hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低出生体重児のストレス反応とグルココルチコイドレセプター遺伝子DNAメチル化解析

極低出生体重児31名の臍帯血、退院後血でグルココルチコイド(GR)遺伝子プロモーター領域の8つのCpGのメチル化率と周産期、新生児期要因の関係を解析した。臍帯血のメチル化率の平均値およびCpG#209のメチル化率は在胎期間と負の相関を認めた。退院後血と臍帯血の同CpGのメチル化率の差は、平均値およびCpG#209、#205において在胎期間と有意な正の相関を認めた。出生前ステロイド投与例は非投与例にくらべ臍帯血CpG#206のメチル化率が有意に高率であった。早産であるほどストレス反応を制御するGR遺伝子の一部CpGのメチル化率が出生前に増加し、生後のストレス反応に影響している可能性が示唆された。低出生体重児は、一般児にくらべ自閉症スペクトラム障害(ASD)など、行動や感情の発達障害の合併が多いことが報告されているがその理由は不明である。NICUに入院した低出生体重児のストレス反応とグルココルチコイドレセプター(GR)遺伝子(NR3C1)のDNAメチル化率の関係を検討し、低出生体重児における発達障害の発症にエピジェネティクスによるGR遺伝子のDNAメチル化変化が関与することを明らかにすることを本研究の目的とした。平成26年度には、研究の実施計画を倫理委員会に申請し研究の承認を得た。研究対象は、在胎30週未満または出生体重1000g未満の児とし、NICU入院時に保護者に説明を行い同意を取得した。同意の得られた7名の臍帯血から、DNA抽出キット(Flexigene DNA Blood Kit)を用いてゲノムDNAを抽出し保存中である。0.51.5mlの臍帯血全血から1575μgのDNAが回収でき、メチル化解析に十分な量であることを確認した。NR3C1の解析領域の遺伝子情報からプライマー配列を決定しプライマー設計を行い、メチル化解析の準備を整えた。対象の、妊娠中の経過、母体へのステロイドを含めた投与薬物、在胎期間、出生体重、NICU入院期間中にみられる合併症、治療についての情報を経時的に取得し、データベースを作成した。平成26年度の目標症例数は10名であったが、7名しか同意・検体取得ができなかったため、対象を32週未満または出生体重1500g未満に拡大する予定とし、倫理委員会への変更申請を行う。また、唾液中のコルチゾール・アミラーゼの測定法を確立したが、NICU入院中児での測定ができなかったため、平成27年度には唾液の採取とコルチゾール、アミラーゼの測定を実施する。平成26年度は同意の上試料を採取できたのは2名のみであったため、平成27年度には、対象を在胎30週未満または出生体重1000g未満の児から、在胎32週未満または出生体重1500g未満の児に拡大した。これにより目標症例数40例中、臍帯血は30例から採取ができた。またNICU退院後の試料も22例から採取した。全血からDNAを抽出し連結可能匿名化後に保存した。保存したDNAサンプルからヒトGR遺伝子(NR3C1)のDNAメチル化解析のための調整を行った。また、臍帯血を採取した30例の、周産期情報、NICU入院中の合併症や治療のイベントを診療録から後方視的に抽出し、データベースを作成した。データベースは出生体重、在胎期間、SGAの有無、出生前および出生後グルココルチコイドの使用、人工呼吸の有無、在院日数などの項目からなる。平成28年度前半には全サンプルについて、バイサルファイト処理したDNAからPCR法によりNR3C1遺伝子の-3492-3082領域を増幅し、PCR産物をPyroMark MD systemにより精製しシークエンスを行う。確定した2つのシークエンスprimerを用いてCpGサイト113までのDNAメチル化率を測定する。データベース化した周産期・新生児期の合併症、予想されるストレスの程度と臍帯血およびNICU退院後血液のNR3C1遺伝子の各CpGサイトのメチル化率およびメチル化率の変化との関連を統計学的手法により解析を行う。目標症例数に達しないため当初の研究対象かを拡大して倫理委員会に変更申請を行い、許可後に、同意取得とサンプル採取を行ったため時間を要した。しかし対象拡大により平成27年度末に、目標症例数の75%まで到達できた。NR3C1遺伝子のDNAメチル化率の測定は、効率よく確実に解析するためには、40サンプル以上で実施することが望ましいため、メチル化率の測定が遅れた。平成27年度に対象を在胎32週未満または出生体重1500g未満の児に拡大したことにより、平成28年度内で計31症例の臍帯血およびNICU退院後試料を採取できた。保存したDNAサンプルからヒトGR遺伝子(NR3C1)のDNAメチル化解析を行った。全サンプルについて、バイサルファイト処理したDNAからPCR法によりNR3C1遺伝子の-3492-3082領域を増幅し、PCR産物をPyroMark MD systemにより精製しシークエンスを行った。2つのシークエンスprimerを用いてCpGサイト113までのDNAメチル化率を測定し、平成29年2月に測定を終了した。

また、対象31例の周産期情報、NICU入院中の合併症や治療のイベントを診療録から後方視的に抽出し、出生体重、在胎期間、SGAの有無、出生前および出生後グルココルチコイドの使用、人工呼吸の有無、在院日数などの項目からなるデータベースを作成した。データベースに臍帯血およびNICU退院後血液のNR3C1遺伝子のエクソン1Fの13のCpGサイトのメチル化率を入力し、メチル化率、メチル化率の変化と周産期・新生児期の合併症、予想されるストレスの程度との変化との関連を統計学的手法により解析を行った。臍帯血の平均メチル化率を75パーセンタイル以上のHigh群、2575パーセンタイルのMidium群、25パーセンタイルのLow群に分けて比較すると、H群はL群に比較し優位に出生時の在胎期間が短かった。性別、出生体重、出生体重SDスコアに差を認めなかった。早産であるほど、胎内でNR3C1遺伝子のメチル化が増加していることが示唆された。今後その他の周産期要因との関連を統計学的に検討し論文発表を行う。目標症例数に達しないため当初の研究対象を拡大して倫理委員会に変更申請を行い、許可後に、同意取得とサンプル採取を行った。平成28年度前半で目標症例数40例の75%である31例まで到達できたため、NR3C1遺伝子のDNAメチル化率の測定を行った。測定終了が2月となったため、研究期間を1年延長して現在結果を解析中である。該当年度に同意が得られた11名の臍帯血および退院後採血の児血のDNAを用いて、グルココルチコイドレセプターであるNR3C1遺伝子のプロモーター領域(ADS749-FS、ADS2386-FS)のメチル化率をパイロシークエンスにより測定した。平成28年度までに同様の測定を行った20名とあわせて計31名の結果を解析した。臍帯血の測定したすべてのCpGのメチル化率の平均は在胎期間と負の相関(r=-0.432,p=0.02)を認めた。ADS2386-FSのCpG#209領域のメチル化率も在胎期間と負の相関(相関係数-0.36、p=0.047)を認めた。退院時採血と臍帯血の同部位のメチル化率の増減(デルタメチル化率)は、測定したすべてのCpGの平均値、およびCpG#209、#205において、在胎期間と正の相関を認めた。すなわち、より早産であるほど出生時のグルココルチコイドレセプターのメチル化率が高いことが示唆された。更に、出生からNICU退院までの間のメチル化率の増加は、より早産であるほど大きいことが示唆された。一方、ADS749-FS領域のメチル化率は、在胎期間、出生体重、重篤な合併症等と有意な関連を認めなかったが、すべてのCpGにおいて測定値が低値であり、測定感度の問題があることが考えられた。以上より、早産とNR3C1遺伝子のExon 1F Promoter領域のメチル化率の増加の関連が明らかとなった。早産出生となった原因は多様であるが、より早産であるほど出生前の大きなストレスが生じストレス反応を制御するグルココルチコイドレセプターのメチル化率を増加させ、児の成長後のストレス反応に影響する可能性が示唆された。ストレス反応の変化が早産でリスクの高いことがしられるADHDなどの発達障害と関連するかについては、児の発達についての長期的な観察が必要である。極低出生体重児31名の臍帯血、退院後血でグルココルチコイド(GR)遺伝子プロモーター領域の8つのCpGのメチル化率と周産期、新生児期要因の関係を解析した。臍帯血のメチル化率の平均値およびCpG#209のメチル化率は在胎期間と負の相関を認めた。
自然睡眠薬開発を指向した脳微小透析法による脳内活性物質の探索と構造解析

われわれは,自然睡眠を指標としたスクリーニングを行い,断眠させたラットの脳幹抽出物から睡眠促進物質としてウリジンおよび酸化型グルタチオンを単離,同定した.その後,これら睡眠促進物質の睡眠機構における役割を解明する目的で,まずラット脳内における経時変動を脳微小透析-HPLC法を用いて定量分析し,さらに睡眠および覚醒状態との関連を検討することを計画している.その初期の実験において,HPLCクロマトグラム上の睡眠促進物質以外の数種のピークが経時変動し,大まかな昼夜リズムと相関して増減することを見出している.そこで,これらの経時変動が睡眠および覚醒状態と相関性を示すか否かを検討する予備実験を行った.まず脳微小透析-HPLC装置と,自由行動下でラットの脳波を測定,解析する装置とを有機的に結合させ,長期実験を行えるシステムの構築を試みた.しかし,脳微小透析法のプローブである微小透析膜は,期待に反して長期の便用には不適で,脳内埋め込み後数日でめづまりをおこし,脳内からの試料溶液の採取量が極端に低下してしまい,経時変動するピークの統計的に有意な定量値が得られなかった.また,いろいろな材質の透析膜を使用してみたが改善は認められなかった.したがって,特定のピークの経時変動と睡眠および覚醒状態との相関を詳細に調べることは現状では不可能であった。今後は,上記の長期実験を行えるシステムの構築を続行するとともに,大まかな昼夜リズムと相関して経時変動するピークをそれぞれHPLCで単離したのち構造解析し,さらにそれらのラットの睡眠に対する効果を別個に検討する計画である.われわれは,自然睡眠を指標としたスクリーニングを行い,断眠させたラットの脳幹抽出物から睡眠促進物質としてウリジンおよび酸化型グルタチオンを単離,同定した.その後,これら睡眠促進物質の睡眠機構における役割を解明する目的で,まずラット脳内における経時変動を脳微小透析-HPLC法を用いて定量分析し,さらに睡眠および覚醒状態との関連を検討することを計画している.その初期の実験において,HPLCクロマトグラム上の睡眠促進物質以外の数種のピークが経時変動し,大まかな昼夜リズムと相関して増減することを見出している.そこで,これらの経時変動が睡眠および覚醒状態と相関性を示すか否かを検討する予備実験を行った.まず脳微小透析-HPLC装置と,自由行動下でラットの脳波を測定,解析する装置とを有機的に結合させ,長期実験を行えるシステムの構築を試みた.しかし,脳微小透析法のプローブである微小透析膜は,期待に反して長期の便用には不適で,脳内埋め込み後数日でめづまりをおこし,脳内からの試料溶液の採取量が極端に低下してしまい,経時変動するピークの統計的に有意な定量値が得られなかった.また,いろいろな材質の透析膜を使用してみたが改善は認められなかった.したがって,特定のピークの経時変動と睡眠および覚醒状態との相関を詳細に調べることは現状では不可能であった。今後は,上記の長期実験を行えるシステムの構築を続行するとともに,大まかな昼夜リズムと相関して経時変動するピークをそれぞれHPLCで単離したのち構造解析し,さらにそれらのラットの睡眠に対する効果を別個に検討する計画である.
大動脈外膜に局在する血管前駆細胞を介した血管病変形成メカニズムの検討

本研究においては、血管に局在する血管前駆細胞の局在と血管病変との関わりを検討した。GFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を放射線照射した野生型マウスの骨髄に移植し、骨髄細胞をGFP発現細胞に置換え、大動脈をリング状に薄切し、3次元組織培養を行うことで、血管前駆細胞が骨髄に由来する細胞であるのかを検討した。その結果、発芽した細胞中にGFP発現細胞はほとんど検出されず、新生された血管にもGFP発現細胞は検出されなかった。このことにより血管前駆細胞は骨髄由来ではないこと、血管新生には骨髄由来細胞ではなく血管外膜に元々局在する血管幹細胞が関与する可能性が示唆され、血管病による血管障害を受けた際、血管前駆細胞は骨髄からの動員ではなく、血管外膜に局在する血管前駆細胞が血管新生に関与することが示唆された。また血管に高い親和性を示す蛍光標識レクチンをラットに静脈内投与をすることにより血液循環のあるvasa vasorumと血液循環のない血管前駆細胞との判別を行った。その結果、血液循環のない血管前駆細胞はvasa vasorum周辺に多く局在し、さらに血管外膜周囲の脂肪組織中の微小血管周囲にも局在することが認められた。また、動脈硬化モデルラットでは血管外膜においてvasa vasorum、さらには血管外膜周囲の微小血管が増殖することが認められた。以上のことより、血管病変によるvasa vasorum、血管周囲脂肪細胞における微小血管の増殖に血管外膜局在性の血管前駆細胞が関与している可能性が示唆された。
分子生物学的手法を用いた植物葉圏細菌相の解析

自然界には培養できない細菌が多く、土壌では約99%は培養できない細菌と考えられているが、植物体では不明であった。本研究では、染色法を用いることで、代表的な作物である、イネ、ムギ葉面の「培養できる細菌」(A)と「培養できない細菌を含む全細菌数」(B)を国内2カ所で調べ、両者の割合を世界で初めて明らかにした。この結果、ムギの比率A/Bは1/1000程度に対して、イネでは1/10程度と顕著に異なることを明らかにした。この結果、培養できない細菌(未利用資源とも言える)の全細菌に対する比率はムギがイネに比べ顕著に高いことと、培養法による細菌の評価(数、役割等)における留意点を提出することができた。つくば市と福岡市の2地域において、コシヒカリ(つくば市と福岡市)とヒノヒカリ(福岡市)の2品種の健全イネの葉圏における細菌集団構造の基礎的知見を得る目的で、全細菌数及び培養可能細菌ついての性状解析を行った。全細菌の測定は染色法を用い、培養可能細菌については平板希釈法で細菌数の計測を行った。とくに、今年度は、植物体成分の混入が少なく比較的解析しやすい葉面細菌について、全細菌数と培養可能菌数を比較した。その結果、両品種の葉面には約10^6 cfu/gの細菌が存在しており、そのうち約10^5 cfu/gの細菌が培養可能であった。葉内も合わせた葉圏には、約10^710^8 cfu/gの培養可能な細菌が存在した。葉面における培養可能な細菌の構成のうち、グフム陰性でオキシダーゼおよびカタラーキシダーゼともに陽性の細菌群と、グラム陽性でオキシダーゼ陰性、カタフーゼ陽性の細菌群の2つが優占であった。また培養可能な全細菌のうち、AHL(アシル化ホモセリンラクトン)分解菌は1327%、および同生産菌は約57%であった。これらの結果、少なくともイネにおいて、全細菌が培養可能な細菌数より多く、イネの葉面には培養できない細菌が少なくとも培養可能細菌の10倍以上生息していることがはじめて示唆された。これまで土壤中には、培養可能細菌数は全細菌数の1%程度といわれているが、イネの葉面でも培養できない菌が圧倒的多く生息していることが示唆されたことは、植物体の微生物の利活用、遺伝子源として新な可能性があること、および生態系における微生物の役割を解析するうえで意義のある成果と考えるただし、本年度得られた結果の信頼性については、年度の反復が必要であり、20年度も引き続き検討する。つくば市と福岡市の2地域において、コシヒカリ(つくば市と福岡市)とヒノヒカリ(福岡市)の2品種の健全イネの葉圏における細菌集団構造の基礎的知見を得る目的で、全細菌数及び培養可能細菌の性状解析を行った。また、本年度はムギでの細菌数の比較も行った。さらに、つくば地区においては、1年目に実施した全細菌測定法の勘弁、迅速化のために、測定法の改良を行った。細菌数調査の結果、イネにおいては、福岡地区、つくば地区の2ヵ年の試験結果から「培養できる細菌」に比べ、全細菌が有意に多いことが明らかとなった。このことから、イネの葉鞘には、「培養できない細菌」が「培養可能な細菌」より明らかに多いことが解明された。また、ムギにおいては、葉鞘の全細菌数は「培養可能細菌」より100倍以上多く、この比率はイネ(約10倍程度)より遙かに高かった。このことから、同じイネ科植物のイネとムギの葉鞘でも、「培養可能細菌数」と「培養できない細菌数」の比率が顕著に異なることが示唆された。このような結果が事実だとすると、葉圏微生物の生態、生物防除などを研究する際に極めて重要な知見を提出することができる。このため、最終年度は、とくの年度の反復を行う必要があるので、ムギの調査をさらに実施し、最終的にイネ、ムギの「全細菌数」と「培養可能細菌数」の比率を明らかにしたい。その他、福岡地区においては、イネ、ムギの葉圏細菌(培養可能細菌)について、昨年同様に、16SrDNA解析による種の構造解析やクオラムセンシング物質生産性を調べ、ほぼ昨年同様の結果を得た。つくば地区においては、「全細菌数のより安定した計測法」を開発することができた。従来に比べ簡単で、迅速であるため、より多くのサンプルを短時間で解析することができるようになった。

また、本年度は昨年に続きムギでの細菌数の比較も行った。つくば地区では昨年開発した全細菌測定法を用いたイネ、ムギの全細菌数を調べ、培養菌数との比較を行った。その結果、イネにおいては、福岡、つくば地区の3カ年の試験結果から「培養できる細菌」に比べ、全細菌が有意に多いことが明らかとなった。また、イネ、ムギとも葉鞘洗浄液中の「全細菌数(培養できない細菌を含む)」は「培養可能な細菌」より多かったが、その割合は、イネ(約10倍程度)より著しく高かった(ムギ:100倍以上)。さらに、本年は、ムギで培養可能菌が全細菌数の100分の1以下になる原因は、低温などの環境ストレスによるVBNC化ではないかと仮説をたて、1)VBNC化を減らすとされている活性酸素阻害剤(ピルビン酸)を入れた培地を用いた分離、2)菌密度に及ぼす気象要因の影響評価を行った。その結果、ピルビン酸の影響は認められなかったが、培養可能細菌数は、サンプリング日までの5日間の平均相対湿度などが大きく影響している可能性が示唆された。以上から、3カ年の研究で、まず葉鞘洗浄液の全細菌数評価手法を開発するに成功した。次に、それらの技術を基に、イネ、ムギにおける全細菌数と培養可能細菌数の比率が安定していること、しかし、その比率がイネとムギで異なることを明らかにした。さらに、ムギで培養可能細菌数の全細菌数に対する比率がイネに比べ著しく少ない原因として、気象要因が関与していることが示唆された。植物体における全細菌数、培養可能細菌数の評価をした例は世界で初である。
GnRHニューロンの活動性同期のメカニズムの解明

生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンの制御機構における性差を明らかにするために、成熟動物の脳内において主な抑制性伝達物質であるGABAに着目して検討を行った。その結果、GABAおよびGABA_A受容体のアゴニストであるmuscimolにより細胞内カルシウム濃度の上昇がみられ、GABA_A受容体のアンタゴニストであるbicucullineで反応が阻害されたことから、GABAがGnRHニューロンでは興奮性に作用していること、さらに、雌では90%のGnRHニューロンが興奮性を示すのに対して、雄では50%のみであり、興奮性を示すGnRHニューロンの割合には性差があることが明らかになった。また、興奮性を示すGnRHニューロンの割合には日内変動があることや、性周期に伴う変動があることがわかった。発達に伴うGABA応答の変動を調べたが、発達段階ではGABAの反応に性差はみられなかった。GnRHニューロンでみられるGABA応答の変動は細胞内Cr濃度のレギュレーターであるKCC2の機能発現の変動である可能性が考えられたため、KCC2の機能制御機構の検討を行ったところ、KCC2はC末端にチロシンキナーゼのリン酸化部位が一カ所存在するが、この部位への変異の導入によりKCC2が機能しなくなることや、C末端領域の欠失によりKCC2が機能しなくなることが明らかになった。次に、GnRHニューロンが示すCa^<2+>オシレーションにおけるGABAの役割について検討を行ったところ、GABAによりCa^<2+>オシレーションの同期が増加することがわかった。さらに、GnRHニューロンに投射しているGABAニューロン終末からのreleaseを調べたところ、雄に比べて雌の方がspontaneous IPSCのfrequencyが高いこと、すなわちGABA releaseが多いことが明らかになった。雌ラットでは、4日に一度、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)の大量分泌が起こり、その結果、黄体形成ホルモンが分泌され、排卵が引き起こされる。一方、雄ラットではGnRHの周期的な大量分泌が起こらないため、性周期を示すことはない。GnRHニューロンの制御機構およびその性差のメカニズムは明らかになっていない。そのメカニズムとして、視床下部に散在するGnRHニューロンの活動が同期している可能性が考えられる。一方、未熟動物の多くの脳部位において多数のニューロンが同調して活動するメカニズムとしてGABAの興奮性作用が注目されている。GnRHニューロンに対するGABAの作用を調べたところ、GABAは、雌ラットでは90%、雄では50%のGnRHニューロンで細胞内Ca^<2+>を上昇させ、興奮性として作用していることが明らかになった。GnRHニューロンの株細胞であるGT1-7細胞を用いて、Cl^-を細胞外にくみ出すトランスポーターであるK^+-Cl^- cotransporter (KCC2)の発現をウエスタンブロッティング、免疫染色法により調べたところ、KCC2の発現はみられなかった。また、GT1-7細胞にKCC2を強制発現させたところ、GABAの作用は抑制性に変化した。よって、GnRHニューロンのautocrineのメカニズムにより、活動依存的にKCC2の発現を抑制し、GABAに対する反応を興奮性にしている可能性が考えられるため、現在、in vivoでGnRHニューロンにKCC2をレンチウイルスを用いて強制発現させ、性周期への影響を調べている。また、Ca^<2+>オシレーションの同期を記録するための視床下部のスライス培養系を確立し、GnRHの合成阻害やGnRHニューロンの活動性抑制によるCa^<2+>オシレーションの同期の変化やKCC2の発現の変化を検討中である。
初期物質進化過程の実験的解明:コンドライトからエコンドライトへ

太陽系形成初期には、コンドライトといわれる非常に始源的な物質がまず形成され、それらがいろいろな熱源により溶かされて、エコンドライトと呼ばれる溶けた形跡のある物質が形成される。これは太陽系最初期の物質進化である。これを実験室内で再現するため、顕微鏡下、真空状態で、1150度程度までの加熱溶融実験を行い、初期の物質進化が鉄を含む物質に密接に関係していることを明らかにした。本研究の目的は、コンドライト隕石について、低温での小規模な初期部分溶融によって、どのような組織・組成のメルトが形成されるか実験的に再現・分析し、さらに、コンドライトからエコンドライトへの物質進化の初期状態を残しているプリミティブ・エコンドライトに見られる組織・鉱物組成と比較することにより、原始惑星の最初期に起こった分化過程を実験的にシミュレートし、物質分化の最初期の素過程を解明することである。始原的コンドライト隕石のチップを用いて、光学顕微鏡下で、加熱・溶融実験を行い、低温部分溶融メルトの形成に伴う溶融量の違いで、隕石組織やメルト組成がどのように変化するかについて、その場観察することが最も重要な実験である。この実験を行うためには、既設置の光学顕微鏡下で、部分溶融実験を行うための顕微鏡用真空加熱装置が必須であり、これを本研究費で購入した。この加熱装置は試料部を加熱するとともに、真空にすることが可能であり、この装置を光学顕微鏡下に設置し、初期的なセッティングを行い、所定の真空度と温度が達成可能であることを確認した。さらに、予備的な実験と装置の最適化を行った。酸素分圧を還元的にすることによる白金の劣化について、過去の実験による劣化程度の情報収集を行ったが、予想以上の劣化が確認できたため、今後、慎重に実験条件を決定する予定である。当面は、手持ちの始原的なコンドライト隕石のチップを用いて、予備的な実験も含めて、真空加熱実験を行う予定である。本研究の目的は、コンドライト隕石について、小規模な初期部分溶融によって、どのような組織・組成のメルトが形成されるかを実験的に再現・分析し、さらに、コンドライトからエコンドライトへの物質進化の初期状態を残しているプリミティブ・エコンドライトに見られる組織鉱物組成比較することにより、原始惑星の最初期に起こった分化過程を実験的にシミュレートし、物質分化の最初期の素過程を解明することである。始原的コンドライト隕石のチップを用いて、光学顕微鏡下で、加熱・溶融実験を行い、比較的低温での部分溶融メルトの形成に伴う溶融量の違いで、隕石組織やメルト組成がどのように変化するかについて、その場観察することが最も重要な実験である。この実験を行うため、既設置の光学顕微鏡下で、部分溶融実験を行うための顕微鏡用真空加熱装置を購入した。この加熱装置は試料部を加熱するとともに、真空にすることが可能であり、初期的なセッティングを行い、所定の真空度と温度が達成可能であることを確認し、さらに、始原的な普通隕石を用いて実験を行うとともに装置の最適化を行っている。酸素分圧を還元的にすることによる白金の劣化については短時間の加熱ならばそれほどの劣化が起こらないようであるが、今後数多くの実験を重ねることによって、実験条件を決定する必要があると考えられる。加熱実験では、当面は目視による観察を行っているが、今後は生成物の分析を準備中である。本研究の目的は、コンドライト損石について、小規模な初期部分溶融によって、どのような組織・組成のメルトが形成されるかを実験的に再現・分析し、さらに、コンドライトからエコンドライトへの物質進化の初期状態を残しているプリミティブ・エコンドライトに見られる組織鉱物組成と比較することにより、原始惑星の最初期に起こった分化過程を実糊にシュミレートし、物質分化の最初期の素過程解明することである。光学顕微鏡下で、部分溶融実験を行うための顕微鏡用真空加熱装置を本経費で購入した。H6コンドライト損石(Asuka881571)のチップを用いて、1150°Cまで、真空条件下で加熱・溶融実験を行った。その結果、約1000°Cで、まずFeSが周りの物質と反応し、徐々に部分溶融することが分かった。チップ試料を用いた場合は、粉末試料を用いた通常の溶融実験と比較して反応の進み具合が遅いことが予想されるが、一定温度をある程度保つことでゆっくりと反応が進み、また、FeSが周りの物質と徐々に反応していく。このようにまずFeSから反応が進んで行くことは、プリミティブ・エコンドライトに見られるような鉄分布の偏りと調和的な結果であり、初期の物質進化の研究に重要な示唆を与えるものである。また、酸素分圧を還元的にすることによる白金の劣化については短時間の加熱ならばそれほどの劣化が起こらないようであるが、今後数多くの実験を重ねることによって、実験条件を決定する必要があると考えられる。しかしながら、真空条件下でも初期の物質進化について重要な示唆を与える結果が得られた。
プラナリア再生におけるマスター遺伝子としてのホメオボックス遺伝子の研究

プラナリアは再生能力の強さと、三胚葉性の原型をもつ点で動物体制の研究に独特の機会を与えている。プラナリアの再生における形態形成を明らかにするために、軸形成に強い相関をもつHOM-Cタイプのホメオボックス遺伝子、位置情報に関連した細胞間シグナル分子の解析を進めた。ゲノムを用いたPCR法によって、19種類のホメオボックス遺伝子群を同定した。PCR産物をプロープにして、プラナリア頭部のcDNA IibraryからDjh3,Djh4の2個のクローンをえ、全長の構造を決定した。Djh3,Djh4は各々ショウジョウバエのabd-AとDfdの相同遺伝子であり、HOM-Cタイプのホメオボックス遺伝子がプラナリアにおいて初めて確認された。Djh3とDjh4はcDNAライブラリーサイズ250万の中で各1個しか存在しないものであり、in situ hybridizationで検出できないレベルあると考えられる。HOM-Cが正常プラナリアに低レベルでしか発現せず、再生体で発現レベルが高まる可能性を検討した。1,2日目再生体mRNAからPCRによりホメオボックス遺伝子を検索したところ、新たに6個のHOM-Cタイプのものをえた。扁形動物であるプラナリアに約8種のHOM-Cタイプの遺伝子が確認された。位置情報に関連した頭部領域特異的な遺伝子、抗体を効率的に探索するために、IDS法(immuno-differential screening)を開発した。頭部と咽頭に対する2種類のポリクローン抗体でcDNA発現ライブラリーを検索し、比較することによって、頭に特異的なcDNAクローンと特異抗体を同時にえることができた。特に、注目されたのは、ウエスタンブロットで頭、尾の末端構造に強く発現する30kDタンパク質とその遺伝子(PN5)である。PN5はノザンブロットでは検出できない発現量の少ない遺伝子であり、遺伝子構造からはロイシンジッパーをもつ分泌性の新規なタンパク質をコードしていた。
量子効果を導入したナノワイヤー熱電変換素子の開発と評価

移動度の変化をホール係数測定により実験的に評価するために、集束イオンビーム加工を利用したホール測定用電極の作製を行った。サンプルの直径が非常に細い点とビスマスが大気中で酸化しやすいという点から、ナノワイヤー側面に局所的な電極を取り付ける事は非常に多くの困難を要する。そのため、ビスマスナノワイヤーにおけるホール測定の結果は、これまで報告されていなかった。そこで、本研究では研磨と集束イオンビーム加工を利用して、石英ガラス製の鋳型中に配置されたビスマスナノワイヤーに対してナノスケールのホール測定用の局所電極を作製した。このように作製した直径700nmのビスマスナノワイヤーを利用してホール係数の測定に成功し、キャリア移動度の評価を行った。ナノワイヤーにおけるホール係数の測定は世界で4例目、ビスマスナノワイヤーに関しては初めての結果となった。また、直径160nmのビスマスナノワイヤーのゼーベック係数の温度依存性を測定したところ、これまでの直径200nm以上のサンプルでは現れなかったゼーベック係数の上昇が観察された。これまでの研究では、ワイヤー直径を小さくすることによりキャリアの平均自由行程が制限され、キャリア移動度が減少するために、ゼーベック係数は徐々に低下する傾向があった。しかし、直径160nmのビスマスナノワイヤーの測定結果は、予想される温度依存性よりも上昇し、50K程度で極値を持つような温度依存性が得られた。理論計算によると直径200nm以下ではバンド構造が変化することにより、ゼーベック係数が変化すると予想されている。このようにビスマスナノワイヤーにおけるゼーベック係数の上昇を世界で初めて観測した。世界で初となる直径700nmのビスマスナノワイヤーのホール係数測定に成功し、キャリア移動度の評価まで行った。また、直径160nmのビスマスナノワイヤーの開発と測定を行い、ゼーベック係数が上昇する結果が得られている。このように、当初の目標であったナノワイヤー中のキャリア移動度評価と、ナノワイヤー化によるゼーベック係数の上昇を達成することが出来たので、順調に進展しているといえる。これまでの研究で、直径160nmBiナノワイヤーを利用して世界で初めて熱起電力の向上が示唆される結果が得られた。しかしながら、理論的に予想されている50nm以下という直径に比べて大きく、その原因がわかっていないというのが現状である。そこで、今後はこの結果を詳細に検証するためにより小さい直径でのゼーベック係数の測定や、極低温・強磁場を利用したシュブニコフ・ド・バース振動・ネルンスト起電力の測定によるフェルミ面の解析等を進めていく。そして、ナノワイヤー構造を利用したエネルギー変換効率の大幅な向上を目指す。熱電変換材料にナノワイヤーや超格子等の低次元量子構造を導入することにより、エネルギー変換効率が大幅に向上する可能性が理論的に示されており、本研究ではビスマスナノワイヤーを用いた熱電変換材料の研究を行っている。今年度までに直径80nm以上で長さが1mm以上の石英ガラスに覆われた単結晶ビスマスナノワイヤーの作製を行い、直径160nm以上のサンプルについて測定に成功した。4端子法により抵抗率を評価するために、研磨と集束イオンビームによるナノ加工を利用して石英ガラス中に配置されたナノワイヤー側面へ4ヶ所のナノスケール局所電極の形成を行った。この結果、作製した局所電極がオーミック接合で得られていることを確認し、ビスマスナノワイヤーの4端子法による抵抗測定に成功した。さらに、抵抗率の温度依存性の測定を行ったところ、300Kでの測定結果はバルクビスマスの値と一致したが、低温側ではバルクの値から離れてくる結果が得られた。この温度依存性は、キャリアの平均自由行程がワイヤー直径により制限を受け、移動度が減少する効果を考慮した計算により再現することができた。この結果に関して米国での国際学会(ICT2012)および日本熱電学会にて発表を行い、日本熱電学会講演奨励賞を受賞した。またJournal of Electronic Materialsにて論文として発表した。さらに、移動度の変化を実験的に評価するために、ビスマスナノワイヤーにおけるホール測定を試みている。局所4端子電極を作製した技術を応用し、ビスマスワイヤーの両側面への局所的なホール電極の作製を行った。その結果、作製した電極が電気的導通を得られていることを確認した。また、量子効果の導入によりナノワイヤーの状態密度が一次元化すると、フェルミ準位に変化が生じると予想されることから、Shubnikov-de Haas振動の測定によるフェルミ準位の評価も行ったところ、測定した393nm以上のナノワイヤーにおいてはフェルミ準位の変化は確認されなかった。現在、研磨と集束イオンビーム(FIB)によるナノ加工を用いてナノワイヤー側面へ局所電極を作製し、ホール測定による移動度の評価を試みている。当該年度では、石英ガラス中に配置された直径4μmのビスマスマイクロワイヤー上に作製した局所電極を利用して実際にホール係数の測定を行った。その結果、150K300Kのホール係数測定に成功し、ビスマスマイクロワイヤーの移動度の実験的評価に成功した。測定から得られた移動度はバルクビスマス単結晶の値とほぼ一致しており、この結果は直径4μmを仮定したモデル計算の結果にも対応していることが分かった。

また、これまでの測定で同じ程度の直径のビスマスナノワイヤーにおいても異なる抵抗率の温度依存性が得られている。特に、低温領域で正の温度係数を持つ温度依存性は、これまでに本研究グループが報告したキャリアの平均自由行程制限モデルでは再現できていない。そこで、それらの結果について結晶方向と対応させて解析を行った。その結果、ビスマスナノワイヤーの結晶方向がBinary-Bisectrix平面内に配向している場合には低温での正の温度係数が現れないのに対して、Trigonal軸に傾くにつれて低温で正の温度係数が現れることを確認した。さらに、直径160nmビスマスナノワイヤーのゼーベック係数において、これまでの200nm以上のサンプルでは現れなかったゼーベック係数の変化が確認された。理論計算では100nm以下でゼーベック係数が上昇すると予想されているにもかかわらず、160nmでゼーベック係数が上昇するとし、う結果が得られた。このようにビスマスナノワイヤーにおけるゼーベック係数の上昇を世界で初めて確認した。移動度の変化をホール係数測定により実験的に評価するために、集束イオンビーム加工を利用したホール測定用電極の作製を行った。サンプルの直径が非常に細い点とビスマスが大気中で酸化しやすいという点から、ナノワイヤー側面に局所的な電極を取り付ける事は非常に多くの困難を要する。そのため、ビスマスナノワイヤーにおけるホール測定の結果は、これまで報告されていなかった。そこで、本研究では研磨と集束イオンビーム加工を利用して、石英ガラス製の鋳型中に配置されたビスマスナノワイヤーに対してナノスケールのホール測定用の局所電極を作製した。このように作製した直径700nmのビスマスナノワイヤーを利用してホール係数の測定に成功し、キャリア移動度の評価を行った。ナノワイヤーにおけるホール係数の測定は世界で4例目、ビスマスナノワイヤーに関しては初めての結果となった。また、直径160nmのビスマスナノワイヤーのゼーベック係数の温度依存性を測定したところ、これまでの直径200nm以上のサンプルでは現れなかったゼーベック係数の上昇が観察された。これまでの研究では、ワイヤー直径を小さくすることによりキャリアの平均自由行程が制限され、キャリア移動度が減少するために、ゼーベック係数は徐々に低下する傾向があった。しかし、直径160nmのビスマスナノワイヤーの測定結果は、予想される温度依存性よりも上昇し、50K程度で極値を持つような温度依存性が得られた。理論計算によると直径200nm以下ではバンド構造が変化することにより、ゼーベック係数が変化すると予想されている。このようにビスマスナノワイヤーにおけるゼーベック係数の上昇を世界で初めて観測した。研磨と集束イオンビーム加工を利用することでビスマスナノワイヤーにおいて4端子測定に成功し、測定結果をモデル計算により再現した。さらに、ビスマスナノワイヤーの移動度を実験的に評価するために、ホール測定用の電極の作製にも成功している。また、並行してShubnikov-de Haas振動の測定を行い、エネルギー構造の評価も行った。
電流に駆動された磁化ダイナミクスの物質デザイン

1.電流と磁化の相互作用の統一的記述電流が磁化に及ぼす効果である「スピントルク」、および時間・空間変化する磁化が電子に及ぼす「スピン駆動力」(あるいは、その結果として生じる「スピン起電力」)は、互いに作用・反作用の関係にあり、有効作用により統一的に記述するととができる。スピン移行トルクとその反作用について、対応する有効作用を導出した。これは、局在磁性体・遍歴磁性体のタイプに関係なく適用することが出来、少なくとも概念上は、第一原理計算との融合に際して重要になると期待される。2.スピントルクの公式の導出第一原理計算によりスピントルクを計算するのに有用な公式の導出を目標に、まずは微小振幅の方法に基づいて公式を導いた。3.スピン起電力による逆スピンホール効果の理論磁化ダイナミクスによりスピン起電力(スピンに依存した有効電場)が生じ電流(伝導度の対角成分)が流れるが、スピン軌道相互作用の存在により生じるホール電流(伝導度の非対角成分)を調べた。この現象は、正確な意味で、スピンホール効果の逆効果に対応している。1.スピントルクの計算:スピン緩和が磁性不純物により生じる場合今までは、電子の分散がk^2に比例する場合に、グリーン関数の積分を解析的に実行することにより計算していた。本研究では、tight-binding modelにも適用できるように、任意の電子分散の場合に対して計算できるよう拡張を行った。更に、第一原理計算への適用を視野に入れて、遍歴強磁性体に対する定式化を試みた。また、今まではスピン緩和の弱い場合を想定して、その最低次で計算していたが、本研究ではスピン緩和の強い場合にも計算を拡張した(論文準備中)。2.スピントルクの計算:スピン緩和がスピン軌道相互作用+非磁性不純物により生じる場合手始めに、簡単なRashba型スピン軌道相互作用を用いて、散逸的トルクの係数αおよびβを計算した。(論文準備中)3.スピン起電力の理論磁化の時間変化と空間変化がともに存在するとき、スピンに依存した電場(起電力)が生じることが指摘されていた。これを、スピン緩和の効果を取り入れて、微視的に計算した。(論文準備中)1.電流と磁化の相互作用の統一的記述電流が磁化に及ぼす効果である「スピントルク」、および時間・空間変化する磁化が電子に及ぼす「スピン駆動力」(あるいは、その結果として生じる「スピン起電力」)は、互いに作用・反作用の関係にあり、有効作用により統一的に記述するととができる。
反応拡散システムによるマウス胚初期パターン形成の解析

反応拡散波は拡散するactivatorとinhibitorによってパターン形成が起きるとするものであり、近年マウスの左右軸形成に関与するNodal, Lefty(TGF・βsuperfamily)が反応拡散波を利用している事が推測されてきたがその詳細な機構は不明であった.今回私達は、左右軸形成においてNodalとLeftyを用いた反応拡散波が利用されている事を実験とsimulationの両面から明らかにした。私達の内臓臓器の多くは左右非対称な形態、配置をとるが、現在までに判明している発生段階での一番早い左右非対称性はマウス8.5日胚のノードに見られる.この時ノードに存在する繊毛が全て同一方向に回転する事によって右から左への体液の流れが生じる.その後左の側板中胚葉でNodal, Lefty2,Pitx2が、神経底板の左側でLefty1が発現するのであるが、なぜ右側ではどの遺伝子も発現してこないのであろうか?この疑問に答える為、今回私達は次のような新しい仮説を考え検証した.(1)ノードからは両側の側板中胚葉にシグナルが伝達される.(2)左側で先に発現が始まったNodal, Leftyが右側でのNodal発現を抑制する.この仮説を検証するためにマウス胚を用いた実験、またコンピューターシミュレーフションを用いて解析した結果、確かに仮説を証明する結果が得られた.さらにこれらの実験結果から、左右決定はやはり拡散速度の違うactivator(Nodal)とinhibitor(Lefty)を用いた反応拡散系で行われているのではないかと考えることができた。その後左右決定を詳細に行う目的でシミュレーションを用いて解析を進めていくにつれ、マウス胚において左右が決定される時に重要な事は一体何であるのかという事をいくつか新しく発見した.これは今までの分子生物学的手法では見えてこなかった事であり、まさに「system biology」の概念を利用した解析手法である。今回私達は左右決定において次のような新しい仮説を考え検証した。(1)ノードからは両側の側板中胚葉にシグナルが伝達される。(2)左側で先に発現が始まったNodal,Leftyが右側でのNodal発現を抑制する。この仮説を検証するためにマウス胚を用いた異所発現実験を行った。まずマウス胚右側でNodalを強制発現させると、左側での内在でのNodal発現が抑制されていた。これは右側で発現したLeftyが左側まで拡散してNodal発現を抑制していることが判明した。さらに、左側でのNodal発現をGFP-lefty2発現ベクターを用いて抑制すると右側でNodalを発現する胚が得られた。さらに、コンピューターシミュレーションを用いて解析した結果、確かに仮説を証明する結果が得られた。さらにNodalとLeftyの拡散速度を比較した結果、左右決定はやはり拡散速度の違うactivator(Nodal)とinhibitor(Lefty)を用いた反応拡散系で行われていると結論づけることができた。その後左右決定を詳細に行う目的でシミュレーションを用いて解析を進めていくにつれ、マウス胚において左右が決定される時には、Nodalのpositive loopの回転速度が早い事が重要である事がわかった。これにより、マウス胚では安定に左側を決定しているものと考えられる。さらに、RT-PCRを行った結果、右側でも弱くNodalが発現しておりこの右側での発現の量、タイミングもシミュレーションで予想した通りであった。
アミロイド形成機構を元に考案したアミロイドポリニューロパチーの新たな治療法の開発

平成17年度から19年度にかけてFAP ATTR V30Mの肝移植によらない根治治療を確立することを目的として、1.TTRの4量体構造の安定化を図り、アミロイド形成を阻止する治療:Cr^<3+>投与によるアミロイド形成抑制治療、2.アミロイドの伸張反応を抑制し、アミロイド形成を阻害する治療:新たなアミロイド結合物質BSBの誘導体であるFSBを用いた治療、3.すでに組織に沈着したアミロイドを溶かす治療:異型TTRを抗原とするワクチン治療、4.TTRの産生を完全にシャット・アウトする治療:single stranded oligonucleotides(SSOs)を用いた遺伝子治療、の4つの研究を行った。結果は以下のとおりである。1.Cr^<3+>をFAPMet30の遺伝子を持つトランスジェニックマウスに12ケ月投与したところ、組織のTTR沈着を若干抑制する傾向が認められたが有意差は得られなかった。2.BSBはシンチ作りに向けて、Brの箇所をFに変えたFSBを大量に合成し、PETに向けた試薬を合成した。3.抗体治療に関してはFAP患者を免疫する抗原として特にTTR115-124抗体に注目して組織にTTR沈着が認められたトラスジェニックマウスにこれを投与したところ、TTRの沈着が消失した。このとき血中のTTR濃度は変化しなかった4.遺伝子治療の更なる展開として、効率的に遺伝子治療を行うため、Single-stranded DNA expression vectorの開発を行い、in vitroで有効であることを最終的に確認した。その他としては肝移植ではFAP患者の眼のアミロイド沈着は抑制できないため、網膜の光凝固治療を施工したところ、硝子体のアミロイド沈着の進行が制された。以上の結果より、上記四プロジェクトのうち、遺伝子治療と抗体治療が最も有効で、今後これに特化した治療戦略を立て、FAPの肝移植によらない治療法を確立する予定である。家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)ATTRV30M(トランスサイレチン(TTR)の30番目のバリンがメチオニンに変異したもの)の肝移植によらない根治治療を確立することを目的として、1.TTRの4量体構造の安定化を図り、アミロイド形成を阻止する治療:Cr^<3+>投与によるアミロイド形成抑制治療、2.アミロイドの伸張反応を抑制し、アミロイド形成を阻害する治療:新たなアミロイド結合物質(trans,trans),-1-bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene(BSB)の誘導体であるFSBを用いた治療、3.すでに組織に沈着したアミロイドを溶かす治療:異型TTRを抗原とするワクチン治療、4.TTRの産生を完全にシャット・アウトする治療:single stranded oligonucleotides(SSOs)を用いた遺伝子治療、の4つの研究を行った。1.Cr^<3+>をFAP Met30の遺伝子を持つトランスジェニックマウスに3ヶ月投与したところ、血中濃度の優位な上昇が得られたが、摂食状態、体重変化、血中トランスアミナーゼ値など有意な変化はなかった。2.BSBの継続投与でも、これらの値に優位な変化は認められなかった。3.抗体治療に関してはFAP患者を免疫する抗原としてATTR F78Pに加えて、TTR115-124の抗体が血中のTTRとは反応せず、組織沈着アミロイドとのみ反応することが新たに明らかになった。

4.遺伝子治療ではBNA化したSSOsが肝細胞の培養系で27%の相同組み換えが起こることが確認されたが、in vivoでの効率を上げるため、超音波を肝臓にあて、組み換え効率を上げる方法を検討中である。次年度はさらに研究を進め、根治治療のツールを絞る予定である。家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)ATTRV30M(トランスサイレチン(TTR)の30番目のバリンがメチオニンに変異したもの)の肝移植によらない根治治療を確立することを自的として、1.TTRの4量体構造の安定化を図り、アミロイド形成を阻止する治療:Cr^<3+>投与によるアミロイド形成抑制治療、2.アミロイドの伸張反応を抑制し、アミロイド形成を阻害する治療:新たなアミロイド結合物質(trans,trans),-1-bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)stylylbenzene(BSB)の誘導体であるFSBを用いた治療、3.すでに組織に沈着したアミロイドを溶かす治療:異型TTRを抗原とするワクチン治療、4.TTRの産生を完全にシャット・アウトする治療:single stranded oligonucleotides(SSOs)を用いた遺伝子治療、の4つの研究を行った。結果は以下のとおりである。1.Cr^<3+>をFAPMet30の遺伝子を持つトランスジェニックマウスに12ヶ月投与したところ、組織のTTR沈着を若干抑制する傾向が認められた。2.BSBはシンチ作りに向けて、Brの箇所をFに変えたFSBを大量に合成し、組織沈着アミロイドとの反応性を検討したところ、良好な結果が得られた。3.抗体治療に関してはFAP患者を免疫する抗原として特にTTR115-124抗体に注目して組織にTTR沈着が認められたトラスジェニックマウスにこれを投与したところ、TTRの沈着が消失した。4.遺伝子治療ではBNA化したSSOsが肝細胞の培養系で27%の相同組み換えが起こることが確認されたが、投与量や、合成費がヒト応用には多すぎるため、これを効率化するためSingle-stranded DNA expression vectorの開発を行い、かなり良好な結果を収めている。次年度は本プロジェクトの最終年度となるため、さらに研究を進め、特に抗体治療と遺伝子治療に絞りFAPの治療研究をヒト応用可能なものに発展させて行きたい。平成17年度から19年度にかけてFAP ATTR V30Mの肝移植によらない根治治療を確立することを目的として、1.TTRの4量体構造の安定化を図り、アミロイド形成を阻止する治療:Cr^<3+>投与によるアミロイド形成抑制治療、2.アミロイドの伸張反応を抑制し、アミロイド形成を阻害する治療:新たなアミロイド結合物質BSBの誘導体であるFSBを用いた治療、3.すでに組織に沈着したアミロイドを溶かす治療:異型TTRを抗原とするワクチン治療、4.TTRの産生を完全にシャット・アウトする治療:single stranded oligonucleotides(SSOs)を用いた遺伝子治療、の4つの研究を行った。
センチネルリンパ節を標的とした新たな頭頸部癌機能温存治療の開発

uPA活性依存的に抗腫瘍効果を発揮する腫瘍溶解性センダイウイルスBioKnifeのセンチネルリンパ節転移標的治療について舌扁平上皮癌頸部リンパ節マウスモデルにおいて検討した。主な研究成果は、1原発巣に注入したベクターの頸部リンパ節へ移行、レポーター遺伝子発現の確認、2BioKnifeが頚部リンパ節転移(LNM)に感染、LNMを抑制、3LNM内でアポトーシスの誘導、が挙げられる。BioKnifeはセンチネル理論に従って頸部リンパ節に移行し、転移を抑制することが示された。本研究結果から、BioKnifeの臨床応用による新たな頭頸部癌低侵襲治療の礎となることが期待された。頸部リンパ節転移は頭頸部癌患者の予後を決定づける最重要因子である。本研究では、これまでリンパ節転移診断に用いられてきたセンチネルリンパ節(SN)を治療の標的とし、頸部リンパ節制御の新たな治療法を開発することを目指している。申請者らは、市販のフチン酸キットを用いICGのSN検出能の長時間化、2次リンパ節が描出されにくい、といった手法を考案し報告してきた。この手法を用いSNを標的とした治療法の開発に取り組んでいる。ウイルスベクターによる遺伝子治療実現可能性を検討するため、レポーター遺伝子としてGFPを搭載したセンダイウイルスベクターを用いた遺伝子発現の検討を行っている。頭頸部癌舌リンパ節転移株同所移植モデルにおいて、舌腫瘍部にベクター単独、またはICGとベクター混合液を注入し、頸部リンパ節におけるGFP発現を検討している。またICG-Tc-フチン酸によるRI+蛍光hybrid法によるSN検出率向上に向けた検討なども行っている。昨年度よりSNを標的としたウイルスベクターによる遺伝子治療実現可能性を検討するため、レポーター遺伝子としてGFPを搭載したセンダイウイルスベクターを用いた遺伝子発現の検討を行った。頭頸部癌舌リンパ節転移株同所移植モデルにおいて、舌腫瘍部にベクター単独、またはICGとベクター混合液を注入し、頸部リンパ節におけるGFP発現を検討し、SNにおけるレポーター遺伝子発現を確認した。続いて腫瘍溶解性センダイウイルス(Bioknife)を用いた治療効果の検討を行った。腫瘍を舌に移植し、2週間後にBioknifeを腫瘍に注入し、2週間後の頸部リンパ節転移率を検討した。結果有意に転移の抑制効果を認め、新たなリンパ節転移に対する治療法としての可能性を示すことができた。またICG-Tc-フチン酸によるRI+蛍光hybrid法によるSN検出率向上に向けた検討なども継続して行っている。当初計画では、Photodynamic therapyや抗がん剤、分子標的薬などを用いた検討も行う予定であったが、確実に効果が期待できるBioknifeによる検討にまずは注力した。SNを標的とした新規治療という点では、明らかな研究成果も上がってきており、2年間の達成度としては良好であると考えている。SNを標的としたウイルスベクターによる遺伝子治療の検討を進めてきた。まずはレポーター遺伝子としてGFPを搭載したセンダイウイルスベクターを用いた遺伝子発現の検討を行った。頭頸部癌舌リンパ節転移株同所移植モデルにおいて、舌腫瘍部にベクターを注入し、頸部リンパ節におけるGFP発現を検討し、SNにおけるレポーター遺伝子発現を確認した。腫瘍を舌に移植し、2週間後にBioknifeを腫瘍に注入し、さらに2週間後の頸部リンパ節転移率を検討した。結果有意な転移抑制効果を認めた。原発巣のみならずリンパ節転移の抑制を示せたことで、早期頭頸部癌のリンパ節転移に対する新規治療法としての可能性を示すことができた。またBioknife投与に伴う腫瘍免疫導入による転移抑制効果についても検討を行った。疑似遠隔転移モデルを用いた検討では、原発巣へのBioknife投与により、有意な遠隔転移抑制効果を認めた。その裏付けとして、腫瘍免疫誘導を示すデータも得られており、そのメカニズムも示しつつ良好な成果が得られている。SNを標的とした新規治療という点では、明らかな研究成果を上げることができている。今後Bioknifeによる転移抑制効果について、近日中に特許出願を行う予定である。このため現在データの一部は公表を控えており、今後発表等を行うために1年間の延長を行っている。これまで3年間の達成度としては良好であると考えている。本研究では、uPA活性依存的に抗腫瘍効果を発揮する腫瘍溶解性センダイウイルスBioKnifeのセンチネルリンパ節転移標的治療について検討し、舌扁平上皮癌頸部リンパ節マウスモデルにおいてその有効性を示した。