hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光情報の伝達と発現機構の研究

本研究の目的は、情報としての光が光受容体に吸収された後、生理現象が発現されるまでの反応鎖を解明することである。シダ原糸体細胞における光屈性と偏光屈性は、原糸体亜先端部両側間におけるPfrの濃度の差によってその方向が制御されること、さらに、Pfrは急速にPrに変換された後再びPfrに変換されることが示唆された。また屈性誘導には細胞表層に存在する微小管の配向が、重要な役割を担っていることが明らかにとなった(和田)。イネ・フィトクロム遺伝子をタバコに導入した組換えタバコ植物体にはタバコ・フィトクロムの5倍量のイネ・フィトクロムが合成され、弱光下で下胚軸の伸長抑制に働いていることが示唆された(長谷)。エンドウ・フィトクロム遺伝子の上流域をβーグルクロニダーゼの遺伝子につなぎ、ペチュニアに導入、転写活性を調べた。その結果、フィトクロム遺伝子は暗黒中で明条件下での約50250倍の転写活性を持つことが分かった(米田)。クラミドモナスのカーボニックアンヒドラーゼの遺伝子を解析した。この酵素には2つの遺伝子(CAH1,CAH2)が存在し,タンデムに並んでいた。CAH1mRNAの誘導にはCO_2濃度の低下と光が必須である。一方CAH2mRNA量は極く微量であり、またCAH1の転写パターンとは逆であった(福沢)。紫外線UVーBによってアントシアン合成が誘導されるヤグルマギクのカルスを使用し、アントシアンが植物の紫外線による傷害の防護に役立っていることを明らかにした。UV-C、UV-BによるDNA損傷ピリミジンダイマーの生成がアントシアン合成に伴ない抑制された(大西)。脊椎動物視細胞のトランスデューシンのT_2サブユニットはRas蛋白質に共通なC末端アミノ酸配列を持ち、さらに疎水性分子によって修飾されていることが示唆された(秋野)。また明順応に伴なうカルシウム濃度低下がホスホジエステラーゼの活性に作用することが分かった(河村)。
現代粉体技術が作り出す超微粒子天然鉱物の日本画表現への応用研究と科学的検証

平成30年度の研究においては、主にアズライト粉砕によるサブミクロン領域粒子の製造と、菱田春草の未発表画の借り受けなど研究制作の準備から始めた。日本画画材屋「喜屋」よりアズライトから製造されている天然群青白番を様々な原産地のものを取り寄せ、最も発色に優れたアメリカ原産のものを用いることに決定し、様々な粉砕時間を試しながらサブミクロン化した原料の発色を調べた。ここで問題になったのは、4個がけ遊星ボールミル長時間粉砕による緑変と灰色化である。そこで大阪大学の接合科学研究所の内藤牧男教授との共同研究において、現在考えうる最良の色彩と粒子径とのバランスを見出し、研究制作に必要な岩絵具の製造準備が整った。現在考えうる最小の粒子径は200nm付近であり、それより微細な粒子製造には時間を必要となるため、本研究においては200nmで最良の色彩を製造することに目標を定めた。菱田春草の作品借り受けについては、飯田市美術博物館の協力を得て、9月に全部で4点の未発表画を借り受け、調査のためのサンプル画作りや本学所有の蛍光X線分析計を用いての予備分析を行なった。未発表画4点の蛍光X線分析及び分光測色については、外部研究機関での委託調査目指したが、金銭的理由と歴史的価値のある作品の取り扱い上の理由などで未だ調査は行われていないが、分光測色については本学内の測色計で対応が可能であることが分かり、来年度早々に調査をすることになる予定である。アズライトのサブミクロン粒子化については、当初予定していた微粒子化するにつれ深くなる発色をより洗練させるための基礎実験を行なったのだが、いずれの実験においても当初予定していた発色を得ることができなかった。結果として現在まで本学で行われてきた研究において得られた結果の科学的検証を行う必要に迫られた。そこで、原材料の産地の違いによる色彩の違いや、粉砕時間や遊星ボールミルの回転速度を変化させて基礎開発に時間を使うことになった。これは原料にばらつきがある天然無機顔料の性質ゆえの結果と言える。最初に用意すべきサブミクロンアズライト顔料の製造に1年を費やしている現状と、それとは逆にそれ以外の準備が予定内で進んでいることを考え、やや遅れていると判断をした。初期研究の遅れについては以下のようなタイムスケジュールを立て来年度の6月中に色材を用意するよう調整中である。アシザワファインテック株式会社の協力を得て具体的に製造日の調整を行なっている。菱田春草の未発表画の分光測色については、本学において来年度5月中の検査、8月以内での専門教授による分析が行われる。更に6月中に製造が完成するサブミクロンアズライト顔料による模写も6月より行われ、更に春草未発表作品4点より1点を選んでの表装が来年度9月から半年の予定で行われる。更にタイ、中国の提携大学での提供作品制作もおこなわれることから、渡航準備に取り掛かっている。タイへは9月中に訪れ、中国については、サブミクロンアズライト顔料を送ることでのコスト削減を考えて調整を進めている。個々の研究は予定通りに戻りつつある。

初期研究の遅れについては以下のようなタイムスケジュールを立て来年度の6月中に色材を用意するよう調整中である。アシザワファインテック株式会社の協力を得て具体的に製造日の調整を行なっている。菱田春草の未発表画の分光測色については、本学において来年度5月中の検査、8月以内での専門教授による分析が行われる。更に6月中に製造が完成するサブミクロンアズライト顔料による模写も6月より行われ、更に春草未発表作品4点より1点を選んでの表装が来年度9月から半年の予定で行われる。更にタイ、中国の提携大学での提供作品制作もおこなわれることから、渡航準備に取り掛かっている。タイへは9月中に訪れ、中国については、サブミクロンアズライト顔料を送ることでのコスト削減を考えて調整を進めている。個々の研究は予定通りに戻りつつある。サブミクロンアズライト顔料の基礎研究に一年を要したことが本年度予算の多くを執行出来なかった理由である。来年度にはタイへの海外出張の予定もあり担当者、分担者ともに使用することになる。
自己免疫性肝疾患の病態・治療効果・予後と遺伝子多型および発現蛋白の網羅的解析

日本人自己免疫性肝炎の長期予後の現状を解明するため、患者間および日本人の平均寿命と比較検討した。再燃を繰り返すことが、予後悪化の原因であり、適切な免疫抑制療法、特に1度再燃後の治療が重要である。病態に関しては、多くのサイトカインが複雑に関与しているが、特に、向炎症性およびTh17系細胞の関与とIL12p40による制御性T細胞の抑制の関与が示された。原発性胆汁性肝硬変の疾患感受性、抵抗性に関しては、HLA-DR-DQハプロタイプ、およびいくつかの遺伝子多型の関与が、GWASを含めた解析で明らかになった。1.自己免疫性肝炎および原発性胆汁性肝硬変患者の長期予後のデータ解析を行い、自己免疫性肝炎に関しては日本肝臓学会総会で発表し論文投稿中である。2回以上の再発を繰り返さなければ予後は一般人と変わらないとの結論をえた。また、自己免疫性肝炎の遺伝的背景を今までのわれわれの研究成果をもとにレビューした招待公演を日本消化器病学会総会時に行われたInternational Forumで行った。2.自己免疫性肝炎感受性遺伝子のゲノムワイドアソシエーション解析(genome-wide association study: GWAS)を行い、有意差のある遺伝領域近傍に存在する遺伝子のSNP構造を検索中である。原発性胆汁性肝硬変においては、国立病院機構長崎医療センターとの共同研究の一環として行っている。3.原発性胆汁性肝硬変の病態と遺伝子多型の関連では、マイクロサテライト解析を用いたゲノムワイド解析を行いヨーロッパ肝臓学会、日本肝臓学会総会にて発表し、A2BP1が新たな疾患感受性遺伝子であることを論文発表した。さらに原発性胆汁性肝硬変の疾患感受性や病態とCTLA4遺伝子多型との関連も学会発表および論文発表した。4.自己免疫性肝炎発症時と治療後の患者血清中の30種類のサイトカイン・ケモカインを同時測定し、サイトカインと病態との関係を明らかにし、肝臓学会東部会で発表し、論文は受理されている。5. IgG4関連疾患は現在注目を集めており、自己免疫性肝炎の一部にIgG4高値例が存在すること、自己免疫性肝炎の中での比較検討を行い報告し、論文発表を行った。23年度の実績1.自己免疫性肝炎の症例収集とデータ解析では、愛媛大学からの症例と合わせ200例を超える長期観察例の臨床データ、長期予後、発がん、遺伝的因子を解析して、雑誌「Hepatology 2012」にアクセプトされた。原発性胆汁性肝硬変に関しても疾患感受性とHLAの関連を詳細に検討し、雑誌「Hepatology 2012」に掲載された。2.自己免疫性肝炎のゲノムワイドアソシエーション解析(GWAS)は、当科症例のデータは解析中である。現在のところ、有意な遺伝子領域はいくつかあるが、それほど強い関連を示すものはない。当科の症例数が少ないため、厚生労働省難治性肝疾患研究班での共同研究が進行中である。3.原発性胆汁性肝硬変に関しては、長崎医療センターおよび国立病院機構肝疾患研究班と共同で、CTLA4とSLC4A2と疾患感受性について報告した(J.Gastroenterol2011)。同疾患のGWASに関しては、上記施設と共同研究が進行中である。4.サイトカイン・ケモカインの解析に関しては、蛍光マイクロビーズアレイシステムLABScanTM100 with XYPで30種類以上を網羅的に解析、自己免疫性肝炎の発症にかかわる数種類を同定し、ネットワーク解析を発表した(Hepatol Res 2011)。その後、より詳細な、肝炎の発症から治療介入を経時的に解析している。24年度の実績1.自己免疫性肝炎のゲノムワイドアソシエーション解析(GWAS)については、当科症例のデータは投稿中である。自己免疫性肝炎の症例収集とデータ解析では、愛媛大学からの症例と合わせ200例を超える長期観察例の臨床データ、長期予後、発がん、遺伝的因子を解析して、雑誌「Hepatology 2012」に掲載された。3.サイトカイン・ケモカインの解析に関しては、蛍光マイクロビーズアレイシステムLABScanTM100 with XYPで30種類以上を網羅的に解析、自己免疫性肝炎の発症にかかわる数種類を同定し、より詳細な、肝炎の発症から治療介入を経時的に解析し、現在論文作成中である。23年度に計画された目標のうち、ゲノムワイド解析以外は論文となり、とくにHepatologyの2本の論文は高く評価されている。免疫関連蛋白であるサイトカインの解析も論文となり、さらに研究を進めている。以上より、おおむね順調に進展していると判断される。24年度が最終年度であるため、記入しない。自己免疫性肝炎は症例数が少なく、ゲノムワイド解析は多数の施設の参加が必要である。現在、厚生労働省難治性肝疾患研究班で全国規模の解析が行われている。

その結果として、重要な遺伝子が発見された時には、当科で長期にわたって集積した症例を使ってより詳細な解析を行うことができる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
質量顕微鏡法を用いた肝細胞癌における脂質代謝異常の解明

肝細胞癌37例を対象に質量顕微鏡法を用いて脂質解析を行った。肝細胞癌と隣接非癌部においてリン脂質の分布が異なっていた。リン脂質の分布が異なる原因として、リン脂質のリモデリング酵素(LPCAT)の発現を確認したところLPCAT1の発現が癌部において増加していた。2種類の肝細胞癌細胞株に対してLPCAT1の遺伝子発現を抑制したところ、コントロールの細胞と比較してリン脂質の組成に変化が生じ、増殖が抑制され、浸潤・遊走供に抑制された。次にLPCAT1を過剰発現させたところ、細胞増殖や浸潤能が増加することが確認された。「研究の目的」質量顕微鏡法を用いて肝細胞癌手術摘出標本の癌部と隣接非癌部における脂質分布の違いを明らかにし、発癌や癌の進展における脂質合成・代謝経路の関与を解明する。「研究の成果」肝細胞癌37例(C型肝炎由来25例、B型肝炎由来7例、非B非C5例)を対象に質量顕微鏡法を用いて解析を行った。解析により、肝細胞癌と隣接非癌部においてリン脂質の分布が異なることが判明した。また肝細胞癌であってもC型肝炎由来、B型肝炎由来、非B非C肝細胞癌で同じような分布を示すわけではなく、リン脂質の分子種によっては分布が異なることも明らかになった。癌部と隣接非癌部においてリン脂質の分布が異なる原因として、リン脂質のリモデリング酵素であるLysophosphatidylcholine acyltransferase (LPCAT)の発現が変化していると推測し、4種類のサブタイプの発現をRT-PCRで確認したところLPCAT1の発現が癌部において増加していることが明らかになった。またLPCAT1に関してはWestern blottingにて蛋白レベルでも発現が増加していることが明らかになった。LPCAT1の肝細胞癌に対する影響を調べるために、2種類の肝細胞細胞株(Huh7,HepG2)に対してsiRNAを用いてLPCAT1の遺伝子発現を抑制したところ、Huh7細胞では増殖が抑制された。また、細胞の浸潤・遊走に関してmigration assayとinvasion assayを行ったところHuh7細胞では浸潤・遊走供に抑制され、HepG2細胞では遊走が抑制された。次年度は、LPCAT1を過剰発現させた場合に細胞増殖や浸潤能に変化が生じるのか確認する。癌部と隣接非癌部においてリン脂質の分布が異なる原因として、リン脂質のリモデリング酵素であるLysophosphatidylcholine acyltransferase(LPCAT)の発現が変化していると推測し、4種類のサブタイプの発現をRT-PCRで確認したところLPCAT1の発現が癌部において増加していることが明らかになった。LPCAT1の肝細胞癌に対する影響を調べるために、2種類の肝細胞細胞株(Huh7, HepG2)に対してsiRNAを用いてLPCAT1の遺伝子発現を抑制したところ、コントロールの細胞と比較してリン脂質の組成に変化が生じた。LPCAT1のノックダウンにより、2種類の細胞ともに増殖が抑制された。また、細胞の浸潤・遊走に関してmigration assayとinvasion assayを行ったところ浸潤・遊走供に抑制された。次にLPCAT1を過剰発現させた細胞で同様の実験を行ったところ、細胞増殖や浸潤能が増加することが確認された。次年度は、この研究成果を論文としてまとめ発表する予定である。最終年度に予定していた論文発表に向けて、研究の成果が得られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究成果を論文発表する。
古細菌プロテアソームによる神経変性疾患の治療

平成20年度はこれまでに我々が培養細胞を用いた実験によって得られた「古細菌のプロテアソームが共に発現させた変異SOD1等の細胞毒性をもつ蛋白質を変異体選択的に分解し、その細胞毒性を軽減する」効果を個体レベルにて確認することが目的であり、古細菌のプロテアソームを発現するトランスジェニックマウスと変異SOD1を発現するトランスジェニックマウスのダブルトランスジェニックマウスを作成し、運動機能、生命予後について検討した。まず古細菌のプロテアソームを安定的に発現するラインを2ライン確立させた。変異SOD1 (G93A)を安定的に発現するライン(既存)との交配により安定的に両蛋白質を発現するダブルトランスジェニックマウスのライン(G93A/psm)を3ライン作成した。以後それぞれのラインのマウスの運動機能をロータロッド、ハンギングワイヤーで比較、また体重の推移、死までの日数を比較した。ロータロッドでは16rpm3分間にてG93A/-, G93A/psm, -/psmそれぞれn=22, 20, 18で落下までの日数に有意差は得られず(105日±14日(G93A/-)、110日±12日(G93A/psm))、ハンギングワイヤーも同様有意差は得られず、また、生存曲線にも有意差は得られなかった(128日±5日(G93A/-)、130日±8日(G93A/psm))。今後は古細菌のプロテアソームを用いるアプローチについて根本的な再考が必要であると考えられた。神経変性疾患には神経細胞内に異常な蛋白質凝集体をみとめるものが多く、本研究で主に扱う家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)の他にも、孤発性の筋萎縮性側索硬化症(ALS)やパーキンソン病、アルツハイマー病等、多岐に渡っている。これらの疾患では神経細胞を死に至らしめる各種疾患に共通する病態メカニズムが存在していると想定されている。今回我々が用いた古細菌のプロテアソーム(PS)は真核細胞のPSの祖先にあたり、その構成は単純だが、in vitroにおける作用は真核細胞のPSに比べて強力であると報告されている。まず、古細菌Methanosarcina mazeiのPS (Mm-PS)の構成サブユニットαとβをクローニングし、Neuro2aやHEK293の培養細胞内で発現させ、αとβは活性を持つ機能的な複合体を形成する事を確認した。また野生型及び変異SOD1と共発現させその効果を調べたところ、Mm-PSは用量依存的に変異体特異的にSOD1の発現量を低下させた。Cycloheximide chaseやPulse chase等の結果より、変異SOD1の発現量の低下は変異SOD1の分解が促進されている為であると考えられた。さらにMm-PSは変異SOD1による細胞毒性をも軽減した。また、変異SOD1以外の異常凝集体を形成する蛋白の分解を促進した事からも本研究は家族性筋萎縮性側索硬化症の新しい治療法の可能性を示すのみならず、パーキンソン病やアルツハイマー病等の異常蛋白凝集体が関係する他の神経変性疾患の治療法としても有望であると考えられる。現在はこれらの結果を踏まえてMm-PSのトランスジェニックマウスを作成して変異SOD1トランスジェニックマウスと交配させてダブルトランスジェニックマウスを作成し、変異SOD1がもたらす毒性を軽減させることが出来るかどうか個体レベルにて運動機能、体重変化、生存期間などを比較してその効果を検討中である。
Ngly1/ENGase欠損がマウスに招く致死性/致死性回避のメカニズム解明

本研究では、細胞質での糖鎖脱離を担う酵素、Ngly1とENGaseの哺乳動物における未知の生理機能の解明に取り組んだ。そのためにNgly1、ENGase遺伝子欠損マウスの解析を行い、ENGaseの欠損は特に異常を示さない一方で、Ngly1の欠損が様々な異常(心臓、造血、筋肉、神経、体重など)を引き起こすことを明らかにした。さらに、それらの異常はENGaseの追加欠損により、回避可能な異常と回避不可能な異常に分かれることも明らかとした。ENGase非依存的なNgly1欠損による異常には、最近報告された内容を元に検証を行った結果、転写因子Nrf1の機能が関与している可能性が高いことが確認された。本研究の目的は、Ngly1とENGaseのほ乳動物における未知の機能解明である。また、研究実施計画における当該年度の予定は、「Ngly1欠損により生じる異常の解明」と「N-GlcNAc仮説の検証」であった。「Ngly1欠損により生じる異常の解明」に関しては、予備的知見で示した異常に加え、マウス発生時に貧血や浮腫といった異常がNgly1欠損により生じることを発見した。興味深いことに、浮腫はENGaseの追加欠損により回避されるが、貧血は回避されないことも発見した。また、タンパク質分解系(ユビキチン-プロテアソーム系、オートファジー)との関連については細胞レベルでの解析に取り組んだ。ユビキチン-プロテアソーム系に関しては、プロテアソーム阻害剤(MG132)処理でユビキチン化タンパク質の挙動変化を調べたが、Ngly1-KO細胞に特異的な変化は観察されなかった。オートファジーに関しては、細胞を飢餓状態で培養し、オートファジーが誘導される程度を比較した結果、Ngly1欠損によりオートファジーの誘導が低減する傾向が見られた。「N-GlcNAc仮説の検証」に関しても、細胞レベルでの検証に取り組んだ。本仮説では、Ngly1欠損下でENGaseが特定の糖タンパク質に作用し、タンパク質にN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)が1残基残ったタンパク質(N-GlcNAcタンパク質)を産生し、それが有害な働きをしている、と考えている。そこで、Ngly1-KO細胞とNgly1;Engase-KO細胞の細胞質中の糖タンパク質を比較解析した。その結果、Ngly1;Engase-KO細胞により多く蓄積している糖タンパク質(即ち、Ngly1欠損下特異的にENGaseが作用し得る糖タンパク質)を12個同定した。得られた成果から、国際学会の口頭・ポスター発表を1件、投稿論文を1報発表することができた。当該年度においては、予定外の研究代表者の所属研究機関の異動(理化学研究所から順天堂大学への異動)があったため、研究に用いるサンプルの異常等に時間を費やし、想定していたよりも研究の遂行は遅れた。しかしながら、平成29年度で予定していた「Ngly1欠損で生じる異常の中でENGase欠損により抑制可能/不可能な異常の同定」に関しては、マウス発生段階における異常の中で、浮腫はENGase欠損により抑制可能、貧血はENGase欠損により抑制不可という結果がすでに得られている。前項で示した研究実績の概要の中のいくつかの実験に関しては、異動によるタイムロスで実験数が不足しているため、若干の進行遅れがあるが、全体としてはおおむね順調に研究は進展していると言える。本研究の目的は、Ngly1とENGaseの哺乳動物における未知の機能解明である。研究実施計画における当該年度の予定はNgly1欠損で生じる異常の中でENGase欠損により抑制可能/不可能な異常の同定であった。また、昨年度実施分について不足している部分の追加実験についても行う予定であった。上記の内容に複合的に取り組むため、以下のような実験に取り組んだ。タンパク質分解系(ユビキチン-プロテアソーム系、オートファジー)との関連について、細胞レベルでの解析に取り組んだ。オートファジーに関してはNgly1欠損により野生型と比べて、基底状態でのオートファジーの減少、飢餓状態でのオートファジーの増加が見られたが、統計的に有意な差では無かった。面白いことに、これらの異常はEngaseの追加欠損では回避されなかった。ユビキチン-プロテアソーム系との関連については、昨年、プロテアソームの機能低下時にそのサブユニットの発現調節を担う転写因子Nrf1の機能発現にNgly1の活性が重要であることが報告されたため(Tomlin et al, ACS Cent. Sci., 3(11), 2017)、同様に細胞レベルでの検証に行った。その結果、プロテアソーム阻害剤(bortezomib)添加時に、Ngly1欠損によってNrf1の活性化が阻害されることが再現し、細胞生存率もNgly1欠損により低下した。これら2つの現象はEngaseの追加欠損では回避できなかった。N-GlcNAc仮説の検証については、前年度までに同定したいくつかのN-GlcNAcタンパク質候補が、実際にN-GlcNAcタンパク質化しているかの生化学的な検証に取り組んだ。残念ながら、市販の抗体では標的タンパク質に対して特異性の高いものが少なく、免疫沈降などを行えなかったため、特定のN-GlcNAcタンパク質の同定には至ることができなかった。

そのためにNgly1、ENGase遺伝子欠損マウスの解析を行い、ENGaseの欠損は特に異常を示さない一方で、Ngly1の欠損が様々な異常(心臓、造血、筋肉、神経、体重など)を引き起こすことを明らかにした。さらに、それらの異常はENGaseの追加欠損により、回避可能な異常と回避不可能な異常に分かれることも明らかとした。ENGase非依存的なNgly1欠損による異常には、最近報告された内容を元に検証を行った結果、転写因子Nrf1の機能が関与している可能性が高いことが確認された。平成29年度は、平成28年度に行った「Ngly1欠損により生じる異常の解明」と「N-GlcNAc仮説の検証」に関してデータが不足している部分の追加実験と、実施計画で予定していた「Ngly1欠損で生じる異常の中でENGase欠損により抑制可能/不可能な異常の同定」に取り組む。「Ngly1欠損により生じる異常の解明」に関しては、Ngly1欠損とタンパク質分解系の関連について、統計的に有意な違いがあるかどうかを議論するための再現実験を細胞レベルで取り組む。何か顕著な違いを同定できれば、その減少について個体レベルでの解析にも取り組みたい。「N-GlcNAc仮説の検証」に関しては、平成28年度に同定した12個の糖タンパク質について、それらの機能とNgly1欠損により生じる異常との関連を調べる。まずは、同定した12個の糖タンパク質の機能について文献などを調べ、特に、Ngly1欠損により生じる異常と関連がありそうな糖タンパク質から、ノックダウン/ノックアウトを細胞レベルで行い、Ngly1欠損により生じた異常がどのように変化するのかを調べる。「Ngly1欠損で生じる異常の中でENGase欠損により抑制可能/不可能な異常の同定」に関しては、平成28年度にすでに発見した貧血と浮腫以外に、第一項で示したタンパク質分解系との関連などについても、ENGase欠損がそれらの現象に関与しているのかを調べる。糖鎖生物学消耗品の購入が予定していたよりも若干少なかったため。使用額に相当する研究に必要な消耗品の購入に当てる。
高齢者の歩行中における重心動揺の体力的・バイオメカニクス的研究

高齢者に多い転倒を視野に入れた研究の第一歩として,高齢者のバランス機能が歩行運動の左右動と如何なる関係にあるのかに焦点を当てて研究した.被験者は高齢の男性95名(75.0±7.3歳),女性123名(73.5±7.3歳)と,若年男性58名(20.9±1.0歳),女性68名(20.4±1.5歳)の総数344名であった.2台のビデオカメラを用いて自由歩行における動作を収録し,身体重心の三次元座標分析し,次の結果を得た.1.足向角(両足間の角度の平均値)は,高齢群の男性が20.8±9.1度,女性が9.6±9.4度,若年群では男性が13.6±7.9度,女性が0.4±7.8度で,足向角の平均値は,男女ともに高齢群のほうが若年群に比して有意に大きく,「高齢者が若年者より外股歩きをする」ことが明らかであった.2.歩隔の平均値は,高齢群の男性が0.071±0.031m,同女性が0.059±0.044m,若年群では男性が0.071±0.039m,女性が0.066±0.033mで,歩隔には高齢群と若年群の間に男女とも有意差がなく,高齢群の歩隔は若年群と同等であるとみられた.また,歩隔の性差では高齢者にのみ有意な差(男>女)が認められた.3.高齢群における歩行速度と体力指標には,加齢との間で負の相関がみられ,加齢に伴う体力の低下が示唆された.以上の結果から,若年群と比較した高齢群の特徴として,基本的(平均的)には足向角の大きい外股歩きであり,特に高齢群の年齢の高い人ほど膝伸筋力やバランス能力が低く,歩隔が広く,歩行速度も遅い傾向にあることが明らかとなった.高齢者に多い転倒を視野に入れた研究の第一歩として,高齢者のバランス機能が歩行運動の左右動と如何なる関係にあるのかに焦点を当てて研究した.被験者は高齢の男性95名(75.0±7.3歳),女性123名(73.5±7.3歳)と,若年男性58名(20.9±1.0歳),女性68名(20.4±1.5歳)の総数344名であった.2台のビデオカメラを用いて自由歩行における動作を収録し,身体重心の三次元座標分析し,次の結果を得た.1.足向角(両足間の角度の平均値)は,高齢群の男性が20.8±9.1度,女性が9.6±9.4度,若年群では男性が13.6±7.9度,女性が0.4±7.8度で,足向角の平均値は,男女ともに高齢群のほうが若年群に比して有意に大きく,「高齢者が若年者より外股歩きをする」ことが明らかであった.2.歩隔の平均値は,高齢群の男性が0.071±0.031m,同女性が0.059±0.044m,若年群では男性が0.071±0.039m,女性が0.066±0.033mで,歩隔には高齢群と若年群の間に男女とも有意差がなく,高齢群の歩隔は若年群と同等であるとみられた.また,歩隔の性差では高齢者にのみ有意な差(男>女)が認められた.3.高齢群における歩行速度と体力指標には,加齢との間で負の相関がみられ,加齢に伴う体力の低下が示唆された.以上の結果から,若年群と比較した高齢群の特徴として,基本的(平均的)には足向角の大きい外股歩きであり,特に高齢群の年齢の高い人ほど膝伸筋力やバランス能力が低く,歩隔が広く,歩行速度も遅い傾向にあることが明らかとなった.高齢者の歩行運動におけるバランス能力を探るため,身体重心の動きを三次元解析し,若年者との比較を通して高齢者の特徴を探った。被験者は高齢男性25名(平均年齢75・5±6・3歳)と対照群の大学生男生25名(21.2±0.8歳)で、自由歩行における動作を2台のビデオカメラに収録し、身体重心の三次元座標値分析し、次の結果をえた。1.高齢群の歩行速度が遅い原因は,歩調よりむしろ歩幅の狭さに起因しており、特に高齢群では足向角(爪先の開き)が大きく,歩隔(左右方向の足幅)の狭い、いわゆる「外股歩き」の特徴が認められた。2.歩行中における身体重心の動揺は、左右動の場合、若年群が左右方向に均等な揺れを示したのに対し,高齢群の揺れは一方向に偏向する傾向にあった。重心の上下動には高齢群と若年群の間に有意差が認められなかったが、前後動では、高齢群では片脚支持期のピーク(mid・stance)直前に後方へ身体重心の進行が遅れ,スイング期に加速する傾向が認められた。3.三次元空間における高齢者の重心動揺の特徴は,(若年群に比して)(1)片脚支持期の中期mid・stance)に向けて,重心が上昇しつつ後方に遅れる、(2)上下動はほぼ同期しているが左右方向への重心動揺が偏向する傾向にあり,対身長比でみた重心動揺の移動離では高齢群の方が若年群より明らかに小さい。

4.体力テスト結果との関係では、重心上下動の大きい高齢者ほどバランス能力が優れている傾向にあったが、前後・左右動揺との間には特別な関係が認められなかった。以上の結果から、自由歩行における高齢者の特徴は、若年者に比して進行方向への速度変化が大きく、左右方向と上下方向への移動範囲が狭く、立脚中期(ミッドスタンス)に入る前の前方移動が遅いことから、若年者よりやや不安定な歩行をする傾向にあると考えられた。高齢者に多い転倒を視野に入れた研究の第一歩として,高齢者のバランス機能が歩行運動の左右動と如何なる関係にあるのかに焦点を当てて研究した.被験者は高齢の男性95名(75.0±7.3歳),女性123名(73.5±7.3歳)と,若年男性58名(20.9±1.0歳),女性68名(20.4±1.5歳)の総数344名であった.2台のビデオカメラを用いて自由歩行における動作を収録し,身体重心の三次元座標分析し,次の結果を得た.1.足向角(両足間の角度の平均値)は,高齢群の男性が20.8±9.1度,女性が9.6±9.4度,若年群では男性が13.6±7.9度,女性が0.4±7.8度で,足向角の平均値は,男女ともに高齢群のほうが若年群に比して有意に大きく,「高齢者が若年者より外股歩きをする」ことが明らかであった.2.歩隔の平均値は,高齢群の男性が0.071±0.031m,同女性が0.059±0.044m,若年群では男性が0.071±0.039m,女性が0.066±0.033mで,歩隔には高齢群と若年群の間に男女とも有意差がなく,高齢群の歩隔は若年群と同等であるとみられた.また,歩隔の性差では高齢者にのみ有意な差(男>女)が認められた.3.高齢群における歩行速度と体力指標には,加齢との間で負の相関がみられ,加齢に伴う体力の低下が示唆された.以上の結果から,若年群と比較した高齢群の特徴として,基本的(平均的)には足向角の大きい外股歩きであり,特に高齢群の年齢の高い人ほど膝伸筋力やバランス能力が低く,歩隔が広く,歩行速度も遅い傾向にあることが明らかとなった.
動的再構成による高速並列信号処理

本年度は,動的再構成を用いることでLSIチップ上の演算器間データ通信時間を低減して高速演算を実現する信号処理回路の設計を行った.ディジタル信号処理などの数値演算処理において,ある乗算器Mが行った乗算結果を他のデータとともに加算する場合には,乗算器Mから加算器へ乗算結果のデータ通信が必要となる.加算器と乗算器Mの距離が大きければ,大きなデータ通信時間が必要となり,処理速度を低下させる.しかし,乗算器Mの近傍に演算を実行しない演算器があれば,その演算器を加算器に再構成することでMから加算器へのデータ通信時間を短縮できる.動的再構成は,機能変更が必要な一部の回路の再構成を,他部の動作と並行して行う再構成方式であり,処理の進行に応じて不要となった機能を必要な機能へ再構成することで処理速度を低下させずに回路資源を有効に活用できる可能性がある.そこで,桁直列(digit-serial)固定小数点演算を行う乗算回路と加算回路の間の再構成が容易であることに着目し,動的再構成によって演算器間データ通信時間を低減して高い処理速度を実現する離散コサイン変換(DCT)回路を設計した.回路シミュレーションにより,設計回路は(1)データ通信と演算のクロックを分離するスケジューリングにより,高速なクロックでの動作を可能とし,(2)動的再構成によってデータ通信時間を低減してDCT処理に必要なクロック数を削減することで高速なDCT処理が可能であることが確認できた.設計した回路は,レイアウトレベルで集積回路設計を行い,東京大学大規模集積システム設計教育研究センター(VDEC)のチップ試作サービスを用いて集積回路試作を行った.本年度は、動的再構成可能LSIを用いて高速並列信号処理を実現する際に必要となるスケジューリング手法の開発を行った。動的再構成可能LSIでは、LSI上の他の部分のゲート回路が演算器やレジスタとして動作中に、一部のゲート回路のみを他の演算器やレジスタに組み替えることができる。動的再構成の場合であっても再構成にはある程度の時間を要し、また当然ながら再構成中のゲート回路は演算には利用できない。近年の半導体技術の進歩により、ゲートを組み合わせた演算器の遅延時間に比べて配線を用いたデータ通信の遅延時間が相対的に大きくなってきている。そのため、乗算器の結果を加算器で使用するといった場合に、乗算器と加算器の間の通信に必要な時間に対して、乗算器を再構成し、得られた加算器に乗算結果を通信する時間の方が短ければ、より高速な処理が実現できる。そこで、ディジタル信号処理の高速並列処理のため、演算間データ通信時間と演算器の動的再構成を考慮して演算と通信の実行時刻を決定する手法を考察した。そこでは、演算の演算器への割当と演算問通信時間の評価を同時に行うことで、正確な演算間通信時間に基づいて最適な演算器割当と動的再構成スケジュールを求めるている。いくつかの実用的な例題において、提案手法によって高速な並列処理が達成できることを確認した。本年度は,動的再構成を用いることでLSIチップ上の演算器間データ通信時間を低減して高速演算を実現する信号処理回路の設計を行った.ディジタル信号処理などの数値演算処理において,ある乗算器Mが行った乗算結果を他のデータとともに加算する場合には,乗算器Mから加算器へ乗算結果のデータ通信が必要となる.加算器と乗算器Mの距離が大きければ,大きなデータ通信時間が必要となり,処理速度を低下させる.しかし,乗算器Mの近傍に演算を実行しない演算器があれば,その演算器を加算器に再構成することでMから加算器へのデータ通信時間を短縮できる.動的再構成は,機能変更が必要な一部の回路の再構成を,他部の動作と並行して行う再構成方式であり,処理の進行に応じて不要となった機能を必要な機能へ再構成することで処理速度を低下させずに回路資源を有効に活用できる可能性がある.そこで,桁直列(digit-serial)固定小数点演算を行う乗算回路と加算回路の間の再構成が容易であることに着目し,動的再構成によって演算器間データ通信時間を低減して高い処理速度を実現する離散コサイン変換(DCT)回路を設計した.回路シミュレーションにより,設計回路は(1)データ通信と演算のクロックを分離するスケジューリングにより,高速なクロックでの動作を可能とし,(2)動的再構成によってデータ通信時間を低減してDCT処理に必要なクロック数を削減することで高速なDCT処理が可能であることが確認できた.設計した回路は,レイアウトレベルで集積回路設計を行い,東京大学大規模集積システム設計教育研究センター(VDEC)のチップ試作サービスを用いて集積回路試作を行った.
含水物質に対する高温高圧下での地震波速度変化の測定

沈み込み帯火山フロント直下のスラブ上面付近には、地震学的に推定されている地震波低速度層が存在する。一方,スラブ上面のマントルウェッジには,スラブから付加した水によってできる含水層の存在が予想されている。この含水層と地震波低速度層との対応関係を調べるためには,マントルウェッジの物質としてはペリドタイト,含水層の物質としてはこのペリドタイトに水が付加してできたアンフィボール・ペリドタイトの両者を伝わる弾性波速度の比較が必要である。とりあえず,今回はモデル物質としてグラニュライトおよびこのグラニュライトに水が付加してできたことがわかっているアンフィボライトを用い,これら両者の弾性波速度を,1GPaの圧力で,850°Cまでの測定をおこなった。その結果,両者の弾性波速度は温度とともにほぼ直線的に減少し、また両者のP波,S波の比較ではともに顕著な速度差がみられた。例えば,700°Cでのそれぞれの速度は、グラニュライトでP波が7.75km/s,S波が4.37km/s,アンフィボライトでP波が7.40km/s波が4.21km/sであり、グラニュライトに対するアンフィボライトの速度低下の割合は,P波,S波ともに約4%程度である。この結果からの類推によって,マントルウェッジのペリドタイトがスラブから付加した水によって含水層となり,そのために数%程度の低速度層を形成している可能性が十分考えられることがわかった。
DNAグロビュール構造を核とした多元積層ナノクラスターの構築

DNA分子は高分子電解質の性質を持ち、DNA表面にカチオンが濃縮することによって、渦上に凝集したグロビュール構造へ転移する。研究代表者は、近年、このDNAグロビュール構造を鋳型として金属ナノ結晶を均一クラスター化させることに成功した。本研究では、金属ナノ結晶クラスター体表面を新たな反応場として、自身がこれまで蓄積したバイオミネラリゼーション技術も組み合わせて、目的結晶構造を持つ金属・半導体・セラミックスのナノ結晶をDNAグロビュール構造に沿って多階層に構造化させたコアシェルナノクラスターを作製し、温和な環境下で多元コアシェルナノクラスターを作製するプロセスを提案・開発する。そこで本年度は、DNAグロビュール構造を鋳型とした金属・半導体・セラミックスのナノ結晶クラスター体の作製至適DNAグロビュール構造に濃縮された各金属イオンをミネラリゼーション化し、ナノ結晶クラスターを作製した。その際に、金属イオンを濃縮したDNAグロビュール構造にミネラリゼーションを導入する時点でグロビュール構造が変性する可能性を防ぐためにグロビュール構造を安定化させるアスコルビン酸を加えたところ、構造を安定化させることに成功した。また、ナノ結晶表面の触媒機能を利用して、上記で作製したナノ結晶クラスター体の表層に、他の金属・半導体・セラミックスを積層化させた。積層化については、反応時間を制御することにより、その膜厚を制御できるかを検討したところ、反応時間で膜厚だけでなく形状も制御し得ることが分かった。研究者は、近年、このDNAグロビュール構造を鋳型として金属ナノ結晶を均一クラスター化させることに成功した。本研究では、金属ナノ結晶クラスター体表面を新たな反応場として、目的結晶構造を持つ金属・半導体・セラミックスのナノ結晶をDNAグロビュール構造に沿って多階層に構造化させたコアシェルナノクラスターを作製する。そのために、本年度は、まず、様々な金属イオンをDNA溶液中に加え、各金属イオン濃度変化によるDNA分子の形態変化を動的光散乱と蛍光顕微鏡などで観測し、ナノ結晶クラスターの鋳型として魅力のあるDNA高次構造形態を見出した。そして、次に、ナノ結晶クラスターの懸濁液に硝酸セリウムを加えることによって、金属ナノ粒子表面の触媒機能を利用した酸化セリウムの合成を試みた。その結果、金属ナノ結晶クラスター体表面に約50nmの厚みを持つ酸化セリウム層が合成され、金属ナノ結晶クラスターを核としたオタマジャクシ構造の形成に成功した。これは、金属ナノ結晶クラスター体中の金属ナノ粒子表面は触媒活性を持ち、それを利用すれば、金属ナノ結晶クラスター体表面にセラミックス層を簡便に合成できることが分かった。さらに、他のセラミックスの合成も試みたところ、酸化亜鉛や酸化鉄も合成可能であることが分かった。計画に沿って、DNAグロビュール構造を鋳型とした金属ナノ結晶クラスターを作製し、それを核として二階層に構造化させたコアシェルナノクラスターを作製できたため。計画通りに研究を推進し、現在成功している二階層コアシェルを多階層にまで展開させる。
ＧｖＨ反応とＧｖＬ反応の差を決定するＨＬＡ遺伝子及び非ＨＬＡ遺伝子の解明

造血細胞移植ではドナーと患者の間で特別な移植免疫反応が生じる。生着したドナー由来の免疫担当細胞が患者組織を攻撃する重症移植片対宿主病(GVHD)の抑制や白血病細胞を攻撃し移植後の白血病の再発を防ぐ移植片対白血病効果(GVL効果)の惹起は移植成績の向上のための最重要課題である。本研究では骨髄バンクを介した大規模な移植症例を用いて精緻な免疫遺伝学的手法を駆使し、人は多様なHLA抗原とHLA領域の構造を有し、この多様性が規則性をもってGVHDやGVL効果を生み出していることを明らかにした。移植の臨床に有用であるとともに、どうして移植免疫反応・自己免疫反応が生じるのかを明らかにする重要な知見となった。わが国においては難治性造血器腫瘍に対して非血縁骨髄移植が年間1200例以上、非血縁さい帯移植が約1000例実施されているが、その治癒率は約50%に留まっている。その主な要因は同種移植免疫反応に伴う移植片対宿主病(GVHD)で患者とドナーの組織適合性抗原、特にHLAが関与している。また、HLAの違いにより移植後の白血病の再発が抑制される移植片対白血病反応(GVL)の存在が明らかにされ、さらにHLAハプロタイプそのものがGVHDの発症に関与しているなどの臨床的な知見が集積されつつあるが、その本態を明らかにするためには高度な遺伝免疫学的なアプローチが不可欠である。本研究では、GVHDとGVLの差を決定するHLA遺伝子ならびにHLAと連鎖不平衡にある非HLA遺伝子を明らかにすることを目的にしてH22年度は以下の研究を実施した。日本人におけるHLA領域の保存性の解析:非血縁造血幹細胞移植ドナーと患者の全ゲノム関連解析(GWAS)により得られた、HLA領域(6番染色体短腕のテロメア側から25-34Mbの範囲)の約1500のSNPアリルとHLA型を用いて、HLA領域の保存性をhomozygousなHLAハプロタイプ(HP)を有する個人のSNPコンセンサスシークエンスをベースにして日本人に頻度の高いHLA-HP 40種類の保存性を検討した。この結果、99.5%以上のSNPs均一性を保っているHPと99.5%以下の均一性の違いがあり異なったLDブロックを有するHPが存在することが明らかになり、ドナーと患者のHPの適合性を評価する基礎データが得られた。さらに、SSOP法にてHLA-A, B, C, DRB1, DQB1, DPB1の遺伝子型を非血縁者間移植100ペアーでタイピングを実施し、今後の解析の基礎資料とした。わが国では非血縁骨髄移植、非血縁さい帯移植が多数例実施されているが、その治癒率は約50%に留まっている。その主な要因は同種移植免疫反応に伴う移植片対宿主反応(GvH)で患者とドナーの組織適合性抗が関与していることが臨床的な解析から判明している。また、HLA-CとHLA-DPB1のアリルの違いにより移植後の白血病の再発が抑制され、移植片対白血病反応(GvL)の存在が明らかにされているが、その本態を明らかにするためには高度な遺伝免疫学的なアプローチが不可欠である。本研究では、GVHDとGVLの差を決定するHLA遺伝子ならびにHLAと連鎖不平衡にある非HLA遺伝子を明らかにすることを目的にしてH23年度は以下の研究を実施した。日本人におけるHLA領域の保存性の解析を非血縁造血幹細胞移植ドナーと患者1600ペアーのHLA領域の約1500のSNPアリルとHLA型を用い、HomozygousなHLAハプロタイプ(HP)を有する個人のSNPコンセンサスシークエンスをベースにして、453種類の日本人のHLA-ADQB1のHLA-HPとそのSNP配列を決定することができた。頻度の高いHLA-HP40種類の保存性を検討したところ、HLA-HP毎にHLA領域の保存性は異なっており、さらにHLA-HP間では保存された領域(ブロック)を共有しており、HLAとその領域をHLAブロックとして移植免疫反応を捉えることの重要性を示すことができた。HLA適合非血縁移植ではドナーと患者ハプロタイプの不適合によりGvH反応が高頻度に生じるとの海外の報告があるが、日本人間の非血縁移植では高率にHLA-HPとそのSNPが適合しており、さらに不適合移植でもGvH反応に有意差がないとの予備的結果が得られ、日本人間移植におけるGvH反応の低率な発症の要因の一つと考えられた。

多様な細菌・ウイルスなどの外的要因により選択・獲得されてきたHLAの高度な多型性は、他人の細胞を患者に移入するという人工的な医療行為である造血幹細胞移植において、生着したドナー由来の免疫担当細胞が惹起する重症移植片対宿主病(GVHD)と移植片対白血病反応(GVL)の誘導に深く関わっている。HLAと連鎖し、特定のHLAアレルと強い連鎖不平衡を保っているHLA領域の非HLA遺伝子がこの要因と考えられ、本研究では、よく整備された非血縁者間骨髄移植ペアーの試料を用い、GVHとGVLの差を決定するHLAと連鎖不平衡にある非HLA遺伝子を最新のゲノム科学と免疫遺伝学的手法を用いて明らかにすることを目的としている。平成24年度までに、日本人の主要なHLAハプロタイプそのものがGVHの発症に関与していることを明らかにした。日本骨髄バンクを介して実施された非血縁者間骨髄移植ドナーと患者(1800ペアー、3600個人)のHLA領域(6番染色体短腕のテロメア側から25-34Mb)のmulti-SNPs(約1500)とHLA-A, B, C, DRB1, DQB1, DPB1アリルのデータを用いて、日本人の主要HLAハプロタイプHLA-ADQB1までの40種類のSNPコンセンサスシークエンスを同定し、平成25年度には各HLAハプロタイプのLDブロックの組み合わせと共有LDブロックを明らかにした。さらに、非血縁者間骨髄移植6967症例の解析で3つのHLAアリル型とその関連するHLAハプロタイプそのものが急性GVHDの発症に関与していることを明らかにすることができた。これらHLAアリルは自己免疫疾患における関連HLA型でも見出されており、GVHDとGVLの発症機序の解明にための新たな知見を得ることができた。現在SNP多型と上記HLA領域のハプロタイプLDブロックを組み合わせることにより、その責任遺伝子に迫ろうとしている。同種造血幹細胞移植により生じる移植片の拒絶や移植片対宿主病(GVHD)、移植片対白血病効果(GVL)は、組織適合性抗原の異なる他者の造血幹細胞をいわば人工的に患者に移植することにより生じている。これら反応は、非自己のアロ抗原を認識すると考えられ、ドナーと患者のHLAの違いとの関連は一部臨床的に明らかにされているが、これら移植免疫反応の機序の解明を目的とした。今年度は、非血縁者間骨髄移植約8000ペアーにつき免疫遺伝学的解析を実施した。その結果、各HLA座不適合のリスクで、有意(p<0.01)を示したのは,3度以上の急性GVHD:HLA-A, B, C, DPB1、慢性GVHD:HLA-C、GVL効果:HLA-C, DPB1であった。また、HLA-DRB1あるいはDQB1単独の不適合では急性GVHDの発症に影響を与えてないが、HLA-DRB1とDQB1両者の不適合があると有意に急性GVHDの頻度が高くなり、移植後の死亡率は高くなることが判明した。これは、両抗原が関与することによりはじめて重症急性GVHDが生じることを示しており、GVHDの発症機序としてHLAクラスIIの基礎的研究に寄与するものと考えられた。さらに、患者及びドナーのHLAアリルやハプロタイプそのものと移植後の急性GVHDの関連を解析した。頻度が5%以上あった43アリルの中で、患者とドナーのHLA-A*33:03, -C*14:03, -B*44:03, -DRB1*13:02, -DQB1*06:04は有意に急性GVHD 2-4度のリスクが低いことと関連し、この5つのアリルが属する日本人で2番目に頻度の高いハプロタイプも同様な関連を示した。一方、患者とドナーのHLA-B*51:01と患者のHLA-C*14:02は有意に急性GVHD 3-4度のリスクが高いことと関連し、患者あるいはドナーのHLAアリルやハプロタイプそのものが移植後の同種免疫反応と関連することが示された。
細胞内環境での蛋白質間相互作用阻害剤スクリーニング技術の開発

本研究では、細胞内環境で簡便に蛋白質間相互作用を検出でき、阻害剤スクリーニングも可能な技術の開発を目指した。これらを達成するために、二種類のシグナル伝達タンパク質に着目し、タンパク質間相互作用を増殖シグナルというリードアウトに変換する系を構築した。その結果、蛋白質間相互作用を細胞増殖で検出でき、阻害剤を評価することに成功した。本研究ではレポーター分子として受容体やその下流のシグナル伝達分子を用い、蛋白質間相互作用に伴う増殖・生存シグナル伝達をリードアウトとして検出する。これまでに、増殖因子受容体であるc-kitと相互作用を検出したい蛋白質やペプチドとのキメラを構築し、蛋白質間相互作用や蛋白質-ペプチド間相互作用を細胞増殖により検出することに成功した。しかし、アフィニティーが弱い相互作用は検出することができなかった。様々なアフィニティーの蛋白質間相互作用を扱うためには、検出可能なアフィニティーのダイナミックレンジを広くする必要がある。そこで、より低いアフィニティーの相互作用を検出できる高感度なキメラを新たに分子構築することにした。本年度は、これまでに構築したc-kitキメラに、FK506結合蛋白(FKBP12)のF36V変異体(ヘルパー)を導入し、合成小分子リガンドAP20187の添加によりキメラの二量体形成を補助することで、標的蛋白質間相互作用の感度向上が達成できるかを検証した。標的蛋白質間相互作用として、AP21967依存的に相互作用を誘導できるFKBP12ーFRB(T2098L変異体)のペアをまず選んだ。FKBP12とFRB(T2098L変異体)をBait, Preyとしたキメラコンストラクトをレトロウイルスベクターに組み込み、IL-3依存性Ba/F3細胞に遺伝子導入し、恒常発現株を取得した。IL-3非存在下で様々な濃度のAP21967を添加して培養した結果、ヘルパーを導入した場合において、より低いAP21967濃度で細胞増殖が見られた。また、恒常的に相互作用するp53 peptideーMDM2のペアについても同様に実験した結果、ヘルパーを導入した場合においてのみ細胞増殖が見られた。以上より、ヘルパー導入により本蛋白質間相互作用検出系の感度を大きく向上できることが示された。本年度はc-kitキメラを用いた細胞増殖をリードアウトとする蛋白質間相互作用検出系の高感度化に向けた検証が目標であった。実際に2つの蛋白質間相互作用ペアについて、ヘルパー導入による検出感度向上を達成したことから、おおむね順調に進展している。これまでに、増殖を誘導する受容体チロシンキナーゼの細胞内ドメインを利用し、オリゴマー化による増殖シグナル伝達を共通原理として蛋白質間相互作用を検出する系を確立した。しかし、この系においては、標的蛋白質としてオリゴマー形成蛋白質を選んだ場合、恒常的に増殖シグナルが出てしまうため、相互作用ペプチドのスクリーニングは原理的に困難である。そこで本年度は、オリゴマー化によらず「膜局在」によって活性化されるシグナル分子を利用した新たな系を構築し、原理的にオリゴマー蛋白質をも標的蛋白質として用いることが可能な系の開発を目指した。シグナル伝達分子のSOSは、膜に局在するだけで、増殖に関わるシグナル伝達カスケードであるRas/MAPK経路を活性化することが報告されている。そこで第一に、標的蛋白質間相互作用として小分子リガンドAP21967依存的なFKBP12-FRB(T2098L変異体)相互作用を用いて系の実証を試みた。FRB(T2098L変異体)を膜アンカリング配列と融合して膜に局在させ、FKBP12とSOSとのキメラ蛋白質を細胞質に発現させるような発現ベクターを構築した。これらをIL-3依存性Ba/F3細胞に遺伝子導入して恒常発現株を取得した。IL-3非存在下でAP21967を添加して培養した結果、AP21967依存的な増殖シグナルが生じることが分かった。そこで第二に、標的蛋白質間相互作用としてMDM2-pDIペプチド間相互作用に本系を同様に適用した結果、この場合も標的蛋白質間相互作用の細胞増殖による検出に成功した。以上より、膜局在シグナル分子を利用した蛋白質間相互作用検出系の構築に成功した。本年度は、標的蛋白質としてオリゴマー蛋白質も適用可能な系として、膜局在型シグナル分子を利用した新規蛋白質間相互作用検出系を開発することが目標であった。結果として、2種類のペアの蛋白質間相互作用を検出できたことから、おおむね順調に進展したといえる。本研究では昨年度までに、受容体チロシンキナーゼであるc-Kitの細胞内ドメインと相互作用を検出したい標的タンパク質2種類をそれぞれ連結したキメラ受容体を構築し、標的タンパク質間相互作用を細胞増殖シグナルにより検出することに成功した。しかし、これまでにc-Kit以外の受容体に適用したことはなかった。また、キメラ受容体は細胞質に発現させていたが、受容体は本来細胞膜に局在しており、膜局在型の方がシグナル伝達強度は強くなる可能性がある。従って、別の受容体を用いる、または膜局在させた方が検出感度は向上する可能性が考えられた。そこで本年度は、c-Kit以外の受容体として、受容体チロシンキナーゼとは別のファミリーであるタイプIサイトカイン受容体のc-Mplを用いたキメラ受容体を構築し、膜局在シグナルの有無で増殖シグナル伝達能が変化するのかを検証した。