hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代量子シミュレータ・量子デザイン手法の開発

また、特定領域における成果を公表するとともに、計算機マテリアルデザイン研究における国際的なコミュニティの形成とその分野における最新の成果と情報を共有するために平成18年5月31日6月3日に東京未来館において国際会議International Conference on口Quantum Simulators and Design (QSD2008)を開催した。国際会議には8カ国から合計220人が参加し、13件の招待講演、10件の口頭発表および120件のポスター発表があり、活発な議論と情報の交換がなされ、国際会議の目的を十二分に果たすことができた。引き続き連携して同じ場所で行われた次世代ナノ統合シミュレーションソフトウェア研究開発国際会議(1st International Conference of The Grand Challenge to Next-Generation Integrated Nanoscience)との相乗効果も有意義であった。9月および3月に5日間にわたる計算機マテリアルデザインワークショップを国際高等研、関西原研、および大阪大学サイバーメディアセンターにおいて行い、領域の多くのメンバーがチュトリアルコースの講師を務めた。最終年度を迎えて領域全体の研究は様々な進展を見た。A01班におけるLDAを超える手法開発に関しては、今後の新たな向けて手法の一層のブラッシアップがはかられているし、A02ではゆっくりではあるが確実に進展を見せている。A03班における計算機マテリアルデザインの応用は昨年度同様多くの成果が次々と出てきており、領域にとって心強い進展をみせている。
ナノ加工技術を利用したオンチップ・神経ネットワーク機能計測技術

ナノ加工技術を利用したオンチップ・神経ネットワーク機能計測技術として、デジタルカメラに使用されるCMOSセンサアレイを細胞外電位計測電極として使用することにより神経ネットワークの面的な動きを高密度に計測するシステムの開発を行った。ハイスピードカメラに使用されるマイクロレンズアレイ並びにフォトダイオードアレイを有さないCMOSセンサアレイを採用し、センサアレイ上で培養出来るよう加工を行った。その結果、培養液をセンサアレイ上に浸して電位を検出できる原理検討に成功した。また、センサアレイ上で細胞を高密度に配置するための技術開発に成功した。【平成23年度実施計画:神経細胞を培養するためのCCD素子の開発と初代神経細胞の培養法の確立】【研究結果の具体的内容】デジタルカメラなどに利用される2次元センサアレイの原理を利用してマルチアレイ型の細胞外電位計測法の開発を行った。その中で、株式会社ディテクトと協力し、センサアレイとしてハイスピードカメラに使用するCCDセンサアレイの中でも、光をセンサに集光するためのマイクロレンズアレイを搭載しないタイプを利用し細胞外電位記録用のデバイスを作製した。次にセンサアレイ上で細胞を培養する条件を検討した。細胞培養に利用する培地はセンサアレイ上に使用した際に短絡(ショート)し機能を失う。そこで、培養中に通電しても短絡しないコーキング法の検討、並びにコーキング剤による細胞障害性の検討を行った。その結果、センサアレイ部以外の金属部分と水分が接する箇所を完全にコーキングすることによりセンサアレイ上を培養液で満たし通電しても短絡しない条件を見つけ出した。また、コーキング剤としてはエポキシ系と比較してシリコン系コーキング剤が短絡せず、センサアレイ上での細胞培養に適している事を明らかにした。また、センサアレイ上での細胞接着基質としてはポリ-L-リジン、ポリエチレンイミンなど通常の神経細胞培養に使用される接着基質が利用できることを明らかにした。【意義・重要性】通常の用途とは異なり水分の付着によりCCDセンサアレイ短絡し機能を損なうが今回の検討によりセンサアレイ上に通電しながら細胞培養を行う事ができ実際の目的に応じたセンサ開発の足がかりができた。デジタルカメラなどに利用される2次元センサアレイの原理を利用してマルチアレイ型の細胞外電位計測法の開発を行った。本年度の研究目標としては、CMOSセンサアレイ上での細胞外電位計測を目標に研究を進めた。2012年度、光をセンサに集光するためのマイクロレンズアレイ、フォトダイオードを搭載しないタイプの高感度CMOSセンサアレイを新しく採用することにより細胞外電位のシグナルをより検出しやすい細胞外電位記録用のデバイスの作製・並びにソフトウェアの開発を行った。2012年度開発に成功したCMOSセンサアレイ上での細胞培養法を用いることで検討を進めた。その際、神経細胞より細胞外電位シグナル強度が強く、活動の様子を顕微鏡下で観察が出来る心筋細胞で評価を行った。その結果、当初、心筋細胞がCMOSセンサアレイ上で拍動の様子が認められ活動している事が観察できたが電気生理学的な活動を確認できなかった。その後、信号処理の方法を変更するデバイスを作製することで、シグナル様の波形を各素子上で確認できた。そこで現在、得られたデータからハイパスフィルターやフーリエ変換技術を含めた様々な波形処理技術、画像解析技術が可能なソフトウェアを新規に開発することによりシグナル/ノイズ比を上げ、得られたデータが真に細胞外の活動を捉えているのかを確認中である。また、開発を進めるにあたりバイプロダクトとして、電気生理的な活動を保持する初代培養細胞を用いて研究を迅速に進めるため、胎仔由来の神経細胞並びに心筋細胞の初代培養凍結保存技術の開発に成功した。本年度より光をセンサに集光するためのマイクロレンズアレイ、フォトダイオードを搭載しないタイプのCMOSセンサアレイを新しく採用することにより細胞外電位のシグナルをより検出しやすい細胞外電位記録用のデバイスの作製・並びにソフトウェアの開発を行った。培養中に通電しても短絡しないコーキング法の検討、並びにコーキング剤による細胞障害性の検討を行った。その結果、CCDセンサアレイと同様にCMOSセンサアレイ部以外の金属部分と水分が接する箇所を完全にコーキングすることによりセンサアレイ上を電解質である培養液で満たし通電しても短絡しない条件を見つけ出した。また、コーキング剤の種類による細胞障害性の検討を行った。その結果、通常市販されているコーキング剤では防水効果は高いが細胞障害性も高いことがわかった。様々な素材を検討した結果、防水性も高く細胞障害性も低い材質を決定することが出来た。次に、センサアレイ上で細胞培養が可能か検討した。その際、神経細胞より活動電位の強さが大きく、拍動することにより細胞障害性を顕微鏡下で確認が出来る心筋細胞を用いた。結果、細胞接着基質をセンサアレイ上にコーティングする事により、細胞培養が可能であることを明らかにした。

さらに、現在CMOSセンサアレイ上に施している絶縁層や、インピーダンスを挙げるための処置が重要であることを明らかにした。当該年度より、2次元センサアレイ素子の開発をカスタマイズできる会社と画像処理が専門の会社と協力する事で前年度に引き続き神経活動計測用2次元センサアレイの開発を行った。特に本年度は、得られたデータからシグナル検出を行うため、ノイズ軽減するためのデバイス開発、信号処理解析のアルゴリズム開発を行った。企業と提携し、フーリエ変換を用いたノイズ除去が行えるソフトウェアの開発を行った。その結果、活動電位様のシグナルを取得する事に成功した。ただし、強力なアルゴリズムを用いても非常に弱い信号しか取得できなかった。原因の一つとして、CMOSデバイス上では細胞が成熟するまでうまく生存できないことや、細胞間同士の接着度が通常の培養とは様子が異なることを発見した。そこで、CMOS以外の場所で培養し、ある程度細胞培養が安定した後にCMOSセンサアレイ上で培養する方法を思いついた。方法としてはカルシウムの有無でゾル/ゲル状態を変化させるアルギン酸と呼ばれる高分子を用いる事で、細胞を一旦培養した後で、タンパク分解酵素を使用することなく培養皿から細胞を回収する技術の開発に成功した。この技術を用いる事により、神経細胞が成熟しネットワークを形成した後、そのネットワーク構造を破壊することなく培養皿から回収し別の場所に移し替えることができる神経細胞シートの作製に成功した。本技術は心筋細胞や角膜上皮細胞のシートを作製する温度応答性高分子では作製する事ができなった技術である。本技術で作製した人工組織は強力で同期した神経発火が確認できたためCMOS上に再配置したした最新号検出できる可能性は高い。また、実際に神経細胞シートは積層する事でそれぞれのシートの神経活動が同期することも明らかにし、人工神経組織の作製が行えることも明らかにした。本研究課題のテーマ以外に再生医療分野での応用も期待できる。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理26年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度の目的に掲げた「神経細胞を培養するためのCCD素子の開発と初代神経細胞の培養法の確立」に関してセンサアレイ上での培養に成功し、実際のセンサ開発として協力企業と連携して進めている点でおおむね順調に進展していると評価する。24年度以降の目標としてセンサアレイ上での細胞培養と細胞外電位計測を掲げて進めてきた。当初、CCDセンサアレイによる開発を掲げていたが、通常CCDセンサアレイは、カメラに使用されるためにセンサアレイの上面にフォトダイオードアレイ、マイクロレンズアレイをすでに加工した物しか出荷をしない。しかしながら、細胞は直接センサアレイに接触しないと細胞外電位を計測できない。
並列プログラムに現れる非同期型通信のプロセス代数による解析・検証

前年度までの研究では、制限された協調型言語で並列プロセスを記述し、タプル空間の状態遷移とプロセスの軌跡によるモデル検査を試みた。この状態遷移は有限状態機械(FSM)でモデル化され、また軌跡とは協調型言語の操作を文字とみなしたときの文字列である。この研究の結果、協調型言語とタプル空間を用いた並列プロセスに対し同時に全てのプロセスを検証の対象とするのではなく、いくつかのプロセスは検証済みとして特定のプロセスとタプル空間との並列動作を対象とすることを想定した。今年度の研究では、上の想定の下でFSMを有限オートマトン(FA)およびそれと等価な正規表現、プロセスの軌跡を文字列とみなし、モデル検査のうち正規表現による文字列照合問題(RPM)に帰着できる問題を考察した。ただし並列プロセスを考察する場合に生じるFSMの"状態空間爆発問題"を避けるために、従来からあるFAによる文字列の受理問題によってRPMを解くのではなく、正規表現自身を使って解く解法を採用した。更に文字列が正規表現に照合することが確定した後の照合位置の特定、すなわち出現位置とその長さについても考察した。照合位置の特定をFAを用いて解く場合、決定性か非決定性かによって特定が困難であったり容易であったりする事を注意しておく。具体的には文字列の左商に基づく正規表現関数を用い、RPMをキーワードによる文字列照合問題の一種の拡張とみなし、RPMのKnuth-Morris-Pratt型アルゴリズムによる解法を構築した。更に正規表現関数の性質を調べることで、照合位置の特定が可能であることがわかり、連接の形をした正規表現の場合ではあるが、そのアルゴリズムを構成した。前者のRPMの解法については研究集会「応用数学合同研究集会」で、後者の照合位置の特定については情報処理学会「第67回全国大会」で口頭報告した。今年度の研究では、一般の並列プロセスを制限された協調型言語を用いて記述し、タプル空間の状態遷移とプロセスの軌跡によるモデル検証を試み、その評価として実験を中心に従来方法との比較を行った。モデル検証は調べたい性質が満たされているか否かを、有限状態機械(FSM)の状態空間を探索することによって調べる。この探索は可達性解析、すなわち与えられた初期状態から到達できる各状態において論理テストを行うことが基本となるが、ここで問題になるのは"状態空間爆発問題"である。特に一般の並列プロセスをモデル化した複数個のFSMが通信しあいながら並列に動作する状況では、FSMの並列合成において状態空問の直積をとることにより、状態空問の爆発が起こる。そこで本研究では一般の並列プロセスではなく、協調型言語のin, out, rd操作を持つ各直列プロセスとタプル空間の組み合わせを対象としたモデル検証について検討した。具体的には以下の手順ですすめた。1.プロセス間の通信を、プロセスとプロセスの間に配置したタプル空間の通信に置き換える。2.プロセス間の通信を、in, out, rd操作とタプル空間の状態の組による軌跡によってモデル化する。今回の実験に合わせてデッドロックが起こる(安全性が満たされない)ような状況の軌跡による記述を行った。3.相手側のプロセスの軌跡とタプル空間の状態遷移を組み合わせ、これと手元のプロセスの軌跡により状態空間の爆発を抑えてモデル検証を行う。ただしこれはまだ実験のみで、理論的根拠は示すには至っていない。2.を中心とした内容は研究集会「2002年度冬のLAシンポジウム」で、3.を中心とした内容は情報処理学会「第65回全国大会」で口頭報告した。今年度の研究では、協調型言語による並列プログラムを対象として、安全性の線形時相論理に基づくモデル検証を試みた。

結果としてin, out, rd操作を持つ各直列プロセスとタプル空間の組み合わせを対象としたモデル検証を行う際の1つの形式化ができた。さらに実験を通じてこの形式化の有効性を確かめた。この形式化は具体的には以下の3つを対象とし、各項目にあげたような抽象化を行う。1.タプル空間を、タプル空間内のタプルに関する論理式を原始論理式とするクリプケ構造とみなす。2.プロセスをin, out, rd操作をアクションとするラベル付き遷移システム(LTS)とみなす。3.プロセスをin, out, rd操作をアクションとする軌跡ともみなす。モデル検証は調べたい性質を記述した時相論理式が成立するか否かを、有限状態機械(FSM)の状態空間を探索することによって調べる。クリプケ構造はその対象となるFSMであるが、一般に並列プログラムのモデル検証では各プロセスをモデル化したFSMの並列合成において状態空間の直積をとることにより"状態空間爆発"という問題が生じる。そこで検証の対象とする部分を1つのプロセス(LTS)とタプル空間(クリプケ構造)の通信に限り、他のプロセスとタプル空間との通信は軌跡を利用することにした。このときクリプケ構造と軌跡は前もって組み合わせておき、LTSとこの特殊な形のクリプケ構造による検証という形に帰着した。最後に安全性の検証の実験を通して、特殊な形のクリプケ構造がちょうど失敗集合をなす拒絶集合と軌跡の組に似ていること、状態空間ではなく上の組み合わせによる問題が生じることを確かめたが、理論的根拠を示すにはいたっていない。上の形式化の内容は応用数学合同研究集会で、さらに実験による検証を含めた内容は第1回ディペンダブルソフトウェアワークショップ(DSW2004)で口頭報告した。前年度までの研究では、制限された協調型言語で並列プロセスを記述し、タプル空間の状態遷移とプロセスの軌跡によるモデル検査を試みた。この状態遷移は有限状態機械(FSM)でモデル化され、また軌跡とは協調型言語の操作を文字とみなしたときの文字列である。この研究の結果、協調型言語とタプル空間を用いた並列プロセスに対し同時に全てのプロセスを検証の対象とするのではなく、いくつかのプロセスは検証済みとして特定のプロセスとタプル空間との並列動作を対象とすることを想定した。今年度の研究では、上の想定の下でFSMを有限オートマトン(FA)およびそれと等価な正規表現、プロセスの軌跡を文字列とみなし、モデル検査のうち正規表現による文字列照合問題(RPM)に帰着できる問題を考察した。ただし並列プロセスを考察する場合に生じるFSMの"状態空間爆発問題"を避けるために、従来からあるFAによる文字列の受理問題によってRPMを解くのではなく、正規表現自身を使って解く解法を採用した。更に文字列が正規表現に照合することが確定した後の照合位置の特定、すなわち出現位置とその長さについても考察した。照合位置の特定をFAを用いて解く場合、決定性か非決定性かによって特定が困難であったり容易であったりする事を注意しておく。具体的には文字列の左商に基づく正規表現関数を用い、RPMをキーワードによる文字列照合問題の一種の拡張とみなし、RPMのKnuth-Morris-Pratt型アルゴリズムによる解法を構築した。
新しい医薬資源からの抗がん性物質の探索と分子標的の解明

本研究では、抗がん剤のリード化合物の発見およびその血管新生阻害機構やアポトーシスの誘導機構解明を目的として、血管新生阻害物質や天然由来のアポトーシス誘導物質の探索およびその作用機序の解明を行なった。今回、抗腫瘍活性を持つアカネ科植物由来のRA-VIIについてウシ大動脈内皮細胞を用いて、血管新生に対する作用を検討した。その結果、RA-VIIは3nMで細胞数が減少しBrdUによるDNA合成の検討から3nMでDNA合成抑制されていることが判った。また、この濃度で細胞毒性を示し、DAPI染色ではRA-VIIがアポトーシスを誘導することが判明した。さらに、RA-VIIによってwound migration assayによる細胞遊走能は1nMから抑制され、type I collagen gelを用いた管腔形成は30nMで有意に阻害された。また、アクチンストレスファイバーの観察から薬物処置によりストレスファイバーの形成が減少することが明らかとなった。本天然物がウシ大動脈内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成を3nMの極めて低濃度で抑制し、血管新生抑制作用を示すことを発見した。また、ラット褐色細胞腫由来細胞PC12Dにおいて、アンキリンリピート蛋白質V-1がF-アクチンからのアクチン分子の脱重合を促進するCapZと結合し、その活性を阻害することを見い出した。一方、真菌由来化合物のIC101のアポトーシス誘導作用についてさらに詳細に検討した結果、IC101はHSP90のATP作用部位への作用により、HSP90のリン酸化作用が阻害され、このHSP90の機能抑制に起因するAktの脱リン酸化がアポトーシスを誘導することが判明した。したがって、これらの天然薬物は新たな分子標的治療薬の有望なリード化合物およびアポトーシスや細胞増殖抑制の分子機構解明ための有用な薬理学的ツールとなることが期待される。
X線結晶構造解析やNMRでは困難であった、天然変性タンパク質と特異的に相互作用する小分子との複合体の構造解析を、エレクトロスプレー質量分析法、冷却イオントラップ法及び赤外レーザー分光法を組み合わせた新規手法によって可能にする。この手法を、パーキンソン病の原因物質であるα-シヌクレインフラグメントとその凝集を阻害するドーパミンとの複合体に適用し、ドーパミン結合部位に誘起されるタンパク質の二次構造を解明する。
樹木の耐塩性に関わる根系の塩イオン排除機能評価に関する研究

植物の塩吸収を抑制するには蒸散を抑制すべきという意見と逆に蒸散を促進すべきという相反する見解があるが、本研究は、塩吸収量と蒸散速度との関係ならびに塩吸収の機構を調べた。まず、耐塩性が異なる2樹種(感受性のヒラドツツジと耐塩性のシラカシ)にNaCl濃度150mMの水耕による塩処理を行った。この結果、Na吸収量と蒸散量とは正の相関関係があること、ヒラドツツジで葉量を減らすと苗木のNa+吸収量は減るが、葉のNa含有率が高まり被害発生が早まることがわかった。さらに、移植による根の痛みが塩吸収に影響するかを調べるために、シラカシと感受性のキンモクセイの水耕苗を用い、根の先端5mmを切断処理した。根の切断直後とその3日目及び対照苗をNaCl濃度150mで水耕し、Na吸収と蒸散速度との関係を調べた。その結果、キンモクセイでは被害率が高く、塩処理はいずれも蒸散を低下させたが、根の切断処理は蒸散速度にもNa吸収量にも影響しなかった。シラカシでは、切断直後の塩処理苗の塩吸収量は有意に大きく被害率も高かった。切断3日後の塩処理苗では蒸散は大きいが、塩吸収量は根を切断しなかった苗と差がなく、被害率も同様に低かった。また、蛍光物質ピラニンを塩処理と同様に行い、根の下表皮や内皮にあるカスパリー線が欠如した部分を通過するバイパスフロー量を推定し、このバイパスフローを通る多量の塩の受動的な吸収があり、このために蒸散が塩吸収を促進することを確認した。すなわち、蒸散は塩吸収を増大させた。さらに、7樹種の苗をセルローズの染色剤TinopalCBS液で水耕し、蛍光顕微鏡写真により根におけるCBSの分布とカスパリー線との関係を調べた。キンモクセイは下表皮にカスパリー線を欠き、このためにCBSは皮層に多く吸収されたが、中心柱への侵入はみられなかった。この点は今後重点的に追跡する必要があると判断された。根の表面に達した水とイオンは並列的に存在する二つの経路、シンプラストとアポプラストを経て放射方向に移動し、中心柱の維管束に達する。アポプラストを流れる養水分は、疎水的なカスパリ-線で進入を阻止され、ここを通り抜けるためにいったんシンプラストに吸収される必要がある。根を切断した場合、水とイオンがほとんどアポプラストを経由してカスパリ-線の阻止もなくて容易に樹体内に入ると考えられる。一方、傷口に癒合組織ができれば、塩分の吸収は遅れると予想される。そこで、シラカシとキンモクセイの1年生水耕苗を用い、根の先端(細根30本の長さ2-5mm)を切断した直後の苗、切断後3日目の苗、および切断しない苗を150mMNaCl液で水耕し、塩処理しない苗と比較し、上述の仮説を検証するとともに、樹種間のNaイオン吸収特性及びNaイオン吸収と蒸散との関係を明らかにした。結果と考察:被害率は、根の切断直後の苗で高く、処理の影響が認められ、キンモクセイはシラカシより高かった。両樹種ともNa含有量および含有率においても切断処理の影饗が認められた。シラカシでは、根の切断直後の苗ではNaClの吸収が多く、切断後3日放置すると、吸収が抑制されることが明らかになった。

このことは、技術的には植栽する直前に根切するより、数日前に根切して仮植するほうが望ましいと考えられる。根あたりの蒸散速度の平均値とイオンの吸収量では、キンモクセイは、蒸散速度の増大につれて、Naイオン吸収量も増加し、シラカシでもその傾向が認められた。両者の関係は、両樹種とも同一の回帰線上にあり、キンモクセイはシラカシに比べて蒸散量が大きいためにNaイオン吸収量が大きくなると考えられた。前報のシラカシとヒラドツツジの2樹種も同じ傾向を示したことから、両者の正の相関は複数の樹種間で認められる可能性が示唆された。植物の塩吸収を抑制するには蒸散を抑制すべきという意見と逆に蒸散を促進すべきという相反する見解があるが、本研究は、塩吸収量と蒸散速度との関係ならびに塩吸収の機構を調べた。まず、耐塩性が異なる2樹種(感受性のヒラドツツジと耐塩生のシラカシ)にNaCl濃度150mMの水耕による塩処理を行った。この結果、Na吸収量と蒸散量とは正の相関関係があること、ヒラドツツジで葉量を減らすと苗木のNa+吸収量は減るが、葉のNa含有率が高まり被害発生が早まることがわかった。さらに、移植による根の痛みが塩吸収に影響するかを調べるために、シラカシと感受性のキンモクセイの水耕苗を用い、根の先端5mmを切断処理した。根の切断直後とその3日目及び対照苗をNaCl濃度150mで水耕し、Na吸収と蒸散速度との関係を調べた。その結果、キンモクセイでは被害率が高く、塩処理はいずれも蒸散を低下させたが、根の切断処理は蒸散速度にもNa吸収量にも影響しなかった。シラカシでは、切断直後の塩処理苗の塩吸収量は有意に大きく被害率も高かった。切断3日後の塩処理苗では蒸散は大きいが、塩吸収量は根を切断しなかった苗と差がなく、被害率も同様に低かった。また、蛍光物質ピラニンを塩処理と同時に行い、根の下表皮や内皮にあるカスパリー線が欠如した部分を通過するバイパスフロー量を推定し、このバイパスフローを通る多量の塩の受動的な吸収があり、このために蒸散が塩吸収を促進することを確認した。すなわち、蒸散は塩吸収を増大させた。さらに、7樹種の苗をセルローズの染色剤Tinopal CBS液で水耕し、蛍光顕微鏡写真により根におけるCBSの分布とカスパリー線との関係を調べた。キンモクセイは下表皮にカスバリー線を欠き、このためにCBSは皮層に多く吸収されたが、中心柱への侵入はみられなかった。この点は今後重点的に追跡する必要があると判断された。
マウス遺伝子改変の高効率化:ターゲティングベクターの正確かつ迅速な構築法

遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期の綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み、ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS21loxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形成導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに第三のlox Pを挿入するため,pMODloxZeoDAmp-3を構築した.このplasmidはTn5のtranspositionに必須な領域に挟まれた形でloxP-Zeo-loxPカセットを有しており,試験管内での反応により,カセットを任意のDNAに挿入することができる.これらの遺伝子モジュールを用いてmVam2, V-ATPase a3について遺伝子破壊を進め、キメラマウスの作出と遺伝子破壊マウスの作成に成功した.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期に渡っての綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み,ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK Promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS211oxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形質導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに,BACのChloramphenicol耐性遺伝子に,ori VとZeocin耐性遺伝子からなる遺伝子断片を相同組換え法により導入し,BACコピー数の増加を誘導できる系を構築した.これらの遺伝子モジュールを用いることにより,条件的遺伝子破壊が可能となるalleleを,mVam2,mVam6,Syntaxin-7,V-ATpasea3について構築した.これらをES細胞に導入した結果,細胞レベルで相同組換えが起きたクローンを全てのalleleに関して確立することができた.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期の綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み、ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS21loxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形成導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに第三のlox Pを挿入するため,pMODloxZeoDAmp-3を構築した.このplasmidはTn5のtranspositionに必須な領域に挟まれた形でloxP-Zeo-loxPカセットを有しており,試験管内での反応により,カセットを任意のDNAに挿入することができる.これらの遺伝子モジュールを用いてmVam2, V-ATPase a3について遺伝子破壊を進め、キメラマウスの作出と遺伝子破壊マウスの作成に成功した.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.
非分割型光電変換素子による超高感度高分解能ナノラジアン角度センサに関する研究

本研究は、角度計測において一般的に応用されているオートコリメーション法における角度検出感度を向上させるためスポットサイズを小さくすると、光スポットの強度分布の最も強い中心部分が分割型PD隙間に埋もれてしまう事によるS/Nの低下が起こる従来技術の欠点を解消するため、非分割型光電変換素子を用いることによって微小角度変位量の測定が可能な角度センサを提供し、その能力を実証した。本研究は、角度計測において一般的に応用されているオートコリメーション法における角度検出感度を向上させるためスポットサイズを小さくすると、光スポットの強度分布の最も強い中心部分が分割型PD隙間に埋もれてしまう事によるS/Nの低下が起こる従来技術の欠点を解消するため、非分割型光電変換素子を用いることによって光軸周り以外の微小角度変位量の測定が可能な超高感度高分解能小型多自由度角度センサを提供し、その能力を実証する事を目的としている。本年度は以下の計画に沿って基礎実験を行った。1.光学系検討:小型化を念頭に光学素子の最適配置などの検討。2.原理検証実験:簡易な光学系を用いて原理の確認を行い、開発仕様などを決定。3.ナノラジアン1軸角度センサ作製:角度センサの信号処理回路を含んだ設計および作製。随時、電子部品・光学部品およびホルダーを購入。4.光学系組立調整:完成した1軸角度センサを現有の除振台上において、オシロスコープの出力を観察しながら光学系の調整。調整は測定範囲全域を用いて行うことが望ましいため、現有のPZTステージを用いて測定対象面を傾斜させながら行う。5.基礎実験:オシロスコープにより取得した測定結果について各特性評価などを行い、得られた結果をまとめて報告した。現状において多分割型の素子を用いた角度センサに対して感度、分解能ともに2倍程度の向上が見られた。本研究の目的は、角度計測において一般的に応用されているオートコリメーション法を用いる際に角度検出感度を向上させるためスポットサイズを小さくすると、光スポットの強度分布の最も強い中心部分が分割型PDの不感帯に埋もれてしまう事によるS/N比の低下が起こる従来技術の欠点を解消するため、非分割型光電変換素子を用いることによって微小角度変位量の測定が可能な超高感度高分解能角度センサを提供し、その能力を実証する事である。ビームスプリッタにより分割した一方のビームにより定義される光軸からPD受光面の長さの半分程度のオフセット量を与えてPDを配置する事によって原理上不感帯のサイズが関係なくなるため回折限界まで絞った極小のスポットを用いてもS/Nが低下しない光学系を提案した。なお、分割した他方のビームの強度変化をモニタすることにより光源の強度変化の影響を除去することができる。提案した光学系に基づき角度センサを作製し、性能評価を行った。角度変化を与えるために歪みゲージを内蔵したPZT傾斜ステージを用いた。傾斜角を変化させながら作製した角度センサと歪みゲージからの出力を同時に取得した。評価条件は傾斜角の入力範囲は330秒であり、レーザ強度は382.5μWであった。実験結果より安定した角度変化が得られることを確認し、センサ感度は0.0181%/秒であった。得られた結果をまとめて学会で報告した。
非線形複合システムにおける分岐現象とカオス

本研究は,非線形特性をもつサブシステムが,複数個結合した非線形複合システムに発生する分岐現象やカオスの発生機構やその他の形質を明らかにすることを目的としたものであって,当該年度に明らかにした結果は以下の通りである.1)周期解とカオスの共存現象この現象は,初期値の微少変動によって,システムの位相的ふるまいが変化し,たとえば安定な周期解が別の周期解に,あるいはカオスに分岐する現象を言うものである.初期値のごく微少変動で,全く異なる現象を呈することは,今後,人間の思考,ひらめき,記憶などの解明にも関係のあることとして注目を集めている.この現象は,本研究によってはじめて明らかにされたものであって,ごく簡単な一次元ディジタルシステムや,サンプル値制御系において,このような共存現象がみられることを示し,その発生機構を研究した.この現象は特に複合システムに限ったことではないが,複合システムにおける結合関係と密接な関係がある.2)実システムへの応用多くのサブシステムが結合してできる非線形複合システムの例として,大型宇宙構造物をとりあげ,このようなシステムの安定性を研究した.さらにフィードバックによる最適制御問題を論じた.これらの研究結果にもとづいて,現在,カオスや分岐現象を研究している.次に非線形複合システムの例として,生体をとりあげ,生体(ヒト)におけるB型肝炎の発生機構を解明した.その数字モデルとして,非線形微分方程式モデルを考え,この微分方程式の解軌道がカオスになることから, B型肝炎の発生との関連について論じた.本研究は,非線形特性をもつサブシステムが,複数個結合した非線形複合システムに発生する分岐現象やカオスの発生機構やその他の形質を明らかにすることを目的としたものであって,当該年度に明らかにした結果は以下の通りである.1)周期解とカオスの共存現象この現象は,初期値の微少変動によって,システムの位相的ふるまいが変化し,たとえば安定な周期解が別の周期解に,あるいはカオスに分岐する現象を言うものである.初期値のごく微少変動で,全く異なる現象を呈することは,今後,人間の思考,ひらめき,記憶などの解明にも関係のあることとして注目を集めている.この現象は,本研究によってはじめて明らかにされたものであって,ごく簡単な一次元ディジタルシステムや,サンプル値制御系において,このような共存現象がみられることを示し,その発生機構を研究した.この現象は特に複合システムに限ったことではないが,複合システムにおける結合関係と密接な関係がある.2)実システムへの応用多くのサブシステムが結合してできる非線形複合システムの例として,大型宇宙構造物をとりあげ,このようなシステムの安定性を研究した.さらにフィードバックによる最適制御問題を論じた.これらの研究結果にもとづいて,現在,カオスや分岐現象を研究している.次に非線形複合システムの例として,生体をとりあげ,生体(ヒト)におけるB型肝炎の発生機構を解明した.その数字モデルとして,非線形微分方程式モデルを考え,この微分方程式の解軌道がカオスになることから, B型肝炎の発生との関連について論じた.
肺胞基底膜のIV型コラーゲンの分子種と遺伝子発現

今年度、我々の研究は以下のような進展が見られた1)IV型コラーゲンα4遺伝子転写産物の発現についてIV型コラーゲンα4の遺伝子転写産物に関して、我々のこれまでの結果から第1エキソンの異なる2つの転写産物(1と1')が存在することがわかっているが、Northern blot法と定量的RT-PCR法によって、これらの転写産物をそれぞれ独立に検出する系を確立することに成功した。これによりIV型コラーゲンα4遺伝子転写産物の発現について、以下のような知見を得た。i)2つの転写産物は、基底膜に富む様々な組織において発現している。上皮細胞由来の細胞株、基底膜を多く含む組織中で発現が見られた。中でも特に発現が顕著なのは、肺胞の上皮細胞由来の細胞株であった。ii)競争的PCR法により転写産物1と1'の転写産物の発現の差について比較を行ったところ、ある種の細胞についてこれらの発現量に100倍もの差が見られた。こうした発現の差が、組織特異的プロモーターによるものと考え、更に検討を重ねている。2)レポーター遺伝子による、IV型コラーゲンα4遺伝子のプロモーター領域の解析α4の転写産物1と1'のそれぞれのプロモーターの活性を見るためのレポーター遺伝子の設計と作製を行った。当初の計画であるルシフェラーゼ遺伝子を用いた測定に先立ち、CAT遺伝子による解析も進行中である。エキソン1'、エキソン1それぞれの上流の2kbをカバーするゲノム断片をCAT遺伝子につないだコンストラクトを作製した。このコンストラクトに基づき、さらに他のコラーゲン遺伝子の例でも見られるようなイントロン1内の転写調節配列の存在の可能性も含めて、数種類のコンストラクトを現在作成中である。
政策ネットワークの変容に関する実証研究

政治家・官僚・利益団体リーダーに対して蓄積されてきた3波のサーベイデータの分析を行い、日本政治の30年間の構造変化を解明する研究成果を東洋経済新報社から、研究代表者である久米郁男と研究分担者であり、3波のサーベイデータ作成の責任者であった村松岐夫との共編著として2006年に出版した。その後この分析結果のより広い政治学的意義を確認しつつ、またそのような変化が生じた因果メカニズムの解明を目指して研究を発展させるため、サーベイデータと世論調査データをリンクした分析、さらに利益団体の政治経済学的属性とリンクした分析、さらには事例研究的手法での分析などを進めた。その中間報告会は、2006年3月に神戸において国際ワークショップとして開催したが、2007年8月にはブリティッシュ・コロンビア大学民主主義制度研究所との共催で米国の政治学者であるT.J.Pempel、Ellis Krauss、Megumi Naoiなどの海外研究者を招き開催した国際研究集会Modeling Power Relationships in Japanese Democracyにおいて、各メンバーが最終ペーパーを発表した。そこでの基本的な知見は、日本政治に「中央化」の傾向、すなわち、断片化・分権化していた政策決定機能が、中央に形成されるリーダーシップや中枢人物の交流場にシフトして来たことの発見であり、更にその背後では団体調査データや世論調査データの分析から示される、国家-社会関係の変化があることを実証的に解明できたことにある。なお、これらの研究業績を英文ジャーナルへ発表すべく最終改訂作業を終えつつある。本研究の目的は、1990年代に日本の政策ネットワークがどのように変化したのか。その変化はどのようにもたらされたのかを、政策ネットワークを構成する主要アクターである官僚、政治家、利益団体リーダーに焦点を当てて、それらアクターの相互作用のパターンを分析することにある。そこで利用する基幹的データは、上記3アクターに対してほぼ10年間隔で行われてきた3波のサーベイ調査データである。本年度の成果の概要は以下の通りである。(1)分析未着手であった第3波の団体データを利用して利益団体政治の30年間にわたる変化に関する記述的分析を行い、さらに進んで、各アクターデータの時系列的比較と時期別の横断的比較を連結して、政策ネットワークのパターンの変化の析出分析を進めた。この分析のために、分担協力者に加えて本プロジェクトに対する非公式の研究協力者を招き、研究会を開催し、その分析結果をとりあえず図書として刊行するめどを立てつつある。また、研究代表者はその分析を国際的に発信するべく、カリフォルニア大学アーバイン校での国際研究会で報告を行った。(2)サーベイデータの自由回答欄のデータベース化をすすめ、PDF形式でのデータ蓄積整理が完成しつつある。(3)サーベイデータと連結すべき政治家公約のデータ化と時事世論調査データ個票の整理を進め、またそれ以外の社会経済データとの連結につき準備を行った。なお、次年度の研究において政策ネットワークに関する理論的な検討を深めるために、政策ネットワークに関する理論研究会(於学習院大学)の開催および国際ワークショップ開催の準備交渉を行った。2005年から、政治家・官僚・利益団体リーダーに対して蓄積されてきた3波のサーベイデータの分析を研究会を適宜開催しつつ継続して行ってきたが、その分析結果から日本政治の30年間の構造変化を解明する研究成果を東洋経済新報社から、研究代表者である久米郁男と研究分担者であり、3波のサーベイデータ作成の責任者であった村松岐夫との共編著として2006年に出版した。そこで、我々は日本政治の構造に於いて何が壊され、何が採用されようとしているかの探求に関心をおいて分析を進め、日本政治における利益集団民主主義が変貌し、日本政治における「中央化」の傾向を明らかにすることが出来た。すなわち、断片化・分権化していた政策決定機能が、中央に形成されるリーダーシップや中枢人物の交流場にシフトしていることを様々な局面で確認できた。このような分析結果のより広い政治学的意義を確認しつつ、またそのような変化が生じた因果メカニズムの解明へ向かうことが次の課題であった。

そのため、サーベイデータと世論調査データをリンクした分析、公約データと接合した分析、さらに利益団体の政治経済学的属性とリンクした分析などを進めた。さらに、この最新の日本政治に関する知見を国際的に発信し、また比較政治的な観点から検討を進めるために2006年3月には米国から政治学者であるT.J.Pempel、Ellis Krauss、Megumi Naoiを招き国際ワークショップを開催し最終年度における国際的情報発信の準備を行った。2005年から、政治家・官僚・利益団体リーダーに対して蓄積されてきた3波のサーベイデータの分析をもとに日本政治の30年間の構造変化を解明する研究成果を東洋経済新報社から、研究代表者である久米郁男と研究分担者であり、3波のサーベイデータ作成の責任者であった村松岐夫との共編著として2006年に出版したが、その後このような分析結果のより広い政治学的意義を確認しつつ、またそのような変化が生じた因果メカニズムの解明を目指してきた。そのため、サーベイデータと世論調査データをリンクした分析、さらに利益団体の政治経済学的属性とリンクした分析、さらには事例研究的手法での分析などを進めた。その中間報告会は、2006年3月に神戸において国際ワークショップとして開催したが、2007年8月にはブリティッシュ・コロンビア大学民主主義制度研究所との共催で米国の政治学者であるT.J.Pempel、Ellis Krauss、Megumi Naoiなどの海外研究者を招き開催した国際研究集会Modeling Power Relationships in Japanese Democracyにおいて、各メンバーが最終ペーパーを発表した。そこでの基本的な知見は、日本政治に「中央化」の傾向、すなわち、断片化・分権化していた政策決定機能が、中央に形成されるリーダーシップや中枢人物の交流場にシフトして来たことの発見であり、更にその背後では団体調査データや世論調査データの分析から示される、国家一社会関係の変化があることを実証的に解明できたことにある。なお、これらの研究業績を英文ジャーナルヘ発表すべく最終改訂作業を終えつつある。
アカパンカビの組み換え修復にかかわる遺伝子の単離とその構造解析

今年度はmus-23遺伝子のクローニングを行った。mus-23遺伝子は連鎖群IIのflとtrp-4遺伝子のあいだにmapされた。コスミドライブラリーを使ってmus-23変異株のMMS感受性を相補するDNAを単離し、これをサブクローニングし、塩基配列を決定したところ、1578bpのORFを含んでいた。cDNAについても同様の配列決定を行ったところ、両者は一致し、イントロンの存在は見られなかった。予想されるタンパク質の分子量は約60KDであった。このタンパク質のアミノ酸配列と相同性を持つタンパク質をデーターベースで検索したところ出芽酵母のMrellがヒットした。Mrellタンパク質は酵母の組み換え修復タンパク質として知られており、主に二本鎖切断の修復に関わっている。mrell変異株とmus-23変異株とは極めてよく似た表現型を示し、mus-23遺伝子がアカパンカビの組換え修復遺伝子であることが明らかになった。酵母の発現ベクターを使ってmus-23遺伝子を酵母mrell株中で発現させたが、mrell株のMMS感受性は回復しなかった。これにより機能の上での相同性は示すことができなかった。mrellとmus-23との只一つの違いは紫外線に対する感受性でmus-23が高い感受性を示すのに、mrellは野生株と同様の感受性しか示さない。最近、アカパンカビには酵母とは異なる除去修復系のあることが明らかになり、この修復系はくみかえ修復系と共に働くことが予想されている。おそらくmus-23遺伝子はこの修復系と共同で働き、紫外線損傷の除去に関わっていると考えられる。
滑らかな曖昧性モデルとリアルオプション：理論と応用

平成30年度は以下の2つの研究テーマを柱として研究を進めた。1.昨年度に引き続き、滑らかな曖昧性モデル(smooth ambiguity)において、曖昧性が意思決定者の最適投資行動にどのような影響を与えるかに関して分析を行った。risky assetとambiguous assetの二つの資産への投資選択問題において、曖昧性の存在が、ambiguous assetへの投資を減少させる十分条件を導出した。さらに、本研究によって、国際分散投資の問題において重要なパズルである、ホームバイアスパズルを説明できることを示した。本研究は、国際的学術誌であるAnnals of Operations Researchに採択された。2.昨年度に引き続き、Klibanoff et al. (2005, Econometrica)のモデルに基づき、曖昧性への態度が、意思決定者の投資行動にどのような影響を与えるかについて、分析を行った。曖昧性が投資行動に与える効果は、確率優位だけで決定されるわけではなく、投資関数が補完的か代替的かによって異なることを証明した。2019年度中に国際的学術誌に採択されるよう、改訂に努める。曖昧性モデルを考慮したリアルオプションに関する研究論文の執筆には至らなかったが、曖昧性モデルの研究が国際的学術誌に採択されたため、このように自己評価する。2019年度については、前年度までに得られた研究成果を踏まえた上で、曖昧性モデルにおけるリアルオプションの研究を進展させる。平成29年度は以下の2つの研究テーマを柱として研究を進めた。1.滑らかな曖昧性モデル(smooth ambiguity)において、曖昧性が意思決定者の最適投資行動にどのような影響を与えるかに関して分析を行った。さらに、本研究によって、国際分散投資の問題において重要なパズルである、ホームバイアスパズルを部分的にであるが解消できることを示した。本研究は、現在、国際的学術誌に投稿・審査中である。平成29年度中に採択に至らなかったが、平成30年度中には採択されるよう、改訂に努める。2.上記研究と同様に、Klibanoff et al. (2005, Econometrica)のモデルに基づき、曖昧性への態度が、意思決定者の投資行動にどのような影響を与えるかについて、分析を行った。従来のGillier (2011, Review of Economic Studies)と異なり、曖昧性が投資行動に与える効果は、確率優位(stochastic dominance)だけで決定されるわけではなく、投資関数が補完的か代替的かによって異なることを証明した。本研究は平成29年度に国際的学術誌に投稿したが、平成30年度には採択されるよう、改訂に努める。曖昧性モデルを考慮したリアルオプションに関する研究論文の執筆には至らなかったが、曖昧性モデルの研究が進んでいるため、このように自己評価する。平成30年度については、平成29年度に得られた研究成果を踏まえた上で、曖昧性モデルにおけるリアルオプションの研究を進展させる。(理由)学内業務および他の科研費との関係から、次年度以降に執行した方が適切と判断したため。(使用計画)研究成果報告及び研究打ち合わせのための出張費として適切に執行する予定である。
高機能高信頼多相型プログラミング言語の表現

多相型レコード計算の理論やデータベースの多相型理論などを基礎とし,・高機能多相型システム,・高い相互運用可能性(inter-operability),・外部資源の柔軟で安全なアクセス,・堅牢かつ効率良い実装の特徴をあわせ持つ,広域分散環境に適した新しいプログラミング言語の実現を目指した研究を行い,以下の成果をあげた.(1)相互運用のための型理論の構築レコード多相性の理論を基礎とし,ML系言語からJAVA等のオブジェクト指向言語のクラスを透明に使用可能にする理論を構築し,そのプロトタイプを実装した.(2)証明論に基づくJAVAバイトコードの検証の理論JAVAのバイトコードを,論理学の証明とみなすことにより,その整合性を自動検証する理論を構築し,そのプロトタイプを実装した.(3)レジスタ割り付けの理論的基礎証明論的考え方を用いて,正しさが検証可能でかつより系統的なレジスタ割り当て方式の理論を構築し,そのプロトタイプを実装した.(1)と(2)の成果は,2002年10月のACM主催のプログラミング言語に関するの国際会議にて発表した.(3)の成果は2003年4月ETAPS主催のプログラミング言語に関するの国際会議にて発表予定である.多相型レコード計算の理論やデータベースの多相型理論などを基礎とし,・高機能多相型システム,・高い相互運用可能性(inter-operability),・外部資源の柔軟で安全なアクセス,・堅牢かつ効率良い実装の特徴をあわせ持つ,広域分散環境に適した新しいプログラミング言語の実現を目指した研究を行い,以下の成果をあげた.(1)相互運用のための型理論の構築レコード多相性の理論を基礎とし,ML系言語からJAVA等のオブジェクト指向言語のクラスを透明に使用可能にする理論を構築し,そのプロトタイプを実装した.(2)証明論に基づくJAVAバイトコードの検証の理論JAVAのバイトコードを,論理学の証明とみなすことにより,その整合性を自動検証する理論を構築し,そのプロトタイプを実装した.(3)レジスタ割り付けの理論的基礎証明論的考え方を用いて,正しさが検証可能でかつより系統的なレジスタ割り当て方式の理論を構築し,そのプロトタイプを実装した.(1)と(2)の成果は,2002年10月のACM主催のプログラミング言語に関するの国際会議にて発表した.(3)の成果は2003年4月ETAPS主催のプログラミング言語に関するの国際会議にて発表予定である.
アトピー性皮膚炎のバリア機能破綻に関わるタンパク質群の網羅的な同定・相対定量解析

アトピー性皮膚炎は、病変部の紅斑や丘疹、痂皮と掻痒が特徴の皮膚疾患である。本疾患の病態には様々な細胞間接着因子やサイトカイン、ケモカイン、プロテアーゼが関わると考えられているが、その詳細な分子機序は不明な点が多い。本研究は、角層タンパク質の発現異常を質量分析法を用いて網羅的に解析し、角層バリア異常に関わる原因タンパク質、および、病勢を反映する分子を明らかにすることを目的とした。平成27年度は、質量分析法による角層タンパク質の同定数を改善するため、テープストリッピング法で採取した角層からのタンパク質抽出法、および、抽出したタンパク質由来のペプチドの分画法を検討した。さらに、これらの方法を用いて、患者病変部角層と健常人角層を用いた相対定量解析を行った。その結果、角層タンパク質の抽出方法は、界面活性剤を用いる方法が適し、ペプチドの分画法は、逆相HPLC法が適していることが明らかとなった。上記のタンパク質抽出法、および、HPLC分画法を用いて、患者病変部角層および健常人角層を用いた相対定量解析を行った結果、2385個のタンパク質が同定できた。現在、解析中であるため、最終的な結果ではないが、同定したタンパク質のうち、約700個のタンパク質が有意な発現差を示した。これらのタンパク質のいずれかが目的のタンパク質の可能性がある。平成25年度から平成26年度に実施した解析では、同定したタンパク質数は191個であったことから、本年度明らかにしたタンパク質抽出条件およびペプチド分画法は、角層タンパク質の解析に適していると考えられた。現在、より詳細な解析を行い、同定したタンパク質の信頼性、および、病勢との関連を検証している。その後、候補タンパク質に対する免疫学的手法を用いた検証を行うことで、アトピー性皮膚炎の病変部角層において病態の形成に関与するタンパク質が検討できるものと期待される。アトピー性皮膚炎の角層バリア機能の破綻は、様々な細胞接着因子やプロテアーゼおよびサイトカインなどが関与するが、これまで、これらのタンパク質群の変動を一度に捉える方法は無かった。iTRAQ法は、質量分析計を用いて、検体間で増減しているタンパク質群を網羅的に相対定量する有用な方法である。本研究は、アトピー性皮膚炎の角層バリアの破綻に関わるタンパク質群を明らかにすることを目的とし、iTRAQ法を用いて、アトピー性皮膚炎の局所病変部の角層中に特異的であり、かつ、病勢に関与するタンパク質群を網羅的に定量・同定することを計画している。初年度は、テープストリッピング法を用いて採取した角層タンパク質に対してiTRAQ法に適した抽出条件を検討した。対象はアトピー性皮膚炎患者2名とし、対照は2名の健常人とした。それぞれの角層採取部位は頸部に統一した。セロテープと角層を有機溶媒で剥離させ、角層を採取した。角層タンパク質は尿素を用いて抽出し、トリプシン消化した。その後、トリプシン消化物をiTRAQ試薬でラベルした。iTRAQ法のデザインは、各アトピー性皮膚炎患者の頸部角層タンパク質と2名の健常人の頸部角層タンパク質のPoolを一組とし、2組のサンプルをnano-LC-MALDI/TOFを用いて相対定量解析した。その結果、最大218個のタンパク質が同定され、ケラチン以外のタンパク質は191個であった。現在、これらのタンパク質のうち、発現差を有するタンパク質のデータベース解析を実施している。初年度は、テープストリッピング法を用いて採取した角層を回収するため、有機溶剤を用いた工程を経てた後、各層タンパク質をiTRAQ法を用いて解析した。本年度は、得られたタンパク質群をデータベース検索し、各層タンパク質の抽出法およびタンパク質の分画方法の妥当性を検討した。ケラチン以外の191個のタンパク質のうち、同定の信頼度が高いタンパク質は50個ほどであった。そのうち、発現変動が検出されたタンパク質は10個であった。これら10個のタンパク質のうち、幾つかは既にアトピー性皮膚炎において発現量が異なると報告されているタンパク質であった。これは、本法によっても各層タンパク質の変動をとらえていることを示している。しかしながら、同定したタンパク質の個数は当初の予想よりも少なかった。この理由として、検体からのタンパク質の抽出効率が有機溶媒の使用によって低下し、さらに複雑なタンパク質構成が起因していると考えられたことから、次年度はこれらの問題を克服する必要がある。