hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海洋性アンモニア酸化細菌による温室効果ガス亜酸化窒素の生成

本研究の目的は、硝化に伴う亜酸化窒素の生成の過程を明らかにすることである。海洋性のアンモニア酸化細菌(AOB)から抽出したヒドロキシルアミン酸化還元酵素(HAO)によって亜酸化窒素が生成することを直接証明した。また、変異導入による機能解析を目的として、HAOの発現系構築に取り組んだ。既存の手法の適用が困難であることが明らかとなったため、別種のAOBを宿主とする系を新たに設計した。さらに、従属栄養性の硝化菌からピルビン酸オキシム酸素添加酵素を精製し、アルドラーゼの相同タンパク質であることを見出した。1.海洋性アンモニア酸化細菌(AOB)であるNitrosococcus oceani NS58生菌、およびそこから抽出精製したヒドロキシルアミン酸化還元酵素(HAO)を用い、放出される亜酸化窒素(N2O)ガスを定量するとともに、その同位体的性質を分析した。その結果から、好気的な条件の下ではHAOの反応副産物として、また嫌気条件では硝化的脱窒と呼ばれるプロセスによって、それぞれN2Oが生成することが示唆された。この研究は東京工業大学のグループとの共同研究として行い、Biogeosciences誌に掲載予定である。2.NS58のHAOの結晶化と構造解析に成功した。また基質アナログであるアセトアルドキシムとの複合体についても2.0Å分解能の結晶構造が得られた。3.海洋性AOBであるNitrosomonas cryotoleransから、HAOなどの酵素タンパク質を精製し、その機能や構造を分析した。その結果、NS58とN. cryotoleransが進化系統上異なるAOBであることを反映し、その硝化やN2O生成の酵素学的性質にも大きな違いがあることを確かめた。(1)アンモニア酸化細菌(AOB)が放出する亜酸化窒素(N2O)ガスが、主としてヒドロキシルアミン酸化還元酵素(HAO)の反応副産物として生成することを、海洋性AOB Nitrosococcus oceani NS58およびそこから抽出精製したHAOを用いて明らかにした(Biogeosciences誌に掲載)。(2)N. oceani HAOの結晶化と構造解析に成功し、基質アナログであるアセトアルドキシムとの複合体についても2.0Å分解能の結晶構造が得られた(投稿中)。2.特に耕作地等の富栄養土壌環境においては、従属栄養性の硝化細菌の、硝化作用に対する寄与が大きいことが知られている。従属栄養性硝化細菌の一種であるAlcaligenes faecalisを用いて、硝化に関わるピルビン酸オキシム酸素添加酵素PODの精製と遺伝子クローニングを行った。その結果、PODが解糖系酵素の一つであるアルドラーゼ(クラスII)のホモログであることが明らかとなった。さらにPOD組み換え体を用いた解析の結果、本来の補因子である亜鉛イオンが鉄イオン(FeII)に置換されたため、アルドール反応のかわりにジオキシゲナーゼ反応を触媒する酵素に機能転換したという、極めて興味深い仮説を提案することとなった(投稿準備中)。本研究の目的は、硝化に伴うN2Oの生成の過程を明らかにすることである。初年度(H25)には、海洋性のアンモニア酸化細菌Nitrosococcus oceaniから抽出精製したヒドロキシルアミン酸化還元酵素(HAO)を用い、HAOによる酵素反応によって亜酸化窒素(N2O)が生成することを直接証明した。H26年度は、HAOによるN2O生成を分子レベルで解明することを目的として、HAO反応の速度論的な解析を行った。また変異導入による機能解析を目的として、HAOの発現系構築に取り組んだ。最終年度(H27)では、前年度に引き続いてHAOの発現系の構築を試みた。シュワネラ菌を宿主とする既存の手法の適用が困難であることが明らかとなったため、別種のAOBを宿主とする系を新たに設計し、ベクターの作成までは現在完了している。一方、H26年度から開始した、従属栄養性細菌による硝化に関する研究に大きな進展があった。従属栄養的にアンモニア酸化をおこなうアルカリジェネス菌から硝化酵素PODを精製し分析を行った。その結果、亜硝酸生成反応を触媒するPODが、本来は解糖や糖新生に関わる酵素であるアルドラーゼの相同タンパク質であることを見出した。さらにH27年度には、PODの詳細な生化学的分析を行うとともに、従属栄養硝化能が報告されている細菌や菌類のほとんどにPOD遺伝子が存在することを見出し、またそれらがPOD活性を示すことを発現系を用いて確かめた。本研究結果に基づいて、HAOによるN2O生成の反応メカニズムを提唱した。その仮説を裏付けるため構築中のHAO発現系を用いて詳細な解析を行う予定である。またサブテーマに関しては、PODの生化学的な分析から、POD遺伝子をターゲットとした従属栄養硝化菌の環境動態解析へ研究を展開していくことを計画している。

HAOによるN2Oの生成反応に関する研究は本研究計画の主テーマであるが、(1)に述べるように、H26年度は技術的に極めて難しい段階に差し掛かっており、鋭意努力している。一方、H26年度から開始したサブテーマに関しては、(2)に述べるように極めて興味深い成果が得られていることから、総合的にみて、おおむね順調な進展状況にあるとした。1.硝化作用に伴うN2Oの生成の主たる要因が、AOBが持つ酵素HAOの副反応であることが、純培養したN. oceani、およびそれから精製したHAOを用いた同位体分析や構造解析によって強く示唆された。Geobiosciences誌で提案した、HAOによるN2O生成反応の分子メカニズムの検証は、本研究テーマの中心課題である。そのためにはHAOへの変異導入、機能解析を行うことが必要であり、その前段階としてHAO組み換え体の発現系構築に取り組んでいる。当初試みた、S. oneidensisを宿主とする既存システムでは、残念ながら過剰発現には成功しなかった。その原因は、HAOが、この酵素特異的な翻訳後修飾系をおそらく必要とするためであり、別種のAOBを宿主としてN. oceani HAOを発現させるシステムの構築を現在試みている。2.一方、サブテーマとしてH26年度から開始した、従属栄養性硝化細菌による硝化作用の生化学的機構の分析に関しては、予想以上の進展があった。従属栄養性硝化細菌A. faecalisから硝化酵素PODを精製し、その分子的、酵素的、および遺伝子的分析を行った。その結果、本来は解糖系に関わる酵素アルドラーゼが、補因子の入れ替えのみによって、酸素添加反応という全く異なる酵素機能を発揮し、PODとして機能していることが明らかとなった。環境微生物生化学本研究計画の最終年度であるH27年度は、以下の2項目にテーマを絞り研究を進める。1.HAO過剰発現系の構築と、これを用いたHAOへの変異導入と機能解析HAOの活性中心であるP468は、c型ヘムに近傍のチロシン残基が共有結合するという、HAO特有の翻訳後修飾を受けている。前年度中にS. oneidensisを宿主とする発現系の構築を試みたものの失敗に終わった理由は、おそらくS. oneidensisにこの修飾システムが存在しないためと考えている。そこで現在は、Nitrosomonas cryotoleransあるいはNitrosomonas europaeaという、別種のAOBを宿主として、N. oceaniのHAOを発現させるシステムの構築を試みている。両者ともAOBであり、自身のHAOを持っているが、N. oceaniとは進化系統的に遠いため、HAOの配列相同性も50%以下とかなり低い。そのため、キメラタンパク質の出現などの可能性は低いと予想している。現在は、デザインしたプラスミドの効率的な形質転換法について検討している。この手法によってHAO組み換え体の発現が可能になれば、H25年度にすでに明らかとなっているHAO活性中心の結晶構造に基づいて、周辺のアミノ酸残基に変異導入を行う。変異の酵素機能への影響を解析することで、Geobiosciences誌で提案した、HAOによるN2O生成反応の分子メカニズムを検証する。2.従属栄養性硝化に関わる酵素PODの構造及び機能の解析H
日本企業の海外現地経営における「現地採用日本人」の活用に関する研究

2018年度は、前年度に引き続き、在外日系進出企業及びそこに勤務する現地採用日本人社員に対するアンケート調査と海外でのヒアリング調査に注力すると同時に、これまでの研究成果の発信に努めた。具体的には、タイ及びドイツにおいて、現地人材会社の協力のもと、アンケート調査(日系進出企業分・現地採用者本人分)をスタートさせるとともに、ベトナムと中国でヒアリング調査を実施した。研究成果の発信の面では、中国での調査の成果がThunderbird International Business Review誌に査読付き論文として掲載された(英国レディング大学クリス・ブリュースター教授との共著、古沢がfirst author)。また、英国アンケート調査の成果を『異文化経営研究』に招聘論文として発表した。さらに、異文化経営学会において、中国調査の成果に関する研究報告を行った。このほか、中国での研究成果(アンケート調査・ヒアリング調査の成果)に基づき、Journal of International Management誌に投稿し、先頃受理されたところである(2019年度に刊行予定)。アンケート調査は、英国と米国において、日系進出企業分・現地採用者本人分ともに終了した。米国でも日系進出企業分が回収目標を達成し、現地採用者分もほぼ目標回収数に到達している。2018年度にスタートしたタイとドイツでのアンケート調査も順調に推移している。各国で実施しているヒアリング調査においても、有益な知見が得られており、アンケート調査との相乗効果が発揮されていると考える。そして、これまでの研究成果については、前述のとおり、学術論文・学会発表等を通した発信に努めている。研究代表(古沢)の事故(骨折)により、1年間研究期間が延長となったが、全体として順調に進展していると思われる。2019年度は、引き続き各国でのアンケート調査・ヒアリング調査に取り組むとともに、成果の発信に一層注力したい。具体的には、新たに論文の投稿や学会発表を行うほか、これまでの研究成果を取り纏める形で、商業出版に向けた原稿執筆をスタートさせる予定である。平成28年度は「国際人的資源管理」や「現地採用本国人社員」(self-initiated expatriates: SIEs)等に関する関連文献をレビューするとともに、中国・英国で実施した日系進出企業とそこに勤める現地採用日本人社員本人に対するアンケート調査結果の詳細な分析を行った。また、中国・英国にて日系企業と現地採用日本人双方へのヒアリング調査を実施した。そして、国際ビジネス研究学会第23回全国大会にて「多国籍企業の海外現地経営における『現地採用本国人』の活用に関する研究ー在中国日系進出企業へのアンケート調査・ヒアリング調査に基づいてー」と題して研究成果を発表した。このほか、日米の学術誌(『国際ビジネス研究』『Thunderbird International Business Review』)に論文を投稿した(査読審査中)。さらに、訪米調査を行い、米国でのアンケート調査に向けた予備的ヒアリングを実施すると同時に、調査の共同実施主体である在米日系人材会社と打ち合わせをし、調査要領を確定させた。中国・英国のアンケート調査・ヒアリング調査からの主たる発見事実とインプリケーションは以下のとおりである。1.現地採用日本人を雇用している日系企業は、日本語能力や日本のマナーの理解といった日本人SIEsの「日本人性」を重視している。2.現地採用日本人は、日本人駐在員に比して中国語/英語能力に優れるとともに、現地での在住・勤務・留学経験においても両サンプル間に統計的有意差が検出された(現地採用日本人>駐在員)。3.先行研究で散見された日本人SIEsの否定的側面(思考・行動の過度の現地化や責任感・忠誠心の欠如等)に関する企業側の不満は大きくなかった。これらの結果は、現地採用日本人が「日本」と「中国/英国」の「バウンダリー・スパナー」としての可能性を秘めた人的資源であることを物語っていると言えよう。中国・英国でのアンケート調査・ヒアリング調査からは、示唆的な分析結果が得られている。また、これまでの研究成果を学会発表や論文投稿という形で結実させることができた。さらに、米国でのアンケート調査に関しても、共同実施主体と綿密な打ち合わせを行い、29年度上期実施に向けての準備が整った。29年度は、既にアンケート調査・ヒアリング調査を終えた中国における「現地採用日本人の活用」に関して研究成果の取り纏めと発信に注力するとともに、英国ではアンケート調査のフォローアップとしてのヒアリング調査を実施した。また、新たに米国・タイで日系進出企業及びそこに勤務する現地採用の日本人社員双方に対するアンケート調査を開始した。そして、5番目(最終)の調査対象国であるドイツでの予備調査を行い、アンケート調査の共同実施主体を確定させた。中国調査の成果としては、現地採用日本人は日本人駐在員と比して、中国での長い在住・勤務経験を有し、中国語能力に優れることから「バウンダリー・スパナー」(日中間の文化の橋渡し役)としての可能性を秘めた人材集団である旨を示した。また、人的資源管理施策と現地採用日本人の「バウンダリー・スパナー」としての役割遂行との関係性を考察するための理論モデルを構築し、その有効性を在中国日系進出企業へのアンケート調査(統計分析)を通して検証した。その結果、人的資源管理における「規範的統合」(経営理念の共有化)と「制度的統合」(グローバルな人事制度)が各々「信頼関係」と「グローバルなキャリア機会」に結び付くとともに、それらが現地採用日本人の「グローバル・マインドセット」(全体最適の思考・行動)の涵養に資することが分かった。そして、「グローバル・マインドセット」及び「中国文化への精通」「中国語能力」が現地採用日本人の「バウンダリー・スパナー」としての働きを促進することが明らかとなった。上記の研究成果は、日本企業の中国における今後の人的資源管理施策のあり方に関して示唆を与えるものであり、理論と実務両面への貢献を果たしうると考える。

3年間の研究プロジェクトの2年目を終えた時点で、予定した5ヶ国における調査のうち、4ヶ国で調査は終了または実施中となるなど順調に推移している。残るドイツについても前述のとおり、アンケート調査の共同実施主体が決まった。調査結果も学術・実務両面において意義深いと考えられるものが生まれており、現在その成果を国内外のジャーナルへの論文投稿や学会発表という形で発信しているところである。2018年度は、前年度に引き続き、在外日系進出企業及びそこに勤務する現地採用日本人社員に対するアンケート調査と海外でのヒアリング調査に注力すると同時に、これまでの研究成果の発信に努めた。具体的には、タイ及びドイツにおいて、現地人材会社の協力のもと、アンケート調査(日系進出企業分・現地採用者本人分)をスタートさせるとともに、ベトナムと中国でヒアリング調査を実施した。研究成果の発信の面では、中国での調査の成果がThunderbird International Business Review誌に査読付き論文として掲載された(英国レディング大学クリス・ブリュースター教授との共著、古沢がfirst author)。また、英国アンケート調査の成果を『異文化経営研究』に招聘論文として発表した。さらに、異文化経営学会において、中国調査の成果に関する研究報告を行った。このほか、中国での研究成果(アンケート調査・ヒアリング調査の成果)に基づき、Journal of International Management誌に投稿し、先頃受理されたところである(2019年度に刊行予定)。アンケート調査は、英国と米国において、日系進出企業分・現地採用者本人分ともに終了した。米国でも日系進出企業分が回収目標を達成し、現地採用者分もほぼ目標回収数に到達している。2018年度にスタートしたタイとドイツでのアンケート調査も順調に推移している。各国で実施しているヒアリング調査においても、有益な知見が得られており、アンケート調査との相乗効果が発揮されていると考える。そして、これまでの研究成果については、前述のとおり、学術論文・学会発表等を通した発信に努めている。研究代表(古沢)の事故(骨折)により、1年間研究期間が延長となったが、全体として順調に進展していると思われる。平成29年度は、上期に米国におけるアンケート調査(日系進出企業と現地採用日本人の双方を対象)を実施する。また下期には上記アンケート調査の第一次分析結果を受けて、回答者へのヒアリング調査を行い、研究の深耕を図る。これらの研究成果は、前年度に引き続き、学会発表や論文投稿により発信していく。
α、β-不飽和アルデヒドヒドラゾンのアルキル化による第4級炭素の立体選択的合成

本研究では、α,β-不飽和アルデヒド=ジメチルヒドラゾンのα位が選択的にアルキル化され、さらに炭素-炭素二重結合がα,β-位からβ,γ-位に転位するという反応を不斉第4級炭素原子の構築に適用するため、まずジメチルヒドラゾンとイミンを合成し、その反応性について検討した。その結果種々のヒドラゾンやアルキルイミンでは化学収率や操作の点においてジメチルヒドラゾンよりも用いやすい優れたヒドラゾンであることがわかった。この結果を基に不斉源をもつアルキル基を導入し、不斉合成が行えることを見いだした。また、不斉ヒドラジンであるSAMPやRAMP((S)および(R)-1-amino-2-methoxymethylpyrrolidine)ヒドラジンを用いてヒドラゾンとし、同様のα位のアルキル化を行ったところ、立体選択的にα位がアルキル化され、不斉第4級炭素原子を構築することができた。この段階でジアステレオマ-である生成物の高速液体クロマトグラフィー分析によれば、最終的なアルデヒドのenantioexcessは85%以上にも達することがわかった。さらに、2-メチル-2-ブテナ-ル=シクロヘキシルイミンを塩基で脱プロトン化、アルキル化し、さらに加水分解を行うことにより、α位に四級炭素を持つ2-アルキル-2-メチル-3-ブテナ-ルが得られることを見いだした。またヒドラゾンををモノパーオキシフタル酸マグネシウムを反応させることにより、α位に四級炭素を持つニトリルが好収率、高選択的に得られることを見いだしている。絶対配置については、立体配置が既知の2-シアノ-2-メチル-3-フェニルプロピオン酸メチルに誘導することにより、(R)-体であることがわかった、これらの結果をもとに不斉誘導機構についても考察した。本申請者はこれまでに、alpha,beta-不飽和アルデヒド=ジメチルヒドラゾンのalpha位が選択的にアルキル化され、さらに炭素-炭素二重結合がalpha,beta-位からbeta,gamma-位に転位するという反応を見いだしている。この反応ではアルキル化されたヒドラゾンが酸触媒によって容易にアルデヒドに戻り、しかも二重結合の再転位が起こらないためにビニル基とホルミル基を持つ第4級炭素原子の構築に価値ある反応となっている。この反応を不斉第4級炭素原子の構築に適用するためにジメチルヒドラゾン以外の不斉源を持つアルキルヒドラゾンを合成し、その反応性について検討した。その結果種々のアルキルフェニルヒドラゾンでは化学収率や操作の点においてジメチルヒドラゾンよりも用いやすい優れたヒドラゾンであることがわかった。この結果より、不斉源をもつアルキル基を導入することにより、不斉合成が行えることがわかった。現在不斉炭素を持つアルキル基の導入について検討している。これとは別に不斉ヒドラジンであるSAMPおよびRAMP((S)および(R)-1-amino-2-methoxymethylpyrrolidine)ヒドラジンを用いてヒドラゾンとし、同様のalpha位のアルキル化を行った。その結果、立体選択的にalpha位がアルキル化され、不斉第4級炭素原子を構築することができた。この段階でジアステレオマーである生成物の高速液体クロマトグラフィー分析によれば、最終的なアルデヒドのenantio excessは85%以上にも達することがわかった。現在これらの化合物の立体構造を決定するため、立体配置既知化合物への誘導を行っている。なお、この結果については1994年度日本化学会春季年会にて発表する。

本年度は、α,β-不飽和アルデヒド=ヒドラゾン類およびイミン類のエナンチオ選択的、位置選択的アルキル化反応によるα-アルキル-β,γ-不飽和カルボニル化合物の合成研究を行った。まずはじめに、2-メチル-2-ブテナ-ル=シクロヘキシルイミンを塩基で脱プロトン化、アルキル化し、さらに加水分解を行うことにより、α位に四級炭素を持つ2-アルキル-2-メチル-3-ブテナ-ルが得られることを見いだした。この反応では、位置選択的にα位でアルキル化が進行し、α,β位の二重結合がβ,γ位に転位している。さらに、2-アルキル-2-メチル-3-ブテナ-ル=ジメチルヒドラゾンのアルキル化を行い、さらに塩化第二銅を反応させるとアルデヒドが得られるだけでなく、モノパーオキシフタル酸マグネシウムを反応させることにより、α位に四級炭素を持つニトリルが好収率、高選択的に得られることを見いだしている。これらの反応を応用して,キラルなヒドラゾンとして2-メチル-2-ブテナ-ル=(S)-1-アミノ-2-(メトキシメチル)ピロリジン(SAMP)ヒドラゾンを用いることにより、α位に四級炭素をもつ光学活性なニトリルを高エナンチオ選択的に合成した。絶対配置については、立体配置が既知の2-シアノ-2-メチル-3-フェニルプロピオン酸メチルに誘導することにより、(R)-体であることがわかった、これらの結果をもとに不斉誘導機構についても考察した。また、不斉源をもつアミンより合成したキラルなイミンを用いると、光学活性なアルデヒドがエナンチオ選択的に得られることも見いだし、反応の考察を行った。なお、これらの結果について1994年度日本化学会春季および秋季年会にて発表した。
ショックにおけるサイトカイン・血管作動性物質の臓器循環維持・調節機構への関与

本研究の目的は、モデル動物を用いて、各種ショック時の臓器循環の維持・調節機構を明らかにし、更にサイトカイン・血管作動物質がその際に果たす役割を明確にすることである。立案時には、脳・心・腎・肝・消化管などの主要臓器全部の循環動態把握を目指したが、ショック時においては、肝動脈と門脈の二系統から灌流される複雑な血流動態を示す代謝の要である肝の重要性が再確認された。そこで今回は、最初に肝循環動態の維持・調節機構を明らかにするべくミニブタ(13kg前後)を用いた。全身麻酔下にて右心負荷をかけ、肝うっ血状態を作成することにより、肝血流動態を検討した。右心負荷としては、生理食塩水2000mlを30分にて急速静注することとした。肝を中心とした動脈圧と静脈圧のほか、電磁流量計を用いて心拍出量・肝動脈血流量・門脈血流量・下大静脈血流量を測定した。更に各部位の血流量と血圧から、それぞれの血管抵抗を計算によりもとめた。心拍出量と下大静脈血流量は、生理食塩水の2000ml負荷に至るまで負荷と共に増加する。しかし、肝動脈血流量は負荷500mlの時が最大で、以降は減少し、門脈血流量は負荷1000mlまで増加を示し、以降プラトーに至る。一方、血管抵抗についてみると、全身の血管抵抗は生理食塩水2000mlの負荷では変化が見られないのに対し、門脈の血管抵抗は負荷量の増加に伴い経時的に増加する。また、肝動脈の血管抵抗は生理食塩水1500ml以上の負荷で急激に増加する。以上の結果は、門脈と肝動脈にはそれぞれ自動調節機能が働いて肝全体の灌流を保とうとする働きのあることが示唆された。この自動調節能は明らかにほかの臓器と異なる特異な循環維持・調節機構の存在が示された。現在は、このモデルを用い、ショック時の循環動態及びそれに及ぼすサイトカイン・血管作動物質の役割を明らかにすべく実験をすすめつつある。
超熱速度領域における分子散乱ダイナミクスと超低高度・低抵抗衛星設計へのインパクト

本申請では、これまで世界的にもその重要性が十分認識されてこなかった「衛星表面での超熱気体分子の散乱ダイナミクス」を正しく理解するために、本申請者が所有する材料劣化研究用原子状酸素ビーム発生装置を用いた実験によるデータ収集を行う。さらに超熱速度領域の原子状酸素散乱ダイナミクスとDSMC計算と組み合わせることにより、低抵抗衛星設計の基本原理の獲得と、DSMC計算スキームの高度化を行う。これらの一連の研究により世界に先駆けて超低高度地球軌道領域を開拓する基盤技術を獲得することを目指す。
進化情報を用いたDNA修復酵素複合体の相互作用部位予測

ゲノムは放射線や化学物質による攻撃を受け続けている。これらの攻撃の結果、ゲノム配列に変化が生じるが、生物にはこの障害を修復する機構がある。また、DNA複製の際にも複製ミスは起こっているが、そのミスもほとんどの場合は修正されている。DNAの塩基配列をある程度保存することができなければ、ゲノムにコードされている情報が変化してしまい、その生物は死にいたる。ゲノムを修復するDNA修復酵素は複合体を形成していることが、生化学的な解析および立体構造解析でわかってきた。ところが、各修復システムの全立体構造が判明しているのはまれで、単体の構造もしくはドメインの構造のみが判明している場合が多い。そこでDNA修復酵素において、立体構造が判明している各サブユニットまたはドメインのどの部分が複合体形成に関与するかを、進化的情報から抽出する方法の開発と適用を目的として本研究を開始した。本研究の結果以下の3点を達成した。1)DNA修復関連タンパク質のアミノ酸配列、ゲノム上の位置、及び相互作用の情報を収集したデータベースを継続的に発展させた。その結果、現在133種類のDNA修復関連タンパク質が知られており、そのうちの82種類については、少なくともドメインの立体構造がホモロジーモデリングによって構築可能であることがわかった。2)タンパク質立体構造のデータベースを用いて、20種のアミノ酸残基がタンパク質の内部に埋まる傾向を調べたところ、従来の疎水性指標とは異なる傾向にあることがわかった。3)上記2つのデータを用いてDNA修復関連タンパク質の相互作用面を調べたところ、RuvAの他タンパク質(RuvB)との相互作用面を正しく推定することができた。また塩基除去修復酵素AAGには、他の修復関連タンパク質と相互作用しそうな表面が存在しないことが推定され、AAGが単体で損傷DNAに作用することが推定された。
ＳＫＩＰによるリソソームとリソソーム関連オルガネラの選択的輸送メカニズムの解明

報告者は先行研究で、メラノソームの微小管順行性輸送の制御因子であるkinesin-1の欠損によりメラノソームが核周辺に凝集することを明らかにしている。そこでまず、マウスに存在する全43種類のKif分子に対するsiRNAを作成し、メラノソームの凝集が誘導されるものを網羅的にスクリーニングし、複数種の候補Kif分子を同定した。次にこれら結果のオフターゲット効果の可能性を検証するためにsiRNAのターゲットサイトをさらに3本増やし、またsiRNAの処理により実際mRNAの量が低下していることをRT-PCRにより検証を行った。これらの一連のスクリーニングの結果Kif1cという機能未知の分子を同定することに成功した。Kif1cのメラノソーム輸送への関与については証明されなかったが、これらの実験の過程でKif1cのtailドメインがメラノソーム特異的に局在することを発見した。さらに興味深いことに精製したKif1cのtailドメインを固定したメラノサイトと反応させると細胞に発現させた時と同様に、メラノソームに局在した。このことからKif1cのtailドメインが新規のメラノソーム特異的マーカーとして機能することが示唆された。さらに詳細な解析の結果、Kif1cのtailドメインはメラノソームの内腔部分であるメラノコアを直接認識していることが判明した。そこでKif1cのtailドメインを"M-INK (Melanosome INteracting Kif1c)"と名付け、このツールを利用した細胞染色への応用を行った。興味深いことにM-INKはこれまで染色が難しかったケラチノサイト内に転移されたメラノソームも認識した。28年度が最終年度であるため、記入しない。リソソーム関連オルガネラであるメラノソームは、リソソームともメラノサイト内で共存し、両者は機能に応じて細胞内の別々の場所へと選択的に輸送されているが、その制御メカニズムはこれまで全く解明されていなかった。報告者はこれまでの研究で、メラノサイトにおいて低分子量Gタンパク質Rab1Aがメラノソームの微小管順行性輸送を制御していることを示し、Rab1Aの結合分子としてSKIPというkinesin-1結合因子を同定することに成功している(Cell Struct. Funct., 2011; J. Cell Sci., 2012)。興味深いこと、SKIPは低分子量Gタンパク質Arl8との結合を介して、リソソームの微小管順行性輸送を制御することが報告されており、SKIPがRab1AとArl8を介して、メラノソームとリソソームの選択的輸送を制御している可能性が示唆されていた。本年度は、二つの低分子量Gタンパク質(Rab1A及びArl8b)、そのエフェクタータンパク質であるSKIP、ならびにkineisn-1モーターのメラノサイトにおける機能解析を実施し、「Rab1AとArl8bという異なる低分子量Gタンパク質がSKIPという共通のエフェクタータンパク質を介してリソソームとメラノソームという類似したオルガネラの輸送を制御していること」を解明した。昨年度は、二つの低分子量Gタンパク質(Rab1A及びArl8b)、そのエフェクタータンパク質であるSKIP、ならびにkineisn-1モーターのメラノサイトにおける機能解析を実施し、「Rab1AとArl8bという異なる低分子量Gタンパク質がSKIPという共通のエフェクタータンパク質を介してリソソームとメラノソームという類似したオルガネラの輸送を制御していること」を解明し、Scientific Reports誌に筆頭著者として論文発表している。今年度はこれらの研究により得られた知見を拡張し、1.メラノソーム輸送に関わるkinesin分子の網羅的スクリーニング及び2.Kif1c分子のメラノサイト内における機能解析を行いメラノソーム輸送を制御するKif分子の全貌解明に努めた。昨年度までで本研究課題のメインテーマである「SKIPによるリソソームとリソソーム関連オルガネラの選択的輸送メカニズムの解明」に関して「リソソーム上のArl8b及びメラノソーム上のRab1Aが共通エフェクターであるSKIPを介して両者の微小管順行性輸送を制御する」ことを明らかにし既に論文発表を行っている(Ishida et al. Sci. Rep. 5: 8238, 2015)。そこで本年度はその研究内容をさらに発展させ「メラノソーム輸送に関わるキネシン分子の網羅的解析」に取り組んだ。

実験は順調に進行しており、現在既にKif1cをメラノソーム輸送に関わる新規分子として同定することに成功している。報告者は先行研究で、メラノソームの微小管順行性輸送の制御因子であるkinesin-1の欠損によりメラノソームが核周辺に凝集することを明らかにしている。そこでまず、マウスに存在する全43種類のKif分子に対するsiRNAを作成し、メラノソームの凝集が誘導されるものを網羅的にスクリーニングし、複数種の候補Kif分子を同定した。次にこれら結果のオフターゲット効果の可能性を検証するためにsiRNAのターゲットサイトをさらに3本増やし、またsiRNAの処理により実際mRNAの量が低下していることをRT-PCRにより検証を行った。これらの一連のスクリーニングの結果Kif1cという機能未知の分子を同定することに成功した。Kif1cのメラノソーム輸送への関与については証明されなかったが、これらの実験の過程でKif1cのtailドメインがメラノソーム特異的に局在することを発見した。さらに興味深いことに精製したKif1cのtailドメインを固定したメラノサイトと反応させると細胞に発現させた時と同様に、メラノソームに局在した。このことからKif1cのtailドメインが新規のメラノソーム特異的マーカーとして機能することが示唆された。さらに詳細な解析の結果、Kif1cのtailドメインはメラノソームの内腔部分であるメラノコアを直接認識していることが判明した。そこでKif1cのtailドメインを"M-INK (Melanosome INteracting Kif1c)"と名付け、このツールを利用した細胞染色への応用を行った。興味深いことにM-INKはこれまで染色が難しかったケラチノサイト内に転移されたメラノソームも認識した。報告者は採用一年目である今年度、以下の二つの課題について国際誌に論文発表を行った。まず第1に本研究課題のメインテーマである「SKIPによるリソソームとリソソーム関連オルガネラの選択的輸送メカニズムの解明」に取り組み、「リソソーム上のArl8b及びメラノソーム上のRab1Aが共通エフェクターであるSKIPを介して両者の微小管順行性輸送を制御する」ことを明らかにした(Ishida et al. Sci. Rep. 5: 8238, 2015)。第2にサブテーマとして「常時活性化型Rab27A変異体の発現によるメラノソーム輸送阻害メカニズムの解明」にも取り組み、こちらに関しても筆頭著者として論文発表を行った(Ishida et al. J. Biol. Chem. 289: 11059-11067, 2014)。さらに、これらの研究業績が評価され、日本色素細胞学会の奨励賞を受賞した。以上の事柄から判断して、報告者が本年度、研究計画当初の期待以上に業績を挙げたものと判断しています。Kif1cがメラノソーム輸送を制御するのなら、モーター部分を含む全長Kif1cをメラノサイトに発現させると、メラノソーム輸送が活性化されメラノソームの局在に顕著な影響を与えることが予想される。しかしKif1cの全長を発現させてもメラノソーム輸送の活性化は観察されなかった。一般的にkinesin分子は自己の活性化に対する抑制能を持っていることが知られており、Kif1cがこれを発揮することでメラノソーム輸送が活性化されないのではないかと仮説を立て、今後この仮説の実験的な検証を行う。
脊髄における鎮痛機構のネットワーク、鎮痛薬相互作用の解明

エダラボン、サルポグレラート、セレコキシブ、プロポフォールがTail flick testで投与量依存性の効果を示さず、ED50値を求めることができなかった。これらの薬剤もFormalin testにおいてはED50値を求めることができた。バクロフェン、モルヒネ、ネオスチグミン、カルバコールは、Tail flick test、Formalin testのPhase1 phase2ともにED50値を求めることができた。相互作用に関しては、Tail flick testにおいて、YM872とバクロフェン、YM872とネオスチグミン、セロトニンとバクロフェンで相加効果、AP-5とバクロフェン、クロニジンとバクロフェン、ブピバカインとバクロフェンで拮抗作用が認められた以外の組み合わせでは相乗効果を認めた。Formalin test phase 1において、ミダゾラムとネオスチグミンで相加効果、エピバチジンとバクロフェンで拮抗作用を認めた以外は相乗効果を、phase2においては用いた全ての組み合わせで相乗効果を認めた。手術後7日の研究期間中、手術側でVon Frey FilamentsによるAllodyniaの増強、Incapacitance Testerによる加重の低下、足底の熱刺激による逃避反応の増強が認められた。モルヒネの髄腔内投与では、手術によるIncapacitance Testerによる加重の低下を投与量依存性に抑制せず、足底の熱刺激による逃避反応は1μgから十分に抑制した。Von Frey FilamentsによるAllodyniaの増強はモルヒネにより抑制されたが、投与量依存性は認められなかった。これらより手術後痛は痛みの種類により薬剤の効果が異なることが示された。ラット髄腔内にバクロフェン、カルバコール、サルポグレラート、セレコキシブ、エダラボン、プロポフォールを投与してTail flick test、Formalin testを用いて鎮痛効果を検討した。サルポグレラート、セレコキシブ、エダラボン、プロポフォールはTail flicktestでは鎮痛作用を示さなかった。バクロフェン、カルバコールのTail flick testにおける50%有効量(ED_<50>)は各々0.32μg、051μgであった。Formalin testのphase 1、phase 2のED_<50>はバクロフェン0.0062μg、0.0126μg、カルバコール0.201μg、0.0078μg、サルポグレラート94.4μg、306.1μg、セレコキシブ0.0247μg、0.0088μg、エダラボン0.25mg、0.25mg、プロポフォール448.8μg、275.1μgであった。バクロフェンとミダゾラム、AP-5、YM872、クロニジン、ブピバカイン、セロトニンの相互作用を検討し、バクロフェンとミダゾラムのTail flick test、バクロフェンとミダゾラム、クロニジン、ブピバカイン、AP-5、YM872のFormalin testで相乗効果を認めた。ラット後肢に切開を加える術後痛モデルを作成し、熱刺激、圧刺激(Von Frey Filament)、重心動揺(Incapacitance Tester)の経時的変化を観察した。これら3種類の検査は必ずしも同じ傾向を示さなかった。バクロフェン、モルヒネ、ネオスチグミン、カルバコールは、Tail flick test、Formalin testのphase1 phase 2ともにED50値を求めることができた。

相互作用に関しては、Tail flick testにおいて、YM872とバクロフェン、YM872とネオスチグミン、セロトニンとバクロフェンで相加効果、AP-5とバクロフェン、クロニジンとバクロフェン、ブピバカインとバクロフェンで拮抗作用が認められた以外の組み合わせでは相乗効果を認めた。Formalin test phase 1において、ミダゾラムとネオスチグミンで相加効果、エピバチジンとバクロフェンで拮抗作用を認めた以外は相乗効果を、phase2においては用いた全ての組み合わせで相乗効果を認めた。手術後7日の研究期間中、手術側でVon Frey FilamentsによるAllodyniaの増強、Incapacitance Testerによる加重の低下、足底の熱刺激による逃避反応の増強が認められた。モルヒネの髄腔内投与では、手術によるIncapacitance Testerによる加重の低下を投与量依存性に抑制せず、足底の熱刺激による逃避反応は1μgから十分に抑制した。Von Frey FilamentsによるAllodyniaの増強はモルヒネにより抑制されたが、投与量依存性は認められなかった。これらより手術後痛は痛みの種類により薬剤の効果が異なることが示された。
成熟機能細胞の分化転換能（分化可塑性）を利用した新たな組織再生療法の可能性

これまでにわれわれが報告してきた、骨芽細胞株MC3T3-E1を用いた脊髄損傷の再生実験と同様に、初代培養骨芽細胞を用いても脊髄損傷後の神経再生、下肢運動機能回復などが可能か否かについて検討した。その結果、1マトリゲルと混和したMC3T3-E1を移植した群、2マトリゲルと混和した初代培養骨芽細胞(マウス大腿骨あるいは頭蓋冠より分離・培養)を移植した群、3マトリゲルのみを注入した群、4切断のみ行ったコントロール群の4群において、1および2の2群で同様のマウス下肢運動のBBB Scaleの改善が認められた。また、脊損後に経時的に組織を採取し、脊髄切断部、切断部頭側、切断部尾側のそれぞれにおける脊髄組織の組織学的検索を詳細に行ったところ、それぞれの細胞移植に関連した組織修復・再生が認められた。また、これらの組織において、神経細胞関連分子を指標として、RNAレベル、タンパク質レベルでその発現につきreal-time PCR、免疫組織化学的手法等を用いて検索し、移植細胞の動向、発現分子の変化、周囲細胞への分化誘導の有無、分化転換の有無について確認したところ、移植細胞周囲での発現分子の変化が認められた。細胞移植群では、1)切断部に移植細胞あるいは周囲より誘導された細胞が密に存在する、2)切断部より尾側で脊髄組織の変性が抑制される、3)移植細胞以外の周囲の細胞にも神経細胞への誘導効果が見られる、という所見が得られた。これらの脊髄損傷に対する再生治療効果を確認することで、骨芽細胞株MC3T3-E1と同様に初代培養骨芽細胞でも脊髄損傷の再生の可能性が示唆された。当初予定通りに進行しており、今後は他の細胞を使った再生の可能性について検討準備が進んでいるため。これまでの結果をもとに、成熟機能細胞の一つである骨芽細胞株による脊髄損傷の再生医療と同様に、他の組織・臓器由来の様々な成熟機能細胞を用いてもそれらによる同様の脊髄損傷への再生治療が可能か否かにつき検討することで、周囲環境による分化転換現象を利用した再生医療が、どのような成熟機能細胞でも普遍的に可能であるか、または各種成熟機能細胞それぞれにより周囲環境による分化転換誘導の反応性に差があるのか否かを明らかにする。この検討により、再生医療に用いる細胞は目的となる組織・臓器により選定すべきかあるいはどの細胞にも分化転換するポテンシャルがあるのかを確認し、臨床応用に際し、より安全かつ確実な細胞源の確保を目指す。具体的にはまず、比較的入手が容易あるいは臨床を想定して患者負担が少ないと考えられる以下のような細胞を用いて、脊髄損傷部への移植を行い、検討する。1口腔粘膜上皮細胞2皮膚線維芽細胞3軟骨細胞4筋細胞5神経細胞6血管内皮細胞7脂肪細胞さらに本研究では、脊髄損傷のみならず、他の組織・臓器における再生医療にも、各種成熟機能細胞を細胞源として用いることが可能であるか否かについても検討する。失われた組織や臓器の再生を目指す再生医療実現のための細胞源として、現在幹細胞を用いた研究が進められているが、生物学的制約や倫理的問題、遺伝子導入の安全性などいまだ克服すべき点は多い。そこで本研究では、再生医療の実現において必要な細胞の供給源を、従来の幹細胞ではなく、生体内において最終分化した細胞とし、これらの最終分化細胞を遺伝子導入を行うことなく、周囲環境の変化のみにより分化転換させ、目的とする再生医療を実現できる可能性につき検討する。このため、再生を目指す組織・臓器環境に適した成熟機能細胞の選定を行うことで、どのような再生環境においていずれの成熟機能細胞が細胞源として適しているかを明らかにするという、新規の再生医療の確立を目指した基盤研究を行っている。初年度には、マウス大腿部より骨片を採取して骨芽細胞を分離培養した。この骨芽細胞を神経誘導培地により培養すると神経細胞用細胞に変化し、また神経分化マーカーが遺伝子発現していることを確認した。このことから初代培養骨芽細胞は、in vitro下に神経細胞へ分化することが示された。現在は骨芽細胞株MC3T3-E1、初代培養骨芽細胞による細胞移植実験を行い、現在脊髄組織の組織学的検索を進めている。脊髄損傷モデルマウスの作製にあたり、安定した手技の確立に時間を要していた。現在、一部細胞を用いた細胞移植実験を行い、脊損後に経時的に採取した脊髄損傷部分の脊髄組織の組織学的検索を進めているが、検討項目が多く組織の処理および試料の整理に時間を要している。

また、これらの組織において、神経細胞関連分子を指標として、RNAレベル、タンパク質レベルでその発現につきreal-time PCR、免疫組織化学的手法等を用いて検索し、移植細胞の動向、発現分子の変化、周囲細胞への分化誘導の有無、分化転換の有無について確認したところ、移植細胞周囲での発現分子の変化が認められた。細胞移植群では、1)切断部に移植細胞あるいは周囲より誘導された細胞が密に存在する、2)切断部より尾側で脊髄組織の変性が抑制される、3)移植細胞以外の周囲の細胞にも神経細胞への誘導効果が見られる、という所見が得られた。これらの脊髄損傷に対する再生治療効果を確認することで、骨芽細胞株MC3T3-E1と同様に初代培養骨芽細胞でも脊髄損傷の再生の可能性が示唆された。当初予定通りに進行しており、今後は他の細胞を使った再生の可能性について検討準備が進んでいるため。骨芽細胞株MC3T3-E1、初代培養骨芽細胞を用いて脊髄損傷後の神経再生、下肢運動機能回復などが可能か否かについて個体数を増やして検討を継続する。各群間でその後のマウス下肢運動の経時的に観察する。また、脊損後3、5、7日目、2、4、8、12、16週目に組織を採取し、脊髄切断部、切断部頭側、切断部尾側における脊髄組織の組織学的検索を行い、それぞれに関連した組織修復・再生の有無につき検討する。また、これらの組織において、神経細胞関連分子を指標として、RNAレベル、タンパク質レベルでその発現につきreal-time PCR、免疫組織化学的手法等を用いて検索し、移植細胞の動向、発現分子の変化、周囲細胞への分化誘導の有無、分化転換の有無について詳細に確認する。このとき、必要に応じて、MC3T3-E1および初代培養骨芽細胞にGFP遺伝子を導入し、周囲の既存細胞との識別に利用することにより、いずれの細胞が相互にどのような関係にあるのか、相互分子シグナルの発現の有無、相互に分化転換誘導が行われているのか、などにつき検索することで、新たな再生医療確立を目指す。以上を確認することで、骨芽細胞株MC3T3-E1と同様に初代培養骨芽細胞でも脊髄損傷の再生が可能か否か、再生を目指す環境に細胞を置くことによる分化転換を利用した再生医療が不死化細胞株・初代培養細胞にかかわらず共通して認められる現象なのかを明らかにし、両者が脊髄損傷における再生医療の細胞源として応用可能か否かを確認する。これまでの結果をもとに、成熟機能細胞の一つである骨芽細胞株による脊髄損傷の再生医療と同様に、他の組織・臓器由来の様々な成熟機能細胞を用いてもそれらによる同様の脊髄損傷への再生治療が可能か否かにつき検討することで、周囲環境による分化転換現象を利用した再生医療が、どのような成熟機能細胞でも普遍的に可能であるか、または各種成熟機能細胞それぞれにより周囲環境による分化転換誘導の反応性に差があるのか否かを明らかにする。この検討により、再生医療に用いる細胞は目的となる組織・臓器により選定すべきかあるいはどの細胞にも分化転換するポテンシャルがあるのかを確認し、臨床応用に際し、より安全かつ確実な細胞源の確保を目指す。具体的にはまず、比較的入手が容易あるいは臨床を想定して患者負担が少ないと考えられる以下のような細胞を用いて、脊髄損傷部への移植を行い、検討する。1口腔粘膜上皮細胞2皮膚線維芽細胞3軟骨細胞4筋細胞5神経細胞6血管内皮細胞7脂肪細胞さらに本研究では、脊髄損傷のみならず、他の組織・臓器における再生医療にも、各種成熟機能細胞を細胞源として用いることが可能であるか否かについても検討する。
キトサン金属塩系木材防腐剤による高耐朽性発現のメカニズム

本研究では、申請者の発案により、ポストCCAを目指して、小林と協力して開発した全く新しいタイプの木材防腐剤である「キトサン金属塩系木材防腐剤(CCS)」で処理した木材試験体(スギJIS小試験片とスギ実大材)中での薬剤成分(銅元素)の存在様式(固着状況)、ならびにこれと関連させて処理試験片中でのオオウズラタケ(TYP)菌糸の挙動をSEM-WDXAで詳細に調べることによって、CCS処理による防腐効力発現のメカニズムを推定した。JIS・A9201(1991)耐候操作を施したJIS小試験片中での銅元素は、試験片表面に露出している内腔部分と軸方向柔細胞および放射組織中にだけ存在し、それ以外の仮動管内腔中には存在しなかった。このようにJIS小試験片中でCCS成分は試験片表層と柔細胞内腔中に選択的に固着していた。しかし実大材では試験体表層の数細胞にしかCCS成分は存在していなかった。それにもかかわらず、CCS処理したJIS小試験片はCCA3号処理と同等かそれ以上の優れた防腐効力を示した。ところで、TYP菌糸はスギ試験片中で放射柔細胞中に集中的に存在し、軸方向柔細胞中にも存在していたが、仮道管内腔中では放射組織と接しているところを除いて、ほとんど存在しなっかった。このようにTYP菌糸は柔細胞中に選択的に侵入することによって、柔細胞とそれに隣接する細胞壁を劣化することが分かった。TYP菌糸のこのような特異な挙動と、CCS成分の組織中での特異な分布がうまく一致したことによって、高い防腐効力が発現されたものと推察した。このようにCCS処理は、従来のCCA処理のように「全細胞壁含浸固着型」ではなく「特定細胞壁表面固着型」であることにより、CCAの約1/101/20の金属量で同等の効力を発揮し、安全性の高い防腐処理法であることが判明した。平成7年度は、申請者らが木材用防腐剤として新しく開発したキトサン金属塩系薬剤(キトエ-ス:CCS)で処理したスギ試験片中における薬剤成分の存在様式と固着状況について、SEM-WDXAを用いて調べた。その結果、当初の予想に反して、小試験片であったにもかかわらず、薬剤成分(銅元素)は組織中で局在していた。すなわち、仮道管では、試験片表面に露出している内腔の表面には銅元素が高濃度に存在していたが、試験片中央部の仮道管内腔には存在しなかった。一方、軸方向柔細胞(樹脂細胞)や放射柔細胞の内腔には、試験片中央部に至るまで、銅元素がよく浸透していた。しかし細胞壁中での濃度は内腔表面より低く、壁中への浸透は悪かった。固着状況については、薬剤処理(金属含有量にして0.41.6kg/m^3)した後、所定の耐候操作をしても、銅元素の存在様式およびその濃度(線分析によるピーク高さ)に変化がなかったことから、銅元素は細胞内腔表面にかなり強固に固着していることが分かった。また、薬剤処理濃度が変わると組織中での銅元素の分布にも違いが現われた。すなわち1.6kg/m^3含有処理では、表面に露出していた仮道管内腔と全ての放射組織中に銅元素は高濃度に存在していた。1.0kg/m^3含有処理では、一部の放射柔細胞中に薬剤浸透の悪いところがあったが、ほとんど1.6kg/m^3含有処理と同じであった。1.0kg/m^3以下の処理では、組織中の銅元素濃度にかなりムラがあった。

CCSのこのような存在様式や固着状況と、すでに確かめられている防腐性能との関連性を考えると、CCSによる処理は、従来の防腐薬剤のように木材細胞壁中に浸透して効力を発現するのではなく、露出している細胞内腔表面とか柔細胞内腔表面に選択的に固着して、菌糸からの攻撃を外界との境界表面で防ぐことによって効力を発現してると考えられる。この点について、引き続き、詳細に調査中である。平成8年度は、申請者が小林と協力して新たに開発したキトサン金属塩系木材防腐剤(商品名キトエ-ス:CCS)で処理したスギ試験片中、および無処理スギ試験片中におけるオオウズラタケ(TYP)菌糸の挙動をSEMで詳しく調べた。TYP菌糸による腐朽の形態的変化は、まず放射柔細胞壁またはこれに接する仮道管壁に現れたが、仮道管自体の形態変化は少なかった。これは、試験片内における菌糸の存在場所と関係する。すなわち、TYP菌糸は主に放射柔細胞中と軸方向柔細胞中で見受けられたが、仮道管内腔中では、放射組織に接するところを除いて、ほとんど見られなかった。放射組織から仮道管内腔中に菌糸が侵入しているのはしばしば観察された。しかし不思議なことに、木口面を被覆している菌糸層から木口面に開口している仮道管内腔中に菌糸が直接侵入していることは少なかった。菌糸の存在する近くでは、分野壁孔の壁孔膜が消失したり、壁孔縁が消失することによって、孔口の拡大が認められた。さらに放射組織に接する仮道管では有縁壁孔の壁孔縁が劣化を受けてS2フィブリル方向に沿って割裂したり、有縁壁孔の付近にボアホールが開いていたりしていた。さらに仮道管壁の劣化が進行すると、壁自体がS2フィブリル方向に沿って割裂した。このようにTYP菌糸は、小試験片中では放射組織中とか軸方向柔細胞中に選択的に存在していた。次に、CCS処理試験片中では、平成7年度に報告したように、CCSの薬剤成分は放射組織や軸方向柔細胞中に選択的に分布していたことから、これらの細胞中には菌糸が全く存在していなかった。このため、これらの細胞やその周辺の細胞壁ではTYP菌糸による劣化による形態変化が全く認められなかった。このように、CCS処理は薬剤成分が菌糸の侵入経路となるところに選択的に浸透することによって、少ない薬剤量で効果的に防腐効力を発現していることが分かった。