hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運航ナレッジマネジメントに基づく災害時の革新的船舶避難方法

安全航行を優先するシナリオとしているため、航路交差部で減速によるいわゆる渋滞現象(混雑)が見られるケースもあるが、総じて安全に避難できることが実時間視界再現装置付き操船シミュレーターで確認できた。本研究では、様々な想定津波に対して柔軟に対応できる船舶避難アルゴリズムを作成するとともにその適用性を検討することとした。まず、津波来襲時の船舶の対処方法にかかる既往の資料調査などにより、津波来襲時の避難シナリオの要素条件を整理した。次に避難シナリオとして、避難時の混雑、心的ストレス、船舶の接触や衝突などの二次災害が津波による船舶への一時被害より大きくなることを避けるため、通常の船舶の航行状態を倣ったシナリオをベースとした。さらに津波来襲時の自動避難シミュレーションを行った結果、総じて安全に避難できることが確認できた。(1)アンケート内容の検討と実施:津波などの海にかかる災害が起こったときの対応方法を決めるにための素データとなるアンケート調査方法について聞き取り結果も参考にアンケート手法の検討を行う。次にアンケートを海事関係者の協力も得て実施する。なお構築するデータベースに多様性を持たせることもできるだけ広くこのアンケート調査を実施する。(2)避難シナリオの検討と評価:船舶が避難行動を取るときの選択肢の選定とその基準について、聞き取り調査やアンケート調査に基づき、環境条件などと関連づけて、災害規模・形態と取るべき避難パターンを絞り込む。またアンケート結果を解析して構築されたデータベースから、船舶の刻々の避難行動の危険度を導出する手法を検討する。これは災害時の避難行動にかかる安全性を評価する危険度にかかる項目を融合したものとする。次に)避難シナリオの評価:「避難シナリオの評価方法」の手順にしたがい、個々の船舶ごとに避難時の安全性指数を導出する。これを、想定避難海域、想定避難時間の範囲で集計し統計解析を行い、シナリオごとの安全度や適否の判定を行う。(3)レジリエント評価:各船舶の避難シナリオごとの評価集計について、避難シナリオなど選択肢の変更を繰り返す手法を援用し、最も危険度低い、換言するとなんらかの被害を被ってもその損失が低く、もとの社会基盤にもどりやすい、すなわちレジリエントな避難手法の探索を行う。(4)総合評価:前項「レジリエント評価」の結果を踏まえ、さらにナレッジデータベース自動アクセスの簡便性、処理に要する計算時間なども総合的に勘案し、このマリンハザードナレッジマネジメントを具体的なシステムとして実現するために解決すべき課題と方法について纏める。(1)アンケート内容の検討と実施;津波などの沿岸や港湾にかかる自然災害が発生した場合の操船者がとる対応方法を、知識ベース集約から援用するための手法開発に必要案アンケートなど事務担当者への調査方法・記載方法などの確認を行う。港湾や船種によって対応方法も多様化することが分かってきており、アンケートはきめ細かな対応と分析だ必要であるので、これらに留意した方法をとる予定である。(2)避難シナリオの検討と評価:
網膜神経回路網の研究

網膜内には各種の神経伝達物質あるいは神経活性物質が分布することが明かとなっている。我々は従来から免疫組織化学法を用いこれら各種の神経活性物質の網膜内分布を中心として検討してきた。現在までレセプタ-の精製が困難であったためにその組織内局在、それを含有する細胞の形態学的特徴を調べることは不可能であった。しかし、神経伝達物質の効果はそれを受容するレセプタ-蛋白に結合してはじめて発揮される。従ってレセプタ-の局在の検討は網膜視覚伝達機構の解明のために不可欠なものである。しかし、近年βアドレナ-ジックレセプタ-の構造が決定され、その抗体が作成されるようになり、免疫組織あるいは免疫化学的な応用が可能となってきた。今回は免疫組織化学法を用い網膜において重要な役割を有していると考えられるβアドレナ-ジックレセプタ-の網膜内分布を中心として検討した。チロシンハイドロキシレ-ス抗体とβ2ーアドレナ-ジックレセプタ-抗体を用いて網膜の免疫組織化学を試みた結果、大型アマクリン細胞はチロシンハイドロキシレ-スおよびアドレナ-ジックレセプタ-両方を含有していた。この知見はド-パミン含有アマクリン細胞とアドレナ-ジックアマクリン細胞との連関を示す。一方、ド-パミン含有アマクリン細胞はまたヴィタミンーD依存性のカルシウム結合蛋白質(カルビンディン、27000kDa)様免疫反応性をも有していた。このことからカルビンディンが網膜ド-パミナ-ジックニュ-ロンのプレシナプティック機能に重要な役割を果たしているものと推察された。私たちは、今まで主としてヒヨコ網膜を材料として各種神経伝達物質の局在を光学顕微鏡ならびに電子顕微鏡を用いて証明してきた。その際用いた手法は神経伝達物質あるいはその合成酵素に対する抗体による免疫組織化学法によった。この手法により明かにされることは、その物質が網膜のどの細胞に存在するか、あるいはその物質的で生成されるかである。神経伝達物質の効果はレセプタ-の局在の検討は、網膜視覚伝達機構解明のため不可欠なものである。現在までレセプタ-の精製が困難であったため、その形態学的局在を正確に把握することは不可能であった。しかし、近年βアドレノレセプタ-の構造が決定され、それを抗原とした抗体の作成が可能となり、その形態学的応用1.実際に作用が発現する神経細胞あるいは受容器の局在を知る(光学顕微鏡ならびに電子顕微鏡的に)。2.神経伝達物質を放出していると考えられるとその作用が発現するレセプタ-との関係を知る(二重染色法による)。などの道が開かれた。今回の研究目的はこの抗βアドレノレセプタ-抗体を用い、網膜におけるβアドレノレセプタ-の局在を明らかにすることにある。βアドレナリンレセプタ-抗体により、ラット網膜アマクリン細胞に豊富な陽性細胞を認めた。連続する2枚のsemithirsectionによりこの陽性細胞がチロシンハイドロキシレ-スをも同時に含有することを示した。この結果はド-パミン性アマクリン細胞がアドレナリン性アマクリン細胞よりのinputを受容することを示す。また、今回はビタミンD依存性カルシウム結合蛋白質ーカルビンディン様免疫反応を試みた所、ド-パミン細胞が同時にカルビンディンを含有することが明らかとなった。このことはド-パミン性アマクリン細胞にカルビンディンが後シナプス機能になんらかの役割を果たしていることが示唆された。

従ってレセプタ-の局在の検討は網膜視覚伝達機構の解明のために不可欠なものである。しかし、近年βアドレナ-ジックレセプタ-の構造が決定され、その抗体が作成されるようになり、免疫組織あるいは免疫化学的な応用が可能となってきた。今回は免疫組織化学法を用い網膜において重要な役割を有していると考えられるβアドレナ-ジックレセプタ-の網膜内分布を中心として検討した。チロシンハイドロキシレ-ス抗体とβ2ーアドレナ-ジックレセプタ-抗体を用いて網膜の免疫組織化学を試みた結果、大型アマクリン細胞はチロシンハイドロキシレ-スおよびアドレナ-ジックレセプタ-両方を含有していた。この知見はド-パミン含有アマクリン細胞とアドレナ-ジックアマクリン細胞との連関を示す。一方、ド-パミン含有アマクリン細胞はまたヴィタミンーD依存性のカルシウム結合蛋白質(カルビンディン、27000kDa)様免疫反応性をも有していた。このことからカルビディンが網膜ド-パミナ-ジックニュ-ロンのプレシナプティック機能に重要な役割を果たしているものと推察された。
多形性腺腫の軟骨形成におけるフィブロネクチンの役割

多形性腺腫は、口腔内においてもっとも多く見られる唾液腺腫瘍であり、大きな特徴として軟骨の形成を認める。しかし、その形成機序および病態については明らかでない点が多い。軟骨組織の形成には多数の基質蛋白質あるいは細胞の分化、増殖因子が存在するが、その中で主なものはコラーゲンやフィブロネクチンであり、中でも軟骨、骨組織にはコラーゲンタイプI、II、IV、XおよびXIの関与が知られている。これまでわれわれは、病理組織学的に多形性腺腫と診断された標本を用いて、軟骨様組織が認められた症例についてコラーゲンタイプI、II、Xの局在を検索し、それぞれのコラーゲンが多形性腺腫の組織内に存在することを明らかにした。またこれらのコラーゲンは軟骨細胞様細胞の分化とともに発現が変化し、それが軟骨の石灰化あるいは骨化に深く関与していることが推測された。一方、フィブロネクチンは細胞の分化、増殖さらにコラーゲンと細胞との接着に関与しているといわれている。今回は、コラーゲンとフィブロネクチンとの関与について蛍光抗体法を用い検討した。フィブロネクチンとコラーゲンタイプIの染色部位はほぼ同じであった。しかし標本をヒアルロニダ-セ処理するとコラーゲンタイプIIの染色部位にほぼ同じであった。これらのことは、フィブロネクチンが、前駆軟骨細胞の性質を持つ細胞、間質に認められたが前石灰化、石灰化部位には認められなかった。しかし、ヒアルロニダーゼ処理すると、この部位にも存在が確認できた。以上のことより、フィブロネクチンは、様々な分化過程においてその発現状態が変化することがわかった。
農村地域における社会企業活動の国際比較-アジア諸国を中心にして-

農村開発や地域の振興は社会状況に対する不満(Strain)から引き起こされるが、貧しい生活に対する人々の不満だけで社会企業活動が始まるわけではないことも明らかになっている。社会的課題のプロセスは意識・問題との対話・解決案の創造・評価という4つの段階で捉えることができる。課題を解決していく中、起業活動は、農村地域の住民(女性とか)の地域コミュニティー運営参加への内発的動機づけを高めるという傾向が見て取れた。また、コミュニティーにおける創業活動の拡散を促進するうえで,模倣が重要な役割を果たした。平成22年度では、本研究参加者は組織学習、社会問題解決のプロセス、社会運動論、社会ネットワーク論などの基礎理論に依拠しながら、これまでの理論を展開し、それぞれフィールドでもっているケースをより詳細に調査し、分析していくことにより、理論をさらに発展させた。例えば、組織学習の視点で、本研究は主に岩手県、宮城県の中山間地域における3件の農村女性起業を対象とした調査の分析を行なった。本調査の分析から、農村女性起業の社会的意義と持続可能性を探るうえで、組織学習の観点がきわめて重要であることが示唆された。また、社会ネットワーク論では、中国温州市の農村地域における創業活動の活発化現象の考察を行い、地域のソーシャル・キャピタルのバランスを達成することの重要性を認識してきた。さらに、内部メンバーのブローカー役に注目し、ソーシャル・キャピタルのバランスを達成するための方法とプロセスについての認識を深めた。社会運動論では、本研究参加者は4つの事例(日本では大分県大山町、宮城県内の上品の郷の道の駅、タイではBangplub村のザボン&グリーン・ツーリズム運動とwat-taptimdang村の唐辛子ペーストの女性運動)をさらに調査し、分析結果に基づいて、今後タイや他の東南アジアの国々に採用できるモデルを構築した。また、多様な臨床設定(clinical setting)への応用を目的とし、人間の日常生活における課題解決を研究するという『人間の問題解決の理論(Theory of Human Problem Solving)』理論の研究蓄積が社会企業活動研究における社会問題解決のプロセスの解明に多くの示唆を与えてくれる。Theory of Human ProblemSolvingは、人間が自らの課題を解決していくプロセスを意識・問題との対話・解決案の創造・評価という4つの段階で捉えている。人間の問題解決の理論で研究蓄積がされている課題解決のプロセスの理論は社会企業活動の課題解決のプロセスとして応用し、その理論を社会企業活動の研究で発展させていくことができると考えられる。平成23年度では、ケースの比較、また、ケース自体をもう少し違う環境・分野に転換・応用する時に、どういうことが起こりそうなのか、という分野を拡大し、分析を深めることができた。例えば、社会企業活動のスケーリングの論点に関しては、組織学習の視点では、中山間地域における農村女性起業の担い手と既存の地域コミュニティとの間の相互作用の実態を分析した結果として、農村女性起業は、既存の地域コミュニティ運営の潜在的担い手ともいえる女性に対して内発的動機づけを促進する機能を持つことが示された。他方、地域の住民を巻き込んでいる社会企業活動は、そのネットワークや活動を地域のセーフティネットとして発揮し、活動を強化していることも見られている。例えば、東北地域の農村地域の産業振興に寄与する農商工連携は、近隣の農家と緊密なネットワークを持ち、全体としてサプライチェーンのネットワークが地域の周縁で完結しているため、大きな地震があったりしても、確実に商品を提供でき、継続して事業を展開できる大きな力になっている。コミュニティベースト(community-based)の農商工連携が復活力というか回復力がすごく強くなり、今回のような震災にあってもそれに対して体制や復旧力が強く、ある意味では、コミュニティレジスタンス(地域の抵抗力)が発揮したともいえる。平成23年度の研究成果を踏まえて、平成24年度において、より積極的には本研究の比較の結論、インプリケーション、新しい研究の方向性について研究の成果を発信していく。本研究はわが国の農村地域における農商工連携と女性起業、日本とタイの間での一村一品運動、ベトナムにおける農村地域の貧困削減を目指した社会企業活動、中国温州地域における創業活動の連鎖現象などの各国における社会企業活動の事例をベースに、共通の分析視点に基づきながら、これらの事例を比較し、経済発展の中でこうした農村地域における新たな社会企業活動のもつ意義と可能性を解明した。組織学習の視点では、従来の中山間地域コミュニティー運営においていわば脇役と見なされることの多い農村女性にとって,起業活動は,彼女たちの地域コミュニティー運営参加への内発的動機づけを高めるという傾向が見て取れた。ただし,担い手女性の実際面での運営関与はいまだ困難な傾向にあったことが明らかとなった。社会ネットワーク論では、コミュニティーにおける創業活動の拡散を促進するうえで,模倣が重要な役割を果たした。また、時間の経過とともに,創業活動の拡散プロセスにおける主要な模倣の類型も変化していることを認識することができた。さらに,創業活動の模倣的拡散における格差現象の存在を発見した。社会運動論では、農村開発や地域の振興は社会状況に対する不満(Strain)から引き起こされるが、貧しい生活に対する人々の不満だけで運動が始まるわけではないことも明らかになっている。

また、住民たちのリーダー、解決方法に対する信頼(Trust)や運動の団体を形成することをサポートする結束型ネットワークも重要であることを本研究は強調した。社会問題解決のプロセスの観点では、人間が自らの課題を解決していくプロセスを意識・問題との対話・解決案の創造・評価という4つの段階で捉えている。既存の研究は個人と個人が置かれる社会コンタクストに焦点を当てたが、このプロセスが実際に社会的課題を解決していくプロセスにもあてはまることができることを本研究は主張した。おおむねに順調に進展しているが、本研究の調査フィールドのひとつである東北地域は昨年大震災を受けたため、社会企業活動はさらに活発になったと見られている。危機への対応とそれに応じる社会企業活動の展開という要素を本研究の分析枠組みに取り入れ、その論点を巡り、東北地域のフィールドをさらに調査する必要があると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。危機への対応とそれに応じる社会企業活動の展開という要素を取り入れた本研究の研究成果を国内外の学会などにて公表し、国内外の学術雑誌などを通じて積極的に情報発信をしていく。また、研究成果を震災復興にいかしていく。
堆積物供給フォーシングに対する河川デルタ堆積系の層序応答

下流側から作用する海水準フォーシングと上流側から作用する堆積物供給フォーシングは河川デルタの堆積層序構造を支配する二大要因である。それらの層序機能を、長崎大学の堆積実験水槽マルジ系を使用して、モデル実験の手法により解明する。2018年度は海水準フォーシングの機能の理解に関していくつかの重要な知見を導くことができ、一部は論文化に至った。1.水槽内の静止水位(海水準、堆積盆水深)をラン毎に変えて行う実験シリーズにより、デルタ分流チャネルに及ぼす海水準フォーシングの効果の一端が明らかになった。堆積盆水深が大きいほど、分流チャネルは側方移動とアバルジョンを生じにくく、より安定化し、究極的には平衡河川が実現する。この実験結果は別途提唱されていた理論的モデルで裏付けられる。これらの新知見をまとめた論文を米国地球物理学連合のGRL誌へ投稿した(2019.4.8掲載確定、5.21出版)。2.水槽内水位を所定の周期・振幅のもとで上下変動を繰り返す実験シリーズにより、多サイクル海水準変動フォーシングのもとでのデルタ性大陸棚の成長の一つの類型が明らかになった。対称形海水準サイクルの進行に伴って、当初顕著に現れた非平衡応答はやがて平衡応答へと収斂する。よく発達した長寿命のデルタ性大陸棚では、海水準上昇期には非デルタ性かつ海進性の沖積河川層が薄く堆積し、その上位には下降期の埋積性かつ海退性のデルタ層がやはり薄く堆積し、これらが交互に累重する。その過程でオートジェニックな平衡河川が半ば必然的に実現する。論文2編(改訂稿)をまもなく投稿。3.完新世の海水準フォーシングのもとでのメコン河デルタの応答を考察した論文を米国地質学会Geology誌へ投稿した(2019.4.18掲載決定)。4.静止海水準条件を前提に創られた平衡指数モデルを海水準上昇にも拡張できることを理論的に示した(投稿中)。研究開始(2017.8.1)から今日に至るまで研究計画を精力的に進め、当初想定していたよりもかなり早いペースで研究成果が現れつつある。得られた研究成果に基づく共著論文は、すでに1編が出版済み(米国地球物理学連合Geophysical Research Letters誌by Wang、Muto、Urata、Sato & Naruse)、1編が掲載確定(米国地質学会Geology誌by Wang、Tamura & Muto)、2編の改訂稿が準備中(by Wang & Muto;いずれも近日中に再投稿できる見通し)、さらに1編が投稿中(Wang、Muto & Naruse)の状態にある。これらと並行して、2018年5月に日本地球惑星科学連合大会にて口頭講演、同年8月に国際堆積学会議(カナダ)にてポスター講演、また2019年3月には京都大学でのセミナーにて口頭講演、によりそれぞれ研究成果を発表した。なお、特別研究員奨励費および別経費で購入したコンピュータ3機を導入できたことにより、画像の読み取りとその後の解析作業を短時間で終えることができた。研究分担者(外国人特別研究員)は、2018年10月から12月にかけて本国職場の事情で帰国滞在せざるを得なかったが、その不在期間中も分担者が画像解析と論文執筆に邁進したことにより、成果が実を結んだ。今後(2019.4.17.31)は、限られた期間のもと、これまでに得られた研究成果の論文化を進めることが主たる活動となる。それと同時に,海水準フォーシングと堆積物供給フォーシングの統合的かつ複合的な層序機能を探究するための新たなモデル実験を実施する。2018年度に引き続き,2019年度においても特にオート層序解析および平衡指数モデルの観点から実験を行い、7月末までにその成果を取りまとめ,できるだけ早期に新規投稿原稿として論文化することを計画している。論文執筆および実験と並行して,これまでに得られた研究成果を国内学会で発表する(研究分担者;日本堆積学会2019年大阪大会(4月)での口頭講演と日本地球惑星科学連合大会(5月)でのポスター講演を予定)。これら二大フォーシングの統合的かつ複合的な層序機能をモデル実験の手法で解明する。実験には長崎大学環境科学部の堆積実験水槽マルジ系を使用する。平成29年度(2017年8月2018年3月)は、本実験研究のセットアップと対照を兼ねて、条件一定を基本とする2種類の実験シリーズを実行した。一つは、水流量(=河川流量)・給砂量(=土砂供給量)・水槽内水位(=海水準、堆積盆水深)のいずれも不変とした。水槽内水位をラン毎に替えたところ、水槽内水位が大きいほど、分流チャネルは平衡状態に近づき、側方移動とアバルジョンを生じにくくなり、安定化する。この知見を2018年1月に米国学術誌へ投稿した(査読中)。もう一つは,水流量・堆積物供給量を固定したうえで、水槽内水位を所定の周期・振幅のもとで上下変動を繰り返す条件を採用した。これは多サイクル海水準変動のもとでのデルタ性大陸棚の成長を調べることでもある。周期・振幅をラン毎に替えたところ、いずれの場合も、サイクル進行に伴って水位上昇期には非デルタ性の急激な海進による無堆積面が広がり、下降期にオートジェニックな平衡河川が実現しやすくなることが明らかになった(投稿論文準備中)。

これらの実験研究に加えて、河川流量・土砂供給量、海水準下降速度一定のもとで成長した天然河川デルタの実例として、完新世メコン河デルタに関する既存の文献をレビューしたところ、このデルタがオートジェニックな平衡河川系によって発達した(もしくはその途上にあった)ことが判明した。これは地層記録から平衡河川が検出された初めての事例である。この知見を平成30年3月の日本堆積学会秋田大会で発表するとともに、同年4月に米国学術誌へ投稿した(再々投稿、査読中)。研究開始(研究員の来日、平成29年8月1日)から研究計画を精力的に進めたことにより、当初想定していたよりもかなり早いペースで研究成果が現れつつある。得られた研究成果に基づく共著論文をすでに2編投稿中(Wang、Muto、Urata、Naruse; Wang、Tamura、Muto)であり,近日中に3編目(Wang、Muto)を投稿できる見通しである。なお、特別研究員奨励費が使用できるようになったのが平成29年11月で、データ解析に使用するデスクトップコンピュータ(Windows機、特注)を購入できたのも同月であった。遅いタイミングではあったが、これと同時に実験データの解析に必要なソフトウェア(Agisoft PhotoScan、Matlabo)が使用可能になり、解析作業を短い時間で終えることができた。一方、当初の計画では、水流量を特定の時系列パターンで変動させることを想定していたが、この操作の実行に必要なローラーポンプ新機種が欠品状態(11月発注時のメーカー側回答)にあり、1月中旬の納品となった。このため、水流量を変動させる条件設定は平成30年度に実施することとし、代わりに水槽内水位(=海水準)を所定のパターンで変動させる実験を先に行うこととした(水流量と給砂量は一定)。この代替実験で予想以上の重要な成果が得られたことにより、今後の実験研究の方向性が定まった。下流側から作用する海水準フォーシングと上流側から作用する堆積物供給フォーシングは河川デルタの堆積層序構造を支配する二大要因である。それらの層序機能を、長崎大学の堆積実験水槽マルジ系を使用して、モデル実験の手法により解明する。2018年度は海水準フォーシングの機能の理解に関していくつかの重要な知見を導くことができ、一部は論文化に至った。1.水槽内の静止水位(海水準、堆積盆水深)をラン毎に変えて行う実験シリーズにより、デルタ分流チャネルに及ぼす海水準フォーシングの効果の一端が明らかになった。堆積盆水深が大きいほど、分流チャネルは側方移動とアバルジョンを生じにくく、より安定化し、究極的には平衡河川が実現する。この実験結果は別途提唱されていた理論的モデルで裏付けられる。これらの新知見をまとめた論文を米国地球物理学連合のGRL誌へ投稿した(2019.4.8掲載確定、5.21出版)。2.水槽内水位を所定の周期・振幅のもとで上下変動を繰り返す実験シリーズにより、多サイクル海水準変動フォーシングのもとでのデルタ性大陸棚の成長の一つの類型が明らかになった。対称形海水準サイクルの進行に伴って、当初顕著に現れた非平衡応答はやがて平衡応答へと収斂する。よく発達した長寿命のデルタ性大陸棚では、海水準上昇期には非デルタ性かつ海進性の沖積河川層が薄く堆積し、その上位には下降期の埋積性かつ海退性のデルタ層がやはり薄く堆積し、これらが交互に累重する。
酵素学的研究によるホスファチジン酸のde novo合成を担う分子基盤の解明

細胞膜リン脂質の前駆体であるホスファチジン酸(PA)は、真核生物・真正細菌を問わずアシルグリセロールリン酸アシル基転移酵素(AGPAT)によってde novo合成される。AGPATは膜内在性タンパク質であるために精製が極めて難しく、これまで酵素学的な知見が乏しかった。以前の研究において、低温性細菌Shewanella livingstonensis Ac10由来の細菌型AGPAT (以下、PlsCと表記)を活性を保ったまま精製することに成功し、基質特異性などの反応特性を明らかにした。この結果に基づき、AGPAT/PlsCの反応機構解析を目的として平成30年度は以下の実験を行った。2)安定性の低いS. livingstonensis Ac10由来PlsCの結晶構造解析を目指して、同酵素に対する阻害剤の開発に取り組んだ。平成29年度に行った1次スクリーニングで選抜された38化合物について2次スクリーニングを行い、6化合物にPlsC活性を040%にまで低減する阻害効果が確認された。このうち5化合物には共通してベンゼンジオール構造が含まれ、これが阻害活性に重要だと考えられた。また、選抜された阻害剤を構造的に改変することでより強い阻害効果を示す化合物が得られた。平成29年8月に他の研究グループによって好熱菌由来のPlsCの結晶構造が報告され、AGPAT/PlsCによるアシル基転移反応の基礎的な分子機序が提唱された。これを受け当初の実験計画を変更し、S. livingstonensis Ac10由来PlsCの変異解析および阻害剤開発に取り組むこととした。変異解析では、野生型PlsCと比べて変異型PlsCは想定外に不安定であり精製過程で失活してしまったため、目標としていた基質特異性を決定する分子機序の解明には至らなかった。一方で、本酵素に対する阻害剤開発では、結晶構造解析に供するに充分な50%阻害濃度を示す化合物が得られ目標を達成することができた。スクリーニング実験の結果、S. livingstonensis Ac10由来PlsCに対する阻害剤の開発に成功したが、その阻害様式は未解析であり、また、阻害効果の評価についても現状では50%阻害濃度の測定のみである。より多角的な評価が必要であるため、速度論解析による阻害様式および阻害定数の決定、等温滴定カロリメトリーによる解離定数の測定、円二色性分散計を用いた酵素-阻害剤複合体の熱安定性試験を行いたい。この結果に基づき、AGPAT/PlsCの反応機構解析を目的として平成29年度は以下の実験を行った。1)平成29年8月に他の研究グループによって好熱菌由来のPlsCの結晶構造が報告された。これを鋳型としてS. livingstonensis Ac10のPlsCの立体構造モデルを計算し、本酵素の特徴である不飽和脂肪酸特異性を決定するアミノ酸残基について同モデル構造から検討付けを行い、変異解析を行った。変異型酵素は作製済みであり、現在、それらの基質特異性について解析を進めている。2) PlsCの精製方法に基づき、精製酵素の特性が未解明である真核生物のAGPATの異種発現および精製に取り組んだ。ヒトおよびマウスのAGPATについて大腸菌Escherichia coliを宿主とした発現系を構築し、培養条件の検討やコドンの最適化などを通して異種発現を試みたが、微量に発現するにとどまった。3)安定性の低いS.livingstonensis Ac10 PlsCの結晶構造解析を目指して、PlsC阻害剤の開発に取り組んだ。京都大学化学研究所の竹本靖助教に化合物ライブラリーを供与していただき、PlsCによるPA合成反応の阻害を指標に一次スクリーニングを行ったところ、阻害活性を示す複数のヒット化合物を得た。これを受け、本研究課題で当初計画していたS. livingstonensis Ac10 PlsCの反応機構解析および結晶構造解析を一旦凍結し、本酵素の阻害剤開発などに着手したため。

平成29年度に行った1次スクリーニングで選抜された38化合物について2次スクリーニングを行い、6化合物にPlsC活性を040%にまで低減する阻害効果が確認された。このうち5化合物には共通してベンゼンジオール構造が含まれ、これが阻害活性に重要だと考えられた。また、選抜された阻害剤を構造的に改変することでより強い阻害効果を示す化合物が得られた。平成29年8月に他の研究グループによって好熱菌由来のPlsCの結晶構造が報告され、AGPAT/PlsCによるアシル基転移反応の基礎的な分子機序が提唱された。これを受け当初の実験計画を変更し、S. livingstonensis Ac10由来PlsCの変異解析および阻害剤開発に取り組むこととした。変異解析では、野生型PlsCと比べて変異型PlsCは想定外に不安定であり精製過程で失活してしまったため、目標としていた基質特異性を決定する分子機序の解明には至らなかった。一方で、本酵素に対する阻害剤開発では、結晶構造解析に供するに充分な50%阻害濃度を示す化合物が得られ目標を達成することができた。前述の研究実績1) 3)に基づいて、つぎのように研究を進める。2)ヒト/マウスAGPATを精製して諸性質を分析するには、現在の発現量では不十分であることが予想される。そこで、ヒトやマウスと同じ真核細胞である酵母を宿主とした発現系に切り替えることでタンパク質収量の改善を試みる。その後、PlsCの精製方法を適用して精製し、機能解析を行う。3)一次スクリーニングで得られたヒット化合物について、構造活性相関を考慮しながら二次スクリーニングを展開し、より阻害活性の高い阻害剤の開発を目指す。また、ヒト/マウスAGPATに対する阻害活性を試験し、抗菌薬としての利用価値を検討する。スクリーニング実験の結果、S. livingstonensis Ac10由来PlsCに対する阻害剤の開発に成功したが、その阻害様式は未解析であり、また、阻害効果の評価についても現状では50%阻害濃度の測定のみである。より多角的な評価が必要であるため、速度論解析による阻害様式および阻害定数の決定、等温滴定カロリメトリーによる解離定数の測定、円二色性分散計を用いた酵素-阻害剤複合体の熱安定性試験を行いたい。前述のとおり、本研究課題で計画していたS. livingstonensis Ac10 PlsCの反応機構解析および結晶構造解析を一旦凍結したことで、当初想定していた試薬および物品を購入しなかったため、次年度使用額が生じた。平成30年度はAGPAT/PlsCの発現系構築と精製、機能解析、および阻害剤開発を重点的に進め、それらの実験に必要な試薬・物品の購入費として使用する。また、得られた成果を発表するにあたり必要となる学会旅費、論文投稿料に使用する。S.livingstonensis Ac10由来PlsCの変異解析において、変異型PlsCの精製が想定外に難航しため反応特性解析に至らず、当初予定していたほどの支出が発生しなかった。
中国アニメーション史の再検証

本研究は、日中米三国からの大量な資料を集め、判断、整理しつつ、徹底的な実証研究を行うものであり、昨年度の研究活動は主にアメリカでの現地調査、資料収集と関連者のインタビューを中心に行い、今年は、中国本土のほうが中心になり、調査以外、段階的な研究結果の発表を日本と中国両方でも行った。今回の海外調査は北京市、上海市、南京市、南通地方の如皋など四地で実行し、出発前に、具体的な課題設定として「上海美術電影製片場の文書資料と関係者インタビュー」、「中国アニメーションのキーマンである万兄弟と特偉に対する同僚の評価」、「『鉄扇公主』製作時の万兄弟の状況(政治的)考査」、「持永只仁の中国滞在期の貢献」および「30年代中国映画におけるアニメーションの位置」を設定した。関係者インタビュー、コレクターの個人博物館の訪問、上海美術電影製片場の現地調査、各図書館などでの資料収集などによって、貴重な情報を入手した。また、昨年度の報告にも言及した、日本国内で協力したテレビマンユニオン制作の持永只仁のドキュメンタリーに最後まで参加し、同作品は2015年8月にWOWOWにて公開された。さらに、持永只仁の日本での高弟と杉並アニメーションミュージアムの館長の協力により、2016年の2月に、中国の人形アニメーションに関心を持つ学生を招き、ミュージアムで体験講義を企画した。これにより、持永只仁が北京電影学院にて教鞭をとった80年代以来、中国学生が再び「持永流」のアニメーション技術を勉強する機会を設けることができた。研究者として、このイベントを企画したことは重大な意義を持っている。論文投稿が順調に進み、持永只仁についての研究結果を7月号の中国の学術誌に掲載する予定であり、2月に既にその研究成果を北京大学での特別講義の内容として発表した。また、昨年11月に日本アニメーション学会にて研究成果の発表を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、日中米三国からの大量な資料を集め、判断、整理しつつ、徹底的な実証研究を行うものであり、今年度の研究活動は主にアメリカでの現地調査、資料収集と関連者のインタビューを中心に行った。現地調査はロサンゼルス、シカゴ、ワシントン、ニューヨークなど四地で実行した。出発前に新しく発見した資料によって、具体的な課題設定を「1920-40年代中国アニメーションの米国上映状況」、「中国最初のアニメーターの在米生活状況」、および「20年代中国アニメーターアメリカ制作会社との関係」に調整し、3週間の滞在で一定な成果をあげた。また、映画年鑑を調べる副成果物として、中国映画史ではまだ言及されていない20年代にアメリカで上映された最初の中国映画を見つけた。今回の調査によって論文の想定結果と構成を調整しなければならなくなったが、従来の研究空白である20-30年代中国映画と中国アニメーションがアジア以外における存在感の薄さをはじめて認識した。また、日本国内では力尽くして関連者のインタビューを実現させた。まずは70年代末から何回も中国に渡り、中国アニメーションについて取材していた記者・アニメーション研究者の小野耕世さんに連絡し、インタビューした。彼の手元ではまだ戦争時代の中国抗日アニメーションのコピーが残っていることが判明され、これは重大な突発である。その後、彼経由で日中アニメーション交流史のキーマンの持永只仁先生の遺族の持永伯子さんにも連絡がとれ、面会を組んだ。持永さんから貴重な写真と手紙を頂き、新たな手掛かりを入手した。二人とも高齢者であり、これも貴重な資料収集となっている。以上のような調査と平行して、中国の学術誌での論文投稿も順調に進み、基礎研究の一部の「動漫」の定義についての研究結果が発表された。また、日本アニメーション学会に参加し、ほかのアニメーション史の研究者と意見交換をした。

論文投稿が順調に進み、持永只仁についての研究結果を7月号の中国の学術誌に掲載する予定であり、2月に既にその研究成果を北京大学での特別講義の内容として発表した。また、昨年11月に日本アニメーション学会にて研究成果の発表を行った。今年度の研究活動は計画通りに展開した。特に海外調査も含めた中で、様々な想定外のことが起きたが、結果としては90%の目的を達成した。日本国内での関連者のインタビューも、敏感で外国人に対する警戒感の高い高齢者であるため、接触するには苦労しましたが、最後も予想以上に話を教えてくれて収穫が大きかった。論文作成のほうは少し進度が遅れているが、貴重な資料収集が充分に仕上げたため、より質の高い論文が書ける自信をつけた。27年度が最終年度であるため、記入しない。新年度では、前半に残りの中国国内での資料収集と新しく入手した手掛かりによるイギリスでの関連者インタビューを実現させることを計画している。後半では、集まった資料を整理、鑑別し、先行研究(日本とアメリカの権威的アニメーション史研究も含め)との比較を行う。分析を通じて得られた結果をまとめ、その事実に基づき、最初の想定に修正を加えながら、博士学位論文を作成しはじめる。日中アニメーション交流史の研究結果について学会大会で発表する予定。
ナノカーボンコーティングを用いた新規歯周病治療法

ナノカーボン素材の生物学的特性を評価するために,酸化グラフェン(GO)ならびにカーボンナノチューブ(CNT)の生体親和性を検討した.またGOを用いた歯の抗菌コーティング法,ならびにGOスキャフォールドによる再生療法を開発して歯周病治療法としての有効性を検討した.その結果,GO,CNTともに低濃度において生体親和性は良好で,CNTは細胞増殖促進効果を発揮した.一方GOによる歯のコーティング処理によって抗菌性歯面を獲得することができた.また,GOスキャフォールドは細胞親和性が高く,抜歯窩や根分岐部骨欠損に埋入すると骨新生を強く促進した.以上よりナノカーボン材料は有用な医用材料であることが示された.新しい歯科治療法を開発することを目的として,酸化グラフェン(GO)を用いて象牙質表面のコーティングを行い評価した.GOにはnanoGRAX(三菱ガス化学)を用いた.GO分散液をメチルピロリドン(NMP)にて希釈して,象牙質ブロックをコーティング処理した.SEM観察の結果,GOによって象牙質表面にフィルムが形成され象牙細管が封鎖された.以上よりGOによる歯面コーティングが可能であることが明らかになった.次にGOフィルムの生物学的特性を調べた.GOフィルムおよびGOを化学的還元処理したRGOフィルムを作製してE1細胞を播種した.その結果,両フィルムに細胞の付着伸展を認めたが,DNA量は両フィルムともに少なく増殖は抑制された.一方,ALP活性はRGOフィルムで強く発現し,RGOフィルムは骨芽細胞の分化レベル上昇に効果的であると考えられた.次にコラーゲンスキャフォールドをGOとRGOでコーティングした.SEM観察,圧縮強度測定後,ラットに埋入して組織学的に評価した.その結果,スキャフォールドは一様にフィルムに覆われ,圧縮強度はコントロールに比較してRGOで強く上昇した.組織学的観察ではコーティングによる生体親和性の低下は認めず,スキャフォールド内部へのイングロースを観察した.イングロース面積はRGOスキャフォールドで最も高い値であった.以上よりRGOコーティングはスキャフォールドの特性を向上させることが明らかになった.また,GO,RGOのタンパク質吸着および徐放性を検討した.GOおよびRGO溶液作製後アルブミンを添加,アルブミン吸着量を測定した.また,吸着後の経時的なアルブミン徐放量を測定した.その結果,GOのアルブミン吸着量はRGOの2.5倍を示した.また,GOでは経時的なアルブミンの徐放を認めた.以上から,GOはドラッグデリバリーデバイスとして応用できると考えられた.酸化グラフェン(GO)による象牙質表面コーティング方法の検討を継続した.その結果,GO濃度を0.10.5wt%に設定し,520wt%のメチルピロリドンをGO分散液に添加することで,象牙質表面に細管封鎖を伴う強固な被膜を形成することができた.次にGOフィルムの抗菌性を調べた.象牙質表面にGOフィルムを作製し,S.mutansを播種したところ,GO濃度0.01wt%以上でS.mutansの増殖を抑制した.またラット歯牙に窩洞形成して象牙質を露出させ,0.1wt%GOでコーティングした後,2,4週目に歯牙を摘出してSEM観察したところ,コーティングしていない象牙質面に比較して口腔内細菌の付着やプラーク形成が少なく,長期的にGOの抗菌性が発揮されていた.以上よりGOは抗菌性歯面コーティングとして応用できる可能性が示された.一方でコラーゲンスキャフォールドのGOコーティングに関する検討を継続し,本年度は異なる濃度のGOを用いて評価した.GOコーティングは濃度依存性にコラーゲンスキャフォールドの圧縮強度を向上させたが,高濃度では細胞増殖性,また生体内における細胞侵入性,生体吸収性や分解性の低下を認めた.そこで低濃度GOを用いたコーティング条件に変更して再評価した.0.01wt%GOでコーティングしたスキャフォールドへ骨芽細胞を播種したところ,コントロールに比較して有意に細胞増殖を認めた.またラット背部皮下へ移植したところ,細胞のイングロースを促進し,免疫染色にてマクロファージのほか,血管内皮細胞,線維芽細胞の強いイングロースを観察した.生体親和性,生分解性は良好であった.さらにラットの皮膚欠損部へ移植したところ,上皮の再生率はコントロールの2倍であった.以上より低濃度GOコーティングスキャフォールドは組織再生に有効であることが示された.酸化グラフェン(GO)塗布法のビーグル犬への応用を検討した.前臼歯に実験的歯周病モデル(2級分岐部欠損)を作成して露出根面へのGO分散液の塗布を行い,組織学的に評価した.その結果,歯周組織に強い炎症反応は見られなかったものの,根面にそって上皮のダウングロースが頻繁に認められ,大幅なペリオドンタルアタッチメントの獲得はできなかった.さらなるGO塗布方法の検討が必要であると思われた.一方で前年度に引き続きGOスキャフォールドの組織再生効果を検討した.ラット背部皮下へGOスキャフォールドを埋植して10日目の免疫染色分析の結果,炎症性M1マクロファージだけではなく,再生に重要な役割を果たす組織修復型M2マクロファージのイングロースが促進されることが明らかになった.なおコントロールのコラーゲンスポンジの埋植では,M1マクロファージのイングロースが優勢であり,M2マクロファージはほとんど認めなかった.したがって生体内でGOスキャフォールドのリモデリングが活発に起こっていると考えられた.

ラット頭蓋骨上へのGOスキャフォールドの埋植実験では,5週目においてコラーゲンスポンジに比べて2.2倍の骨増生を認め,GOの添加が骨形成促進作用を発揮することが明らかになった.続いてイヌ抜歯窩へのGOスキャフォールド埋植実験を行った.上顎前臼歯を抜歯後GOスキャフォールドを埋入して2週後に組織学的検討を行ったところ,早期から新生骨が形成されており,コラーゲンスポンジを移植したコントロールに比較して約5倍もの骨形成面積を示し,GOスキャフォールドは骨補填材としての機能を強く発揮した.また実験的歯周病モデル(2級分岐部欠損ならびに1壁性骨欠損)へGOスキャフォールドを埋植した結果,CT撮影で歯槽骨の再生を認め,組織学的にも歯根膜形成を伴う歯周組織の再構築が観察された.以上より,GOスキャフォールドは骨・歯周組織の再生に有効であることが示された.ナノカーボン素材の生物学的特性を評価するために,酸化グラフェン(GO)ならびにカーボンナノチューブ(CNT)の生体親和性を検討した.またGOを用いた歯の抗菌コーティング法,ならびにGOスキャフォールドによる再生療法を開発して歯周病治療法としての有効性を検討した.その結果,GO,CNTともに低濃度において生体親和性は良好で,CNTは細胞増殖促進効果を発揮した.一方GOによる歯のコーティング処理によって抗菌性歯面を獲得することができた.また,GOスキャフォールドは細胞親和性が高く,抜歯窩や根分岐部骨欠損に埋入すると骨新生を強く促進した.以上よりナノカーボン材料は有用な医用材料であることが示された.平成26年度は動物実験を中心に評価を行う予定であったが,動物実験用のビーグル犬の飼育施設で行われた耐震補強工事が予定よりも長期間であったため,イヌを用いた検討を早期に始めることができなかった.しかし,現在研究をすみやかに再開し,精力的に行っていることから,進捗状況の回復は容易と考えている.歯周病学平成27年度はビーグル犬を用いた動物実験を中心に行う.昨年度にナノカーボンの根面塗布の濃度条件が確定できたことから,ビーグル犬に実験的歯周炎を作製してナノカーボンコーティングを行い,臨床評価を含む前臨床試験を行う予定である.さらに小動物において,ナノコーティングフィルムの生体親和性のほか,各種グロースファクターを併用してナノカーボンコーティング面への組織形成を確認する.また用途拡大を検討し,昨年度に検討したナノカーボンコーティングスキャフォールドを用いた歯周組織再生療法について検討する.平成25年度の計画において,象牙質ブロックの作製とナノカーボンコーティングを行い,SEMにおいてコーティング状態が評価され定量的評価も順調に行われた.フィルム上での細胞培養ではSEM観察,DNA量,ALP活性の定量のほか,プロリファレーションアッセイ,ROSアッセイも追加継続している.またフィルムの濃度による細胞培養テストも行っている.さらにはじめ予定していなかったフィルムのAFM,XRD分析,カルシウム吸着テストを追加した.タンパク質吸着試験ではアルブミン及びリゾチームを用いて,評価を終了した.現在酸化グラフェンフィルム上での抗菌性試験のデータを評価中である.また,小動物を用いた生体適合性試験も順調に行われ,さらに生体吸収性の評価も行っている.
希土類金属触媒を用いる不飽和結合への求核付加反応

トリアルキル希土類金属錯体を触媒として用いて一酸化炭素のカルボニル化反応を行うと、室温・低一酸化炭素圧(12気圧)という穏やかな反応条件下でも、対応するホルムアミドが選択的に得られることを見出した。この反応は、低温・低圧で進行するアミンのカルボニル化反応の最初の例である。また、この触媒は、ニトリルやイソシアニドへのアミンの付加反応やcis-選択的head-to-head二量化反応にも高活性を示すことを見出した。トリアルキルイットリウム錯体あるいはトリアミドイットリウム錯体を触媒として用いることにより、室温・12気圧の一酸化炭素存在下で、ピロリジンが容易にカルボニル化され、1-ホルミルピロリジンが得られることをすでに見出している。他のアミンと一酸化炭素の反応について検討したところ、ピペリジン、モルホリンなどの環状二級アミンだけでなく、ジエチルアミンやジイソブチルアミン、ベンジルメチルアミンなどの非環式二級アミンの場合にも対応するアミドが中高収率で得られた。ベンジルアミンやヘキシルアミンなどの一級アミンの場合には、高温で反応を行っても低収率であった。また、錯体触媒の中心金属をスカンジウム、ランタン、ネオジム、ガドリニウム、ルテチウムに替えて同様の反応を行ったが、触媒活性に大きな差異は見られなかった。一酸化炭素を等電子構造のイソシアニドに替えてアミンとの反応を行ったところ、2,6-ジメチルイソシアニドやp-メトキシフェニルイソシアニド等の芳香族イソシアニドだけでなく、シクロヘキシルイソシアニドやベンジルイソシアニド等の脂肪族イソシアニドも、ジエチルアミンやピロリジン等の二級アミンと室温で速やかに反応し、対応するN,N,N'-三置換アミジンが定量的に得られた。一方、トリアルキルイットリウム錯体を触媒として用いることにより、室温で、ピロリジンがベンゾニトリルに求核付加し、N,N-二置換ベンズアミジンが高収率で得られることをすでに見出している。他のアミンについて検討したところ、ピペリジンの場合にはN,N-二置換ベンズアミジンが高収率で得られたが、モルホリンやジエチルアミン、ジイソブチルアミンの場合には、60°Cで反応を行っても、対応するアミジンの収率は中程度であった。これまでのわれわれの研究において、トリアルキルイットリウム錯体を触媒として用いることにより、室温・12気圧の一酸化炭素存在下で、脂肪族二級アミンが容易にカルボニル化され、N,N-ジアルキルホルムアミドが得られることが既に見出されている。この反応は、希土類触媒を用いるカルボニル化反応の最初の例である。また、低圧の一酸化炭素圧下でアミンからホルムアミドが得られる数少ない例の1つである。本年度は、まず、脂肪族一級アミンや芳香族アミン(アニリン誘導体)を反応基質として用い、対応するホルムアミドの合成を試みた。室温では、ほとんど反応は進行しなかったが、反応温度を120-140°Cに上げると一酸化炭素圧が低圧のままでも反応は進行し、収率は20%程度と低収率であったが、対応するホルムアミドのみが得られな。反応は選択的であり、副生成物は生成しなかった。一方、ジイソプロピルアミンのような立体障害の大きな二級アミンを用いた場合には、トリアルキルイットリウム錯体触媒存在下でホルムアミドが得られるものの、収率は低かった(22%)。触媒をn-ブチルリチウムにかえて反応を行ったところ、ホルムアミドのみが収率50%で得られた。ピロリジンやジエチルアミン等の他の二級アミンを用いた場合にも反応は進行したが、収率は40%程度であった。また、一酸化炭素圧を1 MPaまで上げても、収率の向上は見られなかった。しかし、リチウムを触媒とするカルボニル化反応は、われわれの知る限りではこのアミンのカルボニル化反応が最初の例である。これまでの我々の研究において、トリアルキルイットリウム錯体を触媒として用いることにより、室温・12気圧の一酸化炭素存在下で、脂肪族二級アミンが容易にカルボニル化され、N,N-ジアルキルホルムアミドが得られることが既に見出されている。トリアルキルイットリウム錯体のみを触媒として用いた場合、フェニルアセチレンの二量化反応は進行しないが、触媒量のピロリジンを加えるとcis-選択的にhead-to-head二量化反応が進行し、室温・60時間の反応で、cis-1,4-ジフェニルー1-ブテン-3-インが94%収率で選択的に得られた。反応温度を120°Cまで上げると選択率は97%程度に低下したが、反応はほぼ1時間で完了した。

スカンジウム、ランタン、ネオジム、ガドリニウム、ルテチウムトリアルキル錯体を用いた場合も同様に反応が進行し、cis-1,4-ジフェニル-1-ブテン-3-インが選択的に得られた。一方、1-オクチンの二量化の場合には、トリアルキルイットリウム錯体のみを触媒として用いると120°C・4時間の反応で、アミンを添加しなくてもcis-7-ヘキサデセン-9-インが85%収率で得られたが、cis-選択率は85%と低かった。n-ブチルリチウムを触媒として用いた場合も、アミンを添加するとフェニルアセチレンのcis-夕選択的head-to-head二量化反応が進行し、収率30%と低収率ではあるが、cis-1,4-ジフェニル-1-ブテン-3-インが選択的に得られた。
病原性酵母カンジダの倍数性変換と染色体再配列を制御する遺伝子の解析

日和見感染菌Candidaalbicansは通常二倍体だが、いくつか菌株では多倍数化した細胞の出現とそれに続く倍数性の減少すなわち倍数性変換が認められ、同時に染色体再編成が生じている。したがって倍数性変換がゲノムの変化を誘導する可能性を示唆している。倍数性変換を示す株の表現型はSps^-(suppresser of ploidy shift)で表される。それに対し、核相が一定である株の表現型はSps^+で表される。細胞融合実験からSps変異は劣性であることが示されているので、Sps^+株のゲノムDNAライブラリーをSps^-株に形質転換し、フロキシンB培地上で白い集落を形成すること、集落形態が滑面となること、増殖速度が速くなること、核の形態が一核となることという選択条件を設定しSPS遺伝子の単離を試みた。前年度に遺伝子破壊株であるSTN21U-1株に形質転換実験を行い、上記の選択方法に基づいてSps^+を示す13個の形質転換体を得た。本年度はその中からNo.115株をSPS遺伝子をもつ候補として選び出した。この株は細胞集団中にSTN21U-1株で観察される細胞よりも小さな細胞を生じる傾向があった。このNo.115株からプラスミドDNAを回収し、インサート部分をサブクローニングし、塩基配列を決定後に相同性検索を行ったところ、RAD5(REV2)遺伝子と高い相同性が見られた。Rad5タンパクはDNA修復タンパクのひとつであり、DNAへリカーゼであると考えられているが、詳しい機能については明らかにされていない。Rad5変異株では組み換えの頻度があがることが報告されているので、Sps^-株で染色体再編成が高頻度に起こるのは、RAD5遺伝子の変異に由来しているかもしれない。また、Sps^-株で高次倍数化するのは、RAD5の未知の機能が損なわれたためかもしれない。以上のことからRAD5がSPS遺伝子群の有力な候補の1つである可能性が考えられた。現在、RAD5遺伝子の機能解析を試みている。日和見感染菌Candidaalbicansは通常二倍体として存在しているが、いくつか菌株では多倍数化した細胞の出現とそれに続く倍数性の減少すなわち倍数性変換が認められ、同時に染色体核型の変化を示す。C.albicansのSTN21株は倍数性変換を示し、さらに染色体再配列が認められる。同じ遺伝的バックグラウンドを持つSTN22株は二倍体で安定な染色体核型を示すので、STN21株では倍数性を制御する遺伝子に変異が生じたと考えられる。また、細胞融合実験からこの変異は劣性であることが示されている。本研究では安定な二倍体を示す981株由来のゲノムDNAライブラリーをSTN21株に形質転換し、倍数性変換を制御している遺伝子を単離することを試みた。ライブラリーはURA3を選択マーカーとしてもつベクター上に構築されているので、まずarg4^-であるSTN21株からura3変異株を作成しなければならない。そこで、ARG4遺伝子によりURA3遺伝子を分断したURAブラスターを構築し、ura3変異株(STN21ul)を作成した。STN21ulはSTN21株と同様に倍数性変換の性質を示した。STN21株、STN21ul株は四倍体細胞を集団中に含むためフロキシンB添加YPD培地上で赤色コロニーが生じ、二倍体であるSTN22株では白色のコロニーが現れる。そこで、コロニーの色をスクリーニングの際の相補性の指標として用い、STN21ul株の形質転換体の中から白色ないし薄いピンク色のコロニーを示すものを選び出した。このうちから13個の形質転換体を得ており、これらは親株よりもかなり生育速度が早く、白色のコロニーを示す。現在、形質転換体から相補したDNAを回収、その性状を明らかにしている。今後は、二倍体株STN22での相同遺伝子を破壊して倍数性変換が生じるかどうかを検証する。

このNo.115株からプラスミドDNAを回収し、インサート部分をサブクローニングし、塩基配列を決定後に相同性検索を行ったところ、RAD5(REV2)遺伝子と高い相同性が見られた。Rad5タンパクはDNA修復タンパクのひとつであり、DNAへリカーゼであると考えられているが、詳しい機能については明らかにされていない。Rad5変異株では組み換えの頻度があがることが報告されているので、Sps^-株で染色体再編成が高頻度に起こるのは、RAD5遺伝子の変異に由来しているかもしれない。また、Sps^-株で高次倍数化するのは、RAD5の未知の機能が損なわれたためかもしれない。以上のことからRAD5がSPS遺伝子群の有力な候補の1つである可能性が考えられた。現在、RAD5遺伝子の機能解析を試みている。