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薬剤耐性単純ヘルペスウイルスによる新生児ヘルペスの病態解明と治療戦略に関する研究

1.私たちは世界で初めて,ウイルス学的に証明されたアシクロビル(ACV)耐性単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)によるヘルペス脳炎(新生児ヘルペス患者)を報告した(Kakiuchi, S, et al. JCM, 2013).その患者の脳脊髄液中に認められたHSV-1のチミジンリン酸化酵素(vTK)遺伝子中のQ125H変異を有する組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)をF株由来BACシステムを用いて当該組換えウイルスを作出した.この変異は実際にACVに耐性を誘導することを証明した.そのACV耐性HSV-1はマウス脳内接種による神経病原性を調べたところ,比較的高い病原性が維持されていることが明らかになった.2. Q125H変異を有する組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は間接的な評価ではペンシクロビルやガンシクロビルに感受性であると推測されていた(Kakiuchi S, etal. J Clin Microbiol ;51(1):356-9, 2013).しかし,それは確かにACVに耐性を示したものの,さらにペンシクロビルやガンシクロビルにも交差耐性を示した.3. ACV耐性HSV-1による脳炎患者の脳脊髄液中に検出されたvTK遺伝子のACV耐性化の責任遺伝子として報告されたR41HとA156Vの変異はACV耐性を誘導しないことが証明された.4.遺伝子組換え技術を用いて,HSV-1のvTK遺伝子を水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)のvTK遺伝子に組換えたウイルス(VZV-HSV-1vTK)を作出した.また,同様にHSV-1のvTK遺伝子を挿入させた組換えウイルス(HSV-1-HSV-1vTK)も作出した.ACV存在下でACV耐性ウイルスを作製したところ,VZV-HSV-1vTKの場合,すべてDNAポリメラーゼに変異が入り,それが耐性を誘導する原因であった.一方,HSV-1-HSV-1vTKのACV耐性株の場合,すべてがvTK遺伝子に変異が挿入されていた.VZVのvTK関連ACV耐性化は,極めて起こりづらく,ACV耐性VZV感染症の報告事例が少ないことに関連していると考えられた.アシクロビル(ACV)耐性単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)によるヘルペス脳炎(Kakiuchi S, et al. JCM, 2013)の脳脊髄液中に認められたHSV-1のチミジンリン酸化酵素(vTK)遺伝子中のQ125H変異を有する組換えHSV-1を作出した.この変異は実際にACVに耐性を誘導することを証明した.そのACV耐性HSV-1のマウス脳内接種による神経病原性を調べたところ,比較的高い病原性が維持されていることが明らかになった.また,ACVへの感受性とマウスにおける神経病原性には,負の相関があることが証明された.ウイルス学的検査と適切な治療法の選択の重要性が確認された.1)今後の研究の推進方策(最大800字)作出されたチミジンリン酸化酵素(vTK)遺伝子中のQ125H変異を有する組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は,これまでの研究(Kakiuchi, S, et al. JCM, 2013)では,ACV以外のvTK関連薬剤であるペンシクロビル,ブロバビル,ガンシクロビルに野生株と同等の感受性を示すことが予想される.そこで作出された組換えHSV-1のこれらの薬剤に対する感受性を調べるとともに,マウスにおける神経病原性を評価する.ヘルペス脳炎患者の脳内で出現したACVr HSV-1の性状を解析することで,新生児ヘルペス脳炎患者における病態と治療法のあり方と考察する.ACVr HSV-1の薬剤感受性と神経病原性および皮膚病原性に正の相関があることが明らかにされた.この研究に関する成果を学術論文にまとめる.
肺がんの薬剤耐性と転移因子を分子標的とした免疫遺伝子治療

多剤耐性(MDR)癌細胞が発現するP糖蛋白質(P-gp)に対する抗体MRK16はマクロファージ(MΦ)の抗体依存性細胞障害反応(ADCC)を誘導し、MDR癌細胞を障害する。本年度は、肺癌の遠隔転移とMDRの克服を目的に、MDR肺癌細胞の多臓器転移に対する抗P-gp抗体の治療効果を検討し、更にMΦのADCCを強化すべくMDR肺癌細胞へMΦ活性化因子M-CSFまたはMΦ遊走因子MCP-1の遺伝子導入を行い、抗P-gp抗体との併用効果を検討し、以下の成果を得た。1、ヒト小細胞肺癌株H69及びP-gp陽性MDR株H69/VPはNK細胞除去SCIDマウスに静注した場合、多臓器(肝、腎、リンパ節)転移を形成した。ビンデシン治療はH69の転移形成を抑制したがH69/VPのそれを全く抑制せず、H69/VPの転移巣での抗癌剤耐性を確認した。2、抗P-gp抗体(マウス抗体MRK16とキメラ抗体MH162)は用量依存性にH69/VPの多臓器転移形成を抑制した。3、H69/VPにM-CSFまたはMCP-1遺伝子を導入し生物活性を有するM-CSFまたはMCP-1産生株を得た。これらの株を用い上記転移モデルにてMRK16治療の転移抑制効果を検討した。(1)H69/VPに対する遺伝子導入はin vitroでの増殖能及びP-gp発現に影響しなかった。(2)M-CSF遺伝子導入はMΦ活性化により肝及びリンパ節転移を抑制したが腎転移には影響しなかった。しかし、MRK16併用にて各臓器の転移形成が完全に抑制された。(3)MCP-1遺伝子導入は転移形成に影響しなかったが、MRK16併用において転移抑制効果を有意に増強した。その機序として、転移巣で産生されたMCP-1がMΦ集積を促進しADCCを増強させたと考えられた。以上より、MDR肺癌に対する抗転移療法を開発する上で、免疫エフェクター細胞の転移局所への動員と活性化を試みるアプローチの重要性が示唆された。3.抗P糖蛋白質抗体はマクロファージの抗体依存性細胞障害反応(ADCC)を誘導し、ヌードマウス皮下に移植された多剤耐性ヒト肺癌及び卵巣癌細胞の増殖を抑制することを示し、さらに癌細胞へのMCP-1、またはM-CSF遺伝子導入が抗P糖蛋白質抗体の治療効果を増強することを明らかにした。(Nishioka Y.etal.,Int.J.Cancer,1997;Sone S.etal.,Jpn.J.Cancer Res.,1996)また、ヒト小細胞肺癌が高発現しているガングリオシドGM_2に対するマウス・ヒトキメラ抗体KM966がヒト単球及びリンパ球のADCCを誘導しヒト小細胞肺癌株を傷害することを明らかにした。(Hanibuchi M.etal.,Jpn.J.Cancer Res.,1996)4.肺癌患者の抗腫瘍エフェクターの自己癌細胞に対するキラー活性の解析:まず、健常人のエフェクター細胞を用いて新規サイトカインのキラー活性に対する影響を検討した。IL-12およびIL-15は用量依存性にリンパ球の抗腫瘍活性(LAK)を誘導しうること、単球の存在下でその活性がさらに増強されることを明らかにした。(Takeuchi E.etal.,Jpn.J.Cancer Res.,1996)現在、肺癌患者から分離した末梢血単核球に対するIL-12、IL-15および両者併用の効果を検討している。臨床を反映した肺癌の遠隔転移モデルの作製と癌関連抗原を標的とした分子生物学的制御を目的に検討し、以下の諸点を明らかにした。1.NK活性欠損のSCIDマウスに組織型が異なるヒト肺癌細胞を経静脈的に移入し、6-8週間後に多臓器への転移形成モデルを確立した。また、左心室腔内への接種による骨転移モデルを確立した。2.M-CSF、IL-10,MCP-1遺伝子導入ヒト肺癌細胞の転移能を上記モデルで検討しMCP-1遺伝子導入肺癌細胞は何ら転移形成に影響しなかったが、M-CSFおよびIL-10遺伝子導入肺癌細胞は転移臓器の微小環境条件により異なった転移形成能を示した。3.抗P糖蛋白抗体はNK細胞、マクロファージの抗体依存性細胞傷害反応(ADCC)を誘導し、NK欠損SCIDマウスでの多剤耐性ヒト肺癌転移モデルにて治療効果があることを示し、さらに癌細胞へのMCP-1またはM-CSF遺伝子導入が抗P糖蛋白抗体の治療効果を増強することを明らかにした。多剤耐性癌細胞へのIL-2遺伝子導入もヌードマウスへの皮下移植モデルで抗体治療を増強した。4.ヒト小細胞肺癌が高発現しているガングリオシドGM2に対するマウス・ヒトキメラ抗体KM966がADCCを誘導しヒト小細胞性肺癌細胞の遠隔転移形成を抑制し、生存期間を延長した。5.肺癌浸潤による胸膜炎のIFN-γ局所療法効果、キラー誘導サイトカイン(IL-12,IL-15)による肺癌患者リンパ球キラー活性発現とTh2サイトカイン産生能を示した。

以上、肺癌転移制御のため癌関連抗原に対する抗体を中心に、サイトカインおよびサイトカイン遺伝子導入の併用による集学的治療の可能性を検討してきた。今後は、骨転移、脳転移モデルでの検討、さらにin vivoでのサイトカイン遺伝子のキャリヤ-として効率のよいベクターの開発を進めていく予定である。臨床を反映した肺癌の遠隔転移モデルの作製と癌関連抗原を標的とした遠隔転移の分子生物学的制御について検討し、以下の諸点を明らかにした。1. NK活性欠損のSCIDマウスに組織型が異なるヒト肺癌細胞を経静脈的に移入することにより、多臓器転移モデルを確立した。また、左心室腔内への接種による骨転移モデルも作成した。2. MCP-1、M-CSF、IL-10、CD82遺伝子導入ヒト肺癌細胞の転移能を上記モデルで検討した結果MCP-1遺伝子導入は転移形成に影響しなかったが、M-CSF、IL-10遺伝子導入は転移臓器の微小環境条件により異なった転移形成能を示し、CD82遺伝子導入はNK細胞の除去により血行散布を促進した。3.抗P糖蛋白抗体がマクロファージの抗体依存性細胞傷害反応(ADCC)を誘導しNK欠損SCIDマウスにおいて多剤耐性ヒト肺癌の遠隔転移形成を抑制すること、さらに癌細胞へのMCP-1、M-CSF遺伝子導入が抗P糖蛋白抗体の治療効果を増強することを明らかにした。4.小細胞肺癌に高発現しているガングリオシドGM2に対するマウス・ヒトキメラ抗体がADCCを誘導し、小細胞性肺癌の遠隔転移形成を抑制することを示した。5.臨床症例において肺癌の癌性胸膜炎に対するIFN-γ局所療法の有効性を示し、キラー誘導サイトカイン(IL-2,IL-12,IL-15)による肺癌患者リンパ球のキラー活性とTh2サイトカイン産生能の相違を明らかにした。6. LAK細胞はマクロファージに対してと同様に樹状細胞に対しても障害作用を示し、その活性はIL-2-LAKでより高かった。7.キノロン誘導体のMS209がサイクロスポリン及びベラパミルとの併用により肺癌細胞の多剤耐性を相乗的に克服することを示した。以上、癌関連抗原に対する抗体療法とサイトカイン遺伝子導入の併用による集学的治療の可能性を検討してきた。今後は、骨転移、脳転移モデルでの検討、in vivoでのサイトカイン遺伝子導入のためのベクターの開発を進めていく予定である。多剤耐性(MDR)癌細胞が発現するP糖蛋白質(P-gp)に対する抗体MRK16はマクロファージ(MΦ)の抗体依存性細胞障害反応(ADCC)を誘導し、MDR癌細胞を障害する。本年度は、肺癌の遠隔転移とMDRの克服を目的に、MDR肺癌細胞の多臓器転移に対する抗P-gp抗体の治療効果を検討し、更にMΦのADCCを強化すべくMDR肺癌細胞へMΦ活性化因子M-CSFまたはMΦ遊走因子MCP-1の遺伝子導入を行い、抗P-gp抗体との併用効果を検討し、以下の成果を得た。1、ヒト小細胞肺癌株H69及びP-gp陽性MDR株H69/VPはNK細胞除去SCIDマウスに静注した場合、多臓器(肝、腎、リンパ節)転移を形成した。ビンデシン治療はH69の転移形成を抑制したがH69/VPのそれを全く抑制せず、H69/VPの転移巣での抗癌剤耐性を確認した。2、抗P-gp抗体(マウス抗体MRK16とキメラ抗体MH162)は用量依存性にH69/VPの多臓器転移形成を抑制した。3、H69/VPにM-CSFまたはMCP-1遺伝子を導入し生物活性を有するM-CSFまたはMCP-
統合失調症の結合性障害の包括的解明：超高磁場MRIによる次世代結合性解析

統合失調症の神経基盤は脳領域間の結合性の病態であるとの知見が集積しつつある。脳領域間の結合性の病理は、その形態学的側面を捉える拡散MRIと、その機能的側面を捉える安静時fMRIによってそれぞれ視覚化が可能である。しかし従来のMRI撮像技術には、複数の線維束の交差部位において白質走行の推定が困難となるなど、技術的限界が残されてきた。そこで本研究では、従来型のMRIの問題点を克服した次世代拡散MRI技術などを導入し、統合失調症の結合性病理を明らかにすることを目指している。上述の目標を達成するために、高傾斜磁場強度MRI(3テスラ)および超高磁場MRI(7テスラ)を用いて、健康被験者、統合失調症被験者の撮像を実施した。3テスラMRIに関しては初年度の目標被験者数30例を達成した。また、7テスラMRIに関しては初年度に目標とした最適な撮像パラメータ決定を終えた。この撮像条件のもとに健康被験者において撮像を開始できている。また、3テスラMRIから得られた拡散画像については、マルチコンパートメントモデル解析(neurite orientation dispersion and density imaging: NODDI)およびfixel-based analysisの2種類の方法で解析を行い、予備的な結果を得た。さらに、3テスラMRIから得られた安静時fMRIデータについては、human connectome project(HCP)のパイプラインに基づく機能的コネクトーム解析の準備を整えた。目標症例数の被験者登録を達成し、撮像と解析にする技術的な面でも、初年度の目標を達成できた。被験者撮像は研究は計画どおり順調に進行しているため、現状の体制を維持する。得られた画像の解析には高度な技術を要するため、適宜、解析の専門家の助言も得ながら、迅速かつ妥当な解析を目指す。初年度のため、学術論文などの成果報告ができなかったが、2年次以降、成果発表を目指す。
DNA組換え修復タンパク質群による発がん防御の分子機構

がん化の原因となる二重鎖切断は、相同組換えを経由した"相同組換え修復"経路によって修復される。相同組換えでは、"相同的対合"と呼ばれる過程で物理的なDNA鎖の対合と交換が行われる。これまでに、相同的対合において働くと考えられるヒトのタンパク質として、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Dmc1、Rad52、Rad54、Rad54B、Xrcc2、Xrcc3等が報告されている。これらの遺伝子は細胞のがん化防御に重要であると考えられている。本研究では、Rad51パラログ(Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2およびXrcc3)に着目した。Rad51パラログの欠損は、高頻度の染色体断裂を伴う染色体異常、シスプラチンやマイトマイシンCなどの抗がん剤への感受性充進、そしてX線に対する抵抗性の低下などが報告されており、細胞のがん化との関連が注目されている。そこで、まずヒト細胞内での存在が確認されている2種類の複合体(Xrcc3-Rad51C複合体およびBCDX2複合体)のうち、その解析が立ち後れているBCDX2複合体(Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2)の再構成をリコンビナントタンパク質によって行った。そしてBCDX2複合体が組換え中間体であるHoliday構造やY型DNA構造に特異的に結合すること、強いアニーリング活性を有することなどを明らかにした。また、相同的対合反応の中心酵素Rad51は、白血病細胞においてTyr315が恒常的にリン酸化されるが、そのTyr315がポリマー形成に重要で、なおかつ単鎖DNAに対する結合部位に含まれることを明らかにした。さらに、Rad51のホモログであるDmc1の立体構造解析に成功した。ヒトDmc1は、8量体のリング構造を基本とする16量体のダブルリング構造を形成していた。
ヌクレオチド除去修復反応の細胞内調節機構に関する研究

我々はこれまでDDB (DDB1/DDB2ヘテロダイマー)がヌクレオチド除去修復の促進因子として働くことを示してきたが、最近このDDBがユビキチン・プロテアソーム系にも関与することが示されており、本研究でもヌクレオチド修復の調節や修復以外におけるDDBの機能に視野を広げて解析を行った。具体的には、作製したDDB1特異的モノクローナル抗体を用いてDDB1の細胞内局在性を調べるとともに、DDB1とDDB2を各々ドキシサイクリン存在下で過剰発現する細胞株を樹立し、各サブユニットを過剰発現させたときの細胞への影響を検討した。その結果、抗DDB1モノクローナル抗体による免疫染色像は、主に細胞質に局在するという従来の過剰発現細胞を用いた報告とは異なり、核内でドット状の局在を示した。また、この染色像はDDB2遺伝子に変異をもつXP-E細胞、およびDDB2の発現が抑制されているチャイニーズハムスター細胞でも観察されることからDDB2に非依存的であることがわかり、他の因子の関与が考えられた。また、核の一部に局所紫外線照射を行うとこのドットはDNA損傷部位に集積し、この反応はDDB2に依存していた。一方、DDB1を過剰発現させた細胞ではドット状の染色像は見られず、多くは細胞質のみが強く均質に染色された。興味深いことに、このDDB1過剰発現細胞株は増殖能やコロニー形成能に著しい抑制が見られ、一部の細胞ではアポトーシス誘導が観察された。さらに、ヌクレオチド除去修復能には顕著な影響は認められなかったが、過剰発現時に細胞内のc-Jun量が顕著に増加し、またリン酸化体も増加していることがわかった。以上の結果より、DDB1がc-Junの活性調節およびアポトーシスにも関与する可能性が示唆された。本年度は、DDB(damaged-DNA binding protein)の機能に関する解析を中心に行い、以下のような成果を得た(文献3)。まず、p48サブユニットとp127サブユニットの各々のcDNAをpFASTBac1ベクターにサブクローニングし、リコンビナントバキュロウィルスを作製した。これをSf21昆虫細胞に共感染させ、そこからリコンビナントDDBヘテロダイマーをほぼ均一に精製した。シクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)、あるいは(6-4)光産物(6-4PP)を1箇所に含むDNAを基質とした試験管内修復反応を行い、DDBが切断効率に及ぼす影響について調べた。細胞粗抽出液にはDDB活性を欠損しているチャイニーズハムスターAA8細胞から調製したものを使用した。その結果、CPDの基質を用いたときにのみDDBによる切断効率の促進が見られた。さらに、ゲルシフト法を用いて各基質との結合性を調べたところ、これまでの報告どおり6-4PPに対して最も強い親和性を示したが、CPDに対してもコントロールより高い親和性が見られた。また、CPDの基質を用いて、他の修復因子と組み合わせてゲルシフトアッセイを行ったところ、XPAあるいはXPA+RPAと混合したときに複合体の形成が観察された。そこで、DDBとXPAとのタンパク間相互作用の可能性を考え、プルダウンアッセイを行った。その結果、両者の間に相互作用が確認され、主にp48との相互作用に依存していることが示された。以上の結果より、DDBはCPDに結合した後、XPAの損傷部位への導入を促し、その結果として修復効率を上昇させることが示唆された。近年、細胞レベルの実験からDDBはCPDのゲノム全体からの修復(GGR:global genomic repair)に働くことが示唆されており(Hwang et al,1999;Tang et al,2000)、本実験の結果はこのメカニズムを試験管内系で示したものと考える。今後は、DDBの促進作用に細胞粗抽出液中の未知因子が関与(介在)していないか、試験管内再構成系で確認する必要がある。また、このメカニズムが細胞レベルでも実証できるか調べる予定である。1)局所紫外線照射法を用いたヌクレオチド除去修復(NER)機構の解析直径8μmの穴があいたメンブレンフィルターを通して細胞に紫外線を照射することで核の一部にのみDNA損傷を誘起し、特異抗体で染色することにより、各基本NER因子の損傷部位への集積動態を詳細に検討した。その結果、XPAタンパクは正常ヒト細胞やXP-F細胞およびXP-G細胞で損傷部位への集積が見られたのに対し、XP-C細胞では全く見られず、XPAの損傷部位へのリクルートにXPCが必要であることが示唆された。また、THIIHのサブユニットであるXPBについても同様の実験を行ったところ、正常細胞、XP-A細胞、XP-F細胞、XP-G細胞で局在化が観察されたが、XP-C細胞では認められず、TFIIHの損傷部位へのリクルートにもXPCが要求され、XPA、XPF-ERCC1、XPGは必要ないことがわかった。一方、XPGやXPF-ERCC1では、XP-A細胞およびXP-C細胞で損傷部位への集積が見られなかったことから、これらのエンドヌクレアーゼのリクルートにはXPA、XPCともに必要であることが示された。以上の結果より、細胞内における基本NER因子の損傷部位への集合様式として、XPC-HR23B、TFIIH、XPA(+RPA)、XPG/XPF-ERCC1の順番があることが示唆された。2)DDBのヌクレオチド除去修復反応促進機能の解析

DNA損傷に対して高い親和性を示すDDB(damaged-DNA bindillg protein)のNER反応における機能の解析を行った。バキュロウィルス・昆虫細胞系で作製したリコンビナントDDBをシクロブタン型ピリミジンダイマーを特定部位に1個含むDNA基質を用いた試験管内修復系に添加すると、切断効率が顕著に上昇することを見いだした。また、6つの基本NER因子からなる試験管内再構成系においても同様の促進効果が見られたことから、DDBは基本NER因子に直接的に作用して切断効率を促進することが明らかとなった。また、先に用いた局所紫外線照射法を利用して、DDBが紫外線照射直後から損傷部位に集積してくること、またこの反応にはXPAやXPCが不要であることを明らかにした。これらの結果より、DDBはNERの極めて初期の段階で損傷認識の補助因子として働いていることが示唆された。1)紫外線誘発DNA損傷部位におけるヒストンH2AXリン酸化反応の解析局所紫外線照射法と蛍光免疫染色法を利用した解析系は、DNA修復関連因子のDNA損傷部位への集積様式を解析するのに有用であったが(昨年度報告)、本年度はこの系を応用して、紫外線誘発DNA損傷の生成部位におけるヒストンH2AXのリン酸化について検討した。これまで、電離放射線によるDNA二本鎖切断生成に伴うH2AXのリン酸化はよく知られていたが、局所紫外線照射後1530分程度から損傷部位特異的にH2AXのリン酸化が認められ、紫外線損傷によっても同じ反応が起きることが明らかとなった。また、この反応にはDNA合成期依存的なリン酸化と非依存的なリン酸化が存在し、前者はDNA複製装置が損傷部位で停止した後の相同組換え反応と関連するのに対し、後者はヌクレオチド除去修復反応に依存した反応であることが示唆された。2)DDBのヌクレオチド除去修復促進反応メカニズムの解析我々は、昨年度、DNA損傷に対して高い親和性を示すDDB(damaged-DNA binding protein)が、シクロブタン型ピリミジンダイマーを基質とした試験管内ヌクレオチド除去修復反応を顕著に促進することを明らかにしたが(Wakasugi et al.,2003)、本年度はこのDDBによる修復促進効果の作用メカニズムについて詳細に解析した。その結果、DDBはヌクレオチド除去修復の必須因子であるXPAと直接的に相互作用し、XPAの損傷DNAへの結合性を顕著に上昇させることを見出した。また、XPA上に存在するDDBとの相互作用部位を同定し、この部位に1アミノ酸置換型変異を導入することでDDBの修復促進作用が消失することを明らかにした。以上の結果より、DDBはXPAを損傷部位に効率的にリクルートすることで修復反応を促進することが示唆された。一方、ニワトリDT40細胞よりDDB1 cDNAをクローニングすることに成功し、アミノ酸配列レベルでヒトと97%という極めて高い相同性を示すことを明らかにした(Fu et al.,2003)。我々はこれまで、DDBがシクロブタン型ピリミジンダイマーの修復促進に働くことを試験管内修復反応系、および局所紫外線照射法を用いて示してきたが、本年度はその促進メカニズムについて解析を行い、以下の成果を得た。
科学的エビデンスに基づく，「課題探究型の説明」カリキュラムの開発と検証

本研究では,「課題探究型の説明」を,事柄の生成(構想/構成),説明の生成(構想/構成),評価・改善・発展及び三側面の相互作用による営みとして捉えた。次に,この捉えに基づいて,中学校数学の全4領域(「数と式」,「図形」,「関数」,「資料の活用」)において,その領域における説明の特性に基づいてカリキュラム開発枠組みを設定し,この枠組みに基づいて,学習指導要領に即して「内容ー活動対応表」を作成した。最後に,「内容ー活動対応表」に基づいて一連の授業を開発・実践し,カリキュラムの実現可能性を確かめ,今後の課題を特定した。【“課題探究型の説明"の概念】課題探究及び説明に関する先行研究に基づいて,“課題探究型の説明"をプロダクトではなく,探究のプロセスとして"課題探究として説明すること"と捉え直し,ことがらの生成,説明の生成,評価・改善・発展の三側面とこれらの相互作用からなる営みと概念規定した。【カリキュラムの構成原理の設定】カリキュラムのスコープをデザインするために,説明の生成に内在する,説明を構想すること及び説明を構成することに着目し,それぞれにレベルを理論的に設定した。次に,証明を構想すること/構成することの両者が未分化である学習レベルを考慮し,説明を構想するレベルと説明を構成するレベルとを組み合わせることによって,9つの学習レベルを設定した。最後に,カリキュラムのシーケンスをデザインするために,仮説的学習軌道(Simon, 1995)を理論的基盤として,構想が構成に先立つこと等に着目し,二段階の学習レベルの移行過程を定め,これをカリキュラムの構成原理とした。【意図される学習とその系列についての考察】学習レベルの移行過程を中学校数学全体で実現すること,そして,学習指導要領解説の内容の系統や配列を暫定的に用いることをカリキュラム開発の前提とすると,意図される学習とその系列について,第I期の移行過程を中学校第一学年で実現し,第II期の移行過程を中学校第二学年及び第三学年で実現することが必要となるが明らかとなった。■領域「図形」における「内容ー活動対応表」の作成■カリュラムの内容として,中学校学習指導要領解説数学編の「第2章目標及び内容第3節各学年の内容」に示された各学年の領域の項目とその順序を基本的に採用した。各内容において意図される諸活動をカリキュラムの構成原理に基づいて設定し系列化することによって,領域「図形」における「内容ー活動対応表」を作成した。■領域「数と式」における「内容ー活動対応表」の作成■領域「図形」と同様に,カリュラムの内容として,中学校学習指導要領解説数学編の「第2章目標及び内容第3節各学年の内容」に示された各学年の領域の項目とその順序を基本的に採用した。カリキュラムの構成原理については,我が国の中等学校数学科で意図されている「文字式による説明」に即して領域「図形」の構成原理を準用し,これに基づいて各内容において意図される諸活動を設定し系列化することによって,領域「数と式」における「内容ー活動対応表」を作成した。■領域「関数」における課題探究型の説明カリキュラムの構成原理の設定■数学的モデリング過程に基づいて,領域「関数」における課題探究として説明することの特性を明らかにするとともに,本領域における課題探究型の説明カリキュラムの構成原理の案を作成した。■領域「資料の活用」における課題探究型の説明カリキュラムの構成原理の設定■ToulminによるArgumentationの枠組みに基づいて,領域「資料の活用」における,課題探究として説明することの特性を明らかにするとともに,本領域における課題探究型の説明カリキュラムの構成原理の案を作成した。本研究では次のことを目的とする:中学校数学科の全領域(数と式,図形,関数,資料の活用)において,課題探究型「構想→実践→評価・改善」の説明カリキュラムを科学的エビデンス(全国学力・学習状況調査の結果等)に基づいて開発し,その効果を検証する。この目的を達成するために,本年度は次の実績を得た。【領域「数と式」の「内容ー活動対応表」に基づく授業化】領域「数と式」の「内容ー活動対応表」において,昨年度までに授業化していない内容及び活動について,中学校教員と連携し学習指導案及びワークシートを作成し,授業を実践し,データを収集した。【領域「図形」の「内容ー活動対応表」に基づく授業化】領域「図形」の「内容ー活動対応表」において,昨年度までに授業化していない内容及び活動について,中学校教員と連携し学習指導案及びワークシートを作成し,授業を実践し,データを収集した。【領域「関数」におけるカリキュラム開発枠組みの構築】前年度作成された課題探究型の説明カリキュラムの構成原理の案に基づいて,領域「関数」における説明の現状を実証的に捉えるとともに,カリキュラム開発の規範的な枠組みを構築した。【領域「資料の活用」におけるカリキュラム開発枠組みの構築】前年度作成された課題探究型の説明カリキュラムの構成原理の案に基づいて,領域「資料の活用」における説明の現状を実証的に捉えるとともに,カリキュラム開発の規範的な枠組みを構築した。本研究では次のことを目的とする:中学校数学科の全領域(数と式,図形,関数,資料の活用)において,課題探究型「構想→実践→評価・改善」の説明カリキュラムを科学的エビデンスに基づいて開発し,その効果として授業としての実現可能性を検証する。■領域「数と式」:「

内容ー活動対応表」に基づき,中学校教員と連携し学習指導案及びワークシートを作成し,一連の授業を実践することにより,カリキュラムの実現可能性を検証することができた。また,授業化を通じてカリキュラム開発枠組みを改善するとともに,それに応じて,「内容ー活動対応表」を修正した。,■領域「図形」:「内容ー活動対応表」に基づき,中学校教員と連携し学習指導案及びワークシートを作成し,一連の授業を実践することにより,カリキュラムの実現可能性を検証することができた。■領域「関数」:内容ー活動対応表」に基づき,中学校教員と連携し学習指導案及びワークシートを作成し,一連の授業を実践することにより,カリキュラムの実現可能性を検証することができた。■領域「資料の活用」:内容ー活動対応表」に基づき,中学校教員と連携し学習指導案及びワークシートを作成し,一連の授業を実践することにより,カリキュラムの実現可能性を検証することができた。本研究では,「課題探究型の説明」を,事柄の生成(構想/構成),説明の生成(構想/構成),評価・改善・発展及び三側面の相互作用による営みとして捉えた。次に,この捉えに基づいて,中学校数学の全4領域(「数と式」,「図形」,「関数」,「資料の活用」)において,その領域における説明の特性に基づいてカリキュラム開発枠組みを設定し,この枠組みに基づいて,学習指導要領に即して「内容ー活動対応表」を作成した。最後に,「内容ー活動対応表」に基づいて一連の授業を開発・実践し,カリキュラムの実現可能性を確かめ,今後の課題を特定した。研究実施計画で予定された下記の内容について前者2件については十分達成でき,後者2件については概ね達成できたため,前記のように判断した。■領域「数と式」の「内容ー活動対応表」に基づく授業化■領域「図形」の「内容ー活動対応表」に基づく授業化■領域「関数」における「内容活動対応表」の作成■領域「資料の活用」における「内容ー活動対応表」の作成27年度が最終年度であるため、記入しない。数学■領域「数と式」:「内容ー活動対応表」に基づく評価問題等の作成及び授業化■領域「図形」:「内容ー活動対応表」に基づく評価問題等の作成及び授業化■領域「関数」:「内容ー活動対応表」の作成及び授業化■領域「資料の活用」:「内容ー活動対応表」の作成及び授業化平成24年度の研究計画のうち,次の2点が平成24年度内に達成された。・課題探究及び説明に関する先行研究に基づいて“課題探究型の説明"の概念を規定する。・規定された証明の概念に基づいてカリキュラムの構成原理を定める。一方,平成24年度の研究計画のうち,次の点については解決の方法が理論的に明らかにされ,解決の実現は次年度に持ち越された:「領域「図形」について,カリキュラム構成原理に基づいて中学校各学年の目標,内容,活動等及びそれらの配列を定める」。研究実施計画で予定された下記の内容についておおむね達成できたため,前記のように判断した。
食、農、暮らしの再編とむらの女性力についての社会学的研究

本研究では、暮らしの中に埋もれた女性力を掘り起こすことを通して、戦後の農業・農村発展史の中に女性を位置付けた。戦後に地域農業や農村社会が劇的に変化した際、女性は男性同様に土木作業に従事するなど地域発展を下支えし、社会的な変化に柔軟に対応することで自家農業の発展を指向し、食をはじめとする日々の暮らしを成り立たせた。稲作の機械化初期段階から大型化までの男女の農作業の変化を詳らかにしたことで、機械導入の初期において女性の作業が重労働化したこと、女性が稲作農業の技術から切り離された経緯や稲作から退去した端緒も明らかにすることができた。本研究の目的は、戦後の農山漁村社会の変化に関する研究において、もっとも明らかにされていない日常の暮らしのなかにある女性力の解明にある。というのも、戦後の農山村地域における発展の一翼を担った土地改良事業および稲作農業の機械化一貫体系の成立の背後にある農村の女性力の把握と意義を明らかにすることは、今後の地域再生や地域づくりを展望するにあたり必要不可欠だからである。今年度は、滋賀県琵琶湖周辺部の農村においてヒアリング調査をおこなうことで、稲作農業の機械化以前の役畜労働および機械化初期における女性と男性の農作業の詳細について実態把握を進めたと同時に、文献の収集および資料の発掘に努めた。当時の農村女性たちがどのようなネットワークを利用することで土地改良事業の土木工事に参入したのか、そしてそのような女性のネットワークと役畜の共同利用グループに関連があるのかについても調査を進めた。数多くの事例を聞き取り資料を収集することができたことで、技術発展におけるジェンダーを多面的に考察する端緒を掴むことができた。また、食の変化と圃場整備や灌漑の近代化、農業の機械化との関連を検討するための調査も予定通り進めることができ、数多くのデータを収集することができた。これらの成果の一部は日本村落研究学会西日本支部会において報告をおこなった。本研究の目的は、戦後から高度経済成長期における農山漁村社会に関する研究のなかで、これまで検討が不十分であった日常の暮らしのなかにある女性力を解明することである。戦後から高度経済成長期にかけて発揮された女性力の実態把握とその意義を明らかにすることは、現在の地域社会を検討するためにも、また、今後の農山漁村における地域づくりを展望するためにも必要不可欠である。戦後の農山漁村社会の変革期における女性力に関連する調査データや資料を数多く発掘し、初歩的な検討を加えた。検討の結果、第1に、当時の公共事業や経済成長といった大きな社会変化の背後で、女性力は暮らしの中に埋もれていたが、村落社会や家族の技術や適応力、調整力といった様々な側面で重要な機能を果たしてきたことが明らかにされた。第2に、居住集落の外部に広がる女性のネットワークが、役畜の共同所有にも起源を持ち、その後の機械化初期の共同所有や機械作業の受委託にも影響を及ぼしたことを明らかにした。本研究は、このように戦後の地域発展を支えた女性力の諸相を具体的に描き出すとともに、女性力を農業発展史や農山漁村の発展史の中核に位置づけることを試みている。女性力の検討を研究の軸に据えることによって、食、農、地域社会の再編を暮らしの側面から深く検討するとともに、多様な生活者が地域社会の暮らしを豊かにしてきたことを実証しつつある。これらの成果の一部は論文としてとりまとめた。昨年同様にヒアリング調査をおこなうと同時に、これまで収集した資料をデータ化しながら調査と研究を進めた。また同時に農業、漁業センサスのデータ分析をおこない、事例と照合することで調査対象集落の特徴や社会背景を明らかにした。女性の労働や活動が地域社会や自営農業の発展を下支えしたことを実証し、その意義を位置づけた。それらの一部は、論文「滋賀におけるおかず漁ー女性と男性の違いに注目してー」、「稲作農業の機械化と女性農業労働の変化」としてまとめた。上記のとおり交付申請書に記載した研究実施計画の各事項について概ね順調に進展している。本年度は研究総括に向けて、滋賀を中心に新潟、高知、岡山において補足インタビューを実施し、農村の暮らしのなかにある女性力について考察を深めた。昨年から今年度にかけての調査では、稲作の機械化初期段階における農作業の変化を詳らかにしたことにより、女性の農作業が機械の導入期に重労働化したことを明らかにした。小型のコンバインや田植え機が導入されたとき、女性たちは機械操作をはじめとする新しい技術体系とは無縁の周辺的な雑労働を担ったのである。機械が導入されたことで作業全体は機械の作業速度を重視したものに再編され、その際に女性たちは機械の速度に合わせて作業することを要求されたのである。この時期に女性が担った農作業の内容を解明したことで、機械の導入期から大型化が完結するまでの間に発揮された女性力が多大であったことを明らかにでき、また、機械が大型化された際に女性が稲作農業から離れた背景や端緒もとらえることができた。戦後の農業発展を支えた農業機械化の初期段階で発揮された女性力は顕著であり、この調査研究の成果は滋賀大学環境総合研究センターの年報に論文として投稿し、琵琶湖博物館の研究セミナーにおいても報告を行った。これにより、稲作農業機械化の背後にあった農村の女性力を、農業発展史のなかに位置付けることができると考える。また、農業の機械化と女性の労働再編によりもたらされた食の変化についても、インタビュー調査を行うと同時に、滋賀の食事文化研究会の協力を得て考察を進めた。

その結果、圃場整備や灌漑の近代化と相前後して姿を消した採取食や保存食と女性とのかかわりを解明することができた。採取にまつわる女性の知恵や技術に関する考察については、論文として滋賀の食事文化研究会の年報に発表した。本研究では、暮らしの中に埋もれた女性力を掘り起こすことを通して、戦後の農業・農村発展史の中に女性を位置付けた。戦後に地域農業や農村社会が劇的に変化した際、女性は男性同様に土木作業に従事するなど地域発展を下支えし、社会的な変化に柔軟に対応することで自家農業の発展を指向し、食をはじめとする日々の暮らしを成り立たせた。稲作の機械化初期段階から大型化までの男女の農作業の変化を詳らかにしたことで、機械導入の初期において女性の作業が重労働化したこと、女性が稲作農業の技術から切り離された経緯や稲作から退去した端緒も明らかにすることができた。今年度は農山漁村集落における高齢女性たちへのヒアリング調査を重点的におこなった。研究実施計画の通り、4月から7月は滋賀県の琵琶湖沿岸部の複数集落において集落調査をおこなった。また、長期の休みには瀬戸内海沿岸の島である男木島でも調査を実施した。滋賀県で昭和30、40年代に実施された土地改良事業において、女性の土木工事への労働参入がどの程度存在したのかに関する調査を予定通り実施した。またその際には、役畜利用における女性ネットワークに関する実態調査も進めた。これにより当時の農村女性たちが従事した労働の内容をかなり明らかにすることができた。また、女性の農業労働の内容変化と食の変化との関係を明らかにするために、滋賀県の琵琶湖沿岸部における水田漁労に関する聞き取り調査も実施した。この調査により、滋賀県における水田漁労の実態とジェンダー関係、および、稲作農業の機械化後に女性の漁労が変化したことが明らかになった。これらの結果の一部は、日本村落研究学会西日本支部会において発表した。上記の通り、交付申請書に記載した各事項について概ね予定通り順調に進展している。今年度は、補足調査をおこないながら三年間の研究成果を取りまとめる。これまでの調査で得られた女性力にまつわる情報を分析し、地域的特徴を析出する。地域類型ごとに女性力の内容やその違いを明らかにし、女性力の意義を村落社会のなかに位置づける。さらに、データは地理的情報システムを活用して地図化することで、多面的な女性力を可視化する。社会の変革期に発揮された女性力が地域社会や自営農林漁業の再編に与えた意味や重要性についてさらに深く考察する。それらの成果は学会や研究会で報告をおこなうと同時に学術誌へも投稿する。農村社会学2015年は、さらに資料と事例を充実させるために、昨年予備調査をおこなった新潟県十日町市および瀬戸内海の島においてフィールド調査を進め、同時に、滋賀県においても昨年同様にヒアリング調査を実施する。それにより平地農村部と山間地農村部における女性力の内容やその違い、また、漁村における女性力の内容や意義を明らかにすることができると考えている。他方で、現在までのヒアリングのデータを整理・資料化し、文献を読み込むことで分析枠組みの構築にも着手する予定である。成果は機会を見つけて随時発表する予定であるが、27年も日本村落研究学会で報告をおこなう予定である。
喘息の気道リモデリング抑制に有用なアロマテラピー精油の探索と分子メカニズムの解明

気管支喘息は咳、喘鳴、息苦しさなど日常生活に大きく支障をきたすため、慢性化へ移行を防ぐことは社会的にも重要である。慢性化した喘息では気道構造の変化(リモデリング)がみられ、喘息の長期化・難治化へとつながる。今回、精油の作用を気道リモデリングでみられる粘液産生および組織の線維化に着目して検討を行う。本研究によって、喘息管理における精油の長期的な効果、すなわち抗リモデリング作用を明らかにする。
スマートシステムやスマートサービスにおけるイノベーションシステムの国際比較分析

ICTや先端技術をベースとしたスマートサービスやシステムに着目し、イノベーションを興すダイナミズムや技術経営戦略について理論、実証の両側面から重層的に分析し日亜欧諸国の事例を元に検証した。科学技術政策論、技術経営論、技術経済論、情報通信政策論などの学際的手法を軸に、異なる国、セクター、企業、機関、プロジェクトを対象にマクロ、メゾ、ミクロレベルにおいて、新しい指標や方策を開発し、スマートシステムやスマートサービスイノベーションに影響を与える要因の分析・検証を行った。学際的に実施された分析結果を元に総合分析を実施し、総合戦略を構築した。その上で最適サービスイノベーションシステム形成パスを見出した。既存関連研究をレビューし、総合的分析方法、研究のスコープ、リサーチクエスチョン、データ構築の課程や仮設を確立した。スマートサービスイノベーションシステムの課題、スコープ、実証分析対象プロジェクト、分析すべき技術経営課題を確定し、予備分析を実施した。韓国のB2Bモバイルサービスにおけるイノベーションのダイナミクスと解明し、新しいB2Bサービスイノベーションモデルを構築した。242のモバイルサービスのデータからいかにイノベーションダイナミクスが進化し、どのような要因がモバイルサービスイノベーションに影響を与えるか明らかにした。技術とサービスの観点から分析した結果、2つ以上のサービスが結合しておきるイノベーションや新規モバイルサービスにユーザの活発な参加が引き起こすイノベーションなど、異なる6種類のイノベーションタイプを明らかにした。(論文に掲載され、PTC国際会議で発表)日本の携帯電話向け音楽サービスを題材にして、それぞれの世代に参画していたプレーヤの役割、プレーヤ間で取引されたものを定義することで形成されたバリューネットワーク分析を実施し日本の携帯電話メーカが競争力を失っていった過程を分析した。(米国で開催されたPICMETで発表)新技術の実用化・事業化の直前、または直後の新しい技術を対象に、事業化の阻害要因を克服・回避し、事業化を実現・推進するための実効的な新技術による事業化プロセスのモデル化を図った。(MOT学会誌に掲載済)中国における電気自動車の発展、技術の進化過程について論文データを元に分析した。(アジアのMOTの国際会議ASIALICSで発表)スマートグリッドの初期段階の普及に関する情報収集を行い、Sussex大学(SPRU)のエネルギー分野の研究者と意見交換を行った。ビッグデータを使った医療分野向けのスマートサービスに関する予備調査を開始した。インターネットをベースとしたNGNサービスによるパラダイムシフトに対応するたに、NTTが新たにサービスアプリケーション層の技術競争力を構築し、ネットワーク層の競争力との融合を図った技術戦略の過程について実証分析を行い、韓国で行われた国際会議ASIALICSで発表し、また論文がジャーナルに受理された。台湾のICデザインサービス企業が戦略的提携により、エコシステムを形成している過程について、ケーススタディーを行い、技術経営の国際会議PICMETで発表した。中国の電気自動車産業における技術軌道、進化について論文データを元に実証分析を行い、PICMETで発表した。新興技術を事業化し、イノベーティブな製品・サービスを提供していく上でユーザーからの要求課題を分析し、パートナーの連携等について探索する過程について、実証分析を行い、ジャーナルに掲載された。スマートハウスの初期段階の普及について、日独における標準化戦略と技術戦略に焦点を当て、我が国ではスマートハウス事業を推進するためのエコーネットを、ドイツではKNXアソシエーションを比較対象として日独でヒアリングを行い分析を行った。また、4か所で進行中のスマートコミュニティーの国家プロジェクトを対象にヒアリング調査を行った。クラウドサービス提供者がビッグデータを利用して行く過程で知識コンバージェンスが起きて行くプロセスについて計量書誌分析をベースに実証研究を行い、マレーシアのクラウドサービス提供者に、新しく生まれる機会について提言を行った。知識コンバージェンスを分析する上でビッグデータに関連したキーワードを抽出する手法を開発し、韓国で開催された国際会議で発表し、最優秀学生論文賞を受賞した。また、放送サービス提供者がいかにビッグデータを利用し始めているのか、研究を行う上でリサーチプランを作成した。電気自動車EV分野における技術革新に焦点を当て、技術変化と学習効果の関連性に関する複雑な事象を対象に、その軌道を識別するオリジナルなダイナミックな測定方法を、特許の計量書誌学的調査方法をベースに開発し、海外のジャーナルに受理された。また、技術能力チェーンという概念を提案した上で、中国における先端企業がEV分野に参入し、技術競争力を短期間で蓄積して行ったキャッチアップ戦略について事例研究を行い、米国で行われた技術経営の国際会議PICMETで発表した。クラウドコンピューティングとビッグデータの知識のコンバージェンスが起きるメカニズムを解明する計量書誌学的手法を開発した。その上でマレーシアにおけるクラウドサービスの特徴について分析し、ビッグデータを活用する事による新しい機会の創出についてサービス提供者に提言をし、国際会議PICMETで発表した。ビッグデータの利活用により、公共サービスで起きているイノベーションに焦点をあて放送サービスイノベーションが起きる経緯について放送サービスのバリューチェーンを元に、ビッグデータの4Vとの関連性について仮設を立てNHKと英国のBBCで進行中の6つのプロジェクトを対象に比較分析を行い、アジアで開催されASIALICSというMOTの国際会議で発表した。日本とドイツにおけるスマートハウスに関する標準であるエコーネットとKNXを対象とし、スマートハウスの普及にかかわる、異なる主体(関連機器メーカ、政府、標準化団体)を対象に、ヒアリングを元に、スマートハウスの普及を妨げる要因や日独の標準戦略の強み、弱みなどについて分析し、ASIALICSで発表し、海外のジャーナルに受理された。台湾のICデザインサービス企業が戦略的提携によりエコシステムを形成している過程についてケーススタディーを行い、研究成果は海外の一流ジャーナルに掲載された。

米国で開催されたMOT分野の国際会議PICMETやアジアの技術経営や技術政策の国際会議ASIALICSを含む国際会議で9回発表を行った。(2016 9月にはPICMETで2本発表する予定である。)また、海外の一流ジャーナルにも6本(受理を含み)掲載され、研究はおおむね順調に進展したと言える。しかしながら3年目に完全に終了しなかった理由は主に3点あげられる。東工大で大規模な組織(及び教育)改革が平成28年4月に行われ、その準備で多忙であった。放送大学で2017年に開講される「技術経営の考え方」という講座の主任講師(放送大学の客員教授)となり、講座で使われる15章から成る教材テキストの執筆作業に予想以上時間を割すことになった。また、当初予期していなかった文部省からの依頼で2015年12月から「もんじゅのあり方の検討会」の有識者として委員になり、時間を割くことになった。1発展段階にあるスマートグリッドを対象に、1961-2014年における発展過程を分析する上で、スマートグリッドを構成している技術群の技術進化、技術クラスターの形成について、日欧米の特許を活用した新たな手法を開発し、米国の国際会議PICMETで発表した。その結果、スマートグリッドを構成している技術群には5つのクラスターが存在し、特に3つのクラスターを中心にイノベーションが起き、技術進化の軌跡が明らかになった。2電力事業者、IT企業等様々なアクターが関わっているスマートグリッドおける技術的学習、ビジネスモデルのイノベーションについて、国家的デモンストレーションプロジェクトに参加している企業を対象に実証分析を行い、アジアで毎年開催されるMOTの国際会議ASIALICSで発表した。その結果、価値創造(Value creation)、価値獲得(Value capture)の観点から3種類のビジネスモデルを明らかにし、またスマートグリッド分野に新規参入しているICT(情報通信)企業が重要な役割を果たしていることを見出した。3ビッグデータの利活用により、放送サービスがイノベーションによりスマート化している過程に焦点を当て、NHKと英国のBBCを対象に比較分析を行い、その結果をイギリスで行われたSussex大学SPRU科学政策研究所50周年記念会議で発表した。ビッグデータ価値チェーンと放送業者の価値チェーンの関係を分析する新たな手法を開発し、NHKとBBCで進行中のプロジェクトを対象に展開し、ビッグデータを活用する上で、新たに創造されるサービスの特徴を明らかにした。
マイクロバイオデバイスを評価するための高解像度電気化学顕微鏡の開発

本研究の目的は、マイクロデバイスの性能・機能を正確に評価するために、走査型電気化学顕微鏡(Scanning Electrochemical Microscope, SECM)をベースとし、さらに走査型近接場光顕微鏡(Near-Field Scanning Optical Microscope, NSOM)をハイブリッド化したシステムを構築することにある。SECMの解像度を大幅に向上させ、ナノメートル領域でのバイオイメージングを可能とするため新たな距離制御機構を取り入れたシステムを構築する。また、NSOMと融合したハイブリッドシステムを構築しマイクロデバイスの定量的評価を行うことを目的に、1.ナノメートルサイズのプローブ電極の作製法、2.ShearingForceを用いた試料-プローブ間距離のナノメートル制御、3.SECMとNSOMとの融合によるマイクロバイオデバイスの評価、の課題を重点的に検討した。これにより、検出系の高性能化とデバイス基板のインテリジェンス化の両面からシステムの性能向上が実現した。具体的な研究成果を以下に挙げる。1.構築した測定システムを用いて、細胞デバイスのイメージングおよび定量解析を行った。プログラム、フィードバック系を改良し、倒立顕微鏡ステージ上にて培養したまま細胞機能計測を実施可能なシステムを構築した。2.半径=100nmの電極を作製した。電極絶縁部を含むプローブ自体のスケールダウンが実現したことにより、Shearing forceによる距離制御で得られる形状イメージングの空間分解能を飛躍的に向上することができた。3.コラーゲンゲル包埋型の細胞・微生物チップに加え、低融点アガロースにより微生物をチップ上に固定化した。さらに、貫通型シリコン基板やポリジメチルシロキサン(PDMS)流路と組合わせることにより、チップ上での大腸菌形質転換や、変異原物質・内分泌撹乱物質の暴露が可能なマイクロデバイスを開発した。本研究は、マイクロバイオデバイスの性能・機能を正確に評価するために、走査型電気化学顕微鏡(SECM)をベースとし、さらに走査型近接場光学顕微鏡(SNOM)をハイブリッド化したシステムの構築を目指している.本年度は、SECMをマイクロバイオデバイスの定量的評価に用いるために、ナノメートルの解像度を有する新しいシステムの開発を試みた.具体的には、(1)ナノメートルサイズのプローブ電極の作製、(2)せん断応力(shearing force)を用いた試料-探針間の距離制御、(3)SECMとSNOMの融合によるマイクロデバイスの評価を実施に関して基礎的・予備的な検討を行った.(1)ナノ電極プローブの作製を実施し、半径300nmの電極を作製した.プローブとして従来の白金微小電極以外にカーボンファイバー電極や、光ファイバー型電極を試作した.(2)Shearing forceによる距離制御により(1)で作製したプローブで安定な形状イメージングの取得に成功した.また、透過光と形状の同時イメージングも行った.今後、さらにプローブ形をナノメートルサイズまでスケールダウンすることにより近接場光イメージングの取得を目指す.(3)ナノニクスNSOM-100を用いて、GFP発現大腸菌の近接場光と形状の同時イメージングを実施した.GFP発現大腸菌からプラスミドを単離し、SNOMイメージングを検討した.蛍光色素をインターカレートしたDNAをmica基板上に分散し、プローブ顕微鏡観測に適した試料調整の条件検討を行った.Mica表面をMg2+などの2価カチオンで処理することにより、DNAの基板への結合を制御できることが確認できた.本研究は、マイクロバイオデバイスの性能・機能を正確に評価するために、走査型電気化学顕微鏡(SECM)をベースとし、さらに走査型近接場光学顕微鏡(SNOM)をハイブリッド化したシステムの構築を目指している。本年度は、SECMをマイクロバイオデバイスの定量的評価に用いるために、検出系の高性能化とデバイスの基板のインテリジェンス化の両面から検討を行った.具体的には、(1)改良型ナノ電極プローブによる空間分解能の向上(2)プローブ顕微鏡を用いた生体分子のナノパターニング技術の検討