hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線抵抗性細菌由来DNA鎖切断末端結合タンパク質の構造機能解析

本研究では極めて効率のよいDNA修復機構を持つ放射性抵抗性細菌DeinococcusradioduransのDNA日本鎖切断修復関連蛋白質DdrAの構造機能解析を行うことを目的としている。これまでに複数の生物種由来のDdrAのコンストラクトの構築を行い、結晶化に適したコンストラクトの選抜および結晶化に成功した。またこれまで知られていないプロセッシングが存在していることを見出した。今後、結晶解析を進めるとともに新規プロセッシング機構の解明を行う予定である。すでに構築済みのDrDdrAコア領域の発現系に加えて中程度高熱性を有するDgeoDdrAのコア領域の発現系またDrDdrAおよびDgeoDdrAの全長の発現系を構築した。DgeoDdrAコア領域については新規に結晶化条件を探索し、3オングストローム程度の回折能を持つ結晶を得ることに成功した。しかし、今年度中に予定されていた国際宇宙ステーションを利用した高品質タンパク質結晶生成実験が半年間延期されたため、平成27年度中ごろに宇宙実験がシフトしたため、宇宙実験は実施できなかったが、その間に全長型DdrAが細胞抽出液によってNまたはC末端がプロセッシングを受けることを新たに見出した。このプロセッシングは既存のプロテアーゼ阻害剤では阻害を受けないことも同時に見出した。また10merから30merの長さのオリゴDNAを合成し、それらオリゴDNAとDdrAコア領域との複合体を作製し、それら複合体の熱安定性を評価したところ、10merのオリゴDNAに対してもっとも強固に結合することを見出した。昨年度までに構築した複数の発現系を用いて精製し、精製試料を用いた熱安定性測定を行い、タンパク質が最も安定して存在できる溶液条件をみいだした。安定条件を用いて結晶化実験を行い、そのうちDrDdrA157の新規の結晶化条件から最大で2.4Å分解能の回折データを取得した。しかし得られた回折データから双晶が解消していないことが判明した。そこで当初計画通りDgeoDdrA157とDrDdrA157の二種類に対して微小重力環境を用いた結晶化実験を行ったところ、DgeoDdrA157については分解能の劇的な向上と双晶の解消は果たせないことが判明した。DrDdrA157については現在国際宇宙ステーションにて結晶化実験実施中であり、平成28年5月に地球に帰還する予定となっているため、帰還後直ちに回折実験を実施する予定である。新たな結晶化条件の探索の結果、宇宙実験に計画通り移行することが出来た。さらに2.4Å程度の回折データの収集にも成功している。一方で双晶の解消が思いのほか難航しているため当該年度内に予定していた構造決定に至っていないため、やや遅れていると判断している。本研究では極めて効率のよいDNA修復機構を有する放射性抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランスのDNA二本鎖切断修復に関与するDdrAタンパク質の構造機能解析を行うことを目的としている。このDdrAタンパク質は放射線誘導性タンパク質であり、デイノコッカス・ラジオデュランスにおいて放射線で誘導されるタンパク質の中で最も高い発現量変化を示し、デイノコッカス・ラジオデュランスのDNA修復機構に関与するタンパク質である。しかしDdrAがDNA修復にどのようかかわっているか全くの不明であり、本研究によって得られるDdrAタンパク質の構造機能相関はデイノコッカス・ラジオデュランスのDNA修復機構の全容解明に重要な意味を成す。先行研究でデイノコッカス・ラジオデュランスのDdrAタンパク質の結晶は解析が不可能な疑似欠面双晶となることを明らかにしていたが、本事業にて、デイノコッカス・ラジオデュランスの発現系に加えて、その近縁種であるデイノコッカス・ジオサーマリスのDdrAのコア領域の発現系構築、精製系確立、結晶化条件確立、開捏データ収集条件確立などを実施し、疑似欠面双晶を解消した結晶から2.5Åのデータ、位相決定のための重原子置換体結晶から3.5Åのデータ収集に成功し、構造解析を進めている。また、発現系構築、精製系構築の過程で、細胞内因子によってDdrAタンパク質が限定分解によるプロセッシングを受けていることを明らかにし、現在デイノコッカス・ラジオデュランスおよびその近縁種を対象にDdrAタンパク質のプロセッシング機構の解明を行っており、プロセッシングに関わるタンパク質の道程作業を進めている。放射線照射によって引き起こされる限定分解プロセッシング機構の報告はこれまでになされておらず、生物学的に極めて重要な成果であり、今後プロセッシング機構の全容解明に向けた取り組みを続ける予定である。予定されていた宇宙実験が半年間延期され、構造解析のスケジュールは遅延したが、その間タンパク質発現コンストラクトの見直しや、細胞抽出液を用いたタンパク質プロセシングの項目を先行して実施したため、スケジュールの組換えは起きたものの計画上は順調に進呈していると判断している。平成28年度には構造決定を行い、オリゴDNAとの共結晶化を行う。

また、新たなプロセッシング機構に関して、放射線照射菌体を破砕し、液体クロマトグラフィーとMALDI TOF-MSを組み合わせ、プロセッシングを行っているプロテアーゼの有無およびその同定を行い、DNA結合能とプロセッシングの関係について明らかにしたい。プロセッシング位置の同定後、プロセッシング前後での構造変化を解析するため、全長、コアドメインに加えて、プロセッシング後のコンストラクトを作成しその構造解析を進める。構造生物学宇宙実験によって良質な結晶が得られ次第、構造決定を行い、得られた構造情報を基に迅速に変異体作製実験に移行する。また今年度、結合するオリゴDNAが見いだせたため、そのオリゴDNAとの共結晶化を行いDNA認識機構を平成27年度中に明らかにしたい。双晶の解消が難航したため、結晶化用オリゴヌクレオチドの購入を見送ったため。年度内に予定していた宇宙実験が延期となり、宇宙実験条件検討に用いる消耗品等の購入を見送ったため。5月に国際宇宙ステーションから帰還予定の結晶の回折実験と並行してオリゴヌクレオチドとの共結晶化に着手する予定としており、合成外注費として使用予定。その他消耗品についても平成28年度前半に使用予定。平成27年度中に宇宙実験を実施するため、その条件検討作業に用いる。
内的作業モデルの世代間伝達とその変容プロセスに関する研究

目的内的作業モデルの児童期から青年期における変容過程を明らかにすることを目的とする。特に、今回は、その変容に影響を及ぼす要因として家族以外の「重要な他者」との出会いに注目し、重要な他者のイメージやその影響の視点から変容の過程を細討する。方法大学生男女112名(男性47名、女性63名)に調査を実施した。質問紙としては、児童期のIWMを捉えるものとして幼少期IWM尺度、青年期については、中尾・加藤(2005)の青年期IWM尺度、また重要な他者については、(1)重要な人物の属性(2)重要な他者のイメージ(3)重要な他者からの影響、について質問した。結果まず、幼児期IWM尺度及び重要な他者に関する尺度では、因子分析を行った。その結果、幼児期IWM尺度では、先行研究と同じように「見捨てられ不安」と「親密性の回避」の2因子が抽出された。重要な他者の特性としては、「当てになる存在」「前向きな存在」「大人的存在」の3因子を抽出し、影響では、「人間不信」「自己受容」「情緒不安定」の3因子を抽出した。次に、児童期から青年期におけるIWMの変化についてみると、54名の者に何らかの変化が見られた。つまり、安定から不安定あるいは不安定から安定へとIWMの変化が見られ、その時の重要な他者としては、「先生」「友人」「恋人」の割合が高かった。さらに幼児期から青年期への尺度得点の変化で見ると、「前向きな存在」の他者との出会いによって親密性の回避傾向は低くなり、「人間不信」については、見捨てられ不安・親密性の回避ともに増加している人ほど高くなっていることが示唆された。今年度、これまでの研究で行ってきた母親の愛着スタイルの違いによる子どものとらえ方の違いについて、研究結果もまとめて、学会に報告した。1方法対象者3歳児前後の子どもを持つ母親194名にアンケートを配布、有効回答102名質問紙(1)AQSより抽出した子どものさまざまな行動と、その行動に対する母親の受け入れ難さの程度を聞いた項目(5件法)(2)成人版愛着スタイル尺度(IWM尺度:詫摩・戸田(1988))18項目手続き京都市内の保健所における3歳時検診の際に、直接母親に依頼をし、後日郵送によって回収。2結果まず、因子分析により、母親の子どもの育てにくさについては、「ぐずりやすさ」「育てやすさ」「関係のとりにくさ」の3因子を抽出し、この質問紙を「子どもの育てにくさ尺度」と命名した。また、「ぐずりやすさ」に関しては、内的作業モデルの安定群よりも両価群の方が子育てにゆとりが持ちにくいということが示された。次に、内的作業モデルの測定には意識的なレベルだけではなく無意識的なレベルまで踏み込んで把握する必要がある。そこで、本研究では、無意識的なレベルでの対人パターンを把握するため、投映法の心理検査であるTATを取り上げる。TATでは、20枚のカードを使うが、本研究ではその中でも特に対人関係のパターンを示しやすいカード数枚を用いて、物語を作成してもらう。物語の解釈を通して、被検者の愛着スタイルを、安定型、両価型、回避型に分類し、それと愛着スタイル(IWM尺度)との関連を検討する。1方法対象者大学生90名質問紙TAT図版6枚、成人版愛着尺度、自尊感情尺度手続き現在、分析を進めているところであり、平成18年度に学会において、結果を発表予定目的内的作業モデルを測定する尺度として、これまでは質問紙が主であったが、その妥当性・信頼性が問題視される中、本研究では、TAT物語による投影法を用いることで、そのパターンを明らかにしようとした。方法大学生男女145名(有効回答125名)に調査を実施した。

質問紙としては、TAT図版6枚、成人版愛着スタイル尺度、FACESKG-IV、自尊感情尺度、自己肯定感尺度を用いた。結果まず、先行研究を参考にして、TAT物語の分類基準を作成した。その基準に基づいて、125名のTAT結果の解釈、分類を行った(安定74名、回避28名、両価23名)。次にこのTAT結果による3群について、愛着スタイル尺度得点による分散分析を行った。その結果、アンビバレント得点においては、安定群と両価群において差が見られたが、それ以外では有意な差は見られず、したがって、愛着スタイル尺度とTATによって捉えられるIWMは、完全には重なり合うものではないことが示された。つまり、意識レベルでの質問紙と、より深い無意識レベルまでを考慮したTATでは、捉える内的作業モデルが多少異なることが示された。TATと自己肯定感では、人間不信において、安定群に対して両価群が有意に高いことが示され、また、家族関係にっいては、きずな得点において安定群が回避・両価群より高いことが示された。これらより、TAT物語により内的作業モデルに関連する自己肯定感や家族関係との関連が示され、TAT物語法の妥当性が示された。目的内的作業モデルの児童期から青年期における変容過程を明らかにすることを目的とする。特に、今回は、その変容に影響を及ぼす要因として家族以外の「重要な他者」との出会いに注目し、重要な他者のイメージやその影響の視点から変容の過程を細かく検討する。方法大学生男女112名(男性47名、女性63名)に調査を実施した。質問紙としては、児童期のIWMを捉えるものとして幼少期IWM尺度、青年期については、中尾・加藤(2005)の青年期IWM尺度、また重要な他者については、(1)重要な人物の属性(2)重要な他者のイメージ(3)重要な他者からの影響、について質問した。結果まず、幼児期IWM尺度及び重要な他者に関する尺度では、因子分析を行った。その結果、幼児期IWM尺度では、先行研究と同じように「見捨てられ不安」と「親密性の回避」の2因子が抽出された。重要な他者の特性としては、「当てになる存在」「前向きな存在」「大人的存在」の3因子を抽出し、影響では、「人間不信」「自己受容」「情緒不安定」の3因子を抽出した。次に、児童期から青年期におけるIWMの変化についてみると、54名の者に何らかの変化が見られた。つまり、安定から不安定あるいは不安定から安定へとIWMの変化が見られ、その時の重要な他者としては、「先生」「友人」「恋人」の割合が高かった。さらに幼児期から青年期への尺度得点の変化で見ると、「前向きな存在」の他者との出会いによって親密性の回避傾向は低くなり、「人間不信」については、見捨てられ不安・親密性の回避ともに増加している人ほど高くなっていることが示唆された。
EBウイルスの潜伏感染時と溶解感染時におけるEBNA1の機能解析

EBウイルス(EBV)のコードするEBNA1はEBV潜伏感染細胞でEBVゲノムのエピゾーム状態での維持や細胞が分裂する際の分配に機能することが知られている。EBNA1蛋白質は潜伏感染時の複製開始点であるoriPのFRやDS領域、およびQプロモーター領域(QP)に結合することは、これまでin vitroフットプリンティングの実験でのみ報告されているが、in vivoでそれらの結合性は実証されていなかった。また溶解感染時にもEBNA1蛋白質は発現しているが機能や動態については不明な点が多い。今回我々はEBNA1が結合しているEBVゲノム上の領域を網羅的に検索するため染色体免疫沈降(ChlP)法の改良を行い、EBV感染細胞で¢EBNA1のEBVゲノムへの結合動態を細胞周期、溶解感染誘導時について解析した。染色体免疫沈降(ChIP)法でin vivoでもEBNA1蛋白質が潜伏感染時にoriP領域に結合していることを確認したが、細胞周期での結合量の変化はみられなかった。また共焦点レーザー顕微鏡を用いてEBNA1蛋白質の細胞内局在性を検討した結果、潜伏感染時は核内に拡都して小さなドット状に分布したが、溶解感染の誘導によりreplication compartmentsに局在することがわかった。EBVのコードするBMRF1産物(DNAポリメラーゼ不随蛋白質)は複製の場に広く分布していたがEBNA1蛋白質はそれらの近傍に一部重なるように局在していた。これらの結果からEBNA1はEBVの溶解感染時にもウイルスゲノム複製の場に局在していることが予想され、EBNA1蛋白質は合成されたEBVゲノムDNAのoriP領域に結合することによってreplication compartmentsに繋ぎ止める働きを持つ可能性が示唆された。EBNA1蛋白質は潜伏感染時の複製開始点であるoriPのFRやDS領域、およびQプロモーター領域(Qp)に結合することは、これまでin vitroフットプリンティングの実験でのみ報告されているが、in vivoでそれらの結合性は実証されていなかった。今回我々はEBNA1が結合しているEBVゲノム上の領域を網羅的に検索するため染色体免疫沈降(ChIP)法の改良を行い、EBV感染細胞でのEBNA1のEBVゲノムへの結合動態を細胞周期、溶解感染誘導時について解析した。染色体免疫沈降(ChIP)法でin vivoでもEBNA1蛋白質が潜伏感染時にoriP領域に結合していることを確認した。細胞周期での結合量の変化はみられなかった。EBNA1蛋白質のoriPへの結合性は溶解感染誘導後さらに増大することを明らにした。またEBNA1蛋白質の細胞内局在性を検討した結果、潜伏感染時は核内に拡散して小さなドット状に分布したが、溶解感染の誘導によりreplication compartmentsに局在することがわかった。これらの結果から合成されたEBVゲノムDNAのoriP領域がEBNA1によってreplication compartmentsに固定化のために働いている可能性が示唆された。EBウイルス(EBV)のEBNA1がoriPのFRやDS、Qプロモーター領域に結合することはこれまでフットプリントの実験から報告されている。今回我々は染色体免疫沈降(ChIP)法の改良によりEBNA1が結合しているEBVゲノム上の領域を網羅的に検索することが可能となったので、潜伏感染、溶解感染、細胞周期で比較検討を行いEBNA

1のEBVゲノムへの結合動態について解析した。ホルムアルデヒドでEBV感染細胞をクロスリンク処理した後CsCl密度勾配遠心にかけ抗EBNA1抗体でChIPを行いランダムプライマーで増幅しラベルしたものをプローブとし、EBVゲノムライブラリーのどの部位に結合しているかをサザンブロットハイブリダイゼーションで検討した。潜伏感染状態にある各培養細胞を出発材料として抗EBNA1抗体でChIP法を行うと、EBVゲノムライブラリー中oriPを含むBamHl C断片やQプロモーターを含むQ断片が検出された。EBV潜伏感染状態の細胞の細胞周期による比較で結合状態に著しい変化は見られなかったが、B95-8 tet-BZLF1細胞にDOXを添加することにより溶解感染を誘導した実験の結果から、溶解感染時にもEBNA1蛋白質はDSやFRといったoriP領域及びQプロモーター下流に結合し続けていることが確認された。また共焦点レーザー顕微鏡を用いてEBNA1、BMRF1、PCNA、BrdUの取り込みについての細胞内局在性ついて検討したところ、溶解感染時にはEBNA1はBMRF1と一部共局在している像が観察された。このことからEBNA1はDNA複製の場の一端に局在していることが予想される。真核細胞では染色体DNA複製と連結してミスマッチ修復システムが働き、誤って取り込まれたヌクレオチドを除去修復することによって、ゲノムの完全性を保持している。EBVの溶解感染を誘導すると宿主DNA合成はおこらないが、S期様細胞内環境になる。一方でEBVのゲノム複製は核内の局在した部位(replication compartments ; RC)でおこっている。EBVのゲノム複製にミスマッチ修復が連結しているのかどうか検討する為、EBV DNA複製と宿主の複製・修復タンパク質の局在性を共焦点レーザー顕微鏡で解析し、相互関連を検討した。溶解感染誘導時にはEBV複製蛋白質であるBMRF1蛋白質が染色される部位はBrdUの取り込みの部位に一致し、またEBVゲノムのBamHI W断片をプローブとしたFISHとも共局在する。したがってウイルスゲノム複製の場であるRC全体に均一に局在することから、そのマーカーとして使用できる。宿主蛋白質PCNA、またPCNAをDNAにロードするRF-CはRC内に共局在することが観察された。溶解感染誘導後BrdUを取り込ませウイルスDNAを標識し、PCNA抗体で免疫沈降させてdepletion assayを行ったところ、PCNAもBALF2,BMRF1と同様に複製されたEBVゲノムと結合していることが確認された。さらに宿主細胞のDNAミスマッチ修復(MMR)に関与するタンパク質群MSH2,MSH6(MutSαを構成),MLH1,PMS2(MutLα)が溶解感染の誘導によりRC内でPCNAと一致して局在することが明らかとなった。
芳香族ジカルボン酸誘導体とアルキルベンゼンとの[3+3]光環化付加反応

芳香族ジカルボン酸誘導体とアルキルベンゼンとの[3+3]光環化付加反応の適応範囲及びそのメカニズムを検討し,次の知見を得た。1. 1,2-,1,3-,1,4-,2,3-,1,8-位に酸無水物基,イミド基,ジエステル基,ジシアノ基が置換したナフタレン化合物とトルエン,キシレンなどのアルキルベンゼンとの光反応を検討した結果,1,8-位に酸無水物基,イミド基,ジシアノ基が置換した化合物でかなり一般的に[3+3]光環化付加反応が進行することが明らかになった。2.ベンゼン,アントラセン,フェナントレンなどナフタレン以外の骨格をもつ芳香族ジカルボン酸誘導体とアルキルベンゼンとの光反応では,[3+3]光環化付加反応は全く認められなかった。3.種々のアルキルベンゼンによる1,8-ナフタレンジカルボン酸無水物および1,8-ナフタルイミドのケイ光消光速度定数は,[3+3]光環化付加反応の起こり易さとよく対応することが明らかになった。4.反応系の光電子移動に伴う自由エネルギー変化ΔGの値が,その系で観測される光反応の形式を決定する非常に重要な因子となっていることが明らかになった。特に,[3+3]光環化付加反応が進行するためには,系のΔGの値が負に大きくなる必要があることが明らかになった。5.以上の結果などより,[3+3]光環化付加反応は,アルキルベンゼンから1,8-ナフタルイミドの励起一重項状態への電子移動,生じるラジカルイオン間のプロトン移動,生じるラジカルペア間の電子移動,最終的に生成するアニオン-カチオン間の熱的な環化付加反応,という一連の過程を経て進行していると考えられる。また,このメカニズムによって,反応の適応範囲,反応に対する溶媒効果などが非常に合理的に説明できた。芳香属ジカルボン酸誘導体とアルキルベンゼンとの[3+3]光環化付加反応の適応範囲を検討したところ,次の知見が得られた。1.1,2-,1,3-,1,4-,2,3-,1,8-位に酸無水物基,イミド基,ジエステル基,ジシアノ基が置換したナフタレン化合物とトルエン,キシアンなどのアルキルベンゼンとの光反応を検討した結果,1,8-位に酸無水物基,イミド基,ジシアノ基が置換した化合物で[3+3]光環化付加反応が進行することが明らかになった。1,8-ナフタレンジカルボン酸無水物では,トルエン,キシレン類,トリメチルベンゼン類などとの反応で,一方,1,8-ナフタルイミドでは,キシレン類,トリメチルベンゼン類などとの反応で,[3+3]光環化付加反応の一般性が認められた。また,1,8-ナフタルイミドの場合には,N上にアルキル基やアリール基をもつ広範な化合物で,[3+3]光環化付加反応が一般的に観測された。3.種々のアルキルベンゼンによる1,8-ナフタレンジカルボン酸無水物および1,8-ナフタルイミドのケイ光の消光速度定数を求めたところ,得られた値と[3+3]光環化付加反応の起こり易さとがよく対応していることが明らかになった。

以上の研究より,反応の適応範囲の大枠が明らかになったので,平成10年度は,電子移動の起こり易さや芳香環1,3位での結合の起こり易さと[3+3]光環化付加反応との関係の整理,合成化学的応用の可能性を検討したい。平成10年度は,平成9年度の研究で不十分な点を補うとともに,電子移動の起こり易さやナフタレン環2,4位での結合の起こり易さと[3+3]光環化付加反応との関係を整理し,次の知見を得た。1.アルキルベンゼンから1,8-ナフタルイミドの励起一重項状態への電子移動反応から[3+3]環化付加反応が進行している可能性を検討するために,それぞれの反応系の光電子移動に伴う自由エネルギー変化ΔGの値を求め,その系で観測される[3+3]環化付加反応及び水を組み込む付加反応との関係を調べたところ,系のΔGの値がその系で観測される光反応の形式を決定する非常に重要な因子となっていることが明らかになった。特に,[3+3]光環化付加反応が進行するためには,系のΔGの値が負に大きくなる必要があることが明らかになった。2.ナフタレン環2,4位での結合の起こり易さと[3+3]光環化付加反応との関係を整理するために,PM3分子軌道計算により反応に関与する可能性のある1,8-ナフタルイミドのラジカルアニオン,カルボニル基で水素原子を引き抜いて生じるラジカル及びアニオンのスピン及び負電荷の密度分布を計算したところ,カルボニル基で水素原子を引き抜いて生じるアニオンの負電荷の密度がナフタレン環2,4位に局在化しており,[3+3]環化付加反応を導くのに有利な状況にあることが明らかになった。3.以上の結果より,[3+3]光環化付加反応は,アルキルベンゼンから1,8-ナフタルイミドの励起一重項状態への電子移動,生じるラジカルイオン間のプロトン移動,生じるラジカルペア間の電子移動,最終的に生成するアニオン-カチオン間の熱的な環化付加反応,という一連の過程を経て進行していると考えられる。また,このメカニズムによって,反応の適応範囲,反応に対する溶媒効果等が非常に合理的に説明できた。
Th9細胞の分化メカニズムの解明

我々が同定したTh9細胞の分化を調節する転写因子について、in vivoにおける役割を検証するため、in vivo Th9細胞分化誘導評価系の構築を行なった。OVA抗原とアジュバンドを用いてin vivoでTh9細胞の分化を誘導させ、その指標となるIL-9産生を細胞内染色法で検出することに成功した。さらにより詳細にIL-9細胞の分化誘導の違いを検出するため、in vivoで分化誘導したTh9細胞を、in vitroにおいて抗原提示細胞存在下で抗原刺激し、細胞培養液中のIL-9の濃度を測定することで、in vivoにおけるTh9細胞の分化誘導の程度を詳細に評価することに成功した。<in vivo Th9細胞を検出する評価系(ova惹起の気道炎症モデル)の構築>オバアルブミン(ova)特異的なTCRを持つOTIITgマウスから単離したナイーブCD4 T細胞をレシピエントマウスであるCD45.1コンジェニックマウスに静脈内投与し、24時間後にovaをLPSと一緒にマウスに経鼻投与した。その後、ovaの投与回数・投与期間を変化させながら経鼻投与し、顎下リンパ節、縦隔リンパ節、脾臓から細胞を単離し、ionomycinとPMAで単離した細胞をin vitroにて再刺激し、CD4 T細胞が産生するサイトカインのパターンと量を測定した。移入した細胞からその割合は少ないもののIL-9産生細胞を検出することができた。IL-4産生細胞はIL-2を高発現している細胞群と一致したが、IL-9産生細胞は他のサイトカイン産生細胞との相関は見られなかった。サイトカイン産生細胞の割合はIL-2 > IFNγ> IL-4 > IL-9となり、IL-9産生細胞の割合は最も少なかった。興味深いことに最後にovaを投与してから45日が経過すると、他のサイトカインよりもIL-9の発現量は減少した。この結果はin vitroでTh9細胞を分化誘導するときに、刺激後day3をピークに、それ以降IL-9産生量が減少することと一致する。これまで、12週間での急性期を念頭にしたモデルで行ってきたが、今後Th9細胞の分化に必須であるTGFβの関与が大きいと思われる慢性期を想定した気道炎症モデルにシフトする。in vivoにおけるIL-9産生細胞の検出に成功した。IL-9産生細胞はIL-5産生細胞と比較すると同程度の割合存在したが、T細胞が産生する主なサイトカインであるIL-2、IFNγ、IL-4などと比較するとその割合は低かった。in vitroでTh9細胞を分化誘導するためには、IL-4とTGFβが必須であり、in vivoではTh2細胞を検出できたことから、ナイーブCD4 T細胞をTh2細胞に分化誘導できるだけのIL-4が本実験モデルで存在していることが伺える。その一方で、Th9細胞の分化に必須なもう一つのサイトカインであるTGFβの発現量が少ないことが考えられた。そこで、TGFβの関与が知られている慢性炎症モデルを用いて、炎症を誘導して中長期間におけるIL-9産生細胞の評価を始めている。また、本目的以外にもアジュバンドとしてLPSのほかにAlumや真菌の死菌を使ったときに、IL-9だけでなく、他のサイトカインの産生量や産生パターンに変化があり、アジュバンドによるTh細胞からのサイトカイン産生パターンの違いもわかってきた。こちらも平行して研究する。<in vivo Th9細胞を検出する評価系(ova惹起の気道炎症モデル)の構築>オバアルブミン(ova)特異的なTCRを持つOTIITgマウスからナイーブCD4 T細胞を単離し、レシピエントマウスであるCD45.1コンジェニックマウスに静脈内投与し、24時間後にovaをLPSと一緒にマウスに経鼻投与した。ovaとLPS投与して2日後と4日後にovaを経鼻投与し、翌日にこれらのマウスから顎下リンパ節、肺、脾臓から移入したCD4T細胞を単離し、抗原提示細胞を加えて3日間ova peptideで刺激した。細胞培養上清に含まれるIL-9量をELISAにより測定したところ、ova+LPSで免疫しなかった個体から単離した移入CD4T細胞と比較して、はるかに高濃度のIL-9が蓄積していた。この結果からin vivoでTh9細胞が分化誘導したことが示唆された。さらに、それらの細胞を細胞内染色したところ、10%から50%のIL-9陽性細胞が検出された。IL-9発現強度は、in vitroでTh9細胞を分化誘導させた場合とほぼ同程度であり、量及び質共にTh9細胞が分化誘導していることが明らかとなった。したがって、in vivoでTh9細胞を分化誘導させ、Th9細胞からのIL-9産生量、及びTh9細胞の分化した細胞数の割合を検出する評価系を構築することができた。本来の目的であるTh9細胞の分化における転写因子GFI1の役割を解明するため、OTII TgマウスをGFI1ノックアウトマウスと交配させ、OTII Tg GFI1ノックアウトマウスを作製した。GFI1ノックアウトマウスとその同腹の野生型マウスを比較したところ、明らかな有意差をもって、GFI1ノックアウトマウスでTh9細胞数の割合、及び細胞培養上清IL-9の蓄積量が増加していた。レポーターマウスなどを用いないと目的を達成しできないと想定していたが、現在我々が保持しているツールで目的を達成することができた。当初の目的として挙げてきたin vivoでTh9細胞を分化誘導し、Th9細胞数やILー

9産生量を評価できる実験系を構築することができた。これまで他の研究者から報告されてきた実験系では再現できず、他の研究者も同様な意見を持っており、高いハードルかと思われたが、研究費のサポートと根気よく実験を進めることで、極めて再現性の高い評価系を構築することができた。さらに上記の実験から、Th9細胞のサイトカイン産生がどの組織で起きているのかヒントとなる大変興味深いデータを得ることができた。炎症が起きたときに生体内のどの組織や領域でT細胞がサイトカインを産生しているか明らかにできれば、免疫学を理解する上で、一歩前進することができると思われる。in vivoでのTh9細胞分化における転写因子GFI1の役割を評価するため、はじめにオボアルブミン(ova)特異的なTCRを持つOTIIトランスジェニック(Tg)マウスを転写因子GFI1遺伝子欠損(KO)マウス、あるいは野生型(WT)マウスと交配させて、OTII GFI1 KOマウスとOTII GFI1 WTマウスを作製した。これらのマウスからナイーブCD4T細胞を単離し、それらの細胞をレシピエントマウスであるCD45.1コンジェニックマウスに静脈内投与し、翌日ovaとpapain(もしくはLPS)の混合液を麻酔下のマウスに経鼻投与し、その2日後と4日後に再度ovaを経鼻投与した。最後にovaを経鼻投与した翌日にマウスから顎下リンパ節、肺、脾臓を摘出して、移入したCD4T細胞を含む免疫細胞を単離し、抗原提示細胞の存在下で3日間ova peptideで刺激した。細胞培養上清に含まれるIL-9量をELISAにより測定したところ、GFI1 KOマウスのCD4T細胞を移入したマウスから単離した細胞では、GFI1 WTマウスのCD4T細胞を移入したマウスから単離した細胞と比較して、IL-9産生が統計的有意差を持って亢進していた。また、それらの細胞を細胞内染色したところ、GFI1 KOマウスのCD4T細胞では、GFI1 WTマウスのCD4T細胞と比較して、IL-9陽性細胞の割合が統計的有意差を持って亢進し、さらに、蛍光標識された抗IL-9抗体の蛍光強度も増加していた。これらの結果から、in vivoにおいても転写因子GFI1がCD4T細胞のIL-9産生、つまりTh9細胞の分化、および細胞あたりのIL-9産生量を抑制的に制御していることが強く示唆された。我々が同定したTh9細胞の分化を調節する転写因子について、in vivoにおける役割を検証するため、in vivo Th9細胞分化誘導評価系の構築を行なった。OVA抗原とアジュバンドを用いてin vivoでTh9細胞の分化を誘導させ、その指標となるIL-9産生を細胞内染色法で検出することに成功した。さらにより詳細にIL-9細胞の分化誘導の違いを検出するため、in vivoで分化誘導したTh9細胞を、in vitroにおいて抗原提示細胞存在下で抗原刺激し、細胞培養液中のIL-9の濃度を測定することで、in vivoにおけるTh9細胞の分化誘導の程度を詳細に評価することに成功した。気道炎症モデルをこれまでの短期間(12週間)から、中期間(24週間)にシフトさせる。
熱帯域における成層圏－対流圏力学結合過程

研究体制は、研究手法をもとに、理論・力学モデル班、データ解析班、現業的応用実験班、からなる3班体制とし、各班が密接に連携をして、階層的数値モデル群を駆使した系統的実験、得られたデータを基にした理論構築、および新理論に基づく観測解析データ・モデル出力データの解析を行い、総合的研究を推進している。各班の平成30年度の研究実績の概要は以下の通りである:(1)理論・力学モデル班:成層圏部分を十分に解像する三次元領域気象モデルを長期間時間積分することにより、成層圏でらせん状に風向変化する水平平均風の場が回転・変形しつつ下方に位相伝播する自励的周期的変動解を初めて得た。また、全球メカニスティック大気モデルの構築に必要な球面調和関数変換において、新しい漸化式を発見したことにより、変換に必要な計算時間を大幅に削減することに成功した。(2)データ解析班:気象庁長期再解析データJRA-55と衛星データを用いて、2018年2月に生起した極渦分裂型の成層圏大規模突然昇温現象について、熱帯域を中心に下部熱圏高度までの力学場の詳細な解析を行い、過去の事例との比較を行った。赤道成層圏準二年周期振動(QBO)に伴う北半球冬季極渦や亜熱帯ジェットの変動状態とその変動機構を調査した。また、全球非静力モデルと客観解析データを用いて、成層圏力学場が台風の発生・発達に与える影響の評価を行った。(3)現業的応用実験班:熱帯成層圏におけるQBOを再現できる気象研究所地球システムモデルを用いて、地球温暖化に伴う気候変化を調べる実験を行った。そのモデル出力データや再解析データを解析して、成層圏から対流圏への影響について調べた。QBOがインド洋から西部太平洋にかけての北半球夏季季節内振動の強さに影響を及ぼすこと、成層圏突然昇温がとくに南太平洋での対流活動および熱帯低気圧の発生頻度に影響を及ぼすことを明らかにした。各班とも研究は概ね順調に進展している。昨年度と同様に、5月の日本気象学会春季大会、日本地球惑星科学連合2018年大会等で、関連研究者が集合し、各班の研究手法の確認なども含めて情報共有を行った。今後も引き続いて、短期間の成層圏突然昇温から、QBO、成層圏寒冷化までの成層圏変動ごとに、熱帯域における湿潤対流駆動の多階層な連結変動への下方影響を評価し、予測改善インパクト実験を行う。また、課題ごとにデータ解析と数値実験を並行して実施する。(1)理論・力学モデル班:熱帯域湿潤対流の多階層連結変動に関する理論展開を目指して、領域気象モデルを用いて積雲対流の集団化組織化に対する成層圏影響の評価実験を進める。また、計算高速化を図った大気大循環力学モデルにより、不安定周期変動解の数値的解析を進めていく。(2)データ解析班:データ整備と更新を継続し、2018年12月末から2019年1月にかけ、長く継続して生起した大規模成層圏突然昇温に注目し、下部熱圏高度までの詳細な解析を行って、従前の事例との比較研究を進める。(3)現業的応用実験班:成層圏の変動を再現できる気象研究所地球システムモデル、および領域非静力学モデルによる実験結果から、成層圏から対流圏の熱帯対流活動・季節内変動・熱帯低気圧等への下方影響の評価を行う。また、国内の定期的研究集会では、研究参画者ができる限り集合して、進捗状況の確認と情報交換を行うとともに、国内外の関連研究集会に積極的に参加して、最新成果を発表し研究交流をさらに進める。さらに、今年度末に京都で成層圏-対流圏結合を軸とした国際研究集会を開催して、3年間にわたる研究推進の総まとめを行う。

QBOがインド洋から西部太平洋にかけての北半球夏季季節内振動の強さに影響を及ぼすこと、成層圏突然昇温がとくに南太平洋での対流活動および熱帯低気圧の発生頻度に影響を及ぼすことを明らかにした。各班とも研究は概ね順調に進展している。昨年度と同様に、5月の日本気象学会春季大会、日本地球惑星科学連合2018年大会等で、関連研究者が集合し、各班の研究手法の確認なども含めて情報共有を行った。理論・力学モデル班、データ解析班、現業的応用実験班、からなる3班の研究体制を構築し、各班が密接に連携をして、階層的数値モデル群を駆使した系統的実験、得られたデータを基にした理論構築、および新理論に基づく観測解析データ・モデル出力データの解析を行った。熱帯域における湿潤対流を駆動源とした成層圏-対流圏結合変動について、現象の記述と力学過程の理解から最先端モデルによる将来予測までの総合的研究を推進している。各班の平成29年度の研究実績の概要は以下の通りである:(1)理論・力学モデル班:鉛直・水平2次元の領域気象モデルにおいて自励的に生じた成層圏の準二年周期振動(QBO)的変動が対流圏の積雲対流にどのような影響を及ぼすのかを調べ、QBOの位相によって、大気下層で水平風の鉛直シアが強い位相では積雲対流が強化され、雲層上端付近で風速シアが強い位相では積雲対流が弱化されることを明らかにした。(2)データ解析班:衛星データを用いて、成層圏突然昇温生起前後の下部熱圏領域までの全球的子午面循環の変動特性について解析した。気象庁長期再解析JRA-55ファミリーデータや多数の気候モデルにおける成層圏突然昇温の発現頻度等を調査した。JRA-55、対流雲活動衛星観測データを用いて、熱帯下部成層圏の循環場の変動が熱帯の積雲対流活動に与える影響を調べた。また、JRA-55、ERA-Interim、MERRA、MERRA2の再解析データ間の赤道域力学場の比較を行った。(3)現業的応用実験班:気象研究所地球システムモデルの改良を行い、鉛直解像度の向上、非地形性重力波のパラメータリゼーションの実装等により、熱帯成層圏におけるQBOの振幅や周期をある程度再現できるようになった。そのモデルによるQBO相互比較実験(QBOi)と関連する追加実験の結果を用いて、QBOの再現性や力学的特徴を調べた。研究体制構築は順調に進んでいる。5月の日本気象学会春季大会、日本地球惑星科学連合2017年大会等で、関連研究者が集合し、各班の研究手法の確認なども含めて情報共有を行った。今後も引き続いて、短期間の成層圏突然昇温から、QBO、成層圏寒冷化までの成層圏変動ごとに、熱帯域における湿潤対流駆動の多階層な連結変動への下方影響を評価し、予測改善インパクト実験を行う。また、課題ごとにデータ解析と数値実験を並行して実施する。(1)理論・力学モデル班:熱帯域湿潤対流の多階層連結変動に関する理論展開を目指して、領域気象モデルを用いて積雲対流の集団化組織化に対する成層圏影響の評価実験を進める。また、計算高速化を図った大気大循環力学モデルにより、不安定周期変動解の数値的解析を進めていく。(2)データ解析班:データ整備と更新を継続し、2018年12月末から2019年1月にかけ、長く継続して生起した大規模成層圏突然昇温に注目し、下部熱圏高度までの詳細な解析を行って、従前の事例との比較研究を進める。
診療参加型歯科臨床実習における学習効果の可視化ーeポートフォリオの開発ー

近年,歯学部・歯科大学では技能教育の改善が求められ,診療参加型臨床実習の実践が推奨されている.学生が実際の診療の中でどのようなことを感じ,学習し,どのような指導を受けたか,という学習過程,日々の臨床実習での学習活動を記載する電子ポートフォリオを開発し経時的に記録・評価をおこなった.臨床実習が進むにつれ,ポートフォリオに記載された教員による学生の評価は向上しており,経験を積むことによる学生の臨床能力向上が反映されたものと推察された.以上のことから,臨床実習における電子ポートフォリオの導入は,学生自身の振り返りや教員の学生指導にとって有用であると考えられた.新潟大学歯学部では従前より、学生を担当医の一人と位置づけておこなう診療参加型の臨床実習を実施しているが、(経験すべき)「ミニマムリクワイアメント」の達成と、処置ごとに定められた「実習点数」合計点の目標到達をもって、臨床能力を身につけたとする、いわゆる「みなし評価」を行ってきた。しかしながら、より統合的な臨床能力を評価し、学習成果を実体化することを目的として、2011年度より紙のポートフォリオを、さらに2013年度からはweb統合型データベースを応用した電子化ポートフォリオを導入した。(本システムの特徴)本システムは電子化による入力の簡便性、どこからでもアクセスでき、瞬時に検索ができ、振り返り学習ができる利便性を有している。学習者にとってのメリットだけでなく、教員にとっても臨床実習の進行度や学生の成長などが一元的に閲覧、比較検討できるなどの利便性を供与することが可能となった。新潟大学で行っている診療参加型の歯科臨床実習において、総合的な臨床能力を評価し、学習成果を実体化することを目的として、2011年度から紙媒体によるポートフォリオを、2013年度からはweb統合型データベースを応用した電子ポートフォリオを開発して導入した。本研究はその電子ポートフォリオの開発並びに学生の学習促進についての研究を主眼に置いているが、本年度は開発・導入初年度からさらに改良、バージョンアップを重ね、1学生、教員の両者が使いやすいシステムつくり(メールシステムの導入と実装など)2多様なメディアを同梱できるシステムの開発(紙媒体、動画の取り込み機能など)3記入された膨大なテキストデータの解析を主に推進した。本研究の取り組みは研究内容を発表した日本歯科医学教育学会でも注目されるところとなり、「システム開発賞」を受賞した。また、近年の歯科臨床実習の充実への全国的な取り組みとも相まって、国内関係者から注目されるところとなっている。本年度はデータベース、webサーバともにシステムの更新を行い、利用者への利便性を高めることができた。上記に挙げたように、学生から教員へポートフォリオ作成を通知できるメールシステムをポートフォリオシステムに実装し、また、各種の紙媒体を手軽に取り込み、ポートフォリオに貼り付けできるような機能及び環境を整備した。入力されたテキストデータについて、テキスト間イニングの手法を応用して、現在解析作業を進めている。新潟大学で行っている診療参加型の歯科臨床実習において、総合的な臨床能力を評価し、学習成果を実体化・可視化することを目的として、2011年度から紙媒体によるポートフォリオを、2013年度からはweb統合型データベースシステムを応用した電子ポートフォリオを開発して導入した。本研究はその電子ポートフォリオの開発ならびに学生の学習促進についての研究を主眼に置いているが、研究期間を通して電子化による入力の簡便性、どこからでもアクセスでき、瞬時に検索でき、振り返り学習ができる利便性を供与することができた。また、開発当初から年次ブラッシュアップを重ね、学生・教員の両者が使いやすいシステムつくりの推進(メールシステムの導入と実装など)、多様なメディアを同梱できるシステムの開発(紙媒体・動画の取り込み機能)、記入された膨大なテキストデータの質的分析(テキストマイニング)などを実施することができた。本研究の推進により、これまで必ずしも整理された形で実体化されていなかった、学生が何を考え、どのような指導・評価を受け、どのようなことを学んだか、という学習および成長の過程を一連のポートフォリオの作成及び評価の積み重ねによって可視化することが可能となり、学習者・教員双方にメリットのある、効率的な歯科臨床実習マネージメントシステムが構築され、日々運用を継続している。この取り組みは研究内容を発表した日本歯科医学教育学会でも「システム開発賞」を受賞し、近年の歯科臨床実習の充実への全国的な機運とも相まって、国内関係者から注目されるところとなった。近年,歯学部・歯科大学では技能教育の改善が求められ,診療参加型臨床実習の実践が推奨されている.学生が実際の診療の中でどのようなことを感じ,学習し,どのような指導を受けたか,という学習過程,日々の臨床実習での学習活動を記載する電子ポートフォリオを開発し経時的に記録・評価をおこなった.臨床実習が進むにつれ,ポートフォリオに記載された教員による学生の評価は向上しており,経験を積むことによる学生の臨床能力向上が反映されたものと推察された.以上のことから,臨床実習における電子ポートフォリオの導入は,学生自身の振り返りや教員の学生指導にとって有用であると考えられた.2013年より、先行して所有していたサーバーを用いて、試験的に電子化ポートフォリオの開発と運用を行っていたが、2014年からは科学研究費の助成を受け、新たなサーバシステム、基幹データベースソフトウェアを導入することができた。これにより、2014年11月から臨床実習を開始した現歯学科6年生ではより多機能なweb統合型データベースシステムとして電子化ポートフォリオによる学習環境を提供することができた。また、2015年4月からは上記システムを応用して口腔生命福祉学科(歯科衛生士教育)の臨床実習においても、電子化ポートフォリオを導入する準備が整った。引き続き臨床実習でのポートフォリオ活用を推進する。

現在、歯学科および口腔生命福祉学科(社会福祉士・歯科衛生士養育過程)の両学科において、最終学年で行われる臨床実習に本システムが導入されており、学生が日々の臨床実習で得た知識や今後の改善策などが自分の言葉で自由文テキストとして記載され、教員も同じくフィードバックコメントを記載している。最終年度に当たる28年度においては、さらなるシステムのブラッシュアップを図ると同時に、これらのコンテンツ解析をすすめ、学生の学びや、難しいと感じている点などをピックアップするとともに、どのような教育を行うことが有効なのか、本システムの機能を用いて解析していく予定である。口腔外科学引き続き臨床実習での電子化ポートフォリオの運用を継続する。この電子化ポートフォリオには学生が臨床実習で得た知識、今後の改善策などが自分の言葉で記載されており、それに対する教員からのフィードバックコメントも記載され、日々その枚数は増加している(2013年11月-2014年10月:約1300枚、2014年11月-2015年3月現在:約1600枚)。これらのコンテンツ情報を解析し、学生の学びや何を難しいと感じているか、それに対してどのような指導を行えば効果的なのか、などをさらに明らかにしていく。旅費等が早期予約などによって安価にすることができた。また、学生に使用させるPC端末なども当初予定より安価に調達することができた。当初予定していたサーバー関連機器が予定より安価に購入することができた。また、旅費についても予算よりも安価に決済することが可能であった。学生に利用させているカラープリンター消耗品および論文執筆のための資料収集・コピーおよび文献購入のために使用予定である。学生の利便性を高めるためのネットワーク機器、サーバーの保守管理に関する機器の導入に充てる予定。2015年度日本歯科医学教育学会において教育システム開発賞を受賞
肺癌抗体治療のターゲット分子におけるスプライス異常と効果の分子生物学的相関研究

本研究では、肺癌抗体治療のターゲット分子におけるスプライス異常と治療効果との分子生物学的相関について検討している。まずは肺癌の実臨床で使用開始となった抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体の治療効果とPD-1、PDL-1におけるスプライスバリアントとの関連を検討中であり、平成29年度は、肺癌細胞株20種と肺癌臨床検体40検体からRNA、cDNAライブラリーを作製、4種類のPD-1スプライスバリアントと、7種類のPD-L1スプライスバリアントを判別するためのプライマーセット5組と7組をそれぞれ設計した。これと並行して、非小細胞肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体も現時点で29症例を集積し、ライブラリーに加え解析中である。本研究では、肺癌抗体治療のターゲット分子におけるスプライス異常と治療効果との分子生物学的相関についての検討を、下記研究計画で進めている。1全エクソンアレイによるスプライスバリアントおよびスプライス異常が疑われる遺伝子を同定する。2注目分子のスプライスバリアントを判別するためのプライマーセットを設計し、PCRによるスプライスパターンを推定する。3cDNAシークエンスでのスプライスパターンや、さらにgenomicDNAシークエンスによるスプライス異常(point mutation/insertion/deletion等)を確定する。4スプライス異常により新たに生産される蛋白についてもその機能を推定する。現在までに、1でまずPD-1、PD-L1に注目し、肺癌細胞株20種と肺癌臨床検体40検体を用いて2を行い、抗体療法の効果と相関している可能性が示唆されるバリアントを絞り込んだ。しかし、予想外にバリアントが多く、プライマーの作製に時間を要した。また、非小細胞肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体集積にも時間を要した。現在は、非小細胞肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体集積もなされたため、この解析を行い、治療効果との関連を検討するとともに、3の準備中である。また、PD-1、PD-L1だけでなく、PD-L2、VEGF、CTLA-4などの検討分子に対しても、プライマーセットを設計し、PCRによるスプライスパターンの推定を行っているところである。2に関して、抗PD-1抗体(Nivolumab)投与によるresponse群とnon-response群のPD-1 splice variantを比較することで、抗PD-1抗体(Nivolumab)のエピトープを含むvariant aが存在しても他のvariantが混在していれば治療効果に影響を及ぼすか否かが判明する。その結果を踏まえ、スプライスバリアントが治療効果に影響を及ぼすのであればその先の3の解析に進み、PD1、PD-L1のcDNAシークエンスでのスプライスパターンや、さらにgenomic DNAシークエンスによるスプライス異常(point mutation/insertion/deletion等)を確定することができる。同時に、PD-L2、VEGF、CTLA-4などひろげた検討分子に関して、2を完了し、3に備える。現在は、非小細胞肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体集積もなされたため、最初に注目したPD-1、PD-L1の3の工程が終了すれば、そのノウハウを元に他の分子に関してはスムースに2・3が行え、解析・検討が進められると考えている。複数の癌領域において、免疫チェックポイント療法などの抗体薬による治療が奏効することが知られている。しかしながら奏効例と非奏効例において、その効果を分ける生物学的相違の背景は未だ不明であり、極めて高額な抗体薬を治療効果の予測がつかない状況で投与しているのが現状である。免疫系は極めて多様で、その多様性を担保するために選択的スプライシングによって生成されるスプライスバリアントが複数存在する。抗体薬治療においては抗体が作用する部位の配列異常やスプライス異常が存在すれば抗体薬の効果は期待できず、治療効果を左右している可能性がある。まずは肺癌の実臨床で使用開始となった抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体の治療効果とPD-1、PDL-1におけるスプライスバリアントとの関連を検討中であり、下記研究計画で進めている。本年度は1で注目した遺伝子に対して、2・3を進めるために肺癌細胞株20種と肺癌臨床検体40検体からRNA、cDNAライブラリーを作製した。また肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体も集積し、ライブラリーに加えている。現在、PD-1、PD-L1に1で注目し、2を終え、3の準備を行っているところである。現在までに、複数の肺癌細胞株での全エクソンアレイ解析で、PD-1、PD-L1の複数のスプライスバリアントの存在を確認した。それぞれのスプライスバリアントを判別するためのプライマーセットを設計し、PCRによるスプライスパターンの推定を可能とした。肺癌細胞株20種と肺癌臨床検体40検体を用いて作製したライブラリーで、PD-1、PD-L1のスプライスパターンをPCRで解析し、抗体療法の効果と相関している可能性が示唆されるバリアントをすでに絞り込んだ。

また、研究代表者本人の外科治療に伴い、研究全体の進行に遅れが生じた。現在は、プライマーセットの設計は完了し、肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体も集積中であり、治療効果との関連を同時に解析し、3の準備を整えている状況である。また、PD-1、PD-L1だけでなく、PD-L2、VEGF、CTLA-4など検討分子をひろげてプライマーセットを設計し、PCRによるスプライスパターンの推定を行っているところである。本研究では、肺癌抗体治療のターゲット分子におけるスプライス異常と治療効果との分子生物学的相関について検討している。まずは肺癌の実臨床で使用開始となった抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体の治療効果とPD-1、PDL-1におけるスプライスバリアントとの関連を検討中であり、平成29年度は、肺癌細胞株20種と肺癌臨床検体40検体からRNA、cDNAライブラリーを作製、4種類のPD-1スプライスバリアントと、7種類のPD-L1スプライスバリアントを判別するためのプライマーセット5組と7組をそれぞれ設計した。これと並行して、非小細胞肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体も現時点で29症例を集積し、ライブラリーに加え解析中である。本研究では、肺癌抗体治療のターゲット分子におけるスプライス異常と治療効果との分子生物学的相関についての検討を、下記研究計画で進めている。1全エクソンアレイによるスプライスバリアントおよびスプライス異常が疑われる遺伝子を同定する。2注目分子のスプライスバリアントを判別するためのプライマーセットを設計し、PCRによるスプライスパターンを推定する。3cDNAシークエンスでのスプライスパターンや、さらにgenomicDNAシークエンスによるスプライス異常(point mutation/insertion/deletion等)を確定する。4スプライス異常により新たに生産される蛋白についてもその機能を推定する。現在までに、1でまずPD-1、PD-L1に注目し、肺癌細胞株20種と肺癌臨床検体40検体を用いて2を行い、抗体療法の効果と相関している可能性が示唆されるバリアントを絞り込んだ。しかし、予想外にバリアントが多く、プライマーの作製に時間を要した。また、非小細胞肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体集積にも時間を要した。現在は、非小細胞肺癌に対して抗体療法を行った症例の検体集積もなされたため、この解析を行い、治療効果との関連を検討するとともに、3の準備中である。また、PD-1、PD-L1だけでなく、PD-L2、VEGF、CTLA-4などの検討分子に対しても、プライマーセットを設計し、PCRによるスプライスパターンの推定を行っているところである。最初に注目した分子であるPD1、PD-L1のcDNAシークエンスでのスプライスパターンや、さらにgenomic DNAシークエンスによるスプライス異常(point mutation/insertion/deletion等)をまず確定し、治療効果との関連を解析する。