hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
好酸球由来脂質メディエーターによる炎症収束機構の解明

好酸球は顆粒球の一つで、寄生虫感染やアレルギー疾患が生じた際、炎症巣に集積し種々のサイトカインやカチオン性タンパク質等の顆粒を放出することによって炎症を誘発するエフェクター細胞である。一方、好酸球を欠損したマウスの解析によって、炎症の制御や創傷治癒など組織恒常性の維持にも関わっていることが近年明らかになっており、好酸球の多面的な機能に注目が集まっている。当研究室ではこれまでに、マウスの急性腹膜炎モデルを用いた解析から、急性炎症の収束期の炎症巣に、好酸球が集積すること、好酸球に高発現する脂肪酸代謝酵素12/15-リポキシゲナーゼ(12/15-LOX)依存的に炎症巣からの好中球の消散、所属リンパ節の肥大が促進されることを報告している。このことから、好酸球が炎症収束において必須の機能を果たしていることが示唆される。一方、好酸球は炎症の有無にかかわらず、腸管に数多く常在することが知られている。また、腸管には約1000種類、総数100兆個にも及ぶ腸内細菌が共生しており、免疫細胞との相互作用により独自の免疫系を形成していることが近年明らかとなってきている。しかし、腸内免疫における常在性好酸球の機能については未解明な点が多い。そこで、腸管常在性好酸球がどのようにして腸内細菌と関わり、腸管の恒常性を制御しているのかを明らかにすることを目的として研究を行った。実際に腸内細菌が好酸球に対して影響を与えうるかについて、抗生物質を投与することで腸内細菌を欠失させたマウス(ABXマウス)を用いて解析を行った。腸管の脂質代謝物を高速液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析装置を用いて網羅的に解析したところ、ABXマウスの腸管ではコントロールマウスに比べて12/15-LOX代謝物量が減弱していた。これらの結果から、腸内細菌依存的に好酸球が12/15-LOX由来の脂質代謝物を産生ししていることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。炎症反応は、生体の恒常性を維持する上で必須の生体応答である。一方、一度誘発された炎症は適切に収束しなければならず、この機構の破綻が慢性炎症や組織損傷の一因であると考えられている。現在までに、炎症の起炎については多くの研究がなされているが、収束については不明な点が多く残っている。当研究室ではこれまでに、マウスの急性腹膜炎モデルを用いた解析から、急性炎症の収束期の炎症巣に、好酸球が集積すること、好酸球に高発現する脂肪酸代謝酵素12/15リポキシゲナーゼ(12/15-LOX)依存的に炎症巣からの好中球の消散、所属リンパ節の肥大が促進されることを報告している。また、腹腔細胞のDNAマイクロアレイを用いた解析から、好酸球、12/15-LOX依存的に最も発現変動する遺伝子の一つとしてケモカインであるCXCL13を見出し、炎症の収束がCXCL13依存的に生じることを報告している。また私はこれまでの研究から、LXA4の投与により、好酸球欠損によるCXCL13発現細胞減少が回復することを見出している。そこで、LXA4はどのようにしてCXCL13発現細胞を制御し炎症の収束を促進するのかという分子メカニズムを明らかにすることを目的として研究を行った。LXA4には既知の受容体が3種類存在する。そのため、私は炎症を惹起したマウスに各受容体のアンタゴニストを投与することで、CXCL13発現細胞数への影響を解析した。その結果、FPR2受容体のアンタゴニストを投与した際に減少するということを見出した。このことから、好酸球は12/15-LOX依存的にLXA4-FPR2のシグナル経路を介して、CXCL13発現細胞の遊走もしくはCXCL13発現、CXCL13の放出などを制御する可能性が考えられる。好酸球由来脂質メディエーターによる炎症収束機構の解明を目指し解析を行った。これまでに好酸球由来の脂質メディエーターであるリポキシンA4(LXA4)がCXCL13発現細胞を制御していることを示唆しており、その制御機構ついての解析を行った。その結果、LXA4の受容体のアンタゴニストによってCXCL13発現細胞数が減少することを見出した。今後は、受容体を介してどのようにCXCL13発現細胞が制御されているかという詳細なメカニズムの解析を行う予定であり、好酸球と12/15-LOXの炎症収束における生理的機能とその意義の解明に向けての進展が期待できる。当研究室ではこれまでに、マウスの急性腹膜炎モデルを用いた解析から、急性炎症の収束期の炎症巣に、好酸球が集積すること、好酸球に高発現する脂肪酸代謝酵素12/15リポキシゲナーゼ(12/15-LOX)

依存的に炎症巣からの好中球の消散、所属リンパ節の肥大が促進されることを報告している。このことから、好酸球が炎症収束において必須の機能を果たしていることが示唆される。また、近年ドデシル硫酸ナトリウム(DSS)誘導性の潰瘍性大腸炎モデルにおいても、好酸球が産生する12/15-LOX系代謝物が炎症収束を促進することが報告され、好酸球が腸管においても炎症収束を促進していることが示唆された。好酸球は骨髄で成熟した後に腸管、子宮、乳腺、胸腺といった限られた組織に常在している。しかし、腸内免疫における常在性好酸球の機能については未解明な点が多い。そこで、腸管常在性好酸球がどのようにして、腸管の恒常性を制御しているのかを明らかにすることを目的として研究を行った。まず、定常状態のマウスの腸管を、フローサイトメーター(FACS)を用いて解析することで、好酸球が腸管、特に胃に近い部分に豊富に常在することを見出した。腸管は、腸内細菌だけでなく外来由来の微生物とも常に接触している組織であり、恒常的に炎症反応を引き起こしている可能性も考えられる。そのため、好酸球が12/15-LOX系代謝物を介して恒常的な炎症反応の収束を促進している可能性が考えられる。私はこれまでに好酸球由来の脂質メディエーターが炎症収束を促進することを見出している。そこで、腸内細菌や外来由来微生物と常に接している腸管に好酸球が常在する点に着目し、好酸球由来脂質メディエーターによる腸管恒常性維持機構についての解析を行った。その結果、腸管の好酸球が脂肪酸代謝酵素12/15リポキシゲナーゼ(12/15-LOX)を高発現すること、12/15-LOX欠損マウスの腸管では定常的に炎症が生じていることを見出した。以上のことから、腸管常在好酸球は脂質メディエーターを介して炎症収束を促進し、腸管の恒常性を維持していることが示唆される。今後は、腸内細菌と好酸球由来の脂質メディエーターとの関与を解析することから、好酸球がどのようにして腸管の環境を感知して炎症を収束させているかというメカニズムの解析を行う予定であり、好酸球と12/15-LOXの炎症収束における生理的機能とその意義の解明に向けての進展が期待できる。好酸球は顆粒球の一つで、寄生虫感染やアレルギー疾患が生じた際、炎症巣に集積し種々のサイトカインやカチオン性タンパク質等の顆粒を放出することによって炎症を誘発するエフェクター細胞である。一方、好酸球を欠損したマウスの解析によって、炎症の制御や創傷治癒など組織恒常性の維持にも関わっていることが近年明らかになっており、好酸球の多面的な機能に注目が集まっている。当研究室ではこれまでに、マウスの急性腹膜炎モデルを用いた解析から、急性炎症の収束期の炎症巣に、好酸球が集積すること、好酸球に高発現する脂肪酸代謝酵素12/15-リポキシゲナーゼ(12/15-LOX)依存的に炎症巣からの好中球の消散、所属リンパ節の肥大が促進されることを報告している。一方、好酸球は炎症の有無にかかわらず、腸管に数多く常在することが知られている。また、腸管には約1000種類、総数100兆個にも及ぶ腸内細菌が共生しており、免疫細胞との相互作用により独自の免疫系を形成していることが近年明らかとなってきている。そこで、腸管常在性好酸球がどのようにして腸内細菌と関わり、腸管の恒常性を制御しているのかを明らかにすることを目的として研究を行った。
極薄鋼板の湾曲磁気浮上搬送装置の開発に関する研究

薄鋼板生産ラインの搬送工程においては,ローラによる接触搬送が行われているために表面品質の劣化という問題が発生している.この問題の解決方法として磁気浮上技術の応用による非接触搬送に関する研究がなされている.しかしながら,磁気浮上システムにおいて0.3mm未満の柔軟鋼板を浮上対象とする場合には,その薄さゆえにたわみが大きくなり浮上制御は困難となる.そこで柔軟鋼板を塑性変形しない範囲で曲げた状態で浮上させることを提案した.特に本課題ではスライディングモード制御理論を用いて浮上性能の検討を行った.また比較として最適制御理論にて浮上制御を行った.その結果,スライディングモード制御理論を用いることで,外乱を十分抑制できることを確認できた.薄鋼板生産ラインの搬送工程においては,ローラによる接触搬送が行われているために表面品質の劣化という問題が発生している.この問題の解決方法として磁気浮上技術の応用による非接触搬送に関する研究がなされている.しかしながら,磁気浮上システムにおいて0.3mm未満の柔軟鋼板を浮上対象とする場合には,その薄さゆえにたわみが大きくなり浮上制御は困難となる.そこで柔軟鋼板を塑性変形しない範囲で曲げた状態で浮上させることを提案した.特に本課題ではスライディングモード制御理論を用いて浮上性能の検討を行った.また比較として最適制御理論にて浮上制御を行った.その結果,スライディングモード制御理論を用いることで,外乱を十分抑制できることを確認できた.自動車や飛行機などの製品に使用されている冷延鋼板は,様々な工程においてローラにより接触支持搬送される.このような鋼板の製鉄所における搬送ラインの長さは数kmにも及び,種々の加工プロセスを経ながら搬送装置上を10m/s以上の高速で走行している.しかしながら鋼板の処理工程の一つであるめっき処理工程では,切板状鋼板の塗装などの化粧処理工程において,鋼板とローラの接触による表面品質劣化が認められ,鋼板搬送ラインの解決すべき重要な課題となっている.このように,塗布むら,傷の発生などを極力抑えた品質,生産性の向上が急務である.そこで本申請では,極薄鋼板を一方向のみに湾曲させて電磁力で吸引し,非接触な支持を行う磁気浮上制御装置の開発を行う.本年度の成果は以下の通りである.1.湾曲磁気浮上薄鋼板の理論モデルの構築と動的挙動の解明磁気浮上させる極薄鋼板の最適な湾曲率を数値解析により求めた.2.制御装置設計,製作鋼板を曲げて浮上させるための機構・装置設計を行い,磁気浮上装置に実装した.3.浮上実験の実施浮上鋼板のたわみ角などを変更して浮上実験を実施し,データを収集した.自動車や飛行機などの製品に使用されている冷延鋼板は,様々な工程においてローラにより接触支持搬送される。このような鋼板の製鉄所における搬送ラインの長さは数kmにも及び,種々の加工プロセスを経ながら搬送装置上を10m/s以上の高速で走行している。しかしながら鋼板の処理工程の一つであるめっき処理工程では,めっき処理後に鋼板を乾燥するために鉛直方向や水平方向へ2050m搬送されている。この乾燥工程ではローラなどの支持が難しく高い張力の付加ができないことも伴って鋼板に弾性振動が発生する。同様に,切板状鋼板の塗装などの化粧処理工程においても,鋼板とローラの接触による表面品質劣化が認められ,鋼板搬送ラインの解決すべき重要な課題となっている。軽量化などの社会の需要から鋼板は益々薄くなり,現在では0.1mm以下の極薄鋼板も製造が可能となって流通している。これを電磁力で非接触支持するためには,制御装置の機構そのものにも工夫が必要である。そこで極薄鋼板を対象とした磁気浮上制御装置の開発を行う。本年度は以下の項目に関して重点的に研究を実施した。1.センサ,電磁石配置の理論的検討と制御性能の最適化2.最適配置後の浮上実験特に、湾曲させた薄鋼板の非接触浮上制御システムにロバスト性の強いスライディングモード制御理論を適用することによって,1次モードの卓越振動から高次モードまでの振動を十分抑制することが可能となった。自動車や飛行機などの製品に使用されている冷延鋼板は,様々な工程においてローラにより接触支持搬送される。この乾燥工程ではローラなどの支持が難しく,高い張力の付加ができないことも伴って鋼板に弾性振動が発生する。そこで極薄鋼板を対象とした磁気浮上制御装置の開発を行った。特に本申請では板を一方向のみに湾曲させて電磁力で吸引し,非接触な支持の実現を目標とした。本年度は最終年度として,「磁場特性を考慮した湾曲磁気浮上薄鋼板の動的挙動」の解明ならびに「第2次浮上実験」を実施した。その結果,極薄鋼板に対する磁場の影響を考慮した理論モデルの構築と,その際の動的挙動の解明に基づき浮上実験を行い,設計した制御システムの有効性を確認できた。
生体分解性高分子マイクロスフェアによる網膜色素上皮細胞への薬物ターゲティング

薬剤を生体分解性高分子マイクロスフェアに封入させ,その高分子の種類,分子量を変えることにより,薬剤の放出を制御することが可能である。我々は,眼科領域における生体分解生高分子マイクロスフェアの有用性を既に報告している。今回は,網膜色素上皮細胞の貧食性に着目して,マイクロスファアに薬剤を包含させ、それを投与することにより効率よく薬剤を細胞内に運搬し,その機能を薬物的に修飾することが最終目的である。その前段階としてin vitroにおいて,培養ヒト網膜色素上皮細胞を用いて,マイクロスフェアの貧食を確認し,in vivoでは,家兎眼の網膜下にマイクロスフェアの懸濁液を注入し,経時的にマイクロスフェアの細胞内での動態および周囲組織に対する影響を検討した。成果を以下に示す。ヒト網膜色素上皮細胞を培養し,直径5ミクロン以下の蛍光色素,1,4bis〔2-(5-penyloxazolyl)]-benzene(POPOP)を含むポリ乳酸マイクロスフェアを投与した結果,細胞内のPOPOP濃度が経時的に増加することが確認された。走査型電子顕微鏡および蛍光顕微鏡により形態学的にもマイクロスフェアの貧食を確認した。家兎眼において,経硝子体的にマイクロピペットを用いて,直径5ミクロン以下の色素,sudan black Bを含むポリ乳酸マイクロスフェア(分子量:11,000)の懸濁液を網膜下に注入した。投与後6時間,24時間,1週間,1ヶ月の投与部位の組織切片を作成した。マイクロスフェアは投与後6時間から網膜色素上皮内に確認され,1ヶ月後でも認められ。神経網膜には大きな影響は認められなかった。成果を以下に示す。
血管内皮前駆細胞を用いた炎症性腸疾患の治療戦略

まず、健常人末梢血から単核球を分離後、血管内皮前駆細胞(EPC)を分化誘導した。幹細胞マーカーCD34、血管内皮細胞マーカーLectin、Flk-1、VE-cadherin等やacLDLを共焦点レーザー顕微鏡や、FACSで観察し、EPCであることを確認した。次に炎症性腸疾患(IBD)末梢血中のEPCと血液幹細胞の動態を検討した。IBD、感染性腸炎、健常人のEPC数を測定した。活動期の潰瘍性大腸炎(UC)では、健常人、クローン病、感染性腸炎に比較してEPC低下を認めた。さらにUCのEPC数はHbとの正の相関、血小板数と負の相関を認めた。感染性腸炎では、健常人に比較してEPC増加を認めた。つぎにColony Assayで、BFU-E、CFU-G、CFU-GM、CFU-GEMM、CFU-Fコロニー数を計測した。各コロニー数は各疾患群間で有意差を認めなかった。UCのEPC減少の原因としてEPCへの分化異常が関与していることが示唆された。次に、健常人より分離培養したEPCをDSS腸炎マウスへ投与した。2.5%DSSを7日間飲水させ腸炎を誘発DSS開始後3日目にマウスを2群に分け、一方に1×10^6cellsのEPCを尾静脈より投与した。もう一方の群は対照群とし、PBSを投与した。体重を連日、臨床スコアを隔日で測定し、DSS投与終了後5日目に兎殺した。EPC投与群では対照群に比して体重の有意な改善を認めた。また、臨床スコアや腸管長も対照群と比較しEPC投与群において改善傾向を認めた。以上よりEPCやその誘導体がIBDの新たな治療法となる可能性が示唆された。現在、再実験を行い上記の結果を確認すると共にEPCによる腸炎改善の機序や投与されたEPCの動態について検討を進めている。血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cell, EPC)の炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病)への治療応用を目的とした研究を行っている。今年度は、まず炎症性腸疾患患者末梢血でのEPCの動態を観察した。(1)基礎実験として、健常人の末梢血から比重遠心法により単核球を分離後、ゼラチンコートした培養皿上で下垂体抽出液を含む培養液で培養し、EPCに分化誘導させた。幹細胞マーカーである抗CD34抗体、および血管内皮細胞マーカーである抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体、抗Tie-2抗体、抗VE-cadherin抗体を用いた現有の共焦点レーザー顕微鏡や、フローサイトメトリー法を用いてこの培養細がEPCであることを確認した。(2)つぎに炎症性腸疾患患者の末梢血より単核球を分離し、健常人での実験と同様の方法でEPCへの分化誘導を行い、健常人や急性腸炎のEPCと細胞数、表面マーカー(抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体、抗Tie-2抗体、抗VE-cadherin抗体)の発現、遊走能(Boyden chamber法)等を比較した。これまでの検討により、炎症性腸疾患では、健常人や急性腸炎と比較してEPCの量的・機能的異常が存在することを示唆するデータが得られつつある。

今後、さらに症例数を増やして確認するとともに、次年度は炎症性腸疾患の動物モデルに対してEPCの投与実験を行い、EPCが消化管粘膜の組織修復に関与しているか否か、ひいては炎症性腸疾患の治療となり得るか否かの検討を行う予定である。今年度は、炎症性腸疾患患者末梢血中における血管内皮前駆細胞(EPC)と血液幹細胞の動態について検討した。炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病)、感染性腸炎、健常人から末梢血を採取し、比重遠心法により単核球を分離した。単核球をゼラチンコートした培養皿上で下垂体抽出液を含む培養液で培養しEPCに分化誘導させ、Endothelial marker、Hematopoietic markerであるacLDL、Lectin、VE-cadherin、vWF、CD31、KDR、CD34、CXCR4を用いた蛍光免疫染色とフローサイトメトリーによりEPCの確認を行なった。その結果、活動期潰瘍性大腸炎では、健常人、クローン病、感染性腸炎に比較してEPCの有意な低下を認めた。さらに潰瘍性大腸炎のEPC数はヘモグロビンとの正の相関、血小板数との負の相関を認めた。一方感染性腸炎では、健常人に比較してEPCの有意な増加を認めた。つぎにMethoCult^<TM>を用いてColony Assayを行ない、BFU-E、CFU-G、CFU-GM、CFU-GEMMおよびCFU-Fの各コロニー数をカウントした。Colony Assayでは、BFU-E、CFU-G+GM、CFU-GEMMコロニー数は各疾患群間で有意差を認めなかった。CFU-Fコロニーはいずれの群でも形成されなかった。潰瘍性大腸炎ではEPCの減少がみられ、その原因の1つとして血液幹細胞からEPCへの分化異常が関与している可能性が示唆された。EPCまたはその誘導体の投与が炎症性腸疾患の新たな治療法となる可能性が示唆された。今後動物実験によりEPCの炎症性腸疾患での役割を検討する予定である。今年度は、昨年度の研究成果を論文として発表した(下記参照)。また、動物実験により血管内皮前駆細胞の炎症性腸疾患での役割を検討した。まず、健常人より分離した末梢血単核球より血管内皮前駆細胞を分離培養し増幅させる実験系を確立した。増幅した血管内皮前駆細胞を回収しデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)にて腸炎を惹起したSevere combined immunodeficiency(SCID)マウスへ投与しその効果を検討した。2.5%DSSを7日間自由飲水させ腸炎を誘発。DSS開始後3日目に臨床スコアを測定し、マウスを2群に分け、一方に1×10^6cellsの血管内皮前駆細胞を100μlのリン酸緩衝液(PBS)に懸濁し尾静脈より投与した。もう一方の群はコントロール群とし、PBS100μlを尾静脈より投与した。実験経過中、体重を連日、臨床スコアを隔日で測定し、DSS投与終了後5日目にサクリファイスを行った。血管内皮前駆細胞を投与したマウスではコントロール群に対してDSS終了後4日目より体重の有意な改善を認めた。また、臨床スコアにおいても改善傾向であった。腸管長においてもコントロール群と比較し血管内皮前駆細胞投与群において長い傾向を認めた。このことから血管内皮前駆細胞またはその誘導体の投与が炎症性腸疾患の新たな治療法となる可能性が示唆された。現在、再実験を行い上記の結果を確認すると共に血管内皮前駆細胞による腸炎改善の機序や投与された血管内皮前駆細胞の動態についてさらなる検討を進めている。
反芻家畜における栄養素排泄低減のための栄養・飼料制御技術の開発に関する研究

我が国では、食品製造副産物の飼料としての利用が環境保全の点からも、飼料の自給率を上げるためにも望まれているが、いまだ十分に利用されていない。本研究は、特に発酵食品製造副産物の飼料としての利用を試みた。我が国では、食品製造副産物の飼料としての利用が環境保全の点からも、飼料の自給率を上げるという点からも望まれているが、いまだ十分に利用されていない。第一に様々な発酵食品製造副産物の成分分析を行い、その飼料としての利用の可能性を検討した。ビール粕、ビール酵母、ウイスキー粕、醤油粕はかなりの量の有機物と粗タンパク質を含んでおり、濃厚飼料の代替物として利用できる可能性が示された。また、醤油粕はマクロミネラル(ナトリウム、塩素、リン、カルシウム)に富んでおり、マクロミネラル源としての利用が可能であることが明らかとなった。一方、焼酎粕は水分含量が著しく多いため、利用する上で問題であることが示された。第二に高い水分含量の焼酎粕を利用するため、様々な濃度の焼酎粕とイナワラを用いたサイレージ調製を行い、ヤギにおける嗜好性を検討した。イナワラと比較し、イナワラと等量の焼酎粕からなるサイレージは嗜好性が高いことが明らかとなり、また、このサイレージのみを給与することにより体重を維持できた。第三にイナワラまたは焼酎・イナワラサイレージとビール粕、醤油粕、ビール酵母からなる飼料を調製し、ヤギを用いた消化試験に供試した。飼料の乾物、粗タンパク質、粗脂肪、粗繊維の消化率は焼酎を加えることにより向上した。反芻胃内pHは6.436.90であり、アンモニア態窒素は25.945.9mg/dlであり、反芻胃内微生物が繊維消化を行う上で良好な環境を保てることが示された。
脊椎動物の線胃における塩酸分泌細胞とペプシノゲン分泌細胞の分化と進化の機構

我々はこれまでに、消化管間充織で特異的に発現される転写因子であるFoxl1欠損(Foxl1-/-)マウスでは、腺胃上皮細胞の増殖が昂進し、通常は下等脊椎動物にしか見られないOxynticopeptic Cells様の細胞が上皮内に分化することを見いだした。よってFoxl1の作用機構を調べれば、は虫類から哺乳類への進化の過程で、Oxynticopeptic Cellsから塩酸分泌細胞とペプシノゲン分泌細胞が分化した機構が明らかになることが期待される。また消化管上皮細胞の増殖昂進と分化異常は小腸でも観察されるので、Foxl1は、腺胃だけでなく小腸でも、同様な機構で作用していると考えられる。そのため、Foxl1の作用機構の解析を小腸でも行った。その結果、Foxl1-/-マウス小腸では、(1)細胞接着因子としては、EphB2およびEphB3が野生型よりも強く(EphB2は約3倍、EphB3は約1.5倍)またより広い(EphB2は約2倍)範囲で発現されること、(2)細胞間情報伝達に関与する因子としては、間充織におけるWnt4およびWnt11の発現が野生型の3-4倍に増えること、(3)細胞外基質としては、上皮におけるSyndecan2および間充織におけるGlypican3の発現が野生型よりも増加していることを見いだした。これらの結果は、間充織で発現されるFoxl1は、Wntなどの作用を介してEphによる上皮細胞の細胞接着を制御し、その結果、上皮細胞の分化が変動するという機構を示唆している。またFoxl1-/-マウス胃では、SNAP25という細胞内情報伝達物質の発現が野生型の約1/3に減少していることを見いだした。Foxl1-/-マウスでは、胃上皮細胞内でのSNAP25による情報伝達が抑制されるため、その結果、Oxynticopeptic Cells様の細胞が分化するという機構の存在が示唆される。今後、これらの因子の作用機構を調べることにより、胃上皮細胞の分化と進化の機構を明らかにしたい。我々はこれまでに、消化管間充織で特異的に発現される転写因子Fkh6(最近、遺伝子名がFoxl1に変更されたので以下それに従う)をノックアウトした(Foxl1-/-)マウスでは、腺胃上皮細胞の増殖が昂進し、その分化が異常になることを見いだし(Fukamachi et al.,Biochem, Biophys.Res.Commun.,280,1069-1076,2001)、間充織から分泌される誘導因子の同定を試みてきた。最近このノックアウトマウスの消化管上皮直下に、細胞外基質であるプロテオグリカンが異常蓄積していることが報告され、これが誘導因子である可能性が示された(J.Biol.Chem.,276,43329-43333,2001)。実際、我々が作成したノックアウトマウスでも細胞外基質が増加していることが確認されたので、この異常蓄積された細胞外基質の作用機構の解明が重要な課題となった。最近我々は、Foxl1-/-マウスの十二指腸でパネート細胞の分布に異常があることを見いだした。

一方、細胞接着・情報伝達因子であるEphB2/B3が欠損するとパネート細胞の分布が異常になることが最近報告された(Cell,111,251-263,2002)。よって、Foxl1-/-マウスにおいても、細胞外基質の異常蓄積がEphB2/B3の分布異常を引き起こし、その結果、上皮細胞の増殖・分化が異常になるという機構が考えられる。実際、Foxl1-/-マウスにおいてEphB2/B3の分布に異常があるという予備的なデータが最近得られた。今後、このデータを確認すると共に、上記の仮説に基づいて、解析を進める。我々はこれまでに、消化管間充織で特異的に発現される転写因子であるFoxl1欠損(Foxl1-/-)マウスでは、腺胃上皮細胞の増殖が昂進し、通常は下等脊椎動物にしか見られないOxynticopeptic Cellsの細胞が上皮内に分化することを見いだした。よってFoxl1の作用機構を調べれば、は虫類から哺乳類への進化の過程で、Oxynticopeptic Cellsから塩酸分泌細胞とペプシノゲン分泌細胞が分化した機構が明らかになることが期待される。また消化管上皮細胞の増殖昂進と分化異常は小腸でも観察されるので、Foxl1は、腺胃だけでなく小腸でも、同様な機構で作用していると考えられる。そのため本年は、Foxl1の作用機構の解析を小腸でも行った。その結果、Foxl1-/-マウス小腸では、(1)細胞接着因子としては、EphB2およびEphB3が野生型よりも強く(EphB2は約3倍、EphB3は約1.5倍)またより広い(EphB2は約2倍)範囲で発現されること、(2)細胞間情報伝達に関与する因子としては、間充織におけるWnt4およびWnt11の発現が野生型の3-4倍に増えること、(3)細胞外基質としては、上皮におけるSyndecan2および間充織におけるGlypican3の発現が野生型よりも増加していることを見いだした。これらの結果から、間充織で発現されるFoxl1は、Wntなどの作用を介して、Ephによる上皮細胞の細胞接着を制御し、その結果、上皮細胞の分化が変動するという機構が明らかになった。またFoxl1-/-マウス胃では、SNAP25という細胞内情報伝達物質の発現が野生型の約1/3に減少していることを見いだした。Foxl1-/-マウスでは、胃上皮細胞内でのSNAP25による情報伝達が抑制されるため、その結果、Oxynticopeptic Cells様の細胞が分化するという機構の存在が示唆される。本年は、Foxl1の作用に関わると思われる因子の同定に成功した。
六朝文学に於ける『山海経』受容史

●基礎研究とその成果六朝文学に於ける『山海経』の受容の形態について、主に、東晋の郭璞『山海経図讃』を採り上げ、また、郭璞以降の『山海経』受容の形態を、初唐成立とされる『天地端祥志』に探った。研究・調査に当たっては、図像と文献の双方からの検討を試みた。(1)の郭璞『山海経図讃』については、当該作品の一編である、「崑崙丘圖讃」を採り上げ、そこに展開される、郭璞独自の水の宇宙観について検討した。その研究成果は、論文の形に纏め、『松浦友久先生記念中国古典文学論文集』に掲載した。(2)の六朝以降の『山海経』受容については、現在、日本にのみ残る逸書・前田尊経閣文庫所蔵『天地端祥志』に見える『山海経』受容を巡って、主に郭璞の影響を中心に検討した。その成果は、日本道教学会全国大会にて発表し、早稲田大学21世紀COE研究報告書に纏めた。さらに『天地端祥志』に見える鳳凰の項目に『山海経』の鳳凰の系譜を引く四羽の凶鳥が描かれる点に注目し、この凶鳥の成立と変遷を巡って、『山海経』世界とも関わりの深い。緯書『楽叶圖徴』を中心に検討した。その成果は21COE研究に於て発表した。●『山海経』図像調査とその成果(学会発表など)『山海経』の図像研究としては、日本道教学会全国大会において、六朝以降の『山海経』受容の形態を探る試みとして用いた前田尊経閣文庫本『天地端祥志』に賦される34の図像について『山海経』図像との関わりを、郭璞という人物を軸に検討した。検討に当たっては、『天地端祥志』との継承関係が認められる敦煌本『端應圖』にも言及した。その研究成果は早稲田大学21COE研究報告書として纏めた。基本研究とその成果六朝文学に於ける『山海経』の受容の形態を、(1)東晋の郭璞、(2)梁の江淹の二人の六朝詩人を中心に検討した。その研究・調査に当たっては、図像学と文献学の双方からの検討を試みた。(1)の郭璞と『山海経』の関わりについては、主に『山海経図讃』を中心に、その瑞祥観念を基軸として文献・図像の双方から検討し、その成果を早稲田大学の21世紀COE研究として報告書に纏めた。(2)の江淹については、『山海経』の補欠と目される「遂古篇」について文献を主軸に検討し、その成果は日中学会で発表し、投稿論文に纏めた(投稿査読中)。『山海経』図像調査とその成果『山海経』図像の調査として、04.9.6-16の間、デジタルカメラを使用して、中国の四川省に点在する漢代の闕、及び画像石の調査を行った。調査は主に西王母の仙境とその眷属-特に九尾狐の図像に絞り、約350カットの図像資料を得た。その成果はデータベース化し瑞祥観念との関わりを中心に検討した(1)の郭璞『山海経図讃』研究に用いた。05.3.17-27の間、同様の目的のもと、中国の河南省出土の漢画像石・画像磚の調査を予定している。また、(2)の梁の江淹に於ける『山海経』の受容研究の一貫として、『山海経圖』を製作したと伝えられる梁の張僧〓の傑作・大阪市立美術館所蔵の「五星二十八宿圖」を調査した。また、二度に亘る四川省での漢闕画像(石)資料の収集成果については、一部を上記の早稲田大学21世紀COE研究報告会に於て発表した。●『山海経』図像調査とその成果(学会発表など)

『山海経』の図像研究としては、日本道教学会全国大会において、六朝以降の『山海経』受容の形態を探る試みとして用いた前田尊経閣文庫本『天地端祥志』に賦される34の図像について『山海経』図像との関わりを、郭璞という人物を軸に検討した。検討に当たっては、『天地端祥志』との継承関係が認められる敦煌本『端應圖』にも言及した。その研究成果は早稲田大学21COE研究報告書として纏めた。
強力に複数の炎症性サイトカインを抑制する新薬・DHMEQのSLEに対する治療開発

自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス(SLE)は難治性である。34%の患者に後遺症を認め、症状が安定していても、副作用が多いステロイドを内服し続けなればならない。重症例に、単一の炎症性サイトカインを抑える生物学的製剤が試されているが、効果は弱く、重篤な副作用が問題である。一方、新規NF-κB阻害剤・DHMEQは、強力に複数の炎症性サイトカインを抑制し、副作用が少ない。申請者らは、DHMEQに着目し、さまざまな難治性のモデルマウスにおいて、治療効果を明らかにしてきた。これらの成果をふまえ、本研究では、SLEのモデルマウスに対してDHMEQが有効であることを証明する。
脳死関連肺障害の病態解明と予防・治療法の開発－特にＮＰＹとＶＥＧＦと関連して

我々は、ラット神経付き肺潅流標本およびラットフィブリン誘発神経原性肺水腫(NPE)モデルを用いた検討において、肺交感神経終末でカテコールアミンと共存する神経ペプチドY(NPY)による神経性調節が細胞透過性に関与することを明らかにしてきた。しかしながら、NPYの作用機序は未だ不明なままである。本研究は、in vitro肺細胞透過性評価系を構築し、NPYの作用機序を細胞レベルで明らかにすることを目的とする。本年度は、昨年度に導入したヒト正常肺微小血管内皮細胞(HMVEC-L)とヒト気管支上皮細胞株(Calu-3)の2種類のin vitro細胞透過性アッセイ系を用いてNPYの作用を検討した。半透膜のついたセルカルチャーインサートを24ウェルプレートに懸垂した。インサート内側に細胞を播種し、外側には内側と液面の高さが同じになるように培地を満たした。インサート内の細胞が単層を形成するまで培養した後、インサート内側にNPYを添加した。同時に、100 &micro;g/mLの蛍光標識したアルブミンを添加した。添加6-24時間後にウェル中培地の蛍光強度を測定し、細胞透過性の指標とした。また、ヒト単球細胞株THP-1細胞を分化処理したマクロファージモデル細胞をNPY存在下で培養し、その培養上清をCalu-3アッセイ系に供することにより、肺上皮細胞に対するNPYの間接的な作用を検討した。HMVEC-LおよびCalu-3の両方のアッセイ系において、1 ×10-7 MのNPYは細胞透過性に影響を及ぼさなかった。しかしながら、1 ×10-8 MのNPYで処理したマクロファージ培地は、培養6時間後に有意な細胞透過性亢進を引き起こした。これらの結果は、NPEにおいて、NPYが血管内皮細胞や肺上皮細胞に直接作用するのではなく、マクロファージ刺激を介して肺上皮細胞透過性亢進を引き起こしていることを示唆する。肺動脈血管内皮細胞層における透過性亢進作用を検討する試験系として、下部に1 μmの孔を持つ膜のついたインターセル内に細胞を播種し、3日間培養後にインターセル内に薬物と共に蛍光物質FITCで標識されたアルブミンを添加して、反応終了後にインターセル外側ウェル中培地の蛍光強度を測定する方法を確立している。この系を用いてLipopolysaccharideや血管内皮細胞成長因子(VEGF)など、数種の既報の血管内皮細胞透過性亢進物質の作用を検討したところ、全てで報告どおりの有意な透過性亢進作用が認められた。しかし、肺水腫発症に関与すると考える神経ペプチドY(NPY)をはじめ、いくつかの麻酔薬には、この系での有意な細胞透過性亢進作用は認められなかった。一つの要因として、細胞間の隙間を大きくする作用が小さい場合、分子量が大きいFITC標識アルブミン(分子量66 kDaのアルブミン1モルに分子量389.4のFITCが7-12モル結合)の通過が妨げられるため、透過性亢進作用が弱い物質の効果は検出が難しくなっているのではないかと考えた。そこで、未検討であった吸入麻酔薬のIsoflurane(2%)とSevoflurane(3%)の作用をこれまでの試験系で検討すると同時に、アルブミンの結合していないFITCを用いたアッセイ系でも同薬剤の評価を行うことにした。薬剤の反応時間を8時間まで検討したが、2種の吸入麻酔薬はどちら系においても有意な細胞透過性亢進作用を示さなかった。アッセイの際にコントロールとなる細胞単層バリアーに対するFITCおよびFITC標識アルブミンの8時間後における透過率はそれぞれ、58-70%と25-34%で、使用する蛍光物質の分子量の違いが透過率に反映することを確認し、FITCを使用する系が既存のものとは検出感度の異なるアッセイ系として使用できる可能性が示唆された。揮発性吸入麻酔薬を用いた検討は、これまでのペプチドや薬剤のように培地へ直接添加するのではなく、チャンバー内で細胞系にガスを暴露させる方法であったため、麻酔機器の準備から実際の運用、安定した暴露条件の設定に時間を要した。しかしながら、吸入麻酔薬の作用を細胞レベルで評価できる環境を整えることができた。検出感度の異なるin vitro肺血管内皮細胞モデル系を追加できたことと併せて、今後研究を進めるにおいて有益であると考える。上記に加え、現在検討途中段階にある血管平滑筋細胞を用いたNPY誘発VEGF産生量の測定試験を先行して行なったため、当初の優先検討課題であった「ラット脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わるneuropeptidesの同定とVEGFの関与」に着手できなかった。肺動脈血管内皮細胞層における透過性亢進作用を検討する試験系として、下部に1 &micro;mの孔を持つ膜のついたインターセル内に細胞を播種し、3日間培養することで膜上に細胞バリアを形成させた後、インターセル内に薬物と共に蛍光物質FITCで標識されたアルブミンを添加して、反応終了後のインターセル外側ウェル中培地の蛍光強度を測定する方法を確立している。この系を用いてLipopolysaccharideや血管内皮細胞成長因子(VEGF)など、数種の既報の血管内皮細胞透過性亢進物質の作用を検討したところ、検討した全ての物質で報告どおりの有意な透過性亢進作用が認められている。

しかしながら、我々が神経原生肺水腫発症に関与すると考えている神経ペプチドY(NPY)はこの系で細胞透過性亢進作用を示さず、ノルアドレナリンとの共存下でも作用は認められていない。本年度は、この系を用い、未検討であったアドレナリン単独の作用を検討すると共に、NPYとの併用効果についても検討を行った。アドレナリンは、神経原生肺水腫患者の血中で検出されるレベルである10-100 nMになるように、併用するNPYはラット脳死モデルにおける肺水腫液中濃度の100 nMになるように調製、添加し、37°Cインキュベーター内で24時間反応を行った。その結果、アドレナリンは検討した濃度範囲において有意な細胞透過性亢進作用を示さなかった。また同様に、アドレナリン30および100 nMとNPY 100 nMとの併用でも細胞透過性に変化は見られなかった。以上の結果から、神経原生肺水腫における細胞透過性亢進は、アドレナリンやNPYが血管内皮細胞に直接的に作用することにより引き起こされるのではないことが示唆された。我々が確立した細胞透過性評価系を用いた検討において、神経原生肺水腫発症に関与すると考えているNPYが、通常の培養条件のみならず、低酸素やカテコールアミンとの併用など、実際の病態を考慮した培養条件下でも全く作用が認められないため、NPYの作用メカニズム解明に向けて今後どのように研究を進めていくのが良いか考えることに時間を要した。今年度に得られた実験結果も含め、NPYの作用点が肺血管内皮細胞以外にある可能性が示唆されたことは、今後を考える上で有益であった。上記に加え、当初の優先検討課題であった「ラット脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わるneuropeptidesの同定とVEGFの関与」について、ラットではなくマウスを用いて検討を開始しているが、研究に使用できる脳死モデルマウスの確立には至らなかった。我々は、ラット神経付き肺潅流標本およびラットフィブリン誘発神経原性肺水腫モデルを用いた検討において、肺交感神経終末でカテコールアミンと共存する神経ペプチドY(NPY)による神経性調節が細胞透過性に関与することを明らかにしてきた。しかしながら、NPYの作用機序や一般的な肺水腫との関連については未だ不明なままである。本研究は、in vitro肺細胞透過性評価系を構築し、NPYの作用機序を細胞レベルで明らかにすることを目的としている。我々はこれまでに、肺動脈血管内皮細胞(HPAEC)を用い、薬物等による細胞透過性亢進作用を評価するin vitroアッセイ系を確立し、NPYの作用を検討してきた。しかしながら、NPYはこの系で細胞透過性亢進作用を示さず、ノルアドレナリンやアドレナリンとの共存下においてもその作用は認められなかった。本年度は、in vitroアッセイ系をより実際の肺環境に近いものとするために、ヒト正常肺微小血管内皮細胞(HMVEC-L)とヒト気管支上皮細胞株(Calu-3)を使用することによるアッセイ系の改良を試みた。さらに、これらアッセイ系確立後のNPY評価に先立ち、2つの細胞におけるNPY受容体の発現の有無を蛋白質レベルで解析した。HMVEC-LおよびCalu-3で作製した2つのin vitro細胞透過性アッセイ系において、陽性対照となりうるLipopolysaccharide(LPS)の有意な細胞透過性亢進作用を確認した。そのLPSの作用濃度は、HMVEC-L系では100 ng/mlであったのに対し、Calu-3系では5 μg/ml以上であった。
再生不良性貧血および骨髄異形成症候群におけるモノソミ-7に関する研究

1)骨髄単核球におけるモノソミ-7陽性細胞の変動:再生不良性貧血よりMDSへ移行した4症例の再生不良性貧血初期はモノソミ-7は陰性であった。しかし、MDSに進展するに伴い、骨髄での陽性率は上昇した。染色体検査で100%monosomy 7を有するAML症例では98%の骨髄細胞がモノソミ-7陽性を示した。2)コロニーにおけるモノソミ-7陽性細胞の変動:染色体検査で100%monosomy 7を有するAMLの骨髄細胞から形成されたコロニーでは、1シグナル細胞率は94.194.1%(平均96.7%)であった。FISH法では偽陰性が生じることより、このAMLの骨髄直接法およびコロニー細胞のモノソミ-7陽性率は100%と考えられた。ところが、再生不良性貧血よりMDSへ移行した3症例の骨髄血でモノソミ-7を認めた検体から形成されたコロニーでは、コロニー内1シグナル細胞率は11.497.2%であり、同一コロニー内にモノソミ-7陽性細胞と正常核型細胞が種々の割合で混在することが見いだされた。メチルセルロース半固形培地に細胞を埋め込んで培養する方法は、1個の細胞から分裂、増殖し、1個のコロニーを形成すると言われている。従って、正常核型細胞とモノソミ-7陽性細胞が同時に存在したコロニーの血液前駆細胞は元来2個の7番染色体を有しているものの、分化・増殖する過程でどちらか一方の7番染色体が欠損し、モノソミ-7細胞を生じると考えられた。また、混在したコロニーが複数個形成されたことより、MDS初期ではモノソミ-7を獲得した血液前駆細胞だけからモノソミ-7細胞が生じるのではなく、複数の正常核型細胞に7番染色体の不安定性が存在し、それらの細胞からモノソミ-7細胞が生じたと考えられた。
抗腫瘍活性天然物の活性制御機構の解明

海洋天然物には極めて低濃度で強力な細胞毒性を示す化合物が見出されており、抗がん剤のリード化合物として期待されている化合物が複数存在する。強力な細胞毒性物質は、それを生産する生物自身においても有害な作用を及ぼす可能性があり、その生合成過程には自らが生産した二次代謝産物の毒性に対する自己耐性機構および活性化機構が潜在的に内在している可能性が高い。しかし、強力な細胞毒性を有する海綿由来天然物において、このような耐性ー活性化機構を明らかにした研究例はこれまでほとんどない。そこで、本研究では海綿由来細胞毒性物質の組織傷害応答性の活性化機構を明らかにすることを目的とした。中でもハリコンドリンBやエクテナサイジンは海洋天然物由来の抗がん剤開発の成功事例として記憶に新しい。細胞毒性物質の多くがチューブリンやアクチンなどの細胞骨格分子やタンパク質脱リン酸化酵素などを特異的に阻害し、細胞周期に変調をもたらし、増殖阻害活性を発揮する。これらの標的分子は動物細胞に共通して存在するタンパク質である一方、生物活性海洋天然物の多くが海綿やホヤなどの海洋無脊椎動物に含まれている。したがって、海洋無脊椎動物における強力な細胞毒性物質の生産機構には自己耐性機構が内在している可能性が高いが、その詳細な機構はほとんど分かっていない。本研究では伊豆半島、伊豆諸島に生息するチョコガタイシカイメン(Discodermia calyx)を対象として細胞毒性物質生産過程の自己耐性機構を明らかにすることを目的とした。チョコガタイシカイメンにはタンパク質脱リン酸化酵素1及び2Aの特異的阻害剤であるcalyculin Aが高濃度で含まれている。我々は先行研究においてcalyculin Aの生合成遺伝子の取得に成功しており、その詳細な機能解析の過程で、calyculin Aのリン酸化酵素CalQを見出した。CalQは当初生合成の最終産物と考えられていたcalyculin Aをさらにリン酸化し、ピロリン酸基を有する新規化合物phosphocalyculin Aを与える。Phosphocalyculin Aの細胞毒性はcalyculin Aよりも1000倍低下しており、未同定の脱リン酸化酵素によって脱リン酸化され、活性化されることが分かっている。そこで、海綿粗酵素液に含まれるphosphocalyculin A脱リン酸化活性を指標に脱リン酸化酵素の単離・同定を試みた。Calyculin類は伊豆半島沿岸に生息するチョコガタイシカイメンDiscodermia calyxより単離された強力な細胞毒性物質であり、タンパク質脱リン酸化酵素1及び2Aを特異的に阻害する。分子内に有するリン酸エステル基がリン酸化セリン、スレオニン残基のミミックとして機能し、強力な酵素阻害活性を示すと考えられている。先行研究において我々は海綿D. calyxのメタゲノムDNAより、calyculin生合成遺伝子のクローニングを行った。さらに遺伝子クラスター上流にコードされたリン酸基転移酵素を大腸菌にて異種発現し、その機能解析を試みた。その結果、calyculin Aの分子内リン酸エステル基がさらにリン酸化され、より低毒性なphosphocalyculin Aが生じることが分かった。Phosphocalyculin Aは従来の抽出、単離工程では見出されていなかった新規類縁体であった。そこで、海綿D. calyxより粗酵素液を調製し、プロドラッグ体phosphocalyculin Aと反応させた。その結果、D. calyx特異的に存在する酵素により、phosphocalyculin Aの脱リン酸化が進行し、calyculin Aが生じた。これらの実験結果は、calyculin類のリン酸化-脱リン酸化を介した巧妙なactivated chemical defense機構が海綿D. calyxに内在することを示している。さらに、活性化酵素である脱リン酸化酵素を同定するために、phosphocalyculin A脱リン酸化活性を指標として、陰イオン交換やゲルろ過など各種クロマトグラフィーを用いて海綿粗酵素液の分画精製条件を検討した。その結果、粗酵素液より比活性が約100,000倍濃縮した活性タンパク質画分が得られ、SDS-PAGEにおいて約50 kDa付近に活性画分特異的なバンドが確認できた。現在、MS/MS解析により得られたタンパク質の同定を試みている。海綿動物Discodermia calyxに含まれるcalyculin Aはタンパク質脱リン酸化酵素1および2Aを特異的に阻害し、極めて強力な細胞毒性を示す。我々は海綿メタゲノムよりcalyculin A生合成遺伝子クラスターの取得に成功し、詳細な生合成経路の解析を進めている。その過程で見出したリン酸基転移酵素CalQがcalyculin Aにリン酸基を付与し、ピロリン酸基を含むphosphocalyculin Aを生成することを明らかにした。Phosphocalyculin Aの細胞毒性は約1,000倍低下しており、calyculin Aのprodrug体であることが示唆された。また、遺伝子クラスターの局在を解析することで、calyculin Aは海綿共生微生物Entotheonellaによって生合成されることを突き止めた。これらのことから、海綿共生微生物はより低毒性なphosphocalyculin Aを生産することで、動物であるホスト側への毒性を軽減していることが示唆される。さらにCalyculin Aは抗菌活性を示さないことから、生産者であるEototheonellaに対しての毒性はないものと考えられる。そのため、この巧妙な物質生産機構には共生微生物と海綿動物間のクロストークが伺える。

本研究ではphosphocalyculin Aからcalyculin Aへの変換を担う脱リン酸化酵素の同定を試みた。海綿粗酵素液の段階で見出された脱リン酸化活性を指標に硫安分画や各種クロマトグラフィー法を組み合わせ、比活性が粗酵素液よりも約10万倍濃縮した活性画分を得ることに成功した。SDS-PAGEによって活性画分に特異的なバンドが確認できたことから、該当するバンドを切り出し、MS/MS解析に供した。しかしながら、タンパク量が微量であったため、アミノ酸配列の解析には至らなかった。そこで、さらにザイモグラフィーを用いて、ゲルの切り出し、活性試験を繰り返し、該当するバンドの取得を試みた。得られたタンパク質のアミノ酸配列の解析を現在進めている。海洋天然物には極めて低濃度で強力な細胞毒性を示す化合物が見出されており、抗がん剤のリード化合物として期待されている化合物が複数存在する。強力な細胞毒性物質は、それを生産する生物自身においても有害な作用を及ぼす可能性があり、その生合成過程には自らが生産した二次代謝産物の毒性に対する自己耐性機構および活性化機構が潜在的に内在している可能性が高い。しかし、強力な細胞毒性を有する海綿由来天然物において、このような耐性ー活性化機構を明らかにした研究例はこれまでほとんどない。そこで、本研究では海綿由来細胞毒性物質の組織傷害応答性の活性化機構を明らかにすることを目的とした。本年度は脱リン酸化活性を有する酵素の分画・精製を重点的に試みた。海綿内におけるphosphocalyculin Aの活性化は組織障害依存性の刺激に伴い作動するが、単純にプロドラッグ体と活性化酵素が混じり合う機構だけでは説明できない要素がいくつか考えられる。例えば、組織障害だけではcalyculin A生産者である微小なバクテリア細胞まで物理的に壊すことは不可能と考えられる。したがって、より複雑なシグナル伝達機構が内在することが示唆される。そのため、シグナルの最下流に位置する活性化された脱リン酸化酵素をまず同定することが重要な足がかりとなる。超遠心、硫安分画、各種ゲルろ過やイオン交換カラムクロマトグラフィーを分離方法として検討した。その結果、比活性を濃縮することに成功したが、依然として効率的な分離には至っていない。今年度はさらにカラム精製条件を詳細に検討するとともに、基質との親和性を指標としたアフィニティーカラムやザイモグラフィーの適用も試みる。天然物化学予定していた物品の納品が年度内に間に合わなかったため。前年度末に購入を予定してた試薬類の購入に充てる。
配偶子幹細胞/ニッチシステムの季節性制御機構の解明

熱帯以外の地域に生息する多くの動物は、特定の季節にのみ生殖活動を行う「季節繁殖」という戦略をとっている。なかでもウズラは洗練された季節適応能力を有しており、生殖腺もごく短い繁殖期にのみ一過的に発達させる。このため非繁殖期の精巣は外見上、未分化な状態にまで退縮する。本研究では生殖活動の季節変化に着目し、配偶子幹細胞/ニッチシステムの制御機構を解明することを目的とした。生物は日照時間の変化をカレンダーとして季節繁殖を制御しているが、哺乳類以外の脊椎動物は脳内に存在する脳深部光受容器によって日長の変化を感知することが知られていた。脳深部光受容器の存在は約100年前にカール・フォン・フリッシュによって指摘されていたが、その実体は不明であった。本研究ではウズラの脳深部に発現する新規な視物質「オプシン5」を同定した。オプシン5は脳内だけでなく、精巣にも発現していることから、今後精巣における機能の解明が期待される。また、ウズラを長日条件から短日及び低温条件に暴露した結果、精巣の退縮が認められた。その際、精巣の形態変化を詳細に解析した結果、精巣の退縮にはアポトーシスが関与していることが明らかになった。また、同時に血中のホルモン濃度を測定し、機能解析を実施した結果、季節繁殖の制御における精巣の退縮には、オタマジャクシがカエルに変態する際に尾が退縮するのと同様な仕組みが関与していることが明らかになった。熱帯以外の地域に生息する多くの動物は、特定の季節にのみ繁殖活動を行う「季節繁殖」という戦略をとっている。なかでもウズラは脊椎動物の中で、特に洗練された季節適応能力を有しており、生殖線もごく短い繁殖期にのみ一過的に発達させる。このため非繁殖期の精巣は外見上、未分化な状態にまで退行する。このように急速かつ劇的な生殖腺の形態変化を伴う鳥類の季節繁殖は特徴ある配偶子生産様式を示す動物種の一例として、GSC/ニッチシステムを理解するための最適な系を提供する。本研究では生殖活動の季節変化に着目し、GSC/ニッチシステムの制御機構を解明することを目的としている。鳥類の精子形成については分子レベルの研究はほとんど行われておらず、精子形成に関与する遺伝子についての知見も皆無といって良い。そこでまず、哺乳類において精子形成に関与することが知られているマーカー遺伝子(Ptzf, GFRal, c-Ret, E-cadherin, c-Kit, Stra8, Vasa)のウズラオルソログをクローニングし、open reading frameの塩基配列を決定した。さらに、活発に精子形成を行っている繁殖期の精巣において、上記の分子マーカーの局在をin situ hybridizationによって詳細に検討した。この解析によって、鳥類と哺乳類の精子形成の相違点が徐々に明らかになってきた。