hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イムノバイオティクスによる炎症性腸疾患予防・改善機構の解明と戦略的防御食品の開発

本研究は、炎症性腸疾患の予防に有効な、新規「イムノバイオティック食品」の開発基盤を築くことを目的とし、ヒトモデルとして期待されるブタ腸管上皮細胞株(PIE細胞)を用いて、イムノバイオティクスの抗炎症活性について解析した。その結果、パタ-ン認識受容体を介して抗炎症性を発揮するイムノバイオティクスの選抜が可能となり、その機構解明が飛躍的に進むことが大いに期待され、「イムノバイオティック食品」の創製に向けた開発基礎が得られた。【背景および目的】炎症性腸疾患(IBD)は,Quality of Life (QOL)を著しく低下させることから大きな社会問題に発展している.本研究は,イムノバイオティクスによる炎症性腸疾患の発症防御機構を,特異的受容体介在性のサイトカインネットワークの観点から総合的に解明し,新規"イムノバイオティック食品"の開発基盤を築くことを目的としている.本年度は,IBDの予防・改善に有効なイムノバイオティクスとその活性因子の評価系について,ヒトモデルとして有望なブタにおいて,受容体の中でもNodに注目し,その解析と応用を目的とした.【方法】ブタNodファミリーのクローニングとその遺伝子導入細胞(トランスフェクタント)の構築(1)ブタにおいてNod1,Nod2をクローニングし,腸管における発現を解析した.(2)IBDに有効なイムノバイオティクスのスクリーニング系細胞株を構築するため,Nod1,Nod2のトランスフェクタントをCHO K-1あるいはHEK293細胞株で構築を試みた.構築した細胞の免疫応答性を検討した.【結果】(1)ブタNod1およびNod2の遺伝子配列を解析し,全構造遺伝子のクローンを得た.定量的RT-PCR法により,初生仔ブタおよび成熟ブタの各種組織において,それら遺伝子の発現を解析することができた.(2)ブタNod1およびNod2の遺伝子導入細胞系の構築に成功し,細胞内タンパク発現を確認した.発現細胞は,Nod1およびNod2のポジティブリガンドに対する免疫応答性を発揮することが確認された.試験したイムノバイオティクスのほとんどは,Nod2を介して免疫応答を亢進することがわかった.以上の成果は,Nodを介するイムノバイオティクスの選抜と,その免疫応答機構の解明につながるものと期待された.【目的】潰瘍性大腸炎やクローン病に代表される炎症性腸疾患(IBD)は,若年層を中心にその患者数が増加しており,大きな社会問題に発展している.本研究は,イムノバイオティクスによる炎症性腸疾患の発症防御機構を解明し,新規"イムノバイオティック食品"の開発基盤を築くことを目的としている.本年度は,昨年度構築した評価系を用い,イムノバイオティクスのスクリーニングとその免疫発現機構の解析を進めるとともに,ブタ腸管上皮細胞株(PIE細胞)における炎症性免疫応答機能を解析し,ブタ腸管免疫細胞との共培養系から新たな分子免疫評価システムを考案する.【研究成果】1.ブタパターン認識受容体(PRR)の強制発現細胞を用いて,NF-kappaBレポーターアッセイを指標として,乳酸菌ライブラリーから有用なイムノバイオティクスの候補を選抜することができた.2.ブタ腸管上皮細胞株(PIE細胞)におけるPRRの発現を解析した結果,TLR19の発現が認められ,中でもTLR4/MD-2の発現が極めて高かった.PIE細胞の炎症応答に関わるリガンド応答性についてサイトカイン発現から解析することができた.3.PIE細胞およびブタ腸管免疫細胞の共培養系を構築し,イムノバイオティクスの抗炎症性に関わる評価系として応用可能であると考えられた.【目的】潰瘍性大腸炎やクローン病に代表される炎症性腸疾患(IBD)は、その患者数が増加し、大きな社会問題に発展している。本研究は、イムノバイオテイクスやイムノジェニクスによる炎症性腸疾患の発症防御機構を解明し、新規"イムノバイオテイック食品"の開発基盤を築くことを目的としている。本年度は,ヒトモデルとして期待されるブタ腸管上皮細胞株(PIE細胞)を用い、昨年度構築した分子免疫評価システムにより、イムノバイオテイクスの抗炎症活性について解析した。【研究成果】1. PIE細胞において、下痢原性大腸菌(ETEC)によるTLR4/MD-2を介した炎症応答の誘導が認められ、免疫評価パラメータを決定した。イムノバイオテイクス候補菌株の中で、ETECによる炎症応答を軽減する菌株が選抜された。2. PIE細胞とブタ腸管バイエル板免疫担当細胞との共培養系を確立し、イムノバイオテイクスの分子免疫評価系としての発展的応用性が期待された。3. PIE細胞をイムノバイオテイクスで前刺激することにより、ETECによる炎症誘導が顕著に抑制された。イムノバイオテイクスによる抗炎症性発揮の機構について、受容体と細胞内シグナル伝達の側面から解析したところ、Toll様受容体2と未知受容体を介するシグナル伝達により、炎症性サイトカインやケモカインの誘導を阻害する可能性が考えられた。以上の研究により、抗炎症性のイムノバイオティクスの選抜とその評価が可能となった。
炎症性骨吸収におけるヘルパーT細胞(Th1・Th2細胞)の役割

ヘルパーT細胞はTh0、Th1及びTh2の三者に分類され、後二者の量的バランスが炎症の進行に深く関わる。本研究ではアジュバント関節炎ラットの炎症滑膜組織に浸潤したT細胞の量的変化をTh1及びTh2細胞に区別して解析し、炎症の動態をより詳細に考察した。特に、知覚神経の関与に注目して解析を進めた。近年、数種のケモカインやサイトカインを指標としてTh1細胞とTh2細胞とを区別する報告がみられる。しかし、in vivoの研究は数も少なく、指標としての信頼性についてはまだ議論が定まっていない。我々は、Th1細胞を識別するためのケモカインとしてCXCR3を、同サイトカインとしてはIFN-γを、一方Th2細胞のケモカインとしてはCCR4を、同サイトカインとしてはIL-4を採用することとしてアジュバント関飾炎ラットの炎症滑膜組織での二重染色を実施し、その妥当性を検討した。その結果、CXCR3とIFN-γとのいずれかに陽性な細胞の90%以上がそれらに二重陽性、CCR4とIL-4とのいずれかに陽性な細胞の95%以上がそれらに二重陽性を示すこと、一方、CXCR3とIL-4およびCCR4とIFN-γに二重陽性の細胞はそれぞれ10%以下、及び5%以下に過ぎないことが明らかとなった。よって、Th1及びTh2細胞の動態を解析するための指標として、これらのケモカインとサイトカインを用いることの妥当性が証明された。次いで、これらのケモカインを指標としてTh1およびTh2細胞を識別することとし、アジュバント関節炎における坐骨神経の関与を解析した結果、次のことが明らかになった。すなわち、あらかじめ坐骨神経を切除したアジュバント関飾炎ラットでは、アジュバント投与2-4週にかけて、全Th細胞に占めるTh1細胞の割合がTh2細胞のそれに比較して高かった。一方、疑似的神経切除を行ったアジュバント関節炎ラットでは、2週まではTh1細胞の割合が高かったのに対し、4週後ではTh2細胞の割合が高くなった。このことは、ラットアジュバント関節炎ラットにおける知覚神経の抗炎症作用を強く示唆する。
計算科学シミュレーションによる膜電位依存性チャネルVSOPの動作機構研究

細胞膜間物質輸送の分子機構を解明する為に、VSOPの系を全原子モデルでMD計算しVSOPのopen構造とclosed構造を構築し解析した。その結果、open構造ではS4へリックスに特有なARG残基が様々なコンフォメーションでS3及びS1のGLU残基と塩橋対をなしてプロトン移動パスを構成することを示唆する結果を得る事ができた。これに加えて、closed構造では実験で報告された塩橋ペアとは異なるARGとGLUの塩橋対で構造を安定化して全く水分子を透過させない構造を得る事ができた。VSOPの電位依存的ゲーティング分子機構についての検証研究をこの結果を基に進めてゆく予定である.膜蛋白質VSOPは、2006年に大阪大学の岡村グループによって同定された電位センサー部分のみを持ち小孔を持たない新規プロトンチャネル分子VSOP(Voltage-Sensor Only Protein)で、本年度はその分子動力学シミュレーションに着手しました。VSOPは単量体で機能を持ち、膜電位変化を膜貫通セグメントS4が感知して静止状態と活性状態間の構造変化を引き起こしてプロトン通過を制御する事が実験的に示唆されています。VSOPは今まで知られている最小のイオンチャネルでKvチャネルの1/10サイズで、かつシンプルな構造を持ち、未だに謎が多いイオンチャネルの基本機能であるイオン選択性及びゲーティング機構の解明に理想的な(日本発の)モデル蛋白質として注目され、その研究進展が大いに期待されています。VSOPは精密で高速な全原子分子動力学シミュレーション計算が十分実施可能で計算科学による機能解明が大いに期待できます。本研究提案では、VSOPに様々な先進的な分子シミュレーション手法を活用してこれまで不明だった電位依存的チャネルの基本機能の解明を推進中です。本年度は、VSOP2量体のMDシミュレーションを実行してコイルドコイルの安定性に関わると予想されるTrp残基の役割をVSOPに関わる実験研究者と協力することで具体的に明らかにして国際学術雑誌に論文発表しました。さらに蛋白質の構造変化を容易に分子シミュレーションで駆動し得る新たな方法論を開発して国際学術雑誌に論文発表しました。VSOPの構造と機能の関わりを明らかにするための第一段階として脂質2重膜とVSOP2量体の全原子系を構築して長時間分子動力学(MD)シミュレーション計算を順調に開始することができました。得られたMDシミュレーションデータを詳細に解析し、実験研究者と密接に連携することでVSOPの2量体を安定化していると考えられるTrp残基の役割を具体的に明らかにしました。これらの研究成果を論文として国際学術雑誌Journal of Biological Chemistryに掲載しました。加えて効率良く蛋白質構造変化を分子シミュレーションで誘起する手法を開発して国際学術雑誌Journal of Computational Chemistryに論文掲載しました。この手法はVSOPのプトロン透過に関わる構造変化を解明する事に大いに役立つと考えています。本研究は、電位依存型プロトン透過性膜タンパク質VSOPの原子レベルでの機能を研究する事を目的としている。VSOPの立体構造は連携研究者である大阪大学中川教授の研究室でX線結晶構造解析手法で解明されたが、その構造はプロトン透過に関わる開いた(Open)構造と閉じた(Close)構造の中間構造であると考えられている。VSOPの機能を研究する為にはOpen構造とClose構造の情報が不可欠であり、28年度はこれらの構造を予測するために分子動力学シミュレーション研究を遂行した。VSOPはS1からS4の4本の膜貫通へリックス領域からなる構造を取っている。生理学的実験から明らかとなった塩橋相互作用を再現するようにS4へリックスを脂質2重膜垂直方向に実験から予想される程度分移動した。Open構造を得るためにはS4を細胞膜外方向に移動し、Close構造を得る為にはS4へリックスを細胞内内側に移動した。次にVSOP構造で欠損している側鎖原子及びループ部分をmodellar等のツールで補正した。得られた全長のVSOP膜タンパク質を予め平衡化したPOPCの脂質2重膜に挿入して平衡化の分子動力学シミュレーションを実施した。平衡化したVSOP膜タンパク質と脂質2重膜の系を100nsecから200nsec定圧力(1気圧)定温度(310K)の条件下で長時間分子動力学シミュレーションを実施した。得られた構造から、水分子を透過させないClose構造とグロッタス機構でプロトンを透過すると予想されるOpen構造を得た。Close構造に関して分子シミュレーション中に何個の水分子が透過するかを計測するプログラムを作成しその水分子透過個数を計測したところ全く水分子を透過しない計算結果を得た。これに加えて粗視化モデルによるOpen、Close構造の探索分子動力学シミュレーションも実施中である。本年度はVSOPの開いた構造と閉じた構造を探索するための分子動力学シミュレーションを遂行して生理学的な実験事実を反映する構造を得る事ができた。これらの構造からは、1)Close構造からは特別な2つの塩橋ペアを形成する事で水分子の透過及びプロトン透過の両方を厳密に阻害する分子機構が存在する可能性が示唆された。2)Open構造からはこれまで全く不明であったプロトン透過機構がグロッタス機構によって実現されている可能性が大きいことを、分担研究者との議論及びトラジェクトリー解析から明らかにすることができた。Close構造で特別な2つの塩橋ペアの存在が透過阻害の原因であることはこれまでに報告されていない全く新規な知見であり、VSOP機能の解明に大きな貢献をすると考えている。加えてOpen構造から指摘されたプロトン透過機構は、VSOP膜タンパク質の構造ダイナミックスがプロトン透過を制御している事を示唆している。

連携研究者岡村教授の実験生理学的な検証からVSOP機能の本質であるプロトン透過の新たな性質が明らかにされることが期待される。以上の様に研究代表者と分担者及び連携研究者が密接に共同研究を遂行して成果を挙げつつある事から本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。大阪大学の岡村グループが発見した電位センサーが酵素活性を制御する新たな電位センサー蛋白質であるVoltage Sensing Phosphatase(VSP)は電位センサー部分のみを持ち小孔を持たない新規プロトンチャネル分子でその特徴からVSOP(Voltage-Sensor Only Protein)と命名された。VSOPは今まで知られている最小のイオンチャネルでKvチャネルの1/10サイズで、かつシンプルな構造を持ち、未だに謎が多いイオンチャネルの基本機能であるイオン選択性及びゲーティング機構の解明に理想的な日本発のモデル蛋白質として注目され、その研究進展が大いに期待されている。さらに大阪大学の中川グループによってVSOPの静止状態(中間構造)のX線構造が解かれ原子レベルの詳細が世界に先駆けて明らかにされた。本研究はこの「日本発VSOP」を先進の計算科学シミュレーション手法で研究し膜電位センサーチャネルの基本機構の解明を推進することを目的とする。我々は、VSOPの分子シミュレーション研究を実施しデータ解析の基盤を整備すると共に、多数の始状態から出発して多くの中間状態から終状態を目指すトラジェクトリーを選択して距離行列の情報を用いてMDシミュレーションによる構造変化を誘起する一連の並列・並行MDシミュレーションを実行するシェルプログラムを用いてMDシミュレーションを多数並列及び並行して実行した。その結果、オープン構造ではS4へリックスに特有なARG残基が様々なコンフォメーションでS3やS1のGLU残基と塩橋対をなしてプロトン移動パスを構成することを示唆するシミュレーション結果を得る事ができた。これに加えて、クローズド構造では実験で報告された塩橋ペアとは異なるARGとGLUの対で構造を安定化して全く水分子を透過させない構造を得る事ができた。細胞膜間物質輸送の分子機構を解明する為に、VSOPの系を全原子モデルでMD計算しVSOPのopen構造とclosed構造を構築し解析した。その結果、open構造ではS4へリックスに特有なARG残基が様々なコンフォメーションでS3及びS1のGLU残基と塩橋対をなしてプロトン移動パスを構成することを示唆する結果を得る事ができた。これに加えて、closed構造では実験で報告された塩橋ペアとは異なるARGとGLUの塩橋対で構造を安定化して全く水分子を透過させない構造を得る事ができた。VSOPの電位依存的ゲーティング分子機構についての検証研究をこの結果を基に進めてゆく予定である.今後はVSOPのMDシミュレーションを更に発展させてVSOP構造とプロトン透過機構の関連をさらに明らかにしてゆく予定です。
家族性アルツハイマー病S182/STM2/E51遺伝子産物の同定と生理機能の検索

早発性家族性アルツハイマー病の原因遺伝子としてS182(14q24.3),STM2(1q31.42),E5-1(1q31.42)がクローニングされ,同疾患の発症はこれら遺伝子内に頻発する変異に直接起因することが明らかとなった。脳神経細胞において重要な役割を果たしていると考えられるS182/STM2/E5-1遺伝子産物(プレセニリン)の生化学的基本特性および生理機能の検索を試みた。プレセニリン1および2について特異的な高抗原領域をコンピューター予測し,抗原ペプチドを合成し,4種の抗体を作製した。いずれの抗体もプレセニリン抗原に特異的であり,抗体価も十分であった。神経芽腫細胞,神経膠芽腫細胞,神経星状細胞をはじめとする各種ヒト培養細胞について^<32>P/^<35>S-Metで培養標識した後,免疫沈降を行い発現を調べた。プレセニリン1,2の細胞内発現はいずれの細胞においても非常に少なく,細胞内リン酸化も受けないことが明らかとなった。また,プレセニリン抗体免疫沈降複合体に付随するプロテインキナーゼ活性は検出されなかった。極微量タンパク質プレセニリンの機能解析にあたり,プレセニリンcDNAトランスフェクション/ステーブルトランスフォーマントのクローニングを行いつつある。これら早発性家族性アルツハイマー病の研究過程で,アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質(APP)に付随するプロテインキナーゼ活性を見出し,このAPP結合タンパク質cDNAを酵母ツ-ハイブリッド法にてクローニングした。このタンパク質は細胞外,膜貫通,細胞質内領域から構成されるレセプター様タンパク質で,膜上に局在することが明らかとなった。APP付随Pロテインキナーゼは活性化にMn^<2+>/Mg^<2+>を要求し,Ser/Thrキナーゼであった。現在,神経細胞アポトーシスにおける生理的役割を検索解析中である。また,アポトーシスにおいて重要な役割をするPARPの細胞内リン酸化も見出した。今後,神経細胞アポトーシスシグナルトランスダクションの分子機構を,プレセリニン,APP結合キナーゼに注目し,解明していきたい。早発性家族性アルツハイマー病の原因遺伝子としてS182(14q24.3),STM2(1q31.42),E5-1(1q31.42)がクローニングされ,同疾患の発症は両遺伝子内に頻発する変異に直接起因することが明らかになった。脳神経細胞において重要な役割を果たしていると考えられるS182/STM2/E51遺伝子産物(Presenilinタンパク質)の生化学的基本特性および生理機能の検索を試みた。Presenilin1および2について特異的な高抗原領域をコンピューター予測し、抗原ペプチドを合成し、4種の抗体を作製した。いずれの抗体もpresenilin抗原に特異的であり、抗体価も十分であった。神経芽腫細胞、神経膠芽腫細胞、神経星状細胞をはじめとする各種ヒト培養細胞について^<32>P/^<35>S-Metで培養標識した後、免疫沈降を行い発現を調べた。Presenilin1,2の細胞内発現はいずれの細胞においても非常に少なく、細胞内リン酸化も受けないことが明らかとなった。また、Presenilin抗体免疫沈降複合体に付随するプロテインキナーゼ活性は検出されなかった。極微量タンパク質presenilinの機能解析にあたり、DNA-トランスフェクッションによる真核細胞内発現系確立の必要性が生じ、presenilin cDNAの調製と真核細胞presenilin発現用ベクターの作製を行いつつある。

現在,神経細胞アポトーシスにおける生理的役割を検索解析中である。また,アポトーシスにおいて重要な役割をするPARPの細胞内リン酸化も見出した。今後,神経細胞アポトーシスシグナルトランスダクションの分子機構を,プレセリニン,APP結合キナーゼに注目し,解明していきたい。
生理活性ペプチドサリューシンβの糖尿病慢性血管障害における病態生理学的意義の解明

糖尿病患者数は世界的にも我が国でも年々増加しており、これらの糖尿病に伴う慢性血管障害の発症・進展を抑制することが糖尿病治療の目標の根幹であることは言うまでもない。新規生理活性ペプチドのサリューシンβは特異な物理化学的性状を有するため、その機能解明は困難を極めた。近年、この特性を回避し測定系を構築し、ヒト血中総サリューシンβ濃度を測定系の確立に成功した。サリューシンβは血管障害治療の新たな標的分子として現在注目されており、今回の研究では糖尿病慢性合併症におけるサリューシンβの病態生理学的意義の解明を目的としている。2017年度は遊離サリューシンβの正確な測定系の樹立と、糖尿病患者を対象として血液サンプルの採取・測定を実施した。遊離サリューシンβのサンドウィッチELISA系の確立を共同研究者とに行い、血中遊離サリューシンβを測定することに成功した。また並行して北里大学病院内分泌代謝内科で加療中の糖尿病患者でインフォームドコンセントを得た患者より血液サンプルを採取し、2017年度末までに約150例の血液サンプルの集積が行われた。2018年度は、集積した血液サンプルの測定を行っている中で、構築した遊離サリューシンβの新規測定系において測定精度の再確認が必要となった。そのため測定系の再検討を行い、より精度の高い測定系を確認することができた。このため2018年度に血液サンプルの再測定を実施した。併せて、カルテベースでのクリニカルデータの抽出として年齢、性別、体格などの基本的調査項目、糖尿病関連の血液検査マーカーデータ、糖尿病慢性合併症(神経障害、腎症、網膜症)や大血管障害に関わるクリニカルデータを順次カルテベースに抽出を行い、サリューシンβの糖尿病慢性合併症における病態生理学的意義の検討を行っている。2017年度に集積した血液サンプルの測定を行っている中で、構築した遊離サリューシンβの新規測定系において測定精度の再確認が必要となった。そのため測定系の再検討を行ったためやや遅れている。しかし、結果的により精度の高い測定系に修正、確認することができた。2019年度は現在までの血液サンプルの再測定を進め、糖尿病慢性合併症におけるサリューシンβの病態生理学的意義を明らかにすることを目的とする。サンプルの収集に関しては、特に糖尿病慢性合併症の進行した症例のサンプルがやや不足しており、引き続き収集を行っていく。またカルテベースに集積患者のクリニカルデータの抽出を継続し、どのような糖尿病慢性合併症および血管障害によるサリューシンβの差異を明確にし、糖尿病患者におけるサリューシンβの病態生理学的意義を詳細に検討していく予定である。サリューシンはバイオインフォマティクス解析によって初めて同定された生理活性ペプチドホルモンで、サリューシンαとβの2種類のアイソフォームが同定された。しかし、このペプチドは特異な物理化学的性状を有するため、その機能解明は困難を極めた。近年、この特性を回避し測定系を構築し、当研究室でヒト血中総サリューシンβ濃度を測定する高感度サンドイッチELISA系の確立に成功した。当該年度は遊離サリューシンβの正確な測定系の樹立と、糖尿病患者を対象として血液サンプルの採取及び測定を予定していた。遊離サリューシンβのサンドウィッチELISA系の確立を共同研究者とともに行い、血中に存在する遊離サリューシンβを測定することに成功した。血中総サリューシンβの高感度サンドウィッチELISA系とともに、測定条件が十分に整った状況である。また並行して北里大学病院内分泌代謝内科で加療中の糖尿病患者でインフォームドコンセントを得た患者より血液サンプルを採取し、当該年度末までに約150例の血液サンプルの集積が行われた。現在、順次サリューシンβの測定を進めており、クリニカルデータの抽出として年齢、性別、体格などの基本的調査項目、糖尿病関連の血液検査マーカーデータ、糖尿病慢性合併症(神経障害、腎症、網膜症)や大血管障害に関わるクリニカルデータを順次カルテベースに抽出を行い、サリューシンβの糖尿病慢性合併症における病態生理学的意義の検討を行っている。遊離サリューシンβのELISA系測定の構築ができており、現在、糖尿病患者を対象に血液サンプル、クリニカルデータの収集が進んでいる。順次、サンプル及びデータの収集を進めるとともに、データ解析を進めており、おおむね予定通りに進んでいる。

遊離サリューシンβのサンドウィッチELISA系の確立を共同研究者とに行い、血中遊離サリューシンβを測定することに成功した。また並行して北里大学病院内分泌代謝内科で加療中の糖尿病患者でインフォームドコンセントを得た患者より血液サンプルを採取し、2017年度末までに約150例の血液サンプルの集積が行われた。2018年度は、集積した血液サンプルの測定を行っている中で、構築した遊離サリューシンβの新規測定系において測定精度の再確認が必要となった。そのため測定系の再検討を行い、より精度の高い測定系を確認することができた。このため2018年度に血液サンプルの再測定を実施した。併せて、カルテベースでのクリニカルデータの抽出として年齢、性別、体格などの基本的調査項目、糖尿病関連の血液検査マーカーデータ、糖尿病慢性合併症(神経障害、腎症、網膜症)や大血管障害に関わるクリニカルデータを順次カルテベースに抽出を行い、サリューシンβの糖尿病慢性合併症における病態生理学的意義の検討を行っている。2017年度に集積した血液サンプルの測定を行っている中で、構築した遊離サリューシンβの新規測定系において測定精度の再確認が必要となった。そのため測定系の再検討を行ったためやや遅れている。しかし、結果的により精度の高い測定系に修正、確認することができた。平成30年度は現在までの血液サンプルの測定を進めるとともに、特に糖尿病合併症重症度別の不足している症例を中心に血液サンプルの充足を図り、糖尿病慢性合併症におけるサリューシンβの病態生理学的意義を明らかにすることを目的とする。特に糖尿病慢性合併症の進行した症例のサンプルがやや不足しており、引き続き収集を行っていく。またカルテベースに集積患者のクリニカルデータを抽出し、どのような糖尿病慢性合併症および血管障害によるサリューシンβの差異を明確にし、糖尿病患者におけるサリューシンβの病態生理学的意義を詳細に検討していく予定である。2019年度は現在までの血液サンプルの再測定を進め、糖尿病慢性合併症におけるサリューシンβの病態生理学的意義を明らかにすることを目的とする。サンプルの収集に関しては、特に糖尿病慢性合併症の進行した症例のサンプルがやや不足しており、引き続き収集を行っていく。またカルテベースに集積患者のクリニカルデータの抽出を継続し、どのような糖尿病慢性合併症および血管障害によるサリューシンβの差異を明確にし、糖尿病患者におけるサリューシンβの病態生理学的意義を詳細に検討していく予定である。今年度内のサリューシンβの測定に関して血液サンプル収集症例数はほぼ予定通りであるが、測定実施検体数が予定症例数より少なったことが主たる要因と思われる。次年度は今年度測定予定であった既に収集してある血液サンプルの測定および次年度に新たに収集する血液サンプルの測定を予定しており、物品費としての使用が予想される。また研究成果により論文発表の準備段階に入ることを予定しており、当該年度の未使用分の使用が予想される。2018年度に遊離サリューシンβの測定精度の再検討を行い、当初の2018年度に予定していた測定系で使用する消耗品などの費用を含め、今年度に使用しなかった額が生じた。
大学間・インバウンド・キャリアとの連携による異文化間コミュニケーション能力の育成

海外研修は大学教育の重要な柱となっているが、その成果を事後研修や長期的キャリアへどう発展させるかは、十分な検証がなされていない。本研究では、1)海外研修において伸びる・伸びない能力を特定し、2)事後研修として、海外連携プログラム(大学間連携やインバウンドとの連携など)の構築、3)海外経験が学生のキャリア形成意識に関する調査を行い、今後の大学カリキュラムへの提案を行う。
磁気トンネル接合を用いたナノ磁性体の磁化反転機構に関する研究

直径20nm程度の磁気トンネル接合を用いて、ナノ磁性体の磁化反転機構に関する研究を行った。特にナノ磁性体の磁化反転機構と微細加工条件との関係について研究を進めた。その結果として、微細加工条件に依存してナノ磁性体の磁化反転の様子が変わることを明らかにした。また、マイクロマグネティックシミュレーションを用いることで、微細加工条件に依存して変化する磁化反転の様子が、素子端部に変質層が形成されることを仮定することで説明できることを明らかにした。ナノ磁性体は、ハードディスクドライブやスピン移行トルクを用いた不揮発メモリなどの応用で用いられている。そのような応用では、情報保持時間を決めるエネルギー障壁が重要な特性の一つである。エネルギー障壁を正しく評価するためには、磁化反転機構を理解することが重要である。また、ナノ磁性体の磁化反転機構はこれまで長く議論されてきたが、未だ充分に理解されているとは言いがたい。本研究の目的は、ナノ磁性体の磁化状態を検出するために適した磁気トンネル接合を用いて、磁化反転磁界の角度依存性を評価し、その評価を通して、ナノ磁性体の磁化反転機構を理解することである。本年度は、数値計算によるデバイス構造の設計、用いる材料の特性評価、磁気トンネル接合の作製、作製した直径20 nm程度の磁気トンネル接合の磁化反転磁界の角度依存性の評価を行った。はじめにデバイス構造の設計を行った。磁気トンネル接合では、二つの強磁性体が用いられるために、磁化が反転しやすい層はもう一方の強磁性層からの磁界を感じる。数値計算により、もう一方の強磁性層から印加される磁界の不均質性が小さくなるようにデバイスを設計した。次に、設計したデバイス構造を適用した磁気トンネル接合を作製し、直径20 nm程度の磁気トンネル接合を作製した。作製前に用いる材料の特性を評価し、直径30 nm程度までは室温での動作に問題がないことを確認した。直径20 nm程度の磁気トンネル接合の磁化反転磁界の角度依存性を幅広い温度で測定し、一斉磁化反転が生じていることを明らかにした。当初の予定では、平成28年度に数値計算を用いてデバイス構造を設計し、平成29年度に用いる材料の評価・デバイス作製・作製したデバイスの磁化反転磁界の角度依存性の評価を行う予定であった。実際には、平成28年度中に作製したデバイスの磁化反転磁界の角度依存性まで行い、直径20nm程度の磁気トンネル接合の磁化反転機構を明らかにすることに成功した。以上のことから、当初の計画以上に進展していると判断する。本研究の目的は、微細磁気トンネル接合を用いたナノ磁性体の磁化反転機構を明らかにすることである。昨年度までに、参照層からの漏洩磁界が少ない構造では、直径20nm程度の磁気トンネル接合において、一斉磁化反転が生じることを明らかにした。本年度は、更に研究を進めて、プロセス条件により磁化反転機構がどのように変化するかについて検討した。磁気トンネル接合の加工手法を変えて2種類の構造を有する約直径20nmの磁気トンネル接合を作製し、それぞれの磁気トンネル接合の保磁力の磁界角度依存性を測定した。一方の磁気トンネル接合は、昨年度までに作製・評価したものと同じであり、一斉磁化反転を示した。一方、もう一方の磁気トンネル接合は、一斉磁化反転モデルでは説明できない振る舞いを示した。二つの磁気トンネル接合では、参照層からの漏洩磁界の不均質性とエッジ部の変質層の大きさが異なることが予想されたために、それぞれの影響を考慮するためにマイクロマグネティックシミュレーションを行った。マイクロマグネティックシミュレーションの結果、二つの磁気トンネル接合で見られた振る舞いの違いは、エッジ部の磁気異方性を減少させることで同様の特性を再現できることが分かった。また、参照層からの漏洩磁界は磁化反転機構にほとんど影響を及ぼしていないことも分かった。以上の結果をまとめて原著論文を1編出版した。本年度は、更にホモダイン検出方法を用いて電流誘起トルクの測定と電流誘起磁化反転特性の評価も行い、国際学会と国内学会でそれぞれ1度ずつ発表した。現在、これらの内容を纏めた論文の執筆中である。平成29年度は、最終年度となる。初めに、平成28年度に得られた結果に関して論文を執筆する。その後、デバイスサイズが異なる磁気トンネル接合を作製し、その磁化反転磁界の角度依存性を5K程度の低温から室温まで評価する。以上の研究を通して、デバイスサイズ・測定温度と磁化反転機構の関係を総合的に理解する。また、得られた結果については、国際学会ならびに国内学会にて発表し、成果を社会へと還元する。スピントロニクス
シナプス・エピトランスクリプトーム計測による精神疾患理解の新展開

精神疾患のバイオマーカー、診断法、治療法の開発において、手がかりが掴めていない。申請者はシナプスに局在するRNAの化学修飾(シナプスに局在するエピトランスクリプトーム)に着目し、特にメチル化アデノシン塩基(m6A)をもつmRNAおよびlncRNAを網羅的に解析した結果、ヒト神経発達および精神疾患に関与する数千もの遺伝子の転写物が検出され、その修飾認識の阻害がシナプス形態および機能の異常を誘発することを明らかにした。本研れは、化学修飾を目印にしたRNA群の詳細な機能解析をすることによって、シナプスの生理的機能や精神疾患の分子病態の解明に挑む。
道路アメニティの非市場評価に関する研究

美しい道路景観、きれいな空気、走り易い道路線形などの道路アメニティの整備も道路整備事業の重要な要素であるが、これらの要素は利用者に多くの便益をもたらすにもかかわらず無料で提供されるので、利用者はこのような便益を明確に認識しないことが多い。さらに、非市場財の改善便益の評価手法が理論的問題を抱えているといったこともあり、現在、道路アメニティ整備の便益評価において困難が生じている。本研究では、この便益を所得の尺度で評価するための方法を検討した。まず、効用理論における等価的偏差(事業があった場合の効用水準を満たすという条件の下で事業をあきらめるために妥当と考える最低補償額)の概念を用いて道路整備事業の便益を定義した。次に、効果の二重計測や計測漏れをなくすために、一般均衡のフレームで便益の定義式を展開して便益評価モデルを誘導した。このとき、便益を「交通便益(一般化交通費用の減少による便益)」と「道路アメニティ便益(道路アメニティの向上による便益)」に分離した形で整理した。前者については交通市場の消費者余剰の増加分で捉え、後者については道路アメニティの代理市場における消費者余剰の増加分に近似して表現した(この場合の代理市場とは道路アメニティの変化の影響を直接受ける市場のことであるが、ここでは交通市場を取り上げた)。さらに、後者については、道路アメニティの向上があった場合の効用水準を満たすという条件の下でその向上をあきらめるために妥当と考える交通費用、道路アメニティの向上がなかった場合の効用水準を満たすという条件の下でその向上を受け入れるために妥当と考える交通費用、といった概念的な交通費用を定義し、これらを用いて新たな評価モデルを誘導した。本モデルを用いてケーススタディを行ったが、交通便益に比べて道路アメニティ便益が過大に評価される嫌いがあった。この問題はアンケート調査に基づく交通需要関数の推定段階で発生しているものと考えられ、今後の課題として残された。
癌におけるカタラーゼ遺伝子の発現調節

Greensteinや中原らによって観察された担癌マウスにおける肝カタラーゼ活性の低下現象は、癌患者における代謝のdown regulationの理解に一つの手掛りを与えるものとして古くから注目されてきた。また一方、癌細胞自体のカタラーゼ活性が極度に低下していることも知られている。我々は、このカタラーゼ活性低下の機構を分子生物学的なアプローチで解析することを意図し、ラットよりカタラーゼ遺伝子を単離し、遺伝子発現制御の解析を行った。カタラーゼ遺伝子のプロモーター領域にはTATA boxはみられず、CC ATT boxやGC boxが数個あり、ハウスキーピング遺伝子の特徴を備えていた。また、複数個ある転写開始点からの転写は、ヘパトーマ細胞において、いずれの開始点からの転写も著しく低下していた。さらに、カタラーゼ遺伝子のプロモーター領域とCAT遺伝子との組換遺伝子を作製し解析したところ、カタラーゼ遺伝子の上流4kb付近に、癌細胞において遺伝子発現の抑制に関与するシスーエレメントが存在することが明らかとなった。このシスーエレメントは、遺伝子の0.5kb上流にあっても、また方向が逆であっても遺伝子発現の抑制作用を示した。このシスーエレメントに特異的に結合するタンパクが、正常肝細胞核抽出液中には見られず、ヘパトーマ細胞核抽出液中に存在することが、ゲルーシフトアッセイによって示された。このタンパクが癌細胞において、遺伝子発現を特異的に制御しているトランスー作用因子であるかどうかは、目下、試験管内転写実験で解析中である。癌における遺伝子発現の異常のメカニズムの一つとして、癌細胞に特異的に発現する転写抑制因子がその癌細胞の(複数の)遺伝子の転写を制御している可能性が考えられる。
骨芽細胞のカチオンチャネルのメカニカルセンサーとしての意義とホルモン制御について

シングルチャネルパッチクランプ法により人培養骨芽類似細胞(HuO9)の陽イオンチャネルについて研究を行った。HuO9は高いオステオカルシン産生能を持つヒト骨芽類似細胞として最近株化された細胞系である。この細胞をプラスチックシャーレで系代培養し、シーディングより2日から14日の細胞がコンフルエントとなった状態で実験に使用した。この細胞膜に多数存在するセルアタッチの状態で122pSの大きさのいわゆるMaxi-K channelのイオン透過性と細胞内カルシウム濃度感受性と膜電位感受性について調べた、このチャネルはPK/PNa>12の特性を持つカリウムチャネルであり、少なくとも100nMレベルの細胞内カルシウム濃度により活性化され濃度の上昇とともにさらに強く活性化された、膜電位の脱分極によっても活性化され過分極により非活性かされた。さらにパッチ電極に加えられた陰圧(ストレッチ)により活性の上昇が認められた。この細胞に存在するバリウム透過性陽イオンチャネル(非選択性陽イオンチャネル)の動態について研究を行ない、イオン透過性、膜電位感受性等について1999年度日本生理学会にて発表を予定している。シングルチャネルパッチクランプを測定するため、低ノイズで適当な時間のクランプを行いデータを記録再現できるシステムの設定を行なった。記録系のシステムはパッチクランプ専用アンプとアクテイブフイルタDATテープ記録装置で構成し、解析時はDATで必要なデータを再生しインターフェイスを通してコンピュータにおくるシングルチャネル解析に最適なシステムとした。実験に適した状態の人線維芽細胞の初代培養を行うために数種類の培養液(ボビン牛血清の濃度と培養液の種類をかえて)での培養を行い比較した。この細胞による予備実験で、ストレッチ反応性チャネルが人線維芽細胞にも存在することを確認した。そのうちの一つのチャネルのストレッチ反応性は現在までに報告されているストレッチ反応性チャネルと時間に対する応答性が異なると思われある一定時間以上に続く比較的大きなストレスに対して反応がおこると考えている。このチャネルはストレスに対する線維芽細胞の増殖反応と関係をもつと仮定しチャネルの同定と再現性の確認を行っている。一方、骨芽細胞の初代培養は比較的感染よるコンタミネーションを起こしやすく培養開始から実験までの期間の決定が難しく実験条件が安定しにくかったので、まず継代培養細胞の使用を検討している。前年度、シングルチャネルパッチクランプを測定するため、低ノイズで適当な時間のデータを記録再現できるシステムの設定を行なった。また実験に適した状態の人線維芽細胞を初代培養し、この細胞による予備実験で、特異な伸展活性化チャネルが人線維芽細胞に存在することを確認した。一方、人骨芽細胞の初代培養を試みた。今年度は線維芽細胞の伸展活性化チャネルのストレッチに対する反応と線維芽細胞成長因子との関係を中心にチャネルの同定と再現性の確認を行った。チャネルはカチオンチャネルであり、チャネルの修飾等の直接的な関連は認められなかった。成長因子の投与と伸展活性化チャネルのチャネル密度との関連を示唆するデータを得たので再現性を検討している。一方、骨芽細胞の継代培養細胞を確保しパッチクランプに最適な条件を検討した。この細胞でもストレッチ反応性チャネルの存在は確認できたが培養条件によりチャネルの存在は不確定であり、チャネルの同定作業を現在行っている。ヒト骨芽類似細胞HuO9は高いオステオカルシン産生能を持つヒト骨芽類似細胞として最近株化された細胞系である。この細胞の継代培養後7日から12日目で、細胞表面をコラゲネースで約15分処理することで良好なパッチ膜のシール抵抗(50-100Gオーム)と再現性のあるチャネル活性を得た。シングルチャネルパッチクランプ法により、膜電位感受性Caイオン感受性のある120-140pSのカリウムチャネルを検出同定し、細胞内イオン環境によるチャネル開口確率の変化とイオン選択性を決定した。このチャネルはセルアタッチの条件下ではパッチ膜に対するストレッチにやや遅れて反応性しチャネルの開口確率が上昇し、細胞外のBaイオンでブロックされる。インサイドアウトの条件下ではストレッチに対しての反応を示さず、細胞内Caイオン濃度の上昇と膜電位の脱分極によりその開口確率が上昇する。一方、この細胞にはストレッチ感受性非選択性陽イオンチャネルが存在し60cm水柱程度のかなり高いストレッチで開口確率が上昇する。

このチャネルのPNa/PKはほぼ1に近く、2価イオンであるCaイオンも通過すると考えられる。これらの結果から、ストレッチ感受性非選択性陽イオンチャネルが細胞内にCaを流入することで、カリウムチャネルの活性と細胞内イオン環境の変化が起こることが示唆され、ストレッチというメカニカルな刺激に対する細胞の応答がいかにして起こるかという疑問に対して1つの可能性ある仮説を示すことができた。
孔辺細胞原形質膜H^+-ATPaseの活性化に関与するプロテインキナーゼの同定

本研究では、孔辺細胞原形質膜H^+-ATPaseの活性化に関わるプロテインキナーゼを含めH^+-ATPaseと直接相互作用するタンパク質のcDNAを酵母のTwo-hybrid法により単離し、その機能を明らかにすることを目的として研究を進めてきた。スクリーニングには主に原形質膜H^+-ATPaseのC末端領域を用いて行った。これは原形質膜H^+-ATPaseが活性化される際にこの領域がリン酸化され、原形質膜H^+-ATPaseを直接リン酸化するプロテインキナーゼや脱リン酸化するホスファターゼはこの領域を認識している可能性が高いためである。これまで、ソラマメ孔辺細胞のcDNAライブラリー由来の約1500万コロニーをスクリーニングし、300個の陽性クローンを単離した。現在、これら陽性クローンのシークエンス作業を進めているところであるが、cDNAの明らかとなったものとして、ATP/GTP-binding site motif AをもつLEA-like proteinやvestitone reductatseやphosphate transporterや多くのunknown proteinがある。これらの陽性クローンはTwo-hybrid法では間違いなく相互作用するものであるが、本当に細胞内で原形質膜H^+-ATPaseと相互作用するかは不明であり、今後の解析が非常に重要である。今後は、これらのタンパク質のうち相互作用の強いものやアミノ酸配列から機能が明確なもの(たとえばキナーゼやホスファターゼなど)を選び、シロイヌナズナのノックアウトラインにおける気孔の開閉やin vitroでの原形質膜H^+-ATPase活性に対する影響を調べ、その機能を証明する予定である。本研究では孔辺細胞原形質膜H^+-ATPaseの活性化に直接関わるプロテインキナーゼを含めH^+-ATPaseと相互作用する蛋白質を酵母のTwo-hybridシステム法、免疫沈降法により単離し、その機能を明らかにすることを目的として進めてきた。酵母を用いたTwo-hybridシステム法では、H^+-ATPaseのN末端領域(159残基)、1番目と2番目の膜貫通領域間(115235残基)、C末端領域(845956残基)の各断片を含むベイトプラスミドを構築した。これらベイトプラスミドを用いて孔辺細胞cDNAライブラリー由来の1x10^7クローンのスクリーニングを行った。その結果、195クローンが陽性クローンとして得られた。現在これら陽性クローンのcDNAのシークエンス作業を進めているところである。cDNAの配列が明らかとなったものとしては、ATP/GTP-binding site motifAをもつLEA-like proteinやvestitone reductaseなどがある。LEA-like proteinについてはin vitroでH^+-ATPaseと直接結合することも確認した。原形質膜H^+-ATPaseに対する抗体を用いた免疫沈降法では、確実に細胞内でH^+-ATPaseと結合する蛋白質を単離することができる。そこで、H^+-ATPaseと共同沈降する37kDa蛋白質をMass解析により同定したところ、興味ある蛋白質であることが明かとなった。今後は、これら蛋白質の機能を明らかにするため、H^+-ATPaseの活性やリン酸化レベルへの影響をin vitroまたは孔辺細胞プロトプラストを用いた一過的発現系により調べる予定である。
熱帯域の河川流域における環境劣化と保全対策に関する研究

GISやリモートセンシング技術を活用して、ベンガワンソロ流域における土壌侵食の原因の解明と土壌劣化の評価に取り組んだ。これまでの研究の結果、流域全面積の約36%から年間60t/haを超える深刻な土壌侵食を生じていると評価でき、特に急傾斜地での農地開発は土壌劣化を加速させることが明らかとなった。土壌劣化や土地生産性の低下を削減することを目的に、保全地域を特定するとともに、土壌・水保全対策の実施に向けて土地保全マップを作成した。この保全マップは行政機関のみならず、学校においても土壌・水保全に関する教育プログラムとして使用できる仕様とした。更に、土壌損失の低減を目指した作物残渣マルチング(土壌被覆)法の保全能を評価するために、人工降雨装置を活用してモデル実験を行った。実験の結果、マルチングを施さない試験枠からの土壌流亡量と比較して、3040%の土壌被覆によって土壌流亡量を38%から53%程度を削減できることが明らかとなった。このマルチング法による保全対策は、現地で容易に手に入る作物残渣を活用して適用できるものであり、ベンガワンソロ流域の現地農家からも受け入れられる技術であると期待が寄せられている。土壌劣化や土地生産性の低下の削減を目的に作成された土地保全マップに基づいて、作物残渣マルチング(土壌被覆)法などの適切な保全技術を普及することで、ベンガワンソロ流域における土壌・水保全に大きく貢献するものと評価できる。併せて本研究では、リアルタイムで河川水のモニタリングに向けた情報システムの開発にも取り組んだ。このプログラムによって約94%の予測精度で24時間後までの水位予測を可能にすることに成功している。熱帯域では降雨強度の高い降雨が頻発し、森林伐採や農地開発などの面的な開発が流域での物質動態に顕著な影響を与える。その中でも、インドネシア国の最長河川であるジャワ島のベンガワン・ソロ川の流域では、流域面積の30%にあたる11,023haの森林が主に農地開発のため失われ、河川周辺の97,216haの土地では宅地開発が進んでおり、ベンガワン・ソロ川流域における水環境および周辺環境の急激な悪化が大きな問題となっている。併せて森林の農地開発が進行するにつれて、周辺の農地からの土壌粒子や肥料成分が表面流や浸透流でベンガワン・ソロ川に流出しており、流域における水環境の悪化、特に富栄養化が顕在化してきている。降雨に伴う有機物を多く含む作土の流出は、生産基盤における土地資源の損失のみならず、これらが蓄積する水域では富栄養化などの水質汚濁を引き起こしている。そこで本研究では、ジャワ島のベンガワン・ソロ川流域を対象として環境劣化の現状を定量的に把握するとともに、適切な保全対策について検討することを目的とする。平成20年度の研究期間は、平成20年11月から平成21年度3月までの5ヵ月間であった。そこで初年度に当たる平成20年度には、ベンガワン・ソロ川流域の現地調査を実施して、現地関係機関より地図情報を収集するとともに、流域内の堆積土量や栄養成分濃度に基づいた環境評価を進めた。併せて、ベンガワン・ソロ川流域の環境劣化分類図の作成を目指して、地図情報の解析に必唇なコンピュータや解析ソフトを整えた。インドネシアでは232以上もの河川流域において環境劣化が進行しているが、その中でもベンガワンソロ流域は過去10年間における急速な森林伐採とともに、森林から農地や住宅への土地利用の転換が急速に進んでおり、環境劣化の深刻な流域の一つに挙げられている。GISやリモートセンシング技術を活用して、ベンガワンソロ流域における土壌侵食の原因および土壌劣化の評価に取り組んでいる6これまでの研究の結果、流域全面積の約36%は年間60t/haを超える深刻な土壌侵食を生じていると評価でき、特に急傾斜地での農地開発は土壌劣化を加速させていることが明らかとなった。土壌劣化や土地生産性の低下を削減していくことを目的に、保全地域の特定とともに、土壌・水保全対策の施用に向けた土地保全マップを作成した。この保全マップは行政機関のみならず、学校においても土壌・水保全に関する教育プログラムとして使用できる。更に、このプログラムは農家における環境意識や知識の向上にも寄与できるものと考えられる。

併せて本研究では、リアルタイムで河川水のモニタリングに向けた情報システムの開発にも取り組んだ。このプログラムによって約94%の予測精度で24時間後までの水位予測を可能にすることに成功している。
機械学習の知見を用いた生体神経系の学習メカニズムの解析とその機械学習応用

人工ニューラルネットワークを始めとして,生体神経系のダイナミクスに学び応用した情報処理・機械学習システムの研究・開発はこれまでも盛んに行われてきました.本研究では,とくに生体神経系のダイナミクス(神経活動)及び学習(神経結合)における確率的に見える挙動(ゆらぎ)に着目し,それらが持つ計算論的な意味を機械学習との比較によって明らかにすることを試みました.まず神経結合のゆらぎについて検討したところ,神経活動の減弱や過増強に対する堅牢性(恒常性)に貢献していることを,シミュレーション及び理論解析の両面で確認しました.このことは神経結合の恒常性を現象論的・機能的な観点だけではなくメカニズム的に説明できるという点で意義ある結果です.また恒常性が計算論的に果たすと考えられている様々な機能が,単なるゆらぎから得られることを示唆しています.一方神経活動については,そのダイナミクスを決定論的に記述した場合でも,振る舞いが確率的に見えることがあります.この性質は信頼性のある情報処理には難点と考えられてきました.しかし,この振る舞いが比較的質の良い擬似乱数の生成や確率分布の近似として有用であるという予備的な結果を得ました.この結果は生体神経系モデルを用いたベイズ的生成モデルの構築の基礎となりえます.以上の点から,本研究はダイナミクスと学習の両面におけるゆらぎについて,その意味付けと応用への基礎的な成果です.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。
RECK/MMP-9balanceによる消化器癌悪性度診断のパラダイムシフト

【目的】臨床消化器癌症例におけるRECK遺伝子発現の有無、程度を解析し、またMMP-9発現をも併せて評価(RECK/MMP-9 balance)することにより癌の悪性度を客観的に把握し得るか否かを検討した。【方法】(1)大腸癌症例より得られた凍結切片を用いて癌部、非癌部よりRNAを抽出し、Nothern Blot Hybridizationを行い、NIH imageにより発現強度を定量化した。(2)免疫組織化学染色(ABC法)によりRECKおよびMMP-9蛋白の発現率、部位、強度を観察した。染色強度、染色面積を評価し、overall scoreを算定した。(3)活性型MMP-9の癌部での発現を観察するため、gelatin zymographyを行った。(4)データ解析:mRNAレベル、蛋白レベルでの癌部、非癌部におけるRECK score、MMP-9 scoreと各種臨床病理学的因子との相関を解析した。また活性型MMP-9とRECK score, MMP-9 scoreとの相関、さらに、RECK/MMP-9値と各種臨床病理学的因子との相関を単変量、多変量解析し、予後との関連を評価した。(5)癌部におけるVEGFの発現、および抗CD34抗体を用いてmicro vessel density(MVD)を免疫組織染色にて評価し、RECK発現と血管新生との関連を検討した。【結果】癌部では非癌部に比べ、RECK mRNA発現が低下していた。RECK蛋白発現は、組織型、リンパ節転移、Dukes' stage、脈管侵襲との相関が認められた。無再発生存率は、RECK陽性例は陰性例に比べ、有意に再発率が低かった(p=0.011)。RECKとMMP-9の発現を併せて評価したところ、RECKを優位に発現している症例(RECK≧MMP-9)では、その他の症例に比べ、有意に再発率が低く(p=0.0003)、多変量解析でも独立した予後因子となった(p=0.0122)。Gelatin zymographyによる活性型MMP-9とRECK発現との間には相関を認めなかった。RECKとVEGFの発現には負の相関が見られ(p=0.0037)、RECKとMVDにも負の相関関係が認められた(p=0.006)。【総括】RECKは大腸癌においてその発現が低下しており、大腸癌の予後を強く規定する因子であることが明らかとなった。またRECKとMMP-9発現のバランスを評価することにより、大腸癌の悪性度を把握できることが示された。その機序として、RECKは腫瘍の血管新生を抑制していることが、示唆された。【目的】