hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グリア細胞を介した浸透圧制御の分子的基盤の解明

線虫のイノシトール輸送担体(HMIT)をコードする3つの遺伝子(hmit-1.1, hmit-1.2, hmit-1.3)について発現解析および欠損変異体作製を行った。その結果、hmit-1.2およびhmit-1.3が線虫のグリア細胞に発現すること、hmit-1.2のみが高浸透圧条件下において著明な発現誘導を示すことを明らかにした。またhmit-1.2ノックアウト線虫が体液の高浸透圧負荷に脆弱であることを見出した。以上の結果から、グリア細胞のイノシトール輸送担体(hmit-1.2)が浸透圧に応答して発現誘導されること、それが個体としての浸透圧制御に重要な役割を果たすことが明らかとなった。近年、体液浸透圧制御におけるグリア細胞の働きが注目されている。浸透圧受容器ではグリア細胞がニューロンの活動を制御することがわかってきた。これまでに、RNAiスクリーニングを行った結果、Prospero/Prox1転写因子のホモログであるCEH-26をコードする遺伝子のRNAiにより、高浸透圧忌避行動が顕著に低下することが明らかとなった。またグリア細胞マーカーの発現解析から、CEH-26がグリア細胞の分化に重要な役割を果たすことが明らかとなった。詳細な遺伝学的解析を行うため、ceh-26遺伝子ノックアウト線虫を作製したところ、ホモ致死となった。そこで、線虫においては未だ確立されていなかったコンディショナルノックアウト法の開発に着手した。具体的には、まず外来遺伝子を線虫ゲノムにシングルコピーで挿入する手法を開発し、同手法により当該遺伝子をLoxP配列で挟む構造のトランスジーンを導入した。このトランスジェニック線虫を既存の変異体と交配することで、種々のコンディショナルノックアウト線虫が作製できる。現在、ceh-26遺伝子ノックアウト線虫を作製中である。これまでにProspero/Prox1転写因子のホモログであるCEH-26をコードする遺伝子のRNAiにより、高浸透圧忌避行動が顕著に低下することを見出した。またCEH-26はグリア細胞選択的に発現し、浸透圧受容ニューロンには発現しないことを明らかにした。同手法を用い、ceh-26遺伝子ノックアウト線虫を作製した。現在組織特異的および時期特異的ノックアウトによる表現型を解析中である。またグリア細胞それ自身においても、脳内の浸透圧変化により、様々なオスモライト輸送担体の発現が制御されている。本研究では、浸透圧調節におけるグリア細胞の役割と、それを担う分子メカニズムを明らかにするべく、線虫C. elegansのイノシトール輸送担体(HMIT)に着目して解析を行った。線虫においてHMITをコードする3つの遺伝子(hmit-1.1, hmit-1.2, hmit-1.3)について発現解析および欠損変異体作製を行った。このグリア細胞は、まさに線虫の浸透圧受容ニューロン(ASHニューロン)を覆うグリア(amphid sheath glia)であった。また、各欠損変異体の表現型解析から、hmit-1.2ノックアウト線虫が体液の高浸透圧負荷に脆弱であることを見出した。ヒトのグリア由来培養細胞においてもHMITが高浸透圧ストレスにより誘導された。以上の結果から、線虫において、グリア細胞のイノシトール輸送担体(hmit-1.2)が浸透圧に応答して発現誘導されること、個体としての浸透圧制御に重要な役割を果たすことが明らかとなった。また、高浸透圧ストレスによるグリア細胞でのイノシトール輸送担体の発現誘導は種間で普遍的なメカニズムであると考えられた。平成24年度は、グリア細胞ーニューロン間の相互作用に関与する遺伝子群の同定を目的として研究を行った。

研究計画に沿って、約1000遺伝子についてRNAiスクリーニングを行い、グリア細胞の発生、分化、機能維持に関与する遺伝子を複数個同定した。またceh-26遺伝子に関しては、高浸透圧忌避行動が顕著に低下することを明らかにし、グリア細胞ーニューロン間の相互作用に関与する可能性を見いだした。従って、研究は概ね順調に進展していると評価した。平成23年度は、線虫グリア細胞の浸透圧応答性レポーターを用い、細胞内シグナル分子群の同定を目的として研究を行った。研究計画に沿って、ノックアウト線虫やRNAiによるスクリーニングを行い、いくつかの候補分子を同定している。ceh-26遺伝子ノックアウト線虫を作製し、グリア細胞特異的、また時期特異的なノックアウトによる表現型解析を行う。またニューロン側で機能する分子を探索するため、ceh-26ノックアウト線虫の表現型を抑圧するような遺伝子変異(またはRNAi)のスクリーニングを行う。グリア細胞における浸透圧応答の分子メカニズムに加え、グリア細胞/ニューロン間のシグナル分子の探索を行う。ニューロンでのRNAi効果は弱いことが知られるため、遺伝子破壊的手法を第一選択とする。線虫の培養に必要なプラスチック器具、変異体解析などに用いる薬剤やシーケンス試薬などの消耗品費が主に必要な経費である。また学会における成果発表のため、旅費等を申請している。
周術期呼吸管理の基礎及び臨床的研究(顎間固定と胸郭・腹壁運動の変動を中心に)

【対象および方法】全身麻酔下にて下顎骨後退術に伴う顎間固定を行った患者8名のうち、術前および顎間固定後の呼吸経路により以下の3群に分類した。1.術前および顎間固定後ともに呼吸経路が鼻呼吸のみであった症例4例(N群)2.術前は鼻呼吸のみがみられ、顎間固定後には鼻呼吸と口呼吸を行っていた症例3例(N→NO群)3.術前に鼻呼吸と口呼吸がみられ、術後に口呼吸のみであった症例1例(NO→O)顎間固定後、N群およびN→NO群では鼻呼吸経路を、またNO→Oでは口呼吸経路を遮断し、胸郭および腹壁呼吸運動をストレインゲージ式呼吸pick upを用いて記録した。同時に各呼吸経路遮断時における終末呼気炭酸ガス分圧(EtCO_2)と経皮酸素飽和度(SpO_2)を計測した。測定が可能な症例では動脈血酸素分圧(PaO_2)および二酸化炭素分圧(PaCO_2)を測定した。【結果】N群では鼻呼吸経路の閉塞によって胸郭・腹壁呼吸運動および各測定項目に変動はみられなかった。N→NO群では鼻呼吸および口呼吸経路が解放している状態では規則的な呼吸運動を示したが、鼻呼吸経路閉鎖により不規則となった。鼻呼吸経路の解放により規則的な呼吸運動に回復した。NO→Oでは口呼吸経路の遮断により、胸郭および腹壁の運動が著しく抑制され鼻呼吸への移行も不可能であった。動脈血液ガス分析値は、口呼吸経路遮断約1分後にPaO_2は93.2mmHgから74.6mmHgへ低下した。PaCO_2は45.7mmHgから50.0mmHgへ増加した。SpO_2は一時94%へ低下した。【測定方法】全身麻酔下にて顎間固定を伴う下顎骨後退術を行った患者8名を対象とした。被験者にはあらかじめ研究の主旨を説明し同意を得た。鼻呼吸および口呼吸を別々に測定できるよう試作したマスクと呼吸モニターカプノマックウルティマを用いて、手術前日および全身麻酔覚醒後に鼻呼吸および口呼吸の有無を測定した。全身麻酔終了後、鼻呼吸が認められた症例では、鼻呼吸経路を閉鎖した。また、顎間固定後に口呼吸のみが認められた症例では、口呼吸経路を閉鎖した。それぞれの呼吸経路を閉塞した時の胸部および腹部の運動をストレインゲージ式呼吸ピックアップを用いて記録した。【測定結果】術前および全身麻酔後の呼吸経路は、(1)術前および顎間固定後ともに鼻呼吸のみであった者4例(N→N群)、(2)術前は鼻呼吸のみがみられ固定後鼻呼吸をと口呼吸行っていた者3例(N→NO群)、(3)術前に鼻呼吸と口呼吸がみられ、術後に口呼吸のみであった者1例(以下NO→O)であった。各群における、それぞれの呼吸経路を閉塞させた時の胸部および腹部の運動は、N→N群では、鼻呼吸経路の閉塞によって胸部および腹部の運動に大きな変動は見られなかった。N→NO群では、鼻呼吸経路閉鎖により呼吸運動が不規則となったが、鼻呼吸経路の閉鎖を解放すると規則的な運動にもどった。NO→Oでは、口呼吸経路の閉塞により腹部および胸部の運動が著しく抑制された。【結論】顎間固定を行った全身麻酔後に口呼吸が関与している症例では、確実な気道確保が行えるよう呼吸管理に特に注意が必要である。
プロトンポンプと金属イオン輸送系の機能構造、機能共役、細胞ダイナミクスの解明

細胞は必須金属イオンを過不足なく濃度調節しつつ利用している。この点を、液胞が担う金属イオンの集積機能とそれを支えるプロトンポンに焦点を当て、分子素子自身とシステム全体としてのイオン調節機構の両面を解明することを研究目的とした。植物は必要な金属の余剰分を液胞に蓄え、必要に応じて細胞質に供給する。本研究では、液胞への金属集積を担うZn^<2+>/H^+対向輸送体(MTP1)とその機能を支えるH^+-ピロホスファターゼ(H^+-PPase)に焦点を当てる。二次能動輸送体は液胞膜プロトンポンプ(V-ATPaseとH^+-PPase)が形成するpH勾配を駆動力する。各分子の詳細な作動機構イオン濃度センサーを含む機能ドメイン、膜局在のダイナミズム、生理機能の特性,そして一次・二次能動輸送系の協調機構の解明を目的とする。さらに、金属イオンホメオスタシスに関わると推定される新規金属結合タンパク質(PCaP)について、金属イオン輸送系との関連に焦点を当てた。今年度は、MTP1についてイオン選択性とイオン輸送活性に機能する特定アミノ酸残基を、亜鉛結合領域、イオン選択領域等として特定した。さらに活性調節上きわめて重要と推定しているHisを多く含む領域(His領域)のタンパク質化学的な解析を進めて亜鉛結合数あるいは亜鉛結合による微細な構造変化を、ITCあるいはCDスペクトル解析で明らかにした。また、MTP1遺伝子を欠いた変異株(亜鉛感受性株)にMTP1遺伝子を導入すれば亜鉛耐性が回復することなどを明らかにした。また、H^+-PPaseとMTP1が根端領域で協調的に高いレベルで発現することを明らかにできた。金属結合タンパク質については、タンパク質化学的特性の一部を明らかにできた。本課題では、プロトンポンプと亜鉛輸送体に着目し個別輸送体の特性と輸送体間の協調的な調節機能の解明に努めた。とくに、液胞膜亜鉛輸送体MTP1に注目して、MTP1の特徴的アミノ酸30残基の生化学的機能の解明(FEBS J., 2012)、MTPのHis領域の分子構造の生化学的な構造と亜鉛結合性の定量・定性的研究(FEBS Open Bio, 2013)、植物における亜鉛過剰と鉄欠乏症での輸送系タンパク質の変動に関する生化学的関連性の解明(Plant Physiol., 2011)、液胞膜H+-PPaseの第二の機能(PPi加水分解;第一の昨日はプロトン能動輸送)の重要性(Plant Cell, 2011; Plant Signal. Behav., 2012)、H+-PPaseとホスファチジルイノシトールリン酸との相互作用(Plant Cell, 2013)等の成果をまとめ発表した。H+-PPaseの個別アミノ酸の機能上の評価(投稿準備中)、さらに、生化学的機能を維持したGFP付H+-PPaseを自プロモータで発現させることで、生理的条件をすなおに反映したH+-PPaseの可視化に成功し、世界の研究者が望む理想的な液胞膜可視化を達成することができた(論文改訂中)。GFP付H+-PPaseによる可視化によって、金属イオンの種類や濃度が変化するとき、H+-PPaseの細胞内局在の詳細を生きた細胞でのリアルタイム観察が可能となる。この他、H+-PPaseの機能に関して、基質濃度によって、基質加水分解とプロトン能動輸送の共役関係が変化するとの予備知見も得ることができた。細胞は必須金属イオンを過不足なく濃度調節しつつ、タンパク質の構成要素として利用している。過不足のない濃度調節について、液胞が担う金属イオンの集積機能とそれを支えるプロトンポンプに焦点を当ててきた。分子素子自身の構造と機能に加え、システム全体としてのイオン調節機構の両面を解明することを研究目的とした。本研究では、液胞への金属集積を担うZn2+/H+対向輸送体(MTP1)とその機能を支えるH+-ピロホスファターゼ(H+-PPase)に焦点を当てている。MTP1のような二次能動輸送体は液胞膜プロトンポンプ(V-ATPaseとH+-PPase)が形成するpH勾配を駆動力する。各分子の詳細な作動機構、イオン濃度センサーを含む機能ドメイン、生理機能の特性等の解明を目的とした。さらに、金属イオンホメオスタシスに関わると推定される新規金属結合タンパク質(PCaP)についても焦点を当てた。今年度は、MTP1についてイオン選択性とイオン輸送活性に機能する特定アミノ酸残基を、亜鉛結合領域、イオン選択領域等として特定し、さらに活性調節上きわめて重要と推定しているHisを多く含む領域(His領域)のタンパク質化学的な解析を進めて亜鉛結合数、亜鉛結合による微細な構造変化、亜鉛に対する結合定数を、ITCあるいはCDスペクトル解析で明らかにし、2編の論文として公表した。また、MTP1遺伝子を欠いた変異株(亜鉛感受性株)にMTP1遺伝子を導入すれば亜鉛耐性が回復し、高速郵送型のMTP1改変分子を発現した植物体では亜鉛欠乏により感受性となることなどを明らかにした。また、H+-PPaseとMTP1が根端領域で協調的に高いレベルで発現することを明らかにできた。金属結合タンパク質については、タンパク質化学的特性、および細胞生物学的機能の一部を明らかにした。液胞膜亜鉛輸送体MTP1は、植物の過剰亜鉛に対する耐性を規定する不可欠な膜輸送体である。そのMTP1がどのように亜鉛濃度を感知し、過剰分を液胞に能動輸送するのかを主要課題とした。部位特異的変異導入法で機能アミノ酸

残基、たとえばイオン選択性や輸送活性に関わる残基、を特定することができ、論文投稿まで辿り着くことができた。さらに、機能部位を人工合成してそのタンパク質化学的特性を明らかにでき、全体として当初の予定をやや上回った成果である。一方、プロトンポンプに関する研究もおおむね順調に進展した。25年度が最終年度であるため、記入しない。液胞膜亜鉛輸送体MTP1は、植物の過剰亜鉛に対する耐性を規定する不可欠な膜輸送体である。そのMTP1がどのように亜鉛濃度を感知し、過剰分を液胞に能動輸送するのかを主要課題とした。部位特異的変異導入法で機能アミノ酸残基、たとえばイオン選択性や輸送活性に関わる残基、を特定することができ、論文発表した。さらに、シロイヌナズナに特徴的なHis領域のタンパク質化学的な性質を解明し論文投稿まで辿り着くことができた。また、亜鉛輸送体およびその変位酵素の発現植物の作成と生理的な特性を見出しつつある。プロトンポンプの可視化と観察においても具体的に進展し、世界のスタンダードとなる可視化液胞マーカーの作出に成功した。全体として当初の予定をやや上回った成果である。(1)H^+-PPaseの構造と機能調節機構:植物から精製した分子の結晶解析から膜ドメイン部分の構造情報が得られる。予測される機能部位のアミノ酸を部位特異的に変異させた酵素を作成して機能を判定する。(2)H^+-PPaSeの可視化と細胞特異性、金属応答性の解明:自プロモータ::H^+-PPaSe-GFPを発現させた株を作出した。金属の過不足条件での組織・細胞でのH^+-PPaseの発現強弱、液胞形態を解析する。(3)Zn輸送体の亜鉛濃度センサー機能の解明:His領域は細胞質Zn^<2+>濃度のセンサーと推定される。His領域のタンパク質化学的特性を解析し、機能調節への寄与を解明する。(4)液胞プロトンポンプと金属輸送体変異株での金属応答性の解明:H^+-PPaseとV-ATPaseの機能欠失株が金属(Zn,Cuなど)の過不足条件でどのような表現型を示すかを解析し、金属ホメオスタシスにおけるプロトンポンプの寄与を判定する。(1) H+-PPaseの構造と機能調節機構:植物から精製した分子の結晶解析から膜ドメイン部分の構造情報が得られる。(2) H+-PPaseの可視化と細胞特異性、金属応答性の解明:自プロモータ::H+-PPase-GFPを発現させた株を作成できたので、金属の過不足条件での組織・細胞でのH+-PPaseの発現強弱、液胞形態を解析する。(3) Zn輸送体の亜鉛濃度センサー機能の解明:His領域は細胞質Zn2+濃度のセンサーと推定される。His領域のタンパク質化学的特性の一部は解明できたので、次のステップとしてNMR法により高次構造の解明につなげ、構造をもとに調節機能を議論する。(4)液胞プロトンポンプと金属輸送体変異株での金属応答性の解明:H+-PPaseとV-
元代の江南についての政治的・社会的研究

前後の時代と比較して史料の残存が少ない元代史の研究方法として、明・清代史料の中からいかに元代史料を発掘するかが鍵となっている。明・清代史料を博捜する必要はもちろんであるが、先人によって切り拓かれた成果を有効に活用するのも一つの方法である。台湾の王徳毅氏らによる『元人伝記資料索引』に記される小伝は、限界はありながらその意味で有効な史料を提供してくれる。私はこれの全面的な利用を図り、官職・事績などの事項をすべてカードに採録して、今後の研究に活用できる形に整えた。個別のテーマの論文執筆は、本年は「元代江南における官・民構造と徴税請負体制」の一編を執筆したにとどまっている。本編は私の元代南中国の研究の出発点と視点を再確認したもので、現在、南京大学元史研究室で中国語訳されつつある。その「官」の中には元代の帝室や功臣が江南に所有した名義上の土地(位下領・投下領)や税が含まれるが、これは決してモンゴル帝室の家政とか直接支配を物語るばかりではない。当時の中国における官・民分かちがたい行政システム、社会システムと関わっている課題であることが明らかになりつつある。この観点から、元代帝室の家政機関の制度的基礎研究と、位下領・投下領の実態、さらにはこれが明代にどのように継承されるかについての見通しがある程度ついた段階である。この部分は本年中には論文として公表するに至らなかったが、今後順次、論文として発表してゆく予定である。中国近世史上に元代をどう位置づけるかについての考察も、現在編著者の一人として予定されている『宋元時代史の基本問題』の中で明確にしてゆきたいと考えている。
Ｎ－アレニルニトロン鍵中間体を活用する新規触媒反応の開発

π酸性遷移金属を触媒とする骨格転位反応は、他の反応系では切断困難とされる強固なσ結合の開裂を伴うことから、結合活性化反応として興味深い。さらに複雑な分子骨格を一段階で構築する有機合成化学的観点からも魅力的である。申請者は、O-プロパルギルオキシムが新たな合成素子として、全く過去に例がない骨格転位反応を起こすことを明らかにしている。また、当化合物の触媒的骨格転位反応に示唆されている高い反応性を有するN-アレニルニトロンが重要な鍵中間体であるという知見が得られた。申請者は、次なるステージとして、N-アレニルニトロン中間体を捕捉・活用し、O-プロパルギルオキシムの「合成素子」としての有用性の拡充並びに新規触媒反応開発により、高官能基化されたヘテロ環化合物を効率的に構築する有機合成手法を提供する。このような作業指針のもとに、多様なヘテロ環構築反応を見出した(Tetrahedron Lett.2014,55,1178-1182;Org.Chem.Front.2014,1,914-918)。これらの反応は、アルキンの遷移金属のπ配位と、引き続くオキシム窒素原子の求核攻撃によって得られるビニル金属中間体を経て進行する。今回申請者は末端アルキンを有するO-プロパルギルオキシムとスルホンアジドを銅触媒存在下で反応させた場合、銅アセチリド中間体の発生を経てケテンイミン中間体を生じると予想した。更に、ケテンイミンに対するオキシム窒素原子の求核攻撃を経る新たな分子変換が進行すると考えた。このよしんうな作業仮説の下に、末端アルキンを有するO-プロパルギルオキシムとスルホンアジドとの銅触媒反応について検討した結果、多くの生理活性物質に含まれる基本骨格であるα、βー不飽和Nーアシルアミジン化合物が良好な収率で得られることを見出した(Org.Lett.2014,16,5184-5187.)。26年度が最終年度であるため、記入しない。π酸性遷移金属を触媒とする骨格転位反応は、1988年にTrostらにより、パラジウム触媒を用いた1,6-エンインの骨格転位反応が報告されたことを契機に、精力的に研究されている領域である。この反応系は、他の反応系では切断困難とされる強固なσ結合の開裂を伴うことから、結合活性化反応として興味深い。これまでの研究では合成素子として1,n-エンインやプロパルギルエステルが主要な対象であった。これに対し、申請者は、O-プロパルギルオキシムが新たな合成素子として、全く過去に例がない骨格転位反応を起こすことを明らかにしている。また、当化合物の触媒的分子内骨格転位反応に示唆されている高反応性を有するN-アレニルニトロンが重要な鍵中間体であるという知見が得られた。申請者は、次なるステージとして、N-アレニルニトロン中間体を捕捉・活用し、O-プロパルギルオキシムの「合成素子」としての有用性の拡充並びに新規触媒反応開発により、高官能基化されたヘテロ環化合物を効率的に構築する有機合成手法を提供することを目的とする。N-アレニルニトロン中間体が(1)ニトロン(2)アザジエン(3)アレンの3種の反応性官能基を有していることから、各々の反応性に応じた捕捉剤を系中に添加することで、各部位の特性を反映する様々な触媒反応を開発できると考え、幾つかの捕捉剤について検討した。申請者はまず、N-アレニルニトロン中間体がニトロンとしての反応性を着目し、dipolarophileとの1,3-双極子環化付加反応を検討した。検討の結果、トシルイソシアネートを用いることで、「3+2」環化付加反応・脱二酸化炭素・環化の連続反応が進行し、多置換ジヒドロピリミジン生成物を中程度の収率で得ることを見出した。次に、N-アレニルニトロン中間体がアザジエンとしての反応性を着目し、求ジエン体とのHetero-Diels-Alder反応を検討した。検討の結果、アルキンやアゾジカルボキシレートを用いた場合、hetero-Diels-Alder反応が進行し、それぞれ多置換ピリジン誘導体、トリアジン誘導体を得た。今後、これらの反応の反応条件の最適化を行うことで、N-アレニルニトロン中間体の反応性を解明する基礎且つ重要な知見が得られると考えている。

申請者は、次なるステージとして、N-アレニルニトロン中間体を捕捉・活用し、O-プロパルギルオキシムの「合成素子」としての有用性の拡充並びに新規触媒反応開発により、高官能基化されたヘテロ環化合物を効率的に構築する有機合成手法を提供する。このような作業指針のもとに、多様なヘテロ環構築反応を見出した。これらの反応は、アルキンの遷移金属のπ配位と、引き続くオキシム窒素原子の求核攻劉,よって得られるビニル金属中間体を経て進行する.今回申請者はChangらの報告(JACS. 2005, 127, 02038-2039)に基づき、末端アルキンを有するO-プロパルギルオキシムとスルホンアジドを銅触媒存在下で反応させた場合、銅アセチリド中間体の発生を経てケテンイミン中間体を生じると予想した。更に、ケテンイミンに対するオキシム窒素原子の求核攻撃を経る新たな分子変換が進行すると考えた。このような作業仮説の下に、末端アルキンを有するO-プロパルギルオキシムとスルホンアジドとの銅触媒反応について検討した結果、多くの生理活性物質に含まれる基本骨格であるα、β-不飽和N-アシルアミジン化合物が良好な収率で得られることを見出した。π酸性遷移金属を触媒とする骨格転位反応は、他の反応系では切断困難とされる強固なσ結合の開裂を伴うことから、結合活性化反応として興味深い。さらに複雑な分子骨格を一段階で構築する有機合成化学的観点からも魅力的である。申請者は、O-プロパルギルオキシムが新たな合成素子として、全く過去に例がない骨格転位反応を起こすことを明らかにしている。また、当化合物の触媒的骨格転位反応に示唆されている高い反応性を有するN-アレニルニトロンが重要な鍵中間体であるという知見が得られた。このような作業指針のもとに、多様なヘテロ環構築反応を見出した(Tetrahedron Lett.2014,55,1178-1182;Org.Chem.Front.2014,1,914-918)。これらの反応は、アルキンの遷移金属のπ配位と、引き続くオキシム窒素原子の求核攻撃によって得られるビニル金属中間体を経て進行する。今回申請者は末端アルキンを有するO-プロパルギルオキシムとスルホンアジドを銅触媒存在下で反応させた場合、銅アセチリド中間体の発生を経てケテンイミン中間体を生じると予想した。このよしんうな作業仮説の下に、末端アルキンを有するO-プロパルギルオキシムとスルホンアジドとの銅触媒反応について検討した結果、多くの生理活性物質に含まれる基本骨格であるα、βー不飽和Nーアシルアミジン化合物が良好な収率で得られることを見出した(Org.Lett.2014,16,5184-5187.)。26年度が最終年度であるため、記入しない。計画した反応を見出すことに成功したものの、反応生成物の収率には課題が残っている。今後、反応条件の最適化について更なる検討を行い、収率の向上を目指す。申請者は研究計画に従いこれまでに、N-アレニルニトロン鍵中間体を活用した二種類の分子間カスケード反応を見出し多置換ジヒドロピリミジン、トリアジン生成物が良好な収率で得られた。今後、N-アレニルニトロン鍵中間体を活用する新たな環化連続反応の開発に取り組んでいきたいと考えている。
河口域における懸濁物質の輸送・分布過程のモデル化

本研究は、河口域における懸濁物質の輸送・分布および堆積・再懸濁の過程を、数値モデル実験の手法と現場観測および既往観測資料の解析とを組み合わせて解明し、それに基いて、それぞれのタイプの適当でかつできるだけ単純化されたモデルを作成するのが目的である。本年度は、強混合型ないし緩混合型の河口域に重点を置いて観測し、水平2次元一層モデルの適用性を検討した。具体的な実績は以下の通りである。1.観測に基く検討有明海奥部の千潟に注ぐ小河川である八田江の河口域で、濁度と塩分および流速の鉛直分布を潮汐の一周期にわたり詳細に観測した。その結果、上げ潮初期の比較的強い潮流が底泥を強く巻き上げて高濁度水を上流に運ぶため、上げ潮時全体の濁度の輸送量は下げ潮時全体のそれに比べて2倍程度になることなど、懸濁物質の鉛直分布や水平輸送の、上げ潮時と下げ潮時の非対称性鉛直シアーの効果、干出前後における濁度輸送量の寄与の程度が明らかになった。2.数値シミュレーションによる検討有明海の奥部では、潮流による鉛直混合が著しくて、濁度の鉛直分布の潮汐周期の変化の中では、巻き上げと沈降の効果が卓越している。このような場所での懸濁物質の輸送・収支と堆積・洗堀を再現するために水平2次元一層の数値モデルの開発を試みた。その結果、潮流はミオ筋と千潟部で流速シアーが著しく、これが洗堀、堆積量に大きな影響を持っため、ミオ筋を十分再現できるような細かいメッシュで行うことが必要であることがわかった。また、巻き上げと堆積において、底泥の圧密状態と粒度組成を把握すること、流速と底質の特性との平衡状態を知ることの重要性が明らかになった。今後、これらの問題に焦点を絞った観測が必要である。
有機反応の制御因子に関する研究

1.光励起ハロゲノナフトキノンと電子種富なビニルエーテルとの付加反応は、三重項励起状態から電荷移動型エキサイプレックスを経由して進行することが明らかとなった。溶液の極性は本反応の重要な制御因子であり、アセトニトリルのような強い極性溶媒中ではクオンラジカルとして解離してしまうために、反応の効率が著しく低下する。2.チ-メトキシフェノールをテトラフェニルポルフィリン(TPP)と1,チ-ベンゾキノン(Q)の存在下で光照射すると2量化して、ジフェニルエーテル誘導体を与えることを見い出した。本反応はポルフィリンの光電子移動型増感反応により進行し、溶媒の極性以外にも、キノンの酸化還元電位・濃度ならびに4-メトキシフェノールとの電荷移動錯体能などが制御因子となる。3.ビス-チロシン-修飾ポルフィリンを2.6-ジクロル-1.4-ベンゾキノンと光照射することにより、キノン-キャップドポルフィリンが一段階で合成できることがわかった。一連の光反応でキノンをポルフィリン側鎖に導入し、ポルフィリンからキノンへの分子内光電子移動反応の効率について検討したところ、両者のクロモファの距離と共に両者の相対的配向が極めて重要な制御因子であることを見い出した。4.太陽光エネルギー貯蔵システムとして、ユバルトポルフィリンを用いたクワドリシクラン→ノルボルナジエンの発熱異性化反応を検討したところ、まずコバルト上の疎水ポケットに基質が取り込まれ、クワドリシクランのち員環上エキソ部位がコバルトのd電子の影響で攻撃されることがわかった。
バイオケモメカニカル機能を持つアクリルアミド系高分子ゲルの生体影響

本研究では、医用生体材料としての潜在的可能系をもつN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)から成るハイドロゲルの生体毒性を、詳細な動物実験から検討することを目的とする。昨年度の短期動物実験から、NIPAAmゲルはほとんど生体毒性を示さないことが分かっているが、研究の性格から充分な再現性を持った実験データを取得することが必要となる。そこで、本年度も、薬物投与後の短期間観察(10日程度)による急性毒性の検討を行なった。具体的には、LD_<50>値以下のモノマー及びモノマーと等モル量(残基濃度)のゲル試料を皮下注射により投与し、行動リズム(脳神経障害の検討)、生化学検査(肝・腎機能及び一般代謝機能の検討)、体重と食物摂取量との関係(成長因子への影響)を調べた。実験期間は10日程度としたが、生化学検査には一匹のラットの全血液を必要とするので、この実験を3回繰り返して行なった。その結果、NPAAmモノマーは比較滴強い毒性(神経系の代謝阻害)が認められたが、ポリマー(ゲル)にはこの影響が全く認められなかった。ただし、試料の投与後23日の間に投与部位の炎症が認められたが、これはNIPAAmゲルによるものでは無く、皮下注射に伴う炎症反応で、投与6日後にはほぼ完全に治癒することがわかった。これらの結果は、専門誌(Naturwissenschaften)投稿する予定で、現在「まとめ」を行なっている。以上の様に、本研究の結果は、医用生体材料としてのNIPAAmゲルの潜在的可能性を支持するものであったが、今後は年単位にわたる動物実験(長期実験)を行ない、発癌性など詳細な項目にわたり、安全性を調べる必要がある。本研究では、医用生体材料としての潜在的可能性を持つNPAAmゲルの生体毒性を、詳細な動物実験から検討することを目的とする。本年度は、薬物投与後の短期間観察(10日程度)による急性毒性の検討を行なった。具体的には、LD_<50>値以下のモノマーおよびモノマーと等モル量(残基濃度)のゲル試料を皮下注射により投与し、行動リズム(脳神経障害の検討)、生化学検査(肝・腎機能及び一般代謝機能の検討)、体重と食物摂取量との関係(成長因子への影響)を調べた。実験期間は10日程度したが、生化学検査には一匹のラットの全血液を必要とするので、この実験を3回繰り返して行なった。その結果、NPAAmモノマー比較滴強い毒性(神経系代謝阻害)が認められたが、ポリマー(ゲル)にはこの影響が全く認められなかった。ただし、試料の投与ご2-3日の間は、投与に伴う炎症反応が認めあれたので、これを確認する為の実験を計画した。以上の成果は、専門誌(Naturwissenschaften)投稿する予定で、一部の確認実験(炎症反応に関して)を行なっている。本研究では、医用生体材料としての潜在的可能性を持つN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)から成るハイドロゲルの生体毒性を、詳細な動物実験から検討することを目的とする。

その結果、NPAAmモノマーは比較滴強い毒性(神経系の代謝阻害)が認められたが、ポリマー(ゲル)にはこの影響が全く認められなかった。ただし、試料の投与後23日の間の投与部位の炎症が認められたが、これはNIPAAmゲルによるものでは無く、皮下注射に伴う炎症反応で、投与6日後にはほぼ完全に治癒することがわかった。これらの結果は、専門誌(Naturwissenschaften)投稿する予定で、現在「まとめ」を行なっている。以上の様に、本研究の結果は、医用生体材料としてのNIPAAmゲルの潜在的可能性を支持するものであったが、今後は年単位にわたる動物実験(長期実験)を行ない、発癌性など詳細な項目にわたり、安全性を調べる必要がある。
児童が地域社会に参画することができるようになる教材の開発～まちづくりの視点から～

人と人・人とまち・人と自然等をつなぐ方策の創出,自分の住んでいる地域や国に対する愛情や誇りを醸成する日本(地域)独自のデザインを明らかにすることを目的とし,小学校の教師と都市デザインの専門家,地域の有識者等との対話を通じて,研究してきた。計画としては, 5つのstepを設けている。本年度は,これまでの研究をテキストにし,教育現場で活用しながら検証する第4 stepであった。地域の課題に対して,専門家チームと協働しながら実践し,事例を増やしてきた。「どのようにすれば,まちは賑わうのか」という課題で,以下の7つの視点を導き出し,迫った。1個性・・・アイデンティティをもった場所2連続性と領域性・・・公共の空間と私的な空間との適切な区別3公共空間の質・・・魅力的で機能する屋外領域4移動しやすさ・・・たどりつきやすく,通りやすい場所5わかりやすさ・・・明解なイメージ,把握しやすい場所6順応性・・・容易に変容できる場所7多様性・・・空間の質や行動の選択肢が豊富な場所第5 Stepでは,上記の視点から子どもたちが考えられるかどうか検証し,事例を一般化して広めていく段階である。本年度は,事例数が十分ではないことで,他の図書に一部の実践を編著として記録した。2015年度中に発売予定である。
インドにおける近代的宗教表現の展開とその影響

「近代的宗教概念」の西洋近代的なバイアスは様々に批判されてきたが、本研究では、近代インドの、ネオ・ヴェーダーンタからM. K.ガーンディーらの言説と、タイル・絵画・英人墓地の墓石などの形象表現を対象に、近代的宗教概念それ自体に、すでに非西洋世界側の主体性が刻まれていることを明らかにし、議論に新たな位相をひらくことを目指した。その結果、インドにおいて、宗教/世俗をめぐる言説が、必ずしも西洋の既製の概念の受入ではないかたちで主体的に展開していたこと、また新たな経済環境の元、東/西、伝統/近代の対立を超えたグローバルで新たな宗教表現が成り立ち展開していたことが確認された。平成27年度は当初計画通り、12月12-13日開催の国際ベンガル学会を核に研究を進めた。本学会では、The Dynamics of Religion in Modern Bengal I-IVとして4つのパネルを編成した。研究代表者である冨澤と、研究分担者である豊山亜希(以下すべて敬称略)、研究協力者である間永次郎、平野久仁子との協議のもとパネル編成を進め、最終的に冨澤、豊山、平野を含む計13名からなる4パネルで、本研究事業の目的にふさわしい発表と議論がなされた。参加者のうち、ストックホルム大学のフェルディナンド・サルデラ、ベンガル・アカデミーのサイモン・ザカリアは本科学研究費により招聘した。他に、海外から台湾大学の李宥霆とラジュシャヒ大学のモストファ・トリクル・アフシャン、国内からは福内千絵、稲賀繁美、スワーミー・メダサーナンダ、澁谷俊樹、臼田雅之、置田清和の参加を得た。美術史研究、ネオ・ヴェーダーンタ研究、バウルやガジャンの人類学的研究、ヴァイシュナヴァ研究等、多様なテーマ、方法論の発表がなされたが、一貫して近代ベンガルにおける「宗教」なる現象と概念の問い直しが行われることとなり、大きな成果を得た。13日の学会終了後には、研究分担者・協力者4名で会合を持ち、活動方針について協議した。12月18日には冨澤が所属する東京大学附属図書館U-PARLとの共催で、ワークショップ“Archiving of Asia in Asia"を開催し、上記のサルデラを講師に、他に東京外国語大学の足立享祐と東京大学の宮本隆史をコメンテーターに迎えて、インドにおける宗教関連の貴重資料のデジタル化とオープンアクセス化のプロジェクトをモデルに、アジア研究における資料の保存・利用・共有のあり方について議論した。3月15日には冨澤、間、平野で会合を行い、特に最終年度の国際学会参加を焦点に、今後の研究活動について検討した。27年度は上記のとおり、当初計画どおりに国際ベンガル学会を核に研究活動を展開し、四つのパネルでの発表・討議を無事実現することができた。この活動には本研究活動のコアメンバーとなっている冨澤・豊山・間・平野が全員参与し、さらに国内外の多くの研究者からの協力と、本研究テーマへの理解、賛同を得ることができた。本研究事業の最大の課題は、宗教学の枠組みに閉ざされある種の閉塞状況に陥っている近代的宗教概念論を近代インドの文脈で多様なディシプリンと幅広く共有し、近代インド研究と宗教研究双方の自己批判の行き詰まりを打破する可能性を探ることである。その意味で、多くの研究者からこの企図に対する理解と参与を得た意義は極めて大きいものと考えている。27年度はコアメンバーそれぞれの従来の研究を持ち寄り、学会の場で他の研究者と共有するかたちで進み、想定どおりの成果を得たので、28年度以降はそこから各人の研究に新たな展開を得るべく、コアメンバー間の研究の共有の機会をさらに増やす必要があろう。平成28年度は、前年度12月に開催された国際ベンガル学会の成果を基盤に、本研究計画の代表者・分担者・協力者である冨澤かな・豊山亜希・間永次郎・平野久仁子の間で、それぞれの専門性に応じた研究を展開、共有してきた。冨澤は国際ベンガル学会で報告した、近代インドの宗教概念の展開を"spirituality"の語彙の用例から検討する作業を継続しつつ、新たに近代インドにおける"secularism"という語彙の用例へと調査研究を広げている。また、インドの英人墓地の墓石意匠の調査も継続的に展開している。豊山はカルカッタの邸宅建築における表象の変遷の検討を進めるとともに、新たにインドの近代画の潮流を藩王国の近代美術コレクションから見直し、従来一般的であった、ラヴィ・ヴァルマーらの油彩の系譜とベンガル派との対立図式自体を再考しようとしている。間はガーンディーの思想の展開を細かく検証する博士論文を完成し、そこから、ガーンディーにおける人間の二面性の認識やこれに対する議論の重要性と根本的な一元論の方向性とがどのように成立・共存したのかを、ヴィヴェーカーナンダ的なネオ・ヴェーダーンタとの関わりとともに検討している。平野は日本人仏教僧とヴィヴェーカーナンダの関係等の研究を継続するとともに、ヴィヴェーカーナンダの、特にカルマ・ヨーガ論を核とするヨーガ論と、これとは系譜を異にするハタ・ヨーガの理論の検討に着手している。これらはすべて、近代インドの宗教表象の多様性を新たな視点で見直すことを目指す試みであり、最終年度である2019年度に国際学会でパネル発表をすることを具体的目標に設定して研究を進展させている。8月1日と3月20日に研究報告会を開き、研究状況を共有し討議をするとともに、国際学会へのアプライについて方針を討議、決定した。

平成28年度は当初計画どおり、前年の国際ベンガル学会の成果を基盤に、本研究活動のコアメンバーである冨澤・豊山・間・平野それぞれの研究に新たな視点を取り入れ、29年度の国際学会アプライに向け、その成果を共有・展開することができた。本科研メンバー外でも、例えば福内千絵氏がインド近代美術の神表象の見直しをめぐる成果を継続的に発表するなど、本研究計画の助成により構成したパネルのメンバーがその成果を進展させている例が見られ、また、冨澤がこの学会のプロシーディング編集に協力するなど、継続性のある活動を展開することができた。28年度は27年度の成果を受けてそれぞれの研究調査を進め、共有することができたが、国際ベンガル学会を核に多くのアウトプットを行った前年度に比べると発表件数がやや下がったため、29年度は成果の公開により注力したい。本研究では、いわゆる近代的宗教概念批判の意義を受け止めつつ、その行き詰まりやジレンマに抗することを意図し、近代インドの言説・形象双方の宗教表現を対象に、近代的宗教概念それ自体に、すでに非西洋世界側の主体性が刻まれていることを明らかにし、議論に新たな位相をひらくことを目指した。研究協力者の平野久仁子、間永次郎と代表者の冨澤かなは、近代インドの宗教言説が、伝統と近代性の問題や他者の存在をどう受けとめつつ成り立たってきたか、分析を進めた。平野はヴィヴェーカーナンダを中心に、近代ヨーガ論と、近代アジアの仏教論の展開を跡づける研究を行った。間はガーンディーの哲学、特にブラフマチャルヤ論の成立と全体像をインドの思想伝統やネオ・ヴェーダーンタとの関係に着目しつつ分析する研究を進めた。冨澤は近代インドでspirituarityとsecularityに関わる語彙がいつどう用いられてきたか、量的分析の可能性に着目しつつ分析を進めた。形象表現に関しては、研究分担者の豊山亜希が、インドの近代絵画史の伝統/近代の対立図式の見直しを行うとともに、近代インドにおけるマジョリカタイルの普及と空間表現の変容が、広域的な経済の展開とともに生じてきた様を分析した。また冨澤は、近代インドの英人墓地の墓石意匠の複雑な成り立ちの研究を進めた。27年度には国際ベンガル学会で、近代ベンガルの宗教の動態を4パネルで多面的に検討し、国内外の多くの参加者と問題意識を共有し、最終年度には、国際シンポジウムとセミナーの開催と、国際学会への参加を行った。その中で、宗教/世俗をめぐる言説が、インドで主体的に展開していたこと、そして同時に、これを再統合し、あるいは対立軸をずらす論理展開が強く見られたことが確認され、また新たな経済環境の元、東/西、伝統/近代の対立を超えたグローバルで新たな形象表現が成り立ち展開していたことが確認された。「近代的宗教概念」の西洋近代的なバイアスは様々に批判されてきたが、本研究では、近代インドの、ネオ・ヴェーダーンタからM. K.ガーンディーらの言説と、タイル・絵画・英人墓地の墓石などの形象表現を対象に、近代的宗教概念それ自体に、すでに非西洋世界側の主体性が刻まれていることを明らかにし、議論に新たな位相をひらくことを目指した。その結果、インドにおいて、宗教/世俗をめぐる言説が、必ずしも西洋の既製の概念の受入ではないかたちで主体的に展開していたこと、また新たな経済環境の元、東/西、伝統/近代の対立を超えたグローバルで新たな宗教表現が成り立ち展開していたことが確認された。今後の活動の最大の節目として、最終年度の国際学会参加を検討している。
現代ケベック文学におけるアイデンティティの模索-伸展する多民族化を背景として-

本年度の研究実績の概要としては、ケベック文学の最新の潮流に照らし読み直しを行なってきたフランス系カナダを代表する作家の一人であるガブリエル・ロワについて、ロワが育った背景にある多文化主義的および多言語主義的状況が、作家とその作品にどのような影響を及ぼしたかを、主に支配者層に属するイギリス系カナダ人の描かれ方に注目し詳細に分析を行なった。その結果、ロワにおいては、多文化主義的、多言語主義的状況は文化相対主義的な感性を育み、さらにその作品においては、言語的、政治的な差異を超えた普遍的な結びつきを志向する傾向が見られた。この研究成果の一部は、1998年6月フランスのアヴィニョンで開催された国際学会-カナダの二言語政策の総決算と展望-において発表した。なお、ロワの代表作の一つであり、多様な移民の子供たちとの共生を描いた小説『わが心の子らよ』(1977)を「カナダの文学」シリーズの一巻として訳出し彩流社より刊行した.(1998年12月)一方、ロワ研究と平行し、最新のケベック文学の動向において重要な位置を占める移民作家に注目し,特に、トリニダート出身でカナダ政府の多文化主義を批判しトロント(英語圏)からモントリオール(仏語圏)に移住したN.ビースンダットについて、その著書『幻影の市場』(1993)における多文化主義批判を追いながら、カナダの多文化主義が孕む矛盾と限界、およびカナダ政府とは異なった形での多民族の共存を模索するケベック社会の可能性と問題点について、詳細な検討を行なった。この研究成果の一部は、まず1998年4月に立命館大学で行なわれた比較文化研究会において発表し、さらにそれを発展させたものを『立命館言語文化研究』10巻5・6合併号(立命館大学言語文化研究所、1999年3月)に論文「カナダの多文化主義を超えて一N.ビースンダットの多文化主義批判とケベックにおける多文化共同体の模索-」として発表した。本年度の研究成果としては、まず第一に、フランス系カナダを代表する作家であるガブリエル・ロワの作品を、最新のケベック文学の動向に重ね合わせて読み直し、分析を行なった。特に、マニトバの少数派であるフランス系に生まれ、英語系の学校で教育を受けたロワが、少数派である悲哀を抱きつつも、支配者である英系社会に対し開かれた相対主義的な眼差しを失わず、多様な民族を受け入れる普遍主議的な感性を培っていった過程を、主にその自伝『絶望と魅惑』を通して分析した。この分析の成果の一部は、論文Les images del ́anglophone chez Gabrielle Royとして『カナダ文学研究No.6』1997.12月に発表した。今後は、他者との共生のテーマを追求する素地となった、このようなロワの感性や思考が、ケベックおよびカナダにおける多文化主義や多元主義にどのような影響を及ぼしたかについてさらに分析を深め、本年6月フランスで行なわれる国際学会『カナダにおける二言語主義の再考』において発表する予定である。本年度はさらにこのロワの研究と平行し、中国系のイン・チャンやブラジル出身のセルジオ・コキス、イタリア系のマルコ・ミコ-ネなど、90年代以降ケベックで活躍している最新の移民作家の動向について、東京のカナダ大使館研究情報センター等において、ケベックからの最新の雑誌などを通して、情報、資料収集に努め、専門家との意見交換を行なった。今後はこれらの作家の作品や資料の詳細な分析を進め、それぞれの作家において、アイデンティティの模索がどのように行なわれ、それが伸展しているケベック社会の多元化にどのように結びついているかを分析する。
正常および異常甲状腺ホルモン受容体の発現と機能に関する分子生物学的研究

1.甲状腺ホルモン不応症における異常T3受容体の解析本邦で発見された全身型甲状腺ホルモン不応症(GRTH)患者のT3受容体(TR)β遺伝子の解析を行い、4例において点突然変異を同定した。いずれもホルモン結合領域をコードするエクソン7ないし8に位置するものであった。さらに下垂体型不応症(PRTH)の患者においてもアミノ酸333番めのArgがTryに点突然変異していることを発見した。GRTHの一例とPRTHの異常TRを発現させ、T3結合能を調べると、いずれもT3結合親和定数が正常の1/201/50に著明に低下していた。PRTHのTR遺伝子異常は世界で最初の報告であり、PRTHとGRTHの発生機序に関し重要な知見を与えるものとなった。現在、GRTHとPRTHの異常TRを細胞に発現させ、DNA結合能、転写活性能、二量体形成能を比較検討している。またGRTHの症例のうち一例は、臨床的に明かな不応症であるにもかかわらず、TRβ遺伝子異常を同定することが出来なかった。この症例のTRα遺伝子解析を進めている。2.HL-60細胞におけるT3作用白血病細胞であるHL-60細胞の分化は、レチノイド酸(RA)によって誘導されるが、T3はこのRAの分化誘導作用を増強することを発見した。T3単独では分化誘導作用を示さなかった。このT3の増強効果は少なくとも一部は細胞内cAMP増加作用によるものと考えられる成績を得た。また細胞をRAであらかじめ12時間プライミングしておけば、その後RA非存在下でもT3の分化誘導促進作用は認められた。また、HL-60細胞にT3受容体が存在することをT3結合法で証明した。
DNAアレイと成熟不全変異体、形質転換体トマトを用いた果実成熟制御鍵因子の解析

モデル作物であるトマトにおいて、DNAアレイ、成熟不全変異体および形質転換技術を駆使して成熟制御における鍵因子を解析した。12000遺伝子のDNAアレイを用いて、成熟前後に顕著に変化する428個の成熟関連遺伝子を特定し、内244個は完全にエチレンの制御下にあることを示した。新規成熟関連転写・シグナル因子としてGRAS, SAHH, b-ZipおよびBTB因子を見いだした。また、成熟および花弁離脱を顕著に抑制されるEIL抑制形質転換トマトを作成し、成熟エチレン生成の開始は発育段階的によって決定されていることを示した。これらの知見を基にキウイフルーツ果実の成熟機構を解析し、エチレン信号伝達系とは独立した低温誘導成熟機構があることを明らかにした。果実の成熟機構解明は、貯蔵・流通技術の開発・改善の鍵であるとともに、園芸生理研究の焦点の一つである。最近、トマトが果実のモデル作物として取り上げられ、国際協力の下にゲノム計画が進展しつつある。国内では筆者らも協力した変異体集団の作成やDNAアレイの整備、完全長cDNA収集、データベースの整備などが行われ、トマトにおいては多様な研究基盤が整ってきた。このような背景の下に、本研究は、(1)トマト果実成熟に関わる遺伝子を網羅的に解析し、その制御機構の全体像を把握すること、(2)成熟の引き金となる最初のエチレン生成を誘導する鍵因子を決定すること、(3)成熟進行における信号伝達系の系統整理と主要転写制御因子を決定することを目的とする先駆的試みである。本研究の特徴は、筆者らが独自に作出したエチレン不感受性形質転換体(エチレン信号伝達因子EIN3/EIL遺伝子をノックアウト)、変異体集団およびDNAアレイなどの新素材・技術を駆使して、多数の候補の中から成熟の鍵因子を検索し、形質転換技術を用いて決定することにある。本研究の成果は、果実生理研究における新局面を開くとともに、実用面でも果実品質の向上、流通・貯蔵技術の改善、高品質・長寿命品種の育成に直接的に貢献できる。成熟関連遺伝子の抽出(研究代表者、久保および研究協力者が担当)成熟エチレン生成開始前と開始後の野生型果実からそれぞれRNAを抽出し,逆転写酵素を用いて33Pおよび蛍光色素でラベルしたプローブを作成した。トマトDNAアレイ(かずさDNA研究所より供給,約12,000のトマト遺伝子の同時発現解析が可能)を用いた網羅的遺伝子発現解析により、初期エチレン誘導因子の検索を行った。トマトDNAアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。果実成熟に伴って3倍以上に発現レベルが増加する遺伝子が240個、逆に3分の1以下に減少する遺伝子が188個みつかり、合計428個の遺伝子を成熟関連遺伝子として同定した。さらに、エチレン作用阻害剤1-MCPに対する反応を調査したところ、成熟に伴って発現が増加する遺伝子内、211個(88%)がエチレンに依存していること、発現が低下する遺伝子の内でも36個の遺伝子がエチレンに直接的に支配されていることが明らかになった。また、成熟関連遺伝子の内約80%がrin,nor成熟不全変異体トマトではエチレン処理によっても発現レベルは大きく変化せず、これらの遺伝子はエチレンとRIN,NOR信号伝達系の両者によって制御されていることが明らかになった。研究分担者の矢野が構築しているトマトデータベース(Mibase)およびRIKEN Transcription Databaseを利用して、成熟関連遺伝子の機能分類を行ったところ、20個の転写制御遺伝子が含まれていることが明らかになった。今後、この抽出された転写制御因子と果実成熟の関係を、VIGS法および形質転換技術を用いて解析する予定である。マクロアレイを用いて調査した12284個の遺伝子のうち成熟関連遺伝子は、428個存在し約5%の割合を占めていた。成熟に伴い発現が増加した遺伝子は、242個、減少した遺伝子は188個であった。そのうちエチレン応答性遺伝子は298個で、成熟に伴って増加した遺伝子が231個、減少した遺伝子が67個であった。エチレン応答性の遺伝子のうちRIN依存性の遺伝子は、111個存在し約37.2%の割合を占めた。NOR依存性の遺伝子は、204個存在し約68.9%の割合を占めた。RINとNOR両方に非依存性を示した遺伝子は、僅か16個でエチレン応答性遺伝子の多くは、RIN, NORに依存していた。さらに、トマトマクロアレイにより成熟に伴う転写因子を調査し、選び出した転写因子についてVIGS法を用い遺伝子機能解析を行った。成熟に伴い発現が顕著に増加した転写因子は29個あり、これらのうち成熟に伴い増加したTDR4、GRAS、VHOX1、S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase、成熟に伴い減少したb Zip、BTB、C 2 H2についてVIGS法による解析を行った。GRASの抑制により、果実成熟は抑制された。

b Zip、S-adenosyl-L-homocysteine hydrolaseの抑制により、成熟は促進された。VOHOX1を幼果で抑制すると形態異常が起こり、開花20日では成熟抑制を示した。これらの遺伝子については更なる解析が必要である。マクロアレイ分析とVIGS法による遺伝子機能解析の有用性が示された。成熟関連転写因子の抽出(研究代表者、久保および研究協力者が担当)マクロアレイを用いて調査した12284個の遺伝子のうち成熟関連遺伝子は、428個存在し約5%の割合を占めていた。成熟に伴い発現が増加した遺伝子は、240個、減少した遺伝子は216個であった。そのうちTurning段階の1-MCP処理によって、発現レベルがMG段階のレベルに戻るエチレン依存性遺伝子は、成熟に伴って発現が増加する遺伝子のうち231個(96%)、減少した遺伝子のうち67個(35%)、合計298個であった。エチレン依存性成熟関連遺伝子のうちRIN依存性の遺伝子は、213個存在し71%の割合を占めた。NOR依存性の遺伝子は、264個存在し89%の割合を占めた。RINとNOR両方に非依存性を示した遺伝子は、僅か16個でエチレン応答性遺伝子の多くは、RIN,NORに依存していた。信号伝達経路においてNORはRINの上流に位置し,より多くの遺伝子を制御していると推測されており,今回の結果はその見解に一致した.また、成熟に伴って増加するエチレン依存性転写因子としてTDR4,TDR6などのMADS因子に加えてGRAS因子が抽出され、エチレン信号伝達系とGA信号伝達系のクロストークが示唆された。また、成熟に伴って減少する転写因子としてはbZip、BTB、TF-other因子などが抽出された。前年度までの解析によって、果実成熟の前後で遺伝子発現レベルが急激に増加する因子として、GRAS,S-adenosyl-L-homocysteinhydrase,TDR4およびTDR6、逆に成熟に伴って発現レベルが顕著に低下する因子としてbZIP因子が抽出された。これらの因子の発現をDNAアレイによって、EIN3/EIL抑制形質転換トマトおよび野生型トマト果実において解析したところ、いずれも開花後50日後でも発現増加がみられず、外生エチレン処理にも反応しなかった。したがって、これらの因子は完全にエチレン信号伝達系の下流に位置するものと推察された。これらの転写制御因子について、その全鎖長cDNAをトマトナショナルバイオリソースから供給を受け、ノーザン分析およびリアルタイムPCR分析によって発現パターンの再検討を行った。その結果、DNAアレイでの解析結果とほぼ同様な傾向を示した。抽出された転写制御因子GRASついてアグロバクテリウムをベクターとしたGFPと35Sプロモーターを使ったコンストラクトを構築し、RNAinterference法を用いて、発現抑制形質転換トマトを作出した。8系統についてGFP発光によって形質転換系統であることを確認し、その内1系統については果実成熟までの観察が完了した。