hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深海底熱水活動域における化学合成微生物の共生機構を分子的に理解する

本研究は、深海底熱水孔環境において共生関係にある微生物-大型生物の相互作用・相互認識機構を分子レベルで解明することを目的としている。特に生物間の相互認識に関わる生体分子「糖鎖」に注目し研究を進めてきた。これまでの研究において、深海底熱水孔環境に生息する共生微生物およびそのホスト生物の両者について、糖鎖の発現解析・プロファイリング・構造解析を行い、両者の相互認識・相互作用に寄与する可能性の高い特異な新奇糖鎖を見いだすことに成功した。本研究は糖鎖分子を扱う第三の分子生物学(=グライコミクス)を深海底に初めて導入し、共生関係にある微生物-大型生物の相互作用・相互認識機構を分子レベルで解明することを目的とするものである。2008年度は、主に日本近海の深海底熱水活動域に由来する甲殻類およびその共生微生物系統群に注目し、(1)共生微生物における糖鎖の発現確認、(2)発現糖鎖のプロファイル解析、の2項目を中心に研究を進めた。(1)においては、発現タンパク質のプロテオミクスと糖鎖染色を組み合わせることにより、50種類を超える糖鎖修飾タンパク質を検出し、微生物の炭素代謝およびエネルギー代謝において基盤的役割を担うタンパク質の多くが糖鎖修飾を受けていることを見いだした。一方(2)においては、ヒドラジン分解法を用いて糖鎖を遊離し、官能基を持つビーズを用いて精製・ラベル化を行なった後にMALDI-TOFMS解析に供することで、部分的ではあるが発現糖鎖のプロファイル決定と大まかな構造解析を行うことに成功した。本年度の研究において共生微生物に発見した糖鎖の一部は極めて新規性が高く、共生微生物-ホスト生物間の相互認識機構に関与する可能性が高い。加えて、それらの糖鎖構造は微生物における真核生物型糖鎖の生理機能やその進化過程の研究のみならず、病理学・免疫学といった幅広い研究分野へのインパクトが非常に大きい。現在、糖鎖精製法の改善、プロファイリング精度の向上および詳細な糖鎖構造解明を試みている。本研究は糖鎖分子を扱う第三の分子生物学(=グライコミクス)を深海底に導入し、共生関係にある微生物-大型生物の相互作用・相互認識機構を分子レベルで解明することを目的とするものである。平成21年度は、計画していた目標を全て達成し、想定以上の成果を得た。本年度は、主に1.全ゲノム解析済みの共生微生物(純粋培養細胞)、2.ホスト生物の血清、3.ホスト生物のバクテリオサイトから分画した共生微生物細胞(環境試料)を用いて、(1)現有設備による微生物糖鎖の精製・検出・構造解析法の確立、(2)微生物細胞表層に特化した糖鎖解析技術の確立、(3)ホスト生物における糖鎖認識タンパク質の探索と性状解析、の3項目を重点的に進めた。その結果、(1)においては、糖鎖精製法・ラベル化法・MALDI-TOFMSの設定を最適化することにより、ピコモルオーダーの糖鎖を高感度に検出し構造解析することが可能な系を確立した。また、(2),(3)においてはハイスループットなアレイ技術を用いて解析を行なった。(2)においては、FISH (fluorescent in-situ hybridization)法により染色した微生物細胞をそのままレクチンアレイに供し、共生微生物の細胞表層に高発現している糖鎖をプロファイリングすることに成功した。(3)においてはホスト生物の血清中にレクチン活性を検出することに成功したが、糖鎖アレイにて性状解析できるほどレクチン含量は多くなかったため、現在レクチン分子の濃縮・精製を行なっている。加えて、インド洋中央海嶺で実施した研究調査航海において、細胞内共生微生物を有する希少巻貝の大群集を発見し、平成22年度に行う解析に必要となる細胞内共生系試料を採取・調整することに成功した。以上の結果の一部は、国内外における複数の学会や新聞・国際誌等で報告した。本研究は、糖鎖分子を扱う第三の分子生物学(=グライコミクス)を深海底に導入し、共生関係にある微生物-大型生物の相互作用・相互認識機構を分子レベルで解明することを目的とするものである。平成22年度は、計画していた目標を全て達成し、想定以上の成果を得た。本年度は、主に共生微生物を培養することができていない細胞内共生系において、1.細胞内共生微生物と2.そのホスト生物における糖鎖プロファイル(どのような糖鎖がどれくらい存在するか)の解析を重点的に進めた。昨年度にインド洋中央海嶺において実施した研究航海において採取していた試料を用いて、共生微生物とホスト生物の細胞を物理的に分画してから解析を行なった。解析にはこれまでの研究において最適化してきた糖鎖精製法・ラベル化法・MALDI-TOFMS解析法を用い、様々な生理状態における細胞内共生微生物およびホスト生物の糖鎖プロファイルを解析することに成功した。

本年度の研究により、共生微生物を分離できない共生系においても、これまで解析してきた細胞外共生系と同じレベルで、異種生物間の糖鎖を介した相互認識・相互作用機構を解析し、総合的に体系化するための知見を得ることが出来た。加えて、ホスト生物において発現している糖鎖のプロファイルが、ホスト生物の生理状態を敏感に反映する指標として応用可能であることを見いだした。以上の結果の一部は、国内外における複数の学会や国際誌等で報告した。
高齢化社会における地方都市の生涯教育関連指標の開発に関する研究

1.研究対象である北陸地方の高齢化に関するデモグラフィックな指標は,次のとおりである.(1)老年人口比率は,全国的にみてかなり高い.(2)しかしながら,核家族世帯比率は小さく,したがって,高齢者の単独世帯の比率は小さい.2.富山県を対象として,高齢者の生涯教育活動に関連する環境要因指標を検討した.(1)施設としての「老人憩の家」等の数の老人人口に対する比率は全国的にみて高い.(2)組織としての老人クラブ加入率等も高い.(3)老人クラブ加入率は,富山県内市町村についてみると,町村部で高い.3.高齢者の生涯教育活動の実態および教育活動能力指標を明らかにする目的で質問紙調査を実施した.調査の概要は次のとおりである.(1)調査地点:富山県高岡市の老人福祉センター3ヵ所.(2)調査対象:各センター利用者.(3)抽出方法:利用者の中から任意に抽出.(4)調査方法:調査員による質問紙面接法.(5)調査期日:昭和63年1月8日, 9日.(6)有効回収票数:247.(7)調査内容:現在の教育・余暇活動,過去の活動経験,活動を始めた経緯,ゲートボール,友人関係等,および属性.4.この質問紙調査の結果の概要は次のとおりである.(1)高岡市の高齢者の余暇・教育活動は,都市(横浜市)の高齢者の同様の調査結果と比較しても,かなり活発である.(2)過去の活動経験との関連をみると,スポーツや学習活動においては,過去の活動経験という能力ストックの影響が大きい.趣味については,高齢者になってから始めるケースも多い.(3)ゲートボールは,高齢者になってから始めることの多い活動であるが,そのきっかけとしては,友人の影響がもっとも大きい.5.本研究の今後の展開としては,環境要因と能力要因との関連を精緻に検討することである.1.研究対象である北陸地方の高齢化に関するデモグラフィックな指標は,次のとおりである.(1)老年人口比率は,全国的にみてかなり高い.(2)しかしながら,核家族世帯比率は小さく,したがって,高齢者の単独世帯の比率は小さい.2.富山県を対象として,高齢者の生涯教育活動に関連する環境要因指標を検討した.(1)施設としての「老人憩の家」等の数の老人人口に対する比率は全国的にみて高い.(2)組織としての老人クラブ加入率等も高い.(3)老人クラブ加入率は,富山県内市町村についてみると,町村部で高い.3.高齢者の生涯教育活動の実態および教育活動能力指標を明らかにする目的で質問紙調査を実施した.調査の概要は次のとおりである.(1)調査地点:富山県高岡市の老人福祉センター3ヵ所.(2)調査対象:各センター利用者.(3)抽出方法:利用者の中から任意に抽出.(4)調査方法:調査員による質問紙面接法.(5)調査期日:昭和63年1月8日, 9日.(6)有効回収票数:247.(7)調査内容:現在の教育・余暇活動,過去の活動経験,活動を始めた経緯,ゲートボール,友人関係等,および属性.4.この質問紙調査の結果の概要は次のとおりである.(1)高岡市の高齢者の余暇・教育活動は,都市(横浜市)の高齢者の同様の調査結果と比較しても,かなり活発である.(2)過去の活動経験との関連をみると,スポーツや学習活動においては,過去の活動経験という能力ストックの影響が大きい.趣味については,高齢者になってから始めるケースも多い.(3)ゲートボールは,高齢者になってから始めることの多い活動であるが,そのきっかけとしては,友人の影響がもっとも大きい.5.本研究の今後の展開としては,環境要因と能力要因との関連を精緻に検討することである.
運動知覚における視聴覚情報統合のメカニズムの解明

視覚刺激の点滅に同期させて、音を左右の耳から交互に提示し、点滅刺激が左右に動いているように見えるときに、動きの処理の中枢であるhMT野が活動することが明らかになった。事象関連電位を用いた視聴覚統合の研究は、仮現運動刺激と学習性の音ー視覚刺激の対連合刺激を用いて、学習性の音によって誘発される運動刺激と仮現運動刺激との間にミスマッチ負電位が検出できるか否かを検討した。音による視覚刺激の動きに順応させる以前だと、仮現運動刺激と学習性の音ー視覚刺激の対連合刺激を使った課題で、明瞭な視覚性ミスマッチ負電位が観察された。しかし、対連合に順応した後には負電位が消失した。7テスラfMRI装置は、これまで使っていた3テスラ装置と比べて、ヘッドコイル(頭を覆って、MR信号を取得する装置)が極めて小さく、また、計測中に発生する騒音も大きかった。これらの特性に合わせて聴覚刺激装置と画像刺激装置の試作を行った。特に、大きな低周波騒音の下で、被験者が聞き分けられる音に限りがあり、聞き分けられる刺激の作成も行った。2つの視覚刺激を交互に呈示して、1つの刺激が左右に動いて見える時に(仮現運動が生じている時に)、第5次視覚野(MT野)が強く活動し、聴覚刺激に対して第1次聴覚野が強く活動することを確認した。また、超高磁場MRIなので、1立方ミリメートル単位での、非常に高い空間分解能で機能画像を取得できることも確認した。静止している視覚刺激の点滅に同期させて、音を左右の耳から交互に提示すると、静止しているはずの視覚刺激が左右に動いて見えるようになる(Hidaka et al., 2010)。この聴覚刺激に誘発される視覚刺激の動きを知覚している時の脳活動をfMRIで測定した。その結果、音を左右の耳から交互に提示されて、視覚刺激が左右に動いて見えている時には、MT野が強く活動した。ところが、音が左右両耳から提示されるか、もしくは左右どちらか一方の耳から提示されていて視覚刺激が単に点滅しているようにみえるときには、MT野の活動は見られなかった。この結果は、音に誘発される視覚刺激の動きの知覚にMT野が深く関わっていることを示している。静止した視覚刺激の点滅に同期させて、音を左右から交互に提示すると、視覚刺激が左右に動いて見える。この現象の脳内メカニズムを明らかにするために、fMRIと誘発電位法を用いて脳活動を計測した。また、主観的判断と合わせて、パブロフ型分化条件付けの手続きを用いて、刺激に対する応答を記録した。視覚刺激の点滅に同期させて、音を片耳あるいは両耳から提示しても、視覚刺激は同じ場所で点滅しているように感じられ、視覚連合野(MT野)の活動にも変化は見られなかった。ところが、点滅に同期させて、音を左右から交互に提示すると、視覚刺激が左右に動いて見えるようになり、MT野が強く活動した。この結果から、視覚連合野(MT野)が聴覚系からの入力も受けて視聴覚情報統合を行っていることが明らかになった。また、パヴロフ型分化条件付けを用いて応答を記録すると、主観的判断を行う以前の感覚情報処理の様子が記録できることが明らかになった。このうち、心理(行動)実験の結果は、昨年度の欧州視覚学会と北米神経科学学会で発表した。また、心理実験に関する論文は、国際誌(Journal of Vision)に掲載された。fMRI実験の結果は、今年度の北米神経科学学会で発表し、国際誌に投稿する予定である。また、視聴覚刺激に対する誘発電位の結果と合わせて、脳内の情報伝搬の推定を試みる予定である。今年度は、感覚情報を処理する際に、他のモダリティの感覚情報も合わせて処理していることを確認するために、体性感覚系による動きの処理も合わせて検討する予定である。視覚刺激の点滅に同期させて、音を左右の耳から交互に提示し、点滅刺激が左右に動いているように見える時、音を左右どちらか一方の耳にだけ提示し視覚刺激が単に点滅しているように見える時、および、点滅の位置を変化させて仮現運動が見える時の3条件について、脳活動をfMRIで測定した。その結果、仮現運動が見えているときには、側頭葉のhMT野が強く活動し、視聴覚情報統合によって点滅刺激が動いて見えているときにもhMT野に活動が観察された。この結果、音によって視覚刺激が動いて見える現象が、聴覚系の活動が視覚系の働きを修飾していることに起因することが示唆された。音によって点滅刺激が動いて見える現象の責任部位を明らかにするために、残効法(De-activation)を使ったfMRI計測を行った。仮現運動刺激に対する脳活動を測定した後に、音によって動いて見える視覚刺激を複数回提示する。その後に改めて仮現運動刺激に対する脳活動を測定する。2つの刺激に対して同じように働いている部位は、繰り返し活動しているため2度目の仮現運動刺激に対する活動が低下するが、個別に働いている部位は同じように活動するだろうと予測した。仮説を支持する結果が得られているが、統計検定を行うためには、被験者数を増やす必要があり、現在も、継続している。事象関連電位を用いた視聴覚統合の研究は、仮現運動刺激と学習性の音ー視覚刺激の対連合刺激を用いて、脳波を測定した。

音による視覚刺激の動きに順応させる以前だと、仮現運動刺激と学習性の音ー視覚刺激の対連合刺激を使ったOddball課題で、明瞭な視覚性Mismatch Negativityが観察された。しかし、対連合に順応した後ではMismatch Negativityが消失した。この結果は、順応によって正の残効が形成されたため2種類の刺激を弁別することが困難になったことを示している。視覚刺激の点滅に同期させて、音を左右の耳から交互に提示し、点滅刺激が左右に動いているように見えるときに、動きの処理の中枢であるhMT野が活動することが明らかになった。事象関連電位を用いた視聴覚統合の研究は、仮現運動刺激と学習性の音ー視覚刺激の対連合刺激を用いて、学習性の音によって誘発される運動刺激と仮現運動刺激との間にミスマッチ負電位が検出できるか否かを検討した。音による視覚刺激の動きに順応させる以前だと、仮現運動刺激と学習性の音ー視覚刺激の対連合刺激を使った課題で、明瞭な視覚性ミスマッチ負電位が観察された。しかし、対連合に順応した後には負電位が消失した。7テスラMRI装置に合わせた刺激提示法を確立するのに、時間を要した。fMRIによる脳活動測定は予定通りに進捗しているが、誘発電位法による脳活動計測は、改装された実験室でのハムノイズ除去に手間取っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。知覚心理学音に誘発される視覚刺激の動きを見ているときのMT野の活動を、多くの被験者で測定する。同時に、誘発電位の計測も開始する。誘発電位計測を早急に行って、fMRIによる活動部位の推定結果と合わせて、急ぎ解析する。
狭隘空間の移動ロボットに有効な多毛構アクチュータ

本研究は、複雑な配管内部や災害現場など、人間の潜入しにくい狭隘空間を移動探するロボットの開発を目的としている。その実現のためには、推進駆動用アクチュエータおよび伝達駆動系の小型構造化・高出力化が不可欠である。そこで、研究代表者らが提案してきた偏平チューブを用いた流体アクチュエータを用いて駆動系の省スペース化を図り、目的のロボット実現手段を検討していくことにした。まず、アクチュエータ単体の駆動推進力を検討するため、自励振動を生成する円形偏平チューブ:(Flat Ring Tube、以後FRTと呼ぶ)の駆動特性を調べた。その結果、FRTの振動数は内部の流量にほぼ比例して増加すること、推進力を最も効率よく伝達できる最適な接触箇所が存在すること、同一流量でもチューブサイズの小型化に伴い振動数が増加すること、などが明らかとなった。次に、円筒形状またはマット形状の移動探査機の推進を目指し、FRTを複数個用いてそれらの周部に配置したところ、上記最適部で駆動した場合でもFRT個数の増加とともに全体の推進力が減少することが明らかとなった。移動体体幹の長さが短い場合にはFRTの設置個数の最小化を図ることで推進可能であるが、長くなった場合には本手法では十分な推進力を得られないと考えられる。その解決策として、対抗した複数の偏平チューブの手繰り出し現象を用い、外部環境に対して全く摺動せずに探査装置を搬送する、全く新しい移動方式を考案した。これは、円筒状柔軟ホース内部からホース表皮が手繰り出されるように推進する動作を基本とするものである。試作したホースユニットは、ホース表皮の外壁軸方向に位相差180度を有して2本の偏平チューブを配置した構造を基本としている。偏平チューブ端部から1気圧程度の空圧で加圧すると、探査用カメラを狭隘空間で推進させることが確認できた。また、方向操舵・搬送機能も実現し、外径50mm程度の円筒形構造による曲率100mm程度の湾曲狭隘空間のS字クランクでの移動も実現できた。一方、FRTの多毛構造体を人体表面に装着することにより、筋血流の促進効果を生成することも明らかとなった。このようなFRTによるウェアラブル・マッサージデバイスは、家庭用水道圧を駆動源として電気を全く使用しないアクチュエータであるため、電磁ノイズを発生することがなく、ペースメーカー使用者や妊娠中の女性にも気軽に使用可能である。サーモグラフィーによる計測の結果、10分間のマッサージにより使用後30分以上も皮膚表面温度の上昇効果がみられた。以上のように、FRTは移動体の推進力生成機能と同時に、人体の血流促進機能も生成できることが明らかとなった。本研究は、工場内や災害現場など、人間の潜入しにくい狭隘空間を移動探査できるロボットの開発を目的としている。その結果、FRTは外部環境と接触する箇所に応じて振動幅が異なり、駆動力を生成するのに適した接触部の存在が明らかとなった。次に、円筒形状またはマット形状の移動探査機の推進を目指し、FRTを複数個用いてそれらの周部に配置したところ、上記最適部で駆動した場合でも全体として十分な推進力を得ることはできなかった。これは、FRTを複数個配置したことにより、各々のFRTへの流量が減少し、推進力の低下につながったものと考えられる。偏平チューブ端部から1気圧程度の空圧で加圧すると、探査用カメラを狭隆空間で推進移動させることが確認できた。今後は、さらに移動環境の形状に応じて、方向操作を行いながら推進する方式を検討してゆく予定である。

次に、円筒形状またはマット形状の移動探査機の推進を目指し、FRTを複数個用いてそれらの周部に配置したところ、上記最適部で駆動した場合でもFRT個数の増加とともに全体の推進力が減少することが明らかとなった。移動体体幹の長さが短い場合にはFRTの設置個数の最小化を図ることで推進可能であるが、長くなった場合には本手法では十分な推進力を得られないと考えられる。その解決策として、対抗した複数の偏平チューブの手繰り出し現象を用い、外部環境に対して全く摺動せずに探査装置を搬送する、全く新しい移動方式を考案した。これは、円筒状柔軟ホース内部からホース表皮が手繰り出されるように推進する動作を基本とするものである。試作したホースユニットは、ホース表皮の外壁軸方向に位相差180度を有して2本の偏平チューブを配置した構造を基本としている。偏平チューブ端部から1気圧程度の空圧で加圧すると、探査用カメラを狭隘空間で推進させることが確認できた。また、方向操舵・搬送機能も実現し、外径50mm程度の円筒形構造による曲率100mm程度の湾曲狭隘空間のS字クランクでの移動も実現できた。一方、FRTの多毛構造体を人体表面に装着することにより、筋血流の促進効果を生成することも明らかとなった。このようなFRTによるウェアラブル・マッサージデバイスは、家庭用水道圧を駆動源として電気を全く使用しないアクチュエータであるため、電磁ノイズを発生することがなく、ペースメーカー使用者や妊娠中の女性にも気軽に使用可能である。サーモグラフィーによる計測の結果、10分間のマッサージにより使用後30分以上も皮膚表面温度の上昇効果がみられた。以上のように、FRTは移動体の推進力生成機能と同時に、人体の血流促進機能も生成できることが明らかとなった。
オートファジー終結因子Tag1の作動機序の探求

オートファジーは大規模細胞内分解機構であり、主に栄養飢餓などにより誘導される。オートファジーはそもそも栄養飢餓などのストレスに対する防御としての役割をにない、すなわち、事故の分解が過剰に進行すると細胞死に直結するという矛盾を内包している。この矛盾は、細胞がオートファジーを停止する機能を有しているという仮説により昇華される。実際、酵母細胞を長期間の窒素源飢餓に曝したところ、8時間から12時間でオートファジーが停止することが明らかとなった。酵母ゲノムワイド変異株コレクションをスクリーニングすることで、このオートファジーの停止に欠損のある変異株を同定し、その責任遺伝子をTAG1と名付け、解析を行った。TAG1は液胞膜に局在するタンパク質であった。飢餓の伴いTAG1は液胞上でクラスターを形成し、それに伴いミクロオートファジーが進行して、液胞内で分解された。それと同時に転写が亢進し。Tag1タンパク質の量は適度に保たれていた。液胞内腔領域がその機能や、クラスター形成に重要であった。Tag1欠損株では、オートファジー実行分子のAtgが集合した状態、PASの形成後の分散が抑制されていた。それはPAS形成の鍵因子であるAtg13の再リン酸化が、抑圧されていることが、少なくとも1つの原因であることが明らかとなった。これらのことからTag1はAtg13のリン酸化を調節することで、オートファジー集結に関与することが明らかとなった。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。オートファジーは栄養飢餓などにより誘導され、その制御の中心を担っているのがTORC1である。しかし、その上流でどのような分子機構が機能しているかは未知な部分が多い。我々は酵母細胞においてゲノムワイドなスクリーニングをすることにより、オートファジーが正常に誘導されるが、その終結に欠損をしめす変異体の同定に成功し、その原因遺伝子をTAG1と名付けた。Tag1タンパク質は液胞膜に局在し、その全長がその機能に必要であった。しかしながらTag1はTORC1の活性調節を介して機能するわけではないことが判明した。さらに我々は、TORC1の上流で働く新規に因子Pib2の同定にも成功した。Pib2はホスファチジル3リン酸結合タンパク質であり、それにより液胞膜に局在した。Pib2はTORC1と結合し、TORC1を液胞膜上にアンカーする役割も担っていた。その結合はグルタミン存在下に増強し、またPib2を含む複合体中にラジオアイソトープでラベルしたグルタミンは結合したがロイシンは結合しなかった。これらのことからPib2複合体はグルタミンを直接感知することで、TORC1の活性を調節する役割があることが示唆された。さらに哺乳類細胞において、TORC1がRhebによる活性化される機構として、リソソームに局在するTORC1がゴルジ体に局在するRhebとの間のオルガネラ間コンタクトが重要であるという新しい概念を提唱した。実際飢餓時にオートファジーが誘導される際、リソソームとゴルジ体間のコンタクトサイトの数が変動することを証明した。Atg13のリン酸化の検出法に困難があり、Tag1の機能解析がやや遅れている。Atg13の様々なタグの付加や、リン酸化特異的抗体を使用するなど、工夫することでTag1の機能解析を推進する。
心筋Sirt1の脂肪毒性抑制作用の解明と拡張障害型心不全への新規治療応用について

マウスへ飽和脂肪酸リッチな食事を与えたところ、心筋特異的Sirt1欠損マウス(Sirt1CKO)では拡張障害が強く観察された。SCD1の発現はSirt1CKOでは低く、膜リン脂質の飽和脂肪酸化(SFA/MUFA比が高い)が観察され、小胞体ストレスも強く誘導されていた。NMN投与は心筋Sirt1活性を高め、SCD1発現を上昇させた。さらに飽和脂肪酸によるSFA/MUFA比の上昇を低く抑え小胞体ストレスを軽減し、拡張障害も改善させた。NMNの効果はSirt1CKOでは観察されなかった。本研究は脂肪毒性に対する心筋Sirt1の抑制機構について探索し、脂肪毒性による拡張障害型心筋症に対するSirt1活性化剤Nicotinamide Mononucleotide:NMNの効果を調べることを目的としている。ラット初代培養心筋細胞においてパルミチン酸負荷時にSCD1の発現がSirt1依存性に誘導されることを確認した。またパルミチン酸負荷時に膜リン脂質の脂肪酸組成が飽和脂肪酸が多くなるように変化するが、Sirt1 knockdown細胞ではその変化が顕著であることを確認した。パルミチン酸負荷により小胞体ストレスが誘導され、小胞体ストレスが長期化することで細胞死が誘導されることを確認した。Sirt1活性化剤であるNicotinamide Mononucleotide: NMNの前処置によりパルミチン酸負荷による細胞死が抑制されることを確認し、機序として膜リン脂質の飽和脂肪酸化の抑制と小胞体ストレスの軽減作用を特定した。マウスの心腔内へ圧トランスデューサー付きカテーテルを挿入することで、EDPVRという拡張機能の指標を得る実験系を構築した。高脂肪食負荷をしたマウスでは心肥大・線維化・拡張障害が起こることを確認し、心筋細胞特異的Sirt1 knockoutマウスではより増悪することを確認した。またSirt1活性化剤NMNの投与により高脂肪食負荷に伴う心筋傷害が軽減できることを確認した。拡張障害をもたらす脂肪毒性心筋症に対して有効性を示した薬物治療はなく、本研究により脂肪毒性の新規機序の解明と共に新規治療法開発の可能性も示唆される。計画書通りに進展している。前年度はラット初代培養心筋細胞においてパルミチン酸負荷時にSirt1依存性にSCD1が誘導されることを確認したが、今年は心筋Sirt1が転写因子LXRを介してSCD1を誘導していることを、LXRαβknockdown細胞とLXRアゴニスト(T0901317)を用いて確認した。さらに高脂肪食負荷で引き起こされる拡張障害が心筋Sirt1欠損マウスでは増悪すること、LXRアゴニストを用いることで心筋Sirt1欠損マウスの拡張障害をレスキューできることを確認した。また、高脂肪食から高オリーブオイル食へ切り替えることで拡張障害が軽減されることも確認した。さらに高脂肪食負荷を行った心臓ではmicroRNA-195とmicroRNA-451が誘導されることで心筋AMPKのリン酸化低下とSirt1活性の低下が引き起こされるが、高オリーブオイル食を負荷した心臓ではこれらのmicroRNAが誘導されないことを確認した。心筋細胞へパルミチン酸を負荷すると細胞膜の脂肪酸組成が飽和脂肪酸へ傾くことにより小胞体ストレスが誘導され細胞死が起こることを前年度に確認していたが、その細胞死はIRE1経路のうちXBP1非依存性の経路(IRE1リン酸化経路)によって引き起こされることを確認した。さらにIRE1リン酸化経路がTRPCchannelの発現を上昇されることで心肥大と拡張障害を起こしていることも確認した。拡張障害をもたらす脂肪毒性心筋症に対して有効性を示した薬物療法はなく、本研究により脂肪毒性の新規機序の解明と共に新規治療法開発の可能性も示唆される。国内学会や国際学会で発表し本研究の有用性を示すとともに学術雑誌への投稿・論文化を予定している。循環器内科学1培養細胞を用いた実験が予定していた実験計画よりも順調に進み、試薬や細胞維持にかかるコストが少なくなった。2心筋細胞特異的Sirt1欠損マウスもメーティングが順調に進んだためエサ代や飼育にかかるコストが少なくなった。以上1と2が理由として挙げられる。心筋細胞特異的Sirt1欠損マウスで高脂肪食負荷に伴う心筋障害が増悪することが確認できた。培養細胞を用いた実験ではSirt1活性化剤であるNicotinamide Mononucleotide(NMN)と不飽和脂肪酸のオレイン酸の2つが脂肪毒性に対して有効であることが確認できた。よって、当初は次年度でSirt

1活性化剤NMNのマウスへの投与で高脂肪食負荷に伴う心筋障害が改善できるかを評価する予定であったが、それに加えてオレイン酸の同時投与でも改善効果が認められるかという実験を追加する予定である。
ドイツにおける自治体の「就労扶助」対策に関する実態調査

ドイツ連邦共和国では,社会扶助を受給している失業者への生活保障システムと就労援助システムの見直しが,急速に進んでいる。失業を減らすために,「活性化」を基本方針に,労働事務所(Arbeitsamt)と社会事務所(Sozialamt)を統合し,「ジョブ・センター」を創設する,また,失業扶助(Arbeitslosenhilfe)と社会扶助(Sozialhilfe)を統合し,「失業手当II」を創設することになった。我々は,ビーレフェルト,デューレン,フレンスブルク,ブレーメン,フランクフルトにおける就労扶助の実態を調査した。さらに,4つのモーツァルトプロジェクトに関してヒアリングをした。それを通じて,我々は,つぎの成果を得ることができた。(1)「失業扶助(Albeitslosenhilfe)」と「社会扶助(HLU)」との統合にむけた,具体的課題と先進事例を明らかにすることができた。「基礎所得」制度との関連も含め,給付水準,給付要件,実施給付に関わる論点も把握できた。(2)同時に,就労援助サービスにおける多様な展開を概観でき,労働事務所と社会事務所の統合にむけた手ががりと課題を把握できた。第1は,「協力義務」(Mitwirkungpflicht)が新たに運用上の前提として強調されていることの問題性であり,第2は,対人サービス(アセスメント,援助計画,ケースマネジメント)が各地で拡充され,ケースマネジメントに重点が置かれていることである。(3)ドイツ公私扶助連盟やノルドライン・ヴェストファーレン州は,基礎自治体での経験をもとに,就労援助サービスの質を高める努力をしている。ケァマネージャの教育カリキュラムが作られている。制度改革の規模はかってなく大きいが,重要なポイントを明らかにすることができた。ドイツ連邦共和国において、要扶助状態にある失業者(失業扶助及び生活扶助の受給者)を対象に、その人達の一般労働市場への再統合を目標として開始された、職業安定所と福祉事務所の協同プロジェクトである「モーツァルト(MoZArT)」プロジェクトに関して、ドイツ現地において以下の調査を行なった。1ドイツ連邦労働省(ベルリン及びボン)現在連邦労働省は、中央管理部門がベルリンに移り、各分野の担当部門はボンで業務を行なっている。そのため、ベルリンの企画部門と、ボンの失業扶助担当部門(「モーツァルト・プロジェクト」実施担当)の両方を訪問し、同プロジェクトの経緯と目標を調査した。また今後制度改革が論じられていく日程を確認した。同時に、前提となる失業扶助受給者に関わる基礎データと従来の先行研究成果を収集した。2ノルドライン・ヴェストファーレン(NRW)州労働省就労援助を積極的に援助してきた同州の担当者から、州としての取組みの成果と課題をヒアリングした。連邦とも基礎自治体とも異なる視点から、「ソーシャルエージェンシー」という新たな機構改革を打ち出しているNRW州だが、その基本は、金銭給付と現物給付以上に「サービス給付」の意義を重視していることであった。3ブレーメン市福祉事務所、ブレーメン労働局現在ドイツ各地30自治体で取り組まれている「モーツァルト・プロジェクト」だが、その具体例について、ブレーメン市の福祉事務所と職業安定所からヒアリングをした。ここでは、アセスメントを重視し、プロファイリング手法を取り入れて、早期の援助に力点をおいている。担い手として、民間の派遣会社が深く関わっている。4研究者との意見交換こうした実態を踏まえ、どのような理論的課題があるのか、ハネッシュ教授(ダルムシュタット福祉単科大学)、ライプフリード教授(ブレーメン大学社会政策センター)、エンゲルス所長(ISG研究所)と意見交換を行なった。ここから、Mitwirkung(社会扶助法第1条)及びサービス給付(社会法典1、第11条、13条)の再解釈がポイントであることが明らかになった。5なお、こうした行政担当者、研究者へのヒアリングに際しては、日本の現状と、我々の研究計画や目的意識を説明し、意見交換を行なった。

相手側に我々の意図を理解してもらうことができ、今後E-mailでの意見交換を継続し、次年度の再調査(2002年秋)に協力してもらうことも合意した。ドイツ連邦共和国では、社会扶助を受給している失業者への生活保障システムと就労援助システムの見直しが、急速に進んでいる。失業を減らすために、「活性化」を基本方針に、労働事務所(Arbeitsamt))と社会事務所(Sozialamt)を統合し、「ジョブ・センター」を創設する、また、失業扶助(Arbeitslosenhilfe)と社会扶助(Sozialhilfe)を統合し、「失業手当II」を創設することになった。我々は、ビーレフェルト、デューレン、フレンスブルク、ブレーメン、フランクフルトにおける就労扶助の実態を調査した。さらに、4つのモーツァルトプロジェクトに関してヒアリングをした。それを通じて、我々は、つぎの成果を得ることができた。(1)「失業扶助(Albeitslosenhilfe)」と「社会扶助(HLU)」との統合にむけた、具体的課題と先進事例を明らかにすることができた。「基礎所得」制度との関連も含め、給付水準、給付要件、実施主体など、金銭給付に関わる論点も把握できた。(2)同時に、就労援助サービスにおける多様な展開を概観でき、労働事務所と社会事務所の統合にむけた手がかりと課題を把握できた。第1は、「協力義務」(Mitwirkungpflicht)が新たに運用上の前提として強調されていることの問題性であり、第2は、対人サービス(アセスメント、援助計画、ケースマネジメント)が各地で拡充され、ケースマネジメントに重点が置かれていることである。(3)ドイツ公私扶助連盟やノルドライン・ヴェストファーレン州は、基礎自治体での経験をもとに、就労援助サービスの質を高める努力をしている。ケアマネージャの教育カリキュラムが作られている。制度改革の規模はかつてなく大きいが、重要なポイントを明らかにすることができた。
強直性脊椎炎病因蛋白質HLA-B27の受容体LILRB2を介した発症機構の解明

本研究の目的は、HLA-B27が通常のHLA-クラスIには見られない重鎖ホモダイマーとして細胞表面に発現することに着目し、受容体との認識機構解明、創薬および治療へとつながる分子レベルでの解析を目指すことである。本年度は、HLA-B27重鎖ホモダイマーの受容体として、これまでに複合体の構造解析に用いていたLILRB2に加え、近年新たに同定されたKIR3DL2を用いた構造解析を行った。KIR3DL2はHEK293細胞で細胞外ドメインを発現させた。KIR3DL2とHLA-B27重鎖ホモダイマーをモル比1:1で混合し、結晶化スクリーニングを試行した。今年度内に解析可能なデータは得られなかったが、今後も引き続き異常型ホモダイマーの受容体を介した分子認識機構の解明に向けて、構造解析を継続する予定である。また、HLA-B27、B27重鎖ホモダイマーを用いて、シグナル伝達制御可能な化合物スクリーニング系の確立に向けて、複数の手法を試みた。その結果、通常のHLA-B27分子は示差走査熱量分析法や示差走査蛍光測定法のいずれの手法でも分子の変性点が2点あるものの、測定条件の最適化を行えば、スクリーニングの系として用いることが可能であると予想された。また、HLA-B27重鎖ホモダイマーはペプチドを提示していないため、化合物がペプチド溝に結合することにより、ペプチドレパートリーが変化し、異常な免疫反応を誘導する可能性は低いと考えたが、DMSO含有条件下での適した測定系の確立には至らなかった。今後、細胞を用いたアッセイ系についても検討していく予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、B27が通常のHLAクラスIには見られない重鎖ホモダイマーとして細胞表面上に発現することに着目し、受容体との認識機構を解明し、創薬および治療へとつながる分子レベルでの解析を目指すことである。本年度は、これまでに初期実験により比較的均一な粒子構造が観察されたB27重鎖ホモダイマーの電子顕微鏡像の解析を進めたが、粒子像のクラス分けが困難であり、未だ3D構造を得られていない。現在、ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製のみ行ったサンプルで解析を進めているが、B27重鎖ホモダイマー蛋白質の調製条件などを検討する必要があると考えている。また、近年B27重鎖ホモダイマー特異的受容体としてLILRB2以外にNK細胞上に発現するKIR3DL2が注目されてきている。KIR3DL2を介したシグナルはTh17制御にかかわっていると考えられているため、LILRB2とともに、KIR3DL2も含めた相互作用を解析できるよう、KIR3DL2蛋白質調製に向けた準備を行った。また、表面プラスモン共鳴法を用いた低分子化合物スクリーニング系の確立に向けて、DMSO入りのBufferでの連続アッセイを試みたが、現在良い系がまだ確立できていない。条件や手法の検討を来年度も継続して行う予定である。今年度内に電子顕微鏡解析による分子の全体構造を得ることを目標としていたが、解析を進める中で、分子像の解析が困難となっている。全体分子像を得ることによって、ホモダイマー形成の分子配向や、表面に露出した部位を推定できることによって受容体結合部位同定に向けて重要な情報を得ることができるため、来年度も継続して解析を進める予定である。また、同時に、受容体としてLILRB2に加え新たにKIR3DL2を対象とした解析を研究内容に加え、分子間相互作用解析、相互作用を制御する低分子化合物のスクリーニングへと繋げる予定である。

KIR3DL2については、発現コンストラクトを完成させ、初期実験によりタンパク発現を確認することができているため、解析を行うことが十分可能であると考えている。今後は、本年度に引き続き電子顕微鏡解析による構造解析を進めるとともに、来年度の研究計画に挙げていた受容体とのシグナル制御可能な低分子化合物スクリーニングを行う予定である。B27重鎖ホモダイマータンパク質の性質上時間のかかる表面プラスモン共鳴法によるスクリーニングの系は本年度中に確立できなかったが、当研究室は多様な手法でのスクリーニングの系を他のタンパク質で用いているため、適した手法を探索していく。また、強直性脊椎炎の病態と関連の深いKIR3DL2を介するB27重鎖ホモダイマーシグナルの寄与の解明・制御を目指し、タンパク質レベルでの解析を進める。
歯を移動した際に歯根膜牽引側骨表面に形成される類骨の石灰化メカニズムの研究

[目的]歯を強制的に移動すると牽引側の歯根膜と代償性骨添加の生ずる圧迫側の歯槽骨の骨膜では、骨芽細胞が活性化され類骨が形成される。そしてここにカルシウム(Ca)とリン酸(Pi)が運ばれリン酸カルシウムの沈着を生じ、新たな骨が形成される。しかし、この骨形成時のCaやPiがいかなる形で輸送されるのか、またどのようにその濃度がコントロールされているのかなど不明な点が多い。今回、私たちはこのような視点から、まず歯根膜の細胞外free Ca^<2+>に着目し、Ca^<2+>のfluorescent indicatorであるFluo-3を歯を移動中のラットに投与し、その検出を試みた。[材料と方法]実験動物としては12-13週齢のWistar系雄性ラットを用いた。固定式装置により、上顎第一臼歯に約15gの矯正力を適用し、舌側移動を行った。移動7日後、ネンブタール麻酔下で開胸し左心室よりFluo-3を1mg投与した。約1分後にト殺、速やかに上顎骨を採取し、液体窒素下で凍結した。その後OCT compoundに包埋し、凍結ミクロトームで5μmの未固定非脱灰凍結切片を作製し蛍光顕微鏡で観察した。また一部の切片はカーボン蒸着し、electron probe micro-analysis(EPMA)を行った。[結果と考察]歯根膜全体においてCa^<2+>の存在を示す緑色の傾向がみられた。特に牽引側骨表面の類骨層と圧迫側歯槽骨骨膜側の類骨層に相当して強い蛍光がみられた。類骨のEPMAでもその他の歯根膜の領域と比較して強いCaのピークが示された。圧迫側では破骨細胞と骨とのinterfaceに相当すると思われる部位に一層の細い蛍光が観察された。切片を蒸留水で洗浄して観察すると、歯根膜全体から蛍光は失われ、またEPMAでも強いCaのピークはなかった。以上から、骨形成時の類骨ではfree Ca^<2+>の濃度が上昇しており骨形成部位ではCa濃度を押上げる機構が働いているのではないかと思われた。歯を移動した際のラット第一臼歯歯根膜の未固定非脱灰凍結切片を弱拡大で観察すると、歯槽骨や歯髄および歯根膜の牽引部と圧迫部が明瞭に識別できた。歯の移動7日間経過した牽引側では歯根膜腔は拡大し、歯根膜線維は牽引され歯槽骨表面ではトルイジンブルー染色でメタクロマジ-を示すかなりの厚さの類骨の形成が認められ、骨形成が活発に行われているものと思われた。また、アルカリ性ホスファターゼ活性も骨表面部位すなわち類骨層に相当する部位に認められた。走査電子顕微鏡で牽引側の歯根膜を観察すると、弱拡大では歯根膜線維のnetwork arrangementは観察されたが、その他細胞や血管の識別は難しかった。骨表面を拡大してみると類骨と思われる部位では骨に埋入する歯根膜線維(Sharpey′s fiber)と線維間基質が観察された。反射電子で観察すると石灰化骨基質と未石灰化基質との境界がかなり明瞭に区別できた。そこで、この骨に埋入する歯根膜線維と線維間

基質での元素分析を行った結果、骨表面に近い類骨ではPとCaの非常に高いピークとS, ClとKのピークがみられた。骨表面から離れるに従いPとCaのピークは低下傾向を示した。さらに離れると、Sと同程度の低いピークとなる。Sのピークの高さはほとんど変化はみられなかった。CaとPの線分析においても骨表面に向うにつれてピークの上昇傾向がみられた。従って、類骨内ではCaとPの濃度は一定でないこと、そして両者の濃度は石灰化骨基質に近付くにつれて上昇するものと思われ、歯の移動時の骨形成部位ではなんらかのCaやPの濃度を押し上げる働きがあるのではないかと思われる。以上から、歯の移動によって形成される類骨内ではCaとPの濃度は一定ではなく石灰化骨基質に近付くにつれて上昇傾向を示した。[目的]歯を矯正的に移動すると索引側の歯根膜と代償性骨添加の生ずる圧迫側の歯槽骨の骨膜では、骨芽細胞が活性化され類骨が形成される。そしてここにカルシウム(Ca)とリン酸(Pi)が運ばれリン酸カルシウムの沈着が生じ、新たな骨が形成される。しかし、この骨形成時のCaやPiがいかなる形で輸送されるのか、またどのようにその濃度がコントロールされているのかなど不明な点が多い。今回、私たちはこのような視点から、まず歯根膜の細胞外free Ca^<2+>に着目し、Ca^<2+>のfluorescent indicatorであるFluo-3を歯を移動中のラットに投与し、その検出を試みた。[材料と方法]実験動物としては12-13週齢のWistar系雄性ラットを用いた。固定式装置により、上顎第一臼歯に約15gの矯正力を適用し、舌側移動を行った。移動7日後、ネンブタール麻酔下で開胸し左心室よりFluo-3を1mg投与した。約1分後にト殺、速やかに上顎骨を採取し、液体窒素下で凍結した。その後OCT compoundに包埋し、凍結ミクロトームで5μmの未固定非脱灰凍結切片を作製し蛍光顕微鏡で観察した。また一部の切片はカーボン蒸着し、electron probe micro-analysis(EPMA)を行った。[結果と考察]歯根膜全体においてCa^<2+>の存在を示す緑色の蛍光がみられた。特に牽引側骨表面の類骨層と圧迫側歯槽骨骨膜側の類骨層に相当して強い蛍光がみられた。類骨のEPMAでもその他の歯根膜の領域と比較して強いCaのピークが示された。圧迫側では破骨細胞と骨とのinterfaceに相当すると思われる部位に一層の細い蛍光が観察された。切片を蒸留水で洗浄して観察すると、歯根膜全体から蛍光は失われ、またEPMAでも強いCaのピークはなかった。以上から、骨形成時の類骨ではfree Ca^<2+>の濃度が上昇しており骨形成部位ではCa濃度を押上げる機構が働いているのではないかと思われた。
高齢者用軽スポーツの運動量の分析

本研究は高齢者用軽スポーツ(グランドゴルフ、パタ-ゴルフ、ペタンク、フライングディスクゴルフ、ターゲットバ-ドゴルフ)の運動量を明らかにするため、60歳以上の高齢者を対象にして、消費カロリー、歩行数(以上カロリーカウンターで測定)、心拍数(ハートレートモニターで測定)及び主観的強度を測定した。結果を要約すると次のようになる。1.1週間の消費カロリー及び歩行数を測定した結果、1日ごとの運動量(運動のみの消費カロリー)の平均値は男が175214kcal、女が168222kcalの範囲にあり、一方歩数の平均値は男が63707750歩、女が72699788歩の範囲にあった。また、1日の運動量及び歩数の個人差はかなり大きいことが認められた。2.各軽スポーツの平均心拍数からみた運動強度は、パタンク=パタ-ゴルフ<フライングディスクゴルフ=グランドゴルフ<ターゲットバ-ドゴフルの順に高くなっていた。また、主観的強度は低く、各軽スポーツ間で明らかな差がみられなかった。3.各軽スポーツの運動量及び歩行数を30分間当たりに換算して比較してみた結果、パタ-ゴルフ<ペタンク<ターゲットバ-ドゴルフ<グランドゴフル<フライングディスクゴルグの順で運動量及び歩行数が大きくなっていた。また、1日の消費カロリーの中で占める各軽スポーツの運動量の比率は高齢者の生活様式と関連することが推察された。以上、本研究では軽スポーツの種目を一部変更して実施したが、高齢者用軽スポーツの運動量の相対差が明らかになった。
自閉症モデルラット脳における神経伝達物質異常の定量的・形態学的解析

自閉症は、対人関係の障害・コミュニケーションの障害・こだわりなどを特徴とする先天的な脳発達障害である。原因は不明であり、解剖学的な異常、即ち脳の形態の異常は見出されていない。一方、神経生物学的には、こだわり、対人関係の障害、同一性の保持などの行動上の特徴から、脳内の神経伝達物質セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリンの異常が指摘されてきた。これまでの研究で研究代表者らは、自閉症モデルラット脳でのセロトニン神経系の異常について報告してきた。今回の研究ではドーパミン、ノルアドレナリン解析を試みた。自閉症モデル動物では広く神経伝達物質の異常が存在する可能性がある。自閉症モデルラットを用い、脳内の神経伝達物質の異常を定量的・形態学的に解析する。研究代表者はこれまで、妊娠ラットにサリドマイドを投与する方法で自閉症モデルラットを作成し、セロトニン神経系の異常について報告してきた。本研究ではドーパミン、ノルアドレナリンの異常を明らかにする。さらに選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害剤投与下でのノルアドレナリン動態を解析する。自閉症モデルラット脳でセロトニンに加えてドーパミン、ノルアドレナリン異常を明らかにすることで、自閉症の行動異常の神経生物学的基盤を解明する。自閉症モデルラットを作成する。即ち、ヒト妊婦が妊娠中のある特定の時期(ヒトで妊娠20ー24日)にサリドマイドを内服すると、児に手足の奇形は起きないが自閉症が高率に発症する、という事象を、妊娠ラットで忠実に再現した方法である(ヒト妊娠20ー24日はラットでは妊娠9日に相当)。具体的には妊娠9日目の妊娠ラットにサリドマイド(500mg/kg)を内服させ妊娠を継続させ、胎仔ラットまたは生まれた仔ラットを用いる。3年計画のうちの初年度である今年度は、予備実験として、自閉症モデルラット脳及び正常ラット脳各部位における神経伝達物質の、発達に伴う発現推移の比較(定量的及び免疫組織化学的手法で)を明らかにする。具体的には、まず発達段階の脳各部位を取り出し、発達に伴うドーパミン、ノルアドレナリン含量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定した。いずれも検出感度が十分あり、今後、部位別、グループ別の統計的検討を今後行う。概ね順調と言える。未だ予備実験ではあるが、発達に伴うドーパミン、ノルアドレナリン含量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定したところ、いずれも検出感度が十分あり、今後、部位別、グループ別の統計的検討を今後行うことの見通しが立ったためである。今後統計的検討を行う。ヒト妊婦が妊娠中のある特定の時期(ヒトで妊娠20ー24日)にサリドマイドを内服すると、児に手足の奇形は起きないが自閉症が高率に発症する、という事象を、妊娠ラットで忠実に再現した方法である(ヒト妊娠20ー24日はラットでは妊娠9日に相当)。3年計画のうち初年度、及び2年目は、自閉症モデルラット脳及び正常ラット脳各部位におけるドーパミン・ノルアドレナリンの、発達に伴う発現推移の比較(定量的及び免疫組織化学的手法で)を明らかにしてきた。具体的には、発達に伴う発現推移の比較(定量的及び免疫組織化学的手法で)、即ち脳各部位及び発達に伴うドーパミン、ノルアドレナリン含量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定するとともに、形態学的にもチロシンハイドロキシラーゼ染色(ドーパミン検出)、ドーパミンベータハイドロキシラーゼ染色(ノルアドレナリン検出)を行った。現在再検中である。概ね順調と言える。発達に伴う発現推移の比較(定量的及び免疫組織化学的手法で)、即ち脳各部位及び発達に伴うドーパミン、ノルアドレナリン含量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定するとともに、形態学的にもチロシンハイドロキシラーゼ染色(ドーパミン検出)、ドーパミンベータハイドロキシラーゼ染色(ノルアドレナリン検出)を行った。現在再検中である。自閉症モデルラットは従来通りの方法で作成した。即ち妊娠9日目の妊娠ラットにサリドマイド(500mg/kg)を内服させ、胎仔、または生まれた仔ラット(生後50日)を用いた。

研究代表者らの自閉症モデルラット作成は国内外でも多く引用されている(Drug Discovery Today, 2; 93: 2005, Neuroscience 142 ; 267: 2006, Neurosci Res, 57; 289: 2007)。妊娠9日目を選んだのは、ヒトでのサリドマイドによる自閉症はヒト受精20-24日目=ラット妊娠9日目=に内服した妊婦にのみ発症し、これを再現した自閉症モデルラットではやはり妊娠9日目に投与した群でのみ、脳海馬セロトニンが上昇していたためである。またサリドマイドの投与量は既報に基づく量を用いた。コントロールとして、溶媒(5%アラビアゴム)のみ同様に内服させた妊娠ラットからの胎仔、または生まれた仔ラットを用いる。3年目の最終年度は1年目2年目の追試験を行い、自閉症モデル動物では広く神経伝達物質の異常が存在する可能性があることが示唆されたが、最終的な結論を得るためにはさらに追試験を実施している。確定的データが得られた段階で学会発表、論文報告を行う。自閉症は、対人関係の障害・コミュニケーションの障害・こだわりなどを特徴とする先天的な脳発達障害である。原因は不明であり、解剖学的な異常、即ち脳の形態の異常は見出されていない。一方、神経生物学的には、こだわり、対人関係の障害、同一性の保持などの行動上の特徴から、脳内の神経伝達物質セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリンの異常が指摘されてきた。これまでの研究で研究代表者らは、自閉症モデルラット脳でのセロトニン神経系の異常について報告してきた。今回の研究ではドーパミン、ノルアドレナリン解析を試みた。自閉症モデル動物では広く神経伝達物質の異常が存在する可能性がある。初年度の延長として、発達に伴うドーパミン、ノルアドレナリン含量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による測定を継続する。今後、部位別、グループ別の統計的検討を今後行う。脳幹ノルアドレナリン神経起始核(=青斑核)からの神経軸索投射パターンや、選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害剤(SNRI)投与下での変動(担当:成田、江藤)を行う。SNRIはシナプス間隙でのノルアドレナリンの再取り込みを阻害することで、シナプス間隙のノルアドレナリン濃度を高めるため臨床でしばしば用いられている。SNRIはノルアドレナリンだけでなくドーパミンの再取り込みにも影響する。自閉症におけるSNRIのノルアドレナリン濃度への影響を調べるため、正常及び自閉症モデルラットにおいてSNRI(1.5mg/kg=ヒト投与量)を投与し脳各部位でのドーパミン、ノルアドレナリン濃度をHPLCで測定する。最終年度は、発達に伴う発現推移の比較(定量的及び免疫組織化学的手法で)、即ち脳各部位及び発達に伴うドーパミン、ノルアドレナリン含量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定するとともに、形態学的にもチロシンハイドロキシラーゼ染色(ドーパミン検出)、ドーパミンベータハイドロキシラーゼ染色(ノルアドレナリン検出)を再度検討、統計処理を行う。
抗がん剤のゲノム薬理学研究

がん化学療法について適切な集団・薬剤を選択し、ゲノム網羅的関連解析(GWAS)を行い、薬剤反応性や薬物有害反応に関連する遺伝素因を同定し、その情報を用いて化学療法施行前に薬物有害反応のリスクを予測するシステムの開発を行うことを目的とした。H23年度の研究実施計画としては、サンプルの収集、遺伝子型解析データの取得、得られたデータのQC(品質検査)処理、薬物有害反応に関する臨床情報の収集とクリーニング、関連解析の着手とした。バイオバンクジャパンのサンプルから抗がん剤投与後重篤な副作用(グレード3以上)を示した805症例と、副作用を示さなかった4,804症例を用いて解析を行った。これらの症例について更に投与された主な薬剤により群分けし733,202SNPsを搭載したイルミナOmniExpressBeadChipによりタイピングを行った。ゲノム網羅的な有意水準(Fisher正確検定P値<5x10^<-8>)で有害反応と相関するSNPは同定することができなかったが、10^<-6>,10^<-7>レベルの複数の薬剤反応関連候補領域を同定することができた。これらは将来別のサンプルセットを用いた検証実験を行う際の探索的基本情報になり得る。このようなGWASによる解析は、薬剤に対する反応性や薬剤による副作用の誘発等、複合表現型に関わる遺伝的変異のリストを提供し、それらは将来、特定の薬剤に対するリスクを持つ患者を同定する予測システムに活用可能である。治療に先立ち、薬効や薬物毒性を評価する予測システムは、がん患者の生活の質(クオリティー・オブ・ライフ、QOL)を向上させるし、個々のがん患者への投与量を明確にできれば、医療費負担も軽減できるであろう。薬効に関わる新たな遺伝子もゲノム網羅的解析により同定されるであろうし、それらの研究成果は薬剤反応性や薬剤による副作用の機能解明にも役立つと考えられる。