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アスリートのキャリア発達に向けての介入方略の質的検討

本研究は4か年計画の下,アスリートのキャリア発達に関連した先行研究を概観し,質的研究方法を熟達しつつ,アスリートのキャリア発達おける発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築し,その効果を検証するといった研究課題を設定し,遂行した.特に,本研究では,【経験の記述】→【概念の見える化】→【概念の相対化】→【議論】といった個性記述的アプローチを援用したキャリア発達支援プログラムを実施した.そして,複線径路等至性モデル(TEM)を利用して,元オリンピアンのキャリア発達過程について検証した.その結果,オリンピアンのキャリアトランジションの意味について可視化することができた.本研究は4カ年計画の下、アスリートのキャリア発達に向けての専門的な介入方略について質的に検討する。この目的の達成のために、本研究は次のような研究課題を設けた。すなわち、1)アスリートのキャリア発達に関連した研究を概観する、2)質的研究方法の習熟に向けて文献を概観し、スポーツ心理学領域へ有益な提案をなす、3)アスリートのキャリア発達における発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築する、4)アスリートのキャリア発達における専門的介入方略を実施し、その効果を検証する、などである。これらの項目と照らし合わせると、上記1)に関連して「Athletes' Careers Across Culture」という著書の中、第11章「Athletes' career in Japan: Before and after retirement in sports」を分担執筆し、発刊した。上記2)については、関連文献を40編ほど熟読し、レジュメ化した。また、日本質的心理学会などにおいて積極的な意見交換を行い、有益な視点を獲得するに至っている。上記3)については、元オリンピアンや元プロ野球選手、元プロバスケットボール選手などを対象として、「語り」を中心的な手法とした介入方略を試験的に実施している。上記4)については、日本体育学会第64回大会において、「競技引退に伴って直面する心理社会的発達課題の検討」と題する研究成果発表(ポスター発表)を行い、研究成果の取りまとめに向けて有益な意見交換を行った。本研究は4カ年計画の下、アスリートのキャリア発達に向けての専門的な介入方略について質的に検討する。この目的の達成のために、本研究は次のような4つの研究課題を設けた。それは、1)アスリートのキャリア発達に関連した研究を概観する、2)質的研究方法の習熟に向けて文献を概観し、スポーツ心理学領域へ有益な提案をなす、3)アスリートのキャリア発達における発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築する、4)アスリートのキャリア発達における専門的介入方略を実施し、その効果を検証する、などである。これらの項目と照らし合わせて、現段階での進捗状況としては、まず、上記1)に関連して、「Athletes' Careers Across Cultures」という著書の中で第11章「Athletes' careers in Japan: Before and after retirement in sports」を分担執筆した。そこでは、この領域における我が国の研究動向を報告するに至っている。また、2)については、日本質的心理学会での意見交換や関連文献の収集、これに関する要約を作成するなど、地道な作業を継続している。このような基礎的作業を背景として、3)と4)への取り組みを強化したい。特に、上記3)に関連して、これまでにもフィールドワークと称して、全国各地に散在する元アスリートの生活圏内に入り込み、インタビューを実施することで、多くの有益な情報を獲得してきた。その成果については、日本体育学会第63回大会にてポスター発表(「元プロ野球選手のアイデンティティ再体制化についての質的検討」)を行い、有益な意見交換を行った。本研究は4か年計画の下,アスリートのキャリア発達に関連した先行研究を概観し,質的研究方法を熟達しつつ,アスリートのキャリア発達おける発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築し,その効果を検証するといった研究課題を設定し,遂行した.特に,本研究では,【経験の記述】→【概念の見える化】→【概念の相対化】→【議論】といった個性記述的アプローチを援用したキャリア発達支援プログラムを実施した.そして,複線径路等至性モデル(TEM)を利用して,元オリンピアンのキャリア発達過程について検証した.その結果,オリンピアンのキャリアトランジションの意味について可視化することができた.本研究の課題は、1)アスリートのキャリア発達に関連した研究を概観する、2)質的研究方法の習熟に向けて文献を概観し、スポーツ心理学領域へ有益な提案をなす、3)アスリートのキャリア発達における発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築する、4)アスリートのキャリア発達における専門的介入方略を実施し、その効果を検証する、といった4点を設定している。特に、上記3)と4)については、進捗状況が遅れ気味であるが、最終年度であることから、早急にインフォーマントを獲得し、インタビュー調査をし、「語り」を中心とした介入方略の検討を実践し、検証していきたいとて考えている。スポーツ心理学今後は、下記のような課題の遂行を目論んでいる。1)インフォーマントの開拓し、インタビュー調査を実施する。2)質的研究方法に関連する先行研究を、更に40編ほど熟読し、データベース化していく。3)現在進行中のフィールドワークを中心に、専門的介入方略のフォーマットを作成し、実践していく。4)専門的介入方略の効果の検証は、前述の3)の進捗状況と密接に関連している。3)と4)は連動しつつ、作業を進めていきたい。本研究の課題は、1)アスリートのキャリア発達に関連した研究を概観する、

2)質的研究方法の習熟に向けて文献を概観し、スポーツ心理学領域へ有益な提案をなす、3)アスリートのキャリア発達における発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築する、4)アスリートのキャリア発達における専門的介入方略を実施し、その効果を検証する、といった4点を設定している。特に、上記3)と4)については、若干、進捗状況が遅れ気味であるが、今後も、地道な取り組みからインフォーマントを獲得し、インタビュー調査をし、「語り」を中心とした介入方略の検討を実践していきたいと考えている。本研究の課題は、次の4点に集約できる。それは、1)アスリートのキャリア発達に関連した研究を概観する、2)質的研究方法の習熟に向けて文献を概観し、スポーツ心理学領域へ有益な提案をなす、3)アスリートのキャリア発達における発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築する、4)アスリートのキャリア発達における専門的介入方略を実施し、その効果を検証する、といった課題である。これらの課題解決を目論み、「Athletes' Careers Across Cultures」という著書の中で第11章「Athletes' careers in Japan: Before and after retirement in sports」を分担執筆した。そこでは、国内外における本研究領域の先行研究を概観し、解説している。これは、上記の1)に相当している。2)、3)、4)については、本年度も含めて漸次遂行していく。インタビュー調査に協力してもらえるインフォーマントがうまく開拓できず、調査費用が残ってしまった。当初、予定していた数のインフォーマントを獲得できなかったことから、分析に利用するはずであった物品費とその他については、手つかずの状況であった。今後、下記の課題毎に研究遂行していきたい。1)アスリートのキャリア発達に関連した研究を概観する:既に、英語での著書を出版し、本邦における関連研究のを整理し、概観している。従って、今後も新たな研究を発見し、理解する。2)質的研究方法の習熟に向けて文献を概観し、スポーツ心理学領域へ有益な提案をなす:質的研究関連の著書や論文を検索、整理し、勉強会などへも積極的に参加する。3)アスリートのキャリア発達における発達課題の克服を目指した専門的介入方略を構築する:これに関連して、フィールドワークについては、今後も継続的に実施する予定であるが、元アスリートからのキャリア情報を収集する傍ら、具体的な専門的介入方略を検討するといったように研究課題をシフトしていく必要性があると考えている。4)アスリートのキャリア発達における専門的介入方略を実施し、その効果を検証する:上記3)と連動し、準備を進めていく。次年度に向けて、インタビュー調査の計画を綿密に実行する必要がある。特に、インフォーマントの開拓が本研究を遂行する上で大きなカギとなるといえる。
ケミカルアレイによる膜結合蛋白質発現細胞を用いたリガンド探索手法の開発

細胞結合アッセイの基礎的な処理条件を確立するために、RGDペプチド、RGEペプチド、ポリ-L-リジン(PLL)、ポリーL-アルギニン(PLA)、コラーゲンを固定化したテストケミカルアレイを作製し、HEK293T細胞を用いて、これらの化合物との結合が検出できる条件を検討した。RGD配列は、フィブロネクチンの細胞接着部位として同定されたアミノ酸配列であり、細胞表面のインテグリンがこの配列を認識して結合する。RGD配列のアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)に置換したRGE配列は、細胞接着活性を失う。この3アミノ酸だけでは接着活性は低いため、RGD、RGEペプチドとしては、環状ペプチドであるCyclo(-GRGDSP)、Cyclo(-GRGESP)をそれぞれ用いた。PLL、PLAは正電荷を有しており、細胞表面が負電荷を有している細胞と静電的に結合するため、ポジティブコントロールとして使用した。HEK293T細胞をCell Tracker Orangeで染色し、種々の条件で、テストアレイ上で1時間インキュベーションしたところ、PLL、PLAおよびRGDペプチドに細胞の結合が見られる条件を見出した。その際、RGEペプチドには細胞の結合が見られなかった。しかし、細胞の結合量を増やすために、インキュベーション時間を一晩中に設定したところ、テストアレイ表面全体に細胞が接着してしまい、化合物スポットに対する結合の選択性が判別できなくなった。今後、基板の検討も含めて細胞結合アッセイの処理条件の検討を行う予定である。今年度計画していたケミカルアレイ上での細胞結合アッセイの基礎的な条件の検討を行なったが、条件によっては細胞の吸着が問題になることがわかった。来年度には、金基板のケミカルアレイにより表面プラズモン共鳴法での検出と細胞の吸着を抑制する方法を試す予定であり、今年度、問題点を把握することができたため、概ね順調に進展している。本研究では、細胞の非特異的吸着を抑制することが重要である。細胞の非特異的吸着を抑制する技術の開発のために、ガラス基板表面上に化合物を固定化したケミカルアレイと金基板表面上に化合物を固定化したケミカルアレイの2種類の方法で検討を進める予定である。膜結合蛋白質発現細胞を用いたリガンド探索手法として、細胞結合アッセイに加え、細胞内カルシウムイオン測定法によるスクリーニング条件の確立も行なっていく予定である。細胞の非特異的吸着を抑制する技術の開発のために、ガラス基板表面上に化合物を固定化したケミカルアレイと金基板表面上に化合物を固定化したケミカルアレイの2種類の方法で検討を進める予定であるが、今年度は、ガラス基板での検討に時間がかかったため、金基板での検討が出来ず、次年度使用額が生じた。次年度では、次年度使用額と翌年度分の助成金と合わせて、細胞結合アッセイの金基板での検討および、膜結合蛋白質発現細胞を用いたリガンド探索手法として、細胞内カルシウムイオン測定法によるスクリーニング条件の確立のために使用する。
アミノ配糖体抗菌薬などによる内耳障害に対する蛋白治療〜臨床応用への基礎的研究〜

今回我々はアポトーシス抑制活性強化型蛋白FNKにPTD(Protein Transduction Domain)を付加したPTD-FNK蛋白を作成し、PTD-FNK蛋白が通常高分子タンパクは通過困難といわれている内耳蝸牛窓膜を通過し内耳有毛細胞へ到達することを確認した。さらに到達したPTD-FNKでアミノ配糖体による急性内耳障害が予防できることを確認した。この成果はより副作用の少ない鼓室内局所投与での蛋白治療への発展につながると考える。研究目的1.カナマイシン・エタクリン酸投与によるアポトーシス発現の時間的経過を解明する。2.アポトーシス抑制蛋白であるPTD-FNKの内耳細胞でのIn Vitroにおけるアポトーシス抑制効果を検討した。研究方法1.モルモットに対してカナマイシン皮下注・エタクリン酸静脈投与を行い6、12、24、36、48、60時間後における蝸牛有毛細胞でのTunnel陽性細胞の確認を行った。サーフェスプレパレーションテクニックを用い蝸牛有毛細胞を観察した。2.ラット蝸牛らせん神経節細胞を摘出し培養を行い神経栄養因子欠乏下でPTD-FNK投与群と非投与群で培養アポートシス発現に差を認めるかどうか確認した。研究成果1.36時間まではTunnel反応が確認できなかったが、48時間目でTunnel反応が主に基底回転においておこることを確認できた、60時間後ではTunnel反応は乏しく48時間前後での反応か活発であることが推測された。今後は48時間前後を詳細に分割して各回転ごとに時間的な差があるかどうかを検討する予定である。2.現時点ではFNKによって細胞死の予防が確認できていない。FNKの投与濃度、時期などの関係によるものか、神経栄養因子の欠乏によるアポトーシスがFNKが抑制するミトコンドリアの経路によらないことが原因として考えられる。今後ネオマイシン、グルタミン酸などアポトーシス誘発因子を投与した際にFNKがアポトーシス抑制効果を示すか検討する予定である。3.PTD-FNK鼓室内投与にてコルチ器有毛細胞、前庭有毛細胞にFNKが取り込まれていることが確認できた。研究目的アミノ配糖体抗菌薬による内耳有毛細胞障害に対して抗アポトーシス蛋白PTD-FNKの全身投与においてその予防効果を証明したが、全身投与の場合複数回の投与の必要がありまた、全身敵副作用が危惧される。今回より簡便で、副作用が少ないと考えらる鼓室内投与によるその予防効果について検討した。研究方法1.鼓室内投与におけるPTD-FNKの内耳分布PTD-FNKにmyc tagを付加したPTD-myc-FNKを使用しmycに対する免疫染色にてその取り込みを確認した。白色モルモット全身麻酔下、蝸牛骨包を開放、PTD-myc-FNK3ulをゼラチンスポンジ(スポンゼル)に浸し蝸牛窓小窩に静置し、1,3,6,12,24,48時間後における取り込みを確認した。2.PTD-FNK鼓室内投与におけるアミノ配糖体抗菌薬内耳障害の予防効果硫酸カナマイシン200mg/kg、エタクリン酸40mg/kg投与内耳障害モルモットモデルに薬剤投与1時間前にPTD-FNKを6mg/ml 3ulスポンゼルに浸し蝸牛窓小窩に静置することで聴力・有毛細胞の障害予防できるかを確認した。コントロールは対側耳とし、PTD-FNKの代わりに溶媒を浸し静置した。研究成果1.PTD-myc-FNKは高分子でありながら蝸牛窓謨を通過し内耳有毛細胞へ取り込まれることがわかった。しかも、1時間後より速やかに取り込まれ24時間後まで有意に取り込みを認めた。6時間で代謝される全身投与に比べてより長時間作用することが示唆された。2.PTD-FNK投与耳では有意にABRの閾値上昇を抑えることができ、かつ外有毛細胞の障害を有意に抑制することができた。全身投与では7回にわたる投与でその効果を得られたが、今回鼓室内投与では1回投与でその効果を得ることができた。また、全身的な副作用も得に認めなかった。現在上記成果を投稿中である。
発達過程におけるステロイド代謝の微小環境での変化と痛覚情報伝達との相互連関

ステロイド代謝酵素である3α-ハイドロキステロイド・デヒドロゲナーゼ(3α-HSD)は、5α-リダクターゼとの作用で合成されるアロプレグネノロンはGABA-A受容体に結合し、GABAの機能を亢進させる。そこで、痛みを含むストレス環境下において、中枢神経系におけるストレス情報の重要な中継部位である視床下部の室傍核における3α-HSDの発現をラットを用いて免疫組織化学的に解析した。片側の手足に2%PFAを投与した群では、無処置群と比較して室傍核における3α-HSD免疫陽性細胞数と反応性が増加した。よって、痛みを伴うストレス反応に、視床下部室傍核での3α-HSDが関与することが示唆された。本研究は、GABAA受容体と結合して鎮痛作用を示す神経ステロイドの産生に関与するステロイド代謝酵素の発現とその局在について脊髄と脊髄神経節を中心に形態学的に明らかにするのが目的である。そこで、、細胞膜に存在するGABAA受容体と結合して、抗不安、鎮静、鎮痛などの神経抑制作用を示し、また胎生期には神経細胞の増殖作用を示すことが知られているアロプレグナノロンを合成するステロイド代謝酵素である5α-reductaseと3α-hydoroxysteroid dehydrogenase (3α-HSD)の2つの酵素のうち、3α-HSDの中枢神経系内における発現に注目して、まず最初に成熟ラットの脳と脊髄に於ける3α-HSDの分布について免疫組織化学的に詳細に検索した。方法は、動物には成熟Wistar系ラットを用いて、4%PFA固定液で潅流および浸漬固定したあと、凍結背切片を作製し、ラット3α-HSDに対して自家作製したウサギポリクローナル抗体を用いて、HRPあるいは蛍光標識法を用いて切片を免疫染色した検鏡した。ラット3α-HSDに対する抗体の特性は、ラット3α-HSDを強制発現させたCOS-1細胞を用いて、ウエスタンブロッティングおよび免疫組織化学的に確認した。3α-HSD陽性細胞は、中枢神経系内に広く分布していたが、部位によってその発現には特徴がみられた。特に、嗅球、脳幹部には、多数の陽性細胞が認められた。3α-HSDの発現胞は、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに認められたが、ミクログリアには見られなかった。脊髄の灰白質、白質と脊髄後根神経節にも、多数の3α-HSD陽性細胞が認められた。これらの陽性細胞のいくつかは、痛覚の伝導経路と関連していることから、痛覚情報とこれら3α-HSD陽性細胞との関連性についも検討を進めていく予定である。本研究は、GABA-A受容体と結合して鎮痛作用を示す神経ステロイドの産生に関与するステロイド代謝酵素の発現とその局在について脊髄と脊髄神経節を中心に形態学的に明らかにするのが目的である。そのために、神経ステロイドの作用を決定づける細胞内の塩素イオン濃度を制御する陽イオン-塩素イオン-共輸送体分子の変化あるいはGABA-A受容体との関連が考えられる神経ステロイドを代謝するいくつかの酵素の発現を調べるために、新たに作製した抗体を含めて検討を行った。これまで、神経ステロイド代謝酵素の局在についての形態学的な報告はいくつかあるが、局在が明確ではないことが多く、5α-reductaseについては2種類のアイソフォームがあり、神経系では1型が優位であるが、2型の存在も示唆されてはいるが、形態学的解析は十分でない。また、3α-hydroxysteroid dehydrogenase (3α-HSD)、についても、4種類のアイソフォームがあり、aldo-keto reductaseスーパーファミリーに属する類似した他酵素との識別が難しく、抗体を用いて細胞レベルでの局在を特定できていなかった。そこで、鎮痛作用を示す神経ステロイドの産生に関与する5α-reductase、3α-HSDなどの代謝酵素について新たに特異抗体を作製し、その局在等について検討した結果、今回新たに作製した抗体が、神経ステロイド代謝酵素を各々特異的に認識することを生化学的および組織化学的に確認し、代謝酵素の発現がそれぞれに特有な局在を示すことを確認した。本研究は、GABAA受容体と結合して沈痛作用を示す神経ステロイドの産生に関与するステロイド代謝酵素の発現とその局在について脊髄と脊髄神経節を中心に形態学的に明らかにするのが目的である。方法としては、GABAA受容体と結合して鎮痛、鎮静、抗不安などの神経作用を示すアロプレグネノロンの合成酵素である5α-reductaseと3α-hydroxysteroid dehydrogenase (3α-HSD)の2つの酵素について、このうち特に3α-HSDの中枢神経系内における発現に対して、成熟ラットの脳と脊髄における3α-HSDの分布を免疫組織化学的に検索した。Wistar系ラットを用いて、4%PFAで潅流・浸漬固定した後、凍結切片を作製し、抗3α-HSDウサギ抗体を用いて、HRPあるいは蛍光で標識して免疫染色した。ラットの中枢神経系内には3α-HSD陽性細胞が広く分布し、特に嗅球と脳幹部に多数の3α-HSD含有細胞が認められた。3α-HSDは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに発現していた。脊髄の灰白質と白質、および脊髄後根神経節にも3α-HSD含有細胞が認められた。5α-reductaseの2型に対する抗体を用いて、5α-reductaseの2型を含有する細胞を同様に検討し、5α-reductaseの2型が、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに発現することを確認した。

この結果を踏まえて、痛覚情報との関連性について解析を進める予定である。本研究は、疼痛情報伝達に関わる神経系に焦点を当て、GABAA受容体と結合して鎮痛作用を示す神経ステロイドの産生に関与するステロイド代謝酵素の発現とその局在について、細胞内の塩素イオン濃度を調節する陽イオン-塩素イオン-共輸送体分子の発現と局在との空間的・時間的な関係を、形態学的に含有細胞を特定して検討することが目的である。このうち、ストレス負荷時における5α-リダクターゼ1型酵素(5α-R1)と3&#61537;-ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ(3α-HSD)の発現について、ラット視床下部室傍核において片側の足底に2%パラホルムアルデヒドを注射後での変化を解析した。その結果、5α-R1の発現には変化がみられなかったが、3α-HSD陽性細胞の数と免疫反応性が増加した。また、陽イオン-塩素イオン-共輸送体分子のうち、室傍核においてNKCC1陽性細胞の数がKCC2陽性細胞数よりも多く認められた。以上の結果から、視床下部の室傍核において、5α-R1と3α-HSDが関与して産生されるアロプレグネノロンがGABA-A受容体の作用を増強ししてストレスおよび痛みの制御に関与している可能性が示された。ステロイド代謝酵素である3α-ハイドロキステロイド・デヒドロゲナーゼ(3α-HSD)は、5α-リダクターゼとの作用で合成されるアロプレグネノロンはGABA-A受容体に結合し、GABAの機能を亢進させる。そこで、痛みを含むストレス環境下において、中枢神経系におけるストレス情報の重要な中継部位である視床下部の室傍核における3α-HSDの発現をラットを用いて免疫組織化学的に解析した。片側の手足に2%PFAを投与した群では、無処置群と比較して室傍核における3α-HSD免疫陽性細胞数と反応性が増加した。よって、痛みを伴うストレス反応に、視床下部室傍核での3α-HSDが関与することが示唆された。平成26年度に、ステロイド代謝の解析に必須である抗体ならびにプローブの作製と入手を行い実験を進める予定であった。しかし、うまく進まなかったので、ステロイド代謝の微少環境での変化と痛覚情報伝達との相互関連についての実験計画を変更して、新たに抗体ならびにプローブの作製と入手を行うこととしたため。解剖学このため、ステロイド代謝の解析に必須である抗体ならびにプローブの作製と入手を平成27年度で行った後に、ステロイド代謝の微少環境での変化と痛覚情報伝達との相互関連についての実験計画を進めることとした。当初の計画では、細胞膜に存在するGABAA受容体と結合して、抗不安、鎮静、鎮痛などの神経抑制作用を示し、また胎生期には神経細胞の増殖作用を示すことが知られているアロプレグナノロンを合成するステロイド代謝酵素である5α-reductaseと3α-hydoroxysteroid dehydrogenase (3α-HSD)の2つの酵素のうち、3α-HSDの中枢神経系内の分布について、成熟時と発達過程における発現を追求し、さらに、陽イオン-塩素イオン-共輸送体分子との関係を疼痛モデル動物を使って解析する予定になっていたが、現在の研究進度はその途中の段階にある。
自己DNAによる自然免疫活性化の分子機構とその生理作用

赤血球前駆細胞は、最終分化の過程で脱核により核を失う。私達は、これまでに、脱核時に放出された核はマクロファージによって貧食され、この核DNAはマクロファージのリソソームに存在するDNase IIによって分解されることを示してきた。そして、DNase IIが欠損すると、未分解DNAを蓄積した胎仔肝臓のマクロファージがIFN-βを産生し、造血を抑制する結果、マウスは重篤な貧血により胎生期で死滅することを明らかにしてきた。本研究では、IFN-βへの応答性を除去することにより胎生致死を回避したDNase IIとIFN受容体の二重欠損マウス及び、出生後でのDNase II遺伝子の破壊を可能にする、誘導型のコンディショナルノックアウトマウスを作製した。これら2つの系統のDNase II欠損マウスはともに、重篤な慢性関節炎を発症した。すなわち、これらマウスでは、四肢の末端部の腫脹、滑膜細胞の過増殖、骨破壊などが観察された。また、造血器官である骨髄や脾臓では、未分解DNAを蓄積したマクロファージが多数観察された。さらに骨髄でのTNF-α遺伝子の発現、及び、血清中のTNF-αタンパクの量が、ともに関節炎発症前の時点から既に上昇していることを見出した。そこで、抗TNF-α中和抗体をDNase II欠損マウスに投与したところ、関節炎の発症は抑制された。以上の結果より、DNase II欠損マウスでは、骨髄などにおいて、DNAを蓄積したマクロファージがIFN-βのみならずTNF-αも産生し、TNF-αの作用によって滑膜細胞が活性化され、関節炎を引き起こしていると結論した。この成果は自己DNAの分解不全が関節リウマチの原因となりうるという、これまで予想されなかった可能性を提示した。DNase II欠損マウスは、疾患モデルマウスとして、発症機序や原因がいまだ十分に明らかでないヒト関節炎の病態理解に貢献することが期待される。私達は、DNaseII遺伝子欠損マウスの解析を行い、脱核時に放出された核はマクロファージによって貧食され、この核DNAはマクロファージのリソソームに存在するDNaseIIによって分解されることを示してきた。そして、DNaseIIが欠損すると、未分解DNAを蓄積した胎仔肝臓のマクロファージがIFN-βを産生し、造血を抑制する結果、マウスは重篤な貧血により胎生期で死滅することを明らかにした。本年度、私達は、IFN-βへの応答性を除去することにより胎生致死を回避したDNaseIIとIFN受容体の二重欠損マウス及び、出生後でのDNaseII遺伝子の破壊を可能にする、誘導型のコンディショナルノックアウトマウスを作製した。これら2つの系統のDNaseII欠損マウスは同じ表現型を示し、重篤な慢性関節炎を発症した。骨髄でのサイトカイン遺伝子の発現をreal-time PCRによって定量した結果、TNF-α遺伝子の発現が、関節炎発症前の時点から既に上昇していることがわかった。血清中のTNF-αタンパクも、関節炎発症前から既に上昇していた。抗TNF-α中和抗体をDNaseII欠損マウスに投与したところ、関節炎の発症は抑制された。

以上より、DNaseII欠損マウスでは、骨髄などにおいて、DNAを蓄積したマクロファージがIFN-βのみならずTNF-αも産生し、TNF-αの作用によって滑膜細胞が活性化され、関節炎を引き起こしていると結論した。DNaseII欠損マウスは、疾患モデルマウスとして、発症機序や原因がいまだ十分に明らかでないヒト関節炎の病態理解に貢献することが期待される。DNaseII欠損マウスでは、分解を免れたDNAがマクロファージに蓄積し、IFN-βが構成的に産生される。その結果、マウスは赤血球造血に異常をきたし、重度の貧血により胎生期で死滅する。DNAの蓄積によってIFN-βが誘導される分子機構を明らかにするため、本年度は、ウイルス感染時などでIFN-βを誘導することが知られている転写因子IRF-3またはIRF-7と、DNaseIIとの二重欠損マウスを交配によって作製し、解析を行った。DNaseII,IRF-3二重欠損マウス及び、DNaseII,IRF-7二重欠損マウスは共に部分的に致死性が解除され、メンデルの法則により期待される数に対して、それぞれ15%、5%の割合で生存して誕生した。それぞれの二重欠損マウスのembryoを解析し、DNaseII単独欠損マウスと比較した。結果、E14.5における胎仔肝臓でのIFN-β遺伝子の発現上昇は、二重欠損マウスで共に部分的に減弱し、E17.5におけるヘマトクリットの値は、共に部分的に回復していた。よって、未分解の自己DNAによるIFN-βの誘導機構に、IRF-3、IRF-7が関与していることが示された。同時に、IRF-3、IRF-7が互いの機能を相補している可能性を強く示唆した。一方、DNaseIIを生後に欠損させる、誘導型DNaseII conditional欠損マウスは加齢に伴い関節炎を発症する。本年度は、このマウスでの関節炎発症の機構を調べるため、各種免疫要素を欠損する遺伝子欠損マウスとの交配を行い、多重欠損マウスを作製した。これらマウスを今後長期的に観察、解析し、疾患が発症するかどうかを調べることが可能となった。
鶏内耳有毛細胞の再生に関する研究

鶏再生内耳有毛細胞の起源を同定する目的で本実験を行った。孵化後第2日目の幼鶏を用い、強大音響刺激により内耳有毛細胞に障害を与えた後ブロモデオキシウリジン(BrdU)を腹腔内投与した。BrdUは細胞周期のS期細胞のDNA鎖にとりこまれる。再生有毛細胞の起源となる細胞が増殖、分化する際にBrdUを取り込むことになり、このBrdUの局在を検討することにより再生有毛細胞の起源を同定できる。BrdU投与後経時的に鶏の聴覚器官であるラゲナを摘出、免疫組織化学法を用いBrdUの局在を検討した。音響暴露後2日目のラゲナにおいて、基底膜近くに存在する支持細胞にBrdUの取り込みを認めた。音響暴露後7日目のラゲナでは、有毛細胞の再生が確認され、有毛細胞、支持細胞にBrdUの取り込みを認めた。また、BrdUの取り込みを認めた支持細胞は対象群で認められる支持細胞の存在部位に近く、すなわち、音響暴露後2日目のものに比して、より感覚上皮表面に近い部位に存在した。以上の所見により再生内耳有毛細胞の起源については、強大音響刺激による感覚上皮障害後、支持細胞が分裂増殖しその一部が有毛細胞へと分化するものと推察された。透過型電子顕微鏡による観察では、音響暴露後7日目の再生内耳有毛細胞において神経終末とのシナプス結合をおもわせる所見を得ているが、再生有毛細胞の再生過程における微細構造については現在検討中である。あわせて、再生感覚上皮における神経伝達物質についても検討を加える予定である。
果樹における新しい休眠打破法の開発に関する研究

1.GC-マス分析により、ニンニクの休眠打破有効成分は2硫化ジアリル、ニラではアリルメルカプタン、ラッキョウでは2硫化ジメチルと同定された。2.ブドウに対しては、2硫化ジメチルの休眠打破作用が最も強く、塗布および気浴処理で効果あり、これらを含むニンニクの精油であるガ-リックオイルが休眠打破に有効であった。3.モモについては、`八幡白鳳'において、ガ-リックオイル10倍液の処理が最も効果的で、石灰窒素とほぼ同程度の発芽促進作用があることが示され、1月5日加温で12日、1月14日加温において、3日の発芽促進が認められた。しかし、早期の処理ではガ-リックオイル処理に伴い最終発芽率がやや低下した。一方、ニンニク搾汁液の効果はなかった。4.甘果オウトウについては、モモとほぼ同様の効果が得られた。5.ナシについては、`二十世紀'において、Chill Unit0515の時期において48時間嫌気処理および2%CaCN2処理では、休眠打破効果はなかったが、45°C4時間処理で休眠打破効果が認められた。ガ-リックオイルの効果は認められなかった。6.カキについては、ガ-リックオイルおよびGA3の休眠打破効果は認められなかったが、石灰窒素20%上澄み液およびメリット青2部液で休眠打破効果が高いことが明らかとなった。7.カンキツについては、`興津早生'において、ニンニク搾汁および石灰窒素には発芽促進効果はないが、BA100ppm溶液が著しい効果をもつこと、一方低地温処理により、新梢および開花数を増加することが示された。8.休眠打破の機構については、ブドウではKCNとSHAMの処理により、発芽が促進されることから、シアン耐性呼吸阻害が関与しているものと推察された。一方、ニホンナシでは休眠打破の過程において、不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比が低下していくことを見出し、細胞膜の機能的変化が関わっているものとみられた。1.アリウム属植物中の休眠打破有効成分:GC-マスによりニラとラッキョウ中の揮発性イオウ化合物を分析したところ、主成分は前者ではアリルメルカプタンとメチルメルカプタン、後者では2硫化ジメチルであった。次に、ブドウの挿し穂でそれらの休眠打破効果をみたところ、効果はアリルメルカプタンが最も大きかったが、いずれの場合もニンニクの主成分である2硫化ジアリルよりも劣った。2.ブドウの二期作における休眠打破法の検討:休眠打破効果を示す数種のイオウ化合物を二期作目のせん定直後に塗布または気浴処理したところ、いずれの物質でも塗布処理の効果が大きかった。3.果樹種類間での化学物質による休眠打破効果の差異:温州ミカンの場合、11月以降のベンジルアデニン処理で打破効果が大きく、一方ニンニク汁液と石灰窒素処理では効果を示さなかった。甘果オウトウとモモでは、ガ-リックオイルと石灰窒素の効果が大きかったが、モモでは甘果オウトウよりも低濃度での処理が有効と思われた。なお、ニンニク汁液の効果は低かった。カキの場合、西条、平核無および富有では石灰窒素の効果が最も大きく、次いでメリット・ブル-、ジベレリンの順で、ガ-リックオイルには効果が認められなかった。また、平核無や富有よりも西条での効果が大きかった。

一方、刀根早生では石灰窒素には劣るもののガ-リックオイルでも効果が認められた。4.休眠打破に好適な温度条件の探索と打破のメカニズム:ニホンナシについて休眠完了のための低温要求量をみたところ、低温による休眠覚醒は個体の前歴によって異なり、加温の前歴がある個体ではそうでないものに比ベて早く発芽した。この場合、発芽の早かった加温歴のある個体では低温感応後の枝梢内および芽内でのブドウ糖と果糖の増加が早かった。ブドウの切り枝にKCNとシアン耐性呼吸阻害剤であるSHAMを処理すると、いずれの場合も発芽が促進されたことから、発芽促進剤処理による休眠打破にはシアン耐性呼吸阻害が関与していると推察された。1.ニンニク中の休眠打破有効成分:GCーマスによりニンニク中のイオウ化合物を分析したところ、硫化ジアリル、2硫化ジアリル、3硫化ジアリルなどのアリル基をもった物質が種々同定されたが、その揮発物では3硫化ジアリルは検出されなかった。従って、ニンニクの揮発性物質がブドウの芽の休眠打破に有効であることを考えると、ニンニク中の休眠打破有効成分は2硫化ジアリルと推察される。2.切り枝に対する化学物質処理:モモの場合、ガーリックオイル10倍液で発芽が促進された。カキの場合、石灰窒素20%液とメリットブルー2倍液では発芽が促進されたが、ジベレリン500ppmでは効果がなく、またガーリックオイル原液10倍液では芽が枯死した。3.鉢植え個体に対する休眠打破処理:根箱に植えたモモを12月と1月から加温したところ、いずれの時期とも発根が発芽に先行した。また、1月から加温したモモについて化学物質処理を併用したところ、石灰窒素とガーリックオイルではそれぞれ加温開始後24日と30日で発芽した。9月に摘葉処理したモモでは発芽が促進された。カキについて加温時期を変えて化学物質を処理したところ、いずれの時期とも休眠打破効果は石灰窒素で最も大きく、ガーリックオイルで小さく、またジベレリンで抑制された。4.休眠打破のメカニズム:ニホンナシの加温栽培樹と露地栽培樹について芽内の脂質代謝をみたところ、前者ではリノレン酸の割合が高く、また不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比も高かった。このことから、加温栽培樹と露地栽培樹とでは休眠導人期完了期において芽の呼吸、物質の輸送・代謝、ホルモンの受容等に影響する生理機能に差異が生じたことが考えられる。さらに、ニホンナシの芽の呼吸に関与する酵素活性を調査したところ、G6PDH活性は休眠導入期から最深期にかけて低く、自発休眠打破後に急上昇した。このG6PDH活性の上昇は休眠打破期においてベントースリン酸回路の呼吸に占める割合が高いことを示唆しており、この変化が休眠打破と密接に関係していると思われる。本研究計画の最終年度にあたり、これまでに得られた知見をもとに以下の果樹について、新しい休眠打破法の実用的使用法を検討した。実績の概要は次のとおりである。1.ブドウでは、`マスカット・オブ・アレキサンドリア'においてガーリックオイルを中心に、溶媒および処理濃度を検討したところ、サラダオイル原液、Tween20および60ではその濃度に関係なくガーリックオイル50%区で最も発芽促進効果が認められ、一方、Tween80ではガーリックオイルの10%、50%ともに1%よりも0.01%を添加した場合に効果が高いことが示された。2.モモについては、`八幡白鳳'において、ガーリックオイル10倍液の処理が最も効果的で1月5日加温で12日、1月14日加温において、3日の発芽促進が認められた。しかし、モモにおいては、ガーリックオイル処理に伴い最終発芽率が低下することが示された。
新規細胞内カルシウム結合蛋白質peflinの機能解析

peflinは、5つのEF-handをもつpenta-EF-hand(PEF)カルシウム結合蛋白質であり、アポトーシス誘導に関与するカルシウム結合蛋白質ALG-2と同じファミリーに属すことを見出した。本研究において、peflinの特異的モノクローナル抗体を作製することにより、peflinは、アポトーシス誘導に関わるCa^<2+>結合蛋白質ALG-2とヘテロダイマーを形成すること、また、細胞内局在性解析の過程で、peflinが細胞質に存在するのに対して、ALG-2は細胞質と核にも存在することを見出した。peflinの主な機能として、ALG-2とヘテロダイマーを形成することにより、ALG-2の安定性、局在性や機能を制御している可能性が考えられる。細胞性粘菌は、その生活環において単細胞から多細胞へ分化するため下等モデル真核生物として注目されているがこの生物にもPEF蛋白質が存在することを明らかにした。peflinの相互作用因子探索のため酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行ったが、ALG-2が陽性クローンとして得られたが、他のクローンは、擬陽性と判断された。一方、ALG-2の相互作用因子を探索した結果、peflinとともに、Alixが陽性クローンとして得られた。さらに新規相互作用因子としてアネキシンXIが見出された。欠損変異体解析よりアネキシンXIのN末端領域と結合すること、in vitroでの解析によりカルシウム依存的に結合することが明らかになった。また、アネキシンXIのN末端領域とAlixのC末端領域はアミノ酸配列に類似が見られ、共通の結合モチーフを有していることが推察された。5つのEF-handモチーフ(PEFドメイン)をもつ新規カルシウム結合タンパク質様の部分配列をESTデータベース上に見出し、これをpeflinと命名して、完全長cDNAをヒト胎児ライブラリーよりクローニングした。PEFドメインをもつタンパク質としては、カルパイン小サブユニット、sorcin,grancalcin,および予定細胞死(アポトーシス)と密接に関係することが知られているALG-2が知られていたが、推定されるアミノ酸配列を比較すると、peflinはこれらのうちALG-2と最も相同性が高かった。また、ALG-2と比較して、N末端にはPro,Glyおよび疎水性アミノ酸に富む領域をもち、Ala-Pro-Gly-Gly-Pro-Tyr-Gly-Gly-Proをコンセンサスとする特徴的な9残基配列を9回繰り返した領域を挿入していた。PeflinのPEFドメインのN末端にHisを6残基付加した組み換え体(6xHis-△Npeflin)を大腸菌で発現させたが、発現産物は不溶性であったので、変性剤存在下で6xHisを認識するアフィニティ樹脂を用いて精製した。これを抗原としてマウスに注射し、抗血清を得た。ウエスタンブロットによりヒトT細胞白血病細胞株Jurkatや骨髄性白血病細胞株HL60などで、分子量30Kに相当する位置に特異的バンドを検出した。cDNAより推定される分子量とよく一致し、得られたcDNAが本来の翻訳開始コドンをもつことを強く示唆した。最近、特異性の高いモノクローナル抗体を取得することに成功し、今後はpeflinのカルシウム上昇に伴う細胞内局在性の変化などを免疫学的に解析する予定である。5つのEF-handモチーフ(PEFドメイン)をもつ新規カルシウム結合タンパク質peflinに対するモノクローナル抗体を作製した。S-35Metでラジオアイソトープ標識したJurkat細胞抽出液の免疫沈降を行うと、peflinの分子量30Kに相当するバンド以外に、22Kのバンドが検出された。Ca2+存在下では22Kのバンドは消失した。22KのバンドはALG-2であることをALG-2抗体を用いて証明した。すなわち、免疫沈降物中にALG-2が含まれることをウエスタンブロッティングにより確認するとともに、逆に細胞抽出液のALG-2抗体による免疫沈降物中にpeflinが存在することを確認した。細胞抽出液の10万

xg遠心上清をゲル濾過すると、peflinとALG-2は、一緒に溶出され同じフラクションに回収された。両タンパク質はヘテロダイマーを形成していることが強く示唆された。Jurkat細胞の蛍光免疫染色を行うと、peflinは細胞質に、ALG-2は細胞質とともに核内にも検出された。細胞質ではpeflinとALG-2はヘテロダイマーを形成しているが、核内ではALG-2はホモダイマーを形成していると思われる。peflinはALG-2と結合することにより細胞質での作用が制御され、Ca2+濃度が上昇するとpeflinはALG-2との複合体から離れ、未知のタンパク質に結合して生理的機能を発揮すると想像される。遠心分離による細胞分画を行うと、peflinはCa2+存在下では膜および細胞骨格画分に回収される。現在、相互作用因子を酵母ツーハイブリッド法により探索中である。我々は、カルパインやALG-2と同様に5つのEF-handをもつタンパク質としてpeflinを発見したが、特異抗体を作製して生化学的解析を行ない、peflinがALG-2とヘテロダイマーを形成していることを明らかにした。そこで、両者の結合部位を推定するため、ALG-2との相互作用を酵母two-hybrid法により解析した。その結果、EF-4/5がダイマー形成部位であることが判明した。さらに、ヒト胚性腎細胞HEK293にトランスフェクションして発現解析を行ったところ、ともにEF-5欠損体は半減期が著しく短く、培地中にプロテアソーム阻害剤を添加することによって検出が可能となった。EF-5はダイマー形成に必須であり、peflinおよびALG-2はダイマーを形成することにより、蛋白質の折りたたみが正確に起こり、安定化すると考えられる。一方、peflinの新規相互作用因子を探索するため、HeLa cDNAライブラリーを用いて酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行ったが、ALG-2が陽性クローンとして得られた。その他のクローンは、種々の判定基準から擬陽性と判断された。peflinとALG-2がヘテロダイマーを形成していることから、両者を同時に発現させたthree-hybrid法を構築して探索する必要があると思われる。一方、ALG-2を'bait'にして同ライブラリーを探索した結果、peflinとともに、既にその相互作用因子として報告されているAlixが陽性クローンとして得られた。現在、さらに新規相互作用因子としての可能性がある2つのクローンについて解析中である。ひとつはアネキシンXI、他は、ヒトゲノムデータベース上で機能未知となっており、今後の展開が期待される。
悪性胸膜中皮腫に対するmTORを標的とした分子標的治療の基礎的検討

mTOR阻害剤であるTemsirolimusは悪性胸膜中皮腫細胞株の増殖抑制効果を濃度依存性に示すことをIn Vitroで示した。特にp70s6kのリン酸化を阻害すること、またアポトーシスのマーカーとして知られるcleaved-caspase3の発現レベルを亢進させることを確認した。FACS法により、MSTO211H以外の細胞株、H226,H290,and Y-MESO14ではアポトーシスの誘導が確認された。さらにTemsirolimusとCisplatinは相乗効果を示すこと、Temsirolimusは抗血管新生効果、特にVEGF発現抑制効果を示すことを明らかにした。Temsirolimusは抗腫瘍効果と、血管新生抑制効果の両面の作用を持つことが示された。平成21年度はラパマイシンの悪性胸膜中皮腫細胞株に対する治療効果をIn Vitroで検討した。次いで、各種薬剤のコンビネーションアッセイを施行した。Cisplatinの濃度はIC50値を参考に0.1μg/ml,0.3μg/mlとした。Pemetrexedについても同様に0.1μg/ml,0.3μg/mlとした。MSTO211HのみにTemsirolimus, Cisplatinの相乗効果を確認した。Temsirolimus, Pemetrexedは相乗効果は認められなかった。正常細胞(中皮細胞のIMR-90, Met-5A)に対しても同様に検討したが、治療効果は認めなかった。MTT assayの問題点として単薬剤使用時とコンビネーションアッセイでの感受性がかなり異なる点が挙げられ、細胞株の継代を繰り返したことが-因と考えている。mTOR阻害剤の悪性胸膜中皮腫への治療効果を確認するため、動物モデルを用いた検討を施行予定であるが、その前段階であるIn Vitroでの検討ではほぼ期待通りの治療効果が得られたと考えている。本年度は、m-TOR阻害剤であるTemsirolimusの悪性胸膜中皮腫細胞株(H226, H290, Y-meso14, MSTO211H, MRC-5, IMR-90, Met-5Aの細胞株を用いた)に対する治療効果をIn Vitroにて確認した。次いで、現在臨床にて同腫瘍に対して使用されているCisplatin, Pemetrexedeとの治療効果の比較、さらには各種薬剤の組み合わせによる治療効果について検討した。さらに血管新生因子の発現についても検討することに取り組んだ。解析方法としてはMTTアッセイ、FACS法、ELISA法、ウェスタン法などを行った。その結果、mTOR阻害剤であるTemsirolimusは悪性胸膜中皮腫細胞株の増殖抑制効果を濃度依存性に示すことをIn Vitroで示した。FACS法により、MSTO211H以外の細胞株、H226.H290.and Y-MESO14ではアポトーシスの誘導が確認された。Temsirolimusは杭腫瘍効果と、血管新生抑制効果の両面の作用を持つことが示された。本研究のごとく、悪性胸膜中皮腫に対してのmTORを標的とした治療法の開発は、全世界でもIn Vitroの研究はもとより、In Vivoでもわずかな成果が認められるのみである。本研究は現在使用されている抗腫瘍剤、外科的、放射線治療をもってしても根治困難な悪性胸膜中皮腫に対しての新規分子標的治療法を開発するという点で意義あるものである。
クルマエビ抗ウイルス因子の挙動および産生誘導機構の解明

クルマエビの血リンパ液中に存在する抗ウイルス応答関連因子の挙動を把握することを目的として、その因子の特定や検出系の構築を試みている。クルマエビの血リンパ液にはヘモシアニンと呼ばれる酸素を運搬するタンパク質が存在しているが、ヘモシアニンの血リンパ液中の存在量は極めて多く、血リンパ液中総タンパク質の9割以上を占めている。そのため、存在量の少ないタンパク質の量を測定することは非常に困難であるため、ヘモシアニンをできる限り除去する必要がある。これまでに、硫安沈殿、金属イオンやポリクローナル抗体、さらにはモノクローナル抗体などを用いてヘモシアニンの除去を試みたものの、血リンパ液中の微量タンパク質の解析に活用できるヘモシアニン除去法を確立するには至っていなかった。本年度は、ある種の高分子化合物により高分子タンパク質を沈殿させることで低分子タンパク質を解析することが可能であることが明らかとなった。本解析系により、血リンパ液中の微量タンパク質の量的把握がより高精度に実施できると考えられる。クルマエビの血リンパ液中には血球から分泌される抗ウイルス応答因子も存在すると考えられることから、抗ウイルス応答を誘導させたクルマエビの血球を採取し、次世代シークエンサーによるトランスクリプトーム解析を実施した。解析の結果、極めて遺伝子量が増加するものと顕著に遺伝子量が低下する抗微生物ペプチド群が検出された。これまでにこのように相補的な挙動を示す免疫関連因子はクルマエビでは認められておらず、エビ類独自の免疫応答の解明に重要な知見になると考えられる。クルマエビの血リンパ液からのヘモシアニンの除去の効率化を図るために、様々な手法を試してきたものの、現実的に利用可能な方法の条件検討に非常に多大な時間を要するに至った。そのため、血リンパ液中の抗ウイルス応答タンパク質の解析系の開発が遅れている。また、試験管内での抗ウイルス応答関連因子の挙動を把握するにも至ってはいない。しかしながら、トランスクリプトーム解析により、血球において数多くの免疫応答関連因子の変動を捉えていることから、今後はこれらの情報を基にタンパク質の解析系の構築への繋げていくことが可能となったと考えている。高分子タンパク質の除去法を用いて処理したクルマエビの血リンパ液のプロテオーム解析を実施し、タンパク質レベルでの抗ウイルス応答関連因子の探索を実施する。発現に変動が見られたタンパク質については、質量分析によりタンパク質の同定を試みる。また、トランスクリプトーム解析により明らかとなった抗ウイルス応答関連遺伝子群については抗体を作製し、血リンパ液中の変動を把握する。抗ウイルス因子の活性には,ウイルスの糖鎖構造が深く関与していることが推測される。そこで,抗ウイルス因子の精製タンパク質を用いて,シュガーチップによりその標的の糖鎖組成を明らかとする。また,ウイルスの構成成分については,その表面糖鎖構造をレクチンカラムあるいはレクチンアレイを用いることで明らかとする。表面糖鎖構造の情報を基に,抗ウイルス因子,ウイルス構成因子に対する抗体および細胞内のファゴソームやリソソームマーカーにより,抗ウイルス因子が如何に機能を発揮しているかについて,蛍光多重免疫染色法によりその実態を明らかとする。クルマエビの抗ウイルス因子の挙動を把握するために,既報の抗ウイルス応答誘導因子を接種した個体と無処理の個体における血リンパ液のプロテオーム解析を実施した。二次元電気泳動像において血リンパ液中濃度に変動が認められた因子について,質量分析によるタンパク質の同定を行うとともに次世代シークエンサーにより取得したトランスクリプトームから遺伝子配列を特定した。抗ウイルス応答候補因子について大腸菌を用いて組換えタンパク質を作製し,ウサギに免疫しポリクローナル抗体を得た。本抗体を用いたELISA法により,血リンパ液から当該抗ウイルス応答因子の検出は可能であったが,血リンパ液中の濃度が極めて低く濃度変化を把握することは困難であった。血リンパ液中の抗ウイルス因子の挙動を高精度に測定するためには,血リンパ液中に多く含まれるタンパク質(Highly abundant proteins:HAP)を除去する必要があると考えられた。特にヘモシアニンは血リンパ液中タンパク質の90%程度を占めており,微量タンパク質の検出を困難にしている。そこで,クルマエビの血リンパ液によりマウスを免疫し,これらHAPに対するモノクローナル抗体の作出を試みた。ELISA法により96株のハイブリドーマから血リンパ液に特に強く反応する株のスクリーニングを実施した。クルマエビの血リンパ液に対して強い反応を示した12株を選択し,免疫共沈降法によりHAP除去効果の評価を実施したが,HAP除去に有用な株は得られなかった。血リンパ液中に多く含まれるタンパク質(Highly abundant proteins:HAP)を除去するための抗体作出において,ヘモシアニンと結合性の高い抗体の作出を試みたが,モノクローナル抗体によるタンパク質の除去は効率が悪く,実際に解析系に導入することは困難であると考えられた。そのため,HAP除去にはポリクローナル抗体を利用することやHAPの性質を利用した方法など別のアプローチが必要である。

これまでに、硫安沈殿、金属イオンやポリクローナル抗体、さらにはモノクローナル抗体などを用いてヘモシアニンの除去を試みたものの、血リンパ液中の微量タンパク質の解析に活用できるヘモシアニン除去法を確立するには至っていなかった。本年度は、ある種の高分子化合物により高分子タンパク質を沈殿させることで低分子タンパク質を解析することが可能であることが明らかとなった。本解析系により、血リンパ液中の微量タンパク質の量的把握がより高精度に実施できると考えられる。クルマエビの血リンパ液中には血球から分泌される抗ウイルス応答因子も存在すると考えられることから、抗ウイルス応答を誘導させたクルマエビの血球を採取し、次世代シークエンサーによるトランスクリプトーム解析を実施した。解析の結果、極めて遺伝子量が増加するものと顕著に遺伝子量が低下する抗微生物ペプチド群が検出された。これまでにこのように相補的な挙動を示す免疫関連因子はクルマエビでは認められておらず、エビ類独自の免疫応答の解明に重要な知見になると考えられる。クルマエビの血リンパ液からのヘモシアニンの除去の効率化を図るために、様々な手法を試してきたものの、現実的に利用可能な方法の条件検討に非常に多大な時間を要するに至った。そのため、血リンパ液中の抗ウイルス応答タンパク質の解析系の開発が遅れている。また、試験管内での抗ウイルス応答関連因子の挙動を把握するにも至ってはいない。しかしながら、トランスクリプトーム解析により、血球において数多くの免疫応答関連因子の変動を捉えていることから、今後はこれらの情報を基にタンパク質の解析系の構築への繋げていくことが可能となったと考えている。クルマエビ血リンパ液中に多く含まれるタンパク質(HAP)を除去するための抗体作製の抗原としてヘモシアニンの組換えタンパク質を作製し,ポリクローナル抗体の作出を試みる。また,ポリエチレングリコール等を用いた方法によりHAP除去を試みる。血リンパ液中のヘモシアニンを除去し,ELISA法により抗ウイルス候補因子の変動を把握する。また,免疫組織化学法により,抗ウイルス因子の産生細胞の特定および局在について明らかにする。抗ウイルス性因子を産生する細胞集団を用い,試験管内で,ウイルス構成成分により刺激する。これらの細胞集団を経時的に回収し,網羅的な遺伝子発現解析を行い,刺激に応答する遺伝子群を特定する。これらの遺伝子群について,RNA干渉による網羅的遺伝子ノックダウンを実施し,抗ウイルス因子の発現が抑制される遺伝子を探索する。抗ウイルス因子の産生抑制遺伝子の合成RNAあるいは発現コンストラクトを細胞内に導入し,抗ウイルス因子の発現量の変化を測定する。これらの結果より,抗ウイルス性因子の産生に関わる遺伝子の特定を行う。高分子タンパク質の除去法を用いて処理したクルマエビの血リンパ液のプロテオーム解析を実施し、タンパク質レベルでの抗ウイルス応答関連因子の探索を実施する。発現に変動が見られたタンパク質については、質量分析によりタンパク質の同定を試みる。