hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵星細胞の細胞外基質クリアランス機能に着目した新規膵癌治療法の開発

【背景と目的】癌細胞がプロテアーゼの分泌を介し周囲組織へ浸潤することは知られているが、細胞外基質(ECM)を細胞内に取り込み分解する基質クリアランスの機構については知られていない。膵癌細胞が浸潤する際上皮間葉移行(EMT)を起こすことに注目し、癌細胞がEMTにより線維芽細胞同様コラーゲンリモデリングに関与しているのではないかと仮説を立てた。【結果】コラーゲンでコーティングした蛍光ビーズを用いて、膵癌細胞、膵線維芽細胞のコラーゲン取り込み能を評価した。その結果、線維芽細胞同様膵癌細胞もコラーゲンを細胞内に取り込む機能を有することが明らかとなった。コラーゲン取り込み受容体と呼ばれるCD280(endo180)は膵癌細胞膜表面に発現し、EMTによりその発現が亢進し、その結果コラーゲン取り込み能も亢進することが明らかとなった。膵癌細胞株の中でも間葉系の形質を呈する細胞株群は特にCD280(endo180)の発現が高く、EMTとコラーゲン取り込み能の関連性が明らかとなった。一方、コラーゲン取り込み受容体として認知されているintegrineβ1の発現はEMT並びに膵癌細胞のコラーゲン取り込み能に関連を認めなかった。CD280(endo180)をノックダウンすることで膵癌細胞株の浸潤能が低下することも明らかとなり、膵癌細胞の持つコラーゲン取り込み機能は膵癌浸潤に重要な役割を持つことが示唆された。【結論】膵癌細胞の持つECMの細胞内分解機構は、癌細胞が浸潤するスペースを形成するという観点より新しい浸潤メカニズムであると考えられる。この基質クリアランス機構の解明により新たな治療標的となる分子の同定が進むことが期待される。今年は3年間で構成される研究計画の1年目であり、交付申請書に記載した年次計画通りに進んでいる。立案した研究方法が適切であったため、仮説の検証が順調に進んでいる。vitroの結果は揃ってきているので、今後はヌードマウス、shCD280を導入した膵癌細胞株を用いてコラーゲン取り込み能が膵癌進展にどのような影響を持つのかvivoにて検証する。また、細胞内に取り込んだコラーゲンの分解機構と膵癌浸潤との関連について、リソソームに分布するシステインプロテアーゼであるカセプシンに注目して研究を進める。
ドーパミン神経系異常と心理的ストレスが引き起こす多動性障害の機構の解明

ATF5欠損マウスは多動などの異常行動を示した。特にホームケージではない新規の環境において、多動や不安様行動が上昇していることがわかった。ATF5欠損マウスの異常行動の原因を調べるために、脳内神経伝達物質であるモノアミンの量を解析したところ、扁桃体などでドーパミンなどの量が減少していることがわかった。本研究では、多動などの異常行動の原因を解明するために、ATF5欠損マウスを用いて脳内異常の原因を明らかにすることを目的とした。本年度は、まずATF5欠損マウスの扁桃体の神経細胞について解析を行った。扁桃体に局在するニューロンを可視化し顕微鏡観察を行ったところ、扁桃体の大きさ、総細胞数については、ATF5欠損マウスは野生型マウスに比べて変化はなかった。扁桃体は、大脳皮質に連結した部位であり、大脳皮質を構成しているニューロンは扁桃体にも存在する。ATF5欠損成体マウスの大脳皮質は厚さや細胞数には異常が見られなかったが、インターニューロンが減少していることがわかった。一方、扁桃体のインターニューロンに顕著な異常は見受けられなかった。モノアミンの一つであるセロトニン作働性ニューロンにおいては、新生仔期の縫線核で減少していることが明らかになった。この原因として、アポトーシスの増加、ミクログリア増加を指標とした炎症状態の増加、アストロサイトの増加によるグリオーシスを検討したが、いずれにおいてもATF5欠損マウスの縫線核において顕著な増加はみられなかった。次に、ATF5が関与する脳内分子機構を明らかにするために、ATF5が多く発現している部位を免疫染色などで解析し、RNA発現解析を行なった。ストレス応答や神経細胞の骨格形成に関する遺伝子発現に増減が見られた。来年度は、これらの因子がATF5と協調して働いているか解析を行う。モノアミン作動性ニューロンの起始核と投射先の解析は計画通りおおむね順調に実施できた。また、ATF5欠損マウスのRNA発現解析も計画通り実施することができ、ATF5欠損において発現変動している候補因子の同定を行うことができた。以上のことより、実験計画の実施は概ね順調に進展しているといえる。異常行動を示す脳内分子機構を明らかにするために、引き続きATF5欠損マウスを用いてATF5が関与する分子機構の解析を行う。ATF5欠損マウス脳のRNA発現解析で明らかになったATF5欠損で発現が変動している候補因子の解析を行う。候補因子のRNA発現について、リアルタイムPCRにて解析を行い、評価する。発現変動があった因子の発現部位や結合タンパク質についても解析を行う予定である。また、ドーパミン作働性ニューロンの投射先である扁桃体や線条体におけるドーパミン受容体の発現解析を行い、ATF5欠損マウスにおけるドーパミンシグナルについて解析を行う。近年、多動を特徴とする発達障害が子供・大人共に増加し、二次障害として不安障害や反抗挑戦性障害などを併発することが報告されている。さらに、多動性障害の原因の一つとしてドーパミンなどのモノアミン神経系の異常あると考えられている。私達は、ストレス応答性の転写因子ATF5を同定し、ATF5欠損マウスが多動の表現型を示すことを明らかにした。さらに、ATF5欠損マウスの脳の各領域においてドーパミンの定量を行ったところ、情動を司る扁桃体などでドーパミンの量が顕著に減少していることがわかった。以上のことから、ATF5欠損マウスの異常行動の原因の一つは、ドーパミン神経系を含むモノアミン神経系の破綻であることが予想された。これらのことから、ATF5が関与する多動を含む行動異常を引き起こす原因を明らかにすることを目的とした。本年度は、ATF5欠損マウスのモノアミン神経系の解析を行った。ドーパミン合成に関与するTHの免疫染色によりドーパミン作働性ニューロンの解析を行なった。8週齢のATF5欠損マウスにおいてドーパミン作働性ニューロンの起始部である腹側被蓋野と投射先である線条体ではTH発現には顕著な差は見られなかった。一方、AADC、COMTなどのドーパミンの生合成・代謝に関与している因子は、ATF5欠損マウスと野生型マウスではmRNA発現量に差がなかった。また、モノアミン神経伝達物質であるセロトニン作働性ニューロンの解析を行ったところ、ATF5欠損マウスの縫線核でセロトニン作働性ニューロン数が変化していることが明らかになった。一方、マウス神経芽細胞腫Neuro-2a細胞をジブチリルcAMP(dbcAMP)を添加し、ドーパミンニューロンへ分化を試みた。しかし、dbcAMPを添加したNeuro2a細胞においてTHの発現量は変化せず、ドーパミン作動性ニューロンへの分化が確認できなかった。本年度は交付申請書に記載した通りドーパミンを含むモノアミン神経系の解析を計画した。ドーパミン合成因子であるTHの発現はATF5欠損マウスの腹側被蓋野、及び線条体で野生型マウスと比べて顕著な差は見受けられなかったが、セロトニン作働性ニューロンの数がATF5欠損マウスの縫線核において変化していることが明らかになった。したがって、研究課題の進捗状況は概ね順調であると言える。次年度は、ATF5の下流因子の探索を行い、モノアミン作働性ニューロンの変化の原因を明らかにしたいと考えている。

特にホームケージではない新規の環境において、多動や不安様行動が上昇していることがわかった。ATF5欠損マウスの異常行動の原因を調べるために、脳内神経伝達物質であるモノアミンの量を解析したところ、扁桃体などでドーパミンなどの量が減少していることがわかった。本研究では、多動などの異常行動の原因を解明するために、ATF5欠損マウスを用いて脳内異常の原因を明らかにすることを目的とした。本年度は、まずATF5欠損マウスの扁桃体の神経細胞について解析を行った。扁桃体に局在するニューロンを可視化し顕微鏡観察を行ったところ、扁桃体の大きさ、総細胞数については、ATF5欠損マウスは野生型マウスに比べて変化はなかった。扁桃体は、大脳皮質に連結した部位であり、大脳皮質を構成しているニューロンは扁桃体にも存在する。ATF5欠損成体マウスの大脳皮質は厚さや細胞数には異常が見られなかったが、インターニューロンが減少していることがわかった。一方、扁桃体のインターニューロンに顕著な異常は見受けられなかった。モノアミンの一つであるセロトニン作働性ニューロンにおいては、新生仔期の縫線核で減少していることが明らかになった。この原因として、アポトーシスの増加、ミクログリア増加を指標とした炎症状態の増加、アストロサイトの増加によるグリオーシスを検討したが、いずれにおいてもATF5欠損マウスの縫線核において顕著な増加はみられなかった。次に、ATF5が関与する脳内分子機構を明らかにするために、ATF5が多く発現している部位を免疫染色などで解析し、RNA発現解析を行なった。ストレス応答や神経細胞の骨格形成に関する遺伝子発現に増減が見られた。来年度は、これらの因子がATF5と協調して働いているか解析を行う。モノアミン作動性ニューロンの起始核と投射先の解析は計画通りおおむね順調に実施できた。また、ATF5欠損マウスのRNA発現解析も計画通り実施することができ、ATF5欠損において発現変動している候補因子の同定を行うことができた。以上のことより、実験計画の実施は概ね順調に進展しているといえる。本年度は、モノアミン作働性ニューロンの解析を行った。ドーパミン合成因子であるTHの発現はATF5欠損マウスの腹側被蓋野、及び線条体で野生型マウスと比べて顕著な差は見受けられなかったが、セロトニン作働性ニューロン数がATF5欠損マウスの縫線核において変化していることが明らかになった。次年度は、さらに、モノアミンの合成・代謝に関与する因子の解析を行うととともに、モノアミン作働性ニューロン数が変化した原因を解析する。ATF5欠損マウス脳のRNA発現解析を行いたいと考えている。異常行動を示す脳内分子機構を明らかにするために、引き続きATF5欠損マウスを用いてATF5が関与する分子機構の解析を行う。ATF5欠損マウス脳のRNA発現解析で明らかになったATF5欠損で発現が変動している候補因子の解析を行う。候補因子のRNA発現について、リアルタイムPCRにて解析を行い、評価する。発現変動があった因子の発現部位や結合タンパク質についても解析を行う予定である。また、ドーパミン作働性ニューロンの投射先である扁桃体や線条体におけるドーパミン受容体の発現解析を行い、ATF5欠損マウスにおけるドーパミンシグナルについて解析を行う。
二次元層状物質の構造異常のX線的研究

1TーTiS_2の層間にAg原子を挿入した化合物Ag_xTiS_2ではAg原子の結晶学的2次元性のためa^*b^*面内からc^*方向に伸びた非常に微弱な棒状のX線散漫散乱が観測される。本研究では室温で2次元性を示すAg原子が低温では3次元的な相関を現すかどうか、またもし現れるならばどの様な過程を経て次元性の移行が起るのかを明らかにするため、単結晶試料を作成しX線散乱実験を行なった。ステ-ジ2(x=0.15)では降温と共に面内の2次元的な秩序のみが発達し、それが約250Kで終了すると同時に3次元的な相関が現れる。しかし、それは面内も積層方向も短範囲な規則にとどまり、180K以下では変化が見られない。また、棒状散漫散乱に沿って指数Lが半整数の位置に強度極大が現れることにより、積層はαβαβ...の傾向が強い。一方、ステ-ジ1(x=0.25)にも同様な3次元秩序が現れるが、ステ-ジ2より長距離な相関を持つことが確認された。さらに、格子定数の温度変化の測定では、ステ-ジ2の試料のC車軸に関し250Kで異常な変化を観測した。これは次元性の移行に結びついており、2次相転移的と思われる。ステ-ジ2のAg原子が2次元的に相関する温度領域(250350K)において、面内のX線散漫散乱の強度分布を定量的に測定し、2次元の原子対相関々数を求めた。その関数を用いて計算機実験を行い、短範囲規則構造を求めた結果、√<3>×√<3>R30^°構造となる領域がみられ、温度低下と共に発達することが判った。しかし、DaumasーHeroldモデルで予測される様に、その領域は結晶全体には広がらない。以上述べたAg_xTis_2化合物の他に1TーTiS_2にAu原子を挿入する試みを行なったが成功しなかった。また、Mn_xTiS_2化合物ではステ-ジングの存在をはじめて確認した。1T-TiS_2の層間にAg原子を挿入した化合物AgxTiS_2では室温でa^*b^*面内からc^*方向に伸びた非常に微弱な棒状のX線散漫散乱が観測される。これはAg原子の結晶学的振舞いが2次元的であることを示す。本研究では室温で2次元性を示すAg原子が低温では3次元的な相関を現すかどうか、またもし現れるならばどのような過程を経て次元性の移行が起こるのかを明らかにするため、単結晶試料を作成しX線散乱実験を行なった。その結果、ステ-ジ2(X=0.15)では降温と共に面内の2次元的な秩序のみが発達し、それが約250Kで終了すると同時に3次元的な相関が現れる。また、棒状散漫散乱に沿って指数Lが半整数の位置に強度極大が現れることより、積層はαβαβ...の傾向が強い。

一方、ステ-ジ1(X=0.25)にも同様な3次元秩序が現れるが、ステ-ジ2と比較して長距離な相関を持つことが確認された。さらに、格子定数の温度変化の測定では、ステ-ジ2の試料の(軸に関し250Kで異常な変化を観測した。これは次元性の移行に強く結びついている。なお、これらの移行には温度ヒステリシスが全くなく、2次相転移的に移行する。ステ-ジ2の2次元性を保ったままAg原子が短範囲規則する温度領域(250K350K)において、面内のX線散漫散乱の強度分布を定量的に測定し、二次元の原子対相関関数を求めた。その温度変化から、低温相での面内構造は√<3>×√<3>3R30°構造であると予測され、面内の相関は2次元OrnsteinーZernike関数で良く近似出来た。さらに面内のAg原子の最近接位置には空孔が存在する確率が大きく、ほとんど温度変化しないこともわかった。このことは面内でAg原子同志を第一近接から排除しようとする相関が非常に強いことを示しており、ステ-ジ変化および面内のAg原子濃度にも関係していると考えられる。前年度にはステ-ジ2Ago、_<15>TiS_2中のAg原子の2次元性を保ったまま短範囲規則する温度領域(250350K)において,面内のX線散漫散乱の強度分布を定量的に測定し,2次元の原子対相関々数を求めた。今年度ではその原子対相関々数を用いて,モンテカルロ法による計算機実験を行い,Ag原子の短範囲規則構造を求めた。この結果,350Kではほぼ無秩序な配列をしているが,300K,280Kと温度降下に伴い,秩序化が進み,散漫散乱極大の位置から予測された√<3>×√<3>R30°構造を持つ小さな領域がかなり存在することが判った。一方,低温相では2×2型構造の出現も予測されるが,短範囲規則構造にはほとんど存在していないことが判った。DaumasーHe^^′roldモデルで予測される様に,√<3>×√<3>R30°構造を持つ領域は有限の大きさを持ち,結晶全体には広がらない。以上述べたAg_xTiS_2化合物の他に,いままで報告例のない1TーTiS_2の層間にAg原子を挿入する試みを気相成長法および電気化学的な方法により行なった。温度や溶液の濃度を変えて育成を試みたが,層間化合物を作成することは出来なかった。また,1TーTiS_2にMnを加え気相成長法により育成したMn_xTiS_2(X<1/3)単結晶を用いてのX線散乱実験の結果,ステ-ジ1およびステ-ジ2の存在が確認された。この事実はいままで1TーTiS_2に3d遷移金属を挿入した化合物に対して報告側はなく,はじめてと思われる。現在,この系に対して,Mnの組成と格子定数の関係および相図の作成を進めている。
疾病媒介蚊の地理的変異の精査、並びにその起因環境のGISによる分析

感染症媒介蚊の生息環境を、一定のプロトコールに従いデジタルカメラで撮影した地表写真画像の分析により疾病媒介蚊の選好する環境を景観生態学的に評価しようとした。北タイのモデルフィールドにおける試行では、Anopheles minimus sensu lato(東南アジアの重要マラリア媒介蚊)を対象種とし、山地から平野にかけての蚊の密度と、周辺景観の主たる構成要素を計量した。その結果、山地から平野への景観上の開放傾向、幼虫発生源である水域の物理・化学的属性の勾配、An. minimusの密度低下が並行的に認められた。媒介蚊の侵淫密度の高い環境と低い環境を、異なる景観構成要素による異なる景観パターンとして定量的に表現可能であることも判った。また、インドネシア、ロンボク島のマラリア流行地では、An. balabacensisと同定された山地性のハマダラカの関与が、我々によりこの島としては初めて明らかにされたが、この媒介蚊の空間分布と、写真法により評価された森林の鬱閉度との間に明らかな相関が認められた。今回の地上写真による景観解析法は、未だ精度の点で多くの問題を残してはいるが、実用精度としては認め得る環境の数値的(客観的)評価が、総体としての環境のまま可能で、データ採取が平易かつ安価なため適用性が高く、常に実地調査に立っているので分析過程と結果提示を通じてリアリティーが高い(我々はこの点を最も評価している)など利点も多く、尚しばらく追求する価値のある環境評価法だと考えている。
記憶の獲得、保持、想起、全ての過程に不断の出力が必要な神経細胞の行動遺伝学的解析

研究代表者は、ショウジョウバエの忌避記憶(匂いと電気ショックを連合)と報酬記憶(匂いとショ糖報酬を連合)、それぞれに特異的な神経回路があり相互に抑制することを明らかにした。加えて、それらは記憶の獲得、保持、想起、全ての過程で必要であった。本研究では(1)記憶の素過程(獲得、保持、想起)それぞれにおけるこれらの神経細胞の具体的な機能の解明を進めるとともに、(2)忌避、報酬シグナルに特異的回路の特異性と相互抑制の機構を探る。脊椎動物においても同様の相互抑制の仕組みが示されており、情動に関わる記憶形成において進化的に普遍性の高い機構であると考えられる。
細胞膜上での宿主-ウイルス因子群の攻防がHIV-1病態形成に与える影響

HIV-1感染における病原性発現は、ウイルス増殖とこれを抑制する宿主制限因子との攻防の結果である。たとえば、SERINC3/5など一部の宿主制限因子は細胞膜に局在してHIV-1の出芽や感染性を減弱化させるが、Nefなど細胞膜に局在するウイルス蛋白質はこれら宿主因子の機能を阻害する。細胞膜に局在するウイルス蛋白質(Vpu, Env, Nef,マトリックス)は、互いに独立して、あるいは協同して、細胞膜型の宿主因子との攻防あるいは感染性ウイルス粒子の構築に働くと考えられるがその全貌は分かっていない。本研究は、生体内におけるウイルス蛋白質の個々、あるいは協同した機能と宿主制限因子との相互作用を解析し、病態発現との関連性を明らかにすることを目指す。本研究を進めるにあたっての予備検討として、膜貫通領域予測ツールを用いて、SERINC5の膜貫通領域の予測を行った。これにより、SERINC5は4つの細胞内ループおよび5つの細胞外ループを有する10回膜貫通型ドメインを構成すると予測された。この予測をもとに、細胞内および細胞外ループにアラニン変異を導入することで、SERINC5による感染性の制御に重要なドメインの同定に成功している。並行して、国内外の未治療のHIV-1感染者からクローニングしたNef蛋白質のSERINC5阻害活性を解析し、その機能的な違いを生じるNefの変異も同定している。今後は、感染性に影響をおよぼすSERINC5の機能ドメインと生体内で選択されるNefの変異の相互作用が病態発現に及ぼす詳細な解析を行う予定である。SERINC5の機能に重要なドメインの同定および、SERINC5活性阻害に影響を及ぼすNefの変異の同定に成功している。以上のより、おおむね順調に進んでいると言える。感染者臨床情報(CD4カウントや血漿ウイルス量など)およびSERINC5活性阻害に影響を及ぼすNefの変異のインフォマティクス解析を行い、病態形成への影響を解析する。特に、興味深い結果が得られた感染者に関しては、Nefのその他の機能解析(HLA発現低下作用、ウイルス複製作用)も行っていく。また、蛍光顕微鏡等での解析を視野に含め、SERINC5およびNef変異の相互作用が動態に及ぼす影響も明らかにしていく。予定していた感染者検体に変動があったため、クローニングおよび発現ベクターの作製に使用予定であった消耗品の使用額が減少した。平成31年度は蛍光顕微鏡の解析をメインに行い、データを取得後はすみやかにまとめていく。よって、主に試薬代に使用し、研究成果発表のための学会参加の旅費および論文投稿に使用する。平成31年度使用予定の195万円のうち、物品費に120万円、旅費に40万円、論文投稿に30万円、その他に5万円を使用する予定である。
日本・韓国・台湾の農業構造の比較研究

本研究は日本・韓国・台湾の農業構造の比較研究を目的としている。この目的に基づいて3国の現地フィ-ルド調査及び、その結果をとりまとめるための合同シンポジウムを行なった。日本・韓国・台湾は同じ東アジアモンス-ン地帯に位置しており、歴史的にも経済発展的にも類似したコ-スを歩んできているものの、3国の個々の政策や経済発展の形態はそれぞれに異なっている面が多い。農業構造の面でま、3国ともに稲作灌漑農業を基礎とした家族経営が主体であること、また零細な土地所有と分散耕地という点で共通しているが、反面で1960年代以降の農家減少率、兼業化の程度、農業就業者の年齢構成など多くの点で相違している。本研究では農産物需給と価格政策、農産物流通、農産物流通、就業構造と生産の組織化、農地政策、地域計画と農村整備、農業技術と土地改良、農業金融と農業団体、営農指導と普及事業など多面的な比較視点から3国間の農業構造の比較を試みた。農産物需給と価格政策の面では、3国とも経済成長のテンポに従って、増産政策から所得支持政策に転換してきたこと、米消費の減少から過剰の発生と生産調整が行なわれているという共通点をもっている。しかし、支持価格制度については日本が多様な手法を採用しているのに対し、韓国・台湾では12種のみが採用されているという違いがある。貿易については、総貿易額では3国とも輸出超過であるが農産物ではいずれも輸入超過である。農産物流通については、3国は非常に類似した卸売市場制度を有しているが。その実態は大きく相違している。日本では中央集散市場体系により全国流通とそれに対応した産地形成が進んだが、韓国では流通施設の未整備、台湾では流通施設の小規模性から流通体系が形成されていない。戦後、3国ともその理念や方法においてきわめて類似した農地改革が実施され自作農体制が創り出された。しかし、その内容には次のような違いがある。日本では1952年に農地法が制定され、農地改革が法的に裏付けられたのに対して、韓国では農地法が現在まで制定されていない。一方、台湾の農地改革は遅かったが、その内容はきわめて斬新なものであり、またその後も、自作農的土地所有性が定着するような政策が持続的に講じられている。また3国とも高度経済成長を経た現在、若年層を中心とした農家労働力の流出と家族協業体制の崩壊、借地関係の進展などで、自作農と借地主義との調整が模索されている。農業技術について、1960年代以降、3国とも農業機械化が進行した。台湾では作業受託が広範に発達しており、稲作面積の8割以上が機械収穫されている。機械化の進展している日本では大規模層の増加がみられるが、韓国・台湾ではむしろ大規模層が減少し、中規模層の増加がみられる。農業労働力の流出、高性能機械の導入などを背景に、規模拡大と経営発展の方法として設立されている農業生産組織は、大きく共同作業の組織、機械・施設の共同利用組織、土地利用の組織などに分類される。日本、韓国が比較的同じような生産組織の形態をとっているのに対して、台湾では委託経営、共同経営、合作社などの形態があり、また作業受託を行なう委託経営が圧倒的に多いという違いがある。農業構造比較においては、その類型の違いによって3国間の比較を行なうのか、経済発展の違いによって比較を行なうのかという問題がある。本研究ではできるだけこの2つの視点を取り入れて研究のとりまとめを行なった。このように多面的な視点から日本・韓国・台湾の農業構造比較を行なったのもとしては本研究が初めてのものであり、研究成果を図書にて刊行を予定している。

日本では1952年に農地法が制定され、農地改革が法的に裏付けられたのに対して、韓国では農地法が現在まで制定されていない。一方、台湾の農地改革は遅かったが、その内容はきわめて斬新なものであり、またその後も、自作農的土地所有性が定着するような政策が持続的に講じられている。また3国とも高度経済成長を経た現在、若年層を中心とした農家労働力の流出と家族協業体制の崩壊、借地関係の進展などで、自作農と借地主義との調整が模索されている。農業技術について、1960年代以降、3国とも農業機械化が進行した。台湾では作業受託が広範に発達しており、稲作面積の8割以上が機械収穫されている。機械化の進展している日本では大規模層の増加がみられるが、韓国・台湾ではむしろ大規模層が減少し、中規模層の増加がみられる。農業労働力の流出、高性能機械の導入などを背景に、規模拡大と経営発展の方法として設立されている農業生産組織は、大きく共同作業の組織、機械・施設の共同利用組織、土地利用の組織などに分類される。日本、韓国が比較的同じような生産組織の形態をとっているのに対して、台湾では委託経営、共同経営、合作社などの形態があり、また作業受託を行なう委託経営が圧倒的に多いという違いがある。農業構造比較においては、その類型の違いによって3国間の比較を行なうのか、経済発展の違いによって比較を行なうのかという問題がある。本研究ではできるだけこの2つの視点を取り入れて研究のとりまとめを行なった。このように多面的な視点から日本・韓国・台湾の農業構造比較を行なったのもとしては本研究が初めてのものであり、研究成果を図書にて刊行を予定している。本研究は日本・韓国・台湾の農業構造の比較研究を目的としている。初年度は台湾の農業構造分析を行なった。これに引き続き平成2年度は、調査対象国を韓国に移し、その農業構造分析を現地フィ-ルド調査により行なうことにした。1.日本側研究者は前年度台湾におけるシンポジウムで決定した役割分担に基づいて、それぞれの研究課題に取り組んだ。さらに平成3年度の調査対象計画地区である千葉県山田町にて予備的調査を行なった。また、この間日本・韓国・台湾の3国間の通信によって、現地調査の共通調査項目と農業構造変動の年表を作成するなど、研究とりまとめにむけての準備作業が進められた。2.韓国側研究者は今年度韓国調査にむけて調査対象地区を確定し、その予備調査を行なった。この結果、今年度韓国調査は平成3年3月1926日(一部研究者は16日から)に決定した。調査地はソウル近郊、〓州、済州島の3カ所となり、当初計画以上に現地調査の内容を充実させることができた。現地では3国の合同調査、及びシンポジウムが行なわれる。3.台湾側研究者は前年度行なった台湾現地調査の補足調査に取り組んだ。4.韓国シンポジウムにおいては、この2年間の研究成果の検討が行なわれる他、来年度の日本調査の内容、及び研究とりまとめに向けての具体的な討議が行なわれる。5.来年度は本研究の最終年度にあたるため、研究分担者の合同会議を重視し、韓国・台湾の研究分担者を2回に渡って日本へ招聘する計画である。本研究は、日本・韓国・台湾の農業構造の比較研究を目的としている。
糖尿病患者の治療中断および耐糖能異常者の２次健診未受診の関連要因の解明

職域健診において、糖尿病および耐糖能異常が疑われるにも関わらず治療中断・未治療が約70%であることが明らかになった。その要因として低ヘルスリテラシーが関与している可能性が示唆された。ヘルスリテラシーについては、群馬県嬬恋村福島JA厚生連関連の2施設(坂下厚生総合病院、高田厚生病院)、所沢市内の診療所において健診受診者や通院患者を調査した。その結果、ヘルスリテラシーと健康習慣に有意な関連、また男性おいてはメタボリックシンドロームの有病率と有意な関連を認めた。嬬恋村での住民健診者においては、年齢・男女別の層別の解析でもヘルスリテラシーと健康習慣に有意な関連を明らかにできた。本研究に関して、主任研究者の横川は群馬県嬬恋村における住民健診データを用いて解析した。その結果、本研究のテーマであるヘルスリテラシーが健康的な生活習慣に有意に関連していることが明らかになった。さらに、高齢者に層別して検討したがやはり有意な関連を認めた。高齢者に関するヘルスリテラシーの研究はわが国では前例がなく初めての報告となる。なお、福島JA厚生連の関連施設に依頼している外来ドック受診者のデータについては平成26年9月末を期限として現在アンケート調査を依頼している。さらに、未受診の状況を確認するために東京都予防医学協会に依頼し、平成25年度同協会が実施した最大14万人の健診データを入手することができた。分担研究者の福田洋は職域におけるヘルスリテラシーの現状を評価している。その特徴を国内の各学会に報告している。本研究では「地域(自治体)」「職域」「病院」をフィールドとして、それらの健診受診者を対象とした観察前向き研究を計画している。既に分担研究者の福田は、企業及び健康保険組合を中心に6団体に研究協力の同意を取り付けて、その一部は平成25年度の国内学会で報告予定である。今後、それらの異なるフィールドのデータを標準化し、連結データとしてデータベースの構築を行う。「地域」については、現在2つの自治体(北海道、群馬県)から研究協力の同意を取り付けている。群馬県の自治体については現在基本健診に合わせてアンケート調査を実施中であり、今後アンケート調査内容と健診データを連結する作業を行う予定である。北海道の自治体については、現地説明会を終了し今後基本健診受診者に対してアンケート調査を実施する予定である。それらの結果は、湯浅の助言を基に遂行する予定である。「病院」については、福島県内の2病院の病院健診受診者を中心に平成24年10月からアンケート調査を実施している。現在のところ、ほとんど拒否者はおらず順調に調査を遂行している。分担研究者らとは密に情報共有を行っており、本研究の主題である「ヘルスリテラシー」に関して最新情報を福田を中心に発信している。25年度に開催予定の複数の関連学会において既に、一般口演およびシンポジウムが予定されており、本研究の成果も報告する予定である。横川および湯浅は、最も早くデータ回収が終了した群馬県嬬恋村における住民健診データとヘルスリテラシーに関連するデータを分析した。そのなかで、嬬恋村では高齢者の割合が多く70%前後であった。これまで、国内外で高齢者のヘルスリテラシーを評価した先行研究はないことから、年齢別・男女別の検討を行った。その結果、年齢や性別に関わらず高ヘルスリテラシーは良好な生活習慣に有意に関連していることが明らかになった。英文学術論文としてまとめ、現在国際誌に採択されている。また、福島JA厚生連の協力により福島県内の2つの関連病院で実施したアンケート調査に関して約3000件を超える回答が得られた。現在ベースラインとして1800名の分析を行っている。その結果、高ヘルスリテラシーは良好な生活習慣に関連していた。さらに、糖尿病とも関連している可能性が示唆された。現在分析を進め国際誌への投稿を準備している。福田は職域健診においてヘルスリテラシーの6社に協力いただき実施した。その結果、ヘルスリテラシーは良好な生活習慣に有意に関連していることを見出し、日本公衆性学会総会(宇都宮市)のシンポジウムで発表した。全調査期間を通じて、地域として群馬県嬬恋村および北海道新ひだか町、病院として福島JA厚生連関連の2施設(坂下厚生総合病院、高田厚生病院)に対象者の登録を依頼し、約5,000例の健診受診者を登録することができた。また、所沢市の診療所においても450名の通院患者の登録ができた。当初の計画通りに群馬県嬬恋村住民健診におけるアンケート調査は終了し、連結データベースの構築も終了している。さらに、分析用データへの改変も終了し医学上有用な結果・成果が得られたために国際誌に投稿した。現在採択され、印刷中である。北海道日高郡新ひだか町住民健診におけるアンケート調査は終了し、連結データベースの構築も終了している。

対象者数が少ないことから単独での分析は行っていない。今後上記の成果を参考に再分析を予定している。職域領域では、6社の企業健診データをそれぞれ取りまとめ国内学会で報告している。今後は、これらの連結データベース化を目指し論文化することと計画している。予防医学当初の計画通りに群馬県嬬恋村住民健診におけるアンケート調査は終了し、医学上有用な結果・成果が得られたために国際誌に投稿した。現在採択され、印刷中である。今後、雑誌事務局と連携しつつ修正を重ね印刷を目指す。また、縦断データの分析はこれから行う予定であり、横断データの論文の修正が終了した後、縦断分析用データベースの構築を計画する。福島JA厚生連の関連2施設(坂下厚生総合病院・高田厚生病院)の健診におけるアンケート調査については2年間の調査期間が終了し、粗分析中である。その結果、医学上有用と思われる結果が確認され、現在詳細分析を進める予定である。1800名の分析対象者数を確保できており、詳細分析の結果が確定次第論文化して国際誌への投稿を目指す。北海道日高郡新ひだか町住民健診におけるアンケート調査は終了しており、上記の成果を参考に再分析を予定している。さらに、今回の研究の対象者は総数で5000名を超える可能性があり、それらすべての対象者の連結データベースが構築できるか検討する予定である。順次得られた成果は日本公衆衛生学会総会・日本労働生成学会総会・日本総合健診学会総会など国内学会で発表する予定である。職域領域データについては、連結データベース化を計画し論文化を目指す。当初予定していたベースライン調査は順調に進行している。追跡調査に関して平成26年4月に群馬県嬬恋村で実施予定であり、福島JA厚生連の関連施設のデータについては平成26年10月以降に回収予定である。東京都予防協会から得られたデータについてはデータクリーニングを行い分析を予定している。24年度は主に研究協力施設の選定を行い、「地域(自治体)」「職域」「病院」のフィールドを確保することができた。したがって、予定通りの達成と評価できる。湯浅の支援により現地説明会も適切に実施することができ、各協力支援組織と一定の信頼関係を得ることに成功している。また、「職域」については祖分析が可能な集計を行っておりその成果は福田らが国内学会で報告を予定するに至っている。一部の協力組織においては24年度内の調査が実施できなかったが、それは健診自体が年度当初に集中していたことにあり、25年度早々に調査を行う準備は既に完了している。国際誌に投稿予定であった論文に関して、投稿は終了しているものの査読業務が遅れていることから掲載料の執行が終了していない。また、一部のデータの分析が終了しておらず今後の英文校正および投稿に関する諸費用の執行が終了していない。これらの執行は、論文の採択状況によって大きく影響されることから予定通り執行できなかった分析は順調に進行しており今後予定通りに執行できるものと考えている。
強レーザー場電子散乱によるドレスト状態測定

強光子場中の分子ダイナミクスに対するドレスト状態(光と分子が強く結合した状態)の寄与を解明することを目的として、分子のドレスト状態の特性を直接観測するための分子-電子散乱実験装置の開発を行った。開発した装置の性能評価実験と電子軌道シミュレーション計算を行った結果、目標とする強レーザー場特有の電子散乱現象を初めて観測するために必要な装置性能を満たすことが確認された。平成19年度は強レーザー場電子散乱実験を実現するための装置開発を進めた。実験装置は、単色電子線源、散乱チャンバー、エネルギー分解回折像装置からなる。1keVの単色電子線を強レーザー場中で分子と衝突させ、エネルギー分析器により光電場内で散乱された電子を選別し、二次元検出器で検出する。平成19年度は、装置の組み上げを完了し、テスト実験を実施して装置性能を評価した。ファラデーカップによる電子線強度測定から、単色電子線源は当初の予定通り約1μAの電子線を発生できることが分かった。また、電子線と各種アパーチャー、スリット、電子エネルギー分析器等のアライメントを行い、電子銃から出射された電子が検出器まで到達できることを確認した。Arガスを試料として、弾性散乱電子の角度分布測定を行い、電子エネルギー分析器等の電極へ印加する電圧の最適値を求めた。得られた弾性散乱電子のエネルギー幅から、装置全体のエネルギー分解能は当初の目標を上回る約0.4eVであることが分かった。また、散乱電子の捕集限界は散乱角±15°であり、小角散乱領域に現れるドレスト状態形成を示す信号を観測するには十分な性能であることが確認された。観測された弾性散乱電子のエネルギー分布の裾の広がりは非常に小さく、中心エネルギーから波長800nmの一光子分(1.55eV)シフトしたエネルギー値での分布は殆どゼロであった。開発する実験手法では強レーザー場中で散乱されて光子エネルギーを吸収した散乱電子の微小な信号を捕らえる必要があるが、この結果は光子エネルギー吸収電子を明確に選別して観測可能であることを示している。平成20年度は強レーザー場電子散乱法の実現を目指して、予備実験や装置の改良などを行った。まず、マイクロチャンネルプレートを用いた電子線パルスの時間幅計測から、電子線のパルス時間幅が約40nsであることが分かった。また、微小信号の高精度観測を目指して、電子散乱画像の計数法観測のためのデータ取り込みシステムを構築した。そして、散乱電子の計数法測定から背景信号の強度は弾性散乱信号の約10^<-3>程度であることが分かった。観測対象となる信号強度は弾性散乱信号の約2×10^<-6>程度と見積られるため、観測する信号は背景信号の約2×10^<-3>程度と考えられる。そのため、目的の信号を観測するためには非常に高いS/N比が必要になるが、実際の測定では電子線の強度不足のため、観測対象となる信号の有無を判別するほどのS/N比が得られなかった。そこで、電子線強度の向上と電子線パルス幅の短縮による背景信号の軽減を目的として、光電陰極型超短パルス電子銃を新たに設計・製作した。この電子銃は銀コートされた窓材(膜厚50nm)からなる陰極に266nmの光パルスを背面照射することによって光電子を発生させ、0.3mm下流に設置した陽極によって直ちに1keVまで加速する。加速された電子パルスは電磁レンズによってコリメートされ、偏向器を経て散乱点に達する。製作した電子銃についての電子線軌道シミュレーションを行った結果、従来の電子銃よりも電子線強度で約20倍、背景信号とのコントラスト比で約400倍の向上が見込まれ、光電場内電子散乱法の実現に十分な性能を持つことを示した。
循環流動層の伝熱特性に及ぼす粒子挙動の影響に関する基礎研究

He-Neレーザーシートを透過させた結果、管断面にはレーザー光の濃淡模様が、また軸を含む垂直断面には曲線を描く筋状の模様が観察され、粒子は単一分散粒子として運動するのではなく、細長くうねりながら上昇する粒子集団(クラスター)を形成する事が判明した。また、水平透明ガラス管内に内視鏡を挿入して観察した結果、クラスターが管側面を通過した後、円管後方の剥離領域に巻き込まれて円管上面に落下、堆積、滑落、再上昇する運動の流動形態は大旨次のように分類できた。(A)管上部での静止堆積層の形成:粒子循環量が小さい場合で、堆積層の下端では局所的に崩壊と復元が繰り返される。崩壊粒子集団はまばらに点存して表面を滑り、降下する。(B)静止堆積層の消滅:粒子循環量が大きい時に見られる。(1)堆積層の緩慢移動域、(2)崩壊・滑落の激しい流動域および(3)滑落してきた粒子が再度吹き上げられる混合領域、の三領域が明確になる。(C)(1)が管上半分の大部分を占め、(2)と(3)が同じ領域で発生:粒子循環量が極めて大きく高粒子濃度の時認められる。一方、水平伝熱管の平均伝熱係数は粒子濃度(層内粒子分率epsilon_s)に支配され、(a)epsilon_sがおよそ0.05までの希薄な領域ではepsilon_sの増加とともにNu数も増加したが、(b)それ以上の粒子濃度ではNu数はepsilon_sによらずほぼ一定値を示した。(a)の現象は粒子の流動様式(A)→(B)の領域と、また(b)は(C)と対応した。特に(2)の領域の大きさが伝熱係数の上昇と関係があるものと考えられた。局所の粒子挙動の定量化が伝熱機構の解明に不可欠な事が分かった。
アレルギー性鼻炎におけるORMDL3遺伝子発現の影響

目的は小児気管支喘息の候補遺伝子とされるORMDL3が、アレルギー性鼻炎発症機序にどのように関与しているかを調べることである。そのために前年度に炎症細胞の分離条件の条件を確立し、炎症細胞の染色条件などを確立し、代表的な炎症細胞刺激因子による炎症細胞が生体内と同様に炎症反応を起こすことを確認した。組織内のアレルギー性炎症とORMDL3関連を調べた。手術で採取した鼻粘膜におけるORMDL3の発現量を検討したところ、アレルギー性炎症においてはORMDL3が病態の形成に深く関与することを示唆するデータを得ることができた。目的は小児気管支喘息の候補遺伝子とされるORMDL3が、アレルギー性鼻炎発生機序にどのように関与しているかを調べることである。そのために、アレルギー性炎症に関わる代表的な炎症細胞(好酸球、抹消血単核球)の分離条件(採取血液量、分離時間など)を確立した。さらに各炎症細胞をヘ染色、蛍光免疫染色などで形態を観察する方法を確立した。各炎症細胞やその培養液からからRNA,タンパクを分離し、測定する条件(細胞密度、培養時間など)を確立した。分離した炎症細胞をGM-CSFやIL-5などの炎症細胞刺激因子存在下で培養し、その形態や炎症性サイトカインの分泌などを測定し、活性化されていることを確認した。アレルギー性炎症患者の鼻粘膜における炎症細胞を蛍光免疫染色で観察し、炎症細胞の活性化マーカーの局在を把握した。そのために前年度に炎症細胞の分離条件を確立し、炎症細胞の染色条件などを確立し、代表的な炎症細胞刺激因子による炎症細胞が生体内と同様に炎症反応を起こすことを確認した。今後はさらにアレルギー性疾患患者と健常人の抹消血好酸球でその反応を比較する方針である。アレルギー性鼻炎本年度の研究により炎症細胞の分離、RNA,タンパク抽出条件や活性化条件が把握できた。さらに蛍光免疫染色、フローサイトメトリーや共焦点レーザー顕微鏡などの実験機器の取り扱いにも習熟した。そのため、目的のORMDL3のRNA,タンパク、組織・細胞内での局在や発現細胞数などの測定が可能な段階に到達している。採血可能なアレルギー性鼻炎患者、非アレルギー性鼻炎患者の人数も把握しており、協力要請も可能な段階に到達している。アレルギー性鼻炎患者、非アレルギー性鼻炎健常者、スギ抗体陽性かつ未発症者3群において各群40名ずつ採血と鼻粘膜擦過細胞採取を行う。採取した末梢血から炎症細胞(好酸球、好塩基球、T細胞)を分離し、その炎症細胞と鼻粘膜上皮細胞におけるDanger signals(環境要因)暴露によるORMDL3, Alarminsの発現誘導と遺伝要因との関連を調べる。さらにこれらの炎症細胞にAlarmins(内在性環境要因)を暴露し、ORMDL3、炎症性サイトカイン、炎症性メディエーター発現誘導と遺伝要因との関連を調べる。当該年度は主に本研究の予備実験や条件検討、実験機器の操作など、小規模な実験に終始したため。小規模な実験ではあるが貴重な被験者のサンプルや高価な試薬を無駄にしないための重要な年度であった。次年度は当該年度の条件をふまえ、被験者への謝金や大量サンプル処理に向けた試薬の購入などを予定している。
明るいガンマ線バースト初期残光の偏光分光測光同時モニター

本年度は、1年目に開発・納品された6素子ウォラストン・プリズムを装着した観測装置HOWPolを用いてガンマ線バースト(GRB)の観測を実施すると共に、偏光キャリブレーションの手法の確立、および早期に観測するためのサーバプロセスの見直しを目指した。・2010年4月から2011年3月に掛けて、計16回、GRBのアラート(GCNソケット通信)に反応して観測を行った。そのうち2回は装置トラブルのため観測が出来ず、3回は、望遠鏡は自動で動いたものの、装置トラブルのため自動では露出が開始されずに手動で観測を開始した(このため観測開始まで時間を要した)。残り11回は完全自動で観測できたが、残念ながらGRB残光はいずれも暗く、偏光測定は出来なかった。・無偏光標準星を多数観測して、望遠鏡の第3鏡による器械偏光を精査し、モデル曲線を適用することで、任意の望遠鏡位置における器械偏光量を0.3%精度で推定できるようになった。・11回の自動観測中、アラート受信から露出開始までの時間は最速で42秒であったが、100秒以上掛かった例が7例と多数を占めた。望遠鏡の装置回転機構と装置のステージ駆動とに時間を要していることが判り、解決を図ったが、まだ完全ではなく、今後の課題である。なお、当初本課題は平成23年度までを研究期間としていたが、平成23年度から基盤(B)の別課題が採択されたことから、本課題は平成22年度にて終了となる。ただ、東広島天文台の1.5m望遠鏡とHOWPolによるGRB観測のスタンバイ・自動観測は、今後も継続する予定である。本研究の本年度の目標は、ルチル(TiO2)を素材としたウェッジ付き6素子ウォラストンプリズムを開発して、稼働中の観測装置HOWPolへ組み込み、ガンマ線バースト(GRB)の広視野測光分光同時観測を行うことであった。ガンマ線バーストの初期報告の位置誤差(3分角)をカバーする広い視野で1露出型偏光観測を行うには、方解石などの複屈折性の大きい素材で30mm□以上の大型のプリズムを作る必要があるが、方解石は熱膨張率の軸差が大きく、熱変化に弱いため、外気に晒される観測装置での利用は向かない。そこで、最近大型のインゴットが手に入るようになった、熱膨張率の軸差が少ないルチル材での製作を試みた。2009年5月には光学設計ソフトZEMAXを用いたプリズム光学設計を終えて、材料の手配を開始した。6月にはプリズムの構成に充分な硝酸できるだけのインゴットが手に入り、すぐに業者へ加工を依頼した。当初は4カ月程度の加工期間を見込んでいたが、ルチルは癖のある結晶で、業者が必ずしもその扱いに慣れていなかったことや、加工ミスが許されるほど充分な材料が無かったことから、加工は非常に入念に行われた。その結果、当初の予定よりも5カ月ほど遅れた2010年3月にプリズムが完成し、広島大学に納品された。実験室でレーザーを当ててみたところ、4つのビーム分離はほぼ設計通りに行われていることがわかり、所期仕様を満たした1露出型観測のめどが立った。HOWPolそのものでの観測は、既存のプリズムを用いた超新星、GRB等の観測等を行った。本プリズムを用いた試験観測は2010年度に入ってから行い、その後、GRBの観測を開始させる予定である。
植物電圧依存型カルシウムチャネルA+TPC1の分子生物学的機能解析

申請者はゲノム情報を解析して、シロイヌナズナから動物のL-タイプ電位依存型Ca^<2+>チャネルα-サブユニットと2次構造において高い相同性を示す遺伝子(AtTPC1)を見出し、酵母発現系や発光カルシウムインジケーター蛋白質であるエクオリンを導入した形質転換植物を用いた解析から、AtTPC1が植物で初めて単離された電位依存型Ca^<2+>チャネル遺伝子であることを間接的に証明した(Furuichi et al., 2001a)。本年度の研究では、AtTPC1が電位依存型Ca^<2+>チャネルであることを直接的に証明する為、パッチクランプ法を用いた解析を行った。AtTPC1過剰発現タバコBY-2培養細胞およびNtTPC1発現抑制株を用いたパッチクランプ法による電気生理学的解析から、AtTPC1およびNtTPC1は形質膜の過分極によって活性化される電圧依存型Ca^<2+>チャネルであることを証明した。また、イギリスのグループから同蛋白質が液胞膜にも局在し、SVチャネルとして機能することを示唆する論文が発表されたのでAtTPC1の細胞内局在部位について更に詳細な解析を行った。その結果、AtTPC1蛋白質の大部分は液胞膜に局在するものの、一部は形質膜に局在すること、液胞型AtTPC1では結合蛋白質の作用により形質膜型と異なるCa^<2+>依存性を示すことを明らかとした。併行して行った結合蛋白質同定実験では、上述の機能制御ユニットの同定は行えていないものの、AtTPC1を液胞へ移行させる輸送蛋白質の同定に成功した。(論文作成中)AtTPC1によって情報伝達が行われると類推される糖、窒素化合物をシグナル分子とした情報伝達系や、カルシウムシグナリング以降に活性化される蛋白質リン酸化酵素カスケードについて、3報の論文を発表した。申請者はゲノム情報を解析して、シロイヌナズナから動物のL-夕イプ電位依存型Ca^<2+>チャネルα-サブユニットと2次構造において高い相同性を示す遺伝子を見出し、そのクローニングに成功した。この遺伝子は動物のL-タイプ電位依存型Ca^<2+>チャネルに特徴的な4回繰り返し(4-domain)構造の半分に相当する2-domain構造をもつ新規なタイプのチャネル蛋白であったことから、two-pore calcium channell(AtTPC1)と命名した。酵母発現系や発光カルシウムインジケーター蛋白質であるエクオリンを導入した形質転換植物を用いた解析から、AtTPC1が植物で初めて単離された電位依存型Ca^<2+>チャネル遺伝子であることが強く示唆された(Furuichi et al.,2001a)。本年度の研究では、AtTPC1の電気生理学的解析を第一目標とし、これに併せて生化学的諸性質を明らかとする為に上述のエクオリンと共にAtTPC1を過剰発現するシロイヌナズナ個体及び培養細胞、タバコBY-2培養細胞を作出した。AtTPC1特異抗体を用いた発現解析により膜画分に過剰発現している形質転換体を選抜した後、AtTPC1過剰発現タバコBY-2培養細胞を用いてサイトゾルCa^<2+>濃度上昇([Ca^<2+>]_c上昇)を引き起こす既知の外的刺激(過酸化水素、サリチル酸、糖、低浸透圧処理)に応答したエクオリン発光を計測した。その結果、電圧依存型Ca^<2+>チャネルを活性化することが電気生理学的、または生化学的に示唆されている過酸化水素、サリチル酸、糖に応答したエクオリン発光は野生株と比較して有意に増加した。また、伸展活性化チャネルを活性化する低浸透圧処理ではAtTPC1過剰発現株、野生株との間に有意差は見られなかった。また、上述のAtTPC1特異抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析の結果、この蛋白質が形質膜特異的に発現していることが明らかとなった。これらの成果は、AtTPC1がその存在、生化学的意義が電気生理学的手法、生化学的手法により示唆されてきた形質膜電位依存型Ca^<2+>チャネルであることを強く支持するものである。次にこの細胞株を用いてパッチクランプ法による電気生理学的解析を試みたが、国内研究機関に有する動物細胞系に特化した既存の技術では高確率での測定が不可能であったことよりヴュルツブルグ大学(ドイツ連邦共和国)に渡航し、植物細胞に特化した測定技術を習得した。申請者はゲノム情報を解析して、シロイヌナズナから動物のL-タイプ電位依存型Ca^<2+>チャネルα-サブユニットと2次構造において高い相同性を示す遺伝子(AtTPC1)を見出し、酵母発現系や発光カルシウムインジケーター蛋白質であるエクオリンを導入した形質転換植物を用いた解析から、AtTPC1が植物で初めて単離された電位依存型Ca^<2+>チャネル遺伝子であることを間接的に証明した(Furuichi et al.,2001a)。本年度の研究では、タバコBY-2培養細胞に発現するAtTPC1 homologueであるNtTPC1AおよびBを単離すると共に、AtTPC1過剰発現タバコBY-2培養細胞およびNtTPC1発現抑制株を用いてサイトゾルCa^<2+>濃度上昇([Ca^<2+>]_c上昇)を引き起こす既知の外的刺激(過酸化水素、サリチル酸、糖、低浸透圧処理)に応答したエクオリン発光を計測した。

また、伸展活性化チャネルを活性化する低浸透圧処理ではAtTPC1過剰発現株、野生株との間に有意差は見られなかった。(3報の論文として成果を公表。本年度分は2報)AtTPC1が電位依存型Ca^<2+>チャネルであることを直接的に証明する為、前年度に引き続いてドイツ・ヴュルツブルグ大学にてパッチクランプ法の習得を行うと共に所属機関(名古屋大学)への技術移転を行った。AtTPC1過剰発現タバコBY-2培養細胞およびNtTPC1発現抑制株を用いたパッチクランプ法による電気生理学的解析から、AtTPC1およびNtTPC1は形質膜の過分極によって活性化される電圧依存型Ca^<2+>チャネルであることを証明した。さらに、植物TPC1型チャネルは細胞質におけるレドックス状況により構造的変化を伴う制御を受けていることを示唆する生理学的に重要な知見を示した。(論文作成中)申請者はゲノム情報を解析して、シロイヌナズナから動物のL-タイプ電位依存型Ca^<2+>チャネルα-サブユニットと2次構造において高い相同性を示す遺伝子(AtTPC1)を見出し、酵母発現系や発光カルシウムインジケーター蛋白質であるエクオリンを導入した形質転換植物を用いた解析から、AtTPC1が植物で初めて単離された電位依存型Ca^<2+>チャネル遺伝子であることを間接的に証明した(Furuichi et al., 2001a)。本年度の研究では、AtTPC1が電位依存型Ca^<2+>チャネルであることを直接的に証明する為、パッチクランプ法を用いた解析を行った。また、イギリスのグループから同蛋白質が液胞膜にも局在し、SVチャネルとして機能することを示唆する論文が発表されたのでAtTPC1の細胞内局在部位について更に詳細な解析を行った。その結果、AtTPC1蛋白質の大部分は液胞膜に局在するものの、一部は形質膜に局在すること、液胞型AtTPC1では結合蛋白質の作用により形質膜型と異なるCa^<2+>依存性を示すことを明らかとした。併行して行った結合蛋白質同定実験では、上述の機能制御ユニットの同定は行えていないものの、AtTPC1を液胞へ移行させる輸送蛋白質の同定に成功した。(論文作成中)AtTPC1によって情報伝達が行われると類推される糖、窒素化合物をシグナル分子とした情報伝達系や、カルシウムシグナリング以降に活性化される蛋白質リン酸化酵素カスケードについて、3報の論文を発表した。