hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光リガンド結合タンパク質の発現による分泌顆粒の形成・成熟・開口放出過程の可視化

分泌顆粒の形成から開口放出までの過程を可視化することを目指して,蛍光リガンド結合タンパク質であるHaloTagを耳下腺腺房細胞に発現させる系を立ち上げた。分泌タンパク質であるアミラーゼのシグナルペプチド配列のみを結合したHaloTagは分泌顆粒へ輸送された。蛍光リガンドでラベルした後刺激すると,顆粒状蛍光の消失がリアルタイムに観察され,刺激依存的な開口放出のライブイメージングに成功した。分泌顆粒の形成から開口放出までのライブイメージングを目指して,蛍光リガンド結合タンパク質であるHaloTagを耳下腺腺房細胞の初代培養細胞に発現させる系を立ち上げた。耳下腺の分泌タンパク質であるアミラーゼ遺伝子の部分配列とHaloTagとの融合遺伝子を作成し,アデノウイルスベクターに組み込んで,腺房細胞に導入した。その結果,HaloTagは細胞に効率よく発現し,HaloTagリガンドであるTMR蛍光試薬によりラベルされ,生細胞での観察が可能になった。作成した融合遺伝子のうち,アミラーゼのシグナル配列のみを結合したHaloTagが,アミラーゼと細胞内局在が一致していた。また,βアドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノール依存的に分泌されたことから,HaloTagタンパク質が分泌顆粒へ輸送されたことが確認できた。共焦点レーザー顕微鏡に設置した培地灌流装置を利用して,観察しながらβアドレナリン受容体刺激を行ったところ,顆粒状蛍光の消失がリアルタイムに観察され,刺激依存的な開口放出のライブイメージングに成功した。これまで,唾液腺において分泌タンパク質の輸送経路がどのように制御されているかは不明であった。何らかの輸送シグナルの存在や,分泌タンパク質の複合体形成が顆粒への輸送に必須であるという意見がある。しかし今回の結果から,分泌顆粒への輸送には特別なシグナルは必要なく,小胞体において膜を超えるためのシグナルペプチド配列があれば,分泌顆粒へ受動的に輸送されることがわかった。また,Native PAGEにより分泌顆粒内のタンパク質の複合体形成を調べたところ,アミラーゼが多量体を形成しているのに対して,HaloTagは単量体で存在していることが確認できた。本研究により,唾液腺における分泌タンパク質の顆粒への輸送には,特別な輸送シグナルも,複合体形成も必要でないことが示唆された。分泌顆粒の形成から開口放出までのライブイメージングを目指して,蛍光リガンド結合タンパク質であるHaloTagタンパク質を耳下腺腺房細胞の初代培養細胞に発現させる系を立ち上げた。耳下腺の分泌タンパク質であるアミラーゼ遺伝子の部分配列をクローニングしてHaloTagとの融合遺伝子を作成し,アデノウイルスベクターに組み込んで,腺房細胞に導入した。その結果,HaloTagは細胞に効率よく発現し,HaloTagリガンドであるTMR蛍光試薬によりラベルされ,生細胞での観察が容易であることがわかった。これまで,唾液腺の分泌顆粒のライブイメージングは様々な方法で試みられていたが,顆粒を維持した培養細胞が確立していなかったため,困難であった。培養細胞の代わりに,in vivo,または組織から単離した直後の細胞を用いての研究が試みられてきたが,遺伝子操作が難しいために,解析に限りがあった。しかし,本研究で作成したHaloTag発現系を,我々が以前から開発してきた初代培養細胞系と組み合わせることにより,分泌顆粒への外来タンパク質の輸送を容易に観察できるようになった。しかも,HaloTagタンパク質は蛍光リガンドの添加により観察を行うため,蛍光の強さが調節でき,減衰しにくいため,比較的長時間の観察にも耐えうる。蛍光リガンドを結合させた後のHaloTagタンパク質の電気泳動後の検出も容易かつ感度が高いため,少ない細胞で生化学的な解析も効率よく行える。本システムにより,唾液腺の顆粒形成および開口放出の解析が進むことが期待される。本研究では,1)耳下腺腺房細胞の分泌顆粒にHaloTagタンパク質を発現させて,蛍光リガンドで特異的にラベルすることにより,生きた細胞で分泌顆粒を観察するシステムを立ち上げること,そして2)新旧の分泌顆粒を染め分けて,顆粒の成熟度と開口放出効率の関連を解析することの2つを目標とした。平成23年度の研究によって,アミラーゼ部分配列とHaloTagタンパク質との融合遺伝子を複数種類作成し,アデノウイルスベクターに組み込んだ。組換えアデノウイルスの作成・増幅を行い,耳下腺腺房細胞の初代培養細胞への感染効率や外来遺伝子の発現チェックを行った。いくつかのアミラーゼ融合HaloTagタンパク質を発現させたが,アミラーゼのシグナル配列のみを持ったHaloTagタンパク質が分泌顆粒へ効率よく輸送されることを明らかにした。この結果,生きた細胞で特異的に分泌顆粒をラベルすることが可能になった。共焦点レーザー顕微鏡上で生きたまま細胞を観察するための灌流系も立ち上げ,刺激依存的な開口放出を観察することができるようになったため,第1の目的はすでに達成できたといえる。

また,目標2)については,2色の蛍光リガンドで新旧の染め分けを試み,ラベルの時間を変えることにより,それぞれの蛍光リガンドでラベルされる顆粒の割合が変わることを確認した。したがって,顆粒の成熟度を形態から定量化できると期待される。現在,蛍光リガンドでラベルした細胞から分泌顆粒を精製し,パーコール密度勾配遠心により成熟顆粒と未成熟顆粒を分離している。成熟顆粒は未成熟顆粒に比べて密度が大きいと言われており,HaloTagリガンドによるラベルの差が成熟度と一致するかを確認中である。平成24度は,新旧の分泌顆粒を染め分けた状態での開口放出を定量化し,顆粒の成熟度と開口放出効率の関連を決定できると考えている。1.分泌顆粒の成熟および開口放出の観察分泌顆粒および開口放出のライブイメージング解析を行う。HaloTagタンパク質の発現後に時間を変えて,波長の異なる蛍光色素リガンドを添加すると,タンパク質合成されてから時間の経っているHaloTagと新しく合成されたHaloTagを染め分けることができる。この方法により,古い分泌顆粒(成熟顆粒)と新しい分泌顆粒(未成熟顆粒)を生きた状態で見分けることが可能になる。タイムラプス測定により,開口放出した分泌顆粒の成熟度を1個ずつ記録し,開口放出の効率と分泌顆粒の成熟度の関係を解析する。非刺激時と刺激時の開口放出を比較し,数理解析を行うことによって,分泌顆粒の成熟と開口放出の共役が存在するのか,また,その場合,共役はどのように制御されているかを解析する。2.分泌顆粒へのタンパク質の輸送メカニズム分泌タンパク質が小胞体内へ輸送される際に,シグナル配列は切断されるはずである。したがって,今回用いたHaloTagがゴルジ装置で選別を受ける時点では,アミラーゼ由来の配列はすでに含まれていない。それにも関わらず分泌顆粒へ輸送されることから,ゴルジ装置における分泌顆粒への積込みには特別なシグナルは必要不可欠ではないと考えられた。しかし,この現象がHaloTag特異的なものであり,HaloTagタンパク質上にたまたま顆粒への輸送シグナルが存在した可能性も残っている。そこで,アミラーゼのシグナル配列の存在が顆粒への輸送への必要十分条件であるかを確認するために,シグナル配列をHaloTag以外のレポータータンパク質につなげて,HaloTagと同様のシステムで細胞に発現させる。分泌顆粒への輸送効率を解析することによって,ゴルジ装置における分泌タンパク質のソーティング機構について検討する。本研究に用いる細胞培養装置,共焦点レーザー顕微鏡,ウエスタンブロット解析に必要な蛍光イメージアナライザーは,すでに当研究機関に備わっており,共同に使用できる環境である。また,画像解析に必要なIMARIS3次元計測オプションモジュールMeasurement Pro
レーザーアブレーションにより生成した金属原子の化学発光

真空槽中の金属板(Y,La,B,Al等)にYAGレーザー光の基本波をレンズで集光して照射し、アブレーションにより生成した金属原子をそのまま真空槽中のガス(O_2,CO_2,CCl_4等,5-100mTorr)と反応させ、反応生成物の発光スペクトルを観測した。また、発光強度の時間変化をデジタルオシロスコープで記録した。生成した金属原子の相対濃度を、ホローカソードランプによる原子吸収によりモニターした。Y+O_2系の場合、強いYO A^2Π→X^2Σ^+遷移と共に、弱いB^2Σ^+→X^2Σ^+遷移、C^2Π→X^2Σ^+遷移が見られた。YO A状態の生成は発熱反応であるが、B状態、C状態の生成は吸熱反応である。La+O_2系でも、La0 D^2Σ^+→X^2Σ^+遷移など吸熱反応による化学発光が見られた。CO_2との反応でも同様であった。反応生成物の発光の時間変化を観測することにより、金属原子の試料金属板上のレーザースポットから発光観測地点までの距離(約20mm)の飛行時間を測定した。金属原子と気体分子との換算質量を用いて飛行時間を相対的並進エネルギーに換算し、原子吸光で求めた原子数で割ることにより化学発光断面積の相対並進エネルギー依在性、即ち励起関数を求めた。研究を行ったほとんどの系で励起関数のしきい値は反応熱ΔEと一致し、反応にバリヤーがないこと、即ち活性化エネルギーが0であることがわかった。一方、Al+CCl_4系では、AlCl A^1Π状態の生成に励起Al原子が関与していることが、発光の時間変化から明らかになった。
トレット症候群のドーパミンD_2受容体遺伝子の解析

トレット症候群は複雑な運動チックと一つ以上の音声チックを伴う重症型チック症である。トレット症候群は浸透率の低い常染色体優性遺伝と考えられ、治療面ではドパミン受容体を遮断するHaloperidolが著効を示すことが知られている。しかしトレット症候群におけるドパミン系システムの異常は同定されていない。本研究ではD2受容体、D4受容体の遺伝子多型を調べ、トレット症候群の病因と病態を探ることを目的とした。患者より採取した血液からのgenomic DNA抽出を行い、PCR法でドーパミン受容体の多型性部位を増幅、制限酵素での消化により多型性の検討(RFLP法)を行った。解析対象とした多型性部位は、第11染色体長腕の11q22-23にあるドパミンD2受容体の下流に存在するTaqIA部位、ドパミンD2受容体上流に存在するTaqIB部位、そして第11染色体短腕の11q15.5に同定されるドーパミンD4受容体の細胞質内第3ループに存在する27回の48bp繰返し多型配列である。同意のとれた7名のトレット症候群患者および28名の傾眠症患者、Berrettini WHらの報告したAfrican-American88名の正常対照者について、D2TaqIA部位、D2TaqIB部位対立遺伝子頻度を比較した。D2TaqIA部位では,トレット症候群がA1:14%(2/14)A2:86%(12/14)であるのに対し、傾眠症群ではA1:43%(24/56)A2:57%(32/56),正常群ではA1:40%(70/176)A2:60%(106/176)であった。D2TaqIB部位では,トレット症候群患者B1:14%(2/14)、B2:86%(12/14)で、傾眠症群ではB1:39%(22/56),B2:61%(24/56),正常群ではB1:22%(38/176),B2:78%(138/176)であった。D4受容体の多型についてはトレット症候群患者にのみ行った。結果C3(4回反復):15(94%)C1(2回反復):7(6%)であった。なお健常日本人中での対立遺伝子頻度はC1:1%C2:5%C3:78%C4:1%C5:15%と報告されている。今回の研究では症例数が少なく統計的な比較検討はできない。少数例での予備的検討として、トレット症候群患者ではD2受容体のTaqIA部位でもTaqIB部位でもTaqIにて切断されるA2,B2対立遺伝子を少なくとも一つは持っており、A2,B2対立遺伝子と疾患との関連があるかもしれない。なお健常日本人中での対立遺伝子頻度はC1:1%C2:5%C3:78%

C4:1%C5:15%と報告されている。今回の研究では症例数が少なく統計的な比較検討はできない。少数例での予備的検討として、トレット症候群患者ではD2受容体のTaqIA部位でもTaqIB部位でもTaqIにて切断されるA2,B2対立遺伝子を少なくとも一つは持っており、A2,B2対立遺伝子と疾患との関連があるかもしれない。本書類を作成している段階では、ヒト血液を用いてD_2受容体遺伝子の多型を決定するシステム確立の途上にある。具体的には、(1)患者より採取した血液からのDNA抽出(担当:金生)、(2)D_2受容体遺伝子多型部位の近辺の構造にもとづいたプライマーの決定・合成(担当:福田)、の2過程はすでに完了しており、現在は、(3)抽出したDNAからのPCRを用いたD_2受容体遺伝子の多型部分の増幅(担当:本多)、(4)増幅DNAにもとづく遺伝子多型の決定(担当:本多)、の2過程の条件設定を行なっている段階である。研究の進行は、予定通りである。本研究においては、臨床場面で得られた血液検体からD_2受容体遺伝子の多型部分を決定する過程を、確実かつ簡便に行なう方法をいかに確立するかが最も重要であり、この点についての条件の詳細の決定を現在進めつつある。平成8年度は平成7年度に確立したシステムにもとづいて、トレット症候群患者のD_2受容体多型を決定し、疾患・症状との関連を検討することを予定している。対象とする患者は、トレット症候群・チック症の専門外来への通院患者から選択し、同意を得たうえで血液を採取し、同時に各患者のチック症状・精神症状についての評価を行なう。可能な患者については、血液中のドーパミン代謝物であるホモバニリン酸濃度も同時に測定し、前シナプス細胞のドーパミン代謝活性の指標として合わせて検討する。平成7年度に確立したシステムに基づいて,本年度は同意のとれた7名のトレット症候群患者のドーパミンD2受容体の多型性の検討を行った。さらにD2部位に加えてD4受容体の多型性を決定する簡便な方法を作成し,あわせて検討を行った。実際に対象とした多型性部位は、第11染色体長腕の11q22-23に同定されているドーパミンD2受容体の3′noncoding領域で、エクソン8より約5kb下流に存在するTaqIA部位、同じくドーパミンD2受容体の5′noncoding領域で、エクソン1より約900bp上流に存在するTaqIB受容体、そして第11染色体短腕の11q15.5に同定されるドーパミンD4受容体の細胞質内第3ループに存在する27回の48bp繰返し多型である。いずれもPCR法でドーパミン受容体の多型性部位を増幅し,D2TaqIA部位,D2TaqIB部位については制限酵素TaqIで消化し,RFLP法で解析を行った。7名のトレット症候群患者,28名の傾眠症患者,Berrettini WHらの報告したAfrican-American88名の正常対象者について,D2TaqIAおよびBの対立遺伝子頻度を比較した。D2TaqIA部位では,トレット症候群がA1:14%(2/14)A2:86%(12/14)であるのに対し、傾眠症群ではA1:43%(24/56)A2:57%(32/56),正常群ではA1:40%(70/176)A2:60%(106/176)であった。D2TaqIB部位では,トレット症候群患者B1:14%(2/14),B2:86%(12/14)で、傾眠症群ではB1:39%(22/56),B2:61%(24/56),正常群ではB1:22%(38/176),B2:78%(138/176)であった。D4受容体の多型については、トレット症候群患者で結果C3(4回反復):15(94%)、C5(2回反復):1(6%)で、Inoueらによると健常日本人中ではC1:1% C2:5% C3:78% C4:1% C5:15%と報告されている。
へき地に特化した心理援助システムの案出 ―自助・共助で自立する地域への公助導入―

本研究では、外部支援が届かないため自立せざるをえなかった地域に対して、心理的援助を導入する方法について開発と検討を目的とした。成果として、へき地についてはその地理と風土の特殊性によっては既存の方法が通用しないことが検証された。その点を考慮した実証実験の結果、各支援方法について住民から概ね好意的な評価を得た。今後の課題としては、住民の中でも世代間ではニーズに差がある、現地の行政職員や保健師を定期的・継続的サポートする方法については対象者の時間的・肉体的負担が強い、という点が挙げられた。この点については次段階での研究課題として継続検討をおこなうこととした。研究初年度を終え、対象地域内の全戸訪問活動の実施効果を感じている。現在、アクション・リサーチをおこない、その客観的検証を進めている。東日本大震災における被災地支援も3年目を迎えた。本研究の対象地域となる岩手県下閉伊郡田野畑村においては、被災者のみを対象とする即応的支援が終息し、現地では、全村を対象とした「地域が結束できる支援」が求められる段階へ移行した。そこで、これまで研究チームが活動の象徴的アイコンとしてきた「バラ」を用い、1「被災を忘れていないという支援側からのメッセージ」・2「物理的にも社会的にも分断されつつある田野畑村を今一度繋ぎ直すという被災者側の共通の話題」という2点を意図し、全村1300世帯を対象として、バラを手渡しし、短時間の傾聴をおこなう「訪問・対面型相談支援の検証」研究を実施した。本研究では、直接的な被災地域だけでなく、可視的な被害のない地域(田村・高下・平田,2012)をも対象とし、公平性の高い支援効果について実証。被支援者からもおおむね好意的に受け止められた。世代別では、高齢者は被災者と同様に支援活動を肯定的に評価するとともに、直接的な関わりなどソーシャル・サポートを求めている姿が見出された。バラ配布による戸別訪問自体に勇気づけられ、食事会における知人との関わりに多くの参加者が満足していた。また近親者の死や自身が孤独であることが、被災者と同様に「喪失体験」として体験されていることがうかがわれた。一方で、20代から40代の働き盛りの子育て世代などでは、支援活動に対してやや侵襲的に感じていることがうかがえたが、「コミュニティ再生を意図したイベント(食事会)」などの活動は、非日常の体験として評価された。初年度に引き続き、被災者を対象とした「個別・集団支援の方法」「被災地域行政・福祉担当者に対する心理理論・支援方法の教育」「心理的支援を受容する風土の醸成」に関してその方法を検討しているが、研究最終年度においては、以下の内容について人材を傾注した実地踏査をおこない、検討を進めた。1)インタビュー調査・・・被災地域(羅賀地区・島越地区・仮設住宅)各戸へ訪問し、現状・今後の展望・支援への感想・意見に関するインタビュー調査を実施。幅広い年齢層より多くの意見を聴取することが出来た。2)個別相談・心身健康度チェック・・・自殺リスクの原因となるアルコール摂取程度について、個別面談と同時にアルコールパッチテストを実施することで調査をおこなった。また、心理面での健康度・被災ダメージからの復帰・被災の捉え方などを聞き取るべく、半構造化面接による聴取をおこなった(実施後は傾聴につとめ、心身緊張の緩和をはかった)。3)戸別訪問による聴取・・・バラの花を介在させることで、話し手の緊張度を下げつつ、被災の捉え方を聴取。対象は被災有無を問わず全村とし、被災により被害をうけた方々・被災はせず被害も無いが被災地域内のため何らかの影響を受けた方々、の両者の立場を明らかにすることが出来た。4)参加者(非臨床心理士であるボランティア学生)の心理状態分析・・・心理士としてトレーニングを受けていない人材が支援に参加することについて、その安全性・心理的変化を分析。心理検査をを事前事後で実施し、その影響を検討した。以上について、研究協力者による研究班に分かれて分析を行っており、平成27年度中に学会発表および投稿予定。臨床心理学、性格心理学、創造性の研究東日本大震災後の即応的被災地支援として入村し、支援活動を続けてきているが、入村直後の課題は被災者のケアだけでなく、メンタルヘルス過疎ともいうべきこの土地にいかに外部者の支援の手を差し込み、この地にあった形の支援体制を構築するかが大きな課題となった。その意味で、この被災後数年間は、メンタルヘルスに関する支援を浸透させるための下地作りとも言うべき活動であったといえる。共通的話題として、また荒んだ心理状態を緩和させる意味合いとして「バラ」は確実にコミュニティを再生する力を持ち、被災者に生きる活力を与えた。しかしこれらが支援として根付き、継続的にコミュニティを再生させ、被災者のアイデンティティの回復にどの程度寄与するかは、これからの活動にかかっていると言える。

バラを用いた支援は、継続的な心理支援のアイコンとして根付かせつつ、必要な資源や体制の整備して新しい形でコミュニティを再構成していくと同時に、メンタルヘルスの問題に関してどのように気づき、どのような対応をとるのかという具体的な情報やルートの整備が必要となる。こうした活動は今後数年単位で継続的に手を入れていく必要があり、メンタルヘルス過疎地の心理支援そのものの達成度という意味では、目的の達成度は2割程度であろう。しかし、現状では支援継続性の必要性・支援方法の案出・支援方法の検証などのシステムが急速に形成されつつあり、多少遅れつつも前進をしていると考えている。研究として見た場合、重要な観点を見出しつつあると考えている。今年度の活動計画の大幅な変更はないが、食事会イベントを用いた「コミュニティ再生」を縮小し、目的を知人との再会、交流、コミュニティの再会に絞るイベントへ形態を変える。イベントはその中心を様々な心理的、身体的ケアのプログラムとする。H25年度の活動から、高齢者世代が元に戻る未来を目指しているのに対し、若年世代が今という現実をどう生き、自分の人生をどう作り直していくかにその焦点があることが想定されており、それぞれの世代が抱える葛藤に即した支援のありかたを検討する必要があることが示された。そのため、各世代へのアプローチが可能なプログラムの提供を検討していく。その準備として事前に被災者に戸別訪問及びインタビューを行い、現状のストレスやニーズ、葛藤の把握に努める。全戸へのバラの配布は従来の夏期実施から秋期実施へと移す(バラの鮮度・各戸での保管状況などを鑑みた結果)。また、インタビュー可能な家庭からは事前の戸別訪問インタビューと同様に被災地及び村の実態把握のための聞き取りを行う。また今後の継続的支援の在り方の一つとして、コミュニティ再生をめざし、バラ配布に関与した学生が村の日常の入り込むことによる、いわば共有体験型の支援活動の可能性を模索している。そのために必要な情報収集を始め、村との折衝等を今年度の活動の一部(被災地を運営するシステム自体へと介入し、その負担軽減と復興支援案・支援者の技術向上などをめざし、自立を目指す支援へとシフトアップする)に組み込むことを予定している。研究初年度は、被災有無に関わらない「公平な支援」を実践すべく、対象地域全土全戸への訪問活動をおこなった関係上、ボランティア人員(研究協力者・支援者他)の旅費に最大限の予算を割いた。人件費を可能な限り抑え、すべてを活動費(研究の推敲自体に掛かる費用と認識)に割いたが、支給規模を超えるものとなった。また、コミュニティ再生イベントの準備にあたり、物品のほとんどを東京から搬入せざるを得ず、結果として出費も多かったため以上のような結果となった。上記結果は、支援のすべてを支援者が準備し、対象者を来場させて支援を提供しようという姿勢によるものであった。この姿勢は、即応支援から継続されていたものであり、その効果等を実証すべく敢えておこなわれた部分もある。平成26年度は、現地への交通方法も簡便になり(三陸鉄道の全線運行再開)旅費の削減が図られると考えている。
太陽面活動現象の観測データを利用した電磁流体モデリング

本研究の成果は、太陽観測衛星「ひので」の観測データと数値シミュレーションによるモデリングを連携させ、種々の太陽活動現象の物理機構を明らかにした点にある。具体的には、黒点磁場の形成と散逸過程、浮上磁場の進化と活動性、フレアを発生する活動領域の特性について新たな知見を得た。太陽面で生じる活動現象のモデル化を観測データに基づいて進めるという研究目的の下、活動現象と密接な関係を持つ物理過程の解明を目指してモデリングを行い、その一方で太陽観測衛星ひのでの高精度観測データを利用して現象発生の鍵となる観測的特徴を導くことを目指して研究を遂行した。具体的な研究内容は、活動領域を構成する黒点の形成過程に注目し、部分的に分裂した磁束管が太陽面へ浮上する過程を3次元数値シミュレーションにより再現することで、同一磁極を持つ小黒点の融合による黒点形成のモデル化に初めて成功した。融合に伴い太陽面上で発生するガスの流れや太陽大気中に形成される磁場構造の特徴を導出したことは、活動現象の発生メカニズムを理解する上での重要な知見につながり、今後観測データを用いて実環境での活動性を調べる研究への確かな第一歩となる。また、ひのでが取得した太陽面上の時系列化されたベクトル磁場データを詳細に調べることで、フレアと呼ばれる太陽面爆発の前兆となる観測的特徴を導いた。それによれば、活動領域で見られる「磁場構造のねじれ」を定量化した量である磁気ヘリシティの進化曲線が重要な物理的情報を特ち、大規模なフレアではその発生前に磁気ヘリシティの進化に顕著なsaturationが存在することを見出した。このsaturationの物理的起原について、ねじれを持つ磁束管の浮上の観点から説明を与えた。この成果は、活動領域におけるベクトル磁場の進化を高い精度で取得できるひのでであればこそ得ることが出来たものであり、フレア発生に関して新しい予見方法を示したと言える。本年度は、太陽面磁場の活動性に関して理論観測両面で研究を進め、以下にあげる成果を得た。1)太陽面における磁場領域の融合過程:太陽面磁場の分布は、黒点に代表される大規模な磁場の集中領域とそれを取り巻く小規模な集中領域に分けられる。大規模な集中領域の形成は、比較的小規模な集中領域の融合により行われることが観測から示唆されていたが、具体的な融合過程については未解明であった。本研究では、浮上する分裂磁束管の3次元電磁流体シミュレーションにより磁場領域の融合過程を初めて再現するとともに、融合に伴って生じる現象の物理過程を明らかにした。具体的には、分裂磁束管の磁場の捻れが融合時に回転運動を発生させる過程を導出し、回転運動を伴う融合現象という観測事実の説明に成功した。2)太陽面下の磁場構造の推定:太陽面下において磁場がどのような構造を持つかということは、磁場が太陽面上へ浮上したのち上空で起こす活動現象の性質を知る上で重要である。その一方で、太陽面下の磁場構造を直接観測することは出来ない。本研究では、太陽面で観測される磁場分布の特性を統計的手法により導出し、それに基づいて太陽面下の磁場構造を推定する手法を考案した。3)太陽光球面磁場の観測的特徴に基づいた太陽フレアの発生予測:太陽フレアは太陽コロナ磁場の爆発的な進化に伴い生じる現象であるが、観測的にコロナ磁場を直接捉えることは未だ困難である。一方、太陽光球面の磁場構造及び進化については太陽観測衛星ひのでにより詳細な情報が得られている。本研究では、ひのでが取得した光球面磁場データの解析によりフレア発生に関与する光球面磁場の観測的特徴を導出し、フレアの発生予測へとつながる成果を得た。本年度は、太陽フレアを起こす活動領域の進化を特徴づける観測量をデータ解析により導出する一方、フレアに代表される太陽面活動現象の発生に中心的な役割を果たしている3次元磁気リコネクションのメカニズムを数値シミュレーションにより詳細に調査した。具体的な成果は以下のとおりである。1)フレア活動の指標となる観測的特徴量の導出太陽フレアはコロナ中で生じる磁場の散逸現象であるが、コロナ中の磁場を直接測定するのは困難である。本研究は、観測可能な太陽光球面における磁場分布の時間発展から、フレアを起こす活動領域の性質・進化を把握する手法を提示した。即ち、太陽観測衛星ひのでにより得られた光球面ベクトル磁場の時系列データを解析し、フレア発生へと向かう活動領域の進化を特徴づける観測量の導出に成功した。本解析により、余剰磁場エネルギーを生む磁場のねじれが活動領域の進化とともに黒点の特定の部分に集中していく一方、フレア直前には磁場のねじれが有意に減少することが確認された。本研究結果は、今後フレアの発生予測をする上で極めて有効な観測情報を提供するものである。2)ジェット現象を可能にする3次元磁気リコネクションの磁場配位古典的な2次元リコネクションの描像に対し、3次元空間を連続的に分布している磁場配位の下、ダイナミソクなジェット現象を可能にするリコネクションがどのように発生するか、その時間発展を数値シミュレーションにより再現し詳細な解析を行った。その結果、磁場の向きが異なる2つの領域間に磁場形状が連続的に変化する遷移領域が形成され、そこで生じる磁気リコネクションがダイナミックなプラズマ運動を可能にすることが判明した。

本研究結果は、3次元磁場構造においては、強度や方向が異なる磁場領域の中間に生じる遷移領域が数々の活動現象の物理過程に重要な寄与をしていることを強く示唆している。
自己免疫疾患の発症要因としてのT細胞CDC154分子の発現異常の分子生物学的解析

これまでの研究により、IFN-αが全身性エリテマトーデス(SLE)のような自己免疫疾患の発症の引き金となることが明らかにされている。またCD154の発現が異常に増強しそれが長時間にわたり持続することにより、SLEに特徴的な多クローン性のB細胞の活性化、高ガンマグロブリン血症、自己抗体産生が引き起こされる可能性が考えられる。本研究においては、活性化されたヒトCD4陽性T細胞におけるCD154の発現に対するIFN-αの影響を検討した。その結果、IFN-αは固相化抗CD3抗体にて活性化されたCD4陽性T細胞の初期活性化段階においてCD154分子タンパク及びmRNAの発現を抑制したが、その後の活性化段階において、CD154の発現を増強することを明らかにした。次年度は、その詳細なメカニズムについて検討を行なった。その結果、IFN-αは抗CD3抗体刺激CD4陽性細胞のCD154mRNAのstabilityに対しては何ら有意の変化を与えなかった。一方、ヒトT細胞白血球株Jurkat細胞に、CD154遺伝子のプロモーター領域を組み込んだluciferaseレポータープラスミドを感染させてtransfectantを作成し、これを用いてIFN-αとIL-12の影響を検討したところ、IFN-αとIL-12は相加的にluciferase活性を増強した。以上の結果より、IFN-αは、IL-12とは異なる機序によりCD154mRNAの転写を増強し、これによりCD154の発現を長時間に亘り持続させ、SLEのような自己免疫疾患の病態に深く関与することが示唆された。これまでの研究により、IFN-αが全身性エリテマトーデス(SLE)のような自己免疫疾患の発症の引き金となることが報告されている。本研究において、我々は活性化されたヒトCD4陽性T細胞におけるCD154の発現に対するIFN-αの影響を検討した。健常人末梢静脈血より単核球を精製し、L-leucine methyl ester処理によりNK細胞、マクロファージ、単球等のaccessory細胞を完全に除去した後にT細胞を精製し、これを固相化抗CD3抗体にて刺激してCD154の発現を誘導した。CD154の発現はフローサイトメトリーとRT-PCRにより評価した。IFN-αは固相化抗CD3抗体にて活性化されたCD4陽性T細胞の初期活性化段階(培養開始24時間)においてCD154分子タンパク及びmRNAの発現を抑制したが、その後の活性化段階(培養開始72120時間)において、CD154の発現を増強することが明らかになった。こうした傾向はIL-12や抗CD28抗体の添加では変化が見られなかった。これらの結果は、IFN-αがIL-12やCD28副刺激とは異なった機序で、CD4陽性T細胞におけるCD154の発現を増強していることを示している。以上の結果より、IFN-αは活性化T細胞においてCD154の発現を長時間にわたり増強することにより、SLEのような自己免疫疾患の病態に深く関与している可能性が示唆された。これまでの研究において、IFN-αが全身性エリテマトーデス(SLE)をはじめとする自己免疫疾患の発症の引き金となることが報告されている。昨年度の研究において、IFN-αは固相化抗CD3抗体にて活性化されたCD4陽性

T細胞の初期活性化段階においてCD154分子タンパク及びmRNAの発現を抑制したが、その後の活性化段階において、CD154の発現を増強することを明らかにした。本年度は、その詳細なメカニズムについて検討を行なった。その結果、IFN-αは抗CD3抗体刺激CD4陽性細胞のCD154 mRNAのstabilityに対しては何ら有意の変化を与えなかった。一方、ヒトT細胞白血球株Jurkat細胞に、CD154遺伝子のプロモーター領域を組み込んだluciferaseレポータープラスミドを感染させてtransfectantを作成し、これを用いてIFN-αとIL-12の影響を検討したところ、IFN-αとIL-12は相加的にluciferase活性を増強した。以上の結果より、IFN-αとIL-12はいずれもCD154 mRNAの転写を増強することにより、CD154の発現をupregulateすることが示唆された。
CD5陽性DLBCLの新規バイオマーカーの同定

本研究では、平成30年度においてCD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC type DLBCLの症例を20症例集め、これらの症例について質量分析を行い、CD5陽性DLBCLにおいて発現の上がっているタンパク質、下がっているタンパク質を同定する計画であった。我々は、まず上記の40症例についての病理所見データベース作成について、まず症例を提供施設と連絡を取り、我々の施設と協力施設において相互に倫理委員会の承認を得るなど研究体制の確立を行った。次いで40症例の選定、収集を行い、病理所見データベースの作成を完成した。次いで、タンパク質についての質量分析を行うために、FFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発を行った。加熱による架橋の除去法を検討した結果、95 °Cの加熱を180分行うことで、最も高い収量が得られることがわかった。この時、緩衝液pHの違いはタンパク質抽出量を変化させないことがわかった。タンパク質抽出液組成について検討した結果、20 mM Tris-HCl(pH9),2 % SDS, 1 % β-octyl glycoside, 0.2 Mグリシンの組み合わせで最も高い収量が得られた。本組成における精製後の回収量の検討ではDOCを加えることで、より多くのタンパク質が得られた。これらのの検討結果から得た最適な条件によって、DLBCL症例のFFPE標本3検体からタンパク質抽出を行った。その結果、それぞれから47個、245個、524個のタンパク質が同定された。具体的には免疫グロブリン重鎖、CD44などが得られた。同定されたタンパク質は細胞質中に存在する分子が多数同定されたが、上記のような膜タンパク質も20個得られた。タンパク質同定に用いられたペプチドは、各サンプルで少なくとも半数は疎水性であった。第一に病理所見データベースは、CD5陽性DLBCLは発生頻度の低い疾患であり、提供施設において、40症例を選定、標本を作製するのに時間がかかった。次にFFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発については、溶出バッファーの検討を行った。その際に抽出したタンパク質濃度はBradford法、BCA法、ローリー法、2-D Quant kitなど複数の方法にて検討した。しかし、FFPE標本から抽出したタンパク質では化学修飾が加わっており、測定方法によりタンパク質濃度は一致せず、タンパク質濃度測定ができなかった。現在はSDS-PAGEを行い、各サンプルを流したレーンでのtotal intensityを測定している、これにより、サンプル間の相対濃度を測定し、質量分析前にサンプル中のタンパク質濃度をそろえている。この点もまた、今回、研究を進める上で遅れる原因となった。さらに、タンパク質抽出の効率を高めるために界面活性剤を用いた。界面活性剤の入っている状態では質量分析を行うことはできない。そこで、タンパク質の精製が必要である。そのため、タンパク質抽出量が減少することとなり、現在その点を改善中である。CD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC typeDLBCLの症例を20症例集め、これらの症例に関してのデータベースを急ぎ完成させる。また、開発したタンパク質溶出プロトコールによる質量分析を行い、CD5陽性DLBCLにおけるバイオマーカーの探索を行う。それと並行し、必要に応じて質量分析イメージングを行い、CD5陽性DLBCLに特異的なタンパク質の発現とその領域を調べる。それぞれのたんぱく質の発現領域、発現領域の周囲、発現していない領域に区分し、各区分でのマクロファージ、M2型マクロファージの密度、血管の密度、細胞障害性T細胞、制御性T細胞の密度を算出する。これにより、細胞密度と、新規に見出したたんぱく質との分布相関を分析し、マクロファージの集簇や細胞障害性T細胞、制御性T細胞の密度との関係など微小環境への影響について明らかにする。CD5陽性DLBCLと対照群であるCD5陰性ABC type DLBCLを、質量分析にて検出されたたんぱく質分子の発現の有無によりそれぞれ陽性群と陰性群の4群に分類する。それぞれ検出されたたんぱく質について、各々4群において初診時における非ホジキンリンパ腫の国際予後指数(年齢、血清LDH、Performance Status、病期、節外病変数)を比較検討し、予後に関する新規バイオマーカーを探索する。また、陽性群と陰性群での節外臓器への進展の有無、中枢神経再発の有無についても比較検討する。これにより、新たに病理診断に有効な予後因子を同定する。本研究では、平成29年度においてCD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC type DLBCLの症例を20症例集め、これらの病理所見に更に患者の臨床情報(病歴、身体所見、検査データ、画像データ、その他フローサイトメトリー、遺伝子・染色体解析結果、in situ hybridyzation結果)を付加した良質な病理所見データベースの作成とFFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発する計画であった。病理所見データベースの作成については、まず上記の40症例について提供して下さる施設と連絡を取り、協議し、我々の施設と協力施設において相互に倫理委員会の承認を得るなど研究体制の確立を行った。次いで40症例の選定、収集を行い、病理所見データベースの作成を行っている。FFPE

標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発については、その重要となる要因の一つが組織の破砕である。我々は用手法よりも効果的な方法として超音波による破砕、ビーズによる破砕を試した。いずれの方法においても用手法よりもタンパク質の溶出量を大幅に増やすとともに、ビーズによる破砕では多検体を同時に処理できるため、実験操作にかかる時間を大幅に軽減することに成功した。次に溶出バッファーの検討を行った。溶出バッファーは30%アセトニトリル、クエン酸バッファー、Tris-Hcl、Urea、グアニジン塩酸にて検討した。これらの結果からはクエン酸バッファー、Tris-HclはそれぞれpHを変えて検討したが、30%アセトニトリルと収量は変わらなかった。一方Urea、グアニジン塩酸では様々な濃度を検討した結果、それぞれ2倍、4倍の収量の増加が得ることに成功した。本研究では、平成29年度においてCD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC type DLBCLの症例を20症例集め、その病理所見データベースの作成とFFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発する計画であった。病理所見データベースは、40症例について提供施設の選定や連絡体制の確立に時間がかかった。FFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発については、タンパク質の組織からの溶出における組織の破砕の検討を行った。我々は超音波による破砕、ビーズによる破砕、用手による破砕などを試し、上記のようにビーズによる破砕がタンパク質の溶出量を増やすことができるとともに、実験操作にかかる時間を軽減できることを明らかにした。このために、装置の選定・新規購入や破砕時間、破砕回数の最適化が必要であり、そのためにも時間を要する結果となった。このようにビーズによる破砕法を導入したが、これに伴い、組織中のDNAが破砕されてしまい、実際に質量分析を行う際にサンプルの粘性が高まり、質量分析を行うことができないという問題が起こった。これをチェックするためのアガロースゲル電気泳動やDNA破砕が起こらないための条件検討が必要であった。これも時間が予想よりもかかった原因の一つである。また、溶出バッファーの検討においては界面活性剤によるタンパク質溶出も検討しているが、Bradford法によるタンパク質濃度測定ができないため、現在BCA法の導入、そのための機器の選定・購入を進めており、これも結果が遅れる一因となった。本研究では、平成30年度においてCD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC type DLBCLの症例を20症例集め、これらの症例について質量分析を行い、CD5陽性DLBCLにおいて発現の上がっているタンパク質、下がっているタンパク質を同定する計画であった。
脳皮質層形成のダイナミクス

発生期大脳皮質の脳室帯(神経幹細胞が存在)と中間帯(最終分裂を終えて新たに誕生した神経細胞が、脳表面に向かって移動する途中の部位)を、それぞれ実体顕微鏡下で切り出して、二種の異なる蛍光色素でラベルした後、混合して再凝集培養を行うという実験等により、分散時に中間帯にあった(より)早生まれの神経細胞と、脳室帯にあった(より)遅生まれの細胞では、それぞれが特異的に凝集する傾向を有することを見いだした。そして、中間帯の神経細胞間の方が、脳室帯の神経細胞間よりもその凝集傾向が強いことを示唆する結果を得た。この結果は、中間帯細胞と脳室帯細胞の間の一般的な特徴の相違というわけではなく、少なくとも胎生14日生まれの細胞については、誕生時期特異的な性質であることを見いだした。すなわち、胎生14日生まれの細胞は、培養開始時点における局在部位に関わらず、それ以前やそれ以後に誕生した細胞と、再凝集培養下において互いに分離して凝集する傾向を示した。以上の結果から、脳室帯で産生された大脳皮質神経細胞(興奮性の投射性神経細胞)は、辺縁帯直木まで移動しなくても、既に移動中において、その誕生時期に依存して相互に凝集する性質を獲得している可能性が示唆された。また、辺縁帯に存在するカハール・レチウス細胞からは、正常な層形成に必須とされるリーリンが分泌され、移動細胞の最終配置を制御すると考えられているため、次に、この誕生時期依存的な細胞凝集傾向にリーリンが関わっているかどうかを検討した。その結果、リーリンシグナルを受容する移動細胞の細胞内で、それを伝達するために必須であることが知られているDab1の欠損マウスであるヨタリ突然変異マウス(リーリン欠損と同様の脳の形態異常を示す)においても、上記の誕生時期依存的な細胞凝集傾向は認められた。以上より、リーリンシグナルとは独立に、この特異的凝集能は獲得されることが示唆された。発生期大脳皮質の脳室帯と中間帯を含む領域を蛍光色素でラベルした後、再凝集培養を行った。その結果、次第に強い蛍光の細胞(培養開始時に既に最終分裂を終えていた細胞)と、弱い蛍光の細胞(培養開始後に分裂した細胞)の二種に分かれた。そして、凝集塊において次第に強い蛍光を持った細胞が凝集塊の中心近くに集まる傾向を示した。この結果は、早生まれの細胞と遅生まれの細胞では、それぞれが特異的に凝集する傾向を有することを示唆する。この実験で"早生まれの細胞"とは、培養開始時に既に最終分裂を終えて中間帯を移動中の細胞であったと推定され、一方、"遅生まれの細胞"とは、培養開始時点においてまだ脳室帯にあって分裂能力を持っていた細胞と推定される。そこで次に、中間帯と脳室帯とをさらに切り分けて、各々別の色の蛍光色素でラベルした後、両者を混ぜて、再凝集培養実験を行ってみた。その結果、予想通り、中間帯に由来する細胞は凝集塊の中心近くに有意に集まる傾向があることが確認された。そこで次に、ブロモデオキシウリジンを種々の発生時期に投与して、各々の時期に最終分裂した細胞をラベルしたのち、脳室帯と中間帯を含む領域を切り出して、同様の培養実験を行った。まずは、胎生14日または15.5日にラベルし、胎生16日に培養を開始した。その結果、胎生14日生まれの細胞の方が、胎生15日生まれの細胞よりも、凝集塊の中心近くに集まる傾向を示した。胎生16日において、胎生14日にラベルされる細胞は多くが既に中間帯まで移動しており、一方、胎生15.5日にラベルされる細胞は胎生16日においてはまだ殆どが脳室帯に局在することも確認した。そこで次に、同様に胎生13日または14日にブロモデオキシウリジンでラベルし、胎生14.5日で培養を行ってみた。その結果、胎生13日生まれの細胞は、既に多くが14.5日においては中間帯に出ていたにもかかわらず、凝集塊の周辺近くに局在する傾向を示し、一方、胎生14日生まれの細胞は、14.5日においてはまだ殆どが脳室帯にあったにも関わらず、凝集塊の中心近くに局在する傾向を有することを見いだした。以上より、脳室帯で産生された神経細胞は、辺縁帯直下まで移動しなくても、その誕生時期に依存して相互に凝集する傾向を有することが示唆された。

すなわち、胎生14日生まれの細胞は、培養開始時点における局在部位に関わらず、それ以前やそれ以後に誕生した細胞と、再凝集培養下において互いに分離して凝集する傾向を示した。以上の結果から、脳室帯で産生された大脳皮質神経細胞(興奮性の投射性神経細胞)は、辺縁帯直木まで移動しなくても、既に移動中において、その誕生時期に依存して相互に凝集する性質を獲得している可能性が示唆された。また、辺縁帯に存在するカハール・レチウス細胞からは、正常な層形成に必須とされるリーリンが分泌され、移動細胞の最終配置を制御すると考えられているため、次に、この誕生時期依存的な細胞凝集傾向にリーリンが関わっているかどうかを検討した。その結果、リーリンシグナルを受容する移動細胞の細胞内で、それを伝達するために必須であることが知られているDab1の欠損マウスであるヨタリ突然変異マウス(リーリン欠損と同様の脳の形態異常を示す)においても、上記の誕生時期依存的な細胞凝集傾向は認められた。以上より、リーリンシグナルとは独立に、この特異的凝集能は獲得されることが示唆された。
次世代ガンマ線望遠鏡を用いた超新星残骸観測による宇宙線起源の解明

宇宙線の主要な加速起源は未だ解明されていないが、中でも超新星残骸は有力な候補天体であり、衝撃波によって粒子を加速していると考えられている。本研究では複数の超新星残骸をCherenkov Telescope Array(CTA)の大口径望遠鏡で観測する。CTAは現在順次建設中の超高エネルギーガンマ線望遠鏡群であり、現行の望遠鏡に対して10倍の感度と3倍の角度分解能を有する。観測結果を星間物質やX線放射等の分布と比較し、ガンマ線の起源やその拡散係数を議論することで、超新星残骸における宇宙線の加速機構や拡散過程を明らかにする。
機能的発現に補助因子を必要とするG蛋白共役型受容体の発現機構の分子レベルでの解明

本研究ではこれら補助因子を必要とする受容体の機能的発現のメカニズムについての解明を、クローン化GABA-B受容体を用いて、(1)発現受容体の細胞内局在を免疫組織学的、ならびに共焦点レーザーを用いて特定し、(2)発現受容体の多量体化・複合体化をFluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)を用いて、さらには(3)GABAB受容体刺激後のシグナル伝達機構を電気生理学的にアッセイし、機能性受容体の発現の分子メカニズムを総合的に解析しようとするものである。(1)については、細胞膜上に機能的受容体が発現するときにはすでに細胞内で受容体が複合化しているという知見を得た。またHeat shock protein 90の活性阻害薬geldanamycinが細胞膜への受容体の移動、並びにdimerizationを抑制するという知見を得た。(2)については、まだ発現の最適化が完全には行われておらず、さらに検討を要している。(3)については、特にGABAB受容体について、GABAB-1R、GABAB-2Rを用いてアフリカツメガエル卵母細胞に機能的な受容体を発現させ、GABAの結合に必要な受容体サブタイプ、また、シグナルを下流に伝えるのに必要不可欠なサブタイプについて、どちらがその役割に関与しているかどうか検討した。そのためにGABAB受容体とG-proteinとを融合させたFusion proteinを作製し、これらを発現させ詳細に解析を試みた。これまでに、GABAの結合にはGABAB-1Rが重要であり、機能発現にはGABAB-2Rが必要であるという知見を得ている。つまり、「機能的であるためにDimerizationを必要とする受容体」において、1)Dimerizationに影響を与える薬物、2)受容体へのリガンド結合に影響を与える薬物(現在まで専らこの点に注目して薬物の開発が行われてきた)、3)機能活性をもつ部位に影響を与える薬物に分けてそれぞれ薬物開発が可能となるということを示唆している。これまでに得られた知見を通して、Dimerizationを形成する受容体に対しての新薬開発という観点からこの研究をさらに発展させていきたいと考えている。申請者らは、GABA-B受容体ならびにAM受容体について、クローン化受容体発現細胞あるいはそれぞれの受容体を発現している組織・細胞を用いてそのシグナル伝達メカニズムについて検討を行ってきた。偶然にも両受容体は、機能的に発現するためには補助蛋白を必要とする受容体であった。GABAB受容体の場合はGABA-B1とGABAB-2というサブタイプがヘテロダイマーを作ることが機能発現に必須であり、AM受容体はCRLRがRAMP2とともに発現することが必須である。本研究ではこれら補助因子を必要とする受容体の機能的発現のメカニズムについての解明を、クローン化GABA-B受容体、ならびにAM受容体(CRLR+RAMPs)を発現させた細胞を用いて、(1)発現受容体の細胞内局在を免疫組織学的、ならびに共焦点レーザーを用いて特定し、(2)発現受容体の多量体化・複合体化をFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)を用いてアッセイし、さらには(3)GABA, AM受容体刺激後のシグナル伝達機構を電気生理学的にアッセイし、機能性受容体の発現の分子メカニズムを総合的に解析しようとするものである。(1)については、現在最適な発現状況を検討しているところであるが、細胞膜上に機能的受容体が発現するときにはすでに細胞内で受容体が複合化しているという知見を得ている。

(2)については、まだ発現の最適化が完全には行われておらず、さらに検討を要している。(3)については、特にGABAB受容体について、GABAB-1R、GABAB2Rを用いてアフリカツメガエル卵母細胞に機能的な受容体を発現させ、GABAの結合に必要な受容体サブタイプ、また、シグナルを下流に伝えるのに必要不可欠なサブタイプについて、どちらがその役割に関与しているかどうか検討している。そのためにGABAB受容体とG-proteinとを融合させたFusion proteinを作製し、これらを発現させ、さらに詳細に解析を試みている。これら3つのアッセイを組み合わせることで、来年度研究終了時までには当初の自的を完遂できるものと考えている。本研究ではこれら補助因子を必要とする受容体の機能的発現のメカニズムについての解明を、クローン化GABA-B受容体、ならびにAM受容体(CRLR+RAMPs)を発現させた細胞を用いて、(1)発現受容体の細胞内局在を免疫組織学的、ならびに共焦点レーザーを用いて特定し、(2)発現受容体の多量体化・複合体化をFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)を用いてアッセイし、さらには(3)GABA, AM受容体刺激後のシグナル伝達機構を電気生理学的にアッセイし、機能性受容体の発現の分子メカニズムを総合的に解析しようとするものである。(1)については、細胞膜上に機能的受容体が発現するときにはすでに細胞内で受容体が複合化しているという知見を得た。またある種のHeat shock proteinの活性阻害薬(HSP 90 inhibitor geldanamycin)が細胞膜への受容体の移動、並びにdimerizationを抑制するという知見を得た。(3)については、特にGABAB受容体について、GABAB-1R、GABAB-2Rを用いてアフリカツメガエル卵母細胞に機能的な受容体を発現させ、GABAの結合に必要な受容体サブタイプ、また、シグナルを下流に伝えるのに必要不可欠なサブタイプについて、どちらがその役割に関与しているかどうか検討している。そのためにGABAB受容体とG-proteinとを融合させたFusion proteinを作製し、これらを発現させ詳細に解析を試みている。これまでに、GABAの結合にはGABAB-1Rが重要であり、機能発現にはGABAB-2Rが必要であるという興味深い知見を得ている。これらのことは、「機能的であるためにDimerizationを必要とする受容体」において、1)Dimerizationに影響を与える薬物、2)受容体へのリガンド結合に影響を与える薬物(現在まで専らこの点に注目して薬物の開発が行われてきた)、3)機能活性をもつ部位に影響を与える薬物に分けてそれぞれ薬物開発が可能となるということを示唆している。