hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト疾患モデルマーモセットを用いたゲノム編集による遺伝子修復治療技術の確立

ヒト疾患モデルマーモセットを用いたゲノム編集による遺伝子修復治療技術の確立を目指し、先ず、切断効率の良いCIRSPR-Cas9の種類と標的DNA配列の組み合わせを検討した。標的となるIL2RG遺伝子エクソン3のDNA変異部位の近辺を標的とするSpCas9やCpf1などの様々なCRISPRタンパク質の変異体とガイドRNAと合わせて、最も切断活性の高い組み合わせを同定した。さらにそのCRISPRとIL2RG領域の修復用ドナーDNAとを用いて、全細胞の約90%という高頻度で相同組換え修復を達成した。それをさらにヒトCD34陽性造血幹前駆細胞に適応した。電気穿孔法でCas9とガイドRNAとを複合体の形で導入し、直後に遺伝子修復用のドナーDNAとして、IL2RG遺伝子座の相同DNA配列に挟まれたVenusレポーター遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターを用いて導入した。その結果、38%の高効率で標的IL2RG遺伝子座にVenus遺伝子が組み込まれた。これらの細胞で造血コロニーアッセイを行いPCRにより遺伝子修復の割合を確認すると、相同組み換えが40%で検出された。次にマーモセットCD34陽性細胞で同様の実験を行なったところ、Venus陽性細胞は約30%であった。次に、遺伝子修復の安全性を高める方法として、1)ゲノムワイドなオフターゲット切断部位の同定と、2)ネガティブ選択法によって修復用ドナーDNAのランダムな部位への組込みを除く方法とを、検討した。1)についてはゲノムワイドなオフターゲット切断部位を検出するために、CIRCLE-seq法を導入した。2)については、BRD4遺伝子に対するshRNAを利用した選択法に加えて、iCaspase9自殺遺伝子を利用する技術の開発を行った。現在のところ選択効果がそれほど顕著に見られず、更なる条件の至適化が必要だと考えられる。「目的1:ゲノム編集の効率化」遺伝子修復の効率を上げる方法として、1) CRISPR-Cas9の効率の良い発現と、2)修復の鋳型DNAの効率の良い導入の2点から検討した。SpCas9タンパク質とヒトもしくはマーモセットのIL2RGもしくはHPRT遺伝子座を標的としたガイドRNA(gRNA)とを発現する方法として、Cas9 mRNA + gRNA、RNP(Cas9タンパク質とgRNAとの複合体)、プラスミドDNA、E1欠損型アデノウイルスベクターDNA、ヘルパー依存型アデノウイするベクターDNAならびにアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターDNAを構築した。また、それぞれの遺伝子座にマーカー遺伝子をゲノム編集で組み込みためのドナーDNAをコードした、プラスミドDNA、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターDNAならびにAAVベクターDNAを構築した。「目的2:ゲノム編集の安全化」遺伝子修復の安全性を高める方法として、1)人工制限酵素の活性を制御してオフターゲット切断を減少させる方法と、2) shRNAを利用したネガティブ選択法によって修復用ドナーDNAのランダムな部位への組込みを除く方法とを検討している。Cas9の活性を厳密に制御するために、合成抗菌剤トリメトプリム(TMP)の添加によって蛋白質の安定を制御できる大腸菌DHFR遺伝子断片をCas9に融合した制御可能Cas9(ddCas9)遺伝子を作製した。また、このタンパク質が発現することを、培養細胞でウエスタンブロット法によって確認した。shRNAを利用した新規のネガティブ選択法については、既に候補としているRRP-12遺伝子に対する何種類かのshRNA発現カセットを搭載したAAVベクターを構築した。ヒトiPS細胞で実験を行ったが、用いたAAVの血清型では遺伝子発現効率が低いため、他の血清型をスクリーニングした。「目的1:ゲノム編集の効率化」CRISPRを発現する様々なウイルスベクターなどのプラスミドDNAは完成し、一部はDNAレベルで血液系の培養細胞(K562)で活性を検討した。ウイルスまで産生するという当初の予定通りには行かなかったが、その一方で、多様なドナー用ベクターDNAも構築した。それに加えて、ゲノム編集を蛍光の発光で安易に測定できる293細胞とK562細胞を樹立出来た。これらの点から、当初とは予定が違うが十分の進捗は得られたと考える。また、現在入手可能な唯一のマーモセット由来細胞株であるマーモセットのES細胞を理研細胞バンクより入手した(初代細胞は、線維芽細胞を実中研より入手済み)。しかし、この細胞の培養はフィーダー細胞が必要であり、遺伝子導入を妨げる。しかし、工夫することによって3継代はフィーダー細胞なしで培養出来たので、今後その方法で遺伝子導入・ゲノム編集法を検討する予定である。この点は、予期しなかった問題を上手く解決出来たと考える。「目的2:ゲノム編集の安全化」私達は既にヒトES/iPS細胞の増殖に関与するRRP-12遺伝子を標的としたshRNAを用いたネガティブ選択が有用であることを示した。これらをコードするHPRT標的AAVベクターを産生したが、上記のように血清型が至適ではなかった。そこで様々な血清型をスクリーニングし直して、DJと呼ばれる血清型が非常に高い効率でヒトiPS細胞に遺伝子を導入することを見出した。一方、このshRNAが血液細胞で働くかについてはまだ検証出来ておらず、今後の課題である。「目的1:ゲノム編集の効率化」ゲノム編集による遺伝子修復の効率を上げる方法として、切断効率の良いCIRSPR-Cas9の種類の検討と、修復部位を標的とするガイドRNAの検討を行なった。CRISPRタンパク質には一般的に使用されているSpCas9以外にも、サイズが小さくアデノ随伴ウイルスベクターに挿入可能なSaCas9、オフターゲット切断の少ないCpf1などが存在する。

それらのCRISPRタンパク質は対応するガイドRNAの配列も異なるため、目標となるIL2RG遺伝子の変異部位を標的とするガイドRNAと合わせて、最も切断活性の高いCRISPRタンパク質とガイドRNAの組み合わせをヒト血球系培養細胞を用いて同定した。さらにそのCRISPRとIL2RG領域の修復用ドナーDNAとを用いて、全細胞の約90%という高頻度で相同組換え修復を達成した。「目的2:ゲノム編集の安全化」遺伝子修復の安全性を高める方法として、1)ゲノムワイドなオフターゲット切断部位の同定と、2) shRNAを利用したネガティブ選択法によって修復用ドナーDNAのランダムな部位への組込みを除く方法を検討している。少ない細胞数でゲノムワイドなオフターゲット切断部位を検出するために、CIRCLE-seq法の技術を導入した。CIRCLE-seq法は、対象とするゲノムDNAを環状にした後にCRISPRで切断し、その部位をディープシーケンスすることにより高感度でオフターゲット部位を同定することができる。shRNAを利用したネガティブ選択法については、造血系細胞の生存に関わるBRD4遺伝子に対するshRNAを修復ドナーDNAの末端に挿入することにより、ドナーDNAがランダムにゲノムに組み込まれた場合にはBRD4遺伝子がノックダウンされて細胞の増殖を抑制する。そのための修復用ドナーAAVベクターを構築している。「目的1:ゲノム編集の効率化」これまでに樹立したゲノム編集を蛍光の発光(GFP)で安易に測定できる血液系のヒト培養細胞(K562細胞)を用いて、SpCas9、SaCas9、Cpf1などのCRISPRタンパク質を発現するプラスミドと、それらに対応するいくつかのガイドRNAを発現するプラスミドを用いて切断活性の検討を行なったところ、SpCas9を用いた組み合わせで最大60%の蛍光が検出できた。SpCas9タンパク質とガイドRNAをin vitroで直接混合して作るRNP複合体と、蛍光遺伝子を含んだ修復用ドナーDNAをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてK562細胞に導入すると、切断活性の高いCRISPRの組み合わせで、細胞を選択することなく全細胞の約90%という高効率で遺伝子の組み換えが検出できた。「目的2:ゲノム編集の安全化」1) K562細胞から抽出したゲノムDNAを用いて、CIRCLE-seq法の技術を確立させた。Covaris社の超音波破砕機で平均300bpに断片化したゲノムDNAの末端を酵素で修復し、ライゲーションを行うことでゲノム配列由来の環状DNAのライブラリーを作製した。その環状DNAライブラリーにSpCas9とIL2RG遺伝子をターゲットとするガイドRNAのRNP複合体を加えることにより、目的配列とオフターゲット配列を含む環状DNAが切断される。
モデル生物を用いた減数分裂期におけるTORC1の活性化と生理機能の分子機構の解明

TORC1 (Target of rapamycin complex 1)キナーゼは栄養シグナルを感知して細胞の成長や増殖を制御する。本研究ではモデル生物の分裂酵母(S. pombe)を用いて,窒素源飢餓でおこる減数分裂期におけるTORC1の活性制御機構およびその機能の検討を行った。減数分裂特異的にTORC1の活性化が起こることを明らかにし,それに関わる2つの分子を同定した。またTORC1が遺伝子発現調節を介して適切な減数分裂進行に関わることを明らかにした。本成果は減数分裂期におけるTORC1機能制御の新しい分子モデルとなることが期待される。目的:TORC1キナーゼは生育環境中の栄養シグナルを受け、細胞の主要な機能を制御する。本研究では、モデル生物である分裂酵母の減数分裂過程におけるTORC1の活性制御メカニズムおよび生理機能を明らかにし、生殖細胞におけるTORC1の分子機能モデルの構築を目指す。研究代表者は、減数分裂でのTORC1活性制御について、減数分裂(減数分裂前DNA合成、第一および第二減数分裂)の各プロセスで進行が停止する遺伝子変異株を用いTORC1活性化の起点となっているプロセスを特定し、その活性化に重要な働きをする分子の1つを同定した。この分子は減数分裂時に特に機能を発揮するタンパク質であり、TORC1との相互作用は今後の課題である。一方、体細胞分裂においてTORC1制御に関わる上流因子が、減数分裂期のTORC1に対しても同様に作用することが明らかとなり、TORC1を制御する分子として減数分裂特異的分子と体細胞分裂と共通の分子が協調的に作用する、大変興味深い可能性が示唆された。また、ラパマイシンによりTORC1機能を阻害すると、減数分裂進行の遅延と一部の減数分裂関連因子のタンパク質発現に遅延が見られたことから、それら因子の発現をコントロールする分子、例えば転写因子、がTORC1の標的分子となる可能性が示唆された。体細胞分裂サイクルにTORC1は主に液胞膜上に局在する。TORC1構成因子の減数分裂での細胞内局在について予備的な実験を行い、体細胞分裂期とは異なる興味深い局在を示す結果が得られている。目的:TORC1キナーゼは生育環境中の栄養シグナルを受け、細胞の主要な機能を制御する重要な分子である。本研究では、モデル生物である分裂酵母(S. pombe)の減数分裂過程におけるTORC1の活性制御メカニズムおよび生理機能を明らかにし、生殖細胞におけるTORC1の分子機能モデルの構築を目指す。研究代表者は、減数分裂時にTORC1が細胞外栄養環境非依存的に強く活性化されることを明らかにしている。また、その減数分裂特異的なTORC1活性制御について、減数分裂の各プロセスで進行が停止する遺伝子変異株を用い、TORC1活性化の起点となるプロセスと活性化に必須な分子を昨年度同定したが、本年度においてもさらに、別の分子が減数分裂特異的TORC1の活性化に部分的関与することを突き止めた。この分子は体細胞分裂と減数分裂の両周期の進行に関わることが知られている。また、哺乳類細胞ではG2-M期移行期にこの分子とTORC1との相互作用が知られているが、減数分裂時では詳細は明らかとなっていない。さらに、減数分裂時にTORC1の機能を阻害すると、特に減数分裂前DNA複製の開始の遅延が示され、DNA複製に関わるいくつかの分子の発現異常が認められた。このことは、TORC1が減数分裂時にDNA複製の開始に関わること、そして減数分裂前DNA複製を含め、減数分裂進行に関わる分子群の発現調節に関わっていることを示唆している。このTORC1の性質はこれまでにどの生物種においても報告されていない。また、TORC1は通常主に液胞膜上に局在するが、減数分裂進行時には体細胞分裂期とは異なる特徴的な局在を示しており、その生理的な意義の解析を進めている。本年度も減数分裂でのTORC1活性制御機構について解析を進め、重要な働きをする分子を昨年度に続き同定し、減数分裂時のTORC1の役割として減数分裂前DNA複製開始への関与およびDNA複製に関わる分子の発現制御への関与が明らかとなり、減数分裂特異的なTORC1活性制御の分子メカニズムの解明が進んだ。これらの結果を受け、関連分子とTORC1とのより直接的な相互作用の検証へと進むことが可能となった。また、この減数分裂特異的なTORC1の制御機構は、これまで知られている栄養依存的なメカニズムとは独立的に働いている可能性が高いことも示唆され、全く知られていない制御メカニズムを提示できるかもしれない。さらに減数分裂期のTORC1の細胞内局在は、体細胞分裂時の液胞膜上とは異なるユニークな局在化を示す結果が得られており、その局在は、TORC1が減数分裂前DNA複製開始制御以外の減数分裂のイベントへの関与の可能性を示唆しており、研究の新たな展開が期待できる。目的:TORC1キナーゼは生育環境中の栄養シグナルを受け、タンパク合成や細胞の主要な生理機能を制御する重要な分子である。また、その減数分裂特異的なTORC

1活性制御について、減数分裂の各プロセスで進行が停止する遺伝子変異株を用いて、TORC1活性化の起点となるプロセスと活性化に必須なRNA結合タンパクを同定し、さらに、別の分子(プロテインキナーゼ)が減数分裂特異的TORC1の活性化に部分的関与することを突き止めた。このプロテインキナーゼは減数分裂のいくつかのフェーズの進行に関わることが知られているが、減数分裂初期における機能がTORC1の制御に関わることが示唆された。ただ、今回明らかとなった減数分裂の機能分子とTORC1との相互作用は、直接的なものか、別の分子を介した間接的なものかはさらに詳細な解析が必要である。また、減数分裂時にTORC1の機能を特異的に阻害すると、減数分裂前DNA複製の開始の遅延が示され、減数分裂進行に関わるいくつかの分子の発現異常が認められた。この結果は、TORC1が減数分裂に必要な分子群の発現を制御することで減数分裂進行に関わることを示唆している。このTORC1の性質はこれまでにどの生物種においても報告されていない。また、TORC1は通常、体細胞分裂期には主に液胞膜上に局在するが、減数分裂進行時では体細胞分裂期とは異なる特徴的な局在を示しており、その生理的な意義の解析を進めている。本年度も減数分裂でのTORC1活性制御機構について解析を進め、重要な働きをする分子を同定した。減数分裂時のTORC1の役割として減数分裂前DNA複製開始への関与およびDNA複製に関わる分子の発現制御への関与が明らかとなり、減数分裂特異的なTORC1活性制御の分子メカニズムの解明が進んだ。これらの結果を受け、関連分子とTORC1とのより直接的な相互作用の検証へと進むことが可能となった。また、この減数分裂特異的なTORC1の制御機構は、オートーファジーによる栄養素のリサイクルの影響を受けるが、栄養依存的な制御に付加的に作用している可能性が高く、全く知られていない制御メカニズムを提示できるかもしれない。さらに減数分裂期のTORC1の細胞内局在は、特徴的な局在化を示す結果が得られており、TORC1が減数分裂前DNA複製開始制御以外の減数分裂のイベントへの関与の可能性を示し、新たな展開が期待できる。TORC1キナーゼは生育環境中の栄養シグナルの変動を感知して,タンパク合成を含む同化作用とオートファジーなどの異化作用をコントロールして細胞の成長や増殖を制御する重要な分子である。本研究ではモデル生物の分裂酵母(S. pombe)を用いて低栄養状態で誘導される減数分裂におけるTORC1の制御メカニズムおよび機能を明らかにし,生殖細胞の分化過程におけるTORC1の分子機能モデルの構築を目指す。研究代表者は減数分裂時にTORC1が栄養環境非依存的,すなわち内因的な要因により強く上方調節されることを見出している。そのTORC1制御について,減数分裂の各プロセスに関わる分子の遺伝子変異株を用いて活性化に関わる分子の解析を進めた。その中でプロテインキナーゼの一つが減数分裂特異的なTORC1活性化に部分的に関与することを突き止めた。この分子は減数分裂の複数のプロセスに関わることが知られているが,減数分裂初期の機能がTORC1制御に関わることが示唆された。
人間を直接把持する救助ロボットのためのマルチセンサ制御システム

本研究は、大震災やトンネル崩壊などの大規模災害の被災者に対して、ロボットが人間を直接把持して救助するロボットシステムを開発することを目的としている。本研究は3年計画であり、初年度には、被災者を直接救助する方法についての動作分析と検討を行い、救助ロボットの基本形態と機能を設計した。さらに、人間を直接把持するためのロボットハンド部と、触覚や力覚、すべり覚などのセンシング機能に関する検討を行った。第2年度では、マルチセンサ融合処理システムを構築し、把持の方法、把持力の決定、および人間の体の引き上げ制御に対応できるようにした。ここでは、救助ロボットモデルとして、クローラによる移動機能を持つ台車に主アームとして5軸垂直多関節型ロボットを設置した。また、サブアームとして、水平関節ロボットをおいた。ロボットハンドは、順応型2本指ハンドとし、主アームとサブアーム同一形態とした。ただし、サブアームハンドはツールとして利用するため取り外し可能とした。このシステムモデルとダミー人形を用いて救助作業の基礎的な実験を行った。最終年度では、2年度に引き続いて救助ロボットシステムモデルの完成を目指した。1.人間の腕の把持と引き上げ制御アルゴリズムを確立し、実験によって有効性を確認した。2.作業ツールへの展開をすすめ、ツールにおける自律・操作制御系を確立した。3.救助搬送車から試作し、救助ロボットシステムを構築した。以上の結果から、本研究の成果をまとめると次のようになる。人間把持用ハンド部を取り付けた救助ロボットモデルを試作し、マルチセンサ融合と知識に基づくルールベーストおよび、操作自律強調系としての救助ロボット制御システムを確立し、モデル実験によってその有効性を確認した。さらに、その実用化に対する課題の抽出を行って研究をまとめた。本研究は人間を直接ハンドリングする救助ロボットのセンシングシステムおよび制御システムを開発する事を目的としている。本研究では、まず被災者を直接救助する方法についての動作分析と検討を行い、救助ロボットの基本的形態と機能を設計した。つぎに、人間を把持するためのロボットハンド部とそこにおける各種センシング機能に関する検討を行った。ここでは、既存の小型産業用ロボットのハンドに外力順応型ハンド機構を採用し、感圧導電性ゴムによる分布型触覚センサ、6軸力覚センサおよびボール型すべり覚センサを配置してマルチセンサ系とした。このセンサハンドを備えた主アームの他に、引き起こした被災者を支えるための補助アームを設置し、双腕型とした。さらに、本体部分の移動部に、クローラ機構を採用した移動機構を備えることにした。マルチ触覚センサ情報は融合処理され、把持方法の決定、把持力の制御および引き上げ軌道の修正に用いると同時に、被災者に危害が及ばないよう安全確保のために用いた。さらにこのロボットには、被災者位置計測・把持部設定用および作業監視用の2つのCCDカメラによる視覚センサを備えることにした。これらの機構を持つ救助ロボットの小型モデルを試作し、被災者ダミ-人形の救助作業実験を行った。ダミ-に対して、接近し、手首部分を把持し、把持部を引くことにより上半身を引き起こし、補助アームで横から抱き込むように支える救出・搬出作業の基本部分を安全に実現することができた。今後は、さらに多様な状況に対応するため双腕の協調制御、センサ情報処理の高速化と多様な情報の抽出、救出動作の確実性の向上などについて検討を加え、救助ロボットシステムの実現のための基本データを収集することにした。初年度にまず、被災者を直接救助する方法についての動作分析と検討を行い、救助ロボットの基本的形態と機能を設計した。

ここでは、ロボットのハンドに外力順応型ハンド機構を採用し、分布型触覚センサ、6軸力覚センサおよびすべり覚センサを配置してマルチセンサ系とした。このセンサハンドを備えた主アームの他に、引き起こした被災者を支えるための水平多関節型の補助アームを設置し、双腕型としている。本年度では、これらマルチ触覚センサ融合処理を効率化し、把持方法の決定、把持力の制御および引き上げ軌道の修正が適切にかつ迅速にできるシステムとした。さらに、補助アームのハンド部分を取り外し可能とするとともに、狭い隙間に挿入して強い力で拡幅できるような自動制御/手動操作両用の救助用ハンドとした。これらの機構をもつ双腕救助ロボットの小型モデルを用いて、ダミー人形の救助作業実験を行ない、多様な状況に対応するため双腕の協調制御、センサ情報処理の高速化と手動操作/自動制御の協調による救出動作の確実性の向上などについて検討を加えた。過去2年間の成果をふまえて研究を進め、提案する救助ロボットシステムの基礎的な技術の開発の目的を完成させた。今年度の内容および最終結果は以下の通りである。1.人間の腕の把持と引き上げ制御アルゴリズムの確立人間把持用ハンド部を取り付けた救助ロボットモデルを使用し、マルチセンサ融合と知識に基づくルールベースト制御および、操作自律協調系としての制御システムを確立した。2.作業ツールへの展開ロボットハンドを切り離して約1.5メートルのアルミ円筒に取り付け、ツールとして用いることのできる機構を構成し、人間の把持と隙間拡幅の両機能をもつ実用的なツールシステムを製作した。このツールには分布型触覚センサを取り付け把持状況が判断できるようにした。3.救助搬送車の試作被救助者を載せて搬送する機構を構成し、システム付加した。このシステムのモデル実験をおこなってその効果を検証した。また、作業用ツールの有効性についても併せて検討した。4.救助ロボット制御システムの実用化への検討本研究で開発した全体のシステムが救助ロボットのツールおよび自律マニピュレータ、搬送システムとして有効であることが示された。さらに、その実用化に対する課題の抽出を行って研究をまとめた。
特殊ラグランジュ部分多様体と可積分系へのループ群論的アプローチ

前年度に引き続き, 3次元特殊ラグランジュ部分多様体と可積分系の対応を,ループ群論の手法を用いて定式化することを目標とした.複素3次元ユークリッド空間の特殊ラグランジュ部分多様体(特殊ラグランジュ錐)と,代表的な可積分系の一種である戸田格子方程式の解は,具体的な対応関係をもつ.報告者はその対応関係を,一般化されたワイエルシュトラス型表現公式とよばれる調和写像の構成法を介して,ループ群の観点より特徴付けた.この結果は論文"A cnstruction of special Lagrangian 3-folds via the generalized Weierstrass representation"にまとめ,近く出版予定である.また,この対応は同時に,或る二つの等質空間同士の対応として捉えることも出来得ると思われる.その相違について,本年度はこれらの間の変換写像として定式化すべく考察を行い,明示的な結果は得られていないものの,いくつかの進展を得た.この研究については今後も続けていく方針である.また,複素4次元ユークリッド空間のある超曲面として定義される複素錐の特殊ラグランジュ錐についても上述の結果の類推が成り立つかどうか考察した.複素ユークリッド空間でない,より一般のカラビーヤウ多様体上の特殊ラグランジュ部分多様体については未だあまり知られておらず,その例を与える試みとしてこの考察は意義があるものと思われる.これに関してまとまった結果は未だ得られていないが,引き続き考察を続けていく。(抄録なし)3次元特殊ラグランジュ部分多様体と可積分系の対応を,ループ群論の手法を用いて定式化することをその目的とした.具体的には,一般化されたワイエルシュトラス型表現公式とよばれる調和写像の構成法を応用して,複素ユークリッド空間の3次元特殊ラグランジュ錐及び戸田格子方程式を構成し,その関係性を考察した.その対応自体の定式化は未だ考察中であるが,特殊ラグランジュ錐を与える上記表現公式の初期値となるループ群値正則1形式を完全に決定した.また,特殊ラグランジュ錐が非特異及び自明(3次元複素ユークリッド空間内の3次元実ベクトル空間)となる場合の上記正則1形式の形も定めることが出来た.橋本・酒井氏は論文"Cohomogeneity onespecialLagrangian submanifolds in thecotangent bundle of the sphere"の中で,斉次多項式として複素錐を与え,それがカラビ-ヤウ多様体であることを証明したのであるが,本年度はこの複素錐の特殊ラグランジュ部分多様体を,今までの研究からの類推により構成することを試みた.これは現在進行中であるが,(複素ユークリッド空間でない)一般のカラビ-ヤウ多様体の特殊ラグランジュ部分多様体の例はまだあまり得られておらず,実際に構成が出来れば,特殊ラグランジュ部分多様体そのものの性質等を考察するのに意義がある.また,上記の類推が成り立てば,同時に対応する可積分系が得られる可能性が大いにあり,これは可積分系理論の観点からも大変興味深い.前年度に引き続き, 3次元特殊ラグランジュ部分多様体と可積分系の対応を,ループ群論の手法を用いて定式化することを目標とした.複素3次元ユークリッド空間の特殊ラグランジュ部分多様体(特殊ラグランジュ錐)と,代表的な可積分系の一種である戸田格子方程式の解は,具体的な対応関係をもつ.報告者はその対応関係を,一般化されたワイエルシュトラス型表現公式とよばれる調和写像の構成法を介して,ループ群の観点より特徴付けた.この結果は論文"A cnstruction of special Lagrangian 3-folds via the generalized Weierstrass representation"にまとめ,近く出版予定である.また,この対応は同時に,或る二つの等質空間同士の対応として捉えることも出来得ると思われる.その相違について,本年度はこれらの間の変換写像として定式化すべく考察を行い,明示的な結果は得られていないものの,いくつかの進展を得た.この研究については今後も続けていく方針である.また,複素4次元ユークリッド空間のある超曲面として定義される複素錐の特殊ラグランジュ錐についても上述の結果の類推が成り立つかどうか考察した.複素ユークリッド空間でない,より一般のカラビーヤウ多様体上の特殊ラグランジュ部分多様体については未だあまり知られておらず,その例を与える試みとしてこの考察は意義があるものと思われる.これに関してまとまった結果は未だ得られていないが,引き続き考察を続けていく。今年度までの研究を論文にまとめるのに時間を要したことと,上記にあるように橋本・酒井氏によるカラビーヤウ多様体の特殊ラグランジュ部分多様体の構成について考察を行った為,当初の研究計画が若干遅れることとなった.今年度の研究目標であった,3次元特殊ラグランジュ部分多様体と戸田格子方程式の関係を,各々から得られる等質空間同士の対応として定式化することを試みる.これにより,特殊ラグランジュ部分多様体を与える偏微分方程式と戸田格子方程式の相違をみる.並びに2年目の研究計画として,特殊ラグランジュ部分多様体に対応するループ群のクラスの幾何学的性質を考察する.さらに,今年度取り組んだ,上記の複素錐に対する特殊ラグランジュ部分多様体の構成をする.(抄録なし)
スコットランド啓蒙の文明社会史論と経済学―スミスとロバートソンを中心に

2018年6月にマドリード大学にて開催された欧州経済思想史学会(ESHET)において、`National Defence and the Wealth of Nations in Adam Smith'との題目で研究発表を行った。アダム・スミスについての研究書『アダム・スミスの商業文明』(仮題)の根幹部分の議論を発展させることができた。続けて9月に明治大学で開催されたInternational Conference on Economic Theory and Policyでは、`Adam Smith on the State: Cosmopolitan or Economic Nationalist?'との題目で、同じ議論をさらに別角度から捉え直すことができた。また、11月に徳島文理大学大学院総合政策学研究科にて行われた総合政策学研究会第6回研究例会では、「スコットランド啓蒙ー社会科学の源流」との題目で発表を行い、上記のスミスの議論を含めて、スコットランド啓蒙の文明社会史論について、あらためて振り返ることができた。発表の要旨を、11月に出版された『歴史と地理』(山川出版社)第719号に掲載された「読書案内啓蒙思想」で、一般向けに紹介した。交付申請書に記載した「平成30年度の研究実施計画」から細部が変更されたものの、アダム・スミスについての研究書の執筆を継続した。6月の欧州経済思想史学会(ESHET)での個別研究報告の後、夏季にはスコットランドのエディンバラ大学、およびスコットランド国立図書館(NLS)において資料収集等を行い、エディンバラの研究者と意見交換を行うことも、研究実施計画の通りに実行出来た。アダム・スミスについての研究書の執筆を継続する。並行して2019年6月にニューヨークのコロンビア大学にて開催される北米経済学史学会(HES)において個別研究報告を行う。続けて9月に明治大学で開催されるInternational Conference on Economic Theory and Policy、および10月にシドニー大学にて開催されるオーストラリア経済思想史学会(HETSA)においても、スミスについての個別研究報告を行う予定である。また、11月にキャンパスプラザ京都・京都大学サテライト講習室にて行われる日本ピューリタニズム学会関西部会では、ウィリアム・ロバートソンについての個別研究報告を行う予定である。アダム・スミス研究としては、東洋大学で12月に開催されたシンポジウム「18世紀ブリテン世界におけるコスモポリタニズムーヒューム、スミス、バークの所論から」にて、「経済思想史における国家、ネイション、コスモポリタニズムー重商主義からアダム・スミスを中心に」との題目で、また北海道大学東京オフィスで2017年3月に開催された「戦争と平和の経済思想」第2回研究会では、「礫岩政体、自然法、通商ー近世欧州の戦争と経済」との題目で研究発表を行った。交付申請書に記載した「平成28年度の研究実施計画」から細部が変更されたものの、アダム・スミスについての研究書の執筆を継続した。6月の北米経済学史学会(HES)での個別研究報告の後、夏季にはスコットランドのエディンバラ大学、およびスコットランド国立図書館(NLS)において資料収集等を行い、大学院時代の指導教官であったNicholas Phillipson氏等、エディンバラの研究者と意見交換を行うことも、研究実施計画の通りに実行出来た。並行して、「「第三の道」をめぐる英国政策事情ーブレア労働党政権10年史(1997-2007年)」と題する論文を、徳島文理大学大学院総合政策学研究科・編『総合政策学入門』(晃洋書房、2017年11月)の第8章として出版し、そのエッセンスを慶應義塾大学で12月に開催されたイギリス哲学会関東部会第100回研究例会にて、「英国現代社会民主主義における平等の概念」と題して研究発表した。現代の英国政治におけるスミスの影響の一端を掘り起こすことで、18世紀啓蒙の文明社会史論の射程の広さと現代的意義を再認識することができた。交付申請書に記載した「平成29年度の研究実施計画」から細部が変更されたものの、アダム・スミスについての研究書の執筆を継続した。

6月の欧州経済思想史学会(ESHET)での個別研究報告の後、夏季にはスコットランドのエディンバラ大学、およびスコットランド国立図書館(NLS)において資料収集等を行い、エディンバラの研究者と意見交換を行うことも、研究実施計画の通りに実行出来た。アダム・スミスについての研究書の執筆を継続する。並行して2017年6月の北米経済学史学会(HES)において個別研究報告を行う。夏季には昨年に引き続き、英国エディンバラで短期の在外研究を行う予定である。並行して2018年6月の欧州経済学思想史学会(ESHET)において個別研究報告を行う。並行して2019年6月にニューヨークのコロンビア大学にて開催される北米経済学史学会(HES)において個別研究報告を行う。続けて9月に明治大学で開催されるInternational Conference on Economic Theory and Policy、および10月にシドニー大学にて開催されるオーストラリア経済思想史学会(HETSA)においても、スミスについての個別研究報告を行う予定である。また、11月にキャンパスプラザ京都・京都大学サテライト講習室にて行われる日本ピューリタニズム学会関西部会では、ウィリアム・ロバートソンについての個別研究報告を行う予定である。次年度に旅費がかさむため、多少の予算を残して支出した。(理由)次年度に旅費がかさむため、多少の予算を残して支出した。(使用計画)交付申請書の研究実施計画で記した通り、海外での学会発表と夏季の在外研究の費用として用いる計画である。交付申請書の研究実施計画で記した通り、海外での学会発表の費用として用いる計画である。交付申請書の研究実施計画で記した通り、海外での学会発表と夏季の在外研究の費用として用いる計画である。
循環系のオーファン受容体を特異的に細胞内移行させる未知の生理活性ペプチドの探索

G蛋白共役型受容体(GPCR)の多くが、特異的なリガンドの結合により速やかに細胞内移行(インターナリゼーション)する。これまで、種々の培養細胞(HEK-293細胞やCHO細胞)に安定発現させたオーファン受容体(リガンドが未定の受容体の総称)の細胞内セカンドメッセンジャー(cAMPやCa^<2+>)を標的に未知の生理活性物質がいくつも同定されてきたが受容体の細胞内移行を標的にして成功した例は皆無である。今回、循環系の臓器(ブタの左心房、左心室、肺、腎臓、副腎)の抽出液を可能な限り大量に獲得し、濃縮した。その一部を酸化に十分注意(ペプチドのCYs-Cys開裂を防止)しながら凍結乾燥して細胞培養用の培地(サンプル中のペプチドの吸着を防ぐため含有BSAの濃度を1%に増加した)に再溶解し、サンプルを調整した。一方、2種の安定発現系(class Bのヒトオーファン受容体2種)のクローンのうち、FACS解析で細胞膜発現の最も低いものを選定し直し、前述のサンプルを個別に添加したが、蛍光顕微鏡とFACS解析でリガンド依存性の細胞内移行を確認することが出来なかった。我々が樹立したアドレノメデュリン(AM)受容体サブタイプの安定発現系(Kuwasako, et. al. J. Biol. Chem. 2000)に、高濃度のAMが存在するブタ副腎の抽出液を添加したところ、いずれの受容体サブタイプも迅速に細胞内移行したことから、方法論やアッセイの手順に問題はなかったと思われる。種々の条件検討を十分に行った結果、class Bの別のオーファン受容体を用いるのが最適と考え、現在、検討し直している。クラスBのG蛋白共役型受容体(GPCR)のリガンドはペプチドである。したがって、我々はこのクラスに属するオーファン受容体を標的にし、そのリガンドの同定を目指している。これまでの研究の進行状況は極めて順調であり、下記の(1)-(5)の成果を得ることができた。(1)独自にデザインしたプライマーを用いてRT-PCRを行い、ヒトの循環系の臓器(心臓/肺/腎臓/副腎)に高発現している2つのオーファン受容体を選定した(GPCR_AおよびGPCR_B)。(2)PCR法により、それらの遺伝子(完全長)を獲得した。(3)各遺伝子のシグナル配列の直後にV5タグを付加し、さらに終止コドンを欠如させた3'端にGFP遺伝子を融合させて、発現ベクター(pCAGGS/Neo ; Kuwasako et al.(2000)J.Biol.Chem.)に組み込んだ。(4)リポフェクタミン法を用いて、それらの融合遺伝子(V5-GPCR_A-GFPおよびV5-GPCR_B-GFP)をHEK-293細胞(当該研究に最も適した培養細胞)に導入し、G418(ネオマイシン)による薬剤選別を行った。数週間後に、二重染色を行い、V5タグとGFPが共発現しているクローンをそれぞれ3つずつ獲得した(標的受容体の細胞膜発現は、FACS解析で定量した)。(5)当教室で確立した方法を駆使して、ブタ/ウシの組織(心房/心室/肺/副腎)を抽出した。今後、得られた組織抽出液を逆相HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過などに適宜展開して、リガンドを精製していく予定である。循環系の臓器(ブタ左心房、左心室、肺、腎臓、副腎)の断片を専用の抽出液で10分間煮沸し、十分に冷却した後にホモジナイズした。高速遠心後に得られた上清をろ過し、その一部を凍結乾燥してD-MEM培地(含0.1%BSA)に再溶解したものを2種の安定発現系(class Bのヒトオーファン受容体2種)に個別に添加したが、リガンド依存性の細胞内移行を確認することができなかった。我々が樹立したアドレノメデュリン(AM)受容体サブタイプ(3種)の安定発現系にAMが高濃度存在するブタ副腎の抽出液を添加したところ、いずれの受容体も速やかに細胞内移行したことから、方法論やアッセイの手順に問題はないと思われる。(1)たまたま細胞内移行を惹起しないオーファン受容体を選択してしまった可能性、(2)受容体の細胞膜発現が強すぎる可能性(一般に、受容体の細胞膜発現が強いほどリガンド依存性の細胞内移行を惹起しにくい)、(3)リガンドの塩基性や疎水性が高いためにビーカーやチューブに吸着してしまった可能性、(4)リガンド内にCys-Cys結合が存在する場合、その結合が酸化などによる開裂で活性を失っている可能性、(5)組織抽出液中の標的物質の濃度が低い可能性などが考えられる。それぞれに対して、我々は次のような対策を講じている。(1)他のオーファン受容体の安定発現系を獲得する。(2)上記の2つのオーファン受容体において、FACS解析で細胞膜発現の最も弱いクローンを用いる。(3)ペプチドの吸着を抑えるTriton(細胞毒性が高いのでアッセイ前に除去)を加えるかBSA濃度を上げる。(4)サンプルが酸化されないよう注意する。(5)組織抽出液を大量に獲得し、濃縮する。一般に、リガンドと結合したG蛋白共役型受容体のほとんどが、様々な分子(プロテインキナーゼA(PKA)やPKCなど)と干渉することが知られているが、オーファン受容体の異分子間干渉を標的にして新規生理活性ペプチドを同定したとする報告は皆無である。

そこで、我々は上記のオーファン受容体の安定発現系にPKAとPKCを別々に安定発現させた二重安定発現系を樹立して、FRET解析で蛋白間の干渉を認めた分画の精製を目指すべく研究も展開している。G蛋白共役型受容体(GPCR)の多くが、特異的なリガンドの結合により速やかに細胞内移行(インターナリゼーション)する。これまで、種々の培養細胞(HEK-293細胞やCHO細胞)に安定発現させたオーファン受容体(リガンドが未定の受容体の総称)の細胞内セカンドメッセンジャー(cAMPやCa^<2+>)を標的に未知の生理活性物質がいくつも同定されてきたが受容体の細胞内移行を標的にして成功した例は皆無である。今回、循環系の臓器(ブタの左心房、左心室、肺、腎臓、副腎)の抽出液を可能な限り大量に獲得し、濃縮した。その一部を酸化に十分注意(ペプチドのCYs-Cys開裂を防止)しながら凍結乾燥して細胞培養用の培地(サンプル中のペプチドの吸着を防ぐため含有BSAの濃度を1%に増加した)に再溶解し、サンプルを調整した。一方、2種の安定発現系(class Bのヒトオーファン受容体2種)のクローンのうち、FACS解析で細胞膜発現の最も低いものを選定し直し、前述のサンプルを個別に添加したが、蛍光顕微鏡とFACS解析でリガンド依存性の細胞内移行を確認することが出来なかった。我々が樹立したアドレノメデュリン(AM)受容体サブタイプの安定発現系(Kuwasako, et. al. J. Biol. Chem. 2000)に、高濃度のAMが存在するブタ副腎の抽出液を添加したところ、いずれの受容体サブタイプも迅速に細胞内移行したことから、方法論やアッセイの手順に問題はなかったと思われる。種々の条件検討を十分に行った結果、class Bの別のオーファン受容体を用いるのが最適と考え、現在、検討し直している。
災害現場におけるクラッシュ症候群の新規重症度判定法の樹立と初期治療戦略の開発

本研究は、瓦礫の下敷きになったヒトたちが生じるクラッシュ症候群の治療が、病院搬送後に行われることで手遅れとなるケースを改善するため、現場で所持する医薬品などのなかで適切な治療を開発することを目的としている。平成30年度の研究結果の概要は、以下のとおりである。(1)アイシングの有効性について:ラットのクラッシュ傷害部にアイシング処置を30または180分間行うことで有効性を示すことが章となったが、特に、30分間のアイシング処置は低体温症状を起こさずに一時的にカリウムの全身循環を弱めることによって延命効果があった。加えて、急性期の後に問題とされる炎症反応を抑制することが明らかとなった。このアイシングの効果は、HMGB1、IL-6およびIL-10の発現を抑制し、ミトコンドリア自身の崩壊ならびに機能を改善することを明らかとした。本研究は、慢性期に問題となる虚血再灌流傷害に伴う全身炎症反応症候群を改善できる可能性を示唆した。(2)アドレナリンの予防的投与について:クラッシュ症候群の急性期の死因は、高カリウム血症による心不全や低循環性ショックなどであるが、エピネフリン投与は一時的な血中カリウム値の低下や血圧上昇作用を示すものの、投与6時間後以降はアドレナリンのβ作用が心機能亢進を引き起こし、傷害部位の血流を上昇させてカリウムの全身循環への放出性を高めることで生存率が上昇しなかった。つまり、単独使用は推奨されず輸液などを併用することで有効性を発揮できると考えられた。本研究は、瓦礫の下敷きになったヒトたちが生じるクラッシュ症候群が、混乱した現場の治療判断によって患者予後を大きく左右されていることから、現場レベルで正確な判断ならびに適切な治療を実施するための指標を皮膚状態を介して病態進展の予測することを目的としている。この関連性を明らかにすることで、クラッシュ症候群の皮膚による診断法を開拓する。1年目の研究目的は、以下のとおりである。(1)これまでに確立したウィスターラットクラッシュ症候群モデルは皮膚状態を評価するのに適していないことから、皮膚状態を評価するためのヘラレスラットクラッシュ症候群モデルによって、生存率、バイタルサイン、血液ガスパラメータ、生化学的マーカーなどによって再現性を評価する。(2)ヘアレスラットクラッシュ症候群モデルにおける皮膚の状態を、経表皮水分蒸散量測定、角質水分量測定、皮膚表面温度測定、皮膚色測定(紅斑・メラニン)、患部および全身の皮膚表面の血流量測定によって傷害性を評価する。(3)上記の1および2から得られた結果を踏まえて、皮膚状態を創刊する種々パラメータを明らかにし、その関連性から皮膚症状の進行メカニズムについて解明する。結果の概要は、ヘアレスラットクラッシュ症候群モデルがウィスターラットクラッシュ症候群モデルと同等に再現できた。その皮膚状態はクラッシュ傷害を受けた個所の皮膚傷害性が増大し、皮膚色は病態進行による赤色化から白色化に遷移した。すなわち再灌流による一時的な毛細血管拡張による赤色化と進展する全身虚脱による血流低下が白色化を進行したと考えられた。加えて、炎症惹起に伴うメラニン合成の低下も示唆された。皮膚傷害と病態進展の関連性の判定は、従来から用いられている重症度の指標(カリウムやCPKなど)と高い相関性を示し、初期の皮膚変化は後に進行する高カリウム血症の程度などの予想が可能であることも示唆された。動物種の変更に伴うクラッシュ症候群モデルの再現性が高いこともあって、皮膚状態の評価と病態進展の関連性の解析は、概ね計画通りに進行している。現在は、軽症度のタイプのヘアレスクラッシュ症候群モデルを構築中であり、皮膚症状と病態の関連性を評価している。これまでに明らかにしている重症度タイプのモデルと比較するには至っていない。2年目の研究結果の概要は、以下のとおりである。(1)アイシングの有効性について:ラットのクラッシュ傷害部にアイシング処置を5、30、60、180分間実施した。筋肉をアイシングすることで血流の抑制は可能であるがクラッシュ部に走行する血管自体の収縮がアイシング処置終了後から回復するため、カリウムが全身に放出してしまい生存性を高めることはできなかった。加えて、180分間アイシングを実施するとカリウム放出は抑制されるものの、低体温症状やアシドーシス進行によって顕著な生存性の延長は得られないことも明らかとなった。つまり、アイシングを実施する際は、医療機関への搬送が3時間程度の場合にのみ適用可能な処置と考えられた。(2)血管収縮剤(エピネフリン)の有効性について:クラッシュ症候群の急性期の死因は、高カリウム血症による心不全や低循環性ショックなどであるが、エピネフリン投与は一時的な血中カリウム値の低下や血圧上昇作用を示すものの、投与6時間後以降はアドレナリンのβ作用が心機能亢進を引き起こし、傷害部位の血流を上昇させてカリウムの全身循環への放出性を高めることで生存率が上昇しなかった。現在は、筋肉に分布する血管の収縮することを期待して傷害部位に投与した場合の有効性を調査している。(3)平成28年度実施したクラッシュされた皮膚傷害に関連する一酸化窒素メカニズムの予備調査:クラッシュした皮膚は、物理的な傷害では説明できない時間依存的な傷害が明らかとなった。その原因は炎症反応の進行であることが予想された。炎症性サイトカインは著しく上昇し一酸化窒素メカニズムにも著しい変化を示した。

アイシング処置ならびにアドレナリン投与は、血管収縮作用によって傷害部位からのカリウムの全身循環への放出抑制によって生存性を高めると予想したが、それぞれの処置には有効性がある反面で副次的な作用などによって血中カリウム値が高くなるり、その理由を明らかにするために時間を要したが概ね順調に進行している。アドレナリン投与を有効的な方法とすべく障害部位に投与するなどして、全身性の副次反応を低下可能な投与経路について現在検討中である。一方、炎症性メカニズムを調査する過程で皮膚免疫の低下を示すような知見が得られ、当初予定していない事案であるが平成30年度において解明する予定である。本研究は、瓦礫の下敷きになったヒトたちが生じるクラッシュ症候群の治療が、病院搬送後に行われることで手遅れとなるケースを改善するため、現場で所持する医薬品などのなかで適切な治療を開発することを目的としている。平成30年度の研究結果の概要は、以下のとおりである。(1)アイシングの有効性について:ラットのクラッシュ傷害部にアイシング処置を30または180分間行うことで有効性を示すことが章となったが、特に、30分間のアイシング処置は低体温症状を起こさずに一時的にカリウムの全身循環を弱めることによって延命効果があった。加えて、急性期の後に問題とされる炎症反応を抑制することが明らかとなった。このアイシングの効果は、HMGB1、IL-6およびIL-10の発現を抑制し、ミトコンドリア自身の崩壊ならびに機能を改善することを明らかとした。本研究は、慢性期に問題となる虚血再灌流傷害に伴う全身炎症反応症候群を改善できる可能性を示唆した。(2)アドレナリンの予防的投与について:クラッシュ症候群の急性期の死因は、高カリウム血症による心不全や低循環性ショックなどであるが、エピネフリン投与は一時的な血中カリウム値の低下や血圧上昇作用を示すものの、投与6時間後以降はアドレナリンのβ作用が心機能亢進を引き起こし、傷害部位の血流を上昇させてカリウムの全身循環への放出性を高めることで生存率が上昇しなかった。つまり、単独使用は推奨されず輸液などを併用することで有効性を発揮できると考えられた。軽症度のクラッシュ症候群モデルの皮膚症状の解析ならびに病態の解析を行っている。同時に、2年目に計画している、治療・処置による効果の解析は、重症度・軽症度のクラッシュ症候群モデルを使用したクラッシュ部のアイシング処置の効果について予備検討中である。アドレナリンの副次的作用を減らし有効性を保つ投与経路の決定を行っている。同時に、3年目に計画している一酸化窒素メカニズムの解析ならびに本研究を実施したなかで明らかとなったクラッシュした皮膚免疫機能の低下について証明する予定である。直接経費の一部を使用せずに次年度使用額となった理由は、実験結果の再現性が高く、当初購入予定であったヘアレスラット使用数を減らすことができたためである。その分を次年度に予定している一酸化窒素や皮膚免疫メカニズム解明に使用する予定である。
新規天然蛍光分子の探索と生細胞イメージリング剤の創出

西部四国領域植物エキスライブラリーの蛍光スクリーニングにおいて強い蛍光成分が認められた検体のうち,コクサギ(Orixa japonica,ミカン科)について蛍光成分の分離精製を継続した。その結果,60種以上の化合物の単離精製を行うことが出来た。蛍光強度についてはフラノキノリン類がもっとも強い蛍光を持ち,クマリン類も次いで強かった。そのうち主成分であるシキミアミンについて,生細胞への導入を試みている。細胞への導入効率をあげるために脂溶性を高める目的での誘導体作成等も同時に行っている。一方,蛍光成分が認められた植物種について,ナンテン(Nandina domestica)より黄色蛍光成分が認められたことから,成分の単離を行った。その結果,ベルベリンであることが明らかとなった。さらにヒコダイ(Echinops setifer)より,強い青色蛍光成分が認められたがその成分についてはウンベリフェロンであることが明らかとなった。現在,フサザクラ(Euptelea polyandra)に含まれる強い黄色蛍光物質について成分の分離を行ったところ,明らかな強い黄色蛍光物質を数種単離することに成功したが,NMRにおいてシグナルが観測されないため,X線結晶構造解析等について検討している。さらに,amarastelline Aを母核とし,構造の改変を行った化合物群の蛍光特性,およびpH応答についての検討を行うことにより,カンチン構造が環境応答型の蛍光センサーとして有用であることが明らかとなった。約150種の西部四国域の植物エキスライブラリの構築と蛍光スクリーニングを行った。昨年度の蛍光スクリーニングにおいて強い蛍光が認められたコクサギの継続に加え,ナンテン,ヒコダイ,フザザクラなどの多様な植物成分の蛍光成分について検討を行った。天然蛍光物質については,数多く含有されてはいるが,分離,単離が困難なケースが多かった。超微量で分析が出来ないケースも多発した。多様な天然蛍光化合物群の単離を成功させるために,分野開拓を行うことも目的としているが,当初の目的は遂行されているものと考える。初期の研究として,南米産植物由来Quassia amaraの蛍光成分アマラステリンAを用いた蛍光化合物の合成研究,あるいは蛍光母核構造を用いたセンサーへの適用などについても同時に研究を進めている。既に構築済みの植物エキスライブラリーを活用し,多様な植物に含まれる蛍光成分について明らかにしていく。蛍光成分の新規分野開拓と蛍光成分の扱い方,分離手法などの開拓を同時に行っていく。さらに,得られた蛍光成分,蛍光成分の母核構造を活用して,更なる有用な化合物への改変などを視野にいれ,生細胞への導入,あるいは蛍光イメージリング剤への応用研究などを行うこととする。生細胞導入については誘導体作成などについても順次行い,応用研究へと展開を行う予定である。独自に集めた植物1000種より新規天然蛍光化合物を探索する目的で,メタノール抽出によるエキスライブラリーを構築した。そのうち106種224種について10mgを正確に計り取り,メタノール1mLに溶かしてTLC(F254不含量)にスポットを行った。365 nm蛍光照射下にて,その殆どの植物エキスにおいて強弱の差はあるが,蛍光スポットが認められることが分かった。そのうち30-40%が赤色蛍光を示した。赤色蛍光の多くは葉緑素(クロロフィル)のポルフィリン構造によるものであることが推測された。輝度の違いはあるが,青色,黄色,緑色蛍光などの蛍光を示すものが数多く認められた。赤色蛍光を持つ検体は,クロロフィルを除く目的で,LH-20, ODSなどに伏してみたが,前処理としては簡便とはいえず,方法論の開拓が必要であると考えられる。全ての検体についてTLCで展開を行った。黄色,青色蛍光を示すスポットを選択し,その中で強い蛍光を示すいくつかの検体について,天然蛍光化合物の単離を行うことにした。ミカン科のコクサギ(Orixa japonica)に強い青色蛍光が認められ,蛍光化合物の単離を行ったところ,フランを含むキノリン系アルカロイドであるskimmianineが同定された。本化合物は,337 nmでの励起波長において419 nmに強い蛍光スペクトルを示すことが明らかとなった。今後は類縁化合物の徹底調査を行うことにより,構造と蛍光の関係,あるは蛍光特性について検討を行う。これまで行ってきたQuassia amara由来のamarastelline Aの種々の誘導体合成とそれらの蛍光特性については,誘導体作成を行うことにより,PH応答型の蛍光センサーへの応用研究が展開している。これらの結果については論文にまとめた。一方,amarastelline Aの全合成研究についてはほぼ達成され論文としてまとめた。新たな天然蛍光化合物を見出すべく,約200種の検体を用いて,探索研究を行った。その結果,キノリン系アルカロイドであるskimmianineを見出すことに成功した。昨年度分の蛍光スクリーニングにおいて強い蛍光成分が存在すると認められた検体のうち,コクサギ(Orixa japonica,ミカン科)について蛍光成分の分離精製を行った。蛍光成分の分離はシリカゲルクロマトグラフィーの他,逆相HPLCを用いた分離精製にて単離を行った。HPLCを用いた分離では,多波長UV検出器(PDA)の他,蛍光検出器を用いて行った。その結果,6種の新規化合物を含む37種のアルカロイドを単離精製し,構造を明らかにすることが出来た。