hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新たなシグナル伝達系Ｈｉｐｐｏ経路による卵巣機能調節メカニズムの解明

Hippo pathwayは、細胞増殖や器官サイズを制御するシグナル伝達系として明らかになっている。Hippo pathwayによるシグナルは、最終的に転写共役因子YAP/TAZの活性を制御することで様々な遺伝子の発現を調節している。最近、我々は卵巣顆粒膜細胞においてcAMPシグナルで誘導される多くの遺伝子がYAP/TAZにより抑制されることを見いだしている。本年度は、顆粒膜細胞におけるYAP/TAZによる転写調節メカニズムの解析を行った。転写共役因子はDNAに結合する転写因子に作用することで、遺伝子発現を制御している。そこでYAP/TAZが相互作用する因子について検討したところ、転写因子TEADが同定された。顆粒膜細胞におけるTEADノックダウンの影響を検討したところ、YAP/TAZのノックダウンと同様、YAP/TAZ標的遺伝子であるCTGF, CYR61が発現抑制される一方で、ステロイド代謝酵素CYP19A1, CYP11A1, HSD3B2が発現誘導された。顆粒膜細胞におけるステロイド代謝酵素の発現抑制に、YAP/TAZとTEADの相互作用が及ぼす影響を検討する目的で、TEADノックダウン細胞にYAPの恒常性活性化型である5SA-YAPを強制発現した。その結果、コントロール細胞では5SA-YAPを強制発現すると、8Br-cAMP誘導性のCYP19A1, CYP11A1, HSD3B2発現が著しく抑制される一方、TEADノックダウン細胞に5SA-YAPを強制発現したところ、CYP19A1, CYP11A1, HSD3B2の発現抑制は観察されなかった。これらの結果から、卵巣顆粒膜細胞ではHippo pathway下流のYAP/TAZ-TEAD複合体がステロイド産生を抑制的に制御しており、FSHはこの抑制を解除することでステロイド産生を促進する可能性が推測された。Hippo pathwayは、細胞の増殖や器官サイズを制御するシグナル伝達系で、この経路が活性化すると転写共役因子YAP/TAZがリン酸化されて核外に移行し不活性化する。卵胞発育期における顆粒膜細胞では、YAP/TAZの標的遺伝子であるCTGFとCYR61の発現量が非常に高いことから、この時期の顆粒膜細胞ではYAP/TAZ活性が高いと考えられた。しかし、卵胞がPreovulatory follicleまで発育するとこれらの発現は顕著に抑制される。このことから、FSH刺激により卵胞がAntral follicleからPreovulatory follicleまで発育するとHippo pathwayの活性化によりYAP/TAZによる転写活性が抑制されると考えられた。そこで、卵胞発育期の顆粒膜細胞でダイナミックに活性が変化するYAP/TAZについて、卵巣における役割を検討した。YAPの恒常性活性化型である5SA-YAPのアデノウイルス発現系を作製し、卵巣顆粒膜細胞由来KGN細胞および初代培養ラット卵巣顆粒膜細胞に5SA-YAPを導入して、細胞増殖や遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。その結果、これらの細胞への5SA-YAPの導入により、細胞増殖の促進が認められた。また、5SA-YAPの遺伝子発現に対する影響を検討したところ、cAMPシグナルで誘導される多くの遺伝子が5SA-YAPの導入により発現が抑制された。このことからYAP(TAZ)は細胞の増殖を促進し分化を抑制する重要な因子であると考えられた。さらに顆粒膜細胞でFSHによるpreovulatory follicleへの成熟にYAP/TAZ活性の抑制が重要であることが示唆された。申請時に予定していたように、ラット初代培養系およびヒト由来顆粒膜細胞株KGN細胞を用いて、網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、YAP/TAZが顆粒膜細胞の増殖や成熟(分化)を制御する上で重要であることを示すデータを得ている。このように本年度の研究により、YAP/TAZが卵胞の発育過程を制御する重要な因子であることを明らかにした。本年度は、顆粒膜細胞におけるYAP/TAZの遺伝子発現に対する影響を明らかにするため、エストロゲン産生に重要なCYP19A1遺伝子の発現への影響を検討した。顆粒膜細胞由来KGN細胞を用いてYAP/TAZノックダウンの影響を検討したところ、その発現の誘導が認められた。またcAMP刺激時にYAPの恒常性活性化型である5SA-YAPを強制発現させると、CYP19A1遺伝子の発現は抑制された。このことからYAP/TAZはCYP19A1の遺伝子発現を負に制御する因子であることが示された。さらにCYP19A1遺伝子の卵巣型プロモーター領域(PII)約2 kbを用いてルシフェラーゼアッセイを行ったところ、遺伝子発現様式と同様にYAP/TAZノックダウンによってルシフェラーゼ活性は上昇し、5SA-YAPの導入によりその活性は抑制された。以上の結果から、YAP/TAZは転写レベルでCYP19A1の発現を制御する因子の1つであることが示された。申請時に予定していたように、YAP/TAZの標的遺伝子に対する転写制御メカニズムについて解析を行った。その結果、顆粒膜細胞においてYAP/TAZはCYP19A1遺伝子の発現を転写レベルで制御していることを明らかにした。本年度の研究により、YAP/TAZが卵巣機能の制御に重要な因子の1つであることが初めて示された。

Hippo pathwayによるシグナルは、最終的に転写共役因子YAP/TAZの活性を制御することで様々な遺伝子の発現を調節している。最近、我々は卵巣顆粒膜細胞においてcAMPシグナルで誘導される多くの遺伝子がYAP/TAZにより抑制されることを見いだしている。本年度は、顆粒膜細胞におけるYAP/TAZによる転写調節メカニズムの解析を行った。転写共役因子はDNAに結合する転写因子に作用することで、遺伝子発現を制御している。そこでYAP/TAZが相互作用する因子について検討したところ、転写因子TEADが同定された。顆粒膜細胞におけるTEADノックダウンの影響を検討したところ、YAP/TAZのノックダウンと同様、YAP/TAZ標的遺伝子であるCTGF, CYR61が発現抑制される一方で、ステロイド代謝酵素CYP19A1, CYP11A1, HSD3B2が発現誘導された。顆粒膜細胞におけるステロイド代謝酵素の発現抑制に、YAP/TAZとTEADの相互作用が及ぼす影響を検討する目的で、TEADノックダウン細胞にYAPの恒常性活性化型である5SA-YAPを強制発現した。その結果、コントロール細胞では5SA-YAPを強制発現すると、8Br-cAMP誘導性のCYP19A1, CYP11A1, HSD3B2発現が著しく抑制される一方、TEADノックダウン細胞に5SA-YAPを強制発現したところ、CYP19A1, CYP11A1, HSD3B2の発現抑制は観察されなかった。これらの結果から、卵巣顆粒膜細胞ではHippo pathway下流のYAP/TAZ-TEAD複合体がステロイド産生を抑制的に制御しており、FSHはこの抑制を解除することでステロイド産生を促進する可能性が推測された。卵胞発育におけるYAP/TAZの役割をより詳細に明らかにするため、上記細胞系を用いてYAP/TAZノックダウンによる影響を検討する。また、YAP/TAZの作用機序を明らかにするため、ルシフェラーゼアッセイやChIPアッセイなどの解析法を用いて、標的遺伝子の発現調節メカニズムについて解析予定である。卵巣機能の制御に対するYAP/TAZの役割を明らかにするため、CYP19A1遺伝子以外の標的遺伝子を同定しそのメカニズムを解析する。また、卵巣機能に必須の転写因子NR5Aファミリーの活性に対する影響を検討し、どのようなメカニズムで転写調節しているか解析する予定である。必要とした消耗品が、予定より少なく済んだため、次年度使用額が生じた。概ね使用計画通りである。翌年度の計画は従来通りである。遺伝子解析用試薬を予定より多く購入し、研究予定より詳細な遺伝子発現解析を行う。
理想的な結晶方位を有する電磁鋼板の磁気効率評価装置の作製

磁気効率を評価する装置を作製するために回生により発電も可能なスイッチトリラクタンスモータ(SRモータ)を試作した。ロータ部には高温鍛造により組織制御したFe-3.0mass%Si合金を、ステータ部にはSPCC(低炭素鋼)を用いた。板厚は1mmとした。極数は標準的なものとし、ロータ部は4極、ステータ部は6極とした。ロータ部の材料には高温鍛造よって組織制御の発達度が異なる鍛造試料を用意し比較することとした。ロータ径は20mmとした。熱間鍛造条件は実用的な面も考慮し、比較的高速な5.0×10^<-3>s^<-1>の加工で真ひずみ-2.0まで加工した材料をベースとした。ブラケット部はアルミ板で作製した。シャフト部は市販のリニアシャフトを購入し、利用した。磁気効率を評価すあるにあたっては回生発電による発電量を測定し、モータ部のトルクをトルク変換器で測定することにより行った。回転部は無段階変速付ミニ旋盤を購入し、カップリングにより接続した。モータ部とトルク変換器についてもカップリングで接続した。発電量はデジタル出力付クランプメータで出力し、トルク変換器の出力とともに既存のデータロガーによって記録した。回生発電による回路設計は公開されているものを利用して行ったが、電気をうまく取り出すことができなかった。トルクの測定については発達度の異なる板材によりロータを作製したが、発達度の高いロータの方が若干高い値を示したものの、十分な有意差を確認することはできなかった。ロータ、ステータを積層により電磁力を増大させる必要があると考えられる。9月に電気・電子・情報関係学会東海支部連合大会に参加して情報収集を行い、エアギャップなどの情報を得ることができた。板厚は1mmとした。
東アジアの経済統合と発展途上国企業の多国籍化-マレーシアの事例

東アジアにおける経済統合は各国間及び地域間自由貿易協定の締結により急速に進んでいる。これを背景として、域内の貿易が増大するとともに、域内の発展途上国企業による海外進出も活発化した。これまで、域内各国の比較優位に基づく生産立地が多く観察されていたが、近年、新たな形態として、既存の先進国企業との取引関係に基づく技術などの経営資源の向上により競争力を増し、世界的な多国籍企業の協力会社として海外進出を行うケースが機械産業を中心として増加している。平成20年度は、基本的な情報収集、研究機関及び地場企業でのヒアリングを中心に、研究計画に基づいて現地調査を実施した。マレーシア企業の多国籍化に関してはマラヤ大学、及びマレーシア工業開発庁において、現時点での最新の情報を入手した。これにより、業種別(製造業内)の直接投資動向を把握することが可能となった。また、これらの情報をもとに、データベースの作成に着手した。地場企業でのヒアリングはクアラルンプールを中心に、合計11社で実施し、海外進出を可能にした経営資源(内的要因)と域内の経済統合の影響(外的要因)について詳細な情報を得た。業種による相違はあるものの、機械産業に属する企業の場合、マレーシア国内での多国籍企業との取引により、新たに技術などの経営資源を獲得し、このことが海外進出に結びつくケースが多く見られた。一方で、一部の企業では自社による技術開発もみられた。経済統合の影響は現時点では主に輸出拡大に貢献している面があることが政府関係機関でのヒアリングにより明らかとなったが、直接投資拡大への影響については個別企業により認識に差があった。また、現地の研究協力者である、Dr. Chew(モナーシュ大学)を招聘し、小樽商科大学において研究会を開催した。理論面では主に発展途上国企業の多国籍化に関する文献収集と精読に努めた。これまで、ほとんど研究がなされていなかった、マレーシア企業の多国籍化に関し、基本的な調査から開始し、現地の大学、研究機関、政府系機関からもその成果に大きな関心が寄せられている。本研究はマレーシア国内において未だ十分な研究が行われていない分野であり、前年に引き続き、実態を正確に把握するため、マレーシア地場企業での詳細なヒアリングを実施した。今回は北部のペナン地区を中心に8社の協力を得ることができた。米国系多国籍企業が多い地区であり、これらの多国籍企業が地場企業の育成と海外進出に関与するケースが多くみられた。特に半導体メーカーによる地場企業の育成はこれら企業の経営資源の蓄積に多大な影響を与えたといえる。理論的にはこれらはフラッグシップ・モデルもしくは擬似内部化理論を用いて説明することができる。東アジア、特にマレーシアにとってはASEANの経済統合とFTAを通じた中国との経済関係の強化が地場企業の海外進出に大きな影響を与えると考えられる。これについては、企業特性などにより相違がみられるが、多くの企業からポジティブな見解が得られた。しかしながら、企業の発展レベルからして海外展開を企業戦略の中心に据える製造業企業は少なく、経済統合の利益を十分には得ていないという事実も観察された。経済統合と発展途上国企業の多国籍化についての理論面からの研究については現地の研究協力者であるマラヤ大学のAslam博士とともに進めている。現段階では経済統合が外部からの直接投資を引きつけることが明らかとなった。これについては博士を小樽商科大学に招き、ワークショップを開催し、学内外の研究者と議論を深めた。引き続き、経済統合が域内での直接投資を増大させるか否かについて産業分類をした上での検討に着手した。本研究はペナン地区の政府系機関やマレーシア工業開発庁も関心を寄せており、これら機関との連携により、研究成果の地元への還元も進んでいる。平成22年度は、引き続き海外進出を果たしたマレーシア企業での詳細なヒアリングを実施した。過去2年間の企業でのヒアリングを総括する段階に入り、電機・電子、自動車などの機械産業において、特に先進国出身の多国籍企業との取引を通じた技術移転などの経営資源の移転がマレーシア企業の競争優位の源泉となったこと、そして、これらの競争優位を活用して海外に進出するケースが多数存在することが裏付けられた。さらにはこれまでの取引関係を継続するために海外直接投資を行い、多国籍化するという図式がほぼ明らかとなった。伝統的な比較優位に基づく生産立地の変化のみでは説明されない、関係特殊性に基づく発展途上国企業の多国籍化のパターンといえる。一方で、経済統合と発展途上国企業の多国籍化を総合的に説明する理論的な枠組みの構築は、その途上にある。貿易によらず海外進出を選択する要因は前述のような説明が可能であるが、さらに、フラグメンテーション理論や企業内貿易、フラッグシップモデルなどを援用し、産業を特定化することにより、両者の関係を取り込んだ理論的分析は可能となりつつある。これまで、マレーシア企業の対外直接投資統計の整備が進んでいなかったが、ようやく、中央銀行と統計局がこれらを公表するようになった。

しかしながら、産業ごとの統計ではないため、引き続き、個別企業の海外進出状況に基づいたデータの集積が必要であり、これらをマレーシアの共同研究者とともに継続している。また、昨年度はマレーシアの共同研究者であるモナーシュ大学のChew博士を招聘し、小樽商科大学において研究会を開催し、これまでの研究の成果を公表するとともに、今後の研究に対する示唆を得た。企業でのヒアリングと並行してマレーシア工業開発庁、マラヤ大学、マレーシア科学大学、民間研究機関においてヒアリングと意見交換を行った。
読解力に関する教科内容策定のための説明的文章教材コーパス作成及び活用方法の開発

本研究では、説明的文章の範囲を確定し、各教科書における説明的文章教材の時代順のリスト「説明的文章教材一覧」を作成した。また、昭和40年度及び平成20年度当時に学校現場で使用されていた検定教科書、東京書籍『新しい国語』,大阪書籍『小学国語』,学校図書『小学校国語』,教育出版『小学国語ひろがる言葉』,光村図書『国語』各社の説明的文章教材テクストをデジタル化してデータベースを作成した。平成20年度研究の成果については、次のとおりである。1.昭和36年から現行教科書における説明的文章教材題材のデータベース化本研究では、読解力に関する教科内容策定のための説明的文章のコーパス作成の在り方について探求することが目的である。その初期の段階として、コーパス作成の基礎となる研究対象の特定を行った。その全体傾向を明らかにするために、昭和36年から現行小学校国語教科書における説明的文章教材の題名に関するデータベースを作成した。2.現行小学校国語教科書(平成17年版)における説明的文章教材のテキストデータ作成現在の説明的文章教材の特質を明らかにするために、5社がら出版されている現行小学校国語教科書における説明的文章教材をテキストデータに変換した。テキストデータに変換したことにより、語句の検索や字数などの形態面の情報を容易に得ることが可能になる。このデータベースが、全体のコーパスの作成方法や活用方法を探求する基本となる。平成21年度研究の成果については、次の通りである。1.過去の小学校国語教科書(昭和40年版)における説明的文章教材のテキストデータ作成本研究の経過で、すべての教科書説明的文章教材をテキストデータベース化することは困難と考え、昨年度作成した平成17年現行版教科書のデータベースと比較するサンプルデータとして、過去の教科書に絞ってデータベース化を行うことにした。そのサンプルデータとして選定したのは、昭和40年使用の国語教科書である。この時期から教科書の広域採択が始まり、現在の説明的文章の教材類型の原型が作られ始めた時期だからである。具体的には、現在の説明的文章教材の特質を明らかにするために、6社から出版されている小学校国語教科書における説明的文章教材をテキストデータに変換した。2.説明的文章コーパスサンプルデータによる論文発表以下に示す雑誌論文3点の関係論文を掲載するに至った。これは、コーパスづくりの基礎資料となるものである。また、平成20年度当時に学校現場で使用されていた検定教科書、東京書籍『新しい国語』,大阪書籍『小学国語』,学校図書『小学校国語』,教育出版『小学国語ひろがる言葉』,光村図書『国語』各社の説明的文章教材テキストをデジタル化してデータベースを作成した。これらの教科書は、平成17年に改訂されたものである。続いて昭和40年度改訂版教科書の日本書籍『小学国語』,東京書籍『新編新しい国語』,大阪書籍『小学国語』,学校図書『小学校国語』,教育出版『新版標準国語』,光村図書『国語』を同じようにデータベース化した。研究内容について、作成した平成17年改定版教科書における説明的文章または昭和40年改訂版の教科書、さらには本研究により解明された観点からそれ以外の説明的文章教材について、各研究者が分析した説明的文章の特質に関する論考を研究報告書に掲載した。
全エクソーム解析による１型糖尿病感受性バリアントの同定

21例の1型糖尿病患者の全エクソーム解析を施行した。検出した感受性バリアント候補の中で、自然免疫に重要であるToll様受容体(Toll-like receptor, TLR)ファミリーの1つの遺伝子に発見された低頻度の非同義変異に着目した。5000例を超える関連解析において変異のhomozygoteの頻度が1型糖尿病患者に有意に増加し、1型糖尿病兄弟発症の1家系において兄弟が共にこの変異のhomozygoteであることが判明した。一方、興味深いことに、2型糖尿病では野生型アレルが有意に増加していた。機能解析を現在進めている。日本人において、1型糖尿病の感受性遺伝子として、HLAクラスII(DRB1、DQB1)遺伝子以外に、インスリン(INS), CTLA4, IL2RA, ERB B3, CLEC16Aなどの遺伝子が報告されている。しかし明らかになった非HLA感受性遺伝子の効果は弱く、他にも多くの非HLA1型糖尿病感受性遺伝子が存在していると考えられる。そのため、われわれは以前の研究(平成2525年度科研費)では、次世代シーケンスを用いた変異・多型解析を1型糖尿病候補遺伝子(非HLA)について行い、白人以外では初めての1型糖尿病に関連する低頻度バリアントとして、GLIS3遺伝子のA908Vが1型糖尿病に有意に抵抗性であることを見いだした。今回の研究では、範囲を拡げて、全ゲノムエクソーム解析により、日本人1型糖尿病と関連する低頻度バリアントの検索を施行している。本年度は、すでに施行してあった複数例のゲノムDNAを等量混合したプールDNAについての全ゲノムエクソーム解析のデータから、蛋白機能に影響を与える可能性が高いバリアントを選別し、一部のバリアントについて多数例での検討を行った。しかしながら、いくつかの有意度レベルが低いバリアントが得られたものの、問題点も明らかになり、今後はプールDNAではなく個別の症例DNAの全ゲノムエクソーム解析を行っていくこととした。日本人1型糖尿病感受性遺伝子として、HLAクラスII遺伝子以外に、複数の非HLA遺伝子が報告されているが、他にも多くの非HLA感受性遺伝子が存在していると考えられる。今回の研究では、全ゲノムエクソーム解析により、日本人1型糖尿病と関連する低頻度バリアントの検索を施行している。昨年度は、プールDNAについての全ゲノムエクソームデータの解析を施行したが、プールDNAを使用したことに起因する問題点も明らかになり、本年度は個別症例の全ゲノムエクソーム解析を以下のように行った。まず、発症において遺伝要因の関与が強いと考えられる1型糖尿病症例および非HLA遺伝子の強い関与が想定される1型糖尿病症例(抵抗性のHLAクラスIIハプロタイプを保有)を選別した。最終的に兄弟発症の2例を含む20例の1型糖尿病症例と1例の非糖尿病家族の全ゲノムエクソーム解析を施行した。各例について、4万個程度のバリアントが検出されたが、その中でいくつかの条件でさらに選別を行った。すなわち、1ナンセンス変異、フレームシフト変異、ミスセンス変異、21000ゲノムデータベースに報告されていないかアレル頻度が0.05未満、3変異のホモが1型糖尿病症例に存在する、4in silicoの解析によりコードする蛋白の機能低下が予想され、5コードする蛋白が1型糖尿病の発症に関与し得ると考えられること、等の条件により、最終的に10個のバリアントを今回は選別し、多数例での関連解析を施行している。現在、約1200例の解析を行っているが、4個のバリアントにおいて、変異のホモが1型糖尿病群においてのみ有意に集積し、その中の1個のバリアントは1型糖尿病と有意に関連していた。今回、個別DNAの全ゲノムエクソーム解析を行い、いくつかの低頻度の1型糖尿病感受性バリアントの候補を検出した。特に、1つのバリアントは1型糖尿病との有意な関連も認めている。このバリアントはアジア人種(特に日本人)に特異的に見られ、自然免疫に重要な遺伝子(これまでに白人1型糖尿病感受性遺伝子として未報告)のバリアントであった(詳細は未発表のため省く)。今後、より多数例でのこのバリアントとの関連の確認を行っている状況である。最終的に10個のバリアントを今回は選別し、多数例での関連解析を施行した。結果として、約1200例の解析により、4個のバリアントにおいて、変異のホモが1型糖尿病群においてのみ有意に集積し、その中の1つであるトール様受容体1(TLR1)遺伝子L144P変異は1型糖尿病と有意に関連し、1型糖尿病兄弟発症の1家系において兄弟が共にこの低頻度バリアントのhomozygoteであった。最近報告された東北メディカルメガバンクのコントロールデータを用いても1型糖尿病との関連は有意であった。TLRファミリーはウイルスや細菌由来の成分を認識し生体防御の応答を誘起する。興味深いことに、1型糖尿病モデルのNODマウスへの種々のTLRリガンドの投与-これは感染を模する-により1型糖尿病の発症が顕著に抑制される(PlosOne 5:e11484, 2010)。

すなわち、いわゆる「衛生仮説」(衛生環境の向上による感染症の減少が自己免疫疾患の増加をもたらす)にTLRファミリーは密接にかかわることが動物実験から示唆されていた。我々が見出した機能低下を来す可能性が高い低頻度バリアントLeu144Proと1型糖尿病との関連は、ヒトにおける「衛生仮説」の遺伝学的な実証になる可能性がある。現在、TLR1とヘテロダイマーを形成し細菌由来のリガンドを認識するTLR2も含めて、複数の低頻度バリアントの解析を行うと共に、医科学研究所との共同研究によりTLR1のL144P変異の機能解析を施行している。21例の1型糖尿病患者の全エクソーム解析を施行した。検出した感受性バリアント候補の中で、自然免疫に重要であるToll様受容体(Toll-like receptor, TLR)ファミリーの1つの遺伝子に発見された低頻度の非同義変異に着目した。5000例を超える関連解析において変異のhomozygoteの頻度が1型糖尿病患者に有意に増加し、1型糖尿病兄弟発症の1家系において兄弟が共にこの変異のhomozygoteであることが判明した。一方、興味深いことに、2型糖尿病では野生型アレルが有意に増加していた。機能解析を現在進めている。すでに研究実績の概要にも触れたが、プールDNAについての全ゲノムエクソーム解析データからのバリアントの選別とその後の多数例の関連解析においては、以下の問題点が明らかとなった。すなわち、1一部のバリアントについては個別のタイピングにおいて多型の存在が確認されず、2存在が確認されたバリアントについてもプールDNAでの解析から推定されるバリアントの頻度が個別のタイピング結果とかなり異なることが多かった。そのため、今回のストラテジーでは有意度レベルのバリアントを得ることは困難と考えられた。このアーチファクトの要因をいろいろと吟味した結果、プールDNAを使用したことの要因が大きいものと考えられ、今後個別DNAの全ゲノムエクソーム解析を行っていく方針とした。予定通り最終年度である今年度(平成28年度)で終了し、得られた感受性バリアント(候補)について論文発表を行う予定である。今後の発展的な課題、すなわちバリアントの機能解析、さらにこれらの遺伝子(およびファミリー遺伝子)の変異スクリーニングと1型糖尿病での関連解析などについては新たな研究課題として申請する予定である。糖尿病予定通り最終年度である平成28年度で終了する予定である。得られた成果により、新たな研究課題の申請を検討する。昨年度とは研究のストラテジーを変更し、個別の症例の全ゲノムエクソーム解析を行い10個のバリアントについて多数例での関連解析を行っているが、多数例での解析に時間を要しているため、少額ではあるが次年度使用額が生じた。当該年度は、別の研究費によりすでに施行していたプールDNAに対する全ゲノムエクソーム解析のデータの分析を主として行っていた。研究計画にある通り、蛋白機能に影響を与える可能性が高い「蛋白置換バリアント」の選別を行い、一部のバリアントについては共同研究グループの多数例での解析を行った。しかし、問題点が明らかとなり、研究のストラテジーを変更し、個別DNAの全ゲノムエクソーム解析を行っていく方針としたため。
エンドサイトーシスの特異的制御機構とがん・精神疾患の分子病態

受容体や接着分子の取り込み(エンドサイトーシス)は多様な細胞機能に重要だが、細胞がどの様に細胞上の膜分子を選別しているのか、という重要な問題は未解決である。私達が研究を進めてきたアクチン結合分子Girdinはがん細胞及び神経芽細胞の運動を制御する分子である。今回の研究では、Girdinが膜小胞の切断に重要なdynamin分子の活性を制御し、かつ取り込まれる膜分子の種類の特異性を決定することを明らかにした。さらに遺伝子改変マウスや培養細胞を用いた検討により、Girdin/dynamin複合体による膜分子輸送の制御が、神経芽細胞の運動能やがん細胞の極性破綻に関与している可能性を明らかにした。本研究の目的は、Girdinおよびそのファミリー分子の研究を基点にしてエンドサイトーシスの特異的制御機構を解明するとともに、その制御機構が癌・精神疾患の分子病態において果たす役割を明らかにすることである。これまでにRNA干渉法によってGirdinをノックダウンしたHeLa細胞において、トランスフェリン受容体のエンドサイトーシスは抑制されるが、EGF受容体のエンドサイトーシスは影響を受けないという興味深い結果を得ている。本年度はさらにGirdinがインテグリンβ1やE-カドヘリン等の多様な分子のエンドサイトーシスに与える影響を検討した。またエンドサイトーシスの空間的制御の問題について、全反射蛍光顕微鏡(TIRF)を用いて、各分子の動態を固定細胞およびタイムラプスイメージングにより観察した。その結果、Girdinはインテグリンβ1のエンドサイトーシスは制御しない一方で、E-カドヘリンのエンドサイトーシスを制御するという結果が得られ、Girdinは分子(カーゴ)特異的な膜輸送を制御することが明らかになった。またTIRFを用いた解析によって、Girdinは細胞の中心部分底面におけるエンドサイトーシスは制御するが、細胞の辺縁部では制御しないことも明らかにした。また、これまでに精製タンパクを用いたin vitroGTPaseアッセイにより、GirdinのN末端ドメインがダイナミンと結合し、そのGTPase活性を促進することを示している。本年度はN末端ドメインの中心部(85アミノ酸)にダイナミン制御機能があることを明らかにした。さらに上記の活性に重要なアミノ酸残基を同定するために、N末端ドメインに各種点変異および欠失を導入し、それぞれの変異体の組み換え蛋白質を精製した。なお、本実験の一部は聖マリアンナ医科大学の三好洋講師と共同で実施した。本研究の目的はGirdinファミリーの研究を基点にしてエンドサイトーシスの制御機構を解明するとともに、癌・精神疾患の分子病態において果たす役割を明らかにすることである。これまでにGirdinはインテグリンやEGF受容体のの取り込みは制御せず、E-カドヘリンやトランスフェリン受容体の取り込みを制御するという結果が得ている。またGirdinのN末端ドメインにダイナミンへの結合活性及びその活性制御機能が存在することを明らかにした。今年度はN末端ドメイン変異体の組み換え蛋白質を用いてダイナミンの活性制御に与える影響を検討したところ、63番目と84番目のアルギニンをアラニンに置換した変異体においてダイナミン活性化機能が有意に低下することを示した。また変異体をHeLa細胞に発現させた場合に、トランスフェリン受容体の取り込みが有意に低下することが明らかとなった。Girdinによる選択性エンドサイトーシスの制御がどのような病態と関与するか検証するため、本機構の異常が上皮細胞の癌化過程でみられる極性の破綻につながる可能性について検証した。上皮細胞においてGirdinをノックダウンしたところ、本来は基底側膜に中心に局在するE-カドヘリンやトランスフェリン受容体の局在異常が観察された。このことは過去に報告されている癌におけるGirdinの発現異常が上皮細胞の極性の異常化に関わっていることを示唆するものである(投稿中)。また私達はGirdinのノックアウトマウスでは脳室下帯で新生される神経芽細胞の集団移動の異常がみられ、Girdinが精神疾患の病因に関わる分子であることを報告しているが、同マウスの組織切片において細胞間接着部位におけるN-カドヘリンの局在異常が存在することも見出した。今後はGirdinによる選択的エンドサイトーシスの制御が神経芽細胞の移動に関わる可能性について検証する。本研究の目的はGirdin分子を基点として特異的エンドサイトーシスの制御機構を解明するとともに、同機構が癌・精神疾患の病態において果たす役割を明らかにすることである。これまでにGirdinがカドヘリンやトランスフェリン受容体のエンドサイトーシスを特異的に制御すること、GirdinのN末端ドメインにダイナミンへの結合領域およびダイナミン活性の制御機能が存在することを明らかにした。さらにGirdinによる選択性エンドサイトーシスの異常が上皮細胞の癌化過程でみられる極性の破綻につながる可能性について明らかにした。

本年度は細胞表面で観察されるエンドサイトーシスの動態を全反射照明蛍光顕微鏡で観察し、Girdinがエンドサイトーシスのホットスポットに集積しエンドサイトーシスの初期段階から小胞の取り込みまでの複数のステップに関わる分子であることを見出し、論文で報告した。以前にGirdinは成体脳の海馬や脳室下帯の神経幹細胞から分化する神経芽細胞の移動に重要であり精神疾患の発症に関わることを報告した。本年度はGirdinによる特異的エンドサイトーシスの制御が神経芽細胞におけるN-カドヘリンの動態に重要であることを見出した。N-カドヘリンの機能制御には細胞内の膜輸送機構が関わることが知られているが、私達はモーター分子の一つkinesinがGirdinに結合することを見出し、これがN-カドヘリンの動態に与える影響について検討した。またGirdinが癌関連線維芽細胞(CAF)にも発現していること、Girdinの発現を抑制したCAFでは運動能が低下すること、またそのようなCAFと腫瘍細胞を共移植した場合に腫瘍の進展が抑制されることを明らかにした。本結果はGirdinによるCAFの運動制御が癌の進展に重要であることを示しており、論文で報告した。26年度が最終年度であるため、記入しない。実験病理学26年度が最終年度であるため、記入しない。Girdinの結合分子として同定したダイナミンについて、その結合様式を生化学的に詳細に解明することができた。またGirdinが膜分子の種類特異的にエンドサイトーシスを制御することが明らかとなり、本研究の目的としているエンドサイトーシスの特異的制御機構の一端を解明することができた。Girdinとダイナミンの結合についてその結合の責任部位を生化学的に詳細に解明することができた。またGirdinが選択的エンドサイトーシスを制御する分子であり、同機構の異常が上皮細胞の癌化の過程で観察される極性破綻と関わっている可能性について検証できた。今後は研究計画に従い、各種変異体の作成とそのダイナミンGTPase活性に与える影響の検討、またその細胞生物学的な意義、特にがん細胞や神経細胞の細胞運動に与える影響を検討する。また本研究の目標の一つである構造・活性相関の解明にむけて、Girdin/ダイナミン複合体の精製・結晶化の共同研究を具体的にすすめる段階に入る予定である。研究計画に従い、Girdinによる選択的エンドサイトーシスががん細胞の極性破綻や神経芽細胞の集団移動を制御している可能性について詳細に検討する。また本研究の目標の一つである構造・活性相関の解明にむけて、Girdin/ダイナミン複合体の精製・結晶化を連携研究者とともに具体的段階にすすめる予定である。本年度は各種変異体の作製とその活性測定実験が予定通りに進展せず、それらの経費を次年度に繰り越した。次年度は本助成金を使用して上記実験を行う他、変異体導入細胞の表現系解析に充当する予定である。
量的変化をもつモデルマウスを応用した本態性高血圧症の発症機構解明

我々はアンギオテンシノーゲン遺伝子変異が本態性高血圧と関連することを示した。またアンギオテンシノーゲンの量的変化が血圧と密接に関連することも示している。アンギオテンシノーゲン(AGT)の量的変化が血圧にどのような機序で、かつどの臓器で影響をおよぼすかを動物モデルで解析する。実験に使用するマウスは米国North Carolina大学のSmithies教授のグループにより作成されたものである。マウスAGT遺伝子を破壊したマウス、かつ正常の染色体部位にAGT遺伝子を2個重複して挿入したマウスである。Gene Dose Effectを解析することができるモデルマウスとして確立されている。すなわち、交配により、0コピー、1コピー、2コピー、3コピーそして4コピーとアンギオテンシノーゲン量を変化させることができる。これらのマウスはAGTコピー数以外の遺伝背景がほぼ同一である。各々を交配させることにより、AGT遺伝子を各1,2,3,4個有するマウスを得る。各マウス作成の確認は,PCR法、サザーンブロット法を用いた遺伝子タイピングによって行なった。そして血圧測定、血中アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンペプチド測定など基本データを収集する。血圧測定は侵襲の少ないTail-cuff法でおこなう。マウス血圧測定に関しては、BP-98A,Softronを用い、1匹あたり30分間測定した(安定するまでの時間も含む)。本態性高血圧症の重要な外来因子として塩分摂取はよく知られている。4種の異なる遺伝型をもつマウスに高Na飼料(Na=2%)、普通Na飼料(Na=0.26%)を摂取させ、血圧の変化と血中AGTのレベルを測定する。これらのマウスはもともとAGT発現量に差があるので、塩分摂取によりAGTがさらにどのように変化するか、かつ血圧変化との関連性の解析を試みた。現在のところ、この食餌条件ではマウスの血圧に影響をすことはなかった。おそらくマウスは血圧上昇に関して耐性があるためと示唆される。しかしながら、血圧の変化はなくても近位尿細管での遺伝子発現には変化があることが予測でき、これらがヒト高血圧の候補遺伝子と考えられる。現在DNA arrayシステムにて包括的遺伝子発現変化を測定しているところである。アンギオテンシノーゲン(AGT)の量的変化が血圧にどのような機序で、かつどの臓器で影響をおよばすかを解析する。すなわち、交配により、0コピー、1コピー、2コピー、3コピーそして4コピーにアンギオテンシノーゲン量を変化させることができる。そして血圧測定、血中アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンペプチド測定などを基本データを収集する。マウス血圧測定に関しては,BPー98A,Softronを用い、1匹あたり30分間測定した(安定するまでの時間も含む)。4種の異なる遺伝子をもつマウスに高Na飼料(Na=2%)、普通Na飼料(Na=0.26%)を摂取させ、血圧の変化と血中AGTのレベルを測定する。現在のところ、この食餌条件ではマウスの血圧に影響を及ぼさないので、Na量を増加させるなど条件を変えて試みる。

4種の異なる遺伝型をもつマウスに高Na飼料(Na=2%)、普通Na飼料(Na=0.26%)を摂取させ、血圧の変化と血中AGTのレベルを測定する。これらのマウスはもともとAGT発現量に差があるので、塩分摂取によりAGTがさらにどのように変化するか、かつ血圧変化との関連性の解析を試みた。現在のところ、この食餌条件ではマウスの血圧に影響をすことはなかった。おそらくマウスは血圧上昇に関して耐性があるためと示唆される。しかしながら、血圧の変化はなくても近位尿細管での遺伝子発現には変化があることが予測でき、これらがヒト高血圧の候補遺伝子と考えられる。現在DNA arrayシステムにて包括的遺伝子発現変化を測定しているところである。
遺伝暗号解読のメカニズム

<コドン認識におけるアンチコドン1字目の転写後修飾の役割>___ー.セミミクロHPLC/FRITーFAB・MASによる修飾ヌクレオシド分析の系を構築した(石倉).NMR解析から,2'ー0ーメチル化によってUおよびCのコンホメ-ションが固くなること,イノシンでは,Aの認識にコンホメ-ションの柔らかさが重要なことを見いだした(河合,宮澤,横山).コドン・ボックスの読み分けにおいて,修飾による「固さ」の調節とともに,tRNA種の細胞内量比の重要性を示した(横山).高GC,高ATゲノムの生物ではアイソアクセプタ-量比がコドン使用頻度とよく対応し,マイコプラズマにおいてコドンCGGが「ナンセンス」であることを見いだした(安達).<異常な翻訳>___ー.終結因子RF2の機能に重要な残基を同定し,<herC>___ー遺伝子がリジルtRNA合成酵素をコ-ドすることを証明した(中村).挿入因子IS1のトランスポ-ゼス発現におけるフレ-ムシフト機構を調べた(大坪).哺乳類において,セレノシステイニルtRNA合成には,Seドナ-としてHSe^ーが関与することを証明した(水谷).種々の非天然型アミノ酸を組み込んだヒト上皮成長因子の合成に成功した(宮澤,横山).<tRNAアイデンティティ->___ー.大腸菌のアイデンティティ-決定因子の全体像がほぼ明らかになった(長谷川,横山).セリン,ロイシン,アラニン以外のtRNAでアンチコドンが決定因子となっている。識別塩基は,多くの場合に重要である.イソロイシンtRNAと合成酵素の結合にともないL字型3次構造が変形することがNMR解析により明らかになった(横山).セリンとチロシンでは長い可変ル-プが重要であることが証明された(長谷川).酵母チロシンtRNAで,アミノアシルステムとアンチコドンア-ムの両方が必要であった(西川).停止コドンのサプレッションを指標にtRNAやアミノアシルtRNA合成酵素の変異株を単離する系を構築した(井口).<コドン認識におけるアンチコドン1字目の転写後修飾の役割>___ー.セミミクロHPLC/FRITーFAB・MASによる修飾ヌクレオシド分析の系を構築した(石倉).NMR解析から,2'ー0ーメチル化によってUおよびCのコンホメ-ションが固くなること,イノシンでは,Aの認識にコンホメ-ションの柔らかさが重要なことを見いだした(河合,宮澤,横山).コドン・ボックスの読み分けにおいて,修飾による「固さ」の調節とともに,tRNA種の細胞内量比の重要性を示した(横山).高GC,高ATゲノムの生物ではアイソアクセプタ-量比がコドン使用頻度とよく対応し,マイコプラズマにおいてコドンCGGが「ナンセンス」であることを見いだした(安達).<異常な翻訳>___ー.終結因子RF2の機能に重要な残基を同定し,<herC>___ー遺伝子がリジルtRNA合成酵素をコ-ドすることを証明した(中村).挿入因子IS1のトランスポ-ゼス発現におけるフレ-ムシフト機構を調べた(大坪).哺乳類において,セレノシステイニルtRNA合成には,Seドナ-としてHSe^ーが関与することを証明した(水谷).種々の非天然型アミノ酸を組み込んだヒト上皮成長因子の合成に成功した(宮澤,横山).<tRNAアイデンティティ->___ー.大腸菌のアイデンティティ-決定因子の全体像がほぼ明らかになった(長谷川,横山).セリン,ロイシン,アラニン以外のtRNAでアンチコドンが決定因子となっている。識別塩基は,多くの場合に重要である.イソロイシンtRNAと合成酵素の結合にともないL字型3次構造が変形することがNMR解析により明らかになった(横山).セリンとチロシンでは長い可変ル-プが重要であることが証明された(長谷川).酵母チロシンtRNAで,アミノアシルステムとアンチコドンア-ムの両方が必要であった(西川).停止コドンのサプレッションを指標にtRNAやアミノアシルtRNA合成酵素の変異株を単離する系を構築した(井口).
ミトコンドリアに由来する傷害関連分子パターンの受容体同定およびその生体機能解析

本研究は、ミトコンドリア由来の傷害関連分子パターン(MTDs)に存在する自然免疫活性化能を持つペプチド、特にその存在が予測されているホルミルペプチドを同定し、その生理的存在意義を解明することを目的としているが、本年度の検討により、以下の結果が得られた。1)ミトコンドリアDNAにコードされた13種類のタンパク質由来のホルミルペプチドのうち、MCT-2を含む5種類の高い活性を示すホルミルペプチドについて、それらの受容体を検討した。その結果、すでに明らかになっているMCT-2に加えて、NADHデヒドロゲナーゼ・サブユニット4 (1-20)ならびにNADHデヒドロゲナーゼ・サブユニット5 (1-28)はホルミルペプチド受容体2 (FPR2)のみを特異的に活性化すること、これに対しNADHデヒドロゲナーゼ・サブユニット6 (1-6)はホルミルペプチド受容体1 (FPR1)を特異的に活性化すること、さらにチトクロームcオキシダーゼ・サブユニットI (1-13)はFPR1とFPR2の両方を活性化することが示された。2) MCT-2以外のMCTsの中でも活性の高い、ミトコンドリア移行配列由来でN末端がホルミル化されていない好中球活性化ペプチド、MCT-3に対する特異的MAb、AH1を獲得し、それを用いて、MTDsにおけるMCT-3の存在を検討した。その結果、MTDsの逆相HPLCによる精製画分において、AH1に対する免疫活性が認められ、MTDsにMCT-3あるいはその誘導体が存在していることが示唆された。3) MCT-3を含むMCTsの受容体や情報伝達を解析した結果、それらMCTsの情報伝達にGi2タンパク質が関わっていること、さらにそれらに対する受容体が、従来のGタンパク質共役受容体と異なり、Gi2を含む少なくとも5種類以上のタンパク質からなる複合体である可能性が高いことが示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。最近、非感染性の炎症を起こす因子として、ミトコンドリア由来の傷害関連分子パターン(MTDs)という分子群の概念が提起されている。このMTDsの活性因子としてミトコンドリアDNA (mtDNA)とホルミルペプチドが考えられていたが、ごく最近、高度に精製されたmtDNAは好中球を活性化しないことが報告された。一方、MTDs中のホルミルペプチドは未だ同定されていない。そこで本研究では、我々が生体から同定したmitocryptide-2(MCT-2)を含む内因性ホルミルペプチドに対する特異的モノクローナル抗体(MAb)を作製し、それらを用いることで、MTDs由来のホルミルペプチドを同定し、その受容体を含む情報伝達機構を明らかにすることを目的としている。平成29年度は下記の2点について検討した。1)MCT-2に対する特異的なMAbを獲得し、それを用いて、MTDsにおけるMCT-2の存在を検討した。その結果、MTDs中にMCT-2またはその誘導体が存在している可能性が示唆された。2)ホルミルペプチドを認識する受容体として好中球に発現しているformylpeptide receptor 1(FPR1)およびそのホモログformyl peptide receptor 2(FPR2)のリガンド認識機構の解析を行なった。すなわち、まずFPR2と特異的に結合し活性化するMCT-2の構造活性相関を検討した。その結果、MCT-2がその受容体を活性化するのに必要な最小構造がMCT-2(1-7)であること、さらにN末端ホルミル基ならびに1位Metが活性発現に必須であることを見出した。加えてMCT-2のどのような構造的特徴がFPR1とFPR2の受容体選択性に関与しているのかを検討した結果、MCT-2の鎖長が短くなることによりFPR2に対する特異性が失われ、むしろFPR1と結合し活性化することが示された。平成29年度の研究計画では、我々が生体から同定したMCT-2を含む内因性ホルミルペプチドに対する特異的MAbを作製し、それらを用いることで、MTDs由来のホルミルペプチドを同定することを目標としていた。これに対し本年度の研究により、MCT-2をはじめとした3種類の内因性ホルミルペプチドに対する特異的中和MAbsの取得に成功した。さらに、取得したMAbsのうちMCT-2に対する特異的MAb、NhM2A1を用いて、MTDsにおけるMCT-2の存在を検討したところ、MTDs中にNhM2A1に対する免疫活性が存在することが示され、MCT-2あるいはその誘導体がMTDs中に存在している可能性が示唆された。現在、研究目標を達成するため、MTDsに存在するMCT-2の化学構造を解析するとともに、MCT-2以外のホルミルペプチドの存在や分子形態についても検討を進めている。また本年度は、次年度で計画していた、ホルミルペプチドを認識する受容体として好中球に発現しているFPR1とそのホモログFPR2のリガンド認識機構の解析も行なった。すなわち、まずFPR2と特異的に結合し活性化するMCT-2の構造活性相関を検討した結果、MCT-2がその受容体を活性化するのに必要な最小の構造がN-ホルミル基を含む1位から7位であること、N-ホルミル基と1位Met側鎖が活性発現に必須であることが示された。さらにMCT-2のどのような構造的

特徴がFPR1とFPR2の受容体選択性に関与するのかを検討した結果、MCT-2の鎖長が短くなることにより、活性化する受容体がFPR2からFPR1にシフトすることが示された以上のように、本研究は当初の計画以上に進展していると考えられる。本研究は、ミトコンドリア由来の傷害関連分子パターン(MTDs)に存在する自然免疫活性化能を持つペプチド、特にその存在が予測されているホルミルペプチドを同定し、その生理的存在意義を解明することを目的としているが、本年度の検討により、以下の結果が得られた。1)ミトコンドリアDNAにコードされた13種類のタンパク質由来のホルミルペプチドのうち、MCT-2を含む5種類の高い活性を示すホルミルペプチドについて、それらの受容体を検討した。その結果、すでに明らかになっているMCT-2に加えて、NADHデヒドロゲナーゼ・サブユニット4 (1-20)ならびにNADHデヒドロゲナーゼ・サブユニット5 (1-28)はホルミルペプチド受容体2 (FPR2)のみを特異的に活性化すること、これに対しNADHデヒドロゲナーゼ・サブユニット6 (1-6)はホルミルペプチド受容体1 (FPR1)を特異的に活性化すること、さらにチトクロームcオキシダーゼ・サブユニットI (1-13)はFPR1とFPR2の両方を活性化することが示された。2) MCT-2以外のMCTsの中でも活性の高い、ミトコンドリア移行配列由来でN末端がホルミル化されていない好中球活性化ペプチド、MCT-3に対する特異的MAb、AH1を獲得し、それを用いて、MTDsにおけるMCT-3の存在を検討した。その結果、MTDsの逆相HPLCによる精製画分において、AH1に対する免疫活性が認められ、MTDsにMCT-3あるいはその誘導体が存在していることが示唆された。3) MCT-3を含むMCTsの受容体や情報伝達を解析した結果、それらMCTsの情報伝達にGi2タンパク質が関わっていること、さらにそれらに対する受容体が、従来のGタンパク質共役受容体と異なり、Gi2を含む少なくとも5種類以上のタンパク質からなる複合体である可能性が高いことが示された。本年度の検討により、MTDs中にMCT-2が存在する可能性を示すとともに、MCT-2の鎖長がFPR1ならびにFPR2の受容体選択性に関わっていることを見出した。今後は、MTDsに存在するMCT-2の化学構造を解析するとともに、MCT-2以外のホルミルペプチドの存在や分子形態の解明を目指す。また、FPR1ならびにFPR2が生体内において、それぞれどのような役割を担っているのかを明らかにすることも試みる。1) MTDsに由来する内因性ホルミルペプチドの同定:MTDs中に存在するMCT-2あるいはその誘導体について、NhM2A1の免疫活性を指標に、各種クロマトグラフィーを用いて精製し、質量分析やエドマン分解法により化学構造を決定する。また、すでに複数種のMCT-2以外の内因性ホルミルペプチドに対する特異的中和MAbsの獲得にも成功しているが、それらを用いることで、他の内因性ホルミルペプチドの同定も試みる。2)傷害モデルにおけるFPR1ならびにFPR2の関与:肝傷害をはじめとした非感染性の傷害モデルを作製し、FPR1ならびにFPR2特異的拮抗阻害薬を用いて、内因性の傷害におけるFPR1ならびにFPR2の役割を検討する。また、MCT-2をはじめとした内因性ホルミルペプチドに対する特異的中和MAbsを用いることで、非感染の傷害における内因性ホルミルペプチドの関与も検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
機能性有機低分子ゲルの創製

われわれは、(1)新規な有機低分子ゲルの創出、(2)ゲルの凝集形態と分子構造・分子間相互作用との相関の解明、(3)有機低分子ゲル創出のための分子設計指針ならびに三次元網目状組織体構築の手法の確立、(4)有機低分子ゲルの熱可逆的ゾル-ゲル転移の解析、(5)有機低分子ゲルの光・電子機能材料への応用、を目的として研究を行なっている。これまでに、π電子系を含む有機低分子4,4',4"-tris(stcaroylamino)triphenylamine(TSATA)ならびにN,N',N"-tristearyltrimes-amidc(TSTA)が、種々の有機溶媒とゲルを形成しうろことを見いだしている。ゲルに関するこれまでの研究は、ほとんどが高分子系を対象としている。これに対し、低分子有機化合物で形成されるゲル(有機低分子ゲル)の研究は、有機材料化学における新しい領域を開拓するものとして興味深い。われわれは、(1)新規な有機低分子ゲルの創出、(2)ゲルの凝集形態と分子構造・分子間相互作用との相関の解明、(3)有機低分子ゲル創出のための分子設計指針ならびに三次元網目状組織体構築の手法の確立、(4)有機低分子ゲルの熱可逆的ゾル-ゲル転移の解析、(5)有機低分子ゲルの光・電子機能材料への応用、を目的として研究を行っている。これまでに、4,4',4"-tris(stearoylamino)triphenylamine(TSATA)ならびにN,N',N"-tristearyltrimesamide(TSTA)が、種々の有機溶媒とゲルを形成しうることを見いだしている。本研究では、さらに新しい有機低分子ゲルの創製を目指して、新規化合物1,3,5-tris(4-octadecanoylaminophenyl)benzene(TSAPB)ならびに1,3,5-tris(4-stearoylaminophenylphenylamino)benzene(TSA-TDAB)を設計・合成し、これらの分子が、実際に種々の有機溶媒とゲルを形成することを見いだした。これらの新規分子系において、(1)分子間水素結合とゲル形成能との相関、(2)アルキル鎖長とゲル形成能との相関、(3)有機低分子ゲルの微細構造、について検討を行った。その結果、TSATA,TSTAと同様に、TSAPBならびにTSA-TDABにおいても、3つのアミド結合部における分子間水素結合と適当な長さの長鎖アルキル基が、ゲル形成に必要な三次元ネットワーク構造の形成に重要な役割を果たしていることを明らかにした。
炎症抑制シグナル蛋白A20及びPyrinによる気道炎症制御の試み

ピリンタンパク質は4つの主要なタンパク質ドメインから構成され、同様にピリンドメインを持つファミリ-タンパク質と相互作用し、炎症性サイトカインであるIL-1βの産生を抑制し、さらにNFκBの活性化を抑制し、炎症を終息させる働きを持つ。このピリン蛋白の中でヘリックス構造をなすピリンドメインは蛋白-蛋白の相互作用に関わる重要な部分である。我々はピリンドメインの相互作用するプラットフォ-ム形成を阻害することによって炎症の抑制を行うため、細胞内導入ペプチドシークエンス(KKKKKKKKK)をアミノ末端に付加し、さらにカルボキシ末端にはHAタグシークエンスを付加したピリン蛋白由来のピリンドメインを大腸菌で作成した。この蛋白をNiカラム、ゲル濾過、陰イオン交換カラム、そしてエンドトキシンを除くためにポリミキシンカラムで精製し、マウス気管支喘息モデルを作成後、経鼻的に導入しその効果を検討した。結果:血清、BALF中の炎症性サイトカインを検討し、IL-5がピリンドメイン導入した群で有意に低下し、好酸球の減少も確認された。また組織の検討ではピリンドメインタンパク質は気道上皮細胞、気道上皮下の単核球にもその導入が確認された。これらの結果は経気道的投与により、吸入ステロイド薬に替わり選択的にNFκBを抑制しアレルギー性気道炎症を抑える治療薬の可能性を示した。本研究で炎症抑制に用いたピリンタンパク質は4つの主要なタンパク質ドメインから構成され、同様にピリンドメインを持つファミリータンパク質と相互作用し、炎症性サイトカインであるIL-1betaの産生を抑制し、さらにNF-kBの活性化を抑制し、炎症を終息させる働きを持つ。このピリン蛋白の中でヘリックス構造をなすピリツドメインは蛋白-蛋白の相互作用に関わる重要な部分である。そこでわれわれはピリンドメインの相互作用するプラットフォーム形成を抑制することで炎症を終息できないかと考え、細胞内導入ペプチドシークエンス(KKKKKKKKK)をアミノ末端に付加し、さらにカルボキシ末端にはHAタグシークエンスを付加したピリン蛋白由来のピリンドメインを大腸菌で作成した。このピリン蛋白の中でヘリックス構造をなすピリンドメインは蛋白一蛋白の相互作用に関わる重要な部分である。