hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水溶性ニッケル-ルテニウム複核錯体を触媒とする水中窒素固定法の開発

本研究は、水中・常温・常圧でニッケル-ルテニウム複核錯体を触媒とする水素発生を伴う窒素固定法を開発に挑んだ。その結果、新規水溶性ニッケル-ルテニウムヒドリド錯体の合成と構造解析に成功した(2007年4月25日にプレスリリース)。さらに、ヒドリド錯体を触媒とする銅イオンの電子還元に成功した(2008年8月5日にプレスリリース)。合成した新規水溶性ルテニウム窒素錯体を溶存窒素センサーへと応用した。ニトロゲナーゼによる窒素固定の反応は、十分に窒素がある条件でも常に水素発生を伴う。そのため、研究の初期にはニトロゲナーゼはヒドロゲナーゼの一種であると考えられていた。しかし、ニトロゲナーゼの触媒反応における水素発生の理由については、現在でも依然として明らかになっていない。本研究ではニトロゲナーゼの触媒反応における水素発生をヒドロゲナーゼの行う水素分子の活性化に当てはめた。本年度は、水中・常温・常圧で水溶性ルテニウムアクア錯体と水素分子を反応させ、水素分子をヘテロリティックに活性化し、架橋ヒドリド配位子を持つ水溶性ルテニウムヒドリド錯体の合成に成功した(Science,2007,316,585-587)。さらに、架橋ヒドリド配位子を持つ水溶性ルテニウムヒドリド錯体を触媒とする「水中でpHに依存したカルボニル化合物の水素化と水素/重水同位体交換反応」に成功した(Proc.Natl.Acad.Sci.,USAに平成20年3月8日投稿)。本研究成果は、今後の水素活性化の基礎研究の発展に寄与するとともに、次期エネルギー源としての水素の研究開発につながると期待される。また、本研究成果は、平成19年4月25日にプレスリリースされ、Science誌のPerspectiveで紹介、C&EN NEWS(ACS)で紹介、Chemistry World(RSC)で紹介された。平成19年4月27日、西日本新聞、日刊工業新聞に掲載された。本年度は、「水溶性ニッケル・ルテニウムアクア錯体を触媒として水中・常温・常圧という極めて温和な条件下で、錯体の水配位子を水素分子と置換させることで、高効率でプロトンとヒドリドイオンに開裂させ、水素からの触媒的な電子抽出」に成功した(Chem. Lett.2008,37,970-971)。さらに、反応で生成する低原子価錯体等の中間体を単離し構造を決定することにより、水中での触媒の関与した水素分子の活性化機構を解明した(Dalton Trans.2008,4747-4755)。本研究成果は、今後の「ニトロゲナーゼの触媒反応における水素発生のメカニズム解明」に寄与すると期待できる。本研究成果は、平成20年8月5日にプレスリリースし(場所:九州大学伊都キャンパス、説明者:小江誠司)、英国王立化学会Chemical Scienceと日本化学会のホームページで紹介され、毎日新聞、日経新聞、西日本新聞、読売新聞に掲載された。また、英国王立化学会Dalton TransactionsのHot ArticlesおよびTop10Most-Accessed Articlesに選ばれた。
ヌクレオシド・ヌクレオチドの立体化学的研究

核酸,ヌクレオシド,ヌクレオチドがその利用酵素と結合(相互作用)する際のヌクレオシド部分の立体構造を明かにすることは酵素作用機序の解明やヌクレオシド系薬物の開発にとって基礎的に重要な課題である。我々はヌクレオシドにおけるグリコシル結合まわりのねじれ角が固定されたいわゆるシクロヌクレオシドがこの研究に役立つと期待し、炭素架橋シクロヌクレオシドの合成を企画した。我々はすでにヌクレオシドの炭素架橋に有効な反応を見出しているが、今回これらの一般化に成功した。併せてシクロヌクレオシドの生物活性の検討を行った。1.ピリミジンシクロヌクレオシドとそのリン酸エスルの合成。(1)6-シアノウリジンより6,5′-メタノシクロウリジンを合成した。(2)2′-ケトウリジン体のWittig反応とひきつずく環化により2′-デオキシ-6,2′-エタノウリジン,2′-デオキシ-6,2′-メタノウリジン,6,2′-メタノウリジンを合成した6,2′-体のねじれ角は268.1°であった。(3)6,3′-メタノウリジンとシチジン,6,3′-メタノチミジンの3-ケトリボース体よりの合成に成功した。(4)6,5′-シクロウリジン2′,3′-環状リン酸は膵臓リボヌクレアーゼの基質となり、水解物は阻害剤となった。即ちこの酵素はアンチ型のヌクレオシドを認識することが証明された。2.プリンシクロヌクレオシドの合成。(1)2′-ケトアデノシンより出発し2′-デオキシ-8,2′-エタノアデノシン,8,2′-メタノアデノシンなどを合成した。(2)8,2′-メタノグアノシン類を同様に合成した。(3)8,2′-シクロアデノシン類はアデノシンデアミナーゼの基質となった。3.その他上述の如く合成したシクロヌクレオシドのうち検定を行った化合物に関する限り特筆すべき抗ウィルス活性や制がん活性は認められなかったが、これはヌクレオシドにおけるグリコシル結合のねじれ角のためではなく、生体内リン酸化をうけにくいためと思われる。
物性可変溶媒による金属イオンの単離濃縮技術の基礎的検討

金属単離濃縮に対し、最近、二酸化炭素を溶解させることで瞬時に極性が変化し、溶解・析出を制御できる物性可変溶媒(分子)(Switchable Polarity Solvent/Molecule)の研究が進められている。事実、NiやCoなどを溶解させた水溶液に配位子を加え、アミン系溶媒を存在下で二酸化炭素を吹き込むことで均一相を形成させ、その後アルカリを加えることで再度アミン相が形成し不均一相を形成し、その際、配位子により錯体が疎水的である場合に親水物質と分離濃縮が容易にできるとの報告がなされている。このコンセプトに則り、水熱有機酸浸出と物性可変溶媒(物性可変分子)による金属単離を併用したLIB正極材料リサイクルフローの可能性を探索する。すなわち、水熱有機酸浸出において、有機酸および条件を選定することでMnを単離する。その後、Li、Co、Niを含む有機酸水溶液に物性可変溶媒(例:アミン系分子。以下、アミン系分子を想定して記述)を加え、さらにはCoと疎水性錯体を組む配位子を存在させる。ここで二酸化炭素を吹き込むことで炭酸リチウム(Li2CO3)を析出させ、アミン系分子を均一相に導く。その後、アルカリを加えるか、もしくは減圧することで二酸化炭素を除去し、アミン系分子を再度疎水化することによりCoーアミン系分子錯体を溶媒に分配させ、同時に疎水性溶液中にNiを回収し、それぞれの溶媒は再度利用可能とする。今年度、物性可変性分子としてアミノ酸を選択し、CoやNiとアミノ酸との錯体形成能を評価したところ、グリシンおよびアラニンによりCoおよびNiいずれも水溶液中で錯体を形成することが判明した。アミノ酸は二酸化炭素と接触することでカルバミン化合物を形成し物性が変化することから、今後、その可変性と分離性能を評価する。アミン分子として環境に適合した分子であるアミノ酸を選択した。物性可変性溶媒によるプロセスに加え、物性可変性分子を用いることにより溶媒使用量も低減可能であることから、アミノ酸利用を見出したことで当初の計画を達成している。引き続きアミノ酸を用いた検討を進めながら、再利用を容易にする溶媒系の探索も進める。さらに、現状プロセスの改善を目的にフローでの検討も進める。具体的には、リチウムイオン電池を対象としたプロセスを例に説明すると、Li、Co、Ni、Mnそれぞれの単離にはPC88Aという有機溶媒への溶解度差を利用して順次分離濃縮する方法がとられている。溶媒の価格が高く溶媒ロスに対しコストが高くなることに加え、溶解度差が小さく分離濃縮に1週間規模の時間を要することから設備が大型になる。この課題を解決するためには、連続化が可能なコスト優位なプロセス開発を進める必要がある。物性可変性分子であるアミノ酸を用いることができることを見出したことから、CoやNiそれぞれを二酸化炭素の作用を利用して別種の錯体へと導き、それらの溶解度差を利用し、複数金属を同時・並列・高速・高効率で単離・濃縮する連続技術を目指した研究へと発展させる。

この課題を解決するためには、連続化が可能なコスト優位なプロセス開発を進める必要がある。物性可変性分子であるアミノ酸を用いることができることを見出したことから、CoやNiそれぞれを二酸化炭素の作用を利用して別種の錯体へと導き、それらの溶解度差を利用し、複数金属を同時・並列・高速・高効率で単離・濃縮する連続技術を目指した研究へと発展させる。海外からの購入品の価格が変動したことによる支出費用が減少したことによる。
ブタ脂肪のトリアシルグリセロール分子種組成と結晶性状を制御し、物性を改変する

本研究では、ブタ脂肪のTAG分子種組成および結晶性状の制御機構を解明し、これらによる物性の改変効果を検証することを目的とした。ブタ脂肪組織におけるTAG合成酵素のアイソフォーム発現は、他の哺乳動物におけるそれと比較して特有な態様であり、これがブタに特有なTAG分子種組成をもたらしている可能性が示唆される結果を得た。また、ブタ脂肪の結晶化状態を評価するラマン分光指標を開発し、枝肉冷却過程における結晶状態の解析や、ブタ脂肪組織における結晶の分布の可視化に成功した。さらに、冷却条件の異なるブタ脂肪ではかたさや外観が異なることを明らかにした。(1)ブタ脂肪組織中のトリアシルグルセロール(TAG)においては、sn-2の位置にパルミチン酸が特異的に多く結合している。そこで、sn-2にacyl-CoAを結合させる1-acylglyceroi-3-phosphate-0-acyltransferase(AGPAT)のアイソフォーム1および2についてブタおよびウシの組織での発現量を比較した結果、ブタ脂肪組織においてのみAGPAT1が主に発現しており、他の組織やウシの組織ではAGPAT2が主に発現していた。この結果はAGPATIおよび2の発現量の違いがブタTAGの分子種の違いの原因となりうることを示唆している。(2)ブタ皮下脂肪前駆細胞株(PSPA)およびマウス脂肪前駆細胞株3T3-L1における脂肪酸組成は、同じ培地で培養しても両者において異なっており、同条件において合成する脂肪酸に種間差があることがわかった。また、培地に添加する中鎖脂肪酸を変化させることで、PSPAの脂肪酸組成が変化することを明らかにした。これらのことは、生理的および栄養的条件の違いによりTAG分子種組成を制御できる可能性を示している。(3)肥育豚を常法によりと畜・冷却した場合の皮下脂肪組織におけるTAG分子種の結晶状態の変化をポータブルラマン分光法により解析することができた。脂肪の冷却条件による脂肪の結晶性状変化を抽出脂肪および脂肪組織の両方で解析が可能となり、TAG分子種の結晶状態と冷却条件やTAG分子種組成との関係解明への展開が期待できる。(4)冷却条件を変えた脂肪の外観変化について、抽出脂肪を用いた予備的検討を実施した。その結果、TAG結晶性状と外観の関係解明にあたっては、冷却条件のより詳細な検討が必要であることが分かった。(1)ブタ脂肪組織中トリアシルグリセロール(TAG)のsn-1にacyl-CoAを結合させるglycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT)およびsn-3にacyl-CoAを結合させるdiacylglycerol acyltransferase (DGAT)のアイソフォームについて脂肪組織、筋肉、肝臓でのmRNA発現量の分析を行った結果、脂肪組織と肝臓の間でアイソフォームの発現量が異なった。(2)マウス脂肪前駆細胞株(3T3-L1)とブタ脂肪前駆細胞株(PSPA)ではTAG合成遺伝子遺伝子アイソフォーム発現の経時的な変化が異なっていた。マウスとブタの脂肪細胞株でみとめられたこの発現様式の違いは、脂肪組織における発現様式と酷似しており、細胞レベルでもブタの特異性を明らかにした。(3)冷蔵保存期間を変えた豚脂肪組織における脂肪の結晶および結晶多形の分布状態をラマン顕微鏡を用いて調べた。その結果、高次構造を形成して系の物性に影響を及ぼしていると考えられているβ'型結晶多形についてはネットワーク状に分布していることを確認し、可視化に成功したと考えられた。(4)脂肪の結晶度と物性の関係については、一定の冷却速度にて異なる冷却終了温度まで冷却した精製ラードについてプランジャを侵入させた場合の圧縮加重を測定する実験系を検討した。その結果、圧縮加重は冷却終了温度により異なった。(5)外観と脂肪の結晶度との関係を明らかにするため、「ヒトが見てわかる違い」を判定するためのパネルを作成した。具体的には、農研機構畜産草地研究所職員を対象にThe Farnsworth D-15 testを実施し、色覚に異常の認められなかった47名をパネリストとして選抜した。1トリアシルグリセロール(TAG)のsn-1位にacyl-CoAを結合させるグリセロール3リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、sn-2位にacyl-CoAを結合させる1-アシルグリセロール3リン酸-O-アシルトランスフェラーゼ(AGPAT)およびsn-3位にacyl-CoAを結合させるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)のアイソフォームについて、ブタの皮下、腎周囲および腹腔内脂肪のmRNAを用いて発現量の比較を行った結果、脂肪沈着部位によるアイソフォーム発現様式に違いはなく、GPATアイソフォーム4の高発現は、ブタの脂肪組織特異的な現象であることが明らかになった。さらに、ブタの脂肪前駆細胞株(PSPA)を用いてsiRNAによる遺伝子発現阻害試験を行い、GPAT4遺伝子の発現量の抑制を確認した。

2結晶多形が異なるとラマンスペクトルも異なることを利用し、多変量解析により結晶多形の種類に分けてラマンイメージを作成することを試みた。その結果、テクスチャーの悪化に関係すると言われているβ型結晶多形の分布とその経時変化を新たに明らかにすることが出来た。このβ型結晶多形は多変量解析の結果得られたスペクトル形状より、豚脂肪に最も多いOPOやそれと類似の脂肪分子種のものであると考えられた。これが豚脂肪組織において冷蔵保存10日2ヶ月の間に大きな結晶に成長していることが確認できた。3冷却速度を変えることで結晶多形が異なることを利用し、精製ラードの冷却速度を変えた場合にその硬さや外観が変化するかどうかを検証した。その結果、冷却速度が増加すると硬さも上昇すること、および硬さが異なる程度に冷却速度を変えたラードでは外観についても識別可能な差があることが明らかとなった。結晶多形の制御によりブタ脂肪の物性を制御できる可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。畜産物利用学26年度が最終年度であるため、記入しない。TAG合成遺伝子に関する検討、脂肪細胞を用いた検討、ラマン分光法を用いた結晶性状検討等についてはほぼ計画通りであり、結晶性状と外観の関係解明についても問題点はある程度明確であることから、全体としてはおおむね順調に進展している。TAG合成遺伝子に関する検討、脂肪細胞を用いた検討、ラマン分光法を用いた結晶性状検討等についてはほぼ計画通りであり、結晶性状と物性の関係解明についても実験系の確立が進んでいることから、全体としてはおおむね順調に進展している。全体として方針を変更することなく、TAG合成遺伝子に関する検討、脂肪細胞を用いた検討、ラマン分光法を用いた結晶性状に関する検討、および結晶性状と外観の関係解明についてそれぞれ研究を実施する。全体として方針を変更することなく、TAG合成遺伝子に関する検討、脂肪細胞を用いた検討、ラマン分光法を用いた結晶性状に関する検討、および結晶性状と物性の関係解明についてそれぞれ研究を実施する。最終年度であることから、生体→TAG分子種組成→結晶性状→物性というストーリーでの品質制御に向けた展望が示されるように結果をとりまとめる。「豚肉の脂肪のやわらかさなど比較して紹介ー畜産草地研究所が研究紹介」畜産日報、2015年4月23日付、5面(掲載確定)次年度使用額67,903円については主として旅費の節約等により生じたものであり、これについては次年度請求額と併せて、より研究を効果的に推進するため契約職員の人件費等に充当する。研究に係る経費の節約等を行った結果、次年度使用額が生じた。次年度請求額と併せて、より研究を効果的に推進するため契約職員の人件費等に充当する。
サイクロトロンを必要としないPET用分子イメージング薬剤製造システムの構築

PET(positron emission tomography)による画像診断は,短半減期放射性核種を使用するため,サイクロトロン施設の併設を必用とする。我々は,サイクロトロンを使わない^(68)Gaの製法である^(68)Ge/^(68)Gaジェネレータシステムの構築を目的に,物理的構造特性の異なる有機高分子母体に, N-メチルグルカミン(MG)を導入した^(68)Ge吸着剤を合成し,高分子母体がジェネレータの性能に与える影響と,ジェネレータから得られた^(68)GaのPET用薬剤調製への適用について検討した。PET(Positron emission tomography)による画像診断は,短半減期放射性核種を使用するため,サイクロトロン施設の併設を必用とする。我々は,サイクロトロンを使わない^<68>Gaの製法である^<68>Ge/^<68>Gaジェネレータシステムの構築を行っており,N-Methylglucamine基(MG)を有する樹脂が,Ge及びGaに望まれる吸脱着挙動を示すことを見出している。本年度の研究では,親水的な多孔性高分子母体にMGを導入し,Ge及びGaの吸脱着挙動への母体構造の効果を検討した。重合反応時のGMA,EG及びMIBKの混合比を変化させ,種々のPGMA-EGを合成した。得られたPGMA-EGの比表面積は15100m^2/gであり,EGおよびMIBK混合割合の増加に伴って増大した。PGMA-EG-MGのGeに対する平衡吸着量は0.070.42mmol/gであったことから,PGMA-EG-MGのGe吸着能が確認された。比表面積の最も大きなPGMA-EGから誘導したPGMA-EG-MGへのGeの吸着は,30分以内にほぼ平衡に到達した。さらに,同じPGMA-EG-MGをカラムに充填し^<68>Geを吸着させた後,0.1M TrisodiumCitrate溶液を通液すると,速やかな^<68>Gaの脱着が観察された。その際,カラムからの^<68>Geの脱離は殆ど認められなかった。これらの結果は,樹脂の母体構造はGe及びGaの迅速な吸脱着挙動に影響を与える因子の一つであることを示していると考えられた。PET(Positron emission tomography)による画像診断は、短半減期放射性核種を使用するため、サイクロトロン施設の併設を必用とする。我々は、サイクロトロンを使わない^<68>Gaの製法である^<68>Ge/^<68>Gaジェネレータシステムの構築を行っており、N-Methylglucamine基(MG)を有する樹脂が、Ge及びGaに望まれる吸脱着挙動を示すことを見出している。本年度の研究では、親水的な多孔性高分子母体にMGを導入し、Ge及びGaの吸脱着挙動への母体構造の効果を検討した。Glycidyl methacrylate(GMA)及びEthylene glycol dimethacrylate(EG)にMethyl iso-butyl ketone(MIBK、多孔化剤)を混合し、懸濁重合法により高分子母体(PGMA-EG、粒子径0.250.50mm)を合成した。PGMA-EGにMGを付加させPGMA-EG-MGへ誘導した。その結果、非放射性Geに対する平衡吸着量が0.24 mmol g^<-1>、50%吸着量に到達する時間が5分以内のPGMA-EG-MGが得られ、キャリアフリーの放射性^<68>Geの吸着剤として十分な吸着能を有することが確認できた。そこで、このPGMA-EG-MGを充てんしたカラムに、^<68>Ge溶液を通液してジェネレータを作製した。カラムに添加した^<68>Geのほぼ100%がカラムに保持された。^<68>Geと^<68>Gaの放射平衡に到達、0.1M Na_3 citrate溶液を溶離剤と、ジェネレータからの流出液を1mlずつ分画した。各分画の^<68>Ga及び^<68>Geの放射活性を測定すると、ジェネレータ内の^<68>Gaの56.9±1.9%が第一分画に溶出した。また、^<68>Geの漏出は、4.9×10^<-4>%以下であり、ジェネレータに求められる^<68>Gaの選択的かつ迅速な溶離が達成された。本研究では、^<68>Ge/^<68>Gaジェネレータシステムの構築を目的に,物理的構造特性の異なる有機高分子母体に,メチルグルカミン(MG)を導入した^<68>Ge吸着剤を合成し,高分子母体がジェネレータの性能に与える影響と,ジェネレータから得られた^<68>GaのPET用薬剤調製への適用について検討した。

Glycidyl methacrylate(GMA)及びEthylene glycol dimethacrylate(EG)に,Methyl iso-butyl ketone(MIBK,多孔化剤)を混合し,比表面積が100m^2以上の高分子母体(PGMA-EG)を合成した。さらに,MGを付加しPGMA-EG-MGへ誘導した。PGMA-EG-MGを充てんしたカラムに,^<68>Ga溶液を通液してジェネレータを作製した。^<68>Gaと^<68>Gaの放射平衡に到達後,0.1MNa_3citrate溶液で溶出させた^<68>Gaを用いて,DOTATOCの標識を行った。DOTATOCはソマトスタチン受容体に対して選択的結合性を示し,腫瘍診断を目的とした薬剤として使用される。DOTATOCの^<68>Ga標識では,ジェネレータから溶出した^<68>Ga溶液の一定量とDOTATOCを混合し,配位子交換を利用した標識反応の後、HPLCで分析した。得られたラジオクロマトグラムには、ジェネレータから溶出したGa citrateの保持時間(1.5min)とは異なる保持時間(8min)に放射能ピークが観察された。さらに,非放射性GaとDoTATOCの錯体を同条件下で分析すると,220nmにおけるUV吸収ピークも保持時間(8min)に観察された。以上のように,^<68>Ga標識DOTATOCの生成が確認できたことは,PGMA-EG-MGを吸着剤として用いたジェネレータが,^<68>Ga標識PET用薬剤の調製に適用できることを示している。
Sox9ユビキチン化酵素発現異常と骨格系発達異常および神経障害との関連

内軟骨性骨形成過程においてSox9は間葉系細胞が軟骨細胞へと分化する方向性を決定する転写制御因子として知られており、Sox9の活性の厳密な調節が正常な骨格形成に必要だと思われる。本課題では、Sox9の細胞内量を調節するSox9特異的ユビキチンリガーゼを同定し、このユビキチンリガーゼによるSox9の細胞内量調節が内軟骨性骨形成に及ぼす影響を調べ、ユビキチンリガーゼの異常によるSox9の分解不全と神経疾患との関わりについて明らかにした。内軟骨性骨形成過程においてSox9は間葉系細胞が軟骨細胞へと分化する方向性を決定する転写制御因子として知られており、分化の段階に応じたマーカー遺伝子の転写を活性化していると考えられ、Sox9の活性の厳密な調節が正常な骨格形成に必要だと思われる。本課題では、Sox9の細胞内量を調節するSox9特異的ユビキチンリガーゼPro-1を同定し、このユビキチンリガーゼによるSox9の細胞内量調節が内軟骨性骨形成に及ぼす影響を調べる事、さらにこのユビキチンリガーゼにおける変異が重篤な神経疾患を引き起こしていることが以前より報告されているため、ユビキチンリガーゼの異常によるSox9の分解不全と神経疾患との関わりについて明らかにすることが最終目的である。今年度は以下の研究成果を得た。1. Sox9複合体成分のプロテオミクス解析Sox9の機能を調節する分子を単離する目的で、タグ蛋白のついたSox9を軟骨細胞中に強制発現し、Sox9複合体を精製後プロテオミクス解析することにより、Sox9特異的ユビキチンリガーゼを同定した。2.ユビキチンリガーゼのSox9への結合、およびユビキチン化促進の確認同定したユビキチンリガーゼのSox9への結合をin vivo, in vitroで確認した。さらにこのユビキチンリガーゼがSox9のユビキチン化を促進し,Sox9の分解を促進する事をin vitroおよびin vivoのユビキチンアッセイによって確認した。さらにユビキチンリガーゼの過剰発現により、Sox9の転写活性が低下する事をレポータージーンアッセイによって確認した。本課題では、Sox9の細胞内量を調節するSox9特異的ユビキチンリガーゼを同定し、このユビキチンリガーゼによるSox9の細胞内量調節が内軟骨性骨形成に及ぼす影響を調べる事、さらにこのユビキチンリガーゼにおける変異が重篤な神経疾患を引き起こしていることが以前より報告されているため、ユビキチンリガーゼの異常によるSox9の分解不全と神経疾患との関わりについて明らかにすることが最終目的である。1.ユビキチンリガーゼを発現ベクター導入により胎生期肢芽より単離した軟骨細胞に過剰発現させ、Sox9の活性におよぼす影響、細胞内Sox9量の減少、軟骨細胞マーカー遺伝子発現の変化を確認したところ、ユビキチンキナーゼ発現により,細胞内Sox9濃度の低下に伴う2型コラーゲンプロモーター活性の低下、アグリカンmRNAの低下が観察された。2.ユビキチンリガーゼをsiRNA導入により軟骨細胞でノックダウンし、Sox9の活性におよぼす影響、細胞内Sox9量の減少、軟骨細胞マーカー遺伝子発現の変化を確認したところ、細胞内Sox9濃度の上昇に伴った2型コラーゲンプロモータ活性の上昇、アグリカンmRNAの増加が観察された。最終年度である今年度は得られた以下の研究成果を国際情報誌に発表している。1.Sox9を過剰発現した軟骨細胞抽出液から精製したSox9結合蛋白の解析により、ユビキチンリガーゼが単離された。2.このユビキチンリガーゼとSox9断片を酵母内で共発現する事により、Sox9中のユビキチンリガーゼ結合部位はHMGドメインである事が明らかとなった。

3.Sox9はユビキチンリガーゼ、ユビキチン発現ベクターとの共発現で細胞内で効率良くユビキーチン化される事、また、それぞれのリコンビナント蛋白によりin vitroでもユビキチン化される事が明らかとなった。4.Sox9発現ベクター、ユビキチンリガーゼ発現ベクター導入による細胞内での異所性発現により両者は核内での部分的な共局在が観察された。5.骨形成におけるSox9,ユビキチンリガーゼの役割を調べるために、胎生期の長管骨をそれぞれの抗体で免疫染色すると、Sox9は前肥大軟骨層および骨端軟骨辺縁部で強い発現を示すが、ユビキチンリガーゼの発現はそれらの領域で非常に弱く発現している事が明らかとなった。6.ユビキチンリガーゼを発現ベクター導入により胎生期肢芽より単離した軟骨細胞に過剰発現させたところ、ユビキチンキナーゼ発現により,細胞内Sox9濃度の低下に伴う2型コラーゲンプロモーター活性の低下、アグリカンmRNAの低下が観察された。7.ユビキチンリガーゼをsiRNA導入により軟骨細胞でノックダウンし、Sox9の活性におよぼす影響、細胞内Sox9量の減少、軟骨細胞マーカー遺伝子発現の変化を確認したところ、細胞内Sox9濃度の上昇に伴った2型コラーゲンプロモータ活性の上昇、アグリカンmRNAの増加が観察された。8.ユビキチンリガーゼ欠損マウスより調製した神経細胞抽出液では、Sox9の蓄積のみでなく、Sox8,Sox10も蓄積している事が明らかとなり、これらが神経疾患の誘発に結びついている可能性が示唆された。
バルク及び表面融解のミクロスコピックな検討

物質の融解は化学者にとって極めてなじみ深い現象であるにもかかわらず,融解のミクロスコピックな起源は,振動の非調和性が本質的に重要であるということ以上には理解されていない。本研究のテーマは,XAFS(x-ray-absorption fine structure)分光法を融解という現象を.ミクロスコピックに局所構造と非調和熱振動の観点から検討することであり,これは申請者らのこれまでの非調和性に注目した研究と直接的に関連するものである。まず準備段階として,融解より十分低温でのバルク固体のEXAFSのデータから量子統計力学的に原子間ポテンシャルを見積もり,従来提唱されているポテンシャルの妥当性を検討した。EXAFSで観測される原子間相対変位の熱平均を理論的に計算するため,ここでは,経路積分法を採用した。経路積分法を実際の系に適用するにあたって,有効半古典的ポテンシャル法を利用した。この手法を金属にも適用できるようにするため,経験的ポテンシャル関数として通常は古典論的に用いられているEmbedded Atom Method(EAM)を今回の経路積分有効ポテンシャル法に応用するための立式を行った。次に,固体表面および表面融解状態での原子の振動異方性・非調和性を表面EXAFSにより実験的に検討した。系としてはまずKBr基板上のKCl超薄膜を扱った。融解の実験までを検討するには至らなかったが,融解の前兆である表面原子の揺らぎの異方性に関して定量的な見積もりを行った。さらに,もともとの中心課題と考えていた金属薄膜(グラファイト上のNi,Cu)における表面原子の振動異方性・非調和性を表面EXAFSにより実験的に検討した。本年度はまず小型の超高真空仕様の試料槽を設計・製作した。このための液体窒素冷却試料マニピュレータ・半導体検出器導入機構等を購入した。真空はターボ分子ポンプを主排気とし10^<-10>Torr台の超高真空を得ることができた(排気系は予算範囲におさまらないので現有設備を利用した)。試料は赤外線ヒーターにより7001000°C程度までの加熱と液体窒素による冷却ができた。次に,物質構造科学研究所放射光研究施設(PF)BL11BにおいてKBr(100)単結晶表面上にエピタキシャル成長したKCI薄膜のC1-K吸収端EXAFSの測定を行った。KC1の膜原を2,6,20Åと変化させかつ測定温度をそれぞれ変化させバルクのKC1との局所構造変化を調べた。現在解析中である。主たる目的である表面融解の実験はPF課題審査委員会において高い評価で採用され,Cu/graphite系について98年4,6月にPF-BL12Cにて行うことが決まっている。現在その準備中である。理論に関しては,低温における固体の非調和熱振動を記述する量子力学的手法を検討した。従来我々が開発してきた量子統計力学的摂動展開法に基づいたEXAFSキュムラント計算は,分子には有効であるが固体の場合は数値計算が極めて困難であった。今回新たに経路積分有効ポテンシャル法による計算が有用であることを見出した。これを二原子分子Br_2,固体Kr,Niに適用し、実験で得たEXAFSキュムラントと非常によい一致を見た。特に,Niのような金属に対してもembedded atom法と経路積分有効ポテンシャル法を組み合わせることが可能であることを見出した点で,今後の本研究にも有効である。

本研究のテーマは,XAFS(x-ray-absorption fine structure)分光法を融解という現象を,ミクロスコピックに局所構造と非調和熱振動の観点から検討することであり,これは申請者らのこれまでの非調和性に注目した研究と直接的に関連するものである。まず準備段階として,融解より十分低温でのバルク固体のEXAFSのデータから量子統計力学的に原子間ポテンシャルを見積もり,従来提唱されているポテンシャルの妥当性を検討した。EXAFSで観測される原子間相対変位の熱平均を理論的に計算するため,ここでは,経路積分法を採用した。経路積分法を実際の系に適用するにあたって,有効半古典的ポテンシャル法を利用した。この手法を金属にも適用できるようにするため,経験的ポテンシャル関数として通常は古典論的に用いられているEmbedded Atom Method(EAM)を今回の経路積分有効ポテンシャル法に応用するための立式を行った。次に,固体表面および表面融解状態での原子の振動異方性・非調和性を表面EXAFSにより実験的に検討した。系としてはまずKBr基板上のKCl超薄膜を扱った。融解の実験までを検討するには至らなかったが,融解の前兆である表面原子の揺らぎの異方性に関して定量的な見積もりを行った。さらに,もともとの中心課題と考えていた金属薄膜(グラファイト上のNi,Cu)における表面原子の振動異方性・非調和性を表面EXAFSにより実験的に検討した。
哺乳類細胞に潜在する未知DNA修復反応の解明

我々は、哺乳類細胞における紫外線誘発DNA損傷に対する修復機構として、ヌクレオチド除去修復以外の反応が存在する可能性を見出し、本研究ではその反応メカニズムを詳細に解析した。その結果、この反応にはヌクレオチド除去修復の初期過程で働く損傷認識因子XPCが必須であり、別の損傷認識因子であるDDBは必要ないことがわかった。一方、DDBが正常に存在する場合は、プロテアソーム活性もこの反応に必要であるが、DDB2ノックダウン下では必要ないことから、DNA損傷がDDBによって認識されたときはCul4-DDB1 E3リガーゼによるユビキチン化と分解反応が必要と推測された。我々は、ヒト細胞において紫外線誘発DNA損傷がヌクレオチド除去修復(nucleotide excision repair; NER)欠損下でもゲノムからゆっくり消失することを見つけ、NERのバックアップ機構が存在する可能性を示唆している。本研究では、この修復反応に関わる因子を同定し、この反応メカニズムを解明することを目的としている。これまでの解析から、この修復現象にはp53およびユビキチン・プロテアソーム系の関与が示唆されていたが、初年度はこの点をさらに詳しく解析するとともに、p53の下流のNER因子であるDDB2とXPCの関わりについても各種阻害剤やsiRNAを用いて詳細に調べた。まず、p53リン酸化Ser15抗体を用いてp53の活性化をモニターしたところ、NER欠損下で修復現象が見られる時間帯に著しいリン酸化が観察され、このリン酸化はNERが正常なヒト細胞では見られないこと、またプロテアソーム阻害剤の処理で完全に抑制されることを明らかにした。一方、DDB2とXPCの関与については、siRNAを用いたノックダウン実験から少なくともXPCの関与が示され、またこのXPCが修復反応過程でプロテアソーム依存的に分解される可能性も示唆した。XPCはDNA損傷認識を担うNERの初期因子であり、DNA損傷に結合した状態でその後のNER過程が進行しないと、何らかの仕組みでXPCが分解されてDNA損傷が除去されるモデルが考えられた。当初の計画はすべて実行され、未知の修復反応にp53、XPC、プロテアソームが関与することを明確に示して、各々の関係性についてもモデルとして提起することができた。このユビキチン・プロテアソーム系で働くE3リガーゼの候補も得られており、申請時の計画どおりかそれ以上の進展があったと判断した。本研究では、我々が見出したヌクレオチド除去修復(nucleotide excision repair; NER)欠損下における紫外線誘発DNA損傷の修復現象について、そのメカニズムの解明を目的としている。初年度の解析から、この反応にはNERの損傷認識因子であるXPCが必要であること、またこの反応過程でXPCはユビキチン・プロテアソーム依存的に分解される可能性が示された。一方、この修復反応と同時期にがん抑制遺伝子産物p53のリン酸化が生じていることもわかったが、その原因や役割については不明であった。今年度は、主に両者の関係性に注目して解析を行った。まず、p53リン酸化の引き金となる原因を推測する目的で、DNA損傷応答ネットワークで重要な働きをもつ3種類のPIKKの阻害剤を用いてプロテインキナーゼの同定を試みたところ、ATMとATRの両方が関与することが示唆された。次に、NERを欠損した色素性乾皮症相補性A群(XP-A)患者由来細胞でsiRNAによりXPCをノックダウンして紫外線照射後のp53のリン酸化を調べたところ、通常と変わらない(もしくはそれより早い)リン酸化が観察された。また、XP-A患者由来細胞のp53をノックダウンしてもNER非依存的な修復が見られたため、p53のリン酸化反応が今回の修復現象に直接関与する可能性は低いと考えられた。一方、この未知の修復反応に他のNER因子が関与するかについても調べ、XPBとERCC1-XPFの関与が示唆された。今後は、初年度に提起したモデルをさらに検証しつつ、DNA損傷の除去を担うエンドヌクレアーゼの同定やその後の反応についても明らかにしていきたい。また、申請時に計画されているとおり、NERをバックアップするこの仕組みがどのような生物学的役割を持っているのか、この反応に特異的な因子を見つけ、ゲノム編集等で欠損させることで、NERとの関係性も含めて検討して予定である。分子細胞生物学
顔の向きを捉えて応答できる視線座標インターフェースの構築

2009年度は眼球の動きに対応した眼電図(EOG)波形から視線の座標を抽出するシステムを構築した。実験では眼球の動きに対応した視線の座標を検出することができることを明らかにした。しかし、眼球の動きでEOG出力が飽和することも分かった。よって、2010年度にはHead Mounted Display(HMD)を用いてシステムの改良を行った。その結果、EOG出力が飽和することなく視線の座標を検出できることを明らかにした。さらに、2011年度では頭部の動きに対応した視線の座標を検出するシステムを構築した。実験では頭部の動きから視線の座標を検出することができることを明らかにした。2007年に超高齢社会を迎えた我が国では、高齢者の介護福祉支援策の充実が大きな社会問題となっている。なかでも、老老介護や独居老人の世帯では、寝たきり生活者が増えており日常生活支援が急務となっている。本研究では、自分の意思で対話できるヒューマン・インターフェースとして、ディスプレイに表示された情報だけでなく、部屋の空間に設置された設備機器の制御についても顔の向きと視線で対話できるシステムを構築することが具体的目的である。本年度に実施した研究は、【I.システムの構築】において、小型で軽量な可搬型のノートPCを用いた新システムを構築している。視線の動きは、水平成分と垂直成分とに分けた2台の生体増幅器で捉えたデータから視線座標として抽出することに成功している。その視線座標データは、無線LAN経由で解析用ノートPCに転送し、日常生活支援に利用可能なデータへの加工を進める。また、【II.電極装着法の改良】では、新たな信号誘導用の電極装着法として、眼鏡フレームの耳掛け部分に計測用の電極が装着できるタイプの眼鏡フレームを加工している。なお、顔の向きを検出する部分については設計を変更する。さらに、【III.信号処理法の開発】では、新システムの構築に合わせて順次、計測システムが稼働できるようにプログラム開発をLABVIEW言語とMATLAB言語を使って行っている。以上より本年度行った研究の成果は、電気学会の光応用・視覚/計測合同研究会にて発表し、多く皆様からの評価が得られた。我が国は,世界で最初に超高齢社会を迎えており、独居老人や老々介護の世帯数の増加に伴って、寝たきり生活を余儀なくされる人々の日常生活支援が早期に解決すべき課題となっている。本研究では、寝たきり者自身が視線で操作するヒューマンインターフェースの構築を目指している。その方法は、ディスプレイに提示される情報を視線選択することで対話を可能にする。さらに、顔の向きと視線で目常生活の部屋に設置されているAV機器や照明装置などが調節できるヒューマンインターフェースシステムを構築することが最終的な目標である。本年度は、【I.顔の向きを捉える計測システムの構築】について、情報提示の方法を据置型ディスプレイから眼鏡型ヘッドマウントデイスプレイ(HMD)に変更したことによって、寝たきり者でも装着が簡単で,頭部の動きや顔の向きに左右されずに視線で情報を選択することが可能となった。視線選択で意図する文字を入力する検証実験では良い結果が得られた。【II.信号計測処理システムの稼働】については、LABVIEW言語で眼電図データのコンピュータへの取り込み処理システムを構築した。そして、MATLAB言語では眼電図データの解析処理システムを構築した。その結果、情報が視線で選択できるようになった。さらに、【III.検証実験測定】では、情報の提示にHMDを用いたシステムを構築して、視線による簡単な文字入力の検証実験を行った。その結果、視線選択で簡単な文章入力のできることや、頭部の動きに影響を受けないことなどを確かめた。以上、本年度行った研究成果は、平成22年度電気関係学会東海支部連合大会、平成22年度電気学会基礎・材料・共通部門大会、および、電気学会光応用・視覚/計測合同研究会にて発表し、多くの皆様から評価を得た。我が国では超高齢社会の進展に伴って福祉支援の充実が大きな社会問題となっている。近年では、老々介護や独居老人の世帯で孤立死や孤独死される高齢者が増えており、寝たきり状態でも外部との連絡に利用できるヒューマンインターフェースの開発が喫緊の課題である。本課題では寝たきり者でも利用できる「顔の向きを捉えて応答できる視線座標インターフェースの構築」を目指している。平成21年度にはディスプレイ提示された情報を視線追跡しながら外部対話を行うシステムを構築している。検証実験では眼球の動きを捉えた角膜網膜電位(眼球電図)から視線座標を検出している。しかし、眼球の振れ角が40度を超えると眼球電図出力が飽和することを明らかにした。平成22年度にはディスプレイをヘッドマウントディスプレイ(HMD)に変更して直線性の良い視線座標の検出システムを構築している。検証実験では眼球の振れ角に左右されない直線性の良い眼球電図出力が得られた。

本年は最終年度で構築した2種類のシステムを用いて寝たきり生活者を対象に【I.検証実験測定】と【II.臨床実験測定】を進める予定であった。しかし、当研究室には医療設備も無く不慮の事故に対処できないことから予定していた実験測定を変更し、新たに「頭部の動きから視線座標を検出するヒューマンインターフェース」を構築して検証実験を進める。このシステムはめがねフレームの利き目でない側に無線式の3軸角速度センサーを取り付けてリアルタイムデータ処理手法で稼働させている。特徴は寝たきり状態でも装着できて身体の負担にならない簡便法である。検証実験は健常者を対象に測定した。その結果では頭部の動きから視線座標を高精度に検出できることを確かめた。以上の成果は、平成23年度電気関係学会東海支部連合大会、平成23年度電子情報通信学会技術研究報告会(LOIS2011-94)にて発表し、多くの皆様ら評価が得られた。
エルゴード理論の研究

エルゴード性は数学の多くの分野に表れる。本研究では多岐にわたっているエルゴード理論の研究を総合的に進めようとするものであった。古典的にはエルゴード理論は、測度空間において測度を不変に保つ変換の理論であるが、本研究の大きな部分の一つは問題を抽象的に捉えた研究である、即ち空間Xとその中で作用する変換の集合Sが作るSemigroupを考えて、変換半群(S,X)とX上の関数が作る関数空間に関して、AmenabilityとErgodicityにつき、綿密な研究が進められて成果が得られた。つぎに古典的なエルゴード理論の面では、いわゆる同型問題が大きい問題でその研究は1958年にKolmogorovによりエントロピーが導入されて以来、著しく発展してきており、数多くの優れた結果が得られている。その線に沿ったものとして本研究でとりあげたのは、確率空間における変換のエントロピーが0である場合、変換が空間で定義された関数が作る空間【L^2】にひきおこすユニタリ作用素のスペクトルはどのようなものであるか、という問題である。この問題では具体例についてエントロピーの値を算出するなど一定の前進が見られている。また有限測度空間における可積分関数のエルゴード的変換による時間平均は空間平均に一致する即ちn→∞のとき1/n【(n-1)!Σ!(i=0)】f(T^ix)→1/(m(y))〓f(x)dmが成り立つわけであるが、その収束の状況に興味が持たれ、具体的な関数f、変換Tについて、数値解析的に調べる研究も進められ、現在も継続中である。そのほか、エルゴード理論の統計学への応用、数論への応用、多変数関数論とエルゴード定理について、微分幾可学や複素解析学から見たエルゴード性の研究、作用素列の収束とエルゴード定理について等、各分担者により研究が進められそれぞれ進歩が見られた。なお、文献の収集・情報の交換という点でも得られるところが少なくなかった。
配位子の変形を利用した二核錯体の構築と触媒的不斉合成への展開

分子内に複数の金属中心を有する多核錯体は,金属間の相互作用によって単核錯体にはない反応性を示すため,新たな均一系触媒としての応用が期待される.一方,多核錯体の多くは既存の構造をテンプレートとした合成手法に限られており,新しい合成手法の開発が求められている.本研究では,新たな触媒合成指針として,配位子骨格の変形を利用した二核触媒の合成手法を確立し,得られる二核錯体を用いた新規触媒反応の開発を行う.分子内に複数の金属中心を有する多核錯体は,金属間の相互作用によって単核錯体にはない反応性を示すため,新たな均一系触媒としての応用が期待される.一方,多核錯体の多くは既存の構造をテンプレートとした合成手法に限られており,新しい合成手法の開発が求められている.本研究では,新たな触媒合成指針として,配位子骨格の変形を利用した二核触媒の合成手法を確立し,得られる二核錯体を用いた新規触媒反応の開発を行う.
光ファイバー温度計による燃焼場の乱れ計測

(1)定常拡散燃焼場での燃焼実験定常拡散燃焼場における燃焼の温度場を光ファイバー温度計OFT(Optical Fiber Thermometer)システムで計測し,また,レーザー2焦点流速計を用いて,定常拡散燃焼場の空気の流れ場を同時に計測した。結果として、燃焼変動および流れ場の乱れには相関性があることが示された。(2)ディーゼルエンジンによる実験直接噴射式過給ディーゼルエンジン燃焼室内での燃焼火炎温度場,すすの生成およびすすの酸化過程を調べるために,OFT計測システムを用いて、燃焼室内の温度場および火炎温度変動を計測した。火炎温度に対してフーリエ解析を行うことによって単一サイクルの燃焼期間における温度場の変動の時間変化および多サイクルに亘る乱れのサイクル変動等の燃焼の詳細な変化を明らかにした。理論的には2領域モデルを用いて未燃焼域から燃焼域への空気導入率、換言すれば燃焼域の空気過剰率を計算した。また、燃焼室中の温度変動、圧力変動および燃焼域の空気過剰率には相関性があることが示された。さらに、拡散燃焼期における火炎温度変動のパワースペクトルの解析結果によればこのパワースペクトルが乱流理論におけるコルモゴロフの-5/3スペクトルと一致していることを示した。火炎温度変動と燃焼場の乱れの相関性によれば、燃焼場の乱れがほぼ等方性を有すると推定された。また、ディーゼルエンジンにドッジプランジャ式パイロットインゼクタを適用し、主噴射に近接したパイロット噴射が燃焼および排気物質に及ぼす影響を実験的に調べた。結果として、少量のパイロット噴射によって、着火遅れが短縮され、また燃費およびNOx・燃費背反の関係が改善されたが、この原因が燃焼変動の解析結果から明らかにされた。
アメリカにおける森林の多面的利用の制度的基盤の解明

近年のアメリカでは、森林をめぐる木材生産、景観や生態系の保全、各種のレクリエーション等の多面的利用が発展してきた。この発展を可能とした制度的基盤を、1保全地役権をはじめとした柔軟な土地権利関係の運用、2各種の保障制度(助成金・税制優遇・関連保険等)、3多様なニーズを効果的に結びつける調整主体の役割の検証を通じて解明し、今後の日本等で、森林の有効活用による地域活性化を図るための方向性を提示する。
新聞記述における伝承性と出版物における文化伝播の研究II

印刷が地方でも大量に増えたのは、(新聞と教育の普及だけではなく)地方制度の整備によって地方官庁の印刷物が飛躍的に増加したことがあげられる。特に公布式の制度化によって法令を一般庶民に知らしめる必要性から官報や県報といった印刷物が増加したことが大きな一因である。近代化に伴い、次々に生まれる新制度と役所内の文書の増大は、速報性と大量印刷を助長させたと考えられる。明治18年の地方官庁(長野県公文書)で、一ヶ月に18万枚の印刷枚数が記録されており、多い月では40万枚の印刷記録がある。印刷の種類としては、罫紙、統計類まで含んでおり、使用した紙の種類も和紙から洋紙まで様々なものに印刷をしている。その上、一ヶ月の印刷費用も非常な大きな金額が記載されており、印刷枚数を裏付けている。このように印刷物が明治10年代以降、非常に増えたことから、各地の道府県でも印刷機が必要になったと考えられる。明治10年以降にほとんどの地方で新聞印刷が開始されることから、公文書の印刷が大きな役割を果たしていたことが理解できる。また、こうした印刷機は高価なため各地の地方官庁で購入したものが、貸与されたとの記録もあり、新聞創設期には、官庁舎内で印刷されていたとの記録もある。明治期に、これだけの印刷物というのが大量に出回ったのは、これまでの木版印刷が想像以上に多くの印刷を可能にし、大量の和紙生産をも可能にしていたのではでないかと考えている。また、こうしたことが現在における伝承の変化を生み出したと考えている。その他、近代印刷物に関する保存科学的な資料調査を行った。昨年から今年度、宮崎県の公文書で見つかった資料を手がかりに、全国的な調査をおこなった。これについては、第三回東アジア出版文化に関する国際学術会議などで発表した。この中では、これまでの調査を中心に、公文書の印刷実態を発表した。特に公文書においては、明治六年前後より地方でも活字印刷が始まっており、かなり早い時期から政策の即時性を印刷に求めていたことがわかった。その他にも役所では石版、こんにゃく版、謄写版、青焼きなどの数多くの複写技術が採用されている。しかしながら、現在の状況では、こんにゃく版や青焼きといった複写技術が印刷史の中で、正確に把握されていなかったこともあり、技術史的にも不明な点が多く、今後も調査を続け明らかにしていきたいと考えている。現在調査中の段階ではあるが、このような数多くの印刷技術が一般大衆に広まっていったと考えられ、これらの拡がりが逆に、役所における洋紙や和紙の使用状況にも反映されていったと考えられる。今後は印刷がどのように民衆文化とかかわり、影響を及ぼしたのかを検討していきたい。その他、資料保存についても言及した。例えば明治二〇年代より昭和二〇年代までよく見かける「こんにゃく版」などは、現状のままでは印刷面が次第に薄くなり消えてしまう可能性のあるもので、資料調査や印刷技術の調査だけではなく、使用された材料や、これらの入手経路、素材の科学的分析の必要性についても検証する必要があることを述べた。
細菌L-乳酸脱水素酵素を用いたアロステリック機構の解明

1.変異酵素のX線結晶解析:フルクトース1,6-二燐酸(FBP)の結合部位のアミノ酸残基であるアルギニン173とヒスチジン188をそれぞれグルタミンとチロシンに置換した変異酵素の予備的解析によると後者ではヒスチジン残基の複素環と同じ位置にチロシンの芳香環が存在することが明かとなり、ヒスチジンの正電荷と水素結合がFBPの結合に必須であることが明かとなった。2.基質阻害の解析:セリン198およびセリン318を置換した変異酵素を作成し解析した結果、これら残基がミカエリス定数と阻害定数に関与していることを明らかにした。3.TおよびR型構造の酵素を含む結晶のX線結晶解析:新たな条件下で得られた結晶を解析したところ、T型及びR型酵素が1:1で同一結晶格子中に存在する珍しい結晶であり、アロステリック酵素のT、R両状態の酵素構造を同一条件下で解明することが可能となった。精密化の結果、2.5オングストロームの解像度での両構造の分子構造を明らかにした。2.アロステリック現象の分子機構:上記の解析により、T状態酵素へのFBPの結合によりP軸界面でのサブユニット間の静電的反発が解消され、FBP結合部位を中心としてサブユニットが回転してR状態になる。その結果Q軸のサブユニット間に形成されている活性部位が変化して活性な形になることがわかった。これにより、アロステリック現象が分子レベルで詳細に解明されたことになる。1.R型構造の酵素の結晶化:従来の研究においてビフィズス菌L-乳酸脱水素酵素(LDH)のアロステリック状態のT型の構造がX線結晶解析で得られたがR型の結晶は得られず、他のLDHのR型の構造と比較してきたのでR型の結晶を得る努力をしてきたが、限られた条件下ではR型の結晶が得られることがわかった。現在この結晶のX線解析を行っている。2.変異酵素のX線結晶解析:LDHのアルギニン173とヒスチジン188はアロステリック・エフェクターであるフルクトース1,6-二燐酸(FBP)の結合部位にありアロステリック転移に重要な役割を担っているアミノ酸残基であるがこれらをそれぞれグルタミンとチロシンに置換した変異酵素は前者ではFBP非存在下での活性の増大、後者ではFBPが結合せず、FBPによる活性化の消失が起こる。これら変異酵素の結晶化に成功し、現在X線解析を進めている。予備的解析によると後者ではヒスチジン残基の複素環と同じ位置にチロシンの芳香環が存在することが明かとなり、ヒスチジンの正電荷と水素結合がFBPの結合に必須であることが明かとなった。3.基質阻害の解析:LDHでは強い基質阻害があるため、酵素の反応機構の詳細な速度論的解析の妨げとなっている。この現象を解析して基質阻害を回避するためにセリン198およびセリン318を他のアミノ酸に置換した変異酵素を作成し解析した結果、これら残基がミカエリス定数と阻害定数に関与していることを明らかにした。1.TおよびR型構造の酵素を含む結晶のX線結晶解析:昨年度、限られた条件下ではR型の結晶が得られることがわかったと報告したが、この結晶をすでに解析してあるT型酵素の構造パラメーターを用い、分子置換法を用いて解析したところ、T型及びR型酵素が1:1で同一結晶格子中に存在する珍しい結晶であることが判明した。これによりアロステリック酵素のT、R両状態の酵素構造を同一条件下で解明することが可能となった。すでに1.9オングストロームの解像度で解かれているT状態の構造をモデルとして精密化を行い、2.5オングストロームの解像度での両構造の分子構造を明らかにした。2.アロステリック現象の分子機構:上記の解析により、T、R両状態ではサブユニットの三次構造はきわめて類似しており周辺のループ部分のみが異なることが明らかにされた。

T状態ではサブユニットP軸間にあるFBP(フルクトース1、6-二燐酸、アロステリック)結合部位のアルギニン173、およびヒスチジン188の正電荷がサブユニット間の反発を引き起こしているがFBPの結合によりこれが解消されるためFBP結合部位を中心としてサブユニットが回転してR状態になり、その結果Q軸界面付近にある活性部位が変化して活性な形になることがわかった。これにより、アルギニン173、およびヒスチジン188を置換させた変異酵素の予備的なX線結晶解析の結果と共に、アロステリック現象が分子レベルで詳細に解明されたことになる。