hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
デバイス応用に向けた2次元材料の電子物性の理論設計

昨年度までに、2次元材料であるグラフェン、六方晶窒化ホウ素、窒化炭素においてフェムト秒レーザーによる電場増強効果があることがわかり、本年度はレーザーによる水分子分解反応に必要なレーザーパワー閾値を2次元材料近傍にて2倍近くも下げることが出きることを時間依存密度汎関数理論によるシミュレーションで見出した。この結果はPhys. Rev. B誌に結果を掲載された。さらにカーボンナノチューブ近傍では、パワー閾値を4分の1にまで減少できることも見出し、現在論文執筆中である。これらの知見は、フェムト秒レーザーという光量の大きな光源による化学反応を増強する効果を2次元材料が有していることを強く示唆するものである。また2次元SSHモデルを層状に積層した系において電子状態やトポロジカル状態の解明を行った。されに、ARPESによる表面状態観測データ解析の高度化、自動化のため情報理論に基づく手法開発を行った。2次元SSHモデルを層状に積層したモデルの電子状態を計算し、ヒンジに局在した「トポロジカル・コーナー」状態を示した。2次元コーナーの角度を変えて、「トポロジカル・コーナー」状態が出現する角度を明らかにした。一般の多角形において、出現するコーナー状態の数とその条件を解明した。このモデルは、対称性を何も想定しないところに特徴があり、今年度幾つかのグループから提案があった結晶トポロジカル絶縁体のコーナー、ヒンジ状態とは異なる。原子層表面のARPES観測データ解析において、一方情報理論に基づいたモデル選択の手法を開発した。テストデータを用いて、ディラックコーンの有無を高精度で判別できることを例示した。29年度が最終年度であるため、記入しない。2D材料の光電場の応答特性から、ある周波数の光電場に対してその電場の増幅とTHZ変調効果があることを第一原理シミュレーションから見出し、THZ光源デバイスの一部に2D材料を用いることを提案した。この増幅・THZ変調を起こすには励起光周波数が2D材料の励起エネルギーと共鳴条件にあることが必須であり、可視光領域よりもUV領域の共鳴周波数において、光電場の増幅・変調効果が著しいことが分かった。背景となる物理は異なる周波数に対する励起間の干渉現象であると理解される。可視光領域では、励起強度の光周波数分布が広範囲にわたっており位相干渉による緩和が早く起きるので電場増幅には至らない。一方UV領域ではエネルギー幅の狭い領域に高い励起強度が集中しており狭い領域の周波数の干渉が起きるので電場増幅の後THZ周波数での電場変調が起きているものと理解される。また、グラフェン、ナノチューブを実用的な電子回路の一部に応用する際には、加工プロセスによってグラフェン端の終端やナノチューブの扁平化がおきることが考察される。そこで、端が閉じた2層グラフェンあるいは扁平したカーボンナノチューブに着目し、その電子状態の層間相互作用依存性を明らかにした。2層グラフェンを有効質量理論で取り扱い、2層の重なり方に依存する有効的な層間相互作用を導出した。閉じた端は有効的な境界条件により接続した1層グラフェンとして取り扱った。このような計算は、大規模な第一原理計算を実行することなくグラフェン・ナノチューブによる電子デバイス特性を予測することに有益である。今までは2D材料の光吸収と共鳴する周波数の光電場特性に着目していたが、レーザー発振装置側からみた実用性を考え固定された周波数(波長に換算して800nm)を持つパルス幅50fsのレーザー電場にたいしても増強効果がみられるか検証中。現在までに2D材料では元の電場の60%以上の増幅効果があることを見出し、2D材料を筒状にしたナノチューブ構造では2倍以上の増幅効果があることを見出した。また、予備的計算により、このような光電場増強効果は、レーザー場を利用した分子分解反応を促進することも分かってきた。レーザー装置と2D材料(ナノチューブ)を組み合わせた分子分解装置の構築への提案を準備中である。光周波数が固有の励起状態と共鳴条件にない場合でも増幅がみられることは、2D材料においては材料の分極効果、さらに筒状のナノチューブにおいては分極効果に加えて局面における電界集中効果があることで理解できる。また、端が閉じた2層グラフェンあるいは扁平したカーボンナノチューブについては、層間相互作用が重要となるアカイラルな構造の場合について詳しく調べた。すなわち、アームチェア型、ジグザグ型ナノチューブが扁平したとき層間相互作用は大きく、また2層のずれによって相互作用は大きく変化する。それに従い2層グラフェンの電子状態は半導体から金属へまた半導体へバンドギャップの開閉を伴い大きく変化する。これらの状態の上下層の波動関数は導出した境界条件によく整合し、閉じた境界の影響をほとんど受けないことを明らかにした。その結果対応する2層グラフェンのエネルギー分散関係を離散化したものとして概ね理解されつつある。

また2次元SSHモデルを層状に積層した系において電子状態やトポロジカル状態の解明を行った。されに、ARPESによる表面状態観測データ解析の高度化、自動化のため情報理論に基づく手法開発を行った。2次元SSHモデルを層状に積層したモデルの電子状態を計算し、ヒンジに局在した「トポロジカル・コーナー」状態を示した。2次元コーナーの角度を変えて、「トポロジカル・コーナー」状態が出現する角度を明らかにした。一般の多角形において、出現するコーナー状態の数とその条件を解明した。このモデルは、対称性を何も想定しないところに特徴があり、今年度幾つかのグループから提案があった結晶トポロジカル絶縁体のコーナー、ヒンジ状態とは異なる。原子層表面のARPES観測データ解析において、一方情報理論に基づいたモデル選択の手法を開発した。テストデータを用いて、ディラックコーンの有無を高精度で判別できることを例示した。光増幅効果を利用したデバイスアプリケーションを第一原理計算より提案する。増強された光電場による、2D材料付近の分子における光化学反応の促進の可能性や、貴金属ナノ粒子にかわる光増幅デバイスの可能性を第一原理計算によるシミュレーションで検証する。また、連携研究者は産総研と東北大学が共同で設立した数理先端材料モデリングオープンイノベーションラボラトリに異動し、数学、理論物理による材料開発の加速を目指した研究を行っている。具体的には、複雑原子構造と電気伝導度など材料機能の相関の解明、トポロジカルによる材料特性の分類を目指した研究などを推進してゆく。29年度が最終年度であるため、記入しない。
植物のポリアミンは光合成を促進し乾燥ストレス適応に役立っているのか

ポリアミン溶液が大気CO2を捕捉して溶液中に無機炭酸を濃縮すると,ルビスコのカルボキシレーション反応の基質となり光合成に貢献すると考えられる。前年度までは,光合成の炭酸固定回路を部分的に試験管内で再現し,NADHの減少速度から炭酸固定回路の進行速度を評価する方法で,ポリアミンの効果を間接的に検証してきた。本年度は,このプロセスを直接検証するため,ポリアミンにより溶液中に濃縮された無機炭酸から半精製のルビスコが生成する生成物を質量分析計で定量する実験を行った。その結果,ポリアミンを含まないコントロール溶液では,CO2を添加してもルビスコのカルボキシレーション反応がほとんど進行しないのに比べ,ポリアミンを添加した溶液は反応速度が3倍程度まで統計的に有意に上昇し,ポリアミンによる光合成促進効果を直接示すことに成功した。この成果の一部は,研究代表者と分担者らの共著論文(Yasumoto et al. 2018,安元ら2018)として発表した。また,乾燥地生態系の植物の光合成生産にポリアミンが果たす役割を検証するため,昨年度に引き続き小笠原諸島父島の乾性低木林において,木本植物5種の光合成速度,気孔コンダクタンス,葉肉コンダクタンスの日変化観測を行った。その結果,5種のうち4種は気孔コンダクタンスと葉肉コンダクタンスが,高い正の相関を維持しながら日変化することを見出すことができた。これらの木本植物では気孔コンダクタンスと葉肉コンダクタンスが共通の葉内要因によって制御されている可能性が高いと考えられる。ポリアミンが,葉肉コンダクタンスの促進機構として機能するだけでなく,気孔コンダクタンスにも関与する可能性の検討を行う予定である。これらの野外観測で得られたデータの一部は,研究分担者らによる共著論文(Kono et al. 2019)として発表した。昨年度も,計画していた実験の大半を行うことができた。葉のポリアミンによる光合成促進について,当初の予想を裏付ける実験結果が引き続き得られ順調に論文公表も行えている。一方,細胞外水の採取と微量のサンプルからポリアミンを定量する方法の開発には,当初計画から遅れが生じている。以上の理由から,本研究課題はおおむね順調に進展していると考える。微量サンプルからのポリアミンの定量を確実に行うため,HPLC法と,質量分析計を持ちいた定量法を同時に行い定量性の比較・検討を行う。その上でポリアミン生合成阻害実験を,室内および野外生態系で実施する。植物の光合成は葉緑体内のCO2濃度に強く制限を受けている。アポプラスト液相から葉緑体内の酵素(ルビスコ)へのCO2輸送に生体内のポリアミンが促進し,光合成に貢献している可能性がある。そこでまず,ポリアミン溶液に溶解した大気CO2をルビスコが利用可能か検証した。半精製ルビスコ,イタドリの葉の粗抽出液のいずれもポリアミン溶液によってCO2固定反応が進行し,ポリアミン溶液に溶解した大気CO2をルビスコが利用可能であることが明らかになった。また,葉内のCO2濃度が減少すると,それに応答して光合成能力が上昇する。この応答に,葉内で生合成されたポリアミンが関与しているか,生合成の阻害剤(DFMO)および細胞膜に存在するポリアミン輸送体の阻害剤(PTI)によって検証した。その結果,これらの阻害剤によって低CO2に応答した光合成促進が遅れ,特に高濃度のDFMOによって応答は消失することが示された。これらのデータは葉内のポリアミンが葉肉細胞表面からルビスコまでのCO2輸送を促進し光合成に寄与していることを強く示唆している。本研究では,強い乾燥ストレスに樹木がさらされている小笠原諸島父島の乾性低木林で,ポリアミンが光合成促進に寄与しているか野外生態系において検証を予定している。本年度は,その予備実験として本土の乾燥した荒地に生育するイタドリを材料に野外実験を行った。その結果,野外生態系においても葉を低CO2状態にさらすと,光合成能力の上昇がおこり,その大きさは葉に含有するポリアミンの量と良い相関があることが分かった。また,小笠原諸島父島において調査対象種の選定を終えた。昨年度は,計画していた実験の大半を行うことができた。そして,それらの実験の結果は当初に予想していた「葉が合成するポリアミンが光合成に貢献している」ことを強く示唆しており順調な成果が得られつつある。一方で,維管束を通じて葉の外部から運びこまれるポリアミンが光合成に果たす役割については,プロトコル開発と予備実験にとどまっており研究計画から若干の遅れが生じている。以上の理由から,本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。全ての生物の細胞内に高濃度で存在するポリアミンは気相のCO2を液相中へ捕捉し無機炭素化合物として濃縮する働きがある。このポリアミンの働きによって植物の光合成が促進される機構の検討を行った。ポリアミン溶液を一晩付与した葉では,光合成によるCO2の利用効率CE(葉内空隙のCO2濃度上昇当たりの光合成の増加割合)と,葉内空隙から葉緑体までのCO2拡散コンダクタンスgmが,人工導管水を付与した葉に比べて統計的に有意な増加を示した。また,一晩人工導管水を付与した葉は低CO2条件によってgmが増加したが,ポリアミンを付与した葉では,低CO2条件によってgmがさらに上昇することはなかった。従って,昨年度報告した,葉が低CO2条件に応答して光合成能力を上昇させる機構には,葉のポリアミンが関与していることが示唆された。

また,小笠原諸島の父島の乾性低木林において昨年度選定を行った小笠原固有種5種を対象にした調査を行った。5種の光合成速度,気孔開度(コンダクタンス),葉内CO2濃度の日変化を観測した結果,日中における光合成速度と,葉内CO2濃度の変動幅の大きな種と小さな種が存在することが明らかになった。これらの葉にポリアミンの生合成阻害剤を付与した状態で,同様の日変化測定を行った。日変化測定を行った葉の一部は,液体窒素で凍結固定し,冷凍したまま研究室に持ち帰った。これらの葉のポリアミン量・組成,およびルビスコ量と活性を測定し,日変化測定した光合成速度やその変動にポリアミンがどのような影響を与えているか検討を行う予定である。昨年度も,計画していた実験の大半を行うことができた。葉のポリアミンによる光合成促進について,当初の予想を裏付ける実験結果が得られている。一方,細胞外水の採取と微量のサンプルからポリアミンを定量する方法の開発には,当初計画から若干の遅れが生じている。以上の理由から,本研究課題はおおむね順調に進展していると考える。ポリアミン溶液が大気CO2を捕捉して溶液中に無機炭酸を濃縮すると,ルビスコのカルボキシレーション反応の基質となり光合成に貢献すると考えられる。前年度までは,光合成の炭酸固定回路を部分的に試験管内で再現し,NADHの減少速度から炭酸固定回路の進行速度を評価する方法で,ポリアミンの効果を間接的に検証してきた。本年度は,このプロセスを直接検証するため,ポリアミンにより溶液中に濃縮された無機炭酸から半精製のルビスコが生成する生成物を質量分析計で定量する実験を行った。その結果,ポリアミンを含まないコントロール溶液では,CO2を添加してもルビスコのカルボキシレーション反応がほとんど進行しないのに比べ,ポリアミンを添加した溶液は反応速度が3倍程度まで統計的に有意に上昇し,ポリアミンによる光合成促進効果を直接示すことに成功した。この成果の一部は,研究代表者と分担者らの共著論文(Yasumoto et al. 2018,安元ら2018)として発表した。また,乾燥地生態系の植物の光合成生産にポリアミンが果たす役割を検証するため,昨年度に引き続き小笠原諸島父島の乾性低木林において,木本植物5種の光合成速度,気孔コンダクタンス,葉肉コンダクタンスの日変化観測を行った。その結果,5種のうち4種は気孔コンダクタンスと葉肉コンダクタンスが,高い正の相関を維持しながら日変化することを見出すことができた。これらの木本植物では気孔コンダクタンスと葉肉コンダクタンスが共通の葉内要因によって制御されている可能性が高いと考えられる。ポリアミンが,葉肉コンダクタンスの促進機構として機能するだけでなく,気孔コンダクタンスにも関与する可能性の検討を行う予定である。これらの野外観測で得られたデータの一部は,研究分担者らによる共著論文(Kono et al. 2019)として発表した。葉のポリアミンによる光合成促進について,当初の予想を裏付ける実験結果が引き続き得られ順調に論文公表も行えている。一方,細胞外水の採取と微量のサンプルからポリアミンを定量する方法の開発には,当初計画から遅れが生じている。
衛星データと物質循環モデルを組み合わせたインドシナ半島の広域フラックス推定

NPP(純一次生産量)とHeterotrophic Respirationが年々変動、特にエルニーニョによりどのような影響が起こるのか解析を行った。1982年から1999年を対象として、NPPをAVHRRデータをもとにNECP/NCAR再解析データを気象データとしてMODIS17アルゴリズムを用いて計算した。またHeterootrophic Respirationの年々変動はインバージョンモデルから推測される陸域炭素収支からNPPの変動を差し引くことで求めた。NPPの変動は地域によってエルニーニョに対して異なった変動を示すが、Heterotrohic Respirationは全球で見ると温度に依存して変動していることが明らかになった。研究成果はJournal of Geophysical Researchに発表された。二つ目にMODIS17アルゴリズムを用いる際に問題となるVPD (Vapor Pressure Deficit)の推定方法の確立を行った。VPDは元来衛星による推定は困難とされており、地上観測データの内外挿をもとに計算されてきたが、Boucherの仮説に基づいたフィードバック原理から地表面温度からの推定が可能になる。そこでMODIS11の地表面温度を用いて、植生モデルの入力パラメーターとして必要な日中平均VPDの推定を行った。得られた結果は砂漠や海岸線などのフィードバックが働かない地域を除けば、植生モデルに用いるのに十分な精度の結果が得られた。得られた結果はJournal of Geophysical Researchに投稿した。最後に地表面温度から推定されたVPDを用いることで、入力パラメーターが衛星データのみによる水・炭素フラックスの推定を行った。衛星データのみを用いるメリットは主にシステマチックなデータ取得にある。潜熱フラックス推定は短期間のフラックス変動を捉えることが困難であった。今後マイクロ波リモートセンシングなどの土壌水分データを用いる必要があることが明らかになった。それに対してNPPとGPPの推定はMODIS17アルゴリズムを用いることで十分良い結果が得られた。得られた結果はMODIS Vegetation Wokshoop2においてポスター発表を行った。広域フラックスの推定には衛星データと気象データが必要である.本年度は衛星データと気象データの収集及びそのバイリデーションを行った.また同時に炭素フラックスの推定に用いるモデルの検討及び応答の解析を行った.NOAA/AVHRRのlevel1bデータ1998年分をSAA(Satellite Active Archive)よりダウンロードし,これをPaNDA(Package for NOAA Data Analysis)を用いて幾何補正した.さらにGTOPO30をレファレンスとしてマニュアルで精密な幾何補正を行った.気象データはNCEP/NCAR Reanalysis Dataからsurface levelの気象データを日単位で収集した(日最高気温・日最小気温・比湿・下向き短波放).NCEP/NCAR Reanalysis Dataは経年変化を調べるにはモデルによるシステマチックなバイアスが含まれるという問題がある.それを補うために,補助のデータとしてCMAP・GPCC・ISCCP・University of Delaware気象データをダウンロードしてバリデーションを行った.炭素フラックスのコンポーネントの1つにNPP(Net Primary Production)があり,植物に依存するため,NPPは人為的な影響を受けやすい.NPPの推定法としてLight Use Efficiency(LUE)モデルを用いた.モデルは気象データと衛星から得られるLeaf Area Index(LAI)及びFraction of Photosynthetic Active Radiation(FPAR)を用いた.熱帯のNPPの変化がEl-Nino Southern Oscillation(ENSO)の影響を受け,気温の変化を通して二酸化炭素収支に大きく影響していることを明らかにした.また,上記の方法で推定を行ったVPDを用いることで水・二酸化炭素フラックス推定を全て衛星データを入力データとして行うことが可能である.この方法で得られた結果をバリデーションを行い,現在結果をまとめている.NPP(純一次生産量)とHeterotrophic Respirationが年々変動、特にエルニーニョによりどのような影響が起こるのか解析を行った。

それに対してNPPとGPPの推定はMODIS17アルゴリズムを用いることで十分良い結果が得られた。得られた結果はMODIS Vegetation Wokshoop2においてポスター発表を行った。
ルシフェラーゼの発展的インビボ活用を可能とする新規ルシフェリンプローブ群の創製

現代の生物学では、特定の応答が起きた時だけ蛍光を発する機能を持つ「蛍光プローブ」分子を活用して、各種の細胞応答を細胞が生きている状態で観測する技法が汎用されている。しかし動物個体内の細胞応答の観測は、光の組織透過性が悪いため、一般に困難である。そこで本研究では、ホタルの発する生物発光システムに適用可能な、生物発光プローブを開発し、蛍光法では達成できなかった深部のイメージングを可能とするシステムの構築を目指した。その結果、組織透過性の良い近赤外発光を示すルシフェリン誘導体や、特定の細胞応答に対応して生物発光を与えるルシフェリンプローブの開発に成功した。本年度はまず、アミノルシフェリンのアミノ基にリンカーを介して種々のアクセプター蛍光団を導入した誘導体を数多く合成し、発光基質として認識される要件を探る実験を行った。具体的には、リンカーの長さ、蛍光団の大きさ、電荷、方向性などを変化させた基質を合成し、そのルシフェラーゼ基質としての評価を行った。その結果、一定以上の長さのリンカーを介して、BODIPY、フルオレセイン、ローダミン、シアニンなど種々の蛍光団を導入した基質は、反応速度は遅いものの、ルシフェラーゼ基質として機能することが明らかとなった。実際、Cy7をBRETアクセプターとして導入した基質では、800nmを超える近赤外発光が観測され、従来は全く報告のない近赤外生物発光システムを構築することに初めて成功した。生細胞・動物応用を考える際には、プローブの細胞内局在とルシフェラーゼの局在が一致する必要がある。そこで、核、ミトコンドリア、ER、サイトゾルにそれぞれルシフェラーゼを発現・局在させた細胞も本年度作成した。震災の影響や、研究室立ち上げ工事が遅れた関係で、購入予定であった顕微鏡システムの導入が年度末となってしまったものの、導入した観測システムを用いて、生細胞系での発光イメージング実験を開始した。アクセプター蛍光団を指標とする蛍光イメージング実験も同時に行い、プロープ基質は分子構造によって大きく異なる局在を見せることがこれまでに明らかとなった。小動物個体内の各種応答をin vivo検出可能な機能性発光イメージングプローブの開発に関しては、スルホン酸をアルキル基を介してアミノ基に導入したルシフェリン誘導を合成し、そのin vitro系、細胞系でのアッセイを行った。その結果、本基質は細胞膜非透過性であり、実質的に細胞系での発光を0に押さえることが可能であることが示された。ここから、本骨格を用いた機能性プローブの設計が可能であることが明らかとなった。本年度は、これまでの研究で確立することに成功した、プローブ分子内電子移動による生物発光消光(BioLeT)を動作原理とする、全く新たな一酸化窒素(NO)プローブの開発を行った。具体的には、NOと反応することによってtriazoleを形成し、そのHOMO energy levelが大きく低下することが知られている1,2-diaminobenzene部位を発光団近傍に組み込んだルシフェリン誘導体(DALs)を開発した。その結果、DAL4はNO選択的かつ反応させたNOの量と比例して、BioLeTの解除に伴う大きな発光上昇を示すことが明らかとなり、さらに生細胞イメージングにも応用可能であり、ラット腹腔内でNO徐放剤から発生するNOを剃毛・開腹することなく可視化することにも成功した。以上の様に、BioLeTに基づく戦略により、従来は開発不可能であった生物発光プローブを論理的に開発可能であることが明らかとなった。さらにこれまでに開発に成功してきた、高い反応性をもつ活性酸素種(hROS)を特異的に検出可能な生物発光プローブAPLに関しても、新たな戦略の基づく感度の劇的な改良を行った。APLもBioLeTの解除によって発光上昇を示す生物発光プローブであるが、プローブ由来のバックグラウンド発光が大きいため、luc TGラット急性腹膜炎モデルで好中球から発生するhROSをin vivoで検出することは困難であった。そこで、基質の細胞膜透過性も同時に制御することで、バックグランド発光を大きく低減させる戦略で、プローブの高感度化を目指した。具体的には、APL中のaminophenoxy部位のamino基をスルホアルキル化したSO3H-APLを開発した。その結果、SO3H-APLは生細胞中において、約1/100の量のhROSをAPLと同じactivation ratioで検出あることがわかり、実際にluc TG ratの急性腹膜炎モデルにおいても、刺激に応じて好中球から発生するhROSを剃毛・開腹することなく明瞭に検出可能であることが明らかとなった。昨年度までに確立した分子内BRETを原理とする近赤外発光ルシフェラーゼ基質設計法に基づき、本年度新たにSiローダミン類、Cy7-COOMe、BODIPY 650を有する生物発光基質を開発した。

まず生細胞系での検証から、これら三種の基質は全て十分な細胞膜透過性を有し、ルシフェラーゼとの反応によって特徴的な長波長発光を示すことが明らかとなった。例えばCy7-COOMeをBRETアクセプターとして導入した基質では、細胞外に基質を添加することで、800 nmを超える近赤外生物発光が観測された。次に、各基質由来の生物発光の組織透過性の比較を行った。具体的には生ハムを重ねることで均一の厚みを持つ擬似的な組織を作成し、各基質とルシフェラーゼとの反応によって生成する生物発光の組織による減弱を測定した。その結果、通常のルシフェリンと比較して、Cy7-COOMe-ALでは組織による発光強度の減弱は約1/6程度であり、深部からの発光観測に優れた基質であることが明らかとなった。最後に本基質類をマウスに適用した結果、確かにin vivoで近赤外発光を示すことが明らかとなった。以上の成果はAngew. Chem. Int. Ed.に掲載され、また注目すべき論文としてHot paperに選ばれた。次に、分子内光誘起電子移動による生物発光制御(BioLeT)法を原理として、他の研究プロジェクトで本年度開発することに成功した活性酸素(hROS)検出生物発光プローブAPLに、さらに各種置換基を導入することで、細胞膜透過性やROSとの反応性に変化が出るかを検討した。その結果、アルキルスルホン酸基を導入した新規APL誘導体は、ROSとの反応前の生物発光効率が極めて低く、またROSとの反応効率も高く、より大きなシグナルの変化を有する優れたhROSプローブとして機能することが明らかとなった。ケミカルバイオロジー分子内BRETを原理とするルシフェリンプローブの開発に成功しただけでなく、ルシフェラーゼ基質として機能させるための種々の因子を決定できたことは、今後の機能性プローブ設計の際に、大きな力を発揮するものと期待できる。また初年度に、各種ルシフェラーゼ発現細胞を複数種構築できたことも、今後の研究進展を考える上で大きな成果である。25年度が最終年度であるため、記入しない。分子内BRETを原理とする世界初の近赤外発光ルシフェリンプローブの開発に成功し、これが生細胞系だけで無く、in vivoマウス系でも機能することが明確に示された。また組織による発光の減弱という観点からも、従来の可視光発光プローブに対する明らかな優位性を持つプローブの開発に成功した。さらに、特定の応答をin vivoで検出可能な"activatable"生物発光プローブの開発に関しても、他の研究プロジェクトで確立された設計原理と相乗的に機能する新たな分子修飾法を見出すことに成功した。これらの結果は、当初計画以上の成果であり、最終年度の研究進展を考える上で大きな意味を持つ成果である。開発に成功した近赤外発光ルシフェリン基質を生細胞系、動物個体系へと適用し、in vivoでの近赤外生物発光システムの構築を狙った研究を継続する。またactivatable発光プローブに関しては、スルホン酸、カルボン酸の存在による細胞膜透過性の制御に基づく、活性酸素検出ルシフェリンプローブを開発し、その生細胞系での機能の検証を行う。
脳虚血モデル細胞を用いた脳血管疾患の脳内病態解析：法医脳機能新法の開発

本研究では、脳虚血に伴うミトコンドリアの生活反応を解明し、その生活反応を指標とした新規法医脳機能バイオマーカーを開発する事を目的とした。そこで、脳虚血モデル神経細胞を用いて、ミトコンドリアの形態と機能との関係について検討した。正常状態に比べ、虚血条件下では、呼吸及びミトコンドリア活性が有意に減少していた。これら細胞機能の低下に伴ってミトコンドリアの形態は、複雑な繊維構造から単純な糸状及び粒状のパターンに変化した。さらに、ミトコンドリアの形態変化は、固定標本においても生活反応として保持されていた。以上の結果は、ミトコンドリアの形態が脳虚血の法医バイオマーカーとして有用であることを示唆している。本研究では脳虚血に伴うミトコンドリアの形態変化と脳機能との関係を調べ、その病態を解明する事でミトコンドリアの生活反応を指標とした新規法医脳機能診断法を開発する事を目指している。従って、本研究では生前のミトコンドリアの形態変化がその機能を反映する事を実験的に証明し、その後、その機能が死後の形態変化としてどのように保存されているのかを解析する必要がある。そこで、当該年度は高分解能蛍光顕微鏡DeltaVisionを用いた3次元画像解析により、生理的条件下でのミトコンドリアの形態変化を経時的に検討した。また、生理的条件下での細胞及びミトコンドリアの活性を経時的に調べた。さらに、ミトコンドリア内で蛍光蛋白質遺伝子を一過性及び恒常的に発現させたヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yの作製を行った。・ラット大脳皮質神経細胞の作製:ラット胎仔E17大脳皮質をTypsin-EDTAで処理し細胞を単離後、培養容器に移してCO2インキュベータ内で2週間培養後、実験に使用した。・ラット大脳皮質神経細胞のミトコンドリア及び細胞機能:生理的条件下において、ミトコンドリア及び細胞機能の変化を経時的に調べた。測定時間内でミトコンドリア活性及び呼吸活性に変化は認められなかった。・ラット大脳皮質神経細胞のミトコンドリアの形態:ミトコンドリア特異的蛍光試薬を用いてミトコンドリアの形態を観察した。ミトコンドリアは絶えず分裂と融合を繰り返し、測定時間内において形態異常は認められなかった。・蛍光蛋白質遺伝子発現細胞:ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yを用いて、ミトコンドリア内で蛍光蛋白質遺伝子を一過性及び恒常的に発現させた細胞を作製した。一過性発現細胞では形態異常は認められなかったものの、恒常的に発現させた細胞では明らかな細胞及びミトコンドリアの形態異常が認められた。高分解能蛍光顕微鏡DeltaVision用恒温装置の納品が遅れたため、生理的条件下でのミトコンドリアの形態変化の検討に遅延が生じた。しかし、次年度に予定していた解析条件の検討など実験の一部を前倒して行ったため研究期間を通じて、ほぼ計画通り進行している。我国において、脳虚血を伴う脳血管疾患・傷害による死亡は死因の約12%を占めており、4大死因の一つである。従って、脳虚血の病態を精査し、死者の生前の状態を推定する事は法医学において重要である。一方、ミトコンドリは細胞の生と死の両面に関与しており、ミトコンドリアの形態はその機能を反映していると考えられている。しかしながら、これまでの法医診断ではミトコンドリアの生活反応に着目した解析は殆どない。そこで、本研究では脳虚血に伴うミトコンドリアの形態変化と脳機能との関係を調べ、その病態を解明する事でミトコンドリアの生活反応を指標とした新規法医脳機能診断法を開発する事を目指している。従って、生きている状態でのミトコンドリアの機能変化と形態変化を経時的に検討する必要がある。その後、生前と死後の相違を比較する事で、「ミトコンドリアの機能が死後のミトコンドリアの形態としてどのように保存されているのか」を検討する。そこで、当該年度は、高分解能蛍光顕微鏡DeltaVisionを用いた3次元画像解析により、虚血処理(Oxygen-glucose deprivation: OGD処理)後のミトコンドリアの機能及び形態を明らかにし、生理的条件下と比較した。・脳虚血に伴うミトコンドリアの機能変化OGD処理後の神経細胞では、核、細胞体および樹状突起が委縮し、OGD処理時間依存的に生存率の低下、死亡率の増加を認めた。また、OGD処理時間依存的にミトコンドリア活性および呼吸活性の低下を認め、生理的条件下の細胞に比べ有為な細胞及びミトコンドリア機能の低下が示唆された。・脳虚血に伴うミトコンドリアの形態変化生理的条件下のミトコンドリアでは融合と分裂を認め、比較的伸長状態を維持していた。一方、OGD処理後の神経細胞では、OGD処理時間依存的に伸長状態から断片化状態へと移行した。現在までに、生理的条件下とOGD処理後のミトコンドリアの機能と形態について比較検討を実施しており、研究はほぼ計画通りに進展しているものと考える。本研究では脳虚血に伴うミトコンドリアの形態変化と機能との関係を明らかにし、ミトコンドリアの生活反応を指標とした法医脳機能診断法を開発する事を目指している。当該年度は、平成27及び28年度に引き続き、脳虚血モデル系(Oxygen-Glucose Deprivation:OGD処理神経芽細胞種)を用いて、虚血がミトコンドリアの機能及び形態に及ぼす影響を検討した。さらに、脳虚血モデル細胞を固定し、ミトコンドリアの形態を観察した。

・脳虚血に伴うミトコンドリアの機能変化: OGD処理細胞ではコントロール群と比べ、2時間後に有意な死亡率の増加を認めた。一方、生存率(エステラーゼ活性)は、OGD処理後速やかに減少した。また、細胞呼吸およびミトコンドリア活性はOGD処理時間依存的に低下した。これらの活性は間接的な細胞の生存率の指標として用いられており、これらの残存活性は死戦期における細胞の生活反応に起因している事が示唆された。・脳虚血に伴う細胞及びミトコンドリアの形態変化: OGD処理時間依存的に細胞体、樹状突起及び核の委縮を認めた。また、ミトコンドリアの形態は複雑な繊維状の構造から、虚血に伴って糸状およびドット状に変化した。これらの形態変化は、ネクローシスやオートファジーなどの細胞死の過程に関連しており、細胞の機能および生活反応を反映していると考えられた。・死後のミトコンドリアの形態:ミトコンドリアの形態変化は固定後の細胞においても保存されていた。即ち、脳虚血後、神経細胞の生活反応によって生じたミトコンドリアの形態変化は、死後の脳においても保存されており、法医脳機能マーカーとして有用であると推察された。本研究では、脳虚血に伴うミトコンドリアの生活反応を解明し、その生活反応を指標とした新規法医脳機能バイオマーカーを開発する事を目的とした。そこで、脳虚血モデル神経細胞を用いて、ミトコンドリアの形態と機能との関係について検討した。正常状態に比べ、虚血条件下では、呼吸及びミトコンドリア活性が有意に減少していた。これら細胞機能の低下に伴ってミトコンドリアの形態は、複雑な繊維構造から単純な糸状及び粒状のパターンに変化した。さらに、ミトコンドリアの形態変化は、固定標本においても生活反応として保持されていた。以上の結果は、ミトコンドリアの形態が脳虚血の法医バイオマーカーとして有用であることを示唆している。脳虚血に伴うミトコンドリアの形態変化と脳機能との関係を調べるために、虚血処理(Oxygen-glucose deprivation: OGD処理)神経細胞を作製し、上記生理的条件下のミトコンドリアの形態と機能変化について比較検討する。・OGD処理ラット大脳皮質神経細胞及びヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yのミトコンドリアの形態変化の検討する。・OGD処理ラット大脳皮質神経細胞及びヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yのミトコンドリア及び細胞機能の検討する。・生理的条件下と虚血処理後のミトコンドリアの形態を比較検討する。上記の結果から、ミトコンドリアの形態は細胞及びミトコンドリアの機能の低下に伴って変化する事が示唆された。そこで、この形態変化とネクローシス或いはオートファジなどの細胞死との関係について検討する。さらに、ミトコンドリアの生活反応を指標とした新規法医脳機能診断法を開発するために、細胞固定標本を用いて、「ミトコンドリアの機能が死後のミトコンドリアの形態としてどのように保存されているのか」について検討する。なお、研究期間最終年度である平成29年度に、研究成果の一部を取りまとめ学会で発表し、国際誌へ投稿予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。法医学29年度が最終年度であるため、記入しない。
成人T細胞白血病に対する抗癌剤とサイトカイン併用療法に関する基礎的・臨床的研究

我々は、ATL細胞が種々のリンフォカインや副甲状腺ホルモン関連物質(PTHrP)を産生し、そのなかでインターロイキン1およびPTHrPは血清カルシウム濃度を上昇させ、そのカルシウム濃度上昇はATL細胞をさらに増殖させることを研究してきた。今回は、1)MT-2細胞によるPTHrP産生に対するインターロイキン(IL)1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6の影響を検討した。PTHrPの産生はインターロイキンの添加なしに、72-96時間まで経時的に増加した。PTHrP産生はIL-2で濃度依存的に増強し、IL-4では濃度依存的に抑制された。DNA合成能および細胞数はいずれのサイトカインでも変化はなかった。2)ATL患者から分離した新鮮ATL細胞を用い、PTHrP産生に及ぼす種々のサイトカイン(IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ)の影響を検討した。(1)ATL細胞のDNA合成能(^3H-TdRの取込)に対するIL-2、IL-4の影響の検討では、9例中8例のATL細胞がIL-2によって、7例はIL-4によって増殖した。(2)IL-2は新鮮ATL細胞からのPTHrP産生を濃度依存性に増強した。また、その他のサイトカインはPTHrP産生に影響を及ぼさなかった。3)IL-6は骨芽細胞から分泌され、破骨細胞による骨吸収活性を促進するとの報告がある。よって、新鮮ATL細胞のIL-6の産生に及ぼすIL-2およびIL-4の影響を検討した。末梢血よりATL細胞を分離した。IL-6活性はIL-6EIAキット(TFB)を用いて測定した。IL-6mRNAの発現はノーザンブロット法にて解析した。IL-4は濃度依存性にATL細胞からのIL-6産生を抑制した。このIL-4のIL-6産生に対する抑制効果は抗IL-4モノクロナール抗体により解除された。またIL-4はATL細胞のIL-6mRNAの発現を抑制した。以上、IL-2はATL細胞自体を増殖させ、PTHrPをも増加させるため、IL-2はPTHrPによる高カルシウム血症を介して、さらにATL細胞を増殖させると考えられる。IL-4はPTHrP、IL-6の産生を抑制するため、高カルシウム血症によるATL細胞増殖を防止する効果が期待できると考えられる。
脳特異的マーカーアルドラーゼCの遺伝子構造と発現細胞の同定

ラットのアルドラーゼC型ゲノム遺伝子を単離した。この遺伝子は8個のイントロンで分断された9個のエクソンより構成されている。遺伝子の塩基配列を決定した。遺伝子領域3590塩基、遺伝子の上流809塩基、遺伝子の下流461塩基の計4,860を含む。転写開始点を決定するためにS1マッピングおよびプライマー延長法を行なった。その結果転写開始点が2カ所存在することがわかった。その結果プロモーター領域には特徴的な塩基配列がみあたらないことがわかった。GCボックスは1カ所見つかったがIn Vitro転写系を利用した結果では有効に働いていないことがわかった。従って新しいプロモーターシークエンスの可能性がある。アルドラーゼCmRNAは脳で発現していることはすでに明らかになっていたが、それでは脳のどの領域(細胞)で発現しているかを明らかにするためにリボプローブを用いてinSitu hybridlzationを行なった。用いた組織は脳の大脳皮質、海馬、視床、小脳および脊髄である。その結果銀粒子は小脳のプルキンエ細胞に集中的に入っていることがわかった。現在までにラットのアルドラーゼAおよびB遺伝子を明らかにしているのでそれらと塩基配列を比較した。その結果、アルドラーゼA、Bの第1エクソン部分はアルドラーゼC第1イントロン付近とホモロジーがあることがわかった。一方アルドラーゼCの第1エクソン部分とホモロジーのある部分をA、B両遺伝子にもとめたが見あたらなかった。従ってアルドラーゼCの第1エクソンは進化の過程で新たに獲得されたエクソンである可能性がある。ラットアルドラーゼCのcDNA(pRAC2-1)をプローブに用い, 85万個のファージライブラリーから2個のクローンを得た.遺伝子上流800塩基,下流約650塩基を含む約5000塩基対に及ぶ塩基配列を決定した.その結果遺伝子は3.5Kbで9個のエキソンから成ることがわかった.遺伝子はハプロイドゲノム当り1コピーであった.遺伝子の転写開始点をSIマッピングとプライマーエクステンション法により決定したところ,三ケ所あることがわかった.プロモーター領域にはTATA配列やGCrich配列が見られた.脳型(C型)の遺伝子なのでID配列の存在を確かめたところ, 5 ́上流約1Kbのところに方向は不明であるが,コンセンサスID配列と一塩基のみが異なる配列が見られた.遺伝子の下流2.5Kbにも2個のID配列が認められた.一方A型やB型の遺伝子の周辺には明確なID配列は認められなかった.現在までA, B型遺伝子の解析を終了し,ここにC型遺伝子の構造がわかったので構造を比較したところ,コーディングエクソンはATGから同じ数のアミノ酸のところでイントロンがそれぞれ挿入されていることがわかった.このことはこれらアイソザイム遺伝子は一つの祖先遺伝子から派生したものであることを示唆した.一方リーダーエクソンは各々のアイソザイム配列が異なり組織(臓器)の特異性に応じて配列が進化の過程で獲得されていることがわかった.一方現在cDNAをプローブに用い脳の組織のIn Situ Hybridizationを行なっている.予備的データではあるが,脳型は脳全体で発現しているというよりも,ある特定の神経細胞で発現しているようである.ノーザンブロッティングの結果アルドラーゼCmRNAは脳で特異的に発現していることがわかったので、脳の発育と発現変化の関係を明らかにするために各ステージの胎仔期を用いてドットスポット解析を行なった。サンプルは胎仔15日目、17日目、19日目、生後4日目、成体を用いた。その結果各時期の違いによる発現量の変化は認められなかった。コントロールとしてA型遺伝子も調べたが発生・分化過程での発現量の変化は認められなかった。ついで脳のどの組織で発現しているのかを明らかにするために脳の部分、脊髄神経などの切片をつくりin situ hyprizationを行なった。

プローブとしてはCとAのそれぞれセンス、アンチセンスのリボプローブを作成した。調べた組織は大脳皮質、海馬、視床、小脳、脊髄などである。Cについて検討したところ、特に小脳のPurkinje細胞層に集中的に銀粒子が集まっていることがわかった。大脳皮質、海馬、視床では目立った変化はなかったが、脊髄の後根神経節や外側運動核の運動ニューロンには銀粒子がコントロールよりもやや優位に認められた。一方Aの方であるが集中的に銀粒子はみられないものの全体にわたってCよりも多くみられた。特にその中でも大脳皮質の内錐体層、海馬の錐体細胞層、脊髄の後根神経節、外側運動核などに銀粒子が比較的多く認められた。以上脳のin situ hybridizationで目立ったのはプルキンエ細胞でのCの顕著な発現であり、一方Aはこの細胞での発現は抑制されていた。
有機金属気相選択成長法による半導体ナノワイヤの形成と単電子素子への応用

有機金属気相選択成長法を用い作製したInAsナノワイヤに対し電気的評価を試みた。InAsナノワイヤに対しては、SiNxによるMIS(Metal-Insulator-Semiconductor)上面ゲートを形成し、ナノワイヤの電気的特性を評価した。その結果、背面ゲートに比較し良好なゲート制御性が確認でき、最大伝達コンダクタンスGm_max=150mS/mmが得られた。電流オン/オフ比は3桁と現存のMOSデバイスに対しては劣るものの、更なるプロセスの改善を行えば、電界効果トランジスタとしても十分な性能が期待できる。これまでのナノワイヤの成長に関する研究から、単電子デバイスの障壁/チャネル層の候補として、GaAs/InAsあるいはInGaAs/InAs等のヘテロ接合が考えられる。そこで、はじめに単層のInGaAsナノワイヤを形成し、その組成を評価した。作製したInGaAsナノワイヤでは、In組成が約76%と高く、チャネルを形成するInAsに対しバンドオフセットが176meVと小さな値となるため、今後、In組成を減少させバンドオフセットを調節する必要がある。また、InAsおよびInGaAsナノワイヤに対する電気特性の評価結果から、移動度(数100cm^2/Vs)など材料から期待される特性が得られていないことが明らかとなった。原因については幾つか考えられるが、ナノワイヤの表面の効果、成長時の不純物混入などが考えられる。ナノワイヤの表面の効果に対しては、以前報告したコア/シェル構造による表面不活性化が有効に機能するものと考えられる。一方、不純物混入に対しては、不純物として考えられるカーボンの結晶層への混入を抑制するため、ナノワイヤ成長時の成長温度を低温にし、ナノワイヤを形成する必要があるものと考えられる。有機金属気相選択成長法を用い作製した半導体ナノワイヤに対し電気的評価を試みた。電気測定を行った半導体ナノワイヤは、シランによりドーピングを行ったn型ガリウム砒素、さらに、ドーピングを行ったガリウム砒素をナノワイヤの直径方向にアルミガリウム砒素で覆ったヘテロ構造を有する二種のナノワイヤを用いた。電極構造は、p型シリコン/二酸化シリコン基板に作製したそれぞれのナノワイヤを散布し、電子線露光装置により単一のナノワイヤに対し電極構造を形成した。p型シリコンはアルミを蒸着し背面ゲートとして利用し、二酸化シリコンによりナノワイヤと絶縁している。これらの資料に対し電気的な評価を行ったところ、n型ガリウム砒素を用いたナノワイヤは電気的な評価が困難であることがわかった。これは、ナノワイヤの直径が微小であるためナノワイヤが空乏化しチャネルが消失しているためと考えられる。一方、n型ガリウム砒素をアルミガリウム砒素で覆った構造においては、典型的なオーミック特性が得られ、その抵抗値は数MΩ程度であった。この抵抗値はナノワイヤのサイズから導き出される値より数百倍から数千倍の大きさに相当する。これは、ナノワイヤと電極部分の接触面積が小さいこと、金属とナノワイヤの接合が良好ではないことに起因すると考えられる。さらに背面ゲートの機能を確認したところ、背面ゲートはナノワイヤの導電率を変化させる機能を有していないことがわかった。これは、化合物半導体の表面準位に起因する結果と考えられる。これらの結果から、ナノワイヤを用いた単電子素子の実現に対しガリウム砒素・アルミガリウム砒素ヘテロ構造ナノワイヤが適していること、ショットキーゲートの必要性が明らかとなった。有機金属気相選択成長法を用い作製したInAs、InGaAsナノワイヤに対し電気的評価を試みた。また、InGaAsナノワイヤ成長時にSiH4を導入し、ドーピングを行ったInGaAsナノワイヤに対して同様の評価を行いドーピングの効果を確認した。評価方法は、p型Si/SiO2基板に作製したそれぞれのナノワイヤを散布し、電子線露光装置により単一のナノワイヤに対し電極構造を形成した。p型Siは、ナノワイヤに対する背面ゲートとして用いている。背面ゲート構造は、デバイスの作製が容易であるが、伝達コンダクタンスが悪いこと、将来的に単電子トランジスタを作製する上で局所的なポテンシャル変調が必要となるが、この構造では局所的なポテンシャル変調が困難であることが予想されるため、背面ゲートに加えナノワイヤの表面にショットキーゲートを設けナノワイヤの電気的特性を評価した。InAsナノワイヤにおいて、GaAsナノワイヤでは困難であった背面ゲートによる電界効果トランジスタ動作を確認した。このInAsナノワイヤFETに対し温度5Kにおいて、背面ゲート特性を調べたところ、そのドレイン電流特性はクーロンブロッケードを示した。クーロンブロッケードの起源を探るため、ゲート電圧-ドレイン電圧-ドレインコンダクタンス測定を行ったところ、クーロンダイアモンドが確認でき、その特性から見積もられるドットのサイズが15nm程度であることが分かった。これまでの研究で、ナノワイヤ内に無数の双晶が形成されていることが明らかとなっているが、今回見積もられたドットのサイズと双晶のサイズ等に直接的な相関は認められなかった。ナノワイヤ内のドット形成の起源は、現状では明らかとなっていない。一方、InGaAsナノワイヤではInAsおよびGaAsナノワイヤで困難であったショットキーゲートによるドレイン電流変調を確認した。背面ゲート及びショットキーゲートの伝達コンダクタンス特性を比較したところ、ショットキーゲートにおいて20倍程度の伝達コンダクタンスの改善を確認した。ショットキーゲートによる室温における最大伝達コンダクタンスは30mS/mm、144Kにおいて50mS/mmであった。また、背面ゲートではゲート電圧-ドレイン電流特性に大きなヒステリシスが確認されたのに対し、ショットキーゲートではヒステリシスは確認されなかった。

室温におけるInGaAsおよびSiをドープしたInGaAsナノワイヤのFET特性を比較したところ、SiをドープしたlnGaAsナノワイヤにおいて負の閾値電圧の増加が確認された。これは、成長時に導入したSiH_4がn型ドーパントとして機能していることを示している。有機金属気相選択成長法を用い作製したInAsナノワイヤに対し電気的評価を試みた。InAsナノワイヤに対しては、SiNxによるMIS(Metal-Insulator-Semiconductor)上面ゲートを形成し、ナノワイヤの電気的特性を評価した。その結果、背面ゲートに比較し良好なゲート制御性が確認でき、最大伝達コンダクタンスGm_max=150mS/mmが得られた。電流オン/オフ比は3桁と現存のMOSデバイスに対しては劣るものの、更なるプロセスの改善を行えば、電界効果トランジスタとしても十分な性能が期待できる。これまでのナノワイヤの成長に関する研究から、単電子デバイスの障壁/チャネル層の候補として、GaAs/InAsあるいはInGaAs/InAs等のヘテロ接合が考えられる。そこで、はじめに単層のInGaAsナノワイヤを形成し、その組成を評価した。作製したInGaAsナノワイヤでは、In組成が約76%と高く、チャネルを形成するInAsに対しバンドオフセットが176meVと小さな値となるため、今後、In組成を減少させバンドオフセットを調節する必要がある。また、InAsおよびInGaAsナノワイヤに対する電気特性の評価結果から、移動度(数100cm^2/Vs)など材料から期待される特性が得られていないことが明らかとなった。原因については幾つか考えられるが、ナノワイヤの表面の効果、成長時の不純物混入などが考えられる。ナノワイヤの表面の効果に対しては、以前報告したコア/シェル構造による表面不活性化が有効に機能するものと考えられる。一方、不純物混入に対しては、不純物として考えられるカーボンの結晶層への混入を抑制するため、ナノワイヤ成長時の成長温度を低温にし、ナノワイヤを形成する必要があるものと考えられる。