hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ベイズ統計によるトラップの捕獲効率を考慮した森林性昆虫群集の生息密度推定

森林昆虫は多様な種が含まれる分類群であり、森林生態系の維持に重要な役割を担っている。一方でトラップによる森林昆虫の捕獲には、トラップの捕獲効率が周囲の環境によって変わりやすく、昆虫の生息密度を明らかすることが困難であるという欠点が指摘されてきた。本研究ではピットフォールトラップとマレーズトラップの二つの昆虫の捕獲方法を対象とし、それぞれのトラップの捕獲効率に物理環境が与える影響を明らかにする。北海道空知地域の皆伐地と人工林に金属製フェンス(5×5m)を3つずつ作成し、囲い込み実験を2018年6月と7月に1週間ずつ行った。フェンス内には9個のピットフォールトラップを設置し、1週間毎日回収した。森林性のオサムシ類3種を対象とし、多項分布モデルを用いて、各日の捕獲効率に各日の地温の平均値が与える影響およびフェンス内の生息密度の推定を行った。この結果、3種中2種で地温の上昇に従って捕獲効率が増加する傾向がみられた。また上記の捕獲効率を考慮するモデルでは、考慮しないモデルと比較して生息密度は高く推定された。2018年5月から8月にかけて北海道空知地域の人工林と伐採地にマレーズトラップと気温ロガー、風速計を設置し、サンプルの回収を3週間おきに実施した。2017年5月8月のサンプルを含め、各調査期間に捕獲されたカミキリムシ類の総個体数と調査期間中の物理環境(気温、風速、開空度)との関係性を検証した。その結果、カミキリムシの個体数は平均気温の上昇に従い増加することが明らかになった。なお優占種4種中3種の個体数が各物理環境によって影響を受けることが明らかになった(平均気温(1種)、平均風速(2種)、開空度(2種))。以上の結果は、物理環境は森林性昆虫類の捕獲効率に影響を与えており、物理環境が大きく異なる環境間で生息密度を比較する際には、捕獲効率の変化を考慮する必要があることを示唆している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究ではピットフォールトラップとマレーズトラップの二つの昆虫の捕獲方法を対象とし、それぞれのトラップの捕獲効率に影響を及ぼす物理環境を明らかにする。初年度である今年度は、それぞれのトラップによる森林昆虫の捕獲調査と物理環境の調査を開始した。ピットフォールトラップの捕獲効率の調査は10月に北海道札幌市の森林および開放地にて行った。地表性甲虫の移出入を防ぐ金属製フェンス(3m×3m)を3地点に設置し、1週間、フェンス内の地表性甲虫類の日ごとの捕獲個体数を記録した。また、この調査によりフェンス内の地表性甲虫類の生息密度が低いことが示唆されたため、来年度の調査ではより広いフェンス(5m×5m)を作成して調査を行い、季節を変えて調査することで平均気温とフェンス内の生息密度や捕獲効率との関係について検証を行う予定である。マレーズトラップの捕獲効率調査として、北海道芦別市道有林にて、5月から8月にかけてマレーズトラップによるカミキリムシ類の捕獲を行った(全9地点)。同時にトラップの周囲にて気温と相対湿度の計測を行い、また9地点のうちの3地点では風速の計測を行った。サンプルは3週間おきに回収した。この結果、マレーズトラップにて捕獲されるカミキリムシ類の種数と個体数は、調査期間内の平均風速に対して山なりの関係を持つこと、また期間内の平均気温は種数と個体数に正の影響を与えることが示された。初年度より、それぞれのトラップ(ピットフォールトラップおよびマレーズトラップ)の捕獲効率の調査を開始することができ、またマレーズトラップについては気温や風速などの物理環境と捕獲されたサンプルとの関係性について予備解析を行うことができたため。

その結果、カミキリムシの個体数は平均気温の上昇に従い増加することが明らかになった。なお優占種4種中3種の個体数が各物理環境によって影響を受けることが明らかになった(平均気温(1種)、平均風速(2種)、開空度(2種))。以上の結果は、物理環境は森林性昆虫類の捕獲効率に影響を与えており、物理環境が大きく異なる環境間で生息密度を比較する際には、捕獲効率の変化を考慮する必要があることを示唆している。今後は、それぞれのトラップの調査地点を初年度よりも増やし捕獲調査および各物理環境調査を行う予定である。これら2年間の野外調査で得られた結果をもとに、各トラップの捕獲効率に各物理環境が及ぼす影響の相対的な重要性を明らかにする。また、物理環境が捕獲効率に与える影響と捕獲効率がトラップで実際に得られる昆虫の個体数に与える影響を考慮するベイズモデルをトラップごとに構築する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
細菌の外膜タンパク質ＧＡＰＤＨによる広範な感染症の予防

魚類エドワジェラ症原因菌の外膜タンパク質GAPDHの、ブリの難病である類結節症とノカルジア症に対する免疫効果を調べた。また、GAPDH免疫の検討対象となり得るヒト病原細菌の検討を行った。その結果、類結節症に対して防御効果は十分とはいえないが、当該菌ホルマリン死菌ワクチンよりも高かった。ノカルジア症に対しては、防御効果は認められなかったが、感染魚体内の菌増殖を抑制し、免疫グロブリンの産生量およびブリの免疫関連遺伝子の発現性を高めたことから、ある程度の非特異的・アジュバント的効果を示すと推定された。魚病菌Mycobacteriumsp.はヒトにも病原性の可能性あるモデル菌に適当と考えられた。ブリのノカルディア症は弱抗酸性で分枝形態を示すグラム陽性細菌Nocardiaseriolaeを原因菌とし、薬剤による治療が困難な養殖ブリの難病とされる。GAPDHによる免疫の効果を図るためには攻撃試験による効果判定が必須であるが、低菌数感染から始まる感染成立には長期間の飼育を要する。そこで、感染の過程をより短期間でモニタリングする手法として、実験感染後の菌の体内消長をリアルタイムPCRで測定する技術の確立を目指した。供試魚には平均魚体重約50gのブリを用い、供試菌株には養殖ブリから分離した強毒株であるN-2927株とやや弱毒株であるU-1株の2株のN. seriolaeを用いた。実験感染は、約10の56乗CFU/mlの濃度の両株海水懸濁液にブリを10分間浸漬して行った。その後2629日間にわたり、経時的に感染魚を3尾ずつ取り上げて各臓器と末梢血を採取し、DNA抽出後に16SrRNA遺伝子を標的にしたSYBRGreenによるリアルタイムPCR法に供した。死亡魚についても同様に行った。その結果、N-2927株感染魚では、感染7日後から死亡魚が見られ、13日後には死亡率が100%となった。N-2927株の16SrRNA遺伝子のコピー数は、感染3日後から腎臓と脾臓、感染6日後から胃、感染7日後から肝臓、心臓、腸管および鰓でU-1株の遺伝子コピー数よりも有意に高い値となり、感染7日後にすべての臓器で死亡魚の値と同程度に達した。U-1株感染魚では死亡魚は見られなかったものの、菌の遺伝子が長期間にわたり確認された。本菌は感染後の体内における菌増殖期間が長く、また感染魚の死亡率にも個体差が生まれやすいために、免疫等による効果の判定が困難とされるが、本法の使用により短期間かつ感染過程を反映しながらGAPDHの免疫効果の判定を行うことができる見通しがついた。エドワジェラ菌Edwardsiella tardaのGAPDHの免疫効果を,魚病の中でも難病とされるブリの類結節症とノカルジア症について検討した。類結節症では,GAPDHを大腸菌で発現・精製したもの,類結節症菌のホルマリン死菌(FKC),およびこれら両者の混合物を各ワクチンとし,ブリ稚魚を注射免疫したのち類結節症菌の感染(攻撃試験)を行った。その結果,GAPDHを含む抗原の免疫魚は,FKC単独免疫魚よりやや高い生存率を示したが,対照魚(非免疫魚)との有意差が認められなかったことから,GAPDHは類結節症に対して多少免疫効果はあるものの,十分とはいえない結果となった。つぎに,GAPDH遺伝子産物を大腸菌で発現させ精製したリコンビナントワクチン,および大腸菌にGAPDH遺伝子を発現させたDNAワクチンについて,ブリの免疫関連遺伝子発現効果とノカルジア菌に対する感染防御効果を検討した。その結果,脾臓・肝臓におけるCCケモカイン,MHCクラスII分子,インターロイキン-1βの各発現量,および免疫グロブリン総産生量は,両免疫魚で対照魚より有意に高く免疫刺激効果が認められた。また,ワクチン投与後に攻撃試験を行ったブリ体内におけるノカルジア菌の増殖量(16SリボソームRNAのコピー数で測定)は,対照魚よりも抑制されていた。しかし,攻撃試験による生存率では,対照魚との間で有意差が認められなかった。この理由として,免疫菌E. tardaのGAPDHと感染菌ノカルジア菌のGAPDHは,アミノ酸レベルでの相同率が低く(43%),抗原性に大きな相違があるためではないかと考えられる。また,ノカルジア症に対して期待したいわゆるアジュバント効果などの非特異的防御能は,感染防御できるほどではないと判断される結果となった。その結果、これらは互いに共通の先祖を持つ菌種と考えられ、Mycobacterium sp.は魚類だけでなくほ乳類や人にも病原性が報告される遺伝子の一部を有することが確認された。これまでに報告されている種々のヒト

由来病原菌を、魚に感染させて実験を行うことは非常に困難であるが、ブリ類から分離されるMycobacterium sp.が、ヒトやほ乳類への病原性にも関連する遺伝子性状を有する菌でありながら、魚類飼育系で実験微生物として使用することができる菌であることから、当初の研究目的に従い、広範なGAPDHの免疫効果を図るための実験微生物として使用する研究計画に進むことができる見通しがついた。実験魚飼育施設の給水ポンプ系の予期せぬ故障により、予定の魚類飼育実験を平成23年度に繰り越して実施した。しかし、平成24年度に繰り越した平成23年度分の実験と、平成24年度分として当初から計画していた実験とを併行して施設(飼育水槽)を使用せざるを得なかったため、計画していた魚類飼育実験すべてを完了できていない。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度予定の実験を繰り越して平成24年度に併行して実施したため、本年度に計画していた魚類飼育実験の一部が実施に至っていない。平成23年度から平成24年度に繰り越して実施する実験のうち、未消化の実験(GAPDHのアジュバントとしての効果)は、平成25年度に実施する。平成25年度には実験量が増えることになるが、本年度開発できた感染微生物の遺伝子量の推移を測定する方法が活用できることになったため、効果を図るための飼育実験を伴った攻撃実験の期間を大幅に縮小しながら、目的の成果を得ることが可能である。室内実験については上記のように成果を得たが、不十分であった魚類飼育を伴う実験は、平成25年度に実施する予定である。平成25年度は、この分の実験も合わせて実施するが、病原体の遺伝子量を測定する方法を(平成23年度からの繰り越し分として)平成24年度に開発できたので、飼育実験のうち攻撃試験については、大幅に期間を短縮して実施する見通しができている。平成25年度の当初計画は変更することなく実施する予定である。
唾液中のリン脂質活性化療法を用いた新しい睡眠時無呼吸症候群の薬物治療法の開発

上気道の開通性には唾液中および上気道粘膜の表面張力が大きな役割を果たしている。これまでに、閉塞性睡眠時無呼吸症候群では、唾液中の表面張力(サーファクタント)の中でフォスファチジルコリン(PC)の濃度上昇が上気道粘膜の表面張力を低下させ、呼吸をしやすくさせていることがわかった。口腔・咽頭粘膜の内因性サーファクタントの生理的役割を解析するため、唾液サンプルから表面張力とPC濃度の分析を行っている。表面張力はPull-off-forceテクニックを用いて測定し、PC濃度などのリン脂質の濃度を液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)で測定している。女性の生理周期の4ポイント(月経期、卵胞期、黄体期前期、黄体期後期)で唾液サンプル採取を行い、それぞれのポイントでの唾液表面張力とPCの濃度の測定を行い、簡易ポリソムノグラフィの結果との関連性を調べている。また、OSAの重症度に関与している内因性サーファクタントの検討を継続していたところ、唾液中のイオン代謝産物を網羅的に測定することが可能となった。OSAの重症度で変化するPC以外の内因性サーファクタントの検討を継続していたところ、慶應義塾大学先端生命科学研究所で唾液中のイオン代謝産物を一斉に測定できる技術があることがわかった。研究計画の追加で、他施設共同研究となったため、再度倫理委員会の承認後、共同研究施設での倫理審査が必要となり、そこに時間を要してしまった。平成29年度までの研究成果をとりまとめ、女性の生理周期でのPCの変化については、論文投稿準備中である。唾液中のイオン代謝産物を網羅的に測定し、OSAの重症度で変化するPC以外の内因性サーファクタントの検討を継続する予定である。これまでに、閉塞型睡眠時無呼吸症候群では唾液中の表面活性物質(サーファクタント)の中でフォスファチジルコリン(PC)濃度の上昇が上気道粘膜の表面張力を低下させ、呼吸をしやくすさせていることがわかった。口腔・咽頭粘膜の内因性サーファクタントの生理的役割を解明するために、唾液サンプルから表面張力とPC濃度測定を行っている。表面張力はpull-off forceテクニックを用いて測定し、PCなどのリン脂質の濃度を液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)で測定している。得られた測定値を生理学的因子と環境的因子により多変量解析を行い、それぞれの要素との因果関係を評価している。年齢、性別、体重(BMI)、合併疾患の有無との関連性を検討している。また、女性の生理周期の4ポイント(月経期、卵胞期、黄体期前期、黄体期後期)で唾液サンプル採取を行い、それぞれのポイントでの唾液表面張力とPC濃度の測定を行い、簡易ポリソムノグラフィの結果と関連性を調べている。当院を受診している睡眠時無呼吸症候群患者のみでは対象者数が非常に少ないため、関連病院に共同研究を依頼し、サンプル数を増やそうとしているところである。表面張力はPull-off-forceテクニックを用いて測定し、PCなどのリン脂質の濃度を液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)で測定している。得られた測定値を生理学的因子と環境因子により多変量改正を行い、それぞれの要素と因果関係を評価している。年齢、性別、体重、BMI、合併疾患の有無との関連性を検討している。女性の生理周期での比較は概ね終了したが、動物実験まで及んでいない。

研究計画の追加で、他施設共同研究となったため、再度倫理委員会の承認後、共同研究施設での倫理審査が必要となり、そこに時間を要してしまった。現在進めている測定の継続を行う。唾液サンプル数を増やし、唾液表面張力およびPC濃度の測定を行い、測定結果と夜間ポリソムノグラフィの各解析データ(無呼吸指数、低呼吸指数等)、年齢、性別、体重(BMI)、合併症の有無、喫煙歴、飲酒歴などの生理学的因子と環境因子の関連性を検討するために、多変量解析を行う。当院を受診している睡眠時無呼吸症候群患者のみでは対象者数が非常に少ないため、関連病院に共同研究を依頼し、サンプル数を増やそうとしているところである。さらに動物実験も予定している。全身麻酔下で管理したウサギの分離上気道実験モデルを用いて、外因性サーファクタントの局所補充療法の効果を評価する。女性の生理周期での比較は、概ね終了しており、統計を整理するのみとなった。継続してまとめ、論文での発表を予定している。動物実験は、共同研究者と協力し、早急に開始する。平成29年度までの研究成果をとりまとめ、女性の生理周期でのPCの変化については、論文投稿準備中である。唾液中のイオン代謝産物を網羅的に測定し、OSAの重症度で変化するPC以外の内因性サーファクタントの検討を継続する予定である。動物実験を開始しておらず、実験動物費用、麻酔薬剤費用がかかっていないため。研究の進捗がやや遅れており、材料・消耗品等の物品の購入が少なかったため。研究計画の追加で他施設共同研究となったため、倫理審査に時間を要し、本年度、研究が遅れている。ほとんど進捗していないため、使用がなかった。次年度は、PC含め唾液中成分の網羅的測定に使用する予定である。実験動物(ウサギ)、麻酔薬剤、試薬の購入に使用する。動物・薬剤・試薬等の購入に使用する。
トランスナショナルなシティズンシップと人権に関する思想史的研究

2018年度は、本件とは別に私が研究代表者となり3年間にわたって進めてきた科研費による研究(「EUの多次元的な福祉レジーム改革とシティズンシップの変容に関する研究」、課題番号:16H05730)の最終年度にあたるため、年に2回の研究会を通じて共有された研究分担者たちによるEU加盟各国での福祉レジーム改革に関する調査結果をも参照しながら、「社会的に排除された人びと」の実態とその支援策の展開について知見の整理を進めた。その際、EUによる移民統合政策と共通庇護制度の分析を担当した私自身は、欧州委員会が2000年代に入ってから提唱した定住移民のためのcivic citizenshipという構想の行方、ならびにEU加盟各国において施行されている移民への「市民統合(civic integration)」政策の展開に着目して、2003年に採択されたEUの「家族再結合指令」および「長期居住者指令」が、(EU加盟国の国籍を有する市民のみが享受することのできる)EUシティズンシップとは異なる広義の欧州シティズンシップの形成にとって有する意味を考察した。上記の調査作業を整理するための理論的枠組みとして、フランスの政治哲学者であるJ.ランシエールのいう「政治」と「人権」の独特な概念、ならびにイギリスの政治学者であるE.アイシンが提唱する「遂行的シティズンシップ」の概念を援用し、得られた知見への分析を行なった。以上の研究の成果は、私が2019年9月に公刊した論文「EUは越境する人の権利をどこまで認めているか?」において発表した。また、上記の共同研究の成果をまとめた編著を出版する計画を研究分担者とともに立案した。上述のとおり、2018年度は、EU加盟国の国民のみが享受することのできる狭義のEUシティズンシップに限定されない広義の欧州シティズンシップの形成・変容の経緯を跡づけてみた。その成果は上述のとおり、2018年9月に私が公刊した論文「EUは越境する人の権利をどこまで認めているか?」において論述した。この論文では、EUシティズンシップの進化、1999年のタンペレ欧州理事会を端緒とするEUの「共通庇護・移民政策」の展開過程、その過程において生じた欧州委員会のcivic citizenship構想と加盟国政府の市民統合政策との乖離、難民受け入れにおける「安全保障化(seciritization)」への傾向、加盟国による難民受け入れの分担原則を定めたダブリン規則の機能不全などを指摘した。この論文ではまた、人権とシティズンシップとの関連を分析するための理論的な枠組みを構築する一環として、ランシエールのいう「政治」の概念とアイシンの「遂行的シティズンシップ」論との共通性を発見し、両者の議論は、移民・難民が自分たちの置かれた境遇を公共の場に訴えようとする取り組みを評価するうえで重要な含意を有していると論じておいた。総じて、EUとその加盟国では、移民の排斥を唱える右派勢力の台頭とイギリスのEUからの離脱にもかかわらず、「国籍差別の禁止」原則を盾にしながら、移民や難民の地位をEU加盟国の国民の地位へと接近させていく試みと運動が静かに進行していることが明らかになった。2019年度にはまず、上述の「EUの多次元的な福祉レジーム改革とシティズンシップの変容に関する研究」の枠内で研究分担者とともに共同研究の成果を編著にまとめる作業に取り組む。そのうえで2019年度には、近代哲学、とくにドイツ観念論のテキストの読解に力を注ぎ、人格の相互承認による権利関係の生成という人権論の基本論理を、現代社会の多文化的状況に沿って再解釈し具体化する。その際、J.Gフィヒテの自然法論からG.W.F.ヘーゲルの「客観的精神」の概念への展開行程において人格の相互承認の論理が演じている役割の重要性に着目しなければならない。とくにドイツ語版ヘーゲル全集における関連テキスト(『イェナ体系構想I・II・III』、『哲学的諸学の百科全書』の各年度版、精神哲学に関する講義ノートなど)の読解に力を注ぐ。ドイツ観念論の承認理論を多文化的状況における権利論へと応用しているのは、現代ドイツの哲学者であるJ.ハーバーマスであるが、彼の理論には学ぶべき点が多いものの、言語的コミュニケーションと合意の偏重という欠点も見られる。私は、承認および権利の生成における紛争や断絶というJ.ランシエールの議論、ならびに人間の身体性および脆弱性というM.ヌスバウムやB.S.ターナーが強調している観点を重視し、紛争・対立と人間の身体性を盛り込んだ権利論の構築へと歩を進めたい。この作業を哲学史の面から補強する試みとして、H.グロチウスとS.プーフェンドルフの自然法論の再解釈にも取り組むことになろう。

その際、EUによる移民統合政策と共通庇護制度の分析を担当した私自身は、欧州委員会が2000年代に入ってから提唱した定住移民のためのcivic citizenshipという構想の行方、ならびにEU加盟各国において施行されている移民への「市民統合(civic integration)」政策の展開に着目して、2003年に採択されたEUの「家族再結合指令」および「長期居住者指令」が、(EU加盟国の国籍を有する市民のみが享受することのできる)EUシティズンシップとは異なる広義の欧州シティズンシップの形成にとって有する意味を考察した。上記の調査作業を整理するための理論的枠組みとして、フランスの政治哲学者であるJ.ランシエールのいう「政治」と「人権」の独特な概念、ならびにイギリスの政治学者であるE.アイシンが提唱する「遂行的シティズンシップ」の概念を援用し、得られた知見への分析を行なった。以上の研究の成果は、私が2019年9月に公刊した論文「EUは越境する人の権利をどこまで認めているか?」において発表した。また、上記の共同研究の成果をまとめた編著を出版する計画を研究分担者とともに立案した。上述のとおり、2018年度は、EU加盟国の国民のみが享受することのできる狭義のEUシティズンシップに限定されない広義の欧州シティズンシップの形成・変容の経緯を跡づけてみた。その成果は上述のとおり、2018年9月に私が公刊した論文「EUは越境する人の権利をどこまで認めているか?」において論述した。この論文では、EUシティズンシップの進化、1999年のタンペレ欧州理事会を端緒とするEUの「共通庇護・移民政策」の展開過程、その過程において生じた欧州委員会のcivic citizenship構想と加盟国政府の市民統合政策との乖離、難民受け入れにおける「安全保障化(seciritization)」への傾向、加盟国による難民受け入れの分担原則を定めたダブリン規則の機能不全などを指摘した。この論文ではまた、人権とシティズンシップとの関連を分析するための理論的な枠組みを構築する一環として、ランシエールのいう「政治」の概念とアイシンの「遂行的シティズンシップ」論との共通性を発見し、両者の議論は、移民・難民が自分たちの置かれた境遇を公共の場に訴えようとする取り組みを評価するうえで重要な含意を有していると論じておいた。総じて、EUとその加盟国では、移民の排斥を唱える右派勢力の台頭とイギリスのEUからの離脱にもかかわらず、「国籍差別の禁止」原則を盾にしながら、移民や難民の地位をEU加盟国の国民の地位へと接近させていく試みと運動が静かに進行していることが明らかになった。2019年度にはまず、上述の「EUの多次元的な福祉レジーム改革とシティズンシップの変容に関する研究」の枠内で研究分担者とともに共同研究の成果を編著にまとめる作業に取り組む。そのうえで2019年度には、近代哲学、とくにドイツ観念論のテキストの読解に力を注ぎ、人格の相互承認による権利関係の生成という人権論の基本論理を、現代社会の多文化的状況に沿って再解釈し具体化する。その際、J.Gフィヒテの自然法論からG.W.F.ヘーゲルの「客観的精神」の概念への展開行程において人格の相互承認の論理が演じている役割の重要性に着目しなければならない。とくにドイツ語版ヘーゲル全集における関連テキスト(『イェナ体系構想I・II・III』、『哲学的諸学の百科全書』の各年度版、精神哲学に関する講義ノートなど)の読解に力を注ぐ。ドイツ観念論の承認理論を多文化的状況における権利論へと応用しているのは、現代ドイツの哲学者であるJ.ハーバーマスであるが、彼の理論には学ぶべき点が多いものの、言語的コミュニケーションと合意の偏重という欠点も見られる。
電子線励起発光顕微法による表面プラズモンの研究

本研究において透過型電子顕微鏡に搭載した光検出システムを用いて電子線励起発光法を開発してきた。この手法では、試料から放射される光の偏光方向を選んでスペクトルを測定し、特定の波長の光だけを使ってフォトンマップを観察できる。この手法は、金属表面に誘起される表面プラズモンを可視化できる。本研究では、光の波長以下の微細構造を持つ金属フォトニック結晶に生じる表面プラズモンをこの手法を用いて調べ、金属フォトニック結晶の示す新規な光学特性を探ると同時にその機構を明らかにすることを目的とした。従来のカソードルミネッセンス検出装置を改良し、放射スペクトルを高感度で検出するCCD検出器と集光ミラーを直接観察できるCCDカメラを設置した。また、新たに角度分解機能を備えた光検出装置の開発を行った。ナノホールをもつ金属薄膜や、金属表面の1次元および2次元ナノ構造に形成される表面プラズモンの性質を調べる実験を行った。1次元構造としては単一ストライプ構造およびその1次元周期構造を、2次元構造としては微粒子を六方格子および正方格子状に配列した試料を作製した。電子ビームで励起したとき放射スペクトルに発光ピークが現れるのを観測した。発光ピークは、局在した表面プラズモンの固有モード、または周期構造に特有の定在波モードと対応することが分かった。単一表面ステップの放射スペクトル像の放射角依存性の測定から、遷移放射と表面プラズモン放射との干渉効果がフォトンマップにおけるコントラストの重要な発生機構であることが明らかとなった。関連した研究として、フォトニック結晶からの放射、周期構造表面に平行に電子が入射するとき発生するSmith-Purcell放射の測定も行い、この手法による新たな知見が得られた。初年度は、既設の光検出器を装備した透過型電子顕微鏡を主要装置として用い、以下の試料に対して波長や偏光方向を選択したイメージング、および位置指定した発光スペクトルの測定から表面プラズモンの性質を調べた。(1)2次元配列したナノホールをもつ金属薄膜(2)ストライプ状の格子表面、および微粒子の1次元および2次元に配列した表面(1)では、Ebbesen氏から試料を提供してもらい、ナノホールのエッジに局在した表面プラズモンモードの存在を証明した[Optics Communications 239,61(2004)]。試料は、膜厚270nm、ホール径240nm、間隔600nmのナノホール配列をもつもので、波長700nmの光に対して異常透過が起こる。p偏光とs偏光方向でいろいろな波長の光でフォトンマップを測定した。ナノホールエッジに局在したコントラストは局在表面プラズモン(LSP)によるもので、それとは別に波長700nmのマップに対角線方向に走る線状のコントラストを観測し、これは表面を伝播する表面プラズモンポラリトン(SPP)が定在波を形成していると考えた。このモードがホールに局在したLSPモードと結合して異常透過の現象が起こると解釈できる。(2)では、シリコン表面に2次元的に配列させたポリスチレン球状微粒子に銀やアルミニウムを蒸着した表面における表面プラズモンの共鳴モードを調べ、その発光を用いて各モードの発光パターンを観測した。これら共鳴モードの発光は、ブリルアンゾーン境界の波数をもつ定在波のパターンを示すことが見出された。この結果から、共鳴モードの発光エネルギーは、表面プラズモンのフォトニックバンドのバンドギャップにおけるエネルギーに対応すると予想され、全てのモードのバンド構造との対応を調べている。また、既存の装置による実験と並行して、角度分解型光検出装置の開発を行った。この装置を使った実験は来年度行う。平成17年度は、前年度の研究を継続して行う一方で、前年度に作製した角度分解型光検出装置を使ってナノホールや1次元および2次元表面構造に形成される表面プラズモンからの発光の放射角依存性を調べる実験を行った。

この装置には偏光方向と波長とを選別する機能があるのでそれらを特定の値に設定することでプラズモンモードを選択できる。試料である単一ストライプ構造およびその周期構造は、文科省ナノ支援総合プロジェクトの技術代行により作製してもらった。今年度の研究成果を以下に示す。1.ナノホールをもつ金属薄膜試料に対して放射角毎に角度分解した発光スペクトルや発光像の測定を行った。その結果を透過光スペクトルの角度依存の結果と比較して、光の異常透過現象における表面プラズモンの機構を検証した。2.単一ストライプ構造ではストライプに平行に伝播するモードと垂直に伝播するモードに分けられ、さらに前者ではエッジモードと平面モードがあり、後者にはエッジを両端とする定在波モードがある。後者の定在波表面プラズモンモードを、発光のスペクトルマップから明らかにした。3.1次元および2次元表面周期構造は回折格子として働くため単一ストライプ構造の場合とは異なるシャープなピークをもつ放射角依存性を示すはずであり、その測定を行った。結果は予想に反し、シャープな角度分布は見られなかった。また、周期構造内における切り立ったエッジからは局在表面プラズモンによると考えられる発光が高角領域に現れた。来年度も引き続きモード毎の変化を調べていく予定である。平成18年度は、主にデータ解析と発光の性質の解明に力を入れた。単一ステップからの発光によってフォトンマップに生じる干渉縞コントラストの放射角度依存性を精密に調べた結果、コントラストの原因に遷移放射が関わっていることが明らかとなった。この解釈に基づいて以前の結果の見直しを行った。また、新たに以下の研究を行った。1.金属フォトニック結晶単一ストライプ構造および球状微粒子を2次元配列させた構造に続き、複雑な構造として3角柱をハニカム状に配列させた構造における表面プラズモンの性質を調べた。Γ点の定在波モードのエネルギーは微粒子配列の場合と異なることが分かった。2.金属フォトニック結晶表面に平行に入射した電子線によるコヒーレント光放射2次元配列した球状微粒子表面に平行に電子線を入射させてSmith-Purcell放射の測定を行った。発光スペクトルには鋭いピークが現れ、電子の進行方向の周期対応したピーク波長であること、ピーク位置は放射角に依存してシフトすることを確認した。さらに、未知の発光ピークが現れ、フォトニックバンドとの関係を調べている。3.誘電体フォトニック結晶Masegure教授から提供された逆オパール構造のフォトニック結晶を用いて電子線の入射側および出射側に放出された光のスペクトルを測定したところ、多数の発光ピークが観測された。フォトニックバンド構造との関係を調べ、バンドギャップに対応するスペクトルの谷があることを見出した。
１細胞計測のためのフォトニクス・マイクロフルイーディックス融合デバイスの構築

動物細胞から分泌される分子の検出を目的に、光方向性結合器(DC)型バイオセンシングシステムを作製した。まずポリマー導波路DCによる原理検証を行った後、窒化シリコン導波路DCにより、センシング領域の微小化を図った。シミュレーションによるデバイス設計の後、実際にデバイスを作製し、その動作を確認した。これを微小流路と結合して、微小領域で生体関連物質のセンシングが可能なことを示した。方向性結合器干渉計による検出では、2つの近接した導波路間での2つの固有モードの位相干渉を利用する。入射光として基底モード光を入射すると、平行導波路で2つの固有モード(偶および奇モード)の結合モードとして伝搬する。2つの固有モードは、導波路外部に染み出す近接場を介して、表面(特にギャップ内)に接する媒質の屈折率の影響を受ける。これにより、互いの干渉により出射光強度が変化する。FDTD法による電磁界シミュレーションを利用し、導波路断面寸法、屈曲部の角度、ギャップ間隔G、結合器全長Lを決定した。この際、方向性結合器干渉計の極限的な構造として、G = 0に相当するマルチモード型干渉計の構造検討も併せて行った。断面寸法が縦横0.6 μm ×0.6 μmの直線導波路を基本構造としたギャップレス方向性結合器を計算モデルとして、センサ領域の周辺媒質の屈折率変化によるシグナル変化に線形性が認められた。また、抗原抗体反応を想定した分子層の屈折率変化により、シグナル変化が得られることを確認した。シミュレーション結果をもとに、方向性結合器干渉計およびマルチモード型干渉計をSiO2 / Si基板上にネガ型フォトレジストSU-8を用いて作製した。導波路断面のSEM画像から設計通りの導波路構造の形成を確認した。波長632 nmの光学系で導波路端面への光入射実験を行ったところ、結合器全長Lを変化させたデバイスから得られたシグナルは、シミュレーション結果と良い一致を示した。センシング素子としての評価のため、検出部に水を滴下し、その前後で得られる導波光の強度変化をCCDカメラで観察した。その結果、液滴による屈折率変化(Δn = 0.33)で光強度が変化する様子が確認された。また、測定結果とシミュレーションによる結果が一致することが確認された。微小領域での高感度バイオセンシングを目指し、トランスデューサとなる方向性結合器の試作と評価を進めた。厚さ2.0 μmのSiO2層(屈折率1.46 (波長633 nm))を形成したシリコン基板上にフォトレジストSU-8 (屈折率1.59 (波長633 nm))の導波路を電子線描画により形成し、方向性結合器を作製した。導波路寸法は、幅600 nm、高さ700 nm、間隔300 nmとした。測定は方向性結合器出射部の光強度をCCDカメラの画像から定量し、規格化することにより調べた。まず、デバイスの応答を、空気、水、エタノールをサンプルとして調べた。伝搬光の規格化光強度P2/( P1 + P2))の変化を測定し、FDTD法によるシミュレーション結果との比較を行った。測定値とシミュレーション結果は良い一致を示した。また、DC長20μmのデバイスにおいても、空気、水、エタノールそれぞれのシグナルを分離することができ、微小なデバイスを用いた異なる液体の測定が可能であることが示された。続いて、方向性結合器表面に1本鎖プローブDNAを固定化し、それと相補的配列を持つ量子ドット修飾DNA (QD-DNA)をハイブリダイズした際のシグナル変化を測定した。測定には方向性結合器長201540 μmの異なる16種のデバイスを用いた。QD-DNAをハイブリダイズした際のシグナル変化の測定では、方向性結合器長20μmの微小なデバイスにおいても、規格化光強度0.71から0.74へと有意な変化が確認され、相補鎖DNAの検出が可能であった。一方、方向性結合器長1540μmのデバイスにおいては、規格化強度が0.32から0.94に変化し、応答が増幅されることが確認された。これらの結果より、方向性結合器型デバイスにより、微量な表面吸着物質の測定が可能であることが示された。フォトニック集積回路における重要な素子の一つである光方向性結合器は、バイオセンサの微小化、高感度化に有望である。本研究では、1細胞センシングを最終的な目標に、光方向性結合器バイオセンサの開発を行った。方向性結合器は2つの導波路が近接した構造を有する。入射したレーザー光は2つの固有モード(偶および奇モード)の結合モードとして導波路中を伝搬する。固有モードは表面と接する媒質の屈折率に応じて異なる依存性を示し、導波路外部に染み出す近接場を介して互いに干渉するため、2つの導波路からの出射光強度が変化する。これらの出射光強度の比を取ることにより、入射時や伝搬時の光減衰に起因する出射光強度の絶対値の変動の影響を低減できる。ビーム伝搬法および有限要素法を用いたシミュレーションにより、センサ特性のシミュレーションを行い、これをもとに方向性結合器を設計・作製した。まず、電子線描画により形成した厚膜フォトレジスト(SU-8)導波路から成る方向性結合器を作製した。この方向性結合器とPDMS

微小流路を結合し、一本鎖DNAをプローブとして方向性結合器表面に固定し、微量溶液中の相補的なDNAが検出できることを確認した。また、ビオチン化表面へのストレプトアビジン結合も確認した。シミュレーションの結果、センサ高感度化には方向性結合器の伸長が有効であることが示された。そこで、導波路材料を厚膜フォトレジストからよりコア・クラッド間の屈折率差の大きいシリコン窒化膜に変えた方向性結合器を作製した。この方向性結合器では結合部を長くし、これを微小領域に収容するため、折り畳み構造とした。1細胞と同スケールの領域への長尺方向性結合器の集積化により、1細胞のその場測定に適した光センサ素子が実現した。動物細胞から分泌される分子の検出を目的に、光方向性結合器(DC)型バイオセンシングシステムを作製した。まずポリマー導波路DCによる原理検証を行った後、窒化シリコン導波路DCにより、センシング領域の微小化を図った。シミュレーションによるデバイス設計の後、実際にデバイスを作製し、その動作を確認した。これを微小流路と結合して、微小領域で生体関連物質のセンシングが可能なことを示した。シミュレーションによる設計の後、方向性結合器を実際に作製して、屈折率の異なる溶液あるいはDNAを用いた特性評価を進めた。これにより、当初の予想通りの応答が得られることを確認した。微小流路と結合して水溶液プラグ中の成分の検出を行う実験がやや遅れているが、全般的には計画通り研究が進展し、当初予想していた結果が着実に得られている。27年度が最終年度であるため、記入しない。センサ・マイクロマシン微小流路を結合して、水溶液プラグ中のタンパク質を検出することを行う。これまでの評価により、結合長が長いほど、高感度な測定が可能であることが示された。一方で、プラグを用いることによる使用する溶液量の微量化も重要な課題である。これらを両立しうる微小流路構造を検討する必要がある。これを確認した後、細胞を用いた実験へと進む。平成25年度は、1リッジ型導波路構造で構成される方向性結合型干渉計の作製、2液滴操作用流路構造の作製と干渉計との接続を目標としていた。この種のフォトニックデバイスを試作する場合、細部の寸法を決定するためのシミュレーションが不可欠であり、研究はまずここから開始した。シミュレーションの作業は順調に進行し、試作を進める上での細部の最適寸法を決定した。なお、以下に述べるように、試作に遅れが生じたため、平成26年度以降に実施予定であった、ギャップ間隔G = 0に相当するマルチモード型干渉計のシミュレーションも平成25年度に実施した。方向性結合器干渉計およびマルチモード型干渉計の導波路構造は、当初SiO2(n = 1.45)/ Si基板上に形成したSiN層に形成する予定であったが、学内の共用設備の導入が遅れたため、ネガ型フォトレジスト(SU-8)で導波路構造を作製した。目標2については、目標1において最終的な構造決定には至らなかったため、流路構造の検討を25年度に開始するところまでは至らず、その前段階として、水をサンプルとして干渉計感応部に滴下し、変化を見ることにとどまった。平成26年度中に予定していた国際会議での成果発表が平成27年4月にずれ込んだ。また、デバイスの試作・評価に必要な資材は平成26年度末までに使用分は間に合っていた。
多死時代における「死別の時」の家族リジリエンス査定と家族システム調整スキルの開発

本研究は、多死の時代に人々が地域包括ケアシステム下で、納得のいく死を迎えられるか、家族は看取る力を持っているか、を問題意識として、その実態と看護専門職の家族支援スキルを考案したものである。具体的には、1地方都市の高齢者ビッグデータ分析および家族介護世帯調査、2家族を対象とした「終末期を看取る家族リジリエンス研究」、および3家族支援専門看護師が実践する家族調整スキルの3点を探索し、成果をまとめた。本研究は、調査研究と研修を並行して行っていくアクションリサーチ法を用い、家族システムの調査と家族内コンフリクトを調整していくモデルを開発し、研修で効果を確認しつつ、モデルを発展させていく方法をとった。本研究の目的は、「死別の時」という追い詰められた状況下で発揮される家族の力、すなわち「家族リジリエンス」の詳細を明らかにすることである。初年度はまず文献で、家族リジリエンストの構成要素を整理した。家族(メンバー)が健康問題を持った状況下での、家族の力としては「家族生活力量」という考えがある。それは「家族が健康生活を営むための知識、技術、態度、対人関係、行動、情緒が統合されたもの」で、セルフケア力やエンパワメントの概念から、健康問題対処力、役割再配分、関係調整・統合力、家事運営、家計管理および日常生活を保つ力と社会資源活用技術である。一方、リジリエンスとは「回復力」や「弾力性」であり、ある苦しい状況下から這い上がって回復する力、困難性を跳ね返す・打ち勝つ力である。リジリエンスと家族力量の違いは、力を持っている、持っていない、の特性ではなく、獲得可能なものである、という捉えである。ワルシュは危機的状況を通して家族が家族として回復する可塑性を「家族レジリエンス」という概念で提示した。それは家族のもつ対応力、塑性力、適応力で、そのキーとなる態度や認知は、a.苦難に意味づけをする, b.問題と「よく戦う姿勢」,c.肯定的な信念(ビリーフ)をもつこと,d.家族の柔軟性や結びつく力や資源,e.明確でオープンな情緒表現と問題解決コミュニケーション、であるとしている。今年度の調査として、家族リジリエンスに特化したものではないが、I県A市における高齢者約3万人の健康・要介護状態・認知症・家族介護に関するデータを分析した。結果として、地区別で健康度(要介護度)に有意な差がみられた。要因として地区での交流など、ソーシャルサポートが推察されるが、家族介護力(リジリエンス含む)測定は次年度計画に持ち越した。看護師が行う、家族内コンフリクトにおける「メンバー間調整スキル」の抽出はできた。初期の計画では、質的研究手法でリジリエンスの内容を抽出してから、それをもとに事例分析のパターンマッチングで、介入方法を明らかにする計画でいたが、量的調査が入ったことで、質的研究が約半年遅れている。ただし準備は進めており、先に家族間調整スキルが整理できたこともあり、おおむね順調と考える。本研究の目的は、1つは多死時代における、「死別の時」に対処する家族リジリエンスを査定するための、家族リジリエンスの構成や内容に関する質的研究であり、2つ目は、臨死期に多発する家族システム内・外での、コンフリクトを調整していくスキル開発である。2016年度は調査実施として以下5本行った。当初エスノグラフィー等の質的手法で「死別の時」の家族のもつ力の構成要素探索を計画したが、変更して実態調査を予定より早めて実施した。この研究活動の視座は、死別の時を<高齢者の死>と<病気とりわけ`がん'での死>に分けて、家族リジリエンスを、1家族成員(当事者と取り囲む一人ひとり)がもつ力、2システムとしての家族がもつ力(凝集力や塑性性)、そして3社会との関わり力(共助、公助への関与)の3段階で捉えている。また、調査対象を、家族支援を行う看護職と、地域のシステムそのものを設定し、それらの組み合わせで、調査を行った。(1).高齢者の終末期×地域システム:K市の「最期まで住み続けられる地区・そうでない地区の要因分析」ービッグデータを用いた実態調査.(2).高齢者の終末期×家族リジリエンス:K市の「家族介護者の就労変化と経済損失」調査とH市での「全要介護世帯での介護負担感と「死」をめぐる認識。家族リジリエンス調査」ーアンケート調査.(3)`がん'での死×家族リジリエンス査定:毎月1回の家族看護研究会でのケーススタディ分析ー家族成員各々がもつ力および相互作用のダイナミックスから、支援すべきところの焦点化をはかる。リジリエンスの構成要素の探索と看護師の調整力アップの2つのねらいを持つ。(4)`がん'での死×看護師の支援困難感と関連要因:アンケート調査(5)`がん'での死×看護師の肯定的実践と認識および関連要因:アンケート調査以上、断続的に多面的に調査研究を行った。最初の計画では、質的研究手法を用いて家族リジリエンスの構成要素を明確にし、それをもとに調査票を作成して、地域での高齢者家族を対象とした「死別の時」の統計的実態調査を計画したが、全てが同時進行的に進んでいる。その意味では、計画以上のスピードと言えなくもないが、ケーススタディでの質的研究分析が遅れており、全体としてはおおむね、という評価になる。

本研究の目的は、1つは多死時代における、「死別の時」に対峙する家族リジリエンス(=困難からの回復、塑性力)を家族システムの枠組みで、その構成要素を分析することであった。2つ目は、多死の時代の地域ケアシステムから支援を考察することであり、具体的には、人々が地域包括ケアシステム下で納得のいく死を迎えられるのか、の問題意識で、その可能性を探索することであった。同時に納得のいく死を可能にするための、看護援助職のスキルの開発を計画した。調査の焦点は3つあり、「地域実態調査」と「家族調査」そして「専門職調査」であった。まず実態調査では、初年次に地方のA市の高齢者ビッグデータを使って、地域での高齢者介護と住み方を調べ、今後の推移を考えた。さらにB市で要介護世帯でのリジリエンス調査を行った。両調査からは都会に比較して、地方の小規模市は家族リジリエンスを持っており、また文化の影響下で介護を持ちこたえようとしているが、人口減少する中では、ソーシャルキャピタル(=社会的な絆の力)を強化する必要性が示唆された。2つ目の家族システム調査は、最終年度に「終末期を看取る家族リジリエンスの構成要素の研究」を行った。対象は壮年期がん患者を自宅で看取った家族であり、看取り時の対応の決断には、「患者の願い」を叶える「家族の凝集」の様があった。3つ目の専門職調査は、家族支援専門看護師(以下CNS)がとらえる家族の「調整」スキルをまとめた。CNS特有の調整は、《メンバー相互作用での「反応」を見逃さずに見極め、それを手がかりに推察し、新たな反応(相互作用)を引き起こして、意向/思いのすり合わせをする》であった。本研究では、以上の調査結果と家族看護研究会等での看護専門職への知見のフィードバックを重ね(アクションリサーチ法で)、家族リジリエンスの構成要素の解明と家族システム調整スキルの提示を行った。本研究は、多死の時代に人々が地域包括ケアシステム下で、納得のいく死を迎えられるか、家族は看取る力を持っているか、を問題意識として、その実態と看護専門職の家族支援スキルを考案したものである。具体的には、1地方都市の高齢者ビッグデータ分析および家族介護世帯調査、2家族を対象とした「終末期を看取る家族リジリエンス研究」、および3家族支援専門看護師が実践する家族調整スキルの3点を探索し、成果をまとめた。本研究は、調査研究と研修を並行して行っていくアクションリサーチ法を用い、家族システムの調査と家族内コンフリクトを調整していくモデルを開発し、研修で効果を確認しつつ、モデルを発展させていく方法をとった。初期の計画では、質的研究手法でリジリエンスの内容を抽出し、それをもとに事例分析のパターンマッチングで、介入方法を明らかにする計画でいた。それと並行して家族間調整スキル開発を計画していたが、先に整理できた。半年遅れとなっている、リジリエンスの質的研究を進めながら、量的調査で、家族力量および家族リジリエンスの実際と関連要因を探索したいと考えている。2017年度は、本研究の最終年度となる。統計学的な調査が先に進行しており、裏付けのためのヒヤリングなど質的調査をK市で実施する予定である。また、ケーススタディからの膨大なケースデータを整理して、「死別の時」に臨む家族の、家族リジリエンスを明らかにする予定である。家族看護データ整理補助作業の人件費(謝金)が予定よりも、少なくて済んだため。論文公表のための英文校正費用を準備していた。予定していた論文公表が平成29年度になるため、63,225円の未使用額が発生した。
自己削除型レンチウイルスベクターによる遺伝子治療法の開発

ゲノム編集技術CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9を利用した「自己削除型」レンチウイルスベクターによる遺伝子治療法の開発のため、研究計画に従い、1)この自己削除型レンチウイルスベクターの構築を行った。まず、このsgRNAs(single-guide RNA)による特異的遺伝子のノックアウトを検討するため、恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFPの蛍光で容易に判定のできる293T細胞(LTR(long terminal repeat)-GFP-LTR、の形でランダムにゲノムに組込み)を作成した。これらの細胞にLTRを標的とするsgRNAを恒常的に発現させ、GFPの除去を確認した。そのノックアウト効果をsgRNA発現ユニットを1数個タンデムに配列させて検討したところ、異なる箇所を2個ターゲットした場合が最も効率よく、ノックアウトできた。しかしながら、これらのsgRNAを改変H1-2O2の下流につなぎTet-誘導性のGFPの除去を検討したところ、Tetによる誘導性の除去ができなかった。複雑なベクター構築により、改変H1-2O2プロモーターの発現抑制が充分でなった可能性が考えられた。本課題の実践的な目的は、レンチウイルスベクターを使った目的遺伝子のノックアウトの後、使用したレンチウイルスの除去である。そのため、1つのベクターにすべてのコンポーネントを収めるのではなく、レンチウイルスベクターによる目的遺伝子のノックアウトの後に、宿主細胞のゲノムに組込まれにくいAAVベクターを使うことにより、ゲノムに組込まれたレンチウイルスベクターの除去を行う方法を検討した。この方法により20%くらいの効率でレンチウイルスベクターのが除去が確認された。まずこのsgRNAs(single-guide RNA)による特異的遺伝子のノックアウトがうまくいくか検討するため、既にノックアウト効果が知られているGFPの配列、及びレンチウイルスベクターのLTR(long terminal repeat)を標的とする複数の配列を、sgRNAの構成的な発現をさせるU6プロモーターの下流につないだものを作成した。2)HTLV-1が感染したヒト培養細胞での実験、3)第二段階のTet(テトラサイクリン)を加え、sgRNA2の発現を誘導し、この自己削除型レンチウイルスベクターそのものの除去を確認する実験に先立ち、恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFP、DsRedといった蛍光で容易に判定のできる293T細胞(1293T細胞にGFPを恒常的に発現する細胞、2DsRedを恒常的に発現するレンチウイルスベクターを作成、感染させ、LTR-DsRed-LTRの形でゲノムに組込まれた293T細胞)を作成した。これらの細胞にGFP、レンチウイルスベクターLTRを標的とするsgRNAを恒常的に発現させ、GFPおよびレンチウイルスベクターが除去できることを確認した。現在、これらのsgRNAを改変H1-2O2の下流につなぎTet-誘導性のGFPおよびレンチウイルスベクターの除去ができるか、検討しているところである。当初の実験計画2)HTLV-1が感染したヒト培養細胞での実験、3)第二段階のTet(テトラサイクリン)を加え、sgRNA2の発現を誘導し、この自己削除型レンチウイルスベクターそのものの除去を確認する実験に先立ち、恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFP、DsRedといった蛍光で容易に判定のできる293T細胞を作成したため、進捗が遅れることとなった。しかしながら、これらの細胞を用いることにより、恒常的なノックアウト効果が簡便に確認することができた。さらにTetによる誘導的なノックアウトの検討も詳細にできると期待できる。ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を利用した「自己削除型」レンチウイルスベクターによる遺伝子治療法の開発のため、研究計画に従い、ウイルスベクターの構築を行った。まず、このsgRNAsによる特異的遺伝子のノックアウトを検討するため、恒常的なノックアウト効果、及びTetによる誘導可能なノックアウトをGFPの蛍光で容易に判定のできる293T細胞(LTR-GFP-LTR、の形でランダムにゲノムに組込み)を作成した。これらの細胞にGFP、LTRを標的とするsgRNAを恒常的に発現させ、GFPが減弱することを確認した。また、ノックアウト効果をsgRNA発現ユニットを1数個タンデムに配列させて検討したところ、異なる箇所を2個ターゲットした場合が最も効率よく、ノックアウトできた。しかしながら、これらの標的遺伝子のsgRNAを改変H1-2O2の下流につなぎTet-誘導性のGFP蛍光を観察したが、誘導性の除去ができなかった。単純なベクター構築では機能していた改変H1-2O2プロモーターの誘導発現が、この複雑なベクター構築の際はうまく機能しなかった。一方、ノックアウトの方法としてsgRNA発現ユニットと切断部位周辺の相同配列、stop codonをドナーDNAとして載せたアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使う方法でも、効率のよいノックアウトができた。ベクターの各コンポーネントの機能は確認できたので、誘導性のノックアウトができるよう各コンポーネントのつなぎ方等を再検討する。また、本課題の目的、レンチウイルスベクターを使った目的遺伝子のノックアウトの後、使用したレンチウイルスの除去を達成するため、1つのベクターにすべてのコンポーネントを収めることにこだわらず、挿入できるサイズは大きくないが宿主細胞のゲノムに組込まれにくいAAVベクターも使って段階的に進める実験も並行して行っている。