hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
眼球と唇の動きに着目した顔の特徴抽出に関する研究

本研究計画では人間のコミュニケーションにおける情報処理の実体を多元的に解析することを目的として、顔の表情からの情報要素を調べた.眼球の運動については、情報のポインタ(指示器)としての利用の可能性を調べ、唇の運動からは、ことばの理解のための補助手段として利用可能かどうかを調べた.A.研究用計測実験システムの構築映像と音声とを同時に記録・解析する必要があることから,われわれがすでに所有している生体信号解析システム(昭和62年度文部省私学研究助成補助金により整備された)を利用することができた.一部,映像処理用のワークステーション,映像入力用回路,メモリについては当科学研究費補助金の援助を得た.B.研究成果(1)唇の特徴抽出について:1.唇の縦幅、横幅、前歯の縦間隔の3個のパラメータを用いて、11種の子音の識別を試みた。識別は概ね成功したが、/k,g/と/r/については混同した。2.混同の原因のひとつは、画像のフレームレートが低いことである。そこでビデオ信号のラスターを画像処理で補間する方法を考案し、コンピューターシミュレーションで確かめた結果、時刻の精度をかなり向上できることがわかった。3.これらの成果はいくつかの学会論文として出版された.また,詳細は金沢工業大学博士論文・修士論文としてまとめられた.(2)眼の特徴抽出:1.まず首を固定した条件で注視点の抽出実験を行った。被験者にマトリクス状のターゲットを注視させ、虹彩の画像から注視方向を推定するという方法で、注視点の再現性をしらべた結果、かなりよい精度で注視点の相対関係が再現できた。2.同様な実験を首を固定しない条件下で行った。原データのままでは、注視点の推定位置は現実のものとかなり異なったが、特定の座標変換を行うことによって、首を固定した条件とほぼ同等にまで注視点の位置を再現できた。3.これらの成果はいくつかの学会論文として出版された.また,詳細は金沢工業大学修士論文としてまとめられた.本研究計画では人間のコミュニケーションにおける情報処理の実体を多元的に解析することを目的として、顔の表情からの情報要素を調べた.眼球の運動については、情報のポインタ(指示器)としての利用の可能性を調べ、唇の運動からは、ことばの理解のための補助手段として利用可能かどうかを調べた.A.研究用計測実験システムの構築映像と音声とを同時に記録・解析する必要があることから,われわれがすでに所有している生体信号解析システム(昭和62年度文部省私学研究助成補助金により整備された)を利用することができた.一部,映像処理用のワークステーション,映像入力用回路,メモリについては当科学研究費補助金の援助を得た.B.研究成果(1)唇の特徴抽出について:1.唇の縦幅、横幅、前歯の縦間隔の3個のパラメータを用いて、11種の子音の識別を試みた。3.これらの成果はいくつかの学会論文として出版された.また,詳細は金沢工業大学修士論文としてまとめられた.1.はじめに:我々は音声の研究を行っているが、本研究では、唇や目の特徴を調べることによって、人間のコミュニケーションにおける補助情報として応用できる可能性を探っている。2.装置:基本的には、ビデオ画像を量子化してコンピュータにとりこみ、その後はソフトウェアで、画像処理・特徴抽出を行う構成である。まず、コンピュータ・システムは、我々の研究室にすでに配備されているものを用いた。画像入力装置は別予算で入手した。本研究の補助金より、ビデオモニタとビデオタイマを入手した。3.画像処理:基本ソフトウェアを開発した。手順は、(1)画像の量子化、(2)前処理(平滑)、(3)輪郭抽出(微分)に分れる。(1)については、転送速度は8フレーム1秒である。(2)の平滑は、(3)でノイズが強調されないように行う。目下8枚の連続画像をすべて加算する。結果は良好だが、将来運動画像を対象とする際は検討を要する。(3)はSobe1の微分オペレータが最適であった。4.唇の特徴抽出:顔全体の画像から唇の形を求めるには解像度が悪いので、目下は唇を拡大して撮影している。音声情報の補助のために、口唇の内側の輪郭を抽出した。上歯の像の妨害の除去が必要であり、照明を周囲から行うことにより解決した。パラメータ化は、唇の縦幅・横幅とした。

5.眼の特徴抽出:瞳の輪郭の一部の情報から瞳の中心を求め、まぶたとの相対関係から視線の方向を求める。しかし、(1)眼球表面の画像が予想に反して不明瞭、(2)瞳の方向を求める目的には、まぶたの計上は必ずしも信頼できる標識になりにくい、などにより、さらに検討を要する。6.まとめ:適当な画像入力装置が見あたらず、入手が遅れたため、とりかかりが遅れたが、ほぼ初年度の計画通り遂行された。1.はじめに:我々は音声の研究を行なっているが、本研究では、唇や眼の特徴を調べることによって、人間のコミュニケ-ションにおける補助情報として応用できる可能性を探っている。2.予備実験:本年度は、唇と眼の運動の特徴抽出の予備実験を行なった。唇についても眼についても、頭部を固定した条件で、唇の部分もしくは片側の眼の部分を拡大して撮影した。3.唇の特徴抽出:唇の内側の上下幅・横幅、および上下前歯間距離をパラメ-タとした。その結果、(1)/aCa/(C:13子音)の発話環境で、口唇音/p,b,m/、歯茎音/t,d,n/など、調音点の異なるグル-プ別に7個のグル-プに区別できた。(2)さらに、口唇音/p,b,m/については、開大・閉小の速度・加速度の大小に着目することによって、それぞれをうまく区別できた。4.眼球の動きの特徴抽出:注視点を移動する場合の眼球(片側)の動きを調べた。画像から虹彩の中心を計算して、眼球の向きと対応させた。その結果、(1)マトリクス状に配置された点群の注視に対して、虹彩の中心は、ほぼ各点を区別できるような対応を示した。ただし、水平より下側を(つまり俯角で)注視する場合は、理想的な相対位置より上方に寄る傾向を示した。(2)1点の注視に際しても、短い時間構造での微細変動が観察された。したがって、この変動分以下の空間精度で、注視位置を推定することは困難なことを示唆する。5.まとめ:(1)唇については、少なくとも頭部固定の条件下においては、原理的に、読唇の自動化の可能性を示唆する結果がえられた(2)眼については、予め設定された目標点群を用いる場合は、注視方向を推定でき、それを指示手段として利用できる可能性を示した。1.はじめに:本研究は人間のコミュニケ-ションにおける情報処理の実体を多元的に解析することを目的として、顔の表情からの情報要素を調べるための画像処理の基礎システムを開発するのが目的である。2.唇の特徴抽出について:唇の縦幅、横幅、前歯の縦間隔の3個のパラメ-タを用いて、/aCa/の擬単語環境で11種の子音(C)の識別を試みた。識別は概ね成功した。識別に混同を生じさせた子音は/k,g/と/r/である。混同を生じさせた原因のひとつは、画像のフレ-ムレ-トが低いことである。そこで低いフレ-ムレ-トを克服する方法を検討した。ビデオ信号のラスタ-を画像処理で補間する方法を考案し、時刻の精度をかなり向上できる可能性をコンピュ-タ-シミュレ-ションで確かめた。3.眼の時徴抽出:まず首を固定した条件で注視点の抽出実験を行った。被験者にマトリックス状のタ-ゲットをランダムな順序で注視させ、虹彩の画像から注視方向を推定するという方法で、注視点を正しく再現できるかどうかをしらべた。
レーザープラズマを用いた高輝度Ｘ線集光技術の開発

平成30年度は、レーザープラズマを用いたX線集光技術開発のために金属サンプルにフェムト秒レーザーを照射し、そのフルエンスの違いによる反射率変化の計測を実施した。サンプル表面にプラズマが生成する閾値近傍の照射強度ではスパレーションという薄膜飛散が発生するが、その際に生成する薄膜がX線領域のビームスプリッタとして機能することをX線領域のニュートリング生成から確認した。また、X線自由電子レーザーSACLAにおいて、軟X線屈折計測のためのポンプ-プローブ実験を開始した。軟X線レーザーを、併設のチタンサファイアレーザー(ポンプ光)によって生成したプラズマに入射させ、プラズマ生成の有無によって生じる光路変化をビームライン後方の二次元検出器で取得することを試みた。プラズマ生成のための試料は、窒化シリコンまたは金属薄膜からのプラズマを用いた。照射実験を進める中で、チタンサファイアレーザーとプローブ光(軟X線レーザー)の試料上での照射位置調整などの課題が明らかとなった。本研究テーマは、2018年度SACLA基盤開発プログラムにおいて「SXFEL照射強度の精密調整機構を備えたポンプ-プローブ実験装置の構築」として採択され、引き続きSACLAにおいて推進していく予定である。計算機シミュレーションによるX線レンズの設計に関しては、炭素イオンに対する衝突輻射モデルを構築し、励起状態占有密度及び実効的な電離速度係数を評価した。衝突輻射モデルの結果を流体コードに組み込むことにより、X線の集光に寄与するプラズマの電子密度空間分布を導出した。更にX線レンズの性能を評価するために、対向する平板からレーザープラズマが吹き出す配置を2セット用い、縦方向と横方向の集光を独立に行うことを仮定した。与えられた電子密度分布に対して光線追跡によりX線の集光状態を計算し、X線レンズ生成に最適なレーザー照射条件を評価した。近年、フェムト秒からピコ秒のパルス幅を持つ高輝度X線発生技術が確立、その利用が急速に拡大しつつある。これらのX線源の性能を最大限引き出すためには、高効率で高耐力なX線集光素子が必要不可欠であるが、現状で、そのような光学素子が実現しているとはいえない。最近、我々はX線の蜃気楼現象をプラズマ中で初めて観測したが(Nature Commun. 2013)、その際にプラズマの特殊な電子密度分布が、高品質でほとんどロスの無いX線の凹レンズとして作用することを見いだした。本研究では、高輝度パルスX線源の高度な利用に資するために、プラズマのX線光学素子としての可能性を突きつめ、プラズマの電子密度の空間分布を制御することにより、X線を高効率に集光できるプラズマ凸レンズの生成技術を確立し、集光径サブミクロンのX線集光の実証をめざす。平成28年度は、金ターゲットと超短パルスチタンサファイアレーザーを用いたプラズマ光学素子(X線ビームスプリッター)生成の最適条件を確認した。プローブ光に軟X線レーザー(波長13.9nm)を用いることで、プラズマ光学素子形成に至る膨張ダイナミクスの時間発展を明らかにすることができた。チタンサファイアレーザーの強度や膨張時間の違いにより、生成したプラズマ光学素子の形状が変化し、プラズマ凸レンズを生成させるための屈折率変化に与える影響を評価している。また、チタンサファイアレーザーの3倍波(波長266 nm)をプローブ光とするプラズマ観測用の干渉計測装置の準備を進めている。初年度において、計算機シミュレーションに関しては、炭素をターゲットとして用いたプラズマ光学素子に関する計算を開始した。実験に関しては、凸レンズの効果を持つプラズマ光学素子となり得る超短パルスレーザー生成プラズマの計測に着手し、実験データが得られ始めている。また、軟X線レーザーを用いた計測によりプラズマ光学素子としての機能を持つプラズマの生成条件についても確認しており、研究はおおむね順調に進捗していると言える。近年、X線自由電子レーザーや高次高調波、そしてレーザー駆動のプラズマ軟X線レーザー等の高輝度X線発生技術が確立され、その応用が急速に拡大しつつある。これらのX線源の性能を最大限引き出すためには、高効率かつ高性能のX線集光素子が必要不可欠であるが、現状で、そのような素子の生成方法が確立しているとはいえない。我々はプラズマの密度効果を利用した軟X線の凹レンズの生成に実験的に成功し(Nature Commun. 2013)その手法の延長としてプラズマの電子密度空間分布によりX線の凸レンズを過渡的に生成するために必要なプラズマの制御技術の確立し、集光径サブミクロンのX線集光の実証をめざす。平成29年度は、プラズマの生成時の電子密度空間分布の時間発展を定量的に評価するために、炭素原子に対する衝突輻射モデルを構築し、そこに輻射捕獲が、励起状態占有密度のダイナミクスにどれほどの影響を与えるかを見積もるために、光吸収に起因する項を組み入れた計算コードの開発に着手した。さらに、軟X線自由電子レーザー(92eV)を用いたX線レーザーの電子密度勾配による屈折の影響を計測する実験を開始した。軟X線自由レーザーの屈折計測を行うための計測機配置の設計及びポンププローブ実験用窓型ターゲットの設計、また、軟X線レーザーと同期するチタンサファイアレーザーの集光やポンププローブ実験の光学配置に関する設計を実施した。計算機シミュレーションに関しては、電子密度の空間的な増加の時間発展を定量的に評価するための衝突輻射モデルの構築を行い、より詳細な解析を行うための輻射捕獲の影響の検討を始めた。実験に関しては、X線自由電子レーザーSACLAのマシンタイムを取得し、電子密度勾配によるX線の屈折実験を開始しており、研究はおおむね順調に進捗していると言える。

平成30年度は、レーザープラズマを用いたX線集光技術開発のために金属サンプルにフェムト秒レーザーを照射し、そのフルエンスの違いによる反射率変化の計測を実施した。サンプル表面にプラズマが生成する閾値近傍の照射強度ではスパレーションという薄膜飛散が発生するが、その際に生成する薄膜がX線領域のビームスプリッタとして機能することをX線領域のニュートリング生成から確認した。また、X線自由電子レーザーSACLAにおいて、軟X線屈折計測のためのポンプ-プローブ実験を開始した。軟X線レーザーを、併設のチタンサファイアレーザー(ポンプ光)によって生成したプラズマに入射させ、プラズマ生成の有無によって生じる光路変化をビームライン後方の二次元検出器で取得することを試みた。プラズマ生成のための試料は、窒化シリコンまたは金属薄膜からのプラズマを用いた。照射実験を進める中で、チタンサファイアレーザーとプローブ光(軟X線レーザー)の試料上での照射位置調整などの課題が明らかとなった。本研究テーマは、2018年度SACLA基盤開発プログラムにおいて「SXFEL照射強度の精密調整機構を備えたポンプ-プローブ実験装置の構築」として採択され、引き続きSACLAにおいて推進していく予定である。計算機シミュレーションによるX線レンズの設計に関しては、炭素イオンに対する衝突輻射モデルを構築し、励起状態占有密度及び実効的な電離速度係数を評価した。衝突輻射モデルの結果を流体コードに組み込むことにより、X線の集光に寄与するプラズマの電子密度空間分布を導出した。更にX線レンズの性能を評価するために、対向する平板からレーザープラズマが吹き出す配置を2セット用い、縦方向と横方向の集光を独立に行うことを仮定した。与えられた電子密度分布に対して光線追跡によりX線の集光状態を計算し、X線レンズ生成に最適なレーザー照射条件を評価した。炭素をターゲットとして用いたプラズマ光学素子に関する計算を継続する。また、実験に関しては、ターゲットを変更して、プラズマ凸レンズとなるような密度勾配をもつ照射条件について実験と計測を進める。計算機シミュレーションに関しては、プラズマパラメータ(電子温度)の時間変化に対して炭素原子のイオン化の時間発展とそれに伴う電子密度の時間発展を解くことで、プラズマの電子密度勾配によるX線に対する屈折率の空間分布の時間発展を計算する。実験に関しては、X線自由電子レーザーやレーザー駆動プラズマ軟X線レーザーをプローブとして用いることで、プラズマ凸レンズの生成に必要なレーザー照射条件の確立をめざす。平成29年6月に予定している理研SACLAでのX線実験において使用する予定のプラズマ生成用の照射材料の仕様を精査するための予備実験が年度末までかかったため、研究予算を効率的に執行するために照射材料購入費を繰り越すこととした。また、平成28年度の研究成果を平成29年5月に行われる国際会議において発表するため、その旅費を繰り越すこととした。
浸透圧の不均衡を利用したフィラメント状及び膜状構造物質の会合体形成の実用化の試み

浸透圧の不均衡によって生じる熱力学的な力と、分子集合体の弾性要素との間のカップリングを利用して、分子集合体を会合させる方法を理論面、実験面で研究し、以下の成果を得た。まず理論面では、溶質の弾性要素を考慮にいれて浸透圧の不均衡下での溶質の振舞いを熱力学的に解析した結果、平衡状態では溶質の弾性的収縮により生じる弾性圧力が浸透圧の不均衡とが釣り合うこと、またその結果、溶質が会合体を形成すること等の可能性をはじめて明らかにした。次に実験面では浸透圧の不均衡を、1.高分子量の共溶媒により作り出す方法。2.オスモメーターを利用して作り出す方法。について検討し、それぞれにつき次の成果を得た。1.共溶媒として、高分子量のポリエチレングリコールを用い、リン脂質小胞、およびアクチンフィラメントの会合現象を研究し、上述の理論により解析した結果、以下のことが実験面ではじめて明らかになった。即ち、高分子量のポリエチレングリコールが立体障害のため、溶質表面から選択的に排除を受け、その結果、バルク層との間に浸透圧の不均衡が生じる。そしてその不均衡をうめるため、脂質二層膜やフィラメントが収縮を受け、その自由エネルギーを増加させることにより、やがて会合し、そしてその会合状態はひとつの熱力学的安定状態であるということが明らかになった。この方法により生体物質の秩序ある会合状態を作り出すことの可能性が示された。2.広範囲にわたる強さの浸透圧の不均衡を作り出し、かつ準弾性光散乱の測定及び光化学反応を行うことが可能なシステムを試作した。レーザーを光源とした準弾性光散乱測定装置の組み立ては完了し、現在、オスモメーター方式による、半透膜を境とした静水圧の差により浸透圧の不均衡を作ることが可能な特殊セルを作成し、その性能及びレーザー光源を用いての光化学架橋反応により会合状態を固定する試みを行っている。浸透圧の不均衡によって生じる熱力学的な力と、分子集合体の弾性要素との間のカップリングを利用して分子集合体を会合させる方法を、理論面、実験面で研究し、今年度は以下の成果を得た。まず理論面では、溶質の弾性要素を考慮に入れて浸透圧の不均衡下での溶質分子の振舞いを熱力学的に解析した結果、平衡状態で次の関係式が成立することを明らかにした。Cosm=P_EここでCosmは浸透圧の不均衡により生じるオスモティック・ストレス、P_Eは溶質の弾性的な収縮により生じる弾性圧である。これより浸透圧の不均衡と溶質の弾性的収縮により生じる弾性圧とが釣り合う結果、溶質の自由エネルギーが増加し、会合体を形成することの可能性が解析的に明らかになった。次に実験面では、浸透圧の不均衡を、1.高分子量の共溶媒により作り出す方法、2.オスモメーターを利用して作り出す方法、について検討し、それぞれ次の成果を得た。1.共溶媒として、高分子量のポリエチレングリコールを用い、リン脂質小胞及びアクチンフィラメントの会合現象を上述の理論により解析し、以下のことを明らかにした。即ち、高分子量のポリエチレングリコールの溶質表面からの選択的排除の結果、溶質分子はオスモティックストレスを受ける。その結果、脂質二層膜やフィラメントが収縮し、その自由エネルギーを増加させ、やがて会合する。そしてその会合状態は一つの熱力学安定状態である。2.オスモメーターを利用して広範囲にわたる強さの浸透圧の不均衡を作り出し、かつ準弾性光散乱の測定および光化学反応を行うことが可能なシステムの試作をすすめ、前年度完了したレーザーを光源とした準弾性光散乱測定装置の組み立てに続き、今年度は半透膜を境とした内外の静水圧の差により浸透圧の不均衡を作ることが可能な特殊なセルを作製し、その性能を検討している。
肺高血圧症の新規治療ターゲット、筋特異的カベオラタンパクＭＵＲＣの機能解析

肺動脈性肺高血圧症の病態の一部にRho/ROCKシグナルが関与していると言われている。申請者らは筋特異的カベオラ関連タンパクMURCをノックアウトしたマウスで肺高血圧モデルを作製し評価したところ、対照と比べ有意に肺高血圧の程度が抑制されていた。ラット大動脈平滑筋細胞でMURC発現を抑制すると増殖・遊走が有意に抑制されRhoA活性も低下していた。同じカベオラ関連タンパクであるCaveolin-1(Cav1)はGα13との結合によりRho/ROCKシグナルを抑制するが、MURCはCav1とGα13との結合を弱め、Gα13の活性化を介してRho/ROCKシグナルが活性化することを明らかにした。肺動脈性肺高血圧症の進展には、以前からRhoA/ROCKシグナルが重要な役割を果たしているとの報告があり、実臨床においてもROCK阻害薬が肺高血圧の治療に使用されいる。2008年に単離・同定した筋特異的タンパク(MURCと命名、のちにカベオラ関連タンパクの1つであることが報告され別名としてCavin-4と命名された)の心筋における役割の解析を行っていく中でMURCが心筋細胞内のRhoA/ROCKシグナル伝達に関わっていることをを明らかにした。MURCは血管平滑筋細胞でも発現を認め、本研究の目的は肺高血圧における血管平滑筋細胞でのMURCの機能的な役割を明らかにすることである。平成24年度では、MURCは血管平滑筋細胞のカベオラに局在するもののその形成には必須ではないこと、MURCは同じくカベオラ関連タンパクの1つでその変異・欠損が肺高血圧の原因の一つとされているcaveolin-1と結合していること、MURC/Cavin-4は血管平滑筋細胞の増殖能、遊走能を正に制御していることを明らかにした。今年度は、1MURC欠損マウスに低酸素負荷を行い作成した肺高血圧モデルでMURCが肺高血圧の進展に関与するか2RhoA/ROCKシグナルのキー分子とMURCとの関係について検討した。MURC欠損マウスは有意に肺高血圧が抑制され、末梢肺動脈では血管平滑筋細胞の増殖が抑制されていた。肺組織におけるROCK活性化もMURC欠損マウスで有意に抑制されていることを間接的に確認でき、MURCは肺血管平滑筋細胞でのRhoA/ROCKシグナルに関与している可能性が示された。caveolin-1は活性型Gα13と結合することによりRhoA活性を負に制御しているが、MURCもGα13にあるcaveolin-1結合ドメインを持っていることを発見し、単離した血管平滑筋細胞を使った実験で、MURCは競合的にcaveolin-1とGα13の結合を抑制し、結果的に活性型Gα13とp115RhoGEFの結合を促進することによりRhoA活性を上昇させていることを突き止めた。肺動脈性肺高血圧症の促進には、以前からRhoA/ROCKシグナルが重要な役割を果たしていると報告されており、ROCK阻害薬は実臨床でも使用されるようになりその効果も確認されている。申請者は2008年に筋特異的発現遺伝子(MURCと命名)を同定し、心筋、骨格筋細胞における役割の解析を行ってきたが、その中でMURC過剰発現により心肥大を経由して心不全にいたることを報告し、この機序にMURCが心筋細胞内のRhoA/ROCKシグナル伝達に大きな役割を果たしていることを報告した。MURCは心筋細胞、骨格筋細胞だけでなく血管平滑筋細胞にも発現を認めることから、本研究では以下の研究計画によりMURCの血管平滑筋細胞での機能を詳細に明らかにすることを目的としている。平成24年度では以下の項目について検討を行った。1血管平滑筋細胞におけるMURCとカベオラの関係の検討2MURCの血管平滑筋細胞の増殖能・遊走能への関与の検討まず、血管平滑筋細胞のカベオラとMURCの関係を明らかにするために、ラット大動脈からコラゲナーゼ処理などを経て血管平滑筋細胞を単離し、MURCの局在を免疫染色にて検討したところ細胞膜上に局在していることが明らかになった。さらにカベオラへの局在が報告されているcaveolin-1との免疫沈降反応で互いに結合していることが分かり、間接的にだがMURCがcaveolin-1と共に細胞膜上のカベオラに共局在していることを示すことが出来た。カベオラ関連タンパクはカベオラ形成に重要であると言われていたため、レトロウイルスベクターを用いMURC発現抑制を行ったが血管平滑筋細胞上のカベオラには変化を認めなかった。同じくレトロウイルスベクターを用いMURC過剰発現または発現抑制させた血管平滑筋細胞の増殖能、遊走能を検討した結果、MURCは増殖・遊走とも正に制御していることが明らかとなった。

肺動脈性高血圧症の進展には、以前からRho/ROCKシグナルが重要な役割を果たしているとの報告があり、実臨床においてもROCK阻害薬が肺高血圧症の治療に使用されている。2008年に単離同定した筋特異的カベオラ関連タンパクMURC(Cavin-4)の心筋における役割を解析した結果、MURCが心筋細胞内のRhoA/ROCKシグナル伝達に関わっていることを明らかにした。MURCは血管平滑筋細胞においても発現が認められるため、本研究の目的は肺高血圧における血管平滑筋細胞内でのMURCの機能的役割を明らかにすることとした。平成24年度には、MURCは血管平滑筋細胞膜のカベオラに局在するもののその形成自体には必須ではないこと、同じカベオラ関連タンパクの1つで肺高血圧症の原因遺伝子の1つとされているCaveolin-1とMURCは結合していること、ラット大動脈血管平滑筋細胞の増殖能・遊走能をMURCは正に制御していることをそれぞれ明らかにした。平成25年度は全身MURCノックアウトマウスを作出し1%低酸素負荷を4週間行うことにより肺高血圧モデルを作成し対照マウスと比較したところ、MURCノックアウトマウスは有意に肺高血圧が抑制されていた。末梢の肺動脈組織の検討で肺血管平滑筋細胞の増殖が抑制されていることも確認できた。肺組織におけるROCK活性化もMURCノックアウトマウスでは有意に抑制されていることを突き止め、MURCは肺血管平滑筋細胞でのRhoA/ROCKシグナルに関与している可能性が示された。Caveolin-1は活性型Gα13と結合することによりRhoA活性を負に制御しているが、大動脈血管平滑筋細胞を用いた実験で、MURCは競合的にCaveolin-1とGα13の結合を阻害しRhoA活性を上昇させることを明らかにした。平成26年度は、ヒト肺血管平滑筋細胞でも上記の結果が同じであることを確認し論文として投稿中である。循環器病学当初計画した項目についてはすべて検討できており、概ね予想通りの結果が得られているため。当初計画した項目についてはすべて検討することが出来ており、「MURCがカベオラ形成に必須ではなかった」という点が予想外であったものの、その他の結果については概ね予想通りの結果となったため。論文投稿をするべく今までの結果をまとめている。今後査読により追加実験を求められた場合は逐次それに対応していくことにしている。平成24年度の結果をもとに、以下の検討を行う。1RhoA/ROCKシグナルのキー分子(RhoA,RhoGEF,RhoGAPなど)とMURCの関係の検討血管平滑筋細胞でMURCがRhoA活性を変化させるか検討し、さらにROCK阻害薬でMURCによる増殖能・遊走能亢進が影響を受けるか確認する。RhoA/ROCKシグナルにはRhoA(GTP or GDP form)、RhoGEF、RhoGAPなど様々な分子が関わっており、カベオラは様々な蛋白を膜で活性化させるのに重要な役割を担っていることも知られていることから、MURCとそれら分子を免疫沈降反応やpull-down assayなどを用いて結合性を検討する。
実用的な心臓電気活動解析を目指した心筋興奮伝導シミュレーション法の確立

1.3次元心筋モデルの開発・検討心筋線維方向の回転は、実際の3次元の心筋の興奮伝導特性を表現する上で、非常に重要である。そこで、研究代表者の従来モデルに対して細胞内導電率テンソルを導入し、心内膜から心外膜にかけて導電率テンソルの主軸が変化するモデルを構築し、心筋線維方向の回転を表現した(日本ME学会大会2001年5月発表)。動的膜容量変化の異方向性に関して、代表者の従来論文で既に有効性を論じているが、本年度は、数理モデル上の生理学的パラメータや数値計算上のパラメータ(空間刻み幅)、そして膜容量異方向性の度合いを決めるパラメータに関して、相互のパラメータ感度を詳細に検討し、動的膜容量異方向性が、電気生理学的興奮伝導異方向性の特徴をより忠実に再現出来る可能性を示した(電通大紀要論文2001年7月発表)。2.高速計算法の改良高速計算法として、従来よりノード間引きという独創的手法を提案してきたが、本年度は、さらに計算効率を向上させるために、ノード間引きによる高速計算法に時間刻み幅自動調節機構を組み合わせた、新しいハイブリッド計算法を検討した(電子情報通信学会研究会2002年3月発表)。ノード間引き法の有無、時間刻み幅自動調節の有無による、計4通りの計算法を比較検討し、新しいハイブリッド計算法が最も高速な結果を示した。3.本年度の研究評価と今後の展開以上により本年度実施計画はある程度達成されたが、特に高速計算法に関しては、更なる計算効率の向上、複雑な興奮伝導過程(spiral wave等)における計算精度の検証が必要であり、これらの点が今後の課題である。
食道発声者の構音獲得過程の解析とそのリハビリテーションへの応用

1.無喉頭者に単音節を発話させ、その録音サンプルについて聴取実験を行った。各音節の同定試験を施行した結果、母音、半母音においては高い正答率を示したが、無声破裂音や「は」行音では比較的正答率が低かった。摩擦音については習熟度の低い症例の正答率がきわめて低い傾向が認められた。食道音声に比較的習熟した無喉頭者の録音サンプルを、食道音声を熟知している言語聴覚士が聴取し音声表記した。全般的に正しく聴取されたが、子音の一部に有声・無声の混乱が見られた。また、無喉頭者にとって生成が困難と言われている/h/が正しく聴取されている被験者と省略や/*/に近い歪み音に聴取された被験者がいた。3.上記の症例についてパラとプレートを作成し、エレクトロパラトグラフィの手法を用いて、舌と口蓋の接触パタンの記録を行った。4.並行して、エレクトロパラトグラフィ用いた接触パタンと接触時間に関するデータを計算機上で処理するプログラムを開発した。5.上記の方法を用いて各被験者の構音動態を観察したところ、正しく/h/と聴取された発話者の構音動態は、正常者と大きく異なり舌が奥舌面を中心に口蓋と接触していた。このことから、/h/の構音訓練法として、/k/に近い口蓋摩擦音を導くという方法が妥当であることが証明された。摩擦音については習熟度のひくい症例の正答率がきわめて低い傾向が認められた。2.食道音声にあまり習熟していない無喉頭者の録音サンプルを、食道音声を熟知している言語聴覚士が聴取し音声表記したところ、子音が比較的正しく生成された一方で、母音の生成時に/k/や/t/が付加した。これは発声のための空気摂取時に舌が口蓋に接触することが原因と考えられた。3.上記の症例についてパラトプレートを作製し、エレクトロパラトグラフイの手法を用いて、舌と口蓋の接触パタンの予備的記録を行った。その際に種々の空気摂取法についてそのパターンを比較することを試みた。4.並行して、エレクトロパラトグラフィを用いた接触パタンと接触時間に関するデータを計算機上で処理するプログラムを開発した。このプログラムによってパラトグラム上で前方から後方に分割した各分確ごとの接触の面積と時間経過が明瞭に観察できるようになった。5.食道音声の数種の訓練法を試み、観察した。2.食道音声に比較的習熟した無喉頭者の録音サンプルを、食道音声を熟知している言語聴覚士が聴取し音声表記した。また、無喉頭者にとって生成が困難と言われている/h/が正しく聴取されている被験者と省略や/ζ/に近い歪み音に聴取された被験者がいた。3.上記の症例についてパラトプレートを作成し、エレクトロパラトグラフィの手法を用いて、舌と口蓋の接触パタンの記録を行った。
動物体内における脂肪分布の制御に関与する遺伝子群の解明

○筋肉内特異的脂肪蓄積遺伝子座についてのコンジェニック解析と候補遺伝子の検索12年度において、肥満型OLETFラットにおける最長筋内特異的な脂肪蓄積の原因となる第1染色体上のQTLについて、そのQTLゲノム領域のみがOLETF由来ゲノムとなっており、それ以外のバックグラウンドゲノムがF344のレシピエントゲノムとなっているコンジェニック系統をマーカーアシストスピードコンジェニック法により作製した。このコンジェニックをマーカー型タイピングすることにより、QTL解析により筋肉内特異的脂肪蓄積遺伝子が存在すると考えられた約50cMのゲノム領域の一部である約10cMの領域がOLETF由来の移入ゲノムとなっていると判明した。また、このコンジェニックおよびレシピエント系統であるF344について、最長筋内脂肪量を測定したところ、コンジェニックはF344に比べて有意に高い最長筋内脂肪量をもつことが明らかになった。この結果から、OLETFにおける筋肉内特異的脂肪蓄積遺伝子は第1染色体上の約10cMの領域に存在することが確証された。この領域に存在する候補遺伝子を調査したところ、ADRA2A、Pnlip、Pnliprp1、およびPnliprp2遺伝子が候補になると示唆された。さらに、コンジェニック解析により明らかにされた10cMのゲノム領域はウシ8q12-q18および26q12-q23に相当しており、これらの領域にウシ脂肪交雑QTLが存在するという報告はこれまでのところなされていないことから、ウシ脂肪交雑の遺伝的解析において今後注目すべきゲノム領域になりうると考えられた。○筋肉内特異的な脂肪蓄積を特徴とするモデル動物の検出OLETFにおけるQTL解析およびコンジェニック解析で明らかにされた遺伝子座以外の目的形質遺伝子座同定のための第一段階として、Zucker-fa、Wister-fa、Dahl-fa、WKAH、LEA、TM、SHC、およびEXHCという肥満・脂質代謝異常を特徴とするミュータントラットの35週齢での体重、体長、体脂肪率、副睾丸脂肪量、後腹膜脂肪量、腸間膜脂肪量、皮下脂肪量および筋肉内脂肪量を測定した結果、Zucker-faおよびLEA系統では、他部位に比べて最長筋内に優勢的に脂肪蓄積が生じているラットモデルであることを明らかにした。NIDDMのモデル動物として確立されたOLETFラットでは肥満を呈することが知られており、副睾丸、後腹膜、腸間膜といった腹腔内脂肪組織および皮下脂肪組織への脂肪蓄積量が増加している。OLETFとF344とのF_2インタークロスにおいて35週齢での副睾丸脂肪量、後腹膜脂肪量、腸間膜脂肪量、皮下脂肪量を測定し、約350個のマイクロサテライトマーカー座のタイピングを行うことで肥満遺伝子のQTL解析を実行した。第2番、8番染色体上の2つのQTLは腸間膜脂肪量のみに、第4、9、14番染色体上の4つのQTLは後腹膜脂肪量にのみ影響を及ぼすことが明らかにされ、脂肪蓄積に関わる遺伝子は体内部位によりそれぞれ異なっていることが示唆された。さらに最長筋組織より凍結切片を作成し、脂肪染色、画像解析を行うことで、OLETFラットは正常ラットであるF344に比べ筋肉内脂肪蓄積量が増加していると判明した。この表現型に関与する遺伝子を(OLETF×F344)F_2ラットを用いたQTL解析により検討した結果、第1番染色体上にLODスコア=3.4をもつQTLが存在することが示された。このQTLは筋肉内脂肪量に特異的に関与する主効果遺伝子であると考えられた。また、この遺伝子は筋肉内脂肪量のF_2における全遺伝分散の約10%を説明するものであり、その脂肪量の増加に対しOLETF由来のアリルが劣性様式で働いていると判明した。RATMAP、MGD、GDBといったゲノムデータベースを利用することで、QTLが存在するゲノム領域における肥満・脂肪蓄積関連遺伝子の情報を得て、候補遺伝子について調査した結果、α2adrenergic receptor遺伝子が有望なpositional candidateであると考えられた。さらに、このQTLゲノム領域はpfat3、DAHL3、Dmolという既知の肥満QTLの染色体領域と一致していた。

さらに、コンジェニック解析により明らかにされた10cMのゲノム領域はウシ8q12-q18および26q12-q23に相当しており、これらの領域にウシ脂肪交雑QTLが存在するという報告はこれまでのところなされていないことから、ウシ脂肪交雑の遺伝的解析において今後注目すべきゲノム領域になりうると考えられた。○筋肉内特異的な脂肪蓄積を特徴とするモデル動物の検出OLETFにおけるQTL解析およびコンジェニック解析で明らかにされた遺伝子座以外の目的形質遺伝子座同定のための第一段階として、Zucker-fa、Wister-fa、Dahl-fa、WKAH、LEA、TM、SHC、およびEXHCという肥満・脂質代謝異常を特徴とするミュータントラットの35週齢での体重、体長、体脂肪率、副睾丸脂肪量、後腹膜脂肪量、腸間膜脂肪量、皮下脂肪量および筋肉内脂肪量を測定した結果、Zucker-faおよびLEA系統では、他部位に比べて最長筋内に優勢的に脂肪蓄積が生じているラットモデルであることを明らかにした。
赤外円偏光二色性による光学活性分子の不斉構造の研究

今年度購入した高輝度光源および回折格子の使用により、現在の振動円偏光二色性(VCD)測定装置の性能は下記の通りである。測定波数領域:10、0002、000cm^<-1>最小検知感度:△A=10^<-6>OD分解能:304cm^<-1>光学活性なα-およびβ-フェニルアルコールの四塩化炭素溶液中における分子内水素結合系のOH伸縮振動のVCDを測定し、OH伸縮振動のコットン効果とコンホメーションの関係を研究した。その結果、OH伸縮振動の旋光強度はdynamic polarization modelによって説明できることがわかった。
骨成長障害における分子基盤の解明:軟骨無形成症に対する治療法開発への応用

【背景】軟骨無形成症(Ach)は遺伝性四肢短縮型低身長症の中で最も頻度が高く、線維芽細胞増殖因子受容体3型(FGFR3)の活性型変異により著明な低身長をきたす。現在行われている成長ホルモン療法の効果は充分とはいえず、病態生理に基づいた新規治療法の開発が希求されている。これまでに私たちは軟骨株化細胞を用い、Ach型FGFR3変異がPTHrPの発現低下を来たした結果アポトーシスを誘導し、これがPTHrPの補充により阻止されること、type II collagen promoterにより軟骨特異的にAch型変異FGFR3を発現するAchモデルマウス(AchTG)の胎児骨を用いた器官培養にてPTHが骨伸長改善作用を有することを見出した。【目的】Achの骨成長障害に対する短期的および長期的なPTHの効果をモデル動物にて検討する。【短期投与】日齢720日にかけてPTH(100μg/kg,1000μg/kg)を連日皮下注射し、日齢21日に大腿骨を剖出、骨長の計測および組織学的検討を行った。AchTGは野生型と比較し大腿骨の伸長障害を認めた(10.15±0.44mm,11.43±0.27mm,p<0.001)。PTH投与によりAchTGは10.84±0.38mm(100μg/kg p<0.05),10.59±0.20mm(1000μg/kg p<0.05)と骨伸長の改善を認めた。AchTGは成長軟骨板の短縮を認めたが、PTHにより増殖軟骨細胞層を中心に拡大した。【長期投与】生後15週にかけてPTH(100μg/kg)を週3回皮下注射し、日齢42日に上腕骨・橈骨・大腿骨・脛骨を剖出し、同様に評価を行った。AchTGでは全ての骨に伸長障害を認めた。PTH投与によりAchTGにて骨伸長の改善を認めたが、PTHの投与による成長軟骨板の変化は認めなかった。【結論】PTHはモデル動物において軟骨無形成症の骨成長障害を改善し、新規治療薬となる可能性が示された。【結果】(1)FGFR3活性の検討:FGFR3のリン酸化は、野生型FGFR3導入細胞(WT細胞)と比べてACH細胞、TDII細胞、SADDAN細胞では、それぞれ20倍、100倍、140倍の増加が見られた。(2)変異FGFR3導入細胞におけるStat1の活性化:Stat1のリン酸化は、TDII細胞およびSADDAN細胞においてWT細胞と比べそれぞれ61倍と135倍増加した。一方、ACH細胞ではStat1の活性化はごくわずかであった。次いでStad-GFP融合蛋臼によりStat1の核移行を検討したところ、TDII細胞およびSADDAN細胞では核に強く局在する一方で、ACH細胞の核でのシグナルはごく弱いものであった。(3)ドミナントネガティブ(DN)-Stat1の作用:TDII細胞ではWT細胞と比較して[^3H]-thymidineの取り込み能は約60%に低下していた。この細胞に、DN-Stat1を導入したところ[^3H]

-thymidineの取り込み能は約85%にまで回復した一方で、DN-Stat5a、DN-Stat5bを導入した場合では、回復効果は認めなかった。(4)恒常的活性型Stat1の作用:恒常的活性型Stat1を作製しATDC5に導入したところ、野生型Stat1導入細胞と比べ[^3H]-thymidineの取り込み能は約50%低下した。【考察・結論】Stat1はTD細胞およびSADDAN細胞で非常に強く活性化されているとともに、ACH細胞でも軽度ながら活性化され、その程度は臨床的重症度およびFGFR3活性と相関することが判明した。さらに、ドミナントネガティブ型および恒常的活性型Stat1の発現実験により、Stat1が軟骨細胞の増殖能を制御していることが明らかとなった。これらの結果により、Statファミリーの中でも特にStat1が、四肢短縮型小人症の発症機序に重要な役割を果たしていることが判明した。【目的】軟骨無形成症(ACH)を代表とするFGF receptor3(FGFR3)関連疾患の骨成長障害は、恒常的活性型FGFR3が軟骨細胞の増殖を抑制するためである。最近、私達は細胞実験で、軟骨細胞の分化促進によりアポトーシスが過剰に起こっていることもその一因であること、さらにPTHがこのアポトーシスを抑制することを報告した。今回、PTHの骨伸長促進作用の治療への応用を目的とし、器官培養系を用いて検討を行った。【方法】1)マウス胎仔大腿骨に,FGFR3の野生型(Ad-WT)、致死性骨異形成症II型(TDII)の変異(Ad-TD)を各々組み込んだアデノウイルスベクター(MOI 18)を2.5日間暴露、感染させた後、血清非含有のメディウムで培養を行い、培養前と培養3日後、6日後に各々の骨長を測り、増加率を比較検討した。2)Ad-WTに感染させた骨にPTHを添加し、骨の骨伸長増加率についてPTH非添加の骨と比較検討した。3)軟骨無形成症モデルマウスより採取した大腿骨を1,2)と同様に検討した。【結果】1)Ad-WTに感染させた骨の長軸方向への増加率を100%とすると、Ad-TDの増加率は、培養3日目に32.9±10.5%、6日目に66.9±14.4%と有意に抑制されていた。(P<0.05)2)PTHを添加したAd-WTの骨において、骨長の増加率は、非添加の骨と比較し、培養3日目で1.2倍(p=0.036)、培養6日目で1.16倍(p<0.01)であった。軟骨無形成症モデルマウスより採取した大腿骨を用いた検討でも同様の結果が得られた。【結論】器官培養系においてもFGFR3の変異が骨成長を抑制することが確認され、PTHの骨伸長作用が期待できた。PTHが軟骨無形成症群の骨成長障害に有効である可能性が示唆された。【目的】軟骨無形成症(ACH)は四肢短縮型低身長症の中で最も発症頻度の高い疾患で、点突然変異したFGF receptor 3(FGFR3)の恒常的活性化による軟骨細胞の増殖抑制が原因で、一部はSTAT1のリン酸化を介する。ACH類似疾患には、軽症型の軟骨低形成症(HCH)、重症型の致死性骨異形成症I、II型(TDI、TDII)、さらに重症のSADDANがある。今回、FGFR3関連疾患の発症メカニズムを解明する目的で変異FGFR3を用いて検討した。【方法】発現ベクターにより次の変異FGFR3をHEK293T細胞に強制発現した二膜貫通領域内のY373C(TDI)、G380R(ACH)、及びチロシンキナーゼ領域内のK650N(HCH)、K650E(TDII)、K650M(SADDAN)。
植物生体情報計測におけるマシンビジョンの応用 -植物生体内水分変化の推定-

本研究は,植物生産の主体となる作物の生育を管理するための情報収集システムの構築を目指したもので,将来的には,完全な植物工場へと発展させるための基礎的研究である.特に,ここでは,植物の生体情報を直接かつ,非侵襲に計測する技術として,画像計測を用いている.植物の生理や生育や形態変化の挙動に対して,その物質輸送や信号伝達系の媒体となる水に着目し,その生体内水分を萎れによる葉の挙動から推定するシステムの構築をおこなった.ただし,植物の硬さは,経験的なデータ(植物の履歴)との相関から求め,さらに,切断試験により検証した.計測システムは,植物がしおれていく状態での形態変化の情報を計測するための画像計測システムと,しおれを生じさせるために水ストレスを与える環境制御装置とから構成した.次に植物体内水分を推定するために計測対象物における茎・葉などの部位毎の水分変化特性をもとめ,それぞれのモデル化を行い,次に個体における水分変化の計測からとそれを構成する部位毎における水分変化を作成したモデルから推定を行った.その結果,微少な水分変化(0.03%程度)を推定することは困難であるが,0.1%程度の変化量に対しては誤差が少なく推定できることが明らかとなった.本研究は,植物生産の主体となる作物の生育を管理するための情報収集システムの構築を目指したもので,将来的には,完全な植物工場へと発展させるための基礎的研究である.特に,ここでは,植物の生体情報を直接かつ,非侵襲に計測する技術として,画像計測を用いている.植物の生理や生育や形態変化の挙動に対して,その物質輸送や信号伝達系の媒体となる水に着目し,その生体内水分を萎れによる葉の挙動から推定するシステムの構築をおこなった.ただし,植物の硬さは,経験的なデータ(植物の履歴)との相関から求め,さらに,切断試験により検証した.計測システムは,植物がしおれていく状態での形態変化の情報を計測するための画像計測システムと,しおれを生じさせるために水ストレスを与える環境制御装置とから構成した.次に植物体内水分を推定するために計測対象物における茎・葉などの部位毎の水分変化特性をもとめ,それぞれのモデル化を行い,次に個体における水分変化の計測からとそれを構成する部位毎における水分変化を作成したモデルから推定を行った.その結果,微少な水分変化(0.03%程度)を推定することは困難であるが,0.1%程度の変化量に対しては誤差が少なく推定できることが明らかとなった.
気孔葉緑体シグナルの探索および新奇気孔葉緑体形成因子の機能解析

孔辺細胞には葉緑体が存在するが、その機能や形成メカニズムに関しては不明な点が多い。そこで、葉肉細胞の葉緑体は正常だが、孔辺細胞の葉緑体形成に異常をもつgles1変異体をシロイヌナズナから単離した。葉緑体を構成する膜脂質は原核型と真核型の2つの脂質代謝経路から合成される。gles1変異体の原因遺伝子は、葉緑体の包膜に存在し、真核型脂質を葉緑体に取り込む輸送体の一部をコードしていた。また、孔辺細胞は葉肉細胞と比較して原核型の脂質経路が退化しているというユニークな脂質代謝特性を示すことが分かった。これらの結果より、真核型の脂質代謝経路は気孔の葉緑体形成に必須であることを明らかにした。気孔は一対の孔辺細胞からなり、孔辺細胞には葉緑体が存在する。孔辺細胞における葉緑体の機能については諸説あるが、不明な点が多い。また気孔葉緑体の形成メカニズムも全く分っていない。そこで、気孔における葉緑体の役割を明らかにするために、気孔の葉緑体の自家蛍光がほとんど観察されない変異体gles1を単離した。この変異体では、CO2及び光に対する気孔応答性が低下していることが分かり、ABAに対する応答性はほぼ正常であった。さらに気孔閉鎖を促すS型陰イオンチャネルの活性が、CO2特異的に阻害されることが分かった。気孔葉緑体が、気孔開閉メカニズムにおいて、重要な役割を果たしていることが示唆されたが、どのように孔辺細胞内のイオンバランス制御に関わっているのか、その仕組みは不明である。そこで、光やCO2などの環境シグナルを感知した気孔葉緑体は、葉緑体シグナルをイオンチャネルやポンプなどに伝えてイオンバランス制御をするという作業仮説をたてた。葉緑体シグナルの実体を明らかにするため、まずイオンチャネルの活性制御に関わると考えられているATP及びカルシウムに着目し、その濃度変化を明らかにすることにした。ATP及びカルシウムセンサータンパクを発現させた植物を用いて、環境刺激を与えたときの、孔辺細胞内の濃度変化をリアルタイムでモニターした結果、HCO3-刺激を加えることで、一過的に孔辺細胞内のカルシウム濃度が上昇することが分かった。一方、ATP濃度に関しては大きく変化しないことが示唆された。気孔の葉緑体が気孔開閉制御に重要な役割を果たしていることを明らかにした。また、研究目標としていた孔辺細胞内のATP及びカルシウムイオン濃度変化をリアルタイムでモニターする実験系を構築することができた。この実験系を用いて、気孔の葉緑体分化が阻害されたgles1変異体を解析することで、葉緑体シグナルの一端が明らかになると期待される。気孔細胞は葉緑体を持っているが、その機能や形成メカニズムについては、不明な点が多い。gles1(green less stomata 1)は気孔葉緑体形成変異体であり、CO2に対する気孔応答性が低下している変異体である。この変異体では、気孔閉鎖を駆動するS型陰イオンチャネル(SLAC1)の活性も低下していた。そこで、SLAC1の制御因子の一つであるカルシウムイオンに着目して、孔辺細胞におけるカルシウムイオンの濃度変化を測定した。その結果、CO2処理により、一過的なカルシウムイオンピークが出現したが、その出現頻度及び変化率はgles1変異による影響を受けなかった。気孔葉緑体は、カルシウムシグナルとは異なるメカニズムでSLAC1の活性制御に関与すると考えられる。またgles1の原因遺伝子は葉緑体包膜に存在し、葉緑体へ脂質を輸送する複合体のサブユニットの一部をコードしていた。そこで、この複合体が気孔葉緑体形成に関与しているのか明らかにするため、他のサブユニットの変異体を用いて気孔葉緑体の自家蛍光及びCO2に対する応答性を調べた。その結果、他のサブユニットに変異を持つ植物も、gles1と同様に、気孔葉緑体形成に異常があり、CO2に対する応答も低下していた。気孔の葉緑体形成において葉緑体の脂質輸送体が重要な役割を果たしていることが示唆された。気孔の葉緑体はカルシウム非依存の経路を介して、S型陰イオンチャネルの活性制御に関与していることが分かった。またgles1変異体の原因遺伝子の解析から、気孔の葉緑体形成に葉緑体の脂質輸送体が関与するという新しい知見を得ることができた。気孔の孔辺細胞には葉緑体が存在するが、その機能や形成メカニズムに関しては不明な点が多い。gles1 (green less stomata 1)変異体は葉肉細胞の葉緑体形成は正常だが、孔辺細胞の葉緑体形成が損なわれた変異体として単離され、CO2に対する気孔応答性も低下していた。この変異体の原因遺伝子は葉緑体の包膜に存在する脂質輸送体の一部をコードしていた。チラコイド膜に含まれる脂質は葉緑体形成に必須であり、葉緑体内で作られる原核型と、小胞体を経由して作られる真核型の2つの脂質代謝経路を介して合成される。この輸送体は、真核型経路における小胞体から葉緑体への脂質輸送を担っており、gles1変異により、真核型経路由来の葉緑体脂質含量が低下していた。また脂質輸送体の他のサブユニットに変異を持つ植物もgles

1変異体と同様に気孔葉緑体形成に異常があったことから、気孔の葉緑体形成には真核型経路由来の葉緑体脂質が必須であることが分かった。気孔葉緑体形成と脂質との関係を明らかにするため、質量分析計を用いた孔辺細胞及び葉肉細胞の脂質プロファイリングをおこなった。その結果、孔辺細胞は葉肉細胞と比較して原核型の脂質代謝経路が退化しており、真核型の脂質代謝経路が発達しているというユニークな脂質代謝特性を示すことを明らかにした。孔辺細胞では原核型の脂質代謝経路が低下している分、真核型経路を介して作られる葉緑体脂質が、気孔葉緑体形成には欠かせないと考えられる。孔辺細胞には葉緑体が存在するが、その機能や形成メカニズムに関しては不明な点が多い。そこで、葉肉細胞の葉緑体は正常だが、孔辺細胞の葉緑体形成に異常をもつgles1変異体をシロイヌナズナから単離した。葉緑体を構成する膜脂質は原核型と真核型の2つの脂質代謝経路から合成される。gles1変異体の原因遺伝子は、葉緑体の包膜に存在し、真核型脂質を葉緑体に取り込む輸送体の一部をコードしていた。また、孔辺細胞は葉肉細胞と比較して原核型の脂質経路が退化しているというユニークな脂質代謝特性を示すことが分かった。これらの結果より、真核型の脂質代謝経路は気孔の葉緑体形成に必須であることを明らかにした。カルシウムセンサータンパクを発現させたgles1変異体を用いて、環境刺激を与えた際のイオン濃度変化をモニターし、気孔葉緑体がカルシウムシグナルに関与しているのかを精査する。また、変異体の原因遺伝子の機能解析を進めることで、気孔葉緑体形成の分子メカニズムを明らかにする。gles1変異体は、気孔細胞の葉緑体の形成が阻害されているが、葉肉細胞の葉緑体は正常であった。つまり細胞によって葉緑体形成メカニズムが異なると考えられる。この葉緑体形成の組織特異性を決定する要因の一つが、葉緑体における脂質組成の違いかもしれない。その可能性を検証するため、気孔細胞及び葉肉細胞の脂質プロファイリングをおこなう予定である。植物分子生理学物品費の使用額が当初の予定よりも少なく済んだため。遺伝子工学試薬など物品費の使用額が当初の予定よりも少なく済んだため。次年度で、遺伝子工学試薬を使った実験を多数計画しているので、その実験にあてる予定である。次年度で、細胞をプロトプラスト化する試薬や脂質解析用の試薬を使った実験を多数計画しているので、その実験にあてる予定である。