hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
標的遺伝子に点突然変異をもつマウスの開発研究

マウスゲノムに誘発した新規点突然変異のアーカイブ化と変異高速発見システムを駆使し、特定の遺伝子機能解明を普遍的に誰でも利用できる基盤開発を目的とする。利用者が標的とする遺伝子領域を特異的に増幅するPCRプライマーさえ準備すれば、どのマウスゲノム配列/遺伝子配列でも点突然変異をもつマウス系統を提供できる。利用者は提供された変異マウス系統を用いてゲノム機能を個体表現型レベルから遺伝子ネットワークに至るまで自在に解析する。今年度は、まず凍結精子アーカイブを約10,000に、ゲノムDNAアーカイブを8,000に増強した(権藤)。点突然変異を検索する標的として生殖形態形成関連(山田)や生殖細胞発生関連(北田)の未知遺伝子群を探索同定しプライマー設計が可能となった。脳神経関連(饗場)、老化関連(菅原)、がん関連(木南)、免疫関連(西田)、ポリコーム群(古関)、PCP関連(上野)、遺伝子発現関連(阿部)、それぞれの遺伝子群において、昨年度設定したプライマーを用いてTGCE法を用いてスクリーニングを行った(権藤)。すでにのべ14遺伝子から昨年度の3倍近くとなる合計30ほどの点突然変異を検出し(権藤)、そのうち6系統についてはすでにマウスとして交配し機能解析に入った(西田、阿部、木南、饗場、古関)。さらに、ほぼ同数の変異系統を、現在、凍結精子から回復し個体に戻すことを検討している(菅原、上野、他)。また昨年度示唆されていたTGCEの検出感度を検討するためにダイレクトシーケンシングや他の変異発見システムとの比較解析にも着手した。昨年に引き続き更なる利用者を募り標的遺伝子総数135となりhttp://www.gsc.riken.jp/Mouse/で公開している。ENUはランダムに変異を誘発する。特定の遺伝子を標的として変異を起こすことはできない。しかし、大規模に変異を蓄積しすればどの遺伝子にも複数の変異が含まれるように整備することは理論上可能である。われわれのスクリーニング結果から、整備したG1マウス10,000匹からなる凍結精子アーカイブには平均100bpに1個変異が含まれていることがわかっている(権藤)。すなわち遺伝子の大きさを平均23kbとして20から30個の変異をどの遺伝子にも検出できる。まさに「変異マウスライブラリー」そのものである。本研究ではさらに研究分担者(西田、上野、阿部、古関、菅原、木南、饗場)を含め内外の研究者から特定の標的遺伝子の提案と変異スクリーン用のPCRプライマーの提供を受け、マルチプレックスTGCE法を中心として新規変異高速発見システムの構築スクリーンも進めて来た。これまで全常染色体にわたって63の遺伝子に199のプライマーを設計し、45の遺伝子に総数で155の突然変異を発見同定した。この変異マウスライブラリー構築と新規変異発見システムの結果については今年度論文発表した(権藤)。昨年度すでに凍結精子から起こして解析している変異マウス系統(西田、阿部、木南、饗場、古関)に加え、菅原、上野にも体外受精法で回復した変異マウス系統を提供し、ゲノム機能解析に入った。
磁気ビーズを用いたDNA多型領域のクローニングと昆虫の繁殖戦略の解明

本研究の第一の目的であるマイクロサテライト領域を特定するための新たな方法の確立については以下の通りである。対象動物としては、マイマイガLymantria disparのDNAを用いた。まず、対象動物のサンプルから抽出・精製したDNAをプラスミドに組み込み、大腸菌中で増殖させた。その後、ヘルパーファージを用いて一本鎖にし、磁気ビーズにつけた(GT)_<25>プローブを使ってマイクロサテライト領域を持つと思われるものを採取した。プローブと目的領域が最もよくアニールする温度条件は、70°Cから75°C付近であった。その後、採取したマイクロサテライト領域を含むプラスミドを二本鎖にした後、再び大腸菌中で増殖させ、プラスミドを分離して目的のDNAの塩基配列を決定した。このようにして採取された(GT)n領域を含むクローンは24クローンであり、そのうちの11ク自一ンがユニーククローンであった。第二の目的は特定されたマイクロサテライトDNA多型領域を用いた昆虫の繁殖戦略の解明である。我々は得られたマイクロサテライト領域を用いてマイマイガの父子判定を行い,繁殖戦略としての交尾後ガード行動の意義を検討した。マイマイガで,2匹のオスと順次交尾させたメスおよびその2匹のオスからDNAを抽出した。また.メスが産んだ卵内で発生した前幼虫からもDNAを抽出し,PCR法によりマイクロサテライト領域を増幅し,前幼虫各個体の父親がどちらのオスであったかを特定することに成功した。各2オス・1メスの組み合わせの場合のP_2値(2回目の交尾によって受精された卵の割合)を求めた結果,この値が大きく変異し,2回の交尾の間隔と関係があることが示唆された。従って,マイマイガの場合,オスが交尾後ガードを行うことは,メスの再交尾を遅らせることにつながり,これによって自らの精子で卵を受精できる確率を高めることができるという点で,有効な戦略であることが明らかとなった。本年度は主としてマイクロサテライト領域のクローニング方法の開発を行った。まず、対象動物のサンプルからDNAを抽出・精製し、制限酵素で消化したのち150塩基対から350塩基対の長さのものを集め、プラスミドに組み込み、大腸菌中で増殖させた後、ヘルパーファージを用いて一本鎖にし、マグネットビーズにつけた(GT)_<25>プローブを使ってマイクロサテライト領域を持つと思われるものを採取した。この際の温度設定をさまざまに変えて実験を行い、もっともよく採取できる条件を検討した。その後、採取したマイクロサテライト領域を含むプラスミドを二本鎖にした後、再び大腸菌中で増殖させた後、プラスミドだけを分離してプラスミド中の目的のDNAの塩基配列を決定するという実験を繰り返し行った。また、近年発表されたマイクロサテライト領域のクローニングの方法である、挿入配列を持つ一本鎖プラスミドにGTリピートのオリゴヌクレオチドを加え、ハイブリダイズしたもののみをDNAポリメラーゼで二本鎖にしてマイクロサテライト領域を特定するという方法も同時に行い、新しい方法と比較・検討した。さらに、鱗翅類ではGTリピートが取れにくいという報告もあるので、蛾の場合についてはGATAリピートやGACAリピートについても、同様の方法で採取する実験を行った。対象動物としては、まず方法の開発のためにヒトのDNAを用い、ついで蛾のDNAとして、マイマイガLymantriadisparのDNAを用いた。既に新しい方法を用いていくつかのマイクロサテライト領域の特定に成功しているが、まだ採取の効率が低いので、現在、さらに採取効率を上げるための条件設定を行っているところである。

また、その他にはカメムシ類やヤスデ類のDNAも抽出も行っており、今後の実験に用いる予定である。本年度は昨年度に引き続き、マイクロサテライト領域のクローニング方法の開発を行った。まず、対象動物のサンプルから抽出・精製し、制限酵素で消化した150塩基対から350塩基対の長さDNA断片を、プラスミドに組み込み、大腸菌中で増殖させた後、ヘルパーファージを用いて一本鎖にし、マグネットビーズにつけた(GT)_<25>プローブを使ってマイクロサテライト領域を持つと思われるものを採取した。この際の温度設定およびバッファー中の塩濃度をさまざまに変えて実験を行い、もっともよく採取できる条件を検討した。その後、採取したマイクロサテライト領域を含むプラスミドを二本鎖にした後、再び大腸菌中で増殖させた後、プラスミドだけを分離してプラスミド中の目的のDNAの塩基配列を決定するという実験を繰り返し行った。また、採取したプラスミドが本当に目的のGT-repeat領域を含んでいるかを検証するため、ドットブロットハイブリダイゼーションを行った。その際、(GT)_<10>をジゴキシゲニンでラベリングしたものをプローブとして用い、アルカリンフォスファターゼ法による化学発光により検出した。対象動物としては、まず蛾のDNAとして、マイマイガLymantria disparのDNAを用い、いくつかのマイクロサテライト領域の特定に成功した。また、他の節足動物への応用の可能性を検討するために、ヒラタヤスデBazillozonium nodulosumのDNAにおけるマイクロサテライト領域の特定も現在進行中である。本年度は昨年度までにクローニングを行って得られたプライマ-をPCRに用いる際の条件設定およびこれを用いたマイマイガLymantria disparの父子判定を行い,繁殖戦略としての交尾後ガード行動の意義について研究を行った。まず,昨年度までに特定したプライマーについて,PCRの際の反応液の組成,用いるTaq polymeraseの種類,アニーリングの温度,反応サイクルの回数などをさまざまに変えて,最も安定して反応産物を得られる条件を決定した。次に,対象動物であるマイマイガで,2匹のオスと順次交尾させたメスおよびその2匹のオスからDNAを抽出した。また,メスが産んだ卵内で発生した前幼虫からもDNAを抽出し,得られたプライマーを用いてPCR法により増幅したのち,電気泳動によって増幅されたDNA領域の長さを調べた。このようにしてバンドとして検出された領域のうち母親由来でないバンドを2匹のオスのバンドと比較することで,前幼虫各個体の父親がどちらのオスであったかを特定することに成功した。各2オス・1メスの組み合わせの場合のP_2値(2回目の交尾によって受精された卵の割合)を求めた結果,この値が大きく変異し,2回の交尾の間隔と関係があることが示唆された。従って,マイマイガの場合,オスが交尾後ガードを行うことは,メスの再交尾を遅らせることにつながり,これによって自らの精子で卵を受精できる確立を高めることができるという点で,有効な戦略であることが明らかとなった。
Skyrme-QRPAを用いた二重ベータ崩壊の遷移行列要素の計算

ニュートリノ質量を決めるためのニュートリノレス二重ベータ崩壊の遷移行列要素の計算を行うプログラムを開発し、必要な基底状態ならびに励起状態の計算を質量数150近傍で行った。最も大きな成果は、中間状態の重複計算をほとんど厳密に近いものにしたことである。これは最先端の計算機によって可能になったことで、乱雑位相近似のニュートリノレス二重ベータ崩壊への応用をいままでより正確にする進歩である。本研究課題の目的は、ニュートリノの質量を決定するために必要な情報のひとつである原子核のニュートリノレス二重ベータ崩壊の遷移行列要素をQRPAを用いて求めることである。ニュートリノの質量は、素粒子物理の発展に大きな影響を与える重要な物理量のひとつである。QRPAとは原子核の主に励起状態を研究するためによく用いられている近似方法のひとつである。その遷移行列要素は、遷移の二種類の中間状態を遷移の始状態と終状態に基づいてQRPAによって求めること、遷移の始状態から中間状態へと終状態から別の中間状態への遷移行列要素を求めること、そして、二種類の中間状態の重複を求めることの三つの部分で構成される。QRPA計算の準備はすでにできている。平成23年度10月の交付以来、研究代表者寺崎は、二種類の中間状態の重複計算方法とプログラムの開発を行い、現在開発とテスト計算を終えてこのことに関する論文を執筆中である。この計算に関しては、当初先行して行われている他の研究者の方法を用いればよいと考えていたが、その方法を詳細に検討した結果、ニュートリノ質量の重要性を考えるともっと精密な計算を行うべきであるという結論に達し、新たな計算方法の開発から行った。その特徴は、QRPAの状態波動関数をあらわに用いて、多粒子間の力学的相関をできるだけ取り入れようとすることである。その計算は相当に複雑であり、高度に並列化されたプログラムの開発が必要であった。プログラムの開発の後、寺崎は比較的軽い原子核でのテスト計算を精力的に行い、複雑な式の中のどの項が重要であるか、何に注意して計算をする必要があるかなど、本課題の遂行にとって必要な情報を多く取得した。以上が現在までの研究実績と成果であり、すでに2,3の口頭発表を通じて国内外の研究者と意見交換を行った。計画では、ニュートリノレス二重ベータ崩壊の始状態と終状態をHartree-Fock-Bogoliubov(HFB)計算で求める、それらを基に乱雑位相近似(QRPA)計算を行う、始状態と終状態から求めた二種類のQRPA状態の重複行列要素を求める、ニュートリノポテンシャルの二体行列要素を計算する、二体移行の遷移行列要素を求める、これらの行列の積のトレースを求めることにより、原子核行列要素を求める。位相空間因子を計算するという段取りであった。計画の実施期間中にはまず76Ge, 76Se, 130Te, 130Xe, 136Xe, 136Ba, 150Nd, 150Smの基底状態がHFB計算によって求められた。QRPA計算の三割くらいが終了し残りの計算が目下進行中である。ニュートリノポテンシャルの行列要素、二体移行遷移行列要素、位相空間因子を計算するプログラムが完成した。任意のQRPA状態の重複の計算に関しては、最も進んだ計算機を用いれば、今までこの課題の分野で用いられてきた方法よりもずっと厳密に近い方法が計算可能であると判断し、そのような方法を開発して、プログラムを完成させた。計画の実行中この部分に最も時間と労力が充てられた。この方法とテスト計算ならびにQRPA重複行列の数学的性質について三本の論文を出版した。QRPA重複行列要素計算の発展が本計画の研究実績の中で最大の成果である。異なる中間状態の重複を精密に行うため、既存の方法よりも進んだ計算方法と複雑なプログラムの開発が必要であったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は数値計算を精力的に行うべき段階に来ている。このため、すでに筑波大学計算科学研究科学センター学際共同利用による大規模計算のためのコンピュータアカウントを取得した。また、使える資源は限られるが、京都大学基礎物理学研究所と大阪大学核物理研究センターのスーパーコンピュータのアカウントも取得済みである。さらに東京大学の新しいスーパーコンピュータの利用も検討中である。これらの計算機資源を駆使して、予定の計算を実行する。
漢方薬の脳浮腫抑制作用に着目した新しいてんかん治療の基礎研究

症候性てんかんの治療戦略上、脳浮腫発症制御は重要であるため、五苓散による予防的治療の可能性を検討した。重積発作(SE)側頭葉てんかんモデルマウスの海馬、扁桃体で、SE後初期の一過性BBB透過性亢進が血管原性脳浮腫を誘導したことを明らかにした。これらの指標に対して、五苓散はSE後、1日3回(300 mg/kg)経口投与に2日後に有意な抑制効果が認められた。さらにSE2日後、有意に増加したアクアポリン4、炎症性サイトカイン発現量は、五苓散投与で有意に抑制された。また、SRS出現はSE10日後でも観察されなかった。本研究において、五苓散のSE後脳浮腫に対する臨床適用の可能性を示した。てんかん原性は症候性局所関連てんかん発症の原因になると考えられている。つまり、てんかん原性期の脳機能変化をコントロールすることが続発性てんかん発症の回避につながると考えている。我々は脳MRI所見からてんかん原性初期に脳浮腫出現を確認し、続発性てんかん発症と脳浮腫の関連が重要であることを報告した。そこで本研究では、脳神経外科において脳浮腫の治療に用いられている五苓散(GRS)を用い、てんかん原性の脳浮腫に対するGRSの影響について検討した。側頭葉てんかんモデルマウスは常法に従い、ピロカルピン(PILO、290 mg/kg)投与し、90分間に5回全身痙攣発作を繰り返す重積発作(SE)後ジアゼパムで発作を終息させた。その1時間後から生理食塩水(0.1 mL/10 g)、GRS(100、300 mg/kg、ツムラより原末を供与)の経口投与を開始し、1日3回(8:00、13:00、18:00)7日間投与した。SE後2日目および7日目にMRI撮像(T1WI, T2WI, DWI)を行った後、脳を摘出、大脳皮質、海馬、扁桃核、線条体、間脳(視床、視床下部含む)、小脳に分画し、各部の脳水分含量を測定した。SE後2日のMRI所見では、海馬、扁桃核領域でT2WI、DWIの高信号を示し血管原性脳浮腫を呈していることを示した。実際、脳水分含量は2日目でこれらの領域において有意な上昇が認められた。これらてんかん原性初期の脳浮腫変化をGRS (100および300 mg/kg)連続経口投与が抑制した。つまり、自然痙攣発作(SRS)発現の引き金となる可能性がある脳浮腫発症をGRSが抑制していることから、続発性てんかん発症に対して予防的な効果を有すると考えられる。これらてんかん原性初期の脳浮腫変化をGRS (100および300 mg/kg)連続経口投与が抑制した.さらに脳浮腫に関与しているアクアポリンの発現に対する効果も併せて検討した。GRSは、アクアポリン4と9mRNA発現量の増加を有意に抑制した。つまり、自然痙攣発作(SRS)発現の引き金となる可能性がある脳浮腫発症に関与するアクアポリンの発現を、GRSが抑制していることで、続発性てんかん発症を予防的に抑制するには、GRSの早期投与が有効であると考えられる。MRI所見からSE2日後の海馬、扁桃体/梨状皮質領域でT2WI、DWI高信号を示した。つまりSE後、側頭葉領域で血管原性脳浮腫が発症したことを示した。MRI所見のPILO-SE誘発血管原性脳浮腫を、GRSはSE2日後の抑制していることを示した。PILO-SE後、海馬、扁桃体/梨状皮質においてのみ増加した水分含量を、GRSは用量依存的に有意に低下させた。

GdT1WII所見からSE後の血管原性脳浮腫はBBB透過性亢進に対しGRSは、BBBに対し保護的に作用することで、血管原性脳浮腫を抑制することが示唆された。さらに、PILO-SE後BBB透過性亢進時に認められるアクアポリン4と9mRNA発現量の増加を、GRSはこのアクアポリン4と9 mRNA発現量の増加を有意に抑制した。脳浮腫は、生命予後を左右する重大な病態であり、脳浮腫発症制御は症候性てんかんの治療戦略上重要である。利水作用を有する漢方方剤「五苓散」による予防的治療の可能性を検討した。重積けいれん(SE)側頭葉てんかんモデル動物の脳浮腫と自発けいれん発作(SRS)出現とBBB透過性検討のための、実験方法を確立した。ICR雄性マウスにピロカルピン投与後5回けいれん重積させ、その後SRSは、24時間ビデオ撮影で観察した。SE 2日後のMRI所見で海馬、扁桃体に血管原性脳浮腫が認められた。実際、SE2日後の同部位の水分含量も有意に増加した。血管原性脳浮腫とBBBの関連からガドリニウム増強MRI撮像で、同部位で一過性BBB透過性亢進を観察した。つまり、SE後初期の一過性BBB透過性亢進が血管原性脳浮腫を誘導したことが明らかとなった。この手法を用い五苓散の効果を検討した。五苓散はSE後、1日3回(30と300 mg/kg)経口投与した。高用量群においてのみ、SE2日後有意な抑制効果が認められた。次に、海馬、扁桃体の水チャネルのアクアポリン(AQP)と炎症関連分子の発現量をRT-qPCRで測定した。SE2日後、有意に増加したAQP4、炎症性サイトカインは、高用量群で有意に抑制された。さらに、SRS発症(つまりSE後てんかん発症)に対する効果検討のためSRS観察した。平均1週間後にSRSを発症する本モデルにおいて、SE10日後でも高用量群ではSRS出現は観察されなかった。本研究においては、SRSのけいれんを指標に五苓散の効果を評価した。一方、臨床で重要性が指摘されている非けいれん発作は脳波でのみ検出される。今後、五苓散の臨床適用を考える上で、五苓散の長期投与と24時間ビデオ・脳波測定を行う必要がある。しかし、五苓散のSE後脳浮腫に対する臨床適用の可能性は示した。症候性てんかんの治療戦略上、脳浮腫発症制御は重要であるため、五苓散による予防的治療の可能性を検討した。重積発作(SE)側頭葉てんかんモデルマウスの海馬、扁桃体で、SE後初期の一過性BBB透過性亢進が血管原性脳浮腫を誘導したことを明らかにした。これらの指標に対して、五苓散はSE後、1日3回(300 mg/kg)経口投与に2日後に有意な抑制効果が認められた。さらにSE2日後、有意に増加したアクアポリン4、炎症性サイトカイン発現量は、五苓散投与で有意に抑制された。また、SRS出現はSE10日後でも観察されなかった。本研究において、五苓散のSE後脳浮腫に対する臨床適用の可能性を示した。側頭葉てんかんモデルであるピロカルピン重積けいれんモデルを用い重積けいれん後MRI及び脳水分含量を測定することで2日目で血管原性脳浮腫が発症していることを示せた。この動物に重積けいれん終息後から1日3回五苓散を経口投与することで、血管原性浮腫の発現が用量依存的に抑制されることを明らかにすることができた。五苓散は、抗炎症効果があることも知られているので、、脳浮腫抑制効果と炎症との関係を明らかにする。PILO-SEにより誘発される脳浮腫の原因を探るとともに、漢方薬の脳浮腫抑制効果と抗てんかん原性効果について検討する。できれば、EEG測定をしたいと考えている。薬物治療学五苓散は水チャネルであるアクアポリンに作用することが報告されている。
Long-PCRによる日本人α-サラセミア遺伝子異常の研究

αグロビン遺伝子は,第16番染色体上に,上流よりα_2,α_1と2個の遺伝子が従列に位置する.更に,α_2の約3.5kb上流よりα_1の3'末端にかけてX,Y,Zの3種類の相同性が高い領域が,重複して2組存在しており,α_2及びα_1遺伝子は何れも,それぞれのZ領域に位置している.このことを踏まえて下記の4項目の検討を計画し,long-PCRの技術を駆使して順次検討を加えている.1.α_1,α_2グロビン領域(各々約2kb)のPCRプロダクトの合成法の確立について(1)α_2グロビン遺伝子を含む約890bpのPCRは既に確立している.(2)α_1グロビン遺伝子を含む約840bpのPCRは(1)ほど容易ではなく,現在検討中である.(3)α_1グロビン遺伝子が存在するZ領域約2kbのPCRは,現在検討中であるが,極めて困難である.引き続き検討する.(4)α_2グロビン遺伝子が存在するZ領域約2kb及びα_1,α_2を含む約5kbのPCRは今後検討する.2.点変異あるいは数塩基の挿入又は欠失による異常血色素のDNAシーケンサーによるDNA分析法の確立についてα_2グロビン遺伝子において既に確立している.他の領域についてもPCR法が確立されれば解決する.3.広範囲欠失型のサラセミアの分析法の確立について広範囲の欠失型の1つで、SEA型のPCR法およびDNAシーケンサーによる分析法は確立している.他の広範囲欠失型のサラセミアの分析法は今後の課題であるので引き続き検討する.4.mRNAを鋳型とするRT-PCRとのコンビネーションによる異常血色素を含むαサラセミアの出現機序の探査についていまだ,検討の段階に入っておらず今後重点的に検討する.以上,研究実績の概要を記したが,総括すると以下のようになる.この研究はPCR法の確立が鍵となる.しかし,αグロビン遺伝子のPCR法は他の遺伝子領域に比して困難なので,今後更に種々検討をしなければならない.一方,4.については比較的容易に検討できると考えられるので,この方面の検討にも注力したい.αグロビン遺伝子は,第16番染色体上に,上流よりα_2,α_1と2個の遺伝子が従列に位置する.更に,α_2の約3.5kb上流よりα_1の3'末端にかけてX,Y,Zの3種類の相同性が高い領域が,重複して2組存在しており,α_2及びα_1遺伝子は何れも,それぞれのZ領域に位置している.このことを踏まえて下記の4項目の検討を計画し,long-PCRの技術を駆使して順次検討を加えている.1.α_1,α_2グロビン領域(各々約2kb)のPCRプロダクトの合成法の確立について(1)α_2グロビン遺伝子を含む約890bpのPCRは既に確立している.(2)α_1グロビン遺伝子を含む約840bpのPCRは(1)ほど容易ではなく,現在検討中である.(3)α_1グロビン遺伝子が存在するZ領域約2kbのPCRは,現在検討中であるが,極めて困難である.引き続き検討する.(4)α_2グロビン遺伝子が存在するZ領域約2kb及びα_1,α_2を含む約5kbのPCRは今後検討する.2.点変異あるいは数塩基の挿入又は欠失による異常血色素のDNAシーケンサーによるDNA分析法の確立についてα_2グロビン遺伝子において既に確立している.他の領域についてもPCR法が確立されれば解決する.3.広範囲欠失型のサラセミアの分析法の確立について広範囲の欠失型の1つで、SEA型のPCR法およびDNAシーケンサーによる分析法は確立している.他の広範囲欠失型のサラセミアの分析法は今後の課題であるので引き続き検討する.4.mRNAを鋳型とするRT-PCRとのコンビネーションによる異常血色素を含むαサラセミアの出現機序の探査についていまだ,検討の段階に入っておらず今後重点的に検討する.以上,研究実績の概要を記したが,総括すると以下のようになる.この研究はPCR法の確立が鍵となる.しかし,αグロビン遺伝子のPCR法は他の遺伝子領域に比して困難なので,今後更に種々検討をしなければならない.一方,4.については比較的容易に検討できると考えられるので,この方面の検討にも注力したい.
南極2m赤外線望遠鏡の基礎技術開発

国立極地研究所を中心として日本が開発を進めている南極の氷床「ドームふじ」は標高が高く(3810m)、大気の透過率も高いと予想される。しかしシーイング等の天文学的条件に関するデータがない。そこで、ドームふじの天文学的気象条件(シーイング、測光夜数、背景光の明るさ)の調査を行うために、口径40cmの極地用望遠鏡を開発した。-80度で正常に動作するためには、できる限り同じ材質で熱膨張などの影響をさける必要がある。特にドームふじはきわめて厳しい環境にあるので、現地での調整はできる限り少なくしなければならない。そこで常温で調整した後、冷却化でも性能を維持する軸受けなどを開発した。また運搬と現地での組み上げを容易にするために、総量200kg余りある望遠鏡は5分割できる構造とし、最低2人での組み上げができることを確認した。本装置の極寒環境での性能を評価するために、平成20年2月に日本で一番寒い場所といわれる北海道陸別町に分解した望遠鏡を運搬し、現地で組み上げ実験観測を行った。最低気温は-23°Cだったが、この極寒環境においても、望遠鏡、制御システムなど必要な観測装置は暖める必要もなく、正常に動作し、当初の性能が出ていることを確認した。その他、極寒で動作する機械部品、電気・電子回路の技術的検討、大型望遠鏡の雪上設置法の検討、シーイング測定装置DIMMの開発、SODAR乱流強度の微小熱擾乱への較正を行った。本研究で南極に口径2mの赤外線望遠鏡を設置するための基礎的な技術開発とサイト調査のための装置の開発を行った。そこで、ドームふじの天文学的気象条件(シーイング、測光夜数、背景光の明るさ)の調査を行うために、口径40cmの極地用望遠鏡の光学系と鏡筒を開発した。特に、ドームふじはきわめて厳しい環境にあるので、現地での調整はできる限り少なくしなければならない。常温で調整した後、冷却化でも性能を維持できるような様々な工夫を行った。ドームふじ基地は大陸に厚さ3000m以上もの氷が覆っている地域である。その氷の上に建築物を設置した場合、次第に沈降していく。従って望遠鏡とドームの軽量化と設置方法が懸案となる。本研究では雪上に構造物を建設する技術について検討を行った。また望遠鏡や観測装置は極低温下に置かれるために、電気・電子機器が動作しない場合が想定される。そこでマイナス80度環境での観測装置の正常な駆動と性能を確認するために、本研究で用いる様々な電気部品をマイナス80度に冷却して動作確認を行った。具体的に天文サイト調査を進めるために音波で大気の擾乱するSODARと雪上車と機の振動をしらべるための加速度計を第48次隊南極観測隊に観測装置を託し、シーイングと振動に関するデータを得た。

また運搬と現地での組み上げを容易にするために、総量200kg余りある望遠鏡は5分割できる構造とし、最低2人での組み上げができることを確認した。本装置の極寒環境での性能を評価するために、平成20年2月に日本で一番寒い場所といわれる北海道陸別町に分解した望遠鏡を運搬し、現地で組み上げ実験観測を行った。最低気温は-23°Cだったが、この極寒環境においても、望遠鏡、制御システムなど必要な観測装置は暖める必要もなく、正常に動作し、当初の性能が出ていることを確認した。その他、極寒で動作する機械部品、電気・電子回路の技術的検討、大型望遠鏡の雪上設置法の検討、シーイング測定装置DIMMの開発、SODAR乱流強度の微小熱擾乱への較正を行った。
ヒトの視覚野における高空間分解機能的磁気共鳴イメージング(fMRI)の研究

1.静的視野検査の施行により、視放線の障害部位が臨床的にあらかじめ推定可能であった脳出血による視野障害症例に、機能的磁気共鳴イメージング法および拡散テンソル画像法をおこなった。2.機能的磁気共鳴イメージング法による視覚皮質における網膜位置情報レチノトピーの検討と、視放線の視覚皮質への接続性評価をおこなった。レチノトピー情報は、視野障害を正確に反映した結果が観察された。3.上記結果を、高磁場3T装置に応用し、シーケンスの最適化をおこなった。従来の1.5T装置と同程度の撮像時間内での撮像と、3T装置の長所である高空間分解能が可能となった。実際には、撮像時間は同じであるのに対して、機能的磁気共鳴イメージング法では、従来の1.5T装置では、3mm四方の空間分解能に対し、3T装置では、2mm四方の空間分解能が実現可能であった。拡散テンソル画像法では、1.5T装置では、2.5mm四方の空間分解能に対し、3T装置では、1.5mm四方の空間分解能が実現可能であった。4.緑内障性視野障害は、視覚野における形態変化を伴うことが剖検例で報告されている。緑内障症例に対して高空間分解能機能的磁気共鳴イメージング法および拡散テンソル画像法を施行した。先天緑内障症例において、視覚野、および視放線における形態変化を伴うことが示された。実際には、視覚野において、前方皮質の減少が観察され、視野障害に一致した。視放線に一致した白質の減少も同時に観察された。認知機能研究チームにおける最初の3ヶ月間、主に2つの課題に集中した。自分の研究課題に関する文献に親しむと同時に、将来実験を行う際に用いる技術の習得を始めることだ。(1)まず文献学習では、精神物理学の観点同様ニューロイメージングの観点から、顔の知覚の分野における従来および現在の業績に重点をおいた。二つの主流が、顔の知覚分野を支配しており、興味深い論争を引き起こしている。主にNancy Kanwisherのグループによって行われた研究は、顔の認知は、顔の特定という過程を含んでいると論じている。彼らは、特別な脳の領野-the fusiformface are(FFA)-が、単独で顔の知覚に貢献していると主張する。他方、Gauthierのグループは、顔は我々がエキスパートレベルで弁別することを学習してきた知覚物体の一つの特に難しい部類であるに過ぎないないと述べている。Gauthierは、FFAは被験者が鳥や車、ひいては、Greeblesとして知られるコンピュータが一般化した無意味な形状の異なったタイプ間の識別を行う時にも活動することを示した。顔の認知がこの領野に強く依存するということが確かであるにも係わらず、知覚のどの相がFFAによって結びつけられるのか、これは、まだはっきり解明されていない。この問題は、FFA中には、顔のみならず、動物、車、抽象的彫像などの物体カテゴリーが特定の領域に限定された副領域に描き出されると主張する高解像度機能的磁気共鳴画像法(fMRI)に関する論文が昨年末に発表された時に、より興味深いものとなった。彼らは一般的なfMRIは顔が優位を示す雑多な領野の平均を反映するだけだが、FFA集の視覚過程は顔に限定されないと結論している。しかし、いくつかの論争後、解析の誤りが判明し、正誤表が発表された。私の考えでは、これはその問題に対する大きな興味を反映しており、高解像度fMRIを用いていかに顔に関する情報はFFA中に描き出されるかを扱う私のプロジェクトの目的を非常に強く正当化するものである。(2)高解像度fMRI技術の向上は、この最初の3ヶ月の2番目の課題だった。MR基礎をMR物理学者と共に学習した後、私は4テスラのMRIスキャナーを作動するための訓練を受けて来た。この訓練の目的は、将来私が、全く独力でfMRI実験を主導することができるよう深く技術を理解することにある。1.後頭葉にある1次視覚皮質は、網膜における位置情報が正確に保たれている。皮質におけるこの位置情報の反映をレチノトピーとよぶ。2種類の視覚刺激と高分解能機能的磁気共鳴イメージング法をもちいて、データ採取条件、視覚刺激方法を至適化することで、ヒトにけるレチノトピー情報が10分程度のデータ採取時間で検討可能なった。2. 1次視覚皮質では、視放線を介して情報の受け取りがおこなわれている。拡散テンソル画像法は脳内白質における神経線維の走行を可視化させるあたらしい画像法である。脳内白質をほぼカバーする撮像範囲で、拡散テンソル画像データ採取を可能とした。神経線維走行評価には、高性能PCを使用し、現在理論的にもっとも詳細な走行評価が可能なProbabilistic Tracking法を採用した。3.高分解能機能的磁気共鳴イメージング法でえられたレチノトピー情報と、拡散テンソル画像法からProbabilistic Tracking法をもちいて視放線の1次視覚皮質への接続性の詳細な評価をおこなった。4.視覚皮質が保たれているものの、脳出血により視放線の障害をきたした視野障害患者に対して、レチノトピーの検討と、視放線の視覚皮質への接続性評価をおこなった。また、視野障害から臨床的に想定された障害を受けた視放線の走行も、損傷情報を正確に反映した結果となった。

5.以上より、われわれの構築した手技は、ヒト視覚皮質の機能を詳細に検討可能であることが証明された。これらのデータは、臨床用1.5T装置によって得られたものであるが、来年度は3T装置を使用して、より高空間分解能なデータ採取を施行する。1.静的視野検査の施行により、視放線の障害部位が臨床的にあらかじめ推定可能であった脳出血による視野障害症例に、機能的磁気共鳴イメージング法および拡散テンソル画像法をおこなった。2.機能的磁気共鳴イメージング法による視覚皮質における網膜位置情報レチノトピーの検討と、視放線の視覚皮質への接続性評価をおこなった。レチノトピー情報は、視野障害を正確に反映した結果が観察された。3.上記結果を、高磁場3T装置に応用し、シーケンスの最適化をおこなった。従来の1.5T装置と同程度の撮像時間内での撮像と、3T装置の長所である高空間分解能が可能となった。実際には、撮像時間は同じであるのに対して、機能的磁気共鳴イメージング法では、従来の1.5T装置では、3mm四方の空間分解能に対し、3T装置では、2mm四方の空間分解能が実現可能であった。拡散テンソル画像法では、1.5T装置では、2.5mm四方の空間分解能に対し、3T装置では、1.5mm四方の空間分解能が実現可能であった。4.緑内障性視野障害は、視覚野における形態変化を伴うことが剖検例で報告されている。緑内障症例に対して高空間分解能機能的磁気共鳴イメージング法および拡散テンソル画像法を施行した。先天緑内障症例において、視覚野、および視放線における形態変化を伴うことが示された。実際には、視覚野において、前方皮質の減少が観察され、視野障害に一致した。視放線に一致した白質の減少も同時に観察された。
動力学的震源モデルに基づく強震動予測

JSPSの最初の一年間では、震源の動力学的破壊過程を差分法(FDM)により数値的に解析を行うとともに,震源の傾斜断層モデルを動力学的に解析する手法を開発した。差分法(FDM)は,動力学的震源過程を含む震源の数値モデル化に広く使われてきたが,その理論的及び計算上の拘束条件から,使用される断層モデルは,無限媒質内の水平的な断層や垂直的な断層のような断層面がFDM格子に平行である場合に強く制限されて来た。しかしながら,最近の観測及び運動学的逆解析結果によれば,広く地震現象を説明するには,曲がったり屈曲したような幾何学的により複雑な断層モデルの導入を必要とする。従って,FDM格子に対して傾斜した断層面を持つ傾斜断層モデルを扱うための手法の開発が切望されていた。本研究では,Pitarka(1999)によって開発された非一様格子間隔の3次元FDMを使って,傾斜断層モデルの動力学的挙動を解析する手法が提案された。この手法は,格子に対して断層面を一直線にさせる事無く,より現実的に複雑な幾何学的形状を持った断層モデルを扱うのに使用される事ができる。この手法の妥当性は,Madariaga他(1998)によって解析され結果が得られている動力学的震源問題の二つの場合,即ち,一つは均質弾性媒質内の円形断層の瞬間破壊モデル,もう一つは断層面上に局在化された円形アスペリティーから始まる矩形断層の自由破壊モデル,について数値実験を行う事によって検証され,この手法を傾斜断層モデルの動力学的破壊過程の解析に使用出来ることが示された。提案された手法は,1999年台湾集集地震に適用された。この地震の断層には曲線的な断層モデルが使用された。得られた動力学的震源モデルに基づき震源近傍での強震動が評価された。これらの研究結果は二つの論文にまとめられ,JGR (J.Geophysical Res.,刊行済み)とGRL (Geophysical Res., Lette,査読中)にそれぞれ投稿された。
レバミピド局注液の食道内視鏡治療後狭窄予防効果についての検討

食道癌の内視鏡治療時に切開する粘膜下層のlifting剤としてレパミピド局注液と生理食塩水(コントロール)を使用し、レバミピド局注液による内視鏡治療後の食道狭窄予防が可能か検証するためにブタを用いた動物実験を計画した。平成30年度は動物実験計画書作成、動物実験委員会の承認を得た後、実験に必要な内視鏡でデバイスや試薬を購入した。合計3回の動物実験を行い、実験動物の購入・搬送費、飼育費などに研究費を使用した。1頭は内視鏡治療後1週間後に、もう1頭は2週間後に安楽死させ、食道を摘出し内視鏡治療後潰瘍底の面積、食道の幅(狭窄の程度)を計測した。まだ実験数が少ないものの明らかにレバミピド局注液を使用した方が食道の幅は広かった。(狭窄の程度が少なかった。)さらに内視鏡治療後潰瘍底の大きさはレバミピド局注液を使用した群の方がむしろ大きかった。おそらくレバミピド局注液を使用すると潰瘍治癒スピードが遅く、線維化が少ない可能性を考えた。本年度はさらに実験頭数を追加して、摘出した食道組織の炎症細胞数や線維化を病理評価(ミクロ)も行う予定である。残りの1頭は麻酔導入後全身に発赤と湿疹が出現し、血圧や脈拍が安定しなかったことからその場で安楽死とした。おそらく麻酔薬によるアレルギー反応と考える。予定より遅れてはいるものの、動物実験の準備、導入は順調であり、本年度も実験の継続を予定している。動物実験計画書の提出、修正、審査、承認に予定より時間がかかった。その後の実験物品の購入、実験準備にも時間がかかったため。また、実験動物が麻酔薬によるアレルギー反応で実験を中止せざるを得なかったことがあった。予定よりやや遅れているものの、実験は順調に進んでいると思われ、本年度取り戻せる予定である。平成30年度に順調に動物実験を開始できたため、本年度は1月に1回程度の頻度で動物実験を継続する予定である。本年度で予定の実験を終了させ、炎症細胞や線維化の程度を病理評価する予定である。来年度は最終年度であり、実験成果のまとめ、学会や論文報告を行う予定である。動物実験の準備に時間がかかったことにより、予定より実験が遅れているため。本年度中に動物実験を終了させる予定である。1か月に1回のペースで実験を計画している。実験で摘出した食道組織の病理評価も行う予定であり、病理試薬購入費、病理検査費の支出も予定している。
治療抵抗性進行肝癌に対するインターフェロンレセプターを介した免疫化学療法の確立

IFN併用化学療法の作用機序の検討(1)IFNAR(IFN受容体)とそのシグナル伝達機構の解明。IFN併用化学療法の作用機序のなかで、IFNARを介した直接的抗腫瘍効果について、そのシグナル伝達制御機構において検討した。その結果、抗腫瘍効果とIFNARの発現強度の有意な相関関係について、in-vitroでの遺伝子導入によるIFNAR発現誘導モデルを用いて証明した。また、シグナル伝達機構の中でp-STAT、Bcl-xlの有意な関与が明らかになった。IFN併用化学療法下での免疫賦活作用を介する抗腫瘍効果について検討したところ、TRAIL-TRAIL受容体を介したIFN併用化学療法の作用機序は、その抗腫瘍効果の誘導においては宿主のNK細胞が関与していた。また、TRAIL、TRAILRの発現にはそれぞれ5FU、IFNが関与していることが明らかになった。さらに、Fas-FasLの系と肝癌細胞のapoptosisの誘導については、リンパ球を介した間接的抗腫瘍効果の証明のみならず、そのシグナル伝達機構としてCASPASE、FLIPなどの関与が確認できた。(3)網羅的遺伝子解析に基づいた本治療法の機序解明IFN併用化学療法施行前後の臨床検体を用いた網羅的遺伝子解析(PCR-arrayによる解析)において、その治療効果予測を85%に施行し得る可能性が示された。1)IFN-α併用化学療法を施行した進行肝細胞癌31例より得られた標本に対して、IFN-α/βreceptor(IFNAR)蛋白の発現を免疫染色にて評価し、臨床効果との関連性を検討した。IFNARの発現例22例中15例で臨床効果が認められ、非発現例9例では全て無効であった。これらによりIFNAR蛋白の発現が本併用療法の治療効果に大きく関係していることが示唆された。また,AFP、PIVKA-II、奥田分類、CLIPスコアーとIFNAR蛋白発現の5項目について単変量解析を行ったところ、IFNAR蛋白の発現のみが効果に対する独立因子であり、IFNAR蛋白が本併用化学療法の治療効果予測に有用である可能性が示唆された。2)肝癌細胞株と末梢血単核球を用いたin vitro実験系の検討で、IFN-α+5-FU刺激により末梢血単核球のTRAILが誘導され、一方で同刺激により肝癌細胞のTRAIL receptorの発現が増加することを確認した。さらにCytotoxic assayより、末梢血単核球中の主にNK細胞と単球が、一部TRAILを介して肝癌細胞への細胞障害作用を有することが明らかとなった。これらの結果よりTRAIL/TRAIL receptorを介した免疫賦活作用がIFN-α+5-FU併用化学療法の作用機序に関与していることが証明された。現在Fas/Fas Ligandを介した免疫賦活作用についても検討中である。1.IFN併用化学療法の作用機序の検討(2)(1)と同じ肝細胞癌株を用いて、IFN-α、IFN-βのそれぞれについて、3種類の抗ガン剤(5FU、CDDP、ADR)との併用効果の差異について、腫瘍細胞増殖抑制試験を用いて検討した。その結果、すべての抗ガン剤に対して相加的併用効果を、さらに5FUについては、相乗的併用効果を認めた。今後の臨床症例での検討が期待される。2.難治性進行肝細胞癌症例に対するIFN併用化学療法の効果予測の検討本年度も、治療法の選択肢が無くなった進行症例(脈管侵襲陽性症例)に対し、積極的にIFN併用化学療法を施行した。これらの症例において、preliminaryではあるが、各種臨床因子(AFP、PIVKA-II、OKUDA Score、CLIP Score、IFN受容体の発現)について、多変量解析を施行した。その結果、IFN併用化学療法の治療効果については、IFN受容体非発現症例においては、期待できないことが統計学的に明らかになった。
Ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎの癌抑制遺伝子としての働き

前年度では、AMBNを安定的に高発現する143B-Luc細胞を樹立し、caspase-3を介したアポトーシスを示すことを明らかにした。今年度はさらに、AMBN安定発現株は、colony形成能と細胞遊走能の低下を示すことを見出した。AMBNの下流シグナルとしてSrcおよびその下流であるStat3経路に着目して検討を行った。骨肉腫細胞株におけるAMBNの発現とSrc-Stat3経路の活性化は負の相関を示しており、AMBN安定発現株においてSrc-Stat3経路が不活性化していることを見出した。そこで、AMBN安定発現株に恒常的活性化型Src(Src-Y527F)を過剰発現させると、Stat3の再活性化が認められるとともに、アポトーシスの抑制、colony形成能および細胞遊走能の亢進が認められた。In vivoマウスモデルでは、コントロールの143B-Luc細胞と、AMBN安定発現株をマウスの足に接種すると、AMBN群では原発巣での腫瘍増大の抑制および肺転移の低下が見られた。さらに、AMBN安定発現株に抗がん剤のドキソルビシン(Dox)を作用させると、コントロールと比較して顕著なアポトーシスの増加が観察され、この増加はSrc-Y527Fの過剰発現によって抑制された。またNOS-1細胞(AMBN高発現細胞株)で、AMBNの発現をknockdownし、caspase-3を介したアポトーシスの抑制、遊走能の亢進、Doxに対する感受性の低下が認められた。また143B-Luc細胞にSrcおよびStat3阻害薬を投与すると、AMBN安定発現株の結果を模倣した。以上より、AMBNがSrc-Stat3の抑制を介して骨肉腫の増殖進展を抑制し、Doxに対する感受性を亢進することが明らかとなり、AMBNの発現を指標とした悪性度診断やDoxとの併用によるAMBNの治療への応用の可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はAmeloblastin(AMBN)の、in vitroにおける骨肉腫細胞の増殖能・遊走能に及ぼす作用の解析および細胞内シグナル解析、またヌードマウスを用いて、in vivoにおける骨肉腫の増大・転移に及ぼす作用の解析を行い、以下の結果を得た。a)AMBN過剰発現が、骨肉腫細胞の増殖能に及ぼす作用と細胞内シグナルに関してAMBNを骨肉腫細胞に過剰発現させると、その増殖能は有意に低下し、かつFACS解析により、G1期での細胞周期停止が誘導されていることが分かった。このphenotypeは、AMBN過剰発現がc-mycの発現を抑制することによって生じることが明らかとなった。b)AMBN過剰発現が、骨肉腫細胞の遊走能に及ぼす作用と細胞内シグナルに関してAMBNを骨肉腫細胞に過剰発現させると、stress fiberおよびfocal adhesionの形成が誘導され、かつwound healing assayにより骨肉腫細胞の遊走能が有意に低下することが分かった。このphenotypeは、AMBN過剰発現が、RhoAを活性化(GTP結合型に転換)することによって生じることが明らかとなった。予備実験として、Controlの骨肉腫細胞とAMBNを過剰発現させた骨肉腫細胞をヌードマウスの脚に接種し、腫瘍の増大・転移をluciferinを用いたin vivo imaging assayで解析した。結果として、AMBNを過剰発現させた骨肉腫細胞を接種したマウスでは、Control群のマウスに比べて、腫瘍の増大・転移が抑制されている傾向が認められた。a) AMBN過剰発現が、骨肉腫細胞の細胞死を誘導する作用機序に関して今回新たにAMBNを安定的に高発現する143B-Luc細胞を樹立したことで、この細胞の増殖が有意に抑制されていることが示された。AMBN高発現株の143B-Luc細胞では、FACS解析にてSubG1期の増加、Annexin Vを用いたapoptosis assayにてApoptosisの増加が示され、さらにWestern blotにてCaspase-3の活性化が認められ、アポトーシスが誘導されていることが明らかとなった。b) AMBN過剰発現が、骨肉腫細胞の抗がん剤への感受性に及ぼす影響に関してAMBN高発現株の143B-Luc細胞は、アドリアマイシンの併用により、コントロールに比べ、より多数の細胞がアポトーシスを示し、抗がん剤への感受性が亢進していることが明らかとなった。コントロールの143B-Luc細胞と、AMBNを一過性に過剰発現した143B-Luc細胞をヌードマウスに接種し、腫瘍の増大・転移をluciferinを用いたin vivo imaging assayおよび病理組織学的に解析した。結果として、コントロール群に比較して、AMBN過剰発現群は原発巣での腫瘍径と肺転移の有意な抑制を示した。3)骨肉腫患者の生検標本を用いた臨床病理学的解析AMBNの発現は、肺転移と負の相関、予後と正の相関存示すことが明らかとなった。

そこで、AMBN安定発現株に恒常的活性化型Src(Src-Y527F)を過剰発現させると、Stat3の再活性化が認められるとともに、アポトーシスの抑制、colony形成能および細胞遊走能の亢進が認められた。In vivoマウスモデルでは、コントロールの143B-Luc細胞と、AMBN安定発現株をマウスの足に接種すると、AMBN群では原発巣での腫瘍増大の抑制および肺転移の低下が見られた。さらに、AMBN安定発現株に抗がん剤のドキソルビシン(Dox)を作用させると、コントロールと比較して顕著なアポトーシスの増加が観察され、この増加はSrc-Y527Fの過剰発現によって抑制された。またNOS-1細胞(AMBN高発現細胞株)で、AMBNの発現をknockdownし、caspase-3を介したアポトーシスの抑制、遊走能の亢進、Doxに対する感受性の低下が認められた。また143B-Luc細胞にSrcおよびStat3阻害薬を投与すると、AMBN安定発現株の結果を模倣した。以上より、AMBNがSrc-Stat3の抑制を介して骨肉腫の増殖進展を抑制し、Doxに対する感受性を亢進することが明らかとなり、AMBNの発現を指標とした悪性度診断やDoxとの併用によるAMBNの治療への応用の可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに、in vitroおよびin vivoの実験いずれにおいても、当初の計画通りに実験が進み、結果が順調に得られている。今後も予定通りに実験を進めていくことが可能である。現在まで、in vitroとin vivoの実験両方で、当初の計画通りに実験が進み、良好な結果が得られている。今後も計画通りに実験を進めて行く。1)In vitroの実験では、AMBNの増殖能および遊走能への影響として、c-mycおよびRhoAがシグナルのターゲットとして明らかとなったが、それらとAMBN-CD63-Integrin-Sroの経路との関連性について、今後さらに検討していく。また、AMBNを最初から過剰発現している骨肉腫細胞株を用い、AMBNをknockdownした解析も加えて今後検討していく。2)In vivoの実験においては、n数を増やして実験を再度行い、腫瘍の増大・転移抑制に関して検討を行う。またマウスの腫瘍組織を用い、免疫組織化学的染色による検討も行う。3)骨肉腫症例におけるAMBNの発現と臨床病理学的データとの相関を、当初の予定通り検討する。1) in vitroの実験では、AMBN過剰発現が細胞死を誘導し、抗がん剤への感受性を促進することが明らかとなった。今後は上記の現象とAMBN-CD63-Integrin-Srcの経路との関連について、分子メカニズムを詳細にしていく予定である。2) In vjvoの実験では、AMBN過剰発現により腫瘍の増大抑制、肺転移の抑制が示されたが、AMBNの過剰発現が一過性であったため、AMBNを安定的に高発現する143B-Luc細胞を用いて再度同様の実験を行うと共に、アドリアマイシンを併用する群を追加することで、更なる臨床的意義を高めた実験を行う予定である。
動的キラリティーの制御と軸不斉を有する新規生理活性物質の創製

γ-セクレターゼ阻害薬であるLY-411575の基本骨格である7員環ビフェニルラクタムには軸不斉異性体が存在しているが、その立体構造並びに異性体間の生物活性については精査されていない。しかし実際には、どちらか一方の異性体が活性発現に寄与しているはずであり、活性の高い医薬品の開発には軸不斉を持つ化合物の立体化学を解明する必要がある。そして、7員環ビフェニルラクタム骨格、さらに類似骨格である8員環及び9員環ビフェニルラクタムについて立体化学の解明を行い、軸不斉に基づく立体構造及び物理化学的性質を明らかにした。医薬品の中には、中心不斉の他に立体配座が固定されることで生じる動的な不斉を持つものが多く存在している。それら医薬品のキラリティーは生体内で厳密に認識される。そこで、生理活性物質のファーマコフォアとして重要な軸不斉を有するアトロプ異性体の効率的合成法を開発するとともに、動的な軸不斉を有する化合物の立体化学を明らかにし、構造活性相関研究を行う。本年度は、軸不斉を有するビフェニルラクタム骨格の立体化学の解明を行った。γ-セクレターゼ阻害薬であるLY-411575(Lilly社)の基本骨格である7員環ビフェニルラクタムには2つのsp^2-sp^2軸に基づく軸不斉異性体が存在しているが、その立体構造並びに異性体間の生物活性については精査されていない。しかし実際には、どちらか一方の異性体が活性発現に寄与しているはずであり、活性の高い医薬品の開発には軸不斉を持つ化合物の立体化学を解明し、生物活性と軸不斉との関係を明らかにする必要がある。そこで、7員環ビフェニルラクタム骨格について検討し、得られた知見に基づき生理活性物質の基本骨格として散見される8員環及び9員環ビフェニルラクタムについて立体化学の解明を試みた。8及び9員環ビフェニルラクタム誘導体をキラルカラムを用いたHPLCで分析したところ、7員環同様に2つの軸が連動し、それぞれラセミ体である単一の化合物として存在することが分かった。そして、鏡像異性体を分取し、X線結晶構造解析により立体構造を明らかにした。また、軸の熱力学的安定性を比較した結果、8員環で最も安定性が高いことが分かった。つまり、化合物の安定性に与える環の大きさの影響について明らかにすることができた。また、アルキル化における反応性についても検討し、環拡大に伴う立体構造の違いよって異なる立体選択性で進行することも見出した。この反応性の違いを利用し、アトロプ異性体の効率的な合成を目指す。医薬品には中心性キラリティーの他に動的なキラリティー(軸性キラリティー)を有するものがあり、それらのキラリティーは生体内で厳密に認識されている。つまり生理活性物質のファーマコフォアとして重要な軸不斉を有する様々な化合物の立体化学を解明し、アトロプ異性体の効率的合成と構造活性相関研究を行うことは、新しい生理活性物質の創出に粟がる。これまでにアルツハイマー病の治療薬として期待されるLY-411575(Lilly社)の基本骨格である7員環ビフェニルラクタム並びに類似構造である8及び9員環ビフェニルラクタムの立体化学の解明を行った。そして、2つの不斉軸は連動していること、軸の安定性は8員環で最も高いことなど安定性や化学反応性について興味深い知見を得た。本年度は、同様に軸不斉を有するベンゾジアゼピノン骨格における立体化学及び軸性キラリティーと生物活性の関係について解明を目指した。本骨格もまた医薬品の基本骨格として散見され、ベンゼン環とアミド結合に基づくsp^2-sp^2軸が存在している。したがって、本骨格の立体化学の解明は、見過ごされているキラリティーを明らかし、新規医薬品の設計に役立つものと思われる。ベンゾジアゼピノン誘導体について、NMR及びHPLCにより分析を行った。^1H-NMRにおいて軸不斉異性体の存在が示唆されたことから、キラルカラムを用いたHPLCにより分析したところエナンチオマーの関係にある2つの軸不斉異性体が分離され、室温下比較的安定に単離することができた。両エナンチオマーの単結晶の作成に成功し、X線結晶構造解析を行い、立体構造並びに絶対配置を明らかにした。また、種々のベンゾジアゼピノン誘導体を合成、軸不斉異性体を分離し、バソプレシン受容体親和性と軸不斉との関係を調べた結果、一方のエナンチオマーが高い結合親和性を示し、受容体が軸不斉を認識していることを明らかとした。