hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鰭から四肢へー陸棲適応へ向けた形態進化ー

さらに、筋肉パターンについては、複数の筋形成マーカーを用いた解析と電子顕微鏡解析により、従来報告されていた形式とは異なる形式で、鰭の筋肉が進化したという結果を得ている(田中ら、投稿準備中)。このように、平成27年度までに、研究計画をほぼ達成し、重要な成果を得ることができた。本研究では、古代魚の鰭が四肢へと進化したプロセスを解明することを目的として研究を行った。その結果、鰭から四肢への過程において、前側領域と後側領域のバランスが大きくシフトして「後側化」すること、この過程には前後軸パターンを制御するGli3の発現制御領域の機能の変化が関連することを明らかにした。さらに、サメの鰭を人為的に「後側化」すると、鰭の3本の基骨が1本になることを実証した。神経パターンについては、神経ガイダンス因子のSema3Aの発現様式の変化が四肢神経の多様性を生み出すことが示された。筋肉パターンについては、従来報告されていた形式とは異なる形式で、鰭の筋肉が進化したことが示された。本年度の目標は、対鰭から四肢への進化の過程における骨格、筋肉、および神経パターンについて、発生過程の比較解析、変化の原因となる遺伝子候補の探索に加えて、原因遺伝子の発現の変化の要因を探索していくことであった。まず、骨格パターンについては、すでに鰭から四肢への変化を引き起こした原因遺伝子を同定し、その発現パターンの違いを引き起こした原因ゲノム領域を数10 bpの範囲にまで絞り込むことに成功している。次に、神経パターンについても、軟骨魚類、両生類、羊膜類について、鰭/四肢の神経パターンの発生プロセスについて比較解析し、少なくとも羊膜類については、反発性の軸索ガイダンス因子Sema3Aの発現パターンが発生に伴い多様に変化することを確認している。また、筋肉パターンについても、軟骨魚類胚を用いて、複数の筋芽細胞マーカーの発現パターンを解析しているところである。これらのことから、現在までの達成度は、当初の計画以上に進展しているとした。27年度が最終年度であるため、記入しない。進化発生学平成26年度までの研究は、当初の計画以上に進展しているので、大幅な計画の変更はない。骨格パターンの変化については、当初の計画以上に進展しており、初年度のうちにパターンの変化を説明できる原因遺伝子が見つかっただけでなく、原因遺伝子の発現パターンを変化させた原因ゲノム領域を数10 bpの範囲にまで絞り込むことに成功している。今後は、平成26年度1月に発表されたゾウギンザメのドラフトゲノムの情報なども有効に利用して、有力な候補遺伝子について、機能解析や原因ゲノム領域の同定を進めて行く予定である。本年度の目標は、1)対鰭と四肢の骨格と筋肉、神経の形成過程におけるパターンを比較し、2)その変化の原因となる遺伝子候補を探索することであった。骨格パターンに関しては、計画通りに軟骨魚類胚の対鰭原基とニワトリ胚の肢芽で骨格パターンの形成に関与すると考えられた遺伝子の発現パターンを比較することで、原因遺伝子の候補を同定するに至った。この原因遺伝子については、原因ゲノム領域をニワトリ胚を用いた機能解析により同定できた。さらに、鰭原基の形成に関わる原因ゲノム領域を編集した魚の作成にも成功した。これらの成果は、本来平成26年度以降に行う予定であった
慢性関節リウマチ滑膜における接着分子を介した炎症性サイトカイン産生増強機構の解析

a)RA患者滑膜細胞、RA由来滑膜細胞株E11より無刺激状態においてIL-1,6,TNFαの発現が認められた。b)RA患者滑膜細胞およびE11上には無刺激状態でICAM-1分子の発現が認められた。IFN-γ添加にてICAM-1の発現は増強し、VCAM-1の発現が新たに誘導された。c)RA患者滑膜細胞およびE11をホルマリン固定したTリンパ球(PMAにてインテグリンを活性化した後固定)と混合培養、あるいは滑膜細胞上のICAM-1,VCAM-1分子を抗ICAM-1抗体、抗VCAM-1抗体にてクロスリンクすることによりIL-1,6,TNFαの発現が増強した。2)接着分子を介する刺激により活性化される核内因子の検索AP-1、NFkB、CREB、NFIL-6など既にいくつかの炎症性サイトカインの遺伝子発現に重要な核内因子の結合モチーフをタンデムに数個もつCATベクターをトランスフェクションし、ICAM-1分子を抗体にてクロスリンク刺激した時のCAT活性を検討したところ、AP-1結合部位を含むもののみ有意なCAT活性増強が認められた.3)接着分子を介する刺激に反応するIL-1βの遺伝子調節領域の同定a)E11において、ICAM-1分子を介する刺激に応答するIL-1β遺伝子調節領域は、転写開始部位より約3000bp上流に存在する約400bpの領域であった。この領域に存在するAP-1結合部位がIL-1β刺激時のIL-1β転写誘導に重要な働きをしていることが明らかとなった.b)ICAM-1刺激に応答するIL-1β遺伝子調節領域のDNAをプローベとしてバンドシフトアッセイを行ったところ、刺激によりAP-1蛋白が活性化されプローベに結合することを確認した.以上より慢性関節リウマチ滑膜細胞においては、サイトカインなどの可溶性分子による刺激に加えて、周囲の細胞との接着を介して炎症性サイトカイン遺伝子の発現調節が行われており、炎症の持続遷延に関与している事が示唆された。1)ICAM-1、VCAM-1を介する炎症性サイトカイン(IL-1,6,8,TNFα)の発現誘導の検討a)RA患者滑膜細胞、RA由来滑膜細胞株E11より無刺激状態においてIL-1,6,TNFαの発現が認められた。
注意欠陥/多動性障害(ADHD)の生物学的要因の解明

ADHD、前頭連合野の機能異常、ドーパミン(DA)調節系の変化との間に深い関係が示唆されている。ADHDが若年児童に主として見られることから、発達の初期に前頭連合野内で生じたDA調節系に関連したある種の変化がADHDの原因であると考えられる。この仮説が正しいかどうかを検討し、その変化を安全に是正する方法を見つければ、この障害を克服することができる。そのためには、(1)ラットやマウスに替わり、ヒトに近いサルによるADHDの動物モデルの確立、(2)DA関連薬物の細胞レベルの作用機序の解明、(3)DA関連薬物が神経回路網レベルで果たす調節動態の解明、(4)DAと他のモノアミン、カテコールアミンとの相互作用の解明、(5)動物モデルによるDA関連薬物の効果の検証、(6)より安全で治療に有効な化学物質の探索、(7)定量的な指標による診断法の確立、などが不可欠である。そこで、これらの項目に関する調査・研究を短期間に集中して実施し、共同研究グループの確立と共同研究計画の策定をめざした。2回の研究会と1回のシンポジウムを京都で開催した。研究会では教育者、精神科医、カウンセラーを招き、「前頭連合野の機能異常」、「DA調節系の変化」の2要因の妥当性を検討した。しかし、ADHD児が示す障害のスペクトルの多様さ、MPDを含む薬物の効果の多様さが報告者の話題の中心になり、ADHDの生物学的要因の絞り込みが難しいことが明らかになった。しかし様々な報告は、ADHD、前頭連合野の異常、DA調節系の変化に深い関係のあることを示していることから、調査の目的である「発達の初期に前頭連合野内で生じたDA調節系に関連したある種の変化がADHDの原因である」という仮説にもどり、この妥当性を考察するために、C.R.Yang博士、Y.Goto博士、G.Frankle博士、B.M.Li博士を招待し、シンポジウムを開催した。ADHDの専門家、前頭葉障害に関わる神経心理学者、DAの作用機序に関する神経科学者が会し、議論した結果、「発達の初期に前頭連合野内で生じたDA調節系に関連したある種の変化がADHDの原因である」は当面非常に有効な仮説であることを確認した。
モンゴル帝国成立基盤の解明を目指した考古学的研究

本研究は13世紀初頭のモンゴル帝国の成立と強大化の背景を、考古学資料から明らかにしようと企画された。具体的には初代君主チンギス・カンが本拠をおいたモンゴル高原東北部の遺跡調査を実施し、その出土品を通して当時のようすを復元する作業をおこなった。今年度(2018年度)は5月にヘンティー県バヤン・オボー郡ハンザト遺跡、8月に同県デリゲルハーン郡アウラガ遺跡(チンギス・カンの本拠「大オルド」跡)の発掘調査をモンゴル科学アカデミー歴史・考古学研究所と共同で実施した。ハンザト遺跡は既知であったが年代が特定されていなかった。我々の2017年度に実施した年代測定で、13世紀初頭であることが明らかになったので、調査に着手した。その結果、当時有数の大型の宮殿の跡だと明らかになった。その規模は間口で32mを超え、君主もしくは君主の兄弟クラスの人物の宮殿だと想定できる。モンゴル帝国史研究の上で、近年で最も重要な発見だと考えている。一部のみの発掘なので、まだ不明な点が多い。より詳しい内容を知るため、次年度以降も調査を続ける予定である。アウラガ遺跡では前年度から継続で第2建物とした建物基壇の発掘をおこなった。基壇のほぼ半面を完掘できた。現時点で調査団は、構造と遺跡内の位置から、この建物はチンギスが家臣や外国使節の謁見などの政治的セレモニーをおこなった場だと想定している。残る半面を次年度以降に精査する予定である。それ以外に、本年度は放射性炭素による年代測定を精力的におこない、モンゴル側が調査して当該期の墓葬や生産遺跡の年代を明らかにした。これは今後の研究に大変有益である。本研究の当初計画において目的の一つとしたアウラガ遺跡第2建物の構造を明らかにでき、チンギス・カン政権の政治セレモニーの場が解明できたことは大きな成果である。また、当初は想定していなかったハンザト遺跡での君主級の宮殿跡の新発見はモンゴル帝国史研究に重要な新知見をもたらすに違いない重大な成果である。それ以外に、理化学的年代測定結果といった実証的なデータが着実に蓄積できている。今後の研究にきわめて有益な資料となろう。これら3点から本研究の進捗状況は「おおむね順調」といってよい。最終年度(2019年度)に向けて、研究の総まとめをおこなう。まず、アウラガ遺跡第2建物の残り半分の発掘を完了させ、建物の機能を確定したい。つぎに、ハンザト遺跡の性格をある程度明らかにできるように発掘調査を継続したい。建物自体が大型で、本科研期間内ので終結は不可能なので、次期科研に全容解明を委ねたい。本年度は次期科研申請への基礎となる実証的なデータを得たいと考えている。我々チームは2021年度までにアウラガ遺跡を中心としたモンゴル帝国成立期の遺跡調査の成果報告書刊行を考えている。次年度は本研究の総括も兼ねて、その作業に着手したと考えている。13世紀初めにユーラシア大陸の多くの部分を占めたモンゴル帝国。その中核のモンゴル部族はモンゴル高原東北部の弱小グループであったが、短期間に力を蓄え、チンギス・カンの指揮のもと、巨大国家を築きあげた。なぜそのようなことが可能だったのか、文字資料からはうかがい知れない部分が多いので、物質資料による考古学的アプローチからこの問題の解決を企図しているのが本課題である。とくにチンギス・カンの興隆の舞台となったモンゴル国東北部の遺跡に注目して、考古学的フィールド調査によって研究を行なうのが、本課題の基本方針である。計画初年度である平成27年度はつぎのような調査研究を行ない、成果を得た。まず、6月に東京、淑徳大学にてキックオフミーティングを行ない。調査方針の確認と実施計画を研究分担者の参加のもとで実施した。7月には笹田分担者がモンゴル科学アカデミーと共同でモンゴル帝国勃興期の生産遺跡の踏査を行なった。ヘルレン川流域で新たな当該期遺跡を発見したこと、しかも、国家の基盤を支えた窯業や金属器といった生産地を明らかにしたことは今後の研究展開に重要な意味をもとう。8月には小畑、三宅、笹田各分担者がモンゴル帝国初期の首都であるアウラガ遺跡の発掘調査を行ない、鉄鍛冶工房や銅工房を検出した。国家の中心で武器などの生産が行なわれていたことを明確にするデータである。9月には三宅分担者と白石研究代表者が当該期の墓地遺跡を発掘し、人骨試料を得た。これらはDNA分析や食性分析を行ない、その出自系譜や生活環境を明らかにするために役立とう。同じく9月には村上分担者がロシア南シベリア地域の金属器工房の踏査を行なった。モンゴルの鉱物資源の多くは南シベリアから搬入されていたと史料はいうが、それを確かめるための調査である。いずれも現在資料整理・試料分析中で、具体的な成果はそれらを踏まえて公表する予定である。研究目的の主要部分となる生産遺跡を通しての権力基盤形成過程の探求という部分に着目したとき、平成27年度において当該期の生産遺跡を新たに発見できたことは、想定以上の新たな知見をもたらすものと大いに期待できる。モンゴル帝国の最初の首都であったアウラガ遺跡およびその周辺にて、モンゴル帝国強大化の背景を解明することに関わる考古資料の収集に努めた。おもな現地調査は2度にわたり実施した。5月にはアウラガ遺跡の南に位置するゴルバンドブ遺跡の発掘調査を行った。その結果、モンゴル帝国に先行する良好な墓地を確認できた。

とくに、モンゴル族勃興期に相当する9-10世紀代の墓を発掘した意義は大きい。当地方において、遊牧王権が如何に醸成されたかを知る上で、重要な手がかりを与えてくれるものになろう。これについてはH29年度に別科研を申請し、別途調査研究を行いたいと考えている。つづいて9月にはアウラガ遺跡で発掘調査を行った。遺跡内で第二の規模を誇る第2建物跡を発掘し、宮殿あるいは寺院と思われる礎石建物の基礎部分を検出した。当時の建築技術、および設計技術を知る上で、多くの手がかりを与えてくれそうだ。また、首都の構造、当時の政治や文化を明らかにするうえで重要な発見と考える。並行して過去に検出した遺構(Loc.2およびLoc.9)から出た灰のウオーターセパレーション法による精査を実施し、穀物および昆虫という当時の食性や環境を示す重要な資料の検出に成功した。とくに、薬用と考えられる植物種子の検出は、今後の研究展開が興味深いといえる。そのほかにも製鉄考古学ではモンゴル帝国初期の鉄資源を支えたアルタイ山脈地域の製鉄遺跡の踏査も行っている。研究成果公開としては、論文2編、学会発表2本がある。とくに論文1編はこの分野に強い関心を持つ中国の雑誌に中国語で発表したものである。今科研でメインの発掘対象と考えているアウラガ遺跡第2建物跡の発掘に着手し、その構造を理解するうえで重要なデータが得られたことと、植物考古学、製鉄考古学、動物考古学の資料が確実集積され、分析が進んでいることが理由である。本研究は13世紀初頭のモンゴル帝国の成立とその強大化の背景について、考古資料から明らかにしようとするものである。具体的にはモンゴル帝国の初代君主であるチンギス・カンが本拠をおいたモンゴル国、とくに東北部をフィールドにして考古調査を実施した。5月にはダダル郡のヌツゲン・ウンドル遺跡で墓地の調査を行った。地表面の構造から12世紀ごろのモンゴル族の祖先の墓群と推定されたが、実際にはそれよりも古かった。しかしながら、先モンゴル期における当地方の状況を知る上で重要な知見を得ることができた。8月にはモンゴル帝国の最初の首都であるアウラガ遺跡の発掘を行った。前年度から継続している大型政庁あるいは祭祀建物と考えられる第2建物を調査し、その具体的規模と構造の手掛かりを得た。これについては次年度以降も継続する予定である。なお、アウラガ遺跡に関しては廃棄遺構から採取した土の水洗を行い、当時の生活を知る上での基礎資料となる有機遺物の回収に成功している。9月にはアルタイ山脈周辺の踏査を行い、当該期の鉄生産関連の新たな遺跡の発見に成功した。史料などからアルタイでは古くから金属器生産が盛んで、それがモンゴル高原の遊牧民族の興隆につながったと言われてきたが、今回の発見でそれを実証的に裏付けることができるようになると期待している。6月には先行の科研の実績報告と本科研の中間報告的な意味をもつ著書を刊行できた。また、調査な速報的なレポートは、学会およびマスコミを通じて、その概要を報告している。
女子大学生のライフスタイルの変化と生理不順の要因に関する研究

[研究目的]女性大学生のライフスタイルの変化を把握し、生理不順の要因を明らかにすること。[研究方法]1.対象山形大学20年度入学の女子学生674名2.方法入学時女子のみ対象とした記名アンケート調査を実施し、663名(98.4%)解析対象とした。前年度までと同様に生理関連の調査内容に、生活習慣に関する項目(過去1年間における食事回数・時間・内容、睡眠、運動量、体重増減、ストレス、体の健康状態)を記入してもらった。また生理不順についてはアンケートにて過去5か月間の月経の状況の図示、周期について確認した。過去5か月間の月経の状況より、正常者572名、生理不順に該当する学生77名、無回答14名であった。相談希望者42名(63%)中、電子メール電話で連絡し、応じた18名と自発来談8名計26名に対して面接調査を行った。生活習慣である食事、睡眠、運動、ストレス、体の健康状態、BMIチェック等についてその後の経過を確認するために「ライフスタイルノート」を作成させ、同時に基礎体温測定方法を指導し測定させた。約半年後に同様に連絡をし、面接調査を行った。その際、春以降の大学生活のライフスタイルの変化を知るために、調査事項として食習慣(食事時刻、摂取時間)、睡眠習慣(就寝時刻と起床時刻)、運動習慣(部活やサークル)、アルバイト、ストレス、体の健康状態、生理不順の有無をより具体的に面接調査した。[研究成果]26名に約半年後面接を行った結果、1. 4名は、春の面接ですでに生理周期が正常であり、誤認識により、生理不順と思い込んでいた。2. 5名はすでに治療中のため、引き続き医療機関受診をすすめた。3. 17名中10名は、正常な生理不順の改善がみられた。生理不順の原因がバイト等での睡眠の乱れ、体重の減少増加の急激な変化、食生活の乱れ、ストレス等と思われたため、生活習慣の見直しを指導し、基礎体温計・基礎体温表を記入させて改善が見られた。しかし、7名は指導後も引き続き生理不順が見られたために、医療機関紹介となった。以上により、学生の生活習慣指導をおこなうことにより、生活習慣の改善と生理不順の関連を理解し、健全な学生生活の見直しができ、生理不順の改善も確認された。一方、部活、アルバイト、一人暮らしでの食生活の乱れ、睡眠不足等による乱れたライフスタイルの変化は、生理不順の原因になる要因であることが明らかになった。今後とも生活変化のパターンと女子学生のライフスタイルからの要因を探り、これからの健康指導に約立てたい。
哺乳類下顎の形態進化の背景にある発生モジュールの解明

本研究は哺乳類に特徴的な形態である聴覚器官の進化的成立に着目した。中耳は胎児期に生じる咽頭弓において形成され、耳小骨と鼓膜で構成される。従来、鼓膜は外耳道と第1咽頭嚢が第1、2咽頭弓の境界に沿って会合することにより形成される膜成分であると考えられてきた。本研究では、マウスとニワトリにおける鼓膜の形成過程をさらに詳細に比較し、両者における中耳形成の相違点を明らかにしようと考えた。マウスやニワトリの咽頭弓における遺伝子発現解析や実験発生学的手法により、マウス・ニワトリの鼓膜形成過程が共に従来の理解とは異なることを明らかにした。以上の研究結果を原著論文として発表した。顎口類の下顎は一般に複数の骨要素の結合により形成されるのに対し、哺乳類の下顎は歯骨という一つの骨要素のみからなる。哺乳類独自の下顎形態が進化した背景にある発生学的な変化を解明したいと考えた。羊膜類の下顎のパターニングにはHoxコードのデフォルト状態に制御される「近位部」と、Otx2陽性の神経堤細胞に制御される「遠位部」という、2つの発生モジュールが存在するという仮説を実証するため、以下の実験を行っている。Otx2陽性の神経堤細胞がどの形態要素に分化するかを検討するため、タモキシフェン誘導型のOtx2-CreマウスであるOtx2(CreERTM)とR26R-lacZマウス系統の交配を行っている。現在タモキシフェン投与の量やタイミングを検討している。またより容易に解析を遂行するため、R26R-H2B-EGFP系統を使用する準備を進めている。次に、Hoxa-2ノックアウトマウスと神経堤細胞でのHoxa-2過剰発現マウス胚の3次元再構築を行い、重複あるいは欠損する形態要素の同定を試みている。また、哺乳類における下顎の近位部は中耳として進化し、したがってこの領域に鼓膜が形成されるが、他の羊膜類では上顎領域に鼓膜が形成される。このため、哺乳類と他の羊膜類の鼓膜の形成メカニズムが異なることが示唆される。これについて検討するため、現在鼓膜を形成する外耳道の発生起源について、マウスとニワトリを用いた比較発生学的解析を行っている。哺乳類独自の下顎形態が進化した背景にある発生学的変化を解明するため、マウスとニワトリを用いた比較分子発生学を行った。哺乳類にはHoxコードのデフォルト状態に制御される「近位部」と、Otx2陽性の神経堤細胞に制御される「遠位部」という、2つの発生モジュールが存在するという仮説を立て、これを実証したいと考えている。Hoxa2のノックアウトマウスと、神経堤細胞特異的にHoxa2を強制発現させたマウスにおける顎顔面領域の表現型を詳細に調べるため、三次元再構築ソフトウェアを用いて解析した。またOtx2陽性の神経堤細胞が由来する形態要素を同定するため、Otx2のプロモーター領域がCreリコンビナーゼ遺伝子に接続されたコンストラクトをゲノム中に挿入したマウス(Otx2-Creマウス)が使用可能であるかについて検討している。マウス胎仔におけるOtx2の遺伝子発現パターンを詳細に調べ、Otx2-CreマウスとR26R-lacZマウスの掛け合わせにより得られたマウス胚のデータと比較している。次に、哺乳類と他の羊膜類の鼓膜形成メカニズムの共通点と相違点を調べることを目的として以下の実験を行った。マウスの鼓膜形成に関わる新規分子を探索するため、野生型マウスと鼓膜欠損モデルマウス(Gscノックアウトマウス)の中耳形成領域のマイクロアレイ解析を行い、鼓膜形成に関わる候補遺伝子を複数得た。また、ニワトリ胚における鼓膜の形成過程を詳細に調べたところ、マウスの鼓膜形成メカニズムとは大きな相違点があることを示唆する結果を得た。当初の予定通り研究を遂行している。本研究の目的は、哺乳類が独自の下顎形態を進化させた発生学的背景を明らかすることである。哺乳類の進化過程では、それまで複数の骨要素から形成されていた下顎が下顎骨のみから成る一枚骨となり、その他の骨要素の一部は聴覚器官である中耳として機能するようになった。これまでの研究成果として、哺乳類の下顎の形態進化に深く関与する中耳の成立に着目したところ、鼓膜が哺乳類では下顎の一部、爬虫類や鳥類では上顎の一部として形成されることから、鼓膜を伴う中耳が両系統で独立に進化したことを明らかにした。また両系統において鼓膜が異なる骨要素と関係を持った背景には、顎関節の発生位置の相違があることが示唆された。具体的には、マウスでは上下顎領域の境界がニワトリと比較して背側に形成され、これが両者の鼓膜形成位置の違いを生み出していると考えられる。本研究では、上下顎領域の境界がマウスとニワトリで異なる原因を調べるため、ニワトリの胚発生において上下顎の形態形成が起こる時期を特定し、この時期における上下顎の形態形成に関与する遺伝子の発現をマウスとニワトリで比較した。その結果、これらの時間空間的発現パターンの相違が両者における上下顎境界の形成位置の相違に関与していることが示唆された。次に、マウスとニワトリの鼓膜形成の発生メカニズムの共通点と相違点を明らかにするため、両者における鼓膜形成過程を詳細に比較した。マウスとニワトリにおける第1, 2咽頭弓の境界と鼓膜の形成位置の関係を調べたところ、両者の鼓膜形成位置が大きく異なることがわかった。

また、ニワトリにおいて鼓膜形成に関与する咽頭弓を同定するため、ニワトリとウズラを用いた神経堤の交換移植を行い、現在、得られたキメラ胚の表現型を解析している。当初の研究計画と一部異なるものの、本研究課題の目的に関する重要な研究結果を得ることができたため。これまでの研究より、哺乳類下顎の近位モジュールに属する中耳の構成要素である鼓膜が哺乳類系統と爬虫類-鳥類系統で独立に獲得されたことが強く示唆された。そこでマウスとニワトリにおける鼓膜の形成過程をさらに詳細に比較し、両者における中耳形成の相違点を明確にしようと考えた。成書によれば、鼓膜は「第1咽頭溝と第1咽頭嚢が、第1, 2咽頭弓の境界に沿って会合することで形成する」とされるが、その根拠となる研究データは不明確であった。そこでマウスとニワトリの咽頭弓の前後軸に沿った形態パターニングに着目して鼓膜形成過程の解析を行った。マウスHoxa2の発現プロファイル解析や、第2咽頭弓が消失して代わりに第1咽頭弓が重複するHoxa2ノックアウトマウス胚(第1咽頭弓重複胚)を調べた結果、マウスの鼓膜は第1咽頭弓内で形成され、その形成には第1咽頭弓の存在が必要十分であることがわかった。ニワトリでも同様にHoxa2の発現プロファイル解析とニワトリ・ウズラキメラ実験による第1咽頭弓重複胚を解析したところ、ニワトリの鼓膜は第2咽頭弓内で形成され、その形成には第2咽頭弓が中心的な役割を果たしていることがわかった。これらの結果から、マウス・ニワトリの鼓膜形成過程が共に従来の理解とは異なることを明らかにした。また、鼓膜形成においては、第1, 2咽頭弓の境界ではなく、鼓膜を構成する上皮とそれに付着する骨要素を由来する間葉との相互作用が中心的な役割を果たすことが示唆された。以上の研究結果を原著論文として発表した。本研究は哺乳類に特徴的な形態である聴覚器官の進化的成立に着目した。中耳は胎児期に生じる咽頭弓において形成され、耳小骨と鼓膜で構成される。従来、鼓膜は外耳道と第1咽頭嚢が第1、2咽頭弓の境界に沿って会合することにより形成される膜成分であると考えられてきた。本研究では、マウスとニワトリにおける鼓膜の形成過程をさらに詳細に比較し、両者における中耳形成の相違点を明らかにしようと考えた。マウスやニワトリの咽頭弓における遺伝子発現解析や実験発生学的手法により、マウス・ニワトリの鼓膜形成過程が共に従来の理解とは異なることを明らかにした。Otx2陽性の神経堤細胞がどの形態要素に分化するかの検討、Hoxa-2ノックアウトマウスと神経堤細胞でのHoxa-2過剰発現マウス胚の3次元再構築は予定通り進行している。当初の計画に加え、マウスの鼓膜形成に関わる新規分子を探索する研究を進めている。野生型マウスと鼓膜欠損モデルマウス(Gscノックアウトマウス)の中耳形成領域のマイクロアレイ解析による新規候補遺伝子の探索をさらに進めていく。これまでに哺乳類と爬虫類ー鳥類における上下顎境界の形成位置の相違、鼓膜の形成位置やメカニズムの相違について明らかにすることができた。今後はこれまでの実験結果の追試、追加実験によって得られた結論を補強するデータを取得し、研究成果として原著論文や総説を発表する予定である。発生生物学平成26年度は、当初の研究計画に加えて新たに哺乳類系統と爬虫類-鳥類系統における外耳道の発生起源の相違についての検討も始めた。
非アルコール性脂肪肝炎の病態の究明(酸化ストレスとミトコンドリアの関与を中心に)

最初にわれわれは,肝細胞特異的PTENノックアウトマウスを作成し,NASHの動物モデルを確立した。このマウスの初代培養肝細胞に過酸化水素を加えてから60分後には,cell viabilityが20%まで低下した。しかし,過酸化水素を加える前に,抗酸化剤であるN-acetyl cystein(NAC)をpre incubationするとcell viabilityが著明に改善し,また肝細胞内のreactive oxygen species(ROS)も約1/3に軽減した。またそれに伴って,NACはミトコンドリア障害も抑制した。次に,PTENノックアウトマウスに脂肪肝の発症や酸化ストレスを抑制する薬剤であるN-acetyl cystein(NAC),Eicosapentaenoic acids(EPA),Ursodeoxycholic acid(UDCA)を投与した。薬剤投与は離乳直後とし,40週齢と70週齢で脂肪性肝炎と肝癌の肉眼的,組織学的改善の有無を評価した。また,血中肝胆道系酵素,脂質,ラジカル生成能と肝組織における脂肪含有量,脂肪酸分画,抗酸化・脂肪酸合成酵素関連遺伝子の発現を10週齢,40週齢で検討した。NACは、ROSを消去することにより肝炎を抑制した。EPAとUDCAは,SREBP1cの発現減少により肝脂肪化を抑制し,オレイン酸/ステアリン酸比の低下とERKのリン酸化減少に基づいて発癌を抑制した。EPAとUDCAによる肝炎抑制の背景はROSの減少であったが,EPAはさらにAMPKα1の発現を増加させることにより,SREBPlcの発現を調整していることが明らかになった。以上,NAC,EPA,UDCAは,作用点は異なるが,ROSの消去に基づいてPten KOマウスの肝障害を抑制しており,これらの薬剤を併用することによりNASHを効果的に治療できると考えられた。1.<肝細胞特異的PTENノックアウトマウスの作成>実験で用いる肝細胞特異的PTENノックアウトマウスを作成し,NASHの動物モデルを確立した。2.<初代肝細胞培養の樹立>肝細胞特異的PTENノックアウトマウスから肝細胞を単離後,初代培養肝細胞の樹立に成功した。4,<confocal laser microscopyによる初代培養肝細胞のミトコンドリア障害の可視化>3.で示したROSを惹起させる様々な刺激を加えた後,60分後にはmitochondrial permeability transition(MPT)が生じ,ミトコンドリアの膜の脱分極が生じた。5.<PTENノックアウトマウスの肝病変に対する抗酸化ストレス剤のin vitroにおける効果>3.で示したROSを惹起させる様々な刺激を加える前に,抗酸化剤であるN-acetyl cystein(NAC)をpre incubationするとcell Viabilityが著明に改善し,また肝細胞内のROSも約1/3に軽減した。また,NACはMPTと,ミトコンドリア膜の脱分極を抑制した。よって,NACは肝細胞内のROSを軽減することによって,ミトコンドリア障害を抑制し,肝細胞保護作用を示すことが示された。NACがin vivoでも効果があるか否かや,その作用メカニズムを明らかにするとともにin vivoで効果がある新たな薬剤候補を検討することを次年度の課題としたい。<PTENKOマウスの肝病変に対する薬剤のin vivoにおける効果>PTENノックアウトマウスに脂肪肝の発症や酸化ストレスを抑制する薬剤であるN-acetyl cystein (NAC), Eicosapentaenoic acids (EPA), Ursodeoxycholic acid (UDCA)を投与し,肝への脂肪沈着,炎症細胞浸潤,線維化,発癌等を抑制することができるか否か検討した。

薬剤投与は離乳直後とし,40週齢と70週齢で脂肪性肝炎と肝癌の肉眼的,組織学的改善の有無を評価した。また,血中肝胆道系酵素,脂質,ラジカル生成能と肝組織における脂肪含有量,脂肪酸分画,抗酸化・脂肪酸合成酵素関連遺伝子の発現を10週齢,40週齢で検討した。NACは、細胞内還元型glutathioneを増加させ,reactive oxygen species (ROS)を消去することにより肝炎を抑制したと考えられたが,SREBPlcの発現は抑制されず,したがって肝の脂肪化は抑制されなかった。EPAとUDCAは,SREBPlcの発現減少により肝脂肪化を抑制し,オレイン酸/ステアリン酸比の低下とERKのリン酸化減少に基づいて発癌を掃制した。EPAとUDCAによる肝炎抑制の背景はROSの減少であったが,EPAはn3/n6比の上昇と抗酸化酵素の発現増加に基づいて肝内ROSを制御していると考えられた。さらに,EPAは,Aktのリン酸化は抑制しないが,AMPKα1の発現を増加させることが明らかになり,EPA投与によるSREBPlcの発現の調整は,AMPKを介する経路が関わっていることが考えられた。以上,NAC, EPA, UDCAは,異なった作用機序に基づいてPten KOマウスの脂肪肝,脂肪性肝炎,肝癌の増悪を抑制しており,これらの薬剤を併用することによりNASHを効果的に治療できると考えられた。
リンパ性樹状細胞を用いたPBCナイーブT細胞からの自己反応性T細胞クローンの誘導

初年度の検討により原発性胆汁性肝硬変(PBC)におけるリンパ性樹状細胞(DC)に機能障害が存在していた。本年度は、その原因の検索とpyruvate dehydrogenase(PDH)による自己反応性T細胞の誘導に努めた。(対象と方法)(成績)健常者とPBCではIL-10、IL-12の産生量に差異を認めなかったが、NO産生量はPBCにおいて健常者より有意に(P<0.001)に上昇した。NO inhibitorであるN^G-monomethyl-L-arginine monoacetate(L-NMMA)の添加によりPBCでのNO産生は減少し、低下していたallogenic MLRは回復した。PDHをDC分離後、T細胞との混合培養前に添加すると(PDH-パルス)、健常者及びパルスしない群と比較してT細胞増殖が有意に誘導された。(結論)PBCにおいてDCに機能異常が存在することをみた。その機能を回復することで、DCは自己抗原に対する自己反応性T細胞クローンの誘導に有用であると考えられた。ヒトPBC及びPBC類似肝病変を有する老齢マウスの胆管病変部位にリンパ性樹状細胞が存在し、最も強くMHCclassIIを発現していることを証明した。初年度はリンパ性樹状細胞を末梢血から分離し、混合培養にてリンパ球幼惹化反応がどの程度起こるか否かについて健常者及びPBC患者で検討した。(対象と方法)PBC患者及び健常者の末梢血より2種類の方法でリンパ性樹状細胞(LDC)を分離した。Ficoll-Conray比重遠心法ののち、1)negative selection法と2)GM-CSFとIL-4を添加した培養(サイトカイン添加培養法)を行った。混合培養のためのT細胞はロゼット法とT細胞recovery kitで採取した。(成績)リンパ性樹状細胞はnegative selection法、サイトカイン添加培養法のいずれでも、80%以上の純度で末梢血より分離することができた。リンパ性樹状細胞であることは、樹状突起をもつその特異的な形態を光学顕微鏡で観察し、さらにフローサイトメトリーによるMHCclassII、CD80、CD86の発現により確認した。分離したリンパ性樹状細胞をT細胞と混合培養すると、PBC患者では健常者と比較して有意に幼惹化反応が低下することが判明した。(結論)PBC患者のリンパ性樹状細胞ではリンパ球の幼惹化の誘導が起こりにくかった。現在、その原因について検討中である。尚、その他の実験については進行中である。(対象と方法)(成績)健常者とPBCではIL-10、IL-12、の生産量に差異を認めなかったが、NO生産量はPBCにおいて健常者より有意に(P<0.001)に上昇した。NO inhibitorであるN^GG-monomethyl-L-arginine monoacetate(L-NMMA)の添加によりPBCでのNO産生は減少し、低下していたallogenicMLRは回復した。
海藻の食物繊維ならびにポリフェノール化合物の消化管内における有用性に関する研究

これまでは主に日本産の食用海藻を試料として食物繊維ならびにポリフェノール化合物の分布を調べましたが、それに加えて熱帯地方であるインドネシア産の海藻に付いても分析を行い、日本産の試料と同様に陸上植物に比べて多量の水溶性食物繊維を含むこと、異なる種類のポリフェノールを多く含むことが明らかになりました。この結果に基づいて、インドネシア産海藻由来のポリフェノール成分の抗酸化性を油エマルジョンの酸化モデルを用いて検討し、2002年4月に奈良で開催された日本水産学会において発表しました。一方、これらの海藻の加工に視点を置き、食物繊維の粒子のサイズが異なることでどのように水溶性食物繊維の溶出が異なり、また水溶性食物繊維の粘性によってそれらの生体に及ぼす影響が異なるのかをラットを用いた動物実験で検討し、これも同学会で発表しました。引き続いて海藻成分が腸管内でどのように生理効果を発現しているのかを明らかにするため、腸管細胞であるCaco-2を購入し、この培養系において海藻成分を共存させた場合にどのような影響が細胞に現れるのかを検討しています。具体的にはCaco-2を培養し、腸管内でごく一般的に生じる酸化損傷を過酸化水素を用いて引き起こします。その培養系に海藻のポリフェノール化合物を添加することでこの損傷が改善されることなどを明らかにすることを試みています。このような実験系において、DNAラダーやキットによる染色によるアポトーシスの検出などを行い、これらの要因となった物質を防ぐために望ましい海藻成分を明らかにできることを期待しています。これまでに食用海藻を試料としてそれらの食物繊維ならびにポリフェノール化合物の分布を調べました。この際に、原料としてアオサとヒトエグサが混ぜられている青海苔などの商品を避けるため、これらの原料を実際にサンプリングしました。これらの分析の結果、陸上植物に比べて多量の水溶性食物繊維を含むこと、異なる種類のポリフェノールを多く含むことが明らかになりました。ポリフェノールによる抗酸化性の発現に関する研究に関しては2001年10月に横浜で行われた70th anniversary of The Japanese Society of Fisheries Science International Commemorativeで"Antioxidativeor prooxidative effects of seaweed fractions in oil emulsion model"の表題で発表し、2001年10月に京都で開催されたInternational Symposium on More Efficient Utilization of Fishe and Fisheries Products"では"Polyphenolic compoundsfrom seaweeds : Distributions and their antioxidative effects"の表題で発表しました。これらの研究はすでにProceedingとして受理され、2002年のFisheries Science Supplementとして公表される予定です。食物繊維に関する研究では脂質代謝に及ぼす影響に視点をおき、食物繊維による胆汁酸の吸着などについて検討しました。試験管内実験においてこの検討を行った結果をまとめ、Fisheries Scienceに発表しました。引き続き動物実験を行い、どのような状態の食物繊維が健康にいいのかを明らかにしようと試みております。現在は、これらの海藻の加工に視点を置き、食物繊維の粒子のサイズが異なることでどのように水溶性食物繊維の溶出が異なり、また水溶性食物繊維の粘性によってそれらの生体に及ぼす影響が異なるのか、などを検討しております。
アジア太平洋の地域コミュニティにおける個人経営体を重視した社会開発と環境保全

宇宙船地球号の乗員、地球市民という概念は、閉じられた自然空間に経済社会が制約されることを意味するが、自然環塊によって賦存量の制約は、資源エネルギー・土地・水・大気など本源的資源にあって、厳しく、その収奪的な利用は、環境悪化を引き起こす。そして、本源的資源の利用可能性が将来にわたって低下し,加えて、本源的資源の利用に伴う排出物・廃棄物による環境悪化も生じてくる。したがって、先進国・途上国における人口増加は,資源エネルギーの消費急増となって本源的資源への人口圧力を高め,貧困者の資源利用可能性を引き下げる。他方,少子長寿(高齢)化がもたらす利益は,(1)総エネルギー消費や廃棄物排出の減少と土地・森林・漁場・水への人口圧力の低下による地球全体への環境負荷の引き下げ,(2)1人当たりの本源的資源の利用可能性の拡大とアメニティの向上,(3)学齢児童の減少による1人当たり教育サービスの向上,が指摘でき,持続可能な開発にも貢献する。そこで,社会開発を進めて、少子化を促すことは,1人当たりのインフラ・本源的資源の利用可能性を拡大しつつ,環境への総負荷を引き下げることに繋がり,環境保全に有利である。また,そこで,途上国でも、ジェンダー平等化,リプロダクティブ・ヘルスとプライマリー・ヘルスケアの充実は,女性の社会進出の機会を確保し,乳幼児死亡率の引き下げ,避妊実施機会の提供を促すことで,人権の確立に配慮しながら,出生率を引き下げることが可能になる。特にこのような人口政策は、地域コミュニティの住民に対して有効であり、グローバルな視点でみても、持続可能な開発と親和的な人口抑制政策として機能するといえる。これは,人権保護に配慮したジェンダー平等化,リプロダクティブ・ヘルス,プライマリー・ヘルスケアの充実であり、新たな草の根の環境政策であると結論できる。南北問わずに少子高齢化が進んでいるが,少子化対策としての出生率の回復は,誤った政策であり,かえって資源エネルギー消費の拡大から環境問題を悪化させてしまう。つまり,人口増加に伴う弊害除くことが持続可能な開発にとって重要であり,ジェンダー平等,リプロダクティブ・ヘルスが人口抑制と人間環境改善にともに結びつく親和的政策である。他方,国内人口移動の流れを都市化の中で把握しつつ,都市インフォーマル部門,フィリピンとインドネシアの地方の貧困の実情を明らかにした。また、タイの家内工業の特徴を押さえた上で,調査に基づいて,農業,女子労働と関連が深いシルク生産の実態を明らかにし,個人経営体・内職者が柔軟型ネットワークによって結びついていることを示した。さらに,地球温暖化の要因である温室効果ガスを削減できるようなエネルギー政策を,産業,民生,運輸,発電について考察した。また,エネルギー政策の実効性を高めるにために,インセンティブ型環境政策として,排出権の取引,GEF,炭素税などを議論する。そして,再生可能エネルギーの開発が社会開発と環境保全に有効なことを示した。さらに,熱帯林を取り上げ,熱帯林減少の要因として,従来の見解が,薪炭生産と焼畑を過大評価し,用材生産と企業的フロンティア開発を過小評価していること示した。そして,地域コミュニティの管理するローカル・コモンズとしての熱帯林では,コモンズの悲劇やモラル・ハザードが抑制され,適切な管理が行われる可能性が高いことを論理的に明らかにした。日本との関連では,アジア廃棄物の排出と処理を概観した上で,規制の限界を指摘した。そして、廃棄物抑制のために廃棄物処理有料化、デポジット制度、バージン資源への課税が有効であるが,アジアでは低賃金を活かした労働集約的なマテリアルリサイクルが盛んであり、これと日本のゴミ輸出が関連していることを示した。

本研究は、開発途上国と先進工業国の双方を視野に入れて、持続可能な開発に資するように、アジア太平洋における中国、タイ、フィリピンなど途上国の個人経営体を対象とした草の根援助を具体的に提唱した。つまり、開発途上国の人々の主要な雇用形態・就業形態は、地域コミュニティにおける小規模な農業、製造業などの個人経営体が中心であって、資本形成は不十分なため個人経営体の労働生産性は低い。しかし、土地、森林、水、沿岸資源はローカル・コモンズとして、地域コミュニティのメンバーの利益を保護するように利用されており、資源の収奪は抑制されている。これは、メンバーが情報を共有した信頼関係が成立していたり、メンバー相互のモニタリングが機能したりしているためである。このようなローカル・コモンズの適正管理に加えて、個人経営体1人当たりエネルギー消費水準は低く、廃棄物やCO_2排出量も先進国よりも遙かに低い。アジア太平洋地域の途上国における個人経営体を、社会的弱者やソーシャルセイフティーネットの取り組みとしてみるのではなく開発と環境保全の担い手として育成する方法を考えた。先進工業国は高水準の経済活動を続けて、エネルギー消費、廃棄物などの観点で環境負荷を高め、環境債務を累積させた。その一方で、資金技術の上では先進工業国の対応能力が期待されている。そこで、この南北の「共通だが差異ある責任」をふまえ、環境債務を返済するために、先進工業国は開発途上国への環境ODAを充実させるべきであろう。他方、開発途上国には、労働集約的技術に基づく大きな雇用吸収力、地域コミュニティによるローカル・コモンズの適正管理が指摘できる。また、天然素材の活用技術に優れ、廃棄物も少なく抑えられている。そこで、地域コミュニティの個人経営体を対象とした草の根環境ODAが持続可能な開発を推進する有力な手段となる可能性が高いといえる。資源エネルギー・土地・水・大気など自然環境によって賦存量が定まっている本源的資源と環境問題のかかわりは,(1)本源的資源の収奪的利用による環境悪化,(2)本源的資源の利用可能性の低下,(3)本源的資源の利用に伴う排出物・廃棄物による環境悪化,と整理できる。所得分配の不平等を踏まえれば,貧困者1人が利用できる本源的資源は,貧困層の人口急増と並んで,富裕層の人口増加によって,大幅に減少する。したがって,途上国よりも先進国の人口増加は,資源エネルギーの消費急増となって本源的資源への人口圧力を高め,貧困者の資源利用可能性を引き下げる。他方,少子長寿化がもたらす利益は,(1)総エネルギー消費や廃棄物排出の減少と土地・森林・漁場・水への人口圧力の低下による地球全体への環境負荷の引き下げ,(2)1人当たりの土地や森林の利用可能性の拡大による生産性とアメニティの向上,(3)学齢児童の減少による1人当たり教育サービスの向上,が指摘でき,持続可能な開発にも貢献する。アジェンダ21では,人口と生産の増加が地球の資源エネルギーに圧力を加えていると指摘し,持続可能な開発と人口問題を統合して扱うことを求めている。そこで,社会開発を進めて、少子化を促すことは,1人当たりのインフラ・本源的資源の利用可能性を拡大しつつ,環境への総負荷を引き下げることに繋がり,環境保全に有利である。
氷結晶誘導を利用した酵素含浸による形状保持型介護食作製に関する研究

凍結含浸法は食材の凍結と減圧処理を利用した酵素等の急速含浸法であるが、在宅調理に適用できない。凍結含浸工程から減圧処理を省略した新規酵素含浸法について検討を行った。これまでに食材表面に酵素(ペクチナーゼ)を付着させた状態で食材を凍結・解凍し、そのまま酵素反応させると食材が軟化する現象を見出した。これは酵素が拡散によって食材内に浸透したものと考えられた。そこでこの拡散メカニズムについて検討を行った。凍結から解凍、浸漬に至る各工程において、酵素等の高分子物質の食材内への拡散作用を確認するため、高分子物質としてブルーデキストラン(BD、分子量200万)を用いた。食材としてダイコン、ジャガイモを用い、事前に10分茹で加熱し、1BDに浸漬した状態で凍結し、凍結した状態のまま切断した。2試料を凍結し、BD溶液に浸漬して10分間で解凍した後に切断した。3試料を凍結し、解凍後、BD溶液に10分間浸漬した後に切断した。その結果、BDは凍結食材を解凍する時に食材内水分を通して拡散・浸透することがわかった。実際に酵素を利用してその効果を調べたところ、BDの浸透結果と一致した。酵素拡散を利用して食材を軟化する方法として、凍結前に酵素を塗布する方法と凍結食材を解凍する時に酵素に浸漬する方法がある。本法の適用において、事前加熱、凍結方法、酵素濃度、解凍温度、酵素反応方法、酵素液の浸漬方法、酵素粉末の塗布方法及び酵素粉末の賦活剤の利用法についてそれぞれ適応性について明らかにしておく必要がある。そこで、各工程について食材の硬さを指標に適応性について評価した。その結果、凍結前酵素浸漬と解凍中酵素浸漬では両方良好であるが、酵素粉末では前者がより有効であった。その他の工程では、酵素反応を低温(3°C)で長時間(12時間)行うことで、ほとんどの事例で食材を良好に軟化させられることがわかった。氷結晶誘導含浸では,酵素の付着方法として酵素液と酵素粉末を利用する方法があるが,拡散効果は食材表面における酵素の濃度勾配が高いほど高くなるため,酵素粉末を直接塗布する方が効果的であった。しかし,食材の軟化の均一性と酵素使用コストを比較した場合,酵素液を塗布または浸漬した方が有用であることがわかった。酵素粉末を直接塗布する場合,食材内部または表面の水分量が極めて重要で,酵素の使用量に影響を及ぼすことがわかった。食材に酵素粉末を塗布する工程において,微量の酵素を均一に塗布するためには酵素に賦活剤を混合した酵素粉末が必要となる。賦活剤添加による酵素拡散及び軟化食材の離水に及ぼす影響を検討した結果,低分子糖類が酵素拡散に促進的に働き,高分子であるβ型でんぷんは離水を防止する効果が認められた。また,有機酸塩類の添加はペクチンに結合するCaのキレート効果とpH調整効果が認められ,食材の軟化を促進することが明らかとなった。凍結含浸と氷結晶誘導含浸で得られた食材の物性をテクスチャー解析した結果,両者に差異は認められず,氷結晶誘導含浸の有用性が認められた。食材の長期保存を目的にレトルト介護食の連続処理に関する実験を行った。氷結晶誘導含浸は減圧処理を必要としないため,レトルトフィルム内で酵素拡散による含浸処理と酵素反応,酵素失活処理を連続的に行うことが可能である。そこで,予め酵素塗布し凍結した状態の食材をレトルトフィルムに密封し,フィルム内での酵素反応・失活・レトルト殺菌による形状保持型介護食を作製した結果,レトルト釜内部の温度上昇速度と適した増粘剤を選択することで形状保持した状態の介護食を作製できることがわかった。なお,本法では食材の軟化度の均一性に問題は残った。今後は,効率的かつ低コスト(酵素添加量の低減効果、酵素反応時間の短縮効果)で均一軟化する条件を検討する予定である。1氷結晶誘導含浸に及ぼす浸透圧制御物質等の影響の解明:酵素に添加する賦活剤の効果について,酵素粉末の場合は酵素の希釈,浸透拡散効果の促進及びキレート作用が見出され,酵素液として利用しても同様の効果が得られることを見出した。さらに,ドリップ生成に伴う離水防止効果についても明らかにした。課題として,食材の水分量と酵素粉末の添加量,または酵素液の調製方法(酵素濃度,賦活剤の選択,粘度など)についてさらなる検討が必要である。2酵素の表面塗布方法の検討:酵素の塗布方法について,拡散効果を促進するために酵素粉末の表面塗布が有効と考えられたが,食材の軟化を均一に行うためには,微量の水分添加が効果的であることを見出した。さらに,添加時期についても食材の凍結前,凍結後いずれの添加時期においても同様の軟化効果が得られることを明らかにした。その際,添加する水分量の添加方法,添加量についての課題は残った。また,酵素の添加量は製造コストに反映されるので,酵素の添加量と添加方法について最適化を図った。3凍結含浸食材と氷結晶含浸食材のテクスチャー解析による比較:凍結含浸食材と氷結晶含浸食材の比較では,食材の軟化の均一化については前者の方が優れていたが,処理方法をプロトコル化することでほぼ同様の形状保持型介護食の製造が可能であることを見出した。その際,事前加熱温度または事前加熱方法(熱風,スチーム,煮沸)の選択が重要で,食材ごとに適正化を図る必要があった。

4形状保持軟化介護食の作製:氷結晶誘導含浸による酵素含浸を利用することで極めて簡易的な工程で連続的な酵素含浸,酵素反応,殺菌工程を行えることがわかった。ただし,タケノコなどの冷凍変性が生じる食材の場合,凍結含浸とは異なり,凍結変性の影響を受け,食材の物性は変化することがわかった。今後は,この工程の最適化を図り,汎用的な方法を見出す予定である。申請者は,食材内への酵素含浸法の開発において,減圧工程を必要としない簡易な酵素含浸法である「氷結晶誘導を利用した酵素含浸法」を新たに考案し,そのメカニズムについて,仮説を立てその検証を行った。その結果,酵素含浸,すなわち拡散による食材組織内への酵素の染み込みは,食材を凍結させる際の氷結晶生成時よりも,氷結晶の融解時に生じることを解明した。物資の拡散は,分子量,温度,粘度及び拡散物質の濃度勾配に影響することから,高分子化合物である酵素の拡散を最大化するための条件として,食材の前処理,酵素温度と酵素の濃度勾配等について至適条件を検討した。食材の解凍時における酵素拡散を効率的に行うための処理工程として,1加熱処理ー酵素塗布ー冷凍ー解凍ー酵素反応ー酵素失活,及び2加熱処理ー冷凍ー酵素浸漬ー解凍ー酵素反応ー酵素失活,の2工程が存在することから,最もシンプルな2の処理工程について検討した。ペクチナーゼとセルラーゼの混合酵素剤を調製し,食材の硬さを指標に軟化効果を検証したところ,事前加熱処理が酵素拡散と組織の軟化に重要で,特に湿式加熱が食材の軟化に効果的であった。酵素拡散は食材内の水分を通じて行われることから,含水率の高さと,加熱による組織損傷効果が相乗的に働いたものと考えられた。また,酵素の濃度勾配を高める手法として,凍結前に粉末状態で塗布する方法が有効で,酵素の低減化にも影響することがわかった。今後は,食材の解凍温度,時間の設定,凍結条件の最適化,酵素粉末の配合について検討する予定である。本研究成果は,2017年1月31日に特許出願を行った。(特願2017ー15915、食材への酵素導入方法)1氷結晶含浸における事前処理および酵素液の至適条件の設定:ブルーデキトランによる含浸効果について,凍結過程に加え,融解過程について検討を行った。その結果,当初考えいた凍結過程よりも融解過程において酵素含浸が生じることを明らかにした。それを基に,事前処理の効果を検討したところ,湿熱加熱が有効で,組織の損傷効果に加え,含水率の増加による拡散効果が増大したものと推察された。2冷凍速度、冷凍温度が酵素含浸に及ぼす影響の解明:食材の解凍工程において拡散による酵素含浸が生じることから,解凍操作も重要となった。まずは,凍結方法について検討を加えた結果,組織が硬く軟化しにくいレンコンなどは緩慢冷凍が必要であるが,多くの食材は急速凍結でも十分食材は軟化することがわかった。次年度は,解凍工程の最適化を検討する。3酵素反応温度、反応時間が酵素含浸に及ぼす影響の解明:酵素の反応方法として,衛生面から,急速軟化(至適条件で操作)と緩慢軟化(低温で長時間酵素反応)の2通りがある。急速軟化でも目的の軟化度に達成させることは可能であるが,その場合は事前加熱の影響を考慮する必要があった。低温で酵素反応する方法は,在宅調理や施設調理を想定すると,施設面及び衛生面で有利である。