hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多次元医用画像と深部情報可視化映像によるリアルタイム手術支援システムの開発

呼吸器外科手術領域では、CT検診の普及により小型早期肺癌が多く発見され、高齢化に伴い高齢者肺癌の増加が著しく、安全で確実な低侵襲手術の開発が望まれている。当該研究では、近年急速に進歩している多次元医療画像の開発・発展させ術前シミュレーション・術中ナビゲーションの新しい手術支援システムを開発し、より普遍的かつ実用的な技術の構築を行った。今後、さらなる実用化に向けて研究を継続する予定である。平成25年度は初年度より引き続き1区域切除における術前シミュレーション画像で得られた3次元画像(Virtual segmentectomy)と、それに基づいた肺区域切除検体との比較検討を行いその整合性(切除断端までの距離、切離肺動脈、肺静脈、気管支)を確認しソフトの有効性を検証した。さらに新たに2局所進行肺癌により広範囲に浸潤を認めるもの、もしくは術前導入治療により解剖が正常とは異なる手術難易度の高い症例に対する術前3次元画像をもとにした術前シミュレーションならびに術中ナビゲーションシステムの開発を行った。2012年度にはまずは4例のパイロットスタディを行い1区域切除における術前シミュレーション画像で得られた3次元画像(Virtual Segmentectomy)と、それに基づいた肺区域切除検体との比較検討を行いその整合性(切除断端までの距離、切離肺動脈、肺静脈、気管支)を確認しソフトの有効性を検証した。さらに2胸腔鏡下手術において、術前3次元画像をもとに有効なポートの位置、肺血管気管支走行の同定、ならびに血管、気管支切離ステープルの角度を測定し、適切な術前シミュレーションのアルゴリズムを構築した。また3術中ナビゲーションとして動的3次元画像として胸腔鏡モニターと平衡におくダブルモニターとしておくことにより区域切除がより安全に正確に行えることを確認した。呼吸器外科領域における低侵襲手術である1縮小切除(区域切除、楔状切除)、2胸腔鏡下手術に対する、安全性と確実性を目指した多次元医用画像を活用した手術シミュレーションシステムの構築を行った。さらに3局所進行肺癌に対する拡大手術に加えて、本年度には4手術支援ロボットへの応用に関して研究報告を行った。呼吸器外科領域における低侵襲手術として1縮小切除(特に区域切除)、2完全鏡視下手術に対する安全性と確実性を高めることを目的とした多次元医用画像を活用した手術シミュレーションシステムの構築を行った。さらに前年度から3局所進行肺癌に対する拡大手術、もしくは根治治療後進行肺癌に対するサルベージ手術など難易度の高い手術に関して、4また手術支援ロボットへの応用に対して以下の研究報告を行い、本研究の最終年度として以下にまとめる。当初の目的である1縮小切除(区域切除、楔状切除)、2胸腔鏡下手術に対する、安全性と確実性を目指した多次元医用画像を活用した手術シミュレーションシステムの構築はほぼ達成したと考える。それに加え新し分野として3局所進行肺癌に対する拡大手術、4手術支援ロボット(daVinci S)への応用に対してある一定の成果が得られた。但し、深部情報可視化映像によるリアルタイム手術支援システムの開発はその技術的問題に置いて開発が進んでいない。呼吸器外科呼吸器外科領域の手術では肺臓を虚脱して行う事により、術前3Dとの位置関係の把握が困難である。1虚脱を加味した3Dの位置の把握をブタ肺虚脱モデルによりそのアルゴリズムの解明を行っている。2肺を虚脱せずに手術を行う技術の開発を行っている。本年度の研究目標は概ねクリアーしており研究状況は順調である。症例の集積を重ねて、そのupdateの結果として国際学会のシンポジウムでの発表と英語論文を1本掲載している。但し、術中ナビゲーションとして動的3次元画像および深部情報可視化映像の開発に関しては若干遅れている。初年度の研究目標はクリアーしえおり研究状況は順調である。そのoutcomeの状況として今年度は2回の学会報告ならびに3本の英語論文の掲載をしている。多次元医用画像と深部情報可視化映像によるリアルタイム手術支援システムの臨床での検証において、症例集積に遅れを認めた。最終年度である平成26年度には更なる症例登録を増やし区域切除における術前シミュレーション(Virtual segmentectomy)の有効性を評価する試験の完遂を目指す。さらに術中ナビゲーションとして動的3次元画像および深部情報可視化映像の開発の強化に努める。平成24年度には4例のパイロットスタディーを行いその認容制は証明できた。本年度には区域切除、胸腔鏡下手術施行症例に対し術前シミュレーション、術中リアルタイム手術支援システムの有効性を前向きに検証をする。次年度以降における国内学会ならびに国際学会での発表ならびに、英語論文の校閲に使用する予定である。本研究におけるメイン課題は1術前シミュレーション(Virtual segmentectomy、simulation VATS)の有効性と2術中ナビゲーションとして動的3次元画像および深部情報可視化映像の開発である。1に関しては当初の計画通りに進行しているが、2に関しては深部可視化映像機器の選定と開発に時間を要している。本年度には術中ナビゲーションとして動的3次元画像および深部情報可視化映像の開発を目的としたダブルモニター、3Dモニター、3Dカメラの選定を進め物品費として計上する予定である。

本年度には物品としては手術室でダブルモニターとして使用する高画質モニターを購入する予定である。その他、通信費や実験費用などの消耗品と国内外への発表・報告に伴う旅費と論文掲載費が主なものである。
航空燃料由来の有害微量元素汚染の初解明、特に鉛汚染に着目した全国規模での空港調査

国内34空港のビル屋上堆積物とバス乗り場の道路脇粉塵を採取し、有害元素濃度を測定した。その結果、空港ビル屋上堆積物における有害元素濃度と空港発着便数は有意な正の相関を示した。空港以外の屋上堆積物に対しても有意に高く、空港バス乗り場の道路脇粉塵に対しては大型空港ほど差が拡大した。空港ビル屋上堆積物と道路脇粉塵では前者で高濃度で、鉛同位体比の値も異なった。元素レベルや濃度組成は自動車道路脇および鉄道軌道脇の堆積物と異なり、交通モードによる有害元素汚染の形態が異なることが明らかとなった。航空機の運航は環境への有害金属放出源として寄与していることが強く示唆された。2014年度は、成田、羽田、関西、新千歳、丘珠、青森、大館能代、秋田、花巻、仙台、庄内、山形、福島、新潟、松本、小松、神戸、中部国際、伊丹、松山、北九州、熊本、長崎、鹿児島、宮崎の各空港で試料を採取した。そして、成田空港、羽田空港、関西空港、仙台、庄内、山形、松本の試料について重点的かつ先行的に解析を進めてきた。成田、羽田、関西の主要3空港で採取した屋上堆積物は、Alにより規格化したエンリッチメントファクターが、すべての試料で、Zn、Cd、In、Sb、Biは40を超過する「きわめて強い汚染」に達した。3空港すべての試料でInは「強い汚染」、Cu、As、Mo、Sn、Pbは「汚染」から、「きわめて強い汚染」のレベルであった。庄内、山形、松本空港では、Cdは全試料で「きわめて強い汚染」、Cu、Zn、As、In、Sb、Bi、Pbは「汚染」から「強い汚染」と判断された。空港の屋上堆積物は、我々が過去に調査した東京都内の非空港7地点の屋上堆積物と比べ、元素濃度は明らかに高かった。屋上堆積物が1試料に限られた松本空港を除き、Li、Ni、Zn、Rb、Mo、In、Cs、Ba、Tlは5空港で共通、Mn、Ni、As、Zn、Cd、Pbは一部以外で、非空港地点よりも有意に高濃度だった(Mann-WhitneyのU検定、p<0.05)。各空港で採取した道路脇粉塵と比べると、とくに羽田空港と成田空港は、屋上堆積物で高濃度の傾向が強かった。さらに、これら元素の屋上堆積物中濃度は、各空港の1日当たり発着便数によって有意に直線回帰された(p<0.05)。以上から、航空機運航と空港屋上堆積物における有害金属汚染との関連が示唆された。そして、汚染のレベルは空港の規模に依存するが、汚染の組成は共通しており、航空機の運航が自動車走行以上に多種の有害金属を多量に放出している可能性を示す結果を得た。・有害元素汚染レベル:成田、羽田、関西の3空港の屋上堆積物は、Zn、Cd、In、Sb、Biのエンリッチメントファクター(EF)が40を超過する「きわめて強い汚染」が認められた。Cdの場合、羽田空港で最高濃度19.5mg/kg(EF=15.3)を示し、他2空港も同レベルがみられた。また、3空港すべての試料でIn、Cu、As、Mo、Sn、Pbは「強い汚染」または「汚染」から「きわめて強い汚染」のレベルに達した。庄内、山形、松本空港では、Cdは「きわめて強い汚染」、Cu、Zn、As、In、Sb、Bi、Pbは「汚染」から「強い汚染」のレベルであった(5<EF<40)。よって、空港周辺の有害金属汚染は空港の規模に依存するが、汚染を起こす元素は規模に関わらず共通することが示された。・空港とそれ以外で採取した屋上堆積物の比較:空港の屋上堆積物は、我々が過去に調査した東京都内の非空港7地点の屋上堆積物と比べ、元素濃度は明らかに高かった。Li、Ni、Zn、Rb、Mo、In、Cs、Ba、Tlは共通して、Mn、Ni、As、Zn、Cd、Pbは一部を除き、非空港試料より有意に高濃度だった。したがって、小規模空港周辺でも有害金属汚染が存在することが示唆された。・自動車、鉄道との比較:とくに羽田空港と成田空港は、元素濃度は道路脇粉塵よりも屋上堆積物で高い傾向が強かった。羽田空港では、Be、V、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Se、Mo、Cd、Bi濃度が屋上堆積物で道路脇粉塵よりも有意に高かった。鉄道周辺で採取した土壌試料ではNiやCrが高く、汚染パターンが異なった。したがって、航空機、自動車、鉄道では周辺における有害金属汚染の形態はそれぞれ異なることが示された。・発着便数との関係:屋上堆積物のCr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Mo、Cd、In、Sn、Sb、Tl、Pb、Bi、Hg濃度は各空港の1日当たり発着便数によって有意に直線回帰された。したがって、航空機運航と空港屋上堆積物における高濃度の有害金属汚染との関連が推測された。2015年度における本研究への取り組みは、これまでに採取してきた試料の有害元素分析と、それにもとづくデータの解析を主としてきた。また、これら成果の公表として、国内外の学会(環境化学討論会、Society of Environmental Toxicology and Chemistry)で発表した。2015年度における研究進捗として、航空機運航による汚染を、さまざまな交通手法の中で位置づけるという観点を取り込んだことが特筆できる。

すなわち、これまで重視してきた空港ターミナルビルの屋上堆積物に加え、ビル前のバス、タクシーなどの乗降場で道路脇粉塵を集めること、鉄道との比較を行うため東京近郊の電化区間と非電化区間、北海道の非電化区間で線路近くから土壌や堆積物を採取し、それらの分析結果との比較も進めている。試料分析の結果、主要大型空港と位置付けた成田、羽田、関西の3空港で、屋上堆積物のZn、Cd、In、Sb、Biはエンリッチメントファクターが40を超過し、「きわめて強い汚染」であると判定された。一方、これら有害金属元素は、地方の小型空港で採取した屋上堆積物では、前記3空港と比べ大幅に低かった。道路脇粉塵は、主要大型空港と地方空港での元素濃度差は屋上堆積物より不明瞭だった。屋上堆積物と道路脇粉塵では、とくにZn、Cd、In、Biは屋上堆積物で高く、空港ごとに両者の有害金属レベルを比べると、濃度差は大型空港ほど大きかった。これらのことから、道路脇粉塵では明瞭でない汚染が屋上堆積物に現れており、空港周辺における汚染の存在が示唆された。空港ターミナルビル前の道路脇粉塵は、空港来場者数に伴う自動車交通量を反映し、ターミナルビル屋上堆積物は空港周辺大気との関与が強いと考えられる。したがって、空港における有害金属汚染は航空機の離発着が汚染源である可能性が支持され、当初の目的達成に近づいている。このような研究の進捗から、本課題の進捗状況はおおむね順調であると判断される。・有害元素汚染レベル:成田、羽田、関西の主要3空港は、屋上堆積物のZn、Cd、In、Sb、Biのエンリッチメントファクター(EF)が40を超過する「きわめて強い汚染」が認められた。また、3空港すべての試料でIn、Cu、As、Mo、Sn、Pbは「強い汚染」または「汚染」から、「きわめて強い汚染」のレベルに達した。地方空港では、Cdは「きわめて強い汚染」、Cu、Zn、As、In、Sb、Bi、Pbは「汚染」から「強い汚染」であったが、屋上堆積物の重金属レベルは主要空港よりも低かった。屋上堆積物における重金属濃度は各空港の発着便数と有意な正の相関をもち、航空機運行の汚染への関与が示唆された。・鉛同位体比分析による汚染の解析:高レベルの汚染が確認された主要空港の試料では、屋上堆積物とターミナルビル前のバス停における道路脇粉塵で鉛同位体比に差異がみられた。したがって、汚染起源の違いによって鉛同位体比が異なると考えられ、有鉛航空燃料の関与など、引き続き、要因の解析を進める必要がある。・異なる起源との比較:空港の屋上堆積物は、非空港7地点の屋上堆積物と比べ、元素濃度は明らかに高かった。Li、Ni、Zn、Rb、Mo、In、Cs、Ba、Tlは共通して、Mn、Ni、As、Zn、Cd、Pbは一部を除き、非空港試料より有意に高濃度だった。したがって、航空機運行の影響の大小よって汚染レベルが異なること、汚染起源の違いの影響が示唆された。空港の屋上堆積物、空港のバス乗り場の道路脇粉塵、鉄道敷地脇の土壌試料で元素レベルを比べると、とくに大型空港で元素濃度は道路脇粉塵よりも屋上堆積物で高いこと、鉄道周辺と元素組成が異なることが明らかとされた。以上から、これまで環境化学分野で注目されなかった航空機起源の汚染が明確に存在し、自動車、鉄道など交通モードによって有害金属汚染の形態が異なることが示された。国内34空港のビル屋上堆積物とバス乗り場の道路脇粉塵を採取し、有害元素濃度を測定した。その結果、空港ビル屋上堆積物における有害元素濃度と空港発着便数は有意な正の相関を示した。空港以外の屋上堆積物に対しても有意に高く、空港バス乗り場の道路脇粉塵に対しては大型空港ほど差が拡大した。
環境放射性物質を用いた湿地生態系機能評価に関する研究

本研究では,環境放射性物質の影響が緊急に問題になっている高汚染地域の湿地(福島県北部太平洋側の河道内湿地)、低汚染地域の湿地(霞ヶ浦、涸沼湿地)及び非汚染地域(尾瀬ヶ原、釧路湿原)を比較対象とし、自然の豊かな湿地生態系において、1)放射性物質(Cs137,Cs134)の放射性物質蓄積量および湿地植物への移行率評価と2)生態系機能評価を調査・解析・コンパートモデル化を行い、湿地生態系への環境放射能の影響評価手法を得ることを目的とした。(目的)日本の代表的な湿地生態系(高汚染、低汚染、非汚染湿地)での放射性物質の汚染実態と環境動態を把握する。特に高汚染地である福島県北部太平洋地域の河川湿地における詳細な汚染地域マップの作成と被ばく量の定量化を行うとともに、湿地植物への移行率、自然による浄化機能、除染処理効果に関する生態系機能を定量把握し、被ばく量低減効果を提示する。(成果)【(1)湿地生態系での放射性物質等の実態把握】(1)物理化学的環境の把握・各地域の5地点に連続測定用の水位データロガーを周年設置した。・過去に収集された融雪、積雪、凍結深などの全ての気象データを収集解析して、冬期春期のモデル化し環境変動を把握した。・池とう生態系における水温分布、地下水流入等の水収支解明、モデル化に必要なデータを収集した。(2)水循環・物質循環機能の把握1)水循環機能の把握・永久方形区に表層から塩ビパイプを埋設し、定期的に水位を測定し、表層地下水の流動性を場所・深度別に比較した。・電磁流速計を設置し、水の交換を測定した。・河川水、土壌間隙水、雨水等の採取を行い、水質測定を行った。2)土壌環境の変動性の把握・永久方形区において植物の植生調査・現存量・密度・群落高の測定を行った。採取した植物の窒素・炭素安定同位体比の分析サンプルを収集した。3)放射性物質、物質循環機能の把握・表層コア約100mlを定量採取し、現地で環境放射性物質をSX-SPAにて簡易分析し、Ge検出器で詳細分析を実施した。有機物含有量測定を行った。・画像解析の教師として永久方形区の植生調査を実施する。・湖沼でADCPを装備した自動制御の環境観測プロファイラーをチャーターして、水深・流行流速分布・水温等の物理的なモニタリングを行った。赤城大沼での流速分布、湖盆図を作成した。航空写真の自動判読による植生分類、流路網解析を実施し、ホットスポットからの流入経路を推定した。湖沼堆積物による過去の履歴評価高汚染地域の湿地(福島県北部太平洋側の河道内湿地)、低汚染地域の湿地(霞ヶ浦)及び非汚染地域(尾瀬ヶ原、釧路湿原)の代表的湖沼から湖底堆積物を簡易湖沼コアサンプラーで採取し、深さ1cm毎に切り分けて、乾燥、灰化後、Ge分析計で環境放射性物質を定量した。過去の環境汚染(1960年代核実験、チェリノブイリ事故)による汚染履歴を解析して、その湖沼流域への環境放射性物質の負荷量と堆積量の関係を求め、福島第一原発事故の減少曲線を推定した。空間線量汚染マップを作成福島県浜通地方は、2011年3月の東日本大震災によって、地震と大津波の被害に見舞われ、さらに放射性物質も蓄積している。これらの湿地生態系への被害、今後の自然再生はどう進めたらよいかを検討した。植物の生息適地の分布域は大津波でどうなったか。2011年3月11日には地上部は枯れていたため、植生への被害は少なく、植物遺体の蓄積や堤の破壊が確認された。マルチコプターによる新田川河口域湿地の空間線量汚染マップを作成した。オギなどの少し高い場所で空間線量が高く、上流の放射性セシウムが洪水の度に流下して蓄積していくと考えられた。リモセン技術を使うことで、高濃度汚染地域に立ち入らなくとも、除染効果を継続的に監視し、評価し、必要な対策をとることは可能となった。環境放射性物質の影響が緊急に問題になっている高汚染地域の湿地(福島県北部太平洋側の河道内湿地)、低汚染地域の湿地(霞ヶ浦、涸沼湿地)及び非汚染地域(尾瀬ヶ原、釧路湿原)を比較対象とし,自然の豊かな湿地生態系において,1)放射性物質(Cs137,Cs134)の物質収支および湿地植物への移行率評価と2)生態系機能評価を調査・解析・モデル化を行い,湿地生態系への環境放射能の影響評価手法を得ることを目的とした。(4)詳細な汚染地域マップの作成と汚染量低減課程のモデル化詳細な汚染地域マップの作成と汚染量低減課程のモデル化を高汚染地域の湿地(福島県北部太平洋側の河道内湿地)で行った。1)福島4河川オルソモザイク化

震災前2006年オルソ地表解像度28cm、震災後オルソ地表解像度宇多川:16cm、他3河川:オルソ地表解像度:24cm。2)福島4河川の河道内湿地の航空写真からの植生自動判別、ヨシ、ススキ、オギ、ガマ、開水面、裸地、他に類型区分、植生毎にGIS化、面積等を求めた。3)福島4河川の河道内湿地の微地形の測定を行った。4)詳細な底質汚染地域マップの作成、空間線量計(Thermo社製)を用いて、植生図を元に底質の環境放射能を測定し、GIS化した。また、空間放射線量の現地調査を行いそれぞれの関係を明らかにした。5)詳細な湿地植物の汚染地域マップの作成、底質の環境放射能、移行係数、植生図、密度、草高等のデータを元に、相関関係を求めて湿地植物群落毎に汚染地域マップを作成した。6)土砂流失、堆積の現地観測データから底質及び湿地植物の放射性物質分布の地図化を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。湿地生態学26年度が最終年度であるため、記入しない。・計画通りハンノキ等の樹木の円盤、赤城大沼では湖沼堆積物を採取して、年輪解析、底質分析等より環境変動を検出する準備を行った。湿地植物への移行係数の解明高汚染地域の湿地、低汚染地域の湿地及び非汚染地域から底質及び湿地植物を採取して、環境放射性物質のGe分析を予定通りに行った。湖沼堆積物による過去の履歴評価高汚染地域の湿地、低汚染地域の湿地及び非汚染地域の代表的湖沼から湖底堆積物を簡易湖沼コアサンプラーで採取し、Ge分析で環境放射性物質を予定通りに定量できた。【(1)湿地植物への移行係数の解明】高汚染地域の湿地、低汚染地域の湿地(霞ヶ浦、涸沼湿地)及び非汚染地域(尾瀬ヶ原、釧路湿原)から底質および湿地植物を採取して、環境放射性物質の分析を行う。・底質:表層コア約100mlを定量採取し、現地で環境放射性物質をSX-SPAにて分析する。一部粒度組成、有機物含有量測定のため持ち帰る。・湿地植物:バイオマス推定のための定量採取、草高、密度を測定。環境放射性物質のため5-10本を地上部のみ刈り取り、乾燥、灰化(450°C)、U-8容器に入れてγスペクトロメトリー法で環境(粒度、有機物含有量)との関連を解析する。詳細な汚染地域マップの作成と汚染量低減課程のモデル化を高汚染地域の湿地で行う。福島河川オルソモザイク化、福島河川の河道内湿地の航空写真からの植生自動判別、福島河川の河道内湿地の微地形と微細流路網の作成、詳細な底質汚染地域マップの作成、詳細な湿地植物の汚染地域マップの作成、土砂流失、堆積の現地観測データから底質及び湿地植物の放射性物質分布の時系列予測を行い、地図化する。【(2)湖沼堆積物による過去の履歴評価】高汚染地域の湿地(福島県北部太平洋側の河道内湿地)、底汚染地域の湿地(霞ヶ浦、涸沼湿地)及び非汚染地域(尾瀬ヶ原、釧路湿原)の代表的湖沼から湖低堆積物を簡易湖沼コアサンプラーで採取し、深さ1cm毎に切り分けて、乾燥、灰化(450°C)、U-8容器に入れてγスペクトロメトリーで環境放射性物質を定量する。・解析:過去の環境汚染(1960年代核実験、チェルノブイリ事故)による汚染履歴を解析して、その湖沼流域への環境放射性物質の負荷量と堆積量の関係を求め、福島第一原発事故の減少曲線を推定する。年度末における額が未確定の項目があったため、予算に余裕を持たせて執行した。そのため、次年度に繰り越したためである。
TWEAKレセプターFn14の遺伝子プロモーター解析

TNFファミリーのサイトカインであるTWEAKの受容体Fn14の遺伝子レベルでの発現調節に関する研究を行った。Fn14の設計図である遺伝子配列の発現を調節する因子、つまり転写因子は多岐にわたっていることが示唆され、それらの転写因子もしくは発現調節に重要な遺伝子配列を制御することによりTWEAKサイトカインによる生体反応の調節が可能になるものと考えられた。TNFスーパーファミリーの一つであるTWEAK(TNF-like weak inducer of apoptosis)は細胞増殖,血管新生,炎症反応,腫瘍増殖等多彩な生理活性をもつサイトカインで,そのレセプターであるFn14(Fibroblast growth factor-inducible 14)を介して活性がもたらされる。本研究は転写レベルでのFn14の発現制御メカニズムを解明することが目的であり,本研究によりFn14発現機構が解明され,関与する転写因子が明らかになれば,それをターゲットとしたTWEAK/Fn14シグナルの間接的な制御による炎症の治療,さらには新たな抗腫瘍療法の確立に発展する可能性を秘めている。平成19年度においては,Fn14遺伝子をコードしている配列の上流である遺伝子プロモーターをクローニングし,ルシフェラーゼベクターを作成した。それらのベクターと気道上皮細胞株BEAS-2Bとを用いたルシフェラーゼアッセイによって,Fn14遺伝子の転写調節に重要である配列を同定した。また,PCRをベースとした部位特異的変異導入を行い,重要な配列周囲に人為的に変異導入し,ルシフェラーゼ活性を比較することによってさらに転写調節に重要な配列を絞り込むことに成功した。本年度行われた結果をもとに,今後ゲルシフトアッセイを用いた,転写を調節している転写因子の同定,またその転写因子によるサイトカイン産生や,抗腫瘍活性に及ぼす影響を検討する予定となっている。TNFスーパーファミリーの一つであるTWEAK(TNF-like weak inducer of apoptosis)は細胞増殖、血管新生、炎症反応、腫瘍増殖等多彩な生理活性をもつサイトカインで、そのレセプターであるFn14(Fibroblast growth factor-inducible 14)を介して活性がもたらされる。本研究は転写レベルでのFn14の発現制御メカニズムを解明することが目的であり、本研究によりFn14発現機構が解明され、関与する転写因子が明らかになれば、それをターゲットとしたTWEAK/Fn14シグナルの間接的な制御による炎症の治療、さらには新たな抗腫瘍療法の確立に発展する可能性を秘めている。平成19年度においては、Fn14遺伝子をコードしている配列の上流である遺伝子プロモーターをクローニングし、ルシフェラーゼベクターを作成した。それらのベクターと気道上皮細胞株BEAS-2Bとを用いたルシフェラーゼアッセイによって、Fn14遺伝子の転写調節に重要である配列を同定した。また、平成20年度においてはBEAS-2B細胞に対し種々のサイトカイン刺激を施すことにより、サイトカイン刺激特異的に発現の変化するプロモーター配列を同定した。これらの結果をもとに、BEAS-2B細胞におけるFn14発現を調節している転写因子、およびFn14発現変化によるTWEAK刺激に対する炎症性サイトカイン発現の変化等に関して検討した。
注意欠陥多動性障害(AD/HD)の感受性要因-環境要因型動物モデルの開発

初年度の結果を踏まえ,以下の2つの感受性要因-環境要因系モデルについて検討した.(1)メタロチオネイン欠損(MTKO)-水銀モデル:C57BLマウスおよびこれを野生型とするMTKOマウスを周生期に0.5mg/m^3の水銀蒸気(Hg^0)に連日6時間ずつ曝露し,出生後の行動機能を評価した.MTKOではオープンフィールド活動性の低下を認めた。受動回避試験およびモリス水迷路(空間学習機能試験)では,メスのMTKOマウスのみ,Hg^0曝露群の成績が対照群より劣っていた.曝露群における脳内Hg濃度はピーク時期で1ppm未満であり,これらの行動影響が比較的軽度の曝露で生じていることが示唆された.(2)性ホルモン-甲状腺ホルモン撹乱モデル:胎生期にジエチルスチルベストロール(DES)処理し性ホルモン環境を攪乱した動物で行動異常が認められたことを受けて,ここに甲状腺ホルモン撹乱を加えた系について検討する予定であったが,甲状腺ホルモン撹乱の影響のみ検討を行なった。WI系雄性ラット(10週齢)に4週間0.03%の濃度のメチルチオウラシル(MTU)溶液を飲料水として自由に摂取させた.4週目に賭殺し、血漿中の甲状腺ホルモン(T3,T4)およびコルチコステロン(CORT)の各濃度をラジオイムノアッセイ法にて定量した.その結果、副腎重量,血漿中甲状腺ホルモン濃度指標はいずれもMTU投与群において有意に低値であった。血漿中,CORT濃度においてはMTU投与群と対照群との間に有意差はみられなかった。飲料水にMTUを混和することによって甲状腺ホルモン系低機能モデルラットを作成できることがわかった.以上,本研究では3つのモデルを検討し,一般毒性が生じないような負荷で行動影響を惹き起こすことができたが,多動かつ学習障害を示すようなモデルの確立には至っていない.今後,未検討の項目についても詰めていきたいと考えている.本年度は主として2つのモデルについて検討を行った,(1)C57BL-セレン欠乏モデルとして,離乳期より低セレン食で飼育したC57BL系マウスについて,飼育開始後4および16週の時点でオープンフィールド試験,5週の時点で受動回避試験を行った.本試験系については,既に飼育8週の時点ではオープンフィールドにおける活動性が亢進することを認めている.4週経過時でのオープンフィールドでは,欠乏群において活動亢進の傾向を認めたものの,統計的有意差には至らなかった.また,16週経過時では欠乏群と充足群(対照群)との間に差を認めなかった.受動回避試験については,5週経過時点で全く差を認めなかった.以上より,セレン欠乏による多動の出現する時期には,time-windowが存在することが示唆された.(2)メタロチオネイン欠損(MTKO)-水銀モデルとして,メタロチオネインI, IIをともに欠損したマウスと野生型マウスとを用い,長期にわたる水銀蒸気への曝露を行い,曝露3および5ヶ月の時点において,オープンフィールドにおける活動性ならびに受動回避試験における回避成績を調べた.その結果,オープンフィールド行動に関しては,水銀曝露による活動亢進がいずれの試験時点でも認められたが,MT欠損自体は影響を及ぼさなかった.ただし5ヶ月時において,MT欠損に水銀曝露が複合した場合にのみ,移動速度が上がることが示唆された.一方で,受動回避については,MT欠損群が,水銀曝露の有無にかかわらず成績が悪く,記憶学習の障害が示唆された.5ヶ月時において回避試験を繰り返したところ,3ヶ月時の記憶が保持されていたことが確認され,この記憶の保持はMT欠損の水銀曝露群において劣っていた.以上より,MT欠損と水銀曝露とは行動学的に異なる影響を及ぼし,両者が長期に渡って複合すると多動と記憶障害を示すことが明らかになった.初年度の結果を踏まえ,以下の2つの感受性要因-環境要因系モデルについて検討した.(1)メタロチオネイン欠損(MTKO)-水銀モデル:C57BLマウスおよびこれを野生型とするMTKOマウスを周生期に0.5mg/m^3の水銀蒸気(Hg^0)に連日6時間ずつ曝露し,出生後の行動機能を評価した.MTKOではオープンフィールド活動性の低下を認めた。

飲料水にMTUを混和することによって甲状腺ホルモン系低機能モデルラットを作成できることがわかった.以上,本研究では3つのモデルを検討し,一般毒性が生じないような負荷で行動影響を惹き起こすことができたが,多動かつ学習障害を示すようなモデルの確立には至っていない.今後,未検討の項目についても詰めていきたいと考えている.
口腔内環境の変化によって海馬に発現する遺伝子の網羅的解析

口腔内環境の変化によって海馬での遺伝子発現がどのように変化し,また神経新生に関する遺伝子はどのように変化するかを明らかにすることである.そのため実験の基本は飼育形状の変化による海馬の遺伝子発現の違いを明確化する.口腔内環境変化による海馬の遺伝子発現の違いを明確化させる.神経新生に関する遺伝子がどのようなメカニズムで発現するかを検討することである.実験動物にはラットまたはマウスを用い飼料形状の違いによる変化の観察を行った.飼料形状を固形のものと粉状のものでそれぞれ飼育し,飼育期間終了後海馬に発現する遺伝子発現の評価を行うためにDNAマイクロアレイを用いた.海馬組織を採取しRNAを抽出しスライドガラス上に数万個のDNAスポットを作製し,ハイブリダイゼーションさせた.ハイブリッド形成の強度を指標にして数多くの遺伝子の動的挙動を定量的に計測した.固形飼料を与えた硬性咀嚼群と粉状飼料を与えた軟性咀嚼群では発現遺伝子に違いが見られ,数個の遺伝子に差が見られた.老化促進モデルマウス(SAMP)では飼育期間が異なるため内分泌系の変化などから条件設定を行った.また,これらの条件において脳内のカテコールアミンの動態もマイクロダイヤリシス法により観察を行い,各条件群との比較で変化が見られた.これら内分泌系の変化と遺伝子発現の変化を比較検討を行った.今回の実験結果を基盤に今後,口腔環境変化(咬合支持の喪失)などにより遺伝子発現の動態に影響を及ぼすかを比較検討できると考えられる.また,それぞれに影響するターゲット遺伝子の機能解析を行うことによって咀嚼器官と脳機能との関わりのメカニズムを解明できるのではないかと考えている.口腔内環境の変化によって海馬での遺伝子発現がどのように変化し,また神経新生に関する遺伝子はどのように変化するかを明らかにすることである.そのため実験の基本は飼育形状の変化による海馬の遺伝子発現の違いを明確化する.口腔内環境変化による海馬の遺伝子発現の違いを明確化させる.神経新生に関する遺伝子がどのようなメカニズムで発現するかを検討することである.実験動物にはラットまたはマウスを用い飼料形状の違いによる変化の観察を行った.飼料形状を固形のものと粉状のものでそれぞれ飼育し,飼育期間終了後海馬に発現する遺伝子発現の評価を行うためにDNAマイクロアレイを用いた.海馬組織を採取しRNAを抽出しスライドガラス上に数万個のDNAスポットを作製し,ハイブリダイゼーションさせた.ハイブリッド形成の強度を指標にして数多くの遺伝子の動的挙動を定量的に計測した.固形飼料を与えた硬性咀嚼群と粉状飼料を与えた軟性咀嚼群では発現遺伝子に違いが見られ,数個の遺伝子に差が見られた.老化促進モデルマウス(SAMP)では飼育期間が異なるため内分泌系の変化などから条件設定を行った.また,これらの条件において脳内のカテコールアミンの動態もマイクロダイヤリシス法により観察を行い,各条件群との比較で変化が見られた.これら内分泌系の変化と遺伝子発現の変化を比較検討を行った.今回の実験結果を基盤に今後,口腔環境変化(咬合支持の喪失)などにより遺伝子発現の動態に影響を及ぼすかを比較検討できると考えられる.また,それぞれに影響するターゲット遺伝子の機能解析を行うことによって咀嚼器官と脳機能との関わりのメカニズムを解明できるのではないかと考えている.
唾液腺の分枝形成に関わる成長因子の作用機構

成長因子によって誘導されるマウス胚唾液腺上皮の分枝形成について、研究をおこなった。13日胚の唾液腺原基からディスパーゼ処理により上皮を単離し、単離した上皮を基底膜物質(マトリゲル)で覆い、培養液に成長因子EGFとFGF-7を添加し、上皮単独培養をおこなった。培養液にEGFのみを加えると上皮は盛んに分枝形成をおこない、FGF-7のみを加えると上皮の分枝は抑制され柄(Stalk)の伸長が観察された。両者を同時に加え、その量比を変えると、分枝パターンも変化した。このことは、正常の分枝パターンが間充織から分泌されるEGFとFGF-7の量比によって調節されている可能性を示唆している。唾液腺上皮の分枝パターンを変化させるEGFとFGF-7の作用機構としては、上皮の細胞増殖パターンに影響を与え、その違いが原因となって分枝パターンが異なってくることが考えられる。そこで、培養上皮中のDNA合成細胞をBrdUで標識し、ホールマウント標本で免疫染色した。培地に加えた成長因子の刺激によるDNA合成は、培養開始8時間後に出現することが判明したので、8時間以降のサンプルについて細胞増殖パターンと分枝パターンとを比較した。その結果、分枝の前半の溝(Cleft)がEGF刺激によって形成される過程においては、溝の中央の陥入する部位とその周囲で細胞増殖活性に差が無いこと、また、分枝の後半の溝が深くなり柄が伸長する過程においては、小葉(Lobule)の先端部は高い細胞増殖活性を維持しているのに対して、柄の部分の細胞増殖活性は低下していることが判明した。これらの結果は、分枝形成は細胞増殖の不均一なパターンが原動力となって進行するという従来のモデルが妥当でないことを示している。マウス胚唾液腺上皮を基底膜物質(マトリゲル)で覆い,培養液にEGFを加えるとlobule形成が誘導され,一方,培養液にFGF-7を加えるとlobule形成は抑制され,stalkの伸長のみが促進されるという当研究で開発された実験系を用いて研究をおこない,平成10年度は以下の2つの結果を得た。1.EGFとFGF-7を同時に加えると,分枝形成パターンがその濃度比に依存して変化することを明らかにし,正常発生で観察される分枝パターンが再現されるEGFとFGF-7の濃度を決定した。正常マウス胚唾液腺でのEGFとFGF-7のmRNAの発現が報告されており,今回の結果は,正常の分枝形成はEGFとFGF-7の微妙,なバランスによって制御されている可能性を強く示唆している。2.EGF培養した上皮とFGF-7培養した上皮について,DNA合成細胞をBrdUで標識し,ホールマウント免疫染色をおこない,分枝パターンと細胞増殖パターンとの因果関係を調べた。EGF培養した上皮でcleft形成直前のもの,浅いcleftが形成されているもの,どちらにおいても,DNA合成細胞の分布は一様で,cleft形成位置と相関した分布の偏りは認められなかった。一方,FGF-7培養した上皮は,stalkの伸長が観察される初期の段階から,先端部から基部にかけてDNA合成細胞数が次第に減少していくパターンが観察され,かなり伸長した時にはDNA合成細胞は先端部に局在していた。以上の結果から,分枝形成過程前半のcleft形成は細胞増殖パターンと因果関係は無く,後半のstalk伸長は細胞増殖パターンと因果関係が有ると結論した。13日胚の唾液腺源基からディスパーゼ処理により上皮を単離し、単離した上皮を基底膜物質(マトリゲル)で覆い、培養液に成長

因子EGFとFGF-7を添加し、上皮単独培養をおこなった。培養液にEGFのみを加えると上皮は盛んに分枝形成をおこない、FGF-7のみを加えると上皮の分枝は抑制され柄(Stalk)の伸長が観察された。両者を同時に加え、その量比を変えると、分枝パターンも変化した。このことは、正常の分枝パターンが間充織から分泌されるEGFとFGFF-7の量比によって調節されている可能性を示唆している。唾液腺上皮の分枝パターンを変化させるEGFとFGF-7の作用機構としては、上皮の細胞増殖パターンに影響を与え、その違いが原因となって分枝パターンが異なってくることが考えられる。そこで、培養上皮中のDNA合成細胞をBrdUで標識し、ホールマウント標本で免疫染色した。培地に加えた成長因子の刺激によるDNA合成は、培養開始8時間後に出現することが判明したので、8時間以降のサンプルについて細胞増殖パターンと分枝パターンとを比較した。その結果、分枝の前半の溝(Cleft)がEGF刺激によって形成される過程においては、溝の中央の陥入する部位とその周囲で細胞増殖活性に差が無いこと、また、分枝の後半の溝が深くなり柄が伸長する過程においては、小葉(Lobule)の先端部は高い細胞増殖活性を維持しているのに対して、柄の部分の細胞増殖活性は低下していることが判明した。これらの結果は、分枝形成は細胞増殖の不均一なパターンが原動力となって進行するという従来のモデルが妥当でないことを示している。
アポトーシス誘導因子を用いた肝硬変治療薬の開発

肝硬変は、ウイルス性肝炎やアルコールおよび薬物による慢性肝障害が進行し、肝臓が線維化していくことによって、肝臓が硬く変化して肝機能が減衰する疾患である。不可逆的な疾患であるため治療薬がなく、肝移植以外に根治を望めないというのが現状である。そのため、安全性が高く、効果的な肝炎および肝硬変の治療薬が望まれている。そこで本研究では、肝臓の線維化のメカニズムに着目し、アポトーシスを利用して肝硬変で中枢的役割を担う活性化した肝星細胞を死滅させることにより、肝硬変の治療薬を創製することを目的とした。具体的には、アポトーシスの誘導因子であるTRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)と、ゼラチン誘導体を利用したナノDDS技術を組み合わせて、肝硬変の治療を目的としたナノDDSの開発を行った。具体的には、アポトーシスの誘導因子であるTRAILと、ゼラチン誘導体を利用したナノDDS技術を組み合わせて、肝硬変の治療を目的としたナノDDSの開発を行った。本年度は、TRAILとゼラチン誘導体からなるナノDDSに活性化した肝星細胞に対する標的指向性を与えるために、ゼラチンに標的分子であるcyclic Arg-Gly-Asp (RGD)を様々な割合で化学導入した。これらのcyclic-RGD導入ゼラチンとTRAILに様々な濃度の酢酸亜鉛溶液を混合し、コンプレックスの作製条件を検討した。作製したコンプレックスの表面電位は電気泳動光散乱光度計、粒子径は動的光散乱法で測定を行った。次に、ヒト肝癌細胞(HepG2)と肝星細胞(LI90)を用いて、アポトーシス誘導に効果のある濃度の評価を、蛍光標識化アネキシンVおよびプロピウムアイオライドを用いたFACS解析で行った。また、カスパーゼ3、8の活性はそれぞれの蛍光基質を用いて測定した。肝硬変モデルマウスの作製は、マウスに四塩化炭素/オリーブオイルを腹腔内に週3回ずつ4週間投与して行った。薬剤投与後の肝臓の評価は、肝臓摘出後、切片作製を行い、マッソン・トリクローム染色での免疫染色およびHE染色を行い、組織の形態観察および線維性コラーゲン量の評価を行った。本年度は、活性化した肝星細胞に対する本ナノDDSの標的指向性を高めるために、ゼラチンに標的分子であるcyclic Arg-Gly-Asp (RGD)を化学導入した。ヒト肝癌細胞(HepG2)、肝星細胞(LI90)およびマウス線維芽細胞(L929)に様々な濃度のTRAILを添加後、アポトーシス誘導の評価を行った。アポトーシス誘導の評価は、蛍光標識化アネキシンVおよびプロピウムアイオライドを用いたFACS解析と、カスパーゼ3、8の活性をそれぞれの蛍光基質を用いて測定した。また、マウスに四塩化炭素/オリーブオイルを腹腔内に週3回ずつ2または4週間投与して、肝硬変モデルマウスを作製した。肝臓を摘出後、ホルマリン固定、パラフィン包埋、切片作製を行い、マッソン・トリクローム染色、α-SMAでの免疫染色およびHE染色を行い、組織の形態観察および線維性コラーゲン量の評価を行った。

当初、ゼラチンに肝星細胞への標的分子であるマンノース6リン酸の化学導入を試みたが、縮合剤によるゼラチンの内部架橋によってゲル化が起こり、マンノース6リン酸導入ゼラチン誘導体の作製がうまくいかなかった。そのため、もう一つの標的分子であるcyclic RGDの合成依頼を行い、ゼラチンにcyclic RGDを化学導入した。cyclic RGDの合成に時間がかかったことも研究の進行が遅れた原因となっている。しかしながら、次年度に計画していた肝硬変モデルマウスの作製および評価方法はすでに確立できている。まず、標的分子導入ゼラチンとアポトーシス誘導因子TRAILタンパク質ならびに酢酸亜鉛とを様々な濃度で混合し、コンプレックスを作製する条件を検討した後、in vitroでのナノDDSの細胞毒性試験、動物を用いた血中安定性評価、肝硬変モデル動物を作製してナノDDS投与による治療効果を評価し、本ナノDDSの肝硬変の治療薬としての有効性を明らかにする。平成24年度ナノDDSの体内動態と肝硬変治療効果の評価1.ナノDDSの物理化学的性質(アフィニティクロマトグラフィ、表面電位、粒子径等)の解析:標的分子導入ゼラチンとアポトーシス誘導因子TRAILタンパク質ならびに酢酸亜鉛とを様々な濃度で混合し、コンプレックスを作製する条件を検討する。得られたコンプレックスの結合性はアフィニティクロマトグラフィ、表面電位は電気泳動光散乱光度計、粒子径は動的光散乱法で測定する。コンプレックスに含まれる亜鉛の濃度は、原子吸光光度計で測定する。2.細胞毒性試験:L929細胞を用いて、WST法により細胞毒性試験を行う。動物実験に用いる濃度で細胞毒性がないか評価する。3.血中安定性および体内動態の評価:アポトーシス誘導因子TRAILタンパク質を放射性同位体125Iでラベル化し、標的分子導入ゼラチンならびに亜鉛とナノDDSを形成させた後、マウスの尾静脈から投与する。一定時間後に眼窩採血を行い、RI活性を測定することにより、血中残存量を算出する。125Iラベル化TRAIL単独の場合と比較することにより、ナノDDSによるTRAILの血中安定効果を評価する。また、一定時間後、各臓器を摘出し、RI活性を測定することにより、体内動態の評価を行う。4.肝硬変モデルマウスを用いた治療効果の評価:四塩化炭素を、マウス腹腔内に週3回ずつ4週間投与して肝硬変モデルマウスを作製する。ナノDDS、TRAILのみ、またはPBSのみを静脈投与し、一定期間後に肝臓を取り出して固定、包埋、切片作製を行う。切片をマッソン・トリクローム染色、α-SMAおよび抗TRAIL抗体で免疫染色し、組織の形態観察および線維性コラーゲン量の評価を行う。また、摘出した肝臓の全RNAを抽出し、線維性コラーゲンTypeI、α-SMAの転写レベルをリアルタイムPCRにより解析する。
直流高電圧印加による超臨界流体の流動特性の解明

超臨界二酸化炭素+エタノール系の電流-電圧特性を系統的に測定した。測定には縦4mm、横4mmの銅製電極を用い、電極間を2mmで測定した。温度308、318K、圧力8.020MPa、エタノールの濃度を02.63mol/Lに変え、直流電圧を05000V印加して電流値を測定した。その結果、一定の印加電圧では温度が高いほど、圧力が低いほど、またエタノール濃度が高いほど電流値が高くなることがわかった。これにより、電流のキャリアはエタノール分子であり、二酸化炭素分子は電流を妨げるように働くと推察された。すなわち、温度が高く、圧力が低くなると電流を妨げる二酸化炭素の密度が減少して電流値が上がり、エタノールの濃度が増加すると電流のキャリアであるエタノール分子の密度が増加して電流値が上がると推察された。電極間に麻糸をたらし、超臨界二酸化炭素+エタノール系308K、8.0MPaにおいて5000Vの直流電圧を印加したところ、麻糸は正極のほうに傾いた。超臨界二酸化炭素のみのときは同様の実験をしても麻糸は動かなかったことより、超臨界二酸化炭素+エタノール系に直流電圧を印加すると流動が発生することが確認できた。ナフタレンをエタノールに溶解させた試料を容器の底に入れ、超臨界二酸化炭素で加圧して308K、8MPaにした。また、容器の底にはあらかじめ電極を挿入した。そして、容器上部のナフタレン濃度を紫外分光器で測定した.電圧を印加しない場合は30分経過しても容器の上部にはナフタレンは検出されなかった。次に、同じ実験条件で徐々に直流電圧を印加したところ、1000V印加した20分後から容器の上部にナフタレンが検出されるようになった。これにより、超臨界二酸化炭素+エタノール系に直流電圧を印加すると系内が撹絆されることが確認された。超臨界二酸化炭素に直流高圧電場を印加した際の電流値を測定するため、まず始めに電極を作った。電極は銅製で高さ10mm、幅10mm、厚さ2mmであり、電極の間隔は2mmとした。この電極を新たに作製したセルに装着し、そのセルを循環ポンプ付きの高圧系に入れた。次に、温度35°Cとし、系内に二酸化炭素を導入して圧力8.OMPaから20.1MPaの条件下で最大電圧6000Vを印加した。直流高圧電場を印加すると。電流値は瞬時に0.10.2μA程度まで上がるものの、2030秒後には電気は流れなくなった。電圧を印加した最初に電気が流れるのは、電極に電気が溜まるためと思われる。電気が電極に溜まった後は電気が流れないことから、純粋な超臨界二酸化炭素には電気は流れないことがわかった。次に、超臨界二酸化炭素にエタノールを添加し、直流高圧電場を印加した時に電気が流れるかどうか検討した。温度35°C、圧力11.7MPa、エタノールの濃度7.9wt%の時は6000Vまで直流高圧電場を印加しても電気は流れなかった。さらに、温度35°C、圧力18.4MPa、エタノール濃度30.5wt%で直流高圧電場を印加した時の電流値を測定した。直流高圧電場を印加すると、数十秒後に最大電流値が得られ、それから徐々に電流値は減少し、2分過ぎには電流値は安定した。そこで、直流高圧電場印加より2分後から1分間の電流の平均値を記録した。印加電圧を上げていくと電流値は印加電圧に対してほぼ直線的に上昇し、7000Vの時電流値は0.08μAであった。この電圧より高い電圧を印加すると電流値の増加率は上昇し、10000Vを超えると電流値は急激に上昇した。印加電圧が10000Vを超えると放電が起こっていると推察された。

次に、同じ実験条件で徐々に直流電圧を印加したところ、1000V印加した20分後から容器の上部にナフタレンが検出されるようになった。これにより、超臨界二酸化炭素+エタノール系に直流電圧を印加すると系内が撹絆されることが確認された。
発癌性マイコトキシン汚染食品の迅速診断法の開発

食品および食品原材料から直接、真菌のアフラトキシン生合成に関与する酵素の遺伝子をマルチプレックスPCRにより検出し、食品のアフラトキシン汚染を迅速簡便に診断する方法を開発した。その結果、今回収集した食品のアフラトキシンBG汚染は59検体中15検体(25.4%)であったが、遺伝子検出法では27検体(45.8%)からBG産生酵素の遺伝子が検出された。以上から、アフラトキシンBG汚染は考えられているより広範囲の食品に発生する危険性があること、また、その原因菌としては高いアフラトキシンBG産生能をもつA.parasiticusとA. nomiusが関与している可能性があることが明らかになった。Ehrichらの報告により、チトクロームP450酸化酵素と予測されるCypAがアフラトキシンGの産生に必須であることが明らかになったため、cypAに何種類かプライマーを設計したが、種間の変異が多く、BG産生種すべてを検出することができなかった。そこで、cypAの上流にあり、B産生性A.flavusではcypA同様欠損している、norBをターゲットにプライマーを設計した。その結果、B産生性菌5株については、約700bpの位置にバンドが1本検出され、BG産生菌22株については、約700bpと約300bpの位置に2本のバンドが検出された。アフラトキシンを産生しない6株は全くバンドが検出されなかった。B産生性のA.pseudotamarii1株だけが、予測される約700bpの位置にバンドが検出されず、ordAのプライマーを設定した位置の遺伝子配列が他種と異なっている可能性が考えられた。しかし、この種は現在までに2株しか分離されていない非常に珍しい種であるため、通常の食品のアフラトキシン汚染には寄与していないと推測される。以上より、アフラトキシンの自然汚染に関与すると考えられる菌についてはマルチプレックスPCR法でB産生菌とBG産生菌を区別しながら検出できることが確認できた。現在、アフラトキシンの規制は日本ではB_1の暫定基準値のみであるが、FAO/WHO合同食品規約委員会による国際規格に照準を合わせ、B_1,B_2,G_1,G_2値を合計した総量規制が検討されている。前年度、アフラトキシンの自然汚染に関与すると考えられる真菌の菌株についてmultiplex PCR法でB変生菌とBG変生菌を区別できることが確認できた。今年度はアフラトキシン汚染食品からDNAを抽出し、直接、multiplex PCR法でアフラトキシン産生に関与する遺伝子の検出を試みた結果、コーンフラワー、コショウ、ピーナッツ等18検体(Totalアフラトキシン0.7392.9μg/kg)中、16検体から標的遺伝子を検出できた。検出できなかった2検体はアフラトキシン濃度が0.7あるいは0.17μg/kgと日本の基準値B_1 : 10μg/kgを大幅に下回っていた。また、アフラトキシンBとGが検出されたサンプルはすべて、PCRの結果と一致したが、アフラトキシンBしか検出されなかったサンプル7検体中3検体はPCRではBG変生菌の存在が予想された。今年度は、食品中からアフラトキシン産生菌であるAspergillusflavus,A.parasiticus,A.nomiusの存在を菌種別に特異的に検出できるmultiplex PCR法を開発した。本法をアフラトキシンBあるいはB,G産生酵素の遺伝子検出と組み合わせることにより、産生菌とアフラトキシン汚染の関係を予測できる。コーンフラワー、コーングリッツ、コショウ、ピーナッツ、アーモンド等の市販食品について、アフラトキシン汚染濃度、培養法によるアフラトキシン産生菌の菌数測定と同定、食品から直接のアフラトキシン産生酵素の遺伝子の検出、食品から直接の菌種別PCRを実施した。また分離した菌のアフラトキシン産生性もHPLC法で測定した。その結果、アフラトキシンBとG汚染が結構広く存在することが確認できた。今まで、アフラトキシンBとG汚染があるにもかかわらず、食品から分離されるアフラトキシン産生菌はほとんどA.flavusであり、BとG産生菌が分離されることは非常に少ない。今回、遺伝子を検索することにより、BとG産生菌であるA.parasiticusやA.nomiusが、アフラトキシン汚染に一定関与していることが証明できた。また、低レベルのアフラトキシンBしか検出されなかった食品からもBとGの産生酵素の遺伝子が検出されていることから、BとG産生菌は考えられている以上に広く存在することが予測された。