hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
幾何曲面を持つ機械部品の創成CBN研削に関する基礎的研究

電着CBN皿形砥石と浸炭焼入れ鋼の試験片を用いた定圧極微小量平面研削実験において、CBN砥粒の脱落が顕著に起こった。この損傷には、(1)被削材によるニッケルボンドの損傷(2)被削材屑のCBN砥粒被覆による電着層の剥離、(3)高接触圧力によるCBN砥粒の〓開、の3種があり、研削速度の遅いとき、研削圧力の高いとき、振動的な負荷が作用するとき、試験片のエッジ部を研削しているときに顕著に起こることが明らかとなった。この事実は、創成CBN研削に於ける問題点を解く鍵を与えるものと考えられる。浸炭焼入れ鋼の円盤状試験片の外周を、種々の滑り・転がり速度の条件の下で電着CBN皿形砥石に押し付ける定圧極微小量平面研削実験を行い、押しつけ圧力・研削速度(滑り速度)・転がり研削量のあいだの関係を実験的に求めた。極めて遅い研削速度の下での定圧極微小量平面研削に於いては、比研削量(研削量/被加工物が砥石をこすった距離)は、(1)研削速度には依存せず、(2)押しつけ圧力に比例し、(3)転がり速度が増加するほど増加するという、通常の研削加工の場合と異なる挙動が明らかとなった。代表的なCBN創成研削加工法である歯車形CBN電着砥石による焼入れ歯車の仕上げ研削加工について、開発したシミュレ-ションプログラムにこの結果を用い、歯車形CBN砥石の形状精度や加工条件により、加工工程中に歯車形CBN砥石にどのような力が働くのか、仕上げ加工された歯車の製作精度はどのようになるのかを検討した。また、歯車形CBN砥石ならびに浸炭焼入れ被削試験歯車を製作し、研削加工実験を行った。シミュレ-ション結果と実験結果は、被加工物の研削取り代等についてかなり良い一致を見たが、ミクロンオ-ダ-の歯面形状精度については、対応に若干の相異が認められた。この主たる原因は、CBN砥粒電着後の歯車形砥石の形状精度の測定が不可能であるため、実際の砥石形状精度が正確につかめなかったこと、実験に用いた研削盤自体の剛性やバックラッシュに若干の問題があったことにあると考えられる。しかし、焼入れ後の被研削歯車の取り代が熱処理歪のために局部的に大きくなるところでは、CBN砥粒の損傷が容易に起こるような研削圧力になることが明らかになるなど、加工条件の設定について有用な知見が得られた。
大動脈解離におけるマクロファージ分化制御機構の解明と治療応用への挑戦

血行動態負荷によって生じた大動脈の微小損傷は、マクロファージStat3活性を亢進したmSocs3-KOで解離に進展した。mSocs3-KOの微小損傷ではマクロファージが炎症性優位に機能分化し、平滑筋は血行動態負荷により増殖応答と組織修復能が増加したが、微小損傷では有意に低下していた。修復能低下のメカニズムとして、増殖応答の阻害因子で細胞老化や組織修復能の低下にも深く関わるInk4a/Arf発現が亢進していることを発見した。マクロファージ機能分化により炎症が亢進される一方、修復能を持つ平滑筋への機能分化が抑制されることにより解離を発症すると考えられた。大動脈解離は大血管が破綻して死に至る重篤な疾患である。保存的治療や外科的治療が行われるが、効果的な内科的治療はなく、また予防法もない。我々は大動脈に血行動態的負荷をかけると微小な血管障害を生じる事、またマクロファージ特異的にIL-6系シグナルを亢進すると血管障害から大動脈解離へ進展する事を発見した。大動脈組織の遺伝子発現を調べたところ、血管障害を発症する前から細胞増殖に関わる遺伝子発現が亢進し、血管障害後は炎症応答に関わる遺伝子発現が亢進していた。さらに、IL-6系シグナルを亢進したマウスではそれぞれの遺伝子発現がより強く見られ、一方で平滑筋機能や細胞外マトリックス代謝に関わる遺伝子発現が抑制されていた。細胞増殖と炎症応答について、組織で起こる変化を調べたところ、免疫蛍光染色により中膜、外膜の細胞で細胞増殖が亢進していることが判明した。また、血管障害に浸潤したマクロファージはIL-6系シグナル亢進により炎症性のM1マクロファージに分化していることが判明した。当該年度はヒトの大動脈解離におけるIL-6系シグナルとマクロファージの動向を免疫蛍光染色で調べた。また、マウスモデルにおける血管平滑筋の機能分化について、マーカータンパクの解析を開始した。マウス解離モデルを使用したこれまでの研究により、IL-6系シグナルを亢進したmSocs3-KOでは解離へ進展する事があきらかとなった。本年度はヒト大動脈組織を用いて、IL-6系シグナルの下流分子である活性化STAT3とマクロファージの二重戦色を行った。ヒト大動脈解離の組織では、外膜と中膜外側を中心にマクロファージSTAT3が活性化していた。さらに、解離の先端方向にある非解離組織では解離部よりも強くマクロファージSTAT3が活性化しており、マクロファージSTAT3が解離の進展に重要である事が示唆された。また、mSocs3-KOで平滑筋機能に関連する遺伝子発現が抑制されていたことを受け、大動脈の平滑筋分化マーカーについてウェスタンブロットによる解析を開始している。大動脈解離は大動脈が破綻して死に至る重篤な疾患である。予防法は確立されておらず、保存的もしくは外科的治療を行っても慢性的に進行して合併症を来す例も少なくない。これまでの研究で、血行動態負荷によって生じた大動脈の小さな血管損傷が、マクロファージ特異的にIL-6系シグナルを亢進したマクロファージ特異的Socs3ノックアウト(mSocs3-KO)マウスでは病態が進展し、解離を発症することを発見した。マクロファージIL-6系シグナルの解離発症メカニズムを解明するため正常大動脈から血管損傷までを経時的に解析した。経時的トランスクリプトーム解析によると、野生型大動脈では血管損傷により炎症関連遺伝子や増殖応答関連遺伝子の亢進が見られた。mSocs3-KOではより早い血行動態負荷のみの段階でより強い変化が見られ、収縮線維や細胞骨格など平滑筋機能を示唆する遺伝子発現が抑制されていた。血管損傷に浸潤したマクロファージの形質を調べると、mSocs3-KOでは炎症性マクロファージへ分化する傾向を示していることがわかった。またヒト解離組織を用いた蛍光染色では血腫の進展部位においてマクロファージSTAT3の活性化が亢進しており、ヒト解離病態においても病態進行とマクロファージSTAT3との関連が示唆された。上記より、マクロファージIL-6系シグナルは血行動態負荷により炎症応答、増殖応答、平滑筋機能に影響を与え解離発症に寄与していると考えられた。当該年度は炎症応答、平滑筋分化型に着目してタンパクレベルの経時的解析を行い、野生型とmSocs3-KOを比較した。これまでの研究で、病態の進行とともに炎症応答、平滑筋機能の変化がもたらされる事がわかった。本年度は「コントロール」、「シャム手術」、「血行動態負荷」、「血管損傷」の各4病期に採取した大動脈を用いて、タンパクレベルで炎症応答、増殖応答、平滑筋機能、細胞外マトリックス代謝について解析した。ウェスタンブロットによる解析の結果、野生型ではコントロールから血管損傷に病態が進行するにつれ炎症応答(JNK)、増殖応答(Cyclin D3)、平滑筋脱分化(SMemb)が上昇し「血管損傷」の時点で最大値となった。mSocs3-KOでは血管損傷の至る前の「血行動態負荷」の時点で最大値となり、これらの分子が早期に高値となる事がその後の解離への進展へ関連する事が示唆された。大動脈解離は大動脈が突然破綻して死に至る重篤な疾患である。急性発症であるため予防は難しく、救命できても慢性期に合併症を来す例が少なくない。

解離にはIL-6とマクロファージが重要と報告されており、マクロファージ特異的にIL-6系シグナルを亢進すると解離病態にどう影響するか、マクロファージ特異的Socs3ノックアウト(mSocs3-KO)マウスを用いて調べた。ヒト解離組織を用いた蛍光染色では解離進展部位でマクロファージIL-6シグナル下流分子STAT3の活性化が亢進しており、ヒト解離病態への関連が示唆された。マウスモデルでは、血行動態負荷によって生じた大動脈の微小損傷が、mSocs3-KOでは解離に進展することを発見した。微小損傷までの経時的トランスクリプトーム解析によると、野生型では微小損傷により炎症や増殖に関連する遺伝子の発現が亢進していた。これらはmSocs3-KOでは微小損傷前から亢進しており、平滑筋に関連する遺伝子発現は抑制されていた。これらより解離に先だってマクロファージや平滑筋の表現型が変化していると考えた。微小損傷に浸潤したマクロファージの分化状態を調べたところ、mSocs3-KOでは炎症性M1へ分化する傾向を示した。平滑筋は野生型では病態の進行とともに収縮型の減少、合成型の増加を呈していた。この変化と並行してLOX、pSmad2も増加しており、修復能の亢進が示唆された。一方、mSocs3-KOでは微小損傷前に修復応答のピークを迎え、微小損傷では修復応答の低下を認めた。以上より、マクロファージIL-6系シグナル亢進はマクロファージの形質変化を含む炎症応答の亢進と平滑筋の形質変化による修復能の低下を経て解離を進展させることが明らかとなった。急性発症すると考えられている解離だが、多段階の分子変化を経ており、臨床応用が期待される。血行動態負荷によって生じた大動脈の微小損傷は、マクロファージStat3活性を亢進したmSocs3-KOで解離に進展した。mSocs3-KOの微小損傷ではマクロファージが炎症性優位に機能分化し、平滑筋は血行動態負荷により増殖応答と組織修復能が増加したが、微小損傷では有意に低下していた。修復能低下のメカニズムとして、増殖応答の阻害因子で細胞老化や組織修復能の低下にも深く関わるInk4a/Arf発現が亢進していることを発見した。マクロファージ機能分化により炎症が亢進される一方、修復能を持つ平滑筋への機能分化が抑制されることにより解離を発症すると考えられた。1.平滑筋機能マウス大動脈の平滑筋分化マーカーの解析を継続し、野生形とmSocs3-KOで平滑筋分化状態を比較する。2.マクロファージSTAT3既知の培養実験ではSTAT3活性化マクロファージはM1分化能が高い事がしられており、本研究でも大動脈組織のフローサイトメトリーによるとmSocs3-KOではM1/M2マクロファージ比が高くなっていた。本年度に確立したマクロファージと活性化STAT3の二重染色プロトコールを用い、マウス大動脈におけるマクロファージSTAT3活性化について野生形とmSocs3-KOを比較する。野生型マウスにコラーゲン重合阻害薬BAPNとアンジオテンシンIIを投与すると、約2週間で解離を発症する(BAPNモデル)。BAPNモデルで解離発症前のマクロファージ分化型を確認する。BAPNモデルでIL-6受容体中和抗体、JAK阻害薬、STAT3阻害薬を投与して炎症性マクロファージへの分化を抑制し、解離発症が抑制されるか調べる。心臓・血管内科
緊急時において公衆の線量を遡及的に測定評価する実用的技術の開発

本国際共同研究では,年代測定等の研究分野で用いられている最先端の測定技術・ノウハウを活用し,生物学的な線量評価に比べてより迅速かつ高精度に個人の被ばくレベルと被ばく状況(入射方向,線質、部位等)を把握する実用的な線量評価法を、世界に先駆けて開発し社会実装することに取り組んでいる。具体的には、被ばくした人から採取した生体試料(爪、髪、歯のエナメル質等)についての放射線応答から直接的に人体が受けた被ばくレベルを推定すると共に、生体試料に比べて高感度でバックグランドが低く試料による応答の差異が比較的少ない化学的に安定した素材(携帯電話の部品、アクセサリ、衣類等)を複合的に用いて,それらの試料に含まれるラジカル量あるいはその量に相関する信号(電子スピン共鳴吸収ESR、光刺激蛍光OSL、熱刺激蛍光TL等)を測定する。それらのデータを総合的に解析することにより,被ばくの状況と人体各部位が受けた線量を精緻に再現する方法を開発し、実用的なプロトコルを提示する。本研究は順調に進捗しており、初年度となる2018年度には、研究代表者と若手研究者である研究分担者が本共同研究の相手方であるオーストリア国・ザルツブルグ大学のグループを訪問し、同グループが有する高性能のラジカル測定技術や先端的な試料処理設備を見学し使用スケジュールの調整を測るとともに、具体的な研究実施計画の策定に取り組んだ。相手方が有する最先端の測定装置・解析技術についても、持参した試料の一部を実際に測定させてもらい、機器の性能や留意点を確認するとともに、一連の作業手順を修得した。次年度(2019年度)には相手方の施設に一ヶ月近く滞在して放射線由来のOSL/TL測定を行い、各手法の線量評価精度についての考察を経て、画期的で実用的な線遡及的量評価法の開発・実用化に取り組む。当初計画していたとおり、先方の施設を訪れて、想定していたとおり先方が保有する最先端の実験機器を使用して一部の試料を測定することができた。また、当該科研費事業として、今後4年間にわたり密な共同研究を実施していくことについて先方の合意を得ることができ、次年度以後に実施する研究の計画について議論・立案し、スムーズに研究を実施する目途が立った。次年度(2019年度)には、日本側が有する放射線照射装置で一定量の放射線を照射した試料を若手研究者(廣田)が相手方に持参し、相手方が有する最先端の測定装置・解析技術を十分に修得するとともに、約一ヶ月間相手方の施設に滞在して持参した試料および相手方との比較較正に有用な現地の試料を用いて放射線由来のOSL/TL測定等を行う。そして、それらのデータから推定した線量値と日本側で測定・取得したESR信号の測定データに基づく線量値との比較を行い、各手法の遡及的線量評価の精度について考察し、その成果を論文にまとめて投稿する。

そして、それらのデータから推定した線量値と日本側で測定・取得したESR信号の測定データに基づく線量値との比較を行い、各手法の遡及的線量評価の精度について考察し、その成果を論文にまとめて投稿する。相手方の研究者を当該年度(2018年度)内に当該科研費事業の経費により招聘することを計画していたが、先方の事情により次年度(2019年度)に延期することになり、そのため次年度使用額の増が生じた。
血液-組織関門におけるグルコース輸送体蛋白発現の分子形態学的研究

グルコースは,代謝の其質として,きわめて重要な役割をはたしている.ヒトを含む高等動物では,グルコースは血液によって体内の隅々にまで供給されている(血糖).一方で,特殊に分化した組織細胞の集合体である高等動物では,「血液-組織関門」が存在し,血液成分の自由な流入が阻害されている部位がいくつか存在する.脳(血液・脳関門),眼(血液-眼関門),胎盤(胎盤関門)などがそれである.本研究では,これらの関門部位における関門内へのグルコース輸送の分子機構を,形態学的なアプローチにより解析した.グルコース輸送体の各アイソフォームに対する特異抗体は,アイソフォームに特異的な合成ペプチドを抗原として家兎で作製した.一部のものについてはアフィニティー精製して用いた.ラット胎盤関門と,ラット血液-眼房水関門においては,2層の上皮細胞層(合胞体細胞ないしは,毛様体上皮細胞)が関門をなす.私は血液-組織関門に特に多量に存在しているGLUT1グルコース輸送体が,この関門をなす細胞の細胞膜に多量に局在するのを明らかにした.しかも関門のそれぞれの側のコンパートメントに面する細胞膜に特に多量に存在した.2層の上皮細胞層同士はきわめて良く発達したギャップ結合で結ばれていた.ラット胎盤での予備的な実験では,このギャップ結合はコネクシン26からなっていた.したがって「GLUT1グルコース輸送体→コネクシン(26)→GLUT1グルコース輸送体」という順で,グルコースは2層の上皮細胞層からなる血液-組織関門を通過すると推定される.グルコースは,代謝の其質として,きわめて重要な役割をはたしている.ヒトを含む高等動物では,グルコースは血液によって体内の隅々にまで供給されている(血糖).一方で,特殊に分化した組織細胞の集合体である高等動物では,「血液-組織関門」が存在し,血液成分の自由な流入が阻害されている部位がいくつか存在する.脳(血液・脳関門),眼(血液-眼関門),胎盤(胎盤関門)などがそれである.本研究では,これらの関門部位における関門内へのグルコース輸送の分子機構を,形態学的なアプローチにより解析した.グルコース輸送体の各アイソフォームに対する特異抗体は,アイソフォームに特異的な合成ペプチドを抗原として家兎で作製した.一部のものについてはアフィニティー精製して用いた.ラット胎盤関門と,ラット血液-眼房水関門においては,2層の上皮細胞層(合胞体細胞ないしは,毛様体上皮細胞)が関門をなす.私は血液-組織関門に特に多量に存在しているGLUT1グルコース輸送体が,この関門をなす細胞の細胞膜に多量に局在するのを明らかにした.しかも関門のそれぞれの側のコンパートメントに面する細胞膜に特に多量に存在した.2層の上皮細胞層同士はきわめて良く発達したギャップ結合で結ばれていた.ラット胎盤での予備的な実験では,このギャップ結合はコネクシン26からなっていた.したがって「GLUT1グルコース輸送体→コネクシン(26)→GLUT1グルコース輸送体」という順で,グルコースは2層の上皮細胞層からなる血液-組織関門を通過すると推定される.ラットを用い、血液ー組織関門を有する臓器として脳、毛様体、網膜、精巣、胎盤、末梢神経などを採取し、グルコース輸送体蛋白の検索をおこなった。cDNAの塩基配列から予測されるアミノ酸配列の情報を用い、各グルコース輸送体アイソフオーム相互でホモロジーが見れれず、かつ親水性の部位(C末ないしその近傍)の10ないし13個のペプチドを合成し、ヘモシアニンと結合させて抗原として抗体作製を試みた。このような方法等により一応GLUT1GLUT5の抗体を得ているが、ラットでの免疫染色には適さないものもあり、現在さらによりよい抗体を調製中である。ラット胎盤関門では母体血側から、1層の細胞性栄養膜細胞、2層からなる合胞体栄養膜の細胞、基底膜、胎子血管の内皮細胞の順に層状構造をなす。このなかで2層からなる合胞体栄養膜細胞の、母体血に接する側と胎子血管側の細胞膜に多量のGLUT1が局在するのを見いだした。一方細胞性栄養膜細胞と胎子血管の内皮細胞にはGLUT1陽性所見は見いだされなかった。超薄切片の電顕観察ならびに凍結割断レプリカ法により観察すると、2層の合胞体栄養膜細胞層は良く発達したギャップ結合により連結している。また細胞性栄養膜細胞と胎子血管の内皮細胞は、その扁平化した部位に窓を有していた。以上の所見から、ラット胎盤において、母体血グルコースは、(1)GLUT1によりまず1層目の合胞体栄養膜細胞に入る。(2)ギャップ結合により2層目の合胞体栄養膜細胞へ移行する。(3)2層目の合胞体栄養膜細胞の基底部細胞膜GLUT1により胎子循環へと入ると推定される。このように細胞膜輸送体蛋白GLUT1とギャップ結合の協同作用によりラット胎盤関門をグルコースが透過していると考えられる。グルコースは,代謝の其質として,きわめて重要な役割をはたしている.ヒトを含む高等動物では,グルコースは血液によって体内の隅々にまで供給されている(血糖).一方で,特殊に分化した組織細胞の集合体である高等動物では,「血液-組織関門」が存在し,血液成分の自由な流入が阻害されている部位がいくつか存在する.脳(血液-脳関門),眼(血液-眼関門),胎盤(胎盤関門)などがそれである.

本研究では,これらの関門部位における関門内へのグルコース輸送の分子機構を,形態学的なアプローチにより解析した.グルコース輸送体の各アイソフォームに対する特異抗体は,アイソフォームに特異的な合成ペプチドを抗原として家兎で作製した.一部のものについてはアフィニティー精製して用いた.ラット胎盤関門と,ラット血液-眼房水関門においては,2層の上皮細胞層(合胞体細胞ないしは,毛様体上皮細胞)が関門をなす.私は血液-組織関門に特に多量に存在しているGLUT1グルコース輸送体が,この関門をなす細胞の細胞膜に多量に局在するのを明らかにした.しかも関門のそれぞれの側のコンパートメントに面する細胞膜に特に多量に存在した.2層の上皮細胞層同士はきわめて良く発達したギャップ結合で結ばれていた.ラット胎盤での予備的な実験では,このギャップ結合はコネクシン26からなっていた.したがって「GLUT1グルコース輸送体→コネクシン(26)→GLUT1グルコース輸送体」という順で,グルコースは2層の上皮細胞層からなる血液-組織関門を通過すると推定される.
温度による行動制御の基盤となる快・不快情動生成機構の解明

これまでに神経活動マーカーcFosの免疫染色により、暑熱・寒冷環境において視床室傍核が活性化することを明らかにしてきた。本年度は、視床室傍核の下流経路を明らかにするため、快・不快情動に関与する側坐核、扁桃体中心核、分界条床核に着目し、これらの脳領域に投射する神経細胞を逆行性に標識した。その後、暑熱・寒冷環境暴露による視床室傍核での神経細胞活性化をcFos免疫染色により可視化した。暑熱・寒冷環境暴露により側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射する視床室傍核神経細胞が活性化することが明らかとなった。定量的な解析を行ったところ、視床室傍核のcFos陽性神経のうち、側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射しているものは、暑熱環境では、56.1%、50.5%、20.9%、寒冷環境では、40.0%、48.1%、24.0%であった。さらに、暑熱・寒冷環境曝露中の視床室傍核の神経活動を小型蛍光顕微鏡を用いたカルシウムイメージング法によりリアルタイムに計測する実験系を構築した。また、領域内の坂口班との連携により、温度感受性蛍光プローブtsGFPを活用した脳内温度計測法の開発に着手した。2019年度の研究において、ファイバーフォトメトリー法により温度選択行動中の動物の脳内温度変化と神経活動変化を同時計測する実験系を構築することを目指す。脳浮腫領域では乳酸アシドーシスに伴う約2°Cの異常発熱が起こっており、これがTRPV4を異常活性化させ浮腫病態を増悪することを見いだした(岡部班との連携成果)。また、グリア細胞が浮腫を起こした際に、体温にプラスして浮腫に伴う膜伸展刺激が生じることがTRPV4の異常活性化を引き起こし、サイトカイン放出を惹起し、神経細胞死を引き起こすことを見いだした(ルーベン大学・ユタ大学との国際連携研究成果)。暑熱・寒冷環境暴露により側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射する視床室傍核神経細胞が活性化することを明らかとし、定量的な解析も行った。以上より、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。神経活動マーカーc-Fosの発現解析により、視床室傍核から快・不快情動生成に関与する側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射する神経が暑熱・寒冷環境曝露により活性化することを明らかにしている。しかしながら、c-Fosタンパク質発現を指標とした免疫組織学的解析では、時間分解能が低く神経細胞活性化の時間経過を詳細に解析することが困難であり、また、暑熱環境曝露と寒冷環境曝露で同じ神経細胞が活性化するのか、あるいは、刺激により異なった神経細胞が活性化するのかについても明らかにすることができない。そこで今年度の研究では、小型蛍光顕微鏡を用いて、暑熱・寒冷環境曝露中の神経活動をカルシウムイメージングによりリアルタイムに計測する。この方法により1つ1つの神経細胞の活動を経時的に記録することができ、各神経細胞がどのような刺激により、どのような時間経過で活性化するのかを明らかにすることができる。さらに、昨年度に引き続き、領域内の共同研究により温度感受性蛍光プローブtsGFPを活用した脳内温度計測法を開発する。ファイバーフォトメトリー法を用いて、温度選択行動中の動物の脳内温度変化と神経活動変化の同時計測を試みる。研究分担者の柴崎は、培養アストロサイトにおける温度感受性蛍光プローブtsGFPの温度計測機能を検証するとともに、アストロサイト特異的TRPV4ノックアウトマウスの急性海馬スライス標本を用いて、カルシウム活動・細胞代謝・細胞内温度に野生型マウスとの違いがどの程度あるのかを調べる。カルシウム活動はYC nano3.1、細胞代謝はGO-ATeamを用いたFRET計測にて調べる。細胞内温度分布はFPTあるいはtsGFPによる蛍光変化計測にて調べる。環境温度選択は、多くの動物に共通してみられる体温調節機構であり、「行動性体温調節」と呼ばれるが、これには、温度により惹起される快・不快情動が重要である。しかしながら、日常生活において経験する寒暖、すなわち、040°Cの温度領域において環境温度を感知して快・不快情動が生成するメカニズムは未だ明らかでない。そこで本研究では、研究代表者らが不快情動生成への関与を示した分界条床核内神経情報伝達と、快情動生成に関与する側坐核内神経情報伝達に着目し、040°Cの温度環境での快・不快情動生成の神経機構を明らかにする。

さらに、脳局所温度計測・制御デバイスを活用し、領域内での共同研究を密に進めることにより、脳局所温度センシングによる快・不快情動生成と代謝・生体リズム制御の可能性を検討するとともに、生体リズムに起因する脳局所温度変化の生理的意義を明らかにすることを目的とする。平成27年度には以下の研究を行った。1)インビボマイクロダイアリシスにより暑熱環境下において分界条床核でのノルアドレナリン遊離が亢進することを明らかにした。2)c-Fosマッピングにより暑熱環境下で活性化する神経細胞の脳内分布をラットおよびマウスにおいて明らかにした。3)不快情動生成に関与する分界条床核内神経機構について、グルタミン酸神経情報伝達の亢進、および、2型神経細胞におけるアデニル酸シクラーゼーcAMP-PKA系が不快情動生成に関与することを明らかにした。4)従来報告のあった温度の異なる2つの床面の嗜好性を検討する「2プレート嗜好性試験」に加え、気相の温度も制御する新しい「気相温度制御2プレート嗜好性試験」について実験条件の検討を開始した。5)脳局所温度計測・制御デバイスを用いた実験条件の検討を進めた。「研究実績の概要」に記したように、マイクロダイアリシス法およびc-Fosマッピング法を用いた研究、さらには、不快情動生成に関与する分界条床核内神経機構に関する研究については一定の研究成果を得ている。行動試験および脳局所温度計測・制御デバイスを用いた実験については実験条件の詳細な検討を行いデータを蓄積している。以上より、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。神経活動マーカーc-Fos発現を指標とした組織学的解析により、暑熱環境下(38°C)で神経活動が亢進することが示された脳領域のうち、c-Fos発現上昇が顕著であった視床室傍核について逆行性トレーサーを用いてc-Fos陽性細胞の投射先を検討したところ、視床室傍核c-Fos陽性細胞の多くが、側坐核および分界条床核に神経投射を送っていることが明らかとなった。前年度の研究で、暑熱環境下ノルアドレナリン遊離が亢進することが示された分界条床核について、インビボマイクロダイアリシス法を用いて寒冷環境(8°C)負荷の影響を検討したところ、寒冷環境によってもノルアドレナリンレベルが上昇することが明らかとなった。分界条床核に投射するノルアドレナリン神経の細胞体が存在する弧束核において暑熱環境負荷時にc-Fos陽性かつチロシン水酸化酵素(カテコラミン神経のマーカー酵素)陽性の神経細胞が観察された。暑熱環境下における場所嗜好性・嫌悪性に関わる脳領域を明らかにするために、2種のプレート温度に加え、気相温度を制御できる行動実験系を構築した。イボテン酸を用いた破壊実験により分界条床核の関与を検討したが、分界条床核破壊後に温度選択行動は変化しなかった。一方、温度センサー分子の機能解析では、従来、侵害熱センサー(52°C以上で活性化)として知られていたTRPV2が、メカノセンサーとしても機能するDual Functionを持っており、神経回路形成や損傷軸索再生過程に関与していることを見いだした。さらに、TRPV2活性化の分子機構の一端を明らかにした。「研究実績の概要」に記したように、c-Fos免疫染色と逆行性トレーサーを用いた組織学的解析により暑熱環境下で活性化する神経路の一端を明らかにしている。
戦後日本の少年非行に関するデータベースの構築

少年非行に対処してきた機関の一つに、関西地区を中心に活動を行なっている社団法人、大阪少年補導協会がある。当協会の資料室には、少年非行に関して、昭和30年代から現在に至るまでの新聞記事・雑誌記事、また全国各地の補導機関が発行したパンフレット類が膨大に所蔵されている。しかし、それらの資料の大半は、予算・人員の制約上、ほとんど整理されずに保管庫に眠ったままとなっている。その上、昭和時代の資料は紙質が悪く、また保存環境もきわめて劣悪なため、資料の多くがいまや崩壊の危機に瀕している。そこで本研究は、大阪少年補導協会の資料室に眠る全資料のデジタル化を目指して企画された。しかし、実際の作業を進めていくにつれ、資料の膨大さから、全てを処理するには時間的にも金銭的にも制約が大きいことに気づくに至った。そこで、すでに朽ち果てて判読不能になりつつあった昭和30年代の旧資料について、まずはハード・コピーにとって保全をはかることを最優先の作業事項とした。作成されたハード・コピーは、今後のデジタル化作業を待つべく、現在は大阪少年補導協会の資料室に保管されている。本研究では、時間と予算の制約から、そのデジタル化の作業は不可能であったが、今後さらなる継続作業を期待している。さらに本研究は、そのハード・コピーをもとに、昭和30年代から40年代にかけての少年非行に関する新聞記事スクラップについての目録一覧をデジタル・データとして作成し、(CD-ROM)化を行なった。新聞記事の本文については、まだデジタル化されていないため、この目録を検索した後に、ハード・コピーにあたる必要がある。しかし、新聞記事の見出し部分については、すべてデジタル化されてこの目録に収録されているので、この目録本体だけでも、この分野におけるデータベースとしてはじゅうぶんに利用価値があるものと確信する。現在、大阪少年補導協会内に所蔵されている戦後日本の少年非行に関する各種新聞記事スクラップの中から、データベース化して価値のあると思われる資料をピックアップし、そのアナログ・コピーを作成している。すでに紙が劣化しているため、そのままではいかなる使用にも耐えられないと思われるためである。さらに、そのアナログ・コピーから、デジタル・データを構築するための入力作業を同時並行して続行中である。以上の作業にあわせて、デジタル・データを検索するために有効なキーワードを案出するために、少年非行に関する様々な出版物に目を通し、データベースの枠組の考案中でもある。具体的には、昭和30年代から昭和50年代にかけての資料を中心に、アナログ・コピーを作成し、またデジタル・データ構築のための入力作業を行なっている。昭和50年代以降については、すでに各新聞社でデータ・ベースを作成しているので、あらためて構築する必要はないと考えたからである。一方、それ以前のものについては、各新聞社の縮刷版はあるものの、読売新聞を除いてデジタル化はされていない。そのため、関連する記事を発見するためには、逐一に冊子をめくっていかねばならないのが現状である。したがって、この期間における記事もまずデジタル化することが優先されるべきと考え、そこから着手した次第である。少年非行に対処する機関として、関西地区を中心に活動をおこなっている社団法人、大阪少年補導協会がある。当協会の資料室には、少年非行に関して、昭和30年代から現在に至るまでの新聞記事・雑誌記事、また全国各地の補導機関が発行したパンフレット類が膨大に保存されている。しかし、それらの資料の大半は、予算・人員の制約上、ほとんど整理されずに保管庫に眠ったままとなっていた。また、昭和時代の資料は紙質が悪い上に、保存環境もきわめて劣悪なため、資料の多くがいまや崩壊の危機に瀕していた。

そこで本研究は、大阪少年補導協会の資料室に保管されている少年非行に関するこれら第一次資料のうち、すでに朽ち果てて判読不能になりつつあった昭和30年代昭和40年代の旧資料について、分類整理をした後に、重要と思われるものについて、まずはハード・コピーにとって保全をはかった。つぎに本研究は、そのハード・コピーをもとに、昭和30年代から40年代にかけての少年非行に関する新聞記事スクラップについての目録一覧をデジタル・データとして作成し、CD-ROM化を行なった。新聞記事の本文については、デジタル化するだけの余裕が金銭的にも時間的にもなかったため、今回は見送らざるをえなかった。しかし、新聞記事の見出し部分については、すべてデジタル化されているので、この目録本体だけでも、この分野におけるデータベースとしてはじゅうぶんに利用価値があろう。
ヒト胎児脳由来神経前駆細胞を用いた神経分化におけるAhR・Arntの機能解明

ダイオキシン、PCBなどの環境化学物質の胎生期曝露は脳発達に大きな影響を及ぼすことが示唆されているが、ヒトの神経分化に対する影響の解析は十分でない。本研究では、ダイオキシンの作用点として知られるAhRならびにArntの神経分化における機能を解明し、これらを介した化学物質曝露影響について研究を行った。その結果、AhR/Arntをノックダウンしたヒト胎児由来神経前駆細胞の神経系への分化が阻害されることが観察された。また、脳発達にかかわる甲状腺ホルモン受容体:TRとAhR/Arntとの関係について解析し、TRとArntは相互に結合し、TR標的遺伝子の発現を制御していることが示唆された。本研究は脳発達におけるダイオキシン類の毒性発現メカニズムの解明について、アリル炭化水素受容体:AhRならびにその核内移行因子:Arntの本来の生物学的な役割について不明な点を明らかにし、従来の「ダイオキシン曝露ありき」の研究から脱却し、AhR/Arntの本来の機能を明らかにしたうえでの毒性評価法の確立を目指すことを目的としている。平成26年度においてはAhR・Arntのノックダウンによる神経分化におけるAhR・Arntの機能解析をまずおこなった。ヒト胎児脳由来神経前駆細胞株Rencellに対し、AhR・ArntをターゲットとしたRNA干渉法によるノックダウンを行った。神経分化前にsiRNAを遺伝子導入したのち、分化前ならびに分化開始後3日目にAhR,Arntの発現がノックダウンされていることを確認した。さらに、ノックダウン後にタンパクならびにtotal RNAを回収し、神経系細胞への分化状態を神経細胞とアストロサイトのマーカーの発現を確認したところ、どちらの細胞系のマーカーも発現量の現象が観察された。同時にAhR,ArntのChIP-seq法のため、Rencellを用いたそれぞれのChIP assay法の確立を行い、ChIP-seqに向けた準備段階に入っている。また、これまでに得られているダイオキシン曝露時のマイクロアレイデータから転写因子パスウェイ解析を行い、曝露影響を認めるいくつかのシグナル伝達経路の候補について検証を進めている。本研究は脳発達、特に神経分化におけるアリル炭化水素受容体:AhRならびにAhR核内移行因子:Arntの機能解析を行うことにより、ダイオキシン類の毒性発現メカニズムの解明を目指すものである。平成27年度においては、昨年、RNA干渉法によるヒト胎児脳神経前駆細胞株Rencellの内因性AhR/Arntのノックダウンならびに神経系細胞への分化の減少を認めたため、他の分化マーカーの発現確認により分化状態のプロファイルを行った。また、ノックダウンに対して、AhRおよびArntの過剰発現時の神経分化状態の検証も行った。しかし、神経分化において、過剰発現の有意な影響は認められなかった。同時に、Arntが甲状腺ホルモン受容体:TRとクロストークしている可能性についてこれまで検証してきた。そのため、ArntがTRを介して遺伝子転写制御にかかわる可能性を考慮し、ArntによるChIP assayをTRが結合すると予想されるゲノム上の結合領域について解析した。しかし、Arnt依存的な有意な変化は認められなかった。これらの結合状態は細胞種または分化の状態によって変化することが十分に考えられるため、より詳細な検証が必要である。また、AhRならびにArntをターゲットとしたChIP-seq法を行ったが、解析に能う十分な結合シグナルが得られることができず、本研究期間での解析を断念した。ChIP法ならびにChIP-seq法はサンプルの状態のみならず、抗体によっても結果が変化するため、適した抗体のスクリーニングを行い、今回の経験を踏まえ今後も進めていきたい。当初より予定していた、AhRならびにArntのノックダウンに関して、研究を進める上で十分な実験試料を得ることの出来る系が完成しており、また、そのシステムを用いて、神経分化の変化も認められている。一方ChIP-seqについてはほぼ準備が整っており、合わせて、パスウェイ解析からダイオキシン曝露時に関与しうるカスケード候補もあがっている。以上からほぼおおむね順調に進展している。神経毒性学平成27年度は、まず、平成26年度中に新たに認められたノックダウンによる神経分化の変化について、そのメカニズムを解明することを主たる目的とする。あわせて、ChIP-seq法により得られたデータを下に、AhRおよびArntのより詳細な解析を行い、神経分化における生理学的な役割についての解明を目指す。以上のことから平成27年度も当初の予定通り、研究が遂行できると予想するが、ChIP-seq法の遂行にあたり、当初予定していた予算よりも多く使用する可能性があるため、動物実験については十分な遂行が難しいかもしれない。計画的に研究を遂行することにより、研究費の倹約を行い、当初の予定通り研究を進める。
戦後日本の中小企業における労使交渉の制度化-オーラルヒストリーによる検証の試み-

本研究では、中小企業を中心に、戦後日本の労使関係の制度化を分析した。歴史分析によって労使協議制度の導入とその効果を明らかにし、アンケート調査によって労使協議の問題を検討し、運営方法によってその効果が異なることを明らかにした。さらに、企業内の労使協議だけでなく、産業別、地域別、全国における労働組合の参加の形を検討した。本研究では、中小企業における労使交渉方式が、いつ、どのような形で制度化されたのかを検証する。中小企業労使と産業別労働組合専従者のオーラルヒストリーを実施し、それぞれの利害関係を踏まえて交渉過程を分析する。結果的に、大企業の労使関係とは異なる中小企業独自の特徴、(1)産業別労働組合の影響力、(2)企業別労働組合の連帯の難しさを確認する。労働組合間の対立と協調に関しては、労働組合アンケートからも分析する。2008年度は、UIゼンセン同盟の元組織部長のヒアリング調査を行い、中小企業産業集積地域における労働組合組織化の活動内容を把握した。製造業の組織化から流通業の組織化へ転換する産別労働組合の戦略転換についても検討した。現在7回のインタビューを終了したが、今後3回ほどインタビューを追加する予定である。また、現在の産別活動を把握するため、千葉県と埼玉県の県支部に訪問し、活動の実態をヒアリングした。調査の記録は、「第4章組織化と労働条件決定における産別労働組合の役割」『UIゼンセン同盟の組織形態と機能に関する研究報告書』(平成18年度財団法人労働問題リサーチセンター調査研究助成) pp.63-86にまとめた。さらに、戦後労働組合史に関係する資料調査を行い、戦後労働争議資料、旧同盟資料、大阪と名古屋、愛媛における資料を把握し、そのインタビュー記録を今後の公開に向けてデータ化した。産業別労働組合運動と企業別労働組合運動を比較検討できる可能性について検討した。平成21年度では、第一に産別労働組合リーダー2名のオーラルヒストリーを実施し、1名に関しては報告書を刊行し、もう一名に関しては減殺編集中である。産別労働組合が企業の労使関係に果たした具体的役割を検証しつつ、分析を開始している。また、労働組合と企業人事の文章資料とオーラルヒストリーを使って、経営合理化や労働協約締結、さらに新人事制度導入に対して労使がどのような交渉をしたのかを検討した。日本型の労使関係の源流を探る試みになっている。さらに、3種類の労働組合対象のアンケート調査データを分析し、数本の論文を作成した。「交渉内容別に見た労使協議制度の運用とその効果-「問題探索型」労使協議の分析-」(日本労働研究雑誌)を発表し、他は日本労務学会で発表をした。現在は発表論文を投稿に向けて改良中である。現時点の労使協議制度や苦情処理制度のなどの「制度化」された労使関係が、どの程度機能しているか、また限界がどこにあるのかを検証している。現在、労使交渉案件の「個別化」に伴い、従来の労使交渉ツールでは対応できていない事例が生まれていることを確認し、その改善策として新たな「制度化」を進めている企業労使が一部あることが確認された。なお、そもそも中小企業においては、企業別労働組合では対処できない交渉案件も多く、産別労働組合の役割が期待されているが、「組織化と労働条件決定における産別労働組合の役割」「法政大学キャリアデザイン学部紀要」で明らかにしたように、産別労働組合の支援にも限界があることを確認されている。以上、平成21年度の研究成果をふまえて、個別に分析を進めてきた産業別労働組合と企業別労働組合の連携実態の分析が22年度の目的となる。本研究では、中小企業における労使交渉方式が、いつ、どのような形で制度化されたのかを検証した。そのために、中小企業労使と産業別労働組合専従者のオーラルヒストリーを実施し、それぞれの利害関係を踏まえて交渉過程を分析した。そこから、大企業の労使関係とは異なる中小企業独自の特徴を捉えられる。具体的には(1)産別労働組合の影響力、(2)企業別労働組合の連帯の難しさを確認する。労働組合間の対立と協調に関しては、労働組合アンケートからも分析した。まず、オーラルヒストリー調査としては、2009年度に引き続き、全繊同盟(現UIゼンセン)のリーダーを対象に調査を行った。また、金属産業の労使関係史について以下の論文を作成した。「終戦直後における賃金制度の変動-「経営協議会」史料(19451949)の分析-」『日本労働研究雑誌』No.596(2010年)(南雲智映と共著)pp.99-113「統一労働協約締結をめぐる労使交渉-中小企業労使関係の事例-」『立教経済学研究』(南雲智映・島西智輝と共著)第63巻4号pp.69-106(2010年)また、アンケート調査の分析では、主に産別組織の役割と中小企業労使の調査を分析し、以下の論文を作成した。「組織化と労働条件決定における産別労働組合の役割」『法政大学キャリアデザイン学部紀要』第7号(南雲智映と共著)

pp.329-358(2010年)「中小企業における従業員発言機構の機能」『日本労務学会誌』第12巻2号(田口和雄と共著)pp.43-61(2011年)刊行予定
風送塵の土壌化生成磁性ナノ粒子の探査

中国黄土高原のレス・古土壌層の帯磁率は降水がもたらすレスの土壌化により増加するため、古降水量の指標となる。帯磁率の増加は土壌化生成のSP磁性粒子がもたらすことが分かっている。しかし、SP粒子が分離抽出されたことはなく、その生成メカニズムも不明なままである。本研究では、約50nmかそれ以下のサイズであるSP粒子が101 μmの砕屑物粒度帯に最も多く含まれていることを発見した。そして、SEM観察により、この粒度帯から磁気抽出した砕屑粒子が主に白雲母からなるケイ酸塩鉱物であることを見つけた。このことから、土壌化生成磁性ナノ粒子はケイ酸塩鉱物中に含有物の形で存在すると結論した。中国黄土高原Lingtaiで採取したレス,古土壌試料を用いて,風送塵の土壌化によるMagnetic Enhancementに寄与する二次生成磁性粒子の探査を行った。帯磁率の異なるレス、古土壌を水に溶かした懸濁液を作り,まず,10マイクロメートル(以下ミクロンとする)メッシュの篩を用いて,10ミクロン以上の粒子を分離した.次に,遠心機を用いてStokesの定理を応用して1ミクロン以下の粒子を分離した.その結果,レス,古土壌のバルク試料をそれぞれ10ミクロン以上, 101ミクロン, 1ミクロン未満と3つの粒度帯に分離することに成功した.なお,当初計画していたミリポアフィルターを用いた試料の分離は成功しなかった.原因は,懸濁液の濃度が薄ければ問題なくろ過できるが,実験に必要な量の試料をろ過するためには,大量のフィルターと膨大な時間を要するからである.しかも,試料のロスが大きいため,定量的な議論が困難であり,この方法は用いないことに決めた.分離後のそれぞれの試料に対して帯磁率と帯磁率の周波数依存性の測定, IRM獲得実験,磁気ヒステリシス測定,また,バルク試料に対して熱磁気分析を行った.その結果,古土壌の高い帯磁率を担う磁性粒子のうち強磁性体はマグネタイト(Fe3O4)であること,そして, Magnetic Enhancementに寄与する二次生成磁性粒子の大部分は超常磁性(superparamagnetic ; SP)であること,それらの粒子は101ミクロンの粒度帯に集中することが分かった. SP粒子サイズは約50ナノメートル未満であるため,土壌化起源の二次生成磁性粒子は,砕屑性のケイ酸塩鉱物粒子中に包有物として存在する可能性が高いことがほぼ確実となった.中国高度高原のレス・古土壌層の帯磁率は東アジア夏季モンスーン、特に降水量の代理指標として古気候学の分野で広く使われている。代理指標となる理由は、降水がもたらすレスの土壌化により生成する二次的な磁性粒子が帯磁率の増加を引き起こすためである。しかしながら、土壌化により生成する磁性粒子の種類は何か、それがどのような状態で存在するのか実態は解明されていない。岩石磁気学実験により、間接的に磁性粒子は超常磁性(SP)か単磁区(SD)サイズの強磁性鉱物であることわかっていることから、本研究では岩石磁気実験に加え、電子顕微鏡観察によってナノスケールで存在すると予想される磁性粒子の探査を行った。まず、帯磁率値の異なるレスと古土壌試料の砕屑粒子を3つの粒度帯(D1: >10 μm, D2: 101 μm, D3: <1 μm)に分け、帯磁率の周波数依存性、IRM獲得実験、熱磁気分析を行った。その結果、約50nmかそれ以下のサイズであるSP粒子はD3ではなく、D2に最も多く含まれていることを発見した。さらに、D1にもわずかであるが含まれている。このことは、土壌化は氷期にも起こる普遍的なものであり、土壌化により生成したSP粒子、SD粒子は単体で存在するのではなく、砕屑物中に含有物として入っていること示唆する。IRM獲得実験、熱磁気分析からSPまたはSDサイズの土壌化生成磁性粒子はマグネタイトかマグヘマイトであることも分かった。次に、フィンガーマグネット法を用いて分離したレス、古土壌試料から強磁性粒子の抽出を試みた。量が少ないこともありレスからは物質は磁気抽出できなかったが、古土壌試料からは大量の砕屑粒子が抽出できた。磁気抽出した砕屑粒子のSEM観察の結果、鉱物は主に白雲母と黒雲母、わずかな石英、磁鉄鉱からなることが分かった。最も多いのは、白雲母であった。この結果、土壌化生成磁性ナノ粒子は雲母などケイ酸塩鉱物中に含有物の形で存在すると結論した。超常磁性粒子が農集する砕屑粒子の粒度帯を絞り込むことに成功したことは,本来の目的の成果である.

Magnetic Enhancementに寄与する二次生成磁性粒子の大部分は超常磁性であることが明らかにできたことは、予期せぬ大きな成果である.これは,申請時にはなかった,帯磁率の周波数依存性が測定できる帯磁率計が新規設備として設置されたことによる.古環境学・古地磁気学超常磁性粒子が農集する砕屑粒子の粒度帯がレス・古土壌層の年代にも地域にも依らず,普遍的なものであることを検証するために,Lingtaiに加えXifengの試料も用いて分離実験を行う.そして,超常磁性粒子が農集する粒度帯の砕屑粒子のSEMおよびTEM観察を行う.
マイコプラズマ滑走の足の動きの検出

全くユニークなメカニズムである,マイコプラズマの滑走運動における,"あし"の動きを明らかにするために,以下の研究を行った.(1)活性のある滑走装置を単離し,ATP加水分解サイクルーガラス結合一動き,の関係を明らかにした,(2)低濃度の界面活性剤で処理することで細長く伸びた細胞の滑走運動を解析することにより,力発生の最小単位を見積もった.(3)シアル酸オリゴ糖や,ライブラリー抗体により細胞が固形物表面から解離する直前の動きを解析することで,"あし"が協同的に動いていることを示唆した.(4)滑走装置のタンパク質に結合して,滑走を阻害するライブラリー抗体を40個取得し,滑走時における力の伝達を明らかにした.また,これらの抗体を用いることで,滑走タンパク質各部位を蛍光ラベルすることに成功した.(5)滑走装置を構成する3つのタンパク質,Gli123, Gli349, Gli521のネガティブ染色電子顕微鏡法による構造解析を進めた.また,これらのタンパク質の液中における挙動を高速AFMによって明らかにした.全くユニークなメカニズムである,マイコプラズマの滑走運動における,"あし"の動きを明らかにするために,以下の研究を行った.(1)遊離のシアル酸を加えることで滑走時のあしの数を減らし,粘度をあげて熱ゆらぎを抑えることで,あしの最小単位の動きを細胞の動きに反映することに成功した.(2)細胞を高輝度の蛍光ビーズでラベルして,高速度カメラで撮影することで,最小単位の動きを詳細に解析した.(3)低濃度の界面活性剤で細胞を処理することで,細胞が細長く変化することを見いだした.この状態での滑走運動から,横に並んだあしの動きが同一の位相で動いているのではないことを示した.(4)滑走装置を菌体から遊離させ,単離することに成功した.(5)滑走装置を構成する3つのタンパク質,Gli123,Gli349,Gli521をネガティブ染色電子顕微鏡法で観察することにより,高解像度のイメージを得た.(6)16種類の合成シアル酸化合物を用いて,滑走における直接の結合対象の化学構造を明らかにした.(7)滑走装置のいろんな部分に特異的に結合する人工抗体を40個単離した.(8)単離したあしタンパク質のシアル酸結合活性を,原子間力顕微鏡を用いて測定した.全くユニークなメカニズムである,マイコプラズマの滑走運動における,"あし"の動きを明らかにするために,以下の研究を行った.(1)活性のある滑走装置を単離し,ATP加水分解サイクルーガラス結合一動き,の関係を明らかにした,(2)低濃度の界面活性剤で処理することで細長く伸びた細胞の滑走運動を解析することにより,力発生の最小単位を見積もった.(3)シアル酸オリゴ糖や,ライブラリー抗体により細胞が固形物表面から解離する直前の動きを解析することで,"あし"が協同的に動いていることを示唆した.(4)滑走装置のタンパク質に結合して,滑走を阻害するライブラリー抗体を40個取得し,滑走時における力の伝達を明らかにした.また,これらの抗体を用いることで,滑走タンパク質各部位を蛍光ラベルすることに成功した.(5)滑走装置を構成する3つのタンパク質,Gli123, Gli349, Gli521のネガティブ染色電子顕微鏡法による構造解析を進めた.また,これらのタンパク質の液中における挙動を高速AFMによって明らかにした.
動物細胞内での細胞内抗体選択法の開発

本研究では次世代抗体医薬品の創製を目指して、動物細胞の細胞質内に発現させた蛋白質抗原に対する細胞内抗体を迅速、かつ直接的に選択することが可能な汎用的新規選択法の開発を行った。抗原と結合することにより増殖シグナルを伝達する人工受容体として、単鎖抗体scFvのナイーブライブラリーと受容体c-kitの細胞内ドメインを柔軟なG4Sリンカーで連結したキメラ受容体ライブラリーを構築した。このキメラ受容体をモデル抗原である狂犬病ウイルス由来の核蛋白質とともにIL-3依存性の動物細胞Ba/F3内で発現させ、IL-3非存在下の培養条件で増殖してきた細胞から、抗原蛋白質に結合するscFvを取得することに成功した。細胞内蛋白質を創薬標的として、その機能阻害に抗体を応用する際には、細胞内の還元的環境下で機能を発揮する「細胞内抗体」が必要となるが、既存の方法によって選択された抗体の多くは分子内のS-S結合が還元され細胞内では一般的に不安定であるため、細胞内抗体として機能する抗体をさらに選択する必要が有る。また、細胞内蛋白質は一般的に分離精製過程やプレート表面への固定化過程で変性し易く、抗原となる細胞内蛋白質の正常な立体構造を維持した状態で抗体選択を行うことには困難を伴う。そこで、本研究では次世代抗体医薬品の創製を指向し、細胞内に発現させた蛋白質抗原に対する細胞内抗体を細胞内で迅速に、かつ直接選択可能な汎用的な新規選択法の開発を目的とした。今年度は、新規抗体選択法の原理実証のために、抗体scFvと受容体c-Mpl細胞内ドメインとを連結した抗体ー受容体キメラ、小分子AP20187依存的二量体形成ドメインであるFK506結合蛋白質FKBP12の変異体F36Vと抗原蛋白質を連結した抗原キメラを構築した。AP20187依存的に抗原キメラが細胞内で二量体を形成するかどうかを確認するために、抗原キメラの下流にさらに受容体c-Kit細胞内ドメインを連結した抗原-受容体キメラも構築した。この抗原-受容体キメラ遺伝子を導入したIL-3依存性のプロB細胞株Ba/F3は、AP20187濃度依存的に細胞増殖c-Kit細胞内ドメインの二量体化に基づく細胞増殖シグナルを伝達し、IL-3非存在下でも増殖活性を示したことから、AP20187依存的に抗原キメラが細胞内で二量体を形成することが示唆された。今後は、抗体scFvと受容体c-Mpl細胞内ドメインとの間のリンカー長を種々に変えた抗体ー受容体キメラを構築し、AP20187依存的な細胞の運動性の亢進が見られる抗体ー受容体キメラを選択する。抗体scFvと受容体c-Mpl細胞内ドメインとを連結した抗体ー受容体キメラおよび小分子AP20187依存的二量体形成ドメインであるFK506結合蛋白質FKBP12の変異体F36Vと抗原蛋白質を連結した抗原キメラの遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込み、IL-3依存性Ba/F3細胞株に遺伝子導入を行い、抗生物質選択により安定発現株の取得を行った。この細胞株を光分解性BAM基板上に固定化し、IL-3非存在下、低血清条件下で数時間培養し、その後AP20187を添加して抗原キメラを二量体形成させ、細胞の運動性を評価した。しかし、細胞の運動性の亢進はほとんど見られなかった。抗原キメラの下流に受容体c-Kit細胞内ドメインを連結した抗原-受容体キメラではAP20187依存的に細胞内で二量体を形成することが示唆されたことから、細胞運動性の亢進が見られなかった理由としては、抗体ー受容体キメラの抗原依存的な二量体形成が起こっていない可能性が考えられる。本研究では次世代抗体医薬の創製を指向し、細胞内に発現させた蛋白質抗原に対する細胞内抗体を細胞内で迅速に、かつ直接選択可能な汎用的な新規選択法の開発を目的とした。今年度は、ヒト合成ナイーブscFvライブラリーであるTomlinson Iをc-Kitに連結したキメラ受容体ライブラリーならびに狂犬病ウイルスN蛋白質をBa/F3細胞内に発現させ、細胞の増殖ならびにアレイ化した細胞の運動性により評価し、N蛋白質特異的に二量体化しシグナルを伝達するscFv-cKitキメラ受容体のスクリーニングを行った。その結果、scFvとc-Kitの間にGly4Serのペプチドリンカーを挿入したキメラ受容体を用いることによって細胞の増殖を指標に、N蛋白質に特異的に結合するscFv-cKitキメラ受容体の取得に成功した。しかし、運動性の亢進によるスクリーニング方法ではN蛋白質に特異的に結合するscFv-cKitキメラ受容体を選択することは困難であった。さらに、合成小分子であるAP20187依存的な二量体形成ドメインとして汎用的に利用されているFK506結合蛋白質FKBP12の変異体F36VとcーKit細胞内ドメインとの間に抗原蛋白質あるいはscFvライブラリーを挿入した2種類のキメラ受容体を用いて細胞内での抗原とscFv部位の蛋白質間相互作用を検出する系の構築を目指した。