hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写因子の活性化制御を目指した新規合成ペプチドの創製と効率的細胞内導入

近年、HIV-1 Tat由来の塩基性ペプチドが効率的に細胞膜を透過することが明らかとなり、これをキャリアとして、様々なタンパク質が細胞内に容易に導入されることが報告されている。我々は、Arg(アルギニン)残基に富む多くのペプチドがHIV-1 Tatペプチドと同様の細胞膜透過能とキャリア能を有することを新たに見いだし、また、Argのみからなるオリゴペプチドにも細胞膜透過能があり、鎖長(分子内のArg残基の数)により細胞透過性や細胞内での局在が異なることを明らかにした。一方、これまで、直鎖型のArgに富むペプチドの膜透過性が検討されてきたが、今回、新たに、Argを含む種々の分岐型ペプチドを合成し、これらの細胞膜透過性の検討を行った。ヒト子宮癌由来のHeLa細胞を用いて、得られたペプチドの細胞膜透過性について検討したところ、分岐型ペプチドでも、直鎖型のペプチドと同様に高い細胞透過性を示すことが明らかとなった。また、分岐の違いによる細胞内局在の相違も見られた。HIVのRNA配列に結合するArgに富むペプチドを用いてRNA分解酵素を細胞内に導入出来ることが分かり、さらに、細胞内でHIVの増殖阻害活性を示した。転写因子NF-κBの活性化に関与する蛋白質I-κBのリン酸化部位、およびユビキチル化部位に対応するペプチドを合成し、アルギニンペプチドと結合させ、細胞内に導入したところ、NF-κBの活性化を阻害できることが分かった。しかし、阻害の程度は場合によって大きく異なり、この原因に関して現在検討を加えている。また、転写因子Sp1のDNA認識部位に対するペプチドを細胞内に導入し、Sp1認識部位を有するレポーター遺伝子において転写が阻害できることも見出した。HIV-1 Tatタンパク由来のペプチドTat-(48-60)とのコンジュゲーションにより、外来タンパクを細胞内に導入できることが知られている。Tat-(48-60)はRNA結合ペプチドであることから、我々は蛍光ラベルした種々のRNA結合ペプチドを合成し、それらの膜透過能と、ペプチド、タンパク質の細胞内導入キャリアとしての可能性について検討を行った。その結果、用いたRNA結合ペプチド10種のうち9種について細胞内導入が観察され、これらのうち良好な細胞内移行を示したペプチドを用いて分子量約29,000のカルボニックアンヒドラーゼも効率よく細胞内に取り込まれることが分かった。これらの結果から、このような効率的な膜透過はTatペプチドに特有のものではなく、アルギニンに富む塩基性ペプチド広く一般に見られることが示唆された。また、膜透過機序の検討により、従来知られているエンドサイトーシスとは異なる取り込み機序が存在することも示唆された。我々は、次に、416残基のアルギニン残基からなる蛍光ラベルしたペプチドを合成し、配列中のアルギニン残基数の影響を調べた。その結果、アルギニン4残基のものはほとんど細胞内に移行しなかったのに対し、8残基のものは非常に効率よく細胞内に移行した。しかし、アルギニンの数がこれより増えるに従い、逆に細胞内への移行は起こりにくくなることがわかった。これらのペプチドとカルボニックアンヒドラーゼのコンジュゲートを調製したところ、取り込み効率に関して同様な鎖長依存性が見られた。以上により、細胞内移行にはアルギニンのみならず、その数も重要な働きをすることが示唆された。これらのペプチドの細胞内導入法をもとに、現在、転写因子の活性化制御を目指したペプチドの設計を行っている。HIV-1Tatタンパク

由来のペプチドTat-(48-60)とのコンジュゲーションにより、外来タンパクを細胞内に導我々は、Arg(アルギニン)残基に富む多くのペプチドがHIV-1Tatペプチドと同様の細胞膜透過能とキャリア能を有することを新たに見いだし、また、Argのみからなるオリゴペプチドにも細胞膜透過能があり、鎖長(分子内のArg残基の数)により細胞透過性や細胞内での局在が異なることを明らかにした。今回、これらの膜透過ペプチドの導入機序について詳細に検討したところ、これらのペプチドの膜透過は、従来のエンドサイトーシスとは異なる共通の機序により行われていることが示唆された。また、細胞表層の硫酸化多糖がペプチドの細胞膜への吸着に関与していることも明らかとなった。一方、これまで、直鎖型のArgに富むペプチドの膜透過性が検討されてきたが、今回、新たに、Argを含む種々の分岐型ペプチドを合成し、これらの細胞膜透過性の検討を行った。ヒト子宮癌由来のHeLa細胞を用いて、得られたペプチドの細胞膜透過性について検討したところ、分岐型ペプチドでも、直鎖型のペプチドと同様に高い細胞透過性を示すことが明らかとなった。また、分岐の違いによる細胞内局在の相違も見られた。さらに、分子量3万程度のタンパク質も導入可能であることが分かった。また、HIVのRNA配列に結合するArgに富むペプチドを用いても、RNA分解酵素を細胞内に導入出来ることが分かり、さらに、細胞内で抗エイズ活性を示すことも明らかとなった。現在、これらの活性の向上と作用機作について検討中である。近年、HIV-1 Tat由来の塩基性ペプチドが効率的に細胞膜を透過することが明らかとなり、これをキャリアとして、様々なタンパク質が細胞内に容易に導入されることが報告されている。我々は、Arg(アルギニン)残基に富む多くのペプチドがHIV-1 Tatペプチドと同様の細胞膜透過能とキャリア能を有することを新たに見いだし、また、Argのみからなるオリゴペプチドにも細胞膜透過能があり、鎖長(分子内のArg残基の数)により細胞透過性や細胞内での局在が異なることを明らかにした。HIVのRNA配列結合するArgに富むペプチドを用いてRNA分解酵素を細胞内に導入出来ることが分かり、さらに、細胞内でHIVの増殖阻害活性を示した。転写因子NF-κBの活性化に関与する蛋白質I-κBのリン酸化部位、およびユビキチル化部位に対応するペプチドを合成し、アルギニンペプチドと結合させ、細胞内に導入したところ、NF-κBの活性化を阻害できることが分かった。しかし、阻害の程度は場合によって大きく異なり、この原因に関して現在検討を加えている。また、転写因子Sp1のDNA認識部位に対するペプチドを細胞内に導入し、Sp1認識部位を有するレポーター遺伝子において転写が阻害できることも見出した。
超局所解析の手法による偏微分方程式の定量的解析

この研究は、偏微分方程式における解のなめらかさや大きさなど定量的な性質の解析において、超局所解析の手法を取り込むための汎用性のある方法論を構築し、偏微分方程式論の研究における新しい可能性を追求していくものである。それを具現化する道具としてのフーリエ積分作用素論とその理論の枠組みとしての関数空間論の整備を基本課題に据え、さらには、より一般の偏微分方程式に対する様々な基本的評価式を導出しその諸性質を考察するという応用課題に取り組むことによって、その方法論の有効性を実証していく。これは、偏微分方程式論における調和解析学の成果の積極的な利用という近年における世界的な動向に対し、さらに超局所解析の視点を融合させる独創的な試みである。今年度は、これまでの研究において積み残しとなっていた課題である「平滑化評価式の比較原理の一般化」に対して重点的に取り組んだ。これまでM. Ruzhansky氏との一連の共同研究により、正準変換と比較原理を組み合わせることにより様々な平滑化評価式が導かれるという知見を得ていたが、これらは全空間上の定数係数の分散型方程式のみに対する平滑化評価式のみを扱うものであり、証明もフーリエ変換による方法に強く依存していたため、それ以外の場合への適用は難しいものと考えられていた。しかし、今年度はM. Ben-Artzi氏を共同研究チームに招き入れ、スペクトル解析の方法論を推し進めることにより、比較原理はより抽象的な枠組に於いても成立する「原理」であることを示すことができた。その帰結として、一般領域上やポテンシャルがある場合など平滑化評価式に対しても比較原理が適用可能となった。この成果をまとめた論文は現在投稿中である。基本課題については、昨年度までにフーリエ積分作用素の有界性に関する大きな研究の進展があった。応用課題については、今年度に平滑化評価式の比較原理に関する十分な成果があがっている。まだ進展の見られない応用課題もあるが、総じて順調に進展しているものと判断している。いよいよ最終年度を向かえるということもあり、そろそろこの研究も収束させていきたい。重点的に取り組みたい課題として、「モジュレーション空間上の非線形作用とその応用」を掲げておく。これに関しては、昨年度までの研究の進展により「モジュレーション空間に属する函数fと滑らかな函数Fに対して,それらの合成函数F(f)は同じモジュレーション空間に属するか?」という基本的な問題に対して、(指数に関する「ある制限」のもと)肯定的な解答を与えていた。今後は「ある制限」が何処まで緩められるかについて探っていきたい。今年度の第1の成果として、フーリエ積分作用素の大域的なLp-有界性の理論を構築した。フーリエ積分作用素のLp-評価式は、これまでp=2の場合に大域的評価式が、一般のpの場合に局所的評価式が成立することが知られていたが、今回の研究成果により、一般のpの場合にも大域的評価式が得られることを示した。第2の成果として、非分散型方程式に対する平滑化評価式を導出した。非分散型方程式に対しては一般には平滑化評価式は成立しないことが知られており、その代わりとして「不変評価式」が提唱されていたが、今回の研究成果により、すべての定係数分散型方程式が「不変評価式」をみたしていることが示された。第3の成果として、制限定理及び分散型方程式に対する平滑化評価式における最良定数を決定した。これまでシュレディンガー方程式に対する様々なタイプの平滑化評価式の最良定数を決定してきたが、依然として未知のままとなっているケースも残されていた。今回の研究成果により、これら未知のケースに対してもほぼ完全な解答を与えることができた。今年度は、昨年度までに研究成果が上がってきた研究課題の中でも特に「課題1.フーリエ積分作用素の大域的なLp-有界性の理論の構築」と「課題2.シュレディンガー方程式に対する平滑化評価式における最良定数」の二つの課題に着目し、それらに対する研究を発展させた。

課題1に対しては、これまでRuzhansky氏との共同研究により、より一般の相関数に対する大域的なLp-有界性を示してきたが、その際に用いた議論をモチーフとして、一般の積分作用素において局所的な有界性から大域的な有界性が導かれるための一般論の構築を行った。この理論からも既存のフーリエ積分作用素の有界性定理が導かれるが、他の様々な作用素においても意味のある応用を持つものと期待しており、引き続き研究を継続していきたい。課題2に対しては、これまでBez氏らとの共同研究によりシュレディンガー方程式に対する様々なタイプの平滑化評価式の最良定数を決定してきたが、これら最良定数の表現とシュレディンガー方程式の適切性に対する竹内-溝畑予想との関連性をさらに明らかにすべく、まずは基礎研究に終始した。基本課題に関しては、これまでにフーリエ積分作用素の大域的な有界性に関する基本的な性質が解明できており、ほぼ計画通りの進捗状況である。応用課題に関しては、非分散型方程式に対しても平滑化評価式を一般化した不変評価式が成立することを解明しており、さらにはその最良定数に関する新しい知見を得るなど、当初の予定以上の進展をみせている。他の応用課題に対してはまだ着手できていないが、総じて順調に進展しているものと判断している。この研究は、偏微分方程式における解のなめらかさや大きさなど定量的な性質の解析において、超局所解析の手法を取り込むための汎用性のある方法論を構築し、偏微分方程式論の研究における新しい可能性を追求していくものである。それを具現化する道具としてのフーリエ積分作用素論とその理論の枠組みとしての関数空間論の整備を基本課題に据え、さらには、より一般の偏微分方程式に対する様々な基本的評価式を導出しその諸性質を考察するという応用課題に取り組むことによって、その方法論の有効性を実証していく。これは、偏微分方程式論における調和解析学の成果の積極的な利用という近年における世界的な動向に対し、さらに超局所解析の視点を融合させる独創的な試みである。今年度は、これまで研究成果が上がってきているシュレディンガー方程式に対する平滑化評価式や、その双対としての制限定理に関する研究を発展させるべく、「課題1:非斉次シュレディンガー方程式の平滑化評価式に対する最良定数」および「課題2:最良評価式の安定性」の2課題に関して様々な考察をおこなった。課題1に対しては、これまでBez氏らとの共同研究によりシュレディンガー方程式に対する様々なタイプの平滑化評価式の最良定数を決定してきたが、これらはいずれも斉次方程式の場合に限られており、その手法は非斉次方程式の場合には必ずしも適用できない。今年度は何が本質的な困難であるのかを探るべく、さまざまな試行を行った。これに関しては、今後も研究を継続していく。課題2は、最良の評価式とその等号成立条件が与えられているとき、「評価式が等号に近い関数は等号成立条件にも近いであろうか?」という一般的な問題を扱ったものであり、やはりBez氏らとの共同研究により、古典的な球面への制限定理の場合にひとつの肯定的な解答を与えることができた。基本課題に関しては、フーリエ積分作用素の大域的な有界性に関して様々な角度からの研究がすすんでおり、ほぼ計画通りの進捗状況である。応用課題に関しては、平滑化評価式に関する研究が突出して進展している。
病院併設BNCTにむけた血液・組織内ホウ素分析手法の最適化

実験の結果から、液体試料、付着細胞においては、micro-PIXE:/PIGEでホウ素の検出は可能であり、その分布を高濃度であればマッピングすることができる。BNCTにおいては、ビーム施設の問題はあるが、液体試料においては、臨床補助の可能性はある。細胞においては、治療に必要とされる30-40μgB10/g程度の組織内濃度では十分な定量的検出ができず、バックグラウンドに埋もれている状態であり、さらに一桁程度高感度ないしは高分解能の検出が必要であると考えられる。加速器を用いてホウ素中性子捕捉療法を施行するにあたり、必要なホウ素濃度測定技術の要件について検討している。原子力研究開発機構高崎研究所においてMicro-Proton Induced X-Ray Emissionを用いて、陽子線を用いたホウ素濃度側的技術の基礎的検討を行っている。マイクロビームでは極めて微量な検体で、かつ微小な元素分布が確認できるため、中性子照射による細胞生存率をあわせて検討できれば、合わせて細胞内分布と殺細胞効果についての検討が可能となる見込みである。現時点ではおよそ20ppmのホウ素濃度が本手法で確認可能であり、標準曲線もサンプル数少ないものの、R2=0.85程度の相関を得ることができ、判定量的測定が可能であると思われた。検査時間もおおむね要求時間内で10分以内であり、実臨床への応用の可能性は高いと考えている。今後さらに実験数を増やし、詳細を検討すること、細胞2次元分布をコントロール、陽性コントロールと比較検討してゆく予定である。最終的な目標は、腫瘍細胞内のホウ素濃度が、可能な限り詳細に推測できることである。現時点では、血液中のホウ素濃度は、即発ガンマ線ないし発光プラズマ法で検出することが可能であり、血中濃度から腫瘍濃度を推察する手法である。加速器では、測定可能な照射時間が短時間であるため、血液サンプルの数が減じることが考えられ、より詳細に血液-腫瘍の相関関係を検討する必要がある。日本原子力研究開発機構高崎研究所において、Micro Proton Induced X-ray EmissionおよびMicro Proton Induced Gamma Ray emission (micro PIXE and PIGE)を用いたマイクロビームを用いたホウ素濃度測定技術の基礎的検討を行った。polycarbonate membrane上に培養細胞を付着させ、ホウ素化合物を付加したのち、凍結乾燥した状態で、切り出した膜を測定専用のホルダーに装着した。リン、カリウム、硫黄などの元素分布を同時測定のPIXEによって二次元画像を取得し、MATLAB上で、細胞内と細胞外をこれらの元素分布を用いて推定し、2次元画像中の、細胞内外のホウ素分布比を算出する手法について検討を行っている。ホウ素によって生じるガンマ線の検出が不十分で、十分なS/N比が得られていない。検体のホウ素濃度を上昇させて再実験を行うこと、また腫瘍組織における細胞、間質での検討を行う予定である。ホウ素濃度測定が可能であった。また、細胞内外の分布について推察するアルゴリズムを開発し、検証している。今後組織における分布、照射実験との関連を検討してゆく。ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)の実施にあたり、少なくとも血液中のホウ素濃度を照射中に短時間に把握する必要がある。従来原子炉BNCTでは、即発ガンマ線分析が利用可能であった。また、あわせてプラズマ発光分析を照射中に施行して中性子照射時間を決定していた。照射時間によって中性子線量を決定するため、ホウ素濃度は治療効果、副作用にかかわる極めて重要な測定値である。現在、原子炉に代わって、加速器中性子線源が国内外で開発され、臨床研究が一部開始されており、今後病院併設型BNCTが可能になる見込みである。日本原子力研究開発機構、のち量子科学技術研究開発機構の高崎量子応用研究所において、Micro beamを用いた微小サンプルの元素分析が可能であり、これを用いたホウ素分析の可能性について検討した。利用した機器はMicro Proton Induced X ray EmissionおよびMicro Proton Gamma ray Emission (micro PIXE and PIGE)であり、これらを用いて細胞、組織でのホウ素濃度測定手法について検討した。血液、溶液中のホウ素濃度は半定量的に、必要な5-10分程度の時間での測定が可能であった。細胞内ホウ素濃度は、細胞の同定、ホウ素カウントの検出は可能であったが、背景との差が小さく、細胞内外の比率は目視で確認できなかった。画像処理で細胞内外比を算出する手法を開発した。組織ホウ素分布については、組織の形態学的構造が低分子の分布では可視化が困難であり、さらなる検討を要する。ホウ素濃度測定が可能で、ほぼ定量性については検討可能であった。今後細胞内分布、中性子照射実験との関連を検討してゆく予定である。凍結乾燥による細胞サンプルの調整ははほぼ安定した。今後、定量性、(凍結乾燥)組織切片、液体の測定について検討してゆく。

脳神経外科リハビリテーション試料前処理、試料交換台については、後日機械的に解決可能な問題とかんがえられる。試料ホルター、サンプル分析アルゴリズムについてさらに全血、血清、血漿について詳細を検討してゆく。細胞の中性子照射実験を京都大学実験原子炉で行う予定であったが、原子炉が稼働せず、実験が不可能であったため。次年度以降、利用可能な中性子ビームがあれば利用する。また海外での実験も検討する。細胞照射実験によって、ホウ素濃度、細胞内ホウ素分布との関連を検討する予定であり、その費用に使用する。次年度以降、可能になり次第、細胞照射実験を施行し、ホウ素濃度、細胞内ホウ素分布との関連をとらえる検討を行う予定である。
ラット警報フェロモンの同定

本年度に得られた成果の概要は以下の通りである1.フェロモン候補分子の絞り込み及び同定これまでの研究により確立した吸着剤(Tenax)及び提示方法(濾紙に滴下)を用いてフェロモン陽性試料を準備し、それを分画していくことで警報フェロモン分子の候補を絞り込んだ。しかしながら、その結果同定できた4つの候補物質にはフェロモン活性が認められない事が明らかとなった。そのためフェロモン陽性試料を分画していくことでフェロモン候補物質を絞り込むという方法を見直し、フェロモン陽性試料において容易に同定された化学物質を全て購入及び合成し、それらをブレンドして作製したサンプルにフェロモン活性が存在するかを検討することとし、現在解析中である。2.安寧フェロモン解析のための実験系の改良前年度に確立した安寧フェロモン評価系を用いて、安寧フェロモンに対する理解を深める目的で実験を行った。主嗅覚系で受容された安寧フェロモン情報がどのような経路を辿り扁桃体へと伝達されているかを解析するため、主嗅球から直接的な投射を受けている核の一つである前嗅核を破壊したところ、安寧フェロモン作用が特異的に阻害される事が明らかとなった。またこの結果は主嗅覚系が破壊され嗅覚情報が受容できなくなったためではない事も明らかとなった。以上の結果より、主嗅覚系で受容された安寧フェロモン情報は、主嗅球へと伝達された後に前嗅核へと伝達されていることが示唆され、安寧フェロモン情報は主嗅覚系の中でもある特定のルートを辿ってその情報が伝達されている事が示唆された。本年度に得られた成果の概要は以下の通りである1.フェロモン分子の化学特性の検討:フェロモン分子同定への前段階として、その揮発性およびフェロモン含有水濃縮の可能性を、最も簡便な生物検定法である聴覚性驚愕反応試験を用いて検討した。その結果、フェロモン含有水に直接接触できなくても被験動物は驚愕反応の増強を示すことが明らかとなったため、警報フェロモンは揮発性の物質であることが示された。また、加熱濃縮したフェロモン含有水でも、被験動物に同様の反応を引き起こしたため、フェロモン含有水を濃縮することが可能であるということか明らかとなった。2.フェロモン作用の検討:警報フェロモンは体温上昇反応の増強、驚愕反応の増強および防御行動や危険評価行動の増加といった、実験系に応じた様々な反応を引き起こすことから、その第一義的な作用は受容動物における不安の惹起であることが推察された。この可能性を検討するため、聴覚性驚愕反応試験を用いて、警報フェロモン作用における抗不安薬の効果を観察した。ベンゾジアゼピンやCRF拮抗薬等の事前投与により、警報フェロモンの作用を阻害できたことから、警報フェロモンの作用は受容動物における不安の惹起であることが示唆された。3.安寧フェロモン解析のための実験系の確立:警報フェロモン分子解析の際に混入してしまう安寧フェロモンに対する理解を深めるため、その効果を観察できる実験系の確立を目指した。恐怖条件付けをした被験動物に条件刺激を提示する際、単独で提示する群と、他個体と一緒に提示する群とでその反応を比較したところ、他個体と一緒に提示すると恐怖条件反応が大幅に緩和されることが明らかとなったことから、この評価系は安寧フェロモン解析に用いることが可能であると考えられた。今後、より洗練された実験系へと改良を加えていく予定である。本年度に得られた成果の概要は以下の通りである1.吸着剤の選定麻酔したドナーを用いて警報フェロモンを放出させ、それを様々な吸着剤に吸着させた後、吸着した物質を再び水中に吸着させ、以前と同様の方法でレシピエントに提示することでフェロモン活性の有無を判定する。その結果、警報フェロモンを捕捉するにはTenaxを吸着剤として用いることが、その後の分析作業も含めて、最適であることが判明した。2.提示法の確立実験1で選定した吸着剤を用いて、吸着したフェロモンのより簡便な提示法を検討した結果、吸着剤の抽出液を濾紙に滴下して提示する方法が一番簡便で再現性が高いことが判明した。3.フェロモン候補分子の絞り込み上記の研究にて確立した吸着剤及び提示方法を用いて、警報フェロモン分子の候補を絞り込んだ。その結果現在までに4つの候補物質を同定することができた。現在、これらの物質が目的とするフェロモン分子であるかを、上記の生物検定法を用いて検討している。4.安寧フェロモン解析のための実験系の改良前年度に確立した安寧フェロモン評価系を、より洗練する目的で実験を行った。まず被験動物と他個体とを金網で隔離し、同様の効果が得られるかを観察した。その結果、金網越しの他個体でも被験動物のすくみ行動を抑制することが明らかとなった。次に、硫酸亜鉛を投与することで嗅覚系を破壊した被験動物を用いた結果、嗅覚系が重要な役割を担っていることが明らかとなった。以上の結果から、本現象は安寧フェロモンを介した現象であることが示唆された。

しかしながら、その結果同定できた4つの候補物質にはフェロモン活性が認められない事が明らかとなった。そのためフェロモン陽性試料を分画していくことでフェロモン候補物質を絞り込むという方法を見直し、フェロモン陽性試料において容易に同定された化学物質を全て購入及び合成し、それらをブレンドして作製したサンプルにフェロモン活性が存在するかを検討することとし、現在解析中である。2.安寧フェロモン解析のための実験系の改良前年度に確立した安寧フェロモン評価系を用いて、安寧フェロモンに対する理解を深める目的で実験を行った。主嗅覚系で受容された安寧フェロモン情報がどのような経路を辿り扁桃体へと伝達されているかを解析するため、主嗅球から直接的な投射を受けている核の一つである前嗅核を破壊したところ、安寧フェロモン作用が特異的に阻害される事が明らかとなった。またこの結果は主嗅覚系が破壊され嗅覚情報が受容できなくなったためではない事も明らかとなった。以上の結果より、主嗅覚系で受容された安寧フェロモン情報は、主嗅球へと伝達された後に前嗅核へと伝達されていることが示唆され、安寧フェロモン情報は主嗅覚系の中でもある特定のルートを辿ってその情報が伝達されている事が示唆された。
歯の他家移植治療法の基盤となる歯根膜細胞の分化誘導法の確立

胎生期BrdUラベリング法を歯の他家移植に応用し、歯の移植後の歯髄と歯周組織再生過程におけるLabel-retaining cells (LRCs)の動態を観察した。その結果、歯の移植後にドナーのLRCsが歯髄中央部に維持されると象牙質形成が惹起されることが明らかとなった。また、GFPマウスを用いた実験により、移植歯の歯髄は内皮細胞と遊走性間葉細胞を除きドナーの細胞で構成されており、歯周組織はマラッセの上皮遺残以外はホスト細胞に置き換わっていることも明らかとなった。【方法】妊娠ICRマウスに24日間BrdUを腹腔内投与し、ラベルマウスを作成した。このラベルマウスと非ラベルマウス間で、3週齢時に臼歯抜去後、歯冠部を舌下部へ他家移植した。術後1日2週後にアルデヒド系固定液で灌流固定し、EDTA脱灰後、パラフィン切片を作製し、抗ネスチン・抗オステオポンティン・抗BrdU抗体を用いた免疫染色を行った。なお無処置群の左側臼歯を対照群とした。【結果および考察】対照群歯髄では、歯髄中央部に広範にLRCsが局在し、象牙芽細胞はネスチン強陽性を示した。術後に歯髄のネスチン免疫陽性反応が消失したが、57日後に、ネスチン陽性象牙芽細胞様細胞が歯髄・象牙質界面に再配列した。ネスチン陽性象牙芽細胞様細胞の配列に先立ち、歯髄・象牙質界面にはオステオポンティン陽性の基質が観察された。ラベル歯の移植群においては、術後1日から髄角部歯髄にLRCsが観察され、その後LRCsが増加し、再生象牙芽細胞層にLRCsが観察された。移植後2週になると、歯髄腔に骨組織形成が惹起されたが、骨組織周囲はネスチンおよびBrdU陰性であった。一方、非ラベル歯の移植群では、周囲の舌筋組織に広範にLRCsが局在し、術後3日以降には歯髄腔のLRCsが増加したが、再生象牙芽細胞層にはLRCsは観察されなかった。以上より、歯の移植後にLRCsが象牙芽細胞様細胞に分化するのに対し、骨組織には他の細胞群が分化する可能性が示された。歯の損傷後の歯髄および歯根膜治癒過程における象牙芽細胞分化機構ならびに歯根膜分化機構を解明することを目的に、歯の再植・移植後の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびオステオポンチン(OPN)の反応を免疫細胞化学的に検索した。深麻酔下で23週齢上顎第一臼歯再植および臼歯抜去後に歯または歯冠部を舌下部へ自家・他家移植した。術後1日2週後にアルデヒド系固定液で灌流固定し、EDTA脱灰後、パラフィン切片を作製し、抗GM-CSF・抗OPN・抗ネスチン抗体を用いた免疫染色を行った。対照群歯髄では、咬頭頂領域を中心に歯髄・象牙質界面に弱いオステオポンチン陽性反応が見られ、象牙芽細胞はネスチン強陽性を示したが、歯髄内はGM-CSFは陰性であった。術後に歯髄のネスチン免疫陽性反応が消失したが、37日後に、GM-CSF陽性細胞、OPN陽性細胞の出現に引き続き、ネスチン陽性象牙芽細胞様細胞が歯髄・象牙質界面に再配列した。14日後には歯髄腔に骨組織形成が惹起されたが、骨芽細胞がOPN陽性反応を示した。GM-CSF陽性反応産物は象牙細管内にも見られ、既存の象牙質と再生象牙質の界面にOPN陽性反応が観察された。さらに、in situ hybridizationによりOPN遺伝子発現を検索すると、免疫反応とほぼ同じ発現パターンを示した。以上より、歯の再植・移植後の歯髄治癒過程における象牙芽細胞の分化には、GM-CSF発現とOPN発現が重要な役割を果たす可能性が示された。今回我々は胎生期BrdUラベリング法を歯の他家移植に応用し、歯の移植後の歯髄と歯周組織再生過程におけるLabel-retaining cells(LRCs)の動態を観察すると共に、GFPマウスを用いて移植後の治癒過程におけるドナーとホストの関わりを検索した。妊娠ICRマウスに3日間BrdUを腹腔内投与し、ラベルマウスと非ラベルマウス間で上顎第一臼歯を深麻酔下で抜去後、相互に他家移植した。術後3日8週後にアルデヒド系固定液で灌流固定し、EDTA脱灰後、パラフィン切片を作製し、象牙芽細胞分化マーカーとして抗ネスチン、接着性骨基質タンパク質として抗オステオポンチン(Opn)、抗BrdU抗体を用いた免疫染色、歯根膜のマーカーとしてペリオスチンmRNA、Opn mRNAを施し光顕で観察した。

さらに、GFPマウスと野生型マウス間で他家移植を行い、術後2週後の標本を観察した。移植後2週の歯髄腔には、免疫拒絶反応群、象牙質形成群、象牙質+骨組織混在群の3通りの治癒パターンが観察された。ラベル歯の移植群において、再生象牙芽細胞が観察される部位には歯髄中央部にはLRCsが観察されたのに対し、骨組織形成部位にはLRCsは観察されなかった。一方、非ラベル歯の移植群では、歯髄腔にはLRCsは観察されなかった。以上より、歯の移植後にドナーのLRCsが歯髄中央部に維持されると象牙質形成が惹起されることが明らかとなった。また、GFPマウスの解析により、移植歯の歯髄は内皮細胞と遊走性間葉細胞を除きドナーの細胞で構成されており、歯周組織はマラッセの上皮遺残以外はホスト細胞に置き換わってきた。一方、歯髄治癒過程において、Opn mRNAおよびペリオスチンmRNAの発現が見られた。
大学入試の個別選抜におけるCBT活用に関する研究

これまで実施してきた「科学的な思考力・判断力・表現力」を評価するためのCBT開発を発展させ,テキスト,動画,写真,計算機能,データベース,受験者の解答手順の制御など,CBTの特長を活かすことでペーパーテストでは技術的に問うことができなかった側面から評価することができる「総合問題」を開発し,「思考力・判断力・表現力」の測定範囲を拡充する。加えて,大学入試固有の運用面(リスクや課題等)を考慮することにより,単に能力評価の技術開発にとどまらない,各大学における個別選抜での活用に向けた実践的知見を得る。
植物細胞壁における異物認識・情報伝達・防御応答のダイナミズム

植物に固有の細胞壁が病原体による感染を未然に防ぐ物理的な障壁となることは周知の事実であるが、外界からの生物的あるいは化学的な情報を受信(認識)し、それらを正確に伝達して細胞あるいは組織全体の防御機構を成立させる動的な小器官であることが最近の申請者らの研究によって明らかとなってきた。本研究は、細胞の外側で行われる高次の情報処理システムの分子基盤について、病理学の視点からメスを入れ、細胞(組織)の統御と恒常性の維持を図る植物細胞壁の新たな機能に迫るものである。エンドウ褐紋病菌が生産するサプレッサー(抵抗性抑制因子)は、宿主の細胞壁での病原体認識とこれに続く一連の応答を標的とし、遺伝子応答を伴う防御応答の発現を著しく抑制(遅延)する。今年度は、細胞壁での認識に続く下流の応答に関連する情報伝達機構について、同菌が生産するエリシター(抵抗性誘導因子)とサプレッサーを用いて詳細に調べた。その結果、エリシターはサリチル酸経路の指標遺伝子PR10-1を活性化したが、サプレッサーとの共存下にはその活性化は著しく抑制された。そこで、防御応答の抑制(遅延)におけるジャスモン酸経路とのクロストークの関与について調べる目的で、モデル宿主Medicago truncatulaからジャスモン酸(類縁体の生成も含む)合成への関与が推定される30遺伝子をデーターベースから検索し、これらのサプレッサー応答性について解析した。その結果、恒常発現している遺伝子も一部みられたが、プラスチド酵素をコードするAllene oxidesynthaseやAllene oxide cyclaseの他、ペルオキシゾーム酵素をコードするアシル合成酵素遺伝子(ACS)、β酸化関連遺伝子(ACX、KAT)ならびに最終段階で働くチオエステラーゼ(TEase)のいずれもが12-oxo-PDA reductase(OPR)と同調してサプレッサーで活性化されることが明らかとなった。また、ジャスモン酸からイソロイシン誘導体(JA-Ile)を生成するJAR1もサプレッサー応答性であり、処理後15時間以内で活性化した。これらの結果より、サプレッサーは宿主のジャスモン酸合成を転写レベルから亢進し、生成するジャスモン酸を介してサリチル酸に依存した防御機構を一時的に阻害しているものと考えた。事実、LOX、AOSならびにAOC遺伝子を発現抑制したエンドウ葉では褐紋病菌に対する感受性が低下することを確認している。次年度は、サプレッサーによるサリチル酸経路の干渉作用におけるCOI1要求性について解析を進める予定である。エンドウ褐紋病菌が生産するサプレッサーは宿主(エンドウ)の防御応答を抑制するが、非宿主には逆にエリシターとして作用する。これまでに、宿主・非宿主からサプレッサーの標的分子が調べられ、その1つが細胞壁にあるエクト型ATPase(アピラーゼ)であることがわかってきた。今年度は、非宿主であるササゲをモデルとして、サプレッサーに対する初期応答について解析した。その結果、サプレッサーで処理したササゲ葉では15分以内にO^-_2生成が認められた。本生成は、SHAM、SODならびにカタラーゼの投与によって低下し、NADH inhibitor I-1でほぼ完全に阻害されたことから、細胞外ペルオキシダーゼによるNADH(電子供与体)の酸化によるものと考えられた。そこで、O^-_2生成に伴って細胞外に生成する防御因子について解析したところ、病原糸状菌の発芽や付着器形成には影響しないが、付着器からの侵入を阻害する抗菌性物質(感染阻害物質)が新たに生成されていることが明らかとなった。一方、ササゲのエクト型ATPase遺伝子(VsNTPasel)の発現抑制個体を作出したところ、O^-_2生成は著しく低下し、非病原菌による感染が成立するようになった。このことは、細胞壁にあるエクト型ATPase(VsNTPasel)が細胞外ペルオキシダーゼに依存した02--生成と下流の防御応答(感染阻害物質の生成など)を調節し、非宿主抵抗性に深く関与していることを示している。さらに、O^-_2生成を開始するする内生シグナルについての解析から、サプレッサーとADPを共存させたササゲ葉では0.110μMの処理でO^-_2生成は促進され、加水分解耐性のADP[β]Sは単独処理で生成を誘導した。これらの結果は、アポプラストでATPの加水分解で生成するADPがO^-_2生成(細胞外オキシダテブバースト)を開始する有力な内生シグナルとして働く可能性を示唆する。本研究結果は、細胞壁にあるエクト型酵素ATPaseによるオキシダティブバースト反応と細胞外アデニンヌクレオチド代謝との関連を新たに指摘したものであり、細胞壁が外界からの異物と積極的に対峙する小器官であることを改めて示したものである。

本研究課題の最大の特徴は、植物細胞壁に存在するエクト型ATPase(アピラーゼ)を分子標的とする病原糸状菌由来のサプレッサー(抵抗性抑制因子)の作用機序の解析を通して、細胞壁が独自に備えた異物認識・免疫システムとその回避の仕組みについて明らかにする点にある。申請者らはすでに、エクト型ATPaseの近傍には複数の免疫機構に関連したタンパク質が存在し、これらと協調して細胞壁での免疫応答を成立させていることを示してきた。逆に言えば、このATPaseの機能低下(活性抑制)が免疫不全を引き起こし、結果として病原体による感染を許すという考え方である。今年度も、細胞壁ATPaseを免疫応答の「マスター酵素」と位置付け、これを起点とするタンパク間相互作用や細胞内部(下流)への情報伝達について、生理・生化学的な解析を加えた。エンドウの細胞壁タンパク質を調製し、Blue-Native電気泳動で解析した結果、エクト型ATPaseは活性酸素生成酵素の1つであるジアミンオキシダーゼと複合体として精製され、この活性がATPaseと同調して調節されることが明らかとなった。一方、エンドウ褐紋病菌由来のサプレッサーならびにATPase阻害剤を用いた解析から、ATPaseの活性阻害とジャスモン酸を介した情報伝達系の亢進は深く関連すること、さらに、ジャスモン酸合成に関与する遺伝子を発現抑制したエンドウでは、本菌に対する感受性(罹病性)が著しく低下することなどが示された。これらの結果より、サプレッサーは宿主の細胞壁ATPaseを標的とし、この活性抑制がジャスモン酸合成を促進し、生成するジャスモン酸を介してサリチル酸に依存した防御機構を一時的に阻害することで自身の感染を有利にしているものと考えられた。植物細胞壁における異物認識・情報伝達機構について、細胞壁に構成的に存在するエクト型酵素による認識と、それに続く初期応答(細胞外オキシダティブバーストや感染阻害物質の生成)を導く新たな経路を示すとともに、これらの調節にアポプラストにおけるアデニンヌクレオチドが関与することを突き止めることができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、細胞壁に構成的に存在し、異物認識に伴って活性化するエクト型酵素の解析から、ATPase(アピラーゼ〉や細胞外ペルオキシダーゼの重要性について明らかにしてきた。次年度(最終年度)では、細胞外に新たに生成する抗菌性物質の構造とその生合成経路を明らかにすることで、「植物細胞壁における異物認識・情報伝達・防御応答のダイナミズム(当該研究課題名)」について総括したい。
リソソームストレスとしての腎疾患の病態解明とそれに基づく治療薬の探索

(1)腎虚血再灌流のリソソームストレスの病態生理学的意義研究代表者らのこれまでの研究で、腎尿細管オートファジーは急性腎障害(AKI)からの回復に重要な役割を果たす一方で、オートファジーフラックスの維持に必要なリソソーム機能が種々の腎疾患ストレス下で低下していることや、脂肪毒性とリソソーム機能に密接な関連があることが判明している。また古くからAKI時には脂質代謝が低下することも知られている。2018年度はAKI後の経時的なリソソーム機能の変化と脂質代謝との関連を検討した。腎片側虚血再灌流(35分)後のマウス腎では、1リソソームの拡張およびカテプシンDの成熟の低下などリソソーム機能の低下、および2カテプシンDのリソソームから細胞質への溢流、ガレクチン3陽性リソソームから示唆されるリソソーム膜の透過性亢進(LMP)を認めた。またGFP-LC3マウスを用いたオートファジーフラックスの解析から、尿細管では6時間後および7日後に二峰性のオートファジー亢進を認めるが、24日後はオートファジーが停滞することが判明した。さらにAKI後の腎尿細管組織では脂肪滴の蓄積、脂肪酸β酸化の低下、ATP含量の低下を伴っていた。以上からAKI時には脂質代謝の異常が、リソソーム機能障害、さらにはオートファジー活性の低下を惹起して、病態を悪化させるものと推測された。(2)腎尿細管リソソーム機能におけるTFEBの役割(1)腎虚血再灌流のリソソームストレスの病態生理学的意義については当初の予定より順調に進んでおり、「今後の研究の推進方策」の記載した追加実験が終了すれば、論文化に取り掛かることができる状況である。(2)の尿細管特異的TFEBノックアウトマウスについても樹立が終わり、TFEBが近位尿細管でノックアウトできていることが確認できている。(1)腎虚血再灌流のリソソームストレスの病態生理学的意義1低酸素再酸素培養下の腎尿細管細胞を用い(虚血再灌流負荷を模している)、脂肪酸β酸化を薬剤により亢進することで、リソソームの拡張の軽減、成熟カテプシンDの増加、オートファジーフラックスの改善、細胞死の軽減が認められるかを検証する。培養細胞において予想通りの結果が得られれば、マウス虚血再灌流負荷モデルで類似の薬剤を投与し、病態の改善が得られるか否かを検証する。(2)腎尿細管リソソーム機能におけるTFEBの役割樹立した尿細管特異的TFEBノックアウトマウスを用い、各種腎疾患におけるTFEBの役割を検証する予定である。具体的には(1)と同様の虚血再灌流負荷や急性尿酸腎症モデルを計画している。

具体的には(1)と同様の虚血再灌流負荷や急性尿酸腎症モデルを計画している。交付していただいた額と実際に使用した額に些少な誤差が生じたためで、ほぼ当初の実験計画通りの計画で遂行できている。
終末糖化産物受容体及びその可溶性受容体を標的とした肥満・動脈硬化の制御

糖尿病の慢性合併症の成因において、終末糖化産物(advanced glycation end-products, AGEs)とその受容体receptor for AGEs (RAGE)は、中心的な役割を果たすことが想定されている。本研究課題において我々は、RAGE欠失が非糖尿病環境において高脂肪食負荷による肥満、動脈硬化の進展を抑制すること、この効果に血中アデイポネクチン濃度に対する影響が関与することを明らかにした。さらにRAGE欠失脂肪組織において調節される遺伝子を網羅的に解析し、インスリン情報伝達、脂肪細胞分化にかかわる遺伝子がRAGEの主要な標的である可能性を示した。終末糖化蛋白(AGEs)受容体(RAGE)は、糖尿病合併症の病因・病態に深く関与する。今回我々はRAGEとadiposityの関連をApo E RAGEダブルノックアウトマウスを用いて解析し、その動脈硬化進展との関連を検討した。動脈硬化誘発食負荷群20週齢において、Apo E-/-RAGE-/-マウスはApo E-/-RAGE+/+に比べて体重、精巣上体周囲脂肪重量は有意に低下し、脂肪細胞サイズも低下していた。また大動脈プラーク面積は脂肪重量、脂肪細胞サイズと有意な正の、血清アディポネクチン濃度と有意な負の相関を認め、RAGEのadiposityに対する影響が動脈硬化進展に影響することが推測された。さらにRAGE-/-マウスの脂肪細胞サイズ減少に対する影響はApo E+/+のマウスでも観察された。脂肪細胞サイズの有意な変化が認められる以前の脂肪組織におけるgene microarray、ontology、KEGG pathway解析の結果、RAGE-/-脂肪組織においては脂肪細胞分化、インスリン情報伝達、脂肪酸生合成に関連する遺伝子が有意に抑制されていた。アデノウイルスを用いたRAGE過剰発現は3T3L1の脂肪細胞分化を促進し、肥大脂肪細胞が誘導され、インスリン情報伝達因子、脂肪細胞分化関連因子の遺伝子発現が有意に亢進していた。以上のように、RAGEはインスリン情報伝達に関与することにより、脂肪酸合成、脂肪細胞分化に影響し、adiposityに影響することが示された。またRAGEの動脈硬化進展に及ぼす影響の少なくとも一部は、adiposityに対する影響により説明されると考えられる。糖尿病の慢性合併症の成因において、高血糖とその結果形成される終末糖化産物(advanced glycationend-products, AGEs)は中心的な役割を果たすことが想定されている。多くのin vitroにおける検討により、高血糖・AGEは酸化ストレスを惹起し、血管内皮細胞の生理的恒常性の破綻、周細胞のアポトーシス・脱落、壁細胞の増殖・細胞外マトリックスの産生をうながし、微小血管においては無秩序の血管新生を、大血管においては動脈硬化を促進すると考えられる。近年、血中レベルに加えて皮膚組織AGEsをautofluorescenceとして非侵襲的に測定することが可能となった。この皮膚autofluorescenceは、皮膚組織生検標本中のAGEsと強く相関することが報告されているが、我々の解析では血漿中AGEsとの相関は非常に弱い。腎不全患者における我々の検討では、皮膚autofluorescenceは動脈壁硬化と正の、血管内皮前駆細胞数と負に相関することより、AGEの組織沈着が、心血管疾患リスク因子の一機序を担っている可能性がある。AGEを標的とした治療法として現在まで、AGE生成阻害薬、AGE架橋切断薬などが開発されてきているが、AGE構造多様性や、副作用など多くの問題がまだ克服されていない。そこで種々のAGE作用を細胞内に伝達するReceptor for AGEs(RAGE)を標的とした抗AGE療法の可能性を検討している。我々は内皮細胞を舞台としたTNFαなどのサイトカインがRAGE切断促進作用を有し、RAGEシグナルに深く関連することを見出した。現在この現象の細胞内機序を検討し、RAGE標的療法への応用を期している。
統語理論を応用・発展させ、様々な言語の不定詞句及び受動構文の構造を解明すること。

ミニマリスト統語理論の枠組みで、特にbelieve型とwant型の不定詞句補部に焦点をあてた。Chomsky(2005)によれば、raising TとECMTの主語は、主語条件に従わないことが指摘された。つまり、主語からの抜き出しが可能というわけである。そこで、本研究では、この立場が妥当なものであるのかどうかを検証するために、believe型以外のECM構文、使役の非定形節、知覚の非定形節、小節などの主語からの抜き出しが可能であるのかどうかを論証した。さらに、これまでの先行研究で、believe型とwant型の不定詞句補部の構造がどのように区別されてきたかを観察し、Boskovic(1997)やLasnik and Saito(1991)などの分析に対して問題点をいくつか指摘した。代案として、これまで明確にされていない両者の統語的類似点(主語からの抜き出し、文副詞の生起、主語からの外置、等位接続など)を提示することにより、believe型動詞とwant型動詞はともにECM動詞であることを主張した。また、なぜwant型の不定詞句主語は、受動化されないのかという問題を取り扱った。仮説として、want型他動詞は、φ素性と格素性を持つが、want型受動動詞は受動化によりφ素性を失う(格素性はそのまま保持する)ことを提案した。この点に関しては、今後の研究課題でもある。上記の研究は、ECM動詞の不定詞句補部主語が主節へobject raisingを行うのかどうかという問題を解き明かすことになる。本研究では、多くのネイティブスピーカーが、ECM主語が主節へ繰り上がるのに抵抗を感じるという調査結果を得た。この事実を、Chomsky(2005)の枠組みでどのように捉えるのかは今後の課題と言える。ミニマリスト統語理論の枠組みで、不定詞句補部の研究を行った。特に、wantタイプ動詞とbelieveタイプ動詞の相違を指摘し、その相違がどのような原理から生じるのかを明確にした。伝統的には、believeタイプ動詞はTPの不定詞句補部を選択し、例外的格付与により不定詞句主語とAgreeを起こすと分析されてきた。一方、wantタイプ動詞はCPの不定詞句補部を選択し、不定詞句主語は、CP内で空の補文標識とAgreeを起こすと分析されてきた。しかし、本研究では、こうした従来の分析とは異なり、そもそも例外的格付与という関係は存在せず、両タイプの動詞が補文標識を伴わない不定詞句補部を選択する場合、その不定詞句補部は一様にTPであることを主張した。また、例外的格付与の関係を廃止するために、両タイプの動詞は不定詞句補部の主要部TとAgreeを起こし、不定詞句主語は(Tに生成される)空の補文標識とAgreeを起こすという代案を提示した。本研究の成果発表として、日本英語学会にて口頭発表を行った。また、ミニマリスト統語理論の枠組みで、受動文の動詞句構造の研究を行った。扱った言語は、英語、ウクライナ語、ドイツ語、オランダ語、北ロシア語、ノルウェー語、ネパール語、フィンランド語、カナラ語など。こうした言語(英語を除く)の受動文では、Chomsky(1981)やBurzio(1986)が普遍的であると主張する格吸収操作と意味役割吸収操作の相互関係が見られない。また、この事実は、Chomsky(2001)が提案する"Maximization原理"にとっても問題点となる。そこで、本研究では、様々な言語の受動文を説明するためには、少なくとも3タイプの動詞句構造を仮定する必要があり、格吸収操作は受動形態素により随意的に引き起こされ、意味役割吸収操作は普遍的に軽動詞vにより引き起こされることを提案した。ミニマリスト統語理論の枠組みで、受動文の派生及び構造について研究を行った。新たな提案として、様々な言語の受動文の派生を説明するには少なくとも3タイプの動詞句構造を考える必要があることを主張した。さらに、受動化による動詞の格吸収は、受動形態素-enにより随意的に行われるが、外項の意味役割は普遍的にvの主要部により義務的に行われることを指摘した。また、多くの言語では、受動形態素による格吸収が行われずに、一致素性が削除されない現象があり、この事実はChomsky(2001,2004)Maximizationの原理を再検討しなければならないことを示唆する。そこで、Agreeとは、同一の素性値をもった局所関係にあるprobeとgoalの間で起こるものであるという提案を行った。また、表層の主語とby句に生起する照応形との束縛関係に焦点をあて、最も妥当なby句の位置を決定した。次に、受動文のby句の主要部であるbyの意味特徴について研究を行った。byは、他の前置詞とは異なり、動作主、着点、起点、経験者など多くの意味役割を自由に受け取ることができる。この事実から、byは従来想定されているような意味的に空な要素ではなく、意味的に多義的な要素であるという提案を行った。この提案を支持するために、歴史的な証拠として古期英語、中期英語、近代英語に見られるby句の変化・変種をとりあげた。次に、ミニマリスト統語理論に基づいて、不定詞句補部の派生及び構造について研究を行った。

特に、believeタイプの例外的格付与構文に焦点をあて、従来の例外的格付与という操作を否定し、埋め込み主語に埋め込み文内で格付与されるという提案を行った。そのため、不定詞節が格素性及び一致素性を持つことを主張し、主節動詞との間でAgreeを起こすという分析を提示した。また、顕在的な補文標式が生起しない不定詞節は、普遍的にTPであるという議論を行った。この立場は、経済性の原理からも支持されるものである。ミニマリスト統語理論の枠組みで、特にbelieve型とwant型の不定詞句補部に焦点をあてた。Chomsky(2005)によれば、raising TとECMTの主語は、主語条件に従わないことが指摘された。つまり、主語からの抜き出しが可能というわけである。そこで、本研究では、この立場が妥当なものであるのかどうかを検証するために、believe型以外のECM構文、使役の非定形節、知覚の非定形節、小節などの主語からの抜き出しが可能であるのかどうかを論証した。さらに、これまでの先行研究で、believe型とwant型の不定詞句補部の構造がどのように区別されてきたかを観察し、Boskovic(1997)やLasnik and Saito(1991)などの分析に対して問題点をいくつか指摘した。代案として、これまで明確にされていない両者の統語的類似点(主語からの抜き出し、文副詞の生起、主語からの外置、等位接続など)を提示することにより、believe型動詞とwant型動詞はともにECM動詞であることを主張した。また、なぜwant型の不定詞句主語は、受動化されないのかという問題を取り扱った。仮説として、want型他動詞は、φ素性と格素性を持つが、want型受動動詞は受動化によりφ素性を失う(格素性はそのまま保持する)ことを提案した。この点に関しては、今後の研究課題でもある。上記の研究は、ECM動詞の不定詞句補部主語が主節へobject raisingを行うのかどうかという問題を解き明かすことになる。本研究では、多くのネイティブスピーカーが、ECM主語が主節へ繰り上がるのに抵抗を感じるという調査結果を得た。この事実を、Chomsky(2005)の枠組みでどのように捉えるのかは今後の課題と言える。
介護支援専門員に対するサポート体制のモデル構築に関する実証的研究

本研究は、介護支援専門員に対するサポートを継続的に行いため、その体制のモデルを構築し、活性化に向けた方策について実証的に明らかにすることを目的とした.初年度である平成30度の研究の目的は、介護支援専門員に対するサポート体制の特徴と新たなサポート源の抽出しため、国内外の文献研究を行った。その結果「実践共同体(community of practice)」という概念を抽出した。その具体的な内容と概念を明確にするために、「実践共同体(community of practice)」が活性化されている海外のケアマネジャーに対するインタビュー調査を実施した(事例研究)。1次分析の結果、活動内容とカテゴリーについては、57の概念を抽出し、12個のカテゴリー(参加を阻害する組織の構造的な要因、活動参加への組織の理解、省察的思考を用いた実践を行う、利用者理解を深める、情報共有を通した実践能力の強化、相互スーパービジョン体制の構築、成長の場、自律性の力の経験、適切な負荷の必要性、情報の蓄積、実践家が連帯できる機会、活動成果の拡散)にまとめられた。最後に4次元(所属機関の次元、クライエント(利用者)の次元、ケアマネジャー次元、社会的次元、実践家が連帯できる機会、活動成果の拡散)に分類した。現在、2次分析を行っている。その研究から示唆された内容を中心に、日本における介護支援専門員の実践共同体に関するインタビュー調査を実施する予定である。研究計画の通りに研究を進んでおり、文献研究やインタビュー調査から明らかとなった新たなサポート源について、その活動が活性化されている海外の事例を研究し、その内容の分析を行った。その結果について、韓国社会福祉学会にて研究発表を行った。今後は、調査内容をもとに、学術論文を執筆をする予定である。また、当初の計画の通りに、日本における介護支援専門員の実践共同体に関するインタビュー調査を実施し、その内容から抽出された内容をもとに量的調査を実施する予定である。