hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔粘膜における宿主細菌相互作用の解明と歯科疾患及び全身疾患治療への応用

口腔細菌ー免疫系ー骨代謝系の相互作用に関与する因子を探索する過程で、口腔粘膜に存在する免疫細胞で高発現しており、破骨細胞や骨芽細胞といった骨構成細胞でも発現が認められる遺伝子Xに着目した。当該遺伝子の欠損マウスを作成したところ、野生型マウスと比較して身体サイズが小さく、成長に伴い体長および体重の差が顕著になることが明らかになった。骨格系の異常を疑い、全身のレントゲン写真、マイクロCTによる頭蓋骨、椎骨、大腿骨の撮影、脛骨の組織切片作成及び骨形態計測を行った。その結果、大腿骨、椎骨、脛骨の長軸および短軸の短縮、海綿骨量の減少、頭蓋骨の石灰化不全など、生理的条件下で骨組織に著名な表現系が認められた。破骨細胞の数や骨吸収面には変化を認めなかった。また、in vitroでの破骨細胞分化や骨吸収機能も正常であった。さらに、骨髄移植の実験から、血球系の破骨細胞ではなく、間葉系の細胞で遺伝子Xが欠損することが、骨表現系の原因であることを明らかにした。現在floxマウスの作成に着手しており、骨構成細胞や各種免疫細胞で特異的に遺伝子Xを欠損するマウスを樹立し、解析する予定である。具体的には、osterix-Cre(骨芽細胞)、Dmp1-Cre(骨細胞)、Col2-Cre(軟骨細胞)、CD4-Cre(T細胞)、Mb1-Cre(B細胞)といった系統を既に導入しており、順次floxマウスとの交配を勧め、生理的および病的条件下での遺伝子Xの機能を探索する。新規の遺伝子欠損マウスを作成したところ、骨にユニークな表現系が認められた。当該遺伝子のfloxマウス作成にも着手しており、今後、様々な細胞特異的に当該遺伝子を欠損したマウスを樹立し解析することで、骨代謝のみならず免疫系や宿主菌叢相互作用に関して新たな知見が得れると期待される。遺伝子Xのfloxマウスを樹立し、細胞種特異的に遺伝子Xを欠損するシステムを構築する。骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、破骨細胞、各種免疫細胞特異的なCre lineと交配し、表現系を解析する。
介護保険による高齢者のサービス利用行動変容と介護サービス供給に関する研究

介護保険下で達成すべきシステム課題を明らかにするために、介護保険導入による高齢者のサービス利用行動変容と介護サービス供給への影響を調査した。介護保険導入前については、1998年にA県I市(高齢者人口約16000人,老年人口割合約19%)において、在宅要援護高齢者1807名を対象に高齢者実態調査を行った。有効回答者数は1283名(有効回答率71%)であった。その中で、常時介護者がいる高齢者(A群)は1024名(80%)、常時ではないが介護者がいる高齢者(B群)は57名(4%)、介護者がいない高齢者(C群)は202名(16%)であった。それらの3群を比較検討した結果、3群の背景の特徴とともに、日常生活における問題やサービス利用の現状とサービス利用の希望について明らかにすることができた。介護者がいない高齢者(7割が一人暮らし)の場合は、半数の人が「訪問介護」を利用していたが、「デイケア」や「デイサービス」などの通所サービスの利用に関しては12割程度の利用であった。しかし、日常生活で困っていることとしては、「話し相手がなく、孤独である」が最も多く、7割の人が「訪問介護」の利用を、4割の人が通所サービスの利用を希望していた。常時介護者がいる高齢者でも「話し相手がなく、孤独である」が最も多く、「訪問介護」や通所サービスの利用を希望する人が、現在利用中の23倍多くなっており、介護保険導入によってそれらのサービスが増えると予測された。一方、常時介護者がいる高齢者では、6割が医師の訪問診療を受けており、2割が医療器具の装着や看護婦等による医療処置を受けていた。そして、「日常生活で困っていること」では、2%の高齢者が「体や病気のことを相談する相手がいない」と答えていた。それにもかかわらず、「訪問看護」の利用者は1割であり、そのサービスを知っている人は半数で、しかも利用の希望者はその4割にすぎなかった。「訪問看護」に対する認知度は「訪問介護」や通所サービスに対する認知度の1/2であり、介護保険の導入に伴い「訪問看護」に対する認知度を高める必要があると言える。また、常時介護者がいる高齢者を対象に、日常生活の自立度と、年齢、性別、疾病、家族のケア能力、社会的支援との関連を分析した。その結果、自立度と疾病、介護者の健康、社会的支援との間に相関関係が認められた。介護保険導入後における1725名の二次判定の結果は、導入前に比べて介護度の高い高齢者及び一人暮らしの割合が多かった。介護保険導入前後におけるサービス利用行動変容の分析が今後の課題である。

介護保険下で達成すべきシステム課題を明らかにする為に、介護保険導入による高齢者のサービス利用行動変容と介護サービス供給への影響を調査した。介護保険導入前については、常時介護者がいる高齢者1024名を対象に、日常生活の自立度と年齢,性別,疾病,家族のケア能力,社会的支援などとの関連を分析した。(1)高齢者を前,中,後期に分類した場合、前期から後期になるに従って「自立」,「要援護」は減少し、「寝たきり」では後期が前期の約2倍であった。(2)「自立」,「要援護」は、男女がほぼ同じ割合であったが、「寝たきり」では女性が多かった。(3)97%の人が何らかの病気を持っていた。(4)家族構成は、7割が2世帯または3世帯家族,2割が高齢者同士の2人暮らし,1割が1人暮らしであった。家族構成によって自立度の割合に違いはなかった。(5)2世帯,3世帯家族の社会的支援の活用は、「通所サービス」の利用が4割と最も高く、その6割は「自立」,「要援護」の人であった。「在宅サービス」の利用は1割以下であった。「訪問入浴」利用者の9割,他の在宅サービス利用者の7割は「準寝たきり」,「寝たきり」の人であった。「福祉用具」は35%,「短期入所」は9%の利用で、「要援護」,「準寝たきり」,「寝たきり」が3割ずつを占めていた。2世帯,3世帯家族に対して、高齢者2人暮らしの社会的支援の活用は、「訪問介護」の利用が約2倍で、反面「訪問入浴」の利用が1/2であった。他のサービス利用はほぼ同じ割合であった。(6)主たる介護者は高齢者が過半数を占めていた。介護者の「健康状態」は、全体では7割が「健康」,3割が「不健康」であった。しかし、「自立」,「要援護」,「準寝たきり」の介護者に比べて、「寝たきり」の介護者は「不健康」の割合が多かった。また、2世帯,3世帯家族の介護者に比べて、高齢者2人暮らしの介護者は「不健康」の割合が多かった。(7)サービス利用の経験者では、利用利益の自己評価が全体的に高く、現在介護保険導入後の行動変容について分析中である。介護保険下で達成すべきシステム課題を明らかにするために、介護保険導入による高齢者のサービス利用行動変容と介護サービス供給への影響を調査した。介護保険導入前については、在宅の要援護高齢者1024名を対象に、日常生活の自立度と年齢,性別,疾病,家族のケア能力,杜会的支援などとの関連を分析した。その結果、(1)日常生活の自立度は「自立」25%,「要支援」,35%,「準寝たきり」21%,「寝たきり」15%であった。(2)前期高齢者が24%,中期高齢者が38%,後期高齢者が39%で,前期から後期になるにしたがって「自立」,「要支援」は減少し、「寝たきり」では後期が前期の約2倍であった。(3)性別では、男性が38%,女性が62%であった。「自立」,「要支援」では、男女がほぼ同じ割合であったが、「寝たきり」では女性が多かった。(4)家族構成は、「一人暮らし」1%,「高齢者の2人暮らし」16%,「2,3世帯家族」70%,「その他」11%で、家族構成によって自立度に違いはなかった。(5)2,3世帯家族による社会的支援の活用は、「通所サービス」の利用が4割と最も多く、その6割は「自立」,「要援護」の高齢者であった。(6)社会資源の利用率を家族構成別に比較すると、2,3世帯家族に比べて、高齢者2人暮らしは「訪問介護」の利用が2倍であり、「訪問入浴」の利用が1/2であった。他のサービス利用はほぼ同じであった。
光トポグラフィーによる嗅覚中枢の同定と嗅覚検査への応用

平成18年度ニオイ刺激装置を作製し、健常成人ならびに嗅覚脱失患者に対してニオイ刺激時の脳血流変化を近赤外線分光法(光トポグラフィー; ETG-4000, HITACHI)を用いて測定した。得られた結果としては,それぞれのニオイ刺激,三叉神経刺激において酸化ヘモグロビン濃度は特定のチャンネルにおいて経時的に特有の変化を示した。また刺激後に有意な反応を示す部位を検討したところ,ニオイ刺激時と三叉神経刺激時とでは異なる印象を受けた。平成19年度ニオイ刺激装置をさらに改良して、前年度同様、正常者、嗅覚障害者に対して実験を行った。前年度同様の結果が得られた。問題点として、光トポグラフィーで確認されるヘモグロビンの変化は、頭位の移動によっても影響を受けていることが判明した。また、同一被検者において再現性が見られないこともあった。今後は同様の刺激を行い、機能的MRI、脳磁計などでも測定を行い、NIRSで得られた結果との対比を行う予定である。本年度はニオイ刺激装置を作製し,健常人を用いてニオイ刺激時の脳血流変化を近赤外線分光法(光トポグラフィー;ETG-4000,HITACHI)を用いて測定した。ニオイ刺激装置は電磁弁を用いたマルチチャンネルの装置であり,パーソナルコンピューターを用いて制御した。刺激に用いた嗅素はフェニルエチルアルコール,硫化水素であり,三叉神経刺激ガスとして二酸化炭素を用いた。3種の刺激ガスを無臭空気刺激を挟んで交互に被検者鼻腔に流し,その間の酸化ヘモグロビン,還元ヘモグロビンの変化を光トポグラフィーを用いて測定した。被検者は嗅覚正常な成人13名と外傷性嗅覚障害患者1名である。被検者には開眼の上,安静鼻呼吸をさせた。両側側頭部に固定したそれぞれ15個のプローブから22チャンネルのデータを得た。各刺激の直前の空気刺激時のデータとの差をもって刺激時の値とした。結果として,それぞれのニオイ刺激,三叉神経刺激において酸化ヘモグロビン濃度は特定のチャンネルにおいて経時的に特有の変化を示した。すなわちニオイ刺激時では前方に変化が強くあらわれるのに対して,三叉神経刺激では後方で強く現れる傾向を示した。しかし,被検者による差も認められるため,現在更なる解析を行っているところである。一方,外傷性嗅覚障害患者では,三叉神経刺激ではヘモグロビン濃度の変化を認めたのに対して,ニオイ刺激において有意な血流の変化は認めなかった。平成18年度に作製したニオイ刺激装置にさらに改良を加え,健常成人ならびに嗅覚脱失患者に対してニオイ刺激時の脳血流変化を近赤外線分光法(光トポグラフィー;ETG-4000,HITACHI)を用いて測定した。刺激に用いた嗅素はコェニルエチルアルコール,硫化水素であり,三叉神経刺激ガスとして二酸化炭素を用いた。しかし,光トポグラフィーで確認されるヘモグロビンの変化は,頭位の移動によっても影響を受けていることが判明した。また,同一被検者において再現性が見られないこともあった。頭部の固定なども含め,今後検討が必要である。
マイクロ波加熱による金属ナノ微粒子の創製と粒径制御

本年度は、まずマイクロ波加熱による銀のナノロッド・ナノワイヤーの合成を試みた。銀のようなfcc構造の貴金属の一次元ナノ構造体を作製するには、核発生剤と保護安定剤が大きな影響を及ぼすことが、これまでの研究で判明している。今回保護安定剤として使用したpolyvinylpyrrolidone (PVP)は同じ添加量でも、平均分子量が36万のPVPを保護安定剤に用いた方がPVP(Mw=1,4万)の場合より一次元ナノ構造体の形成に有利であることがTEM観測から判明した。また一段階目で合成した一次元Agナノ構造体をテンプレートとして原料であるAgNO_3と再反応させることで、より伸長した一次元Agナノ構造体の調製を検討した。その結果、長軸方向の伸長に原料が優先的に消費されてアスペクト比の非常に高い一次元Agナノ構造体の生成可能なことがわかった。この伸長過程でロッド・ワイヤー以外の球形粒子を除去後に伸長反応を行なうことで、原料を効率的に使用でき、かつ更なる伸長が可能なことが判明した。実際に遠心分離によりロッド・ワイヤーの分離を試みた結果、分離1回目は一次元ナノ粒子の数密度が50%以下であったが、分離8回目は80%以上に向上した。昨年度までマイクロ波加熱を用いた金属ナノ材料の合成研究を行い、HAuCl_4をPVP存在下エチレングリコール中で加熱・還元すると金のナノ微結晶がわずか2,3分の加熱時間で迅速合成可能なことを見出した。本年度はこの微結晶を種微粒子として用いてAgNO_3を還元すると新規なコアシェル構造を有するAu/Ag複合ナノ微粒子が合成可能なことを見出した。マイクロ波加熱による還元は最初の金コア粒子の合成とそれに続く銀のシェル構造の合成の2段階で行った。結晶構造解析はTEM SAED, EDS分析により行った。三角形コアプレートからは逆三角形のシェル、8面体コアからはcubicシェル、10面体双晶からはロッド状シェル構造が選択的に生成することを見出した。このような構造が出現するのはPVPがAuでは{111}、Agでは{100}面へ選択的に吸着するためとして理解できた。近年、金属ナノ粒子を利用したナノデバイスや新規な光学材料の開発などが期待され、その粒径や形状の制御に関する研究が活発に行われている。本研究ではマイクロ波加熱による金属ナノ微粒子の創製と粒径制御を行う計画である。本年度は、マイクロ波加熱法を用いて、エチレングリコールを溶媒・還元剤としたポリオール法による金・銀ナノ粒子の作製を試みた。その結果以下のような顕著な研究成果を得た。1)金ナノ結晶:マイクロ波照射2分後に60-90nmを一辺とするプリズム状の三角形から六角形までの多角形ナノプレートの合成に成功した。電子線回折の画像解析から、これらのプレートは金単結晶でプレートは電子線の(1,1,1)方向に位置していることがわかった。溶液の紫外・可視吸収スペクトルを測定すると三角プレート結晶による特徴的な新規なプラズモン共鳴バンドを640nm付近に確認することができた。このような多角形ナノプレートは従来のオイルバス加熱では合成できなかった。よって、マイクロ波照射下でのプレート状ナノ結晶の生成の要因には、マイクロ波による電界中での結晶成長や粒子表面の局所加熱などの影響が考えられる。2)銀ナノワイヤー:照射1分後の反応溶液のTEM観察では、ほぼ球形の銀ナノ粒子が生成しており、さらに照射を続けた3分後にはロッド状の銀粒子が生成し始め、照射5分後には直径約40nm、長さを500nm以上とする銀ナノワイヤーが多く観察された。また、保護材であるPVPの添加量を減少させた系では、より長い銀ナノワイヤーが生成することがわかった。以上のようにマイクロ波加熱ポリオール法を用いて金についてはプリズム状多角形ナノ結晶、一方銀についてはナノワイヤーを比較的均一でかつ短時間で作製することに世界に先駆けて成功した。1)金ナノ結晶:マイクロ波照射2分後に60-90nmを一辺とするプリズム状の三角形から六角形までの多角形ナノプレートやナノロッドやワイヤーの合成に成功した。本年度はこれらの異方性生成物の最適合成条件の検討を行った。特に原料となるHAuCl_4の濃度、保護安定剤であるポリビニルピロリドン(PVP)の添加量、PVPの鎖長、溶媒などの条件を変えて合成した。その結果ナノプレートやワイヤーなどの異方性生成物の形状とサイズはこれらの条件を変えることにより制御できることを見いだした。2)銀ナノワイヤー:エチレングリコールを溶媒・還元剤として銀ナノ材料の合成実験を昨年に続き行った。AgNo_3の濃度、核発生剤であるH_2PtCl_6の添加量、保護安定剤であるPVPの添加量、PVPの鎖長などの条件を変えて合成した。その結果、銀ナノロッド、ワイヤー、シートなどの異方性生成物の形状とサイズはこれらの条件を変えることにより制御できることを見いだした。

以上のようにマイクロ波加熱ポリオール法を用いて金についてはプリズム状多角形ナノ結晶、一方銀についてはナノワイヤー、ナノシートの合成とサイズ制御技術の開発に成功した。来年度以降は液相レーザーアブレーション法との併用を計画している。そのための基礎実験を行いAg,LiCoO_2,CoOxなど各種材料のナノ微粒子の作製に成功した。本年度は、まずマイクロ波加熱による銀のナノロッド・ナノワイヤーの合成を試みた。銀のようなfcc構造の貴金属の一次元ナノ構造体を作製するには、核発生剤と保護安定剤が大きな影響を及ぼすことが、これまでの研究で判明している。今回保護安定剤として使用したpolyvinylpyrrolidone (PVP)は同じ添加量でも、平均分子量が36万のPVPを保護安定剤に用いた方がPVP(Mw=1,4万)の場合より一次元ナノ構造体の形成に有利であることがTEM観測から判明した。また一段階目で合成した一次元Agナノ構造体をテンプレートとして原料であるAgNO_3と再反応させることで、より伸長した一次元Agナノ構造体の調製を検討した。その結果、長軸方向の伸長に原料が優先的に消費されてアスペクト比の非常に高い一次元Agナノ構造体の生成可能なことがわかった。この伸長過程でロッド・ワイヤー以外の球形粒子を除去後に伸長反応を行なうことで、原料を効率的に使用でき、かつ更なる伸長が可能なことが判明した。実際に遠心分離によりロッド・ワイヤーの分離を試みた結果、分離1回目は一次元ナノ粒子の数密度が50%以下であったが、分離8回目は80%以上に向上した。昨年度までマイクロ波加熱を用いた金属ナノ材料の合成研究を行い、HAuCl_4をPVP存在下エチレングリコール中で加熱・還元すると金のナノ微結晶がわずか2,3分の加熱時間で迅速合成可能なことを見出した。本年度はこの微結晶を種微粒子として用いてAgNO_3を還元すると新規なコアシェル構造を有するAu/Ag複合ナノ微粒子が合成可能なことを見出した。マイクロ波加熱による還元は最初の金コア粒子の合成とそれに続く銀のシェル構造の合成の2段階で行った。結晶構造解析はTEM SAED, EDS分析により行った。三角形コアプレートからは逆三角形のシェル、8面体コアからはcubicシェル、10面体双晶からはロッド状シェル構造が選択的に生成することを見出した。このような構造が出現するのはPVPがAuでは{111}、Agでは{100}面へ選択的に吸着するためとして理解できた。
光学顕微鏡像面フ-リエ分光映像法の研究

本研究の目的は、高い測定効率を持つと予想される分光映像計測システムの一つを開発し、その信号対雑音比、空間分解能、スペクトル分解能等の主要性能の限界を理論と実験によって明らかにすることにより、本システムの有用性および応用範囲を明確にし、実用システム開発のための新たな知見を得ることである。本研究の欠席の概要は以下のとうりである。1.小型フ-リエ分光器と顕微鏡対物レンズを組合わせ、結像面における干渉信号をダイオ-ド・アレ-を用いて検出する微小物体向けの分光映像計測システムについて、信号対雑音比等の主要性能を理論的に解析し、適切な性能評価基準を作り出した。2.様々な条件下で従来の分光映像システムと本システムとの数値計算による比較検討を行った。3.最も望ましいモデルに対応する光学系および機械系を設計・試作し、基本的な対象について測定実験を行い、理論との比較を行った。また、実際に白色光によって照明された物体(人形)について分光画像の再生実験を行い高品位の再生像を得ることができた。4.以上の研究の結果、主要性能、特に信号対雑音比と測定時間に関する理論と実験の一致を確認し、本手法の基本的な有用性を確認するとともに応用範囲等にたいする新たな知見を得た。中でも、検出器ノイズが優勢な場合、本手法の測定効率が他の方法ひ比べて格段によいことが明らかになったことは実用上極めて重要である。
神経幹細胞の増殖とニューロン分化を協調させる新規分子機構

Sbno1の機能を明らかにするために、本研究ではSbno1タンパク質の異なる部位を認識する抗体を作成した。これら抗体はウェスタンブロットで、それぞれ異なったバンドパターンを検出した。つまり、Sbno1はタンパク質が合成されたのちに、特異的な切断制御を受け、断片化していることを示唆している。Sbno1Sbno1結合因子には、それぞれ細胞増殖(細胞周期制御因子)、アポトーシス(脱ユビキチン化酵素)、細胞分化(転写因子)に関与する複数の因子が同定された。これらの研究結果からSbno1は多様な分子機構に与することで、これら分子機構を統合する役割をもつのではないかと考えられた。脳発生に関わる新規因子Sbno1はアミノ酸配列の類似性からstrawberry notchファミリーに属する核酸作用分子と考えられる(Baba et al., 2006)。脳発生過程でのSbno1タンパク質の発現の詳細が不明であったので、特異的抗体を作製し、免疫組織化学的手法で発生中のマウス大脳皮質での発現を調べた。我々の作製した2つの抗体のうちHM2抗体では胎生12.5日から軟膜直下の細胞で明瞭なSbno1発現を検出した。発生が進むと免疫陽性細胞は増え、皮質板(cortical plate)でSbno1の強い発現が、中間帯(intermediate zone)の細胞でSbno1の弱い発現が検出された。HM2抗体を用いてウェスタン解析を行うと、アミノ酸配列から予想される分子量(140kDa)付近に2つのバンドが検出され、その他に120kDa, 80kDaにメジャーなバンドがみられた。これらのバンドは胎生期(E14.5, E17.5)では強いが、成体の脳ではとても弱かった。HM2抗体はSbno1タンパク質の中央部分のアミノ酸配列を認識する。一方、Santa Cruz社から販売されているH240抗体はSbno1タンパク質のN末側240アミノ酸を抗原として作製されている。この抗体で免疫組織化学を行うと、皮質板の細胞の核で強い免疫陽性反応がみられるが、脳室帯においても明瞭な染色がみされる。そこでマウス胎児脳から神経幹細胞を摘出し、一次培養下でH240抗体を用いてSbno1の発現を観察した。Sbno1は基本的にDAPIで染色されるDNAと共局在するが、分裂中の細胞ではDNAと相反する空間的分布をみせ、免疫陽性シグナル強度は減弱していた。これらの観察からSbno1には2つの抗体でそれぞれに検出される様なタンパク質のアイソフォームなどが存在し、細胞周期などに従って細胞内での局在が変化する様な制御を受けていることが示唆された。一方Sbno1タンパク質の生化学的機能についての解析は行うことができなかった。我々がこれまでに同定した脳の発生に関わる新規因子Sbno1はアミノ酸配列の類似性からショウジョウバエで最初に報告されたstrawberry notchファミリーに属する。保存されたモチーフからこのファミリー分子がRNA,DNAと相互作用することが予想されるが、その作用機序は不明である。これまで我々はSbno1タンパク質の異なる2つの部位を認識する抗体を準備し、免疫組織学的にSbno1タンパク質の発現を調べてきた。Sbno1のN末側240アミノ酸を認識するH240では領域によって濃淡はあるものの発生中の脳の全体が染まった。一方、タンパク質の中央部分を認識するHM2ではもっぱら分化を開始したニューロンでのみ発現が観察できた。そこで我々は次にウェスタンブロット解析によってこれら抗体で検出されるタンパク質のバンドパターンを検討した。するとH240ではタンパク質の全長と思われる150kDaのバンドが明瞭に検出されるが、HM2ではほとんど検出されなかった。一方でHM2では70kDaのバンドが極めてよく検出された。我々はSbno1タンパク質を強制発現させるプラスミドの作成を試み、HEK293T, COS7, NIH3T3, Hela細胞を用いてプラスミドの導入を行った。その結果、COS7でもっと再現性良くタンパク質の発現を誘導することができることがわかった。またこれまでにSbno1と結合する可能性が示唆されているOtub1についても同様にプラスミドの作成を行い、COS7細胞で発現を誘導できることを確認した。そこで、次に両タンパク質を同時に培養細胞に導入する実験を試み、成功した。現在、Sbno1,Otub1を発現させるプラスミドを培養細胞に導入し、両者の結合を免疫沈降法によって確認する実験を行っている。そもそも本研究課題は26年度に研究代表者の長期の病気によって大きく遅れをとってしまった。さらに、27年度にはともに研究を行っていた大学院生が、本研究代表者との共同作業をやめてしまい、別の研究者と研究を始めた。27年度に本研究代表者は東北大学内で研究室を異動し、異動した先の新しい研究室の立ち上げには極めて多くの労力と時間を必要としたので、実験を再開するのに時間がかかってしまった。27年度秋ごろに新しく学部学生が研究に加わり、多くの進捗がみられた。一方で、研究代表者は28年1月に東北大学准教授から滋賀医科大学教授へと異動、昇進した。教授に審査に対応するため多くの時間を必要とし再び研究に遅れが生じた。また仙台から滋賀への異動に伴って、機材の搬送などに多くの時間を費やしており、遺伝子組み換え実験申請、動物実験申請、実験室のP1A申請などにも承認までに長い時間がかかり、その間、研究はストップした。

Sbno1の機能を明らかにするために、本研究ではSbno1タンパク質の異なる部位を認識する抗体を作成した。これら抗体はウェスタンブロットで、それぞれ異なったバンドパターンを検出した。つまり、Sbno1はタンパク質が合成されたのちに、特異的な切断制御を受け、断片化していることを示唆している。Sbno1Sbno1結合因子には、それぞれ細胞増殖(細胞周期制御因子)、アポトーシス(脱ユビキチン化酵素)、細胞分化(転写因子)に関与する複数の因子が同定された。これらの研究結果からSbno1は多様な分子機構に与することで、これら分子機構を統合する役割をもつのではないかと考えられた。2014年度は4月から8月までの長期にわたり体調不良になり、研究の進捗に影響を与えたものの、それ以降はウェスタン解析のセットアップや免疫組織化学のプロトコルの改善などによって、Sbno1タンパク質を検出する実験条件を確立することができた。また幹細胞の一次培養といった新しい手法を取り入れることもでき、Sbno1タンパク質発現解析については計画していたよりも進んだ。一方、Sbno1タンパク質の生化学的機能の解析については手が回らなかった。よって全体としては一部に遅滞がみられたもののおおむね順調に研究は進展していると言える。上記のように27年度には研究代表者には本研究課題を進める以外のことで、多くの時間を奪われて、研究に協力する人員を失ってしまったのは、残念至極であるが、結果的には教授職に就任し、自分の研究室を持つことができ、自らの研究を進めていくための安定した研究環境を得ることに成功した。研究は進まなかったが、その分、予算を使っていないので、新しい環境で、これまでの遅れを取り戻すべく、日々研究環境の充実と大学院生などの人員確保に努力しているところである。これまでは所属部署の長(教授)からの要求などに応えるために使っていた時間を心置きなく自分の研究に使うことができるようになったのは、何よりも大きな前進である。上記研究の一部を学術雑誌に投稿したにもかかわらず、所属研究室の長の妨害によって雑誌掲載に至らないなどの不利益は、今後は決して起こらないと期待される。また、自らの研究室が機能するようになるまでの間は、近隣の研究室の協力をえることができるので、設備、試薬などは本研究課題で得られる研究費によってそろえていく一方で、協力研究室の現有設備を利用して研究を進めていくことが可能である。これまで大変な遅れを生じさせてしまったが、それをとりかえすべく邁進していく所存である。幹細胞生物学Sbno1タンパク質の生化学的機能の解析に力をいれて研究を進める。これまでに酵母two hybridスクリンーニング(Takano et al., 2010)により示されているSbno1とOtub1のタンパク質どうしの相互作用の大脳皮質発生における役割を共免疫沈降法と、これらタンパク質の変異分子をマウス胎児脳へエレクトロポレーションによって導入した際に幹細胞機能やニューロンの分化にどのような影響を与えるかを調べる。Otub1はp53の脱ユビキチン化酵素であり、p53の大脳皮質発生への関与は、これまでにいくつかの研究グループによって示唆されている。
唾液腺カルシウム応答のｉｎ　ｖｉｖｏイメージングと唾液分泌の同時測定

本研究は、生きた動物において、唾液腺のCa2+応答はどのように変化し、唾液分泌に関わるのかを明らかにすることを目的とした。ラットの顎下腺に蛍光Ca2+センサーを導入し、唾液分泌刺激薬を投与すると腺全体に細胞内Ca2+濃度上昇が観察され、Ca2+応答の時間・空間的変化は薬物ごとに異なることが明らかになった。薬物によるCa2+応答と唾液分泌を同時測定すると、低濃度ではCa2+応答より遅れて分泌が起こり、Ca2+応答と分泌に時間差があることが明らかになった。またCa2+流入を増強させる分子の強制発現は、受容体刺激によるCa2+応答を増強させることから、分泌機能改善に有用である可能性が示唆された。本研究は、生きた動物において唾液腺のカルシウム(Ca2+)応答がどのように変化し、唾液分泌に関わるのかを明らかにすることを目的とする。本目的を達成するため、本年度は以下の実験を行った。超高感度Ca2+センサー発現ウイルスベクターを用いてCa2+センサーを顎下腺へ導入した。この方法によって導入されたCa2+センサーは主に腺房細胞に発現していた。Ca2+センサーを発現させたラットにムスカリン受容体作動薬やアドレナリン受容体作動薬を腹腔内あるいは静脈内投与すると顎下腺に有意なCa2+上昇が観察され、これらのCa2+応答は受容体拮抗薬により完全に抑制された。刺激薬によって惹起されたCa2+応答の大きさや変化のパターンを比較すると、薬物ごとに上昇率や持続時間などに大きな違いがあることが明らかとなった。さらに、レーザースペックル血流計を用いて薬物投与による顎下腺の血流動態の同時イメージングを行ったところ、刺激薬によって大きく血流が増減することが明らかとなり、その持続時間にも大きな違いが観察された。この結果は、唾液分泌が、細胞内のCa2+応答だけでなく、血流量変化によっても大きく影響させている可能性を示す直接的な証拠である。最終年度である平成25年度は、この方法を用いて様々な薬物刺激に加え、舌神経刺激反射による顎下腺のCa2+応答についてさらに調べる。さらに唾液分泌量のリアルタイム測定と血流動態のイメージングを同時に行い、唾液分泌に関わる細胞内Ca2+応答と血流、さらに神経系のフィードバックなどの関係を明らかにする。また顎下腺のCa2+応答と唾液分泌に関与するタンパク質を解析するためのウイルスベクターを導入し、唾液分泌との関連を検討する。本研究は唾液腺のCa2+応答と唾液分泌との関係を明らかにすることを目的とし、生きた動物(ラット)の顎下腺におけるCa2+動態のリアルタイムイメージングを行った。超高感度Ca2+バイオセンサー(YC-Nano50)を顎下腺に発現させ、薬物による顎下腺全体のCa2+応答を観察した。アセチルコリン(ACh)、アドレナリン、サブスタンスPの持続的な静脈投与により、顎下腺全体に細胞内Ca2+濃度([Ca2+]i)上昇が起こることを明らかにした。これらの受容体刺激によるCa2+応答を比較すると、[Ca2+]iの時間空間的変化や持続性に大きな違いがあることが明らかとなった。一方、βアドレナリン受容体やプリン受容体作動薬では[Ca2+]i上昇は観察されなかった。AChによる顎下腺のCa2+応答と唾液分泌との関係をより詳細に調べるため、微細圧力センサーを用いてCa2+応答と唾液分泌の同時測定を行った。[Ca2+]iと唾液分泌は、AChの注入速度(薬物濃度)に依存して増大した。また低濃度のACh投与では、小さな[Ca2+]i上昇にやや遅れて分泌が観察され、Ca2+応答と分泌に時間差があることが明らかとなった。AChによるCa2+応答は自律神経節遮断薬では抑制されなかったことから、静脈内投与されたAChによる顎下腺のCa2+応答に自律神経節の関与は小さい可能性が示唆された。さらに神経刺激(舌神経刺激)による顎下腺のCa2+応答を可視化した。舌神経を電気刺激すると、顎下腺の一部に一過性の[Ca2+]i上昇が観察され、薬物刺激とは大きく異なる[Ca2+]i変化を示した。このとき唾液分泌の同時測定を試みたところ、[Ca2+]i上昇と分泌に大きな時間差は認められなかった。これは唾液腺において、神経刺激と薬物刺激ではCa2+応答と唾液分泌が大きく異なる可能性を示す興味深い結果であった。この目的を達成するため、本年度は以下の実験を行った。麻酔したラットの顎下腺にCa2+蛍光指示薬(fura-2)を取り込ませた。

顎下腺を露出し、唾液分泌刺激薬(アセチルコリン:ACh)の投与によるCa2+応答を測定した。AChを顎下腺に直接注入すると注入部位のCa2+上昇が観察された。一方、腹腔内投与では、Ca2+上昇は観察されなかった。AChの腹腔内投与により十分な唾液分泌が認められることから、唾液分泌を起こすのに必要な薬物濃度によるCa2+応答は想定よりも低い可能性が考えられた。そこで、より高感度で変化率の大きなCa2+センサーを顎下腺へ導入することを試みた。2種類のCa2+バイオセンサー(カメレオン-NanoおよびG-GECO)はfura-2よりも高感度、あるいは蛍光比の変化率が大きいという特徴を持ち、小さなCa2+応答を捉えることが可能である。これらのCa2+センサーをウイルスベクター化し、それを用いることで顎下腺に特異的に発現させることができる。これらを発現するウイルスを作製し、生きたラットの顎下腺(特に腺房細胞)にCa2+センサーを発現させた。このラットにACh(10mg/kg)を腹腔内投与すると、顎下腺の腺房細胞で明瞭なCa2+上昇が観察され、この上昇が時間ともに低下する反応をイメージングで捉えることに成功した。また、この時に十分な唾液分泌が起きることを確認した。平成24年度以降は、この方法を用いて様々な分泌刺激薬によるCa2+応答を調べるとともに、その反応に対する受容体拮抗薬や酵素阻害薬の影響を検討する。また顎下腺のCa2+応答と唾液分泌に関与するタンパク質を解析するためのウイルスベクターの作製を行う予定である。高感度Ca2+センサーを用いた方法により、ラット顎下腺のin vivo Ca2+イメージング方法を確立した。この手法により、従来の蛍光指示薬(fura-2)では捉えることの出来なかった小さなCa2+変化の検出が可能となり、唾液分泌刺激薬の腹腔内や静脈内投与により顎下腺で起こるCa2+応答の可視化に加え、同時に顎下腺の血流動態をレーザースペックルイメージングでの可視化に成功した。さらに予備実験ではあるが、超小型圧力センサーを用いることで秒単位での微量な唾液分泌量変化を捉えることに成功した。これらの実験から、ムスカリン受容体作動薬のアセチルコリン、ピロカルピンあるいはベタネコールの刺激が、それぞれ異なったCa2+応答や血流動態変化を起こし、これらの違いが唾液分泌量やその変動パターンに大きく影響している可能性が示された。これは同じ受容体刺激薬であっても薬物ごとに作用様式が異なることを示す非常に興味深い結果である。これらの結果は、唾液分泌における細胞内セカンドメッセンジャー、血流動態および唾液分泌を直接同時に解析することによって得られるもので、生体内における唾液分泌機構の解明への重要な結果を得ることが出来た。平成24年度では予定した研究計画を達成することは出来なかったが、イメージングによるCa2+応答と血流動態の解析により生体内おける唾液分泌機構の解明のための予想以上の成果を上げることが出来た。今後はこれらイメージングと唾液分泌の同時測定実験に加え、唾液分泌に関係するタンパク質に関する研究を推し進める予定である。Ca2+蛍光指示薬(fura-2)を用いて、顎下腺への唾液分泌刺激薬の直接注入により、生きたラットの顎下腺のCa2+応答を測定することができた。一方で、腹腔内投与では、顎下腺のCa2+応答を捉えることができなかった。
超高層大気下部の経度非一様性の国際協同観測

超高層大気下部の高度100kmの大気の経度構造をとくに地上からの高感度大気光画像観測中に見られる微小構造や、ナトリウムライダーによる温度、組成構造などの観測から明らかにした。その結果、大きな経度変化が見られたが、同時に緯度方向にも数度で大きく異なる構造も見られ、超高層大気下部の中間圏・下部熱圏領域を二次元マッピングするような観測研究が今後重要となることを示唆した。本研究は下層との相互作用を考える上で重要な超高層大気下部の大気不安定領域の経度変化を日本および米国での地上からの光電波協同観測を軸にさらに発展させたネットワークを構築し衛星観測も動員して明らかにすることを目的としている。本年度は下記にように順調に進展した。。1)米国コロラドと日本での光電波協同観測コロラドでのOHイメージャ観測を継続してライダーやレーダーとの協同観測を進めた。また、コロラド州立大と京大でライダーデータについて統一的なデータ処理が行なえるように議論を進めた。京大宇治構内でナトリウムライダー観測を定期的に行い、年周変化を捉えることに成功した。また、米国での光電波協同観測に対応して、信楽MUレーダーとNaライダーを中心にイメージャ2地点観測も組み合わせたキャンペーン観測を実施して熱圏下部構造のデータを取得した。2)拡大ネットワーク観測と衛星協同観測イメージャの観測点を拡大し、日本(信楽)と同じ緯度での米国観測の可能性を調査した。その結果ニューメキシコにイリノイ大学のイメージャが設置されていることが判明し、共同研究の準備を行なった。同時に衛星観測も導入して大規模な温度・風速構造の経度変化を調べるために、ドイツからOberheideを招へいして、SABERデータの解析を行ない、大気潮汐波の影響や大気安定度の経度構造などを明らかにした。3)、蓄積データの解析とデータベース化観測により蓄積されたデータについて統一した手法により解析を進めるとともに、データベース化を行なう準備を行なった。日本とコロラドでのナトリウムライダー観測から温度について同じ解析手法を用いて解析することを進めた。さらに、イメージャデータからOH大気光中のリップルの統計を同じ手法で調べるべく、コロラドイメージャのリップル等の解析をすすめ、季節・時間変化や重力波の特性、波動との相互作用を解明した。本研究では、下層との相互作用を考える上で重要な超高層大気下部の大気不安定領域の経度変化という概念で、日米で行なってきた地上からの光電波協同観測を発展させたネットワークを構築し衛星観測も動員して、下部熱圏の力学的経度非一様性の実態を観測的に明らかにすることを目的とする。本年度も下記のように順調に進展した。1)米国コロラドと日本での光電波協同観測日米の観測を継続してデータを蓄積するとともに、ライダーおよびMUレーダーの温度風速の詳細観測データを取得する集中観測を実施した。また、とくにNaライダーの温度導出アルゴリズムや較正法について日米共同で改良を進めた2)拡大ネットワーク観測と衛星協同観測前年調査を進めたニューメキシコ州でのライダーおよび大気光イメージング観測についてデータ解析などの共同研究を進めた。特にNaライダーの比較で同経度でも緯度35度と40度で違いが大きいことを確認した。地上観測のデータとSABER等の衛星解析/GCM(CMAM)を比較したが、温度構造については経度差はあまり見いだされなかったが、Naの組成構造はより大きな違いを見出した。一方、GCMからは潮汐の異なる波数の重ね合わせで大きく経度構造ができることも示した。3)蓄積データの解析とデータベース化これまでに蓄積したイメージャ、ライダー、レーダーデータを用いて、温度構造、リップルイメージによる不安定領域解析、大気重力波の伝搬解析を行ない、またナトリウム層の変動も加えて解析した。とくに、米国で多頻度のリップルを観測し、その季節変化が日米とも重力波の季節変化と相関があること、すなわち至点期に大きく、分点期に小さいことを見出した。一方、個々の大気不安定イベントとリップルの対応が必ずしも完壁でないとされる点の詳細について検討と解析を進めた。また大気不安定における重力波振幅の重要性を見出した。1)米国コロラドと日本での光電波協同観測米国コロラドと日本でのライダーとの同時観測データを中心に協同観測データの解析を行った。海外共同研究者のJoe She教授が3カ月間日本に滞在し、その間に海外共同研究者のJia Yueとも協同して研究のとりまとめを行った。日米のリップル統計比較時に明らかになったライダーによる大気安定度との一対一対応の弱さはライダーデータ解析上の高度勾配導出の固有の問題と明らかできた。2)拡大ネットワーク観測と衛星協同観測大型の多波長全天大気光イメージャをドイツの大気物理研究所のKuelungsbornに設置してデータの少ない欧州域の多波長全天イメージャ観測を開始した。また、その後北欧のALOMARにもイメージャを展開した。

この間、ドイツのレイリー・ラマン・共鳴散乱ライダー観測と貴重な同時観測データを取得した。ドイツでの観測からはMLT重力波の構造を多面的観測から明らかにした。3)蓄積データの解析とデータベース化これまでに取得蓄積したデータを総合的に解析した。とくに、Rippleの統計についての解析方法のバイアスや最適な比較方法を十分議論した。また、日米の比較ではMLT領域の大きな差異も見られたが、緯度5度程度の違いの影響も大きいことが示され、今後MLTを緯度経度だけでなくマップとして捉えるような思想の切り替えが必要であることが示された。以上のように本課題は多くの理学的知見を得たと同時に、米・独との研究者ネットワークも築くことができ、期待以上の発展を遂げた。
CBL会合アダプター(CIN85)による正常ならびに自己免疫疾患B細胞の機能制御

B細胞抗原受容体(BCR)下流の正負シグナルのバランス調節は、自己反応性B細胞を自己寛容あるいは自己免疫の方向へ誘導するかの運命決定の上で重要である。本研究では、c-Cbl会合アダプター(CIN85)がBCR下流においてこのようなシグナルバランス調整に重要な分子であることが明らかになった。本年度は、CIN85の各アダプタードメインの機能解明、CIN85ノックダウンによるB細胞機能の解明、ヒト正常B細胞におけるCIN85の機能解明について検討した。(1)CIN85の各アダプタードメインの機能解明野生型、SH3ドメイン欠損型CIN85を発現したB細胞株を使用して研究を行った。その結果、CIN85のSH3ドメインはCb1とBLNKとの結合にきわめて重要であり、CIN85は抗原受容体刺激によるCa fluxに対して作用することが判明した。(2)CIN85ノックダウンによるB細胞機能の解明CIN85の機能解明には(1)のような外因性CIN85を導入する系のみでは不十分と考え、CIN85 shRNAベクターによる内因性CIN85発現が90%程度にまでノックダウンされたB細胞株を使用し研究を行った。その結果、CIN85はSyk,PLCγ2などといったB細胞抗原受容体シグナル伝達における重要な分子の活性化を制御することが判明した。(3)ヒト正常B細胞におけるCIN85の機能解明CIN85によるB細胞機能制御の解明には(1)や(2)のようなB細胞株のみを使用した研究では不十分と考え、健常人より純化したB細胞にnucleofectionシステムによりCIN85 shRNAベクターを導入した。その結果、CIN85がノックダウンされたB細胞では、抗原受容体刺激によるB細胞生存や増殖が変化することが判明した。以上の結果より、CIN85は抗原受容体シグナルの下流にてB細胞機能を制御している重要なアダプター分子であることが強く示唆される。本年度は、CIN85による抗原提示制御メカニズムの解明、自己免疫疾患B細胞におけるCIN85の発現異常の解明について検討した。(1)CIN85による抗原提示制御メカニズムの解明B細胞抗原受容体(BCR)は、生存、増殖、分化に必要なシグナルを産生すると同時に、自らは抗原を取り込みプロセスするという抗原提示機能の上で重要である。CIN85野生型、アダプタードメイン欠損型、RNAiベクターによるCIN85ノックダウン細胞を使用し、刺激後のBCRの取り込み(internalization)についてフローサイトメトリーを使用し評価した。その結果、いずれの細胞においてもBCRのinternalizationはコントール細胞と同様であり、B細胞の抗原提示能の最初の段階である抗原の取り込みについて、CIN85は作用しないことが判明した。(2)自己免疫疾患B細胞におけるCIN85の発現異常の解明CIN85によるBCRシグナルの可能性は、このアダプター分子の自己免疫疾患(特にSLE)におけるB細胞の機能異常への関与を示唆する。自己免疫疾患B細胞(CD19^+)をナイーブならびにメモリーB細胞サブセットの分画まで純化を行い、real-timePCRによるCIN85 mRNAの定量的評価ならびにwestern blotによるCIN85蛋白の定量的評価を行った。その結果、健常人B細胞サブセットに比べ、自己免疫疾患B細胞サブセットにおいてCIN85発現がmRNAならびに蛋白レベルの両方において低い傾向にあることが判明した。以上の結果より、CIN85は、抗原受容体を介したB細胞機能を制御することにより、自己免疫疾患における自己反応性B細胞の運命決定に重要なアダプター分子であることが強く示唆される。
近隣地域再生における「就労」の導入と住民の主体化に関する社会福祉援助論的研究

本研究は、近隣地域再生においてコミュニティオーガニゼーションが導入している「就労」プログラムについての基礎的研究を行うものである。シカゴ市内に立地する36の近隣地域の再生プログラムに、アクティベーションやワークフェアなどをはじめとする就労プログラムが導入されている。これらのプログラムとその実施状況と成果について情報収集し、社会福祉援助方法論の観点から分析し、住民主体化における就労支援の位置づけについて明らかにするものである。シカゴの近隣地域では、失業は大きな課題である。産業構造の転換によるブルーカラー層の男性の失業が大量に発生し、地域の貧困や治安の悪化に影響を与えてきた。これに伴った更生者の就業問題、未婚で子どものいる女性の長期的な失業が課題とされてきた。このために就労支援や働く場の確保は近隣地域開発でも重視され、就労支援プログラムが多様に展開してきている。近隣地域を対象とした社会福祉援助方法論として、住民の主体化や参加を実現するための方法や理論が研究されてきた。本研究では、「就労」が導入され、雇用というスタイルの住民の参加や主体化、住民のエンパワメントが実現されてきたと同時に、地域問題解決のツールとしても活用されているという点に着目して、社会福祉援助論的な観点から研究を行う。この調査の結果、先進的な取り組みを実施しているコミュニティオーガニゼーション及び、シカゴ市内におけるコミュニティオーガニゼーションの取り組みの全体像を把握した。(1)中間就労や就業支援をコミュニティ再生プログラムに導入する、(2)社会的に排除されているグループに役割を付与する、(3)教育プログラムと就業支援を一体的に進める、(4)ビジネスインキュベーション等によって就労の場を開発する、(5)近隣地域内に企業誘致、(6)公的主体からの事業委託で雇用促進、(7)スキルアップ支援などが確認できている。研究費を得たことによって、年度期間中2回の渡航を実施できた。また、中間支援組織など各コミュニティの活動を熟知しているキーパーソンに出会うことができた。これによって、ヒアリングや資料収集などの調査が順調に進んだ。今後は、中間支援組織で入手した情報を元に個別のコミュニティの調査を実施する。2019年3月に2週間シカゴに出張した際、ホテル代等の請求が年度を超したため残金が出たように見えるが、実際には年度内に使い切っている。
クロロキンのドラッグリポジショニングによる新規放射線増感治療の開発

本年度は膵臓癌に対するクロロキンの放射線増感効果を探索すること目標とした。まずヒト膵臓癌培養細胞の中からMiaPaCa2を選択し、通常培地(DMEN)中で培養し、3次元スフェロイドを形成させる。これにより中心部が低栄養の状態を作ることができ、膵癌組織に近い状態を再現するとともにオートファジーの関与についても検討することが可能である。低接着ディッシュ上で培養することでスフェロイドが形成されたが、その大きさにはバラつきが生じた。スフェロイドによる個体差を避けるため、低接着ウェルにて単一スフェロイドの形成を行った。低接着型96ウェルに1ウェルあたり1000個の細胞を播種することで均一なサイズのスフェロイド形成を得ることができた。これらに放射線照射、放射線照射とクロロキン投与併用の処理を行いスフェロイドのサイズを測定した。放射線照射は4Gy、クロロキン濃度は0.1-10μMで投与した。オートファジーは試薬(DALGreen)を添加して蛍光を観察した。処理後1週間までサイズを測定したが、スフェロイドのサイズの変化は軽微であった。また、放射線照射、放射線照射とクロロキン投与処理をすることで蛍光を観察することができたが、クロロキン投与による蛍光の差などは明らかにできなかった。本年度は膵癌培養細胞において、スフェロイド形成を得ることが可能であり、また放射線照射、放射線照射とクロロキン投与処理によりオートファジー現象を示唆する蛍光を定性的に観察することが可能であった。3次元スフェロイドを形成するヒト膵臓癌培養細胞を選択することが必要であり、MiaPaCa2を低接着ディッシュ上で培養することでスフェロイド形成が可能であった。これにより中心部が低栄養の状態を作ることができ、培養細胞で膵癌組織に近い状態を簡便に再現した。ディッシュ上で複数のスフェロイド形成が可能であったが、サイズに大小があり、コントロール、照射、照射と薬剤の投与による細胞の反応を比較するためには単一のスフェロイド同士の方が平易に比較できると考え、低接着の96ウェル上にて培養(1000個/ウェル)することでほぼ均一なサイズの単一のスフェロイドを形成することが可能であった。クロロキン投与による放射線増感効果を検討するため放射線照射、放射線照射とクロロキン投与併用の処理を行った。今回の検討ではスフェロイドのサイズに有意な差を見出すことができなかった。クロロキン投与によるオートファジーは試薬を添加して蛍光を観察することができたものの放射線照射、放射線照射とクロロキン投与処理による差などは明らかにできなかった。上記のような結果を得たが、本年度の進捗状況としては通常培地における培養とスフェロイド形成を主体とした定性的な検討にとどまっており、やや遅れている。スフェロイド形成が可能なディッシュ、ウェルの選択や照射線量、クロロキンの投与量選択に時間を要したためである。しかしながら基本的な設定については本年度確定しており、次年度以降は本年度の設定を使用することが可能である。1)低栄養培地におけるクロロキン投与と細胞応答次年度はまず、オートファジーが発現すると思われる低栄養培地で細胞を培養し、細胞応答について検討を行う。具体的には細胞生存率、DNA損傷、オートファジー発現、アポトーシス誘導、細胞周期の変化について検討する。本年度確立した3次元スフェロイドの状態で放射線照射、クロロキン投与、照射と薬剤併用の3群で処理を行い、変化を比較する。生存率については96ウェル上で行い吸光度をプレートリーダーで測定する。DNA損傷については35mmディッシュで観察を行う。その他については6ないし10cmディッシュ上で細胞を固定・回収し、フローサイトメトリーで抗体を用いて定量的に測定する。2)クロロキン投与とmTOR阻害剤投与の比較前項と同様の処理を行い、mTOR系活性を解析することでクロロキンの作用部位、作用機序を明らかにする。これまで当研究室で解析してきたmTOR阻害剤(エベロリムス)はクロロキンと異なりオートファジーを活性化する。mTOR阻害剤は抗腫瘍効果を有しており放射線との併用効果も観察されている。この点について、クロロキンと抗腫瘍効果、作用を比較検討することで放射線増感効果が高い薬剤を特定する。3)実験動物を用いた腫瘍組織・正常組織レベルでの放射線増感効果・有害反応評価膵癌細胞をヌードマウス大腿皮下に移植し腫瘍を形成させる。放射線照射、クロロキン投与、照射とクロロキン投与を行い、腫瘍増殖率を測定する。さらに固定凍結切片を作成し、in vivoにおけるオートファジー活性及びmTOR活性を評価する。クロロキンの腫瘍血管への影響や転移形成抑制効果についても、免疫染色や動物用CT撮像を用いて評価し、臨床応用に結びつけ、治療成績向上につながりうる研究となるように実験を行う。

これらに放射線照射、放射線照射とクロロキン投与併用の処理を行いスフェロイドのサイズを測定した。放射線照射は4Gy、クロロキン濃度は0.1-10μMで投与した。オートファジーは試薬(DALGreen)を添加して蛍光を観察した。処理後1週間までサイズを測定したが、スフェロイドのサイズの変化は軽微であった。また、放射線照射、放射線照射とクロロキン投与処理をすることで蛍光を観察することができたが、クロロキン投与による蛍光の差などは明らかにできなかった。本年度は膵癌培養細胞において、スフェロイド形成を得ることが可能であり、また放射線照射、放射線照射とクロロキン投与処理によりオートファジー現象を示唆する蛍光を定性的に観察することが可能であった。3次元スフェロイドを形成するヒト膵臓癌培養細胞を選択することが必要であり、MiaPaCa2を低接着ディッシュ上で培養することでスフェロイド形成が可能であった。これにより中心部が低栄養の状態を作ることができ、培養細胞で膵癌組織に近い状態を簡便に再現した。ディッシュ上で複数のスフェロイド形成が可能であったが、サイズに大小があり、コントロール、照射、照射と薬剤の投与による細胞の反応を比較するためには単一のスフェロイド同士の方が平易に比較できると考え、低接着の96ウェル上にて培養(1000個/ウェル)することでほぼ均一なサイズの単一のスフェロイドを形成することが可能であった。クロロキン投与による放射線増感効果を検討するため放射線照射、放射線照射とクロロキン投与併用の処理を行った。今回の検討ではスフェロイドのサイズに有意な差を見出すことができなかった。クロロキン投与によるオートファジーは試薬を添加して蛍光を観察することができたものの放射線照射、放射線照射とクロロキン投与処理による差などは明らかにできなかった。上記のような結果を得たが、本年度の進捗状況としては通常培地における培養とスフェロイド形成を主体とした定性的な検討にとどまっており、やや遅れている。スフェロイド形成が可能なディッシュ、ウェルの選択や照射線量、クロロキンの投与量選択に時間を要したためである。しかしながら基本的な設定については本年度確定しており、次年度以降は本年度の設定を使用することが可能である。1)低栄養培地におけるクロロキン投与と細胞応答次年度はまず、オートファジーが発現すると思われる低栄養培地で細胞を培養し、細胞応答について検討を行う。具体的には細胞生存率、DNA損傷、オートファジー発現、アポトーシス誘導、細胞周期の変化について検討する。本年度確立した3次元スフェロイドの状態で放射線照射、クロロキン投与、照射と薬剤併用の3群で処理を行い、変化を比較する。生存率については96ウェル上で行い吸光度をプレートリーダーで測定する。DNA損傷については35mmディッシュで観察を行う。その他については6ないし10cmディッシュ上で細胞を固定・回収し、フローサイトメトリーで抗体を用いて定量的に測定する。2)クロロキン投与とmTOR阻害剤投与の比較