hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔機能向上効果プログラムが有する大脳認知機能局在部位との機能的結合の探索的解析

本研究は、介護予防や歯科診療の臨床現場で口腔機能向上機能訓練法として実施されている口腔機能向上プログラムの中から、1口腔関連プログラムにより活性化される大脳前頭前野の機能局在部位の変化に関する知見の詳細について再検討することで、認知機能の向上効果を有するプログラム課題候補を選定するとともに、2それらのプログラム課題候補の遂行に伴う認知機能の変容について、認知・学習機能に関連する大脳機能局在部位の活性化と認知機能・学習効率の変化との関連性を明らかにすることを目的としている。本研究期間の2年目である平成30年度には、近赤外線分光法(NIRS)を用い、主にA)舌圧強化の支援グッズやB)口唇閉鎖力強化の支援グッズを用いたプログラム課題を遂行し、大脳前頭前野の認知機能局在部位の活性化の機序の解析を進めた。A)舌圧強化の支援グッズを用いたプログラム課題では、大脳前頭前野の活性化を示す傾向は認められたものの、舌圧強化の強度に対応した大脳前頭前野の活性化の有意な増大(広義の「用量反応関係」)は認められなかった。B)口唇閉鎖力強化の支援グッズを用いたプログラム課題では、A)舌圧強化の支援グッズを用いたプログラム課題に比べ、大脳前頭前野の活性化を示す所見が強く認められ、さらに、口唇閉鎖力の強度に対応した認知・学習機能に関連する大脳機能局在部位の活性化の変化の増加が見出された。新たに見出されたこれらの大脳前頭前野の活性化に関する知見から、舌圧強化に関連する口腔機能向上プログラムよりも、口唇閉鎖力強化に関連するプログラム課題の方が認知機能の向上を期待できる課題プログラム候補となり得る可能性が見出された。また、3ヶ月間の口腔ケアプログラムに伴う血液中の認知機能関連因子の変化を探索する臨床介入研究も実施しており、統合的な大脳認知機能の探索的解析としての研究を並行して行っている。初年度の平成29年度に実施した、ぶくぶくうがい(頬部の膨らませ運動)、タンギング(舌打ち運動)、構音機能訓練(「パ・タ・カ・ラ」の発音)のプログラム課題の遂行において、有意な大脳前頭前野の活性化が見出されなかったことから、頬部・舌・発音や発語等の運動を中心とした口腔機能向上プログラム課題では有意な大脳前頭前野の活性化効果が得られないことが確認できていた。それを受け、平成30年度はA)舌圧とB)口唇閉鎖力に関連する口腔機能向上プログラムを中心に検討し、それぞれのプログラム課題における大脳前頭前野の活性化の特徴を解析することができた。さらに、3ヶ月間の口腔ケアプログラムに伴う認知機能の評価指標と血液中の認知機能関連因子の変化を探索する臨床介入研究も実施しており、統合的な大脳認知機能の探索的な研究を並行して行っている。また、口腔ケアプログラムとしての口腔内寒冷刺激に伴う大脳前頭前野の活性化効果について、原著論文として取り纏めることができており、研究活動はおおむね順調に進展していると考えている。当該年度の研究成果として得られた、A)舌圧とB)口唇閉鎖力に関連する口腔機能向上プログラム課題について再検証を行い、今後の認知機能の変容を検討する際の課題プログラム候補として活用していくとともに、原著論文の執筆に向けて統計学的解析を進めていきたい。さらに、3ヶ月間の口腔ケアプログラムに伴う血液中の認知機能関連因子の変化に関する臨床介入研究を継続実施することで、改訂長谷川式簡易知能評価やMMSE(Mini Mental State Examination)等の評価指標を用いた認知機能の変容の解析とともに、血液中の認知機能関連因子の変化についても検討することで、統合的な大脳認知機能の探索的研究を進めていきたい。本研究は、介護予防事業や歯科診療の口腔機能向上機能訓練法として臨床現場で実施されている口腔機能向上プログラムの中から、1これまでにわれわれが見出した口腔関連課題による大脳前頭前野の機能局在部位に関する知見を学術的に勘案して検討すべきプログラム課題候補を選定するとともに、2それらのプログラム課題の遂行に伴う認知機能の変容効果について、認知・学習機能に関連する大脳機能局在部位の活性化や認知機能・学習効率の変化との関連性を明らかにすることを目的としている。本研究期間の初年度である平成29年度には、近赤外線分光法(NIRS)を用い、複数の口腔機能向上に関連するプログラム課題を遂行し、認知機能局在部位の活性化の機序解析を検討した。当初の研究実施計画に合わせ、口腔機能向上プログラム課題の中で、A)口唇・頬部のマッサージ、B)ぶくぶくうがい(頬部の膨らませ運動)、C)タンギング(舌打ち運動)、D)構音機能訓練(「パ・タ・カ・ラ」の発音)の課題を遂行するとともに、E)口唇閉鎖力の支援グッズやF)舌圧強化の支援グッズを用いたプログラム課題についても実施した。A)E)の口腔機能向上プログラム課題の中で、B)ぶくぶくうがい(頬部の膨らませ運動)、C)タンギング(舌打ち運動)、D)構音機能訓練(「パ・タ・カ・ラ」の発音)の課題では有意な大脳前頭前野の活性化は得られなかったものの、E)口唇閉鎖力の支援グッズやF)舌圧強化の支援グッズを用いた課題遂行において有意に大脳前頭前野が活性化されることを見出した。これらの新たに見出した大脳前頭前野の活性化に関する知見は、将来的な認知機能の変容を検討する際の課題プログラム候補として活用することが可能になる。また、血液中の認知機能関連因子の変化を探索する臨床介入研究にも活用することができる研究上の意義を有すると考えられる。

初年度である平成29年度には、口腔機能向上に関与する機能訓練として日本摂食嚥下リハビリテーション学会がまとめている訓練法〔武原ら:日本摂食嚥下リハビリテーション学会誌,2014年〕を参考に、12種類の脳神経(嗅神経舌下神経)の機能的対応を示す複数の口腔機能向上プログラム課題を遂行し、近赤外線分光法(NIRS)を用いた認知機能局在部位の活性化の機序解析を検討することができた。その中で、申請当初、大脳前頭前野の活性化効果を有すると想定していた、B)ぶくぶくうがい(頬部の膨らませ運動)、C)タンギング(舌打ち運動)、D)構音機能訓練(「パ・タ・カ・ラ」の発音)の課題の遂行において、有意な大脳前頭前野の活性化は得られなかったことが見出された。一方、E)口唇閉鎖力の支援グッズやF)舌圧強化の支援グッズを用いた課題遂行において、有意に大脳前頭前野が活性化されるという、新たな知見を見出した。これらの知見は、今後の認知機能の変容を検討する際の課題プログラム候補として活用することが可能になる。また、血液中の認知機能関連因子の変化を探索する臨床介入研究にも活用することができ、研究活動の広がりにつながる研究成果と評価している。本研究は、介護予防や歯科診療の臨床現場で口腔機能向上機能訓練法として実施されている口腔機能向上プログラムの中から、1口腔関連プログラムにより活性化される大脳前頭前野の機能局在部位の変化に関する知見の詳細について再検討することで、認知機能の向上効果を有するプログラム課題候補を選定するとともに、2それらのプログラム課題候補の遂行に伴う認知機能の変容について、認知・学習機能に関連する大脳機能局在部位の活性化と認知機能・学習効率の変化との関連性を明らかにすることを目的としている。本研究期間の2年目である平成30年度には、近赤外線分光法(NIRS)を用い、主にA)舌圧強化の支援グッズやB)口唇閉鎖力強化の支援グッズを用いたプログラム課題を遂行し、大脳前頭前野の認知機能局在部位の活性化の機序の解析を進めた。A)舌圧強化の支援グッズを用いたプログラム課題では、大脳前頭前野の活性化を示す傾向は認められたものの、舌圧強化の強度に対応した大脳前頭前野の活性化の有意な増大(広義の「用量反応関係」)は認められなかった。B)口唇閉鎖力強化の支援グッズを用いたプログラム課題では、A)舌圧強化の支援グッズを用いたプログラム課題に比べ、大脳前頭前野の活性化を示す所見が強く認められ、さらに、口唇閉鎖力の強度に対応した認知・学習機能に関連する大脳機能局在部位の活性化の変化の増加が見出された。新たに見出されたこれらの大脳前頭前野の活性化に関する知見から、舌圧強化に関連する口腔機能向上プログラムよりも、口唇閉鎖力強化に関連するプログラム課題の方が認知機能の向上を期待できる課題プログラム候補となり得る可能性が見出された。また、3ヶ月間の口腔ケアプログラムに伴う血液中の認知機能関連因子の変化を探索する臨床介入研究も実施しており、統合的な大脳認知機能の探索的解析としての研究を並行して行っている。
バスケットボールの競技力を規定する諸要因に関する構造論的研究

「競技力」は、わが国のスポーツ界で広く一般に用いられている重要な用語であるが、漠然とした曖昧な解釈が許されてしまっている。しかし、この競技力の内実に何某かの共通了解を実定させなければ、実際のゲームや指導の場面における指導者や競技者や研究者間の議論は不毛なものへと陥ってしまうことは必定である。そこで本研究では、可視的で一回性的で多様な表層でのスポーツ現象を支えて、それを深層で秩序づけている、「身体性」「知性」「感性」を構成契機とする不可視の仕組みを「スポーツ構造」という分析装置に見ることで、「スポーツ構造がバスケットボールの競技力を規定する」という独自の命題設定から、バスケットボールの競技力を規定する諸要因の解明を目的とした。この目的を達成するために、日・独・米の三カ国のバスケットボール並びに競技力等に言及する文献の収集とそれらの精読を行い、三契機の一つである「知性」について、三年の間、次のような研究課題について検討を行った。まず、類概念としてのボールゲームについて、その競技力の内実を究明するための普遍的な枠組みに関する予備的考察を行った(研究課題1)。次に、「原理論的アプローチ」を新たな研究方法として提案することで,従前とは全く異なる視点から「戦術研究」の究明を行った(研究課題2)。さらには、バスケットボール競技におけるチーム戦術を深層で規定する構造とその原理・原則の究明を行った(研究課題3)。なお、研究課題1は、第16回日本スポーツ方法学会で、研究課題2は、第56回日本体育学会での「スポーツの戦術」に関するシンポジウムで、それぞれ成果を発表した。さらに、研究課題3は、「バスケットボール競技におけるチーム戦術の構造分析」(スポーツ方法学研究,17(1):25-39,2004)という題目の論文に纏められ、「平成16年度日本スポーツ方法学会学会賞」を受賞した。「競技力」という言葉は,わが国のスポーツ界で広く一般に用いられている重要な用語であるにもかかわらず,漠然とした曖昧な解釈を許している概念はないと推断される.しかし,この競技力という言葉は,意識の深層に存在する汎時的な言葉であると見做されるが故に,この深層意識での言葉を一義化して,つまり概念の同一的で不変な意味を抽出して,その内実に何某かの共通了解を実定させなければ,実際のゲームや指導の場面において,指導者とプレイヤー間のコミュニケーションばかりか,指導者同士あるいは指導者と研究者間の議論を不毛なものへと陥らせてしまうのであり,況やその向上を図ろうとすることなど不可能であろう.そこで,本研究では,可視的で一回性的で多様な表層でのスポーツ現象を支え,それに根拠を与えている不可視の深層での仕組みにこそ共通了解が存すると仮定し,それを身体性,知性,感性という3つの構成契機から成る「スポーツ構造」という術語でもって捉えることで,「スポーツ構造がバスケットボールの競技力を規定する」という独自の命題設定から,バスケットボールの競技特性を規定する普遍的な仕組みの解明を目的とした.3年計画の初年度として今年度は,日・独・米の3カ国のバスケットボール関係並びに競技力等に言及する文献の収集とそれらの精読を通じて,バスケットボールの競技力を構成する3契機の一つである知性の中核要因たる戦術に焦点が当てられた.

そして,戦術の中でも特にチーム戦術は,表層での現象においては実に多種多様な動きのかたちとして映ずるが,深層での構造にはそれらに通底する普遍的な諸原理が存在するとの仮説から,構造主義的アプローチを方法として援用することで,チーム戦術の深層構造の究明を行った.今年度の成果は,学術雑誌『スポーツ方法学研究』(第17巻第1号)において,厳正な審査を経て「原著論文」として紙上発表された.「競技力」という言葉は,わが国のスポーツ界において広く一般に用いられている重要な用語であるにもかかわらず,漠然とした曖昧な解釈を許していると考えられる.しかし,この競技力という言葉は,意識の深層に内在する汎時的な言葉であると見做されるが故に,この深層意識での言葉を一義化して,つまり概念の同一的で不変的な意味を抽出して,その内実に何某かの共通了解を実定させなければ,実際のゲームや指導の場面において,指導者とプレイヤー間のコミュニケーションばかりか,指導者同士あるいは指導者と研究者間の議論を不毛なものへと陥らせてしまうのであり,況やその向上を図ろうとすることなど不可能であろう.そこで,本研究では,可視的で一回性的で多様な表層でのスポーツ現象を支え,それに根拠を与えている不可視の深層での仕組みにこそ共通了解が存在すると仮定し,それを身体性,知性,感性という3つの構成契機から成る「スポーツ構造」という術語でもって捉えることで,「スポーツ構造が競技力を規定する」という独自の命題設定から,バスケットボールの競技特性を規定する普遍的な仕組みの解明を目的とした.この目的を達成するための3年計画の2年目として,今年度は,上述した構成契機の内の知性の中核要因たる戦術について,昨年度紙上発表した「バスケットボール競技のチーム戦術の構造分析」(スポーツ方法学研究,第17巻第1号:平成16年度スポーツ方法学会学会賞受賞)の結果に基づき,わが国のトップレベルに位置する,高校,大学,実業団の各チームを対象に,また,わが国のトップレベルの指導者たちとの研究協議をもとに,実証的研究を行った.そして,そこでの研究の一連の成果として,第16回日本スポーツ方法学会(3月21日,山形大学)において口頭発表を行った.なお,上述したことと併せて,3つ目の構成契機たる「感性」の内容究明に関連するものとして,「バスケットボール指導者のコーチングフィロソフィーに関する研究」を『スポーツコーチング研究』(第2巻第2号)に紙上発表した.「競技力」は、わが国のスポーツ界で広く一般に用いられている重要な用語であるにもかかわらず、漠然とした曖昧な解釈を許している概念はないと推断される。しかし、この競技力という言葉は、意識の深層に存在する汎時的な言葉であると見做されるが故に、この深層意識での言葉を一義化して、その内実に何某かの共通了解を実定させなければ、実際のゲームや指導の場面において、指導者と競技者間のコミュニケーションばかりか、指導者同士あるいは指導者と研究者間の議論は不毛なものへと陥ってしまうことは必定である。そこで本研究では、可視的で一回性的で多様な表層でのスポーツ現象を支えて、それを秩序づけて根拠を与えている不可視の深層での仕組みたる「スポーツ構造」にこそ共通了解が存すると仮定し、「スポーツ構造がバスケットボールの競技力を規定する」という独自の命題設定から、バスケットボールの競技特性を規定する普遍的な仕組みの解明を目的とした。三年計画の最終年である今年度は、日・独・米の三カ国のバスケットボール関係並びに競技力等に言及する文献の収集とそれらの分析を通じて、スポーツ構造を構成する三契機の一つである「知性」の中核要因たる戦術に焦点が当てられた。
抗CCP抗体の病的意義の研究からめざす関節リウマチの病態解明および最適化治療

次に関節リウマチ(RA)患者から得られた滑膜線維芽細胞(RASF)を用い、骨芽細胞へ分化誘導し、抗CCP抗体刺激をおこなった。抗CCP抗体刺激、非刺激に関わらずRASFの骨芽細胞への分化を認め、抗CCP抗体による骨芽細胞分化抑制機序は認めなかった。さらに、抗CCP抗体のRASFにおけるケモカイン・サイトカイン産生能への影響を検討した。RASFを抗CCP抗体存在下に培養し、その上清中のケモカイン・サイトカインをluminex法によるmultiplex bead assayにて網羅的に測定した。抗CCP抗体の刺激によりIL-6などの炎症性サイトカインの上昇は認めなかったが、MCP-3の上昇を認め、抗CCP抗体によるケモカイン産生能の増強作用を認めた。今後は多数症例での確認および、シトルリン化酵素であるPAD4刺激、またはPAD4強制発現下にて同様の実験を行いRASFにおける抗CCP抗体の作用をより詳細に解析する。抗CCP抗体誘導性破骨細胞分化の手技を確立しており、さらに滑膜線維芽細胞を用いた実験では抗CCP抗体作用刺激によりケモカインの産生能が上昇することを同定している。今後は研究計画に基づき、関節リウマチ患者由来の末梢血CD14陽性細胞からの抗CCP抗体誘導性破骨細胞分化を行い。患者背景と破骨細胞形成の相関やその詳細な機序を解析していく。また、滑膜線維芽細胞を用いた実験ではPAD4強制発現によりさらに抗CCP抗体による作用の増強が期待でき、より抗CCP抗体の滑膜線維芽細胞への作用が顕著となることが期待できるが、PAD4強制発現の手技は確立しておらず、今後確立していく必要がある。本年度の研究は概ね予定通りに行っているが、網羅的な遺伝子解析などはおこなっておらず次年度使用額が生じた。次年度に網羅的遺伝子解析や、薬剤による破骨細胞分化抑制実験などをおこなっていく。
ヒトメラニン生成関連遺伝子のメラノサイト特異的転写の分子機構

研究の目的はメラニン合成関連遺伝子の色素細胞特異的な発現機構を明らかにすることであり当該年度に以下の事を明らかにし発表している。1:ヒトチロシナーゼ遺伝子の色素細胞特異的転写機構ヒトチロシナーゼ遺伝子の転写開始点から上流約-1.8kbに存在する配列TDE(Tyrosinase Distal Element)を見い出した。競合阻害実験等によりTDEに特異的に結合する因子がbasic-helix-loop-helix-leucinezipper(bHLH-LZ)構造を持つ転写因子USFに近い性質を持つことが示されたので、bHLH-LZ構造を持つ転写因子USFとMITFについてチロシナーゼ遺伝子の転写活性に対する効果の解析を行った。MITFはメラニン細胞やマスト細胞の欠損などを表現型とするmicrophthalmiaマウスの原因遺伝子産物Miのヒト相同産物である。解析の結果、MITFがTDEを介してチロシナーゼ遺伝子の転写を活性化することが明らかになった。これはチロシナーゼの発現を調節する転写因子がはじめて報告された事例である。またこれによってMITFが転写因子として実際に機能する事が確認された。2:ヒトTRP-2遺伝子の単離と構造解析研究の目的はメラニン合成関連遺伝子の色素細胞特異的な発現機構を明らかにすることであり当該年度に以下の事を明らかにし発表している。2:ヒトTRP-2遺伝子の単離と構造解析
腫瘍関連マクロファージ指向ＤＤＳの開発と癌に対する新しい薬物治療戦略

腫瘍組織に存在する腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、がん治療において重要な標的細胞であるが薬物を選択的に送達させる方法が無い。マンノース修飾キャリアでは、同レセプターを発現する全身のマクロファージに薬物が送達される。本研究では、マクロファージ指向性を有するマンノース修飾バブルリポソームと腫瘍組織への超音波照射を利用した方法を考案し、TAM細胞質内へ選択的に核酸薬物を送達させることに成功した。本研究の目的は、癌微小環境における腫瘍関連マクロファージを標的としたDDS開発とその癌治療への展開である。本年度は、腫瘍関連マクロファージに発現するマンノースレセプターによって認識され、超音波照射後に発生するキャビテーションエネルギーにより発生する一過性の小孔を介して、細胞内に核酸・遺伝子導入を可能とするマンノース修飾バブルリポソーム製剤について、siRNA送達及びプラスミドDNA送達特性、高密度焦点式超音波照射に関する評価を行った。ルシフェラーゼに対するsiRNAを用いて作製した超音波応答性マンノース修飾バブルリポプレックスへの超音波照射併用により、マクロファージのエンドソームではなく、細胞質内へ高効率に送達され、高い遺伝子発現抑制効果を示していることが示された。一方、off target効果の原因となるI型インターフェロの産生は、カチオン性リポソーム試薬であるLipofect Amineを用いて導入した場合と比べ、顕著に低い値であり、安全に使用できることが示された。この低い免疫反応性は、toll like receptor7,8が発現するエンドソームを介さず細胞質内に直接siRNAを導入しているためであると推察される。バブルリポソームの臨床応用に向けた製剤処方に関して、生体適合性添加物のみで調製された新規バブルリポソーム/高分子複合体の調製を試み、従来の研究室で開発しているバブルリポソームと同様の物理化学的性質を有しており、超音波照射の有無によりマウス肝臓での遺伝子発現制御が可能な製剤であることを確認した。さらに、マウス大腸がん細胞であるcolon26細胞を移植したマウスに高密度焦点式超音波照射をおこなったところ、固形腫瘍の増殖抑制効果が認められた。本年度は、TAM選択的なDDS開発に関して、in vivoでの検討と癌治療への展開を中心に進めた。colon-26固形がんモデルマウスに対して、マンノース修飾バブルリポソーム/NF-kappaB decoy複合体を腫瘍内投与し、腫瘍部位に超音波照射を行うことで、TAMに対してNF-kappaB decoyを送達させた。その結果、Th1サイトカイン量が増大し、Th2サイトカイン産生量が有意に減少、また、VEGF, MMP-9発現量の減少、NO産生能の亢進が認められ、TAMの表現型の存在比がM1型有意なものへシフトされている可能性が示された。また、TAM選択的にNF-kappaB decoyを導入により、腫瘍増殖抑制効果、ならびに延命効果が認められた。さらに、Ehlrich腹水がんモデルマウスを用いて、マンノース修飾バブルリポソーム/NF-kappaB decoy複合体の腹腔内投与と超音波照射の併用により、がん性腹水中のTAMに対するNF-kappaB decoyの導入を行った。固形腫瘍の場合と同様に、腹腔内における血管新生、がん細胞増殖、腹水貯水が有意に抑制することができ、また、延命効果が得られることが示された。以上、マンノース修飾バブルリポソームと超音波照射の併用によるTAM選択的なDDSの開発に成功し、また、癌治療へ応用できる可能性が示された。一方、新たながん治療に有効な標的指向性キャリアとしてシアリルルイスX修飾リポソームを開発し、ヒト血管内皮細胞株HUVECを用いた培養細胞での検討において、本リポソームがE-セレクチンを介してHUVECと結合することが示された。本研究の目的は、癌微小環境における腫瘍関連マクロファージ(TAM)を標的としたDDS開発とその癌治療への展開である。2年目となる本年度は、TAMへの高効率なオリゴ核酸導入に基づくTAM機能の制御化による癌治療戦略の構築と医療応用を目指したアニオン性の新規バブル製剤であるリポポリプレックスの開発を行った。TAMへの核酸・遺伝子導入に関して、マンノース修飾バブルリポソームと超音波照射の併用によりNF-kappaB decoyをTAMに導入することで、マウス皮下に移植した腫瘍組織中のTh2型サイトカイン濃度が減少すると共にTh1型サイトカイン濃度が増大した。さらに、NF-kappaB decoy導入後TAMを分離し、産生されるサイトカインを評価したところ、同様の変化が認められた。以上、超音波照射とマンノース修飾バブルリポソームを用いて、高効率にTAMへNF-kappaB decoy導入を行うことで、TAMのphenotype変化が認められる可能性が示された。

また、昨年度まではカチオン性を示すバブル製剤を用いていたが、本研究成果の医療応用を目指した新規バブル製剤として、核酸、カチオン性高分子、超音波造影ガス内包アニオン性リポソームを静電的相互作用を利用して混合し、新たにアニオン性を示す超音波応答性リポポリプレックスの調製法の構築と最適化を行った。マウスへリポポリプレックスを静脈内投与後に超音波照射を行ったところ、超音波照射した臓器において高い遺伝子発現を示し、これは従来のカチオン性製剤とほぼ同じレベルでの遺伝子発現であった。一方、新規バブル製剤はアニオン性であるため、従来のカチオン性製剤でみられる赤血球との相互作用による凝集は示さなかった。以上、アニオン性を示し、安全な遺伝子導入が可能となるリポポリプレックスの開発に成功した。生体適合性のDDS製剤処方に成功したことは当初の計画以上である。一方、計画していたGM-CSFの遺伝子導入に関しては、計画の遅れを生じた。以上、総合的におおむね順調に進展したものと判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。ほぼ当初計画通りに進んでいる。本年度、生体適合性の材料でバブル製剤を調製できたので、マンノース修飾を行う。これにより、臨床適用可能な製剤としても開発することができると考えている。その他、実験計画の変更は無い。大きな問題は現在のところない。本年度、赤血球との相互作用を示さず、従来の超音波応答性カチオン性バブル製剤とほぼ同レベルの遺伝子導入能を発揮できるアニオン性の超音波応答性バブルリポポリプレックスの調製法の開発に成功した。本研究成果の医療応用を考慮に入れ、安全性の高いバブルリポポリプレックス製剤を基本とし、既に確立している手法で糖修飾を行い、本研究を実施していきたい考えている。その他の点については、実験計画に従って研究を遂行する。
腫瘍血管における薬剤抵抗性関連トランスポーター発現解析

これまで正常血管内皮細胞に比べ,腫瘍血管内皮細胞において薬剤抵抗性関連トランスポーターP-glycoprotein(P-gp)の発現が高いことを見出した.本研究では,これらのトランスポーター発現ががんの治療抵抗性に関わる可能性について検討した.In vitroにおいて腫瘍血管内皮細胞にPaclitaxelとP-gp阻害剤を併用すると,Paclitaxel単独処理よりも増殖抑制効果が得られた.担癌マウスにPaclitaxelとP-gp阻害剤を投与すると,Paclitaxel単独投与よりも抗腫瘍効果が得られた.腫瘍血管内皮のP-gp阻害ががん治療に有用である可能性が示唆された.抗がん剤に対する薬剤耐性は,がんの再発や予後不良に大きく影響する重要な因子である.近年,腫瘍血管を標的とした血管新生阻害療法に対しても、時に治療抵抗性がおこることが報告されている.また,がん細胞だけではなく,がんの間質細胞もその薬剤抵抗性に重要な役割を担っていることが報告され,このがん間質細胞が新たながん治療に対する薬剤耐性のメカニズムとして注目を浴びている.最近われわれはがん細胞のみならず,腫瘍血管内皮も薬剤抵抗性を獲得することを報告しており,本研究では腫瘍血管内皮における薬剤耐性関連トランスポーターの発現解析を行い,血管新生阻害療法に対する治療抵抗性との相関を検討するとともに,薬剤耐性を回避できる新たな治療法の開発を目指した基盤研究を行う.H25年度は舌がん,メラノーマなどのヒト腫瘍細胞をヌードマウスに皮下移植し,腫瘍塊から腫瘍血管皮細胞を,正常マウス皮膚からは正常血管内皮細胞を分離・培養した。また、ヒト腎がん臨床検体、およびヒト大腸がん、肝がん臨床検体からも数Lot血管内皮細胞を分離し培養を行った。解析の結果、純度の高い血管内皮細胞の分離ができており、今後正常血管内皮細胞と腫瘍血管内皮細胞における薬剤耐性関連トランスポーターのmiRNA,タンパク発現量の解析を行う上で非常に重要な成果である.平成26年度はin vitroにおける抗がん剤とトランスポーター阻害剤併用療法の有効性を検討した.具体的にはin vitroにおいて腫瘍血管内皮細胞の抗がん剤に対する抵抗性がP-gp阻害剤でキャンセルされるかを検討した.トランスポーター阻害剤もベラパミル,レセルピン,PSC833など複数種類使用し,in vitroで増殖能,血管新生能を解析し血管新生阻害療法上,有効な治療法を検討した.in vivoにおける抗がん剤とトランスポーター阻害剤併用療法の有効性の検討:マウス腫瘍皮下移植モデルにおいてin vitroでの検討で挙がったトランスポーター阻害剤を用いて,抗がん剤単独投与群と比較し抗がん剤との併用療法でより抗腫瘍効果が得られるか検討をおこなった.その結果,ベラパミルとパクリタキセルに併用することにより,低濃度のパクリタキセルに対する治療感受性がベラパミル併用により有意に高くなることを見出した.また,腫瘍の成長も抑制され腫瘍血管新生阻害効果もCD31染色により明らかになった.また肺への転移に関しても抑制された.なお,これらの結果は5-FUとベラパミルの組み合わせでは得られず,ベラパミルが確かに腫瘍血管のトランスポーターの阻害を介してトランスポーターにより排出されるパクリタキセルの治療効果を選択的に増強したことが確かに示された.これらのことから,腫瘍血管のトランスポーターの阻害は抗がん剤感受性を高めより副作用の出現しにくい低用量の抗がん剤の治療への応用が可能であることを示唆した.ヒト臨床検体を用いて薬剤耐性関連トランスポーター発現を組織学的に解析した.薬剤耐性トランスポーターの発現が腫瘍細胞のみならず,腫瘍血管でも一部認められ,マウスで得られた知見がヒトでもあてはまることを確認した.薬剤耐性関連トランスポーターのひとつであるP-gpはABCトランスポーターであり,幹細胞マーカーとしても知られている.幹細胞マーカーALDHの活性をもとに,腫瘍血管内皮細胞をALDH highとALDH lowに分けてフローサイトメトリーでソーティングし,それらのMDR1遺伝子の発現を比較した.いずれの集団においてもMDR1発現は正常血管内皮細胞よりも高く,ALDH highとALDH lowの間では違いが見られないことから,ALDH活性とMDR1(P-gp)発現には直接関連がないことがわかった.次に,腫瘍血管においてP-gp発現がどのようなメカニズムで亢進するのか検討した.VEGFをはじめとしたがん細胞由来液性因子,がん細胞由来エキソソーム,低酸素などが関与していることがわかった.これまで正常血管内皮細胞に比べ,腫瘍血管内皮細胞において薬剤抵抗性関連トランスポーターP-glycoprotein(P-gp)の発現が高いことを見出した.本研究では,これらのトランスポーター発現ががんの治療抵抗性に関わる可能性について検討した.

In vitroにおいて腫瘍血管内皮細胞にPaclitaxelとP-gp阻害剤を併用すると,Paclitaxel単独処理よりも増殖抑制効果が得られた.担癌マウスにPaclitaxelとP-gp阻害剤を投与すると,Paclitaxel単独投与よりも抗腫瘍効果が得られた.腫瘍血管内皮のP-gp阻害ががん治療に有用である可能性が示唆された.腫瘍血管内皮におけるトランスポーターの抑制in vivoの腫瘍モデルにおいて検証し,仮説のとおり抗血管新生作用を見出すことができた.腫瘍血管新生ヒト臨床検体における腫瘍血管の薬剤耐性関連トランスポーターの発現と予後との統計解析を進める.共同研究を行っている臨床講座から臨床検体サンプルを供与していただき,組織免疫染色によって腫瘍血管内皮の薬剤耐性関連トランスポーター発現量を網羅的に解析し,正常血管との比較検討,および各症例のがん悪性度,抗がん剤に対する治療抵抗性,予後との相関について統計解析をおこなう.さらに,がん細胞と腫瘍血管内皮細胞の相互作用について,培養上清を用いてあるいは共培養を行い,薬剤抵抗性や未分化能の維持などを解析する予定である.また,腫瘍血管内皮細胞が特異的に発現する分泌タンパクおよび膜表面タンパクを同定し,それらのがん細胞に対する影響を解析する予定である.また,腫瘍血管内皮細胞におけるトランスポーターの発現メカニズムについても,上述の共培養や培養上清を用いた実験により検証を進める予定である.また,ABCトランスポーターは幹細胞のマーカーでもあることから,腫瘍血管のトランスポーターが発現していることが腫瘍血管内皮の異常性にどのように関わっているのかについても検討する予定である.例えばこれまでわれわれが見出してきた,腫瘍血管内皮細胞の骨分化能や幹細胞性,さらには血管新生能にもどのように関与しているのかについても検証する.この様な研究で明らかになった分子を標的とした治療もin vivo siRNA送達システムによって試みる予定である.正常皮膚および腫瘍組織から分離できる血管内皮細胞は非常にわずかなポピュレーションであり、なおかつ分離後に順調に細胞が増殖するまで時間がかかったため。この血管内皮初代培養細胞の分離培養操作に時間を要したため、各サンプルの薬剤関連トランスポーターのmRNA発現、およびタンパク発現量の解析をH25年度に完了することができなかった。H26年度に行う予定だったマウスを用いた実験について、細胞の準備に時間を要したため。今後、培養し増えた正常血管内皮細胞、および腫瘍血管内皮細胞から、RNAおよびタンパクを抽出し、薬剤耐性関連トランスポーターの発現をin vitroで解析するとともに、ヒト臨床検体からの血管内皮分離培養もすすめ、発現解析を行っていく。また、共同研究先の各臨床講座から臨床検体サンプルを供与していただき、組織免疫染色によって腫瘍血管内皮の薬剤耐性関連トランスポーター発現量を網羅的に解析し,正常血管との比較検討,および各症例のがん悪性度,抗がん剤に対する治療抵抗性,予後との相関について統計解析をレトロスペクティブ,プロスペクティブにおこなう予定である.細胞は既に準備ができているため、4月より速やかに実験を進める予定である。
トヨタ生産システムの地域企業への導入過程と定着実態

強い「現場」が再評価されている。TPSは競争力を強化する生産システムとして高く評価され、トヨタやその下請企業以外の企業にも導入されている。しかし、TPSは、単なる純技術的に競争優位な経営手法ではない。本研究は、地域企業におけるトヨタ生産システム(TPS)の導入過程を詳細に検証することで、TPSが取り巻く社会関係の中で浸透している(あるいはしていない)ことを明らかにし、TPSを社会的文脈で捉え直した。前世紀の初めに誕生して以来、フォード生産システムは世界規模で広がった。しかし、このシステムは、大量生産・大量消費の時代には効率性が高かったものの、前世紀の終わりには、限られた資源をより効率よく活用し、労働者の「参加」を促し「やる気」を引き出すトヨタ生産システム(TPS)に取って代わられるようになった、と言われる。TPSの定着や広がりはもはや自明とみなされる。しかし、TPSの導入や定着は、システムに内在した「合理性」や「メリット」により自然と単線的に進むわけではない。放っておけば、現場はすぐに「元に戻って」しまう。そこで、個々の企業内と企業を取り巻く環境の中で、TPSを定着させるための「仕掛け」と「力」が必要となるのだ。本年度は、岐阜県のK市で行われているTPSの導入活動に密着し、その点をマクロレベルから明らかにした。岐阜県は、平成20年度より「『ムダ取り』推進事業費助成金を創設し、「県内中小企業の現場の生産性向上や改善により、各企業の収益力を高めるための活動をモデル的に支援」している。なかでもK市の金属団地では、積極的に地域企業が「カイゼン」に取り組んでいる。月に一回の頻度でカイゼン活動の発表会が行われ、各企業の成果が披露され、不十分な点が指摘され、そして次回の発表までの課題が指示される。この活動のモデルは、「トヨタ生産方式自主研活動」(「トヨタ自主研」)であり、それは下請企業を含めたトヨタグループ全体にTPSを浸透させる上で非常に大きな役割を果たしてきた。K市のカイゼン活動の参加企業は、ほとんどが取引関係がなく、そこまで「徹底した活動」が展開されているわけではないが、地域社会での元々のつながりも契機となり、業種を超えてTPSの導入が図られている様子が明らかになった。トヨタ生産システム(TPS)は、経済合理性の観点から高く評価されてきた。フォード生産システムに比べて、環境変化への適応力が高く、現場から組織を「変革」し、労働者から「やる気」を引き出すシステムとして考えられてきた。そして、この技術優位性により、TPSは世界規模で浸透するものと想定されてきたのである。しかし、地域社会に導入された事例を観察すると、TPSの導入先には多様性があり、産業・企業規模・商品特性・企業を取り巻く環境により、定着の仕方は大きく異なることが明らかになった。カンバンシステムとは、あくまで一定の生産量(平準化)を前提として「微調整」の役割を果たすにすぎない。しかし、取引先との力関係が弱い小規模企業は、取引先に平準化をお願いしにくい。また、生産があまりにも多品種で少量の場合は、カンバンシステムを導入すると、システムが煩雑になりすぎて、かえって生産性が下がる。これは一つの事例にすぎないが、各企業は特殊性を抱えており、トヨタのようにはTPSが導入・定着しにくいことが分かった。もっとも、トヨタからすれば、その特殊性を踏まえて、独自のTPSを構築すべきであるというだろうが、そこまでの力量とエネルギーを持てない企業の方が世の中には多いのである。それ故に、TPSは導入したものの、根付いていない企業が少なくないのだ。逆に、経営者の中には、TPSの導入にリーダーシップを発揮し、生産量が少ない時は、従業員教育に時間を割き、全社員でカイゼン活動に取り組んでいる企業もあった。本年度の調査により、TPSの定着は、企業が置かれた状況や経営者のリーダーシップ、他の管理制度との整合性により大きく変わってくることが明らかになった。一昨年度は、産業政策としてのトヨタ生産システム(TPS)の導入支援を明らかにし、昨年度は、複数の地域企業における導入事例の調査を行った。本年度は、企業の現場に焦点をあてて、ミクロの場から導入過程と働く場への影響について調査した。既存の企業にTPSを導入する場合、実際に働いている者からすれば、カイゼン活動を行わなくても不都合はない。なぜなら、現状でも職場は「回っている」からである。したがって現状に手を加えることは難しい。現状を変えようとすれば、現場からの反発や非協力的な態度に遭遇することも珍しくない。それらを排してまでカイゼンを行うには、強制力と持続力が必要となる。しかし、中小企業の多くはそれらの力を持ち合わせておらず、形だけの提案活動で終わっているのが実態である。カイゼン活動に付随する問題はそれにとどまらない。カイゼン活動とは、既存の生産をより効率的に行うことが目的であり、端的に言えば、コスト削減を意図したものである。

しかし、これだけに力を注ぐと、コスト競争に入り込み、付加価値の高い商品の開発がおろそかになる。大企業であれば、分業体制が確立されており、コスト削減と商品開発とでそれぞれ人材が割り当てられているだろうが、中小企業であると、それぞれに豊富な人材を配するほどの余裕はない。つまり、カイゼン活動とは、そもそもそれを定着させることは難しく、たとえ定着させたとしてもコスト競争に入り込み、付加価値の高い商品の開発がおろそかになるという、本質的なジレンマを抱えているのである。調査先の中小企業のほとんどは、カイゼン活動が形骸化し、開店休業状態になるか、カイゼン活動に振り回されるかのいずれかであった。調査対象者が全面的に協力してくださるため、当初の計画を超えて、順調に研究が進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。地域企業との協力関係を維持し、今まで通りに研究計画を進める。
ウイルス構造を模倣した多糖/核酸複合体による新規遺伝子導入剤の開発

天然多糖シゾフィラン(SPG)と核酸の複合体を応用してDNAの細胞へのデリバリーを目指し研究を行った。SPGは特定の配列を有する一本鎖核酸を認識して高分子複合体を形成する性質を持つ。今年度は、DNAを効率よく細胞核内へ導入することを目的とし、複合体の設計を行った。癌細胞の核内で高い活性を持つことが知られているテロメラーゼを標的とした。SPGの分子量を小さくすることで核内へ移行するアンチセンスDNAの量が増えたが、分子量が小さくなることで複合体の安定性が低下するという問題があった。そこで、それ自体の核膜透過能は低いが、複合体が安定に形成できる分子量のSPGに核輸送タンパク質インポーチンβを化学修飾したSPGを合成した。これとテロメラーゼに対するアンチセンスDNAを複合化し、細胞核内へのアンチセンスDNAのデリバリーを行った。その結果、この複合体はアンチセンスDNAのみの場合に比べて核内へDNAの移行効率が上がり、テロメラーゼ活性を抑制することが示された。これらの成果はBulletin of Chemical Society Japan誌へ投稿し、すでに受理されている。天然多糖シゾフィラン(SPG)と核酸の複合体を応用して遺伝子DNAの細胞へのデリバリーを目指し研究を行った。そこで、遺伝子組換え技術を駆使し、直鎖状DNAへpoly(dA) tailを付加することで遺伝子DNA/遺伝子DNA複合体の形成を試みた。SPGそのものには細胞膜透過性がないため細胞膜親和性を有するペプチドをSPG側鎖に化学修飾した。この化学修飾SPGとtail付加DNAを混合することで複合体形成を行い、原子間力顕微鏡(AFM)やゲル電気泳動を用いて複合体形成を確かめた。AFM観察より、SPGは直鎖状DNAの両末端に結合しており、ある種のウイルスゲノム構造に似たダンベル状構造を取っていることがわかった。この複合体を培養細胞に添加し、遺伝子導入を行った。用いた遺伝子は最近、タンパク質発現を特異的に抑制することができるツールとして注目を集めているRNAi(RNA干渉)遺伝子とし、複合体形成による効果を調べた。その結果、細胞親和性ペプチド修飾SPGと遺伝子を複合化することでRNA干渉効果の向上が確認できた。さらに、合成したペプチド修飾SPGは、一般的に遺伝子導入剤として用いられているカチオン性ポリマーと比べて細胞毒性が著しく低いことが確かめられた。これらの成果はJournal of Controlled Release誌へ投稿し、すでに受理されている。
2-ブロモプロパンと1-ブロモプロパンの生殖毒性と生物マーカーに関する実験的研究

(1)雄ウィスターラット40匹を10匹ずつの4群に分け、3群にl-ブロモプロパンを800ppm、400ppm、200ppm一日8時間、12週間、小動物曝露用チャンバー内で曝露した。対照群には新鮮空気のみを曝露した。前肢握力、後肢握力、尾の運動神経伝導度は量依存的、時間依存的に低下し、尾の遠位潜時は延長した。さらに、末梢神経の解きほぐしではミエリンの変性が800ppm群で見られた。(2)上記実験で生殖器に対する影響を調べた。その結果、量依存的に精子数、運動率が減少し、形態異常精子は増加していた。精巣重量は有意な変化がなく、精巣の病理組織学的検査では精子数減少を説明できる所見はえられなかったが、精嚢重量は200ppm以上で有意に減少した。(3)雌ウィスターラット36匹を9匹ずつの4群に分け、3群に2-ブロモプロパンをl000ppm1300ppm1100ppm一日8時間、9週間曝露した。性周期を膣スメア法で観察するとともに、卵巣の連続切片を作成し、卵胞数を計測した。性周期の撹乱を示す個体は量依存的に増加した。性周期撹乱が明らかでない100ppmで有意に始原卵胞の減少が見られた。(4)雌ウィスターラット35匹を7匹ずつの5群に分け、4hに3000ppmの2-ブロモプロパンを8時間吸入させ、曝露1日、3日、5日、17日後にそれぞれ解剖し卵巣を取り出した。(3)と同様の方法で卵胞数を計測した結果、始原卵胞数が5日、17日後に有意に減少した。TUNEL法陽性の始原卵胞は5、17日後に有意に増加した。以上、1-ブロモプロパンは、強い神経毒性とともに雄性生殖毒性を有することが明らかとなった。また、精巣上体精子指標、性ホルモン依存器官である精嚢などの重量、連続切片による卵胞計測、アポトーシス細胞を観察するために開発されたTUNEL法等が、鋭敏で有効な生物マーカーであることが示唆された。(1)雄ウイスター系ラット36匹を9匹ずつの4群に分け、3群に2-ブロモプロパンを3000ppm、1000ppm、300ppm、一日8時間、9週間、小動物爆露用チャンバー内で曝露した。対照群には新鮮空気のみを爆露した。爆露終了時、300ppm以上の濃度で精巣上体精子数、運動精子率は量依存的に減少し、病理組織学的には精巣胚細胞が減少し、1000ppm以上では胚細胞を見つけることができなかった。末梢血液所見は汎血球減少を示し、骨髄の病理組織学的所見でもすべての系統の造血細胞が減少していた。(2)2-ブロモプロパン3000ppm、8時間雄ラットに爆露し、12時間後、24時間後、3日後に屠殺、精巣を取り出し、ブアン固定の後、病理組織学的検索を行った。その結果、2-ブロモプロパンが精祖細胞を標的とすることが明らかとなった。(3)2-ブロモプロパン1000ppm、100ppm、1-ブロモプロパン1O00ppm、一日8時間、12週間、雄ラットに曝露した結果、2-ブロモプロパン曝露によって量依存的に末梢神経伝導速度が低下した。2-ブロモプロパン100ppmでは精子形成、精巣に対する影響は明らかでなかった。一方、1-ブロモプロパン1000ppmでは末梢神経伝導速度の高度の低下が見られたが、精巣の病理組織では明らかな変化が認めれらなかった。(4)2-ブロモプロパンと1-ブロモプロパンのDNAに対する付加物形成能を核酸分析装置で現在解析中である。以上、2-ブロモプロパンは1-ブロモプロパンより生殖、骨髄毒性が強かったが、後者は前者より神経毒性の点では強かった。本結果より、2つの異性体は作用機序、標的細胞に大きな違いがみられることが明らかとなった。

性周期を膣スメア法で観察するとともに、卵巣の連続切片を作成し、卵胞数を計測した。性周期の撹乱を示す個体は量依存的に増加した。性周期撹乱が明らかでない100ppmで有意に始原卵胞の減少が見られた。(4)雌ウィスターラット35匹を7匹ずつの5群に分け、4hに3000ppmの2-ブロモプロパンを8時間吸入させ、曝露1日、3日、5日、17日後にそれぞれ解剖し卵巣を取り出した。(3)と同様の方法で卵胞数を計測した結果、始原卵胞数が5日、17日後に有意に減少した。TUNEL法陽性の始原卵胞は5、17日後に有意に増加した。以上、1-ブロモプロパンは、強い神経毒性とともに雄性生殖毒性を有することが明らかとなった。また、精巣上体精子指標、性ホルモン依存器官である精嚢などの重量、連続切片による卵胞計測、アポトーシス細胞を観察するために開発されたTUNEL法等が、鋭敏で有効な生物マーカーであることが示唆された。
完全人工環境下での鳥類胚の孵化と家畜工場への利用

本年度は、遺伝子導入ニワトリ作製のための遺伝子導入法の最適化を試みた。放卵直後の胚盤葉より調製した胚細胞に遺伝子を導入し、他の胚盤葉期胚に注入してキメラを作る胚盤葉キメラ法を検討したが、注入胚細胞のキメラ胚における寄与が少なく実用的でないことがわかった。次に我々の開発したリポソーム法を用いて直接遺伝子を胚に導入することを試みた。孵卵48時間後に胚の血中に心臓からリポソームを注入したところ、2日後の胚の生存率は80%と高く、遺伝子導入効率も高いことが確認できた。この際の遺伝子発現が注入部位である心臓に限られていたため、この点の改善を行った。そこで血中におけるDNAとリポソーム複合体を安定させるためにDNA結合タンパク質プロタミンに疎水基を導入し、このプロタミンを介してDNAとリポソームが強く結合するようにした。この改良型リポソームを用いた所、心臓以外の内臓にも遺伝子発現領域が広がる傾向が認められた。これらにより生殖系列への遺伝子導入法の基礎技術ができたと考えられる。一方、卵管特異的に外来遺伝子を発現させるためのベクターを構築した。ニワトリ胚繊維芽細胞より、λ-ファージを用いてゲノムライブラリーを作製した。約10万個のファージの中からオボアルブミン遺伝子のプロモーター領域をクローニングした。さらに卵管特異的に遺伝子を発現するのに必要な領域約4kbの下流に、ヒトインスリン遺伝子をつないだ発現ベクターを作製した。オボアルブミンの卵管での遺伝子発現はきわめて強いので、このベクターによるヒトインスリンの卵白への効率的生産が期待できる。我々は卵殻のかわりにガラスカップとテフロン膜よりなる人工容器を用いてウズラ胚を孵化させることに世界ではじめて成功しており(孵化率40%)、さらにニワトリ卵殻を用いた場合は80%の孵化率で孵化させることに成功している。本研究ではこの成果を応用し、ガラスカップとテフロン膜を用いた人工容器で放卵直後の胚盤葉期のニワトリ胚を孵化させることができた。これはウズラの場合と同様に、乳酸カルシウムを添加し酸素通気を行うことで成功したもので、孵化率は20%であった。一方、2卵黄など特大の卵殻をホスト卵殻とし、それに胚を移して培養する技術も開発し80%以上というきわめて高い孵化率を得ることができた。また生まれたヒヨコは順調に生育した。これにより次年度以降に予定している遺伝子導入ニワトリの作製と、卵白への有用物質生産の技術的基礎ができたと考えられる。一方、ガラスカップやテフロン膜など人工卵殻を用いウズラ胚を培養した場合、培養47日目に卵黄内カルシウム濃度が低下しこれが孵化率が低い原因と考えられた。そこで種々の培養条件で卵黄内カルシウム濃度を測定したところ、乳酸カルシウム添加時には培養初期におけるカルシウム濃度の顕著な落ち込みが緩和されることが判明した。一方、無機塩の吸収を改良するためカゼインホスホペプチド、ビタミンD及びE、カルボニックアンヒドロラーゼなど添加した培養を行ったが、効果がなかった。

そこで血中におけるDNAとリポソーム複合体を安定させるためにDNA結合タンパク質プロタミンに疎水基を導入し、このプロタミンを介してDNAとリポソームが強く結合するようにした。この改良型リポソームを用いた所、心臓以外の内臓にも遺伝子発現領域が広がる傾向が認められた。これらにより生殖系列への遺伝子導入法の基礎技術ができたと考えられる。一方、卵管特異的に外来遺伝子を発現させるためのベクターを構築した。ニワトリ胚繊維芽細胞より、λ-ファージを用いてゲノムライブラリーを作製した。約10万個のファージの中からオボアルブミン遺伝子のプロモーター領域をクローニングした。さらに卵管特異的に遺伝子を発現するのに必要な領域約4kbの下流に、ヒトインスリン遺伝子をつないだ発現ベクターを作製した。オボアルブミンの卵管での遺伝子発現はきわめて強いので、このベクターによるヒトインスリンの卵白への効率的生産が期待できる。
細胞表層におけるセプチン重合・脱重合機構の解析

セプチン系は重合性GTP結合蛋白質が構成する普遍的な細胞骨格系であるが、アクチン系・微小管系などに紛れがちなこと、遺伝子重複、適当な阻害剤がないことなどからその全貌は謎に包まれている。セプチンの重合・脱重合機構に残された問題を解明すべく、FRAPおよび電子顕微鏡技術を駆使して時空間的解析を行い、以下の結果を得た。1)セプチンのターンオーバー率はサブユニットごとに異なる。これはヘテロポリマー内の位置や他の細胞骨格分子との会合によるものと想定される。2)平均的なセプチンサブユニットのターンオーバー率は平均的なアクチン膜骨格のそれよりも23倍遅い。3)セプチンをRNAiで枯渇させてもアクチンのターンオーバーには影響しないが、作用機序の異なる2種のアクチン阻害剤はいずれもセプチンのターンオーバーを著明に遅延させた。このunilateralな関係は代表者らが以前報告した、アクチンストレスファイバー上での両者の相互依存性とは全く異なる。4)以上のメカニズムを解析するため、急速凍結レプリカ免疫電子顕微鏡法を用いて細胞表層のセプチンを標識したところ、アクチン膜骨格上で一様に分布してはおらず、特に分岐部、末端部、結節部、束化部に集積する傾向が見られた。これは代表者らが以前報告したように、アクチンとセプチンは直接相互作用せず、ミオシンやアニリンなどのアクチン会合分子を介して間接的にリクルートされることと符合する。5)細胞表層のセプチンは膜蛋白質GLASTのカルボキシル末端の29アミノ酸残基と相互作用することによってターンオーバー率を低下させた。以上を総合すると、アクチン膜骨格の中で相対的に安定な構成成分であるセプチンがスカフォールドないし側方拡散バリアとして機能する際の普遍的な作用メカニズムの概要を解明できた。共焦点レーザー顕微鏡による分子動態の定量的ライブイメージング(FRAP法)これまでの研究で、細胞膜直下に集積したGFP-septin融合蛋白質に対するFRAP(光退色後蛍光回復)法が、セプチン重合体の細胞内動態の解析において定量性と再現性が高く非常に有効であることがわかった。この手法と系を工夫し、細胞膜直下のセプチン重合体に焦点を絞って解析し、アクチン依存性を持ちながら表層アクチン以上の安定性を有することがわかった。また、その存在が、他の膜蛋白質の挙動を制限する足場ないし障壁となっている可能性を検証した(一部投稿中)。2007年にセプチンの構造が決定された後も、GTP交換・水解反応と重合/脱重合サイクルの共役に関する最大の謎はいまだ手付かずで残されている。申請者らも長年この難問に取り組んできたが、その一環としてGTPのガンマ位のリン酸基との会合領域の1つであるSwitch I領域がサブユニットの酵素活性とダイナミクスに決定的に重要であることを確定した。そこで、当該領域の重要と思われるアミノ酸に多数の変異を導入し、重要な残基をほぼ特定した(現在最終検証中)。これらの事実は最近より高解像度で解けた原子構造情報(未発表)を補完する重要な新知見であるため、引き続き集中的に解析を進める。セプチン系の分子動態解析を目的として、培養神経細胞の細胞膜直下に集積したGFP-septin融合蛋白質に対するFRAP(光退色後蛍光回復)法を行った。膜蛋白質分子や細胞膜直下のアクチン分子に比べてセプチン分子のターンオーバーは緩慢であり、細胞膜直下のセプチン集合体の安定性が示唆された。この特性は細胞膜形状の保持や、膜蛋白質のスカフォールドないし拡散障壁としての役割に適したものと考えられた。

RNAiでセプチンを枯渇させた細胞で関連分子の動態を調べたところ、cortical actinの動態に有意な変化が見られない条件で、syntaxin-1(膜貫通型tSNARE)やGLASTのターンオーバーが有意に促進した。したがって、細胞膜直下のセプチン系がこれらの分子のスカフォールドないし拡散障壁として局在や安定化に寄与する可能性が支持された。このような分子機構は、sept4欠損マウスのドパミン神経末端においてsyntaxin-1やDATが減少すること(Neueon 2007)の理由の1つと考えられる。酵母からヒトまで保存された重合性GTPaseセプチンは、アクトミオシンや微小管と協調して細胞形態制御に関与する一方、多様な膜蛋白質の局在や機能を規定する拡散障壁や足場を形成する。しかし、その多機性とサブユニット間の機能重複のために、特に哺乳類での細胞機能、生理機能、病態との関連には不明な点が多い。代表者らはフランスのパスツール研グループとの過去4年間にわたる共同研究で、セプチンとアクトミオシンによるバスケット状の構造物が宿主細胞内に侵入した赤痢菌やリステリア菌を包囲、拘束することを見出し、報告した(Cell Host Microbe 2010)。また、大脳皮質ニューロンにおけるセプチン系の阻害が軸索・樹状突起の伸長を阻害すること、それが微小管安定化機構の異常によるものであることを示した(Ishihara et al.,投稿準備中)。これは線虫のセプチン変異体unc-59/-61で報告された神経突起伸長・分岐異常と符合する。代表者らは米国グループとの共同研究で低分子量G蛋白質Cdc42のエフェクター蛋白質ファミリーCdc42ep1-5/Borg1-5を介したセプチン系の制御メカニズムを提唱したが(Nat Cell Bio1 2001)、このパスウェイの生理的意義は長らく未検証のままであった。そこで、小脳バーグマングリアや海馬歯状回ニューロンなどで発現し、セプチンと共局在するCdc42ep4に着目してノックアウトマウスを作製した。既に運動学習に関する興味深い形質が明らかになりつつあり、個体数を増やしてH23年度上半期に網羅的行動解析を行う予定である。