hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内情報伝達系と細胞骨格蛋白からみた脳虚血の病態と治療に関する研究

脳虚血の病態進行に、細胞内カルシウム濃度の増大が大きな鍵を握っている。カルシウム依存性のタンパク質分解酵素calpainの活性化およびcalpastatin(内因性修飾物質)の変動は、細胞骨格タンパク質fodrinの分解に関わり、虚血傷害を修飾する可能性がある。本研究では、ラットの脳虚血モデルを用い、calpain、calpastatinと細胞骨格タンパク質について検討し、虚血後脳障害の新しい治療法の展開をはかることを目的とした。1.断頭モデル断頭脳標本のhomogenateでWestern blotting法によりfodrinを測定,azocaseinとの反応からm-calpainを測定した。また、加熱処理試料でcalpastatinを測定した。37°Cでは断頭後40分の間に著明なα-fodrinの分解を認めた。m-calpainは有意な変化を示さなかった。Calpastatin活性は有意に減少した。断頭前後に33°Cに維持するとα-fodrinの分解が抑制された。2.前脳虚血モデル両側総頸動脈遮断、低血圧50mmHgモデルでは、30分虚血時および再灌流60分後に、α-fodrin分解が約1.5倍、2倍に増加した。Calpastatin活性は有意な変化を示さなかったが、細胞質中のcalpainは再潅流で有意に減少し、calpainが活性化(膜へ移行)された結果と考えられた。Calpain inhibitor-1(CAI)静注(虚血10分前)で、再潅流60分のα-fodrinの分解が有意に抑制され、細胞質中のcalpainの減少(活性化)も抑制傾向を示した。Zymographyでは、15分虚血(血圧35mmHg)再潅流60分で、特に海馬でfodrinの分解と、細胞質中のcalpainの減少(活性化)が著明であった。以上より、虚血で細胞質中のcalpainが減少(活性化)し、α-fodrinの分解が亢進する。この変化は海馬で顕著で、低体温とCAIで抑制されることが明らかとなり、虚血性脳障害の新たな治療の展開につながる結果が得られた。脳神経細胞は短時間の虚血侵襲で細胞死にいたる。この機序として細胞内のCa濃度上昇が重要視されているが、細胞死への過程、特に細胞内情報伝達系の変化の詳細は未解明である。最近、Ca依存性タンパク質分解酵素であるcalpainが、他の細胞内情報伝達系物質を修飾し、また細胞骨格タンパク質を分解することが示唆されている。In vitroでは、これらの細胞骨格タンパク質がPKCによってリン酸化されることが明らかであるが、生体内の調節機構および虚血時の反応については未解明である。すなわち、虚血や再潅流に伴う生体内でのcalpainの活性および局在の変化を捉えることは、虚血性神経細胞傷害の機序解明に重要と考えられる。本研究では、ラットの脳虚血モデルを用い、免疫ブロット法、酵素活性測定によりcalpain活性の変化と細胞骨格タンパク質分解産物の経時的変化を検討し、虚血後脳障害に対する新しい治療法の理論的基盤を得ることを目的とした。

今までに、ラットの全脳虚血モデルを用い、免疫ブロット法(購入の電気泳動装置使用)、酵素活性測定(購入の分光光度計使用)により虚血後の(1)calpain活性(2)内因性calpain阻害物質であるcalpastatinの阻害率、(3)細胞骨格タンパク質の1つであるfodrinの分解産物(BDPs)の経時的変化を観察した。その結果、虚血後(1)calpain活性は上昇、(2)calpastatinの阻害率は有意に上昇、(3)BDPsは有意に増加した。このことから、急性期の脳虚血による細胞障害がcalpainの活性化を促進し、calpastatinによるの阻害を抑性することで実質的なcalpain活性は上昇し、BDPsが増加したことが示唆される。以上から、全脳虚血による急性期の細胞傷害でのcalpainの役割がより明らかになった。現在、さらに低体温による脳保護効果とcalpain活性との関係を検討中である。今後、前脳虚血モデルを用いて虚血再潅流後のcalpain活性の変化、およびcalpain阻害剤や低体温による修飾作用について検討する。また、現在のCalpain活性の測定方法を改良し、微量サンプルでの測定を可能にすることで、calpainの局在性と虚血侵襲に対する脆弱部位でのcalpain活性の変化を明らかにし、脳内のcalpainの性格をより明確にする。本年度は、主に前脳虚血モデル(一部断頭モデル)を用い、虚血時および再潅流時の病態を検討した。また、zymographyにより、calpainとfodrinの変化の局在性を海馬、大脳皮質、小脳で測定した。さらに、脳保護という観点から、軽度低温(33°C)、およびcalpain阻害薬であるcalpaininhibitor-1(CAI)の影響を検討した。断頭前および後(40分間)に軽度低温を維持すると、α-fodrin分解は有意に抑制され、低温によるcalpainの酵素活性の抑制が脳保護効果を示す可能性が示唆された。前脳虚血モデル(両側総頚動脈遮断と低血圧(50mmHg))では、30分虚血時および再潅流60分後にα-fodrinの分解が約1.5倍、2倍に増加した。また、calpastatin活性は有意な変化を示さなかったが、細胞質中のcalpainは再潅流で有意に減少し、calpainが活性化(膜へ移行)された結果と考えられた。虚血10分前にCAIを静注すると、再潅流60分でα-fodrinの分解が有意に抑制され、細胞質中のcalpainの減少(活性化)も抑制される傾向がみられた。Zymographyで局在変化をみると、特に海馬で、虚血時と再潅流時にfodrinの分解と、細胞質中のcalpainの減少(活性化)が著明であった。以上より、(1)虚血で細胞質中のcalpainが減少(活性亢進)し、fodrinの分解が亢進すること(2)この変化は海馬で顕著であること(3)低体温でこれらの変化が抑制され、脳保護作用の一機序としてcalpain活性抑制作用があげられること(4) CAIの全身投与が細胞傷害を軽減しうることが、明らかとなり、虚血性脳障害の治療の展開に示唆を与える結果が得られた。
肉腫における炎症性サイトカインのマクロファージを介した役割の解明

MCP-1過剰発現細胞株を作成し、xenograftモデルにてその成長の比較を行ったところ、MCP-1過剰発現細胞株では生着した腫瘍は増殖が早く、腫瘍内浸潤血管が増加していた。腫瘍からマクロファージを回収し解析したところ、基質分解酵素の発現が上昇しており、MCP-1はマクロファージを活性化し腫瘍の成長に様々な影響を与える可能性が考えられた。Ewing肉腫は骨に原発する腫瘍であり、骨破壊、肺転移が問題となる。今後の研究にて腫瘍から産出されるMCP-1の腫瘍成長への影響のみならず、骨破壊や肺転移に対してどのような影響を与えるかを腫瘍の骨発生モデルや肺転移モデルを使用し解明する。
光曝露がサーカディアンリズム関連疾患に及ぼす影響に関する縦断研究

生体リズムは(サーカディアンリズム)は内分泌・代謝・循環・精神機能などの多くの生理現象に関与している。サーカディアンリズムに最も強く影響を与える環境因子は光であることが分かっており、現代人の不自然な光の浴び方(日中に少なく夜間に多い)がサーカディアンリズム障害や多種多様な疾病の原因になっている可能性がある。申請者らは、「日常生活の光曝露」を実測した世界ではじめての疫学研究(平城京コホートスタディ)を開始し、その横断解析で光曝露がメラトニン分泌量・肥満症・糖尿病・脂質異常症・高血圧・睡眠障害・うつ・動脈硬化と関連することを報告した。本研究の目的は、疾病の新規罹患や健康指標の変化を追跡調査し、ベースライン調査で測定した日常生活の光曝露が健康に及ぼす影響を縦断的に明らかにすることである。平成29年度は目標対象者数の追跡調査を実施することができ、身体計測・血液検査・尿検査・動脈硬化検査などの主要項目の測定を行うことができた。また本年度に研究代表者が筆頭著者の複数の論文が英文科学誌に採択・掲載された。これらの研究成果は本研究の目的である日常生活の光曝露が健康に及ぼす影響を検討する上で重要である。平成30年度は当初予定していた追跡調査データのクリーニングおよび統合を完了し、複数の縦断分析結果を報告できたため、全体としておおむね当初の計画通りに調査・測定が進展していると考えられる。また、本研究の目的を達成するために必要な複数の論文を科学誌に採択・掲載されたことは評価できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は大規模疫学研究(平城京コホートスタディ)において、日常生活の光曝露が健康に及ぼす影響を縦断的に明らかにすることである。平成27年度は350名について追跡調査を実施することができ、身体計測・血液検査・動脈硬化検査などの主要項目の測定を行うことができた(2015年度目標:280名)。また疾病罹患を含む質問票について約750名から回収することができた。本研究の関連する学術的成果として、本年度に研究代表者が筆頭著者である4本の論文が英文科学誌に採択・掲載された。これらの研究成果は本研究の目的である日常生活の光曝露が健康に及ぼす影響を検討する上で重要な先行知見となる。研究1年目である平成27年度の目標は280名の対象者への追跡調査実施であった。おおむね当初の計画通りに調査・測定が進展していると考えられる。本研究の目的を達成するために必要な先行知見として、4本の論文が科学誌に採択・掲載されたことは評価できる。本研究の目的は、疾病の新規罹患、メラトニン分泌量の変化、動脈硬化の進行を追跡調査し、ベースライン調査で測定した日常生活の光曝露が健康に及ぼす影響を縦断的に明らかにすることである。平成28年度は予定していた対象者数の追跡調査を実施することができ、身体計測・血液検査・尿検査・動脈硬化検査などの主要項目の測定を行うことができた。研究2年目である平成28年度は予定していた対象者数の追跡調査を実施することができ、全体としておおむね当初の計画通りに調査・測定が進展していると考えられる。

平成29年度240名について追跡調査を実施することができ、疾病罹患を含む質問票について800名以上から回収することができた。全体としておおむね当初の計画通りに調査・測定が進展していると考えられる。また、本研究の目的を達成するために必要な複数の論文を科学誌に採択・掲載されたことは評価できる。生体リズムは(サーカディアンリズム)は内分泌・代謝・循環・精神機能などの多くの生理現象に関与している。サーカディアンリズムに最も強く影響を与える環境因子は光であることが分かっており、現代人の不自然な光の浴び方(日中に少なく夜間に多い)がサーカディアンリズム障害や多種多様な疾病の原因になっている可能性がある。申請者らは、「日常生活の光曝露」を実測した世界ではじめての疫学研究(平城京コホートスタディ)を開始し、その横断解析で光曝露がメラトニン分泌量・肥満症・糖尿病・脂質異常症・高血圧・睡眠障害・うつ・動脈硬化と関連することを報告した。本研究の目的は、疾病の新規罹患や健康指標の変化を追跡調査し、ベースライン調査で測定した日常生活の光曝露が健康に及ぼす影響を縦断的に明らかにすることである。平成29年度は目標対象者数の追跡調査を実施することができ、身体計測・血液検査・尿検査・動脈硬化検査などの主要項目の測定を行うことができた。また本年度に研究代表者が筆頭著者の複数の論文が英文科学誌に採択・掲載された。これらの研究成果は本研究の目的である日常生活の光曝露が健康に及ぼす影響を検討する上で重要である。平成30年度は当初予定していた追跡調査データのクリーニングおよび統合を完了し、複数の縦断分析結果を報告できたため、全体としておおむね当初の計画通りに調査・測定が進展していると考えられる。次年度の目標はさらに追跡調査をすすめ前年度同様に実施することである。追跡調査の人員配備や測定方法なども確立しておりこの点も問題ないと考える。訪問調査による追跡を積極的に行う予定である。次年度の目標は追跡調査データをクリーニング・統合し、縦断分析結果を報告していく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
分子標的治療薬に対するオーダーメイド医療のための基礎研究

我々はBRAKの遺伝子発現が確認できない癌細胞を、デシタビン処理するとBRAKの遺伝子発現が回復することを見出した。BRAKのプロモーター領域はメチル化によって不活化しており、ゲフィチニブ処理においても、BRAKの遺伝子発現回復による抗腫瘍効果は期待できない。BRAKのメチル化をマーカー分子として、(1)メチル化を受けていない場合はゲフィチニブ単剤、(2)メチル化を受けている場合はデシタビンとゲフィチニブの多剤併用療法が期待される。近年癌治療は分子標的治療法の導入により大変革を遂げつつある。我々は分子標的治療薬の一つであるゲフィチニブの効果にケモカインBRAK/CXCL14が関与しており、BRAK/XCL14が発現していない癌細胞においてはゲフィチニブが効果を示さない結果を得た。癌細胞でBRAK/CXC14が消失する原因としてプロモーター領域のメチル化が関与しており、メチル化を簡便に特定するための手法の一つとして、メチル化特異的PCR法が挙げられる。我々の目的は、BRAK/CXCL14のメチル化領域の決定を行うことにより、BRAK/CXCL14に対するメチル化特異的PCR法を確立することである。しかしながら、BRAK/CXCL14のプロモーター領域はいまだ報告がなく、メチル化特異的PCR法を確立するためには、まずその領域を決定することが先決である。そこで19年度において、我々はメチル化をうけるBRAK/CXCL14のプロモーター領域の検索を行った。実験手法としては、BRAK/CXCL14の転写開始点を決定するための5'RACE法とプロモーター活性及び領域決定のためプロモーターアッセイを用いて実験を行った。その結果、BRAK/CXCL14の転写開始点は従来報告されていた部分より下流であることが確認され、さらに我々が見出した新たな転写開始点の上流近辺にプロモーター領域が存在することが明らかとなった。19年度の研究成果としては、BRAK/CXCL14のプロモーター領域を決定できたことである。このことは20年度行う予定であるメチル化特異的PCR法のプライマー設計を行うことに寄与し、円滑に実験を遂行できると推測される。分子標的治療が従来の医療と比較し優れている点は、医療品の有効性や副作用の出ない量を調べることができるため、より個人差を考慮した治療を遂行することができる。癌治療においても同様に、分子標的治療法の導入により大変革を遂げ、テーラーメイド医療の開発が行われている。我々が取り扱う頭頸部扁平上皮癌においても、EGFRからのシグナルが癌細胞の病態の悪化に関与することが明らかとなっており、ゲフィチニブの応用が試験段階で行われている。我々はこれまでに、抗腫瘍効果を示す分子BRAKがEGF受容体シグナルによって制御されていることを見出した。さらに、頭頸部扁平上皮癌細胞にはBRAKを発現している癌と、していない癌に大別されるが、発現しているものに関しては、in vivoの実験系で、ゲフィチニブがBRAKの遺伝子発現を上昇させながら、腫瘍を縮小させることを明らかにした(この報告によりIADR Hatton Award優勝)。またBRAKの遺伝子発現が確認できない癌細胞において、脱メチル化剤である5アザシチジンで処理をすることで、BRAK発現が誘導された。我々は、このような細胞において、ゲフィチニブ処理においてもBRAKの遺伝子発現は回復せず、腫瘍縮小効果を示さない結果を得た。これらの結果は、BRAKのメチル化を検出することが、ゲフィチニブの効果予測のマーカー分子として活用できることを示し、テーラーメイド医療の指標となりえるものと期待される。
ウラン化合物磁性体における電子状態の解明

本研究課題では、強相関f電子系における磁性の起源を電子状態から明らかにすることを研究目的として、同じ結晶構造を持ちながら磁気的に異なる性質を示すUX3 (X=Al, Ga, In)化合物の電子状態を、放射光光電子分光を用いて明らかにした。非磁性体であるUAl3と反強磁性体であるUGa3において5f電子は遍歴的である一方で、反強磁性体UIn3においては電子相関効果が強いことが明らかとなった。特にこれら化合物の大まかなフェルミ面形状は類似の構造を持つ一方で、細部に違いが観測された。これは遍歴f電子系磁性の起源を解明する上において最も基礎的な情報であり、その解明に向けて大きく前進することができた。本研究課題では、強相関f電子系における磁性の起源を電子状態から理解することを研究目的として、系統的な磁気的性質を示すUX3 (X=Al, Si, Ga, Ge, In, Sn)のバンド構造とフェルミ面を角度分解光電子分光によって決定し、定量的な解析を行うことによって磁性の発現機構をU 5f電子状態から明らかにすることを目的としている。平成26年度は、これらの課題を遂行するための実験環境の整備を行い、反強磁性体UGa3および常磁性体UAl3に対する初期的な実験を行って、磁性の違いが電子状態にどのように現れるかを研究した。特に微小試料測定のための試料ホルダーと試料観察カメラシステムの開発によって、0.5mm程度のUAl3試料の劈開と測定が可能なことを証明することができた。角度分解光電子分光測定の結果、これら化合物の詳細なバンド構造とフェルミ面を得ることができた。特に反強磁性体UGa3に関してはバンド計算との詳細な比較を行って、その電子状態がバンド計算によって良く理解できることを明らかにした。この成果は2014年7月にGrenobleで行われた強相関電子系国際会議において発表を行った。常磁性体であるUAl3との比較を行ったところ、両者は非常に似た電子状態を持っていることが明らかになった。その一方で、フェルミ面形状が定量的には異なっていることが見出され、この違いが磁性状態の違いとなっていると考えられる。また、4d-5f吸収端(hn=736 eV)付近においてU 5f強度の共鳴増大が起こることが見出された。4d-5f吸収端における共鳴増大は従来起こらないことが報告されていたが、詳細な測定の結果10 %程度の増大が起こることが明らかとなった。共鳴効果を用いることによってU 5f成分をより詳細に調べることが可能であり、今後の研究を推進する上でも有用である。本研究課題では、強相関f電子系における磁性の起源を電子状態から理解するため、系統的な磁気的性質を示すUX3化合物のバンド構造とフェルミ面を角度分解光電子分光によって決定し、磁性の発現機構をU 5f電子状態から明らかにすることを目的としている。平成27年度はUIn3に対する角度分解光電子分光およびUAl3に対する共鳴光電子分光実験を中心に行った。UIn3は反強磁性体であるが、格子定数がこれまで測定してきたUGa3やUAl3に比べて約10%大きく、U 5f電子同士の重なりが小さいため、より局在した性質が期待される。角度分解光電子分光実験の結果、U 5f電子を反映した準粒子バンドのエネルギー幅は0.5 eV以下であることが見いだされ、UAl3やUGa3で観測されていた1 eV程度のバンド幅と比べても狭く、5f電子の局在性が強くなった結果であると考えられる。今後詳細なバンド構造を決定し、UAl3,およびUGa3の結果や、バンド計算との比較を進める。また、これまでの研究において、今までU 5f軌道に対する散乱断面積の共鳴増大効果が起こらないとされていたU 4d-5f吸収端において15 %程度の共鳴増大効果が観測されたため、UAl3に対して共鳴光電子分光実験を行って、スペクトルにおけるU 5f電子の寄与を導出する研究を行った。この結果は角度分解光電子スペクトルにおけるU 5f電子の寄与の同定に有効であり、日本物理学会第71回年会において発表を行った。また、U 5f電子状態と磁性状態を明らかにするうえで、5f電子をもたないTh化合物との比較が非常に有効であることが明らかとなってきた。特に今期は、隠れた秩序転移を示すURu2Si2のTh置換系であるThRu2Si2に対する角度分解光電子分光研究を行って、成果を2016年磁性国際会議において発表を行った。UAl3, UGa3およびUIn3の内殻光電子スペクトルについてはJournal of the Physical Society of Japanにレビュー記事の一部として投稿し、受理された。これまでのところUAl3, UGa3, UIn3の優良なデータの取得を完了しており、解析も順調に進行している。また、当初予定していなかった共鳴光電子分光の活用や、Th置換系を利用した5f電子状態の詳細な研究も進展しており、研究目的である磁性状態の解明に向けて新しい情報が得られている。本研究課題では、強相関f電子系における磁性の起源を電子状態から理解することを研究目的として、系統的な磁気的性質を示すUX3化合物のバンド構造とフェルミ面を角度分解光電子分光によって決定し、磁性の発現機構をU 5f電子状態から明らかにすることを目的としている。

平成28年度は、UIn3に対する共鳴光電子分光実験を中心に行った。UIn3は、これまで測定してきたUAl3, UGa3に比べて格子定数が約8%程度大きく、比較的局在的な性質を示すことが期待される反強磁性体であ。U 4d-5f共鳴光電子分光実験を詳細に行うことにより、UIn3におけるU 5f電子の部分状態密度を導出することに成功した。この結果を比較的遍歴的な性質を示すUAl3の結果と比較したところ、基本的な構造はUAl3とUIn3で似通っており、EF付近に大きな状態密度を持つものの、UIn3ではフェルミ準位から約0.5-2 eV程度深い位置に、局在したU 5f電子状態からの寄与が存在することが明らかとなった。これらの結果は、UIn3においては電子相関の効果が強いことを示しているが、電子相関効果の強さと反強磁性転移温度は相関していることから、磁性の起源としては単純にフェルミ面の構造だけではなく、電子相関の効果も重要な役割を果たしていることを示している。本研究課題では、強相関f電子系における磁性の起源を電子状態から明らかにすることを研究目的として、同じ結晶構造を持ちながら磁気的に異なる性質を示すUX3 (X=Al, Ga, In)化合物の電子状態を、放射光光電子分光を用いて明らかにした。非磁性体であるUAl3と反強磁性体であるUGa3において5f電子は遍歴的である一方で、反強磁性体UIn3においては電子相関効果が強いことが明らかとなった。特にこれら化合物の大まかなフェルミ面形状は類似の構造を持つ一方で、細部に違いが観測された。これは遍歴f電子系磁性の起源を解明する上において最も基礎的な情報であり、その解明に向けて大きく前進することができた。当初予定した実験要素の開発は概ね予定通りに進んでいる。また、当初予定していた試料に対する測定を完了することができた。これまでに得られたUAl3, UGa3, UIn3の膨大なデータにより、磁性状態と電子状態の関係が明らかになってきており、今後はこれらのデータ解析と論文発表に集中して取り組む。さらに、これらの化合物に対する共鳴角度分解光電子分光実験の実施も考慮に入れ、当初予定していた他の化合物に対する実験に実施についてはデータ解析の進捗を見ながら判断する。物性物理学今後は予定通り微小試料の測定を行い、データの詳細な解析を進める予定である。また、当初は想定していなかった共鳴光電子分光実験も推進する。当初予測していた液体ヘリウムの購入が他の実験の余剰などによって賄うことができたため。昨年度は、想定以上に実験が順調に進んだため、液体ヘリウムの購入費を当初見込みよりも抑えることができた。また、試料観察カメラについては、より高性能なPCが必要なため、購入を今年度に延期した。平成28年度の実験における液体ヘリウムの購入に利用する。今年度はより多くの実験を行うため、想定以上の液体ヘリウムが必要があり、液体ヘリウムの購入に用いる。また、解析用PCを購入する。
ウォ-タ-ジェット応用アンギオプラスティの基礎的研究

目的:本研究はウォ-タ-ジェット手術法の新しい応用、即ち、新たに開発したジェットノズル装備のカテ-テルを血管内に導き、体内諸血管内の血栓や粥腫あるいは腫瘍を除去する手術法、ウォ-タ-ジェット応用アンギオプラスティ用実用機の開発に対する基礎的な検討を行うことにある。研究結果:1.既に開発を終了したウォ-タ-ジェット手術装置およびジェットノズル付きカテ-テルを用い、カテ-テルの耐圧、性能試験の実施した。この結果ジェットノズル付きカテ-テルは従来から使用していたメタル性のノズルより優れた性能を示した。2.ブタ摘出心冠動脈および家兎大動脈を対象とし、モデル血栓や凝血塊を血栓と考え、ウォ-タ-ジェットの噴射による破砕・剥離状態を血管内内視鏡により観察し、作用機序を検討した。この結果、ウォ-タ-ジェットの噴射による再開通の機序は、まず噴射部位の血栓に孔があき、血栓は細かく砕かれる。そしてウォ-タ-ジェットの噴流は、さらにこの細かく砕かれた小血栓塊を巻き込む乱流を形成しながら、穿孔を続け、血栓の孔を大きくした。またウォ-タ-ジェットの噴流は、小血栓塊を粉砕すると同時に、血管内腔を激しく擦過しながら洗浄する効果をもたらした。まとめ:ウォ-タ-ジェットアンギオプラスティのin vitroのモデル実験では血栓の貫通と粉砕は、迅速にかつ完全に行なわれた。今後粥腫などより硬い血管内組織の破壊効果について検討を加えることにより、ウォ-タ-ジェットアンギオプラスティの適応性は拡大するものと思われた。
固気液混相流のエクサスケール直接シミュレーション

多数の固体物体を含む自由界面流れの高精度シミュレーションの実現に向けて,本研究では,自由界面と物体表面に高解像度格子を配置する適合細分化格子法の実装と,スーパーコンピュータに搭載された複数台のGPU(Graphics Processing Unit)を用いた大規模並列計算を進めてきた.2018年度では,動的な適合細分化格子法を導入した格子ボルツマン法による単相流計算の複数GPU実装を行い,その後,そのコードを流体構造連成解析や自由界面流れの計算に適用した.昨年度に開発した適合細分化格子法を導入した格子ボルツマン法の単一GPUコードを拡張し,複数GPU計算を行えるようにした.並列化では,空間充填曲線による領域分割を用いた動的負荷分散を行うことで,各GPUに割り当てられる格子点数を均一化した.GPU間通信の削減や,演算と通信のオーバーラップを実装することで,GPU間通信のオーバーヘッドを削減し, 256GPUまでの良好なスケーリングを達成した.適合細分化格子法の複数GPUコードに,昨年度開発した格子ボルツマン法による混相流解析手法を実装した.適合細分化格子法により計算コストを均一格子の場合の10%以下に削減できることを確認した.ダム崩壊問題などの自由界面流れの実問題に適用し,提案した手法により大規模な混相流解析が実現可能であることを確認した.昨年度から開発を進めているマルチフェーズフィールド法による領域分割法を,格子ボルツマン法に導入する予定であったが,適合細分化格子法を導入した格子ボルツマン法では各格子点の計算量が解像度毎に異なるという問題が解決できず,マルチフェーズフィールド法による負荷分散を格子ボルツマン法の複数GPU計算に適用するには至らなかった.本年度の補助金は,パソコンおよびパソコン周辺機器の購入,研究成果発表のための学会参加費,学会参加の旅費に当てられた.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。多数の固体粒子を含む混相流の高精度シミュレーションの実現を目指し,本研究では,相界面近傍にのみ高解像度格子を局所的に割り当てる適合細分化格子法の実装と,スーパーコンピュータに搭載された複数台のGPU(Graphics Processing Unit)を用いた大規模並列計算を進めている.本年度は,大規模解析に適した完全陽解法である格子ボルツマン法による混相流解析手法の構築,高解像度格子を動的に計算領域に割り当てる適合細分化格子法の高効率なGPU実装方法の検討,複数GPUで並列計算するための動的負荷分散手法の構築を行った.格子ボルツマン法による固体物体と相互作用する自由界面流れの計算手法の開発では,乱流計算手法であるCumulantモデルを導入することで,高レイノルズ数の自由界面流れを安定して計算が可能となった.複数GPU実装し,等間隔格子を用いて大規模な自由界面流れの計算を実行した.高解像度の格子を局所的に割り当てる適合細分化格子を導入した単相の格子ボルツマン法の単体GPU実装では,高精度が必要な領域に,高解像度の等間隔格子の塊を配置するブロック構造を用いることで,GPU計算で高い演算性能を達成した.適合細分化格子法の並列計算のための新しい動的負荷分散手法の開発では,一般的に多結晶組織のシミュレーションに用いられるマルチフェーズフィールド法を計算領域の分割に適用することで,GPU間の通信コストの削減に成功した.本年度の補助金は,パソコン周辺機器の購入,研究成果発表のための学会参加費,および学会参加の旅費に当てられた.混相流解析手法に関しては,当初の研究計画では固体,気体,液体の三相を扱える手法の構築を予定していたが,高レイノルズ数の乱流では格子ボルツマン法による気液二相流の計算が不安定になる問題があった.そこで,気相の流れ場は解かずに液相のみの計算を行い,気液界面で境界条件を与えることで,自由界面流れの計算を可能にした.高レイノルズ数で気液界面が不安定になる問題が解消され,安定して物体を含んだ自由界面流れの計算が可能となった.適合細分化格子法の実装では,まず,単相の格子ボルツマン法の計算に適合細分化格子法を導入し単体のGPUでチューニングを行った.格子データがメモリ上で連続になるブロック構造にすることで,GPUで高速に計算可能にした.球周りの流れの解析では,均一格子の計算と比較して計算コストを1.3%に,計算時間を5.2%に削減することができた.また,H29年度の計画では当初予定していなかった複数GPU計算に取り掛かることが出来た.適合細分化格子法の並列実装は複雑であるため,気液界面を与えられた速度場で移動させるだけの検証コードの作成を行った.当初予定していた空間充填曲線に基づく領域分割では,各GPUに割り当ててられる小領域が凹凸のある複雑形状で表面積が増加するため,通信コストが多くなってしまう問題が確認できた.そこで,多結晶粒組織のシミュレーションに用いるマルチフェーズフィールド法を適合細分化格子の領域分割へ適用し,計算コストと通信コストの最小化を行える領域分割法を提案した.当初予定していた空間充填曲線よりも提案したマルチフェーズフィールド法による負荷分散は,通信コストを削減することができた.多数の固体物体を含む自由界面流れの高精度シミュレーションの実現に向けて,本研究では,自由界面と物体表面に高解像度格子を配置する適合細分化格子法の実装と,スーパーコンピュータに搭載された複数台のGPU(Graphics Processing Unit)を用いた大規模並列計算を進めてきた.

2018年度では,動的な適合細分化格子法を導入した格子ボルツマン法による単相流計算の複数GPU実装を行い,その後,そのコードを流体構造連成解析や自由界面流れの計算に適用した.昨年度に開発した適合細分化格子法を導入した格子ボルツマン法の単一GPUコードを拡張し,複数GPU計算を行えるようにした.並列化では,空間充填曲線による領域分割を用いた動的負荷分散を行うことで,各GPUに割り当てられる格子点数を均一化した.GPU間通信の削減や,演算と通信のオーバーラップを実装することで,GPU間通信のオーバーヘッドを削減し, 256GPUまでの良好なスケーリングを達成した.適合細分化格子法の複数GPUコードに,昨年度開発した格子ボルツマン法による混相流解析手法を実装した.適合細分化格子法により計算コストを均一格子の場合の10%以下に削減できることを確認した.ダム崩壊問題などの自由界面流れの実問題に適用し,提案した手法により大規模な混相流解析が実現可能であることを確認した.昨年度から開発を進めているマルチフェーズフィールド法による領域分割法を,格子ボルツマン法に導入する予定であったが,適合細分化格子法を導入した格子ボルツマン法では各格子点の計算量が解像度毎に異なるという問題が解決できず,マルチフェーズフィールド法による負荷分散を格子ボルツマン法の複数GPU計算に適用するには至らなかった.本年度の補助金は,パソコンおよびパソコン周辺機器の購入,研究成果発表のための学会参加費,学会参加の旅費に当てられた.平成30年度は,格子ボルツマン法による混相流シミュレーションに高解像度格子を局所的に割り当てる適合細分化格子法を導入し,複数台のGPUを用いた大規模混相流解析を行う.まず,昨年度開発した格子ボルツマン法による物体を含んだ自由界面流れの解析に適合細分化格子法を実装し,単体のGPU実装を行う.現在,格子ボルツマン法の単相流の計算への適合細分化格子法のGPU実装は既に完了している.単相格子ボルツマン法のGPUコードを混相流解析に拡張していく予定である.次に,適合細分化格子法を導入した格子ボルツマン法による混相流計算の複数GPU実装を行う.昨年度から開発を進めている,マルチフェーズフィールド法に基づく領域分割による適合細分化格子計算の動的負荷分散手法を格子ボルツマン法の複数GPU計算に導入する.提案する領域分割法を格子ボルツマン法に導入した後,東工大のGPUスパコンTSUBAME3.0にて実行性能測定,スケーリングの測定を行う.その後,本研究の混相流計算コードの実問題への適用を行う.多数の固体粒子間に形成される液架橋の計算や,瓦礫を含んだ津波の計算などを行う予定である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
事業者の自主規制規範とビジネス・オンブズマン制度の比較法政策的研究

本研究は、わが国における消費者政策の第3の波として、消費者利益擁護のための事業者による自主的取り組みを市場を通して促進することが重視されている現在において、事業者団体による自主規制規範の制定やADRの一種であるビジネス・オンブズマン制度について海外の状況を調査・研究し、そこから得られる成果をもとに日本における21世紀型の消費者法政策モデルを析出することを目的としている。比較の対象としては、もっとも成功していると言われているオーストラリアについて、数度の現地調査を含んで詳しく検討した。そして、オーストラリアと日本の類似スキームの比較を行い、日本におけるあるべき自主規制規範制度及びそのコンプライアンス・メカニズムの一環としてのビジネス・オンブズマン制度について、行政規制との関係、消費者や行政関係者の参加による共同規制の可能性を含めて、法政策的な検討を行った。オーストラリアモデルは事業者団体中心の取り組みに消費者団体、行政が協力するという枠組みであるが、他方、わが国では、個別企業による自主行動基準策定によるコンプライアンスメカニズムが近時強調されている。そこで、このような個別事業者によるコンプライアンスメカニズムと事業者団体主体のそれとの法政策面での比較検討、及び両者はどのような関係にあるべきかについての検討をも行った。また、ISOにおける消費者保護のためのいくつかの国際標準化作業についても情報収集を行った。本研究は、わが国において、消費者契約法や金融商品販売法等、事業者による自主規制を促進する法制化が進みつつある現状において、事業者団体による自主規制規範の制定や裁判外紛争処理制度の一種であるビジネス・オンブズマン制度の面で、注目に値する実績をあげてきているいくつかの海外諸国を対象に、行政規制と自主規制の関係、事業者の自主規制制度とビジネス・オンブズマン制度の現状と特徴、消費者及び行政の参加による共同規制への試みの現状を調査し、その上に立って、自主規制制度を含めた消費者法モデルを析出し、21世紀にあるべき消費者重視の日本型モデルを提案することを目的としている。その中で、平成12年度は、研究の初年度として、カナダとオーストラリアの事業者・事業者団体による自主規制について、外枠としての法規制の内容と自主規制との関係、それぞれの歴史的発展経緯、両者の中間形態としての共同規制や標準化への動きに注意を払いながら、全体的な把握につとめた。具体的には、カナダについては、電子商取引の分野における消費者保護のための標準化という視点から産業省消費者問題局やカナダ標準会議の調査を行った。オーストラリアについては、いくつかの業界オンブズマン及びコンプライアンス専門家を相手とした調査を行うとともに、財務省タスクフォースによる「消費者市場における業界自主規制」最終報告書の検討を行った。また、国際標準化機構消費者政策委員会の年次総会(京都市)において、松本がパネリストとして講演するとともに、各国の関係者と情報交換を行った。本研究は、わが国において、行政による事前規制を中心とした消費者政策から、消費者利益擁護のための事業者による自主規制を市場を通して促進する政策の重視が求められている現在において、事業者団体による自主規制規範の制定やADRの一種であるビジネス・オンブズマン制度の面で、注目に値する実績をあげてきているいくつかの国を対象に調査・研究し、そこから得られる成果をもとに日本における21世紀型の消費者法モデルを析出することを目的としている。平成13年度においては、前年度に収集したデータを下により掘り下げた検討を行うこととし、共同規制においてとりわけ顕著な成果を挙げているオーストラリアについて、集中した調査を行った。タンが、オーストラリア法改革委員会(6月)、消費者問題専門家会議(10月)、コンプライアンス専門家会議(11月)に出席して最新の情報を収集するとともに、いくつかの団体から、自主規制規範、ADR、コンプライアンスの関係についてヒアリングし、実態調査を行った。また、この分野での世界の第一者であるビル・ディー氏の来日を機会に、内閣府、経済産業省、帝塚山大学においてシンポジウムやスタッフセミナーを行い、意見を交換した。また、松本は、ISOの消費者政策委員会総会(5月)に出席して、自主規制規範、企業の苦情処理、業界ADRについての国際規格化の動向を調査した。オーストラリアの調査との対比でも、ISOの調査の対比でも、わが国では、事業者団体を軸にした共同規制の考え方が希薄であることが明らかになった。

また、本研究の成果は、松本及びタンがとりまとめに参加した、国民生活審議会消費者政策部会自主行動基準検討委員会の、事業者による自主行動基準の策定・公表とその遵守体制の整備を求める中間報告の内容の一定部分に反映している。本研究は、わが国における消費者政策の第3の波として、消費者利益擁護のための事業者による自主規制を市場を通して促進することが重視されている現在において、事業者団体による自主規制規範の制定やADRの一種であるビジネス・オンブズマン制度の面で、注目に値する実績をあげてきている諸国について調査・研究し、そこから得られる成果をもとに日本における21世紀型の消費者法モデルを析出することを目的としている。平成14年度においては、過去2年間の調査研究において収集したデータを下に、各国の比較、とりわけもっとも成功していると言われているオーストラリアのスキームと日本の類似スキームとの比較を行い、日本におけるあるべき自主規制規範制度及びそのコンプライアンス・メカニズムの一環としてのビジネス・オンブズマン制度について、行政規制との関係、消費者や行政関係者の参加による共同規制の可能性を含めて、法政策的な検討を行った。あわせて、わが国固有の状況から出てきている、個別企業による自主行動基準策定によるコンプライアンスメカニズムと、事業者団体主体のコンプライアンスメカニズムの法政策面での比較検討、及び両者はどのような関係にあるべきかについての検討を行った。また、ISOにおける消費者保護のためのいくつかの国際標準化作業についても情報収集を行った。
虚血による過活動膀胱発症メカニズムの解明と新規治療法の確立

本邦では高齢化に伴い、過活動膀胱の発症は急増し、治療法の確立が急務とされている。近年、膀胱虚血による過活動膀胱(OAB)発症機序が注目されている。これまで我々は世界初の慢性膀胱虚血ラットモデル作成に成功し、OABへの酸化ストレスの関与を解明した。本研究において更に、慢性膀胱虚血ラットを用いてOABの病態を最終的にジャッキさせるとされる求心性神経活動を調べた。新規薬剤としてアンギオテンシンII受容体拮抗薬であるARBに検討を行った。具体的には膀胱虚血ラットにARBの投与を行い、排尿動態、酸化ストレス及び求心性刺激を測定し、改善効果を評価した。平成25年度の研究においては12週齢の雄ラットを使用し、両側総腸骨動脈内皮損傷作成を行い膀胱虚血ラットとした。この方法としては、血管拡張用のカテーテルを用いて総腸骨動脈に挿入、バルーンを擦過し内膜の肥厚と内膜の狭小化を引き起こすものである。実際にこの手術を施行したラットの総腸骨動脈の血管肥厚を組織学的に確認し、膀胱括約筋が過活動膀胱における病態と同様な収縮反応を引き起こすことを証明した。また4週後に特殊なゲージを用いてそれぞれの排尿動態を測定すると、一回排尿量の低下と排尿回数の増加を認め、人間における過活動膀胱患者と同じ排尿障害を呈することを確認した。つぎに求心性の刺激が増加することを確認するため、脊髄L6後角のc-fos発現を検討中である。今後さらにこの総腸骨動脈損傷ラットを用いて、ARB投与を行い、排尿動態に対する改善効果を検討予定である。
骨粗鬆症の病態制御へのIRISINと協調する新分子機構とエピジェネティクスの解明

骨粗鬆症の病態制御に向けて新しい戦略基盤の確立のために、IRISINと協調する副甲状腺ホルモン受容体(PPR)のシグナルとの相互作用に基づく骨形成促進の分子機構に着目した。まずIRISINが硬組織に発現することを時系列で検討した。その結果、IRISINの硬組織における発現とその時間依存性を明らかにした。さらに硬組織におけるエピジェネティック制御研究として、ヒストンメチル化酵素G9aに注目して解析をおこないmRNAおよび蛋白の局在を明らかにし、酸化ストレスでLgr4のmRNAのレベルが抑制されることイリシンと協調する副甲状腺ホルモン受容体のシグナルとb2AdRの相互作用を明らかにした。本年は骨粗鬆症の病態制御に向けて新しい戦略基盤の確立のために、IRISINと協調する副甲状腺ホルモン受容体(PPR)のシグナルとの相互作用に基づく骨形成促進の分子機構に着目した。さらに硬組織におけるエピジェネティック制御研究として、ヒストンメチル化酵素G9aに注目して解析をおこないmRNAおよび蛋白の局在を明らかにした。PPRシグナルの骨粗鬆症に対する骨量増加のメカニズムはなお十分には明らかでないことから、骨形成のアナボリックな作用を老化の観点から検討する新しい遺伝子のLgr4の解析を行った。その結果、酸化ストレスとして用いた過酸化水素により骨芽細胞様細胞MC3T3EにおけるLgr4のmRNAのレベルが抑制されることが明らかとなった。この酸化ストレスによる骨芽細胞様細胞MC3T3EにおけるLgr4のmRNAのレベルの抑制は0.1mMで有意差はなかったが1mMでは50%以上の抑制として観察された。酸化ストレスによる骨芽細胞様細胞MC3T3EにおけるLgr4のmRNAのレベルの抑制は時間依存性であり12時間以内に観察されその後48時間まで持続していた。制御モードの検討では酸化ストレスによる骨芽細胞様細胞MC3T3EにおけるLgr4のmRNAのレベルの抑制は転写阻害剤DRBの存在下ではなおも観察されたが、一方でたんぱく質合成阻害剤の存在下では観察されないことから酸化ストレスによる骨芽細胞様細胞MC3T3EにおけるLgr4のmRNAのレベルの抑制は新蛋白の合成を必要とする転写後性の制御によると推察された。従ってLgr4が骨芽細胞では酸化ストレスにより制御されこのことから骨量制御に寄与することが示唆された。IRISINの硬組織における発現を解析して時系列的な側面を明らかにした。さらにエピジェネテイックな制御に関わる分子の存在を見出した。さらにPTHのアナボリック作用に関わる骨芽細胞の骨形成の制御に機能する新しい分子のLgr4はメカニカルストレスに関連する酸化ストレスにより制御されることが初めて明らかとなった。これまでLgr4はアイスランドの国民の全ゲノム解析により骨粗鬆症と関連することが報告されているがメカニカルストレスに関連する骨形成の主体である骨芽細胞における働きは十分には明らかとされていなかった。今回、化ストレスとして用いた過酸化水素により骨芽細胞様細胞MC3T3EにおけるLgr4のmRNAのレベルが抑制されることが明らかとなった。酸化ストレスは老化とも関連しており、骨量のレベルがメカニカルストレスにより維持されることが老化により効率の低下した状況では、よりマイナスの状況になることが推察されるが、酸化ストレスにより骨芽細胞様細胞MC3T3EにおけるLgr4のmRNAのレベルが抑制することはその一部を担う可能性がある。今後IRISINとの関連やPTHによる骨形成促進、アドレナリン受容体との連関においてLgr4が持つ意義を解明することにより重要な基礎的基盤を与えるものとなることが期待される。骨粗鬆症の病態制御に向けて新しい戦略基盤の確立のために、イリシンと協調する副甲状腺ホルモン受容体(PPR)のシグナルとベータ2アドレナリン受容体(b2AdR)シグナルの相互作用に基づく骨形成促進の分子機構を明らかにすることを目的とした。ベータ2アドレナリン受容体は副甲状腺ホルモン受容体によるシグナルに基く骨の形成促進作用に必須である。従ってPTHのシグナルがベータ2アドレナリン受容体のシグナルで制御をうけていることが推察されるがその二つの受容体がどのように相互作用をするかは明らかでなかった。そこでベータ2アドレナリン受容体のシグナルがそれ自身は比較的短い時間のみ細胞内においてcAMPシグナルを伝えるが一方でこのシグナルが副甲状腺ホルモン受容体によるシグナルに対しては核内のPKAならびにCREBの活性をより長く聞かせることが明らかとなった。このメカニズムはエンドソーム上に細胞表面からリガンドの結合のあとで移行した副甲状腺ホルモン受容体が細胞内においてエンドソームに存在したままでcAMPを造り続ける時間がベータ2アドレナリン受容体によって延長することによるものであることが観察された。この際のcAMPの産生の増加においてはG蛋白とアデニルシクラーゼの相互作用が必須であった。ベータ2アドレナリン受容体シグナルはG蛋白複合体の一定のプールを遊離させこのことがさらなるエンドソームのcAMP増加作用にいたるものと考えられた。またこのような分子の作用が起こる場となる間葉系の細胞の発生期におけるGPCRと相互作用の推察されるイリシンの発現の時間経過を見出した。

その結果、IRISINの硬組織における発現とその時間依存性を明らかにした。さらに硬組織におけるエピジェネティック制御研究として、ヒストンメチル化酵素G9aに注目して解析をおこないmRNAおよび蛋白の局在を明らかにし、酸化ストレスでLgr4のmRNAのレベルが抑制されることイリシンと協調する副甲状腺ホルモン受容体のシグナルとb2AdRの相互作用を明らかにした。本邦ではおよそ1200万人に影響を及ぼしている骨粗鬆症は、非常に多くの患者の存在する疾患でありながら、適切な骨形成の機構はなお明らかではなくこれに必須である骨芽細胞の制御シグナルについてはなお十分には解明されていなかった。今回のIRISINの硬組織における存在並びに骨の形成に関わる新しい分子のLgr4がメカニカルストレスに関連する酸化ストレスにより制御されることが初めて明らかとなったことは今後の研究の上でこれらの分子の重要性を示すものである。これまでLgr4はアイスランドの国民の全ゲノム解析により骨粗鬆症以外の疾患とも関連することが報告されている。現在骨粗鬆症は全身の虚弱性として筋肉の低下やロコモとの関連が示唆されている。メカニカルストレスに関連する骨形成の主体である骨芽細胞における働きはLgr4とともに働く接着分子などとの関連がなお十分には明らかとされていない。細胞レベルでのLgr4解析の結果に基づきさらにIRISIN,PTH,アドレナリン受容体がメカニカルストレスとLgr4や接着分子等とともに新たなメカニズムとして骨形成の新分子機構を中核に解明する予定である。整形外科学研究計画の上で消耗品を次年度で購入することが必要であったため消耗品の購入に使用する(プラスチック製品、抗体など組織化学的試薬、動物)
葉緑体分裂を制御する膜脂質シグナル経路の解析

申請者はこれまでに葉緑体包膜脂質ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI4P)が葉緑体分裂因子PDV1と結合して葉緑体の分裂を制御していることを明らかにし、その合成酵素PI4Kα1を同定した。本研究では、PI4Pの可視化プローブを用いて葉緑体上のPI4Pの局在を調べた。PI4Kα1の発現は葉、根などでは弱く、雄しべや雌しべなどで強いことがわかった。発芽後初期の生育にPI4Kα1が重要なことが示唆された。PDV1と結合する可能性のあるタンパク質を多数単離し、その中には相互作用が知られていない葉緑体関連因子があった。今回同定した中に未知の葉緑体分裂関連因子が含まれていることが期待される。葉緑体分裂は分裂装置により葉緑体包膜が分断される機構である。我々はこれまでに膜脂質ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI4P)が葉緑体分裂因子PDV1と相互作用し、葉緑体分裂を制御していることを明らかにした。本研究では葉緑体膜上のPI4Pの動態の詳細を明らかにし、葉緑体上のPI4Pやその合成酵素PI4Kα1によって制御される他の現象を探索し、またそのシグナル経路を制御する因子を明らかにすることなどを目的としている。本年度は、PI4Pの可視化プローブを発現しているシロイヌナズナとPDV1、PDV2、DRP5Bなどの欠損変異体および過剰発現体のかけ合わせを行った。これらの観察を行い、葉緑体分裂時のPI4Pの挙動の解析を進めている。葉緑体のPI4Pの主要な合成酵素であるPI4Kα1について、蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子導入株の作製を行った。この融合タンパク質をpi4kα1ヘテロ欠損株に発現させたところ、通常では致死になると考えられるpi4kα1遺伝子をホモに欠損した個体を単離できたことから、この融合タンパク質がPI4Kとして正常に機能していることが確かめられた。これを用いてPI4Kα1の局在パターンや発現パターンの解析を行い、期待通り細胞質への局在を観察することができた。発現は葉、根などでは弱く、雄しべや雌しべなどで強い蛍光が確認された。PI4Kα1の発現抑制を誘導できる株では、発芽まもなく発現抑制をすると発現抑制の強さに相関して発育の阻害がみられた。特に、強い発現抑制が起こるラインでは、播種後4日で発現抑制を誘導するとほとんど生育できずに枯死してしまうが、誘導時期を遅くすると、生育があまり阻害されないことがわかり、発芽後初期の生育にPI4Kα1が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。我々はこれまでに膜脂質ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI4P)が葉緑体分裂因子PDV1と相互作用し、葉緑体分裂因子DRP5Bの葉緑体分裂面への局在量を調節することで、葉緑体分裂を制御していることを明らかにした。さらに、PI4PとPDV1による制御を受ける未知の葉緑体分裂関連因子の同定を目指している。本年度は未知の葉緑体分裂因子の候補として、DRP5Bと進化的にもっとも近いと考えられるDRP5Aに注目して研究を進めた。DRP5Aの欠損変異体をストックセンターから取り寄せ、DRP5Bとのかけ合わせを進めている。さらに未知因子の探索を行うため、PDV1に対する抗体の作製を行った。PI4Kα1の発現抑制を誘導できる株を使った解析では、強い発現抑制が起こるラインでは、播種後4日で発現抑制を誘導するとほとんど生育できずに枯死してしまうが、直接種子を発現抑制を誘導する培地に播種した場合にはほとんどの種子が発芽したことから、種子の発芽にはPI4P量の減少があまり影響しないことが示唆された。しかし、発芽した植物体はほとんど成長せず枯死してしまったことから、発芽後の生育にはPI4Pが重要な役割を果たしていることがわかった。抗PDV1抗体の作製が予定より遅れたため、今年度は抗体の作製のみでそれを用いた解析にまで進むことができなかった。葉緑体包膜のPI4Pのみを特異的に減少させる植物の作出の試みを今年度に予定していたが、今年度中には作製できなかった。本研究では葉緑体上のPI4Pの動態の詳細を明らかにし、葉緑体上のPI4Pやその合成酵素PI4Kα1によって制御される他の現象を捜索し、またそのシグナル経路を制御する因子を明らかにすることなどを目的としている。本年度は、平成27年度に作製した抗PDV1抗体を用いて、PDV1と結合するタンパク質の探索を行った。

シロイヌナズナPDV1遺伝子欠損体(pdv1)とPDV1遺伝子過剰発現株(PDV1ox)をPI4K阻害剤でそれぞれ処理し、植物体を破砕し葉緑体を分画した。分画した葉緑体画分を界面活性剤で処理し、PDV1を含む膜タンパク質を可溶化させた液と抗PDV1抗体を用いて免疫沈降を行い、得られたタンパク質を質量分析法により同定し、pdv1とPDV1oxで比較したところ、100個強のタンパク質がPDV1oxのみで同定された。その中には、PDV1と相互作用が確認されている葉緑体分裂関連因子や、相互作用が確認されていない葉緑体分裂関連因子が含まれていた。よって、本研究により、葉緑体分裂因子同士の新たな相互作用の可能性が示唆された。また、今回同定されたタンパク質の中に目的とした未知の葉緑体分裂関連因子が含まれている可能性があり、今後の解析によって新規の葉緑体分裂の制御機構が明らかになることが期待される。申請者はこれまでに葉緑体包膜脂質ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI4P)が葉緑体分裂因子PDV1と結合して葉緑体の分裂を制御していることを明らかにし、その合成酵素PI4Kα1を同定した。本研究では、PI4Pの可視化プローブを用いて葉緑体上のPI4Pの局在を調べた。PI4Kα1の発現は葉、根などでは弱く、雄しべや雌しべなどで強いことがわかった。発芽後初期の生育にPI4Kα1が重要なことが示唆された。PDV1と結合する可能性のあるタンパク質を多数単離し、その中には相互作用が知られていない葉緑体関連因子があった。今回同定した中に未知の葉緑体分裂関連因子が含まれていることが期待される。本年度に予定していた種々の遺伝子組み換え体などの作製はほぼ予定通りに完了し、それらを用いた解析をはじめることができている。PI4Kα1の発現抑制を誘導できる株を使った解析によって、発芽後初期の生育にPI4Kα1が重要な役割を果たしている可能性が示唆され、葉緑体分裂との関連をさぐる重要な手がかりを得ることができたと考えている。drp5a drp5b二重欠損株が得られたら、表現型の解析を行う。表現型が出ない場合にはDRPファミリーの他の遺伝子も候補にする。作製した抗PDV1抗体を使い、PDV1と相互作用する未知因子の探索を行う。PI4Kα1の発現抑制を誘導できる株や、PI4Kα1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させた株、PI4Pの可視化プローブを発現させた株など、現在までに作出した様々な植物体を用いて、PI4Pの動態の詳細、PI4Pの関わる他の現象の探索や葉緑体分裂との関わりなどを解析していく。植物生理学現在進行中の葉緑体分裂時のPI4Pの挙動の解析や、様々な時期にPI4Kα1の発現抑制を誘導したときの影響の解析などを引き続き行う。これまでに得られた結果をふまえ、発芽初期の生育におけるPI4Kα1の役割や葉緑体分裂との関係などをより詳細に解析していく計画である。平成27年度以降の計画として予定していた葉緑体外包膜のPI4Pが制御するシグナル経路の探索やDRP5Bと独立にはたらきPI4Pの制御を受ける葉緑体分裂因子の探索なども予定通り進めていきたいと考えている。研究の進捗が計画より遅れたため。本年度に受理された学術誌論文の掲載料の支払いを予定していたが、その請求が本年度中にこなかったため。今年度に計画されていた研究の遅れ分は来年度に行い、それらの実験に必要な試薬・消耗品などの購入に使用する。論文掲載料に使用する。