hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子修復治療を可能にする正確なゲノム編集技術の開発

CRISPR/Cas9によるゲノム編集には、相同組換え(HR)、非相同性末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)などがある。このうち、HRは、正確で自在なゲノム編集を達成するために非常に有益であるが、その頻度はNHEJやMMEJに比べて極めて低い場合が多い。前年度までに、eSpCas9(1.1)とSpCas9-HF1という改変型Cas9がHR活性を亢進することを見出していたが、今年度はさらに新たに報告されたHypaCas9という改変型Cas9のHR活性を検討した。その結果、eSpCas9(1.1)やSpCas9-HF1よりも効率よくHRを誘導し、NHEJ/MMEJを抑制することが明らかとなった。また、これまで一塩基置換の導入効率を用いてHR活性を評価していたが、改変したCas9が数千塩基のDNA断片のノックイン効率も同様に向上させるかを検討した。ノックインには野生型Cas9、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、HypaCas9を用いた。その結果、改変型Cas9ではノックインの際に生じるNHEJ/MMEJ頻度も低下する傾向が認められた。また、ノックイン効率をピューロマイシン耐性の獲得頻度として評価したところ、改変型Cas9では、野生型Cas9よりも高い頻度で耐性を獲得し、ノックイン効率も向上することが明らかとなった。検討した3種類の改変型Cas9のうち、数千塩基のDNA断片のノックインでもHypaCas9が最もNHEJ/MMEJ活性の抑制とHR活性の向上に有効であることが明らかとなった。HypaCas9が新たなCas9改変体として、一塩基置換だけでなく、ノックインにおいてもHR活性を高め、NHEJ/MMEJ活性の抑制に有効であることが明らかになった。また、これまでに得られた結果を論文として発表することができた(Kato-Inui, NucleicAcids Research 2018)。これらの改変は、生体内ゲノム編集に有用な小型のCas9であるSaCas9に有効であると予想されるため。これまでに得られた、HR頻度を向上させ、NHEJ/MMEJ頻度を抑制するためのアプローチを複合的にSaCas9に適用し、正確なゲノム編集を誘導可能な小型のSaCas9を作製し、生体内ゲノム編集に向けて準備を進める。また、ウィルソン病患者由来iPS細胞のATP7B遺伝子の変異の修正も、改良したCRISPR/Cas9のゲノム編集条件を駆使して実施する。CRISPR/Cas9は、標的配列特異的なgRNAにヌクレアーゼであるCas9が誘導され、標的ゲノムDNAが切断される。切断されたDNA修復反応には、相同組換え(HR)、非相同性末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)などがある。このうち、組換えを介してドナーDNA配列通りに編集が起こるHRは、正確で自在なゲノム編集を達成するために非常に有益である。しかし、その頻度はNHEJやMMEJに比べて極めて低い場合が多い。我々は、改変したCas9やgRNAの使用が、HR頻度を亢進することを見出していたが、今年度はその特性についてさらに詳細な解析を進めた。まず、改変型Cas9として既に報告のあるeSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1に、DNAとの相互作用を変化させる変異を追加で導入した改変体、さらに、いくつかの変異を修正した改変体も作製し、DNAとの相互作用様式の変化強度を調節した一連の改変体シリーズの活性を検討した。

また、gRNAについても標準より長いものと短いもの、さらにグアニンだけでなく他のヌクレオチドを追加したものを作製し、これらのgRNAシリーズの活性を検討した。その結果、HR活性を亢進し、NHEJ/MMEJ活性を抑制するには、至適な標的ゲノムDNAとCas9-gRNA複合体の相互作用強度が存在することが明らかとなった。正確なゲノム編集を達成するためには、HR頻度を高め、NHEJ/MMEJ頻度を抑制する必要がある。今年度に得られた、HR活性を亢進し、NHEJ/MMEJ活性を抑制するために、至適なゲノムDNAとCas9-gRNA複合体の相互作用強度が存在するという発見は、今後のさらなるCRISPR/Cas9ゲノム編集技術の発展に有益であると考えられるため。これまでに得られた、HR頻度を向上させ、NHEJ/MMEJ頻度を抑制するためのアプローチを複合的にSaCas9に適用し、正確なゲノム編集を誘導可能な小型のSaCas9を作製し、生体内ゲノム編集に向けて準備を進める。また、ウィルソン病患者由来iPS細胞のATP7B遺伝子の変異の修正も、改良したCRISPR/Cas9のゲノム編集条件を駆使して実施する。改変型Cas9やgRNAの利用に加えて、ゲノムDNA修復因子とCas9の融合などの様々なアプローチによって、さらにHR頻度の向上とNHEJ/MMEJ頻度の抑制を目指す。Cas9-gRNA複合体のゲノムDNAへの結合様式の相違が、HR活性とNHEJ/MMEJ活性のバランスを変化させる分子機構の解明を目指し、得られた知見をさらなる改良につなげる。また、得られた知見をCas9だけでなく、Cas9 nickaseにも応用する。
NO合成酸素の反応機構の解析

前年NO合成酵素の精製および性質の検討を目的として1)酵素活性の簡便かつ確実な測定法の確立2)牛脳より酵素の精製を試みた。活性の測定は、トリチュウムラベルしたアルギニンを用い、生成したシツルリンをTLCで分離し、液体シンチレーションカウンターで測定した。今まで報告されているカラムを用いる方法よりずっと簡便かつ確実な方法であった(発表予定)。酵素精製については、活性が著しく低く、部分精製したもののその性質をを検討するには十分な量が得られなかった。酵素そのものの含量が低いか酵素が著しく不安定なため、脳摘出のための時間中に失活したものと思われる。ラット小脳は約百倍ほど活性が高く精製も可能であったが、材料を大量に得るのは経済的に現在の研究費では不十分であった。そこで、本年度はcDNA発現系を用いて酵素の発現をこころみた。全長をコードしたcDNAをtaqプロモターをふくむベクターに組み込みE.coliにて発現させたところ、ウエスタンブロットで酵素たんぱく質の発現が確認され、十分な量の発現がみられたものの殆どが不溶性たんぱく質であった。上清の活性を測定したところ、NADPH diaphoraseをふくめ、活性は見られなかった。そこで、cDNAの一部をコードしたドメイン部分のcDNAを同様の系で発現させたが結果は同様であった。現在それぞれのcDNAにつきバキュロウイルスに組み込み発現を試みている。NO合成酵素は脳型、マクロファジ型、内皮型の三種が知られ、それぞれ精製され、その一次構造は知られている。それぞれ生理的には、非常に重要な役割が知られ注目されている酵素である。又それぞれFAD、FMN、P-450型ヘム、ビオプテリン、カルモジュリンをもつ複雑な酵素であり、反応機構、調節機構も興味がもたれている。その内脳型はカルモジュリンとの結合が比較的弱いため、酵素反応にはこの物質を加える必要があるため、カルモジュリン依存型といわれ、その他は、否依存型として分類されている。しかし酵素が不安定であり、含量も少ないため、大量の精製酵素が得難く、それぞれ補欠分子族の役割と反応機構の詳細は十分わかっていない。今回、酵素反応機構を検討するに値する量の脳型酵素の大量精製を試みた。又同時に簡便な活性測法がないため、一年目は酵素測定法の簡便かつ、高感度の方法を確立した。^<14>C-アルギニンを基質として反応后生成物をTLCにて展開し、イメージアナライザーでシツルリンの放射活性を測定し、多数の反応組成液を同時に効率よく測定する方法を確立した。又今まで行われて来たネズミ脳からの精製方法を改良し牛脳から高収率で得られる方法を検討した。酵素は極めて不安定であり、3時間4°Cで約半分に失活する。それは蛋白分解によるより別の要因である事をウエスタンブロットの解析は示していた。そのため、安定化させるため種々の条件検討を行い、殆ど失活しない組成液が検討できた。それを利用し、酵素の精製を行い、300μgの高比活性の酵素が得られるようになった。今まで難しい点を改良したため、時間と労力を費やしたが、今回后の解析が可能となる大きな進歩が得られた。一方全長をコードしたCDNAの発現をE.Coliで試みたが、蛋白は出来ているものの、活性はなかった。しかし、発現蛋白を用いて多量の抗体を作製することがで来た。近年、生体に於いて、血管拡張作用の媒体として、また、神経細胞では、cGMPを上昇させる場合のメッセンジャーとして、NOが発見され、注目されてきた。続いてNO合成酵素が発見され、アルギニンのグアニド基のN2より、合成されることも明らかにされている。現在、酵素の精製も行われているが、不安定であることと量が少ないため、性質の同定は、はっきりしていない。従って、NO合成酵素を大量に精製する目的で、牛脳より精製を試みた。

既に、報告されているAMPアフィニティークロマトグラフィーを含む方法に基づいたが、蛋白化学的には適するが反応機構を検討するには酵素が不安定であり、とくに精製度が進むと失活が著しく、BSA等による安定化もできなかった。現在生体中に安定化させる因子が有るか検討中である。また、酵素活性を測定するのに、生成物であるシツルリンを、プレラベルし、HPLC法による分離定量に基づく簡易測定法を現在検討中である。今後は、大量精製の方法としては、酵素のcDNAを譲受け、(国立ガンセンター江角博士より)バキロウイルス-昆虫培養細胞系で発現させ精製する。その酵素を用いて、補欠分子族の定量、スペクトル上の性質、補欠分子族(FMN,FAD)間の酸化還元電位の高低を嫌気的条件で滴定してもとめる。又、カルモジュリンがこの酵素の反応を調節している事が知られている。従って、カルモジュリン存在下でフラビンの酸化還元電位がどう変化するか、吸収スペクトルがどう変化するかを検討する。ストップドフロー法にて基質NADPHによる酵素の還元反応をフラビンの吸収変化で追跡し素反応を明らかにする。また、予め、ヂチオナイトで還元した酵素とアルギニンとの酸化反応速度の解析を行う。以上をもとに、NO合成酵素の反応機構を明らかにする。
MRエラストグラフィーによる臓器硬度測定：慢性腎疾患および慢性膵炎への臨床応用

現行の肝MRエラストグラフィー機を応用し膵MRエラストグラフィーを試みた。使用機器は3.0T臨床機、外部Driverを上腹部正中へ固定し、外部振動周波数を60Hz,と40Hzで撮像した。結果、60Hzにおいては硬度測定不能例が多く、実用は困難と考えられた。40Hzでは測定不能例は有意に少なく、測定可能面積も大きかった。また、40Hzにおいてのみ、慢性膵炎症例で有意に膵実質の硬度が高値であった。未だ解決すべき技術的問題はあるものの臨床応用の可能性は見いだすことができた。なお、腎に関してはボラテイアでMREを試みたが、本システムでは十分な画質が得られなかったため、今回は膵のみを対象とした。研究初年度にはまず膵におけるMRエラストグラフィ(MRE)の撮像パラメータの決定から行った。肝の硬度測定に際して種々のパラメータを検討した既報のデータ(JpJR、2014 in press)をもとに、膵に適した撮像条件を下記のように選定した。この条件の下、膵病変を疑われてMR胆管膵管撮影(MRCP)が撮像された19名の患者にMREを施行した。全19例でMREは施行可能であった。うち胆道結石もしくは感染疑い7名、膵嚢胞性病変7名、慢性膵炎3名であった。前二者の膵実質の硬度は2.0±0.47kPa,慢性膵炎患者では3.3 ±0.1 kPaであり有意差をもって後者が髙値を示した(p<0.05, unpaired t-test)。今回の検討で膵MREは実行可能であり、膵炎患者では硬度が上がることを示しうる可能性が示唆された。しかしながら測定可能面積は十分とは言えずさらなる設定条件の改善が望まれる。近年発表の論文(JMRI 2015;31:369-75)によると、1.5T機において膵専用の新たに作成した外部振動passive driverを用い、3mm厚の2DEPIで50スライス、6回の息止め(15s)に分けて撮像したデータを3次元MREインバージョンアルゴリズムで解析、MEG70Hzとした結果、外部周波数は肝に用いる60Hzよりも40Hzのほうが適するとの報告であった。我々の現有のハードウェアでは、3.0T、外部振動passive driverは肝専用に販売されている商品、インバージョンアルゴリズムは2次元MSDI法、という制約があり、この状況下で上記内容を追試することとし、外部振動周波数/MEG=60Hz/80Hz(現肝MREと同じ条件)、40Hz/80Hzの2者で比較した。膵の硬度が評価可能であった例数と、膵の面積に対して何%が測定可能だったかを指標として38例の膵MRCP施行患者において比較した。その結果:1測定可能例60Hz 24/38、40Hz 37/38 (p<0.001、カイ二乗検定)2測定可能面積比60Hz 25±29%、40Hz 76±25% (p<0.001, paired t-test)即ち我々の結果でも外部周波数40Hzのほうが60Hzよりも優れることを追試することができた。使用機器は3.0T臨床kRI(Discovery 750W、GE)、外部Driverを通常の肝とは異なり、上腹部正中へ変更固定し、パラメータとして外部振動周波数を60Hz(肝臓と同じ、TR/TE=1000/59),と40Hz(TR/TE=1000/71)で撮像した。他のパラメータは両者ともにMEG 80Hz、位相offset数:4(0, π/2, π, 3/2*π)、MSG 17.6mT/mで撮像した。対象は38 pts (M:F=18:20;年齢26-86, 66 ±15)臨床診断はIPMN(または膵嚢胞)17、胆道結石5、慢性膵炎3、急性膵炎2、膵腫瘍(疑)3、胆嚢炎3、その他5であった。結果、測定不能例は、60Hz:14/38(37%)、40Hz: 1/38(3%)であり、測定可能面積比は60Hz: 25 ±29%、40Hz: 76 ±25%といずれも40Hzのほうが優れていた。一方測定値は(体尾部38例、頭部5例)60Hz:3.6 ±0.9% CV 0.25 40Hz:2.0 ±0.4% CV 0.2と40Hzのほうが有意に低値かつばらつきの少ない結果となった。測定可能例ではほとんどで波の伝搬は左背側から腹側へ向かう方向に見られた。即ち、外部周波数60Hzにおいては硬度測定不能例が多く、実用は困難と考えられた。疾患群間の比較では60Hzを用いた硬度では有意差は認めなかったが、40Hzにおいてのみ慢性膵炎症例で有意に膵実質の硬度が高値であった。波の伝搬など未だ解決すべき問題は少なからずあるものの臨床応用の可能性は見いだすことができた。なお、腎に関してはボランテイアで種々の方法でMREを撮像することを試みたが、本システムでは十分な画質が得られなかったため、膵のみを今回は対象とした。

現行の肝MRエラストグラフィー機を応用し膵MRエラストグラフィーを試みた。使用機器は3.0T臨床機、外部Driverを上腹部正中へ固定し、外部振動周波数を60Hz,と40Hzで撮像した。結果、60Hzにおいては硬度測定不能例が多く、実用は困難と考えられた。40Hzでは測定不能例は有意に少なく、測定可能面積も大きかった。また、40Hzにおいてのみ、慢性膵炎症例で有意に膵実質の硬度が高値であった。未だ解決すべき技術的問題はあるものの臨床応用の可能性は見いだすことができた。なお、腎に関してはボラテイアでMREを試みたが、本システムでは十分な画質が得られなかったため、今回は膵のみを対象とした。近年発表された膵に特化したMREシステムに比べ、我々の肝MRE用製品のパラメータを一部改変したシステムでもほぼ同様な結果が追試できた。ある程度の膵硬度の推定には役立つと考えられた。腹部画像診断、IVR上記のパラメータ設定のシステムを用いてより多数の膵疾患症例を測定し、その硬度測定のもつ有用性を明らかにする。本研究が膵に対して実行可能であり、一応の成果を示すことはできたが、まだ撮像条件の最適化が十分でないと考えられるため。撮像条件の最適化のさらなる検討を続けるとともに、それが明らかになるまでは現状の撮像条件でn数を増やし、本条件による膵MREの可能性と限界を明らかにする。
国際環境法上の予防アプローチに基づく海洋科学調査の規律の研究

本研究は、国際環境法上の予防アプローチ(precautionary approach)の発展が、海洋の科学調査活動に対する規律にいかなる影響を与えつつあるのか、解明することを目的とする。研究期間の1年目である2018年度においては、海洋環境分野における科学調査の予防的規律の展開について、主に商業目的の活動に対する規律との関係に着目しながら調査を進めた。第1に、本研究の予備的調査として、海洋科学調査の国際法上の規律全般に関わる先行研究の調査を行い、環境保護の観点からの規律の位置付けや、問題とされてきた論点等の把握に努めた。第2に、漁業分野や汚染分野の個別の条約体制(南極生物資源保存条約やロンドン海洋投棄条約、北東大西洋海洋環境保護条約等)においての、環境法規範による海洋科学調査活動の規律の現状の調査を遂行した。これらの研究により、海洋科学調査に関する活動についても、その類型を問わず、予防アプローチを含む国際環境法規範の規律の対象となる点については、学説上も国家実行上も争いがなくなりつつあることを確認するとももに、例えば海洋肥沃化活動の場合のように、予防アプローチの下では、科学調査目的の場合に限って活動を許容するなど、商業目的の場合との規制上の区別がより先鋭化する傾向があり、またそれゆえに科学調査概念自体の明確化が一層の課題となっている点等について知見を得ることができた。以上のように2018年度においては、本研究の予備的・基礎的な研究作業を遂行した。特に漁業分野・汚染分野の条約体制の調査については、検討すべき条約機関の採択文書等が多く、また現在進行形の発展状況も追う必要があるといった事情から、主要な条約体制下の実践に関する調査に想定以上に時間がかかってしまい、まだ十分調査が及んでいない条約体制が残っている。研究代表者が所属している研究会等の機会や人脈を最大限活用し、関連分野の専門家との意見交換等を通じて、さらに効率的に研究作業を遂行するよう努めたい。また2019年度後期より研究期間を取得する予定であり、その期間を利用して遅れを取り戻したいと考えている。研究計画の遂行が若干遅れている状況に鑑み、調査出張やインタビュー等の効果をできるだけ高めるため、次年度以降にそれらの実施を延期したことから、次年度使用額が生じている。
異構造マスタスレーブマニピュレータを用いた医療ロボットシステムの開発

ロボットを用いた制御技術により、遠隔地における触覚の再現を行う研究が数例報告されている。そのほとんどが同じ構造のロボット2台を用いた物である。しかしながら実際の現場では作業効率向上のため構造が異なることが多い。本研究では構造が異なるロボット間での触覚の再現を可能とする手法を開発する。1自由度鉗子ロボットと3自由度ロボットの間で、触覚を再現することでその有効性を確認している。検証実験により、構造が異なるロボット間でも触覚を伝達できることを確認した。マスタスレーブマニピュレータを用いたバイラテラル制御技術により遠隔地における触覚の再現を行う研究も数例報告されている。しかしそのほとんどが同構造のマニピュレータ2台を用いた物である。しかしながら実際の現揚で用いられるマニピュレータは作業効率向上のため人間が操作を行う側(マスタ)と、作業を行う側(スレーブ)の構造が異なる場合が多く、また行う作業によって作業側のツールは変更があるため、スレーブマニピュレータの構造は様々な形を取る。つまり従来までのバイラテラル制御技術では対応できないのである。本研究では異構造のマスタスレーブマニピュレータに対して触覚の再現を可能とする制御系を開発する。提案するバイラテラル制御手法は個々のロボットシステムに構築した制御系に影響を与えずに、異構造のロボットシステムにおいてバイラテラル制御実現する。初年度は1自由度鉗子ロボットの設計・製作を行った。製作したロボットにはアクチュエータとしてリニアモータを採用している。これはリニアモータが摩擦の影響を受けにくく、機械共振を持たない理想的なアクチュエータであるからである。作成した2台のロボットはOSをRT-Linuxとした制御用PCを用いて、バイラテラル制御系を構築しその特性評価を行った。評価実験から、マスタ・スレーブマニピュレータ間の力・位置の一致が確認できており、良好な制御特性が得られている。しかしながら、機構部による非線形摩擦の影響等が多少見られ制御特性に悪影響を与えており、その対策が必要である。しかしながら実際の現場で用いられるマニピュレータは作業効率向上のため人間が操作を行う側(マスタ)と、作業を行う側(スレーブ)の構造が異なる場合が多く、また行う作業によって作業側のツールは変更があるため、スレーブマニピュレータの構造は様々な形を取る。今年度は製作した1自由度鉗子ロボットと、従来より研究代表者の保有する3自由土間乳プレー他との間での異構造バイラテラルアルゴリズムの開発を行った。提案するアルゴリズムは、それぞれのマニピュレータの位置情報と力情報を加速度次元上でやりとりをし、構造の違いをヤコビ行列、逆ヤコビ行列を用いて吸収する物である。提案する手法はシミュレーションにより理論検証を行い、その有効性を確認している。本技術が実現できることにより、様々な形状のロボットシステムに対して、バイラテラルシステムを実現でき、その操作性能を向上することが可能となる。
関節拘縮と創傷治癒、老化、慢性炎症の関連性に着目した新たな疾患概念の検討

関節可動域制限(以下、拘縮)は、理学療法士にとって最も重要な治療対象の1つである。ラット膝関節拘縮モデルを用いて、免疫組織化学的に筋線維芽細胞の出現数を指標に、拘縮と創傷治癒、老化、慢性炎症の関連性を検討することで、関節疾患全般を横断的に理解し、新たな疾患概念の構築を試みる。この研究目的に則った研究は、申請者が検索した限りで、これまで行われていない。
フィリピンでの超高性能地震観測と西太平洋地域グローバル地震観測網の構築

当研究の目的は,(1)西太平洋超高性能地震観測網計画の一環としてフィリピン国に観測システムを設置し,記録の収録と解析を行うこと,(2)フィリピンの地震危険度の推定と地震発生機構・テクトニクの研究を行うことである。以上(1),(2)の順で成果の概要を述べる。(1)超高性能地震計は,平成3年度にフィリピン火山地震研究所のタガイタイ観測点に設置し順調に記録の収録が開始された。記録の解析は現在進められており3カ月以内の報告できるものと思う。地震の収録は,連続収録とトリガー収録の二つの方式を取っている。連続収録は1点1秒,トリガー収録は42点1秒サンプリングを行っている。トリガー記録は,1年で約200点収録されている。現在の問題は,時刻較正と停電対策の2点である。現システムはオメガ電波を用いて時刻較正を行っているが,受信状況等多くの難点を持っている。このため,GPSを用いて時刻較正を行う予定であるが,市販品は高価なため,渋谷(分担者)が手づくりで作製する計画を持っている。停電はフィリピンでの大きな社会問題である。経済的な進展のみられないフィリピンでは,この12年に電力事情が急激に悪化してきた。昼間に5時間程度の停電は普通である。自動車用バッテリーで停電対策を取っているが,長期間の停電を繰返すとバッテリーは回復不可能となる。このため,停電時はファイル書き込みを止め,復電時にも電圧回復まで収録を待つような対策を取る必要がでてきた。これらは,平成5年度5月頃に2名が訪問し実施する予定である。計画立案時や設置の際には予想されなかったことではあるが,発展途上国での研究計画は万全の対策を取る必要があることを示している。(2)地震危険度等フィリピンは,1990年にフィリピン地震が発生し,1991年にピナツボ山が大噴火,1993年1月にはマヨン山が噴火をした。このようにフィリピンはルソン島を中心に地震火山活動が活発になっている。河高性能地震計を置いているタガイタイ観測所はタール火山の外輪山にあり,マグマ性の地震活動の監視も兼ねている。タール火山の近年の地震活動は高く,噴火の可能性が高いと言われている。火山の噴火や災害の防止軽減のためには,噴火規模の推定が必要である。この基礎資料として,マグマ溜りの位置,深さ,規模,および部分溶融面の位置や深さの情報が欠かせない。平成5年2月末から2週間にわたり,人工地震を用いた地殻構造調査が行われた。平成4年12月に研究協力者の西上がフィリピン火山地震研究所の研究者と共に,発破点の選定,地震計の設置点の調査,業者の折衝等を行い,2月末の本調査へ向けての準備を完了させた。深さ50mの発破孔を2本掘削し,200kgのダイナマイトを人工地震源として,地震探査を実施する予定を立てた。発破点はタール湖(カルデラ湖)西岸に置き,観測点を東岸沿いに南北に展開し,扇状放射観測を行った。発破を2度に分けた理由は,収録システムが日本側とフィリピン側と併せて16組しかなく,1回で東岸域に並べると間隔が荒くなり,マグマ溜り検出には適さないことがわかったためである。本調査では,1回目の発破では東岸の北側に,2回目の発破では南側に展開した。これにより32組の収録システムにより地震探査が行われたと同じくなり,かなり詳しい調査が可能となった。日本から8名,フィリピン側から10名の参加があり,かなりハードなスケジュールをこなし調査・観測を成功させることができた。観測点へは陸路から近づくのは難かしく,ボートを用いて観測システムや観測者の輸送を行ったが,観測期間中は風が強く波が荒かったようだが,これらの困難に果敢に立ち向かい実験を成功に導いた。今年度の研究実績をまとめると,(1)超高性能地震計が稼動し,順調に記録が取れ始めたこと,(2)フィリピン国では始めての研究を目的とした人工地震を用いた地震探査が行われたことがあげられる。後者の探査は,フィリピン側に大きな影響を与えると共に,日本側研究者にも種々の困難を乗り越え共同研究を行う重要さを教えてくれた点は貴重であった。平成5年度からも更に発展した形で国際学術研究が行われる予定である。

停電はフィリピンでの大きな社会問題である。経済的な進展のみられないフィリピンでは,この12年に電力事情が急激に悪化してきた。昼間に5時間程度の停電は普通である。自動車用バッテリーで停電対策を取っているが,長期間の停電を繰返すとバッテリーは回復不可能となる。このため,停電時はファイル書き込みを止め,復電時にも電圧回復まで収録を待つような対策を取る必要がでてきた。これらは,平成5年度5月頃に2名が訪問し実施する予定である。計画立案時や設置の際には予想されなかったことではあるが,発展途上国での研究計画は万全の対策を取る必要があることを示している。(2)地震危険度等フィリピンは,1990年にフィリピン地震が発生し,1991年にピナツボ山が大噴火,1993年1月にはマヨン山が噴火をした。このようにフィリピンはルソン島を中心に地震火山活動が活発になっている。河高性能地震計を置いているタガイタイ観測所はタール火山の外輪山にあり,マグマ性の地震活動の監視も兼ねている。タール火山の近年の地震活動は高く,噴火の可能性が高いと言われている。火山の噴火や災害の防止軽減のためには,噴火規模の推定が必要である。この基礎資料として,マグマ溜りの位置,深さ,規模,および部分溶融面の位置や深さの情報が欠かせない。平成5年2月末から2週間にわたり,人工地震を用いた地殻構造調査が行われた。平成4年12月に研究協力者の西上がフィリピン火山地震研究所の研究者と共に,発破点の選定,地震計の設置点の調査,業者の折衝等を行い,2月末の本調査へ向けての準備を完了させた。深さ50mの発破孔を2本掘削し,200kgのダイナマイトを人工地震源として,地震探査を実施する予定を立てた。発破点はタール湖(カルデラ湖)西岸に置き,観測点を東岸沿いに南北に展開し,扇状放射観測を行った。発破を2度に分けた理由は,収録システムが日本側とフィリピン側と併せて16組しかなく,1回で東岸域に並べると間隔が荒くなり,マグマ溜り検出には適さないことがわかったためである。本調査では,1回目の発破では東岸の北側に,2回目の発破では南側に展開した。これにより32組の収録システムにより地震探査が行われたと同じくなり,かなり詳しい調査が可能となった。日本から8名,フィリピン側から10名の参加があり,かなりハードなスケジュールをこなし調査・観測を成功させることができた。観測点へは陸路から近づくのは難かしく,ボートを用いて観測システムや観測者の輸送を行ったが,観測期間中は風が強く波が荒かったようだが,これらの困難に果敢に立ち向かい実験を成功に導いた。今年度の研究実績をまとめると,(1)超高性能地震計が稼動し,順調に記録が取れ始めたこと,(2)フィリピン国では始めての研究を目的とした人工地震を用いた地震探査が行われたことがあげられる。後者の探査は,フィリピン側に大きな影響を与えると共に,日本側研究者にも種々の困難を乗り越え共同研究を行う重要さを教えてくれた点は貴重であった。平成5年度からも更に発展した形で国際学術研究が行われる予定である。本研究は,フィリピン国ルソン島に超高性能地震計を設置し,ここで収録されたデ-タと他の西太平洋地域から得られたデ-タを併せ,世界でももっと造構造運動の激しいこの地域の運動のメカニズムを明きらかにするために立案された。本年度は,この目的達成のために,
植物細胞の成熟への転換をつかさどる転写メカニズムの分子イメージング

生物の正常な成長には厳密に制御された細胞の機能転換が必須である。本研究では根端での細胞機能転換の鍵となるUPB1の下流で働く転写因子MYB50の機能解析を通じて細胞の成熟に関わる細胞機能転換分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。平成29年度に得られた結果より、MYB50の標的遺伝子を4つに絞り込み、それら4つの遺伝子の過剰発現株・プロモーターレポーターを持つ形質転換体を作成した。それぞれが、MYB50の発現部位とよく似た場所で根で発現することがわかった。過剰発現株はT2世代を獲得することができた。MYB50の上流のUPB1の発現を変化させることで、MYB50の下流遺伝子にも影響があるかをタイムコースリアルタイムqPCRにより調べた。その結果、UPB1の発現を薬剤で誘導するとそれに応じて、MYB50の発現が減少すること、かつMYB50下流遺伝子の4つのうち2つが有意に発現が減少することがわかった。この発現変動は薬剤処理の時間依存的であり、UPB1がMYB50の発現を抑制することにより引き起こされていることを証明することができた。これらの一つは細胞壁成分であるペクチンの分解酵素であるペクチンメチルエステラーゼで、もう一つは細胞伸長を制御するシグナルに関わるペプチドをコードする遺伝子である。以上のことから、MYB50が細胞壁組成を根端の伸長領域で変化させ、またペプチドの量を変化させることで、さらに下流にシグナルを伝達して細胞伸長に関わっていることが強く示唆された。同時にMYB50の結合DNA配列をin vitroで決定するために、新規の迅速簡便転写因子結合配列決定法の確立も進めた。この方法により、テストを行なった結合配列が既知の転写因子のDNA結合配列を決定することができ、論文として投稿中である。生物の正常な成長には厳密に制御された細胞機能の転換が必須である。本研究では根端での細胞機能転換に重要な役割を果たすUPB1の下流で働く転写因子MYB50の機能解析から、細胞の成熟に関わる細胞機能転換分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。平成29年度はMYB50誘導発現系を用いたMYB50の支配する転写ネットワークの解析を進めた。エストラジオールによるMYB50の誘導発現を1、3、6時間行い、それぞれからRNAを抽出し、RNAseq解析を行った。その結果エストラジオール3時間処理で105遺伝子、6時間処理で163遺伝子が有意な発現変動を示していた。これらの遺伝子をすでに獲得しているChIPseqデータと統合した。その結果、数十の遺伝子のゲノム領域にMYB50が結合していることがわかった。これらの遺伝子の中で細胞の成熟に関わる遺伝子、特に、細胞壁の形成に関わると考えられる遺伝子4つの発現を、35Sプロモーター下でMYB50を過剰発現させた35S::MYB50株中で調べたところ、顕著な発現変動を示した。また、以前報告しているUPB1のマイクロアレイデータとの比較解析からも、これらがUPB1下流で発現変動を示すこともわかった。以上の結果から、今回抽出した4つの細胞壁合成関連遺伝子が、UPB1からMYB50という転写ネットワークによって制御され、根端の細胞成熟に関わることが強く示唆された。また、根の部位得意的な薬剤処理を施すためのイメージングの条件検討を行った。その結果、エストラジオールは倍地中を拡散し、根端から地上部方向へ吸収されて行くことがわかった。植物の根端からある程度の距離を置いてエストラジオール処理を施すことで、プロモーターの発現の強弱を調節することは可能であった。当初の計画通り、MYB50エストラジオール誘導発現株を用いたタイムコースRNAseq解析を実行できた。このデータセットを解析することにより、MYB50が転写制御を行う下流遺伝子の同定を行うことができた。また、ChIP解析とRNAseqを統合することにより、MYB50のダイレクトターゲットの絞り込みも進めることができた。転写因子の機能解析を進めるに当たり、重要なダイレクトターゲット候補遺伝子群を選抜できたことは、本研究が計画通り順調に進んでいることを示している。また、もう一つの目標であったイメージング法の改良も順調に進んでいる。本実験系で利用している誘導発現株ではエストラジオールを用いている。このエストラジオールの拡散の度合いや、それが根の成長に与える影響を定量化できたことは、今後のイメージング法改良の基盤となると言える。以上、2点の進捗から本課題研究は順調に進んでおり、平成30年度に行う研究の基盤は十分に得られている。

その結果、UPB1の発現を薬剤で誘導するとそれに応じて、MYB50の発現が減少すること、かつMYB50下流遺伝子の4つのうち2つが有意に発現が減少することがわかった。この発現変動は薬剤処理の時間依存的であり、UPB1がMYB50の発現を抑制することにより引き起こされていることを証明することができた。これらの一つは細胞壁成分であるペクチンの分解酵素であるペクチンメチルエステラーゼで、もう一つは細胞伸長を制御するシグナルに関わるペプチドをコードする遺伝子である。以上のことから、MYB50が細胞壁組成を根端の伸長領域で変化させ、またペプチドの量を変化させることで、さらに下流にシグナルを伝達して細胞伸長に関わっていることが強く示唆された。同時にMYB50の結合DNA配列をin vitroで決定するために、新規の迅速簡便転写因子結合配列決定法の確立も進めた。この方法により、テストを行なった結合配列が既知の転写因子のDNA結合配列を決定することができ、論文として投稿中である。平成30年度は平成29年度抽出することができたMYB50の下流に存在する細胞壁形成に関わる遺伝子群の機能解析を進め、UPB1から始まるMYB50を介した根の細胞機能転換メカニズムを明らかにする。まずはMYB50下流遺伝子のプロモーター領域をクローニングし、それらを蛍光タンパク質と融合させるTranscriptional fusionラインとT-DNA挿入による遺伝子破壊株を獲得する。Transcriptional fusionに関しては平成29年度に確立した、イメージング法を利用し、MYB50を誘導発現させたのちのこれら下流遺伝子の発現様式を捉える。また、遺伝子破壊株を用いて、根の表現型の詳細な観察も進める。これらの実験結果を合わせ、MYB50下流の根の細胞機能転換に関わる転写ネットワークを明らかにする。MYB50の上流制御機構も重要であるので、平成29年度に作成したpMYB50::2xCFPをUPB1の誘導発現株に導入する。この形質転換体を用いてUPB1からMYB50への時空間転写制御を可視化する。この可視化においても平成29年度に確立したイメージング手法を用いる。MYB50の上流と下流の制御機構を明らかにし、それらのデータを論文としてまとめ、根端における細胞成熟への機能転換をつかさどる時空間転写制御メカニズムを明らかにする。MYB50の機能解析に加え、イメージング法の改良も引き続き行う。平成29年度に誘導系で用いているエストラジオールが一定の速度で拡散し、シロイヌナズナの根は地上部方向へ輸送することがわかった。そこで、平成30年度は局所的な刺激をマイクロキャピラリーにより行う。根端のメリステム領域のみの誘導は難しいことから、伸長領域で局所的な誘導をかけることにより、細胞の伸長や分化に関わるイメージングの確立を目指す。物品購入の際の消費税分の差額が繰越となった。少額なので今年度中に使用が可能と判断した。
患者の病院選択行動に基づく第2次医療圏における病院の適正配置

病院経営に関する従来からの定説は、●たくさんの診療科を揃え、設備が整った大規模病院ほど、患者の評価は高くなる●したがって、大病院ほど患者を集めやすく、病院経営が安定するというものであった。このため、各病院はそれぞれ自己完結型の大病院を目指してきた。このような発想には、競合する近隣病院の影響、患者の病院へのアクセサビリティ(通院や入院の便利性)、診療科の差異等が全く考慮されていない。包括医療制度の下では、各病院はマーケティング的発想を取り入れ、病院の魅力を構成する要因を的確に捉え、病院経営に反映させねばならない。横須賀-三浦の第2次医療圏及び隣接する横浜市南部地域に存在する国家公務員共済組合傘下の3病院について、年間の外来・入院患者の全データを診療科別に収集し、個々の患者の住所、年齢、受診病院名、受診診療科、受診回数等のデータベースを作成し、分析を行った。ハフモデルを参考に、患者の病院選択行動を説明する数理モデルを作成した。また、同じ国家公務員共済組合傘下の東京都区内にある某病院についても外来・入院患者のデータを収集し、横須賀-三浦地区の3病院と比較分析を行った。都区内のように競合が激しい地区では通院時間を考慮したVoronoi分割が極めて有効であること、診療科毎に通院時間の影響が大きく異なることが分かった。研究の途上で、不足しがちな夜間時における小児科医師を少数の拠点病院に集約する拠点病院方式の効果について、Voronoi分割を利用して分析し、茨城県の医療関係者に提供した。地区別の人口データや年齢構成、各病院の受診比率、さらには地形、交通機関、都市状況など地域の諸データを地図上に視覚的に表示し、患者の病院選択行動における隠された構造を読み取ることが病院経営上極めて有効であり、本研究によりその仕組みを整備できた。最後にこれらの研究成果を報告書に取りまとめた。病院経営に関する従来からの定説は、(1)たくさんの診療科を揃え、設備が整りた大規模病院ほど、患者の評価は高くなる(2)したがって、大病院ほど患者を集めやすく、病院経営が安定するというものであった。このような発想には、競合する近隣病院の影響、患者の病院へのアクセサビリテイー(通院や入院の便利性)、診療科の差異等が全く考慮されていない。本研究は(1)横須賀-三浦の第2次医療圏に位置する大規模病院の患者動向の調査、(2)患者の病院選択行動の解明とモデル構築、(3)診療科の差異が患者の受診活動に与える影響、(4)開設診療科と病院の魅力度、(5)患者の病院選択行動に基づく病院の適正配置等を研究し、病院経営のあるべき姿を求めるものである。本年度は、横須賀-三浦の第2次医療圏及び隣接する横浜市南部地域に存在する国家公務員共済組合傘下の旧令病院の3病院について、年間の外来・入院患者の全データを診療科別に収集し、個々の患者の住所、年齢、受診病院名、受診診療科、受診回数等のデータベースを作成し、その整理・分析を開始したところである。これと並行して、ハフモデルを参考に、患者の病院選択行動を説明できるモデルを作成するための検討をおこなった。病院経営に関する従来からの定説は、(1)たくさんの診療科を揃え、設備が整った大規模病院ほど、患者の評価は高くなる(2)したがって、大病院ほど患者を集めやすく、病院経営が安定するというものであった。

このような発想には、競合する近隣病院の影響、患者の病院へのアクセサビリティ(通院や入院の便利性)、診療科の差異等が全く考慮されていない。包括医療制度の下では、各病院はマーケティング的発想を取り入れ、病院の魅力を構成する要因を的確に捉え、病院経営に反映させねばならない。本研究は、(1)横須賀-三浦の第2次医療圏に位置する大規模病院の患者動向の調査、(2)患者の病院選択行動の解明とモデル構築、(3)診療科の差異が患者の受診活動に与える影響、(4)開設診療科と病院の魅力度、(5)患者の病院選択行動に基づく病院の適正配置等を研究し、病院経営のあるべき姿を求めるものである。本年度は、前年度に引き続き、横須賀-三浦の第2次医療圏及び隣接する横浜市南部地域に存在する国家公務員共済組合傘下の旧令病院の3病院について、年間の外来・入院患者の全データを診療科別に収集し、その分析を行った。また、これらと比較するため、同じ国家公務員共済組合傘下の東京都内にある中目黒病院についても外来・入院患者のデータを収集・入力し、横須賀-三浦地区の3病院と比較分析を行った。これらのデータ収集には国家公務員共済組合病院部の松岡博次長の協力を得た。さらに、Voronoi分割の有効性を確認するため、筑波大学付属病院・松井陽教授と国土技術政策総合研究所・石井儀光研究員の協力を得て、茨城県における大規模病院の位置・担当医師数のデータから、不足しがちな夜間時における小児科医師を、少数の拠点病院に集約する拠点病院方式の効果を検討した。病院経営に関する従来からの定説は、(1)たくさんの診療科を揃え、設備が整った大規模病院ほど、患者の評価は高くなる(2)したがって、大病院ほど患者を集めやすく、病院経営が安定するというものであった。このため、各病院はそれぞれ自己完結型の大病院を目指してきた。本年度は、前年度までに着手できなかった地区別の人口データや年齢構成、あるいは各病院の受診比率、さらには地形や交通機関、経済活動の状況など地域の諸データを地図上に視覚的に表示し、その隠された構造を読み取る研究を推進した。このためにデジタル地図データを購入し、視覚的に表示する仕組みを整備した。これらの整備には国土技術政策総合研究所・石井儀光研究員の協力を得た。このシステムを利用し、国家公務員共済組合傘下の4病院(横浜南病院、横須賀北部共済病院、横須賀共済病院、東京共済病院)のデータについて分析を継続した。
クェーサーマイクロレンズ現象を利用した銀河系外惑星の探索

クェーサーマイクロレンズ現象を利用した、新たな銀河系外惑星の探査手法を確立するための研究を行った。理論的研究としては、惑星成分を考慮したクェーサーマイクロレンズ現象を計算するための専用計算機の整備を行った。また特殊な計算コードの基礎部分を作成し、精度・計算効率ともに、十分なスペックにあることを確認した。観測的研究としては、所属する研究機関での観測・データ解析を実施したが、解析手法の確立を行ったのみで、実際には十分な精度を持つデータが得られないことが判明した。そこで、他の観測所で精度の良い観測データを取得するためのストラテジーの構築と、過去のモニタリングデータをもとにした観測提案を行った。本研究は、系外惑星の多様性を探るため、多重像を持つクェーサーの理論的、ならびに、観測的研究から、銀河系外に存在する太陽系外惑星の探索の実現を試みるものである。まず理論的研究については、クェーサーマイクロレンズ現象による増光の計算を正確、かつ、高速に実現するためのGPGPUによる計算コード実装を試みた。年度途中で、当初予定のものより高いスペックのGPGPUが年度後半に発売される事が判明したため、計算機の購入自体は年度終わり頃になったが、それまでにGPGPUによるテスト計算程度であれば可能な現有の計算機を用いて、コード開発を行った。十分な高速化には至っていないが、専用言語CUDAを用いたプログラミングが可能になった。計算量は格段に少ないが、原理的には全く同じ計算を利用する、銀河系内のマイクロレンズ現象の異常な光度変動の再現に関する計算が可能となった。本来の目的実現に耐えるコードへと発展させるため、コード開発を引き続き行う。一方で観測的研究については、所属する研究機関の天文台を利用して、多重像を持つクェーサーの2色同時モニタリング観測を行った。天文台利用可能な時間の制約などから、実際の観測は、当初計画していた数の半分程度の天体に留まっているが、定常的なモニタリング観測を実施し、今後も継続してゆく。データ解析については、これまで経験のあった銀河系内のマイクロレンズ現象の解析に用いられるDIAという手法を利用しつつ、参照星の少なさなど異なる状況に対応するための解析手法の変更点を洗い出した。特に、集中的に観測している2天体については、多重像を完全に空間分解することはできていないが、光度変動の抽出には成功しており、引き続き観測データの解析手法の改良を行う。最後に、クェーサー自身の光度変動を積極的に利用して、クェーサー本来の光度を推定する方法についても検討を行った。まず理論的研究については、昨年度に引き続き、GPGPUを用いた高速数値計算の実装に取り組んできた。専用言語CUDAのアップデートによるプログラミングの効率化への対応を行い、単一の恒星と惑星によるマイクロレンズ現象による増光パターンの計算の効率化を行った。現在は、クェーサーマイクロレンズ現象の状況下での増光パターンの計算コード作成へと移行している。一方で観測的研究については、継続して所属する研究機関の天文台を利用した、多重像を持つクェーサーの2色同時モニタリング観測を実施してきた。天候に恵まれなかったこともあり、実際の観測は予定の半分以下であり、取得したデータの数・質ともに十分とは言えなかった。集中的に観測している2天体について、DIAによる解析を行い、クェーサーの光度変動抽出を行った。多重像を分解できたクェーサーについては、多重像間の時間の遅れの補正を行った結果、マイクロレンズ現象候補を検出するに至ったが、観測データの重なりが少なく、より確かな結論に至るまでに、引き続き観測データの取得が必要である。また、多重像に分解できないもう1つのクェーサーについても、マイクロレンズ現象の検出に成功したが、多重像の空間分解ができていないことが原因で、その増光の強度を定量的に評価することができなかった。まず理論的研究については、クェーサーマイクロレンズ現象による増光の計算を正確、かつ、高速に実現するためのGPGPUによる計算コード実装を目的に研究を進めた。前年度末に購入した専用計算機による計算の実行に向けて、計算コード作成に使用していたハードウェアとの違いと、専用言語CUDAのバージョンアップに伴う利便性の向上に対応する修正を行った。また実際に銀河系内の系外惑星によるマイクロレンズ現象による光度変動計算のためのコードは完成した。またそのコードを利用して、実際に所属する研究機関の天文台などを利用して観測された、銀河系内のマイクロレンズ現象による光度変動を、この専用計算機によってフィッティングを実行し、十分なパフォーマンスで計算が可能であることを確認した。更に、クェーサーのマイクロレンズ現象を計算する際の計算効率化のために重要となる、重力多体計算へのGPGPU使用について資料収集を行った。一方で観測的研究については、所属する研究機関の天文台を利用して、多重像を持つクェーサーの2色同時モニタリング観測を行ってきたデータについて吟味を行った。過去3年分の観測データをDIAという手法によって解析した結果、変動成分は見られるものの観測誤差も変動に比べて無視できず、その原因がこの天文台特有の高いバックグラウンドと、小さくないシーイングに起因すると考えられる。クェーサーのマイクロレンズ現象自体を検出することは、この天文台では容易でないことが分かった。

最後に、クェーサー自身の光度変動を積極的に利用して、クェーサー本来の光度を推定する計算コードの開発を行った。所属研究機関の所属学部において、学科再編が行われたが、それに関連する様々な用務によって当初予定していた研究時間(エフォート)をこの研究課題にさくことが十分にできず、結果として当初予定よりも研究の進捗が遅くなった。加えて、前年度に購入した専用計算機の不調も重なった。結果として、本来であればクェーサーのマイクロレンズ現象の光度変動を計算するための計算コードが形になっているべきところ、それが達成できていないことから、予定より研究の進捗状況は遅れていると言わざるをえない。本研究は、系外惑星の多様性を探るため、多重像を持つクェーサーの理論的、ならびに、観測的研究から、銀河系外に存在する太陽系外惑星の探索の実現を試みるものである。まず理論的研究については、引き続き高速計算を実現するためのGPGPUを利用した数値計算の実装を目的として研究を行った。まず、既に購入していた専用計算機に新たにGPGPUユニットを増設し、より効率的な計算が実行できるハードウェアの拡張を行い、実際に計算効率が約2倍向上したことを確認した。クェーサーのマイクロレンズ現象を数値計算するための計算コードは現在開発中である。一方で観測的研究については、マイクロレンズ現象による光度変動の特徴をクェーサー本体の構造由来のものと、系外惑星由来のものと切り分ける必要がある。そのため、マイクロレンズ現象の詳細な観測が不可欠となるが、その発生を前もって予言することは不可能である。そこで、本研究課題にとって理想的な観測対象であるクェーサーの過去のモニタリングデータを解析し、マイクロレンズ現象を初期段階で捉えるための判断基準を見積もった。更にその基準をもとに、本体の構造を探るためのX線衛星による観測プロポーザル、ならびに、マイクロレンズ現象の判断の材料となる地上でのモニタリング観測の観測プロポーザルを作成・提出した。特に地上でのモニタリング観測は、そのデータが初期段階でのマイクロレンズ現象を捉えるために有用なだけでなく、のちの解析によって実際に系外惑星の存在について議論をするためにも重要なものである。また、統計的な議論を行うためには、このような手法を適用するための対象天体数の充実も重要課題であることから、大規模サーベイ観測から多重像を持つクェーサーの候補天体探索にも協力しており、実際に新たな候補天体を発見した。クェーサーマイクロレンズ現象を利用した、新たな銀河系外惑星の探査手法を確立するための研究を行った。理論的研究としては、惑星成分を考慮したクェーサーマイクロレンズ現象を計算するための専用計算機の整備を行った。また特殊な計算コードの基礎部分を作成し、精度・計算効率ともに、十分なスペックにあることを確認した。観測的研究としては、所属する研究機関での観測・データ解析を実施したが、解析手法の確立を行ったのみで、実際には十分な精度を持つデータが得られないことが判明した。
ナマコ由来の神経突起伸展作用ガングリオシド成分の探索研究

本研究は、新規生理活性ガングリオシドの探索を目的として、PC-12細胞に対する神経突起伸展作用を示すガングリオシドをナマコ類から単離し、その化学構造並びに、生理活性について検討を加え、構造活性相関について考察する事を企図するものである。材料生物については、トラフナマコ、グミ(福岡県沿岸)、ジャノメナマコ、アデヤカバイカナマコ、クロテナマコ、チズナマコ並びに、シカクナマコ(沖縄県沿岸)の合計7種のナマコを採集した。本年度は、そのうちトラフナマコ、グミ、ジャノメナマコを常法に従い処理し、脂溶性脂質画分並びに水溶性脂質画分を得た。そのうち水溶性脂質画分を各種カラムクロマトグラフに繰り返しふし、ガングリオシド成分の分離を試みた。尚、ガングリオシドの構造並びに、構造活性相関について知見を得るために、一般にガングリオシドの生合成前駆物質であると考えられているセレブロシド成分についても、脂溶性脂質画分からの分離を試みた。その結果、トラフナマコからは3種のセレブロシド分子種と11種のガングリオシド分子種を、グミからは2種のセレブロシド分子種と1種のガングリオシド分子種を、ジャノメナマコからは3種のセレブロシド分子種をそれぞれ分離することが出来た。グミのセレブロシドについては、5種の構成主成分を分離する事にも成功した。各成分については、機器分析的並びに、化学的手法を組み合わせて構造の解明を行った。その結果、全てのセレブロシドの構造と、5種のガングリオシドの構造をそれぞれ明らかにする事が出来た。構造の明らかになった各成分については、PC-12細胞に対する神経突起伸展作用を調べた。その結果100μg/mlの濃度で、全てのガングリオシドに、神経突起伸展作用を示す事を見出す事ができた。また、活性発現には、糖鎖中にシアル酸の存在が不可欠である事も確認できた。尚、上記の研究成果については、日本生薬学会第43回年会、平成8年度日本薬学会九州支部大会で発表済みであり、更にその一部については、日本薬学会第117年会で発表予定である。