hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境負荷量推計のための高精度走行量推計手法の開発

本研究は、自動車から排出される環境負荷量の推計を精度高く行うための交通量推計を開発することを目的として、(1)交通量の変動特性の分析、(2)交通調査の調査精度の分析、(3)走行量の推計制度の改善手法の解析、(4)貨物車の走行経路選択特性の分析、について研究をすすめた。成果は次の4点に集約される。(1)都市内の幹線道路における断面交通量の変動の大きさは、年平均日交通量に対し3-5%程度である。また変動は周期変動(月変動、週変動、曜日変動)と偶然変動に分割でき、その比率はほぼ4:6である。(2)人手による断面交通量の調査結果は、偶然誤差に加え、マイナスの傾向誤差を有し、その程度は、調査する交通量の増加に伴って大きくなる傾向を示す。(3)アンケート方式でOD交通量を調査した場合、交通量の20-30%が欠落してしまう。その主なものは、家付近での短い移動距離の交通、長い移動途中での立寄りの交通、1日に多くの移動を行う人の交通、である。(4)断面交通量を用いて、OD交通量を修正することで、走行量の推計制度は大きく改善できる。特にOD交通量が傾向誤差を有する場合には、OD交通量の修正に用いる関数を工夫することで改善効果は一層高まる。交通量の変動特性のうち、OD交通量の変動特性、及び貨物車の走行経路選択特性については、いくつかの分析を試みたが、本研究の期間内では一般化できる水準の成果が得られず、今後の課題として残った。本研究は、3年間をかけ自動車から排出される環境負荷量の推計を精度高く行うための交通量推計手法を開発することを目的としている。本年度は、第1年目であり、以下の3項目について検討を行った。1.断面交通量、及びOD交通量の変動特性の把握2.貨物車の経路選択特性の把握3.走行量を精度高く推計する手法の開発これらの各項目について、今年度得られた主な成果は、以下の通りである。1.大都市の一般道路の断面交通量はほぼ正規分布し、その変動は、月変動、曜日変動、週変動、偶然変動に分割できる。またOD交通量の調査精度は、断面交通量の調査精度に比較し数倍程度悪く、適切な修正が必要である。2.貨物車は、一般道路と都市高速道路を、両道路の走行距離の違い、走行費用(燃料費+人件費+道路利用料)の違い、高速道路の出口から目的地までの距離を考慮して、選択している。3.断面交通量を用いてOD交通量を修正することにより、走行量の推計精度は大幅に向上させることが可能である。この走行量の推計精度は、交通量が知られている道路断面の数の増加に伴って改善されるが、その向上の程度は、全道路断面の半分程度の断面交通量が知られている時が高い。これらのうち1.2.については、学会で既に発表した。本研究は3ヵ年計画であり、本年は2年目に当たる。本年は、断面交通量の変動特性、及びOD交通量の計測誤差の分析、貨物車による一般道路と高速道路の経路選択要因の分析、及び断面交通量とOD交通量の計測誤差と変動特性を考慮したOD交通量の修正方法の開発を行った。断面交通量の変動特性は、都内22ヵ所の幹線道路断面での1年間の交通量について分析し、交通量の変動が傾向変動と偶然変動から構成され、その割合は約4:6であること、傾向変動は、月変動、曜日変動、週変動で表わせることを示している。さらに同様の分析を首都高速道路についても行い、変動特性は一般道路と類似していること、しかし交通量の変動の大きさは一般道路のそれよりも大きいこと、交通量の変動は一般道路のそれと相関関係が高いことを明らかにしている。OD交通量の計測誤差については、移動量の記入に併せて、移動した時間をも記入してもらう調査表を作成し、これを用いてその把握を試み、20%30%程度の傾向誤差が存在することを明らかにしている。

貨物車の経路選択要因については、独自に実施したトラック運転手を対象としたアンケート調査を用いて抽出を試み、高速道路の走行距離と一般道路の走行距離、高速料金を含む移動に要する費用、出口ランプから目的地までの距離が要因として考えられることを明らかにしている。OD交通量の修正方法として提案している方法は、基本的にはOD交通量に比べ、計測誤差が小さい断面交通量にOD交通量を配分した結果が一致するようにOD交通量を修正するというものである。そして、この修正を行うための関数を、OD交通量の計測誤差が偶然誤差が大部分と考えられる場合と、傾向誤差が無視できない場合に分け提案し、その有効性を簡単なネットワークを用いてシミュレーションにより示している。本年度は、次の2点について研究を進めた。1.OD交通量の調査誤差を分析するため、同一対象者に対し2種類の調査を用いて交通行動調査を行い、発生する誤差の程度、内容、原因を明らかにする。2.調査制度の高い断面交通量を用いて、OD交通量を修正するための効率的な手法を開発する。前者から以下の3点が明らかとなった。(1)現在の標準的な調査表を用いて、トリップ単位で交通行動を捉えた場合、2025%実際のトリップ数よりも少ないこと(2)調査から抜け落ちてしまうトリップは、自宅からの短距離のトリップ、長距離の移動の途中で他の目的のために立寄るトリップ、及び1日に多くのトリップを行う人のトリップが大部分であること(3)調査からトリップが抜け落ちる原因は、調査対象者がトリップとして意識していないこと、記述が面倒であること後者については、以下の2点が明らかとなった。(1)OD交通量が前者の研究で明らかとなった傾向誤差を有する場合には、修正に用いる関数を傾向誤差の性質に応じ適切に設定することで改善効果を高めることができること(2)改善効果は傾向誤差が大きければ大きいほど高いこと
CTL誘導によるキャリア-細胞を用いた卵巣癌特異的細胞性免疫性遺伝子治療の試み

卵巣癌特異的オンコリティックアデノウイルスAdE3-IAI.3Bは、単独ではヌードマウスモデルにおいて一時的に著しい抗腫瘍効果を示すものの、全ての腫瘍に再発が認められる。このため、293細胞あるいはA549細胞をAdE3-IAI.3Bのキャリアー細胞として用いると、ヌードマウスモデルにおける腫瘍の再発が認められず、in vitroの実験において坑アデノウイルス中和抗体による感染抑制が解除されることが明かとなった。Syngeneicな(C57BL/6 x C3/He>F1マウス由来の高転移性の卵巣癌細胞株OVHMに対して、キャリアー細胞を投与しても抗腫瘍効果は示さなかった。UVで不活化したアデノウイルスを皮下注射後のキャリアー細胞治療により、腫瘍は完全に消失し再発は認められなかった。さらに、再度OVHMを投与しても腫瘍形成は認められず、腫瘍免疫が誘導され腫瘍拒絶が確立していることが明かとなった。オンコリティックアデノウイルス作成には、E1Aプロモーターと腫瘍特異的プロモーターとを置換する方法がとられているが、nt552-448の部位が最も適当と思われた。アデノウイルスによる治療にはサイトカインサージによるショック死が問題とされているが、0.2%アテロコラーゲン併用によりヌードマウス副作用死が4分の一に減少可能となった。A549は、癌細胞であるため、人に対する腫瘍形成能を消失させる必要があり、ヌードマウス、scidマウスにおける検討で、400Gy照射が至適照射量であった。卵巣癌は、早期に腹腔内に播種性転移を示すことから、こうした病態に対する治療法を確立することが重要である。キャリアー細胞としてA549を用いると、20%のCRが得られたが、他の293およびSW626ではまったくCRは得られなかった。また、アデノウイルスの感染条件はヌードマウス皮下腫瘍モデルに対しては200MOI、24時間感染、腹腔内播種性モデルに対しては、5MOI、24時間感染が最も良好な抗腫瘍効果を示した。OVHM卵巣癌細胞を用いたsyngeneic mouse modelにおいて、adenovirus-GM-CSFを10MOIキャリアー細胞に共感染して事前免疫後投与したところ抗腫瘍効果が増大し、さらにキャリアー細胞として293細胞とA549細胞を併用したところ、1回投与により完全腫瘍退縮が可能となった。このため、腹腔内腫瘍である卵巣癌に対してはこの治療により完全治癒の可能性が考えられ、臨床的に有用な治療法となることが示唆された。卵巣癌特異的オンコリティックアデノウイルスAdE3=IAI.3Bは、単独ではヌードマウスモデルにおいて一時的に著しい抗腫瘍効果を示すものの、全ての腫瘍に再発が認められることが明かとなった。

このため、293細胞あるいはA549細胞をAdE3-IAI.3Bのキャリアー細胞として用いると、ヌードマウスモデルにおける腫瘍の再発が認められず、in vitroの実験において坑アデノウイルス中和抗体による感染抑制が解除されることが明かとなった。Syngeneicな(C57BL/6 x C3/He)F1マウス由来の高転移性の卵巣癌細胞株OVHMを用いてAdE3-IAI.3Bの感染したキャリアー細胞である293細胞およびA549細胞の抗腫瘍効果を検討した。AdE3-IAI.3B単独あるいはAdE3-IAI.3B感染キャリアー細胞を投与しても抗腫瘍効果は示さなかった。メモリーT細胞への抗原認識を期待してUVで不活化したアデノウイルス10^7vpを皮下注射し34週間後に、AdE3-IAI.3Bを250vp/cell感染した200Gy放射線照射後のA549細胞を810mmのOVHM皮下腫瘍に7.5x10^6 cell/mouseを6回腫瘍内注射したところ、腫瘍は15日後に完全に消失しさらに150日後においても再発は認められなかった。こうして治癒したマウスに、再度OVHMを10^6個、皮下移植したところ全てのマウスにおいて腫瘍形成は認められず、腫瘍免疫が誘導され腫瘍拒絶が確立していることが明かとなった。tumor vaccinationの可能性を検討するためOVHMを80Gyで放射線照射して腫瘍形成能を消失させた後、10^6個皮下注射し、2週間後にOVHMを皮下移植したところ腫瘍発育遅延が認められたが腫瘍拒絶は認められなかった。このため、キャリアー細胞治療後に認められる腫瘍拒絶は、単にOVHM癌細胞が死滅することによるものではなくオンコリティックアデノウイルス感染によって誘導されることが示唆された。E1Aプロモーターを削除するため491-552bpおよび404-552bpを削除し、その位置にIAI.3Bプロモーターを挿入したAdE3-491-IAI.3B、AdE3-404-IAI.3B、さらにはそれぞれのfiber knobにRGD motifを挿入したAdE3-491-IAI.3B-RGD、AdE3-404-IAI.3B-RGDを作成し、抗腫瘍効果を検討したところ、削除する位置によって、あるいはRGDを負荷することによってそれぞれ抗腫瘍効果に差が認められなかった。このため、wild type adenovirusができないという点においてAdE3-404-IAI.3Bが最も適当と思われた。キャリアー細胞による遺伝子治療には、強力な抗腫瘍効果を示すオンコリティックアデノウイルスを作成することが重要である。オンコリティックアデノウイルス作成には、E1Aプロモーターと腫瘍特異的プロモーターとを置換する方法がとられているが、この際に置換するプロモーター領域が問題となる。今回、nt552、nt552-491、nt552-448、nt552-404の各部位を欠失して、同部位に腫瘍特異的プロモーターを導入したところ、nt552、nt552-491、nt552-448において抗腫瘍活性はほぼ類似していたが、nt552-404において活性が10分の一に低下した。これは、nt448-404の間にアデノウイルスの増幅に重要な領域があるものと思われた。アデノウイルスによる治療にはサイトカインサージによるショック死が問題とされているが、0.2%アテロコラーゲン併用によりキャリアー細胞によるヌードマウス副作用死が4分の一に減少可能となった。
発話における流暢性の発達と幼児期における吃音の自然回復

幼児期には非流暢な発話が観察されることが知られているが、吃音もほとんどは幼児期に発生し、その多くが学齢期までに消失することが吃音の自然回復として知られている。両者とも言語の統語的側面の発達と関係していることが指摘されているけれども、両者の関係はまだ明らかになっていない。本研究の目的は、吃音が自然回復した1名の、吃音の発生前から消失までの自然発話データを統語発達との関係で分析し、その結果を、吃音を示さなかった幼児の発話の非流暢性と言語発達との関係と比較することによって、発話における流暢性の発達と幼児期における吃音の自然回復との関係を解明することである。本研究は、原因が明らかになっていない吃音の問題を明らかにするための基盤となるものである。今年度(1年目)の計画は、既に収集が終わっている、吃音の自然回復を示した幼児1名のデータ分析を行うことと、吃音を示さなかった幼児4名のデータに追加するために幼児2名の縦断研究(自然発話の収集)を継続することであった。吃音の自然回復を示した幼児1名の1歳6カ月から3歳2カ月までの自然発話データと各発話の文構造と吃音の特徴をエクセルへ入力した後、文構造の発達的変化と吃音の自然回復との関係を分析した。今回の分析から、自然発話の縦断研究データのエクセルへの入力には予想以上に時間を要することが明らかになった。また、予測しなかったことであるが、吃音を示さなかった幼児の追加データとして縦断研究の対象としていた幼児2名のうち1名に吃音が生じ、その後自然回復した。この結果、当初の計画では、吃音の自然回復を示した幼児については1名を予定していたが、さらに1名を加えることが可能になった。今年度は、(1)収集済みの、吃音の自然回復を示した幼児1名のデータ分析を行うことと、(2)追加のための、吃音を示さなかった幼児2名の縦断研究データの収集を継続することであった。上記(1)については、計画通り、吃音の自然回復を示した幼児1名の1歳6カ月から3歳2カ月までの約1年半の自然発話データとそれぞれの発話の文構造と吃音の有無と特徴をエクセルに入力し、文構造の発達的変化と吃音の発生・自然回復との関係を分析した。今回の分析において、1歳6カ月から3歳2カ月までの幼児1名の自然発話をエクセルに入力するのに約1年を要した。その結果、分析を行った幼児1名の結果については学会報告や論文投稿までに至らなかった。上記(2)については、これはまったく予測していなかったことであるが、吃音を示さなかった幼児4名のデータに追加するための縦断研究の対象であった2名のうち1名に吃音が生じ、この吃音はその後自然回復した。そのため、結果としては、吃音の自然回復を示した貴重な縦断研究データを、さらに1名について得ることができた。吃音の自然回復を示した幼児のデータ収集を優先したため、吃音が生じなかった幼児として対象としていたもう1名については十分なデータ収集ができなかった。今年度の研究の結果、幼児の自然発話の1歳6カ月から3歳2カ月までの縦断データのエクセルへの入力と分析には、一人当たり約1年を要することが明らかになった。この結果から、分析対象とする幼児の自然発話の縦断データは、当初の計画(吃音の自然回復を示した幼児1名と吃音を示さなかった幼児6名、計7名)よりも減らす必要があることが明らかになった。一方、吃音が生じなかった幼児の追加のための縦断研究の対象であった幼児2名のうち1名に吃音が生じ、その吃音は自然回復した。その結果、予測しなかったことであるが、吃音の自然回復を示した幼児の吃音の発生前から自然回復までの貴重なデータをさらに1名増やすことが可能になった。上記のような1年目の結果を踏まえ、今後の研究の推進方策として、2年目は、(1)新たに加わった、吃音の自然回復を示した幼児1名のデータ分析を行うこと、(2)吃音を示さなかった幼児については当初の予定よりも対象児を減らし、既に収集が終わっている2名のみとし、この2名についてデータのエクセルへの入力と分析も行うこと、また、(3) 1年目でデータ分析が終了した吃音の自然回復を示した幼児1名について、学会発表および論文投稿を行うこととした。3年目は、当初の予定通り、1年目と2年目の研究成果をまとめて、流暢性の発達と吃音の自然回復との関係を解明し、その結果を学会等で発表するとともに、論文として投稿する。

本研究の目的は、吃音が自然回復した1名の、吃音の発生前から消失までの自然発話データを統語発達との関係で分析し、その結果を、吃音を示さなかった幼児の発話の非流暢性と言語発達との関係と比較することによって、発話における流暢性の発達と幼児期における吃音の自然回復との関係を解明することである。本研究は、原因が明らかになっていない吃音の問題を明らかにするための基盤となるものである。今年度(1年目)の計画は、既に収集が終わっている、吃音の自然回復を示した幼児1名のデータ分析を行うことと、吃音を示さなかった幼児4名のデータに追加するために幼児2名の縦断研究(自然発話の収集)を継続することであった。吃音の自然回復を示した幼児1名の1歳6カ月から3歳2カ月までの自然発話データと各発話の文構造と吃音の特徴をエクセルへ入力した後、文構造の発達的変化と吃音の自然回復との関係を分析した。今回の分析から、自然発話の縦断研究データのエクセルへの入力には予想以上に時間を要することが明らかになった。また、予測しなかったことであるが、吃音を示さなかった幼児の追加データとして縦断研究の対象としていた幼児2名のうち1名に吃音が生じ、その後自然回復した。この結果、当初の計画では、吃音の自然回復を示した幼児については1名を予定していたが、さらに1名を加えることが可能になった。今年度は、(1)収集済みの、吃音の自然回復を示した幼児1名のデータ分析を行うことと、(2)追加のための、吃音を示さなかった幼児2名の縦断研究データの収集を継続することであった。上記(1)については、計画通り、吃音の自然回復を示した幼児1名の1歳6カ月から3歳2カ月までの約1年半の自然発話データとそれぞれの発話の文構造と吃音の有無と特徴をエクセルに入力し、文構造の発達的変化と吃音の発生・自然回復との関係を分析した。今回の分析において、1歳6カ月から3歳2カ月までの幼児1名の自然発話をエクセルに入力するのに約1年を要した。その結果、分析を行った幼児1名の結果については学会報告や論文投稿までに至らなかった。上記(2)については、これはまったく予測していなかったことであるが、吃音を示さなかった幼児4名のデータに追加するための縦断研究の対象であった2名のうち1名に吃音が生じ、この吃音はその後自然回復した。そのため、結果としては、吃音の自然回復を示した貴重な縦断研究データを、さらに1名について得ることができた。吃音の自然回復を示した幼児のデータ収集を優先したため、吃音が生じなかった幼児として対象としていたもう1名については十分なデータ収集ができなかった。今年度の研究の結果、幼児の自然発話の1歳6カ月から3歳2カ月までの縦断データのエクセルへの入力と分析には、一人当たり約1年を要することが明らかになった。この結果から、分析対象とする幼児の自然発話の縦断データは、当初の計画(吃音の自然回復を示した幼児1名と吃音を示さなかった幼児6名、計7名)よりも減らす必要があることが明らかになった。一方、吃音が生じなかった幼児の追加のための縦断研究の対象であった幼児2名のうち1名に吃音が生じ、その吃音は自然回復した。その結果、予測しなかったことであるが、吃音の自然回復を示した幼児の吃音の発生前から自然回復までの貴重なデータをさらに1名増やすことが可能になった。上記のような1年目の結果を踏まえ、今後の研究の推進方策として、2年目は、(1)新たに加わった、吃音の自然回復を示した幼児1名のデータ分析を行うこと、(2)吃音を示さなかった幼児については当初の予定よりも対象児を減らし、既に収集が終わっている2名のみとし、この2名についてデータのエクセルへの入力と分析も行うこと、また、(3) 1年目でデータ分析が終了した吃音の自然回復を示した幼児1名について、学会発表および論文投稿を行うこととした。3年目は、当初の予定通り、1年目と2年目の研究成果をまとめて、流暢性の発達と吃音の自然回復との関係を解明し、その結果を学会等で発表するとともに、論文として投稿する。
マスト細胞におけるアクチビンの役割:発現、機能ならびに作用機構について

アレルゲン-IgE複合体が結合するとマスト細胞は活性化し、ヒスタミンなどを放出し炎症が誘起される。一方、アクチビンは細胞の分化・増殖を調節する分泌性蛋白である。マスト細胞におけるアクチビンの役割を明らかにするため、マスト細胞におけるアクチビンの発現ならびに機能を調べた。マスト細胞をDNP-IgE複合体で刺激したところ、アクチビンAの発現・分泌量は著増した。IgE刺激によって細胞内Ca^<2+>濃度が持続的に上昇することが知られている。そこで、ionomycin (IM)を使って細胞内Ca^<2+>濃度を増加させたところ、アクチビンβ_A鎖の遺伝子誘導が見られたが、cyclohexamide存在下でこの現象は見られず、アクチビンβ_A鎖誘導には新規の蛋白合成を必要としていると考えられた。細胞内Ca^<2+>濃度の上昇によってcalmodulin (CaM)が活性化する。CaM antagonistでこの細胞を前処理した場合、IMによるアクチビンβ_A鎖の遺伝子誘導は起こらず、また、CaM-dependent kinase (CaMK)の阻害剤で前処理した場合もアクチビンβ_A鎖誘導は起こらず、この遺伝子誘導にCaMKの関与が示唆された。一方、低濃度のアクチビンA(100pM)には前駆マスト細胞を遊走させる効果があり、高濃度のアクチビンA(4nM)にはマスト細胞プロテアーゼ-1(mMCP-1)の発現を誘導する効果があった。以上の結果、感染部位で刺激されたマスト細胞はアクチビンAを分泌すること、アクチビンAが遠隔の未分化なマスト細胞の遊走を促すこと、ならびにアクチビンAはマスト細胞の分化を促進することが明らかになり、アクチビンAは免疫細胞であるマスト細胞機能の正の調節因子として働くと考えられた。アレルゲン-IgE複合体が結合すると免疫細胞であるマスト細胞は活性化し、ヒスタミンなどを放出し炎症が誘起される。マスト細胞におけるアクチビンの役割を明らかにするため、マスト細胞におけるアクチビンの発現ならびに発現調節を調べた。ラットマスト細胞様細胞-RBL-2H3-をDNPで架橋したIgEで刺激したところ、アクチビンβ_A鎖のRT-PCR産物量が明らかに増加した。IgE刺激によって細胞内Ca^<2+>濃度は持続的に上昇するので、Ionomycin(IM)を使って細胞内Ca^<2+>濃度を増加させたところ、β_A鎖の遺伝子誘導が見られたが、Cyclohexamide存在下でこの現象は見られず、β_A鎖誘導には新規の蛋白合成を必要としていると考えられた。細胞内Ca^<2+>濃度の増加によってCalmodulin(CaM)が活性化する。CaM antagonistでこの細胞を前処理した場合、IMによるβ_A鎖の遺伝子誘導は起こらず、また、CaM-dependent kinase (CaMK)の阻害剤で前処理した場合もβ_A鎖誘導は起こらず、この遺伝子誘導にCaMKの関与が示唆された。β_A鎖のpromoter領域を利用したreporter assayによって、これらのβ_A鎖誘導調節は転写レベルで起こること、gel-shift assayによって、enhancer領域にAP-1やCREB/ATFが結合し得ること、さらにAP-1の構成因子であるc-fos、JunBの遺伝子誘導がIMによって起こることが分かった。以上の結果、『RBL-2H3細胞では、細胞内Ca^<2+>濃度の増加によるCaM活性化を通して、CREB/ATFが活性化される一方、AP-1を構成する分子の遺伝子誘導を通して、AP-1活性が上昇し、β_A鎖の転写が促進される』と考えられた。
ミャンマーヒ素汚染地域での発達、発育に関するコホート調査

昨年度末(2019年3月)にミャンマーへ行き、海外共同研究機関であるミャンマー連邦共和国Department of Medical Research (DMR)を訪問し、今後の計画を打ち合わせた。その結果、1)2019年7月までに当該施設およびミャンマーの共同研究施設において本研究の倫理審査を受ける。2)2019年9月までに調査地域の決定し、調査の手順を確認決定する。3)2019年11月から、研究代表者および研究分担者が、調査地域に赴き、現地共同研究施設スタッフとともに現地調査を開始する。以上のような手順で本研究を行うことでDepartment of Medical Research (DMR)との調整がつき、海外共同研究機関と当該機関が現在2019年11月の本調査開始に向けて、使用機器の調達、倫理審査受審を含めて準備中である。当初は2018年11月には現地に赴き、調査の打ち合わせを行い、雨季が始まる前(2019年5月)に調査を開始したい旨、海外共同研究機関の責任者に打診したが、日程の調整がつかず、調整のための渡航がが2019年3月にずれ込んだ。そのことで雨季に入る前の調査開始が不可能となった。雨季には調査地域は激しいスコールに見舞われることが多く、地域全体が水没する可能性があり、調査開始には適さない状況となる可能性が強いことから、雨季をさけ、乾季となる9月以降の調査が適切と考えた。結果乾季の11月に開始することになった。2019年5月からの調査開始を予定していたが、海外共同研究機関であるDMRとの調整が現地の都合で遅れたため、その後のプロセスである倫理審査の受審、および調査スタッフ教育も遅延した。そのため当初予定時期での調査が難しくなり、2019年11月に調査開始を延期した。以上からやや遅れていると判断した。2019年11月から調査を開始し、本研究の予定に従って以後の研究を行う予定である。計画では2019年5月から調査を開始するために、2018年度に数度ミャンマーの共同研究機関(DMR)と打ち合わせする予定であった。しかし海外共同研究機関(DMR)の都合で2018年度末に1度のみの調整となったことにより、2019年度にその調整を行うため次年度にその費用を繰り越した。
がん間質での免疫応答に着目した非小細胞肺がんに対する新規がん免疫治療の開発

本研究期間内においては、非小細胞肺がんのがん間質におけるがん免疫応答を解析するために、主要ながん間質細胞であるがん関連線維芽細胞のPD-L1発現に着目した。非小細胞肺がん組織から単離したがん関連線維芽細胞を用いて、PD-L1発現に関与する因子の特定を試みた。肺がん細胞株のPD-L1発現は、インターフェロンガンマによる刺激により可逆性に制御されることから、がん関連線維芽細胞をインターフェロンガンマで刺激してPD-L1発現の変化について調べた。その結果、がん関連線維芽細胞のPD-L1は、mRNAレベルとタンパクレベルにおいて、インターフェロンガンマにより発現の上昇を認め、この制御は可逆性であることが判明した。がん組織におけるインターフェロンガンマの主要な産生細胞は、活性化リンパ球であることから、インターフェロンガンマを産生する活性化リンパ球とがん関連線維芽細胞を共培養してPD-L1発現について調べた。その結果、活性化リンパ球との共培養により、がん関連線維芽細胞のPD-L1発現は上昇することが判明した。このことから、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在は、活性化リンパ球の存在、つまり、抗腫瘍免疫応答が誘導されている可能性が示唆された。これを検証するために、非小細胞肺がん組織検体を用いて、PD-L1免疫組織染色を行い、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在と予後との関係について調査した。その結果、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在する群(カットオフ値1%)では、存在しない群に比較して、有意に予後(手術後の無再発生存期間)が良好であった。多変量解析の結果では、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在は独立した予後因子であることが判明した。非小細胞肺がんに対するがん免疫治療は、免疫チェックポイント阻害薬の登場により注目を浴びているが、それでも、未だ根治には至らず、非小細胞肺がんの根治のためには、新規の概念に基づくがん免疫治療法の開発が必要である。本研究では、非小細胞肺がん組織の不均一性と、がん組織の増大に伴って生じる低酸素状態という特徴的な腫瘍内環境に着目した。本年度の研究では、がん組織を構成する細胞群、つまり、がん細胞およびがん間質細胞(免疫担当細胞およびがん関連線維芽細胞)が、低酸素状態において受ける影響について、腫瘍免疫学的見地から解析した。特に、がん細胞とがん関連線維芽細胞の相互関係において、免疫抑制性のサイトカインであるTransforming growthfactor-beta(TGF-beta)やInterleukin-6 (IL-6)の低酸素状態での発現の変化について調査した。がん組織の増大に伴って生じる低酸素状態により、がん細胞とがん関連線維芽細胞が共同で免疫抑制性のサイトカインを分泌し、これが、抗腫瘍免疫応答の低下に関与している可能性が考えられた。&#61481;&#61472;低酸素状態におけるがん細胞-がん関連線維芽細胞、がん関連線維芽細胞-免疫担当細胞の相互関係について理解できつつあり、この結果を基に、次の段階に発展させられる可能性が出てきた。本研究では、非小細胞肺がん組織の不均一性に着目し、がん間質の“pro-tumorigenic"な機能、特に、がん組織の増大に伴って生じる低酸素状態という特徴的な腫瘍内環境において、代表的ながん間質細胞であるがん関連線維芽細胞に制御を受けるがん免疫応答に焦点を当てた。本年度の研究においては、腫瘍微小環境による抗腫瘍免疫応答の制御の観点から、がん関連線維芽細胞における免疫チェックポイント分子Programmed cell death ligand 1 (PD-L1)の発現について解析した。その結果、非小細胞肺がん組織由来のがん関連線維芽細胞においても、がん細胞と同様にPD-L1分子の発現を認めた。さらに、がん関連線維芽細胞におけるPD-L1の発現レベルは、タンパクレベルおよびmRNAレベルともに、サイトカインであるインターフェロンγにより可逆的に発現制御を受けることが判明した。さらに、リンパ節転移および遠隔転移のない非小細胞肺がん切除例に対して、PD-L1免疫組織染色を行い、がん関連線維芽細胞におけるPD-L1発現と予後(無再発生存期間)との関連について解析したところ、PD-L1高発現群では、PD-L1低発現群に比較して、有意に無再発生存期間の延長を認めた。活性化した腫瘍浸潤リンパ球が分泌するインターフェロンγにより、がん関連線維芽細胞は影響を受け、PD-L1発現に至るものと考えられた。低酸素状態の腫瘍組織において、がん関連線維芽細胞のpro-tumorigenicな機能について理解できつつある。つまり、がん関連線維芽細胞のがん細胞に対する増殖効果、エフェクター免疫担当細胞に対する免疫抑制効果により、pro-tumorigenicな腫瘍微小環境を構築しているものと考えられる。低酸素状態における抗腫瘍免疫応答の抑制には、PD-L1以外に、免疫抑制性サイトカインTransforming growthfactor-beta (TGF-beta)が関与していると考えているが、当初、TGF-betaの発現には、低酸素応答における鍵分子(転写因子)であるHypoxia inducible factor 1 (HIF-1)が、直接的に制御していると想定していた。

しかし、今年度、HIF-1をノックアウトした肺がん細胞株を作成して解析した結果、必ずしもHIF-1により直接的な発現制御を受けているようでなかった。従って、TGF-betaの発現制御に関しては、別のサイトカインによる影響あるいは分泌後の影響について解析する必要が生じてきた。本研究期間内においては、非小細胞肺がんのがん間質におけるがん免疫応答を解析するために、主要ながん間質細胞であるがん関連線維芽細胞のPD-L1発現に着目した。非小細胞肺がん組織から単離したがん関連線維芽細胞を用いて、PD-L1発現に関与する因子の特定を試みた。肺がん細胞株のPD-L1発現は、インターフェロンガンマによる刺激により可逆性に制御されることから、がん関連線維芽細胞をインターフェロンガンマで刺激してPD-L1発現の変化について調べた。その結果、がん関連線維芽細胞のPD-L1は、mRNAレベルとタンパクレベルにおいて、インターフェロンガンマにより発現の上昇を認め、この制御は可逆性であることが判明した。がん組織におけるインターフェロンガンマの主要な産生細胞は、活性化リンパ球であることから、インターフェロンガンマを産生する活性化リンパ球とがん関連線維芽細胞を共培養してPD-L1発現について調べた。その結果、活性化リンパ球との共培養により、がん関連線維芽細胞のPD-L1発現は上昇することが判明した。このことから、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在は、活性化リンパ球の存在、つまり、抗腫瘍免疫応答が誘導されている可能性が示唆された。これを検証するために、非小細胞肺がん組織検体を用いて、PD-L1免疫組織染色を行い、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在と予後との関係について調査した。その結果、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在する群(カットオフ値1%)では、存在しない群に比較して、有意に予後(手術後の無再発生存期間)が良好であった。多変量解析の結果では、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞の存在は独立した予後因子であることが判明した。低酸素状態におけるがん細胞-がん関連線維芽細胞、がん関連線維芽細胞-免疫担当細胞の相互関係について、機能の面と、さらに機能阻害による改善の面から調査する。低酸素状態の腫瘍組織における、がん関連線維芽細胞に抗腫瘍免疫応答の抑制効果について、さらに解析を進める。つまり、PD-L1を発現したがん関連線維芽細胞のエフェクター免疫細胞に対する抑制機能について、また、がん関連線維芽細胞が分泌するTGF-betaについて、その発現制御について、ヒト非小細胞肺がん由来のがん関連線維芽細胞を用いて解析を進める。また、このようながん関連線維芽細胞のpro-tumorigenicな機能が、抗線維化薬によって阻害され得るのか解析を進める予定である。
生合成系プロテオミクス網羅的機能解析技術を活用した非天然型機能性分子の合理的設計

1)生合成系プロテオミクス機能解析技術の確立、2) adenylation (A) domainの迅速、網羅的、体系的機能解析、3)非天然型ペプチド化合物の設計および生物合成を目的に、研究を実施した。以下に、各項目に関して記載する。1)生合成系プロテオミクス網羅的機能解析技術の確立:生合成系プロテオミクス機能解析技術の基盤となるA-domain選択的ラベル化剤(> 20)の機能解析を実施した。具体的には、大腸菌組換えNRPSおよび内在性NRPSを利用したラベル化実験を行った。その結果、ほぼすべてのA-domain選択的ラベル化剤はNRPS A-domainをラベル化できた。また、アルキン、アジド、アルケンなどの機能性官能基を有する20種類の非天然アミノ酸を担持したaminoacyl-AMS化合物の合成を行った。20種類の天然アミノ酸を担持したaminoacyl-AMS化合物を加え、40種類のaminoacyl-AMS化合物群を得た。2) A-domainの迅速、網羅的、体系的機能解析: A-domain選択的ラベル化剤と40種類のaminoacyl-AMS化合物を活用したNRPS A-domainの機能解析を行った。これまでに、大腸菌組換えタンパク質および内在性NRPS A-domain 28種類の解析を実施した。3)非天然型ペプチド化合物の設計&middot;生物合成:生合成系プロテオミクス解析結果に基づき、アミノ酸を培地へ添加し、precursor-directed biosynthesisを行った。具体的には、グラミシジンSおよびサーファクチン生産菌を利用し、非天然型ペプチド化合物の創製を検討した。その結果、部位特異的に非天然アミノ酸をグラミシジンSおよびサーファクチンへ導入できることがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。非リボソーム性ペプチド合成酵素(NRPS)adenylation (A) domain選択的ラベル化技術を活用した生合成系プロテオミクス解析技術を確立し、非天然型ペプチド性化合物の合理的な設計および生物合成を実現することを目的に本研究を実施した。生合成系プロテオミクス解析技術を活用することにより、多くの非タンパク質性アミノ酸に基質特異性を有するA-domainを複数見出すことができた。このA-domainを利用することで、非天然型ペプチド系化合物群の生物合成がprecursor-directed biosynthesis (PDB)により実現できると考えている。ABPPプロファイルを活用し、非天然型ペプチド系化合物の設計を行う。生合成経路上に存在するすべてのA-domainのABPPプロファイルを作製することにより、A-domainの交差基質特異性等を明らかにする。これにより、非天然型ペプチド系化合物の合理的な設計が実現するとともに、培地へ添加するアミノ酸を選別する。次に、ABPPプロファイルに従い、A. migulanus ATCC 9999 (gramicidin S)およびB. subtilis ATCC 21332 (surfactin)に対して、PDBを実施し、部位特異的に天然/非天然アミノ酸をペプチド系化合物へ導入する。さらに、導入した非天然機能性アミノ酸を足掛かりに、合成化学的に非天然型ペプチド系化合物群の構築を実施する。
磁化された薬液塊の磁場による患部集中ターゲティングの研究

医療分野において患者に薬剤を投与する場合,通常服用や注射が行われるが,この方法では薬剤が患部だけではなく体内全体にまわってしまう上,患部で必要な濃度を確保するために薬剤の量を多くせざるを得ず,正常な部位にも強く作用して副作用が生じる問題を避けることができない.例えば,制がん剤はがん細胞以外に正常な細胞にも作用して副作用を生じさせるため,がん細胞にだけ集中的に作用させることが望まれる.薬剤を患部に集中させる方法の一つとして磁気力により薬剤を患部に集中,保持する方法が考えられる.薬剤に磁性をもたせる方法として,薬剤自体に磁性をもたせる,薬剤の化学構造の一部に磁性をもつ部分を付加する,磁性流体を混ぜたものをエマルジョン化するなどの方法が考えられる.これらを血管に注入して外部から磁気力で患部へ誘導し,集中,保持して治療しようとする試みである.本研究はこの問題の基礎として磁化された液体塊(液滴)を磁気力によって流れの中の一箇所に集中・保持することを試み、このとき生じる諸問題を解明したものである.具体的には磁性薬剤を磁性流体で,血液を清水でそれぞれ模擬して次の実験を行った.1.磁性液滴の磁気力による捕獲水中を落下する磁性液滴を磁気力によって捕獲することを試み,磁気力の強さ,液滴の大きさ,濃度による捕獲可能の限界,捕獲時の液滴の軌跡,速度の変化,形状の変化などを調べた.2.水流中における液滴の集中・保持磁性液滴の大きさ,外部印加磁場の強さを変え,水中において保持された液滴形状の変化,スパイクの発生状況,スパイクの水流による運動などを調べた.3.磁性液滴形状の界面性状による変化水中における表面張力やエマルジョン表面の張力,液滴体積により液滴形状が変化すると予想されるため,その基礎研究として磁性液面上に種々の性状の膜を形成し,スパイク発生に対する強さ,磁気の強さによる形状変化などを調べた.医療分野において患者に薬剤を投与する場合,通常服用や注射が行われるが,この方法では薬剤が患部だけではなく体内全体にまわってしまう上,患部で必要な濃度を確保するために薬剤の量を多くせざるを得ず,正常な部位にも強く作用して副作用が生じる問題を避けることができない.例えば,制がん剤はがん細胞以外に正常な細胞にも作用して副作用を生じさせるため,がん細胞にだけ集中的に作用させることが望まれる.薬剤を患部に集中させる方法の一つとして磁気力により薬剤を患部に集中,保持する方法が考えられる.薬剤に磁性をもたせる方法として,薬剤自体に磁性をもたせる,薬剤の化学構造の一部に磁性をもつ部分を付加する,磁性流体を混ぜたものをエマルジョン化するなどの方法が考えられる.これらを血管に注入して外部から磁気力で患部へ誘導し,集中,保持して治療しようとする試みである.本研究はこの問題の基礎として磁化された液体塊(液滴)を磁気力によって流れの中の一箇所に集中・保持することを試み、このとき生じる諸問題を解明したものである.具体的には磁性薬剤を磁性流体で,血液を清水でそれぞれ模擬して次の実験を行った.1.磁性液滴の磁気力による捕獲水中を落下する磁性液滴を磁気力によって捕獲することを試み,磁気力の強さ,液滴の大きさ,濃度による捕獲可能の限界,捕獲時の液滴の軌跡,速度の変化,形状の変化などを調べた.2.水流中における液滴の集中・保持磁性液滴の大きさ,外部印加磁場の強さを変え,水中において保持された液滴形状の変化,スパイクの発生状況,スパイクの水流による運動などを調べた.3.磁性液滴形状の界面性状による変化水中における表面張力やエマルジョン表面の張力,液滴体積により液滴形状が変化すると予想されるため,その基礎研究として磁性液面上に種々の性状の膜を形成し,スパイク発生に対する強さ,磁気の強さによる形状変化などを調べた.医療分野において患者に薬剤を投与する場合,通常服用や注射が行われるが,この方法では薬剤が患部だけではなく体内全体にまわってしまう上,患部で必要な濃度を確保するために薬剤の量を多くせざるを得ず,正常な部位にも強く作用して副作用が生じる問題を避けることができない.例えば,制がん剤はがん細胞以外に正常な細胞にも作用して副作用を生じさせるため,がん細胞にだけ集中的に作用させることが望まれる.薬剤を患部に集中させる方法の一つとして磁気力により薬剤を患部に集中,保持する方法が考えられる.薬剤に磁性をもたせる方法として,薬剤自体に磁性をもたせる,薬剤の化学構造の一部に磁性をもつ部分を付加する,磁性流体を混ぜたものをエマルジョン化するなどの方法が考えられる.これらを血管に注入して外部から磁気力で患部へ誘導し,集中,保持して治療しようとする試みである.本研究はこの問題の基礎として磁化された液体塊(液滴)を磁気力によって流れの中の一箇所に集中・保持することを試み,このとき生じる諸問題を解明しようとするものである.磁性薬剤を磁性流体で,血液を清水でそれぞれ模擬し,水流中で磁性液滴を水流に流されることなく磁気力により一箇所に集中・保持することを試み,関連する諸問題を解明する.具体的には次の事項について実験を行った.1.水流中の液滴の集中・保持磁性液滴の磁化率,外部印加磁場の強さを変え,水中における保持された液滴形状の変化,スパイクの発生状況,スパイクの水流による運動などを調べた.

2.磁性液滴の作製水中における表面張力やエマルジョン表面の張力,液滴体積により液滴形状が変化すると予想されるため,種々の性状の液滴を作製し,液滴の変形に対する強さ,磁気による形状変化などを調べた.医療分野において患者に薬剤を投与する場合,通常服用や注射が行われるが,この方法では薬剤が患部だけではなく体内全体にまわってしまう上,患部で必要な濃度を確保するために薬剤の量を多くせざるを得ず,正常な部位にも強く作用して副作用が生じる問題を避けることができない.したがって,薬剤を患部にだけ集中的に作用させることが望まれる.薬剤を患部に集中させる方法の一つとして薬剤に磁性をもたせて磁気力により薬剤を患部に集中,保持する方法が考えられる.本研究はこの問題の基礎として磁化された液体塊(液滴)を磁気力によって流れの中の一箇所に集中・保持することを試み,このとき生じる諸問題を解明しょうとするものである.磁性薬剤を磁性流体で,血液を清水でそれぞれ模擬し,水流中で磁性液滴を磁気力により捕獲し,一箇所に保持することを試み,関連する諸問題を解明する.具体的には次の事項について実験を行った.1.磁性液滴の磁気力による捕獲水中を落下する磁性液滴を磁気力によって捕獲することを試み,磁気力の強さ,液滴の大きさによる捕獲可能の限界,捕獲時の液滴の軌跡,速度の変化,形状の変化などを調べた.2.水流中における液滴の集中・保持磁性液滴の大きさ,外部印加磁場の強さを変え,水中において保持された液滴形状の変化,スパイクの発生状況,スパイクの水流による運動などを調べた.3.磁性液滴形状の界面性状による変化水中における表面張力やエマルジョン表面の張力,液滴体積により液滴形状が変化すると予想されるため,その基礎研究として磁性液面上に種々の性状の界面を形成し,スパイク発生に対する強さ,磁気の強さによる形状変化などを調べた.磁性薬剤を磁性流体で,血液を清水でそれぞれ模擬し,水流中で磁性液滴を磁気力により捕獲し,一箇所に保持することを試み,関連する諸問題を解明するため次の事項について実験を行った1.磁性液滴の磁気力による捕獲水中を落下する磁性液滴を磁気力によって捕獲することを試み,磁気力の強さ,液滴の大きさ,濃度による捕獲可能の限界,捕獲時の液滴の軌跡,速度の変化,形状の変化などを調べた。2.水流中における液滴の集中・保持磁性液滴の大きさ,外部印加磁場の強さを変え,水中において保持された液滴形状の変化,スパイクの発生状況,スパイクの水流による運動などを調べた.3.磁性液滴形状の界面性状による変化水中における表面張力やエマルジョン表面の張力,液滴体積により液滴形状が変化すると予想されるため,その基礎研究として磁性液面上に種々の性状の膜を形成し,スパイク発生に対する強さ,磁気の強さによる形状変化などを調べた.
切口面高品質化と局部応力緩和を用いた超高張力鋼板のプレス成形性の向上

近年,地球環境問題の観点から自動車の軽量化が重要になっている.そのために非常に大きな強度を持つ超高張力鋼板の板厚を小さくして使用されてきている.超高張力鋼板は低延性であり,プレス成形中にフランジ成形のような局所的な引張りが負荷されると割れやすい.穴広げ試験による基本的な鋼板の特性の調査とともに割れを防止する傾斜パンチによるフランジ成形法が開発された.フランジ部の角の引張応力は,パンチの傾斜角度によって減少させられた.近年,地球環境問題の観点から自動車の軽量化が重要になっている.そのために非常に大きな強度を持つ超高張力鋼板の板厚を小さくして使用されてきている.超高張力鋼板は低延性であり,プレス成形中にフランジ成形のような局所的な引張りが負荷されると割れやすい.穴広げ試験による基本的な鋼板の特性の調査とともに割れを防止する傾斜パンチによるフランジ成形法が開発された.フランジ部の角の引張応力は,パンチの傾斜角度によって減少させられた.近年,産業界では自動車部品の軽量化に伴い,車両重量の1/3を占める車体プレス部品に比強度の大きな高張力鋼板の利用が拡大している.引張強さが600MPa級までの鋼板は比較的延性に富むため実用されているが,800MPa以上の鋼板や1000MPa以上の超高張力鋼板では延性が非常に低くなり,プレス成形時に割れが生じて産業界では大きな問題となっている.車体部品は板材を絞り,せん断にされ,板材の端をフランジ曲げされて成形される.曲げる条件により曲げ端部が伸ばされる伸びフランジとなり,引張応力によりフランジ割れが発生する.端部縁はせん断された切口面となっているために切削による切口面よりも延性が半減し割れが生じ易く,延性の低減量はせん断加工条件によって影響される.本研究では,延性が非常に低い超高張力鋼板のプレス成形性を向上させるために,切口面高品質化と局部応力緩和を行った.超高張力鋼板のフランジ割れにおいて各種せん断加工法や鋼種によるクラックの発生・進展挙動のメカニズムを穴広げ試験により明らかにして切口面の品質に及ぼす影響因子を解明した.穴広げ試験により鋼板の強度の増加とともに限界穴広げ率は低下して,それぞれの板材において限界穴広げ率が最大になる穴抜きクリアランス比が存在した.穴抜き加工された超高張力鋼板の引張試験から切口面の巨視的な高低差が大きいと切欠きになってクラックが発生していた.切口面における破断面硬さの増加とともに,限界穴広げ率が減少しており,せん断変形による切口面の延性の低下が確認された.局部的に伸びフランジ部の引張応力を緩和するために,フランジ成形パンチを部分的に傾斜させたプレス成形法を開発した.超高張力鋼板に対して局所的に引張応力を緩和してフランジ長さの限界を向上できた.近年,産業界では自動車部品の軽量化に伴い,車両重量の1/3を占める車体部品に比強度の大きな高張力鋼板の利用が拡大している.600MPa級までの鋼板は比較的延性に富むため実用されているが,800MPa以上の鋼板や1000MPa以上の超高張力鋼板では延性が非常に低くなり,割れが生じて産業界では問題となっている.一般的に車体部品は生産コストの低いプレス成形により得られている.車体部品は板材を絞り,せん断にされ,板材の端をフランジ曲げされて成形される.曲げ条件により曲げ端部が伸ばされる伸びフランジとなり,引張応力によりフランジ割れが発生する.端部縁はせん断された切口面となっているために切削による切口面よりも延性が半減して割れが生じ易く,延性の低減量はせん断加工条件によって影響される.伸びフランジ性は一般的に穴拡げ試験により評価され,高張力鋼板の伸びフランジ性に関しては,鋼種による影響,せん断クリアランスの影響,切口面周囲の引張応力の勾配の影響の調査が行われている.また,向上法には,コイニング,シェービング,穴周囲の焼鈍による方法が報告されているが,超高張力鋼板に有効化は明確でない.一方では,伸びフランジ部の引張応力の低減により割れを防止できる.一般的には,引張応力を緩和するために伸びフランジ部の曲率半径の増加や製品の曲げ長さの減少により対応している.しかし,製品形状が大きく変わってしまうために利用が難しいことが多い.延性が非常に低い超高張力鋼板のプレス成形性を向上するために,切口面高品質化と局部応力緩和を行なった.超高張力鋼板の伸びフランジ性の評価法を行うために,穴拡げ試験を行った.また,製品形状をほぼ同じになるような金型に傾斜をつけて引張応力を緩和して割れを防止する傾斜パンチによる伸びフランジ成形を導入して超高張力鋼板のプレス成形性を向上させた.
色素性乾皮症神経変性に対する治療法の探索～抗酸化という側面からの基礎的検討～

色素性乾皮症(XP)、コケイン症候群(CS)患者における原因不明の神経変性の機序として酸化的DNA損傷の修復に着目した。In Vitro実験系(H2O2感受性実験、酸化的DNA損傷修復能定量)にてXP、CS細胞は酸化ストレスに弱く、その高感受性は抗酸化剤で軽減できる可能性が確認された。CSモデルマウスにおいて、CS患者の画像所見同様、大脳のミエリン障害が免疫組織学的に観察された。これらin vitro、in vivo評価系は今後XP、CSの治療法の探索に有用なtoolとなり得る。本研究の目的は、色素性乾皮症(XP)、コケイン症候群(CS)など紫外線性DNA損傷の修復(ヌクレオチド除去修復:NER)異常で発症する遺伝性光線過敏症患者の生命予後を左右する進行性、原因不明の神経学的異常の病態を解明し、治療手段を探索することである。XP, CS神経症状の病態は種々XP、CS因子(XPA、XPB、XPD、XPG、CSA、CSB)が持つDNA修復、転写という機能のみでは説明できない。我々は同病態にNERのみならず酸化ストレスによるDNA損傷修復(塩基除去修復、二重鎖切断修復など)も関与しているのではないかという仮説を提唱した。昨年度までにXP、CS細胞でのH2O2高感受性、CSA/CSB遺伝子ノックダウンによるH2O2高感受化を確認し、XPG完欠損マウス中枢神経の解析準備を完了した。今年度は新たなXP、CS患者を各々15例、4例同定し、XPGマウスの詳細な検討を行い、また酸化ストレスを引き起こす放射線を各種XP、CS細胞に照射し、その後の修復経過を観察した。XPGマウスではMBP、CC1、Olig2の発現を検討し、大脳皮質でのみオリゴデンドロサイトの分化、ミエリン形成が障害されていることが判明した。一方、オリゴデンドロサイトの脳への遊走能には異常はみられなかった。末期には大脳皮質のみならず内包にもミエリン形成障害生じるが脳梁、海馬は異常がないことが確認された。また多くのXP、XP/CS、CS細胞ではに二重鎖切断の経時的変化に異常がみられた。今回の結果はXP、CS細胞はNERのみならず酸化的DNA損傷、二重鎖切断の修復機能が低下している可能性をさらに示唆するものである。XP、CS患者にみられる多彩な臨床症状の重要度予測、病態解明を行う上で、新たな患者解析は重要である。またこれらの疾患の病態を検討する上でマウスモデルの詳細な解析は有用である。本研究の目的は、色素性乾皮症(XP)、コケイン症候群(CS)など紫外線性DNA損傷の修復(ヌクレオチド除去修復:NER)の異常で発症する遺伝性光線過敏症患者の生命予後を左右する進行性、原因不明の神経学的異常の病態を解明し、進行抑制、ひいては治療手段を探索することである。XP神経症状についてはXPA、他のXP因子(XPB、XPD、XPG)が持つ転写というNER以外の機能のみでは説明できない。我々は日光過敏、露光部高発癌(XP)に関わる背景因子であるNERに加え、酸化的DNA損傷に対する修復(塩基除去修復:BERなど)にも関わっているのではないかという仮説のもと、新たな患者情報の蓄積、神経変性との関連を解析中である。本年度は以下の研究結果を得た。(1)コロニー形成能を指標にした感受性試験では、新規XPA細胞、今回新たに加えたCSA細胞、CSB細胞はいずれもH2O2高感受性であった。(2)正常細胞のCSA、CSB各遺伝子をノックダウンしたところ、H2O2高感受性となった。(3)最重症型で極めて稀なXP/CS complexを新たに2名診断(XPD/CS、XPG/CS)し、表現型・遺伝型関連(重要ドメインに欠失やナンセンス変異があれば予後がきわめて不良でH2O2高感受性)を確認した。(4)XPG完全欠損マウス中枢神経(大脳皮質、海馬など)に髄鞘不全を認めた。今回の結果はXP、CS細胞はNERのみならず酸化的DNA損傷の修復機能が低下している可能性をさらに示唆するものである。XP、CS患者にみられる多彩な臨床症状の重要度を予測する上で、患者蓄積、遺伝学的解析は重要である。またこれらの疾患の病態を検討する上でマウスモデルは有用である。次年度はこのモデルマウスの神経組織を構築する種々の因子の発現、機能など詳細な分子解析を実施する予定である。脳や神経は紫外線非曝露組織であるため、XP、CS患者におけるその変性機序は各種XP因子、CS因子が担うヌクレオチド除去修復(NER)の異常のみでは説明できない。そこで今回我々は、皮膚外症状の誘因として、紫外線によるDNAの直接損傷に対する修復(NER)欠損のあるXP、CS患者ではこれまで異常が指摘されなかった酸化的DNA損傷に着目した。