hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体組織を用いたメカノトランスフェクション・センシング機構の解明

その結果、組織吸引を行っていない葉ならびに遺伝子導入条件である1回吸引した葉においては、ROSの発生は認められなかったものの、5, 10回吸引した葉においては、回数に一致したROSの増加が認められた。これらの知見は、短時間に繰り返し組織吸引圧刺激を付与した生体組織においてはROSが発生し、ROSがメカノセンサーとして働く可能性を示したものである。ほぼデータは得たが、投稿するに際し、腎臓・心臓に関するメカノトランスフェクションでの詳細な遺伝子発現分布に関する追加実験が必要である。今後は計画に従い、メカノトランスフェクションによる遺伝子発現制御化ならびにメカノセンシングの可視化と機構の解明に関する研究を実施する予定である。腎臓・心臓に関するメカノトランスフェクションでの詳細な遺伝子発現分布に関する追加実験を行い、投稿を進める。腎臓と心臓への動物実験手技の確立に予想より時間を要したが、手技は確立できたため、速やかに研究計画を実行し、投稿をすすめる。
浮遊粒子状物質(SPM)定量化のための圧電振動センサ(QCM)の開発

浮遊粒子状物質(SPM)の定量測定を行うQCMセンサを開発することを目的とし、3次元有限要素モデリングを用いた数値解析法を検討し、2、3の評価実験を行った。主振動モードに限定した3次元有限要素モデルと2次元モデルによる解析結果は、吸着質量に対する感度に関して、双方がほとんど一致した。マルチチャネルQCMのモード結合問題を、2次元有限要素モデルで解析した。結合を回避するには、各振動子間にトレンチを設けるだけでなく、ダンパー材をトレンチ内に挿入して振動を吸収させるのが効果的である事が分かった。3次元有限要素モデルを用いて、AT-カットとY-カットの振動子の周波数-温度特性の解析を行った。これにより等価回路パラメータの温度係数を算出し、設計中のデバイスを用いてSPMセンサ回路を構成したときの動作を回路シミュレータで解析することが可能となった。伝送線路モデルによるシミュレーションと最適化アルゴリズムを組み合わせた吸着膜のパラメータ同定法を開発した。この同定法は、SPMを吸着する膜の存在により生ずる測定誤差を補正するために利用できると考えられる。AT-カット振動子の周波数-温度特性の測定と微粒子検出実験を行った。温度特性の測定により温度特性の数値シミュレーションの妥当性が示された。検出実験においては、QCMにより微粒子検出を行えることを示した。本研究で行った数値シミュレーション技術の基礎的な開発の成果は、QCMを用いたSPMセンサの開発を行う際に、多いに役立つものと考えられる。本年度は主に圧電振動センサ(QCM)の3次元有限要素解析に用いる数値シミュレータの改良、及びセンサの特性測定を行うための測定系の準備・予備実験を行った。圧電振動解析プログラムの改良水晶振動子をQCM用のセンサとして用いる場合、環境温度の変化により振動子の共振周波数が変化すると、それはそのまま測定誤差につながる。また、メインモードの温度特性が良好であっても高次輪郭振動などのスプリアスモードの共振周波数は温度に依存して変化し、特定の温度でメインモードと結合する場合がある。これはその温度において発振周波数ジャンプを引き起こし測定値線形性が悪化する。このような現象のシミュレーションなどを行うため、研究代表者らが従来開発した3次元圧電振動解析プログラムに温度特性の効果を含めるために新たなコードを開発し組み込んだ。測定系の準備・予備実験QCMによるSPM測定実験を行うために、測定系の準備を行った。測定系はセンサとなる水晶振動子、発振回路、発振周波数測定器、データ記録・解析装置、及び複素インピーダンス測定装置よりなる。振動子単体の共振特性測定は複素インピーダンス測定装置により行い、データ記録・解析装置に測定値を記録する。この測定は温度変化や質量負荷に対する共振周波数変化の測定及び振動モード分布の測定などに用いる。発振周波数変化の測定は、センサである振動子を組み込んだ発振回路の発振周波数を周波数カウンタで測定し、データ記録・解析装置に記録する。この測定系を用いた予備実験としてタバコの煙の検出実験を行った。タバコの煙を充満させた密閉箱にセンサを挿入し発振周波数変化を測定・記録したところ、センサ挿入直後より周波数変化が観測された。また一定環境下ではSPM測定装置開発を行うために必要とされる発振周波数安定度も得られていることが確認できた。本年度は(QCM)センサに用いる振動子表面の吸着膜の影響と、振動子の周波数安定性の検討を行った。SPM吸着のための吸着膜の影響の検討本研究で採用している粒子検出法は圧電天秤法による質量検出であり、空気中に浮遊している微小粒子を計測するには振動子表面にトラップする必要があり、振動子表面に粘着性の吸着膜を設置する必要がある。このような膜は一般的に水晶に比べて柔らかいため、必ずしも振動子の表面と一体となって振動せず、その弾性の効果を考慮しなければならない。従ってトラップされた粒子の質量と振動子の共振周波数変化の関係は、従来より用いられてきた集中定数モデルに基づく理論式とは一致しなくなる。

この問題に対処するため、吸着膜の物理的性質、粒子の質量及び共振周波数の関係を、伝送線路モデルに基づく数値シミュレーションにより明らかにした。また、湿度・温度など環境の変化により吸着膜の物理的パラメータが変化する事を想定し、これらの変化を振動子の共振特性から同定することを試みた。ここでは伝送線路モデルによる数値シミュレーションの結果と測定値を一致させるよう、吸着膜の物理的パラメータをDFP最適化法により修正していく方法をとった。振動子の周波数安定性の検討本研究では前述したとおり圧電天秤法を採用しており、SPM検出には振動子の共振周波数変化を用いる。従って振動子の周波数安定性はセンサの測定限界を決定付ける重要なファクターである。振動子の共振周波数を変化させる要因としては、湿度・温度などの環境の変化が考えられる。ここでは、振動子の周波数-温度特性を3次元有限要素モデルによる数値シミュレーションにより検討した。その結果、一般に良く知られるATカット振動子特有のS字カーブが再現されるとともに、特定の温度においてメインモードとスプリアスモードの結合に起因する周波数ジャンプが見られた。このような検討が数値シミュレーションで行える事は、SPMセンサのための振動子設計において非常に有用である。また、実験により実際に周波数-温度特性の測定を行うとともに、オーバオールな周波数安定性の実験的検討を行った。
フラビウイルス脳炎の重症化・致死性に関わる病原性発現機序の解析

フラビウイルス脳炎の重症化に関わる病原性発現機序を調べるために、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルスを感染させたマウスモデルを用いた解析を行った。その結果、感染個体の重症化には、ウイルスが神経細胞に感染することに加え、個体側の免疫応答が神経細胞に傷害的に働いていることが複合的に関わった結果生じていることが示唆された。フラビウイルス脳炎の重症化に関わる病原性発現機序を調べるために、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)Oshima株および日本脳炎ウイルス(JEV)JaOArS982株を感染させたマウスモデルを用いた解析を行った。1. TBEV Oshima株中に含まれるsmallおよびlarge plaque typeクローンのそれぞれをマウスに皮下接種させたところ、small plaque typeはマウスに病原性を示さなかった。一方、large plaque typeではほとんどのマウスで体重減少および臨床症状が確認されたが、そのうち一部のマウスだけが死に至り、残りは回復した。このことから、TBEV Oshima株の親株には病原性の異なるウイルスが混在していることが示唆された。2. JEV S982株をマウスに皮下接種させたところ、ほとんどのマウスが発症したが、一部のマウスだけが重症化後死に至り、残りは軽症で回復した。重症個体の大脳皮質内のウイルス量は10^6pfu/g組織以上であったが、軽症個体のなかにも同程度のウイルス量を示す個体がみられた。重症個体は軽症個体にくらべ、大脳皮質のGFAP、TNF alpha、IL-10の増加、IL-2、IL-4の低下がみられた。一方、脾臓においてはIL-10の増加、TNF alpha、IFN gamma、IL-4、CD3、CD8の低下がみられた。また、血清中のコルチコステロン、IL-10の上昇がみられた。これらのことから、日本脳炎ウイルス感染における重症化の病態発現機序には神経組織へのウイルス感染に加え、全身性の免疫およびストレス応答のバランスが重要であることが示唆された。フラビウイルス脳炎は、重症化し髄膜炎・脳炎を起こすと致死性が高く、回復しても患者の多くは後遺症が問題となるが、その機序については不明な点が多く特異的な予防・治療法は確立されていない。昨年度の本研究成果において感染個体のIL-10やTNFα応答が重症化に関係していることが示唆された。そこで本年度の研究では宿主側要因としてTNF、IL-10に着目した解析を行った。1)ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)Oshima株および日本脳炎ウイルス(JEV)S982株をIL-10 B6 KOマウスに感染させたところ、両ウイルスともにB6マウスにくらべて致死性の増加がみられた。しかしながら、両ウイルスとも中枢神経組織内のウイルス量はB6マウスにくらべて有意な差がなかったことから、致死性の増加すなわち重症化には感染個体の免疫応答が関わっている可能性が示唆された。2)一方、TBEV Sofjin株およびJEV JaTH160株感染では、IL-10 B6 KOマウスとB6 KOマウスに致死性の違いがなかったため、これらのウイルス感染による重症化にはIL-10応答の影響は少ないものと思われた。3)TBEV Oshima株およびJEV S982株をTNFR1 KOマウスに感染させたところ、TBEV Oshima株感染では致死性の増加がみられたが、JEV S982株感染では致死性に有意な差がなかった。したがって、TBEV Oshima株感染ではTNF応答が関連した感染応答が重症化に影響を及ぼしている可能性が示唆された。4)一方、TBEV Sofjin株およびJEV JaTH160株感染ではTNFR1 KOマウスとB6 KOマウスに致死性の違いがなかったため、これらのウイルス感染による重症化にはTNF応答の影響が少ないものと思われた。
天然物の超臨界流体抽出における複合エントレーナ効果の解明

超臨界二酸化炭素、超臨界二酸化炭素+水、超臨界二酸化炭素+エタノール、超臨界二酸化炭素+水+エタノールに対するカフェインの溶解度をオンラインの赤外分光器により静置法で測定した。測定は温度40°C、圧力は15.0MPaで行った。その結果、超臨界二酸化炭素に水を飽和状態まで添加することにより、カフェインの溶解度は22%上昇することがわかった。また、超臨界二酸化炭素にエタノールを1000molm^<-3>添加することによりカフェインの溶解度は5倍上昇し、エタノールのエントレーナ効果が大きいことがわかった。水とエタノールを同時に用いると、水またはエタノールを単独に用いるよりカフェインの溶解度のおよぼすエントレーナ効果が小さいことがわかった。さらに、超臨界二酸化炭素にカフェインを溶解させ、エタノールを添加すると、カフェイン中の2つのカルボニル基(2と6の位置)の赤外吸収ピークが変形したので、カフェインのカルボニル基とエタノールが相互作用していることが示唆された。そこで、カフェインのカルボニル基のピークを波形分離したところ、エタノールを添加すると低波数側に新たなピークが現れ、これをカフェインとエタノールの相互作用種のピークと同定した。そして、2の位置のカルボニル基は6の位置のカルボニル基よりエタノールと相互作用しやすいことがわかった。さらに、カフェインの溶解度におよぼすエタノールのエントレーナ効果をカフェインのカルボニル基とエタノールの相互作用種の観点から解析したところ、エタノールの添加に伴うカフェインの溶解度の上昇は、主として相互作用種の濃度の増加によるものであることが示された。生理活性物質のモデル物質としてカフェインを選び、天然物からの生理活性物質の超臨界二酸化炭素抽出におけるエントレーナ効果を測定した。まず、高圧セルにカフェインを既知量入れ、系内を測定温度・圧力にして超臨界二酸化炭素に完全に溶解させた。その後、超臨界二酸化炭素中のカフェインの吸光度を測定した。カフェインの仕込み量を変えて同様な操作を数回行い、カフェインの仕込み量と吸光度の関係を求め、検量線を得た。次に、超臨界二酸化炭素には完全には溶解しないように過剰量のカフェインを仕込み、超臨界二酸化炭素に飽和溶解したときのカフェインの吸光度を測定した。検量線を外挿し、超臨界二酸化炭素に飽和溶解したときのカフェインの吸光度よりカフェインの飽和濃度(飽和溶解度)を求めたところ、2.60x10^<-3>mol L^<-1>となり、文献値と良好に一致した。さらに、過剰量のカフェインを高圧セルに仕込み、水を注入してカフェインの溶解度の上昇率(エントレーナ効果)を測定したところ、最大22%上昇することがわかった。超臨界二酸化炭素に対するカフェインの溶解度におよぼす水のエントレーナ効果が数倍あるとする文献と、ほとんど無いとする文献があるが、数倍あるとする文献はあやまりであることが明らかになった。次に、エタノールのエントレーナ効果を測定した。エタノールは測定条件下で超臨界二酸化炭素と完全に混和する。添加したエタノールの量に応じてカフェインの溶解度も上昇し、エタノールの添加量が1mol L^<-1>のときカフェインの溶解度は約5倍になることが示され、エタノールのエントレーナ効果が大きいことがわかった。天然物からの生理活性物質の超臨界二酸化炭素抽出におけるエントレーナ効果の基礎的知見を得るため、生理活性物質のモデル物質としてカフェインを選び、超臨界二酸化炭素中に溶解したカフェインとエントレーナであるエタノールの相互作用をフーリエ変換赤外分光器で測定した。その後、超臨界二酸化炭素中のカフェインの赤外吸光度を測定した。

次に、エタノールを系内に徐々に添加すると、カフェイン中の2つのカルボニル基による赤外吸収ピーク(1715および1675cm^<-1>)が変形したので、カフェインのカルボニル基とエタノールが相互作用していることが示唆された。そこで、カフェインのカルボニル基のピークを波形分離したところ、エタノールを添加すると57cm^<-1>くらい低波数側に新たなピークが現れ、これをカフェインとエタノールの相互作用種のピークと同定した。カフェインとエタノールの濃度を色々変えて測定を行い、エタノールと相互作用していないカフェインと、エタノールと相互作用しているカフェインの濃度をそれぞれ求めたところ、カフェインのカルボニル基とエタノールは1対1で相互作用種を作ることがわかった。また、カフェインのカルボニル基とエタノールの相互作用種の濃度はラングミヤ型の式で整理できることがわかった。その式を用い、カフェインの溶解度におよぼすエタノールのエントレーナ効果をカフェインのカルボニル基とエタノールの相互作用種の観点から解析したところ、エタノールの添加に伴うカフェインの溶解度の上昇は、主として相互作用種の濃度の増加によるものであることが示された。生理活性物質のモデル物質としてタキソールを選択した。タキソールは強い高腫瘍活性を持ち、卵巣がんや乳がんに対する抗がん剤として利用されている。しかし、タキソールの原料となるイチイの木は、成長に200年もかかり、樹皮に含まれる量も0.02wt%と非常に小さいため、高効率・商収率の分離方法が必要となっていたためである。タキソールの抽出を行うための基本となるデータの蓄積を目的として、赤外分光光度計を組み込んだ装置により、超臨界二酸化炭素に対するタキソールの溶解度の測定を行った。溶質であるタキソールは可視窓付きセルにあらかじめ仕込んだ後、超臨界二酸化炭素を導入し、タキソールを超臨界二酸化炭素に溶解させた。十分に時間が経った後、赤外分光光度計により3250cm^<-1>を中心に広がる幅広いピークのピーク高さに変化が見られなくなった点を平衡点と見なし、そのピーク高さから超臨界二酸化炭素に対するタキソールの溶解度を求めた。測定は温度323.2K、圧力15.020.0 MPaで行った。測定結果より、溶媒である二酸化炭素の密度の上昇に伴い、タキソールの溶解度が増加することが示された。また、超臨界二酸化炭素に対するタキソールの溶解度の文献値は2セット報告されており、それらはオーダーが違うほど異なっているが、本研究で得られた溶解度から、本測定と圧力範囲が異なるものの、Catherineらが報告した値の方が妥当であることが示された。次に、エタノールを添加することによるエントレーナ効果を測定することを試みた。しかし、タキソールの3250cm^<-1>を中心に広がる幅広いピークと多量に存在するエタノールのピークが重なってしまい、この方法ではタキソールの溶解度を決定することは困難であることがわかった。
脳腫瘍幹細胞の微小環境制御に基づいたprecision medicineの展開

悪性神経膠腫が治療抵抗性を獲得する原因として、さまざまな要因が考えられているが、我々は微小環境、中でも低酸素環境と腫瘍幹細胞に注目し、悪性神経膠腫の患者検体から腫瘍幹細胞株を単離・樹立し、低酸素環境における遺伝子変化を検討した。腫瘍幹細胞は、腫瘍幹細胞は微小環境下で多様性を獲得すること、腫瘍幹細胞が腫瘍微小環境を利用する分子機構などが分かってきた。すなわち、腫瘍幹細胞自身も、ゲノム・エピゲノムに変化を生じ、多分化能のバランスをとり、様々な環境に適応し、腫瘍形成や増殖に深く関わっている。そこで、微小環境における腫瘍幹細胞の多様性獲得機構を解明することは極めて重要であり、それらをターゲットにした治療は新たな分子標的になりうると考えられる。本研究では、多くの腫瘍幹細胞株、特にクエン酸代謝関連酵素であるIDH変異型幹細胞株、K27M異常を有する幹細胞株など用いて、遺伝子異常に基づいた微小環境制御という視点からprecision medicineの開発を目指すことを目的とした。本研究には膠芽腫細胞株、悪性神経膠腫患者の組織から単離・培養した複数の患者由来腫瘍幹細胞、特にIDH1変異細胞株や脳幹腫瘍患者由来のK27M変異細胞株Saga 027を用いて遺伝子相違による影響を比較検討している。脳腫瘍幹細胞をマウスに移植すると、患者腫瘍の特性を有した組織形態を呈する。組織間で形態変化の特徴を捉え、そのメカニズムについて検討を行っている。なかでも、炎症の関与について検討を行ったところ、脳腫瘍幹細胞を維持するためには、PI3K-NF-κBなどの活性化し、炎症シグナルを惹起し、さまざまなサイトカインケモカインを産生することが分かった。また、臨床で治療抵抗性であるSaga 027細胞について検討したところ、多くの既存の抗がん剤や分子標的薬に対しては、殆ど総ての治療に抵抗性であった。これまで樹立できた脳腫瘍細胞株や幹細胞株ではIDHの変異のない細胞しか株化できなかったが、共同研究者らとIDH変異のある幹細胞株樹立に成功している。これらの細胞を用いて様々な研究を行っているのに加え、小児脳幹部腫瘍の患者由来のヒストン蛋白K27M遺伝子異常を有する幹細胞株Saga027細胞の樹立にも成功した。そこで、このような背景のもと、患者検体から得られた遺伝子プロファイルの全く異なる脳腫瘍幹細胞を用いて、腫瘍細胞ニッチについて検討し、ゲノム異常に基づいた新規治療法の開発を目指している。現在、脳腫瘍に発現している特定の遺伝子解析を研究室内で行い、悪性度や予後に関与することを見出した。また、その阻害剤を見出し、皮下腫瘍では効果があることを見出した。現在中枢神経移植モデルでの効果を検討中である。また、これらの細胞株や幹細胞株を用いて、飢餓状態における腫瘍細胞の脂質代謝の検討を行っており、米国脳腫瘍学会などで発表し、新規治療法の開発に努めている。現在、これらの成果の一部を纏め学会誌に投稿中である。・腫瘍幹細胞における免疫応答と脳内微小環境変化脳腫瘍組織には腫瘍浸潤リンパ球やマクロファージの浸潤が観察され、腫瘍の進展や制御に複雑に絡み合っている。近年、腫瘍内多様性が、周囲に浸潤する免疫細胞の多様性を生み出していると報告されている。臨床検体を用いて、複数領域分割解析の統合解析を行うことで、シュミレーションモデルを構築し、多様性の評価を行う。また、腫瘍幹細胞の栄養飢餓環境における代謝メカニズムの解明と治療効果ついて比較検討を行っており、従来の切り口とは異なった視点での解析や治療法の開発に従事する予定である。

これまで樹立できた脳腫瘍細胞株や幹細胞株ではIDHの変異のない細胞しか株化できなかったが、共同研究者らとIDH変異のある幹細胞株樹立に成功している。これらの細胞を用いて様々な研究を行っているのに加え、小児脳幹部腫瘍の患者由来のヒストン蛋白K27M遺伝子異常を有する幹細胞株Saga027細胞の樹立にも成功した。そこで、このような背景のもと、患者検体から得られた遺伝子プロファイルの全く異なる脳腫瘍幹細胞を用いて、腫瘍細胞ニッチについて検討し、ゲノム異常に基づいた新規治療法の開発を目指している。現在、脳腫瘍に発現している特定の遺伝子解析を研究室内で行い、悪性度や予後に関与することを見出した。また、その阻害剤を見出し、皮下腫瘍では効果があることを見出した。現在中枢神経移植モデルでの効果を検討中である。また、これらの細胞株や幹細胞株を用いて、飢餓状態における腫瘍細胞の脂質代謝の検討を行っており、米国脳腫瘍学会などで発表し、新規治療法の開発に努めている。現在、これらの成果の一部を纏め学会誌に投稿中である。・腫瘍幹細胞における免疫応答と脳内微小環境変化脳腫瘍組織には腫瘍浸潤リンパ球やマクロファージの浸潤が観察され、腫瘍の進展や制御に複雑に絡み合っている。近年、腫瘍内多様性が、周囲に浸潤する免疫細胞の多様性を生み出していると報告されている。臨床検体を用いて、複数領域分割解析の統合解析を行うことで、シュミレーションモデルを構築し、多様性の評価を行う。また、腫瘍幹細胞の栄養飢餓環境における代謝メカニズムの解明と治療効果ついて比較検討を行っており、従来の切り口とは異なった視点での解析や治療法の開発に従事する予定である。2018年度、物品が安く購入できたため支出が抑えられました。2019年度、試薬、抗体などの購入に物品費を使用致します。
合成高分子分解遺伝子のクローニングと解析

(2)Sphingomonas macrogoltabidus No.203のPEG脱水素酵素遺伝子のPCRによる増幅:前年度に増幅されたDNA断片(pegAA)については、その塩基配列を決定した結果、全長289bpであり、両端にはそれぞれプライマーの配列が確認された。また、前年度に合成したPCRプライマーを用いてさらに検討したところ、PQQ結合部位から上流側約500bpの断片が増幅された。このpegAB断片についても塩基配列を一部読みとったが、相当するアミノ酸配列とは一致しなかった。(3)pUC119およびCharomid9-36によるジーンライブラリーの作成とコロニーハイブリダイゼーション:本菌の染色体DNAのSalI消化断片を、pUC119またはCharomid9-36に挿入し、大腸菌JM109においてジーンライブラリーを作成した。(1)で得られたpeaAA断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行ったが、どちらのライブラリーについても陽性のクローンは得られなかった。(4)EMBL3によるジーンライブラリーの作成とプラークハイブリダイゼーション:本菌の染色体DNAのMboI消化断片を、EMBL3に挿入し、大腸菌ER1647においてジーンライブラリーを作成した。PCRプライマーとして合成したオリゴヌクレオチド2種を新たにプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行ったが、陽性のクローンは得られなかった。(5)PEGの細菌外膜透過性と分解能:PEG資化菌では一般に、PEG培地で分解酵素が誘導され、外膜にポーリンが形成されることから、ポーリンを含む外膜構造がPEG分子の透過性に関与していることがうかがえたが、S.macrogoltabidus No.203では、例外的にPEGによる誘導効果が認められなかった。本菌は遺伝子に何らかの変異が生じて、酵素の誘導機構および細胞膜構造が変化したものと推測された。大腸菌におけるEー1のジ-ンライブラリ-の作成と活性発現:Eー1の構成菌でPEG分解を行うFlavobacterium sp.の全遺伝子(XhoI消化断片)をコスミドべクタ-pVK102(mob+)に挿入し、大腸菌HB101およびS17ー1(tra+)に形質導入して、ジ-ンライブラリ-を作成したが、大腸菌で分解は発現しなかった(PEG生育)。また、PEG脱水素酵素活性をリゾチ-ム処理菌体で測定したが、十分な酵素活性は検出できなかった。このFlavobacterium sp.は外来DNAの分解活性が強く、将来PEGー株を宿主として用いるには不適当と考えられる。PEG脱水素酵素のアミノ酸配列の決定とプロ-ブの作成:上記のように、PEG生育によるクロ-ン検索が難しいので、PEG脱水素酵素を既知の方法で精製し、末端アミノ酸配列を決定し、これよりプロ-ブを作成した。これを用いてPEG脱水素酵素遺伝子のクロ-ン検索を行い、サブクロ-ニングを試みる。大腸菌における203のジ-ンライブラリ-の作成と活性発現:PEG4000資化菌203のジ-ンライブラリ-を作成した。本菌はプラスミドを所有しないのと、外来DNAを分解しないので、将来PEGー宿主として使える可能性が高い。本菌の全DNA(Sal I断片)をEー1と同様にコスミドベクタ-につなぎ、大腸菌S17ー1に入れて、ジ-ンライブラリ-を作成したが、PEG生育を指標とするクロ-ン検索では、活性発現は認められなかった。PEG資化菌の再同定化学分類法に基づく再同定を行い、4000以上の資化菌(20,000資化菌ではPEG分解者)はすべてSphigomonas属とみなされたが、基準株7株はPEGに全く生育しなかった。

1000以下の低分子資化菌はPseudomonas属またはAlcaligenes属と判定された。(1)大腸菌におけるPEG4000資化菌S.parapeglytica No.203のジ-ンライブラリ-の作成と活性発現:共生菌Eー1のジ-ンライブラリ-に代わって、本菌の全DNA(SalI消化断片)をコスミドベクタ-pVK102(mob^+)に挿入し、大腸菌S17ー1に形質導入させて、新たなジ-ンライブラリ-とした。本菌はプラスミドを所有せず外来DNAを分解しないので、将来PEG^-宿主として使える可能性が高く、PEG^-変異株を既に取得している。しかし、PEG資化能を指標とするクロ-ン検索では活性発現は認められなかった。(2)PEG脱水素酵素のアミノ酸配列の決定とプロ-ブの作成:(1)で述べたようにPEG生育によるクロ-ン検索が難しいので、PEG脱水素酵素を既知の方法で精製し、リシルエンドペプチダ-ゼおよびV8プロテア-ゼを用いた消化物についてHPLCによるペプチドマッピングを行った。得られたペプチドのうち、前者の消化物から6断片、後者の消化物から2断片のN末端アミノ酸配列を決定した。これらのアミノ酸配列と既知のE.Coliのグルコ-ス脱水素酵素のPQQ結合部位のアミノ酸配列から塩基配列を推定し、それぞれプライマ-オリゴヌクレオチドを合成した。これらを用いて本菌株の全DNAを鋳型としたPCR反応を行った結果、PQQ結合部位から下流側約300bpの断片が増幅された。本酵素タンパク質のMWは約60、000なので、構造遺伝子にして約1.5kbpと換算され、上流には約1kbpが存在しているものと思われる。今後はこれをプロ-ブとしてクロ-ン検索を行う。また、全DNAの制限酵素消化物からサザンハイブリダイゼ-ションで、PCR産物を下流側に含む遺伝子断片を求めてクロ-ニングを行う。(3)pVK102およびpMFY31の接合伝達:pVK102およびpMFY31が大腸菌からS.parapeglyticaへ接合伝達され得ることを確認した。従って、今後(2)でクロ-ン検索ができた場合、大腸菌から目的遺伝子をPEG ^-S.parapeglyticaへ接合伝達して活性発現の有無や発現必須領域の決定を行うことも可能である。(4)PEG脱水素酵素に対する抗体の作成:精製したPEG脱水素酵素を4回にわけて、ウサギに静注し、血清中の抗体をOucheterlony法およびイムノブロッティングで確認した。この血清はコロニ-ハイブリダイゼ-ションによるクロ-ン検索や、クロ-ニング産物の同定に用いられる。(2)Sphingomonas macrogoltabidus No.203のPEG脱水素酵素遺伝子のPCRによる増幅:前年度に増幅されたDNA断片(pegA A)については、その塩基配列を決定した結果、全長289bpであり、両端にはそれぞれプライマーの配列が確認された。また、前年度に合成したPCRプライマーを用いてさらに検討したところ、PQQ結合部位から上流側約500bpの断片が増幅された。
マウスアンチセンスRNAの機能解析とX染色体の進化

この研究課題を始める時点において、前職揚でin silicoで同定した約2500のセンスーアンチセンス遺伝子対配列惰報を有していた。これら遺伝子対はcDNA配列から得られたものであり、実際に細胞内で転写されていると考えられたが、直接の発現は確認されていなかった。これらセンス-アンチセンス遺伝子の実際の発現を確認するため、センス鎖とアンチセンス鎖と区別して発現、定量を可能とするオリゴDNA(60mer)によるマイクロアレイを作成し、2500対の遺伝子のうち約2000対(4000個)の遺伝子に関して主要組織(繊維芽細胞、脳、心臓、精巣)における発現解析を行った。その結果、90%以上の遺伝子がそれぞれの組織において発現し、その発現量、そしてセンス鎖とアンチセンス鎖の発現量の比も組織によって変化しているものがあることが判明した。7対14遺伝子をランダムに選び、遺伝子の発現をノーザン解析してみたところ、遺伝子が蛋白質をコードしているかいないかに関わらず、センス-アンチセンス遺伝子座からはノーザンプロット上ではスメアとして検出される様々なサイズのpolyA無しのRNAが転写されていることが判明した。また、これらは核内に局在する傾向があることもわかった。このような新規のRNAの状態が判明したため、通常の方法でセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のみをノックアウト、ノックダウンすることにより遺伝子の機能解析を行うのは難しいということも判明した。X染色体転座マウスと亜種間の多型情報を用いて、X染色体上のセンス-アンチセンス遺伝子のうち7つに関してX染色体不活化を免れているかを確認したところ、通常の遺伝子と同様に片方の対立遺伝子が不活化していることが確認された。センス-アンチセンス遺伝子座からは以上のように特徴のある発現が見られるので、遺伝子座ごとに詳細な転写単位を同定し、機能解析を進めていくことが必要であると考えられる。この研究課題を開始する以前に我々がマウス・トランスクリプトーム解析により同定したアンチセンスRNA(natural antisense transcript、NAT)遺伝子は2500個にも及んだ。その他、ヒト、線虫、ショウジョウバエ、シロイヌナズナ、イネなどでも次々、数百個以上のNATが同定されるに及んで、これらNATには、二本鎖RNA(dsRNA)形成等、もしくはその他のしくみにより、対応するセンス鎖遺伝子の発現調節を担う普遍的な遺伝子調節機構があるのではないかと考えられるようになってきている。我々はまず、インフォマティックス的に同定したセンス・アンチセンス遺伝子対が実際の組織で発現しているかを検討するため、センスRNAとアンチセンスRNAを区別して解析できるオリゴDNAマイクロアレイチップ(約2000組のセンス・アンチセンス遺伝子)を作成して発現解析を行った。その結果、そのほとんどの遺伝子(90%以上)がいずれかの主要組織(脳、心臓、精巣、繊維芽細胞)で発現していることを確認した。また、センス鎖遺伝子とアンチセンス鎖遺伝子の発現の比は組織によって異なり、組織特異的パターンがあることが判明した。代表的なセンチ・アンチセンスRNAの発現をノーザンブロットで解析したところ、非翻訳性のアンチセンスRNAはcDNAとして単離されたものより実際は巨大RNA分子(10kb以上、ノーザンブロット上でスメアとして検出される)として、主に核内に存在していることがわかった。これらの結果はNAT特有の発現及び発現調節機構の存在を示唆すると考えられる。この研究課題を始める時点において、前職場でin silicoで同定した約2500のセンスーアンチセンス遺伝子対配列情報を有していた。

これらセンス-アンチセンス遺伝子の実際の発現を確認するため、センス鎖とアンチセンス鎖と区別して発現、定量を可能とするオリゴDNA(60mer)によるマイクロアレイを作成し、2500対の遺伝子のうち約2000対(4000個)の遺伝子に関して主要組織(繊維芽細胞、脳、心臓、精巣)における発現解析を行った。その結果、90%以上の遺伝子がそれぞれの組織において発現し、その発現量、そしてセンス鎖とアンチセンス鎖の発現量の比も組織によって変化しているものがあることが判明した。前年度における解析結果より、センス-アンチセンス遺伝子座からはノーザンブロット上ではスメアとして検出される様々なサイズのpolyA無しのRNAが転写され、これらは核内に局在する傾向があることが判明したため、組織切片を用いたin situ hybridizationを行い、核内における転写産物の蓄積を再確認した。このような新規のRNAの状態が判明したため、通常の方法でセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のみをノックアウト、ノックダウンすることにより遺伝子の機能解析を行うのは難しいということも判明した。センス-アンチセンス遺伝子座から転写されているRNAにpolyAがついていないものが多いことを受けて、マイクロアレイ解析においてもpolyA無しのRNAをターゲットにして解析を行ったところ、polyAのあるもとは違ったセンス-アンチセンス遺伝子の発現比が得られた。
光センサ-を用いた末梢循環機能解析装置の開発

光センサ-を用いた末梢循環機能解析装置の開発に取り組み、種々の基礎的検路を行い、更にそれを振動工具取扱い業務従事者の末梢循環機能の評価に応用した。本装置では、還元ヘモグロビン、酸化ヘモグロビン、および全ヘモグロビンの吸光度に関係した波長光の発光ダイオ-ドを用い、透過光や反射光をフォトダイオ-ドで検出することによりいくつかの末梢循環指標の観察が可能となった。本研究の成果は以下の通りである。1)還元ヘモグロビン、酸化ヘモグロビンの吸光度がほぼ等しい波長光と最も異なる波長光の2つの光の透過光強度から動脈血酸素飽和度が無侵襲に測定される。2)ヘモグロビンを反映する波長光を用いてカフによる圧迫時における透過光強度の変化から指血管の最高血圧、平均血圧が測定される。さらに平均血圧の時の血管容積Vで規格化したvascular volume ratioが算出され、末梢動脈の圧容積関係が血管弾性として定量的に評価できる。3)末梢動脈の持つ非線形性そのものもカフ圧と透過光強度の関係から評価される。4)全ヘモグロビンを反映する2種類の波長光の透過光強度から組織血液量が連続的にモニタ-される。5)臨床的応用により軽度の末梢循環機能異常の早期診断、およびレイノ-現象などの自覚症状を訴える者の重症度の評価に有用である。以上、本装置の開発は従来の血流以外のいくつかの末梢循環指標の同時測定を可能とするものであり、末梢動脈の弾性持性を含めた末梢循環機能の加齢変化や動脈硬化性変化だけでなく、末梢循環障害の早期診断、重症度の判定への利用も可能である。今後は更に、振動・騒音・寒冷といった各種条件の単一あるいは複合した影響について本装置で観察可能な末梢循環指標に加え、組織血流量も含めた末梢循環機能を総合的に評価・検討していくことを計画している。末梢循環機能の指標である脈波、組織の酸素飽和度、末梢血管の血圧や弾性を非観血的に測定するため、非観血的血圧測定法の一法であるオシロメトリック法と指尖容積脈波検出器にピーク波長の異なる2種類の発光ダイオード(LED)とフォトトランジスタを用いるという新しい方法を考案し、基礎的検討を行った。730nmおよび950nm帯の発光ダイオードとフォトトランジスタをカフ内面のゴム面に対向させ取り付けた圧迫用水封入カフを試作し、ヒトの指に装着した。ポンプによりカフに水を注入しカフ圧を増加させ、その際の動脈系血管床容積の変化を透過光量変化として光センサーアンプを用いて検出した。同時に心拍動に伴う容積脈波成分を記録し、脈波振幅が最大となるカフ圧(平均血圧:Pm)、脈波の消失するカフ圧(最高血圧:Ps)を測定した。また、全血液のヘモグロビン濃度および還元ヘモグロビンに関係した透過光量からヒトの指において組織の酸素飽和度の測定も可能とした。次に、血管弾性の比較を容易にするため、transmural pressure(TP:平均血圧ーカフ圧)30mmHgの時の動脈血管床容積(Va)をカフ圧が平均血圧(Pm)と一致した時の容積(Va)で規格化したVa/Vo(Vascular Volume Ratio)を算出し、血管のコンプライアンスの指標とした。これによって指血管の血管弾性の客観的評価が可能となった。以上のごとく、脈波、組織の酸素飽和度、末梢血管の血圧や弾性などの無侵襲計測の臨床応用が可能となり、現在環境温を含めた種々の条件下での応用を行っている。

また、全血液のヘモグロビン濃度を反映する800nm帯のLEDを利用することにより装置を改良し、容積脈波や指血圧だけでなく全血液量の非観血的測定という従来報告のない計測法も開発中である。この全血液量の測定においては相対的評価だけでなく、単位体積あたりの血液量の絶対値評価をも可能としていく予定である。光センサ-を用いた末梢循環機能解析装置の開発に取り組み、健常者を対象とした種々の基礎的検討を行った。その結果、還元ヘモグロビン、酸化ヘモグロビン、および全ヘモグロビンの吸光度に関係した波長光の発光ダイオ-ドを用い、透過光や反射光をフォトダイオ-ドで検出することにより、1)動脈血酸素飽和度、2)指血管の最高血圧及び平均血圧、3)末梢動脈のもつ圧容積関係における非線形性、4)組織血液量といったいくつかの末梢循環機能の同時観察が可能となった。健常者における本装置の応用から、加齢に伴って指血管の血管弾性が低下すること、指のうっ血時に血流の減少に反して組織血液量が増加することなどが観察された。次に本装置を振動工具取扱い業務従事者の末梢循環機能の評価に応用した。指血管の機能的器質的変化や周囲の組織の変性硬化を有するチェンソ-使用者では脈波成分△Iの振幅が健常者に比べて小さいため、血管弾性による評価が行えず、脈波の出現点及び最大点の検出の有無によりいくつかのパタ-ンに分けて指血管のもつ圧容積関係における非線形性を評価した。さらに脈波成分△Iの最大値△Imaxについて検討を加え、△Imaxと平均透過光強度I^-との比(△Imax/I^-)を算出することにより、指血管がもつ圧容積関係における非線形性をより客観的に評価することも可能とした。このように、本装置によって観察される指標は軽度の末梢循環機能異常の早期診断、およびレイノ-現象などの自覚症状を訴える者の重症度の評価に有用であった。以上、本装置の開発はいくつかの末梢循環指標の同時測定を可能とするものであり、末梢動脈の弾性特性を含めた加齢変化や動脈硬化性変化だけでなく、末梢循環障害の早期診断、重症度の判定への利用も可能である。今後は、環境刺激の単一あるいは複合した影響について本装置で観察可能な末梢循環指標に加え、組織血流量も含めた末梢循環機能を総合的に評価・検討していく予定である。
口腔癌細胞に対するエクソソームを利用したsiRNA・ミサイル療法の開発

本研究は標的細胞特異的なdrug deliverysystemの開発研究であり、ヒト免疫機構などの影響を受けない安全な輸送の担体となるエクソソームによるシステムの開発を目指している。癌患者の生体組織から分離・培養可能と考えられる線維芽細胞に着目し、そこから単離されたエクソソームを利用することで理想的な輸送の担体を確立し、標的細胞特異的なdrug deliverysystemを研究することは今後の癌治療における新たな道を開く一助となると考えている。以下に本年度の成果を示す。1.ヒト胎児線維芽細胞への標的遺伝子搭載:エレクトロポレーションを用いて標的遺伝子発現プラスミドベクターを導入し、ヒト胎児線維芽細胞に標的遺伝子を高発現させることに成功した。2.エクソソームへの標的遺伝子搭載:標的遺伝子を高発現させたヒト胎児線維芽細胞より抽出したエクソソームに、標的遺伝子が搭載されていることを確認した。3.エクソソーム吸着能評価試験:エクソソームRNAを蛍光標識し口腔癌細胞(SAS)へ作用させたところ、標的遺伝子搭載エクソソームがコントロールと比較して高い効率で口腔癌細胞へ取り込まれることを確認した。4.エクソソームへのsiRNA搭載:エレクトロポレーションを用いて、当講座で同定した癌関連遺伝子のsiRNAをエクソソームに搭載することに成功した。5. siRNA搭載エクソソームを用いた細胞増殖能試験:細胞増殖能に関与する遺伝子のsiRNAを搭載した標的遺伝子高発現エクソソームを口腔癌細胞(SAS)に作用させたところ、コントロールと比較して有意に細胞増殖能が低下していることを確認した。使用する細胞種の変更(樹状細胞⇒線維芽細胞)はあるが、計画通りに研究は進行している。現在、増殖能以外の機能解析を進めている段階である。機能解析が完了すれば予定通りに担癌マウスを使用したsiRNA搭載エクソソームによる増殖能試験を含む機能解析などに進む予定である。
植物の根表層工学の開発

目的タンパク質を細胞外分泌した後、細胞壁にトラップすることが可能になれば、環境浄化酵素の機能を引き出す上で有効であると考えられる。PRXによるフェノールの除去は、植物細胞壁にフェノールが酸化重合されることにより行われるが、このような反応系では、PRXを細胞壁に固定化することで細胞壁へのフェノール結合効率の上昇が期待される。細胞壁結合ドメインとしてArabidopsis thaliana EXP1由来Cellulose BindingDomain(CBD)およびNitociana tabacum TLRP由来Cys-rich Domain(Cys-D)の利用を検討した。まず、細胞壁結合ドメインを融合した組み換えタンパク質を植物体根に添加し、各ドメインの機能評価を行う。緑色蛍光タンパク質(EGFP)をレポーターとして用い、各組み換えタンパク質を発現するための遺伝子構築を行った。大腸菌に導入後、IPTGによる転写誘導を行い、各組み換えタンパク質が生産されることを確認した。現在、各組み換えタンパク質の大量生産および精製を行う。植物細胞壁に各組み換えタンパク質を添加し、緑色蛍光を見ることで細胞壁との結合性を評価を行っている。次に、CBDもしくはCys-DとHRP C1aの融合遺伝子にN末端分泌シグナルペプチドコード領域を融合した各遺伝子を、アグロバクテリウム法によりタバコ培養細胞に導入した。得られた形質転換カルスからタンパク質サンプルを調製して等電点電気泳動およびペルオキシダーゼ活性染色を行い、HRP C1aを発現するクローンを選抜した。これらのうち、Cys-D発現細胞の培地上清および細胞可溶性画分を調製し、等電点電気泳動を行い、細胞内と培養上清の両方に組換えタンパク質の生成が確認された。環境汚染物質の中でも、特に環境ホルモン活性を有する一群の化合物が問題となっているが、これらの多くはフェノール系化合物である。西洋ワサビ(Armoracia rusticana)ペルオキシダーゼ(HRP)は、フェノール系化合物の酸化重合反応による浄化に有用であり、また白色腐朽菌(Phanerochaete chrysosporium)のMnペルオキシダーゼ(MnP)はフェノール系化合物を含む芳香族化合物を分解すると考えられており、ダイオキシン、PCB、農薬等の分解が期待されているリグニン分解酵素である。そこで、昨年度までにタバコ培養細胞(BY2細胞)での分泌生産に成功したHRPに加え、Mnについても分泌生産の検討を行った。本研究では、分泌効率を高めるために宿主のBY2細胞で高レベルに分泌されるタンパク質(38kDaPRX、β-D-glucanexsohydrolase)に由来するシグナルペプチドを利用した。また、タンパク質の生産量を高めるために、高効率翻訳領域として機能するアルコールデヒドロゲナーゼ5'UTR領域(NtADH-5'UTR)を付加した。5'UTR領域および分泌シグナルを融合したMnP遺伝子をアグロバクテリウム法によってBY2細胞に導入し、発現量が異なるクローンを選抜した。選抜後液体培地に移し、培地中に分泌されたMnPのウェスタン解析を行った結果、目的のバンドが検出され、MnPを分泌生産するBY2細胞を取得した。次に、酵素活性を検討したところ、形質転換BY2細胞において生産されたMnPが酵素活性を持つ事を確認した。さらに、分泌性の有用酵素を植物細胞壁に固定するため、植物細胞壁結合性アミノ酸領域あるいはセルロース結合ドメインをコードした遺伝子断片をそれぞれクローン化し、分泌型HRPまたはMnPのC末領域に融合したキメラ遺伝子の構築を行った。
14族元素-14族元素二重結合の生成機構とその動的挙動の研究

7、8-ジゲルマビシクロ[2.2. 2]オクタジェン誘導体(1)から光照射により発生させたゲルマニウム-ゲルマニウム二重結合種の発生機構とその動的挙動の研究を化学的捕捉剤実験、レーザー閃光実験、低温UV実験、および^1HCIDNPを用いて行った。誘導体1を光照射するとゲルマニウム-炭素結合の切断に伴い、1、6-ジラジカルの1重項ラジカル対が生成し、その1重項ラジカル対から3重項ラジカル対を経由して目的とするゲルマニウム-ゲルマニウム二重結合種が発生することがわかった。ゲルマニウム二重結合種は低温UVおよびレーザー閃光分解法により380nm付近に吸収極大を持ち、ゲルマニウム上の置換基がアリール基の場合はその吸収位置は長波長側に移動する。ゲルマニウム二重結合種といろいろな基質との反応をレーザー閃光分解法で検討した結果、酸素とは極めてよく反応することがわかった。また、ゲルマニウム二重結合種は四塩化炭素やアルコールともよく反応するのに対し、ジエンとの反応は遅い。ポリハロメタン類の中でもクロロホルムやジクロロメタンとは反応しない。アルコールとの反応ではメタノールが一番早く反応するのに対し、エタノール、I-プロパノール、t-ブタノールになるにしたがい反応は遅くなる。また、アルキン類、アルカン類やヒドロシランとは全く反応しない。これらレーザー閃光分解法を用いた速度論的結果は、捕捉剤実験を用いた反応生成物との実験結果とよく一致した。7、8-ジゲルマビシクロ[2. 2. 2]オクタジェン誘導体(1)から光照射により発生させたゲルマニウム-ゲルマニウム二重結合種の発生機構とその動的挙動の研究を化学的捕捉剤実験、レーザー閃光実験、低温UV実験、および^1HCIDNPを用いて行った。
日本近世近代移行期における内水面漁業の研究－琵琶湖を対象に－

本研究では、具体的に以下の2つの課題に取り組んだ。1、琵琶湖漁業の「近世」から「近代」への質的変化の分析、2、明治初期における琵琶湖漁業の担い手についての具体的分析。1では、滋賀県内の各研究機関に所蔵されている漁業関連史料の収集・調査・分析をおこなった。これらの史料は、琵琶湖漁業研究の基礎資料となるものであり、史料集の刊本化を目指し準備をすすめている。2では、明治期の養魚技術発展に貢献した中川源吾に焦点をあて分析をおこなった。その成果の一部として『明治・大正期の中川源吾をめぐる史料と地域社会』と題した報告書を刊行した。本研究の基本的な方法は、1、滋賀県内の各研究機関に所蔵されている近世・近代の漁業史料について漁業権・漁業技術・漁法・漁民の「知」という視角による再検討、2、集中的にひとつの地域(知内区)におけるインテンシブな現地調査である。具体的には、以下の2つのステージで構成している。1、琵琶湖漁業の「近世」から「近代」への質的変化の分析(琵琶湖の漁業権に関する基礎的研究を発展させる形で、あらたな視角ー漁業技術・漁民の「知」ーを取り入れながら琵琶湖漁業の具体的な質的変化を捉える)2、明治初期における琵琶湖漁業の担い手についての具体的分析(中川家文書の調査・研究作業を進め、中川源吾の業績分析を通じて琵琶湖漁業の近代への展開を解明する)。平成25年度は、本研究に必要な史料の調査と本研究に関わる研究史の収集をおこなった。具体的な作業は、以下の通りである。1、中川家文書の整理・調査(写真撮影・目録作成・翻刻作業)2、滋賀県内の各研究機関に所蔵されている漁業関連史料の把握および調査(滋賀県庁文書、大津市歴史博物館所蔵史料等)3、中川源吾の業績についての基礎調査(滋賀県および鹿児島県)4、明治初期の漁業政策についての研究史整理。調査研究のうち、とくに史料調査については、代表者および研究協力者とともに作業をおこなった。翻刻作業については、その一部をアルバイトに委託した。平成25年度の研究は、史料の所在把握と収集作業が中心となった。所在確認した史料については、平成26年度中に調査をおこなう予定にしている。1、琵琶湖漁業の「近世」から「近代」への質的変化の分析(琵琶湖の漁業権に関する基礎的研究を発展させる形で、新たな視角ー漁業技術・漁民の「知」ーを取り入れながら琵琶湖漁業の具体的な質的変化を捉える)2、明治初期における琵琶湖漁業の担い手についての具体的分析(中川家文書の調査・研究作業を進め、中川源吾の業績分析を通じて琵琶湖漁業の近代への展開を解明する)。平成26年度は、平成25年度に引き続き、本研究に必要な史料の調査をおこなった。1、中川家文書の調査・整理(写真撮影・翻刻作業)、2、滋賀県内の近世から近代にかけての漁業史料の調査(滋賀県庁・滋賀県水産試験場等)、3、中川源吾の業績についての総合的な調査(滋賀県および鹿児島県)、4、調査した史料を用いた論文作成作業。平成26年度は、史料調査のみならず聞き取りによる調査も含めて総合的な調査をおこなった。これらの調査で得たことをベースに論文作成の準備をおこなっている。本研究の基本的な方法は、1、滋賀県内の各研究機関に所蔵されている近世・近代の漁業史料について漁業権・漁業技術・漁法・漁民の「知」という視角による再検討、2、集中的にひとつの地(滋賀県高島市マキノ町知内区)におけるインテンシブな現地調査である。具体的には、以下の2つのステージで研究を構成している。1、琵琶湖漁業の「近世」から「近代」への質的変化の分析(琵琶湖の漁業権に関する基礎的研究を発展させる形で、新たな視角ー漁業技術・漁民の「知」ーを取り入れながら琵琶湖漁業権の具体的な質的変化を捉える)2、明治初期における琵琶湖漁業の担い手についての具体的分析(中川家文書の調査・研究作業を進め、中川源吾の業績分析を通じて琵琶湖漁業の近代への展開を解明する)。平成27年度は、具体的に以下の作業をおこなった。1、過去2年間の調査で収集した古文書(中川家文書・滋賀県庁所蔵文書・滋賀県水産試験場所蔵文書等)の解読と分析。2、鹿児島県への漁業技術伝播に関する聞き取り調査。3、琵琶湖漁業に関する既刊の刊本史料の収集と、原本との照合作業。4、琵琶湖以外の内水面漁業に関する研究史の収集作業。日本の内水面漁業の歴史の把握と、それにおける琵琶湖漁業の位置づけの確認。5、これらの作業を踏まえた、論文執筆作業。平成27年度は、上記15の作業をおこなったが、とりわけ1については、調査途中のものについては、引き続き調査整理(写真撮影・目録作成)をおこなっている。平成27年度は、研究に必要な古文書の解読作業や聞き取り調査、既存刊本史料の見直し作業など具体的な作業は進んだ。その一方で、未調査史料の調査を終えることができなかった。しかし、本研究にどうしても必要となる史料であるため、調査済み史料を用いた分析作業と同時進行で、史料調査(写真撮影・目録作成)をすすめる必要がある。

本研究の基本的な方法は、1、滋賀県内の各研究機関に所蔵されている近世・近代の漁業史料について、漁業権・漁業技術・漁法・漁民の「知」という視角による再検討、2、集中的にひとつの地(滋賀県高島市マキノ町知内区)におけるインテンシブな現地調査である。具体的には、以下の2つの課題に取り組んだ。1、琵琶湖漁業の「近世」から「近代」への質的変化の分析(琵琶湖漁業権の具体的な質的変化を捉える)2、明治初期における琵琶湖漁業の担い手についての具体的分析(中川家文書の調査・研究作業を進め、中川源吾の業績分析を通じて琵琶湖漁業の近代への展開を解明する。)。最終年度となる28年度は、具体的に以下の作業をおこなった。1、これまで収集した古文書の解読作業およびそれを用いた具体的な分析作業。2、刊本史料のデータ入力作業およびそれを用いた具体的な分析作業。3、上記の作業を踏まえた論文執筆作業。4、中川源吾史料の解読、データ化。5、研究報告書の作成、刊行。1、2については、本研究および今後の研究にも継続して必要な基礎史料を手元に揃えることができた。3については、現在も継続して論文執筆をおこなっており、平成29年度中に投稿の予定である。4、5については、『明治・大正期の中川源吾をめぐる史料と地域社会』と題して、翻刻史料と解説を加えた研究報告書を刊行した。今後は、この研究報告書を修正し、さらに論考を加えて、出版を計画している。本研究では、具体的に以下の2つの課題に取り組んだ。1、琵琶湖漁業の「近世」から「近代」への質的変化の分析、2、明治初期における琵琶湖漁業の担い手についての具体的分析。1では、滋賀県内の各研究機関に所蔵されている漁業関連史料の収集・調査・分析をおこなった。これらの史料は、琵琶湖漁業研究の基礎資料となるものであり、史料集の刊本化を目指し準備をすすめている。2では、明治期の養魚技術発展に貢献した中川源吾に焦点をあて分析をおこなった。その成果の一部として『明治・大正期の中川源吾をめぐる史料と地域社会』と題した報告書を刊行した。平成26年度は、平成25年度に引き続き史料調査に重点をおいて研究をおこなった。調査は順調にすすんでおり、平成27年度も引き続き史料調査をすすめつつ、論文を量産する予定である。当初、本研究は3年間の計画で開始したが、研究に必要な史料の調査に時間を要し、研究を1年延長した。最終年度にあたる平成28年度とそれ以降は、下記の研究計画に基づき作業をおこなう。1、解読した史料を分析して、論文を作成する。2、本研究で解読した史料等を中心にした琵琶湖漁業に関する史料集を作成する。3、本研究の成果についての報告書を作成する。13の作業を踏まえ、将来的には、琵琶湖漁業の歴史についての著書の執筆を予定している。日本史平成27年度は、平成25・26年度の調査で得た史料をもとに、論文作成をおこなう。ただし、いまだ未調査の史料も多くあるので、調査の回数を減らすことなく、両方の作業をハイペースですすめる予定である。また同時に調査をおこなった史料をもとに、琵琶湖漁業についての史料集作成に向けての準備作業もおこなう予定である。