hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
黄色ブトウ球菌に対する特異抗体を用いた生体材料への付着阻止に関する研究

(目的)我々は黄色ブドウ球菌の莢膜多糖体抗原が本菌に対する感染防御抗体を誘導することを明らかにしてきた。本来の目的は、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌に対する特異抗体を用いて生体材料を被覆することにより、同菌の付着が抑制されるか否か検討することである。(方法)健常人28名と明らかな感染症を合併していない糖尿病患者20名、計48名のヒト血清中の黄色,ブドウ球菌莢膜多糖体に対するIgM, IgG, IgA抗体活性を酵素標識免疫定量法(ELISA)阻止試験にて測定した。そのうち黄色ブドウ球菌Smith株に対する抗体活性が高い血清(IgG 57%,IgM 18%,IgA 1%)と抗体活性が低い血清(IgG 0%, IgM 1%, IgA 0%)を実験に用いた。1000倍あるいは100倍希釈のヒト血清を用いて昨度と同様の方法にてプラスチック固相のpercent Index of adherence(IA %)を求め、抗体活性とIA %との関係を検討した。(結果)1000倍希釈のヒト血清では、抗体活性の高い血清前処置群のIA %は平均26.9%,抗体活性の低い血清前処置群では平均31.7%であった。100倍希釈のヒト血清では、抗体活性の高い血清前処置群のIA%は平均19.7%,抗体活性の低い血清前処置群では平均25.3%であった。(考察)黄色ブドウ球菌Smith株に対する抗体活性の高いヒト血清で生体材料を前処置することにより、同型菌株の付着が抑制される傾向がみられた。さらに、!000倍希釈より100倍希釈のヒト血清の方が付着を抑制する傾向がみられた。すなわち、生体材料への黄色ブドウ球菌の付着は、抗体の含有量に依存して抑制されると言える。(目的)本研究の目的は、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌に対する特異抗体を用いて生体材料を被覆することにより、同菌の付着が抑制されるか否か検討することである。まずプラスチック固相への付着について検討した。(方法)使用菌株はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌SMU-01株を用いた。10名のヒト血清中の黄色ブドウ球菌莢膜多糖体に対するIgM,IgG,IgA抗体活性を、酵素標識免疫定量法(ELISA)阻止試験にて測定した。そのうち黄色ブドウ球菌Smith株に対する抗体活性が高い血清(IgG57%、IgM18%、IgA1%)と抗体活性のない血清を実験に用いた。1000倍希釈のヒト血清16mlをプラスチックシャーレ(FALCON)に入れ30分室温で静置し、phosphate-buffered saline(PBS)(pH7.2)で3回洗浄した。次に10^3、10^2、10^1CFU/mlに調整した黄色ブドウ球菌SMU-01株の菌液16mlをシャーレに入れ5時間室温で静置した。菌液を除去してPBSで3回洗浄し、1%glucose、0.015%neutral red含有trypticasesoy agarを入れ、37°Cで48時間培養した。その後、培地上に37%formalin 20mlを添加し、24時間固定後寒天を除去し、Mackenzieらの方法に準じてシャーレの表面に付着した菌数を測定し、接種菌数との比を指数(percent Index of adherence, IA%)として表した。(結果)抗体活性の高いヒト血清前処置群のIA%は、抗体活性のないヒト血清前処置群のそれより低値であった。今後、生体材料を用いて同様の実験を行う予定である。

さらに、ヒト血清よりIgG、IgM分画を抽出・精製し、どの画分に異物への付着を阻止する働きがあるかを検討する。(目的)我々は黄色ブドウ球菌の莢膜多糖体抗原が本菌に対する感染防御抗体を誘導することを明らかにしてきた。本研究の目的は、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌に対する特異抗体を用いて生体材料を被覆することにより、同菌の付着が抑制されるか否か検討することである。(方法)健常人28名と明らかな感染症を合併していない糖尿病患者20名、計48名のヒト血清中の黄色ブドウ球菌莢膜多糖体に対するIgM,IgG,IgA抗体活性酵素標識免疫定量法(ELISA)阻止試験にて測定した。そのうち黄色ブドウ球菌Smith株に対する抗体活性が高い血清(IgM 18%,IgG 57%,IgA 1%)と抗体活性が最ち低い血清(IgM 0.5%,IgG 0%,IgA 0%)を実験に用いた。1000倍あるいは100倍希釈のヒト血清を用いて昨度と同様の方法にてプラスチック固相のpercent Index of adherence (IA%)を求め、抗体活性とIA%との関係を検討した。また、ステンレス製プレートおよびチタン製プレートを用いて同様の実験を行った。(結果)1000倍希釈のヒト血清では、抗体活性の高い血清前処置群のIA%は平均26.9%,抗体活性の低い血清前処置群では平均31.7%であった。100倍希釈のヒト血清では、抗体活性の高い血清前処置群のIA%は平均19.7%,抗体活性の低い血清前処置群では平均25.3%であった。ステンレス製プレートやチタン製プレートにおいても同様の傾向が認められた。(考察)黄色ブドウ球菌Smith株に対する抗体活性の高いヒト血清で生体材料を前処置することにより、同型菌株の付着が抑制される傾向がみられた。さらに、1000倍希釈より100倍希釈のヒト血清の方が付着を抑制する傾向がみられた。すなわち、生体材料の付着は抗体の含有量に依存して抑制されると言える。
ロバストなネットワーク構築のための影響最大化に基づくアプローチ

本研究では、社会ネットワーク分析の分野で開発されてきたネットワークにおける影響力の強いノードを特定する影響最大化アルゴリズムを応用し、ノードの故障やウィルス拡散に対する将来インターネットの頑健性を向上させる技術を開発することを目的としている。本研究ではまず、影響最大化アルゴリズムの特性評価を実施した。その結果、従来有効であると考えられていた影響最大化の近似アルゴリズムは、ネットワークの不完全性が大きい場合に、その有効性を大きく低下させてしまうこと、一方、局所的な情報のみに基づく発見的アルゴリズムは不完全性に対する耐性が高いことを明らかにした。次に、影響最大化アルゴリズムの特性評価の結果を踏まえ、影響最大化の発見的アルゴリズムを用いた、ネットワークのロバスト性向上手法を開発した。特に、ノードの故障ならびに攻撃に対するロバスト性を向上させるためのリンク追加アルゴリズムと、ウィルス拡散を抑制するための免疫付与アルゴリズムを開発した。2017年度までに、モデルを用いて人工的に生成したネットワークを用いた初期的な評価を実施し、これらのアルゴリズムの基本的な特性を評価した。最終年度である2018年度には、将来インターネット環境を想定して、これまでに開発したアルゴリズムの有効性を評価した。特に、ネットワークの構造が部分的にしか得られない場合、およびネットワークの接続関係の情報に誤りが含まれる場合のアルゴリズムの有効性を評価した。その結果、開発したアルゴリズムは、ネットワークの情報が不完全であっても良好に動作することを示した。平成28年度はまず、シミュレーション実験により、影響最大化アルゴリズムの基本的な特性の評価を行った。その結果、大規模で動的に変化するネットワークに対して、ノードの次数に基づく影響最大化の発見的アルゴリズムは、ネットワークの局所的な情報のみでも有効に動作することを明らかにした。これにより影響最大化アルゴリズムが、大規模な将来インターネットにおける保護ノード決定手法として利用できる可能性が高いことを確認した。さらに、将来インターネットにおけるウィルス拡散被害を評価するためのモデルの構築を行なった。ノード間のウィルス拡散と、ウィルス拡散に起因するノードの故障やネットワークからの離脱を表現可能な数理モデルを構築した。構築したモデルを用いた実験により、ネットワークに対して何も保護を行わない場合には、悪意あるユーザの意図的な攻撃によってネットワークが分断されてしまうことを示した。さらに小規模なネットワークに対して、影響最大化アルゴリズムに基づくノード保護手法を適用し、ネットワークの頑健性がどの程度向上するかを評価した。その結果、影響最大化アルゴリズムに基づくノード保護手法はネットワークの頑健性を向上させるのに有効であるものの、ネットワークの構造的特徴によっては、十分な効果が得られないといった、次年度に向けた課題も抽出された。影響最大化アルゴリズムに基づくノード保護手法を設計し、ノード保護手法の有効性を評価するためのモデルの構築を行なった。また、基礎的な評価により、設計した手法がある程度有効に動作することが確認できた。また次年度に向けた課題も抽出された。ベースとなる手法の開発と、評価環境の構築が完了しており、おおむね順調に進展している。ネットワークの構造的特徴によって、ノード保護手法の有効性が低下してしまうことも確認しているが、次年度以降に予定していた手法の改良の過程で解決していく予定であり、全体の進捗には大きな影響を与えないと考えている。平成29年度は、前年度から引き続き、影響最大化アルゴリズムの基本的な特性の評価を行った。シミュレーション実験により、ノード間の関係にノイズが含まれる場合には、従来の影響最大化の近似アルゴリズムは性能を劣化させる可能性が高いこと、局所的な情報のみに基づく発見的アルゴリズムはノイズに対する耐性が高いことを明らかにした。ノード間の接続関係が正確に得られない場合には、影響最大化の発見的アルゴリズムが、大規模な将来インターネットにおける保護ノード決定手法として利用できる可能性が高いことを確認した。さらに、将来インターネットにおけるノードの故障ならびに攻撃に対するロバスト性を向上させるための多層ネットワークに対するリンク追加アルゴリズムを開発し、その評価を行った。ノードの影響力を考慮したリンク追加によって、効率的にネットワークのロバスト性を向上させることができることを示した。さらに、ネットワーク中の少数のノードを保護することでウィルス拡散に対してネットワークのロバスト性を向上させる手法を検討した。モデルで生成したネットワーク上で、ウィルス拡散のシミュレーション実験を行った。その結果、各ノードの局所的な情報のみから推定したノードの影響力に基づきノードを保護することで、ウィルス拡散の被害を抑制し、ネットワークのロバスト性を向上させられることを示した。当初の研究計画では、3年間で以下の4つの項目を実現することを目的としていた。(A)ネットワーク規模に対してスケーラブルな保護ノード決定アルゴリズムの開発、(B)トポロジ変化に対して頑健なアルゴリズムの開発、(C)異種のノードおよびリンクで構成されるネットワークにおけるアルゴリズムの評価と拡張、(D)リアクティブ型アルゴリズムの開発。研究期間の2年目の平成29年度までに、項目(A)、および(B)について、影響最大化アルゴリズムに基づくノード保護手法の設計と評価を実施した。項目(C)については多層ネットワークに対するリンク追加手法の設計と評価を実施した。項目(D)については最終年度である平成30年度に取り組む予定である。4つの目的のうち3つについては既に達成しているため、おおむね順調に進展していると考えている。

本研究では、社会ネットワーク分析の分野で開発されてきたネットワークにおける影響力の強いノードを特定する影響最大化アルゴリズムを応用し、ノードの故障やウィルス拡散に対する将来インターネットの頑健性を向上させる技術を開発することを目的としている。本研究ではまず、影響最大化アルゴリズムの特性評価を実施した。その結果、従来有効であると考えられていた影響最大化の近似アルゴリズムは、ネットワークの不完全性が大きい場合に、その有効性を大きく低下させてしまうこと、一方、局所的な情報のみに基づく発見的アルゴリズムは不完全性に対する耐性が高いことを明らかにした。次に、影響最大化アルゴリズムの特性評価の結果を踏まえ、影響最大化の発見的アルゴリズムを用いた、ネットワークのロバスト性向上手法を開発した。特に、ノードの故障ならびに攻撃に対するロバスト性を向上させるためのリンク追加アルゴリズムと、ウィルス拡散を抑制するための免疫付与アルゴリズムを開発した。2017年度までに、モデルを用いて人工的に生成したネットワークを用いた初期的な評価を実施し、これらのアルゴリズムの基本的な特性を評価した。最終年度である2018年度には、将来インターネット環境を想定して、これまでに開発したアルゴリズムの有効性を評価した。特に、ネットワークの構造が部分的にしか得られない場合、およびネットワークの接続関係の情報に誤りが含まれる場合のアルゴリズムの有効性を評価した。その結果、開発したアルゴリズムは、ネットワークの情報が不完全であっても良好に動作することを示した。平成28年度までは、ノード保護手法の設計と、その評価基盤の構築に注力し、ノード保護手法の基礎的な評価を実施した。今後は、将来インターネットを想定した環境における評価を実施していく。具体的には、異種のノード、リンクで構成されるネットワーク(ヘテロジニアスなネットワーク)での評価を行う。各リンクの通信容量が異なるという条件、および性能の低いノードは保護できないといった制約条件を与えた場合の手法の有効性を明らかにし、改良を行う。また、これまでに開発した手法は、予め少数のノードを保護することで、ネットワークが攻撃を受けた際や、故障が生じた際のネットワークの頑健性を高めることを目指していた。それに対して今後は、ネットワークが攻撃を受けた後、あるいは故障が発生した後に、攻撃や故障の被害を抑える手法を検討する。
軽架線による木寄集材装置つき小形運材車の試作

1.研究目的と方法クレーンあるいはウインチを用いるこれまでの小形運材車の木寄集材能率を改善するために、軽架線による木寄集材装置つき小形運材車を試作・開発することを目的とする。このために、62年度には、(1)設計理念の確立、(2)基本設計、(3)試作機の組み立て、63年度には(4)試作機の機械性能測定、(5)試作機の作業性能測定、(6)試作機の評価を行った。2.設計概要試作機の設計条件としては、(1)運材機能率:積載容量2m^3、走行速度4km/h、(2)木寄集材機能部:対象材300kg、材地傾斜±20度、最大木寄集材距離100m、搬器走行速度1m/s、(3)積込み・荷おろし機能部:グラップローダ容量0.3m^3とした。また各部の設計概要は、(1)ベースマシンおよび運材機能部:既製のRM8TWD-ASをベースマシンとして、エンジン出力33PS、4輪駆動、4輪操舵、総重量3tとする。(2)木寄集材機能部:ランニングスカイラインシステムによって木寄集材が可能なように、探索つきの全高5mのタワー、最大張力900kgの径8mmワイヤロープ200m巻込可能なウインチドラム2個を装着する。(3)積込み・荷おろし機能部:旋回角度270度、場程4.5mのグラップルロータを装着する。3.試作機の機械性能ベースマシン、ウインチ、グラップルローダについて各々機械性能を測定した結果、ほぼ設計値どおりの値が得られた。4.試作機の作業性能作業能率の測定、集材コストの算出、荷掛手の労働負担の測定を行った結果、ほぼ設計値どおりの値が得られた。5.試作機の評価従来のクレーン付小形運材車と比較して評価した結果、(1)集材能率約2倍、(2)集材可能距離約2倍、(3)労働生産性約3倍、(4)使用域±20度、(5)集材コスト約50%、(6)荷掛手の労働負担約20%減であり、今後これまで小形運材車が入りにくかった傾斜地および非皆伐地に広く使われるものと期待される。今年度は研究計画どおり、1.前年度製作の試作機改良・手なおし、2.試作機の機械性能評価のための基礎試験、3.試作機の作業性能評価のための応用試験、4.研究成果のとりまとめを実施した。得られた結果の概要は以下のとおりである。1.ウインチの巻上力と巻上速度を設計値に近づけるために油圧モータの交換、タワー先端部の作業索受けシーブ取付方法の改良、控索架設のための簡易手巻ウインチの設置などの改良・手なおしを行った。2.試作機の機械性能試験を行った結果、ほぼ設計値どおりの値が得られた。3.試作機の作業性能試験を行い、作業能率の測定、集材コストの算定、荷掛手の労働負担の測定を行った結果、それぞれ当初期待したとおりの値が得られた。4.研究成果報告書を印刷した。

従来のクレーン付小形運材車と比較して試作機を評価した結果は以下のとおりである。1.木寄集材能率は約2倍である。2.木寄集材可能距離は約2倍である。3.労働生産性は約3倍である。4.クレーン付小形運材車の使用可能域は上げ木集材可能林分にかぎられるのに対して、試作機は勾配20度程度の上げ木および下げ木両集材が可能である。5.木寄集材コストは約50%である。6.荷掛的の労働負担は約20%軽減される。7.残存立木への損傷については不明である。今後の課題としては、ハード面で1.インターロック装置の開発、2.運転操作レバー位置の検討、3.グラップルソーあるいはプロセッサ装置の装着、ソフト面で1.導入効果の上がる林分条件の検討、2.集材路の配置、3.作業実績の積み重ねの必要性などがあげられる。
実測と公的情報を活用した地域の自然災害・大気環境に関する教材開発とその手法提案

「深い学び」のための題材として,九州の大気環境や自然災害を児童・生徒が探究的に学習するための素材収集や教材化を行なうこと,探究的な学習における児童・生徒自身による体験的活動の利用に適した機材やその使用方法を検討することを目的として研究を行なった.桜島火山は生活圏内で長期にわたって活発に活動している活火山であるため,火山活動や大気環境の観測が充実している.これらの観測結果は,インターネットを介して公開されているので,学校教育における探究的な学習でも容易に利用できる.学校現場におけるICT活用環境も整ってきていることから,研究代表者らが定点観測用のカメラを設置して,観測・インターネット公開している定点カメラ画像や,作成・公開している桜島に関するデジタルコンテンツも含めて,探究的な学習における公的機関のデータ利用について桜島噴火の教材化を例に整理した.九州各地に設置している定点観測用カメラについて,機材劣化やネットワーク環境の変化に対応するために観測機材やシステムの更新を行なった.観測結果の画像アーカイブおよびデジタルコンテンツの作成を行った.自治体が測定し,環境省がWeb公開している微小粒子状物質濃度の速報値と安価な微小粒子状物質の簡易測定器による測定結果を比較したところ,学校教育用の教具としての有用性が確認できたので,簡易測定器を用いた測定活動を取り入れた,小学校第6学年理科最終単元における微小粒子状物質の教材化を行った.小学校教員向けの研修会において,小学校理科新学習指導要領における自然災害に関する内容の充実について,単元ごとの取扱いと学習活動において役立つ情報を得られる公的機関のサイトの紹介を行なった.平成30年度の実施計画に基づいて研究が進んでおり,成果発表も行なうことができた.環境や災害に関する学習素材・教材はできるだけ新しいものを使用することが望ましいため,前年度に引き続き,自然災害に関する情報や大気環境に関するデータの収集や観測・解析を継続するとともに,教材用のモデルの作成および検討を行う.本研究で観測したデータや撮影や処理を行った画像を教育用の素材として提供するために,空を連続撮影した画像や,実測データ,衛星画像などを“学校現場で利用しやすい形"でアーカイブ・Web公開する方法について検討し,素材データベースを構築する.火山灰・ガスの輸送や大気環境への影響についての基礎研究として,桜島,新燃岳,阿蘇などの噴煙・火山ガスの移流拡散,高濃度SO2事象について,教材化に適した最近の事例を検討し解析と教材化を行なう.「深い学び」のための題材として,九州の大気環境や自然災害を児童・生徒が探究的に学習するための素材収集や教材化を行なうこと,探究的な学習における児童・生徒自身による体験的活動の利用に適した機材やその使用方法を検討することを目的として研究を行なった.桜島火山は生活圏内で長期にわたって活発に活動している活火山であるため,火山活動や大気環境の観測が充実している.これらの観測結果は,インターネットを介して公開されているので,学校教育における探究的な学習でも容易に利用できる.学校現場におけるICT活用環境も整ってきていることから,研究代表者らが定点観測用のカメラを設置して,観測・インターネット公開している定点カメラ画像や,作成・公開している桜島に関するデジタルコンテンツも含めて,探究的な学習における公的機関のデータ利用について桜島噴火の教材化を例に整理した.九州各地に設置している定点観測用カメラについて,機材劣化やネットワーク環境の変化に対応するために観測機材やシステムの更新を行なった.観測結果の画像アーカイブおよびデジタルコンテンツの作成を行った.自治体が測定し,環境省がWeb公開している微小粒子状物質濃度の速報値と安価な微小粒子状物質の簡易測定器による測定結果を比較したところ,学校教育用の教具としての有用性が確認できたので,簡易測定器を用いた測定活動を取り入れた,小学校第6学年理科最終単元における微小粒子状物質の教材化を行った.小学校教員向けの研修会において,小学校理科新学習指導要領における自然災害に関する内容の充実について,単元ごとの取扱いと学習活動において役立つ情報を得られる公的機関のサイトの紹介を行なった.平成30年度の実施計画に基づいて研究が進んでおり,成果発表も行なうことができた.環境や災害に関する学習素材・教材はできるだけ新しいものを使用することが望ましいため,前年度に引き続き,自然災害に関する情報や大気環境に関するデータの収集や観測・解析を継続するとともに,教材用のモデルの作成および検討を行う.本研究で観測したデータや撮影や処理を行った画像を教育用の素材として提供するために,空を連続撮影した画像や,実測データ,衛星画像などを“学校現場で利用しやすい形"でアーカイブ・Web公開する方法について検討し,素材データベースを構築する.火山灰・ガスの輸送や大気環境への影響についての基礎研究として,桜島,新燃岳,阿蘇などの噴煙・火山ガスの移流拡散,高濃度SO2事象について,教材化に適した最近の事例を検討し解析と教材化を行なう.
下垂体腺腫発症に関連するlncRNAの探索とその機能解析

CRNDEはマクロ腺腫においてミクロ腺腫の3倍の発現を認め、ACTHomaの増殖、浸潤性に関連することが示された。CRNDEはACTHomaにおいて細胞質に有意な発現を認め、現在さらなる分子機序の解析を行っている。下垂体腺腫はホルモン分泌能を有しながら腫瘍化するため、良性でありながら全身性の徴候をきたし、死亡率を上げ、QoL低下をもたらす比較的頻度の高い頭蓋内腫瘍である。本腫瘍の腫瘍化メカニズムに細胞周期におけるG1-S期調節を抑制するRb、Cyclin依存性キナーゼ阻害蛋白(CDKI)などの機能破綻が関わっており、我々は近年EGFRとそのファミリーであるHER2を標的とした低分子阻害薬がCDKI、Rbを刺激し、ホルモン合成分泌抑制、腫瘍のアポトーシスを誘導することを発表した(JCI 2011, Mol Endocrinol 2011)。本研究においては、近年細胞周期調節、癌の腫瘍化に関わっている事が明らかとなってきているlong non-coding RNAの下垂体腺腫腫瘍化メカニズムにおける役割を網羅的に解析し下垂体腺腫に対する分子標的薬の探索を目的とする。クッシング病患者から摘出されたACTH産生腫瘍7検体を用いマイクロアレイ解析を行った。その中で現在腫瘍の浸潤性に関連性があると考えられたCRNDEというlong non-coding RNAを同定した。現在CRNDEについての機能解析を行うため、発現ベクターを作成している。また、本マイクロアレイ解析よりクッシング病の腫瘍化に関連すことが示されているCycin Eと関連を示すlncRNAを検索したところ乳がんなどの多くの癌で転移、浸潤性を規定しているHOTAIRを同定した。ACTH産生腫瘍のマウス由来細胞株であるAtT20を用いてCyclin E阻害剤処理するとHOTAIR発現は上昇し、Cyclin EをsiRNAでノックダウンしても同じようにHOTAIRの発現は上昇した。このことからHOTAIRはCyclin Eにより負に制御されていることが明らかとなった。次にHOTAIRをAtT20でノックダウンしたところ細胞増殖が抑制された。以上のことからACTH産生細胞ではCyclin Eが腫瘍化に関わっているものの、その下流でHOTAIRが抑制され、腫瘍の増殖や浸潤性が抑制されている可能性が考えられ現在更なる検討を行っている。いままでマイクロアレイ解析で腫瘍浸潤性の有無で比較検討し、有意差を認めるlncRNAを検索してきた。その中でいくつかの差が高いものをRealtime PCR法で更なる腫瘍も含め検討した。しかし、そのいくつかは明らかな有意差を認めるものではなかった。この網羅的解析の中から重要と思われるlncRNAを抽出する過程が最も時間を有した。また、lncRNAには繰り返し配列が多く、クローニングにも時間を要した。しかし、現在当初計画したとおりに順調に実験計画は進行していると考えている。クッシング病の原因であるACTH産生下垂体腺腫(ACTHoma)の術後7検体を用いてマイクロアレイ解析を行った。ここでは本腫瘍浸潤性と関連するKnosp分類を用いKnosp分類0-1群と2-4群の比較検討を行った。Knosp分類0-1群に比べ2-4群で有意に3倍以上の上昇を認めたlncRNAとして4つの候補遺伝子を選出した。次に、さらなる28例のACTHoma術後検体を用いてその4つのlncRNA発現量をリアルタイムPCR法で検討したところ、colorectal neoplasm differentially expressed(CRNDE)が有意に発現上昇を認めることが明らかとなった(p = 0.013)。また、CRNDE発現はマクロ腺腫においてミクロ腺腫より発現が高い傾向を認めた(p = 0.050)。次にCRNDEには幾つかのスプライスバリアントアイソフォームが報告されており、そのアイソフォーム発現パターンを解析したところ、ACTHomaではエクソン3を欠くスプライスバリアント2の発現が高いことが明らかとなった。次にCRNDEの細胞内局在を、核内RNA、細胞質RNAを分離してRealtime PCR法を用いて定量することにより検討した。まずヒト腎癌細胞株HEK293T細胞を用いて検討したところ、CRNDEは主に細胞質に局在していた。さらにACTHoma術後検体を用いて解析したところ同じように細胞質に主なCRNDEの局在を認めた。意義;ACTHomaの浸潤性、増殖性に関連するlncRNAとしてCRNDEを同定した。浸潤性ACTHomaは手術の寛解率も低く、予後不良である、しかしその浸潤性に関連する因子は明らかでない。今回明らかとなったCRNDEがどのように浸潤性と関連するのか、現在解析中である。クッシング病検体を用いた研究が多いが、希少疾患であり検体数が限られるため多くの実験を行うための十分な検体がなかなか得られない事が理由として挙げられる。モデル細胞株を用いた実験で代用することを模索しているが、lncRNAは種差や組織での違いが大きく、ACTHomaの人由来モデル細胞が確立していないことが実験における幅を狭めており、それを克服するためのモデル実験系を同時に確立する実験を行っているため進捗がやや遅れていると考えている。Cushing病の原因として近年USP8体細胞変異が同定されたが、その特徴としてミクロ腺腫であることが示されている。一方Cushing病における予後不良因子はマクロ腺腫や浸潤性の高い腫瘍であるが、その分子機序は明らかでない。

我々はこの分子機序を明らかにするため近年腫瘍浸潤性、増殖に関連することが明らかになってきているlong non coding RNA (lncRNA)に着目して以下の実験を行った。Cushing病術後7検体を用い、海面静脈洞浸潤の指標であるKnosp分類を用いてgrade0-1とGrade2-4に分けてマイクロアレイ解析を行い5倍以上の違いを認めるlncRNAを選定した。次に16例の術後検体を用い、Realtime PCR法でその妥当性を検証したところColoRectal Neoplasm Differently Expressed (CRNDE)をCushing病の浸潤性、増殖性と関連する有意なlncRNAとして同定した。さらに30例のCushing病術後検体でCRNDEとそのCushign病患者の臨床的背景との相関性を検討した。CRNDEはACTH、コルチゾール分泌との相関は認めなかったが、腫瘍サイズ、腫瘍浸潤性の使用であるKnosp分類と相関を認めた。次にCRNDEが他の下垂体腫瘍の増殖性、浸潤性と関連するかを検討するため、非機能性下垂体腺腫、プロラクチノーマ、先端巨大症の術後検体を用いてRealtime PCR法で検討を行ったが、それらの腫瘍では全く関連性を認めず、Cushing病特異的な現象であることを確認した。LncRNAは核内では転写調節を、細胞質では翻訳調節を行っていることが知られているため、Cushing病における局在を確認したところ、主に細胞質に存在することが明らかとなった。現在その機能についてさらなる検討を行っている。CRNDEはマクロ腺腫においてミクロ腺腫の3倍の発現を認め、ACTHomaの増殖、浸潤性に関連することが示された。CRNDEはACTHomaにおいて細胞質に有意な発現を認め、現在さらなる分子機序の解析を行っている。現在同定したlncRNAのshRNAを用いたノックダウン安定株を、さらにCrispr/Cas9を用いたノックダウン細胞を作成し、その機能を解析する予定である。また、ヒトACTH産生細胞株であるDMS-79を用い、CRNDEやHOTAIRがACTH発現における転写、翻訳、タンパク質修飾や安定性に与える影響、細胞における増殖能、浸潤能に与える機構を解析する。また、ヌードマウスを用いた検討で、実際にLncRNA強制発現株、ノックアウト株などを移植したマウスでの腫瘍増殖農を検討する。本研究の意義は下垂体腺腫を調節するlncRNAを同定する事により発現が上昇しているlncRNAが同定できれば、そのAntisense oligo等を用いてその発現を抑制する事が、低下しているlncRNAが同定されれば、その抑制機構を明らかにすることにより1下垂体腺腫に対する標的薬物の開発につながるということである。また、下垂体腺腫におけるlncRNAの解析という新しい切り口の研究を進める事により、まだまだその機能が十分明らかとなっていない2lncRNAの新たな病理学的意義を新たに見出す可能性がある。現在実験モデル系の確立のため、術後検体を用いた三次元細胞培養実験系を作成している。本実験系が確立すれば多くの実験を前に勧めることができる。
モンゴルの伝統的歌唱「ホ-ミ-」の知覚に見る分凝の研究

モンゴルの伝統的歌唱「ホ-ミ-」は、1名の歌手が同時に2つの高さを表現する歌唱法である。通常、ひとつの音源から発せられた音が2つに分凝して聴こえることはない。このような特殊な知覚が、ホ-ミ-に含まれるどのような物理的音響特性を手がかりとした聴覚情景分析によるものかを明らかにするために研究を行った。まず、モンゴルのプロのホ-ミ-歌手2名に、口から空気が放出される技法、および、鼻から空気が放出される技法によるホ-ミ-のロングトーン歌唱を行わせ、収録した。さらに、ホ-ミ-歌唱を練習しているアマチュアに同様のロングトーン歌唱を行わせて、これを収録した。これらのロングトーン音の物理的音響特性を明らかにするために、サウンドスペクトログラムの分析を行った。次に、これらロングトーン音に含まれる2つの高さとその大きさを、2つの純音で模倣させる心理実験を行った。これらの音響特性と心理実験の結果を対応させた結果、ホ-ミ-で知覚される低く一定した高さは基本周波数に対応しており、メロディーを形成する甲高い音の高さは第2ホルマントによって鋭く共振された特定の倍音の周波数に対応することが分かった。また、メロディー音がいかに明確に知覚されるかには、共振された倍音の強さそのものではなく、近隣の成分との相対的な強さの差が重要であることが分かった。さらに、ホ-ミ-音の知覚に以下にような過程が含まれることが示唆された。聴覚に入力されたホ-ミ-音の音響情報は聴覚末梢系でスペクトル解析され、その後、高次過程において、このスペクトルを内包するようななめらかなエンベロープを抽出しようとする。しかし、周囲に比して特定の部分音の強さが強いと、このエンベロープからはみ出る部分が生じる。このはみ出した部分と、エンベロープに内包された部分とが分凝し、別々に知覚されると考えられる。
ベルクソン美学研究

1ベルクソン美学研究の一環として、1992年に公刊されたベルクソン美学講義を取り上げ、その意味を思想史的状況の下に、またベルクソニスム全体との関連の下に探ろうと試みた。その結果、フランス十九世紀折衷主義のクザンとその弟子のジュフロワの美学思想がベルクソン美学講義のひとつの源泉になっていることが明らかにされた。とくにジュフロワの『美学講義』(1843)がベルクソンの美学思想に与えた影響は大きい。ジュフロワの考える美の哲学の原理は、客観における「表現」と主観における「共感」の二項から成るが、ベルクソンは自らの美学講義で基本的にこの概念枠を踏襲している。さらに、主観を客観のうちに移し入れるというジュフロワ的共感の構造は、ベルクソンの哲学的方法としての直観の構造と同様である。しかし、ジュフロワ的共感においては主客の断絶が残されるのに対して、ベルクソ的直観においては表現が即ち共感であるような形で主客の合一が果たされるという点で両者は異なり、この点に直観の美学としてのベルクソン美学のもつ、レアリスムとイデアリスムとの対立を乗り越える理論的射程を認めることができる。2ベルクソンにおける想像の問題を笑い・夢・神話といふ三つのトポスにおいて取り上げ、ベルクソンの思想の中では受動性の勝った再生的想像に属するこれらの主題のうちに能動性の勝った創造的想像の契機が胚胎していることを示し、それによって客観から主観への、あるいは物質の側から精神の側へと通じる道が(外側から見れば)非連続的でありながら(内側からみれば)連続的であることを示した。これはベルクソン美学の本質をなすと思われる創造と受容との原理的相即、観想・行為・制作の起源的同一を、静態的なイマージュから力動的な直観へ向かう方向において論証しようとする試みであり、これまであまり注目されて来なかったベルクソン美学の思想的意義に光をあてるものである。
時間分解共鳴ラマン分光法によるタンパク質の速い構造変化の検出

酵素が示す特異的反応性は、反応中心における触媒活性に加えて、そとりまく蛋白質の合目的的な構造変化が重要である。未反応の基質を取り込み、生成放出するメカニズムがあって初めて酵素は繰り返し反応できる。その役割を担うのが質部分であり、それはかなり速いコンフォメーション変化を含む。本研究では呼吸系いて酵素を水に変える酵素であるチトクロム酸化酵素と、酸素貯蔵タンパクであるミロビンの反応中間体を時間分解共鳴ラマン分光法で追跡した。ウシ心筋チトクロム酸素と一酸化炭素との複合体をレーザー光で光解離させることによりO_2反応をスタートさせ、a_3ヘムに結合するO_2に4個の電伝達していった各段階における共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素同位体でシフるバンドを調べ、Fe^<III>-O^-_2→Fe^<III>-O-O-Cu^<II>→Fe^<IV>=O→Fe^<III>-OHと変化していくことを初めて確立し、本酵素の60年間に及ぶ研究の歴史にブクスルーを作った。ミオグロビンの分子構造はdeoxy型もoxy型も1.5Å分解能のX線結晶解析で明らかにされているが、そのいづれにおいてもO_2が蛋白の外側からヘム鉄に到達する道筋が存在しない。リガンドの脱着に伴う蛋白の速造変化をナノ秒のポンプ/プローブ時間分解ラマン分光法で追跡した。リガンドと一酸化炭素を用いた。COはサブピコ秒で光解離し、100ナノ秒からミリ秒にかけ結合する。再結合した分子のFe-co伸縮振動を観測するシステムを組立て、まずミオグロビンとその遠位ヒスチヂン変異体6種について上記の測定をした。続いてクミオグロビンの人工変異体についても数種測定し、静的なFe-co伸縮振動数が0cm^<-1>のものの再結合が510cm^<-1>のものより速いことを見つけた。しかし再結合途中で、いわゆるオープン形に対応するバンドはされなかった。この結果の解決のため、蛋白質の分子動力学計算をする一方で、非経分子軌道計算をも実施した。酵素が示す特異的反応性は、反応中心における触媒活性に加えて、それをとりまくタンパク質の合目的的な構造変化が重要である。未反応の基質を取り込み、生成物を放出するメカニズムがあって初めて酵素は繰り返し反応できる。その役割を担うのがタンパク質部分であり、それはかなり速いコンフォメーション変化を含む。本研究では呼吸系において酸素を水に変える酵素であるチトクロム酸素酵素と、酸素貯蔵タンパクであるミオグロビンの反応中間体を時間分解共鳴ラマン分光法で追跡した。ウシ心筋チトクロム酸化酸素と一酸化炭素との複合体をレーザー光で光解離させることによりO_2との反応をスタートさせ、a_3ヘムに結合するO_2に4個の電子を伝達していった各段階における共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素同位体でシフトするバンドを調べ、Fe^<iii>-O_2→Fe^<III>-O-O-H→Fe^<IV>=O→Fe^<III>-OHと変化していくことを初めて確立し、本酵素の60年間に及ぶ研究の歴史にグレークスルーを作った。

ミオグロビンの分子構造はdeoxy型もoxy型も1.5Å分解能のX線結晶解析で明らかにされているが、そのいづけにおいてもO_2がタンパクの外側からヘム鉄に到達する道筋が存在しない。リガンドの脱着にともなうタンパクの速い構造変化をナノ秒のポンプ/プローブ時間分解ラマン分光法で追跡した。リガンドとして一酸化炭素を用いた。COはサブピコ秒で光解離し、100ナノ秒からミリ秒にかけ再結合する。再結合したもののFe-CO伸縮振動を観測するシステムを組立て、まずヒトミオグロビンとその遠位ヒスチヂン変異株6種について上記の測定をした。遠位ヒスチヂンの置換により静的なFe-CO伸縮振動は490510cm^<-1>と変化し、490cm^<-1>付近のものの再結合は510cm^<-1>のものより非常に速かった。しかし再結合途中で、いわゆるオープン形に対応するバンドは観測されなかったので、新しい理論モデルの構築が必要なことがわかった。クジラミオグロビンで同種の実験を試みつつある。酵素が示す特異的反応性は、反応中心における触媒活性に加えて、それをとりまく蛋白質の合目的的な構造変化が重要である。未反応の基質を取込み、生成物を放出するメカニズムがあって初めて酵素は繰返し反応できる。その役割を担うのが蛋白質部分であり、それはかなり速いコンフォメーション変化を含む。本研究では呼吸系において酸素を水に変える酵素であるチトクロム酸化酵素と、酸素貯蔵タンパクであるミオグロビンの反応中間体を時間分解共鳴ラマン分光法で追跡した。ウシ心筋チトクロム酸化酵素と一酸化炭素との複合体をレーザー光で光解離させることによりO_2との反応をスターとさせ、a_3ヘムに結合するO_2に4個の電子を伝達していった各段階における共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素同位体でシフトするバンドを調べ、Fe^<III>-O_2^-→Fe^<III>-O-O-Cu^<II>→Fe^<IV>=O→Fe^<III>-OHと変化していくことを初めて確立し、本酵素の60年間に及ぶ研究の歴史にブレークスルーを作った。ミオグロビンの分子構造はdeoxy型もoxy型も1.5Å分解能のX線結晶解析で明らかにされているが、そのいづれにおいてもO_2が蛋白の外側からヘム鉄に到達する道筋が存在しない。リガンドの脱着に伴う蛋白の速い構造変化をナノ秒のポンプ/プローブ時間分解ラマン分光法で追跡した。COはサブピコ秒で光解離し、100ナノ秒からミリ秒にかけて再結合する。再結合した分子のFe-CO伸縮振動を観察するシステムを組立て、まずヒトミオグロビンとその遠位ヒスチヂン変異体6種について上記の測定をした。続いてクジラミオグロビンの人工変異体についても数種測定し、静的なFe-CO伸縮振動数が490cm^<-1>のものの再結合が510cm^<-1>のものより相当速いことを見つけた。しかし再結合途中で、いわゆるオープン形に相当するバンドは観測されなかった。この結果の解釈のため、蛋白質の分子動力学計算をする一方で、非経験的分子軌道計算をも実施した。
固体上での無溶媒反応を基盤とする高環境調和型不斉合成システムの開発

従来の有機合成において大量に消費される有機溶媒と、高希少性・高毒性を有する金属錯体触媒の使用及び処理の問題を解決する環境調和型不斉合成システムの開発を目指して研究をおこなった。3価の希土類金属イオンと多方向伸展性の配位子とから自己組織化により合成した触媒が、無溶媒条件において効果的なルイス酸触媒として機能することを見出した。これらの触媒は反応後に回収することができ、繰り返しの使用が可能であることを確認した。また有機溶媒の代替品としての有機ポリマーの可能性を確かめた。従来の不斉合成において大量に消費される有機溶剤と、高希少性・高毒性を有する金属錯体触媒の使用及び処理の問題を解決する「固体上での無溶媒反応を基盤とする高環境調和型不斉合成システム」の開発を目指して研究をおこなった。まず本システムの可能性を検討するために、アキラルな自己組織化型高分子金属錯体を合成し、その機能評価をおこなった。希土類アルコキシドとアキラルな多方向性配位子としてのアリールジ-及びトリスルホン酸とを混合することで合成した高分子希土類金属錯体は、高い安定性を有しており単離、長期保存、及び空気中での取り扱いが可能であることがわかった。これらをヘテロDiels-Alder反応と窒素求核剤を用いたエポキシドの開環反応のルイス酸触媒として用いたところ、反応溶媒を使用しない不均一条件において良好な変換率で反応が進行し、中でもスカンジウム錯体が高い触媒活性を示すことが明らかになった。これらは厳密な反応条件を必要とせず、空気中での反応においても不活性ガス雰囲気下と遜色ない触媒活性を示すことがわかった。また反応終了後には少量の有機溶媒を用いて触媒と基質及び生成物とを容易に分離することができ、回収した触媒は適度に加熱乾燥操作をおこないながら使用することで10回以上の再利用が可能であることが確かめられ、本触媒の高い実用性が明らかとなった。次にこれらの無溶媒不均一反応の不斉反応への展開を目指し、ビナフチル骨格を有する新規二方向性キラルスルホンの合成をおこなった。これまでに光学純品の1, 1-ビ-2-ナフトールを出発物質とし、3, 3'位及び6, 6'位にスルホ基を導入した新規ジスルホン酸の合成に成功した。従来の不斉合成において大量に消費される有機溶剤と、高希少性・高毒性を有する金属錯体触媒の使用及び処理の問題を解決する「固体上での無溶媒反応を基盤とする高環境調和型不斉合成システム」の開発を目指し、(1)多方向性キラル配位子と金属イオンを混合するだけで自己組織化によって調製されるキラルな高分子金属錯体触媒の創製と無溶媒反応の不斉触媒としての利用、及び(2)不溶性有機ポリマーを従来の有機溶媒の代替反応媒体として用いる新しいタイプの不斉反応の開発の両面から研究をおこなった。(1)に関しては、光学純品の1,1'-ビ-2-ナフトール(BINOL)の6位及び6,6'位にスルホ基を導入した新規キラルスルホン酸を二方向性、及び三方向性のキラル配位子とし、これらとスカンジウムイソプロポキシドとをTHF/メタノール混合溶媒中で混合することで対応する錯体を合成した。これらの錯体は多くの有機溶媒に不溶であり、また元素分析の結果、スカンジウムとキラル配位子が想定される比で構成されていることが示唆された。本錯体をアミンによるエポキシドの不斉開環反応のルイス酸触媒として用いたところ、エナンチオ選択性は不十分なものの、無溶媒条件において定量的に目的の開環体を与えることがわかった。また(2)については、溶媒中の均一系反応で良い結果を与えているイッテルビウムービナフチルリン酸錯体触媒を有機ポリマー上に分散させ、無溶媒条件でのヘテロDiels-Alder反応をおこなうことで本システムの有用性を検討した。有機ポリマーを種々検討したところ、耐溶媒性に優れたポリ(テトラフルオロエチレン)を用いた系が良い結果を与え、高いエナンチオ選択性は発現しなかったものの、同触媒をもちいた溶媒中での均一系反応よりも高収率で目的の付加体を与えることがわかった。グリーンケミストリーの観点から、高価で毒性の高い金属錯体触媒を使い捨てせずに回収・再利用しながら実現される精密有機合成法の開発、また大量に消費される有機溶剤の使用量を、大幅に削減する手法の開発が近年強く求められている。本研究では、回収・再利用可能なキラルな固体触媒を自己組織化で合成し、これを無溶媒反応へ利用展開することで、高環境調和型不斉合成システムの開発を目指した。1,1'-ビ-2-ナフトール(BINOL)を出発原料とし、この3,3'位及び6,6'位にスルホ基を導入した光学純品の新規BINOL誘導体を合成した。

これらを二方向伸展性、及び三方向伸展性のキラルスルホン酸配位子とし、種々の希土類イソプロポキシドと溶媒中で混合することで、自己組織化により対応する高分子錯体を合成した。元素分析の結果、スカンジウム錯体で想定するイオン/配位子比で構成されているものが得られ、またこれらは多くの有機溶媒に不溶な高分子錯体であることが示された。本錯体をベンジルアミンによるメソエポキシドの不斉開環反応(不斉非対称化)のルイス酸触媒として用いたところ、エナンチオ選択性には改善の余地があるものの、無溶媒条件において目的の光学活性なアミノアルコールを定量的に与えることがわかった。またBINOLの環状リン酸エステルを、スペーサーを介して6位で連結させた新規キラルリン酸を合成し、これを二方向伸展性配位子として用いた自己組織化型高分子リン酸希土類金属塩を種々合成した。これをジクロロメタン中、ヘテロDiels-Alder反応の不均一不斉触媒として用いたところ、収率、立体選択性とも中程度ながら、反応後に回収した触媒は活性を維持し、3回の再利用が可能であることがわかった。
人工多能性幹細胞作製技術を応用した神経変性疾患細胞機能・回路異常病理の解明

iPS細胞から分化した神経細胞のイメージングを行う技術、遺伝子ノックインヒトiPS細胞作製技術、神経細胞迅速分化技術を開発。これらの技術でALS患者運動神経細胞を作製・解析し、の新たな病態を明らかにした(Sci Transl Med 2012)。アルツハイマー病患者神経細胞・アストロサイトを作製・解析し、新たな医療の方向性を示した(Cell Stem Cell 2013)。ヒトiPS細胞から分化したグリア系神経前駆細胞を用いて、ALS治療にiPS細胞が細胞源として有用である可能性を示した(Stem Cell Reports 2014)。開発してきた新技術を班員間の共同研究に用いた。神経変性疾患は、ある特定のニューロサーキット(神経回路)が選択的脆弱性を有し、変性することによって生じる難治性疾患である。神経変性疾患の病因病理は神経細胞機能障害、構造異常タンパク質蓄積、神経細胞死、非神経系細胞による神経変性加速により成立する。本計画では、人工多能性幹細胞(indnced pluripotent stem cell : iPS細胞)作製技術を応用して、それらの過程のうち、最も初期の変化である神経細胞機能障害を再現する神経変性疾患モデルの開発を行う。本年度は、シナプス小胞から細胞外への放出活動の蛍光イメージングコンストラクトを作製し、PC12細胞株において、シナプス機能のイメージングを行った。また、イメージングコンストラクトのレンチウイルスを用いたヒト神経細胞への導入システムの構築を行った。さらに、ヒトiPS細胞由来神経細胞の電気生理学的解析を行い、神経機能の解析を行った。シナプス機能を得るために、分化誘導後に得た神経細胞は長期培養を要するが、iPS細胞から分化誘導した神経細胞のみでは、長期培養できない場合には、iPS細胞から分化誘導した神経細胞とマウス由来グリア細胞等との共培養系の確立を行う。今後は、ヒトiPS細胞から分化誘導した神経系細胞が存在する培養条件を検討する。最終的に、神経変性疾患における特定の神経回路の選択的脆弱性の解明、正常・疾患比較および、疾患罹患神経系・非罹患神経系細胞比較により、神経変性疾患における神経細胞機能障害・回路異常病理の解明を行う。本計画では、人工多能性幹細胞(induced pluripotentstem cell:iPS細胞)作製技術を応用して、それらの過程のうち、最も初期の変化である神経細胞機能障害を再現する神経変性疾患モデルの開発を行っている。本年度、上位運動ニューロンの存在する大脳皮質第V層に比較的特異的な転写因子をレポーター遺伝子としてEGFPをノックインの手法で導入したコントロールヒトiPS細胞を作製した。EGFPの発現以外に、sNPアレイ、qPCR等の方法で、この遺伝子のプロモーター下にEGFPがノックインされていることを確認した。このiPS細胞を用いて、大脳皮質神経細胞への分化誘導を行い、in vitroにおけるレポーター遺伝子の発現時期についての経時的検討を行った。また、EGFP発現細胞をフローサイトメトリーによって純化・収集を行った。マイクロアレイによる遺伝子発現解析によって、レポーター遺伝子発現神経細胞ではprojection neuronに特徴的な遺伝子群の発現が上昇しており、興味深いことにそれらの遺伝子は上位運動ニューロン切断モデルで、大脳皮質第V層に発現が上昇する遺伝子群と一部共通であった。また、本年度、上記レポーターを発現する遺伝性ALS iPS細胞を作製し、現在、それらのクローンについて、ノックイン細胞を選択中である。神経変性疾患の病因病理は神経細胞機能障害、構造異常たんぱく質蓄積、神経細胞死、非神経系細胞による神経変性加速により成立する。本計画では、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell: iPS細胞)作製技術を応用して、最終的には、それらの過程のうち、最も初期の変化である神経細胞機能障害を再現する神経変性疾患モデルの開発をめざす。これまで、シナプス・ニューロサーキットパソロジーの創成のために、以下の新技術を確立した。(#1) iPS細胞から、神経変性疾患で変性する神経細胞を分化誘導後、その細胞をウイルスベクターによりイメージングを行う技術、(#

2)特定の神経細胞のマーカー遺伝子をレポーター遺伝子として、その遺伝子のプロモーターの下流にEGFPを導入したヒトiPS細胞を作製・解析する技術、(#3)線維芽細胞からニューロンを作製するdirect conversionの技術を応用して、iPS細胞から迅速に成熟神経細胞を作製する技術、(#4) iPS細胞から、神経変性疾患で変性する神経細胞を分化誘導後、シングルセルレベルでその細胞を解析する技術、(#5) iPS細胞から、神経変性疾患で変性する神経細胞を分化誘導後、その細胞を用いて、神経変性疾患における初期変化である神経機能障害を検出する技術。今後、各種新技術を用いて、神経変性疾患における神経機能障害・回路異常病理の解明を行う。これまで蓄積してきたヒト神経変性疾患iPS細胞を用いた分化誘導技術・疾患解析技術を、班員間共同研究を通じて、他班員の標的神経疾患の解析への利用をすすめていく。神経変性疾患は、ある特定のニューロサーキット(神経回路)が選択的脆弱性を有し、変性することによって生じる難治性疾患である。神経変性疾患の病因病理は神経細胞機能障害、構造異常たんぱく質蓄積、神経細胞死、非神経系細胞による神経変性加速により成立する。本研究では、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stemcell: iPS細胞)作製技術を応用して、それらの過程のうち、最も初期の変化である神経細胞機能障害を再現する神経変性疾患モデルの開発を行なった。コントロールおよびALS iPS細胞から上位・下位運動ニューロンを作製し、in vivo/in vitroでニューロサーキットの再現を試み、神経変性疾患、特にALSにおける神経機能障害・回路異常病理の解明を行なった。昨年度までに、線維芽細胞からニューロンを作製するdirect conversionの技術を応用してマウスES細胞/iPS細胞から迅速に成熟運動ニューロンを作製する技術を確立した。この技術をヒトiPS細胞に応用し、ヒト上位・下位運動ニューロン作製する方法を確立した。本年度は、昨年度に引き続き、ヒトiPS細胞から作製した上位および下位運動ニューロンを用いて、in vitroでニューロサーキットの再現後、ウィルスベクターを用いて各種イメージング用コンストラクトを導入し、上位・下位運動ニューロンのネットワーク形成を解析した。さらに、同様の技術を用いて、コントロールおよびALS iPS細胞から上位・下位運動ニューロンを作製し、in vivo/vitroでニューロサーキットの再現を試み、分子生物学的解析、direct conversion技術と合わせて、ALSにおける神経機能障害・回路異常病理の分子病態解明を行なった。また、昨年度に引き続き、これまで蓄積してきたヒト神経変性疾患iPS細胞を用いた分化誘導技術・疾患解析技術を、班員間共同研究を通じて、他班員の標的神経疾患の解析への利用すすめた。本計画では、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell: iPS細胞)作製技術を応用して、最終的には、それらの過程のうち、最も初期の変化である神経細胞機能障害を再現する神経変性疾患モデルの開発をめざす。
膵特異的レトロウイルスによるトランスアクチベーションを介したI型糖尿病発症機序

研究代表者らはヒトI型糖尿病患者における膵B細胞に対する自己免疫現象を分析し、その病因解明をすすめている。ヒトでウイルス感染を契機としたI型糖尿病の急性発症が知られるが、研究代表者らは本疾患の最良のモデル動物であるNODマウスの膵B細胞内にもレトロウイルスgag蛋白が発現することを証明していた。さらに、NODマウス膵よりレトロウイルスのcDNAの単離に成功していたのを契機に、本研究でレトロウイルス遺伝子そのものの全構造のクローニングに成功した。NODマウスは、糖尿病発症に先だって膵島炎を有する点で、ヒトのモデル動物と認識される特徴を有する。クローニングしたウイルスのRNAは膵島炎開始週令である4-6週令の膵に最も多く発現することが明らかになった。また、このウイルスは特異な遺伝子構造を有し、通常レトロウイルスに典型的に認めるenv,pol遺伝子を部分的に欠損しているほか、同領域にレトロポゾンのモチーフが複数挿入されていた。エイズウイルスで知られるように、レトロウイルスは頻繁にその遺伝子構造を変化させて病原性を発揮するとされる。本研究で明らかとなったウイルスの構造は、繰り返す組み換え現象とレトロポゾンの挿入という複雑な進化過程を経て、独自の機能を獲得したことを示している。モロニ-白血病ウイルスで知られるように、レトロウイルスのLTRには、宿主細胞の組織適合抗原遺伝子の一部をトランスアクチベーションすることが知られる。本ウイルス遺伝子が膵島炎と一致して膵島内で過剰発現し、同じメカニズムで組織適合抗原遺伝子を活性化することによって、自己免疫現象を増強、I型糖尿病の病因の一角をなすとの結論が導き出された。