hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線による冠動脈狭窄(心筋硬塞)発生の予防法の開発

等量混合培地にインスリン、トランスフェリン、および牛胎児血清5%を添加した培地で5日間培養した心筋細胞に2Gy、5Gy、10Gy、20Gy、および50GyのX線照射を行い、エンドセリン遺伝子mRNAの発現量について、RT-PCR法を用いて検討を行った。その結果、X線の10Gyから50Gyの線量において、照射2時間より8時間後にかけてエンドセリンmRNAの発現量の増加を認めた。定量的評価の結果、増加量は最大270%という結果が得られた。心筋細胞は50GyのX線照射によっても、24時間後の細胞生存率の低下は観察されず、培養心筋細胞はX線による細胞障害に対し強い抵抗性を示すことが分かった。細胞に対する放射線の照射は、細胞内にフリーラジカルを生じさせることが知られているため、このラジカル発生によるラジカルスカベンジャー分子の誘導が起こるかどうかについてmRNAの発現についても検討を加えた。その結果、エンドセリンの場合と同様に、Mn-SOD、カタラーゼ遺伝子の有意な発現増加が認められた。これまでの情報から、エンドセリンmRNAの細胞内での発現上昇には、低酸素刺激やトロンビン刺激などとともに、細胞内に発生するラジカルに起因する場合が報告されており、X線照射による細胞内エンドセリンmRNA産生の上昇には、X線照射に起因するラジカルの産生が関与することが示唆された。次に、エンドセリンのmRNAの発現上昇が、エンドセリンペプチドの産生上昇につながるかどうかを検討するため、培養心筋細胞に20GyのX線を照射後、12時間、24時間後の培養液を採取し、その中のエンドセリン分子についてELISA法を用いて定量を行った。しかし、培養液中には有意な量のエンドセリン分子の産生は認めることが出来なかった。この結果は、分子の産生量が測定に十分で無いのか、あるいはエンドセリンmRANの上昇が分子の産生につながっていない、単なる遺伝子発現の変化でしかないことを示唆しており、この点についてはさらなる検討課題である。前年度の実験から、ラット新生児より採取した心筋細胞に2Gy、5Gy、10Gy、20Gy、および50GyのX線照射を行い、エンドセリン遺伝子mRNAの発現量について、RT-PCR法を用いて検討を行ったところ、X線の10Gyから50Gyの線量において、照射2時間後より8時間後にかけてエンドセリンmRNAの発現量が最大270%の増加を示した。しかし、エンドセリンのmRNAの発現上昇が、エンドセリンペプチドの産生上昇につながるかどうかを検討するため、培養心筋細胞に20GyのX線を照射後、12時間、24時間後の培養液を採取し、その中のエンドセリン分子についてELISA法を用いて定量を行った。本年度は、引き続き、心筋細胞へのX線照射によるエンドセリンペプチドの産生について検討を加えた。培養心筋細胞に20GyのX線を照射後24時間後の培地について、培養液をカートリッジ式逆相カラムを用いて約10倍に濃縮したサンプルについてエンドセリンペプチドの量をELISA法によって測定した。しかし、エンドセリンペプチドの産生は認めることができなかった。一方、X線照射後の培養細胞自身をエンドセリン特異的抗体を用いた細胞免疫染色を行ったところ、わずかではあるがエンドセリンの存在が認められた。このことは、X線照射によって、心筋細胞はエンドセリンを産生するものの、その量は極めて少ないことが推察された。
S100ファミリー蛋白の腎癌における発現と早期診断および分子標的療法の可能性の検討

ヒトS100蛋白は14種類(S100A1-S100A14)の遺伝子が1番染色体の1q21領域にclusterとして存在する。そこで、研究期間に切除した腎癌組織と正常部腎組織のS100A1、A10をRT-PCRにて測定した。その結果、腎癌組織におけるS100A10の陽性率は75%と比較的高率であったが、S100A1はほとんどすべての腎癌組織ならびに正常部腎組織において検出された。また、細胞膜においてS100A10の標的分子であるとされ、テトラマーを形成するAnnexin IIの発現も検討した。Annexin IIとそのリガンドのS100A10は腎においては遠位尿細管から集合管にかけて発現しているが、近位尿細管に由来する腎癌組織では、Annexin IIとS100A10が遺伝子および蛋白レベルで強く発現していた。また、腎癌組織におけるS100/Annexinの過剰発現と癌の病理・臨床因子との関連について検討した結果、S100A10と同様75%で発現が認められた。一方、腎癌組織における血小板由来血管内皮細胞増殖因子のTdPRaseの高発現についても昨年度に引き続き確認した。結果をまとめると、(1)腎癌組織47例について、3つのマーカー候補遺伝子(S100A10,Annexin II,B-FABP)の評価を行った結果、3つとも癌部位で遺伝子の過剰発現が確認されたが、特にB-FABPは腎の正常組織での発現がほとんど認められず、最も特異性が高いと判定された。(2)腎癌の病理学的因子と過剰発現を検討した結果、核異型G1でのみ、S100A10とAnnexin IIの共過剰発現が有意に認められた。(3)臨床的背景因子との相関を検討した結果、腎癌組織、正常部ともにS-100 A10mRNAの検出例・非検出例の間で臨床病期、異型度、浸潤様式および腫瘍長径、CRP・IAP等のパラメータで差は認めなかった。S100蛋白は約20種類がファミリーを形成し、組織特異的に発現し、標的分子と結合し機能を発揮する。ヒトでは14種類の遺伝子が1番染色体のlq21領域にclusterとして存在し、S100A1-S100A14と命名されている。この領域は、癌において染色体の転座などの異常が頻繁に認められる。我々はS100A1とS100A10が腎癌組織(n=5)に特異的に発現し、非癌組織ではS100A5が発現し、健康成人尿中にはS100A5が確認できることを過去に報告した。今回、RT-PCRにより本研究期間に摘除した腎癌組織(n=11)と非癌組織のS100A1、A10を測定した結果、腎癌組織におけるS100A10の陽性率は75%と比較的高率であった。一方、S100A1はほとんどすべての腎癌組織と非癌組織において検出された。細胞膜においてS100A10の標的分子であり、テトラマーを形成するAnnexin IIの発現も併せて検討した結果、S100A10と同様に75%で発現した。しかし、S100A10、Annexin IIと腎癌の臨床病理学的因子の間に関連性はなかった。

S100A10は腎癌に比較的高率に発現する分泌型蛋白で、今後尿や血清においての検討を加え、腎癌腫瘍マーカーとしての可能性を調べる必要がある。また、分子標的となりえるか検討するため、症例数を増やしてその局在を詳細に調べる予定である。一方、我々は腎癌組織における血小板由来の血管内皮細胞増殖因子であるTdPRaseの発現と予後因子としての可能性に関しても検討してきた。一方、S100A4は癌の浸潤・転移に関与し、予後因子の1つで、一部の癌では血管新生因子と報告されているため、S100A4とTdRPaseの関連性も検討している。S100A4は多くの組織や細胞で発現しており、腎癌の予後因子としての可能性につき、今後症例を追加し検討する予定である。ヒトS100蛋白は14種類(S100A1-S100A14)の遺伝子が1番染色体の1q21領域にclusterとして存在する。そこで、研究期間に切除した腎癌組織と正常部腎組織のS100A1、A10をRT-PCRにて測定した。その結果、腎癌組織におけるS100A10の陽性率は75%と比較的高率であったが、S100A1はほとんどすべての腎癌組織ならびに正常部腎組織において検出された。また、細胞膜においてS100A10の標的分子であるとされ、テトラマーを形成するAnnexin IIの発現も検討した。Annexin IIとそのリガンドのS100A10は腎においては遠位尿細管から集合管にかけて発現しているが、近位尿細管に由来する腎癌組織では、Annexin IIとS100A10が遺伝子および蛋白レベルで強く発現していた。また、腎癌組織におけるS100/Annexinの過剰発現と癌の病理・臨床因子との関連について検討した結果、S100A10と同様75%で発現が認められた。一方、腎癌組織における血小板由来血管内皮細胞増殖因子のTdPRaseの高発現についても昨年度に引き続き確認した。結果をまとめると、1.腎癌組織47例について、3つのマーカー候補遺伝子(S100A10,Annexin II,B-FABP)の評価を行った結果、3つとも癌部位で遺伝子の過剰発現が確認されたが、特にB-FABPは腎の正常組織での発現がほとんど認められず、最も特異性が高いと判定された。2.腎癌の病理学的因子と過剰発現を検討した結果、核異型G1でのみ、S100A10とAnnexin IIの共過剰発現が有意に認められた。3.臨床的背景因子との相関を検討した結果、腎癌組織、正常部ともにS-100 A10mRNAの検出例・非検出例の間で臨床病期、異型度、浸潤様式および腫瘍長径、CRP・IAP等のパラメータで差は認めなかった。
スギ花粉症に対する舌下免疫療法施行患者血清中の網羅的蛋白解析から得た新薬開発

スギ花粉症は、成人の約35%が発症している。多くの治療法が対処療法であるが、唯一根治療法とされるのが、抗原特異的免疫療法である。本研究では、スギ花粉症に対して舌下免疫療法を行い、アポ蛋白A-4(apolipoprotein A4)が血清中で上昇した患者で治療効果が認められることを見出した。そして人エアポ蛋白A-4が抗原刺激によるヒスタミンの遊離を抑制した。さらにスギ花粉症の遺伝子検索を行い、IL-33、DAF、Filaggrinがスギ花粉症と関連あることを見い出し、アポ蛋白A-4とともに治療標的分子としての可能性があると思われた。スギ花粉症患者に対して舌下免疫療法を行い、その治療前後、スギ花粉飛散前、ピーク時、飛散後において経年的に採血し保存しておいた血漿を用いてプロテーオム解析を行った。その結果舌下免疫療法施行患者において、肝細胞・小腸で産生されるアポ蛋白A-IV、C4A、トランスサイレチンが上昇した。プラセボ群ではこれらの蛋白は変動しなかった。これらのPathway解析を行うと、転写因子であるHepatocyte nuclear factor 4αが共通の上流因子であり、それぞれの蛋白発現を制御していた。スギ花粉症の症状とはアポ蛋白A-IVが相関しており、症状の程度とアポ蛋白A-IVの変動は、有意に正の相関を示していた。また人工的アポ蛋白A-IVを作成し、スギ花粉症患者末梢血から好塩基球を分離し、スギ抗原(Cryj1)とともに添加し、ヒスタミンの遊離率を測定すると、有意にヒスタミンの遊離率を抑制した。舌下免疫療法施行患者において、別途にin vitroヒスタミン遊離率を測定すると、実薬群でプラセボ群に対して有意に低下していた。以上のことから舌下免疫療法の効果発現にアポ蛋白A-IVが関連していることが判明した。アレルギー性鼻炎は、本来Th2型の疾患であるとされていたが、最近は多くのサイトカインの関与も報告されている。IL-33は炎症性サイトカインの一つであるが、スギ花粉症患者、非アレルギー健康人、慢性副鼻腔炎患者の血清中IL-33を測定するとスギ花粉症患者において他の2群に比較して有意に高値を示した。またIL-17もアレルギー反応に重要なサイトカインであるが、舌下免疫療法施行年数を重ねるにつれて、治療効果の上がった患者において血清中IL-17が有意に低下していることが判明した。舌下免疫療法を行ったスギ花粉症患者の治療前後、スギ花粉飛散前、ピーク時、飛散後において経年的に採血した血漿を用いて、IL-17、IL-33、TGF-β、IL-10をELISAキットにて測定した。その結果、IL-17は、舌下免疫療法の施行年数が2年を超えると、治療前に比べ有意に低下することが判明した。そして2年目以降も順次低下していった。しかしIL-33、TGF-β、IL-10は有意な変動を認めなかった。このことは、アレルギー炎症を舌下免疫療法がIL-17低下を介して誘導している可能性を示している。また舌下免疫療法との相乗効果を認める治療法探索のため、舌下免疫療法と乳酸菌とのプラセボ対照2重盲検試験を行った。その結果、乳酸菌による治療効果ともに免疫療法との相乗効果が認められた。その機序として乳酸菌内のCpG-DNAの影響を考え、B細胞上の共刺激分子発現への影響を調べるとCpG-DNAはB細胞のPD-L1発現亢進をNFκB活性のシグナルにて誘導し、抗原存在下のT細胞からのIL-5産生を抑制した。この抑制は可溶性PD-1を介していた。またこれまでの舌下免疫療法の網羅的解析から、アポ蛋白A-IVが、スギ花粉症の症状と有意に正の相関を示しており、人工的アポ蛋白A-IVが好塩基球からのヒスタミン遊離を押さえていたが、このプラセボ対照2重盲検試験において実薬群では、有意に末梢血のヒスタミン遊離能が低下しており、アポ蛋白A-IVのin vitroの結果と一致した。rs10746463,P=0.00033,危険塩基A)、Intelectin-1(rs2274907,P=0.009,危険塩基A)の遺伝子がスギ花粉症に関連していることを見出した。ORMDL3:TT型はリスクアレルホモでスギ花粉症が有意に多く、かつORMDL3発現が亢進していた。さらに鼻粘膜上皮で多くのORMDL3の発現を認めた。アトピー型喘息での責任SNPでもあり、アレルギー性鼻炎と有意な高い相関を示した。rs7216389のリスクアレルTT型の患者ではORMDL3発現が有意に亢進していた。ORMDL

3発現は、鼻粘膜上皮、線維芽細胞で認め、それぞれpoly-IC刺激で発現が亢進した。アレル別に末梢血からCD4陽性細胞を分離し、poly-IC刺激を行うとリスクアレルTTでIL-10、IL-17の産生が有意に高かった。さらにスフィンゴシン1リン酸もリスクアレルTTで高値であった。DAFは、補体C3がC3a活性型になるのを抑制する遺伝子であり、AA型ではDAFの発現が低く、有意に高いスギ特異的IgE、総IgEであった。スギ花粉飛散時期では、スギ花粉症患者末梢血においてDAF発現が有意に低下し、スギ花粉症患者鼻粘膜でのIntelectin-1は、有意な発現亢進を認めた。一方スギ特異的IgE陽性ながら未発症者では、鼻粘膜でのIntelectin-1発現は低値であった。
整数量子数を持つ立方晶希土類化合物の単結晶試料作製と多極子相互作用による異常物性

立方晶対称性がある一部のプラセオジム化合物では重い電子的異常が見られ、我々はその原因を四重極相互作用等を起源とした異常ではないかと推論した。本研究では、プラセオジムおよび整数量子数を持つ希土類の立方晶化合物を取り上げ、比熱、熱電能、磁化を中心とした実験を行った。具体的には、PrMg_3, PrPd_3, PrCu_4X, RSb, RFe_2Zn_<20>等の単結晶試料を作成し、磁気と四極子等との相関について考察した。立方晶の結晶対称性を持つプラセオジム化合物で見られる重い電子的異常は、実は、四重極相互作用等の多極子相互作用を起源とした異常ではないか、との推論を基に、プラセオジム化合物で発現する異常の起源を極低温での比熱と熱電能を中心とした実験により明らかにすることを本研究の目的としている。成果として、低温で巨大電子比熱係数C/Tをもつ立方晶PrMg_3の低温における熱電能係数S/Tを測定し、PrMg_3はS/Tがきわめて小さく、重い電子系でみられるC/T vs S/Tの関係が全く成立しないことを実験的に明らかにし、巨大C/Tの原因を4f電子の伝導電子との強相関によるものでなく4f電子の多極子によるものであると推測した。(研究発表の1)立方晶PrPd_3は2K近傍に磁気転移があることは既知であったが、今回0.5Kまでの低温での磁場中比熱を測定し、磁場中での異常な相図を明らかにし、この原因についても四極子または多極子が寄与している可能性があることを指摘した。(研究発表の2)立方晶PrCu_4Auについて基礎物性を測定し、磁気転移温度(2.5K)以上の温度で大きい比熱の裾をあること、TNまでのエントロピーが小さいこと、等のことから重い電子系物質と類似しているが、熱電能の測定から、重い電子系的な振る舞いは所謂伝導電子との強相関が原因でないことを提案した。(研究発表の3)AuをAgで置換した同じく立方晶PrCu_4Agの単結晶試料の作製に成功し、電気的・磁気的・熱的な基礎的物理量の結晶方位依存性を測定した。単結晶による詳細な実験研究をしたにも関わらず、未知の種々な異常性により現在のところ研究発表に至っていない。議論・解析を深めて早急に研究成果としてまとめたい。同型のNdCu4Agの単結晶試料作製にも成功し、結晶方位依存性を含んだ詳細な磁場中比熱などの実験研究により相図を確定した。(研究発表の4)立方晶の結晶対称性を持つプラセオジム化合物で見られる重い電子的異常は、実は、四重極相互作用等の多極子相互作用を起源とした異常ではないか、との推論を基に.プラセオジム化合物で発現する異常の起源を極低温での比熱と熱電能を中心とした実験により明らかにすることを本研究の第1の目的である。本年度は引き続き、PrCu_4AgとNdCu_4Agの単結晶育成の努力し、2つのRCu_4Ag(R=Pr,Nd)の単結晶育成を成功させた。NdCu_4Agに対しては詳細な磁場中比熱、磁化・帯磁率のデータから磁場-温度の相図を決定した。PrCu_4Agに関しては、新潟大学後藤教授の協力により、超音波による弾性定数の実験を行った。PrCu_4Agは有限の磁気転移温度を持ち、基底状態はΓ5の磁気秩序状態であることが明らかになった。また、無磁場での詳細な弾性定数の実験から低温で大きなソフトニングがあることが見出された。すなわち、PrCu_4Agは、ネール温度をもつ磁気双極子による反強磁性体であると同時に電気四極子による効果が共存する物質として注目される。また、NdCu_4AgのNd元素は半整数の4f電子数をもつクラマース元素であるが、単結晶の結晶方位に依存した磁場中比熱の詳細な実験を行い、PrCu_4Agの非クラマース元素の物質と比較検討した。更に、本年度は非クラマース元素の立方晶Ho化合物にも挑戦し、HoFe_2Zn_<20>とHoRu_2Zn_<20>をZn fluxにより単結晶試料作製に成功した。詳細な実験がスタートしている。参照試料としてDyFe_2Zn_<20>、YFe_2Zn_<20>の単結晶試料作製にも成功している。現在、我々は、国内での共同研究をも含めて、順調に実験を進めている。更に、次年度に向けて、Grenoble(フランス〉のInstitut Neelとの共同研究の計画を進めている。立方晶の結晶対称性を持つプラセオジム化合物で見られる重い電子的異常を探ることが本研究の第1の目的である。

その発展としてプラセオジムだけでなく整数量子数をもつホロニウム化合物を取り上げることが2年度以降の研究計画である。昨年度からホロニウム化合物の試料作製を開始し実験研究をスタートさせた。HoSbの詳細な磁場中比熱、磁化、熱膨張、磁歪の実験から、HoSbは非クラマース2重項を基底状態にもち、磁気秩序と4極子秩序が複雑に絡みあった詳細な相図をもつことを明らかにした。HoRu_2Zn_<20>の単結晶に関しては、Hoは立方対称性の位置にあり、磁性原子が希薄にもかかわらず強い磁気異方性があること、この強い異方性は結晶場ハミルトニアンで解析できることを明らかにした。RuをFeで置換した化合物H。Fe_2Zn_<20>に関しては、HoRu_2Zn_<20>と比較して磁性転移温度が大きく上昇した。Ho間の交換相互作用の増大の原因を探るため、YFe_2Zn_<20>の詳細な実験を行い、YFe_2Zn_<20>の中のFeの磁性が、所謂、nearly ferromagnetismであること、HoFe_2Zn_<20>の中でFeが磁気転移温度を増強させていることを明確にした。遍歴電子である3d電子が局在性の強い4f電子の交換相互作用を増強させていることを理論的にも明確にできたことは重要である。
子どもの自尊心の国際比較から解く、生きる力・いじめ・学校教育への示唆

本研究は、アフリカ・アジア(日本を含む)の中学生を対象にして、子どもの自尊心の形成過程、「いじめ」との関連性および学校教育への影響を検証することを目的としたものである。とくに、いじめの加害者側および被害者側の自尊心について男女差や国際比較で差がみられるかどうかを検証した。結果、調査国すべてで男子の方がいじめの加担者になる場合も被害者になる場合も多かった。また、多くの国でいじめに関わっている(加害・被害含めて)生徒の方が、いじめに関わっていない生徒より自尊心が低かった。本研究は、アフリカ・アジアの事例から子どもの自尊心の形成過程と「生きる力」や「いじめ」との関連性および学校教育への影響を検証する、比較教育・教育開発・心理学の分野横断的な研究である。研究初年度である平成25年度は、その位置づけを「萌芽期」とし、研究の土台作りから始めた。具体的には前半は、関連する領域(学校文化、自尊心、いじめなど)に関して先行研究を行った。その上で、2013年9月にはケニアのナイロビの公立小学校、複数校において、第8学年(日本の中学2年生)を対象に教育調査を行った。この時期を選んだ背景には、ケニアは1ー3月、5ー7月、9ー11月の3学期制で、9月の半ばというのは最も児童が落ち着いている時期であるということがあったが、予期せぬ出来事は起こり、訪問時、教員組合によるデモが行われており、学校は公的には閉鎖されていた。しかしながら、途上国の面白いところで、それぞれの学校には管理職教員(多くの場合、日本の校長先生にあたる、Head teacherと呼ばれる先生方)と、第8学年にあたる児童は登校していた。8年生が登校していたのは、ケニアの卒業試験(KCPE)のための勉強をするためであるが、いかに受験勉強が大切かどうかを暗に示す出来事であった。幸運にも、調査対象が第8学年であったため、調査は予定通り行うことができた。10月以降は、H市の公立中学5校において、同様の調査(こちらは悉皆調査)を行い、合計約2500名の生徒から有効回答を得ることができた。さらに、ケニアにおける調査結果を、2014年3月、トロントで行われた第58回米国比較教育学会にて口頭発表した。本研究は、アフリカ・アジア・中南米の事例から子どもの自尊心の形成過程と、「生きる力」「いじめ」との関連性および「学校教育への影響」を検証する、比較国際教育・教育開発・心理学の分野横断的な研究である。研究開始2年目にあたる平成26年度は、その位置づけを研究の「展開期」とし、研究を進めた。具体的には、2014年10月に、ブータン教育省基礎教育課の方々を招聘し、子どもの自尊心に関する日本とブータンの比較セミナーを本学で主催した。セミナーでは、「すべての子どもに教育を(EFA)」という万人のための教育の目標を念頭に置き、障がいのある子どもたちも含め、学校教育の意義や自尊心について広く討論した。さらに、子どもの自尊心にどういった問題がある時、学校でいじめが起きるかなど、自尊心といじめの因果関係を含めて広く議論した。2014年11月以降には、地方政令指定都市のH市にある、公立中学校(複数校)で、質問紙調査および聞き取り調査を行い、生徒2500名以上の有効回答を得ることができた。これらの調査結果を2015年3月、アメリカのワシントンDCで行われた米国比較教育学会(CIES)などで口頭発表を行った。会場からは、多くの質問が寄せられて、とくに、いじめる側(加害側)の自尊心に関して男女差が見られたことや、その理由、また、日本独特の文化で、質問紙の回答をどちらかというと低めにつけてくる可能性はないのかどうか(とくに女子)、などの質問を受けた。本研究は、アフリカ・アジア・中南米の事例を用いて、子どもの自尊心の形成過程と「生きる力」「いじめ」との関連性および「学校教育への影響」を検証する、比較国際教育・教育開発・心理学の分野横断的な研究である。研究3年目にあたる平成27年度は、その位置づけを研究の「総括期」と位置づけ、研究をまとめた。具体的には、前年度に続き、政令指定都市にある学校(複数校)にて、質問紙調査および聞き取り調査を行い、生徒2200名以上から有効回答を得ることができた。さらに、本研究結果を2015年7月に鳴門教育大学で行われた「国際教員養成協議会(ICET)第59回世界大会」で、英語で口頭発表を行い、海外から参加の研究者からも多くの質問やコメントを受けた。現在、英語の論文にまとめているところである。本研究は、途上国と日本の事例を用いて、学校教育現場への示唆や、教育の質の向上に資することをその目的としたが、子どもがいじめの加害者になる場合や被害者になる場合と、自尊心の形成との関係、そして、家庭での家族との関係や、コミュニティの影響、さらに、勉強の達成感や学校での満足感も変数に入れ、このような複数の要因がどのように子どもたちに影響を及ぼしているのかを国際比較検証した。結果として、最も多感な時期とされる子どもたち(中学生)の心の形成過程に示唆を得られる研究となった。また、本研究の研究結果(一部)は中国新聞に2015年9月15日30面に掲載された。

本研究は、アフリカ・アジア(日本を含む)の中学生を対象にして、子どもの自尊心の形成過程、「いじめ」との関連性および学校教育への影響を検証することを目的としたものである。とくに、いじめの加害者側および被害者側の自尊心について男女差や国際比較で差がみられるかどうかを検証した。結果、調査国すべてで男子の方がいじめの加担者になる場合も被害者になる場合も多かった。また、多くの国でいじめに関わっている(加害・被害含めて)生徒の方が、いじめに関わっていない生徒より自尊心が低かった。本研究は、おおむね予定通りに進んでおり、とくに日本での調査は学校への報告も含めて好評であったため、結果として3カ年続けることができた。また、研究結果の報告に関しても、国内外の学会にて口頭発表を予定通り行った。2015年9月15日の中国新聞に本科研の研究結果一部が掲載された。新聞掲載は前科研に引き続き2度目である。教育社会学平成27年度は、研究最終年度となるため、研究結果を国際学会での口頭発表と、国際的なジャーナルへの投稿を通して発信することを目標としている。平成25年度は、当研究初年度であったが、海外での現地調査(於、ケニア)、そして日本の政令指定都市での調査ともに順調に予定通り終えることができた。また、自尊心に注目した、日本の教育問題と途上国の教育問題に関する研究ということで、平成25年6月22日には、中国新聞に本研究が紹介された。そしてこの新聞を目にした校長先生より講演依頼を受け、小学校で講演を行った。研究結果に関しても、2013年3月には、米国比較教育学会にて口頭発表し、世界に向けて研究成果を発信することができた。また、日本で調査協力していただいた各学校においても、それぞれ調査を報告しに行くことができた。さらに、2013年10月に、メキシコにおいてもパイロット研究調査を行うことができた。以上の観点から、当研究は「当初の計画より若干進展している」、と言うことができると考える。前年度から1770円の繰越金がある。これは使い切らなかった端数である。本来の予定以上に進んでいる当研究であるが、日本の中学において当研究が評価が良かったため、平成26年度、平成27年度と続けて学校調査(悉皆調査)を行うことになった。従って、縦断的調査として、本年度も日本の政令指定都市において2500名程度を対象とした調査を行う。また、今年度はケニアでの調査結果を英語論文にして国際的なジャーナルを通して発信する。口頭発表は、秋に行われる日本教育社会学会にて、日本での平成25年度の学校調査(悉皆調査)結果を口頭発表する。さらに、日本の調査校からの希望もあり、知見共有として、以前から交流のあるブータン教育省基礎教育課の課長の招聘を考えている。子どもの自尊心に関する書籍の購入にあてるつもりである。次年度に繰り越す3716円は、使い切らなかった端数である。アンケート調査用紙2500枚の入力を依頼した会社に、割引をしてもらった残りの金額である。子どもの自尊心に関する書籍の購入に回す予定である。
栽培植物に窒素固定力を付与する試み

本研究では、第一にマメ科植物でトランスポゾンタギングを行うため、ミヤコグサ(L.jiaponicus Gifustrain)とMedicago trancaturaを用いて実験を行った。ミヤコグサではDs導入株1株を得たが、形質転換される率は大変低いものであった。M.truncatulaではさまざまな培地組成を検討したにもかかわらず形質転換株は得られなかった。一般にマメ科植物は形質転換が困難であると言われている。そこで、ミヤコグサを用いて無菌植物の芽生えに直接Agrobacteriumを感染させる方法およびパーティクルガンを用いた方法でAc,Dsの導入を試みている。予備的実験の結果、ミヤコグサでは、Agrobacteriumを感染させない状態でのカルスからのシュート形成率は19.4%であった。この値は、他のマメ科植物と比較して著しく高い値であり、ミヤコグサにおいてAc,Dsの導入効率の低さはAgrobacteriumの感染の低さに起因していることが明らかとなった。次に、ダイズのいわゆるスーパーノジュレーション変異(nts382)を用いて、ディファレンシャルディスプレイ法でnts遺伝子を選び出すことを試みた。結果、ディスプレイにおいて、発現に違いが見られた5クローンを配列解読後、ノーザン解析を試みたが、親株と変異株に発現の差は見られず、目的の遺伝子は得られなかった。第三に、根粒菌によって生合成される植物に根粒を誘導する引金分子であるNodファクターの有機合成を試み、従来の合成法を改良し、高い収量で合成する方法を確立した。第四に、根粒形成の初期に発現が調節されている遺伝子について、根粒形成場所が特定できる植物であるセスバニアを用いてディスプレイ法で遺伝子をスクリーニングした。結果、8個の候補遺伝子をクローニングし、塩基配列を解読した。これらの発現については分析中である。
幼児期後半から学童期における箸使用の発達に対応した食育プログラムの開発

本研究により、箸使用に着目し、子どもの健やかな発育を目指した栄養学の観点に加えて、日本の食文化を反映した箸を鍵に、幼児期は箸を使い始めの3歳(年小)、練習期5歳(年長)、熟達期8歳(小学2年)の発達変化を、保育所と、学童保育所での食事場面をVTRにより観察し、解明することができた。さらに、家庭用・教育者用のパンフレット教材を核とした食育プログラムとその評価システムを提案することができた。本研究課題は、申請者が幼児期後半から学童期にかけての箸使用行動の発達過程を明らかにし、それに対応した食育プログラムと評価方法を提案する。本年度は、平成17年度の質的な観察データを基に、質問紙調査で量的な把握をし、家庭での箸使用状況と、保護者の箸使用に関する家庭での支援方法を探ることを目的とした。そのために、2005年11月S市の保育所に在園する06歳児1429名の保護者を対象に、箸の使用状況、及び家庭での箸に関する食育に実践状況、さらに保育所での食育に関するニーズについて質問紙を設計し、データの解析を行った。1003名の回収が得られたが、有効回答は年齢未記入を除いた976名であった。その結果、以下の点が明らかになった。1)箸の使用開始は23歳5か月にまたがり、個人差が大きかった。また、箸の使用は1歳で13.7%、2歳で約50%、3歳で80%に達していた。2)箸使用に関する保護者の悩みは「教え方がわからない」が31.5%で最も多かった。3)箸の使用に関する会話は2歳頃の箸の持ち始めの時期、56歳ぐらいの箸の習熟期の2時期に多く見られた。4)箸選びや教え方に関する情報源がないと考えている保護者が41.2%みられた。5)箸使用に関する食育は、家庭で担うべきであるという認識が強い一方で、保育園から箸の選び方教え方について情報が欲しい、また、保育園での指導状況についてもっと知りたいというニーズが多くみられた。以上の結果から、保護者は箸の使用について家庭で指導することという認識を持っているものの、その情報源が少ないと認識しており、保育所を拠点とし、メディアや保健所・保健センターなど、地域全体での取り組みも期待されていることが明らかになった。昨年度は、平成17年度の質的な観察データを基に、2005年11月S市の保育所に在園する06歳児1429名(有効回答976名)の保護者を対象に、質問紙調査を実施した。箸の使用開始は23歳5か月にまたがり個人差が大きいこと、また、箸使用に関して、保護者の約3割が「教え方がわからない」という悩みをかかえていること、さらに、保護者の約4割が箸選びや教え方に関する情報源がないと考えていることが明らかになった。この結果を踏まえて、研究1として、今年度は幼児976名に自由回答による質問紙調査を実施し、保護者は箸使用に関して家庭で指導することという認識を持っているものの、その情報源が少ないと認識しており、保育所を拠点とし、メディァや保健所・保健センターなど、地域全体での取り組みも期待されていることが明らかになった。研究2として、箸を使い始める幼児の家庭での食事場面の事例研究を踏まえ、幼児期は箸を使い始めの3歳(年小)、練習期5歳(年長)各6名ずつは保育室にて、熟達期にある8歳(小学2年)6名は学童保育所にて計18名の横断的な発達変化を観察法により明らかにした。その結果、個人差はあるものの、3歳から5歳にかけては著しく箸の使用行動は発達するが、学童期の8歳では5歳児との箸の持ち方や使い方などにおいて著しく発達しているとはいえない実態が明らかになった。本研究の課題は、幼児期後半から学童期にかけての箸使用行動の発達過程を明らかにし、それに対応した食育プログラムと評価方法を提案することである。昨年度までに、06歳児1429名の保護者を対象にした質問紙調査により、箸使用に関して、保護者の約3割が「教え方がわからない」という悩みをかかえていること、また、保護者の約4割が箸選びや教え方に関する情報源が少ないことや、相談の場がないことが明らかとなった。さらに、幼児期は箸を使い始めの3歳(年小)、練習期5歳(年長)各6名ずつは保育室にて、熟達期にある8歳(小学2年)6名は学童保育所での観察に結果、個人差はあるものの、3歳から5歳にかけては著しく箸の使用行動は発達するが、学童期の8歳では5歳児との箸の持ち方や使い方などにおいて著しく発達しているとはいえない実態が明らかになった。

今年度は、昨年度までのVTRによる、箸を使い始めの3歳(年小)、練習期5歳(年長)、熟達期8歳(小学2年)の横断的な発達変化の観察を踏まえて、幼児期後半から学童期までの箸の使用行動の観察項目を、親や子ども自身が確認できる行動発達項目として抽出した。これに加えて、親の情報入手状況や保育所や学校などの地域での社会資源の活用度を含めたチェックリストを含んだパンフレット教材を試作することができた。来年度は、家庭用・教育者用に試作したパンフレット教材を核としたプログラムを開発し、その評価方法について検討を行い、幼児期後半から学童期にかけて箸使用に着目した食育プログラムを開発していくこととする。本研究の課題は、幼児期後半から学童期にかけての箸使用行動の発達過程を明らかにし、それに対応した食育プログラムと評価方法を提案することである。平成18年度には06歳児1429名の保護者を対象にした質問紙調査により実態把握を行い、平成19年度の箸を使い始めの3歳(年小)、練習期5歳(年長)、熟達期8歳(小学2年)での箸の使用行動の観察項目を盛り込んだ保育所や学校などの地域での社会資源の活用度を含めたチェックリストを含んだパンフレット教材を試作してきた。平成20年度は、家庭用・教育者用のパンフレット教材を核としたプログラム案を作成し、その評価方法について検討を行い、幼児期後半から学童期にかけて箸使用に着目した食育プログラムを開発することを目的とした。試作したパンフレット教材を用いて、箸を使い始めの3歳、練習期5歳、熟達期8歳の各3名ずつ、計9名の事例研究を通して、チェックリストの妥当性を検証することができた。さらに、実際に、パンフレットを4保育所(35歳)、2小学校(6・7歳)に配布し、ベースライン調査とともに、情報の提供を行った。授業の2コマにより、箸使いに関する授業を行い、さらに、その6か月後に再配布し、教材の有効性についてのプロセス評価と、幼児・児童の食行動の発達をとらえるための知識・態度・スキルの習得、また、地域資源の積極的活用についての効果を検証することができた。これにより、乳幼児から学童期にかけた発達の連続性を考慮し、箸使いに関する食育プログラムを開発し、その有効性に関して検証することができた。
呼吸介助法が局所肺の酸素化に与える影響の検証ーMRIを使用して

急性期における呼吸理学療法では、多くの理学療法士が呼吸介助を日々の臨床において用いている。この手技は、換気不全部位に対し実施することで、虚脱肺の再拡張、換気改善、酸素化に有効であることが確実で、MRIを用いた本研究の先行研究においても、手技を実施した局所肺の拡張と換気改善に対し有効であることを報告している。しかし、実際に手技を実施した局所肺の酸素化については未だに解明できていない。本研究では、高濃度酸素を吸入しながら撮像するO2-Enhanced MRIという撮像法を用い、呼吸介助を実施した局所肺の酸素化をMRI画像で視覚的に確認することを目的とした。本研究では、高濃度酸素吸入中に呼気量の計測を行うために、まず数種類のマスクおよびバルブ等を用い、高濃度酸素吸入および呼気の計測が同時に可能なマスクおよびフローセンサーの自主作成を行なった。マスクおよびフローセンサーは、実際にMRI室で計測を行うには、計測に用いる電子機器を磁場の影響を受けないMRIの室外に設置する必要があるため、室内においてフローセンサーチューブを1mと延長したもの2種類用意し、作成したマスクおよびフローセンサーで酸素吸入中の呼気量の計測を経皮的酸素濃度を測定しながら行い、延長したフローチューブセンサーの呼気量の計測精度を検証し、MRI室で使用可能なマスクおよびフローセンサーを完成させた。完成させたマスクおよびフローセンサーを用い、O2-Enhanced MRIの撮像を、先行研究をもとに行い、通常呼吸における局所肺の酸素化を検証した。撮像は、いくつかの撮像パラメータを研究分担者との打合せおよび試行を繰り返した結果、取得した撮像パラメータを用いることで、通常呼吸においては高濃度酸素吸入により肺の酸素化が示唆される画像を取得することが可能となった。呼吸介助法は,急性期呼吸理学療法において多くの理学療法士が臨床で頻回に使用する手技である.この手技は,局所換気不全部位に対し実施することで換気増大,酸素化の改善を図ることが確実な手技であり,我々はこれまでにこの手技が局所の換気を増大することをMRI画像で証明してきたが,酸素化については未だ不明である.本研究は,O2-enhanced MRIという手法を用い,呼吸介助法が呼吸介助を実施した局所肺の酸素化を改善するかを検証するものである.研究は,呼吸介助法を加えない通常呼吸時の画像を取得する撮像法を確立すること,次に取得した画像の解析手法を確立することの大きく2段階で実施する計画を立てた.撮像法については,研究分担者である放射線技師と打ち合わせを繰り返し行うとともに,先行研究を参照に実際にMRI撮像を行い撮像シーケンスの確立を目標に試行を繰り返している.撮像を繰り返し撮像シーケンスの確立には至っていないが,研究を遂行する上でいくつかの課題を明確にすることができた.なかでも,本撮像手法には高濃度酸素吸入マクスが必須だが,本研究で使用予定のMRI装置においては,既存のマスクでは良好な画像を取得することが困難である可能性が示唆された.そのため,より鮮明な画像を取得するためマスクの開発を進めている.それに加え,呼気ガス分析装置のデータを同時に取得できるようマスクにフローセンサーが装着できるよう開発中である.これらいくつかの課題について,繰り返し打ち合わせを行い現在対策を進行中である.平成28年度に実施予定であったMRI撮像手法の確立ができていないため.急性期における呼吸理学療法では、多くの理学療法士が呼吸介助を日々の臨床において用いている。MRI撮像手法を確立すべく試行を繰り返すとともに,先立って画像解析手法の確立を進める.当該年度にMRI撮像手法を確立し,呼吸介助法を加えない通常呼吸時の画像を取得すると同時に呼気ガス分析装置を使用し換気状態を評価する予定であった.その予定に伴い,呼気ガス分析装置からのアナログデータを解析するPowerLab及び解析ソフト,取得した画像の解析ソフトを購入予定であったが,MRI撮像手法の確立に至っていないため,平成29年度にそれらの予定が持ち越されたため次年度使用額が生じた.MRI撮像手法を平成29年度に確立する予定である.

そのため,平成29年度内に呼気ガス分析装置からのアナログデータを解析するPowerLab及び解析ソフトを購入予定である.また,MRI撮像手法の確立に先立ち試行中のMRI画像を用い画像解析手法の確立を予定しているため,画像解析ソフトも購入予定である.
熱電発電材料をめざす金属間化合物相のフォノン散乱による熱伝導率低減と性能向上

700°C付近の高温度域で使用できる熱電発電用の有望な候補材としてn型の優れた熱電特性を示すハーフホイスラー型の金属間化合物MNiSn(M=Hf, Zr)合金に着目した。光学式浮遊帯溶融(OFZ)法を用いてクラックを抑制した単相合金とすることで優れたSeebeck係数と電気抵抗率を十分に引き出すことができる。熱伝導率の低減によって熱電性能をさらに向上させるために、OFZ法とホットプレス(HP)法を融合して組織を複合化する新たな合金作製プロセスの確立を目指した。OFZ法で作製した単相合金を原料粉末に用いて種々の条件下でHP法により焼結することが特徴であり、有効なフォノン散乱源として働く異相界面を導入する。複数種類の合金や第2相粒子を粉末状態で混合でき、組織の複合化が可能である。例えばHfNiSnおよびZrNiSnの合金粉末を複合化する場合、相互拡散によって(Hf, Zr)NiSn固溶体相が形成することをEPMAによって確認した。HfとZrの原子質量差と原子半径差に基づく固溶体効果でフォノン散乱の増大が期待できる。また第2相粒子として絶縁体ZrO_2を均一微細に分散して熱伝導率の低減をはかった。異相界面による散乱のため電気的特性は劣化すると予測したが、OFZ材と同等の優れた電気的出力因子を維持できる。一方、HPプロセス中に酸化物等の不純物相が生成し、導入した異相界面と共にキャリア濃度と比熱に大きな影響を及ぼす。そのため熱伝導率の低減効果は明瞭に確認できないが、その構成因子である熱拡散率は効果的に低減できることを明らかにした。酸化物形成の抑制効果を検討するためにAr-4%H_2還元ガス雰囲気において荷重負荷なしの条件で圧粉焼結による試料を作製した。雰囲気制御が有効であると同時に、負荷加重調整による空隙率の制御によって大きく熱伝導率を低減できることを見いだした。熱電発電材料の性能は、電気的特性である熱起電力と電気伝導率の積として表される出力因子、熱的特性である熱伝導率によって評価される。本研究では熱伝導率を低減することによって性能向上を目指すため、熱電発電材料の候補としてハーフホイスラー型金属間化合物であるTiNiSn、ZrNISn、HfNiSnに着目した。これまでに我々はハーフホイスラー単相合金の作製を試みており、ZrNiSnおよびHfNiSnの単相化に成功している。TiNiSnの単相化の問題点を明確にすることを目的として、各合金系のハーフホイスラー相を中心に相平衡と状態図情報を詳細に調べて比較を行った。組織観察と示差熱分析の結果から、TiNiSnは3元包晶反応によって形成するため溶融凝固法による単相化が困難であることが分かった。この結果を踏まえ、光学式浮遊帯法の条件を検討しながらTiNiSnの単相化を引き続き行う。本研究ではフォノン散乱により熱伝導率の格子成分を効率よく低減することを考えている。(1)各原子サイトの同族元素による置換固溶、(2)粉末冶金法による界面の導入という2つの方策が挙げられる。まずHfとZrが互いに置換固溶する(Hf, Zr)NiSnの単相合金を用いて、HfとZrの組成比を変えて熱伝導率の低減効果を調べた。効果により熱伝導率は低減し、(Hf_<0.5>,Zr_<0,5>)NiSnの組成付近で最も効果的に低減することを明らかにした。

電気的特性はほとんど損なわれないため、熱電発電材料として極めて高い性能を示す。次に、(Hf_<0.5>,Zr_<0,5>)NiSn単相合金を粉砕してホットプレス法により焼結し、界面導入による熱伝導率の低減効果を調べた。しかし予想に反して、熱伝導率の低減は観察されなかった。今後、ホットプレス条件の検討、電気的特性との関連を調べることにより熱伝導率の低減効果に及ぼす諸因子について詳しく検討する。700°C付近の高温度域で使用できる熱電発電用の有望な候補材として、n型の優れた熱電特性を示すハーフホイスラー型の金属間化合物MNiSn(M=Hf,Zr,Ti)合金に着目する。一般にハーフホイスラー化合物は電気的な熱電特性に優れていることから、比較的高い熱伝導度を低下させることが材料開発の鍵である。熱伝導度Kはキャリアである電子の寄与成分K_<el>とフォノン散乱に係る格子の寄与成分K_<ph>の和として決まる。つまり優れた電気的特性を維持しながら熱伝導度を低減することは難しく、効果的にK_<ph>を低下することが重要である。本研究ではフォノンの効果的な散乱源を積極的に導入してKphを低下させる方法を考え、粉末冶金法を用いて界面を多量に導入する方法を主体とする製造プロセスによるK_<ph>の低下を目指す。(Hf,Zr)NiSn合金をホットプレスによって作製した昨年度の結果を踏まえ、本年度はホットプレス条件の最適化を行った。焼結温度1000°C、付加荷重50MPa、3時間というホットプレス条件に加え、昇温時に荷重を段階的に徐々に付加すること、焼結時間経過後に速やかに抜重してから徐冷することによって微小き裂の発生を効果的に抑えることができ、理論密度98%以上を有する健全な試料が作製できる。従来法で作製した試料は潜在するき裂のために熱伝導度が過大評価される傾向にあり、測定値の比較だけでは大きな差異は確認できない。予想を覆して電気伝導度が劣化しないため、より積極的に熱伝導度を低減する策としてZrO_2粉末を混入した試料の作製を試みた。その結果、平均粒度を45μm程度に調整し、ZrO_2粉末の体積率を1から3%とすることで試料の作製ができることを明らかにした。今後、熱電特性の評価を行って性能向上を目指す。700°C付近の高温度域で使用できる熱電発電用の有望な候補材としてn型の優れた熱電特性を示すハーフホイスラー型の金属間化合物MNiSn(M=Hf,Zr)合金に着目した。光学式浮遊帯溶融(OFZ)法を用いてクラックを抑制した単相合金とすることで優れたSeebeck係数と電気抵抗率を十分に引き出すことができる。熱伝導率の低減によって熱電性能をさらに向上させるために、OFZ法とホットプレス(HP)法を融合して組織を複合化する新たな合金作製プロセスの確立を目指した。OFZ法で作製した単相合金を原料粉末に用いて種々の条件下でHP法により焼結することが特徴であり、有効なフォノン散乱源として働く異相界面を導入する。複数種類の合金や第2相粒子を粉末状態で混合でき、組織の複合化が可能である。例えばHfNiSnおよびZrNiSnの合金粉末を複合化する場合、相互拡散によって(Hf,Zr)NiSn固溶体相が形成することをEPMAによって確認した。HfとZrの原子質量差と原子半径差に基づく固溶体効果でフォノン散乱の増大が期待できる。また第2相粒子として絶縁体ZrO_2を均一微細に分散して熱伝導率の低減をはかった。
齲蝕におけるヒトDNAの分子疫学的研究

平成9年度は,カリエスフリーの者66名とDMFTが10以上の者40名のボランティア(平均年齢20歳)から頬粘膜を採取し,DNAを抽出精製した後,HLA遺伝子のうちHLA-DQA1のタイピングを行った。1.頬粘膜の採取とDNA精製前年度で毛髪からフェノール・クロロホルムを用いないでDNAを抽出する方法を確立したが,抽出したDNAを用いてPCR反応を行うと,増幅阻害を受けた試料が多数発現した。毛髪中のメラニンによりPCR反応が阻害されるという報告が最近発表され始めたため,今年から急遽,試料を頬粘膜の剥離細胞にかえた。剥離細胞を採取する際,口腔内の細菌や食物残渣が混入する恐れがあるため,プロテイナーゼとセントリコンを用いてそれらの混入物をろ過し,ヒトのDNAのみを抽出精製する方法を採用した。この方法で,全ての試料からPCR反応に必要なDNA量が得られた。2.HLA-DQA1のタイピングとう蝕との関係得られたDNAのHLA-DQA1領域をPCR法で増幅し,HLA-DQA1の各対立遺伝子に特異的な塩基配列と相補的なシークエンスが固定されているプローベストリップスと反応させた。反応後発色させ,発色パターンからHLA-DQA1を6タイプに分類した。カリエスフリー群とカリエス多発群,それぞれのHLA-DQA1各タイプの出現頻度についてX^2検定を行ったところ,両群間には統計学的有意差が認められなかった。平成7年度は,毛髪からDNAを抽出し,それをHLA(ヒト白血球型抗原)のDQα遺伝子を用いたDNAフィンガープリント法により群別する方法を確立した.1.毛髪からのDNA抽出被験者から毛根を含む3本の毛髪(長さ1015cm)を採取し,はさみで裁断した.試料から,DNA抽出キットを用い,DNAを抽出し,DNAを回収した.本研究に適したDNA抽出キットは,有機溶剤を用いない陽イオン界面活性剤を用いた方法であった,界面活性剤は細胞を破壊し,同時に核酸と電気的に中性なコンプレックスを形成し,高速冷却遠心機と振盪機のみで,容易にDNAを抽出できた.また陽イオン界面活性剤は菌体とウイルス粒子を破壊する作用があるので,病原菌等,感染の恐れのあるサンプルでも容易に取扱ができた.2.HLAのDQαDNAのPCR増幅とタイピング抽出したDNAを耐熱性のTaqDNAポリメラーゼを用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)法によって増幅した.増幅反応は,PRC用セットを用いて,遺伝子増幅装置内で32サイクル行った.その後,HLA DQαDNA Probeを用いて21のHLA.DQαgenotypeの何れかに群別した.毛髪からDNAを抽出する方法は,DNAを抽出する際,多量のメラミン色素が混在すると,PCR法によるDNAの増幅が阻害されるとの報告があり,法医学での血液鑑定や親子鑑定等診断を要する場合には注意が必要であるとの指摘がある.しかし,本研究の目的である疫学調査では,個々の症例を診断するのではなく,多数の被検者を集団的に評価するため,毛髪からのDNAを採用してもよいと考えた.また,実験に用いたDNA診断は,齲蝕と関係ある遺伝子配列が未定であるため,本研究では法医学で血液鑑定や親子鑑定に用いられているHLA DQαgenotypeによるフィンガープリント法を採用した.平成8年度は,50人のボランティアからの毛髪の採取と,口腔内診査およびう蝕活動性試験を行った。1.毛髪の採取とDNA精製被検者から毛根を含む3本の毛髪を採取した。試料からのDNA抽出は,前年度で採用した陽イオン界面活性剤でなく,InstaGene Purification Matrix Buffer (Bio-Rad)を用いた。陽イオン界面活性剤は,DNAの回収率が低く,必要量のDNAを得るには,多数の毛髪を採取しなければならないことが判明したため,前年度で確立したDNA抽出法を使わず,新しく開発されたInstaGene Purification Matrix Bufferに変更した。フェノール,クロロホルムを用いないInstaGenePurification Matrix Bufferは,ボイルだけでPCR増幅過程において阻害となる細胞lysateを吸着するため,簡単にDNAを精製できるキットである。2.口腔内診査とう蝕活動性試験口腔内診査は,ミラーと深針を用いて行った。う蝕の検出基準は,平成7年に改正された日本学校歯科医会の基準に従った。すなわち,未処置歯(C),要観察歯(CO),処置歯,喪失歯,健全歯のいずれかに診断した。集計では,要観察歯は健全歯に分類した。う蝕活動性試験は,すべての被検者にカリオスタット,ミューカウント,RDテスト,グルコースクリアランスの各試験を行った。

剥離細胞を採取する際,口腔内の細菌や食物残渣が混入する恐れがあるため,プロテイナーゼとセントリコンを用いてそれらの混入物をろ過し,ヒトのDNAのみを抽出精製する方法を採用した。この方法で,全ての試料からPCR反応に必要なDNA量が得られた。2.HLA-DQA1のタイピングとう蝕との関係得られたDNAのHLA-DQA1領域をPCR法で増幅し,HLA-DQA1の各対立遺伝子に特異的な塩基配列と相補的なシークエンスが固定されているプローベストリップスと反応させた。反応後発色させ,発色パターンからHLA-DQA1を6タイプに分類した。カリエスフリー群とカリエス多発群,それぞれのHLA-DQA1各タイプの出現頻度についてX^2検定を行ったところ,両群間には統計学的有意差が認められなかった。