hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ZFNとrecombineeringを利用した遺伝子機能解析法の開発

人工的亜鉛ジンクフィンガー・ヌクレース(ZFN)と、BacterialArtifitial Chromosome(BAC)をベースとしたP[acman]をrecombineeringによって自在に改変し、これらを組み合わせて目的の遺伝子機能を自在に制御できる解析法を、ショウジョウバエをモデル動物として確立することを目的として研究を行った。WebツールZiFiTとZFNGenomeを利用して、CaMKIIコード領域の2つの人工的に設計された亜鉛ジンクフィンガー・ヌクレース(ZFN)標的配列9 bp+spacer 6 bp+9 bp (24bp)を選び、BLASTによってCaMKIIに特異的な配列であることを確かめた。オープンソースとしてのOPEN(Oligomerized Pool Engineering)を利用して、先ほどの標的配列の2種類の9bpをそれぞれ持つレポーター遺伝子を組み込んだ大腸菌で、感染可能な複数の組み合わせ持つプールのZFアレイをアッセイする大腸菌2ハイブリッドを行い、複数の最適なZFタンパクの選択を行っている。さらに最近報告された簡便な方法CoDAを生かせないかについても検討中である。一方、私が研究を進めているもう一つのニューロン特異的C2HC型Znフィンガー転写因子dnzf遺伝子については、P因子の不正確な切り出しによって既に欠失変異体を作製していたので、これを使ってattB-P(acman)をrecombineering法によって自在に改変して遺伝子機能を解析できるかを検討することにした。dnzf遺伝子をふくむ22、30 kbpのattB-P(acman)では変異体の表現系を回復することができなかったので、さらに80、100kbpのattB-P(acman)を持つトランスジェニックフライを作製した。いずれも変異体の表現系を回復することができた。dNZF発現ニューロンを標識するために、recombineeringによって80 kbpのattB-P(acman)の一部を欠失させてGAL4に置き換えたコンストラクトを作製し、トランスジェニックフライを作製中である。今後、内因性の発現を模倣でき機能を回復しないことを確認できれば、レポーター遺伝子を使って野生型と変異体での形態的機能的差異を詳細に調べる亜鉛ジンクフィンガー・ヌクレース(ZFN)と、Bacterial Artifitial Chromosome(BAC)をベースとしたattB-P(acman)をrecombineering法によって自在に改変し、これらを組み合わせて目的の遺伝子機能を自在に制御できる解析法を、ショウジョウバエをモデル動物として確立することを目的として研究を行った。1.いくつかのツールを使ってCaMKIIコード領域の最適なZFN標的配列を選択した。2.OPEN(Oligomerized Pool Engineering)を利用して標的配列を持つレポーター遺伝子を組み込んだ大腸菌を使って、感染可能な複数の組み合わせ持つプールのZFアレイをアッセイする大腸菌2ハイブリッドを行い、実験的に最適なZFタンパクを選択した。3.2つのZFNをそれぞれNLSを含む発現ベクターpCS-NLSにin-frameに組み込み、in vitroでキャップ付きRNAを合成した。NHEJ(非相同末端結合)による遺伝子改変に、これらのRNAを初期胚初期胚に注入し、成虫になったものを別個に交配しライン化した。ZFNによる遺伝子破壊を、標的配列を挟む部分にプライマーを作製しPCRを行い、DNAの欠失・付加を検出できる方法でスクリーニング中である。4.CaMKIIの遺伝子破壊は進行中であるので、申請者が作製したdNZF変異体について80kbpのattB-P(acman)によって表現型が回復することを確かめた。これをrecombineeringによって、翻訳開始をなくし酵母GAL遺伝子を挿入したattB-P(acman)を作製し、現在ライン化を試みている。このラインが内因性の発現パターンを再現できることを確め、当初の計画のようにCaMKI1遺伝子をrecombineeringによって改変しZFNと組み合わせた遺伝子機能解析法を確立する。
モード水の形成とサブダクションを介した北太平洋の水温・塩分構造の変動

アルゴフロートによる観測データの解析により、東部亜熱帯モード水の分布特性および水温・塩分偏差の形成への影響に関する研究を行った。東部亜熱帯モード水の密度の分布を見ると、冬季混合層深度の極大域では重いモード水が形成され、その東と南では軽いモード水が形成されることがわかった。海洋内部へとサブダクト後、いずれのモード水も循環に乗って南西へと移流される様子が見て取れたが、軽いものが比較的速やかに散逸するのに対して、重いものは翌年の冬季にも見られるなど、密度による分布特性の違いが明らかになった。重い東部亜熱帯モード水の密度帯に対応する等密度面上では、経年的な塩分偏差がアウトクロップ面から下流域へと伝播している様子が確認できた。モード水形成域では、2006ー2009年に強い高温・高塩アノマリー、2014ー2015年に強い低温・低塩アノマリーが形成されていた。モード水形成域における等圧面および等密度面上における塩分偏差の時間発展を見ると、2006ー2009年には、冬季混合層とモード水の下端から重い密度面へと、高温・高塩偏差が伝わっている様子が確認された。一方で2014ー2015年には、冬季混合層が浅いために、形成されたモード水の下端から重い等密度面上への高温・高塩偏差の伝播は起こらず、低温・低塩偏差が生まれたことがわかった。さらに、モード水形成域におけるこの密度面上の塩分偏差は、冬季混合層および春季のコア塩分の偏差とよく対応していた。さらにモード水の下端ではsalt fingerと呼ばれる強い拡散が起こりうる状況であることが、アルゴフロートによる観測から判明した。以上より、東部亜熱帯モード水はサブダクト後、拡散によって速やかに散逸するものの、その塩分偏差は拡散によって重い密度面へと伝わると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。アルゴフロートの観測データの解析により、東部亜熱帯モード水の形成要因、形成域における季節・経年変動、サブダクション過程を調べた。東部亜熱帯モード水の形成域である北太平洋亜熱帯域東部の冬季混合層深度の極大域が、夏季の海面密度極大の分布とよく対応していた。この海面密度極大の形成には海面塩分フロントの存在が重要であることがわかったほか、この海面密度極大が形成されることで亜表層との密度差が小さくなり、局所的に成層が弱く、冬季混合層の発達しやすい状況となっていた。この状況が東部亜熱帯モード水の形成に重要であると考えられ、東部亜熱帯モード水形成における海面塩分フロントの存在の重要性が新たに示唆された。また、形成域における混合層水温・塩分の季節・経年変動とそのメカニズムを調べたところ、両者の季節変動において、冬季に混合層が深くなることに伴う混合層の下からの低温・低塩水のエントレインメントが重要な役割を果たしていた。さらに、等密度面上を水温偏差と密度補償する塩分偏差であるスパイシネスアノマリーが、形成域から経年的に亜熱帯循環内を伝播している様子が確認できた。このスパイシネスアノマリーは基本的に形成域の水温変動を反映していたが、年によっては塩分変動が重要な寄与を持っていた。一方で、東部亜熱帯モード水は海洋内部にサブダクト後、速やかに消失していた。このことから東部亜熱帯モード水消失後もアノマリーは海洋内部に残ると考えられる。また、この経年的なアノマリーが翌年の冬季に再出現しない要因として、下流域の冬季混合層深度がスパイシネスアノマリーの伝播する深度よりも浅いことが考えられる。これまで東部亜熱帯モード水の形成過程、サブダクション過程を対象に研究を行った。研究目的である、形成域における東部亜熱帯モード水の水温・塩分の季節・経年変動の調査および季節変動のメカニズムの解明を達成することができた。さらに、形成域における経年変動に関連した経年的なスパイシネスアノマリーが等密度面上を亜熱帯循環に乗って下流域へと伝播していること、東部亜熱帯モード水が海洋内部へサブダクト後、速やかに消失する一方で、これらのスパイシネスアノマリーが海洋内部に消えずに残ることなど、東部亜熱帯モード水のサブダクション過程に関して新たな知見を得ることができた。また、形成位要因に関しても海面塩分フロントに伴った夏季海面密度極大の存在の重要性を指摘できた。以上より、現在までの進捗状況は予定通り順調に進んでいると判断できる。

モード水形成域における等圧面および等密度面上における塩分偏差の時間発展を見ると、2006ー2009年には、冬季混合層とモード水の下端から重い密度面へと、高温・高塩偏差が伝わっている様子が確認された。一方で2014ー2015年には、冬季混合層が浅いために、形成されたモード水の下端から重い等密度面上への高温・高塩偏差の伝播は起こらず、低温・低塩偏差が生まれたことがわかった。さらに、モード水形成域におけるこの密度面上の塩分偏差は、冬季混合層および春季のコア塩分の偏差とよく対応していた。さらにモード水の下端ではsalt fingerと呼ばれる強い拡散が起こりうる状況であることが、アルゴフロートによる観測から判明した。以上より、東部亜熱帯モード水はサブダクト後、拡散によって速やかに散逸するものの、その塩分偏差は拡散によって重い密度面へと伝わると考えられる。今後は東部亜熱帯モード水形成域においてスパイシネスアノマリーがどのように形成されるのか、海洋内部へサブダクトしたスパイシネスアノマリーが亜熱帯循環全体の構造にどのような影響を及ぼすのか、などの残された部分を詰め、論文として投稿する予定である。また、論文投稿後、本研究のもう一つの研究対象である中央モード水および移行領域モード水に研究対象を移す。これらのモード水の形成域における季節・経年変動およびそれらのメカニズムの解明、具体的な流路などその詳細なサブダクション過程の解明、そしてサブダクトしたこれらのモード水が先行研究によって指摘されている経年的な水温アノマリーの下流域での再出現とどのように関連しているのか、その定量的評価を研究目的としてさらに解析を行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ラグランジュ型シミュレーションによる細胞の透過・吸着ダイナミクスの解明

本研究では,繊維層中を流れるマイクロ粒子の挙動を詳細にシミュレートすることで,複雑な繊維層の構造が粒子の移動特性に与える影響を明らかにすることを目的とする.特に多血小板血漿(PRP)作製のためのフィルターによる濾過プロセスを念頭に置き,それらを通して,粒子の繊維への付着および移動現象の解明を目指す.平成30年度は「細胞が分散した溶液の繊維層中の流動解析」を主として行った.繊維への細胞粒子の付着を表すために,繊維ー粒子間に作用する力の再検討をした.前年度に検討したvan der Waals力,静電気力に加え,血小板とPRPフィルターの間に作用する力について文献調査を行った.PRPによる分離プロセスでは,流体中に血小板以外の血球成分も含まれるため,それらを用いた実験等も行った.血小板と血管壁の間に作用する力のモデルはいくつか見つかったものの,PRPフィルターに関連した情報を得ることはできなかった.また,市販のPRPフィルター中で血小板および血球の透過挙動を観察することが可能かどうかを検討するために,マイクロスケールの装置を自作したが,期待した成果は得られなかった.このため,化学・生物学的な引力による吸着よりも先に,まずは流体力学に基づく細胞粒子挙動を丁寧に再現し,繊維の隙間に細胞粒子が捕捉される現象に着目して,細胞粒子のサイズの効果を議論することにした.細胞粒子のサイズに数倍のオーダーの幅がある場合に,粒子が繊維に妨げられることによって捕捉される現象をStokesian dynamics法によって再現した.従来の計算コードでは繊維と粒子の半径が等しいという前提のものであったが,任意の半径を与えられるように拡張した.新しい計算コードの妥当性を確認した後,粒子サイズの異なる条件で解析を行い,繊維層内部を通過する際の粒子挙動の違い,および捕集されやすさの違いについて考察した.本年度は,「細胞が分散した溶液の繊維層中の流動解析」が目標であった.血小板および白血球の繊維への吸着過程の再現には至らなかったが,まずは流体力学に基づく細胞粒子挙動を丁寧に再現し,繊維の隙間に細胞粒子が捕捉される現象を明らかにすることにした.Javadpour and Jeje (2012)によると,PRPフィルターの繊維と血小板の半径は同程度であることが報告されているが,分離プロセスでは血小板よりもサイズの大きな血球成分も存在する.このことから,細胞粒子のサイズに数倍のオーダーの幅がある場合に,粒子が繊維に妨げられることによって捕捉される現象をStokesian dynamics法によって再現した.前年度までに,繊維層を球形粒子の集合体でモデル化し,内部の流動場を解析する計算コードを作成したが,その中では粒子径を一定値として扱っていた.当該年度は,粒子径を粒子毎に異なるパラメータに変更した計算コードを構築した.まずは粒子が少ない場合についてStokes流れの特徴である対称性などを確認し,妥当性を検証した.次に,粒子モデルで表した繊維層内部に流体が満たされている場合に,細胞粒子が移動する現象をシミュレートした.計算結果から,細胞粒子のサイズによって,繊維に妨げられて捕集される細胞粒子の数,および繊維層内での細胞粒子の挙動が異なる傾向が示唆された.粒子の挙動として,特に個々の粒子の速度の違いや粒子群全体の拡がりに着目し,定量的な評価と考察を行った.次年度に実施予定であった「細胞サイズが移動特性に与える影響」については当該年度に達成済みである.一方で,「繊維への細胞の付着判定」については当該年度に達成できなかったため,次年度にも引き続き検証を行う.それ以外の研究内容については,当初の計画通り,令和元年度には「繊維層の構造が内部の細胞の移動特性に与える影響」に取り組む予定である.繊維層の形状および体積率が及ぼす影響については,当該年度に完成させた計算コードをアレンジすることで解析可能であると期待される.繊維の形状は,現状は直線状の繊維層を対象としているが,屈曲したより複雑な形状の繊維層に対しても解析し,内部の粒子の挙動に与える効果を明らかにする.繊維の体積率については,フィルター繊維を意図して1%7%程度の範囲に設定する.令和元年度は最終年度であるため,これまでの結果を整理し,国内外の学会発表や論文投稿にも重点的に取り組む.本研究では,繊維層中を流れるマイクロ粒子の挙動を詳細にシミュレートすることで,複雑な繊維層の構造が粒子の移動特性に与える影響を明らかにすることを目的とする.特に多血小板血漿(PRP)作製のためのフィルターによる濾過プロセスを念頭に置き,それらを通して,粒子の繊維への付着および移動現象の解明を目指す.平成29年度は「繊維ー細胞間の相互作用の検討」を主として行った.まずは繊維ー細胞間に作用するvan der Waals力(VDW力)を検討した.繊維を円柱形状で近似し,円柱と球形粒子の間に作用するVDW力を導出し,任意の位置にランダムに配置された円柱群と球形粒子間のVDW力を算出する計算コードを完成させた.次に,静電力について,Javadpour and Jeje (2012)により測定されたPRPフィルターの1本の繊維と血小板および白血球の間に作用する静電力をもとに,円柱ー球形粒子間に作用する静電力の計算をコードに組み込んだ.細胞の繊維への付着を考える場合には,これらに加えて生物学的反応により発生する力も考慮する必要があると考えられるため,現在検討を行っている.繊維中の細胞挙動のシミュレーションには,研究代表者らがこれまでに用いてきた数値解析手法であるStokesian dynamics法を用いる.

繊維層を球形粒子の集合体でモデル化し,内部の流動場を解析する計算コードに加え,本研究では,繊維層内部の流体で満たされた空隙部分を細胞粒子が移動する現象を再現するためにコードの改良を行い,その妥当性を確認した.さらに,各時刻における粒子と繊維の位置関係に応じたVDW力および静電力を考慮する計算コードを完成させた.現状では繊維ー粒子間の吸着は再現できていないが,任意の形状・配置を有する繊維層内部における細胞粒子の運動は解析可能となった.本年度は,「繊維ー細胞間の相互作用の検討」が進捗目標であった.繊維および細胞をそれぞれ円柱および球形粒子で近似し,それらの間の相互作用として,VDW力,静電力,生物学的反応によって発生する力を対象として検討した.このうち,VDW力および静電力については,任意の位置関係における円柱ー球形粒子間の相互作用を導出し,計算コードを作成することができた.生物学的反応によって発生する力については,さらに詳細な調査が必要な段階であり,引き続き検討事項として残すところとなった.また,本年度の後半では,次年度に実施予定であった「細胞が分散した溶液の繊維層中の流動解析」のうち,Stokesian dynamics法の適用可能性の検討,およびVDW力と静電力の計算コードへの組み込みを行うことができた.本研究では,繊維層中を流れるマイクロ粒子の挙動を詳細にシミュレートすることで,複雑な繊維層の構造が粒子の移動特性に与える影響を明らかにすることを目的とする.特に多血小板血漿(PRP)作製のためのフィルターによる濾過プロセスを念頭に置き,それらを通して,粒子の繊維への付着および移動現象の解明を目指す.平成30年度は「細胞が分散した溶液の繊維層中の流動解析」を主として行った.繊維への細胞粒子の付着を表すために,繊維ー粒子間に作用する力の再検討をした.前年度に検討したvan der Waals力,静電気力に加え,血小板とPRPフィルターの間に作用する力について文献調査を行った.PRPによる分離プロセスでは,流体中に血小板以外の血球成分も含まれるため,それらを用いた実験等も行った.血小板と血管壁の間に作用する力のモデルはいくつか見つかったものの,PRPフィルターに関連した情報を得ることはできなかった.また,市販のPRPフィルター中で血小板および血球の透過挙動を観察することが可能かどうかを検討するために,マイクロスケールの装置を自作したが,期待した成果は得られなかった.このため,化学・生物学的な引力による吸着よりも先に,まずは流体力学に基づく細胞粒子挙動を丁寧に再現し,繊維の隙間に細胞粒子が捕捉される現象に着目して,細胞粒子のサイズの効果を議論することにした.細胞粒子のサイズに数倍のオーダーの幅がある場合に,粒子が繊維に妨げられることによって捕捉される現象をStokesian dynamics法によって再現した.従来の計算コードでは繊維と粒子の半径が等しいという前提のものであったが,任意の半径を与えられるように拡張した.新しい計算コードの妥当性を確認した後,粒子サイズの異なる条件で解析を行い,繊維層内部を通過する際の粒子挙動の違い,および捕集されやすさの違いについて考察した.本年度は,「細胞が分散した溶液の繊維層中の流動解析」が目標であった.
地震予知・火山噴火予知研究の総合的評価及び今後のあり方に関する調査研究

本研究では、「地震予知のための新たな観測研究計画の推進について」(測地学審議会建議)及び「第6次火山噴火予知計画の推進について」(測地学審議会建議)に基づいて実施されている地震・火山噴火予知研究の進捗状況、実施状況、研究成果等について全体を総合的に調査するとともに、それに基づいて、今後の観測研究のあり方について具体的に検討した。地震予知研究については、大学等の調査観測結果及び解析結果など研究動向を調査するとともに論文等研究成果を収集した。また、地震予知研究協議会による平成11年度、12年度、13年度の「地震予知のための新たな観測研究計画」年次報告書(項目別)及び、同(大学別)を資料として活用すると共に、平成14年3月及び平成15年3月に東京大学地震研究所で「地震予知研究成果報告会」を開催し、研究者、行政担当者、マスメディア関係者、一般市民など約100名が参加して、研究の成果とその意義を議論した。これらの議論の他、電子メールやホームページ等によって研究者から意見を聴取し、地震予知研究の現状と展望を評価し、次期観測研究計画について検討した。火山噴火予知研究についても、同様に大学等の研究動向、研究成果を調査し、マグマ学、火山化学など異なる専門分野の研究者による知見を加え、火山噴火予知研究の成果について総括的評価を行った。近年低周波地震が増加した富士山についても、その社会的影響が大きいことから検討した。富士山は、噴火間隔が長く、噴火メカニズムが良く理解されているわけではない。どのような観測研究を強化すべきか検討した。これらの、議論に基づき、第7次火山噴火予知計画について検討した。本研究は,「地震予知のための新たな観測研究計画の推進について」および「第6次火山噴火予知計画の推進について」に基づいて実施されている地震・火山噴火予知研究の実施状況および研究成果等について全体を総合的に調査するとともに,それに基づいて,今後の観測研究のあり方について具体的に検討することを目的とする.地震予知研究については,大学等の調査観測結果及び解析結果など研究動向を調査するとともに論文等研究成果を収集した.また,地震予知研究協議会による平成11年度及び12年度の「地震予知のための新たな研究計画」年次報告項目別,及び大学別を資料として活用するとともに,平成13年度の終わりには東大地震研究所で「地震予知研究成果報告会」を開催し,研究者,行政担当者,マスメディアなど約100名が参加して,研究の成果とその意味について議論した.その他,大学等の関係研究者に対して,電子メールやホームページによる意見聴取を実施した.それらの資料を詳細に分析し,地震活動,地殻変動,地球化学,地球電磁気等の異なる専門分野の研究者による知見を加え,地震予知研究の成果について総括的評価を行った.火山噴火予知研究についても同様に大学等の研究動向,研究成果を調査し,マグマ学,火山化学など異なる専門分野の研究者による知見を加え,火山噴火予知研究の成果について総括的評価を行った.昨年低周波地震が増加していた富士山についても,社会的影響が大きいことから検討した.富士山は噴火間隔が長く,噴火メカニズムがよく理解されているわけではない.どのような観測研究を強化すべきか明らかにした.本研究では、「地震予知のための新たな観測研究計画の推進について」(測地学審議会建議)及び「第6次火山噴火予知計画の推進について」(測地学審議会建議)に基づいて実施されている地震・火山噴火予知研究の進捗状況、実施状況、研究成果等について全体を総合的に調査するとともに、それに基づいて、今後の観測研究のあり方について具体的に検討した。本研究は、「地震予知のための新たな観測研究計画の推進について」(測地学審議会建議)及び「第6次火山噴火予知計画の推進について」(測地学審議会建議)に基づいて実施されている地震・火山噴火予知研究の進捗状況・実施状況、研究成果等について全体を総合的に調査するとともに、それに基づいて・今後の観測研究のあり方について具体的に検討することを目的とする。

また、地震予知研究協議会による平成11年度、12年度、13年度の「地震予知のための新たな観測研究計画」年次報告書(項目別)及び、同(大学別)を資料として活用すると共に、平成14年3月10日、11日に東京大学地震研究所で「地震予知研究成果報告会」を開催し、研究者、行政担当者、マスメディア関係者、一般市民など約100名が参加して、研究の成果とその意義を議論した。これらの議論の他、電子メールやホームページ等によって研究者から意見を聴取し、地震予知研究の現状と展望を評価し、次期観測研究計画について検討した。火山噴火予知研究についても、同様に大学等の研究動向、研究成果を調査し、マグマ学、火山化学など異なる専門分野の研究者による知見を加え、換算噴火予知研究の成果について総括的評価を行った。近年低周波地震が増加した富士山についても、その社会的影響が大きいことから検討した。富士山は、噴火間隔が長く、噴火メカニズムが良く理解されているわけではない。どのような観測研究を強化すべきか検討した。これらの、議論に基づき、第7次火山噴火予知計画について検討した。
食道癌局所における浸潤促進因子についての研究

食道扁平上皮癌(ESCC)の浸潤先端部においてEMT(上皮間質転換)様の形態変化を示す細胞が存在し、それらがときにEMTのマーカーであるZEB1の発現とともにNotch1の核内発現(ICN1)を示すことを明らかにした。この特定のパターンのICN1発現の有無は、ESCC症例の中長期予後と明らかに相関しており、さらに腫瘍の深達度、脈管侵襲、リンパ節および遠隔転移の有無といたfactorとも相関が見られることが明らかになった。このICN1発現は化学・放射線療法後のESCC標本や局所再発病変においてその陽性頻度が有意に増しており、腫瘍の予後不良や転移再発の重要なマーカーとなり得ることを示した。1.食道癌の手術標本を用いて病理組織学的、免疫組織化学的検討を行った。通常のヘマトキシリン・エオジン染色(H/E)により、食道癌浸潤部における癌細胞の形態変化、特にEMT様変化の有無・程度を検討し、更にNotch1の免疫染色により、同部におけるNotchシグナルの活性化を示唆する核染色の有無・程度を検討し、さらに中長期予後の判明している症例に関して予後との相関性を統計処理にて検討した。それにより、ある特定のNotch1蛋白の組織発現パターンを示した症例では有意に生命予後が不良であることが統計的に明らかになった。2.食道空腸吻合を施したラットの食道をサンプリングし、その組織形態を検討したところ、食道炎、異型性上皮、バレット上皮(化生上皮)、腺癌、扁平上皮癌という多彩な組織像をとる個体がみられた。このサンプルから凍結切片を作成し、レーザーマイクロダイセクション法によって各々の組織型をとる部分からそれぞれ組織を採取し、tRNAを抽出した。1.食道癌の手術標本を用いた病理組織学的、免疫組織化学的検討にて、食道癌浸潤部におけるEMT(epithelial-mesenchymal transition)様の形態変化の有無、またNotch1免疫染色による核染色の有無と、中長期予後とに相関性があることは前年度までに統計的に明らかになった。そこでさらに、術前化学療法後の食道癌手術標本や、術後再発病変の標本を集めて検討したところ、それら病変においてはEMT様細胞およびNotch1核染色陽性細胞の存在する割合が有意に高いことが明らかになった。またこのNotch1の発現にはいくつかのパターンがあることを見いだし、特定のパターンにおいて有意に予後との相関が高いことが明らかになったが、今回さらに症例を増やすことにより統計データがより確実となった。2.ラット実験的食道癌モデルの凍結切片よりtRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを試行した。この実験モデルではびらん性食道炎、異形成(dysplasia),バレット上皮、腺癌、扁平上皮癌と多彩な組織像をとり、それぞれの部位からマイクロダイセクション法にて選択的に細胞を採取した。採取したtRNAのクオリティは良好で、マイクロアレイにて良好なデータを得られた。現在はデータ解析中である。食道扁平上皮癌(ESCC)の手術標本を用いた病理組織学的検討により、特に癌の浸潤先端部において、EMT(epithelial-mesenchymal transition:上皮間質形質転換)様の形態変化を示す細胞が存在し、それらがときにEMTのマーカーであるZEB1の発現とともにNotch1の核内発現(intracellular Notch1: ICN1)を示すことを明らかにした。またこのとき見られる特定のパターンのICN1発現の有無は、ESCC症例の中長期予後と明らかに相関していることを示し、さらに腫瘍の深達度、脈管侵襲、リンパ節および遠隔転移の有無といったfactorとも相関が見られることが明らかになった。さらにこのICN1とZEB1の共発現は口腔・舌・咽頭喉頭等の頭頚部扁平上皮癌(HNSCC)においても食道と同様の頻度でみられ、さらにはこのICN1の発現は化学療法後のESCC標本や局所再発および転移性再発標本においてその陽性頻度が有意に増しており、腫瘍の予後不良や転移再発の重要なマーカーとなり得ることを示した。所属機関における実験設備の都合のため、最も重要なマイクロダイセクションの行程を他施設にて行う必要があり、そのため日程調整が難航するとどうしても実験の進行は遅れがちになる。さらに当初採取したサンプルのクオリティに問題があり、実験方法およびサンプルの輸送方法に試行錯誤を重ねてようやく良好なサンプルを得るに至ったため、この面でも相乗効果的に遅れを生じた原因となったと思われる。医歯薬学上述のマイクロアレイの結果を踏まえ、検討対象となる遺伝子・蛋白について、個別にreal time PCRや免疫組織化学的に検討を加え、確証作業を行う。細胞培養については、3次元培養を行うための細胞が現所属機関において入手困難となる可能性があり、その場合は一般的な癌細胞株での実験にシフトする。

事情により採択後に所属機関の変更があり、研究環境の変化による新たな環境の整備に期間を要し、特に本研究に必要な機器が使用できなくなり他施設に出張して実験することを余儀なくされたこともあり、当初の予定よりいくぶん遅れているのが現状です。研究進捗の遅延により、細胞培養等の実験の開始が遅れたため。上項にあげた不都合についても、協同研究者の施設と協力することにより解決したため、今後は当初の予定通りの研究推進が可能と考えます。まずはRNAマイクロアレイにて食道炎、化生、異型性、浸潤癌の各フェーズにおける遺伝子発現の差異を検討して、その後のin vitroの実験につなげていきます。また、臨床標本による組織学的所見と予後の相関に関しては、統計学的に有意差が確認されており、このデータを基にした成果発表も期間内に可能と考えます。マイクロアレイは現在データ解析中だが、その結果を踏まえて、標的遺伝子についてreal time PCRを行う際の試薬購入、プローベ作製および購入費用、免疫組織化学的検索を行う際の抗体・試薬等の購入費用、また細胞培養のための細胞・試薬等の購入等が必要となる。その他食道癌症例の組織サンプル選別や打ち合わせのため共同研究施設への出張旅費や、学会出張旅費等も必要になると思われ、無駄のないよう有効かつ適正に使用してゆく。研究進捗の若干の遅延のため、最も費用を要するRNAマイクロアレイおよびその後のreal time PCR等の実験を当該年度中に行うことができず、翌年度に持ち越してしまったため。外注となるRNAマイクロアレイに関してサンプルは調整済みであり、次年度中に確実に使用することになります。その後の諸実験に関しては先のアレイをうけて流動的に施行することになると思われますが、計画通りにいけばreal time PCRや特殊細胞培養など、比較的コストのかかる実験が必要になってきますので、無駄のないよう有効に使用してまいります。
自励振動高分子を用いたナノアクチュエーターの創成

本研究ではこれまでに化学振動反応として知られているBZ反応の化学エネルギーを直接力学エネルギーに変換する完全人工合成の高分子モータ「自励振動ポリマー」を作成した。本年度は、さらなる機能化を目指し自励振動高分子を基板上に組織化することにより、ナノ・マイクロレベルの蠕動アクチュエータとして応用することを目的とした。設計に先立って、振動子であるポリマーとナノゲル微粒子の振動挙動を比較することにより、蠕動アクチュエータにおける優位性を比較した。その結果をもとに、振動子の基板上への二次元配列による物質輸送機能性表面の設計を行った。まず、振動挙動の比較のために、各々の相転移現象を蛍光強度により測定した。その結果、ポリマーは連続的にcoil-globule転移するのに対して、ゲル微粒子においては架橋によってポリマー同士が協同的に振る舞うために不連続的な体積相転移が起こった。この結果より、振動時においてもポリマーは連続的な形態変化、ゲル微粒子は不連続的に体積変化していることが予測された。基板上に二次元配列した場合には形態の時間変化が空間的に展開されるため、ポリマー配列では蠕動波の波面が緩やかに、ゲル微粒子配列では切り立った波面になると考えられ、物質輸送表面におけるゲル微粒子の優位性が示された。次に、基板上へのゲル微粒子配列による、物質輸送表面の作製を行った。最初に、シリカ微粒子を鋳型とした二段階鋳型重合法を用いてゲル微粒子二次元配列表面の新たな作成法を確立した。温度応答性のpoly(N-isopropylacrylamide)の微粒子配列表面においては、温度によって表面形状を変化させることに成功した。それに伴って、表面の摩擦特性、親疎水性など様々な性質が制御できると考えられる。さらには、同様の方法により自励振動ゲル微粒子の基板上への二次元配列に成功した。その基板をBZ反応基質溶液に浸すと、化学反応波の伝播が確認され、物質輸送の可能性が示唆された.我々はこれまでに外的刺激のない閉鎖系において自励的に膨潤収縮振動する高分子系を実現しており、ナノ・マイクロデバイスとしての応用への研究を行っている。この振動の駆動力は化学振動反応として知られているBZ反応であり、その触媒であるルテニウムビピリジン錯体(Ru(bpy)_3^<2+>)を温度応答性高分子であるN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)に導入することにより、化学的な振動エネルギーを力学的な振動エネルギーに変換している。本研究では、自励振動するナノゲル微粒子を基板上に2次元的にアレイ化することによって、表面物性が時間変化する振動型表面や、表面に添加した物質を輸送するコンベア型ナノゲルアレイを作成することを目的としている。このような機能性表面の設計においては、ゲル微粒子を基板上にアレイする方法と、ポリマー鎖を基板上にグラフトする方法が考えられる。これまでに、ゲル微粒子と未架橋ポリマーの振動挙動や相転移挙動を比較しながらナノコンベアへの適応性を考察し、ゲル微粒子の優位性を示した。また、2段階鋳型重合法を用いて10μmの単分散ゲル微粒子を最密充填に2次元アレイした新規な機能性表面を作成した。現在は、表面上における振動波の実現、個々の微粒子の振動特性や微粒子同士の同期現象、微粒子の配列パターンによる振動波形の制御などを行い、機能性表面の実現をめざしている。また生理条件下における応用への試みも行っている。一般的にBZ反応を起こすためには、酸、酸化剤、還元剤、金属触媒が必要であり、生理条件下における振動の実現は不可能である。本研究では現在ポリマーに組み込んでいる金属触媒の他に、酸化剤供給部位、pHコントロール部位を組み込むことによって、マロン酸やクエン酸などの基質のみの存在下における振動の実現を目指している。前述のコンベア型機能性表面とあわせて、生理条件下における細胞のマニピュレーションなどへの応用も期待される。

温度応答性のpoly(N-isopropylacrylamide)の微粒子配列表面においては、温度によって表面形状を変化させることに成功した。それに伴って、表面の摩擦特性、親疎水性など様々な性質が制御できると考えられる。さらには、同様の方法により自励振動ゲル微粒子の基板上への二次元配列に成功した。その基板をBZ反応基質溶液に浸すと、化学反応波の伝播が確認され、物質輸送の可能性が示唆された.
屋外環境においてロバストなマーカレス重畳表示を用いた観光案内システムの開発

本研究では,史跡等の屋外展示施設においてスマートフォン等の携帯端末及び拡張現実技術を利用して展示物の情報提示を行うシステムの開発を目指し,対象物体の色及び輝度勾配方向の出現頻度を用いた高速な特定物体検出手法(情報提示に必要な位置合わせ)の提案・開発を行った.提案手法は,日照変化,経年変化等屋外において顕著に発生し物体検出の精度低下の要因となる環境変化に対してロバストかつ高速に物体検出を行うことが可能である.また,現在さまざまな研究が進められている深層学習を用いた手法と比較して事前学習に必要な時間を大幅に短縮でき,スマートフォン等計算能力の劣る環境においても実用的な速度で実行可能である.本研究は,屋外の史跡において,位置センサ(GPS,電子コンパス)及びモーションセンサ(加速度,ジャイロセンサ)を搭載するスマートフォンを用いてカメラ入力に対する画像認識とセンサ情報を組み合わせる事で,人工物を設置することなく対象の説明を重畳表示するシステムの提案及び開発することを目的とする.画像認識による方法は高精度な位置合わせが可能である反面,1)認識対象が増加するに従い処理時間及び誤認識が増える,2)対象の撮影方向や日照が大きく変わると認識が困難となる,などの問題がある.本研究では,位置センサにより認識対象を絞り込み,日照変化に対して変化の少ない色情報を取り入れる事で位置合わせの精度向上を狙う.さらに,モーションセンサによりカメラのぶれを検出し,トラッキングのロストを防ぐ.最終的に,実際の観光案内に耐えうるロバストかつユーザビリティの高いシステム開発を目指す.初年度は,色情報を用いて位置合わせアルゴリズムの改善を計り,日照変化の影響を大きく受ける屋外において,位置合わせ精度が向上することを明らかにした.さらに,モーションセンサを用いることでユーザの動きに対する追従性が向上することを確認した.本研究の目的は,史跡等の屋外展示物においてリアルタイム画像認識技術を用いてモバイル機器のカメラで撮影した映像の被写体に説明を重畳表示する(一般に拡張現実とよばれる)技術の開発である.提案手法を用いることで,利用者は説明対象と視覚により直感的に把握できるため,解説の本質的な内容に集中することができる.屋外では,GPSによる位置情報が容易に利用できる反面,照明環境の変化が比較的大きく,それに伴い照度変化だけでなく,対象物の「見え」が変化するため従来の局所特徴量を用いた手法では,検出精度が十分ではなかった.本研究では,照明方向の影響を比較的受けにくい「色情報」を用いてより高精度な物体検出の実現を目指している.局所特徴量は,ノイズやブラー(ブレ)に影響を受けやすく,特にモバイル端末に搭載されたカメラは光学性能が低いため影響が大きく現れる傾向がある.そこで,2015年度は,統計的な二つのアプローチにより対象物体の画像上の位置を推定する手法を提案した.一つ目のアプローチは,特徴点の相対位置に基づき対象物の中心を算出し,複数の特徴点から得られる中心点候補を用いて統計的に位置を推定する方法である.同様の手法が,交通標識を対象とした認識手法として提案されており,本手法は中心点の算出方法を変更することで推定精度の向上を図った.二つ目は,色領域の空間的な分布に基づき高速に対象物の位置を検出する手法(SHOCOL)である.本手法は,検出対象物体の色の(2次元画像における)空間分布をピクセル単位のヒストグラムとして学習しておき,ピクセル単位のバックプロジェクションの総和を用いて物体の存在位置を推定する.単純な色ヒストグラムのバックプロジェクションと異なり,色の空間的な分布も評価されるため高精度な位置推定が可能であり,アルゴリズムが単純なため計算時間が短い.2015年度は複数アプローチによる特定物体検出手法の開発を行い,様々なシーン,対象物に対して評価実験を行った.その結果,屋外の多くの場所において,SHOCOL(今年度提案した色の空間分布を用いた手法)を用いることで安定的に物体の位置検出が行えることが示された.さらに,SHOCOLによる物体位置検出に基づき特徴点の絞り込みを行うことで,より広範囲の特徴点のマッチング精度を向上することができ,実験対象のシーンにおいては,カメラの3次元位置推定精度が向上することが示された.本研究の目的は,史跡等の屋外展示物においてリアルタイム画像認識技術を用いてモバイル機器のカメラで撮影した映像の被写体に説明を重畳表示する(一般に拡張現実とよばれる)技術の開発である.提案手法を用いることで,利用者は,提示情報と対象の関係を視覚的に把握できるため,解説の本質的な内容に集中することができる.屋外では,GPSによる位置情報が容易に利用できる反面,照明環境等の変化が大きく,それに伴い照度変化だけでなく,対象物の「見え」が変化するため従来の局所特徴量を用いた手法では,検出精度が十分ではなかった.本研究では,色や輝度勾配の空間的な分布を利用したロバストかつ高精度な特定物体検出手法を開発し,経年変化や照明環境の変化に対してロバストに検出できることを示した.最終年度は,輝度勾配の空間分布を利用した撮影環境の変化にロバストな特定物体検出手法を提案した.また,特定物体検出結果を用いて局所特徴量によるマッチングの誤対応を除くことで,屋外における三次元自己位置姿勢を推定の精度を高めることが可能であることを示した.さらに,長い文章を重畳表示することを想定したビューマネージメント手法を提案した.本研究では,史跡等の屋外展示施設においてスマートフォン等の携帯端末及び拡張現実技術を利用して展示物の情報提示を行うシステムの開発を目指し,対象物体の色及び輝度勾配方向の出現頻度を用いた高速な特定物体検出手法(情報提示に必要な位置合わせ)の提案・開発を行った.提案手法は,日照変化,経年変化等屋外において顕著に発生し物体検出の精度低下の要因となる環境変化に対してロバストかつ高速に物体検出を行うことが可能である.

また,現在さまざまな研究が進められている深層学習を用いた手法と比較して事前学習に必要な時間を大幅に短縮でき,スマートフォン等計算能力の劣る環境においても実用的な速度で実行可能である.本研究は,カメラで撮影した映像に対してリアルタイムにアノテーション(注釈または説明)を重畳表示するシステム開発を目的とする.実現に当たっては,画像がどこからどの方向に撮影されているかを高速かつロバストに推定する必要がある(自己位置姿勢推定と呼ばれる).初年度は,色情報を用いた特徴点マッチング手法を実装及び評価し,日照が大きく変化する環境において位置合わせ精度が向上することを確認しているため,「概ね順調」とした.2016年度は,これまでの開発技術を用いて観光案内システムの実装を行う.モバイル端末において実装する場合,機種により内蔵カメラの光学性能が大きくことなるため,性能が低いデバイスを想定して実験を行う必要がある.例えば,意図的に画質を劣化させた映像を用いた実験などを想定している.2015年度に3次元位置推定精度の向上可能性を確認したが,より多くのシーンにおいて検証実験を行う必要がある.特に,本研究では屋外史跡における情報提示を目的としているため,城跡等の遺跡を対象とした実験を重視することを検討している.沖縄県においては,城跡が重要な観光資源となっており多くの観光客が訪れている反面,案内や説明が不十分と思われるためリピート率向上のためにも,AR等情報機器を活用した付加コンテンツの開発は地域振興の点で意義がある.提案システムは,検出された物体に対する説明を重畳表示することを想定しているが,カメラの姿勢変化に伴い付加情報が移動してしまうと,視認性が著しく悪化する.そこで,対象物と付加情報の関連を明確に提示しつつ,視認性の高い情報表示を行うため情報表示のレイアウトを工夫する必要がある.画像内の対象物の位置(画像中心からの距離など)や情報提示開始時点からの経過時間等に基づき重要度を算出し,情報の提示位置を入れ替える等のアルゴリズムを検討する.進化型計算、マルチエージェントシステム、観光情報システム2年目は,色情報を用いた位置合わせアルゴリズムの改善とより多くの環境を想定した評価実験を行う.これまでの評価実験により,位置合わせの精度は撮影対象となる物体の形状により変化することがわかっている.より多くのシーンに対して評価実験を行う事で精度低下の要因を明らかにし更なる改善を試みる.また,当初予想した通り,認識対象となる物体の手前に別の物体がある場合,偽のエッジが検出され認識精度が大きく低下することを確認した.そこで,特徴量データベースを作成する際の3次元再構成を特徴点単位ではなくピクセル単位で行う事で詳細な3次元モデルを作成し,偽のエッジを排除するアルゴリズムの開発を行う.最終年度は,ユーザインタフェースの開発及び評価実験を行う.対象物体に対して,単純に3次元グラフィクスを重畳表示するだけであれば,単に推定されたカメラの位置姿勢に基づき3次元モデルを描画するだけで良い.しかし,文字情報を表示する際には,対象オブジェクトを情報で隠さないよう位置を調整する必要がある.
虚血再灌流傷害における腎尿細管上皮のリソゾーム酵素の役割について

腎虚血再灌流(I/R)傷害は腎移植時の重要課題である。尿細管上皮のI/R傷害におけるオートファジー(AP)リソソーム系の関与を近位尿細管特異的カテプシンD欠損(CDKO)マウスで解析した。野生型マウスではI/R負荷後、近位尿細管上皮細胞(RPTEC)にAPの誘導とCD活性の増強を認めた。CDKOマウスでは、非I/R下でも様々な小胞体異常やオートファゴソーム像を認めた。I/R負荷にてRPTECのこのような変化が特に細胞死の形態を示す細胞で増強し、野生型に比べ尿細管傷害が強かった。腎I/R傷害はRPTECに誘導されるAPの強さに依存し、その下流にあるリソソームプロテアーゼの関与が示唆された。腎虚血再灌流(I/R)傷害は腎移植において重要な課題である。尿細管上皮へのI/R障害にはオートファジー(AP)/リソソーム系の関与が報告されているが、傷害時のAPやリソソームプロテアーゼ(LP)については不明な点が多い。腎虚血再灌流(I/R)傷害の分子機構を明らかにするため、今回、プロテアーゼ阻害剤投与や代表的なリソゾームタンパク質分解酵素であるカテプシンB(CB)、L(CL)欠損マウス、およびI/R傷害の感受性の高い皮髄境界部の近位尿細管特異的カテプシンD欠損(RPTEC-CDKO)マウスを用いて、腎I/R傷害を解析した。I/R負荷後、近位尿細管上皮細胞(RPTEC)にAPの誘導と、CD活性の増強が認められた。CB,CL欠損マウスではI/R負荷による腎障害に野生型との差は認めなかったが、I/R負荷時にプロテアーゼ阻害剤を用いてシステインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ活性を抑制したところ、3日後の腎傷害は有意に抑制された。RPTEC-CDKOマウスの皮髄境界部上皮細胞を電顕的に観察すると、負荷なしの腎臓においてもオートファゴソーム(AV)を始め、fingerprint像(FP)や輪状に集積した小胞構造(LER)が認められ、LERの中央部にはしばしばAVが見られた。RPTEC-CDKOマウスにI/R負荷をかけると、皮髄境界部のRPTECにはAV、FP、LERが増加し、特に、細胞死の形態を示す細胞では細胞質全域がこれら構造物に占められていた。さらにI/R後の腎組織傷害は野生型に比べRPTEC-CDKOマウスにて有意に重度であった。以上の結果より、腎I/R傷害は尿細管上皮に誘導されるAPの強さに依存すること、またその下流にあるリソソームプロテアーゼも関与することが明らかとなった。腎虚血再灌流(IR)傷害の分子機構を明らかにするため、今回、プロテアーゼ阻害剤投与や代表的なリソゾームタンパク質分解酵素であるカテプシンB(CB)、L(CL)欠損マウス、および皮髄境界部の近位尿細管特異的カテプシンD欠損(CDKO)マウスを用いて、腎I/R傷害を解析した。I/R負荷時にプロテアーゼ阻害剤を用いてシステインおよびアスパラギン酸系LP活性を抑制したところ、3日後の腎傷害は有意に抑制された。RPTEC-CDKOマウスの皮髄境界部上皮細胞を電顕的に観察すると、オートファゴソーム(AV)を始め、fingerprint像(FP)や輪状に集積した小胞構造(LER)が認められ、LERの中央部にはしばしばAVが見られた。このマウスにI/R負荷をかけると、皮髄境界部のRPTECにはAV、FP、LERが増加し、特に、細胞死の形態を示す細胞では細胞質全域がこれら構造物に占められ、野生型に比べ有意に傷害の程度が高いことが分かった。以上の結果より、腎I/R傷害は尿細管上皮に誘導されるAPの強さに依存すること、またその下流にあるリソソームプロテアーゼも関与することが示唆されたリソソームプロテアソーゼの抑制が腎I/R傷害を悪化させ、APの強さが関わっていることが明らかとなった。

これらの結果を、第6回オートファジーシンポジウム、第118回日本解剖学会にて発表した。また、現在、論文作成に着手しており近々投稿予定である。今後は、atg9やatg7などのオートファジー関連遺伝子を尿細管特異的に欠損させたマウスの作成に取り組みAP抑制が腎I/R傷害に与える影響の分子レベルでのより詳細な解明を行っていく予定である(次年度の研究費の使用計画)コンディショナルノックアウトマウスの作成、維持に必要な試薬、プラスチック器具の購入。国内外の学会、研究会での発表のための旅費。マウスの血液検査、尿検査の外部委託、電顕写真の現像、焼き付けに必要な代金。論文投稿料、印刷費、外国語論文の校閲費として計上した
昆虫の膜脂質特性を与えたリポソームを用いた溶質輸送調節の解析

昆虫の越冬休眠では,凍結や低温障害を避けるためにグリセロールを増加蓄積するケースが多い。このしくみは,細胞内外の水やグリセロールの細胞膜を介した再配分である。その生体膜機能を調べるためにグリセロール輸送タンパクを特定し,それを組み込んだ人工膜(リポソーム)実験系の確立をめざした。昆虫細胞においても,アクアポリン(AQP)が水分子の選択的通過路であるだけでなく,グリセロールも輸送可能なAQPの分子種(アクアグリセロポリン: GLP)として分布する。幼虫のすがたで越冬休眠するニカメイガから休眠期で機能するAQPやGLPを特定し,その分子の輸送特性や越冬期の役割を追究した。昆虫の組織特異的な溶質輸送機能を調べることによって,昆虫細胞が有する原形質膜機能の柔軟な環境適応力を考察することを目的として実験を進めている。平成27年度(初年度)に得られた成果は以下のとおりである。原形質膜の指標となる輸送タンパク質としてアクアポリン(水チャネル)を解析している。(1)カイコの発育中卵巣(developing ovaries)において,2種類の水選択的アクアポリンが存在し,その2者は,卵母細胞が完成するプロセスで異なる分布を示すことを発表した(Maruyama et al., 2015)。これらのアクアポリンは,水のみを通過させるので,卵形成過程で水分吸収による容積増大に関わることが示唆された。さらに,我々が以前にカイコ幼虫から同定したグリセロール・尿素をも輸送するアクアグリセロポリンが,卵母細胞を包む濾胞細胞に分布することが新たにわかった。(2)上記のアクアグリセロポリンは,カイコの幼虫では中腸の円筒細胞で発現していることを示した(Maruyama and Azuma, 2015)。このアクアグリセロポリンの特異的抗体を作製し,幼虫が休眠相でグリセロールを多量に蓄積するニカメイガにおいてどの組織で発現しているかを調査したところ,マルピーギ管や後腸で強く発現している傾向が得られた。グリセロールを蓄積する組織として脂肪体の関与が考えられていたが,それとの関連は今後のさらなる実験が必要である。(1)輸送活性の測定を定量的に行うための実験系のセットアップに時間がかかっている。そこで,アプローチを変えて,発育中の卵巣を用いて,卵内への取込実験も行っている。(2)卵形成期の卵は,卵の量的・質的拡大が容積増大に伴って起こる。つまり,外来性のタンパク質(vitellogenin)や卵自身が合成するタンパク質だけでなく,発育中の卵は,糖質などその他の低分子溶質を取り込んで,グリコーゲンや脂質として卵中に蓄積する。いずれの溶質にしても送達輸送される方向は,卵の中心へ向かうので,14C-glycerolや14C-ureaの輸送活性を現在測定しているところである。(3)ニカメイガ幼虫のように休眠する幼虫の特定の組織細胞における脂質変化については,これまでに正確な検証が,組織や発育時期特異的にはなされておらず,原形質膜など細胞の膜成分を構成する脂質(特にリン脂質)の変化についての精度の高いデータは得られていない。これは平成27年度より取り組んでいる実験であるが,休眠相におけるニカメイガ幼虫の特徴的な組織における脂質分析とグリセロール分析を引き続き実施している。昆虫の休眠研究は、20世紀の間に様々な現象が把握され、個別の昆虫種における様々な適応現象としてリポートされてきた。休眠昆虫に共通する一つの事実として,グリセロールを血液や細胞内に高濃度に蓄積することがあげられる。休眠昆虫ではグリセロールをどのようにして細胞や組織で配分あるいは偏在させているか,その動態を水やグリセロールを輸送する原形質膜のタンパク質であるアクアポリンから調査した。実験材料としては,幼虫休眠の際にグリセロールを高濃度(0.3 M)に蓄積するニカメイガ幼虫を使用した。ニカメイガ幼虫で,水選択的なアクアポリンのサブタイプ(DRIP)が,幼虫の気管系で強く発現していた。蚊(Aedes aegypti)の成虫でも同じDRIPサブタイプが気管に分布することが既に報告されていたが(2000年),その生理的意義や役割について、充分に明確な説明がなされていなかった。ニカメイガ幼虫で,気管での発現は,非休眠幼虫が秋冬へ向けて低温下に曝され休眠化するのに伴い,そのタンパク質としての量は増加傾向が認められた。気管組織は幼虫の頭部から尾部まで全身に分布しているので,この気管を介した水分保持機能に関与していると推定された。当初,申請計画にも記載し,ニカメイガ幼虫での存在を期待予想していたグリセロールをも輸送するサブタイプ(アクアグリセロポリン:GLP)の存否について,目下明確な結果を得ていない。ニカメイガの推定GLPが,幼虫のどの組織に多く存在するかについて,充分なデータを得るまでには至らず、これは最終年度での課題として残された。また,アクアポリンが少なくとも気管系に分布することが判明したので,気管細胞の膜脂質を分析することによって,アクアポリンなどの膜タンパク質との関係性をさらに調査することも,当該申請課題の重要項目と考えられた。