hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化器癌の発生・進展における細胞間情報伝達系の解明

何らかの細胞間の作用がこの現象の原因と考えられるが、その詳細は現時点では不明であり、今後は、in vitroで長期にわたって細胞が接触する実験系を用いてepigeneticな変化を明らかにしていく予定である。正常肝組織と癌細胞が接触する実験系を用いて、細胞間,特に癌細胞と正常肝細胞の間の細胞膜接触面をgap junctionの構成蛋白、コネキシンの抗体で免疫染色した結果肝細胞間には発現が認められるが、癌細胞との間には明らかな発現が認められず、癌におけるコネキシン発現の低下の意義を今後検討すべきとの結果を得た。また、同所性in vivoの系として、マウス直腸粘膜下に癌細胞を直接注入する実験系を開発した。この方法は同所性の腫瘍として転移実験に用いることが可能であるのみでなく、長時間にわたり、正常細胞と接種した癌細胞が接触するため、正常上皮に及ぼす癌細胞の影響を検討できる。接種後約3週後に直腸病変部を切除し組織学的に正常粘膜を観察すると、一部の直腸粘膜に細胞異型を認めた。この異型細胞にはp53異常蛋白の蓄積が確認された。この現象が起こる頻度は、接種する癌細胞の種類により異なっており、癌細胞を固定して接種しても、細胞を超音波破砕した膜成分を粘膜下に注入しても異型細胞は発生せず、生細胞が粘膜組織と接触することが重要と考えられた。現在はその再現性を確認するとともに、肝臓、胃漿膜面から腫瘍細胞を接種する系を確立し直腸以外の組織での正常細胞異型を検討している。またヌードラットを用いて他種における現象の再現性を確認している。何らかの細胞間の作用がこの現象の原因と考えられるが、今後は、in vitroで長期にわたって細胞が接触する実験系を用いてepigeneticな変化を明らかにしていく予定である。
アンビエント情報環境における装着型コンピュータのための情報提示機構の実現

アンビエント情報環境で考えられているユーザが受動的にサービスを受ける環境では、ユーザが装着型・携帯型コンピュータを介してサービスを受ける機会が増える。このような環境では、イヤホンや振動子、装着型ディスプレイなどユーザの好みに応じて複数の情報提示機器を装着していることが考えられ、利用環境に応じてユーザが認知しやすい機器が変化すると考えられる。しかし、現在のアプリケーションは、作成時に特定の提示機器を想定して作成するため、柔軟に提示機器を変更できない。この問題に対して本課題では、アプリケーションが提示を指示した情報を提示機器ごとに提示可能な情報に変換する機構の実現を目指している。本研究課題の最終年度である本年度は、実アプリケーションへの適用を目指し、作成する所望のアプリケーションに対し容易に機構を利用するための枠組みを実現した。具体的には、提案機構をモジュール化することで、提示機器の柔軟な着脱に対応するための提示機器ごとのプロファイル、および汎用的な提示機器選択を実現するための情報変換フィルタの定義を容易に行う枠組みを実現した。また、アプリケーションと独立した情報提示を行うため、情報提示プロトコルを定義し、プロトコルに則したアプリケーションから汎用的に情報提示要求を受けられるよう、実装を行った。提案機構を用いることで、従来のアプリケーションと同量のコード量で、状況に応じた情報提示を行えることを確認した。提案機構により、今後ますます増えると考えられるユーザの利用する情報提示機器を、アプリケーション作成者が環境に応じたユーザの認知しやすさを意識することなく選択できるため、アンビエント情報環境におけるアプリケーション制作の活性化につながると考えられる。周辺のコンピュータとユーザが互いに協調し、より快適なサービスを提供するアンビエント情報環境において、コンピュータがその時のユーザに応じた情報の提示手段を動的に選択することが重要となる。例えば周囲が賑やかなところで音を用いた伝達が困難であったり、移動中のユーザに視覚で情報を提示することが危険であったりする。一方で、機密情報は公衆ディスプレイやスピーカで提示できないといった制約や、すぐに伝える必要のある情報は積極的にユーザに働きかけるデバイスを利用したほうがよいといった制約が存在する。そこで本研究では、これらの制約を考慮した上で、その時のユーザの状況や周辺環境に応じた情報提示を行える機構の実現を目的としている。具体的に本年度は、以下の3点について重点的に研究を遂行した。・情報の種類と提示に関する要求事項の明確化・提示装置が取り扱える情報の明確化・提案機構の動作概要の提案情報の種類や提示に関する要求事項と提示装置との関係の明確化では、現在数多く提案されている装着型コンピュータを用いたアプリケーションや提示装置について調査を行い、情報の種類として8種類、情報提示の際に考慮すべき5つの特性(緊急性、必要性、有効性、持続性、機密性)を導き、提示装置との関係を示した。これらの明確化した結果から、提案機構では提示する情報を提示装置ごとに情報を変換する仕組み、ユーザ状況や周辺環境を考慮した情報提示装置選択の枠組みを実現した。どのようなユーザ状況や周辺環境がどのような装置に影響があるかの調査や影響の大きさに関する調査を今後進める予定である。アンビエント情報環境に代表されるユーザが受動的にサービスを受ける環境では、ユーザが装着型・携帯型コンピュータを介してサービスを受ける機会が増える。このようなコンピュータで用いられる情報提示機器は、ユーザの好みに応じて変化したり、使用環境に応じて最適な機器が変化すると考えられるが、現在のアプリケーション作成では、作成時に提示機器を想定して作成するため、柔軟に提示機器を変更できない。本研究では、使用環境に応じて最適な情報提示機器を評価する仕組みを、情報を変換する情報変換フィルタ、および提示機器に認知に与える影響度を算出するモジュールを定義することで実現した。情報変換フィルタは、文字情報から画像情報への変換など、情報の変換を行うフィルタや文章の要約など情報を変形する処理を指し、フィルタごとに情報の削減度合いから影響度を算出する。また提示機器に対しては、その時のユーザ状況・周辺環境からその提示機器を利用する際の影響度を算出する。機構が提示機器を選択する際に、影響度が一定値以下となる提示機器を用いて情報を提示する。今後は、自動的にフィルタを選択するだけでなく、アプリケーション制作者の記述した制約やルールに基づきフィルタを自由に変更できる仕組みを実現する。またフィルタや提示機器の影響度の基準を均一化する仕組みの実現が必要である。

提案機構を用いることで、従来のアプリケーションと同量のコード量で、状況に応じた情報提示を行えることを確認した。提案機構により、今後ますます増えると考えられるユーザの利用する情報提示機器を、アプリケーション作成者が環境に応じたユーザの認知しやすさを意識することなく選択できるため、アンビエント情報環境におけるアプリケーション制作の活性化につながると考えられる。
細胞時計を模倣した周期的遺伝子発現システムの構築

遺伝子の発現振動は様々な遺伝子に見られ、転写翻訳におけるフィードバック制御の重要性が示唆されているが、転写因子のDNA結合と遺伝子発現振動との分子レベルでの関係は、未だ明らかではない。人工的に周期的発現を生み出すことができれば、遺伝子発現の振動メカニズムを解明するための新しい方法になると考えられる。前年度までに、代表的なDNA結合ドメインとして知られるジンクフィンガードメインと時計タンパク質として知られるBMAL1およびCLOCKタンパク質を用いて人工転写因子を作製し、哺乳細胞において、通常発現振動を起こさない遺伝子に対しても、リズミックな遺伝子発現を誘起することに成功した。また、転写因子のDNA結合親和性が振幅に影響を与えることを示唆する結果を得た。これらの知見を利用し、より大きな振幅を与えるシステムの構築に取り組んだ。ジンクフィンガーを用いたフィードバック回路の追加を試みた結果、抑制因子の発現と分解のバランスや発現のタイミングが振動発現の誘起には重要であることが示唆された。また、ジンクフィンガー以外のDNA結合ドメインを導入した人工転写因子を作製したが、十分な振幅を得ることができなかった。この結果は、転写複合体構造の安定性も発現振動の重要な要素になることを示唆している。一方、時計タンパク質に変異を導入してジンクフィンガーを用いた人工転写因子の標的DNA配列選択性を向上させたところ、より大きな振幅を生み出すことができた。人工システムを用いて得られたこれらの結果は、発現振動を理解するために重要な知見を与えるものである。25年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子の発現振動は様々な遺伝子に見られるが、転写因子のDNA結合と遺伝子発現振動との分子レベルでの関係は、未だ明らかではない。本年度は、研究代表者が最近デザインした"リズミックな遺伝子発現を誘起する人工転写因子"の性質を系統的に変化させ、転写因子のDNA結合と遺伝子発現振動との関係を明らかにするとこを目的として研究を行った。そのために、DNA結合特性が系統的に異なる種々の変異タンパク質を作製し、また、プロモーター中のタンパク質結合配列の数を変えた一連のレポーターベクターを作製した。これらを細胞内へ導入し、人工転写因子が遺伝子発現へ与える影響をレポーター遺伝子の発現をリアルタイムでモニタリングすることにより検討した。まず人工転写因子のDNA結合配列選択性を高めたところ、より振幅の大きい遺伝子発現リズムが生じた。逆に、人工転写因子の結合親和性を低下させると、振動発現は全く見られなくなった。また、認識サイトの数が多いほど遺伝子発現リズムの振幅が大きいことがわかった。これらの結果より、転写因子のDNA結合親和性は発現振動の振幅に寄与する一方で、周期やリズム位相に関しては、影響しないということが示唆された。さらに、これらの知見を利用し、本来は振動発現しない遺伝子を、人工転写因子を用いてリズミックに振動させることにも成功した。DNA結合特性の評価に関しては、予定通り研究を遂行でき、さらに得られた知見を活かして人工タンパク質の分子デザインを行うことによって、本来は振動発現しない遺伝子を周期的に発現させることにも成功した。人工転写因子を用いて細胞時計の構築原理に関する知見を得たい。また、より大きな振幅を与えるシステムの構築に取り組み、細胞内環境下で周期性が生み出される要因を検証したい。
多孔質中He薄膜超流動を用いた量子渦状態の基礎研究

本研究は理想的な2次元超流動体であるHeの単原子膜を、3次元的に繋がりのある、孔の大きさの揃った多孔質基盤上に、形成し、出現する超流動の特性を計測し、超流動の基本問題を解明する基礎物理学的研究である。具体的には当初次の3つの目的が立てられ、これを実現すべく様々な方策が検討された。I.この多孔質ガラス中に形成されるヘリウム薄膜の系での渦糸の渦芯特性や、動的性質など特性の解明(主に捻り振り子法による研究によって明らかにする)。II.渦糸格子の生成と融解現象の基礎研究(回転クライオスタットを用いた捻り振子実験)。III.超流動流れと渦糸の相互作用の定量的研究とこれを用いた渦状態の解明(回転下の超流動流れ実験で、渦格子状態と乱流転移研究)。I.及びII.捻り振り子法を駆使した研究により、以前に解明した2次元渦芯の特性に対し、この系独特の3次元渦の特性が定量的に解析され、渦芯の大きさが多孔質基盤の孔径によって規定されているらしい事が見出された。また、回転下の捻り振り子実験のエネルギー散逸ピークの解析から回転によって確かに孔渦が励起されこれによって新たなエネルギー散逸ピークが生じる事が解明された。これらの情報は、新たな超流動等量子渦系の探査に役立てられる事であろう。III.本研究によって薄膜超流動実験に欠かせない連続冷凍装置の導入が行われその性能試験が行われた。今後これを用いた超流動流れ実験と回転とを組み合わせた研究活動によって量子渦の秩序状態と乱れのある系との定量的研究が進むと期待される。これまで2次元性と3次元性がその超流動転移温度や超流動密度の温度依存性などの超流動特性にどのように反映されるべきかについて定説がなかった、「3次元的に孔が繋がった多孔質の表面に形成された超流動He単原子膜」について高精度ねじり振り子法を用いた精密実験を行った。超流動密度の温度依存性の精密な評価から多孔質の孔径が1ミクロン及び10ミクロンの系で3次元超流動位相揺らぎの長さを表すJosephsonの長さの絶対値が評価され、(A)孔径がこのように大きくともJosephsonの長さは全温度領域にわたって孔径より大きく、超流動の3次元性が確かに示されている事が明らかになった。更に、(B)T=0Kの近傍の超流動密度の温度依存性から3次元フォノン励起とつじつまの合う結果が得られた。この様な3次元超流動性は、次のような2次元超流動性に起因する特徴ある振る舞いと共存している。すなわち、超流動転移温度自体は2次元超流動転移温度を規定しているユニバーサル・ジャンプと呼ばれる2次元密度に比例した関係を持ち、また、Tc近傍では2次元特有のエネルギー散逸がねじり振り子法で観察される。この様な系を回転させたときにどの様な励起が可能であるのか、実験的研究が久保田研究室で実現した世界最高速の回転冷凍機で研究されている。この結果の一部は、久保田により第23回低温物理国際会議で招待講演として報告された。この会議を契機にこれまで解明が遅れていた「多孔質中He薄膜超流動の回転ピーク」について理解が大いに進んだ。取り分け、多孔質の孔径を変えた時に回転下で何が起こるべきかについて見通しを得る事が出来る様になった。これまでの予備的な実験でこれを確かめるとともに、論文を準備している。2003年8月、米国で開かれた量子液体固体国際シンポジウムQFS2003で、1960年代末から理論的にその可能性が議論されて来た量子固体での「超流動固体」

SuperSolid状態が多孔質中の固体Heで見出されたとの報告があり、我々の系でも関連した事柄が既に見つかっている可能性があり、上記液体薄膜の超流動との対比を行っている。また、2003年12月物性研ワークショップとして関連の議論を行った。また、この問題で精力的に理論的検討を進めているイタリアミラノ大学D.E.Galli博士に来日して頂き様々な可能性について議論を行った。
プラセオジム化合物の核と電子の示す超低温物性

畑(大阪市大)等は増強核磁性体PrCu_6の核スピンが2.18mK以下で傾角スピン構造に整列することを発見した。我々はPrCu_6が単斜晶構造をとることに着目し、Van Vleck帯磁率、超微細相互作用を介した核スピン間Dzyaloshinsky-Moriya型RKKY相互作用を導出し実験結果の解析を行った。一方、北沢(物質・材料研究機構)等は、斜方晶系PrPtAlが5.8K以下で電子磁性の傾角スピン構造をとることを発見した。この系ではイオン間RKKY相互作用が結晶場の効果を上回り、電子系に磁気秩序が現れる。我々は結晶構造の解析に基づき、非等価な2個のPrイオンについてのVan Vleck帯磁率の主軸の傾きから傾角スピン構造を論じた。(2)PrPb_3における反強電気4重極秩序(AFQO)と核スピン秩序立方晶系のPrPb_3では、Γ_3基底2重項状態が実現する。Γ_3状態には電気4重極モーメントが附随しており、0.4K以下で電気4重極モーメントが交互に配列するAFQOが実現する。河江(九大)等は、Prを2%のLaで置換することでAFQOが壊され、それ以上のLa濃度では温度に比例する比熱を観測した。我々はLaによるPrの結晶場の乱れによりこの現象を説明した。また、PrPb_3のAFQO状態、AFQO状態のもとで核スピン系の自発分極についても理論研究を行った。AFQO状態には対称性の異なる2個の固定解があること、AFQO状態で核スピンは互いに交錯した2組の反強磁性秩序を示すことなどを明らかにした。我々の計算結果は阿部(金沢大)等の磁化測定の結果に対応する。プラセオジム(Pr)の基底多重項はJ=4で9重に縮退している。この縮退は結晶場により解け、1重項あるいは2重項基底状態が実現する。我々は、これらについて次のテーマで研究を行った。1)基底1重項PrCu_6のf電子系は低温まで状態にとどまり、2.4mKの超低温で核スピンが整列することを分担者の畑等が発見した。その核磁性は特異で、斜方晶結晶のa軸方向に反強磁性、b軸方向に強磁性を示す。斜方晶結晶での非等価なプラセオジムの核スピン間にDzyaloshinsky-Moriya型のRKKY相互作用を我々は導出し、このCanted反強磁性を説明した。一方、北澤(物質・材料研究機構)らは実験的に、PrPtAl系のf電子系に対しCanted反強磁性を見出した。我々は、結晶構造の対称性がPrCu_6の高温相と同一であることに注目し、この磁性の起源は結晶の1イオン型異方性エネルギーにあることを結論した。現在、このモデルを平均場近似で計算し、実験に合う結果を得ている。特異な温度変化を示す核スピン緩和時間の理論とあわせ投稿準備中。2)PrPb_3は立方晶系で非磁性のΓ_3基底2重項状態が実現する。この2重項には電気4重極モーメントが伴い、低温で互い違いに整列し反強4重極秩序が生じることが知られている。この系のPrを2%ほどのLaで置換するとこの反強4重極秩序が壊れ、温度Tに比例した比熱を示すランダムな秩序に移行することを河江ら(九大)が見つけた。

我々は、この起源は、LaのためにΓ_32重項のランダに分布するエネルギー分裂が生じ、それがガラス系で見られると同じ理由でTに比例する比熱を導くとの描像を提起した。現在、これに対するモデルハミルトニアンを導き、局所的平均場近似による計算と、スピン波に相当する4重極波の考察を履開している。プラセオジム化合物の磁性・超低温物性に関し、主に次の2点の研究を行なった。1)PrPtAlのf電子Canted磁性の機構PrPtAlは、斜方晶系TiNiSi構造をとり、単位胞に4ユニットのPrPtAlを含む。1個のプラセオジムイオン(Pr)は他の3個のイオンと互いに点対称、及び鏡映の関係にある。最近、北澤(物質材料研究機構)らはこのPrPtAlがTc=5.8K以下でa軸に沿って強磁性、c軸に沿って反強磁性のcanted磁性を示すことを実験的に明らかにした。我々は結晶の対称性に基づきこの系の磁性の機構を解明した。結晶主軸の方向が鏡映の関係にある2個のPrイオン(A及び,Bサイト)のヴァン・ブレック帯磁率テンソルの非対角要素は互いに逆符号となることを導き、Prイオン間に等方的RKKY相互作用を仮定してA、Bサイトの磁化に対する平均場方程式を立てこれを解いた。結果は実験の特徴を定性的に再現する。2)PrPb_3におけるf電子系反強4重極秩序(AFQO)のもとでの核磁気秩序PrPb3は立方晶系で、Prの基底状態は電気4重極モーメントが伴った非磁性2重項状態である。Tc=0.4K以下では電気4重極モーメントが反強的に整列(AFQO)することが知られている。我々はこのAFQO状態を理論的に調べた。O_<22>成分がサイトごとに反強的に出現し、その2乗に比例してO_<20>成分が各サイトで等符号で現れる。O_<22>成分に寄生してO_<20>成分が現れることは、磁性における弱強磁性に対応するものであり興味深い。AFQO状態の各副格子ではヴァン・ブレック帯磁率テンソルは対角的だが対角成分が副格子で互いに入替わっている。このため、超低温で出現する核スピン整列ではAFQO状態の各副格子で核スピンが反強磁性的に並び、且つ2つの副格子では整列するスピンの方向が互いにほぼ垂直になっている。すなわち2種の反強磁性秩序が入り組んだ特異な磁気構造をとる。T_N=3mKと評価される。求めた核帯磁率は阿部(金沢大)らの実験結果に定性的に対応している。
低酸素応答による生理的心肥大抑制を介した心不全発症機転の解明

本研究においては、過度な肥大によって生じた低酸素環境によって引き起こされる細胞内の変化、特に低酸素誘導因子(Hif-1α)と転写制御されるREDD1に着目し、非代償性心不全の発症機転における同分子の機能解析を行った。心不全モデルの不全心筋ではHif-1αおよびREDD1の発現は増加していた。単離心筋細胞を低酸素環境で培養することによりREDD1の発現は増加を伴って、細胞死が誘導されたが、siRNAによりREDD1をノックダウンすると細胞死が増悪した。以上の結果から、慢性心不全では過度な肥大によって生じる低酸素環境に応答して増加したREDD1が、保護的な役割を果たしている可能性が示唆された。心筋梗塞後心不全モデル、および拡張型心筋症モデルマウスの心筋組織における低酸素誘導因子(Hypoxia-inducible factor-1α(Hif-1α))とREDD1 (DDIT4)の発現を解析した。両心不全モデルの不全心筋を用いてWestern blotによる評価を行ったところ、Hif-1αは著明に増加していた。加えてreal-time PCR法によりHif-1αで転写制御される複数の遺伝子(PDHK1, COX4-isoform2等)の発現が上昇していたことから、慢性心不全の心筋組織は低酸素環境に晒されていることが示唆された。またREDD1についてもWestern blotおよびreal-time PCRにより発現の評価を行ったところ、同分子が両心不全モデルにおいて著明に増加していた。これらの結果から、不全心筋においては低酸素応答としてREDD1の発現が上昇しており、心不全の進展において何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。ラット新生仔単離心筋細胞を用いて、低酸素刺激によるREDD1の発現と低酸素刺激が単離心筋細胞に与える影響について検討した。単離心筋細胞を1%低酸素環境にて培養することにより、Western blotによる解析にてHif-1αが著明に増加し、さらにWestern blotおよびreal time PCR法にてREDD1の発現誘導が確認された。加えて、1%低酸素環境下での24時間の培養により細胞死が引き起こされることを確認した。これらを踏まえ、REDD1ノックアウトマウスの作成を開始し、ノックアウトマウス作成のためのゲノムデザインを行った。KOMP(米国)よりREDD1ノックアウトマウスを導入(購入)予定であったが、KOMPでの繁殖・供給が追い付いておらず、供給困難であった。現在(2017年4月)までに入手が困難であり、また今後も繁殖の見通しもつかないとの連絡があったため、ノックアウトマウスを新規に作成する方針へ変更とした。現在、ゲノムデザインまでは行ったが実際の作成作業以降は次年度に繰り越しとなった。心筋梗塞後心不全モデルおよび拡張型心筋症モデルマウスに加え、大動脈縮窄圧負荷モデルでの心筋組織における低酸素誘導因子(Hypoxia-inducible factor-1α(Hif-1α))とREDD1 (DDIT4)の発現を解析した。これら全ての心不全モデルにおける不全心筋において、転写因子であるHif-1αの発現は増加をしていた。さらにreal-time PCR法によりHif-1αで転写制御される複数の遺伝子の発現が上昇していたことから、心不全の心筋細胞は低酸素環境に晒されていることが示唆された。またREDD1についてもWestern blotおよびreal-time PCRによる発現の評価を行ったところ、同分子が全ての心不全モデルにおいて著明に増加していた。これらの結果から、心不全の原因に関わらず不全心筋においては低酸素応答としてREDD1の発現が上昇しており、心不全の進展において何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。ラット新生仔単離心筋細胞を用いて、REDD1の心筋細胞における機能解析を行った。単離心筋細胞を1%低酸素環境にて培養することにより、Hif-1αとともにREDD1のmRNAおよび蛋白レベルでの発現が誘導された。1%低酸素環境下での24時間の培養は細胞死を引き起こすが、siRNAによりREDD1をノックダウンすることで、低酸素環境下にて誘導される細胞死を増悪させた。低酸素環境下での培養によりmTOR活性は強く抑制されるが、REDD1のノックダウンではmTOR活性が上昇しており、これらの結果から低酸素環境下でのmTOR活性化は細胞傷害につながることが示唆された。さらに前年度に続き、ノックアウトマウスの作成を継続し、REDD1ノックアウトマウス(F1)を樹立した。REDD1ノックアウトマウスの入手が不可であったことについては予定外であり、当該実験については予定よりも遅れている。しかしながら、その他については概ね実験計画通りに研究を進められている。本年度はノックアウトマウス使用以外の研究を前倒しで実施しており、次年度にノックアウトマウスを使用した実験を集中的に実施する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。循環器内科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
5歳児における発達障害の診断手法の開発と疫学研究

1疫学調査:平成23年4月から平成29年3月までに満5歳になる全5才児5,014名(月齢平均:63カ月)に一次スクリーニングを施行した。3,954名から回答を得た(回収率78.8%)。発達障害リスク児抽出アルゴリズム(特許出願中)を用いた二次健診の対象児は773名(19.5%)であった。最終的に希望者45名を含む559名が二次健診に参加した。自閉症スペクトラム障害(ASD)と診断されたのは87名(男児60名、女児27名)であった。ASD診断を受けた対象者に後日ADI-RまたはADOSを施行した。母集団を対象児5,016名に補正して算出した有病率は、3.22%(95% CI of 2.66-3.76)であった。ASDでは注意欠如・多動性障害(ADHD)合併が50.6%、発達性協調運動障害(DCD)の合併が63.2%、知的障害(ID)の合併が36.8%、境界知能(BIF)の合併が20.7%であった。ASDの88.5%は少なくとも一つの神経発達障害を併存し、23%は他の3つの障害が併存していた。2疫学調査における使用尺度の妥当性の検討:ASSQの5歳児適用における妥当性(Adachi,2018)を検証した。睡眠習慣について中国の研究者と共同研究を行い、国際比較を行った。3バイオマーカーの検討:Gazefinderを用いた注視点検査では、5歳のASD児の注視率に性差があることを明らかにした。発達性協調運動障害(DCD)の病態解明のため、認知機能と感覚機能が協調運動に与える影響について関連性を明らかにした。4診断手法の開発:リスク児抽出(平均18%)アルゴリズムを完成させ、検証の結果、受診リスク児の平均72%が発達障害と診断された。平成31年3月27日特許出願した。スクリーニングツールと注視点検査の組み合わせにより、女児ASDの早期発見方法を発見した。発達障害の有病率及び併存率の推定:平成26年4月から平成28年10月までに健診に参加した全5才児3804名(月齢平均:63カ月)を解析の対象とした。一次スクリーニングは2923名(76.8%)から回答を得た。二次検診の対象児は607名(20.8%)であった。最終的に希望者31名を含む440名が二次健診に参加した。ASDの診断については、さらに補助診断検査としてASD診断を受けた対象者に後日ADI-RまたはADOSを施行した。その結果、自閉症スペクトラム障害(ASD)が3.30%、注意欠如・多動性障害(ADHD)が4.95%、発達性協調運動障害(DCD)が5.54%、知的障害/境界知能(ID/BIF)が3.33%であった。また、ASDではADHD合併が60.0%、DCDの合併が61.1%、ID/BIFの合併が40.0%であった。疫学調査における使用尺度の妥当性の検討:AD/HD-RSの内的整合性(N Takayanagi, et al. 2016)、ASSQ短縮版の5歳児適用における妥当性(足立ら、2016)を検証した。リスク因子の検討:得られた疫学データからロジスティック回帰分析を行い、ASDのリスク因子は出生体重2500g未満と父親の高齢が有意な結果となった。バイオマーカーの検討:ASD群でIGF-1、VLDL-Cho、VLDL-TGに有意な性差があった。バイオマーカーとASD、ADHD症状との関連性はIGF-1が実行機能の問題、VLDL-Choが相互的対人関係の問題、VLDL-TGが社会性、想像力、対人関係の問題と負の相関があったGazefinderを用いた注視点検査では、5歳のASD児は興味のある映像への注視は長く、興味のない映像への注視は短いことが確認された。発達障害の有病率及び併存率の推定:5歳児発達健診は地域に定着しつつあり、健診参加者は年間85%を超えており、研究は順調に遂行している。疫学調査における使用尺度の妥当性の検討:各尺度の地域性、年齢を考慮した妥当性の検討について総説も含め5報論文化している。未着手のものについて次年度に解析を行う。バイオマーカーの検討:検出力の関係でサンプル数を要するため、さらにサンプルを増やし解析を進めていく。性差が結果に大きく影響を与えるため、男女に分けて解析を進めていくこととする。

母集団を対象児5,016名に補正して算出した有病率は、3.22%(95% CI of 2.66-3.76)であった。ASDでは注意欠如・多動性障害(ADHD)合併が50.6%、発達性協調運動障害(DCD)の合併が63.2%、知的障害(ID)の合併が36.8%、境界知能(BIF)の合併が20.7%であった。ASDの88.5%は少なくとも一つの神経発達障害を併存し、23%は他の3つの障害が併存していた。2疫学調査における使用尺度の妥当性の検討:ASSQの5歳児適用における妥当性(Adachi,2018)を検証した。睡眠習慣について中国の研究者と共同研究を行い、国際比較を行った。3バイオマーカーの検討:Gazefinderを用いた注視点検査では、5歳のASD児の注視率に性差があることを明らかにした。発達性協調運動障害(DCD)の病態解明のため、認知機能と感覚機能が協調運動に与える影響について関連性を明らかにした。4診断手法の開発:リスク児抽出(平均18%)アルゴリズムを完成させ、検証の結果、受診リスク児の平均72%が発達障害と診断された。平成31年3月27日特許出願した。スクリーニングツールと注視点検査の組み合わせにより、女児ASDの早期発見方法を発見した。2000年にアメリカ神経学会American Academy of Neurology(AAN)が推奨した2段階のアルゴリズム9)に従って健診プロトコールを作成した。これは第1段階として、すべての子どもたちに、とくに自閉症の発達サーベイランスとスクリーニングを実施し、あらゆるタイプの非定型発達のリスクがある子どもたちを早期に発見し、とくに自閉症のリスク高い子どもたちを特定する、そして第2段階として、他の発達障害と区別しつつ自閉症を診断し評価すること、としている。このため、HFC Studyでは、1市内在住の年度内(例:2016年4月2017年3月)に満5歳になるすべての子どもたち、年間12001300名を対象に一次スクリーニング(質問紙)を郵送、配布し、回収後に2次健診の必要性を通知し、年間約150名の子どもに二次健診(実測、質問紙による症状評価、面接など)を施行した。20132016年度に施行した弘前市5歳児健診、対象者総数5016名、健診参加者3954名(78.8%)について、欠損値補完を行い、参加者における自閉症スペクトラム障害(ASD)の有病率及び弘前市での発生率を算出した。有病率は2.27%(95%信頼区間1.90-2.72)、発生率は1.60%(95%信頼区間1.29-1.99)であった。有病率の男女比はおおよそ2:1であった。効率よく発達障害を早期発見できる健診を行うために、スクリーニングツールの組み合わせを統計処理により分析した。調査尺度の組み合わせによりリスク児を効率よく発見することが可能であり、弘前大学独自の抽出方法としてさらに再検証を行った。独自の抽出方法については現在、特許申請を検討中である。これにより、早期発見が難しい女児のASDの検出が可能であることを確認し、2018年4月国際学会(INSAR)で報告を行った。疫学統計はデータの処理に時間を要するため、健診施行から統計処理できるまでに1年を要する。このため、当該年度は前年度までの蓄積結果を解析している。統計専門家に処理の妥当性についてさらに検証が必要なため、解析に予定したより多くの時間を要する。現時点でASDの疫学調査について完了しており、おおむね順調に進展していると言える。発達障害の有病率及び併存率の推定:引き続き健診の実施を行うとともに、若年化での実施を念頭に置いてスクリーニングツールを検討する。尺度の妥当性の検討、発達検査の短縮版作成:DCDQ-Jについて5歳における妥当性を検討する。また二次健診で用いたDOSCO半構造化面接
１８世紀フィレンツェにおける絹織物工業と保護主義

2018年9月及び2019年2ー3月にかけて、シエナ国立文書館やフィレンツェ国立文書館で史料調査を行い、関連する史料の探索と写真撮影を引き続き進めた。シエナ国立文書館においては、フィレンツェに次ぐ重要都市シエナにおける同職組合に関する政策に関連する史料を閲覧し、フィレンツェの事例と比較しつつ検討を進めた。フィレンツェでの史料調査においては、狭義の絹織物工業保護政策に留まらず、関税改革の全体像や消費税政策、さらには同時代の財政状況全般を見ていくことで、研究課題である18世紀フィレンツェの絹織物工業保護政策をより広い視点から考察しようと努めた。特に18世紀のヨーロッパ諸国を悩ませた軍事費の増大に関しては、官房文書や財務委員会文書にとどまらず、軍事行政に関する文書も一部閲覧し、他国とは異なりトスカーナでは18世紀後半に軍事費は減少しており、それに合わせて国家全体の財政状況も好転したことが判明した。以上のような史料にもとづきながら、「18世紀トスカーナ大公国における軍事費-啓蒙改革とヨーロッパ政治」を『立正史学』に発表した。本論文においては、1748年のアーヘンの和約とそれ以後のブルボン-ハプスブルクの同盟によってイタリア半島の安定が実現されたこと、同時にそれによってトスカーナも軍事費を削減することができるようになり、それが財政の好転へとつながっていくことを指摘した。また、絹織物などの工業政策についても、財政的に余裕があったことがおそらく保護政策を堅持する方針へとつながっていたと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2016年8月から9月にかけて、シエナ国立文書館、フィレンツェ国立文書館及びフィレンツェ商工会議所文書館において史料調査を実施し、絹織物関連の史料を閲覧し、必要な部分については写真撮影を行った。特にフィレンツェ国立文書館では、Segreteria di GabinettoやCarte Gianniなど、18世紀後半の政策決定過程を具体的に知ることのできる史料を閲覧・写真撮影し、その内容を分析することで、絹織物工業保護政策の具体的な政策立案過程を知ることができた。また、同文書館に所蔵されている貴族家系の文書やlibri di Commercioなどの史料群のなかに、17-18世紀の絹織物工業者の帳簿が残されていることも確認し、そのうち18世紀後半の絹織物工業者Cenniの帳簿については、これまでその存在が知られていなかった帳簿を含めて、写真撮影を行った。また、2017年2-3月には再度フィレンツェ国立文書館において史料収集と写真撮影を行った。研究成果の公表については、11月には史学会大会西洋史部会において、「18世紀トスカーナにおける絹織物工業保護:近世イタリア都市工業と啓蒙改革」と題する報告を行い、史料収集の成果の一部を報告した。同時に本年度は、『西洋史学』258号において「18世紀トスカーナ大公国における統一土地台帳編纂計画とその挫折:ピエトロ・レオポルド期の改革路線対立」と題する論文を公表し、博士論文の研究成果の一部を日本語で発表しただけでなく、ほぼ同内容のスペイン語論文を発表し、国内外で研究成果を世に問うことができた。本年度はイタリアにおける史料調査を二度実施し、フィレンツェ国立文書館、シエナ国立文書館及びフィレンツェ商工会議所文書部における関連史料の残存状況の確認と、必要な史料の写真撮影を行った。これらの史料から、18世紀の絹織物工業保護政策の変遷が具体的に明らかになった。またフィレンツェ国立文書館では、今まで知られていなかった絹織物工業者の帳簿を発券し、実際に閲覧した上で、一部の帳簿については写真撮影を行うことができた。同時に、フィレンツェ以外のイタリア諸都市の絹織物工業の状況についても、二次文献を網羅的に収集・読破することによって知見を得ることができた。これらによって得られた成果の一部を、口頭報告において公表しており、論文についても現在執筆中である。以上のような状況に鑑み、研究はほぼ当初の予定どおりにおおむね順調に進展していると考えられる。本年もフィレンツェ国立文書館にて9月、2ー3月にそれぞれ資料収集を行い、絹織物工業に関連する一次史料の写真撮影を行う一方で、これまで収集してきた史料を含めて体系的に史料読解を行った。また、昨年までの研究で得られた知見をもとにして二つの論文を公表した。(動向論文)「18世紀イタリアにおける土地台帳編纂研究の射程-ヨーロッパ政治の中の啓蒙改革」、『地中海学研究』40、157-168頁、2017年は、18世紀の啓蒙改革期の政策に関するイタリアの研究動向を追ったものだが、同時に博士論文で得られた研究の成果をより広い文脈に結び付けつつ、イタリアにおける土地台帳編纂に関する研究史を追っており、イタリアの研究の成果を日本の歴史学会に還元することを意図している。本研究の研究課題により直接に関連するものとしては、「近世イタリア都市工業と啓蒙改革:18世紀トスカーナにおける絹織物工業保護」を『史学雑誌』に発表した。イタリア諸都市の工業は近世を通じて衰退し、イタリアは農業中心の社会へと変容したのだと長らく考えられており、18世紀後半の啓蒙改革もこうした農業中心の社会への変容に対応した改革と考えられてきた。しかし、実際には18世紀の後半においてもトスカーナをはじめとするイタリア諸国で絹織物工業が存続しており、実際18世紀の後半のトスカーナでは原材料となる生糸の輸出禁止措置を含む都市工業保護の政策が取られていることを指摘した。保護政策により当時堅調だった都市フィレンツェの絹織物工業を振興することで、絹織物という工業製品の輸出に立脚した経済発展の道を目指していたことを明らかにした。

上述のように、本年は二つの論文を刊行しており、博士論文の研究の成果のみならず、本研究課題に直接かかわる研究成果を論文の形で公表している。また、イタリアでの史料調査も引き続き続けており、先行研究では知られていない一次史料も多く発見し、必要部分を写真撮影することができた。こうした事情に鑑みて、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えることができる。2018年9月及び2019年2ー3月にかけて、シエナ国立文書館やフィレンツェ国立文書館で史料調査を行い、関連する史料の探索と写真撮影を引き続き進めた。シエナ国立文書館においては、フィレンツェに次ぐ重要都市シエナにおける同職組合に関する政策に関連する史料を閲覧し、フィレンツェの事例と比較しつつ検討を進めた。フィレンツェでの史料調査においては、狭義の絹織物工業保護政策に留まらず、関税改革の全体像や消費税政策、さらには同時代の財政状況全般を見ていくことで、研究課題である18世紀フィレンツェの絹織物工業保護政策をより広い視点から考察しようと努めた。特に18世紀のヨーロッパ諸国を悩ませた軍事費の増大に関しては、官房文書や財務委員会文書にとどまらず、軍事行政に関する文書も一部閲覧し、他国とは異なりトスカーナでは18世紀後半に軍事費は減少しており、それに合わせて国家全体の財政状況も好転したことが判明した。以上のような史料にもとづきながら、「18世紀トスカーナ大公国における軍事費-啓蒙改革とヨーロッパ政治」を『立正史学』に発表した。本論文においては、1748年のアーヘンの和約とそれ以後のブルボン-ハプスブルクの同盟によってイタリア半島の安定が実現されたこと、同時にそれによってトスカーナも軍事費を削減することができるようになり、それが財政の好転へとつながっていくことを指摘した。また、絹織物などの工業政策についても、財政的に余裕があったことがおそらく保護政策を堅持する方針へとつながっていたと考えられる。次年度は、今年度得られた成果を論文の形で公表することを目指すと同時に、フィレンツェ絹織物工業者の帳簿の分析に着手することで、具体的な生産のあり方や、絹織物販路等について分析を進めたいと考えている。合せて、フィレンツェ以外の絹織物工業の事例についても、トスカーナ地方に限らず積極的に情報を得ることで、イタリア半島全体の絹織物工業の実態やその販路について大まかな見取り図を提示できるように努めたい。本年度もフィレンツェで夏と冬に二度の史料調査を実施する予定である。特に本年度は、昨年度までの調査で判明している絹織物工業者の帳簿を重点的に閲覧し、必要部分を写真撮影し、詳しく検討する予定である。合わせて、絹織物工業を取り巻く状況や制度的な枠組みをより広い視点から分析するため、当時の政府の財政記録や税関の記録、さらに関税改革の記録等についても重点的に検討していく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
数珠玉状および網目状フラーレン連結分子の光化学反応による生成

本研究では、有機分子の光化学反応によってビラジカルを発生させ、「ラジカルスポンジ」としてのC_<60>フラーレンに付加反応することを利用して、数珠玉状および網目状フラーレン連結分子の生成について検討した。有機光化学反応によるビラジカル発生法として、種々のシクロアルカンの環のC-C結合開裂、シクロアルカノンのアシル基のα開裂によって、アルカンのメチレン鎖を変化させることによる1,n-ビラジカルの発生、カルボニル基の分子内γ水素引き抜きによる1,4-ビラジカルの発生を、溶液中のレーザーフラッシュホトリシス法(励起レーザーとして主にXeClエキシマーレーザー308nm光を使用)によるビラジカルの過渡吸収測定から検討した。この結果、様々な原料を使用した光化学反応によって様々なビラジカルを発生させることができ、原料の有機分子の吸収にあった波長の高強度のレーザー光を照射することによって光化学反応を効率的に起こし、高密度・高濃度のビラジカルを発生させることが可能であることがわかった。次に、溶液中にC_<60>フラーレンを共存させておき、前述のXeClエキシマーレーザー励起による有機光化学反応によってビラジカルを発生させ、ビラジカルとC_<60>フラーレンとの付加反応を検討した。これら混合系では、ビラジカルの過渡吸収がC_<60>フラーレン基底状態の吸収と重なっているため、ビラジカルの過渡吸収測定は困難であった。また、C_<60>フラーレン自身もXeClエキシマーレーザー照射によって励起される。しかし、両者の濃度調整によって有機化合物の光化学反応を優先的に起こし、ビラジカルを発生させることができる場合を見い出した。実際に生成した炭素成分の質量測定によれば、数珠玉状および網目状フラーレン連結分子が生成している可能性が示唆された。本研究では、有機分子の光化学反応によってビラジカルを発生させ、「ラジカルスポンジ」としてC_<60>フラーレンに付加反応することを利用して、数珠玉状および網目状フラーレン連結分子の生成について明らかにすることを目的とする。本年度は有機光化学反応によるビラジカル発生法として、種々のシクロアルカンの環のC-C結合開裂、シクロアルカノンのアシル基のα開裂によって、アルカンのメチレン鎖を変化させることによる、1,n-ビラジカルの発生、カルボニル基の分子内γ水素引き抜きによる1,4-ビラジカルの発生を、溶液中のレーザーフラッシュホトリシス法(励起レーザーとして主にXeClエキシマーレーザー308nm光を使用)によるビラジカルの過度吸収測定から検討した。したがって、数珠玉状および網目状フラーレン連結分子が生成している可能性があり、今後は、生成物の分析によって明らかにする。
高効率オゾン発生装置の開発を目指した高圧酸素高周波放電の基礎的研究

酸素原料ガス無声放電ならびに大気圧ヘリウム・酸素混合ガス高周波(13.56MHz)放電の実験と大気圧高周波放電の流体モデルによるシミュレーションを行った。酸素原料ガス無声放電によるオゾン生成に関する実験より,時間変調方式でのオゾン生成効率は放電への投入電力の増加に伴い減少するが,従来の連続方式電力供給源を用いた場合に比べオゾン生成効率は最大で約20%改善できることが明らかになった。達成したオゾン生成効率の最大値はおよそ220g/kWhであった。ヘリウム・酸素混合ガス高周波放電に関する実験より,酸素混入率が5%未満の場合安定したグロー放電が得られること,グロー放電からアーク放電に移行する前にαモードからγモードへのモード変化が生じることが明らかとなった。また,発光分光法ならびに紫外光吸収法に基づくプラズマ組成の推定結果より,大気圧高周波放電中の酸素原子密度はバリア放電などの他の大気圧放電中での酸素原子密度に比べて数桁高くなる一方,オゾン密度は他の大気圧放電に比べてむしろ低くなった。高周波放電でのオゾン生成効率は低く1-10g/kWh程度であった。しかしながら,時間変調式電力供給源を使用した場合,オゾン生成効率は連続方式に比べ最大でおよそ20倍改善された。流体モデルによるシミュレーションを行い,ヘリウム・酸素混合ガス高周波放電の酸素混入の影響について調査した結果,プラズマ中のイオン組成は0.1%程度の微少酸素混入時でさえ純ヘリウム放電のイオン組成とはかなりの差異があり,正イオンとしては酸素分子正イオン,負の荷電粒子としては酸素原子負イオンがそれぞれ支配的となった。連続方式と時間変調方式の2方式の電力供給源を用いて酸素無声放電ならびにヘリウム・酸素混合ガス高周波(13.56MHz)放電の放電特性,オゾン生成効率等に関する実験研究を行った。さらに,大気圧高周波放電の放電特性ならびにプラズマ組成を明らかにするため流体モデルによるシミュレーションを行った。結果を以下に記す。酸素無声放電によるオゾン生成に関する実験研究では,時間変調方式(低周波)でのオゾン生成効率は放電への投入電力の増加に伴い減少するが,従来の連続方式(低周波)電力供給源を用いた場合に比べオゾン生成効率は最大で約20%改善できることが明らかになった。ヘリウム・酸素混合ガス高周波放電の研究では,酸素混入率が5%を超えるとグロー放電からアーク放電へ移行すること,酸素混入量に比例して放電開始電圧が増加すること,連続方式ではオゾン生成効率は低いこと等を実験的に明らかにした。しかしながら,時間変調式(高周波)電力供給源を使用した場合のオゾン生成を調査したところ,オゾン生成効率は改善され,連続方式(高周波)に比べ最大でおよそ20倍改善された。流体モデルによるシミュレーションを行い,ヘリウム・酸素混合ガス高周波放電の酸素混入の影響について調査した。その結果,プラズマ中のイオン組成は,0.1%程度の微少酸素混入時でさえ純ヘリウム放電のイオン組成とはかなりの差異があり,正イオンとしては酸素分子正イオン,負の荷電粒子としては酸素原子負イオンがそれぞれ支配的となった。大気圧ヘリウム・酸素混合ガス高周波(13.56MHz)放電の放電電流-電圧特性、発光分光法ならびに紫外光吸収法に基づく放電プラズマ組成の推定に関する研究を行った。以下に結果を示す。ヘリウム・酸素混合ガス高周波放電の放電電流-電圧特性測定の結果、酸素混入率が5%未満の場合単位面積当たりの電力が15-20W/cm^2以下であれば安定したグロー放電が得られること、グロー放電からアーク放電に移行する前にαモードからγモードへのモード変化が生じること、グロー放電が形成された時の高周波放電電流の波形ひずみ率は低く正弦波に近似できることなどが明らかとなった。発光分光法ならびに紫外光吸収法に基づくプラズマ組成の推定の結果、大気圧高周波放電中の酸素原子密度はバリア放電などの他の大気圧放電中での酸素原子密度に比べて数桁のオーダーで高くなる一方、オゾン密度は他の大気圧放電に比べてむしろ低くなった。特に、電力の増加に伴い酸素原子密度は比例的に増加するが、オゾン密度は電力の増加に伴い減少した。

電力増加に伴うオゾン密度の減少は、電力の増加に伴うガス温度の上昇のため酸素原子と酸素分子の三体衝突によるオゾン生成反応率が低下することおよび電子とオゾン分子との解離衝突によるオゾン破壊頻度が高くなることによるものと考えられる。したがって、電子とオゾン分子との解離衝突によるオゾン破壊とガス温度上昇の抑制が可能な時間変調式電力供給源を使用した場合に大気圧高周波放電による高効率オゾン生成は可能となることが明らかとなった。
人工変異蛋白を用いたS. hyicus表皮剥脱毒素の毒素活性領域の解析

Staphylococcus hyicus表皮剥脱毒素B(SHETB)の活性領域を解析するため、site-directed mutagenesisにより87番目のヒスチジンをアラニンに換えたH87A、135番目のアスパラギン酸をアラニンに換えたD135A、209番目のセリンをシステインに換えたS209C、227番目のリジンをグルタミン酸に換えたK227E、180番目のチロシンをフェニルアラニンに換えたY180Fの5つの人工変異蛋白を作製した。SHETBおよび5つの人工変異蛋白をヒト表皮由来株化細胞であるNCTC2544細胞に接種し、37°C,48時間培養したところ、SHETB、K227EおよびY180Fでは1:160希釈まで細胞の円形化が認められ、毒素活性が確かめられた。一方、H87A、D135AおよびS209Cでは1:5希釈でも円形化は認められなかった。また、これらの毒素液をSHETBの感受性動物である1日齢ニワトリひなに接種したところ、SHETB、K227EおよびY180Fでは接種3時間以内に表皮剥脱現象が認められたが、H87A、D135AおよびS209Cでは表皮剥脱現象は認められなかった。以上の成績より、SHETB分子中の87残基目のヒスチジン、135残基目のアスパラギン酸および209残基目のセリンが毒素活性に必須であり、これらのアミノ酸残基を含む領域が毒素の活性発現に関与する領域であることが確かめられた。これら3残基を含む領域はセリンプロテアーゼにおいてよく保存されている構造であるので、SHETBの活性本体はセリンプロテアーゼであると推定される。S.hyicusが産生する表皮剥脱毒素B(SHETB)には、S.aureus表皮剥脱毒素A(ETA)の活性領域と考えられている120残基目のヒスチジン、172残基目のアスパラギン酸、195残基目のセリンから成るcatalytic triadと類似の構造が見られるので、この構造を変化させるため、site directed mutagenesisを用いて塩基の置換を起こし、変異蛋白の構築を試みた。SHETB遺伝子全長を増幅するプライマー、5'-末端および3'-末端に変異点を持ったプライマーを使用してPCRを実施し、アミノ酸1残基の置換を伴う1塩基が置換した変異SHETB遺伝子を増幅し、pUC系プラスミドに連結後、大腸菌に形質転換した。上記の実験の結果、SHETBの135残基目のアスパラギン酸がアラニンに置換された変異蛋白(D135A)、187残基目のヒスチジンがアラニンに置換された変異蛋白(H187A)、209残基目のセリンがシステインに置換された変異蛋白(S209C)を発現する形質転換株を得た。次に、本来のSHETB、変異SHETBを活性を保ったまま精製するため、抗SHETBマウスモノクローナル抗体をCNBr-activated Sepharose 4Bにカップリングし、アフィニティーカラムを作製した。現在、上記の形質転換株の培養上清を濃縮後、アフィニティークロマトグラフィーによりSHETB蛋白を精製する方法を検討中である。S.hyicus表皮剥脱毒素B(SHETB)遺伝子組換え

プラスミド(pSHETB-1)を基にsite-directed mutagenesisによりSHETBの87残基目のヒスチジンをアラニンに置換した変異蛋白(H87A)、135残基目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異蛋白(D135A)、209残基目のセリンをシステインに置換した変異蛋白(S209C)、227残基目のリジンをグルタミン酸に置換した変異蛋白(K227E)、180残基目のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異蛋白(Y180F)をコードする遺伝子を組換えたプラスミドを構築し、大腸菌JM105株に形質転換した。pSHETB-1形質転換JM105株および上記5種類の形質転換株をアンピシリン加LBbroth中で毎分150回の振〓下で37°C、24時間培養後、培養菌液を3回凍結融解し、高速遠心(10,000×g,30分間)後の上清を無菌濾過した。濾液に硫酸アンモニウムを80%飽和度になるように加えて4°C、一晩塩析後、遠心(10,000×g,30分間)沈渣に少量の燐酸緩衝食塩液を加えて溶解し、同液で4°C、48時間透析して毒素蛋白液を調製した。上述したように調製したSHETB、H87A、D135A、S209A、K227E、Y180Fを階段希釈後、NCTC2544細胞に接触して37°C、48時間培養したところ、SHETB、K227EおよびY180Fは1:160まで細胞の円形化が認められたが、H87A、D135AおよびS209Aでは1:5でも円形化が認められなかった。また、SHETB、K227EおよびY180Fを皮下接種した1日齢ニワトリひなでは3時間以内に表皮剥脱が見られたが、H87A、D135AおよびS209A接種例では表皮剥脱は生じなかった。以上の結果より、SHETB蛋白中の87残基目のヒスチジン、135残基目のアスパラギン酸、209残基目のセリンが毒素活性に必須であり、これらのアミノ酸残基を含む領域が毒素活性発現に関与する領域であることが確かめられた。なお、これらの構造はセリンプロテアーゼのcatalytic triadと推定されるので、SHETBの活性本体はプロテアーゼ様作用と考えられる。