hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
各種蛋白分解酵素処理試料からの遺伝標識の検索とその法医学的応用

本研究では各種の蛋白分解酵素で処理した血清(あるいは血漿)を用い、遺伝標識を検索したが、同時に電気泳動法や等電点電気泳動法の改良、およびエレクトロブロッティングにおける緩衝液組成の比較も行った。また必要に応じ、SDS電気泳動法も併用した。平成4年度から平成5年度に至る2年間において得た成果は次の通りである。1.補体C3型において、日本人から新たに3種類の変異型を検出した。これらの変異はβ鎖上のアミノ酸の置換に起因する可能性が示唆された。そのうちの1変異型(F02)はArgがGlnに置換していることが判明したが、これについてはDNAレベルでの研究も行った(論文投稿中)。2.補体C4型について、判定法の詳しい条件は論文(印刷中)に記載したが、血漿、血清を問わず、比較的変性の認められる試料でも、これらをカルボキシペプチダーゼBおよびシアリダーゼで同時に処理することにより、型判定は可能であった。さらにC4型検査は法医学の親子鑑定のみならず、臨床医学における病因研究にも応用できることがわかった。すなわち、IgA腎症、天疱瘡、水泡性類天疱瘡および全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患の発症には、C4*AQ0遺伝子が大きく関与することが明らかになった。3.アンチトリプシンIII型については、判定法、変異型および分類法を、論文(印刷中)および学会で報告した。4.その他の血清蛋白遺伝標識(補体HF型、同BF型、同Cls型等)についても新しい知見を得ているが、酵素分解フラグメントの遺伝性について今後検討したい。5.法医学的応用の1つとして、血痕からの遺伝標識判定を試みた。血痕浸出液をそのまま試料に用いるとヘモグロビンの混在が型判定に大きく影響を及ぼすが、血痕浸出液をフロリジルと蛋白分解酵素とで処理すると、TF型やHP型が明瞭に判定できることが示唆された(投稿準備中)。平成4年度は補体蛋白質のC3型,C4型およびHF型,そして血液凝固線溶系因子のATIII型の解析を行った。C3型については,日本人をはじめとする蒙古系人種において,変異型の出現頻度は低いにもかかわらず,種類の多いことが特徴的である。今回も我々は通常の電気泳動法使用して,日本人から新たに2種類のC3変異型を検出した。これらの変異はC3分子のどの部分の変化で生じているかを調べるために,蛋白質解酵素処理,SDS電気泳動法およびエレクトロブロッティング法を用いて検索しているが,β鎖上のアミノ酸置換に起因している可能性が示唆された。C4型については,試料の種類(血清,EDTA血漿,ヘパリン血漿,クエン酸ナトリウム血漿およびEDTAを加えた血清)と,それらを処理する酸素の種類を検討した。その結果,EDTA血漿またはヘパリン血漿をカルボキシペプチターゼCおよびシアリダーゼで同時に処理し,電気泳動を行ったのち免疫固定法でC4パターンを観察すると,C4アロタイプは明確に分類できることがわかった。また保存状態の良い血清からでもアロタイプ分類は可能であった。これらの知見は1992年10月の日本法医学会中四国地方会で発表した。現在,C4変異型をパパインやトリプシンで処理した試料を用い,SDS電気泳動法とエレクトロブロッティング法とで検出する方法を検討している。HF型については,血清中のHF蛋白と抗HF抗体との複合物から変異型を検出する方法を試みた。

本法によるデータと従来の等電点電気泳動法によるデータとは相違のみられる点があるので,さらに検討を続けている。ATIII型に関しては,シアリダーゼ処理試料を用いることにより数種類の変異型が検出できた。この成果は現在論文にまとめているが,第3回日本臨床化学会四国支部会総会でも発表を予定している。本年度は、これまでに得た成果について更に検討を加え、学会発表を行い論文にまとめることを主に行ったが、各種の蛋白分解酵素で処理した血清(あるいは血漿)を用いた遺伝標識の検索も引き続き行った。また、電気泳動およびエレクトロブロッティグにおける緩衝液組成を比較するとともに、SDS電気泳動法も併用した。補体C4型判定法の詳しい条件は論文(印刷中)に記載したが、カルボキシペプチダーゼBおよびシアリダーゼで同時に処理した場合、血漿、血清を問わず、比較的変性の認められる試料からも型判定は可能であった。さらにC4型検査は、法医学の親子鑑定のみならず、臨床医学における病因研究にも応用が可能であることがわかった。本研究では、IgA腎症、天疱瘡、水泡性類天疱瘡および全身性エリテマトーデスの各患者試料を検査したところ、これらの自己免疫疾患の発症にはC4*AQ0遺伝子が大きく関与していることが明らかになった。この知見は前記の判定法とともに、論文(印刷中)および学会で発表した。次に、前年度に得たアンチトリプシンIII型の判定法、変異型および分類法について、更に検討を加え、論文(印刷中)および学会で報告した。補体C3型に関しても幾つかの知見を得たが、日本人における新しい変異型F02はArgがGlnに置換していることが判明した。これについてはDNAレベルの研究も行い、論文にまとめた(投稿中)。その他、補体HF型、同BF型、同Cls型等についても新しい知見を得ている。法医学的応用の1つとして、血痕からの遺伝標識判定を試みた。血痕浸出液をそのまま試料に用いる場合、ヘモグロビンの混在が型判定に大きく影響を及ぼすが、血痕浸出液をフロリジルと蛋白分解酵素とで処理すると、TF型やHP型が明瞭に判定できることが示唆された。これについては更に検討を加え、論文報告する予定である。
細胞障害と薬剤耐性に関与するアンチオキシダントの酸化的ストレスによる発現誘導

「目的」生体が細胞障害を防御したり、癌細胞が抗ガン剤に対し耐性を獲得する機構については幾つかの機序が考えられるが、特にグルタチオン(GSH)とその代謝産物の関与が示唆されている。本年度は、ヒト癌細胞株を用い、シスプラチン(CDDP)の解毒にGSHがいかに関与するかを代謝産物の細胞外への輸送とGSHの合成酵素であるγ-グルタミルシステイン合成酵素(γ-GCS)やGSH関連酵素の発現の面から検討した。「方法と結果」ヒト癌細胞株として卵巣癌細胞(A2780)とその耐性株(A2780DDP)及びヒト大腸癌細胞(HCT8)とその耐性株(HCT8DDP)を用いた。GSH濃度は酵素リサイクル法により測定した。CDDPの細胞内外での動態を明らかにするために、HPLCを用いた分離と原子吸光によるCDDPの定量を行った。輸送実験は、^3H-Glycineを用いて細胞外へ排出された代謝産物の放射活性を測定した。CDDPは、1時間の曝路でもGSHと1:2(モル比)の結合体を作り、細胞外へもこの結合様式で輸送された。その輸送速度は、耐性株で増加していた。更に、薬剤耐性癌細胞では、GSH濃度の増加、γ-GCS活性の増加とmRNA発現の増加を認めた。同時に、グルタチオンS-トランスフェラーゼとグルタチオンペルオキシダーゼの増加が認められた。「結論」CDDP耐性には、GSH合成速度の上昇、速やかな細胞内でのCDDP-GSH結合体の形成と、同結合体の細胞外への輸送が関与していると考えられた。細胞障害を引き起こす酸化的ストレスに対する細胞内防御機構を、特にグルタチオンとそれに関連する酵素を中心に検討した。血管内皮細胞を用いた実験では、細胞内グルタチオン濃度をグルタチオンエステル添加で上昇させたりリブオニンスルフォキシミン添加で減少させた後にt-butylhydroperoxideを投与して観察すると、グルタチオン濃度とMTTアッセイ法による細胞障害度に負の相関が認められた。更に、この酸化的ストレスによってグルタチオン合成の律速酵素である、γグルタミルシステイン合成酵素(γGCS)の活性上昇が数時間で認められた。この活性上昇は、γ-GCSmRNAの発現と酵素蛋白の合成に引き続いて生じることが明かとなった。ヒト卵巣ガン細胞、大腸ガン細胞、肺ガン細胞などの培養細胞でシスプラチン耐性細胞においてどのような機構が薬剤耐性に関与しているかを検討した。これらのシスプラチン耐性細胞では、いずれも細胞内グルタチオン濃度が上昇していた。γ-GCS活性、酵素蛋白量、mRNAの発現は耐性細胞で高かった。一方、スーパーオキシドジスムターゼ活性、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性、グルタチオン過酸化酵素活性、グルタチオン還元酵素活性には変化は認められなかった。次にシスプラチンがどのようにして細胞内で代謝されているかを検討すると、この薬剤は細胞内へ取り込まれた後に、グルタチオンと結合し、その後に細胞外へ輸送されることが明かとなった。この輸送系はエネルギー依存性であった。シスプラチン耐性細胞ではどの細胞でもグルタチオンと結合した細胞外への輸送活性が上昇していた。これらのことから、ガン細胞がシスプラチン耐性を獲得する機序にグルタチオンの合成増加と細胞外への輸送活性の上昇が関わっていることが明らかとなった。現在γ-GCS遺伝子の発現調節機構を解明しているところである。「目的」生体が細胞障害を防御したり、癌細胞が抗ガン剤に対し耐性を獲得する機構については幾つかの機序が考えられているが、特にグルタチオン(GSH)とその代謝産物の関与が示唆されている。本年度は、ヒト癌細胞株を用い、シスプラチン(CDDP)の解毒にGSHがいかに関与するかを代謝産物の細胞外への輸送とGSHの合成酵素であるg-

グルタミルシステイン合成酵素(g-GCS)やGSH関連酵素の発現の面から検討した。「方法と結果」ヒト癌細胞株として卵巣癌細胞(A2780)とその耐性株(A2780DDP)及びヒト大腸癌細胞(HCT8)とその耐性株(HCT8DDP)を用いた。GSH濃度は酵素リサイクル法により測定した。CDDPの細胞内外での動態を明らかにするために、HPLCを用いた分離と原子吸光によるCDDPの定量を行った。輸送実験は、3H-Glycineを用いて細胞外へ排出された代謝産物の放射活性を測定した。CDDPは、1時間の曝露でもGSHと1:2(モル比)の結合体を作り、細胞外へもこの結合様式で輸送された。その輸送速度は、耐性株で増加していた。更に、薬剤耐性癌細胞では、GSH濃度の増加、g-GCS活性の増加とmRNA発現の増加を認めた。同様に、グルタチオンS-トランスフェラーゼとグルタチオンペルオキシダーゼの増加が認められた。「結論」CDDP耐性には、GSH合成速度の上昇、速やかな細胞内でのCDDP-GSH結合体の形成と、同結合体の細胞外への輸送が関与していると考えられた。
電気化学ツールによるシリコンのナノ・マイクロ構造微細加工

電気化学的に生成する多孔質シリコンの構造発現を統一的に把握するために諸条件下で生成する微細構造を詳細に検討し、以下の成果を得た。(1)マクロ孔形成は独立した事象として考えるのではなく、他の構造を含んだ多孔質構造形成として統一的な視点で取り扱わねばならないことを明らかにした。(2)ルゲート型多孔質シリコンのセンサー応用の可能性を示し、電気化学手法による微細構造制御による光学特性の向上の可能性を示した。電気化学手法を多孔質シリコンの微細構造形成ツールとして一般化するために、マクロ孔形成時の不均一孔形成と多孔層積層構造における界面不均一化について、現象の把握と解析モデルの開発に取り組んだ。【配列マクロ孔形成条件の把握と最適化】孔内への金属充填挙動解析において良好な結果を得た界面成長を記述する結合写像格子モデルにより、プリェッチピット配列からのシリコンの陽極溶解挙動を解析した。シリコン内の電位分布を考慮したモデルにより多孔質シリコンで見られる孔深さ方向における孔径の均一性を模擬することに成功した。しかし、電解初期におけるエッチピットからの孔径拡大挙動を模擬するに至っておらず、フッ化物イオンの濃度分布を考慮したモデルへの改良が必要である。さらに、同一ピット径で同一配列間隔のパターンから始めても、陽極酸化により形成される孔構造が使用する溶液種類に依存することを実験により明らかにした。サブミクロンサイズの中間孔径を有する多孔質シリコンの形状を制御することによって、分枝構造と平滑構造が実現し、これらの構造を鋳型として金を電析して得られる金微細構造が良好な表面増強ラマン散乱特性を示すことを見いだした。【積層構造形成条件の把握と最適化】多孔度を正弦波変調したルゲート型多孔質シリコンにおいて、二層積層構造と各積層構造を線形結合して一層とした構造を作製し、それぞれの構造が同一の反射スペクトル特性を示すことを確認した。これらの構造を用いて、アルコール蒸気の検知を行い、二層成分を線形結合した一層構造が、蒸気と両成分が最表面から接しているために、より早い検出時間を示し、良好なガスセンサー特性を持つという結果を得た。電気化学手法を多孔質シリコンの微細構造形成ツールとして一般化するために、マクロ孔形成時の不均一孔形成における溶液中成分の影響と、ルゲート型多孔層積層構造における構造制御による光学特性の安定化について、現象の把握と解析モデルの開発に取り組んだ。【配列マクロ孔形成条件の把握と最適化】配列マクロ孔形成において、また、溶液種に含まれるアルコールについては、これまで、溶液の表面エネルギーを下げて陽極酸化時における水素気泡発生による表面や孔閉塞を防ぐという物理作用を担うものと考えられてきた。本年度行った研究において、溶液中に存在するアルコールはシリコンの溶解、孔形成挙動に直接関係することを見いだした。また、アルコールの炭素数が低いほど、安定な孔形成を阻害することが分かった。その作用機構については今後の課題となる。孔形成をモデル化するために、界面成長を記述する結合写像格子モデルにより、プリエッチピット配列からのシリコンの陽極溶解挙動の解析に前年度に引き続いて取り組んだ。シリコン内の電位分布を考慮したモデルにより多孔質シリコンで見られる孔深さ方向における孔径の均一性を模擬することができた。しかし、実験的に得られる挙動を模擬するには至っておらず、さらに解析法の改良を図っている。【積層構造形成条件の把握と最適化】多孔度を正弦波変調したルゲート型多孔質シリコンにおいて、二層積層構造での反射スペクトル特性の向上を図るために、相関に整合層を導入することによって、反射スペクトル中に現れる干渉によるフリンジを大幅に低減することが可能となった。また、ガウス関数でアポダイゼーションを掛けて反射スペクトルの向上を図ったが、可視光領域での強い吸収のために期待する結果が得られなかった。電気化学手法を用いると、これらの複雑な構造制御が電流を制御することによって容易に実現することを確認した。電気化学手法を多孔質シリコンの微細構造形成ツールとして一般化するために、マクロ孔形成時の不均一孔形成ならびにその他の孔径を持つ多孔質シリコンの構造形成における溶液中成分の影響と、ルゲート型多孔層積層構造における塩基性環境での化学安定化について、現象の把握と制御法の開発に取り組んだ。【配列マクロ孔形成条件の把握と最適化】と【ミクロ・メソ孔多孔質シリコン形成の寸法精度向上】について、溶液種に含まれる有機溶媒が安定なマクロ孔形成に大きな影響を及ぼすことを見いだしている。この挙動についてさらに検討し、フッ酸濃度と電流密度が、スケルトン構造(マクロ孔様構造にミクロ孔が充填した構造)、均一ミクロ孔構造、マクロ孔構造に分類される孔構造の出現を決めることを見いだした。また、添加する有機溶媒によって、各構造間の遷移条件が異なることが判明した。本研究を通じて、マクロ孔形成は独立した事象として考えるのではなく、ミクロ孔形成を含んだ多孔質構造形成として統一的な視点で取り扱わねばならないことが明らかになった。

マクロ孔形成機構解明に向けて、マクロ孔様構造であるスケルトン構造形成過程を結合写像格子モデルによって解析し、ミクロ多孔質層とスケルトン構造の間の界面成長挙動をほぼ再現することができた。【積層構造形成条件の把握と最適化】について、多孔度を正弦波変調したルゲート型構造多孔質シリコンの構造形成については、これまでの研究によって各種構造制御と光学特性の向上が可能となった。各種環境におけるセンサーへの応用の視点から、弱塩基性環境下の化学安定性の向上に取り組んだ。アセチレン蒸気環境中で中温熱処理することにより、表面に炭化水素基を導入した後に、ウンデセン酸処理した親水性表面処理により、塩基性であるアミン類蒸気環境下で良好な安定性が得られ、表面処理がセンサー応用時に有力な安定化手法であることを示した。マクロ孔生成については、これまでに注目されていなかった溶液中の有機溶媒の寄与が大きいことを見いだし、安定なマクロ孔生成には炭素数の大きいアルコールの存在が有効であることを発見している。多重型積層構造をもつ多孔質シリコンの構造制御による光学特性の最適化に成功している。一方、孔構造形成過程のモデル化においては、当初の予想以上に難しい課題であることが明らかになり、一層の努力が必要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。メソ孔をもつ多孔質シリコンからなる積層ルゲート構造について、作製時の最適化はほぼ終えたので、光学センサーへの応用時に避けることができない積層構造の化学安定性に取り組む。配列マクロ孔形成時の構造安定性に対して溶液中に含まれるアルコール等の有機溶媒の効果が大きいことが判明し、こちらが安定多孔質構造の作製に重要であることを認識した。そのために、当初取り上げる予定であったマスクパターン下部での形状追従性について保留とし、有機溶媒の効果をミクロ・メソ孔からなる多孔質シリコンでも検討することを優先する。孔形成過程のシミュレーションは重要課題であるが、問題点が多くはかどっていない。糸口を見いだせるように最大限努力する。
アラインを用いた芳香族縮合複素環の多様性指向型合成

本年度は、アライン二分子と元素間二重結合種(カルボニル化合物・ニトロソ化合物・イミン)一分子とのカップリング反応を新規開発し、それらを機軸として多様な芳香族縮合複素環を合成することを目的とした。まず、既に開発に成功しているアラインとアルデヒドとの2:1カップリングに関する検討を行い、これまでに検討していない種々のアラインやアルデヒドへと適用することで、反応の官能基許容性を明らかにすると同時に、基質適用範囲を拡張することに成功した。特に、アルデヒドの構造は反応進行に決定的な影響を及ぼし、立体的に嵩高い程、また、電子供与性置換基(アルコキシ基・アルキル基)をより多く有する程、高収率で生成物であるキサンテンを与えることを明らかにした。例えば、2-イソプロポキシ-1-ナフトアルデヒドはベンザインとの反応で86%の高収率で生成物を与えた。また、ヒドロキシ基やスタニル基のような比較的反応性の高い官能基を持つ基質を用いても、それら官能基を損なうことなく反応は進行し、本カップリングの官能基許容性の高さを明らかにできた。さらに、様々な置換アラインを用いることで一群の多置換キサンテン類の構造多様性を獲得するとともに、非対称アラインを用いた反応により本カップリングが確かに系中で発生したアラインを経由していることも実証した。その他、ニトロソ化合物やイミンを用いて上記同様の2:1型カップリング反応の開発も試みた。アルデヒドとは異なり複雑な混合物が生じ、現時点では目的を達成するには至っていない。アライン(ベンザイン)は反応性に富む二官能性の活性種であるうえ、医農薬・液晶性分子等に代表される機能性π共役分子の基幹構造である芳香族骨格を導入できる合成素子であり、その有機合成への利用は極めて魅力的である。本研究では、アラインを反応母体とした新規多成分連結反応を開発し、多様な芳香族縮合複素環を創製することを目的とした。具体的には、アラインの高い求電子性に基づき、中性求核剤との作用で生ずる双性イオンのアニオン部とカチオン部とを任意の第三成分(求電子剤)で連結することで、標的複素環骨格の構築を計画した。求核剤、求電子剤の組み合わせを種々検討した結果、求核剤に炭素-窒素二重結合種の芳香族アルドイミン、求電子剤に二酸化炭素を用いると、期待したアラインとの三成分連結反応が進行し、ベンゾオキサジン骨格を一段階、高収率で構築することに成功した。イミンの芳香族部には、4-メトキシフェニル基のような電子豊富なもの、および1-ナフチル基、メシチル基のような立体的に嵩高いものを、イミン窒素上には、第一級および第二級アルキル基をもつものを用いた際に三成分連結反応は円滑に進行し、極めて広範なイミンが利用可能であることを明らかにした。また、アラインに関してもその適用範囲は広く、特に、三重結合部位の隣接位に導入した置換基の電子的・立体的効果により、イミン付加の位置選択性を高度に制御できることも見つけた。反応の効率的進行に必要な二酸化炭素圧は一気圧であり、反応系を二酸化炭素雰囲気にするだけで充分であった。
血球細胞における酸化ストレス応答制御機構の解析

一般に、骨髄造血組織は異物による酸化ストレスに脆弱であることが知られるが、酸化ストレスによる造血系破綻の実態やその分子機構は明らかではない。本研究では、骨髄細胞ではストレスタンパクの低応答性が酸化ストレスに対する高感受性の原因となっているという作業仮説を立て、これを検証することを目的とした。血球由来細胞のモデルとして数種の白血病細胞株とマウス骨髄細胞を用い、これらの細胞に対するベンゼン代謝物(ヒドロキノンおよびベンゾキノン)の細胞毒性を非血球由来細胞と比較したところ、用いたいずれの血球由来細胞でも非血球由来細胞と比べ顕著に認められた。代表的なストレス応答タンパクであるヘムオキシゲナーゼー1(HO-1)およびNAD(P)H-キノン酸化還元酵素の遺伝子発現を検討したところ、血球由来細胞におけるベンゼン代謝物のこれら遺伝子誘導作用は、非血球由来細胞に比較し極めて限定的に認められた。ストレス応答タンパクの遺伝子誘導において中心的に機能する転写因子Nrf2とそのシスエレメントである抗酸化剤応答配列(ARE)の応答性を検討したところ、血球由来細胞ではNrf2の核移行やARE転写活1生化の障害が生じていることが明らかになった。従って、血球由来細胞のベンゼン代謝物に対する高感受性はNrf2-AREの低感受性に基づくストレス応答タンパクの低応答性が原因であることが示唆された。次に、抗がん剤の骨髄毒性と酸化ストレスの関連性について検討を進めた。5-フルオロウラシル(5-FU)は骨髄毒性を示す典型的な抗がん剤である。5-FUはin vivoおよびin vitroにおいてマウス骨髄細胞のHO-1を誘導した。また、5-FUはin vitroで骨髄細胞に活性酸素を発生させた。さらに、5-FUのHO-1誘導と骨髄毒性は並行して生じたことから、5-FUによる骨髄毒性には酸化ストレスが関与することが示唆された。血球由来細胞のモデルとして、白血病細胞株HL-60、K562およびTHP-1細胞とBALB/cマウス大腿骨より採取した骨髄細胞を、非血球由来細胞のモデルとしてHepG2およびWI-38細胞を用いた。これらの細胞に対するベンゼン代謝物(ヒドロキノンおよびベンゾキノン)の細胞毒性は、用いたいずれの血球由来細胞でも非血球由来細胞と比べ顕著に認められた。代表的なストレス応答タンパクであるヘムオキシゲナーゼ-1(H0-1)およびNAD(P)H-キノン酸化還元酵素(NQ01)の遺伝子発現を検討したところ、血球由来細胞におけるベンゼン代謝物のこれら遺伝子誘導作用は、非血球由来細胞に比較し極めて限定的に認められた。ストレス応答タンパクの遺伝子誘導において中心的に機能する転写因子Nrf2とそのシスエレメントである抗酸化剤応答配列(ARE)の応答性を検討したところ、血球由来細胞ではNrf2の核移行やARE転写活性化の障害が生じていることが明らかになった。

血球由来細胞のモデルとして数種の白血病細胞株とマウス骨髄細胞を用い、これらの細胞に対するベンゼン代謝物(ヒドロキノンおよびベンゾキノン)の細胞毒性を非血球由来細胞と比較したところ、用いたいずれの血球由来細胞でも非血球由来細胞と比べ顕著に認められた。代表的なストレス応答タンパクであるヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)およびNAD(P)H-キノン酸化還元酵素の遺伝子発現を検討したところ、血球由来細胞におけるベンゼン代謝物のこれら遺伝子誘導作用は、非血球由来細胞に比較し極めて限定的に認められた。ストレス応答タンパクの遺伝子誘導において中心的に機能する転写因子Nrf2とそのシスエレメントである抗酸化剤応答配列(ARE)の応答性を検討したところ、血球由来細胞ではNrf2の核移行やARE転写活性化の障害が生じていることが明らかになった。従って、血球由来細胞のベンゼン代謝物に対する高感受性はNrf2-AREの低感受性に基づくストレス応答タンパクの低応答性が原因であることが示唆された。次に、抗がん剤の骨髄毒性と酸化ストレスの関連性について検討を進めた。5-フルオロウラシル(5-FU)は骨髄毒性を示す典型的な抗がん剤である。5-FUはin vivoおよびin vitroにおいてマウス骨髄細胞のHO-1を誘導した。また、5-FUはin vitroで骨髄細胞に活性酸素を発生させた。さらに、5-FUのHO-1誘導と骨髄毒性は並行して生じたことから、5-FUによる骨髄毒性には酸化ストレスが関与することが示唆された。
ゼオライト骨格外アルミニウムに起因する強い固体酸の発現制御とその触媒作用

ZSM-5型ゼオライトを様々なアンモニア水で処理したところ、骨格外Alの分布や濃度を制御することができ、ZSM-5の酸強度分布を変化させることに成功した。アンモニア水の温度や処理温度によって得られるZSM-5の酸性質が変化することがわかった。さらにこのように処理したZSM-5では強い酸点が多く存在するため、アルカンのクラッキング活性を増大させることができた。一方、酸溶液によって処理したZSM-5でも強い酸点が増大するが、アンモニア水によって処理した場合とは異なり、クラッキング活性は低下していた。このように酸処理と塩基性処理では、ZSM-5の酸点に引き起こされる効果が全く異なることを見出した。アンモニア脱離法によるゼオライトの酸性質の定量的測定から、塩基処理によって生成する強い酸点は、骨格内Alと骨格外Alが相互作用することによって発現しているとういう新規な酸点構造のモデルを提案した。またアンモニアの昇温脱離法(TPD)を駆使し、Y型およびモルデナイト型ゼオライトでは高Al組成においても骨格内Alから定量的に酸点が発現していることを見出し、ゼオライトでの酸点発現の解明が進んだ。さらにUSY型ゼオライトをEDTA水溶液中で還流することによって、ブレンステッド酸量を増大させると同時に酸強度を変化させることができた。このように処理した触媒ではパラフィン分解活性が著しく向上し、さらに分岐または直鎖アルカンに対する反応選択性を変化させることに成功した。上記のように系統的な手法により、ゼオライトの酸性質を変化させることができた。これまでのZSM-5の酸性質に関する検討から、ZSM-5には通常の骨格内のAlに由来する酸点のほかに強酸点が発現していることが見出されてきた。今回、酸点の強度分布・濃度の定量的測定が可能であるアンモニア昇温脱離法(NH_3TPD)を駆使し、この強酸点の発現要因とその触媒作用について検討をおこなった。その結果、この強酸点はAlを含浸法によって導入、あるいは、脱Alにより生成すること、さらに脱Alの程度と強酸点濃度が対応することから、強酸点の発現にはZSM-5の骨格外のAlが関与していることが推察された。さらにNH_3TPDによるZSM-5上の酸点の定量的検討から、この強酸点は骨格外Alと骨格内Alとの相互作用によって生ずることが示唆された。酸点の種類を同定するため、吸着ピリジンをIRによって観察したところ、骨格外Alの存在によりルイス酸濃度が増加していることがわかった。触媒作用としてオクタンのクラッキングについて検討したところ、強酸点濃度が高いほど転化率が増大しており、骨格外Al濃度が触媒活性を決める上での重要な要因の一つであることが示された。以上のように本年は酸性質・触媒活性といった面から、ZSM-5上で発現する酸性質を巨視的に調べできた。次年度は微視的な視点から強酸点サイトの構造に関する検討を行う。キャラクタリゼーションの手法として、MAS NMRによりAl側、Si側の双方から情報を得ることにより強酸点の構造を解明する。今回はZSM-5について検討してきたが、さらに他の構造を有するゼオライトと比較し、強酸点発現の機構を明確にする。これまで含浸法によってアルミナをZSM-5の骨格外に導入することにより、強い酸点が発現することを見出してきた。今年度はさらに酸・塩基処理、およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)処理による骨格外酸点の制御を試みるとともに、本手法をUSY型ゼオライトにも展開した。また骨格外アルミニウムの導入によって発現する強い酸点の構造モデルも提案した。

一方、酸溶液によって処理したZSM-5でも強い酸点が増大するが、アンモニア水によって処理した場合とは異なり、クラッキング活性は低下していた。このように酸処理と塩基性処理では、ZSM-5の酸点に引き起こされる効果は全く異なることを見出した。アンモニア脱離法によるゼオライトの酸性質の定量的測定から、塩基処理によって生成する強い酸点は、骨格内Alと骨格外Alが相互作用することによって発現しているとういう新規な酸点モデルを提案した。さらにUSY型ゼオライトをEDTA水溶液中で還流することによって、ブレンステッド酸量を増大させると同時に酸強度を変化させることができた。このように処理した触媒ではパラフィン分解活性が著しく向上し、さらに分岐または直鎖アルカンに対する反応選択性を変化させることに成功した。上記のように系統的な手法により、ゼオライトの酸性質を変化させることができた。
構造システム生物学を指向した高度好熱菌の環境応答機構の研究

我が国で実施された「タンパク3000」プロジェクトによって、タンパク質の立体構造が多数解析された。一方で、タンパク質個々の立体構造は生物を構成する部品であり、それらがどのように統合されて、全体として有機的なシステムを形成するのかが今後の構造生物学分野において重要な研課題になっている。そうした背景を踏まえ、私は高度好熱菌の環境応答機構をモデルシステムに選択して、センサーキナーゼタンパク質、転写制御タンパク質の立体構造に基づいて、システムとしての機構を解明することを目的として研究を進めた。研究の手順としては、高度好熱菌由来のセンサーキナーゼタンパク質、転写制御因子タンパク質の大量発現および結晶化を試みた。転写制御因子タンパク質については、2種類について構造解析を終了し、1種類の転写制御因子タンパク質については単結晶を得て、回折データを収集した後、現在構造解析を進行させている段階である。また、低分解能の単結晶が1種類得られたが、構造解析には至らなかった。2種類の転写制御タンパク質の構造を比較した結果、転写制御因子タンパク質は活性中心に存在する残基や、2次構造のパターンなどは高度に保存されている一方で、αヘリックスの位置が微妙に異なることにより、情報伝達経路の下流に位置するタンパク質との相互作用を調節していることが示唆された。一方、センサーキナーゼタンパク質については、1種類について単結晶は得られたものの、分解能が向上せずに、構造解析には至らなかった。高度好熱菌Thermas thermophilusHB8の八種類の転写制御因子の遺伝子をクローニングした。目的タンパク質を大量発させるために、PCR法によって目的遺伝子を増幅し、pETsystemに組み込んだ。宿主は大腸菌BGL21(DE3)あるいはJM109(DE3)を使用した。30L培養装置を使って、形質転換した大腸菌を大量培養した。大腸菌はリゾチウム・DNAaselで破砕処理した後、超遠心して上澄みを得た。上澄みを70°Cで加熱することにより、耐熱性を有する目的タンパク質以外の共雑タンパク質を沈澱させた。HPLC装置を使って更に精製し、四種類の転写制御因子についてSDS-PAGEでシングルバンドレベルの試料を得た。得られた試料の結晶化を試みたところ、三種類の試料について単結晶を得た。大型放射光施設(SPring-8:兵庫県播磨)にてX線回折測定を行い、二種類の転写制御因子について立体構造を解明した。それらの構造を比較したところ、リン酸化に伴う2量体化に関与すると予想される部位が構造変化を起こしていることが明らかになった。現在、更に詳細に構造と機能の関係を検討中であり、論文作成の準備を進めている。一方、ヒスチジンキナーゼタンパク質については、三種類のクローニングに成功したものの、すべてのタンパク質は不溶性になってしまい、現在までに結晶化用の試料は得られていない。そこで、新たにN末端の膜貫通部位を削除した発現系をそれぞれについて構築を試みている。高度好熱菌由来の転写制御タンパク質はほぼすべて精製されたものの、センサーキナーゼタンパク質の安定的な精製には成功していない。これは、センサーキナーゼタンパク質の多くがN端に膜貫通部位を持つ膜タンパク質であり、通常の精製方法では不溶性画分に沈殿してしまうためである。そこで、菌体の破砕後のペレットを界面活性剤入りの溶液で洗浄する方法で、センサーキナーゼタンパク質の可溶化・精製を試みたところ、1種類のセンサーキナーゼタンパク質について精製に成功した。他のセンサーキナーゼタンパク質についても、この方法で今後精製を試みる予定である。この方法は、高度好熱菌の他の膜タンパク質精製にも適用可能と考えられるので、今後必要さらに必須となる高度好熱菌由来膜タンパクの構造・機能解析に役立つ。同時に、膜タンパク質の発現に最適化した無細胞系発現系も利用して発現・精製を試みる。精製したセンサーキナーゼタンパク質単独の構造解析を試みるのと同時に、それぞれ対になる転写制御因子との複合体結晶を調製し、それらの構造解析を試みる。結晶化のスクリーニングは、全自動結晶化・観察ロボットシステムHTS-80を使用して行う。現在、3種類の転写制御タンパク質の構造解析に成功し、更に、低分解能ではあるが、2種類の転写制御タンパク質について結晶を得ている。今後は、これらの結晶化の最適化を行い、構造解析を行う予定である。
高精度な空力騒音の数値予測に向けた真の音源の同定

二次元角柱周りの流れから発生する空力音を対象とし, Lighthillテンソルを音源とした分離計算を行った.その結果,角柱中心から下流に渦6つ程度に相当する領域までが遠方音場に寄与する主要な音源であることがわかった.このことは,渦が角柱から放出される際に成長・変形することが音波の発生に寄与していることを示唆しており,音場を予測する際は,この領域の音源を流体解析において精度良く捉える必要がある.さらに,以上のように角柱まわりの空力音源に関して得られた知見を,強いピーク性の音が問題となるキャビティまわりの流れや平板列まわりの流れへ応用した.初年度は,マッハ数0.2, 0.4の二次元角柱周りの流れから発生する空力音を対象とし,主流マッハ数が発生音における散乱音と直接音の寄与に及ぼす影響や,遠方の音場に寄与する主要な音源を明らかにした. Lighthillテンソルを音源とした分離計算を行い,以下の知見を得た.(1)Lighthillテンソルの第2, 3項の影響はマッハ数によらず無視できる程小さいことを確認した.(2)圧力変動の大きさが極大となる角度で比較した際, M = 0.2では,直接音は散乱音に比べ18dB程度小さく,全体音に及ぼす影響も無視できるほど小さい.一方, M = 0.4においては, 1.5dB程度小さいのみであり,直接音が全体音に及ぼす影響も無視できない.そのため, M = 0.4では直接音を考慮した音場の予測が必要である.(3)角柱中心から20.5D程度下流までの領域(渦6つ程度に相当)内に遠方音場に寄与する主要な音源が存在し,このことは,渦が角柱から放出される際に成長・変形することが音波の発生に寄与していることを示唆している.最終年度においては,上記の音源探査手法を,より高いレイノルズ数(平板長さ基準のレイノルズ数は87000)の二次元平板まわりの流れやキャビティ流れにも適用し,乱流成分においても,適切な音源をにより音場が予測可能であることが確かめられた.また,風洞実験において問題となる主流乱れがキャビティ音に及ぼす影響について明らかにした.様々な乱れ度と積分スケールをもつ主流乱れを付加した数値計算を実施し,それぞれのパラメータが空力音に及ぼす影響を明らかにした.また,ピーク性音が低下する際,キャビティ内の基本周波数におけるLighthill音源分布も3次元化することが確認された.二次元角柱周りの流れから発生する空力音を対象とし, Lighthillテンソルを音源とした分離計算を行った.その結果,角柱中心から下流に渦6つ程度に相当する領域までが遠方音場に寄与する主要な音源であることがわかった.このことは,渦が角柱から放出される際に成長・変形することが音波の発生に寄与していることを示唆しており,音場を予測する際は,この領域の音源を流体解析において精度良く捉える必要がある.さらに,以上のように角柱まわりの空力音源に関して得られた知見を,強いピーク性の音が問題となるキャビティまわりの流れや平板列まわりの流れへ応用した.主流マッハ数0.2, 0.4の二次元角柱周りの流れから発生する空力音を対象とし,主流マッハ数が発生音における散乱音と直接音の寄与に及ぼす影響や,遠方の音場に寄与する主要な音源を明らかにすることを目的として, Lighthillテンソルを音源とした分離計算を行った.その結果以下の知見を得た.(1)Lighthillテンソルの第2, 3項の影響はマッハ数によらず無視できる程小さいことを確認した.(2)Lighthillテンソルに基づく空力音の分離計算により,音の伝播角度に関するドップラー効果を予測可能であることが確認された.(3)圧力変動の大きさが極大となる角度で比較した際, M = 0.2では,直接音は散乱音に比べ18dB程度小さく,全体音に及ぼす影響も無視できるほど小さい.一方, M = 0.4においては, 1.5dB程度小さいのみであり,直接音が全体音に及ぼす影響も無視できない.そのため, M = 0.4では直接音を考慮した音場の予測が必要である.(4)角柱中心から20.5D程度下流までの領域(渦6つ程度に相当)内に遠方音場に寄与する主要な音源が存在し,このことは,渦が角柱から放出される際に成長・変形することが音波の発生に寄与していることを示唆している.そのため,音場を予測する際は,この領域の音源を流体解析において精度良く捉える必要がある.また,上記の音源探査手法は,アスペクト比が15の二次元平板まわり(平板長さ基準のレイノルズ数は87000)の流れにおいても有効であることを確かめており,後流が乱流となる流れにも有効であると考えられる.上記の研究成果は機械学会論文集B編に掲載された.初年度の目標としていた,渦放出により音が発生する代表例である角柱まわりの流れにおける真の音源の同定を達成することができた.層流で二次元的な流れとなる低レイノルズ数(ReD = 150)において,マッハ数を0.20.4と変化させ,物体と音の波長のスケール比が真の音源に及ぼす影響を調査し,有効な分離音響計算手法を構築できた.さらに,本手法が後流が乱流となる場合の平板まわりの流れにおいても有効であることが確かめることができた.キャビティ流れにおける音源の同定を行っていき,高精度な音響計算手法を構築していく.

また,吸音材の効果を音響計算に取り入れることは,音響計算の手法上,まだ課題があるため,本音響計算手法を用いてまずはキャビティの深さを変化させた際の発生音への影響を調査することで,キャビティ音の受動的制御に取り組む予定である.東京大学の情報基盤センターFX10スーパーコンピュータシステムの負担金100万円.計算用可視化ソフト保守費用15万円.実験装置製作費20万円.国内の研究成果発表(2回)10万円.国外の研究成果発表(1回)25万円.英語添削費用10万円.
小膵腫瘤性病変の鑑別診断能の向上に関する内視鏡的ならびに分子生物学的研究

超音波内視鏡(EUS)と膵液の遺伝子診断を組み合わせた一連の内視鏡下の検査が、小膵腫瘤性病変の検出とその鑑別診断にいかに有用であるかを明らかにしようとした。対象は、腹痛などの自覚症状、検診でのチェック、膵酵素や腫瘍マーカーの上昇、糖尿病の悪化などより膵の異常が疑われた患者176例であり、EUSにより膵の一次スクリーニングを行った。腫瘤や膵管拡張などの異常エコーが検出された場合、内視鏡下に純膵液を採取し、PCR-RFLP法によりK-rasコドン12の点突然変異を検索した。同時に、通常のエコー(US)、コンピューター断層撮影(CT)、内視鏡的膵管造影(ERCP)などの各種画像診断を施行し、腫瘤検出能をEUSと比較した。その結果、1)EUSにより36例(20%)の充実性膵腫瘤が検出された。うち19例は膵癌であり、腫瘍径12cmの小膵癌が7例が含まれていた。また、17例は、炎症性膵腫瘤で、そのうち13例は2cm以下の小腫瘤であった。2)各画像診断の検出感度を比較すると、全体では、USが68%、CTが79%、ERCPが84%、EUSが100%を示した。そして、2cm以下の小さな者に限ると、US29%、CT43%、ERCP86%、EUS95%となり、EUSは小病変の検出に優れていることが示された。3)特異性について比較すると、全体では、USが53%、CTが88%、ERCPが88%、EUSが82%を示した。そして、2cm以下の小さな者では、US69%、CT92%、ERCP100%、EUS92%であり、特異性については、ERCPやCTと同等であった。4)EUSと膵液の遺伝子診断を組み合わせたが、感度、特異性ともEUS単独の成績を凌ぐことはできなかった。しかし、、膵液中のK-ras変異の検索は、EUSにて検出された小腫瘍性病変の診断確定には有用であった。以上の成績より、現時点では、これら遺伝子診断を併用した一連の内視鏡検査の早期診断法としての意義は明らかにできなかったが、今後、1cm以下の小病変がどんどん検出されるようになれば、その真の意義が明らかになるであろう。

同時に、通常のエコー(US)、コンピューター断層撮影(CT)、内視鏡的膵管造影(ERCP)などの各種画像診断を施行し、腫瘤検出能をEUSと比較した。その結果、1)EUSにより36例(20%)の充実性膵腫瘤が検出された。うち19例は膵癌であり、腫瘍径12cmの小膵癌が7例が含まれていた。また、17例は、炎症性膵腫瘤で、その内13例は2cm以下の小腫瘤であった。2)各画像診断の検出感度を比較すると、全体では、USが68%、CTが79%、ERCPが84%、EUSが100%を示した。そして、2cm以下の小さな者に限ると、US29%、CT43%、ERCP86%、EUS95%となり、EUSは小病変の検出に優れていることが示された。3)特異性について比較すると、全体では、USが53%、CTが88%、ERCPが88%、EUSが82%を示した。そして、2cm以下の小さな者では、US69%、CT92%、ERCP100%、EUS92%であり、特異性については、ERCPやCTと同等であった。4)EUSと膵液の遺伝子診断を組み合わせたが、感度、特異性ともEUS単独の成績を凌ぐことはできなかった。しかし、膵液中のK-ras変異の検索は、EUSにて検出された小腫瘍性病変の診断確定には有用であった。以上の成績より、現時点では、これら遺伝子診断を併用した一連の内視鏡検査の早期診断法としての意義は明らかにできなかったが、今後、1cm以下の小病変がどんどん検出されるようになれば、その真の意義が明らかになるであろう。超音波内視鏡(EUS)と膵液の遺伝子診断を組み合わせた一連の内視鏡下の検査が、小膵腫瘤性病変の検出とその鑑別診断にいかに有用であるかを明らかにしようとした。対象は、腹痛などの自覚症状、検診でのチェック、膵酵素や腫瘍マーカーの上昇、糖尿病の悪化などより膵の異常が疑われた患者176例であり、EUSにより膵の一次スクリーニングを行った。腫瘤や膵管拡張などの異常エコーが検出された場合、内視鏡下に純膵液を採取し、PCR-RFLP法によりK-rasコドン12の点突然変異を検索した。
感覚機能を調節する脂質制御遺伝子の探索

生物の感覚機能は、外界の情報を取り入れることで、環境変化に応じた生体の恒常性の維持や適切な行動を発現させるために不可欠である。これまでに、TRPチャネルを始めとする受容体タンパク質については数多く報告されてきたが、それ以外の感覚受容に関わる必要因子の解析はほとんど進んでいない。本研究ではショウジョウバエモデルを用いて温度や機械刺激を受容する感覚神経細胞を対象とした脂質制御遺伝子の網羅的な発現解析を実施し、さらに脂質制御遺伝子の感覚応答への役割を行動解析スクリーニングなどを通して明らかにする。
倫理的判断能力の獲得を目指した看護学生版倫理的行動尺度の開発と行動基準の検討

本研究では、看護学生が看護学実習で体験するケアの倫理的行動について評価できる尺度を開発するとともに、看護学生の倫理的判断能力の獲得を目指した看護教育のあり方を検討することを目的としている。2018年度は、「看護学生および看護師における倫理的行動」の概念を基盤に、看護学生が看護学実習で経験するケアの倫理的行動について評価できる看護学生版倫理的行動尺度を開発し,その尺度の信頼性と妥当性を検証した。その結果、看護学生版倫理的行動尺度は,5因子29項目で構成され,信頼性と妥当性が確認された.さらに、看護学生の倫理的行動の行動基準の提示と関連要因を明らかにするために、全国の看護学生1500名程度(看護系大学,短期大学,専門学校の最終学年の看護学生)を対象に、開発した「看護学生版倫理的行動尺度」を用いて全国調査を実施した。2019年度は、看護学生の倫理的行動の行動基準の提示と関連要因に関する研究を継続し、データの集計および分析を行う予定である。今年度の研究成果は、2018年8月に開催された日本看護学教育学会学術集会で「看護学生および看護師における倫理的行動」を発表した。また、継続教育における倫理的判断能力の獲得レベルと倫理教育の現状について論文にまとめ、International Journal of Nursing & Clinical Practicesに投稿し、掲載されている。看護学生版倫理的行動尺度の開発が順調に進んだ。2019年6月にこの尺度を用いて、看護学生の倫理的行動の行動基準の提示と関連要因を検討する予定であったが、尺度の完成に伴い2018年度内でアンケート調査を実施することができた。現在は、アンケートの集計および分析に取り組んでいる。全国の看護学生1500名程度(看護系大学,短期大学,専門学校の最終学年の看護学生)を対象に開発した「看護学生版倫理的行動尺度」を用いて全国調査を実施し,看護学生の倫理的行動の行動基準の提示と関連要因(倫理的行動に影響を与える講義や演習,実習の授業設計)を検討する.分析は,看護学生の倫理的行動の行動基準を記述統計で求め,倫理的行動と授業や演習との関連性を検討する.結果は、学会で発表、学会誌に投稿することを検討している。本研究では、看護系大学の看護学生が、看護学実習で経験するケアの倫理的行動について評価できる尺度を開発するとともに、看護学生の倫理的判断能力の獲得を目指した看護教育のあり方を検討することを目的としている。平成29年度は、倫理的行動を定義するために概念分析を行なった。さらに専門家会議で、概念化したものが学生に適応するかどうかを検討した。尺度開発の理論的背景となる倫理的行動の概念化については、国内外の既存文献を読み整理し、Rogersの概念分析法で概念整理を行った。その結果、「看護学生および看護師における倫理的行動」は、属性が5カテゴリー、先行要件が3カテゴリー、帰結が3カテゴリーであった。専門家会議では、大学教員3名、看護部長等の管理職3名で、基礎教育課程での倫理的行動におけるパフォーマンスレベルの検討および「看護学生および看護師における倫理的行動」の概念を基盤とした尺度の検討を行った。今年度の研究成果は、倫理的行動および類似概念に関して文献検討した「基礎教育と継続教育における倫理的判断能力の獲得レベルと倫理教育の現状」を、平成29年12月に開催された日本看護科学学会で発表した。また、「看護学生および看護師における倫理的行動」は、平成30年8月に開催される日本看護学教育学会学術集会で発表することが決まっている。次年度は、概念分析を基盤とした尺度開発を行う予定である。今年度は、倫理的行動および概念分析に関する国内外の既存文献を読み、概念の整理を行った。尺度開発の理論的背景となる概念が明確化し、今年度の計画は終了できた。さらに専門家会議では、次年度の尺度開発に向けて検討を行い、準備は整いつつある。今年度の進捗はおおむね順調である。

2019年6月にこの尺度を用いて、看護学生の倫理的行動の行動基準の提示と関連要因を検討する予定であったが、尺度の完成に伴い2018年度内でアンケート調査を実施することができた。現在は、アンケートの集計および分析に取り組んでいる。次年度は、概念分析を基盤とした尺度開発を行う。対象は、ランダムに選定した看護系大学5校から6校の4年生400名480名にアンケート調査を行う。具体的には、概念分析を基盤とした質問項目を作成し、アンケート調査を行う。アンケートの収集は、留め置き法とする。分析は相関係数を算出し、信頼性は内的整合性を検討するためクロンバックα信頼係数を算出する。妥当性は、探索的因子分析と確証的因子分析を行うことで、構成概念妥当性の検討を行う。さらに、既存尺土との併存妥当性の検討を行う。全国の看護学生1500名程度(看護系大学,短期大学,専門学校の最終学年の看護学生)を対象に開発した「看護学生版倫理的行動尺度」を用いて全国調査を実施し,看護学生の倫理的行動の行動基準の提示と関連要因(倫理的行動に影響を与える講義や演習,実習の授業設計)を検討する.分析は,看護学生の倫理的行動の行動基準を記述統計で求め,倫理的行動と授業や演習との関連性を検討する.結果は、学会で発表、学会誌に投稿することを検討している。今年度は、データ整理およびデータ入力のために人件費を確保していたが、依頼せずに行なえ削減できたため、次年度へ繰り越した。看護基礎教育における倫理的判断能力の獲得レベルと倫理教育の現状について論文にまとめ、海外誌に投稿し、査読中であるため、次年度使用額が生じており、掲載料として使用する。
酵母プリオンの伝搬に対する分子機構の解明

出芽酵母には、[PSI^+]などのタンパク質性の遺伝因子(酵母のプリオン現象)が存在する。[PSI^+]の原因タンパク質であるSup35(酵母プリオンタンパク質)がダイナミックにオリゴマー化し、そのオリゴマーがプリオンとして娘細胞に伝播していくことが1細胞におけるSup35タンパク質の動態を経時的に追うことで明らかとなった。プリオン現象が安定に伝播するためには、Hsp104という脱凝集にかかかるシャペロンが必要であることが遺伝学的解析結果から示唆されている。我々はHsp104と酵母プリオンとの関係を明らかにするために、細胞内におけるプリオンの分子動態、およびHsp104の分子動態を解析することにした。Hsp104の機能をGuHCl処理によって阻害すると[PSI^+]が消失することが遺伝学的にわかっているが、その分子メカニズムは分かっていなかった。それを明らかにするために、我々は蛍光分子相関法(FCS)を用いて、GuHCl処理した細胞のSup35の動態を1細胞レベルで解析を行なった。その結果、母細胞には大きなアミロイド様のヒモ状凝集体が細胞質に形成され、その回りには[PSI^+]株に存在するオリゴマーが存在していた。このヒモ状の凝集体が形成されることは過去にLiebmanらのグループにより示されているが、この疑集体がいったいどのようなものなのか特徴付けは行なわれていない。このヒモ状凝集体をもった親細胞から出芽した娘細胞、孫細胞には世代を経るごとに親細胞におけるオリゴマーよりも分子サイズの小さなものが伝播されており、最終的にGuHClで処理された細胞集団は[psi^-]に近づいていることがわかった。出芽酵母には、酵母プリオンが存在する。我々の研究から、プリオンは細胞の成長に伴ってダイナミックに凝集体からオリゴマーになり、そのオリゴマーの状態で娘細胞に伝搬されていくことが分かった(Kawai-Noma,2006,Gene to Cells)。このプリオンのダイナミクスに脱凝集シャペロンであるHsp104が関与しており、プリオンの維持にはHsp104の適度な発現量が必要であると考えられている。それは、Hsp104を過剰発現したり、欠損および機能を阻害したりすると、プリオンが失われることが遺伝学的にわかったからである。しかし実際にプリオンが消失する分子メカニズムは分かっていない。そこで我々は、Hsp104を過剰発現させた場合とHsp104の機能をGuHClによって阻害した場合のプリオンダイナミクスの変化を、蛍光相関分光法(FCS)を使って調べた。Hsp104を過剰発現させると、世代をへてオリゴマーのサイズが小さくなり、モノマーに近づいていることが分かった。次に、Hsp104の機能をGuHCIによって阻害すると、12時間のGuHCI処理の間に、世代をへて、小さなサイズのプリオンオリゴマー、およびモノマーが伝搬され存在していることが分かった。これらの結果から、Hsp104はプリオンダイナミクスの重要な因子であり、Hsp104の発現量、および機能阻害によりオリゴマー(凝集体)の分断と伝搬に障害が起き、新しくできた娘細胞には分子サイズの大きなプリオンよりも、分子サイズの小さなものが伝搬しやすくなっていることがわかった。プリオン現象を要素に分けて考えると、プリオンの「実体」が「増殖」していきながら、「伝搬」することが必要である。「実体」であるオリゴマーが、Hsp104によって「増殖」および「伝搬」していく現場をとらえることができたと考えられる。