hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎細胞癌の遠隔転移予防に関する治療学的研究

本研究においては以下の点を明らかにし得た。1)マウス腎腺癌肺高転移株細胞の実験的肺転移をtetracycline系抗菌薬であるminocyclineの投与により抑制することができた。In vitroにおける検討から、癌細胞のtype IV collagen分解能をminocyclineが阻害することによりこの抑制効果が出現したものと考えられた。したがって、このような作用を持つ薬剤を腎細胞癌の転移予防に臨床的にも応用し得る可能性が推測された。現在、この点に関し臨床データーを集積している。2)マウス腎腺癌肺高転移株細胞の実験的肺転移ではさらに、IFN-γ,IL-2に著明な肺転移抑制効果が認められた。両者とも癌細胞の増殖抑制効果を示し、これが肺転移抑制の主たる機序と思われたが、IFN-γは癌細胞の持つtype IV collagen分解能をも抑制したことから、IFN-γの肺転移抑制効果にはこの機序も関与していると推測された。3)ヒト腎細胞癌株を用いた癌細胞と血管内皮細胞の接着・浸潤機序が検討では、(1)両者の接着およびその結果としてのin vitroにおける浸潤が、炎症性サイトカイン(IL-6など)により増強されること、を明らかにした。さらに、(2)この機序はサイトカインによる血管内皮細胞上の接着分子VCAM-1の発現亢進により腎細胞癌細胞上のVLA-4との接着が促進されるためであることも示した。したがって、腎細胞癌におけるIL-6などの炎症性サイトカインの産生抑制あるいは接着分子の機能阻害などが、腎細胞癌の転移抑制に結びつく可能性があろう。1.われわれが確立したマウス腎腺癌の高転移株では、その転移能が癌細胞から分泌されるtype IV collagenaseとそれによるtype IV collagenolysisと良く相関していたことに注目し、この酵素の機能を阻害する薬剤を見出し、これがin vitro浸潤能、in vivo転移能を抑制するか否かを検討した。その結果、teracycline系抗菌薬がマウス腎腺癌のin vitro浸潤能を濃度依存的に抑制する結果が得られた。さらにこれに平行し、この薬剤がtype IV collagenolysisを抑制する結果も認められた。一方、in vitroの浸潤に関与する他の要因である癌細胞の細胞外基質への接着あるいは癌細胞自身の遊走能には全く変化は見られなかった。以上から、teracycline系抗菌薬がtype IV collage-nase活性阻害およびそれにtype IV collagenolysisの抑制により、in vitro浸潤能を抑制したと考えられた。さらに、マウス腎腺癌を用いた実験的肺転移の検討では、tera-cycline系抗菌薬が濃度依存的にマウス高転移株の実験的肺転移を明らかに抑制した。このことは、teracycline系抗菌薬が血管からの腎腺癌細胞のextravasationを、その作用機序であるtype IV collagenolysisの抑制という機序により阻止した物と考えられた。2.これまで、lymphocyted-homing receptorであるCD44が、ある種の癌細胞ではその肺転移能に深く関与していることが指摘されてきた。この点に関して、マウス腎腺癌の転移株で検討したところ、高肺転移株ではその発現が強く認められたのに対し、高肝転移株あるいは低転移株での発現は低かった。したがって、CD44の発現は癌細胞の肺転移能に関与していることが示唆された。われわれのこれまでの検討から、腎細胞癌ではIL-6が産生されており、この産生との転移出現とが平行する所見が得られていた(Journal of Urology,148,1778,1992)。一方、種々のサイトカインが血管内皮細胞上の接着分子の発現に影響することが知られている。

そこで、今年度は炎症性サイトカインであるIL-1,TNF-alpha,IL-6が血管内皮細胞上の接着分子発現にどのような影響を与えるのか、またこの結果が腎細胞癌のin vitro浸潤能にどのような影響を与えるのかを検討した。上記のサイトカインで処理した血管内皮細胞をmatrigelに重層させたin vitro浸潤能測定系を用い、腎細胞癌のin vitro浸潤を検討するといずれのサイトカインの場合も浸潤癌細胞数が明らかに増加した。上記のサイトカインは、【.encircled1.】血管内皮細胞と腎細胞癌細胞の接着を促進したこと、【.encircled2.】一方、腎細胞癌の遊走能およびtypeIV collagenolysisには影響を全く与えなかった。事実、FACSscanでは腎細胞癌細胞上にVLA-4が発現していたが、サイトカインで処理した血管内皮細胞上にはそのligandであるVCAM-1の有意発現が認められた。したがって、サイトカインで血管内皮細胞を処理した場合に腎細胞癌の浸潤能が増強したのは、サイトカインによるJ血管内皮細胞と腎細胞癌との接着が増強したためと考えられた。この結果は、臨床的にIL-6高値の腎細胞癌に転移傾向が強いという事実を一部裏付けるものと考えられた。本年度の研究では、これまでの研究成果を踏まえ、(1)サイトカインによるマウス腎腺癌の浸潤・転移の抑制効果とその機序、(2)血管新生阻害剤によるマウス腎腺癌の転移抑制、(3)tetracyclineを用いた腎細胞癌の転移出現予防効果、を検討した。1)マウス腎腺癌を用いて実験的肺転移に対するIFN-α、γおよびIL-2の効果を検討した。IFN-αは転移抑制効果を示さなかったが、IFN-γあるいはIL-2の投与により濃度依存的に肺転移が抑制された。特にIFN-γとIL-2の併用により両者が相乗的に作用し著明な肺転移抑制効果が得られた。IFN-γおよびIL-2の肺転移抑制効果の機序を検討するために、マウス腎腺癌の皮下移植腫瘍に対する増殖抑制効果を検索した。その結果両者とも移植腫瘍の増殖を抑制した。さらにIFNのtype IV collagenolysis抑制効果を検討した。IFN-αにはこの効果は認められなかったが、IFN-γは明らかな抑制効果を示した。したがって、IFN-γの肺転移抑制効果にはマウス腎腺癌の増殖抑制効果とtype IV collagenolysis抑制効果とが関与していることが推測された。2)血管新生阻害剤fumagilin誘導体(TNP-470)によるマウス腎腺癌の実験的肺転移抑制を検討した。TNP-470はマウス腎腺癌の皮下移植腫瘍の増殖および肺高転移株のDNA合成をいづれも抑制したが、肺高転移株による実験的肺転移は抑制しなかった。肺高転移株が肺転移巣を形成する初期の段落では血管新生の関与は低いことが推測された。3)tetracyline(単独、IFN-γ併用)を用いた腎細胞癌の転移予防効果の臨床的検討では現在まで70例が集積されている。
CNR/プロトカドヘリン分子群における多様性の生理学的意義の解明

CNR/プロトカドヘリンα分子群は、哺乳類を含む脊椎動物の脳神経系で発現する多様化膜分子群であり、これまでの研究結果から、軸索投射に関与する可能性が示唆されている。本研究ではCNR/プロトカドヘリンα分子群の多様性の意義を解明することを目的として、同遺伝子の分子的多様性を改変したマウスを作製した。これらの遺伝子改変マウスは外見上、野生型マウスとの相違は認められなかった。また各遺伝子改変マウスについて同遺伝子の発現量を解析したところ、全体の発現量に大きな変化は無かった。このことからCNR/プロトカドヘリンα分子群には常に発現量を一定に保つ機構が存在することが明らかになった。脳神経系は多様化した神経細胞種から構成され、それらが多数のシナプス結合でつながり合うことで神経回路が形成されている。個々の神経細胞が適切な相手とシナプス結合を形成するには、細胞膜表面分子群による多様化分子認識機構が想定されるが、脳神経系における神経細胞の多様化と組織化をもたらす分子メカニズムについては十分に明らかになっていない。多様化膜分子群であるCNR/プロトカドヘリンαはプロトカドヘリンα1α12,C1,C2からなる14種の分子種からなり、いずれの分子種も主に中枢神経系で発現する。また、個々の神経細胞ではこれら23分子種が異なる組み合わせで発現していることから同分子群は個々の神経細胞における多様性の創出に寄与していることが考えられる。そこで本研究では、CNR/プロトカドヘリンαの分子的多様性神経の細胞多様化と神経回路組織化への機能を明らかにすることを目的とし、CNR/プロトカドヘリンα遺伝子クラスター構造をジーンターゲティング法により変換させCNR/プロトカドヘリンα1分子種のみ発現する遺伝子改変マウスを作製した。このマウスは正常に成育し、外見上野生型マウスとの相違は認められなかった。また、CNR/プロトカドヘリンαmRNAの発現量を野生型マウスと比較したところ、プロトカドヘリンα1分子種は約70倍に増加していたが、分子軍全体の発現量に有意差は認められなかった。このことは同遺伝子において各分子種ごとに発現様式は異なるものの、全分子種の発現量を維持する機構が存在することを示唆している。脳神経系は個性を持った神経細胞が神経回路を形成し組織化されることでシステムとして機能を生み出している。しかし、この脳神経系における神経細胞の多様化と組織化をもたらす分子メカニズムについては十分に明らかになっていない。クラスター型プロトカドヘリンに属するCNR/プロトカドヘリンα分子群は、神経回路形成やシナプス形成に関わる神経細胞間認識に関わる14種類のアイソフォームで構成される多様化膜分子群であり、個々の神経細胞で差次的発現をすることが知られていることから、神経細胞の個性をもたらす分子群であることが示唆されている。そこで本研究ではCNR/プロトカドヘリンαの特徴である分子的多様性や個々の神経細胞での差次的発現は脳システム構築においてどのような生理学的意義があるのかを明らかにするために、CNR/プロトカドヘリンα分子群の発現するアイソフォーム数を減少させ、同分子群の多様性を変化させた種々の遺伝子改変マウスを作製、解析した。作製した各遺伝子改変マウスは外見上、野生型マウスとの相違は認められなかった。また、これらの遺伝子変換マウスにおけるCNR/プロトカドヘリンα分子群の発現を、定量PCR法、in situハイブリダイゼーション法、単一神経細胞での発現解析法より詳細に解析をしたところ、発現するアイソフォーム数を変換させても同遺伝子全体の発現量に大きな変化は無かった。さらに同遺伝子にはアイソフォームを確率的に発現するメカニズムと恒常的に発現するメカニズムが存在することも示唆された。クラスター型プロトカドヘリンに属するCNR/プロトカドヘリンα分子群は、哺乳類を含む脊椎動物の脳神経系で発現する多様化膜分子群であり、マウスでは14種のファミリー分子(α1α12, c1, c2)が存在し、いずれの分子種も細胞外ドメインにカドヘリンモチーフを有する1回膜貫通型分子である。これらの遺伝子について発現様式を単一神経細胞に対するRT-PCRで解析した結果、同分子群は個々の神経細胞ごとに異なる24種の分子種を発現しており、また、この遺伝子発現は対立染色体ごとでに独立したものであった。そこで本研究ではCNR/プロトカドヘリンαの特徴である分子的多様性や個々の神経細胞での差

次的発現は脳システム構築においてどのような生理学的意義があるのかを明らかにすることを目的として、CNR/プロトカドヘリンα分子群の1分子種のみを発現、すなわち同分子群の多様性を欠失した遺伝子改変マウス(Pcdhα1マウス)を作製した。Pcdhα1マウスは外見上、野生型マウスとの相違は認められず、交配維持が可能であった。以前、Pcdhα全分子種を発現しない遺伝子ノックアウトマウスを作製し、匂い受容体遺伝子にlacZ遺伝子をノックインしたマウスと交配することで嗅神経細胞の異常について解析したところ、嗅神経投射において異所性の糸球体が観察された。しかし、同様の実験をPcdhα1マウスで行ったところ、嗅神経投射に異常は観察されなかった。このことから正確な嗅神経投射にはCNR/プロトカドヘリンαの分子的多様性は関与していないことが示唆された。また、Pcdhα1マウスにおけるCNR/プロトカドヘリンαmRNAの発現様式を解析したと.ころ、発現する分子種を1つにしても、同遺伝子全体の発現量に大きな変化は無かった。このことからCNR/プロトカドヘリンα分子群には常に発現量を一定に保つ機構が存在することが明らかになった。
頭蓋内病変に対する陽子線治療の最適化に関する基礎的研究

脳腫瘍に対する陽子線治療の効果を最適化するために、腫瘍細胞に対する陽子線の生物学的効果の不確実性を減少させるとともに、放射線抵抗性の解析を行った。培養細胞とDNA溶液を対象とした研究では、まず陽子線のDNA塩基損傷と糖鎖切断の特徴を明らかにした。次に、陽子線のエックス線に対するRBEを異なるエンドポイントで明らかにした。一方、照射後の細胞から放射線抵抗性クローンを単離し、それらのがん幹細胞性質を明らかにすることで、今後の放射線抵抗性克服の手掛かりとした。高エネルギー陽子線のエックス線に対する生物学的効果比(RBE)の検討200MeV陽子線と、10MVエックス線を培養細胞(0NS76,MOLT4)に照射し、コロニー形成アッセィ、Annexin-Vを用いたFCMによるアポトーシスの定量化、γ-H2AXfocusの染色による二本鎖DNA切断の定量的解析を行った。その結果、同じ物理線量を照射しても陽子線の方が早期にアポトーシスを誘導し、最終的な細胞死も陽子線照射後は、エックス線照射後の1.5倍となった。また二本鎖DNA切断によるγ-H2AX focusの出現は照射後30分でピークとなり、陽子線でエックス線に対して1.4-1.8倍のfocus作ることが明らかになった。コロニー形成能によるRBEは1.06であった。陽子線のエックス線に対するRBEは1.1とされているが、二本鎖DNA切断や細胞死の誘導においては1.4-1.8と高いことが示唆された。陽子線の放射線化学的効果の検討サケ精子DNA溶解液に対してエックス線および陽子線のLETを変化させて10Gy照射し、生成されるラジカルによつてDNAから切り.出される80H-dGの生成量を.HPLCにて測定した。その結果、エックス線、1keV/μm、4keV/μm陽子線の順に80H-dGの生成量が減少し、その比は、約1:0.8:0.5であり、酸素の存在、温度により若干影響を受けた。これまで陽子線の生物学的効果はエックス線と同等で、放射線化学的にも陽子線の効果は間接効果が主であると想定されてきたが、陽子線とエックス線ではDNA損傷のメカニズムが異なることが示唆された。陽子線のエックス線に対する生物学的効果比(RBE)の検討【目的】陽子線治療の生物学的不確実性を克服し、陽子線治療の最適化を目指す。【方法】ヒト腫瘍培養細胞(ONS76,MOLT4)に、200MeV陽子線(SOBP中央部)と、10MVエックス線を同じ条件で照射し、(1)Annexin-Vによるアポトーシスの定量化、(2)γ-H2AX focusの染色によるDNA二本鎖切断の定量的解析、(3)コロニー形成アッセイ、を行った。【結果】(1)陽子線はエックス線よりも早期にアポトーシスを誘導した。また、陽子線はエックス線の1.28倍の細胞死を誘導した。(2)γ-H2AX focusの出現は照射後30分でピークとなり、陽子線はエックス線の1.29-1.56倍のDNA二本鎖切断を生じた。(3)コロニー形成能によるRBEはONS76では1.06、MOLT4では1.20であった。【結論】陽子線のエックス線に対する一般的RBEは1.1とされてしいるが、他のエンドポイントや細胞の種類により高値となることが示された。陽子線の放射線化学的効果の検討【目的】陽子線の細胞傷害性におけるラジカルの関与を明らかにし、陽子線治療の最適化を目指す。【方法】(1)サケ精子DNA溶解液に対してエックス線および陽子線(0.4keV/μm、4keV/μm)を10Gy照射し、ラジカル消去剤(エダラボン)添加前後で80H-dGの生成量を測定した。(2)ヒト腫瘍培養細胞(MOLT4)にエックス線および陽子線(0.4keV/μm、4keV/μm)を照射し、エダラボン添加前後でγ-H2AX focusの染色によるDNA二本鎖切断を定量化した。【結果】エックス線、0.4keV/μm、4keV/μm陽子線の順に80H-dGの生成は減少し、エダラボンはエックス線の80H-dGの生成を最も強く抑制した。また、エダラボンはエックス線照射1時間以内のDNA二本鎖切断の出現を有意に抑制した。【結論】陽子線とエックス線ではDNA損傷におけるラジカルの関与が異なることが示唆された。本課題では現下の陽子線治療に伴う「生物学的不確実性」を克服し、頭蓋内疾患に対する陽子線治療の効果を向上させるために、(1)高エネルギー陽子線のラジカルを介する放射線化学的効果の検討、(2)異なる生物学的エンドポイントにおける陽子線のRBEの検討、(3)悪性脳腫瘍幹細胞と放射線耐性の解析、を行なった。

課題(1)、ラジカル:陽子線(150MeV)の異なる2点(plateau, Bragg peak)とエックス線(200kV)のlineal energy値(y値)を測定した。それらの各点でssDNA溶液を照射し、生じる8-OHdGを測定して酸化損傷の違いを明らかにした。さらに、ラジカル消去剤エダラボンによりラジカルの作用を抑制した場合の酸化損傷の変化を明らかにした。また、各点での照射後に、ssDNAと腫瘍細胞(MOLT4)に生じるDNA二本鎖切断の頻度を明らかにした。現在、これらの結果を論文として執筆中である。課題(2)、生物学的効果比(RBE):脳腫瘍細胞(ONS76)と急性白血病細胞(MOLT4)を用いて、陽子線(200MeV)のエックス線(10MV)に対するコロニー形成アッセイによるRBEを明らかにした。さらに、各照射により誘導されるアポトーシスとDNA二本鎖切断を定量的に解析して、異なった生物学的エンドポイントにおける陽子線とエックス線との違いを明らかにし、論文として発表した。課題3、がん幹細胞:培養脳腫瘍細胞(ONS76)から放射線耐性クローンを20株単離した。それらを対象としてCD133の発現を解析したところ、8クローンで上昇がみられ、特に3クローンでは大幅な上昇がみられた。これらの3クローンではSP分画も増加し、コロニー形成アッセイやSphere形成アッセイでも増殖能の上昇がみられ、がん幹細胞の特性をもつことが示唆された。
摂食コントロールによる新しい炎症性腸疾患治療

大腸炎モデルマウスを絶食ー再摂食させて炎症の回復過程を検証したところ、絶食マウスは非絶食マウスよりも腸炎からの回復が早く、食物線維を含まない餌(非線維食)で再摂食させると回復が遅れた。腸炎からの回復が遅れる非線維食で再摂食させたマウスに有機酸を注腸で加えると、乳酸、酪酸を加えたマウスで腸炎からの回復が促された。通常食で再摂食させたマウスの腸内細菌叢では、乳酸菌の比率が増加し、糞便中の乳酸濃度も上昇していた。以上から、絶食ー再摂食することにより増殖する乳酸菌が産生する乳酸が、腸炎からの回復に重要な役割を果たしていることが示唆された。この結果は腸炎の治療に新たな可能性を与えてくれるものである。我々はこれまでにマウス絶食ー再摂食モデルにおいて、再摂食時に大腸上皮細胞回転の一過性亢進が起こり、これは乳酸菌が食物繊維を代謝して産生する乳酸に依存すること、発癌物質の暴露タイミングと摂食を協調操作することで、発癌のコントロールが出来ることを見出してきた。そこでこの知見に基づき、摂食コントロールによって大腸炎症が抑制できないかどうか検討を行った。5週齡の雄C57BL/6JマウスにDSSで大腸炎を作成し、絶食ー再摂食させて炎症の回復程度を検証したところ、絶食ー再摂食群は非絶食群に比べて炎症からの回復が早く、非繊維食(ORS)で再摂食群させても回復は遅延した。続いてORSで再摂食させたマウスに酢酸、酪酸、乳酸の注腸を加えたところ、酢酸、乳酸のみが摂食依存性に炎症回復を促進させた。これらの結果から、発癌モデルと同様に食物繊維から産生される乳酸が絶食ー再摂食が誘導する炎症回復に重要であることが示唆される。実際にT-RFLP解析で腸内細菌叢を調べると通常食での絶食ー再摂食群では乳酸菌の比率が増加していた。さらに乳酸が炎症回復を促進するメカニズムについて栄養シグナル系に着目して検証すると、通常食での絶食ー再摂食群と乳酸注腸群でのみ、mTORシグナル系の下流分子の発現が抑制されていた。これらのことから、大腸炎の回復期に絶食ー再摂食を行うと、増殖した乳酸菌が食物繊維を代謝し産生された乳酸が、直接あるいは間接的に大腸上皮に作用し、炎症回復を促進している機構が働くことが推測される。現在さらなる分子生物学的な機構の解明に取り組んでいるところである。DSSによる大腸炎の作成にマウスの個体差が大きく、至適条件の決定に時間を要したため。炎症性サイトカインの解析結果から栄養シグナル系の関与を推測するまでに、各種分子の解析を行う必要があり、これに時間を要したため。我々はこれまでにマウス絶食ー再摂食モデルにおいて、絶食時に大腸上皮細胞回転が停止する一方、再摂食時には一過性亢進が起こり、この現象が食物繊維を代謝して産生された乳酸に依存すること、大腸上皮細胞への発癌物質の暴露タイミングと摂食を協調操作することで、発癌のコントロールが出来ることを見出してきた。そこでこの知見に基づき、摂食を操作することで大腸の炎症が抑制できないかどうかの検討を行った。5週齡の雄C57BL/6Jマウスにデキストラン硫酸(DSS)で大腸炎を作成し、絶食ー再摂食させて炎症の回復過程を検証したところ、絶食ー再摂食群は非絶食群と比べて体重、陰窩数ともに回復が早く、非繊維食(経口補水塩:ORS)で再摂食させても回復は遅延した。同様に絶食ー再摂食群は非絶食群と比べて大腸組織中の炎症性サイトカイン(IL-1b, IL-17)発現が有意に抑制されたが、ORS再摂食群では抑制されなかった。この結果は絶食と栄養シグナルに加え、腸内細菌由来の食物繊維が腸炎からの回復に必要であることを示唆している。これまでの知見から、この系においても乳酸が関与している可能性が高いと考えた我々は、腸炎からの回復が遅延するORS再摂食群に乳酸を含む有機酸を注腸して加えたところ、乳酸、酪酸を加えた群で腸炎からの回復が促進された。また通常食での再摂食群では、T-RFLP解析で腸内細菌叢を調べると、乳酸菌の比率が増加しており、大腸内容物の有機酸分析でも乳酸の濃度が上昇していた。以上より我々のこれまでの知見と同様に、大腸炎モデルにおいても、絶食ー再摂食することで大腸内で増殖する乳酸菌由来の乳酸が、炎症からの回復過程に重要な役割を担っていることが示された。このことは摂食を操作することで大腸炎からの治癒を促進できることを示唆している。

以上から、絶食ー再摂食することにより増殖する乳酸菌が産生する乳酸が、腸炎からの回復に重要な役割を果たしていることが示唆された。この結果は腸炎の治療に新たな可能性を与えてくれるものである。本研究系においても乳酸の関与が示唆される。注腸での乳酸投与実験に加えて、乳酸含有餌を作成し、投与実験を行う予定である。また、栄養シグナル系は下流でT細胞分化に関わっており、これが炎症を抑制している可能性があるため、大腸粘膜固有層に存在するT細胞を分離し、そのフェノタイプを解析する準備を進めている。最終的には初発の潰瘍性大腸炎患者における大腸粘膜での解析も目指したい。消化器内科学(下部消化管)申請時に予定していた実験の進捗に若干の遅れが発生しているため。各実験における動物、消耗品購入費、腸内細菌叢解析、学会発表や論文投稿にかかる諸経費に充てる。
多彩な遺伝子異常に対応可能な風邪ウイルスを用いた癌の治療

【背景】アデノウイルスベクターを用いた癌の遺伝子治療ではいかに多くの腫瘍細胞にウイルス感染を誘導できるかが問題となる。解決策の一つとして制限増殖型のE1B55kを欠失した変異アデノウイルス(ONYX-015)が開発され、その有用性が既に報告されている。しかし、ONYX-015はP53経路に異常のある癌細胞でのみ有効て、全ての癌に適応があるとはいえない。癌細胞ではP53経路またはRB経路に異常が存在するため、RB経路を標的とする治療戦略も有用と考える。【目的】早期発現遺伝子E1Aに変異が存在すると、アデノウイルスはRB/E2F解離が誘導できずに正常細胞では増殖しない。しかし、RB経路に異常が存在する癌においてはRBからE2Fが遊離するため、このE1A変異アデノウイルスは増殖可能となり殺腫瘍効果を示すことが報告されている。本研究ではE1B55kのみならず、E1Aにも変異の存在するアデノウイルス(AxdAdB-3)を作製し、膵癌に対する抗腫瘍効果を検討レた。さらに、E1Aの血管新生抑制作用についても検討を加えた。【まとめ】変異アデノウイルスは癌細胞で特異的に増殖し、癌の遺伝子変異の違いに関わらず強い抗腫瘍作用を示した。この変異アデノウイルスをベクターとして活用する遺伝子治療を開発したい。【背景】アデノウイルスベクターを用いた癌の遺伝子治療では、いかに多くの腫瘍細胞にウイルス感染を誘導できるかが問題となる。しかし、ONYX-015はP53経路に異常のある癌細胞でのみ有効で、全ての癌に適応があるとはいえない。癌細胞では、p53経路またはRB経路に異常が存在するため、RB経路を標的とする治療戦略も有用と考える。私の研究ではE1Aに変異の存在するアデノウイルス(AxdAdB-3)を作製し、膵癌に対する抗腫瘍効果を検討している。【まとめ】我々の戦略が正しいことがこれまでの実験結果から明らかとなった。癌の性格に関わらず抗腫瘍作用が得られる治療法が確立できる可能性がある。
高出力紫外レ-ザ用光学平面の超精密加工と評価

本研究は、紫外の高出力レ-ザに使用できる高精度、高透過率もしくは高反射率、高レ-ザ耐力、高信頼性を有する平面光学素子を提供し、高出力エキシマ・レ-ザおよびレ-ザ核融合の開発を側面より強力に支援することを究極の目的とする。本年度は、以下のように紫外用光学材料の超精密加工、加工表面の微細表面粗さ測定システムの構築、高出力レ-ザ照射による表面機能の測定を行なった。1)レ-ザ・ガラスを超精密平面研削盤とSD1500ー75ーBダイヤモンド砥石を使用するワンパス研削により、表面粗さRmax5nm以下の光学面が得られた。紫外用反射鏡材料としてはCVD-SiC on SiCが理想的な材料と考えられ、これをフロ-ト・ポリシングした。CVD膜の配向性が十分でなく、膜内の結晶方向が一定でないため、粒界段差が生じたが、単一結晶粒内では0.2nmrms以下の表面粗さが得られた。今後はより配向性の良いCVD-SiC膜の作製を図る。透過用材料として合成石英を選び、これをフロ-ト・ポリシングした結果、表面粗さ0.14nmrmsが得られた。2)超鏡面の表面評価法を確立するために、米国マイケルソン研究所のベネット博士を招へいして、Talystepによる世界最高感度の触針式表面解析システムを構築し、ノイズレベル0.05nmrms以下の表面粗さ測定を可能にした。セイコ-電子工業と共同で、ノマルスキ-式微分干渉顕微鏡塔載の走査型トンネル顕微鏡を開発し、各種表面の評価を行なった。導電性のない試料に対しては日本電子と共同で、大型試料用マグネトロンスパッタ装置を開発し、購入・設置した。3)超精密研削および光学研磨したレ-ザ・ガラスLHGー8表面に集光した高出力レ-ザを照射して、レ-ザ耐力を測定した結果、従来の光学面のレ-ザ耐力15J/cm^2に対し、研削面では25J/cm^2が得られた。本研究は、紫外の高出力レ-ザに使用できる高精度・高透過率もしくは高反射率、高レ-ザ耐力,高信頼性を有する平面工学素子を提供し、高出力エキシマ・レ-ザおよびレ-ザ核融合の開発を側面より強力に支援することを究極の目的とする。本年度は、以下のように紫外用光学材料の超精密加工、加工表面の微細表面粗さ測定システムの構築、高出力レ-ザ照射による表面機能の測定を行った。1)レ-ザ、ガラスを超精密平面研削盤とSD1500-75-Bダイヤモンド砥石を使用するワンパス研削により、表面粗さRmax5nm以下の光学面が得られた。紫外用反射鎖材料としてはCVD-SiC on SiCが理想的な材料と考えられ、これをフロ-ト・ポリシングした。今後はより配向性の良いC'VD-SiC膜の作製を図る。

2)超鎖面の表面評価法を確立するために、米国マイケルソン研究所のベネット博士を招へいして、Talystepによる世界最高感度の触針式表面解析システムを構築し、ノイズレベル0.05nmrms以下の表面粗さ測定を可能にした。セイコ-電子工業と共同で、ノマルスキ-式微分干渉顕微鏡搭載の走査型トンネル顕微鏡を開発し、各種表面の評価を行なった。導電性のない試料に対しては日本電子と共同で、大型試料用マグネトロンスパッタ装置を開発し、購入・設置した。3)超精密研削および光学研磨したレ-ザ・ガラスLHG-8表面に集光した高出力レ-ザを照射して、レ-ザ耐久を測定した結果、従来の光学面のレ-ザ耐力15J/cm^2に対し、研削面では25J/cm^2が得られた。
PI3Kをターゲットとした難治性喘息における粘液産生制御の検証

難治性喘息のひとつの病型として、杯細胞の過形成や粘液栓形成の関与が報告されている。粘液栓については気道上皮細胞からのMUC5AC産生が重要であるほか、近年粘液栓の粘ちょう性に好酸球ETosisが関与することが明らかになっている。本研究では、粘液産生の制御に着眼し、動物実験等からその制御に関与することが示唆されているPI3Kγについて、PI3Kγ選択的阻害薬の粘液産生への影響およびそのメカニズムについて検討することで難治性喘息の新規治療薬探究への基盤的知見を得ることを目的としている。平成29年度はEGF刺激による気道上皮細胞株からのMUC5AC産生をPI3Kγ選択的阻害薬が有意に抑制するという知見を得た。近年、複数の論文で気道上皮細胞からのIL-8やGM-CSFが気道上皮細胞からのMUC5AC産生を誘導するという報告がなされている。その結果をうけ、平成30年度はeotaxin刺激による気道上皮細胞からのIL-8、GM-CSF産生をPI3Kγ選択的阻害薬が抑制するかをELISA法を用いて検討した。結果、PI3Kγ選択的阻害薬は気道上皮細胞からのIL-8、GM-CSF産生を有意に抑制するという知見が得られた。加えて平成30年度は、PI3Kγ選択的阻害薬の好酸球ETosisへの影響を検討した。ヒト分離好酸球をSYTOX IgAで刺激することで好酸球のETosisが誘導できるが、この反応をPI3Kγ選択的阻害薬が抑制する現象を複数回観察している。今後は、好酸球ETosisに対するPI3Kγの関わりをさらに検討していく予定である。平成30年度は、気道上皮細胞からのMUC5AC産生ならびにIL-8、GM-CSF産生をPI3Kγ選択的阻害薬が有意に抑制することを確認できた。また平成30年度は好酸球ETosisに対するPI3Kγの関与についても検討を行い、複数回の検討でPI3Kγ選択的阻害薬が好酸球SYTOX IgAによるETosisの誘導を抑制するという結果を得ている。平成31年度はこの好酸球ETosisへの関わりをさらに検討するとともに、これまで得られた知見を国内外の学会でひろく発信していく予定である。平成31年度は、主に好酸球ETosisに対するPI3Kγの関わりについてさらに検討を加えていく。具体的には現在すすめているSYTOXIgA刺激による好酸球ETosisについてのPI3Kγ選択的阻害薬の影響について、位相差観察、共焦点観察、電子顕微鏡による観察で、現在まで確認できているPI3Kγ選択的阻害薬による抑制現象を再現できるか検討を重ねて行く。以上の実験系についてはPan-PI3K阻害薬も同様にして行い、Pan-PI3K阻害薬とPI3Kγ選択的阻害薬のETosisに与える影響の違いなども検討していく。平成29年度、平成30年度で気道上皮細胞からのMUC5AC産生やサイトカイン産生におけるPI3Kγの関わりについては、有意な実験結果が得られている。そのため平成31年度は、これまで得られた知見を国内外に学会発表や論文発表でひろく発信していく予定である。難治性喘息のひとつの病型として、杯細胞の過形成や粘液栓の産生の関与が報告されている。粘液栓については杯細胞でのMUC5AC産生が重要であるほか、近年粘液栓の粘ちょう性に、活性化し細胞死した好酸球からのDNA放出(ETosisによるDNA traps)が関与することが明らかになった。本研究では、粘液産生の制御に着眼し、動物実験等からその制御に関与することが示唆されているPI3Kγについて、PI3Kγ選択的阻害薬の粘液産生への影響およびそのメカニズムについて検討することで難治性喘息の新規治療薬探究への基盤的知見を得ることを目的とする。平成29年度は、粘液産生機構へのPI3Kγの関与を検討するために、ヒト気道上皮細胞株、NCI-H292を用いて、EGFRのligandであるEGF刺激によるMUC5AC産生へのPI3Kγ選択的阻害薬、AS605240の影響を検討した。基礎研究として、EGF刺激によるNCI-H292細胞株からのMUC5AC産生をRT-PCR法を用いて、その産生を確認。その後、MUC5AC産生へのPI3Kγの影響を検討した。AS605240で前処理後、気道上皮細胞株をEGFで刺激し、刺激後の検体についてMUC5ACの産生をRT-PCRで検討した。結果、EGF刺激によるMUC5AC産生をPI3Kγ選択的阻害薬の前処理により、有意に抑制することがわかった。今後は刺激上清でのELISA法での検討の追加やシグナル経路の解析など実験を行っていきたいと考えている。気道上皮細胞株からの粘液産生機構におけるPI3Kγの関わりについて、RT-PCR法を用いた検討で、有意差をもった検討結果が確認できた。今後追加の実験が必要となる部分もあるが、平成29年度での実験計画については概ね順調に進展していると考えている。平成30年度は、シグナル経路の解析などの検討の追加と、好酸球のETosisに対するPI3Kγの関わりについて検討を重ねる予定である。

粘液栓については気道上皮細胞からのMUC5AC産生が重要であるほか、近年粘液栓の粘ちょう性に好酸球ETosisが関与することが明らかになっている。本研究では、粘液産生の制御に着眼し、動物実験等からその制御に関与することが示唆されているPI3Kγについて、PI3Kγ選択的阻害薬の粘液産生への影響およびそのメカニズムについて検討することで難治性喘息の新規治療薬探究への基盤的知見を得ることを目的としている。平成29年度はEGF刺激による気道上皮細胞株からのMUC5AC産生をPI3Kγ選択的阻害薬が有意に抑制するという知見を得た。近年、複数の論文で気道上皮細胞からのIL-8やGM-CSFが気道上皮細胞からのMUC5AC産生を誘導するという報告がなされている。その結果をうけ、平成30年度はeotaxin刺激による気道上皮細胞からのIL-8、GM-CSF産生をPI3Kγ選択的阻害薬が抑制するかをELISA法を用いて検討した。結果、PI3Kγ選択的阻害薬は気道上皮細胞からのIL-8、GM-CSF産生を有意に抑制するという知見が得られた。加えて平成30年度は、PI3Kγ選択的阻害薬の好酸球ETosisへの影響を検討した。ヒト分離好酸球をSYTOX IgAで刺激することで好酸球のETosisが誘導できるが、この反応をPI3Kγ選択的阻害薬が抑制する現象を複数回観察している。今後は、好酸球ETosisに対するPI3Kγの関わりをさらに検討していく予定である。平成30年度は、気道上皮細胞からのMUC5AC産生ならびにIL-8、GM-CSF産生をPI3Kγ選択的阻害薬が有意に抑制することを確認できた。また平成30年度は好酸球ETosisに対するPI3Kγの関与についても検討を行い、複数回の検討でPI3Kγ選択的阻害薬が好酸球SYTOX IgAによるETosisの誘導を抑制するという結果を得ている。平成31年度はこの好酸球ETosisへの関わりをさらに検討するとともに、これまで得られた知見を国内外の学会でひろく発信していく予定である。EGF刺激による気道上皮細胞からのMUC5AC産生をPI3Kγ選択的阻害薬が有意に抑制するという結果をうけ、今後は、同様の刺激によって得られた上清におけるMUC5ACの産生についてELISA法を用いて検討を重ねる。加えて、ERKやMAPKなどのシグナル経路に対するPI3Kγの関わりについて検討を加える。さらに、粘液の粘ちょう性に関わるとされる好酸球ETosisについてPI3Kγの関与を検討していく。具体的には、ヒト好酸球からETosis誘導を引き起こすことが明らかとなっている、SYTOX IgA刺激や、IL-5 + PMA刺激の前に、好酸球をPI3Kγ選択的阻害薬で前処理し、好酸球ETosisの誘導が抑制されるかを、位相差観察、共焦点観察、電子顕微鏡による観察にて検討する。平成31年度は、主に好酸球ETosisに対するPI3Kγの関わりについてさらに検討を加えていく。具体的には現在すすめているSYTOXIgA刺激による好酸球ETosisについてのPI3Kγ選択的阻害薬の影響について、位相差観察、共焦点観察、電子顕微鏡による観察で、現在まで確認できているPI3Kγ選択的阻害薬による抑制現象を再現できるか検討を重ねて行く。以上の実験系についてはPan-PI3K阻害薬も同様にして行い、Pan-PI3K阻害薬とPI3Kγ選択的阻害薬のETosisに与える影響の違いなども検討していく。
異種組織界面における水チャネル分子ＡＱＰ１の存在意義の解明

我々は物理的性質の異なる組織境界面に水チャネル分子であるアクアポリン-1 (AQP1)を強く発現する細胞群が存在することを発見し、その発生学的、および組織学的特徴を明らかにした。これらの異種組織境界のAQP1陽性細胞は、細胞骨格が未熟で巨大な細胞表面積/体積比を持つ全く新しいカテゴリーに分類(異種組織連結細胞)できる細胞であることが示唆された。歯科領域では無細胞セメント芽細胞と歯槽骨表層細胞がこれに相当した。これらの異種組織連結細胞に発現する結合組織性のAQP1は水分子輸送よりもむしろ、細胞の変形・運動に伴う細胞内外への水分子の移動に関与している可能性が示唆された。物理的性質の異なる組織が連結する部位に、特異的にアクアポリン1陽性細胞が局在する。多くのアクアポリン1陽性細胞は密生結合組織の組織境界面に存在することから、コラーゲン合成との関連が推察されたため、コラーゲン合成に不可欠なL-gulono-gamma-lactone oxidase欠損モデルラット(od/od)の歯根膜の免疫組織学的解析を行った。これらのラットでは、歯根膜腔は拡大し、コラーゲン形成障害によるものと思われる疎らな歯根膜線維が観察された。アクアポリン1陽性細胞はアクアポリン発現を減弱することなく、むしろ、アクアポリンの免疫活性が上がっている像が観察された。これにより、これらの細胞でのアクアポリン1の発現はコラーゲンの合成とは無関係であることが示唆された。歯根膜細胞の一次培養石灰化誘導実験では、誘導とともにアクアポリン1の発現は上昇したが、石灰化は見られなかった。これは、アクアポリン1の発現は石灰化には直接的には関与していないことが示唆された。また、細胞骨格との関連で、これらの細胞は線維性アクチンフィラメントに対して陰性を示した。これは、組織境界におけるアクアポリン1陽性細胞の特徴として、未熟な細胞骨格を持っていることを示唆していた。アクアポリン1との様々な免疫多重染色を行い、アクアポリン1陽性細胞は組織に依存した異なる免疫組織学的特徴を持ち、それらの細胞の生物学的役割には多様性があることが示唆された。しかしながら、本細胞は共通の特徴として、無数の細胞突起を持ち、かつ、大きな細胞表面積を持ち、異なる組織境界面に局在していることがわかった。アクアポリン1の発現は組織境界という特殊環境における何らかの共通の機能を果たしていることが推測された。我々はラット歯牙組織発生過程の研究遂行中、物理的性質の異なる組織が連結する部位に、特異的にAQP1陽性細胞が局在することを発見した。これら組織界面に位置するアクアポリン1陽性細胞群は無細胞セメント質や固有歯槽骨表層で観察されたアクアポリン陽性細胞同様、無数の細胞突起を発達させていた。また、歯根膜同様な組織形態、機能を持つ腱組織を観察すると、腱組織にもアクアポリン陽性細胞が密に分布していた。組織学的観察結果は歯根膜アクアポリン陽性細胞は腱細胞と同様な性質を有し、組織界面の構成に深く関与していることを想像させた。しかしながら、異種組織界面に存在するアクアポリン陽性細胞の細胞学的特性は未だ不明である。アクアポリン陽性細胞は強靱な運動器・咀嚼器の連結部分において見られるだけではなく、骨組織-鼻粘膜、口蓋粘膜-骨組織、皮筋-表皮、毛包-皮膚といった機械的ストレスの弱い部位にも存在するので、これらの細胞は新しい結合組織細胞の一種として分類できる可能性を示していた。次に我々は、アクアポリン陽性細胞の発生学的動態の解析により。様々な硬組織-軟組織移行部の発生および形成に大きく関与していることを明らかにした。咬筋の発生では咬筋筋膜形成部位、および顎骨埋入部位の発達にアクアポリン陽性細胞が関与していることが明らかとなった。また、歯根膜細胞の一次培養を行い、石灰化誘導培地により石灰化誘導を行うとアクアポリンの発現に変化が見られることが明らかになった。アクアポリンは歯根膜細胞の分化および形態変化に何らかの役割を果たしていることが示唆された。我々は物理的性質の異なる組織境界面に水チャネル分子であるアクアポリン-1 (AQP1)を強く発現する細胞群が存在することを発見し、その発生学的、および組織学的特徴を明らかにしてきた。上皮組織に発現するAQP1は水分子の輸送に関与するが、これらの異種組織連結細胞に発現する結合組織性のAQP1の役割は全く不明であった。

これらの組織境界では水分子の輸送や浸透圧の調整との関連性が薄いことから、歯根膜異種組織連結細胞(セメント芽細胞・歯槽骨表層細胞)でのAQP1は全く新しい機能を担っていると考えられた。歯根膜細胞の石灰化誘導実験では石灰化の誘導とともにAQP1の発現は上昇し、培養細胞の形態は線維状から楕円状へと変化したことから、AQP1は歯根膜細胞の形態の変化に関与している可能性が示唆された。また、異種組織連結細胞でのAQP1の役割については、AQP1陽性異種組織連結細胞は組織境界でその物性の違いによる過大な機械的ストレスにさらされることが予想されることから、これらの細胞はAQP1の発現によって、水分子の細胞内外への透過性を上げることによって水分子の移動を容易にし、受動的な変形することによって機械的ストレスを減衰している可能性が示唆された。これらの特殊な結合組織におけるAQPの役割を解明するためにCRISPR/Cas9システムを用いたAQP1遺伝子欠損マウスの作製を試みた。その結果、4系統の遺伝子欠損マウスの作製に成功した。今後は、これらの仮説を実証するために、AQP1遺伝子欠損マウスの表現形を解析することによって結合組織性のAQP1の役割を解明する。口腔解剖学正常組織での組織学的解析、および、vitroでの遺伝子発現プロファイルの解析を終え、更に石灰化とアクアポリンの発現の関係を解析した。また、壊血病モデルラットを用いてコラーゲン合成との関連を解析しアクアポリン発現とコラーゲン合成との関連を解析した。その結果、アクアポリンは細胞の果たす機能に特異的な役割というよりも、むしろ、細胞境界の特殊な環境に必須の細胞生物学的、あるいは、細胞生理学的役割を持っていることが推測される。これらの、生理学的、細胞生物学的役割を解析するため、アクアポリン1遺伝子欠損マウスを作成し解析を進める予定である。我々は、形態学的、発生学的所見より、アクアポリン陽性細胞は生体各所に存在し、また、石灰化組織と密接な関係があることを確認した。これらの結果にもとづいて、細胞レベルでのアクアポリンの役割を検討するため、身体の様々な細胞の一次培養を行い、石灰化誘導培地により石灰化を誘導し、石灰化におけるアクアポリンやそのほかの細胞分化マーカーの発現がどのように変化するのか解析中である。アクアポリン1遺伝子改変マウス作成について、ゲノムデータベースを検索しアクアポリン1遺伝子の構造を特定、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集ストラテジーおよびガイドRNAを決定する。決定したデザインに基づき。ガイドRNAおよびCas9発現ベクターを構築する。構築した4種類のベクターについて、HEK293T細胞内でのターゲット配列切断活性の評価を行う。Vivoでのアクアポリン1の生物学的役割を解析するため、アクアポリン1遺伝子欠損マウスの樹立を行う。ガイドRNAを組み込んだCas9発現ベクター2種をC57BL/6Nマウスから採取した前核期受精卵にインジェクションし、F0マウスを作成する。アクアポリン欠損マウス樹立後、様々な生理学的条件下ですでに蓄積したデータと比較して組織形態学的解析を行う。これまであられた研究成果の、詳細な検討を行う。身体各組織でのアクアポリン陽性細胞のコラーゲン基質と石灰化組織に着目した微細構造学的観察。また、細胞培養実験の解析の後、SiRNAによるアクアポリンノックダウン実験を行い。
脳性麻痺発症のリスクが高い早産児の両親の父親役割遂行に向けた調整を支える看護援助

本研究の目的は、脳室内出血もしくは脳質周囲白質軟化症を合併し、脳性麻痺発症のリスクが高まった早産児の両親の父親役割遂行に向けた調整を支援する、新生児集中治療室(以下、NICU)における看護援助を明示することである。平成30年度は、当初の予定を変更し、以下を行った。1.前年度行った専門家会議において、言葉が難しく理解しづらいという意見が挙がった看護援助の一部である評価指標について、研究者の先行研究「脳性麻痺の診断を受けた早産児の父親役割遂行に向けた両親の調整過程」で得られた結果から、評価の視点等を作成、追加した。この取り組みにより、脳性麻痺発症のリスクが高い早産児の両親の父親役割遂行に向けた調整を支援する、NICUにおける看護援助として、1アセスメント指標、2看護援助の概念枠組み、3看護職の行動指標、さらに初定期外来受診時に使用する4評価指標を完成させた。2.開発した看護援助を臨床で使用することを目指し、研究者の先行研究で得られた結果と、今回開発した上記14を含む実践マニュアルを、看護援助開発の経験がある小児看護学研究者2名との話し合いを数回重ねながら、作成した。3.当該年度の計画進捗を考慮し、平成30年度は看護援助の完成・実践マニュアル作成及び、研究成果発表準備を中心に進め、研究成果の一部を日本小児看護学会第29回学術集会に演題登録した。現在は、本研究成果を学術誌へ投稿するため、和文と英文で論文にまとめている。施設及び研究協力者への報告は次年度に行う予定とした。当初、平成30年度は、作成した看護援助を用いてパイロットスタディを行う予定であったが、倫理的配慮の問題から施設より研究協力が得られず、前年度の段階で交付申請書に記載した研究実施計画を見直し、一部計画を変更したが、看護援助の完成・実践マニュアル作成及び、次年度研究成果発表準備といった修正後の計画に沿って、交付申請書に記載した研究目的達成に向け、順調に進んでいる。1.研究成果の普及・公表活動として、学会発表と論文投稿を行う。令和元年8月に開催される、日本小児看護学会第29回学術集会で研究成果の一部を発表する。また、令和元年11月12月に開催される、第39回日本看護科学学会学術集会での発表、令和2年2月に開催される、The 6th International Nursing Research conference of World Academy of NursingScienceでの発表を目指す。令和2年3月末までには本研究の成果について論文にまとめ、和文と英文で学術誌に投稿し、国内外に向けた発表を行う。2.研究成果の普及・公表活動を予定より広範囲に行うことで、関連研究の情報収集を継続して行う。3.別途報告書を作成し、当該年度中に研究協力施設および対象者への報告を行う。平成29年度は以下を行った。1看護援助の開発に向けて、NICUにおける具体的な看護援助を検討するために国内外の先行研究より、「親子関係形成への看護援助」や「父親と母親間の関係性への看護援助」などに注目し、文献検討を行った。文献検討は当初、介入研究のみに焦点を当て行う予定であったが、NICUに入院している子どもと家族への看護援助そのものが開発途上にあることを考慮し、看護援助の内容をなるべく広く抽出できるよう、介入研究に限らず文献検討を行った。2先行研究「脳性麻痺の診断を受けた早産児の両親の父親役割遂行に向けた調整過程」で得られた結果および、上記1の文献検討より得られた結果より、脳性麻痺発症のリスクが高い早産児の両親の父親役割遂行に向けた調整を支援する看護援助を開発した。3開発した看護援助の内容的妥当性および実行可能性の検討のため専門家会議を行った。専門家会議によって得られたデータを分析し、看護援助を修正した。今後は、1)さらに開発した看護援助の、内容の検討および家族との共有方法を検討していくこと、2)専門家会議で得られたデータを基に、臨床での使用を目指した実践マニュアルの作成をしていく予定である。看護援助の開発までに時間を要したが、専門家会議は順調に行うことができたため、交付申請書に記載した研究実施計画に沿っておおむね順調に進んでいる。

2.開発した看護援助を臨床で使用することを目指し、研究者の先行研究で得られた結果と、今回開発した上記14を含む実践マニュアルを、看護援助開発の経験がある小児看護学研究者2名との話し合いを数回重ねながら、作成した。3.当該年度の計画進捗を考慮し、平成30年度は看護援助の完成・実践マニュアル作成及び、研究成果発表準備を中心に進め、研究成果の一部を日本小児看護学会第29回学術集会に演題登録した。現在は、本研究成果を学術誌へ投稿するため、和文と英文で論文にまとめている。施設及び研究協力者への報告は次年度に行う予定とした。当初、平成30年度は、作成した看護援助を用いてパイロットスタディを行う予定であったが、倫理的配慮の問題から施設より研究協力が得られず、前年度の段階で交付申請書に記載した研究実施計画を見直し、一部計画を変更したが、看護援助の完成・実践マニュアル作成及び、次年度研究成果発表準備といった修正後の計画に沿って、交付申請書に記載した研究目的達成に向け、順調に進んでいる。当初、平成30年度は、作成した看護援助を用いてパイロットスタディを行う予定であった。しかし、開発した看護援助は早産児の出生時より看護援助を展開していく必要があり、倫理的配慮の問題から施設より研究協力が得られず、パイロットスタディを行うことが難しいと判断した。そのため平成30年度は、早産児の両親へのインタビューにより、開発した看護援助の、更なる内容の検討および家族との共有方法を検討することを予定している。また、臨床での使用を目指し、開発した看護援助の実践マニュアルを作成していく予定である。1.研究成果の普及・公表活動として、学会発表と論文投稿を行う。令和元年8月に開催される、日本小児看護学会第29回学術集会で研究成果の一部を発表する。また、令和元年11月12月に開催される、第39回日本看護科学学会学術集会での発表、令和2年2月に開催される、The 6th International Nursing Research conference of World Academy of NursingScienceでの発表を目指す。令和2年3月末までには本研究の成果について論文にまとめ、和文と英文で学術誌に投稿し、国内外に向けた発表を行う。2.研究成果の普及・公表活動を予定より広範囲に行うことで、関連研究の情報収集を継続して行う。3.別途報告書を作成し、当該年度中に研究協力施設および対象者への報告を行う。研究はおおむね順調に進み、研究費も研究の遂行に合わせ計画通り執行しているが、当初の計画よりも設備備品が安く購入できたため、次年度使用額が生じた。平成30年度は、面接調査の旅費や面接調査・データの保管に必要な備品の購入等を計画している。関連研究の情報収集のために参加を予定していた学術集会について、所属大学における業務の都合上、参加を断念したため、残金が生じた。次年度は、成果発表が多く計画されているため、残金を使用する予定である。次年度使用額は、研究成果の普及・公表活動を予定より広範囲に行うための旅費に充当し、また、英論文のまとめる際の英文校正費、報告書作成費に充てる予定である。