hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
弛緩部型中耳真珠腫の発症・進展機序の解明と予防・治療に関する研究

真珠腫の病態に合わせた適切な術式選択は再発を防止する上で重要であり、また術後聴力成績にも影響を与える。真珠腫の形成や上皮の進展は、表皮と線維芽細胞を主体とする表皮下組織のオートクラインやパラクラインによる表皮の増殖・分化の亢進、上皮のmigration障害によるdebris形成と炎症の持続など、悪循環により拡大進展すると考えられた。中耳粘膜の再生に関しては、培養中耳粘膜組織の作成と移植実験に成功。すなわち家兎の中耳粘膜から三次元的な中耳粘膜を作成し、それを他の家兎に移植し、形態的にも生理学的にも正常に近似する粘膜が形成された。これまで表皮の増殖・分化におけるサイトカインや細胞周期関連物質の関与、表皮の分化と細胞死などについて検討してきた。その結果、真珠腫の進展は炎症の悪循環であり、多くのサイトカインネットワークが関与することが推測された。また表皮の最終分化に深く関与するinvolucrin、各種のPKCと阻害因子について検討では、真珠腫上皮の増殖においては各種の炎症性サイトカインの発現が亢進するものの、分化と細胞死に関しては正常上皮と同様に行われること、また上皮と上皮下組織は密接に関連しながら病態を形成するなどが理解された。その中でも真珠腫上皮の活性に深く関与するものとして上皮下の線維芽細胞の存在がある。真珠腫進展においてこの線維芽細胞の果す役割について検討した結果、中耳真珠腫においても線維芽細胞が病態を決定するような表現型を持つことによって局所免疫を制御し、またparacrine loopによるケラチノサイトの増殖も制御している可能性が考えられた。そしてEpidermal growth factor(EGF)familyに属する増殖因子であるEpiregulinが正常皮膚由来と比較して中耳真珠腫由来の細胞において優位にmRHAが増強していた。また免疫組織の検討では、Epiregulinは中耳真珠腫のケラチノサイトと線維芽細胞に強発現しており、病態との関連が強く示唆された。すなわち感染によって活性化されたケラチノサイトやその他の炎症性細胞から産生される因子が、線維芽細胞からのEpiregulinの産生を惹起させ、再びケラチノサイトの増殖や分化に関与するというメカニズムの存在が示唆された。平成19年度は、このような基礎的な研究に加え、術前・後、手術所見から臨床病態の解明や、手術成績などを学術誌、学会報告をしてきた。臨床病態の解析を継続的に行った。今年度での手術所見などの臨床所見からも、従来から指摘している我々の真珠腫の成因(炎症による表皮細胞の増殖・分化、ならびに表皮下組織の障害など)を肯定する所見が得られた。手術の工夫にしても、遺残性再発に対しては、内視鏡を術中に使用することにより効果があがり、再形成性再発に対しては、薄い軟骨片による鼓膜形成や鼓室形成術も有る程度の効果のあることが理解できた。真珠腫上皮のモデルとして培養表皮細胞を用いて細胞周期関連物質であるcdk2(cyclin dependent kinase2)、cdk4の発現を調べると、IL-1αとKGFの刺激によりその発現が充進することがわかった。これまでの研究結果と併せて考えると、真珠腫では上皮下の炎症によりIL-1αやKGFをはじめとする各種の炎症性サイトカインの発現が亢進し、その影響を受け表皮細胞におけるcdk2、cdk4がup-regulateされ表皮細胞の増殖を来たすと考えられた。20年度は白色家兎の中耳粘膜および鼻粘膜から温度応答性感受性皿を用いた粘膜細胞シートを作成し、組織学的検討を行った結果では、中耳粘膜細胞シートおよび鼻粘膜細胞シートは正常中耳粘膜とほぼ同等の構造を呈した。すなわちH-E染色では単層の粘膜上皮と線維芽細胞を含む上皮下の構造が認められ、上皮のマーカーであるサイトケラチンおよび上皮下組織のマーカーであるVimentinで免疫染色を行ったところ、各々適正な部位に発現を認めた。電子顕微鏡所見でも微絨毛が観察され、正常粘膜組織に近似した構造を呈した。この結果をもとに動物実験を進めている。術式ごとの手術成績を分析した結果、真珠腫の病態に合わせた適切な術式選択は再発を防止する上で重要であり、また術後聴力成績にも影響を与えることが理解された。真珠腫上皮、上皮下組織、(表皮の増殖・最終分化やアポトーシス機構、上皮バリアー機構や基底膜変化)の検討では、真珠腫の形成や上皮の進展は、鼓膜上皮の陥凹だけでは起こらず、炎症の持続など別の要因が加わることが不可欠と考えられた。真珠腫上皮の増殖においては各種の炎症性サイトカインの発現が亢進するが、分化と細胞死に関しては正常上皮と同様に行われること、また上皮と上皮下は密接に関連しながら病態を形成するなどが理解された。

すなわち表皮と線維芽細胞を主体とする表皮下組織のオートクラインやパラクラインによる表皮の増殖・分化の亢進、上皮のmigration障害によるdebris形成と炎症の持続など、悪循環により拡大進展すると考えられ、この背景には、炎症の反復による乳突蜂巣の発育障害やfold形成など軟性形態の構造変化があり、幼小児期における滲出性中耳炎など中耳炎症病変のcontrolが予防の中心となると推測された。上皮下線維芽細胞の役割の研究では、IL-1αで刺激した線維芽細胞において包括的に遺伝子発現解析をおこなった結果、GM-CSF、TGF-α、Epiregulin、ICAM)-1などは中耳真珠腫由来の線維芽細胞において有意にmRNA発現が増強していた。とくにEpiregulinの免疫組織学的検討では、Epiregulinは中耳真珠腫のケラチノサイトと線維芽細胞に強発現しており、病態との関連が強く示唆された。中耳粘膜の再生では、家兎の中耳粘膜から三次元的な中耳粘膜を作成し、それを他の家兎に移植し、形態的にも生理学的にも正常に近似する粘膜が形成された。
ヒト肝臓のグルコース代謝調節に対する肝疾患の影響に関する研究:ピルビン酸脱水素酵素キナーゼとホスファターゼの発現に対する影響

【目的】ピルビン酸脱水素酵素(PDH)複合体は、ミトコンドリアの代表的酵素である。PDH複合体は、バリン代謝系の律速酵素、(branched-chain α-ketoacid dehydrogenase(BCKD))と極めて類似した酵素であり、その活性はBCKD複合体と同様に特異的kinase(PDH kinase)とphosphataseにより調節されることが明らかにされている。最近、PDK kinaseには4つのアイソザイムが存在することが明らかにされた。本研究では、グルコース代謝の律速酵素であるPDH複合体の活性を調節するkinaseの遺伝子発現と、それに及ぼす肝疾患の影響をヒト肝臓において調べた。また同時にバリン代謝系の酵素に対する肝疾患の影響も検討した。【対象と方法】正常肝、慢性肝炎、硬変肝、および肝細胞癌を肝切除時に採取した。肝組織の総RNAを抽出し、PDHkinase(PDK)の各アイソザイム(1型4型)のmRNA量をRT-PCR法によって定量した。またバリン代謝系のkey enzymeであるmethacrylyl-coenzyme A(MC-CoA)hydrataseとβ-hydroxyisobutyryl-coenzyme A(HIB-CoA)hydrolaseの酵素活性を分光学的方法にて測定した。さらにこれらの酵素のmRNAをRT-PCR法によって定量した。【結果】PDKアイソザイムのmRNA量では、正常肝においてはPDK4が最も高く、次いでPDK2、PDK1の順であった。PDK3は検出されなかった。PDK2およびPDK4は、正常肝に比べて硬変肝と肝細胞癌では、有意差はないが低下傾向を認めた。MC-CoA hydratase活性、HIB-CoA hydrolase活性は、正常肝に比べ、硬変肝と肝細胞癌において有意に低下していた。一方、これら酵素のmRNA量は、硬変肝においては、高値を示すものの、肝癌、慢性肝炎では正常肝と差はなかった。【考察】PDK2とPDK4のmRNA量は肝疾患により減少する傾向があり、肝疾患に伴う糖代謝異常に影響を与えている可能性が示唆された。また、肝疾患時のバリン代謝系酵素の活性低下は、酵素発現における遺伝子情報伝達後の調節により制御されることが示唆された。【目的】ピルビン酸脱水素酵素複合体はミトコンドリアにおけるエネルギー産生において重要な酵素であるのみならず解糖系とトリカルボン酸サイクルを調節している重要な酵素でもある。ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(PDK)によってリン酸化され不活性化されるが、PDKには4つのisoenzyme(PDK1,PDK2,PDK3,PDK4)が存在することが明らかになり、その遺伝子が同定された。今回我々は、人の正常肝組織と硬変肝、肝細胞癌をもちいてこれら4種類のPDKのmRNAを定量しisoenzymeパターンを分析した。【対象と方法】

肝組織は肝細胞癌や転移性肝癌に対する肝切除時に採取し、肉眼所見と病理組織所見から正常肝(n=8),硬変肝(n=8),肝細胞癌(n=8)の3群に分類した。これら肝組織からtotalRNAを抽出し、RT-PCR法を用いてPDK1とPDK2、PDK3、PDK4のmRNAを定量した。RT-PCRに用いるプライマーは[H-^<32>P]ATPでラベルした。RT-PCR後、約350bpのPCR産物が得られた。電気泳動を行いこれらの放射活性をlaser imageanalyzerで測定した。【結果】正常肝におけるPDKのmRNAのisoenzymeはPDK4>PDK2>PDK1でありPDK3は検出されなかった。これは、硬変肝、肝細胞癌においても同様であった。また、発現量は正常肝と硬変肝、肝細胞癌で同程度であった。【考察】ヒト肝においてはPDKの4つのisoenzymeのうちPDK4が最も強く発現していた。飢餓や糖尿病がラット心筋においてPDK4を誘導することが最近明らかにされた。術前の絶食と外科的なストレスにより、患者から得られた肝組織においてPDK4が誘導された可能性がある。これは、ピルビン酸脱水素酵素複合体を不活性化するという意味で極めて重要なことと考えられる。PDK4はヒト肝組織において極めて重要な酵素であると考えられる。【目的】ピルビン酸脱水素酵素(PDH)複合体は、ミトコンドリアの代表的酵素である。PDH複合体は、バリン代謝系の律速酵素、(branched-chain α-ketoacid dehydrogenase(BCKD))と極めて類似した酵素であり、その活性はBCKD複合体と同様に特異的kinase(PDH kinase)とphosphataseにより調節されることが明らかにされている。最近、PDK kinaseには4つのアイソザイムが存在することが明らかにされた。本研究では、グルコース代謝の律速酵素であるPDH複合体の活性を調節するkinaseの遺伝子発現と、それに及ぼす肝疾患の影響をヒト肝臓において調べた。また同時にバリン代謝系の酵素に対する肝疾患の影響も検討した。【対象と方法】正常肝、慢性肝炎、硬変肝、および肝細胞癌を肝切除時に採取した。肝組織の総RNAを抽出し、PDHkinase(PDK)の各アイソザイム(1型4型)のmRNA量をRT-PCR法によって定量した。またバリン代謝系のkey enzymeであるmethacrylyl-coenzyme A(MC-CoA)hydrataseとβ-hydroxyisobutyryl-coenzyme A(HIB-CoA)hydrolaseの酵素活性を分光学的方法にて測定した。さらにこれらの酵素のmRNAをRT-PCR法によって定量した。【結果】PDKアイソザイムのmRNA量では、正常肝においてはPDK4が最も高く、次いでPDK2、PDK1の順であった。PDK3は検出されなかった。PDK2およびPDK4は、正常肝に比べて硬変肝と肝細胞癌では、有意差はないが低下傾向を認めた。
長周期海洋変動に対する固体地球の荷重応答の研究

非潮汐性の長周期海洋変動に対する固体地球の荷重応答を計算するシステムを構築した。まず、調査研究旅費を用い、海洋の質量移動を記述するデータベースを調査を行った。その結果、NASA JPLで開発された海洋大循環モデルのアウトプット(ECCO2)のうち、海底圧力変動データが適当であると判断した。このデータベースは、生の海面局度計データと異なり、質量変化に寄与しないバロクリニック成分を含んでいないため、本研究の目的に適する。1993年から2002年の10年間のデータを解析した。まず海底圧力の10年間の平均場を求め、この平均場からの変動成分を海水の高さの変動に変換し、1日毎に1度グリッド化した。次に毎日の海水面の変動場を球面調和関数の180次まで展開し、その展開係数に荷重ラブ数を作用させることによって、荷重変位のマップを作成した。全体で3657日分の全球マップを作成した。この荷重マップ群を用いれば、地球上の任意の点について非潮汐性海洋変動による荷重変位の時系列を得ることが出来る。例として、アンテナの年周変位をmmの精度で予測する必要があるVERA計画の観測点のうち、水沢・小笠原・石垣の各局の変位の時系列を調べたところ、それぞれ最大で、±3.6mm、±2.9mm、±2.2mmの変動をすることが予測された。島嶼の小笠原・石垣よりも内陸に位置する水沢の変位が一番大きかったのは予想外であったが、これは日本海の海洋変動の影響が予想以上に大きかったためである。今後は、GPS等独立な観測との比較による検証を行った後、成果をまとめ学術雑誌に公表し、荷重変位マップはウェブ上で一般に公開する予定である。1.荷重応答を畳み込み積分を用いて見積もるソフトウエアの改修を開始した。一般に、このような計算は、(1)全球の細かいグリッドヘの分割、(2)各グリッドにおける水質量が地球表面のある点(評価点)におよぼす荷重の影響の評価、という手順を踏む。高速化のためのアルゴリズム改良として、(1)についてはグリッド分割の最適化、(2)についてはグリッド点と評価点の角距離に関する対象性の利用を検討した。改修自体はまだ完了していないため、来年度も引き続きソフトウエア開発を継続する。3.ECCOプロダクトを用いた予備的な解析を行った。海面高度、および表面海水温度の1度グリッドデータの180次までの球面調和係数から全球的な荷重変形のスナップショットを描く試験計算を行った。温度係数の検討、regional modelとの比較などを引き続いて行う予定である。
非アルコール性脂肪性肝炎の食事療法の有効性とそのメカニズム

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の発症には生活習慣が関与するとされている。我々の研究グループは、食事の摂取により線維症を伴う脂肪性肝炎を発症するモデル動物SHRSP5/Dmcrを開発した。これを用いて、NASHに対する食事介入の有効性について評価することを本研究の目的とした。NASHは重症化すると肝硬変を含む肝線維症を発症するが、線維化が観察される以前の介入は生化学的、組織学的に改善が認められた。また、線維化進展以降の介入であっても、線維化を進展させるシグナル伝達系の発現は抑制されており、食事介入の意義が示された。高脂肪・高コレステロール(HFC)飼料の摂取により高度の線維症を伴う脂肪性肝炎を発症するSHRSP5/Dmcrを用いて、脂質コントロールを主体とした食事介入の有効性について検討を行うことを目的とし、HFC飼料を継続的に投与した群と、一定期間HFC飼料を摂取した後に飼料を普通(SP)試料に置換した群を比較した。これまでの報告通り、HFC試料の摂取期間依存的に肝臓が肥大し、脂肪沈着、炎症細胞浸潤が観察された。血中及び肝臓中のコレステロール値が著しく上昇していたが、血中の中性脂肪値は変動せず、肝臓中では増加の後に病態の進展に伴い低下する傾向にあった。また、HFC飼料の2週間では顕著な線維沈着は観察されず、8週間では重篤な線維症を発症していた。SP飼料への置換による脂質コントロールにより、肝重量、血中および肝臓中のコレステロール値、肝障害マーカー値が顕著に低下した。しかし、HFC飼料8週間投与後に食事介入を行った群では肝臓中のコレステロール値はベースラインの値までは低下しなかった。また、組織学的には、食事介入により脂肪肝および炎症所見が著しく軽減し、肝実質の類洞構造が回復したが、線維化に対しては大きな変化が認められなった。以上のことから、線維症を伴う脂肪性肝炎に対する脂質コントロールを主体とした食事介入は、肝臓への脂肪沈着および炎症細胞浸潤に対しては速やかにその効果を示すが、線維症に対する影響はさらに長期的な検討が必要であることが示された。また、我々のグループによる先の研究において、食事によるコレステロールの負荷は肝臓のコレステロール取込みおよび生合成経路に異常を来たさず、むしろその代謝産物である胆汁酸の合成促進と排出抑制が肝障害を誘導している可能性が示されている。申請者の実験においても、食事介入によるコレステロール摂取量の変化がこれらの経路に影響を与えたことが考えられる。高脂肪・高コレステロール(HFC)飼料の摂取により高度の線維症を伴う脂肪性肝炎(非アルコール性脂肪性肝炎:NASH)を発症するSHRSP5/Dmcrを用いて、脂質コントロールを主体とした食事介入の有効性について検討を行うことを目的とし、HFC飼料を継続的に投与した群(NASH群)と、一定期間HFC飼料を摂取させた後に飼料を普通(SP)飼料に置換した群(食事介入群)を比較した。平成25年度に行った動物の飼育、サンプル採取、血液生化学検査、組織所見の評価に引き続き、平成26年度はさらに詳細な分析として、ウエスタンブロッティング法を用いたタンパク発現の分析、免疫染色法を用いた評価を行った。NASH群ではHFC飼料の継続的な摂取により、脂質代謝に関与する因子(DGAT、CPT、ACC)の発現が顕著に低下したが、食事介入群ではそれらがすべて正常化した。また、HFC飼料の摂取は肝線維化を誘導する因子(TGF-β1、α-SMA)の発現を著しく増加させたが、その後の食事介入はそれらを低下させた。NASH群の肝組織では多くのCD68陽性細胞が散在しており、重篤な線維化が観察されたが、食事介入群ではCD68陽性細胞の局在は線維化部分に限られた。これらのことから、食事介入はすでに形成された肝線維化を明らかに改善するには至らなかったが、線維化誘導に関与するシグナル伝達は抑制されていることが明らかとなり、食事介入の有効性が示された。また、CD68陽性細胞は食事介入後も一部残留しており、更なる治療の必要性が示された。総合領域、生活科学、食生活学2013年度に実施を予定していた動物の飼育および試料の採取、実験サンプルの調整、血液生化学検査はすでに行った。また、肝臓中脂質含量の定量、組織標本の作製および観察もすでに実施した。2014年度は得られたデータを基に、そのメカニズムを明らかにするための分析を行う。病態に対する食事介入の影響の機序を明らかにするため、ウエスタンブロット法により、脂質の分解・合成に関与する因子、線維化進展に関与する因子の発現量の分析を行う。これらを実施し、関連因子のシグナル伝達を分析することにより、表現型として観察された所見だけではなく、分子レベルでの影響を明らかにし、食事介入の有効性を総合的に評価する。
発育・老化に伴う体温調節反応の身体部位特性およびそれに及ぼす運動習慣の影響

(1)子どもは,暑熱・運動刺激に対し発汗能が未分化なため,若年成人に比し躯幹部の皮膚血管拡張に依存した熱放射特性を呈した。さらに,環境温が皮膚温より高くなると,子どもは前額で発汗および皮膚血管拡張を急激に亢進した。局所加温実験による子どもの最大皮膚血管コンダクタンスが若年成人より高かったことから(背と大腿),上記子どもにみられた皮膚血管反応特性には,部分的に皮膚血管の組織解剖学的年齢差も関与していることが示唆された。(2)寒冷刺激に対し,子どもは若年成人より四肢部の皮膚温を顕著に低下した。この特性は,手中指では皮膚血管収縮の亢進と大きな体表面積/質量(Ad/Wt)の両要因,大腿では皮膚血管の収縮亢進ではなく大きなAd/Wtと皮下脂肪厚の体格的要因に起因した。子どもはいずれの部位でも若年成人と同等の皮膚冷感覚点数を有したため,皮膚冷受容器数の年齢差が上記子どもの特性を生じたとは考え難かった。(3)暑熱刺激に対し,高齢者は若年成人に比し大腿と背で皮膚血管拡張能の低下を認めた。最大皮膚血管コンダクタンスの老化に伴う低下は,前腕でみられたものの背・大腿では認められなかったことから,上記皮膚血管拡張能の低下は皮膚血管の組織解剖学的変化より,皮膚血管の収縮神経や拡張系の変化により強く関連するものと考察された。(4)高齢者の寒冷刺激に対する皮膚血管収縮の程度は,前額・胸・手中指では若年成人と同等であったが,大腿・背では小さかった。このため,皮膚血管の拡張能のみならず収縮能も老化に伴い低下し,その低下に身体部位特性が存在することが示唆された。皮膚冷感覚点密度および部位あたりの推定総数には年齢差はみられなかった。(5)子どもではVO_2max,高齢者では日常歩行量またはVO_2maxが,暑熱・寒冷時の皮膚血管反応と関連した。そのため,子ども・高齢者ともに運動習慣の確立が皮膚血管調節能の改善に有効な手段になり得る可能性が示唆された。実験1:環境温(T_a)が中立温域から漸次上昇(28→40°C)または下降する(30→17°C)条件下(いずれも60分暴露)で児童(B群:10歳前後,n=7)・若年成人(Y群:22歳前後,n=9)・高齢者(O群:70歳前後,n=8)の皮膚血流反応(LDF)を身体5部位で比較し,その発育・老化特性を検討した。(1)T_a上昇時;LDFはいずれの群においてもT_aの上昇に伴い増加したが,その増加は暴露後半において顕著だった。B群のLDFはY群に比し,胸部で有意に高く,逆に大腿で有意に低かった。また,暴露後半,前額においてB群のLDFの増加の程度がY群より有意に大きく,この反応は局所発汗量の増加と反応した。O群は前額・胸・手中指ではY群と同等のLDFを示したが,背・大腿では有意に低かった。(2)T_a下降時;いずれの群もT_aの下降に伴いLDFが有意に低下した。LDFは暴露中B群がY群に比し,前額と手中指で有意に低く,胸と背で有意に高かった。

O群はY群に比し,背・大腿で有意に低く,前額で有意に高く,胸と手中指では群差がみられなかった。以上の結果,暑熱・寒冷刺激に対するLDF反応は発育・老化に影響され,その程度は身体部位で異なることが確認された。実験2:上記実験とほぼ同一被験者の前額,胸,背,前腕,大腿部(約20cm^2)を各々40分間局所加温し,42°Cの皮膚温を保持させた際のLDFを連続的に測定した。LDFはいずれの被験者も20-25分目まで増加し,その後一定値を保ったため,35-40分目のLDFを各人の最大皮膚血流量(LDF_<max>)とした。LDF_<max>は,いずれの部位においてもB群vs.Y群およびO群vs.Y群に,いずれの年齢群においても身体部位間に,それぞれ有意な差は認められなかった。これらの結果は,上記暑熱・寒冷実験でみられたLDFの発育・老化特性は,皮膚血管それ自体の老化変性または未発達さに起因するものではなく,自律神経を介して応答特性を反映している可能性が示唆された。(1)運動時における思春期前児童の体温調節反応特性を検討するため,皮下脂肪厚および体重当たりの最大酸素摂取量がほぼ同等な7名の思春期前男児(10-11歳)と11名の男性若年成人(21-25歳)に,30°C・45%rh環境下で40%VO_<2max>の自転車運動を45分間負荷した。その結果,30°C環境下の中等度運動時において,思春期前児童は,低い発汗量に関わらず躯幹部の皮膚血管拡張をより亢進し,若年成人とほぼ同等に深部体温を調節した。さらに,若年成人では前腕皮膚血流量が胸・背より有意に高かったのに対し,子どもの皮膚血流量には部位差がみられなかった。これらの結果は,皮膚血管の拡張の程度には発育と関連した身体部位差が存在する可能性を示唆する。(2)昨年度に見出した子どもや高齢者にみられた寒冷反応特性が,体温調節中枢への温度入力として重要な役割を持つ皮膚冷感覚点数に起因するか否か検討するため,7名の思春期前男児,10名の男性若年成人,9名の男性高齢者の皮膚冷感覚点を測定した。子どもはいずれの部位でも若年成人や高齢者より高い皮膚冷感覚点密度を有したが、部位あたりの推定総数には年齢差はみられなかった。そのため,子どもや高齢者の寒冷反応特性には,体温調節中枢への温度入力として重要な役割を持つ皮膚冷感覚点が直接的に影響しているとは考えられないと結論された。(3)子どもや高齢者の暑熱・寒冷反応反応とVO_<2max>や日常歩行量の関連性を検討した結果,子どもではVO_<2max>,高齢者では日常歩行量またはVO_<2max>が,暑熱・寒冷時の皮膚血管反応と関連した。また,高齢者では日常歩行量が大腿の発汗量と関連したが,子どもでは発汗量と関連する項目がみられなかった。これらの結果から,更なる検討が必要であるが,子ども・高齢者ともに運動習慣の確立が皮膚血管調節能の改善に有効な手段になり得る可能性が示唆された。
腎細胞癌に対する新規治療標的としてのAKT3-HIF1α経路の解明と薬剤の開発

残念ながらAKTサブタイプの発現と臨床的な予後には相関が見られなかった。(1)周囲環境によるHIF1αの発現量変化が転写制御によるものなのか、分解制御によるものなのかを明らかにするために、周囲環境の操作によりHIF1α発現量を変化させた細胞から抽出したmRNAを用いてリアルタイムPCRによりHIF1αのmRNAの変化を測定しました。(転写制御の可能性の検討)(2)AKT3 pathway上で直接的にHIF1αを制御している蛋白を明らかにするために、周囲環境の操作でH IF1α発現量を変化させた細胞の抽出液と、AKT3やその下流蛋白に対する抗体やGST融合蛋白を用いて免疫沈降を行いました。現在免疫沈降によって得られた結合蛋白の同定を試みています。平成27年度には以下の研究を行いました。1)昨年度に作成したshRNA発現ベクター(HIF 1α& 2α, AKT 1 3およびScrumble配列)を腎細胞癌株RCC4 (von Hippel-Lindau腫瘍抑制遺伝子欠損株;正常酸素濃度化でも低酸素で発現誘導のかかる遺伝子群の発現が亢進している)にトランスフェクションし、Puromycinを用いて導入された細胞のみを選出して安定的な発現抑制株を樹立しました。現在はこれらの細胞株におけるHIF 1α& 2α及びAKT 1 3の発現をそれぞれの分子に対する特異的モノクローナル抗体を用いてWestern Blottingにより測定し、HIFとAKTのサブタイプに特異的な相関関係が存在するかどうかを検証しております。2)横浜市立大学泌尿器科で手術時に採取した腎細胞癌の凍結検体70組(腫瘍部分と周囲正常腎実質部分)から組織抽出液を作成し、Hypoxia-Inducible Factor (HIF) 1α& 2α、AKT 1 3,リン酸化AKTの発現量をそれぞれの分子に対する特異的なモノクローナル抗体を用いたWestern Blottingにより測定しました。正常部分における発現量を基準として腫瘍部分での発現量がどの程度増減しているのかを算出し、病理データとして得られている組織型・悪性度との相関を検討しました。3)現在は上記の凍結検体からRNAを抽出してcDNAを合成し、これを用いてReal time PCRを行い、shRNA発現ベクターによるそれぞれの分子の抑制が他の分子の発現量に与える影響がmRNAレベルで生じているのかを確認する作業を行っています。1) Double knockdownのための異なる薬剤選択性を持つshRNA vectorの作成も順調に進んでおり、近日中に安定抑制株を作成できる見込みがたっております。淡明細胞型腎癌の半数近くでmTOR経路の変異や発現異常が報告されている一方、mTOR阻害剤は5%程度の症例にしか縮小効果をもたらさない。その理由として、この経路は細胞が周囲の感興を感知して自身の生存を優先するのか分裂による成長を優先するのかを決定する経路であることがあげられる。このシステムを安定して機能させるために、複雑なフィードバック機構が備えられている。そのためmTORを抑制するだけでは期待されたほどの腎細胞癌増殖抑制効果が発揮されなかったと考えられている。この問題を克服するべく、この経路上の様々な分子をmTORと同時に制御する薬剤が開発されたが、結果としてその副作用の強さが理由となり、フェーズ3にたどり着けなかった。今回我々はAKTにサブタイプが存在し、一部の機能をシェアしていることに注目して、これを個別に抑制することで、mTOR阻害剤による腎癌細胞への増殖抑制効果を安全に増強しうるかを検討した。まず腎細胞癌の臨床検体を用いて個々のAKTサブタイプの発現状況を確認したところ、腎癌組織では全てのAKTサブタイプが発現していた。またmTOR経路と相互作用を示すことが知られているHIFαサブタイプについても解析したところ、HIF1αでのみAKT13と発現が連動していた。淡明細胞型腎癌の発生にはHIF2αが重要であることが知られているが、HIF1αもその成長に大きく影響している。そのためこの後はHIF1αとAKTの関係について探索を試みた。腎細胞癌株に対しsiRNAをもちいたAKT13の抑制実験を行い、PI3K-AKT-mTOR経路の各分子及びHIFαサブタイプの蛋白発現への影響を観察した。今回の実験系ではAKT1の発現抑制がHIF1αの発現量に最も大きく影響していた。今後はAKT1得的阻害剤とmTOR阻害剤の併用による相乗効果について検討を加える予定である。1)細胞レベルで確認されたAKTサブタイプとHIFαサブタイプの相互作用を臨床検体を用いたWestern Blottingの結果と照合し、論文化します。2)これらの相互作用が相克を起こすのか、それとも相加的・相乗的に作用しうるのかの解析をshRNA発現ベクターによるDouble knockdownにより解析します。3)低酸素状態においてHIF-AKTが腎細胞癌の薬剤抵抗性に与える影響の解析範囲を免疫チェックポイント阻害剤にまで広げていきます。具体的にはHIFの下流にある免疫関連遺伝子の発現について腎細胞癌凍結標本から抽出したRNAを用いてReal-Time PCR法により測定します。泌尿器科腫瘍学25年度に以下の実験を予定を早めて行うことができましたAKT3 pathwayによるHIF1αの発現制御が腎細胞癌の増殖・浸潤能与える影響について、腎細胞癌株を用いてこの蛋白の強制発現株とsh-RNAベクターを用いた発現抑制株を樹立します。

樹立した細胞株の増殖能と浸潤能について、まず細胞培養ディシュ上でそれぞれXTTアッセイとMatrigel invasionアッセイを行って測定しました。一方で以下の実験はプロモーター領域を組み込んだVectorの作成にて間取り、まだ施行できていません。HIF1αのプロモーター領域を組み込んだHisタグ付きのベクターを作製して、周囲環境の操作でHIF1α発現量を変化させた細胞の抽出液とmixし、ニッケル担体で精製をかけてプロモーター領域への結合蛋白を選別します。(プロモーター領域との結合実験)予定とは若干異なるペース配分になってはいますが、おおむね順調に進展しているものと考えられました。マウスへの腫瘍移植で腫瘍の造成が遅く、予定されていた実験の一部が今年度に継続となったためSCIDマウスの購入費に充てるための予算の一部を次年度にまわしました。(1)樹立した細胞株をヌードマウスへ移植し、増殖・浸潤能や血管新生への影響を、腫瘍径の測定と免疫染色を併用した病理組織学的検討、及び採血でのサイトカインやその他の増殖因子の測定により検出します。(2)この経路がHIF1α以外の標的をもつ可能性を検出するために強制発現株と発現抑制株および元の細胞株からmRNAを抽出し、マイクロアレイ法を用いてどの遺伝子の発現に影響を与えているのかを網羅的に検出します。選別された遺伝子についてはリアルタイムPCRによる検証を行います。(3)この蛋白がAKT経路の下流にあるmTORC1のみならずmTORC2複合体の構成に必須かどうか、抗mTOR抗体を用いた共沈降実験で蛋白結合の強度を測定します進行状況で述べたように、プロモーター結合実験を進めることができず、またリアルタイムPCR実験と免疫沈降実験及び発現を変化させた細胞の樹立は他の実験で使用している消耗品がたまたま使用できたため、予定していた費用がわずかに残っている形になりました。今年度にプロモーター結合実験を再度試みるのでその分の費用が必要になります。また予算に余裕が有れば、作成したXenograftへのAKTもしくはHIF阻害作用を持つ薬物の投与実験を行う予定です。
L-アスコルビン酸の生体内抗酸化機構と生理効果

ビタミンC、すなわちL-アスコルビン酸(L-Ascorbic Acid、以下AsAと省略)は人間に必須の微量栄養素であり、コラーゲンの生合成、芳香族アミノ酸代謝、脂質代謝、免疫能・細胞増殖作用の賦活化等々の重要な生理作用に関与していることは広く知られている。しかし、AsA分子の有する生理効果の詳細については、生理効果の発現過程におけるO^-_2の寄与の有無も含めてまだ不明の点が多い。一方、AsAは非常に還元性が強く、抗酸化剤として広く食品の加工・貯蔵時に添加・使用されている。近年、AsAの生体内における抗酸化ビタミンとしての生理効果が重視されるにつれて、その生体内抗酸化機能と生理効果との関連をより明確にするための試みがなされるようになってきたが、この両者の正確な相互関係については現在なお明確にされていない。AsAの生体内における抗酸化機能と、生理効果の発現過程との関連を明らかにするため、その第一段階として、両者の関係について実験化学的および計算化学的手法による詳細な検討を試みた。まず、AsA及びその関連物質につき半経験的分子軌道法(主にMOPAC VER6.0)により、最適化された立体化学的構造(平衡構造)、各原子上の電子密度、双極子モーメント、生成熱、各分子軌道の形状やエネルギー等々を求めた。特に、AsAと酸素分子(3重項および1重項)との反応過程、すなわち自動酸化過程について詳細な計算化学的解析を試みた。また、実験化学的にAsAの自動酸化反応生成物の確認を行った。すなわち、反応初期過程で生成する微量の生成物をTMS誘導体としてGC-MSにより分離・同定した結果、等モルのスレオン酸、シュウ酸の生成を明らかにした。また、その際、O^-_2の生成することもSOD等を用いることにより実験化学的に確認した。これらの結果を総合し、従来未知であったAsAのC2酸素付加物を経由する新しい自働酸化反応機構を提示した。ビタミンC、すなわちL一アスコルビン酸(L-Ascorbic Acid、以下AsAと省略)は人間に必須の微量栄養素であり、抗壊血病作用のほか、コラーゲンの生合成、芳香族アミノ酸の代謝、脂質代謝、免疫能・細胞増殖作用の賦活化等々の重要な生理作用に関与していることは広く知られている。AsA分子の有する生理効果の詳細についてはまだ不明の点が多く残されている。AsAの生体内における抗酸化ビタミンとしての生理効果が重視されるにつれて、その生体内抗酸化機構と生理効果との関連をより明確にするための試みがなされるようになってきたが、この両者の正確な相互関係については現在なお明確にされていない。AsAの生体内における抗酸化機構と、生理効果の発現過程との関連を明らかにするため、その第一段階として、モデル酵素反応系における両者の関係について実験化学的及び計算化学的手法による詳細な検討を行うことにした。まず、AsA(L-キシロ-AsA)およびその関連物質(D-キシロ-AsA、Lアラボ-AsA、D-アラボ-AsAなど)の内、市販されていない入手困難なものの合成を試み、さらにそれらの酸化型の合成についても検討した。AsA及びその関連物質(各物質の酸化型も含む)について半経験的分子軌道法(主としてMOPAC VER6.0)による計算を行い、各分子の動的構造に関連する情報[最適化された立体化学的構造(平衡構造)、各原子上の電子密度、双極子モーメント、生成熱、各分子軌道の形状やエネルギー等をも含む]を求め、それらに基づき、それぞれの最適化された動的構造につき検討した。

また、上記AsA及びその関連物質について、酸素分子(3重項および1重項)との反応過程について計算化学的な追究を試みた。さらに、実験化学的にそれらの自動酸化反応生成物の確認をHPLC等により試みた。ビタミンC、すなわちL-アスコルビン酸(L-Ascorbic Acid、以下AsAと省略)は人間に必須の微量栄養素であり、コラーゲンの生合成、芳香族アミノ酸代謝、脂質代謝、免疫能・細胞増殖作用の賦活化等々の重要な生理作用に関与していることは広く知られている。しかし、AsA分子の有する生理効果の詳細については、生理効果の発現過程におけるO_2^-の寄与の有無も含めてまだ不明の点が多い。一方、AsAは非常に還元性が強く、抗酸化剤として広く食品の加工・貯蔵時に添加・使用されている。近年、AsAの生体内における抗酸化ビタミンとしての生理効果が重視されるにつれて、その生体内抗酸化機能と生理効果との関連をより明確にするための試みがなされるようになってきたが、この両者の正確な相互関係については現在なお明確にされていない。AsAの生体内における抗酸化機能と、生理効果の発現過程との関連を明らかにするため、その第一段階として、両者の関係について実験化学的および計算化学的手法による詳細な検討を試みた。まず、AsA及びその関連物質につき半経験的分子軌道法(主にMOPAC VER6.0)により、最適化された立体化学的構造(平衡構造)、各原子上の電子密度、双極子モーメント、生成熟、各分子軌道の形状やエネルギー等々を求めた。特に、AsAと酸素分子(3重項および1重項)との反応過程、すなわち自動酸化過程について詳細な計算化学的解析を試みた。また、実験化学的にAsAの自動酸化反応生成物の確認を行った。すなわち、反応初期過程で生成する微量の生成物をTMS誘導体としてGC-MSにより分離・同定した結果、等モルのスレオン酸、シュウ酸の生成を明らかにした。また、その際、O_2^-の生成することもSOD等を用いることにより実験化学的に確認した。これらの結果を総合し、従来未知であったAsAのC2酸素付加物を経由する新しい自働酸化反応機構を提示した。
垂直p-n界面制御による新規太陽電池セル構造の実現

本研究では、有機半導体薄膜内でのp-n界面の配向制御をナノスケールで実現することにより、有機薄膜太陽電池の大幅な発電効率アップが可能な新規薄膜作製手法を探究した。この一環として、高分子ナノワイヤのテンプレート合成方法を開発するに至った。また、テンプレートサイズが小さい程、導電率が向上することが分かった。すなわち、テンプレートサイズをナノオーダーまで縮小することにより、高分子配向制御の可能性を示唆する結果が得られた。これらの結果を応用することにより、高分子が基板垂直方向に配向した有機薄膜太陽電池の実現が可能である。有機薄膜太陽電池は、真空プロセス等の製造コスト高の要因を削減でき、容易な大面積化の可能性もあり、その他のSi系太陽電池等に比べて大幅なコストダウンが期待できる。ただし、現状ではその変換効率は報告されている最高値でも8%程度しかない、寿命が短い、といった課題があり、その実用化は難しい。本研究では、有機半導体薄膜内でのp-n界面の配向制御をナノスケールで実現することにより、将来的には有機薄膜太陽電池の大幅な発電効率アップが可能な新規薄膜作製手法を探究した。これまでの研究で高い光電変換効率が得られている有機薄膜太陽電池の薄膜構造は、主にバルクヘテロ型である。ただし、理論的にはこのバルクヘテロ型が最も適した構造とは言えない。本研究では、有機半導体のp-n界面の配向制御をナノスケールで実現することにより、バルクヘテロ型に代わる新規薄膜構造の作製を目指した。ポーラスアルミナ構造をテンプレートに用いた電解重合により、高分子ナノロッドの合成を試みた。さらに、この高分子ナノロッド単体を基板上に取り出し、その電気特性を測定したところ、テンプレートサイズが小さい程、導電率が向上することが分かった。すなわち、テンプレートサイズをナノオーダまで縮小することにより、高分子配向制御の可能性を示唆する結果が得られた。今後はさらに研究を進め、実際に合成された高分子ナノロッドを用いて有機薄膜太陽電池を作成・評価し、有機薄膜内部で形成されるナノ構造の解析およびp-n界面制御の可能性を追求する。実際に合成された高分子ナノロッドについて、光電子分光(XPS)、ラマン分光、およびエネルギー分散型X線分析(EDX)手法を用いて導電率向上のメカニズムを調べたところ、実際にテンプレートサイズを縮小するほど高分子鎖の配向が整い、また、ドーパント濃度はテンプレートのサイズによらず一定であることが判明した。すなわち、導電率の向上は高分子中の移動度が向上した結果であることが明らかとなった。今後はさらに研究を進め、実際に合成された高分子ナノロッドを用いて有機薄膜太陽電池を作成・評価し、有機薄膜内部で形成されるナノ構造の解析およびp-n界面制御の可能性と移動度向上による高効率有機薄膜太陽電池の実現を目指す。
RETチロシンキナーゼの下流シグナルを調節する因子の探索と発癌制御への応用

RETチロシンキナーゼ(以下RET)は個体発生、腫瘍形成と関連の深い分子である。RETには主に2つのアイソフォーム(RET51、RET9)が発現しており生体内ではRET9の役割が重要であるとされる。RET発現誘導細胞株をもちいた検討では、RET9発現後に細胞内のチロシンリン酸化レベルの著しい上昇が見いだされた。下流の発現遺伝子の比較より2つのisoform間で発現が変化した遺伝子として261個を同定した。これらには多数の転写因子が含まれた。次にGST pull-down法によりRET51およびRET9間での共沈タンパク質の差を検討したが、両者の差を示す分子の同定には至らなかった。今後さらにスケールアップしての検討を加える。RETチロシンキナーゼisoform間に認める下流シグナルの差の検討と分子メカニズムの解明を行うために、テトラサイクリンの除去により変異型RET51およびRET9を誘導し、経時的な下流シグナルの変化を検討した。変異型RETの発現誘導後1日程度でRET9型を誘導した細胞株において細胞内のチロシンリン酸化レベルの上昇が見られ、両者の間で異なった分子のチロシンリン酸化が観察された。PTP1D/SHP2, PTP1C/SHP1, MKP2, KAPなどのtyrosine phosphataseには発現量の差は観察されず、未知の調節機構があることが示唆された。そこでRETを免疫沈降し共沈するタンパク質のLC/MSによる同定を検討したが、入手しうる抗RET抗体を用いた条件では銀染色レベルでのRET51およびRET9間で十分な量の共沈タンパク質は確認できなかった。そこでRETの2つのisoformのエクソン12以降とH4遺伝子の融合遺伝子であるPTC1/RETを新たに作成し、GSTを5'末端または3'末端に導入しグルタチオンビーズを用いたpull-down法によりRET51およびRET9間での共沈タンパク質の差を検討することとした。293FTにトランスフェクションしライセートを作成しpull-down法を行い銀染色で検討し共沈されるタンパク質を多数観察した。isoform間で安定して差として観察される共沈タンパク質の同定を行っている。次に同様にトランスフェクションしたライセートよりRNAを抽出しRETの2つのisoform間でDNAマイクロアレイを行った。RET9のトランスフェクションを行った場合に、発現が亢進している遺伝子が多数観察されている。現在パスウェイ解析を行い、isoform間に認める下流シグナルの差について検討を加えている。RETチロシンキナーゼisoform間に認める下流シグナルの差の検討と分子メカニズムの解明を行うために、RETとH4遺伝子の融合遺伝子であるPTC1/RETを昨年度作成し、さらにGSTを導入しpull-down法により2つのisoform(RET51, RET9)間での差の検討を行った。293FTにトランスフェクションし共沈されるタンパク質は観察されたが、両者間で再現性のある共沈タンパク質の差を示すことが困難であった。一方RET51およびRET9間ではGSTの5'末端または3'末端への導入位置に関わらず4G10抗リン酸化チロシン抗体での検討ではリン酸化タンパク質の分布に再現性のある差が観察された。従って現在、スケールアップした条件下で検討を加えている。次にRET51またはRET9発現細胞間での遺伝子発現の差を、DNAマイクロアレイを用いて検討を加えている。DNAマイクロアレイの結果をIngenuity Pathways Analysis(IPA)を用いて検討を加えたところRET9の下流ではRET51に比してCCL23, CXCL6, CXCL9などのchemokine、Interferon alpha、WNT10Aなどの分泌性情報伝達タンパク質の発現上昇が目立った。さらにPRSS3、KLK11などのペプチダーゼの発現上昇が見られた。IPAではこれらの遺伝子発現の変化は細胞移動等に関連したネットワークに分類されるタンパク質の変化として分類され、RET9の生理的機能に一致している。今後RET51およびRET9間の遺伝子発現変化と下流シグナルの差の関係を明らかにする。RETチロシンキナーゼisoform間に認める下流シグナルの差の検討と分子メカニズムの解明を行うために、昨年度は3D-GeneをプラットホームとしたDNA microarrayを行ったが、全遺伝子を解析の対象とした場合、発現量の低い遺伝子ではreal time PCRによるDNA microarrayの検証では極めて再現性が乏しいことが示された。そこでシグナル値が低い遺伝子は破棄して検討した結果real time PCRで得られる実際のRNA量間で高い相関がえら得られた。他の実験系では73%にreal time PCRで再現性が確認出来る結果を得ている。再検証の結果2倍以上の差を示す遺伝子を対象とすると261個の遺伝子がisoform間で発現が異なる遺伝子として規定した。

これらをIPA解析したところ、Gene expressionに関与すると規定される遺伝子群が有意に影響を受けることが明かとなりNFkBと関連してPML, CREBBP, TFF1等の発現が亢進している一方でFOXN3, PBX1, KLF13などの転写因子の発現が低下し2つのisoformの違いに強く影響されることが示された。一方PTC1/RETの強制発現系ではGST蛋白をN末端に付加した場合では9typeのPTC1/RETで2-3倍のチロシンリン酸化の増多が観察された。これを指標にGST pull-downサンプルで明瞭な差を示す沈降物は同定できなかった。さらに51typeのチロシン1052以降の1062,1096のチロシンをフェニールアラニンに置換して見た場合も沈降物、PTC1/RETのリン酸化レベルには大きな差は認められなかった。更にスケールアップしての検討を行っている。
田畑輪換体系下における畑地化効果を活用したダイズの生産性向上に関する研究

わが国では土壌物理性が劣る水田転換畑で主に大豆作が行われるため、ダイズの生産性向上のためには土壌の物理的環境や理化学性の改善が重要である。本研究では、大豆作付け前の水稲作において畑地化効果が期待できる水稲無代かき栽培に着目し、前作水稲作付け時の代かきの有無が転換後の根圏域土壌の物理化学性とダイズの収量形成過程に及ぼす影響を解析した。その結果、水稲ー大豆の田畑輪換体系下において、大豆作付け前の水稲作を無代かき栽培することで、転換後の大豆作付け時における土壌の窒素状態、排水性、砕土性が良好となり、ダイズの乾物生産能も優れ、登熟後期まで葉色が維持され、収量性は11.1%向上することが明らかとなった。わが国のダイズは主に水田転換畑で栽培されているため,出芽時や生育初期における湿害を受けやすく,さらにその後の土壌乾燥による干ばつ害を受けやすいことが低収をもたらす要因とされている.水田転換畑におけるダイズの生産性向上のためには,圃場の排水性と砕土性を中心とした根圏域土壌の物理的環境の改善が必須である.そこで,本研究では輪作体系として畑地化効果が期待される水稲無代かき栽培に着目し,前作水稲作付け時の代かきの有無が転換前後の根圏域土壌の物理化学性とダイズの収量形成過程に及ぼす影響を明らかにし,田畑輪換体系下における畑地化効果を活用したダイズの生産性向上の技術開発に資することを目的とした.平成25年度は前作水稲作付け時における代かきの有無が水稲の収量と作付け後の土壌の物理化学性と微生物相に及ぼす影響について検討した.その結果,代かき区に比べ,無代かき区では,穂数や一穂籾数が多く,倒伏しなかったことから登熟歩合も維持され,収量は810%多かった.また,代かき区に比べ,無代かき区の玄米蛋白質含有率は低く,良質粒率は高くなる傾向がみられた.水稲作付け後の作土層においては,無代かきにより液相率や固相率が低下する一方で,気相率が高まった。また,無代かきにより重力水孔隙率(pF1.5),易有効水分孔隙率(pF3.0)が高まり,飽和透水係数も高い傾向がみられた.土壌の微生物活性に無代かきによる明瞭な影響は認められなかったが,無代かき区は代かき区に比べ,硝酸態窒素量が多くなる傾向がみられた.わが国においてダイズは主に水田転換畑で栽培されている.大豆作付け前の水田は湛水状態とするため代かきが行われ,土壌は単粒化し,高い保水性が整備される.そのため,水田転換畑の圃場は排水性と砕土性が劣り,ダイズは湿害や干ばつ害による影響を受けやすく,現在のわが国のダイズの収量は低く変動的となっている.本研究では輪作体系として代かきを行わない水稲無代かき栽培に着目し,前作水稲作付け時における代かきの有無が転換後の根圏域土壌の物理化学性とダイズの収量形成過程に及ぼす影響を明らかにし,田畑輪換体系下におけるダイズの生産性向上の技術開発に資することを目的とした.平成26年度は前作水稲作付け時における代かきの有無が大豆作付け時の土壌の物理性とダイズの収量形成過程に及ぼす影響について検討した.その結果,代かき区に比べ,無代かき区のダイズは初期生育が旺盛ととなり,収量は約20%多かった.また,土壌0-5cm層の飽和透水係数に代かきの有無による明瞭な差は認められなかったが,土壌5-10cm層の気相率,飽和透水係数は代かき区よりも無代かき区で高かった.以上のことから,前作水稲作付け時において代かきをしない無代かきとすることで,後作の大豆作付時において土壌中層の圃場の排水性が良好となり,大豆は旺盛な生育を示し,増収することが明らかとなった.作物学、栽培学前作水稲作付け時において無代かきの有無による影響を土壌へ処理することに成功した.具体的には,無代かきによる土壌微生物相への明瞭な影響は認められない一方で,無代かきにより土壌の窒素ポテンシャルが向上し,排水性も向上させることができた.このため,平成26年度は当初の予定通り、転換後のダイズの栽培試験を実施することができ,前作の無代かきによる畑地化効果の影響を明瞭に捉えられると確信している.前作水稲作付け時における代かきの有無により土壌物理性・化学性が異なる作土層を形成することが出来た.今後は,耕起時の砕土率が異なることが予想される.

そこで,今後の研究の推進方策としては,圃場レベルで無代かき後のダイズの増収メカニズムの解明に取り組むとともに,耕起後の土壌を場内に持ち帰り,根粒着生能(非着生・通常着生)の異なるダイズや他の畑作物を代かき後土壌と無代かき後土壌それぞれを充填したポット栽培試験に供試することで,無代かきによる土壌の畑地化効果が出芽・苗立や初期の発根,根の伸長,養分吸収,地上部の生育に及ぼす影響について,個体レベルで詳細に解析する予定である.一部の土壌のサンプリングが昨年の大雪・低温に伴う融雪の遅れにより予定どおり実施できなかったため、その分析費用として計上した必要試薬類の差額分が次年度使用額として生じました。ただ、平成26年4月において上記の土壌のサンプリングは実施出来ましたので、平成26年度に繰り越しとなった予算を必要経費として使用する予定でいます。平成25年度に実施出来なかった土壌の分析に要する必要試薬類の経費として使用する予定です。