hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本脳炎ウイルスゲノムの環状化がウイルス複製に及ぼす影響

本研究では、これまでにJEVの複製過程におけるCSの機能について解析するため、ルシフェラーゼ発現JEVレプリコンを作製し、そのCS領域に種々の変異(相補性を喪失する変異・相補性を維持する変異)を導入し解析を行った。4組のCSすべてについて、哺乳類細胞および蚊細胞内のJEVゲノム複製に寄与していることが明らかになり、またその機序として相補性依存型と配列依存型の2種があることが判明している。これらはゲノムRNA上の二次構造の機能を明らかにする上で重要な知見である。そこで、上で観察されたようなCSのウイルス複製に及ぼす影響が実際にゲノム環状化の成否によるものかどうかを明らかにするために、ゲルシフトアッセイ法を用いてRNA-RNAインタラクションの有無を変異を導入したゲノム5'端および3'端を合成して解析を行った。また、本解析は哺乳類細胞とJEV媒介動物である蚊由来細胞の体温である37°Cと28°Cで実施した。その結果、温度による差は認められなかったが、RNAーRNAインタラクション(ゲノム環状化)に対する影響の大きさはCSによる差が認められた。即ち、環状化貢献度の高いCS領域の相補性が維持されていれば、他のCS領域の相補性が喪失していてもゲノム環状化が起こることが示された。従って、本研究により、CS領域は哺乳類細胞と蚊細胞内でのウイルス複製に関与するが、ゲノム全体の環状化を介するものとステムループなど限局的な二次構造を介するものがあることが明らかになった。本研究課題では日本脳炎ウイルス(JEV)のゲノム末端に存在する4組の相補配列がゲノム環状化を介して複製に関与するかどうかを解析した。その結果、ゲノム環状化に重要な相補配列とウイルス複製に重要な領域をそれぞれ決定した。また、ゲノム環状化に必要な領域はウイルス複製に関与するが、ウイルス複製に必要な領域がすべてゲノム環状化に重要であるとは限らないことが明らかになった。これらゲノム上の相補配列の機能は哺乳類細胞と蚊細胞において差は認められなかった。これらの知見は未だ開発段階の特異的治療薬の開発に貢献するものと考えられる。今後はゲルシフトアッセイにより、RNAの結合性を確認しゲノム環状化への寄与を明らかにすると同時に、必要に応じて複数の相補配列領域に同時に変異を導入し、ウイルス複製に及ぼす影響を解析する。またこれらの相補配列領域が抗ウイルス薬の標的となり得るかどうかについても検証する予定である。今後はNon-RIゲルシフトアッセイを4組のCS全てについて、哺乳類(37°C)および蚊(28°C)体温で結合反応を行い、再度実施する計画である。また、これまでに得た結果についても再現性を確認する予定である。ウイルス学、ワクチン学Non-RIゲルシフトアッセイの実施を計画していたが、使用試薬・器具の選定および条件設定に時間を要し当初の研究計画分すべての検討を本年度内に行えなかったため、次年度使用額を生じた。Non-RIゲルシフトアッセイのRNA結合反応を定法に従い95°C加熱して実施していたが、日本脳炎ウイルスの生活環にそのような高温環境はないとの指摘を受け、哺乳類の体温である37°Cおよび蚊の体温である28°C条件下で再度実施する必要が生じたため。
母乳育児率の上昇につながる映像を用いた妊娠期からの母乳育児支援プログラムの開発

母乳育児の継続に影響する妊娠期の母乳育児のイメージ・知識を明らかにする目的で調査を行った。母乳育児を希望する妊婦に依頼し妊娠期から産後6か月迄に4回ずつ面接を行った。妊娠期は母乳分泌や育児生活に関する漠然としたイメージや不安を持ちつつも妊娠・分娩に関する知識のニーズが高く、母乳育児について具体的な知識を持っていなかった。出産後は母乳育児開始とともに母乳育児のイメージや不安が具体化し積極的に情報収集を行おうとする傾向が高まっていた。また、育児で多忙な母親はインターネットを活用した情報収集を行っていることが明らかとなった。調査結果を基に母乳育児を希望する母親に役立つ映像資料作成の準備をすすめた。核家族化、少子化、地域の交流の希薄化などにより、現代の育児環境では、出産前から母乳育児を行う人を身近に見る機会や、話を聞く機会が少ない。そのため、多くの母親が母乳に対する具体的なイメージや知識が不十分なまま、産後の生活を迎え、予想とは違う母乳育児の実際にギャップを感じている。妊娠中には9割の妊婦が母乳育児を希望していたにもかかわらず、出産後1か月における母乳育児率は42.4%、6か月では34.7%と低く、母乳育児を継続できない現状が報告されている。本研究は、妊娠末期から産後6か月の母親を対象とし、1.妊娠期の母乳育児の知識、母乳育児に対するイメージについて、2.母乳育児を継続することに影響した産後6か月間の体験について、縦断的な調査を行う。その結果を基に、産後6か月まで母乳育児を継続することに影響した妊娠期の知識や母乳育児のイメージを明確化し、「母乳育児率の上昇につながる、映像を用いた妊娠期からの母乳育児支援プログラム」を開発することを目的とする。平成25年度は1.妊娠期の母乳育児支援方法に関する文献検討、2.妊娠期の母乳育児支援の実態について調査(書籍・DVDを購入し知識取得、母乳哺育学会、助産学会、母乳育児学習会に参加)、3.予備調査(プレテスト)の実施、4.調査で使用する質問紙・面接ガイドの作成、5.倫理審査への申請、6.調査開始後、必要時に相談できる専門家(小児科医、栄養士、産科医師)、母乳育児支援の専門家と連携を図ることのできる体制づくり、7.調査者の面接能力の向上を行い、8.国際認定ラクテーションコンサルタントの再認定を受けた。また、合わせて、研究協力施設への依頼と研究協力妊婦の募集をすすめた。核家族化、少子化、地域の交流の希薄化などにより現代の育児環境では、出産前から母乳育児を行う人を身近に見る機会や話しを聞く機会が少ない。そのため多くの母親が母乳に対する具体的なイメージや知識が不十分なまま産後の生活を迎え、予想とは違う母乳育児の実際にギャップを感じている。本研究は、妊娠末期から産後6か月の母親を対象とし、1妊娠期の母乳育児の知識、母乳育児に対するイメージについて、2母乳育児を継続することに影響した産後6か月間の体験について、縦断的な調査を行う。その結果を基に、産後6か月まで母乳育児を継続することに影響した妊娠期の知識や母乳育児のイメージを明確化し、「母乳育児率の上昇につながる、映像を用いた妊娠期からの母乳育児支援プログラム」を開発することを目的とし本研究を行った。平成26年度は倫理審査より承認を受け、対象者募集、妊娠期産後6か月間の母親に対する質問紙調査、面接調査を行った。現在調査1の分析を行っており、調査2については分析の準備中である。また、平成27年度計画に向けて、母性看護学専門家と会議日程調整を行う。また、一部DVD作成時に使用可能な映像撮影を開始し、今後撮影に協力して下さる授乳中の母子の募集を開始した。研究成果の公表については、平成25年度に参加した日本母乳の会主催ワークショップ「妊娠中の乳房ケア」をまとめ、優秀演題として第23回母乳育児シンポジウムでポスター発表を行った。本研究は、妊娠末期から産後6か月の母親を対象とし、母乳育児を継続することに影響した母親の妊娠期および産後6か月間の知識・イメージを明確化する目的で縦断的な調査を行った。研究者所属大学の倫理審査を経て平成26年6月より関東近県の母親学級を主催している市町村及び、産科診療所にて対象者の募集を行った。20名の妊婦より研究参加承諾の連絡をいただいた。その後、妊娠期は17名、産後1か月時は15名、産後3か月時は18名、産後6か月時は18名の母親に母乳育児の知識・イメージ及び体験に関する面接調査を行った。産後6か月までの4回の面接を全て実施できた母親は15名であった。面接調査期間は平成26年7月平成27年8月だった。平成27年度は主に結果分析を行った。妊娠期は多くの母親が母乳育児について具体的な知識・イメージを持っておらず、漠然と母乳育児を行いたいという希望を持っていることが明らかとなった。また、母乳育児を希望しているものの、実際に産後母乳が出るか、母乳育児を頑張りすぎることで自身がストレスフルな状況になること等を危惧していた。一方で妊娠期は妊娠中や分娩に関する知識のニーズが高く、母乳育児については特に調べていなかった。出産後、母乳育児開始後に母乳育児の知識・技術を習得したいというニーズが高まり、母親が自ら積極的に情報収集を行う傾向がみられた。産後に育児で多忙となる母親の情報収集手段は、インターネットの活用が多い事が明らかになった。

また、妊娠期の母乳育児の知識・イメージやケアについて焦点を当てた原著論文18論文を検討し、研究報告「妊娠期の母乳育児支援のあり方に関する検討」をまとめた。さらに、母性看護学の専門家及び母乳育児支援者による会議を行い、母乳育児継続に役立つためのDVDの試作品を作成した。また情報提供方法としてインターネット利用を計画しホームページの作成準備をすすめた。母乳育児の継続に影響する妊娠期の母乳育児のイメージ・知識を明らかにする目的で調査を行った。母乳育児を希望する妊婦に依頼し妊娠期から産後6か月迄に4回ずつ面接を行った。妊娠期は母乳分泌や育児生活に関する漠然としたイメージや不安を持ちつつも妊娠・分娩に関する知識のニーズが高く、母乳育児について具体的な知識を持っていなかった。出産後は母乳育児開始とともに母乳育児のイメージや不安が具体化し積極的に情報収集を行おうとする傾向が高まっていた。また、育児で多忙な母親はインターネットを活用した情報収集を行っていることが明らかとなった。調査結果を基に母乳育児を希望する母親に役立つ映像資料作成の準備をすすめた。研究計画書では、平成25年度に妊婦を対象とした調査(調査1)において得られた結果を基にして、平成26年度は4月10月の期間に出産直後から産後6か月間の母乳育児に関する調査(調査2)を実施予定であった。しかし、研究者の所属する施設内で教員の人事異動に伴い、研究者の研究コホートが低下し調査1の開始が遅れた。平成26年度は倫理審査を経て、妊娠期にある研究協力者を募集し、平成27年6月までに調査2を全て終了する予定である。さらに、調査を行うに当たり、研究対象母子のスケジュールを優先した結果、調査日時の調整に時間を要したため、研究全体が遅延している。現在、調査1の分析を進めている。今後順次調査2の結果の分析を行い、視聴覚資料試作品作成に向けた準備を行う予定である。また、視聴覚資料作成に協力いただける母子の募集を開始している。現在、母乳育児場面を数場面撮影済みである。母性看護・助産学平成25年度、平成26年度に得られた結果を基にして、母乳育児率の上昇につながる母乳育児支援プログラム開発を行う。開発の第1段階として、調査1、調査2の結果を基にプログラム・DVD原案作成する。開発の第2段階として、母性看護学専門家、母乳育児支援者らによる専門家会議にてDVD原案修正を行う。開発の3段階として、DVD撮影・編集を行う。母乳育児率の上昇につながるDVDの試作品を完成させる。本研究で得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。同時に、完成したDVDを用いた母親が望む母乳育児率上昇につながる母乳育児支援プログラムを考案する。また、大学の支援として、業務を行う非常勤者の雇用により職場環境を調整し研究者が本研究を行うコホートの確保を進めている。研究結果の公表については、今後調査1の結果をまとめ、学術集会で発表するとともに、学会誌への投稿を計画している。妊娠期の母乳育児支援方法に関する文献検討、学会参加を行い最近の知見を得たうえで調査で使用する質問紙・面接ガイドの作成を行った。12月には日本母乳の会主催の第22回ワークショップに参加し「妊娠中の乳房ケア」について、母乳育児支援を行う専門家とディスカッションし、妊娠中の母乳育児支援について現状と課題についてまとめた。
d-f元素系多核錯体を前駆体とする均一複合酸化物の新規低温調製法

本研究の目的は、結晶としてあらかじめ単離したヘテロ金属錯体の熱分解による混合酸化物の調製法を新しく提案することである。この方法は、原子レベルで均一な高表面積の混合酸化物を調製する方法として非常に有望なものである。ここでは、主に、d-f元素系を対象とした。LaとCoがシアノ基やオキサラト基で架橋された三次元ネットワーク構造をとっているLa[Co(CN)_6]・5H_2OおよびLa[Co(ox)_3]・8.5H_2Oを熱分解した結果、600°Cでペロブスカイト型酸化物LaCo_3の単相になった。この温度は、La_2O_3とCoOの(1:2)混合物を前駆体とした場合の生成温度1000°CやLaとCoの(1:1)水溶液からシュウ酸塩として共沈させたものを前駆体とした場合の生成温度1200°Cよりもはるかに低温である。EPMA測定から、ヘテロ金属錯体から得られたLaCoO_3は、均一性においても、非常に高いことがわかった。このように、ヘテロ金属錯体は、複合酸化物の前駆体として非常に優れていることがわかった。本研究の目的は、一旦結晶として単離したヘテロ金属二核および多核錯体(特にd遷移元素と希土類から成るd-f元素系錯体)を前駆体とし、それらの熱分解によって高均質の複合酸化物を低温で調製する新手法を確立することである。本年度は、まず、Sm(III)とFe(III)とがCNによって架橋された三次元ネットワーク構造をとっているSm[Fe(CN)_6]・4H_2Oを合成し、その熱分解について調べた。その結果、700°C・1時間の熱処理によってペロブスカイト型酸化物SmFeO_3が完全に生成することが分かった。これに対して、Sm_2O_3とFe_2O_3の(1:1)混合物を反応させる方法(従来のセラミックス法)では1200°C・24時間の熱処理でようやくSmFeO_3の単相を得ることができた。次に、二核化配位子H_4dhbaen(H_4dhbaen=N,N^x-bis(3-hydroxysalicylidene)ethylenediamine)を用いて、二核錯体MnLa(dhbaen)(OH)(NO_3)(H_2O)_4を合成し、その熱分解挙動を調べた。その結果、600700°Cでペロブスカイト型酸化物LaMnO_3がほぼ完全に生成した。これに対して、La_2O_3とMn_2O_3の(1:1)混合物では1000°Cで処理しないとLaMnO_3単相にならないことが分かった。また、Auger分光分析、TEMおよびSEM観察などから、本研究の錯体分解法によって調製したペロブスカイト型酸化物は、従来のセラミックス法によるものよりもはるかに均一であることが分かった。更に、二核錯体CuRE(dhbaen)(NO_3)(dmso)_m(H_2O)_n(RE=Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Y,Ho,Er,Tm,Tb,Lu)の熱分解についても調べた。その結果、RE_2O_2SO_4とCuOが均一に分散した複合体の生成が、かなりの低温(400900°C)でも可能であることが分かった。本研究の目的は、一旦結晶として単離したヘテロ金属二核および多核錯体(特に,d遷移元素と希土類から成るd-f元素系錯体)を前駆体として用い、それら熱分解によって高均質の複合酸化物を低温で調製する手法を確立することである。2年目に当たる本年度は、Bi-La-Fe系の複合酸化物の調製を試みた。そのために、Bi(III)、La(III)およびFe(III)が三次元ネットワーク構造を取り得るヘテロ金属錯体Bi_<1-x>La_x[Fe(CN)_6]・nH_2O(x=0-1)を合成し、それらの熱分解挙動を調べた。すべての錯体について、ペロブスカイト型酸化物Bi_<1-x>La_xFeO_3の単相を得ることができた。

これらの中で、注目すべきことは、Bi[Fe(CN)_6]・4H_2Oでは700800°CでBiFeO_3の単相に、La[Fe(CN)_6]・5H_2Oでは600700°CでLaFeO_3の単相になるのに対し、Bi_<1-x>La_x[Fe(CN)_6]・nH_2O(x=0.1-0.9)では約500°Cという低温でペロブスカイト型酸化物の単相になったことである。このような低温において調製できるために、粒子成長の抑制が可能となる。事実、500°Cで得られたBi_<0.5>La_<0.5>FeO_3のTEM観察を行った結果、約30nmの微粒子であることがわかった。また、La[Co(C_2O_4)_3]・8.5H_2Oは600°CでLaCoC_3の単相になり、従来のセラミックス法によって1000°Cで調製したLaCoO_3よりも、成分元素の均一性がはるかに高いこともEPMA測定から確認することができた。本研究の目的は、結晶としてあらかじめ単離したヘテロ金属錯体の熱分解による複合酸化物の低温調製法を新しく提案することである。この方法は、原子レベルで均一な高表面積の複合酸化物を調製する方法として非常に有望なものである。これまでの2年間は、主に希土類とd遷移元素から成る(1:1)ペロブスカイト型酸化物の低温調製を行ってきた。最終年度にあたる15年度では、他の複合酸化物の低温調製にも本法が有効であるかを検討した。そのために、LaとCuが2:1の錯体[La_2Cu(C_4O_4)_4(H_2O)_<16>]・2H_2Oを合成し、その熱分解挙動と分解生成物について調べた。この錯体はC_4O_4^<2->(3,4-dihydroxy-3-cyclobutene-1,2-dionate)によってLaとCuが架橋された三次元ネットワーク構造をとっている。200°C付近までに18個の水分子が失われ、650°C付近以上で重量減少がほとんど見られなくなった。この650°C以上の最終プラトーにおける生成物の粉末X線回折パターンを測定した結果、La_2CuO_4の単相になっていることがわかった。このような複合酸化物が生成しているとしたときの重量減少率は63.6%であり、実測値の63.2%ともよく一致している。700°Cで1時間熱処理することによって得られるLa_2CuO_4の粒径を電子顕微鏡(SEM)写真で調べた結果、約100nmで揃っていることがわかった。800°Cで1時間熱処理すると、焼結による粒子成長のために、粒径が約200nmと大きくなる。このように、2種類の金属イオンが1:1のペロブスカイト型酸化物だけでなく、他の複合酸化物の低温調製も、適切なヘテロ金属錯体を前駆体とすれば、充分可能であることがわかった。
学習と評価の可視化により学習ストラテジーを育成する自律学習型英語教材の設計と開発

本研究では,学習ストラテジーの獲得と自律的な学習の促進を目的とした,日本人大学生向けのEAP(English for Academic Purposes)教材の設計及び開発を行った.教材は15ユニット分をオンライン上に構築し,eラーニング教材だけでなく,ブレンド型学習用の教材としても利用できるものを設計した.また,要約や議論,発表といった発信型や技能統合型のタスクを多く取り入れた.対照群と実験群を対象としたアクションリサーチの結果,学習履歴やタスクに関する達成度の評価や助言を可視化し学習者に提示することにより,学習ストラテジーの活用とタスクの達成度,学習意欲の喚起に効果があることがわかった.学習活動と評価に関する情報を可視化することにより,学習者が個々に合った学習ストラテジーを身につけ,自律的に学習するのを支援する英語eラーニング教材の設計及び開発に向け,平成24年度は以下のことを行った.1.双方向型英語運用能力を測るテストについての検討:試行としてTOEFL(R)のサンプルテストを用いて被験者に対し実施した.結果を分析したところ,英語運用能力に関する分別力は高いという結論が得られた.双方向型運用能力について定義の確認と共に,その能力を測る方法について更なる検討が必要であることがわかった.2.双方向的な活動を促す課題やその評価方法についての研究:学生の能動的な学習を取り入れた授業形態であるアクティブラーニングについて,その概念,実践例,評価方法,学習効果について文献調査を行った.調査結果を踏まえ,双方向的な活動を促すと予想される課題を作成した.それらの課題をeラーニング教材に導入する前に,iPadを用いた対面授業で利用し,課題の妥当性について検証を行った.3.学習や評価に関する情報の可視化方法についての研究:学習者にどのような情報をどのような方法でいつ提示することが,学習ストラテジーの確立や学習効果に結びつくのかを調査するために,評価に関する文献調査を行った.また,提示する情報を学習履歴と学習成果に,情報の提示回数を毎回提示する方法と数回にまとめて提示する方法に分類し,学習者に与える影響を分析した.分析結果を踏まえ,学習や評価に関する情報の適切な提示方法について仮説を立て,それを基に平成26年度に実施するパイロットテストの計画を立案した.4.教材開発に向けた準備:平成25年度に着手する教材開発に向け,素材選定,スクリプト作成,教材加工などを行った.5.学会への参加:国内の関連学会に参加し,最新の研究成果について学ぶと共に専門家と情報交換を行った.学習活動と評価に関する情報を可視化することにより,学習者が個々に合った学習ストラテジーを身につけ,自律的に学習するのを支援する英語eラーニング教材の設計及び開発に向け,平成25年度は以下のことを行った.1.教材の設計書の策定および教材プロトタイプの作成と改善:前年度のアクティブラーニングに関する調査結果をうけて,ブレンデッド形態(eラーニングと対面授業)でも利用できるように,eラーニング教材を設計した.教材は,アカデミックリーディング,アカデミックリスニング,アカデミックライティングを統合したタスクによって構成した.教材のプロトタイプは,TBLT(Task-Based Language Teaching)の枠組みに基づき,専門語彙や講義の動画などのリソースの学習というプレタスク,それらを基に要約作成やディスカッション,プレゼンテーションなどを行うメインタスク,それらの活動に対するリフレクションやピアフィードバックなどを行うポストタスクという流れとした.2.教材開発:教材は,授業15回相当の量をCMS(Course Management System)であるSakai上に構築した.また,講義動画のスクリプト,字幕,単語リスト,模範解答などの補助教材を作成した.3.学習や評価に関する情報の可視化方法についての検証:前年度に行った学習成果や評価の可視化方法に関する文献調査に基づき,試験的に情報を学習回ごとに提示し,学習成果物をポートフォリオに蓄積する設定にした.4.学会や研究会への参加:国内の関連学会や研究会に参加し,最新の研究成果について学ぶと共に専門家と情報交換を行った.本研究では,学習ストラテジーの獲得と自律的な学習の促進を目的とした,日本人大学生向けのEAP(English for Academic Purposes)教材の設計及び開発を行った.教材は15ユニット分をオンライン上に構築し,eラーニング教材だけでなく,ブレンド型学習用の教材としても利用できるものを設計した.また,要約や議論,発表といった発信型や技能統合型のタスクを多く取り入れた.対照群と実験群を対象としたアクションリサーチの結果,学習履歴やタスクに関する達成度の評価や助言を可視化し学習者に提示することにより,学習ストラテジーの活用とタスクの達成度,学習意欲の喚起に効果があることがわかった.学習活動と評価に関する情報を可視化することにより,学習者が個々に合った学習ストラテジーを身につけ,自律的に学習するのを支援する英語eラーニング教材の設計及び開発に向け,平成23年度は以下のことを行った.1.EAPコンピテンシーリストの開発:国内外でEAP(English for Academic Purposes,学術目的の英語)教育を実施している機関のシラバスを集め,テキスト化した.また,その他にCEFRやTOEFL,IELTS,ケンブリッジ英検のテストの評価項目から,EAPに言及した能力記述文を抜き出しデータベース化した.データベースの構築にあたっては,和文のものについては英文化し,表記を統一すると共に,能力記述文を学術研究に資するような文脈に書き換えた.次に,データベースをテキストマイニングし,頻出する語や出現傾向を分析した.データを整理し,学術目的の双方向型英語運用能力として習得すべきコンピテンシーのリストを作成した.

2.コンピテンシーを測るテスト開発に向けた準備:リスト化したコンピテンシーを持っているか否かを学習者自身に判断してもらう自己診断アンケートシステムと,客観的にかつ数値的にコンピテンシーの有無を判断するテストの開発に向け,準備を進めた.アンケートについてはオンライン上で回答できるように準備を行った.テストについては選択肢問題だけに限らず,ノートテイキングや要約等のタスクを含めるように構成を検討した.また実施時期,実施方法等について研究計画を立案した.3.学会への参加:TBLT 2011やIATEFL等を含む国内外の関連学会に参加し,最新の研究成果について学ぶと共に専門家と情報交換を行った.学習活動と評価に関する情報を可視化することにより,学習者が個々に合った学習ストラテジーを身につけ,自律的に学習するのを支援する英語eラーニング教材の設計及び開発に向け,平成26年度は以下のことを行った.1.アクションリサーチによる教材の有効性の検証:実験群96名に開発したeラーニング教材を学習してもらい,その学習効果と改善点について調査した.事前・事後テストとしてTOEFL PBT形式のテスト問題2セットを利用し,その結果とともに学習履歴の分析を行った.また,教材の有効性と学習ストラテジーの獲得に関する質問紙調査を実施した.事前・事後テストを対応のあるt検定を用いて分析したところ,特にリスニングセクションにおいて有意な向上が見られ,学習状況と得点には強い相関があった.一方,事前テストの結果,実験群と同等レベルの能力を有すると考えられる対照群には,向上は見られなかった.学習ストラテジーについては,メタ認知面での向上が見られたが,認知面や社会・情意面についてはマイナスの結果が得られた.また,質問紙調査より教材の利便性,学習上の困難点などが明らかとなった.2.教材の改善と再検証:上記の試行を受けて,教材を改善し,再検証を行った.先の検証時とは異なる58名の被験者に教材を学習してもらい,同様にテスト,学習履歴の分析,質問紙調査を行った.被験者は学習成果や評価を閲覧して学習できる群と,閲覧できない群の二つに分類した.閲覧できる群は一回目の検証時よりもテスト,学習状況,質問紙調査で有意に良い結果が得られたが,閲覧できない群では有意な結果が得られなかった.このことから,開発した教材の有効性とともに,学習や評価に関する情報の可視化が自律学習を促し学習効果を上げることがわかった.3.学会や研究会への参加:国内外の関連学会や研究会に参加し,最新の研究成果について学ぶと共に専門家と情報交換を行った.外国語教育,教育工学平成23年度の課題として残っていた,学術目的の双方向型英語運用能力を測るテストについて検討事項が多く残り,平成25年度にも持ち越すこととなってしまった.この作業のずれ込みに伴い,本年度中にeラーニング教材の素材を15つ選定し加工予定であったが,8つに留まり,教材の開発準備に遅延が生じた.前年度は教材の素材選定などの遅れに伴い,開発準備に遅延が生じていたが,本年度は1セット(15ユニット)分を開発することができた.
魚類糞便を用いた健康診断法の開発：魚からのストレスメッセージを非侵襲的に読み解く

本研究は、魚類(マダイ)をモデル生物として、実験生物に全く痛みを与えずに環境ストレス影響を糞便中の各種指標の変化から検出・評価する方法を開発することを目的として行った。2018年度は、ストレス負荷試験として過密養殖試験を屋外環境で行った。試験は、持続的養殖生産確保法で定められた許容飼育密度(10 kg/m3)を参考に低密度(約5.1 kg/m3)と高密度(約15 kg/m3)を再現した簡易生け簀を研究所併設の屋外水槽に設置し、自然水温、日照下で21日間行った。試験期間中、週に1度成長指標(全長・体重)を記録した。7日目,試験終了時には糞便を採取し糞便中細菌の資化能、細菌叢解析、および代謝物総体解析を行うとともに、試験終了時に供試魚の一部を取り出して血清及び肝臓中のストレスマーカー(Superoxide dismutase:SOD)を測定するとともに、過密養殖によるストレスを糞便中の各種指標の変化から検出することを目指した。成長指標は、試験終了時に低密度区の個体の平均体重が高密度区に比べ統計学的に有意に増加した。肝臓中および血清中のSODは顕著に変化しなかったものの、高密度区では外観上傷やヒレの擦れが散見されたことから供試魚が過密養殖によりストレスを受けていると判断した。糞便中細菌の資化能、細菌叢、及び代謝物総体解析では、処理区間で差を検出することができなかった。以上の結果、密殖により生物体(マダイ)は成長抑制によるストレスを受けていることが確認されたものの、それを裏付ける変化を糞便中から検出することはできなかった。これは、サンプリング時の腸内環境がそれぞれストレスを感じる前(7日目)、ストレスに対応して腸内環境がすでに変化し、順応後の見かけ上正常時(21日目)であると推察され、ストレスに呼応した糞便中の変化を捕捉するにはサンプリングのタイミングが重要であることが示唆された。本研究は、魚類をモデル生物として、糞便中の腸内細菌叢及び代謝物の変化を指標とした、実験生物に全く痛みを与えずに環境ストレス影響を検出・評価する方法を開発することを目的として行った。28年度は、有害化学物質(石油毒性成分:フェナントレン(Phe))をストレス源とした曝露試験を2週間行い、1回/週の頻度で糞便、血液を採取しその変化から本手法の妥当性を検証した。(1)血清中のストレスマーカー(SOD)濃度を測定した結果、曝露区で有意に増加しており、供試魚がPheのストレスを受けていると判断した。(2)1糞便を用いた代謝物総体解析の結果、1週目に生理活性アミンであるプトレシンが曝露区で有意に減少していた。この結果は2週目に行った2栄養資化能評価によって腸内細菌のプトレシン資化能が上昇した結果と合致する。3糞便中腸内細菌叢を次世代シーケンサーによって解析した結果、γ-Proteobacteriaが優占している点は共通であったが、その内訳をみると通生嫌気性菌であるVibrionaceaeの割合が減少し、好気性菌であるPseudoalteromonadaceaeの割合が増加していた。このことから、通常嫌気環境である腸内環境が、Pheの暴露により好気的な環境に変化している可能性が示唆された。以上の結果、Pheのストレスに対峙する以下の腸内環境の変化が推察される。すなわち、Pheに対しまず内在性の腸内細菌(か宿主?)が腸内環境を好気的に変化させて適応する(1週目)、しかし、Pheによるストレスが生物体の許容範囲を超えると腸内細菌の種組成や腸内細菌の資化能を変化させ適応しようとする(2週目)、というものである。さらに、曝露終了後清水に戻すと資化能や代謝物に対照区との差は殆どなくなることも確認している。有害化学物質を環境ストレス源としたケーススタディとして、供試魚の糞便の変化を1代謝物、2腸内細菌叢の資化能、3腸内細菌叢の種組成から考察した。その結果、各指標に顕著な変化がみられ、腸内環境の変化が詳らかになるとともに、またそれらの一部は各指標を関連付けることで合理的に説明が可能な変化もみられた。以上より、本研究の達成目標である「実験生物に全く痛みを与えずに環境ストレス影響を検出・評価する方法を開発」に向けた端緒となる成果をあげることができたと考えられる。一方、当初計画に盛り込んでいた糞便中トランスクリプトーム解析は、外注先での技術的な壁(cDNAライブラリの調整不良)により実施困難(失敗)であった。また、当初の想定以上に新鮮な糞便の確保が難航したため、糞便中のトランスクリプトーム解析は断念することとした。29年度は、ストレス負荷試験として過密養殖試験を行った。試験は、持続的養殖生産確保法で定められた許容飼育密度(10 kg/m3)を参考に低密度(約4.6kg/m3)と高密度(同14kg/m3)を再現した水槽内で21日間行った。

7、21日目には肝臓中のストレスマーカー(Superoxide dismutase:SOD)を測定するとともに、糞便を採取し糞便中細菌の資化能、細菌叢解析、および代謝物総体解析を行い、過密養殖によるストレスを糞便中の各種指標の変化から検出することを目指した。成長指標は、試験開始14日目より低密度区の個体の平均体重が高密度区に比べ統計学的に有意に増加した(試験終了時で約10%増)。肝臓中のSODは、7日目のみに高密度区で有意に増加した。これらの指標に加え、高密度区では外観上傷やヒレの擦れが散見されたことから供試魚が過密養殖によりストレスを受けていると判断した。糞便中細菌の資化能、細菌叢、代謝物総体解析の結果、すべての指標で7日目に比べ、21日目で処理区間で大きな変化が見られた。すなわち、資化能においては全資質の16%(q<0.05)が変化し、主成分分析においても顕著な2つのクラスターを形成した。細菌叢は、Proteobacteria門の割合が高密度区で増加する傾向が見られ、種組成の変化が見られた。糞便中代謝物では11%の代謝物が有意に変化した(p<0.05)。以上の結果、密殖により生物体(マダイ)は成長抑制によるストレスを受けており、それらが裏付けられる形で腸内環境が変化していることが推察された。過密養殖を環境ストレス源としたケーススタディとして、供試魚の糞便の変化を1代謝物、2腸内細菌叢の資化能、3腸内細菌叢の種組成から考察した。その結果、各指標に顕著な変化がみられ、腸内環境の変化が詳らかになった。以上より、本研究の達成目標である「実験生物に全く痛みを与えずに環境ストレス影響を検出・評価する方法を開発」に向け、平成28年度の有害化学物質を環境ストレス源としたケーススタディとともに、着実に成果をあげることができていると考えられる。本研究は、魚類(マダイ)をモデル生物として、実験生物に全く痛みを与えずに環境ストレス影響を糞便中の各種指標の変化から検出・評価する方法を開発することを目的として行った。2018年度は、ストレス負荷試験として過密養殖試験を屋外環境で行った。試験は、持続的養殖生産確保法で定められた許容飼育密度(10 kg/m3)を参考に低密度(約5.1 kg/m3)と高密度(約15 kg/m3)を再現した簡易生け簀を研究所併設の屋外水槽に設置し、自然水温、日照下で21日間行った。試験期間中、週に1度成長指標(全長・体重)を記録した。7日目,試験終了時には糞便を採取し糞便中細菌の資化能、細菌叢解析、および代謝物総体解析を行うとともに、試験終了時に供試魚の一部を取り出して血清及び肝臓中のストレスマーカー(Superoxide dismutase:SOD)を測定するとともに、過密養殖によるストレスを糞便中の各種指標の変化から検出することを目指した。成長指標は、試験終了時に低密度区の個体の平均体重が高密度区に比べ統計学的に有意に増加した。肝臓中および血清中のSODは顕著に変化しなかったものの、高密度区では外観上傷やヒレの擦れが散見されたことから供試魚が過密養殖によりストレスを受けていると判断した。糞便中細菌の資化能、細菌叢、及び代謝物総体解析では、処理区間で差を検出することができなかった。以上の結果、密殖により生物体(マダイ)は成長抑制によるストレスを受けていることが確認されたものの、それを裏付ける変化を糞便中から検出することはできなかった。
肺気腫と肺線維症に対する肺再生因子の胸腔内投与による肺再生効果の検討

肺気腫や肺線維症は、進行すると呼吸不全に陥る疾患であり現在根本的な治療法がない。肺気腫や肺線維症により臓器不全に陥った肺を修復するり治療法として肺の再生治療の可能性が期待されている。本研究では、肺気腫モデルマウスと肺線維症モデルマウスに肺再生因子であるHGFの胸腔内投与を行い、その再生効果について検討した。その結果、肺気腫の改善効果は認められなかったが、肺の線維化の抑制は認められ、肺線維症の改善に有効である可能性が示唆された。肺再生因子の胸腔内投与の肺再生効果の検討のために、まず肺再生因子であるHGFの胸腔内投与の用量依存性効果についての検討を行った。C57BL6JマウスにHGF50ngまたは100ngを25μ1の生食に希釈して左胸腔内に注入した。また対照として、生食25μ1を左胸腔内に注入した。Brduを腹腔内投与後、HGF投与24時間後、48時間後に20cm水柱で肺をホルマリン拡張固定した。ホルマリン固定後、パラフィン包埋し3μmの肺組織切片を作成した。その組織切片を用いて、Brdu免疫染色を施行した。HGF50ng24時間群、HGF50ng48時間群、生食24時間群、生食48時間群の4群において各n=4にて、顕微鏡下400倍にて胸膜細胞と肺胞紳胞を全500個カウントし、Brdu陽性細胞の割合を算出した。その結果、HGF投与後24時間後のBrdU陽性肺胞細胞はHGF群と生食群では差を認めなかったが、BrdU陽性胸膜細胞はHGF群で対照群より上昇していた。また、HGF50ng群とHGF100ng群の両群間では差は認められなかった。BudUは増殖細胞に陽性となるため、陽性細胞の増加は細胞増殖の促進が生じたと推測できる。これらの結果からHGF50ngの胸腔内投与は24時間後の胸膜め増殖を促進することがわかった。近年、胸膜側からの肺胞再生の可能性を示唆する報告もあり、時間経過により肺胞の再生の可能性も期待できると考えられた。以上より、HGFの投与量は50ng/bodyとして、現在肺気腫モデルマウスと肺線維症モデルマウスを作成し、HGFを左胸腔内に注入する実験を施行している。肺気腫や肺線維症により臓器不全に陥った肺を修復する治療法として肺の再生治療の可能性が期待されている。胸膜側にも肺胞再生に関与があることが推測されていることから、本研究では、肺気腫モデルマウスと肺線維症モデルマウスに肺再生因子の胸腔内投与を行い、その肺再生効果について検討した。始めに、正常マウスに肺再生因子(Hepatocyte Growth Facctor : HGF)の胸腔内投与を行い、胸膜の細胞増殖促進効果について検討した。対照として生食を、また肺再生因子としてHGF50ng/bodyまたはHGF100ng/bodyを胸腔内投与し、投与24時間後の胸膜の増殖細胞め割合を検討した。その結果、HGF投与群では対照群と比較して胸膜の増殖細胞の割合が増加していたが、HGF50ng/body群とHGF100ng/body群の比較では、胸膜の増殖細胞の割合に有意差はなく用量依存性の胸膜の細胞増殖促進効果は認められなかった。これらの結果より、エラスターゼ誘起性肺気腫モデルマウスとブレオマイシン誘起性肺線維症モデルマウスを作成し、各々にHGF50ngを胸腔内投与しその7週後に肺再生効果について検討した。その結果、エラスターゼ誘起性肺気腫モデルではHGF投与群と非投与群において肺気腫の改善効果は認められなかったが、ブレオマイシン誘起性肺線維症モデルではHGF投与群では非投与群に比較して肺の線維化の抑制が認められた。以上の結果より、肺再生因子であるHGFの胸腔内投与は肺気腫の改善効果は認められなかったが、肺線維症の改善に有効である可能性が示唆された。
後期緑内障における自動車運転と視野障害の関係についての多施設共同研究

初期・中期・後期緑内障患者を各29名選択し、事故率を調査した。自動車事故の既往があるものは初期群で2名、中期群で0名、後期群で10名と後期群で多かった。次に、後期群35名を対象に、両眼視野(Beeline/HfaFiles ver.5にて作成)を用い、交通事故の既往がある群とない群間での視野障害度の比較を行った。両眼視野における中心視野感度の比較では、事故群において中心下方10度内の感度が有意に低かった。以上より後期緑内障患者では両眼視野欠損が進行し、さらに中心10度下方視野の感度が低下すると自動車事故をより起こしやすくなることがわかった。後期緑内障患者の視野障害と自動車事故の関係について調査するため、自治医科大学附属病院にて緑内障患者の臨床データを集積した。2007年9月から2009年10月までに自治医科大学附属病院を受診した後期(ハンフリー視野検査30-2プログラム(HFA30-2)におけるMean deviation(MD)値が両眼ともに-12dB以下)緑内患者29名と、年齢をマッチングした、初期(両眼ともMD値が-6dB以上)・中期(後期群および初期群の選択基準を満たさないもの)緑内障患者を各29名選択し、過去5年間の事故率、運転時間、運転歴を調査した。各病期群29名中、自動車事故の既往があるものは初期群で2名(6.9%)、中期群で0名、後期群で10名(34.5%)と後期群で多かった。運転歴、運転時間では各病期群で差はなかった。次に、自動車事故に関係する視野障害の検出に有効な視野検査方法を調査するため、2007年9月から2010年1月までに受診した後期群35例を対象に、既存のゴールドマン視野検査およびHFA30-2結果から得られた両眼視野(Beeline/HfaFiles ver.5にて作成)を用い、交通事故歴のある群とない群間での視野障害度の比較を行った。ゴールドマン両眼視野検査の結果は事故群と無事故群で差はなかった。HFA30-2両眼視野では事故群、無事故群間で全視野、上半視野、下半視野における感度に差はなかったが、中心視野における感度を比較したところ、中心下方10度内において事故群で有意に感度が悪かった。以上より後期緑内障患者は明らかに初期および中期緑内障患者に比較して自動車事故を起こしやすい状況にあり、特に両眼視野が進行し、特に中心10度下方視野の感度が低下すると自動車事故をより起こしやすいことがわかった。得られた結果により臨床において後期緑内障患者に対し、自動車運転についてより詳細な注意喚起および教育を行う。自治医科大学附属病院を受診した後期(ハンフリー視野検査30-2プログラム(HFA30-2)におけるMean deviation(MD)値が両眼ともに-12dB以下)緑内患者29名と、年齢をマッチングした、初期(両眼ともMD値が-6dB以上)・中期(後期群および初期群の選択基準を満たさない)緑内障患者を各29名選択し、過去5年間の事故率を調査した。次に、自動車事故に関係する視野障害の検出に有効な視野検査方法を調査するため、後期群35例を対象に、既存のHFA30-2結果から得られた両眼視野(Beeline/HfaFiles ver.5にて作成)を用い、交通事故歴のある群とない群間での視野障害度の比較を行った。結果では事故群、無事故群間で中心下方10度内において事故群で有意に感度が悪かった。以上より後期緑内障患者は初期、中期患者に比較して自動車事故を起こしやすく、特に両眼視野が進行し、中心10度下方視野の感度が低下すると自動車事故をより起こしやすいことがわかった。次に注意喚起の方法として有効な方法を調査するため、正常ボランティア8名に対し中心に穴のあいたピンホール(0.5mmと2mm)眼鏡を使用して模擬的視野狭窄状態を作製し、既存の自動車運転シミュレータ(三菱ドライビングシミュレータDS6000)を試行、その事故率を調査した。結果は視野がより狭いほうが事故率が高く、走行場面によって事故率に差があるものとないものに分かれた。以上より既存の自動車運転シミュレータは自動車運転の危険度を予測するために有用であることがわかったが、視野障害患者の注意喚起のためには走行場面の工夫を行う必要があると考えられた。

得られた結果をもとに緑内障患者専用の自動車運転シミュレータの開発を行い、後期緑内障患者に施行することで自動車運転についてより詳細な注意喚起および教育を行う。
唐代における毘沙門天信仰の成立と展開

今年度は主に四川地域の毘沙門天像の図像的な特徴を把握し、それを造立年代の編年の判定につなげることに目的を置いて研究を進めた。四川地域の作例は九世紀という一時期に集中的に造られたにもかかわらず、図像上の特徴や造像位置、造像サイズなどの面でそれぞれに相違点が多い。その地域的偏差・時代的偏差を正確にとらえるためには、この一世紀間にいかなる図像的展開や図像伝播がなされたかを考察する必要がある。したがって、今年度は四川地域の作例の網羅的な実地踏査を行い、既に調査を行っていた??、夾江、楽山、資中、内江、安岳等に加えて、四川北部の?中(大像山摩崖造像)、巴中(南龕)、通江(趙巧岩)の他、仁寿(牛角寨摩崖造像)や大足(北山仏耳岩)の作例調査を行った。その成果は、四川地域の毘沙門天像を網羅的に取り上げた論文で発表、従来未報告であった夾江県牛仙寺摩崖造像の作例など新資料の紹介も行った。当地域の毘沙門天信仰においては、四川のみならず唐朝にとっても南の門戸であった嘉州地域(楽山・夾江)の作例が重視されるべきであり、毘沙門天像が対吐蕃・南詔を明確に意識した鎮護国家を祈願する対象として造立されたという造像背景を顕著に示す事例であることが明らかになった。また、大足の作例には、約一世紀間の四川の毘沙門天図像の伝統とは異なる図像要素が採用されていることも明らかになり、四川地域における毘沙門天図像の展開史の重要な局面を明らかにできた。中国唐代において毘沙門天信仰の盛行した四川と甘粛地域との図像伝播の相互関係を考える上でも、こうした四川のスケールの確立は有効なものであると予想される。また一方で、南北朝時代より塔を捧持する毘沙門天の図像がおこなわれたが、この宝塔捧持の意味について考察を進めるために、南北朝期から隋唐代にかけての舎利信仰の展開と変容についても、主に文献テキストの収集・精読の方向から考察を進めた。唐代後半期から五代期にかけて毘沙門天信仰とそれに伴う造形活動は盛行の一途を辿り、西安周辺地域・甘粛地域・四川地域などに膨大な数の絵画・石窟壁画・摩崖彫刻といった美術作品が残る。本研究の目的は、その造形活動の推移・展開の歴史を体系的に捉えることにある。今年度は2本の柱、すなわち(1)甘粛地域の造形作品の現地調査とデータベースの作成、(2)文献史料・石刻史料による毘沙門天の造形活動記録の検証、これらを軸に研究基盤の構築に専念し、甘粛地域と四川地域の毘沙門天造形活動について比較研究を進めた。まず(1)では、事前に当該地域の毘沙門天関連作品のデータベースを仮作成し、作品タイプ別に分類を行った。その上で敦煌研究院の助力を得て、敦煌市莫高窟、瓜州市楡林窟の壁画・塑像の現地調査を行った。特に本研究において肝要となる『金光明経』を絵画化した変相図、単独毘沙門天像、毘沙門天像と天女像が並立する図像など、当該地域の毘沙門天信仰の成立の問題に絡む作例を中心に精査した。また(2)では、作品の現存しない地域も含め毘沙門天の造形活動が記録される史料を収集・釈読し、現存作品との比較照合を行った。これら(1)(2)の基礎的な検証を通し、四川地域がその土地を舞台にした霊験説話や特異な図像を生み出しながら戦神としての毘沙門天信仰を独自に展開したのに対し、敦燈地域では中央アジアを舞台とした西域起源の説話や伝説をもとに長らく造形活動を行い、四川地域ほどの独自性・土着性を有さなかったことが明らかになった。従来の地域間の差異を問わない一元的な唐代毘沙門天信仰史に対し、大きな見直しを迫る問題提起となった。

当地域の毘沙門天信仰においては、四川のみならず唐朝にとっても南の門戸であった嘉州地域(楽山・夾江)の作例が重視されるべきであり、毘沙門天像が対吐蕃・南詔を明確に意識した鎮護国家を祈願する対象として造立されたという造像背景を顕著に示す事例であることが明らかになった。また、大足の作例には、約一世紀間の四川の毘沙門天図像の伝統とは異なる図像要素が採用されていることも明らかになり、四川地域における毘沙門天図像の展開史の重要な局面を明らかにできた。中国唐代において毘沙門天信仰の盛行した四川と甘粛地域との図像伝播の相互関係を考える上でも、こうした四川のスケールの確立は有効なものであると予想される。また一方で、南北朝時代より塔を捧持する毘沙門天の図像がおこなわれたが、この宝塔捧持の意味について考察を進めるために、南北朝期から隋唐代にかけての舎利信仰の展開と変容についても、主に文献テキストの収集・精読の方向から考察を進めた。
選択的生成物分離操作を組合わせた酵素反応による生理活性ペプチドの合成プロセスの開発

本研究は、酵素反応と同時に生成物を反応系外に抽出分離する手法を用い、更に遊離酵素の連続利用を可能とする新しい生理活性ペプチド連続合成プロセスの開発を目的としている。人工甘味料アスパルテ-ム前駆体(Z-APM、F-APM)連続酵素合成を主に取り上げ、以下の知見を得た。A)アスパルテ-ム前駆体(Z-APM)連続合成に関し、本酵素反応の最適pHは6.5であり、低pHにおいて酵素活性が著しく低下する。しかし低pHにおける本合成手法ではZ-APMの分配比向上による反応収率の向上、基質_L-PheOMeのアルカリ加水分解の抑制、水相内における基質Z-_L-Asp濃度の低下による安定操作の実現等の利点を持つ。低pHにおいてZ-APM連続合成実験を実際に行い、原料基質Z-L-Asp基準で95%以上という極めて高い転化率を維持して安定にZ-APMを合成することが出来た。更に基質濃度を高めた実験を行い、低pHにおいて高生産性が実現可能なことを明らかにした。又、水/有機溶媒二相系バイオリアクターの定常濃度解析の為のモデルを確立し、実験結果及び解析結果の良好な一致を得た。B)安価な基質F-_L-Aspを用いた新規ペプチドであるアスパルテ-ム前駆体(F-APM)連続合成に関し、種々の有機溶媒あるいは抽出試薬を用いた水/有機溶媒二相系において、基質F-_L-Asp及び生成物F-APMの分配比を測定した。その結果トリブチルリン酸(TBP)が本手法によるF-APM連続合成に最適であることを明らかにした。一般的操作法である水一相系ではF-APM合成反応収率は1%未満であるが、本合成法に基づく水/TBP二相系において原料基質F-_L-Asp基準で95%以上の収率を得た。又アンモニウム塩等の抽出試薬や塩を添加することによって、収率が著しく向上することを見出した。本研究は,研究代表者らが先に提出した手法,すなわち,酵素反応と同時に生成物を反応系外に分離する手法を用い,高生産性と高収率の両立,分離・精製工程の簡略化,遊離酵素の連続利用を可能とする新しい生理活性ペプチドの連続合成プロセスの開発を目的としている。本年度はアスパルテ-ム前駆体の連続合成を主として取り上げて研究を行った。1.反応収率・生産性におよぼす諸条件の影響の解明(1)基質濃度の影響:原料基質Z-L-Asp濃度を高くした反応-抽出-晶析系での実験では、基質濃度の増加と共に転化率が増加し,原料基質Z-L-Asp濃度基準で98%以上の極めて高い転化率を得た。本実験範囲においては極めて安定した連続運転を行うことがで,さらに解析結果との良好な一致を見た。また原料基質L-PM濃度の増加による転化率の増加はほとんど見られなかった。(2)pHの影響:素過程である抽出と反応の平衡・速度を各pHにおいて実験的・解析的に解明した。また上記を用いた数値解析の結果,pHを下げることにより,原料基質L-PM濃度基準の収率が増大するためこれまで以上に効率的な連続合成の可能性が示唆された。2.最適操作条件の探索・確立:上記の成果および今年度までの基礎的成果に基づき、最適な操作条件を探索した。3.他反応系への適用:キョ-トルフィン,塩辛味ペプチドの前駆体の酵素反応と抽出に関する基礎特性を測定した。

他の有用な反応系についても継続して探索している。なお長期連続合成試験についても引き続き検討を行う。本研究は、研究代表者らが既に提出している手法、即ち、酵素反応と同時に生成物を反応系外に抽出分離し、かつ遊離酵素を連続利用し得る手法に基づき新しい生理活性ペプチド連続合成プロセスの開発を目的としている。本年度はアスパルテ-ム前駆体であるZ-APMと低原料基質コストのF-APMの連続合成を主に取り上げ研究を行った。A)アスパルテ-ム前駆体(Z-APM)連続合成に関し、1.長期連続合成試験、2.装置の設計指針の確立:本酵素反応の最適pHは6.5であり、低pH域では酵素活性が著しく低下するが、低pH域における本合成法ではZ-APMの分配比向上による収率の改善、基質(L-PM)のアルカリ加水分解の抑制、水相内基質(Z-L-Asp)濃度の低下による安定操作の実現等の利点を持つことを数値シミュレーションによって示した。更に実際に低pH域でZ-APM連続合成実験を行い、原料基質Z-L-Asp基準で97%という極めて高い転化率を維持した安定な連続運転を行った。又、実験結果は解析計算結果に良好に一致した。B)基質F-L-Aspを用いた新規ペプチドであるアスパルテ-ム前駆体(F-APM)連続合成に関し、1.抽出平衡・抽出速度の解析:種々の有機溶媒あるいは抽出試薬を用いた二相系において、基質F-L-Asp及び生成物F-APMの分配比、抽出速度を各pHについて測定し、理論解析を行った。2.最適有機溶媒の探索:一般的操作法である水一相系ではF-APM合成反応収率は1%未満であるが、本合成法を適用することにより80%以上の収率を得た。又、アンモニウム塩を抽出試薬として添加することによって生成物の分配比が著しく増加することを見出した。現在も引き続き本合成法に適した最適有機溶媒を探索している。3.反応機構の解明:迅速平衡可逆反応速度式に基づき、本反応機構の解明を進めている。本研究は、研究代表者らが既に提出している手法、即ち、酵素反応と同時に生成物を反応系外に抽出分離する手法を用いた、遊離酵素を連続利用する新しい生理活性ペプチド連続合成プロセスの開発を目的としている。本年度は人工甘味料アスパルテ-ム前駆体(Z-APM、F-APM)連続合成を主に取り上げ以下の研究を行った。A)アスパルテ-ム前駆体(Z-APM)連続合成に関し、本酵素反応の最適pHは6.5であり、低pHにおいて酵素活性が著しく低下する。しかし低pHにおける本合成手法ではZ-APMの分配比向上による反応収率の向上、基質_L-PheOMeのアルカリ加水分解の抑制、水相内における基質Z-_L-Asp濃度の低下による安定操作の実現等の利点を持つことを数値シミュレーションによって示した。更に低pHにおいてZ-APM連続合成実験を実際に行ったところ、原料基質Z-_L-Asp基準で95%以上という極めて高い転化率を維持して安定にZ-APMを合成することが出来た。更に基質濃度を高めた実験を行い、低pHにおいて高生産性が実現可能なことを明らかにした。B)安価な基質F-_L-Aspを用いた新規ペプチドであるアスパルテ-ム前駆体(F-APM)連続合成に関し、1.最適有機溶媒の探索:種々の有機溶媒あるいは抽出試薬を用いた水/有機溶媒二相系において、基質F-_L-Asp及び生成物F-APMの分配比を測定した。その結果トリブチルリン酸(TBP)が本手法によるF-APM連続結合に最適であることを明らかにした。