hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA複製装置による複製開始フィードバック制御の分子機構

染色体が正常に2倍化するには、染色体複製反応がただ1回だけ開始されるように制御される必要がある。大腸菌のAAA+ファミリー蛋白DnaAは、ATP結合に依存した染色体複製開始因子である。ATP-DnaAと染色体上の複製起点oriCとが高次複合体を形成すると、oriC二重鎖DNAの開裂、DnaBヘリカーゼのDNA上への装着など一連の複製反応が進行する。oriC上にはATP-DnaA特異的な結合配列が存在し、このATP-DnaA特異的なoriC開裂に寄与している。複製の進行に伴い、ATP-DnaAはRmA経路によって不活性なADP-DnaAとなる。これまでに研究代表者はRIDA構成因子2種を複合体として精製し、複合体形成とRIDA機能に直接関わる残基を同定している。さらに本年度は両蛋白質の結合比を算出した(JBC,2005)。次に、DnaAの機能構造解析に着手し、oriC開裂能と複製開始能を特異的に欠損した1アミノ酸置換DnaAを見いだした。この変異DnaAは、一方でDNA結合能、ATP/ADP結合能、RIDA感受性、DnaBローディング能、oriC上での高次複合体形成能を保持していた。フットプリント解析から、この変異DnaAはATPと結合しても、oriC上のATP-DnaA特異的な配列へ結合できないことが判明した。今回の変異残基はAAA+ファミリー間で高度に保存されており、オリゴマー形成の際、隣接サブユニットに結合したATPを認識するアルギニンフィンガーモチーフと予想されている。ゆえに、今回の変異残基は、元来、DnaAに結合したATPを認識し、DnaA・oriC複合体中のDnaAがoriC上のATP-DnaA特異的な配列へ結合できるような構造変化をもたらすことで、DnaA・oriC複合体の活性化に寄与するものと思われる(投稿中)。大腸菌の染色体複製はDnaA蛋白質によって開始される。その後、DNAポリメラーゼ(pol)IIIホロ酵素がDNA上にロードされ、新生鎖が合成される。当研究室はDnaAを標的とした複製制御経路としてRIDA(Regulatory inactivation of DnaA)を見いだしている。RIDAとは、DNA上にロードされたpolIIIβサブユニットとHda蛋白質とがDnaAを不活性化する機構のことである。最近、研究代表者らはβサブユニットとHdaとが安定な複合体として精製できることを見いだしている。この知見から、βサブユニットとHdaとの相互作用がRIDA機能に重要と予想されるが、未だ実証されていない。そこで本研究では、この仮説を機能構造解析の手法を用いて検証することにした。既に、βサブユニットのC末端とpolIIIα、δサブユニットとが相互作用することが知られている。α、δサブユニットならびにHdaの一次配列を比較すると、疎水性アミノ酸に富んだモチーフが見いだされた。ゆえにα、δサブユニットに加え、HdaもβサブユニットのC末端と相互作用する可能性がある。そこでβサブユニットのC末端領域に5種の1アミノ酸置換変異を導入した。これらの変異βサブユニットを試験管内1本鎖DNA複製系に加えると、いずれもβサブユニット活性を保持していた。一方、試験管内RIDA反応に加えると、うち3種の変異体はβサブユニット活性を欠損していた。次に、ヒスタジンタグ融合Hdaでプルダウンすると、RIDA活性を欠損していた3種の変異体のうち少なくとも2種の共沈量が低下していた。以上の結果から、βサブユニットのC末端領域がRIDA機能に重要であること、ならびにこの領域がHdaの結合にも直接関わっていることが示唆される。

ゆえに、今回の変異残基は、元来、DnaAに結合したATPを認識し、DnaA・oriC複合体中のDnaAがoriC上のATP-DnaA特異的な配列へ結合できるような構造変化をもたらすことで、DnaA・oriC複合体の活性化に寄与するものと思われる(投稿中)。
配位アシンメトリー：非対称配位圏設計と異方集積化が拓く新物質科学

本領域研究「配位アシンメトリー」は、配位化学分野において未開拓であった金属中心の非対称配位圏の設計・合成法と異方集積化法の基盤となる新しい学理を生み出すことを目指している。我が国はこれまで、世界の配位化学分野を牽引してきた実績を持つ。本領域研究では、我が国発の新たな物質創成科学「配位アシンメトリー」を拓き、次世代に繋げることに主眼を置く。そのためには、異分野交流と国際的ネットワーク形成を主軸とする国際活動を強力に遂行する必要がある。平成30年度は、前年度までに構築した国際活動支援体制の下に、次のような活動実績を挙げた。平成30年度は、国際融合バーチャルラボの設置とネットワーク構築を積極的に進め、複数班間および公募研究による高度な融合研究を推進するバーチャル研究組織として「融合バーチャルラボ」の設置を進めた(国内:「キラル発光ラボ」等5件、国際:「キラル@メタルラボ」等6件)。例えば、領域代表者の塩谷が主宰する「キラル@メタルラボ」は、海外5ヵ国10グループ、国内領域内外12グループ、および企業2社との共同研究を進めた。大学院生2名を共同研究とネットワーク構築のために海外ラボに約3ヶ月間派遣し、またドイツと中国の海外ラボからポスドク3名を招聘し、密な共同研究を開始し現在に至っている。さらに、国際アドバイザーや国際融合バーチャルラボのメンバーを含めた9名の海外研究者を招聘し、国際公開シンポジウムや二国間学術交流を行った。平成30年度は引き続き、配位アシンメトリーに関する国際共同研究、相互派遣、国際学会開催を推進し、本領域の普及化と国際活動のための支援体制強化を図った。具体的には、以下のような活動実績を挙げた。(1)国際融合バーチャルラボの設置とネットワーク構築:高度な融合研究を推進するバーチャル研究組織として「融合バーチャルラボ」の設置を進めた(国内:「キラル発光ラボ」等5件、国際:「キラル@メタルラボ」等6件)。現在までに、国内約300件、海外約100件の共同研究が進んでおり、すでに約100報の論文発表に至っている。(2)国際融合基礎・実習コースによる若手研究者の育成:本領域の国際アドバイザーや関連分野の海外研究者が講師を務め、配位アシンメトリーに関する実験・理論・計測の基盤・最先端技術や情報を若手研究者や大学院生に提供した(計10回)。また、大学院生2名を共同研究とネットワーク構築のために海外ラボに約3ヶ月間派遣し、またドイツと中国の海外ラボからポスドク3名を招聘し、密な共同研究を開始し現在に至っている。このように、国際的ネットワークの構築は、当初の計画以上に広く加速度的に進展していると判断する。今後の研究の推進方策は、以下のとおりである。(1)これまでに築き上げてきた国際共同研究や国際融合バーチャルラボのネットワーク内の研究交流、およびネットワーク間の融合を強力に推進するための支援を行う。第II期の公募研究者が国際ネットワークを最大限活用できるよう、国際活動の状況を速やかに周知する。(2)海外研究者による配位アシンメトリーに関する実験・理論・計測に関する国際融合基礎・実習コースをさらに強力に推進し、若手研究者や大学院生の育成を図る。(4)国際学会および国内学会の主催・共催・協賛を進め(例:第17回ホスト-ゲスト・超分子化学シンポジウム共催、第5回日本-台湾-シンガポール-香港合同会議共催等)、本領域の普及と国際共同研究の推進を図る。また、若手研究者の勉強会等に海外研究者を派遣し、若手の国際交流を促進する。本領域研究「配位アシンメトリー」は、配位化学を基盤として未開拓であった金属錯体における非対称配位圏の設計・合成法と異方集積化法を拓く新しい物質科学である。配位化学分野では、「集積型金属錯体」、「配位空間の化学」、「配位プログラミング」の領域研究を通して、我が国が世界を牽引してきた実績がある。本領域では、我が国発の新たな物質創成科学を拓き、次世代に繋げることに主眼を置き、我が国が本領域の世界の拠点となり先導し続けることを目標とするため、異分野交流と国際的ネットワーク形成を主軸とする国際活動を強力に遂行する必要がある。そのためには、初年度は領域全体として国際活動を支援する体制の構築に注力した。平成28年度は、領域代表と計画班班長を中心に、国際活動支援班の国際共同研究体制を構築した。本領域推進の軸の一つである配位化学分野では、これまで特定領域研究・新学術領域研究等において米・英・加・仏・独・中・韓との二国間会議を開催し、既に海外研究者との強力なネットワークを構築してきた。また、班員の国際学会の運営経験や、大学・研究機関や日本学術振興会の国際交流事業の実績も十分である。これらの人的基盤を十分に活用し、国際融合バーチャルラボや国際融合基礎・実習コースの立ち上げ、および国際ネットワークの構築と活性化のための準備を行った。さらに、本領域の趣旨、研究業績、進捗状況、国際的なイベントを英語版のウェブサイトにおいて公開し、平成29年度以降の国際活動を促進するために、国際会議および国際学術誌を活用した情報発信等に関する企画・準備を行った。1平成28年度は、代表の塩谷を班長とし計画班員を加えた15名で本支援班の体制を整えた。

国際共同研究、相互派遣、国際学会に関する委員会を設置し、国際融合バーチャルラボの設置、若手研究者の相互派遣、および国際融合基礎・実習コースを軸とした国際活動の支援と、本領域の国際的可視化の向上を図った。国際共同研究の拠点構築のために、海外研究者6名(ドイツ2名、米国、カナダ、英国、中国各1名)を評価メンバーとし、共同研究推進、領域の評価や助言を仰いだ。国際融合バーチャルラボを設置するために、班員や若手研究者を欧米等に派遣し、さらに海外のトップ研究者や若手研究者を招聘し、共同研究の計画および実施を行った。具体例の一つとして、A01塩谷は江原・唯と協力し、ドイツのマールブルク大とドルトムント工科大、英国のエジンバラ大、オランダのアムステルダム大、中国の華東師範大と「金属中心の動的不斉誘導」および「キラルナノ空間の機能化」に関する国際融合バーチャルラボを設置した。塩谷はこれら海外5大学を訪問し、連携研究者および大学院生(2)をドイツ2大学、英国1大学に派遣、ドイツ(2)と英国(1)から教授を、オランダから学生(1)を招聘した。塩谷と中国の教授との共著の総説が近々掲載され、ドイツ・中国との共著も作成中である。若手研究者の視野と専門性を広げ、国際ネットワークを構築するため、理論計算・合成・物性測定の原理と技術を学ぶ「国際融合基礎・実習コース」を6回開催した。配位アシンメトリーの普及を目的として、日本化学会年会特別企画で、本領域に関連セッションを設け、Chiral-at-metalの第一人者であるMeggers教授(マールブルク大学)および領域内外の研究者を招待し、本領域の普及に努めた。また、日本化学会の国際誌2誌を活用し、Coordination Asymmetryの特集の準備を行った。本領域研究「配位アシンメトリー」は、配位化学分野において未開拓であった金属錯体における非対称配位圏の設計・合成法と異方集積化法の基盤となる新しい学理を生み出すことを目指している。我が国はこれまで、「集積型金属錯体」「配位空間の化学」「配位プログラミング」の領域研究を通して、世界の配位化学分野を牽引してきた実績を持つ。本領域研究では、我が国発の新たな物質創成科学「配位アシンメトリー」を拓き、次世代に繋げることに主眼を置く。そのためには、異分野交流と国際的ネットワーク形成を主軸とする国際活動を強力に遂行する必要がある。平成29年度は、初年度に構築した国際活動支援体制の下に、次のように活動実績を挙げた。平成29年度は、領域代表とA01-A04代表者を中心に、国際共同研究体制を構築した。例えば、領域代表者の塩谷は、海外6ヵ国、領域内外、および企業と国際融合バーチャルラボを設置し、すでに若手研究者数名を共同研究の遂行のために3ヵ国に訪問・滞在させ、さらに国際アドバイザーや国際融合バーチャルラボのメンバーも含め約10名の海外研究者を招聘し、実質的な共同研究を若手研究者の派遣と招聘を介して推進した。一部の海外研究者は国際融合基礎・実習コースの講師も務めて、配位アシンメトリーに関する実験・理論・計測の基盤・最先端技術や情報を若手研究者や大学院生に提供した。また、日米合同シンポジウムと錯体化学会を融合させ、配位アシンメトリーの普及を図った。さらに、塩谷は本領域の国際アドバイザーとの共著で分子集積によるキラル空間の構築に関する総説を発表し、国際的に多くの注目を集めている。
硫酸転移酵素の生理機能と生体シグナルの変換・伝達

本研究では、生理機能の不明なオーファン硫酸転移酵素(SULT)のSULT4A1およびSULT7A1の生理機能解明と生体シグナルの変換・伝達への関与解明を目的に研究を行った。SULT4A1に関しては、ゼブラフィッシュ胚を用いた発生段階での遺伝子発現解析を行った結果、神経系の発生・発達において機能を担っていることを明らかにした。一方、SULT7A1に関しては、基質特異性を検討して、シクロペンテノン型のプロスタグランジン(PGA2や15d-PGJ2)の硫酸化を明らかにした。以上のことから、SULT4A1およびSULT7A1の生理機能と生体シグナルの変換・伝達への関与を明らかにすることが出来た。本研究においては、生理機能の不明なオーファン硫酸転移酵素(SULT)の生理機能の解明と生体シグナルの変換・伝達への関与を中心に研究を実施している。標的としては、オーファンSULTと位置づけられているSULT4A1およびSULT7A1に絞り込み、基質分子の予測、培養細胞における機能解析などを中心に研究を実施している。平成24年度は、SULT4A1の機能解明に向けた新たな糸口を得るため、ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウントin situハイブリダイゼーション法による発生段階での遺伝子発現解析を行った。受精後30時間以降でSULT4A1の発現が確認された。発生に伴う発現箇所の変化は無く、一貫して脳および脊髄を中心とした神経系組織において発現していた。モルフォリノアンチセンスオリゴによるSULT4A1ノックダウン実験で、胚発生に影響を来すことと合わせて、SULT4A1は、ゼブラフィッシュの胚発生において、中枢神経系特異的に発現し、神経伝達物質の濃度調節等、脳神経系の機能に重要な働きをしていることが考えられた。SULT7A1に関しては、これまでの研究で生体内における情報伝達分子であるα,βー不飽和カルボニル基をもつ生理活性脂質プロスタグラジン類を特異的に硫酸化するユニークな機能を持つことを見出している。平成24年度は、α,βー不飽和カルボニル基を有する化合物群がヒトの硫酸転移酵素によって広く硫酸化されるのではないかと考え、ナフトキノンをモデル基質として、その硫酸化を検討した。その結果、13種類のヒト硫酸転移酵素のうち、hSULT1A1、1A2、1B1、1C4、1E1の5種類のSULTsがナフトキノンに対して硫酸化活性を示した。これらの結果より、α,βー不飽和カルボニル基を有する化合物が広くヒトSULTにより硫酸化される可能性が示唆された。本研究においては、生理機能の不明なオーファン硫酸転移酵素(SULT)のSULT4A1およびSULT7A1に絞り込み、生理機能の解明を中心に研究を実施した。平成25年度は、SULT4A1の機能解明に向けた新たな糸口を得るため、ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウントin situハイブリダイゼーション法による発生段階での遺伝子発現解析を行った。その結果、SULT4A1は脳全体および脊髄において発現していることを確認することが出来た。また、ノックダウン実験において、前脳、中脳、後脳の形態的異常が観察された。受精後6時間胚においては、既に神経系分化の予定運命が決まっており、今回RT-PCRでSULT4A1の発現を確認したところ受精後3時間胚では発現していないが、6時間胚では発現していることが確認出来た。このことから、ノックダウン実験における形態的発達の異常は、SULT4A1遺伝子のノックダウンが大きく影響して起こったものであるということが示唆され、SULT4A1が神経系の発生・発達においてなんらかの機能を担っていることが考えられた。SULT7A1に関しては、平成25年度は、SULT7A1の基質特異性を詳しく調べたところ、PGE2やPGD2といったプロスタグランジンではなく、それらの代謝物であるシクロペンテノン型のプロスタグランジン(PGA2や15d-PGJ2)を硫酸化していることが明らかとなり、15d-PGJ2の硫酸体調製法の確立を行った。また、15d-PGJ2硫酸体の生理機能解明のため、免疫担当細胞である白血球T細胞やマクロファージの細胞株にプロスタグランジン硫酸体を作用させ、その影響を蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動により解析した。その結果、15d-PGJ2硫酸体は、免疫担当細胞に作用し、その免疫機能に何らかの影響を与えていることが明らかとなった。本研究においては、生理機能の不明なオーファン硫酸転移酵素(SULT)の生理機能の解明と生体シグナルの変換・伝達への関与を中心に研究を実施する。標的としては、オーファンSULTと位置づけられているSULT4A1およびSULT7A1に絞り込み、リコンビナント酵素の調製と生化学的な諸性質の検討、in situハイブリダイゼーションによる組織

特異的発現解析、X線結晶構造解析による構造解析とドッキングモデルからのシミュレーションによる基質分子の予測、培養細胞における機能解析などを中心に研究を実施している。SULT4A1に関しては、生体内(in vivo)で生理機能を担っていることを確かめるべく、ゼブラフィッシュを用いたモルフォリノアンチセンスオリゴ(MO)による遺伝子機能阻害実験(ノックダウン)実験を行った。その結果、受精後26時間後のゼブラフィッシュの胚(26hpfモルファント)において前脳、中脳、後脳の形態的異常がみられた。また、マウス脳total RNAを用いたRT-PCRにより硫酸転移酵素の発現を網羅的に確認した。SULT4A1は脳に特異的に発現しており、ラットにおいて前脳、中脳、後脳でのSULT4A1の存在が確認されていることから、マウス脳においてもSULT4A1が機能していることが示唆された。SULT7A1に関しては、これまでの研究で生体内における情報伝達分子である生理活性脂質プロスタグランジン類を特異的に硫酸化するユニークな機能を持つことを見出している。また、この酵素は、小腸上皮細胞に特異的に発現することが、これまでの研究から明らかとなった。現在、組換えSULT7A1を用いてプロスタグランジンを硫酸化し、その生成物の化学構造について、質量分析装置を用いて同定中である。生理機能の不明なオーファン硫酸転移酵素(SULT)の生理機能の解明が平成23年度結果より更に進展したため。生理機能の不明なオーファン硫酸転移酵素(SULT)の生理機能の解明が一部達成されたため。SULT4A1は、哺乳動物から魚類まで幅広い生物種で発現が確認されている。マウスSULT4A1の生理機能解明に関して、in vivo遺伝子機能阻害試験を行ったゼブラフィッシュをモデルとして、受精から10日までの期間における胎児期から稚魚期において行動学的な観点から解析を進める。また、ノックダウン個体のプロテオーム解析を実施し、タンパク質発現レベルでの影響から、SULT4A1の生理機能解明につながる知見を見出す。マウスSULT7A1の機能解明に関しては、細胞レベルで解析するために、種々の培養細胞にてSULT7A1を強発現しその影響を検討する。細胞としては、プロスタグランジン産生細胞やプロスタグランジンの標的となる細胞由来の細胞株を用いる。解析には、培養細胞にリポフェクション法で哺乳動物発現用ベクターにサブクローニングしたSULT7A1を導入し、硫酸フリーの培地でプレ培養後[35S]-放射活性硫酸でラベルし、培地中に放出された硫酸化された化合物の解析を行う。また、23および24年度の実験で調製されたプロスタグランジン硫酸体の生理機能解明に関しては、プロスタグランジンの標的細胞由来の細胞株に作用させ、その影響を蛍光ディファレンシャルに次元電気泳動を基盤にしたプロテオーム解析によりタンパク質を網羅的に解析することで検討する。種々のプロスタグランジンおよびその硫酸体、さらにその他の生体制御分子およびその硫酸体の影響を生体シグナルの変換・伝達に関連して同様に調べて比較解析する。
成熟時代における都市圏構造の再編とリバブル・シティの空間構造に関する地理学的研究

平成1617年度の2年間における本研究課題では、リバブル・シティとしての評価が高いカナダ・バンクーバーとオーストラリア・メルボルンにおける公共交通網を基軸とした都市圈整備に関する現地調査を実施し、わが国における都市圈整備の方向性を検討することを目的とした。その研究成果の概要は、次の通りである。1.バンクーバー都市圈では、1970年代からの取り組みをベースにしたGVRDによる"Livable RegionStrategic Plan"を基に、公共交通網の再整備と結びついたコンパタトで高密度な街づくりが郊外タウンセンターで実践され、利便性の高い日常生活拠点として整備されている。2.メルボルン都市圈では、1990年代から取り組んできた市街地拡教化防止のための土地利用規制に加えて、2002年に第定されだMelbourne 2030"による持続可能な都市圈整備の取り組みがスタートし、郊外のディストリクト・センターを中心に公共交通でもアクセズ可能で、多様な機能集積による利便性の高い中心地形成が進められている。3.これらの両都市圈での詳細な土地利用調査や公共交通網整備の状況などから、21世紀の持続可能な都市整備方針としてのリバブル・シティの特性の一端を明らかにすることができた。4.わが国でのリバブル・シティ形成の可能性は、東京、大阪など公共交通網の発達した大都市部では高い実現性を有するが、反面、過密な人口密度などによる弊害をどのように緩和するか等の新たな課題が生じる。地方都市部では、低い人口密度とモータリゼーションにより、持続可能な市街地整備の必要性が一層高まっているが、その状況はむしろ悪化しつつある。高齢化の進展などに対応したバリアフリー化などの視点からの再整備が有効であると考えられる。本年度の本研究の目的は、リバブル・シティとしての評価が高いオーストラリア・メルボルンにおける公共交通網を基軸とした都市圏整備に関する現地調査を実施することにあった。具体的な研究は以下のように実施された。1.各研究者によるメルボルンでの研究分担の確認とリバブル・シティ及びメルボルンに関する文献・資料などの共有化を行い、メルボルンでの現地調査での課題を明らかにした。2,山下、藤井、伊藤は11月に現地調査を実施した。ここでは事前にアポイントメントをとったビクトリア州政府、メルボルン市、ムーニーバーレー市などでの聞き取り調査と資料収集、及び都市圏内各地の視察を行った。香川は12月に現地調査を実施し、メルボルン都市圏における住宅価格変動に関する資料収集及び高級住宅地における近年の住宅地変化に関する実地調査を行った。3.現地調査の結果、メルボルン都市圏における持続可能な地域への再編策として、州政府が『メルボルン2030』プランを実施しているが、その中でも都市圏各地の核となるアクティビティ・センターの整備が重要視されていた。これは、都心及び郊外核を多機能でコンパクトかつ高密度な市街地に再整備し、それらを公共交通網の中に位置づけ、ネットワーク化することで21世紀の社会経済環境下に対応しうる持続可能性の高い都市圏に再編しようとするものである。その手法として、メルボルン都市圏には旧来より発達していたトラム、郊外電車及びバスなどの公共交通網が、近年のモータリゼーションの進展によって低下傾向にある利用率に歯止めをかけ、また無秩序な郊外開発を規制することで公共交通網を基軸とした地域を実現できるとしている。4.メルボルンでの取り組みは、公共交通網の発達したわが国大都市圏でも適応可能な手法として大いに参考となることが確認された。また、メルボルンでの研究成果は3月の日本地理学会春季学術大会で報告された。1.研究の目的本年度の本研究の目的は、昨年度調査したオーストラリア・メルボルンと並びリバブル・シティとして評価の高いカナダ・バンクーバーにおける公共交通網の再整備と、それに伴う都市圏の市街地整備に関する現地調査を実施し、昨年度の事例と併せてわが国における都市圏整備の方向性を明らかにすることであった。

2.本年度の研究成果本年度の研究の主な課題であるバンクーバー都市圏の調査は、89月に山下、香川、藤井の3名が実施した。山下は都心と主要な郊外タウンセンターの土地利用調査及び市役所、図書館等でのコミュニティ・プランなどの行政関係資料の収集を行った。香川は郊外住宅地の詳細な視察とサレー市での住宅とショッピングセンター開発の動向などについて調査した。藤井は都心と郊外タウンセンターの機能分担、公共交通との結びつきの状況などを丹念に調査し、その調査結果をメルボルンと比較・検討した。また、研究協力者のブリティッシュ・コロンビア大学のD.W.Edgington助教授とは現地で2度のミーティングを行い、バンクーバー都市圏の開発に関する現状についてのアドバイスを受けた。また、山下、伊藤、藤井は12月にブリスベンで開催されたオーストラリア都布会議に参加し、研究協力者のメルボルン大学のK.O'Connor教授よりメルボルン都市圏整備の現状や特徴について助言を受けると共に、都市研究者との情報交換を行った。その後、メルボルンに移動し、前年度に継続して郊外のアクティビティ・センターの視察とMoonee PondsとGlen Waverleyで土地利用調査を実施した。
バイオポリマーの合成増強を目指したモノマー供給酵素の進化工学

アセトアセチルCoAレダクターゼ(PhaB)は、アセトアセチルCoAとNADPHの2基質から3-ヒドロキシブチリルCoAを生成する酵素であり、ポリヒドロキシブタン酸の生合成系におけるモノマー供給酵素である。本研究では、進化工学的手法によりPhaBの高活性変異体を2つ取得した。本変異体は最大で野生型酵素の約3倍の活性を示し、コリネ菌を宿主としたポリヒドロキシブタン酸の合成に適応したところ、最大で3倍程度の生産性の向上が見られた。アセトアセチル-CoAレダクターゼ(PhaB)は、アセトアセチル-CoA(AcAc-CoA)とNADPHの2基質から3-ヒドロキシブチリル-CoAを生成するモノマー供給酵素である。我々は、代表的なポリヒドロキシアルカン酸(PHA)生産菌であるRalstonia eutropha由来のPhaBに対して進化工学的手法を用いることで、2種類のPhaB高活性変異体(Q47L、T173S)を取得することに成功した。これまでに得られた高活性変異体のQ47、T173に対し、アミノ酸置換を施し酵素活性に与える影響を調べた。Q47の網羅的アミノ酸置換では、すでに取得したQ47Lが最も高い活性値を示した。また、T173の場合でも、取得したT173Sと、もう一つT173Aが高活性値を示した。取得変異体は、最適化されていたことが分かった。取得変異体の高活性化を理解するために動力学的性質を調べた。いずれもkcat値の向上がみられ、高活性化に寄与していた。一方、kcat/Km値からは、Q47LはNADPHに対する、T173SはAcAc-CoAに対する親和性が向上し、傾向が異なっていことが示された。我々の共同研究グループによるPhaBの構造解析に関する研究でも、これらの関係が裏付けられる結果が得られた。バイオポリマーの生産性向上に関する酵素レベルの研究では、PHA重合酵素に関する報告が圧倒的に多く、モノマー供給に着目した研究は僅かである。今回我々はPhaB高活性変異体が、ポリマー生産性の向上に寄与することを示すことができた。PHA研究は応用性が求められレベルまで発展しており、生産プラットフォームとして微生物から植物へのシフトが望まれているが、まだまだ生産性が低いことが課題である。今回得られた情報を元に更なる高活性化PhaBの取得が可能となれば、これらの領域において更なる発展に寄与するものと思われる。当該年度に実施した研究は、1)エラープローンPCRを用いて作成した変異体ライブラリーからのハイスループットスクリーニングによる変異体PhaBの取得, 2)Q47、およびT173の変異部位に対するアミノ酸置換, 3)取得された変異型PhaBの酵素学的性質、およびポリマー合成, 4)取得PhaB変異体をコリネ菌に組み込むことにより合成されるポリマー分析の項目に対して研究を行った。1)に関しては、残念ながら現在のところ先行実験で得られたQ47L、T173S以外は得られていない。2)PhaBの優良変異部位であるQ47、T173に対して、それぞれ全種のアミノ酸置換を施し、これら変異体の酵素活性とポリマー蓄積量に与える影響を調べた。Q47、T173の何れにおいても、スクリーニングで取得されたQ47L、T173Sが最も高い活性を示した。膨大なクローン数(推定100,000個)に対するスクリーニングの段階で、かなりの程度最適化されているものと考えられる。3)Q47L、T173Sの活性の向上は、分子活性、基質(アセトアセチル-CoA、NADPH)に対する結合性のどれに起因するかを明らかにするために速度論解析を行った。何れの変異体も野生型と比べて、kcat値が向上しており、分子活性の向上が活性上昇の主な要因として考えられる。また、T173Sにおいては、アセトアセチル-CoAに対するkcat/Kmが向上しており、アセトアセチル-CoAの親和性も向上していた。4)高活性PhaBであるQ47LおよびT173Sをバイオポリマー生産菌として有望であるコリネ菌に導入し、ポリマー蓄積に与える効果を調べた。その結果、両変異体を用いることで野生型と比べて2倍のポリマー蓄積が見られた。したがって、高活性化PhaBは、多様なプラットフォームへ応用可能であり、ポリマーの生産性の向上に寄与することが明らかとなった。当該年度は、研究実施計画に基づき、計画通りに各研究項目を実施しており、概ね達成している。本研究課題の大きなヤマは、変異体の取得である。しかし幸運なことに、先行実験において、Q47LおよびT173Sが得られていた。これら高活性化PhaBを調査したところ、ポリマー蓄積においても、酵素活性においても良好な結果が得られた。現在の課題は、新たな変異体の取得である。そして更なるPhaB高活性化とそれに伴い期待されるポリマー蓄積率の向上である。1)さらなるPhaBの系統的

進化工学残念ながら、新たな高活性化PhaBの取得は難航している。したがって、現在得られているQ47LおよびT173Sを鋳型として、再びエラープローンPCRによる変異体ライブラリーを作成し、サンプルの母集団を増やすことで更なる高活性化PhaBの取得を目指す。また、研究テーマを共有する他の研究グループが、野生型PhaBのX線結晶構造解析を進めており、Q47L、T173Sに関しても随時実施する予定である。提供される情報をフィードバックし、ランダム変異導入以外の変異導入の指針としたいと考えている。2)さらなる進化酵素のポリマー合成への利活用変異型PhaBの活性に対する3HBベースポリマーの3HB分率に与える影響を評価するために、これまで得られた変異型PhaBを、P(HB-co-HA)およびP(HB-co-LA)合成する大腸菌モデル系に導入し、HB分率の拡大幅を調べる。これまでのところP(HB-co-HA)の3HB分率は、進化型重合酵素によって、14%から70%の幅で得られている。高活性化PhaBを用いてさらなる3HB分率の上昇を目指す。一方、P(HB-co-LA)は、LA分率の向上が望ましく、3HBの供給を抑えたい。よって、低活性化PhaBを用いてLA分率の向上を目指す。そして、得られたポリマーに対して分子量を測定する。申請者の所属研究室は、本研究の遂行に必要な遺伝子工学実験設備、微生物培養装置、酵素タンパク質の精製装置があり、使用可能な状態であった。そこで申請者の23年度の研究費の大部分は、設備備品費にではなく、消耗品に充てることができ、想定以上に本年度の物品費を抑えることができた。しかし、申請者が使用する装置の中には、経年劣化のためか使用不可なものが生じた(例、クロマトグラフィーのカラム、電気泳動槽や振盪器など)。したがって23年度の未使用額は、24年度においてはこれら装置に充てようと考えている。
変角光学的要因に基づく「本物らしさ」の質感知覚の解明

日本視覚学会、Computational Color Imaging Workshop 2019などの各種の関連学会、研究会、セミナー等に参加し、関連分野の多くの研究者と議論を繰り返すことにより、当初の研究計画を更に練り直した。実験に関しては、昨年度から装置の試作と予備実験を繰り返している。昨年度は、電動ゴニオメータの移動速度が当初の見込みより遅かったため、その速度でも可能な実験方法を模索した結果、計画を前倒しして今年度に購入予定であった回転ステージを購入した。今年度は、この構成での新たな装置の試作と予備実験を行っていた。しかし、この電動ゴニオメータを駆動するためのミドルウェアに多数の不具合が見つかり、仕様書通りの駆動ができなかったため、この問題を回避するための方法を模索するうちに長期の試行錯誤が必要となった。例えば、回転ステージの駆動のために与えるパラメータの単位が不明であったり、正常なパラメータ値を与えても不正値として拒否される、原点復帰を指示しても、原点において停止せず何周しても停止しない、など多数の不具合が見つかった。これと並行して、昨年度購入した電動ゴニオメータにおいても、機体表面に表記されたゼロ点と実際の水平点が異なる、水平点からの駆動範囲が仕様上の数値を満たさず、方向による移動範囲が非対称であるなど、多数の不具合が見つかった上、試運転を繰り返すうちににモータから異音が生じ、動作の制御が不安定になった。このため、現在、メーカにモータと制御装置を送り返して修理を依頼しているところである。この修理を待っている間に、電動ゴニオメータでの実験と同時に行う予定の、被験者が自らの手で試料を傾けて行う実験のための装置も作成中であり、こちらはほぼ完成している。装置の不具合のため。装置の修理ができ次第、実験を開始する。日本視覚学会、日本色彩学会、日本眼光学学会、視覚科学コンソーシアム、産業技術総合研究所人間情報シンポジウム、千葉大学色覚と質感セミナー、国際心理物理学会、環太平洋国際照明学会、などの各種の関連学会、研究会、セミナー等に参加し、関連分野の多くの研究者と議論を繰り返すことにより、当初の研究計画を更に練り直した。また、自然科学研究機構生理学研究所主催の生理科学実験技術トレーニングコースに参加することにより、新たな研究手法を習得し、本研究の新たな方向への発展について検討した。実験に関しては、当初の研究実施計画に基いて、電動3軸ゴニオメータのみを入手して実験装置を試作し、予備実験を行おうと試みた。特殊印刷加工の見本品を多数入手し、これを試料として用いた。しかし、電動3軸ゴニオメータの移動速度が当初の見込みより遅く、この速度で効果的な実験を行う方法を模索していたところ、予想外の時間がかかることとなった。予備実験を繰り返してプログラムの改良を進めたが、当初の装置構成だけでは十分な実験が行えない可能性が高いと判断するに至った。そのため、計画を前倒しして、翌年度に購入予定であった回転ステージを入手することとした。現在、これらを組み合わせた実験をするため、装置の改良、プログラミングを進めているところである。この計画変更に伴い、手の動き、頭部運動を検出するセンサーの導入は、次年度に先延ばしにすることとした。当初予定していた装置構成では不十分であることが予備実験を通して判明し、計画を前倒しして装置の改良中であるため。装置の不具合のため。改良中の装置を早急に完成して予備実験、本実験を行う。研究計画の遅れに伴い、外部分担者の予算執行も遅れたため、当該助成金が生じた。翌年度は、遅れを取り戻して、当初の計画通りに執行する。装置の不具合により本実験開始が遅れているため。装置の修理が完了次第、早急に本実験を開始する。
ヌクレオチド結晶構造転移の結晶相反応への応用

一連のヌクレオチド結晶において、水蒸気圧に依存した構造転移現象を見いだし、有機結晶の動的性格の解析、有機結晶相における反応制御の検討を目的とし解析を進めている。平成7年度においては、既に結晶構造転移が引き起こされることを確認しているヌクレオチド結晶について、構造転移に伴い結晶構造にもたらされる変化の解析を進めるとともに、新たに、デオキシヌクレオチドの系について、結晶構造転移の解析に着手した。デオキシアデノシン5'-モノフォスフェイト(dAMP)のナトリウム塩結晶(風乾状態で6水和物)およびデオキシシチジン5'-モノフォスフェイト(dCMP)のナトリウム塩結晶(風乾状態で7水和物)について、相対湿度070%領域で、粉末X線回折法により構造変化の追跡を行った。Na_2dAMPでは、同湿度領域で可逆的結晶構造転移が起ることが確認された。一方、Na_2dCMPでは、回折強度に変化がみられることから結晶水数は変化しているとみられるが、格子定数は変化しないことが明らかになった。今後、重量測定により結晶水数の変化を明らかにするとともに、両結晶の動的性格の差違について、結晶構造に基づき、解析を進めることをことを予定している。ヌクレオチドの塩基部分は、紫外光照射により固相で光反応を起こすことが知られている。結晶相で光二量化反応が起こると期待されるチミン-水和物の結晶化を行い、現在、これを用いて単結晶状態での光反応の条件検討を進めている。今後、水蒸気圧制御により結晶構造に変調を与え、固相内光反応制御を試みるとともに、X線回折法等を用い、反応追跡を行うことを計画している。
超精細断層像で生体内部の微細構造を詳細に観察する次世代型MRI技術の開発

高速フーリエ変換(FFT)に比べ大幅な精度向上が見込まれるNon-Harmonic Analysis(NHA)を医用断層撮影装置であるMRIへ応用し、1.5テスラMRIで可視化が困難な700μm以下の体内深層の微細構造を観察できる超精細技術の開発を目的に研究を行った。本研究では、MRI計測データをNHAで高精度解析することで、従来の分解能よりも微細な空間に存在する物体をNHAで可視化できるか、コンピュータシミュレーションを用いて基礎的な検討を行った。平成30年度では、小動物用MRI(MRmini SA:小動物用1.5テスラMRI、DSファーマバイオメディカル)を用いて、複数の条件下で物理ファントムの撮像を行った。シミュレーション実験では、従来のMRI画像の1ピクセル以下の空間である375×375[μm]の範囲に、微細構造を想定した複数の物体を配置し、物理ファントムを撮像した際の装置パラメータを基に、ノイズの無い理想環境を想定したMRI計測データをコンピュータ上で作成した。作成したMRI計測データを従来法とNHAで解析し再構成したMRI画像の分解能を評価した。実験結果より、従来法によるMRI画像は、375μm以下の微小空間において分解能が不足し、複数の物体を分離できず1つの物体として可視化された。一方、NHAによるMRI画像では、サイドローブが大幅に抑制されたため、約50μmの距離に配置した複数の物体が分離できており、従来法に比べ高精細に微小空間を可視化できる可能性を示した。装置パラメータや従来のMRI画像の分解能と物体位置に関してのデータ収集のため、1.5テスラMRIを用いた複数条件下での撮像が予定通り進んでいる。また、シミュレーション実験により、極小領域に複数の物体が存在する際のサイドローブの干渉や物体同士の分離性を評価し、従来のMRI画像の1ピクセル以下の空間をNHAで可視化できる可能性についての検証も予定通り進んでいる。撮像した計測データに対し、NHAによるMRI画像化を順次行っている。微小空間をより鮮明に画像化できる共焦点顕微鏡を用いた撮像も行っており、NHAによるMRI画像と共焦点顕微鏡による画像を比較し、従来のMRI画像よりも詳細な情報が可視化されているか検証する予定である。引き続きMRI撮像を行い、生体情報における微小空間の可視化に関して検討する。また、撮像時に混入するノイズモデルの見積もり等を基に、NHAを利用する際のパラメータや計測データ数等の環境条件を設計し、より高品質なMRI画像を提供できる技術の確立を目指す。
水稲根面におけるビビアナイトの生成条件解明

水田作土は田植後、湛水されると次第に還元状態となり、この還元状態で作土のリン酸イオンの一部は第1鉄塩のビビアナイトとして結晶化した。そして、ビビアナイトを加熱すると、希酸への溶解性が低下する性質を利用して、その含量を推定する方法を開発した。このビビアナイトの生成量はグライ低地土や灰色程度などの低地土壌グループで多く、黒ボク土では少ない傾向であった。また、作土が酸化状態になる中干し期および収穫期の落水により作土のビビアナイト含量は低下した。ビビアナイトが水稲根面に生成するための(1)土壌条件、(2)リンレベルなどの施肥条件、(3)生育段階などの栽培条件について検討した。川渡フィールドセンター4号水田(非アロフェン質黒ボク土作土,「川渡」)、栗原市鶯沢袋(グライ低地土水田作土2007年春採取「袋」)、大崎市原嶋(グライ低地土水田作土、「原嶋」)の風乾土(<5mm)500gを500mL容ガラストールビーカーに入れ、0.3gN,0.3gP_2O_5,0.3gK_2Oをそれぞれ被覆尿素(70日型)、過リン酸石灰(乳鉢粉砕)、被覆硫加(70日型)として混合し、ひとめぼれ苗をポット当たり1本移植した。各土壌についてリン無施肥区を設定した。根を風乾後、1M塩酸可溶画分のP,Fe含量等を測定し,根周辺の鉄化合物を光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡で観察した。根の1M塩酸可溶P含量は採取時期により変化し,かつ,「川渡」の水稲根は「袋」「原嶋」の1/2以下と少なかった。根の1M塩酸可溶Fe含量も「川渡」で他より少ない傾向であった。「袋」では保存中の易分解性有機物減耗のためか初期の還元が遅れ,水稲根の同Fe含量も初期に少なかった。ビビアナイトの晶出は「原嶋」,「袋」で認められ、「川渡」では外見上認められなかった。「川渡」では活性Al含量が多くリン酸イオン濃度がビビアナイト晶出に達しない、Al,腐植の作る団粒等により還元進行が不均一である,などが考えられる。リン無施肥区において、稲の茎数が少なかったが、「原嶋」「袋」ではビビアナイトの晶出が認められた。また、生育段階に関して、大部分が若い根からなる7月初旬ではビビアナイトがほとんど認められなかったが、8月初旬になると「袋」「原嶋」では鉄プラークのほとんどない根にビビアナイトが認められた。水田に施与される有機質資材の例として、東北大学川渡フィールドセンター産のコンポストを水田作土に加えて、湛水保温したときの可給態リン含量の変化とビビアナイトの晶出の有無を検討した。コンポスト中にはCaH_2PO_4・2H_2OやMgNH_4PO_4・6H_2Oなどのリン酸塩の存在が論議されている。これらのリン酸塩は希酸可溶だが、中性付近での水溶性はやや低い。1.今回用いたコンポストは湛水保温後も粒子として砂画分(>0.05mm)に認められた。その中含まれる無機リンの8割程度は湛水保温期間中に、コンポストから溶出し、水稲のリン源として有望である。2.コンポストを添加して湛水保温した土壌のブレイリン(第2準法)、希酸可溶リンは、風乾細土に比べて大きく増加し、かつ、コンポストの添加量にほぼ応じて増加した。3.湛水保温後のバルク土壌の砂(>0.05mm)画分にはビビアナイトの結晶が、実体顕微鏡および、走査電子顕微鏡およびエネルギー分散型X線分析で容易に認められた。4.コンポスト中のリン成分として、CaH_2PO_4・2H_2OやMgNH_4PO_4・6H_2Oの可能性を否定できないが、明確な結晶としては観察されず、P,Ca,Mg等の集合体のように見られた。還元土壌中でコンポスト中からリンが溶出してビビアナイトが晶出したということは、この還元条件下で、ビビアナイトはコンポスト中のリン酸塩より溶解性が低いことを示唆する。湛水保温中でコンポスト中に残存するリン成分として有機態が考えられた。これまで,ポット栽培稲でビビアナイトの結晶生成を確認してきたが,実際の稲栽培の現場である普通の水田で検討する必要がある。そこで,管理状況の明らかな宮城県古川農業試験場の水田で栽培した水稲根を採取し,ビビアナイトの晶出状況を検討した。同試験場水田(灰色低地土、造成)作土株間からガバトボックスを使い、約7x12cm深さ約8cmの土壌試料を採取した。その土塊を2 mmの篩の上でシャワーヘッドを使い、水稲根を洗い出し、風乾した。

その水稲根から実体顕微鏡で青色の結晶を探し、同結晶の同定を試みた。さらに,105°Cで48時間加熱した水稲根と未加熱のものに0.1M塩酸-1M酢酸混合液20mLを加え、時々振り混ぜながら5時間室温に放置し、濾液のリン濃度を測定した。加熱によるリン濃度の低下分から根のビビアナイト含量を推定した。7月30日と8月28日に採取した水稲根には実体顕微鏡で青色結晶が容易に認められた。走査電子顕微鏡観察ではその結晶は板状の微細結晶の集合体で、エネルギー分散型X線分析によれば、鉄とリンが約3:2の組成を持ち、ごくわずかのCaとMnを含んでいた。結晶は根の表面内部から土壌側へ晶出しつつあるように見られた。微小部X線回折図はビビアナイトに関する既報と一致した。また、これらの試料のビビアナイト含量は4.19.0 g P2O5 kg-1(全リン含量の2427%)と推定された。以上の結果はポット栽培稲とほとんど同様であり、通常の水田でもビビアナイト生成が確認された。これに対して,11月6日にはビビアナイトがほとんど認められず、落水後酸化が進むにつれてFe2+の活動度が下がり、Lindsay (1980)の推測のように溶解消失すると考えられた。ビビアナイトが生成しうる土壌の種類、施肥の影響、水管理の影響、時期による変化などが明らかになり、さらに、バルクの土壌中でも生成しうること、その粗粒画分については定量法も開発されつつある。また、各種資材の添加効果についても解明されつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。ビビアナイトの水稲に対する有効度合い、リン富化土壌からのリン回収などに検討を進める。
環境法における団体の法的地位と環境訴訟

1.環境権論、環境権の立法規定、環境(権)訴訟の現状を検討した。環境権規定については、自治体の環境条例が環境権規定を導入したところが出始めている。環境権訴訟は認められていないが、最近、環境訴訟を広く認めようとする傾向が散見される。2.環境権を実定法上確立するか、新たな環境訴訟を導入することが必要と考えられるが、環境(権)訴訟の主体と想定される環境NPOの実態を知るために、マクロな把握として、全国の環境GO・NPOの概況を、02年および04に調査した。増加傾向にあるが、法人格取得団体は少数である。会員数は100人以内で過半数を占めるなど小規模であり、財政の不足とスタッフの不足などが課題とされている。4.都市化と自然地域が混在する埼玉県143団体、自然が多い長野県97団体についてアンケート用紙を郵送し、回答を得た。前記調査から、環境行政の参加やパートナーシップの例が増えつつあるものの、行政に対する不満はかなり高い割合を示している。環境団体の参加の強化と環境訴訟の必要性を示唆しているが、現実には、埼玉県、長野県調査では、環境訴訟への関与は6団体(当事者1、証人1、支援3、原告団への所属1)で少数にとどまっている。5.比較の材料としてフランス環境法の推移を調査した。フランスでは、すでに環境団体訴訟が存在しているが、近年、環境権が環境法典に規定され(110-2条)、環境法の原則として、予防原則、汚染者負担原則、防止原則、参加原則(情報への参加と意思決定への参加)などが宣言され(110-1条)、さらに憲法的規定として環境憲章案が成立している。本年度の研究は、研究協力者との共同研究を含め、三つの分野にわたった。第1は、NPOの実態に関する調査である。調査は、2002年夏に実施し、各種の資料に基づき、NPO全体(資料として、内閣府資料平成14年7月現在までの調査、旧・経済企画庁「市民活動団体基本調査報告書」-平成9年-、シーズ調査-平成11年末までの調査)、および環境NPO・環境NGO(平成13年環境白書、環境NGO総覧-平成10年版、平成13年版)について、その実態を把握するよう努めた。また、東京都の環境NPO・NGOにについても実態を把握するよう努めた(東京都市民活動推進課「市民活動団体基礎調査報告書」-2002年6月)。これらの実態調査は、報告書「NPOについて」としてまとめている(研究協力者・村田正樹-立教大学法学研究科前期課程1年次の協力による)。第2は、環境NPO・環境NGOの現地における実態である。本年度は、公害被害者が組織したNPOを水俣において実態調査をした。今後、現地における実態調査を続けたい。第3は、外国法における団体の法的位置づけである。この点については、ドイツ法の状況が紹介されつつある(大久保規子氏などの研究)が、フランス法の状況はあまり明確でないので、現在、研究を続けている。また、現地において実態を調べる予定である。(1)本研究にとって、環境権の憲法・法律への立法規定化、あるいは訴訟および参加のあり方の制度化は、基本的に前提となる重要なテーマである。(1)フランス法については、昨年度から本年度にかけて、環境権の憲法規定化を図ろうとする「環境憲章」制定の動きがあるので、その立法動向を研究した。フランスでは、環境団体の参加の権利と訴える権利は、1976年以来承認され、拡大されてきた。環境憲章は、環境権を憲法規範化し、具体的な原則をあげることによって、環境政策をさらに拡大、発展させようとするものであり、環境団体の法的地位にも影響を与えるものと推測される。

また、参加のシステムとして、1995年、デバ・ピュブリック(公共討論)の制度がバルニエ法によって設けられたが、2002年にこれが国の独立の機関として管轄と権限を強化された。この制度は、環境紛争と訴訟がしばしば提起される公共事業に関わる情報の提供と討論を通じての参加の制度であり、環境法における団体の地位に深く関係している。制度の概要を調べた。(2)日本法については、環境訴訟に深く関係する訴訟形態の一つである行政訴訟の制度改革が進行中であったため、その制度化の動向を注視したが、環境(権)訴訟を実現する制度改革とならない改正案となっており、環境権・環境訴訟の必要性と団体の訴える権利の承認の必要性は変わっていない。(2)環境紛争において団体がどのような法的な地位を与えられるべきかの問題の舞台となる場は、裁判のみならずADRも重要である。公害環境紛争の処理に関わる訴訟と公害紛争処理制度の研究を行った。(3)環境NPOの動向を研究協力者の協力を得て調査し、概要をまとめた。本年度は、次のような研究を実施した。1.マクロな把握として、全国の環境NGO・NPOの概況を調査した。これは、02年度に実施した同様の調査から2年後の現況を調べるためのものである。なお、調査は、前回と同様、環境事業団『環境NGO総覧』、環境省『環境白書』、内閣府によるNPO法人格取得状況を中心に用いた。2.インテンシブな調査として、地域を限定して、環境事業団『環境NGO総覧』掲載のNGO・NPOに対して全数調査を実施した。都市化と自然地域が混在する埼玉県143団体、自然が多い長野県97団体についてアンケート用紙を郵送し、それぞれ59団体、43団体から回答を得た。3.前記調査から、環境行政の参加やパートナーシップの例が増えつつあるものの、行政に対する不満はかなり高い割合を示している。最終的には、環境団体訴訟の必要性を示唆しているが、現実には、埼玉県、長野県調査では、環境訴訟への関与は6団体(当事者1、証人1、支援3、原告団への所属1)で少数にとどまっている。4.比較の材料としてフランス環境法の推移を調査した。フランスでは、すでに環境団体訴訟が存在しているが、近年、環境権が環境法典に規定され(110-2条)、環境法の原則として、予防原則、汚染者負担原則、防止原則、参加原則(情報への参加と意思決定への参加)などが宣言されている(110-1条)が、憲法的規定として環境憲章案が成立し、前記原則もまた、環境憲章に導入されている(国民投票待ち)。5.以上から、環境権を立法化するか、環境団体訴訟の導入が検討されるべきである。