hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ノックアウトマウスを用いたアストログリアーサブセットの機能解析

<目的>中枢神経系が損傷を受けると,反応性アストログリアが増殖してグリア瘢痕を作る.このグリア瘢痕が中枢神経の再生を抑制していると考えられている.反応性アストログリアではtenascinが高発現していることから,本研究ではtenascin knockout mouse(TN/KO)を用いてtenascinを発現していないアストログリアの機能について検討することを目的としている.本年度は,マウスの脳に損傷を与え,一定時間経過後に脳の切片を作成し,損傷部位におけるグリオシスおよび創傷治癒の状態について,野生型(WT)マウスとTN/KOで比較検討した.<方法>成体のマウスをネンブタールで腹腔内麻酔し,頭頸部の皮膚を切開し27Gの針を用いて大脳皮質に尾側から吻側にかけて尖刺した.尖刺後1,3,7日目にエーテル麻酔を行ってから,4%PFAを用いてかん流固定したのちに脳を取り出し,翌日,15%sucroseに移し替えて一晩浸潤を行い,凍結切片を作成した.アストログリアの増殖・グリオシスについては抗GFAP抗体を用いて免疫染色法で検討した.<結果と結論>尖刺して3? 7日目にはWTではGFAPの発現は十分高かったのに対して,TN/KOでは3日目にはGFAPの発現が認められたが,7日目にはほとんど発現が認められなかった.このことは,TN/KOではグリオシスがWTよりも早期に終了することが考えられ,逆に言えば,グリオシスを活発に引き起こすには,脳内のアストロサイトがテネイシンを発現していることが必要であると思われた.今後,損傷部位周辺の創傷治癒について検討していく予定である.以上の結果は,日本神経科学会(7月,名古屋),IBRO(7月,Prague, Czech),SFN(11月New Orleans, USA),日本分子生物学会(12月,神戸)において発表を行った.<目的>中枢神経系が損傷を受けると,反応性アストログリアが増殖してグリア瘢痕を作る.このグリア瘢痕が中枢神経の再生を抑制していると考えられている.反応性アストログリアではtenascinが高発現していることから,本研究ではtenascin knockout mouse(TN/KO)を用いてtenascinを発現していないアストログリアの機能について検討することを目的としている.本年度は,マウスの脳に損傷を与え,一定時間経過後に脳の切片を作成し,損傷部位におけるグリオシスおよび創傷治癒の状態について,野生型(WT)マウスとTN/KOで比較検討した.<方法>成体のマウスをネンブタールで腹腔内麻酔し,頭頸部の皮膚を切開し27Gの針を用いて大脳皮質に尾側から吻側にかけて尖刺した.尖刺後1,3,7日目にエーテル麻酔を行ってから,4%PFAを用いてかん流固定したのちに脳を取り出し,翌日,15%sucroseに移し替えて一晩浸潤を行い,凍結切片を作成した.アストログリアの増殖・グリオシスについては抗GFAP抗体を用いて免疫染色法で検討した.<結果と結論>尖刺して3? 7日目にはWTではGFAPの発現は十分高かったのに対して,TN/KOでは3日目にはGFAPの発現が認められたが,7日目にはほとんど発現が認められなかった.このことは,TN/KOではグリオシスがWTよりも早期に終了することが考えられ,逆に言えば,グリオシスを活発に引き起こすには,脳内のアストロサイトがテネイシンを発現していることが必要であると思われた.今後,損傷部位周辺の創傷治癒について検討していく予定である.以上の結果は,日本神経科学会(7月,名古屋),IBRO(7月,Prague, Czech),SFN(11月New Orleans, USA),日本分子生物学会(12月,神戸)において発表を行った.目的:本研究では、損傷を受けた中枢神経の再生を促進する方法の開発を目的としている。損傷部位に出現する反応性アストログリアにはテネイシン陽性のサブセットと陰性のサブセットがあり、前者が中枢神経の再生に対して抑制的、後者が促進的に作用し、後者によって突起伸展が誘導されることがin vitroの系で明らかにされてきている。本研究では、テネイシンノックアウトマウス(以下、TN-C K/Oマウスと略す)の中枢神経系に損傷を与え、再生の進行状態や再生を阻害するグリオシスの状況を野生型マウスに損傷を与えた場合と比較検討しながら、再生時におけるテネイシンの機能を明らかにしようとしている。その準備段階として、本年度はTN-C K/Oマウスの胎児より幼若アストログリアの初代培養系を作成し、野生型マウスから調整した幼若アストログリアの初代培養系との違いを免疫組織学的に検討した。方法:TN-C K/Oマウスの胎生15.5-17.5日目の胎児脳より幼若アストログリア初代培養系を2週間かけて作成した。アストログリアのマーカー抗体であるGFAPを始め、laminin、fibronectin、condoloitine sulfate-6-proteoglicanあるいはin situ hybridization法などを用いて、幼若アストログリアの性状を明らかにした。結果と今後の計画:TN-C K/Oマウスから調整した幼若アストログリアの初代培養系においても、野生型マウスから調整した幼若アストログリアの初代培養系においても、どのマーカーも十分量発現しており、両者で同じ結果が得られた。このことは、TN-C K/Oマウスにおいて、テネイシンが生体内で発現していないために他の分子が異常に発現したりしていることはないということを示している。

今後、このTN-C K/Oマウスを用いて脳損傷部位の再生の進行状況について、野生型マウスの場合と比較検討を行いたい。目的:中枢神経を損傷した際に、テネイシンを高発現する反応性アストログリアが出現する。本研究では、テネイシンノックアウトマウス(TN/KO)を用いて、中枢神経系に損傷を与えた時に、アストログリアにおいてテネイシンが発現しない場合の神経の再生に対する効果を検討しようとしている。昨年度は、TN/KOの胎児より調整したアストログリアの初代培養系について、免疫組織化学的なアプローチをしてアストログリアの性状を検討した。本年度は、昨年度のデータをふまえて、実際に、マウスの脳に損傷を与えて損傷部位周辺における因子の発現などを検討した。方法:TN/KOマウスの胎生15.517.5日目の脳より幼若アストログリアの初代培養系を作成し、常にアストログリアのマーカー抗体であるGFAPを用いて、性状を明らかにしながら実験を進めた。また、成体マウスの脳の大脳皮質領域に吻側方向から尾側方向に向かってハミルトンを用いて穿刺して損傷を与えた。前額断の凍結連続切片を作成し、免疫染色を行った。結果と今後の展望:通常、野生型のマウス胎児より調整したアストログリアの初代培養系では、長期培養した場合には、単層の敷石状の細胞集団の中に、rocky astrocyteと呼ばれる盛り上がった細胞集団が出現する。一方、TN/KOの胎児より調整したアストログリアの初代培養系では、培養フラスコ中で長期培養を行うと、単層保ったままでrochy astrocyteは出現せず、細胞同士が接触した場合でもアストログリアの姿を保っており、敷石状にはならなかった。また、野生型成体マウスにおける損傷脳マウスの系は、ハミルトン穿刺部位周辺でGFAPやテネイシンの発現が上昇しており、すでに報告されている結果と良い一致が見られた。損傷を与える部位や解析するタイミングをつかめたので、今後は、TN/KOを用いて損傷脳実験を行う予定である。<目的>中枢神経系が損傷を受けると,反応性アストログリアが増殖してグリア瘢痕を作る.このグリア瘢痕が中枢神経の再生を抑制していると考えられている.反応性アストログリアではtenascinが高発現していることから,本研究ではtenascin knockout mouse(TN/KO)を用いて,tenascinを発現していないアストログリアの機能について検討することを目的としている.本年度は,マウスの脳に損傷を与え,一定時間経過後に脳の切片を作成し,損傷部位におけるグリオシスおよび創傷治癒の状態について,野生型(WT)マウスとTN/KOで比較検討した.<方法>成体のマウスをネンブタールで腹腔内麻酔し,頭頸部の皮膚を切開し,27Gの針を用いて大脳皮質に尾側から吻側にかけて尖刺した.尖刺後1,3,7日目にエーテル麻酔を行ってから,4%PFAを用いてかん流固定したのちに脳を取り出し,翌日,15%sucroseに移し替えて一晩浸潤を行い,凍結切片を作成した.アストログリアの増殖・グリオシスについては抗GFAP抗体を用いて免疫染色法で検討した.<結果と結論>尖刺して37日目にはWTではGFAPの発現は十分高かったのに対して,TN/KOでは3日目にはGFAPの発現が認められたが,7日目にはほとんど発現が認められなかった.
高度に自己組織化されたメタラマクロサイクリックの精密合成と機能

対アニオンの異なる前駆Cu(I)錯体と,4,4'-ビピリミジン関連配位子を用いて,11種の新規なCu(I)-{配位高分子・メタラマクロサイクリック}-{エチレン,カルボニル}付加体を合成し,その生成過程における対アニオンならびに合成溶媒の役割を系統的に明らかにした。これら新規化合物は,いずれも数少ないアニオンレセプターとなりうることが期待される。また,自己組織化されたCu(I)-{エチレン,カルボニル}付加体を単離・単結晶化できたことは,化学吸着サイトの構築や触媒作用の発現などへの展開も期待できる。C2H4およびCO雰囲気下MeOH溶液中,{BF4-, ClO4-あるいはPF6-}を対アニオンとするCu(I)イオンと6,6'-ジメチル-4,4'-ビピリミジン(Me2bpm)を反応させると,3つの二次元シート構造を有するCu(I)-Me2bpm/{C2H4, CO}付加体である[Cu4(Me2bpm)3(C2H4)3(MeCN)](BF4)4.0.33MeOH}n (1), {[Cu4(Me2bpm)3(C2H4)3(MeOH)0.33](ClO4)4}n (2), {[Cu4(Me2bpm)3(CO)3(MeCN)](PF6)4.0.33MeCN}n (3),および4核Cu(I)-Me2bpm/CO付加体である[Cu4(Me2bpm)4(CO)4](BF4)4.4MeOH (4)が生成した。錯体1, 2および3において注目すべきことは,[Cu3(Me2bpm)3]3+骨格を有するメタラカリックス[3]アレン構造がMeCNあるいはMeOHが配位した別のCu(I)イオンにより繋げられて小さなCu3空孔と大きなCu9空孔を有するキラルな二次元シート構造を形成され,小さなCu3空孔内には錯体1ではMeOHが錯体3ではMeCNが取り込まれ,さらに錯体1, 2および3の大きなCu9空孔の上方には1つの対アニオンがCu9空孔の下方には3つの対アニオンが機能的に取り込まれている。一方Cu(I)-Me2bpm/CO付加体4は,4つのBF4-アニオンのうちの2つが[Cu4(Me2bpm)4]骨格の上方および下方に取り込まれている。以上,昨年度の結果に加えて本年度はbpmの類縁配位子であるMe2bpmを用いて,二次元シート構造を有するCu(I)配位高分子ならびメタラマクロサイクリック-{C2H4, CO}付加体がアニオンおよび溶媒選択的に自己集積化できることを明らかにした。初年度の4,4'-ビピリミジン(bpm),昨年度のその誘導体である6,6'-ジメチル-4,4'-ビピリミジン(Me2bpm)に加えて,本年度は新たに関連配位子として4,4'-ビキナゾリン(biqz)を合成し,同様の実験を行なった。エチレン雰囲気下,メタノール中,[Cu(MeCN)4]X (X=BF4 or PF6)とbiqzを反応させると,銅(I)配位高分子{[Cu4(biqz)2(MeCN)4(MeOH)4](BF4)4}n(1)および{[Cu4(biqz)2(MeCN)8](PF6)4}n (2)が得られた。錯体1および2はいずれも,2つのCu(I)イオンが2つのbiqzに橋かけされ,14員環Cu4C6N4骨格を形成し,さらにこのCu4C6N4骨格が別のbiqzにより連結されることより,一次元二重鎖構造を形成していることを明らかにした。一方,エチレン雰囲気下,アセトン中,[Cu(C2H4)n]ClO4とbiqzを反応させると,エチレンが付加したCu(I)配位高分子{[Cu2(biqz)(C2H4)2](ClO4)2.Me2CO}n (3)が得られた。錯体3は錯体1および2とは異なり,Cu(I)イオンにはbiqzの2個のN原子と1分子のC2H4が配位し,さらにこのCu(I)イオンが別のbiqzにより橋かけされることより,一次元ジグザグ鎖構造を形成していることを明らかにした。このように対アニオンの異なる前駆体を用いることにより,アニオンおよび合成溶媒選択的にCu(I)配位高分子の構造制御が可能であることを実例で示した。エチレン下,アセトン中,[Cu(C2H4)n]

NO3と4,4'-ビピリミジン(bpm)を反応させると,一次元ジグザグ鎖構造を有するCu(I)-bpm/C2H4付加体[Cu2(bpm)(C2H4)(NO3)2]n (1)が生成した。同様に[Cu(C2H4)n]ClO4あるいは[Cu(MeCN)4]BF4とbpmをエチレン下,アセトン中で反応させると,一次元はしご型構造を有する{[Cu3(bpm)2(C2H4)2](ClO4)3}n(2)および{[Cu3(bpm)2(C2H4)2](BF4)3}n (3)が生成した。錯体2および錯体3において興味深いことは2つのClO4-あるいはBF4-アニオンがはしご型構造の内部空孔内に取り込まれていることである。一方,エチレン下,メタノール中において,[Cu(MeCN)4]BF4とbpmを反応させると二次元Cu(I)-bpm/C2H4付加体{[Cu4(bpm)3(C2H4)3(MeOH)](BF4)4}n (4)が生成した。錯体4において興味深いことは3つのCu(I)イオンが3つのbpmにより橋かけされ,メタラカリックス[3]アレン構造が形成され,さらにこれらが他のCu(I)に繋げられることより,キラルな二次元シート状構造が形成し,小さなCu3コア内には1つのBF4-アニオンが,大きなCu3コアの中には3つのBF4-アニオンが取り込まれている。さらにアルゴン下,メタノール中で[Cu(MeCN)4]BF4とbpmを反応させた後,エチレンを通気し,常温で放置すると,錯体4とは異なり,その空孔内にSiF62-アニオンを取り込んだキラルな三次元Cu(I)-bpm錯体{[Cu3(bpm)3](SiF6)1.5}n (5)が生成した。これらの結果に基づき,アニオンおよび溶媒選択的に多核Cu(I)-エチレン付加体が自己集積化できることを実証した。配位子1(Me2bpm)を用いて、新規に4つの関連化合物を合成し、その結果を学術論文として報告した。また配位子4および5の合成ができたので、次年度これらを用いて錯体合成を行なう準備がほぼできた。予備的実験段階にあった化合物15について,学術論文として投稿し掲載することができた。また目的としていた配位子合成について,収率が低いものの最終段階まで、本年度中にその合成まで,たどりつくことができた。配位子4および5を用いて錯体合成を行ない、その構造および性質を明らかにすると共に、C60などの取り込みなどの実験を行ない、最終年度としてすべての実験結果をまとめる。配位子合成の収率を向上させると共に,錯体合成に着手し,その構造および性質などを明らかにする。該当なし試薬,溶媒,器具などの消耗品を購入する。また国内外での研究発表,測定,研究調査などの旅費として使用する。
重度脳障害児における認知機能獲得の発達神経心理モデルと指導プログラムの策定-脳画像診断による発達予測を超えた事例の指導経過の遡及的分析による検討-

本研究は,過去15年間に蓄積してきた諸資料の遡及的分析により,重障児の対人認知機能獲得に関する神経心理学的モデルを定式化し,これに基づいた指導・援助の実践的枠組みを提起することを目的とした.対象児は(1)先天性水頭症や高度の低酸素脳症など発症(受傷)が胎児期及び周生期で,(2)X線CTなどの脳の構造的側面に関する画像診断所見によって障害が皮質水準のみならず皮質下脳幹部にも及んでいることが指摘されている者4人である.遡及的分析を試みた行動的,生理心理学的データは,(1)各種聴覚刺激の実験的呈示場面,(2)援助者による日常的かかわり場面,(3)指導場面の三種である.得られた主要な知見は以下の通りである.(1)10年15年間の生活経験を通して,健常乳児で確認された心拍反応発達モデルに沿った変化が人関連刺激で認められた.これは,重篤な脳の構造的病変からは当初予想できなかった点であり,脳機能の可塑性の高さを示している.(2)行動観察上では,「反応がない,乏しい」状態に大きな変化は見られない.しかし,(1)の情報が援助者に伝えられることによって,次第に微細な変化を援助の手掛かりにできるようになり,働きかけ一反応間の因果関係の理解が進む.つまり,覚醒水準を高め"よい状態(state)"に導入し,指導を行うという一連の流れの中で,より効果的なタイミングで働きかけが実行できるようになり,それにより手掛かりにすべき行動的変化をさらに的確に把握することができる.(3)重篤な脳障害事例への援助に関して,従来は働きかけ(刺激)の強さと量(反復)に目が向けられてきたが,本研究で得られたこれらの結果は,日常の人的かかわりという文脈性(質)を重視すべきことを示したものである.本研究は,過去15年間に蓄積してきた諸資料の遡及的分析により,重障児の対人認知機能獲得に関する神経心理学的モデルを定式化し,これに基づいた指導・援助の実践的枠組みを提起することを目的とした.対象児は(1)先天性水頭症や高度の低酸素脳症など発症(受傷)が胎児期及び周生期で,(2)X線CTなどの脳の構造的側面に関する画像診断所見によって障害が皮質水準のみならず皮質下脳幹部にも及んでいることが指摘されている者4人である.遡及的分析を試みた行動的,生理心理学的データは,(1)各種聴覚刺激の実験的呈示場面,(2)援助者による日常的かかわり場面,(3)指導場面の三種である.得られた主要な知見は以下の通りである.(1)10年15年間の生活経験を通して,健常乳児で確認された心拍反応発達モデルに沿った変化が人関連刺激で認められた.これは,重篤な脳の構造的病変からは当初予想できなかった点であり,脳機能の可塑性の高さを示している.(2)行動観察上では,「反応がない,乏しい」状態に大きな変化は見られない.しかし,(1)の情報が援助者に伝えられることによって,次第に微細な変化を援助の手掛かりにできるようになり,働きかけ一反応間の因果関係の理解が進む.つまり,覚醒水準を高め"よい状態(state)"に導入し,指導を行うという一連の流れの中で,より効果的なタイミングで働きかけが実行できるようになり,それにより手掛かりにすべき行動的変化をさらに的確に把握することができる.(3)重篤な脳障害事例への援助に関して,従来は働きかけ(刺激)の強さと量(反復)に目が向けられてきたが,本研究で得られたこれらの結果は,日常の人的かかわりという文脈性(質)を重視すべきことを示したものである.
光電子移動を制御する励起複合体系の設計

電子供与体と受容体の間にみられる光電子移動はcontact ion pair(CIP)solvent separated ion pair(SSIP)及びfreeion(FI)の三種の状態から反応をおこす。それぞれ異る反応性を示すので、各段階の反応生成物を同定し、その反応状態を制御することにより光電子移動反応を制御する系の確立を目指す。次の三種の系を検討し注目すべき結果を得た。(1)トリシアノベンゼン-2,3-ジメチルブテンの系において、直接Exciplexを経る系では1,3-付加により環状化合物を与えるが(CIPを経る反応)、メディエ-タを用いることによりFIを経る反応が強調され置換生成物を与えることを明らかにした。(2)テトラアルキルシリコン、ゲルマニウム、錫やポリシラン類は電子供与体として働き、テトラシア、ベンゼンの光アルキル化を行う新反応を発見した。このときラジカル時計としてトリメチル(5-ヘキセニル)誘導体を用いると中心金属に依存して生成する環状化合物/直鎖化合物の比が変化した。メディエ-タ-を用いた時の比85/15を基準に用いるとSiでは55%、Geでは40%、Snでは16%がCIPから反応するものと解される。光電子移動反応では始めてSn2的な二分子置換反応の証明がえられたことにも連なり、注目すべき結果である。(3)メディエ-タ-を用いる光反応によりカチオンラジカルを作らせ、ついて単分子分解反応でC-C結合を切断する方法を確立した。この方法は気相における電子衝撃で生成する分子イオンの単分子分解反応と類似しており、マススペクトロメトリ-ミメチック反応と呼べるであろう。N,N-ジメチル-2,2-ジフェニルエチルアミン-ジシアノアントラセンの系がその典型である。
異種臓器移植や麻疹ウイルス感染予防への応用を指向した低分子型補体制御因子の設計

Membrane Cofactor Protein (MCP)は、自己細胞を補体攻撃から保護する制御膜蛋白質であると同時に、麻疹ウイルスのレセプターでもある。本研究では、医薬への応用可能な低分子型MCPを設計するために、MCPの機能部位の解明を進め、以下の3点に要約される研究成果を挙げることが出来た。1:MCPのSCRの機能部位MCPの細胞外領域には、アミノ酸60残基からなる4個のShort Consensus Repeat(SCR)ドメインが連続している。遺伝子工学的な手法を駆使することにより、i;SCR1,2は麻疹ウイルス感染に不可欠な領域である、ii;SCR2,3は古典的経路を介する補体活性化の制御に不可欠である、iii;SCR3,4は第二経路を介する補体活性化の制御に不可欠である、ことを明らかにした。2:MCPのST領域によるMCPの機能制御MCPのSCRドメインには、Ser/Thrに富む領域(ST)が接続する。STには、構造の異なるA,B,Cの3種類があり、ST^<A-B-C>,ST^<B-C>,ST^Cの3タイプが臓器特異的に発現している。麻疹ウイルス感染性と古典的経路の阻害活性に関しては、ST^C>ST^<BC>>ST^<ABC>の順になり、その長さと反比例した。一方、第二経路の阻害活性に関しては、逆にSTのサイズが大きくなるほど阻害活性が強くなることが明らかになった。3:麻疹ウイルス感染性におけるMCPの膜貫通領域の重要性MCPの膜貫通部を欠損させ、脂質膜にGPIアンカー型として発現させた場合には、麻疹ウイルス感染性を示さなかった。これは、麻疹ウイルスの細胞内侵攻には、膜貫通部の構造が不可欠なことを意味している。1:補体制御因子,MCP,の構造と機能の解析MCPと呼ばれる補体制御因子は麻疹ウイルスレセプターでもある。MCPの細胞外領域は、4個のSCRドメインとセリン-トレオニンに富む領域(ST-領域)とからなる。このST-領域には長さの異なる3種類があるが、その長さと補体制御活性や麻疹ウイルスレセプター活性との関連性については明らかでなかった。遺伝子工学的に3種類のST-領域のMCPを細胞膜に発現させ、両活性を比較した。その結果、i)麻疹ウイルスレセプター活性は、ST-領域の長さに反比例して弱くなる、ii)補体制御活性はST-領域の長さに比例して強くなることが明らかになった。2:ハイブリッド型補体制御因子(MCP-DAF)の設計補体制御因子として、MCPの他にDAFと呼ばれる膜蛋白質も存在する。この2種の制御因子のハイブリッド型は臓器移植に活用できると考えられる。そこで、遺伝子工学的にMCPのC-末端側にDAFを接続させたMCP-DAFハイブリッド分子を細胞膜に発現させ、補体制御効果を比較検討した。その結果、MCP-DAFハイブリッド分子は、DAF,MCP単独よりは強い制御活性を示すことが確認された。3:ヒト補体制御因子を発現したブタ血管内皮細胞のヒト補体抵抗性の解析ヒト補体制御因子、MCP,DAF,MCP-DAF,の遺伝子をブタ血管内皮細胞に導入し、これらの蛋白質を発現させ、ヒト補体抵抗性を検討した。これらヒト型制御因子を発現したブタ血管内皮細胞はヒト補体に対して抵抗性を示し、特にMCP-DAF,DAFが最も効果的であることが明らかになった。本研究プロジェクトでは、MCPに焦点をしぼり、下記のような成果をあげた。1)補体制御因子、MCP、における麻疹ウイルスレセプター部位の解析MCPは、同種補体活性化を制御する膜蛋白質であるほかに、麻疹ウイルスのレセプターでもある。

MCPの細胞膜外領域は、4個のSCRと呼ばれるドメインとS-T領域と呼ばれる糖鎖の結合したドメインとからなる。遺伝子工学的に4個のSCRを順に1個ずつ削除した変異型MCRのcDNAを作製し、ハムスター細胞に強制発現させ、麻疹ウイルスレセプターとして必須な領域を解析した。また、S-T領域についても3種類の長さの異なる変異型の存在することが知られているので、それぞれのサイズのS-Tドメインを組み込んだMCPを同様にハムスター細胞に発現させた。その結果、麻疹ウイルスのレセプターとしては、SCR1,2の二つが必須であることが判明した。また、S-Tドメインのサイズが長くなると、麻疹ウイルス感受性が低下することも判明した。2)可溶型MCPが癌患者血清中に増加する可溶型MCPは健常者血清にも検出されるが、癌患者血清では健常血清の300%もの高値を示すことが判明した。また、健常血清の可溶型MCPは30kDaと低分子型であるが、癌患者血清のMCPは55kDaがメジャーであった。この高分子可溶型MCPは、新たな癌検出マーカーとして用いられる可能性を示唆する。Membrane Cofactor Protein (MCP)は、自己細胞を補体攻撃から保護する制御膜蛋白質であると同時に、麻疹ウイルスのレセプターでもある。本研究では、医薬への応用可能な低分子型MCPを設計するために、MCPの機能部位の解明を進めてきた。本年度は、以下の研究成果を挙げることが出来た。1 : MCPは麻疹ウイルス感染に伴い発現数が減少する麻疹ウイルスが宿主細胞に感染すると、MCPの発現数が減少することを見いだした。さらに遺伝子工学的な手法を駆使することにより、その発現数減少(ダウンレギュレーション)には、MCPの細胞内領域の膜に近い部位の配列が重要なことを明らかにした。2 : MCPの膜貫通部位の機能MCP-麻疹ウイルス複合体が宿主細胞の中へと取り込まれると、複数の感染細胞が凝集体を形成する。この凝集体の形成には、膜貫通部位が不可欠であることを、細胞工学的な手法により証明した。3 :サルの麻疹ウイルス受容体もMCPである麻疹ウイルスはヒト以外にもサルにも感染する。ワクチン用の麻疹ウイルス株はサルの細胞株(Vero)を用いて継代培養されているがその受容体の構造に関しては明らかでなかった。ヒトcDNAをプローブに用いて、Vero細胞からMCPをコードする遺伝子を分離し、その構造がヒトMCPと90%近い相同性を示すことを明らかにした。さらに、サルMCPを発現したハムスター細胞には、麻疹ウイルスが強く感染することも証明した。
外科的矯正治療を必要とする反対咬合患者の構音障害とその構音訓練について

外科的矯正治療を必要とする反対咬合患者を対象に、外科的矯正治療後の構音障害の経過と構音訓練の必要性、有効性について検討を行った。術前には、反対咬合のみの症例では、反対咬合の程度が重い症例に歯間音が多く発症していたが、反対咬合のみの症例よりも反対咬合と開咬をあわせもつ症例がoverjetの値に関わらず、歯間音が多く発症する傾向がみられた。術後は開咬を伴う症例が少ないので、術前ほどはっきりしてはいないが、開咬が残存した症例には構音正常に改善した症例はないこと、術後開咬が改善された症例に著しい構音障害が正常になった症例があったことなどから、開咬が歯間音の発症に影響することが示唆された。術後の経過の中では、構音訓練による構音の改善が少なくても全体の40%の症例に認められた。このことは、咬合の改善の得られた術後にあってもなお歯間音は存在すること、そしてその習慣化された歯間音は構音訓練によって改善が得られることがわかった。歯間音はせっかく改善された咬合の状態を後戻りさせる舌の動きでもあることから考えると、歯間音そのものが会話を不明瞭にさせるものではないとしても、構音訓練の意義は大きいといえる。反対咬合患者における構音障害が外科的矯正治療後、どのような経過をたどるものなのか、聴覚的印象で問題になる構音障害だけでなく、聴覚的印象ではあまり問題にならない構音操作上の誤りをも含め構音障害は無視して良いものか、あるいは構音訓練の必要性があるのか、その必要性があるとすればどのような構音訓練が必要なのか、術前治療が必要なのか、あるいは形態の改善後でなければ有効性はないのかなどを明らかにする目的で平成11年4月より外科的矯正治療を予定している症例に言語検査を行った。言語検査は「会話明瞭度」および「構音」について行った.「会話明瞭度」については自由会話と音読による方法を用い、構音については「音節、単語、短文、会話」の系統的な検査を行った.検査の結果、「会話明瞭度」は聴覚的印象による5段階評価を行い「構音」については聴覚的印象を音声表記で記録した.構音検査時には音声録音を行い、構音時の顎・顔面の正面倒面デジタルビデオ録画も同時に行った.ビデオ録画に際しては舌の位置と咬合の状態がよく観察できるように注意を払った.聴覚的印象として問題になる構音障害の他、聴覚的には問題にならない構音操作上の誤りを示す症例が少なくなかった.いずれの構音障害についても本人の自覚の有無は様々であった.構音障害と咬合の状態や歯牙の状態との関連については、資料をコンピューターに取り込み、今後さらに検討を行う予定である.反対咬合患者の構音障害が外科的矯正治療後、どのような経過をたどるのかを明らかにする目的で、本年度は引き続き、外科的咬合改善手術を予定している症例と外科的咬合改善手術後の症例に言語検査と画像分析を行った。言語検査は昨年度と同様に「会話明瞭度構音」について検査し、構音時の音声を録音するとともに、構音操作の際の舌や顎の運動をデジタルビデオに記録した。構音についての「音節、単語、短文、会話」の系統的な検査の結果、外科的咬合改善手術を予定している症例、手術後の症例のいずれにも、聴覚的印象として問題となる構音障害として「側音化構音」などが認められ、聴覚的に問題にならない構音操作上の誤りを示す構音障害として「歯間音化構音」が認められた。いずれの構音障害についても本人の自覚の有無は様々であった。本人の自覚があり、構音訓練を希望した症例については構音訓練を行った。構音訓練に際しては「聴覚的印象ではあまり気にならない構音操作上の誤りを含め、構音障害は無視して良いものか、あるいは構音訓練の必要があるのか、その必要性があるとすればどのような構音訓練が必要か、形態の変化との関連を明らかにする」などの目的で、構音訓練前の構音および構音操作について記録、分析を行った。特に歯間からの舌の突出、下顎の移動などについて外科的咬合改善手術前と後、構音訓練

前と後の変化に注目し、今後さらに検討する予定である。反対咬合患者の構音障害が、外科的矯正治療後どのような経過をたどるのかを明らかにする目的で、本年度は引き続き、外科的咬合改善手術を予定している症例と外科的咬合改善手術後の症例に言語検査と画像分析を行った。外科的咬合改善手術を行った後も構音に改善がみられなかった症例については構音訓練を行い、その経過を記録した。言語検査は昨年度と同様に「会話明瞭度と構音」について検査し、構音時の音声を録音するとともに、構音操作の際の舌や顎の運動をデジタルビデオに記録した。構音についての系統的な検査の結果、「側音化構音」「歯間音化構音」などが多く認められたが、いずれの構音障害についても本人の自覚の有無は様々であった。本人の自覚があり、構音訓練を希望した症例については構音訓練を行ったが、「歯間音」症例では、咬合が改善されているにも関わらず、下顎に連動して舌が出てしまう術前の癖が、静止時ではなく構音時に舌を出す症状として残存する症例が少なくなかった。舌の大きさというよりは構音操作としての運動回路の問題と推察される場合が多かった。「側音化構音」症例も含め、「構音の変化と形態の変化との関連を明らかにする」目的で、今後さらに検討する予定である。反対咬合患者の構音障害が、外科的矯正治療後どのような経過をたどるのかを明らかにする目的で、本年度は外科的咬合改善手術症例の術前術後の言語検査を行い、それぞれの構音検査時の画像分析、音声分析を行った。また術後に構音訓練を希望した症例には構音訓練を行い、その経過をデジタルビデオに記録し、構音操作の際の舌の動きや顎の運動を記録した。術前の構音検査では、その多くに「歯間音化構音」「側音化構音」が認められた。歯間音については、反対咬合の程度が重症なほど歯間音化の頻度が高かった。「側音化」については、咬合の程度との関連は「歯間音化」ほど明らかではなかった。障害音に対する本人の自覚は様々であり、非常に軽度の歯間音を気にする場合もあり、重い側音化構音を呈していても、本人や周りが気にしていない場合もあった。術前に「歯間音化構音」を認められた症例の多くは、手術によって咬合が改善されても、構音操作の習慣化によって歯間音化は残っており、構音訓練によって早期に改善がえられた。
破壊的イノベーション論とプラットフォーム論を統合したデジタル戦略論の展開

本研究は、情報通信技術(ICT)進展によるデジタルコンテンツ流通や端末機器のコモデイテイ化等が促進する産業構造の変化および事業者間協働形態の変化を捉えうるレイヤー戦略論の展開を目的にするものである。このレイヤー(構造)とは、階層構造を持つ製品・サービスあるいは産業構造を差す概念である。レイヤー戦略論はプラットフォーム戦略やエコシステム論からの最新知見を基にして、バリューシステム(事業者間をまたがる価値連鎖)と利用者側から見た製品・サービス全体構造の双方からの鳥敵と分析を可能とする理論として発展させることを目指している。
胆嚢がん最多発国チリにおける本症発生に関わる遺伝的感受性の解析

チリにおける胆嚢がんの発生に関わる遺伝的感受性の検討を病院ベース症例対照研究(コントロール群99名、患者群:胆石症患者144名、胆嚢がん患者65名)を用いて行った。胆石形成、カプサイシン代謝、及び薬物代謝酵素などに関する遺伝子多型の頻度分析を行った結果、チリ女性では、アポ蛋白Bの変異T/T型(P=0.010, OR : 0.14, 95%CI : 0.03-0.63)とコレステロールエステル輸送タンパク質の変異T/T型(P=0.012, OR : 5.04, 95%CI : 1.43-17.8)の存在が胆嚢がん発生と関係していることが示唆された。胆嚢がん多発国チリにおける本症発生の成因解明研究で明らかにされた環境要因(胆石症に加えて赤唐辛子の高摂取)に対する遺伝的感受性の差を解明するためチリ共同研究者と以下の研究を行った。1.DNA抽出のための試料採取:平成20年2月末までにチリ共同研究者が勤務するSotero del Rio病院において患者群(胆嚢がん患者42例、胆石症患者122例)と対照者群(同病院で外科手術を受けた胆石と悪性腫瘍を有しないヘルニア、及び下肢静脈瘤患者62例)の血液標本又はパラフィンブロック標本を採取した。目標とした胆嚢がん患者100例、胆石症患者200例、対照群200例の試料採取が不可能であったためさらに平成20年11月まで延長して試料採取を行うこととした。2.DNA抽出:チリで入手した試料を冷凍状態で日本に持ち帰り、血液標本は自動核酸抽出装置、パラフィンブロック標本は専用の抽出キットを用いてDNA抽出を行った。今後、胆石形成関連遺伝子、カプサイシン代謝関連遺伝子、及び日本とハンガリーの胆嚢がん成因解明研究で明らかにされた薬物代謝関連遺伝子や細胞周期に関する遺伝子多型の頻度を検討する予定である。3.アンケート調査:胆嚢がん患者、胆石症患者、及び対照者の生活習慣、食習慣に関するアンケート調査を行い、得られたデータをコンピュータ入力した。調査は、性、年齢、身長、体重、飲酒及び喫煙暦、職業、教育歴、赤唐辛子摂取を含む食品の摂取頻度、運動、胆嚢痛の期間、妊娠の回数などについて専門のスタッフが聞き取り調査を行った。チリにおける胆嚢がんの発生には、胆石の存在下で赤唐辛子摂取が関係していることが示されていることから、胆石形成と赤唐辛子の辛味成分であるカプサイシン代謝に関する遺伝子変異の頻度を調べ、胆嚢がん発生との関連を明らかにした。研究デザインは、病院べース症例対照研究で、コントロール群として99名(男性28名、女性70名)の胆石、癌非保有の下肢静脈瘤、或いはヘルニア患者、患者群として144名の胆石症患者(男性25名、女性119名)と65名の胆嚢がん患者(男性8名、女性57名)を対象とした。男性では、胆石症患者群に比べ胆嚢がん患者群のCYP1A1 rs4646903のC/T型とC/T+C/C型、及びCYP1A1 rs1048943のA/G+G/G型の頻度が有意に低かった。女性では、胆嚢がん患者群のApo Bの変異T/T型の頻度はコントロール群に比べ有意に低く、CETPの変異T/T型の頻度は胆石症患者群に比べ有意に高かった。これら以外の遺伝子多型の頻度には3群間の有意差は認められなかった。チリ女性では、CETPの変異T/T型は野生C/C型に比べ5.04倍高いオッズ比(95%信頼区間、1.43-17.8)を示したことから、T/T型の存在が胆嚢がん発生と関係していることが示唆された。
象牙質-レジン接合界面の構造解明に関する研究

象牙質-レジン接合界面の微細構造、特に樹脂含浸層の様相は用いられる材料と、生理学および病理学的な変化による象牙質の差異、さらにはin vivoまたはin vitro等の条件によって様々に異なってくることが明かとなり、接着強さと、レジン含浸層の形成状態との関連性についても多くのことが判明した。樹脂含浸層の形成に関して用いる材料として特に影響の大きい因子は、前処理剤の種類、処理時間、さらにはプライマー処理の有無等であり、これらは主として脱灰により露出したコラーゲン線維の層の厚さとその性状に影響するものでボンディングレジンの浸透性を左右することになる。被着体である象牙質側の因子としては、歯種、歯面、歯随までの距離、齲蝕や歯頸部磨耗症による変化、象牙細管の切断方向等で、象牙細管の封鎖や基質部の性状が異なるためにやはり脱灰深さや脱灰層の性状を左右するものとなる。またin vivo条件下では、細管を通して浸出してくる組織液の影響があり含浸層やボンディングレジンの強度にも大きく影響することが示唆された。さらに、脱灰層にレジンが十分に浸透していない場合には含浸層と下部の象牙質との間に辺縁漏洩の経路となりうる新しい層の存生が指摘された。こうしたことから、強力で耐久性のある接着を得るためには、脱灰層に十分にレジンが浸透してその下部の象牙質にまで到達して硬化することが必須で、そのためには、必ずしも厚い樹脂含浸層が必要とは限らないことが判明した。本研究により得られた知見をもとに、さらに優れた接着を得るための材料開発や技法の改良等を継続してゆく予定である。購入した透過反射両用光学顕微鏡を用いて,象牙質ーレジン接合界面の横断面試料を観察し,さらに走査型電子顕微鏡との併用により,接合部の超微細構造が明らかとなった。各構造物のアルゴンイオンに対するエッチングレ-トはそれぞれ異なり,また硬度にも差があることが判明した。これらの構造物のうちで,特に樹脂含浸層については,その形状や内部構造に様々な変化が認められた。すなわち,用いられる接着性レジン材料が異なると,樹脂含浸層の幅や内部構造に差が生じ,このような変化は,レジンの接着強さの成績との間に密接な関連があることが明らかとなった。特に各種の接着性プライマ-を使用することにより,前処理材による象牙質表面の脱灰層におけるコラ-ゲン線維の収縮が抑制されて,脱灰幅とほぼ一致して樹脂含浸層が形成され,その内部のコラ-ゲン線維の密度は,非脱灰象牙質のコラ-ゲン密度と同程度となることが確認された。一方,プライマ-を使用しない場合には,形成される樹脂含浸層の幅は脱灰層よりも小さくなり,内部のコラ-ゲン密度が高くなり,接着強さの低下の一因と考えられる。さらに,被着体となる象牙質の違いも,接合部界面の構造に変化をもたらすことが判明した。すなわち,一般に接着強さの高い,十分に成熟した歯牙における象牙質ではプライマ-を用いなくても脱灰層と一致した樹脂含浸層が形成されるのに対し,幼若な歯牙における象牙質に対しては,脱灰層よりも幅の小さい樹脂含浸層が形成された。このように被着体が異なる場合の接着強さの変化とも,接合界面の構造は密接に関係していることが示唆された。平成2年度に行なった、ヒト抜去歯における象牙質ーレジン接合界面の超微細構造の観察と同様、成猿の生活歯においても、用いる材料や被着象牙質の種類により樹脂含浸層の形状や内部構造に様々な差が生じることが明らかとなり、また、各種の接着性プライマ-を用いることにより、接合状態が大きく改善されることも確認されている。

こうした前処理や、プライマ-の効果については、特に象牙質コラ-ゲンについての生化学的な分析も行ない、接着性の発現機序についても明らかになりつつある。接着試験により界面破壊を生じた部位を側面より観察してみると、接着強さの優劣にかかわらず、どの材料を用いても樹脂含浸層が被着象牙質面上に残存しており、ボンディングレジンと樹脂含浸層の境界付近が弱点となり破壊が生じていることが判明し、樹脂含浸象牙質そのものの強度という点ではかなり優れていることが示唆された。さらにボンディングレジンの強度も接着性向上の為にはかなり重要な因子であることが示唆されている。接合界面を構成する各層の硬度測定やブロム付加レジンの浸透度の測定に関しては、層自体の厚さが十分でない場合の測定には技術的に若干困難な点もあるが、現在続行中である。また従来の前処理、プライマ-塗布、ボンディングという接着操作が大きく改善されると共に、その接着性能も大きく変わりつつあり、これらの新材料をも加えて上記の所見を遂次、学会発表を行ないながら現在検討を続行している。齲蝕象牙質第二層とレジンとの接合界面を観察したところ、窩底部においては、象牙質の構造変化に対応して、同一歯でも部位によって様々で、概ね三種類に大別されることが明かとなった。すなわち、細管が開いている場合には閉塞している部分に比べて、リン酸による管間象牙質の脱灰が深くなっており、細管内に円柱状の構造物が観察される場合には、管間象牙質が脱灰され管周象牙質が溶解しても、最内層は溶解せずに含浸層内に取り込まれていた。また管腔内が微細な結晶で封鎖されている場合には、表層の管周象牙質と細管内結晶が共に溶解消失することが判明した。齲窩の側壁部では被着面に対して象牙細管の走行が平行となっており、窩底部にように細管が横断された部よりも脱灰層の幅は極端に狭く、酸蝕剤の浸透経路として細管が重要な役割を果たしていることが示唆された。また歯頸部の硬化象牙質における接合界面の検討も行った結果、齲蝕象牙質における含浸層の幅はさらに狭くなっており、管間象牙質の構造が異なっていることが示唆された。ブロム付加レジンによるレジンの浸透度の検討が技術的に困難であったため硝酸銀を浸透させて辺縁漏洩を調べたところ、含浸層のように観察される部位でもボンディングレジンの含浸が不十分で辺縁漏洩の経路となるような新たな層の存在が明かとなった。新たに開発された試作新材料を用いた場合について従来の材料と比較してみると、含浸層の幅は1μmかあるいはそれ以下となっており、含浸層とその下部の下部の象牙質との境界部は不明瞭で連続的に移行し含浸層内のコラーゲン線維の横紋構造もより明瞭で前処理によるダメージも少ないことが透過電顕観察により判明した。
イオニクスナノ結晶をアッセンブルしたナノコンポジット反応場

1.メゾポーラスCeO_2ナノ結晶の作製(NH_4)_2Ce(NO_3)_6水溶液にアンモニア水を加えCeO_2ナノ結晶を作製し、それをPEO-PPO-PEOブロックコポリマー(P123)のエタノール溶液と混合し前駆体溶液とした。シリカガラス基板上に前駆体溶液をスピンコートし乾燥後、500°Cで焼成した。作製した薄膜では、CuKa線を用いたときに2q0.5°および0.9°付近にメソ孔の規則配列に起因する回折線が観測された。解析の結果、薄膜中ではメソ孔がCubicに規則配列したメソポーラス構造を有することが明らかとなった。広角領域のX線回折から、CeO2の粒径は約7nmであることが示された。昨年度のTEM観察の結果とあわせ、孔径約15nmのcubic型のメゾポーラスCeO2薄膜の作製に成功した。Ptコロイドとの複合化により、CeO2-Pt複合体からなるメソポーラス薄膜の作製を検討した。2. YSZおよびYDCナノ結晶の表面改質と緻密化代表者らがこれまで研究してきたホットソープ法では、結晶性の良いYSZ、YDCナノ結晶が合成できるが、その表一面がオレイルアミン(OLA)により覆われている。ナノイオニクス特性の研究に用いるために、表面OLAの除去と、ナノ結晶の超高圧プレスによる緻密化を検討した。YSZナノ結晶は800°C以下では粒成長が起こらなかった。酸素中650°Cでの熱処理によりOLAを酸化除去した粒径5nmのナノ結晶を得られた。得られたナノ結晶を6GPa、600°Cで超高圧プレスした。プレス後試料は黒く着色し、砕けていた。ラマンスペクトルの解析から、プレスによって高圧相への相転移が生じたと推察された。YDCナノ結晶を過酸化水素水とともに密閉容器に入れ、200°Cで3時間オートクレーブ処理することによってOLAを低減できることが見出された。代表者らが既に有するNiOナノ結晶とCeO_2ナノ結晶の混合コロイド溶液、コア/シェル型NiO/CeO_2複合ナノ結晶をそれぞれYSZ上に塗布し水素中800°Cで焼成し組織観察した。NiOナノ結晶とCeO_2ナノ結晶の混合コロイド溶液を出発とした場合は、NIO、CeO_2ともに数十nmの大きさにまで粒成長し目的とするナノコンポジットはできなかった。コア/シェル型NiO/CeO_2複合ナノ結晶を出発原料とした実験では、コアNiOの体積分率が5%程度と小さかったため、焼成後は大部分が緻密なCeO_2となった。実験結果より、ナノ結晶コロイドの単純な焼成では目的とするナノ構造は作製できないとの結論に達し、積極的なアッセンブルを行うため次の2を検討した。2.メゾポーラスCeO_2ナノ結晶の作製(NH_4)_2Ce(NO_3)_6水溶液にアンモニア水を加えCeO_2ナノ結晶を作製し、それをPEO-PPO-PEOブロックコポリマー水溶液と混合、乾燥後焼成する方法で、直径約20mmの空孔が規則的に並んだメゾポーラスCeO_2の作製を検討した。ブロックコポリマーを燃焼除去後の試料のTEM観察では、直径約20mmのメソ孔が確認できたが、メソ孔の規則配列に起因するX線回折は検出されず、規則的に並んだメソ孔は達成されなかった。溶液をガラス基板上にディップコートし、せん断応力を加えることによりメソ孔の配列を検討したが、今のところ達成されていない。3.エレクトロスプレー製膜装置を用いたナノ結晶のセミドライアッセンブルエレクトロスプレー装置を用いたコロイド溶液を出発とした成膜の準備として、成膜条件の最適化を行なった。この検討には成膜位置が目視により確認できる蛍光体微粒子を使用した。所望の位置に成膜できるように条件を検討し、装置の改良を行った。

ナノイオニクス特性の研究に用いるために、表面OLAの除去と、ナノ結晶の超高圧プレスによる緻密化を検討した。YSZナノ結晶は800°C以下では粒成長が起こらなかった。酸素中650°Cでの熱処理によりOLAを酸化除去した粒径5nmのナノ結晶を得られた。得られたナノ結晶を6GPa、600°Cで超高圧プレスした。プレス後試料は黒く着色し、砕けていた。ラマンスペクトルの解析から、プレスによって高圧相への相転移が生じたと推察された。YDCナノ結晶を過酸化水素水とともに密閉容器に入れ、200°Cで3時間オートクレーブ処理することによってOLAを低減できることが見出された。
日本語ピッチアクセントの音響的多次元性とその知覚における役割の解明

日本語の単語韻律はピッチアクセントという特徴を持ち、物理的には主に音の高低(基本周波数)で実現されるが、それ以外の音響特徴については具体的なことは分かっていない。一方、日本語以外では、音声の区別には複数の音響特徴が関与していることが分かっている。本研究では、1)アクセント型、2)発声法、3)母音の無声化、が日本語ピッチアクセントの音響特徴や聞き取りに与える影響を網羅的に検証し、日本語ピッチアクセントのもつ音響特徴を定量的に同定する。分類が難しいとされる日本語の単語韻律の詳細が明らかになると、研究の進んでいる他言語との比較が可能となり、音声言語の普遍性と個別性の解明に寄与することができる。
基底膜新コラーゲン鎖の構成する分子,会合体及び生物学的機能

マウスcol4a6遺伝子断片を単離するためにマウス129genomic libraryのスクリーニングを行った。その結果マウスcol4a6遺伝子断片TSg6(約18.3kb)を得た。これを詳細に解析すると、ヒトCOL4A6遺伝子に見られるようなalternative transcriptsは存在しないことがわかった。Col4a6遺伝子の発現停止マウスを作成するために、col4a6エクソン2のなかにNeoR遺伝子を挿入した形のvectorを作成し、ホモロガスリコンビネーションによって129Svマウス由来R1-ES細胞にトランスフェクションし、G418でスクリーニングしNeoR遺伝子陽性細胞を得た。ホモロガスリコンビネーションの判定はgenomic Southern-blottingによって行った。その細胞をC57BL/6胚盤胞に注入、DBF1擬妊娠マウス子宮に移入、キメラマウスの作成を行った。その後交配を繰り返し、heterozygote、homozygoteを得、現在その形質変化を観察する実験を行っている。また、col4a6遺伝子発現については特異抗体をもちいて免疫染色を行ったところ、陰性の結果を得ており、col4a6遺伝子の発現停止実験は成功した。α鎖特異抗体を用いて、分子構成としてα1/α2とα3/α4/α5/とα5/α6の三種があることを特異抗体を用いた免疫二重染色法によつて明らかにした。また、アルポート症候群に食道下部平滑筋症が合併する大変稀な症例を日本国内で見つけだし、詳細な解析を実施した。その結果、COL4A5遺伝子のイントロン1の一部、エクソン1、両遺伝子の遺伝子間部分、COL4A6遺伝子エクソン1'、イントロン1'、エクソン2、およびエクソン2、イントロン2の一部が欠失していることが判明した。また、その欠失部分は17kbに及ぶことがわかった。欠失の周辺にはトポイソメラーゼIおよびトポイソメラーゼIIコンセンサス配列が存在することが判明した。これらの配列は17kbにおよぶ大きな欠失が生じた際、それを修復するための機構と考えられる。新しいIV型コラーゲン分子の会合様式を明かにし、その超分子会合体が作る基底膜構造が、各々の臓器における基底膜の機能とどのような関係しているかを知る目的で、平成8年度は、これらの6遺伝子がどのように発現制御されて生合成され、基底膜を構築するか、また疾患の基底膜形成の異常のメカニズムを中心に解析した。具体的には、1)マウスCo14a6遺伝子発現調節機構の解析:α6(IV)遺伝子発現を見たところ、ホトとは異なって、択一的プロモーターで制御されている訳ではないことがわかった。2)Co14a6遺伝子発現停止ES細胞の作成:マウス遺伝子Co14a6断片にNeo-tk遺伝子を挿入し、エクソン2を除いたコンストラクトを作成し、ES細胞にトランスフェクションし、相同的遺伝子組換え法によってCo14a6 null alleleを得ることができた。現在ヘテロ接合体、ホモ接合体において、顕著な形質変化が現われるか否かの詳細な検索を行っている。3)IV型コラーゲン分子のα(IV)鎖構成と超分子会合体:α鎖特異的モノクローン抗体を用いた組織分布より、6α鎖が構成する分子種を推定することが出来た。

その結果、α1(IV)とα2(IV)、α3(IV)とα4(IV)とα5(IV)そしてα5(IV)とα6(IV)の3種類の分子種が存在すると思われる。このことは、α鎖特異抗体を用いた二重染色によって、また、アルポート症候群などの遺伝性の疾患の症例を用いて染色することによって確かめることが出来た。4)Alport症候群及びび慢性食道平滑筋腫の病因とα5(IV)及びα6(IV)遺伝子変異:入手したAlport症候群及びび慢性食道平滑筋腫合併例について、ゲノムDNA,リンパ球由来mRNAを用いてサザンブロット,SSCP,RT-PCRにより検索を試みた。その結果、COL4A5遺伝子のイントロンの一部、エクソン1、COL4A5とCOL4A6両遺伝子の上流部分、COL4A6遺伝子エクソン1′,イントロン1′、エクソン1、イントロン1、エクソン2そしてイントロン2の一部が欠失していることが判明した。IV型コラーゲンをコードする遺伝子構造がユニークであり遺伝子進化上極めて興味ある構造と発現様式を呈するが、分子のα鎖構成と組織分布と当該組織における機能との相関関係については解決されていなかった。今回、分子構成としてα1/α2とα3/α4/α5とα5/α6の三種があることを特異抗体を用いた免疫二重染色法によって明らかにした。さらに責任遺伝子がCOL4A5であるアルポート症候群の症例を用いた詳細な解析によって、同-分子を構成する場合、ひとつのα鎖が変異を示すと他のα鎖が細胞内で分解されることから、α3/α4/α5とα5/α6の構成分子が存在することが再確認された。さらに、アルポート症候群に食堂下部平滑筋症が合併する大変稀な症例をみつけだし、詳細な解析を実施したところ、COL4A5遺伝子のイントロン1の一部、エクソン1、両遺伝子の遺伝子間部分、COL4A6遺伝子エクソン1'、イントロン1'、エクソン2、およびエクソン2、イントロン2の一部が欠失していることが判明した。また、その欠失部分は17kbに及ぶことがわかった。欠失の周辺にはトポイソメラーゼIおよびトポイソメラーゼIIコンセンサス配列が存在することが判明した。これらの配列は17kbにおよぶ大きな欠失が生じた際、それを修復するための機構と考えられる。さらに、マウスにおいてCo14A6遺伝子発現停止を実験的に作成しその形質変化を観察する実験を行っている。これに関しては、形質変化を観察するためには積極的なストレスをマウスに付加することが必要かもしれないと考えている。