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骨壊死におけるインターロイキン６の役割の検討とそれに基づく治療法の開発

我が国では小児及び成人において大腿骨頭壊死は広く知られているが、治療薬はなく解決すべき課題である。私は2016年より全米第1位の小児整形外科の専門病院であるTexas ScottishRite Hospital for Children(TSRH)と共同研究を開始し分子レベルでの骨壊死発症機序の解明とそれに基づく治療法の開発を行っている。TSRH研究グループは大腿骨遠位端へ血流を供給している血管の内4本の血管を選択的に遮断することにより虚血性骨壊死を確実に誘導する世界初の骨壊死マウスモデルの開発に成功した。また、小児骨壊死患者(ペルテス病)の関節液検体を用いた研究から発症にはインターロイキン-6(IL-6)が関与することを報告している。IL-6は炎症反応の重要な因子であることから、骨壊死発症には炎症との関連性が考えられるが、分子レベルでの病態の詳細は明らかでない。本研究の目的は骨壊死におけるIL-6の役割のさらなる解明を進めることにより骨壊死の新たな治療法を確立することである。今年度は、骨壊死を誘導したマウスモデルに、抗マウスIL-6受容体モノクローナル抗体(MR16-1)を投与し、生理食塩水を投与した群と比較することで、MR16-1が骨壊死を制御するのかを詳細に検討した。その結果、虚血性骨壊死の術後4週におけるマイクロCTにて、MR16-1投与群では生理食塩水投与群と比較して優位に骨壊死後の骨量低下を抑制することを見出した。さらに、MR16-1投与群では生理食塩水投与群と比較して優位に骨壊死後の骨リモデリングにおける骨芽細胞の数と骨形成率が増えていることを明らかとした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、IL-6遺伝子ノックアウトマウスを使用して虚血性骨壊死に関するIL-6の役割を検討した。その結果、虚血性骨壊死の術後4週におけるマイクロCTにて、IL-6遺伝子ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較して優位に骨壊死後の骨量低下を抑制することを見出した。さらに、IL-6遺伝子ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較して優位に骨壊死後の骨リモデリングにおける骨芽細胞の数と骨形成率が増えていることを明らかとした。IL-6遺伝子ノックアウトマウスを使用して虚血性骨壊死に関するIL-6の役割を検討し、その結果、IL-6遺伝子ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較して骨壊死後の骨量低下を抑制することを見出した。その理由の一つとしてIL-6遺伝子ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較して、優位に骨壊死後の骨リモデリングにおける骨芽細胞の数と骨形成率が増えていることを世界で初めて明らかとした。

さらに、MR16-1投与群では生理食塩水投与群と比較して優位に骨壊死後の骨リモデリングにおける骨芽細胞の数と骨形成率が増えていることを明らかとした。IL-6遺伝子ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較して骨壊死後の骨量低下を抑制した結果に基づいて、骨芽細胞だけでなく破骨細胞の増殖・分化についても詳細に検討する。また、虚血後の血管新生の評価についても詳細に検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
微生物の生産するNADH-フマル酸還元酵素阻害剤の探索

宿主内において独特の嫌気的エネルギー代謝を行っているブタ回虫成虫のNADH-フマル酸還元酵素阻害剤をスクリーニングした結果、糸状菌Trichoderma sp.FTD-0795よりharzianopyridoneを単離した。Harzianopyridoneの類縁化合物でより強力なatpenin A5を用いてその標的酵素を検討したところ、複合体IIであることが解明されたが、寄生虫と哺乳類間の選択性は示さなかった。しかし従来の最強の複合体II阻害剤であるcarboxinに比べて300倍以上強力な阻害活性(ウシ心臓ミトコンドリアでIC_<50>=3.6nM)を示すので、複合体II研究において非常に有望なツールになると考えられる。また以前に発見したnafuredinについて研究を続けた結果、nafuredinをアルカリ処理して得られる新物質nafuredin-γを見出した。Nafuredin-γはnafuredinと同等の酵素阻害活性及び抗寄生虫活性を示し、nafuredinの活性本体である可能性も考えられた。このnafuredin-γの全合成を達成することができたので、今後はより強力な活性を示す誘導体を探していきたい。宿主内において独特の嫌気的エネルギー代謝を行っているブタ回虫成虫のNADH-フマル酸還元酵素阻害剤をスクリーニングした結果、糸状菌FTD-0795よりハージアノピリドンを単離した。ハージアノピリドンの類縁化合物でより強力なアトペニンA5を用いてその標的酵素を検討したところ、複合体IIであることが解明されたが、寄生虫と哺乳類間の選択性は示さなかった。しかし従来の最強の複合体II阻害剤であるカルボキシンに比べて300倍以上強力な阻害活性(ウシ心臓ミトコンドリアでIC_<50>=3.6nM)を示すので、複合体II研究において非常に有望なツールになると考えられ、現在アトペニンA5を用いて複合体IIの機能解明の研究を行っている。さらにスクリーニングを継続したところ、糸状菌FKI-1330よりグリソプレニンAを、また生薬当帰の抽出物よりデキュルシン及びデキュルシノールアンゲレートを単離した。単離化合物についてブタ回虫のNADH-フマル酸還元酵素(複合体I+II)及びウシ心臓NADH酸化酵素(複合体I+III)に対する阻害活性(IC_<50>)をそれぞれ調べたところ、グリソプレニンAではいずれも1.6μMで差がなかったが、デキュルシンでは0.6μM及び18.3μM、デキュルシノールアンゲレートでは0.9μM及び18.3μMと回虫酵素に20倍以上の選択性を示した。これらの化合物については、今後抗寄生虫活性を検討していく予定である。また以前に発見したナフレジンについて研究を続けた結果、ナフレジンをアルカリ処理して得られる新物質ナフレジン-γを見出した。ナフレジン-γはナフレジンと同等の酵素阻害活性及び抗寄生虫活性を示し、ナフレジンの活性本体である可能性も考えられた。またナフレジンより簡単な構造であることから、全合成及び誘導体合成にも適していると考えられる。宿主内において独特の嫌気的エネルギー代謝を行っているブタ回虫成虫のNADH-フマル酸還元酵素阻害剤をスクリーニングした結果、Paecilomyces sp. FKI-0550と同定された糸状菌より新規物質であるパシラミノールを単離した。さらにVerticillium sp. FKI-1083株と同定された糸状菌より新規物質のバーティシピロンも単離した。単離化合物についてブタ回虫のNADH-フマル酸還元酵素(複口体I+II)及びウシ心臓NADH酸化酵素(複合体I+III+IV)に対する50%酵素阻害濃度(IC_<50>)をそれぞれ調べたところ、パシラミノールでは5.1μM及び19.8μM、バーティシピロンでは4.1nM及び56.0nMと、いずれも回虫酵素をより強く阻害した。またいずれの化合物も、20μg/mlで自由生活線虫Caenorhabditis elegansの生育を阻止することができた。特にバーティシピロンは回虫酵素を数nMの濃度で阻害し選択性も10倍以上あることから、今後の抗寄生虫活性の検討に期待している。

なお、前年度に単離したグリソプレニンA、デキュルシン及びデキュルシノールアンゲレートについては、現在抗寄生虫活性を評価しているところである。また前年度に報告したナフレジン-γについては、その全合成を達成することができた。今後は確立した全合成ルートをもとに誘導体合成を行い、より強力な活性を示すものを探していきたい。
DNA分解能力を有する触媒抗体の開発と応用

酵素が持つ優れた触媒能力を巧みに応用した測定系は,臨床検査のみならず医学生物学の領域に幅広く浸透し,今日のバイオ技術を支える重要な手段となっている。しかしながら,測定系確立の決め手である酵素の調整法に関しては,今なお,不安定で失活し易かったり,高コストであったりする等の多くの問題点を抱えたままである。従って,酵素に匹敵する触媒能力を持った安定な新素材を開発し,これを代替物として用いることができれば,その応用範囲の広さからみても非常に意義あることと考えられる。本研究では,自己免疫疾患を自然発症する動物の血清中に存在する様々な自己抗体の中から,細胞融合技術ならびにスクリーニング法を駆使して,DNA分解活性を有する触媒抗体を選別し,これを酵素と抗体の両性質を併せ持った新素材として,従来からのDNA分解酵素(DNase)の代わりに応用することを目的として研究を行い,次のような知見を得た。1.サンドウイッチタイプの酵素免疫測定法(ELISA法)を開発し,抗DNA抗体価の測定系を確立した。2.開発したELISA法を用いて,自己免疫疾患を自然発症するマウス(MRL/lprマウス,10週齢)の血清中に抗DNA抗体が高力価で存在していることを確認した。3.プラスミドDNA(主としてpBR322)を基質に用いて,DNA分解酵素活性の測定系を確立した。活性は,基質と検体を37°Cでインキュベートした後に電気泳動にかけ,その後EtBr染色を施し染色パターンの変化をミニタリングする事によって見積もった。4.MRL/lprマウスから抗DNA抗体を活発に分泌している脾臓を摘出し,細胞懸濁液を調製した。これを,ミエローマ細胞懸濁液(SP2/0細胞を使用)と混合し,PEGを用いて両者を細胞融合した。5.融合後にHAT培地で選択を行ったところ,培養プレートあたり35ウエルの割合でコロニーの形成が認められた。6.コロニー形成の認められたウエルより,培養上清を一部採取し,この中に分泌されている多数の自己抗体の中からDNA分解酵素活性を指標にして触媒抗体の選別を行った。7.選別の結果,弱いながらもDNA分解活性の存在が観察され,得られたモノクローナル抗体が触媒抗体として応用され得る道を新たに拓くことができた。酵素が持つ優れた触媒能力を巧みに応用した測定系は,臨床検査のみならず医学・生物学の領域に幅広く浸透し,今日のバイオ技術を支える重要な手段となっている。しかしながら,測定系確立の決め手である酵素の調製法に関しては,今なお,不安定で失活し易かったり,高コストであったりする等の多くの問題点を抱えたままである。本研究では,自己免疫疾患を自然発症する動物の血清中に存在する様々な自己抗体の中から,細胞融合技術ならびにスクリーニング法を駆使して,DNA分解活性を有する触媒抗体を選別し,これを酵素と抗体の両性質を併せ持った新素材として,従来からのDNA分解酵素(DNase)の代わりに応用する事を目的として研究を行った。その結果,現在までに以下のことが明らかとなった。1.サンドウィッチ型のELISA法を用いる事によって,抗DNA抗体価測定系を確立した。2.開発したELISA法を用いて、自己免疫疾患を自然発症するマウス(MRL/lprマウス,10週齢)の血清中に抗DNA抗体が高力価で存在していることを確認した。3. PBR322プラスミドを基質に用いたDNase活性測定系を確立した。活性の大きさは,電気泳動による分離,その後のEtBr染色パターンの変化を検討することにより見積もった。4.抗DNA抗体を活発に分泌しているMRL/lprマウス脾臓とミエローマ細胞(SP2/0細胞)との混合液を調製し,細胞融合剤を用いて両者を融合した。5.融合後にHAT培地による選択を行ったところ,1プレートあたり35ウエルの割合でコロニー形成が認められた。6.現在の所,コロニー形成の認められた融合細胞(抗体産生細胞)から培養上清を採取し,その中に分泌されている多数の自己抗体の内から開発したDNA分解活性を指標にして触媒抗体の選別を行っているところである。

2.開発したELISA法を用いて,自己免疫疾患を自然発症するマウス(MRL/lprマウス,10週齢)の血清中に抗DNA抗体が高力価で存在していることを確認した。3.プラスミドDNA(主としてpBR322)を基質に用いて,DNA分解酵素活性の測定系を確立した。活性は,基質と検体を37°Cでインキュベートした後に電気泳動にかけ,その後EtBr染色を施し染色パターンの変化をミニタリングする事によって見積もった。4.MRL/lprマウスから抗DNA抗体を活発に分泌している脾臓を摘出し,細胞懸濁液を調製した。これを,ミエローマ細胞懸濁液(SP2/0細胞を使用)と混合し,PEGを用いて両者を細胞融合した。5.融合後にHAT培地で選択を行ったところ,培養プレートあたり35ウエルの割合でコロニーの形成が認められた。6.コロニー形成の認められたウエルより,培養上清を一部採取し,この中に分泌されている多数の自己抗体の中からDNA分解酵素活性を指標にして触媒抗体の選別を行った。7.選別の結果,弱いながらもDNA分解活性の存在が観察され,得られたモノクローナル抗体が触媒抗体として応用され得る道を新たに拓くことができた。
質量分析を用いた内視鏡診断法のための新規遠隔試料採取法およびイオン化法の開発

内視鏡は病気の早期発見や治療に利用される重要な医療機器である。一方、生体成分の精密分析に用いられる様々な手法の中でも、質量分析は化合物同定の信頼性が最も高い。本研究ではこの二つの技術を融合するために、内視鏡に組込可能なライン式遠隔検体採取/輸送装置を開発し、ラインで輸送した検体を抽出イオン化して質量分析する手法を確立した。本研究は質量分析を用いた内視鏡診断法のための新規遠隔試料採取法およびイオン化法の開発を目的としている。今年度は山梨大学工学部に設置されているリニアイオントラップ質量分析計(LTQ-Velos, Thermo Fisher Scientific)に装着できる液体サンプル用と固体サンプル用の二つの遠隔サンプリング・イオン化部の試作機の設計と製作が完了した。固体サンプリング・プローブでは使い捨てのサンプリング・プローブ(木綿糸)を用い、生体組織の表面との接触によってサンプルを採取し、試料が自動運送システムにより質量分析機器のイオン化部に輸送される。液体サンプリング・プローブではベンチュリポンプの原理を利用し、遠隔で液溶媒を吸引・噴霧させ、生成したイオンを高圧ガスで質量分析計の導入部に搬送する。イオン源と試料採集部の微調整のため、光学顕微鏡検査システムの構築も行なった。採集効率は標準サンプル(ペプチド、たんぱく質など)を使って最適化のための予備評価実験を行なった。今年度は液体試料を遠隔に採集、イオン化するサンプリング・プローブの改良を行い、性能を評価する自動試料ステージの製作が完了した。サンプリング・イオン化の評価がリニアイオントラップ質量分析計を用いて行い、試料採集が質量分析計から2メートル以上離して行なっても試料の検出ができることが分かった。そして生体試料を採集するサンプリング・プローブを工業用内視顕微鏡に装着した。サンプリング・プローブの先端に木綿糸を用い、生体組織の表面との接触によってサンプルを採取し、試料が自動運送システムにより質量分析機器のイオン化部に輸送される。このシステムを用いて生体を採集する実験の準備を行なった。採集したサンプルのイオン化効率を上げるために、既存の高圧エレクトロスプレーを改良し200度以上に加熱することが成功した。本年度は液体試料の遠隔試料採集・イオン化評価が完了した。生体試料用のサンプリング・プローブを工業用内視顕微鏡に装着し、評価実験が始まった。試料採集プローブとイオン源の改良と最適化が順調に進んでいる。今年度では質量分析計と工業内視鏡に直接装着できる新規遠隔サンプリング・イオン化システムの開発と評価実験を行った。このシステムでは検体採取用の素材として糸などの細いラインを利用し、内視鏡で確認した検査対象部位に検体採取プローブを接触させる。検査対象の表面に由来する成分や組織そのものをそのプローブに拭取らせるように動作させてラインにごく微量の検体を付着させ、そのラインをモータと滑車で患者の体外まで輸送する。ラインは細いことに加えて殺菌されたものとし、本研究は縫合糸として利用されている非吸収性素材(ポリエステル、絹、綿、ステンレスなど)を利用した。微量な生体成分が付着したラインは外部に設置したモータで巻き取り、輸送中の損失なしに数秒程度で質量分析装置のイオン導入口にあるインターフェース部に到達する。ラインに付着した生体成分を専用のアンビエントイオン化部によって大気圧下で効率良く抽出/イオン化させ、質量分析計に取り込ませる。開発したin-vivo内視鏡質量分析法を用いて活きたマウスの肝臓及びヒトの口内のの直接分析の実証実験を行った。当該装置は試料に熱的または化学的損傷を起こすことなく輸送でき、生体内での状態を維持したままの分析が可能であることが分かった。本年度は水溶媒用と固体サンプル用の遠隔試料採集・イオン化プロブの試作が完了した。評価実験が始まり、装置の改良と実験条件の最適化が順調に進んでいる。遠隔で試料及びイオンを採集するためサンプル及びイオン信号の損失、輸送部の汚染問題が起こる見込みである。それに対し、輸送部の設計または輸送チューブの選択についてチューブ内部の帯電効果や流体力学の効果を考慮し、信号の損失及びメモリ効果を最低限にする必要がある。本研究の技術を生体試料の研究に広げるために医学部の専門家との共同研究が必要。質量分析遠隔で試料及びイオンを採集するためサンプル及びイオン信号の損失、輸送部の汚染問題が起こる見込みである。全額執行する予定でしたが、会計システムへの入力の不備から、残金額の把握に誤りがあり、生じた未使用額については次年度に契約を行うことになった。研究者総覧遠隔試料採取とそのためのイオン化評価実験に使う消耗品(金属キャピラリー、液体クロマトグラフィー用の試料チューブなど)を購入する予定。
遺伝子発現変導を指標とした内分泌攪乱物質のスクリーニング手法の開発

SSDD法は短時間にRIと同等の感度で安価に行うことが出来る反面、選択的逆転写反応の特異性の低いこととそれによる偽陽性が多いことが問題点である。これらの問題点はDD法全般に当てはまる問題点といえる。従って、選択的逆転写反応を至適化することが出来れば従来法より利点のあるSSDD法の高いポテンシャルを生かすことが出来る。そこで、本年度は選択的逆転写反応の特異性を向上するための反応条件検討を行った。モデルとして精巣mRNAをTの数と3'端の異なる様々なアンカープライマー(3種類のGT15M、3種類のGT15VN、4種類のT12VN、4種類のT11VN)、3種類の逆転写酵素(AMV RTase、ReverTra Ace RTase、SuperScript RTase)、各種温度(37、40、42、45、47、50°C)で転写し、発現量の異なる3種類の遺伝子特異的プライマー(RFP,protamine1,mrp1)でPCR行い選択的逆転写が起こるかどうかを検討した。もし選択的逆転写の特異性が高ければ異なるアンカープライマー3'末端の一つで逆転写したcDNAでのみ遺伝子特異的プライマーでPCR増幅されることが期待された。結果は、50°Cで逆転写した場合、protamine1遺伝子以外はPCR増幅されず逆転写されないことがわかった。さらに、低い温度で逆転写した場合には本来増幅されるべきアンカープライマーだけでなく増幅されないはずのプライマーでも増幅されこれらの条件では逆転写の選択性が低いことがわかった。これらの結果は、アンカープライマーの3'末端で選択を行うことが出来ず、これらのプライマーが容易にミスマッチを含んでペアリングする事で逆転写が進行してしまうことを示している。従って今後は逆転写反応でcDNAを分画するのではなくその後のPCR反応で厳密な選択を行うことを考えている。
プトレシンが示すメチル水銀毒性軽減作用に関わる分子機構の解明

昨年度までの検討により、メチル水銀に暴露された細胞は、プトレシン合成酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)の酵素活性上昇を介したプトレシンレベルを増加させることでその毒性を軽減していることが明らかとなった。また、プトレシンはメチル水銀によるミトコンドリア傷害を介したアポトーシス誘導を抑制することも見出した。そこで本年度は、プトレシンが示すメチル水銀によるアポトーシス誘導抑制に関わる分子機構を詳細に検討した。メチル水銀はミトコンドリア膜電位の低下およびミトコンドリアからの活性酸素種産生を促進させたが、これらの変動はプトレシン添加およびODC高発現によって抑制された。Bcl-2はミトコンドリア外壁に存在し、ミトコンドリア傷害に起因するアポトーシス誘導を抑制する。このBcl-2のミトコンドリア画分中レベルはメチル水銀処理によって低下されたが、この低下はプトレシン添加およびODC高発現の条件下でも依然として認められた。一方、細胞質に存在するBax、BakおよびBimはdeathシグナルに応答してミトコンドリアへ移動し傷害を引き起こすことでアポトーシスを誘導する。ミトコンドリア画分中のBax、BakおよびBimのレベルはメチル水銀処理によって増加したが、これらの増加はプトレシン添加およびODC高発現によって抑制された。BaxおよびBakのミトコンドリアへのリクルートにcaspase-8によって切断されたBidが関与することが知られており、メチル水銀処理によってcaspase-8の活性化およびBidの切断が促進されたが、これらもプトレシン添加およびODC高発現によって抑制された。以上のことから、プトレシンはメチル水銀によるcaspase-8の活性化を阻害することでミトコンドリア傷害に起因するアポトーシス誘導を抑制していることが明らかとなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本申請者らは、メチル水銀を投与したマウス脳内でプトレシンのレベルが増加し、この条件ではプトレシン合成酵素であるornithine decarboxylase (ODC)の活性が上昇していることを見出している。また、プトレシンの培地中への添加がマウス神経芽細胞のメチル水銀毒性を軽減したことから、ODC活性の上昇がメチル水銀毒性に対する防御応答である可能性が示唆されている。そこで本年度では、メチル水銀によるODC活性の上昇に関わる分子機構について検討した。ODC活性の上昇が認められた濃度のメチル水銀でマウス神経芽細胞を処理したところ、ODC mRNAレベルは変動せず、その蛋白質レベルが増加した。そこで、ODC高発現プラスミドをマウス神経芽細胞に導入したところ、ODC活性の上昇が認められた。シクロヘキシミド(蛋白質合成抑制剤)の存在下において、メチル水銀はODC蛋白質の分解を抑制した。また、プロテアソーム阻害剤の存在下においてODC蛋白質レベルが増加し、本条件ではメチル水銀によるODC蛋白質レベルの増加がほとんど認められなかった。これらのことから、メチル水銀はプロテアソームでのODC蛋白質の分解を抑制することによってODC活性を上昇していることが明らかになった。しかし、メチル水銀はODC蛋白質のユビキチン化レベルにはほとんど影響を与えなかったから、ODC蛋白質のプロテアソームでの分解にODC蛋白質のユビキチン化は関与しないと考えられる。そこで、ODC結合蛋白質であるNQO1の阻害剤であるdicoumarolで前処理したところ、メチル水銀によるODC蛋白質レベルの増加が認められなくなった。また、メチル水銀処理によってODCとNQO1との結合レベルが増加した。以上のことから、メチル水銀はODCとNQO1の結合促進を介してODC蛋白質を安定化させることによってその活性を上昇していることが明らかになった。これまでの本申請者らの研究により、生体はメチル水銀の侵入を感知し、それに応答してODCの活性を上昇させることでメチル水銀毒性から自身を防御している可能性が示唆されている。そこで本研究では、メチル水銀によるODC活性上昇の機構、および、ODCの代謝産物であるプトレシンが示すメチル水銀毒性軽減作用に関わる分子機構を明らかにすることを最終目的として実施している。本年度の研究により、メチル水銀はODC蛋白質のプロテアソームでの分解を抑制することによってその活性を上昇させていること、そしてODC結合蛋白質であるNQO1がメチル水銀処理によってODCとの結合が促進され、この結合がODCのプロテアソームでの分解を抑制していることを明らかにすることができた。プトレシンが示すメチル水銀毒性軽減作用に関わる分子機構については実験途中であるものの、以上のように今後本研究を推進していく上で貴重な知見を得ることができたことから、本研究は計画に従って「概ね順調に進展している」と判断できる。我々は、メチル水銀を投与したマウス脳内でプトレシンの濃度が増加し、この条件ではプトレシン合成酵素であるornithine decarboxylase (ODC)の活性が上昇していることを見出している。また、プトレシンの培地中への添加がマウス神経幹細胞のメチル水銀毒性を軽減したことから、ODC活性の上昇がメチル水銀毒性に対する防御応答である可能性が示唆されている。さらに、メチル水銀によるODC酵素活性の上昇にはNQO1との結合促進を介したODC蛋白質の安定性の増加が関与していることを明らかにした。そこで本年度では、ODC高発現によって上昇したプトレシンによるメチル水銀毒性軽減機構について検討した。メチル水銀による神経細胞死にアポトーシスが関与することが知られている。

プトレシンの培地中への添加によってメチル水銀によるアポトーシスの誘導(DNAの断片化およびカスパーゼ3の活性化)が抑制され、同様の結果がODC高発現によっても認められた。アポトーシスを誘導する主な経路として小胞体ストレスを介する経路、ミトコンドリア損傷を介する経路(以上内在性経路)および種々のデスリガンドからの経路(外来性経路)が知られている。メチル水銀はこれらの経路を全て活性化したが、ODC高発現はメチル水銀によるミトコンドリア損傷を介する経路の誘導(シトクロムcの放出促進などを指標として測定)のみを有意に抑制した。一方、プトレシンと同類のポリアミンであるスペルミンの培地への添加はメチル水銀によるアポトーシス誘導を増強し、スペルミン存在下ではODC高発現によるメチル水銀毒性軽減作用が全く認められなくなった。これらのことから、細胞内で増加したプトレシンはメチル水銀毒性増強作用を示すスペルミンと競合的な作用を示すことによってメチル水銀によるアポトーシス誘導を抑制していることが明らかになった。これまでの先行研究によって、生体はメチル水銀の侵入を感知し、それに応答してODCの活性を上昇させることよってメチル水銀毒性から自身を防御している可能性が示唆されている。そこで本研究では、メチル水銀によるODC活性上昇の機構、および、ODCの代謝産物であるプトレシンが示すメチル水銀毒性軽減作用に関わる分子機構を明らかにすることを最終目的として実施している。本年度の研究によって、ODC高発現によって細胞内で上昇したプトレシンはメチル水銀によるミトコンドリア障害を介したアポトーシス誘導を抑制することでメチル水銀毒性軽減に涵養していることが明らかになった。また、プトレシンはメチル水銀毒性増強作用を示すスペルミンと競合的な作用を示すことによってメチル水銀によるアポトーシス誘導を抑制している可能性を見出すこともできた。プトレシンが示すミトコンドリア障害抑制作用に関わる分子機構について詳細に検討中であるものの、上述のように今後本研究を推進していく上で貴重な知見を得ることができたことから、本研究は計画に従って「概ね順調に進展している」と判断できる。昨年度までの検討により、メチル水銀に暴露された細胞は、プトレシン合成酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)の酵素活性上昇を介したプトレシンレベルを増加させることでその毒性を軽減していることが明らかとなった。また、プトレシンはメチル水銀によるミトコンドリア傷害を介したアポトーシス誘導を抑制することも見出した。そこで本年度は、プトレシンが示すメチル水銀によるアポトーシス誘導抑制に関わる分子機構を詳細に検討した。メチル水銀はミトコンドリア膜電位の低下およびミトコンドリアからの活性酸素種産生を促進させたが、これらの変動はプトレシン添加およびODC高発現によって抑制された。Bcl-2はミトコンドリア外壁に存在し、ミトコンドリア傷害に起因するアポトーシス誘導を抑制する。このBcl-2のミトコンドリア画分中レベルはメチル水銀処理によって低下されたが、この低下はプトレシン添加およびODC高発現の条件下でも依然として認められた。
SOS応答におけるシグナル分子産生の分子機構

大腸菌のSOS応答は、ストレス応答の代表例ではあるものの、その始動のステップは充分わかっていない。その原因の一つは系の複雑さにある。我々は、これまで、複製フォークが特定の部位(複製終結点)で停止する現象を研究してきた。この系をSOS誘導の開始反応同定のために用いようとしたのが本研究である。終結点とは、複製フォークの進行を停止させる染色体上の特定の部位(20塩基対の特異的配列)である。野生株大腸菌の複製は一つの決まった開始点(oriC)より両方向に始まり、環状のDNA上を進み、向かい側で落ち合う。我々は終結配列を合成し、それを野生株のlac遺伝子内に挿入した。この株(ブロック株)では、両方向に進むフォークは共に2つの終結点で阻害され、もしも阻害が完全であるならば、複製を完了出来ず生育不能と予想される。しかしこの株を作成したところ、増殖速度は野生株より少し遅いものの、生存できることがわかった。ブロック株は以下の様な興味深い性質を示した。(1)組換え遺伝子が欠損した場合、生存不能になること。(2) SOS誘導が常時起こっていること。これらの現象全てを矛盾なく説明できるモデルを考え出した。モデルの要点は、停止したフォークを一度こわして、再度新しいフォークを作り直すことにつきる。フォーク停止後、二本鎖切断が起こり、その後生じるDNA分解産物が、SOS誘導のシグナルと考えるとうまく説明できる。現在このSOS誘導に必要な遺伝子を検索中であるが、少なくともRecBCD酸素中のRecDのSOS応答への関与はなさそうである。しかしRecBC遺伝子の関与の有無は、それらの欠損変異を導入するとブロック株が致死性を示すため、今後一考が必要である。ともかくこの系を用いて、SOS誘導が起こらない変異遺伝子を同定することにより、SOS誘導の開始反応、シグナル等を是非明らかにしたい。
2型糖尿病による左室拡張機能障害の分子機序

2型糖尿病において、急性圧負荷が拡張期左室伸展性を低下させる機序を解析した。2型糖尿病心ではAMP deaminaseを介したアデニンヌクレオチドの分解が亢進しており急性圧負荷中に心筋ATP濃度が低下すること、心筋ATP濃度は左室等容弛緩時定数(tau)および左室拡張末期圧と負の相関を認めること、これらの左室拡張特性は間質の線維化や細胞骨格蛋白titinの変化が出現する前より認めることを明らかにした。本年度は、2型糖尿病心筋における急性負荷に対する左室応答、およびその機序として細胞骨格蛋白titinと心筋代謝の変化に焦点を当てて解析した。2型糖尿病モデルラットであるOLETFでは、フェニレフリンによる急性圧負荷時に拡張末期圧-容積関係(EDPVR)の左上方へのシフトがおこり、コントロールラットであるLETOに比べ、有意に拡張末期圧(EDP)が上昇した。一方で、急性容量負荷では両群でEDPVRは右方へシフトし、EDPの上昇は認めなかった。OLETFでは軽度高血圧を合併するが、LETOに腎血管性高血圧を発症させた高血圧性肥大心モデルでは、圧負荷に対するEDP上昇は認めなかった。摘出灌流心標本において、titinの蛋白発現およびPKAによるリン酸化をPro-Qダイアモンドによるゲル染色にて評価した。PKA刺激薬であるドブタミンはOLETF、LETO両群において、トロポニンIやミオシン結合蛋白Cのリン酸化を増加させたが、主要なisoformであるN2B titinのリン酸化は増加させなかった。更に、摘出灌流心標本において、OLETFでは灌流圧を上昇させるとEDPが増加したが、心保護液による心静止下では、圧-容積関係はLETOと同等であった。次に、急性圧負荷が心筋代謝に及ぼす影響を、メタボローム解析にて評価した。OLETFでは圧負荷にて、ATPおよび総アデニンヌクレオチド量の低下とともに、AMPの代謝物であるIMPが増加した。OLETFの心筋では、AMP deaminase活性が、LETOに比べ有意に増加していた。心筋ATP含量は、左室等容弛緩時定数(tau)およびEDPと負の相関を認めた。以上の結果から、糖尿病心筋では、圧負荷時に過剰なアデニンヌクレオチド分解によりATP供給が減少し、左室伸展性が低下することが示唆された。本年度はまず、2型糖尿病心筋においてAMP deaminase(AMPD)活性が亢進する分子機序について検討した。ラット心筋における主要なアイソフォームであるAMPD3の発現は、mRNAおよび蛋白レベルにおいて、2型糖尿病モデルラットOLETFと正常対照ラットLETOに差を認めなかった。心筋AMPD活性は発現量以外にも、至適pH、ATP、ADP、NADHおよびPKCによるリン酸化により上昇し、無機リン酸およびGTPによって抑制されることが報告されているため(Hohl et al. Mol Cell Biochem 1999)、これら活性制御因子の変化について検討した。まず、糖尿病心筋で報告されているPKC活性上昇の関与について検討したが、PKC阻害剤の前処置によるin vitro assayではAMPD活性の低下は認められなかった。次に、糖尿病モデルマウスの肝臓においてAMPD活性が亢進しており、その機序として細胞質無機リン酸の低下が関与するという報告(Cicerchi et al. FASEB J 2014)から、心筋無機リン酸含有量も測定したが、OLETFとLETOに差を認めなかった。以上の結果から、2型糖尿病心筋のAMPD活性は、その発現量ではなく、翻訳後修飾や未知の活性制御因子の関与により亢進していることが示唆された。糖尿病心筋にて上昇したAMPD活性への介入効果に関しては、現時点で活性制御機構が同定できなかったため、発現抑制による介入を試みた。予備実験にて、新生児ラット単離心筋細胞およびH9c2細胞において、siRNAによるAMPD3のノックダウンが可能であることをRT-PCRで確認したが、in vivo-jetPEI(Polyplus transfection)を用いたsiRNAの導入は現時点で達成できていない。医歯薬学急性負荷に対する左室機能応答に関して、OLETFが臨床における収縮能の保たれた心不全(HFPEF)と同様の応答を呈するモデルであることが確認できた。2型糖尿病における、細胞骨格蛋白titinの発現や修飾の変化についても基本的なデータを得ることができた。また、メタボローム解析により、cross-bridgeサイクルの重要な規定因子である心筋エネルギー代謝について、新知見を得る事ができた。2型糖尿病心は拍動下において、後負荷増大に対する拡張機能の感受性が亢進しており、その機序として細胞外基質や細胞骨格の変化ではなく、AMP deaminase活性の亢進を介したATP供給能の低下が関与しているとの成績を得た。今後は、糖尿病心筋にてAMP deaminase活性が亢進する機序、およびAMP deaminaseに対する介入が糖尿病心筋におけるエネルギー代謝および心機能を改善させるかに関して、遺伝子改変マウスも用いて研究を推進する。

今年度の成績をうけて今後遺伝子改変マウスを用いた実験も計画しており、糖尿病モデルマウスにて再現実験を行う予定である。動物の購入や飼育、マウス用の圧-容積カテーテル・人工呼吸器・実験試薬の購入、学会旅費(ヨーロッパ心臓学会年次集会、アメリカ心臓協会年次集会)、論文投稿のための費用として使用する予定である。
金属間化合物の変形と破壊に関する粒界のダイナミックスの原子レベルシミュレーション

金属間化合物に関する原子レベルでのダイナミックスのシミュレーションとして,分子動力学計算を行った.電子状態に起因した金属特有の諸性質を簡便かつ効果的にシミュレーションに反映させるために,原子間相互作用の記述方法として汎関数多体ポテンシャルを用いた.これにより,C16構造を有するZr_2Niについて,その融点やダイナミックスの実験値を再現する結果を得た.さらに,L1_2構造を有するNi_3AlのΣ粒界のダイナミックスについての解析を行った.この場合,粒界は二つの無限平衡平板として結晶中に導入した.粒界を含む結晶のパワースペクトルは顕著な歪依存性を示し,平衡位置からのずれが大きい場合には,低エネルギー領域にシャープなピークが生じることを明らかにすると共に,単結晶と比較した場合,粒界の存在によりスペクトルの一部にだれが生じることを明らかにした.また,一軸引張を受ける場合のΣ粒界を含むNi_3Alの変形ならびに破壊について分子動力学計算を行い,その過程を明らかにした.歪量が小さい場合には結晶の変形は格子の一軸変形として結晶全体において均一に生じ,粒界における乱れは生じない.歪量が臨界値を超えると,引張軸に対して45°の角度に局所的に変型した領域が不均一に生じる.歪量を増加させるとこの領域は粒界に関して対称に存在するようになる.このように,金属間化合物の変型においては,組織レベルのみならず,原子レベルでも変形は局所的に生じることを明らかにした.さらに,変形した結晶に歪を加えると,粒界部分において破断を生じ,破面近傍の数原子層はランダムな構造を有していることを明らかにした.金属間化合物に関する原子レベルでのダイナミックスのシミュレーションとして,分子動力学計算を行った.電子状態に起因した金属特有の諸性質を簡便かつ効果的にシミュレーションに反映させるために,原子間相互作用の記述方法として汎関数多体ポテンシャルを用いた.これにより,C16構造を有するZr_2Niについて,その融点やダイナミックスの実験値を再現する結果を得た.さらに,L1_2構造を有するNi_3AlのΣ粒界のダイナミックスについての解析を行った.この場合,粒界は二つの無限平衡平板として結晶中に導入した.粒界を含む結晶のパワースペクトルは顕著な歪依存性を示し,平衡位置からのずれが大きい場合には,低エネルギー領域にシャープなピークが生じることを明らかにすると共に,単結晶と比較した場合,粒界の存在によりスペクトルの一部にだれが生じることを明らかにした.また,一軸引張を受ける場合のΣ粒界を含むNi_3Alの変形ならびに破壊について分子動力学計算を行い,その過程を明らかにした.歪量が小さい場合には結晶の変形は格子の一軸変形として結晶全体において均一に生じ,粒界における乱れは生じない.歪量が臨界値を超えると,引張軸に対して45°の角度に局所的に変型した領域が不均一に生じる.歪量を増加させるとこの領域は粒界に関して対称に存在するようになる.このように,金属間化合物の変型においては,組織レベルのみならず,原子レベルでも変形は局所的に生じることを明らかにした.さらに,変形した結晶に歪を加えると,粒界部分において破断を生じ,破面近傍の数原子層はランダムな構造を有していることを明らかにした.
日本型生産システムの形成に関する研究

本研究「日本型生産システムの形成に関する研究」は、主に自動車企業を対象とし、サプライヤーとアセンブラーの関係も広義の生産システムと考え、現在の関係がどのように形成されたかを提出するものである。本研究の実施計画に基づき、私が個人的に収集してきた資料の整理を最初に行なった。と同時に、トヨタ自動車に出向きインタヴューなどにより資料の収集をおこなった。また、国立国会図書館などに出向き、これまで検討を行なってこなかった雑誌等の検索、複写などをおこなった。また、折に触れ、元従業員や現在のサプライヤーとの面談をおこなった。また8月には来日したラゾーニック教授やマス教授と本研究の構想について、議論をし、貴重な示唆を受けた。こうした調査、議論をおこなう過程で明らかになったのは、本研究が最初に対象にした、研究対象の時期を戦後のみに限定するだけでは不十分なのではないかということである。また、ラゾーニック教授やマス教授との討論の結果、彼らの研究プロジェクトと本研究が重なることがわかり、彼らの要請にしたがい、彼らの研究プロジェクトに参画することになった。(予備会議は1993年3月にハーヴァード大学にて開催予定で、本研究の成果の一部も、その研究プロジェクト予備会議にて発表する。)秋以降はそれまでの調査をとりまとめる作業に従事するとともに、本研究を時期的に遡る必要性と、それが実現可能か否かについての予備調査も行なった。この結果、研究を遂行することが可能であるとともに、必要であるとの結論に達し、平成5年度の科学研究費一般研究(C)に「日本における下請制度の展開」を申請した。なお、本年度の研究成果の取り纒めは、目下おこなっており、1993年度中には公表したいと考えている。
音声信号処理技術に基づく英語プレゼンテーションのための音声学習支援ソフトの開発

本研究は、英語プレゼンテーションにおける音声面の特徴を発話速度、ポーズ、ピッチ面から分析し、プレゼンテーションに特化した英語発音学習支援ソフトの開発を行った。学習ソフトに必要な音声の読み込み、再生、ピッチ変更、およびピッチ曲線の太さと色の変化による音の強さを表示する機能について検討・試行を行った。また、モデル音声を学習者の声質に近づける機能の試行や学習者とモデル音声を比較して評価するスコアリングシステムの作成を行った。今後はソフトの完成度向上に向けて,ユーザテストやユーザからの意見の反映,また各機能の改善を行う必要がある。本研究の目的は、英語プレゼンテーションに特化した音声学習ソフトウェアの開発と検証を4年計画で実施することである。1年目は英語母語話者のプレゼンテーション時の音声特徴を抽出するため、英語母語話者の音声録音とその音声データにおけるポーズやピッチなどの測定、及び分析を行った。同時に音声の自動認識ソフト開発のための基礎研究を行った。(1)英語プレゼンテーション時の音声特徴を抽出するための手法や分析項目を確認するため、パイロットスタディを実施した。7名の英語母語話者の録音音声と合成音声ソフトの音声について、長さ、ピッチ、インテンシティについて比較分析を行った。その結果、合成音声と英語母語話者の音声上の顕著な違いは、英語にリズムにあることが示唆された。英語母語話者の音声では、強弱リズムをつける際に長さ、ピッチ、インテンシティが同期して変動することで発話にメリハリをつけているが、合成音声の長さはネイティブと似た動きをする一方でピッチとインテンシティはそれに同期しない面が目立った。また、A and Bのように2つの項目をandでつないで発音する際に英語母語話者は、最初の項目を、合成音声は後の項目のピッチを高くする違いなども観察できた。(2)音声の自動認識ソフトの開発に向けた基礎研究として、今年度は音声データを自動で音節にわけるのではなく、音節の核となる母音をもとに区切る手法を試行した。音声データから母音のフォルマントをケプストラム法に抽出できるようになり、その抽出したフォルマント情報から母音の認識するプログラムを作成した。英語プレゼンテーションに特化した音声学習ソフトウェアの開発をめざす本研究の2年目は、英語プレゼンテーション時の音声特徴の抽出のための音声データ収集と分析、および開発するソフトウェアのユーザーインターフェイスの検討を行い、プロトタイプソフトウェアのためのたたき台を作成した。また、1年目からの継続でモデル音声と学習者音声の比較を可能をする上で必要となる、音節の母音認識・抽出方法についての検討を行った。また、AILA (Association of Applied Linguistics)World Congress 2014において、参加者の英語プレゼンテーションスタイルや音声特徴の調査と共同研究者(野口)の研究発表時の英語音声を録音した。また、英語発話の流暢性に関する発表をシンポジウムで行った。英語プレゼンテーションに特化した英語発音練習ソフトウェアの開発をめざす本研究は、これまで学習ソフトに必要なモデル音声の読み込み、再生、ピッチ変更、学習者の音声取得とピッチ抽出および画面への表示などの機能について検討し、試行を行ってきた。本年度は、学習者が真似しやすいモデル音声への変換と音声特徴の画面への表示に取り組むとともに、英語母語話者のプレゼン音声におけるポーズにフォーカスし、ポーズの出現位置、回数、ポーズ長、話速および発話時間に対する割合などを分析した。インテリジビリテイ(相手に通じる発音の明瞭さ)を高めるためには、個々の音素よりもイントネーションの習得が重要だとされ、既存の発音練習ソフトはモデル音声と学習者音声のピッチ変動を上下に表示する形式が多いが、ピッチの変動を知覚・認識を容易にする点を検討し、モデル音声と学習者のピッチや声質を近づけることが効果的ではないかという仮説をたて声質変換を試行した。具体的には声帯振動による音源の情報である基本周波数(F0)と,声道の形状情報であるスペクトル包絡の2つを用い、混合正規分布モデル(GMM: Gaussian Mixture Model)を用いて変換を試行した。また、入力音声の表示方法として昨年度は,音声特徴の表示にピアノロール方式を採用したが、この方法ではモデル音声の波形との差異は直感的に理解しにくいため、今年度はピッチ波形に太さ・色の変化を付加し,音の強さと高さを表現する方法を考案した。あらゆる英文に対応できるシステムではないが、英語プレゼンに頻繁に用いられる英文を活用し、学習者にとって練習しやすく効果的な発音練習ソフトウェアの実現に欠かせない機能の構築とインターフェイスの改善を進めることができている。また、英語母語話者のプレゼン時の音声特徴分析においても、ソフトウェア開発にもっとも取り入れやすいポーズに関して、貴重な分析結果が得られた。本研究の目的は、英語プレゼンテーションに特化した英語発音学習支援ソフトを音声処理技術に基づいて開発することである。まず英語プレゼンテーションを行う際の音声特徴を明らかにするため、英語母語話者のプレゼンテーション時の音声を録音し、話速、ポーズ、ピッチなどの分析を行った。そしてソフト開発の基礎研究として音声データを音節ごとに区切るために母音フォルマントをケプストラム法により抽出し、フォルマント情報から母音を認識するプログラムを作成した。またソフトウェアのユーザーインターフェイスを検討し、プロトタイプのソフトウェアを作成した。学習ソフトに必要なモデル音声の読み込み、再生、ピッチ変更、学習者の音声取得とピッチ抽出および画面への表示機能についての検討・試行を行った。入力音声の表示方法としてはピアノロール方式を採用し、ピッチ波形に太さ・色の変化を付加し、音の強さと高さを表現する方法を考案した。

今年度は、学習者の発音をモデル音声と比較して評価するスコアリングシステムの採点アルゴリズムの改良を行った。ピッチによる採点を基礎点数とし,インテンシティの値を使い加点を行うことで評価を行う方法を作成した。さらに、ペンシルバニア州立大学工学部でプレゼンテーションを教えるMichael Alley教授の授業およびワークショップなどを見学させてもらい、効果的なプレゼンに必要なデリバリー、とりわけ発音の指導のあり方について意見交換を行うと同時に本研究への助言をもらった。今や英語プレゼンテーション力はどの国の学生にとっても研究面や仕事面で欠かせないスキルになっている。日本人学生にとっては外国語である英語で発表するということで英語母語話者以上に英語で話す練習が必要となる。その際に英語プレゼンの特徴をそなえたモデル音声を用いて練習できるソフトウェアは、日本人学生のプレゼン力向上に寄与するものと考える。本研究は、英語プレゼンテーションにおける音声面の特徴を発話速度、ポーズ、ピッチ面から分析し、プレゼンテーションに特化した英語発音学習支援ソフトの開発を行った。学習ソフトに必要な音声の読み込み、再生、ピッチ変更、およびピッチ曲線の太さと色の変化による音の強さを表示する機能について検討・試行を行った。また、モデル音声を学習者の声質に近づける機能の試行や学習者とモデル音声を比較して評価するスコアリングシステムの作成を行った。今後はソフトの完成度向上に向けて,ユーザテストやユーザからの意見の反映,また各機能の改善を行う必要がある。英語プレゼンテーション時の音声特徴を抽出するための英語母語話者の音声データ収集に当初の計画以上の時間がかかったが、それも完了し、分析を進めながら指導上重要なポイントの絞り込みを行っている。また、ソフトの開発するソフトウェアのユーザーインターフェイスの検討を行い,プロトタイプソフトウェアのためのたたき台を作成し、改善点などの洗い出しを行っている。今年度の研究成果を、電子情報通信学会と教育システム情報学会で発表した。これまで開発してきた機能とインターフェイスについての検証を進めながら、アメリカペンシルバニア州立大学のプレゼン指導専門家であるマイケル・アリー教授などから意見や助言をもらい、改善を行う。また、英語母語話者のプレゼン時の音声特徴についての分析をまとめ発表する予定である。英語教育英語プレゼンテーション時の音声特徴抽出とそれに基づいた指導上のポイント項目の検討を深め、ソフトウェア上にどのように提示するかの検討と実装を行う。また、音節中の母音抽出のためのより効果的な方法の検討と、学習者の声のピッチにモデル音声を合わせるための音声処理についての検討を行う予定である。今年度は、当初の計画に沿って英語プレゼンテーション時の音声データの収集と分析、音声自動認識ソフトウェアの開発を進めた。
グラフの連結度とその応用に関する総合的研究

本研究の目的は,グラフの連結度とその応用に関する理論的研究と実用アルゴリズム設計に関する研究を行うことである。解析(所与のグラフの連結度を求めること)、抽出(所望の連結度を持つ部分グラフの抽出)、構成(所望の連結度をもつグラフの構成)に関する理論的研究とアルゴリズム設計、および応用を意識したオンラインアルゴリズム、分散・並列アルゴリズム等の実用アルゴリズムの設計に関する成果を得ている。本研究の目的は、グラフの連結度とその応用に関する研究を行うことである。具体には、解析(所与のグラフの連結度を求めること)、抽出(所望の連結度を持つ部分グラフの抽出)、構成(所望の連結度をもつグラフの構成)に関する理論的研究とアルゴリズム設計、および応用を意識したオンラインアルゴリズム、分散・並列アルゴリズム等の実用アルゴリズムの設計である。今年度の成果としては、以下の通り合計で研究論文16件の出版がある。【I.グラフ構成に関して:7件】(1)各点の辺次数上限が設定されている場合に、所望の点連結度を持ち、かつ辺数が最小のグラフ構成法に関する研究(2件)。(2)グラフの最大誘導木抽出法に関する研究(3件)。(3)プリント基板設計に関して、ビアの少ない配線問題解法、および層数の少ないレイアウト設計問題に関する研究(2件)。前者は(2)を解法ツールとして必要とする。【II.実用アルゴリズムの設計に関して:9件】(1)グラフの最大重みマッチングアルゴリズムの高速化に関する研究(1件)。これは、付加辺重みがある場合に、コスト総和最小で所望の辺連結度または点連結度を満すグラフを構成する手法の高精度化、高速化に有用なツールである。(2)グラフの彩色問題解法の高精度化、高速化に関する研究(3件)。総当り的探索を効率良く実行する分枝限定法の分散・並列処理による高速化を研究している。(3)グラフの点被覆問題解法の高精度化、高速化に関する研究(1件)。グラフの基本問題の一つで幅広い応用を持ち、(2)の高速化にも活用されている。(4)ペトリネット(ベクター加算システムの具体的モデル)に関して、指定した2つのベクトルに対し、一方から他方に遷移するベクトルの加算系列算出法に関する研究、一方から出発して他方に出来るだけ近いベクトルへ遷移する手法に関する研究、および最適初期資源配分問題の解法に関する研究(4件)。これは有向グラフの連結性に深く関係する。本研究の目的は、グラフの連結度とその応用に関する研究を行うことである.具体には、解析(所与のグラフの連結度を求めること)、抽出(所望の連結度を持つ部分グラフの抽出)、構成(所望の連結度をもつグラフの構成)に関する理論的研究とアルゴリズム設計、および応用を意識したオンラインアルゴリズム、分散・並列アルゴリズム等の実用アルゴリズムの設計である。今年度の成果としては、以下の通り合計で研究論文8件の出版がある。【I.グラフ構成に関して:3件】(1)各点の辺次数上限が設定されている場合に、所望の点連結度を持ち、かつ辺数が最小のグラフ構成法に関する研究(2件)。(2)グラフの最大誘導木抽出法に関する研究(1件)。【II.実用アルゴリズムの設計に関して:5件】(1)グラフの彩色問題解法の高精度化、高速化に関する研究(1件)。(2)ペトリネット(ベクター加算システムの具体的モデル)に関して、指定した2つのベクトルに対し、一方から他方に遷移するベクトルの加算系列算出法に関する研究、一方から出発して他方に出来るだけ近いベクトルへ遷移する手法に関する研究、および最適初期資源配分問題の解法に関する研究(4件)。今年度の成果としては、以下の通り合計で研究論文11件の出版がある。【1.グラフ構成に関して:6件】(1)各点に辺の付加に関するある制約が設定されている場合に、所望の辺連結度を持ち、かつ辺数が最小のグラフ構成法に関する研究(3件)。(2)グラフの最大誘導木抽出法に関する研究(2件)。(3)フローネットワークの点容量割り当てに関する研究(1件)【II.実用アルゴリズムの設計に関して:5件】(1)実用的セッションスケジューリング解法に関する研究(2件):実用的なスケジューリングに対する解法の高精度化および高速化に関する研究。(2)ペトリネット(ベクター加算システムの具体的モデル)に関する研究(3件):指定した2つのベクトルに対し、一方から出発して他方に出来るだけ近いベクトルへ遷移する手法に関する研究、および最適初期資源配分問題の解法に関する研究。これらは有向グラフの連結性に深く関係している。