hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ダイオキシンによる発がんプロモーター活性に係る転写因子の作用機序の解析

ダイオキシン(TCDD)による発がんプロモーター活性を解析するために、その細胞内受容体であるアリルハイドロカーボン・レセプター(AhR)に着目した。TCDDの毒性発現にはAhRなど沿い忘内遺伝子の発現変化が強く関与していること、およびヒト肺がん由来細胞であるA549細胞の細胞増殖速度が促進されることを見出した。この促進作用にはかん関連転写因子であるE2Fが係っており、AhRによるE2Fの活性化機構並びにAhRとE2Fの相互作用を追求した結果、AhRはArntと複合体を形成し、さらにE2Fと複合体を形成すること、またその複合体のDNA認識配列への結合にはコアクチペーターとしてSRC-3等が関与していることを明らかにした。Ahレセプター(AhR)はその構造内にbHLH/PASドメインを有し、ダイオキシン類をはじめとする芳香族炭化水素をリガンドとする受容体型転写因子である。以前我々は、ヒト肺がん由来A549細胞において、AhRリガンドの添加ならびにAhR過剰発現が細胞周期S期への移行を速め、その結果、細胞増殖を促進することを報告した。またそのメカニズムの一部として、細胞周期関連転写因子であるE2Fの標的遺伝子の発現量がAhR依存的に増加することを明らかにした。さらに、このAhRによる細胞増殖促進作用は、AhRのヘテロダイマーパートナーであるArntの存在に依存することを示した。そこで、本研究では、AhR/ArntとE2Fとの相互作用をより詳細に検討した。E2FおよびAhR/Arntの活性は、エンハンサー部位にE2F結合部位もしくはXRE(AhR/Arnt結合部位)配列を含むルシフェラーゼ遺伝子を用いたリポータージーンアッセイにより検討した。各因子同士あるいはそれらとDNAとの相互作用は、免疫沈降法およびクロマチン免疫沈降法(ChIPアッセイ)により解析した。AhRおよびArntの共存によりE2F依存的な転写活性の上昇が観察された。その一方でE2Fの存在はAhR/ArntのXRE配列に対する転写活性を低下させた。また、免疫沈降法によりE2F、AhRおよびArntの共沈が確認された。さらに、ChIPアッセイによりAhRがE2F結合配列上に存在すること、またAhRリガンド処理は、E2FのE2F結合配列への結合活性を増強することが示された。これらの結果から、AhR/Arntは、E2Fと複合体を形成することでE2FのDNAへの結合活性を増強すること、その一方でE2FはAhR/ArntのXRE配列に対する転写活性を抑制することが示された。【目的】Ahレセプター(AhR)はその構造内にbHLH/PASドメインを有し、ダイオキシン類をはじめとする芳香族炭化水素をリガンドとする受容体型転写因子である。以前我々は、AhRリガンド添加ならびにAhR過剰発現が、ヒト肺がん由来A549細胞において細胞周期S期への移行を速め、その結果、細胞増殖が促進することを明らかにすると共にそのメカニズムの一部として、細胞周期関連因子であるE2Fの標的遺伝子の発現量がAhR依存的に増加することを報告した。そこで、本研究では、AhRさらにはAhRと二量体を形成するArntとE2Fとの相互作用を検討した。【方法】RNAi法を用いてAhRおよびArntの細胞増殖への影響を確認した。E2FおよびAhR/Arntの活性は、エンハンサー部位にE2F結合部位を含むルシフェラーゼ遺伝子をA549細胞に導入することで検討した。免疫沈降法およびChIPアッセイを行い、各タンパク質の相互作用を解析した。【結果・考察】RNAi法によるAhRあるいはArntのノックダウンは、A549細胞の増殖を抑制した。AhRリガンド処理によりE2F依存的なルシフェラーゼ活性が上昇した。また、この活性の上昇作用は、AhRあるいはArntをノックダウンすることにより減弱された。免疫沈降法によりE2F、AhRおよびArntの共沈が確認された。さらに、ChIPアッセイにより、E2F結合配列上にAhRが存在することが確認された。AhRリガンド処理は、E2F結合配列上へのSRC-3のリクルートを促進した。これらの結果から、ダイオキシン類による細胞増殖促進作用は、AhRがE2Fと複合体を形成することでSRC-3等のコアクチベーターのE2F結合配列上へのリクルートを促進し、その転写活性化能を増強させるためであることが示された。
カイコを用いた薬物動態評価モデルの確立

本研究において、カイコの腸管にシトクロームP450が存在し、ヒトのシトクロームP450によって代謝されることが知られている化合物の大部分が、カイコ腸管において代謝されることを明らかにした。また、トランスジェニック技術を用いた、ヒトシトクロームP450遺伝子発現カイコを樹立し、野生型系統が代謝できなかった化合物の代謝ができることを見いだした。従って、カイコの創薬のモデル動物として有用性が示されたと考えられる。前年度に引き続き、カイコ腸管における薬物代謝について解析を行った。カイコ腸管のミクロソーム画分を調製し、一酸化炭素結合差スペクトルを解析したところ、シトクロームP450に特徴的なスペクトルが得られた。また、調製したミクロソーム画分において、Luciferin化合物の代謝が確認できた。これらの結果と、前年度得られた結果から、カイコに投与された薬物は、腸管のミクロソーム画分で代謝されると考えられる。さらに、複数の薬物について、カイコ腸管における代謝物を検討した結果、哺乳動物と同じ代謝物は見いだされなかった。この結果から、カイコのシトクロームP450の反応機構は、哺乳動物のものと異なると考えられる。従って、カイコは、これまでにない新しい構造の化合物を得るためのバイオリアクターとして利用可能であると考えられる。さらに、前年度に樹立したヒト型シトクロームP450発現カイコを用いて、野生型カイコが代謝できないカフェインが代謝できるか否か検討した。その結果、ヒト型遺伝子を発現するカイコは、発現していないカイコに比べて、カフェインの血中半減期が短くなっていた。また、カフェインを大量に投与すると野生型カイコは成長の阻害が起こるのに対し、ヒト型遺伝子発現カイコは、その副作用が緩和していた。従って、ヒト型のシトクロームP450を持つ、薬物の体内動態を評価するモデルが確立できたと考えられる。本研究により、カイコにおける薬物動態は、哺乳動物と類似している点があることがあきらかとなった。さらに、細胞毒性を示す化合物の急性毒性は、培養細胞系に比べ、カイコの方が、ラット個体との相関が高いことが示されている。従って、安価で倫理的問題がないカイコは、薬物の治療効果を指標としたスクリーニング等、一次的な薬効評価モデルとして有用であることが示されたと考えられる。我々は、カイコの病態モデルを用いて治療効果を指標とした医薬品候補薬の探索法を提唱しており、実際に細菌感染させたカイコを全身評価のモデルとして、マウスモデルでも治療効果を示す新規抗生物質の発見に成功している。本研究では、カイコにおける薬物動態を明らかにし、全身評価モデルとしての基盤を確立することを目的としている。研究代表者らは、これまでにモデル薬物である7-エトキシクマリンについて、腸管でシトクロームP450による代謝を受けることを明らかにしている。さらに、当該年度において、ヒトのシトクロームP450によって代謝されることが知られている化合物Luciferin-CEE, ME, IPA, PFBE, BE、及びフェナセチン、オメプラゾール、アミノピリン等について、カイコの腸管においても同様に代謝されることを明らかにした。また、カイコの一次代謝の場であると考えられる腸管において、シトクロームP450遺伝子の発現をRT-PCRによって検証した結果、特異的に発現している5つの遺伝子を発見した。従って、カイコにおいても、大部分の化合物は哺乳類と同様にシトクロームP450によって代謝され、そのカイコにおける代謝の場は腸管であると考えられる。次に、いくつかの抗生物質をカイコの体液に注射後血中濃度を測定し、その薬物動態パラメーターを解析した結果、ヒトと同様に2ーコンパートメントモデルで説明されうる血中濃度推移を示し、定常状態時の分布容積が哺乳類の場合とほぼ一致することが判明した。このことが、抗生物質がカイコでヒトと同様な治療効果を示す上で重要な要素になっている可能性がある。さらに、本年度においてカイコが代謝できないカフェインを分解するヒト型シトクロームP450を導入したカイコの樹立に成功した。当初研究計画通りに、カイコにおける薬物動態、及び代謝経路について解析が進んでいる。また、すでにヒト型シトクロームP450発現トランスジェニックカイコの樹立に成功し、その解析についても着手しているなど、当初の研究計画より進んでいる点もあることから判断した。平成23年度の成果を元に、カイコの腸管組織培養系で代謝される代謝産物について、培地中から化合物を有機溶媒などによって抽出し、HPLCによってその代謝物の同定を行い、質量分析計などによって構造を推定する。また、前年度までに樹立したヒト型シトクロームP450発現トランスジェニックカイコにおいて、組織を分離し、薬剤の代謝活性がみられるか否か検討する。その後、薬剤を体液中へ注射し、薬物動態(半減期等)や代謝反応がヒトと類似しているか否か検証する。

さらに、抗生物質の薬物動態についてさらに検証を進め、カイコにおけるPK/PDパラメーターと薬効との相関について検証する。以上の研究の推進により、創薬の早い段階での全身評価モデルとしての、カイコモデルの有用性について、その基盤を確立する。平成24年度では、トランスジェニックカイコの遺伝子型を見分けるのに必要な顕微鏡を購入する。トランスジェニックカイコには胚の段階で挿入されている蛍光タンパク質のマーカーが発現し、それを蛍光顕微鏡で観察することで、個体の遺伝子型の区別が可能である。また、実験に用いるカイコの購入費、及び飼料、薬物の代謝物や体内動態を解析するのに必要なHPLC用のカラム、及び溶媒、それに関連する試薬の購入に充てる。
離散力学系の代数的整数表現の基礎的研究

この研究の最終的な目的は,非線型な遷移過程を持つ離散力学系,特にセル・オートマトンについて一般的な挙動解析の方法を与えることである.離散的代数系は,1960年代に生物学の分野で注目され,生態の形成過程や神経伝達過程が離散的代数系により記述できることが報告された.一般には,自己同型的なモデルやカオス的な要素を含むモデルの解析に有効であると考えられている.しかし,この分野の研究の多くは物理学的あるいは生物学的な直感を含むものが多く,数学の立場から見て理論的には不充分な点があると考えられる.離散的代数系の代表的なものとして知られるセル・オートマトンは1960年代J.von Nenmannによって提案されたが,これについては1980年代に入って,S.Wolfram,P.Guan,Y.He,E.Jenらにより,代数的整数を用いた新しい手法が提出され,数学的な枠組みの中での議論が可能となった.本研究は代数的整数論を用いて,離散的代数系のさらに詳しい解析を行う事を目的としている.今年度は,代数的整数に単因子論を応用し,昨年度行った行列のconvolutionを用いる方法を一般化して非線型セル・オートマトンの挙動の解析をすることを研究目的とした.具体的には,セル・オートマトンの解析を行い,一様性の条件を緩和することが離散力学系にどの様な影響を与えるか検討した.あわせて,様々な境界条件についても同様の検討を行った.この研究の最終的な目的は,非線型な遷移過程を持つ離散力学系,特にセル・オートマトンについて一般的な挙動解析の方法を与えることである.離散的代数系は,1960年代に生物学の分野で注目され,生態の形成過程や神経伝達過程が離散的代数系により記述できることが報告された.一般には,自己同型的なモデルやカオス的な要素を含むモデルの解析に有効であると考えられている.しかし,この分野の研究の多くは物理学的あるいは生物学的な直感を含むものが多く,数学の立場から見て理論的には不充分な点があると考えられる.離散的代数系の代表的なものとして知られるセル・オートマトンは1960年代J.von Nenmannによって提案されたが,これについては1980年代に入って,S.Wolfram,P.Guan,Y.He,E.Jenらにより,代数的整数を用いた新しい手法が提出され,数学的な枠組みの中での議論が可能となった.本研究は代数的整数論を用いて,離散的代数系のさらに詳しい解析を行う事を目的としている.今年度は,代数的整数に単因子論を応用し,昨年度行った行列のconvolutionを用いる方法を一般化して非線型セル・オートマトンの挙動の解析をすることを研究目的とした.具体的には,セル・オートマトンの解析を行い,一様性の条件を緩和することが離散力学系にどの様な影響を与えるか検討した.あわせて,様々な境界条件についても同様の検討を行った.
低遅延ネットワーク実現に向けた簡易かつ高精度な同期技術

本研究の概要は、低遅延や一定遅延のサービス実現に向けて研究開発が広く進められているタイムセンシティブネットワークのLANへの適用において、ネットワークベースの同期技術では十分な時刻同期性能を得ることは困難であり、通常のLANに適用可能な簡易かつ高精度な同期技術が必要となることを動機として、標準電波等を用いた基準信号としての周波数同期技術ならびにネットワークベースの時刻同期技術を組み合わせた、簡易かつ高精度なハイブリッドな同期システムを提案し、その基本動作と性能を検証するとともに、安定なシステム運用についても検討を行う研究である。
肝切除における肝障害メカニズムの解明:類洞内皮細胞への接着分子発現の意義と制御

【研究の背景・目的】サイトカイン(TNFα,IL-1β)により血管内皮細胞上に接着分子が発現し、多核白血球を中心とした炎症細胞の内皮細胞への接着および血管外への遊走と活性酸素や蛋白分解酵素放出による組織傷害のメカニズムが存在することが指摘されている。我々は、肝切除時にサイトカイン血症が惹起されること、またこのサイトカイン血症がステロイドの術前投与により制御されることを報告してきた。今回、肝切除における肝傷害メカニズムをサイトカイン血症→類洞内皮細胞への接着分子発現の点から明らかにする。【材料及び方法】(検討1:肝生検組織の免疫組織染色)肝切除時の開腹時と閉腹時に肝生検針(14G)にて、肝深部より肝生検を行い、その凍結標本を用い、接着分子であるELAM-1,ICAM-1,VCAM-1を免疫組織学的に染色した。(検討2:肝静脈血中の顆粒球エラスターゼ、可溶性ICAM-1とVCAM-1分画の測定)肝生検と同時期に肝静脈から採取した血液を用い、顆粒球エラスターゼ、可溶性ICAM-1とVCAM-1分画を測定した。【結果】(検討1)ELAM-1は肝類洞内皮細胞上には染色されなかった。ICAM-1,VCAM-1は、肝切除後に類道内皮上に発現し(あるいは発現増強し)、その頻度は肝切除術中の肝虚血時間の長さに相関した(虚血40分以内では、4例全て陰性、虚血41分以上では10例中8例陽性)。(検討2)肝静脈血中の顆粒球エラスターゼは、肝切除後に増加した(肝切前129.5【plus-minus】60.7mg/L→肝切後225.0【.+-。】109.5mg/L(n=16);p=0.0063)。一方、肝静脈血中の可溶性ICAM-1分画は肝切除後に低下した(肝切前216.2【.+-。】95.1mg/ml→肝切後163.6【.+-。】88.1mg/ml n=17;p<0.0001)。肝静脈血中の可溶性VCAM-1分画も肝切除後に低下した(VCAM-1:肝切前1134.1【.+-。】539.6mg/ml→肝切後866.5【.+-。】415.3mg/ml(n=17);p=0.0023)。【まとめ】局所に炎症が惹起されると、まず白血球は血管内皮上を転がる"ローリング"を起こし、次に"スティッキング"により強固な結合を形成する。白血球自体は、"ローリング"の際にセレクチンの分子を介した直接刺激や血管内皮細胞などから産生・放出されるIL-8などにより活性化され(トリガリング)、MAC-1などの接着因子発現の増強やリガンド結合能の増強を起こすことが知られている。また、最近ICAM-1の可溶性分画が白血球からの顆粒球エラスターゼ放出を促進することも報告された(J Surg Res 1996)。今回、肝切除後直ちに類洞内皮に接着分子の発現が生じるとともに、肝静脈血中の顆粒球エラスターゼの上昇と接着分子可溶性分画の減少が観察された。したがって、肝切除における肝傷害メカニズムにおいて、サイトカイン→接着分子発現が重要な役割を果していることが明らかになった。また、肝切除直後の肝静脈血中の接着分子可溶性分画の減少は、トリガリングを受け活性化することにより数の増加・結合能の増強を生じた白血球膜表面リガンドと接着分子可溶性分画が結合したことが原因であることが示唆された。ICAM-1,VCAM-1は、肝切除後に類道内皮上に発現し(あるいは発現増強し)、その頻度は肝切除術中の肝虚血時間の長さに相関した(虚血40分以内では、4例

全て陰性、虚血41分以上では10例中8例陽性)。(検討2)肝静脈血中の顆粒球エラスターゼは、肝切除後に増加した(肝切前129.5【plus-minus】60.7mg/L→肝切後225.0【.+-。】109.5mg/L(n=16);p=0.0063)。一方、肝静脈血中の可溶性ICAM-1分画は肝切除後に低下した(肝切前216.2【.+-。】95.1mg/ml→肝切後163.6【.+-。】88.1mg/ml n=17;p<0.0001)。肝静脈血中の可溶性VCAM-1分画も肝切除後に低下した(VCAM-1:肝切前1134.1【.+-。】539.6mg/ml→肝切後866.5【.+-。】415.3mg/ml(n=17);p=0.0023)。【まとめ】局所に炎症が惹起されると、まず白血球は血管内皮上を転がる"ローリング"を起こし、次に"スティッキング"により強固な結合を形成する。白血球自体は、"ローリング"の際にセレクチンの分子を介した直接刺激や血管内皮細胞などから産生・放出されるIL-8などにより活性化され(トリガリング)、MAC-1などの接着因子発現の増強やリガンド結合能の増強を起こすことが知られている。また、最近ICAM-1の可溶性分画が白血球からの顆粒球エラスターゼ放出を促進することも報告された(J Surg Res 1996)。今回、肝切除後直ちに類洞内皮に接着分子の発現が生じるとともに、肝静脈血中の顆粒球エラスターゼの上昇と接着分子可溶性分画の減少が観察された。したがって、肝切除における肝傷害メカニズムにおいて、サイトカイン→接着分子発現が重要な役割を果していることが明らかになった。また、肝切除直後の肝静脈血中の接着分子可溶性分画の減少は、トリガリングを受け活性化することにより数の増加・結合能の増強を生じた白血球膜表面リガンドと接着分子可溶性分画が結合したことが原因であることが示唆された。
音声言語によるマン・マシン・インターフェイスの高度化に関する総合的研究

重点領域研究「音声言語」は,わが国の主要な研究者の協力のもとに, 3ヵ年計画で音声言語によるマン・マシン・インターフェイスの高度化を目指す.本研究は総括班として,研究全体の方向の決定,各研究班間の連絡・調整,各研究班に対する助言,音声データベース・音声処理ソフトウエアの共用,使用ハードウエアの規格統一,成果公表のための会合の企画・開催,研究成果・資料の出版等を行うものであり,本年度は以下の実績をあげた.1.各研究班間で協調して研究を進めることを可能とするため,ハードウエアの規則統一を図った.性能・価格等の点からAPOLO DOMAINに決定し,各班を代表して業者との折衝にあたった.2.音声処理ソフトウエアの共有について検討し,共有ソフトウエアとして適切なものを選定した.現在, APOLO DOMAIN上で開発を進めている.3.各班で共用する音声データベースの内容を決定し,採録条件・管理方法を検討した.既に, 20名の音声を収録し,データベース化を進めている.4.海外の一流の研究者を含めたシンポジウムを開催し,専門家による討議・意見交換を行って,裏面の[図書]の欄に示したような論文集を出版・配布した.海外の研究動向についても情報を得ることが出来た.5.本重点領域研究の成果を民間に周知するとともに,研究成果について討議し,チェックを行うために,公開の研究発表会を開催し,裏面の[図書]の欄に示したような論文集を出版・配布した.6.総括班会議,研究代表者会議を開催し,成果・知見の交流,研究の進め方についての討議を行うとともに,各班の個別の会議に総括班員を派遣して,研究の進捗状況の把握,研究の方向についての助言を行った.7.ニューズレターを発行して,各会合の周知を図るとともに,班間の連絡,研究の速報を推進した.重点領域研究「音声言語」は,わが国の主要な研究者の協力のもとに, 3ヵ年計画で音声言語によるマン・マシン・インターフェイスの高度化を目指す.本研究は総括班として,研究全体の方向の決定,各研究班間の連絡・調整,各研究班に対する助言,音声データベース・音声処理ソフトウエアの共用,使用ハードウエアの規格統一,成果公表のための会合の企画・開催,研究成果・資料の出版等を行うものであり,本年度は以下の実績をあげた.1.各研究班間で協調して研究を進めることを可能とするため,ハードウエアの規則統一を図った.性能・価格等の点からAPOLO DOMAINに決定し,各班を代表して業者との折衝にあたった.2.音声処理ソフトウエアの共有について検討し,共有ソフトウエアとして適切なものを選定した.現在, APOLO DOMAIN上で開発を進めている.3.各班で共用する音声データベースの内容を決定し,採録条件・管理方法を検討した.既に, 20名の音声を収録し,データベース化を進めている.4.海外の一流の研究者を含めたシンポジウムを開催し,専門家による討議・意見交換を行って,裏面の[図書]の欄に示したような論文集を出版・配布した.海外の研究動向についても情報を得ることが出来た.5.本重点領域研究の成果を民間に周知するとともに,研究成果について討議し,チェックを行うために,公開の研究発表会を開催し,裏面の[図書]の欄に示したような論文集を出版・配布した.6.総括班会議,研究代表者会議を開催し,成果・知見の交流,研究の進め方についての討議を行うとともに,各班の個別の会議に総括班員を派遣して,研究の進捗状況の把握,研究の方向についての助言を行った.7.ニューズレターを発行して,各会合の周知を図るとともに,班間の連絡,研究の速報を推進した.
わが国古代寺院における古新羅の要素

わが国には百済から仏教が伝えられた。そして半世紀を経て寺造りの技術者も百済から渡来した。このことは正史に記されていることであるが、古代に造営された初期寺院の中には、百済以外の要素をもつものが少なからず認められる。たとえば、わが国最古の寺院である飛鳥寺の伽藍配置は高句麗金剛寺(清岩里廃寺)に連なるものである。また、飛鳥寺の直後に造営されたと考えられている豊浦寺の所用軒丸瓦は、百済系のものと全く異なった文様構成をもち、高句麗にその系譜を求めることができると考えられている。このような面からすれば、百済・高句麗以外の外来要素、すなわち当時わが国と交渉のあった古新羅(三国時代新羅)の要素もまた古代寺院の遺構や遺物に見受けられる可能性が高いと考えざるを得ない。そうした観点から、古新羅の軒丸瓦の文様構成が百済と高句麗の両者の影響を受けたものであること、そうした文様構成をもつものがわが国7世紀代の寺院所用瓦にも見受けられ、古新羅の要素をそなえた寺院が建立されたことを明らかにした(別掲論文2)。また古代寺院の伽藍配置が変化していく要因については、当時における仏教観の変化によるものとの結論を導き出すことができた。その仏教観の変化は内外の政治情勢が大きく関わっていたものと考えられる。たとえば回廊内の金堂前面に2塔を配置する形態は新羅における鎮護国家の思想を受けて成立したものと考えられる。新羅では文武王代に鎮護国家思想が極度に高まり、感思寺が造営された。わが国ではその影響を受けて持統朝に薬師寺が造営された。このような内容を含めて、その成果の一部を『学叢』13号に掲載する(別掲論文3)。寺院造営の際には、朝鮮半島や中国大陸で造営技術を身につけた僧侶たちが活躍したことが明らかである(別掲論文1)。
ガラスと金属の陽極接合における界面反応層の役割

Kovar合金とホウケイ酸ガラス、Kovar合金表面にスパッタしたアルミニウム膜とホウケイ酸ガラスの陽極接合を行い、接合温度と接合時間の違いによる継手の特性と継手界面の組織の変化を観察した。まず接合のプロセスについては、接合温度を高くすると接合の進行が著しく加速することがKovar、アルミニウムいずれの継手においても見出された。継手の強度については、継手部断面ほぼ全体の接合が達成された継手はいずれの材質の継手も812Mpaのせん断強度を示し、接合時間、接合温度による強度の違いは明らかでなかった。SEMとEPMAを用いて継手接合部の断面組織観察を行ったところ、接合界面での反応層の形成はいずれの材料の継手でも明らかでなかったが、界面近傍のガラス中に形成されるアルカリイオン欠乏層の成長速度が、Kovar合金の継手ではアルミニウム膜の継手と比べて2、3倍大きくなることが見出された。さらにTEMを用いて継手界面近傍の詳細な観察を行ったところ、Kovarの継手では鉄とシリコン、酸素を高濃度に含むアモルファスの複合酸化物層と鉄と酸素を主成分とするFe_3O_4の層の2つの界面反応層が、アルミニウム膜の継手ではアルミニウムと酸素を主成分とするγ-Al_2O_3の反応層が継手界面の全面に形成されていることが見出された。反応層の厚さはKovarの継手中に形成されたもののほうがアルミニウムの継手に形成されたものと比べて数倍大きく、SEM、EPMAで観察されたアルカリ金属イオン欠乏層の厚さの違いは部分的にはこれらの反応層の形成によるアルカリイオン欠乏層中の過剰酸素の消費で欠乏層の成長を抑制する層中の電荷の中和が生じることによってよって説明されるものと考えられた。しかしアルカリイオン欠乏層中の過剰酸素の量から期待される反応層の厚さを計算すると、実際に観察された反応層の厚さよりも数倍大きく、反応層の形成以外にもアルカリイオン欠乏層中の電荷を中和する何らかのメカニズムが働いていることが推察された。平成11年度の研究実績1.陽極接合継手の剪断強度試験接合面にアルミニウムをRFスパッタ成膜したコバール合金及び、アルミニウムのスパッタを行わないままのコバール合金とホウケイ酸ガラスとの陽極接合継手を接合温度、接合時間を何通りかに変化させて作成し、接合強度を剪断試験によって評価した。その結果、全ての継手は812MPaの破断強度を示し、アルミニウムスパッタの有無、接合条件と継手強度の間に明らかな関係は見出されなかったが、破断位置がアルミニウムスパッタした継手ではスパッタ膜中、スパッタなしの継手では接合界面近傍のガラス中となる違いが生じることが明らかになった。2.陽極接合継手界面微細組織のSEM観察アルミニウムをスパッタしたコバール合金及びスパッタを行わないコバール合金とホウケイ酸ガラスとの陽極接合継手界面をSEMを用いて観察し、ガラス中に生じるアルカリイオン欠乏層の厚さの接合時間に対する変化を求めた。その結果、アルミニウムをスパッタした継手ではスパッタを行わない継手と比べて、アルカリイオン欠乏層の厚さが約半分程度に小さくなることが見出された。3.陽極接合継手界面微細組織のTEM観察ガラス/コバール合金陽極接合継手のTEM用薄膜試料の作成法を確立し、継手界面近傍の断面微細組織のTEM観察を行った。その結果、アルミニウムをスパッタしたコバール合金とホウケイ酸ガラスとの継手界面には厚さ数nmの結晶質アルミナの反応層が、アルミニウムをスパッタしないコバール合金ホウケイ酸ガラスとの継手界面には厚さ数nmから230nmの鉄・シリコンアモルファス複合酸化物の反応層と厚さ数nmの酸化鉄の反応層が生じているのが見出された。陽極側金属元素のガラス中への大幅な侵入は今までのところ見出されていない。

しかしアルカリイオン欠乏層中の過剰酸素の量から期待される反応層の厚さを計算すると、実際に観察された反応層の厚さよりも数倍大きく、反応層の形成以外にもアルカリイオン欠乏層中の電荷を中和する何らかのメカニズムが働いていることが推察された。
環境シミュレーションに基づくコンクリート構造物の高機能補修システムの開発

本研究では,特に,構造物の劣化および再劣化に多大な影響を及ぼす環境作用を定量的に評価することで境界条件を明確とし,この結果に基づいたコンクリート構造物の補修システムを開発することを目的としている。さらに,再劣化のメカニズムを明らかとすることにより,構造物の部材,部位に応じた補修工法,補修範囲の選定が適切に実施することが可能となる高機能なシステムを開発した。(1)環境条件のモデル化環境条件のシミュレーションとして,都市キャノピーモデルを組み込んだメソスケールモデルによる関東地方の都市気候解析を実施し,その妥当性の検証を行った。(2)物質移動のモデル化ひび割れを有するコンクリート構造物の塩化物イオンの移動現象のモデル化を実施し,実験結果との比較により妥当性を検証した。さらに,コンクリートの透水機構を実験的に解明した。(3)構造物の劣化度の定量的評価コンクリート構造物の劣化診断プログラムの開発をした。目視点検の入力データから,構造物の劣化原因,劣化程度の推定,第三者影響度の評価,詳細点検方法の提案を専門家の代わりにシステムが行い,診断結果は画面上に表示されるだけではなく,デジタル文書として出力することも可能である。(4)補修システム断面修復は,劣化部分のコンクリートを削除して,特殊材料で修復する最もポピュラーな工法である。実際の現場にて想定される状況を再現し,暴露試験を行った結果,補修部と未補修部間における鉄筋がマクロセル腐食により,早期に腐食される現象が確認された。さらに,再劣化のメカニズムを明らかとすることにより,構造物の部材,部位に応じた補修工法,補修範囲の選定が適切に実施することが可能となる高機能なシステムを開発する。さらに,コンクリート表面の科学的性状をモニタリング可能な手法の開発を進めている。次世代型非接触・非破壊検査手法の開発を目的として,近赤外分光法によるコンクリート構造物の検査手法を開発した。(4)補修システム断面修復は,劣化部分のコンクリートを削除して,特殊材料で修復する最もポピュラーな工法である.近年,施工性の良さから吹付け施工が注目されている.吹付け施工による断面修復工法に関する実験を行った.本研究では,特に,構造物の劣化および再劣化に多大な影響を及ぼす環境作用を定量的に評価することで境界条件を明確とし,この結果に基づいたコンクリート構造物の補修システムを開発することを目的としている。

目視点検の入力データから,構造物の劣化原因,劣化程度の推定,第三者影響度の評価,詳細点検方法の提案を専門家の代わりにシステムが行い,診断結果は画面上に表示されるだけではなく,デジタル文書として出力することも可能である。(4)補修システム断面修復は,劣化部分のコンクリートを削除して,特殊材料で修復する最もポピュラーな工法である。実際の現場にて想定される状況を再現し,暴露試験を行った結果,補修部と未補修部間における鉄筋がマクロセル腐食により,早期に腐食される現象が確認された。
イオンアシスト蒸着法による導電性有機薄膜を電解質とした固体コンデンサの試作研究

有機薄膜アルミニウム(Al)電解コンデンサの実用化を図るため、本研究は三名の共同研究者により3年計画で以下のように(1)イオンアシスト法による有機蒸着膜の創成と薄膜作成技術および膜評価技術の確立(2)固体電解質として利用する各種TCNQ錯体の合成と高導電性有機物質の探索(3)試作有機薄膜Al電解コンデンサの諸特性の測定とその評価(4)各種電気・電子回路に試作コンデンサを実装し、運用と活用面から比較検討と評価を行うもので、最終年度はこれまで2年間で得られた(1)(2)(3)の結果をもとに主に(4)に焦点を合わせて実施した。・固体電解質は、ドナー・アクセプタのモル比が1:13の4,4'-ジピルジル誘導体・TCNQ錯体を利用した時、最も容量出現率が高くなり、それと同時に100eV前後の低エネルギーを用いたアシスト法で成膜を行った蒸着膜(固体電解質)の導電率は10s/cm^2まで向上した。試作コンデンサの周波数特性は、10^5Hg以上で著るしく改善されることが明らかとなり、本コンデンサを高周波インバータ回路およびスイッチング電源等に組み込み、電気・電子素子としての機能評価を行った。・本試作コンデンサの温度特性は10^5Hz以上の高周波領域で、従来品で優れた特性を持つフイルムコンデンサ並みに安定していることが分った。さらにまた本コンデンサはチップ化が図れるため、フイルムコンデンサと比べた場合、価格、サイズ等の点で有利となることが明らかとなった。以上の(1)(2)(3)(4)の研究から得られた結果と成果および業績は報告書として別にまとめた。イオンアシスト蒸着法を用いた有機固体コンデンサの開発という目的で研究を遂行し、本年度に得られた結果を概説すると以下のようになる。o固体電解質として探索している各種導電性材料のうち、4,4′-ジピリジル誘導体・TCNQ錯体が1S/cm^2まで導電率が上昇し、かつコンデンサの要である単位面積当たりの容量出現率が一番大きくなっており、当初予測した値に比較して35%の増大となり満足できる結果が出ている。また同時に蒸着膜はイオンの照射効果により、結晶構造および高次構造が制御でき、一様で均質な薄膜が形成されている。oコンデンサの容量値は理論容量2muF/cm^2のA1箔を利用して、熱蒸着法(0.11muF/cm^2)コロナ帯電方式(0.38muF/cm^2)、振動電極法(0.56muF/cm^2)に比べ、イオンアシスト蒸着法(1.04muF/cm^2)の場合が飛躍的に増加することが明らかとなった。特にイオンアシスト法の中でも静電容量は、イオンエネルギーとイオン電流密度さらにはイオン種(ここでは、Ar^+,N^+,He^+を利用)に著しく依存しており、これまでに得られた最高容量はHeイオンを使用した場合であり、1.38muF/cm^2が最高の容量出現率である。oA1箔のピット径と4,4′-ジピリジル誘導体・TCNQ錯体の分子サイズの関係を明らかにするため、ドナー・アクセプタのモル比の異なる上記錯体(1:0.53)を合成して実験を行った。容量出現率はピット径を一定とした場合、錯体分子のサイズに大きく依存することが分かった。現時点ではTCNQ錯体のドナー・アクセプタのモル比が1:1.5のとき容量出現率が最大となっている。イオンビームアシスト蒸着法を用いた有機固体コンデンサの開発という目的で研究を遂行し平年6年度に得られた結果を概説すると以下のようになる。

○有機固体コンデンサの要である固体電解質は、電子性伝導を持つ各種導電性材料のうち、ドナーを、4,4'-ジピリジル誘導体、アクセプターをTCNQとしたTCNQ錯体が5S/cm^2まで導電率が上昇し、かつ単位面積当たりの容量出現率が最も大きくなっている。また同時に固体電解質として使用している蒸着膜は、イオンの照射効果により、結晶構造および高次構造が制御でき、一様で均質な薄膜が形成されている。○コンデンサの容量値は理論容量2μF/cm^2のAI箔を利用して、これまで試みてきた各種の蒸着法(熱蒸着法・イオンプレーテング蒸着法・コロナ帯電+振動電極法)に比べ、イオンビームアシスト蒸着法の場合が飛躍的に増加することが明らかとなった。特にイオンビームアシスト蒸着法で得られた静電容量は、イオンビームエネルギーとイオン電流密度およびイオン種(ここでは、Ar^+ N^+ He^+を利用)に著しく依存することが分かった。現在までに得られた最高容量はHeイオンを使用した場合であり、さらにAI箔基板を回転させることにより1.54μF/cm^2の容量値を得ることが出来た。この静電容量は77%の容量出現率であり、これまでの最高値となっており熱蒸着法の実に14倍まで上昇している。○容量出現率はピット径を一定とした場合、錯体分子サイズに大きく依存し、現時点においてはTCNQ錯体のドナー・アクセプター比が1:1.3のとき容量出現率が最大となっている。有機薄膜アルミニウム(A1)電解コンデンサの実用化を図るため、本研究は三名の共同研究者により3年計画で以下のように(1)イオンアシスト法による有機蒸着膜の創成と薄膜作成技術および膜評価技術の確立(2)固体電解質として利用する各種TCNQ錯体の合成と高導電性有機物質の探索(3)試作有機薄膜A1電解コンデンサの諸特性の測定とその評価(4)各種電気・電子回路に試作コンデンサを実装し、運用と活用面から比較検討と評価を行うもので、最終年度(平成7年度)はこれまで2年間で得られた(1),(2),(3)の結果をもとに主に(4)に焦点を合わせて実施した。o固体電解質は、ドナー・アクセプターのモル比が1:1.3の4,4′-ジピリジル誘導体・TCNQ錯体を使用した時、最も容量出現率(最大80%程度まで上昇)が高くなり、それと同時に100eV前後の低エネルギーを用いたイオンビームアシスト法で成膜を行った蒸着膜(固体電解質)の導電率は10S/cm^2まで向上した。試作コンデンサの周波数特性は、10^5Hz以上で著しく改善されることが明らかとなり、本コンデンサを高周波インバータ回路およびスイッチング電源等に組み込み電気・電子素子としての機能評価を行った。その結果、従来の溶液型A1電解コンデンサに比べリップルが顕著に抑えられることが分かった。o本試作コンデンサの温度特性は、10^5Hz以上の高周波領域で、従来品で優れた特性を持つフィルムコンデンサ並みに安定していることが分かった。さらにまた本コンデンサはチップ化が図れるため、フィルムコンデンサと比べた場合、価格、サイズ等の点で有利となっている。以上の(1),(2),(3),(4)の研究から得られた結果と成果を報告書としてまとめた。
DNAメチル化による遺伝子発現の長期的な維持機構

本研究では、DNAやヒストンのメチル化といったエピジェネティックなクロマチン修飾に着目することで、個々の遺伝子の発現状態を正常に維持するメカニズムの解明を目的とした。昨年度までに、メダカの組織、およびヒトの公開データを用いたゲノムワイドな解析から、種間で保存された巨大なDNA低メチル化領域が発生において重要な機能を持つ転写因子を修飾していることを明らかにした。さらに、この巨大なDNA低メチル化領域は抑制型のヒストン修飾を非常に高レベルで含んでおり、遺伝子発現が非常に強く抑制されているということを明らかにした。成体の細胞においては、このDNA低メチル化領域のサイズが縮小することで長期的な遺伝子発現の維持に寄与していることが示唆された。25年度では、このDNA低メチル化領域の抑制型のヒストン修飾レベルが、DNA低メチル化領域内の非メチル化CpGの数と相関することを示した。先行研究において、抑制型のピストン修飾を修飾するポリコーム遺伝子群が非メチル化CpGに結合しやすいということが報告されている。従って、本結果と合わせると、初期胚においては、巨大なDNA低メチル化領域がポリコーム遺伝子群を呼び込み、発生を制御する転写因子の発現を強力に抑えることで未分化状態を維持していることが示唆された。また、メダカの変異体と野生型のヘテロ個体を用いた解析から、DNA低メチル化領域のサイズの縮小には、その領域のクロマチンが活性状態になることが必要であることを示した。この結果は、発生に重要な遺伝子は胚発生時期に発現すると自律的にDNA低メチル化領域の縮小が起こり、遺伝子発現が維持されることを示唆している。従って、本研究は巨大DNA低メチル化領域が細胞の分化・未分化状態の制御に寄与する可能性を示した。DNA低メチル化領域のサイズと遺伝子発現の抑制の強さが相関することを明らかにでき、DNA低メチル化の縮小が発生に重要な転写因子の長期的な発現維持に寄与する可能性を示すことができた。(抄録なし)個々の細胞における発生関連遺伝子の発現状態を生涯にわたり正確に維持することは脊椎動物にとって組織の成長や機能維持のために不可欠であり、多くの発生関連遺伝子の発現異常はガン化の原因にもなることが知られている。本研究では、DNAやピストンのメチル化といったエピジェネティックなクロマチン修飾に着目することで、個々の遺伝子の発現状態を正常に維持するメカニズムの解明を目的としている。私はこれまでに、メダカの組織を用いたゲノムワイドな解析から、生涯にわたり発現している遺伝子近傍ではDNAのメチル化レベルが上昇していること、このDNAのメチル化には遺伝子発現を制御するピストン修飾パターンの変化が伴うことを示した。本年度の研究では、これまでに得られたゲノムワイドデータを詳細に解析することで、発生関連遺伝子周辺のDNA非メチル化領域の大きさと抑制型ピストン修飾レベルが相関することを見出した。また、巨大なDNA非メチル化領域は内部に発生において重要な機能を持つ転写因子を多く含んでおり、それらの遺伝子発現量が非常に強く抑制されているという結果も得た。さらに、メダカのデータを公開されているヒトES細胞のデータと比較することで、このような巨大DNA非メチル化領域が脊椎動物の種を超えて保存されていることを明らかにした。一方、メダカ変異体を用いた解析から、DNAメチル化レベルの変化はクロマチン状態に依存することも示した。以上から、細胞の個性を決めるような重要な遺伝子ではDNA非メチル化領域の大きさが調節されることで遺伝子発現状態が維持されていることが示唆された。当初の研究計画通り、ゲノムワイドデータの解析からDNAメチル化と長期的遺伝子発現の関係の普遍性を示すことができた。長期的遺伝子発現に対するDNAメチル化の作用機序についても現在解析中である。

DNA低メチル化領域のサイズと遺伝子発現の抑制の強さが相関することを明らかにでき、DNA低メチル化の縮小が発生に重要な転写因子の長期的な発現維持に寄与する可能性を示すことができた。長期的遺伝子発現維持に対するDNAメチル化の作用機序を明らかにするために、DNAメチル化阻害実験を行う。すでにDNAメチル化を担う酵素が阻害されたトランスジェニックメダカを作成しており、その解析を行う。さらに、ゲノムワイドデータの解析を進めることでDNAメチル化の変化に寄与する候補因子の同定を行う。(抄録なし)
２種の色素分解酵素に秘められた反応のエッセンス

ヘムを異常に歪めて結合する新型ヘム分解酵素(結核菌MhuD・黄色ブドウ球菌IsdG)について、その特殊な反応機構を解明した。MhuDについては反応の全貌解明にほぼ成功し、同一活性中心で1原子/2原子酸素添加反応を融合する初めての酵素であることを示した。IsdGについても、反応条件によってはMhuDと同様の反応が支配的となることを示した。しかし、還元速度などに応じてHCHOの遊離が促進され、細菌における生合成の制御機構の1つと提案された。さらに、新規ヘム代謝物を色素とする蛍光蛋白質の開発にも取り組み、通常生成物に対する選択性の向上など、有望な結果を得た。本年度は、結核菌由来の新型ヘム分解酵素(MhuD)の特殊なヘム分解機構の解明を進めた。これまでの研究により、MhuDと従来型ヘム分解酵素(HO)の反応分岐点が“水酸化ヘム"中間体であることが示唆されている。まず水酸化ヘムの生成を確認するため、嫌気条件でヘム-MhuD複合体と過酸化水素の反応を行った。主生成物として得られたのは不活性型の鉄4価錯体であったが、還元剤の存在下、過酸化水素との反応を繰り返すと水酸化ヘムの蓄積が確認された。よって、MhuDの初反応は「効率の悪い」自己水酸化(1原子酸素添加)であることが証明された。次いで水酸化ヘムの開環機構を検討した。通常、ポルフィリン環の開裂には分子状酸素に加えて、還元剤や過酸化水素が必要であるが、MhuD反応では酸素のみで開環が進行した。さらに、酸素の必要量は水酸化ヘムに対して1モル当量であったため、2原子酸素添加機構が示唆された。実際、酸素との反応で生じる中間体について同位体ラベル実験を行ったところ、1つの酸素分子から2つの酸素原子が基質に取り込まれていることが示され、2原子添加機構が証明された。さらに反応解析を進めた結果、酸素は中心鉄ではなくポルフィリン環を直接攻撃し、ジオキセタン中間体を経由して開環すると提案された。酸素との反応で観測された中間体は、各種分光測定や質量分析の結果、鉄-マイコビリン錯体と示唆された。以上の成果により、MhuDによるマイコビリン生成機構はほぼ解明された。MhuDの特殊な代謝反応は2つの酸素添加モードの機能的な融合で生み出されることが示された。異種機能の融合は酵素機能の可能性を広げる設計戦略として、生物的にも重要と考えられる。ヘム代謝反応は多段階に渡る複雑な反応であるが、今年度の研究で新規MhuD反応機構のほとんどを解明することに成功した。特に、従来は想定もされていなかった2原子酸素添加による開環反応を発見したことは高く評価され、主な研究成果はProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A誌に掲載された。2原子酸素添加の証明には生成物の同位体ラベル実験が行われるが、ホルミル基と水分子の酸素交換のために明確な結果は得られなかった。しかし、反応中間体をタンパク質複合体のまま測定する手法の開発に成功したことで、酸素交換の影響を排除した機構決定が可能となった。今後、同様の手法は酵素メカニズム研究の重要なテクニックの一つになるとも考えられる。PaOタンパク質の研究については少し遅れがあるものの、既に基本的な発現系の構築を終え、発現条件や可溶化タグの最適化を進めており、次年度には十分な成果が得られると考えている。以上のことから、現在までの達成度は「概ね順調に進展している」ものと考えている。本年度は、黄色ブドウ球菌由来の新型ヘム分解酵素(IsdG)の詳細な反応研究を進め、歪みに誘起される特殊なヘム分解機構解明を目指した。IsdGは基質であるヘムを異常に歪めて結合させることで、スタフィロビリン(SB)とホルムアルデヒド(HCHO)という特殊なヘム代謝物を与えると報告されていた。しかし今年度の反応解析によって、HCHO遊離は限定的な条件(Trisバッファー中、シングルターンオーバー)でのみ支配的であり、他の条件ではHCHOを遊離しない分解反応も進行した。得られた新規生成物は"ホルミル基が結合したSB"(SB-CHO)と予想されたが、HPLC及びESI-MSによる解析の結果、反応に用いた還元剤(アスコルビン酸)の付加が確認された。アスコルビン酸は生理的な還元剤とは考えにくく、その付加体はアッセイ条件に依存するアーティファクトと考えられる。そこで還元酵素(CPR)や低濃度アスコルビン酸によるヘム分解を試みたところ、予想通り、アスコルビン酸が付加していない新規生成物が得られ、IsdG本来の生成物と考えられた。これらの生成物を大量調製し、ESI-MSおよびNMRによって構造を検証した結果、SB-CHOと同定された。SB-CHOは、結核菌の同型酵素MhuDにおける生成物の位置異性体にあたり、その生成は昨年度までに解明したMhuD型の反応機構で説明できる。そこでMhuD反応の鍵中間体(水酸化ヘム)とIsdG複合体の反応を検討したところ、2原子酸素添加機構による開環反応が強く示唆された。また、水酸化ヘムと酸素のみの反応ではSB-CHOが選択的に生成し、還元剤の共存下ではHCHOの遊離・SBの生成が見られた。水酸化ヘム自体は同条件では還元されないため、酸素が反応した後に開環中間体が還元されることで、HCHOの遊離は制御されると考えられる。

この様な生成物の制御機構は、細菌におけるHCHO合成量の調節機構としても注目される。前年までに結核菌MhuDの新規反応機構をほぼ解明し、黄色ブドウ球菌IsdGでも同等の機構が期待されていた。しかし、IsdGは反応条件によって多彩な生成物を、非常に複雑なパターンで与えるため、詳細な反応機構はもちろん、その概要さえ掴めていなかった。本年度の研究でIsdG生成物の多くの構造同定に成功したことは、その概要解明に極めて重要な成果である。中でも、アスコルビン酸付加体の生成は非常に珍しい現象であり、ラジカル性の中間体の生成を示唆するだけでなく、他の酵素でも同様の付加体が得られる可能性を強く示唆する。よって、この様な人工還元剤の使用には細心の注意が必要である。生成物の同定と併せて、前年度までの研究成果・手法を活用することで、IsdG反応についても、かなり詳細な部分まで解明することに成功した。PaOタンパク質の研究については少し遅れがあるものの、既に基本的な発現系の構築を終え、発現条件や可溶化タグの最適化を進めており、次年度には十分な成果が得られると考えている。以上のことから、現在までの達成度は「概ね順調に進展している」ものと考えている。本年度は、まず新型ヘム分解酵素(IsdG)の詳細な反応研究を進め、ヘムの異常な歪みに誘起される、特殊な分解機構の解明を目指した。IsdGの生成物はホルムアルデヒド(HCHO)とスタフィロビリン(SB)とされてきたが、生体内に近い反応条件ではHCHOの収率は約10%と低く、"ホルミル基が結合したSB"(SB-CHO)が主生成物として得られた。SB-CHOはヘムの1原子酸素添加、および、生成する水酸化ヘムへの2原子酸素添加によって生成すると考えられる。実際、SB-CHOに導入された3つの酸素原子は全てO2由来であることが確認された。一方、HCHOを遊離したSB生成物でも3つの酸素原子はO2由来であり、加水分解による脱ホルミル反応はほぼ否定された。また、3つの酸素は全て異なるO2分子に由来しており、3度のO2活性化で反応が進行することが示された。よって、SB-CHOと同様の1原子/2原子酸素添加の後、還元的なO2活性化が脱ホルミル化を促進すると示唆された。今後、HCHOの酸素源の決定が望まれる。本年度はさらに、特殊なヘム分解産物の生体内検出を目指し、新たな蛍光タンパク質の開発も試みた。これまでの研究で、ほ乳類型ヘム分解酵素が特定の反応条件下では硫黄原子を取り込んだビリルビン(S-BR)を与えることを見いだした。そこで、ビリルビン(BR)結合型蛍光タンパク質UnaGをベースとし、S-BRを選択的に検出するシステムの構築を試みた。S-BRとUnaG複合体の蛍光強度は非常に弱いものの、BR結合型に比べて励起/蛍光波長が70 nm程度も長波長シフトし、選択的検出は可能と考えられた。また、(S-)BR結合部位に系統的な変異を導入した結果、SBR蛍光の増強やBR蛍光の低減に成功した。今後、これらの変異を組み合わせるなどすることで、SBRの選択的検出は実現可能と考えられる。ヘムを異常に歪めて結合する新型ヘム分解酵素(結核菌MhuD・黄色ブドウ球菌IsdG)について、その特殊な反応機構を解明した。
ポリセオナミドを基盤としたイオンチャネル形成分子の設計・合成・機能制御

本研究は、イオンチャネル形成ペプチド天然物であるポリセオナミドBの構造改変により、その極めて強い細胞毒性を制御するための方法論確立を目的とし、機能制御および詳細な細胞毒性発現評価のために必要となるポリセオナミドBおよびその類縁体の効率的な固相合成法の確立を目指した。適切な保護基戦略を用いることにより、ポリセオナミドBの固相全合成を達成した。これにより、これまで多段階の液相反応やHPLC精製を要した合成が、飛躍的に簡便な操作で実施可能となった。また、量的供給の観点からも優れた合成法を確立した。ポリセオナミドチャネルの側鎖メチルアミド基周辺の立体障害を増大させる目的で、第33残基にN-イソプロピルアスパラギンを導入したダンシルポリセオナミドミミック類縁体の合成を行い、機能評価を試みた。まず固相合成で使用するFmoc保護されたN-イソプロピルアスパラギンの合成を行った。続いて、マイクロウェーブ固相合成により第33残基にN-イソプロピルアスパラギンを導入したC末端(12-48残基)フラグメントの合成を行った。このフラグメントにダンシル基を導入し、さらにN末端(1-11残基)フラグメントチオエステルとの液相カップリングを行うことで全体構造(1-48残基)を構築した。続くTFAを用いた脱保護により、第33残基にN-イソプロピルアスパラギンを有する目的の類縁体ペプチドを得た。また、この類縁体ペプチドのP388マウス白血病細胞に対する細胞毒性をXTT法により評価したところ、ダンシルポリセオナミドミミック(IC50 = 12 nM)と同等(IC50 = 8.8 nM)の活性を示すことが明らかとなった。また、主鎖アミノ酸を置換した各種誘導体の合成・評価の効率を向上することを目指し、ポリセオナミドミミックの完全固相合成のための検討を行った。樹脂をChemMatrixに変更し、マイクロウェーブ固相合成により、樹脂に担持されたC末端フラグメントを得た。これに対し、N末端フラグメントを樹脂上で縮合する検討を行ったところ、PyBOP/HOAtを用いた条件により全体構造が得られることが分かった。得られたペプチドを樹脂から切断し、脱保護することで、起点構造を総収率3%で構築することに成功した。従来法の10倍以上の総収率であり、また液相反応は脱保護の1回のみ、HPLCによる精製も全工程を通して2回のみで実施可能であることから、大幅に効率化された合成法を確立できたと言える。N-イソプロピルアスパラギンが第33残基に導入されたダンシルポリセオナミドミミック類縁体の合成を達成し、このP388マウス白血病細胞に対する細胞毒性を評価することで、主鎖置換体の機能に関する予備的なデータを得ることができた。さらに各種機能評価を実施することで、今後合成する類縁体に関して、ダンシルポリセオナミドミミックおよび今回合成した類縁体のデータと比較することが可能になる。また、今後さらなる類縁体の合成を行うことを踏まえ、合成効率化を目的として完全固相合成の検討を行った結果、これを実現し、収率を大幅に向上することができた。以上より、今後の類縁体合成が従来よりも短期間で効率的に実施可能になることが期待される。本研究は、イオンチャネル形成ペプチド天然物であるポリセオナミドBの極めて強い細胞毒性を構造改変により制御することを目指した。この機能制御を実現するためには、詳細な細胞毒性発現機構の解明と、そのために必要となるポリセオナミドBおよび類縁体の効率的供給が不可欠である。従来のポリセオナミドBの合成法では、側鎖極性官能基によるペプチド鎖の会合・凝集や副反応により、固相のみで全体構造を構築することが困難であった。そのため、合成終盤に多段階の液相反応やHPLC精製を要し、原理的に多種類の誘導体合成には適さなかった。そこで、機能制御および詳細な細胞毒性発現評価のために必要となる効率的な固相合成法の確立を目指し、天然物であるポリセオナミドBの固相全合成のための検討を行った。本合成を実現するため、側鎖ヒドロキシ基に新たに保護基を導入し、凝集や副反応を抑制することとした。この新たな保護基戦略は、これまで合成困難であった37残基からなるポリセオナミドBフラグメントの固相合成による構築を実現した。また、固相担体上における2個のフラグメント連結によりポリセオナミドBの全体構造を構築することに成功した。さらに、適切な脱保護条件を用いることによりポリセオナミドBの固相全合成を達成した。固相反応を主体とした新合成法は従来法と同等の総収率でポリセオナミドBを与え、液相反応を主体とした従来法と比較して簡便な操作で実施可能なだけでなく、量的供給の観点からも優れた合成法であり、ポリセオナミドBおよびその類縁体の合成法として飛躍的に効率化された。また、本研究成果は、巨大複雑構造ペプチドの合成における保護基戦略に関しても新たな知見を与えるものである。