hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞チップを用いた細胞機能解析を可能とするマラリア迅速・高感度検出システムの構築

感染症マラリア撲滅にはギムザ染色法に代わる感染初期に感染の有無を見極める事のできる迅速な診断手法を、これまで構築してきた細胞チップを用いたマラリア検出法を基礎として、構築しようと考えた。原虫のゲノムを標的とし各チャンバー内でPCR反応を行うことで、治療方針を左右する原虫種同定法の確立。また各チャンバー内でマラリア原虫の1week培養、抗マラリア薬添加による生死判定を行うことでハイスループットな抗マラリア薬スクリーニング法の構築を行った。その結果、各反応ステップの基礎条件を決定するし薬剤耐性マラリア診断の基礎技術を構築することができた。今後すべての反応工程がオンチップ上でできる系を構築する。マラリア原虫はヒトの赤血球に寄生を繰り返し、年間感染者数2億人以上うち100万人以上が死亡する人類史上最も重篤な寄生虫感染病である。感染症マラリアの深刻な問題として抗マラリア薬に対する薬剤耐性マラリア原虫の出現や、地球規模の環境変動(特に温暖化)・交通手段の発達によるグローバル化によって感染者数の増加・感染地域の拡大が上げられる。このような背景のなかWHOなどの国際機関ではマラリア撲滅指針の一つに「早期発見および適切な早期治療」を掲げている。近年、治療分野では生薬をベースとした抗マラリア薬やワクチンの開発は実を結びつつある。しかし診断法に関しては、検出感度や検出時間などの面から今だ100年以上前に確立されたギムザ染色による顕微鏡下での観察診断が主流とされている。そのため特に感染初期段階での診断に多大な時間と労力を必要とし、早期発見とその先に続く治療への大きな妨げとなっている。これまでに申請者は大量の血球細胞を一定数ずつ正確に並べる(整列させる)事ができる細胞チップと名付けた微細加工プラスチック基盤を用いることで、大量(百万個以上)の血球細胞の中からたった一個のマラリア感染赤血球を15分で見つけ出すことができる簡便かつ迅速なマラリア手法を確立した。さらに各チャンバーを反応場とし、この中でPCR反応、抗原抗体反応、さらには各チャンバーをwellに見立てる事によって各チャンバーで生化学的、分子生物学的解析を行うことができれば、治療方針を左右する原虫種同定法の確立およびハイスループットな抗マラリア薬スクリーニング法(薬剤耐性試験法)構築が可能になると考えた。そこで今年度は各種反応(機能解析のためのPCR、抗原抗体反応等)に適した細胞チップの形状(デザイン)の検討を行った。これにより溶液交換の適切な形状が判明しつつある。マラリアの制圧戦略の一つに、早期発見(診断)と適切な早期治療が提唱されている。しかし、適切な早期治療へと繋がる早期発見に関しては問題点が多い。そこで申請者は、これまで研究を進めている細胞チップとマラリア寄生原理を利用した、高感度・迅速・簡易なマラリア検出技術を基礎として、細胞チップ上のチャンバー内で分子生物学、生化学の反応を行うことでマラリア原虫種同定法の確立およびハイスループットな抗マラリア薬スクリーニング法(薬剤耐性試験法)の構築を目指す。これにより早期発見、治療の方向性を決める様な原虫種、薬剤耐性といった細胞機能解析を一気通貫的に行うことができ、適切な早期治療へ繋げることができる。本年度は特にチャンバー系を大きくすることで培養用に適した細胞チップを作成し(企業に依頼)、径を大きくしても赤血球が一定数正確に格納、整列するか、これまでの方法どおりマラリア検出可能か評価、改善を行いとともに、細胞チップでの最適な培養条件の検討を行なった。また本研究計画からは外れるが、これまでに開発したマラリア検出用細胞チップ(細胞を100個ずつ整列)評価に向け外国との倫理委委員会審査を本実験にも拡大適用できる事を見越しながら先方との話し合いを継続し、実際のマラリア患者サンプルを入手測定の準備を行った。研究計画に従い、初年度(平成26年度)、本年度(平成27年度)と研究を遂行し細胞チップ上のチャンバー内で分子生物学、生化学の反応を行うことでマラリア原虫種同定法の確立およびハイスループットな抗マラリア薬スクリーニング法の基礎原理を概ね構築する事ができている。この点でおおむね順調に進展していると考えている。本年度は特に昨年度まで積み上げてきた各チャンバーに一定数赤血球が入る条件下で、薬剤耐性評価までの全ての行程(マラリア検出、培養、薬剤耐性評価)をオンチップ化することに取り組んだ。全ての工程を連続させ行い培養後マラリア原虫の遺伝子(actin-1)を検出できたものの、薬剤耐性タイピングのための遺伝子増幅がうまくいかない事が明らかとなった(培養の工程で目的細胞がはがれ、チャンバー内の標的遺伝子量が検出限界以下になっていると想定される)。

今後も薬剤耐性判断までのすべての工程をオンチップ上で行う方法を見出すために個々の工程で決定した条件(チップの形状の、培養条件、PCR条件)について微調整を繰り返し目標の達成を目指す。また、本研究計画からは外れるがマラリア臨床現場で本手法の実証を行う必要性があることから、感染流行地域(アフリカ、ミャンマーなど)でのサンプリングを目指し倫理委員会を含め国内外の各関係機関と連携を進めていた。概ねサンプリングの目途を立てることができた。感染症マラリア撲滅にはギムザ染色法に代わる感染初期に感染の有無を見極める事のできる迅速な診断手法を、これまで構築してきた細胞チップを用いたマラリア検出法を基礎として、構築しようと考えた。原虫のゲノムを標的とし各チャンバー内でPCR反応を行うことで、治療方針を左右する原虫種同定法の確立。また各チャンバー内でマラリア原虫の1week培養、抗マラリア薬添加による生死判定を行うことでハイスループットな抗マラリア薬スクリーニング法の構築を行った。その結果、各反応ステップの基礎条件を決定するし薬剤耐性マラリア診断の基礎技術を構築することができた。今後すべての反応工程がオンチップ上でできる系を構築する。本年度はこれまでに構築した、マイクロチップ上でのマラリア検出から新たな機能付加(マラリア原虫の機能解析:抗原抗体反応やPCR反応による、原虫種や薬剤耐性の検出)を行うたため、これら機能解析反応に適したマイクロチャンバーの形状の検討が重要である。そこで今年度はその検討に重点を置いて研究を進めた。その結果、抗原抗体反応に適したデザインに関しては最適と思われる条件を見出した(PCRに関する条件は、可能そうな条件は見つけられつつあるもののまだ検討の余地あり)。これらの条件をもとに細胞チップの作成を外部に依頼している。これらの検討(成果)をもとに次年度への実際の検出条件検討へとつなげる。こちらに注力したことにより、微小ボリュームでのPCR条件の検討は来年度行うものとする。この基礎原理をマラリア原虫の薬剤を使って、本来の培養シャーレで行っている事を細胞チップで評価検討する必要がある。また本技術はマラリア患者サンプルで行うことができて社会で使える技術として完成すると考えている事から、実際に海外のマラリア患者の血液サンプルを入手し、評価を行う(来年度中にそこまで達成することは難しいかもしれないが)事を目標に、海外の研究者、国際医療機関に働きかけを行うことを考えている。衛生薬学本年度の細胞チップのデザイン条件検討を踏まえ、培養マラリア原虫を用いてチップ上での解析反応(特に抗原抗体反応)を試みるとともに、細胞チップ上での反応系構築を行う。また今年度検討ができていなかった微小ボリューム(100pl)でのPCR条件の検討も並行して行うものとする。さらにこのPCR反応のオンチップ化も追いかけつつ進めていく。そして最終年度にはこれらの技術を持って、マラリア流行地域(アフリカ地域)へ持込み患者サンプルでの実験を行い、実際に使える可能性まで検討を行いたいと考えている。前年度の使用が実験家遂行において少額だったため、その分が今年度残る結果となっている。本年度はある程度経過う通り使用できたと考えている。細胞チップの形状の検討が今年度いっぱいとなってしまったため、チップ作成依頼が年度をまたぐことになってしまった。そのため次年度使用額が生じた。
高頻度にターゲットインテグレーションをおこすニワトリ細胞株の相同組換え機構の解析

細胞のゲノムは、内因的および外因的な要因によって損傷が起る。内因的損傷としては、DNA複製時のエラー、DNA断裂、酸素ラジカルによる塩基の損傷などが起る。外因的損傷を与える原因としては、電離放射線照射、紫外線、環境変異原、抗がん剤などがある。以上のような損傷を修復する複数の経路を生物は、進化の過程で獲得した。この修復経路に異常が起ると、ゲノムの一次構造が不安定になり、発癌が促進される。我々は、高頻度に標的組み換えを起こすニワトリBリンパ細胞株DT40で様々な遺伝子の変異クローンを作成することによってDNA修復機構、特に相同DNA組み換え機構を解析した。(1)相同DNA組み換えは、酵母と同様に電離放射線照射によって生じたゲノムDNAの2本鎖切断を修復する(Cell89:185,1997)。このタイプの修復は、S期後期からG2期にかけてのみ起こる。すなわち、相同DNA組み換え機構は、放射線照射によって切断された染色分体をもう一方の染色分体と組み換えを起こすことによって切断を修復するのであろう(EMBOJ.17:5497,1998)。(2)標的組み換えは、Rad51、Rad51B、Rad54のいずれかがないと検出できないレベルにまで低下した。Rad52は、酵母の相同DNA組み換え機構のなかでは最も重要な分子である。ところが、Rad52欠損株では、放射線感受性は正常レベルであり、標的組み換えも数分の1に低下した程度であった(MCB.18:6430,1998)。(3) Rad51欠損によって染色体段裂が自然発生し細胞死が観察された。この知見は、動物細胞では、DNA複製中に少数のゲノムDNAの2本鎖切断が起こりその致死的損傷を相同DNA組み換えが修復することを示唆している(EMBOJ.17:598,1998)。
視線保持機構における小脳片葉求心系の役割

垂直眼球運動を制御する主要部位として、カハール間質核、前庭神経核、小脳片葉が挙げられる。本研究では、視線保持における脳幹と小脳の相互作用を明らかにすることを目的とし、片葉に投射するparamedian tract(PMT)ニューロンの活動様式および前庭神経核・カハール間質核との入出力関係を解析し、また小脳を介する経路の活動を薬理学的に修飾した時の効果を解析した。発射活動の解析により、PMT求心系が垂直方向の注視期の眼位、サッケードの眼球速度、前庭動眼反射時の頭部速度の情報を小脳に伝えることが明らかにされた。迷路の電気刺激と回転刺激に対する応答の解析により、PMTニューロンが前庭神経核を介し対側前半規管から興奮入力、同側後半規管から抑制入力を受けることが明らかにされた。また、PMTニューロンはカハール間質核からも入力を受けることが示された。PMT領域へのmuscimol局所投与は後半規管優位の眼振、bicuculline投与は前半規管優位の眼振を伴う注視麻痺を引起こし、PMT-片葉系が視線保持とともに左右前庭神経核活動のバランス維持に重要な役割を果たすことが明らかにされた。前庭神経核ニューロンにGABA阻害薬を電気泳動的に投与し抑制入力を遮断すると自発活動と回転応答の振幅がともに増加し、片葉が前庭バランスと反射の調節に大きく寄与することが確認された。また、速度指令から位置指令への変換過程を担うと考えられる特異な発射パタンを示すニューロンが前庭神経核で見出され、これらがカハール間質核と対側後半規管から興奮入力を受けるII型ニューロンであることことが明らかにされた。以上の結果から、左右前庭神経核を結ぶ経路は速度を位置に積分するポジティブフィードバック回路として働き、PMT-片葉系はこれを調節し安定させる役割を担っていると考えられた。小脳片葉に投射することが知られている橋正中部のparamedian tract neurons(PMTニューロン)への前庭迷路、カハール間質核、上丘からの入力様式を覚醒ネコを用いて調べた。PMT領域から単一ニューロン活動を記録し、注視期の発射頻度が上向きの眼位に比例して増加すること、上向きサッケード時には眼球速度に比例したバースト状の活動増加を示すことにより、PMTニューロンを同定した。前庭神経の電気刺激と頭部回転刺激を用い、前庭入力を調べたところ、PMTニューロンが前庭神経核を介して対側前半規管からは興奮入力を受け、同側後半規管からは抑制入力を受けることが明らかにされた。また、カハール間質核の刺激効果から、PMTニューロンはこの核からも入力を受けることが示唆された。さらに、PMTニューロンとその腹側部に位置する休止ニューロンに対する上丘刺激の効果を調べたところ、後者は2シナプス性抑制を受けることが明らかにされた。PMTニューロンを薬理学的に不活性化すると、視線保持障害と前庭バランス異常を示す眼振が起こることはすでに報告した。そこで、PMT-片葉系の主たる出力部位である前庭神経核のニューロンの活動を記録し、GABA阻害薬を電気泳動的に投与したときの効果を有色ラットを用いて調べた。半規管入力を受ける前庭二次ニューロンの中に、GABAを介する抑制性入力を遮断すると、頭部回転刺激に対する応答のゲインが増加するものが見出された。

これらの結果から、PMTニューロンは、注視期の視線保持に関与する脳幹主要部位からの情報を小脳片葉に伝え、片葉による前庭動眼反射のゲイン調節に重要な役割を果たすことが示唆された。1.小脳片葉の入力と出力の薬理学的修飾の効果(1)入力系:片葉に投射するPMTニューロンの活動を薬理学的に修飾し、眼球運動に及ぼす影響を覚醒ネコで調べた。muscimolに加え、本年度はbicucullineを局所注入し効果を比較した。bicucullineは前半規管優位の上向き眼振、muscimolは後半規管優位の下向き眼振を誘発した。緩徐相は指数関数的な経過を示し、PMTニューロン活動修飾が、前庭バランス異常とともに視線保持障害を引起こすことが示された。(2)出力系:片葉の主な標的である前庭神経核ニューロンを対象とし、GABA抑制の遮断効果を麻酔ラットで調べた。半規管系二次ニューロンの活動をマルチバレル電極を用いて記録し、bicucullineおよびpicrotoxinを電気泳動的に投与し、その影響を解析した。投与により、大多数のニューロンの自発活動は著明に増加し、頭部回転刺激に対する応答の振幅も有意に増加した。一方、応答の位相は殆ど影響を受けなかった。以上の結果から、片葉からの抑制は半規管信号と同相で変化し前庭反射のゲイン調節に大きく寄与することが示唆された。2.小脳室頂核ニューロンのサッケード適応学習時の活動サッケードの適応学習課題を遂行中のサル室頂核ニューロンの活動を解析した。サッケードのゲイン減少に伴い、運動開始30ms前から10ms後のニューロン活動が有意に増加し、ゲイン増加に伴いこの期間の活動は有意に減少した。ゲインとバースト活動の変化はよく似た経過を示し、両者の間に有意な相関が認められた。以上の結果から、小脳のサッケード適応への関与が単一ニュ-ロンレベルで強く示唆された。垂直眼球運動を制御する主要部位として、カハール間質核、前庭神経核、小脳片葉が挙げられる。本研究では、視線保持における脳幹と小脳の相互作用を明らかにすることを目的とし、片葉に投射するparamedian tract (PMT)ニューロンの活動様式および前庭神経核・カハール間質核との入出力関係を解析し、また小脳を介する経路の活動を薬理学的に修飾した時の効果を解析した。発射活動の解析により、PMT求心系が垂直方向の注視期の眼位、サッケードの眼球速度、前庭動眼反射時の頭部速度の情報を小脳に伝えることが明らかにされた。迷路の電気刺激と回転刺激に対する応答の解析により、PMTニューロンが前庭神経核を介し対側前半規管から興奮入力、同側後半規管から抑制入力を受けることが明らかにされた。また、PMTニューロンはカハール間質核からも入力を受けることが示された。PMT領域へのmuscimol局所投与は後半規管優位の眼振、bicuculline投与は前半規管優位の眼振を伴う注視麻庫を引起こし、PMT-片葉系が視線保持とともに左右前庭神経核活動のバランス維持に重要な役割を果たすことが明らかにされた。前庭神経核ニューロンにGABA阻害薬を電気泳動的に投与し抑制入力を遮断すると自発活動と回転応答の振幅がともに増加し、片葉が前庭バランスと反射の調節に大きく寄与することが碓認された。また、速度指令から位置指令への変換過程を担うと考えられる特異な発射パタンを示すニューロンが前庭神経核で見出され、これらがカハール間質核と対側後半規管から興奮入力を受けるII型ニューロンであることことが明らかにされた。
新規ケラチン結合蛋白質による上皮細胞分化および増殖制御メカニズムの解明

ケラチン細胞骨格は上皮細胞に特異的に存在するにもかかわらず、上皮分化やそれと相反する細胞増殖への寄与は不明な点が多い。報告者は新規ケラチン結合蛋白質をアミノ酸配列の相同性や局在の類似性からTPHD分子群と名付け、これらがまさに上皮分化・細胞増殖の両面で機能することを実験的根拠により明らかにしつつある。本課題ではトリコプレイン蛋白質による全く新しい細胞増殖制御機構、すなわち中心体で一次線毛動態を制御することにより細胞周期の進行と休止を切替える仕組みを論文報告した。このことは、がん細胞を特異的に死滅させるヒントともなった。また、中心体でのG1期制御が上皮分化に及ぼす影響も今後の検討課題として示された。ケラチンは上皮特異的に発現する細胞骨格蛋白質であるにも関わらず、上皮分化における役割は不明であった。これまでに申請者らはケラチン結合蛋白質Albatrossが上皮分化すなわち細胞極性の制御に関わり、ケラチンがこれを促進することを見出してきた(J. Cell Biol., 2008)。さらにAlbatrossおよびtrichoplein (J Cell Sci., 2005)をそのアミノ酸配列からTPHD分子群(トリコヒアリン・プレクチン類似ドメイン分子群)と名付けた。この分子群の特徴はケラチン結合蛋白質であることに加え、分化状態では主に細胞間接着部位に、そして増殖中は主に中心体に局在を変えることから(J. Cell Sci., 2011)、局在および機能の両面で分化・増殖制御に関わる可能性が考えられた。本研究の目的は、このような分子群と分化・増殖制御との関わりを分子レベルで明らかにすることである。本年度は中心体に局在するtrichopleinによる細胞周期制御の仕組みを報告した(J. Cell Biol., 2012)。中心小体でtrichopleinはAurora-Aキナーゼを活性化しており、これが一次線毛形成を抑制し、G1期からS期への円滑な細胞周期進行に寄与していた。この研究結果は、一次線毛の動態が積極的に細胞増殖と増殖休止のスイッチとなっていることを新たに示すものでもあった。またAurora-A阻害は、一次線毛を形成できないがん細胞を選択的に分裂障害に導き死滅させたことから、がんの治療標的としての可能性も再確認された。現在までに、一次線毛形成を抑制する同様の蛋白質を複数同定した。一次線毛は細胞外シグナルを受容するアンテナでもあるため、今後これらの蛋白質による細胞周期制御への関与やその作用機序の相違点について、細胞分化も意識して検討する予定である。上皮細胞の分化の特徴として、細胞内成分は極性を持って局在する。ケラチンは上皮特異的に発現する細胞骨格蛋白質であるが、極性をふくめ上皮分化における役割は不明であった。これまでに申請者らはケラチン結合蛋白質Albatrossが分化上皮細胞の極性制御に関わり、ケラチンがこれを促進することを見出してきた(Sugimoto, Inoko etal.,J. Cell Biol., 2008)。さらにAlbatrossおよびtrichoplein (Nishizawa, Izawa, Inoko et al., J Cell Sci., 2005)をそのアミノ酸配列からTPHD分子群(トリコヒアリン・プレクチン類似ドメイン分子群)と名付けた。その特徴はケラチン結合蛋白質であることに加え、分化状態では主に細胞間接着部位に、そして増殖中は主に中心体に局在を変えることから(Ibi, Zou, Inoko et al., J. Cell Sci., 2011)、分化・増殖の両方に関わるユニークな分子群であると考えられる。本研究の目的は、このような分子群の持つ2つの局在・機能の相違点の分子機序を明らかにすることである。本年度はこのうち中心体のtrichopleinと細胞周期の関わりを報告した(Inoko et al., J. Cell Biol., 2012)。中心小体でtrichopleinはAurora-Aキナーゼを活性化しており、これが一次線毛形成を抑制し、G1期からS期への円滑な細胞周期進行に寄与していることがわかった。この研究結果は、一次線毛の動態が積極的に細胞周期のG1期からS期への進行またはG0期への遷移の分岐の鍵となっていることを示している。またその分子機序からはAurora-A阻害剤が一次線毛を生じないがん細胞を選択的に分裂障害に導き、死滅させ得る可能性も示された。本年度はtrichopleinの中心体機能について報告した(Inoko et al., J. Cell Biol., 2012)。

すなわち、中心小体でtrichopleinはAurora-Aキナーゼを活性化しており、これが一次線毛形成を抑制し、G1期からS期への円滑な細胞周期進行に寄与していることがわかった。この研究結果は、一次線毛の動態が積極的に細胞周期制御に関わる新知見、具体的には細胞のG1期からS期への進行またはG0期への遷移の分岐の鍵となっていることを示している。またその分子機序からはAurora-A阻害剤が一次線毛を生じないがん細胞を選択的に分裂障害に導き、死滅させ得る可能性も示された。この点で当初の目的であるTPHD分子群による新規分化・増殖制御機構の解明を推し進めることが出来たと考えられる。今後の研究の推進方策としては、これまでの研究成果をさらに推し進め、TPHD分子群の2つの局在・機能すなわち、(1)細胞間接着部位での細胞極性制御機能と(2)中心体での細胞増殖関連機能の相違点を分子機序として詳細に明らかにすることである。そのために、(1)現在得ているAlbatross結合蛋白質候補(ARFIP2, γ-Tubulin Ring Complex(γ-TuRC)蛋白質群)については、分子間結合および機能欠失実験の表現型観察により細胞レベルまで考慮したAlbatrossとの機能相関の解析を行う。(2)加えて、種々の生化学的方法MS解析やプロテインチップによるAlbatross結合蛋白の追加検索も行い、結果をまとめあげる。(3)また、すでに同定しているTrichopleinAurora-A経路や(4)細胞間のTrichopleinの機能をはじめ、(5)複数のTPHD分子についても同様の観点からの解析を可能な限り行う。(1)消耗品費:本研究の遂行のためには培養細胞を用いた免疫染色・細胞工学・遺伝子工学を駆使した手技が必要である。そのための消耗品として、抗体、細胞・大腸菌培養に必要な血清・培地、実験器具(滅菌・ディスポーザブルを含む、制限酵素、DNA、siRNA合成等の試薬類、実験用動物が必要である。(2)旅費等:研究発展のためにも国内・海外学会での発表・情報交換が必須である。その旅費と学会参加費が必要である。これとは別に、論文発表に必要な経費(英文校正料、投稿・別刷り料)、印刷費(成果公開のためのポスターを含む)を考えている。
受精の膜融合を制御する分子メカニズム

哺乳動物の卵は、両生類や棘皮動物とは異なり、一個体から得られる細胞数がとても少なく、過排卵処理をしたマウスからでも20個前後が排卵されるだけである。そのために、生化学実験を行うためには、より多くの動物個体を飼育維持する必要がある。そこで本研究では、生化学実験よりも、受精前後での精子と卵の動き、および蛋白質の動態をできる限り詳細に追跡することに重点を置いた。その結果、いままで知られていなかった受精の膜融合を制御するメカニズムを発見することができた(投稿中)。まず、免疫染色と電子顕微鏡による観察から、野生型マウス卵ではCD9は卵細胞膜を全体にわたって覆っている微絨毛に特異的に局在するのに対して、CD9欠損卵ではほとんどの微絨毛が消失していることを見つけた。続いて、生きた卵でのCD9の挙動をイメージングするために、CD9-EGFPを発現させたCD9欠損卵(CD9-EGFP卵)を作製したところ、卵細胞膜の微絨毛が再形成され、しかも、精子との膜融合能を回復させることができた。この結果から、マウス卵では、CD9-EGFPはCD9と同等の機能を有することが示された。続いて、CD9-EGFP卵を使って、受精過程を生きた状態で観察する実験系を作ることにより、精子と卵細胞膜が相互作用する一連の過程をイメージングすることが可能となった。この実験系を用いて精子と卵の受精前後での挙動を観察したところ、従来の受精研究では、膜融合は精子が卵の細胞膜に結合した後に始まると考えられていたが、実際には全く異なる細胞膜間での相互認識メカニズムが存在することを示す結果が得られた。また、この膜融合の制御メカニズムが実際に機能していることを、CD9欠損卵と野生型卵を用いた再構成系によって証明することができた(投稿中)。この結果から、精子の膜融合活性は卵子から放出される因子によって活性化されることが示唆された。現在、その因子の同定を進めている。受精は、接着・膜融合・多精拒否などからなるが、分子機構の解明には至っていない。本研究は、膜4回貫通型蛋白質CD9を手がかりとして、受精の膜融合を制御する分子機構の解明と、その分子機構を基盤とした精子導入法の開発をめざしている。CD9欠損卵では、精子の透明帯への結合、透明帯の通過、卵細胞膜への結合は起こるが、膜融合が観察されず、抗CD9抗体によっても膜融合異常が誘導されることから、CD9は卵細胞膜で精子側の因子との相互作用に何らかの役割を担っており、膜融合過程のいずれかのステップに必須であると考えられる。CD9の機能を検討するため、マウス未受精卵に様々な変異体を発現させることにより、膜融合の有無を検討したところ、CD9の機能にはC末端にある23アミノ酸が必須であることを明らかにした。さらに、CD9のN末端にEGFPを融合させた蛋白質を卵子特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製し、受精前後でのCD9の経時的な局在変化について調べたところ、受精前後でダイナミックに局在が変化することを明らかにした。すなわち、精子が卵細胞膜に結合した直後に、精子結合部位にCD9が集積し、5秒以内に精子頭部に移動すること、CD9の精子頭部への移動は抗CD9抗体により完全に阻害されることが明らかとなった。

また、CD9は卵子に多数存在する微絨毛に特異的に局在し、電顕による観察から、CD9欠損卵では微絨毛が欠損していることを見つけた。そこで、CD9を卵特異的に発現させたところ、CD9欠損卵に再び微絨毛が形成され、融合能も回復したことから、受精の膜融合には微絨毛の形成が必須であることが明らかとなった。また、この微絨毛はチューブリンによって裏打ちされていることを示唆する結果が得られた。CD9結合蛋白質については、数種類の膜蛋白質を同定し、現在、欠損卵子を作製中である。哺乳動物の卵は、両生類や棘皮動物とは異なり、一個体から得られる細胞数がとても少なく、過排卵処理をしたマウスからでも20個前後が排卵されるだけである。そのために、生化学実験を行うためには、より多くの動物個体を飼育維持する必要がある。そこで本研究では、生化学実験よりも、受精前後での精子と卵の動き、および蛋白質の動態をできる限り詳細に追跡することに重点を置いた。その結果、いままで知られていなかった受精の膜融合を制御するメカニズムを発見することができた(投稿準備中)。まず、免疫染色と電子顕微鏡による観察から、野生型マウス卵ではCD9は卵細胞膜を全体にわたって覆っている微絨毛に特異的に局在するのに対して、CD9欠損卵ではほとんどの微絨毛が消失していることを見つけた。続いて、生きた卵でのCD9の挙動をイメージングするために、CD9-EGFPを発現させたCD9欠損卵(CD9-EGFP卵)を作製したところ、卵細胞膜の微絨毛が再形成され、しかも、精子との膜融合能を回復させることができた。この結果から、マウス卵では、CD9-EGFPはCD9と同等の機能を有することが示された。続いて、CD9-EGFP卵を使って、受精過程を生きた状態で観察する実験系を作ることにより、精子と卵細胞膜が相互作用する一連の過程をイメージングすることが可能となった。哺乳動物の受精過程をイメージングした研究は、本研究が始めてである。この実験系を用いて精子と卵の受精前後での挙動を観察したところ、従来の受精研究では、膜融合は精子が卵の細胞膜に結合した後に始まると考えられていたが、実際には全く異なる細胞膜間での相互認識メカニズムが存在することを示す結果が得られた。また、この膜融合の制御メカニズムが実際に機能していることを、CD9欠損卵と野生型卵を用いた再構成系によって証明することができた。その結果、いままで知られていなかった受精の膜融合を制御するメカニズムを発見することができた(投稿中)。
コラーゲン由来ペプチドの脳神経調節作用のメカニズム解明

これまで我々は、コラーゲン分解物が経口摂取で有効かつ強力な抗うつ様作用を示すことを見出した。本研究では、コラーゲン分解物のうつ行動制御メカニズムを解明することを目的とする。まず、コラーゲン由来ペプチドがうつ行動制御との関連が示唆されているモノアミン、ストレス応答、神経新生、および神経炎症に対して作用するか否か検証する。また、コラーゲン由来抗うつペプチドのアミノ酸配列を同定し、作用部位および標的分子を決定する。これらの研究成果を応用することで、食品由来ペプチド、特に低分子のジペプチドやトリペプチドが脳神経系で機能する生理的意義の解明および機能素材としての利用が期待される。
クラスリン被覆を介するリソソーム酵素の効率的選別輸送

本研究では,クラスリンアダプタータンパク質であるGGA1,2,3の個別機能,およびGGAのユビキチン結合の意義を解析する。1.GGA2を安定にノックダウンする細胞を作製し論文受理された(Hida etal.,in press)。本解析では,GGA2の発現を低下させてもGGA1,3の発現や局在様式に明らかな変化は認められなかった。このことにより,GGA1,2,3は別個に機能する可能性が示唆された。一方,カーゴタンパク質であるマンノース6リン酸受容体の細胞質部分にGFPを付加したキメラタンパク質(GFP-CIMPR-tail)を安定に発現するHeLa細胞を用いて,GGA1,2,3をノックダウンする実験を行った。通常のHeLa細胞とは異なり,同細胞では個々のGGA発現低下により,GFP-CIMPR-tailが局在するトランスゴルジネットワーク(TGN)の形態変化や細胞表面への局在変化を形態学的に検出できた。しかもこれら変化は,発現抑制したGGAにより異なっていた。以上よりGGAの機能異常をより鋭敏に検出できる実験系を確立できたとともに,3つのGGAには別個の機能が存在することを示唆する。2.GGA3のユビキチン結合能の意義を探るため,ユビキチン結合部位に変異を有するGGA3を作製した。VHS-GAT領域のみを発現して比較したところ,ユビキチン結合変異体はTGNやエンドソームへの結合が減弱していた。このことは膜への結合に際してユビキチン結合能が何らかの機能を担うことを示唆する。現在,同変異体を用いてユビキチン結合に依存した相互作用分子の探索を行っている。1.哺乳類細胞においてクラスリンアダプタータンパク質であるGGA(Golgi-10calized,γ-adaptin earhomology, ADP ribosylation factor binding protein)1,2,3の特異的機能を探る目的で、RNAi法によりそれぞれのGGAを発現低下させたHeLa細胞株を樹立した。特にGGA2ノックダウン細胞に関しては正常の5%以下の発現を示す細胞株が得られた。同細胞株ではGGA1/3の発現低下は見られず、局在にも大きな変化が見られないことから、他グループが提唱するGGA1,2,3の相互作用と細胞膜への局在機構との関係は必ずしも重要ではないことが示唆された。一方、GGAsが制御するカーゴタンパク質であるMPR(mannose 6-phosphate receptor)の局在にも光学顕微鏡レベルでの大きな変化は見られなかったが、リソソーム酵素のカテプシンDが細胞外へミスソートされていた。今後、電子顕微鏡レベルでCIMPRの局在を解析する予定である。2.リソソーム酵素の輸送不全状態を解析するために、GGA2ノックダウン細胞で発現変化が見られるタンパク質をDNAマイクロアレイ解析により抽出した。今後、いくつかの新規タンパク質について解析する予定である。3.GFP-CIMPR(cation-independent MPR)のライブセルイメージング解析、クロロキンおよびU18666Aの投与実験、I-cell病線維芽細胞を用いた実験により、CIMPRの細胞内輸送には細胞質外ドメインの存在およびリソソーム酵素の結合に依存した各ステップが存在することを明らかにした。この結果は論文として発表した。
緩和医療における医療用麻薬使用による副作用対策の包括的薬学研究

オピオイドによる悪心・嘔吐に対するより有効な制吐薬のスクリーニングにおいて、オランザピンがこれまで使われてきたD2遮断薬と比べて副作用が少なく有用性が高い制吐薬となることを見出し、日本の緩和医療における制吐剤となりつつある。これにより患者のQOLを上げる一助となった。また、これらの知見を応用してピレンゼピンが制吐薬となりうることも見出し、臨床で検討するに至っている。強オピオイド間で便秘の機序が明らかにことなることを見出した。また、新たな疼痛下におけるオピオイド依存不形成機構を見出した。一方、抗がん剤による神経障害性疼痛下では、オピオイドの依存が形成されることも見出し、危険性の情報を発信した。前年度、M1-受容体に高親和性を持つolanzapineがmorphineにより誘発される嘔気・嘔吐に対して有効性を示したことからより、副作用の少なく選択性の高いpirenzepineを用いてmorphineにより誘発される副作用に対する抑制効果を検討した。その結果、pirenzepineは、フェレットにおけるmorphineにより誘発される嘔気・嘔吐を非常に強く抑制し、さらに、マウスにおける小腸ならびに大腸輸送能抑制効果を有意に抑制した。以上の結果より、pirenzepineは、緩和医療において問題となっているmorphineの副作用を抑制しうる有用な薬剤となることが考えられた。フェレットによる嘔気・嘔吐は、簡便性に欠くことから、アミラーゼを指標にした嘔気・嘔吐のスクリーニングについて検討を行った。催吐作用の非常に強いapomorphineはラットにおける唾液中のアミラーゼ活性を著明に増加させた。また、morphine、oxycodoneならびにfentanylはいずれもアミラーゼ活性を有意に増加させ、この効果は制吐薬であるprochlorperazineによって有意に抑制されたため、本系が嘔気・嘔吐のスクリーニング系として有用である可能性が示唆された。Morphineの精神依存性ならびにせん妄に関与していると考えられている側坐核ならびに線条体におけるmorphineによるドパミンの放出について検討した。その結果、morphineは側坐核において選択的にドパミンの放出を促進していた。また、ドパミンの放出に伴う自発運動促進作用は、定型抗精神薬であるhaloperidolの低用量によって強く抑制され、非定型抗精神薬であるclozapineに対して抵抗性であった。よって、morphineによるせん妄に対しては、haloperidolなどがより有用であると考えられた。以上の結果より、opioid鎮痛薬による便秘は主に末梢性μ-opioid受容体を介した小腸輸送能抑制作用と、中枢性μ-opioid受容体を介した大腸輸送能抑制作用によって引き起こされることが明らかとなった。さらに、その寄与の機序にも3種のopioid鎮痛薬間での相違が認められた。特に、大腸輸送能に関しては、morphineは末梢、脳、脊髄の全てのμ-opioid受容体が重要であるのに対し、fentanylは脳、oxycodoneは脊髄のμ-opioid受容体がそれぞれ抑制作用の発現に重要であることが明らかとなった。モルヒネによって惹起される嘔気・嘔吐に対して、これまでにドパミンD2受容体拮抗薬が使用されて来たが、ドパミンD2受容体拮抗薬は、錐体外路系の副作用が非常に多く発現するといった問題がある。非定型抗精神病薬であるオランザピンは、ドパミンD2受容体に加えセロトニン、ヒスタミン、およびムスカリンなどの受容体に対しても結合親和性を有しており、統合失調症と双極性障害における躁症状の治療薬として用いられている。一方、その多様な作用点は嘔気・嘔吐の発現機序に合致していることから制吐薬としての有用性も期待される。また、モルヒネによって惹起される精神依存は、脳内報酬系と呼ばれる腹側被蓋野から側坐核に投射している中脳辺縁ドパミン神経系の活性化により発現すると考えられている。しかしながら、オランザピンのモルヒネの精神依存に及ぼす影響は未だ明らかにされていない。そこで、モルヒネ誘発嘔気・嘔吐反応および報酬効果(精神依存)に対するオランザピンの効果についても検討を行った。また、神経障害性疼痛および神経障害性疼痛下の睡眠障害に対するオランザピンの効果についても検討を試みた。オランザピンは低用量からモルヒネ誘発嘔気・嘔吐や報酬効果を抑制し、また、嘔気・嘔吐を抑制する用量においては、カタレプシーを引き起こさず、運動協調性、血糖値、消化管運動に影響を及ぼさなかった。オランザピンは、従来の定型抗精神病薬では対応できない難治性の嘔気・嘔吐に対してもその有用性が期待される。さらに、オランザピンは慢性疼痛下における睡眠障害の改善効果などを有していることが示唆された。

こうしたオランザピンの多機能性と安全性は多剤併用の回避につながり、疼痛治療の副作用マネジメントにおいて有用な薬剤として位置付けられることが期待される。本研究では、唾液中アミラーゼ活性とopioid鎮痛薬誘発悪心・嘔吐に相関性があるか否かの検討を行った。ラットにmorphine, oxycodoneを投与したところ、有意な唾液中アミラーゼ活性の上昇がみられ、fentanylにおいては唾液中アミラーゼ活性の上昇傾向がみられた。Prochlorperazineはopioid鎮痛薬誘発悪心・嘔吐に対して臨床現場で広く使用されていることから、次にprochlorperazineを用いてopioid鎮痛薬誘発唾液中アミラーゼ活性に対する影響について同様に検討を行った。その結果、prochlorperazineの処置により、morphineによって上昇したラット唾液中アミラーゼ活性は有意に抑制された。したがって、ラット唾液中アミラーゼ活性とopioid鎮痛薬誘発悪心・嘔吐に相関性があること、更には、ラット唾液中アミラーゼ活性を指標に悪心・嘔吐の評価を行うことが可能であることが示唆された。Morphineの皮下投与による大腸輸送能低下作用は、末梢性μ-opioid受容体拮抗薬であるmethylnaltrexoneの前処置により、morphine低用量では改善したが、高用量では改善が認められなかった。Morphineの脳室内投与においても用量依存的な大腸輸送能低下作用が認められ、この作用はmethylnaltrexoneの前処置では改善されなかった。そこでvagotomyにより迷走神経の関与を検討したところ、morphineの脳室内投与による大腸輸送能低下作用は、vagotomyによって有意な変化は認められなかった。したがって、morphineの高用量では末梢性のみならず中枢性μ-opioid受容体作動作用により迷走神経を介さずに便秘が発現すると考えられる。緩和医療既存薬に比べより副作用の少ないpirenzepineに注力したため、既存薬による血糖に関しては検討出来なかった。しかしながら、pirenzepineの有用性を見出すことができ、さらに嘔気・嘔吐に関してスクリーニング系の構築などを行なえた。また、精神依存形成に関する評価は予定通り行なえた。オピオイドにより誘発される便秘が、小腸由来のものは末梢性のμ-opioid受容体を介し、大腸由来のものは中枢性のμ-opioid受容体を介するといった知見を確認出来た。以上の結果より、欧米で使用されている末梢性μ-opioid受容体拮抗薬は、非常に猶予であることが示唆された。また、モルヒネ、オキシコドンおよびフェンタニルの作用部位ならびに受容体サブタイプはそれぞれ異なることも示すことが出来た。計画に従い、プロクロルペラジンとオランザピン等の効果を比較検討し、これらの薬剤は、モルヒネにより誘発される嘔気・嘔吐反応を抑制した。これらの作用に関して、機能解剖学的なアプローチとして、microdialysis法を用いて、オランザピンによるドパミン神経系に対する影響を検討た。その結果、オランザピンはドパミン神経系を過剰に抑制しない特性を有することが明らかになった。
触刺激によるドーパミン放出と情動の解明―リハビリの意欲向上の生理学的基盤の構築

快情動発現には側坐核ドーパミン放出増加が関与する。触刺激によって申請者は側坐核ドーパミン放出が増加することを明らかにした。ラットは快情動状態にあるときに超音波を発声する。本研究では触刺激によって快情動発現を起こす脳内メカニズムを解明するために、初めにラットに触刺激を行い、快情動超音波発声がみられるかを調べた。続いて、触刺激時の快情動超音波発声を起こす脳内神経機序を明らかにすることを試みた。その結果、触刺激によって快情動超音波発声が起こることが分かり、脳内ドーパミン、セロトニン、オピオイド受容体が超音波発声に関わることを示した。実験には成熟ラットを用い、触刺激を行ったときのラット超音波発声を記録した。ラット超音波発声は超音波の基本周波数帯域によって22 kHz超音波発声と50 kHz超音波発声とに区別され、前者は不快情動の指標、後者は快情動の指標となる。50 kHz超音波発声の超音波画像(ソノグラム)は情動の状態によっていくつかのサブタイプに分けられている。触刺激によって22 kHz超音波発声はみられず、50 kHz超音波発声が顕著に増加した。本研究で用いた触刺激によっても側坐核ドーパミン放出が顕著に増加することをマイクロダイアリシス実験より確認した。オピオイド受容体遮断薬、セロトニン受容体遮断薬を側坐核内に投与すると触刺激時のドーパミン放出増加が抑制された。さらに、側坐核内にドーパミン受容体遮断薬を投与して触刺激を行った際に50 kH超音波発声が減少することを明らかにした。よって、触刺激時の50 kHz超音波発声には側坐核ドーパミン放出が関与し、さらに側坐核内のセロトニン、オピオイド受容体が関与することが示唆された。研究は当初の予定通りにほぼ順調に進行している.予定していたとおり,平成28年度には触刺激によって50 kHz帯域の超音波発声(快情動超音波発声)が発現することを確認した.平成29年度にはその脳内メカニズムを検討する実験を行い,脳内オピオイドの関与を明らかにした.今年度は予定していた側坐核内ドーパミン放出の関与について検討する実験を行った.過去3年間の研究をまとめて論文に投稿するとともに、国際学会で発表する。本研究で用いた触刺激は、これまでに報告されている触刺激よりも非常に多くの快情動超音波発声を出す特徴がある。さらに、他の研究報告で類を見ない特徴的な超音波発声のサブタイプを出すことも明らかになっている。そこで、今後はこの触刺激が快情動の中でもどのような意味を持つ情動状態を作り出しているのかを明らかにする必要がある。さらに、本研究で用いた触刺激に特徴的な超音波発声のサブタイプが意味する情動状態を行動実験で確認していく必要がある。さらに、触刺激によって情動関連脳部位の形態学的変化がみられるかを組織学的に明らかにする必要がある。触刺激によって快情動中枢である側坐核のドーパミン放出が増える.側坐核のドーパミン放出はラット快情動の指標である50 kHz超音波発声を起こす.本研究では50 kHz超音波発声に着目し,触刺激が情動におよぼす影響とその脳内メカニズムの解明を目指す.本研究代表者らは,触刺激によって側坐核のドーパミン放出が増加することを明らかにした(Maruyama et al., 2012).また,側坐核のドーパミン放出がTickling刺激時の50 kHz超音波発声に関与することを報告した(Hori et al., 2013).本研究の目的は,触刺激が50 kHz超音波発声におよぼす影響とその脳内神経メカニズムの解明である.平成28年度ではラットに触刺激としてマッサージ様ストローキング刺激を加え,50 kHz超音波発声が起こることを確認した.また,触刺激を加える部位を変えて超音波発声への影響を検討した.50 kHz超音波発声はオピオイド受容体作動薬を全身性に投与することで変化することが知られている.ストローキング刺激時の超音波発声についても脳内オピオイドが関与する可能性を考え,オピオイド受容体遮断薬を腹腔内に投与して検討した.さらに,超音波発声には側坐核内ドーパミン放出が関与することから,ストローキング刺激時の側坐核ドーパミン放出変化についても検討した.現在,触刺激時の超音波発声増加における側坐核内オピオイド受容体の関与を明らかにするために,オピオイド受容体遮断薬を側坐核内に投与する実験を準備している段階である.当初計画していた超音波記録装置を用いた超音波発声記録実験について,刺激部位差の検討とナロキソン腹腔内投与実験を行った.当初の予定通りに実験が進み,次の段階として,ナロキソンを側坐核内に投与する実験に着手した.ラットは快情動状態にあるときに50 kHz帯域の超音波を発声する(50 kHz USV).本研究では,触刺激時のラット50 kHz USV発現の脳内メカニズムを解明するために以下の二つの検討を行った.1.50 kHz超音波発声におよぼすオピオイドの影響平成29年度は,平成28年度に確認した触刺激時の50 kHz USV発現の脳内メカニズムをオピオイド受容体に着目して検討した.オピオイド受容体遮断薬であるナロキソンの全身性投与(腹腔内投与)と側坐核内局所投与を行い,触刺激時の50 kHz USVにおよぼす影響を検討した.

その結果,ナロキソンによって50 kHz USVに変化がみられた.2.触刺激時の側坐核ドーパミン放出におよぼすオピオイドの影響50 kHz USVの発現には側坐核のドーパミンが関与することが知られている.側坐核ドーパミン放出にはオピオイドとセロトニンが関与することが示されている.平成29年度は,平成28年度に確認した触刺激時の側坐核ドーパミン放出増加反応のメカニズムについて,脳内オピオイド受容体とセロトニン受容体に着目して検討した.ナロキソンを全身性または側坐核に局所投与して,ドーパミン放出反応への影響を検討した.その結果,触刺激時の側坐核ドーパミン放出増加反応は全身性または側坐核へのナロキソン投与によって消失した.続いて,側坐核ドーパミン放出に関与するセロトニンに着目し,セロトニン受容体遮断薬を側坐核内に投与したところ,触刺激時のドーパミン放出増加反応が消失した.側坐核ドーパミンとセロトニンが触刺激時の50 kHz USVに与える影響については今後の検討課題である.研究は当初の予定通りにほぼ順調に進行している.予定していたとおり,平成28年度には触刺激によって50 kHz帯域の超音波発声(50 kHz USV)が発現することを確認した.平成29年度にはその脳内メカニズムを検討する実験に行い,脳内オピオイドの関与を明らかにした.今年度は脳内ドーパミンとセロトニンの関与について検討する実験を開始するところである.快情動発現には側坐核ドーパミン放出増加が関与する。触刺激によって申請者は側坐核ドーパミン放出が増加することを明らかにした。ラットは快情動状態にあるときに超音波を発声する。本研究では触刺激によって快情動発現を起こす脳内メカニズムを解明するために、初めにラットに触刺激を行い、快情動超音波発声がみられるかを調べた。続いて、触刺激時の快情動超音波発声を起こす脳内神経機序を明らかにすることを試みた。その結果、触刺激によって快情動超音波発声が起こることが分かり、脳内ドーパミン、セロトニン、オピオイド受容体が超音波発声に関わることを示した。実験には成熟ラットを用い、触刺激を行ったときのラット超音波発声を記録した。ラット超音波発声は超音波の基本周波数帯域によって22 kHz超音波発声と50 kHz超音波発声とに区別され、前者は不快情動の指標、後者は快情動の指標となる。50 kHz超音波発声の超音波画像(ソノグラム)は情動の状態によっていくつかのサブタイプに分けられている。触刺激によって22 kHz超音波発声はみられず、50 kHz超音波発声が顕著に増加した。本研究で用いた触刺激によっても側坐核ドーパミン放出が顕著に増加することをマイクロダイアリシス実験より確認した。オピオイド受容体遮断薬、セロトニン受容体遮断薬を側坐核内に投与すると触刺激時のドーパミン放出増加が抑制された。さらに、側坐核内にドーパミン受容体遮断薬を投与して触刺激を行った際に50 kH超音波発声が減少することを明らかにした。よって、触刺激時の50 kHz超音波発声には側坐核ドーパミン放出が関与し、さらに側坐核内のセロトニン、オピオイド受容体が関与することが示唆された。研究は当初の予定通りにほぼ順調に進行している.予定していたとおり,平成28年度には触刺激によって50 kHz帯域の超音波発声(快情動超音波発声)が発現することを確認した.
相転移を持つ確率モデルに関する解析

相転移をもつ確率モデル、特に浸透モデル、相互作用のある無限個のブラウン粒子系の研究を中心に行ってきた。研究経過と研究成果をモデルごとに次に説明する。相互作用を持つ無限個のブラウン剛体球系の研究を行った。以前の研究では剛体球間の相互作用がハードコアのみの場合を扱ったが、相互作用のレンジが非有界である場合、対応するSkorohod方程式の解の存在と一意性が成立つことを証明した。この結果から対応するディリクレ形式の一意性も導かれる。纏められた結果は、Stoch.Proc.Appl.,Vol.90,(2000),43-66に掲載された。中心がポアッソン分布に従う合同な凸多角形を2次元ユークリッド空聞に配置して定義される連続パーコレーションモデルの研究を行った。非有界連結成分が存在するための被覆率の臨界値、臨界被覆率が凸多角形によって異なり、三角形の場合に臨界被覆率が最も低く他の場合は真に高いことを証明した。纏められた結果は、Adv.Appl.Prob.Vol.34,(2002),48-57に掲載された。Domany-Kinzelの確率的セルオートマトンのモデル(Domany-Kinzelモデル)について研究を行った。Domany-Kinzelモデルは、パラメータ0【less than or equal】p,q【less than or equal】1を持ち,パラメータがq【greater than or equal】p場合は吸収的、q<p場合は非吸収的になる。吸収的であるDomany-Kinzelモデルとしては、方向性のあるボンドパーコレーションモデル、方向性のあるサイトパーコレーションモデルなどがあり、それぞれq=p、q=2p-p^2の時に対応する。非吸収的であるDomany-Kinzelモデルとしては、rule90と呼ばれるセルオートマトンのモデルがありq=0,p=1の場合に対応する。99年度の研究(香取真理氏、今野紀雄氏との共同研究)によりDomany-Kinzelモデルに対する局所生存確率と大域生存確率とに現れるある種の関係式を証明した。(Journal of statistical Physicsに掲載予定。)吸収的である場合には今までに多くの結果が示されているが、吸収的である事から得られる比較定理の基づいてた解析が中心である。一方、非吸収的である場合の有効な解析法はあまりない。我々が導いた新しい関係式は、吸収的の場合にも非吸収的の場合にも成立し、非吸収的の場合に新しい有効な手法となる。この関係式を用いる事により定常分布の性質、収束定理などに関する結果が得られている。(投稿準備中)。さらにcritical valueに関する解析に関してもこの関係式が有効であると予想される。98年以前の研究では、剛体球間の相互作用がハードコアのみの場合、つまり剛体球が接していない時には互いに影響を受けない場合を扱ったが、今回、相互作用のレンジが非有界である場合、つまりどんなに離れている剛体球も影響し合う場合についてFradon氏、Roelly氏と共同研究を行った。そして、二体ポテンシャルが距離Rの関数Φ(R)として定義され、Rを大きくした時にΦ(R)が指数減少してしていく場合、対応するSkorohod方程式の解の存在と一意性が成立つ事を証明した。得られた結果はStochastic Processes and their Applcationsに発表された。Rahul Roy氏との共同研究により、Boolean modelとよばれる連続パーコレーションモデルの研究を行った。中心がポアッソン分布に従う合同な凸多角形を2次元ユークリッド空間に配置したとき、凸多角形全体からなる集合を考える。その集合の全体の割合、被覆率は、ポアッソン分布のintensityの単調増加関数である。被覆率が高いと非有界連結成分が確率1で存在するが、低いと確率1で存在しない。3次元の凸多面体の場合にも同様な結果を導いた。得られた結果はAdvacesin Applied Probabilityに掲載予定である。

非交叉条件のもとでのN本の単純ランダムウォークは、vicious walkersとよばれる確率過程である。香取氏との共同研究によりvicious walkersに対する中心極限定理を証明した。非交叉条件を与える時間をスケーリングに対してどの様に与えるかにより、得られる拡散過程は時間的に斉次的である場合と非斉次的である場合にわかれる。斉次的拡散過程は、Wyle chamber内の吸収壁ブラウン運動のH変換でDyson modelとよばれているものであり、非斉次拡散過程は、Brownian meanderとよばれる一次元拡散過程の多次元への拡張になっている。この非斉次拡散過程における時刻tでの分布は時間に依存しているが、時刻0に近いところではGUEの固有値分布に近く、非交叉条件の終点時刻TではGOEの固有値分布になり、random matrix modelと密接な関係があることがわかった。纏められた結果は、Physical Review Eに掲載された。非交叉条件にくわえて衝突した回数に応じて相互作用を入れたモデルをFriendly walkersという。相互作用の大きさを制御するパラメータをβと、閾値βcが存在してβがβcより大(supercritical)のときは、対応する自由エネルギーが正になり、βがβcに等しい(critical)とき及びβcより小(subcritical)のときは0になる。2本のfriendly walkersに対しては閾値が厳密に計算されているが、3本以上の場合についての研究はされていなかった。吉田伸生氏との共同研究によりFriendly walkersの本数と自由エネルギーとの関係から閾値に関する評価を導いた。得られた結果は、Probab. Th. Relat. Fieldsに掲載予定である。