hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
八郎湖における環境資源と外来生物規制の影響評価

その結果、外来魚の拡散防止の管理が徹底できれば八郎湖は釣りを主体とした観光資源として地域にとって価値はあると考える住民は全体の約55%、河口湖のように遊漁料を徴収し八郎湖の環境整備・改善に使用することに賛成する住民は全体の約65%であることが判明した。本研究では、外来生物法が八郎湖の環境資源にどのような影響を及ぼしているのかを定量的に評価し、その環境価値について客観的な判断材料を得た。これは今後八郎湖という希少な環境資源の有効利用に結びつくと考えられる。さらにこの研究を皮切りに、八郎湖以外にも同様の問題を抱える地域で、環境資源価値を客観的に評価するという試みが推進されることを期待する。当初、複数回の現地調査を実施しデータ分析を行い、調査取りまとめを行う予定であったが、現地商店の店舗来客人数等の代替データ使用で調査回数の削減ができることが判明し、計画を変更した。代わりに、現地訪問者以外にもアンケート調査範囲を拡大する必要性が判明し、そのように計画し実行した。24年度が最終年度であるため、記入しない。基本的には当初の計画通り研究を進める。
臨床応用を目的としたゲムシタビン耐性膵癌に対する抗CXCR2抗体療法の検討

膵癌に対する化学療法はゲムシタビン(Gem)が広く使用されているが,その効果は十分に満足いくものではない.その理由にはGemに対する耐性化がある.我々はGem耐性膵癌細胞株を樹立しその特徴を検討した.Gem耐性株(Gem-R)はGem感受性株(Gem-S)に比べCXCL8/IL-8の分泌が増加し,それに伴い血管新生能も亢進していた.CXC-Chemokine/CXCR2 axisを抗CXCR2 Abを用いて抑制すると,Gem耐性によって亢進した血管新生能が抑制され,Gem耐性膵癌に対する抗CXCR2 Ab療法の可能性が示唆された.膵癌に対する化学療法はゲムシタビン(Gem)が広く使用されているが,その効果は十分に満足いくものではない.その理由にはGemに対する耐性化がある.そのメカニズムの解明のためにGem耐性膵癌細胞株を樹立した.一方,我々は今までに,CXC-Chemokine/CXCR2 axisを中心としたケモカインネットワークが膵癌血管新生に重要な役割を果たしていることを報告してきた.膵癌患者の膵液中のCXC-Chemokineの濃度は,非癌患者から採取した膵液中のそれより高値であった.膵癌細胞株は,正常膵管上皮細胞(HPDE)よりCXC-Chemokineの分泌能が高かった.膵癌細胞株でも,樹立したGem耐性株は,Gem感受性株よりCXC-Chemokine(CXC8/IL-8)の分泌が亢進していた.CXC-Chemokineは腫瘍血管新生を亢進するため,そのレセプター抗体(CXCR2抗体)療法は臨床応用への可能性を含んでいる.膵癌に対する化学療法はゲムシタビン(Gem)が広く使用されているが,その効果は十分に満足いくものではない.その理由にはGemに対する耐性化がある.我々はGem耐性膵癌細胞株を樹立しその特徴を検討した.Gem耐性株(Gem-R)はGem感受性株(Gem-S)に比べCXCL8/IL-8の分泌が増加し,それに伴い血管新生能も亢進していた.CXC-Chemokine/CXCR2 axisを抗CXCR2 Abを用いて抑制すると,Gem耐性によって亢進した血管新生能が抑制され,Gem耐性膵癌に対する抗CXCR2 Ab療法の可能性が示唆された.医歯薬学平成25年度の研究目的は,膵癌および正常膵におけるCXC-chemokines発現の比較である.内視鏡的に採取した膵液中のCXC-Chemokine濃度は癌患者で高値であることを確認した.細胞レベルでも,膵癌細胞株は正常膵管上皮細胞よりCXC-Chemokine発現が高いことを確認した.さらに,Gem耐性獲得により,膵癌細胞株のCXC-Chemokine(CXCL8/IL-8)分泌が亢進することを確認した.これにより,CXC-Chemokineのレセプター中和抗体(CXCR2抗体)療法の可能性が示唆された.残額が多少残ったので、翌年有効に使用することにした。予定通り研究行うことができた。残額が多少残ったので、翌年有効に使用することにした。
移動走査方式を用いた林冠構造-放射環境-熱収支特性関係の二次林における実態把握

森林の林冠部の構造は森林の水文気象学的特性に影響を与える主要な因子のひとつである。この林冠部の構造の把握にはリモートセンシングの活用が考えれてきたが、その検証のための地上調査が容易でないことが問題であった。従来の検証のための地上調査方法は点情報しか得られなく、かつ多大の労力を要したり、あるいは森林構造の単純化を前提としたものであった。数百メートルスケールで森林の林冠構造を3次元で高精度に測定する方法は、これまでは存在しなかった。私たちはこれまでの研究で、葉と枝を区別して林冠の3次元構造を測定する方法として、2つの波長のレーザを用いる光切断法を森林に適用することを提案した。しかし、この方法はレーザー光を回転走査していたためデータの得られる空間の範囲が小さいという問題があった。そこで、数百メートルの林冠構造を地上測定できる移動走査型の方法を開発した。システムは一輪車と光切断法による距離測定部から構成され、その位置と姿勢は自律的に測定される。距離測定部は一輸車の動きを利用して移動走査される。本装置を森林内で数百メートル移動させながら測定することにより、林冠の上端局・下端高・林冠厚の空間変動が数百メートルにわたって測定される。レールや索道などの設備を用意する必要は全くないという大きな特徴をもつ。森林の気象水文的な特性を理解するため、本装置を用いて測定した結果から林冠表面の粗度の頻度・パターン・大きさを解析した。豊田市内の二次林におけるフラックス観測では林冠表面構造の幾何学的な季節変化が顕熱フラックスの動態に影響する結果が得られ、これらから林冠構造と放射環境・熱収支特性の実態把握を進めることができた。(1)移動走査方式による林冠構造把握を実現するための機器の開発,(2)林冠構造-放射環境-熱収支特性関係の二次林における実態把握,(3)3次元林冠構造データの活用法の検討の,以上の3つについて研究を進めた。(1)は試作品およびデータ収集用プログラムを製作した。実験室内で稼動試験を実施した。(2)は豊田市内の里山林において顕熱フラックスを乱流変動法で測定し,林冠表面温度を放射温度計で測定し,顕熱のバルク輸送係数CHを求めた。CHと主風向方位の関係は風向の地形依存性を反映するとともに,季節変動を呈し,森林構造の幾何学的な季節変化の顕熱フラックスの動態への影響を示唆する結果となった。(3)では2つの有効な活用法を提示した。ひとつはレーザをアクティブに林冠に照射し森林の3次元構造と同化部・非同化部の判別を同時に測定する際に,従来は正規化植生指標のような放射輝度間の演算で対応していたが,本測定のような近距離隔測定においてはレーザ輝度を距離の3/2乗で補正することが有効であることが判った。二つめは3次元林冠構造データを用いたLAI間接測定法の補正で,従来は全天空画像を用いLAIを算出する際に水平な均質な厚さの林冠を前提としていたが,3次元林冠構造データを用いて全天空画像上の林冠厚さを計算に織り込むことにより,その前提条件の成り立たない森林での使用が可能となった。以上の(2)(3)の周辺技術の検討により数百メートルオーダの林冠構造の把握の重要性が高まった。これは(1)で開発中の移動走査方式で把握可能であり,次年度の研究進展が期待される。
水と水溶液の圧力誘起ポリアモルフィック転移と分子運動の関係についての研究

水は4°Cでの密度極大など、物性物理学的な観点からは異常な液体であると認識されている。水の異常性は水が低温で2種類のアモルファス状態をもつことに由来するとの仮説が提案されている。2種類の状態の間での相転移はポリアモルフィック転移と呼ばれる。本研究では純粋な水といくつかの水溶液を用いて、2種類の純粋なアモルファス氷の分子運動の特徴づけ、ポリアモルフィック転移前後での水溶液中の水の分子運動の解明に取り組む。
化合物半導体表面/界面の原子・電子構造制御に関する研究

(1)カルコゲン原子による化合物半導体安定化の機構を明かにする.(2)選択的な化学反応特性を利用して,表面/界面の物性を原子レベルで制御する.(3)隣接ダイマー(表面原子の2量体)間の相互作用が反発力である場合の相変化の機構を調べる,といった目的でS/Se処理により安定化したGaAs表面の構造を扱い以下の結果を得た.(a)As/GaAs(001)のように隣接ダイマー間の相互作用が引力の場合,ダイマーはクラスターを形成して安定化することが知られてきたが,Se/GaAsの場合は,余剰電子が反結合軌道に入ることによって,隣接ダイマーが反発力を持ち,新しい対称性を持つ構造を取ることが期待される.実際,Se/GaAs(001)表面で,2x3超構造や,結晶軸からずれた方向に軸を持つ,新しいダイマー列構造を見いだした.(b)上記2x3構造より少し高温で現れる4x1構造は,ダイマー列のペアリングという新しい表面再構成の構造を持つことを示した。2x1→4x1の構造変化,及び4x1構造でのダイマーのバックリングが表面のSe原子密度に依存すると,表面/界面の電子構造を原子レベルで制御する可能性が開かれる.実際,同手法による表面構造の制御が最近試みられ、光電子分光によって電子構造の連続的な変化が示されている.(c)2x1と2x3構造の解析から,両者間での相変化の機構を調べ、Ga2Se3構造の形成過程を明かにした.同構造の解析は,II-VI/III-Vヘテロ界面の初期成長過程の解明においても意味を持つものと思われる.(1)カルコゲン原子による化合物半導体安定化の機構を明かにする.(2)選択的な化学反応特性を利用して,表面/界面の物性を原子レベルで制御する.(3)隣接ダイマー(表面原子の2量体)間の相互作用が反発力である場合の相変化の機構を調べる,といった目的でS/Se処理により安定化したGaAs表面の構造を扱い以下の結果を得た.(a)As/GaAs(001)のように隣接ダイマー間の相互作用が引力の場合,ダイマーはクラスターを形成して安定化することが知られてきたが,Se/GaAsの場合は,余剰電子が反結合軌道に入ることによって,隣接ダイマーが反発力を持ち,新しい対称性を持つ構造を取ることが期待される.実際,Se/GaAs(001)表面で,2x3超構造や,結晶軸からずれた方向に軸を持つ,新しいダイマー列構造を見いだした.(b)上記2x3構造より少し高温で現れる4x1構造は,ダイマー列のペアリングという新しい表面再構成の構造を持つことを示した。2x1→4x1の構造変化,及び4x1構造でのダイマーのバックリングが表面のSe原子密度に依存すると,表面/界面の電子構造を原子レベルで制御する可能性が開かれる.実際,同手法による表面構造の制御が最近試みられ、光電子分光によって電子構造の連続的な変化が示されている.(c)2x1と2x3構造の解析から,両者間での相変化の機構を調べ、Ga2Se3構造の形成過程を明かにした.同構造の解析は,II-VI/III-Vヘテロ界面の初期成長過程の解明においても意味を持つものと思われる.
物語的な世界表象／コミュニケーションに基づく文化的認知アーキテクチャの構築

2018年度の目標は研究の基本となる理論を作ることであった.その目標通り,ストーリーという情報の構造とその生成を中心とする認知システム/アーキテクチャを作るための基本的な理論・考え方を作った.主要な成果を以下に記す.・物語論におけるストーリーと物語言説という用語を応用して,個体間のコミュニケーションを媒介する表現としての物語=言説と,個体の内部に作られる心的表象としての物語=ストーリーとを区別した.その上で,ストーリーの形で世界を時間的及び言語的に組織化しながら,外界とインタラクションしたり,他者とコミュニケーションをしたりすることが,人間的な知能の本質であるという考え方を提案した.また,その考え方に基づいて,エージェントにとっての世界としてのストーリーの構造を分類的に整理した.・ストーリーを生成する仕組みの基本原理について検討し,その計算モデル化にむけた理論を考案した.ストーリーは,部分と部分,部分と全体が相互に依存し合う,複雑な構造をもつと考えられるため,ストーリーの生成は,従来の中央制御的な情報処理ではなく,分散的・自己組織的なプロセスとしてモデル化する必要があるという考えを示した.この考え方に基づいて,ストーリー生成の基本となる情報処理のタイプを分類的に整理した.・ストーリーを中心とする統合的な記憶システムの枠組みと,それに基づくストーリー生成の基本原理に関する基本的な考え方を整理した.2018年度の目標は,これから行う研究の理論的な土台を作ることであった.研究実績の概要に記したように,ストーリー中心型の認知システム(アーキテクチャ)の基本的な考え方を作ることができた.また,2019年度に行うべき研究の課題も明確に整理することができた.よっておおむね順調に進展しているといえる.今後はより具体的な計算モデルの構築と実装を進めていく.2019年度は,ストーリーを中心とする統合的な記憶システムの枠組みと,それに基づくストーリー生成の基本原理の計算モデル化及び実装を行うことを主な課題として研究を推進する.2018年度の目標は研究の基本となる理論を作ることであった.その目標通り,ストーリーという情報の構造とその生成を中心とする認知システム/アーキテクチャを作るための基本的な理論・考え方を作った.主要な成果を以下に記す.・物語論におけるストーリーと物語言説という用語を応用して,個体間のコミュニケーションを媒介する表現としての物語=言説と,個体の内部に作られる心的表象としての物語=ストーリーとを区別した.その上で,ストーリーの形で世界を時間的及び言語的に組織化しながら,外界とインタラクションしたり,他者とコミュニケーションをしたりすることが,人間的な知能の本質であるという考え方を提案した.また,その考え方に基づいて,エージェントにとっての世界としてのストーリーの構造を分類的に整理した.・ストーリーを生成する仕組みの基本原理について検討し,その計算モデル化にむけた理論を考案した.ストーリーは,部分と部分,部分と全体が相互に依存し合う,複雑な構造をもつと考えられるため,ストーリーの生成は,従来の中央制御的な情報処理ではなく,分散的・自己組織的なプロセスとしてモデル化する必要があるという考えを示した.この考え方に基づいて,ストーリー生成の基本となる情報処理のタイプを分類的に整理した.・ストーリーを中心とする統合的な記憶システムの枠組みと,それに基づくストーリー生成の基本原理に関する基本的な考え方を整理した.2018年度の目標は,これから行う研究の理論的な土台を作ることであった.研究実績の概要に記したように,ストーリー中心型の認知システム(アーキテクチャ)の基本的な考え方を作ることができた.また,2019年度に行うべき研究の課題も明確に整理することができた.よっておおむね順調に進展しているといえる.今後はより具体的な計算モデルの構築と実装を進めていく.2019年度は,ストーリーを中心とする統合的な記憶システムの枠組みと,それに基づくストーリー生成の基本原理の計算モデル化及び実装を行うことを主な課題として研究を推進する.物品費として想定していたコンピュータが,他の予算により入手できたため購入不要となったことに加え,初年度であったこともあり,論文掲載費用や海外発表の旅費が当初の想定よりも少なくなった.2019年度は,海外(主にアメリカ)での研究発表を23回以上行う見込みであるため,繰越分は主にその旅費にあてる計画である.
双非等方物質からの電磁応答におけるトポロジカル効果

(1)トポロジカル物質からのアクシオン電磁応答に双非等方性を考慮すること,(2)双非等方性物質に内包されたトポロジカル要素を発掘すること,の2つを軸に考える.前者については,電磁気構成方程式の非等方的な非対角成分が,トポロジカル物質の電磁応答にどのように表出するかを明らかにすることが計画の中心である.後者については,前者とは逆に現象論的に行われてきた双非等方性物質の議論に,電子系のトポロジカルな構造がどのように反映されているのかを明らかにすることで,回路におけるジャイレーターとトポロジカル物質の対応をつける.(1)トポロジカル物質からのアクシオン電磁応答に双非等方性を考慮すること,(2)双非等方性物質に内包されたトポロジカル要素を発掘すること,の2つを軸に考える.前者については,電磁気構成方程式の非等方的な非対角成分が,トポロジカル物質の電磁応答にどのように表出するかを明らかにすることが計画の中心である.後者については,前者とは逆に現象論的に行われてきた双非等方性物質の議論に,電子系のトポロジカルな構造がどのように反映されているのかを明らかにすることで,回路におけるジャイレーターとトポロジカル物質の対応をつける.
協奏的酸塩基複合ナノ構造を有するメタン酸化カップリング触媒の創成

メタンから基幹化学物質であるエタン/エチレンを直接合成するための酸化カップリングに有効な触媒の創製を目指し、研究代表者が見出したNO直接分解反応との活性点構造の類似性に着目した触媒開発研究を実施した。まずは触媒設計のための基本的指針を得るため、種々の希土類酸化物とバリウムを複合化させた触媒をクエン酸法により合成し、メタン酸化カップリング活性を評価した。希土類酸化物とバリウムを複合化した触媒はNO直接分解活性を示すが、担体である希土類酸化物の塩基性により活性が異なることを見出している。メタン酸化カップリング反応におけるエタン/エチレン収率も希土類酸化物により大きく異なり、特に酸化ディスプロシウムを用いることで750°Cで16%程度の収率を達成できた。一方、酸化セリウムを用いた場合は750°Cでの収率が5%程度であり、最も活性が低くなった。エタン/エチレン収率とNO直接分解活性には比較的良好な相関性があることを改めて明らかにすることができた。希土類酸化物をナノ分散することによる塩基点の増大を目指し、種々の酸化物(ZrO2、SiO2、Fe2O3、Mn2O3など)との複合化を検討した。固体酸性を示すSiO2やFe2O3を用いた場合、メタン転化率、エタン/エチレン収率とも大きく低下した。主に検討した酸化イットリウムではSiO2やFe2O3と複合化することで塩基特性が低下したことによるものと推察した。一方、ZrO2と複合化した場合、650800°Cの温度域でエタン/エチレン収率の向上が見られた。引き続き検討が必要であるが、酸性・塩基性の二元機能を有するZrO2と相互作用することで酸素活性化に有効な塩基点が増大したものと推察しており、引き続き、非常に弱い塩基性を示す酸化物と希土類酸化物を複合化することによるメタン酸化カップリング活性の向上効果を検討する。平成30年度は「酸塩基複合化触媒の調製とメタン酸化カップリング活性」について検討を実施し、触媒の塩基特性の影響を解明するための研究実施計画を立てた。塩基特性が異なる種々の希土類酸化物について詳細な検討を実施し、比較的マイルドな塩基点が多い酸化物を合成することの重要性を見出すことができた。in situラマン分光法については評価条件の最適化に時間を要したため、一部計画から遅れているところもあるが、触媒の高活性化についてはすでに検討を開始しており、次年度につながる知見も出てきていることから、おおむね計画通りに進捗している。平成30年度の検討により、酸塩基の二元機能を有する酸化物との複合化の有効性を見出すことができた。この知見をさらに進展させ、弱い塩基性を示す酸化物との複合化による活性向上効果を検討するとともに、改めてNO直接分解活性との関連性を詳細に検討し、新たな視点からの触媒設計の指針導出を目指す。さらに、平成30年度の導入したin situラマン分光セルを活用した活性点構造に関する検討を本格的に開始するとともに、同位体酸素を用いての酸素種の挙動に着目した反応機構解明につながる知見創出を目指した検討を実施する。得られた成果を整理し、高活性なメタン酸化カップリング触媒を創成するための触媒設計指針を提案する。

in situラマン分光法については評価条件の最適化に時間を要したため、一部計画から遅れているところもあるが、触媒の高活性化についてはすでに検討を開始しており、次年度につながる知見も出てきていることから、おおむね計画通りに進捗している。平成30年度の検討により、酸塩基の二元機能を有する酸化物との複合化の有効性を見出すことができた。この知見をさらに進展させ、弱い塩基性を示す酸化物との複合化による活性向上効果を検討するとともに、改めてNO直接分解活性との関連性を詳細に検討し、新たな視点からの触媒設計の指針導出を目指す。さらに、平成30年度の導入したin situラマン分光セルを活用した活性点構造に関する検討を本格的に開始するとともに、同位体酸素を用いての酸素種の挙動に着目した反応機構解明につながる知見創出を目指した検討を実施する。得られた成果を整理し、高活性なメタン酸化カップリング触媒を創成するための触媒設計指針を提案する。平成30年度においては主要な物品として「ラマン分光用in situセル」の購入を予定し、計画通りに購入した。詳細に実験するために、想定した仕様を若干変更(プログラム昇温が可能な温度調節器)したため、予定価格を若干上回る価格で購入した。消耗品として同位体酸素の購入も計画していたが、上記の理由のため平成30年度には購入することができなくなり、次年度利用(約8万円)が生じることとなった。次年度利用の経費に加えて、次年度に配分される研究費と合わせて同位体酸素(約18万円)を購入する計画である。
膜タンパク質複合体の成熟化過程をin vivo活写する

細胞質外で働くタンパク質は、リボソームによる合成→細胞質膜へのtargeting→膜透過→folding/assemblyと言った複数の過程を経て成熟化する。生細胞内では、個々の反応は独立にシークエンシャルに起こるのではなく、複数の過程が部分的に重複しながら協調的に進む。反応を素過程に分けて解析するin vitro実験系では、タンパク質成熟化の全体像を正しく理解することは難しい。それ故、タンパク質の成熟過程をin vivoで直接追跡し評価できる実験系を構築する必要がある。我々は、膜タンパク質SecYを用いた解析を通して、「部位特異的in vivo光架橋法が、一過的かつ動的なタンパク質間相互作用を高い空間分解能で検出できる優れた方法である。」ことを明らかにした。本研究では、「部位特異的in vivo光架橋実験」を「pulse-chase実験」と組み合わせ、生細胞内で秒単位のタンパク質間相互作用変化を検出・追跡できる高時間・高空間分解能を持つ実験システム(PiXie法と命名)を構築し、in vivoでのタンパク質の成熟化を含めた動態解析を行うことを目指す。昨年の研究により、超強力UV照射装置SP-9(ウシオ電機製)を用いることにより、僅か1秒のUV照射で効率良い架橋形成が可能であることを明らかにし、PiXie法を用いた解析により膜タンパク質のfolding/assembly過程を追跡できることを示した。本年度は、分泌タンパク質VemP新生鎖の成熟化と局在化を本手法を用いて追跡し、成熟化の過程で生じる細胞内因子との架橋形成に成功した。本実験手法の有効性が強く示唆された。更に、部位特異的in vivo光架橋法とPiXie法を用いた研究をまとめたreviewを執筆した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞質中で合成されたタンパク質が正しい立体構造を獲得し機能を発揮するまでには、多くの細胞内因子と連続的に相互作用をすると考えられているが、生きた細胞内のタンパク質成熟体の過程を調べる簡便な方法は存在していなかった。これまで我々は、生細胞内で光反応性のアミノ酸アナログpBPAを部位特異的に導入可能な株を用い、この株に直接UVを照射することで、pBPAに近接する因子との架橋を形成させる手法「部位特異的in vivo光架橋法」を用いて、タンパク質間相互作用を解析してきた。この手法は、アミノ酸残基レベルの高い空間分解能を持つものの、架橋を形成するのに数分以上のUV照射が必要であり、時間分解能はそれほど高くなかった。そこで、種々のUV照射装置を検討した結果、僅か1秒でこれまでの装置と同程度の架橋を形成できる超強力UV照射装置を見い出した。この機器の利用により、高い時間分解能を持つpulse-chase実験と部位特異的in vivo光架橋法を組み合わせたPiXie法(pulse-chase and X-linking experiment)を開発した。この実験手法を用いて、ペリプラズム中に存在する可溶性の因子PhoAの二量体形成速度,内膜タンパク質複合体SecD/Fの会合速度と分子内folding速度、外膜タンパク質LptD/E複合体の会合速度と成熟化過程を解析し、本実験手法の有用性を示した。以上の結果を論文として取りまとめ報告した。生きた細胞内での新生タンパク質の動態解析を可能とするPiXIeを開発し、これを論文として取りまとめJBC誌に報告した。この論文の中で、本手法は、可溶性タンパク質の相互作用だけでなく、膜タンパク質複合体の会合並びに、同一分子内のfolding過程も解析可能であることを示した。よって、本手法は「in vivo生化学」の新しい研究手法として広く利用される可能性がある。架橋が形成されない場合には、相互作用の評価ができないという欠点は持ち合わせてはいるものの、生細胞内で実際に起こっている相互作用の変化を調べる画期的な方法と言え、本研究課題である「in vivo活写する」を実現するための有力な研究手法を確立したと考えており、概ね順調に推移していると思われる。

更に、部位特異的in vivo光架橋法とPiXie法を用いた研究をまとめたreviewを執筆した。PiXie法が、新規に合成されたペプチド鎖の成熟過程を追跡できるかどうかを検証する目的で、合成の途上で翻訳が安定に停止するVemPを対象に解析を進める。VemPは159残基からなる分泌タンパク質であり、C末端の20アミノ酸残基は、翻訳停止に重要な役割を持つ。そこで、C末端の20アミノ酸残基を除く全てアミノ酸をpBPAに改変した変異体を作成し、PiXie解析を行うことで、合成開始から、翻訳停止、膜透過の各々のステップで生じる相互作用を網羅的に解析する。得られた架橋産物中の相手因子は、候補因子に対する特異的抗体を用いたimmino blottingや、精製後に質量分析することにより同定する。本、研究の推進により、本主砲の有用性がさらに明らかにできるものと期待している。すでに予備的な実験を進めており、幾つかの部位で特異的な架橋を形成することを見出している。これらを材料に架橋産物の精製系を確立し、架橋相手の同定を進める予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
眼球形成を支配する転写因子の発現誘導機構

脊椎動物の眼球形成は、細胞(網膜の原基)が外胚葉に作用し、水晶体の分化を誘導することによって開始される。本研究では、細胞からの誘導作用を受けた外胚葉で発現し、その外胚葉領域を水晶体に分化させる転写因子L-Mafの発現誘導機構を解析した。まずL-Maf遺伝子のシス領域(-4.5kbp+1まで)を5'上流側から少しずつ欠失させたものをレポーター遺伝子(β-ガラクトシダーゼ)に連結し、ニワトリ胚組織に導入することによって、L-Maf遺伝子の発現を規定するエンハンサー領域(-1.0k-0.7kbp)を同定した。このエンハンサー領域の塩基配列を決定したところ、転写因子Pax6の結合配列が10箇所存在していた。Pax6遺伝子は小眼症や先天性白内障の原因遺伝子として知られており、予定水晶体外胚葉においては、細胞からの誘導をうける前の時期からあらかじめ発現している。Pax6がL-Maf遺伝子の発現調節に関与する可能性についてより詳細に検討するため、転写因子Engrailedの転写抑制ドメインをPax6蛋白質に付加した融合蛋白質(Pax6-En)を発現するベクターを構築した。Pax6-Enは、野生型Pax6の機能を拮抗的に阻害するドミナントネガティブ変異体として機能すると期待される。このPax6-Enをニワトリ胚の予定水晶体外胚葉で発現されたところ、L-Mafの発現が抑制され、水晶体の形成阻害を伴う小眼症様の形態が生じた。同様な形態はL-Mafのドミナントネガティグ変異体を発現させた場合にもみられた。以上の結果は、Pax6→L-Mafという遺伝子カスケードが眼球形成の中心的役割を果たしていることを示唆しており、眼胞からの誘導シグナルは、あらかじめ外胚葉で発現しているPax6と強調的に作用してL-Mafの発現を促進するものと考えられる。
免疫抑制剤ＦＴＹ７２０とカルシニューリンシグナルのクロストーク機構の解明

本研究は、ゲノムワイドな手法と遺伝薬理学のアプローチを駆使し、免疫抑制薬FTY720の標的因子の網羅的同定と機能解析を行うことで、1)FTY720のカルシウム/カルシニューリン(CN)シグナル伝達経路の活性化機構の解明、2)FTY720添加と酸化ストレス添加時の標的因子の共通性質より導かれるFTY720の作用機構とその機能解析、3)FTY720がタンパク質代謝に与える影響とその意義、そして、4)FTY720が細胞に与える影響とその意義を明らかにすることで、FTY720を介するシグナルネットワークの解明を目指すものである。本年度は以下のことを明らかにした。1FTY720添加時のDNAマイクロアレイを行い、FTY720添加時に発現が変動する遺伝子群を網羅的に同定した。上昇してきた遺伝子群の多くは、既にFTY720により活性化されることを報告したCNシグナル伝達経路(Hagihara et al., 2013)やストレス応答MAPKシグナル伝達経路(Hagihara et al., 2014)により制御されていた。しかしながら、これら二つの経路だけでは発現制御メカニズムが説明できない遺伝子群も存在することが分かった。そこで、転写因子結合配列の検索、さらに転写因子候補のKO細胞を用いたRealtime PCR法による比較を行うことで、FTY720により制御される新たなシグナル伝達経路を明らかにし、現在投稿準備中である。2FTY720感受性遺伝子群を網羅的に同定することにより、FTY720の新たな作用機構/経路を明らかにするとともに、臨床においてFTY720の作用を増強しうる遺伝子群の同定に貢献できると考えた。今回私は、分裂酵母のKO細胞ライブラリーを使用して、3段階のケミカルゲノミクススクリーニングを行い、FTY720感受性遺伝子を網羅的に探索した。そして、同定された因子群の細胞内機能とFTY720との関係について考察を行い、現在投稿準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、ゲノムワイドな手法と遺伝薬理学のアプローチを駆使し、免疫抑制薬FTY720の標的因子の網羅的同定と機能解析を行うことで、1) FTY720のカルシウム/カルシニューリン(CN)シグナル伝達経路の活性化機構の解明、2) FTY720添加と酸化ストレス添加時の標的因子の共通性質より導かれるFTY720の作用機構とその機能解析、3) FTY720がタンパク質代謝に与える影響とその意義、そして、4) FTY720が細胞に与える影響とその意義を明らかにすることで、FTY720を介するシグナルネットワークの解明を目指すものである。まず、CNの下流に位置する転写因子Prz1の転写活性を、in vivoでリアルタイムにモニタリングできるシステムを用いて測定した。その結果、FTY720がカルシウムチャネルの開口を制御することで細胞内カルシウム濃度を上昇させるが、その開口にはマップキナーゼ(MAPK)経路の活性化が一部関与していることを明らかにした。そして、カルシウム/CNシグナル伝達経路が適切に制御されなければ、FTY720に感受性を示すことも明らかにした。また、FTY720を添加すると、活性酸素種の発生上昇とそれに続く細胞増殖抑制、さらにストレス応答MAPKの活性化が起こることを明らかとした。そして、ストレス応答MAPK経路の構成因子のノックアウト細胞がFTY720に超感受性を示すこと、FTY720によるROS産生誘導が正常細胞と比較して顕著に上昇することを明らかにした。したがって、ストレス応答MAPK経路は、FTY720が引き起こす活性酸素種の産生と、細胞増殖抑制に関与していることが考えられる。さらに、FTY720添加により誘導される、カルシウム濃度上昇と活性酸素種の産生という2つの現象の間にクロストークがあることを見出した。

今回私は、分裂酵母のKO細胞ライブラリーを使用して、3段階のケミカルゲノミクススクリーニングを行い、FTY720感受性遺伝子を網羅的に探索した。そして、同定された因子群の細胞内機能とFTY720との関係について考察を行い、現在投稿準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究実施計画通り順調に進行している。研究実施計画1)FTY720のカルシウム/カルシニューリンシグナル伝達経路の活性化機構の解明について、マップキナーゼ経路との関与を証明した。この成果から申請者は、学術雑誌PLoSONEに筆頭著者として掲載された。研究実施計画2)に関してFTY720添加による酸化ストレス誘導とストレス応答マップキナーゼの活性化を証明し、この成果は学術雑誌Genes to Cellsに筆頭著者として掲載された。研究実施計画3)のFTY720がタンパク質代謝に与える影響とその意義に関して、FTY720添加時のタンパク質分解酵素活性の測定や、ユビキチンタンパク質量の変動を見ることで検討中である。また、研究実施計画4)に関して、FTY720が細胞に与える影響とその意義を明らかにするため、「FTY720に感受性を与える遺伝子群」と「DNAマイクロアレイの結果、同定した標的因子のうち、FTY720により活性化されるカルシウム/カルシニューリンシグナルやストレス応答マップキナーゼシグナルという二つのシグナル伝達経路により発現が誘導される遺伝子群」の網羅的な探索を順調に進行中である。今年度はこの探索の完了とそれらの遺伝子群の機能的分類・解析を行う。
可溶型ADAM8がアレルギー性気道炎症を抑制する機序の解明

遊離型ADAM8を分泌するトランスジェニックマウス(ATMS2)を用いて卵白アルブミンによる喘息モデルを作製し、可溶型ADAM8が喘息反応を抑制することを我々は見いだした。サイトカインとケモカインの検討も行ったところ、肺胞洗浄中ではIL-4,IL-5に差を認めなかったが、エオタキシンはトランスジェニックマウスの方で有意に高かった。また、血清中では、IL-4は検出されなかったが、IL-5がトランスジェニックマウスで有意に低値であった。エオタキシンはトランスジェニックマウスの喘息反応を起こした群で、起こさなかった群に対して有意に低値となった。この好酸球性炎症を抑制する機序として、ADAM8がVCAM-1の遊離に関与していることを示した。これは、ADAM8がアレルギー反応に直接関与することを示した初めての研究であった。ヒトの好酸球性炎症おけるADAM8の関与を検討するため、好酸球性肺炎患者の肺胞洗浄中に可溶型ADAM8濃度を測定した。ヒトの好酸球性肺炎患者中の肺胞洗浄液中に有意なADAM8の上昇が、急性好酸球影肺炎患者と慢性好酸球性肺炎患者に見られたが、薬剤性好酸球性肺炎患者では見られなかった。急性好酸球性肺炎ではVCAM-1とCD23との相関も見いだせたが、慢性好酸球性肺炎では見いだせなかった。この結果より、異なる病型の好酸球性肺炎ではADAM8の働きが、異なる可能性が示唆された。また、急性好酸球性肺炎では、発症早期の気管支肺胞洗浄液中のADAM8が高値であり、急性好酸球性肺炎では発症早期に関与していることが示唆された。近年ポジショナルクローニングの手法を用いて、喘息感受性遺伝子としてADAM(a disintegrin and a metalloprotease)33が同定され、特に気道過敏性との関連が指摘されている。ADAMファミリー蛋白は現在30種類以上同定され、接着、細胞融合、蛋白分解に関与している。ADAM8(CD156a)はその中の一つで、気道炎症を担うマクロファージ、好中球、好酸球に存存する。ADAM8の機能として膜型CD23(低親和性IgEレセプター)を切断し、好酸球の細胞接着等に関与していることが知られている。アレルギー性疾患にADAM8の関与が示唆されているが、現在喘息との関与は明らかになっていない。今回遊離型ADAM8を分泌するトランスジェニックマウス(ATMS2)を用いて、アレルギー性気道炎症におけるADAM8役割を明らかにする。ATMS2ではOVA誘発アレルギー性気道炎症が著明に抑制されていた。末梢血ではIL-5とeotaxinがATMS2では有意に低値であった。BALF中ではIL-4,IL-5は両者で明かな差はなかったが、eotaxinはATMSで有意に高かった。
単離心筋細胞に対する虚血、体液因子の影響の研究。-細胞内Ca^<2+>、pH動態を中心にして。

Adrenomedullinの心筋に対する直接作用。Adrenomedullinは心筋細胞で産生され、特に心不全患者では心室内の心筋細胞による産生が亢進していることが確かめられており、病態生理学的に何らかの役割をしている可能性が注目されていたが、その心筋細胞に対する生理的作用は解明されていない。われわれは、兎単離心室筋細胞を用いてadrenomedullinの心筋に対する直接作用を検討し、この心臓におけるautocrineないしparacrine hormoneが心筋細胞に対して容量依存性に陰性変力作用を呈することを見い出した。さらに、その機序について、細胞内カルシウム濃度の変化、カルシウムチャンネルによる内向き電流の測定、細胞内メッセンジャーであるcAMP,cGMP濃度を測定し、以下の結果を得た。1.adrenomdullinは容量依存性に細胞内カルシウム変動の振幅を減少させる。2.この作用はNO合成阻害薬であるL-NMMA、ないしguanylate cyclase inhibitorであるmethylenblueにより阻害される。3.内向きカルシウム電流はadrenomedullinにより減少し、この減少はL-NMMAの存在により抑制された。4.細胞内cAMP濃度はadrenomedullinにより変化せず、一方、cGMP濃度は容量依存性に増加した。以上より、adrenomedullinの陰性変力作用に関して以下の結論を得た。Adrenomedullinは容量依存性に心筋細胞内cNOSを活性化させ、NO産生を増大させる。NOによりguanylate cyclaseが活性化され細胞内cGMPが増大し、cGMPが何らかの機序により細胞内カルシウム振幅を減少させ、陰性変力作用を発現する。このカルシウム変動の振幅の減少には、少なくとも一部は、L-typeカルシウムチャンネルを通したカルシウム流入の減少が関与している。今後は、このhormoneの病態生理学的役割が注目され、現在検討中である。
半導体性ピラー化層状化合物薄膜の合成と選択的ガスセンサへの応用

アルキルトリクロロシランでシリル化した層状化合物へ長鎖のアルキルアミンを添加して得た層間化合物を有機溶媒中に分散させ、これをキャストすることで薄膜を作製、さらにシリル化後、熱もしくは光還元することでピラー化炭素もしくはピラー化チタン酸薄膜を得ることに成功した。このうちピラー化炭素薄膜は導電性が高く、細孔中にガスが吸着した際の抵抗変化により、室温下でガス検知を行うセンサとして機能した。シリル化剤の種類や反応時間等を変化させることで、ピラー間隔、ピラー密度や層間距離を制御することができ、サイズの小さな分子のみやアセトンにのみ応答するものを得ることに成功した。種々のシリコン含有量のシリル化酸化黒鉛薄膜の紫外光還元とそれに続く真空下200°Cでの熱処理によって、p型半導体性を示すピラー化炭素薄膜を合成し、この薄膜へ電極を形成することにより、サイズの異なる分子のガスに対する選択的応答性を調べた。ピラー化炭素中のピラー密度の増加とともに、まずサイズの大きなビニレンカーボネート続いてアセトニトリルに対する応答がなくなり、水素およびオゾンにのみ応答する薄膜が得られた。ピラー密度の増加とともにサイズの大きな分子が層間に到達できなくなってゆくために選択性が発現したものと考えられた。さらに層面上の水酸基の分布状態の異なる種々の半導体性層状化合物のうち層状チタン酸をアルキルトリクロロシランによってシリル化した後に、さらに3ーアミノプロピルトリエトキシシラン、メチルトリクロロシランでシリル化し得られた材料を焼成することでピラー化チタン酸を得ることに成功した。窒素吸着測定から得られたピラー化チタン酸のBET表面積は200m2/gに達すること、また、ミクロ孔を有していたことから、ピラー間に隙間があることがわかった。さらに、アルキルトリクロロシランでシリル化したチタン酸にアルキルアミンを添加すると有機溶媒中でナノシート化することを利用してシリル化チタン酸薄膜の作製に成功した。これをさらにシリル化することも可能でこれを焼成することでピラー化チタン酸の薄膜が作製できた。オクチルトリクロロシランによってシリル化した酸化黒鉛の薄膜を3-アミノプロピルトリエトキシシランもしくはメチルトリクロロシランによってシリル化した後、真空下500°Cで熱処理することによって、層間距離が約1.5nm程度のピラー化炭素薄膜を作製し、これらのジエトキシエタンやジメチルホルムアミド等の種々の有機分子に加えて、有機分子を検知する際に共存する可能性の高い水に対する応答性を調べた。この結果、3-アミノプロピルトリエトキシシランによって短時間もしくはメチルトリクロロシランによってシリル化したものから得たピラー化炭素が、最小分子幅の小さな(0.4nm未満)他の有機分子の蒸気に曝した場合に抵抗が増加しこれらを検知できたにもかかわらず、水蒸気に曝した場合には全く変化しないことを見出した。前者では、ピラー表面がヒドロキシル基に覆われていて親水的であるため水分子は層間に侵入できると考えられることおよび、ピラー密度の大きな試料では抵抗変化が見られたことを考えると、ピラー密度が小さいため吸着した水分子は疎水性の炭素層からは離れた位置に吸着し、電荷移動が起こらないためと考えられた。また後者では、ピラー表面が疎水性のメチル基によって覆われているため水が吸着できず、抵抗変化が見られなかったものと思われ、このことはメチル基を含む粉末状の試料に対して行った水吸着測定で水がほとんど吸着しなかったことからも裏付けられた。アルキルトリクロロシランでシリル化した層状化合物へ長鎖のアルキルアミンを添加することで有機溶媒中に分散できるようにし、得られた分散液を基板上にキャストすることで薄膜を作製、さらにこれをシリル化した後に、不活性雰囲気下で熱処理することによって、ピラー化層状半導体薄膜を得ることに成功した。この方法は、半導体性を示す層状化合物の中でチタン酸および炭素のピラー化に有効であった。このうち酸化黒鉛をホストとして用いて得たピラー化炭素薄膜は導電性が高く、室温下においても細孔中にガスが吸着した際の抵抗変化によりガス検知を行うセンサとして機能した。ピラーの前駆体となるシリル化剤には、3-アミノプロピルエトキシシラン、メチルトリクロロシラン、ジメチルトリクロロシラン等を用いることが可能で、これらのシリル化剤や反応時間等を変化させることで、ピラー間隔や層間距離を制御することが可能であった。ピラー化炭素薄膜の中では、500°Cでの熱処理でも脱離しないメチル基を含むものが、ピラー間隔が狭いためその層間にサイズが小さくピラー間の隙間を通過できる分子のみを吸着できるようになり、これらにのみ応答するものとなることを見出した。さらに、メチル基を多く含む薄膜では疎水性も高くなり、水分子が侵入できなくなった。このため、他のサイズの大きな分子や水分子には応答せず、呼気中に含まれ体内での脂肪燃焼の指標となるアセトンのみに応答する薄膜を作製することに成功した。

このうちピラー化炭素薄膜は導電性が高く、細孔中にガスが吸着した際の抵抗変化により、室温下でガス検知を行うセンサとして機能した。シリル化剤の種類や反応時間等を変化させることで、ピラー間隔、ピラー密度や層間距離を制御することができ、サイズの小さな分子のみやアセトンにのみ応答するものを得ることに成功した。半導体性ピラー化層状化合物のうちまず、室温での応答が可能なピラー化炭素について検討を行い、合成条件を変化させることによってサイズ選択性を付与できること、また、シリル化剤の変更によって疎水/親水性の制御に成功したが、薄膜形成とその後のシリル化過程の反応制御に手間取ったため、計画していた混合ガスの検知を行うとともに、他の層状半導体の薄膜形成まで実施することが出来なかった。工業物理化学現在では、ピラー化炭素前駆体のシリル化酸化黒鉛薄膜の形成と再シリル化反応過程をほぼ制御することに成功している。また、シリル化層状チタン酸薄膜形成についてはすでに確立しており、再シリル化を行いピラー化物を得られる段階にきている。これを元に高温でのガスセンシング装置の構築を急ぎ、種々のガスに対応できるセンサのライブラリを構築する予定である。当初目的とした、層状酸化物のピラー化に成功するとともに、シリル化物の薄膜化にも成功している。「現在までの達成度」の項目に示したとおり、ピラー化炭素薄膜の作製条件の最適化に手間取ったため、さらに高温の条件化で作動するピラー化チタン酸等他の半導体性ピラー化物の薄膜作製およびセンサ特性の解明に必要な器具類の購入は、今年度行うこととしたため、使用額に差が生じた。平成26年度以降は、当初の計画通り、昨年度に得られた新規な半導体性ピラー化層状化合物薄膜の種々のガスに対する電気的応答性を調べるとともに、同様の構造を持つ粉末試料に対する吸着測定によって細孔へ適合する分子の種類と量を明らかにすることで、センサ特性発現のメカニズムを明らかにし、高性能化への指針を得る。また、引き続きピラーの長さ及び太さの制御細孔サイズの制御を試みるとともに、ピラーへのアルミニウム、チタン等の異種元素の導入によるピラーの性質の制御をおこなう。上記の通り、加熱ユニットや、ガスフロー装置等、高温の条件化で作動するピラー化チタン酸等他の半導体性ピラー化物の薄膜作製およびセンサ特性の解明に必要な器具類の購入を行う。日本化学会に参加する予定であったが、同時期に行われた電気化学会で実行委員を務めたため参加を断念した。これにより旅費が当初の予定よりも少なくなった。また、その他として計上していた元素分析費が不要となった。これらのため約4.6万円の差額が出た。次年度使用額は、多くの種類が必要なシリル化剤の購入に充当したい。
高密度光記録材料における非破壊読み出し法への不斉情報の適用の研究

前年度に引き続き、[3]ヘリセン骨格を持つキラルジアリールエテンの合成・物性評価を行なった。アリリックストレインと呼ばれる立体反発効果によって光学活性置換基周辺の配座を制御し、引き続く置換基と対面する芳香環との立体反発および静電反発によって、分子金体のらせん配座を制御することができる。この配座制御された状態に紫外光を照射すると、同旋的に閉環する結果、生成可能な二つのジアステレオメリックな閉環体のうち、一方が過剰(約90%de)に生成した。この閉環体は大きな比旋光度を示す[5]ヘリセン構造を持つため、光照射に伴って約950度と大きく比旋光度が変化した。しかし前年度の研究では、最終生成物のカップリング反応が適切に進行せず、わずかな量しか得られなかった。本年度では、条件を詳細に検討した結果、収率の向上を達成することができ、その合成経路を確立した。この合成法は類似の骨格を持つ化合物に適用可能であった。前年度の結果からジアステレオ選択性の低下が判ったため、この骨格では旋光度増加に必要である芳香環の増加は見込めなかった。そこで、パーフルオロシクロペンテン環に対する、一方の芳香環の接続位置をこれまでの3位から2位へと変更し、芳香環を延長可能にした。このままではやはりジアステレオ選択性が低下することが判っていたため、光学活性置換基を二つ持つ、対称構造とすることとした。この場合、立体反発および静電反発は、これまでと同様に置換基と芳香環の間に働くと同時に、同じ立体構造を持つ二つの置換基間でより強く働くことが予想された。このようなジアリールエテンを合成したところ、98%という非常に高いジアステレオ選択性を示し、比旋光度変化は、これまでで最も大きい1430度に及んだ。また合成経路も非常に簡便になった。これらの結果を、2006年光化学討論会および2007年日本化学会第87春季年会にて報告した。[4]ヘリセン骨格を持つジアリールエテンを分子設計し、合成・物性評価を行なった。この化合物はヘリセン末端にキラル官能基を持っているため、光環化反応を行なった際にジアステレオマーを生成する。キラル官能基に起因する立体反発(アリリックストレイン)によって、ジアステレオマーが一方に大きく偏ることで、光反応に伴って大きな旋光度差が観測されると予測された。しかし実際には、ジアステレオマー比は予想に反して30%deと非常に低かった。分子軌道計算によると、ヘリセン末端部分にキラル官能基を持つことで、ヘリセンそれ自身がキラル官能基との立体反発によってねじれることが判った。この時キラル官能基は、アリリックストレインを効果的に働かせる立体配座とは異なった2種類の配座で安定になることが予測されたため、これを利用してジアステレオマー比を偏らせることが困難であることが判った。さらに、分子のらせん不斉を考慮した計4つの異なる立体配座において、その生成熱がほぼ同じであり、アリリックストレイン以外の要素でジアステレオマー比が大きく偏る可能性もなくなった。以上の結果から、[4]ヘリセンにキラル官能基を持つ骨格では、ジアステレオマー比の向上は見込めなくなった。そこで、[3]ヘリセンに変更し、合成・物性評価を行なったところ、90%deと高いジアステレオマー比を示した。これは芳香環の数が減ったことで、立体反発が減少し、アリリックストレインが効果的に働いているためであると考えられる。光反応における比旋光度変化は、光定常状態と開環体との間で約800度と大きかった。これらの結果を、2005 Korea-Japan Symposium on Frontier PhotoscienceおよびSingapore InternationalChemical Conference-4にて報告した。

このようなジアリールエテンを合成したところ、98%という非常に高いジアステレオ選択性を示し、比旋光度変化は、これまでで最も大きい1430度に及んだ。また合成経路も非常に簡便になった。これらの結果を、2006年光化学討論会および2007年日本化学会第87春季年会にて報告した。
エルトールcytolysinのPro領域の機能解析

1。エルトール溶血毒のprotoxinがコレラ菌可溶性血球凝集素、およびトリプシンによって成熟溶血素となると同時に溶血活性が約20倍上昇することから、コレラ菌やヒト小腸で産生されるタンパク分解酵素が活性発現に重要な役割を果たしていることが解った。2。クローン化したcytolysin遺伝子を利用し、構造遺伝子のPro領域のみが欠失したコレラ菌N86-hlyAΔproを遺伝子置換法で作成した。作られた変異株N86-hlyAΔproの溶血性は著しく低く、pro領域が溶血性の発現に必要であると考えられた。この株では培養上清中にもペリプラズマ中にもmature toxinは見いださず、ペリプラズマ中にのみ、その分解産物が多量に検出された。このことは(i)Pro領域は外膜通過に必要な領域であり、または、(ii)Pro領域がcytolyisn全体をプロテアーゼの分解から防護する役割を果たしている可能性を示唆した。3。精製したProtoxinとmature toxinを塩酸グアニジン処理し、その三次構造を一度破壊後、再構成させたところProtoxinは再構成後、処理前と同じ活性を完全に回復したがmature toxinの活性はまったく戻らなかった。このことから、Pro領域はcytolysinが活性をもつ三次構造を形成する為にも必要分子内シャペロンの役割をはたす部位でもあることが強く示唆された。1。2。3。A。プロデアーゼによるプロセッシングの証明:エルトール溶血毒のProtoxinをオーバープロデュースすることによって大量精製し、これがコレラ菌から精製した可溶性血球凝集素およびトリプシンによって、成熟溶血毒にプロセッシングされると同時に、活性が約20倍上昇することを見い出した。B。プロ領域を欠失した遺伝子の作成:クローン化したCytolysin遺伝子内のPre-Pro領域、およびPro-M領域間に部位特異変異法で人工的に制限酵素切断部位を導入し、その特異部位で切断しPro領域を欠失させた。欠失後、切断の為に一時的に導入した部位でのアミノ酸配列はもとの配列と一致するように作製した。Cytolysin遺伝子の一部をカナマイシン耐性遺伝子と置換した遺伝子を作製し、これを元のコレラ菌に導入し染色体にあるhlyAとの間で相同組換えをおこない薬剤耐性と溶血性を指標としてhlyA欠失コレラ菌を分離した。以上の成果をもとにして次年度はPro領域欠失hlyAのDNAでhlyA欠失コレラ菌に導入し、遺伝子置換を相同組換えで行い、Pro領域欠失コレラ菌を分離し、遺伝子産物がどのように産生分泌されるかを野性型のコレラ菌と比較する予定である。1。hlyAのPre-Pro領域間、およびPro-M領域間にsite-directed mutagenesis法でBalI部位を導入し、BalIで切断しPro領域のDNAを欠失させた。2。Pro欠失遺伝子をスーサイド・ベクターに導入し、もとのコレラ菌の染色体DNAに挿入し、正常遺伝子hlyAがPro欠失遺伝子に置換したコレラ菌を分離した。3。得られたPro領域欠失hlyAコレラ菌の発育は野生型と変化なかったが溶血性は著しく低下していた。4。遺伝子産物がどの様に産生分泌されるかを菌体内、ペリプラズム、培養上清分画に分けウエスタンブロッティング法で調べたところ、培養上清中には殆どcytolysinが見いだされなかったが、ペリプラズマ中には分解された抗原が多量に存在した。5。これらのことからPro領域はcytolysinが活性をもった形で分泌産生されるために必須の領域であることが証明された。また、ペリプラズマ中に分解物が多量に存在していたことから,Pro領域はprotoxinの安定性にも関与していることが示唆された。