遊離単一心筋細胞を用い低酸素再灌流モデルにて研究を行った。ロイシン刺激の細胞に対しイムノブロットを用いてシグナル経路の活性化を調べた結果,ロイシンはインスリン受容体シグナルの下流シグナルには影響を与えることはなかったが,mTORやS6Kなどのシグナル活性を誘発することが明らかとなった。さらに,ミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響を明らかにするため,Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入,トランスフェクションさせた細胞を用い,ロイシンの心筋保護作用がどのように変化するかを調べた。その結果,Opa-1をノックダウンさせることでロイシンの心筋保護作用が棄却されることが明らかとなった。申請書に記載した研究目的に対し,平成30年度の低酸素時にミトコンドリア機能についてロイシンが与える影響に関する実験およびミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響に関する実験の進捗度合いはほぼ予定通りであり,おおむね順調と思われる。ミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響を明らかにするため,Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入,トランスフェクションさせた細胞を用い,ロイシンの心筋保護作用が棄却するかを調べた。Opa-1をノックダウンさせることでロイシンの心筋保護作用が棄却されることが明らかとなった。引き続きロイシンの心筋保護作用に対するミトコンドリア機能の影響についての研究を続け,実験1.の低酸素再灌流モデルにて,ミトコンドリア染色色素(MitoTracker),光褪色後蛍光回復法(FRAP assay)を用いてロイシンによるミトコンドリアダイナミックス(ミトコンドリアの分裂と融合)を明らかにする。分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べることで,ミトコンドリアの融合タンパクであるOpa-1が有意に増加することを明らかにする。Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入,トランスフェクションさせた細胞を用い,ロイシンの心筋保護作用が棄却するかを調べる予定である。最終年度は,in vivo虚血再灌流実験を行うことで現在までの結果をより強固なものとする予定である。マウスを人工呼吸下に開胸,血行動態を測定しながら,心臓冠動脈を30分間閉塞し,2時間の再灌流を行う(コントロール群)。再び冠動脈を閉塞,Evans Blueを注入し心臓を取り出す。心臓をスライスし,再染色後心筋梗塞サイズを測定する。ロイシン群は,虚血再灌流前にロイシン(200 mg/kg i.v.)によるプレコンディショニングを行う。