hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
真菌パンデミックを想定した耐性を持ちにくい革新的ナノバイオ抗真菌剤

昨年、欧米やアジアで初めて真菌症パンデミック(世界的流行)を起こったことから、耐性を持ちにくい新たな作用機序の抗真菌剤の開発が望まれる。本申請では、この独自のクラスター化設計技術を進化させ、それ自身が高い抗真菌活性を有し、耐性が起きにくい銀ナノ粒子を土台として、その表面に古くから天然の抗真菌剤として機能しつづけている耐性を持ちにくい酵素(キチナーゼ)をライブラリー化し、様々な比率でクラスター化することで、使用環境にあわせてオーダーメイド可能な、50倍に抗真菌活性を増強するナノバイオ抗真菌剤を提案する。実施計画では30年度はステップ1.抗菌活性の高い銀ナノ粒子の安価な合成法の開発、ステップ2.高活性なキチナーゼのスクリーニングおよびステップ3.銀ナノ粒子表面へのキチナーゼ提示デザインを行う計画となっていた。1に関しては、HEPES bufferと銀イオンを混合し、銀ナノ粒子の合成に成功した。銀ナノ粒子作製できた。しかしながら、想定通り、安定して同じ形および同じ表面積の粒子を作製することは熟達が必要であった。今後もこの粒子の安定作製がネックになる可能性が高いことが分かった。2に関しては、少し時間がかかったがCAZyデータベースと文献値から20種以上のキチナーゼを選択し、遺伝子全合成する直前まで来ている。今後ライブラリーを作製し順次評価していく。3の銀ナノ粒子表面への酵素提示に関しては、類似酵素であるキトサナーゼ活性を持つ酵素を6×Hisタグを用いた高密度提示させ活性を持つことの確認はできた。高活性化については若干向上傾向があるものの、再現性が取れていないため、条件検討が必要である。最も大きな障壁であり苦戦すると考えていたのは、まず銀ナノ粒子に酵素を提示して活性を示すか否かであったが、この問題をクリアできたことが大きい。酵素ライブラリー作製の進捗がやや遅れてはいるものの、技術的課題は少ない部分であるため全体の進捗に影響は少ない。そのため全体でみるとおおむね順調と判断した。安定した表面積の銀ナノ粒子合成技術の開発がキーとなることから、引き続き継続して力を入れて行っていく。さらに銀ナノ粒子と酵素の提示密度の最適化がこれまでの知見から重要であることもわかっていることから、粒子への酵素提示密度と条件を細かく検討し、安定した範囲を決定する。最後に有望なキチナーゼを20種類程度ライブラリー化し機能として安定性と抗菌活性でスクリーニングを行い、有望酵素に関して、条件を詰める。この時点で学術論文を執筆し公表する予定である。有望酵素の選抜のために、キチナーゼの専門家に相談したところ、難航し、選抜に思ったよりも時間を費やしてしまった。そのため高額な遺伝子全合成用の費用が次年度に繰り越しとなった。またそれに伴い論文化のための費用も次年度に繰り越した。次年度は、酵素を20種類購入し、約600,000円使用する。
HIV関連神経認知障害HANDの発症抑制を目指した抗HIV薬適正使用法の確立

本研究では、抗HIV薬の中でキードラッグであるインテグラーゼ阻害薬3種の血液脳関門透過におけるトランスポータの関与と、それに伴う中枢移行性の違いを明らかにすることで、HIV感染患者の合併症の一つであるHIV関連神経認知障害(HAND)発症抑制に有効な薬物選択法の開発を目的とする。初年度は、BBB透過に関わるトランスポータの同定および実臨床におけるHAND発症状況の調査を行い、以下の成果を得た。これまでにインテグラーゼ阻害薬の一つであるドルテグラビルについてはLC/MS/MSを用いた測定系を確立していたため、その測定条件に追加する形でラルテグラビルおよびエルビテグラビルの測定系を構築し、3剤同時測定系を確立した。極性細胞における輸送実験系を用い、ドルテグラビルが排出型トランスポータであるBCRPの基質となることを明らかにした。他の2剤についても実験を行い、現在結果を解析中である。2.有害事象自発報告データベースを活用したHAND発症状況の調査FDA Adverse Event Reporting System (FAERS)のデータを用いてインテグラーゼ阻害薬の有害事象報告を比較した。ICH国際医薬品用語集MedDRAの分類に従ってHIV関連神経認知障害、認知症、認知障害の3つを解析対象の有害事象とし、その頻度をreporting odds ratio (ROR)法により解析したところ、ドルテグラビルおよびエルビテグラビルではシグナルが検出されなかったが、ラルテグラビルではシグナルが検出され、薬剤とHAND発症の何らかの関係性が示唆された。初年度の目標は、トランスポータ発現細胞を用いてBBB透過に関わるトランスポータの同定を行うこと、およびFAERSのデータを用いて実臨床におけるHAND発症状況の調査を行うことであった。LC/MS/MSを用いたインテグラーゼ阻害薬の3剤同時測定系に関しては大きな問題なく構築することが出来た。トランスポータ発現細胞を用いた輸送実験に関してはドルテグラビルが排出型トランスポータBCRPの基質となることを確認でき、他の2剤についても実験を行い、現在結果を解析している段階である。FAERSを用いたデータベース研究では解析は終了しており、おおむね当初の予定通り進んでいると考えている。現在着手しているトランスポータ安定発現細胞を用いたラルテグラビルおよびエルビテグラビルの輸送実験の結果解析およびFAERSを用いたHAND発症状況の調査結果の分析を行う。これまで、BBBの透過に関わるトランスポータとしてBCRPを中心に検討を進めてきたが、P糖タンパク質の関与も示唆されているため、その影響も考慮しながら検討を進めていく。また、遺伝子改変マウスを用いたin vivoにおける薬剤中枢移行性の評価系の確立に着手し、インテグラーゼ阻害薬のin vivoにおける中枢移行性のデータと実臨床のデータの相関性を確認する。

(理由)LC/MS/MSを用いた薬物濃度測定系の構築が順調に進み、薬剤の購入量が少なくて済んだことおよびFAERSを用いた有害事象自発報告解析において解析に関する費用が予想よりも少なかったことにより、次年度使用額が発生した。(使用計画)遺伝子改変マウスの使用を計画しており、その購入経費として使用予定である。
腰痛の発生を抑制する介護デバイスの実用化研究

我が国をはじめ主要先進国では、人口の高齢化が進んでいる。「いつまでも健康」は理想だが、加齢による介護化、介護の担い手不足、長時間介護の肉体的、精神的負担などは避けれない問題である。この中で筆者らは施設・病院等で日々、多くの高齢者を介護する介護従事者の腰痛の問題に着目している。要介護高齢者をベッドから車椅子に移す際など、介護従事者は中腰姿勢で高齢者の身体を支えるため腰部に負担が集中する。本研究では、高齢者介護で腰部に集中しがちな肉体的負担や疲労を他の部位にバランスよく配分し、腰痛の発生を抑える介護デバイスの開発とその普及を目的にしている。
母仔分離ストレスモデルの酸化ストレス脆弱性とその分子機構の解明

当該研究では母仔分離操作を受けたラットは拘束ストレス直後、脳内の抗酸化能が顕著に低下していることを示すことができた。このことは幼若期における養育環境が劣悪であると、既報のGABA抑制ばかりでなく成熟後後に遭遇する酸化ストレスに対して脆弱性を示し、レドックスが容易に酸化シフトを起こすことを意味している。さらに、てんかん性病態の一モデルであるキンドリング形成も母仔分離群で著しく容易に完成した。この点も、酸化ストレスへの脆弱性とともに、幼若期の劣悪な養育環境が成熟後における脱分極の容易な暴走を許すことを裏付けるものである。ヒト疫学調査上では、すでに劣悪な養育環境(両親の離婚・虐待・希薄な親子関係)が、うつ病・不安障害に影響することが危惧されている。中には、てんかん発症との因果を報告したものも散見されるが、心理的ストレス負荷よりも、虐待起因性の頭部外傷に説明を求める報告が多く、幼児期の心理的ストレスがてんかん起因に結びつける報告はTeicherらの報告などがあるが、少ない現状にある。本研究では、幼児期の不遇な心理的養育環境が成長後に易痙攣性やてんかん原性の早期獲得に結びつくことを示した。てんかんと心理的養育環境の因果関係の存在を深める結果となった。今後は、ヒト疫学調査上での多因子解析が望まれる。下垂体-副腎系の過剰亢進やGABA-A受容体機能の脆弱性を惹起し、その結果けいれんに伴う海馬細胞障害・記憶・学習障害など様々な障害を誘導する、乳幼児期ストレスと考えられている。しかしながら、当該ストレスに暴露された成長ラットのけいれん獲得に関する研究は少ない。【方法】宮崎医科大学動物実験委員会承認の下、Kehoe Pらの方法に従い、雄性仔ラットに対して母ラットや同胞と隔離するNIストレス(PN2-9,lh/lday)を負荷した。生後21日齢で離乳を行い、生後49日齢に至った時点でペンチレンテトラゾール(PTZ)40 mg/kgを隔日に腹腔内投与開始し、全身けいれんが連続2回出現した時点でPTZキンドリング完成とした。完成過程での観察において、各けいれん潜時・持続時間・刺激回数を記録した。また、ウエスターンブロット法を用いてPTZキンドリング開始前のNIストレス海馬内のグルタミン酸・GABA関連蛋白の発現解析を行った。【結果】NI群ではキンドリング初期のけいれん潜時が有意に短く、キンドリング後半でけいれん持続時間が有意に長かく、早期にキンドリングが完成した。NI暴露群においてGLAST, EAACl, Glu-Rl, NMDA-Rlは有意に対照群と比し発現増加、一方GAT-1, GTRAP3-18は有意な発現の低下が観察された。【考察】GABA合成・貯蔵促進を示唆するEAACl増加とGTRAP3-18低下等の結果が得られたが、キンドリング早期完成には、NIによるGlu-RlやNMDA-R1の上昇などのグルタミン酸受容体の発現増大と脆弱なGABA-AR機能に加えGAT-1の低下による逆向輸送低下が関与していると思われる。この度の当該研究ではまず母仔分離操作を受けたラットは拘束ストレス直後、脳内の抗酸化能が顕著に低下していることを示すことができた。このことは幼若期における養育環境が劣悪であると、既報のGABA抑制ばかりでなく成熟後後に遭遇する酸化ストレス(ここでは拘束ストレス)に対して脆弱性を示し、レドックスが容易に酸化シフトを起こすことを意味している。

中には、てんかん発症との因果を報告したものも散見されるが、心理的ストレス負荷よりも、虐待起因性の頭部外傷に説明を求める報告が多く、幼児期の心理ストレスをてんかん起因とするTeicherらの報告があるもののごく少数に限られている。本研究では、幼児期の不遇な心理的養育環境が成長後に易痙攣性やてんかん原性の早期獲得に結びつくことを示した。てんかんと心理的養育環境の因果関係の存在を深める結果となった。今後は、ヒト疫学調査上での多因子解析が望まれる。
オステオポンチンは肺高血圧症の発症機序・病態生理に関与するか?

2.昨年度、OPNが高発現している1症例のIPAH肺血管病変においてヒトヘルペスウイルス-8(HHV-8)の遺伝子産物であるLatency-associated nuclear antigen-1(LANA-1)、及びLANA-1によって誘導されるoncogeneである.β-カテニンとOPNが共に発現していることを免疫組織染色によって確認した。その後症例を追加したが、HHV-8感染が示唆される症例はみあたらなかった。従って、IPAH症例における血中OPN高値とHHV-8感染の因果関係については不明である。3.ラットの低酸素性肺高血圧、右心室肥大、肺血管壁肥厚に対し、OPN中和抗体は抑制効果を示す傾向がある。N数の問題と考えられるが、統計学的有意差を得るに至っていない。肺移植時に摘出されたIPAH症例3例の肺組織では、正常肺(肺癌患者3例の摘出肺非腫瘍部)に比しOPN遺伝子が高発現する傾向を認めた。IPAH肺の免疫組織染色では肺血管病変内および集積したマクロファージにOPNに対する強い染色性が観察された。OPNが高発現している1症例のIPAH肺血管病変においてヒトヘルペスウイルス-8(HHV-8)の遺伝子産物であるLatency-associated nuclear antigen-1(LANA-1)、及びLANA-1によって誘導されるoncogeneであるβ-カテニンとOPNが共に発現していることを免疫組織染色によって確認した。OPN高発現マウスは肺高血圧を自然発症しなかったが、3週間の低酸素曝露後には野生型マウスに比しより高度の肺高血圧、肺血管再構築をきたすことを確認した。
細胞,特異性を規定する転写制御因子研究の推進

「転写因子」研究を,より質の高いものとするために,総括班を組織し,以下の活動を行なった。1.公開シンポジウムの開催(京大会館.1992年6月19日)半田宏(東工大),石井俊輔(理研),岩渕雅樹(京大),藤井義明(東北大),安田国雄(京大)の代表的演者から,最新データに基づく講演があり,100名を超える聴衆との間が活発な討議が行なわれた。2,名簿の作成・配布およびニュースの発行班員間の有効な情報交換,共同研究の実施などを円滑に行なえるよう7月には名簿を配布し,8月,12月,3月にニュースを編集発行して,タイミングの良い情報交換の場として活用した。3.コンファランスの開催(生駒セミナーハウス,9月24日9月26日)計画・公募全班員,総括班員に加えて若手の任意出席者多数を加えて総勢60数名の出席者によって,日本のトップレベルの研究成果についての発表と討議を行なった。4.若手研究者によるワークショップ(サホロ.1993年2月2628日)班員外の任意参加者をも含め,約40名が集い,徹底的議論を実施5.研究成果報告集の編集・発行各班員からの成果報告,publication list並びに代表的論文各1編を印刷・公開した。本年度の全原著論文は150編に達する。6.研究成果の評価総括班会議・幹事会によって,3年間の成果について評価を行なった。
相対論的平均場理論による原子核での表面パイ中間子凝縮

原子核におけるパイ中間子の役割の重要性に着目して、相対論的、非相対論的な理論の枠組みでの理論研究を行った。相対論的な取り扱いでは原子核における負のエネルギーの状態の寄与についても研究を行った。その成果を箇条書きにする。1.相対論的平均場理論の枠組みでパイ中間子凝縮が起きることを数値計算で示した。その結果、スピン軌道力が生じることがわかった。さらにはパイ中間子は原子核表面に凝縮することを示した。2.非相対論的な枠組みで全スピンは保存するが、パリティーと電荷を破った内部粒子状態を用意し、それらの量子数を回復する方法を開発した。パリティーと電荷を射影した後変分をとる計算をHe4で行った。その結果、射影の効果は非常に重要であることを示すことができた。この際にパイ中間子(テンサー力)はHe4の構造に決定的な寄与をしていることを示した。3.テンサー力の効果が重要であることを定量的に示すためにHe5での中性子の位相差を計算した。中性子がs波、p波、d波での位相差をすべて再現するためにはHe4がテンサー力によりp波の混ざりがあることを考慮しなければいけないことを示した。テンサー力がスピン軌道力を引き起こしていることを見事に示した成果である。4.相対論的平均場理論の枠組みでパリティーと荷電の射影を行った後、数値計算をするための定式化と実際の数値計算を行った。パイ中間子の効果を存分に引き出すのにこの射影を行うことは非常に重要であることを示すことができた。結論として、原子核の構造にはパイ中間子が重要な役割を示すことができた。さらにはカイラル対称性の観点からも原子核が理解することが可能となり、ハドロン物理との統一が近いことを実感している。原子核物理は1949年のMeyer-Jansenのシェルモデルの出現で定量的な研究が可能になった。フェルミオンである核子は自らで作る一体場の中を運動しており、エネルギーの低い量子状態の順に底から核子を詰めて原子核を構成する。その際の重要な一体場としてスピン・軌道力を必要とした。原子核のその後の50年はこのシェルモデルを基盤として発展してきた。しかし、最近の理論的・実験的研究によりこのシェルモデルでは多くの物理量に対して問題があることが明らかになってきた。我々はその問題点は湯川の指摘したパイ中間子を充分に取り込むことの出来る枠組みを一体場に導入することで解決できる可能性があるとの指摘を行い、この科研費で本格的な定量的な研究を始めた。その成果を箇条書きする。1.従来の相対性平均場理論の枠内にパイ中間子を導入し、内部状態がパリティーを破る相にあるとする表面パイ中間子凝縮が起こることを定量的に示した。世界的ジャーナルに論文発表した。2.クォークやハドロンの物理ではカイラル対称性がもっとも重要な概念である。その対称性を実現するカイラルシグマモデルのラグランジャンを使って平均場近似のもとで核物質の計算を行い、飽和性が出ることを示した。この際、オメガ中間子の質量も核子と同じ様にカイラル対称性の破れから生じるとすることが重要であることを指摘した。3.さらに表面パイ中間子凝縮を導入することにより原子核のシェル構造が導出できることを示した。この際のラグランジャンにはパラメータを含まないことを強調したい。したがって、まったく第一原理からシェルモデルができることを示したことになる。現在はこれらの結果を論文として準備中である。来年度はこの取り扱いを確立するとともに実験によって明らかになる特徴的な現象の提案を行う研究を行う。

これらの結果の持つ意味を明らかにすることと、今後の研究の方針を立てる為に3月にWorkshopを行った。原子核でのパイ中間子の役割についての研究を行った。今年度の重要な結果はハドロン物理で使っているラグランジャンである線形シグマモデルを使って、相対論的平均場理論の範囲で原子核の記述を行ったことである。カイラル対称性を持っている事と、ほぼ全てのパラメータがハドロン物理で決定されていることで多くのことを見出すことが出来た。1.原子核の中でカイラル対称性は約20%回復していることが分かった。そのとき核子の質量も20%減少している。2.表面パイ中間子凝縮することで始めて原子核のスピン軌道力が再現されることが分かった。現象論的にしか記述されていなかったマジック数がミクロのレベルから導出できたことは非常に重要である。3.問題点として原子核の圧縮率が大きすぎることから通常のマジック数が出せないことが分かった。これらの結果はProg.Theor.Phys.に論文発表された。この結果をふまえて現在研究を進めているのはパリティーの良い状態(パリティー射影)を作って変分計算を行うことである。定式化が完成し現在は数値計算を行っている。さらには、パイ中間子凝縮の結果起こる特徴的な現象の定式化も行った。パイ中間子表面凝縮の研究を相対論的、非相対論的枠組みで研究した。今年の研究はパリティーと荷電射影の問題、および負のエネルギー状態の取り扱いに集中した。非相対論的枠組みは射影の問題は多くの研究があり、定式化も標準の方法に従って行った。その結果は論文(Nucl.Phys.)に発表した。He原子核でのパリティー射影は重要であり、射影の効果でパイ中間子凝縮が起こることを示した。さらには、荷電射影でその効果が3倍に増えることを示すことができた。He原子核の性質を再現するにはテンソル力を1.5倍に増やす必要があることを示した。これは、さらにモデル空間を広げる研究に発展した。相対論的枠組みは負のエネルギー状態の問題があり、定式化もこれまでには無く、試行錯誤の連続であった。最終的には目的のパリティーと荷電射影の定式化を行い、プログラムも作成した。ハドロン物理と原子核物理の統一理論を作るめどをつけることができた。相対論的平均場では負のエネルギーの取り扱いは非常に重要である。最初に正確に計算する方法を開発した。代表的な原子核の計算を行い、その結果を論文(Phys.Rev.)に発表した。負のエネルギーは非常に重要な効果をもたらし、核子の有効質量はあまり小さくはなれないことを示した。その結果はスピン軌道力が小さく、原子核の基本的性質を再現できないことを意味している。この結果は非常に重要でパイ中間子凝縮が必ず必要であるという結果を与えた。さらには、負のエネルギーの近似的な取り扱い方を開発した。この方法で原子核の振動現象も取り扱うことが可能であることを示すことができた。全体として、この研究課題の目標であったパイ中間子表面凝縮の重要性を示すことができた。さらには相対論的な多体理論での負のエネルギーの取り扱い方を完成することができた。
心拍変動ダイナミクスにみられる病態遷移過程の数理的構造の理解とその応用

心拍変動患者の心拍変動特性は、生命予後の予測指標として有用性が示されてきた。従来のアプローチでは、各研究者の経験とアイデアにより、心拍変動の特性を表す指標が導入され、その有用性が生存時間解析で検証されてきた。一方で、ニューラルネットワークなどの機械学習のアプローチでは、事前の特性指標の計算(特徴量抽出)が必要ない方法も存在する。このような方法については、画像解析などの分野でその有用性が示されている。本研究では、心拍変動時系列について、事前の特徴量抽出を行う従来法と、特徴量抽出を行わないQuasi-Recurrent Neural Network (QRNN)の予測結果を比較した。ここでは、心不全患者108例の24時間ホルター心電図から、13時から14時までのRRデータを抽出して使用した。予測するアウトカムは全死亡とした。特徴量抽出に基づく予測では、SDNNなどの心拍変動指標11種を計算し、ランダムフォレストを用いて予測モデルを構築した。一方で、QRNNでは、前処理として、時系列のトレンド除去のみを行った。4年の観察期間中に39例が死亡した。QRNNとランダムフォレストのAUCはそれぞれ0.68と0.67で有意差はなかった。次いでQRNNの予測に基づき2群に層別化したときの生存率には有意差を認めた(log-rank test: p < 0.01)。追加の検証により、心拍変動指標を用いた予測モデルとQRNNを用いた予測では、異なる特徴量を用いて、生命予後を予測している可能性が示された。今後、治療戦略に役立つ情報を得るために、QRNNがどのような特徴を学習し、死亡リスクを予想しているのかを明らかにする必要がある。平成30年度については、新たにニューラルネットワークモデルや深層学習を用いた予後予測について検討した。Quasi-Recurrent Neural NetworkおよびLong Term Short Memoryを用いて検討の結果、これらの予測モデルは、心拍変動時系列の特徴を学習する上でも有用であることが示された。現状では、患者データの例数が数百から数千と小規模であるため、予測性能は中等度にとどまるが、今後、例数が増加することで、予測性能は向上すると考えられる。このようなアプローチは、予後予測や病態遷移過程の理解に役立つと考えられる。さらに、前年度の成果を論文化することもできた。以上より、本研究課題の進捗状況は順調と判断した。今後は、ウェアラブルデバイスを活用し、実世界環境での生体情報モニタリングの可能性を検討する。近年、生体センサの小型化、軽量化により、着用感がほとんどなく、心拍数や身体活動量などを容易に計測可能なウェアラブルデバイスが登場している。そのようなデバイスは、医療や日常の健康管理においても有用と考えられる。本研究では、そのようなデバイスで計測される心拍数・心拍変動の解析についても検討する。1.持続性心房細動患者における脳梗塞発症リスク評価.心房細動は脳梗塞発症のリスク因子である.本研究では,持続性心房細動患者の心拍変動(心室応答時系列)を解析し,脳梗塞発症と関連する心拍変動特性を見いだした.先行研究において,脳梗塞発症のリスク予測指標として心拍変動の粗視化エントロピーが提案されてきた.しかし,粗視化エントロピーが心拍変動のどのような特性を反映しているのかという解釈については,明らかになっていなかった.本研究では,粗視化エントロピーが時系列の確率分布特性,自己相関特性を反映することに注目し,両特性が脳梗塞発症のリスク因子であるかどうかと検討した.分析の結果,確率分布特性が最も重要な脳梗塞発症の予測因子であることが明らかになった.この知見は,心房細動患者における脳梗塞発症リスクの評価に貢献することが期待できる.2.鬱血性心不全の心拍変動特性に基づく予後予測.先行研究において,心拍変動の非ガウス特性は鬱血性心不全患者の予後予測因子であることが示されてきた.本研究では,時系列の非ガウス特性をより詳細に定量化するために,新たなキュムラント分解法を導入した.この方法を用いた心拍変動の解析により,生命予後と関連する時系列特性が明らかになった.3.暑熱環境労働者の体調評価指標の開発.熱中症等の暑熱環境における暑熱障害の発症を予防するため,ウェアラブルデバイスを用いた労働者の体調評価法を開発した.これまで,心拍変動解析は,心拍変動時系列のみを単独で評価する方法が主流であったが,本研究では,加速度信号から評価可能な身体活動量と心拍変動を組み合わせることで新たな指標を導入した.この指標が,体調不良や軽度の暑熱評価に有用であることを示した.心拍変動特性に注目した分析を通じて,心房細動患者における脳梗塞発症のリスク因子,鬱血性心房細動患者の生命予後の予測因子を明らかにすることができた.今後,より大規模なコホート研究を通じて,エビデンスを積み上げる必要があるが,心拍変動解析の有用性を確認することができた.また,早期診断の可能性を示す目的では,ウェアラブルデバイスの有用性を示すことができた.心拍変動患者の心拍変動特性は、生命予後の予測指標として有用性が示されてきた。

一方で、ニューラルネットワークなどの機械学習のアプローチでは、事前の特性指標の計算(特徴量抽出)が必要ない方法も存在する。このような方法については、画像解析などの分野でその有用性が示されている。本研究では、心拍変動時系列について、事前の特徴量抽出を行う従来法と、特徴量抽出を行わないQuasi-Recurrent Neural Network (QRNN)の予測結果を比較した。ここでは、心不全患者108例の24時間ホルター心電図から、13時から14時までのRRデータを抽出して使用した。予測するアウトカムは全死亡とした。特徴量抽出に基づく予測では、SDNNなどの心拍変動指標11種を計算し、ランダムフォレストを用いて予測モデルを構築した。一方で、QRNNでは、前処理として、時系列のトレンド除去のみを行った。4年の観察期間中に39例が死亡した。QRNNとランダムフォレストのAUCはそれぞれ0.68と0.67で有意差はなかった。次いでQRNNの予測に基づき2群に層別化したときの生存率には有意差を認めた(log-rank test: p < 0.01)。追加の検証により、心拍変動指標を用いた予測モデルとQRNNを用いた予測では、異なる特徴量を用いて、生命予後を予測している可能性が示された。今後、治療戦略に役立つ情報を得るために、QRNNがどのような特徴を学習し、死亡リスクを予想しているのかを明らかにする必要がある。平成30年度については、新たにニューラルネットワークモデルや深層学習を用いた予後予測について検討した。Quasi-Recurrent Neural NetworkおよびLong Term Short Memoryを用いて検討の結果、これらの予測モデルは、心拍変動時系列の特徴を学習する上でも有用であることが示された。現状では、患者データの例数が数百から数千と小規模であるため、予測性能は中等度にとどまるが、今後、例数が増加することで、予測性能は向上すると考えられる。このようなアプローチは、予後予測や病態遷移過程の理解に役立つと考えられる。さらに、前年度の成果を論文化することもできた。以上より、本研究課題の進捗状況は順調と判断した。これまでの心拍変動の解析法は,心拍変動時系列を単独で分析するアプローチが主であった.今後は,身体活動量,呼吸変動など,複数の生体信号特性を組み合わせることで,診断や予後予測精度を改善する方法を検討する.また,長期にわたる持続的な生体信号モニタリングを実現するために,ウェアラブルデバイス,ニアラブルデバイスの活用について検討する.特に,労働環境における健康管理への応用を検討する.今後は、ウェアラブルデバイスを活用し、実世界環境での生体情報モニタリングの可能性を検討する。近年、生体センサの小型化、軽量化により、着用感がほとんどなく、心拍数や身体活動量などを容易に計測可能なウェアラブルデバイスが登場している。そのようなデバイスは、医療や日常の健康管理においても有用と考えられる。本研究では、そのようなデバイスで計測される心拍数・心拍変動の解析についても検討する。
神経メディエーターを介して活性を発現する高次機能サポニンの構造と作用機作

天然に最も豊富に存在するサポニンであるacyl基がトリテルペンに結合したタイプ(acylated polyhydroxyoleane 3-Ο-monodesmoside)とトリテルペンoleanolic acidがアグリコンのタイプ(oleanolic acid 3-Ο-monodesmoside)について,活性と構造および作用機作を検討した。1)代表的なacylated polyhydroxyoleane 3-Ο-monodesmoside型サポニンであるescin類に,マウスでの栄養および非栄養性食餌における顕著な胃排出能抑制作用,炭素末輸送能試験での小腸内輸送能亢進作用およびマグネシウム吸収促進作用のあることを明らかにした。さらに,これらの顕著な活性発現にはトリテルペン部に結合したangeloyl基やtigloyl基などのアシル基の存在が必須であるなどの構造と活性に関する知見を得た。また,その作用機作として,マウスを用いた実験において,カテコールアミン枯渇剤やドーパミン拮抗薬およびプロスタグランジン合成阻害剤を用いた実験結果から,escin類の胃排出能抑制作用にはドーパミンがメディエーターとして関与しており,ドーパミン_2受容体刺激によってプロスタグランジン類を遊離させ,最終的に胃排出能を抑制させることを明らかにした。一方,escin類の小腸内輸送能亢進作用にはドーパミンは関与しておらず,セロトニン合成阻害剤およびセロトニン拮抗薬を用いた実験結果から,セロトニンがメディエーターとして重要であることが判明した。さらにプロスタグランジン合成阻害剤や一酸化窒素合成阻害剤を併用した実験結果から,セロトニン_2受容体刺激によって一酸化窒素およびプロスタグランジン類を遊離させ,最終的に小腸内輸送能を亢進させることが明らかになった。Escin類のマグネシウム吸収促進作用には一酸化窒素が関与することを証明した。2)Oleanolic acid 3-Ο-monodesmoside型サポニンであるmomordin Icについて,糖吸収抑制活性および胃排出能抑制活性の他に小腸内輸送能亢進作用のあることを見出すとともに,その作用機作としてセロトニンが関与しており,セロトニン_2受容体刺激によってプロスタグランジン類を遊離させることによって作用を発現することが推察された。
高齢者の多様性を規定する老化恒常性維持に必須な代謝特性解明の基盤的研究

「老化の多様性」解明のため「解糖系代謝と老化」研究と「ヒト血液メタボローム」研究を行った。前者ではPGAMモデルマウスの解析より、糖代謝パラメーターは正常であったが、協調的代謝制御効果を見出した。後者では、ヒト血液メタボロームの結果、80%以上、進化上メタボライトも保存されていることが判明した。さらに30名の健常者の解析で、126個のメタボライトに関し、その個人差バラつきを検定した。最後に、14個の老化マーカーの同定に成功した。そのうち、11個は、我々による新規報告であった。このような高齢者特有のメタボライトは、年齢以外に、食生活、生活様式、健康状態、環境要因などを反映すると推測される。我々は、高齢者の多様性を規定する因子として、代謝特性に注目している。特に、近藤が長寿遺伝子として同定した解糖系酵素PGAMを中心に解析を進めた。その結果、昨年度PGAMが転写後制御機構として、細胞老化の過程で、癌遺伝子Mdm2によりユビキチン化分解を受けることを報告したが(Mikawa et al. JCB 2014)、本年度は、アポトーシスの過程でも、PGAMがMdm2によるユビキチン化を受けることを見出し、報告した(Mikawa et al. J. Cyto. Histo. 2014)。さらに、他のグループが長寿遺伝子として報告したサーチュインに注目し、そのメンバーの一つであるSIRT2がPGAMに結合し、脱アセチルカすることにより酵素活性を制御することを見出し報告した(Tsusaka et al. GtC 2014)。これらの成果は、PGAMが主に転写後制御を受けるという世界初の報告であり、他の二つの国際雑誌に招待され報告した(Mikawa et al. Science Proceedings 2014, Mikawa et al. CMLS 2015)。近藤が長寿遺伝子として同定した解糖系酵素PGAMがユビキチン化や脱アセチル化の制御を受けることを2014年に報告した(三河他JCB,津坂他GtC)。現在、PGAMのin vivoでの効果を検討するため、PGAM-TgマウスおよびコンディショナルKOマウスの解析を進めている。特に糖代謝に注目し、解析を行った。現時点では、様々な糖代謝パラメーターに大きな異常がないことを確認した(未発表)。一方、メタボロームに関しては、2014年に、ヒト血液の最初の解析として、酵母メタボライトと比較検討し、80%以上が保存されており、進化上メタボライトも保存されていることを報告した(Romanas他MolBiosys)。さらにヒト血液における若年と高齢群の比較により14個の老化マーカーの同定に成功し、そのうちの11個は新規のものであった(論文accepted)。以上のように、着実な成果を積んでいる。2014年度に続き、2015年度も4本の国際論文発表を行い、着実に成果を積んでいる。上記のように、PGAM研究に関し順調な成果を上げたので、4つの国際学術誌にその成果を発表となり、順調な経過をたどっている。現在、PGAMマウスの論文投稿準備中である。2016年中には投稿可能と考えられる。メタボロームに関しても、現在さらなる検討中であり、今後さらなる発展が期待できる(未発表)。老化生物学さらに、PGAMの個体における寿命効果を解明するため、マウスモデル中心の解析を進める。PGAM-TG、PGAM-KOマウスの解析を中心として、個体における解糖系代謝調節の意義を検討する。同時に、メタボローム解析により、高齢者の多様性を説明しうる、血液メタボライト候補の同定を目指す。これら成果は、国内および海外学会発表を通じ、最終的に国際学術雑誌への投稿を目指す。人件費の年度末の計算調整で、時間外給料がどうしてもはみ出してしまい、次年度使用額が生じてしまった。当初、ノックアウトマウスを中心とした交配実験による中規模なマウス解析を行う予定であったが、マウスのタイピングミスとマウスの原因不明の死亡が相次ぎ(感染症でないことは確認している)、この部分の計画が遅れており、次年度への予算持ち越しとなった。額は少額であり、計画全体への影響はほとんどない。現在、もう一度最初のヘテロノックアウトマウスからの交配によるコロニー形成をやり直し、順調にマウス数の増殖を認めている。よって、昨年度できなかった、ノックアウトマウス解析実験が、順調にいけば可能であり、本年度予算での実行となる。
病因性ミトコンドリアDNA複製遅延によるミトコンドリア関連疾患治療の検討

ミトコンドリア病の1種であるMELASのミトコンドリアDNA(mtDNA)異常3243 A>Gを標的に、塩基配列特異的にDNAに結合するPyrrole/Imidazoleを骨格とするポリアミド(PIP)化合物を複数作製した。作製した蛍光ラベルしたPIPで、処理後24時間でミトコンドリアに到達していることが判った。しかし48時間後にはミトコンドリアから排出されており、滞留時間が短かった。そこでミトコンドリアでの滞留時間を延長させ、mtDNAへのPIPの結合量を増やすことを考案し、蛍光発色するPIP-TPP化合物を合成し、投与48時間後でもミトコンドリアに局在していることを認めた。MELASのミトコンドリアDNA変異サイトとして3243番目の変異が約80%を占めいている。そこでこの3243番のAからGの変異に対し、PIポリアミドの作製を行った。3243番の遺伝子をGとして、その前後を含む配列に対し2種類の単純ヘアピン構造のPIポリアミドを作製した。純度の高いPIポリアミドを得るため合成室の改良を行ない、2種類のPIポリアミドの合成に成功した(PIP1, PIP2)。連携研究者から分与を受けた、Cybrid(HeLa細胞にMELAS患者のミトコンドリアDNA 3243番目のGの変異を82%もつCybrid1とCybrid作製方法に準じて正常なヒトミトコンドリアDNAを有するCybrid2-対照)を用い、上記2種類のPIポリアミドでの処理を試みた。Cybrid2-対照は増殖が遅く、細胞の濃度を下げすぎると極端に増殖速度が低下するため、実験のための細胞数については再試行を繰り返した。またPIポリアミドの溶媒として、数種類を試し、数日を経ても顕微鏡下で結晶化を起こさなかったDMSOにより溶解し、細胞に投与することとした。この際も、1μMが結晶化を起こさない上限であった。PIポリアミド投与の結果、Cybrid2-対照細胞が死にCybrid1細胞には大きな変化が認められなかった。さらに、PIポリアミド投与期間を最長2週間で行ったが、ミトコンドリアDNAに効果を与えるには、ミトコンドリアのDNA量の多さを考慮すると短すぎる可能性が考えられた。またCybrid2-対照細胞に影響が少なく、Cybrid1細胞の増殖に影響を与える、PIポリアミドそのものの構造、即ち標的遺伝子配列を変更したポリアミドの合成が必要であり、鋭意企画中である。前年度、非修飾のPIポリアミド2種類をHeLa細胞にMELAS mtDNA異常3243A>Gを導入したHeLamt3243と対照群のHeLamtN44(Normal)に20日間にわたって処理したが、細胞の増殖の遅延等の顕微鏡下での変化は認められなかった。また、十分な量のPIポリアミドを作製するのが困難であった。また、その精製度にも問題があった。しかし、PIポリアミドの合成が軌道にのり、研究できる十分な量のポリアミドの入手が以前より簡便になり、精製度も上がった。本年度は、MELAS mtDNA異常3243A>Gを標的としたPIポリアミドにFITC修飾をしたmt3243/FITCを作製することを試みた。その目的は、PIポリアミドがミトコンドリアDNAに局在しているか否かを明らかにするためである。2種類のmt3243に対するPIポリアミド(PIP)の作製と、FITC修飾を試みたが、1種類のPIP-FITC修飾物の合成に成功した。また、本年度から設置された超微形態観察可能なconfocal顕微鏡を用いることにより、ミトコンドリアとPIP-FITCの二重染色観察が可能となった。ミトコンドリア染色にはMitotracker Redを用いた。これらの観察結果から、PIP-FITCは細胞処理後1時間でミトコンドリアに局在する傾向を示した。しかし、3時間後には細胞質の細胞内小器官に移動し、さらに2日後には、核の周囲の細胞内小器官にのみ観察される傾向だった。細胞内小器官のどの部位にPIP-FITCが集積しているかを確認する必要がある。ただしこの観察には、固定に関する問題点があり、PIP-FITCと他の細胞内小器官の固定法が異なるため生細胞での観察が必要であると考えられる。ミトコンドリア病はミトコンドリアの呼吸鎖の機能障害によって引き起こされる多様な疾患群で、ミトコンドリアDNA (mtDNA)または細胞核内ミトコンドリア関連DNAの変異によって引き起こされる。幼少時に発症する症例の主立ったmtDNA変異に着目すると、MELASで認められる3243A>Gの変異は、母系遺伝をする代表的な変異である。症状の多様性患者個々による症状の軽重があるなか、mtDNA異常に共通点がみられることは、これらの異常mtDNAの複製速度を抑制することで細胞内異常mtDNAの割合を減少させることが症状の緩解に貢献すると期待される。我々は、塩基配列特異的にDNAに結合するPyrrole/ Imidazoleを骨格とするポリアミド(PIP)化合物を作製し、細胞内への輸送手段を必要とせず細胞内に到達させ、遺伝子発現を操作する方法を開発している。このPIP化合物を応用し、変異mtDNAの複製を遅延する方法を開発すれば、ミトコンドリア病という難治性疾患を持つ患者にとって有効な治療手段になると期待でき、その意義は大きいと考えられた。

今回、PIPがミトコンドリアに送達されたことは明らかとなった、しかしそのミトコンドリアでの滞留時間(貯留量)の短さが、変異mtDNA減少までに至らなかったと考えられる。そこで、TPPにPIPを結合させた化合物により、より大量のPIPを長時間ミトコンドリア内に滞留させることによって、変異mtDNA減少を誘導することを企画した。TPPは明らかにミトコンドリアに到達し、かつ48時間を経て完全にミトコンドリア局在していることから、PIPの結合により、TPP-PIPはミトコンドリア内に長期に局在することが想定される。現在行っているPIP-TPPの長期処理による変異mtDNAへのPIPの結合とその影響に期待したい。ミトコンドリア病の1種であるMELASのミトコンドリアDNA(mtDNA)異常3243 A>Gを標的に、塩基配列特異的にDNAに結合するPyrrole/Imidazoleを骨格とするポリアミド(PIP)化合物を複数作製した。作製した蛍光ラベルしたPIPで、処理後24時間でミトコンドリアに到達していることが判った。しかし48時間後にはミトコンドリアから排出されており、滞留時間が短かった。そこでミトコンドリアでの滞留時間を延長させ、mtDNAへのPIPの結合量を増やすことを考案し、蛍光発色するPIP-TPP化合物を合成し、投与48時間後でもミトコンドリアに局在していることを認めた。代表者の体調不良と、PIポリアミドの合成が標的とするDNA構成により困難なため、実験に供するだけの十分な量ができないことが問題であった。両問題点が改善の方向に進んだため、最終年度に向けて研究ペースを早めていきたいと考えている。また、そのように計画が進行しつつある。腫瘍分子病理学1 PIP-FITCを用いて、ミトコンドリアDNAに確かにPIポリアミドが局在すること。その局在時間を確認することにより、ミトコンドリアDNAにPIポリアミドの効果を及ぼすにはどの程度の間隔で処理を行う必要があるかを確認する。2研究に供しているHeLamt3243細胞の生物学的特性(MCT4,VEGF遺伝子発現等)を対照細胞株と比較し、PIポリアミドの効果を簡便に調べられる方法を検討する。即ち、PIポリアミドの効果があり、変異mtDNAが減少した場合のマーカーとなる特徴を検討する。これには、異常ミトコンドリアDNAの含有率の異なる3種類の細胞株を用いる。3 1に応じてFITCの修飾のないPIポリアミドを用いて細胞を処理し、2で明らかとなった生物学的変化を確認する。4 2種類のPIポリアミドについて、どちらがより効率よく異常ミトコンドリアDNAと結合するかを比較する。1。PIポリアミドの構造に合成上、溶解性の低いDNA配列が含まれていたため、構造の改訂を検討しなくてはならなくなった。さらに、関連研究でPIポリアミドに遺伝子発現抑制物質(メチル化物質)等を付加したほうがDNA転写抑制に効果的である事が判明し、当該研究においても検討する有用性がでてきた。2。培養細胞が特殊なcybridであり、さらにmycoplasma感染が研究後半時期に認められたため、その除去が必要となった。また、変異ミトコンドリアDNAの含有率の異なる細胞が得られた事から、PIポリアミドの効果を比較する方法に工夫が必要となった。3。研究代表者の体調不良のため、休養、投薬治療が必要な期間が生じてしまった。
病態時における血液脳関門の破綻と医薬品による中枢神経系副作用の発現との関係解明

医薬品による中枢性痙攣発現の要因にはpharmacokinetics(PK)とpharmacodynamics(PD)によるものがある。PKの要因の一つとして血液脳関門(BBB)のバリアー能の破綻による中枢移行性の亢進が考えられる。痙攣を誘発する薬物としてtheophylline(TP)があり、TP関連痙攣を重篤化させる脳浮腫の発現機序として痙攣及び薬物による脳血管障害の可能性が示唆されている。本研究ではマウスを用いてBBB透過性に及ぼす薬物とそれにより惹起される痙攣の影響を評価することを目的とした。脳室内投与実験:TP又はnorfloxacin(NFLX)を脳室内に瞬時注入して痙攣発現の有無を観察した。静脈内投与実験:TP溶液(12又は18mg/mL)を痙攣発現まで静脈内定速注入した。TP+diazepam(DZP)群にはDZP(4mg/kg)前投与により痙攣が発現しない状態下で高投与量のTPを同時間低速注入した。痙攣発現時にfluoresceinを瞬時に尾静脈内投与し、5分後にその脳組織、血漿中濃度(Cbr、Cp)を測定した。みかけの脳組織移行率(Rc)、取り込みクリアランス(Ki)及び初期分布容積(Vi)を算出した。脳室内投与では、NFLXとTP共に投与量依存的に痙攣発現させた。痙攣発現によるKiの変化は認められずBBB透過性の変化は低いことが示唆された。静脈内投与では、TPの投与量依存的なRcとKiの上昇が見られた。一方、高投与量のTP群とTP+DZP群との間ではRcやKiに有意な差は見られなかった。以上の知見より、痙攣発現の有無と比較してTP濃度に依存したBBB透過性の上昇傾向の方が大きいと考えられた。本研究では、血液脳関門(BBB)透過性に及ぼすテオフィリン(TPL)誘発痙攣の影響を評価することを目的とした。6週齢のddY系雄性マウスの尾静脈から、TPL溶液(18mg/mL)を0.94mL/min/gの注入速度で、正向反射が消失して疾走痙攣が発現するまで静脈内定速注入した(Seizure(+)群)。Seizure(-)群には低濃度のTPL溶液(12mg/mL)を、control群にはsalineを注入した。注入終了後、速やかに水溶性物質のマーカーとしてfluorescein溶液を40mg/kgで尾静脈内に瞬時投与した。それぞれの個体において、脳組織中fluorescein濃度(Cbr)、血漿中fluorescein濃度(Cp)を求め、みかけの脳組織移行率(Rc)と血漿中蛋白結合率(fb)を算出した。Seizure(+)群とcontrol群ではintegration plotにより脳組織取り込みクリアランス(Ki)を求めた。痙攣発現とTPLの存在によるfluoresceinの蛋白結合率の変化は認められなかった。Seizure(+)群はcontrol群に比べて、Kiを有意に上昇させた。Fluorescein投与5分後においてseizure(+)群は、seizure(-)群やcontrol群と比べて、Rcを有意に上昇させた。また、seizure(-)群はcontrol群に比べて、Rcを有意に上昇させる傾向が見られた。薬物としてのTPLの存在の有無と比較して、痙攣発現の有無によるBBB透過性の上昇傾向のほうが強いものであった。以上の知見から痙攣発現がBBB透過性を上昇させる因子の一つであることが示唆された。また、同様のBBB透過性に関する検討を、薬剤誘発の急性腎障害モデルマウスでも行った。本研究では、BBBの破綻を行動学的に評価する方法を確立して脳虚血疾患の病態を評価・解析するために薬物誘発性痙攣を用いた評価法を検討した。ラットに両側総頸動脈結紮並びに瀉血、再還流(6h)を行い、尾静脈からラニチジンを3.25mg/minで定速注入した。間代性痙攣が発現するまでの時間(Onset time)、薬物総投与量、痙攣発現時の血中Ranitidine濃度並びに脳組織中Ranitidine濃度、見かけの脳組織移行率(Rc)を算出した。Sham群、再還流6時間病態群(2VO-6h)、MCI-186治療群(2VO-6h+MCI-186)、Sham+MCI-186群、再還流24時間病態群(2VO-24h)の5群を比較した。Sham+MCI-186群と比較して2VO-6h群のOnset Timeが有意に短縮した他(p<0.05)、Sham群との比較でも、短縮の傾向が見られたことから、脳血管障害によるBBB透過性亢進が、中枢神経系副作用の発現を高める事が示された。痙攣発現時の脳中Ranitidine濃度は、各群すべて濃度が等しく、Ranitidineに対する感受性が脳虚血障害により変化しないということが示された。痙攣発現時の血漿中Ranitidine濃度は、薬物の総投与量に依存した。痙攣発現時の脳組織移行率を示すRc値では、全ての群間で有意差は無かったものの、Sham群と比較して2VO-6h群のRc値の高い傾向が見られた。(pニ0.0517)MCI・-186の前投与による著明な治療効果は見られなかった。今回のモデルや方法に加えて他の虚血モデルやlntegration plot解析の容易な比較的痙攣が持続する薬物を使用する事により、新たな脳血障害の評価系を確立し、脳虚血障害研究を幅広く進めていく事ができると考えられる。

医薬品による中枢性痙攣発現の要因にはpharmacokinetics(PK)とpharmacodynamics(PD)によるものがある。PKの要因の一つとして血液脳関門(BBB)のバリアー能の破綻による中枢移行性の亢進が考えられる。痙攣を誘発する薬物としてtheophylline(TP)があり、TP関連痙攣を重篤化させる脳浮腫の発現機序として痙攣及び薬物による脳血管障害の可能性が示唆されている。本研究ではマウスを用いてBBB透過性に及ぼす薬物とそれにより惹起される痙攣の影響を評価することを目的とした。脳室内投与実験:TP又はnorfloxacin(NFLX)を脳室内に瞬時注入して痙攣発現の有無を観察した。静脈内投与実験:TP溶液(12又は18mg/mL)を痙攣発現まで静脈内定速注入した。TP+diazepam(DZP)群にはDZP(4mg/kg)前投与により痙攣が発現しない状態下で高投与量のTPを同時間低速注入した。痙攣発現時にfluoresceinを瞬時に尾静脈内投与し、5分後にその脳組織、血漿中濃度(Cbr、Cp)を測定した。みかけの脳組織移行率(Rc)、取り込みクリアランス(Ki)及び初期分布容積(Vi)を算出した。脳室内投与では、NFLXとTP共に投与量依存的に痙攣発現させた。痙攣発現によるKiの変化は認められずBBB透過性の変化は低いことが示唆された。静脈内投与では、TPの投与量依存的なRcとKiの上昇が見られた。一方、高投与量のTP群とTP+DZP群との間ではRcやKiに有意な差は見られなかった。以上の知見より、痙攣発現の有無と比較してTP濃度に依存したBBB透過性の上昇傾向の方が大きいと考えられた。