hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脊髄虚血神経保護における抗炎症薬の臨床応用に関する研究

胸腹部大動脈瘤手術後に生じる脊髄虚血(対麻痺)は、様々なモニタや術中管理の改良により減少傾向にあるものの、その発生を完全に防止できないのが現状である。特に近年、手術後遅発性に対麻痺が生じる割合が増加傾向で、その原因として術後発症した脊髄虚血(低灌流、塞栓などが原因)の他に、術中生じた虚血の病態進行による遅発性神経細胞死が考えられている。遅発性神経細胞死の機序として炎症反応の関与が示唆され、炎症性サイトカインの制御が脊髄虚血保護に働く可能性がある。今回抗TNF-α抗体(インフリキシマブ)を用いて脊髄虚血保護に有効か検討することとした。インフリキシマブは既に慢性関節リウマチの治療薬として市販されているため、臨床応用も比較的容易である。しかしインフリキシマブは免疫系に影響を与えるため、手術前後の使用を前提にする場合、その安全性の確立は非常に重要である。平成23年度は、当初の予定通りインフリキシマブ投与の安全性について検討した。家兎(2.5kg)にインフリキシマブ1、3、5、10mg/kg(臨床投与量35mg/kg)を各1羽ずつ投与し2週間飼育し、活動性、摂食状況、排泄、血液生化学検査(薬剤投与2週間後)を観察した。また、手術の影響も考慮するため脊髄虚血のみ行わないsham手術中にインフリキシマブ1、3、5、10mg/kgを投与したものも1羽ずつ行い、2週間観察した。活動性、摂食状況、排泄、血液生化学検査に関して、いずれも特に異常はみられなかった。創治癒は多少影響が生じる可能性が考えられた。創治癒に関しては虚血実験を行いながら、更なる検討を行う計画である。平成24年度は、当初の予定通りインフリキシマブ投与による脊図保護効果について検討できたが、結果は無効で次の計画を遂行しなければならないから平成23年度は、当初の予定通りインフリキシマブ投与の安全性について検討できており、おおむね順調に進行出来ているから。インフリキシマブの有効性が得られなかった場合に考えていた計画に準じて、アナキンラ(IL-1受容体拮抗体)投与による脊髄虚血保護効果の検討を家兎の脊髄虚血モデルを用いて行う。生理食塩水投与群をコントロールとして薬剤投与群と比較する。経時的な神経学的所見(後肢運動機能、感覚機能)を観察した後、再灌流後7日目に灌流固定を行い、病理組織学的検討を行う。また、薬剤の有効性と作用機序の判断のため、脊髄組織標本の免疫染色によるミクログリアの活動性評価を併せて行う。抗TNF-α抗体(インフリキシマブ)投与による脊髄虚血保護効果の検討を家兎の脊髄虚血モデルを用いて行う。計画していた本年度のインフリキシマブの脊髄虚血保護効果の研究において、予定していた実験動物数より少なく結果が得られたため392,094円の未使用額が生じた。この未使用額については、次年度の実験に使用する家兎(1万円/羽)やアナキンラ(20万円/本)や麻酔薬、消毒剤、家兎飼育費、標本代に使用する。また、研究内容報告のための学会旅費にも一部使用予定である。平成23年度において、研究内容の助言に対する謝礼や通信費が予算として計上していたほど必要でなかったため、57,805円の未使用額が発生した。平成24年度予算1,100,000円と合わせて1,157,805円を、インフリキシマブ投与による脊髄虚血保護実験に使用する。家兎(1万円/羽×24羽)やインフリキシマブ(10万円/本×6本)や麻酔薬、消毒剤、家兎飼育費、組織標本代に使用する。
片側前腕欠損者にお ける肩関節筋力とク ロール泳パフォーマ ンスの関係

平成30年度の前半に予定通り実験を行った。本研究の目的は、片側前腕欠損者のクロール泳の競技力向上を目的とした陸上トレーニングのトレーニング指標を示すことにあり、これまで日本人選手を対象に行われたことのない、貴重な資料となる。そこで、実験を行うにあたり、競技レベルが一定水準以上で、安定した測定の必要性を考慮し、トップレベル選手を対象に行うこととした。日本身体障がい者水泳連盟に強化・育成指定選手として選ばれたトップレベルの片側前腕欠損女子選手5名を対象とし、実験は5名全員に行った。トップレベルの選手に限定したことにより、対象者が減少したため、実験内容も肩関節筋力とスイミングパワーに加え、動作解析も行った。収集したデータは鋭意分析中である。分析は個々の対象者に対して行い、推進局面(早期プルスルーフェイズと後期プルスルーフェイズ)でのスイミング速度と肩関節筋力の強さの傾向、スイミングパワーとの検討を行っている。実験実施まではおおむね順調に進展していたが、データ分析の段階で予定よりもやや遅れをとっている。これは、追加で動作解析を行ったことによりデータの処理が煩雑になったこと、グループではなく個々の対象者に対して分析を行っていることが要因となり、データの分析に時間を要しているためである。進展の遅れに対して、令和元年度に予定していた学会発表を行わず、最終予定である論文の投稿および掲載に向けて、分析および論文執筆活動に専念する。対象者が当初計画時点よりも減少したことにより次年度使用額が発生した。そこで、翌年度分のみでは不足していた、英文校正費と掲載料に当てることとする。
磁性合金および磁性積層膜の電気伝導度の第一原理計算

電子状態に対する第一原理計算手法を久保公式に適用することで、物質の電気伝導度テンソルを定量評価するプログラムを作成した。これを用いてスピントロニクス材料として期待される強磁性体において、原子構造や磁気構造の乱れ、スピン揺らぎなどが、電気抵抗率、異方性磁気抵抗効果(AMR)、異常ホール効果(AHE)、およびスピン分極率などの特性にどのような影響を与えるかを定量的に評価することができた。強磁性を示すホイスラー合金の中には一方のスピン状態が金属的,他方が半導体的に振る舞うハーフメタルとよばれる電子構造を持つものが存在することが電子状態計算の結果から予見されている.ハーフメタルのフェルミ準位では片側のスピン状態の電子しか存在し得ないため,これが伝導特性にユニークな性質をもたらすと考えられている.そこで今年度は、スピントロニクス分野での応用が期待されているホイスラー合金Co_2MnAl_<1-X>Six、およびCo_2Mn_<1-Y>Fe_YSiの電気抵抗率のX、Y依存性を第一原理計算による評価を行った。研究方法としては,密度汎関数法による電子状態計算の手法を応用し,完全な規則構造では理想的なハーフメタルとなる。L2_1構造の場合、X=0,1、Y=0,1を除く組成の抵抗率は20(μΩcm)程度であり、Fe-CoやFe-Niなどの合金と同程度である。一方、B2とA2構造では100(μΩcm)程度で推移しており、Co_2MnSiにおける抵抗率の測定値と同程度の値が得られている。ここで注目すべきことは、Co_2MnAl_<1-X>Six領域において部分不規則構造であるB2構造の抵抗率が完全不規則構造であるA2のそれより大きいことである。これは、この組成領域のB2構造がハーフメタル性を維持し、片方のスピン状態にエネルギーギャップがあることを反映したものである。このB2構造の抵抗率は、Co_2MnAl_<1-X>SixからCo_2Mn_<1-Y>Fe_YSiの組成領域に入ると急激に低下するが、これはCo_2MnAl_<1-Y>Fe_YSi(Y>1)においてフェルミ準位がminority spin状態のバンド内に入りハーフメタル性が消失することを反映したものである。これに伴いA2構造とB2構造の抵抗率がY>1領域で逆転し、完全不規則構造であるA2構造の抵抗率が部分不規則構造であるB2構造の抵抗率より大きくなる。強磁性金属の電気伝導度は有限温度におけるスピン揺らぎによって低下することが知られているが実際の物質に対して定量的に評価された例はない。そこで23年度はbcc-Feを取り上げ、スピン揺らぎが電気伝導度に具体的にどのように影響するかを第一原理計算から定量レベルの検討を行った。電子状態の計算には、局所スゼン密度汎関数法の下で強結合線形マフィンティン軌道(TB-LMTO)法を用い、スピン揺らぎは上向きスピンサイトと下向きスピンサイトのランダム配置をコヒーレントポテンシャル近似(CPA)を用いることによって考慮した。そこで得られたコヒーレントグリーン関数を久保公式に代入して電気伝導度の計算を行った。得られた結果は、電気抵抗率(ρ)の磁化依存性(ρ∝1-(M/M_0)^2、-M:磁気モーメントの平均値、M_0:局所磁気モーメント)をよく再現し、更に,M/M_0の変化を温度に換算して得られる電気抵抗の温度依存性を定量的によく再現することが分かった。さらに注目すべきことは、スピン揺らぎの程度に応じて、スピン別の電気伝導度(σ_↑、σ_↓)の大小関係が大きく変化することであり、キュリー温度近傍ではスピン分極率(P=(σ_↑-σ_↓)/(σ_↑+σ_↓))が負になる可能性があることである。このことは、これまで絶対零度における電気伝導度から評価していたスピン分極率も有限温度では顕著に異なる可能性があることを示唆しており、スピントロニクス材料の特性評価にスピン揺らぎの影響を考慮する必要性を示すものといえる。スピントロニクス材料として期待されるいくつかの遷移金属合金の伝導特性を第一原理計算から評価する手法を確立し、物質毎の特性の違いを定量レベルで明らかにすることを目的として研究を行ってきた。この中で当該年度は、久保公式の下で、スピン軌道相互作用を考慮した強結合ーLMTO法により、磁性合金の電気伝導テンソルに関する第一原理計算を行い、原子構造や磁気構造の乱れ、スピン揺らぎが電気伝導度、異常磁気抵抗効果(AMR)、異常ホール効果、スピンホール効果およびスピン分極率に与える影響を定量的に評価した。具体的には、平成23年度に作成したプログラムにスピン軌道相互作用を考慮し、Fe-Ni、Fe-CoおよびPt-Au合金などの物質の様々なスピン配列に対して電気伝導度テンソル(非対角成分を含む)の計算を実行し、AMRやAHEに関する実験との比較を行い、計算の妥当性を確認するとともにこれら物質のスピントロニクス材料としての可能性を評価検証を行った。

fcc-Fe-Ni合金についてAMR効果の計算を行ったところ、fcc-NiでAMR比が20%程度となり、Fe濃度の上昇とともにAMR比が低下してFeが50%程度でほぼ0となった。この結果は、従来の実験結果とよく一致することが確認された。また、異常ホール伝導度については、fcc-Niで約-2000(Ωcm)**(-1)程度の値を示し、Fe濃度が10%程度でほぼ0となる結果が得られた。但し、bcc-Feでは約500(Ωcm)**(-1)であり、実測の70%程度となった。更に、非磁性金属であるPt-AuやPd-Ag合金のスピンホール伝導度についても計算を行い、内因性成分と外因性成分の組成依存性について詳細な検討を行った。不規則合金の電気抵抗やスピン別伝導度から期待されるスピン分極率の定量評価技術を確立し、ハーフメタルを含むスピントロニクス材料のスピン分極率およびスピン揺らぎの影響など予定に即して実行した。また、23年度以降はTMRなどの磁気接合系のコンダクタンスの評価技術の検討を開始する予定になっており、まだ結果を出すに至っていないが、ほぼ計画通りである。24年度が最終年度であるため、記入しない。本課題がスタートした後、スピントロニクス分野では(異常ホール効果、スピンホール効果、結晶磁気異方性など)スピン軌道相互作用が絡んだ現象に注目が集まり、その起源に関する理論研究と第一原理計算に基づく定量評価に対する要求が急速に高まっている。従って、本課題においても、24年度以降はスピン軌道相互作用を考慮した伝導特性の計算技術を確立し、磁気異方性や異常ホール効果などの特性の定量評価を行っていく予定である。
ラット海馬体における情報選択機構の解明

われわれは,海馬体は,課題要求性に基づき,その課題に必要な情報を能動的に選択し,符号化しているという作業仮説を立てている。昨年度は,課題要求性により,入力情報の特定のパラメータに対するラット海馬体場所ニューロン(動物が特定の場所に居るときに活動が上昇するニューロン)の応答選択性が増加し,より重要な情報に応答性が能動的にシフトしていることを報告した。本年度は,ラット用の特殊小型自動車を開発し,この小型自動車にラットを載せて移動することにより,ラットの動き(歩行運動)を制限した状態でラットの居場所を変化させ(受動的移動),能動的に歩行移動したときの場所応答性と比較・解析した。実験では,1)ラットに,オープンフィールド内で脳内自己刺激(ICSS)を報酬としてランダムに移動する場所探索課題および二つの場所の間を往復する場所移動学習課題を行わせ(能動的移動),海馬体場所ニューロンの活動およびラットが移動した軌跡を記録した。2)ラットを小型自動車に載せた状態で,記録した軌跡に沿って移動させ,同じ場所でICSSを強制的に与えて海馬体場所ニューロンの応答性を解析した。その結果,40個の海馬体ニューロンを記録し,能動および受動移動をテストしたすべての場所ニューロン(n=14)で場所応答性が低下することが明らかになった。さらに,サル用自動車を用いてサルにレバ-押し場所移動課題を訓練し,レバ-押しによる能動移動および実験者が強制的に自動車を移動させる受動移動に対するサル海馬体場所関連ニューロンの応答性を比較・解析した。その結果,テストした22個の場所関連ニューロンのうち19個で場所応答性が同様に低下することが判明した。以上の結果は,能動的な感覚情報処理が海馬体で行われていることを強く示唆し,われわれの仮説を支持するものである。
記憶の意図的な抑制メカニズムの検討

平成30年度は不快な記憶の想起を意図的に抑制することによってその記憶の不快さが低減するかについて実験的に検討を行った。実験において参加者は,不快な画像を覚えたあとにその画像について思い出さないようにすることを繰り返した。この前後に,実験参加者は記憶の不快さを評定した。評定の変化を見ることで想起の意図的な抑制が記憶の不快さを低減するかを評価した。実験の結果,不快さが低減するかどうかは参加者の性格特性によって調整されることが明らかとなった。具体的には,うつや不安の程度が低い参加者では意図的な抑制によって記憶の不快さが低減した一方で,うつや不安の程度が高い参加者はむしろ不快さが増幅した。この結果はまず,記憶の制御が感情の制御に大きな役割を果たしていることを示している。さらに重要なことは,本研究で参加者に教示したような「考えない」という記憶の制御方略があらゆる人に有効であるわけではなく,記憶の不快さの低減を必要とするうつや不安の傾向が高い人にとってはむしろ逆効果だということである。この研究成果はInternational Convention of Psychological Scienceという国際学会で発表された。本研究成果に加えて,それまでの研究成果についても日本認知心理学会と日本心理学会でポスター発表を行った。また,以後の研究ではコンピュータシミュレーションを用いる予定であるため,その権威であるUniversity of Colorado, BoulderのRandall O'Reilly教授を訪問し,シミュレーションに関する知識や技術を学ぶとともに,想起の意図的な抑制に関するシミュレーションモデルの構築を行った。平成30年度は当初の計画通り,研究課題に関する実験的な検討を進められている。また,その結果をまとめて年度内に学会にて発表することができた。さらに,今後の研究において重要となるシミュレーションについても開始することができた。当初の計画通り,実験を実施し研究課題を遂行する。それと同時にこれまでの研究成果を論文にまとめ投稿し国際論文誌での出版を目指す。シミュレーションモデルの構築に関しては,O'Reilly教授の協力も仰ぎながら,効率的に研究を進められるようにする。
ヘルパーＴ細胞の異常が引き起こす肥満の病態解析

DUSP16のドミナントネガティブをT細胞特異的に発現させたマウスであるMKP-M CSマウスを作成したところ、ヘルパーT細胞の機能に異常が認められた。さらに、このマウスは摂食過多による体重上昇が認められた。そこで、視床下部の神経ペプチドの発現を調べたところ、摂食時に摂食刺激性のNPYの減少が少ないことが判明した。次に、小腸が分泌し満腹シグナルであるコレシストキニン(CCK)の発現を検討したところ、摂食時における発現が少ないことが判明した。これらのことから、MKP-M CSマウスでは摂食時に、CCKが少なくなり、視床下部のNPYの発現が減少しないため多く摂食し体重増加が起こることが示唆された。メタボリックシンドロームを典型的な例として肥満が炎症系の免疫細胞に与える影響について多くの研究がなされている。しかし、免疫系の異常が肥満を誘発する事象についてはほとんど報告がなされていない。ヘルパーT細胞に発現が認められるMitogenactivated protein kinase phosphatase - macrophage (MKP-M)に注目しのフォスファターゼ活性部位を変異させたMKP-M CSを調整した。そして、MKP-M CSをヘルパーT細胞特異的に発現するマウスを調整したところ、ヘルパーT細胞の異常のみ成らず肥満を示した。このマウスの摂食活動を詳細に検討したところ、離乳時以降に摂食が増加し、脂肪組織のみの重量の増加が認められた。このことは、MKP-M CSマウスの体重増加が食欲増加によるものであると考えられた。そこで、その食欲増加の原因を調べるため脂肪を介する系と胃や腸の消化器を介する系、そして第三脳室周囲組織を介する系の3つの経路に分けて解析した。第一の経路である脂肪を介する系については、正常マウスとMKP-M CSマウスにおいて脂肪が産生するレプチンに差がなかったことからMKP-M CSマウス肥満には余り関わりがないことが判明した。次に、すべての系に共通な視床下部における摂食制御ペプチドであるPOMCやNeuropeptitde Yの産生を検討した。摂食時及び飢餓時の正常型マウス及びMKPM-CSマウスから、視床下部を採取し比較した。その結果摂食時に低下するはずの摂食制御ペプチドであるNeuropeptitde Yの発現上昇が認められた。このことはMKP-M CSマウスに於いて摂食時も満腹感が得られていないということが考えられる。Mitogenactivated protein kinase phosphatase-macrophage (MKP-M)/Dual-specificity phosphatase16 (DUSP16)はヘルパーT(Th)細胞に発現が認められ、Th1細胞の機能発現に深く関わることが判明している。このMKP-M/DUSP16の機能をTh1細胞特異的に抑制したMKP-M/DUSP16ドミナントネガティブ(DN)マウスは摂食過多を引き起こし肥満に至る。この現象を解明するため3つの仮説を立て、最終年度である今年度はそのひとつである胃・小腸を回する経路について注目し検討した。その結果、MKP-M/DUSP16 DNマウスでは摂食刺激シグナルペプチドであるグレリンは胃における発現の上昇が野生型マウスのそれと比べても差がなかった。しかし、胃の膨張で誘発され満腹シグナルを誘発する消化管ペプチドのコレシストキニンにおいて、MKP-M/DUSP16 DNマウスにおける小腸における発現は、野生型マウスに比べ有意に少なくなった。この結果は、昨年の視床下部における摂食ペプチドNeuropeptide Yの発現データと合致し、満腹時に満腹刺激が小腸から視床下部に伝わらないことによるものである。このMKP-M/DUSP16 DNマウスにおけるコレシストキニン発現異常は小腸における免疫担当細胞の一つであるTh細胞に機能変化があると考えれば説明可能である。まず、MKP-M CSマウスの基礎的なデータを詳細に得るため、摂食と体重変化、飲料水と尿量の関係を離乳後から観察し、野生型マウス(C57BL/6)と比較した。その結果、MKP-M CSは摂食量、水分摂取ともに増加し、離乳期は同程度だった体重が離乳後増加していった。また、肝臓などの臓器の重量は変化しないが脂肪組織の増加が認められるので、中性脂肪、総コレステロールも増加している。次に、食餌量からくる脂肪組織の(A)脂肪組織を介する経路について脂肪組織からのシグナルと(B)視床下部における摂食制御ペプチドについて調べた。(A)脂肪組織を介する経路:脂肪組織が分泌し食物摂取を制御するドミナントな因子としてレプチンが挙げられる。

従って、脂肪組織をMKP-M CSマウスと野生型マウスから採取し、RNAを抽出した後、リアルタイムRT-PCR法によりレプチンmRNAレベルを比較した。しかし、どの時間帯も発現パターンに差が認められなかった。(B)視床下部における摂食制御ペプチドの検出: MKP-M CSマウス及び野生型マウスから大脳を取り出し、摂食制御ペプチドを空腹時と絶食後の摂食時で検討したところ、絶食後の摂食時に於いて空腹を示すシグナルであるNeropeptide Yの上昇が認められた。このことは摂食時に低下するはずの摂食ペプチドが残り、空腹感が残ることを示し、このことがMKP-M CSマウスを肥満に誘導している原因となっていることが考えられる。今年度以降の計画は第3脳室周囲組織を介する経路、及び胃や小腸などの消化器を介する経路の検討である。まず、摂食状態または絶食状態の正常マウスとMKP-M CSマウス第3脳室周囲組織を組織学的に調べたところ、炎症精細胞の侵入などMKP-M CSマウスにおける組織学的な変化は認められなかった。そこで、第3脳室周囲組織である視床下部を採取し、IL-1やIL-6そしてTNF-αという炎症性サイトカインの発現を、正常型マウスおよびMKP-M CSマウスを用いて、摂食時および飢餓時の発現を調べた。その結果MKPーM CSマウスの飢餓時にIL-1およびTNF-αの発現上昇が認められた。この結果は、第三の脳室周囲組織を介する経路が働き、MKP-M CSマウスを肥満にしている可能性を示すものである。肥満が免疫系に与える影響については多くの研究がなされているが、逆に免疫系の異常が肥満を誘導する例については殆ど報告がない。これまでに、ヘルパーT(Th)細胞の分化に関わる分子MKP-MをT細胞特異的に不活化したためTh細胞の減少を示したマウス(MKPM-CSマウス)を作成したので、本研究の目標は、このマウスを用い免疫系の異常が肥満にどのように及ぼすかを検討することとした。平成23年度の到達目標は、1)摂食量、飲水量、体重増加を比較し脂肪代謝への影響を検討することであり、そのメカニズムとして2)脂肪組織を介する経路としてレプチンにフォーカスを当て検討し3)視床下部の摂食ペプチドの発現を検討することにあった。その結果、1)詳細な体重増加と摂食のデータを得ることができ、2)レプチンはMKP-Mマウスの肥満にはあまり関係ないことが判明した。さらに3)視床下部では満腹時にも摂食ペプチドであるNeropeptide Yの発現が増加することが判明しているのでほぼ、当初の計画通りの目標は達成できている。今年度は第3脳室周囲組織においてサイトカインの発現を検討したが、最終年度である次年度は胃における摂食シグナルであるグレリンや小腸の満腹シグナルであるコレシストキニンの発現を検討していきたいと考えている。また、MKP-M CSマウスを用いて摂食時と飢餓時におけるCD4陽性T細胞の炎症性サイトカイであるIL-1やIL-6そしてTNF-αの発現をFACScanを用いて検討する予定である。
アグロバクテリウム属細菌による植物形質転換機構の有機化学的解明

本研究者らは,Agrobacterium tumefaciensによる形質転換機構研究において形質転換制御物質を化学的プローブとして用いることが有用であると考え,形質転換制御物質を探索してきた。その際の生物試験法として,ポテトディスク法を用いてきたが,2週間以上を要するという欠点があった。そこで,形質転換をマーカー遺伝子(GUS,β-グルクロニダーゼ遺伝子)の発現で確認する新しい生物試験を確立した。数種の植物について,発現した酵素活性を蛍光測定したところ,タバコBY-2懸濁細胞で最も高い活性が確認された。このタバコBY-2懸濁細胞を用いる試験においてクラウンゴール形成阻害物質julimycin B-IIはED_<50> 1.5μgでGUS発現を阻害した。また,本試験では同時に植物毒性を判定できるため,特異的な形質転換阻害剤探索法として優れている。酵素活性測定法として,蛍光法に代わり組織化学的染色法を用いることにより,簡便な酵素発現の確認ができるようになった。さらに,タバコ以外にAgeratum,Petunia,Melastomaの懸濁細胞も本試験の宿主として有用であることを明らかにした。本研究者らは,クラウンゴール形成阻害物質としてoxazolomycinを単離し,その阻害がA.tumefaciensに対する抗菌活性によるものであり,そのエステルは抗菌活性を失うがクラウンゴール形成阻害活性は保持しているという興味深い知見を既に得ている。oxazolomycin類縁化合物として報告されているcurromycin Bをcurromycin生産菌から精製し,そのdiacetateを調製した。Curromycin Bはクラウンゴール形成阻害及び抗菌活性(MIC 6.3μg/ml)を示したのに対し,そのdiacetateはoxazolomycinエステルと同様に抗菌活性を示さずクラウンゴール形成阻害活性のみを示したことから,curromycinエステルは特異的な植物形質転換阻害物質である可能性がある本研究者らは,Agrobacterium tumefaciensによる形質転換機構研究において形質転換制御物質を化学的プローブとして用いることが有用であると考え,形質転換制御物質を探索してきた。Curromycin Bはクラウンゴール形成阻害及び抗菌活性(MIC 6.3μg/ml)を示したのに対し,そのdiacetateはoxazolomycinエステルと同様に抗菌活性を示さずクラウンゴール形成阻害活性のみを示したことから,curromycinエステルは特異的な植物形質転換阻害物質である可能性がある1)オパイン類の迅速高感度分離定量法の確立形質転換細胞において特異的に生産されるオクトピン,ノパリンなどのオパイン類のHPLCによる定量法について検討を加えた。グアニジノ基を有する3種のアミノ酸,アルギニン,オクトピン,ノパリンを標準物質とし,誘導体化条件の検討を行ったところ,5mMのベンゾインと3分間,100°Cで反応させるのが,最適の条件であった。従って,上記3種のオパインのベンゾイン誘導体のHPLCによる分離が可能となった。現在,実際の植物サンプルへの適用について検討している。2)レポ-タ-遺伝子を組込んだTiープラスミドを保有するアグロバクテリウムを用いる形質転換制御物質検索法の確立pIG221という35Sプロモ-タ-及びβーグルクロニダ-ゼ遺伝子(GUS遺伝子)を有するプラスミドと,もう一つTiープラスミドを有しているアグロバクテリウムとして,A281/pTiBo542,pIG221およびEHA101/pEHA101pIG221を使用した。pTiBo542は,supervirulent strain由来のもので,pEHA101はpTiBo542からTーDNA領域を削除したものであり,クラウンゴ-ル生成能が欠如している。タバコ葉に感染させ蛍光法により活性を測定する予備実験では,EHA101菌感染葉が接種後48,74時間で,高活性を示したので,以後の実験には,EHA101を用いた。接種後,約24時間後から活性が観察され,240時間後まで比活性は直線的に増加した。

すなわち我々が以前に発見した一連の形質転換阻害剤による実験において,アグロバクテリウムの接種約1224時間後に薬剤を投与しても阻害が見いだされなかったことと一致しており,アグロバクテリウムによる植物の形質転換は接種後1日以内に完了していることが明らかとなった。Agrobacterium tumefaciensによる植物形質転換の複雑な機構を解明するために有用な形質転換制御物質を求める新しい生物試験法を開発した。従来,ポテトディスク法により形質転換阻害物質が見いだされてきたが,この方法は結果を得るまでに2週間を必要とする欠点があった。そこで形質転換の確認を遺伝子工学的に導入したマーカー遺伝子の発現で行う方法を考案した。マーカー遺伝子としは活性が安定で,植物にその遺伝子が存在せず,研究例も多い大腸菌由来のGUS(β-グルクロニダーゼ)を選択した。まずタバコ培養細胞BY-2・タバコ葉・ジャガイモ葉・ジャガイモ塊茎の4種の植物体の菌を接種しGUS活性を経時的に測定したところ,タバコ培養細胞BY-2・タバコ葉においてのみ安定なGUS活性の発現が菌接種48時間後に確認された。次にこの2種の植物を用いて,我々がポテトディスク法によりクラウンゴール形成阻害物質として見いだしていたJulimycin B-IIの阻害効果を検討したところ,その48時間後のED_<50>はそれぞれ1.5,25μgであり培養細胞BY-2の方がタバコ葉より10倍以上感度が優れていることが判明し,供試植物としてBY-2を用いることにした。BY-2の生育時期と活性発現について検討したところ対数増殖期から静止期にかけてほぼ一定の比活性が測定された。細胞の扱い易さなどの点を考慮し培養開始6日目ごろの対数増殖期の細胞を用いることにした。このようにして確立した生物試験に我々の研究室でクラウンゴール形成阻害物質として見いだしていたOxazolomycin,植物毒性物質Cycloheximide,抗菌物質Claforanを供したところ,本方法でも活性が確認された。また本方法ではBY-2の新鮮重増加を測定することにより植物毒性の確認ができ,Cycloheximideは植物毒性物質として他の化合物と区別することができた。従って,本試験法により特異的な形質転換阻害物質の探索が可能となった。昨年度の研究で,GUS遺伝子をマーカーとし,タバコBY-2懸濁細胞を宿主とする植物形質転換制御物質を確認する生物試験を確立した。GUS活性は,細胞から調製した無細胞抽出液を酵素源とし,4-methylumberriferyl-β-D-glucuronideを基質とする蛍光測光で求めた。今年度は細胞を酵素源とし,5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronideから生成する青色インジゴ色素の沈着を観察する方法を確立した。本法は,無細胞抽出液の調製及び蛍光測定が不要なため多試料の阻害活性を判定する方法として優れている。さらに,均一性が高い
こどものネットワーク形成と親密化の過程に関する社会心理学的研究

問題と方法:県内3つの幼稚園に協力してもらい、通園する46歳の園児とその母親を対象に、261家庭を調査した。当該年度は、縦断的研究の第一ステップである調査と観察を実施し、被験者属性、家族形態、こどものネットワーク、母親の友人ネットワーク、母親の報告によるこどもの社会的スキル、気質的な特性等をサーベイする目的にある。これにより、現在の子どものネットワークの概要が把握され、親密化の過程を探っていくことができる。対象は、核家族が68.7%、拡大家族30.2%、きょうだい数は、2人、または、3人が88.6%を占めていた。付随する行動観察は、幼稚園での遊びの様子をビデオカメラで録画し、後にチェックリストにより、分類するよう計画された。そのうち、1園では、園児に家族の絵を描かせ、会話を通じて、家族関係等の情報を集めて、資料としている。結果と考察:(1)こどものネットワーク日常接している平均人数は、9.7人。うち、大人(20歳以上)5.4人、こども(ほとんど、同年齢)4.3人。構成は、両親、祖父母、近隣のおばさん、友達(男・女)、幼稚園の先生、習い事の先生等である。接触時間・頻度は、家族、特に両親が多いが、どのような接し方をしているかといった、機能性(遊び、世話等)については、異なる様相を呈している。また、年齢によるネットワークの人数の違いはみられないが、出生順位別では、その構成(接触する対象)と人数に若干差異がみられる。(2)家族関係父親になつく年齢が低いほど、大人との接触人数が多い傾向もみられる。家族との関係は、こどもの絵に表われることが多く、ある特定の家族メンバーの省略、自己との位置関係等で外観でき、園の指導者(担任)の情報と合わせて考えると、より有効である。尚、本研究の結果は、1994年(今年)の日本心理学会、日本社会心理学会で発表の予定である。
長距離相互作用を持つ一次元量子多体系の代数的解析とその応用

昨年度に引き続き、楕円型Ruijsenaars模型についての研究を進めた。量子模型については東京大学の坂井氏や、神戸大学の野海氏らの研究グループとの共同研究によって得られた楕円差分Painleve系とそれに付随する楕円超幾何方程式についての研究成果を基に、これまでに楕円テータ関数による級数解や、さらにパラメータを一般化したものにも適応可能な楕円ガンマ関数の積分によって記述される楕円超幾何積分の解を得ている。一方、一般ルート系において、対応する古典系についての研究はRuijsenaarsやvan DiejenらによるA,BC型の結果しか得られていなかった。そこで今年度は古典楕円型Ruijsenaars模型の可積分性について研究を行うこととした。その結果、系の自由度と同数の保存量の構成とそれらの関数としての独立性についての証明を行うことができた。これによって一般ルート系における楕円型Ruijsenaars模型の可積分性が示されたことになる。保存量の構成はvan Diejenが用いた方法による。具体的には量子古典対応によって量子論における可換差分作用素から古典極限を取るという方法を用いた。以前の研究によって、一般ルート系に付随する模型の可換差分作用素はルート代数と呼ばれる代数を用いて構成されることが明らかとなっている。この構成法とさらにルート系の性質をうまく使うことによって古典極限を取ることができた。また保存量の独立性についても可換差分作用素の構成時における作用素の"先頭項"に着目することによって示すことができた。この結果は既に京都大学数理解析研究所で2005年8月に行われた「ソリトン理論から可積分数理へ」で口頭発表済みである。1.楕円型Ruijsenaars模型とよばれる模型について研究した。この模型は相対論的量子系であり、非相対論的極限として量子Calogero-Sutherland-Moser模型や、戸田格子模型などを含む一般的な模型である。これまでに、この模型が楕円型ルート系(2-extendedという)に関連していると思われていたが、実はさらに大きなルート系、すなわち、3-extendedルート系の対称性を持つことが分かった。この対称性は楕円の2つの周期、差分間隔のすべてを等価に見るものであり、模型の本質的な構造を記述すると考えられる。今後はこのルート系の研究を行う必要が出てきた。2.東京大学の坂井氏や、神戸大学の野海氏らの研究グループによる楕円差分Painleve系に関連して楕円超幾何方程式について研究し、これらの研究結果から量子楕円型Ruijsenaars模型の有理関数型固有関数が構成されることを見出した。これまでは正則関数型の固有関数しか知られておらず、また構成には超越方程式の解を用いるなど、理論的な不備があった。現在のところ、限られたルート系においてのみの結果であるが、この発見は一般の固有関数の構成に大きな役割を果たすと考えられる。当初の研究計画には楕円超幾何方程式の研究はなかったが、野海氏に関連をご教授いただき、その重要性から今後の研究計画に盛り込むこととした。1.昨年度に引き続き東京大学の坂井氏や、神戸大学の野海氏らの研究グループによる楕円差分Painleve系に関連して楕円超幾何方程式について研究した。昨年度は楕円テータ関数の級数解が得られたが、パラメータが特別な場合にしか適用できなかった。今年度発見した解は任意のパラメータで構成可能であり、級数解を含んでいる。解は楕円ガンマ関数の積分で与えられベータ積分の一般化となっている。これらの研究結果から量子楕円型Ruijsenaars模型の有理関数型固有関数が構成されることを見出した。さらに楕円型Ruijsenaars模型は三重可換作用素の族からなるが、その特別な場合の同時固有関数になっていることが分かった。2.上記に関連して、楕円ガンマ関数のモジュラー性についての研究を行った。楕円ガンマ関数は有限個の周期を持つが、そのモジュラー性は周期がある条件を満たす場合のみ知られていた。今年度の研究によって、楕円ガンマ関数の積分表示を用いて、その条件を満たさない場合について明らかにした。
非定常先進流体計測に基づく低次元モデルを利用した次世代流体制御

航空機や自動車など大気中を運動する物体には前進を妨げる空気抵抗が作用する.その低減は地球規模のエネルギー節減のため挑戦し続けなければならない課題である.本共同研究では,大規模な渦構造や衝撃波の振動を伴う流れを動的フィードバックにより制御する新しい概念の流体制御理論の確立を目指す.フロリダ州立大学の研究グループと協働し,双方の知識と技術を持ち寄って,1)非定常先進計測データベース構築,2)低次元モデル化,3)高速応答アクチュエータという3つのキーテクノロジーの研究開発に取り組み,剥離流れと超音速噴流を対象に大型実験設備を用いた実証実験を行い,非定常流れの動的フィードバック制御を実現する.航空機や自動車など大気中を運動する物体には前進を妨げる空気抵抗が作用する.その低減は地球規模のエネルギー節減のため挑戦し続けなければならない課題である.本共同研究では,大規模な渦構造や衝撃波の振動を伴う流れを動的フィードバックにより制御する新しい概念の流体制御理論の確立を目指す.フロリダ州立大学の研究グループと協働し,双方の知識と技術を持ち寄って,1)非定常先進計測データベース構築,2)低次元モデル化,3)高速応答アクチュエータという3つのキーテクノロジーの研究開発に取り組み,剥離流れと超音速噴流を対象に大型実験設備を用いた実証実験を行い,非定常流れの動的フィードバック制御を実現する.
持続可能な観光と国際認証の有効性に関する多面的分析

持続可能な観光の推進を目的とした国際的な認証制度に関する本研究では、申請時に定めた研究計画に沿って大きく3つの目標を達成することができた。第一に、世界全体の持続型観光の認証制度の実態を把握するため、世界最大規模のデータベースを提供するポータルサイトTourism 2030を用いて、そこに蓄積されている認証データ(2019年3月現在250余)を分析した。各認証プログラムに関して、基本情報と認証方法等をデータ化したうえで、認証基準を所有する運営組織の実態や成果を検証し、国際認証の東京フォーラムで発表した。第二に、持続型観光の国際認証に関する詳細な事例研究として、持続可能な観光の世界的基準を構築するとともに認証機関の認定も行う世界持続可能観光協議会(GSTC)に焦点をあて、GSTCが認定した世界的な認証プログラム(2019年3月現在、ホテル及びツアーオペレーター向けが32、観光地向けが11)を対象に、GSTC基準の4つの側面における達成度から認証効果の分析を行った。分析にあたっては、国連が提唱する持続可能な開発目標(SDG)の達成度という観点も取り入れ、各認証プログラムで用いられている指標とSDGの指標との整合性についても分析を行った。研究成果については、国内では日本観光研究学会全国大会にて研究ワークショップを開催し発表するとともに、海外の学会でも発表した。第三に、GSTC認定の国際認証プログラムの地域適用状況について、持続型観光の先進地(欧州とアジア)での現地調査を行い、その成果を中部圏のシンポジウムで発表した。さらに、国内では日本エコツーリズムセンターがGSTCと連携して持続可能な観光の世界基準(GST-Criteria)導入のための啓発活動を行ってきた地域の中で、持続可能な観光地向け国際認証を受けるために積極的に活動している釜石市を対象として聞き取り調査を行った。本研究の進捗状況については、当初の研究計画において掲げていた目標について概ね達成することができたと言える。一つには初年度の大きな目標の一つであった、「世界における持続型観光の国際認証に関する実態調査」については、まず世界の認証制度・プログラムをデータベース化したうえで、認証制度を適用した事例に関する研究論文や報告書等についても調査した。その結果、観光の分野における国際認証の効果に関して、1)観光者、2)観光業、3)観光地、4)観光経営の4つの観点から、どのような持続可能性上の効果があったのかについて、経済、社会・文化、環境、経営の5類型の指標に基づいて実証するための体型的な分析の基盤を構築することができた。本研究の調査過程で、観光分野における品質や持続可能性に関する国際認証制度・プログラムの実効性については、グローバル・ガバナンスの観点からいくつかの課題があることも明らかにすることができた。さらに、もう一つの重要な目標としての現地調査について、国際認証の導入が先行している海外での国際認証機関や認証導入地域の担当者、ならびに国内で国際認証導入を推進する民間組織や自治体レベルで取り組んでいる地域の担当者に対する聞き取り調査を実施することができた。特に、持続可能な観光の世界基準(GST-Criteria)に基づく観光地向け国際認証プログラム(Green Destinations)に焦点をあて、オランダ拠点の運営機関とともに同プログラムの導入地域(国内では釜石市など)での現地調査を通して、国際認証の供給サイドの要因分析に関する研究を遂行することができた。持続型観光の認証制度に対する認知度・選好度調査としての観光地マネジメント組織(DMO)を対象とした調査については、海外との比較が可能となるように海外の先行研究の調査項目の分析し、国内での調査に適した質問項目の設定を行った。今後は、研究計画に沿って、持続型観光の認証制度に対する認知度・選好度調査として、文献調査に加えて、国内の観光地経営組織、観光事業者、さらに観光者に対する定量的及び定性的な調査を実施していく。アンケート調査については、海外の調査を参照しながら、国際的な比較が可能な分析枠組みと質問項目を設定したうえで調査を実施し、その結果を国際的な学会及び国内の学会等で発表していく予定である。さらに、2018年度から着手した持続可能な観光に関する国際認証の体系的なデータベースの構築と実効性の研究成果については、国際観光を取り巻く世界情勢の変化を踏まえながら情報の更新と研究の精緻化を図っていく。世界的な動向としては、持続型観光の国際認証の分野で世界をリードするヨーロッパにおいて現在、持続可能な開発目標(SDG)と関連づけた国際認証基準に準拠した新たなヨーロッパ型の観光認証制度の構築の動きがあり、本研究においてもSDG達成という観点からの持続型観光の国際認証の効果についても分析を行っていく。また、持続可能な観光とGSTC準拠型の国際認証制度に関する最新の状況について、世界中で持続可能な観光の推進に取り組んでいる実務者及び研究者が一堂に集うGSTC年次大会に参加し、各国・各機関の事例について直接情報収集を行うとともに、GSTC準拠型の認証制度を実践し成果をあげている世界の先進地域での現地調査も併せて実施する予定である。2018度と2019年度の研究成果に基づいて、持続可能な観光の推進を目指す日本の観光地でも今後応用できるような、自発的な認証制度を活用した持続型観光モデルを提示することができるようにしていく。さらに、本研究の成果を出版するための具体的な計画を立てたうえで全体構成の設定と執筆に取りかかる。

第一に、世界全体の持続型観光の認証制度の実態を把握するため、世界最大規模のデータベースを提供するポータルサイトTourism 2030を用いて、そこに蓄積されている認証データ(2019年3月現在250余)を分析した。各認証プログラムに関して、基本情報と認証方法等をデータ化したうえで、認証基準を所有する運営組織の実態や成果を検証し、国際認証の東京フォーラムで発表した。第二に、持続型観光の国際認証に関する詳細な事例研究として、持続可能な観光の世界的基準を構築するとともに認証機関の認定も行う世界持続可能観光協議会(GSTC)に焦点をあて、GSTCが認定した世界的な認証プログラム(2019年3月現在、ホテル及びツアーオペレーター向けが32、観光地向けが11)を対象に、GSTC基準の4つの側面における達成度から認証効果の分析を行った。分析にあたっては、国連が提唱する持続可能な開発目標(SDG)の達成度という観点も取り入れ、各認証プログラムで用いられている指標とSDGの指標との整合性についても分析を行った。研究成果については、国内では日本観光研究学会全国大会にて研究ワークショップを開催し発表するとともに、海外の学会でも発表した。第三に、GSTC認定の国際認証プログラムの地域適用状況について、持続型観光の先進地(欧州とアジア)での現地調査を行い、その成果を中部圏のシンポジウムで発表した。さらに、国内では日本エコツーリズムセンターがGSTCと連携して持続可能な観光の世界基準(GST-Criteria)導入のための啓発活動を行ってきた地域の中で、持続可能な観光地向け国際認証を受けるために積極的に活動している釜石市を対象として聞き取り調査を行った。本研究の進捗状況については、当初の研究計画において掲げていた目標について概ね達成することができたと言える。一つには初年度の大きな目標の一つであった、「世界における持続型観光の国際認証に関する実態調査」については、まず世界の認証制度・プログラムをデータベース化したうえで、認証制度を適用した事例に関する研究論文や報告書等についても調査した。その結果、観光の分野における国際認証の効果に関して、1)観光者、2)観光業、3)観光地、4)観光経営の4つの観点から、どのような持続可能性上の効果があったのかについて、経済、社会・文化、環境、経営の5類型の指標に基づいて実証するための体型的な分析の基盤を構築することができた。本研究の調査過程で、観光分野における品質や持続可能性に関する国際認証制度・プログラムの実効性については、グローバル・ガバナンスの観点からいくつかの課題があることも明らかにすることができた。さらに、もう一つの重要な目標としての現地調査について、国際認証の導入が先行している海外での国際認証機関や認証導入地域の担当者、ならびに国内で国際認証導入を推進する民間組織や自治体レベルで取り組んでいる地域の担当者に対する聞き取り調査を実施することができた。特に、持続可能な観光の世界基準(GST-Criteria)に基づく観光地向け国際認証プログラム(Green Destinations)に焦点をあて、オランダ拠点の運営機関とともに同プログラムの導入地域(国内では釜石市など)での現地調査を通して、国際認証の供給サイドの要因分析に関する研究を遂行することができた。
真珠腫性中耳炎の骨破壊におけるマクロファージの役割

真珠腫の骨破壊機序を考える際、骨吸収に不可欠な破骨細胞がヒト真珠腫ではほとんどみられないと言われている。我々は以前の科研において、真珠腫性中耳炎においてマクロファージが真珠腫上皮下に多量にみられることを観察した。そこで、マクロファージが破骨細胞様の活性を有するとの仮説を立てた。インフォームドコンセントのもとに、鼓室形成術の際、真珠腫上皮、上皮下肉芽組織、上皮に接する耳小骨を採取した。以上より、炎症性サイトカインにより、骨髄からマクロファージが真珠腫上皮下に遊走され、破骨細胞様マクロファージ(osteoblast-like macrophage)になり、骨表面に吸着すると考えられた。(1)CD68抗体を用いて免疫染色したところ、上皮下に免疫染色陽性の多核細胞が多数染まり、マクロファージであることが確認された。(2)破骨細胞に発現するカテプシンKとTRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)が、免疫染色およびin situ hybridizationでマクロファージにみられた。(3)RT-PCRにても上記2物質が確認された。(4)破骨細胞の骨表面の接着に必要なOPN(osteopontin)が、免疫組織化学およびin situ hybridizationにて、マクロファージにみられた。(5)真珠腫上皮および肉芽組織のサイトカイン、IL-1,IL-6,TNF-a, M-SCFなどの発現が、組織培養後の上清中にみられた。(3)RT-PCRにても、上記2物質が確認された。以上より、炎症性サイトカインにより骨髄からマクロファージが真珠腫上皮下に遊走され、破骨細胞様マクロファージ(osteoclast-like macrophage)になり、骨表面に吸着すると考えられた。
超高感度HPLCを用いたビタミンEの生体内フリーラジカル捕捉反応解析

ビタミンEによる生体内フリーラジカル捕捉反応を明らかにすることを目的に、ラット臓器磨砕物の脂質過酸化反応時におけるビタミンE反応生成物を超高感度HPLCを用いて分析し、さらに酸化ストレスモデルとしてストレプトゾトシン投与により作成した糖尿病ラット組織中のビタミンE酸化生成物を調べた。まず、ラットの肝臓、心臓、肺、肝臓から磨砕物を調製して脂質過酸化反応を行い、反応の進行に伴うビタミンE生成物の挙動を検討した。その結果、ラット臓器磨砕物の脂質過酸化に伴い内在するビタミンEが消失し、反応生成物としてビタミンE-脂質ペルオキシルラジカル付加体(TOO-PC)やその分解物であるトコフェリルキノン(TQ)が認められた。次に、糖尿病ラットを普通食で4週あるいは8週間飼育後、血漿、肝臓、心臓、腎臓中の脂質過酸化の程度を知るためにリン脂質ヒドロペルオキシド(PC-OOH)を測定した。その結果、正常ラットに比べて糖尿病ラットの血漿、肝臓及び腎臓中のPC-OOH量が有意に高い値を示しており、糖尿病ラットでは酸化ストレスが亢進していることが明らかとなった。また、各組織中のビタミンE濃度は、糖尿病ラットと正常ラットの間で有意な差が認められなかったが、ビタミンEが脂質フリーラジカルと反応して最終的に生成するTQは糖尿病ラットの血漿、肝臓及び心臓において有意に上昇していることが示された。さらに、糖尿病ラット組織中にはTOO-PCの生成を確認することができた。以上の本研究によって、ラット組織中でビタミンEは脂質過酸化を抑制でき、さらに酸化ストレスモデルとして使用したストレプトゾトシン投与糖尿病ラットでも、ビタミンEは脂質ペルオキシルラジカルを捕捉して抗酸化作用を発揮していることが推定された。ビタミンEによる生体内フリーラジカル捕捉反応を明らかにすることを目的に、ラット臓器におけるビタミンE反応生成物の高感度分析法を確立するとともに、ラット臓器磨砕物の脂質過酸化反応時におけるビタミンE反応生成物について検討した。まず、ラット肝臓磨砕物を用いてビタミンE反応生成物のHPLC-電気化学検出による高感度分析法を確立した。すなわち、ラット肝臓磨砕物をフリーラジカル反応開始剤で過酸化反応を開始させた試料を用いて総脂質を抽出し、総脂質をシリカゲルNH_2カラムによってクロロホルム溶出区分とメタノール溶出区分に分けHPLC分析した。その結果、クロロホルム溶出区分にはビタミンEとそのキノン体生成物(TQ)が、メタノール溶出区分にはリン脂質ペルオキシルラジカルとの付加体(TOO-PC)がそれぞれ検出できた。また、メタノール溶出区分は脂質過酸化の指標となるリン脂質ヒドロペルオキシド(PCOOH)の分析にも使用できた。次に、ラットの肝臓、心臓、肺、肝臓から磨砕物を調製して過酸化反応を行い、反応の進行に伴うビタミンE反応生成物の挙動を検討した。肝臓、心臓、肺からの磨砕物では、ビタミンEの消失に伴いPCOOHの生成が確認され、ビタミンEは脂質過酸化を抑制できることが示された。一方、腎臓ではビタミンEの消失とPCOOHの生成が同時に進行しており、ビタミンEは脂質過酸化を抑制していないものと推定した。すなわち、臓器によってビタミンEが脂質フリーラジカルを捕捉できる場合とできない場合があることが明らかとなった。また、ビタミンE反応生成物としてTOO-PCやその分解物であるTQが反応の進行とともに認められた。今後、この結果をもとにして、酸化ストレスを受けたラットのビタミンE反応生成物を解析する予定である。ビタミンEによる生体内フリーラジカル捕捉反応を明らかにすることを目的に、酸化ストレスモデルとしてストレプトゾトシンを投与して作成した糖尿病ラットを使用して、糖尿病ラット組織中のビタミンE酸化生成物について検討した。糖尿病ラットと正常ラットは、普通食で4週あるいは8週間飼育後、血漿、肝臓、心臓、腎臓を採取して試料とした。

まず、それぞれの組織中のリン脂質ヒドロペルオキシド(PC-OOH)をHPLC-化学発光検出法で測定し、生体内脂質過酸化の程度を比較した。その結果、正常ラットに比べて4週目の糖尿病ラットの血漿、肝臓及び腎臓中のPC-OOH量が有意に高い値を示しており、糖尿病ラットでは酸化ストレスが亢進していることが明らかとなった。そこで、ラット各組織中のビタミンEとその酸化生成物であるキノン体(TQ)及びリン脂質ペルオキシルラジカルとの付加体(TOO-PC)をHPLC-電気化学検出法を用いて測定した。その結果、糖尿病ラットと正常ラットの間で各組織中のビタミンE濃度に有意な差は認められなかったが、ビタミンEが脂質フリーラジカルと反応して最終的に生成するTQは、4週目の糖尿病ラット血漿、肝臓及び心臓において有意に上昇していることが示された。さらに、糖尿病ラット組織中にはTOO-PCの生成を確認することができた。すなわち、このTOO-PCの生成の確認から、糖尿病ラット組織中でビタミンEはリン脂質ペルオキシルラジカルを直接捕捉していることが示された。以上の本研究によって、酸化ストレスモデルとして使用したストレプトゾトシン投与糖尿病ラットでは、ビタミンEは脂質ペルオキシルラジカルを直接捕捉して抗酸化作用を発揮していることが推定された。
ヒトI型コラ-ゲン遺伝子の転写調節機構の研究:cisーacting elementsの解析

我々は活性持続型ビタミンC(Asc2ーP)がヒトI型コラ-ゲンを構成するα_1(I)鎖およびα_2(I)鎖遺伝子の転写を活性性化することを明らかにした。本年度はこの転写活性化機構の解析を行った。1.Asc2ーPによる転写活性化過程を明らかにするために,ヒト皮膚線維芽細胞をAsc2ーPで8時間から6日間処理し,α_1(I),α_2(I)鎖の合成量,mRNA量,核転写活性を調べた。Asc2ーP処理6日後にα_1(I),α_2(I)鎖の合成は6倍に上昇した。一方、それぞれに対するmRNA量は処理3日後に最大となり,未処理の3倍の値を示した。核の転写活性は処理8時間後に2倍,40時間後に3倍となり,以後一定となった。また,Asc2ーPと同時にシクロヘキシイミドを添加し,細胞の蛋白質合成を90%以上阻害してもAsc2ーPによるI型コラ-ゲン遺伝子の転写活性化は阻害されなかった。これらの結果はAsc2ーPは蛋白質の合成を介さずにI型コラ-ゲンを構成するα_1(I)鎖およびα_2(I)鎖遺伝子の転写を同時に活性化することが明らかになった。また,mRNAの翻訳の活性化機構の存在も示唆された。2.エ-ラ-ダンロス症(EDS)患者細胞におけるα_2(I)鎖遺伝子の転写の阻害。我々は先にEDS患者細胞でα_2(I)鎖が検出されないことを報告した。この細胞をAsc2ーPで処理すると,α_1(I)鎖遺伝子の転写は正常細胞と同様に活性化されたが,α_2(I)鎖遺伝子ではAsc2ーPによる活性化は全く起らなかった。このことから,EDS患者細胞のα_2(I)鎖遺伝子ではAsc2ーPに応答するcisーacting elementsに異常があると考えられる。現在この患者細胞のα_2(I)鎖遺伝子のプロモ-タ-領域とエンハンサ-領域と考えられる第1イントロンの部分をPCR法で増幅し,クロ-ニング中である。この部分の塩基配列の決定により,Asc2ーPに応答する配列が明らかになると考えられる。