hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
宇宙の微小重力環境下でのタンパク質結晶化と結晶化容器の開発

本年度はスペースシャトルを利用して2回の宇宙実験を実施した。ニワトリ卵白リゾチームについて2つの異なる結晶化条件で結晶化を行い、正方晶の条件では1種類、また、単斜晶の条件では2種類の形の異なる単結晶と斜方晶の単結晶を得ることができた。本年度の実験結果から得られた結論として、1.3種類の単結晶(単斜晶、斜方晶、正方晶)を得た。結晶構造解析によって結晶の分子配列を解析した結果、宇宙で晶出した結晶の分子配列は地上でも晶出し、報告例があった。2.結晶核生成時のタンパク質分子の挙動が地上とは異なっていることを示唆する結果を得た。単斜晶の結晶化条件からは3種類の異なる結晶が晶出したのであるが、地上の結晶はいずれも異なる結晶化条件から晶出したもので、結晶核生成に際し、微小重力下ではタンパク分子表面の物理的特性が結晶核の種類を決定する因子となっていることが推測される。一方、正方晶の場合は、分子配列で両者を区別することができず、結晶の種類も1種類で合ったことから宇宙においても比較的安定な結晶核が生成されることが判明した。3.結晶化容器の開発については透析法に基づく装置の設計を行った。当初の計画ではモックアップモデルを試作する予定であったが、本年度は設計段階での試行錯誤に留まった。また、フライトモデルの製作は金額的に不可能であるため断念した。スペースシャトルを利用して宇宙の微小重力環境の下でニワトリ卵白リゾチームの結晶化を行った。結晶化方法は蒸気拡散法の原理に基づいて製作された装置を用いた。単斜晶が晶出する条件では、宇宙では形状の異なる2種類の単斜晶が得られた。また、同一条件で、斜方晶が晶出した。一方、正方晶の条件でも正方晶以外に斜方晶と思われる結晶が晶出した。形状の異なる単斜晶は厚みのため結晶(β=114°)と極めて薄い板状結晶(β=91°)で、外観で容易に区別することができ、宇宙では専ら後者の結晶が得られる確率が高かった。しかし、X線結晶構造解析の結果、これら2種類の単斜晶は結晶内部の分子配列が同じであったことから、形態的相違については宇宙と地上の環境差による結晶面の成長速度の差に起因するものと考えられる。一方、斜方晶については地上で晶出した正方晶や単斜晶を30°C以上の高温条件においたとき現れる斜方晶(high temperature form)と宇宙で晶出した斜方晶では、結晶内の分子パッキングが全く異なっていた。地上でも宇宙の斜方晶と同じ結晶内分子パッキングを有する斜方晶が晶出したという報告はある。しかし、分解能が6Åで、それ以後の研究報告がなく、地上の結晶については研究が進んでいない。次に正方晶について、宇宙で晶出した正方晶は形状だけでなく結晶内分子パッキングも地上の正方晶と全く同一であった。以上のように、宇宙では条件によって地上の結晶とは空間群の異なる結晶が晶出することが判明した。しかし、3種類の空間群(単斜晶、斜方晶、正方晶)に属する宇宙並びに地上の結晶について構造解析した結果、得られた分子構造を比較すると、タンパク質分子自体の構造的変化は数ヶ所に揺らぎの多い箇所が認められたものの、宇宙と地上の結晶の間で本質的に顕著な差異はなく、タンパク質分子に結合した水の構造についても保存性の高い3分子の結合水は共通に保存されていた。
エアバッグ式ヒッププロテクターの最適化デザインによる継続的装着率の改善

新たに開発したエアバッグ式ヒッププロテクターは、臀部に伝達される衝撃力は1/10以下に低下することができた。本研究はプロテクターの継続的装着率の改善に向けて、エアバッグの最適化デザインの設計、衝撃力緩和作用と装着性に優れたヒッププロテクターの開発を行った。プロテクターの厚みは2cm以下では直接接触が起こり、それを防ぐためには気圧を1.3気圧以上に高くする必要があり、装着感を損なう可能性があることが示唆された。我々が開発したエアバッグ式ヒッププロテクターはバッグ内に封入されたCO2ガスの圧縮変形、設定圧以上での放出を利用して、転倒時に受ける衝撃力を効果的に緩和し、高齢者の転倒による頸部骨折を予防すること、また、従来市販品より衝撃緩和能が高く、装着性に優れた構造にすることで、装着持続性を高めることを目指している。市販のC社製硬質、A社製ゲルパッド,B社製軟質プロテクターと試作エアバック式ヒッププロテクターについて振り子式衝撃荷重試験および動的粘弾性試験を実施した。衝撃緩和効果を(プロテクター無の最大荷重PO)/(有の最大荷重Pp=37.6kN))で定義すると、C社硬質タイプは2.5、A、B社軟質タイプはそれぞれ3.2、2.1であり、一方、試作のエアバック式プロテクターは95.3と高い緩和効果が実証された。また、動的粘弾性試験においては、衝撃エネルギー散逸効果を絶対弾性率Eと損失正接tanδで比較すると、硬質タイプは絶対弾性率615kg/mm2,Tanδは0.207、A社ゲルタイプでは81kg/mm2,0.59、一方、エアバッグ式は120615kg/mm2、0.811であった。以上の結果、エアバック式ヒッププロテクターは従来品に見られない優れた衝撃力緩和機能があることが推察された。装着性については、装着時の苦痛、運動性、重さによるずれ、就寝時の寝返り、トイレ動作等において目立った改善効果が確認された。気体の流動圧縮性を利用したエアバッグ式ヒッププロテクターを既に考案した。衝撃荷重の体表面分散能と衝撃エネルギー吸収能は現在市販の硬質シェル、軟質ゲルシート式プロテクターに比べて飛躍的に向上した。ヒトの転倒を想定した振り子式衝撃荷重試験を実施して、プロテクター無しに比べて、臀部に伝達される衝撃力は1/10以下に低下することが分かった。本研究はプロテクターの継続的装着率の改善に向けて、最適化デザイン(特に、インターフェイス・デザインに着目)手法を用いてエアバッグ形状の設計、衝撃力緩和作用と装着性に優れたヒッププロテクターの開発、及び骨粗鬆症重篤度とエアバッグ式ヒッププロテクターの適応限界の関係を明確にする。高齢者の頸部骨折予防にはプロテクターが高い衝撃吸収能を有することと継続的装着率を高めることの両立が肝要である。プロテクターの受圧面積や厚みの制限に配慮しつつ、安全性と装着性に優れたプロテクターをデザインする必要がある。エアエアバッグの内圧の設定も課題の一つである。幸い、エアバッグ方式は既存のものに比べて衝撃緩和機能が極めて高いので、装着性を損なわずに思い切ってコンパクト化できる可能性がある。さらに、腰部外側の湾曲にヒッププロテクターの底部曲率を合わせることで、一様な圧力分散が可能であった。しかし、プロテクターの厚さについては2cm以下では直接接触が起こり、それを防ぐためには気圧を1.3気圧以上に高くする必要があり、装着感を損なう可能性があることが示唆された。気体の圧縮性を利用したエアバッグ式ヒッププロテクターを考案した。ヒトの転倒を想定した振り子式衝撃荷重試験を実施して、プロテクター無しに比べて、臀部に伝達される衝撃力は1/10以下に低下することができた。エアバッグ方式は既存のものに比べて衝撃緩和機能が極めて高いので、装着性を損なわずに思い切ってコンパクト化できる可能性がある。
変動軸力を受ける鉄筋コンクリ-ト柱のせん断抵抗挙動に関する研究

地震荷重の下では、鉄筋コンクリ-ト構造における柱部材には、水平力の変動に伴い軸力の変動が生じる。この軸力変動は、中高層建物の外柱において著しく引張軸力の生じる場合すらある。一方、現在使用されている鉄筋コンクリ-ト部材の設計式は一定軸力の下での強度・変形特性に基づいており、変動軸力への対応はなされていない。本研究では、曲げせん断を受ける鉄筋コンクリ-ト柱の履歴復原力特性に及ぼす変動軸力の影響を明かにし、実際の構造物の構造設計時に有益な基礎資料を得ることを目的としている。この目的に沿って行なわれた実験および実験結果の分析より得られた結果を下に示す。1.同一せん断補強筋を有する柱においては、上限軸力一定の場合よりも変動軸力の場合のほうが、柱の層間変形の増大に伴うせん断補強筋応力の進展が若干早い。しかし、その差は小さく実際の部材設計時には考慮しなくてもよいと考えられる。2.変動軸力の場合よりも、上限軸力が変動せずに加わる場合のほうが異形軸鉄筋の付着割裂き作用が大きくなる。この現象は、軸鉄筋の付着応力及びダウエル作用の実測結果、供試体の破壊状況からも明かである。3.上に述べた1.および2.の結果より、変動軸力を受ける柱のせん断および付着設計においては、上限軸力一定の場合にたいしてせん断破壊および付着割裂破壊が生じないように設計しておけばよいと考えられる。4.変動軸力を受ける柱の危険断面の曲げせん断設計おいては、上に述べた3.によるせん断および付着設計に加えて、上限軸力時に対する曲げじん性設計が不可欠であり、必要に応じた横拘束筋の配置が必要である。横拘束筋の必要量は、拘束コンクリ-トにたいする応力ひずみ曲線モデルを用いて求められる。鉄筋コンクリート柱材には、地震荷重時において変動軸力が作用し、このような状況での柱材のせん断抵抗挙動を明らかにすることは架構の耐震安全性を確保する上で極めて重要である。本観点より研究が実施されたもので現在までに得られた成果は以下の通りである。1.変動軸力下でのせん断挙動は、一定軸力の場合と若干異なる。特にせん断ひびわれ耐力、せん断補強筋応力の発生過程が軸力の変動によって左右される。例えは、低軸力から高軸力まで変動させると、せん断ひびわれ耐力は低軸力一定の場合より大きく高軸力一定の場合より小さい。また、このせん断ひびわれ発生時期の差がせん断補強筋の応力発生時期に対応する。2.柱が最終的な破壊に至る過程は、軸力変動によって影響される。しかし最終破壊時における耐力および変形は、最終破壊時における軸力を一定軸力として加えた柱における値と大差ない。すなわち、設計上は最終状態における軸力を目安とすればよいと考えられる。3.変動軸力の上限値が大きい程、主鉄筋に沿った付着割裂破壊を生じる傾向がある。この現象は、柱クリティカル断面における主鉄筋応力より求めた平均付着応力の値と、主鉄筋の付着割裂強度との対比により説明できる。4.塑性理論の下界の定理を用いてせん断設計式を誘導すると、軸力の影響を考慮できない。これは、静的釣合い場を与えるモデルの設定に問題があるものと考えられ、適切なモデル化を行えば、変動軸力に対応出来る塑性理論に基づいたせん断設計式が得られるものと考えられる。これについては、次年度に行う予定である。
新たな線維筋痛症モデル動物の開発と運動療法の生物学的効果の探索

本研究では足関節不動化により発生する筋痛の病態解明を行い,これが線維筋痛症モデルとして妥当かどうかを検証した.具体的には,ラット足関節をギプスで4週間固定し,筋痛の発生状況,脊髄後角とDRGにおける中枢性感作,骨格筋内のNGF,末梢神経線維の分布状況を検索した,結果,ラット腓腹筋において機械的刺激に対する痛覚閾値,NGF発現増加,神経C線維の神経密度増加を認めた.また,脊髄後角ではCGRPの増加,DRGでは感覚神経細胞のphenotype switchが認められ,慢性的な中枢神経感作の徴候が認められた.これらの事象は線維筋痛症の末梢病態と発生メカニズムに関与するのではないかと考える.平成26年度では,長期間の下肢不動による新たな線維筋痛症モデルラットを開発することを目的とし,実験を行った.具体的には,実験動物には8週齢のWistar系雄性ラット29匹を用い,対照群(n = 11)と右側足関節を最大底屈位で4週間ギプス固定する不動群(n = 18)に振り分け,Randall-Selitto testにて腓腹筋の圧痛覚閾値を測定した.実験期間終了後,一部のラット(対照群,n=5;不動群,n=6)から腓腹筋を摘出し,筋組織における病理所見の確認を行った.また,一部の腓腹筋を用いてNGF含有量の含有量をwestern blot法にて測定した.残りのラット(対照群,n=6;不動群,n=12)は,NGFレセプター阻害実験に供した.NGFレセプター阻害実験では,腓腹筋にNGFレセプターの拮抗物質であるK252aを筋内投与し,投与10分から60分後まで腓腹筋の圧痛覚閾値の変化を観察した.結果,不動群の筋圧痛覚閾値および足部表在の痛覚閾値は不動2週目から対照群と比較して有意に低下し,その状況が不動期間終了まで継続した.不動期間終了後,対照群および不動群の腓腹筋では,筋線維損傷などの病理所見はいずれも認めなかったが,不動群では筋内NGF含有量増加を認めた.また,NGFレセプター阻害実験の結果,K252aを投与すると10分後より圧痛覚閾値は有意に上昇,つまり回復した.以上のことから,関節不動により線維筋痛症に類似する症状の発生を認め,そのメカニズムには過剰なNGFの発現増加が関与していることが示唆された.今後,中枢性感作の発生の有無を確認し,線維筋痛症モデルとしての妥当性を高め,それを踏まえて運動負荷実験へ進めていく.平成27年度は,平成26年度に作成した長期間の下肢不動による新たな線維筋痛症モデルラットについて,異なる不動期間での検討,ならびに免疫組織化学的手法を用いた痛覚閾値低下メカニズムの検討を行った.具体的には,モデル作成方法は昨年度同様とし(対照群,n=20;不動群n=20),不動期間を2週間(n=10)と4週間(n=10)に設定し,痛覚閾値低下の起因と見られる骨格筋NGFの発現量の変化を検討した.その結果,腓腹筋内のNGFは不動期間2週,4週のいずれにおいても腓腹筋の痛覚閾値の低下とNGF発現の増加が認められた.次に,腓腹筋内に分布する痛覚を完治する神経C線維の密度を検討した結果,不動期間2週,4週のいずれにおいても密度の増加が認められた.平成26年度に行ったNGレセプターブロック実験では,腓腹筋にNGFレセプターをブロックすると即時に痛覚閾値は上昇したが,完全には正常化しなかった.その理由が,今回明らかとなった神経C線維の密度増加にあると推測された.平成27年度に予定していた線維筋痛症モデルラットの骨格筋における末梢神経線維の分布を明らかにすることができた.ただ,末梢神経密度の算出に予想以上の期間を要しため,侵害受容体の発現状況の検討には至らなかった.現在,早急にDRG神経細胞における侵害受容体の発現状況を解析している.これまでの結果より,本研究で作成した不動誘発生筋痛症の発症メカニズムにはNGFの発現増加と末梢神経密度の増加が関わっていると考えられる.これらの変化の上位メカニズムを探るべく,平成28年度では筋病態をさらに詳しく解析した.ターゲットはマクロファージである.具体的には,不動に曝された骨格筋内では血流低下のため酸素不足状態となり,HIF-1およびマクロファージ遊走因子のMCP-1が増加し,マクロファージの集積が起きる.そしてマクロファージより分泌される炎症性サイトカインIL-1bやTGFbが筋痛の原因となるNGF発現と関連がある可能性が示唆された.また,これらの事象は,線維芽細胞を刺激してコラーゲンの発現および筋線維間の結合組織の増加を促進し,筋伸張性の低下と筋性拘縮の発生にも繋がる.つまり,不動に伴う筋痛と関節拘縮は同じメカニズム上で起きる症状であり,これが線維筋痛症の末梢病態である可能性が示唆される.そして,筋痛と筋性拘縮のため不動状態がさらに長期化すると悪循環に陥り,最終的には感覚刺激入力の減少により末梢神経脊髄レベルでの中枢性感作を引き起こし,さらに精神的ストレスが加わることによって痛覚閾値の低下が慢性化していくのではないかと思われた.

一方,線維筋痛症に対する運動療法の治療効果を探るべく,本モデルの不動期間においてトレッドミルによる全身運動を負荷し,痛覚閾値および中枢性感作の変化を検索した.その結果,運動療法は脳内のエンドロフィンの発現を誘発し,下行性疼痛抑制系を賦活化して痛覚閾値の低下の慢性化を抑制することが明らかとなった.つまり,運動療法には線維筋痛症の発生を予防する可能性が示唆された.ただ,進行した線維筋痛症に対する運動療法の効果検証には至らず、課題を残した.本研究では足関節不動化により発生する筋痛の病態解明を行い,これが線維筋痛症モデルとして妥当かどうかを検証した.具体的には,ラット足関節をギプスで4週間固定し,筋痛の発生状況,脊髄後角とDRGにおける中枢性感作,骨格筋内のNGF,末梢神経線維の分布状況を検索した,結果,ラット腓腹筋において機械的刺激に対する痛覚閾値,NGF発現増加,神経C線維の神経密度増加を認めた.また,脊髄後角ではCGRPの増加,DRGでは感覚神経細胞のphenotype switchが認められ,慢性的な中枢神経感作の徴候が認められた.これらの事象は線維筋痛症の末梢病態と発生メカニズムに関与するのではないかと考える.平成26年度では,足関節不動モデルラットの骨格筋の痛覚閾値の低下が慢性化する時期を明らかにし,その骨格筋における痛覚閾値の低下に対するNGFの関わりを明らかにすることが目的であった.「研究実績の概要」に記載したとおり,予定の知見は得られ,すでに次の段階として中枢神経系の解析を既に進めている.よって研究は順調に進展していると判断できる.平成28年度は,本モデルに対する運動療法の効果を検討していくが,その前に,中枢性感作の状況,ならびに不動解除後の疼痛閾値の推移を確認する必要がある.本モデルを線維筋痛症のモデルとするならば,中枢性感作の発生とその慢性化が条件であるためである.脊髄レベルでの中枢性感作の発生に関しては別の研究で確認しているが,その中枢性感作がどの程度の期間持続するかは明らかにしていない.それを明らかにした後,本モデルの不動解除後において運動負荷実験を進めていく予定である.リハビリテーション学平成26年度では,不動により痛覚過敏が惹起されたが,これが線維筋痛症モデルとして妥当かどうかを検証するためには,中枢性感作の有無を確認する必要がある.したがって,平成27年度では,脊髄後角に分布する神経ペプチドを評価していく.中枢神経感作が確認された後には,そのトリガーとなる末梢組織の変化を探索していく.平成26年度では,不動による骨格筋の痛覚過敏の発生メカニズムにはNGFの過剰発現が関与していることが示したが,NGFの由来細胞やその原因は明らかにできていない.また,NGF拮抗物質の投与により痛覚過敏の軽減を認めたが,正常レベルには回復していない.つまり,NGF以外の要因が関与している可能性が高く,その1つとしては末梢神経線維密度の増加を予想している.平成27年度は,上記の2点を明らかにすることを第一の目的とし,研究計画書に従って実験を進める.また,運動負荷実験の予備実験を行う.運動負荷方法としては,トレッドミル走行を予定しているが,懸念されることは運動負荷によるストレスの影響である.予備実験でその評価を行い,過剰なストレスの発生が確認された場合は,運動負荷方法を再検討する予定である.
イスラム法における国際法的規範(イスラム諸国の国際的な行動の実証的分析を通じて)

本研究では、伝統的な国際法におけるイスラム国際法の位置付けについて、国際連合やイスラム国際機関、イスラム諸国の動きを通じて解明することが目的である。現在はその一段階として、イスラム法の重要な原理であるイスラム経済法の理念が、イスラム諸国の中でどの程度の国際法的性格をもち、今後のイスラム国際法の原理として展開される可能性があるのかについて検討している。具体的には先駆的なイスラム政策を実施しているパキスタンにおけるイスラム経済政策の実態について分析をしている。ここでは、1991年にパキスタン連邦裁判所イスラム法廷が、すべての利子を違法として廃止するように求めた判決内容の分析を通じて、イスラム経済法の今後の国家的展開の行方について見極めようとするものである。このことは、イスラム経済法の理念が、イスラム諸国の共通の実践的原理として妥当するものかどうか、また、同時にイスラム国際法の重要な指針として展開されるものであるかどうかを探ることでもある。研究の対象資料としては、判決内容、判決に関する公文書、学者・政治家・財界人・実務家などの有識者により作成された関連資料、書籍及びインタビュー内容、イスラム国際機関の各種機関紙などを取り揃えて調査分析を実施している。さらに、今後、未入手のものも多数取り揃えて、これまで同様に、調査・分析を継続していく必要がある。現在は、対外国取引方式の現状と行方(国内と国際の区別)、判決の問題点(観念性)、判決内容の実現可能性(感情的な消極性)、国内・国際社会の反応(批判性)などについて分析を行い、イスラム化政策の現状・限界、今後の展開などをみる。
キラル有機オキソアンモニウム塩による新規酸化的分子変換

当研究室で見出したAZADO型オキソアンモニウム塩のアルケンへの求電子的付加反応の合成化学的活用性の開発を目指して研究を行った。検討の結果、新たに合成した9-nor-azaadamantaneN-oxyl(Nor-AZADO)がAZADOを凌駕する反応性を示すオキソアンモニウム型酸化活性種の前駆体となることを見出すとともに、環状シリルエノールエーテルから良好な収率でα,β-不飽和ケトンが生成することを見出した。さらに、鎖状シリルエノールエーテルからに1,2-ジケトンを与える条件を確立し、その触媒反応化にも成功した。本研究は、先に当研究室で見出した萌芽シーズ:azaadamantane型オキソアンモニウム塩のアルケンへの求電子的付加反応の適用性を明らかとして、その精密合成化学的活用性の拡張を目指すものである。2年計画の初年度の検討において9-nor-azaadamantane N-oxyl (Nor-AZADO)を見出し、このものに由来するオキソアンモニウム塩が電子豊富なアルケンの一つとして位置付けられるシリルエノールエーテルと反応して良好な収率で付加体を形成することを確認した。そして、これよりヒドロキシルアミンが脱離してα,β-不飽和ケトンが得られるという前例のない分子変換を確立することに成功していた。2年計画の最終年度にあたる本年度は、まずNor-AZADOの有用性の基盤を確立するべく、その大量合成法の開発を検討した。その結果、100グラムスケールでNor-AZADOを獲得する合成法の開発に成功し、市販化への途を開くことができた。これよりNor-AZADOに不斉要素を導入したキラルNor-AZADOの合成を試み、鍵基質まで到達した。一方、AZADOに不斉要素を導入したキラルAZADO誘導体を合成してアルコールの不斉酸化、さらには電子豊富アルケン類との反応を検討した。その結果、アルコールの不斉酸化反応において、触媒活性部位のβ位にCyclohexylmethyl基を有するキラルAZADOは、対応する位置にbenzyl基を有するキラルAZADOより高い不斉認識能を示すことを明らかにできた。今後、Cyclohexylmethyl基を有するNor-AZADOの合成を急ぎ、電子豊富アルケン類との反応性を検証する。本研究は、先に当研究室で偶然見出した萌芽シーズ:AZADO型オキソアンモニウム塩のアルケンへの求電子的付加反応の適用性を明らかとし、その精密合成化学的活用性の拡張を目指すものである。2年計画の初年度にあたる本年度は、アザアダマンタン型オキソアンモニウム塩の化学的特性とレドックス特性に関する知見を実験的に求め、他の有機オキソアンモニウム塩類との相違点の明確化を期して検討を行った。種々検討の結果、新たに合成した9-nor-azaadamantane N-oxyl (Nor-AZADO)がAZADOを凌駕する反応性を示すオキソアンモニウム型酸化活性種の前駆体となることを見出した。すなわち、Nor-AZADOは、アルコール空気酸化反応(1 atm Air /cat. NaNO2/AcOH)において最も高い触媒回転率を記録した一方、アルケンとの反応においても良好な収率で求電子付加体を与えることを確認した。さらにアルケン付加における基質適用性を検討する途上で、環状シリルエノールエーテルが速やかに付加反応を起こして、良好な収率でα,β-不飽和ケトンが生成することを見出した。また鎖状シリルエノールエーテルを基質とする反応では触媒的に1,2-ジケトンを与える条件を確立し、その触媒反応化にも成功した。何れの反応においても、オキソアンモニウムイオンの対イオンとしてBF4-が最良の結果を与えることを確認した。萌芽シーズとして設定していたAZADOよりも遙かに高い求電子反応性を示すNor-AZADOを見出すことができた。これにより、当初予想していた以上の研究成果が得られている。引き続き、Nor-AZADOに潜在する合成化学的機能性の開発を目指して探索研究を継続する。加えて、光学活性Nor-AZADOを合成して、不斉反応への展開を図る。光学活性触媒の合成とその反応性について検討を行うため、研究費は有機薬品、無機薬品、ガラス器具等の消耗品の購入に充てる予定である。
優位側大脳半球の側頭葉下面における言語関連中枢の同定に関する研究

平成16年度は平成15年度に引き続いて、優位大脳半球の側頭葉下面の言語関連中枢の研究を行い、最終的に以下の成果を得た。1)優位半球側頭葉下面の電気刺激による言語機能の解明難治の左内側側頭葉てんかん患者の術前検索の一環として、読み、書き、音声言語理解の要素を含む多様な言語課題を用いて側頭葉下面の皮質電気刺激による検索を行った結果、以下の知見を得た。(a)優位半球側頭葉下面は視覚言語処理過程と、聴覚言語処理過程の一部に関与している。(b)視覚言語処理過程に関しては、側頭葉下面内に漢字処理に関与する領域とかな処理に関与する領域が別々に存在する。(c)漢字の認知処理過程と図形・絵の認知処理過程は一部共通要素を持つ。2)優位半球側頭葉下面の事象関連電位による言語機能の解明漢字・かな文字単語の音読と物品の絵の呼称を中心とする視覚呈示課題を用いて、難治の左内側側頭葉てんかん患者の側頭葉下面の慢性硬膜下電極から事象関連電位を記録して解析を行った結果、音読黙読に関連してN200が誘発され、その一部は皮質電気刺激による言語領野と一致した。3)術前術後での神経心理検査結果の検討側頭葉底部言語野の皮質電気刺激結果に基いて、難治の左内側側頭葉てんかんでの同部位の機能を温存した焦点切除症例で、術前の神経心理検査と術後1年にわたる追跡調査を実施した。Wechsler Memory Scale-Revised(WMS-R)での言語記憶の低下は認めず、むしろ術前より改善した。以上より、優位半球側頭葉底部言語野は同側海馬と相まって言語記憶過程に一定の役割を果たす可能性が示唆された。4)言語優位半球同定の検査手法言語優位半球の同定において、最も信頼性の高い検査であるWada testに従来使用されていたアモバルビタールの製造中止に伴い、アモバルビタールに替えて、プロポフォールを用いてWada testを実施し、プロポフォールがWada testにおいてアモバルビタールと同等の安全性と有効性を有することを証明し、実施手法を確立した。平成15年度において、優位大脳半球の側頭葉下面における言語関連中枢の同定に関する研究を行い、次のような成果が得られた。1)優位大脳半球同定に関する検査手法の確立言語優位半球の同定において、最も信頼性の高い検査であるWada testに従来使用されていたアモバルビタールの製造中止に伴い、アモバルビタールに替えて、本邦で初めて麻酔薬のプロポフォールを用いてWada testを実施し、プロポフォールがWada testにおいてアモバルビタールと同等の安全性と有効性を有することを証明し、実施手法を確立した。2)優位半球側頭葉下面の脳機能マッピングによる言語機能の解明難治てんかん患者の術前検索の一環として、読み、書き、音声言語理解の要素を含む多様な言語課題を用いて側頭葉下面の皮質電気刺激による検索を行った結果、次のような知見を得た。

(b)視覚言語処理過程に関しては、側頭葉下面内に漢字処理に関与する領域と仮名処理に関与する領域が別々に存在する。(c)漢字の認知処理過程と図形・絵の認知処理過程は一部共通要素を持つ。3)優位半球側頭葉下面の事象関連電位による言語機能の解明漢字・かな文字単語の音読と物品の絵の呼称を中心とする課題を用いて側頭葉下面に留置した慢性硬膜下電極から事象関連電位を記録して解析を行い、現在、脳機能マッピングの結果との比較検討を進行中である。4)術前術後での神経心理検査結果の検討皮質電気刺激結果の評価に基づいて、機能温存による難治側頭葉てんかん外科治療を行った症例について、術前の神経心理検査と術後1年にわたる追跡調査を実施し、術前術後の比較検討を実施中である。平成16年度は平成15年度に引き続いて、優位大脳半球の側頭葉下面の言語関連中枢の研究を行い、最終的に以下の成果を得た。1)優位半球側頭葉下面の電気刺激による言語機能の解明難治の左内側側頭葉てんかん患者の術前検索の一環として、読み、書き、音声言語理解の要素を含む多様な言語課題を用いて側頭葉下面の皮質電気刺激による検索を行った結果、以下の知見を得た。(a)優位半球側頭葉下面は視覚言語処理過程と、聴覚言語処理過程の一部に関与している。(b)視覚言語処理過程に関しては、側頭葉下面内に漢字処理に関与する領域とかな処理に関与する領域が別々に存在する。2)優位半球側頭葉下面の事象関連電位による言語機能の解明漢字・かな文字単語の音読と物品の絵の呼称を中心とする視覚呈示課題を用いて、難治の左内側側頭葉てんかん患者の側頭葉下面の慢性硬膜下電極から事象関連電位を記録して解析を行った結果、音読黙読に関連してN200が誘発され、その一部は皮質電気刺激による言語領野と一致した。3)術前術後での神経心理検査結果の検討側頭葉底部言語野の皮質電気刺激結果に基いて、難治の左内側側頭葉てんかんでの同部位の機能を温存した焦点切除症例で、術前の神経心理検査と術後1年にわたる追跡調査を実施した。Wechsler Memory Scale-Revised(WMS-R)での言語記憶の低下は認めず、むしろ術前より改善した。以上より、優位半球側頭葉底部言語野は同側海馬と相まって言語記憶過程に一定の役割を果たす可能性が示唆された。4)言語優位半球同定の検査手法言語優位半球の同定において、最も信頼性の高い検査であるWada testに従来使用されていたアモバルビタールの製造中止に伴い、アモバルビタールに替えて、プロポフォールを用いてWada testを実施し、プロポフォールがWada testにおいてアモバルビタールと同等の安全性と有効性を有することを証明し、実施手法を確立した。
男性介護者の実態に関する質的調査研究-家族・ケア・ジェンダーのインターフェイス

本研究課題は、増加し続けている日本の男性介護者を取り巻く介護実態および家族関係ついて、質的調査研究を通じて明らかにするものであった。量的および質的調査を通じて、家事をめぐる困難、仕事との両立をめぐる困難、暴力的行為等、男性介護者固有の課題を解明した。これを踏まえ、男性介護者への支援プログラムの開発に向けて、まず、全国各地で行われている男性介護者支援活動(集いの開催)に参与観察を行い、男性の組織化の現状について分析した。さらに、「男性介護者と支援者の全国ネットワーク」の設立に参画した。2006年度に実施した男性介護者に対する全国調査を分析し出版した(津止正敏・斎藤真緒著『男性介護者白書-家族介護者支援への提言』かもがわ出版、2007年8月、津止正敏・斎藤真緒、2007、「家事にうろたえ、孤立に悩む夫たち、息子たち-全国調査データが示した"現実"」『論座』8月号、261-268頁、朝日新聞社)。この全国調査分析については、2008年コペンハーゲンで開催される研究集会「Conference Transforming care」での報告も決定している。また、すでに20年ほど前から増加傾向にある欧米での男性介護者の実態とその実証的・理論的研究を踏まえ、ケアとジェンダーに関する理論枠組みを検討し、学会報告を行った(「男が介護するということ-家族・ケア・ジェンダーのインターフェイスー」(日本家族社会学会、2007年9月、札幌学院大学)。さらに、全国調査インタビュー調査への協力意思を表明していた男性介護者および調査研究を通じて知り合った男性介護者に対する個別インタビュー調査を行った(8名)。具体的には、介護を引き受ける経過や困難(家事や仕事との両立)、他の家族との関係や将来の見通し等について半構造化インタビューを行った。現在データ分析中であり、2008年度に学会報告及び公表論文化する予定である。また、全国で先駆的に取り組みが始まっている男性介護者の当事者組織(荒川区オヤジの会、長野県シルバーバックの会、認知症の人と家族の会での「男性介護者のつどい」)の取り組みを視察し、それぞれの組織構造や活動状況についての特性を調査した(継続中)。イギリスを中心とするヨーロッパの家族介護者政策の歴史および現状・課題について、文献サーベイを行うと同時に、イギリス国内最大の家族介護者による当事者組織であるCarer's UKに対する調査を実施中である。なお、男性介護者研究の理論的・実践的課題については、公表論文として発表した(『立命館産業社会論集』第45巻第1号、2009年6月刊行予定)。2009年3月には、ノッティンガムで開催されたイギリスの高齢者虐待予防に関する全国大会(The National 2009 Action on Elder Abuse Conference)に参加するなど、高齢者虐待予防としての家族介護者支援の在り方という観点からこの問題についかて検討している。現在、以下の4点にわたっておもに研究を実施している。第1点は家族介護者支援政策に関するサーベイである。サセックス大学において、第2点は高齢者虐待予防に関する政策比較である。第3点は、マスキュリニティに関する理論的研究である。2009年4月には、カナダのモントリオールで開催されたAmerican Men's Studies Associetionの国際学会(Beyond Borders : Masculinities and Margins)に参加することで、他の研究者との研究ネットワークの構築を図った。第4点は、質的調査方法論に関する研究である。NVivoを中心とする質的調査のソフトウェアの利用方法に関するトレーニングを、University of Surreyにおいて継続的に行っている。第一に、男性介護者の介護実態について、量的・質的調査を実施した。具体的には、全国初の男性介護者に対する実態調査を実施し、高齢男性介護者を中心として、介護者自身の健康問題や、仕事との両立の困難(介護離職)、家事(炊事、洗濯、買い物)における困難、地域における孤立傾向が確認された。一連の量的研究は『男性介護者白書一家族介護者支援への提言』としてまとめ、「2008年度生協総研研究賞特別賞」を受賞した。また、男性介護者の「主観的現実」に注目し、インタビュー調査および男性介護者が執筆した手記の分析を行った。本研究では、家族介護固有の感情の変化を、「両義的感情経験」としてとらえ、初動期から看取りまでの介護プロセスに即した介護感情の変遷を分析した。第二に、男性介護者に対する具体的な支援方法として、東京、長野、福岡、宮城といった各地ですでに実施されている、男性介護者の集いの参与観察を行った。研究開始当初は予定していなかったが、各団体調査を行う過程において、どの団体も会員の拡大や運営方法に苦慮しており、他団体の情報を欲していた。こうした意向を踏まえ、各団体に呼びかけ、2007年から1年間準備会議を定期的に開催し、2008年3月に「男性介護者と支援者の全国ネットワーク」結成集会を開催し、150名の会員から活動が開始した。

1周年を迎えた2010年4月現在では、会員は400人まで拡大した。当事者の組織化や社会的な情報発信を含む「アクションリサーチ」という性格を強めるものとなった。研究の先進性・現代性・社会性という観点からみても、男性介護ネットの設立に関与できたことは、現場に徹底的に寄り添いながら考えるという、研究姿勢を獲得する上で極めて貴重な体験であった。
食物アレルゲン腸管透過抑制活性成分の探索

食物アレルギー発症の第一段階である腸管からのアレルゲン透過を抑制することはアレルギー予防に効果的である。申請者は前年度までにアレルゲン腸管透過抑制成分としてペプチド系とポリフェノール系の2タイプの活性成分を明らかにした。さらにこれらの結果から、タンパク質およびポリフェノール含量が高い食品にプロテアーゼ処理を行えば、ペプチド系とポリフェノール系の両者の活性成分を含む抗アレルギー食品を創製することが可能であると考え、アレルゲン腸管透過抑制食品である、トリプシン処理ゴマ抽出物(ETS)を製造するという一連の製造工程を確立した^<1)>。本年度はTSEのアレルギー腸管透過抑制とは別の抗アレルギー作用として、肥満細胞の脱顆粒抑制に着目し、TSEに肥満細胞の脱顆粒抑制があるかどうかを検討し、活性成分を単離・構造決定することを目的とした。ラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3を用い、β-ヘキソサミニダーゼ(酵素活性測定法)およびヒスタミン(HPLC on-column法)の遊離からIgE依存性脱顆粒度を測定した。酵素処理ゴマには高い脱顆粒抑制活性が認められたので、逆相HPLCにより活性成分を単離した。NMRおよび質量分析の結果から、活性成分の1個をトリプトファンと同定した。ゴマにはもともとトリプトファンは遊離の状態で存在しているが、酵素処理の条件下(微アルカリと40°Cの加温)で活性成分は有効に可溶化されることが明らかとなった。トリプトファン濃度0.1mMで、β-ヘキソサミニダーゼの放出を20%阻害した。もう1種の活性成分は検討中である。本研究は、食物アレルゲン取り込み経路である消化管粘膜のバリア機能を高めてその透過を防ぎ、アレルギーを予防するという作業仮説のもと、腸管のモデルとなるCaco-2細胞単層膜に対する卵アレルゲンovalbumin (OVA)の透過抑制活性を指標にアレルゲン腸管透過抑制成分の探索および解析を行った。アレルゲン腸管透過抑制成分にはペプチド系とポリフェノール系の2タイプがあった。ペプチド系活性成分として、Trp、PheおよびTyrのエチルエステル(OEt)およびこれら芳香族アミノ酸のGlyをC末端に持つジペプチドを明らかにした。Trp-OEtは10^<-6>M付近で最も強い活性を示した。Caco-2単層膜に対する透過抑制機作の検討を行った結果、Trp-OEtはエネルギー依存的輸送(トランスセルラー経路による輸送)におけるアレルゲンの透過を抑制することが強く示唆された。ペプチド以外のアレルゲン腸管透過抑制成分をターゲットとし、植物性食品から検索を行った。特に活性の高かったオールスパイス、コリアンダー、タラゴンおよびタイムから活性成分を単離した。NMRおよびマススペクトルによる活性成分の解析の結果、これらの活性成分をpimentol (オールスパイス由来)、rosmarinic acid (タイム由来)、Iuteolin-7-Ο-β-glucuronide (タイム由来)、quercetin-3-Ο-β-glucuronide (コリアンダー由来)およびrutin (タラゴン由来)と同定した。これらの成分は10^<-4>10^<-6>Mで活性を示し、共通のベンゼン環オルトジフェノール構造が活性に関与していることが推定された。本研究はポリフェノール類に既知機能(抗酸化性)とは異なる特徴が併存することを示す最初の例である。申請者は前年度までに、ペプチド系およびポリフェノール系の2タイプのアレルゲン腸管透過抑制成分を明らかにした。今年度はこれら両活性成分含むアレルゲン腸管透過抑制食品を作製することを目的とした。製造工程をデザインするにあたり、タンパク質含量が高く、かっポリフェノールの存在が期待できる食品として、油糧種子を選択した。アレルゲンとして卵白アルブミンを、腸管モデルとしてCaco-2細胞を用いてアレルゲン腸管透過抑制を測定した。脱脂油糧種子をスクリーニングした結果、脱脂黒ゴマに最も強い活性が認められた。酵素は、苦味を発生させることなく高度にタンパク質を水溶化させる粗トリプシンを選択した。以上の結果をふまえ、ヘキサンで脱脂したゴマをpH88.5に調整しながらトリプシンで40°C3時間加水分解後、煮沸による失活を行い、遠心分離した上精を凍結乾燥することにより、アレルゲン腸管透過抑制食品であるトリプシン処理ゴマ抽出物(ETS)を製造するという一連の製造工程を確立した。ETSから逆相HPLCにより活性成分を単離した。NMRおよび質量分析の結果から活性成分はSer-Asn-Ala-Leu-Val-Ser-Pro-Asp-Trp-Ser-Met-Thr-Gly-Hisおよびsesaminol2'-O-β-glucopyranosyl(1→2)-O-β-glucopyranosideおよびsesaminol2'-O-β-glucopyranosyl(1→2)-O-[β-glucopyranosyl(1→6)]-β-glucopyranosideであった。

さらにこれらの結果から、タンパク質およびポリフェノール含量が高い食品にプロテアーゼ処理を行えば、ペプチド系とポリフェノール系の両者の活性成分を含む抗アレルギー食品を創製することが可能であると考え、アレルゲン腸管透過抑制食品である、トリプシン処理ゴマ抽出物(ETS)を製造するという一連の製造工程を確立した^<1)>。本年度はTSEのアレルギー腸管透過抑制とは別の抗アレルギー作用として、肥満細胞の脱顆粒抑制に着目し、TSEに肥満細胞の脱顆粒抑制があるかどうかを検討し、活性成分を単離・構造決定することを目的とした。ラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3を用い、β-ヘキソサミニダーゼ(酵素活性測定法)およびヒスタミン(HPLC on-column法)の遊離からIgE依存性脱顆粒度を測定した。酵素処理ゴマには高い脱顆粒抑制活性が認められたので、逆相HPLCにより活性成分を単離した。NMRおよび質量分析の結果から、活性成分の1個をトリプトファンと同定した。ゴマにはもともとトリプトファンは遊離の状態で存在しているが、酵素処理の条件下(微アルカリと40°Cの加温)で活性成分は有効に可溶化されることが明らかとなった。トリプトファン濃度0.1mMで、β-ヘキソサミニダーゼの放出を20%阻害した。もう1種の活性成分は検討中である。
高温固体面と液滴の突然接触による過渡的沸騰現象

液滴が加熱固体に衝突した際の変形挙動と固液界面の沸騰現象を高時空間分解能で観察する手法を確立した.その手法を用いて滑らかな金属面と水液滴の衝突を観察したところ,熱伝導理論で推定される接触面温度と液体として存在できる過熱限界温度の大小関係で,過渡的沸騰現象が整理できることが示された.また,単一液滴衝突において,固液界面で安定的に蒸気膜が形成される高温条件では、液滴の慣性力と表面張力の比で定義される無次元数が変形挙動を支配することも確認できた.液滴が加熱固体に衝突した際の変形挙動と固液界面の沸騰現象を高時空間分解能で観察する手法を確立した.その手法を用いて滑らかな金属面と水液滴の衝突を観察したところ,熱伝導理論で推定される接触面温度と液体として存在できる過熱限界温度の大小関係で,過渡的沸騰現象が整理できることが示された.また,単一液滴衝突において,固液界面で安定的に蒸気膜が形成される高温条件では、液滴の慣性力と表面張力の比で定義される無次元数が変形挙動を支配することも確認できた.汎用性のある噴霧冷却(スプレー冷却)特性の予測を行うには、そこで見られる物理現象をできる限り詳細に把握することが肝要である。本研究は、液体とその沸騰点よりはるかに高温の固体面とが突然接触(衝突)する際に起こる過渡的かつ局所的な沸騰現象を基礎実験によって明らかにすることを目的としている。本年度は研究代表者が過去の研究で開発した観察手法を発展させ,変形途中の液滴を多方面から同時観察する手法を確立した。その詳細は次のようである。観察実験では2台の高解像度デジタルスチルカメラと3台のストロボライトを用意し、2つの光学系を設置した。一つの光学系では、変形途中の液滴形状をバックライト法と2重露光法を併用して撮影した。液滴が固体面に衝突する前にフラッシュを1度発光させて液滴直径を確認し、衝突後にもうひとつのフラッシュを発光させて変形中の液滴画像を得た。また、フロントライトで液滴を撮影する別の光学系で液滴の3次元形状と液滴内部の沸騰を観察した。2つのカメラの撮影タイミングを同期させることで、液滴形状を多方面から観察することが可能になった。この手法で直径0.6mmの水液滴と滑らかな加熱インコネル板(表面温度170°C500°C)との衝突現象を研究し、その有効性を確認した。低温域では固液界面に孤立気泡が、高温域では蒸気膜が形成されるが、そのような沸騰現象は理想化した1次元非定常熱伝導理論から予測される固液界面温度と、液体の状態で存在できる加熱限界温度の大小関係で大まかに分類可能であることが明らかになった。汎用性のある噴霧冷却(スプレー冷却)特性の予測を行うには、そこで見られる物理現象をできる限り詳細に把握することが肝要である。本年度は昨年度の研究で開発した観察手法を使用して,変形途中の液滴の写真観察を実施した。まず直径0.6mmの水液滴と滑らかな加熱インコネル板(表面温度170°C500°C)との衝突現象を研究した。つぎに、直径が2.3mmの水液滴を使用して同様の実験を行った。直径0.6mmおよび2.3mmの変形挙動を詳細に比較した結果、衝突直後に固液界面で蒸気膜が形成される高温域では慣性力と表面張力の比で定義されるウェーバ数が等しければ、変形挙動に力学的な相似性があることが分かった。低温域では、沸騰気泡や粘性摩擦の効果が無視できないためウェーバ数だけで変形挙動を整理できないことが分かった。さらに、連続液滴衝突の力学的挙動の解明にも取り組んだ。衝突現象は単一液滴のそれとは大きく異なることが分かったが、データ数が不十分であるので次年度も研究を継続していく予定である。本研究の目的は、液滴がその沸騰温度よりも充分高い加熱固体面に衝突した際の変形挙動と過渡的な沸騰現象を実験によって明らかにすることである。これを達成するために、初年度(H21)に観察手法を確立し、H22年度は液滴と固体との衝突角度が垂直の場合の観察実験を実施した。H23年度は、斜め衝突における固液界面の沸騰現象が変形挙動に及ぼす影響について検討した。直径が約0,6mmの水液滴を滑らかなインコネル合金面に斜め衝突させたところ、一次元熱伝導理論で推定される接触時の固液界面温度が水の加熱限界温度よりもかなり低い場合は沸騰気泡が、高い場合は蒸気膜が形成された。斜め衝突では非沸騰の温度領域でも、液滴の変形は3次元性を示すが、沸騰気泡が存在する温度領域ではそれがより顕著である。沸騰気泡は固液接触直後から発生・成長する一方、液滴は球形から、薄い紡錘形状に変形する。液膜の薄い部分では、蒸気気泡の破裂が発生し、液滴の破壊が促進された。

蒸気膜が形成される温度域では、斜め衝突にもかかわらず、液滴の形状は比較的軸対称性を維持した。蒸気膜の存在により、軸対称性を阻害する液滴と壁面との粘性摩擦が小さくなるためと考えられる。この結果は、米国機会学会誌に投稿中である。また、エマルション液滴を用いた斜め衝突実験も実施した。エマルションは水と油滴から構成される非単一組成の液体であり、見かけの表面張力や粘性係数が水よりも小さい。蒸気泡の破裂による液滴の破壊が、水液滴の場合より起こりにくいことが確認されたが、その詳細なメカニズムは次年度も引き続いて研究予定である。さらに、連続液滴衝突の力学的解明にも取り組み、衝突間隔の影響を明らかにした。しかし、データ数が未だ不十分なためこれも次年度の継続課題である。本研究課題の目的は、液滴がその沸騰温度よりも充分高い加熱固体面に衝突した際の変形挙動と過渡的な沸騰現象を、実験によって明らかにすることである。本年度は2液滴連続衝突時の変形挙動と沸騰現象を研究し、単一液滴実験では評価できない液滴間相互作用の解明に注力した。実施した実験条件は次のとおりである。供試液体は常温の水であり、液滴直径は約0.6 mm、液滴速度は1.52.5m/s、2液滴の間隔は直径の数倍以下である。衝突板は表面が滑らかなインコネル合金及びサファイアガラスで、その表面温度を170、200,300,400、500°Cと変化させた。また、液滴と固体面の衝突角度は90°(垂直衝突)から45°まで変化させた。固体面に衝突・変形した先行液滴に後続液滴が衝突すると、2液滴が合体し、その内部に干渉流が発生する。垂直衝突では、固液界面で非常に弱い沸騰しか発生しない固体面温度170°Cの場合と、固液界面に蒸気膜が安定して形成される500°Cの場合に、合体液滴は軸対称に近い変形挙動を示した。しかし、それ以外の温度条件では沸騰気泡の破裂により液滴形状は3次元性を示した。また、固体面温度が170、200°Cの場合、先行液滴衝突時に固液界面で蒸気気泡が離散的に発生するが、後続液滴が衝突すると蒸気気泡の数密度やサイズが明らかに減少した。これは固液界面およびその近傍の温度低下による蒸気気泡の凝縮が理由であると考えられる。傾斜衝突では液滴変形挙動は3次元になった。これは、後続液滴が先行液滴に衝突する際、先行液滴が斜面下方に移動しており、オフセット衝突になるためである。そのため、液滴間距離が重要な支配因子となることが分かった。流動現象は観察実験のみならず3次元数値解析によっても解明した。以上のように、研究の所期の目的は達成されたと考えている。実験装置の保守や小規模な変更(改修)、物理現象の再現性を確認するための追加実験などの理由で研究に必要な時間は当初の計画よりも増えている。しかし、それらは対応が可能な範囲に収まっており、本研究課題はおおむね順調に推移していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画に沿って研究を進めていく予定である。実験手法の妥当性や、それによって得られる結果についてとくに問題はないと考えており、研究計画に変更はない。
トリセルラータイトジャンクションによる上皮バリア機能形成の分子機構

私たちの体表や管腔は上皮とよばれる細胞のシートにより覆われている。上皮をつくる上皮細胞は敷石状に並んで強く接着しており、細胞同士が密着することによって、細胞間の隙間における物質の漏れを防いでいる。本研究では、上皮細胞同士の密着部位のうち、3つの上皮細胞の角が接する部分を構成するタンパク質アンギュリンファミリーのはたらきを研究した。アンギュリンファミリーの1つを欠失させたマウスが内耳有毛細胞の変性による難聴を示すことが明らかになった。1)MDCK II細胞を親株として、アンギュリンファミリーの1つであるアンギュリン1/LSR遺伝子のTALENによる遺伝子破壊を試み、蛍光抗体法によるスクリーニングによって3クローンのアンギュリン1/LSR欠失細胞株を樹立することに成功した。ところが、MDCK II細胞は、TALENによる遺伝子破壊細胞の作製に適する一方で、細胞シートの電気抵抗値がきわめて低いため、上皮バリア機能を細胞シートの電気抵抗値から評価することに難があった。そこで、MDCK II細胞の低電気抵抗値の原因となっているタイトジャンクションの構成分子クローディン2をノックアウトした細胞をTALENにより樹立したところ、細胞シートの電気抵抗が約50倍上昇することを見出した。そこで、27年度は、このクローディン2ノックアウトMDCK II細胞を親株としてアンギュリン1/LSRノックアウト細胞を作製する。2)本研究の重要な目的の1つであるアンギュリン1/LSR,アンギュリン2/ILDR1の機能差を理解するために、アンギュリン2/ILDR1遺伝子ノックアウトマウスの表現型を解析した結果、このマウスでは、内耳コルチ器のアンギュリン2/ILDR1の欠失をアンギュリン1/LSRの発現が相補するにもかかわらず、高度の難聴が生ずることを見出した。この結果は、トリセルリンを引き寄せる共通の機能以外に、両分子に機能差があることを示唆する。3)マウスL細胞においてクローディンが形成するタイトジャンクションストランドの形態をトリセルリンが複雑化させる活性について、従来示されていたクローディン1以外に、クローディン2、クローディン3でも同様な変化が生ずることを明らかにした。さらに、トリセルリンのN末端細胞質領域を欠失させた変異分子はクローディン3が形成するストランド構造の複雑化を引き起こさないことを見出した。1)年度当初は、クローディン2欠失MDCK細胞を出発材料として、トリセルラータイトジャンクション(tTJ)の構成分子であるアンギュリン1(LSR)の遺伝子をゲノム編集法の一つであるTALENにより欠失させる予定であった。しかし、並行して行ってきた実験から、TALENより簡便で汎用性も高いCRISPR/Cas9によるゲノム編集法が、マウス乳腺由来上皮細胞株EpH4にも適用できることが確認された。EpH4細胞はこれまで当グループでtTJ構成分子の機能解析に用いてきた細胞株である。そこで、本研究で得られる解析結果を従来の研究結果と比較できる利点を重視して、年度当初の方針を変更し、MDCK細胞の代わりにEpH4細胞をベースにしてCRISPR/Cas9によりアンギュリン1欠失細胞を取得した。この細胞では、本来アンギュリンファミリーによってtTJにリクルートされるトリセルリンがtTJに濃縮しないことが確認された。2)年度当初の計画に従い、自作の抗トリセルリンウサギ血清をアフィニティー精製した抗体を用いて、MDCK細胞をベースにトリセルリン欠失細胞の取得に成功した。ところが、先述のように、EpH4細胞においてCRISPR/Cas9システムによる遺伝子編集が可能となったため、用いる細胞をEpH4細胞に変更し、トリセルリン欠失細胞の樹立を試み、取得に成功した。年度当初は、MDCK細胞を用いてTALEN法によりゲノム編集を行う予定で実験を進めていたが、並行して進めていた、より簡便なゲノム編集法であるCRISPR/Cas9法が年度途中から動き出し、かつ従来のtTJ構成分子の解析で用いてきたEpH4細胞に適用できることがわかった。本研究を従来の研究成果と比較する上では、従来私がtTJ研究に用いてきたEpH4細胞で本研究を進める方が最終的に有利であると判断し、アンギュリン1,トリセルリンをそれぞれ欠失する細胞をEpH4細胞で取得し直したため遅れが生じている。いずれも細胞の取得には成功している。現在、これら細胞に全長のアンギュリン1あるいはトリセルリン、その変異分子を導入した細胞株を作製中であるが、年度予定に含まれていたバリア機能の測定には至っていない。前年度までに作製していたアンギュリン1ノックアウトEpH4細胞と親株のEpH4細胞の上皮バリア機能を解析したが、クローンごとのばらつきが大きく、信頼できるデータを取ることができなかった。理由としてEpH4細胞のクローン性が不安定であることが推測された。そこで、用いる細胞をクローディン2をゲノム編集によりあらかじめ欠失させて経上皮電気抵抗値を増加させたMDCKII細胞に変更し、CRISR/Casシステムによりアンギュリン1を欠失させた細胞株を複数クローン取得した。解析の結果、この細胞では、全てのクローンにおいてコントロールと比較して経上皮電気抵抗値が大きく減少するとともに分子量450の可溶性トレーサーの著しい透過が観察された。この細胞で機能解析を進めるために、まず、MDCKII細胞のトリセルラータイトジャンクション(tTJ)におけるタイトジャンクション構成分子の局在を詳細に調べたところ、オクルディン、クローディンファミリーがアンギュリン1、トリセルリンとともに基底膜方向に伸長していることが確認された。