hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ユニークな資源家系の造成と高多型性マーカー開発によるウズラ経済形質遺伝子座の解明

本課題では、ウズラの経済形質関連遺伝子座のマッピングにむけて、コマーシャル・ウズラの遺伝子プールの中から見出したユニークな系統による資源家系の造成、形質データの収集、マイクロサテライトマーカーの開発を実施した。家系の親世代とした2つの系統間で、体重と複数の卵関連形質に有意差が認められた。この資源家系を用いることにより、経済形質遺伝子座の特定を効率的に行うことができると考えられる。ウズラの経済形質に関与する遺伝子座の解明にむけて、平成26年度は、以下の研究内容を実施した。1.資源家系の造成に有用となる系統を探索するために、国内の生産農家から商業用ウズラ合計8系統319羽(採肉用1系統ならびに採卵用7系統)のDNA解析用試料を収集した。これらの系統を常染色体上に位置する44のマイクロサテライトDNAマーカーを用いて解析し、系統間での遺伝的分化の程度を推定した。その結果、採卵用7系統の間では、遺伝的分化がみられない、あるいはその度合いが比較的小さいことが明らかとなった(Fst値で、0.003から0.021の範囲)。一方、採肉用1系統と採卵用7系統の間では、すべてのケースで有意な遺伝的分化がみられ、その度合いも比較的大きいことが判明した(Fst値で、0.116から0.127の範囲)。これらの結果から、経済形質関連遺伝子座のマッピングのための家系の造成にむけて、有用な知見を得ることができた。2.遺伝子マッピングに必要となる新たなマイクロサテライトDNAマーカーの作成を実施した。具体的には、DNAマーカーとなり得るウズラゲノムの常染色体上にあると推定される120カ所の繰り返し配列(CAリピート)について、その両端にプライマーを設定し、それらの一部について、複数系統のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い増幅の有無を確認した。さらに、残りのマーカー部位についても増幅の有無と多型の程度について現在解析を進めている。本研究では、以下の内容でウズラの経済形質関連遺伝子座のマッピングにむけた基盤を整備した。1.コマーシャル・ウズラ13系統の遺伝的背景を明らかにし、資源家系の親世代の候補となる2つの系統を選定した。45のマイクロサテライトマーカーを用い、各系統間の遺伝的分化の程度を評価した。B系統を除いたその他12系統の間では、大きな遺伝的分化は認められなかった。一方で、B系統とその他12系統の間では、高い遺伝的分化がみられた。これらの結果は、B系統は他の系統と遺伝的差異が大きく、マーカー型にも大きな違いが存在する可能性を示唆していた。そこで、13系統の中から遺伝的分化の程度が高いA系統とB系統を資源家系の造成に用いることとした。2.A系統とB系統の受精卵を導入し、孵化・育成した。その後、経済形質のデータを収集し、系統間で有意な差があるかを検討した。体重については、雌雄ともにB系統がA系統よりも有意に高かった。また、卵関連形質についても系統間で大きな違いがみられた。初産日齢は、B系統はA系統よりも遅い傾向にあり、初産時の卵重は、B系統がA系統よりも有意に大きかった。このように、形質にも大きな差異が存在していた。したがって、これらの系統を資源家系の作成に用いることで、効率的なマッピングが期待できると考えられる。現在、A系統とB系統を交配し、F1の生産を実施している。3.新たなマイクロサテライトマーカーを作成するために、120箇所のCAリピート候補領域にプライマーを設定した。その中の64箇所で増幅が認められ、10箇所を選び、蛍光標識を付加したプライマーにより、多型の程度を確認したところ、最大で1マーカーあたり9つのアリルを検出することができた。これらのマーカーは、今後の遺伝子マッピングにおいて、有効なツールとして利用できると考えられる。当初の計画では、本年度内に資源家系の造成と形質データの収集を開始する予定であったが、飼育設備の設計と発注に多くの時間を費やすこととなり、家系の造成の開始が遅れた。その他については、おおむね計画通りに進行している。動物ゲノム多様性学本年度に明らかとした系統間の遺伝的分化の程度を考慮した上で、資源家系の造成を優先して実施する。飼育設備の設計と発注に当初の計画以上の時間がかかったため、本年度に購入予定であった飼育設備の経費を次年度へ繰り越した。次年度の初めには、繰越金を使用して飼育設備を導入する。
教員グループの協働により探究能力を育成する授業研究ネットワークの構築

中学の段階までに理科・数学の興味を根付かせ,科学的に課題を解決する方法を学べば,高校以降の科学の意欲と学力につながると考え,中等教育の理科・数学の必修の授業における探究能力を育成する授業を開発する。本研究では,高等学校のスーパーサイエンスハイスクール等で実践されている探究活動の指導法と探究能力との関係を調査し,効果のある指導法を基に,一般の小中高大で実践できる授業パッケージを開発し,普及させるものである。
大脳皮質の細胞構築獲得における入力線維を中心とした外的要因の役割の解明

本研究では哺乳類大脳皮質において領野ごとに層構造が特異化するメカニズム、および霊長類などの大脳皮質においてシワと呼ばれる脳回・脳溝構造が形成されるメカニズムを明らかにするために、研究が盛んに行われてきた神経前駆細胞などの内的要因に加えて入力線維などの外的要因が重要な役割を果たす可能性を検討している。本年度はこれまでに得られた知見を踏まえて以下の研究を行った。1.昨年度までに、視床入力線維を欠損したマウスでは標的領野の4層でニーロン数が減少するが、それが入力線維の末端に発現する分泌タンパク質の強制発現により回復することを見出した。本年度はこれらの遺伝子ノックアウトによる機能喪失実験を行ったところ、欠損マウスの感覚野では、線維欠損マウスと同様に、4層ニューロン数が減少していることがわかった。これより、視床入力線維によって制御される感覚野の第4層の発達は、視床入力線維の末端に発現する分子を介して行われることがより強く示唆された。2.昨年度までに、外的因子が脳回に局在化する分子基盤を明らかにするためにシンプルな2本の脳溝を持つモルモットを用いて脳回と脳溝の発現プロファイルを解析した。本年度は発現差を示した候補遺伝子のうち細胞外タンパク質をコードするものについてin situ hybridizationを行い脳内での発現パターンを調べた。その結果、脳回に特異的な発現を示す遺伝子が複数個同定された。以上より、領野形成における外的因子の役割とその分子実体を明らかにし、また脳回形成における外的因子の局在化とその分子基盤解明につながる知見を得た。29年度が最終年度であるため、記入しない。大脳皮質の領野および脳回の細胞構築が形成されるメカニズムは興味深い課題であるが未だ明らかになっていない部分が多い。そこで、本研究ではそれに関わる現象および分子基盤を解明することを目的とした。平成26年度には、まず細胞構築獲得に領域特異的な細胞死が関与する可能性を調べるために、生後マウスおよびモルモットの脳切片に対するCleaved Caspase-3およびsingle strand DNAの免疫染色を行った。その結果、例えば第4層が薄いマウスの運動野や皮質が薄いモルモットの脳溝などに陽性細胞が集中する傾向は見られなかった。次に、領野の細胞構築が変化するときに特定の領域への細胞移動が起きているのかを調べるために、生体内で大脳皮質ニューロンの移動を観察する系の立ち上げに着手した。子宮内電気穿孔法によりマウスの第4層ニューロンに蛍光タンパク質を導入してラベルし、領野細胞構築が明瞭化する生後にマクロ共焦点顕微鏡で観察したところ、複数領野を含む広視野内でラベルされた細胞の分布を高感度に観察できた。今後はタイムラプス観察系を確立し、ニューロンの移動方向を解析する。また、脳回の細胞構築獲得に関わる因子を同定するために、脳回に局在する因子を探索した。モルモット脳切片に対して細胞種マーカー等による免疫染色を行ったところ、脳回に強いシグナルを示すものがいくつか見つかった。今後はそれらの脳回形成における機能解析を行う。本研究は、大脳皮質の領野および脳回形成において細胞構築が変化する過程に注目している。発生期において均一で平坦な大脳皮質から層の厚みや細胞種が異なる領野や皮質が湾曲した脳回が作り出される。このときに起こっている現象を解明し、またそれを引き起こす外的要因を同定することを目的とした。平成27年度には、第一に、領野形成時に起こる現象として領域特異的なニューロンの移動や運命転換の有無を検討した。感覚野第4層ニューロンのライブイメージングにより領野形成前後での細胞分布を変化を観察した結果、領野をまたいで移動するニューロンは見られなかった。また視床軸索を除去したマウスにおける層マーカーの免疫染色から、第2/3層や第5層マーカーの発現は大きく変化していないことがわかった。一方、大脳皮質外から侵入してくる細胞種についても発現解析を行い、領野形成への関与を示唆する結果を得たため、現在その役割を解析中である。今後はこれに加えて、入力線維依存的な領野層形成の分子メカニズムに関しても解析を進める。第二に、脳回形成を制御する要因を同定するため、これまでに同定した脳回局在因子の脳回形成における役割の解析を行った。モルモット胎児に対する除去手術を行い、生後脳回がおおむね形成された時期に解析したところ、脳溝パターンが著しく乱れたサンプルが複数得られたことから、脳回形成に関与していることが示唆された。今後はより特異的に因子を操作したときの脳回・脳溝形成の変化を調べる。平成27年度までに行う予定であった研究計画をおおむね終了し、平成28年度に行う実験に一部着手していることから。本研究課題は、哺乳類の大脳が持つ領野構造や脳回構造の形成メカニズムを解明することを目的としており、特に外的因子の関与について検討している。前年度までに領野特異的な層構造の形成に入力線維が必要であることを明らかにしており、平成28年度にはその分子メカニズムの解明を目指した。入力線維を欠損させたマウスにおいてその標的領野で入力線維に由来する分泌タンパク質を過剰発現させることで再供給を試みた。その結果、入力線維欠損時に見られる層構造の乱れが回復する傾向が観察された。よってこれら分子が領野形成に関与することが示唆された。

また、入力線維以外の外的因子についても変異マウスを用いて細胞種を特異的に除去することにより検討したが、領野構造の明らかな変化は観察されなかったため、領野形成に関与する可能性は低いと考えた。脳回・脳溝構造については、これまでに知見を得ていた形成期に脳回に局在する因子の1つに着目し、その量を増加させる方法の検討・開発を行った。この手法を脳溝をもつモルモットの胎児に対して適用させることで脳回形成への影響を解析している。研究の目的である領野と脳回の形成メカニズムの解明に関して、領野については外的因子の関与とその分子メカニズムの解明、脳回については外的因子の同定に近づいているため。本研究では哺乳類大脳皮質において領野ごとに層構造が特異化するメカニズム、および霊長類などの大脳皮質においてシワと呼ばれる脳回・脳溝構造が形成されるメカニズムを明らかにするために、研究が盛んに行われてきた神経前駆細胞などの内的要因に加えて入力線維などの外的要因が重要な役割を果たす可能性を検討している。本年度はこれまでに得られた知見を踏まえて以下の研究を行った。1.昨年度までに、視床入力線維を欠損したマウスでは標的領野の4層でニーロン数が減少するが、それが入力線維の末端に発現する分泌タンパク質の強制発現により回復することを見出した。本年度はこれらの遺伝子ノックアウトによる機能喪失実験を行ったところ、欠損マウスの感覚野では、線維欠損マウスと同様に、4層ニューロン数が減少していることがわかった。これより、視床入力線維によって制御される感覚野の第4層の発達は、視床入力線維の末端に発現する分子を介して行われることがより強く示唆された。2.昨年度までに、外的因子が脳回に局在化する分子基盤を明らかにするためにシンプルな2本の脳溝を持つモルモットを用いて脳回と脳溝の発現プロファイルを解析した。本年度は発現差を示した候補遺伝子のうち細胞外タンパク質をコードするものについてin situ hybridizationを行い脳内での発現パターンを調べた。その結果、脳回に特異的な発現を示す遺伝子が複数個同定された。以上より、領野形成における外的因子の役割とその分子実体を明らかにし、また脳回形成における外的因子の局在化とその分子基盤解明につながる知見を得た。平成26年度は出産・育児に関わる採用中断期間を平成26年4月9月までとったため、6ヶ月間の採用期間となり、うち平成26年10月27年1月の4ヶ月間は研究再開準備支援期間であった。限られた研究期間であったが、平成26年度と27年度に行う予定であった実験の大部分に着手し、約半分については結論を得た。このため、本研究はおおむね順調に進展していると考える。次年度には、上述したようにこれまでの研究で得られた結果についてのより詳細な解析を進めるとともに、本来計画していた各感覚野の割合に特徴を持つ動物種の解析に着手する。領野形成メカニズムに関してはこれまで得られた結果をまとめて成果発表する。また、脳回形成メカニズムに関してはモルモットにおける外的因子の増加実験を行い、関与するかどうかの結論を得る。また、分子メカニズムの解明に迫るため、特異的に発現する分子の探索を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
rDNAエピゲノムを調節する新たな栄養素同定とそれによるリボソーム制御の解析

本年度は、引き続きKDM2Aを調節しうる栄養素候補抽出のスクリーニングを行った。前年度にHigh throughput解析用の実験系を検討し、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定が適切と考えられたため、今年度はこれを用いて、約100種の栄養関連化合物から、1乳がん細胞株のMCF-7細胞増殖を変化させる化合物、21の増殖変化がKDM2A依存的に生じる化合物、3メトホルミンによるMCF-7の細胞増殖抑制効果を変化させる化合物をスクリーニングした。その結果、前年度までに同定されていた化合物(aKG、コハク酸、ビタミンC、L-バリン、フマル酸)に加え、新たに、1の解析結果から、MCF-7細胞の増殖を変化させる化合物が約10種同定された。また、1の増殖変化が、KDM2A依存的に生じるかを解析したところ、少なくとも3種にその作用が示唆された(2解析結果)。一方、3の解析結果から、メトホルミンによるMCF-7の細胞増殖抑制効果を変化させる化合物の候補を6種同定した。次に、これら化合物によるKDM2A依存的制御の解析、及びメトホルミンによる増殖抑制効果を変化させる機序を解析した。まず、(A) aKG、コハク酸によるKDM2A制御の解析:前年度までにaKG、コハク酸の細胞内量はメトホルミン誘導性のKDM2A依存的rRNA転写抑制に作用する事を示した。メトホルミンはTCA回路に作用する事から、メトホルミンによる有機酸変動とそれによるKDM2A制御の可能性を検討した。その結果、メトホルミンは細胞内コハク酸量に作用し、それを通じてKDM2A活性を制御する可能性を見出した。(B) MCF-7細胞増殖を変化させる栄養成分の解析:実験2で同定した栄養素の一つを解析した所、細胞増殖を減少させる程度の濃度処理により、rRNA転写を減少させる事が分かった。本年度は、研究計画のうちおよそ120種類の栄養関連化合物を含むライブラリーから、MCF-7細胞の増殖を変化させるもの、この変化がKDM2A依存的に誘導されるもの、メトホルミンによるMCF-7細胞増殖減少を変化させるものをスクリーニングした。その結果、初年度までに同定していた物も含め計20種類の栄養関連化合物に上記いずれかの活性がある事が分かった。次に、これらの化合物によるタンパク質合成能への影響を解析する予定であったが、スクリーニング系の構築が完成しなかったため、別の指標である、rRNA転写への影響でタンパク質合成能への影響を評価する事とした。抽出された化合物のうち、2種についてはKDM2A制御を介した、rDNAのエピジェネティックな調節に関わる事が分かった。一方、他の化合物については、rRNA転写への影響を解析中であるが、その中の少なくとも1種類はKDM2A依存的なrRNA転写制御を変える可能性が考えられ、2種は、メトホルミンによるrRNA転写抑制を変える可能性が考えられた。次年度以降にこれらの分子機序、特にKDM2Aを介したrDNAエピゲノム制御の解析を進め、当初の研究目標を達成したい。基本的に研究計画通りに研究を進展させる。得られた結果の判断により実験を柔軟に変更する。本年度のスクリーニングの解析結果から、乳がん細胞株のMCF-7細胞の増殖を変化させた化合物が約10種類、このうち、KDM2A依存的に増殖が変化した物が3種類見つかった。次年度はKDM2A依存的に増殖変化を起こす3種類について重点的に解析を行い、特にKDM2A依存的なrRNA転写制御、及びrDNAエピゲノム制御があるかを解析する。これにより、栄養素を起点とするrDNAエピゲノム制御を通じた新たな細胞増殖制御を明らかにしていきたい。メトホルミンによる細胞増殖抑制効果を変化させる6種類の栄養関連化合物については、まずKDM2A依存的なrDNAエピゲノム制御への作用の解析を行なう。これらの化合物の作用点がKDM2Aでない場合には、それより上流の作用点を模索する実験を行い、化合物がどの作用点でメトホルミン誘導性の機序に関わるのかを明らかにしていきたい。研究計画上、候補栄養素処理によるタンパク合成能への影響を検討する予定であったが、増殖への影響がタンパク合成能の調節とは限らない為、先にrRNA転写への影響を解析した。その結果として、候補栄養関連化合物にrRNA転写への活性が認められたため、次年度にタンパク質合成能を指標にした、High throughput解析が行えるアッセイ系の構築を行う。本年度は、細胞増殖を指標にしたKDM2Aを調節しうる栄養素候補抽出の為のスクリーニング系構築を行った。High throughput解析に適応させるため、マルチウェルプレート上での解析が行える、自動写真撮影法、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定(CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay Thermo社)、アラマーブルー法による測定を検討した。検討対象とした栄養素のうち、約30種類の栄養素を抽出し試薬調整後ミニライブラリーとし、本実験系の構築に使用した。その結果、自動写真撮影法は微細な変化が検出できず、アラマーブルー法は栄養添加による代謝変動の影響を強く受けた為、本解析に適応できなかった。一方、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定は栄養添加による影響も弱く、細胞数をよく反映し解析に耐えうることが分かった為、この手法を用いてスクリーニングを行っていく事とした。ミニライブラリーの解析結果から、KDM2A依存的に増殖変化を誘導する栄養素が抽出出来た。MCF7細胞で特定濃度のL-val処理、フマル酸処理がKDM2A

依存的に増殖変化を示した。ここで計画を変更して次年度計画していた候補栄養素の機能解析を先行して行う事とした。次に、L-val、フマル酸に加え予備検討で抽出されていたaKG、コハク酸処理によるKDM2A依存的な制御の解析を行った。その結果、フマル酸処理は特定の濃度域でKDM2A依存的にrRNA転写抑制を誘導する事が分かった。現在はその機序について解析を進めている。一方、aKG、コハク酸の細胞内量はメトホルミンによって誘導されるKDM2A依存的なrRNA転写調節に作用する事が明らかとなった。加えて、メトホルミン処理はコハク酸の量を、グルタミン除去はaKG量を変動させる事、これらの処理は、乳がん細胞の増殖に寄与する事が分かった。本年度は、研究計画の初めに設定した、細胞増殖を指標にしたKDM2Aを調節しうる栄養素候補抽出の為のスクリーニング系構築を完了した。構築には自身で作成した栄養素約30種のミニライブラリーを利用した。これは、当初計画した栄養素ライブラリーの価格が高く、系の構築が完了してから行う事が効率的と判断したためである。結果、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定が適切であると考え、本研究計画ではこの手法でスクリーニングする事とした。次年度以降、当初計画した栄養素ライブラリー全てを検討しKDM2A依存的増殖を示す栄養素を抽出する。次に系構築過程で抽出された栄養素がKDM2A依存的現象を誘導するかを検討した。これは、スクリーニングによる抽出がどの位精度よくできているか、先に検証するためである。スクリーニングの結果MCF7細胞で特定濃度のL-val処理、フマル酸処理がKDM2A依存的に増殖変化を示す事が分かったが、KDM2A依存的なrRNA転写調節が検出できたのはフマル酸のみであった。L-valについてはrRNA転写制御を介さずに増殖に作用していると考えられた。つまりスクリーニングによる抽出後真にKDM2A依存的rRNA転写制御を誘導するかどうかは個別に検証すべきである事が分かった。これに加えて、予備検討で抽出されていたaKG、コハク酸処理によるKDM2A依存的な制御の解析を行った。その解析結果は論文投稿に向け準備を進めている。初年度は以上の様な進展であった。個々の計画中で部分的に実験を延期した点と、先行して行った点が生じたが、相殺するとおおむね順当に進展していると考える。本年度は、引き続きKDM2Aを調節しうる栄養素候補抽出のスクリーニングを行った。前年度にHigh throughput解析用の実験系を検討し、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定が適切と考えられたため、今年度はこれを用いて、約100種の栄養関連化合物から、1乳がん細胞株のMCF-7細胞増殖を変化させる化合物、21の増殖変化がKDM2A依存的に生じる化合物、3メトホルミンによるMCF-7の細胞増殖抑制効果を変化させる化合物をスクリーニングした。その結果、前年度までに同定されていた化合物(aKG、コハク酸、ビタミンC、L-バリン、フマル酸)に加え、新たに、1の解析結果から、MCF-7細胞の増殖を変化させる化合物が約10種同定された。
骨と歯の形成における軟骨由来成長因子と上皮成長因子の協同作用

ウサギ肋軟骨細胞のDNA合成とプロテオグリカン合成をともに促進するソマトメジン様ペプチドをウシ胎仔軟骨より精製し,これを軟骨由来因子(CDF)と命名した.また,ウシ胎仔軟骨には中性で11Kおよび塩基性で16Kや,プロテオグリカン合成促進活性のみを持つ26KCDFなど数種の分子種が存在することが分かった.CDFの作用機構を検討した結果,そのDNA合成促進作用は軟骨細胞のG1期初期に作用すること,また, CDFとEGFを共存させるとDNA合成が相乗的に促進されるが,この際,まずCDFが軟骨細胞のG1期初期に作用するとEGFなどの非ソマトメジン因子などの増殖刺激に対応しうるようたに活性化されることが分かった.軟骨細胞にホスホチロシンホスファターゼの阻害剤であるvanadate(0.6-60μM)を添加するとチロシンリン酸化レベルが1.5-31倍に上昇した.また, 0.6-6μMでは軟骨型プロテオグリカン合成が亢進した.しかし20-60μMでは反ってプロテオグリカン合成が抑制され,悪性形質転換が起こった.したがって軟骨細胞の分化機能の発現および形質転換にはチロシンリン酸化が関与していることが分かった.ウサギ肋軟骨より成長軟骨細胞を分離して高密度で浮遊培養を行うと,まずDNA合成が亢進し,次いでプロテオグリカン合成, II型コラーゲン合成の亢進を経てアルカリフォスファターゼ活性, X型コラーゲン合成および活性型ビタミンD_3受容体レベルの上昇を来し,遂いには軟骨内石灰化が発現しIn vivoにおける軟骨細胞の分化の過程を再現することに成功した.この系にFGFを添加して2ヶ月間培養を続けたところ,軟骨型プロテオグリカン産生を伴う軟骨様組織の形成が起こったが,アルカリフォスファターゼ活性の上昇や初期石灰化は反って抑制された.今後は,この系を歯胚の培養に応用してその分化の過程を追求したい.ウサギ肋軟骨細胞のDNA合成とプロテオグリカン合成をともに促進するソマトメジン様ペプチドをウシ胎仔軟骨より精製し,これを軟骨由来因子(CDF)と命名した.また,ウシ胎仔軟骨には中性で11Kおよび塩基性で16Kや,プロテオグリカン合成促進活性のみを持つ26KCDFなど数種の分子種が存在することが分かった.CDFの作用機構を検討した結果,そのDNA合成促進作用は軟骨細胞のG1期初期に作用すること,また, CDFとEGFを共存させるとDNA合成が相乗的に促進されるが,この際,まずCDFが軟骨細胞のG1期初期に作用するとEGFなどの非ソマトメジン因子などの増殖刺激に対応しうるようたに活性化されることが分かった.軟骨細胞にホスホチロシンホスファターゼの阻害剤であるvanadate(0.6-60μM)を添加するとチロシンリン酸化レベルが1.5-31倍に上昇した.また, 0.6-6μMでは軟骨型プロテオグリカン合成が亢進した.しかし20-60μMでは反ってプロテオグリカン合成が抑制され,悪性形質転換が起こった.したがって軟骨細胞の分化機能の発現および形質転換にはチロシンリン酸化が関与していることが分かった.ウサギ肋軟骨より成長軟骨細胞を分離して高密度で浮遊培養を行うと,まずDNA合成が亢進し,次いでプロテオグリカン合成, II型コラーゲン合成の亢進を経てアルカリフォスファターゼ活性, X型コラーゲン合成および活性型ビタミンD_3受容体レベルの上昇を来し,遂いには軟骨内石灰化が発現しIn vivoにおける軟骨細胞の分化の過程を再現することに成功した.この系にFGFを添加して2ヶ月間培養を続けたところ,軟骨型プロテオグリカン産生を伴う軟骨様組織の形成が起こったが,アルカリフォスファターゼ活性の上昇や初期石灰化は反って抑制された.今後は,この系を歯胚の培養に応用してその分化の過程を追求したい.初年度は骨形成モデル系としての軟骨培養細胞系に対する軟骨由来成長因子(CDF)と上皮成長因子(EGF)との協同作用について検討した。CDFはソマトメジン様作用を発現し軟骨細胞の増殖を促進する。しかし、その作用はソマトメジンに属さないEGFやFGFよりも弱い。CDFをEGFあるいはFGFと同時に添加するとそのDNA合成が相乗的に促進される。CDFを最初の5時間だけ軟骨細胞に作用させ、洗浄し、以後はEGF(FGF)だけを作用させても協同作用が発覚した。しかしEGF(FGF)を先に作用させて後からCDFを添加した場合にはEGF(FGF)単独の作用しかみられなかった。したがってCDFは軟骨細胞のG期初期に作用して他の増殖刺激に応答しうるように活性化されることが分かった。また、CDFの軟骨細胞に対する応答性と細胞密度との関係を検討した結果、密度が低い間はCDFの増殖促進活性が強く発現し、細胞密度が高くなるにつれて分化機能が強く発現するようになるという合目的的な調節機構が作動していることも分かった。次に軟骨細胞の浮遊培養系にFGFを添加して2ケ月間培養を続けると軟骨型プロテオグリカンの産生が特異的に増加して白い軟骨様組織が多量に生成した。しかし軟骨内初期石灰化反応はFGFによって抑制された。さらにPDGFやTGFβの作用を検討したところ、PDGFは濃度依存的に軟骨細胞のDNA合成を促進し2-6U/mlで最大となった。PDGFによるDNA合成促進活性はCDFやIGFよりも大きく、EGFやFGFよりも小さかった。

またPDGFはソマトメジンをはじめ他の因子と相乗的に作用してDNA合成を促進した。PDGFやTGFβは濃度依存的軟骨細胞のプロテオグリカン合成を促進し、その作用はIGFに匹敵する程強力であった。
Rashbaスピン、局在スピンおよび伝導電子が織り成す2次元物性

金属カルコゲナイド、金属ハライドなどの2次元物質が新しい電子材料として注目されている。本研究では、このような2次元物質が有する電子スピン物性と2次元電気伝導性に着目し、これらが織り成す低次元物性を明らかにする。具体的には、単層低次元金属の電気伝導性とそれに対する磁性不純物の効果、ラシュバ型スピン分裂を有する2枚の単層低次元金属同士の相互作用による超伝導など新しい物性現象の探索を進める。
二重トンネル接合における導電性有機分子の電気伝導機構の解明

分子素子への応用を念頭において、積層型二重トンネル接合における孤立した導電性有機分子の電気伝導特性の解明を目的とし、研究を行った。本年度は、本研究において発見された光照射によるクーロンステアケースのしきい値変化(光誘起ゲート効果)について、その原因を実験的に解明することを試みた。昨年までに、二重トンネル接合の微小中間電極周辺に存在する空間電荷が、その電気伝導に与える影響について、解析的に明らかにすることに成功していたが、実験的な裏づけは薄弱であった。そこで、膜中の空間電荷分布を知ることができるケルビン法を用いて、16K程度の低温における表面電位特性の光照射依存性の測定を行った。また、温度依存性の測定も同様にして行い、空間電荷の振る舞いと二重トンネル接合の電気伝導特性との関係を検討した。金属と有機膜が接触すると、その界面数nmの領域で電荷の授受が行われ、結果、空間電荷層が形成される。ケルビン法はその帯電電位を知る測定法である。本研究では、絶縁層として用いたポリイミド(PI)薄膜とAuもしくはAlとの接触電位を、光誘起ゲート効果の波長依存性、照射時間依存性に着目して、低温(16K)で測定した。その結果、ケルビン法で測定された金属電極上ポリイミド膜の表面電位特性は、光誘起ゲート効果のそれとよく一致し、この効果が微小中間電極周辺の界面空間電荷分布の変化によりもたらされたことが確認された。温度特性(16300K)からも、空間電荷分布の挙動と有機二重トンネル接合における電気伝導特性はよく一致する結果を得ており、有機薄膜を用いた単一分子計測、もしくは分子素子の電気伝導に界面空間電荷を考慮することの重要性が示された。二重トンネル接合における導電性有機分子の電気伝導機構を明らかにするため、本年度はフラーレン(C60)を中間電極とした二重トンネル接合の作製、及び分子を中間電極とした二重トンネル接合の理解に不可欠な、離散的準位を考慮した電流-電圧特性の理論解析を行った。C60は、球対称で諸物性がよく知られており、微小電極としての機能も報告されていることから、実験的にも解析的にも扱いやすい材料である。また絶縁性高分子、ポリイミドは、本研究室においてその超薄膜での特性が研究されている。通常は、ナノギャップ電極や走査型プローブ顕微鏡を用いて二重トンネル接合を実現するが、本研究ではポリイミド:C60混合膜による作製を試みた。その結果、ポリイミドスピンコート溶液に少量のC60を添加し、作製した超薄膜を用いた金属/有機膜/金属構造素子において、二重トンネル接合に特有なクーロンステアケースの観測に成功した。このような作製法は他に例がなく、本研究で初めて見出されたものである。観測されたクーロンステアケースには、電子一つ一つの帯電に起因した周期的なスペクトルと共に、いくつかの特徴的なスペクトルが現れた。このような特性は、離散的なエネルギー準位を持った材料を介したクーロンステアケースに現れることが知られており、本研究で観測された特性は、ポリイミド絶縁層中に存在するC60に起因するものと考えられる。このように複雑なスペクトルを持つクーロンステアケースの理解のためには、離散的なエネルギー準位を持った中間電極を擁した二重トンネル接合における電流-電圧特性の理論解析が必要不可欠である。そこで、現在クーロンステアケースの解析に用いられている理論を応用し、観測されたクーロンステアケースに適用した結果、中間電極におけるエネルギー構造を見積もることができた。
リフレクションのカテゴリー理論による研究

本研究は当初,リフレクションをモナド計算のメカニズムにより定式化しその意味論を与えるという方向で開始したが,研究を進める過程において,リフレクションを含む幅広い文脈における計算概念について,より明確な視点が必要であることを認識するようになった.そこでまずリフレクションの本質について徹底的な考察を行い,そこからカテゴリー理論的な定式化が有効に働く方向を見出すという方針を立てた.そのために計算概念に関心を持つ哲学者や認知科学の研究者との共同研究を組織し,哲学的考察を含む徹底した議論を行った.その成果として,Smithのリフレクションの定式化にヒントを得て計算における対象と現象の位置づけとそれを形式的に取り扱う際の新しい視点を見出すことができた.これについては科学基礎論学会において講演を行い,現在論文を投稿中である.さらにこの視点に基づいて,現実のコンピュータ,ユーザ,ネットワークなどを含む環境全体を計算システムと考えその中でリフレクティブな計算を捉えることによりカテゴリー理論的な手法が有効に働く場面を模索した結果,幾何学的対象についての計算の意味論という方向性を見出した.その最初の試みとして,メレオトポロジーを計算として取り扱うカルキュラスを構成しその意味論を与えた.メレオトポロジーとは部分と全体の一階の理論であるメレオロジーを,ユークリッド空間が満たすような位相構造について推論できるように拡張したものである.ここでは論理を構成的論理とし,証明をCurry-Howardの対応により計算と見なしてカルキュラスを構成した.そしてユークリッド空間の幾何学的対象からドメインを構成することが出来るというEdalatの結果を用いて自然な表示的意味論を与えた.これについては,科学哲学会,およびALGIワークショップにおいて講演を行い,現在論文を準備中である.本研究は当初,リフレクションをモナド計算のメカニズムにより定式化しその意味論を与えるという方向で開始したが,研究を進める過程において,リフレクションを含む幅広い文脈における計算概念について,より明確な視点が必要であることを認識するようになった.そこでまずリフレクションの本質について徹底的な考察を行い,そこからカテゴリー理論的な定式化が有効に働く方向を見出すという方針を立てた.そのために計算概念に関心を持つ哲学者や認知科学の研究者との共同研究を組織し,哲学的考察を含む徹底した議論を行った.その成果として,Smithのリフレクションの定式化にヒントを得て計算における対象と現象の位置づけとそれを形式的に取り扱う際の新しい視点を見出すことができた.これについては科学基礎論学会において講演を行い,現在論文を投稿中である.さらにこの視点に基づいて,現実のコンピュータ,ユーザ,ネットワークなどを含む環境全体を計算システムと考えその中でリフレクティブな計算を捉えることによりカテゴリー理論的な手法が有効に働く場面を模索した結果,幾何学的対象についての計算の意味論という方向性を見出した.その最初の試みとして,メレオトポロジーを計算として取り扱うカルキュラスを構成しその意味論を与えた.メレオトポロジーとは部分と全体の一階の理論であるメレオロジーを,ユークリッド空間が満たすような位相構造について推論できるように拡張したものである.ここでは論理を構成的論理とし,証明をCurry-Howardの対応により計算と見なしてカルキュラスを構成した.そしてユークリッド空間の幾何学的対象からドメインを構成することが出来るというEdalatの結果を用いて自然な表示的意味論を与えた.これについては,科学哲学会,およびALGIワークショップにおいて講演を行い,現在論文を準備中である.
シンテニー解析と合成生物学的手法の融合によるシアノバクテリア硫酸多糖合成系の同定

硫酸基で修飾された細胞外多糖(硫酸EPS)は、バクテリアの中ではシアノバクテリアが特異的に合成する。硫酸EPSの合成・制御系の解明は、シアノバクテリアの生態の理解に繋がるだけでなく、医薬品等として期待されている硫酸EPSの発酵生産などの応用研究においても重要であるが、これまでに明らかにされたものは研究代表者による一例(Xss)のみである。本研究では、Xssの情報を手掛かりとし、相同性とゲノム上の位置関係から未知合成系遺伝子を推定する手法(シンテニー解析)と、形質転換できない種の遺伝子を形質転換可能な別の種に導入する異種発現システムを組み合わせ、多様な新規硫酸EPS合成系の同定を目指す。
腸内微生物社会形成過程における初期状態の理解

ヒトの腸管内には数百種類以上でおよそ100兆個にもおよぶ腸内細菌が生息しており、これら腸内細菌の集団(腸内細菌叢)は、宿主であるヒトの腸管細胞と相互作用しながら複雑な微生物社会を形成している。腸内微生物社会の恒常性維持がヒトの健康状態に寄与する一方、そのバランスの破綻が様々な疾患発症に関わることが近年の研究で明らかとなりつつある。しかしこの複雑で洗練された腸内微生物社会がどのように形成されるのか、特に腸内細菌側の因子については不明な点が多く残されていた。本研究では、腸内微生物社会形成過程の初期状態の理解を目的とし、モデル実験系として無菌マウスへのミューテーター大腸菌定着による腸内定着因子の解析を実施した。その結果、大腸菌ミューテーターゲノムに複数の変異が蓄積していたことから、これらの変異が腸内定着に有利に働くと考えられた。また腸管免疫系による腸内細菌定着制御メカニズムに迫るため、IgA産生機能を失った無菌AID欠損マウスを作製し、同様に大腸菌ミューテーターを用いて腸内定着試験を行ったところ、異なる大腸菌ミューテーターゲノムに野生型無菌マウスへ定着させた場合とは異なる特徴的な変異が蓄積していたことから、腸内微生物社会の形成には宿主腸管免疫系も重要な役割を担うことが示唆された。これらの結果は、腸内微生物社会の形成過程の理解につながるだけでなく、将来的には腸内定着因子を増強した新たなプロバイオティクスの開発にもつながる。27年度が最終年度であるため、記入しない。海洋や土壌など、地球上のあらゆる環境において、多種多様な微生物社会が環境生態系を維持している。われわれヒトを含む哺乳類全般も例外ではなく、その消化管内には数百種類以上で100兆個にもおよぶ共生細菌群が微生物社会を形成している。バランスのとれた腸内微生物社会はヒトの健康維持・増進に有用であることが知られているが、加齢やストレスなど何らかの要因によりそのバランスが崩れてしまうと、いわゆる悪玉菌と呼ばれる有害菌が増加し、宿主にとって有害な腸内発酵(腐敗)を生じることで、大腸癌や炎症性腸疾患、さらにはアレルギーや代謝疾患などが誘発される。その一方で、ビフィズス菌や乳酸菌に代表される善玉菌そのものを摂取することで、バランスの崩れた腸内微生物社会を改善し、上述の疾患の改善や予防を行うセルフメディケーションの重要性が示唆されている。したがって、腸内微生物社会はわれわれの健康と密接にかかわっていると考えられるが、個々の腸内細菌がどのように振舞うことで腸管内における複雑な共生微生物社会を形成しているのか、すなわち腸内微生物社会形成機構の分子機構は不明であった。そこで本年度は、無菌マウスへ大腸菌およびビフィズス菌を定着させたノトバイオートマウスを作製し、腸内ミニマム生態系モデルとして解析を行った。本モデルマウスから経時的に糞便を採取し、大腸菌およびビフィズス菌各々の糞便中細菌数や、腸管内に分泌される免疫グロブリンA(IgA)の定量、さらには腸内代謝産物のメタボローム解析を実施し、得られた情報から数理生物学的アプローチにより、腸内微生物社会の初期状態を反映する数理モデルを構築した。本年度は研究計画書のスケジュール通りに、大腸菌およびビフィズス菌定着ノトバイオートマウスを作製し、経時的に採取した糞便の網羅的解析を実施した。また、次年度実施予定だった数理生物学的解析も一部実施した。本研究課題の今後の方針は、当初の研究計画通りに無菌マウスへの大腸菌ミューテーター腸内定着試験や、遺伝子改変無菌マウスへの大腸菌ミューテーター腸内定着試験を実施する。
糖刺激によるグルコキナーゼの膵β細胞内での局在変化は酵素活性とどう関連しているか

グルコキナーゼの細胞内局在について、単離ラ氏島より、核、ミトコンドリア、細胞内小器官、細胞質の4分画に分けて各分画内のグルコキナーゼ量をwestern blottingで検討した。毎回、一定した傾向を認めなかった。細胞内諸成分を分画中に溶液中で細胞内器官とグルコキナーゼの結合が解離するためと考えられた。EDTA入りの抽出液の他にマグネシウム入りの抽出液なども試してたが、良好な結果を得ることができなかった。そこで、免役組織学的検討に研究を集中した。共焦点顕微鏡による高倍率観察で、糖刺激前に核近傍に局在したグルコキナーゼは、糖刺激後細胞内全体に散らばるが、その大部分はミトコンドリアの表面に存在するという結果を得た。グルコキナーゼがミトコンドリア表面に存在すると見えるのが、正しいかどうか確認するために、これまでミトコンドリアに結合することが判明しているヘキソキナーゼについても同様の検討を加えた。ヘキソキナーゼは糖刺激前からかなりの部分がミトコンドリアに結合しており、糖刺激後、若干結合量が増えた。また、ミトコンドリア蛍光像とヘキソキナーゼ免疫蛍光像の関係は、糖刺激後のグルコキナーゼ蛍光像とミトコンドリア蛍光像の位置関係とほぼ一致しており、グルコキナーゼは糖刺激後、ミトコンドリアと結合するものと考えられた。糖刺激前の核近傍に局在するグルコキナーゼと細胞内小器官の関係を見るため、ゴルジ装置を免疫染色したが、一致像を認めなかった。さらに、免疫電子顕微鏡観察を試みたが、染色後の固定、脱水などで細胞内小器官が破壊され、良好な像を得られていず、現在も条件設定中である。1培養単離ラ氏島を用いてのグルコカイネースの量および局在の変化の検討糖刺激後のラ氏島内のグルコカイネース(以下GK)量の変化をみる目的で、ラ氏島を単離し一晩培養、5.5mMグルコースHanksで2時間前培養後、5.5mMおよび16.7mMのグルコースを含むHanksで2時間培養し、直ちに総蛋白を抽出し、western blotにてGK量の変化を検討した。通常の約11mMグルコースを含むRPMIで一晩培養した場合、既にGK量が増加しており、上記条件では変化がわからないことが判明した。5.5mMグルコースRPMIで前培養すると、高血糖刺激でGK量が増加することが明らかになった。さらに、細胞内局在の変化を調べるため、核、ミトコンドリア、細胞内小器官、細胞質の4分画に分けて各分画内のGK量を検討したが、一定した傾向を認めなかった。これは、蛋白抽出液中でGKと細胞内器官との結合が解離してしまうためと考えられたので、種々の抽出液を用いて検討中である。2.グルコカイネースの細胞内局在部について免疫組織学的検討GKの細胞内局在部を明らかにするために、共焦点顕微鏡を用いての検討を進めている。GKの局在がGolgi装置と無関係であることを明らかにした。GKがミトコンドリアと結合するとの報告があり、膵切片細胞内のミトコンドリアを観察するため、種々の抗ミトコンドリア抗体を試し、条件設定を行った結果、最近、共焦点顕微鏡でミトコンドリアを検出できる系を確立できた。GKに加え、抗ヘキソキナーゼ抗体も入手し、GK、HKの免疫活性とミトコンドリアとの関係を糖刺激前後で検討中である。

毎回、一定した傾向を認めなかった。細胞内諸成分を分画中に溶液中で細胞内器官とグルコキナーゼの結合が解離するためと考えられた。EDTA入りの抽出液の他にマグネシウム入りの抽出液なども試してたが、良好な結果を得ることができなかった。そこで、免役組織学的検討に研究を集中した。共焦点顕微鏡による高倍率観察で、糖刺激前に核近傍に局在したグルコキナーゼは、糖刺激後細胞内全体に散らばるが、その大部分はミトコンドリアの表面に存在するという結果を得た。グルコキナーゼがミトコンドリア表面に存在すると見えるのが、正しいかどうか確認するために、これまでミトコンドリアに結合することが判明しているヘキソキナーゼについても同様の検討を加えた。ヘキソキナーゼは糖刺激前からかなりの部分がミトコンドリアに結合しており、糖刺激後、若干結合量が増えた。また、ミトコンドリア蛍光像とヘキソキナーゼ免疫蛍光像の関係は、糖刺激後のグルコキナーゼ蛍光像とミトコンドリア蛍光像の位置関係とほぼ一致しており、グルコキナーゼは糖刺激後、ミトコンドリアと結合するものと考えられた。糖刺激前の核近傍に局在するグルコキナーゼと細胞内小器官の関係を見るため、ゴルジ装置を免疫染色したが、一致像を認めなかった。さらに、免疫電子顕微鏡観察を試みたが、染色後の固定、脱水などで細胞内小器官が破壊され、良好な像を得られていず、現在も条件設定中である。
ＩＴＤ－Ｆｌｔ３陽性造血器腫瘍におけるｐ２１ＷＡＦ１の機能解析と新たな治療戦略

FLT3遺伝子に生ずるITD-FLT3変異は急性骨髄性白血病(AML)患者に見られ、様々な治療に抵抗する。私達は本研究で、ITD-FLT3が、細胞周期抑制分子であるp21と転写因子Pbx1の発現を制御すること、そしてp21とPbx1がITD-FLT3陽性細胞の増殖を抑制することを見いだした。更にp21は、ITD-FLT3抑制剤AC220に対して抵抗性のITD-FLT3陽性細胞の増殖を制御することも見いだした。これらはp21がITD-FLT3陽性細胞の治療抵抗性に関与することを示し、ITD-FLT3陽性AMLに対する新たな治療標的となりうることを示唆する。チロシンキナーゼ型受容体Flt3遺伝子に生ずるITD-Flt3変異は、急性骨髄性白血病患者にしばしば見られる。しかし、ITD-Flt3標的治療の効果は不充分であり、正常造血への影響を最小限とした新たな分子標的の開発が必要である。サイクリン依存性キナーゼ抑制分子p21WAF1/CDKN1(p21)は、細胞周期と細胞死の制御に関わるが、ITD-Flt3との機能的な関連については研究されていない。「造血前駆細胞増殖におけるp21WAF1機能が、ITD-Flt3と正常型Flt3では異なる」という仮説の検証を行い、ITD-Flt3による造血細胞異常増殖でのp21機能を解析する。方法:1.ITD-Flt3による造血異常におけるp21WAF1の機能解析2.ITD-Flt3と正常型Flt3シグナルによる造血前駆細胞増殖におけるp21WAF1機能の比較3.p21WAF1機能に影響するITD-Flt3シグナル特異的分子の同定昨年度までに1に関してはp21WAF1がITD-Flt3陽性造血細胞の増殖に抑制的であることを見いだした。2,3に関してはITD-Flt3細胞特異的にp21WAF1の欠損によって発現量が変化する分子の一つであるpbx1という転写因子に注目し、ITD-Flt3はp21の発現増加させ、それによるPbx1の発現減少を介して細胞増殖を抑制することを見いだした。今年度は産前産後の休暇および育児休業によって11ヶ月間(平成25年4月1日平成26年2月28日)研究を中断した。ITD-Flt3は細胞増殖を促進するだけでなく、抑制するシグナルも併せ持つため、ITD-Flt3阻害剤がこの増殖抑制シグナルを破壊することで再発や治療抵抗性を引き起こす可能性がある。今後ITD-Flt3抑制剤の治療抵抗性にp21やpbx1が関わるかどうかについて研究を行う予定である。目的:ITD-Flt3陽性AMLは小児でも予後不良である。種々のITD-Flt3阻害剤はその効果は乏しい。したがってその治療抵抗の分子機構を解明する必要がある。本研究では、p21がITD-Flt3の機能によって発現上昇するにもかかわらず、意外にもp21を介してITD-Flt3が増殖抑制信号も生み出すことを示し、その分子機構を解析した。方法:ITD-Flt3をマウス骨髄細胞に導入し、発現変化する分子を同定した。その中で転写因子Pbx1に注目し、ITD-Flt3による異常増殖に及ぼすPbx1機能と発現制御機構を解析した。結果:ITD-Flt3導入によりマウス骨髄造血c-kit+, Sca-1+, Lin-(KSL)細胞は造血因子非存在下で増殖可能となり、同時にPbx1発現は低下、逆にp21CDKN1Aは増加した。p21を欠損させるとITD-Flt3陽性細胞の増殖は減少した。しかし、shRNAによるPbx1の抑制によりITD-Flt3+細胞の異常増殖は部分的に消失した。逆にP21の欠損によりPbx1発現は有意に上昇し、ITD-Flt3+細胞の異常増殖も亢進した。さらにP21欠損により生じたITD-Flt3+細胞の造血因子非依存性の増殖亢進はshRNAによるPbx1抑制よって有意に減少した。これらはPbx1はITD-Flt3による異常増殖に必要であるにも関わらず、その発現はITD-Flt3によるp21の発現上昇を介して抑制されること、そしてその減少がITD-Flt3+細胞の増殖に抑制的に働くことを示す。これらはITD-Flt3が細胞増殖を抑制するシグナルのコンポーネントを併せ持つことを示唆する。従って、ITD-Flt3を単純に抑制することは潜在的な細胞増殖抑制シグナル成分を活性化することになりうる。即ち、ITD-Flt3を抑制することは細胞増殖を促すことにつながりかねない。Flt3/ITD変異陽性の急性骨髄性白血病は予後不良であり、様々な治療に抵抗する。近年開発されつつあるFlt3/ITD変異抑制剤も効果は不十分であり、Flt3/ITD変異抑制剤に対する抵抗性を獲得することが原因の一つと考えられる。例えば、ごく最近開発されたAC220は他のFlt3/ITD変異抑制剤に比べて選択的で効果が高いとされ、臨床治験が行われているが、Flt3/ITD変異はAC220に対しても抵抗性を示すことが報告され、それらを克服するための手段の開発が必要である。

これまでに私たちはFlt3/ITD変異がサイクリン依存性キナーゼの一つであるp21 CDKN1Aの発現を上昇させること、その上昇がFlt3/ITD変異の増殖を抑制すること、p21の細胞増殖抑制機能は部分的に転写因子であるPbx1の発現抑制を介して行われることを見出した。Flt3/ITD変異がp21発現を上昇させ、細胞増殖を抑制することは、逆にFlt3/ITD変異抑制剤はFlt3/ITD変異を抑制することで2次的にp21発現を抑制するために、細胞増殖を亢進するのではないかということを示唆する。私達は、Flt3/ITD変異がFlt3/ITD変異抑制剤AC220に対して抵抗性を獲得するメカニズムに、p21が関与するのではないかという仮説を考え、検証した。Flt3/ITD変異陽性Ba/F3細胞をAC220と培養すると有意にp21の発現が減少した。同時に細胞数も減少したが、AC220存在下でこれらの細胞を更に培養継続すると、AC220抵抗細胞が出現し、AC220存在下でも増殖した。AC220抵抗細胞にAC220を添加してもp21発現は減少した。私たちは、AC220によるp21の発現減少が、細胞増殖の原因の一つではないかと考えた。そこで、これらの細胞でp21を過剰に発現したところ、AC220に対する抵抗細胞の出現が有意に遅れ、逆にp21をshRNAで抑制すると、AC220に対する抵抗細胞の出現が加速された。これらのデータはAC220によるFlt3/ITDの抑制が2次的にp21の発現を抑制し、その結果細胞増殖促進的に働く可能性を示唆する。Flt3/ITD変異陽性の急性骨髄性白血病は予後不良であり、様々な治療に抵抗する。抗がん剤に対する治療抵抗機構を解明し克服することが患者の予後の改善に結び付く。これまでに私たちはFlt3/ITD変異がサイクリン依存性キナーゼの一つであるp21 CDKN1Aの発現を上昇させること、その上昇がFlt3/ITD変異の増殖を抑制すること、また、Flt3/ITD変異がFlt3/ITD変異抑制剤AC220に対して抵抗性を獲得するメカニズムに、p21が関与することを見出した。今年度は昨年度の研究推進方策に従い、AraCなどの細胞周期依存性抗がん剤に対する抵抗性の分子機構にp21が関与することを証明した。一般に急性骨髄性白血病幹細胞は骨髄のニッチに潜み細胞周期は静止期にある。静止期にある白血病幹細胞は、通常の抗ガン治療に対して抵抗する。これまでの研究で、P21の発現を抑制したFlt3/ITD陽性細胞では、細胞周期が亢進し、同時に細胞増殖が活発になることを明らかにした。白血病治療に広く用いられる抗がん剤シタラビン(Ara-C)は細胞周期S期依存的に細胞殺傷作用を発揮する抗がん薬であるので、Flt3/ITD陽性細胞で上昇するp21がAra-Cに対する感受性に影響を与えるのではないかという仮説を考え検証した。その結果、p21発現を抑制したFlt3/ITD陽性細胞では、コントロールのFlt3/ITD陽性細胞に比べAra-Cに対する感受性が増加することが判った。したがって、Flt3/ITD陽性細胞で上昇するp21はFlt3/ITD陽性細胞のAra-Cに対する感受性を低下させていること、すなわちAra-Cに対する抵抗性を高めることが明らかとなった。FLT3遺伝子に生ずるITD-FLT3変異は急性骨髄性白血病(AML)患者に見られ、様々な治療に抵抗する。私達は本研究で、ITD-FLT3が、細胞周期抑制分子であるp21と転写因子Pbx1の発現を制御すること、そしてp21とPbx1がITD-FLT3陽性細胞の増殖を抑制することを見いだした。
心身の健康行動変容アプリケーションの開発および評価

本研究では,利用者に健康増進に資する行動を積極的にとってもらうための支援や,そのような行動の定着化を目的としたモバイル端末用アプリケーションを開発する.実際の研究においては,a)スマートフォンで利用する身体活動,健康的な食行動,およびストレスマネジメント行動の3つの健康行動を促進させるためのアプリケーションを開発し,b)アプリケーションのモニター実験・本格運用により心身の健康増進介入の有効性を定性的・定量的に評価する.さらに,c)県内での産官学連携やアプリケーションの無料貸与などを通して、最終的には地域住民の包括的な健康にも貢献する.本研究では,利用者に健康増進に資する行動を積極的にとってもらうための支援や,そのような行動の定着化を目的としたモバイル端末用アプリケーションを開発する.実際の研究においては,a)スマートフォンで利用する身体活動,健康的な食行動,およびストレスマネジメント行動の3つの健康行動を促進させるためのアプリケーションを開発し,b)アプリケーションのモニター実験・本格運用により心身の健康増進介入の有効性を定性的・定量的に評価する.さらに,c)県内での産官学連携やアプリケーションの無料貸与などを通して、最終的には地域住民の包括的な健康にも貢献する.