hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質側鎖の平衡揺らぎと基質結合に伴う応答的運動

分子間相互作用では、タンパク質表面の側鎖原子が担っていることを考えれば、主鎖の運動ばかりでなく、側鎖の運動が重要となる。しかしながら、これまで側鎖運動を取り上げた研究は数少なく、それを表現・解析する方法は確立されていない。今年度は、タンパク質間相互作用に伴う側鎖の運動を観察する目的で、Barnase-Bastarのタンパク質間相互作用に伴う側鎖運動を分子シミュレーションで観察した。その方法は、粗視化モデルと共役したタンパク質モデルを用い、基本的にBarnaseの主鎖を結合状態の構造に固定し、Bastar側を主鎖がほとんど動かないが外部自由度は自由に動き、さらには結合状態と非結合状態の2状態のGoモデルを持つ粗視化モデルと共役させ、最終的にはHamilton exchangeによって粗視化モデルの影響を0に外挿した。その際に、実質的な結合速度を変化させ、その影響を見た。その結果として、結合速度が遅いほど、結合が結晶構造に見られる正しいパッキングになる確率が大きくなった。その中を解析すると、数多くの必ずしも長くない疎水性側鎖はサブナノ秒オーダーでは緩和せず、同一のロータマーに止まり、結合速度による影響は顕著ではなかった。しかし、小数の相互作用界面に存在する大型側鎖、Lys,Argや芳香環を持つアミノ酸の側鎖、がサブナノ秒程度の緩和時間で運動をして、結合に伴って最適なパッキングを探索する様子が観察された。これは、アミノ酸の種類、タンパク質上の位置による側鎖運動の依存性が極めて大きいこと、相互作用に伴ってそのロータマーがフォールディングと同様に、最適構造の収斂していくものとして理解されることが分かった。基質との相互作用は多くの場合、タンパク質表面の側鎖原子が担っていることを考えれば、主鎖の運動ばかりでなく、基質認識部位の側鎖の基質結合に伴う運動が重要となる。しかしながら、これまで主鎖運動を表現・解析する方法は確立されてきたが、側鎖運動、特にタンパク質表面に露出した側鎖運動の表現・解析法は存在しない。そこで本研究では、側鎖の運動の表現方法を確立し、それを線型応答理論に適用することで、タンパク質の側鎖を含んだ全原子の平衡揺らぎと機能的運動を接続する理論を構築することを目的とする。(1)側鎖の運動の表現側鎖運動の長時間分子動力学計算による観察と特徴抽出側鎖運動のモデル構築のために、タンパク質側鎖の運動について、LAO結合タンパク質について1μ秒までの長時間分子動力学計算を行い、その軌跡を解析することによって、その動的な振る舞いの一般的性質の抽出を試みた。(2)非調和性の表現:擬調和近似を超える試み分散共分散行列に代わるより一般的な応答関数の表現の可能性として、grid点で表現される分布関数とその応答関数の試みを行った。
マウス肝細胞を用いたHBV in vitro-in vivo感染系構築の試み

HBVはNTCPを必須のレセプターとして肝実質細胞に感染するが、マウス肝細胞にヒトNTCPを発現しても、感染は成立しない。HBV産生ベクターをトランスフェクションすることでウイルス産生がみられることから、マウス肝細胞はHBV侵入の際に制限因子を有していると考えられる。HBVコア蛋白相互作用因子の観点からこの制限因子を明らかにするためにHBVコア蛋白発現マウス肝細胞を樹立した。B型肝炎ウイルス(HBV)は極めて種特異性が高く、哺乳類ヘパドナウイルス(orthohepadnavirus)にヒトを含めた類人猿との相互感染は成立しない。HBV感染には極めて高度に分化した正常肝実質細胞を要し、脱分化していると思われるヒト肝癌由来培養細胞株には感染しない。HBVの生活環の解明には、より簡便なin vitro感染系の構築は勿論だが、HBVの個体内侵入機構、病態発生機構の解明とそれに基づいた治療薬・治療法の開発にはマウスのような小動物を用いた個体レベルでの感染系の構築が不可欠である。NTCP(Na-taurocholate co-transporting peptide)がHBVの感染受容体として同定され、このような困難な研究状況は一気に解決されたかと思われた。が、ヒトNTCPをマウス肝細胞由来(αMLやBNLなど正常肝細胞に近いとされる)細胞株で発現させてもHBV感染が許容されないことを見出した。NTCP以外のヒト型肝細胞因子の存在やマウス肝細胞における抵抗/規制因子(HBVコア蛋白に対する抵抗/規制性因子を含む)の存在が示唆される。本研究ではこれらの因子を見出し、発現、ノックアウト、ノックダウンなどを施し、個体レベルでのHBV感染系の構築を目指している。HBc発現細胞の樹立にやや時間を要しているが、確実に進捗している。1)HBVコア蛋白(HBc)と相互作用する宿主因子の分離・同定とそのHBV感染における機能の解析.(研究代表者;上田啓次)ヒト肝癌由来培養細胞株(HepG2)及びマウス肝細胞株(αML)を用いてHAタグ付きHBVコア蛋白(HA-HBc)発現細胞株(HA-HBc/G2、HA-HBc/αML)を樹立中である。HA-HBcの発現をIFAで確認後、ウェスタンブロットで確認しているが、IFAで確認される発現がウェスタンブロット法で検出されていない等の問題点を解決する必要がある。NTCP・V5His/G2(作製済)を用いて、抗V5抗体アガロース若しくはNi-NTAアガロースを用いたpull-down法により、NTCP複合体を分離した。これまでに、ある宿主因子がHBV感染に必須であることを突き止めているが、その因子がNTCPと複合体を形成していることを見いだしつつある。また、抗V5抗体アガロース若しくはNi-NTAアガロースを用いたpull-down法により、NTCP複合体の全容を解明中である。マウス肝細胞はヒトNTCPを発現しても、B型肝炎ウイルス(HBV)の感染を許容しない。一方で、ウイルス産生ベクターを構築し、トランスフェクション実験を行うと、培養上清中にウイルスを確認できる。このことは、マウス肝細胞において、HBVを産生分泌するための基本的環境は整えられているが、entryから感染成立までの過程(付着からエンドゾームへの取込み、膜融合しコア粒子が細胞質に侵入する過程)において、何らかの阻害機構が働いているものと考えられる。これまでの報告により、本機構にはHBVコアタンパク(HBc)が関わっており、マウス肝細胞が、前述の過程に関わる何らかの制限因子をもっていることが示唆されている。そこで、TGFαトランスジェニックマウスから樹立された正常マウス肝細胞に近いとされるマウス肝細胞(αML;トランスフェクション実験ではウイルスを産生する)を用いて、まず、HAタグ付HBc抗原(HA-HBc)を安定的に発現する細胞株を樹立し、HBc相互作用因子を分離・同定することを試みた。これまで、トランスフェクションおよびレトロウイルスベクターを用いて、安定的HBc発現系の樹立を試みたが、細胞株の樹立が極めて困難であることがわかってきた。最終的には2クローンの分離に成功し、現在、その発現量、細胞内局在を検討している。十分な発現が確認されれば、今後,付加したHAタグを用いて、pulldown実験を行い、相互作用因子の分離・同定を行う。1)HBVコア蛋白(HBc)と相互作用する宿主因子の分離・同定とそのHBV感染における機能の解析.2)NTCPと相互作用する宿主因子(co-receptor候補)の分離とその機能解析.3)マウスshRNAライブラリーを用いたNTCP/αMLにおけるHBV感染スクリーニングとその責任因子の同定及び機能解析.の3項目について、進捗させる。1)の目標達成がやや遅れているものの、発現コンストラクトに問題はなく、現在も樹立に向けたスクリーニングを続け、早晩樹立が期待できる。本細胞が樹立されれば、4)HBVコアタンパクと相互作用する宿主因子の分離・同定とそのHBV感染における機能の解析.を開始する。

2)に関しては、すでに幾つかの因子(これまで申請者が発見した因子を含む)を同定しており、今後、全長cDNAのクローニング、ノックダウン、ノックアウトにより、その機能的意義(マウス肝細胞がHBV感染抵抗性を示す理由)について解析する。ウイルス学実験の遂行は、研究室に残存していた物品を使用することで賄うことができたため、新たに購入せずに行った。研究室に残存していた物品はほぼ使用済となったので、今後は本経費を消費して、研究を進めることになる。
環境に調和した有機トランジスタ作製プロセスの開発

本研究では、有機トランジスタの作製法として、空気中の酸素と太陽光エネルギーを利用した溶液プロセスの開発を目指した。ジチエニルペンタセンは、太陽光により溶存酸素と反応して酸素付加体を与えた。この反応はほぼ定量的に進行するが、その反応速度定数は置換基の種類に依存していた。得られた酸素付加体にUV光を照射するとペンタセン誘導体が再生した。この脱酸素反応が薄膜で進行することを調査し、環境調和型プロセスの構築を検討した。有機トランジスタの研究開発において、ペンタセン前駆体の合成が注目されている。これは、塗布型材料の開発がこの分野で求められているからである。これまでに我々は、6,13-ジチエニルペンタセン(1a)が太陽光存在下で溶存酸素と光反応を起こし、酸素付加体2aが定量的(単離収率81%)に生成することを明らかにした。また、この酸素付加体2aの薄膜にUV光(254nm)を照射すると、ペンタセン1aが再生することを見出した。ペンタセン1aで高い半導体移動度(0.1cm^2 V^<-1> s^<-1>)が報告されていることから、この反応が効率的に進行する分子システムを開発できれば、環境に調和した有機トランジスタ作製プロセスを構築できる。本研究では、2-チエニル誘導体(1a)の代わりに3-チエニルペンタセン誘導体(1b)を合成し、チオフェン置換基の位置効果を調査した。ペンタセン1bから酸素付加体2bへの反応は、1aと同様に定量的に進行した。これらの反応は一次反応速度式に従い、速度定数は2.2×10^<-3> s^<-1>(1b)と1.7×10^<-3> s^<-1>(1a)であった。また、酸素付加体の単結晶X線構造解析を行った。両者とも類似構造が観測され、チオフェン環がペンタセン骨格と交差するように位置していた。また、ペンタセン骨格に架橋した酸素原子は二つのチオフェン環に挟まれていた。このため付加体1aでは、チオフェン環がわずかに歪んでいた。DFT計算で求めた生成熱を比較した結果、2bの方が9.0-8.5kcal mol^<-1>安定であった。溶液中の光照射によってペンタセンの発生率を求めたところ、2bと2aで14%と44%の変換率を記録した。この結果は、ペンタセンの再生プロセスにおいて、分子内の歪エネルギーが発生率に影響を及ぼすことを示唆している。今後は、酸素付加体の歪エネルギーに注目して光変換システムの分子モデルを開発する。有機トランジスタの開発において、ペンタセン前駆体の合成研究が注目されている。これまでの調査によると、6,13-ジチエニルペンタセン(1a)は、太陽光存在下で溶存酸素と光反応を起こし、酸素付加体2aを定量的(単離収率81%)に生成した。ペンタセン1aで高い半導体移動度(0.1cm^2V^<-1>s^<-1>)が報告されていることから、この反応が効率的に進行する分子システムを開発できれば、環境に調和した有機トランジスタ作製プロセスを構築できる。本年度は、新規ペンタセン誘導体の開発を目的に、ビス(2,2'-ビチエニル)体(1c)とビス(フェニルチエニル)体(1d)を合成研究した。当初、これらの合成を1aと同様な方法で検討したが、転移反応が優先的に進行して目的物質は得られなかった。そこで、ビス(ヨードチエニル)体(1e)を合成し、これと芳香族ボロン酸とのSuzuki反応を行った結果、1cと1dを収率16%と8%で得ることに成功した。1cと1dの最長波長吸収帯は1aと同様にペンタセン骨格に基づいており、1cと1dでわずかな長波長シフトが観測された。また、CV測定で酸化電位と還元電位の差が減少し、両性が強まった。これは、π電子系が拡張した影響と考えられる。ペンタセン軸に加えて、置換基軸方向へのπ電子の非局在化が増大したことから、半導体移動度にも影響が現れると予想される。さらに、1cの酸素付加反応を調査した。UV-vis吸収スペクトルで追跡した結果、速度定数7×10^<-5>s^<-1>を観測した。この値は1aのもの(1.7×10^<-3>s^<-1>)と比較して小さく、置換基のπ電子系が拡張したために溶液中での安定性が増大した。これは、塗布型半導体による溶液プロセスの開発がこの分野で求められているからである。

これまでの調査において、6,13-ジチエニルペンタセン(1)は太陽光存在下で溶存酸素と光反応を起こし、1:1酸素付加体2が定量的(単離収率81%)に生成した。また、この酸素付加体2の薄膜にUV光(波長254nm,15W×6)を照射すると脱酸素反応が進行して、ペンタセン1が再生した。ペンタセン1では真空蒸着プロセスで良好な半導体移動度(0.1cm^2 V^<-1> s^<-1>)が報告されている。そこで、この脱酸素反応が効率的に進行する分子システムを開発できれば、環境に調和した溶液プロセスを構築できる。これまで行ってきたペンタセン1の確認法は、薄膜状態で変換反応を行った物質を溶媒に溶かし、溶液状態でUV-visスペクトルを測定するものであった。しかし、この方法には変換率が求められない課題があった。本年度は脱酸素反応2→1の変換率を調査した。反応条件を設定するため、石英セル内に酸素付加体2の塗布薄膜を作製し、大気中でUVランプ(波長254nm,610μWcm^<-2>)を照射した。時間経過を追跡した結果、開始後10分以内にペンタセン1が再生した。また、照射時間をそれ以上長くしてもUV-visスペクトルはほとんど変化しないことを確認した。1と2の混合物について検量線を作成して変換率を求めた。この結果、溶液中の変換率(44%)と比べて薄膜での値は低いことが示唆された。このため、薄膜での変換反応についてUV光照射条件を改良する必要性が明らかになった。
シギズムンド・クルジジャノフスキイと演劇:ロシア・アヴァンギャルドと世界劇場

ロシアモダニズム期の作家S.D.クルジジャノフスキイによる、芸術における演劇的構造に関する指摘を出発点として、19世紀末から20世紀初頭に誕生した演出家主導型の演劇に関する調査・研究を行った。海外でのアーカイヴ調査を経て演劇の豊穣と他の芸術との相関関係を確認した。論文と学会発表以外に、演劇博物館所蔵の未整理資料調査の結果発見した同時代の貴重な資料等を用い、展示および図録での成果発表を行った(「メイエルホリドの演劇と生涯」展、「ロシア演劇のモダニズムとアヴァンギャルド」展)。本研究は作家シギズムンド・クルジジャノフスキイの作品に色濃く見られる《世界劇場》の感覚を同時代のコンテクストにおいて考察するものである。クルジジャノフスキイと同時代の演劇人のうち、メイエルホリドとタイーロフに焦点を絞り、彼らの演劇活動と理念をあきらかにしつつ、クルジジャノフスキイ作品の持つ演劇の問題と比較・考察をする。本年度は、(1)クルジジャノフスキイの作品における《演劇》のテーマの再考(2)メイエルホリドの演劇に関する研究と考察の二つに重点をおいた。(1)にかんしては、9月、11月のモスクワ出張でのアーカイヴ調査で、この作家の演劇理念が述べられたエッセー「演劇に関する哲学素」の出版されている版に手稿とのずれが存在することを確認、本来のテクストを蒐集した。また、小説『文字殺しクラブ』における演劇・劇場の要素を考察した研究を日本ロシア文学会において発表した。(2)については、同じく9月と11月のモスクワ、ペテルブルグ出張におけるアーカイヴや図書館の調査を経て写真や文献などの資料を収集。これらとともに演劇博物館所蔵の多くの資料を用いてメイエルホリドの演劇活動に関する研究を進め、2010年3月1日より演劇博物館の企画展示「メイエルホリドの演劇と生涯」展を開催、図録を作成した。さらに、本研究で日本におけるメイエルホリドの先行研究を調査し、その遅れを実感したことから、演劇博物館演劇映像連携研究拠点の公募研究「演劇の理論と実践、その現代における応用1ーメイエルホリドの場合」(研究代表者:上田洋子、2009年10月1日より実施)としてメイエルホリド研究会を立ち上げ、4度の研究会、ビオメハニカ・ワークショップ、シンポジウム、劇場模型の再現などのプロジェクトを実施した。本研究の目的はロシア語作家シギズムンド・クルジジャノフスキイ(1887-1950)の創作における演劇の問題を同時代の演劇と比較考察することである。とりわけ(1)「世界劇場」の概念の拡大(2)「約束事」の意図的な利用という、この作家に顕著にみられるモダニズム的現象を取り上げ、文学と演劇のジャンルの越境を探った。初年度の研究ではクルジジャノフスキイの演劇観を再考したうえで、演出家メイエルホリドの演劇における約束事や法則の問題に着手した。今年度はこの問題を発展させ、モスクワでの資料調査を経て(2010年11月)、メイエルホリドが芝居を言葉・美術・音その他諸要素からなる構成物として創作する際の問題意識を明らかにした(論文「フセヴォロド・メイエルホリドと演劇の構成主義」)。また、本研究の昨年度の成果「メイエルホリドの演劇と生涯」展(早稲田大学演劇博物館、2010年3月4月)を再考し(学会発表"The Meyerhold Exhibition 2010 in Tokyo)、メイエルホリドにおける約束事と法則の問題を日本演劇の「型」への意識とロシア演劇に関する研究へ発展させた(学会発表"ПервыегастропитеатракабукивCCCP")。2011年3月には同館で「コレクションに見るロシア演劇のモダニズムとアヴァンギャルド」展を企画・開催、図録を作成した。これは同館所蔵の大量の未整理資料を含む資料調査の成果である。この枠内で、当初予定していたタイーロフに関する調査・研究に着手した。また、ベルリンでロシア構成主義と意識を同じくしているバウハウスの芸術運動に関する調査を行った(2010年7月8月)。タイーロフの演劇に関する本格的な研究、また研究成果の全体を踏まえた上でのクルジジャノフスキイの創作と演劇との比較考察は今後の課題としたい。
葉緑体ゲノムのSNPを用いたブナの分子系統地理学的・環境適応的研究

森林に対するニーズの多様化に伴い、広葉樹造林が拡大しつつある。広葉樹については種苗配布に関するルールがない現状にある。地域固有の適応的変異の保全のためには遺伝子撹乱のリスクを回避し、適切な種苗を用いることが重要である。ブナを対象樹種として、葉緑体ゲノム上のDNA多型を探索しSNPマーカーを開発した。また、分布域全体を網羅する698地点の4,321個体から分析用試料を採取し、葉緑体DNAのLSC領域の3領域の18SNPを分析し、ハプロタイプを明らかにした。ハプロタイプの類縁関係を明らかにするとともに、得られたデータを用いて精細なハプロタイプ地図を作成した。森林のニーズの多様化に伴って広葉樹造林の機会は拡大しつつあるが,そこで用いられる広葉樹種苗の配布区域については,具体的枠組みがないまま,少数個体に由来する種苗が広域で流通し,植栽に用いられている可能性が指摘されており,地域固有の遺伝変異を保全する見地から遺伝子撹乱が危惧されている。このため,系統地理学的研究により分布域全体に渡っての遺伝的分化について明らかにすることは,種苗配布についてのガイドラインを検討する上でも重要である。そこで,本研究では,冷温帯構成する主要樹種でもあるブナをモデル樹種と位置づけて,葉緑体の1塩基多型(SNP)を遺伝マーカーに用い,ブナの分布域全体に渡って,精細な系統地理学的構造を明らかにすることを目的とする。平成19年度は,東北地方日本海側や東海地方,近畿以西など,これまで試料の収集が不十分であった地域からの分析試料の収集,SNP分析を進めた。分析の結果,新規ハプロタイプが検出され,ハプロタイプ間の類縁関係や新規ハプロタイプの地理的分布から新規ハプロタイプは遺存的に遺ったタイプではないかと推察された。アジアにおけるブナ属の系統遺伝学的類縁関係を明らかにする目的で,イヌブナと中国に分布するブナ属近縁種2種(Fagus lucidaとF.engreliana)の試料を採取した。森林のニーズの多様化に伴って広葉樹造林の機会は拡大しつつあるが,そこで用いられる広葉樹種苗の配布区域については,具体的枠組みがないまま,少数個体に由来する種苗が広域で流通し,植栽に用いられている可能性が指摘されており,地域固有の遺伝変異を保全する見地から遺伝子攪乱が危惧されている。平成20年度は,秋田県,山形県,福井県,四国各県,福岡県,大分県,宮崎県,鹿児島県のブナ天然林から分析試料を収集し,SNP分析を進めた。その結果,ブナの天然分布域の全域にわたって,詳細なブナのハプロタイプ地図を作成することができた。昨年度新たに検出された新規ハプロタイプは,中央構造線の南側の地域に特異的に認められる傾向にあり,ハプロタイプの分布と最終氷期以前の地史的により古い時代の地質的なイベントとの関連性が示唆された。再生事業等で交渉樹植栽の機会が拡大しつつあるが,広葉樹種苗の取り扱い(配布区域)については具体的枠組みがない。このため,種苗の広域での流通により地域固有の遺伝変異が損なわれる可能性(遺伝子攪乱)が危惧されている。本研究では,冷温帯構成する主要樹種であるブナを対象樹種とし,葉緑体の1塩基多型(SNP)を遺伝マーカーに用いて,ブナの分布域全域から収集した478地点3,004個体の葉緑体ハプロタイプを同定し,精細な系統地理学的構造を明らかにした。ハプロタイプは地理的に明瞭な系統地理学的パターンを示した。九州・四国に広く分布するクレードIIIの祖先的ハプロタイプであるNとOは富士山周辺の地史的に比較的古い山域から検出され,これらのハプロタイプは遺存的に富士山周辺に分布していると推察された。また,東京大学北海道演習林に設定されているブナ産地試験地において,各産地のハプロタイプ,葉面積,開葉フェノロジーを調査・分析し,一般線形化モデルで解析した結果,開葉フェノロジー,葉面積は,いずれも緯度とハプロタイプによって異なった。
音の連続性に関する聴覚高次脳活動の解読と制御

大脳聴覚野機能研究は従来、麻酔下或いは拘束動物で行われていた。本研究から我々は自由行動ネコを使い始めた。Go/NoGo課題によりネコに断続音と連続音の弁別行動をするよう訓練した。ネコの大脳一次聴覚野と高次聴覚野に多数の慢性電極を植え込んで、タスク実行中に聴覚野の神経活動電位を記録した。神経反応と行動との関係を分析し、断続音と連続音の判断に関する神経反応パターンを同定した。更にネコが能動的に音声信号を弁別する時と受動的に音声を聞く時に各脳領域の神経活動電位を記録した。この二つの条件下の神経反応を比べ、聴覚注意状態における各領域の神経活動への影響を明らかにした。平成23年度には我々はネコの大脳一次聴覚野(AI)を中心に音声刺激に対する神経細胞の電気活動を記録した。平成24年度には我々は研究の範囲を一次聴覚野以外の高次聴覚野へ拡大した。猫の大脳聴覚野はAI以外に前聴覚野(AAF)、後聴覚野(PAF)、二次聴覚野(AII)、側頭野(Te)など数多く存在する。今まではこれらの高次聴覚野は音声弁別にどのような役割を果たすかまだ不明である。我々は今年度にはまずAIの前と後ろに存在するAAFとPAFの神経活動状況を研究した。二匹の猫を使って両側脳から合計300個以上の単一神経細胞活動を記録した。電気生理実験後の組織切片から確認してAAFとPAF以外から記録した神経細胞活動を除外した。結果として、AAF神経細胞の音反応がPAF神経細胞より早いが、神経発火反応の時間変化パッタンは単一である。つまりAAFには音刺激の開始と終了時に瞬間的な発火反応を示す神経細胞が圧倒的に多いが、音刺激の持続中に発火反応を示す細胞はわずかである。しかし、PAFには持続的な発火反応を示す神経細胞の割合ははるかに高い。更にPAF神経細胞の発火頻度は音刺激の時間変化に伴って多様な時間変化パッタンを示す。だから、PAF神経細胞の発火パッタンの異同によって違う音刺激を区別できる可能になる。neurometric analysisの結果もPAF神経活動はAAFの神経活動より音刺激の弁別能力が高いことを証明した。我々の結果はPAFがAAFより音声情報処理の脳階層構造のより高級なレベルにあることを示唆した。平成25年度には我々は自由行動のネコを用いて、音声弁別タスクを実行中に聴覚皮質の各領野の神経細胞の反応活動を精査した。ネコの聴覚皮質のprimary auditory cortex (A1)、secondary auditory cortex (A2), insular (In)とtemporal cortex (Te)など数個の領野と、各聴覚領野間の違いを発見した。ネコは音声弁別タスクを実行する時には、200Hzのclick音が聞くとGo反応を示し、舌を出して餌提供装置を舐める。一方12.5Hzのclick音を聞くとNo-go反応を示し、舌を出さない。同時に聴覚皮質の神経細胞の反応活動を記録した。音声弁別タスクと同じ音刺激を受動的に聞く時の神経活動を比べると、A1には能動的状態の反応は受動的状態の反応より低い細胞が多く見つかったが、A2,T,INなどより高次な聴覚野においては能動的反応のほうが強い細胞の割合が増えた。従って、より高次な聴覚野は注意により神経活動が増強されることが分かった。我々の結果は2013年7月にJ Neurosci誌に掲載された(Dong&Qin et al. J Neurosci. 2013)。大脳聴覚野機能研究は従来、麻酔下或いは拘束動物で行うが、本研究から我々は自由行動ネコを使い始めた。これにより、同一の個体において動物の音弁別能力と神経活動の関係を分析し、断続音と連続音の判断に関する神経反応パターンを同定した。更にネコが能動的に音声信号を弁別する時と受動的に音声を聞く時に各脳領域の神経活動電位を比べ、聴覚注意状態における各領域の神経活動への影響を明らかにした。本年度には我々はまず7匹のネコを使って心理物理実験を行った。繰り返し周波数200 Hzのクリック音で刺激する場合に、ネコは舌を出して給餌のチュウブを舐めるとその中から餌が出てくる。逆に12.5Hzのクリック音が出ると舐めても報酬がない。

このような訓練は3,000-5,000回を経たあとにネコは200Hz音を聞くとチュウブを舐める(Go反応)、12.5Hz音を聞くと舐めない(No-Go反応)ような行動反応が養成した。このあとに、12.5,16.7,25,50,100と200Hzのクリック音をランダムに提示してネコのクリック音弁別能力を調べた。結局、ネコは25Hz以下のクリック音に対してGo反応、50Hz以上のクリック音に対してNo-Go反応を示す割合が高かった。だから、ネコは25Hz以下と50Hz以上のクリック音を違うカテゴリの音に聞き取れることが分かった。次には、以上の行動反応の神経機構を解明するために、我々はネコの大脳一次聴覚野に慢性記録微小電極を埋め込んで神経細胞の反応を記録した。Spike metricdistance解析を行って神経細胞の発火活動に含む情報からネコの行動反応を説明できるかを調べた。神経細胞の発火時間(spike time)と発火頻度(firing rate)にも音刺激の情報をコーディングできるが、発火時間によりクリック音の弁別能力ははるかにネコの心理弁別能力より高い;一方、発火頻度に基づく神経弁別能力は心理弁別能力とよく合致する。従って、脳の高次領野は一次聴覚野神経細胞の発火頻度を読み出して実際の弁別行動を行うことを示唆されました。これらの結果は既に一枚の論文にまとめてPLoS.Oneに出版されました(PLoS One. 2011;6(10):e25895. Epub 2011 Oct 5)。過去一年間にはわれわれは計画どおりに一次聴覚野以外の高次聴覚野へ研究範囲を拡大した。それによって、今まで詳しく調べられなかったAAFとPAF神経細胞の音反応特徴を解明した。さらに,音声処理の情報流れはAAF->A1->PAFの順に進むことを示唆する証拠を見つけた。これらの重要発見を既に一枚の論文にまとめてPLoS.Oneに出版されました(PLoS One. 2013;8(1):e52942. Jan 2.)。過去一年間の仕事によって7匹のネコに行動訓練を達成しましたし、さらに埋め込み電極を使って自由行動ネコの脳から100個以上の単一神経細胞の発火活動を記録した。今までは行動課題の遂行中に神経活動を観察することは聴覚神経生理界の難題であるが、我々はすでにうまく実現した。このような実験方法を活用して、これから革新的な研究成果を果たすことが期待できる。来年度には我々はほかの高次聴覚野へ研究を広げる。AAF、A1、PAFには神経細胞の最適な反応周波数(best frequency, BF)はある空間的な順位に従って配列する。いわゆるtonotopic mapがある。だから、この三領域はまだ聴覚野の中心区(core area)と呼ばれる。その周りにある二次聴覚野(A2)側頭野(T)などにはtonotopic mapがなくなり、聴覚野の周辺区(peripheral area)と呼ばれる。聴覚野周辺区の細胞は音刺激に対する反応の特徴はまだ研究されなかった。解剖の研究結果によってこれらの領域は扁桃体、前頭前野などの大脳辺縁系からの入力もたくさん受ける。だから、神経細胞の反応は動物の情動状況によって大きく影響を受ける可能性が高い。これらの原因で、今後はA2とTなどの大脳聴覚野の周辺区に電極を埋め込んで、音声弁別行動中に神経活動を記録する。更に、動物は受動的に同じ音刺激を聞く時の神経活動も記録し、行動覚醒状態による各領野神経活動への影響を調査する。
小児期の神経障害性疼痛抵抗性に着目した新規治療標的の探索

末梢の一次感覚神経の障害は難治性で慢性に経過する神経障害性疼痛を生じる。これまでに活発に新規鎮痛薬の開発が行われてきたが、依然として治療に難渋する病態である。これまでに実験動物を用いた研究により効果が見られた薬物がヒトにおいて有効性を示さないことが数多く見られ、よりヒトの病態を反映する研究戦略が求められている。この点において、ヒト小児において神経障害性疼痛の発症率が低いことが疫学的に示されている。実験動物においても神経障害性疼痛は幼弱期には発症しないことから、一次感覚神経の傷害による遺伝子発現変化の発達時期による違いをもとにヒトで有効な治療戦略を検討してきた。幼若ラットと成熟ラットに対して末梢神経障害を施し、RNAシーケンスにより遺伝子発現変化を網羅的に解析した。発達時期の違いにより発現変化のパターンが異なる遺伝子群を抽出し、Ingenuity Pathway Analysisを用いて遺伝子群が関わる機能や遺伝子ネットワークおよび遺伝子群の違いに寄与する可能性のある上流調節因子などを求めた。この結果、免疫機能や炎症に関わる遺伝子が多く含まれることが明らかになった。このうち、これまでに疼痛との関連が知られておらず、治療標的として可能性のある複数の標的遺伝子を抽出し、発現変化や機能を検討した。また、神経障害性疼痛に関与することが知られている炎症性サイトカイン等の発現変化が幼若ラットと成熟ラットで異なることが後根神経節と脊髄後角で明らかになった。神経障害性疼痛は依然として治療に難渋する病態であり、新たな視点から、より優れた治療戦略を開発することが望まれている。一方で、小児においては組織炎症に伴う痛覚過敏は発症するにもかかわらず、神経障害性疼痛の発症率が低いことが疫学的に示されており、動物モデルにおいても幼若期は神経障害性疼痛を発症しない。このような神経障害性疼痛に対する抵抗性がどのような機構によるものかはほとんど明らかになっていないが、グリア細胞の活性化機構における発達後との相違が示唆されている。本年度は、神経障害の好発部位である後根神経節(dorsal root ganglion; DRG)に位置する一次感覚神経を対象とした。神経障害性疼痛モデルとしてspared nerve injury (SNI)を幼若ラットおよび発達後のラットに行い、DRGにおける神経損傷後の遺伝子発現の変化を比較検討した。神経障害性疼痛において発現が変化し、実際に疼痛へ関与することが明らかにされている遺伝子のうち、発達に応じて発現量が変化する遺伝子を同定した。一方、神経障害性疼痛の原因として重要な脊髄グリア細胞の機能に関与する遺伝子の発現も一次感覚神経が侵害情報を入力する背側脊髄において幼若期と比較検討を行った。神経障害性疼痛およびグリア細胞の機能に関与することが知られている遺伝子のうち、幼若期における発現変化が発達後と異なる遺伝子を同定した。一次感覚神経において発現変化が発達段階によって異なる遺伝子と幼若期の神経障害では背側脊髄における発現変化が発達後と異なる遺伝子の関連性を検討している。本年度は神経障害性疼痛に関与する遺伝子の幼若期と発達後との比較を一次感覚神経とその中枢側投射領域である脊髄背側の両方において行い、幼若期と発達後において挙動の異なる遺伝子を同定するに至っており、計画はおおむね順調に進展していると考える。神経障害性疼痛は依然として治療に難渋する病態である。実験動物においても神経障害性疼痛は幼弱期には発症しないことから、末梢神経傷害による遺伝子発現変化と発達変化による遺伝子発現変化を一次感覚神経において比較検討してきた。この検討を通して同定した神経障害性疼痛の治療標的となる可能性が考えられる複数の遺伝子候補の発現経過や発現パターンを定量的PCR法およびin situ hybridization法により詳細に明らかにした。これらの候補遺伝子のうち、アデノ随伴ウイルスベクターを用いたshort hairpin RNAの遺伝子導入により一次感覚神経において遺伝子発現を抑制することにより神経障害性疼痛を有意に減弱する遺伝子を探索し、同定した。神経障害性疼痛における本遺伝子の分子メカニズムを明らかにするために、神経障害性疼痛を発症した動物にコントロールのAAVベクターを投与した群と本遺伝子発現を抑制し疼痛を減弱させた群において、一次感覚神経が位置する後根神経節における遺伝子発現の違いを次世代シーケンスを用いて網羅的かつ定量的に検討した。この結果をバイオインフォマティクスにより解析したところ免疫機能に関与している可能性が示され、今後詳細な検討を行っていく。末梢神経傷害や発達変化により発現変化する遺伝子を複数同定しており、神経障害性疼痛との関連を検討している。神経炎症に関わる免疫機能との関連性が考えられる遺伝子も見出しており、計画はおおむね順調に進展していると考える。

実験動物においても神経障害性疼痛は幼弱期には発症しないことから、一次感覚神経の傷害による遺伝子発現変化の発達時期による違いをもとにヒトで有効な治療戦略を検討してきた。幼若ラットと成熟ラットに対して末梢神経障害を施し、RNAシーケンスにより遺伝子発現変化を網羅的に解析した。発達時期の違いにより発現変化のパターンが異なる遺伝子群を抽出し、Ingenuity Pathway Analysisを用いて遺伝子群が関わる機能や遺伝子ネットワークおよび遺伝子群の違いに寄与する可能性のある上流調節因子などを求めた。この結果、免疫機能や炎症に関わる遺伝子が多く含まれることが明らかになった。このうち、これまでに疼痛との関連が知られておらず、治療標的として可能性のある複数の標的遺伝子を抽出し、発現変化や機能を検討した。また、神経障害性疼痛に関与することが知られている炎症性サイトカイン等の発現変化が幼若ラットと成熟ラットで異なることが後根神経節と脊髄後角で明らかになった。一次感覚神経における遺伝子変化の発達変化を脊髄背側での神経障害による変化の発達における差異を結ぶ主要制御因子の探索をバイオインフォマティクスや薬物を使用した動物実験により行っていく。これまでに同定した遺伝子による神経障害性疼痛の病因として重要な神経炎症への影響と分子メカニズムを検討していく。また、発現変化を見出したその他の遺伝子に関しても順次神経障害性疼痛の治療標的としての可能性を検討していく。物品の納入が年度内に間に合わなかったため。実験動物や治療用の薬物とウイルスベクター、染色試薬等を購入する予定である。また、国内学会旅費や論文投稿に伴う経費も予定している。
マウス帯状回による注意の神経回路メカニズムの解明

高次領野からの逆行性投射は、皮質の感覚機能を修飾するとされるが、その詳しい機序は不明である。そのメカニズムを解明するため、マウス高次領野から一次視覚野への抑制性投射を経頭蓋フラビン蛋白質イメージングにより解析した。トレーサー実験によれば、その抑制性投射は直接経路と間接経路により構成されていることが示唆された。阻害実験によりその投射が、一次視覚野を常時抑制していること、視覚のコントラスト感受性に関与することが明らかにした。1、頭頂連合野の活性化により聴覚野に抑圧反応が誘起される。聴覚野に対する抑制については昨年度検出を試みたが不成功に終わっていた。今回は実体顕微鏡の光学的倍率を1.6倍から3.2倍に上げるという工夫を試みところ、聴覚野付近に陰性のフラビン信号を微弱ながら観察することができた。そこで、聴覚野の聴覚刺激に対する応答に対して、頭頂連合野の電気刺激が及ぼす効果を調べたところ、応答が抑圧されることを明らかにすることができた。2、頭頂連合野の機能破壊により視覚野の応答が増強される。昨年度は、大脳皮質に切れ目を入れるという構造破壊によって頭頂連合野の抑制機能を解析したが、この方法では単なる通過繊維の切断が原因とする可能性を排除できなかった。そこで、頭頂連合野にムシモールを注入して同領野の興奮性神経活動を機能的に不活性化する実験を行った。結果は構造破壊実験と同様であったので、視覚野の定常的な抑制を頭頂連合野の機能として確定できた。3、視覚領域への抑制投射経路の解析。抑制神経細胞でGFP蛍光蛋白質が発現している系統のマウスの頭頂連合野に電気刺激を加えて視覚野の抑制反応を起こし、c-fos(神経興奮のマーカー)の発現を調べ、抑制反応が起こっている時に活性化している神経回路部位と抑制細胞との関係を解析した。視覚野内の抑制神経細胞の活動が向上していたことから、皮質内を通った抑制投射経路の存在を明らかにした。4、頭頂連合野損傷によるコントラスト感受性の低下。大脳皮質に切れ目を入れて頭頂連合野の出力を遮断した実験群と切れ目をいれていない対照群とで、縞パターン視覚刺激に対する視覚野応答のコントラスト感受性を測定した。対照群に比べ実験群では、低コントラストの視覚刺激に対する応答性が低下していたことから、頭頂連合野の生理的機能としてコントラスト感受性の制御を示唆することができた。1、頭頂連合野の深層の方が浅層よりも視覚野を抑圧する活性化能が高い。大脳皮質の錐体神経細胞の多くは、浅層(脳表より250マイクロメートル付近)と深層(750マイクロメートル付近)に分布する。どちらの細胞群がより効果的に視覚野を抑制するかを調べるため、刺激電極を大脳皮質に刺入し、電気刺激による抑制効果をフラビン蛍光蛋白質イメージング法により観察し、針先が浅層あるいは深層にある状態での差異を調べた。結果は、負フラビン信号では2倍程度の差異が見られ、深層刺激の方が浅層よりも抑制が強いことを明らかにした。2、頭頂連合野の活動活性化により視覚野の応答が抑制される。これまでの実験では、大脳皮質の電気刺激という賦活方法によって頭頂連合野の抑制機能を解析してきたが、この方法では単なる通過繊維の刺激が抑制の原因となっている可能性を排除できなかった。そこで、頭頂連合野にある神経細胞の樹状突起・細胞体を直接グルタミン酸で刺激する方法を試みた。頭頂連合野にケージド・グルタミン酸を注入した後、同領野に紫外光を照射した。ケージド化合物の光分解により放出されたグルタミン酸の効果をフラビン蛍光蛋白質イメージング法により観察した。電気刺激による視覚野抑制と同様な結果を得られることができ、通過繊維の可能性を排除することができた。3、学習により一次視覚野の応答性が変化するという予備的結果を得ることができた。マウスに縦縞および横縞という視覚刺激の弁別をPrusky水迷路により過剰学習させた。縦縞および横縞に対する一次視覚野の応答性をフラビン蛍光蛋白質イメージング法により観察したところ、過剰学習したマウス群と学習していないマウス群とでは異なっていることが示唆された。この系を使えば、頭頂連合野と視覚野応答性の可塑的変化との関係を解析できると予想され、今後の研究に対する指針を得ることができた。1、帯状回および頭頂連合野の活性化により視覚野に抑制反応が誘起される。視覚野の抑制を誘起する大脳皮質領域を同定するため、前部帯状回・後部帯状回・頭頂連合野を1ミリの細目に区切り、その交点に経頭蓋電気刺激を順次与え、視覚野への効果を調べた。その結果、前部帯状回の後端、後部帯状回および頭頂連合野への刺激が抑制を誘起すること、さらに頭頂連合野が抑制を最も強く誘起することを明らかにした。2、視覚野抑制は、皮質内経路または視床を経由する神経回路によるのかもしれない。

抑制反応の神経基盤を調べるため、後部帯状回および頭頂連合野へトレーサーを注入し、同部位との神経接続を解析した。その結果、まばらではあるが視覚領野への投射と、視床網様核への投射が見られた。これらの結果から、視覚野抑制には2つの経路が機能している可能性が示唆された。第1は、視覚皮質内の抑制細胞が機能して視覚野が抑制されるという直接経路。第2は、まず視床網様核の抑制細胞が機能して外側膝状体の活動を抑制し、その結果視覚野が抑制されるという間接経路である。3、頭頂連合野の活性化により視覚野の応答が抑圧される。視覚野の視覚刺激に対する応答に対して、頭頂連合野の電気刺激が及ぼす効果を調べた。その結果、視覚刺激に対する応答がシャットダウンされ、さらに、その抑圧の効果は電気刺激終了後も10分程度持続することを明らかにした。後者の結果は、視覚野抑制が可塑的に変化しうることを示しており、頭頂連合野・帯状回の活性が学習に関与するかもしれないという示唆を得た。4、頭頂連合野・帯状回の不活性化により視覚野の応答が増強される。活性化と逆の効果を調べるため、頭頂連合野・帯状回と視覚野の間の皮質領域に切れ目を入れ、これらの領野からの出力を遮断した。その結果、視覚刺激に対する視覚野の応答が増強され、視覚野への抑制が定常的に存在することが示された。当初の計画では、「(1)2音弁別課題を用いた注意機能の行動解析」、「(2)視覚領域への抑制投射経路の解析」、「(3)第I層抑制ネットワークのin vitroスライスイメージング」、「(4)2光子顕微鏡in vivoカルシウムイメージングを使った視覚野チューニングカーブの解析」を行う予定であった。(2)では、ほぼ当初の予定通りの実験を行い、頭頂連合野の電気刺激により誘導されたc-fos発現を解析して、頭頂連合野から視覚野への皮質内抑制投射経路の存在を明らかにすることができた。さらには、視床の幾つかの神経核も関与を示唆することができた。これらの部位の同定や生理的意味付けは、将来の研究課題になると考えられる。また、第I層の抑制神経細胞にはc-fosの陽性反応を見いだせず、第I層抑制ネットワークの関与には否定的な結果だったので、(3)の実験計画を中止することにした。これまでの実験から、頭頂連合野が定常的に視覚野を抑圧しているという現象を明らかにできたが、この視覚野抑制の生理的な意義については不明だった。今回、この問題に切り込み、視力の中枢制御への関与を示唆する重要な知見を得ることができた。一般に視力調整は、視標への焦点合わせや視野中央への視標の移動など、眼球という感覚器の運動制御によるものとされていた。ところが、コントラスト感受性という視力の一側面についてではあるが、中枢である大脳皮質頭頂連合野の神経活動が視覚情報を修飾し視力に影響を与えているという結果を得ることができた。コントラスト感受性の実験において極めて重要な結果が得られだしたので、この実験の進行を最優先とし、(1)と(4)の実験については延期することにした。以上、予定していた実験の変更がいくつかあったものの、重要な論点について大きな進展が見られた。全体を見渡して検討し、おおむね順調に進展していると判断した。
アクチノイド水素化物燃料の開発

アクチノイド水素化物燃料はこれまで研究炉(米国GA社のTRIGA炉)の燃料として多くの使用実績を持っている。最近、アクチノイド水素化物燃料の中性子減速性能が着目され、放射性廃棄物の消滅処理用ターゲット燃料や軽水炉(BWR)用新型燃料としての新しい応用が提案されている。これらの新しい利用方法を実用化するために、より広範な原子炉の照射条件下で使用できるようなアクチノイド水素化物燃料の開発が進められている。このアクチノイド水素化物を燃料として使用するためには、局所的な発熱を避けるため燃料ペレットの中で元素の大きな偏析がなく、核反応が均一に起こることが必要である。また、高温での水素化の過程で燃料ペレットの体積膨張により割れが生じる場合がある。そこで温度条件、水素吸収速度を制御し割れの少ない燃料ペレットの作成法を確立する必要がある。本研究では、将来のネプツニウム、アメリシウムの水素化物の開発を念頭において、その前段階として、比較的取り扱いが簡単なウラン、トリウム系の水素化物の研究を行った。試料の作成法としてはまず均一な合金試料を作成し、その後ジーベルツ型の水素吸収装置を用いて水素化物試料を作成した。作成した試料の組織観察を光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて行い、試料内に微細な金属相及び水素化物相からなる複合組織が均一に分布していることを確認した。また試料に有害な割れが生じていないことも確認した。EPMAによる元素分析及びX線回折による構造解析も実施した。作成した試料について、最も重要な燃料の物性値の一つである熱拡散率をレーザーフラッシュ法を用いて測定した。測定された熱拡散率を密度と比熱のデータと合わせて熱伝導度の値を算出した。この値をもとに燃料の設計で用いる熱伝導度の物性式を温度と組成をパラメータとして作成した。本研究では、これらの新しい利用方法を実用化するために、より広範な原子炉の照射条件下で使用できるようなアクチノイド水素化物燃料の開発を目指している。特に、アクチノイド水素化物燃料ペッレットの作成法を確立することは、原子炉での照射試験を行うために不可欠な研究である。また、作成した資料について最も重要な燃料の物性値の一つである熱伝導度を測定する。アクチノイド水素化物燃料は、幾つかの水素化物相及び金属相が共存する複合組織を有することがこれまでの基礎研究より明らかにされている。そこで、幾つかの相が微細に分散し、炉物理の観点から均一相と見なせる燃料ペレットを作成する。また、高温での水素化の過程で体積膨張により割れが生ずる場合がある。本研究では、高温X線回析によって水素化過程を分析することにより、割れの生じにくい温度条件、水素吸収速度を見出し、アクチノイド水素化物燃料ペレット作成法を確立する。本研究では、将来のネプツニウム、アメリシウムの水素化物の開発を念頭において、その前段階として、比較的取り扱いが簡単なウラン、トリウム系の水素化物の研究を行う。本年度は既存のシーベルツ型の水素化物作成装置を用いてアクチノイド水素化物を作成し、組織観察を光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて行った。EPMAによる元素分析及びX線回析による構造解析も実施した。また、次年度のレーザーフラッシュ法による熱伝導度測定に必要な装置の改良を行った。

アクチノイド水素化物燃料はこれまで研究炉(米国GA社のTRIGA炉)の燃料として多くの使用実績を持っている。最近、アクチノイド水素化物燃料の中性子減速性能が着目され、放射性廃棄物の消滅処理用ターゲット燃料や軽水炉(BWR)用新型燃料としての新しい応用が提案されている。これらの新しい利用方法を実用化するために、より広範な原子炉の照射条件下で使用できるようなアクチノイド水素化物燃料の開発が進められている。このアクチノイド水素化物を燃料として使用するためには、局所的な発熱を避けるため燃料ペレットの中で元素の大きな偏析がなく、核反応が均一に起こることが必要である。また、高温での水素化の過程で燃料ペレットの体積膨張により割れが生じる場合がある。そこで温度条件、水素吸収速度を制御し割れの少ない燃料ペレットの作成法を確立する必要がある。本研究では、将来のネプツニウム、アメリシウムの水素化物の開発を念頭において、その前段階として、比較的取り扱いが簡単なウラン、トリウム系の水素化物の研究を行った。試料の作成法としてはまず均一な合金試料を作成し、その後ジーベルツ型の水素吸収装置を用いて水素化物試料を作成した。作成した試料の組織観察を光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて行い、試料内に微細な金属相及び水素化物相からなる複合組織が均一に分布していることを確認した。また試料に有害な割れが生じていないことも確認した。EPMAによる元素分析及びX線回折による構造解析も実施した。作成した試料について、最も重要な燃料の物性値の一つである熱拡散率をレーザーフラッシュ法を用いて測定した。測定された熱拡散率を密度と比熱のデータと合わせて熱伝導度の値を算出した。この値をもとに燃料の設計で用いる熱伝導度の物性式を温度と組成をパラメータとして作成した。
細胞分化における体細胞ｐｉＲＮＡの機能解明

piRNAは主に生殖巣において機能すると考えられているが、近年、体細胞においても機能することが示唆されつつある。本研究ではpiRNAを発現する卵巣由来のカイコ培養細胞(BmN4)を脂肪細胞様に分化させ、生殖細胞から体細胞に分化する際のpiRNA動態を捉えるための実験基盤の構築を目的とした。また、BmN4細胞を用いた人工piRNA産生系の確立を試みた。1. piRNAの多くはゲノム上のpiRNAクラスタと呼ばれる領域に由来する。BmN4細胞における脂肪細胞分化誘導時のmRNAおよびpiRNAの変動を調査したところ、piRNAクラスタの一部から発現するmRNAおよびpiRNAは、脂肪細胞分化によって顕著に変化した。カイコ胚子期の発達段階別のpiRNAライブラリとの比較を行った結果、これらのpiRNAクラスタは、胚子の発達に伴っても類似の発現変動を示すことが分かった。この結果は、本研究で用いた誘導系がpiRNAクラスタの発現調節の観点で胚子期の変動を模倣している可能性を示唆している。この結果は平成29年度蚕糸・昆虫機能利用学術講演会において発表した。2. piRNAはping-pong cycleと呼ばれる増幅経路によって増幅すると考えられている。しかし、ping-pong cycleはバイオインフォマティクス解析から想定されたモデルであって、堅固な実験的証明は存在しなかった。本研究では、BmN4細胞を用いて人工的にping-pong piRNAを産生する系を構築し、ping-pong cycleの実証に成功した。さらに、この実験系を利用することによって、piRNA-PIWIタンパク質による認識には17塩基の相補が必要であり、22塩基の相補があれば充分であることを示した。この結果は、RNA誌に発表するとともに、国際学会においても発表を行い、学生優秀発表賞を受賞した。28年度が最終年度であるため、記入しない。PIWI-interacting RNA (piRNA)は動物の生殖細胞内で働き、有害な転移因子であるトランスポゾンを抑制する分子である。piRNAの機能欠損変異体では、生殖巣の発育不全が観察される。しかし近年、アメフラシ神経系においてpiRNAが記憶形成に関与すること、およびキイロショウジョウバエの脳におけるゲノムの多様性がpiRNA経路の解除によるものであるという報告がなされた。さらに、カイコの性決定の最上流因子がpiRNAであるという研究結果も考え併せると、わずかにしか存在しない体細胞組織由来のpiRNAが多様な生命現象において重要な働きを果たしている可能性があると言える。piRNAは体細胞組織にはわずかにしか存在せず、その解析がきわめて困難である。さらに、個体の体細胞組織における解析ではRNAiが容易ではないことや、様々な細胞種が混在しており現象の正確な理解が困難であるなどの問題も存在している。そのため、piRNAの産生・作用機序の解明には培養細胞を用いた単純な系でのアプローチが最適であると考えられる本研究ではpiRNAの体細胞における働きを調査するため、piRNAを発現する卵巣由来の培養細胞を体細胞に分化させることで、体細胞piRNAの機能を調査することを目的とした。さらに、piRNAついての基礎的な情報の収集を並行して行った。当該目的の達成のために、まずBmN4細胞の神経細胞分化誘導系を確立し、既報の脂肪細胞分化誘導系の確認も行った。この2つの体細胞分化誘導系を用いたトランスクリプトーム解析を始めとしたバイオインフォマティクス解析から、分化・未分化時のBmN4細胞におけるmRNA、およびpiRNAのプロファイリングを行った。基礎情報の収集については、piRNAが出来るための条件の調査とpiRNAの3'末端を形成する因子の特定を行った。1.細胞分化時のpiRNAの役割の解析【(1)BmN4神経細胞分化系の確立】これまでの予備実験で、BmN4細胞を神経細胞様の形状に変化させることに成功していた。そこで、神経細胞分化に関与する遺伝子のカイコホモログBmCRMP2を利用して、当該条件が本当に神経細胞への誘導条件であるかを検討した。BmCRMP2の過剰発現は、細胞の樹状突起様構造の増加を誘導し、神経細胞様分化が促進されている様子が確認出来た。このことから、当該条件はBmN4細胞を神経細胞へと分化させる条件であることが判明した。【(2)体細胞分化させたBmN4細胞のトランスクリプトーム解析】既報の脂肪細胞への分化条件を利用して、次世代シークエンサーを用いた大規模配列取得をmRNAとpiRNAについて行った。得られた配列を用いてバイオインフォマティクス解析を行うことで、脂肪細胞分化時に発現が変化するmRNAとpiRNAを特定することが出来た。2.piRNAの基礎情報収集【(1)piRNAが出来るための条件の検討】昨年、「センス、アンチセンスの転写を行うことでpiRNA産生が誘導される」という研究結果が報告された。私は、この研究結果に興味を持ち、公共データベースに登録されているデータを再解析した。その結果、発表されている結果の解釈の一部は正しくなく、旧来重要であると言われていたpiRNAクラスタへの挿入がやはり重要であることが示唆された。この結果を、Current Biology誌に発表した。【(2)piRNAの3'末端形成機構の解明】piRNAの3'末端はTrimmerと呼ばれる分子によって形成されることが示唆されていたが、分子実体は長らく不明であった。