hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Nod1リガンド誘発冠動脈炎の発症機序に関する検討

引き続き、骨髄移植マウスやマウス血管内皮細胞を用いた実験、Nod1リガンド誘発冠動脈炎マウスモデルでの心臓浸潤細胞の解析を行うことで、冠動脈炎の発症機序を明らかにしていくとともに、発症のkeyとなる分子の抑制実験などを今後行っていき、発症機序をより詳細に解析していく。マクロファージだけでなく好中球などを抑制することにより、冠動脈炎が発症するかについて検討を行い、発症機序を解明していく。小児感染免疫予定より順調に実験結果が得られたため、次年度に行う病態解析を予定よりさらに詳細するために、次年度使用額が生じた。特に動物実験が順調に進み、再実験が少なくすんだため。各種ノックアウトマウス、および各機能ノックダウンする抗体などの購入費用に使用する。様々な血球抑制のための実験に使用する予定。
疼痛による情動の発現機序と学習記憶効果

急性あるいは慢性的な疼痛をコントロールすることが困難な理由の一つに感染や疼痛というストレス刺激によって不安、恐怖、およびうつなどの情動が発現し、それらが学習記憶されることで感覚認知の鋭敏化や遷延化を引き起こしていることが考えられる。従って痛覚を受容する中枢神経系として、視床や大脳皮質感覚野以外に、視床下部や、扁桃体、海馬、および前帯状回などの辺縁系の重要性が示唆される。実際、poly I:Cによる感染ストレス時に、視床下部室傍核、視索前野および帯状回において、IFN-α、やセロトニントランスポーターの発現が増強し、痛覚伝達において重要な役割を果たしている脊髄後角膠様質ニューロンに対し、セロトニンが5-HT1A受容体を介して、K+イオンチャンネルの開放による抑制を起こすこと、および膠様質のGABA含有抑制性ニューロンに対し5-HT3受容体を介して活動を上昇させ抑制性シナプス後膜電流を増加させることなどが明らかになった。これらの作用は、侵害受容機構において、セロトニン下行性鎮痛系の作用機序をになうものと考えられた。急性あるいは慢性的な疼痛をコントロールすることが困難な理由の一つに疼痛どいうストレス刺激によって不安、恐怖、およびうつなどの情動が発現し、それらが学習記憶されることで感覚認知の鋭敏化や遷延化を引き起こしていることが考えられる。本年度の本研究の目的は、(1)情動や学習に関与していることが明らかになってきた脳内サイトカインが、これらの痛覚関連学習時において、どのような産生動態を示し、神経系に作用しているのか、および(2)痛覚刺激時の上行性モノアミン系による学習、あるいは条件づけの修飾機序、について明らかにすることであった。そのため、まず、フロイントの完全アジュバントのサスペンジョン溶液をラットの足底部に皮下注した後、von Freyテストで痛覚過敏が発現しているのを確認した。その後、ラットの脊髄、および大脳を取り出し、凍結保存した。神経組織内のIL-1β、IFN-α、TNF-α、IL-6およびそれらの関連物質であるサイクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)、1κB-βなどのmRNAをリアルタイムキャピラリーRT-PCR法で定量するため、それぞれの物質のセンスおよびアンチセンスプライマーを作成し、定量のための最適条件を検討した。大脳皮質の一部を用い、通常のRT-PCR法で得られたcDNAを精製し、濃度希釈系列を作成してPCRによる増幅の標準曲線を作成した。これを用いて、次年度にわたって、凍結した神経組織を、脊髄については後角表層(IおよびII層)後角深層(IIIV層)、さらに、大脳については視床下部や海馬、扁桃体などからパンチアウトした微少標本のmRNAの定量を行う予定である。本年度の本研究の目的は、(1)情動や学習に関与していることが明らかになってきた脳内サイトカインが、これらの痛覚関連学習時において、どのような産生動態を示し、神経系に作用しているのか、および(2)痛覚刺激時の下行性モノアミン系による侵害刺激受容機構の修飾機序を明らかにするため、脊髄スライス標本を用いて脊髄膠様質ニューロンに対するセロトニンの作用を検討した。研究成果を列挙すると、(1)神経組織内のIL-1β、IFN-α、TNF-α、IL-6およびそれらの関連物質であるサイクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)、IκB-βなどのmRNAをリアルタイムキャピラリーRT-PCR法で定量するため、それぞれの物質のセンスおよびアンチセンスプライマーを作成し、定量のための最適条件を検討した。その結果、poly I:Cによる感染ストレス時に、視床下部室傍核、視索前野および帯状回において、IFN-α、IL-1βおよびIκB-βのmRNA発現が増強していることが明らかになった。(2)脊髄後角

膠様質ニューロンに対し、セロトニンが5-HT1A受容体を介して、K^+イオンチャンネルの開放による抑制を起こすこと、および膠様質のGABA含有抑制性ニューロンに対し5-HT3受容体を介して活動を上昇させ抑制性シナプス後膜電流を増加させることなどが明らかになった。これらの作用は、侵害受容機構において、セロトニン下行性鎮痛系の作用機序をになうものと考えられた。
合成ポリペプチドやたんぱく質を分子骨格とした酸化還元分子集合系の作製と機能発現

1.L-フェロセニルアラニンの合成レドツクス活性を持つ非天然アミノ酸としてフェロセニル基をもつアミノ酸を新たに合成し、アシラーゼ法によって光学分割した。昨年度で合成したアンスラキノニルアラニン、ベンゾキノニルアラニンとあわせて、一連のレドックスアミノ酸を得ることができた。2.フェロセニル基やアンスラキノニル基を含むヘリックスポリペプチドの合成と電気化学特性フェロセニルアラニンを1個あるいは2個ヘリックス内部に導入したポリペプチドを固相合成法で得た。これらのポリペプチドのレドックス特性をDMF中のCV曲線から検討した結果、ポリペプチドヘリックスに固定された1個のフェロセニル基は、低分子のフェロセニル基とほぼ同じ酸化還元電位を示すことが分かった。ただし電極との電子移動効率はかなり低下していることが分かった。3.フェロセニル基やアンスラキノニル基を含むポリペプチド電子伝達体の合成ポリペプチドの剛直なヘリックス構造に沿って電子を運ぶ電子伝達体を作製するため、フェロセニル基を一定の間隔でポリペプチドに導入した。3個のアミノ酸に1個数の割合でフェロセニル基を定序配列させることにより、ヘリックスに沿って1擬1次元的にフェロセニル基を配列させることが可能であることが明らかになった。
日本中世の金融動向に関する基礎的研究～利子率、貸借期間、担保等の推移と法～

上記の「研究の目的」を達成するためには、日本中世に関する金融の実態を示すデータが必要となる。ところが、日本中世について、金銭貸借における貨幣・金融財、利子率、貸借期間、担保などの時代ごとの推移に関するデータは、現時点では存在しない。そこで本研究では、米・銭などの中世の貨幣・金融財の借用状と各種の算用状類(年貢その他に関する計算書)におけるそうした記載から、金融の実態に関するデータを構築し、それらの推移を明らかにするとともに、その分析を通じて、変化の要因・メカニズムなどについて解明しようとするものである。
悪性神経膠腫療法時の免疫応答とheterogeneityの関係

神経膠腫のゲノム・エピゲノムを含むheterogeneityと免疫応答の関係性を明らかにするとともに、腫瘍幹細胞や微小環境による腫瘍免疫抑制の解明、免疫療法と新生血管抑制因子を含む分子標的薬との組み合わせやタイミングなどを検討する基礎的な研究を模索することにより、我が国発信の免疫療法を含んだ新たな臨床試験の可能性が広がり、治療成績を改善させる礎となることを期待する。
生物圏におけるセレンの循環機構の解明

セレンは植物にとって非必須であるが、動物にとって必須元素であり、陸域の生物圏では、棲息する生物に毒性を発揮することなく、循環が起こっていると考えられる。そこで動物の排泄形であるセレノ糖が植物に対してどのような影響を与えるのか明らかにすることを目的とし、検討を行った。さらにセレンの代謝過程を明瞭にするため、同属のテルルの代謝との比較を行い以下の成果を得た。セレンは動物にとって必須元素であり,陸域の生物圏では,棲息する生物に毒性を発揮することなく,循環が起こっていると考えられる。セレンの化学的特徴として,セレンは類金属であるため,生体内においては共有結合性の化合物を形成し,セレン自体の化学形を変化させて代謝されていく。一方,植物においてセレンは必須元素ではなく有用元素と認識されている。セレン蓄積性を示す植物ではセレノアミノ酸が生合成されることが知られている。そこでまず,植物におけるセレンの代謝過程を検討した。次に植物→動物のセレンの移行はセレノアミノ酸という双方に有益な化学形で行われていると理解できるが,動物→植物の移行形態であるセレノ糖は双方に有益な,つまり動物だけでなく植物にとっても有益な化学形であるといえるのか明らかではない。そこで動物の排泄形であるセレノ糖が植物に対してどのような影響を与えるのか明らかにすることを目的とし,検討を行った。さらにセレンの代謝過程を明瞭にするため,同属のテルルの代謝との比較を行った。新規のセレン蓄積性植物におけるセレンの代謝物の探索を行ったところ,新規のセレン化合物としてセレノホモランチオニンを同定した。またセレンはその代謝過程で同属の硫黄と厳密に区別されているが,セレノアミノ酸の一種であるセレノメチオニンとメチオニンは区別されずに代謝されることが明らかとなった。テルルについても,セレンよりもさらに厳密に区別されるものの,テルロメチオニンについては,やはりメチオニンと区別されないという結果を得た。またセレン蓄積性植物におけるセレンの化学形依存的な取り込み機構についても検討い,成果を挙げつつある。セレンは植物にとって非必須であるが、動物にとって必須元素であり、陸域の生物圏では、棲息する生物に毒性を発揮することなく、循環が起こっていると考えこれろ。セレンの化学的特徴として、セレンは類金属であるため、生体内においては共有結合性の化台初を形成し、セレン自体の化学形を変化させて代謝されていく。陸棲の動物においては、セレンはセレン糖という化学形態で排泄される。一方、セレン蓄積性を示す植物ではセレノアミノ酸が生合成されることが知られている。そこでまず、植物におけるセレンの代謝過程を検討した。次に植物→動物のセレンの移行はセレノアミノ酸という双方に有益な化学形で行われていると理解できるが、動物→植物の移行形態であるセレノ糖は双方に有益な、つまり動物だけでなく植物にとっても有益な化学形であるといえるのか明らかではない。そこで動物の排泄形であるセレノ糖が植物に対してどのような影響を与えるのか明らかにすろことを目的とし、検討を行った。さらにセレンの代謝過程を明瞭にするため、同属のテルルの代謝との比較を行った。セレンはその代謝過程で同属の硫黄と厳密に区別されているが、セレノアミノ酸の一種であるセレノメチオニンがひとたび生合成されると、メチオニンは区別されずに代謝される可能性を示した。セレンを蓄積する植物であっても、テルルについては、セレンと厳密に区別しており、テルルの蓄積性は低いことを示した。一方で、テルルを蓄積する植物を見出し、権利化に結び付けた。海棲の動物では、陸棲の動物とは異なるセレン代謝を行っている可能性を見出し、現在海域におけるセレンの循環についても検討を開始した。今年度は、実際に動物が排泄するセレン代謝物をモデル植物に曝露し、植物体内でのセレンの代謝がどのように行われているのかを解析するための検討に着手した。これまでの植物に対するセレンの曝露形態は無機のセレン化合物に限られていたため、実際の生物圏におけるセレンの循環を解明する上で、本研究の成果が重要な知見を与えることが期待された。想定したとおり、無機のセレン化合物と有機の動物由来の代謝物では植物に対する代謝過程が異なり、有機のセレン化合物で優位に機能すると考えられる新規の代謝経路の存在を示す成果を得つつある。この経路が解明されれば、必須元素としてのセレンを有効的に植物から摂取する方法を提案したり、環境汚染物質としても懸念されるセレンの植物を利用した浄化法の提案につなげられたりできることが期待される。一方、生物圏におけるセレンの循環を考える上で、セレンと同族の元素をどのように生物が識別しているのかに関する検討も実施したところ、識別を担う生体内因子の存在が確認できた。さらに、セレンと協調して生体内の酸化還元を担う銅との機能的な相補関係を解明することにより、生物間における抗酸化ミネラルのクロストークを検討した。

これにより、動物細胞内における新たな銅の制御機構を明らかにすることができた。この成果は、セレンと同じ抗酸化ミネラルであり、特に神経変性疾患の原因となる銅の代謝異常の機構に関する新たな知見を提供し、アルツハイマー病、プリオン病あるいは筋萎縮性側索硬化症などの診断、治療及び創薬に貢献するものと期待される。
複合系の反応試剤の開発

各種金属化合物と有機化合物との複合系の形成を基盤とした、優れた特徴をもつ反応試剤の開発について検討した。以下にその成果をまとめる。1、不斉触媒の開発(向山、柴崎、奈良坂)光学活性ジアミン配位子をもつスズ(II)トリフラ-トを触媒とする不斉アルド-ル反応が、プロピオニトリル中で効率良く進行し、高い不斉収率で対応する付加体を与えることが明らかになった。各種Synーαー置換ーβーヒどロキシエステル,Synーα,βージヒドロキシエステルが、極めて高い光学純度で合成できる。さらに、パラジウムのキラルなジホスフィス錯体が、分子内ヘック反応、πーアリルパラジウムのアルキル化反応の不斉触媒となり、種々の2環性化合物を良好な不斉収率で合成することに成功した。一方、キラルなルイス酸触媒の開発についても検討され、キラルな1,4ジオ-ルで修飾したチタン化合物が、[4+2],[2+2]付加環化反応の優れた不斉触媒となることを明らかにした。2、高選択的な反応試剤の開発(鈴木、奈良橋、松本)有機ホウ素化合物と芳香族あるいはビニルトリフラ-トとのクロスカップリング反応がリン酸カリウムの存在下パラジウム触媒を用いると、すみやかに進行し、オレフィン、ジエン、ビアリ-ル類が立体選択的に、合成できる。一方、有機化合物の一電子酸化による活性化を基盤とし、ニトロ化合物、βーケト酸、アリルスルフィドなどと、オレフィンとの分子間クロスカップリング反応を見出すことができた。さらに、混合原子価白金錯体を用いることによって、オレフィンの酸素酸化が高い選択性で進行することも明らかになっている。
サイクリン依存性キナーゼによる肝薬物代謝酵素活性制御機構の解明

肝細胞増殖因子が内在性サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害因子の発現を亢進させるとともに、UGT1A1の発現がCDK2阻害剤roscovitine添加により顕著に増大することを見出した。RoscovitineはPXRの350番目セリンのリン酸化に関わるCDK2の作用を抑制することによりUGT1A1遺伝子転写を亢進させること、言い換えると、CDK2によるPXRの350番目セリンのリン酸化がRXRやコアクチベーターとの結合を低下させ、核内での転写調節抑制に働き、負の制御に関わっていることを明らかにした。我々は細胞周期調節因子であるサイクリン依存性キナーゼ(CDK)を介してCARの発現が調節されていることを報告している。本研究において肝がん細胞HepG2の増殖を抑制するHGFが、CARが転写調節の中心的役割を演じているUGT1A1やCYP2B6の発現を亢進することを初めて明らかにした。HGFがCDK阻害因子p16、p21、p27の発現を亢進させることから、HepG2、HuH6、SW480細胞を用い、各種CDK阻害剤、細胞情報伝達阻害剤が薬物代謝酵素の発現レベルに及ぼす影響をリアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング法を用いて解析した。HuH6細胞にHGFを作用させてもp16、p21、p27の発現亢進や増殖抑制は認められず、またUGT1A1やCYP2B6の発現誘導も認められなかった。RoscovitineによりUGT1A1、CYP2B6、CYP3A4の有意な発現亢進が認められたが、HGFによる発現亢進がU0126により抑制されたことから、ERK→p16、p21、p27→CDKを介した制御の可能性が推察された。CDK 4をノックダウンしても影響は認められなかったが、CDK 2をノックダウンしたHepG2、SW480細胞ではUGT1A1、CYP2B6、CYP3A4 mRNAsやタンパク質の発現亢進が認められた。またヒト肝臓Chang liver細胞のCDK 2をノックダウンした場合も、UGT1A1、UGT1A6、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B15の発現が顕著に増大しており、細胞周期に依存してCDK 2がこれらの酵素の発現を負に調節していることが示された。PXRをノックダウンするとroscovitineによるCYP3A4の発現亢進が抑制されたが、CARやPXRをノックダウンしてもUGT1A1、CYP2B6の発現に影響が認められなかった。これらの結果からUGT1A1、CYP2B6の発現がCDK2を介してCYP3A4とは異なる機序で抑制的に制御されていることが示された。細胞分化、増殖時の細胞周期制御メカニズムの研究を進める過程で、種々のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤を用いて薬物代謝酵素(UGT1A1、CYP2B6、CYP3A4)の発現レベルに及ぼす影響について検討した結果、roscovitineがこれら薬物代謝酵素の発現を有意に亢進させることを見いだした。Roscovitineは主にCDK2抑制効果を示すことから、CDK2 siRNAを用いてCDK2をノックダウンすると、薬物代謝酵素の発現が有意に亢進した。さらに、細胞周期に依存した薬物代謝酵素の発現変動を検討するため、double thymidine block法によってS期に同調させた細胞を用い、FCS存在下で再び生育を開始させたところ、CDK2のリン酸化(活性化)に伴い、UGT1A1、CYP2B6の発現が抑制され、一方、CDK2が脱リン酸化されると発現が亢進されることから、CDK2の活性化が薬物代謝酵素の発現を負に制御していることを示す結果が得られた。RoscovitineによるUGT1A1の転写活性化機序を解析したところ、PXRの寄与が最も高いことが示された。PXRのDNA結合部位あるいはリガンド結合部位に存在するSer/ThrをAlaあるいはAspに変異させたPXRを用いて、発現に及ぼす影響を解析したところ、Thr^<57>、Thr^<290>、Ser^<350>、Thr^<408>をそれぞれAspに変異させると、UGT1A1の発現が強く抑制されることが認められた。YFP-PXR融合蛋白質を発現させ核内移行を解析したところ、Thr^<290>、Thr^<408>の変異により核内移行は抑制されたがSer^<350>の変異は核内移行に対しては影響を認めなかった。CDK2の基質特異性がSer^<350>に認められることから、CDK2はPXRの核内での活性化を抑制することにより薬物代謝酵素の発現を負に制御していることが示唆された。

HGF添加培養液では肝がん細胞HepG2の細胞増殖が抑制され、UGT1A1、CYP2B6等の薬物代謝酵素の発現が亢進することを明らかにしている。HGFがCDK阻害因子pl6、p21、p27の発現を亢進させるとともに、UGT1A1の発現がサイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤roscovitine添加により顕著に増大することから、細胞周期調節因子、特に、CDKに着目して薬物代謝酵素の発現制御機構を解析した。CDK1、CDK5をノックダウンしてもUGT1A1発現レベルに有意な変動は認められなかったが、CDK2をノックダウンするとUGT1A1、CYP2B6、CYP3A4の発現が亢進することから、CDK2がこれら酵素の発現を負に制御していることが示された。UGT1A1やCYP2B6の遺伝子発現にCARが転写調節の中心的役割を演じているが、roscovitineを作用させてもCARの核内レベルに有意な影響は認められなかった。RoscovitineによりPXRの核内レベルが増大したことから、PXRに焦点を当て、UGT1A1発現調節機序を解析した。PXRプラスミドDNAをトランスフェクトし過剰発現させた細胞(PXRリガンドrifampicin無添加)に、roscovitineを作用させるとUGT1A1レポーター活性が亢進するが、rifampicinとともにroscovitineを作用させた場合、相加、相乗効果は認められず、roscovitineによりリガンド非依存性に転写が亢進することが示された。変異を導入したPXRを用いてUGT1A1遺伝子発現に及ぼすroscovitineのリガンド非依存性のPXR活性化作用を解析したところ、T350APXRによりUGT1A1 mRNAの発現が亢進し、S350DPXRによるUGT1A1の発現抑制が示された。S350DはRXRとの結合能が低下していたが、コアクチベーターSRC2過剰発現により活性が回復したことから、S350のリン酸化はRXRやコアクチベーターとの結合能が低下させ、活性が消失したと推察された。野生型PXRはCDK2によりリン酸化されたが、S350DPXRのCDK2によるリン酸化が抑制されたことから、roscovitineはPXRの350番目セリンのリン酸化に関わるCDK2の作用を抑制することによりUGT1A1遺伝子転写を亢進させること、言い換えると、CDK2によるPXRの350番目セリンのリン酸化が核内での転写調飾抑制に働き、負の制御に関わっていることを明らかにした。
高精度超音波振動援用加工スピンドルによる難削材への微細・傾斜穴加工技術の開発

慣用的なドリル加工に、超音波振動を重畳することで、a)切りくず排出や潤滑剤の供給を促進することで切削抵抗を抑える、b)工具先端外周部の速度成分は、工具回転による速度成分と振動速度成分の和になる効果がある。これらの特長は、a)については剛性の低い工具、b)については切削速度を稼ぐことが困難な加工に有効である。すなわち小径ドリル工具において、超音波振動援用加工技術は有効であるはずであった。これまで、工具径φ1のドリル工具を超音波振動させることで、切削抵抗が非常に小さくなり、工具の長寿命化やバリの抑制などの効果を確認した。しかし、この手法をφ0.2のドリル工具において適用した場合、超音波振動の効果は消失し、工具の摩耗が激しくなったり、被加工穴が歪んだりする現象が見られた。ドリル工具の有限要素振動解析および振動状態の高速度カメラ撮影を行って本実験装置での駆動周波数60kHz近辺における振動モードを観測した結果、ドリル工具が軸方向に縦振動せずに、曲げ振動モードが顕著であることが確認された。その結果、工具先端が被削材に衝突することで、工具寿命が低下したり、穴形状が歪んだと考えられる。すなわち、φ0.2程度の市販小径ドリル工具を縦振動モードで超音波振動援用加工に利用することはできないことがわかった。しかし、φ0.2程度の穴あけ加工は、燃料噴射ノズルや半導体製造・検査装置において最も需要の多い穴径であり、なんらかの対応が必要である。今後は、超音波振動援用加工に特化した工具形状を設計・製作する予定である。近年、金型製造においては、焼入れ鋼や超硬合金に対して穴径0.1mm、深さ1mm穴を高精度に多数個開けるという要求がある。この場合、レーザ加工、電子ビーム加工および放電加工などの特殊加工が適応されるが、その特性上、加工速度を向上させると、被加工面の熱影響層が厚くなり、穴精度も悪化する。そのため、生産効率と加工精度を両立するのが困難である。これに対し、ドリル加工で熱処理済みの金型鋼に直接穴を開ければ、加工速度と加工精度が両立する。ところが中大径ドリル加工に比べて穴径1mm下の小径ドリル加工では、切削速度の不足、切屑排出性の悪さやドリル剛性不足による折損の問題が、飛躍的に高まる。当然ながら、高硬度難削材に対する加工では、この問題はより顕著になる。本研究では、この問題を解決するための方法として、ドリル工具を超音波振動させながら切削穴あけ加工する方法に注目する。ドリル先端を軸方向に超音波振動させることによって、切屑排出性の向上や切削抵抗の低減が期待できる。本年度は、第一段階としてφ1のドリルを用いて、超音波振動援用加工の特性を明らかにすることで、小径ドリル加工への適用可能性を検討した。焼き入れしたダイス鋼(HRc60程度)に対して、深さ2mm穴あけ加工を行った結果、軸方向切削抵抗は超音波振動を援用することで510%程度低下した。また、その効果は加工回数が進み摩耗が進行するほど、また加工深さが深いほど顕著になった。すなわち、過酷な加工条件ほど超音波振動の効果が高まることがわかった。また、振動援用加工は切れ刃の食い込みを改善するため、特に穴入り口部の幾何精度や表面粗さが良好になることが顕微鏡観察の結果明らかになった。
Revを標的とした新規抗HIV療法の確立

多剤併用療法によっても未だ完全なヒト免疫不全症ウイルス(HIV)の駆逐は不可能であり、既存の分子標的だけでなく、新しい分子標的に対する薬剤の開発が必要不可欠である。本研究ではウイルス複製に必須なアクセサリー蛋白のひとつであるRevを治療標的とする基盤研究を行ってきた。レトロウイルスベクターによってRevペプチドを細胞内で発現させるとHIV複製を抑制できることから、種々の部位を含むRevペプチドをMT-2細胞で発現させ、その抗HIV部位を調べた。アルギニンリッチなヘリックス構造をとる部位が最も強い効果を示し、以前報告されたRev阻害蛋白であるRevM10と同レベルのHIV複製阻害能をもつことを明らかとした。また、同じレトロウイルス属のHTLV-IのRex蛋白のアルギニンリッチ部位でも同じような阻害効果を確認した。また、これらのペプチドは、17アミノ酸まで小分子化可能であることを明らかとした。これらのペプチドを化学合成し、感染細胞に加えたところ、HIVコレセプターであるCXCR4とHIV gp120の結合も阻害することを明らかとした。この方法では十分に細胞内にペプチドが導入されておらず、現在までに報告のある新たな方法で導入を試みているが現時点では有効な方法は見出されていない。このため、当研究期間内には新規治療法の確立には至っていないが、当研究期間中に得られた結果を踏まえて今後さらなるRevペプチドの作用機序解明を行う。さらにペプチドの縮小化、改変を行い、現在臨床治療上、最大の問題となっている薬剤耐性ウイルスの克服戦略を構築する。また、これらの研究成果からRNAウイルスにおけるゲノムの核外移行に関してだけでなく、宿主細胞におけるRNAの核外移行に関しても新しい知見を得ることを目標とする。多剤併用療法によっても未だ完全なヒト免疫不全症ウイルス(HIV)の駆逐は不可能であり、既存薬の改良だけでなく、新しい分子標的に対する薬剤の開発が必要不可欠である。本研究ではウイルスアクセサリー蛋白のひとつであるRevを治療標的とする基盤研究を行っている。本年度はレトロウイルスベクターによってRevペプチドを細胞内で発現させるとHIV複製を抑制できることから、種々の部位を含むRevペプチドをMT-2細胞で発現させ、その抗HIV効果を調べた。今年度行った方法では十分に細胞内にペプチドが導入されておらず、現在新たな方法で導入を試みている。このペプチドの作用機序を解明するためにRevとその標的RNA配列RREの結合をLuciferase活性によって測定しうる系を確立している。これらのことを踏まえて来年度は上記のRevペプチドにおける活性部位の同定と作用機序の解明を行う。レトロウイルスベクターによってRevペプチドを細胞内で発現させるとHIV複製を抑制できることから、種々の部位を含むRevペプチドをMT-2細胞で発現させ、その抗HIV効果を調べた。アルギニン

リッチなヘリックス構造をとる部位が最も強い効果を示し、以前報告されたRev阻害蛋白であるRevM10と同レベルのHIV複製阻害能をもつことを明らかとした。また、同じレトロウイルス属のHTLV-IのRex蛋白のアルギニンリッチ部位でも同じような阻害効果を確認した。これらのペプチドを化学合成し、感染細胞に加えたところ、HIVコレセプターであるCXCR4とHIVgp120の結合も阻害することを明らかとした。この方法では十分に細胞内にペプチドが導入されておらず、現在までに報告のある新たな方法で導入を試みているが現時点では有効な方法は見出されていない。このため、当研究期間内には新規治療法の確立には至っていないが、当研究期間中に得られた結果を踏まえて今後さらなるRevペプチドにおける活性部位の同定と作用機序の解明を行う。さらにペプチドの縮小化、改変を行い、現在臨床治療上、最大の問題となっている薬剤耐性ウイルスの克服戦略を構築する。また、これらの研究成果からRNAウイルスにおけるゲノムの核外移行に関してだけでなく、宿主細胞におけるRNAの核外移行に関しても新しい知見を得ることを目標とする。
肥満抑制因子レプチンの生理的意義と肥満の診断および予防薬・治療薬への応用

肥満におけるレプチンの分泌とインスリン抵抗性の発現、さらにTNF-α分泌との関連を解析した。さらに、ヒト肥満のモデルとして、先天性肥満ラットを用いてレプチン遺伝子発現と肥満そして糖尿病発症への機構を調べた。一方、株化細胞である3T3-L1繊維芽細胞を脂肪細胞に分化させたin vitroの系を用いて、インスリン感受性を増加させるチアゾリジンジオン化合物の作用機構と肥満改善との機構を解析した。得られた結果は下記の通りである。(1)ヒト肥満において、血糖値、血漿のインスリン、レプチン、およびTNF-α値すべてが高い値を示した。とくに、レプチン値は高く肥満のもっとも良い指標となることが示された。食事制限と適度の運動はこれらの高い値を改善させ肥満を抑え、糖尿病発症の予防につながることが期待された。(2)先天性肥満ラツト(fa/fa)は5週齢の早い時期からインスリンおよびレプチンが高く、ヒト肥満のモデルとして有用であることが確認された。このラットを用いて、TNF-αの分泌がインスリン抵抗性を引き起こすこと、およびレプチンの上昇を抑制することから、これらの作用機構の解明が肥満の予防につながることも分かった。(3)3T3-L1繊維芽細胞をインスリンで分化させるとレプチンを分泌するようになる。TNF-αはインスリンの作用を抑えて脂肪細胞への分化を抑制し、レプチンの分泌も減少させた。一方、チアゾリジンジオン化合物はインスリンの作用を強めて脂肪細胞への分化を増強させ、TNF-αの作用を消失させたが、レプチンの分泌も抑制した。チアゾリジンジオン化合物によるレプチン分泌の抑制は、レプチンの感受性の増加によると結論した。レプチンの分泌の過剰は肥満発症の指標となり、チアゾリジンジオン化合物はレプチンの感受性を増加させることが期待された。遺伝性の肥満マウスの発症原因が、脂肪細胞から分泌するレプチン遺伝子の変異またはレプチンの作用低下という異なった機構で説明されている。ある種の肥満型ラットでは、血中インスリン値は異常に高く、レプチンの著しい増加を伴い、さらに、TNFαも増加していた。この肥満ラットの場合には、レプチンの情報伝達系に異常があり、TNFαが関与したインスリン抵抗性が推定された。一方、肥満のヒトの血中のインスリンとレプチンを測定すると両者とも健康人に比べ高値を示すことが分かった。したがって、ヒトの肥満の場合は、ラットの場合と同様に、レプチンの情報伝達機能が低下していると推定した。3T3-L1繊維芽細胞はインスリン、デキサメサゾン、IBMXを添加して培養すると脂肪細胞へ分化してレプチンを分泌するようになる。II型糖尿病の治療薬であるトログリタゾンは核内受容体のPPARγに結合してインスリンの作用を強めることが認められている。このトログリタゾンによるインスリン作用の増強はインスリンの情報伝達系の因子を増加させることも分かった。しかしながら、3T3-L1繊維芽細胞にトログリタゾンとインスリンを共存させ、脂肪細胞への分化を促進させると、レプチンの分泌がほとんど起こらなかった。この現象はトログリタゾンがレプチンのmRNA発現を抑制しているためであることも分かった。トログリタゾンがインスリンの作用を強めて脂肪細胞への分化を促進しているにも拘わらず、レプチン分泌を抑制していることの生理的意義は不明である。これらの研究の成果から、レプチンの作用がII型糖尿病の発症の予防と治療に貢献できるものと期待される。

遺伝的肥満型糖尿病のマウスやラットにおいて、レプチン合成あるいはレプチン受容体に障害があることが分かり、レプチン作用の異常が肥満型糖尿病と密接に関連していることが示された。したがって、遺伝的肥満ラットについて、レプチンの生理的役割を追求するため、各週齢でのレプチン、インスリン、インスリン抵抗性を引き起こすといわれているTNF-αの分泌量を測定した。その結果、レプチンの情報伝達系の障害がレプチンの分泌過剰を引き起こし、糖および脂質の代謝系の異常につながる可能性が示された。そこで、レプチンの分泌制御機構について、3T3-L1脂肪細胞株を用いて検討した結果、レプチンの分泌促進因子としてインスリンがあるが、II型糖尿病の治療薬になっているperoxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γという受容体のリガンドがレプチン合成をmRNA発現レベルで抑制して、レプチンの分泌過剰を制御していることを突き止めた。つぎに、肥満のヒトを対象に糖代謝と脂質代謝、さらに、インスリン、レプチン、およびTNF-α分泌との関連を調べた。肥満のヒトにおいても、ラットと同様に血漿中のインスリンとレプチンの値がいずれも高く、分泌過剰に基づくこれらホルモンの機能低下が認められた。TNF-α値の高いこともインスリン抵抗性発症の原因になって血糖値が正常値の上限を示したことと一致している。適度の運動と食事制限がこれらの因子の分泌過剰を是正して正常に機能する方向に作用する。一方、PPARγのリガンドがインスリンの感受性を改善させ、インスリンの分泌過剰を制御する作用をもつことが示されたのである。
植物生育促進菌類とミヤコグサの共生機構の解析

植物生育促進菌類のトリコデルマ菌は、ミヤコグサの抵抗性遺伝子を抑制し、ゆるい共生関係を樹立するが、ミヤコグサの菌根菌や根粒菌が利用する共生シグナル伝達経路に変異が起きた系統では、抵抗性遺伝子の発現を抑制することができなくなり、根内部に侵入できず、共生関係の樹立に失敗することが示されつつある。このことから、トリコデルマ菌とミヤコグサのゆるい共生関係には共生経路が必要であることが考えられる。ミヤコグサとゆるい共生関係を構築する糸状菌Trichoderma koningii(Tk)が共通共生シグナル伝達経路(common signaling pathwa y:CSP)を利用しているのか検証するために、ミヤコグサの野生型および共生変異系統(pollux-、ccamK-)の根部にTkを接種し、病害抵抗性関連遺伝子である4つのイソフラボノイド型ファイトアレキシン(ベスチトール)生合成遺伝子、PKR1、IFS、HI4'OMT、PTR1の発現誘導パターンをノーザンブロット法により解析した結果、IFS, HI4'OMT, PTR1で発現誘導が起きていることを確認してきた。今年度は、ミヤコグサのCSPの前後に位置する菌根形成シグナル経路に遺伝的変異を有するME778およびME2329を用いて、糸状菌(菌根菌)共生経路が生育促進菌類(PGPF)であるトリコデルマ菌のゆるい共生関係構築に必要であるか検討した。トリコデルマ菌をミヤコグサの幼苗根に感染させるとミヤコグサのCSP変異系統に感染させた場合と同様に、PKR1遺伝子の発現には誘導抑制がかかり、他の3つの遺伝子(IFS、HI4'OMTおよびPTR1)では発現誘導が見られた。これら発現誘導が復活した3つの遺伝子の発現誘導パターンはミヤコグサとは不親和を示す他のPGPFであるPenicillim菌やFusarium菌接種時と類似していることからも、ME778およびME2329系統ではトリコデルマ菌との共生関係構築が拒絶されたことが示唆された。さらにトリコデルマ菌の共生能欠損菌株作成のための遺伝子組み換え法の開発を行った。本菌への遺伝子導入には、ポリエチレングリコール6000を用いた場、最も効率が良くなったが、遺伝子細胞導入試薬リポフェクチンを使用すると効率は悪化した。これらの方法により遺伝子導入が可能となったが、遺伝子導入菌株のゲノムサザン解析から、導入遺伝子の挿入位置は、比較的決まった場所であること、ランダムな遺伝子導入は難しいことが予想された。ミヤコグサとゆるい共生関係を構築する糸状菌Trichoderma koningii(Tk)が共通共生シグナル伝達経路(common signaling pathway:CSP)を利用しているのか検証するために、ミヤコグサの野生型および共生変異系統(pollux-、ccamK-)の根部にTkを接種し、病害抵抗性関連遺伝子であるイソフラボノイド型ファイトアレキシン(ベスチトール)生合成遺伝子、PKR1、IFS、HI4'OMT、PTR1の発現誘導パターンをノーザンブロット法により解析した。さらに、ミヤコグサの菌根形成変異系統であるME778およびME2329に同様にTkを接種し、ファイトアレキシン生合成遺伝子のノーザン解析を行った。ME778は、菌根菌認識能を欠失しており、ME2329は、菌根形成能を欠失していると考えられている。これらの変異系統を用いることで、糸状菌Tkは、ミヤコグサの菌根菌特異的共生シグナル伝達経路を利用しているか調べることができる。ノーザン解析の結果、TkをミヤコグサのCSP変異系統(pollux-、ccamK-)に接種した場合、PKR1遺伝子の発現誘導は野生型とあまり差異はなかったが、他のIFS、HI4'OMTおよびPTR1遺伝子では発現誘導が見られた。これら生合成遺伝子の発現誘導パターンはミヤコグサとは不親和を示すPenicillim菌やダイズ黒根腐病菌接種時と類似しており、Tkとの共生関係構築を拒絶することを意味する。また、菌根形成変異系統でも、CSP変異系統と同様の遺伝子発現パターンが検出されたことから、Tkは、これまで菌根菌特異的であると考えられてきたミヤコグサの共生シグナル伝達経路を利用している可能性が示された。ミヤコグサとゆるい共生関係を構築する生育促進菌類(PGPF)のTrichoderma koningii(Tk)が共通共生シグナル伝達経路を利用しているのか検証するために、ミヤコグサの共生変異系統(菌根形成シグナル伝達経路に遺伝的変異を有する)にTkを接種し、病害抵抗性関連遺伝子である4つのイソフラボノイド型ファイトアレキシン生合成遺伝子の発現誘導パターンを解析した。その結果、IFS, HI4'OMT, PTR1の発現誘導が復活することを確認してきた。

今年度は、菌の共生関連遺伝子を得るためにランダムミューテーション法によりTkの共生能欠損菌株を作製するとともに、Tkのミヤコグサ共生変異系統の根部への定着を顕微鏡解析し、糸状菌(菌根菌)共生経路がTkのゆるい共生関係構築に必要であるか検討した。Tk野生菌株では、ミヤコグサ野生系統のファイトアレキシン生合成遺伝子の発現が抑制されるが、遺伝子組換え体の中に発現量が回復した菌株が見られた。これら菌株は、ミヤコグサのファイアレキシン生合成遺伝子の発現抑制に関わる遺伝子が欠損したために共生能を消失することが考えられるため、今後、ゲノム上の形質転換ベクターの挿入位置を解析することによって、共生関連遺伝子の解明につながる。Tk野生菌株を接種したミヤコグサ強制変異系統の根の横断切片の顕微鏡観察を行い、根内部への感染を解析した結果、野生系統MG20では、根の表皮細胞(間隙)内だけでなく内皮細胞(間隙)内でも菌糸が確認された。一方、共生経路変異系統では、根の表面上では菌糸の定着が一部確認できたが、根の内部まで侵入した菌糸は検出できなかった。このことから、Tkがゆるい共生関係を樹立するには菌根菌の共生経路が必要であることが示唆されたが、今回は横断切片の精度が非常に低く、菌糸の見極めが非常に困難であったため再度の検証が必要である。植物病理学課題推進者の移動先には本研究課題に不可欠な分析機器や蛍光顕微鏡が整備されていないこともあり、変異系統におけるファイトアレキシン生合成遺伝子の発現応答まで終了したが、変異系統根への菌糸の侵入の確認およびファイトアレキシンの生産の確認が未だに残されている。課題推進者の人事異動のため、変異系統におけるファイトアレキシン生合成遺伝子の発現応答まで終了したが、変異系統根への菌糸の侵入の確認およびファイトアレキシンの生産の確認が残されている。トリコデルマ菌のCSPや菌根菌共生経路利用を検証するため、引き続きミヤコグサの共生変異系統(CSP変異体:pollux-、ccamk-、ME778、ME2329)の根部にトリコデルマ菌を接種し、3、5、7日後に根面上の菌糸の定着を光学顕微鏡により解析する。さらに、根内部への侵入を確認するために接種根のパラフィン切片を作製し、菌糸侵入を検証する。トリコデルマ菌の遺伝子変異体作製のため、開発したマーカー遺伝子を組み込んだ糸状菌用の形質転換用ベクターを用いて、プロトプラストーPEG法により形質転換体を作製し、遺伝子の組み換え領域の解析を行う。作製する遺伝子変異体のミヤコグサのファイトアレキシン生合成遺伝子発現誘導能およびファイトアレキシン分泌誘導能の解析を行う。T. koningiiのCSP利用を検証するため、ミヤコグサの共生変異系統(CSP変異体:pollux-、ccamk-、ME778、ME2329)の根部にT. koningiiを接種し、3、5、7日後に根面上の菌糸の定着を光学顕微鏡により解析する。T. koningiiの共生変異菌株の作製:T. koningiiの遺伝子変異体作製のため、開発したマーカー遺伝子を組み込んだ糸状菌用の形質転換用ベクターを用いて、プロトプラストーPEG法や新たな遺伝子導入技術であるアグロバクテリウム法を行う。作製する遺伝子変異体からミヤコグサに対するファイトアレキシン生合成抑制能の欠損した変異体を選抜する。ミヤコグサのファイトアレキシン分析機器の都合により、作出したトリコデルマ菌の遺伝子組換え体接種によるファイトアレキシン分泌の分析が実施できなかったため、実験補助員の人件費に余剰が生じた。
ヒト癌幹細胞に対する分子免疫病理学的基盤研究

ヒト癌幹細胞cancer stem cell/癌起始細胞cancerinitiatingcell(CSC/CIC)に発現する癌抗原の同定とCSC/CIC癌ワクチン開発を目的として、CSC/CIC癌抗原の解析を進めた。その結果、そのような抗原として数十の分子を同定した。これらのうち発現が正常幹細胞に発現を認めない、極めて腫瘍限局性のすぐれた分子として特徴づけられた3分子につきCSC特異的ヒト腫瘍抗原として詳細な解析を行うことができた。これらの成果はヒトCSC腫瘍ワクチン開発の基盤となるものであり、臨床研究、臨床試験に移行可能な段階に達することが出来た。ヒト乳癌、肺癌、膵癌、大腸癌あるいは骨軟部腫瘍からSide population (SP)法によりヒト癌幹細胞分画を分離した。これらはいずれも非SP分画細胞より10010,000倍の高いin vivo造腫瘍性をSCIDマウスで見せた。DNAアレイによりこれらヒト癌幹細胞に選択的に発現する抗原解析を行ったが、以下の5つの抗原をヒト癌幹細胞抗原として同定した。それらはである。これらのいつれの抗原もヒト正常間葉系幹細胞には発現をみなかった。各々の免疫学的特性につき解析中であるが、(1)(2)は細胞面にも発現し抗体の標的にもなり得る分子である。興味あることに(1)(4)(5)は正常組織ではtestisにのみ発現を示すCace-Testis (CT)抗原の特徴をもつ。すなわち、CT抗原がヒト癌幹細胞抗原として重要な研究を占める可能性が示唆され、癌免疫治療の方向性に新たなパラダイムを与える可能性を意味した。特に(5)DNA JB8は免疫原性が高くin vivoで腫瘍の免疫学的拒絶を強く誘導することを確認し、ヒト癌幹細胞特異的ワクチンとしての期待がもたれた。本研究は免疫学的な癌の多様性の解析をめざし、ヒト癌の根幹細胞と考えられる癌幹細胞あるいはcancer initiating cellsに対するT細胞免疫応答の全容を分子免疫病理学的な手法を使い明らかにしようとするものである。本研究の成果は免疫学的癌治療、癌予防に立ちはだかる癌の免役逃避機構等にも大きな解決方法を与えるものと思われ、最も有効なヒト癌治療、予防への方策を得るものと思われる。また病理学的にも本研究は大きな発展が期待され癌幹細胞の新たな特徴づけが可能になる研究につながるといえる。まず、骨軟部腫瘍からヒト癌幹細胞(SCS)、癌起始細胞(CIC)の分離を解析した。その結果SP(side population)法により、ヒト骨肉腫よりCSC/CIC分離に成功した。次にSP法ばかりでなく、ALDH-1法も併用し大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、口腔癌でCSC/CICの分離に成功した。それらに特異的に発現する抗原を種々の方法で解析した。それらのうちについて大きく研究が進んだ。T細胞エピトープも決定した。またin vivo系での治療、予防効果も確認した。1)CSC発現腫瘍抗原のHLA24、HLA-A24拘束性抗原ペプチド決定CSCに発現する抗原は癌免疫治療に極めて適している抗原ワクチンと考えられ、従ってHLA-A24、A2など高頻度発現にアリルにより提示される癌ペプチド抗原を決定した。特に、Or7c-1、DNAJB 8 CSC腫瘍抗原はCSC特異性も高く興味深いものといえる。2)免疫関連分子の発現解析CSCにも免疫を逃避する機構が存在するのかの検討を行った。この疑問は癌免疫の制御にとり、大きな課題である。もし逃避が存在するならその機構を明らかにし、対応方法を確立しない限り有効な癌免疫治療法は不可能である。その結果、HLA-class Iは少なくともCSCで発現を保持することが示唆された。3)CSCのCTLによる感受性解析4)ヒト癌免疫制御のグランドデザイン、グランドプロトコール樹立と臨床試験以上の各研究の成果を総合し、ヒト癌制御に最も適したCSCに安定発現する腫瘍抗原の選択、決定を行った。また、それらのHLA-A24、A2拘束性の抗原ペプチドのうち最も免疫原性の高いペプチドの選択を行った。加えてCSCにおけるHLA class I分子、class II分子、TAP等の免疫関連分子の発現制御を解析、考察し、これらの分子の発現制御に関する薬剤等の投与プロトコールを検討した。最終フェースでは、癌患者での臨床試験に入り、毒性検討、臨床効果、免疫応答につき解析を加え、製薬化、創薬化への基盤を整える。
超短パルスレーザーアブレーションによる微小電子源の作製

本研究の目的は,フェムト秒レーザーを用いて,FEDのエミッタティップを目指した微小電子源をレーザー加工プロセスのみで作製することである.本研究ではレーザーがコンタクトマスクを通過する際の回折現象を利用してレーザー強度分布に強弱を付け,これを金属表面に照射しアブレーションすることによって金属を除去し,1つの開口部内に多数の微細突起物を作製する.H16年度は,照射パルス数,レーザー波長,マスク開口部長さ,タングステン表面とマスクとの距離をパラメーターとして系統的な実験を行い,微細突起物形成の主要因を探した.その結果、マスク開口部エッジからの回折が微細突起物形成の主要因であることがわかった。H17年度は,H16年度の成果を基にタングステン表面にマイクロスパイクアレイを作製し,電子源としての性能を評価する為電界放出電流を測定した.本研究で得られた電流密度は,窒素ドープCVDダイヤモンド,カーボンナノチューブ、グラファイトナノファイバー等と比較して2桁以上低かった.この理由として,作製されたマイクロスパイクの先端曲率半径にばらつきがあり,効果的な電界電子放出に寄与するマイクロスパイクの数が,面積と比較して少ないことが考えられる.この問題を克服すれば,電流密度を数桁以上増加させることが出来ると予想される.そうすると,CNT等と同等あるいはそれ以上の電流密度が低電圧で得られることになり,本手法は環境に優しいクリーンな微小電子源作製のパワフルツールとなりうる.本研究の目的は,フェムト秒レーザーを用いて,FEDのエミッタティップを目指した微小電子源をレーザー加工プロセスのみで作製することである.本研究ではレーザーがコンタクトマスクを通過する際の回折現象を利用してレーザー強度分布に強弱を付け,これを金属表面に照射しアブレーションすることによって金属を除去し,1つの開口部内に多数の微細突起物を作製する.この方法で金属表面に微細突起物を作製した例は無く,微小電子源に応用した例も無い.本手法の利点は以下の通りである:1.レーザーのみで作製する,薬品を一切用いない完全ドライプロセスであるため,環境に優しい,2.レーザー発振器は完全固体レーザーであり,また加工中にも毒ガスを発生しないためクリーンなプロセスである,3.工数はレーザー照射プロセスのみである.従って本手法の完全ドライ・クリーンプロセスが達成されると環境汚染の防止に役立ち,また工数を軽減できることから省エネにもなる.本研究では,照射パルス数,レーザー波長,マスク開口部長さ,タングステン表面とマスクとの距離をパラメーターとして系統的な実験を行い,微細突起物形成の主要因を探した.その結果マスク開口部エッジからの回折が主要因であると考えられたので,実験条件に相当する回折強度パターンを計算し,実験結果と比較した.計算結果は,実験結果と定性的に良く一致した.従って,マスク開口部エッジで回折された強度分布をもったレーザーによるアブレーションによって,マイクロスパイクは形成され配列することがわかった.次年度では,作製されたマイクロスパイクの電子源としての性能を評価する為,電界電子放出電流を測定する予定である.本研究の目的は,フェムト秒レーザーを用いて,FEDのエミッタティップを目指した微小電子源をレーザー加工プロセスのみで作製することである.本研究ではレーザーがコンタクトマスクを通過する際の回折現象を利用してレーザー強度分布に強弱を付け,これを金属表面に照射しアブレーションすることによって金属を除去し,1つの開口部内に多数の微細突起物を作製する.H16年度は,照射パルス数,レーザー波長,マスク開口部長さ,タングステン表面とマスクとの距離をパラメーターとして系統的な実験を行い,微細突起物形成の主要因を探した.その結果、マスク開口部エッジからの回折が微細突起物形成の主要因であることがわかった。H17年度は,H16年度の成果を基にタングステン表面にマイクロスパイクアレイを作製し,電子源としての性能を評価する為電界放出電流を測定した.本研究で得られた電流密度は,窒素ドープCVDダイヤモンド,カーボンナノチューブ、グラファイトナノファイバー等と比較して2桁以上低かった.この理由として,作製されたマイクロスパイクの先端曲率半径にばらつきがあり,効果的な電界電子放出に寄与するマイクロスパイクの数が,面積と比較して少ないことが考えられる.この問題を克服すれば,電流密度を数桁以上増加させることが出来ると予想される.そうすると,CNT等と同等あるいはそれ以上の電流密度が低電圧で得られることになり,本手法は環境に優しいクリーンな微小電子源作製のパワフルツールとなりうる.
β-リン酸三カルシウムによる顎骨再建法

正常ラット上顎骨に人工的に形成した顎骨高度吸収部位に対して,人工骨補填材β-リン酸三カルシウム(β-TCP)を補填し,そのβ-TCPの顎骨骨形成促進能あるいは自家骨置換能を把握することによって,β-TCPが顎骨骨吸収モデルの顎骨再建対して有用であるかについて検討することを目的とした.実験動物には,10週齢のWistar系雄性ラット90匹(1群10匹)を用い,両側上顎第一臼歯を抜歯し,人工的顎骨骨欠損を形成した.右側半側を被検側,残りの左側半側を対照側とし,被検側に対してβ-TCPを補填し,対照側は偽手術のみを行った.β-TCPの補填1,2,4,6,8,10,12,16および20週後に上顎骨を摘出した.なお,1群10匹のうち半数は未脱灰標本とし,β-TCP補填時および上顎骨摘出2週前にカルセインを,上顎骨摘出1週前にテトラサイクリンを腹腔内投与し,摘出した上顎骨はVillanueva bone stainを行い,50μmの前頭断未脱灰研磨標本を作製した.残りの半数は,通法に従いパラフィン包埋し,前頭的な4μmのH-E染色標本とした.その後,光学顕微鏡あるいは蛍光顕微鏡を用いて,β-TCPの新生骨との界面部に生じる現象を観察するとともに,β-TCPの骨置換能に関する観察を行った.β-TCP補填側あるいは対照側とも1週後には新生骨が観察されるとともに,β-TCP補填側における新生骨量は対象側に比べて若干量的に優位であった.しかし,2週後以降20週にかけて新生骨あるいはその後形成された成熟骨は量的あるいは質的に殆ど差が認められなかった.また,β-TCP補填20週後においてもβ-TCPが残存している場合が認められた.以上のことから,本実験モデルに対するβ-TCPの補填は,その初期においてはある程度の骨形成促進能を有する可能性が示唆された.正常ラットの上顎骨を対象として,人工的に形成した顎骨高度吸収モデルに対して人工骨補填材β-リン酸三カルシウム(β-TCP)を補填し,β-TCPと新生骨との界面部に生じる現象を検索するとともに,β-TCP周囲に形成される新生骨の定性的観察を行う.また,人工骨補填材β-TCP周囲に形成される骨形成量の経時的変化を観察することによって,β-TCPの溶出・吸収の過程を経て自家骨に置換される状態の定量的観察を行う.以上のことにより,人工骨補填材β-TCPによる顎骨骨形成促進能,β-TCPによる自家骨置換能を把握し,顎骨骨吸収モデルの顎骨再建が可能であるかについて明らかにすることを目的とした.実験動物には,10週齢のWistar系雄性ラット90匹(1群10匹)を用い,両側上顎第一臼歯を抜歯し,人工的顎骨骨欠損を形成した.右側半側を被検側,残りの左側半側を対照側とし,被検側に対してβ-TCPを補填し,対照側は偽手術のみを行った.β-TCPの補填1,2,4,6,8,10,12,16および20週後に上顎骨を摘出した.なお,1群10匹のうち半数は未脱灰標本とし,β-TCP補填時および上顎骨摘出2週前にカルセインを,上顎骨摘出1週前にテトラサイクリンを腹腔内投与し,摘出した上顎骨はVillanueva bone stainを行い,50μmの前頭断未脱灰研磨標本を作製した.残りの半数は,通法に従いパラフィン包埋し,前頭的な4μmのH-E染色標本とした.現在,β-TCPと新生骨との界面部に生じる現象を観察するとともに,β-TCP周囲に形成される新生骨の定性的観察を行い,また画像解析システムを構築し,β-TCPおよび新生骨の占有面積を計測している.正常ラット上顎骨に人工的に形成した顎骨高度吸収部位に対して,人工骨補填材β-リン酸三カルシウム(β-TCP)を補填し,そのβ-TCPの顎骨骨形成促進能あるいは自家骨置換能を把握することによって,β-TCPが顎骨骨吸収モデルの顎骨再建対して有用であるかについて検討することを目的とした.実験動物には,10週齢のWistar系雄性ラット90匹(1群10匹)を用い,両側上顎第一臼歯を抜歯し,人工的顎骨骨欠損を形成した.右側半側を被検側,残りの左側半側を対照側とし,被検側に対してβ-TCPを補填し,対照側は偽手術のみを行った.β-TCPの補填1,2,4,6,8,10,12,16および20週後に上顎骨を摘出した.なお,1群10匹のうち半数は未脱灰標本とし,β-TCP補填時および上顎骨摘出2週前にカルセインを,上顎骨摘出1週前にテトラサイクリンを腹腔内投与し,摘出した上顎骨はVillanueva bone stainを行い,50μmの前頭断未脱灰研磨標本を作製した.残りの半数は,通法に従いパラフィン包埋し,前頭的な4μmのH-E染色標本とした.