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仏教写本に基づく「タイ及びその周辺地域のパーリ語」研究

本年度は、昨年度実施したタイ国立図書館所蔵写本のローマ字転写から「タイ及びその周辺地域のパーリ語」を分析しながら校訂テキストを作成し和訳すること、物語の内容研究、さらに、それらを博士論文を完成させることを目指した。「タイ及びその周辺地域のパーリ語」を保持する校訂テキストを作成するために、底本の選び方を決定し、それに従いすべての物語の底本を決定した。そして、それらの定本と異なる読みである場合、異読を脚注に記し、写本を校合し、校合したテキストをもとにして、和訳を進めながら既刊の辞書にはない綴りや主語と動詞が一致しない等の文法の崩れがある場合には、脚注において、校訂を加えた。また、校訂した語については、写本上の読みと校訂した読みとをパーリ正典のデータベースで検索するなどして、写本上の読みが一般的なものであるのか否かを分析し、統一した校訂方針のもとで校訂テキストを作成した。作成した校訂テキストは、『マーレッヤ長老物語註』、『コーサラ国仏像縁起譚』、『目連尊者の問い』、『目連尊者の物語』、『スピナクマーラ物語』の5話である。昨年度タイ国立図書館で転写した写本に『目連尊者の涅槃』もあるが、写本の転写が未完であったため、校訂テキストの作成に至ることはできなかった。『マーレッヤ長老物語註』は、タイ人研究者の修士論文としてタイ文字版のパーリテキストとタイ語訳が発表されているが、本研究では、異なる底本に基づきローマナイズテキストを作成し直し、和訳した。『マーレッヤ長老物語註』以外の4つの物語は、すべて初校訂テキスト・初訳である。物語の内容研究として『コーサラ国仏像縁起譚』については、仏像起源伝説を説く他のパーリ語文献との関連を明らかにし、その研究成果を『東海仏教』第57号に発表した。『マーレッヤ長老物語註』については、註釈に引用される文献を研究した結果、パーリ三蔵ではなく、蔵外仏典から引用して註釈を加えており、その引用関係からこの注釈文献がどのような知識に基づいて著作されたのかが分かってきた。『スピナクマーラ物語』については、タイの古謡『サーマネーン・スピンの物語』のパーリ語版であり、出家の功徳を説く物語であることがわかった。本年度のフィールド調査としては、『コーサラ国仏像縁起諌』などに説かれる仏像起源伝説をモチーフにして描いたとされる寺院壁画の調査をエクパノン寺(バッタンボン・カンボジア)やトーンノパクン寺(バンコク)などにおいて実施し、タイ国立図書館とチュラロンコン大学(バンコク)で『マーレッヤ長老物語註』などに引用される文献資料や先行研究の収集を行った。本研究は、タイ及びその周辺に伝わる正典外仏典の写本に基づき、「タイとその周辺地域のパーリ語」がどのような特徴を有する言語であるのかを明らかにするものであるが、本研究を遂行するには既に入手された資料だけでは不十分である。そこで、積極的にフィールドワークを実施し、写本資料を収集した上で、他の南伝仏教国に伝わる三蔵とを比較研究しなければならない。本年度はその第一段階として研究対象である写本の所蔵がカタログに報告されていたデンマーク王立図書館及び大英図書館においてフィールドワークを実施。デンマーク王立図書館において『プラ・マーライ』写本2本、その他蔵外仏典写本8本、大英図書館において『プラ・マーライ』写本12本を調査した。保存状態のよい『プラ・マーライ』写本に関してはパーリ三蔵抄録の箇所をローマナイズし、その他蔵外仏典写本に関してはカタログ情報を確認し、詳細を付け加え、資料を収集した。既に収集していた写本資料に本調査によるデータを加え、『プラ・マーライ』写本にあるパーリ三蔵の抄録とスリランカのパーリ三蔵に基づいたPali Text Societyの刊本、さらにミャンマーのパーリ三蔵データベース(Cha□□asa□gayana)間に見られるパーリ語の差異を抽出し、正典であるパーリ三蔵における「タイのパーリ語」の特徴を導き、1936年にMartiniによってなされたインドシナパーリの分析と対照した。また、スリランカの仏教説話から発展したと考えられる「プラ・マーライ」文献は、タイにおいて地域や社会層に応じて様々なヴァージョンが語り継がれている。その物語の中でもマーライ尊者の地獄巡りの記述に着目し、そこに現れる引用文に基づき、それら様々な「プラ・マーライ」文献がどのような順序で成立してきたのかを考察し、発表した。本研究は、タイおよびその周辺地域に伝わるパーリ語からをローマナイズ校訂テキストをつくるために「タイおよびその周辺地域のパーリ語」の特徴を明らかにするものである。本研究を遂行するため平成23年2月28日まで、優秀若手研究者海外派遣事業によりタイのチュラロンコン大学タイ研究所において、タイ語の習得と写本資料の収集に重点をおき、研究を進めた。タイ語の習得のために海外派遣期間中の受入研究者であるSuchitra Chongstitvatana先生よりTheekayu Jiamjuankhao先生をご紹介頂いた。Theekayu先生は、サンスクリットやパーリ語にも精通されており、タイ語を学びながら、サンスクリットやパーリ語がタイ語にどのような影響を及ぼしているのかを一年間享受頂いた。タイ語の読み・書き・会話を満遍なく習得することができ、タイ中央部でのフィールド調査に対応できるスキルを身につけることができた。タイ国立図書館古文書室に所蔵されている写本調査のため、Suchitra Chongstitvatana先生に研究協力を依頼し、The National Research Council of Thailandへ研究許可を申請。

タイ国立図書館で貝葉写本を調査する許可を取得することは非常に難しいと言われていたが、平成22年度8月から平成23年度2月までの研究許可を取得でき、タイ国立図書館に所蔵されている正典外仏典写本(『マーレッヤヴァットゥディーパニーティーカー』、『モッガラーナビンバパンハー』、『コーサラビンバパンハー』、『モッガラーナヴァットゥ』、『モッガラーナニッバーナ』)の23本の写本をローマナイズ転写した。図書館に所蔵されている写本の量も質も予測以上であり、帰国間際までこれらの調査に追われ、寺院での写本調査には至らなかった。帰国後、国立図書館でローマナイズしたデーターを校合し、仮校訂テキストの作成を進めた。本年度は、昨年度実施したタイ国立図書館所蔵写本のローマ字転写から「タイ及びその周辺地域のパーリ語」を分析しながら校訂テキストを作成し和訳すること、物語の内容研究、さらに、それらを博士論文を完成させることを目指した。「タイ及びその周辺地域のパーリ語」を保持する校訂テキストを作成するために、底本の選び方を決定し、それに従いすべての物語の底本を決定した。そして、それらの定本と異なる読みである場合、異読を脚注に記し、写本を校合し、校合したテキストをもとにして、和訳を進めながら既刊の辞書にはない綴りや主語と動詞が一致しない等の文法の崩れがある場合には、脚注において、校訂を加えた。また、校訂した語については、写本上の読みと校訂した読みとをパーリ正典のデータベースで検索するなどして、写本上の読みが一般的なものであるのか否かを分析し、統一した校訂方針のもとで校訂テキストを作成した。作成した校訂テキストは、『マーレッヤ長老物語註』、『コーサラ国仏像縁起譚』、『目連尊者の問い』、『目連尊者の物語』、『スピナクマーラ物語』の5話である。昨年度タイ国立図書館で転写した写本に『目連尊者の涅槃』もあるが、写本の転写が未完であったため、校訂テキストの作成に至ることはできなかった。『マーレッヤ長老物語註』は、タイ人研究者の修士論文としてタイ文字版のパーリテキストとタイ語訳が発表されているが、本研究では、異なる底本に基づきローマナイズテキストを作成し直し、和訳した。『マーレッヤ長老物語註』以外の4つの物語は、すべて初校訂テキスト・初訳である。物語の内容研究として『コーサラ国仏像縁起譚』については、仏像起源伝説を説く他のパーリ語文献との関連を明らかにし、その研究成果を『東海仏教』第57号に発表した。『マーレッヤ長老物語註』については、註釈に引用される文献を研究した結果、パーリ三蔵ではなく、蔵外仏典から引用して註釈を加えており、その引用関係からこの注釈文献がどのような知識に基づいて著作されたのかが分かってきた。『スピナクマーラ物語』については、タイの古謡『サーマネーン・スピンの物語』のパーリ語版であり、出家の功徳を説く物語であることがわかった。本年度のフィールド調査としては、『コーサラ国仏像縁起諌』などに説かれる仏像起源伝説をモチーフにして描いたとされる寺院壁画の調査をエクパノン寺(バッタンボン・カンボジア)やトーンノパクン寺(バンコク)などにおいて実施し、タイ国立図書館とチュラロンコン大学(バンコク)で『マーレッヤ長老物語註』などに引用される文献資料や先行研究の収集を行った。
サンゴ保全に向けての異分野連携によるサンゴ幼生分散距離の解明

造礁サンゴ幼生の親からの分散距離を、生態学、海洋物理学、工学が連携した野外研究で明らかにすることを目的に、本研究を実施した。生態学的調査から、520 kmの空間的広がりの中で成熟したサンゴが増加すればそれら地域内で幼生定着量が増加するが、50 km以上離れた海域間ではある海域でのサンゴの増加が、他海域の幼生定着量の増加をもたらさないことが明らかとなった。これら結果と海水流動測定の結果から、沖縄島西岸および慶良間諸島では、サンゴのなかで幼生の親からの分散距離が比較的長い放卵放精型のミドリイシ属サンゴにおいて、多くの幼生の親からの分散距離が20 km以内であることが示唆された。生態学的調査:ミドリイシ属サンゴ幼生の親からの分散距離を推定するために、沖縄県内4地域のサンゴ礁28地点において、6月の当該サンゴ放卵放精前までにサンゴ幼生定着基盤を設置、2か月後に回収し、基盤上に定着したサンゴ幼生を計数した。回収時には各地点におけるサンゴ群集調査も実施し、親サンゴの分布状況および大きさ組成と、自然に見られる幼サンゴ群体の密度を記録した。海流輸送パターン:沖縄科学技術大学院大学が所有する位置情報を発信できるドリフターを、親サンゴが多く分布する沖縄本島西海岸、慶良間諸島、久米島を含む複数地点より投入・追跡した。これらのドリフターの軌跡から、琉球列島周辺のサンゴ礁を起点とする海流輸送経路の推定を現在行っている。現有のドリフターはその構造的に浅いサンゴ礁では使用が制限されるため、より小型のドリフターを本研究費で開発した。また、サンゴ礁海域の海水流動測定ができる、高分解能海洋レーダの完成に向けて基本的構成法の確立と機能検証を行った。ソフトウェア無線技術を用いてUHF帯413MHz利用のFMCW(Frequency Modulated Continuous Wave)レーダを構成し、その評価実験を行った。サンゴ礁海域内で120 m程度の距離分解能を確保するために、約1.2MHzの帯域幅を掃引することになるが、送信機および受信機の基本的構成法での実験から、十分レーダとして動作することは確認できた。さらに、この基礎的実験の成果を基に、アレイアンテナ処理のための8受信機構成での信号処理に関する検討を開始した。生態学的調査:平成27年度はサンゴ幼生定着基盤が台風のため消失することもなく、ほぼ全てが回収でき、かつサンゴ群集調査も予定通り実施することができ、親サンゴの分布量と幼生定着量を統計モデルで解析するためのデータが揃いつつある。海流輸送パターン:最大の懸案であった小型ドリフターのプロトタイプを7機、昨年度中に製作し、簡易な漂流試験まで終えることができた。今年度はさらなる運用試験を行う。旧来からのドリフターの解析も進め、0100 kmの空間スケールでの幼生分散を検証するに足る定量的・統計的データを揃えることができる。サンゴ礁海域を高分解能に流動観測できることを目指した、UHF帯周波数を利用したFMCWレーダを、ソフトウェア無線技術を用いて構築できた。その結果、要求される距離分解能について、その元となる送信信号の1.2MHz帯域幅の連続周波数掃引が可能であることを示した。また、その基本的な構成を用いて送受信実験を行い、基礎的な検証が行えた。加えて、方位分解を行うためのアレイアンテナ構成において、8受信機同時信号入力時の計算負荷についての知見を得た。これを元に信号処理法の検討が開始できた。生態学的調査については、沖縄県内4地域のサンゴ礁28地点において、ミドリイシ属サンゴ幼生の親からの分散距離を推定するために、6月の当該サンゴ放卵放精前までにサンゴ幼生定着基盤を設置、2か月後に回収し、基盤上に定着したサンゴ幼生を計数した。また、親サンゴの卵生産量調査も実施した。レーダによる海水流動観測については、サンゴ礁海域の海水流動測定ができる、高分解能海洋レーダの完成に向けて構成法の確立と機能検証を行った。アンテナについては、レーダ方式としてFMCW方式を採用しているため、モノスタティック構成の場合、ダイナミックレンジ確保のため送信出力の受信機への直達波信号レベルを最小限に抑えることが重要になる。この送受信機間干渉を所望のレベルに抑えることができるアンテナ指向性パターンをもつ送信アンテナを検討し実験を行った。また、ソフトウェア無線技術を用いたUHF帯レーダの性能評価として、テレビ送信信号を用いて検証を実施した。海上対象物からの散乱信号実験を行い受信信号解析から良好な成果を得た。漂流ブイによる海水流動観測については、本プロジェクトにて購入したリーフドリフターの漂流実験を、沖縄県恩納村沿岸にて2016年7月から11月にかけて4日間行った。1日目では、リーフドリフターと形状の違う既存漂流ブイとの軌跡による比較を行い、結果に違いが見られた。2日目以降は、より水深の浅いリーフ内で複数同時リリースを行い、数時間での軌跡と潮汐との関係を調べた。全体としては、研究を遂行する上での大きな問題は生じておらず、申請時の計画に沿って研究を進めている。

生態学的調査については、台風等の悪天候のために潜水調査が影響を受けることもなく、親サンゴの分布量および幼生定着量のデータを当初の計画通り収集することができた。また、親サンゴの卵生産量についてはサンゴの放卵放精期前に標本を採取し、現在分析中である。レーダによる海水流動観測については、総務省からの指示により、当初の設計・製作時の周波数から変更することになったが、総務省との調整の結果、帯域幅が若干狭くなりそれに伴い距離分解能も若干劣化することになったが、大幅な周波数変更は免れたことで大幅な回路設計は不要となった。サンゴ礁海域計測に対する距離分解能は確保できたと考えている。当該年度目標の送受信機間干渉を抑えることができる送信アンテナ設計、ならびにソフトウェア無線技術での受信信号処理検証も予定内で進めることができた。漂流ブイによる海水流動観測については、既存漂流ブイに比べ浅場でも海底を引きずることなく流れるリーフドリフターを開発し、漂流実験により目的を達することを確認した。沖縄本島、慶良間諸島、久米島で研究期間中に実施した生態学的調査により、沖縄本島3地域及び慶良間諸島地域では年を違えて、それぞれの地域内で成熟したミドリイシ属サンゴ群体の密度と被度が増加すると、地域内におけるミドリイシ属サンゴ幼生の定着数が増加することが明らかとなった。これら地域の広がりと地域間の距離から、ミドリイシ属サンゴ幼生の多くは、親サンゴから20 kmの範囲内で分散・定着することが示唆された。漂流ブイによる海水輸送観測に関しては、これまでに投入したマイクロスタードリフターの解析を行うとともに、浅海域サンゴ礁内に特化した新型リーフドリフターの検証実験を引き続き行なった。前者については、恩納村、座間味島、久米島、石垣島、南大東島からの漂流パターンを定量化し、サンゴの集団遺伝解析結果との比較検証を進めている。既存のサンゴ幼生の生活史と組み合わせることで、平均的な分散距離などの定量化も行い、論文執筆を進めている。潮流が卓越したところ、海流成分の種な海域など島による違いがある一方で、分散距離には共通した特徴が見られた。また、高解像度海洋モデルについては、特徴的な沿岸流を捉えるには限界があることも確認できた。高分解能海洋レーダの開発と、レーダによるサンゴ礁海域の海水流動測定については、レーダの完成に向けて基本的構成法の確立と機能検証を行った。ソフトウェ無線技術を用いてUHF帯413MHz利用のFMCW(Frequency Modulated Continuous Wave)レーダを構成し、その評価実験を行った。前年度無線局免許における周波数変更があったことを踏まえ、受信機構成を変更した。また、近距離観測を目的とするため、FMCW信号連続送信となることから受信機への直達電力を軽減するための送信アンテナ特性の再調整を行った。現在上記の整合性を検討しつつ、論文執筆を進めている。造礁サンゴ幼生の親からの分散距離を、生態学、海洋物理学、工学が連携した野外研究で明らかにすることを目的に、本研究を実施した。生態学的調査から、520 kmの空間的広がりの中で成熟したサンゴが増加すればそれら地域内で幼生定着量が増加するが、50 km以上離れた海域間ではある海域でのサンゴの増加が、他海域の幼生定着量の増加をもたらさないことが明らかとなった。
「表現力」育成の具体的な教育方法の研究

情報収集能力に関する研究では、ほぼすべての生徒が自己知識で判断できる間違いを含むウェブサイトを生徒に示し、収集した情報に誤りがあることを判断させた。このことから、複数のソースから情報を得ることの大切さ、自身の知識も情報源になることを学習させた。ブログを通じた表現法の研究では、生徒に校内限定公開のブログを製作させ、「改めて印象に残った内容」、「うまいと感じた表現」、「直したほうがよいと感じた表現」の観点から相互評価を行い、評価された内容を各生徒に伝達した。この作業を通じて生徒は自己の文章表現の長所・短所を知ることができた。また、ブログへの書き込みにまつわる事件を取り上げ、人権と表現について考えきせた。プレゼンテーションを通じた表現法の研究では、修学旅行の事前学習をテーマに生徒が5名程度のグループを組み、ウェブサイト、図書館の書籍を利用した情報収集で作品を仕上げ発表した。事前に発表時間を意識させた字数の原稿も用意させた。「説明内容」「スライドの見易さ」などの観点での5段階評価とひとことコメントさせ相互評価させ、評価された内容を各生徒に伝達した。生徒は他の発表の評価内容と比較をして改善点を見つけることができた。相互評価については、文書での評価より数値での評価の方が生徒の反響は大きかった。また、文書での評価は発表の最中に評価シートの記入に追われている生徒が少なくなかった。このことから、評価を数値で行うことが適切であるといえる。
低発現量タンパク質の探索を可能とするフォトアフィニティーセレクション法の開発

有望な生物活性を示す天然物や医薬品候補化合物において、結合タンパク質の合理的な探索同定法の開発は、新規薬剤の開発や生物機構の解明に向けて重要な未解決課題である。本研究では、金ナノ粒子基盤の特性を利用し、結合タンパク質をワンポットでラベル化反応と濃縮精製を行うキャッチ・リリース型タンパク質探索法の確立を目指した。糖鎖リガンドや、非天然型及び天然生物活性化合物をリガンドとし、種々の光反応基を提示した金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの作成方法とタンパク質ラベル化および濃縮精製・同定方法を確立した。有用な生物活性を示す低分子リガンドの作用メカニズムの解明には、結合タンパク質の合理的な同定法の開発が最重要である。低分子リガンドの結合タンパク質を同定するためには、複雑な細胞内タンパク質群より、特異的な結合活性を有するタンパク質を選択的にかつ効率的に検出し、単離する手法を確立する必要がある。リガンドを固定化したアフィニティーカラムを用いる従来法では、高発現量の非特異的結合タンパク質が偽陽性検出される問題が古くより未解決であり、低発現量の結合タンパク質の単離が困難である。この問題を本質的に解決するには、天然物リガンドが細胞系中でタンパク質と相互作用する際に、並行して起こる特異的・非特異的結合相互作用を識別し制御する方法論が求められる。そこで本研究では、multivalent displayによる親和性増大、遠心分離による効率的な濃縮精製および簡便な溶出を可能とする金ナノ粒子を基盤としたフォトアフィニティープローブを創製することを計画した。新規プローブの特性を利用し、結合タンパク質をワンポットでフォトアフィニティーラベリング反応と濃縮精製を行う選択的なタンパク質探索法の確立を目指した。平成27年度においては、親和性の弱いリガンドとして糖鎖リガンドをとりあげ、金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを作成した。糖鎖金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを用いて既知の結合タンパク質を高選択的に捕捉し、濃縮精製することに成功した。本年度は親和性の弱いリガンドとして糖鎖リガンドをとりあげ、金ナノ粒子に固定化するための糖鎖誘導体および光反応基誘導体をそれぞれ合成し、金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの開発を達成した。これより次年度の計画の推進に必要な基盤的原理と方法論が確立したため。低分子結合タンパク質の合理的な同定法の開発は、有用な生物活性分子の作用メカニズムの解明に向けて最重要課題である。代表的な化学的手法として、アフィニティークロマトグラフィー法とフォトアフィニティーラベリング法が挙げられるが、前者では低発現量の結合タンパク質の単離が困難であり、後者では高発現量の非特異的結合タンパク質が偽陽性検出される問題が古くより未解決である。本研究では、低発現量タンパク質の選択的かつ効率的な捕捉と濃縮精製および簡便な溶出を可能とするため、金ナノ粒子を基盤としたフォトアフィニティープローブの開発を目指した。金ナノ粒子基盤の特性を利用し、結合タンパク質をワンポットでフォトアフィニティーラベリング反応と濃縮精製を行う選択的なタンパク質探索法の確立を目指した。平成28年度においては、前年度に開発した糖鎖リガンドとは異なる低分子性生物活性化合物2種をリガンドとして用いて、種々の光反応基を提示した金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの作成方法を確立した。これら低分子金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを用いて既知の結合タンパク質を選択的に捕捉し、濃縮精製することに成功した。本年度は低分子リガンドとしてhCAII阻害剤であるbenzensulfonamideや抗癌活性天然化合物であるrapamycineをとりあげ、低分子リガンド誘導体および4種の光反応基誘導体をそれぞれ設計・合成し、これらを安定的に金ナノ粒子への固定化する方法を確立し、新規の金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの作製に成功した。低分子金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを用いて既知の結合タンパク質を効率的に捕捉し、濃縮精製することに成功した。有望な生物活性を示す天然物や医薬品候補化合物において、結合タンパク質の合理的な同定法の開発は、新規薬剤の開発や生物機構の解明に向けて重要な未解決課題である。従来の親和性に基づいた結合タンパク質探索法は、成功確率がリガンドや未知の結合タンパク質の性質に依存するため、ルーチンワークの技術として確立していない。本研究期間を通して、糖鎖リガンドや、非天然型及び天然生物活性化合物をリガンドとし、種々の光反応基を提示した金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの作成方法とタンパク質ラベル化および濃縮精製・同定方法を確立した。金ナノ粒子上ではリガンドや光反応基を高密度で提示することが可能であることから、プローブ自体はnM程度の低濃度で用いることで、望みのタンパク質の選択的なラベル化と濃縮精製を実現した。われわれは先行研究において、低親和性タンパク質や低発現量タンパク質に対してフォトアフィニティーラベリングを行う場合は、反応効率は低いが高い選択性を示すジアジリン基が有用であることを明らかにした。本研究において、低濃度のプローブを用いる反応条件を達成できたことから、反応効率が高く選択性が低い光反応基の方がより有効であることが示唆された。

また一方で、光反応基によるラベル化は、通常ラベル化の収率が<10%程度の分子プローブと比して、部分的に効率化できた(<70%)ものの、原理的にさらなる収率の向上は困難であることが示唆された。そこで、最終年度では、タンパク質ラベル化剤を光反応基に限定せず、求電子性官能基を導入する金ナノ粒子プローブの開発を検討した。これまでに合成した金ナノ粒子プローブを用い、nM程度の濃度のプローブでタンパク質ラベル化に成功した。有望な生物活性を示す天然物や医薬品候補化合物において、結合タンパク質の合理的な探索同定法の開発は、新規薬剤の開発や生物機構の解明に向けて重要な未解決課題である。本研究では、金ナノ粒子基盤の特性を利用し、結合タンパク質をワンポットでラベル化反応と濃縮精製を行うキャッチ・リリース型タンパク質探索法の確立を目指した。糖鎖リガンドや、非天然型及び天然生物活性化合物をリガンドとし、種々の光反応基を提示した金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの作成方法とタンパク質ラベル化および濃縮精製・同定方法を確立した。当初の研究計画に従い、天然物リガンドを固定化した金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを合成し、これらとタンパク質抽出液を用いてフォトアフィニティーラベリングを行い、結合タンパク質の検出効率や感度、選択性について解析を行う。また、特異的に検出されたタンパク質のシークエンスを同定し、新規結合タンパク質については相互作用解析を行い結合特性の検証を行う。当初の研究計画に従い、合成した天然物リガンドを固定化した金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの設計とフォトアフィニティーラベリングによる結合タンパク質の検出効率や感度、選択性の関係性についてより詳細な解析を行う。生物有機化学・ケミカルバイオロジー当初計上した生化学解析に関わる物品費用やLC-MS/MSによるタンパク質同定を受託解析する経費を次年度以降に支出することとしたため。前年度からの繰り越し金を、次年度分として計上した生化学解析に関わる物品費用やLC-MS/MSによるタンパク質同定を受託解析する経費として支出することとしたため。次年度使用額は、当該研究計画の実施に際して必要となる試薬や溶媒、研究器具消耗品などの物品費、委託解析経費、研究成果発表のための学会参加費用(その他経費)及び旅費として充当する。次年度使用額は、当該研究計画の実施に際して必要となる試薬や溶媒、研究器具消耗品などの物品費、受託解析経費、研究成果発表のための学会参加費用(その他経費)及び旅費として充当する。
放射線抵抗性がん細胞の克服を目指した長期的かつ網羅的な生細胞モニタリング

一般的に電離放射線を照射したがん細胞に誘発される細胞死はアポトーシスであると考えられている。しかし、本研究の代表者がこれまでに行った予備的実験からX線照射で誘発されるアポトーシスの頻度は低いことが示唆された。本研究では、DNA二本鎖切断(dsbs)、オートファゴソーム、そして細胞周期をモニタリングできる細胞株とそれらからCRR細胞及びミトコンドリアDNA欠失ρ0細胞を樹立して、X線照射後に生じる細胞死は果たして本当にアポトーシスであるのかどうか、DNA dsbsと細胞死の様式に関連があるのかなどを、生細胞イメージングを行い検証し、がんの放射線抵抗性の克服を目指す。
強磁性薄膜の交換相互作用に対する電界効果

ゲート電極/絶縁体/強磁性金属という素子構造を用い、ゲート電圧の印加によって磁性を制御する電界効果の研究が精力的に行われており、磁気異方性やキュリー温度といった物性を制御できることが示されている。申請者の目的は、交換相互作用という隣り合うスピン間に働く微視的な力の電界変調の物理を明らかにするべく、交換相互作用とジャロシンスキー・守谷相互作用(DMI)の電界変調を実験的に評価し比較することである。一般にバルクの強磁性体において、交換相互作用とDMIはそれぞれスピン間相互作用の1次と2次の項であり、それらの間には比例関係が成り立つ。また、強磁性薄膜における交換相互作用と界面で誘起されるDMIについても、発現する起源が異なるにも関わらず膜厚に対して比例関係となることが報告されている。その一方で、強磁性薄膜のDMIの電界変調については、これまで報告されてきたもののその物理的な機構は未だ明らかとなっていない。そこで申請者は、交換相互作用とDMIの比例関係に着目して、それぞれの電界変調を比較することによって物理的な機構の解明を目指す。本年度では、まず昨年度に取り組んだ強磁性金属薄膜のキュリー温度の電界変調の微視的起源が交換相互作用の変化である、という研究結果を論文にまとめて発表した。次に、磁壁移動速度の測定によってDMIの電界変調を評価するために、磁気光学顕微鏡による測定系の立ち上げ作業を行った。現在は、Co薄膜試料を測定可能な状態まで完成させており、次年度中に電界印加下での測定を行い、本研究の目的を達成できることが充分に期待できる。また、上記の研究と並行して、磁性の電界効果を利用した磁区書き込みの原理実証を行い、Applied Physics Letters誌に発表した。これは、磁性の電界効果をマグノニックデバイスに応用するための新たな手法を考案した点で意義深い結果である。昨年度は、キュリー温度の電界変調の起源を探るべく交換相互作用の電界変調の評価に取り組み、それらが比例関係にあることを実証した。そしてDMIの電界変調については、磁気光学顕微鏡を使って薄膜面内方向の磁場下における磁壁移動速度を測定することにより評価する手法を採用している。本年度はDMIの電界変調を評価するための測定系の立ち上げを行った。より具体的には、水平・垂直方向それぞれ独立に磁場を印加できる電磁石の設計と発注、パルス磁場を出力するためのコイルの作成と性能評価、実際にDMIを評価するための測定プログラムの作成までが完了している。そのため、次年度ではPt/Co薄膜試料の測定に直ちに取り掛かることが可能である。当初の予定においても本年度の目標は測定準備を完遂することであったため、実験の面では計画通りに進行していると言える。それに加えて、これまでの実験成果は全て論文として発表しており次年度は特に実験に注力可能であるため、総合的に見ると当初の計画以上に進展していると考えられる。本研究の目的は、強磁性金属における交換相互作用とDMIの電界効果を調査することによって、その微視的な発現機構を体系的に理解することである。今後はまず、DMIの電界変調の評価に取り組み、交換相互作用の電界変調と比較した実験結果を半年程度でまとめあげる。そして残りの半年では、その結果を考察して物理的な機構を解釈し、論文化して雑誌に投稿するところまで遂行する予定である。ゲート電極/誘電層/強磁性金属という素子構造を用い、ゲート電圧の印加によって磁性を制御する電界効果の研究が精力的に行われており、これまで磁気異方性やキュリー温度といった物性を制御できることが報告されている。しかし、電界効果の発現機構について微視的な観点からは十分に理解されていないため、本研究は強磁性金属における磁性の電界効果の発現機構を明らかにすることを目的とした。強磁性金属のキュリー温度の電界変調は、室温において磁気相転移を制御する有用な手段である。その一方で、その現象は電界による電子密度や磁気異方性の変化からは説明することができず、起源が未だに明らかになっていない。一般に、キュリー温度は分子場理論によって理解され、磁性原子間の交換相互作用と隣接原子数によって定義される。そこで、本年度はキュリー温度の電界変調の微視的起源を探るために低温領域で交換定数の電界変調を評価し、実際のキュリー温度との相関を調べた。強磁性金属として垂直磁化したPt/Co薄膜試料を用いて測定を行った。まず、電圧印加下で低温領域の磁化の温度依存性を調べることで交換定数の電界効果を評価した。次に、キュリー温度付近の高温領域での磁化の温度依存性からキュリー温度の電界変調についても評価を行った。これらを比較した結果、交換定数の電界変調の支配的な寄与によってキュリー温度が変化する、という物理機構が実証された。このことは磁性の基礎原理である分子場理論によってキュリー温度の電界効果を理解できることを意味しており、物理的に非自明な点の多い電界効果の研究分野において大きな意義を持つ。本年度は低温領域におけるPt/Coの交換定数及びキュリー温度の電界変調の調査を行った。測定した試料は垂直磁化したPt/Co薄膜、誘電層MgO/HfO2、ゲート電極Cr/Auから成るキャパシタ構造となっている。一般に、低温領域における磁化の減少過程は交換定数に依存するスピン波の熱励起によって説明されるため、低温領域の磁化の温度依存性を調べることで交換定数を評価した。

ゲート電圧VGによってCoに電界を印加しながら、超伝導量子干渉計(SQUID)で磁化の温度依存性を測定した。磁化の減少過程が印加電圧VGによって異なることから、交換定数が電界変調されることが分かった。この磁化の温度依存性を解析することにより交換定数の電界変調を評価した。次に、キュリー温度の電界変調を調査し上記の結果との比較を試みた。昇温によって強磁性から常磁性に転移するとき、磁化は温度のべき乗に従って減衰する。そこで、SQUIDでキュリー温度付近の磁化の温度依存性を調査し、べき乗則で解析することによりキュリー温度を評価した。その結果、キュリー温度についても電界によって変調されることを確認した。最後に、今回の実験で得られた交換定数とキュリー温度の電圧依存性の比較を行った。これらが線形関係になることから、微視的な交換相互作用の電界変調により分子場理論に従ってキュリー温度が変化するという機構が実験的に証明された。単なる磁性の電界効果の観測にとどまらず、その微視的な起源解明に至った点において、当初の計画以上に進展していると言える。ゲート電極/絶縁体/強磁性金属という素子構造を用い、ゲート電圧の印加によって磁性を制御する電界効果の研究が精力的に行われており、磁気異方性やキュリー温度といった物性を制御できることが示されている。申請者の目的は、交換相互作用という隣り合うスピン間に働く微視的な力の電界変調の物理を明らかにするべく、交換相互作用とジャロシンスキー・守谷相互作用(DMI)の電界変調を実験的に評価し比較することである。一般にバルクの強磁性体において、交換相互作用とDMIはそれぞれスピン間相互作用の1次と2次の項であり、それらの間には比例関係が成り立つ。また、強磁性薄膜における交換相互作用と界面で誘起されるDMIについても、発現する起源が異なるにも関わらず膜厚に対して比例関係となることが報告されている。その一方で、強磁性薄膜のDMIの電界変調については、これまで報告されてきたもののその物理的な機構は未だ明らかとなっていない。そこで申請者は、交換相互作用とDMIの比例関係に着目して、それぞれの電界変調を比較することによって物理的な機構の解明を目指す。本年度では、まず昨年度に取り組んだ強磁性金属薄膜のキュリー温度の電界変調の微視的起源が交換相互作用の変化である、という研究結果を論文にまとめて発表した。次に、磁壁移動速度の測定によってDMIの電界変調を評価するために、磁気光学顕微鏡による測定系の立ち上げ作業を行った。現在は、Co薄膜試料を測定可能な状態まで完成させており、次年度中に電界印加下での測定を行い、本研究の目的を達成できることが充分に期待できる。また、上記の研究と並行して、磁性の電界効果を利用した磁区書き込みの原理実証を行い、Applied Physics Letters誌に発表した。これは、磁性の電界効果をマグノニックデバイスに応用するための新たな手法を考案した点で意義深い結果である。昨年度は、キュリー温度の電界変調の起源を探るべく交換相互作用の電界変調の評価に取り組み、それらが比例関係にあることを実証した。そしてDMIの電界変調については、磁気光学顕微鏡を使って薄膜面内方向の磁場下における磁壁移動速度を測定することにより評価する手法を採用している。
視覚化とステージ・ステップシートを活用したマット運動技能向上のプログラム開発

マット運動は、体育の授業で行われる種目の中でも、苦手とする生徒が多い種目である。その理由として、自分がどのように体を動かしているかの認識ができず、どのような練習をしたらよいかわからず、苦手となっていくパターンが多く見受けられる。そこで本研究では、タブレット型端末を使用して、自分の動きを認識するとともに、ステージ・ステップシート(それぞれの技を行うにあたってのチェックポイントが書かれたシート)で、技の完成に向けての改善点を確認しながら練習を行うようにした。タブレット型端末には技の見本動画を入れ、自分の動きと見本の動きを見比べられるようにした。また、技ごとに練習場所を指定し、同じ課題に挑戦している仲間同士で教え合いをしながら、自己効力感を高められるようにした。本研究を行う前に、マット運動が好きか苦手か、技の習熟度アンケートを行い、授業ごとに書いたワークシートや、最後の授業での技能テスト及び授業を行ってのアンケートにより調査、分析をした。タブレット型端末の使用については、マット運動が苦手と感じている生徒ほど効果があり、技ができなかった原因が明確にでき、その改善への目標を立てることができた、という意欲面での大きな向上を図ることができた。またステージ・ステップシートとの併用により、個人で目標設定ができ自主的に練習に取り組む姿が多く見られたり、チェックポイントを1つ1つ確認することで、マット運動は「できる」か「できないか」の2つしかないと感じていた生徒にとっては、「まだできないが、少しずつ完成に近づいている」という自信につながった。技能面に関しては、約4割の生徒が小学校で習う開脚技を習得できていなかったが、最終的にはほとんどの生徒が開脚技を完成させ、応用技である伸膝後転や倒立前転に取り組むことができた。
ESRの高度利用を目指した生体関連ラジカルの薬学的研究

本研究プロジェクトにより3年間の研究を行い、次の貴重な成果を得た。(1)L-band ESR法による研究:画像化の感度上昇を目指し、新しい装置を開発するために新しいプローブを試作した(内海)。また、L-band ESR装置の新しい測定法、特に酵素反応をモニターする方法を考案した(小林)。一方、安定スピンプローブを投与したラットやマウスの脳および腹部でモニターしたL-band ERSスペクトルの動態解析を行い、投与量や動物の年齢に依存してスピン消失速度定数が変化することを見出し、将来スピンプローブを結合させた薬物の動態解析に貴重な指標を与えることができた。さらに、定量的薬物動態解析が可能であることを示した(桜井)。一方、酸化的ストレルモデルとして、放射線照射下でのスピンプローブの信号強度は、ストレスの大きさと相関することを明らかにした(小沢)。銅(II)錯体の室温および低温でのL-band ESRスペクトルを初めて観測した(桜井)。(2)X-band ESR法による研究:a)装置の開発:画像化の装置を試作し、実用化の見通しを得た(小林)。b)生体とラジカル:突然変異、疾病(ガン、肝臓病、胃潰瘍など)や老化に関係する活性酸素、フリーラジカルあるいは一酸化窒素NOの検出や生成機構について詳細な解析をおこなった(菊川、古川、岡部)。c)スピンラベル法とスピンプローブ法:スピンラベル法を用いて、赤血球膜タンパク質バンド3の特性とラジカル溶血との関連を明らかにし(佐藤)、また、薬物の経皮吸収や肝臓における代謝の機構を解明するためスピンラベル法の有効性を示した(北河、相本)。d)化学領域におけるESR法の新展開:金属酵素やタンパク質の反応部位におけるラジカルの検出やNOとの新しい反応の確立にESR法の有効性を示した(桜井、小沢、山内、長野)。また、医薬品合成におけるラジカル中間体の検出にESR法が用いられること、および新リ-ド化合物を示した(中室)。以上の結果にもとづいて、薬学領域のESR研究を大いに活性化できた。近年、フリーラジカル、活性酸素、過酸化脂質ラジカルあるいは・NOラジカルなどの生物ラジカルと健康、疾病あるいは老化との関連性が明らかにされつつある。これら常磁性化合物の生成と消去は生理的状態を把握できるのみならず、薬学の領域では医薬品の作用機構の解明や開発研究に不可欠の情報源となりつつある。このような視点に立って、ESRを利用する薬学研究者が集う本研究において、本年度は次のような新しい成果を得た。1)L-バンドESR法を用いた研究:安定スピンラベル剤を実験動物に投与し、体内より無侵襲でラジカルの動態を解明する方法が開発された。同時に、画像化への方法が可能となった。生体金属タンパク質の構造を水溶液中で解明するため、底分子銅(II)錯体についてL-バンドESRスペクトルを検討し、世界で初めて観測することができた。2)BCM-X-バンドESR法を用いた研究:ラットの血液を大動脈から取り出し、ESR装置に循環させ再び大静脈に戻す血液循環モニタリング(Blood Circulation Monitoring)ESR法の開発を行った。本BCM-ESR法により、安定スピンラベル剤の血中動態をコンパートモデルを用いて詳細に解析できることを見出した。スピンラベル剤は、血中で循環するのみならず、一部は各組織に取り込まれ、一部は尿中に排泄されることが判った。3)医薬品・食品:微生物の培養液中にピリミン-鉄錯体を見出し、その銅(II)置換体は現在世界で最も高いスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)様活性をもっていることを明らかにした。日常生活に用いているショウ油、マッシュルームやかつおぶし中には多量のフリーラジカル種が存在し、これらは変異原性やDNA切断活性を持っていることが明らかになった。皮膚細胞への薬物の浸透性を研究する方法としてESRスピンラベル法が有効であることが見出された。

d)化学領域におけるESR法の新展開:金属酵素やタンパク質の反応部位におけるラジカルの検出やNOとの新しい反応の確立にESR法の有効性を示した(桜井、小沢、山内、長野)。また、医薬品合成におけるラジカル中間体の検出にESR法が用いられること、および新リ-ド化合物を示した(中室)。以上の結果にもとづいて、薬学領域のESR研究を大いに活性化できた。昨年スタートした本研究プロジェクトは、2年目に入り、ESRの装置開発及び細胞レベルの研究者を分担研究者に迎え、研究を展開した。本年度に得られた新しい成果はつぎの通りである。1)L-band ESR法による研究:画像化の感度上昇を目指し、新しい装置を開発するために新しいプローブを試作した(内海)。また、L-band ESR装置の新しい測定法、特に酵素反応をモニターする方法を考案した(小林)。一方、安定スピンプローブを投与したラットやマウスの脳および腹部でモニターしたL-band ESRスペクトルの動態解析を行い、投与量や動物の年齢に依存してスピン消失速度定数が変化することを見い出し、将来スピンプローブを結合させた薬物の動態解析に貴重な指標を与えることができた(桜井)。a)装置の開発:画像化の装置を試作し、今後実用化の見通しを得た(小林)。b)生体とラジカル:突然変異、疾病(ガン、肝臓病、胃潰瘍など)や老化に関係する活性酸素、フリーラジカルあるいは一酸化窒素NOの検出や生成機構について詳細な解析をおこなった(菊川、古川、岡部)。c)スピンラベル法とスピンプローブ法:スピンラベル法を用いて、赤血球膜タンパク質バンド3の特性とラジカル溶血の関連を明らかにし(佐藤)、また、薬物の経皮吸収や肝臓における代謝の機構を解明するためスピンラベル法の有用性を示した(北河、相本)。d)化学領域におけるESR法の新展開:金属酵素やタンパク質の反応部位におけるラジカルの検出やNOとの新しい反応の確立にESR法の有効性を示した(小沢、山内、長野)。また、医薬品合成におけるラジカル中間体の検出にESR法の新しい応用性と方法論を見い出した(北)。さらに、セレン化合物の抗酸化活性の評価にESR法が用いられることを示した(中室)。本研究プロジェクトにより3年間の研究を行い、次の貴重な成果を得た。一方、安定スピンプローブを投与したラットやマウスの脳および腹部でモニターしたL-band ESRスペクトルの動態解析を行い、投与量や動物の年齢に依存してスピン消失速度定数が変化することを見出し、将来スピンプローブを結合させた薬物の動態解析に貴重な指標を与えることができた。さらに、定量的薬物動態解析が可能であることを示した(桜井)。一方、酸化的ストレスモデルとして、放射線照射下でのスピンプローブの信号強度は、ストレスの大きさと相関することを明らかにした(小沢)。
障害者の地域居住を促進する活動支援拠点の整備に関する研究

障害者の地域居住を促進するために,いくつかの地域で先進的に取り組まれている活動支援拠点の仕組みと各地域で取り組まれている活動支援拠点の実態の整理を把握し,そのための計画手法を提言することを目的とする。
RNA干渉、マイクロビーズアレイを用いた脊柱靭帯骨化症に対する網羅的遺伝子解析

脊柱靭帯骨化症由来の培養靭帯細胞を用いて、骨化形成過程に作用する因子について検討した。脊柱靭帯骨化由来細胞ではβ-catenin、Runx2、OsterixのmRNA発現量が上昇しており、さらにcyclic tensile strainを加えると各因子のmRNAの発現は有意に増加した。免疫組織化学的局在ではRunx2、Sox-9, Osterixは肥大軟骨細胞に強く発現していた。また、組織学的検討では、骨化巣の増大に伴い骨化前線部の拡大、石灰化前線の不整化・延長が著明となり、石灰化前線の周囲には軟骨細胞が密に集族していた。この石灰化前線近傍は細胞活性が高いことが示唆され、さらに未分化間葉系細胞と軟骨細胞における分化、脱分化の過程が転写因子を介して制御され、成熟した軟骨細胞は種々のサイトカインを発現し、基質への血管進入と石灰化の促進をもたらし、骨形成が誘導されると考えられた。頚椎後縦靭帯骨化症(OPLL)患者、非OPLL患者(頚椎椎間板ヘルニア)の脊柱靭帯組織から骨化部分を除き(骨化前線部を中心)、outgrowth法にて靭帯細胞を単離し,FBS添加DMEM培地にて5継代培養した(Alex P et al Biochemical J, 2003)。また、黄色靭帯骨化症(OYL)患者、非OYL患者(腰椎椎間板ヘルニア、腰部脊柱管狭窄症)の黄色靭帯組織から骨化部分を除き、同様の手法にて靭帯細胞を培養した。本研究はヒト脊柱靭帯の術中採取標本を使用したため、その際には福井大学医学部倫理委員会の承認ならびに術前に患者、その家族に十分なインフォームドコンセントを行い、同意を得た上で行った。採取したtotalRNAを調節後、精製したpoly(A)RNAを得た。バイオアナライザーを用いて純度をチェックした。2)リアルタイムRT-PCR過去のマイクロアレイの結果、神経再生関連遺伝子などを基準に、遺伝子を選択、プライマーを作製し、リアルタイムPCRを行った。3)組織学的・培養細胞の免疫学的検討採取した靭帯組織および培養靭帯細胞の免疫染色を行い、リアルタイムRT-PCRの結果と比較検討した。4)遺伝子解析の準備cDNAライブラリーを作製し、各々のマイクロビーズを作製する。同様に、各グループのpoly(A)RNA等量混合物から蛍光標識プローブを作製する。非損傷群由来のpoly(A)RNAをFluorescein標識、損傷群由来のpoly(A)RNAにはCy5を標識する。ゲートから回収したビーズの中から、各ゲートにおいてクローンのシーケンスを行う。次にクラスターのコンセンサス配列のみをクェリー配列とし、塩基配列データベースに対するBLASTホモロジーサーチを行う。塩基配列データベースはNCBIのRefSeqおよびUniGeneデータを用いる予定である。(1)頸椎後縦靱帯骨化症(OPLL)、胸椎黄色靱帯骨化症(OLF)の手術時に採取した組織について、骨化形態別に骨化進展様式の特徴を病理組織学的に検討した。OPLL、OLFともに骨化巣の増大に伴い骨化前線部の拡大、石灰化前線の不整化・延長が著明となり、石灰化前線の周囲には軟骨細胞が密に集族していた。(2) (1)の実験系をさらに発展させるために、採取した靭帯から遊走させて得た培養靭帯細胞の生物学的特徴について解析した。培養靭帯細胞にFlexercell FX-3000を用いて機械的ストレスをかけ、免疫組織化学染色およびreal time RT-PCR法にて評価した。骨化前線部においてβ-catenin、Sox9の発現は間葉系細胞、増殖期軟骨細胞に強陽性であった。Runx2、TGF-βは増殖期・肥大軟骨細胞に広範に発現していた。培養骨化靱帯では、β-catenin、Sox9、Runx2のmRNA発現量は非骨化靱帯と比較して有意に高値であり、機械的ストレスを加えることで発現量はさらに上昇しており、この異常発現状態が持続することは骨化形成に重要な因子の1つであると考えられた。

頸椎後縦靱帯骨化症(OPLL)、胸椎黄色靱帯骨化症(OLF)の手術時に採取した脊柱靭帯組織から骨化部分を除き、outgrowth法にて靭帯細胞を単離し、FBS添加DMEM培地にて5継代培養した。非骨化患者の各靭帯組織を同様に培養し、コントロールとし、それぞれの生物学的特徴について解析した。培養靭帯細胞にFlexercell FX-3000を用いて機械的ストレスをかけ、免疫組織化学染色およびreal time RT-PCR法にて評価した。骨化前線部においては、β-catenin、Sox9の発現は間葉系細胞、増殖期軟骨細胞に強陽性であった。Runx2、TGF-βは増殖期・肥大軟骨細胞に広範に発現していた。培養骨化靱帯では、β-catenin、Runx2、OsterixのmRNA発現量が上昇しており、さらにcyclic tensile strainを加えると各因子のmRNAの発現は有意に増加した。免疫組織化学的局在ではWnt5a、Wnt7aは未分化間葉系細胞、β-cateninは増殖期軟骨細胞、Runx2、Osterixは肥大軟骨細胞に強く発現していた。骨化前線部では、成長因子や転写因子を介してautocrine/paracrineに細胞が分化・成熟して層構造を形成するが、石灰化前線周囲の軟骨細胞は活性が非常に高く、この軟骨細胞はサイトカインや転写因子を介して血管新生、石灰化の促進、骨芽細胞の分化誘導をもたらすと考えられた。さらにWnt/β-catenin signalingの持続的かつ過剰発現はこれらの系を異常促進させ、このことは骨化形成・伸展に関与する1つの要因であることが示唆された。
成熟過程における分泌系カーゴタンパク質のゲーティング・パーミッション機構の研究

なぜほ乳類の細胞ではきわめて高い効率で高品位な分泌が可能となるかを知るために、輸送されるカーゴタンパク質の成熟過程での動態を一分子レベルで計測するシステムを作成した。解析の結果、分子の成熟化を行う小胞体内腔ではカーゴの糖鎖をグリップとして細胞質のアクチン骨格を利用した強い拡散抑制を行うことなどを見いだした。この拡散抑制は高温ストレス下で顕著となり低温ではほとんど観測されないことから、分子成熟化の基盤をなすと考えられる。新しく作られたタンパク質はフォールディングが完了するまでは不安定な物性を持ち、凝縮しやすいために、その間は分子シャペロンが結合して不安定な部分をマスクすることで、その一時的な会合を介しか保護を受ける。細胞質とは異なり、分泌タンパク質の場合は、小胞体内腔の最大でも100nm程度の大変狭い管腔の中でこの作業が進む。分泌過程は基本的に細胞外への流れであるために、この空間では、細胞質よりも高い割合で新生分子は存在するはずであり、凝集体を形成する危険性が高い。凝集の頻度は分子間衝突の割合に比例するので、凝集する危険性を減らすには、単純拡散の抑制が有効なはずである。この詳細な解析を、全反射顕微鏡を用いて内腔可溶性のモデル分子の1分子像を可視化して、1分子トラッキングとそれらのエバネッセント場への初到達時間解析や、蛍光相関分光法を用いた1分子ダイナミクスの統計的解析などを行うことで、2個以上の糖鎖がある場合には、内腔膜表面への数十ミリ秒程度の結合が起こり、この抑制には、アクチンの重合化を必要とすることを見出した。糖鎖はほとんどの分泌タンパク質に存在することから、品質管理の基礎として機能している可能性が考えられる。そこで、細胞質側から、アクチン骨格を介して膜貫通型受容体による内腔分子の拡散抑制機構が存在するというモデルを提出した。この受容体は、小胞体に存在するレクチン分子の解析により、おそらく膜結合レクチンであるVIPLと思われる。1.分泌系において、小胞体上のマイクロドメインはCOPIIコートにより被われており、そのダイナミクスが新たに作られるタンパク質の細胞外輸送への律速となる。この形成に関して新たに提出されたM.Weissらによる、COPIIのランダムな動きによって小胞体膜上で偶然生じたドメイン内にカーゴ分子がトラップされて輸送が形成されるというモデルを1分子可視化の方法を用いて検討した結果、COPIIコート成分の小胞体膜上での滞在時間は、マイクロドメイン以外では極めて短く、このモデルには無理があることがわかった。この理由として、彼らが用いたタンパク質合成阻害自体がカーゴダイナミクスに影響を与えることを、光変換プローブを用いたモデル分子を用いた実験により見出した。ただ、この影響は細胞種により異なり、その生理的な意味については詳細な解析が必要である。2.siRNAライブラリを用いて見出したホスファチジルコリン合成に関与する因子群が、分泌系の様々なレベルでの顆粒輸送において複雑な制御を行っていることを見出し、さらにその制御には因子自体の局在変化と関連することを見出した。この原因は中間体の量的変化というよりは、濃度勾配の変化によるものであり、ターゲットの同定は進行中である。3.1分子可視化システムの改良により、2008年に発表したデータより一桁上の観測精度を得ることができるようになり、新たに得られた知見に基づいて、我々が発表した細胞骨格系によるカーゴダイナミクスの制御というモデルを再検討し、細胞質構造の内腔側でのカーゴ分子の成熟化における役割について新たなモデルの構築を行った。また、この過程で内腔外界での観察にふさわしい蛍光タグを開発した。