hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規エラスチン結合タンパク質としてのガレクチン９とその機能

ガレクチンファミリーの中で、ガレクチン-9が不溶性エラスチンに対して最も高い親和性を示した。ガレクチン-9が結合するのはエラスチン分子そのものではなく、成熟した不溶性エラスチンに共有結合しているsmall leucine-rich repeat proteins/proteoglycans (SLRPs)ファミリーに属する一群の糖タンパク質、Lumican, Mimecan/Osteoglycin, Prolargin/PRELP, Fibromodulin, Versican、であることが示された。本研究は、不溶性エラスチンに親和性を示すガレクチン9(Gal-9)が、非糖タンパク質であるエラスチンを認識する分子メカニズムを明らかにすることを主たる目的としている。しかし、平成27年度の研究結果は、Gal-9が結合するのはエラスチン分子そのもの(トロポエラスチン、あるいはその架橋反応によって生じる特殊な分子間架橋構造)ではなく、成熟した不溶性エラスチンに共有結合(ジスルフィド結合以外の、おそらくは架橋反応による共有結合)しているsmall leucine-rich repeat proteins and proteoglycans (SLRPs)ファミリーに属する、一群の糖タンパク質であることを示した:不溶性エラスチン標品に存在するGal-9認識構造を同定するため、可溶性エラスチン標品(高度に精製された不溶性エラスチンの有機酸分解物)を用いて、(1) Gal-9固定化カラムによるアフィニティー精製、(2)逆相HPLC精製、(3)トリプシン分解産物の逆相HPLCによる再精製、(4) N-末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、何れもSLRPsファミリーに属するLumican, Minecan/Osteoglycin, Prolargin/PRELP, Fibromodulin, Versicanが同定された。また、不溶性エラスチンに対するガレクチンファミリーの親和性は、Gal-9>Gal-8>Gal-4>Gal-3>>Gal-1>Gal-7の順であり、一般的な糖タンパク質に対する親和性と矛盾しなかった。Gal-9の一方の糖鎖結合ドメイン(CRD)を不活性化した2つの変異体とGal-9を比較すると、Gal-9>>N-末端側CRD不活性化変異体>>C-末端側CRD不活性化変異体となり、不溶性エラスチンに対してC-末端側CRDがより高い親和性を示すことが分かった。平成27年度の当初計画には以下の項目が含まれていた。(1)Gal-9(安定化Gal-9及び各糖鎖結合ドメインを不活性化した変異体)と他のガレクチンファミリーのメンバー(Gal-1, 3, 8)を用いて、高純度不溶性エラスチンとガレクチンの結合を解析する、(2)エラスチンとの相互作用におけるGal-9の2つの糖鎖結合ドメインの寄与を調べる、(3) Gal-9が認識する構造を同定する、(4)典型的な糖鎖に対する親和性との関連を明らかにする、(5)真核細胞用発現ベクターを用いたエラスチン強制発現の予備実験を行う、(6)ノックアウト動物の組織学的/病理組織学的検討を行う。(1)(3)に関しては既に終了した。Gal-9が結合するのはエラスチン分子そのものではなく、SLRPsファミリーに属する一群の糖タンパク質であることが分かったため、(4)は意味を持たなくなった(SLRPsファミリーは一般的な糖タンパク質と同様の糖鎖を持つ)。エラスチン強制発現の予備実験は既に終了しているが、(4)と同様(5)を進める意味はほぼ失われている。(6)のノックアウト動物の組織学的/病理組織学的検討もスタートしたが、現時点では、エラスチン(不溶性エラスチン繊維)- Gal-9複合体が関わる新しい機能に関する手掛かりは得られていない。平成27ー28年度の研究結果から、Gal-9が結合するのはエラスチン分子そのもの(トロポエラスチン、あるいはその架橋反応によって生じる架橋構造)ではなく、成熟した不溶性エラスチンに共有結合しているsmall leucine-rich repeat proteins and proteoglycans (SLRPs)ファミリーに属する、一群の糖タンパク質であることが示唆された:Gal-9が認識する構造を同定するため、可溶性エラスチン標品(不溶性エラスチンの有機酸分解物)を用いて、(1) Gal-9固定化カラムによるアフィニティー精製、(2)逆相HPLC精製、(3)トリプシン分解産物の逆相HPLCによる再精製、(4) N-末端アミノ酸配列分析、を行った。その結果、SLRPsファミリーに属するLumican, Mimecan/Osteoglycin, Prolargin/PRELP, Fibromodulin, Versicanが同定された。これらの中で、LumicanとProlarginに由来するペプチドが最も多く検出された(各々8種類と7種類)。また、Lumicanに由来するペプチドは3カ所の異なるN-glycanの糖鎖結合部位を含んでいた。一方、VersicanとMimecanについては3種類、Fibromodulinの場合は1種類のペプチドが検出された。更に、組換え型ブタエラスチンを用いて、Gal-9がエラスチン分子そのものには結合しないことをレクチンブロット(ビオチン化Gal-9を使用)により確認した。平成28年度の当初計画には以下の(1)(4)項目が含まれていた。

(1)不溶性エラスチンをプロテアーゼで処理し、生成するペプチドの同定と生理活性の検索を行う。(2)エラスチン(トロポエラスチン)からエラスチン線維が形成される過程をin vitroで再現し、Gal-9との相互作用を調べる。また、Gal-9のノックダウン、強制発現がエラスチン線維形成に与える効果を検討する。(3)Gal-9がエラスチン分子そのものには結合しないことを確認するための必要最小限の実験(レクチンブロット)を行う。(4)ノックアウト動物の組織学的/病理組織学的検討(Gal-9とエラスチンの関連)を行う。Gal-9が認識する構造がエラスチン分子そのもの(デスモシン等の架橋構造を含む)ではなく、成熟した不溶性エラスチンに共有結合しているSLRPファミリーに属する、一群の糖タンパク質である可能性が高いことから、(1)と(2)を行う意味は失われている。この点を踏まえて、本年度は不溶性エラスチンに共有結合し、Gal-9に対して親和性を示すSLRPファミリーの同定を主たる目標とし、ほぼこれを達成することができた。(3)については、ビオチン化Gal-9をプローブとしたレクチンブロットにより、Gal-9がエラスチン分子そのものには結合しないことが確認できた。(4)の組織学的検討も27年度に引き続いて行ったが、現時点では、エラスチン(不溶性エラスチン繊維)ーGal-9複合体が関わる新しい機能に関する手掛かりは得られていない。本研究は、不溶性エラスチンに親和性を示すガレクチン9(G9)が、非糖タンパク質であるエラスチンを認識する分子メカニズムを明らかにすることを主たる目的としている。平成27ー28年度の研究結果から、G9が結合するのはエラスチン分子そのもの(トロポエラスチン、あるいはその架橋反応によって生じる架橋構造)ではなく、成熟した不溶性エラスチンに共有結合しているsmall leucine-rich repeat proteins/proteoglycans (SLRPs)ファミリーに属する一群の糖タンパク質、Lumican, Mimecan/Osteoglycin, Prolargin/PRELP, Fibromodulin, Versican、であることが示された。平成29年度は、G9による細胞内情報伝達系の活性化に対して、これらSLRPs(プロテアーゼにより不溶性エラスチンから遊離されるSLRPs由来ペプチド)が影響を与える可能性、あるいはこの逆(SLRPs由来ペプチドの作用に対してGal-9が影響を与える可能性)を、2種類のヒトT細胞株(Jurkat, MOLT-4)を用いて検討したが、明らかな影響は認められなかった。また、in vitroでmacrophage, dendritic cellに分化することが知られているTHP-1,U937細胞に対するSLRPs由来ペプチドの効果を検討したが、分化に対して影響を与えなかった。一方、本研究に関連して行ったG9とIgEの相互作用解析から、G9とIgEの結合において、G9-IgE糖鎖間とG9-ペプチドバックボーン間の相互作用が共同的に働らくことを示す結果が得られた。
心筋交感神経機能解析の再評価:定量的 PET 検査との 対比検討

MIBGによる交感神経機能指標と、PET検査で得られる節前・節後交感神経機能指標と対比した。MIBGの心筋集積はPETで得られる節前交感神経機能と高い相関が得られ、その信憑性を確認できた。ただ心筋局所解析では、PETの方がより心筋への均一な集積がみられ、PETの高い定量性が確認できた。他方、PETで算出される節後交感神経機能(受容体機能)はMIBGの心筋集積とはあまり相関がなく、むしろ心筋からの洗い出しと相関があった。このようにPET検査で得られる節前・節後交感神経機能指標と対比することで、MIBGで得られる機能情報の意義の理解を深めることができた。本研究ではMIBGによる交感神経機能指標と、PET検査で得られる節前・節後交感神経機能指標と対比することで、MIBGで得られる機能情報の意義の理解を深め、より優れた定量的指標を求めることを目的とした研究である。この目的にC-11標識hydroxyephedrine(HED)の合成を、北大病院に設置されたサイクロトロンと合成装置を用いて行い、昨年は薬剤の純度と安全性を確認し、院内自主臨床試験委員会で承認を得て、臨床を開始した。健常例10例での検討ではHEDの心筋集積は高く、その左室心筋内集積は均一であった。また心不全例では下壁を中心に側壁にかけての集積が低下していた。これはMIBGで得られた心筋局所集積の所見とよく一致していた。ただMIBGで得られる下壁の集積低下は一部横隔膜による吸収の影響を受けていることも確認でき、MIBGの検査の際に腹臥位撮像をすることで、横隔膜の位置を下げ、吸収の影響を低減させることでHEDに類似した心筋局所の所見が得られることも確認できた。(この成果は2012年の米国核医学会で口演発表した。)HEDの心筋集積の定量的指標として、投与から40分までの動脈内濃度を分母とし、30-40分後の心筋集積の割合を分子としたRetention index(RI)を算出した。これまで行った健常8例および心不全4例での検討では、RIは心不全例で健常例に比べて約半分程度まで有意に低下することが確認できた。また同時に施行したMIBGで得られた心筋・縦隔比(H/M)も同様に有意に低下していた。また両者の指標には有意な正の相関が得られた。これらの対比を詳細に進めることで、HEDを用いた定量性の高い心筋交感神経機能評価法の確立と、従来から広く臨床の場で利用されてきたMIBG検査法の妥当性、限界、および解析法の改善についても一定の成果が得られた。本研究ではMIBGによる交感神経機能指標と、PET検査で得られる節前・節後交感神経機能指標と対比することで、MIBGで得られる機能情報の意義の理解を深め、より優れた定量的指標を求めることを目的としている。この目的にC-11標識hydroxyephedrine(HED)の合成を北大病院に設置されたサイクロトロンと合成装置を用いて行い、まず薬剤の純度と安全性を確認した。これに基づいて院内自主臨床試験委員会で承認を得て、臨床を開始した。まず健常例10例を対象HED-PET検査を施行したところ、いづれの症例も高い心筋集積が得られ、かつその心筋内集積は均一であった。他方、同じ症例に施行したI-123標識MIBGを用いたSPECTでは、これまでの報告通り、下壁への軽度の集積低下が認められた。そこで同じ症例において再度MIBGの腹臥位でのSPECTを追加収集したところ、下壁への集積低下が改善し、HEDとほぼ同様の均一な集積を示すことが確認できた。これはMIBGの高い集積を呈する肝臓が心筋への集積に及ぼすartifactと推察され、通常の仰臥位での撮影に比べて腹臥位では肝臓が心臓から離れるために、このようなartifactが軽減されるものと考えられた。(なおこの内容は2012年6月の米国核医学会(Society of Nuclear Medicine)で口演発表に採択されている。)最後の2か月に心不全例患者への応用を開始した。これまでの限られた症例での検討では、HED-PET所見はMIBG所見と同様に集積低下を示し、交感神経機能の低下を示唆していた。これらの対比を詳細に進めることで、HEDを用いた定量性の高い心筋交感神経機能評価法の確立と、従来から行われてきたMIBG検査法の限界、および解析法の改善について大きな成果が得られる可能性が期待できる。目的通りC-11標識HEDの合成とその安全性試験に成功し、臨床検討を開始することができた。

初年度に計画をしていた健常例での検討をほぼ終了し、これに基づいて心不全例の検討まで進めることができ、計画通り順調に進んでいる。他方交感神経受容体機能評価も併せて実施する予定であったが、C-11標識CGP12177の合成にはきわめて時間がかかることもあり、今年度には十分な検討を行うことができなかった。この薬剤を併用した節前・節後交感神経機能指標と対比については、次年度に持ち越すこととなっている。HEDでの心筋への集積が高く、鮮明な画像の得られることが確認できた、これを利用して心筋局所の交感神経機能の評価が可能であり、致死性不整脈疾患の交感神経の局所解析などに利用し、不整脈の成因に迫る検討を進める予定でいる。また今回得られたHEDの定量的指標と、従来から用いられてきたMIBGの定量的指標と対比することで、MIBGによる交感神経機能指標の課題と改善点についても明らかにする予定でいる。さらにはC-11標識CGP12177を用いた神経受容体機能評価も再開し、HED所見と対比を計画している。これにより各種心疾患における交感神経機能の節前・節後の統合的な解析が進むことが予想される。残額については、平成23年度に購入した消耗品(試薬・ソフトウェア・薬剤合成用フィルター)の支払いに使用する。
日本近世における金融業者(両替屋,銭屋)の存在形態と機能

日本の近世社会においては、独自な信用経済が発達し、明治以降の資本主義化の一定の基盤をなした。昨年度は、主として自治体史の探査と各地の現地調査により、主として各地の金融資本のありかたについて明らかにし、その建てた銭相場について検討し、いわゆる「通用」銭相場の人為的形成について考察した。今年度はこれに関する論文を発表した。またそれに引き続き、今年は,「通用」銭相場の動向と、諸藩の銀札や郡中議定などで定められる農業奉公人などの労賃の決定方法を検討した。具体的には、摂津国北部の在郷町池田周辺の豊島郡北在組村々および麻田藩を対象とした。結論として、この地域では民衆的「通用」銭相場が藩札相場を規定し、その逆ではにいこと、またこの地域に独自な労働力不足と、「通用」銭相場慣行の普及があいまって、民衆に有利な銀相場名目の賃銭規定が行われていることを確認した。これについては、『新修池田市史』第二巻に概要を執筆ずみで、近日刊行の予定である。また昨年は行うことのできなかった東日本地域の金融業者および金銭相場について史料を収集し、時系列を作成中である。また江戸ー上方の商業関係に及ぼす金銀相場の動向についても、「通用」銭相場的な商人仲間独自の相場が存在し、近世後期に軋轢を生じている。しかし金を中心とする経済圏である東日本と、銀を中心とする経済圏である西日本の相場については、為替などの問題も含め、今後に残した問題が多い。これらのことについては、今後研究を更に進め論文を作成する予定である。日本近世には高度の信用社会が形成され、明治以降の資本主義化の基盤を作った。しかしそれを支えた金融資本の実態については明らかではないため、今年はまず各地の金融業者に関する史料の掘り起こしと、その建てた地域的な貨幣相場について検討した。その成果としては、第一に自治体史の検索と各地の現地調査により、金融資本・貨幣相場に関するデータを収集することができた。特に今年は大坂とその金融的影響の強い西日本、岡山・広島・紀伊田辺・摂津池田・奈良などでデータを収集した。これにより、大坂における本両替のデータベースを作成するとともに、西日本各地の城下町・在郷町・港町において17世紀以降両替・銭屋が広範に存在したこと、領主も藩札政策と関わって次第にそれを取り立てて利用するようになったことが明らかになった。第二の成果は、民衆生活に最も影響のある銭と銀の交換相場について、時系列データを分析し、その動向について興味深い論点をみいだしたことである。すなわち西日本各地の銭相場は、18世紀前半には大坂の本両替・銭両替らが定める銭相場に強い影響力を受けるようになり、それを基準としながらも、それより銀安銭高に移行する。この原因は各地の銭相場が、単なる貨幣の需給関係によるものではなく、藩札の流通や民衆の生活維持、また大坂との商品取引関係を考慮にいれて人為的に定められる、いわば「通用」銭相場といわれるものであるためである。この点に関して、学会発表及び論文作成を行った。
デコイ受容体のnon-canonicalな作用経路の存在の立証とその意義

デコイ受容体の作用機構と存在意義に関する既成概念を覆す2つのデコイ受容体様分子の新たな作用機構を見出した。即ち、1OPGは、RANKLに結合してRANKに結合するRANKL量を減らすことにより、破骨細胞形成を阻害すると考えられていたが、CCN2に結合することによりCCN2の破骨細胞形成作用を阻害すること、2PDGFRLはそのリガンドと想定されるPDGFとは結合せず、CCN2に結合して、CCN2の分子動態を制御することにより、軟骨細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしていることを見出した。3さらに、CD302がCCN2に結合することを見出したので、既成概念を覆す第3の例の発見も期待できる。(1)デコイ受容体OPGのCCN2を介する破骨細胞形成阻害作用1RANKとCCN2との結合を、固相化タンパク結合実験および表面プラズモン共鳴法(Surface Plasmon Resonance:SPR)で調べたところ、高い親和性(95.1nM)で結合した。なお、CCN2は、RANKとRANKLの結合には影響を及ぼさなかった。2破骨細胞前駆細胞であるRAW264.7細胞を用い、CCN2のRANKLシグナルにおよぼす作用を検討したところ,CCN2はNF-kappaBの核移行を促進し、ERK、JNK、p-38のリン酸化も増強した。3また、CCN2は、RAW264.7細胞をRANKL刺激した時にみられるnfatc1、c-fosの発現上昇を増強した。4オステオプロテジェリン(OPG)はRANKのデコイレセプターであり、RANKと同様にRANKLとの結合性を有する。そこでRANKと結合することが明らかとなったCCN2がOPGに結合するか否か調べたところ、RANKよりやや高い親和性(24.5nM)で結合した。5OPGはRANKL刺激によるRAW264.7細胞の破骨細胞への分化を抑制するが、CCN2を培養系に添加することでOPGによる破骨細胞形成抑制作用が劇的に解除された。(2)デコイ受容体様分子PDGFRLの軟骨細胞の増殖・分化に与える影響1PDGFRLが成長板軟骨細胞の増殖・分化過程で、増殖期成熟前期に強く発現し、肥大化とともに消失した。2また、ヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8にPDGFRL遺伝子を導入し過剰発現させるとその増殖が促進された。3プルダウンアッセイでPDGRFRLとCCN2とが結合することを確認した。(3)CCN2とPDGFRLが結合したので、PDGFRL結合分子の探索のためCCN2以外のCCNタンパク質が血小板に存在するか調べたところCCN1,3, 5が存在した。1)ヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8細胞、乳がん細胞MDA-231、HeLa細胞でPDGFRLのmRNAレベルを比較すると、HCS-2/8細胞で圧倒的に高く、また、免疫染色でもHCS-2/8細胞に多量に観察され、その細胞内局在を調べると、細胞質だけでなく核内にも存在した。また、HCS-2/8細胞にPDGFRL遺伝子を導入して過剰発現させると同細胞の増殖が促進されることは昨年度報告したが、軟骨分化マーカーであるアグリカン、II型コラーゲン、MMP13の発現は低下した。一方、PDGFRL過剰発現細胞のconditioned mediumはCCN2による軟骨培養細胞株の軟骨分化マーカーの発現上昇を抑制し、protein kinase C-zetaの活性化も阻害した。昨年度、PDGFRLとCCN2が結合することを見出しており、これらの結果は、デコイ受容体様分子PDGFRLがCCN2の分子動態を制御することにより、軟骨細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしていることを示している。以上の結果は現在論文投稿中である。2)血小板はPDGFに富むため、PDGFRL結合分子探索を目的に、CCN2以外のCCNタンパク質の血小板における存在を昨年度に引き続き調べたところ、CCN1, CCN3, CC5が存在することを、今回免疫染色法でも確認した。また、その由来は、CCN1とCCN5は巨核球であり、CCN3は血球系細胞、CCN2は巨核球から放出される未知の因子により刺激を受けた間葉系細胞であることが示唆された。これらの結果は、Mod. Rheumatol.に受理され印刷中である。3)CCN2結合分子として新たにCD302を見出した。この分子はc-typeレクチンレセプターで細胞の接着、遊走、エンドサイトーシスに関与すると言われており、PDGFRLとの協働作用やそのデコイの発見が期待される。

H26年度の研究計画の内、主となっていた(1)「デコイ受容体OPGのCCN2を介する破骨細胞形成阻害作用」については、研究実績の概要に記載した内容を国際誌Boneに投稿し、2015年に出版された。(2)ただ、「デコイ受容体様分子PDGFRLの軟骨細胞の増殖・分化に与える影響」については、PDGFRLとCCN2の結合をプルダウンアッセイで示したもののSPRでは未確認である。また、その分子間相互作用のPDGFRLの増殖促進効果に対する関与についても未確認である。(3)一方で、当初の予定にはなかったが、PDGFRL結合分子探索の一環として、CCN2に加えてCCNファミリータンパク質のうち、CCN1, 3, 5が血小板に存在することを明らかにした。よって、概ね順調に進展していると言える。機能系基礎歯科学デコイ受容体の2番目の例としてのPDGFRLについて以下の点を検討する。1まず、僅かではあるが前年度にやり残した実験を完遂する。2PDGFRLが軟骨細胞分化に与える影響を培養軟骨細胞を用いて検証する。第一にPDGFRLを同細胞に直接発現させてアグリカン、II型およびX型コラーゲン、MMP-13などのマーカー遺伝子の発現変動の有無を確認する。そして第二に、大腸菌を用いてリコンビナントタンパク質を作製し、それをHCS-2/8細胞に添加して効果をみる。3同様の実験をCCN2で刺激した軟骨細胞を用いて行う。4CCN2の細胞内シグナリングに対するPDGFRLの影響を検討する。5CCN3は以前Novと呼ばれていたCCNファミリーの一員で成長軟骨細胞の分化には抑制的には働く。また、CCN2や他のいくつかの分子と結合することが知られている。そこで、PDGFRLの軟骨細胞の増殖・分化に対する作用にCCN3が関与している可能性があるので、その点物理的結合の面から結合実験やSPRで確かめると同時に、PDGFRLの軟骨細胞増殖・分化に対する作用へのCCN3/Novの関与の有無を検討する。6デコイ受容体として知られている可溶性TNFalpha受容体や可溶性IL2受容体、その他構造上デコイ受容体と考えられる分子で機能不明の可溶性受容体分子の機能解析と作用機構の解析を行い、細胞外シグナル伝達経路に置けるリガンド、受容体、デコイ受容体に続く第4の因子の存在(本プロジェクトではCCNファミリーメンバーとの仮説を立てている)と重要性を明らかにする。PDGFRLやCCNタンパク質およびそのフラグメントのそれぞれの機能を調べるためリコンビナントタンパク質の調製を外注する予定をしていたが、費用節減のため、まずは、過剰発現法にてその作用について予備的知見を得てそれから外注する戦略をとった。そのため時間がかかり、H26年度末までに発注できなかったため。また、学会発表は活発に行ったが旅費は別経費でかなり充当できたため。リコビナントタンパク質調製の外注、人件費、旅費に当初より多めの支出が見込まれ、それらに充当する。
外洋性いか類の食性と分布に関する研究

研究の中心は,南極洋においてBIOMASS計画で採集さたいか類について行なわれた.またいか類に対する強力な捕食者であるマツコウクジラの捕食状態についても検討を加えた.南極洋からはマイクロネクトンいか類として10種が出現した.このうち4種Kondakovia longimana,Moroteuthis knipovitchi,Brachioteuthis picta,Galiteuthis antarcticaが優占種である.いか類の体長組成は種によって異なるが, K.longimanaは最大長36cmで,マツコウクジラにより捕食されていたものの体長(40-80cm)とは明らかに異なるG.glacialisも最大長24cmで,マツコウクジラにより捕食された個体とは明らかに異なる.両種とも南極海の浅海系には小型の個体が分布し,大型の個体は深海系に分布してマツコウクジラに捕食されると考えられる.マントル長40cmから200cmのいかのうち特に40-80cmの個体はK.longimanaと考え得る. K.longimana,B.pictaは主におきあみ類を捕食するが, M.knipovitchiは魚類を主餌料としていた.おきあみ類を捕食するいか類については,体長と捕食されたおきあみ類の体長との間に正の相関があることが, B.pictaおよびK.longimanaの両種で確かめられた.マツコウクジラの体脂皮の厚さの変化は,南極洋の夏期においても特に大きな増加傾向は認められない.このことはひげ鯨の場合と異なり,いか類により構成される餌料環境が特に夏に良いということではないと考えられる.本年度は特に大型トロール網(開口部面積600【m^2】)を使用して南極洋で採集されたいか類について解析を行なった。19801984年の間の資料に基づく結果の一部はすでに1985年に発表されている。体長組成においては、マントル長でB.picta4cm以上,G.antarctica16cm以上となり、そのモードからみて8cm付近のマントル長の個体が多い。これに対してK.longimana,M.knipovitchi,G.glacialisの3種はいずれも、マントル長は6cm以上,36cm以下の個体が出現した。トロール網の目合と遊泳力によりK.longimanaは36cm以上のマントル長の個体は採集されなかった。一方マッコウクジラの捕食した個体の体長組成との間に明らかな差が認められた。各種の主餌料は2つの型に分れた。すなわちK.longimanaはナンキョクオキアミおよびT.macrura,P.gaudichaudiiを主とする動物プランクトンを捕食しているが、M.knipovitchi,B.pictaは魚類およびいか類を捕食し、同種のいかを捕食するカニバリズムが認められた。またK.longimanaの主分布層はおきあみ類の分布層とともに移動し、摂食効果を高めていると考えられる。研究の中心は,南極洋においてBIOMASS計画で採集さたいか類について行なわれた.またいか類に対する強力な捕食者であるマツコウクジラの捕食状態についても検討を加えた.南極洋からはマイクロネクトンいか類として10種が出現した.このうち4種Kondakovia longimana,Moroteuthis knipovitchi,Brachioteuthis picta,Galiteuthis antarcticaが優占種である.いか類の体長組成は種によって異なるが, K.longimanaは最大長36cmで,マツコウクジラにより捕食されていたものの体長(40-80cm)とは明らかに異なるG.glacialisも最大長24cmで,マツコウクジラにより捕食された個体とは明らかに異なる.両種とも南極海の浅海系には小型の個体が分布し,大型の個体は深海系に分布してマツコウクジラに捕食されると考えられる.マントル長40cmから200cmのいかのうち特に40-80cmの個体はK.longimanaと考え得る. K.longimana,B.pictaは主におきあみ類を捕食するが, M.knipovitchiは魚類を主餌料としていた.おきあみ類を捕食するいか類については,体長と捕食されたおきあみ類の体長との間に正の相関があることが, B.pictaおよびK.longimanaの両種で確かめられた.マツコウクジラの体脂皮の厚さの変化は,南極洋の夏期においても特に大きな増加傾向は認められない.このことはひげ鯨の場合と異なり,いか類により構成される餌料環境が特に夏に良いということではないと考えられる.
中国歴代都城の宮廟官寺・門朝城郭配置構造を正確に復原するための遺跡現地共同調査

中国都城の平面プランは、唐の長安城にいたって、その理想型としてのプランがはじめて実現されたとされるが、本研究は、そこに至るまでの間に、歴代の王朝や諸侯国がどのようなプランを考え、またそれをどの程度まで実現したのか、その歴史的な経過を、二里頭(夏王朝)時代からはじめて、殷西周時代・春秋戦国時代・秦漢時代・魏晋南北朝時代、そして隋唐時代という、二千五百年のスパンでたどってみようとするものである。発掘・調査が続いている各都城の遺跡を、日本・中国の研究者で現地共同調査して、収集した最新の考古資料や現地に残る口承資料などでもって、各都城の平面プランを正確に復原するのが、とくに強調すべき方法である。
長距離走のペース配分に関する基礎的研究

長時間運動の限定因子の一つに無酸素性作業閾値(AT)があり、マラソンレース等ではATを指標にして走速度(ペース)を決定することがある。一方長時間運動中には、生体の生理機能(状態)は刻々と変化(多くは低下)するので、マラソン等で一定ペースを保つことは相対的に負荷を増すことになり、そのため徐々にペースを落とす走り方を生理的イ-ブンペースと呼ぶ場合がある。これらのペース低下を引き起こす要因として、心臓・循環機能の低下、代謝変化、脚の筋、腱、関節等の損傷等があげられる。ところが実際のレースにおいて、AT以下のペースで走っていても、これらの生理的変化では説明のつきにくいペース低下が起こることがある。その原因の一つとして、運動が長時間に及ぶと何らかの原因でATが低下する可能性を考えた。すなわち、運動前のATレベルで走っていても、ATが長時間運動中に漸減するとそのペースはやがてAT以上になり、血中乳酸の蓄積が起こる。したがって、乳酸蓄積が制限因子となってペース低下が起こる場合もありうると考えた。そこで、長時間の運動によって一過性にATが減少するのかどうかを明らかにするために以下の実験を行なった。日頃よくトレーニングしている長距離ランナーに対して、30分間のAT下で一定ペースの走運動を行なわせ、その運動の前後に速度漸増負荷走を行ない、その時の呼吸パラメーターからATを測定した。その結果、長時間運動後のATは低下する傾向が見られた。症例を増やすことを第一に今後も検討を続ける予定である。また、フィールド実験に備え、ポ-タブルの乳酸分析機(YSI社製、1500SPORT)を購入した。この機種選定に若干の時間を要したが、種々の条件で乳酸を測定し、より妥当性の高い機種を購入することができた。今後この分析機によってフィールドでの乳酸測定を行ない、AT低下の裏付けをしていきたい。
一次救命処置と大規模救助要請を支援するモバイル・アプリケーションの開発

一般市民により目撃された心原性心肺停止者は年間約2万5千人,そのうち半数は心肺蘇生を受けずに救急搬送されることがわかっている。傷病者の救命率や社会復帰率を高めるためには,心肺停止場面に居合わせた一般市民の救助意志と一次救命処置の能力が重要な鍵を握っている。そこで本研究では,心肺停止場面において一次救命処置支援を行うモバイルアプリケーションの開発を目的としている。アプリケーションの開発および活用により,一般市民の一次救命処置の阻害要因である不安や状況判断の難しさが軽減され,救命率の改善を見込むことができる。2018年度の計画及び研究実績については以下に述べる。スマートフォンアプリケーションを用いた介入研究の結果をもとに,各端末(スマートフォン,タブレット端末,スマートウォッチ)の規格に適合させたアプリケーションの開発予定であったが,介入研究と並行として複数のアプリケーションの開発を行うように計画を変更した。研究は,所属施設および関連施設の倫理委員会から承認を得て,介入研究が開始された。現在データ収集中である。アプリケーションの開発については,iOSおよびAndroidの2つのスマートフォンに適応したアプリケーションを開発およびすでに開発が終わったものについては更なる修正を実行中である。追加の修正としては,アプリケーションユーザの使いやすさを高めるために画面設計の専門家に依頼してスマートフォンアプリの画面デザインの修正を行っている。また,現在これら開発物の普及を目的としたホームページの作成も行っている。ホームページの作成が終わり次第,開発したアプリケーションの公表を行う予定である。現在はすべての倫理委員会を終えているが,承認を得た3つの倫理委員会のうちの1つの倫理委員会において,研究実施者への一次救命に関する研修受講を求めていた。受講,受講資格付与と,再度研究計画の修正と訂正などに時間を要したため予定の遅れがでた。また,研究対象施設となる企業の窓口となる担当者の変更などがあり,データ収集の開始に遅れが出た。データ収集および研究後のアプリケーションの開発・修正ではなく,計画をやや修正し,介入研究とアプリケーションの開発を同時並行とすることで時間の短縮を行う。一般市民により目撃された心原性心肺機能停止者は年間約2万5千人にのぼり,うち半分の者は心肺蘇生を受けずに救急搬送されることがわかっている。そこで本研究では,心肺停止場面において一次救命処置支援を行うモバイル・アプリケーションの開発を目的としている。アプリケーションの開発および使用により,一般市民の一次救命処置の阻害要因である不安や状況判断の難しさが軽減され,救命率の向上の改善を見込むことができる。平成28年度の計画および研究実績については以下に述べる。平成28年度は,研究者が開発したモバイル・アプリケーションが導く胸骨圧迫開始までの所要時間の短縮とアプリケーションの使いやすさの向上を目指すことが計画であった。そのため,現在のモバイル・アプリケーションの効果に関する研究を実施し,研究結果から得られたアプリケーションの評価を活用したアプリケーションの修正,さらに修正したアプリケーションの効果に関する研究を実施する予定であった。画面デザインを担当するデザイナーとの協議の結果,まず従来のアプリケーションのデザインの修正をデザイナーが行い,修正したアプリケーションに関する効果検証を行うという計画へ修正した。平成28年度は,デザイナーによるアプリケーション・デザインの途中である。研究者はiPhoneに加え,Androidで動作するアプリの開発を行い,画面遷移のプログラミングの途中段階にある。また,Apple Watch等のスマートウォッチ用のアプリケーション開発に向けた準備も行っている。研究計画の修正を行い,アプリケーションのデザイン修正後に効果検証の研究を実施することとなった。現在アプリケーションのデザイン修正の完了が遅れているため,その後に続く研究が遅れている。平成29年度の計画及び研究実績については以下に述べる。平成29年度は,開発したアプリケーションにソーシャル・メディアとの連携機能を追加することであった。ソーシャル・メディア機能との連携により,潜在的な救助協力者への応援要請を行い,傷病者の早期救助体制の構築を目指すことができると考えている。現在iOSにおけるソーシャルメディアとの連携の作業を実行中である。現時点でのプログラミングの修正ならびにアプリケーションのアップデートには至っていない。また28年度計画において未実施であった内容については次に述べる。まずアプリケーションのデザインについては,デザイナーによるインターフェイスの修正が終了した。現時点で終了していない内容としては,研究の実施ならびにアップルウォッチのアプリケーション開発である。研究の実施については,共同研究者の施設での倫理委員会への待機状態である。アプリケーションのインターフェイスの修正は実施できたものの,共同研究者の所属する施設での倫理委員会への提出が非常に遅れている。共同研究者とともに解決策を検討中である。その他の遅れについてはプログラミングなどの技術的な問題であり,解決が可能である。

傷病者の救命率や社会復帰率を高めるためには,心肺停止場面に居合わせた一般市民の救助意志と一次救命処置の能力が重要な鍵を握っている。そこで本研究では,心肺停止場面において一次救命処置支援を行うモバイルアプリケーションの開発を目的としている。アプリケーションの開発および活用により,一般市民の一次救命処置の阻害要因である不安や状況判断の難しさが軽減され,救命率の改善を見込むことができる。2018年度の計画及び研究実績については以下に述べる。スマートフォンアプリケーションを用いた介入研究の結果をもとに,各端末(スマートフォン,タブレット端末,スマートウォッチ)の規格に適合させたアプリケーションの開発予定であったが,介入研究と並行として複数のアプリケーションの開発を行うように計画を変更した。研究は,所属施設および関連施設の倫理委員会から承認を得て,介入研究が開始された。現在データ収集中である。アプリケーションの開発については,iOSおよびAndroidの2つのスマートフォンに適応したアプリケーションを開発およびすでに開発が終わったものについては更なる修正を実行中である。追加の修正としては,アプリケーションユーザの使いやすさを高めるために画面設計の専門家に依頼してスマートフォンアプリの画面デザインの修正を行っている。また,現在これら開発物の普及を目的としたホームページの作成も行っている。ホームページの作成が終わり次第,開発したアプリケーションの公表を行う予定である。現在はすべての倫理委員会を終えているが,承認を得た3つの倫理委員会のうちの1つの倫理委員会において,研究実施者への一次救命に関する研修受講を求めていた。受講,受講資格付与と,再度研究計画の修正と訂正などに時間を要したため予定の遅れがでた。また,研究対象施設となる企業の窓口となる担当者の変更などがあり,データ収集の開始に遅れが出た。アプリケーションのデザイン完了により,アプリケーションの開発が完了し,研究の実施,ならびにスマートフォン以外の端末用のアプリケーション開発も可能となる。デザイン完了前に,研究計画の立案を行い,研究実施準備を整備する予定である。共同研究者の施設における研究計画書提出が滞っている。この部分で数か月止まっている状況のため,今後1ヵ月でこのまま待機するのか,あるいは共同研究者の変更について検討する。データ収集および研究後のアプリケーションの開発・修正ではなく,計画をやや修正し,介入研究とアプリケーションの開発を同時並行とすることで時間の短縮を行う。
合衆国法務総裁意見書の研究

本研究では、アメリカ合衆国司法省の長たる法務総裁が政府内の法律問題に関して発する意見書を検討対象として取り上げ、法務総裁意見書及びその原案作成等の権限を有する司法省内の法律顧問室が果たす機能と、これに影響を及ぼす環境要因の分析を行った。この研究により、意見書の機能を評価する、《大統領による統括-独立・中立的法分析》という2極的図式を提示するとともに、わが国における行政内部の適法性確保のためのシステム構築と行政主体内の法務組織が果たすべき役割、その条件等に対して知見を提供した。本研究は、わが国における行政自身による適法性確保のためのシステム構築と行政主体内の法務組織が果たすべき機能に係る議論に対して基礎的な知見を提供するべく、アメリカ合衆国において、法的問題に関して司法省(Department of Justice)の長たる法務総裁が示す意見書(opinion)、及びその原案作成の権限を有する司法省内の法律顧問室(Office of Legal Counsel: OLC)を素材として取り上げ、その機能分析とモデル化を行うことを目的とする。この最終目的に向けて、本年度は、1)OLCの長たる法務総裁次官補(Assistant Attorney General)の任命に係る議会ヒアリング録等の第一次資料の収集・整理作業、及び、2)OLCの歴史的展開を跡づけるための上記第一次資料の検証、諸文献の講読作業を行ってきており、初年度の計画をおおむね達成することができた。上記作業2)を通じては、とりわけ近年におけるOLCをめぐる状況の変容とそれに伴う議論状況を、同じく司法省内の訟務長官(Solicitor General: SG)においておよそ15年ほど先行して見られた状況と対比して検証するという着想を得た。そこで、両者の接続を意識した上で、中間段階の研究報告を複数の研究会において行い、幅広いメンバーから指摘、意見を得た。またこれとともに、本研究の最終段階でわが国の状況と結びつける際に、検証の素材になり得ると目される裁判例を検討する報告も行うことができ、研究者・実務家双方のコメントから示唆を得ている。本研究は、行政自身によるその適法性確保のためのシステム・組織の構築に向けて示唆を得ることを目的とし、アメリカ合衆国司法省の長である法務総裁の、政府内における法律問題に関する意見書作成の任務を対象としたものであり、特に原案作成を行う司法省内の法律顧問室に着目し、その行動様式と機能の分析を行った。これにより、法律顧問室が法務総裁の下に、執行府内の法律家として法解釈を示し、執行府の諸活動について法的側面から審査統御を行う存在として執行府の適法性確保に寄与してきた一方で、とりわけ近時の大統領の(憲)法解釈権という憲法学上の議論の高まりも背景に、執行府内の存在として司法省・法律顧問室が組織的に脆弱であり、この状況の下に法務総裁・法律顧問室の意見書に複数の対抗的な機能が認められることが明らかになった。他方、議会や司法省高官経験のある法学者らによる、法律顧問室内法律家の行動準則の提示や意見書作成過程の執行府内での透明化の主張が近時の法律顧問室に対してみられ、こうした批判的反応は、司法省内で政府訴訟を担当する訟務長官に対し15年ほど前にも近似して存在していたことも明らかになった。こうした執行府の適法性確保への役割に期待が向けられる司法省・法務総裁と、この役割を政府外私人にも与えるべく議会が創設してきた諸制度との関係を解明し、両者を包括して理解するための作業にも取りかかり、近時の合衆国における議論動向の一部を「キー・タム訴訟の原告適格と法の執行」名城法学60巻別冊(2010年)で紹介し若干の検討を行った。引き続き、合衆国政府の適法性確保、解怠是正のためのシステムのあり方を、法務総裁・司法省の法的位置づけと役割に検証の主軸を置いた研究を行う予定である。
現代美術の評価と価値-ベルリンの壁崩壊以降-

今年度は、「現代美術の評価と価値-ベルリンの壁崩壊以降-」と題して、多様化する価値観の変遷の中で、芸術がどのような運命に置かれているのかを探る目的で研究を進めた。具体的には、現代美術を代表する作家の一人である、工藤哲巳の作品研究を通じてまず考察を行い、その成果は(1)ポーランド全国美学大会における口頭発表と現地研究者との討論(2)カタログ『工藤哲巳回顧展』中に、論文「工藤哲巳の戦略-不可能性の哲学、或いは哲学の不可能性」執筆(3)ポーランドでの口頭発表に基づき、ヤギェウォ大学編集の報告書に、論文「Tetsumi Kudo i japonskaawangarda(工藤哲巳と日本の前衛)」掲載という形で発表した。またポーランド現代美術の調査を現地にて行い、国内の作品調査も併せて進めた。現代美術に関係の深い展覧会カタログや美学、美術史学の分野における優れた学術論文、著作も入手し、貴重な資料として活用している。今後の研究の方向としては、次の二つが考えられる。即ち;一つは歴史的見地に立って、現代美術の流れを史的事実を検証しつつ分析する方向。もう一つは、哲学的な視点から、価値論及び存在論の研究を行うと同時に、ポストモダン、ニュー・アート・ヒストリーやフェミニズムといった立場からの美的事象の解明を目指すものである。これらの展望をふまえた上で更に考察を深め、次年度にはポーランド全国美学大会への寄稿及び国内の美学会での口頭発表を予定している。
Muse細胞を用いたてんかん原性治癒手法の確立

古典的なけいれんモデルであるピロカルピン誘発けいれんモデルを用い、けいれん後に脳内細胞数もしくは生化学パラメータ(細胞数、caspase, TNF,glialmarkerなど)がどの程度変化するのかを検討した。さらにけいれんを起こした後にMuse細胞を投与すると、コントロールに比してMuse細胞の生着数は上昇し、幹細胞治療が急性けいれんに対する治療法として可能性があることを確認した。また行動実験(Barnes circle maze test)ではコントロールに比して成績が良い傾向(有意差なし)にあり、同様の実験系をけいれんの再現性高い光脳内けいれん誘発モデルで行うことでMuse細胞治療の有用性を証明できると期待している。現在Muse細胞は投与後どの程度脳内へとどまるのかの検証を行っており、評価時期の最適化とともに効果持続期間を明らかにしたいと考えている。脳内のMuse細胞生着部位特異性が判明すれば、細胞治療という手法のみならず、新たな治療ターゲットとしてのけいれんによる脳内損傷部位が発見されたことになり、新規研究分野へつながると考えている。また別に光脳内けいれん誘発モデルの誘発回数と神経細胞脱落の関係について最適化をはかり、Muse細胞投与時期の検討を行った。従来報告していたTGラット(Wister ratに対する遺伝子導入)よりも遺伝背景をLong-evansへ変更したTGラットの方が実験効率が良いと判明し、以後同動物を使用している。当初予定していた、古典的けいれんモデルにおける生化学的パラメータ変化についての検討はほぼ終了し、けいれん後に多能性幹細胞(Muse細胞)の生着がコントロールに比して多いことを発見した。これは課題の骨子となる問いに対して明確にポジティブな結果が出たことを意味しており、今後本手法を最適化して論文化を行いたい。また予期せぬ結果として、従来報告していた光脳内けいれん誘発モデルに比して、遺伝背景をLong-evans変更したTG ratは操作性および生後週数のフレキシブルさで効率的なことが判明した。今後はこれを用いた実験系を確立していきたい。今後の研究計画として、光脳内けいれん誘発モデルにおけるMuse細胞投与の実験系を最適化することにより、上記で得られたpreliminary dataは明確な有意差を持ってくると考えている。さらに慢性電極留置による長期脳波記録を実現し、Muse細胞投与によるてんかん原性獲得の抑制機序の解析へ進めていきたい。現状で当初予定していた実験計画予定に遅滞なく、概ね達成していると考えている。なお本実験系は「てんかんなどの慢性脳疾患に対する再生治療」として特許に関係する可能性があり、学会発表は控えている。今後論文化する際にへ移行して特許化の可能性も検討したい。当初より予定は進んでいるため、
Cortistatin Aの標的分子同定と抗がんリード化合物創製への展開

血管新生阻害作用を有する海洋天然物cortistatin Aの標的同定を目指して、すでに開発済みの構造単純化アナログ化合物由来のアフィニティープローブ分子を用いたプルダウンによって結合タンパク質の同定、解析を検討し、その絞り込みに成功した。また、同アナログ化合物を短工程、高収率で合成できる第二世代合成法の確立に成功したので、これを用いた構造最適化を検討した結果、天然物に匹敵する強力かつ高選択的な血管新生阻害作用を有する有望なリード化合物を見出し、in vivoでも顕著な抗腫瘍活性を示すことを明らかにした。Cortistatin Aの標的タンパク質を解明するために、申請者らが開発した活性アナログ化合物由来のビオチン標識アフィニティープローブ分子を合成し、これを用いて血管内皮細胞の破砕液からプルダウンアッセイを行い、選択的に結合してくるタンパク質の同定を目指した検討を行っており、活性アナログ化合物由来のプローブ分子(Active probe)に選択的に結合し、HUVEC選択的な増殖阻害活性を示さないアナログ化合物由来のプローブ分子(Dummy probe)には結合しない数種のタンパク質をSDS-PAGE上で見いだせるようになった。現在、結合タンパク質のMSによる同定を進めているが、さらに明確な結果を得る目的で、緩和な条件で化学的に切断が可能な化学構造をリンカー部分へ組み込んだプローブ分子の合成も検討した結果、過ヨウ素酸処理で切断できる1,2-ジオールを導入したプローブ分子が有効に機能することを見いだし、さらに検討を進めている。一方、リード化合物としての構造最適化を容易にするとともに、供給面の更なる改善を目的に、短工程かつ効率的な合成ルートの開発を目指した検討を行った結果、従来法と比較して工程数を半分に減らした第二世代合成法を開発した。ビタミンD2を出発物質にした新しい合成法も確立しており、さらに多様なアナログ化合物を合成していく体制が整った。前年度の検討で、cortistatin Aの構造単純化アナログ化合物を短工程で合成できる第二世代合成法の確立に成功したので、今年度はこれを用いて、より強力かつ高選択的な活性を示す化合物の創製を目指した構造展開を検討した。その結果、A環部分に極性官能基を導入することで血管内皮細胞に対する増殖阻害活性が飛躍的に向上することを見出し、nMオーダーでその増殖を阻害するとともに、がん細胞に対する活性と3000倍以上の選択性を示す有望な化合物を見出すことが出来た。ごく最近、さらに活性の向上した化合物を合成することにも成功しており、in vivo活性評価においても良好な結果が得られているため、新たな抗がん剤のリード化合物として特許申請も計画している。一方、イソキノリン側鎖の構造変換についても検討したが、窒素原子の位置が異なるだけのわずかな変換で全く活性が消失することが明らかになり、標的分子による構造認識が非常に厳密であることがわかった。上記の知見は、標的同定において、非特異結合を見分けるための有用なダミープローブに利用できると考え、実際にフォトアフィニティープローブ分子へと誘導し、活性評価を行ったところ、予想通り、化学構造が非常に類似していながら活性に大幅な差がある、有用なダミープローブ分子であることを明らかにした。後述の通り、当初計画から研究期間を延長してcortistatin Aの標的タンパク質の同定研究を進めることとしており、このダミープローブを用いた検討を開始している。海綿由来の血管新生阻害物質cortistatin Aの標的タンパク質同定に向けて、独自に開発したアナログ化合物由来のフォトアフィニティープローブ分子を合成し、血管内皮細胞の破砕液からプルダウン実験を行うことで、結合タンパク質の解析・同定を試みた。昨年度まで用いていたアフィニティープローブ分子の構造を基盤として、活性発現に影響を及ぼさない位置に、光照射によってカルベンを発生できるジアジリン基を導入したフォトアフィニティープローブ分子を合成した。これを用いたプルダウン実験の結果、活性アナログ由来のプローブ分子に選択的に結合してくる10種類程度のタンパク質を見出した。これらのうち数種のタンパク質については、研究協力者によるLC-MS/MS解析にて同定を行うことができた。同定スコアが高く、ダミープローブで得られた結果と有意な差があった有望な候補タンパク質については、RNAi法によるノックダウン実験を行い、血管内皮細胞選択的な増殖阻害活性との因果関係に関する知見を得た。一方、並行してアナログ化合物の構造最適化研究を進めた結果、これまでよりもはるかに強力かつ高選択的な活性を有する有望な化合物を合成することに成功した。最も優れた活性を示したものは、血管内皮細胞に対する増殖阻害活性がおよそ1 nM、他の細胞に対する増殖阻害活性との選択性が5000倍以上と、天然物に匹敵する活性を有することを見出した。腫瘍移植モデルマウスを用いたin vivo活性評価においても経口投与で顕著な抗腫瘍活性を示すことを明らかにしており、実用的な医薬リードへの展開が期待される。

活性アナログ化合物由来のビオチン標識アフィニティープローブ分子が十分な活性を保持していたため、これを用いたプルダウン実験で標的分子を同定できると考え、検討を進めていたが、非特異的に結合してくるタンパク質が多く、その後の解析が困難であった。選択的に結合してきたと思われるタンパク質についてはMS解析で同定できたため、ノックダウン実験を行ったが、標的分子とは関係ないことが判明するなど、当初計画の研究期間内に目的を達成することが難しい状況となった。そこで年度途中から、光照射により結合タンパク質と共有結合を形成できるフォトアフィニティープローブを新たに合成し、これを利用した標的探索に切り替えて再検討を行っており、研究期間を延長して標的分子の同定を目指すこととした。天然物有機化学フォトアフィニティープローブの利用によって、結合タンパク質の電気泳動パターンは以前に比べるとクリアになり、非特異結合を減らすことが出来ている。現在、上述の活性を持たないダミープローブとの比較検討を進めており、両者で差が見られるもの、すなわちcortistatin Aの標的タンパク質の候補が明らかになりつつある。今後、更に検討を進めて候補の絞り込みを行うとともに、siRNAを用いたノックダウン実験などによる検証を経て、標的タンパク質を明らかにしていく予定である。誘導化前のアナログ化合物と同等の活性を保持したアフィニティープローブ分子の合成に成功しており、これを用いたプルダウン実験も順調に進んでいる。選択的に結合してくるタンパク質も見いだしつつあり、同定のためのMS解析も開始している。また、アナログ化合物の合成法についても従来法から工程数を半減した改良合成法の確立に成功している。平成26年度に、cortistatin Aアナログ化合物由来のアフィニティープローブ分子を用いたプルダウン実験にて標的分子を探索し、RNAi法によるノックダウン実験で検証を行い、研究成果をまとめる予定だったが、従来のプローブ分子では標的分子の同定には至らなかったため、計画を変更し、標的分子と共有結合を形成できるフォトアフィニティープローブを用いた標的探索を行うこととしたため、未使用額が生じた。活性アナログ化合物由来のアフィニティープローブを用いた検討により絞り込みに成功した有望な候補タンパク質については、RNAi法によって該当する遺伝子のノックダウン細胞株を作製し、cortistatin A添加時と同様の表現形が現れるか否か、あるいは同タンパク質の高発現細胞株を作製して化合物に対する耐性を獲得するかを確認する等のケミカルジェネティクスの手法によって、真の標的分子であることを確認する。また、確立できた改良合成法を用いて、より有効性の高い化合物の創製を目指す。例えば、本化合物は脂溶性が高く、経口投与にはCMC-Naによる乳化分散が必要であるため、バイオアベイラビリティーの向上を意識して、極性官能基を有するA環部および側鎖部分の導入による水溶性の向上を検討する。結合タンパク質が同定されれば、その構造情報をもとに化合物とのドッキングスタディを行うことにより、化合物の構造最適化を効率的に進める。また、良好な活性を示す化合物については、腫瘍移植モデルマウスを用いたin vivo試験も行い、その実用性を検証する。