hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多機能神経ペプチドPACAPの精巣特異的生合成調節機序とその生理的意義の解明

多機能神経ペプチドPituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP)は、精巣に高濃度に存在し、PACAPおよびそのレセプター発現が精子形成のステージにより周期的に変化する事から、生殖への関与が示唆されている。我々は、ヒトPACAP遺伝子の精巣特異的発現調節機構を目指し、精巣特異的エクソン上流に精巣特異的プロモーター領域を同定した。さらにこの領域に特異的に結合するタンパク質として、PARP-1とTIARを同定した。これらタンパクをsiRNAでノックダウンすると、80bpのプロモーター活性が変化しPACAPの精巣特異的機能への関与が示唆された。多機能神経ペプチドPituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)は、中枢神経系に分布する他、精巣にも比較的高濃度に存在しており、PACAPおよびそのレセプター発現が精子形成のステージにより周期的に変化する事から、生殖細胞の分裂増殖、分化あるいは生存への関与が示唆されている。我々は、ヒト精巣におけるPACAP遺伝子発現調節機構を解明する目的で、ヒトPACAP遺伝子において、精巣特異的PACAPプロモーター領域の同定と解析を行った。前年度に同定したヒトPACAP遺伝子の精巣特異的エクソン上流の転写調節領域の中の約80bpの領域に精巣特異的プロモーターの存在が示唆されていたことから、F9核蛋白においてこの領域に結合するタンパク質の存在をgel shift assayにより確認し、その結合タンパク質をDNA affinity chromatographyにより精製、Mass spectrometryにより同定を行った。同定したタンパク質の特異性を検討するため、siRNAを用いてノックダウンし、プロモーター活性に対する影響をluciferase assayにより確認した。F9細胞において活性を示すプロモーター領域である80bpを同定し、その領域と核タンパク質との結合を確認した。その結果今年度同定された結合タンパク質はPARP-1とTIARであった。これらタンパクをノックダウンすると、80bpのプロモーター活性が変化した。このうちTIARはそのノックアウトマウスの雄において無精子症を呈することが報告されており、PACAPの精巣特異的機能への関与が示唆された。我々は、PACAPの精巣特異的機能発現を解明する目的で、PACAPの精巣特異的生合成について、ヒトPACAP遺伝子の精巣特異的PACAPプロモーター領域の同定と解析を行った。さらに、PACAP特異的受容体であるPAC1についても、精巣特異的遺伝子発現調節を明らかにするため、ヒトPAC1遺伝子の5'上流域をクローニングし、エクソン1を含む-372/+268領域(hP1L-5)において、NGF刺激により誘導されるプロモーター活性を見出した。NGF刺激によるhP1L-5のプロモーター活性はMEK阻害剤(UO126)によりほぼ完全に抑制され、SP1阻害剤(Mithramycin)により有意に抑制された。hP1L-5に存在する2ヶ所のSP1サイトに点変異を導入し、プロモーター活性を比較検討したところ、-282/-272に存在するSP1が主に関与することを明らかにした。また、ERストレス因子であるTunicamycin処理やin vitro虚血によりPC12細胞におけるPAC1遺伝子発現が抑制されることを見出し、精巣においてもPAC1がダイナミックに発現調節を受けていることが示唆された。多様な生理活性を示すPituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP)は、精巣に高濃度で存在し、精子形成に関与することが示唆されている。しかしながら、PACAPの精巣における生合成、分泌動態についてはほとんど解明されていない。そこで、申請者は、精巣におけるPACAPの生合成及び機能発現を明らかにするため、今年度以下の検討を行った。PACAP遺伝子の上流域の精巣特異的転写制御領域の性状解析に関して、精巣特異的転写エレメント結合因子の精製及び構造解析であるが、前年度までに同定したPARP1とT1LRF9に加えて、細胞の核抽出蛋白より新たに3つの未同定の蛋白を分離精製し、それぞれ質量分析により解析を進め、年度内に結果は得られていないが、今後最終確認する。PACAP特異的受容体であるPAC1遺伝子の精巣における発現調節の比較解析については、まずPAC1遺伝子の5'上流域に存在する転写調節領域の性状解析を行い、前年度より5'上流域に存在するSp1エレメントが、PAC1遺伝子の正の調節に関わるだけでなく、ERストレスや虚血におけるPAC1の負の発現調節においても重要な役割を担う可能性が示唆されたが、今年度そのメカニズムに関して興味ある知見が得られた。

即ち細胞にストレスが加わることにより、トランスグルタミナーゼ2が活性化され核内に移行すると、様々な蛋白の架橋を促進するが、その際Sp1も架橋されることにより、Sp1エレメントに結合できなくなり、その結果遺伝子発現が抑制される。このことは、ERストレス負荷時に、トランスグルタミナーゼ2の核内移行が促進され、ERストレス阻害薬であるSalburinalによって、その移行が抑制されること。またTG2の阻害薬であるCystamineによって、ストレスにより抑制されるPAC1の転写活性が回復することから明らかとなった。これらの知見は精巣におけるPAC1の発現調節の解明に寄与することが期待される。
記憶・学習の分子基盤

モルヒネに対する耐性と依存は脳の可塑的変化により引き起こされると考えられている。NMDA受容体GluRε1欠損マウスではモルヒネ耐性が著しく減弱することを明らかにした。欠損マウスの中脳水道灰白質および腹側被蓋野特異的にGluRε1遺伝子を導入することにより、モルヒネ耐性が回復することを示した。同様に、モルヒネ依存の形成に側坐核のNMDA受容体GluRε1が重要であることを示した。小脳プルキニエ細胞に特異的に発現しているグルタミン酸受容体GluRδ2は小脳可塑性に必須である。GluRδ2欠損マウスの運動学習能力を瞬き反射と音との連合学習で解析したところ、条件刺激と無条件刺激とを同じタイミングで与えるdelayパラダイムにおいて著しく障害されていたが、条件刺激と無条件刺激との間に500m秒の時間間隔を設けるtraceパラダイムでは正常な学習を示すことを見出した。逆に、NMDA型グルタミン酸受容体GluRε1欠損マウスはdelayパラダイムをほぼ正常に学習したが、条件刺激と無条件刺激とを500m秒の時間間隔で与えるtraceパラダイムで障害を示すことを示した。さらに、traceの時間間隔が無い課題の学習獲得は、野生型マウスでは海馬破壊で影響されなかったが、GluRδ2欠損マウスでは海馬背側の破壊により学習獲得が阻害された。これらの結果から、瞬き反射の条件付け学習において条件刺激と無条件刺激とのタイミングに応じて脳内のシステムが使い分けられていることを明らかにした。小脳のシナプス可塑性、運動学習、神経回路形成に重要なGluRδ2と結合する新たな分子としてDelphilinおよびShankを同定した。さらに、GluRδ2はShank、Homer、mGluRlα、GRIP1と複合体を形成し、AMPAR、IP3受容体、mGluRlαを分子的に結びつける要に位置すると考えられた。記憶・学習の分子基盤を明らかにすることを目的とする。マウスの学習行動解析には遺伝的背景を均一にすることが重要である。学習能力の高いC57BL/6の遺伝的背景が99%以上のNMDA受容体サブユニット欠損マウスを樹立した。NMDA受容体G1uRε2サブユニット欠損マウス(-/-)は脳の感覚地図形成が出来ず死亡するが、ヘテロ欠損マウス(+/-)は生育し、海馬CA3野のシナプス可塑性がシナプス特異的に障害されていることから、文脈依存学習を解析した。予想に反してGluRε2(+/-)マウスのフリージング反応が亢進していた。そこで、恐怖条件付けによりその反応性が亢進することが知られている音による驚愕反射を測定した。GluRε2(+/-)マウスの驚愕反射は野生型マウス(+/+)と比較して著しく亢進していた。GluRε2(+/-)マウスの音に対する反応の感度は野生型マウスと同等であった。一方、他のNMDA受容体サブユニットGluRε1、ε3およびε4サブユニットのヘテロ欠損マウスの驚愕反射は、野生型マウスと同等であった。音による驚愕反射の基本回路は脳幹にあり、GlURε2は前脳特異的に発現する。したがって、GluRε2サブユニットは音に対する驚愕反射の制御に特異的に関与すると考えられる。さらに、GlURε1とε2は脳機能において異なる役割を担っていることが示唆される。また、C57BL/6由来の胚幹細胞から、比較的よい効率でICR胚をホストとして生殖系列に伝達するキメラを形成する亜株を単離した。この胚幹細胞を用いて標的遺伝子組換えを行い、純粋にC57BL/6系統の遺伝子組換えマウスを得ることに成功した。

小脳のシナプス可塑性、運動学習、神経回路形成に重要なGluRδ2と結合する新たな分子としてDelphilinおよびShankを同定した。さらに、GluRδ2はShank、Homer、mGluRlα、GRIP1と複合体を形成し、AMPAR、IP3受容体、mGluRlαを分子的に結びつける要に位置すると考えられた。(1)GluRε1サブユニット欠損マウスを用いて瞬目反射条件付けへの海馬可塑性の影響を解析したところ、条件刺激と無条件刺激とを同じタイミングで与えるDelayパラダイムではほぼ正常な学習を示すが、条件刺激と無条件刺激との間に時間的間隔を設けるTraceパラダイムではことにおいて著しく障害されていることを見出した。(2)GluRδ2の局在と可塑性の機構を明らかにするために、細胞質側に位置すると考えられるC末端領域に結合する新規蛋白Delphilinを単離した。Delphilinは小脳においてはプルキニエ細胞に選択的に強く発現し、大脳では視床に弱い発現が認められた。小脳プルキニエ細胞においては、GluRδ2と同様に平行線維シナプスに局在していた。DelphilinはPDZドメイン、FHドメイン有するl024アミノ酸からなり、GluRδ2のC末端と、PDZドメインを介して相互作用することを明らかにした。DelphilinはGluRδ2とともに免疫沈降することを認めた。また、FHドメインを介してアクチン結合タンパク質であるProfilinやSH3領域を有するnSrcと相互作用することが示唆された。これらの結果より、DelphilinはGluRδ2の足場蛋白であるとともに、GluRδ2の細胞内への情報伝達を担う分子であることが示唆される。(3)C57BL/6系統由来胚幹細胞を用いて、シナプス可塑性の中心分子であるグルタミン酸受容体ならびに栄養因子受容体、細胞接着分子の遺伝子に、Creリコンビネースの認識配列loxPを組み込んだベクターを構築し、組換えマウスを得た。グルタミン酸受容体(GluR)δ2サブユニットは小脳プルキニエ細胞に特異的に発現しており、小脳シナプス可塑性、運動学習、回路網形成において重要な働きを担っている。我々は、瞬目反射の条件付け学習において条件刺激と無条件刺激とのタイミングに応じて脳内のシステムが使い分けられていることを明らかにした。traceパラダイムにおいて、条件刺激と無条件刺激との時間間隔を短くした場合、GluRδ2欠損マウスで海馬を破壊した時のみ障害が見られた。短期trace学習にはいずれかのシステムも担いうることが明らかとなった。GluRδ2は発達段階における平行線維シナプスの結合強化・安定化にも関与する。平行線維シナプスに局在するGluRδ2の欠損は登上線維の多重支配を引き起こすが、増加した登上線維の多くは遠位樹状突起にシナプスを形成することを見出した。GluRδ2の欠損による平行線維シナプスの減少により、通常近位部を支配する登上線維の支配領域が拡大したと考えられる。したがって、プルキニエ細胞と登上線維とのシナプスの形成整備は、登上線維同士のhomosynapticな競合と平行線維とのheterosynapticな競合の2段階で行われると考えられる。核移行シグナルを付加した酵母由来の組換え酵素Flp発現ベクターをC57BL/6系統由来の受精卵に導入し、精巣に置いてflp mRNAの発現を示すトランスジェニックマウス系統を得た。
可変色白色光レーザの開発

今年度は白色光レーザービームの直接変調を目指し、第2の方法である、ヘリカルホローカソードレーザーの検討を行った。ヘリカルホローカソードとは、バネあるいはニクロム線のような形状をいい、コイルのピッチをかえることによって放電々圧を制御できることが国内外の研究によって確認されているところから、陰極降下電圧を制御し、励起機構に影響を及ぼして光色を制御しようと試みるものである。二通りの方法を試みた。一つは従来のツインカソード型レーザーの円筒陰極をヘリカル陰極におきかえたもので、円筒陽極とヘリカル陰極とは、光軸の一致しない偏心構造となっている。他の一つは同軸状に配置したものである。いずれの場合もヘリカルコイルのピッチを変えることにより、ある程度、エンドライトの制御はできたが、レーザー発振光に対する直接変調の実験的成果はまだ得られていない。レーザー発振そのものが得にくい状況にあることと、コイルピッチをレーザー管外部から制御することに難点が残されていることによる。第3の方法である吸熱性電荷転移機構の応用とともに今後継続的に研究を続けてゆく所存である。He-Cd混合気体をレーザ媒質とし、ホローカソード放電をレーザ励起源とすることによって、理想的な三原色レーザ光が得られる。このレーザを用い、例えば気象衛星からのデータにより、天気図のカラーコピーを作製するような場合には、現段階では白色レーザ光をいったん三原色に分け、各原色に対して変調をかけた後、再び合成して感光紙上を走査させる方法がとられている。これに対し、本研究は、時分割方式により、白色光ビームに直接変調をかける新方式を開拓することを目的とするものであり、以下に挙げる諸方式を考案した。(1)パルス電流重畳方式(2)格子制御方式(3)放電モード制御方式(4)ヘルカルホローカソード方式(1)および(2)に関しては59年度で一応の成果が納められたので、本年度は(3)に関する各種パラメーターの具体的な把握を行い、設計基準の明確化を試みると共に(4)に関する予備的検討を行い、61年度に実行すべき諸項目の目安を得た。(3)項に関しては、当初電子エネルギーの異なる阻止放電と通常グロー放電の両者のスイッチングを意図したのであるが、管構造の設計次第では、実際にはプラズマの再結合損失を制御していることに相当することが見いだされた。(2)項の方式に比べて安定性がよく、電源が1台ですむ利点が得られるが、応答速度が遅い欠点を有する。この点の克服が次年度以後の課題といえよう。
再生医療の発展に資する殺菌性ラジカル生成光反応を応用した滅菌技術の構築

細胞緩衝液系においての近紫外線発光ダイオード照射による微生物殺菌能を評価した。積算照射量30 J/cm^<2>において、大腸菌は1/10000、黄色ブドウ球菌は1/1000、酵母は1/100まで減少した。最も高い活性酸素種発生抑制効果を示した抗酸化剤であるモリンを添加し、ヒト皮膚繊維芽細胞と共培養後、近紫外線照射による細胞の比増殖速度に与える影響を調べた。その結果、積算照射量5.0 J/cm^<2>において、モリンの添加は比増殖速度を34%増加させた。平成23年度、ヒト皮膚繊維芽細胞に対して低毒性と考えられるUVAーLED照射条件をMTTアッセイを利用し決定した。しかし、アッセイ系の吸光度にUVA照射が影響することが判明し、本測定法は不適であることが分かった。平成24年度は、トリパンブルー色素排除法によるカウント法で照射毒性を評価することとした。その結果、積算照射量14.7J/cm2の時、24時間培養後の増殖率は23%増(未照射時は107%増)であり、この照射量における細胞増殖率に及ぼすポリフェノールの影響を検討した。ポリフェノールは、レスベラトロール以外にカテキン、エピガロカテキンガレート、ケルセチン、モリンを用い評価した。各ポリフェノール添加濃度は、MTTアッセイ法を利用し決定された細胞生存に影響を与えない最大濃度とした。ポリフェノールあり/なしにおいてのUVA照射毒性評価を行った結果、細胞増殖率および比増殖速度(24時間培養で計算)に有意差はなった。従って、この手法では有用なポリフェノールを選定することはできないと判断し、他の評価方法を再検討した。細胞に添加するポリフェノール濃度は、ROS応答蛍光プローブを用い細胞内ROSを相対評価し、ROSを50%抑制する濃度を決定した。その結果、最も低い濃度を示したモリンを有効なROS阻害剤とした。次に、その濃度で細胞を共培養し、その後、積算照射量を変えてUVA処理し、3日間培養における細胞数計数を実施することにより比増殖速度を算出した。比増殖速度に及ぼすUVA照射量の影響は非常に大きく、積算照射量5.0J/cm2においてもその速度を30%減少させることが分かった。しかしながら、モリンと共培養させたところ6%減少に留まった。従って、モリンと共培養させることにより、UVA感受性が低下したことが示唆され、この現象はモリンによる抗酸化効果に起因するものと考えられた。平成23年度研究実施計画では、まず最初に細胞緩衝液系における微生物滅菌条件を決定することであった。微生物(大腸菌、黄色ブドウ球菌、酵母)をPBSに懸濁し、光源として365nmの光を発するLEDを用い、殺菌曲線を作成した。光源部と菌懸濁液との距離、すなわち照射距離を5cmとした場合、残存生菌数を1万cells/mlから10cells/mlとするために60分間の照射を要した。そこで照射距離を2cmにすると、10cells/ml未満とするためには60分照射を要したが、30分照射における生菌率を5cmの場合より1桁下げることができた。この2cm照射距離条件で、他の微生物についても同様に試験した。その結果、60分照射で黄色ブドウ球菌を10cells/ml、酵母を20cells/mlまで減少させることができた。今回の実験では、初発生菌数を細菌では1万オーダー、酵母では1千オーダーとしたため菌が残存したが、1桁低い初発菌数であれば、十分に30分から60分照射で10cells/ml未満にすることができることが推測された。次に、365nm、照射距離2cmのLED光がどの程度細胞毒性を示すのか検討した。細胞は、ヒト皮膚繊維芽細胞を用い、生細胞率はMTTアッセイにより決定した。その結果、30分照射において生細胞率85%を保持し、60分照射で27%まで減少させることが分かった。従って、LED照射条件は、高い殺菌性と極めて高い毒性を示さなかった照射距離2cm、30分間照射と決定した。生細胞率85%から100%に近づけるための工夫は、抗酸化性化合物分岐型水溶性ポリマーにある。所期の計画通り、水溶性ポリマーの合成が進行中であり、現在、ポリマーと抗酸化性化合物とのリンカーとなるペプチドを合成および精製し、300mg取得したところである。LED照射による殺菌効果と細胞毒性評価については概ね計画通りに進んでいる。遅れている点は、細胞毒性に関しては、LED照射による細胞増殖への影響が検討できていないことである。合成に関しては、水溶性ポリマーの合成の進行が遅れている。ポリマーと抗酸化性化合物のリンカーに用いるペプチドを、精製品として大量に取得する必要があったため、その合成と精製に労力と時間を要した。

現在、300mg精製品として取得できているので、このペプチドを用いポリマー合成にシフトする予定である。1.抗酸化性化合物をレスベラトロールとし、これを水溶性ポリマー主鎖からペプチド鎖で分岐させた所期の計画にあるポリマーを早急に合成する。合成物の物性(分子量測定)は外注により進める。細胞へのこのポリマーの添加が、LED照射における生細胞率をどの程度向上させることができるか検証する。2.上記結果において生細胞率の向上が認められた場合、微生物と細胞が混在した系において微生物殺菌が可能であるかを検証する。水溶性ポリマーを合成するための小型油回転ポンプ(TGK GLDー202B 20万円)、細胞培養規模を拡張するためにCO2インキュベーター(サンヨーMCOー5AC 77万円)と細胞凍結容器(三商41ー0032 18万円)、さらに恒温ヒーター(タイテックSMー05N 8万円)を平成24年度初期に購入する。残金は、水溶性ポリマーの創成におけるポリマー合成に係る試薬、有機溶媒の購入、その物性を測定するための外注費に充てる。そして、細胞培養や微生物培養においては消耗品を多く使用するので、これら費用に予算を充てる。また、既に9月に開催される学会発表(東京)登録をしているので、その参加費、旅費にも充てる。
tRNA擬態タンパク質によるリボソーム普遍機能と生体高次機能の発現機構解明

翻訳終結の触媒中心タンパク質因子であるペプチド鎖解離因子について以下の研究成果公表した。(1)tRNA擬態タンパク質eRF1のコドン識別機能ドメインの解明のため、終止遺伝暗号を普遍遺伝暗号として用いない例が多く見られる繊毛虫類に由来するeRF1ホモログを用いた比較解析を進めた。今回は、近縁種中、普遍遺伝暗表と一致する終始遺伝暗号を持つ事が予想されたLitostomatea属由来のeRF1のクローンを取得し、そのeRF1によるコドン特異性を、既に確立した酵母・ヒト由来因子とのキメラ体構築技術と、新規に開発したin vivo終始コドン効率測定系を応用し実証した。これらの比較機能解析により、従来のコドン認識領域に関する知見の絞り込みが可能になったと同時に、繊毛虫類には、終止コドンについて、普遍遺伝暗号を用いる系統が混在する事実も明らかになった。(2)tRNA擬態タンパク質eRF1と共役し機能するペプチド鎖解離因子eRF3に相互作用することが網羅解析から報告されていた因子群について、その作用機構を系統的解析する遺伝学的実験系の構築を行った。各因子について、機能制御の有無や、互換機能性を検証したところ、正負にそれぞれ機能制御する出芽酵母因子SlaIおよびItt1を同定し、これらの機能制御が未知のタンパク質安定化機構とのカップリングを実現している事を明らかにした。不安定化機構を明らかにする目的で、ユビキチンによるプロテアソームや、オートファジー系の細胞内タンパク質分解機構の阻害剤や変異体株を用いた解析を行い、後者がこの分解に主に関わることを示唆する実験結果を得た。(1)真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3は、tRNA擬態性タンパク質であるペプチド鎖解離因子eRF1と結合することで、協調的に翻訳終結反応を遂行するGTP結合タンパク質であり、かつ一方で翻訳終結効率の制御と、細胞内での様々な生理機構を担う因子群との対応を行うハブとして位置づけられる重要分子である。明らかにしたeRF3のX線結晶構造に基づき、eRF3の機能制御モデルを考案した。このモデルは、真核生物においてペプチド鎖解離因子がハブ分子として様々な生理現象に関わる因子群と高次複合体を形成し高次機能を発揮することを分子レベルで具体的に説明した最初のものである。さらに、このN末端拡張領域の作用モデルについて、この領域に結合する制御因子とeRF3の機能性発現解析を行なった。その結果、リングフインガー様蛋白質Itt1p、および、細胞骨格結合蛋白質Sla1pに関してeRF3の機能性・蛋白質安定性に、それぞれが正負に寄与する因子である事を実証することに成功した。(2)原核生物のモデル生物である大腸菌を用い、tRNA擬態蛋白質である解離因子(RF)の機能性に関与するリボソーム相互作用機能部位の網羅的検索を完了し、それぞれのリボソーム因子に関する解析を行なった。その結果、リボソーム蛋白質L11に関する多角的な検証の結果、L11が原核生物解離因子RF1/RF2のそれぞれに異なった作用をするというこれまでの定説を覆す結果を得た。このことは、tRNA擬態蛋白質RFがその機能性発現のために獲得したtRNA・伸長因子とは異なるリボソーム相互作用プラットホームが存在するという新しい概念につながる。(1)tRNA擬態分子とリボソームの機能性解明:異常なmRNA、もしくは異常な読み枠での翻訳は不良なタンパク質産物の合成につながる。一方で、異常なmRNA翻訳においては、効率のよいコンテクストでの終止コドンが提示されない為に翻訳終結の効率が低下し、リボソームが停止した状態になりがちなことが示されている。これらの知見から、我々は、tmRNAによるタンパク質品質管理機構の発動が、非効率な終止コドンでも起きうることを、大腸菌においてモデル系を作成することで検証した。

その結果、終止コドンで不良タンパク質を合成中のリボソームは、終止コドン部位で停止するとmRNAの切断活性を誘起し分解を促進するとともに、tmRNAの働きにより不良タンパク質の分解を容易にすることを実証し論文公表した。(2)これまでに明らかにしたX線結晶構造に基づき、真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3のN末端領域が様々な相互作用因子群との相互作用を介し機能性を制御するというモデルを提案し検証を進めた。結合因子とeRF3の機能性の相関を評価する新規な活性想定系を構築し検証を行った。その結果、eRF3に結合する因子群のうち、N末端部位に結合する二つのタンパク質、リングフィンガー様蛋白質Itt1p、および、細胞骨格結合蛋白質Sla1pに関してeRF3の機能性・蛋白質安定性に、それぞれが正負に寄与する因子である事を実証することに成功した。本成果は、様々な細胞内mRNAの動態を制御する翻訳終結機能が、細胞内でのタンパク質分解系と共役していることを報告した最初の知見である。翻訳終結の触媒中心タンパク質因子であるペプチド鎖解離因子について以下の研究成果を得,公表した。(1) tRNA擬態タンパク質eRF1のコドン識別機能ドメインの解明のため,終止遺伝暗号を普遍遺伝暗号として用いない例が多く見られる繊毛虫類に由来するeRF1ホモログを用いた比較解析を進めた。今回は,近縁種中,普遍遺伝暗表と一致する終始遺伝暗号を持つ事が予想されたLitostomatea属由来のeRF1のクローンを取得し,そのeRF1によるコドン特異性を,既に確立した酵母,ヒト由来因子とのキメラ体構築技術と,新規に開発したin vivo終始コドン効率測定系を応用し実証した。これらの比較機能解析により,従来のコドン認識領域に関する知見の絞り込みが可能になったと同時に,繊毛虫類には,終止コドンについて,普遍遺伝暗号を用いる系統が混在する事実も明らかになった。(2) tRNA擬態タンパク質eRF1と共役し機能するペプチド鎖解離因子eRF3に相互作用することが網羅解析から報告されていた因子群について,その作用機構を系統的解析する遺伝学的実験系の構築を行った。各因子について,機能制御の有無や,互換機能性を検証したところ,正負にそれぞれ機能制御する出芽酵母因子SlaIおよびItt1を同定し,これらの機能制御が未知のタンパク質安定化機構とのカップリングを実現している事を明らかにした。不安定化機構を明らかにする目的で,ユビキチンによるプロテアソームや,オートファジー系の細胞内タンパク質分解機構の阻害剤や変異体株を用いた解析を行い,後者がこの分解に主に関わることを示唆する実験結果を得た。
細胞膜プロテオーム解析を用いた成人Ｔ細胞性白血病新規治療標的分子の探索

我々はHTLV-1が主に末梢血中のCD4陽性T細胞に感染・潜伏することに着目し、膜表面分子を標的としたATL新規治療法の開発を目的として、CD4陽性T細胞における膜プロテオームプロファイル解析を行った。まず正常(n = 14)、無症候性感染者(n = 21)、ATL患者(n = 13)、HAM/TSP患者(n = 21)より末梢血を採取し、フローサイトメトリーを用いてCD4陽性T細胞を単離した。次に膜プロテオームに焦点を絞るため、これらのサンプルのトリプシン消化物からConA-Lectinアフィニティークロマトグラフィーにより糖ペプチドを濃縮した。サンプルをLTQ-Orbitrap Velosにより解析し、最終的に946糖タンパク質(6,791糖ペプチド、FDR < 0.01)を同定した。これら同定されたペプチド中、Welch検定を用いた2群検定で有意(p < 0.05、fold change>2)にATL患者のCD4陽性T細胞で発現が上昇している、あるいはATL患者のCD4陽性T細胞のみで発現しているペプチドを単離した結果、ATLの治療標的候補として25タンパク質/ 71ペプチドを同定した。これらの25タンパク質のうち8タンパク質は以前にHTLV-1感染によって発現上昇するタンパク質としての報告があり、以上の結果から我々の行った糖ペプチド濃縮を用いた膜プロテオーム解析が新規抗体治療薬の開発を目的とした治療標的分子の探索に効率的に結び付くことが示された。今後残る19タンパク質の中から正常臓器での発現が少なく、治療法開発にあたって副作用の少ないと目される治療標的候補に対しATL細胞株、ATL患者検体を使ったバリデーション実験を進めていく予定である。2年間の研究期間のうち、2年目である本年度では前年度までのスクリーニングで抽出されたATL群で発現上昇している分子のうち、データベース検索の結果正常組織での発現が低い2分子に関して、優先的にスクリーニング結果の定量バリデーション実験及び機能解析を行った。2分子のうちgrowth-regulatory adhesion molecule (GRAM)に関してはT細胞受容体の下流シグナル経路を介したT細胞活性化制御に関与すること、Ecto-nucleotidase 1に関しては細胞外の核酸を分解する事が機能的に報告されている。ATL検体8例、健常者7例より末梢血単核球をFicollを用いて単離し、各治療標的候補分子に対する特異的抗体を用いた蛍光染色を行い、Flow cytometryによる小規模なバリデーション実験を実施した。その結果、両分子ともに末梢血CD4陽性T細胞における発現が、ATL患者群、特に急性型ないし慢性型で上昇していることが確認された。また、GRAM強陽性を示すCD4陽性細胞を多く保持しているHTLV-1感染者の末梢血CD4陽性T細胞から、GRAM陽性及び陰性細胞を単離し、各サブポピュレーションに含まれるウイルス量を測定した。その結果、GRAM-CD4+T細胞と比較してGRAM+CD4+T細胞でウイルス量が顕著に高いことが確認された。これらのことからGRAMが感染細胞特異的に発現しており、ATLの有望な治療標的になり得ると考えられる。今後抗GRAM抗体によるADCC活性の誘導を通じたATL治療の模擬実験等を行うとともに、ATL以外のHTLV-1関連疾患であるHAM/TSPなどにおいても同様にGRAMが治療標的となりうるか検証していく。プロテオミクス本研究は抗体治療などに用いる治療標的の同定を研究期間内の最終目的としており、年度内には患者検体のスクリーニングによる治療標的候補タンパク質の同定まで終える予定であった。現在、バリデーション実験をすでに開始しており、すでに特に有望な1候補タンパク質に対する定量解析を行うための系の樹立を終え、JSPFADから提供されたATL、キャリア検体を用いたバリデーション実験を開始する段階にある。これらのことから当初予定していた研究予定より早いペースで研究が進行していると考えられる。進行中のバリデーション実験に加え、上記プロテオーム解析で同定された残りの治療標的分子候補に対する100症例規模のバリデーション実験を行う。具体的には抗体作製、及びそれを用いたFlow cytometryを用いた定量系、また抗体作成が困難な分子に対しては質量分析を用いた定量法であるMultiple Reaction Monitoring(MRM)法による定量系を確立し、全候補タンパク質に対してバリデーション系を確立する。最終的に正常組織における発現や、治療標的分子候補に対して作成した抗体を基にADCC活性、CDC活性を計測し、ATLに対する治療用抗体の実用化が最も期待される候補分子群を15個選別する。
イネ無胚乳変異体の解析による多核胚乳形成機構の解明

多くの被子植物の種子形成過程では、重複受精によって生じた胚乳原核は細胞質分裂を経ない核分裂により多核胚乳形成する。イネでは数千個の核をもつ多核胚乳が形成される。このようなイネ胚乳初期発生の制御メカニズムに関する知見を深めるために、成熟種子においては胚乳組織が欠損しているイネの無胚乳変異体enl2の解析を進めた。その結果enl2変異体は多核胚乳期おける染色体分離や核の離散に異常を示すことが明らかになった。さらに変異の原因遺伝子候補を次世代シーケンサで同定したところ、クラミドモナス等の生物で核膜融合や減数分裂にも機能するとされるタンパク質に類似したタンパク質をコードする遺伝子が浮かび上がった。人類の主要な栄養源である種子胚乳は、極めて特異な様式で発生する。重複受精によって生じた3nの核相をもつ胚乳原核は、細胞質分裂を伴わずに分裂を続け、多核体を経て胚乳組織が形成される点である。しかし、胚乳初期発生、特に多核胚乳の形成に関しては、組織学的・細胞学的知見がある一方、その制御に関わる遺伝学・分子遺伝学的知見は極めて希薄である。本研究は、胚乳初期発生に異常を持つイネ無胚乳変異体の解析を通して胚乳初期発生の制御機構に関する知見を深化させることを目的とする。本年度は、解析対象とした新奇無胚乳変異体のうち、endospermless2 (enl2)について重点的に解析を進めた。変異体と野生型コシヒカリの交配から得られたF2実生について、日本晴-コシヒカリ間多型マーカーを用いたマッピングを行った結果、ENL2は、第4染色体長腕、テロメア近くの15kbの領域に存在することが推定された。この領域には2つの発現遺伝子と1つの予測遺伝子が存在したが、その転写領域には変異部位は見つからなかった。受粉後の子房を固定後PI染色し、共焦点レーザー顕微鏡によりホールマウント観察を行った。enl2が巨大な胚乳核を形成することは計画準備段階で示されていたが、さらに詳細な検討を行った。野生型のシンシチウム胚乳では核が中央細胞の内周に沿って規則正しく並ぶが、enl2ではより少ない数の巨大核が偏在して観察され、分裂期には、染色体数増加が観察された。したがって、enl2の無胚乳の原因は、核の分裂の異常にあると考えられた。また、反足細胞の核にも異常が観察された。野生型には、小さめの核が散在する多核の反足細胞がみとめられたが、enl2ではこれらの核が凝集あるいは融合している様子が観察された。このことから、ENL2は、胚乳にとどまらず、他の多核細胞における核分裂においても重要な働きをしていることが推定された。しかし、イネの胚乳初期発生に関しては、組織・細胞学的知見がある一方、その制御に関わる遺伝学・分子遺伝学的知見は極めて少ない。当初計画のenl3変異体の解析を昨年度断念した代わりに新規に同定したenl7変異体の解析を進めた。enl7の種子は、殆ど胚乳が発達しないレベルから、表面にはしわや凹凸、くびれなどの外見上の異常を示すがある程度の発達を示すものまで異常の程度に大きな幅を示す。本年度は共焦点レーザー顕微鏡観察を中心とした解析を行った。比較的よく発達する変異体種子でも、胚乳細胞数は顕著に減少していが、特に発達の程度が悪い種子では、発生初期(野生型で3-4DAFの段階)以降の細胞分裂が停止し、細胞の肥大と細胞死が起きていた。よって変異体では胚乳発生初期の細胞分裂の速度低下や停止が起こっていると考えられた。比較的発達のよい10 DAFおよび乾燥種子のenl7胚乳外層ではアリューロン(AL)様細胞の層数の増加や細胞分裂面の乱れが観察されるとともに高度に液胞化した細胞や細胞死を起こした細胞が、分化したデンプン性胚乳(SE)細胞との間に観察され、外層での分裂能を持ったSE前駆細胞形成が進まず、液胞化や細胞死、あるいは複数層のAL様細胞形成が起こっているものと推測された。ENL7は胚乳外層における細胞の分裂・分化に重要な働きをする遺伝子であると予測され、ENL7の分子的同定によりイネ胚乳発生初期における細胞分裂・分化の制御機構に関する有益な知見が得られることが期待される。本年度は、無胚乳変異体enl2の解析を重点的に進めた。

これまで解析を進めたenl1と同様に、enl2の多核胚乳も巨大な核を形成することがこれまでに明らかにされている。共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察の結果、野生型では胚乳原核の最初の分裂直後における2つの娘核の明瞭な分離時期において、変異体では両娘核が極めて近接あるいは融合している様子がみとめられた。それ以降では核のサイズが野生型より大きいものがみとめられ、さらに核小体の数やサイズが大きくなった不定形な巨大核が観察されるようになった。分裂期の核おいては染色体分離異常も観察された。enl2の原因遺伝子をマッピングと次世代シーケンサーにより同定した結果、保存度は高く無いもの、真核生物の様々な生物種にそのオルソログが見つかり、接合における核膜融合や減数分裂にも機能するとされているタンパク質をコードすることがわかった。変異体の表現型を考えるとENL2もそれらに関連した機能をもつことが予想される。27年度夏期の気候不順のため胚乳のステージングに若干の不安が残った。形質転換によるenl2原因遺伝子の最終証明が完了しなかった。人類の主要な栄養源である種子胚乳は、極めて特異な様式で発生する。重複受精によって生じた3nの核相をもつ胚乳原核は、細胞質分裂を伴わずに分裂を続け、多核体を経て胚乳組織が形成される点である。しかし、イネの胚乳初期発生に関しては、組織・細胞学的知見がある一方、その制御に関わる遺伝学・分子遺伝学的知見は極めて少ない。本研究は、胚乳初期発生に異常を持つイネ無胚乳変異体の解析を通して胚乳初期発生の制御機構に関する知見を深化させることを目的とする。イネ無胚乳変異体enl2は、以前に報告したenl1と同様に、多核胚乳期に巨大な核を形成する。本年度は、まず、無胚乳変異体enl2の表現型についてこれまでの観察結果の検証を行った。そして胚乳原核の分裂後の娘核の分離に異常があること、染色体分離にも異常があることなどの点を確認した。このような異常は、enl2原因遺伝子候補の他生物におけるオルソログが、接合における核膜融合や減数分裂にも機能するとされているタンパク質をコードすることに関連すると考えられた。また、昨年度までにNGSを用いた解析により同定したenl2変異原因遺伝子候補の最終確定を行う実験も進めた。CRISPR/CAS法を用いてenl2機能喪失アレルを作製し、T1種子の観察したところ、胚乳異常の分離は認められたもののenl2表現型とは必ずしも同一ではなかった。enl2原因遺伝子候補における変異はアミノ酸置換であることを考えると、enl2の胚乳表現型はその変異の機能獲得的性質によるものかもしれない。enl2原因遺伝子確定のために、野生型ゲノム断片導入による相補実験も追加して進めたが、表現型を確認できるまでに至っていない。多くの被子植物の種子形成過程では、重複受精によって生じた胚乳原核は細胞質分裂を経ない核分裂により多核胚乳形成する。イネでは数千個の核をもつ多核胚乳が形成される。このようなイネ胚乳初期発生の制御メカニズムに関する知見を深めるために、成熟種子においては胚乳組織が欠損しているイネの無胚乳変異体enl2の解析を進めた。その結果enl2変異体は多核胚乳期おける染色体分離や核の離散に異常を示すことが明らかになった。さらに変異の原因遺伝子候補を次世代シーケンサで同定したところ、クラミドモナス等の生物で核膜融合や減数分裂にも機能するとされるタンパク質に類似したタンパク質をコードする遺伝子が浮かび上がった。enl3変異体の解析は断念せざるを得なかったが、新規に同定したenl7変異体の解析が進んだ。
ポリアスパルテートα-ヘリックスに特異的ならせんセンスの反転機構の解明

ポリアスパルテート-[-NH-CH-(CH2C(O)OR)CO-]-は、側鎖Rの構造に依存して右巻き、または、左巻きのらせんをとることが知られている。我々は、最近、ポリ(β-フェネチルL-アスパルテート)(PPLA)が、テトラクロロエタン(TCE)中で温度の昇降により、α-ヘリックスの右巻き左巻きの鋭い一次転移を示すことを見い出した。本研究では、まず主として液晶配向下で、^2H-NMR-回転異性状態(RIS)解析法により右巻きと左巻き状態のそれぞれについて側鎖コンホメーションを決定し、ヘリックス-ヘリックス転移について分子論的に検討した。^2H-NMR/RIS測定の結果から、側鎖根元x1のコンホメーションが右巻きと左巻き状態で顕著に異なり、右巻きではトランス、左巻きではゴ-シュ分率が高いことが明らかになった。両ヘリックス状態において側鎖根元のx_1x_2結合は、ヘリックス軸に垂直に伸びたコンホメーションをとる傾向を示している。このことは希薄溶液の二次元DQF-COSY・NMR測定によっても確認した。さらに、別のアプローチとして分子動力学(MD)シミュレーションを行って、側鎖コンホメーションを調べ、^2H-NMR/RISの解析結果と比較した。MDシミュレーションの結果は、良好に実験値を再現した。^2H-NMR/RIS解析とMDシミュレーションの結果から、側鎖根元の結合がヘリックス-ヘリックス転移に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。これまでの研究成果は、すでに第43回高分子年次大会、高分子討論会、第5回IPCにおいて発表し、また、論文〃Conformational Analysis of α-Helical Polypeptides in Two Opposite Screw Forms: A Combined of ^2H NMR and MD Simulation〃としてPolym.J.に投稿し審査中である。
交通計画におけるパネル調査の方法論およびパネルデータ解析手法に関する研究

同一の個体に対して,複数時間断面に渡ってデータを収集するパネル調査によるパネルデータには,非常に豊富な情報が含まれている.この情報の豊富さ故に,パネル調査,分析の必要性が,より大きなものとなっているものと考えられる.特に,断面データを用いた個人間の「違い」に基づいて構築した行動モデルが,各個人の行動の「変化」を表現しているという保証が無いことを考えると,変化情報を含んだパネルデータに基づいた行動モデルこそが,的確に政策評価を行いえるものであるとも言えるであろう.ところが,パネル調査,パネル分析には,母集団の代表性の問題,あるいは,適切な調査設計技法と分析技法の開発など,様々な課題が残されているのも事実である.したがって,現実の交通計画の現場にパネル調査,パネル分析を反映させて行くには,それらの課題を一つ一つ克服していくことが必要である.本研究は,これらの認識に基づいて,パネル調査,分析の有効性を認識しつつ,現実の交通計画に反映させることを最終的な目標として,種々な観点から検討を加えたものである.本研究グループでは,研究期間内に土木計画学研究発表会においてスペシャルセッションを二度,開催した(1996年の第19回土木計画学研究発表会,1997年の第20回土木計画学研究発表会).これらのスペシャルセッションでは,本科研研究グループが中心となって,パネル調査,分析だけでなく,交通調査,交通計画全般に及ぶ広い範囲にわたっての議論を行った.ここでは,本科研の各々の分担者からの話題提供だけでなく,行政やコンサルタントなどの交通計画の現場で交通調査に携わっておられる方々にも出席して頂き,交通計画の現場でどのような調査と分析が必要とされているのか,そして,パネル調査を現場に反映させることは可能であるのか,といった点についても議論した.また,各研究グループでは,パネルデータを用いた連続時間上の動的行動モデルや非観測異質性を考慮した行動モデル,アトリションバイアスを考慮した行動モデルなどの開発や,時系列変化についての動的分析,何らかの政策や震災による影響を分析した事前事後分析等がおこなわれた.同一の個体に対して,複数時間断面に渡ってデータを収集するパネル調査によるパネルデータには,非常に豊富な情報が含まれている.この情報の豊富さ故に,パネル調査,分析の必要性が,より大きなものとなっているものと考えられる.特に,断面データを用いた個人間の「違い」に基づいて構築した行動モデルが,各個人の行動の「変化」を表現しているという保証が無いことを考えると,変化情報を含んだパネルデータに基づいた行動モデルこそが,的確に政策評価を行いえるものであるとも言えるであろう.ところが,パネル調査,パネル分析には,母集団の代表性の問題,あるいは,適切な調査設計技法と分析技法の開発など,様々な課題が残されているのも事実である.したがって,現実の交通計画の現場にパネル調査,パネル分析を反映させて行くには,それらの課題を一つ一つ克服していくことが必要である.本研究は,これらの認識に基づいて,パネル調査,分析の有効性を認識しつつ,現実の交通計画に反映させることを最終的な目標として,種々な観点から検討を加えたものである.本研究グループでは,研究期間内に土木計画学研究発表会においてスペシャルセッションを二度,開催した(1996年の第19回土木計画学研究発表会,1997年の第20回土木計画学研究発表会).これらのスペシャルセッションでは,本科研研究グループが中心となって,パネル調査,分析だけでなく,交通調査,交通計画全般に及ぶ広い範囲にわたっての議論を行った.ここでは,本科研の各々の分担者からの話題提供だけでなく,行政やコンサルタントなどの交通計画の現場で交通調査に携わっておられる方々にも出席して頂き,交通計画の現場でどのような調査と分析が必要とされているのか,そして,パネル調査を現場に反映させることは可能であるのか,といった点についても議論した.また,各研究グループでは,パネルデータを用いた連続時間上の動的行動モデルや非観測異質性を考慮した行動モデル,アトリションバイアスを考慮した行動モデルなどの開発や,時系列変化についての動的分析,何らかの政策や震災による影響を分析した事前事後分析等がおこなわれた.現在,交通計画を実施する際に必要となる調査技法として,同一の固体に対して,複数時間断面に渡ってデータを収集するパネル調査が着目されている.パネルデータに基づいた交通行動に関する分析では,個人の交通行動の動的な分析が可能であることが大きな特徴である.したがって,動的モデルを用いた将来予測による予測精度の向上が期待される.また,パネルデータは,断面調査よりも情報量が豊富であることも特徴として挙げられる.しかし,パネル調査,およびパネルデータに基づいた分析には,WAVEを重ねる毎に被験者が脱落していくパネル消耗に伴う重み付けの問題や,パネル調査を複数回実行することで,被験者に影響を与えその結果データにバイアスが生じるという問題,パネル調査を複数回実行することで,被験者が回答に疲労し,その結果,データにバイアスが生じるという問題(Panel Fatigue),WAVE間の期間をどの様に設定するか,費用が制約されている場合のサンプルサイズと調査回数の最適な組み合わせはどの程度か,等様々な問題が指摘されている.本年度では,これらの問題点に対処すべく,マスポイント法を用いたPanel Fatigue等を含む非観測異質性の考慮,初期サンプルと母集団との相違を補整する方法の提案,および,時間軸上での交通行動の遷移過程を考慮することで適切なパネル間隔の設定法の提案,等を行った.

それに加えて,買い物行動を対象としたパネルデータに基づく分析を行いうことでパネル分析の有効性を示すと共に,地域を一固体と見做した集計パネルデータを用いた分析の有効性も示された.同一の個体に対して,複数時間断面に渡ってデータを収集するパネル調査によるパネルデータには,非常に豊富な情報が含まれている.この情報の豊富さ故に,パネル調査,分析の必要性が,より大きなものとなっていると考えられる.特に,断面データを用いた個人間の「違い」に基づいて構築した行動モデルが,各個人の行動の「変化」を表現しているという保証が無いことを考えると,変化情報を含んだパネルデータに基づいた行動モデルこそが,的確に政策評価を行いえるものであるとも言えるであろう.ところが,パネル調査,パネル分析には,母集団の代表性の問題,あるいは,適切な調査設計技法と分析ぎほうの開発など,様々な課題が残されているのも事実である.したがって,現実の交通計画の現場にパネル調査,パネル分析を反映させて行くには,それらの課題を一つ一つ克服していくことが必要である.本研究は,これらの認識に基づいて,パネル調査,分析の有効性を認識しつつ,現実の交通計画に反映させることを最終的な目標として,種々な観点から検討を加えたものである.本研究グループでは,研究期間内に土木計画学研究発表会においてスペシャルセッションを二度,開催した(1996年の第19回土木計画学研究発表会,1997年の第20回土木計画学研究発表会).これらのスペシャルセッションでは,本科研研究グループが中心となって,パネル調査,分析だけでなく,交通調査,交通計画全般に及ぶ広い範囲にわたっての議論を行った.ここでは,本科研の各々の分担者からの話題提供だけでなく,行政やコンサルタントなどの交通計画の現場で交通調査に携わっておられる方々にも出席して頂き,交通計画の現場でどのような調査と分析が必要とされているか,そして,パネル調査を現場に反映させることは可能であるのか,といった点についても議論した.また,各研究グループでは,パネルデータを用いた連続時間上の動的行動モデルや非観測異質性を考慮した行動モデル,アトリションバイアスを考慮した行動モデルなどの開発や,時系列変化についての動的分析,何らかの政策や震災による影響を分析した事前事後分析等がおこなわれた.
看護基礎教育から継続教育にわたる手指衛生改善のための標準的支援プログラムの構築

本研究の目的は,看護基礎教育から継続教育まで活用できる手指衛生の改善のための標準的支援プログラムを構築することである.看護基礎教育では,簡易細菌検査,蛍光色素法,ATP拭き取り検査,ポートフォリオを活用したプログラムを実施した.継続教育においても,ポートフォリオを除く同様のプログラムを実施した.その結果,受講者の手指衛生に関する知識や認識の向上,手指衛生行動の改善がみられ,本プログラムの有効性が示唆された.医療関連感染防止のために,すべての医療従事者が感染予防行動を身につけることは重要な課題である.本研究の目的は,看護基礎教育から継続教育まで活用できる手指衛生の改善のための標準的支援プログラムを構築することである.今年度は,学士課程2年生及び3年生,継続教育として単科精神科病院の看護師への手指衛生に関する教育的介入と評価を行った.研究時期は2012年4月2013年3月,学士課程2年生には,2011年の2年生へのプログラムと同様に,看護技術関連科目「治療援助論」における,簡易細菌検査法及び蛍光色素法を用いた手指衛生の演習,看護技術演習(注射,導尿等)毎の感染予防行動の自己評価,総合評価等を記録するポートフォリオの活用,臨地実習前のATP拭き取り検査法を用いた手洗い演習を行った.学士課程3年生には,2011年の3年生へのプログラムと同様に,看護学の統合と発展科目「看護マネジメント論」において,蛍光色素法を用いた手袋の外し方と,手指衛生の必要な5つの場面について演習を行った.また,学士課程4年生に対して,学士課程における手指衛生に関する総合評価を行った.看護師に対しては,簡易細菌検査法を用いた手指衛生の研修を行った.これにより,看護師は手指衛生が重要であるという思いを強化し,患者に接する前や患者周囲の環境に触れた後の手指衛生の必要性を認識していた.以上から,これらの教育的介入は,学士課程看護学生,看護師の手指衛生の改善に有効であることが示唆された.医療関連感染防止のために,すべての医療従事者が感染予防行動を遵守することは重要な課題である.本研究の目的は,看護基礎教育から継続教育まで活用できる手指衛生の改善のための標準的支援プログラムを構築することである.最終年度となる今年度は,看護基礎教育の対象を学士課程1年生からとし,2年生へも引き続き手指衛生に関する教育的介入と評価を行った他,4年生への継続的な評価を実施した.また,これまでに実施した看護基礎教育における継続的な感染予防教育の効果,及び継続教育における教育的介入の有効性について学会発表を行った.研究時期は2013年4月2014年3月,学士課程2年生には,従来通り,看護技術関連科目「治療援助論」において,感染予防に関する講義及び簡易細菌検査法と蛍光色素法を用いた手指衛生の演習を行い,看護技術演習(注射,導尿等)毎の感染予防行動の自己評価,総合評価等を記録するポートフォリオを導入した.さらに,臨地実習前にATP拭き取り検査法を用いて手洗い演習を行った.そして1年生には,2年生の内容の早期教育を試みた.学会発表では,学士課程看護学生への継続的な感染予防教育の効果として,手指衛生についての思いがそれぞれの介入毎に望ましいものへと改善されていたことを報告した.また,看護継続教育では,教育的介入後に,石けんや手指消毒剤の使用量が増加したことを報告した.研究期間全体の評価として,簡易細菌検査,蛍光色素法,近年「手洗い」の客観的評価ツールとして用いられているアデノシン三リン酸(ATP)拭き取り検査,ポートフォリオを活用した手指衛生改善のための標準的支援プログラムは,看護基礎教育や継続教育において有効であることが示唆された.本研究の目的は,看護基礎教育から継続教育まで活用できる手指衛生の改善のための標準的支援プログラムを構築することである.看護基礎教育では,簡易細菌検査,蛍光色素法,ATP拭き取り検査,ポートフォリオを活用したプログラムを実施した.継続教育においても,ポートフォリオを除く同様のプログラムを実施した.その結果,受講者の手指衛生に関する知識や認識の向上,手指衛生行動の改善がみられ,本プログラムの有効性が示唆された.医療関連感染防止のために,すべての医療従事者が感染予防行動を身につけることは重要な課題である.本研究の目的は,看護基礎教育から継続教育まで活用できる手指衛生の改善のための標準的支援プログラムを構築することである.今年度は,学士課程2年生及び3年生,継続教育として単科精神科病院の看護師への手指衛生に関する教育的介入と評価を行った.研究時期は2011年4月2012年3月,学士課程2年生には,看護技術関連科目「治療援助論」において,簡易細菌検査法及び蛍光色素法を用いた手指衛生の演習を行った.また,看護技術演習(注射,導尿等)毎の感染予防行動の自己評価,総合評価等を記録するポートフォリオを導入した.さらに,臨地実習前にATP拭き取り検査法を用いて手洗い演習を行った.ポートフォリオの活用により,学生は感染予防行動が重要だとする思いを強め,手指衛生や防護具着用に関する知識を強化していた.また,ATP拭き取り検査法の導入は,手指の汚染状況を確認する機会となり,手指衛生の重要性を再認識し臨地実習中の手指衛生の実践につながっていた.学士課程3年生には,看護学の統合と発展科目「看護マネジメント論」において,蛍光色素法を用いた手袋の外し方と,手指衛生の必要な5つの場面について演習を行った.これにより,学生は,手袋を外した後の手指衛生の必要性及び患者エリア内での手指衛生の必要性への思いを強化していた.