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東アジアにおける医薬品による環境汚染実態調査と環境汚染分析研究者育成協力

医薬品類による河川など水環境汚染調査を東アジアのインドネシアおよび大韓民国において現地の大学との共同で実施した。現地河川より医薬品類を検出測定した結果、インドネシアでは解熱鎮痛剤、大韓民国では日本で検出されている医薬品類が検出された。現在、検体の前処理は現地大学研究者に実施してもらい分析測定を日本にて行っている。今後現地で全ての測定が可能となるように、現地大学薬学部での環境汚染調査研究者育成協力として相互の研究者交流など基盤作成を実施した。近年、新たな環境汚染物質として注目されている医薬品による水道原水や河川水の汚染状況を東アジア諸国で調査を実施し始めた。発展の著しい東アジア諸国は、数億の人口を有し、生活レベルの向上と、伝染病が多いという亜熱帯的気候条件もあり、多種の医薬品、とくに抗生物質の使用量が上昇している。また、畜産や水産養殖に使用される動物用医薬品も量、種類ともに急増している。東アジア各国では、下水処理施設もあまり普及しておらず、使用された医薬品類は除去されることなく環境中に放出されていると予測される。放出された医薬品類は水域や食料品などを媒体として、世界に拡散していると予想される。本年度研究では、広島大学薬学部と新たに学部間協定を結んだインドネシアスラバヤ市にあるエアランガ大学薬学部の協力の下、スラバヤ市のスラバヤ川の汚染について上流、中流、下流での調査を行った。スラバヤ川は地元市民の水道水の水源となっているが、近年汚染が激しく飲用水としての使用が危惧されている。今回採水後汚染について調査したところ、医薬品としてはacetaminophenが検出された。河川水自体は浮遊物質が多く、臭気も激しかった。重金属や、その他汚染物質の調査も今後の調査対象とすべきと考えられた。この河川水についての継続調査を行う予定である。さらに、エアランガ大学薬学部の教員が広島市に環境衛生調査の学習に訪問した。今後さらなる学生、教員による交流を行う予定である近年、新たな環境汚染物質として注目されている医薬品による水道原水や河川水の汚染状況を東アジア諸国で調査している。また、病院や製薬工場などの排水から環境中に流出する医薬品も多く、耐性菌を始め耐性病原体の発生にも関与していることが懸念される。本年度研究では、比較的環境衛生状態が良い大韓民国で調査を実施した。調査地は大韓民国釜山市で、釜山大学薬学部の協力のもと、市内を流域とする温泉川の河川水の医薬品含量を測定した。温泉川の中流、下流から採水、さらに下流付近にある公共下水処理場の流入水、流出水の測定も行った。今回採水後汚染について調査したところ、医薬品としてはacetaminophen、tolbutamideなど日本と同様に医薬品類が検出された。河川水自体は日本の河川水と同じくらい目視的に濁度もなく、臭気も余り強くなかった。さらに、釜山大学薬学部の教員が広島大学薬学部を訪問した。今後さらなる学生、教員による交流を行う予定である。近年、新たな環境汚染物質として注目されている医薬品による河川水などの汚染状況を東アジア諸国で調査した。本研究の最終年として、これまで行ってきた医薬品の環境汚染調査の解析と現地大学への報告、情報交換を行った。インドネシアスラバヤ市のエアランガ大学では、調査を実施したスラバヤ川の汚染が問題となり、水道原水としての危険性が指摘されるということがあり、医薬品汚染のみならず、重金属での汚染など工業化に伴う汚染が問題となった。これにより、さらに汚染調査および調査技術者の育成の必要性が高まり、医薬品のみならず重金属類などの測定に関する情報交換なども実施した。大韓民国釜山大学との共同研究では、市街地を流域とする温泉川の医薬品汚染調査を実施した。韓国内で使用されている医薬品類が日本と類似していることより、日本と同じ医薬品類がほぼ同レベルで検出されることを明らかとした。本調査は、現地釜山大学のMoon教授の協力もあり共同で継続実施している。
細胞外ＡＴＰ放出の機能とメカニズムの解明

ATPシグナリング研究にイメージングが大事と考え、放出ATPを生物発光でリアルタイムにイメージングできる装置を開発したが、本研究ではさらに発光と蛍光の同時測定または高速切り替え測定できるように改良した。それを用い、ヒト表皮細胞において伸展刺激がヘミチャネルを介したATP放出と、TRPC6を介したCa2+の持続的な流入を引き起こし、傷の治癒を促進していること、いろいろな機械刺激を受けている肺の各種細胞が伸展刺激でATPを放出することなど、種々の細胞、組織におけるATP放出とその時間的変化や空間的分布を明らかにした。これによりATP放出の多様性を明らかにしイメージング法の有効性を示すことができた。Luciferin-Luciferase生物発光を用いたATPリアルタイムイメージング装置を開発し保有しているが、本研究ではそれを明るさが桁違いに異なる蛍光と同時に、あるいは高速の切り替えで時間差を最小にした測定系に改良するとともに、ATP放出の機序、役割を各種の細胞で明らかにすることを目的とする。昨年度は赤色のCa2+指示薬が使えるように、633nmの励起光と633nmのノッチフィルターを精度よく組み合わせた蛍光システムを構築しATP発光とCa2+赤色蛍光が光路を切り替えることなく観察できるように改良した。得られた主な研究実績は、1.国際雑誌Methodの編集者からの依頼によりATPルミネッセンスイメージング法のReviewを最新の顕微鏡イメージング法特集の中に執筆した(研究発表・雑誌論文#2)。2.小腸絨毛上皮下に密に存在し他の細胞ともネットワークを形成する上皮下線維芽細胞は機械刺激によってATPを放出し、そのATPシグナリングは小腸絨毛の動きやしなやかさなどの機械的性質を制御していることをすでに明らかにしている。本研究ではさらにサブスタンスPやそれを持つ神経系と相互作用していることを形態的にも機能的にも明らかにした。この相互作用がたくさんの絨毛の調和した運動に関与していることを示唆した。この成果は国際生理学会(バーミンガム・英国)において発表し(研究発表・学会発表#1)、またInternational Review of Cellular and Molecular BiologyにInvitedReviewとして掲載された(研究発表・雑誌論文#1)。3.ヒト表皮培養細胞を用いて、伸展機械刺激によるATP放出が周りの細胞でのATP受容体を活性化しCa2+波が伝播、それが創傷治癒過程を促進することを明らかにした。そのATP放出は創傷部位近傍の細胞のみからヘミチャネルを介して起こることを明らかにした。この成果は生理学研究所研究会他各種学会で発表し、現在J Cell Scienceに投稿、Revise中である。ルシフェリン・ルシフェレース生物発光はATPの高感度検出に用いられているが、その微弱発光を顕微鏡下でイメージングするATPリアルタイムイメージング装置を開発し保有しているが、まずその改良を進めた。明るさが桁違いに異なる発光と蛍光の同時、あるいは時間差を高速の切り替えにより少なくした測定系にするため、蛍光光源として瞬時のON-OFFや波長切り替え可能なLED光源を導入した。主な研究実績としては1.伸展機械刺激が重要な生理的因子と考えられる肺胞上皮のヒト細胞株(A549)を用いて、実際ATPが伸展刺激の強度依存的に放出されることを明らかにした。また放出されたATPは周りの細胞のATP受容体を活性化するに十分な濃度で、十分な距離拡散することを示した。この成果はJournal of Physiologyに掲載されたが、Editor's Choiceに選ばれその巻(2013年591号第5巻)の表紙をATP放出像で飾ることが出来た。2.小腸絨毛上皮下に密に存在し他の細胞ともネットワークを形成する上皮下繊維芽細胞は、機械感受性が強く各種受容体にも反応することなどから、絨毛におけるシグナリングの要としてはたらき、小腸絨毛の動きやかたさなどの機械的性質を制御していることを明らかにしてきている。本研究ではサブスタンスPやエンドセリン等の薬物刺激によってもATPが放出されることや伸展機械刺激によるATP放出の濃度やキネティクスを明らかにした。また培養だけではなくより生体に近い絨毛組織片においてもこれら伸展刺激や薬物刺激によってもATPが放出され、絨毛が収縮することを示した。この成果は各種学会で発表すると共にInternational Review of Cellular and Molecular Biologyからの依頼を受けた総説(in press)に一部記載した。研究実績の概要ルシフェリン・ルシフェレース生物発光を用いたATPリアルタイムイメージング装置を開発し保有しているが、本研究では明るさが桁違いに異なる発光と蛍光の同時、あるいは時間差を高速の切り替えにより少なくした測定系に改良し、ATP放出の機序、役割を各種の細胞で明らかにすることを目的とする。これまでに装置としては、蛍光光源として瞬時のON-OFFや波長切り替え可能なLED光源を導入し、さらに赤色のCa2+指示薬を使用可能にするため、633nmの励起光と633nmのノッチフィルターを精度よく組み合わせた蛍光システムを構築しATP発光とCa2+赤色蛍光が光路を切り替えることなく観察できるように改良した。それを用いて各種細胞でのATP放出を観察し以下のような研究実績が得られた。1.ヒト表皮細胞において伸展刺激が傷の治癒を促進することを示し、それに創傷部最前線の細胞からのヘミチャネルを介したATP放出と、後方の細胞でのATP受容体活性化とTRPC6を介したCa2+の持続的な流入が関与していることを明らかにした(J Cell Sci 127:4159, 2014)。

2.赤血球は血流中で機械刺激に応じてATPを放出し血管を弛緩したり様々な生理作用をしていることが知られているが、そのATP放出の多くの部分が血球の融解に依っていることを明らかにした(Blood 124:2150, 2014)。3.肺及び気道の平滑筋細胞及び線維芽細胞において伸展機械刺激によってATPが放出されCa2+応答が誘起されることを明らかにしその機序、生理的役割について考察した(Am J Respir Cell Mol Biol 51:772, 2014; Biochem Biophys Res Comm 453:101, 2014)。4. JSPS海外招へい研究員で来日したカナダモントリオール大学のDr. Ryszard Grygorczykと肺組織のATPイメージングに関して共同研究を行い、肺の膨張を機械刺激とする肺組織からATP放出の検出に成功した。我々の開発したルシフェリン・ルシフェレース生物発光を用いたATPリアルタイムイメージング装置を改良し、これまでに蛍光光源として瞬時のON-OFFや波長切り替え可能なLED光源を導入、さらに赤色のCa2+指示薬を使用可能にするため、633nmの励起光と633nmのノッチフィルターを精度よく組み合わせた蛍光システムを組み込み、明るさが桁違いに異なる発光と蛍光の同時、あるいは時間差を高速の切り替えにより少なくした測定系を構築した。また生体組織、器官からのATP放出を観察するためにさらに低倍のマクロ顕微鏡を用いたATPイメージングシステムを構築した(最終年度)。それらを用いて各種細胞、組織でのATP放出を観察し以下のような結果を得た。1.ヒト表皮細胞において伸展刺激が傷の治癒を促進することを示し、それにヘミチャネルを介したATP放出と、ATP受容体活性化に伴うTRPC6を介したCa2+の持続的な流入が関与していることを明らかにした。2.赤血球は血流中で機械刺激によってATPを放出し血管の弛緩等の生理作用をしているが、そのATP放出の多くの部分が血球の融解に依っていることを明らかにした。3.肺及び気道の上皮細胞や平滑筋細胞、線維芽細胞において伸展機械刺激によってATPが放出されCa2+応答が誘起されることを明らかにしその機序、生理的役割について考察した。4.ラット肺を摘出しその組織からのATPイメージングを行い、肺の気道を介した膨張を機械刺激とする肺組織からATP放出の検出にはじめて成功した。5.各種正常および乳がん細胞の機械刺激によるATP放出が3次元コラーゲンゲル培養下でも起こることを明らかにした。これは正常およびがん組織のモデル実験系構築の足掛かりとなる。ATPシグナリング研究にイメージングが大事と考え、放出ATPを生物発光でリアルタイムにイメージングできる装置を開発したが、本研究ではさらに発光と蛍光の同時測定または高速切り替え測定できるように改良した。
量的遺伝をするブドウ黒とう病抵抗性の分子的実体の解明

安定して大量のブドウ黒とう病菌(Elsinoe ampelina)分生子(無性胞子)を得る手法を、培地濃度を検討することにより開発し、黒とう病菌の接種試験を継続的に行うことを可能にした。ブドウ94品種系統の黒とう病抵抗性を調査し、病斑径による評価が有効であることを示した。抵抗性ブドウ遺伝資源では、菌侵入後、速やかに過敏感細胞死やフェノール様物質の蓄積が観察され、菌糸の進展が阻害されることを明らかにした。こうした機構は、一定の抵抗性を有する欧州ブドウでも同様に備わっていることが予想された。本研究では黒とう病抵抗性である米国ブドウ、罹病性である欧州ブドウ、そして両者の雑種系統について黒とう病発病程度の評価をすると共に、量的抵抗性の実体が、ある特定の過程(感染の認識、抗菌物質の生成、防御関連遺伝子の発現)に由来しているのか、あるいは複数の過程における複合的な影響であるのか解明することを目的としている。平成20年度においては、13品種系統を用い、圃場での病斑径と温室で栽培した植物の切葉への接種試験による病斑径の相関が非常に高い(相関係数r>0.9)ことを明らかにした。またこの病斑径を基にした抵抗性の品種間差異の評価は、既報の黒とう病抵抗性をよく反映していたことから、病斑径により表現される「ブドウ植物体による黒とう病病斑の進展抑制能力」が抵抗性の主要な要因であることが示唆された。以上の内容について学会発表を行うと共に、論文を執筆中である。一方、病斑数は抵抗性が強いとされる品種でもかなり多くなる場合があることや、表現形の変動(同一接種条件下での病斑数の変動)が大きいことなどから、評価が難しく、一概に既知の抵抗性との相関が高くは無いと予想された。病斑数により表現される「病原菌の植物体内への進入抑制能」の抵抗性要因としての意義が完全に否定されるものではないが、科学的評価、解析に供するには扱うことが難しい形質であることが予想された。一方、本研究の基盤となる黒とう病分生子形成法について、本年度中により詳細な解析を加え、論文を投稿し受理された。この成果によりより安定して黒とう病分生子を得ることが可能になった。ブドウ遺伝資源45品種系統を用いて、感染14日後のブドウ黒とう病病斑径の調査を行った。その中で、既報により黒とう病抵抗性の明らかにされている20品種について、本調査により明らかにされた平均病斑径との相関を調べた。その結果、両者の相関はR=0.75と一定の相関がみられたことから、病斑径を基に抵抗性の品種間差異を評価することは有効であることを明らかにした。また、供試した品種系統の中に、供試葉内での病斑径のばらつきが大きく、褐点状の病斑と進展性の病斑が混在する品種(パーレット、エキゾチック、ピオーネ)があることを見出し、一部の罹病性品種は、部分的に抵抗性を発揮しうることが示唆された。こうした抵抗性を有する品種は、他の高度罹病性品種と比較して抵抗性母本としての価値を有することが予想される。抵抗反応の一つである過敏感反応(HR)について調べるため、Lactophenol trypan blue染色を行った。その結果、イタリアやトムソンシードレスといった罹病性のヨーロッパブドウ品種では、感染2日後に染色される植物細胞はほとんど観察されず、感染7日後においても、HRの生じていない領域に旺盛な菌糸の進展がみられた。一方、Vitis aestivalisでは、感染2日後には感染部位付近においてHRが観察され、菌糸の進展が完全に抑えられるか、非常に抑制されていたことから、この時期にはすでに植物体が菌の侵入を認識し、抵抗反応を誘導できていることが示された。また細胞死と共にフェノール化合物と予想される褐色の物質の蓄積も観察された。こうしたHRやフェノール物質の蓄積が、感染初期に生じる.かどうかが、抵抗性品種間差異の一つの重要な指標となることが考えられる。ブドウ遺伝資源94品種系統を用いて、感染14日後のブドウ黒とう病病斑径の調査を行った。その中で、42品種系統は昨年も調査しており、両調査結果の相関は0.89と非常に高かった。これは両年の調査結果がほぼ等しいことを示した。この2年間の調査を通じ、欧州ブドウ(V.vinifera)とされる品種中、パーレット、エキゾチック、瀬戸ジャイアンツなどは2年通じて比較的病斑径が小さく、一定の抵抗性を有していることが示唆された。また、ピノノワールやシラーといった醸造用のヨーロッパブドウにも比較的病斑径の小さいものが多かった。これに関し、過去の調査結果を調べたところ、川上善兵衛による古い文献においても、これら醸造用ブドウは黒とう病に耐える、との記述があり、本研究により再発見がなされたと言える。

定量的な評価で、欧州ブドウに一定の抵抗性を有する品種があることを初めて示したことは、大きな意義がある。また、果樹研究所で育成保存していた25個体のブドウ母本系統を調査し、3個体がアメリカブドウ並みの強い抵抗性を有していることを明らかにした。感染後の抵抗反応について、実体顕微鏡下での観察を行ったところ、罹病性であるヨーロッパブドウでは感染2日後に表皮細胞の陥没が観察され、すでに黒とう病菌が侵入していることが示唆された。一方、抵抗性の米国野生ブドウでは、感染2日後に、多くの場合感染部位への黒または褐色の物質の蓄積が観察されたが、これらはフェノール化合物の蓄積であると考えられた。そこで、抵抗性の品種コンコードを用いて、感染部位の切片を作成し、蛍光顕微鏡で観察したところ、青い自家蛍光を発する物質の蓄積が観察された。感染により蓄積するレスベラトロールという抗菌物質は、青色蛍光を発することが知られており、今回の結果は黒とう病感染においてもブドウ植物体がレスベラトロールを産生することを示唆している。
高次元多変量モデルに関する変数選択法と応用

本研究では,多変量解析とくに,主成分分析,多変量回帰分析,判別分析,正準相関分析,多変量逆回帰分析,などにおいて,目的変数や説明変数が標本数とともに大きい場合における変数選択法と次元推定法に関して研究することを目的としている.具体的には, (1) AICやCpなどの情報量規準を高次元の場合へ拡張し,それらの性質を解明する.(2)罰則付最適化法に基づく変数選択法を開発し,修正モデル選択法との関係を解明する.(3)得られた結果を数値実験により検証し,さらに実データへの応用に取り組む.30年度の主要な成果は, (T-1)主成分分析における有意な主成分の個数の推定,(T-2)多変量回帰モデルにおける説明変数の選択と次元の推定問題, (T-3)判別分析における変数選択問題, (T-4)多変量回帰・正準相関分析における次元の推定,と関係している.(T-1)に関しては,主成分分析における有意な主成分の個数に関するAICとBIC規準について,高次元一致性をもつための十分条件を与えている.この成果は, Ann. Statist.に掲載されている. (T-2)に関しては,多変量回帰モデルにおいて,一般共分散行列および簡単な共分散構造をもつ場合について,選択変数が大きい場合にも実行可能な一般化一つ取って置き法を提案し,その高次元一致性を示した.これらの結果は投稿中である. (T-3)に関しては,各変数の有意性規準に基づく新たな規準,および,それと同等な一つ取って置き法を提案し,高次元一致性を示した.なお,本研究の期間中には,高次元多変量回帰モデル,および,一組の変数が高次元である正準相関分析において,次元推定のための情報量規準の一致性を示している.また,数値実験による検証も実施し,新たな知見も得ている.本研究では,多変量解析とくに,判別分析,多変量回帰分析,主成分分析,正準相関分析,多変量逆回帰分析,などにおいて、目的変数と説明変数の数が標本数に比べ大きい場合における変数選択法と次元選択法に関して研究することを目的としている.具体的には,次の課題に取り組む.(1)AICやCpなどのモデル選択規準を高次元の場合へ拡張し,それらの性質を解明する.(2)罰則付最適化法に基づく変数選択法を開発し,修正モデル選択法との関係を解明する.(3)得られた結果を数値実験により検証し,さらに実データへの応用に取り組む.28年度の主要な成果は, (S-1)多変量回帰モデルにおける説明変数の選択問題, (S-2)判別分析における変数選択のための罰則付最適化法の開発,と関係している.(S-1)に関しては,共分散行列に対して3つの構造,独立構造、一様構造、自己回帰構造を想定した場合の説明変数の選択問題に取り組んだ.変数選択基準としてAIC規準およびBIC規準を特別な場合として含む一般化基準を考え,目的変数の数と標本数が共に大きくなるという高次元漸近的枠組のもとで,一致性をもつための条件を与えた.その結果の数値的検証も行っている.これらの結果の一部は, 2016年度統計関連連合大会において,分担者櫻井との共同研究として発表した.なお,多変量回帰での次元の推定規準に関して,高次元での一致性を指摘し,国際誌(JMA)に発表した.(S-2)に関しては,判別分析法の回帰アプローチを利用して, Lasso型推定法を提案した.この推定法による変数選択と,モデル選択規準AIC, BICによる変数選択の数値的検討を行った.これらの結果を2016年度統計関連連合大会において,共同研究として発表した.研究実績の概要において述べているように,多変量回帰モデルにおいて,本研究で目標にしている課題(1), (3)に関してかなりの成果を得て,その成果の一部を統計関連学会で発表している.また,判別問題おいて,本研究で目標にしている課題(2)に関して,その成果を統計関連学会で発表している.これらの成果を英文論文とて執筆中である.多変量回帰での成果は,変数の数が標本数より大きい場合に対しても適用できるものであり,これは29年度以降の研究課題にしていたものであり,予定より早く進んでいる.本研究での成果は,主として多変量回帰モデル,判別分析出の成果であるが,これらの成果を,主成分分析,正準相関分析,多変量逆回モデル,などで発展させる糸口になると期待される.本研究では,多変量解析とくに,判別分析,多変量回帰分析,主成分分析,正準相関分析,多変量逆回帰分析,などにおいて,目的変数と説明変数の数が標本数に比べ大きい場合における変数選択法と次元選択法に関して研究することを目的としている.具体的には, (1) AICやCpなどのモデル選択規準を高次元の場合へ拡張し,それらの性質を解明する.(2)罰則付最適化法に基づく変数選択法を開発し,修正モデル選択法との関係を解明する.(3)得られた結果を数値実験により検証し,さらに実データへの応用に取り組む.29年度の主要な成果は, (T-1)主成分分析における有意な主成分の個数の推定,(T-2)多変量回帰モデルにおける説明変数の選択と次元の推定問題, (T-3)判別分析における変数選択問題, (T-4)多変量回帰・正準相関分析における次元の推定,と関係している.(T-1)に関しては,高次元主成分分析における有意な主成分の個数に関するAICとBIC規準について,一致性をもつ場合の十分条件を与えている.

この成果は, Ann. Statist.に掲載されている. (T-2)に関しては,多変量回帰モデルにおいて,簡単な共分散構造をもつ場合について一般化モデル選択規準の高次元一致性を示し,現在,これらの成果含む英文論文を作成し,投稿中である. (T-3)に関しては,各変数の有意性規準に基づく新たな規準を提案し,英文論文を作成中である. (T-4)に関しては,高次元多変量回帰モデル,および,一組の変数が高次元である正準相関分析において,次元の推定規準AIC, BIC, Cpの一致性を示し,雑誌J. Multivariate Anal., SUT Journal of Mathematicsに発表している.研究実績の概要において述べているように,多変量回帰モデル,主成分分析,判別分析,正準相関モデルにおいて,本研究で目標にしている課題(1), (3)に関してかなりの成果を得て,その成果の一部を統計関連学会で発表し,国際的雑誌に掲載している.また,本研究で目標にしている課題(2)に関しては,判別問題において,線形回帰モデル,判別分析における次元のモデル選択規準に関して,正則化法を適用をし,それらの理論的性質や数値的検討を行い,その成果の一部を国際的雑誌J. Multivariate Anal.に発表している.理論的研究成果に関しては,数値実験による検証も実施し,新たな知見も得ている.これらのことから,研究は,概ね順調に進んでいると言える.一般に, AICやBICなどのモデル選択規準に基づく変数選択法には,変数の数が多くなると実行できないという問題点がある.本研究を推し進める過程において,この問題点を解消した規準(検定型変数選択規準)を提案し,その規準の性質を明らかにすることが重要な課題になっている.多変量回帰での成果は,変数の数が標本数より大きい場合に対しても適用できるものである.本研究での成果は,主として多変量回帰モデル,判別分析での成果であるが,これらの成果を,主成分分析,正準相関分析,多変量逆回帰モデル,成長曲線モデルなどで発展させる糸口になると期待される.本研究では,多変量解析とくに,主成分分析,多変量回帰分析,判別分析,正準相関分析,多変量逆回帰分析,などにおいて,目的変数や説明変数が標本数とともに大きい場合における変数選択法と次元推定法に関して研究することを目的としている.具体的には, (1) AICやCpなどの情報量規準を高次元の場合へ拡張し,それらの性質を解明する.(2)罰則付最適化法に基づく変数選択法を開発し,修正モデル選択法との関係を解明する.(3)得られた結果を数値実験により検証し,さらに実データへの応用に取り組む.30年度の主要な成果は, (T-1)主成分分析における有意な主成分の個数の推定,(T-2)多変量回帰モデルにおける説明変数の選択と次元の推定問題, (T-3)判別分析における変数選択問題, (T-4)多変量回帰・正準相関分析における次元の推定,と関係している.(T-1)に関しては,主成分分析における有意な主成分の個数に関するAICとBIC規準について,高次元一致性をもつための十分条件を与えている.この成果は, Ann. Statist.に掲載されている. (T-2)に関しては,多変量回帰モデルにおいて,一般共分散行列および簡単な共分散構造をもつ場合について,選択変数が大きい場合にも実行可能な一般化一つ取って置き法を提案し,その高次元一致性を示した.これらの結果は投稿中である. (T-3)に関しては,各変数の有意性規準に基づく新たな規準,および,それと同等な一つ
金属酸化物クラスター配列制御による機能性イオン結晶の創製

資源の少ない我が国において、エネルギーや物質の有効利用を可能にする環境調和型かつ高機能な材料の開発は、重要な課題の一つである。本研究では、金属の核数と距離が精密に規定された金属酸化物クラスターの配列制御による機能性固体(吸着分離、吸蔵、触媒、イオン伝導、磁性・電子材料)の構築を、サブナノミクロンレベルで行うことを目的とした。当該領域「配位プログラミング」が目指す「機能階層的な超構造体を設計通り精密に組み上げる」、「分子機能を組織化して高効率出力するナノサイズ化学素子の開発」という目的と合致する。平成25年度の主な成果として、(1)三次元細孔を有するイオン結晶の合成とアセチレン及び二酸化炭素の選択的吸着、(2)二次元層構造を有するイオン結晶の合成と無機ガス・低級炭化水素ガスの吸着分離、(3)ポストシンセシスにより細孔体積の増加と吸着量の増加、が挙げられる。(1)(2)と昨年度の成果により、イオン結晶における細孔構造の次元性の制御(1から3次元)に成功したことが最も大きなトピックスである。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、無機ユニット(金属酸化物クラスターであるポリオキソメタレートアニオン)と有機ユニット(カチオン性金属錯体や有機アンモニウム)の協奏による機能発現に重点をおいて研究を進めた。今年度の成果として、(1)二酸化炭素とメタンの分離が可能な多孔性有機ー無機複合化結晶、(2)結晶格子内にサイト欠陥を有し、欠陥部を利用した選択的な分子やイオンの吸着交換が可能な無機結晶、(3)構造柔軟な結晶格子を有し、結晶格子内で形状選択的に過酸化水素を酸化剤としたオレフィン類の酸化反応が進行する有機ー無機複合化結晶、の創製に成功した。これらの成果は、無機ユニットが吸着・反応活性点として機能し、有機ユニットが吸着・反応に適切なナノ空間の構築に関わっており、目標として掲げた「無機ー有機ユニットの協奏」に成功したといえる。本研究では、金属の核数と距離が精密に規定された金属酸化物クラスターの配列制御による機能性固体(吸着分離、吸蔵、触媒、イオン伝導、磁性・電子材料)の構築を、サブナノミクロンレベルで行うことを目的としており、構造ブロックを精密に配列することで、高選択的な吸着分離機能(二酸化炭素/アセチレン、二酸化炭素/メタン、水/エタノール)や形状選択的な触媒機能(ピナコール転位、オレフィン酸化)を有するイオン結晶の構築に成功している。当該領域「配位プログラミング」が目指す「機能階層的な超構造体を設計通り精密に組み上げる」、「分子機能を組織化して高効率出力するナノサイズ化学素子の開発」という目的達成の一手段として、有機物(材料としてみた場合に耐熱性や耐酸化性が低下するため)の助けをなるべく借りない金属酸化物クラスターの配列制御による無機イオン結晶の創製、また、イオン結晶は一般に構造予測が困難であるため、種々のポストシンセシス法による構造の精密制御を行う予定である。
多面的把握に基づく新義真言宗系聖教の解明と公開促進を果たす研究

智積院新文庫聖教「いろは函」の調査を進め、「ゆ函」までの調査を完了した。また、調書のデータ入力は進行中である。デジタル撮影、データ化、デジタル機器による特殊撮影も行なった。また、聖教調査に並行して聖教のデジタルアーカイブ化等も進め、その一つとして、凸版印刷との連携に基づき、古写本のデジタルアーカイブ化を進めた。この成果については、29年度開催のシンポジウムで公開した。また、成果公開として、論文・学会発表等を行ない、招聘発表や学会賞の受賞も果たした。その他、古写本の調査として、智積院関連寺院や京都府下・滋賀県下の古社寺、並びに諸地域における予備調査と撮影等をも行なった。【目的】前科研において、根来寺聖教や新義真言宗系聖教として貴重な新出聖教群を真言宗智山派総本山智積院に確認し、その多面的把握によって、諸領域から招聘発表や学会賞受賞等の評価を得ることが叶った。そこで、従来聖教とは別系統の新義真言宗系聖教の解明を目指し、智積院新文庫聖教の「いろは函」全ての詳細目録の作成と、智積院・新義真言宗系聖教の国語学的な分析・解明、また、言語環境の解明を目指した諸領域による多面的把握と、全体的公開・利用促進の為の技術開発を行なう。【実績】上記に基づき、智積院新文庫聖教の調査を進め、「い函」から「ゐ函」までの調査を完了した。調書作成、デジタル撮影、データ化については、従来より蓄積した画像処理・画像データベースの手法を用い、デジタル機器による特殊撮影も行なった。その方策については、文化財修復の関連業者との意見交換等も行なった。また、聖教調査に並行してデータ班による聖教のデジタルアーカイブ化等も進め、その一つとして、凸版印刷との連携に基づき、古写本のデジタルアーカイブ化において、(1)特殊撮影技術を実用的なものとするため、本学所蔵の角筆文献による検証、(2)京都国立博物館蔵の『世説新書』(国宝)・『本阿弥切』(国宝)等の撮影、研究や文化財体験に資するシステムの確立とその成果の公開、(3)本申請者と同様に他の研究者がデジタルアーカイブ化を行なうための発注方法等を提示、(4)聖教調査とデジタル撮影の場に研究者を招聘して本科研の成果報告と研究の評価・点検を行なった。また、古写本の公開として、現在、申請者が調査可能である真言宗智山派総本山智積院等や京都府下・滋賀県下の古社寺における予備調査と撮影等をも行なった。【実績】上記に基づき、智積院新文庫聖教の調査を進め、「の函」から「け函」までの調査を完了した。また、聖教調査に並行してデータ班による聖教のデジタルアーカイブ化等も進め、その一つとして、凸版印刷との連携に基づき、古写本のデジタルアーカイブ化を進めている。この成果については、28年度開催のシンポジウムで公開予定である。また、古写本の調査として、現在、申請者が調査可能である真言宗智山派総本山智積院等や京都府下・滋賀県下の古社寺、並びに佐賀県下における予備調査と撮影等をも行なった。本年度において、調査対象の1/3の調査を完了した。調査研究成果に関する公開については、智積院御当局より、ご許可を頂いている。デジタルアーカイブのシステムに関しても予定通り進行中であり、試作ソフトも制作している。そこで、従来聖教とは別系統の新義真言宗系聖教の解明を目指し、智積院新文庫聖教の「いろは函」全ての詳細目録の作成と、智積院・新義真言宗系聖教の国語学的な分析・解明、また、言語環境の解明を目指した諸領域による多面的把握を行なう。また、聖教の公開・利用促進の為の技術開発を行なう。【実績】上記に基づき、智積院新文庫聖教の調査を進め、「ふ・こ・え・さ・き・ゆ函」の調査を完了した。

また、聖教調査に並行してデータ班による聖教のデジタルアーカイブ化等も進め、その一つとして、凸版印刷との連携に基づき、古写本のデジタルアーカイブ化を進めている。この成果については、29年度開催のシンポジウムで公開予定である。また、成果の公開としては、論文・学会発表等を行ない、招聘発表や学会賞の受賞も果たした。その他、古写本の調査として、現在、申請者が調査可能である真言宗智山派総本山智積院等や京都府下・滋賀県下の古社寺、並びに佐賀県下における予備調査と撮影等をも行なった。智積院新文庫聖教「いろは函」の調査を進め、「ゆ函」までの調査を完了した。また、調書のデータ入力は進行中である。デジタル撮影、データ化、デジタル機器による特殊撮影も行なった。また、聖教調査に並行して聖教のデジタルアーカイブ化等も進め、その一つとして、凸版印刷との連携に基づき、古写本のデジタルアーカイブ化を進めた。この成果については、29年度開催のシンポジウムで公開した。また、成果公開として、論文・学会発表等を行ない、招聘発表や学会賞の受賞も果たした。その他、古写本の調査として、智積院関連寺院や京都府下・滋賀県下の古社寺、並びに諸地域における予備調査と撮影等をも行なった。本年度において、調査対象の1/3の調査を完了した。調査研究成果に関する公開については、智積院御当局より、ご許可を頂いている。デジタルアーカイブのシステムに関しても予定通り進行中であり、試作ソフトも制作している。1智積院新文庫聖教のうち、「いろは函」の調査を完成させる。2調書に基づいて、データ入力を行なう。3調査・研究成果に基づいて、論考・資料公開を行なう。4調査・研究成果に基づいて、デジタルアーカイブ化を進める。5上記に基づくシンポジウムを開催する。28年度が最終年度であるため、記入しない。日本語学1智積院新文庫聖教のうち、「いろは函」の調査を完成させる。調査先である智積院の収蔵庫の空調設備の故障のため、調査が1回分(実質2日分程度)行えなかったことによる差額が生じた。次年度以降において、調査回数を1回分増やす。
自伝的記憶の想起の偏りを通してみた自閉症スペクトラム児の社会性の障害に関する研究

本研究では、学齢期の自閉症スペクトラム児を対象として、自伝的記憶の想起と社会性の障害との関係性について検討した。その結果、知的障害のある自閉症スペクトラム児は、自閉症スペクトラムを伴わない知的障害児と比較して、感情に関する単語よりも時代区分に関する単語を提示された際に特定の出来事を想起する傾向にあった。また、自閉症スペクトラム児は自己の行為とその結果の因果関係の理解が困難であった。自伝的記憶と心の理論との関連について、ポジティブな単語を提示した際、心の理論を通過した対象児において特定の出来事が想起された数は、通過しなかった対象児において想起された特定の出来事の数を有意に上回っていた。今年度は、高機能自閉症あるいはアスペルガー症候群等のいわゆる自閉症スペクトラム児における自伝的記憶の想起の偏りの有無について検討すること、及び社会性の障害について彼らの実生活上に密着した観察をおこなうことを目的とした。前者について、まず最初に自閉症スペクトラム児を対象とした自伝的記憶の想起の特徴について文献研究をおこなった。その結果、定型発達児とは対照的に自己よりも他者の出来事について想起する傾向にあること、情報の想起そのものは可能であったとしても情報の出典を想起することが難しい傾向にあることが先行研究にて指摘されていた。そうしたことが実生活上で起こりえているのか確認すべく、自閉症スペクトラム児を対象とした放課後支援の場を通じて予備的な観察をおこなったところ、想起内容が他者の想起に偏るというよりも、むしろ自己と他者の両方を併せて自他の関係性を明示して一つの出来事を想起することが困難であるように見受けられた。次年度はこうした特性を客観的に見いだせるような課題を作成し、分析検討をおこなっていきたいと考える。また、社会性の障害についての観察を通じて、社会性の発達支援に必要な支援の枠組みについて検討し、彼らの社会性を発揮させる場を保障することを通じて支援をおこなっていくことの大切さについて考察をおこなった(なお、それらの一部は第52回日本特殊教育学会の自主シンポジウムにて話題提供者として報告をおこなった)。今年度は、自閉症スペクトラム児における社会性の困難に焦点を当てて研究を進めた。具体的には、社会的相互作用場面で見られる「自己の行為とその結果の因果関係の理解の困難」に焦点を当て、彼らの特性を明らかにすることを目的とした。行為者(自己および他者)によって因果関係の理解に違いがあるのかを検証するためにすごろく課題を用いた。知的障害のある自閉症スペクトラム児(8名)と知的障害児(7名)に実施したところ、知的障害児は行為者が自己であっても他者であっても因果関係の理解に違いは見られなかった。一方で、自閉症スペクトラム児は自己が行為者となる場合の因果関係の理解に困難を示す傾向がみられた。これらより、知的機能の制限があっても、自己の行為とその結果の因果関係の理解が困難であるという自閉症スペクトラムの特性が確認された。加えて、すごろく課題においては、因果関係が生じた場面に関する質問(結果理由質問)において、自由回答を求めたのちに複数の選択肢を与えて回答を求めた。筆者らが以前おこなった高機能自閉症児を対象とした調査(鈴木ら, 2014)では、前者よりも後者の成績の方が良好であったが、知的障害のある自閉症スペクトラム児の場合、後者の成績の方が低かった。口頭での回答が難しい場合に選択肢を与えて回答を促すことを意図した課題であったが、知的障害のある自閉症スペクトラム児の場合は、選択肢が複数提示されることで情報過多となってしまい、回答に迷いが生じて成績が低くなってしまう可能性が考えられた。次年度は、自閉症スペクトラム児の社会性の問題について引き続き検討を行うと同時に、自伝的記憶の想起課題を実施し、上述の結果との関連性を含めてさらに検討を重ねていきたい。本年度おこなうべき研究そのものは遂行できたが、昨年度の遅れを取り戻すところまでは至らなかったことが理由である。一方で、報告をおこなった内容以外のデータの収集も既におこなっていることから、その分析を早急に行うことで進捗状況を挽回したいと考えている。今年度は、自閉症スペクトラム児における自伝的記憶の想起の偏りについて焦点を当てて研究を進めた。具体的には次の通り検討をおこなった。知的障害のある自閉症スペクトラム児8名と知的障害児7名を対象とした(レヴン色彩マトリクスを実施した結果、二つの対象群の間には知的機能に有意な差は存在しなかった)。感情に関する単語及び時代区分に関するテーマ(小学校時代、中学校時代等)、合計14個を口頭で順に示して、各々に関して自分の経験した特定の出来事を想起するように指示した。想起された出来事は、それぞれの内容に基づいて特定の出来事を想起できていたか否か(以下、特定性と記す)、いつ、どこで、だれが、どうしたといった情報が含まれていたかどうか分析した。想起内容に他者が含まれていたか、感情の想起があったかどうかも同時に分析した。その結果、想起された全ての情報の特定性、いつ、どこで、だれが、どうした、他者が含まれていたか、感情が含まれていたかについて、対象群間で有意な偏りは見られなかった。一方で、感情に関する単語と時代区分に関するテーマとに分けて分析したところ、特定性に関して、知的障害児は感情に関する単語に対する想起において特定の出来事を想起する傾向にあった。一方、知的障害のある自閉症スペクトラム児は時代区分に関するテーマに関して特定の出来事を想起する傾向にあり、それらの偏りは有意であった(p<0.05)。

これらは、知的障害児と、知的障害を伴う自閉症スペクトラム児との間で自伝的記憶にアクセスしやすい手がかりが異なっている可能性を示唆するものと考えられた。なお、その他の項目については有意な偏りは見られなかった。最後に、対象者数を増やすべく追加調査を年度末に実施済みであり、今後はその分析を急ぐとともに、既に報告した社会性の問題との関係性について検討を進めたいと思っている。本年度は上記のように研究を実施したものの、本来の研究計画に照らし合わせると1年遅れとなってしまっており、遅れた分を挽回するに至らなかった。1年の研究期間延長の中でしっかりと挽回できるようにしたいと考えている。今年度は、自閉症スペクトラム児における社会性の問題との自伝的記憶の想起の関係性について検討を進めた。知的障害のある自閉症スペクトラム児19名(平均年齢16.8歳)と知的障害児26名(平均年齢15.9歳)、合計45名(平均年齢16.2歳)を対象とした。ポジティブ、ネガティブな感情に関する単語、及び時代区分に関するテーマ(小学校時代、中学校時代等)、合計14個を口頭で順に示して、各々に関して自分の経験した特定の出来事を想起するように指示した。想起された出来事において、特定の出来事を想起できたか否か(以下、特定性と記す)、いつ、どこで、だれが、どうした、といった情報が含まれていたか否かと自閉症状の有無、心の理論課題の通過の有無との関連について、Mann-Whitney U検定を使ってそれぞれ分析した。その結果、想起された出来事の上記の項目と自閉症状の有無との間に有意な関連性は見られなかった。一方、想起された出来事と心の理論課題の通過の有無については、ポジティブな単語に関する出来事との想起を行った際に、心の理論課題を通過した対象児において特定の出来事が想起された数が、心の理論課題を通過しなかった対象児において想起された特定の出来事の数を有意に上回っていた(p<0.05)。なお、その他の項目と心の理論課題との間には有意な関連性はなかった。心の理論は自他理解と密接に関連していると考えられている。そうした自他理解と自伝的記憶の想起内容の詳細さとが関連している可能性は、自伝的記憶が「自らの経験した出来事に関する記憶であることから充分にあり得ることと思われる。一方で、ポジティブな単語や時代区分に関するテーマを提示した際にはそうした有意差は見られなかったことから、どのような手がかりを提示した際に想起される出来事の詳細さが変化するかについては今後の課題としたい。本研究では、学齢期の自閉症スペクトラム児を対象として、自伝的記憶の想起と社会性の障害との関係性について検討した。その結果、知的障害のある自閉症スペクトラム児は、自閉症スペクトラムを伴わない知的障害児と比較して、感情に関する単語よりも時代区分に関する単語を提示された際に特定の出来事を想起する傾向にあった。また、自閉症スペクトラム児は自己の行為とその結果の因果関係の理解が困難であった。自伝的記憶と心の理論との関連について、ポジティブな単語を提示した際、心の理論を通過した対象児において特定の出来事が想起された数は、通過しなかった対象児において想起された特定の出来事の数を有意に上回っていた。
根毛形成におけるリン脂質シグナルの役割陰

リン脂質は真確生物における細胞膜の腫瘍構成成分であるだけではなく、膜上に局在するシグナル分子としても重要な役割を果たす。それらは細胞内で局所的に起こる様々な現象の制御に関わると考えられており、実際に動物細胞では、PAやPIP2が細胞の局所的な形態変化における制御シグナルであることが知られている。我々は、植物の細胞形態形成のモデルシステムであるシロイヌナズナの根毛を用いて、局所的制御シグナルとしてのリン脂質の役割を調べた。PIP2は伸長過程の根毛や花粉管の先端に局在することなどから、植物細胞の先端成長における正の制御因子であると考えられている。我々はシロイヌナズナのPIP2生成酵素、PIP5K3が根毛形成に関与することを突き止め、その生物学的機能,分子動態などを調べた。PIP5K3遺伝子は幼植物体では根毛細胞特異的に発現する。その遺伝子の突然変異体では根毛の伸長が抑制され、また、過剰発現により根毛の伸長が促進された。YFPとの融合タンパク質PIP5K3-YFPのPIP5K3プロモーターによる発現はpip5k3突然変異体の形質を相補することができた。このタンパク質の細胞内局在性を観察した結果、PIP5K3-YFPは根毛発生の極初期段階から根毛先端の細胞膜およびその周辺の細胞質に局在し、根毛伸長の終止とともに速やかに消失することが判明した。これらのことから、PIP5K3は、根毛先端において根毛伸長を量的に制御する因子であると考えられる。根毛形成におけるリン脂質シグナル伝達経路の中でPLDの上流に位置する因子としては、これまでの報告からRop2を含むRhoファミリー低分子Gタンパク質がその一つである可能性が高い。そこで、Rop2とAtPLDζ1との間の相互作用をin vitroにおいて大腸菌で作らせた組換えタンパク質(Hi_<S6>-Rop2とGST-AtPLDζ1)を用いて調べた。その結果、それらの組換えタンパク質は特異的に物理的相互作用をし得ることが判った。PLD下流の因子に関しては、PAとの結合が予想されるタンパク質の一つとしてPI(4)P5Kが考えられる。シロイヌナズナに11種類存在するPI(4)P5K遺伝子のcDNAのタンパク質コード領域をすべてクローニングした結果、その中の一つの遺伝子ではスプライシングパターンの異なる複数種のcDNAが存在することが判明した。また、それら遺伝子の発現を器官別に調製されたRNAを用いてNorthern法により解析した結果、花器官で強く発現しているもの、根特異的に発現しているものなどが見い出された。AtPLDζ1およびAtPLDζ2に関するプロモーターGUS融合遺伝子をそれぞれ有する形質転換シロイヌナズナを用いて組織化学的なプロモーター解析を行った。その結果、AtPLDζ1では増殖組織を中心に、花粉を除く植物体全体でプロモーター活性が観察されたのに対して、AtPLDζ2では花粉でのみ強いプロモーター活性が見られた。このことから、AtPLDζ1とAtPLDζ2が組織特異的に役割分担をしているものと考えられる。これまでの研究の結果より、シロイヌナズナの根毛における先端伸長の維持にはホスホリパーゼD(PLD)の一種であるPLDz1の機能が関わることが明かとされている。そのシグナル下流の因子を明らかにする目的で、PLDの生成物であるホスファチジン酸(PA)との結合が予想されるタンパク質としてホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PI(4)P5K)に注目した。シロイヌナズナにはPI(4)P5K遺伝子が11種類存在する。それら遺伝子の発現を器官別に調製されたRNAを用いてNorthern法により解析した結果、PIP5K3遺伝子が根において特異的に発現していることが明らかになった。

さらにプロモーターレポーター解析により、PIP5K3の発現を細胞レベルで解析したところ、根の根毛発生領域において、PIP5K3プロモーターが根毛細胞列特異的に強く発現していることが示された。つぎに、PIP5K3のT-DNA挿入変異体を複数得、それらのホモ接合株を解析した。その結果、それらの根毛の伸長が有意に抑制されていた。誘導的発現系を用いて根においてPIP5K3の過剰発現を行ったところ、根毛の伸長が促進された。また、PIP5K3とYFPとの融合タンパク質は伸長過程の根毛の先端部に局在した。これらの結果は、PIP5K3遺伝子が根毛の伸長を正に制御していることを示している。リン脂質は真確生物における細胞膜の腫瘍構成成分であるだけではなく、膜上に局在するシグナル分子としても重要な役割を果たす。それらは細胞内で局所的に起こる様々な現象の制御に関わると考えられており、実際に動物細胞では、PAやPIP2が細胞の局所的な形態変化における制御シグナルであることが知られている。我々は、植物の細胞形態形成のモデルシステムであるシロイヌナズナの根毛を用いて、局所的制御シグナルとしてのリン脂質の役割を調べた。PIP2は伸長過程の根毛や花粉管の先端に局在することなどから、植物細胞の先端成長における正の制御因子であると考えられている。我々はシロイヌナズナのPIP2生成酵素、PIP5K3が根毛形成に関与することを突き止め、その生物学的機能、分子動態などを調べた。PIP5K3遺伝子は幼植物体では根毛細胞特異的に発現する。その遺伝子の突然変異体では根毛の伸長が抑制され、また、過剰発現により根毛の伸長が促進された。YFPとの融合タンパク質PIP5K3-YFPのPIP5K3プロモーターによる発現はpip5k3突然変異体の形質を相補することができた。このタンパク質の細胞内局在性を観察した結果、PIP5K3-YFPは根毛発生の極初期段階から根毛先端の細胞膜およびその周辺の細胞質に局在し、根毛伸長の終止とともに速やかに消失することが判明した。これらのことから、PIP5K3は、根毛先端において根毛伸長を量的に制御する因子であると考えられる。
スルフィド活性種の生成と反応制御

有機反応において結合の生成と開裂を制御するために、各種のヘテロ元素の応用が注目されている。脂肪族スルフィドを一電子酸化すると、S-S三電子結合による二量体ラジカルカチオンを形成することはよく知られているが、芳香族スルフィドでは生成しないとされて来た。しかし、チオアニソール類の光増感一電子酸化系についてレーザーフラッシュ分光法により追跡した結果、容易にラジカルカチオン二量体を生成することが判明した。濃度変化により2種類の二量体ラジカルカチオンを形成し、吸収極大が470nmのものがσ型、800nmのものがπ型の二量体である。スルフィドと一重項酸素の付加物であるパースルホキシド(Persulfoxide)の特徴的な反応は求核的酸素移動であり、スルホキシドを選択的に酸化してスルホンを与える。このパースルホキシドの反応性がアルコールの添加により大幅に変化することが判明した。溶媒にROHを添加すると活性中間体の求電子性が大幅に増加するが、大過剰量の添加では減少する。一方、CF_3CH_2OHでは、求電子性を大きく増加させる特別な効果があった。このように、アルコール類の効果により、4種類の活性酸素種の介在が示唆された。反応制御の方法として、溶媒の付加と関与が重要であることを示した。
分子設計と試験管内進化法の融合による機能性RNA創製と病害抵抗性植物育種への応用

本研究では、「分子設計と試験管内進化法の融合による機能性RNA新規創製法」の一般化、およびその過程で得られたアプタマーの病害抵抗性植物育種への応用を目的とする。既存の機能性RNA創製法である試験管内進化法は、非合理的であり、実用に足る成果を得られない場合も多い。ここに分子設計という合理的手法を取り入れることで、確実に機能性RNAを創製する。機能性RNAとして、「標的に結合する」という単純な機能によって、自由度の高い応用を可能とする機能性核酸=アプタマーをモデルとする。まず、天然の核酸結合タンパク質に対するアプタマーを創製し、さらに創製したアプタマーを新たな分野において応用する。アプタマーを用いた遺伝子組み換え植物の例は存在しないが、有用な応用であると考えられる。そこで、モデルタンパク質として植物ウイルスの病原性因子を用いる。当研究では植物ウイルスの病原性因子であるp19を大量に精製し、コンピュータモデリングによるp19アプタマーを分子設計、ランダム配列を有するRNA集団の大量調整、これらのRNA集団の試験管内進化法に成功した。すなわち、「分子設計と試験管内進化法の融合による機能性RNA新規創製法」は成功したといえる。この後、同様の手法で機能性RNAを取得できれば、同法は一般法として確立する、その偉大な第一歩である。また、p19アプタマーの生化学的な性質を解析し、p19アプタマーは生体内条件と同様の緩衝液中で結合能を有することが証明された。残念ながら、p19アプタマー遺伝子組み換え植物を作製、p19を有する植物ウイルスに対する病害抵抗性を確認するまでには至らなかったが、十分に応用可能なアプタマーを取得することが出来た。これは、機能性RNA創製の新たな応用の裾野を広げるという点で非常に重要な意義をもつ。年次計画に基づき、第一の標的タンパク質であるp19の大量精製を行った。p19-dsRNAの解離定数がすでに論文で発表されていることから、同論文で用いられた手法により、今回大量精製したp19も同程度の解離定数を示すことを確認した。そこで、コンピュータモデリングによってp19アプタマーの分子設計を行い、ランダム配列を有するRNA集団を大量に調整した。これらのRNA集団を、Ni-アガロースマグネティックビーズに吸着させたp19と試験管内で結合させ、結合したRNAを分離・回収し、逆転写およびPCRによって増幅させた(すなわち、Ni-アガロースマグネティックビーズを利用した試験管内進化法を行った)。このサイクルを9回繰り返すと、ビーズ自体に結合するRNAが増加した。この手法ではこれ以上p19に強く結合するRNAを得られないと判断し、8回サイクルを繰り返したRNA集団をp19と結合させ、ゲル電気泳動を行った。その移動度の差から、p19と結合していると考えられるRNAを抽出した。これによりp19特異的に結合するRNA(p19アプタマー)を分離できた。約60種のクローンの配列を決定したところ、約2/3のクローンが同様の配列を有していた。現在最も保存された配列をp19アプタマーの第一候補として、解離定数の測定など生化学的解析を行っている。今後は、既存のds-RNAよりも強くp19に結合するRNA配列(p19アプタマー)を単離し、p19アプタマー遺伝子組み換え植物を作製、p19を有する植物ウイルスに対する病害抵抗性を確認する予定である。また、配列しか決定されていないクローンについて、順次解析を行い統括的考察を行う予定である。これにより、史上初のアプタマーの植物育種応用が可能になるといえる。