hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨芽細胞および軟骨細胞の分化におけるホメオボックス遺伝子のMsxの作用機構の研究

2添加培地で培養し、骨芽細胞への誘導を行ったが、野生型に比べ、Msx2欠損およびMsx1・Msx2両遺伝子欠損の骨芽細胞様細胞株あるいは間葉系細胞株では骨芽細胞への分化が障害されていた。軟骨細胞の分化におけるMsx1およびMsx2とSox9の関係を解明するため、Msx1、Msx2ノックアウトマウス、およびMsx1・Msx2タプルノックアウトマウスの軟骨でのSox9の発現を調べたが、いずれのマウスでも野生型と比べて差はなく、Sox9は、Msx1およびMsx2により転写調節を受けないと考えられた。Msx1欠損、Msx2欠損、およびMsx1・Msx2欠損細胞株を継代培養を25-35回繰り返すことにより樹立した。未分化間葉系細胞株は胎生14.5日のMsx1ノックアウトマウス、Msx2ノックアウトマウス、およびMsx1・Msx2ダブルノックアウトマウス体幹から、骨芽細胞様細胞株は胎生18.5日のMsx1ノックアウトマウス、Msx2ノックアウトマウスの頭蓋骨および胎生14.5日のMsx1・Msx2ダブルノックアウトマウス下顎由来である。各々のALP活性、parathyroid hormone(PTH)応答性cAMP産生量を調べた。未分化な間葉系細胞株C3H10T1/2および骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1にBMP-2を添加して培養し、骨芽細胞に分化するまでのMsx1およびMsx2の発現量の変化をNorthern blotにより調べたが、これらの細胞株ではMsx1およびMsx2はすでに発現しており、BMP-2添加しても発現の増加は認められなかった。Msx1欠損、Msx2欠損、およびMsx1・Msx2欠損の間葉系細胞株および骨芽細胞様細胞株にBMP-2を添加して培養し、骨芽細胞への分化能を調べたが、いずれの細胞株でもコントロールに比較して分化能が低下していた。野生型細胞株(C3H10T1/2およびMC3T3-E1)にMsx1、Msx2を過剰発現させたが、骨芽細胞へ分化誘導されなかった。Msx1欠損、Msx2欠損、およびMsx1・Msx2欠損株にMsx1、Msx2を過剰発現させてBMP-2を添加すると骨芽細胞への分化能が回復した。Msx1、Msx2蛋白とSox9蛋白の結合性を酵母のtwo-hybrid system法により調べたが、結合性は認められなかった。
視覚情報の知能的マルチモーダル補償システムの開発に関する研究

ユニバーサルデザインを実現したいデザイナーを支援する新しい色補償システムを開発した。本システムによって、色画像情報を色覚正常者(3色覚者)における色カテゴリーを変化させることなく、色覚異常者や高齢者等にも見やすく配色に自動的に変換できる。被験者評価実験の結果から、本システムの有効性が示された。また、視覚(輝度・距離)情報を音の振幅・周波数・呈示時間等に変換することを試みた。評価実験の結果、音情報から輝度や距離の視覚情報を推定でき、音による視覚情報の補償の有効性が示された。さらに、新たなハプティックデバイスを用いた空間認識システムを開発し、距離情報や物体形状を触覚情報に変換できることを示した。高齢者・色覚異常者・ロービジョン(弱視)者に日常生活を支障なく過ごせるよう環境の視覚情報を知能的に補償するマルチモーダルシステムを実現するために、平成23年度は高齢者と色覚異常者にとっての問題箇所を総括して若年色覚正常者に「見やすく」する可視化技術を開発し、シミュレーション画像を見るだけで問題箇所が容易に把握できるシステムを開発した。また、若年色覚正常者も含めて最適な配色を知能的に探索する補償システムを試作した。その際、カメラやディスプレイの正確な分光測色および環境の分光反射率を取得するために、ハイパースペクトルカメラを使用した。高齢者・色覚異常の視覚特性とそのメカニズムをモデル化・定式化し、その逆変換による補償を手始めに、視覚情報をどのように変換し、適切な付加情報を与えれば、各視覚特性を有する人々に対して適切な補償が行なえるかを実際の被験者を用いていくつかの心理物理学実験を行い、その結果を定量的に解析した。各問題箇所の出力結果を、カテゴリカル色認識特性等を考慮して適切に変換することで、高齢者や色覚異常者の視覚情報を補償するシステムを実現した。次に、非健常者である白内障患者の特性も定式化することで、その逆変換を定式化し、画像補償システムに導入した。また白内障のレベルを制御する技術も確立した。これらは、今後ロービジョン者の特性を考慮する際の基礎的な知見となる。また、HMDとカメラを用いて、フィールドワークも可能な視覚シミュレーション・補償システムを試作した。以上のことから、ある程度視覚情報を取得できるすべての人々に対して、環境の視覚情報をより見やすくする知能的配色補償システムが実現可能であることを示した。加齢で劣化した視覚特性を有する高齢者には適切な画像補正を施し、色覚異常者には色情報を変換するとともに文字や図形情報を視聴覚的に付加し、また視力が著しく低下したロービジョン者等の視覚障がい者には材質の質感まで含む視覚情報を補完するための聴覚・触覚情報を付加することで、日常生活を支障なく過ごせるよう環境の視覚情報を知能的に補償するマルチモーダルシステムを開発するために、高齢者や色覚異常者の各視覚特性を測定・定式化するとともに、ロービジョン者の視覚補償のために視・聴・触覚間の相互作用も解明・定式化し、補償効果の定量的評価法を提案した。ロービジョン者等の視覚障がい者に対して、2次元画像あるいは3次元空間の形状情報を効率よく音情報に変換して出力するシステムを試作し、視覚健常者への情報伝達ツールとしての有効性についても併せて検討した。具体的には、音響呈示パターンやタイミング等を変化させた条件間で有効性を測定・比較し、適切なパラメータを取得した。また、視覚情報を触覚情報で補償するシステムを開発し、その有効性を実験によって検証した。この特性は個人差が大きいことが判明したため、パラメータ値の共通化手法について検討した。さらに、視覚情報の補正技術の一般化・精緻化を図り、ユニバーサルデザインツールの性能向上も実現した。高齢者・色覚異常者・ロービジョン者に日常生活を支障なく過ごせるよう環境の視覚情報を知能的に補償するマルチモーダル画像表示システムを実現するために、平成24年度は高齢者と色覚異常者にとっての問題箇所を若年色覚正常者も含めて最適な配色に知能的に補償する視覚呈示システムの改良と理論的解析を進めた。色情報カテゴリカル基本色領域に割り当て、その領域内で色変換を行うことで、元画像の配色を大きく変えずに視認性を向上させた。また、適切な補償が行なえているかを、実際に被験者を用いていくつかの心理物理学実験を行い、検証した。その結果、本補償の有効性を確認できた。次に、聴覚情報を用いた視覚情報の補償を実現するために、3次元音源制御システムを試作し、その有効性を実験的に検討した。音情報の動きや高低によって環境空間情報を呈示できることを示した。また、受動的に聴覚情報を受け取るパッシブシステムに加え、操作者が欲しい情報を手や指等で示すことで得られるアクティブシステムも有効であることも示された。

さらに、触覚呈示システムによる視覚情報の補償方法について、いくつかの手法を提案・検討した。その1つとして、空間を手でスキャンしながら適時必要な情報を触覚で与えることが可能なアクティブシステムを開発し、その有効性を示した。またこれらのマルチモーダル視覚情報補償システムは、視覚障がい者だけでなく、若年健常者にも情報呈示を補助するシステムの有効が重要であることも示唆された。平成23年度の研究実施計画の内容をほぼ実施できた。コンテンツ処理技術の開発は今度行う予定である一方、HMDを用いたシステムは前倒しで実現した。25年度が最終年度であるため、記入しない。視覚補償システムの最適化を当初よりも時間をかけて進めたため、聴覚補償システムの開発がやや遅れている。しかしながら、並列的に触覚補償システムの開発を前倒しで進めており、総合的にはおおむね順調に進展している。ロービジョン者にも対応できるよう聴覚ならびに触覚を用いたマルチモーダルシステムの開発を推進する。また、複雑なコンテンツ等にも適用できるよう、補償アルゴリズムのロバスト化も推進する。聴覚ならびに触覚を用いた視覚情報のマルチモーダル補償システムの開発を推進し、試作機を完成させるとともに、被験者を用いた評価実験を行う。また、様々な場面においてシステムを適用できるよう、ハードウェアならびにアルゴリズムの改良を進める。具体的には、視覚情報から知能的に最適な聴覚・食感情報を生成する手法について検討し、視覚障がい者だけでなく、健常者にも有効なシステムの実現を目指す。
純国産ゲノム編集技術を基軸とした薬用キノコ霊芝の機能性ビルドアップ研究

昨年に引き続き、霊芝の細胞融合・ゲノム編集を効率的に行うための扱い易いプロトプラスト作成に向けての検討を行った。これまでの研究で、形質転換に用いるプロトプラストの性状が形質転換効率に影響することが示唆されたため、本年度は作出したプロトプラストをセルソーターにより分画した。その結果、異なるサイズのプロトプラストを得ることに成功した。また、我々はこれまでに、トリテルペノイド以外の霊芝二次代謝産物であるβ-グルカン合成に関わる遺伝子の探索を行った。このβ-グルカン合成遺伝子をPPRモチーフによるゲノム編集技術を用いてノックアウトすることでトリテルペノイド産生が増加する可能性が考えられる。霊芝(Ganoderma lingzhi)に含まれるトリテルペノイドおよび多糖は、その薬効成分に寄与する主要な生理活性成分である。本研究では、G. lingzhiに含まれるトリテルペノイドの網羅的な分析条件の検討を行った。2017年度は標準品を用いた定量方法を確立し、生育ステージ毎の18種類のトリテルペノイド類を定量した。本年度は質量分析に基づく生育段階におけるG. lingzhiのノンターゲットメタボロミクス分析の方法を検討した。検出された42のピークのうち、26のピークを同定した。そのうち9のピークは標準品より同定し、17のピークは本研究により得られたマススペクトルの開裂と既報の結果から化学構造を推定した。各ピークのピーク面積を比較し、半定量が可能な分析方法を確立した。本結果は今後ゲノム編集によってトリテルペノイド生産能力の高い霊芝を作出した後に、ゲノム編集されていない霊芝と比較してどのような種類のトリテルペノイドが増加しているかを確認するために有効な手段となる。。これまで霊芝のプロトプラスト作出を行ってきたがその作出効率は低く、また、作出したプロトプラストを用いて形質転換を行っても、その形質転換効率も低かった。そこで、プロトプラストの性状が形質転換効率に関係している事が示唆されたため、セルソーターを用いてプロトプラストをサイズによって分画することに成功した。さらにゲノム編集のターゲットとなるβ-グルカン合成遺伝子の探索を終了している。また、PPRもチーフによるゲノム編集を進めるとともに、トリテルペノイド生合成に重要であると考えられる遺伝子を高発現ベクターに組込むための、ターゲット遺伝子の探索も同時に行っている。一方、霊芝トリテルペノイドの網羅的解析方法については、質量分析に基づく生育段階におけるG. lingzhiのノンターゲットメタボロミクス分析の方法を検討した。検出された42のピークのうち、9のピークは標準品より同定し、17のピークは本研究により得られたマススペクトルの開裂と既報の結果から化学構造を推定することができた。さらに各ピークのピーク面積を比較することで、半定量が可能な分析方法を確立することに成功している。霊芝には霊芝トリテルペノイド以外の二次代謝産物としてβ-グルカンがある。そこで霊芝ゲノムに存在するβ-グルカン生合成遺伝子をPPRもチーフを用いたゲノム編集技術を用いてノックアウトすることにより、霊芝の二次代謝産物生合成能力が霊芝トリテルペノイドへ集中し、生産量が向上するかを検討する。また、Wuら(2018)によって、トリテルペノイドの生産に重要であると思われる6つの遺伝子が報告されている。これらの遺伝子を高発現ベクターに組込み霊芝を形質転換させることで、トリテルペノイドを大量に産生する霊芝の作出を目指す。生体内において機能性成分の標的タンパク質はその他のタンパク質との関係性によって機能性を発揮する。そこで、まず得られた霊芝トリテルペノイドの標的タンパク質を同定し、プロテオームに関するバイオインフォマティクス技術を援用し本標的タンパク質と関連する薬効・機能性・疾患に関する情報を取得し、期待される霊芝の新規機能を探索する。さらに上記の知見により機能性が推定できるので、その知見に基づいて、本研究で得られる霊芝トリテルペノイド高生産株とゲノム編集を行っていない親株由来エキスを用いて、細胞・動物試験により、機能性を比較する。霊芝キノコのゲノム編集について、霊芝特異的プロモーターの単離、ターミネーターの単離、霊芝ゲノム編集用ベクターの構築等の実験を行ってきた。その中で、ゲノム編集に用いるプロトプラストの遺伝子導入効率の低さと、遺伝子発現効率の低さは新規キノコ作成において、ボトルネックとなっていた。この状況に変化をもたらしたのは、刑部らのキノコゲノム編集に関する論文であった(Scientific Reports (2017)。これまで、ある一定の形質を有するプロトプラストを用いると効率が上がることが判明していた。よって我々は、霊芝プロトプラストを用いたゲノム編集には、菌糸体を用いた予備的実験の中で、細胞融合・ゲノム編集を効率的に行うためには扱い易いプロトプラストの採取が必須という結論に至り、セルソーターにより最適なプロトプラスト採取の条件を探索している。我々はこれまでに、霊芝子実体の有用成分のLC/MSを用いた網羅的解析技術を確立しており、新規の菌糸体の作成に成功すれば霊芝トリテルペノイドの数十種類を同時に同定できるシステムを構築している。また、我々はこれまでに、ゲノム編集に必要なプロモーター、ターゲット遺伝子(コーデイングシーケンス)、ターミネーター領域のDNAを霊芝特異的遺伝子としてPCR法により探索し、有望領域を決定した。ターゲット遺伝子としてP450遺伝子群のコーディング領域をゲノム編集している。

但し、これらの遺伝子セットが実際に作動するかは未定であるのでキノコゲノム編集で使用された遺伝子も併せて探索している。これまで、当研究室は、キノコプロトプラストの細胞融合法による品種改良には有る特定の形質のプロトプラストを用いると効率が上がることが判明していた。さらに、このキノコゲノム編集の論文から、有る特定の形質を有するプロトプラストは遺伝導入効率が高いという結果を論文データは示していた。よって我々は、霊芝プロトプラストを用いたゲノム編集には、菌糸体を用いた予備的実験の中で、細胞融合・ゲノム編集を効率的に行うためには扱い易いプロトプラストの採取が必須という結論に至った。また、これまでの我々の予備的実験より有る特定の形質を有するプロトプラストは品種改良し易いことが判明している(未発表データ)。また、我々はこれまでに、霊芝子実体の有用成分のLC/MSを用いた網羅的解析技術を確立しており、新規の菌糸体の作成に成功すれば霊芝トリテルペノイドの数十種類を同時に同定できるシステムを構築している。ゲノム編集に必要なプロモーター、ターゲット遺伝子(コーデイングシーケンス)、ターミネーター領域のDNAを日本九州産の霊芝特異的遺伝子としてPCR法により探索してきた。その結果、プロモーター、ターミネーター、ターゲット遺伝子を決定し、それらの情報を元に、ゲノム編集している。但し、これらの遺伝子セットが実際に作動するかは未定であるのでキノコゲノム編集で使用された遺伝子群についても併せて探索している。ゲノム編集に使用する発現システムはGreen gate法を用い、ゲノム編集はPPRタンパク質を用いた方法により行っている。昨年に引き続き、霊芝の細胞融合・ゲノム編集を効率的に行うための扱い易いプロトプラスト作成に向けての検討を行った。これまでの研究で、形質転換に用いるプロトプラストの性状が形質転換効率に影響することが示唆されたため、本年度は作出したプロトプラストをセルソーターにより分画した。その結果、異なるサイズのプロトプラストを得ることに成功した。また、我々はこれまでに、トリテルペノイド以外の霊芝二次代謝産物であるβ-グルカン合成に関わる遺伝子の探索を行った。このβ-グルカン合成遺伝子をPPRモチーフによるゲノム編集技術を用いてノックアウトすることでトリテルペノイド産生が増加する可能性が考えられる。霊芝(Ganoderma lingzhi)に含まれるトリテルペノイドおよび多糖は、その薬効成分に寄与する主要な生理活性成分である。本研究では、G. lingzhiに含まれるトリテルペノイドの網羅的な分析条件の検討を行った。2017年度は標準品を用いた定量方法を確立し、生育ステージ毎の18種類のトリテルペノイド類を定量した。本年度は質量分析に基づく生育段階におけるG. lingzhiのノンターゲットメタボロミクス分析の方法を検討した。検出された42のピークのうち、26のピークを同定した。そのうち9のピークは標準品より同定し、17のピークは本研究により得られたマススペクトルの開裂と既報の結果から化学構造を推定した。各ピークのピーク面積を比較し、半定量が可能な分析方法を確立した。
学歴主義にかわる社会的選抜システムの探索

学歴主義が学校エリートを近代セクターの職場に定着させていく社会的仕組みであったとすれば、同時に存在した非学校エリートのひとびとの間や非近代セクターの職場ではどんな選抜システムが機能していたのか、非学歴社会のサイドから「社会」を見直し、今後の社会的選抜システムの方向を模索してみたい、というのが本研究の目的であった。研究は研究分担者の関心にそって、4つのテーマについて進められ、研究会において報告、議論、ヒアリング等が繰り返された。第1章の「日本の近代化過程にみる非学歴主義的選抜」では、明治期を中心に独学の問題が研究された。近代化初期に独学者に残されていた上昇移動の道は学歴主義の普及によって次第に閉ざされ、資格取得の道にも学歴主義が浸透していく過程が明らかにされた。第2章の「試験制度のパラダイス転換」では、日米の大学入試制度の比較が行われ、大学の量的拡大にもかかわらず、大学入試の「大衆化」が実現できない現状が明らかにされた。また、企業の採用試験、昇進・昇格制度の最近の変化に触れ、基準の設定・評価の客観化による「配置」管理の進行が認められた。第3章の「高学歴集団の選抜システム」では、筆者の調査を含め、学歴による地位達成に関する先行研究の検討がおこなわれた。さらに、高学歴集団の事例として科学技術者の選抜の実態が示され、もっとも高学歴である博士の不人気が指摘されている。第4章の「選抜社会から育成社会へ」では、プロ野球のドラフト制度を中心に、野球選手の人口選抜の妥当性について実証的な分析がおこなわれた。分析の結果、超一流選手をのぞいて妥当性は高くはなく、チームの教育力、育成の方法などの重要性が指摘された。わが国の社会的選抜システムは従来、学歴主義というレッテルのもとにきわめて単純化されて表現されてきた。本研究では、具体的な職業内容,職業組織の採用,昇進の分析を通して、より現実に近い教育と社会的選抜との関係を描きだすことを目的としている。そして多様な選抜システムを抽出、整理するなかで、社会や技術の変化に対応できる選抜システムとは何かを探索しようとするものである。今年度(昭和61年度)は研究分担者がそれぞれ下記のようなテーマを設けて、研究を進めた。研究の進捗状況は毎月の研究会において報告され、意見交換を行っている。1.戦前期における非学歴的選抜の事例研究(天野郁夫)2.心理テスト等の非学歴的選抜手段の情報価値と利用状況について(荒井克弘)3.人材の発見,選抜,育成プロセスの研究-組織と個人の観点から-(矢野真和)4.科学者および技術者の選抜制度-高学歴集団の選抜-(塚原修一)天野は戦前期の非学歴的な選抜システムとして、試験検定と組織内の教育訓練システムの2つを指摘し、「独学」を助ける手段として当時どのようなものがあったか、そしてどのような職業においてこれらのルートが主に機能していたかを歴史的に検討している。今年度は教師、技官(公務員)について研究が進められた。荒井は米国における雇用(Employment)テストの発展について、文献を整理する一方、わが国で雇用テストがどのように現在、利用されているか、大手のテスト産業へのヒアリングを行った。矢野はプロ・スポーツ家を事例に採り上げ、選抜制度、採用時の評価とその後の実績との関係などについて定量的な分析を行った。塚原は高学歴を特徴的な職業属性とする大学等の研究者を対象としてとりあげ、そこでは何が選抜の決め手となるのかについて研究を進めている。61年度にひき続き,各研究分担者はそれぞれ下記の研究テーマに沿って調査,検討を進め,毎月の研究会を通じて研究成果の交流・議論が行われた.

(1)戦前期における非学歴主義的な選抜の研究(教員,警察官等);天野郁夫試験による採用,昇進・昇格制度が確立していた教員・警察官,組織内の教育システムの整っていた逓信省,鉄道省などの戦前の事例を昨年にひき続き調査する一方,独学のシステムと学校制度の比較が論じられた.(2)人材の発見・選抜・育成プロセスの研究;矢野真和プロ野球選手のドラフト制度について,定量的な分析を行った.運動選手のような単能的職業においても,選抜時の評価が必ずしも高い妥当性をもっているわけではないことが明らかになった.とび抜けた能力をもつ者以外は所属組織の属性,組織の教育効果がかなり大きいことが示唆された.(3)心理テスト等の非学歴主義的選抜手段の情報価値と利用状況;荒井克弘企業の採用,昇進・昇格の際に,心理テストがいかに利用されているか,文献,ヒアリング調査によって検討を進めた.企業によりあるいは実施の目的により,中心となる情報価値は多様であり,現在のテスト利用の増加が必ずしもテストの信頼性,妥当性の高さによるものではないことが示唆された.(4)科学者および技術者の選抜制度ー高学歴集団の選抜ー;塚原修一高学歴をその職業属性とする科学技術者の場合,いかなる要素が選抜の決め手となるのか,とくに最先端の分野などで,専門家の養成ルートが確立していないときにどんな専門分野移動が行なわれるのか,主要なキャリアルートは何かが検討された.各研究分担者から最終的な報告が行われ、次のような議論が交わされた。日本の近代化初期には、独学により立身する道は高度な資格職業についても残されていた。しかし、正規の学校教育の普及によって、これらの職業資格の受検に要求される基礎学歴は次第に上昇し、独学者の上昇移動の道は閉ざされていった。それは急速な近代化に即応していかねばならない後発国家の宿命であったともいえる。日本は学校を人材配分機能として先鋭化させる一方、企業内教育に代表されるように、職場内に職業能力養成の場をつくることにも熱心であった。誤解を恐れずにいえば、学校は競争と選抜の場、職場は教育と育成の場へ機能の逆転が生じた。高等教育機会が普及し、進学者が増えるという教育上望ましい変化がむしろ教育の弊害を拡大するという不可解さはこの機能の逆転と無縁ではないであろう。しかし、最近は企業の変化が著しい。高齢化、高学歴化、産業構造の変化などを理由に、選抜を強化した新しい人事管理を開発している。学校も競争、企業も競争という状況が現実となりつつある。これが生涯学習社会化ひとつの側面であるのかもしれない。プロ野球のドラフト制度を追跡した研究では、プロスポーツのような能力概念のはっきりした世界においても、入口の選抜の妥当性は低いことが明らかにされた。その他の一般的職業においては、尚更のことといえよう。だからこそ、教育と育成が大切だという示唆がこの事例からも引き出される。選抜社会が強調されるなかにあって、教育・育成の大事さを強調することこそ「学歴社会にかわる社会的選抜システム」のありかたを示唆するものといえよう。
卵巣癌における膜型エストロゲン受容体GPR30を標的としたEMT現象の制御

GPR30の卵巣癌細胞株の細胞特性への影響とEMT関連因子の発現について検討した。細胞特性に関してGPR30選択的アゴニストであるG1を用い、3D培養を用いて位相差顕微鏡で検討を行った。またG1投与前後の細胞より、EMT関連因子の発現をQuantitative PCR、Western Blotting法にて解析を行った。G1投与により卵巣癌細胞は間葉系細胞様の形態に変化、sphereの形成を認めEMT化が推測された。またG1による刺激により、E-cadherine、AE1/AE3の発現低下、Snail、Vimentinの発現上昇を認め、分子生物学的にもEMT化が証明された。卵巣癌細胞株を用いてGPR30を強制発現させた、卵巣癌白金製剤感受性株(A2780)および白金製剤耐性株(Caov-3)のEMT関連因子の発現と細胞特性(細胞形態の変化、浸潤能など)への影響について検討を行った。まず第1にGPR30の選択的アゴニスト(G1)を用いてGPR30を刺激し、刺激を行う前後の細胞からRNAまたは蛋白を抽出し、EMT関連因子(E-cadherine、Snail)、上皮系マーカー(AE1/AE3)、間葉系マーカー(Vimentin)の発現をmRNAレベルはQuantitative PCR、蛋白発現はWestern Blotting法にて解析を行った。さらに細胞特性に関しては、GPR30の選択的アゴニスト(G1)を用いてGPR30を刺激した時のEMT現象による間葉系細胞への細胞形態変化および細胞集塊の形成の有無について、3D培養を用いて位相差顕微鏡で検討を行った。現在までの進捗状況;比較的予定通りに進捗していると考えるが、今後SiRNAによる抑制実験や、可能であればin vivoでの実験も追加検討をしており、より早く実験を進めていくことが望ましい。卵巣癌における播種・転移の過程に関わっている可能性が示唆されるエストロゲン受容体GPE30の機能解析について研究を行っている。現在GPR30の発現ベクターを作成しGPR30を強制発現させた卵巣癌白金製剤感受性株(A2780)および白金製剤耐性株(CaOV-3、A2780CP)を用い、GPR30陽性細胞と陰性細胞を作成した。GPR30の選択的アゴニストを用いてGPR30を刺激しPCR法でEMTに関与する遺伝(Snail、Slug、E-cadherine)のRNAレベルでの変化を確認した。また3D培養を行い、GPR30陽性細胞は形態変化を起こし細胞集塊を形成することを確認した。今後はさらにGPR30の発現によりEMT関連蛋白の発現、細胞形態の変化、浸潤能、増殖能、薬剤耐性の変化、細胞周期への影響の検討を行う予定である。GPR30の選択的アゴニストによる刺激を行い、EMTに関わる遺伝子(Snail、Slug、E-cadherine、AE1/AE3、N-cadherine、Vimentin)、また接着分子(integrin、ICAM-1など)およびMMPsの発現statusの解析を行う。さらにMTS assay、invasion assayを行い、それぞれの細胞集団の増殖能、浸潤能を解析する。また、抗がん剤を添加しその奏功性や薬剤耐性への影響について解析する。またGPR30強制発現により細胞周期への影響を調べ、同時に抗がん剤への感受性の変化について検討を行う。次に、卵巣癌細胞株を用いたGPR30のGPR30siRNAアデノウイルスベクターを作成し、卵巣癌細胞株に導入し細胞形態の変化および浸潤能、増殖能、薬剤耐性性、細胞周期およびEMTに関わる遺伝子の発現変化についてin vitroで調べ、GPR30siRNAによる卵巣癌のEMTの制御が可能か否かを調べることを予定している。現在GPR30の発現によりEMT関連蛋白の発現、細胞形態の変化、浸潤能、増殖能、薬剤耐性の変化、細胞周期への影響の検討を行っているが、in vitroの条件下で仮定していた実験結果と異なる結果が得られている。GPR30強制発現後の細胞形態の変化後、足場を失った細胞がアポトーシスに陥っている可能性があり、細胞変化の原因が播種の一過程であるのか、細胞死であるのか再度考察する必要があると考えている。その証明のため、現在MTS assay等を用いて、細胞活性について検討を行っている。細胞特性に関して、GPR30の選択的アゴニストであるG1を用いてGPR30を刺激した時のEMT現象による間葉系細胞への細胞形態変化と細胞集塊の形成の有無について、2D培養および3D培養を用いて位相差顕微鏡で検討を行った。結果、GPR30を刺激することで、2D培養では卵巣癌細胞は間葉系細胞様の形態に変化し、3D培養下ではsphereの形成を認め上皮性細胞のEMT化が推測された。2D培養下および3D培養下より、GPR30選択的アゴニストにより刺激を行う前後の細胞より採取したRNA、蛋白を用いて行ったQuantitative PCR法、Quantitative PCRはいずれもアゴニストによる刺激前に比較して刺激後は、EMT関連因子であるE-cadherineの発現低下、Snailの発現上昇、上皮系マーカーAE1/AE3の発現低下、間葉系マーカーVimentinの発現上昇を認め、分子生物学的にもEMT化が証明された。

細胞特性に関してGPR30選択的アゴニストであるG1を用い、3D培養を用いて位相差顕微鏡で検討を行った。またG1投与前後の細胞より、EMT関連因子の発現をQuantitative PCR、Western Blotting法にて解析を行った。G1投与により卵巣癌細胞は間葉系細胞様の形態に変化、sphereの形成を認めEMT化が推測された。またG1による刺激により、E-cadherine、AE1/AE3の発現低下、Snail、Vimentinの発現上昇を認め、分子生物学的にもEMT化が証明された。本年度は、薬剤耐性の影響について、GPR30を選択的アゴニスト(G1)で刺激あるいはアンタゴニスト(G15)で抑制を行い、シスプラチンを濃度変化させ添加し、cell viabilityへの影響をMTS assay法を用いて調べる。また、GPR30の刺激あるいは抑制を行った細胞集団の細胞周期への影響について、フローサイトメトリーを用いて細胞周期を解析し、どの細胞集団が多く含まれているかを解析する。結果が確認できれば、次にGPR30に対するGPR30SiRNAアデノウィルスベクターを作成し、卵巣癌細胞株を用いて抑制実験を進める予定である。実験結果が仮定と相違を認めるのは、実験手技による問題もあり、同時に元来計画していた実験計画にのっとっての研究も進めている。細胞形態の変化が細胞死によって起こっているのであれば、GPR30の機能は転移・播種ではなく細胞死に関わる因子として検討項目を変更していくこととしている。産婦人科
新規開発する刺激法による老化に伴う疾患発症の作用機序解明とその利用発展の検討

骨粗鬆症は高齢者女性に多く、その患者数は1,300万人と推定され、そのうちの約90万人が転倒による骨折が原因で寝たきり者となっている。骨折はADLに影響を及ぼし、QOLを低下させるためこれを予防することが重要かつ有効であると考える。骨粗鬆症に伴う骨折の好発部位には大腿骨頚部や腰椎椎体などがある。高齢者に頻発する骨粗鬆症に伴う骨折の予防を目的とし、振動と振盪を組み合わせた新規刺激装置を作製し、骨密度低下モデルマウスに対して検討を行った。マウスICRのメスに卵巣摘出術を施した骨密度低下モデルを作成し、1日1回30分間の刺激を6日間連続で行い、10週間継続して行った。その後、大腿骨及び腰椎を採取し、骨形態計測法を用いて比較検定を行った。その結果、大腿骨に関しては刺激有群が刺激無群に比べBS/TV、N.Oc/ES、Oc.S/ES、Omt、Tb.N、Mlt(p<0.01)、N.Ob、N.Ob/TV、sLS、N.Mu.Oc/ES、N.Mo.Oc/ES(p<0.05)が有意に増加した。また、刺激有群が刺激無群に比べBS/BV、Tb.Sp、MAR、Aj.Ar(p<0.01)、ES、ES/BS、BRs.R(p<0.05)が有意に低下した。また、腰椎に関してはO.Th、OV/BV、MAR(p<0.05)において対象群である刺激なし群に比べ刺激あり群が有意に高い値を示した。この刺激により骨芽細胞が活性化され、一方では破骨細胞も活動していることが推察でき、活発な骨のリモデリングが行われていると考えられた。これは骨形成過程の途中段階にあり、この後に骨石灰化が起こることが推察された。この刺激方法は刺激が困難である腰椎への刺激ができる装置の検証ができ、急激な骨密度低下を緩和することが示唆された。この刺激方法を発展させ、臨床応用することは新たな骨粗鬆症の予防と治療の可能性を期待できる。新規刺激法の刺激装置の作成は予定どうり順調に作成することが出来た。その刺激装置の効果の検証は骨密度低下モデルマウスにおいてその効果をある程度確認することが出来た。この刺激効果のメカニズムの解明という点で筋発現タンパク質(マイオカイン)の解析が少し遅れている。マイオカインの発現は筋肥大する筋から発現するため今回の刺激期間では考えていたほどの筋肥大が認められないこと、また、骨解析の結果からも刺激期間が不足しているのではないかなどが考えられるためである。現在、運動後の筋肉を液体窒素下で粉砕し、筋溶液を作成し破骨細胞の培養細胞系においてその効果を検証している。また、新たに老化促進モデルマウスSAMP8において、この刺激による認知症予防効果の検証と共に、刺激条件を変えて刺激期間を6カ月に延長した条件により研究を推進している。ロータロッドテスト(運動学修)、Y字迷路(探索行動)、T字迷路(空間学習)、Passive avoid test(長期記憶)行動解析を一部終了し、刺激効果が認められている。今後は脳組織標本を作製し解析を行っていく予定である。また、新たに共同研究者と多発性硬化症モデルマウスに対しても同様な刺激を行いその効果を検討する。転倒を予防する平衡感覚を養う装置と骨折治癒時に老化した細胞を活性化する刺激方法である振動刺激に、新規の振盪刺激を組み合わせたコンビネーション刺激装置の開発を行っている。振盪刺激は水平盤が前後、左右に揺れその上で両足を踏ん張り、等張性および等尺性運動を強制し、腱を介して付着する骨へ刺激を及ぼす。その効果について卵巣摘出術を施した骨密度低下マウスを作成し、腰椎を採取して骨組織標本を作製し骨形態計測法を用いて解析を行った。また、骨格筋から分泌される運動誘発サイトカイン(マイオカイン)が血液を介して骨細胞の活性化を誘発する新規メカニズムを解明するため筋発現タンパク質の解析を行った。その結果、類骨幅(O.Th)、類骨量(OV/BV)、骨石灰化速度(MAR)において対象群である刺激なし群に比べ刺激あり群が有意に高い値を示した(p<0.05)。また、下肢帯におけるBMP-2、IL-1β、IL-6、MyoDの発現解析においても刺激あり群が刺激なし群に比べ有意に高い値を示した(p<0.05)。類骨量(OV/BV)や骨石灰化速度(MAR)が高い値を示したことからこの刺激が骨形成を促進している可能性が推察された。また、BMP-2やIL-1βが刺激あり群で高い値を示したことから骨代謝が現在進行形で活発に行われている可能性が示唆された。腰椎は骨粗鬆症が原因で骨折する好発部位の1つで体幹の深部にあり刺激をすることが困難であると言われている。その腰椎において新規に開発しているコンビネーション刺激装置による刺激で一定の効果が得られた。新規に振動と振盪刺激を組み合わせた刺激装置の開発を行っている。実験群と対照群の各6匹ずつ2群に分け、実験群は1日1回30分間の刺激を6日間連続して行い、1日休息するスケジュールを10週間継続して行った。

骨形態計測法を用いて直接計測により一次パラメーターである類骨量(OV)、類骨面(OS)、類骨幅(O.Th)、骨芽細胞数(N.Ob)、多核破骨細胞数(N.Mu.Oc)などを算出した。この結果、OV、OS、O.Thで刺激あり群は刺激なし群に比べ有意に高い値を示した(p< 0.01)。また、N.ObとN.Mu.Ocに有意差は認められなかったものの、刺激あり群が刺激なし群に比べ高い値を示した。さらに、一次パラメーターをもとに二次パラメーターを算出した。骨量/組織量(BV/TV)、骨梁幅(Tb.Th)、骨梁数(Tb.N)、骨梁間隙(Tb.Sp)、類骨量/骨量(OV/BV)、骨石灰化速度(MAR)、骨形成速度/組織量(BFR/TV)などを算出した。その結果、OV/BVとBFR/TVは、刺激あり群は刺激なし群に比べ有意に高い値を示した(p< 0.05)、またMARは、刺激あり群は刺激なし群に比べ有意に高い値を示した(p<0.01)。また、筋タンパク質発現解析では、大腿四頭筋の筋溶液を作成し、ELISA法にて発現解析を行った結果、BMP-2、IL-1β、IL-6はいずれも刺激あり群が刺激なし群に比べ有意に高い値を示した(p<0.05)。IL-15は刺激あり群が刺激なし群に比べ有意に高い値を示した(p<0.01)。また、Western Blotting法によりMyoDの発現解析を行った結果、刺激あり群が刺激なし群に比べ有意に高い値を示した(p<0.05)。骨粗鬆症は高齢者女性に多く、その患者数は1,300万人と推定され、そのうちの約90万人が転倒による骨折が原因で寝たきり者となっている。骨折はADLに影響を及ぼし、QOLを低下させるためこれを予防することが重要かつ有効であると考える。骨粗鬆症に伴う骨折の好発部位には大腿骨頚部や腰椎椎体などがある。高齢者に頻発する骨粗鬆症に伴う骨折の予防を目的とし、振動と振盪を組み合わせた新規刺激装置を作製し、骨密度低下モデルマウスに対して検討を行った。マウスICRのメスに卵巣摘出術を施した骨密度低下モデルを作成し、1日1回30分間の刺激を6日間連続で行い、10週間継続して行った。その後、大腿骨及び腰椎を採取し、骨形態計測法を用いて比較検定を行った。その結果、大腿骨に関しては刺激有群が刺激無群に比べBS/TV、N.Oc/ES、Oc.S/ES、Omt、Tb.N、Mlt(p<0.01)、N.Ob、N.Ob/TV、sLS、N.Mu.Oc/ES、N.Mo.Oc/ES(p<0.05)が有意に増加した。また、刺激有群が刺激無群に比べBS/BV、Tb.Sp、MAR、Aj.Ar(p<0.01)、ES、ES/BS、BRs.R(p<0.05)が有意に低下した。また、腰椎に関してはO.Th、OV/BV、MAR(p<0.05)において対象群である刺激なし群に比べ刺激あり群が有意に高い値を示した。この刺激により骨芽細胞が活性化され、一方では破骨細胞も活動していることが推察でき、活発な骨のリモデリングが行われていると考えられた。これは骨形成過程の途中段階にあり、この後に骨石灰化が起こることが推察された。この刺激方法は刺激が困難である腰椎への刺激ができる装置の検証ができ、急激な骨密度低下を緩和することが示唆された。この刺激方法を発展させ、臨床応用することは新たな骨粗鬆症の予防と治療の可能性を期待できる。新規刺激法の刺激装置の作成は予定どうり順調に作成することが出来た。その刺激装置の効果の検証は骨密度低下モデルマウスにおいてその効果をある程度確認することが出来た。この刺激効果のメカニズムの解明という点で筋発現タンパク質(マイオカイン)の解析が少し遅れている。
休眠ホルモン剤の創製による多化性蚕種の安定供給

カイコの休眠ホルモンは24個のアミノ酸からなるペプチドアミドである。本ホルモンをカイコの多化性系統の蛹に注射投与すると産下卵は休眠卵となり、休眠状態で卵を長期間にわたって保存することができる。より有効なホルモン類縁体の創製を目的に、約100種類のペプチドを化学的に合成し、それぞれについて休眠卵誘導活性を調査した。その結果、生物活性発現に必須な構造として、(1)C末端がアミド化されていること、及び(2)C末端にFGPRLのアミノ酸配列を有していることが明らかにされた。つまり休眠ホルモンアナログとしてはC末端のヘキサペプチドが有効であると結論され、さらにこの基本活性はN末端のペプチドによって強化されることが示された。休眠ホルモンまたはその類縁体を大量の多化性カイコに一度に投与する方法としては散布による経皮投与法が有効である。このためのホルモン剤を開発するために、脂溶性の活性物質を探索した。カイコの雄成虫の頭部に有機溶媒に可溶な活性物質がみられた。活性物質を精製し、そのうち1種を単離した。本物質はペプチドであり、分子量約10Kであった。N末端の55個のアミノ酸配列を決定した結果、全アミノ酸数の70%がバリン、アラニン、プロリンであり、きわめて特異的な新規なペプチドであることが判明した。本ペプチドの休眠卵誘導活性は休眠ホルモンの1/100であったが、それ以外に本ペプチドは休眠ホルモンの分解を阻害する作用を有していた。休眠ホルモン遺伝子の構造解析、発現実体さらに発現調節機構についての研究を進めた。その結果、本遺伝子は5個のイントロンを含む6個のエクソンで構成され、食道下神経節の12個の神経分泌細胞で発現しており、その発現は催青温度によって調節されていることが明らかになった。また合成休眠ホルモン及び類縁体を投与して得られた休眠卵は天然の休眠卵と同様にソルビトールやアラニンを蓄積し、正常な休眠卵であると判定された。これらの結果は合成休眠ホルモンが蚕卵の長期保存のための化学調整剤として有効であることを証明した。ペプチド合成研究:休眠ホルモンは24個のアミノ酸からなるペプチドアミドである。本分子をN末端からいろいろな長さで切断したペプチドを合成し、その生物活性を比較した。その結果、活性発現の最小部はC末端の6アミノ酸であること、ペプチド鎖長をN末端側に伸ばすとED_<50>値が不連続的に減少すること、N末端のThrも関係していることが判明した。また休眠ホルモン分子内の一定のアミノ酸配列を欠損したペプチドを合成し、その活性を調査したところ、分子内欠損は活性には大きな影響を与えないことも判明した。これらのことから本ホルモンの構造一活性相関を推察し、ホルモンアゴニストやアンタゴニストの分子設計を考えた。ペプチドの分子修飾研究:本ホルモンは水溶性であり、注射による投与は生物活性を示すが、カイコの皮膚を通しての投与は効果を示さない。経皮投与によってホルモン作用を発現させるために、休眠ホルモンのN末端に脂肪酸を結合したペプチド-脂肪酸複合体を合成した。本複合体の生物活性は、注射投与によってはほとんど減少しないことが判明した。しかし、経皮投与による本剤の効果は認められていない。その理由は分子の非極性がまだ十分ではなく、皮膚透過量が十分ではないことによると考えられた。

この点を改良するために新規な分子設計を図りつつある。生物検定、評価研究:合成ペプチドや分子修飾ペプチドの生物検定の結果、各種の活性ペプチドは最大活性、つまり産下卵の休眠割合ではいずれも6070%を示し、その活性に差異はないが、ED_<50>値では大きな差異を示すことが示された。すなわち、分子構造の差異はホルモンの受容体との親和性に反映しており、受容された情報の発現にはほとんど関係していないと判断された。休眠ホルモン類縁体を約50種類化学的に合成し、精製した。これらはいずれも休眠ホルモン分子の断片である。これら類縁体の休眠ホルモン活性を比較し、活性発現のための基本構造はC末端のペンタペプチドであること、この基本構造による活性はN末端側のペプチドによって高められること、つまり休眠ホルモン活性は基本構造と補足構造によって発現されていると結論した。脂溶性の休眠ホルモン活性物質をカイコの雄成虫の頭部から抽出精製した。これは皮膚浸透性を有する休眠ホルモン物質を同定するための実験である。メタノール/ジクロロメタン可溶で、水/ブタノール配分によってブタノール層に回収される分画に休眠誘導活性がみられた。この活性物質を精製、単離し、ペプチドであることを示した。N末端55個のアミノ酸配列をエドマン分解によって決定した結果、全アミノ酸数の70%以上がバリン、アラニン、プロリンによって占められていた。本ペプチドは新規なペプチドであり、VAPペプチドと命名した。休眠ホルモン遺伝子の発現は食道下神経節の12個の神経分泌細胞においてのみ起こっていることを、in situ hybridization法によって証明した。また休眠ホルモン特異抗体を用いた免疫組織化学的な観察により休眠ホルモン様物質は神経軸索や側心体にも分布していることを明らかにした。合成休眠ホルモンを投与することによって人為的に誘導した休眠卵の生理化学的な特質を調査した結果、ソルビトール及びアラニンの有為な蓄積がみられ、天然の休眠卵に匹敵する性状を示した。この結果は合成休眠ホルモンが正常な休眠卵を誘導する能力を有していることを証明し、蚕種の長期保存に活用しうることを示した。
心臓前駆細胞誘導転写因子の同定と多能性幹細胞からの心筋誘導

多能性幹細胞から心筋細胞の分化を誘導するには,複数の液性因子を使用し,心臓中胚葉細胞をへて心筋細胞に分化させる方法が一般的である.しかし,この方法には,工程が煩雑,効率が不安定,液性因子が高価,という課題がある.心臓中胚葉の分化の分子機構および心臓中胚葉の分化を誘導する転写因子については明らかにされておらず,この分子機構を解明し分化を誘導する転写因子を同定することにより,遺伝子の発現のみで多能性幹細胞から選択的に心臓中胚葉細胞の分化が可能になると考えた.ダイレクトリプログラミングを応用したスクリーニングにより線維芽細胞から心臓中胚葉細胞の分化を直接的に誘導するTbx6遺伝子を発見し,Tbx6遺伝子をマウスのES細胞あるいはヒトのiPS細胞といった多能性幹細胞に導入することにより,液性因子を使用せずに心臓中胚葉細胞の分化が可能であることが見い出された.このような中胚葉の分化の機序を解明するため,Mesp1遺伝子に着目して転写因子であるTbx6が直接的に結合する遺伝子を探索した.Mesp1は生体において,あるいは,幹細胞からの中胚葉細胞および心血管系細胞への分化に重要な転写因子であると同時に,線維芽細胞におけるスクリーニングにおいてもTbx6遺伝子により発現が誘導されていた.そこで,ChIP-PCR法によりMesp1遺伝子を解析したところ,Mesp1遺伝子のエンハンサー領域にTbx6の結合が認められ,Tbx6によるMesp1遺伝子への直接的な結合による発現の誘導が明らかにされた.このように,ES細胞からの中胚葉細胞への分化において,Tbx6が直接的および間接的な機序により分化を制御することが明らかにされた.(1)心臓前駆細胞プログラミング因子の選定(済):マイクロアレイデータとcDNAライブラリーから心臓発生過程において、心臓前駆細胞が出現する時期特異的に発現が上昇する転写因子60個を候補因子として選定した。これらをマウス胎児線維芽細胞にレトロウイルスで感染させ、心臓前駆細胞特異的遺伝子であるMesp1の発現をqPCRにより検討した。これまでの予備実験でMesp1を上昇させる単一因子を選定することに成功し、心臓前駆細胞誘導因子Aとした。(2)心臓前駆細胞誘導因子をドキシサイクリンシステムで発現するマウスES細胞を作製し、心臓前駆細胞・心筋細胞を誘導(済):心臓前駆細胞でGFPを発現するT-GFPマウスES細胞を用いて、ドキシサイクリンシステム(Dox)で心臓前駆細胞誘導因子Aを発現するES細胞株を作製した。これまでの予備実験でDoxによる遺伝子発現制御で無血清培地で心臓前駆細胞を誘導することに成功した。誘導効率は従来の液性因子を使用した方法と同程度であり、さらに心臓前駆細胞から心筋細胞の分化を確認した。心筋トロポニンT陽性細胞の誘導効率は約60%と高率であった。(3)心臓前駆細胞誘導の分子機序解明(済):心臓前駆細胞誘導をマイクロアレイで解析し、候補因子導入による遺伝子制御ネットワークを解明した。T, Mesp1, Eomes, Gsc, Mixl1などの中内胚葉系の遺伝子が上昇し、Pax6, Sox1などの外胚葉遺伝子が抑制されていることが判明し、心臓前駆細胞誘導因子による誘導が促進されていることが示唆された。また心臓前駆細胞分化の分子機序を解明するために、免疫クロマチン沈降(ChiP)による検討を行い、心臓前駆細胞誘導因子がMesp1のプロモーターに直接結合して発現を誘導していることが判明した。研究は当初の実施計画のごとく、研究計画の要となる心臓前駆細胞プログラミング因子の同定に成功した。因子によるマウスES細胞からの心臓前駆細胞誘導に関しても、従来の液性因子を使用した方法と同等の誘導効率を示した。現在はその分子生物学的機序の解明を実施しており、因子により細胞運命決定に重要な働きを示す遺伝子群との直接結合を示すことが出来た。さらにヒトiPS細胞を用いて同様の手法で心臓前駆細胞誘導に成功した。1.多能性幹細胞からの中胚葉・心臓中胚葉誘導因子のスクリーニング(前年度に済)2. X因子発現制御マウスES細胞を用いた中胚葉・心筋誘導の確立(前年度に済)3. X因子発現による心臓中胚葉誘導の分子生物学的機序の解明(前年度に済)4. X因子発現制御によるマウスES細胞からの骨格筋・軟骨誘導の確立:中胚葉誘導制御因子Xは、心筋誘導においては誘導が抑制される骨格筋との関連も知られている。発生学では中胚葉から心臓が分化した後に、骨格筋・軟骨の原基である沿軸中胚葉が分化する事から、X因子発現の期間を延長することで、幹細胞から沿軸中胚葉を誘導できると考えた。そして誘導開始から数日間のX因子発現により幹細胞から沿軸中胚葉が誘導され、骨格筋・軟骨への分化を確認した。以上の結果から、X因子が心臓中胚葉だけでなく、骨格筋も誘導可能な中胚葉誘導制御のマスター因子である可能性が示唆された。その分化誘導の機序としてX因子を介したシグナル経路の活性化であることを解明した。5. X因子発現制御ヒトiPS細胞を用いた中胚葉・心筋誘導の確立:X因子は哺乳類に広く保存されている転写因子である。そこでX因子による中胚葉誘導がヒトにおいても保存されていることを確認するため、ヒトiPS細胞に同様の手法でX因子遺伝子を導入した。

ヒトiPS細胞においてもX因子発現のみで、中胚葉・心血管系細胞の誘導を確認し、幹細胞におけるX因子の役割が種を越えて保存されていることを確認した近年、液性因子を用いた幹細胞からの中胚葉誘導において新たな知見が報告され、幹細胞から分化した中胚葉は液性因子の作用により目的外系統への分化が阻害される事で、心臓中胚葉(心臓幹細胞)、または沿軸中胚葉(骨格筋・軟骨の原基)への分化が選択されていることが判明した。(Kyle etal, Cell, 2016)しかし未だ液性因子の下流に存在する転写因子ネットワークなどの分子生物学的な機序は不明である。本研究においては、分化制御の鍵となる転写因子を同定し、機能を解析している点が、先行研究と一線を画しているだけでなく、X因子の直接結合による液性因子の誘導効果を示していることから、従来の研究ではブラックボックスであった液性因子の分子生物学的機序を埋める可能性がある研究といえる。多能性幹細胞から心筋細胞の分化を誘導するには,複数の液性因子を使用し,心臓中胚葉細胞をへて心筋細胞に分化させる方法が一般的である.しかし,この方法には,工程が煩雑,効率が不安定,液性因子が高価,という課題がある.心臓中胚葉の分化の分子機構および心臓中胚葉の分化を誘導する転写因子については明らかにされておらず,この分子機構を解明し分化を誘導する転写因子を同定することにより,遺伝子の発現のみで多能性幹細胞から選択的に心臓中胚葉細胞の分化が可能になると考えた.ダイレクトリプログラミングを応用したスクリーニングにより線維芽細胞から心臓中胚葉細胞の分化を直接的に誘導するTbx6遺伝子を発見し,Tbx6遺伝子をマウスのES細胞あるいはヒトのiPS細胞といった多能性幹細胞に導入することにより,液性因子を使用せずに心臓中胚葉細胞の分化が可能であることが見い出された.このような中胚葉の分化の機序を解明するため,Mesp1遺伝子に着目して転写因子であるTbx6が直接的に結合する遺伝子を探索した.Mesp1は生体において,あるいは,幹細胞からの中胚葉細胞および心血管系細胞への分化に重要な転写因子であると同時に,線維芽細胞におけるスクリーニングにおいてもTbx6遺伝子により発現が誘導されていた.そこで,ChIP-PCR法によりMesp1遺伝子を解析したところ,Mesp1遺伝子のエンハンサー領域にTbx6の結合が認められ,Tbx6によるMesp1遺伝子への直接的な結合による発現の誘導が明らかにされた.このように,ES細胞からの中胚葉細胞への分化において,Tbx6が直接的および間接的な機序により分化を制御することが明らかにされた.現在は論文投稿の準備中の段階である。新たな実験計画としては候補因子のノックアウトによる表現型の検討を考えているが、論文投稿と並行して実験を行う予定である。X因子Creトランスジェニックマウスを用いた生体内での細胞系譜解析:既存の報告では、X因子発現細胞に関してCre-loxPシステムを用いた詳細な細胞系譜解析は存在しない。そこで我々はCRISPR-Cas9システムを用いて、X因子Creトランスジェニックマウスを作製中である。現時点ではノックインに必要なベクターの設計が完了し、マウス胚への導入を施行済みである。本マウスが作成されれば、これまでは詳細が不明であった、発生分化初期からのX因子
ロウ石鉱床産雲母粘土鉱物の鉱物学的研究

本研究では、中国地方に分布する代表的なロウ石鉱床について、その主要構成鉱物の1つである絹雲母鉱物の産状を調査し、さらにX線分析、化学分析、熱分析の実験を行なって絹雲母鉱物の鉱物学的特質を明かにすることを目的にした。得られた成果は以下の通りである。1.絹雲母鉱物のX線的性質や層間化学組成の性質が鉱床と鉱床の産状によって著しく変化する。典型的なロウ石鉱床(岡山県三石地区八木鉱山)では、層間のカリウムが一部アンモニウムによって置換される化学組成上の特徴に加えてモンモリロナイトとの混合層鉱物を形成し、モンモリロナイトの割合は珪化帯,班入り陶石化帯,ロウ石化帯の変質帯に合わせて増加する傾向を示す。一方、高温型の山口県宇久鉱山では絹雲母の結晶度が極めて高く、アンモニウムによる置換もほとんど認められない。結晶学的な積層構造も前者が2【M_2】のポリタイプで特徴づけられるのに対して後者は2【M_1】型を示す。また、テレスコープ型ロウ石鉱床に属する広島県豊蝋鉱山の絹雲母鉱物には八木鉱山と宇久鉱山産試料の中間の性質が認められる。2.ロウ石産絹雲母鉱物の諸性質の中では、窯業原料鉱物として熱的な性質が注目され、特に含アンモニウム雲母鉱物の加熱特性が明かにされた。通常のカリウム雲母鉱物では500-600°C間で構造水の単純な脱水反応が進行するだけであるが、層間にアンモニウムを含むと、400-500°Cでアンモニアガスとなって離脱するために一時的に水素雲母が形成され、この水素雲母からは引き続き700-800°Cの比較的高温で構造水の脱水がゆっくりと進行して1000°Cのムライト生成につながる。この一連の熱反応は体積の著しい収縮を伴っており、含アンモニウム雲母鉱物の重要な加熱特性と考えられる。