hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔細菌がインフルエンザ感染に及ぼす影響の解明とそれを基盤とした感染予防への応用

本研究では、歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalisが産生する酵素によりインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)を開裂し、ウイルス感染を促進するか検討した。その結果、P. gingivalisによりHAは開裂し、ウイルスが宿主細胞に感染できるようになることが明らかとなった。P. gingivalisは、トリプシン様酵素であるジンジパインを産生することから、ジンジパイン阻害薬ならびにジンジパイン欠損株を用いて検討を加えた。その結果、アルギニンを切断するジンジパイン(Rgp)がHAを開裂し、ウイルスの感染性獲得に関与することが明らかとなった。毎年流行するインフルエンザにより小児や高齢者を中心に多くの命が失われている。また、新型インフルエンザの流行も危惧されており、インフルエンザの予防対策は喫緊の課題である。インフルエンザは口腔と密接に関連しており、口腔ケアがインフルエンザの予防に有効とされているが、その分子メカニズムは不明である。そこで本研究では、ウイルスの宿主細胞感染機構に注目し、口腔細菌がウイルスの感染性に及ぼす影響を検討した。A型インフルエンザウイルス(IAV)が宿主細胞に感染するには、ウイルス表面のヘマグルチニン(HA0)がプロテアーゼによりHA1とHA2に開裂して膜融合能を獲得していることが必須である。このプロテアーゼは主に宿主由来と考えられているが、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼでも開裂する。一方、口腔ケアはインフルエンザ発症のリスクを低下させる事実から、口腔細菌由来のプロテアーゼがHAを開裂し、IAV感染に関与している可能性が考えられる。歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalisはアルギニンを切断するジンジパイン(Rgp)とリシンを切断するジンジパイン(Kgp)を産生することから、本年度はジンジパインがIAVの感染に及ぼす影響について検討した。その結果、P. gingivalis培養上清によりIAVのHAは開裂し、感染性獲得に関与することが明らかになった。さらにジンジパインの阻害薬であるRgp阻害薬(KYT-1)およびKgp阻害薬(KYT-36)を用いて検討した。その結果、KYT-1処理によりP. gingivalis培養上清によるHAの開裂および感染の拡大が抑制された一方、KYT-36処理では影響を及ぼさなかった。以上の結果から、P. gingivalisが産生するプロテアーゼの1つであるRgpがIAVのHA開裂活性を持ち、ウイルスの感染性獲得に働くことが示唆された。RgpがウイルスのHAを開裂し感染性獲得に関与が明らかになった。さらに現在、ジンジパイン欠損株培養上清を用いてIAV感染に及ぼす影響の解析を行っており、進捗状況はおおむね順調と判断した。インフルエンザと口腔は密接に関連しており、口腔ケアがインフルエンザの予防に有効とされているが、その分子メカニズムは不明である。本研究では、ウイルスの宿主細胞感染機構に注目し、口腔細菌がウイルスの感染性に及ぼす影響を検討した。A型インフルエンザウイルス(IAV)が宿主細胞に感染するには、ウイルス表面のヘマグルチニン(HA)のアルギニン部がプロテアーゼにより開裂して膜融合能を獲得することが必須である。このプロテアーゼは主に宿主由来と考えられているものの、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼによっても開裂する。口腔ケアがインフルエンザ発症のリスクを低下させる事実から、口腔細菌由来のプロテアーゼがHAを開裂することにより、IAV感染に関与している可能性が考えられる。主要な歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalisはアルギニンを切断するジンジパイン(Rgp)とリシンを切断するジンジパイン(Kgp)を産生しており、HAを開裂する可能性がある。そこで本年度は、ジンジパイン欠損株を用いて、ジンジパインがIAVの感染に及ぼす影響を検討した。その結果、wild-typeおよびKgp欠損株(KDP129)の培養上清によりHAの開裂が認められ、さらに蛍光免疫染色ならびにプラークアッセイによる解析により感染が拡大することが認められた。一方Rgp欠損株(KDP133)およびKgp/Rgp欠損株(KDP136)の培養上清では影響を認めなかった。以上の結果から、P. gingivalisが産生するプロテアーゼの1つであるRgpはIAVのHA開裂活性を持ち、ウイルスの感染性獲得に関与することが示唆された。ジンジパイン阻害薬ならびにジンジパイン欠損株を用いた実験により、RgpがIAVのHAを開裂し感染性獲得に関与していることが明らかになったことから、進捗状況はおおむね順調と判断した。本研究は、口腔細菌がA型インフルエンザウイルス(IAV)感染に及ぼす影響を検討し、インフルエンザ予防法として口腔ケアが有効であることを示すために実施した。【研究1】IAVが宿主細胞に感染するには、IAV表面のヘマグルチニン(HA)のアルギニン部がプロテアーゼにより開裂して膜融合能を獲得することが必須である。このプロテアーゼは主に宿主由来と考えられているが、黄色ブドウ球菌由来プロテアーゼによっても開裂する。これまでの研究により、我々はPorphyromonas gingivalisが産生するジンジパインがHAを開裂し感染する可能性を示した。本年度は、実際にIAVが宿主細胞に侵入するか否かを検討した。

IAVの侵入により宿主細胞のAktがリン酸化することから、P. gingivalisの培養上清存在下で未開裂のIAVによりAktがリン酸化するか検討した。その結果、培養上清非存在下ではAktのリン酸化を認めなかったが、存在下ではAktのリン酸化を認めた。以上の結果から、P. gingivalisは、IAVの感染性獲得に関与することが示唆された。【研究2】歯周病原菌であるFusobacterium nucleatum、P. gingivalis、Prevotella intermediaにより前処理した呼吸器上皮細胞にIAV感染させた際の影響について検討した。その結果、F. nucleatumおよびP. gingivalisにより前処理した細胞では、IAVの感染が拡大し、さらに炎症性サイトカインの増強も認めた。以上の結果から、F. nucleatumおよびP. gingivalisがIAVの重症化に関与することが示唆された。本研究では、歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalisが産生する酵素によりインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)を開裂し、ウイルス感染を促進するか検討した。その結果、P. gingivalisによりHAは開裂し、ウイルスが宿主細胞に感染できるようになることが明らかとなった。P. gingivalisは、トリプシン様酵素であるジンジパインを産生することから、ジンジパイン阻害薬ならびにジンジパイン欠損株を用いて検討を加えた。その結果、アルギニンを切断するジンジパイン(Rgp)がHAを開裂し、ウイルスの感染性獲得に関与することが明らかとなった。ジンジパイン欠損株培養上清を用いてIAV感染機構に及ぼす影響について詳細な検討を加える。さらに今年度行った予備実験により、口腔細菌の代謝産物がIAV感染による炎症性サイトカインの誘導を増強させる可能性が示唆された。そこで今後は、炎症性サイトカイン誘導増強メカニズムについて解析を行う。IAV感染前に細胞が口腔細菌にさらされることで、インフルエンザの重症化を促進させる可能性がある。申請者は口腔細菌代謝産物により、IAVの感染が拡大すること、また炎症性サイトカインの誘導が増強されることを見出している。そこで今後は代謝産物がIAV感染拡大に働くメカニズムの解明、ならびに炎症性サイトカインや抗ウイルスタンパクの誘導に及ぼす影響ついて検討する。微生物学研究を遂行して行く上で、必要に応じて執行した。本年度は口腔細菌の代謝産物がIAV感染による炎症性サイトカインの誘導を増強するメカニズムの解析が遅れたため、抗体等試薬使用量が見込みより少量で済み、当初の見込額と執行額は異なった。研究を遂行して行く上で、必要に応じて執行した。本年度は、炎症性サイトカインや抗ウイルスタンパクの解析が遅れたため、抗体等試薬の使用が少なく済んだため、当初の見込額と執行額が異なった。研究計画に変更はなく、口腔細菌がIAV感染に及ぼす影響を検討するため、次年度において研究試薬等に繰越した研究費も含めて使用する。
新規代替フロン物質探索のためのスクリーニングデータベースの構築

冷凍機やエアコンの作動媒体として利用されているフロン系冷媒は,オゾン層破壊や地球温暖化に影響を及ぼすため,その代替品の開発が急務とされている.本研究では,研究者が実測し,蓄積してきた純物質および混合物に関する冷媒の熱力学的性質情報を精査し,新しい物質に関しては自ら追加測定を行って、研究室ホームページから一般に公開できるデータベースを構築した。本データベースを用いることにより、新規代替冷媒のスクリーニングおよび評価予測ができるようにした.1.昨年度から継続して査読付き刊行論文・国際会議プロシーディングス・国内学会発表講演論文集等、公表してきた論文の実測値データの入力を進めてきた。純物質冷媒に関して20物質、混合冷媒に関しては17混合系(それぞれに複数組成のデータが存在するので、実質的な混合系は50種類以上となる)の実測値データの入力を現状終えている。2.データソースは活用のしやすいようにエクセルファイルを用いて入力してあり、メニュー選択ができるように作られている。流体の基本物性値としては、飽和密度、飽和蒸気圧力、気液平衡圧力である沸点圧力・露点圧力、PVT性質(圧力・体積・温度の3次元関係)、表面張力を対象としている。3.実測値の挙動を図式的に表現するために、すべてのデータに代表的な線図を描き、データベースに加えてある。グラフ表示に関しては、各研究者毎に利用目的が違うので、有益かどうかは受け取る側で決めるべきことではあるが、数多くの種類の冷媒の中から新規代替フロン物質を探索するためのスクリーニングには図式表示は重要であると考えている。4.本データベースは、研究代表者の研究室ホームページから、逐次データの更新を行った上で、既に公開している。今後もさらにデータの入力を増やし、利便性をあげるためのソフトの改良も進めていく。本データベースを用いることにより、新規代替冷媒のスクリーニングおよび評価予測ができるようにした.申請者が査読付き刊行論文・国際会議プロシーディングス・学会講演論文集など、国内外に公表してきた約200編の論文に掲載されている新旧冷媒に関する熱物性値情報を、エクセルファイルの形式で入力し、利用・編集のしやすい形でデータベース化した。作業としては、同時に公開し、実測しているデータに関しても逐次入力している。これらの作業を、ホームページ上でも確認できるように、公開する準備も進めている。流体の基本物性値となる臨界定数、飽和密度の実測値を表す気液共存曲線の実測データを,純物質,混合物ともにグラフ化し、数値データだけではなく,図式化して熱物性挙動が把握できるようにした。混合物に関しては、臨界軌跡を含む臨界点近傍の熱力学性質をMathematicaを利用して3次元化する検討を行った。このグラフは現在も継続して情報の追加を進めているが、組成依存性を具現化しながら最適組成の選択を行なう上での有効なデータベースになるものと考えている。地球温暖化防止のためのフロン系冷媒代替品として、現在も新たな低GWP冷媒の開発は進められており、混合冷媒に関しては熱物性情報が皆無のものが多いので、継続して熱物性計測実験を進めている。本年度はオレフィン系列の新冷媒および混合物の熱物性計測も実施した。1.研究代表者が従来実測により収集してきた,地球温暖化への影響が少ない代替フロン物質の熱物性値情報を,査読論文や国際会議により公表しているものを優先して,純物質冷媒20物質,混合物21混合系についてデータベースを作成した.スクリーニングに活用できる今回作成した熱物性値情報は,臨界定数,飽和密度,表面張力,飽和蒸気圧,定圧比熱,PvTおよびPvTx性質,そして気液平衡性質である.2.データベースは平成24年度から研究代表者の研究室ホームページより公開されている.平成26年度には,混合系の選択が,一覧表から探しやすく検索できるようにインターフェースの改善を行った.3.新規代替フロン物質は,新物質や新しい組み合わせの混合物が次々と登場している,世界中の冷媒メーカーから,最新でかつ利用可能性の高い新物質や新混合物試料を直接入手し,熱物性値測定を新規に計測した.平成26年度に測定した物質は,純物質はR1243zf, 2成分系混合物はR134a+R245fa, R1234yf+R1234ze(E), R1234ze(E)+R1234ze(Z), R32+R1234ze(Z), R134a+R1234ze(Z) .そして3成分系混合物ではR32+R1234yf+CO2である.4.研究成果を公表するため,平成26年度は国内では佐賀と東京,海外では韓国とイタリアで成果発表を行った.平成27年度には,アメリカおよび日本で開催される国際会議で成果を発表することが決まっている.5.新規に測定した熱物性値情報は,全世界で標準プログラムとして利用されているアメリカの国立標準技術研究所(NIST)で作成されたREFPROPと国際連携して,イタリアの研究者ともつながり,全世界に情報公開されている.

機械工学現状で手元にある情報の入力は、純物質および混合物ともにほぼ終了した。そして、数値情報としてだけでなく、図式的情報としてグラフでも整理し、まとめることができた。また、出来上がったデータベースを、試行レベルではあるが大学研究室ホームページを介して一般公開した。数値データとしてのデータベースだけでなく、あくまでスクリーニングに活用することが最終目的なので、図式表示も重要視している。今回入力した情報に関しては、すべてを図式表現できたので、第一次スクリーニングには十分役に立つデータベースになったものと確信している。図式表現に関して、混合物の場合は組成の要素が入るために4次元的な表現が必要となり、最低でも3次元表現が適していると当初考えて、3次元グラフ処理を試みていたが、実際に立体的に表現はできても、データベースとしての実質的な活用には不向きであると考え始めている。この点はさらに次年度、研究を進展させる必要がある。以上より、全体計画としてはおおむね順調に進んでいると考えられる。初年度はデータベースの構築に主眼をおき、過去に公開されている生データを入力して、まず申請者の計測したデータを中心とした新規代替フロン物質のデータベース基盤を作り上げた。200編あまりの論文を精査して、データを統一書式で入力し、さらにグラフ化するところまで完成した。熱物性値情報は3次元表記が出来上がると、理解されやすい傾向があるので、Mathematicaを活用して立体表示にも取り組み、混合冷媒データベースに関してのデモンストレーションが終了した。さらに、データベースを公開するためのホームページ作成にも着手した。これにより、データベース構築に関しての初年度の計画はおおむね順調に進行していると考えている。加えて、不足している熱物性値の追加計測も継続しているので,データの蓄積も順調に進んでいる。平成25年度までに構築したデータベースを改善改良し、さらに他研究者のデータも追加入力し、データベースの信頼性向上に努める。特に臨界定数(臨界温度、臨界圧力、臨界密度)の一覧情報が純物質,混合物ともにまだでき上がっていないので、最終年度の平成26年度中に完成させる計画である。また、新種の物質が登場した場合に、化学構造式と過去の蓄積データからの経験的な手法を取り混ぜた推算手法が必要になってくる。冷媒が対象物質であるデータベースなので、物質の特性も比較的似かよったものが多いのは事実である。この利点を活用し、限られた物質群であれば、従来以上に精度の高い推算式が開発できるものと確信しているので、開発作業を進めていきたいと考えている。平成24年度の構築したデータベースに、さらに他の研究者の利用できるデータを追加し、まず純物質のデータベースを完成させる。その後、申請者が測定を行なった混合物に関する熱物性実験値に基づいて、混合冷媒に関する熱力学的性質推算手法の開発を進める。まず混合物の臨界定数の組成依存性について体系的に調べ、臨界軌跡相関式を確立する.そのために追加で必要となる実験は継続して行なう。作成した推算技術をスクリーニングデータベースを用いて展開させ、さらには実測値がない混合冷媒にまで発展させる。そして実測を行なってその実証を行なう。
術前化学療法の化学療法感受性、遺伝子変異、アポトーシスに対する効果に関する研究

胃癌、大腸癌症例を対象にCollagen droplet drug sensitivity test(CD-DST)を用いて5-fluorouracil(5FU)mitomycin(MMC), cisplatin(CDDP)に対する化学療法剤感受性試験を施行し、感受性を制御する因子として癌組織中のthymidylate synthase(TS活性), dihydropyrimidine dehydrogenase(DPD活性)、thymidine phosphorylase(ThdPaseならびに免疫染色),P-glycoprotein(P-GP)発現,p53蛋白の発現、p53遺伝子変異について関連性を検索し、化学療法剤感受性予測因子としての臨床的意義を検討した。対象は胃癌17例、大腸癌23例の外科的切除症例40例であり、症例の内訳は男性19例、女性21例で、平均年齢71.0±11.2歳であった。現在、さらに25症例の胃癌、大腸癌を追加し、これらの症例の化学療法剤感受性試験を行い結果を集積中である。またこれらの症例の腫瘍組織中のTS活性、DPD活性、ThdPase活性も測定中であり、感受性との関連性についても検討中である。これまで得られた結果から各薬剤感受性と各種酵素活性との関連を検討する目的で、癌組織中のTS活性、DPD活性、ThdPase値の平均値以上を高値群、平均値未満を低値群の2群に分け、両群間のT/C比を比較した。またThdPase、P-GPおよびp53蛋白の免疫組織学的染色を施行し、それぞれの発現陰性群、陽性群の2群に分け、T/C比を比較した。p53遺伝子のexon5,exon6,exon7,exon8における変異はPCR-SSCP法を用い、いずれかのexonに異常バンドを検出したものをp53遺伝子変異陽性と判定し、T/C比を比較した。またさらにdirect sequence法を行い、詳細な塩基配列を決定し、これらと感受性の結果の関連性についても検討中である。これまで得られた結果では5-FU、MMC、CDDP曝露後の平均T/C比はそれぞれ胃癌で79.5±19.6%、81.2±26.5%、81.4±25.9%、大腸癌で86.7±10.8%、101.6±7.2%、102.1±12.3%であった。5-FUに対する感受性はTS活性高値群において低い傾向を示した(p=0.087)が、DPD活性値との間に有意な関連は認めなかった。ThdPase定量では高値群において5-FUに対する感受性が低い傾向を認めたが(p=0.086)、免疫組織学的染色の結果、ThdPaseの発現性と5-FU感受性との間には有意な関連は認めなかった。
図書館情報学教育の実態と改善に関する総合的研究

最初に、図書館情報学教育に関する国内文献を網羅的に収集し、文献を通して我が国の図書館情報学教育に関するこれまでの議論を通時的に整理し、現在抱えている問題点を明確にした。次に、図書館情報学校育の歴史が長く、制度的にも、堅固な基盤をもつ英米を中心に関係文献を収集し、比較研究の視点から英米の図書館情報学校教の現状と改革の動向を把握した。文献調査の結果を参考にして、質問紙を作成し、全国の図書館情報学教育担当者240名、公共図書館長447名、大学図書館役職者1,467名の三つのグル-プを対象に質問紙調査を試みた。各グル-プとも70パ-セント以上の高い回収率を得た。回答デ-タは電子計算機を用いて様ざまな角度から集計・分析を行なった。この分析結果から、現行の司書養成制度、科目構成、教育内容など様ざまな問題点が明らかにされ、将来の改革に向けての示唆が得られた。特に、教育関係者と実務者との間における図書館情報学教育に対する考え方の相違が顕著に表れた。質問紙調査に加えて、全国の主要な図書館情報学教育担当者、公共図書館長、大学図書館員を選び出し、面接調査を試みた。面接調査では質問紙調査では得られなかった詳細な意見や情報を収集することができた。このような意見や情報は質問へ調査結果を総合的に分析・検討を行うのに役だった。最後に、質問紙調査と面接調査による結果を、歴史的、制度的、社会的な諸条件に留意しながら、英米を中心とする諸外国の状況と比較して我が国の図書館情報学教育のあり方をまとめた。
モルモット副腎髄質細胞のムスカリン受容体チャネルの電気生理学的解析

1.モルモット副腎のスライス標本を作成し髄質部分を切り出し,この細片をコラゲナ-ゼ処置することにより,分離副腎髄質細胞標本を作成した.2.この単一細胞を栄養液に浮遊させ,微分干渉顕微鏡下でパッチクランプ電極を用いて細胞膜に穴を開けwhole cell clampを行った.細胞の電流固定を行い,脱分極電流を細胞に与えると活動電位が発生した.3.単一細胞の膜電位をー70mVに固定し,種々の振幅の脱分極刺激を与え細胞膜を横切る電流を記録した結果,電位依存性Na電流,Ca活性化K電流,電位依存性K電流及び電位依存性Ca電流がそれぞれ記録された.4.細胞膜電位をー60mVに固定し,アセチルコリン(ACh)を投与するとすぐに脱感作する内向き電流が記録された.この反応はヘキサメソニウムにより遮断されることから,ニコチン受容体を介する反応である.5.細胞膜電位を0mVに固定し,AChを投与すると時間経過の長い内向き電流が観察された.この反応はアトロピン投与あるいはGDPーβsの細胞内投与により消失した.6.パッチクランプ電極内のEGTA濃度を下げ,細胞内Ca濃度の緩衝作用を低下させ,0mV固定下でAChを投与すると外向き電流が記録された.この反応はK平衡電位で反転することからK電流であることがわかった.このK電流はアトロピンの投与もしくはGDPーβsの細胞内投与により消失した.以上の結果より,モルモット副腎髄質細胞は神経細胞と類似した性質のチャネルが存在する興奮性細胞であることが示された.ムスカリン受容体刺激により外向きK電流と内向き電流が発生し,両反応にはGタンパク質の関与が示唆された.現在,さらにこのムスカリン受容体刺激による反応の解析を行っている.1.モルモット副腎のスライス標本を作成し髄質部分を切り出し,この細片をコラゲナ-ゼ処置することにより,分離副腎髄質細胞標本を作成した.2.この単一細胞を栄養液に浮遊させ,微分干渉顕微鏡下でパッチクランプ電極を用いて細胞膜に穴を開けwhole cell clampを行った.細胞の電流固定を行い,脱分極電流を細胞に与えると活動電位が発生した.3.単一細胞の膜電位をー70mVに固定し,種々の振幅の脱分極刺激を与え細胞膜を横切る電流を記録した結果,電位依存性Na電流,Ca活性化K電流,電位依存性K電流及び電位依存性Ca電流がそれぞれ記録された.4.細胞膜電位をー60mVに固定し,アセチルコリン(ACh)を投与するとすぐに脱感作する内向き電流が記録された.この反応はヘキサメソニウムにより遮断されることから,ニコチン受容体を介する反応である.5.細胞膜電位を0mVに固定し,AChを投与すると時間経過の長い内向き電流が観察された.この反応はアトロピン投与あるいはGDPーβsの細胞内投与により消失した.6.パッチクランプ電極内のEGTA濃度を下げ,細胞内Ca濃度の緩衝作用を低下させ,0mV固定下でAChを投与すると外向き電流が記録された.この反応はK平衡電位で反転することからK電流であることがわかった.このK電流はアトロピンの投与もしくはGDPーβsの細胞内投与により消失した.以上の結果より,モルモット副腎髄質細胞は神経細胞と類似した性質のチャネルが存在する興奮性細胞であることが示された.ムスカリン受容体刺激により外向きK電流と内向き電流が発生し,両反応にはGタンパク質の関与が示唆された.現在,さらにこのムスカリン受容体刺激による反応の解析を行っている.
分裂酵母を用いたGTP結合蛋白質の細胞内局在化と機能制御メカニズムに関する研究

本研究は、細胞内で合成された低分子量GTP結合蛋白質の各分子量が、機能を発現すべき形質膜、ER、ゴルジ装置、分泌装置などの細胞内コンパートメントへ輸送・局在化されるメカニズムを明かにすることを目的としている。このためのモデルシステムとして、我々は分裂酵母(Schizosaccaromycespombe)を用いた。研究初年度においては、まずrasl蛋白質について生化学的解析を行った。その結果、他種生物のras蛋白質と異なり、GDPに対する結合定数がGTPに対するそれよりもかなり大きな値を示すことが明かになった。また、従来この蛋白質の精製は極めて困難であるとされていたが、その原因が蛋白質の表面吸着性に伴う不安定性に原因のあることを明かにした。また、分裂酵母から、G蛋白質を下流に持つレセプター蛋白に共通な膜貫通ドメイン構造をもつ新たな遺伝子pdh1を単離した。最終年度においては特に輸送・局在化のための重要なステップであるイソプレニル化メカニズムの解明に焦点を当てた。まず、ras蛋白質の翻訳後修飾に必要と思われるファルネシル転移酵素(FTase)の部分精製を行い、詳細な速度論的解析を行った。この解析には、初年度に開発した方法を用いた。イソプレニル化反応を触媒する酵素には、他に二種類のゲラニルゲラニル転移酵素が存在することが知られている。これら三種の酵素は基質蛋白質のC末端配列を認識するといわれているが、今回の解析から、分裂酵母のFTaseが示す基質特異性は、基質に対する親和性よりはむしろ反応速度定数の値そのものの差によることを明らかにした。この点については、今後さらに競合実験等により検証を進める予定である。また、FTaseは、一倍体、二倍体酵母、窒素飢餓、非飢餓条件下で発現レベルに変動は見られないことを明らかにした。本研究では、分裂酵母のGTP結合蛋白質を解析の対象とするが、研究開始時にこれらの蛋白質に対する知見は皆無であった。そこで、まず代表的なras蛋白質について生化学的解析を行った。その結果、これまでに知られている他種生物のras蛋白質と異なり、GDPに対する結合定数がGTPに対するそれよりもかなり大きな値を示すことが明かになった。また、従来この蛋白質の精製は極めて困難であるとされていたが、その原因が蛋白質の表面吸着性と不安定性に原因のあることを明かにした(論文準備中)。つぎに、GTP結合蛋白質が細胞内で局在化するために必要な翻訳後修飾反応をin vitroで再構成する作業を開始し、翻訳後修飾の最初のステップであるイソプレニル化反応を、以下の手順で再構成している。まず、各種GTP結合蛋白質のC末端側10残基に相当するオリゴペプチドを合成し、それらを基質に用いてインプレニル化反応を高感度に検出できる系を構築した。現時点に於て、少なくとも複数の異なる基質に対して異なる反応性を示すイソプレニル化活性を検出しており、その原因を究明中である。また、rasペプチドを基質とする酵素の大量精製を行っており、現在、アミノ酸配列を決定する作業が進行中である。一方、既に我々の手で構造解析が終っている、出芽酵母のイソプレニル化酵素遺伝子のホモログを分裂酵母からクローン化する作業を進めていたが、その過程でG蛋白質を下流に持つレセプター蛋白に共通な膜貫通ドメイン構造をもつ遺伝子pdh1を発見した。この遺伝子は分裂酵母の生育に必須であるという、レセプター蛋白質としては際だった特徴を持つユニークなものであることを明かにすることができている(論文準備中)。

本研究は、細胞内で合成された低分子量GTP結合蛋白質の各分子種が、機能を発現すべき形質膜、ER、ゴルジ装置、分泌装置などの細胞内コンパートメントへ輸送・局在化されるメカニズムを明かにすることを目的としている。このためのモデルシステムとして、我々は分裂酵母(Schizosaccaromyces pombe)を用い、今年度は特に輸送・局在化のための重要なステップの一つであるイソプレニル化のメカニズムの解明に焦点を当てた解析を行った。まず、この反応に関与する酵素群のうちras蛋白質の翻訳後修飾に必要と思われるファルネシル転移酵素(FTase)の部分精製を行い、詳細な速度論的解析を行った。この解析には、昨年度の研究で開発した方法を用いたが、基質には細胞内局在部位と被修飾部分のアミノ酸配列が異なるペプチドを用い、相互に比較検討を行った。イソプレニル化反応を触媒する酵素には、他に二種類のゲラニルゲラニル転移酵素が存在することが知られている。これら三種の酵素は基質蛋白質のC末端配列を認識するといわれているが、今回の解析から、分裂酵母のFTaseが示す基質特異性は、基質に対する親和性よりはむしろ反応速度定数の値そもものの差によることを明らかにした。この点については、今後さらに競合実験等により検証を進める予定である。分裂酵母のras蛋白質は、接合と胞子形成の誘導に必要なシグナルを伝達する経路で機能することが知られている。ファルネシル化酵素はその機能発現に必要な酵素であるが、一倍体、二倍体酵母とも特に発現レベルに差は見られず、また窒素飢餓、非飢餓条件下でも大きな変動は見られいことを示した。以上の結果は、ファルネシル転移酵素がras蛋白質以外の蛋白質の翻訳後修飾にも必要なあることを示唆するものである。
MeAIB-PETを用いたアミノ酸イメージングによる新たな腫瘍診断法の確立

2018年度はMeAIBを脳腫瘍診断に応用するために先行研究を行っている研究者や連携研究者と適宜ミーティングを行い、具体的な研究内容について情報収集を行った。特に血液脳関門を通過しない本薬剤の特性は、腫瘍のグレーディングや再発予測の診断に有効であるという先行研究者の結果は本研究を推進する上で有意義な情報であった。今後も連携研究者と密に情報交換をして、有意義な研究プロトコールを模索していきたい。2017年度末からは、特定臨床研究法施行に伴う倫理審査のあり方が変更になり、当施設での本研究の倫理審査が事実上ストップした。提出した書類について何度となく臨床研究支援センターに問い合わせるも倫理審査の方法についての当施設としての方針が立つまで待機するようにと、具体的な指示が無いまま約1年が経過した。現在のところ、当施設での倫理審査の手続き方法について明確な方針が立っていない状態が続いている。2018年度末となり、臨床研究支援センターの担当者が交替し議論を重ねてきた結果、他施設での同様の研究に当施設が連携施設として加えてもらい、その後に当施設の倫理委員会に諮ることが可能かもしれないという結論に至った。たまたま、連携施設である滋賀県立総合病院研究所がすでに倫理委員会を通過して先行研究を行っており、これに組み入れていただくことで本問題が解決できるのではないかと考えた。現在、滋賀県立総合病院研究所の倫理委員会に当院を連携研究者として加えていただく手続きを行っている。研究課題に用いる新しいPETトレーサーであるMeAIBの合成方法が確立されたため、2017年12月院内製剤依頼を経て、2018年1月院内の未承認・禁忌・適応外医薬品等評価室の許可を得た。2018年2月、院内倫理委員会に臨床研究申請書を提出したが、「個人情報保護法等」改正を受けた2018年度からの「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」の改正に基づき、当研究が特定臨床研究に該当すると判断され、東京女子医科大学での当研究の倫理委員会審査がストップした。2018年4月以降の審査再開を待ったが、大学としてどの様な道筋で特定臨床研究の倫理審査を行うかの方針が立たず、明確な回答が得られないまま1年が経過した。2019年4月現在、特定臨床研究の審査方法については大学としての方針が依然立っていない状態である。今後、他施設の臨床研究に組み込んでもらい倫理委員会の承認を得る方法を、臨床研究支援センターと相談しながら進めて行く方針である。当院脳外科の手術件数を勘案すると、倫理委員会の承認を得研究が開始されれば目標症例数にはまだ到達できる可能性がある。C-11標識メチルAIBの薬剤合成について、先行研究者である滋賀成人病センターの加川信也先生、国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構の東達也先生、西井龍一先生のご指導とご協力を頂き、滋賀成人病センターに出張して実施訓練とカンファレンスを行った。既存の合成装置に適した合成方法の選定と合成プログラムの作成を行ったが、合成プログラムを検討、作成する上で、メチルトリフレートの合成、前駆体との反応、HPLC分析条件の最適化などにほとんど経験がなかったため、カンファレンスやアドバイスは非常に重要であり、これらを参考に検討を重ねた。2017年秋の核医学会でもミーティングを行い、合成の過程の詳細について検討を繰り返し、最終的に、3ロット試験の[11C]MeAIBの全合成時間は約32分で、合成収率は約34%となり、目標としていた文献と同等以上の合成時間と合成収率を達成することができた。2018年1月にはほぼ臨床に用いることのできるレベルで薬剤の合成に成功し、院内製剤使用および適応外使用の許可を得るため各委員会に書類を提出した。院内での薬剤使用については許可が下りたものの、「個人情報保護法等」改正を受けた、今回の「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」の改正により、「前向き介入研究」についての倫理委員会審査がストップしており、現在棚上げの状態である。審査の再開、もしくは他施設での審査を受審する道筋がつけば、当院倫理委員会の方針に従って早急に臨床研究を開始する予定である。薬剤合成までの過程は当初予定していた進捗であったが、院内製剤の使用許可、適応外使用の許可、倫理委員会の申請の準備に手間取り、本年4月の法改正の影響で、最終的な倫理委員会の審査が棚上げされた状態である。当院倫理委員会の審査方法について、速やかに道筋がつけられることを期待する。

2018年度末となり、臨床研究支援センターの担当者が交替し議論を重ねてきた結果、他施設での同様の研究に当施設が連携施設として加えてもらい、その後に当施設の倫理委員会に諮ることが可能かもしれないという結論に至った。たまたま、連携施設である滋賀県立総合病院研究所がすでに倫理委員会を通過して先行研究を行っており、これに組み入れていただくことで本問題が解決できるのではないかと考えた。現在、滋賀県立総合病院研究所の倫理委員会に当院を連携研究者として加えていただく手続きを行っている。研究課題に用いる新しいPETトレーサーであるMeAIBの合成方法が確立されたため、2017年12月院内製剤依頼を経て、2018年1月院内の未承認・禁忌・適応外医薬品等評価室の許可を得た。2018年2月、院内倫理委員会に臨床研究申請書を提出したが、「個人情報保護法等」改正を受けた2018年度からの「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」の改正に基づき、当研究が特定臨床研究に該当すると判断され、東京女子医科大学での当研究の倫理委員会審査がストップした。2018年4月以降の審査再開を待ったが、大学としてどの様な道筋で特定臨床研究の倫理審査を行うかの方針が立たず、明確な回答が得られないまま1年が経過した。2019年4月現在、特定臨床研究の審査方法については大学としての方針が依然立っていない状態である。倫理委員会の審査を受け研究の実施が認められ次第、臨床研究を開始する。今後、他施設の臨床研究に組み込んでもらい倫理委員会の承認を得る方法を、臨床研究支援センターと相談しながら進めて行く方針である。当院脳外科の手術件数を勘案すると、倫理委員会の承認を得研究が開始されれば目標症例数にはまだ到達できる可能性がある。MeAIB合成プログラムを検討、作成する上で、メチルトリフレートの合成、前駆体との反応、HPLC分析条件の最適化などにほとんど経験がなかったため、先行研究者のアドバイスを得ながら収率を上げるのに時間を要した。また、院内製剤使用、適応外使用について院内での申請手続きに予想外に時間がかかり、倫理委員会申請が現在やっと行えた状態である。症例に薬剤を投与して実際に研究を開始できれば、それらに材料費や物品費がかかるが、依然開始困難な状態である。院内倫理委員会の手続きの遅れから臨床研究そのものがスタートできていないため。
顕微イメージング・エリプソメーターの開発

対物レンズの後側焦点面で収束する光を用いて、顕微イメージング・エリプソメーターを構築した。一方、円錐プリズムを用いて発生した収束リング光を用いた場合、CCDのセンサ面に試料表面を結像することは困難であった。また、対物レンズに並行光を入射し、後側焦点面における射出光強度分布をCCDで測定する顕微エリプソメーターを構築し、偏光解析パラメーターΨおよびΔ、ならびにミューラー行列を求め、合わせて対物レンズおよびビームスプリッターの影響を推定した。第1に、顕微イメージング・エリプソメーターに用いる光学系の設計を行った。対物レンズの入射光と射出光をビームスプリッターで分離する光学系を採用した。ビームスプリッターを反射および透過する際に、それぞれ強度が半減するが、光軸調整が容易で機械的振動に強い。第2に、NA0.95の対物レンズAおよびNA1.4の油浸型対物レンズBの特性を調べた。まず、対物レンズの前に平面ミラーを設置し、平行光を対物レンズに入射し、ミラーで反射し対物レンズより射出した光が平行となるようにミラーの位置を調節し、対物レンズAおよびBの入射瞳径は射出光の径からそれぞれ約6.8mmおよび約5.0mmと判明した。次に、収束光を対物レンズの入射口の中心に入射し、射出光が収束するように対物レンズの位置を調節し、そのときの対物レンズの位置と光の収束位置から、対物レンズAおよびBの入射瞳の位置は対物レンズの先端からそれぞれ約31.0mmおよび約25.0mmと判明した。また、入射瞳において収束光を入射する中心からの距離と射出する光の角度はアッベの正弦条件を満たすことを確認した。第3に、基本となる顕微光学系を構築した。まず、対物レンズの前に試料を設置し、平行光を対物レンズに入射し、試料表面で反射し対物レンズより射出した光が平行となるように試料の位置を調節し、射出光をレンズによってCCDに結像し明瞭な像を得た。次に、収束光を対物レンズの入射口の中心に入射し、射出光が収束するように対物レンズの位置を調節し、対物レンズの前に試料を設置し、試料表面で反射し対物レンズより射出した光が光軸に対し平行になるように試料の位置を調節し、射出光をレンズによってCCDに結像し明瞭な像を得た。さらに、入射光学系を平行移動し、入射瞳の中心から離れた位置に収束光を入射し、射出光学系の位置を調節することにより、射出光をCCDに結像し明瞭な像を得た。1.顕微イメージング・エリプソメーターの構築(1)明るく正確な照明の実現:顕微光学系において、分光した白色光を用いてケーラー照明(※1)を行った場合、伝送用光ファイバのコア径を0.2mm以下にすると、十分な光の強度が得られないことが判明した。一方、光源としてレーザーダイオード(波長650nm)を用いたところ、CCDの画像にはスペックルノイズが現れるが、焦点位置を正確に合わせることによりノイズをほぼ消失させることができた。これにより、測定に十分な光強度で、入射角の明確なケーラー照明を実現した。※1対物レンズの入射瞳面で収束する光を入射することにより、対物レンズを通して試料に一定の角度で照明を行う方法。(2)装置の構築と測定実施:前記の顕微光学系の照射側に偏光子および液晶可変位相遅延子(LCVR)を、検出側に第2偏光子(検光子)を設置した。LCVRの遅延度を変化させながらCCDの画像を測定し、強度変化の正弦成分Rsおよび余弦成分Rcを抽出した。RsおよびRcを解析することにより、試料として用いたシリコン基板表面における偏光解析パラメーターの分布を求めた。これらの分布には強い干渉縞が現れていたが、ビームスプリッターをキューブ型からプレート型に変更することにより、干渉縞を消失させることができた。2.リング光の発生(1)リング光発生に必要な円錐状プリズムを設計・試作し、(2)並行光を円錐状プリズムに入射し、レンズで集光することにより、リング状収縮光の発生を確認した。3.ズーム機構の開発(1)1対のコーン型ミラーを設計・試作し、(2)コーン型外側ミラーに対し、内側ミラーを対物レンズと共に機械的に駆動するズーム機構を製作した。(3)ズーム機構にリング状収束光を入射することにより、対物レンズを通して試料で反射し、再び対物レンズを通してズーム機構より射出するリング状収束光を観測した。1)円錐状プリズムにより発生させたリング状収縮光を1対のコーン型ミラーからなるズーム機構を通して対物レンズに入射し、試料で反射し対物レンズから射出したリング光をCCDに入射したが、CCDのセンサ面で試料表面の像を結ばせることができなかった。

2)偏光子および位相遅延子によって生成した偏光を対物レンズに入射し、対物レンズの後側焦点面における射出光の強度分布をCCDで測定した。まず、偏光子および検光子の方位角の4種類の組み合わせ毎に計4回、位相遅延子を回転させながら一定角度おきにCCDで測定を行った。それぞれの測定の平均光強度をさらに平均することにより、総平均光強度画像を得た。これを規格化に用いることにより、測定した画像から装置的なノイズを除去した。3)射出光の輪郭線を識別するため、総平均光強度画像のグラディエントを計算し、分水線法を用いて周囲との相対的な輝度の違いによる識別を行い、さらに円でフィッティングした。一定の入射角および方位角毎に同心円状のセクタを規定し、CCDの1画素を10×10に分割した小画素を前記セクタに帰属した。4)偏光素子を一定の方位角に設定して測定を行った。総平均光強度画像で規格化したのち、前記同心円状のセクタにおいて、CCD画像の画素の輝度を、帰属した小画素の数に応じて積算し、DC成分、cos2φ成分、およびcos4φ成分を求め、計数ΨおよびΔを算出した。計算値との比較から対物レンズの光学特性を算出した。入射角が大きくなると共に対物レンズの影響が増大する傾向およびその特性値は先行研究と一致した。
ウィルス様カーゴカプセル固定化基板によるセルトランスフェクションアレイの開発

本研究は、薬剤内包ウイルスカプセルを基板へ固定化してセルトランスフェクションアレイを作り、薬剤高速スクリーニングや特定細胞における網羅的な遺伝子機能解析が可能なシステムを構築することを目的としている。これまでに申請者は、ウイルスのタンパク質のみから形成されるウイルスカプセルの高い標的性と細胞導入率に着目し、薬剤キャリアーとして使用するために、カプセル内部に機能性タンパク質を内包する手法を見出してきた。ウイルスカプセルをより実用的なキャリアーとするために、内包した薬剤を任意の場所で選択的に放出させる機構の構築が求められている。そこで当該年度では、目的分子を取り込んで刺激に応答して放出する機能をウイルスカプセルに付加し、薬剤キャリアーとしての可能性を広げることを目的とした。ウイルスカプセルに6つのヒスチジンからなるhis-tagを導入することで、特異的かつ可逆的な薬剤分子の結合と、pH低下にともなった放出が可能となることを明らかにした。また、薬剤モデル分子を担持させて細胞へ作用させると、細胞に取り込まれた後に細胞内において分子を放出することを示した。これらの結果は、副作用を抑えた効果的な治療のために重要な薬剤送達システムや、薬剤高速スクリーニングを可能とするセルマイクロアレイにおけるウイルスカプセルの薬剤キャリアーとしての有用性を他に先駆けて見出したという点で重要性が高い。多くの遺伝子機能や相互作用を網羅的かつハイスループットに解析する技術として、セルトランスフェクションアレイが注目されている。遺伝子などの薬剤を培養基板上に固定化し、そこへ細胞を播くだけで薬剤が細胞内に導入されるこの手法は、細胞が生きた状態のまま、多種類の遺伝子やタンパク質等の機能を同時に迅速かつ簡便に観察することができるという点で非常に重要な手段だが、その方法・技術に関しては未開発であり、基板への固定化薬剤も核酸だけに限られていることが多かった。そこで本研究では、ウイルスタンパク質が自己集合したナノスケールのウイルスカプセルに薬剤を内包して基板へ固定化し、新規セルトランスフェクションアレイを作製することを目的とした。ウイルスカプセルに、核酸だけでなくタンパク質やこれまで固定化が難しかった低分子などの薬剤を内包することで、複数の薬剤を同時に細胞に導入することができ、多種類の遺伝子やタンパク質の複合機能解析が可能となるものと期待される。まず、大腸菌発現系でウイルスカプセルを作製し、CsClを使った密度勾配遠心法によって精製した。ウイルスカプセルはシアル酸に特異的に結合するため、糖転移酵素を用いてシアル酸を提示したポリマーを合成し、そのポリマーを介して基板への固定化を行った。その結果、シアル酸提示ポリマーを吸着させた基板には何も処理していない基板よりもウイルスカプセルの固定化量が増大することがわかった。次に、可視化のためにFITCで修飾したウイルスカプセルを同様に基板へ固定化し、その上で細胞を培養した。フローサイトメトリーや共焦点顕微鏡で観察を行ったところ、基板に固定化したウイルスカプセルの細胞内への導入が確認された。遺伝子機能や相互作用を網羅的かつハイスループットに解析する技術として、セルトランスフェクションアレイが注目されている。遺伝子などの薬剤を培養基板上に固定化し、そこへ細胞を播くだけで薬剤が細胞内に導入されるこの手法は、細胞が生きた状態のまま、多種類の遺伝子やタンパク質等の機能を同時に迅速かつ簡便に観察することができるという点て非常に重要な手段だが、その方法・技術に関しては未開発であり、基板への固定化薬剤も核酸だけに限られていることが多かった。ここでは特に、ウイルスカプセルへのタンパク質薬剤の内包技術について報告する。ウイルスカプセルを構成するタンパク質は大腸菌内でリコンビナントに発現させるため、様々なペプチドやタンパク質を融合させることができる。そこで、ウイルスカプセルを形成する主要コートタンパク質VP1に加え、そこに結合可能なサポートタンパク質VP2をアンカーとして用いることで、カプセルへの目的タンパク質の内包を行った。薬剤モデルタンパク質として緑色蛍光タンパク質(GFP)をVP2のN末端に融合し、大腸菌でVP1との共発現を行ったところ、GFPのウイルスカプセルへの内包に成功した。GFP内包ウイルスカプセルの蛍光・構造特性評価には、蛍光相関分光法(FCS)を用いた。FCS測定から、ウイルスカプセルの中には約9個のGFP分子が内包されていることが示唆された。

これらの結果は、副作用を抑えた効果的な治療のために重要な薬剤送達システムや、薬剤高速スクリーニングを可能とするセルマイクロアレイにおけるウイルスカプセルの薬剤キャリアーとしての有用性を他に先駆けて見出したという点で重要性が高い。
活動銀河核の広帯域観測による銀河ブラックホール同時進化仮説の検証

前年度に引き続き、Swift衛星BAT望遠鏡によるサーベイで見つかった活動銀河核の分光観測プロジェクト(BAT AGN Spectroscopic Survey, BASS)を進めた。広域X線スペクトルを系統的に解析し、ブラックホール周囲の高温コロナの温度が、エディントン比(ブラックホール質量で規格化した光度)が大きいほど低くなることをつきとめた(Ricci et al.)。また、WISE衛星とHerschel衛星で得られた中間遠赤外線スペクトルを解析し、AGN由来の光度を星生成成分から分離して決定した(Ichikawa et al.)。全天X線監視装置(MAXI)搭載ガススリットカメラ(GSC)が2009年から2016年の7年間にわたって取得したデータを解析し、高銀緯領域におけるX線カタログを完成させ、ApJ誌に出版した(Kawamuro et al.)。カタログは682天体を含み、4-10 keVバンドを含む全天X線探査カタログとして過去最高の感度を達成している。二重AGNをもつ高光度赤外線銀河Mrk 463のNuSTAR衛星による硬X線データを解析した。Mrk 463Eが高いエディントン比をもつこと、またそのトーラスが「埋もれて」はいないことをつきとめた(Yamada et al.)。本年度は、BASSプロジェクトの推進、ChandraによるSXDS領域のX線カタログの作成、MAXI GSCカタログの作成、NuSTARによる二重AGNをもつ高光度赤外線銀河の観測、ROSATとWISEを用いた活動銀河核の探査と、広い研究テーマで多くの成果を出すことができたといえる。さらにBASSプロジェクトを進め、京都大学「せいめい」望遠鏡を使った追求観測を行う。また、AGNクランピートーラスからのX線スペクトルモデルを、近傍AGNの広域X線データに系統的に適用し、トーラス構造に制限を与え、赤外線で得られている結果と比較する。NuSTAR衛星による高光度赤外線銀河の観測とデータ解析を継続し、中心核の構造を統一的に理解する。Swift衛星BAT望遠鏡による全天硬X線サーベイで見つかった活動銀河核の分光観測プロジェクト(BAT AGN Spectroscopic Survey, BASS)を進めた。近傍宇宙にある400天体以上の1型・2型活動銀河核に対し、広輝線の幅または星の速度分散から、ブラックホール質量を導出することに成功した。今後の研究の基本となる、X線スペクトルカタログと可視分光データカタログの第一版を、ApJS誌に出版した(Ricci et al., Koss et al.)。これらのデータベースを用いて、隠された活動銀河核の割合、すなわちブラックホールを覆うガスの立体角が、エディントン比(ブラックホール質量で規格化した光度)と強い逆相関を示すことを発見し、Nature誌に報告した(Ricci et al.)。この事実は、活動銀河核からの輻射フィードバックが、ブラックホール周囲の構造に大きな影響を与えていることを示唆している。NuSTAR衛星で観測されたコンパクト銀河群HGC 62の硬X線データを解析し、そこに含まれる二つの相互作用銀河のトーラス構造に制限を与えた。また、銀河円盤での星形成率とブラックホールへの質量降着率に強い相関がないことを確認した(Oda et al.)。ALMAによるGOODS-S領域の無バイアスサーベイ(ASAGAO)で見つかったミリ波銀河のカタログと、同領域のChandra衛星による深サーベイデータをマッチングさせることで、赤方偏移1-3にある星形成銀河中の活動銀河核を探査した。その結果、超高光度赤外線銀河の90%が活動銀河核を有することを発見した(Ueda et al.)。本年度は、BASSプロジェクトの推進、「すざく」による埋もれた活動銀河核の広域X線スペクトルの解析、NuSTARによる相互作用銀河の観測、ALMAとChandra衛星を用いた遠方星形成銀河からの活動銀河核の探査と、広い研究テーマで多くの成果を出すことができたといえる。さらにBASSプロジェクトを進め、X線と赤外線の光度相関をより詳細に調査する。

京都大学「せいめい」望遠鏡を使った追求観測も開始する。また、活動銀河核のトーラス構造を解明するため、クランピートーラスからのX線スペクトルモデルを完成させ、近傍の活動銀河核の実データに適用する。NuSTAR衛星による高光度赤外線銀河の観測とデータ解析を継続し、星形成とブラックホール成長の関係を調査する。さらにBASSプロジェクトを進め、京都大学「せいめい」望遠鏡を使った追求観測を行う。また、AGNクランピートーラスからのX線スペクトルモデルを、近傍AGNの広域X線データに系統的に適用し、トーラス構造に制限を与え、赤外線で得られている結果と比較する。NuSTAR衛星による高光度赤外線銀河の観測とデータ解析を継続し、中心核の構造を統一的に理解する。スケジュールの折り合いがつかず、海外出張の回数が予定より減ったことと、購入を予定していた備品(計算機)を、大学予算で賄うことができたため。繰り越した使用額は、次年度に追加で行う予定の海外出張旅費および論文投稿費に当てる予定である。海外出張の回数が予定より減ったため。
肺腺癌発生過程において上皮極性異常を引き起こす原因と機構の解明

本研究の目的は肺癌細胞の形態異常の原因を、細胞膜リン脂質(PIP3(3,4,5))の挙動の変化を手がかりにし解明することである。昨年度までの研究で、不死化気道上皮細胞にKRASがん遺伝子を導入することで、細胞形態の紡錘状変化を示すこと、上皮間結合の形成に不安定化が生じていることを明確にした。また、不死化気道細胞における細胞膜リン脂質の挙動を蛍光プローブ(PH domain-EGFP fusion)導入によって解析した結果、低細胞密度条件下では葉状仮足部に、高細胞密度条件下では上皮間結合部へ集積することを明らかにした。本年の研究では、蛍光プローブを導入した不死化気道細胞にKRASがん遺伝子、PIK3CAがん遺伝子の導入を行い、細胞膜リン脂質の挙動と細胞形態の観察・解析を行った。これらのがん遺伝子の導入によって、低細胞密度条件下では多数の仮足状突起物の形成と同部への細胞膜リン脂質の集積が観察された。一方、高細胞密度条件下では上皮間結合形成が不規則になり、細胞膜リン脂質は結合部以外の部位にも点状に散在する像が観察された。更に、KRASやPIK3CAが活性化状態にある数種のがん細胞株(TKB2,H358,H460)に蛍光プローブの導入を行い、細胞形態と細胞膜リン脂質の挙動を観察した結果、がん遺伝子導入不死化細胞と類似し、低細胞密度条件下では多数の仮足状突起物の形成と同部への細胞膜リン脂質の集積、高細胞密度条件下では上皮間結合形成の不規則性と細胞膜リン脂質の斑点状の集積像が観察された。これらの結果から、KRASあるいはPIK3CAの活性化を介した細胞膜リン脂質の異常な蓄積が、がん細胞の形態異常(異型性)を引き起こす原因と一機構であることが示唆され、申請期間内に当該研究目的の大凡は達成された研究経過中にhTERT導入のみで不死化した気道上皮細胞が得られたため、分子細胞生物学的な性質を検討した結果、核型は49XY(+5,+9,+i20)で、p53遺伝子変異、p16発現消失を伴っていた。同細胞は、培地(defined-keratinocyte SFM, Invitrogen)の増殖因子添加物(EGF+KGF+insulin)および足場に依存的な増殖形式を示し、カルシウムイオン濃度1.8mMの培養条件下でE-cadherinによる上皮間結合を介したシート状の単層構築を形成した。以上、明らかな悪性形質を示さず、上皮構築形成能を保持した細胞であり、肺癌細胞の悪性化に伴う上皮構築異常(構造異型)の原因・機構を研究するうえで有用であると考え、同細胞に変異型k-rasV12の導入を行った。結果、1)細胞形態の紡錘状変化、2)増殖因子添加物非存在化でのコロニー形成、3)トランスウエルチャンバーアッセイにおける細胞移動活性の亢進、が観察されたが、4)軟寒天内でのコロニー形成はみられなかった。また、K-rasV12導入細胞は、5)カルシウムイオン濃度1.8mMの培養条件下(48時間観察)においてもE-cadherinを介した上皮間結合形成が不安定であり、培養皿上で盛んな運動性を示した。以上より、肺癌の発生・進展過程において、K-ras遺伝子変異は、肺癌細胞に増殖優位性や浸潤性増殖能を与えると同時に、構造異型を来す一因である可能性が示唆された。また、同不死化細胞に蛍光プローブを導入し上皮間結合形成過程における細胞膜リン脂質(PIP3(3,4,5))の局在を観察した結果、上皮間結合部位への集積を認め上皮構築形成への関与が示唆されたが、その生物学的意義や、K-rasV12の影響については16年度の研究においては明確にするに至らなかった。

これらの結果から、KRASあるいはPIK3CAの活性化を介した細胞膜リン脂質の異常な蓄積が、がん細胞の形態異常(異型性)を引き起こす原因と一機構であることが示唆され、申請期間内に当該研究目的の大凡は達成された