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胎児中枢神経機能障害の発症機序と胎内治療に関する研究―特にメラトニンの抗酸化治療薬としての可能性について―

未熟胎仔脳は成熟胎仔脳より酸化ストレスを受けやすいことより、来年度は未熟胎仔に対して同様の検討を行う予定である。背景】胎児期における酸化的ストレスと出生後の脳障害との関連性が注目されている。我々はin vitro実験において、ラットの胎仔脳は低酸素ストレスには抵抗性であるが、フリーラジカル(FR)による酸化ストレスで容易に障害されることを明らかにし、胎児脳障害は、低酸素血症とは別に酸化ストレスが強く関与していることを明らかにしてきた。また、強力な抗酸化作用を有するmelatonin(M)は胎盤を容易に通過し,成熟ラット胎仔脳mitochondria(Mt)の酸化的障害を抑制する事を報告してきた。しかし実際に中枢神経機能障害を発症するのは、ほとんどが未熟児であるが、未熟児をモデルにした、酸化ストレスに対するMtの障害程度のデーターはなかった。【目的】今年度は,未熟胎仔脳を用い、酸化ストレスに対するMtの障害程度を成熟胎仔脳と比較するとともに,Mの経母体投与がMtの酸化的障害に及ぼす影響を検討した。【方法】1)妊娠16日と20日ラットの胎仔脳Mtを採取した。hypoxanthine 2.5μM, xanthine oxidase 0.02units/ml添加によりfree radical(FR)を発生させる環境下で,Mt呼吸活性(RCI)を酸素電極法で測定し,FRによるRCIの抑制程度を比較した。2)妊娠16日ラットを用い子宮動静脈を20分結紮後,30分再灌流したreperfusion(R)群,結紮の1時間前にM(10mg/kg)を母体に腹腔内投与したM群, sham opeのcontrol(C)群に分別した。3群の胎仔脳Mtを採取しRCIの測定と脂質過酸化物(LPO)をTBA法で測定した。【成績】1)FR添加によるRCIの抑制程度は妊娠20日の28±5%に比較し,妊娠16日では40±6%と有意に高値であった。2)RCIは,C群の2.70±0.11に比較し,R群で2.22±0.10と有意に低値を示したが,M群では2.53±0.08とR群より有意な高値を示した。LPOはC群の7.1±4.2nM/mgprotに比較し,R群で13.5±6.3nM/mgprotと有意に高値を示したが,M群では8.8±2.2nM/mgprotとR群より有意に低値を示した。【結論】未熟胎仔の脳Mtは成熟胎仔に比較し,酸化的障害を受けやすいことが明らかになった。Mの経母体投与は虚血-再灌流による未熟胎仔脳Mtの脂質過酸化を抑制し,Mt呼吸機能障害を著明に改善することが示され、未熟胎児の酸化的脳障害においてもMは抗酸化的に作用することが明らかになった。
遷移金属酸化物のエピタキシーと電子相解析による電極活物質の開発

遷移金属酸化物は,無毒性や化学的安定性のため,種々の電気化学セルに利用されている。本研究では,薄膜技術と電子相図を用いた解析手法とを組み合わせて,遷移金属酸化物の新しい電気化学的機能を見出すことを目的とした.主な研究成果は以下の通りである.(1)鉄系薄膜からなる光電極構造を様々に工夫した結果,水の光電気化学分解反応の効率が大幅に向上した.(2)チタン酸リチウム薄膜の完全かつ可逆的な超伝導体-絶縁体転移をリチウムイオンの電気化学ドーピングにより実現した.(3)酸化チタン薄膜における新しい超伝導相を発見した.我々の研究方法は,持続可能な社会の構築に役立つ新材料・新機能を見つける強力な方法といえる.平成27年度は,次の二つの目標を掲げ,薄膜合成と基礎物性の評価に注力して研究を行った.1光活物質としてのFe系酸化物:組成や配向が異なる試料の電子相図を参照試料の電子相図と比較することで触媒能の制御因子を明らかにする.2電荷活物質としてのTi系酸化物:電荷量からLiの挿入脱離量を精密に制御した電荷活物質薄膜の抵抗率測定を行い,電子相図を完成する.その結果,薄膜合成法ならびに基礎物性評価手法を確立することに成功した.1については,サイクリックボルタンメトリーとインピーダンス解析を組み合わせることによって,触媒能の制御因子を明らかにした.2については,期待通りの電子相図が得られたものの,Liの挿入脱離量を精密に制御することに関しては課題が残った(「現在までの進捗状況」に詳述).以下に1と2の成果の概要を述べる.1α-Fe2O3はc軸よりもそれと直交する軸方向で高い導電率を示すことが知られている.c軸に平行・直交に配向したα-Fe2O3光電極を作製し,光照射下サイクリックボルタンメトリーにより評価した.c軸に直交に配向した場合に光電流が大きいことが分かった.また,インピーダンス解析から,表面準位容量が大きく異なることが分かった.このことは結晶面の安定な表面終端構造や酸素原子密度の違いによるものと結論した.2超伝導材料であるチタン酸リチウム薄膜を負極材に用いたリチウムイオン電池セル構造を形成して充電・放電操作を繰り返し行い,同時にチタン酸リチウムの電気抵抗を測定した.その結果,充電時には常伝導に,放電時には超伝導にと電気抵抗が切り替わることを実証した.また,充電・放電操作前後での超伝導転移温度を比較したところ,両者が完全に一致しており,可逆的な超伝導転移であることを発見した.計画通り進んでいるが,Liの挿入脱離量を精密に制御することができていない.これまでのところクロノアンペロメトリーを用いて脱挿入したLiイオンの定量を行っているが,測定手順の関係で室温と低温を行き返りする間に僅かながらLiイオンの脱挿入が起きていることが分かった.Liイオン量に依存するエレクトロクロミックの性質を利用して分光学的に定量する手法を検討する予定である.一方で,成果のインパクトという意味では我々の予想を上回った.すなわち,「電池を使うと超伝導に」というプレスリリースのタイトルが反響を呼び,テレビ番組で紹介されるとともに,海外の複数のメディアでニュースとして取り上げられた.本研究では,高品位な遷移金属酸化物の薄膜試料を作製し,実用的な可視光応答型光触媒材料やリチウムイオン電池の電極材料を創製すること目的とする.また,反応活性や電子状態を電子相図で解析する手法を提案し,その有用性を明らかにすることを目的とする.前年度に確立した実験結果に基づき,平成28年度は活性を向上させる因子についてさらに検討を進めるとともに材料範囲を拡張した.リチウムイオンの挿入脱離量を精密に制御することができていなかった問題は,試料形状や測定方法を工夫することで解析に十分な精度を達成しえることが分かったため解決した.以下に成果の概要についてテーマ毎に簡潔に記述する.酸化鉄光電極表面上に堆積させる化合物や堆積手法を検討し,光電流の立ち上がり電位を負側にシフトさせる表面化学修飾について明らかにした.後周期の遷移金属を含むリン酸コバルト塩や酸化ニッケルが有用であり,前者ではマイクロ波加熱処理が,後者ではパルスレーザ堆積法が適した手法であることを見出した.2つの化合物に共通する知見として,立ち上がり電位を負側にシフトさせるには12分子層の堆積で十分であり,表面化学修飾の効果は,主に電極表面と電解液の間に存在する電荷移動抵抗の低下によってもたらされることが分かった.電気化学Liイオン挿入によって引き起こされるWO3薄膜における絶縁体ー金属転移の起源を明らかにした.バルクLixWO3のエレクトロクロミック特性が詳細に調べられているのに対し,電子物性についてはほとんど知られていない.AxWO3はA組成に応じて複雑な構造相転移を示し,LixWO3では特に複雑であるため電子相転移との相関が明らかになっていなかった.電気化学セルを用いた電子相図解析とX線構造解析により,正方晶と立方晶が共存する組成領域で絶縁体-金属転移が起こることを初めて明らかにした.本研究では,計画通り電気化学的に挿入脱離が容易な小イオンとなるリチウムを含む遷移金属酸化物を対象に電子相図解析を進めてきた.電気化学的な組成制御には適さない大イオンであるセシウムを含むタングステン酸化物の薄膜成長に注力したところ,バルクにおける超伝導相領域の限界を超える六方晶タングステンブロンズCsxWO3薄膜の合成に成功した.

バルクCsxWO3ではCs組成が0.19を下回ると構造相転移とともに超伝導状態が消失する.Cs組成0.11まで六方晶系である超伝導薄膜を合成することに成功した.超伝導の転移温度がCs組成に依存するというのが定説であるが,Cs組成に関わらず格子定数に依存するという新しい知見が得られた.CsxWO3系における超伝導相図を塗り替える結果であり,さらにCs組成が低い薄膜合成に取り組むことで,バルクを超える超伝導転移温度の達成が期待される.次年度に計画していた原子層制御による界面分極の制御と光触媒活性における界面分極の効果を検討できる系を見出した.すなわち,LaFeO3/SrTiO3ヘテロ接合における界面分極が光触媒活性に与える影響を明らかにした.LaFeO3は,水の酸化反応を触媒する可視光応答型の光電極である.SrTiO3 (100)面との界面分極を制御した接合を形成し,光電気化学特性を評価したところ,界面分極から期待される内蔵電位が観測された.LaFeO3中の光キャリアの導電率が低いことに起因して効率は低いものの,界面分極によりキャリアの取り出し効率を制御した点において新規性が高いと考えている.また,得られた知見により今後バイポーラ光触媒の実証に向けたアプローチがしやすくなった.本研究では,高品位な遷移金属酸化物の薄膜試料を作製し,可視光応答型光電極やリチウムイオン二次電池への応用を可能とする新しい電極活物質を創製すること目的として,反応活性や電子状態を電子相図で解析することで顕著な物性を明らかにしてきた.平成29年度は以下に述べる研究を実施するとともに,3年間で得られた成果を総括した.可視光応答型光電極については,前年度までに得られたFe2O3系光アノード(酸素発生電極)の実験結果に基づき,(1)チタン酸遷移金属MTiO3(M = Mn, Fe, Co, Ni)光アノード,(2)CaFe2O4光カソード(水素発生電極),(3)チタン酸窒化物光アノードの薄膜合成と物性評価に取り組んだ.また,平成27年度に実施した超伝導LiTi2O4の関連テーマとして(4)高次チタン酸化物の薄膜合成に取り組みγ-Ti3O5やTi4O7という新奇な超伝導体を発見した.そして,超伝導の発現にはバイポーラロンを介した非常に珍しい機構が関与していることを示した.さらに高次チタン酸化物の共晶薄膜を作製し超伝導転移温度を三成分系相図で表した.一方,昨年度実施した超伝導CsxWO3の関連テーマとして(5)CsW2O6の薄膜合成と物性評価を進めた.磁気抵抗変化の特異な温度依存性,ならびにCsイオンのラットリングやWサイトの電荷不均化を伴う電子状態を明らかにした.研究課題を通じて扱った20余りの遷移金属酸化物の半数に対して,薄膜形状による新規な電子物性を明らかにした.特にFe2O3系光アノードとLiTi2O4やγ-Ti3O5などの超伝導特性について電子相図解析による顕著な物性を明らかにすることに成功した.遷移金属酸化物は,無毒性や化学的安定性のため,種々の電気化学セルに利用されている。本研究では,薄膜技術と電子相図を用いた解析手法とを組み合わせて,遷移金属酸化物の新しい電気化学的機能を見出すことを目的とした.主な研究成果は以下の通りである.(1)鉄系薄膜からなる光電極構造を様々に工夫した結果,水の光電気化学分解反応の効率が大幅に向上した.
日本前近代社会における下級官人の研究-真継家を中心として-

4年間の研究期間における研究成果は以下のとおりである。(1)名古屋大学文学部所蔵真継家文書の翻刻。翻刻史料は御蔵小舎人としての活動記録である日記、真継家の家伝、諸国鋳物師支配のための鋳物師一覧とでもいうべき覚書帳、明治維新期の下級官人の再編を示す「士族比長取扱」など、これまで翻刻されていない記録の翻刻を行った。その成果は本年度の研究成果報告書に掲載したが、翻刻作業のすべてを収録することができず、収録できなかった分については別の形で本年度中に公刊する予定である。(2)前近代下級官人研究会真継家文書の分析を中心に、主に真継家など近世の下級官人に関して様々な角度から検討する研究会を11回開催した。研究報告の内容は、真継家について真継家の日記の内容紹介、真継家の伊勢神宮例幣の変遷、幕末期の真継家の経済、真継家の相続から見た真継家の親族関係、地方における真継家の鋳物師支配の実態、真継家の鋳物師支配の近世史研究上の位置づけなど真継家に関する研究と、それ以外の下級官人全体に関する研究として、蔵人方出納平田家の親族関係を検討したもの、明治維新期における政府による下級官人の編成を示す士族比長制に関するもの、近世地下官人の知行所支配の実態研究、古代律令制下の官司の事務決済方式を分析したものなど様々である。これらの研究報告については一部を本年度の研究成果報告書に論文として掲載した。(3)論文目録の作成前近代における下級官人に関係する過去の論文目録を作成し、本年度の研究成果報告書に掲載した。採録にあたり直接下級官人に論究した論文以外に、公家・寺社に関する論文、鋳物師に関する論文も採録してある。後者は寺社に所属する職員を下級官人の範疇に入れたこと、および、真継家の鋳物師支配を考慮したためである。(4)近世下級官人関係史料の蒐集4年間の研究期間における研究成果は以下のとおりである。(4)近世下級官人関係史料の蒐集名古屋大学所蔵真継家文書について、日記の写真焼き付け、翻刻作業、一部修理を要する日記の補修を行った。日記は元禄13年から宝永2年の珍弘「御用日記」から始まり、明治18年の能弘「御用日記」に至るまで139点が現存している。歴代当主としては、珍弘・矩弘・親弘・量弘・康寧・則能・能弘の時代のものである。日記名称は「御用日記」「要録抜書」「御用諸式御下行日記」「諸日記」「御用諸日次記」「諸日次記」「要記」「公役私要録」「雑雑日記」など多様であるが、大きくは公的日記と私的日記に分類できるようである。本年度はこのうち元禄13年-宝永2年、宝永5年、宝永6年、正徳5年、弘化元年、文久2年の日記を翻刻した。また、これとは別に、明治初年の「士族比長取扱留」の翻刻を行った。これは、明治初年の地下官人の動向を知る上で重要な史料である。以上の作業以外に、真継家の菩提寺である京都浄福寺に残る墓石の銘文調査を実施した。また、名大購入以前の愛知県半田市楠家に所蔵されていた頃の状態について、当時卒論を書かれた名大卒業生の中村明枝氏から聞き取りを行った。文書伝来過程および菩提寺の調査は今後も継続する必要がある。

真継家以外については、先ず地下官人の概要をつかむため前近代の下級官人・公家に関する論文・著書目録を作成した。また、京都大学文学部所蔵の壬生家文書、宮内庁書陵部所蔵の平田家文書・東山御文庫文書の調査を行い、一部については写真版を購入した。今後、柳原家の史料を初め、真継家文書を読み解くための史料調査を続ける必要がある。夏冬二回の研究会を開催し、羽下祥二「明治維新と地下官人」および西島太郎「真継家文書の日記について」の研究発表を得た。来年度以降も研究会を継続する予定である。平成14年度は、昨年度に引き続き、(1)真継家文書の翻刻、(2)下級官人に関する史料調査、(3)研究会の開催、の三点を中心に研究を進めた。以下、その概略を示す。(1)真継家文書の翻刻享保10年、享保12年から16年、寛延2年から宝暦3年、文久2年、宝永6年、の日記の翻刻作業を行った。翻刻は文字判読の難解さや、協力員の近世公家社会に対する知識の不足により、当初計画より大きく遅れている。平成14年5月から平成15年3月まで文学部建物改修工事のため真継家文書を仮移転しており、そのため原本調査が十分できず、写真版での調査が中心となった。一部の日記については、研究分担者による翻刻原稿の校正作業をはじめたが、当初予定していた史料の刊行はできなかった。今後は分担者と協力員による合同の翻刻作業を進める必要があろう。(2)下級官人による史料調査昨年度の引き続き宮内庁書陵部、国立公文書館内閣文庫所蔵押小路文書、京都大学博物館所蔵狩野亨吉蒐集文書の調査、写真版・マイクロフィルム購入を行った。書陵部所蔵の平田家文書の数量は思いの外膨大であり、日記に限って写真を依頼したが、結局時間と資金面により全部は出来ていない。押小路家文書はすべて購入することができた。また、狩野亨吉蒐集文書は壬生家文書を含んでおり、昨年度の京都大学所蔵壬生家文書の写真版購入と併せて、今後壬生家の研究を進める予定である。(3)研究会の開催本年度は2回研究会を開いた。11月25日の研究会では古尾谷知浩「奈良時代における官司の事務決済方式」、2月17日には三宅幸子「幕末の地下官人-真継家を中心に-」、秋山晶則「真継家の伊勢奉幣参向をめぐって」と題する研究発表を得た。平成15年度は昨年度に引き続き、(1)真継家文書の翻刻、(2)下級官人に関する史料調査・蒐集、(3)研究会の開催、以上三点について研究を進めた。以下にその概略を記す。(1)真継家文書の翻刻享保10年から16年の日次記、慶応3年の日次記の翻刻作業、および、前年度までに翻刻された原稿の校訂作業を始めた。校訂した史料は文久2年日次記、元禄13年から宝永2年までの御用日記、宝永5年の日次記、正徳5年の公役雑録、寛延2年から宝暦3年までの日次記、士族比長取扱留である。(2)下級官人に関する史料調査・蒐集宮内庁書陵部所蔵の壬生家関係の史料で刊本で見ることができない中世史料を調査し、写真版を購入した。主な史料は「雅久卿記」「四巻之日記」等である。国立歴史民俗博物館所蔵の正倉院文書と兼仲卿記・守光卿記を写真版で購入した。いずれも古代・中世の官人を研究する基礎史料である。また、下橋敬長『幕末の宮廷』で著名な京都府立総合資料館所蔵の下橋家文書の写真版を購入した。昨年度重点的に蒐集した平田家文書については、早稲田大学にその一部が所蔵されていることから、中世の日記を中心に概要を調査した。その一部については来年度の予算で写真を購入する予定である。(3)研究会の開催今年度は研究会を充実することに力点を置いた。研究会の日付と報告者は以下のようである。
フェブリフジンをリードとする薬理活性新規キナゾリン型アルカロイドの網羅的探索

マラリアは21世紀に撲滅させなければならない感染症の一つである。現在、マラリア治療には数種類の薬剤が使用されているものの、いずれの薬剤に対しても耐性原虫が発生しており、新たな抗マラリア剤の早急な開発が強く求められている。我々は、中国で用いられる生薬・常山に含まれるアルカロイド・フェブリフジンがクロロキンなどの既存薬よりも強力な抗マラリア作用を示すことを見出した。本研究では、フェブリフジンを起点化合物と位置づけ、医薬品化学領域から新たな抗マラリア剤の開発を目指して研究を進めた。フェブリフジンは強力な抗マラリア作用を示すものの、同時に重篤な胃腸障害などの副作用をもつことが知られている。したがって、臨床薬を開発するためには、副作用が大幅に軽減された誘導体を得る必要がある。本研究では、フェブリフジンの構造をキナゾリン環、ピペリジン環、それらの2種の環を結合するリンカー部の3部に分けて考え、それぞれの部位の構造を変換した誘導体を合成した。その結果、リンカー部をメチレン基に代えた誘導体、キナゾリン環のベンゼン環部分にチオフェン環に変換した誘導体あるいはシクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン環のような脂肪環に変換した誘導体は、抗マラリアを保持したまま副作用が軽減されることが明らかとなった。我々は、現在臨床で用いられている薬剤よりも強力な抗マラリア作用を示す植物アルカロイドであるフェブリフジンを起点として、新たな抗マラリア剤の開発研究を行った。フェブリフジンは強力な抗マラリア作用を示すものの、同時に強い副作用をもつことが知られている。加えて、フェブリフジンは、水性溶媒中で抗マラリア作用の弱いイソフェブリフジンへと容易に異性化する。したがって、化学的に安定で、副作用が大幅に軽減された誘導体を創製する必要がある。本研究では、フェブリフジンの異性化反応を阻止するために、キナゾリン環とピペリジン環をつなぐリンカー部である鎖状炭化水素部分を変化させた誘導体を合成した。すなわち、リンカー部に存在するカルボニル基をメチレン基へと代えた誘導体を合成した。その後、リンカー部の炭素数を変化させた誘導体を合成した。それらの抗マラリア活性を検討した結果、カルボニル基をメチレン基に代えた誘導体は、抗マラリア活性がフェブリフジンよりも若干劣るものの、副作用も大幅に減弱した。この誘導体は、フェブリフジンに代わりうる抗マラリア剤開発におけるリード化合物と考えられる。一方、生薬・常山からフェブリフジン同族体の単離を試みた。しかしながら、フェブリフジン以外のアルカロイドを見いだせなかった。さらに、フェブリフジンを数種の微生物によって変換反応を試みたが、既に我々が合成した酸化体以外の化合物を見いだせなかった。その結果、ピペリジン環やリンカー部の構造を大きく変えた誘導体では、もはや強い抗マラリア作用が保持されないことがわかった。一方、キナゾリン環のベンゼン環部分をシクロペンタン、シクロヘキサン、シクロペプタン環のような脂肪環に変換した誘導体は、抗マラリアを保持したまま副作用が軽減されることが明らかとなった。
対戦型スポーツにおける一流選手の対応能力に関する研究

卓球やバドミントン、テニスなどのラケット競技では、「なぜこのボールを打ち返せるのか?」と疑ってしまうほどの優れた守備力を持つ選手がいる。時間による制約が強い競技特性ゆえ、並外れた対応能力を持つ選手は、ボールなどの飛翔体を『観察して予測する能力』が人一倍優れている可能性が考えられる。そこで本研究では、対戦型スポーツの一流競技者が、1)反応時間や動体視力といった基礎的な認知機能や、2)相手選手のスイング動作についての視覚情報からボール軌道を予測する実戦的な能力が、中程度の選手よりも優れているのかを調査する。2つの研究課題を通して、一流競技者の一流たる所以の一部を明らかにしていく。
ヒト脳内での２段階にわたるアミロイドβ蓄積の機序の解明

アルツハイマー病の原因とされるAβが「なぜ」、「どのように」ヒト脳内で蓄積するのか未だ不明である。我々は脳内のAβの特徴的な領域分布に着目し独自に剖検脳を解析することで、1シナプスがまず全長型Aβの蓄積に関与し引き金となり、2ついで何らかの別の因子がN末端の断片化したAβの蓄積を引き起こし臨床病理症状と結びつくこと、を見出し、提唱した(Shinohara et al., Brain 2017)。その分子的実態や臨床的意義をさらに解明するため本研究では、1シナプスがどのような機序で全長型Aβの蓄積に関与するのか、2断片化Aβがどのような機序で蓄積するのか、の分子的な詳細について、これまでの領域分布に着目した剖検脳解析とともに、新規in vivoマイクロダイアリシスを用いた動物モデル解析や、新規結合因子の同定、領域横断的な遺伝子ネットワークの構築、独自のex vivo分解系の導入、高感度ELISAの開発と臨床検体の解析などを通じて明らかにすることを目的とする。当該年度は、研究に必要な動物モデルや臨床検体の導入や倫理申請を進めるととともに、解析系、実験系の立ち上げ、導入などを行った。3年計画の1年目ということもありいくつかの問題にも直面し、十分な成果は得られてはいないが、残り2年で成果が得られるように私が関与している本研究以外の全体の研究内容・時間配分の見直しも行い、本研究に尽力したいと考える。当該年度における進捗点を以下に列挙する。1.動物モデルの導入、繁殖をすすめ、hAPP-YACマウスやAPPノックアウトマウス各々のホモ化を予定通りに作製できた。それぞれの脳組織の回収も行った。2.断片化Aβに対するELISAを立ち上げた。またいくつかのシナプスマーカーに対するELISAも新たに立ち上げた。3.神経活動を評価するためのマイクロダイアリシスを当研究部で立ち上げ、APP Tgマウスで解析を行った。4.米国のデータベースから多数の脳領域を用いた遺伝子発現解析のデータを入手し、我々の蛋白発現解析と対応させることができるか検討した。5.福祉村ブレインバンクの臨床検体を利用する倫理承認を得るとともに、脳および脳脊髄液、血液を導入し、脳内Aβの量を定量し、AD患者では実際に一部の領域で断片化Aβが多いことを確認した。その一方で、当該年度においていくつかの問題に直面した。以下に列挙する。1.マイクロダイアリシスを用いた解析において、陽性コントロールとしていたAPP Tgマウスにて脳間質液中のAβの測定がELISAの検出感度以下となり、解決に時間を要した。現在その状況は改善しつつある。2.断片化Aβを検出するのに必要な質量分析装置が故障したため、関連した研究を進められなかった。現時点(2019年5月時点)では装置の問題はほぼ解決されている。3.遺伝子ネットワーク解析において、AD患者も解析している米国のAMP-ADデータベースでは多数の領域を解析しているものの、皮質領域が中心のため、皮質下領域を多く含む我々のデータと付随させることが難しいことが考えられた。4.全体的にみて、本研究に充てられる研究時間、人材の不足、当初予定していたほどの実験・研究時間を当てることができなかった。これらの諸問題から、当初予定していた研究計画を達成させることができなかった。当初予定していたが、あまり達成できなかった研究計画を特に重点的にすすめる。具体的には、1.マイクロダイアリシス実験回数の増加、2.修理した質量分析装置を用いた断片化Aβに関する実験の開始、3.遺伝子ネットワーク解析について他のデータベースの利用や自験データの獲得、4.本研究以外の全体の研究内容・時間配分の見直しも行い、本研究に充てられる時間を十分に確保する、などが考えらえる。また上手くいきつつある一部の研究については、さらにそれを利用、発展させ、成果として発表することにも十分尽力したいと考える。

2.断片化Aβに対するELISAを立ち上げた。またいくつかのシナプスマーカーに対するELISAも新たに立ち上げた。3.神経活動を評価するためのマイクロダイアリシスを当研究部で立ち上げ、APP Tgマウスで解析を行った。4.米国のデータベースから多数の脳領域を用いた遺伝子発現解析のデータを入手し、我々の蛋白発現解析と対応させることができるか検討した。5.福祉村ブレインバンクの臨床検体を利用する倫理承認を得るとともに、脳および脳脊髄液、血液を導入し、脳内Aβの量を定量し、AD患者では実際に一部の領域で断片化Aβが多いことを確認した。その一方で、当該年度においていくつかの問題に直面した。以下に列挙する。1.マイクロダイアリシスを用いた解析において、陽性コントロールとしていたAPP Tgマウスにて脳間質液中のAβの測定がELISAの検出感度以下となり、解決に時間を要した。現在その状況は改善しつつある。2.断片化Aβを検出するのに必要な質量分析装置が故障したため、関連した研究を進められなかった。現時点(2019年5月時点)では装置の問題はほぼ解決されている。3.遺伝子ネットワーク解析において、AD患者も解析している米国のAMP-ADデータベースでは多数の領域を解析しているものの、皮質領域が中心のため、皮質下領域を多く含む我々のデータと付随させることが難しいことが考えられた。4.全体的にみて、本研究に充てられる研究時間、人材の不足、当初予定していたほどの実験・研究時間を当てることができなかった。これらの諸問題から、当初予定していた研究計画を達成させることができなかった。当初予定していたが、あまり達成できなかった研究計画を特に重点的にすすめる。具体的には、1.マイクロダイアリシス実験回数の増加、2.修理した質量分析装置を用いた断片化Aβに関する実験の開始、3.遺伝子ネットワーク解析について他のデータベースの利用や自験データの獲得、4.本研究以外の全体の研究内容・時間配分の見直しも行い、本研究に充てられる時間を十分に確保する、などが考えらえる。また上手くいきつつある一部の研究については、さらにそれを利用、発展させ、成果として発表することにも十分尽力したいと考える。
強震継続時間の構造物損傷への影響を考慮した地震動強度指標の検討と被害予測への応用

現在、逼迫性が極めて高いとされる東海、東南海、南海地震等を対象とした一般的な地震防災が様々な形で実施されているが、海溝型地震に特有の長い震動継続時間に着目した具体的な検討までは行われていないのが現状である。近い将来必ず来襲すると予測されている海溝型巨大地震による「非常に長い強震継続時間」について地震工学的に重要な知見を見出すとともに、防災実務に反映できる具体的な情報を提示することを目的として研究を実施した。海溝型巨大地震として東海、東南海地震を対象とし、これらの地震による影響が大きい東海6県域での地震動をケーススタディとして取り入れた検討を行った。継続時間の影響を定量的に評価する対象構造物としては、(1)液状化の危険度が高い地盤上に施工された河川堤防、(2)一般的な連続高架橋にみられるラーメン構造のコンクリート高架橋、さらに(3)木造家屋構造物を対象とした。具体的には、下記の検討を実施した。(1)地震動の強震継続時間が河川堤防の液状化による被害に及ぼす影響に関する検討(2)強震継続時間が長い地震動に対する河川堤防の耐震対策工の検討(3)長周期地震動が長周期コンクリート構造物に与える影響に関する検討(4)中部地域を対象とした広域・詳細震度分布即時推定システムに関する検討これらの検討結果の一部は、海溝型地震を対象とした耐震実務(国土交通省木曽川下流工事事務所における堤防の耐震化業務)にも活用されつつある。本年度(平成19年3月31日)の研究実施計画平成18年度においては、海溝型巨大地震による強震動の特徴とその工学的表現法について、様々な観点から検討を行うとともに、種々の構造系の損傷に対する強震継続時間の影響の違いについて明確にした。具体的に、以下の項目について実施した。(1)海溝型巨大地震による強震動の算定と過去の強震記録との比較検討震動継続時間の定義に関しては、構造物の履歴エネルギーに着目するなど様々な検討がなされてきている。本検討では、地震動の強さをその時刻歴の加速度パワーの観点からとらえ、パワーの時間軸上での集中度などから地震動を"強度"と"継続時間"の2つのパラメータで表現することを検討した。(2)構造系の損傷度からみた強震継続時間の定義に関する検討上記(1)の検討結果を踏まえ、各種構造形式毎に異なる強震継続時間の影響を明確にし、強震動の破壊力をその"強度"と"継続時間"の二つにより表現することを検討した。ここでは、自治体の地震被害想定で重要な検討事項となる(a)一般の木造家屋構造、多くの土木構造物の構造形式である(b)RC構造、を対象として、それぞれの構造形式の被害レベルを二つの地震動情報から推定する手法を検討した。(3)強震継続時間を考慮した広域等価震度マップの作成上記の研究成果に基づき、自治体等で実施されている広域被害予測に強震継続時間の影響を取り入れる方法について検討した。

(1)地震動の強震継続時間が河川堤防の液状化による被害に及ぼす影響に関する検討(2)強震継続時間が長い地震動に対する河川堤防の耐震対策工の検討(3)長周期地震動が長周期コンクリート構造物に与える影響に関する検討(4)中部地域を対象とした広域・詳細震度分布即時推定システムに関する検討これらの検討結果の一部は、海溝型地震を対象とした耐震実務(国土交通省木曽川下流工事事務所における堤防の耐震化業務)にも活用されつつある。
難治性根尖性歯周炎の-酸化窒素産生における血管内皮細胞の役割

目的)難治性根尖性歯周炎の病態を解明する目的で、根管滲出液および歯根肉芽腫における誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)と血管内皮カドヘリン(VE-cadherin)の関連を病理組織学的、分子生物学的に検討したところ、以下の結果を得た。結果)1.根管滲出液の検索:根管滲出液から細胞成分を分離し、サイトスピンを用いて標本を作製したのちH-E染色したところ、PMNsが優位な細胞であった。そのPMNsは免疫染色でiNos陽性を示し、RT-PCR法でiNOSの遺伝子発現を示した。2.歯根肉芽腫の検索:歯根嚢胞と臨床診断された組織をH-E染色し、歯根肉芽腫と病理診断されたものを試料とした。抗ヒトiNOSまたは抗ヒトVE-cadherinモノクローナル抗体を用いて免疫染色したところ、肉芽組織中のマクロファージ、リンパ球、線維芽細胞、PMNsのiNOS陽性と血管内皮細胞のiNOSおよびVE-cadherin共陽性を確認した。また、このiNOS陽性細胞は血管内皮細胞の周囲に多く浸潤していた。このiNOSとVE-cadherinの遺伝子発現をreal time PCR法で検索したところ、全ての歯根肉芽腫サンプルからその遺伝子発現を確認したが、発現強度はVE-cadherinよりもiNOSの方が強い傾向を示した。3.ヒト膀帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)の検索:IL-1βとEsheruchia coli由来LPSで224時間刺激した。培養細胞からのiNOSおよびVE-cadherin遺伝子発現をreal timepCR法で検討したところ、両者の遺伝子発現が確認された。なお、それらの発現強度は歯根肉芽腫のときとは異なり、iNOSよりもVE-cadherinの方が強い傾向を示した。4.Nos合成阻害薬の検討:3.の細胞培養系にNo合成阻害剤を添加し、iNos遺伝子の発現を検索したところ、添加していないものと比較してその発現が低下した。結論)NOの関与によりVE-cadherinの産生が調節されている可能性が示唆された。1.根尖病巣組織:臨床的に歯根のう胞と診断された、全身疾患を持たない21歳から56歳の男女20名から、根尖切除術の際に得られた根尖病巣組織を採取し、本研究に供試した。得られた組織をホルマリンで固定したのちパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン-エオジン重染色を施したところ、16例が歯根肉芽腫で、4例が歯根のう胞であった。2.根管滲出液:排膿が止まらない難治性根尖性歯周炎の患者から、ガラス毛細管を用いて根管滲出液を採取した。採取後直ちに希釈し、遠心分離したのち液性成分と細胞成分とに分離した。細胞成分についてはその後、サイトスピンを用いてpoly-L-lysineでコートしたスライドガラス上に貼り付け、Wright染色を施した。光学顕微鏡で観察したところ、96%以上が多形核白血球であった。また一部は4%paraformaldehide-PBSで固定したのち凍結保存した。

3.根管滲出液内のNO測定:2.で得られた根管滲出液の液性成分を用いて根管滲出液内のNO測定を行った。Griess液を用いて根管滲出液内のnitrateをnitriteに変換したのち、比色計を用いてnitriteの量を測定したところ、1.024.45μMであった。4.根管滲出液内細胞成分のiNos遺伝子の検索:2.で得られた根管滲出液の細胞成分からTRIzolを用いてRNAを抽出し、逆転写酵素を用いて相補的なDNAを作製した。次いで、ヒトiNos特異的なPCRプライマーを用いてiNOS遺伝子を増幅し、アガロースゲル上で検出した。その後、ナイロンメンブレン上に転写し、iNOSのプローブを用いてSouthern Hybridization法を行い、その特異性を確認した。1)誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の免疫組織化学的検索:根管滲出液内細胞成分のサイトニスピン標本と根尖病巣組織の凍結切片を用い、抗ヒトiNOS抗体および抗ヒトE-セレクチン抗体を用いた免疫染色を行ったところ、滲出液内好中球(PMNs)はiNOS陽性を示した。根尖病巣をヘマトキシリン-エオジン重染色し、歯根肉芽腫と歯根のう胞に分類したのち免疫染色したところ、歯根肉芽腫および歯根のう胞内のマクロファージ、リンパ球、線維芽細胞あるいはPMNsのiNOS陽性と血管内皮細胞のiNOSおよびE-セレクチン陽性を確認した。また、歯根のう胞の上皮細胞はiNOS陽性を示した。2)蛍光二重免疫染色法:FITCまたはRITCで蛍光標識したiNOSまたはE-セレクチン抗体を用い、蛍光二重免疫染色を行ったところ、血管内皮細胞の中にはiNOSとE-セレクチンを共に産生しているのが確認された。4)末梢血PMNs(PB-PMNs)の分離:通法に従い、末梢血からPMNsを分離した。5)ヒト臍帯静脈血由来血管内皮細胞(HUVEC)とPB-PMNsの共培養:HUVECにヒトインターロイキン(IL)-1またはガンマーインターフェロン(IFN-γ)とP.gingivalisから抽出したLPSで刺激し、その後PB-PMNsとBoyden chanber内で共培養したところ、IL-1、IFN-γおよびP.gingivalisから抽出したLPSを添加していないコントロール群に比較して、より多くのPMNsが遊走した。6)NOの測定:5)で得られた培養上清中のnitrite量を測定した結果、コントロール群に比較して、IL-1またはIFN-γ添加群で、より多くのnitriteが産生されていた。目的)結果)1.病理組織学的検索:根尖病巣をヘマトキシリン-エオジン重染色し、歯根肉芽腫と病理診断されたものを試料とした。2.免疫組織化学的検索:抗ヒトiNOSまたは抗ヒトVE-cadherinモノクローナル抗体を用いて免疫染色したところ、肉芽組織中のマクロファージ、リンパ球、線維芽細胞あるいはPMNsのiNOS陽性と血管内皮細胞のiNOSおよびVE-cadherin陽性を確認した。また、このiNOS陽性細胞は血管内皮細胞の周囲に多く浸潤していた。3.細胞培養および分子生物学的検索:ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)に対して、リコンビナントヒトIL-1βとEsherichia coli由来菌体外多糖(LPS)で224時間刺激したのち培養細胞を回収した。
背景ニュートリノから大質量星とブラックホールの形成史をたどる理論研究

本研究課題では、ガドリニウムを添加したスーパーカミオカンデにおける超新星背景ニュートリノの観測に先駆けて、多角的視野に立った検出数の理論予測をおこなう。昨年度の研究で、通常の超新星爆発から放射されるニュートリノの時間変動について、後期フェーズ(原始中性子星冷却期)における放出量の数値計算による評価から、状態方程式による有意な差が見いだされたため、今年度は現象論的なモデルを用いて、より系統的な状態方程式依存性を調べた。その結果、ニュートリノ放射のタイムスケールは、主に状態方程式のeffective massと、あとに残される中性子星の半径によって決まることが分かった。特に半径については、小さいほどタイムスケールが長くなることが示され、最近の重力波観測から示唆される半径の結果と合わせると、従来のモデルよりもニュートリノ放射の継続時間が長くなることがわかった。これは、超新星背景ニュートリノのイベント数については上方修正されることを意味している。そのほかに、スーパーカミオカンデにガドリニウムを添加して逆β崩壊反応を識別できるようになると、超新星ニュートリノシグナルとして酸素原子核との荷電カレント反応によるイベントを個別に調べられるようになると期待されている。そこで、shell modelの結果に基づいて酸素原子核とニュートリノの荷電カレント反応によるイベントスペクトルを評価する手法を提唱した。その結果、特にブラックホールを形成するような、ニュートリノの平均エネルギーが高い場合には、このチャネルのイベントを識別できることがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。特に、重力波観測の状況もにらみつつ、ブラックホール形成に伴うニュートリノ放出も含めて、背景ニュートリノのスペクトル予測をおこなうことを目的としている。通常の超新星爆発になる場合とブラックホールができる場合では、星の重力崩壊によって放出されるニュートリノの総量や平均エネルギーに違いがあり、ブラックホールを形成する場合は、星全体に占める数としては少ないが、背景ニュートリノのスペクトルに与える影響は大きいと考えられるため、それも含めた評価をおこなうことにしている。今年度は、通常の超新星爆発から放射されるニュートリノについて、最近、新たに発表された状態方程式に基づいて、後期フェーズ(原始中性子星冷却期)における放出量を数値計算によって評価したところ、これまでの状態方程式と比べて、総エネルギー・平均エネルギーともに高くなることが見いだされた。これは新たに構築された状態方程式の方が、(1)中性子星の半径が小さく、束縛エネルギーが大きいことから、ニュートリノの総放出エネルギーが上がり、(2)表面付近の非一様相が広く、そこでの原子核サイズも大きいことから、ニュートリノと原子核の散乱が効率的に起こり、ニュートリノが逃げにくく温度が下がりにくくなるため、ニュートリノの平均エネルギーも上がることが分かった。当初の計画では、通常の重力崩壊型超新星爆発から放出されるニュートリノの光度や平均エネルギーは、原子核物質の状態方程式に強く依存しないと想定していた。ところが、最近、新たに発表された状態方程式に基づいて、超新星の後期フェーズ(原始中性子星冷却期)におけるニュートリノ放出量を数値計算によって評価したところ、これまでの状態方程式と比べて想定以上に差が大きいことが判明した。背景ニュートリノにおける種々の不定性を評価する上でこの状態方程式による違いを理解する必要があるため、今年度はこの問題に注力しており、研究自体は着実に進んでいるものの当初の計画とはやや異なる方向への進捗であったことから、「やや遅れている」と評価する。今後は、今年度の研究で分かった状態方程式の依存性も考慮に入れて、背景ニュートリノの評価をおこなう。特に、新しい状態方程式は、昨年の中性子星合体現象の重力波観測のデータとも整合しており、今後、標準的なモデルとして定着していく可能性もあることから、当初の計画よりも念入りに原始中性子星冷却とブラックホール形成の両方の場合について、ニュートリノ放出量の状態方程式依存性を検討することとする。その後、現実的な銀河進化のシミュレーションや銀河の観測に基づく星形成史モデルを用いて背景ニュートリノの検出数予測をおこない、将来の背景ニュートリノ観測によって大質量星とブラックホールの形成史にどこまで迫れるのか、その不定性も含めて検討したい。
犬歯周病原性細菌のヒトへの伝播による歯周病発生におけるメカニズムの解析

犬の歯周病原細菌Porphyromonas gulaeの表層には線毛が存在し、遺伝子配列から3つのタイプ(A, B, C)に分類される。本研究では、これら3つの型の線毛のリコンビナントFimA (rFimA)ならびに抗rFimAポリクローナル抗体を作製し、カイコモデルを用いて各タイプの病原性の違いを明らかにした。C型rFimA投与群の生存率は、他のrFimA投与群と比較して有意に低かった。さらに抗FimAポリクローナル抗体投与群では、生存率が高くなった。これらの結果から、C型が最も強い病原性を持つことが示され、線毛が病原性と密接に関連していることが明らかとなった。本研究では,犬とその飼い主から口腔サンプルを採取し、Porphyromonas gulaeをはじめとする各種歯周病原細菌の検出頻度の分析を行い、さらに分離菌株における菌体表層の線毛(FimA)タンパクをコードするfimA遺伝子配列を決定した。飼い主123家族(282歳の169人;男性45名,女性124名)と犬144匹(014歳;オス53匹,メス91匹)の歯肉縁下プラークを綿棒で採取し、滅菌生理食塩水で懸濁した後、通法によりDNA抽出を行った。分析対象とした菌種はヒトの主要な歯周病原細菌として知られている10菌種とP. gulaeを加えた11菌種とし、これらの各菌種に対する特異的プライマーと得られたDNAを用いてPCR法を行った.分析対象とした歯周病原細菌のうちヒトからは11菌種全てが検出され,犬からはAggregatibacter actinomycetemcomitansを除く10菌種が検出された.ヒトではCapnocytophaga sputigenaとEikenella corrodensの検出率が最も高くそれぞれ28.4%と27.8%であった.一方,犬ではTannerella forsythia (70.8%)とCampylobacter rectus (68.1%)と高い検出率であった.P. gulaeはヒトでは10.7 %,犬では64.6 %に検出された.さらに、飼い主および犬から同時にP. gulaeが検出された場合のFimA型はAタイプが最も多く認められた。今後は、P. gulaeが検出された犬と飼い主のプラークサンプルから、菌の分離を行う.分離されたP. gulae株から染色体DNAを抽出し、AP-PCRやRAPD法等を用いてPCRを行い、電気泳動によってフィンガープリントパターンを比較することで、犬および飼い主において同じ菌株であるかを確認する予定である.動物由来歯周病源細菌Porphyromonas gulaeの線毛遺伝子(fimA)は、アミノ酸配列の違いにより3つの型(A、B、C型)に分類される。P. gulaeC型株は動物の歯周病の原因菌であるだけでなく、ペットを飼育する人の歯周病との相関性が高いことをこれまでに報告してきた。そこでカイコを用いた細菌感染モデルによりP. gulae線毛の各型における病原性を評価した。C型株を感染させた群は、AならびにB型株と比較して顕著に生存率が低下したことから、C型保有のP. gulae株が最も病原性が強いことが明らかとなった。さらに、これら3つの型の線毛に対応するリコンビナントタンパク(rFimA)ならびに、精製したrFimAを抗原としてポリクローナル抗体(ウサギ血清抗体)を作製し、カイコモデルによる線毛の病原性を確認した。その結果、カイコP. gulae感染モデル同様、C型rFimAの生存率は他のrFimAと比較して顕著に低下が認められた。一方、FimAポリクローナル抗体投与群では、rFimA投与群ならびにC型fimA保有P. gulae株感染モデルの双方で高い生存率が観察された。これらの結果から、歯周病の病原性はP. gulae線毛タイプとの密接な関連性が示唆された。C型fimA株の増殖を抑制することは、歯周病の発病を予防することができる可能性が考えられたため、C型fimA株の増殖を特異的に抑制する物質を探索した。リンコマイシン系抗生物質クリンダマイシンは、濃度依存性にP. gulae C型fimA株の増殖を抑制した。さらにカイコP. gulae感染モデルでも、クリンダマイシン投与群は著明に生存率を維持することが観察された。本研究の目的であるP. gulaeのFimAタンパクの多様性に焦点をあてて検討する上で、タイプ別リコンビナントFimAタンパクの作製は必要である.

すでにタイプ別FimAタンパクの発現とその精製は終了し、リコンビナントFimAタンパクを用いた抗血清の作製まで完了している.分子生物学FimA欠失変異株の作製を行い、各FimA欠失変異株を用いた歯肉上皮細胞への付着と浸潤の検討を行う予定である.
マンネンタケ由来のプロテアーゼおよびグルカナーゼの分子生物学的手法を用いた解析

本年度は、複数菌株に関する基礎情報の取得、菌株間における酵素遺伝子の配列解析を中心として研究を推進した。具体的には、まず始めにリボソームDNAのITS領域を用いたシークエンス解析をおこない、供試菌株がG.lucidumであることを確認した。さらに菌糸体培養や子実体原基の形成を試み、形態観察からもG.lucidumであることを確認した。また、平板培地を用いた菌糸成長速度を測定し、それぞれの菌糸成長を確認した。これらの結果は、今後の子実体形成に関わる時間を知る上で重要であると考える。次いで木粉培地で菌糸体を培養し、Total RNAを抽出、逆転写反応によりcDNAを合成した。これらを鋳型としてPCR法による目的酵素遺伝子の増幅をおこない、ダイレクトシークエンシングした結果、遺伝子配列情報の取得に成功した。得られた複数菌株の配列情報を本研究室保存菌株のものと比較解析した結果、mRNA配列、予想アミノ酸配列とも高い相同性が確認され、マンネンタケにおいて菌株間で保存性が高いことが示唆された。菌株間における本酵素遺伝子の各ステージでの発現解析のために、木粉培地を用いて複数菌株の子実体原基形成を試みた。その結果、複数菌株で原基形成が確認できた。しかしながら、その後の傘部の形成が不十分であった。今後は原基形成後の栽培条件の検討が必要である。一方、本年度においては、本酵素が成熟した子実体に含まれることを論文として発表した。これらのことは本研究を遂行する上で必要不可欠であり、本研究の社会的意義を広く明らかとした。本年度は、昨年度の研究推進方策の中心である複数菌株に関する基礎情報の取得、菌株間における酵素遺伝子の配列解析を実施できたため、昨年度の研究推進方策の大半を実施できたと考える。さらに木粉培地での子実体形成試験も実施できたことから、菌株間における本酵素遺伝子の各ステージでの発現解析も順調に行えるものと推測している。一方、酵素タンパク質の発現に関しては発現を確認することはできなかったため、おおむね順調に進展しているとした。今後の研究は、菌株間における酵素遺伝子の発現解析を中心として研究を推進する予定である。具体的には、本年度に酵素遺伝子配列情報等の基礎的情報を取得した菌株を利用して、子実体形成を試み、各ステージおよび収穫後の本菌からtotal RNAを抽出し、cDNAを合成した後、リアルタイムPCR法を用いた発現量の解析を行う予定である。また、酵素タンパク質の発現に関しては、無細胞系のタンパク質発現システムを検討する予定である。さらに研究を進めるにあたり本酵素が他の食用きのこに置いても老化に関与しているかを明らかにすることは本研究がきのこにおいて普遍的なものであることの証明として重要であると考える。既往研究により、シイタケでは本グルカナーゼ遺伝子の老化への関与が報告されているため、他の市販食用きのこに関して、発現解析およびこれら遺伝子の配列情報の取得を試みる予定である。民間薬や食品として利用されてきたマンネンタケ(Ganoderma lucidum)は機能性が着目されるきのこである。本研究では、マンネンタケのもつプロテアーゼ(GlGPA)及びグルカナーゼ(GlGH128A)の機能性を明確にし、本菌の有用性を広げる。本年度は目的酵素遺伝子を異種発現するための安定した発現系の構築を試みた。具体的には発現ベクターの構築、形質転換体の取得、発現の確認を行なった。異種発現系としては、コールドショック発現システムを用いた大腸菌の発現系を利用した。人工合成した目的遺伝子を発現ベクターであるpColdベクターにライゲーションし、発現ベクターの構築を試みた。その結果、目的遺伝子であるGlGPAおよびGlGH128A遺伝子は発現ベクターの目的部位に正しく挿入されていることが確認され、2種類の発現ベクターの構築に成功した。次いで発現用大腸菌BL21株へのトランスフォーメーションを行った。形質転換されたBL21株を培養後、タンパク質を抽出し、Hisタグ精製した。精製したタンパク質をSDS-PAGEに供試した結果、目的とする分子量の近辺にバンドが確認された。しかしながら、ネガティブコントロールにも同様のバンドが確認されたことから、明確なタンパク質の発現に至らなかった。一方、マンネンタケ菌株の収集と培養を試みた。複数菌株を取得し、研究室保存菌株とともに培養し、菌糸成長速度や菌糸の形状等を確認した。2種類の発現ベクターの構築までは比較的、順調に進行したと思われる。しかしながら、大腸菌を用いたタンパク質の発現において、明確な結果が得られず、条件検討や実験追加が発生したことが主な理由と考えられる。そのため研究の到達度に少しの遅延が生じたと考える。きのこ由来の酵素タンパク質の発現は宿主との相性や条件など、活性を持ったタンパク質の生成が困難な例も知られている。今後は、ベクターの選択や酵母や麹菌など他の宿主を利用した異種発現系、無細胞系のタンパク質発現システムを試みる必要があると考える。一方、マンネンタケ菌株の収集と培養については、順調に進行していると考える。

また、平板培地を用いた菌糸成長速度を測定し、それぞれの菌糸成長を確認した。これらの結果は、今後の子実体形成に関わる時間を知る上で重要であると考える。次いで木粉培地で菌糸体を培養し、Total RNAを抽出、逆転写反応によりcDNAを合成した。これらを鋳型としてPCR法による目的酵素遺伝子の増幅をおこない、ダイレクトシークエンシングした結果、遺伝子配列情報の取得に成功した。得られた複数菌株の配列情報を本研究室保存菌株のものと比較解析した結果、mRNA配列、予想アミノ酸配列とも高い相同性が確認され、マンネンタケにおいて菌株間で保存性が高いことが示唆された。菌株間における本酵素遺伝子の各ステージでの発現解析のために、木粉培地を用いて複数菌株の子実体原基形成を試みた。その結果、複数菌株で原基形成が確認できた。しかしながら、その後の傘部の形成が不十分であった。今後は原基形成後の栽培条件の検討が必要である。一方、本年度においては、本酵素が成熟した子実体に含まれることを論文として発表した。これらのことは本研究を遂行する上で必要不可欠であり、本研究の社会的意義を広く明らかとした。本年度は、昨年度の研究推進方策の中心である複数菌株に関する基礎情報の取得、菌株間における酵素遺伝子の配列解析を実施できたため、昨年度の研究推進方策の大半を実施できたと考える。さらに木粉培地での子実体形成試験も実施できたことから、菌株間における本酵素遺伝子の各ステージでの発現解析も順調に行えるものと推測している。一方、酵素タンパク質の発現に関しては発現を確認することはできなかったため、おおむね順調に進展しているとした。今後の研究は、酵素タンパク質の発現、複数菌株に関する基礎情報の取得、菌株間における酵素遺伝子の配列解析を中心として研究を推進する予定である。具体的には、酵素タンパク質の発現に関しては、ベクターの選択や酵母や麹菌など他の宿主を利用した異種発現系や無細胞系のタンパク質発現システムを検討する。複数菌株に関する基礎情報の取得については、それぞれの菌株におけるrDNAのITS領域を利用して、分子生物学的手法による種同定を試みる。菌株間における酵素遺伝子の配列解析においては、gDNAおよびtotal RNAを用いて、酵素遺伝子の配列情報を比較解析し、菌株間における差異を確認する。今後の研究は、菌株間における酵素遺伝子の発現解析を中心として研究を推進する予定である。具体的には、本年度に酵素遺伝子配列情報等の基礎的情報を取得した菌株を利用して、子実体形成を試み、各ステージおよび収穫後の本菌からtotal RNAを抽出し、cDNAを合成した後、リアルタイムPCR法を用いた発現量の解析を行う予定である。また、酵素タンパク質の発現に関しては、無細胞系のタンパク質発現システムを検討する予定である。さらに研究を進めるにあたり本酵素が他の食用きのこに置いても老化に関与しているかを明らかにすることは本研究がきのこにおいて普遍的なものであることの証明として重要であると考える。
ＣＬＴを用いた建築物の塑性変形性状とその評価法の開発

木造では塑性域のメカニズムに未解明点が多く,保有水平耐力計算に重要な構造特性係数Dsの算出が難しい。だが,木造の中高層化が期待される今日ではDsの評価法確立は必須である。これまで筆者は,CLTドリフトピン接合部の塑性変形能力把握を目的とした接合部や実大壁の実験を行ってきた。結果,ドリフトピンの縁端距離を変化させると破壊モードが異なりDsに関係する塑性率に差が生じることが分かった。本研究では,CLT等建築物における塑性変形能力を定量的に把握することを目的とする。