hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンチトロンビン・レジスタンスの新規変異探索とマウスモデルによる病態解析研究

血漿検体を用いたATR検出・臨床検査法を自動化機器用に調整し、これを用いてArg596以外のATR変異体候補を探索すべくNa+結合領域(Thr540、Arg541、Glu592、およびLys599)での単一ヌクレオチド置換変異体の凝固活性特性を調べた。その結果、Lys599ArgおよびGlu592GlnではYukuhashi変異およびBelgrade変異と同等のATR残存凝固活性を示し、同様の血栓症リスク示す可能性のあることが判明した。また、Arg593Leu(ヒトArg596Leuに相当)ノックインマウス作製解析において、へテロ接合体同士の高配でのホモ/ヘテロ/野生型の出生比率は1:2:1で、Arg593Leu変異は出生に影響を及ぼさなかった。ホモ/ヘテロ/野生型マウスの血漿検体を解析したところ、ホモ>ヘテロの順で野生型に比べATRを示したものの、ヒトAug596Leu変異体に比べやや弱いATRであった。しかし、ホモマウスのプロトロンビン抗原量は70%、凝固一段法による活性は35%と低値を示し、結果としてATR残存凝固活性はより低値であり、ヒトでのAug596Leu変異と異なりArg593Leu変異ホモマウスでは血栓リスクになる可能性は低いと思われた。組換え技術を用いてトロンビンのアンチトロンビン結合部・Na+結合領域を構成するアミノ酸(596R, 599K, 540T, 541R, 592E)に一塩基置換によるミスセンス変異を導入して種々プロトロンビン変異体の安定発現株を作製したところ、各プロトロンビン変異体は野生型プロトロンビンと同様に細胞培養上清中に分泌されることが判明した。R593L(ヒトR596Lに相当)ノックインマウスは、さらにCAG-Creリコンビナーゼ発現マウスと交配し、LoxP配列を含むNeo耐性遺伝子を除去することに成功した。これにより、完全なR593Lノックインマウス(R593Lへテロマウス)の樹立に成功した。しかし、R593Lヘテロマウスは数匹しか得られず、またmatingも失敗が続いたため、R593Lヘテロマウス(♂)より精子を取り出し、C58BL/6マウスの卵子と人工授精を行った。その結果、仔35匹のうち22匹のR593Lヘテロマウスを得ることができた。先の研究成果として確立した血漿検体を用いた迅速ATR検出スクリーニング法を用い、未だ原因の特定に至っていない遺伝性血栓症症例における新たなATR血栓性素因の検出解析を継続している。Na+結合領域を構成するアミノ酸(596R, 599K, 540T, 541R, 592E)に一塩基置換で生ずるミスセンス変異体発現ベクターを組換え技術にて作製したところ、それぞれ安定発現細胞株では野生型プロトロンビンと同様にその培養上清中に分泌されることが判明し、それぞれATR惹起性のスクリーニング解析予定である。先の研究成果として得られたジーンターゲティング手法により作製したYukuhashi変異(R593Lプロトロンビン:ヒト分子の596Rはマウス分子593Rに相当)のキメラマウス交配により、ヘテロマウス(R593Lヘテロマウス)の作製に成功しており、今後その易血栓性を検討する予定である。我々は新しい血栓性素因・アンチトロンビン・レシスタンス(ATR)を示すプロトロンビン異常症(prothrombjn Yukuhashi, p.R596)の遺伝子異常(F2 c.1787G>T)を報告し(N Engl J Med. 2012)、さらに血漿検体によるATR検出検査法を確立し、これを用いて異なる変異(F2 c.1787G>A, p.R596Q, prothrombjn Belgrade: J Thromb Haemost. 2013)でのATRも同定している。今年度は血漿検体を用いたATR検出・臨床検査法により新たなATR症例を同定し本邦2例目のprothrombjn Belgrade症例を報告した。組換え技術を用いてトロンビンのアンチトロンビン結合部・Na+結合領域を構成するアミノ酸(596H, 599K, 540T, 541R, 592E)に一塩基置換によるミスセンス変異を導入し、種々プロトロンビン変異体の安定発現株を作製したところ、各プロトロンビンの変異体は野生型と同様に細胞培養上清中に分泌され、そのほとんどがATRを示すことが判明したが、多くの変異体でのプロトロンビン凝固活性も減弱していた。また、R593L(ヒトR596Lに相当)ノックインマウスは、CAG-Creリコンビナーゼ発現マウスと交配し、LoxP配列を含むNeo耐性遺伝子を除去することに成功し、完全なR593Lノックインマウス(R593Lヘテロマウス)の樹立に成功し、R593Lへテロマウス同士の高配でのホモ/ヘテロ/野生型の出生比率はおおよそ1:2:1であった。ホモ/ヘテロ/野生型マウスの血漿検体を解析したところ、ホモ>ヘテロの順で野生型に比べATRを示すことが判明した。先の研究成果として確立した血漿検体を用いた迅速ATR検出スクリーニング法を用い、未だ原因の特定に至っていない遺伝性血栓症症例における新たなATR血栓性素因患者を検出・同定した。

Na+結合領域を構成するアミノ酸(596R,599K,540T,541R,592E)に一塩基置換で生ずるミスセンス変異体発現ベクターを組換え技術にて作製したところ、各プロトロンビン変異体は野生型プロトロンビンと同様に細胞培養上清中に分泌され、そのほとんどがATRを示すことが判明した。先の研究成果として得られたジーンタ一ゲティング手法により作製したYukuhashi変異(R593Lプロトロンビン:ヒト分子の596Rはマウス分子59罧に相当)のキメラマウス父配により、ヘテロマウス(R593Lヘテロマウステの作製に成功し、各血漿検体を解析したところ、ホモ>ヘテロの順で野生型に比べATRを示すことが判明した。血漿検体を用いたATR検出・臨床検査法を自動化機器用に調整し、これを用いてArg596以外のATR変異体候補を探索すべくNa+結合領域(Thr540、Arg541、Glu592、およびLys599)での単一ヌクレオチド置換変異体の凝固活性特性を調べた。その結果、Lys599ArgおよびGlu592GlnではYukuhashi変異およびBelgrade変異と同等のATR残存凝固活性を示し、同様の血栓症リスク示す可能性のあることが判明した。また、Arg593Leu(ヒトArg596Leuに相当)ノックインマウス作製解析において、へテロ接合体同士の高配でのホモ/ヘテロ/野生型の出生比率は1:2:1で、Arg593Leu変異は出生に影響を及ぼさなかった。ホモ/ヘテロ/野生型マウスの血漿検体を解析したところ、ホモ>ヘテロの順で野生型に比べATRを示したものの、ヒトAug596Leu変異体に比べやや弱いATRであった。しかし、ホモマウスのプロトロンビン抗原量は70%、凝固一段法による活性は35%と低値を示し、結果としてATR残存凝固活性はより低値であり、ヒトでのAug596Leu変異と異なりArg593Leu変異ホモマウスでは血栓リスクになる可能性は低いと思われた。引き続き、未だ原因特定に至っていない遺伝性血栓症におけるATR血栓性素因の有無について、血漿検体を用いてのATR検出法による検索解析を継続して行うとともに、ATR同定症例においてはその原因遺伝子変異の同定解析も行い、新たなATR遺伝子変異の同定を含めた血栓症発症分子病態の解明を継続して行う。引き続き、トロンビン分子のNa+結合領域に位置しTAT複合体でのAT分子の264Eとの水素結合形成するプロトロンビン599Kならびに水分子を介してAT分子の264Eと結合する540T, 541R, 592Eにおいて、一塩基置換で生ずるミスセンス変異体をそれぞれ作製し、ATR検出検査や各組換えプロトロンビン分子のトロンビン生成能試験への影響を検討、ならびに各組換え体由来トロンビンのTAT形成能を解析し、ATRを示す変異体の同定解析を継続して行う。引き続き、Yukuhashi変異ヘテロマウス(R593Lへテロマウス)を用い、その血漿検体でのATRを検証するとともに、種々血栓誘発刺激(FeCl3刺激や電気刺激法による下大静脈血栓形成、組織因子あるいは高分子ポリリン酸による肺塞栓形成)による血栓形成動態のin vivo解析を行い、野生型マウスとの比較検討を詳細に解析する。また、種々薬剤(未分画ヘパリン、低分子量へパリン、フォンダパリヌクス、抗Xa阻害剤、抗IIa阻害剤)の前投与における上述血栓形成刺激による血栓形成能を未治療群とで比較検討し、Yukuhashi変異マウスの抗凝固薬効効果判定の血栓性素因モデルマウスとしての有用性を検討する。
Musicus・Musikantの概念を用いた近代ドイツ音楽教授史の総合的な研究

前年度に引き続き、Musicus型の音楽家の調査及び、Musikant型の音楽家についての調査をドイツのザクセン地方、旧プロイセン地方(現ベルリン・ブランデンブルク及びポーランドを含む)、バイエルン地方、オーストリア(主にウィーン周辺)の公文書館において進めた。前者についてはこれまでの調査から特に19世紀の教員養成学校での音楽教授や音楽に関する文献の蔵書などを中心に調査を行った。またそれに付随して、バイエルン地方の中等学校の音楽教授に関する資料や、初期の音楽院の設立に関する資料も得ることができた。また、教会オルガニストやカントールといった人物に関する資料を得ることができた。その結果、主に18世紀ごろまでの学識を背景としたMusicus型の音楽教授や音楽家は19世紀以降の近代国家制度の整備に従って、近代的な意味での学校制度の中へと徐々に移行されていったと推測された。つまり、大学のようなアカデミックな学識者から離れてゆくことを意味するが、学校(大学)とキリスト教会との分離はそうすぐには生じなかったので、教会と音楽教育の一体性という意味では、19世紀半ばごろまではなおも中世からのキリスト教的教養の伝統の範疇にMusicus型の音楽が受け継がれたと考えられる。一方でMusikant型の音楽家についても資料収集を行い、主に彼らが就職などで提出したと考えられる証明書や履歴を収集することができた。この資料についてはもう少し解読を進めてゆきたいと考えている。また、研究発表としては日本学表現学会の全国大会にて、昨年度派生的に資料を発見した、子供用に特化された音楽(おもちゃの交響曲)に関する報告を行った。また全面的に本テーマにかかわるものではないが、以前から執筆しているWeb連載記事においても、本研究について反映させることができた。手書きの古文書資料の解読に時間がかかっており、それらに基づいたアウトプットができなかったものの、資料収集については予定遂行できたことによる。最終年度となる次年度は、これまで収集した資料の解読を進めるとともに、19世紀に設立された音楽院(音楽大学)における、教会音楽家(特にオルガニスト教育)の教育についてと、それ以外の専門の音楽家の教育についての調査を行いたい。つまり、本研究での分け方で言えば、前者はMusicus型で後者はMusikant型の音楽家であるが、音楽院という19世紀に設立されたキリスト教的教養の伝統に基づかない新しい教育の場で、この二つのタイプの音楽家養成がどのように共存・並存していたのか、またいかに変化してゆくのかを探りながら、19世紀の音楽家の在り方、現代の音楽家像の成立について考察を進めたいと考えている。そのためには、当初の研究計画にあったライプツィヒ音楽院とともに、ドイツ各地にある(あった)音楽院の資料を現地で調査収集してきたいと考えている。平成28年度は主にMusicus型のいわゆる学識ある音楽家に関連した文献の精読や資料の収集を行うこととしていた。まず、Musicus型の音楽家を養成する教本、つまり単なる技術の向上だけではなく幅広い音楽の知識について取り扱う文献、またこのタイプの典型であるカントール、オルガニストなどを養成するための教本などの文献を現地収集・購入した。また、Musicus型の音楽家の背景を知るために、計画当初は一般教育史や音楽教育史の二次文献を精読することとしていた。しかし、彼らの多くが大学や大学に類するような学歴を有する人物であったことから、西洋におけるいわゆる「学識の歴史」についての二次文献を購入・精読することで、彼らがどのような歴史的背景を持っているのかを整理することができた。このことにより単なる教育史や音楽史のなかではなく、更に広く学識者の歴史的文脈に位置づけることが可能になったと考える。これについては29年度中に得られた知見を整理し紀要等に投稿する予定である。また、ドイツでの現地調査では当初は29年度に行うこととしていたMusicus型の音楽家の現地調査を行った。具体的にはザクセン地域を中心としたオルガニストとカントールの遺産目録に含まれる蔵書目録や蔵書楽譜目録を調査することができた。現在これらの資料については膨大であるため現在も精査中であるが、当時のMusicus型の音楽家であるオルガニストやカントールがどのような学識を持っていたのか、また先述の学識者の歴史からレビューしたときに、彼らを学識者の概念の下で如何に捉えられ得るのかを明確にできる可能性が出てきた。つまり、従来の音楽学では「音楽家」としての一側面からのみしか扱ってこなかったものを、別の視点からとらえることで新たなに包括的な彼らの音楽家像が構築できると考えている。若干予定を変更したため、ドイツの一般教育史や音楽教育史の文献の精読に遅れが出ているものの、それ以外の点では29年度の調査を先取りするなどしており、おおむね順調に進展していると考えている。今年度は1昨年度の収集した教本類の文献の整理、2音楽教授に特徴的な教授思潮・方法に関する文献を収集しその特徴を明らかにすること、3教会型教授を担った教員養成学校、教会音楽家学校などの資料を収集・精読し、教会型音楽教授の実態について明らかにする、以上の3つの点について研究調査活動を行うこととして、これらをまとめることとしていた。まず、1についてはデータベース化の作業が遅れており、次年度の完成を予定している。2については、日本語、外国語の文献などを購入、収集しそれらをまとめる形で論文の形で公表をすることができた。特に、中世以来の学校文化における音楽の在り方の変遷をまとめ、その指摘展開の中でいわゆる音楽家が育まれてきたという文化があることを明らかにすることができた。こちらは、いわゆる現代の芸術家としての音楽家像と異なる音楽家像を提示できたと考えている。

3については、ドイツにおいて主にベルリン(プロイセン文化財団枢密公文書館)と、ライプツィヒ(ザクセン州公文書館)、ウィーン(国立公文書館、市立公文書館、ウィーン楽友協会資料館)において、いわゆる教会型の音楽家養成にかかわる一次資料と、それに取って代わるタイプの音楽学校などの史料を収集した。現地調査の実施が年度の終わりのほうとなり、資料の分析は完全には終えられておらず、翌年度までかかる見通しである。また、調査を進める中で、音楽を習得した子供が演奏した子供用に特化された音楽の存在とその音楽文化ともいえるものがあることを発見した。これについては、並行をして調査を進め、学会などで発表をする予定である。また、これらの調査の成果については、一般向けのWeb連載記事などにおいても反映することができ、研究成果の公開についても論文等のみならず一定の成果を上げることができたと考えている。データベース化や、調査の時期とその分析に関して若干の遅れがみられるものの、当初の予定になかった音楽文化の諸相などについて、新たな進展の可能性が見られることからおおむね進展していると考えている。前年度に引き続き、Musicus型の音楽家の調査及び、Musikant型の音楽家についての調査をドイツのザクセン地方、旧プロイセン地方(現ベルリン・ブランデンブルク及びポーランドを含む)、バイエルン地方、オーストリア(主にウィーン周辺)の公文書館において進めた。前者についてはこれまでの調査から特に19世紀の教員養成学校での音楽教授や音楽に関する文献の蔵書などを中心に調査を行った。またそれに付随して、バイエルン地方の中等学校の音楽教授に関する資料や、初期の音楽院の設立に関する資料も得ることができた。また、教会オルガニストやカントールといった人物に関する資料を得ることができた。その結果、主に18世紀ごろまでの学識を背景としたMusicus型の音楽教授や音楽家は19世紀以降の近代国家制度の整備に従って、近代的な意味での学校制度の中へと徐々に移行されていったと推測された。つまり、大学のようなアカデミックな学識者から離れてゆくことを意味するが、学校(大学)とキリスト教会との分離はそうすぐには生じなかったので、教会と音楽教育の一体性という意味では、19世紀半ばごろまではなおも中世からのキリスト教的教養の伝統の範疇にMusicus型の音楽が受け継がれたと考えられる。一方でMusikant型の音楽家についても資料収集を行い、主に彼らが就職などで提出したと考えられる証明書や履歴を収集することができた。この資料についてはもう少し解読を進めてゆきたいと考えている。また、研究発表としては日本学表現学会の全国大会にて、昨年度派生的に資料を発見した、子供用に特化された音楽(おもちゃの交響曲)に関する報告を行った。また全面的に本テーマにかかわるものではないが、以前から執筆しているWeb連載記事においても、本研究について反映させることができた。
中枢起源不整脈の発生機序に関する実験的研究

くも膜下出血患者ではしばしば心電図変化を伴うことが知られており、各種不整脈から心筋梗塞様の変化も認められる。すなわち中枢の異常が何らかの機序で心に著しい影響を及ぼしているので、その中枢性不整脈の機序を解明する目的でまず家兎の脳底槽、すなわち視交叉槽または脚間槽にきわめて侵襲の少い方法で薬液を注入する方法を開発し、1985年には循環制御誌および関西医科大学雑誌に発表し、さらに1989年にはstrokeに発表した。1987年には第34回日本麻酔学会総会において、家兎脳底槽に0.1%プロスタグランディンF_2αを0.3および0.5ml注入したときの心電図変化、すなわち徐脈、上室性および心室性不整脈、心室性頻拍、ST低下、ST上昇、陰性T波などくも膜下出血患者と似た心電図変化が発生したことを報告し、さらに交叉熱電対の電極を頭頂部から脳底部附近まで挿入し、0.1%プロスタグランディンF_2α0.5mlを注入した直後の徐脈が発生している時点には脳底部脳血流は減少しており、約2030秒後に脳底部脳血流が逆に増加傾向を示すと同時に不整脈が発生することを発表した。この結果は、プロスタグランディンF_2αの注入によって刺激(阻血刺激)されていた視床下部に血流が再開し、視床下部からの心刺激物質の放出または副腎からのエピネフリンの分泌増加などが推定される。交叉電対によって測定される脳血流量は、その増減を連続的に測定し得る利点がある反面、絶対値が測定出来ないという不利な点があった。そこで水素クリアランス式電極を交叉熱電対と反対側に刺入し、血流減少時、すなわち徐脈発生時および脳血流がどれだけ減少したか、不整脈発生時にはどれだけ増加したか、第35回日本麻酔学会(1988年)で発表した。エ-テル麻酔家兎6例では平均80ml/100g/minであり減少は平均-20ml/100g/minであり増加は+510ml/100g/minであった。本教室では昭和58年に家兎で頭蓋咽頭管口を利用して薬液を視交叉槽に注入する方法を開発し発表した.この方法を用いて視交叉槽に0.1%PGF_2α0.5mlを注入するとヒトのくも膜下出血時にみられるものと同様のECG変化,すなわち徐脈,上室性または心室性期外収縮, ST上昇または下隣ときに心室性頻拍などが出現する.このとき同じ場所に1%リドカイン0.5mlを注入すると徐脈,不整脈が消失しST変化に徐々に回復傾向を示す.このとき交叉熱電対の電極を脳底部附近の脳実質に刺入して脳血流量の変化をみていると, PGF_2αが注入された.直後には血流が減少し徐脈が生じ,血流が増加傾向になると不整脈が出現することがわかった.昭和62年9月に科学研究費によって水素クリヤランス法による血流計を購入してからは下記の実験を行った.

1.エーテル麻酔下の家兎17羽を用いて人工呼吸を行い,頭頂部から1側に交叉熱電対の電極を挿入固定し,反対側に水素クリヤランス電極を挿入固定し,先端はいづれも脳底部脳実質内に位置せしめ,まず過換気にして交叉熱電対による脳血流が明らかに減少したのを確認したのち,血液ガス分析を行い,正常時の脳血流量を水素クリヤランス法で測定し(60-70ml/100g),ついで視交叉槽に0.1%PGF_2α0.5mlを注入し,不整脈が出現した時点で脳血流量を水素クリヤランス法で測定した.注入操作に伴う出血がなかった10羽のすべてで水素クリヤランス法による脳血流は10-20%減少した. 2.1.0%リドカイン単独注入時の脳血流量の変化をみるため家兎15羽を用いて水素クリヤランス法による脳血流量の変化をみているが,最初は成績が一定しなかったが最近の4羽では注入直後に血流が増加した.今後さらに例数を増加するつもりである.くも膜下出血患者では、しばしば心電図変化を伴うことが知られており各種不整脈から心筋梗塞様の変化も認められる。すなわち中枢の異常が何らかの機序で心に著しい影響を及ぼしているので、その中枢性不整脈の機序を解明する目的でまず家兎の脳産槽、かなわち視交叉槽または脚間槽にきわめて侵襲の少ない方法で薬液を注入する方法を開発し、1985年には循環制御誌および関西医科大学雑誌に発表し、さらに1989年にはStrokeに発表した。1987年には第34回日本麻酔学会総会において、家兎脳底槽に0.1%プロスタグランディンF_2αを0.3および0.5ml注入したときの心電図変化、すなわち除脈、上室性および心室性不整脈、心室性頻拍、ST低下、ST上昇、陰性T波などくも膜下出血患者と似た心電図変化が発生したことを報告し、さらに交叉熱電対の電極を頭頂部から脳底部付近まで挿入し、0.1%プロスタグランディンF_2α0.5mlを注入した直後の除脈が発生している時点には脳底部脳血流は減少しており、約2030秒後に脳低部脳血流が逆に増加傾向を示すと同時に不整脈が発生することを発表した。この結果は、プロスタグランディンF_2αの注入によって刺激(阻血刺激)されていた視床下部に血流が再開し、視床下部からの心刺激物質の放出または副腎からのエピネフリンの分泌増加などが推定される。交叉熱電対によって測定される脳血流量は、その増減を連続的に測定し得る利点がある反面、絶対値が測定出来ないという不利な点があった。そこで水素クリアランス式電極を交叉熱電対と反対側に刺入し、血流減少時、すなわち除脈発生時および脳血流がどれだけ減少したか、不整脈発生時にはどれだけ増加したか、第35回日本麻酔学会(1988年)で発表した。エーテル麻酔家免6例では平均80ml/100g/minであり減少は平均-20ml/100g/minであり増加は+510ml/100g/minであった。
突然変異導入に関与するREV蛋白の分子生物学的特性の解析

本研究では、ヒトREV蛋白の細胞内局在の解析と、紫外線によるDNA障害が及ぼす影響について検討した。GFP融合REV1、REV3、REV7蛋白をそれぞれ発現させる発現ベクターを作成し、COS7細胞に導入することにより細胞内でそれぞれの蛋白を発現させ、蛍光顕微鏡にてそれらの蛋白の細胞内局在を観察した。その結果、REV1蛋白は核内に存在し、ある割合で数十個の小顆粒状のfocusを形成していること、REV7蛋白は大部分が核内に、一部が細胞質に存在し、focus形成は伴わないことが判明、REV3蛋白は核内に存在しているが、発現が悪いため詳細は不明であった。そこで、REV1にて特異的に認められたfocus形成に着目し、紫外線照射によるDNA損傷との関係を詳細に検討した。GFP融合REV1蛋白をCOS7細胞で強制発現させ、その細胞に紫外線照射によりDNA損傷を与えてREV1のfocus形成の変化を観察した。紫外線照射しない状態で約3%の細胞でfocus形成が認められたが、8J/m^2の紫外線照射8時間後には約25%の細胞でfocus形成が認められた。また、このfocus形成率は、紫外線量に依存して増加した。REV1のfocusはDNA複製forkの指標であるPCNAと共局在を示し、またBrdUを用いた解析により多くのfocusはS期で形成されていることが判明した。また損傷乗り越え型DNA複製に関与する他の蛋白Polκ、、Polηとの共局在も確認された。これらの結果より、REV1のfocus形成は紫外線照射により誘導され、しかもS期のDNA合成と関係している可能性が示唆された。REV1の種々のdeletion mutantを用いて、REV1のfocus形成に重要なドメインを決定したところ、REV1のC末端部分がfocus形成に重要であることが判明した。Polκ、Polη、REV7との結合ドメインの存在する部位であり、REV1がこれらの蛋白の機能に関与している可能性が示唆された。今後は他のDNA損傷誘発薬剤を用いた時のfocus形成についての検討、また、突然変異導入率についての検討を行う予定である。平成14年度はヒトREV蛋白の細胞内局在の解析を中心に研究を行った。REV蛋白はいずれも内因性の蛋白が微量のため、抗体を用いて内因性の蛋白を同定することが困難である。そのため,hREV1はGFP-hREV1またはFLAGタグをつけたhREV1を培養細胞に強制発現させ、またhREV7についてはhREV7の発現誘導細胞株を作成して、それぞれタグに対する抗体、またhREV1に対する抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。細胞株は293細胞株を用いた。その結果、hREV7は細胞の核に局在し、約20%の細胞では数個から数十個の顆粒状のfociを形成していた。hREV7はほとんど全ての細胞で核にびまん性に局在し、顆粒状のfoci形成は示さなかった。紫外線照射や種々の薬剤によりDNA損傷を与えたときのhREV1、hREV7の局在の変化を検討したところhREV1はfoci形成の割合が増加したが、hREV7はfoci形成は示さず、変化は認められなかった。現在さらに詳細な検討を行っているところである。また、hREV7については種々のdeletion mutantを作成して、核への局在に重要なドメィンの場所を決定した。hREV3については、トランスフェクションによる一時的な強制発現では蛋白の発現が確認できなかったため、現在hREV3を高発現する細胞株の作成を試みているところである。

今後は、hREV3の細胞内局在の検討と、hREV1、hREV3のdetetion mutantを用いたときのそれぞれの蛋白の局在の変化を検討する予定である。本年度は、REV蛋白の細胞内局在についての詳細な検討を行った。前年度ヒトREV蛋白の細胞内局在を検討した結果、REV1蛋白は核内に存在し、ある割合で数十個の小顆粒状のfocusを形成していることが判明したので、本年度はこのREV1のfocus形成と紫外線照射によるDNA損傷との関係に着目した。GFP融合REV1蛋白を発現させる発現ベクターを作成し、COS7細胞にトランスフェクションすることによりGFP-REV1蛋白を強制発現させ、その細胞に紫外線照射することによりDNA損傷を与えてREV1のfocus形成がどのように変化するかを検討した。紫外線照射しない状態で約3%の細胞でfocus形成が認められたが、8J/m^2の紫外線照射後8時間では約25%の細胞でfocus形成が認められた。また、このfocus形成率は、時間依存性に、また紫外線量依存性に増加した。REV1のfocusはDNA複製forkの指標であるPCNAと共局在を示し、また多くのfocusは細胞周期のS期で形成されていた。これらの結果より、REV1のfocus形成は紫外線照射に反応して誘導され、しかも細胞周期のS期のDNA合成と関係している可能性が示唆された。また、REV1の種々のdeletion mutantを用いて、REV1のfocus形成に重要なドメインを検討したところ、REV1のC末端部分がfocus形成に重要であることが判明した。この部位は損傷乗り越え型DNA複製に関与する他の蛋白、Polκ、Polη、REV7との結合ドメインの存在する部位であり、REV1の機能にこれらの蛋白が関与している可能性が示唆された。
学校教育の高校物理領域における熱学理解に役立つ熱機関の解析と教材化の研究

[研究目的]高校物理領域で、動的・循環的な熱学理解のための教材としての熱機関は、自然界での物質やエネルギーの循環の問題の認識、また社会的な関心としての循環型社会の形成の問題の認識に対して、役に立つ。熱機関は、専門教科・科目を学ばない生徒にとっても役に立ち、興味を惹き起こす教材3つを取り上げた。[研究方法]熱学教材として(A)常温熱機関(水飲み鳥富士商会)(B)単動式首振りエンジンによる蒸気機関車(商品名:ベビーエレファント号、株式会杜オオミヤ)(C)ビー玉スターリングエンジン(ケンコー)を購入し、動作の計測を行った。併せて文献調査を行った。熱的特性と教材としての実用性を検討した。[研究成果](A)水飲み鳥は、高温部と低温部との温度差、環境との温度差が23度と小さい。その作動において、熱学的な水の状態変化に伴う潜熱の放熱や物質輸送に伴う伝熱(対流)が、力学的な振動周期,系の重心移動(獅子おどしに類似)、慣性モーメント、力のモーメント(てこの原理)などの動作特性と密接につながっている。今回、次のような知見i)ii)iii)が得られた。文献調査で、i)高校における教科・科目での扱い(1)実教出版「理科総合A」(熱エネルギーの性質、水飲み鳥も熱機関)(2)実教出版「原動機」(熱機関のサイクル、熱力学の第2法則の概念図)での扱い。計測では、ii)周期性:DrDAQ(pico technology ltd社製)による記録(1)周囲の気流の影響(水飲み鳥に対して風を送り風速を測定する)(2)風速と周期との関係(気温27.5°C、湿度58.5%および温度27°C、湿度66%)(3)湿度の影響(湿度Hと周期τとの関係)(風速0、気温27°C32°C)を行った。更に、iv)水飲み鳥についての考察では(1)水の気化熱、熱伝導と空気の対流、水の気化熱、熱伝導、空気の対流など熱的環境と動作との関連性を調べた。特に(3)作動のサイクルと熱的サイクルとが一致する点に注目できる。今後、熱機関としてのモデルの検討が一層望まれる。(B)ベビーエレファント号の製作・測定ではキットを利用して,身近にある工具類を用いての「物づくり」体験が可能である。熱源(800°C程度〕による水の加熱によりその動作(往復運度・回転と走行)が確認できる。生徒の知的関心を刺激する教材である。今回、燃焼時間、固形燃料消費量、水消費量、走行時間、走行距離、平均速度について記録を取った。ピストンの往復運動(周期0.2秒)と熱サイクルとは一致しない(はずみ車による慣性運動)ことに留意する必要がある。(3)ビー玉スターリングエンジンは、文献調査によるとスターリングサイクルの特性が確認されている。この教材はスターリングエンジンへの関心を高めるための導入となる教材である。一般にスターリングエンジンは温度差の少ない外燃機関として知られているが、このビー玉スターリングエンジンでは、低温部20°C、高温部140°Cで周期1.5秒の動作であった。

特に(3)作動のサイクルと熱的サイクルとが一致する点に注目できる。今後、熱機関としてのモデルの検討が一層望まれる。(B)ベビーエレファント号の製作・測定ではキットを利用して,身近にある工具類を用いての「物づくり」体験が可能である。熱源(800°C程度〕による水の加熱によりその動作(往復運度・回転と走行)が確認できる。生徒の知的関心を刺激する教材である。今回、燃焼時間、固形燃料消費量、水消費量、走行時間、走行距離、平均速度について記録を取った。ピストンの往復運動(周期0.2秒)と熱サイクルとは一致しない(はずみ車による慣性運動)ことに留意する必要がある。(3)ビー玉スターリングエンジンは、文献調査によるとスターリングサイクルの特性が確認されている。この教材はスターリングエンジンへの関心を高めるための導入となる教材である。一般にスターリングエンジンは温度差の少ない外燃機関として知られているが、このビー玉スターリングエンジンでは、低温部20°C、高温部140°Cで周期1.5秒の動作であった。
組織化常磁性フラーレンの創製と機能

本研究では常磁性内包フラーレンの1, 3-双極子環化付加反応およびカルベン付加反応を用いた種々の常磁性内包フラーレン誘導体を合成した。La@C_<82>誘導体単結晶の電荷輸送特性を調べたところ、μ=10cm^2 V^<-1>s^<-1>という値が見積もられた。この電子移動度はこれまでに報告された電子共役系有機材料の中でも格段に高い値であり、配向制御されたLa@C_82誘導体が非常に優れた電荷輸送特性を有することを示す結果である。近年π電子系化合物は分子エレクトロニクス素子や単一分子デバイスをはじめ、磁気的、光学的機能材料としても注目され、基礎および応用研究が精力的に展開されている。次世代を切り拓く革新的な電子・光・磁気機能を有する物質の創出を図るため、本研究では磁性内包フラーレンに着目し、その分子変換による構造および電子特性の制御を行う。さらに、得られた常磁性内包フラーレン誘導体の組織化を行い、革新的バルク機能を有する材料の創製を目的とする。適切な官能基を思い通りに付加させることができれば、金属内包フラーレンの材料科学への応用に対する重要な足掛かりになると考えられ、革新的機能を有する材料の創製に繋がる。以下の項目について研究を遂行する。(1)磁性金属内包フラーレンの大量合成(2)磁性金属内包フラーレンの化学修飾による機能化(3)磁性金属内包フラーレン誘導体の組織化(4)組織化磁性金属内包フラーレンの物性解明(5)組織化磁性金属内包フラーレンのデバイスへの応用本研究では常磁性内包フラーレンの1, 3-双極子環化付加反応およびカルベン付加反応を用いた種々の常磁性内包フラーレン誘導体を合成した。さらに、得られた常磁性内包フラーレン誘導体の組織化を行い、革新的バルク機能を有する材料の創製を目的としている。本年度は、先ず金属内包フラーレンLa@C82およびLa2@C80をアーク放電により大量に合成し、得られた煤抽出物のHPLC分離により精製を行った。次に合成した金属内包フラーレンについて、カルベン付加反応を用いた機能性置換基の導入を検討した。上記金属内包フラーレンのうち、La@C82は対称性が低いため高位置選択的な付加反応を開発する必要がある。これに対し求電子的なカルベンがLa@C82へ位置選択的に付加することを見いだし、この反応はC82ケージの電子状態とπ電子系曲面の歪みが重要な役割を果たしていることを明らかにした。本年度は、先ず金属内包フラーレンLa@C_<82>およびLa_2@C_<80>をアーク放電により大量に合成し、得られた煤抽出物のHPLC分離により精製を行った。次に合成した金属内包フラーレンについて、1,3-双極子環化付加反応を用いた機能性置換基の導入を検討した。上記金属内包フラーレンのうち、La@C_<82>は24種類の非等価炭素を有するため高位置選択的な付加反応を開発する必要がある。これに対し本反応ではアゾメチンイリドがLa@C_<82>へ位置選択的に付加することを見いだし、この反応はC_<82>ケージの電子状態とπ電子系曲面の歪みが重要な役割を果たしていることを明らかにした。適切な官能基を思い通りに付加させることができれば、金属内包フラーレンの材料科学への応用に対する重要な足掛かりになると考えられる。前年に引き続き、常磁性内包フラーレン(1)La@C_<82>,(2)Ce@C_<82>,(3)Ce_2@C_<80>の大量合成をアーク放電によって集中的に行った。合成した常磁性内包フラーレンはHPLCにより分離精製した。合成したそれぞれの常磁性内包フラーレンについて、光ケイ素化反応、1,3-双極子環化付加反応およびカルベン付加反応を用いた機能性置換基の導入を検討した。

申請者らはすでに求電子的なカルベンがLa@C_<82>へ位置選択的に付加することを見いだしていたが、Ce@C_<82>へも同様に位置選択的にカルベン付加することが分かった。付加位置選択性は、炭素ケージの電子状態とπ電子系曲面の歪みが重要であることが明確となった。C_<80>ケージを有するCe_2@C_<80>への各種反応においても選択的に置換基の導入ができ、X線結晶構造解析による誘導体の構造決定にも成功した。これら得られた知見により、金属内包フラーレンの反応性の予測ができ効率良くフラーレンを誘導体化することが可能となりつつあり、材料創製のために大きな進展となることが期待できる。次世代を切り拓く革新的な電子・光・磁気機能を有する物質の創出を図るため、本研究では磁性内包フラーレンに着目し、その分子変換による構造および電子特性の制御を行う。さらに、得られた常磁性内包フラーレン誘導体の組織化を行い、革新的機能を有する材料の創製を目的とする。前年度に引き続き常磁性内包フラーレン(La@C82,Ce@C82,Ce2@C8。等)の大量合成と分離精製を行なった。合成した常磁性内包フラーレンについて、選択的光ケイ素化反応、1,3-双極子環化付加反応およびカルベン付加反応を用いた置換基の導入を行い、置換基および付加位置の異なる数種の常磁性内包フラーレン誘導体を合成した。誘導体の構造は単結晶X線結晶構造解析により決定した。常磁性内包フラーレン誘導体の組織化体ナノロッド(ナノサイズの針状結晶)の作成を行なった。組織化条件を検討することで、様々な形態およびサイズの集合体を作成した。組織化常磁性内包フラーレンの物性評価として、電子移動度の測定による電荷輸送特性を調べた。誘導体La@C82Adの単結晶およびナノロッドでは異方的な伝導度が観測され、また、これまで報告された電子共役系有機材料の中でも格段に高い電子移動度を示した。これは配向制御されたLa@C82誘導体が非常に優れた電荷輸送特性を有することを示す結果である。常磁性金属内包フラーレンを用いた新規有機材料の開拓に期待が持てると言える。
食品アレルギー治療のための食品アレルギーメカニズムの解析-IgEレセプター高発現B細胞移入動物を利用した基礎的検討-

これまでに、マウスBリンパ腫WEHI-279細胞株をローズベンガルと共に培養後、培養上清中および細胞破砕液中のIgE濃度をELISA法にて測定したところ、ローズベンガルを終濃度100μMで添加したとき培養上清中および細胞破砕液中双方で実験対照群に比して高濃度のIgEが検出された。さらに、WEHI-279細胞を終濃度100μMのローズベンガルと共に培養し、培養後の生細胞中ε鎖mRNAおよびε鎖胚型転写物をRT-PCR法にて測定したところ、実験対照群に比して強いε鎖mRNA発現が認められた。一方、実験対照群とローズベンガル添加群のε鎖胚型転写物発現は同程度であった。以上の結果より、ローズベンガルによるWEHI-279細胞株のε鎖mRNA発現増強およびIgE産生促進作用が示唆された。一方、ローズベンガルはε鎖胚型転写物発現を増強しなかったことから、IgMからIgEへのクラススイッチに影響を及ぼさないことが推察された。そこで、本年度においてはBALB/cマウスを用い、BALB/cマウス脾臓細胞の抗体産生に及ぼす経口投与したローズベンガルの影響について、培養上清中のIgE抗体濃度を指標として検討した。その結果、ローズベンガル経口投与群由来の脾臓細胞培養液中IgE濃度はPBS経口投与群(コントロール)に比して低かった。一方、ロースベンガル経口投与開始2日後にLPSおよびIL-4を腹腔内に投与したマウス由来の脾臓細胞培養液中IgE濃度はPBS経口投与群に比して高かった。以上の結果より、ローズベンガルは単独ではIgE産生を増強しないが、LPS+IL-4存在下ではIgE産生を増強することが示唆された。I型アレルギーに代表されるアレルギー反応は、アレルゲンとIgE抗体の免疫複合体が肥満細胞や好塩基球による血管透過性を亢進し、さらにはアナフィラキシーショックのような重篤な全身症状を呈する。食品アレルギーにおいては、牛乳・大豆・卵といった三大アレルゲン以外の食品成分にもアレルギーを引き起こす症例が多く報告され、原因物質の特定および治療法の確立が早急に求められている。近年、和菓子や餡などに用いられる合成食用色素のローズベンガル(RB)はIgE産生増強作用を有し、I型アレルギーの発症を惹起しうることが明らかとなった。この結果は、三大アレルゲン以外の食品成分である食用色素が生体におけるアレルギーの誘発に関与することを示している。そこで、RBを利用した実験系を確立し、食品アレルギー発症メカニズムの解明を目指した。本年度においては、in vitro実験系でRBの作用機序について検討した。マウスBリンパ腫WEHI-279細胞をRBと共に培養後、培養上清中および細胞破砕液中のIgE濃度をELISA法にて測定したところ、RBを終濃度100μMで添加したとき培養上清中および細胞破砕液中双方で実験対照群に比して高濃度のIgEが検出された。さらに、WEHI-279細胞を終濃度100μMのRBと共に培養し、培養後の生細胞中ε鎖mRNAおよびε鎖胚型転写物をRT-PCR法にて測定したところ、実験対照群に比して強いε鎖mRNA発現が認められた。一方、実験対照群とRB添加群のε鎖胚型転写物発現は同程度であった。以上の結果より、RBによるWEHI-279細胞のε鎖mRNA発現増強およびIgE産生促進作用が示唆された。一方、RBはε鎖胚型転写物発現を増強しなかったことから、IgMからIgEへのクラススイッチに影響を及ぼさないことが推察された。
内皮細胞Primary ciliumの力学特性計測とメカノセンシング機構の解明

細胞は周囲の力学環境に適応して形態および機能を変化させることが知られている.これは細胞が力学刺激を感知・伝達し生化学的信号に変換しているためである.細胞のメカノセンシング機構を理解することは,細胞そして組織の生理・病理に深く関わることから大変重要である.例えば,血管内皮細胞はアテローム性動脈硬化症の発生に深く関与していることが知られており,血流に対する力学応答の観点から盛んに研究が行われてきたがメカノセンシング機構の全容は明らかではない.内皮細胞のメカノセンサとして候補に挙げられている部位にPrimary cilium(一次繊毛)があるが,その力学特性および機能は十分に解明されていない.本研究課題では,これまで直接計測された例のないPrimary ciliumの力学特性を詳細に計測し,流れに対する内皮細胞のメカノセンサとしての同定を試みることを目的とする.初年度は次の項目に取り組んだ.1. Primary Ciliumの単離,2. Primaryciliumの力学特性計測(マイクロフルイディクスデバイスの作製と曲げ試験,マイクロ引張試装置の作製と引張試験およびAFM押し込み試験)である.Primary Ciliumの単離においては,遠心分離法およびカバースリップを用いた単離技術に確立に成功した.Primaryciliumの力学特性計測として,マイクロフルイディクスデバイス技術では流路内においてPrimary ciliumの補足に困難が認められた.マイクロ引張試験装置の開発は順調に行うことができ,Primary ciliumのヤング率は数十kPaとの結果を得ることができた.また,AFM押し込み試験にも成功し,Primary ciliumの局所ヤング率を計測することができ,引張試験と同程度のヤング率を得た.前述したように,Primary Ciliumの単離技術の確立は順調である.単離技術の確立に加えてPrimary Ciliumを単離せずに細胞上で直接力学特性を計測するアプローチについても検討している.Primaryciliumの力学特性計測として,マイクロフルイディクスデバイスによる曲げ試験では,流路内にPrimary Ciliumを補足する要素技術の開発に困難を要しているのが現状である.しかしながら,マイクロ引張試験装置の開発は順調に行うことができ,Primaryciliumの引張試験に成功した他,AFM押し込み試験にも成功しているため初年度の研究進捗状況は概ね順調と言える.Primaryciliumの力学特性計測として,マイクロフルイディクスデバイス作製と曲げ試験については,初年度はPrimary ciliumの補足方法について困難は認められたが,引き続き問題解決に当たりながらデバイス作製を継続する.マイクロ引張試試験において,初年度はマイクロ引張試験機を作製し,Primary ciliumの引張試験を行った.現在,実験データを蓄積しているところであり今年度も継続してデータ収集にを行う.また,引張速度を変えることで粘弾性特性の計測も検討する.AFM押し込み試験において,昨年度は現有のAFMを利用しPrimaryciliumに押し込みによる曲げ試験を行った.今年度はより詳細にPrimary ciliumの力学特性を把握するため,Primary ciliumの長さ方向に対して押し込み位置を変えることでより詳細な局所力学特性の計測を試みる.細胞は周囲の力学環境に適応して形態および機能を変化させることが知られている.これは細胞が力学刺激を感知・伝達し生化学的信号に変換しているためである.細胞のメカノセンシング機構を理解することは,細胞そして組織の生理・病理に深く関わることから大変重要である.例えば,血管内皮細胞はアテローム性動脈硬化症の発生に深く関与していることが知られており,血流に対する力学応答の観点から盛んに研究が行われてきたがメカノセンシング機構の全容は明らかではない.内皮細胞のメカノセンサとして候補に挙げられている部位にPrimary cilium(一次繊毛)があるが,その力学特性および機能は十分に解明されていない.本研究課題では,これまで直接計測された例のないPrimary ciliumの力学特性を詳細に計測し,流れに対する内皮細胞のメカノセンサとしての同定を試みることを目的とする.初年度は次の項目に取り組んだ.1. Primary Ciliumの単離,2. Primaryciliumの力学特性計測(マイクロフルイディクスデバイスの作製と曲げ試験,マイクロ引張試装置の作製と引張試験およびAFM押し込み試験)である.Primary Ciliumの単離においては,遠心分離法およびカバースリップを用いた単離技術に確立に成功した.Primaryciliumの力学特性計測として,マイクロフルイディクスデバイス技術では流路内においてPrimary ciliumの補足に困難が認められた.マイクロ引張試験装置の開発は順調に行うことができ,Primary ciliumのヤング率は数十kPaとの結果を得ることができた.また,AFM押し込み試験にも成功し,Primary ciliumの局所ヤング率を計測することができ,引張試験と同程度のヤング率を得た.前述したように,Primary Ciliumの単離技術の確立は順調である.単離技術の確立に加えてPrimary Ciliumを単離せずに細胞上で直接力学特性を計測するアプローチについても検討している.Primaryciliumの力学特性計測として,マイクロフルイディクスデバイスによる曲げ試験では,流路内にPrimary Ciliumを補足する要素技術の開発に困難を要しているのが現状である.しかしながら,マイクロ引張試験装置の開発は順調に行うことができ,Primaryciliumの引張試験に成功した他,AFM押し込み試験にも成功しているため初年度の研究進捗状況は概ね順調と言える.Primaryciliumの力学特性計測として,マイクロフルイディクスデバイス作製と曲げ試験については,初年度はPrimary ciliumの補足方法について困難は認められたが,引き続き問題解決に当たりながらデバイス作製を継続する.

マイクロ引張試試験において,初年度はマイクロ引張試験機を作製し,Primary ciliumの引張試験を行った.現在,実験データを蓄積しているところであり今年度も継続してデータ収集にを行う.また,引張速度を変えることで粘弾性特性の計測も検討する.AFM押し込み試験において,昨年度は現有のAFMを利用しPrimaryciliumに押し込みによる曲げ試験を行った.今年度はより詳細にPrimary ciliumの力学特性を把握するため,Primary ciliumの長さ方向に対して押し込み位置を変えることでより詳細な局所力学特性の計測を試みる.
養護学校(精神薄弱)高等部における自閉症児にたいする教育内容・指導法に関する調査

本研究は、自閉症児にたいする指導のあり方について、(1)アンケートによる実態調査、(2)教育現場にたいする面接聞き取り調査、の二通りの方法によって明らかにすることを課題とするものである。ここでは、本研究の一環として最近問題となっている養護学校に途中入学してくる自閉症児の教育実態を捉えるために実施した実態調査の結果の要旨を述べる。調査は滋賀県と京都府の障害児学級にたいして行われた。回収数136、回収率36.8%であった。結果の集計はパスキーカード集計システムをしようとして行った。将来養護学校に入学するであろう自閉症児の教育の基本的な考え方については、「A.教科を中心にその中で対人関係の力を育てる」が約20%、「B.遊び・活動などを中心に対人関係を育てることを基本に教科的な力を伸ばす」が約70%、「C.日常生活能力を育てることを中心にしている」が約10%であった。「C」については、京都では約10%、滋賀では約30%と違いがあった。軽度自閉症児の教育集団については、「A.発達遅滞児と同じ集団での指導が有効」が、京都市がともに半数以上、「B.通常の学級の児童と同じ集団での指導が有効」では滋賀が約半数、「C.自閉症児に独自の指導が必要」が、京都で約3分の1の支持であった。自閉症児の教育的措置については、「A.通常の学級」、「B.通級」、「C.固定制の障害児学級」の3つのカテゴリーで見ると、全体としては、「C」の固定制の学級とするものが過半数を占めるが、「通常の学級での指導」が京都10%、滋賀約30%、「通級」が京都約30%、滋賀約50%と、違いが見られた。全体として、自閉症児教育の専門性に関しては、京都で約3分の1の担任が支持しているにすぎなかった。これは、実態として、ほとんどの自閉症児が、発達遅滞との重複障害であることと関係があると思われるが、さらに具体的な内容についての検討を加える必要がある。尚、この研究の成果は、平成6年度滋賀大学実践研究指導センター紀要に掲載する予定である。
唾液腺成体幹細胞の再生能を亢進する因子の解明と治療への応用

胎生期唾液腺原基に特異的に発現する因子の解析として、胎生12日齢マウスの頭頸部凍結組織切片より、口腔粘膜と唾液腺原基を採取し、RNA sequenceを用いて遺伝子発現プロファイルを作成した。また、唾液腺成体幹細胞として酵素処理により分散化した顎下腺よりCD133陽性細胞をフローサイトメトリーで採取した。採取したCD133陽性細胞および陰性細胞についてRNA sequenceを用いて遺伝子発現プロファイルを作成した。胎生期唾液腺原基およびCD133陽性細胞において発現の高い転写因子についてin situ hybridizationを用いて、成獣顎下腺及び胎生期唾液腺原基での局在を確認した。当該年度では胎生期唾液腺原基発生初期段階の上皮部分と口腔粘膜上皮の遺伝子発現プロファイルの作成を目的とした。胎生12日マウス頭部を半割し凍結切片を作成し、レーザーマイクロダイセクションを用いてマウス顎下腺原基の終末部および口腔粘膜上皮を採取した。必要量採取したマウス顎下腺原基の終末部および口腔粘膜上皮からRNAを抽出しcDNAmicroarrayによる網羅的遺伝子解析を行った。作成した唾液腺原基終末部と口腔粘膜上皮の遺伝子発現プロファイルより、唾液腺原基終末部特異的に発現する転写因子5つを候補遺伝子として同定した。次に、同定した5つの転写因子のsiRNAを用いて、胎生13日マウス顎下腺の器官培養での形態変化を解析した。顎下腺器官培養ではsiRNAにより培養2日間後から上皮特異的に遺伝子発現が抑制されることを確認した。顎下腺器官培養の結果より、同定された5つの転写因子のうち1つの遺伝子についてRNAiによる形態変化が認められた。当該遺伝子を抑制した顎下腺では4日間の培養で唾液腺上皮細胞の増殖および分枝が対照群の顎下腺に比べて減少することが明らかとなった。次年度では、形態変化が認められた転写因子の局在解析およびアデノウイルスを用いた遺伝子導入により機能解析を行う。またそのファミリー遺伝子についても、siRNAを用いたマウス顎下腺器官培養や局在解析を行い今後解析を進めていく予定である。胎生12日齢マウスより頭頸部の未固定凍結組織切片を作成し、レーザーマイクロダイセクション法を用いて1口腔粘膜2唾液腺原基直上の口腔粘膜3唾液腺原基の3領域を採取しDNA microarrayおよびRNA sequenceを用いて遺伝子発現プロファイルを作成した。遺伝子発現プロファイルから唾液腺原基直上の口腔粘膜および唾液腺原基で特異的に発現する転写因子を8遺伝子同定した。さらに、候補遺伝子について、in situ hybridizationを用いて唾液腺原基直上の口腔粘膜および唾液腺原基での特異的な発現を確認した。唾液腺成体幹細胞としてBrdU長期保持細胞(LRC)の採取を当初予定していたが、マウス唾液腺においてBrdUの希釈に長期を要するため、酵素処理により分散化した顎下腺よりCD133陽性細胞を唾液腺成体幹細胞としてフローサイトメトリーで採取した。CD133陽性細胞については導管上皮の一部に存在し高いコロニー形成能、スフェア形成能および移植実験での腺組織再構築能が確認された。次に、胎生期唾液腺原基およびCD133陽性細胞において発現の高い転写因子についてin situ hybridizationを用いて、成獣顎下腺及び胎生期唾液腺原基での局在を確認した。さらに、転写因子の機能解析としてアデノウイルスを用いての過剰発現を行った。CD133陰性細胞への転写因子の過剰発現によって高いスフェア形成能を獲得することが確認された。26年度が最終年度であるため、記入しない。再生医療26年度が最終年度であるため、記入しない。胎生期唾液腺の遺伝子プロファイルは作成され候補遺伝子も同定できているが、BrdU長期保持細胞(LRC)については唾液腺のターンオーバーが遅いためBrdUの希釈に長い期間を要するため遺伝子プロファイルの作成はできていない。顎下腺原基終末部と口腔粘膜の比較による候補遺伝子の解析を進めながら同時進行でLRCの遺伝子発現プロファイルの作成をする予定である。顎下腺原基終末部と口腔粘膜の比較による候補遺伝子の局在解析およびアデノウイルスを用いた遺伝子導入により機能解析を行う。同時進行でLRCの遺伝子発現プロファイルの作成も行う予定である。