hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超音波ソノケミストリー効果を利用するバイオディーゼル燃料の高効率合成および応用

本研究は,超音波BDF合成においてより効率の良い合成法を実現するため, 2年間の研究通じて下記の研究成果を得ることができた.合成実験では,まず,超音波ソノケミストリー効果によるBDF合成への影響を明らかにした.続いて,同合成法を多種類の植物油への適用実験結果から本方法の妥当性を確認できた.さらに,量産化に備える流通型超音波BDF合成実験や水洗い作業の必要がなく,固体塩基触媒を利用する超音波BDF合成法を樹立させた.BDF品質測定実験では,合成されたBDFの物性値(粘度,比重,表面張力,流動点など)測定を行った.また,脂肪酸メチルエステルの分子式からBDF燃料理論発熱量の計算法を確立させた.小型エンジンを用いるBDFの燃焼実験では,軽油よりBDFを使う場合,排気ガスの黒煙濃度が低くなるものの, NOx濃度が高くなったことがわかり,適切な噴射時期の調整により,最適なBDF利用が可能であることが判明した.一方,噴射実験の結果から, BDFの噴射角度が軽油に比べてより小さいことが確認された.本研究は,超音波BDF合成においてより効率の良い合成法を実現するため, 2年間の研究通じて下記の研究成果を得ることができた.合成実験では,まず,超音波ソノケミストリー効果によるBDF合成への影響を明らかにした.続いて,同合成法を多種類の植物油への適用実験結果から本方法の妥当性を確認できた.さらに,量産化に備える流通型超音波BDF合成実験や水洗い作業の必要がなく,固体塩基触媒を利用する超音波BDF合成法を樹立させた.BDF品質測定実験では,合成されたBDFの物性値(粘度,比重,表面張力,流動点など)測定を行った.また,脂肪酸メチルエステルの分子式からBDF燃料理論発熱量の計算法を確立させた.小型エンジンを用いるBDFの燃焼実験では,軽油よりBDFを使う場合,排気ガスの黒煙濃度が低くなるものの, NOx濃度が高くなったことがわかり,適切な噴射時期の調整により,最適なBDF利用が可能であることが判明した.一方,噴射実験の結果から, BDFの噴射角度が軽油に比べてより小さいことが確認された.本研究は、超音波ソノケミストリーの化学反応促進効果を利用し、低密度エネルギーの投入、なおかつ、コンパクトな合成システムにより、引火性能および粘性特性などに優れた新しいエステル燃料合成法の提案を研究目標とするものである。研究では、超音波洗浄機を反応器とした上、まず、超音波Cavitation効果および反応器で超音波に照射された液体の温度上昇を調査し、最適は合成条件を見出した。続いて、従来法と超音波ソノケミストリー法を用いてBDFの合成を行うとともに、超音波合成過程を可視化し、反応様子を明らかにしたほか、超音波照射によるBDF合成量産化の可能性を検討した。さらに、TLC法によるBDF生成の判別やGC装置を導入しBDF成分の検出を試みた。物性値の測定では、合成されたBDFの燃焼に関する物性値、たとえば、粘度、比重、流動点、表面張力などを計測したほか、メチルエステル成分を含むBDFの発熱量理論値を予測した。噴霧特性の調査では、BDFの粒径分布計算を行った。また、超音波合成法を様々な植物性油へ適用し、多種類のBDF合成に成功した。さらに、合成されたBDFを小型ディーゼルエンジンの燃料とし、エンジンの動力特性および排気特性、また、噴射タイミングの変化による排気特性の変化を調査した。一連の実験の結果、従来法に比べで、超音波BDF合成法では、合成時間が短縮され、合成効率が向上されたことから、本研究で提案した超音波ソノケミストリーを用いる新しいBDF合成法の妥当性を検証した。バイオディーゼル燃料(Bio-Diesel Fuel: BDF)は再生可能で環境汚染改善に寄与できることから,次世代の燃料として注目されている.これまでに,我々は超音波ソノケミストリBDF合成法を提案し,実験的検証を通じて,本合成法の妥当性を検証してきた.しかし,BDF合成にあたり,エネルギーの投入や後処理の課題が残っており,低コストでかつ高効率の合成方法が求められている.本研究ではこれまでの研究成果をもとに,超音波法によるBDFの合成効率をさらに上げるために,まず,流通型超音波BDF合成のシステム構築を行ない, BDF合成を実施した.続いて, BDF合成後の後処理の手間を省くために固体塩基触媒によるBDF合成実験を試みた.また, BDFの表面張力の測定などを行い, BDFの物性値の調査を行った.さらに,機械式噴霧装置を使用してBDFと経由の噴霧実験を行い, BDFの噴霧特性を調査するとともに数値解析によるBDFの噴霧解析方法を検討した.研究では,二つの9L/minのポンプを利用する流通型BDF合成装置を使用し,短時間に大量のBDFが合成可能であることを確認した.一方,固体塩基触媒に基づく超音波BDF合成法が検証されたことで,水洗いといった煩雑な後処理が必要としないので,合成工程の効率化につながると考えられる.また, BDFと軽油の噴霧実験では,同じ噴射条件のともで,軽油に比べて, BDFは噴霧角度が約3度小さかったことがわかった.これは,粘度と表面張力が異なったためと思われる.さらに, CFD2000を用いてBDFの噴霧解析を行ったところ,適切な粘度,表面張力および蒸気圧などの物性値を与えることが重要であることが確認された.
重大触法事件に関する実証的研究-児童福祉優先の理念の再構築に向けて

2007年の改正少年法によって、重大触法事件の家庭裁判所への原則送致が導入され、児童相談所先議の原則が変容し、児童福祉優先の理念が後退するのではないかと危惧されたが、児童相談所の家庭裁判所への送致事例及び非送致事例(同年11月1日翌年10月31日)を調査し分析した結果、大勢としては変容し後退していない現状が示唆されるとともに、児童福祉優先の理念を再構築するための課題もあることが明らかになった。各児童相談所に協力依頼の文書を送付し電話で日程を調整しほぼ承諾が得られたが、一部は予定していた児童相談所とは違う別の児童相談所の担当ケースであることが判明し、ヒアリング対象は17児童相談所となった。しかし神戸市子ども家庭センターからは守秘義務等を理由にヒアリングを拒否され、また大阪府吹田子ども家庭相談センターからも担当者の異動等の理由で保留され現在に至っている。2011年1月3月にかけて、東京都児童センター(家裁送致ケース1件)、埼玉県所沢児童相談所(家裁送致1件、非送致1件)、埼玉県川越児童相談所(家裁送致1件)、茨城県筑西児童相談所(家裁送致1件)、香川県子ども家庭相談センター(家裁送致3件、非送致1件)、兵庫県姫路子ども家庭センター(家裁送致2件)、愛知県中央児童・障害者相談センター(家裁送致1件、非送致1件)、滋賀県彦根子ども家庭相談センター(家裁送致1件、非送致2件)、東京都小平児童相談所(家裁送致1件)、大分県中央児童相談所(家裁送致1件)、宮崎県中央児童相談所(家裁送致1件)、北海道室蘭児童相談所(家裁送致2件)、東京都品川児童相談所(非送致4件)、東京都北児童相談所(非送致1件)、新潟県新発田児童相談所(家裁送致1件)への訪問調査(ヒアリング、一部記録閲覧含む)を完了し、5月連休明けには反訳作業も終了した。現在はヒアリング結果の内容分析を行っている最中である。最終的に(1)17児童相談所中、15児童相談所、(2)家裁送致21件中、17ケース(それ以外に非送致14ケース)のヒアリングが実現し、2007年少年法改正直後の重大触法事件に関する原則家裁送致をめぐる児童相談所の送致基準・送致理由等々の実態解明が大いに期待できる。全国児童相談所長会から研究代表者が委託を受け実施した「平成21年度定例調査」で明らかになった重大触法事件、即ち平成19(2007)年少年法改正後の1年間(平成19年11月1日から平成20年10月31日まで)に、全国各地で発生した重大触法事件に関与した15児童相談所が家庭裁判所に原則送致した17事例と家庭裁判所に送致しなかった10事例に関して、平成22年度に実施した訪問調査(ヒアリング、記録閲覧)をふまえて、平成23年度はヒアリングした際の録音テープ全部を反訳し、質問項目に即してその内容を分析するとともに、併せて厚生労働省が示した平成19(2007)年の少年法改正前と改正後の児童相談所の家庭裁判所に対する送致の判断基準を文献研究し、同時に平成19(2007)年の少年法改正後1年間以降の動向を把握する参考として、平成19(2007)年の少年法改正後1年間に警察からの児童相談所への重大触法事件の送致事例が最大だったA県の児童相談所に対して、平成20年11月1目から平成22年10月31日までに扱った全事例について、全国児童相談所長会の「平成21年度定例調査」と全く同じ質問項目で実施したアンケート調査の結果を検討した。その結果、平成19(2007)年少年法改正後の重大触法事件に関する家庭裁判所への原則送致・非送致をめぐる児童相談所の判断基準、送致(非送致)理由等がはじめて解明され、平成19(2007)年の少年法改正後も児童福祉優先の理念は全体として堅持され、厳罰化に傾斜していないことが示唆された。その意義と重要性はきわめて大きい。なお本研究の一部をまとめた研究協力者高橋幸成(指導教授:研究代表者)の修士論文「重大触法事件の実証的研究-児童相談所の原則家裁送致をめぐる判断基準」(日本社会事業大学大学院)は高い評価を得ている。2007(平成19)年の少年法改正によって、重大触法事件に関する児童相談所の家庭裁判所への原則送致が義務化された。これによって児童相談所は、長崎事件、佐世保事件のように、非行事実(罪名)の重大性だけで、重大触法事件を家庭裁判所にいわゆる「丸投げ」し、その結果として児童相談所先議の原則が変容し、児童福祉優先の理念が後退するのではないかと危惧された。

本研究は、それを検証する目的で、改正少年法が施行された2007(平成19)年11月1日から2008(平成20)年10月30日までの1年間に、重大触法事件として警察から児童相談所に送致された59事例のなかで、児童相談所が家庭裁判所に送致した21事例、送致しなかった38事例のうち、承諾の得られた15の児童相談所を訪問し、送致された17事例と送致されなかった10事例について、判断基準、送致根拠、処遇意見等に関してヒアリング調査を行った。その調査をふまえた分析と考察によれば、改正少年法施行直後の状況下で、児童相談所の一部には混乱と誤解が生まれ、児童相談所先議の原則が変容し、児童福祉優先の理念が後退しつつあるのではないかとの疑念を招く事例も散見されたが、全体的な状況としては、非行事実(罪名)の重大性(形式的な要件)だけでなく、その要保護性の程度(実質的な要件)を調査・判定し、その年齢も考慮したうえで、児童相談所は家庭裁判所送致の原則と例外(非送致)を判断していることが示唆された。2007(平成19)年の少年法改正後、全国各地の児童相談所に対し、初めてヒアリング調査を行って、重大触法事件に関する原則家庭裁判所送致の実態を具体的に浮き彫りにするとともに、児童相談所先議の原則にもとづく児童福祉優先の理念を再構築するための実践的な提言を行った本研究の意義と重要性はきわめて大きい。研究の目的及び研究の計画に即して、順調に研究が進展している。第2期(平成23年度)の目標であった研究協力者高橋幸成(指導教授:研究代表者)による修士論文の完成はその象徴である。24年度が最終年度であるため、記入しない。日本司法福祉学会等において、研究協力者が修士論文(指導教授:研究代表者)の内容を発表し、質疑応答のなかで考察を深めるとともに、有識者によるシンポジュームを開催して研究代表者が基調報告し、さらに質疑応答を重ねるなかで、最終報告書をまとめる。
アニオン置換を中心とした新規メリライト化合物の合成と物性制御

本研究課題では新規メリライト型化合物やその関連化合物の合成と物性制御を目指して、その化学組成に対して従来のカチオン置換に加えてアニオンサイトの置換を行うことで新物質探索を試みた。さらに、メリライトの特徴のひとつである低次元構造に着目して物性研究を行うとともに、新たな低次元磁性を示す物質の探索や遷移金属のスピン挙動の系統的理解を目指して、関連構造を持つ化合物系へ研究を展開して以下の成果を得た:【メリライト型化合物の合成と物性】(1)メリライト型化合物Sr2MnGe2O7において、酸素不定比性とそれに伴うMnイオンの酸化状態への変化を見い出し、構造や物性への影響を明らかにした。(2)複合アニオン型の新規メリライトへ研究を展開し、オキシ硫化物メリライトSr2MnGe2S6Oの合成に成功し、その構造と磁性を明らかにした。アニオンの変化により相互作用が強められ、磁気転移温度が従来の酸化物より大きく上昇することを見い出した。(3)メリライトと同じカチオン配列を持つ複合アニオン型フレスノイトの合成に成功し、結晶学的なアニオンの配列の違いを反映することで磁気的相互作用が10倍以上に強化されることを発見した。【低次元構造を持つ化合物の合成と物性】(1)理想的な二次元三角格子を有する層状酸化物Ba2La2MW2O12(M = Mn, Fe, Ni, Zn)に対して中性子回折実験を行い、従来とは異なる構造を有することを明らかにし、低温で強磁性や反強磁性の磁気秩序を示すことを見い出した。(2)一次元的な構造的特徴を有するフルオライト派生化合物Ln3MO7(Ln =希土類; M = Nb, Ta等)に関して、固体酸化物中では不安定なCe3+を含むCe3MO7(M = Nb, Ta)の新規合成や、希土類のイオン半径の僅かな違いがもたらす構造相転移の詳細を明らかにした。本課題では、新規メリライト化合物の合成と物性制御を目指しアニオン置換を中心とした新規化合物の探索を試みるとともに、メリライトを含む低次元構造を持つ化合物中における遷移金属のスピン挙動の系統的理解を目的とした研究を実施し、初年度の成果として以下の実績を上げた:【新規オキシ硫化物メリライトSr2MGe2S6Oの合成と磁気的性質】アニオンとしてS2-とO2-を含むアニオン置換型メリライトSr2MnGe2S6O(M = Mn, Zn)の新規合成に成功し、その結晶構造と磁気的性質を明らかにした。この物質では3種類のアニオンサイト(2c,4e, 8f)が存在し、O2-が2cサイト、S2-が残りのサイトを占有する秩序化配列を有することが分かった。また、磁化率・比熱測定の結果、Mn2+イオンによる二次元磁性体として振る舞うこと、さらに、この物質系としては特異的に高い磁気秩序温度(15.5 K)を示すことを見い出した。また、電子構造計算を行い、S2-の導入により磁気的相互作用が強められていることを理論的にも明らかにした。この結果は、アニオン置換によるメリライトの磁性制御が可能であることを示しており、この物質系の研究をさらに展開するための重要な成果を得た。【二次元三角格子磁性体Ba2La2MW2O12の磁気的性質】メリライト(二次元正方格子)とタイプの異なる層状配列(二次元三角格子)を有する層状酸化物Ba2La2MW2O12に関しても成果を得た。中性子回折実験により、この物質が従来の報告とは異なり、空間群R-3の対称性やBaとLaの秩序化配列を有することを発見した。これらの物質が低温で強磁性、または、反強磁性的な磁気秩序を示すことを明らかにした。本課題の主題とも言えるアニオン置換型のメリライト化合物(オキシ硫化物メリライト)の新規合成に成功し、その構造と磁性に関する知見を得た。この結果から、複合アニオン化合物の合成が可能であり、その置換により磁気的相互作用経路やバンド構造に大きな変調をもたらす事の実証となった。(T. Endo et al., Inorg. Chem., 56, 2459 (2017))この成果は、本研究課題を成功させ、さらなる研究展開のための大きな一歩として位置づけられる。本研究課題では新規メリライト型化合物の合成と物性制御を目指して、その化学組成に対して従来のカチオン置換に加えてアニオンサイトの置換を行うことで新物質探索を継続的に試みている。さらに、メリライトの特徴のひとつである低次元構造に着目して物性研究を行うとともに、新たな低次元磁性を示す物質の探索や遷移金属のスピン挙動の系統的理解を目指して、関連構造を持つ化合物系へ研究を展開している。2年目の主な研究成果として、以下の実績を上げた:【マンガンを含むメリライト型化合物の酸素不定比性と物性】マンガンを含むメリライト型化合物Sr2MnGe2O7は、以前に我々のグループによって物性の報告(Inorg. Chem., 51, 3572-3578 (2012))した化合物であるが、その際に、酸素量の異なる組成の合成が可能であることを示していた。

この物質のアニオンサイトが物性に与える影響を明らかにするために詳細に研究を行い、その結果、Sr2MnGe2O7+dと表せる不定比性を持ち、その不定比量d、さらにはXANESによるMn酸化数、中性子回折による構造解析、磁気的性質を明らかにすることに成功した。【二次元三角格子化合物Ba2La2MW2O12の磁性】メリライトとタイプの異なる二次元格子を持つBa2La2MW2O12(M:遷移金属)が従来の報告と異なる結晶構造を持つこと、さらにMサイトの遷移金属の違いにより磁性が大きく変化する(反強磁性・強磁性)こと明らかにし、第一原理バンド計算によりその原因を明らかにした。【フルオライト派生構造を持つ化合物の合成と磁性】Mサイトが一次元的な配列を持つLn3MO7(Ln:ランタノイド; M:遷移金属等)型化合物の構造・磁性を解明するため、新規合成を行い、固体酸化物中では不安定なCe3+を含むCe3MO7(M = Nb, Ta)を得る事に成功し、その構造と磁性を明らかにした。メリライト型化合物に関して、アニオン置換だけでなく酸素不定比性を利用して合成研究を展開し、それらに対して放射光を用いたXANES測定など様々な実験手法や計算的手法を用いることで、磁気的性質だけでなくその電子状態を含めた物性の理解の段階へ進んでおり、研究をさらに進展させることに成功している。さらに、メリライトと関連する種々の低次元構造を持つ派生物質の研究により新たな発見や成果を得ることにも成功している。本研究課題では新規メリライト型化合物やその関連化合物の合成と物性制御を目指して、その化学組成に対して従来のカチオン置換に加えてアニオンサイトの置換を行うことで新物質探索を試みた。さらに、メリライトの特徴のひとつである低次元構造に着目して物性研究を行うとともに、新たな低次元磁性を示す物質の探索や遷移金属のスピン挙動の系統的理解を目指して、関連構造を持つ化合物系へ研究を展開して以下の成果を得た:【メリライト型化合物の合成と物性】(1)メリライト型化合物Sr2MnGe2O7において、酸素不定比性とそれに伴うMnイオンの酸化状態への変化を見い出し、構造や物性への影響を明らかにした。(2)複合アニオン型の新規メリライトへ研究を展開し、オキシ硫化物メリライトSr2MnGe2S6Oの合成に成功し、その構造と磁性を明らかにした。アニオンの変化により相互作用が強められ、磁気転移温度が従来の酸化物より大きく上昇することを見い出した。(3)メリライトと同じカチオン配列を持つ複合アニオン型フレスノイトの合成に成功し、結晶学的なアニオンの配列の違いを反映することで磁気的相互作用が10倍以上に強化されることを発見した。【低次元構造を持つ化合物の合成と物性】(1)理想的な二次元三角格子を有する層状酸化物Ba2La2MW2O12(M = Mn, Fe, Ni, Zn)に対して中性子回折実験を行い、従来とは異なる構造を有することを明らかにし、低温で強磁性や反強磁性の磁気秩序を示すことを見い出した。(2)一次元的な構造的特徴を有するフルオライト派生化合物Ln3MO7(Ln =希土類; M = Nb, Ta等)に関して、固体酸化物中では不安定なCe3+を含むCe3MO7(M = Nb, Ta)の新規合成や、希土類のイオン半径の僅かな違いがもたらす構造相転移の詳細を明らかにした。まだ、合成可能な化合物が限定されているため、物質群の拡張を継続する。合成に成功したSr2MGe2S6Oの様なS:O = 6:1の組成比に加えて、アニオンの結晶学的サイトの特徴を考慮した、4:3や5:2の比を持つ化合物について合成を試みる。この置換比の変化は遷移金属イオン間の磁気的相互作用経路の直接的に変えるため、物性へ強く影響を及ぼすと予想される。
クラウド仮想計算機に適した省エネルギーI/O ソフトウェアの開発

本研究では,既存の仮想化システムのI/Oスケジューラの性能の評価を行い既存のI/Oスケジューラが仮想化環境にて十分な性能を発揮できないことを確認した.つづいて,ホストOSとゲストOSを改変し,スケジューリング結果の保持,動作の解析が可能となる解析システムを構築した.そして,当該解析システムを用いて動作解析を行い,仮想化環境にて十分な性能を発揮できない理由が巨大なイメージファイル間の長距離シークにあることを明らかにし,この問題を解決する手法として飢餓状態判定時間の拡大など提案した.提案手法を,オープンソースのOS,仮想化システムに実装し,複数の仮想化システムで評価したところ,I/O性能の向上,統合サーバ数の向上,消費電力の低減などが確認できた.本研究では,既存の仮想化システムのI/Oスケジューラの性能の評価を行い既存のI/Oスケジューラが仮想化環境にて十分な性能を発揮できないことを確認した.つづいて,ホストOSとゲストOSを改変し,スケジューリング結果の保持,動作の解析が可能となる解析システムを構築した.そして,当該解析システムを用いて動作解析を行い,仮想化環境にて十分な性能を発揮できない理由が巨大なイメージファイル間の長距離シークにあることを明らかにし,この問題を解決する手法として飢餓状態判定時間の拡大など提案した.提案手法を,オープンソースのOS,仮想化システムに実装し,複数の仮想化システムで評価したところ,I/O性能の向上,統合サーバ数の向上,消費電力の低減などが確認できた.研究全体としては,クラウドコンピューティングで用いられる仮想計算機環境においてI/OスケジューラとI/Oサブシステムを改善し,I/O性能の向上を達成し,これにより統合サーバ数の向上を実現し消費電力を削減することを目的としている.本年度は,PCクラスタ上に仮想計算機環境を構築し,小規模な仮想計算機型のクラウド環境を構築した.そして,本クラウド環境に対して,申請者が過去の研究で開発したOSカーネルモニタを適用し,OSの動作を観察できるようにした.この適用によりOS内部で起きたイベント(I/Oの発行,エラーなど)の観察,I/O処理のトレース(分岐の追跡,I/Oの分裂と結合の追跡など),I/Oのボトルネック箇所の自動抽出などが可能となった.次に,本クラウド上でI/Oベンチマークソフトを動作させ,カーネルモニタによりその動作を確認し,既存のI/Oスケジューラ使用時の性能の調査,複数仮想計算機時に性能が低下する理由の考察,既存のI/Oスケジューラの問題の調査を行った.この調査により性能劣化原因がホストOSにおける処理対象仮想計算機の切り替えにあるかことが明らかになり,仮想計算機の切り替えを抑制することにより小規模クラウド環境におけるI/O性能の向上,省電力化が達成された.平成23年度は,ゲストOS(仮想計算機)に適したI/Oスケジューラの開発の開始,ホストOSに適したI/Oスケジューラの開発の開始,1台の物理計算機あたり稼働仮想計算機数を増加させた場合の既存のI/Oスケジューラの性能の評価と性能劣化原因の調査を行う予定であった.そして,当初の予定通りそれを行うことができた.ゲストOSに適したI/Oスケジューラの開発としては,既存のI/Oスケジューラをベースとして簡易な拡張を施したI/Oスケジューラを作成し,既存のI/Oスケジューラより高い性能を得ることができた.同様にホストOSに適したI/Oスケジューラとしても,簡易なI/Oスケジューラを作成し,既存のものより高い性能を得ることができた.1台の物理計算機あたり稼働仮想計算機数を増加させた場合の既存のI/Oスケジューラの性能の評価と性能劣化原因の調査としては,6台程度の仮想計算機を1台の物理計算機上で動作させ,その性能を調査した.そして,既存I/Oスケジューラの動作の解析システムを構築し,動作解析を行い,既存I/Oスケジューラの性能が仮想化環境で低くなってしまう理由が巨大なイメージファイル間の長距離シークであることを明らかにした.解析システムの構築と性能劣化原因の発見が達成された意義は非常に大きく,今年度はこの発見された原因をもとに改良を行えば性能向上が得られることが確実という状況となっている.また,I/Oスケジューラの作成が既に開始されていることの意義も非常に大きく,今後は実装化に伴う困難さがなく性能向上のみに注力して実装を進めることができる.本研究では,仮想化環境に適したI/OスケジューラとI/Oサブシステムの開発,それによる仮想サーバの性能向上,統合サーバ数の向上による消費電力の低減を目標として研究を行った.「仮想化環境に適したI/OスケジューラとI/Oサブシステムの開発」としては,XenとLinuxを用いた仮想化環境を構築し,既存のLinuxのI/Oスケジューラの性能の調査を行った.そして,I/Oスケジューラの動作解析システムを構築し,性能劣化原因の特定を可能とした.さらに,同解析システムを用いてゲストOSとホストOSの両方を含む仮想化環境における既存I/Oスケジューラの動作を調査し,既存I/Oスケジューラの仮想化環境における課題を特定した.そして,それらに関して改善を行ったI/Oスケジューラの実装を行った.「仮想サーバの性能向上」としては,上記の我々の実装したI/Oスケジューラの性能を評価し,仮想化環境にて既存のI/Oスケジューラより高い性能が得られることを確認した.特にホストOS用I/Oスケジューラが高い性能を提供できることを確認した.「統合サーバ数の向上による消費電力の低減」では,I/Oスケジューラを多数のサーバOSを統合した仮想化環境に適するように改善し,多数サーバ統合によるI/O性能の劣化を抑え,高い性能を保ったままでの多数サーバ統合を実現した.

これにより,物理計算機数と消費電力の大幅な低減を実現した.また,I/Oスケジューラの改変によるディスクシーク回数,シーク距離の削減を実現し,ディスクの省電力化に成功した.交付申請書に掲げた全ての項目を達成したから.24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度に,I/Oソフトウェアの動作解析環境の構築がなされ,それを用いてI/Oソフトウェアの欠点を発見した.平成24年度は,この発見された欠点を改善し,既存のI/Oスケジューラより優れたI/Oスケジューラを作成する.研究計画の変更や研究を遂行する上での問題点は発生していない.24年度が最終年度であるため、記入しない。
Nrf2-p62ダブルノックアウトを用いたオートファジー異常による肝発癌の解析

酸化ストレス防御系の転写因子であるNrf2と選択的オートファジーの基質となるp62を掛け合わせたNrf2-p62ダブルノックアウト(DKO)マウスを制作し、NAFLDからNASH、肝臓癌の発癌に至ることを見つけた。また、p62欠損細胞ではアポトーシスシグナルに異常があること、肝Kupffer細胞(マクロファージ)の貪食能に異常があること、臨床検体の健常部でのp62、LC3-A・B発現は有意に生存率が低下し、Cox比例ハザードモデルによる疾患特異的生存率ではLC3-A・Bが有意に予後不良因子であることが解った。以上からp62の欠損にNrf2の酸化ストレスの重積が肝臓癌の発症に至る原因を検討した。本研究では、酸化ストレス防御系の転写因子であるNrf2とp62を掛け合わせたNrf2-p62ダブルノックアウトマウスを用いてNAFLDからNASHを経て肝細胞癌の発症におけるp62の役割を探ることを目的として以下の研究を行った。【in vitroの解析】1)酸化傷害の定量化:DCFH-DAによる活性酸素の定量:UVB照射によって細胞傷害を与え、その際のp62(-/-)MEFの酸化ストレスをDCFH-DAとFACSで定量したところ、活性酸素がp62(-/-)MEFでは減少していることが解った。2)アポトーシスシグナルの検討: p62(-/-)MEFで増殖能の異常が知られているため、p62(-/-)MEFとp62をsiRNAでノックダウンした細胞について、Bcl-2ファミリーの異常を調べたところBcl-2の上昇とBAXの低下が認められた。3)ゲノム編集による変異細胞の制作: CRISPR/Casシステムによるゲノム編集を用いてMEF, Raw264.7, Caco-2に対してp62欠損細胞を製作しNASHのセカンドヒットの原因の究明の準備とした。【in vivoの解析】Nrf2-p62 DKOマウスの準備:Nrf2とp62の単独欠損ノックアウトマウスを交配し、Nrf2(-/-) p62(-/-)ノックアウトマウスを選別し次年度以降の研究の準備をおこなった。【臨床的探索】免疫染色によるオートファジー因子の臨床サンプルでの発現の確認:肝臓の適切なサンプルの収集が遅れたため、症例のそろっていた口腔扁平上皮癌の臨床検体(70例)を選択し、p62, LC3-A, Bの抗体を用いてLsAB法で染色を行い、臨床検体での発現と、臨床病態(TNM分類、pN、局所再発、後発転移、生存率など)との比較を行ったところ、切除断端の正常組織でのp62の発現が腫瘍の再発と関連していることを見出した。in vitroの解析の解析は予定より準備状況がよく、アポトーシスの異常についての検討については結果が得られた。また、ゲノム編集も当初の計画と方針を変えて、解析目的に応じて細胞株を選んで順調に進んだ。in vivoの解析は、マウスの交配が進んで、実際の肝臓の異常を検討できるレベルになった。臨床的探索については、肝細胞癌の病理組織の収集が遅れたため、代用の口腔扁平上皮癌での発現を免疫染色で行ったところ、想定外にp62と再発の関連が見出された。以上から、一部計画の変更があったものの,おおむね進捗状況は順調だと考えられる。本研究では、酸化ストレス防御系の転写因子であるNrf2とp62を掛け合わせたNrf2-p62ダブルノックアウト(DKO)マウスを用いてNAFLDからNASHを経て肝細胞癌の発症におけるp62の役割を探ることを目的として以下の研究を行った。【in vitroの解析】1)アポトーシスシグナルの検討: p62(-/-)MEFで増殖能の異常が知られているため、p62(-/-)MEFとp62をsiRNAでノックダウンした細胞についてFACSで確認したところアポトーシスが低下しており、Bcl-2ファミリーの異常が認められた。これらの原因が、Src系のシグナルにp62が修飾を加えてをアポトーシスを制御していることが示唆された。2) Caco-2細胞を用い、CRISPR/Cas9システムにより、p62、あるいはNrf2欠損細胞を作成した。各Caco-2細胞を単層培養して透過性の指標である細胞膜抵抗値を測定した。【in vivoの解析】Nrf2-p62 DKOマウスの製作:Nrf2とp62の単独欠損ノックアウトマウスを交配し、Nrf2(-/-) p62(-/-)ノックアウトマウスを選別したところ、Nrf2-p62 DKOマウスはNALDからNASHを引き起こし、ある一定の割合で肝臓癌を発症することを確認した。【臨床的探索】免疫染色によるオートファジー因子の臨床サンプルでの発現の検討:臨床検体を選択し、p62, LC3-A, LC3-B, γ-H2AX, 8-OHG, p53, Ki67の抗体を用いて免疫染色を行い、臨床検体での発現を観察したところ、おのおのの発現の状態、臨床病態(TNM分類、pN、局所再発、後発転移、生存率など)との比較をおこない統計学的に関連のあるものを検討したところ、p62,LC3-A・Bとも陽性例において有意に予後不良であることが示唆された。

in vitroの解析の解析は予定より進行状況が良好で、アポトーシスの異常についての検討についてはBclファミリーから、最終的にSrc系のシグナルにp62が関与してアポトーシスに抵抗していることを示唆する結果が得られ、論文として発表した。発癌の原因が炎症性のサイトカインなどである可能性も考えられたため、ゲノム編集も従来の方針を変えて、解析目的に応じて細胞株を変更した。in vivoの解析は、ダブルノックアウトマウスが完成し、実際の肝臓のNAFLDNASHさらに肝臓癌の発症までを検討できるレベルになった。臨床的探索については、肝細胞癌に代用の口腔扁平上皮癌での発現を免疫染色で行ったところ、想定外にp62と再発の関連が見出されたため、8-OHGによる酸化ストレスの評価、γ-H2AXによるDNA障害の評価、p53, Ki67などの評価を加えた。以上から、一部計画の変更があったものの、おおむね進捗状況は順調だと考えられる。前年度までに得られた臨床サンプルのデータとNrf2-p62ダブルノックアウト(DKO)マウスのフェノタイプをもとに、以下の結果を得た。1.in vitroの解析:1)肝クッパー細胞の貪食能を検討するため、腹腔マクロファージを採取し、蛍光ラテックスビーズの取り込みによる貪食能を測定したところ、Nrf2ノックアウト(KO)マウス、Nrf2-p62 DKOで有意に低下を認め、また、TNFα、IL-1βなど腹腔液中の炎症性サイトカインも有意に減少していた。2)門脈からのLPSの透過性の亢進を調べるため、Caco-2細胞を用い、CRISPR/Cas9システムにより、p62、Nrf2欠損細胞を作成し単層培養して細胞膜抵抗値を測定したところp62欠損細胞では有意に他の細胞に比べて低下していた。2.in vivoの解析:1)Nrf2-p62DKOマウスの肝臓癌の発症率を調べたところ50週齢のマウスでは12%(8/66)であったが、Nrf2単独欠損、p62KO、Nrf2KOマウスでは発生は認められなかった。2)病理学的に肝臓の異常の部位を検討したところ、DKOでは有意に線維化の割合が増大していた。3.臨床的探索:臨床検体を選択し、p62, LC3-A, LC3-B,の抗体を用いて免疫染色を行い、おのおのの発現の状態、臨床病態(TNM分類、分化度、局所再発、生存率など)との比較をおこない統計学的に解析したところカプランマイヤー法ではp62、LC3-A・Bとも陽性例において有意に予後不良、Cox比例ハザードモデルによる疾患特異的死亡率ではLC3-A・Bが有意に予後不良であることが示唆された。以上によって、肝臓癌の発がんについてp62欠損によるLPSの透過性の亢進が脂肪肝に作用し炎症を惹起してp62の発癌に至る可能性が示唆された。酸化ストレス防御系の転写因子であるNrf2と選択的オートファジーの基質となるp62を掛け合わせたNrf2-p62ダブルノックアウト(DKO)マウスを制作し、NAFLDからNASH、肝臓癌の発癌に至ることを見つけた。また、p62欠損細胞ではアポトーシスシグナルに異常があること、肝Kupffer細胞(マクロファージ)の貪食能に異常があること、臨床検体の健常部でのp62、LC3-A・B発現は有意に生存率が低下し、Cox比例ハザードモデルによる疾患特異的生存率ではLC3-A・Bが有意に予後不良因子であることが解った。以上からp62の欠損にNrf2の酸化ストレスの重積が肝臓癌の発症に至る原因を検討した。
アルコールの生体中毒作用機序に関する分子生物学的研究

1.エタノールの急性投与によりラット肝臓の核DNA酸化的損傷が上昇2.エタノールによる核DNA酸化的損傷にはcytochromeP4502E1が関与3.ラット灌流肝において、エタノール負荷によりNF-kappaBが活性化4.エタノールによるNF-kappaB活性化動態はその濃度により差異6.エタノール負荷により、AP-1はNF-kappaBと同様に活性化7.NF-kappaB活性化におけるエタノールの作用点としてMEKK1の可能性1.エタノールの急性投与によりラット肝臓の核DNA酸化的損傷が上昇2.エタノールによる核DNA酸化的損傷にはcytochromeP4502E1が関与3.ラット灌流肝において、エタノール負荷によりNF-kappaBが活性化4.エタノールによるNF-kappaB活性化動態はその濃度により差異6.エタノール負荷により、AP-1はNF-kappaBと同様に活性化7.NF-kappaB活性化におけるエタノールの作用点としてMEKK1の可能性この研究では、転写因子の一つであるNF-κB系に着目して、エタノールのおよぼす急性期の生体反応をWistar系雄ラットを用いた潅流肝にて検討し、さらに潅流液組成の変化によりその機序を考察した。潅流安定後にKHS潅流液にethanol(10mM,50mM,100mM),50mM ethanol+diallyl sulide(DAS),CCl_4をそれぞれ付加した。NF-κBのDNA binding siteとして知られている配列に結合するoligonucleotideから^<32>Pでラベルしたプローブを作成し、潅流肝から分画した核画分と反応させた。反応物をnon-denatured PAGEにて分離した後、autoradiographyを行ってプローブと結合したNF-κBを検出した。潅流20分以降では、すべてのethanol群とCCl_4群において検出可能であり、ethanol群内においては、潅流濃度依存性に検出量は増加した。潅流60分後にはethanol+DAS群においても検出された。Control群ではいずれの潅流時間においても検出されなかった。以上の結果よりethanolの急性の作用としてNF-κBの活性化が認められた。EthanalのNF-κBの活性化の機序としては、redoxの変化、TNF受容体を介した伝達系の活性、radicalの産生、IκB系の分解等が考えられる。このうちTNF受容体を介した伝達系の活性化に関してはこの研究では一回潅流法を用いているため、受容体そのものについての影響は除外される。またethanal投与時のradicalの発生に関しては以前よりcytochrome P 450 2E1(2E1)を介する代謝系の関与が指摘されており、この研究においてはDAS(2E1阻害剤)の付加によってこの関与を消去できる実験群を設定し、NF-κBの活性化の抑制が認められている。したがってethanolによるNF-κBの活性化は代謝系によるredox系の変化あるいはIκB系の分解による可能性が示唆され、現在これらの系について検討中である。この研究では、DNAの酸化的損傷と転写制御因子に着目して、エタノール(EtOH)投与時の急性作用をWistar系雄ラットを用いて検討した。DNAの酸化的損傷に関する検討では、In vivoのEtOH投与実験を行った。肝臓内の8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OH-dG)を液体クロマトグラフィーの電気化学検出器で同定し、その値をDNAの酸化的損傷の指標とした。3.5および5g/kgのEtOH投与後2時間で8-OH-dG量はcontrol群に比し有意に増加した後減じた。Cytochrome P450 2Elの阻害剤であるDASとPICを前処置をすることによりこの有意な上昇が消去された。したがってEtOHによる8-OH-dGの産生機序にCYP2Elが関与している可能性が高いことが判明した。一方転写制御因子に関しては、ラット肝臓を用いた灌流実験を行った。灌流後、nuclear画分とcytosol画分に分画した。Nuclear画分についてはRIでラベルしたoligonucleotideを作成し、non-denaturedPAGEにて転写制御囚子NF一κBのDNA結合活性を検出した。Cytosol画分についてはwestern blottingにて抗IκB抗体を用いてIκBを検出した。50mM EtOH灌流群についてはDNA結合活性が灌流20分で最大に達した後減少した。代謝阻害剤である4-methlpyrazoleおよびdiallyl sulfide付加群では50mM EtOH灌流20分での上昇は認められなかった。どちらの阻害剤ともにcytochrome P450 2Elを阻害することから、灌流20分におけるNF-κBの上昇にはcytochrome P450 2Elを介する代謝系が関与していることが判明した。以上のことから、EtOHの急性作用には、cytochrome P450 2Elを介する代謝系が大きく関与することが示唆された。
ミトコンドリア膜融合を駆動するGTPase蛋白質の動的変化とGTP加水分解の役割

ミトコンドリアは外膜と内膜の二重膜構造を持つオルガネラであり、融合と分裂によりその形態を制御している。これまでに融合を制御する因子として、酵母から哺乳動物まで広く保存されているGTP加水分解蛋白質(GTPase)が同定されており、哺乳動物の場合、外膜融合はMitofusin (Mfn)、内膜融合はOPA1が機能する。これらのGTPaseは、膜小胞の分裂に関わるダイナミン様GTPaseであることから、膜との結合、GTP加水分解によるエネルギーを使って、膜融合制御に関わると考えられているが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。これまでにカイコ・バキョロウイルス発現により、構造生物学解析に適したOPA1の調製法及び、in vitroアッセイを確立し、分子機構の解明に努めてきた。これまでの研究技術基盤を用いて、「GTP加水分解がどのように膜融合の駆動力になるか?」を明らかにするためにX線結晶構造解析を進めている。平成30年度は、構造解析に必要な高純度・高濃度OPA1の大量調製法の検討を行った。カイコ・バキュロウイルス発現により発現した膜貫通領域を持つOPA1を、界面活性剤存在下で各種クロマトグラフィーにより精製した。精製したOPA1を限外ろ過膜により濃縮し、その会合状態をゲルろ過クロマトグラフィーで解析したところ、4量体を形成していることが分かった。濃縮や保存のために急速冷凍、解凍の過程が、OPA1の不規則な会合体形成を引き起こさないことが分かったので、精製・濃縮したOPA1を使って、構造解析を進めることができるようになった。X線結晶構造解析に必要な高純度・高濃度のOPA1蛋白質の調製法を確立できたので、計画通り構造解析を進めることが可能となった。またいくつかのOPA1の部分リコンビナント蛋白質の発現、精製法を確立できたので、膜結合部位の同定や結合機構に関する研究が進むことも予想される。しかし一方で、リコンビナント蛋白質の発現・精製法の確立に多くの時間を費やし、解析が進んでいない。ミトコンドリア膜融合の分子機構の全容理解を目指し、外膜及び内膜融合の解析を行う。OPA1のX線結晶構造解析は、結晶化条件のスクリーニングを進める。これと並行して、OPA1とミトコンドリア膜に局在する脂質カルジオリピンとの特異的な結合に必要なドメインの同定及び、結合機構の解明を目指した研究を進める。欠損変異体や構造予測を基にした部分リコンビナント蛋白質を作製し、ミトコンドリア内膜をモデルとした人工脂質二重膜小胞との結合を解析する。外膜融合の分子機構の理解のために、外膜融合GTPase Mfnによるin vitro膜融合解析を進める。カイコ・バキュロウイルス発現により、Mfnを調製し、ミトコンドリア外膜をモデルとした人工脂質二重膜小胞に挿入することで、外膜融合に於けるMfnとミトコンドリア外膜を構成する脂質の役割を解析する。

欠損変異体や構造予測を基にした部分リコンビナント蛋白質を作製し、ミトコンドリア内膜をモデルとした人工脂質二重膜小胞との結合を解析する。外膜融合の分子機構の理解のために、外膜融合GTPase Mfnによるin vitro膜融合解析を進める。カイコ・バキュロウイルス発現により、Mfnを調製し、ミトコンドリア外膜をモデルとした人工脂質二重膜小胞に挿入することで、外膜融合に於けるMfnとミトコンドリア外膜を構成する脂質の役割を解析する。X線結晶構造解析を本格に進めるために、多くの消耗品等の購入が予想されるので、繰越を行った。
形と機能から探る放散虫の系統進化学的研究

放散虫の系統関係を検討する優先順位として,閉室ナセラリアは白亜紀のTurbocapsula属を選び,チベット南部のセクションにおいて,形態形質が系統的に変化すること明らかにした.現生多節ナセラリアのEucyrtidium属2種(E. hexagonatumとE. hexastichum)の殻孔の配列パタンは,中生代の分類基準を適用すると科のレベルの違いがあることが判明した.第15回国際放散虫研究集会を開催した.この国際会議では,社会認知度の低い放散虫を一般社会に普及する活動も展開した.マイクロCTを用いた放散虫の3次元模型は,普及活動に有効であることが示された.系統関係を検討する優先順位として,多節ナセラリアの中からはEucyrtidium属を,閉室ナセラリアからはTurbocapsula属を選び,集中的に取り組んだ.検討したEucyrtidium属2種(E. hexagonatum HaeckelとE. hexastichum (Haeckel))の殻形態の違いである殻孔の配列パタンは,中生代の多節ナセラリアの分類基準を適用すると科のレベルの違いをもつといえる.仮足に代表される軟体部の形態にも明らかな差異が認められる.その一方で,分子生物学的検討からは非常に近縁であるとの結果が示されている.この検討により,殻および軟体部の形態と分子生物学的なデータとは必ずしも整合的でないことを示す一例を認識することができた.どういう形態形質が本質的なのかをつきとめるのかが今後の研究の鍵となる.Turbocapsula属の系統進化については,チベット南部のセクションにおいて,形態形質が系統的に変化することを追跡することに成功した.Turbocapsula fugitivaの祖先種からTurbocapsula fugitivaへの進化は,殻室の減少により特徴づけられる.Turbocapsula fugitivaからTurbocapsula costataへの進化は,肋の発達により特徴づけられる.白亜紀古世のTubocapsula属の進化は,ジュラ紀中世のStriatojaponocapsa属の系統進化と類似点があることが判明した.すなわち,両系統において,進化の初期に4殻室から3殻室への減少が生じている.南チベットのセクションが白亜紀古世の放散虫の検討に適していることが,研究の初期段階に判明し,集中的に研究を進めることができた.Turbocapsula属の進化系統の理解については,所期の予想を超える成果を上げることができた.3Dプリンターでの造形を効果的に行うことが本研究を進めるうえで必須であるが,新潟県内の企業において,プラスティック製の模型が作成できることがわかり,研究を遂行する筋道がついた.放散虫の系統関係を検討する優先順位として,多節ナセラリアの中からはEucyrtidium属を,閉室ナセラリアからはTurbocapsula属を選び,集中的に研究した.Turbocapsula属の系統進化については,チベット南部のセクションにおいて,形態形質が系統的に変化すること明らかにした.この進化系統をもちいて,放散虫化石帯の整備も行った.検討した分類群のうち,白亜紀古世の1新種(Turbocapsula tetras Li and Matsuoka)および1新亜種(Turbocapsula costata multicostata Li and Matsuoka)を記載した.検討したEucyrtidium属2種(Eucyrtidium hexagonatum HaeckelとEucyrtidium hexastichum (Haeckel))の殻形態の違いである殻孔の配列パタンは,中生代の多節ナセラリアの分類基準を適用すると科のレベルの違いもつ.また,仮足に代表される軟体部の形態にも明らかな差異が認められる.その一方で,分子生物学的検討からは非常に近縁であるとの結果が示されている.殻および軟体部の形態と分子生物学的なデータとは必ずしも整合的でないことを示す一例を示すことができた.沖縄近海の表層海域に生息する放散虫29種について,カタログを作成した.1種につき1葉からなるカタログは,放散虫生体の光学顕微鏡写真,殻の光学顕微鏡写真および殻の走査型電子顕微鏡写真を含む.今後,現生放散虫を研究するうえで利用価値の高い基本データになると期待される.新潟県糸魚川地域の礫岩中の珪質岩礫から,古生代シルル紀の放散虫化石を見いだした.これは新潟県最古の化石である.日本列島の含放散虫礫としても最古の記録である.チベットの白亜紀放散虫の研究成果および沖縄の現生放散虫についてのカタログについては,すでに論文が印刷された.チベットの新生代初期の放散虫の系統進化に関する論文も受理直前の状況である.したがって,計画以上に進展していると判断した.中国チベットの珪質岩セクションにおいて古第三紀放散虫の検討を行い,Lychnocanium属などの3新種を含む放散虫群集について記載論文を公表した.本研究にともない,古第三紀の放散虫について,進化系統を把握することができた.沖縄県伊江島から産するペルム紀から白亜紀の放散虫の産出について論文として公表した.沖縄での現生放散虫研究について,過去20年にわたる研究史を振り返るとともに,研究方法についての解説書を英文で出版した.2016年度に執筆した現生放散虫の英文カタログを併用することにより,未経験の人でも現生放散虫研究に親しむことができる.InterRad XV特集号とは別に,スロベニア,スペイン,スイス,アメリカの研究者との共著による中生代放散虫層序についての総説論文を執筆し,投稿した.化石帯を設定するにあたり,放散虫の系統進化を認識することが重要であることが強調されている.

放散虫の系統関係を検討する優先順位として,閉室ナセラリアは白亜紀のTurbocapsula属を選び,チベット南部のセクションにおいて,形態形質が系統的に変化すること明らかにした.現生多節ナセラリアのEucyrtidium属2種(E. hexagonatumとE. hexastichum)の殻孔の配列パタンは,中生代の分類基準を適用すると科のレベルの違いがあることが判明した.第15回国際放散虫研究集会を開催した.この国際会議では,社会認知度の低い放散虫を一般社会に普及する活動も展開した.マイクロCTを用いた放散虫の3次元模型は,普及活動に有効であることが示された.本研究課題のもうひとつの柱である,マイクロCTを使った放散虫殻のデジタルデータを取得を並行的に進めていく.現生放散虫の生態観察についても,引き続き実施する.3D模型への出力についてはメドがたっているので,予定通りに研究を進めることが可能である.本研究課題のもう一つの柱であるマイクロCTを使った形状認識については,海洋開発研究機構(JAMSTEC)や新潟県内の工業試験場などの機器を利用する道筋がついた.それらの装置も活用しながら,形態解析のデータも蓄積していく方針である.古海洋学今年度大量のデータを取得し,次年度に人件費としての使用が見込まれたため,使用を抑制したため画像データを含む多量のデータを整理しつつ,野外調査および室内作業を進め,最終年度の研究を実施する.データ整理のための人件費,国内外のフィールド調査および学会のための旅費,論文作成のための経費などとして使用する予定である.
5型ラミニンの生合成と角化細胞の接着に関する研究

5型ラミニンは基底層角化細胞と基底膜を結び付けるヘミデスモゾームを構成するanchoringfilamentに局在している。われわれはこれまで発表した5型ラミニン(LAM5)の細胞内アッセンブリと分泌に関する基礎的研究を踏まえて、1)先天性表皮水疱症患者角化細胞におけるLAM5生成分泌の異常を明らかにすること。2)LAM5がヘミデスモゾームに加わり角化細胞の接着する機構の解明を目的とした。準備として1)LAM5のαβγサブユニットのcDNAをpGEX発現ベクターに挿入しリコンビナント蛋白を得、兎に免疫しポリクローナル抗血清を作成した。2)ヒト角化細胞mRNAに対するRT-PCRによって、LAM5αサブユニットのcDNA断片を得、全長を有するクローンとして再構成した。接合部型先天性表皮水疱症(JEB)患者由来の角化細胞を、ヒトパピローマウイルスE18遺伝子で不死化し、細胞質内および培養上清におけるLAM5分子の生合成の異常を検討した。その結果、HJEB角化細胞はいずれかのサブユニット蛋白を完全に欠いており、ヘテロ3量体は全く形成されていなかった。軽症型では少ないもののヘテロ3量体が形成され、培養上清に分泌されていた。mRNAレベルを比較したところ、致死型では障害されているサブユニットに対応するmRNAはほとんど検出できず、軽症型ではその量が低下していた。遺伝子配列の検索では変異が特異的に集積した部位は無かった。JEB患者の遺伝子の変異が(1)mRNAの安定性に影響を及ぼしサブユニットの量を減らす、(2)ヘテロ3量体形成に必要な蛋白構造を変質させる、という機序によりLAM5ヘテロ3量体生成が完全あるいは不完全に阻害されることが推定された。LAM5分子の異常特にヘテロ3量体形成の程度が本症患者の重症度と相関していることが明らかになった。本研究は、表皮基底膜の構成に重要である5型ラミニンがどのようにアッセンブリされるかという基礎的な面と、本蛋白が欠損する先天異常である接合部型先天性表皮水泡症の羊水診断の簡略化という臨床的な側面を持っている。現在までのところ1)5型ラミニンの3つのサブユニットに対する抗体を作成し終わった。2)5型ラミニンの3つのサブユニットのcDNAを真核細胞用発現ベクターに挿入した。というところまで進展しており、今後は臨床面:正常ヒト羊水をもちいたウエスタンブロッティングで、5型ラミニンを含むヘミデスモゾーム構成蛋白の産生の有無、産生蛋白の異常の有無につき検討するシステムを構築する。基礎面:培養細胞へのトランスフェクションやin vitro translationを用いてリコンビナント5型ラミニンを作成しそのアセンブリやほかの基底膜構成成分との関連につき検討を進める。という計画を持っている。また、5型ラミニンに対する自己抗体を有する疾患に瘢痕類天疱瘡があるが、患者血清の認識するエピトープを決定するためα鎖蛋白を断片化したリコンビナント蛋白も作成する予定である。

準備として1)LAM5のαβγサブユニットのcDNAをpGEX発現ベクターに挿入しリコンビナント蛋白を得、兎に免疫しポリクローナル抗血清を作成した。2)ヒト角化細胞mRNAに対するRT-PCRによって、LAM5αサブユニットのcDNA断片を得、全長を有するクローンとして再構成した。接合部型先天性表皮水疱症(JEB)患者由来の角化細胞を、ヒトパピローマウイルスE18遺伝子で不死化し、細胞質内および培養上清におけるLAM5分子の生合成の異常を検討した。その結果、HJEB角化細胞はいずれかのサブユニット蛋白を完全に欠いており、ヘテロ3量体は全く形成されていなかった。軽症型では量は少ないもののヘテロ3量体が形成され、培養上清に分泌されていた。mRNAレベルを比較したところ、致死型では障害されているサブユニットに対応するmRNAはほとんど検出できず、軽症型ではその量が低下していた。遺伝子配列の検索では変異が特異的に集積した部位は無かった。JEB患者の遺伝子の変異が(1)mRNAの安定性に影響を及ぼしサブユニットの量を減らす、(2)ヘテロ3量体形成に必要な蛋白構造を変質させる、という機序によりLAM5ヘテロ3量体生成が完全あるいは不完全に阻害されることが推定された。LAM5分子の異常特にヘテロ3量体形成の程度が本症患者の重症度と相関していることが明らかになった。