hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GM-CSF搭載制限増殖型ヘルベスウィルスを用いたヒト難治性肉腫の標的治療

健常人の白血球よりRNAを抽出し、PCR法でヒトGM-CSFの全長cDNAをクローニングした。ヒトカルポニン遺伝子のプロモーター(+73-260bp)を、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)ウイルスの複製開始に必須な転写因子をコードするICP4遺伝子の上流に挿入し、さらにその上流に標識遺伝子lacZを、その下流にInternal Ribosomal Entry Site(IRES)とヒトGM-CSF cDNAを連結した相同組換えベクターpKX2βG3-CALP-ICP4-GM-CSFを構築した。このDNA断片をICF)4欠失HSV変異体c/120のRibonucleotide reductase(RR, ICP6)-locusに相同組み換え法を用いて挿入し、ICP4とRRの二重欠失変異体をスクリーニングした。SK-LMS-1平滑筋肉腫細胞でlacZの発現を指標にしてスクリーニングし、続いてICP4をトランスフェクションしたVero細胞(VeroE5)を用いて3回スクリーニングを繰り返し、3クローンの単一の相同組換え体を得た。無血清培地VP-SFM (Invitrogen)とVeroE5を用いて、まずd12.CALPΔRRウイルスを用いて増殖を1%CS/DMEM培地と比較した。感染後24時間までは、無血清、血清培地ともに同程度の増殖を示した。培養液にすべて無血清培地を用いても、d12.CALPΔRRの精製は可能であり、10^9PFUにまで濃縮可能であった。無血清培地を用いて精製した。d12.CALPΔRRは、平滑筋肉腫に対する細胞傷害活性、GCV感受性など、血清存在下で精製したロットと変わりはなかった。化学発癌繊維肉腫細胞株MethAを同系のC57BL/6マウスに移植し、この肉腫に対し細胞傷害作用をもつd120変異体ウイルスを感染させ、腫瘍消極後26-97日でMethAを再度移植し、活性化Tリンパ球の誘導と腫瘍の拒絶を確認した。ヒトカルポニン遺伝子のプロモーター(+73-260bp)を、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)ウイルスの複製開始に必須な転写因子をコードするICP4遺伝子の上流に挿入し、さらにその上流に標識遺伝子lacZを、その下流にInternal Ribosomal Entry Site (IRES)とヒトGM-CSF cDNAを連結した相同組換えベクターpKX2βG3-CALP-ICP4-GM-CSFを構築した。このDNA断片をICP4欠失HSV変異体d120のRibonucleotide reductase (RR,ICP6)-locusに相同組み換え法を用いて挿入し、ICP4とRRの二重欠失変異体をスクリーニングした。RRはDNAウイルスの複製に必須の酵素であるが、真核細胞でも分裂増殖時に合成されるため、このHSV変異体は、カルポニン遺伝子を発現しかつ活発に増殖している細胞すなわち肉腫に感染すると腫瘍細胞由来のRRを利用して複製可能となり、細胞溶解活性を示す。さらに、宿主の抗腫瘍免疫を賦活化するGM-CSF cDNAをIRESを用いて発現させることにより、ウイルス複製自体による肉腫の傷害作用に加えて、抗腫瘍免疫作用をも合わせもつ。GM-CSFの全長cDNAをクローニングした。

ヒトカルポニン遺伝子のプロモーター(+73-260bp)を、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)ウイルスの複製開始に必須な転写因子をコードするICP4遺伝子の上流に挿入し、さらにその上流に標識遺伝子lacZを、その下流にInternal Ribosomal Entry Site(IRES)と健常人の白血球よりクローニングしたヒトGM-CSF cDNAを連結した相同組換えベクターpKX2・G3-CALP-ICP4-GM-CSFを構築した。このDNA断片をICP4欠失HSV変異体d120のRibonucleotide reductase(RR,ICP6)-locusに相同組み換え法を用いて挿入し、SK-LMS-1平滑筋肉腫細胞でlacZの発現を指標にしてスクリーニングし、続いてICP4をトランスフェクションしたVero細胞(VeroE5)を用いて3回スクリーニングを繰り返し、3クローンの単一の相同組換え体を得た。無血清培地VP-SFM(Invitrogen)とVeroE5を用いて、まずd12.CALPΔRRウイルスを用いて増殖を1%CS/DMEM培地と比較した。感染後24時間までは、無血清、血清培地ともに同程度の増殖を示した。培養液にすべて無血清培地を用いても、d12.CALPΔRRの精製は可能であり、10^9PFUにまで濃縮可能であった。無血清培地を用いて精製したd12.CALPΔRRは、平滑筋肉腫に対する細胞傷害活性、GCV感受性など、血清存在下で精製したロットと変わりはなかった。化学発癌繊維肉腫細胞株MethAを同系のC57BL/6マウスに移植し、この肉腫に対し細胞傷害作用をもつd120変異体ウイルスを感染させ、腫瘍消褪後26-97日でMethAを再度移植し、活性化Tリンパ球の誘導と腫瘍の拒絶を確認した。
神経幹細胞の分化誘導とエピジェネティクス機構(クロマチン調節機構)に関する研究

本研究では、大脳皮質を形成する神経前駆細胞の細胞周期調節機構に、エピジェネティクス機構、特にクロマチン構造を制御するヒストン脱アセチル化酵素が果たす役割を解明する目的で以下の実験行った。方法1.妊娠10-16日目のマウス神経前駆細胞の核抽出液を調整した。抗アセチル化ヒストン抗体でウエスタンブロットを行ないヒストンのアセチル化状態を確認した。2.上記調整サンプルと種々の抗アセチル化ヒストン抗体でクロマチン免疫沈降を行い、細胞周期調節遺伝子のプロモーター領域に対するプライマーを用いてPCRを行った。3.ヒストンのアセチル化を修飾するhistonedeacetylases、Sir2に対するウエスタンブロット解析を行った。4.Tet-systemと神経幹細胞特異的プロモーターであるnestin遺伝子のintron II promoterとを組み合わせ、ドキシササクリン(DOX)投与によりSir2を神経幹細胞で時期特異的に発現可能なマウスの作成を試みた。結果1.発生が進むに従いアセチル化ヒストンH3lys9が増加した。その他既知のH3、H4アセチル化部位は不変であった。2.神経前駆細胞の分裂が進むに従いp27Kip1,p57Kip2等のプロモーター領域が抗アセチル化ヒストンH3lys9抗体により免疫沈降した。3.神経前駆細胞の分裂が進むに従い核内脱アセチル化酵素Sir2のみ減少した。4.TRE配列の下流にSir2遺伝子を挿入した遺伝子断片を持つトランスジェニックマウス(TRE-Sir2)を5ライン作成したが、Sir2を強制発現可能なラインを見つけることができなかった。考察Sirt1はNAD依存性ヒストン脱アセチル化酵素Sir2のマウスホモログ蛋白質であり、酵母のカロリー制限下での寿命延長に重要な役割を果たしていることが知られ、またSirt1欠損マウスでは大脳発生に異常をきたす。以上から神経前駆細胞の細胞周期が進むにつれてSirt1の発現量が減少し、その結果アセチル化ヒストンH3 lys9が減少、CDKIのプロモーターが解放されている可能性がある。強制発現可能なトランスジェニックマウス作成を試みたが、DOX投与量の増量、投与時期・期間の調整にも関わらず、導入遺伝子由来の蛋白質・mRNAを検出可能なラインを見つけることができなかった。大脳皮質を形成する神経前駆細胞の細胞周期調節機構に、エピジェネティクス機構、特にクロマチン構造を制御するヒストン脱アセチル化酵素が果たす役割を解明する。本年度以下の解析を行った。方法1.妊娠10-16日目の胎児前脳背内側を分離し、神経前駆細胞の核抽出液を調整した。抗アセチル化ヒストン抗体でウエスタンプロットを行ないヒストンのアセチル化状態を確認した。2.上記調整サンプルと種々の抗アセチル化ヒストン抗体でクロマチン免疫沈降を行い、沈降したDNAとサイクリン依存性キナーゼ抑制遺伝子(CDKI)のプロモーター領域に対してデザインしたプライマーを用いてPCRを行った。3.ヒストンのアセチル化を修飾するhistonedeacetylase (HDAC1,2,3,4,5,6,8)、Sirt1に対するウエスタンプロット解析を行った。結果3.神経前駆細胞の分裂が進むに従い核内脱アセチル化酵素Sirt1のみ減少した。

考察Sirt1はNAD依存性ヒストン脱アセチル化酵素Sir2のマウスホモログ蛋白質であり、酵母のカロリー制限下での寿命延長に重要な役割を果たしていることが知られている(lmai et al.,2000)。またSirt1欠損マウスでは大脳発生に異常をきたす(Cheng et al.,2003)。我々が行った予備実験ではSirt1をPC12細胞において強制発現すると、アセチル化ヒストンH3 lys9が減少することを確認した。以上から神経前駆細胞の細胞周期が進むにつれてSirt1の発現量が減少し、その結果アセチル化ヒストンH3 lys9が減少、CDKIのプロモーターが解放される可能性がある。Sirt1の神経前駆細胞のCDKI発現調節機構について今後in vivoでの解析を進める予定である。大脳皮質を形成する神経前駆細胞の細胞周期調節機構に、エピジェネティクス機構、特にクロマチン構造を制御するヒストン脱アセチル化酵素が果たす役割を解明する。平成18年度の研究から、神経前駆細胞の細胞周期が進むにつれて脱アセチル化酵素Sir2の発現量が減少し、その結果p27Kip1遺伝子をはじめとしたサイクリン依存性キナーゼ抑制遺伝子(CDKl)のプロモータ配列が解放される可能性を明らかにした(平成18年度実績報告書参照)。そこで本研究ではドキシサイクリン(DOX)存在下でtetracycline responsible element配列(TRE)下流の遺伝子を強制発現可能な逆Tetトランス活性化因子蛋白質(rtTA)と神経幹細胞特異的プロモータである中間径フィラメントnestin遺伝子intron ll promoterとを組み合わせSir2を神経幹細胞で時期特異的に強制発現可能なマウスの作成を試みた。まず、TRE配列の下流にSir2遺伝子を挿入した遺伝子断片を持つトランスジェニックマウス(TRE-Sir2)を作成した。本研究室に導入済みであるトランスジェニックマウスneslin-rtTAは神経幹細胞特異的にrtTAを発現する。このnestin-rtTAと得られたTRE-Sir2 5ラインとをそれぞれ交配し、胎生7日以降の妊娠マウスにDOXを経口投与、両遺伝子を持つマウスのうちSir2を強制発現可能なラインを選択しようと試みた。しかし、導入遺伝子由来の蛋白質・mRNAをともに解析したが、DOX投与量の増量、投与時期・期間の調整にも関わらず、DOX投与による強制発現可能なラインを見つけることができなかった。
ノーザンディメンション

ノーザンディメンション(ND)は、バルト海、北海、ロシア北西地域等を包摂するEUの地域政策プログラムである。NDはヨーロッパ自体の小宇宙である。EU、NATO加盟国(エストニア、ラトヴィア、リトアニア、デンマーク)、非NATO国(フィンランド、スウェーデン)、非EU国(アイスランド、ノルウェー)、そしていずれも比較的小規模でロシアと地理的に近い。それ故に、この地域協力は、「分断のないヨーロッパ作りの実験室」の役割を果たす。本研究は、「拡大EUとスラブ圏の域際交流の拡大によるヨーロッパ経済空間の再編」という分析視角から、「EU内のミクロ地域レベルでの再編問題がEU域外の近隣諸国を含めたマクロなヨーロッパ経済空間の再編問題とリンクする地域協力」の一例としてNDの分析を試みた。本研究が実施された3年間は、EUが15カ国から27カ国へと拡大した時期であった。EU拡大は、EUの域外に留まる国々との共存がEU内部の安定にとっても重要課題となることを意味し、欧州近隣諸国政策の形成を促した。これは「域際交流の拡大によるヨーロッパ経済空間の再編」に連なる「多元的開放型リージョナル・ガバナンス」形成の可能性を切り開いている。これは、まさにNDの課題であった。NDそのものの独自性は薄れたものの、その骨子は欧州近隣諸国政策の中に生きている。EUにとってロシア要因は依然として不安定要素であるとしても、この枠組みで行われてきた様々な協力の試みは、国境を越えた産官学の協力(トリプル・ヘリックス・モデル)に基づいたバルト海経済圏の形成という形で結実しつつある。そこに、ロシア要因を地域の成長要因に組み込む「経済空間の再編」の可能性が芽生え、わたしたちが共同研究を継続する必然性を生み出している。課題「ノーザンディメンション」の枠組みを意識しながら各担当地域の研究を進めるとともに、予備的な現地調査を行った。論文、書籍以外の主な研究活動は、以下の通りである。蓮見口頭発表「ヨーロッパの中のロシア-地域協力の視点から」(比較経済体制研究会、H16.9.17)、「ヨーロッパ共通経済空間の可能性-EU拡大後の欧州秩序とWider Europe」(日本国際経済学会、H16.10.10)、「欧州近隣諸国政策とロシア」(日本国際政治学会、H16.10.16)、「欧州近隣諸国政策について」(慶應EU研究会、COE多文化多世代交差世界の政治社会秩序形成・多文化世界における市民意識の動態、H16.11.20)、「EU拡大とロシア」(内閣官房内閣情報調査室「ロシアの政財界における新しい潮流」委員会、H17.2.14)。カリーニングラードの研究機関との連絡と海外共同究者D.ヴォロンツォフ氏の招聘。志摩田口H16.8.1-H17.1.30(6カ月未満)ポーランドに滞在し、海外共同研究者ソバ氏と協力して、ポーランド主要大学の国境域研究センターおよび中央統計局で情報収集(地域経済交流データを含む)。国際会議「EU拡大の東欧諸国関係への影響」(ワルシャワ大学経営学部、H16.9.16-17)参加、日本人ポーランド研究者・留学生研究会「EU加盟後のポーランドの現状と展望」(ポーランド日本国大使館広報文化センター、H17.1.5)の組織。服部テレビ出演「NHK BSニュース-きょうの世界」の「特集:ベラルーシ"強権体制"の行方」(H16.10.18放送)にゲスト・コメンテーターとして出演。ベラルーシ研究者との協力を含むロシア、ウクライナ、ベラルーシの予備調査(H17.2.17-26)。フィンランド湾周辺地域の地方機関・国境等の共同調査を行った(H17.8.23-8.31)。その他、公表論文以外の主な活動は次の通りである。

蓮見:口頭発表「ワイダー・ヨーロッパの中のロシア」(比較経済体制学会H17.6.4)、「『地域的グローバルガバナンス』形成過程としての欧州近隣諸国政策」(日本EU学会H17.11.13)、「EU拡大後の欧州秩序とボーダー・リージョンの役割」(「国境を越える地域経済カバナンス(基盤研究A:14252007)」研究会にて招待報告H17.12.3)、「ロシアの対EU外交・エネルギー戦略」(内閣官房内閣情報調査室「ロシアの内政・外交に関する調査・研究」委員会H18.3.16)。田口:口頭発表「EUの東方拡大とポーランド」(慶應EU研究会H18.1.28)。夏期にポーランドで資料収集・調査を行った。ワルシャワ大学ソハ教授と協力して、ポーランドおよび周辺諸国の地域レベルでの経済交流分析のため、ポーランド、ウクライナ、ベラルーシ統計局の資料を収集した。1.現地調査2006年8月20-30日、海外共同調査を実施した。サンクトペテルブルグ、カリーニングラード、リトアニア、ラトヴィア、ポーランドの国境地域の視察および国境地域協力機関で聞き取りを行った。サンクトペテルブルグでは「バルト海地域広域協力InterregIIIB」のロシア側担当者、カリーニングラードでは「リトアニア・カリーニングラード・ポーランドの国境を挟む地域協力InterregIIIA」のロシア側担当者と面談し資料収集を行った。リトアニア・ラトヴィア国境視察(ロシア人居住地ダウガフピルスを含む)、さらにベラルーシ・ポーランド国境のテレスポール郡を視察、郡長と面談し資料収集を行った。田口は、さらにポーランドに滞在し、ソバ氏と協力して調査を進め、「ポーランドおよびEU内における経済格差」と題する報告を行った(岡山大学「格差研究会」報告2007年1月17日)。2.研究成果公表:学会分科会にて研究成果を共同で報告海外共同研究者2名を招聘し、2006年10月28日、比較経済体制学会第5回秋季大会の分科会において共同で研究成果の報告を行った。報告内容は以下の通りである。志摩、田口、服部は、コメンテータとして参加した。3.研究成果公表:学術誌にて特集『ロシア・ユーラシア経済』2007年3月号(No.897)において、本共同研究の成果を公表する特集「欧州北部の地域協力とロシア」を企画した。特集内容は以下の通りである。ハウッカラ(フィンランド・国際問題研究所)「欧州近隣諸国政策時代のダイメンショナリズムの妥当性-ノーザン・ダイメンションの場合」、スモロジンスカヤ「グローバリゼーション時代のカリーニングラード-ロシア・EUの和解のおけるその役割」、蓮見雄「欧州北部におけるクラスターの形成とロシア」
生分解性ポリエステルの結晶および鎖における酵素分解機構の解明

本研究では、生分解性ポリエステルの酵素分解速度を制御するための基盤研究として、生分解性ポリエステルの結晶および分子鎖の酵素分解過程を分子レベルで解明することを大きな目的とした。分解酵素が生分解性ポリエステルを分解するときは、吸着ドメインが結晶表面に吸着し、その後に触媒ドメインにより表面のポリエステル分子鎖を加水分解する。申請者は、この酵素が疎水性相互作用に加えて、エステル結合由来の相互作用によってポリエステル結晶表面に吸着すると提案している。そこで本研究では、分解酵素が結晶表面に吸着し加水分解する反応過程を、酵素一分子レベルで直接観察した。液中原子間力顕微鏡および水晶振動子マイクロバランス法を用いることで、酵素の吸着および脱離過程を酵素一分子レベルで定量的に評価することに成功した。この結果から、加水分解酵素が有する基質吸着部位が生分解性ポリエステルの結晶を分解する際に果たす役割をさらに明確にすることに成功した。すなわち、基質吸着部位により酵素の吸着が不可逆的となり、その後の加水分解効率が上昇すると結論した。一方、加水分解酵素の逆反応を利用した酵素重合を用いることで分岐構造を有する新規の生分解性ポリエステルを合成することに成功した。得られたポリマーのセグメント長は熱的性質に大きく影響した。さらに、この生分解性を有する分岐型ポリエステルの酵素分解挙動を詳細に調べた結果、分岐構造や分子鎖末端の数とともに、各分子鎖のセグメント長が分解速度に影響を与えていることをはじめて明らかにした。本研究では、生分解性ポリエステルの酵素分解速度を制御するための基盤研究として、ポリ[(R)-3-ヒドロキシブタン酸](PHB)結晶の酵素分解過程を解明することを大きな目的としている。本研究で用いたRalstonia pickettii T1由来のPHB分解酵素が生分解性ポリエステルを分解するときは、吸着ドメインが結晶表面に吸着し、その後に触媒ドメインにより表面のポリエステル分子鎖を加水分解する。申請者は、これまでに、この酵素が疎水性相互作用に加えて、エステル結合由来の相互作用によってPHBに吸着すると提案している。そこで、本研究ではPHB分解酵素の吸着様式を理解し、吸着量を制御するために、分解酵素がPHB分子鎖のどの部分と反応し吸着しているのか、分子鎖の官能基レベルで明らかにすることを目的とした。はじめに、共重合組成の異なるPHB、ポリL-乳酸、ポリD-乳酸、およびポリエチレンの単結晶を調整し、その表面物性を原子間力顕微鏡(AFM)および前進接触角により測定した。その後、各結晶表面に分解酵素を吸着させ、分子鎖の化学構造、立体規則性、およびエステル結合の有無が酵素吸着に及ぼす影響を調べた。AFM観察により、酵素の吸着量、吸着分布を評価した。さらに、酵素処理後の結晶をメタノールで洗浄し、酵素が脱離した後の結晶表画の摩擦力を解析した。その結果、結晶表面に存在するエステル結合の密度が増加するに従い、酵素の吸着量が増加した。また、結晶表面の粗さが増加すると、酵素の吸着量は低下した。加えて、PHBおよびその共重合体の結晶表面の摩擦力が、酵素処理により低下した。以上の結果から、R.pickettii T1由来のPHB分解酵素はエステル結合に特異的に吸着し、その効果により結晶表面の折りたたみ構造を乱す効果があることが示された。
生体に倣ったポリマー表面の精密設計による高度バイオ認識界面の構築

バイオチップにおいて生体分子を失活させず安定に固定できる基板が求められている。また限られた空間で効率良く反応を行うためには、プローブ分子の単位面積あたりの固定化量を増やすこと、非特異的な吸着を抑制することが重要である。そこで本研究では、生体適合性を有した2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)とグリシジルメタクリレート(GMA)から成るポリマーブラシに抗体フラグメントをその配向性を保って高密度に固定化し高感度分子認識界面を創製することを目的としている。本年度は、ポリマーブラシの組成・構造と、抗体固定化量・活性との関係について詳細な検討を行った。GMAのみから成るGMAポリマー(PGMA)ブラシ、MPCとGMAから成るブロックコポリマーブラシおよびランダムコポリマーブラシを用いた。比較として用いたエポキシ基修飾表面と比べポリマーブラシにおける単位面積あたりのエポキシ基の数(Nとする)は多く、よって多くの抗体をポリマーブラシ表面に固定できたことが確認された。またランダムコポリマーブラシには、PGMAブラシやブロックコポリマーブラシよりも効率的に抗体が固定されており、ブラシ構造の制御により固定化効率を増大できることがわかった。また抗体フラグメントを固定した各表面の抗原認識量も、Nの増減により変化し、ポリマーブラシを用いた場合にエポキシ基修飾表面と比べ多くの抗原をより効率的に認識できることが示された。抗体固定化表面について非特異吸着抑制能の調査を行った所、ポリマーブラシ表面ではエポキシ基修飾表面よりも多く非特異吸着が起こったが、一層目にPMPCを持つブロックコポリマーブラシではこの非特異吸着を減少できることがわかった。以上の結果から、ブラシ構造のさらなる制御を行うことにより、より高感度な分子認識を行うことが出来る基板表面を創製できると考えられる。バイオチップにおいて生体分子を失活させることなく安定に固定化できる基板が求められている。また限られた空間で効率良く反応を行うためには、プローブ分子の単位面積あたりの固定化量を増やすこと、また非特異的な吸着を抑制することが非常に重要である。そこで本研究では、生体適合性を有した2-メタクリロイルオキシエチルボスホリルコリン(MPC)とグリシジルメタクリレート(GMA)から成るブロックコポリマーブラシにこれら生体分子を高密度で固定化しバイオチップ基板表面の構造最適化を行うことを目的としている。本年度は、ポリマーブラシへ抗体フラグメントを固定化してその固定化量および活性を比較した。タンパク質を基板に固定化する場合、配向性を保って固定化することがその活性を維持する上で重要である。本研究では抗原認識部位の反対側にチオール基を有した抗体フラグメントを用いた。まずポリマーブラシのPGMAユニットにエポキシ基を介してピリジルジスルフィド基を導入した。この官能基のジスルフィド結合とチオール基との反応を利用し、抗体フラグメントの配向性を保った固定化を行った。その後抗原との反応性を解析した。その結果PGMAユニットの膜厚の増加に伴いピリジルジスルフィド基の導入量、抗体フラグメントの固定化量、そして抗原との反応性が増加することがわかった。また比較としてエポキシ基を有した有機シランの単分子膜を同様の反応に供したが、ポリマーブラシの方が効率良く抗原と反応できることが明らかとなった。PMPC-b-PGMAブラシとPGMAブラシを比較すると、PGMAブラシの方が抗体の固定化量は多いにもかかわらず、抗原との反応性は両者同程度であった。生体適合性を有するPMPCを持つPMPC-b-PGMAブラシと、GMAのみから成るPGMAブラシとでは、抗体の固定化状態が異なるということが考えられる。
覚醒レベル向上を目指した抗てんかん薬の開発に関する研究

ヒスタミンはそれ自身が覚醒アミンであり、かつ抗けいれん作用を持つ。本研究の目指すところは、ヒスタミンの中枢神経からの放出を促すことにより、けいれんを抑制し、かつ覚醒度を保たせようとすることである。一方、ヒスタミンH3受容体はヒスタミン放出を制御している。すなわち、H3受容体にヒスタミンが結合するとヒスタミン放出を抑制するように働く。まず、けいれん誘発物質であるペンチレンテトラゾール(PTZ)のマウスへの腹腔内連続投与により、全般てんかんモデルの作成を行った。ICRマウスへのPTZ40mgの腹腔内連続投与でけいれんのステージが次第に強くなり、約25日で全般けいれんが起こることが確認された。PTZの用量を変化させると、用量依存性に全般けいれんの形成が促進され、けいれんステージの進行も早くなった。これらの研究は平成11年度に完成した。次に、ヒスタミンH3受容体の性質を検討することにした。H3受容体アゴニストであるメチルヒスタミン5mg(n=10)および10mg(n=6)を腹腔内に投与し、PTZ連続投与による全般けいれんの形成過程を観察した。この結果、全般けいれんの形成はメチルヒスタミンの投与により、約8日で100%のマウスがステージ5を完成した。形成に要する期間も短縮し、投与からけいれん発現までの時間も短縮し、けいれん持続時間も延長した。これらの諸要素は10mg投与のマウスの方がより促進され、用量依存性を示した。このことは、H3受容体を介して全般けいれんの形成が促進されていることを示している。本研究の最終目的は覚醒レベル向上を目指した新しい抗てんかん薬を開発することである。このためわれわれは中枢ヒスタミンがヒスタミンH1受容体を通して、けいれん抑制に働くこと、ヒスタミンH3受容体がヒスタミンの放出を制御していることから、H3受容体阻害薬によって覚醒アミンであるヒスタミン放出を促すという発想に至った。H3阻害薬の効果をみるために、先ず、中枢ヒスタミン神経系のH1受容体ノックアウトマウスを用いて、ペンチレンテトラゾール(PTZ)による全般てんかんモデルのキンドリングを作成することにした。雄性ICRマウス(25g)と雄性H1受容体欠損マウスの野生型(+/+)とH1KO(-/-)を使用した。PTZキンドリングは、PTZ(30-50mg/kg)を連日25日間投与し、けいれん持続時間、けいれんstage、けいれんまでの時間を記録した。行動観察後脳を取りだし、大脳、中脳、小脳、延髄に分け、ヒスタミン含量を測定した。対照群には生理食塩水を投与した。ICRマウスのキンドリングは、PTZ用量依存的にけいれんの度合いが強くなり、30mg/kg群で死亡したマウスは見られなかったが、40mg/kg、50mg/kgと用量が高くなるにつれ、死亡したマウスの数も増加した。この時の脳内ヒスタミン含量は用量依存的に増加していた。H1KOはPTZ(30mg/kg)投与1日目よりけいれんの持続時間が長く、けいれんstageの進行も早かった。H1受容体欠損マウスと野生型(対照群)の脳内ヒスタミン含量は変わらなかったが、25日間連続投与群では、H1KOは野生型マウスより脳内ヒスタミン含量が増加していた。以上の結果より、H1受容体はPTZキンドリングに対し抑制的に作用していることが確認された。今後このモデルに対して、H3受容体阻害薬の効果を検討し、けいれんへの効果と行動について観察する予定である。

本研究の目指すところは、ヒスタミンの中枢神経からの放出を促すことにより、けいれんを抑制し、かつ覚醒度を保たせようとすることである。一方、ヒスタミンH3受容体はヒスタミン放出を制御している。すなわち、H3受容体にヒスタミンが結合するとヒスタミン放出を抑制するように働く。まず、けいれん誘発物質であるペンチレンテトラゾール(PTZ)のマウスへの腹腔内連続投与により、全般てんかんモデルの作成を行った。ICRマウスへのPTZ 40mgの腹腔内連続投与でけいれんのステージが次第に強くなり、約25日で全般けいれんが起こることが確認された。PTZの用量を変化させると、用量依存性に全般けいれんの形成が促進され、けいれんステージの進行も早くなった。これらの研究は平成11年度に完成した。次に、ヒスタミンH3受容体の性質を検討することにした。H3受容体アゴニストであるメチルヒスタミン5mg(n=10)および10mg(n=6)を腹腔内に投与し、PTZ連続投与による全般けいれんの形成過程を観察した。この結果、全般けいれんの形成はメチルヒスタミンの投与により、約8日で100%のマウスがステージ5を完成した。形成に要する期間も短縮し、投与からけいれん発現までの時間も短縮し、けいれん持続時間も延長した。これらの諸要素は10mg投与のマウスの方がより促進され、用量依存性を示した。このことは、H3受容体を介して全般けいれんの形成が促進されていることを示している。
ポリペプチドらせんに特有の水素結合相関の特性解析と合成化学への応用

1.ポリアスパルテートに特有のヘリックス-コイル正転移・逆転移の相図研究:PPLAをtetrachloroethane(TCE)とtrifluomacetic acid(TFA)の混合溶媒に溶かした三元系について、温度とTFA濃度を変えて相図を作り、正逆いずれの転移においても、χ_1結合まわりのコンホメーションにg^-の変化が観測されることを確認した。これによりコンホメーション転移の全体像が把握できた。2.ポリペプチドらせんのコンホメーション転移における水素結合の働き:ポリペプチド鎖においては、らせんの巻き方が変わっても水素結合の本数、エネルギー状態に変化はない。変換は分子内一次転移であり、熱の出入りを伴う。強い水素結合相関の環境下で観測される転移誘発の鍵は側鎖コンホメーションにあると結論した。3.L-アスパルテート共重合体を用いたα-らせん反転に関わる水素結合変換機構の解析:共重合試料Copoly(BLA49:PLA51)について、TCEを溶媒とするリオトロピック液晶状態において^2HNMR測定を行い、らせんの巻き替えが液晶配向を保ったままで進行することを確認した。BLAが50%の領域ではPPLAの場合と同様、末端からのZipper型の転移機構と考え、理論解析を進めている。4.水素結合相関の合成化学への応用:主鎖型液晶のネマチックコンホメーションに水素結合形成能を付与するため、糖鎖を出発物質とするサンプルの合成を試みた。物性解析が可能なサンプル(温度範囲、サンプル量など)はまだ得られていない。4炭糖スペーサーでの合成には成功したが、液晶転移温度が高く(>230°C)詳細な解析には不向きなため、6炭糖での合成を試みている。なお、オキシエチレン型スペーサーのネマチック・コンボメーションに関する構造、熱力学的性質研究には進展があり、高分子物理の共著書の一章にレビュー論文を加えた。(i)ヘリックス-コイル正転移および逆転移の特性解析(希薄溶液)温度上昇によるポリペプチドのヘリックス-コイル転移(正転移)は、限られたポリマー、限られた溶媒でしか起こらず、緩やかな転移である。コイル状態が熱力学的に不安定であることによるものと思われる。各種のポリアスパルテートエステルが示す正転移について、高温コイル状態の主鎖および側鎖コンホメーションの解析を行った。(ii)らせんセンスの反転に関わる遷移状態の実験的確認(等方相液晶相)常温で左巻きを好むベンジルアスパルテート(BLG)と右巻きを好むフェネチルアスパルテート(PLG)のランダム共重合体をおよびそれらの重水素化試料(主鎖、側鎖)を合成し、α-ヘリックスらせんの温度による反転挙動を観測した。水素結合連鎖の存在による協同性は非常に強く、PLA残基の含有が10050%の範囲では、転移温度は変わっても、右から左への反転はPLA100%の場合と同様なS字曲線を示した。同位体ラベル法を利用した実験、理論解析が進行中である。(iii)固相状態におけるらせんセンス反転の特徴と側鎖構造の関連(バルク状態)多くのポリアスパルテートで、らせんの向きの反転が加熱により固相でも起こることが知られている。側鎖エステル基R=-CH_2CH_2CH_2Φおよび-CH_2CH_2OΦの場合を比較すべく合成に着手したが、PVT測定に十分なサンプル量をまだ確保できていない。継続中である。(iV)水素結合相関の鎖状分子への応用の一環として主鎖型液晶のスペーサー部に糖類を導入したサンプルの合成を行っている。

4炭糖の2種について立体構造による液晶相の違いを確認した。1.ヘリックス-コイル正転移および逆転移の特性解析(希薄溶液)各種のポリアスパルテートエステルが示す正転移について、高温コイル状態の主鎖および側鎖コンホメーションのかかわりについてまとめを行った。2.らせんセンスの反転に関わる遷移状態の実験的確認(液晶相バルク状態)液晶状態におけるらせん転移で水素結合連鎖の強い協同性が観測されることを考慮した転移理論を導き、PLA残基含量が10050%の共重合体について2状態理論による解析を行った。3.固相状態におけるらせんセンス反転の特徴と側鎖構造の関連(バルク状態)多くのポリアスパルテートで、らせんの向きの反転が加熱により固相でも起こることが知られている。側鎖エステル基R=-CH_2CH_2CH_2ΦおよびR=-CH_2CH_2OΦの場合を比較すべく合成に着手したが、PVT測定に十分なサンプル量を確保するまでには至らなかった。今年度も継続し、固相転移に特徴的な体積変化の寄与を明らかにしたい。4.相転移における分子内、分子間水素結合変換の影響水素結合相関の鎖状分子への応用の一環として主鎖型液晶のスペーサー部に糖類を導入したサンプルの試作を行った。4炭糖の2種について立体構造による液晶相の違いを確認した後、液晶温度範囲の低下(200°C以下)を目的として6炭糖鎖の導入を試みた。合成の処方はほぼ確立できた。
無分散リングにおける3次元レーザー冷却によるビーム結晶化と引き出しに関する研究

究極の超高品位荷電粒子ビームであるクリスタルビームを実現するため、分子動力学シミュレーションを駆使し、運動量分散のない蓄積リングにおける3次元レーザー冷却法を用いたクリスタルビームの生成手法を探るとともに、広範な温度領域におけるイオンビームの加熱率を種々の条件で評価しクリスタルビーム実現のための物理的条件を明らかにした。また、リングから引き出したクリスタルビームの安定な輸送のための条件を解明した。本年度は、本予算により購入したハイパフォーマンスコンピュータで高速計算環境を整備し、極限まで冷却され結晶化したイオンビームの振る舞いを分子動力学シミュレーションにより解析した。まず、運動量分散のない"無分散リング"のモデルとして、京都大学のイオン冷却蓄積リングS-LSRを含む二つのリングを想定し、レーザー冷却法をモデル化した冷却力により様々な種類のクリスタルビームが生成可能であることを確認した。次に、生成されたクリスタルビームのエミッタンスの時間発展から算出したビームの加熱率を基に、安定性を評価した。加熱率は、極低エミッタンス状態では極めて小さくビームは安定であるが、エミッタンスの増加と共に徐々に増大し、結晶構造が壊れるときに最大となる。加熱率の最大値はある程度以上のビーム強度では一定で、チューンが小さいほど低下する傾向があることが分かった。また、クリスタルビームを安定に引き出すためには、リング内で結晶状態が安定である必要がある。このためには、各四重極電磁石の励磁誤差を0.1%オーダー以下に抑える必要があることが判明した。本研究により、ビーム冷却実験において重要なパラメータである、クリスタルビームを生成するために必要なレーザー冷却力、および、安定に維持するための電磁石の誤差の許容範囲が明らかとなった。また、並行して、当機構のシステム計算科学センターのサポートにより、開発した分子動力学コードの高速化改造にも着手した。スカラチューニングと並列化により、購入したコンピュータ(デュアルコア)で、約1.9倍に高速化され、より効率的な研究が可能になった。平成19年度に引き続き、本補助金によりハイパフォーマンスワークステーションを整備し、より効率的な冷却イオンビームの分子動力学シミュレーションが可能となった。19年度までの成果を基に、無分散蓄積リングのモデルを再検討し低ベータトロンチューン化を図った。まず、レーザー散逸力を簡略化した冷却シミュレーションによりビームの冷却過程や冷却後の特性を調べた。チューンが低いため以前よりも弱い横方向冷却力であっても結晶化が可能であることが分かった。これにより、3次元冷却に必要となる縦方向と横方向の運動を結合するための結合空洞の電場を弱めることが可能になり、結合空洞の設計・製作がより容易になる。また、結晶化に必要な冷却力は運動エネルギーの他、イオンの価数や質量数に依存しないことも分かった。共鳴結合法を適用するにはビームは高周波でパンチされていなければならないが、高周波空洞の導入により冷却ビームの安定化に必要となる外部集束場の周期性は低下する。このため、無分散リングであっても線密度が十分低くない限り、極低エミッタンス状態のビームは不安定であることが分かった。他方、集束場の高い周期性が維持されるよう空洞を周期的に導入することも理論上可能だが、共鳴結合に必要な差共鳴条件が満たされなくなるため3次元冷却はほとんど不可能であった。クリスタルビームの引き出しに関するシミュレーションでは、はじめにさまざまな種類の安定な結晶が生成可能な有限の運動量分散を持つ通常のリングを想定した。引き出し機器によるキックとその後の輸送系の集束場の非周期性のために、エミッタンスが容易に増大することが分かった。線密度の極めて低い1次元結晶構造を除いて、結晶構造を維持したままの輸送は困難であった。無分散リングにおいて3次元レーザー冷却法によりクリスタルビームが生成できるとを分子動力学シミュレーションにより示した。シミュレーション条件として蓄積リング「S-LSR」のラティス構造を想定し、実際にレーザー冷却実験に用いられている40keVの24Mg+イオンビームに対して縦方向の冷却力が3自由度に均等化されるよう結合空洞電場やソレノイド磁場等のラティス条件を最適化した。波長が約280nm、スポット径が1cmのレーザーを2本用いて初期温度が数万Kのビームをレーザー冷却したところ、ビーム電流が十分低い場合、エミッタンスは1e-12m. radへ運動量幅は1e-6へそれぞれ高品質化され、バンチ内の粒子が直線状に整列する安定な1次元結晶構造を形成できた。このとき、掃引後のレーザー周波数離調の最適値はドップラー限界を与える理論値よりも3倍程度大きいこと、3次元冷却が可能な共鳴条件下ではシンクロトロンチューンが大きいためレーザーとイオンの相互作用時間を十分確保できるようレーザー周波数の掃引速度を遅くする必要があることなどが分かった。他方、ビーム電流が高い場合、クリスタルビームの維持条件を十分に満たすことができないため結晶化することはできなかったものの、1e-11m. rad台の超低エミッタンスビームを生成できた。クリスタルビームの引き出しについては静電場によるバンチ全体を一度に引き出すシングルターン引き出し方法を想定した。ビーム輸送系のべ一

タトロン位相進度を変え、クリスタルビームのエミッタンス増加や結晶構造の安定性について解析し、安定化のための条件を明らかにした。引き出しの際の偏向角を小さくし位相進度を小さくするほどエミッタンスの増加量を抑えることができ、上述の維持条件と同等に127度以下では大電流時に形成可能な3次元結晶構造を維持できることが分かった。
深海性魚類における汎世界種の遺伝的変異と種分化:パナマ地狭の形成と関連して

汎世界種である深海性ユキオニハダカCyclothonealbaの遺伝的変異を調べるために,3大洋から得られた44個体の標本と,外群であるC.signata,C.braueriならびにC.acclinidensから計11個体,総計55個体の標本からDNAを抽出し,ミトコンドリアDNAの16SrRNAの前半領域およそ380bpをPCR法により増幅した.このPCR産物をもとに,ダイレクトシークエンス法により当該領域の塩基配列の決定を行った.その結果,ユキオニハダカ種内で種間に匹敵するきわめて大きい変異が認められただけでなく,その分化は地域的にきわめて限定されたものであることが明らかになった.さらに,パナマ地峡による個体群の分断に代表されるいくつかの地理的分断が分子系統樹上で確認できた.また,これらの明瞭な地理的分断以前に太平洋内で従来の生物地理学的なパターンからは予想できなかった,大洋内における個体群の分断が明らかになった.地理的・海洋学的障壁がないこのような大洋内における地理的分断が数百万年前におこり,さらにその分断の影響ががいまだに続いていることは,外洋における「種」というものを改めて考え直さなければならないことを示唆している.形態的にまったく分化せずに遺伝的分化のみ進行するというこの新たな外洋種における種分化パターンの発見は,今後の外洋生物地理学でけでなく,外洋生物学に対して強烈なインパクトを与えるだろうと思われる.汎世界種である深海性ユキオニハダカCyclothonealbaの遺伝的変異を調べるために,3大洋から得られた44個体の標本と,外群であるC.signata,C.braueriならびにC.acclinidensから計11個体,総計55個体の標本からDNAを抽出し,ミトコンドリアDNAの16SrRNAの前半領域およそ380bpをPCR法により増幅した.このPCR産物をもとに,ダイレクトシークエンス法により当該領域の塩基配列の決定を行った.その結果,ユキオニハダカ種内で種間に匹敵するきわめて大きい変異が認められただけでなく,その分化は地域的にきわめて限定されたものであることが明らかになった.さらに,パナマ地峡による個体群の分断に代表されるいくつかの地理的分断が分子系統樹上で確認できた.また,これらの明瞭な地理的分断以前に太平洋内で従来の生物地理学的なパターンからは予想できなかった,大洋内における個体群の分断が明らかになった.地理的・海洋学的障壁がないこのような大洋内における地理的分断が数百万年前におこり,さらにその分断の影響ががいまだに続いていることは,外洋における「種」というものを改めて考え直さなければならないことを示唆している.形態的にまったく分化せずに遺伝的分化のみ進行するというこの新たな外洋種における種分化パターンの発見は,今後の外洋生物地理学でけでなく,外洋生物学に対して強烈なインパクトを与えるだろうと思われる.
ラクトフェリン受容体の単離と栄養生理学的機能解析

ラクトフェリンは鉄結合性の糖タンパク質であり、好中球と腺上皮細胞で合成され、体内外に分泌される。ラクトフェリンは乳、唾液、涙、血液、消化管粘膜などに存在し、健康維持に関わる多機能性タンパク質として注目されている。特に、炎症性腸疾患がラクトフェリンにより軽減することから、腸管免疫機能発現におけるラクトフェリンの作用機構解明が望まれている。本研究では、腸に発現するラクトフェリン結合タンパク質の精製とそのcDNAを単離し、アミノ酸とcDNA配列を決定し、本タンパク質と炎症性腸疾患との関連性について解析を行った。マウス各組織タンパク質に対してリガンドブロッティングを行い、十二指腸、小腸、盲腸、大腸に分子量約500kDaのラクトフェリン結合タンパク質の存在を明らかにした。本タンパク質をアフィニティカラムによりマウス小腸から精製し、アミノ酸配列とcDNAの配列を決定し、ILBP(Intestinal Lactoferrin Binding Protein)と命名した。アミノ酸の一次構造解析より、ILBPはムチン(mucin)様タンパク質と類似したドメインを有し、特にIgGのFcγ領域と結合するタンパク質であるヒトFcγBP(Fc gamma binding protein)と高い相同性を示した。ILBPは非還元状態では500kDaであるが、還元状態では5つのタンパク質(55,60,65,70,120kDa)に解離されラクトフェリンとの結合力が失われた。この結果より、ILBPの分子間ジスルフィド結合による構造形成がラクトフェリンとの結合に必須であることが示された。また、ILBPは脱糖鎖したラクトフェリンも結合することを見出し、糖鎖を介さない結合であることを明らかにした。更に、ILBPの発現量は、デキストラン硫酸誘発腸炎マウスにおいて、腸炎の初期と回復期に増加した。この結果からILBPは粘膜を保護し、腸管免疫に関与することが示唆された。本研究によりムチン様タンパク質とラクトフェリンとの結合が初めて明らかになり、腸管免疫機能発現においてこれらタンパク質の分子間相互作用が重要な役割を果たすと考えられる。ラクトフェリンはトランスフェリンの一種で、鉄結合性糖タンパク質である。ヒトの母乳、特に初乳に高濃度に見られる。また、成人の涙や唾液、鼻の分泌液、精液などの消化や吸収、生殖に関係する分泌液にも多く含まれている。多くの研究がラクトフェリンの生理学的な役割に関して行われ、現在までに抗菌活性、抗ウイルス活性、抗酸化活性、免疫機能活性などが明らかになり、その栄養生理学的役割は大である。しかし、ラクトフェリンの代謝とその詳しい作用機構に関しては明確ではない。ラクトフェリンの受容体を明らかにする事はラクトフエリンの栄養生理学的な有用性をさらに高める事である。私たちは、最初にラクトフェリンに対するリガンドブロッティングを行いラクトフェリン結合タンパク質の組織分布を検討した結果、組織間で分布が異なっていることが明らかになった。更に、分子量の異なるラクトフェリン結合タンパク質が複数存在することが明らかになった。また、小腸では600、250kDaの位置にバンドが確認された。それらのラクトフェリン結合タンパク質をラクトフェリンのアフィニティーカラムを用いて精製した。ラクトフェリン結合タンパク質はNaCl濃度依存的に溶出され、分子量は600、250、150kDaであった。溶出したタンパク質をβ-MEで還元すると600kDaのバンドが消失し、120kDaのバンドが出現した。このことから、600kDaのタンパク質は120kDaを含む幾つかのタンパク質と複合体を形成していることが示唆された。精製したタンパク質の一次構造を明らかにするためにアミノ酸の配列を解析した。250kDaのタンパク質のアミノ酸配列を解析した結果、詳しい配列は現段階では公表できないが、ムチン(mucin)というタンパク質と相同性が高い新規のタンパク質であることが明らかになった。150、120kDaのタンパク質については現在解析している。以上のように、ラクトフェリン結合タンパク質は複数存在し、更に、組織間でも分布が異なっていることを明らかになった。これらの実験結果は、ラクトフェリン代謝は、従来予想されていたよりも非常に複雑で、同一組織であっても取り込み経路は複数存在し、組織により代謝様式が異なることを示唆するものである。現在、それぞれのアミノ酸の配列を解析し、遺伝子解析やクトフェリン結合能解析とin vitro, in vivoでの機能解析などの研究を計画している。

アミノ酸の一次構造解析より、ILBPはムチン(mucin)様タンパク質と類似したドメインを有し、特にIgGのFcγ領域と結合するタンパク質であるヒトFcγBP(Fc gamma binding protein)と高い相同性を示した。ILBPは非還元状態では500kDaであるが、還元状態では5つのタンパク質(55,60,65,70,120kDa)に解離されラクトフェリンとの結合力が失われた。この結果より、ILBPの分子間ジスルフィド結合による構造形成がラクトフェリンとの結合に必須であることが示された。また、ILBPは脱糖鎖したラクトフェリンも結合することを見出し、糖鎖を介さない結合であることを明らかにした。更に、ILBPの発現量は、デキストラン硫酸誘発腸炎マウスにおいて、腸炎の初期と回復期に増加した。この結果からILBPは粘膜を保護し、腸管免疫に関与することが示唆された。本研究によりムチン様タンパク質とラクトフェリンとの結合が初めて明らかになり、腸管免疫機能発現においてこれらタンパク質の分子間相互作用が重要な役割を果たすと考えられる。
ナノ粒子ER流体アクチュエータを用いた安全性の高いパワーアシストシステム

人を介護する際などにはそれほど速い動作を行わないため,慣性力の影響はほとんどなく,重力に起因する力をアシストすれば十分である.そこで,一部の自由度(関節)のみをアクチュエータで駆動し,残りの自由度はパッシブ型の二次元アームを開発した.最大トルク10NmのERアクチュエータおよび最大発生トルク30NmのMRアクチュエータを開発した.これらと上記(1)で開発したアームシステムを統合し,パワーアシストシステムを構築した.次に,これらを用いて基礎制御実験を行った.研究分担者の京都工芸繊維大学の田中克史助教授にナノ粒子ER流体を開発していただいた.また,研究分担者の大阪大学接合科学研究所の内藤牧男教授,阿部浩也助教授に,全く新規のナノ粒子ER流体である金属系のER流体の試作をしていただいた.酸化チタン,表面処理金属粒子,アパタイト等のナノ粒子を用いたER流体の検討を行い,高い電圧強度が必要ではあるが,一部でパワーアシストへの適応の可能性が見つかった.研究分担者の大阪大学機械工学専攻の田中敏嗣教授に基礎的検討をしていただいた.研究協力者の井上昭夫氏に微小ギャップ間における試験装置の開発をしていただいた.ER流体を用いたクラッチ原理型パワーアシストシステムの受動型リハビリシステムへの応用についても検討を行った.その結果,高い安全性を有するリハビリ支援システムが構成可能であることを確認した.ER流体の微小ギャップ間での使用を可能とする片側電極法についても検討を行った.ナノ粒子ER流体は,高電場を要求するため片側電極法の導入は有効であった.人を介護する際などにはそれほど速い動作を行わないため,慣性力の影響はほとんどなく,重力に起因する力をアシストすれば十分である.そこで,一部の自由度(関節)のみをアクチュエータで駆動し,残りの自由度はパッシブ型の二次元アームを開発した.最大トルク10NmのERアクチュエータおよび最大発生トルク30NmのMRアクチュエータを開発した.これらと上記(1)で開発したアームシステムを統合し,パワーアシストシステムを構築した.次に,これらを用いて基礎制御実験を行った.研究分担者の京都工芸繊維大学の田中克史助教授にナノ粒子ER流体を開発していただいた.また,研究分担者の大阪大学接合科学研究所の内藤牧男教授,阿部浩也助教授に,全く新規のナノ粒子ER流体である金属系のER流体の試作をしていただいた.酸化チタン,表面処理金属粒子,アパタイト等のナノ粒子を用いたER流体の検討を行い,高い電圧強度が必要ではあるが,一部でパワーアシストへの適応の可能性が見つかった.研究分担者の大阪大学機械工学専攻の田中敏嗣教授に基礎的検討をしていただいた.研究協力者の井上昭夫氏に微小ギャップ間における試験装置の開発をしていただいた.ER流体を用いたクラッチ原理型パワーアシストシステムの受動型リハビリシステムへの応用についても検討を行った.その結果,高い安全性を有するリハビリ支援システムが構成可能であることを確認した.ER流体の微小ギャップ間での使用を可能とする片側電極法についても検討を行った.ナノ粒子ER流体は,高電場を要求するため片側電極法の導入は有効であった.1、人間共存型ロボットの一つであるパワーアシストシステムの研究においては,安全性が最優先の課題であるにもかかわらず,その対策はほとんどなされていない.本研究の目的は次の通りである.(1)人間を抱え上げるのに必要な力を有するパワーアシストシステムの開発.(2)駆動アクチュエータとして,電場でそのレオロジー特性が制御できるナノ粒子ER流体を用いたコンパクトなERアクチュエータの開発.(3)上記のアクチュエータに適したナノ粒子ER流体の開発.2、本年度は下記の事を行った.(1)アームシステムの開発人を介護する際などにはそれほど速い動作を行わないため,慣性力の影響はほとんどなく,動力に起因する力をアシストすれば十分である.そこで,一部の自由度(関節)のみをアクチュエータで駆動し,残りの自由度はパッシブ型の二次元アームを開発した.(2)クラッチ型アクチュエータを用いたパワーアシストシステムの研究開発最大発生トルク10NmのERアクチュエータおよび最大発生トルク30NmのMRアクチュエータを開発した.これらと上記(1)で開発したアームシステムを統合し,パワーアシストシステムを構築した.次に,これらを用いて基礎制御実験を行った.(3)ナノ粒子ER流体の開発共同研究者の京都工芸繊維大学の田中克史助教授にナノ粒子ER流体を開発していただいた.また,共同研究者の大阪大学接合科学研究所の内藤牧男教授、阿部浩也助教授に,全く新規のナノ粒子ER流体である金属系のER流体の試作をしていただいた.(4)流体の基底年度について共同研究者の大阪大学機械工学専攻の田中敏嗣教授に基礎的検討をしていただいた.研究協力者の株式会社ERテックの井上昭夫氏に微小ギャップ間における試験装置の開発をして頂いた.ER流体とは電場でそのレオロジー特性が制御できる流体であり,その変化は可逆的でかつ高速であり,その力応答速度は数ミリ秒である.そこで,人間と共存して働くメカトロニクスシステムへの応用が期待されている.本研究では,ER流体を用いたクラッチおよびクラッチの入力駆動部からなるERアクチュエータを構成し,ERアクチュエータを用いてパワーアシストシステムを構成する.以下のように研究を進めた.(1)ER流体等のクラッチ原理を用いた安全性の高いパワーアシストシステムの研究開発を本年度は行なった.前年度に開発したパワーアシスト基礎実験システムを参考に,重量物を抱え上げるに必要な力伝達系,構造強度持つシステムを開発した.

次に安全な抱え上げ動作をアシストするための制御方式を確立し,制御実験を行なった.(2)さらに,ER流体を用いたクラッチ原理型パワーアシストシステムの受動型リハビリシステムへの応用についても検討を行なった.その結果,高い安全性を有するリハビリ支援システムが構成可能であることを確認した.(3)ER流体の微小ギャップ間での使用を可能とする片側電極法についても検討を行なった.ナノ粒子ER流体は,高電場を要求するため片側電極法の導入は有効である.(4)また,酸化チタン,表面処理金属粒子,アパタイト等のナノ粒子を用いたER流体の検討を行ない,高い電界強度が必要ではあるが,一部でパワーアシストへの適応の可能性が見つかった.