hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ノルアドレナリントランスポーターの活性調節機構の分子薬理学的解析

トランスポーターの機能調節においてPKCの関与が他の細胞において報告されているが、PKCを不活性化した細胞において、IFN-αによる取り込み抑制作用は減弱されたので、IFN-αによる抑制作用は少なくともPKCを介した作用であることが示唆された。このNAT減少の機序に関しては、(1)遺伝子発現の抑制、(2)mRNAの安定性の低下、(3)トランスポーターの蛋白輸送系の阻害、(4)トランスポーター蛋白のインターナリゼーションやデグラデーションの促進等の可能性が考えられるので、mRNAの定量やアフリカツメガエル卵母細胞並びにホ乳類由来の培養細胞にクローン化NATを発現させ、NAT抑制におけるIFN-αの作用機序について分子生物学的に検討したいと考えている。ノルアドレナリンシナプスセは、放出された神経伝達物質であるノルアドレナリン(NA)がノルアドレナリントランネポーター(NAT)によって再吸収され神経伝達は終了する。中枢神経作用薬の作用部位のひとつとしてNATを想定し、向神経・精神病薬、麻酔薬あるいはサイトカインなどによるNATの活性調節機構について薬理学的に解析することを試みた。NATによるNA再吸収機構の存在する培養ウシ副腎髄質細胞並びにアフリカツメガエル卵母細胞でのNAT発現系を用いて、NA輸送活性に対する麻酔薬の影響について検討した。副腎髄質細胞を静脈麻酔薬ケタミンと反応させると濃度依存性(101000μM,ICマレーシア50=97μM)に細胞内への[^3H]NAの取り込みが抑制された。NA取り込み機能におけるケタミンの抑制は最大取り込み能の減少によるものであり、Michaelis定数の変化によるものではなかった。コカインやデシプラミンなどのNATの特異的阻害剤は競合阻害を示すめに対して、ケタミンによる抑制は非競合阻害であった。さらに細胞膜への[^3H]Desiprmineの結合実験ではケタミンは最大結合を変化させずに、解離定数を増加させる血合阻害を示した。NATを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞においてもケタミンは副腎髄質細胞と同様の抑制作用を示した。以上の結果より、ケタミンはNA輸送機構を非競合的に抑制するが、その作用部位は競合阻害剤のデシプラミンと一部重複しているのではないかと考えられる。
未知巨大遺伝子クラスターの特異的配列取得法の確立

難培養性細菌の遺伝子資源を標的遺伝子特異的に入手する手法の開発を行った。重要創薬ターゲット遺伝子であるリボソーム非依存型ペプチド合成酵素(NRPS)やポリケチド合成酵素(PKS)は、巨大遺伝子クラスターにコードされているため、全ゲノム解読してその全長配列を入手することが最も近道である。標的遺伝子のmRNAの30bp程度の既知配列をプロービングするRNase H assisted RCA法を開発した。これにより標的遺伝子を発現した細菌のみを蛍光標識することに成功し、1細胞全ゲノム解析の道が拓けた。抗菌、抗腫瘍、抗炎症、抗アミロイド作用、免疫抑制剤などを産生するリボソーム非依存型ペプチド合成酵素(NRPS)やポリケチド合成酵素(PKS)は重要な創薬シーズであるが、1つのタンパク質の中に複数のモジュールが並び、各モジュールはさらに複数のドメインからなるモジュール型酵素であり、巨大遺伝子クラスターにコードされていることから、通常のメタゲノム解析では遺伝子分離が不可能である。未知・難培養性微生物であるがゆえに入手することを諦めてきた新規モジュール型酵素を取得するために、本研究では未知・難培養性微生物のモジュール型酵素合成遺伝子の全長を取得し、その全配列をマイニングすることで、完全in vitro合成法の道を拓くことを目的としている。27年度は、申請者のもつ遺伝子特異的全ゲノム増幅法を用いて、モデル細菌Pseudomonas fluorescens ATCC17400株のNRPS遺伝子をプライミングサイトとして特異的に全ゲノム増幅を行い、生じた1本鎖を2本鎖化することを目的とし、その合成に成功した。また、増幅に使用するΦ29DNAポリメラーゼは鋭敏に1分子鋳型でも増幅することが可能なことから、反応調製時の実験空間をISOクラス1の清浄度で行うことが必要であること、また、通常のクリーンベンチでは実験者由来のヒトDNAがコンタミネーションすることを配列解析から明らかにした。これらの知見を踏まえて、ISOクラス1のスーパークリーンゾーン生成装置において、2本鎖化することによって、コンタミネーションフリーの信頼性の高いDNA合成を達成した。申請者のもつ遺伝子特異的全ゲノム増幅法は、単菌分離を必要とせず、混合微生物系の中でも、標的細菌のゲノムのみを増幅することが可能である。基本技術はΦ29 DNAポリメラーゼを用いている点であるが、投入するプライマーは1本のため、1本鎖DNAが生じる。そこで、27年度は、2本鎖化のプロトコルの策定を行った。酵素はΦ29 DNAポリメラーゼを使用し、特異的プライマー(相補鎖)あるいはランダムプライマーの2種類を検討した。現在、ランダムプライマーで、純度の高い2本鎖DNAの合成に成功しており、PacBio次世代シークエンサーの長鎖リード解読に適したDNAであることが明らかになった。ただし、ランダムプライマー使用の場合、浮遊DNAのコンタミネーションによる非特異増幅が懸念される。我々は、通常のクリーンベンチでは作業者本人がコンタミネーションの原因を持ち込むこと、そのDNAはヒト由来の配列を有することを解明し論文に発表した(Bio Techniques, in press)。さらに、それを防止する策としてスーパークリーンゾーン生成装置を使用して非特異増幅なしで2本鎖を合成することに成功している。一方、スーパークリーンゾーン生成装置を持たない研究者でも非特異増幅なしで2本鎖DNAを合成するためには、特異的プライマー(相補鎖)による合成法の確立が望まれる。そこで、引き続きこちらの系も合成方法の最適化を行っている。現在、電気泳動では確認できないものの、Qubitによる分析では2本鎖DNAの存在が確認できている。これは、400Gb程度の相補鎖を合成すると予想され、合成距離が長いために目に見える形での2本鎖にたどり着いていないと考えている。次世代シークエンサーで解析するためには更なる改良が必要である。27年度は、モデル細菌Pseudomonas fluorescens ATCC17400株のNRPS遺伝子をプライミングサイトとして特異的に全ゲノム増幅を行い、生じた1本鎖を2本鎖化することを目的とした。また、反応調製時の実験空間をISOクラス1の清浄度で行うことが必要であること、また、通常のクリーンベンチでは実験者由来のヒトDNAがコンタミネーションすることを配列解析から明らかにした。28年度はATCC17400株の特異的全ゲノム増幅後、2本鎖化した合成ゲノムを、次世代シークエンサーで解析し、2本鎖合成された増幅領域のカバレッジを評価した。また、ゲノムを断片化して、自己環化させ、特異的プライマーで1本鎖合成を試みた。

全ゲノム領域の結果と反して、環状DNAのサイズが小さくなると、合成効率が減少することが明らかになった。申請者のもつ遺伝子特異的全ゲノム増幅法は、単菌分離を必要とせず、混合微生物系の中でも、標的細菌のゲノムのみを増幅することが可能である。基本技術はΦ29 DNAポリメラーゼを用いている点であるが、投入するプライマーは1本のため、1本鎖DNAが生じる。そこで、ランダムプライマーを用いて2本鎖化に成功した。次に、PacBio次世代シークエンサーで解読することにより、リードのカバレッジを評価したところ、2本鎖の合成量と相関しないカバレッジであった。シークエンスケミストリーでは、20kbに断片化後、末端にループプライマーを連結して環状化する手順であるが、サンプル中の残存1本鎖が断片化効率およびライゲーション効率を阻害することがわかった。また、ゲノムを断片化して、自己環化させることで、ターゲット領域を縮小化した環状ゲノムで同様の実験を行った。ターゲット領域を縮小化することで、より高効率に増幅されることを期待したが、予想に反して、合成効率が減少した。蛍光プローブを用いて直接観察した結果、特異的プライミング効率が減少することが原因であることが明らかになった。抗菌、抗腫瘍、抗炎症、抗アミロイド作用、免疫抑制剤などを産生するリボソーム非依存型ペプチド合成酵素(NRPS)やポリケチド合成酵素(PKS)は重要な創薬シーズであるが、1つのタンパク質の中に複数のモジュールが並び、各モジュールはさらに複数のドメインからなるモジュール型酵素であり、巨大遺伝子クラスターにコードされていることから、通常のメタゲノム解析では遺伝子分離が不可能である。未知・難培養性微生物であるがゆえに入手することを諦めてきた新規モジュール型酵素を取得するために、本研究では未知・難培養性微生物のモジュール型酵素合成遺伝子の全長を取得し、その全配列をマイニングすることで、完全in vitro合成法の道を拓くことを目的とした。シングルプライミング全ゲノムssDNA増幅法によって、モデル細菌Pseudomonas fluorescens ATCC17400株のNRPS遺伝子をプライミングサイトとして特異的に全ゲノム増幅を行い、生じた1本鎖を2本鎖化した。そして次世代シークエンサー解析によって、2本鎖合成された増幅領域のカバレッジを評価した結果、目視では見えない量の残存1本鎖がシークエンスケミストリーを阻害し、2本鎖合成量に一致しないカバレッジに留まった。よって、混合微生物系の中から、標的細菌のゲノムのみをin situで標識し、1細胞採取後に全ゲノムを増幅するシングセルゲノミクスで、未知モジュール型酵素合成遺伝子の全長を取得する方針に変更した。そのために、標的mRNAをラベルしシグナル増幅するRNase H assistedRPPCA法を考案した。そして、in situでのmRNA特異的ラベリングに成功した。これにより、FACSによる標的細胞のソーティング、シングセルゲノミクスが可能となった。
位相情報に着目した脳波・脳磁界計測

本研究では,新しい脳波(EEG)・脳磁界(MEG)データの解析法である位相系列解析を開発した.位相系列解析は単に解析方法としても機能するが,本研究では位相系列解析を前提としたEEG/MEGの測定装置・方法も含む実験全体としてデザインした.この結果,特にここ10年間注目を浴びている脳内の位相共振現象(事象関連同期・脱同期,長距離位相共振,位相リセット)を包括的に調べる実験方法を確立した.本実験方法を用いることによって,長距離共振を行うために領野間で位相補正が起る現象が位相リセットであり,過渡的に位相が進行するとき起る現象が事象関連同期・脱同期であるとの実験的証拠を得るに至った.本研究では,新しい脳波(EEG)・脳磁界(MEG)データの解析法である位相系列解析を開発した.位相系列解析は単に解析方法としても機能するが,本研究では位相系列解析を前提としたEEG/MEGの測定装置・方法も含む実験全体としてデザインした.この結果,特にここ10年間注目を浴びている脳内の位相共振現象(事象関連同期・脱同期,長距離位相共振,位相リセット)を包括的に調べる実験方法を確立した.本実験方法を用いることによって,長距離共振を行うために領野間で位相補正が起る現象が位相リセットであり,過渡的に位相が進行するとき起る現象が事象関連同期・脱同期であるとの実験的証拠を得るに至った.本研究の中核をなすオンラインクロック同期EEG/MEG計測装置を試作した.具体的には,ビデオ信号の垂直同期周波数を逓倍してEEG/MEG用のAD変換器のクロックを生成する回路,同垂直同期周波数に同期しかつ互いに精密に位置合せされた映像を出力するプロジェクタ2台,この映像をシールドルーム内で寝た姿勢にある被験者に提示するプロジェクタ支持台,電極がバッファアンプになる脳波キャップからなる.この実験装置を用いることによって,より精密なEEGデータを得ることができ,かつ被験者への負担は大幅に減少した.この装置を用いた両眼立体視のEEG計測を行い,左右単眼での処理,両眼での処理の3通りと,これらの刺激の状態に対する応答と状態変化に対する応答2通りの組合わせの合計6通りに対して脳波の分離に成功した.また,拡張加算平均法である位相系列解析では,位相順を定めるために数多くのパラメータが必要であり,これらを合理的に定める方法の説明不足のために投稿論文が不採択になった.これに対し,逆問題解のエポック間同期のクラスタリングによって,大幅にパラメータ数を減らす方法の開発を行った.また,本研究の応用例として,両眼立体視における左右眼情報処理のバインディング問題について調べた.この結果,単眼処理は主に刺激の状態変化に対応する短潜時成分であり,両眼処理は主に刺激の状態に対応する長潜時成分であることがわかった.なお,通常のEEG/MEG計測ではこれらの成分は分離できない.本研究では,新しいEEG/MEG解析法である位相系列解析を提案した.通常EEG/MEGデータはチャネル,時間,エポックの関数として扱われるが,エポックだけが物理的な意味を持っていない.位相系列解析は,位相情報に着目することによって,エポック順に物理的な意味を持たせ,フーリエ重み付き加算平均を行う加算平均法である.フーリエ重みを持つことから,加算平均は0次,1次...と複数得られ,情報が保存される.ここで0次は通常の加算平均と一致するため,位相系列解析は拡張加算平均法と言える.平成20年度は,平成19年度から経費を繰り越し,オンラインクロック同期EEG/MEG計測装置の試作を終えた.この実験装置を用いて位相系列解析を行い,以下の成果を得た1)EEG/MEGチャネル,または電流ダイポール問の位相情報に基づくクラスタリングを行い,位相系列解析に必要なチャネル選択というパラメータを大幅に軽減した.2)ボタン押し課題の有無に対し,前頭と後頭のEEGチャネルの位相同期を確認したところ,課題有の場合,より顕著に前頭から後頭への位相同期が確認された.3)両眼立体視の情報バインディングについて,0度と180度のみの位相重みを持つ位相系列解析でEEGの解析を行った.この結果,立体感の有無の状態,立体感の無から有・有から無への状態変化,および単眼,両眼のEEGを分離することができ,単眼の反応は主に状態変化に,両眼の反応は状態に顕著に現れた.
毛細血管幹細胞の組織内維持システムの証明

我々は、その毛細血管周細胞(PCs)の中から毛細血管幹細胞(CapSCs)を見出し、『CapSCsは、毛細血管細胞の構造細胞として未分化能が維持され、必要に応じ、組織実質細胞を供給再生して組織を自己修復する』という仮説を証明するために、1微小血管壁の局在でのCapSCsの幹細胞形質変化をリアルタイムに観察できるユニークな実験デバイスなどを利用して、末梢組織における体性幹細胞を維持するシステムを解明するとともに、2筋ジストルフィ動物モデルを利用して、組織内の幹細胞による自己修復能を付与するという組織再生(医療)の新しいコンセプトの妥当性を検証する。目的1 CapSCsの幹細胞としての維持システムの解明1-1「組織導入したCapSCsが、組織の微小血管に局在し、幹細胞機能が維持されてる」ことを証明するために、CardiotoxinによるSCIDマウスの障害腓腹筋へ蛍光発光CapSCsを導入し、骨格筋組織の再生や導入細胞の組織内局在、特に微小血管周細胞として存在する細胞を再分離して、同細胞の多分化能などの細胞機能解析を行った。1-2「CapSCsが、血管内皮周囲に局在することにより幹細胞機能が保たれる」ことを証明するために、ECsチューブとCapSCsとの共培養からなる微小血管チューブデバイスを作成することに成功した。目的2「持続的な骨格筋破壊を起こす筋ジストルフィ発症マウスを用いて、CapSCsを組織導入すると、持続して導入細胞由来の骨格筋を再生させ、その割合が病態経過と共に増加すること」を証明するために、自然発症筋ジストルフィ(mdx mouse)を作製し、同マウスの病態解析を行っている。目的1 CapSCsの幹細胞としての維持システムの解明1-1毛細血管における幹細胞ニッチの証明作業仮設「組織導入したCapSCsが、組織の微小血管に局在し、幹細胞機能が維持されてる」ことを証明するために、CardiotoxinによるSCIDマウスの障害腓腹筋へ蛍光発光CapSCsを導入し、骨格筋組織の再生や導入細胞の組織内局在を明らかにした。また、微小血管周細胞として存在する細胞をFACSにより再分離して、引き続き多分化能などの細胞機能解析を行っている。1-2微小血管チューブシステムにおける幹細胞機能維持の再現作業仮設「CapSCsが、血管内皮周囲に局在することにより幹細胞機能が保たれる」ことを証明するために、ECsチューブとCapSCsとの共培養からなる微小血管チューブデバイスを作成することに成功し、同細胞の機能解析を行っている。目的2「持続的な骨格筋破壊を起こす筋ジストルフィ発症マウスを用いて、CapSCsを組織導入すると、持続して導入細胞由来の骨格筋を再生させ、その割合が病態経過と共に増加すること」を証明するために、自然発症筋ジストルフィ(mdx mouse)への導入実験を行い、その有効性を示す結果が現れている。目的1 CapSCsの幹細胞としての維持システムの解明1-1毛細血管における幹細胞ニッチの証明CardiotoxinによるSCIDマウスの障害腓腹筋へ蛍光発光CapSCsを導入実験、また、移植した細胞を再分離した細胞について、in vitroでの細胞機能解析に加えて、挫滅筋への再導入実験も今後進めていく。1-2微小血管チューブシステムにおける幹細胞機能維持の再現および幹細胞維持の機序解析ECsチューブとCapSCsとの共培養からなる微小血管チューブデバイスを用いて、単一細胞CapSCの遺伝子発現の網羅解析法の開発を目指していく。目的2「持続的な骨格筋破壊を起こす筋ジストルフィ発症マウスを用いて、CapSCsを組織導入すると、持続して導入細胞由来の骨格筋を再生させ、その割合が病態経過と共に増加すること」を証明するために、自然発症筋ジストルフィ(mdx mouse)を用いて、引き続き細胞導入効果の評価を行っていく。目的1 CapSCsの幹細胞としての維持システムの解明

1-1毛細血管における幹細胞ニッチの証明作業仮設「組織導入したCapSCsが、組織の微小血管に局在し、幹細胞機能が維持されてる」ことを証明するために、CardiotoxinによるSCIDマウスの障害腓腹筋へ蛍光発光CapSCsを導入し、骨格筋組織の再生や導入細胞の組織内局在を明らかにした。また、微小血管周細胞として存在する細胞をFACSにより再分離して、多分化能などの細胞機能解析を行っている。1-2微小血管チューブシステムにおける幹細胞機能維持の再現作業仮設「CapSCsが、血管内皮周囲に局在することにより幹細胞機能が保たれる」ことを証明するために、ECsチューブとCapSCsとの共培養からなる微小血管チューブデバイスを作成することに成功している。目的2「持続的な骨格筋破壊を起こす筋ジストルフィ発症マウスを用いて、CapSCsを組織導入すると、持続して導入細胞由来の骨格筋を再生させ、その割合が病態経過と共に増加すること」を証明するために、自然発症筋ジストルフィ(mdx mouse)の病態解析を行ってきた。我々は、その毛細血管周細胞(PCs)の中から毛細血管幹細胞(CapSCs)を見出し、『CapSCsは、毛細血管細胞の構造細胞として未分化能が維持され、必要に応じ、組織実質細胞を供給再生して組織を自己修復する』という仮説を証明するために、1微小血管壁の局在でのCapSCsの幹細胞形質変化をリアルタイムに観察できるユニークな実験デバイスなどを利用して、末梢組織における体性幹細胞を維持するシステムを解明するとともに、2筋ジストルフィ動物モデルを利用して、組織内の幹細胞による自己修復能を付与するという組織再生(医療)の新しいコンセプトの妥当性を検証する。目的1 CapSCsの幹細胞としての維持システムの解明1-1「組織導入したCapSCsが、組織の微小血管に局在し、幹細胞機能が維持されてる」ことを証明するために、CardiotoxinによるSCIDマウスの障害腓腹筋へ蛍光発光CapSCsを導入し、骨格筋組織の再生や導入細胞の組織内局在、特に微小血管周細胞として存在する細胞を再分離して、同細胞の多分化能などの細胞機能解析を行った。1-2「CapSCsが、血管内皮周囲に局在することにより幹細胞機能が保たれる」ことを証明するために、ECsチューブとCapSCsとの共培養からなる微小血管チューブデバイスを作成することに成功した。目的2「持続的な骨格筋破壊を起こす筋ジストルフィ発症マウスを用いて、CapSCsを組織導入すると、持続して導入細胞由来の骨格筋を再生させ、その割合が病態経過と共に増加すること」を証明するために、自然発症筋ジストルフィ(mdx mouse)を作製し、同マウスの病態解析を行っている。目的1 CapSCsの幹細胞としての維持システムの解明1-1毛細血管における幹細胞ニッチの証明作業仮設「組織導入したCapSCsが、組織の微小血管に局在し、幹細胞機能が維持されてる」ことを証明するために、CardiotoxinによるSCIDマウスの障害腓腹筋へ蛍光発光CapSCsを導入し、骨格筋組織の再生や導入細胞の組織内局在を明らかにした。また、微小血管周細胞として存在する細胞をFACSにより再分離して、引き続き多分化能などの細胞機能解析を行っている。
根管滲出液の免疫学的検索、特に好中球の働きについて

根尖病巣の病態や病勢を調べる目的で、患歯の臨床所見と根管滲出液中の細胞成分の質的変動を比較検討した。さらに細胞成分の大半を占めた多形核白血球(好中球)については、電子顕微鏡による形態観察、および白血球細胞機能のなかでMBT還元試験による殺菌能とFITC標識蛍光beadsを用いた貧食能の検索を行い、下記の結論を得た。1.根管滲出液細胞の種類としては、全症例の平均で多形核白血球が97.7%と大半を占め、つぎにlymphocyte1.3%,macraphage1.0%の順であった。細胞成分の割合と患歯の臨床所見との間には、相関関係が認められない。3.根管滲出液中の多形核白血球はその患者の抹消血中の多形核白血球と比較して、還元率が有意に低い値を示した。4.根尖病巣を有する患者の抹消血中の多形核白血球の還元率と健常者のそれとの間に有意な差は認められなかった。5.根管滲出液中の多形核白血球はその患者の抹消血中の多形核白血球と比較して、貧食率が有意に低い値を示した。6.根管滲出液中の多形核白血球の貧食能と臨床的病型との関連性を検討した結果、有意な差は認められなかった。また、根尖病巣を有する患者の抹消血中の多形核白血球の貧食率と健常者との間に有意な差は認められなかった。従来から行なわれていた根管滲出液細胞成分の検索は, Giemsa染色された塗抹標本を光学顕微鏡で観察し,患歯の治療方針の決定や治療効果の判定に役立てられていた.しかしこの染色法のみでは,刻々変動する病態を知る上で不可欠な細胞内の特殊な成分や小器官の構造変異,さらに病単内に遊走した白血球の細胞機能を正確にとらえることは不可能である.そこで研究者は,まずWrights染色で形態学的に細胞を観察した後,細胞成分の大半を占めた好中球について電子顕微鏡で細胞内の詳細な観察を行い,さらにその貧食能・殺菌能などの細胞機能について研究を行なった.初年度は極めて狭小な根管内からの試料採取法の確立と細胞成分の分離,そして光顕的及び電顕的観察のための標本作製技術の習得に主眼を置き,下記の方法を確立した.2.光顕的観察得られた細胞を5×105cells/mlに再調整した後, CytospinIIにて細胞塗抹標本を作製し, Wrights染色を施し,光顕下で形態学的に観察した.根尖病巣の病態を非観血的に知る目的で、根管治療の過程で随時得られることの多い病巣由来の根管滲出液成分に注目し研究を行った。本年度は、根管治療の際に得た滲出液より細胞を分離し、その細胞成分のなかで大半を占めた多形核白血球(好中球)について、特にその細胞を検索して下記の結論を得た。1.根管滲出液中の細胞の生存率および細胞数末梢血と根管滲出液の細胞の生存率および細胞数を比較すると、末梢血は生存率で有意に高い値を示し、細胞数では有意に低い値を示した。2.根管滲出液中の多形核白血球(好中球)の機能検査根管滲出液中の好中球はその患者の末梢血中の好中球と比較して、殺菌能と貪食能の低下が認められた。
MRIによるファンクショナルコネクティビティ画像法の開発と加齢脳解析への適用

本研究は、MRIによる脳の領野間の機能的結合性(ファンクショナルコネクティビティ)解析法を開発し加齢脳研究に応用することを目的とした。探索的多変量解析法の1つである独立成分分析法(independent component analysis)および共分散構造解析法・構造方程式モデリング(structure equation modeling)をfMRI機能的結合性解析に導入し、条件課題の変化に伴い変調される信号動態を領域間の結合強度というスケールで評価する事を可能にした。また、タスクパラダイムが存在しない安静状態のみのfMRIデータに於いても、信号変化が同調する空間コンポーネントとして脳領域を分類する事に成功した。しかし、トラクトグラフィによる経路情報パラメータの初期条件への設定の試みは、単に空間的に近接する条件では適合させることが困難であった。現在、これらに加え皮質容積など解剖学的形態情報を導入し、相互情報量(mutual information)を用いた多角的なデータ分析を継続しているところである。また、本法の臨床応用の可能性を探るため、閉塞性脳血管障害患者の安静時機能的結合性測定を実施した結果、患者群では若年健常群に比較し領域間・領域内結合性が低下する傾向が見られたが、これらの群ではバックグラウンドに存在する脳活動に由来しない生理的信号変化の影響を強く受ける傾向もみられるため、フィルタリング処理の改良が必要であると思われた。しかしながら、本研究において、コネクティビティというスケールにて安静時における基礎的脳活動の観測を可能としたことは、特に脳機能イメージングの加齢医学・臨床医学分野への応用に対して大きな意義があると考える。本研究は、形態的に同定される脳の各領野間の機能的結合性の解析法を開発し加齢脳研究に応用することを目的としている。研究初年度にあたる本年は、脳賦活領域間機能的結合性(ファンクショナルコネクティビティ)解析法の開発と評価などの基礎的検討を「脳賦活領域間機能的結合性解析法の開発」と「トラクトグラフィおよびその他脳形態的情報をパラメータとする初期条件の導入」について実施した。「脳賦活領域間機能的結合性解析法の開発」においては、統計学分野で探索的多変量解析法の1つである独立成分分析法(independent component analysis)および共分散構造解析法として近年注目を集める構造方程式モデル(structure equation modeling)のfMRI機能的結合性解析への導入を試みた。その結果、前者は条件課題の変化に伴い変調される信号動態を領域間の結合強度というスケールで評価する事を可能にし、後者は課題などのタスクパラダイムが存在しない安静状態のみのfMRIデータに於いても信号変化が同調する空間コンポーネントとして脳領域を分類する事に成功した。「トラクトグラフィおよびその他脳形態的情報をパラメータとする初期条件の導入」については、脳白質を信号源とするトラクトグラフィと脳灰白質のfMRIデータを、単に空間的に近接するという情報のみで結びつけることに問題がないか検証を行っている段階である。動物実験による脳賦活領域間機能的結合性解析法の評価を行う上で基礎となる、マンガンによる細胞ラベリング造影能の検討および造影剤の毒性試験と細胞活性保持に関する検討を行った。また、持続的な経路トレースを行うために、造影剤の徐放化に関する検討を行った。

現在、これらに加え皮質容積など解剖学的形態情報を導入し、相互情報量(mutual information)を用いた多角的なデータ分析を継続しているところである。また、本法の臨床応用の可能性を探るため、閉塞性脳血管障害患者の安静時機能的結合性測定を実施した結果、患者群では若年健常群に比較し領域間・領域内結合性が低下する傾向が見られたが、これらの群ではバックグラウンドに存在する脳活動に由来しない生理的信号変化の影響を強く受ける傾向もみられるため、フィルタリング処理の改良が必要であると思われた。しかしながら、本研究において、コネクティビティというスケールにて安静時における基礎的脳活動の観測を可能としたことは、特に脳機能イメージングの加齢医学・臨床医学分野への応用に対して大きな意義があると考える。
リチウムインサーション材料の電位に関する基礎研究

リチウムインサーション材料とは、リチウムイオン蓄電池の電極に用いられる材料のことで、近年の急速な携帯電子機器の普及に大きな役割を果たしてきた。本研究は、リチウムインサーション材料における固相酸化・還元反応の電位に関係する因子を明らかにすることを目的として行った。理論計算および電気化学測定による検討から、リチウムインサーション材料の電極電位は、結晶構造の違いよりも、酸化・還元反応を担う遷移元素の種類に依存することを明らかにした。H27年度は、既存の電池材料について電極電位の計算を遂行するなかで、電位論を構築する上で課題となる計算結果の信頼性および正確性に関する考察を行い、その成果を学術報文として投稿した。また電池材料の電位を明らかにするうえで鍵となる材料(リチウム・コバルト・マンガン酸化物)について合成を検討し、その材料化に成功するとともに電池材料として機能することを確認した。1.計算からのアプローチとしては、まず電池材料の電位の計算結果を実測された電位と比較・検証する際の基盤となる計算科学に固有のランダム誤差の理論的な取り扱い方を確立した.この固体材料のエネルギー計算における成果を「Error Control of Single-Point Energy fromFirst-principles Band Calculations」として学術誌に投稿した.この成果を踏まえて、リチウム含有遷移金属酸化物のなかでスピネル型構造および層構造をもつものについて系統的にエネルギー計算を行い、電池材料の電位に及ぼす構造の違いについて検討した。2.実験からのアプローチとしては、層構造をもつリチウム・コバルト酸化物と、スピネル型構造を持つリチウム・マンガン酸化物とを、任意の組成で混合したリチウム・コバルト・マンガン酸化物について合成を試みた結果、マンガンを過剰に含む組成においてスピネル型構造ではないものの、層構造をもつ材料の合成に成功し、これによりコバルトのみを含む試料からマンガンのみを含む試料まで一連の組成をもつ電池材料が得られた。(計算グループ)H27年度において、電池材料の計算を行うための基盤整備として、計算機部品を購入して従来資産である計算機クラスターを増強した。これにより本課題の遂行に最低限必要な計算環境を整えた。計算機を効率的に運用するためのソフトウェアを導入し、計算支援用プログラムを開発した。仮想的な電池材料としてスピネル型構造および層構造をもつリチウム含有遷移金属酸化物(遷移金属元素として、3d遷移金属元素であるクロムから銅までの元素を対象)について、初期状態および反応後の物質のエネルギーを計算し、そこからそれぞれの材料における理論電位を評価した。また一部の材料については、反応途中の材料についてもエネルギー計算を行うことで、材料の組成変動にともなう電位の変化、つまり電位曲線の可視化を検討した。(実験グループ)本年度では、固相合成法により一連のリチウム・コバルト・マンガン酸化物について合成を試み、リチウム・コバルト酸化物(LiCoO2)およびリチウム・マンガン酸化物(Li2MnO3)を端組成とする固溶体の合成に成功した。またこれらの材料について電気化学測定を行い、いずれの組成においても電池材料として機能すること、および作動電圧および反応の可逆性が材料の組成によって大きく変化することを明らかにした。また、これらの結果から材料のコバルトおよびマンガン含有率の違いによって反応機構に大きな違いが見られることから、それぞれの材料に適した電位計測のための電気化学測定法について検討した。平成28年度は、仮想的な材料も含んだ種々の電池材料について電極電位の計算を行うとともに、実験により得られた電極電位との比較・検討を行うことで、電池材料の固体化学と電極電位との関係性、とくに結晶構造と関係する遷移金属イオンならびにリチウムイオンの局所配位環境と電極電位との関係について考察した。1.計算からのアプローチとして、誤差の取り扱いをまとめ、大阪市立大学紀要にて出版した。同一化学組成でありながら異なる3種類の結晶構造(層構造、スピネル型構造、ルチル型構造)について、リチウム含有量の異なる状態におけるエネルギー計算を行うことで、電池材料の電極電位と結晶構造との関係性について検討した。得られた結果からは、結晶構造の因子としてルチル型構造が広い組成範囲で電極電位の変化が少ないこと、スピネル構造が高電圧側に働くものの高Li組成側での電圧低下が大きくなることが分かった。いずれの構造でも元素ごとの定性的な傾向はおおむね一致しており、電極電位が構造と元素という因子で分類できるという仮説をおおむね裏付けることができた。これらの成果を日本セラミックス協会2017年年会にてポスター発表した。2.実験からのアプローチとしては、リチウム過剰組成をもつコバルト・マンガン酸化物についてコバルトとマンガンの比を連続的に変化させた一連の固溶体を合成し、その電極電位について詳細な検討をおこなった。予備検討より、この材料の固相酸化・還元電位が材料の化学組成と一義的に対応せず、従来の電池機能材料とは異なった反応機構で進行することを明らかにした。またこの特異な現象を解析するために新たな電気化学測定法を考案し、可逆電極電位、電気化学分極、および反応抵抗などの電位論構築に資する多くのパラメータを算出した。これらの成果を電池討論会および電気化学会にて口頭発表した。(計算グループ)平成28年度において、電池材料の計算を行うための基盤整備として、計算機部品を購入して従来資産である計算機クラスターを増強した。

また一部の材料については、反応途中の材料についてもエネルギー計算を行うことで、材料の組成変動にともなう電位の変化、つまり電位曲線の可視化を検討した。(実験グループ)本年度では、リチウム・コバルト・マンガン酸化物(LiCoO2とLi2MnO3の固溶体)について詳細な電気化学測定を行った。開回路電圧測定ならびに分極測定の結果から、この材料においては化学組成と可逆電極電位が一義的な対応関係をもたないことを明らかにするとともに、この材料の固相酸化・還元反応が従来に電池機能材料とは全く異なる反応機構で進行することがわかった。さらに新たに考案した充放電測定法によりこの反応機構について電位論の観点から検討した。本研究では、実際のリチウムインサーション材料を用いて実測した電極電位と、計算により見積もった電極電位との詳細な比較・検討を行なった。電池材料の固体化学と電極電位との関係性、とくに結晶構造と関係する遷移金属イオンならびにリチウムイオンの局所配位環境と電極電位との関係について考察することで、以下のことが明らかとなった。1.同一化学組成でありながら異なる3種類の結晶構造(層構造、スピネル型構造、ルチル型構造)について、リチウム含有量の異なる状態におけるエネルギー計算を行なうことで、電池材料の電極電位と結晶構造との関係性について検討した。得られた結果からは、いずれの構造でも元素ごとの定性的な傾向はおおむね一致しており、電極電位が構造と元素という因子で分類できるという仮説をおおむね裏付けることができた。特に結晶構造の因子としてルチル型構造が広い組成範囲で電極電位の変化が少ないこと、スピネル構造が高電圧側に働くものの高Li組成側での電圧低下が大きくなることが分かった。2.実験においても同一組成でかつ異なる結晶構造(層構造とスピネル型構造)を持つ材料の合成に成功し、その電極電位を比較したところ、結晶構造の違いにより電位形状、つまり電極電位の化学組成依存性は異なるものの、全反応領域を平均した平均電極電位はほぼ近しい値を示した。これらの実験によるアプローチからも電極電位が固相酸化還元する元素に依存し、電位形状が結晶構造に関係することを示唆する結果が得られた。リチウムインサーション材料とは、リチウムイオン蓄電池の電極に用いられる材料のことで、近年の急速な携帯電子機器の普及に大きな役割を果たしてきた。本研究は、リチウムインサーション材料における固相酸化・還元反応の電位に関係する因子を明らかにすることを目的として行った。理論計算および電気化学測定による検討から、リチウムインサーション材料の電極電位は、結晶構造の違いよりも、酸化・還元反応を担う遷移元素の種類に依存することを明らかにした。(計算グループ)
スフェロイド細胞複合体による関節軟骨修復効果

自家軟骨細胞移植法は臨床応用されているが、高齢者に多い広範囲病変に適応困難であることや体外培養期間が長いことなど依然として解決すべき点がある。採取量に制限のある軟骨細胞に高度な増殖能と軟骨細胞への分化能を保有する滑膜細胞を加えた新規混合細胞体を作製した。本法により、日本白色家兎膝関節から単離した軟骨細胞と滑膜細胞からスフェロイド形態の細胞移植体が短期間内に多量準備が可能となり、ヒトへの応用が期待できる。1994年Brittbergらが発表した自家軟骨細胞移植法ACIの臨床応用は、全世界で2万例以上に施行されている。しかし、患者の正常軟骨部から採取する移植用の関節軟骨細胞(AC)は採取量に限界があり、改善すべき点がある。特に高齢者の場合の再生能が乏しいACは、培養増殖能が低く広範囲治療が困難であった。一方、継代しても高い増殖能が変わらない滑膜細胞(SY)は、間葉系幹細胞の存在と軟骨細胞への分化能が報告されている。今回、我々が考案した新規培養法によって多量の細胞移植体を短期間で準備することが可能となった。本研究の目的は、ACとSYからなる軟骨滑膜混合細胞体を作製し、細胞移植体の性状を観察並びに分析して新規ACI法への利用の可能性を明らかにすることである。日本白色家兎の膝由来のACとSYを培養して蛍光標識した後、高密度浮遊状態で振とう培養し混合細胞スフェロイドを作製した。細胞スフェロイドの性状はRT-PCR(1型と2型コラーゲンの発現)と組織学的な評価(トルイジンブルー、サフラニン0染色並びに免疫染色)を実施した。また、軟骨全層欠損部に5つの各条件から作製した細胞スフェロイドを移植し4週後の再生修復効果を検討した。細胞スフェロイドは培養24時間から形成され、SYとAC混合比いずれにおいても作製が可能であった。通常培養条件下での異種細胞が混在する構造物を構築することは困難であるが、本研究の作製法では細胞同士の接触の機会が多く、種類の異なる細胞同士でも混合細胞スフェロイドの構築が可能であった。また、1型と2型の発現とトルイジンブルーの異染性とサフラニン0の染色性が乏しかった性状から分化と脱分化の細胞が混在すると推測された。ACへの分化可能な間葉系幹細胞を含むSYは高い継代増殖率を示し、ACの部分的な代替として低侵襲での組織採取とその効率的な活用法として期待できる。細胞スフェロイドの性状はRT-PCR(1型と2型コラーゲンの発現)と組織学的な評価(トルイジンブルー、サフラニンO染色並びに免疫染色)を実施した。また、1型と2型の発現とトルイジンブルーの異染性とサフラニンOの染色性が乏しかった性状から分化と脱分化の細胞が混在すると推測された。AC及びSYは、振とう運動による持続的な反復により培養容器の底部に留まらず、培養液中に浮く懸濁状態で維持でき、振とう初期段階に現れた小さいサイズの混合細胞塊を中心として多数の他の細胞同士が迅速に接着するようになり、経時的に細胞スフェロイドが成長した。5つの細胞含有条件のすべてにおいて細胞スフェロイドの作製が可能であった。この期間中に、混合細胞塊は、スフェロイド培養開始後12時間から肉眼的にも観察可能であった。さらにスフェロイド培養時間が経過すると振とう培養開始後125時間には細胞スフェロイドは凝縮して輪郭は滑らかになった。

細胞スフェロイドのサイズは、小さいものは、直径が250±100μm、大きいものは、700±250μm程度であった.1994年Brittbergらが発表した自家軟骨細胞移植法ACIの臨床応用は、全世界で2万例以上に施行されている。しかし、患者の正常軟骨部から採取する移植用の関節軟骨細胞(AC)は採取量に限界があり、改善すべき点がある。特に高齢者の場合の再生能が乏しいACは、培養増殖能が低く広範囲治療が困難であった。一方、継代しても高い増殖能が変わらない滑膜細胞(SY)は、問葉系幹細胞の存在と軟骨細胞への分化能が報告されている。本研究の目的は、ACとSYからなる軟骨滑膜混合細胞体を作製し、細胞移植体の性状を観察並びに分析して新規ACI法への利用の可能性を明らかにすることである。.日本白色家兎の膝由来のACとSYを培養して蛍光標識した後、高密度浮遊状態で振とう培養し混合細胞スフェロイドを作製した。細胞スフェロイドの姓状はRT-PCR(1型と2型コラーゲンの発現>と組織学的な評価(トルイジンブルー、サフラニン0染色並びに免疫染色)を実施した。細胞スフェロイドは培養24時間から形成され、SYとAC混合比いずれにおいても作製が可能であった。通常培養条件下での異種細胞が混在する構造物を構築することは困難であるが、本研究の作製法では細胞同士の接触の機会が多く、種類の異なる細胞同士でも混合細胞スフェロイドの構築が可能であった。また、1型と2型の発現とトルイジンブルーの異染性とサフラニン0の染色性が乏しかった性状から分化と脱分化の細胞が混在すると推測された。ACへの分化可能な間葉系幹細胞を含むSYは高い継代増殖率を示し、ACの部分的な代替として低侵襲での組織採取とその効率的な活用法として期待できる。AC及びSYは、振とう運動による持続的な反復により培養容器の底部に留まらず、培養液中に浮く懸濁状態で維持でき、振とう初期段階に現れた小さいサイズの混合細胞塊を中心として多数の他の細胞同士が迅速に接着するようになり、経時的に細胞スフヱロイドが成長した。5つの細胞含有条件のすべてにおいて細胞スフェロイドの作製が可能であった。この期聞中に、混合細胞塊は、スフェロイド培養開始後12時間から肉眼的にも観察可能であった。さらにスフェロイド培養時間が経過すると振とう培養開始後125時間には細胞スフェロイドは凝縮して輪郭は滑らかになった。細胞スフェロイドのサイズは、小さい場合は、直径が250±100μm、大きいの場合は、700±250μm程度であった。
排卵機構におけるメラトニンの病態生理学的意義に関する研究

正常成熟婦人においては、夜間に増量を示すMelatonin分泌とprolactin分泌パタ-ンには有意の相関を示すことを明らかにしてきた。今回、さらに、夜間にのみprolactinの異常な分泌亢進をみるnocturnal hyperprolactinemia、並びに日中の血中prolactin値が100ng/ml以下を示すmoderate hyperprolactinemia症例に注目し、夜間のmelatonin分泌とprolactin分泌との関連を検討した。nocturnal hyperprolactinemia症例の夜間のmelatoninの分泌パタ-ンは、正常婦人と同様であったが、その分泌量は有意に高値であった。prolactin分泌は、夜間に著明な増量を示した。melatonin分泌とprolactin分泌との関連については、prolactinの増量は、melatoninの増量より2時間遅れた増量を示し、正常婦人と同一のmelatoninーprolactin分泌の関連が示された。既ち、nocturnal hyperprolactinemiaの夜間のprolactin分泌の亢進に対して、melatoninの分泌の増量がその要因の一つである可能性が示唆された。一方、moderate hyperprolactinemia群ではmelatonin分泌パタ-ン、並びにその増量も正常婦人と差は認められなかった。prolactin分泌については、夜間に著明な増量を示すものの、melatonin分泌とprolactin分泌との関連については、正常妊婦にみられた様な関連性が明らかに崩ていることが示された。既ちmoderate hyperprolactinemiaにおける、夜間のprolactin分泌亢進機序には、melatoninとは別の要因が強く関与していることが示唆された。以上、nocturnal hyperprolactinemiaならびにmoderate hyperprolactinemia症例の夜間のprolactin分泌機序をmelatonin分泌パタ-ンの関連から検討し、その発症機序に明らかな違いのあることが示された。
静脈皮弁の実験的研究

平成5年度:静脈還流路をもつ静脈皮弁に関するPlasmatic Imbibitionの酵素学的検討(ラット50匹)。《方法》1群:全層植皮と母床の間に生理食塩水を注入。2群:静脈皮弁と母床との間にPRPを注入。3群:静脈皮弁を母床と接触せずに反転し、静脈からPRPを注入4群:axial patternを作製し、母床と接触せずに反転し静脈からPRPを注入。《結果》1群:植皮片は染色されない。2群:皮弁は徐々に染色された。3群:皮弁は染色された。4群:皮弁は染色された。還流静脈温存した静脈皮弁生着は静脈血と母床からのPlasmatic Imbibitioonが作用することが判明した。平成6年度:通過静脈をもつ静脈皮弁のPlasmatic Imbibitionの酵素学的検討(ラビット30羽)。《方法》1群:静脈皮弁と母床の間に生理食塩水を注入。3群:皮弁と母床間にテフロン膜を挿入しPRPを静注。2群:中心静脈を中心に皮弁は染色された。3群:徐々に静脈は染色された中心静脈温存した静脈皮弁は静脈血と母床からのPlasmatic Imbibitionも作用していることが判明した。平成7年度:ラビット48羽を用いて通過静脈をもつ静脈皮弁においてPlasmatic Imbibitionと静脈の流れと、どちらが優位なのかを検討。《方法》1群:植皮片と母床間にfluoresceinを注入した。2群:静脈皮弁と母床との間にfluoresceinを注入。3群:皮弁作製後fluoresceinを静脈から注入。4群:皮弁と母床との間にテフロン膜を挿入し、fluoresceinを静注。《結果》1群:皮弁全体が蛍光を発した。2群:皮弁全体が蛍光を発した。3群:中心静脈が蛍光を発し、次いで皮弁全体が染色された。4群:中心静脈が蛍光を発し、次いで皮弁全体が蛍光を発した。中心静脈温存した静脈皮弁は静脈流れと母床からのPlasmatic Imbibitionも作用していた。1群(10匹):Control群で、皮弁を挙上後に、蒸留水を皮弁と母床との間に注入。2群(20匹):皮弁を挙上後に、蒸留水2mlに溶解したHRPO5000単位を皮弁と母床との間に注入し、皮弁は元の位置に戻す。3群(10匹):皮弁を挙上後に反転して、母床と接触しない様に保持して、蒸留水2mlに溶解したHRPO5000単位を大腿静脈に注入する。4群(10匹):皮弁への動・静脈束を温存し、皮弁を挙上後に反転し、母床と接触しないように保持し、蒸留水2mlに溶解したHRPO 5000単位を大腿静脈に注入する。

結果:皮弁は経時的に採取し、PPD-PC法を用いて組織学的にHRPOの活性部位を判定した。1群:いずれの時期も、皮弁は染色されず、皮弁静脈内の赤血球は褐色に染色された。2群:10分以内に、母床との接触面の皮弁は褐色に染色され、経時的に表皮にかけ徐々に染色され、最終的には皮弁内の静脈内赤血球は赤色に染色された。3群:2時間以内では皮弁は染色されないが、温存した静脈内赤血球は赤色に染色された。4群:術直後から皮弁は褐色に、温存した動・静脈内の赤血球は赤色に染色された。考察還流静脈のみ温存した皮弁内でplasmatic imbibitionが起こっていること、そして、還流静脈内にはretrogradeの流れがあることが新たに判明し、これらが皮弁生着に重要であることが判明した。今回の研究結果で、平成5年度の研究計画を達成できた。通過静脈のみ温存したflow-through-venous flap生着に関するplasmticimbibitionの酵素学的検討。家兎30匹を使用し、耳の両耳を使用し、4.5×3cmの大きさで中心静脈のみ温存した通過静脈を含む皮弁を軟骨上で60皮弁作製した。A群(10皮弁):対照群。一本の通過静脈のみを有する静脈皮弁を挙上後、蒸留水を皮弁と母床との間に注入し、その後皮弁は元の位置に縫合。B群(10皮弁):静脈皮弁を作製直後に、1mlの蒸留水に溶解した5000単位のHRPOを皮弁と母床との間に注入した。C群(10皮弁):静脈皮弁を作製挙上後に、テフロン膜を挿入して、母床との接触を遮断し、中枢部の中心動脈から3mlの蒸留水に溶解したHRPO 50000単位を大腿静脈から注入した。これらの皮弁は経時的に採取して、PPD-PC法を用いて組織固定、基質液との反応を行うことにより組織学的にHRPOの活性部位を明らかした。<結果>A群:皮弁も通過静脈内の赤血球も染色されなかった。B群:皮弁はもとより、静脈内赤血球も褐色に染色された。C群:術後すぐより、皮弁と赤血球は褐色に染色された。以上の結果より、皮弁はplasmatic imbibitionおよび静脈の流れにより生着することが判明し、平成6年度の研究計画を達成できた。通過静脈をもつ静脈皮弁においてPlasmatic Imbibitionと静脈流とどちらが優位なのかを検討。家兎48羽を4群に分けて、各々12羽すなわち3x4.5cmの24皮弁ずつを作製した。《方法》1群:植皮片と母床との間にfluoresceinを静脈より注入した。2群:植皮片と母床間に他の家兎にfluoresceinを注入した後に採取し遠沈させたplasmaを注入した。3群:静脈皮弁と母床との間に上記操作を加えたplasmaを注入。4群:静脈皮弁作製後fluoresceinを静脈から注入。5群:皮弁と母床との間にテフロン膜を挿入し、母床との接触を遮断しfluoresceinを注入。《結果》1群:注入後より皮弁全体が蛍光を発し、経時的の蛍光は増強した。2群:静脈は蛍光を発しないが、植皮片全体は蛍光を発した。3群:2群と同様の所見を得た。4群:注入後に中心静脈が蛍光を発するようにな2-3時間経過してより静脈の周辺が染色されるようになったが皮弁は染色されなかった。5群:4群と同様の所見を得た。《考察》中心静脈温存した静脈皮弁は静脈流れと母床からのPlasmatic Imbibitionが同時に生じた。
心筋細胞実形状を用いた統合解析による微細構造や機能分子が収縮に与える影響の解明

共同研究先の協力により得られた細胞の詳細な形状データを基に,心筋細胞より半筋節長・1/4断面のモデルを作成し,生化学現象・電気現象・力学現象を統合したマルチフィジックス解析を実現した.形状には横行小管の形状のばらつき,ミトコンドリアの配置のばらつきを考慮し,その位置が筋収縮へ与える影響について考察を行った.また,三相理論による電位分布や流体現象の解析により,横行小管内の脱分極時の電位分布や収縮に伴う横行小管内の流体運動について検討した.共同研究先の協力により得られた細胞の詳細な形状データを基に,心筋細胞より半筋節長・1/4断面のモデルを作成し,生化学現象・電気現象・力学現象を統合したマルチフィジックス解析を実現した.形状には横行小管の形状のばらつき,ミトコンドリアの配置のばらつきを考慮し,その位置が筋収縮へ与える影響について考察を行った.また,三相理論による電位分布や流体現象の解析により,横行小管内の脱分極時の電位分布や収縮に伴う横行小管内の流体運動について検討した.心筋細胞の収縮においては,生化学現象,電気現象,および力学現象が複雑に相互作用する.現在,各現象を担う機能分子や微細構造に関する膨大な知見が蓄積されている一方,それらの相互作用を考慮した収縮メカニズムの統合的理解はいまだ不十分であるため,心筋細胞の統合シミュレーションの重要性が高まっている.しかし,生化学・電気・力学の全てを統合したモデルは確立されているとはいえない.本研究ではこれまでに申請者らが構築した電気・生理・代謝統合解析モデルを高度化し,高い空間解像度で微細構造再現し,局所的な濃度場・電位場・応力場を高い空間解像度で表現することを大きな目的の一つとしていた.平成25年度には,心筋細胞微細構造の3次元電子顕微鏡観察について先駆的研究を行っているカリフォルニア大学サンディエゴ校のグループを訪問し,申請者らのこれまでの研究に関する報告の場を設けていただいた.実際に細胞実験を行う立場から細胞モデルへの要望について様々な意見を聞くことができた.さらに,最新の心筋細胞微細構造の3次元データ・メッシュデータの提供を受け,データ処理のノウハウを教えていただき,微細構造を表現した統合解析モデルの実現に大きく前進した.また,平成25年度には計算機環境を整備し,新たに取り組んだ酸素濃度場の解析を取り入れたモデルの計算を行った.この解析結果は2014年2月にはサンフランシスコで行われたAnnual Meeting of Biophysical Societyにて口頭発表を行い,現在論文として取りまとめているところである.心筋細胞の収縮においては,生化学現象,電気現象,および力学現象が複雑に相互作用する.現在,各現象を担う機能分子や微細構造に関する膨大な知見が蓄積されている一方,それらの相互作用を考慮した収縮メカニズムの統合的理解はいまだ不十分であるため,心筋細胞の統合シミュレーションの重要性が高まっている.しかし,生化学・電気・力学の全てを統合したモデルは確立されているとはいえない.本研究ではこれまでに申請者らが構築した電気・生理・代謝統合解析モデルに三相理論を適用して高度化し,高い空間解像度で微細構造再現し,局所的な濃度場・電位場・応力場を高い空間解像度で表現することを大きな目的としていた.平成26年度には,昨年度に共同研究先の協力により得られた細胞の詳細な形状データを基に,心筋細胞より半筋節長・1/4断面のモデルを作成し,生化学現象・電気現象・力学現象を統合したマルチフィジックス解析を実現した.形状には横行小管の形状のばらつき,ミトコンドリアの配置のばらつきを考慮し,その位置が筋収縮へ与える影響について考察を行った.また,三相理論による電位分布や流体現象の解析により,横行小管内の脱分極時の電位分布や収縮に伴う横行小管内の流体運動について検討した.これらの結果についてまとめた論文は現在投稿中である.加えて,統合モデルを用い,現在議論となっている筋原線維間に存在するミトコンドリアと細胞膜直下に存在するミトコンドリアで性質や役割の違いについて解析を用いた検討を行った.この成果についてまとめた論文はBiophysical Journalに掲載が決定している.26年度が最終年度であるため、記入しない。生体シミュレーション26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画では,平成25年度は計算モデルの構築に専念し,平成26年度に共同研究者の協力を得てメッシュ作成に取り掛かる計画であったが,共同研究先との打ち合わせや訪問の日程が早まったため,25年度に微細構造メッシュ作成を前倒しで行った.これにより半筋節長,ミトコンドリアと筋原線維を含んだ領域の有限要素メッシュを実現できた.微細構造の3次元データの提供を受けて改めて困難に気づく点も多く,先に取り掛かることができたことは計算モデルに必要な要素を明確化できたという点で大きな利点であった.また実験を行う立場からの計算モデルへの要望を受けたことも同様である.当初25年度に行う予定であったシミュレータの拡張・改良,機能分子モデルの改善などは予定半ばであるが,26年度に引き続き行う予定であり,おおむね順調に進んでいると考えている.平成25年度に得た微細構造有限要素メッシュに対し,三相理論を適用した有限要素法統合シミュレータを適用することがまず重要な第一歩となる.