hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属タンパク質成熟化の構造生物学

Hypタンパク質群(HypA, B, C, D, E, F)は,水素代謝を行う[NiFe]ヒドロゲナーゼにニッケル・鉄クラスターを組み込み,ヒドロゲナーゼを活性体にする成熟化因子である.われわれが初めて結晶構造解析に成功したHypC, HypD, HypEでの成果を発展させて,本研究ではHypA, HypB, HypFの結晶構造解析,ならびにHypC, HypD, HypE間の機能的複合体の構造・機能解析を行った.本研究は,ヒドロゲナーゼ成熟化因子Hypタンパク質の結晶構造解析を行い,その成熟化過程を構造生物学的に解明することを目的としている.本年度は,HypC-HypD複合体およびHypC-HypD-HypE複合体について,溶液中での複合体形成を検討して結晶化を試みた.HypC-HypD複合体については,溶液中で比較的安定な複合体を形成することがこれまで確認されていたが,今回,X線回折実験に適する結晶が得られた.放射光を用いて2.6Å分解能の回折データの測定に成功し,現在,分子置換法による構造解析を行っている.HypAについては,結晶化に成功していたモノマー状態での構造解析を2.3Å分解能で行った.Zn原子の異常分散効果を利用したSAD法によって位相決定し,現在精密化が進行している.加えて,溶液中で確認できたダイマー状態での結晶化にも成功した,その結晶構造を3.3Å分解能で決定して,現在精密化が進行中である.HypAのモノマー構造は,Ni結合ドメインとZn結合ドメインから構成されており,全体構造として他に類似な構造は見当たらなかった.Ni結合ドメインはコンパクトなα/βフォールドを取っていること,Zn結合ドメインには3本のβ-ストランドとループ領域があり,Zn fingerモチーフによってZn原子を配位していることがわかった.Ni原子結合モチーフのコンフォメーション変化によって,ドメイン間の相対配置が制御されていることが示唆された.一方,ダイマー構造では,予想しなかったドメインスワッピングによって構造の安定化が行われていることが明らかになった.Hypタンパク質群(HypA, B, C, D, E, F)は,水素代謝を行う[NiFe]ヒドロゲナーゼにニッケル・鉄クラスターを組み込み,ヒドロゲナーゼを活性体にする成熟化因子である.われわれが初めて結晶構造解析に成功したHypC, HypD, HypEでの成果を発展させて,本研究ではHypA, HypB, HypFの結晶構造解析,ならびにHypC, HypD, HypE間の機能的複合体の構造・機能解析を行った.本研究は,ヒドロゲナーゼ成熟化因子Hypタンパク質の結晶構造解析を行い,その成熟化過程を構造生物学的に解明することを目的としている.本年度は,HypC-HypD複合体の構造解析を行い,2.6Å分解能での結晶構造を決定した.HypC-HypD複合体において,HypCの保存されたβバレルドメインがHypDの分子中心に結合し,両者の保存モチーフが近接していることが明らかになり,推定した反応機構を支持する結果が得られた.HypC-HypDの相互作用部位は,主に保存された疎水的性残基間の相互作用で形成されていた.また,HypC, HypDおよびHypEタンパク質間の溶液中での複合体形成についても検討した.HypD-HypEあるいはHypC-HypE間での複合体形成は確認できなかったが,HypC-HypD複合体とHypEとは弱い相互作用を確認することができた.そこで,HypC, HypDおよびHypEそれぞれの精製サンプルを等量混合して複合体を調製したところ,X線回折実験に適する三者複合体の結晶が得られた.放射光による回折実験の結果,4.1Å分解能の回折データ収集に成功し,現在,分解能向上のための結晶化条件の改善,分子置換法による構造解析を行っている.前年度構想解析に成功したHypAについては,モノマー状態の構造を2.3Å分解能で,ダイマー状態の構造を3.3Å分解能で,それぞれ精密化を完了した.HypFについては,発現条件および精製方法の改善によって結晶化に十分な量のタンパク質試料調製に成功し,複数の条件において予備的な結晶が得られた.放射光による回折実験の結果,6Å分解能程度の回折点を確認することができ,現在,結晶化条件の改善を進めている.本研究は,ヒドロゲナーゼ成熟化因子Hypタンパク質の結晶構造解析を行い,その成熟化過程を構造生物学的に解明することを目的としている.HypFについては,前年度までに得られた結晶化条件の改善を進め,針状結晶と六角板状結晶が得られ,放射光による回折実験の結果,後者については5A分解能を超える回折が確認でき,六方晶系に属することが明らかになった.HypBホモログについては,斜方晶系に属する結晶が得られ,2.1A分解能での構造解析に成功し,ホモダイマー構造を取ることが明らかになり,精密化を進めている.ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いて,HypAおよびHypCと[NiFe]ヒドロゲナーゼ大サブユニットとの相互作用を解析し,ヒドロゲナーゼ大サブユニットはHypAと強く結合する一方,HypCとは弱くしか結合しないことが示唆された.また,前年度構造決定に成功したHypC-HypD複合体に加えて,本年度はHypC-HypD-HypEの三者複合体の構造解析を行い,2.3A分解能での結晶構造を決定した。

HypC-HypD-HypE複合体においては,HypEダイマーの各側面にHypC-HypD複合体が結合していることがわかった.変異体解析の結果,HypEの保存された疎水性残基が三者複合体形成の留め具として重要な役割を果たしていることも明らかになった.シアノ基転位に関わるHypEのC末端領域は,HypCとHypDで形成されるFe結合部位の付近に位置しており,Cys残基間の酸化還元によってFe原子のシアノ化が起こる反応機構が,強く示唆されるものであった.
骨髄増殖性腫瘍の病態進展におけるドライバー変異とヒストン修飾因子異常の相互的役割

本研究は、真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症を含む、骨髄増殖性腫瘍におけるドライバー変異と、他の遺伝子変異が協調的に作用して病態が進展していく病態を明らかにするものである。カルレチクリン(CALR)のexon 9におけるフレームシフト変異は、骨髄増殖性腫瘍におけるドライバー変異として、JAK2変異に次いで高頻度に認められる。我々は、ゲノム編集法を用いてマウスCalr exon 9に、骨髄増殖性腫瘍症例と同様のフレームシフトを導入した2種類(2 base insertion, CR2iおよび10base deletion, CR10d)のノックインマウスの作出に成功した。本年度は、これら2種類のノックインマウスについて造血を詳細に解析したところ、CR2iマウスについては脾腫、髄外造血を、CR10dマウスでは白血球数および血小板数の増加や髄外造血を認めた。このことから、2種類のCalr変異ノックインマウスのそれぞれが、骨髄増殖性腫瘍の造血を反映しているものと考えられる。従来のCALR変異マウスは全てヒトのCALRを変異させたものを、人為的に導入したモデルのみであり、マウスのCalrそのものを変異させた初めてのモデルにおいても骨髄増殖性腫瘍様の造血を示すことを証明できたことは、きわめて意義深い。今後は、JAK2変異マウスとCalr変異マウスの造血の違い、Ezh2欠失やHmga2発現がCalr変異造血に及ぼす影響を明らかにすることで、骨髄増殖性腫瘍が慢性期の増殖性造血が主体の病態からやがて骨髄線維症を起こし、さらに急性白血病へと進展していく機序の一端を明らかにすることができると期待している。我々は、CRISPR/Cas9によるゲノム編集法を用いて、マウスCalrのexon 9に骨髄増殖性腫瘍症例と同様のフレームシフトを導入した、CR2iおよびCR10dノックインマウスの作出に成功した。これら2種類のノックインマウスについて造血を詳細に解析したところ、CR2iマウスにおいては脾腫、脾臓への巨核球の集族を、CR10dマウスでは白血球数および血小板数の増加や脾臓への巨核球の集族を認め、それぞれMPNの造血を反映していた。これまでの報告において、CALR変異を導入されたマウスは、ヒトのCALRを変異させたものを人為的に導入したモデルのみであったことから、今回マウスのCalrそのものを変異させた初めてのモデルにおいても、骨髄増殖性腫瘍様の造血を示すことを証明できたことが、きわめて意義深いことであると考えている。現在、これらCalr変異ノックインマウスの造血幹細胞について解析中である。骨髄移植による競合的造血再構築法では、野生型マウスと比較して、CR2iマウスでは造血幹細胞の造血再構築能が著明に低下しており、CR10dマウスにおいても、造血再構築能は野生型よりも同等からやや劣っている程度であった。このように骨髄増殖性腫瘍様の表現型を示し、かつ造血再構築能が変化している背景を明らかにするために、造血幹細胞の遺伝子発現を網羅的に調べているところである。さらに、JAK2変異マウスとCalr変異マウスの造血の違い、Ezh2欠失やHmga2発現がCalr変異造血に及ぼす影響を明らかにする。我々は今後、Ezh2欠失やHmga2発現が、Calr変異下の造血に及ぼす影響を明らかにしたいと考えている。また、骨髄増殖性腫瘍の症例においてはJAK2変異例とCALR変異例で予後が異なっていることから、JAK2変異とCalr変異が造血に及ぼす影響の相異についても解析したいと考えている。このため、Calr変異ノックインマウスと、Hmga2トランスジェニックマウス(Ikeda et al, Blood, 2011)やEzh2コンディショナルノックアウトマウスを交配してCalr変異ノックインHmga2トランスジェニックマウスや、Calr変異ノックインEzh2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、造血を解析する予定である。また、JAK2V617FトランスジェニックマウスとCalr変異ノックインマウスについては、それらの造血細胞について差異を明らかにするべく、解析を進めていく。解析においては、遺伝子や蛋白の発現様式、JAK阻害剤に対する感受性を初めとする、様々な検討を予定している。以上により、骨髄増殖性腫瘍が骨髄線維症を起こし、さらに急性白血病へと進展していく機序の一端を明らかにすることができると期待している。

従来のCALR変異マウスは全てヒトのCALRを変異させたものを、人為的に導入したモデルのみであり、マウスのCalrそのものを変異させた初めてのモデルにおいても骨髄増殖性腫瘍様の造血を示すことを証明できたことは、きわめて意義深い。今後は、JAK2変異マウスとCalr変異マウスの造血の違い、Ezh2欠失やHmga2発現がCalr変異造血に及ぼす影響を明らかにすることで、骨髄増殖性腫瘍が慢性期の増殖性造血が主体の病態からやがて骨髄線維症を起こし、さらに急性白血病へと進展していく機序の一端を明らかにすることができると期待している。我々は、CRISPR/Cas9によるゲノム編集法を用いて、マウスCalrのexon 9に骨髄増殖性腫瘍症例と同様のフレームシフトを導入した、CR2iおよびCR10dノックインマウスの作出に成功した。これら2種類のノックインマウスについて造血を詳細に解析したところ、CR2iマウスにおいては脾腫、脾臓への巨核球の集族を、CR10dマウスでは白血球数および血小板数の増加や脾臓への巨核球の集族を認め、それぞれMPNの造血を反映していた。これまでの報告において、CALR変異を導入されたマウスは、ヒトのCALRを変異させたものを人為的に導入したモデルのみであったことから、今回マウスのCalrそのものを変異させた初めてのモデルにおいても、骨髄増殖性腫瘍様の造血を示すことを証明できたことが、きわめて意義深いことであると考えている。現在、これらCalr変異ノックインマウスの造血幹細胞について解析中である。骨髄移植による競合的造血再構築法では、野生型マウスと比較して、CR2iマウスでは造血幹細胞の造血再構築能が著明に低下しており、CR10dマウスにおいても、造血再構築能は野生型よりも同等からやや劣っている程度であった。このように骨髄増殖性腫瘍様の表現型を示し、かつ造血再構築能が変化している背景を明らかにするために、造血幹細胞の遺伝子発現を網羅的に調べているところである。さらに、JAK2変異マウスとCalr変異マウスの造血の違い、Ezh2欠失やHmga2発現がCalr変異造血に及ぼす影響を明らかにする。我々は今後、Ezh2欠失やHmga2発現が、Calr変異下の造血に及ぼす影響を明らかにしたいと考えている。また、骨髄増殖性腫瘍の症例においてはJAK2変異例とCALR変異例で予後が異なっていることから、JAK2変異とCalr変異が造血に及ぼす影響の相異についても解析したいと考えている。このため、Calr変異ノックインマウスと、Hmga2トランスジェニックマウス(Ikeda et al, Blood, 2011)やEzh2コンディショナルノックアウトマウスを交配してCalr変異ノックインHmga2トランスジェニックマウスや、Calr変異ノックインEzh2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、造血を解析する予定である。また、JAK2V617FトランスジェニックマウスとCalr変異ノックインマウスについては、それらの造血細胞について差異を明らかにするべく、解析を進めていく。解析においては、遺伝子や蛋白の発現様式、JAK阻害剤に対する感受性を初めとする、様々な検討を予定している。
ＢＭＰ－３ｂの新たなアディポサイトカインとしての機能およびその病態生理学的役割

BMP-3bは、脂肪組織にも多く発現しているが、そこでの機能は不明であった。これまでの検討で、BMP-3bの脂肪細胞分化抑制作用を見出し、次いでBMP-3bのin vivoでの検討の為、脂肪組織特異的過剰発現マウス(Tg)を作製し、Tgの抗肥満作用やエネルギー消費亢進作用を見出した。脂肪組織では、PPARγ及びPPARγの標的因子である脂肪酸トランスポーター(FAT/CD36)が抑制されており、脂肪酸取り込み量の減少による抗肥満作用が示唆された。また、エネルギー消費亢進作用については、Tgでは、褐色脂肪組織の活性化及び活動量の増加に起因することが示された。私達が発見したBone morphogenetic protein-3b(BMP-3b)の新しい役割として、脂肪細胞から分泌するアディポサイトカインとしての機能およびその病態生理学的役割の解明を目指した研究である。BMP-3bは、構造上、他のBMP (BMP-2, 4や7)と類似したアミノ酸配列を有しているが、それらとは異なる、独自の作用を有している。例えば、骨芽細胞分化抑制作用や初期胚発生過程における頭部(神経)誘導作用などがある。一方、BMP-3bは、脂肪組織にも多く発現しているが、そこでの機能は不明であった。私達のこれまでの培養細胞系の検討において、BMP-3bは、脂肪組織中の脂肪細胞から分泌され、脂肪細胞分化抑制作用を有することや、肥満モデルマウスの脂肪組織でのBMP-3bの発現量増加を見出した。本年度は、BMP-3bの脂肪組織における機能を、動物個体レベルで検討し、生理作用や病態生理学的役割を解析した。まず、BMP-3bを脂肪組織特異的に過剰発現するマウス(aP2-BMP-3b Tg)を作製し、高脂肪食により誘導される肥満に対する作用を調べた。その結果、aP2-BMP-3b Tgでは、野生型と比較して、体重増加抑制、脂肪組織量減少、脂肪細胞の肥大化抑制作用といった抗肥満作用を示した。更には、糖負荷試験やインスリン負荷試験より、耐糖能、インスリン抵抗性の改善効果を明らかにした。一方で、代謝解析の結果、aP2-BMP-3b Tgでは、野生型と比較して、摂食量はむしろ増加していたが、酸素消費量、熱産生量、活動量、飲水量が増加し、代謝が亢進していることが判明した。今後は、これら、aP2-BMP-3b Tgの抗肥満作用のメカニズムの解明や病態生理学的役割の検討を進めていく予定である。BMP-3bは、構造上、他のBMP (BMP-2, 4や7)と類似した構造を有しているが、それらとは異なる、独自の作用を有している。昨年度は、BMP-3bの脂肪組織における機能を、動物個体レベルで検討し、生理作用や病態生理学的役割を解析した。まず、脂肪組織特異的過剰発現マウス(aP2-BMP-3b Tg)を作製し、高脂肪食性肥満に対する作用を調べた。その結果、aP2-BMP-3b Tgでは、野生型と比較して、抗肥満作用(体重増加や脂肪細胞肥大化の抑制等)とそれに伴う耐糖能の改善効果を示した。一方で、aP2-BMP-3b Tgでは、野生型と比較して、摂食量はむしろ増加していたが、酸素消費量、熱産生量、活動量が増加し、代謝が亢進していることが判明した。本年度は、普通食における検討を行った。aP2-BMP-3b Tgでは、野生型と比較して、体重減少や脂肪細胞の小型化を示したが、耐糖能は無変動であった。代謝解析により、酸素消費量や活動量は増加していたが、摂食量には変動が無かった。今後は、これら、aP2-BMP-3b Tgの抗肥満作用や代謝亢進作用等のメカニズムの解明や病態生理学的役割の検討を進めていく予定である。私達が発見したBone morphogenetic protein-3b(BMP-3b)の新しい役割として、脂肪細胞から分泌するアディポサイトカインとしての機能及びその病態生理学的役割の解明を目指した研究である。BMP-3bは、他のBMP(BMP-2,4等)とは異なり、Smad2/3系を介した骨芽細胞分化抑制作用や初期胚発生における神経(頭部)誘導作用等、独自の作用を有する。これまでのin vitroでの検討で、BMP-3bの脂肪細胞からの分泌、肥満マウスによる発現量の増加、脂肪細胞分化抑制作用を見出した。次に、BMP-3bの脂肪組織における機能を動物個体レベルで検討する為、脂肪組織特異的過剰発現マウス(aP2-BMP-3b Tg)を作製した。

昨年までに、aP2-BMP-3b Tg(Tg)は、高脂肪食時における脂肪組織量減少を伴う抗肥満作用や耐糖能改善作用、及びエネルギー消費亢進作用を見出した。本年度は、これらの作用機序の検討を行った。その結果、内臓脂肪組織において、Tgでは、野生型と比較してPPARγが減少し、in vitroでの作用同様の脂肪細胞分化への関与が示された。更にPPARγの標的因子である脂肪酸トランスポーター(FAT/CD36)が抑制されており、Tgにおける脂肪細胞への脂肪酸取り込み量の減少による脂肪組織量減少作用が示唆された。また、エネルギー消費亢進作用については、Tgでは、摂餌量が増加しているものの、褐色脂肪組織の活性化及び活動量の増加に起因することが示された。一方、BMP-3bは、内在性に脳に発現しており、エネルギー代謝制御におけるBMP-3bの中枢性作用にも着目した。Tgにおいて、BMP-3bは、脂肪組織だけでなく脳でも発現が上昇し、エネルギー代謝調節の主要部位である視床下部でも発現が増加していたことから、BMP-3bの新たな中枢性作用が示唆された。BMP-3bは、脂肪組織にも多く発現しているが、そこでの機能は不明であった。これまでの検討で、BMP-3bの脂肪細胞分化抑制作用を見出し、次いでBMP-3bのin vivoでの検討の為、脂肪組織特異的過剰発現マウス(Tg)を作製し、Tgの抗肥満作用やエネルギー消費亢進作用を見出した。脂肪組織では、PPARγ及びPPARγの標的因子である脂肪酸トランスポーター(FAT/CD36)が抑制されており、脂肪酸取り込み量の減少による抗肥満作用が示唆された。また、エネルギー消費亢進作用については、Tgでは、褐色脂肪組織の活性化及び活動量の増加に起因することが示された。研究計画書に記載した事項をほぼ予定通り遂行している。遺伝子改変マウスを用いた検討が中心となるため、それらの繁殖の程度により、多少前後している項目もある。内分泌・代謝研究計画書に記載した方法により研究を推進する。研究計画書に記載した事項を予定通りに進めている。遺伝子改変動物での検討が多いので、動物の繁殖数により、進捗が計画書と比較して、多少前後している検討項目もある。基本的には、研究計画書に記載した計画により推進する。遺伝子改変動物を用いた検討においては、繁殖能力が均一ではないので、進捗状況や結果を踏まえて柔軟に対応していく。年度内の使用量を予測して物品を購入したが、一部、納入を終えることができなかった試薬があったため。上記のような試薬については、次年度中に速やかに発注し、年度内に使用完了とできるように実験を行う。
都市住民を対象とした減塩指導の降圧効果に関する無作為化介入研究

【方法】大阪市N保健所における市民健診で境海域高血圧と判定された者、高血圧の予防を望む者を中心とした40歳以上69歳以下の36名を対象に研究を実施した。具体的には、9月中旬にベースライン検査を実施し、その後無作為に18名ずつの2群に分け、前期介入群と後期介入群とした。約7週間に3回の減塩教室を同じ内容で2シリーズ開催した。1シリーズ目は前期介入群が、2シリーズ目は後期介入群が参加した。ベースライン調査も含めて各シリーズの前後に検査を合計3回実施した。減塩教室に参加しない期間を観察期間(対照期間)とした。本研究では減塩指導の降圧効果は、ベースラインと11月に実施した前期介入後の検査時の24時間尿中食塩排泄量と安静時血圧の成績を用いて評価した。安静時血圧はオムロン医療用イオン自動血圧計(コルネットHEM-904)を用い、20分以上座位での安静を保った後に測定した。減塩到達目標は、ベースライン時の24時間尿中食塩排泄量と24時間思い出し法による食事調査から求めた食塩摂取量との平均値の20%減を個人毎に定めた。減塩教室は、食塩摂取量の自己評価ができるようにするための訓練と、減塩技術の獲得に主体をおいたプログラムで実施した。【結果】ベースラインの尿中食塩排泄量は約9g、収縮期血圧(SBP)は約140mmHg、拡張期血圧(DBP)は約85mmHgで2群間に統計学的有意差は認められなかった。前期介入後は介入群では食塩摂取量に変化は認められなかったが、対照群では増加した。血圧は介入後両群とも低下したが、2群間に有意差は認められなかった。【結論】9g/日と日本人としては食塩摂取量が低い都市住民でも、減塩指導による食塩摂取量の相対的な低下効果が認められた。減塩指導による正味の食塩摂取変化量は-1.9gであり、SBPの正味変化量は-4.7mmHg、DBPの正味変化量は-2.5mmHgであった。
大気圧プラズマによるゲノム応答機構の解明と治療への展開

大気圧プラズマは照射すると特に液中に大量の活性酸素種(ROS)を生成することが知られ、がん治療への応用も研究されている。本研究では、これらの大量のROSを細胞内に導入する手法として、温熱に注目して併用効果を調べた。温熱処理、即ち温度上昇は細胞膜の透過性を亢進し、併用により細胞内へのROS移動が亢進すると思われる。大気圧プラズマ照射実験に際しては、NUグローバル社製のHeプラズマ発生装置を用いた。周波数60Hz, peak-to-peak電圧は7 Kvを用いた。Heガス流量は2 L/minであったアポトーシスについては、細胞膜表面上へのフォスファチジルセリンの発現DNA断片化、形態変化、関連タンパク質の発現等を指標に検討した。その結果、単独での影響がほとんど認められない42度,20分をプラズマ処理後に使用した場合、顕著な増強効果が認められた。大気圧プラズマは大量の活性酸素種(ROS)を生成することは判明しているが、その詳細な機序について、特に発生場所については不明な点が多い。そこで、揮発性アルコール類を用いて、プラズマに特異的なフリーラジカルが生成するか否か、スピン捕捉剤としてDBNBS(3,5-dibromo-4-nitoroso benzene sulfonate)を用いESR-spin trap法にて検討した。作製した大気圧非平衡アルゴン(Ar)プラズマ照射装置を使用、条件は印加電圧Vp-p:18 kV、周波数:20 kHz、ガス流量:2 L/minである。その結果、用いたアルコール類ではOHラジカルにより生じる水素引き抜き反応によるラジカル種のみが認められた。大気圧プラズマの化学反応の特徴は多量のOHラジカルに起因すると思われる。28年度が最終年度であるため、記入しない。近年、ナノテクノロジーの医療応用の研究が進み、ナノ粒子は、疾患の診断や治療のための媒体として有望視されており、その臨床応用も進みつつある。金属をナノスケールまで、微小化すると一般の特性とは異なる性質を示すことがある。ナノ化された白金粒子は、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)およびカタラーゼ活性を示すことが報告されているので、白金ナノ粒子(Nano-Pt)を用いて、大気圧プラズマ誘発アポトーシスに対する作用について調べた。大気圧非平衡アルゴン(Ar)プラズマ発生条件は印加電圧18 kV、周波数:20 kHz、ガス流量:2 l/min.である。調べたところプラズマによる化学作用も距離に反比例するので、主な実験は照射口から8 mmの距離で行った。プラズマの化学的指標として、水溶液中に生成するOHラジカル(・OH)等についてDMPO (5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)をスピン補捉剤として用いてEPR-スピン補捉法で検討した。Arプラズマを照射した細胞内活性酸素種の測定には5種類の蛍光試薬を用いフローサイトメトリーで調べた。細胞内に生成する活性種は・OH,H2O2,OCl-,および僅かなO2.-と思われる。尚、水溶液中に亜硝酸塩の生成が認められるので、細胞内にも存在すると思われる。Nano-Ptを利用して、これらの活性酸素種の除去およびアポトーシスへの影響を検討した。その結果、有意な細胞内活性酸素種の低下およびアポトーシス抑制効果を認めた。現在、窒素添加効果、温熱併用効果についても検討している。細胞内外の活性酸素生成、プラズマ移送気体への窒素添加、ナノ白金粒子添加効果など、論文として公表できた。細胞内への活性酸素の導入、揮発性溶質への影響など、検討する予定である。
高血圧の成因に関連する血圧・体液調節系の新しい因子に関する分子生物学的研究

本研究では、レニンと結合し、その活性を阻害するレニン結合蛋白質(RnBP)と腎近位尿細管ペルオキシゾームに局在するD-アミノ酸酸化酵素(DAO)との二つの蛋白質の構造と機能に関して解析を行い、両因子の生理的意義と循環調節系への関与を追求することを目的とした。1.ヒトゲノム遺伝子の解析ヒトDAO遺伝子の第1イントロンに存在するCA繰り返し配列により構成されるマイクロサテライトマーカーD12S105の解析により、ヒト染色体12q14-q24.33にDAO遺伝子が存在することが明らかとなった。そこでヒト遺伝病として12番染色体にマッピングされている脊髄小脳失調症2の遺伝子座との連関を分子遺伝学的に検索した。既に明らかとされている遺伝性脊髄小脳失調症で典型的に認められる(CAG)の繰り返し配列はヒトDAO遺伝子には存在しなかった。またキューバ国における脊髄小脳失調症2の患者集団の家系においては、DAO遺伝子エキソン内に変異は認められなかったが、この脊髄小脳失調症2の遺伝子座はヒトDAO遺伝子の近傍1cenli Morganの範囲内に存在することが明らかとなった。2.レニン結合蛋白質遺伝子の構造とその発現調節ブタ大動脈内皮層由来の血管内皮細胞においてはレニンとRnBPの遺伝子発現が共に認められ、血管壁レニン・アンジオテンシン系の一員としてRnBPが機能する可能性が示唆された。この血管内皮細胞では、レニン遺伝子の発現抑制因子であるアンジオテンシンII、バゾプレッシン、エンドセリン等の因子はTGF-β、8-bromo cAMPとともにRnBP遺伝子の発現を促進する事が明らかとなった。またラット副腎髄質由来褐色細胞腫より樹立された細胞株PC12においてもRT-PCR法により、両遺伝子が共発現している事が明らかとなり、組織レニン・アンジオテンシン系の因子としてRnBPが普遍的に存在していることが示唆された。本研究では、レニンと結合し、その活性を阻害するレニン結合蛋白質(RnBP)と腎近位尿細管ペルオキシゾームに局在するD-アミノ酸酸化酵素(DAO)と二つの蛋白質を高血圧の成因に関連する血圧・体液調節系の因子として注目し、それらの構造と機能に関して、遺伝子工学・分子生物学の手法を用いた解析を行い、両因子の生理的意義と循環調節系への関与を追究することを目的とした。本年度は、RnBPの血圧調節因子としての機能を解析する目的で、血管系組織における遺伝子発現とその発現調節を検討し、またDAO遺伝子に存在するヒトゲノム上でのDNA多型領域の構造についての解析を進めた。1.ヒトゲノム遺伝子の解析ヒトDAO遺伝子の第1イントロンに存在するCA繰り返し配列とポリT配列に関してヒトゲノムDNAの解析を行い、マイクロサテライトマーカー配列との相同性を検討した。その結果、3′側の17個からなるCA配列の存在する領域が、D12S105マーカーの塩基配列を含むことが明らかとなった。さらに新たに、このCA配列下流のポリT配列も多型であることが明らかとなり、DAO遺伝子がDNA多型マーカーに極めて富むことが明らかとなった。またD12S105マーカーの解析から、ヒトDAO遺伝子がヒト染色体12q14-q23.33に存在することが示された。今後、ヒト成人病の分子遺伝学的解析を行うプローブとしてのヒトDAO遺伝子の有用性が期待される。2.レニン結合蛋白質遺伝子の構造と機能に関する解析

ラットaorta mRNAを用いたNorthern blottingの結果、aortaにおいてもRnBPmRNAの発現が認められた。さらにブタaorta由来血管内皮細胞を用いた解析を行ったところ腎臓の約40%の発現量のRnBPmRNAが認められた。そこでレニン遺伝子の発現を併せて検討するため、まずブタ腎臓mRNAよりヒトレニンの塩基配列をもとにRT-PCR法によりブタレニンcDNA fragmentを単離しその構築を決定した。このブタレニンの塩基配列をもとにRT-PCR法により、ブタ血管内皮細胞におけるレニンmRNAの発現を解析した。その結果、ブタaorta由来の血管内皮細胞おいては、レニンとRnBPの遺伝子発現がともに認められ、Vascular Renin-Angiotensin Systemの一員としてRnBPが機能し得る可能性が示唆された。さらにRnBP遺伝子の発現が培養内皮細胞系においてAngiotensin II及び8-bromo cAMPにより正の調節を受けることが示唆された。本研究では、レニンと結合し、その活性を阻害するレニン結合蛋白質(RnBP)と腎近位尿細管ペルオキシゾームに局在するD-アミノ酸酸化酵素(DAO)との二つの蛋白質を高血圧の成因に関連する血圧・体液調節系の因子として注目し、それらの構造と機能に関して、遺伝子工学・分子生物学の手法を用いた解析を行い、両因子の生理的意義と循環調節系への関与を追求することを目的とした。本年度は、RnBPの組織における遺伝子発現とその発現調節を検討し、またDAO遺伝子に存在するマイクロサテライトマーカーに関しては、患者家系を用いた分子遺伝学的解析を進めた。1.ヒトゲノム遺伝子の解析ひとDAO遺伝子の第1イントロンに存在するCA繰り返し配列により構成されるマイクロサテライトマーカーD12S105を用いて、ヒト遺伝病として12番染色体にマッピングされている脊髄小脳失調症2の遺伝子座との関連を分子遺伝学的に検索した。既に明らかとされている遺伝性脊髄小脳失調症で典型的に認められる(CAG)の繰り返し配列はヒトDAO遺伝子には存在しなかった。またキューバ国における脊髄小脳失調症2の患者集団の家系においては、DAO遺伝子エキソン内に変異は認められなかったが、この脊髄小脳失調症2の遺伝子座はヒトDAO遺伝子の近傍1centi Morganの範囲内に存在することが明らかとなった。2.レニン結合蛋白質遺伝子の発現とその発現調節ブタ大動脈内皮層由来の血管内皮細胞においてはレニンとRnBPの遺伝子発現が共に認められ、血管壁レニン・アンジオテンシン系の一員としてRnBPが機能する可能性が示唆された。この血管内皮細胞では、レニン遺伝子の発現抑制因子であるアンジオテンシンII、バゾプレッシン、エンドセリン等の因子はTGF-βとともにRnBP遺伝子の発現を促進する事が明らかとなった。またラット副腎髄質由来褐色細胞腫より樹立された細胞株PC12においてもRT-PCR法により、レニンとRnBPの両遺伝子が共発現している事が明らかとなり、組織レニン・アンジオテンシン系の因子としてRnBPが普遍的に存在していることが示唆された。
フェムト秒レーザー露光による非晶質半導体の光化学加工

超短光露光によるカルコゲナイド系非晶質半導体の光加工法を確立するため、As_2S_3ガラス試料に対して透明域の波長(800nm)をもつフェムト秒T_1-サファイア-レーザー光(パルス幅約100fs)照射を照射し、試料表面の変化をレーザー顕微鏡により観察した。平成13年度は、T_1-サファイア-レーザー光の2光子吸収過程により光膨張を効率よく誘起できることを実証した。平成14年度は、光膨張の増強を目指した。光膨張は、光励起の際に同時に発生する熱の蓄積による表面の損傷と競合関係にある。表面損傷を避けるため、レーザー光の繰り返しを1kHzから10Hzに下げ、照射強度を1200μW、照射時間を161024s、スポット径を620μmの範囲の種々の条件に設定し露光を行った。その結果、以下のことが明らかとなった。照射強度が43μW以上では損傷を受け、露光域は孔となる。一方、8μW以下では、露光域に光膨張を検出できない(検出限界0.1μm)。積算線量23J/cm^2に損傷の閾値が存在する。このときのレーザー光の侵入長を平成13年度に求めた2光子吸収パラメーターから見積もると0.2mm程度となる。光エネルギーが集中した表面近傍は、ガラス軟化点付近まで温度上昇し、熱膨張率は0.4%に達する。これが、同程度の膨張率をもつ光膨張と重畳する結果、損傷をもたらすものと推測される。超短光露光による光加工においては、この損傷閾値に注意を払う必要がある。超短光露光法は、非線形光学過程を利用するため、上記のように精密な強度制御を要するという難点はあるものの、非晶質の種類やサイズを問わず適用でき、加工時間も短縮できるといった、従来の定常光露光法にない長所をもつことが本研究により明らかとなった。今後の発展を期待する。超短光露光によるカルコゲナイド系非晶質半導体の光加工法を確立するため、As_2S_3ガラスをモデル試料としてTi-サファイア-レーザー光(波長800nm,パルス幅130210fs)照射にともなうガラス表面の変化をレーザー顕微鏡により観察した。以下のことが明らかとなった。レーザー強度を0.41mWに選び、焦点距離40mmのレンズで試料表面に集光したところ、直径約20μmの露光部に隆起:光膨張が観測された。光膨張は露光を重ねるに連れて成長し、128秒の露光で高さ0.9μmに達した。同程度の光膨張を得るのに従来の定常光露光では1000秒かかっていたのに比して、今回の超短光露光の時間は約1桁短い。レーザー強度を0.210.66mWの範囲で変え、光膨張の成長の様子を観察したところ、成長速度はレーザー強度の2乗に比例して急激に速まることがわかった。さらに、レーザー光自身の透過率の強度依存性を測定したところ、レーザー光がそれ自身の強度の2乗に比例して減少することがわかった。以上の結果は、As_2S_3ガラスの光膨張が透明域(波長800nm)の超短光の2光子帯間励起により誘起されていることを示す。

このことは、レーザー光強度の調節によりガラス中への侵入長を制御できること、即ち、従来の定常光露光での侵入長による加工サイズと加工可能材料の制限から開放されることを意味する。以上の実験は、すべて1kHzという高繰り返しのレーザー光を用いて行ってきた。このため、光励起の際に同時に発生する熱の蓄積により表面が損傷し、光膨張は高々1.1μmに止まっている。そこで、現在はパルスセレクターによりレーザー光の繰り返しを10Hz以下に下げ、光膨張に最適な露光条件を決定することを試みている。前年度に引き続き、超短光露光によるカルコゲナイド系非晶質半導体の光加工法を確立するため、As_2S_3ガラス試料に対して透明域の波長(800nm)をもつフェムト秒Ti-サファイアーレーザー光(パルス幅約100fs)照射を照射し、試料表面の変化をレーザ一顕微鏡により観察した。前年度は、Ti-サファイアーレーザー光の2光子吸収過程により光膨張を効率よく誘起できることを実証した。本年度は、は、光励起の際に同時に発生する熱の蓄積による表面の損傷を避け、光膨張を増強することを目指して、レーザー光の繰り返しを1kHzから10Hzに下げ、照射強度1200μW、時間161024s、スポット径620μmなどの種々の条件で露光を行った。その結果、以下のことが明らかとなった。照射強度が43μW以上では損傷を受け、露光域は孔となる。一方、8μW以下では、露光域に光膨張を検出できない。積算線量23J/cm^2に損傷の閾値が存在する。このときのレーザー光の侵入長を前年度求めた2光子吸収パラメーターから見積もると0.2mm程度となる。光エネルギーが集中した表面近傍は、ガラス軟化点付近まで温度上昇し、熱膨張率は0.4%に達する。これが、同程度の膨張率をもつ光膨張と重畳した結果、損傷をもたらすものと推測される。従って、超短光露光による光加工はこの損傷閾値に注意を払う必要がある。
中エネルギー領域大角・単回衝突におけるエネルギー損失・荷電変換過程の研究

中エネルギー領域での大角・単回散乱における荷電変換、非弾性エネルギー損失及びスペクトル形状の統一的理解は、イオン散乱による固体表面の構造・ダイナミクス解析に必要不可欠である。しかしながら、ガス標的を使った原子衝突実験では、標的密度と弾性散乱断面積が非常に小さいため、実際の測定は困難であった。本研究は、清浄な単結晶固体表面を用い、大角・単回散乱における荷電変換、非弾性エネルギー損失及びスペクトル形状を高分解能トロイダル分析器で測定・解析したものである。本研究で使用したトロイダル分析器はΔE/E=9×10^<-4>という優れた分解能を有し、1原子層の深さ分解能を持つ。単結晶試料として、B-type-N1S12(111),MgO(001),KI(001),S1(111)・√<3>×√<3>-Sbを、アモルファス試料としてSi0_2、Hf0_2膜を使用した。本研究で明らかにしたのは以下の5点である。(1)中エネルギーHeイオンに対する大角・単回散乱後の電荷分布は一般に非平衡で、原子番号の小さな標的原子(Z_2 20)ほど平均電荷は大きくなる。また原子番号の大きな標的原子に対しては、平均電荷はMarion-Youngの半実験式にほぼ等しくなる(±20%)。(2)Heの平均電荷は、散乱軌道に沿って、電子密度と滞在時間の積を積分した量でスケーリングすることが出来る。(3)最表面原子に散乱されたHe、Neイオンの平均電荷は出射角依存性を示し、出射角(結晶面から測って)が小さいほど平均電荷は小さくなり平衡電荷分布に近づく。(4)S1(111)-√<3>×√<3>-SbのSb原子から散乱されたHeの単回散乱での非弾性エネルギー損失を測定した。得られた結果は、Schiwietzの理論計算と一致。スペクトル形状は低エネルギー側にTailをもち、非対称GaussianまたはGaussian-Lorentzian型となる。(5)Neなどの重イオンがHigh-Z原子に大角散乱される場合、分子軌道形成による電子密度分希の変化により散乱断面積は増大し、従来の遮蔽Coulomb Potentialの修正が必要。我々は先に、中エネルギーHeイオン入射、高分解能静電型スペクトロメータを使用したアモルファス媒質からの後方散乱スペクトルにおいて、異常表面ピークを観測した。これは、表面近傍で大角・単回衝突したHeイオンのHe^+ Fractionが、非平衡電荷分布を反映して大きくなることに由来する(Y. Kido et al.,Phys. Rev. Lett.82 (1999)3352)。この素過程をより明確に捕らえるために、単結晶固体表面に対して、ダブル・アラインメント条件を設定し、擬似大角、単回衝突下の荷電変換過程を調べた。入射HeイオンのEnergyは30-100keV、用いた単結晶は、A-type NiSi_2(111)、MgO(001)、KI(001)である。

こうして、He^+とHe^<2+> Fractionsのエネルギー依存性、及び標的原子番号依存性を測定した(Y. Kido et al.,Phys. Rev. B64(2001)193403-1)。He^+、He^<2+> Fractionとも標的原子番号(Z_2)が小さいほど大きく、Z_2が^<28>Niより大きくなると一定となり、Marion-Youngの平衡電荷分布にほぼ一致した。このZ_2依存性は、大角散乱後、He^+の電子捕獲断面積がその出射軌道に沿って、通過する場所その電子密度と滞在時間に比例するとする簡単なモデルで説明できることを明らかにした(Submitted to Surf. Sci.)。中・低エネルギーイオン散乱分析において、単一・大角散乱における荷電変換、非弾性エネルギー損失、散乱後のスペクトル形状は、分析精度の向上とその可能性を広げる意味で極めて重要である。ガス標的を使った散乱実験では、標的密度が非常に小さく、十分な収量を確保するためには、測定は小角散乱に限定される。我々は、表面再構成のない単結晶清浄表面(MgO(001)、NiSi_2(111)、KI(001)等)を用い、チャネリング入射-Blocking出射のダブルアラインメント条件を設定することにより、擬単回・大角散乱の測定を可能にした。また、特に、Si(111)-√<3>×√<3>-Sbを形成し、Sbからの単回・大角散乱による非弾性エネルギー損失及びスペクトル形状を調べた。結果は、Grande-Sciwietz達による衝突径数に依存した理論計算値と比較的よく一致した。スペクトル形状は、非対称Gaussian型で近似は可能であるが、出射角が小さく(表面に対して)なるとズレてくるので、さらに系統的に調べてみる必要がある。いずれにしても、単一・大角散乱における荷電変換、非弾性エネルギー損失は、理論的には計算が非常に難しく、系統的なデータ収集が強く望まれている。今後、Energy領域を広げ、対象原子も軽原子まで広げて何らかのScaling則を見出したいと考えている。なお、本研究に関連した発表は、国際会議発表2件、国内会議3件、論文2編(Surface Science, PhysicalReviewA)である。中エネルギー領域Heイオン入射、大角・単回散乱における非弾性エネルギー損失及びスペクトル形状のエネルギー及び散乱角依存性を、Si(111)-√<3>×√<3>-Sbを用いて調べた。最表面Sb原子に大角・単回散乱されたHeイオンの非弾性エネルギー損失値は、Schiwietzの理論計算値と一致した。そのスペクトル形状は、内殻電子励起に起因して低エネルギー側にTailをもち、非対称GaussianまたはGaussian-Lorentzian型となる。その形と幅に関して、Universalな関係式を与えることが今後の課題である。以上の研究に加え、中エネルギーHe及びNeイオン入射での弾性散乱断面積の絶対測定を行った。その結果、軽イオンHeに対しては、ZBL及びHatree-Fock (HF) Modelから求めた遮蔽Coulomb Potential (He^<2+>仮定)による計算値と一致した。しかしながら、重イオンNeがHigh-ZのHfやSb原子に大角散乱される場合、散乱断面積は上記遮蔽Coulomb場(Ne^<10+>仮定)による計算値よりかなり大きくなった。これは、衝突時の分子軌道形成による電子密度分布の変化によって散乱軌道が変化し、結果的に電子の遮蔽効果が減少して、散乱断面積が増大することが分極モデルより定量的に示された。
スキー滑走のシミュレーション法の開発

平成910年度の研究により下記の成果が得られた。3.シミュレーション結果と滑走実験結果は定性的には良く一致する事が明らかになった。スキーロボットを用いた滑走実験結果を参考にして,信頼性のあるスキー滑走のシミュレーション法を開発することが本研究の目的である.平成9年度に行った研究の概要および得られた結果は下記の通りである.1)スキーヤーの身体各部の動作がスキーターンに及ぼす影響を検討できるようにスキー操作モデルを改良した.実際に,スキーヤー各部の基本的な動きは画像解析装置(平成9年度購入設備)により測定し,そのデータを用いてシミュレーションを行い良好な結果を得た.2)足の上下運動によりエッジング動作を行うロボットを開発した.また,スキー滑走時のスキー板に生じるひずみ測定用増幅回路を製作した.さらに,実際のスキー板に近い形状(厚さ分布とサイドカット)のスキー板を製作し実験に用いた.3)滑走実験を行った(平成9年度購入設備である画像解析装置を使用)結果,次の2点は定性的にシミュレーション結果と一致した.a)シューセンターの位置をテ-ル側に移動すればスキー板の回転は大きくなり,トップ側に移動すれば小さくなるが,スキーターンの軌跡はほとんど変化しない.b)スキー板の曲げ剛性が小さければスキーターンの軌跡は小回りとなり,大きければ大回りとなる.上記1)の結果は′′Effects of Skier′s Ski Control on Skiing′′と題して,上記2)の一部および3)のa)の結果は′′Development of Skiing Robot and Its Application to Skiing′′と題して,いずれも平成10年2月2日に開催された国際会議International Meeting of Sports Science, Commemorating the 1998 Winter Olympics in Naganoで発表した.平成10年度は1)平成9年度に得られた結果を論文にまとめる,2)スキーヤーに作用する遠心力等を考慮出来るようにシミュレーション法を改良する,および3)スキー板の長さおよび幅のスキーターンに及ぼす影響を明らかにする,予定である.本研究の目的は、スキー板と雪面の連成運動を考慮したスキー滑走のシミュレーション法を開発することである。平成9年度に引き続き研究を行った結果、平成10年度は下記の研究成果が得られた。1)前年度までの二本足スキーに加えて、一本足スキーを開発した。一本足スキーの開発により、スキー滑走の実験結果と数値計算結果との定量的な比較が容易となる(比較検討は次年度以降の研究課題である)。2)厚さおよびサイドカーブを変化させたスキー板を多数製作した。これらのスキー板の中心線から偏心させた位置に重りをのせることにより、ねじりモーメントを作用させたスキー滑走系(一本足スキーに相当)を用いて滑走実験を行った(平成9年度購入設備である画像解析装置を使用)。その結果、下記の事項が明らかになった。a)スキー板が短くなっても、スキーターン軌跡の曲率半径は変化しないが、スキー板は良く回転する。b)スキー板のウエスト幅を一定にし、ショルダー幅およびヒール幅を大きくした場合には、スキーターン軌跡の曲率半径は大きく(ターンは大回りと)なる。c)スキー板の曲げ剛性が小さくなればスキーターン軌跡の曲率半径は小さく(ターンは小回りと)なる。これらの結果は既に発表済みの数値計算結果とも良く一致した(「スキーターンに及ぼすスキー板の形状と機械特性の影響」と題して、日本機械学会東海支部第48期総会講演会(平成11年3月20日)にて発表)。3)前年度までに開発したスキー滑走のシミュレーション法を整理し、"Simulation of a ski turn"と題して、イギリスでの国際学会"The 2nd International Conference on The Engineering of Sport(July 15,1998)"にて発表した。4)前年度までに開発したスキー滑走のシミュレーション法に改良を加え、スキーヤーに作用する遠心力の影響を考慮できるスキー滑走のシミュレーション法を開発した(「スキーターンに及ぼす遠心力の影響」と題して、日本機械学会主催「D&D CONFERENCE '99(平成11年3月16日)」にて発表)。
網羅的発現解析を応用した膠原病の疾患関連パスウェイおよびｌｎｃＲＮＡの探索

ANCA関連血管炎(AAV)や全身性エリテマトーデス(SLE)は遺伝要因と環境要因により発症に至る多因子疾患であり、まだ未同定の疾患感受性遺伝子が多数存在する。本研究では、AAVおよびSLEを対象とした発現解析による発現変動遺伝子の検出、さらに、検出された遺伝子の発現を変化させうるSNPを候補とした疾患関連研究により、新規SLE・AAV疾患感受性関連遺伝子の同定を試みた。AAV群、SLE群と健常群でlncRNAの発現レベルを比較したところ、健常群との比較において、AAVで20個、SLEで25個のlncRNAで発現変動(|Fold change| > 2、補正後P値<0.01)が認められた。これらのlncRNAについて、データベース解析により発現と関連するSNP (eQTL SNP)および発現制御領域に位置するSNPを各疾患について96個選択し、AAVおよびSLE疾患感受性との関連を調べた。lncRNA ATP6V0E2-AS1の発現は、顕微鏡的多発血管炎(MPA)群において有意に低下していた(Fold change -4.4)。さらに疾患関連研究では、ATP6V0E2-AS1遺伝子の近傍に位置し、遺伝子発現制御領域に位置するSNPにおいて、MPA(補正後P=0.010、オッズ比1.36)およびMPO-ANCA陽性血管炎(補正後P=0.0029、オッズ比1.41)との有意な関連が検出された。一方、SLEにおいては、lncRNA関連SNPとの有意な関連は検出されなかった。マイクロアレイを用いた末梢血の網羅的トランスクリプトーム解析および疾患関連研究により、全身性エリテマトーデス(SLE)、ANCA関連血管炎(AAV)と関連する遺伝子の探索を行っている。1.パスウェイ解析SLEでは、末梢血のトランスクリプトーム解析において、インターフェロン誘導遺伝子群の発現増加(IFN signature)が複数の研究により報告されている。本研究では、IFN signature遺伝子発現とSLEおよびAAVの関連について解析した。SLEおよび顕微鏡的多発血管炎(MPA)において、IFN signature遺伝子群の発現増加が観察された。さらにSLE、MPA間でIFN signature遺伝子発現パターンに相違があることが示唆された。2.関連研究免疫応答に関わるETS1遺伝子は、アジア人集団を対象としたゲノムワイド関連研究によりSLEとの関連が報告されている。末梢血におけるETS1遺伝子の発現とAAVとの関連を調べたところ、AAVにおいてETS1発現量の減少が認められた。そこでSLEの疾患感受性多型であるrs1128334とAAVとの関連について検討した。多発血管炎性肉芽腫症(GPA)およびPR3-ANCA陽性血管炎において、SLEのリスクアリルであるrs1128334 Aの有意な増加が観察された。またMPO-ANCA陽性血管炎でもAアリルの増加傾向が認められた。rs1128334はETS1遺伝子の3'非翻訳領域に位置し、AアリルがETS1遺伝子の発現低下と関連することが報告されている。本研究の結果により、ETS1の発現低下がAAVと関連する可能性が示唆された。疾患特異的パスウェイの検出が難しく、個々のパスウェイ関連遺伝子の解析まで至らなかった。SLEでは、インターフェロン(IFN)誘導遺伝子の発現増加が報告されており、われわれのデータにおいても確認されている。一方AAV関連パスウェイは未だ同定されていない。パスウェイ解析ソフトIngenuity Pathway AnalysisにてAAVのパスウェイ解析を行ったところ、T細胞シグナルに関わるパスウェイが複数検出された。一部のlncRNAにおいて免疫系への寄与が示唆されていることから、lncRNAとSLE、AAVの関連について解析を進めている。lncRNAの発現データを用いてクラスター解析を行ったところ、SLE、AAV、健常者で異なるクラスターに分かれた。このことからlncRNAがSLE、AAVと関連することが示唆された。発現変動が認められたlncRNA (fold change│2│以上,補正後P<0.01)は、SLEでは増加25個、減少63個、AAVでは増加33個、減少24個であった。SLE、AAVで共通していたlncRNAは、増加が6個、減少が1個であった。これらの発現変動lncRNAのSLE、AAV疾患感受性への寄与を調べるために、lncRNAの発現と関連するeQTL SNPおよびlncRNA近傍の転写調節領域に位置するSNPを対象とした疾患関連研究を施行することとした。SLEでは25個、AAVでは20個のlncRNAから各疾患96個のSNPを選択した。現在、これらのSNPと疾患との関連を解析中である。関連解析を行う候補SNPの選択に時間を要した。またSNPタイピングに用いるプライマー、プローブの設計に時間がかかった。これらの理由により、29年度内にSLE、AAV関連SNPの検出まで至らなかった。

AAV群、SLE群と健常群でlncRNAの発現レベルを比較したところ、健常群との比較において、AAVで20個、SLEで25個のlncRNAで発現変動(|Fold change| > 2、補正後P値<0.01)が認められた。これらのlncRNAについて、データベース解析により発現と関連するSNP (eQTL SNP)および発現制御領域に位置するSNPを各疾患について96個選択し、AAVおよびSLE疾患感受性との関連を調べた。lncRNA ATP6V0E2-AS1の発現は、顕微鏡的多発血管炎(MPA)群において有意に低下していた(Fold change -4.4)。さらに疾患関連研究では、ATP6V0E2-AS1遺伝子の近傍に位置し、遺伝子発現制御領域に位置するSNPにおいて、MPA(補正後P=0.010、オッズ比1.36)およびMPO-ANCA陽性血管炎(補正後P=0.0029、オッズ比1.41)との有意な関連が検出された。一方、SLEにおいては、lncRNA関連SNPとの有意な関連は検出されなかった。前年度に引き続き、マイクロアレイ発現データを用いて疾患関連パスウェイの検出を試みる。さらに疾患群で増加あるいは減少しているlncRNAや機能的重要性が示唆される遺伝子に着目して解析を進めていく。RT-PCRにより関連の確認も行う。発現解析により疾患との関連が示唆された遺伝子が、SLE、AAVの疾患感受性と関連するか否かを疾患関連研究により調べる。関連解析では、SLE約900例、AAV約500例、健常対照群約850例を対象とする。現在、DigiTag法によりSLE 388例、AAV 453例のlncRNA 96SNPの遺伝子型タイピングを施行中である。タイピング終了後、関連解析により疾患関連SNPの検出を行う。見出された関連SNPについて、SLE 450例、健常対照群850例の遺伝子型タイピングを行い、関連の確認を行う。AAVについては、現在追加サンプルを収集中であり、サンプルが集まり次第、SLEと同様にreplication studyを行う。さらに関連が確認されたSNP周辺領域のfine mappingを行い、一義的なSLE、AAV疾患感受性SNPの同定を試みる。パスウェイ解析を受託解析で行う予定であったが、フリーのソフトを用いて解析を行ったため残額が生じた。(理由)29年度は、各疾患96SNPの解析を終え、関連が見出されたSNPについて独立のサンプルを用いてreplication studyを行う予定であったが、replication studyまで到達しなかったため残額が生じた。発現解析、SNPタイピングに予算を使用する。必要に応じて次世代シークエンシング解析を行う。