hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
関西時代の谷崎潤一郎に関する実証的研究

1.山田和幸氏(新潟大学卒)が調査・発見された谷崎全集逸文及び関連資料十一点に私が解説を付し、「谷崎潤一郎新資料紹介(1)(3)」と題して、「芦屋市谷崎潤一郎記念館ニュース」(平成七年九月、十二月、平成八年三月号)に発表した。2.神戸の大富豪で、私財を投じて南蛮紅毛美術品を蒐集した事で知られる池長孟と谷崎潤一郎との交友関係に光を当て、谷崎記念館で平成八年二月六日から三月二十四日まで小特集「谷崎潤一郎と池長孟」展を開催すると共に、「芦屋市谷崎潤一郎記念館ニュース」(平成七年十二月)に紹介記事を執筆した。3.谷崎潤一郎が、ラジオやテレビに出演した際のテープやビデオを各ラジオ局・テレビ局の協力で集め、その内容を活字化して、平成七年十二月に、「芦屋市谷崎潤一郎記念館資料集(一)映像音声資料」として刊行した。4.従来、谷崎潤一郎の『細雪』については、反戦平和主義の立場に立つ芸術的抵抗だったという理解が一般的であったが、潤一郎が戦争に対して示した反応を、日清・日露・日中・太平洋の各戦争について精査し、『細雪』執筆当時の潤一郎に反戦的意図がなかった事を明らかにした。その成果は、「谷崎潤一郎と戦争-芸術的抵抗の神話-」と題して、平成八年三月「甲南女子大学研究紀要」第31号に発表した。5.谷崎潤一郎の養女だった観世恵美子さんの御協力により、これまで紹介されたことのない谷崎潤一郎宛の吉井勇・谷崎松子・武者小路実篤・三島由紀夫・棟方志功・古川緑波・花柳章太郎の谷崎潤一郎宛書簡約30通を借覧・調査し、谷崎の交友関係などについて、新たな情報を得た。また、谷崎潤一郎自身の未発表書簡も二通借覧できた。ただし、それらの内容は、まだ公表していない。
唾液腺における水チャネルの細胞核移行機序の解明、新機能の探索と新機能による創薬

耳下腺のM3ムスカリン受容体やα1アドレナリン受容体が刺激を受容すると、水チャネル・アクアポリン5(AQP5)は細胞核と管腔膜へ移動する。AQP5の細胞核への移動機序とその意義の一部を解明した。セビメリンでムスカリン受容体を刺激3分後の核膜では、AQP5とRab5増量と共沈殿が認められた。その増量は界面活性剤可溶性画分でも不溶性画分でも認められたが、核膜に局在するAQP5の蔗糖密度勾配による浮揚性は少なかった。刺激3分後の核の直径は約60%に低下した。加齢とともに核膜へのAQP5の移動は低下するが、私共が開発した人工唾液(特願2013-022555)により解消された。1)AQP5が核膜で輸送する水以外の物質の解明-調製したAQP5が核膜に凝集した核、核膜にほとんど無局在核の外液ヘ蛍光又は3H-標識のアデニン、アデノシン、アデニル酸、ウラシル、ウリジン、ウリジル酸、5-フルオロウラシル等を加え低張に保ち、核内の標識化合物の量を測定した。反対に核外溶液を高張にして外液のmRNA,tRNA, UsnRNA,rRNA,pre-miRNA, miRNA量を測定した。ヌクレオポリンの阻害薬・レプトマイシンBの存在下でも測定し、既知のヌクレオポリンによる輸送影響を除外して検討した。さらに、上述標的物質のみならず、AQP5が輸送する更に多くの物質を探索するため、核外液や核ホモジートを二次元電気得移動にかけ、各種抗体を用いて解析した。核内取り込まれる物質は比較的容易だが、核外へ分泌される物質の同定に難攻している。2)AQP5が核膜上の脂質・ラフトで機能を発揮するのか、ノンラフトで機能を発揮するのかの解明-ラフトを崩壊させる薬物・Methyl-cyclodextrin, Filipinを核外溶液に添加して1)と同様の実験を行い、ラフト崩壊薬の存在下でも同様の結果がでるか検討した。一方、ラフト崩壊薬で処理した核を2)の方法で免疫染色し、共焦点顕微鏡から解析した。ラフト上で機能していた。3)AQP5の核移行機序への低分子量GTPase Rab, Ran関与の解明、定常置へ誘導する因子の検索、移動に関与する細胞内情報伝達系の解明-セビメリンを投与した野生型ラットより経時的に唾液腺を摘出し、管腔膜、細胞質、核膜、核質に分画する。各画分のAQP5を免疫沈降法により回収し、SDS-PAGEと各種抗体を用いたウェスタンブロッティング法からAQP5と複合体を形成している分子を解析し、刺激に応答してAQP5を細胞内の各定常置へ誘導する因子と細胞内情報伝達系を検討した。管腔膜へ移動するAQP5は脂質・ラフトと共に移動することを既に示した(Am.J.Physiol.,289,C1303-1311,2005)が、核へ移動するAQP5の緒性質は不明である。そこで、1% Triton X-100(TX)で核膜のホモジネートを調製して遠心チューブの底に入れ、45%, 35%, 5%の蔗糖溶液を積層、240,000xg, 18時間スウィングロータにて遠心し、各フラクションを水チャネル・AQP5の抗体や脂質ラフトのマーカー・GM1やFlotillin-2の抗体を用いてをウェスタンブロッティングして解析した。管腔膜のAQP5は浮揚性の高い画分に存在していたのに対し、核膜のAQP5は浮揚性の低い界面活性剤不溶性画分に存在していた。また、TX可溶性画分にも多く存在した。成熟(12週齢)と老齢ラット(18ヶ月齢)の雄性ラットに人工唾液(特許、特願2013-022555、経口アンチエイジング剤として私共が開発した)又は、水道水を飲用させて固形飼料にて3週間飼育した。成熟ラットでは水道水で飼育しても人工唾液で飼育しても、セビメリン(M3ムスカリン作用薬)刺激によるAQP5の管腔膜と核への移動に差が認められなかったのに対し、老齢ラットでは水道水を飲用しているとセビメリン刺激によるAQP5の管腔膜と核への移動に老性低下が認められた。しかし、人工唾液を飲用した老齢ラットでは、セビメリン刺激によるAQP5の管腔膜と核への移動の低下が解消された。即ち、唾液腺のM3ムスカリン受容体が刺激を受容すると、AQP5は核膜にも移動して核内外の水移動に役割を果たすこと、核膜へ移動するAQP5が存在するvesicleは浮揚性において管腔膜へ移動するそれとは性質を異にすることを明らかにした。この移動には老性低下があったが、私共が開発した人工唾液を3週間投与することで解消できた。

その増量は界面活性剤可溶性画分でも不溶性画分でも認められたが、核膜に局在するAQP5の蔗糖密度勾配による浮揚性は少なかった。刺激3分後の核の直径は約60%に低下した。加齢とともに核膜へのAQP5の移動は低下するが、私共が開発した人工唾液(特願2013-022555)により解消された。1)無刺激・刺激動物の作成と耳下腺におけるAQP5やAQP5の基盤分子の細胞内局在解析ー8週齢の雄性ラットの尾静脈より生理食塩水又はセビメリン(5mg/kg)を投与して経時的に耳下腺を摘出して凍結切片を作製した。抗AQP5抗体、ラフトのマーカー(Flotillin-2, GM1)、低分子量GTPaseや核膜のマーカー(ラミンB受容体)の抗体と反応後、二次抗体、Alexa Fluor488および568を用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡で観察したところ、セビメリンで刺激1.54.5分後、AQP5のRab5,GM1,ラミンB受容体との共局在が認められた。2)電子顕微鏡による微細構造解析ー摘出した唾液腺をパラホルムアルデヒドとカコジル酸緩衝液で固定後切片を調製し、抗AQP5抗体と反応させ、コロイド金結合抗IgG抗体で可視化し、電子顕微鏡解析するとセビメリンで刺激3分後に核膜でのAQP5の局在を認めた。3)無刺激・刺激動物の耳下腺単離核の調製とAQP5やAQP5の基盤分子の核内局在解析ービメリン投与後経時的に唾液腺を摘出し、DTT,MgCl2を含むSucroseでホモゲナイズし、スィングローターで24,000rpm,90分間遠心後、沈渣を洗浄しRNA /DNAが0.25以下を使用した。免疫染色は1)の方法で、抗AQP5抗体と共にフィブラリン、SC35、PML、p80コイリン、hnRNPI/PTBの抗体を用いて行った。共焦点顕微鏡では3分後の単離核でAQP5のフィブラリンとの共局在が認められた。4)核へ移動したAQP5がヌクレオポリン核膜孔複合体蛋白質の構成一員となるか別の核膜孔を形成するかの検討ー調製した組織切片や単離核標本をヌクレオポリンを構成する蛋白質・Nup93,Nup107/160の抗体やラミン受容体の抗体と抗AQP5抗体を用いて二重染色し、1)の方法で両局在を認めた。得られた成果は、第122回日本薬理学会近畿部会にて発表できたので、概ね順調と思われる。また、Rab5とともに核膜へ集積したAQP5は、ラフト上で浸透圧変化に応答して、昨日しており、前年度に本年度の課題としていた「核膜に集積されたAQP5の意義」も明らかにできた。セビメリン刺激により脂質・ラフトを含む細胞内小胞がRab5の誘導により細胞内移動して核膜に集積されることを明らかにできたので、順調である。Rab5が細胞内移動して核膜に集積される意義の解明は、これから行う。AQP5とヌクレオポリンとの連関性やAQP5が遺伝子発現に関与しているかについて明確にしていく。ラットの尾静脈へセビメリンを投与1.54.5分後の細胞核でAQP5のラミンB受容体との共局在が共焦点顕微鏡観察で認められた。また、電子顕微鏡でも細胞質に局在する細胞内核小胞に存在していたAQP5が、セビメリン投与1.54.5分後、細胞核膜に局在することを認めた。局在移動は定かになったので、今後は、核膜でのAQP5の機能の解明に力を入れる。1)AQP5が結合するDNAの配列決定およびDNAの領域の決定野生型マウスへセビメリンを投与し、経時的に唾液腺を摘出し、ホルムアルデヒドで処理してAQP5とDNAをクロスリンクさせた後、核を単離する。超音波処理にてDNAを切断後、抗AQP5抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行う。沈降物を脱クロスリンク後、DNAフラグメント末端の修復とPCR増幅後、シークエンサー(Applied社)を用いて配列を決定する。
家庭医・総合診療専門医のケアは何がどう違うのか？：質評価のための指標探索研究

本研究は、プライマリ・ヘルス・ケア分野の専門医である家庭医・総合診療専門医の専門性をケアの現場で測定するための指標を探索することを目的とする。この目的のために、<先行研究・文献の詳細な検討><ケア場面の分析><世界のエキスパートとの検討><若手家庭医・総合診療専門医との検討>という4つの研究活動を統合しながら進めていく。
建築環境評価のためのAMeDAS版時刻別気象データと標準気象データの作成

1981年から1995年までの15年間、全国約840地点(4要素観測地点)のAMeDAS時刻別データを気象庁より入手し、建築環境評価に使用する目的で以下のような処理を行った。(1)AMeDASに含まれない日射量、水蒸気圧、大気放射量の時刻別データを推定し、AMeDASに追加した。(2)AMeDASの気温、降水量、日照時間、風向・風速の各要素にはそれぞれ欠測データが含まれている。各要素別に欠測データの補充法について検討し、適切な補充方法を作成して欠測データを補充した。(3)AMeDASの各要素には、欠測ではないがAQC(オートマチッククオリティーコントロール)の条件設定との関係で異常値が含まれている。これらの異常値を可能な限り修正した。以上のような経過により得られた全国の年間時刻別気象データを4枚のCR-ROMに格納した。この中から代表的な約20地点を選択して15年間の熱負荷計算を実行し、空気調和・衛生工学会方式の標準気象データによる熱負荷計算結果を比較し、作成したデータの有用性が高いことを確認した。次に、作成したデータの付加価値を高めるために、以下のようなツールを開発した。(1)GUIにより、CD-ROMから、任意地点、任意年のデータを取り出すツール。(2)水平面全天日射量から、直達日射、天空日射を計算する(直散分離を行う)ツール。(3)地中温度分布を計算するツール。以上により当初目的とした大半の作業を終えたことになる。なお、データのクオリティーチェック、方位別日射量の計算、水温計算、および15年間から空衛学会方式の標準的気象データに相当する気象データを作成する方法については、現在も作業を続行中である。1.まず、AMeDAS、SDP、NGBの各基礎データファイルを作成した。1981年から1995年までの15年間について、4要素観測のAMeDAS全地点(842地点)のデータをCD-Rに書き込んだ。後の処理上、通し番号(1845)をつけた。同じ期間のSDPデータおよび1990年のNGBデータは、AMeDASの要素補充上必要となるので、これもCD-Rに書き込んだ。いずれもランダムアクセスファイルとし、各データの属性を表すリマークを定義して物理量と同時に書き込んだ。2.次に欠測データの補充を行った。気温、風向・風速、日照率、降水量について、上記で作成したAMeDASのCD-R中にランダムに混在している欠測データをすべて補充した。補充の方法は4要素によって異なる。この補充には多大の労力を必要とした。3.日射量、絶対湿度、大気放射量は、AMeDASには含まれない気象要素であるが、建築環境評価のためには欠かすことができない。そのためこれらの気象要素の補充方法を整理した。日射量は日照率から推定するが、AMeDASの日照計が近年新型のものに変更された点を考慮して、旧型、新型のいずれの日照計にも適用できる日射量の補充方法を整理した。4.CD-Rから必要情報を引き出す方法、検索方法、データ公開の方法、地中温度や水温計算のプログラムの追加、直散分離、標準気象データの作成方法等について意見交換し、今後の方針の大筋を定めた。

(2)AMeDASの気温、降水量、日照時間、風向・風速の各要素にはそれぞれ欠測データが含まれている。各要素別に欠測データの補充法について検討し、適切な補充方法を作成して欠測データを補充した。(3)AMeDASの各要素には、欠測ではないがAQC(オートマチッククオリティーコントロール)の条件設定との関係で異常値が含まれている。これらの異常値を可能な限り修正した。以上のような経過により得られた全国の年間時刻別気象データを4枚のCR-ROMに格納した。この中から代表的な約20地点を選択して15年間の熱負荷計算を実行し、空気調和・衛生工学会方式の標準気象データによる熱負荷計算結果と比較し、作成したデータの有用性が高いことを確認した。次に、作成したデータの付加価値を高めるために、以下のようなツールを開発した。(1)GUIにより、CD-ROMから、任意地点、任意年のデータを取り出すツール。(2)水平面全天日射量から、直達日射、天空日射を計算する(直散分離を行う)ツール。(3)地中温度分布を計算するツール。以上により当初目的とした大半の作業を終えたことになる。なお、データのクオリティーチェック、方位別日射量の計算、水温計算、および15年間から空衛学会方式の標準式気象データに相当する気象データを作成する方法については、現在も作業を続行中である。
自然史標本・資料情報処理のためのデータベース構築の基礎的研究

前年度にひきつづき、国立科学博物館所蔵の自然史標本のうちから選ばれた、情報化に適した標本群について、データベース構築とその利用方法に関する研究を進め、予定された研究の完了と取りまとめを行った。情報処理機器としては8台のパーソナルコンピュータおよびミニコンピュータを使用し、外部記憶装置としてフロッピーディスク装置のほか7台の20Mバイトのハードディスク装置を活用した。ソフトウェアーとしては、各標本群に適した必要な情報の特性に応じて、前年度までに作成したBASIC言語による処理プログラムのほか、既成の簡易言語も使用した。処理プログラムには、ファイルのデータを容易に訂正・追加できるように、新たにエディターを開発して組み込んだ。これらを使用して各標本群につき分散処理を行った。対象標本群のうち、海棲哺乳類については簡易言語dBASE【II】による処理が便利であることが確かめられ、これを用いてファイル入力を完了し、また多毛類についてはPIPSを用いてさらにファイルを充実した。これらはカタログとして出力した。古脊椎動物、古人骨については、作成した処理プログラムを用いて大量の詳細な情報を含むファイル入力をを進めた。これらの標本ファイルはそれぞれ標本の検索、研究上必要な情報の抽出、ソーティングによるカタログの作成などの目的に対して利用価値が高いことが確かめられた。研究目的の一つであるシソーラスの作成では、前年度までに作った3種のシソーラスのうち、鳥類名シソーラスのファイルをさらに充実した。本研究で明らかになったパーソナルコンピュータを主体とするデータベース構築の有効性、望ましい情報処理方式、問題点などの研究結果を取りまとめたので、全国的利用のため報告書を印刷配布する。
近現代日本における病者・療養者の生―現場での実践、現場からの思索―

本研究の2年目となった2018年度には、国立療養所大島青松園へ高い頻度で赴き、入所者自治会事務所・文化会館図書室・社会交流会館などで、歴史資料(以下、史料)の調査・撮影・整理・目録作成などをおこなった。成果として、おもに以下の3点をあげることができる。1点目は、大島を訪れた人びとが、大島の歴史に「現場」で触れる糸口となるよう、2017年度に島内各所に設置した「史跡めぐり」の解説パネル執筆の蓄積をふまえて、大島の歴史を、根拠となる史料やレファレンス情報とともに示したことである。これは、歴史研究にとってあたりまえともいえるが、大島で長く生きてきた療養者は、自らの経験を幾重にも折りかさねて記憶しており、史料や聞きとりによってそれらをひきだそうとするとき、そこから得られる多様な情報はしばしば矛盾ないし錯綜する。歴史を叙述しようとする者は、それを慎重に解きほぐし、判断の根拠とともに提示する必要があるが、従来の大島の歴史叙述においては、それがかならずしも充分になされてきたとはいえない。そうした状況から一歩ふみだすために、検証や蓄積が可能な歴史叙述にむけた、環境整備を進めた。2点目は、社会交流会館のオープン準備と連動した史料調査の進展である。展示室や図書室を備えた社会交流会館の正式オープンが2019年4月と決まったことをうけて、それを念頭におきながら、調査・研究とその成果のフィードバックをおこなった。療養者の自治組織が管理してきた文化会館図書室の蔵書や、文化会館とは別の場所で療養者個人によって収集・保管されてきた書籍群の調査・整理・目録作成を、集中的に進めた。3点目は、病者・療養者の生を、「現場」で、展示という方法を用いて、どのように示し得るのかという観点から、ハンセン病と水俣病にかかわる複数の展示施設を調査したことである。調査をとおして、展示のもつ可能性と課題が浮き彫りになった。2018年度は、大島での社会交流会館の正式オープンにむけて、変化する「現場」の状況に対応しながら、以下のとおり研究を進めた。A.大島青松園社会交流会館の正式オープンが2019年4月に決まったことで、そこにむけたスケジュールに対応し、作業に協力しながら、調査・研究を進めた。文化会館の図書室・書庫の蔵書あわせて8000冊ほどが、すべて社会交流会館の図書室・書庫へと移されることになり、それに先だって燻蒸をおこなうと決まったため、年度の前半は、目録作成を中断して、原状(文化会館での最終的な配架状態)記録と燻蒸・移動の準備を集中的に進めた。燻蒸作業ののち、書籍のクリーニングと移動をおこなったうえで、年度の後半は原状を記録した画像と社会交流会館に移った現物を用いて、調査と目録作成を続けた。また、社会交流会館図書室のコンセプトや配架の方針、図書室内展示のあり方などについても検討をおこなった。自治会事務所では、調査・研究のなかで得られた知見や史料をふまえて療養者から話を聞き、それをもとに史料を分析するなど、史料と聞きとりを往還させながら歴史像を探った。かつてない訪問頻度で、刻々と変わる「現場」の状況に対応することができた。B.沖縄愛楽園大島に時間と予算の多くを充てたため、論集にむけた作業は、おもに電子メールを用いて進めた。別財源を用いることにはなったが、沖縄愛楽園に赴く機会を設け、社会交流会館で打ちあわせをおこなうことができた。2019年度の刊行を目指して、目下推敲をかさねている。C.その他病者・療養者の生を「現場」で問い、表現している展示施設の調査をおこなった。とりわけ水俣では、公立の博物館とNPO法人が運営する博物館とで展示方法・内容に大きな違いがあることがわかり、展示のもつ可能性と課題について、認識を深めることができた。以上より、研究はおおむね順調に進展していると考えている。2018年度に得られた成果をもとにして、以下の調査・研究を実施する。A.大島青松園1新設の社会交流会館図書室へと移動させた蔵書(文化会館旧蔵書)を分類・整理したうえで、社会交流会館において閲覧と展示に供する。2ひき続き文化会館旧蔵書の調査・デジタル撮影を進め、原状記録画像を用いるほか、適宜補充調査をおこないながら、2種類の目録(図書として扱うための目録、史料として扱うための目録)を作成する。32の調査の成果と既整理の史料とをあわせて分析し、そこからみえる療養者の生について考察する(石居中心)。4療養者との対話の機会を設け、療養者や療養所のこれまで、いま、これから、について継続的に考える。5変化の著しい療養所内のフィールドワークを定期的におこなう(阿部・石居)。6療養所に関わりのある人びと、とりわけ療養者の歩んできた足跡を地域社会にたどるとともに、7地域社会に残された史料の調査をおこなう(石居中心)。B.沖縄愛楽園1青木恵哉関係史料の調査・デジタル撮影、2沖縄愛楽園関係史料の調査・デジタル撮影を継続的におこなうとともに、3青木恵哉と沖縄愛楽園の草創期について考える論集をまとめる(阿部・石居)。

C.その他1これまでの大島・沖縄での調査・研究の成果をふまえながら、ハンセン病をめぐる史料の保存・管理・活用を「現場」で模索し続けている、国立ハンセン病資料館(東京都)や重監房資料館(群馬県)などの調査をおこなうとともに、2病をめぐる歴史の展示や、史料の保存・管理・活用を「現場」で実践してきた先行例ともいえる、水俣病をめぐるとり組みについて調査する(阿部中心)。3病者・療養者の生や療養所の表象のあり方に着目して、書籍・展示・映像作品・報道などを調査・分析する。4療養所という「現場」で、その歴史や史料ととり組んでいる学芸員や研究者などによるシンポジウムを企画・実施する(阿部・石居)。本研究の1年目となった平成29年度には、国立療養所大島青松園および国立療養所沖縄愛楽園に赴き、大島の入所者自治会事務所・文化会館図書室(自治会の図書室)および沖縄愛楽園交流会館を中心として、歴史資料(以下、史料)の調査・デジタル写真撮影・目録作成、および聞きとりなどをおこなった。成果として、おもに以下の三点をあげることができる。一点目は、大島の自治会事務所および文化会館図書室での史料調査・撮影・目録作成の進展である。この間、大島青松園では、展示室や図書室を備えた社会交流会館という名称の施設が新たに設けられ、オープンにむけた準備が進んでいる。展示には、研究代表者や分担者が続けてきた調査・研究の成果もフィードバックする必要があるため、準備のスケジュールを念頭におきつつ、調査・研究を進めることとなった。とりわけ、自治会事務所では、所蔵写真のデジタル化と調査を進め、戦前からの蔵書が配架されている文化会館図書室では、現状の記録を残すべく、撮影と目録作成に注力した。二点目は、展示という表現の今日的な可能性や課題について、「現場」に立つ学芸員を交えて議論するワークショップを開催したことである。国立ハンセン病資料館(東京都)と長島愛生園歴史館(岡山県)で開催したワークショップでは、いずれも実践的かつ率直な議論をかさねることができた。三点目は、大島療養所(現、大島青松園)や回春病院(熊本県)を経て、沖縄へわたったハンセン病者の青木恵哉、および沖縄愛楽園の草創期を考える論集の刊行にむけて、研究会を開催して議論を深めたことである。この論集のベースは、平成27年度に沖縄愛楽園交流会館で開催したシンポジウム「青木恵哉愛楽園の礎となった療養者」だが、単にシンポジウムの記録集とするのではなく、当日およびその後の議論をとおしてみえてきた可能性と課題を咀嚼したうえでかたちにすることを目指している。平成29年度は、それぞれの「現場」で新たに直面した事態をふまえて、以下のとおり研究を進めた。A.大島青松園当初想定していなかった「現場」の大きな変化として、社会交流会館が新設され、展示室と図書室が設けられることとなった。そこで、オープン(平成31年4月予定)にむけたスケジュールを念頭に、入所者自治会事務所と文化会館図書室での調査・撮影を優先することにした。自治会事務所ではとりわけ、100年を超える歴史をもつ療養所の各所・各時期の様子や、療養所内外における療養者の生活や活動の様子とらえた写真の調査・デジタル化・分析を進めた。また、戦前以来、受贈や購入によって蓄積され、読みつがれてきた膨大な書籍が収められている文化会館図書室では、近い将来、社会交流会館図書室へ蔵書が移されるのを見越して、現状の記録を急いだ。「現場」の変化にあわせて、記録を残す作業と、史料の保存・公開環境を整える作業を、高いレベルで両立することが求められている。B.沖縄愛
光駆動イオンポンプにおける構造と機能相関

本研究においては、光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシンや視物質であるロドプシンを対象として、生体での構造と機能との相関を明らかにすることを目的とした。特に偏光法、時間分解法といった新たな手法を赤外分光法に導入し、水分子の角度情報や低温では捕捉できないような中間体の構造解析を目指した。その結果、以下のような成果が得られた。偏光赤外分光を用いてバクテリオロドプシンの活性中心に存在する水分子の構造解析を行ったところ、プロトン移動に不可欠な水分子は蛋白質内部で特定の配向をしており、その変化がプロトンポンプをもたらすことが示唆された。さらに異性化に伴う蛋白質の側の構造解析を行った結果、異性化反応に伴う発色団の構造変化によって、水分子を含む水素結合ネットワークに大きな歪みが生じていることがわかった。一方、バクテリオロドプシンがプロトン輸送の方向性を発現するためには、蛋白質内部に方向性を規定するスイッチのようなものが過渡的に生じることが必要であろう。我々は最も大きく構造変化をした中間体であるN中間体における水分子の構造変化を測定することに成功し、さらにN中間体に対する偏光赤外分光から、スイッチに伴う蛋白質骨格の構造変化に現れる新しい振動バンドを見出した。またシステインのS-H伸縮振動が他の振動から離れた領域に存在することに着目し、水素結合ネットワークの動的な構造変化のプローブとして、システインの導入を提案した。新たに導入した時間分解赤外分光法からは低温では捕捉できないO中間体を捉え、特有の蛋白質部分の構造変化を明らかにした。さらに発色団レチナールの変化から遅延した蛋白質部分の変化を見出した。4ナノメーター程度離れた膜の間をプロトンを輸送するためには協奏的な蛋白質の構造変化が要求されるが、このような時間的な遅延は構造変化の因果関係を考察する上で重要な知見を与えるものと考えられる。視覚の光センサーであるロドプシンは、超高速異性化を行う結果高い光感度を得ていることが知られている。我々はフェムト秒アップコンバージョン法を用いて、ロドプシンからの蛍光をはじめて実時間で捉えることに成功した。また赤外分光法を用いて活性中心や細胞質側領域に水分子が存在することを明らかにした。視物質であるロドプシンの機能は、光によってG蛋白質を活性化することである。我々は複合体の形成に伴う赤外スペクトルの変化を捉えることに成功し、さらにトランスデューシンにおける相互作用部位であるC末端のペプチドを用いて同様の測定を行うことにより、ロドプシンとトランスデューシンに由来する信号を帰属した。本研究では光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシンと光駆動塩素イオンポンプであるハロロドプシンにおいて光反応に伴う蛋白質の構造変化が機能とどのように相関するのか明らかにすることを目的とした。

特に偏光法、時間分解法といった新たな手法を赤外分光法に導入し、水分子の角度情報や低温では捕捉できないような中間体の構造解析を目指した。その結果本年度は以下の成果が得られた。(1)バクテリオロドプシンの構造解析:膜蛋白質におけるプロトンポンプには水分子が関与することが考えられるが、我々はこれまでに赤外分光法を用いて蛋白質に結合した水分子の水素結合変化を直接、観測することに成功している。このような水分子が蛋白質内部の制限された空間にどのように存在するのか明らかにするために偏光FTIR分光法を用いた実験を行ったところ、3643cm^<-1>に伸縮振動をもつ水分子はその双極子モーメントが膜の法線に対して60°Cの角度を成すことがわかった。水分子は蛋白質内部で特定の配向をしており、その変化がプロトンポンプをもたらすことが示唆された。一方、新たに導入した時間分解赤外分光法から低温では捕捉できないO中間体を捉え、特有の蛋白質部分の構造変化を明らかにした。さらに発色団レチナ-ルの変化から遅延した蛋白質部分の変化を見出した。4ナノメーター程度離れた膜の間をプロトンを輸送するためには協奏的な蛋白質の構造変化が要求されるが、このような時間的な遅延は構造変化の因果関係を考察する上で重要な知見を与えるものと考えられる。(2)ハロロドプシンの構造解析:低温赤外分光法によりハロロドプシンの構造解析を行い、L中間体に2種類の構造体が存在することを見出した。本研究においては、光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシンや視物質であるロドプシンを対象として、生体での構造と機能との相関を明らかにすることを目的とした。特に、効率や選択性、方向性といった生体がもつ特異性がどのように発現されているのか、その機構を蛋白質の構造や光反応ダイナミックスと結び付けて明らかにすることを目指した。分光学的な手法を用いて本年度は以下のような成果が得られた。バクテリオロドプシンの異性化に伴う蛋白質の側の構造情報を得るため、偏光赤外分光法を初期異性化過程に対して適用した測定系を構築した。その結果、異性化反応に伴う発色団の構造変化によって、水分子を含む水素結合ネットワークに大きな歪みが生じていることがわかった。一方、ノセクテリオロドプシンがプロトン輸送の方向性を発現するためには、蛋白質内部に方向性を規定するスイッチのようなものが過渡的に生じることが必要であろう。我々は最も大きく構造変化をした中間体であるN中間体における水分子の構造変化を測定することに成功し、後期プロトン移動に関与していると考えられる水分子の水素結合変化を解析した。さらにN中間体に対する偏光赤外分光から、スイッチに伴う蛋白質骨格の構造変化に現れる新しい振動バンドを見出した。さらにシステインのS-H伸縮振動が他の振動から離れた領域に存在することに着目し、水素結合ネットワークの動的な構造変化のプローブとして、システインの導入全提案した。視覚の光センサーであるロドプシンは、超高速異性化を行う結果高い光感度を得ていることが知られている。我々はフェムト秒アップコンバージョン法を用いて、ロドプシンからの蛍光をはじめて実時間で捉えることに成功した。また赤外分光法を用いて活性中心や細胞質側領域に水分子が存在することを明らかにした。視物質であるロドプシンの機能は、光によってG蛋白質を活性化することである。
普及版COPD身体活動性評価法の確立とテーラーメイド治療の構築

新たな3軸加速度計のCOPD身体活動性評価に対する妥当性を確認した。身体活動性は、雨天の日は低下しており、最低3日のデータを分析する事が必要であった。COPDでは、健常者に比べ歩行時間、歩数、歩行距離は有意に低下していたが、歩行速度は同等であった。また、身体活動性は呼吸困難感と有意な相関があり、非活動状態はmMRC呼吸困難スコア>=2をもって予測できた。気管支拡張薬追加投与により、>=3.0METs、>=3.5METs以上の身体活動時間が延長し、延長効果は、肺機能、特に容量系因子が良好なほど大きかった。気管支拡張薬2種の合剤では単剤に比べ、>=2.0METsの時間の有意な延長を認めた。慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者の身体活動性は、予後と有意な関係を示し、COPD死亡の最大の危険因子とされている。しかも、経過中に身体活動性維持・向上できた患者では低下した患者に比べ予後は有意に良好である。したがって、COPD患者の身体活動性を分析し、改善をもたらす医療介入法を検討することは極めて重要な課題である。身体活動性の改善効果を評価するためには、より客観的で再現性の高い方法で評価することが必要である。特に医療介入の効果を評価する場合は、再現性の確保が極めて重要となる。測定方法としては3軸加速度計が最も精度が高く、我々は、天候や休日を除く3日間のデータの使用が再現性の高い抽出法であることを確認してきている。この方法を用い、国際ガイドラインの推奨に基づき、COPD病期と呼吸困難感に応じた吸入気管支拡張薬追加投与をおこない、身体活動性の改善効果を示す可能性を確認した。この結果に関しては、Int J Chron Obstruct Pulmon Dis誌に採択された。さらに、従来の小型3軸加速度計であるActimarker (AM)の発売が中止となり、本邦にて使用可能でCOPDに対する妥当性の検証された簡易型3軸加速度計が存在しない状況となっていたが、2014年に新たに発売されたActive Style Pro HJA-750C (HJA)が、臨床現場で共通に使用可能となりうる有望機器と考えられた。そのため、HJAの妥当性を検証する目的で、HJAとAMさらには欧州で頻用されているDynaPort MoveMonitor (DMM)を同時に装着し、得られた値の再現性検証を行った。その結果、HJAはAM, DMMとの間で再現性が確認され、AMとDMMの中間の精度であることが確認された。この内容は、まだ論文化できていないが、一部を日本ケア・リハビリテーション学会にて報告した。COPDの身体活動性に対する薬物療法の有意な改善効果を、従来の3軸加速度計を用いて確認し、論文化することができたことは大きな進展であった。さらに、新たな3軸加速度計であるHJAの妥当性検証を行う計画に対し、従来COPDに対する妥当性が検証されている簡易型3軸加速度計の中で、本邦で以前販売されていたAMと、主に欧州で頻用されているDMMを抽出し、HJAと両機器との間で再現性が確認できた。現時点では学会報告のみではあるが、重要な目標の一部は達成できたと考えられる。この内容に関し、現在論文化を進めている。もう一つの計画である身体活動性標準式の作成に向けて、影響因子の絞り込みをおこなった。候補因子として、1研究対象者背景として、年齢、性別、喫煙歴、呼吸リハビリテーション実施の有無、投与中の気管支拡張薬の有無と種類、合併症の有無と種類、2呼吸機能検査として、気管支拡張薬吸入後のスパイロメトリーにおける、FEV1, %FEV1, FVC, %FVC, IC、3運動耐容能として、6分間歩行試験の総歩行距離、歩行中あるいは歩行後の最低SpO2値、4血液検査として、空腹時血糖値、HbA1c、赤血球数、ヘモグロビン、BNP、アルブミン、5身体計測として、身長、体重、Body Mass Index (BMI)、上腕周囲長・上腕三頭筋皮下脂肪厚・浮腫の有無(いずれも利き腕でない方の腕)、握力(利き腕)、6質問票として、不安・うつに関するHospital Anxiety and Depression Scale (HADS)、呼吸困難感に関するmodified Medical Research Council (mMRC)スケールの値などをリストアップした。次年度以降に、これら因子の中から関与因子の抽出をおこなう予定である。慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者における身体活動性の評価と向上策の検討は、極めて重要な課題である。身体活動性の改善効果の評価には、客観性と再現性が重要であり、測定精度としては3軸加速度計を用いた方法が最も高い。我々は、これまで天候や休日を除く3日間のデータの分析が再現性の高い抽出法であることを確認し、また、気管支拡張薬追加投与による身体活動性の改善効果を確認してきた。しかし、従来使用してきた小型3軸加速度計であるActimarker (AM)が発売中止となり、新たにActive Style Pro HJA-750 (HJA)を用いて検証を行っている。まず健常者において、従来妥当性検証済みのAMとDynaPort Move Monitor (DMM)をHJAと同時に装着し、機器の妥当性を検証し、日本ケア・リハビリテーション学会や日本呼吸器学会にて報告した。現在、医学雑誌への採択を目指して追加検討を実施中である。また、今年度は、COPD患者の種類別活動時間を健常者と比較し、歩行時間が有意に低下していることを示した。

さらに、歩行パターンとして、COPDでは1日総歩数、歩行距離は有意に低下しているものの、歩行速度は健常者と変わらないことを示した。これは、距離当たりのエネルギー消費量の少ない速度で歩行している可能性が考えられた。この内容の論文はRehabil Nurs誌に採択された。さらに、COPD患者の身体活動とmMRC呼吸困難スコアの関係を詳細に分析した。その結果、mMRCグレードが上昇する程身体活動性は低下するが、1.5METs・時/日以下を身体非活動とした場合、mMRC 2以上が最も感度の良い身体非活動性の予測指標であることを見出した。この内容の論文はInt J Chron Obstruct Pulmon Dis誌に採択された。健常者において、新たな3軸加速度計であるHJAを、従来COPDに対する妥当性が検証されているAM(以前本邦使用可)およびDMM(主に欧州で頻用)との間で比較し、機器の妥当性は確認できた。論文作成に関してはまだ追加検討を実施中ではあるが、学会報告はおこないある程度の目的は達成できた。さらに、COPD患者の活動性低下の特徴として、歩行に関する詳細な特徴を抽出することができた。すなわち、歩行時間や歩行距離は短縮しているが、歩行速度に関しては有意な低下を認めなかった(COPD: 1.05 m/sec、健常者: 1.06 m/sec)。この点は、筋力低下により歩行速度の低下(0.8 m/sec以下)がみられるサルコペニアとは一部異なる因子が存在する可能性が示唆され、今後検討が必要な新しい研究テーマが発掘されたと考える。COPD患者の身体活動性、特に身体非活動の状態をより簡便に推測できる指標として、mMRC呼吸困難スケール2以上を示すことができた。これにより、COPDの身体活動性の一つの特徴を抽出できたと同時に、mMRC呼吸困難スケールを用いることで身体非活動状態の患者の抽出が容易となり、臨床現場への有用な情報を提示できた。身体活動性標準式の作成に向けて、関連候補因子として、1研究対象者背景、2呼吸機能検査、3運動耐容能、4体格、5併存症(糖尿病、貧血、心不全、低栄養、筋力低下など)、6不安・うつ、7呼吸困難感などをリストアップし、それぞれの指標と身体活動性との関係の検討をH28年1月より開始しており、順調に進みつつある。次年度以降も継続して測定を続け、関与因子の抽出をおこない、標準式作成を目指したい。慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者の身体活動性は、死亡の最大の危険因子でもあり、その詳細分析と有効な医療介入法の開発は極めて重要である。次に、COPD患者の身体活動性の特徴把握を試み、健常者に比し歩行時間、1日総歩数、歩行距離は有意に低下しているものの歩行速度は健常者と同等であることを確認し、2年目にRehabil Nurs誌に採択された。また、mMRC呼吸困難スコアとの関係を分析し、呼吸困難程度が上昇するほど身体活動性は低下するが、特にmMRC≧2が最も感度の良い身体非活動性の予測指標であることを見出し、2年目にInt J Chron Obstruct Pulmon Dis誌に採択された。医療介入の効果として、吸入気管支拡張薬追加投与が有意に身体活動性を改善する可能性を確認し、1年目にInt J Chron Obstruct Pulmon Dis誌に採択された。
有用微生物を固定化するカプセル化微生物製剤の創製と発酵型土壌改良への応用

外部環境に影響されずに微生物が活動できる場として、カプセル化技術を採用する。具体的には、微生物をモノリス型構造をもつ数百μm程度のマイクロカプセルに内包させるため、複合エマルションと液中乾燥法を組み合わせた手法により調製する。微生物内包マイクロカプセルを調製し、調製条件が微生物の活性や固定化量に及ぼす影響を評価する。また、微生物内包マイクロカプセルの性能評価として実証試験を行う予定である。
同種骨移植における電気刺激の影響

[目的]同種保存骨移植において電気刺激が骨癒合促進に有効であるか否かをみるため、家兎の骨膜を介し移植骨を刺激する実験モデルを作製し検討した。[方法]日本白色家兎をdonorとし、その脛骨骨皮質を10mm×3mm大のブロックとして採取し、-80度Cで3週間凍結保存したものを移植骨として使用した。tecipientにはニュージーランド白色家兎を用いた。recipientの脛骨内側の骨膜を剥離して開き、その骨膜下に移植骨をonlay graftした後、骨膜で移植骨を被覆した。この移植骨直上の骨膜に陰極のphi0.3mmステンレス鋼線を固定して、10muAの直流電気刺激を行なった。陽極はphi0.5mm白金線を使用し、陽極と刺激装置本体は大腿内側の皮下に留置した。家兎の一側の下肢を刺激側とし、対側を通電しないコントロール側とした。電気刺激開始後、2、3、4、6週で検体を採取したが、検体採取前に蛍光ラベルによる骨標識を行なった。各週5羽ずつとし、単純X線撮影後、脱灰および非脱灰組織標本を作製して比較検討した。[結果]2週では、移植骨周囲の外骨膜の反応が電気刺激側で著明にみられ、類骨形成や幼弱軟骨細胞が盛んに出現しているのが認められた。4週では、全例に移植骨は骨癒合し、移植床の骨改変も進行して移植床に多数の骨標識をみとめるようになった。また、移植骨周囲の類骨は石灰化し、仮骨を形成していた。これらの変化はいずれも電気刺激側で著明であった。6週では、移植骨は、移植床のみならず周囲仮骨とも交通するようになり、移植骨内にも骨標識を認めるようになったが、この現象も電気刺激側で優位に認められた。以上の如く、移植骨周囲の仮骨形成や、移植床および移植骨自体の骨改変は、電気刺激側で優位であり、骨膜を介した場合の直流電気刺激は、移植骨の再造形を促進させる効果があることが判明した。
作用素不等式とlog-hyponormal作用素の研究

本研究の目的は作用素不等式とlog-hyponormal作用素の研究である。棚橋と内山は主に有界線形作用素のスペクトラムの孤立点とそれに対応するリース射影作用素の研究を行った。主な結果は次である。paranormal作用素の0でないスペクトラムの孤立点に対応するリース射影は直交射影である。A(s,t)作用素とそのAluthge変換について、互いにスペクトラムの孤立点は対応していて、それらに対応するリース射影は一致する。零でない2つの作用素のtensor積がまたlog-hyponromal,A(s,t)になる必要十分条件は、それぞれlog-hyponormal,A(s,t)になることである。Log-hyponormal, p-hyponormal, p-quasihyponormal作用素に対しFuglede-Putnam型の定理が成り立つ。また、棚橋と内山はS.M.Patelと共同研究を行いと共同研究を行い、(p,k)-quasihyponormal作用素についてもinjectiveであればFuglede-Putnam型の定理が成り立つことを証明した。また、クラスA作用素のPutnam不等式等を証明した。また、棚橋と内山はS. Mecheriと共同研究を行いクラスY作用素とlog-hyponormal作用素についてもFuglede-Putnam型の定理が成り立つこと、Algebraically paranormal作用素はWeylの定理を満たすことを証明した。武元と内山はZsidoと共同で、ヒルベルト空間上の有界作用素の数域にかかわるn次元複素ユークリッド空間における凸性についての性質について研究を行った。数域の研究は作用素及び行列の性質の研究に発展し、数学的研究ばかりではなく、数学教育に関する研究にも応用されるものである。三浦は標準ノイマン環に付随するヒルベルト空間上の完全正値写像の概念を用いてKadisonの作用素環におけるジョルダン同型の分解定理の非可換L2バージョンを証明した。また、他の研究者と共同して正錐をもつヒルベルト空間上の有界線形作用素に対して正錐を保存する意味で正とし、これから半順序を導入し、重要な正錐についてこの順序のべきなどに関する不等式について、通常エルミット作用素に定義される順序との違いや諸性質を明らかにした。また、差分方程式x_{n+}=f(x_{n-1},x_n)で定義される数列の収束問題を、Stevicらの結果より単純な証明と一般化を与え、数理生物学における種の競争問題への応用を研究した。主な結果は次である。1.本研究の目的は作用素不等式とlog-hyponormal作用素の研究である。主な結果は次である。(1)paranormal作用素の0でないスペクトラムの孤立点に対応するリース射影は直交射影である。(2)A(s,t)作用素とそのAluthge変換について、互いにスペクトラムの孤立点は対応していて、それらに対応するリース射影は一致する。(3)零でない2つの作用素のtensor積がまたlog-hyponromal, A(s,t)になる必要

十分条件は、それぞれlog-hyponormal, A(s,t)になることである。(6)ある種のSchwarz型不等式を満たす作用素の特徴付けを行った。2.武元と内山はZsidoと共同で、ヒルベルト空間上の有界作用素の数域にかかわるn次元複素ユークリッド空間における凸性についての性質について研究を行った。数域の研究は作用素及び行列の性質の研究に発展し、数学的研究ばかりではなく、数学教育に関する研究にも応用されるものである。3.三浦は他の研究者と共同して作用素の順序構造を調べた。主な結果は次である。(1)G.Ladasらによる3項間の非線形差分方程式に関する収束問題を解決し、さらに、より一般化された関数における収束問題と捉えて証明を与えた。この応用範囲はロトカ・ボルテラ型タイプの微分方程式で与えられるモデルよりも広く、離散型微分方程式の今後の発展的な研究につながると考える。(2)非可換L2空間においてもKadisonの定理が成り立つことを証明した。これは環における順序構造が標準化された線形空間にも適用できるという意味をもつ。また証明の過程でConnesの正錐に関する結果を非可分な空間まで拡張した。(3)作用素の順序を空間の正錐を保存する意味での順序で定義し、その性質を解明した。これは空間の非可換性を順序に反映する概念であり、量子力学への応用や、非可換力学系への応用を目指している。本研究の目的は作用素不等式とlog-hyponormal作用素等の研究である。三浦はノイマン環間の順序同形がどれくらい代数構造を決定するかという問題に取り組み、非可換L^2空間においてもKadisonの定理が成り立つことを証明した。また証明の過程でConnesの正錐に関する結果を、非可分な空間まで拡張した。また、S-E.Takahasi, T.Miuraと共同して、G.Ladasらによって提起された3項間の非線形差分方程式に関する研究の中の収束問題に取り組み、従来よりエレガントな手法で解決しただけでなく、それまでの有理式のものよりかなり一般化された関数における収束問題と捉えて証明を与えた。しかも、その応用範囲も広く、特に数理生物学における(時間おくれのある)多種間競争モデルの研究に重要な契機となった。このことは、ロトカ・ボルテラ型タイプの微分方程式で与えられるモデルよりも、離散型の特徴はより自然な記述と考えることができ、今後の発展的な研究につながると考える。更に、石川、大西と共同して、正錐M_2(R)^+を保存する意味で行列に順序を定義し、2つの半正値行列がこの順序に関してオーダーが付いているならば、ある実数以上の冪についても不等式が成り立つことを証明した。
日本脳炎ウイルスゲノムの環状化がウイルス複製に及ぼす影響

本研究課題では日本脳炎ウイルス(JEV)のゲノム末端に存在する4組の相補配列がゲノム環状化を介して複製に関与するかどうかを解析した。その結果、ゲノム環状化に重要な相補配列とウイルス複製に重要な領域をそれぞれ決定した。また、ゲノム環状化に必要な領域はウイルス複製に関与するが、ウイルス複製に必要な領域がすべてゲノム環状化に重要であるとは限らないことが明らかになった。これらゲノム上の相補配列の機能は哺乳類細胞と蚊細胞において差は認められなかった。これらの知見は未だ開発段階の特異的治療薬の開発に貢献するものと考えられる。日本脳炎ウイルス(JEV)ゲノム両端には4組の相補配列(CS)が見出される。他のフラビウイルスでは3組のCSが確認されており、CSを介してゲノムが環状化し、ウイルス複製に重要であることが報告されている。JEV複製機構におけるCSの役割を検討するため、本年度はルシフェラーゼ発現JEVレプリコンのそれぞれのCS領域に相補性を喪失する変異体と相補性を維持する変異体を構築した。野生型および変異体RNAを哺乳類細胞と蚊細胞に導入して細胞内でのタンパク翻訳能およびRNA複製能について検証したところ、JEVゲノム中の4組全てのCS領域がウイルス複製に関与していることが明らかになった。しかしCS領域により、タンパク翻訳能の低下・欠損が認められるもの、RNA複製能の低下・欠損が認められるものが観察された。さらにこれらのウイルス複製機構への関与は相補性依存性の個所と配列依存性の個所が見出された。中でもJEVゲノムに特異的に認められる4組目のCS領域がタンパク翻訳能の低下・欠損を来したことはJEVの複製機構を理解するうえで重要知見と考えられる。また、CSの機能は哺乳類細胞と蚊細胞において保存されていることが示された。次に実際にこれらのCS領域が結合し、ゲノム環状化に寄与しているかどうかをゲノム両端RNAのみをそれぞれ合成し、ゲルシフトアッセイにより確認した。現時点では4組全ての解析は終えていないが、検討したCSでは野生型同士、変異型同士のRNAを混合すると2本差RNAの形成が起こりバンドの上方シフトが観察された。これらの結果より、JEVゲノムはCSを介して環状化し、ゲノム環状化がタンパク翻訳およびRNA複製に重要な役割を果たしていることが明らかになった。本年度は研究計画通りルシフェラーゼ発現日本脳炎ウイルスレプリコン中の4組の相補配列の種々の変異体を作製し、解析を行った。また、ゲルシフトアッセイ用のRNA発現ベクターについても作製した。本来は4組全ての組み合わせについてゲルシフトアッセイを終える計画であったが、完了できなかった。non-RIゲルシフトアッセイを行うにあたり、条件設定に想定より時間を要したが、最終的には検出可能な条件を設定することができた。従って、本研究計画はおおむね順調と言える。日本脳炎ウイルス(JEV)のゲノムRNA両端には4組の相補配列(CS)が認められる。デングウイルスやウエストナイルウイルスなど同属のウイルスではCSを介してゲノムRNAが環状化し、ウイルス複製に寄与することが報告されている。JEV複製機構におけるCSの機能解析を目的とし、ルシフェラーゼ発現JEVレプリコンを用いた解析を昨年度から継続して行った。CS領域に変異を導入し、相補性を喪失したレプリコンおよび相補性を維持したレプリコンを作製し、哺乳類細胞および蚊細胞内での複製効率を解析したところ、4組のCS全てがウイルス複製に関与することが示された。さらに、その機構としては相補性依存型と配列依存型の2種が存在することが明らかになった。これらはJEVゲノムRNA上に認められるステムループなどの二次構造の機能を明らかにする上で重要所見であると考えられる。また、ゲルシフトアッセイにより、ゲノムRNA両端同士が結合することも示していたが、試験管内反応だけでなく細胞内での結合を確認するため、ルシフェラーゼ発現レプリコンを恒常発現する培養細胞を樹立した。この細胞にゲノム両端部分に相当する人工合成RNAを導入してルシフェラーゼ活性を比較解析したところ、野生型RNA導入群では活性の低下が観察され、変異型RNA導入群では活性低下は認められず、野生型RNAが細胞内でのゲノム環状化を競合阻害した結果であると考えられた。これらの結果から、JEVゲノムは細胞内でも環状化し、なおかつこの環状化がRNA複製に重要であることが明らかになった。また4組のCSの比較において環状化に最も寄与するのは他の類縁ウイルスとの相同性の高いcyclization sequenceと呼ばれるCS領域であることが示された。ルシフェラーゼ発現JEVレプリコンを用いた解析は計画通りに行った。また、昨年度条件設定に時間を要したNon-RIゲルシフトアッセイについても計画通り解析を進めていたが、本解析においてRNA断片を混合後の結合反応を定法に従い95°Cに加熱して実施していたが、研究集会においてJEVの生活環に95°Cという高温環境が無いとの指摘を受け、JEV生活環にある哺乳類および蚊の体温である37°Cおよび28°Cの条件下で再度解析を行うことにしたが、今年度内には全て終了することができなかった。日本脳炎ウイルス(JEV)のゲノムRNA両端には4組の相補配列(CS)が存在する。JEVと同属であるデングウイルスやウエストナイルウイルスでも同様にCSが確認されており、それらのウイルスではCSを介してゲノムRNAが環状化し、そのゲノム環状化がウイルス複製に必須であることがすでに報告されている。