hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東西の接点東欧における脱髄性脳疾患の病理解剖学的比較研究,特にハンガリーを中心に

市にあるポズナン医科大学神経学教室ウエンダー教授のもとを訪れ、そこで極めて多数の剖検例があったのであるが、残念ながら繰り返した戦火の為、それらのデータや標本は散逸し、わずかに23症例が検討対象に出来る状況であった。それにしてもポーランドで40症例が検討対象となり、明らかにバロータイプの病巣を示すもののあったことを確認で来たのはハンガリーと並んで、この東ヨーロッパでは、西洋にも米国や日本にもない、中国との関連性を支持する確実な症例群が存在していることが確認できた。従って脱髄のパターンは民族(遺伝子)との間に密接な関連性をもっていることがグローバルに示されたと言ってよいと思う。3)ル-マニア以前バロ-に関する報告があったということを手がかりに、ブカレストの大学並びに、科学アカデミー等での医学会に参加する機会を得、討議したのであるが、残念ながら、ル-マニアに於ける激しい政情の不安、厳しい経済状況などから、脳を保存する力がなく、脱髄性剖検脳を目にすることは遂にできなった。チェコチャールス大学に1800年代から保存されている剖検記録を頼りに調査したがここでも、残念ながら検討の対象例には遂に遭遇できなった。いずれにしても我々が主力と考えたハンガリーに加えポーランドでも同じような傾向、つまり中国に多発している同心円型の脱髄巣と西洋の散在性多発性硬化症の病巣との混在がこれらの国々の剖検例の中には明らかに混在していることが、少なくとも現在の時点で明らかなことは極めて意義のあることと考えている。平成6年9月末までに相手側研究代表者アンドラスグセオ教授が全ハンガリー国内の主要大学,病院の病理解剖部門と交渉をかさね,それぞれの施設での症例検索方法を詳細に打ち合わせた結果,本年度はまずブタペストを含め南半分を徹底的に10月2日10月15日の間,週末も含め検索を続行した。まず主任研究者のシェ-ケスフェヘルバ-ルで6症例の保存材料と6例の新たな脳組織を検索して切出し,現在標本化を続けている。次いでカポスバ-ルという田舎の施設に生存中のBalo氏病の患者,そして剖検例で定型的なBalo氏病の脳標本を検索する機会に恵まれた。次いで,ハンガリー最大の歴史を持つペ-チ医科大学の病理学教室においてはそこで蓄積されてきた実に75症例という膨大な標本や脳を徹底的に全症例記録し続け,さらに5症例は現在標本作製中である。これら75症例の中には実は欧米の多発性の硬化症とも異なり,中国における同心円硬化症とも異なり,両者の中間的像を示す全く特異な2症例を認めた。この2例は今後の東西の病変推移を云々するのに極めて貴重な症例と考えられ,早速平成7年春の多発性硬化症に関する東欧の研究総会でグセオ教授を筆頭とし,我々も共同研究者として学会報告し,次いで論文に作成してゆく計画をもっている。続いてブタペスト大学を訪れ,ここでも5症例を観察しえたが,残念ながら,度重なる研究室の改築移転によって貴重なBaloの原症例を見出すことができなかった。平成7年度はル-マニアやポーランドも可能な限り調査し,東欧の全貌を総括したいと考えている。他方相手国研究代表者グセオ教授は11月7日から16日まで主任代表者の研究室に来訪し,多発性硬化症脳のパラフィン切片を溶解し,走査方電顕で観察することで立体的な髄鞘崩壊像を見る道を求め得たと極めて満足し帰国した。
ナノ周期構造を利用した間葉系幹細胞自己生成組織の線維強化と軟組織修復の高度化

間葉系幹細胞(MSC)をナノ基板上およびコラーゲンナノ線維上で生成し,nano-SATおよびfiber-SATを生成した.両SATともに線維配向度,線維強化度の高い生体由来材料であり,通常SATに比べ,破断強度と剛性が増大した.ついで,両SATをウサギ大腿骨荷重部軟骨欠損部に他家移植しところ,3ヶ月後において,両材料ともタイプIIコラーゲンの生成を伴う良性の軟骨修復を示した.特に,ナノ線維SATによる修復組織は低い摩擦係数を示し,個体間のバラツキも少なかった.ナノ線維SATによるラット膝蓋腱の修復の追加検討でも,形態学的,力学的に良好な修復経過が観察された.フェムト秒レーザー装置を用いて,これまでの検討結果を参考に条件をふり,ナノ溝周期構造をチタン表面上に加工した.ヒト滑膜由来細胞を培養システムで継代培養して間葉系幹細胞の密度を高め,生成したナノ周期構造上で初期細胞密度6x10^5 cells/cm^2程度で培養した.培養28日後にアスコルビン酸を投与して線維形成を促し,scSATを生成した.原子間力顕微鏡やレーザー顕微鏡等で形態観察を行うとともに,細胞が生成したscSATのコラーゲン量を定量した.その結果,レーザの走査速度を1200 mm/minに高めるとチタン基盤の粗さが適度の抑えられ,その上で培養した細胞の異方性が増し,その細胞が生成するscSAT内のコラーゲン量が増えることが分かった.さらに,生成されたscSATの引張強度は溝なしのチタン上で生成したscSATに比べ,有意に高いことが分かった.研究が研究計画以上に進んだため,当初予定にはなかったタイプIコラーゲンシート上でのscSAT生成も試みた.培養28日後にはコラーゲンシート表面に厚さ50 micro-m程度の薄い細胞層が形成され,破断荷重が有意に増大した.今後はこれら二種類のscSATの培養中に繰り返し引っ張り荷重をあたえ,特性の変化を調べる.また,これらの材料を靱帯や軟骨の損傷部に埋入する動物実験を行い,修復に及ぼす影響について検討を加える.固液ニ相性の力学解析についても検討を行い, scSATのようにコラーゲン線維で強化された多孔質弾性体の力学挙動を解析する手法を開発した.今後は,培養条件により,scSAT内のコラーゲン線維の弾性率や,プロテオグリカンの弾性率および透水性がどのように変化するかについて検討する.平成25年度の検討結果を受けて,チタンにおけるナノ加工条件の最適化を図った.その結果,MSCの伸展度合いを最適にする条件は,パルス時間幅190 fs,レーザフルエンス0.5 J/cm2,走査速度1200 mm/minであることが分かった.力学試験機および解析手法に改良を加えるとともに,ナノ加工や細胞培養の条件等の見直しを行った.PDMS状のナノ溝周期構造を加工してNano-scSATの生成を行い,原子間力顕微鏡,レーザー顕微鏡,力学試験装置を用いてscSATの形態特性と力学特性を調べた.また,ナノ構造上でのscSAT生成とは別に,コラーゲンシート状でscSATを培養し,scSAT/コラーゲン複合体を作成し,上記と同様に培養条件やコラーゲンシートの特性などについてデータをまとめた.その結果,Nano-scSATおよびscSAT複合体は,通常のscSATよりも力学特性が優れていることが分かった.家兎の大腿骨荷重部に部分欠損を作成し,上記で生成したNano-scSATおよびscSAT複合体を他家移植した.また,ラットの膝蓋腱中央部に欠損を作成し,scSAT複合体を他家移植した.移植4時点では,いずれも良好な肉眼所見を示し,修復が確認された.Nano-scSATおよびscSAT複合体を生成するための条件を明らかにした.さらに,これらの材料を用いた軟骨修復,および腱(靭帯)修復実験を行い,移植後一ヶ月においては,良好に治癒することを確認した.移植期間3ヶ月の試料については平成27年度に観察,解析を行う予定である.基礎的検討として,前年度までのナノ加工条件およびナノ線維生成条件を踏襲し,MSCをナノ基板上およびコラーゲンナノ線維上で生成し,ナノ基板SATおよびナノ線維SATを生成した.形態学的観察では,ナノ基板SATは基板の溝方向に平行な微細なコラーゲン線維が密に配向しており,一方,ナノ線維SATはMSCと線維の混合領域が生成され,MSC/混合領域/線維の三層構造が認められた.力学的特性は,両材料ともSATに比べ,破断強度と剛性が増大していた.応用的検討として,ウサギ滑膜由来のナノ基板SATとナノ線維SATをウサギの大腿骨荷重部軟骨に作成した欠損部に他家移植し,移植3ヶ月後に採取した軟骨様生成組織の形態学的観察および摩擦試験等の力学試験を行った.サフラニンOによる形態学的観察では,両材料とも濃赤色を示し,タイプIIコラーゲンと良質のプロテオグリカンの生成が示唆された.しかし,ナノ基板SATによる修復組織は,組織表面から深さ方向に断裂が認められ,組織の連続性が断たれている箇所が散見された.荷重2.5 MPa程度の圧縮荷重下における往復動摩擦試験を行ったところ,ナノ基板SATは組織が脆弱で,数度の繰り返し摩擦により表面が破壊された.これに対し,ナノ線維SATによる修復組織は正常軟骨には及ばないものの,摩擦係数が低値を示し,個体間のバラツキも少なかった.追加検討として,ヒト滑膜由来のナノ線維SATを,ラット膝蓋腱中央1/3の欠損部に移植する異種間移植による修復実験を行った.

その結果,移植を行わなかった対照群に比べ4週後に組織内のコラーゲン線維が有意に増大し,引張剛性が正常群レベルまで向上し,引張強度もわずかに増大した.開発を行った材料のうち,ナノ線維SATは移植時の安定性が高まるだけでなく,軟骨および腱の修復に優れていることが分かった.間葉系幹細胞(MSC)をナノ基板上およびコラーゲンナノ線維上で生成し,nano-SATおよびfiber-SATを生成した.両SATともに線維配向度,線維強化度の高い生体由来材料であり,通常SATに比べ,破断強度と剛性が増大した.ついで,両SATをウサギ大腿骨荷重部軟骨欠損部に他家移植しところ,3ヶ月後において,両材料ともタイプIIコラーゲンの生成を伴う良性の軟骨修復を示した.特に,ナノ線維SATによる修復組織は低い摩擦係数を示し,個体間のバラツキも少なかった.ナノ線維SATによるラット膝蓋腱の修復の追加検討でも,形態学的,力学的に良好な修復経過が観察された.間葉系幹細胞から二種類の方法でscSATを生成する方法を開発し,それらの生成における最適条件を求めることができた.さらに,生成した両scSATを用いた軟骨と腱の修復実験も実施し,良好な治癒生成を得た.実験計画通りに研究が実施できていると考えられる.27年度が最終年度であるため、記入しない。医用生体工学当初の研究計画を基本とし,平成26年度に得られた研究結果を分析して研究計画の微修正(改善)を行う.ナノ構造上で生成するNano-scSATについては,概ね,当初の研究計画に従って研究を進める.コラーゲンシートと複合させたscSAT複合体については,興味深い結果が得られているので,シートの厚さや培養期間などについて条件を変えた実験を計画・実行する.また,両材料の検討において,治癒組織の力学特性のみならず,生成タンパクの分析等を行って,組織修復に関する詳細な結果を得る.研究の準備状況が良かったため,研究が開始される年度当初以前より実質的な研究を開始することができた.そのため,本研究の中心的作業項目であるナノ構造の生成に関して,複数の構造を作成し,それらの形成具合の確認や,その上で生成させたscSATの特性について,十分な力学的評価を行うことができた.その結果,強度を向上させるための加工条件を明らかにすることができた.さらに,当初予定していた間葉系幹細胞のナノ加工表面上での培養のみならず,コラーゲンシート上での培養も実施することができた.この新たな培養と試料生成は,従来のscSATの欠点であるコラーゲン線維の欠乏を補うために考案したものであり,コラーゲンシート上でscSATを培養し,一体化させることにより,線維強化されたscSATを生成することを可能にした.この線維強化scSATについても力学特性の計測を進め,従来のscSATに比較して高強度であるという結果を得ている.scSATの力学解析に関しても順調に進めることができた.従来より,軟骨の粘弾性を表現できる線維強化多孔質弾性体モデルの開発を行ってきた実績があり,その際に開発したモデルをベースに新たなモデルを比較的簡便に開発することができたためである.実験だけでは得られない,scSATの微細構造が力学特性に及ぼす影響について検討を加えることができるようになったため,scSAT生成過程に関する理解が深まり,実験でしぼるべきポイントが明確になり,研究全体がよりスムーズに実施されるようになった.
敗血症による胆汁鬱滞性肝障害の発症機構の解明

感染による胆汁排泄量の低下肝外閉塞性黄疸の患者さんに胆道ドレーナージ術を行った際、血中ビリルビンと胆汁酸、胆汁中ビリルビンと胆汁酸を経時的に測定、血中ビリルビンと胆汁酸の消失速度と、胆汁中へのビリルビンと胆汁酸の排泄量を感染症の有無で比較した。感染症が存在すると血中のビリルビンと胆汁酸の消失は遅延、血中ビリルビン・胆汁酸の低下は遅れ、胆汁中へのビリルビンと胆汁酸の排泄量も低下していた。則ち、感染症を合併すると肝細胞によるビリルビンと胆汁酸の胆汁中への排泄は低下することが明らかになった。エンドトキシンによる肝細胞アポトーシスエンドトキシンの静脈投与で血液中のビリルビン・胆汁酸は1224時間を中心に上昇し、胆汁中へのビリルビン・胆汁酸の排泄は618時間を中心に低下した。エンドトキシンの静注後6時間から8時間をピークに、肝細胞内の活性型Caspase-3の増加を認め、アポトーシスの肝細胞数も増加した。ガドリニウムを投与しクッパー細胞を不活化すると、エンドトキシンによる活性型Caspase-3の増加も肝細胞アポトーシスも観察されなかった。Kupffer cell-conditioned Mediumを培養肝細胞に加えると肝細胞にアポトーシスを生じた。Kupffer cell-conditioned Mediumに抗TNFα抗体を添加すると、肝細胞アポトーシスは抑制された。以上より、エンドトキシンはクッパー細胞に作用し、サイトカンー特に、TNFαの分泌を促し、少なくともこのTNFαが肝細胞にアポトーシスを誘導し、肝細胞の現象に関与していることを明らかにした。エンドトキシンによる胆分泌関連蛋白質の発現抑制胆汁酸とビリルビンの輸送担体(NTCPとOATP,CMOAT)の発現量を調べると、エンドトキシン投与にて、胆汁鬱滞に先行してこれら膜蛋白質が減少した。この現象はクッパー細胞の不活化剤(Gd)にて抑制された。Kupffer cell-conditioned Mediumを単離培養肝細胞に添加してもCMOATの発現低下を生じた。しかし、Kupffer cell-conditioned Medium中に抗IL-1α抗体を添加すると、CMOATの発現低下は抑制され、IL-1αを単離培養肝細胞に添加すると、CMOATの発現低下を生じた。MAP Kinasesの阻害剤PD98059やSB203580を添加すると、Kupffer cell-conditioned MediumによるCMOATの発現低下は抑制された。以上より、エンドトキシンによるCMOATの発現量低下は、クッパー細胞の活性化され、クッパー細胞から分泌されるIL-1αが、肝細胞内のMAP Kinasesを活性化し生じることが明らかとなった。

平成11年度研究成果1.in vivoエンドトキシン投与実験:肝細胞の類洞側と毛細胆管側のビリルビンの輸送担体(OATPとCMOAT)のmRNA量はエンドトキシン投与後12時間目をピークに減少することを確認した。また、胆汁酸の輸送担体NTCPも同様に減少するが、小胞体の酵素(UDPG)はエンドトキシン投与にては変化しなかった。一方、肝細胞アポトーシスはエンドトキシン投与後8時間目をピークにCaspase-3の活性化とTUNEL陽性肝細胞の増加を認めた。これらの変化は、あらかじめKupffer細胞の阻害剤(Gd)を投与しておくと認められなかった。2.in vitroの投与実験:培養肝細胞にエンドトキシンを直接投与しても肝細胞のCMOAT発現量に変化はなかった。エンドトキシンを投与しないKupffer cell-conditioned Mediumを培養肝細胞に加えてもCMOAT発現量は変化しなかった。Kupffer-Hepatocyte Co-culturesystemにエンドトキシンを投与すると、CMOAT発現量は減少し、エンドトキシンを投与したKupffer cell-conditioned Mediumを培養肝細胞に加えてもCMOAT発現量は減少し、エンドトキシンを投与したKupffer cell-conditioned Mediumを培養肝細胞に加えてもCMOAT発現量は減少した。同様に、肝細胞アポトーシスはエンドトキシンを投与したKupffer cell-conditioned Mediumを培養肝細胞に加えた場合やKupffer-Hepatocyte Co-culturesystemにエンドトキシンを投与すると肝細胞アポトーシスは生じた。平成12年度研究成果2.in vitroの投与実験:Kupffercell-conditioned Medium中に抗TNFα抗体或いは抗IL-1α抗体を添加すると、抗IL-1α抗体によりCMOATの発現低下が抑制された。IL-1αやTNFαを単離培養肝細胞に添加すると、IL-1αでCMOATの発現低下を生じた。Kupffer cell-conditioned Mediumを培養肝細胞に投与すると、肝細胞内のMAP Kinases(ERK Kinases,p38 MAP kinases,JNK kinases)の活性化が時間依存性に起こった。そこで、これらMAP Kinases系の阻害剤PD98059やSB203580を添加すると、Kupffer cell-conditioned MediumによるCMOATの発現低下は抑制された。以上より、エンドトキシンによるCMOATの発現量低下は、クッパー細胞の活性化され、クッパー細胞から分泌されるIL-1αが、肝細胞内のMAP Kinases(ERK Kinases,p38 MAP kinases,JNK kinases)を活性化し生じる現象であることが明らかとなった。
「移動」としての所有者句外置について：文と名詞句との平行性の観点から

本研究では、ヒトの言語機能の重要な特性である「移動」について、文と名詞句との平行性の観点から検討する。極小主義理論発展の過程において検討されたコントロール構文の移動分析を受け、所有者句外置構文を同様の観点から検討する。所有者句外置構文では、所有者句が被所有句と離れた文内位置に現れるものの、その所有者として解釈される。この被所有句が、コントロール構文における埋め込み文に相当すると考える。本研究では、所有者句外置構文について、コントロール構文と比較・対象することにより、項構造、機能範疇、素性照合、解釈部門への情報転送の単位等の観点から、「移動」及びそれを支える言語機能の解明に寄与することを目指す。
p53ネットワークの理解と分子標的候補の探索

p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異しているが,“がん抑制遺伝子"であるためp53経路をターゲットとした治療薬の開発は遅れている.本研究ではp53による転写制御ネットワークの全貌を明らかにすること目的とする.本年度は,新規のp53標的としてp120カテニンファミリ遺伝子を同定し,その機能解析を行い,発がんにおける役割を考察した.まずp120カテニンファミリ遺伝子を新規の53標的遺伝子として同定した.細胞レベルの研究から,この遺伝子はp53誘導アポトーシスの制御機構に関連する因子の1つである可能性を示唆する結果を得た.癌細胞において,このp120カテニンファミリ遺伝子の低発現は細胞間接着を変化させ,その結果として癌の浸潤・転移を促進する可能性を示唆する結果も得た.このp120カテニンファミリ遺伝子産物はmRNAスプライシング制御に関連し,さまざまな遺伝子産物の機能に影響を及ぼすと考えられた.すなわち,このp120カテニンファミリ遺伝子はp53シグナル経路にポジティブフィードバックに作用すると考えられる.さらに公開されているデータベースの解析から,この遺伝子の低発現が複数の癌種において生存率の低下につながることを明らかにした.本研究結果は,p53変異によるこの遺伝子発現減少と予後増悪との相関の基盤となる分子メカニズムを示している可能性がある.本年度の研究成果として,p120カテニンファミリ遺伝子が転写活性化因子p53の直接の転写標的であることを見出した.これまでこの遺伝子産物については,細胞質においては細胞接着および細胞運動,核内においてはmRNAスプライシングへの関与が報告されている.本研究では,クロマチン免疫沈降物の次世代シーケンサ解析(ChIP-seq)データを利用して,この遺伝子のp53応答配列候補を探索し,RE1およびRE2を同定した.ChIP-PCR法およびレポーターアッセイ法により,RE1およびRE2配列がp53応答配列であることを確認した.さらに,複数の癌細胞株においてp53強制発現系および内在性p53発現誘導系を用いて,正常型p53によるこの遺伝子の発現誘導を転写レベル,タンパクレベルで確認した.また,この遺伝子が影響を及ぼすmRNAスプライシングをRNA-seqにより解析し遺伝子オントロジー解析を行うことによって,このp120カテニンファミリ遺伝子がタンパク結合および細胞間接着に関連する遺伝子群の選択的スプライシングを変化させることを見出した.すなわち,本研究では癌におけるp53変異によってこのp120カテニンファミリ遺伝子の発現が減少し,数100遺伝子のmRNAスプライシングが変化する.この選択的スプライシングの変化およびp53標的遺伝子の選択性を介してさまざまな遺伝子産物の機能に影響を及ぼし,その結果p53誘導アポトーシスの抑制が惹起され,がん患者の生存率の短縮につながる可能性を提唱できた.今後,いくつかの研究結果について検証実験を実施し再現性等を確認する.最終的には,本研究結果を論文にまとめ,査読付き学術雑誌に投稿予定である.また,本研究成果を日本癌学会など国内学会に研究発表する計画である.p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異しているが,“がん抑制遺伝子"であるためp53経路をターゲットとした治療薬の開発は遅れている.本研究では,p53による転写制御ネットワークの全貌を明らかにすることを目的とする.本年度は,miRNA, lncRNA (long non-coding RNA)などの機能性RNAを介したp53による転写制御の標的分子の同定を試行した.microRNA, lncRNA等の機能性非コードRNAの発現誘導を介して2次的にp53によって転写が制御される標的コード遺伝子群を同定し,p53下流転写ネットワークの全貌を解明する.また,その機能を解析することによって発がん機構への関与を解明する.本年度の研究成果として,次世代シーケンサーを利用したp53タンパクに対するChIP-seq解析により,lncRNA (long non-coding RNA) NEAT1がp53の直接の転写標的であることを見出した.腫瘍細胞の増殖において,NEAT1の発現抑制はp53の機能を減弱させ,さらに,多くのlncRNAを含む遺伝子の転写制御に影響を及ぼした.この研究成果は,NEAT1発現がp53の腫瘍抑制機能に寄与し,p53とNEAT1は腫瘍抑制に貢献する転写ネットワークを形成していることを示唆している.本年度の研究成果として, lncRNAであるNEAT1がp53の直接の転写標的であることを見出した.腫瘍細胞の増殖において,NEAT1の発現抑制はp53の機能を減弱させ,さらに,多くのlncRNAを含む遺伝子の転写制御に影響を及ぼした.数種類の悪性腫瘍においてNEAT1の低発現は予後不良と相関することがわかった.この研究成果は,NEAT1発現がp53の腫瘍抑制機能に寄与し,p53とNEAT1は腫瘍抑制に貢献する転写ネットワークを形成していることを示唆している.この研究成果を査読付学術雑誌であるCancerLettersに発表することができたことから,おおむね順調に進展していると評価した.p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異しているが,“がん抑制遺伝子"であるためp53経路をターゲットとした治療薬の開発は遅れている.

本研究はp53による転写制御ネットワークの全貌を明らかにすること目的とする.最近のp53研究では,癌細胞の浸潤と遊走,そして転移を制御していることも示されている.本年度は,p53により発現が誘導される遺伝子として,breast cancer metastasis suppressor 1 like、BRMS1-like(BRMS1L)を同定した.本研究では,BRMS1Lがp53の新規標的遺伝子であり、主に細胞浸潤と遊走抑制に関与していることを明らかにした.BRMS1L遺伝子近傍に2つのp53結合配列を同定し,p53の直接の転写標的遺伝子であることを示した.BRMS1Lはco-repressor complexであるmSin3/HDAC1の構成因子として同定され,その機能解析が進められてきた.もともとBRMS1Lは,転移抑制遺伝子として解析が進んでいるBRMS1,mSds3とファミリーを形成している.これらファミリー間の差異については不明な点が多いが,p53経路とつながったことで,今後p53による癌細胞の浸潤・遊走抑制におけるメカニズムと合わせて解明を進めることができると考える.興味深いことに,p53の標的遺伝子制御においてBRMS1Lがp53の作用を補強する可能性を示した.本年度の研究では,p53によるp21の転写誘導およびsurvivinの転写抑制にBRMS1Lが関わっていることを示した.重要なことに,種々の癌でBRMS1Lが発現低下しており,乳癌と脳腫瘍でBRMS1Lの低発現が予後不良と関係していることを見いだした.このことからBRMS1Lが発癌抑制に重要な役割を果たしていることが示唆された.本年度の研究成果として,BRMS1L遺伝子がp53の直接の転写標的であることを見出した.もともとBRMS1Lは,転移抑制遺伝子として解析が進んでいるBRMS1,mSds3とファミリーを形成している.これらファミリー間の差異については不明な点が多いが,p53経路とつながったことで,今後p53による癌細胞の浸潤・遊走抑制におけるメカニズムと合わせて解明が進むものと考える.興味深い点は,本年度の研究でp53の標的遺伝子制御において,BRMS1Lがその作用を補強する可能性を示した.これまでp53により下方制御される遺伝子において,その機序にp53を含む転写複合体にリクルートされるcofactorとしてHDACが関与していると考えられる例は多い.本研究では,p53によるp21の転写誘導およびsurvivinの転写抑制にBRMS1Lが関わっていることを示した.その分子メカニズムの解明にはさらなる解析が必要と考えられる.本年度の研究成果を査読付学術雑誌であるCancer Scienceに発表することができたことから,おおむね順調に進展していると自己評価した.p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異しているが,“がん抑制遺伝子"であるためp53経路をターゲットとした治療薬の開発は遅れている.本研究ではp53による転写制御ネットワークの全貌を明らかにすること目的とする.本年度は,新規のp53標的としてp120カテニンファミリ遺伝子を同定し,その機能解析を行い,発がんにおける役割を考察した.まずp120カテニンファミリ遺伝子を新規の53標的遺伝子として同定した.細胞レベルの研究から,この遺伝子はp53誘導アポトーシスの制御機構に関連する因子の1つである可能性を示唆する結果を得た.癌細胞において,このp120カテニンファミリ遺伝子の低発現は細胞間接着を変化させ,その結果として癌の浸潤・転移を促進する可能性を示唆する結果も得た.
手動および自動行動解析システムを用いた、神経因性疼痛ラットの行動観察

ラット坐骨神経結紮モデルを用い、神経因性疼痛下における疼痛関連行動を観察した。疼痛関連行動の手動解析では、活動性の低下や起立後の後肢保護行動という、疼痛関連行動の新たな指標を見出した。続いて自動解析装置を用いて疼痛関連の行動解析を試みたが、環境設定に難渋し、正確な解析はできなかった。平成19年度は、神経因性疼痛ラットの手動による行動解析に焦点を置いた。方法:ラット坐骨神経結紮モデル群(L群:n=9)及びシャム手術群(S群:n=7)を術後5, 12, 30日目に23時間撮影し、起立回数、後肢挙上回数、後肢を気にする(噛む、振る、舐める)回数を手動計測した。また、機械刺激(von Frey test)および冷刺激(acetone test)に対する反応も検討した。結果:L群では時間経過とともに一日の総起立回数及び一時間あたりの最大起立回数が有意に減少した(p<0.05)。さらに、患肢挙上頻度が増加し、30日目では、起立後後肢を気にする頻度が患側で有意に増加した(p<0.01)。患趾変形は急性期のみ明瞭であった。機械刺激(von Frey test)に対する疼痛閥値の低下は、L群で顕著であったが、S群も同様に低下した。考察:起立回数の低下は、急性痛と慢性痛両者の評価に応用できると考えられた。特に、起立後後肢を気にする行動は、慢性期の特異的な行動であり、慢性痛の評価に応用できると考えられた。平成20年度の展望:上記の結果を元に、自動行動解析との結果を比較すべく、現在実験の環境設定を行っている。自動行動解析のための撮影条件は、手動計測のそれと大きく異なり、土壌、照明、録画条件など様々な事柄に対する改善が必要である。特に、現在使用しているラット(白色、中等大)に対しては、背景を全て黒に統一させる必要があり、多大な時間を要している。さらに、痛みに対する詳細な行動の解析はソフトウェア的性質上難しい可能性があり、十分に検討していかなければならないと考えられる。平成20年度は、神経因性疼痛ラットの自動行動解析システムによる行動解析を行った。方法: SD種のラットを用いた。ラット坐骨神経結紮モデル群及びシャム手術群を術後14, 28, 42, 56日目に23時間撮影し、自動行動解析ソフトウェアHome Cage Scanによる行動解析について検討した。結果:1)環境設定:白色ラットの行動解析には、撮影条件として背景を黒色に統一させる必要があった。様々な土壌を用いた結果、Yesterdays News[○!R](ピュリナ社)が最も適していた。ラット籠周辺の壁や机に黒色画用紙と黒色ビニールシートを貼り、背景を黒色に設定したが、籠(アクリル板)にラットの姿が映りこみ、ラットが二匹として認識されるなど、解析エラーが多かった。また、長期間ラットを観察した為にラットが通常の飼育籠(幅44cm,奥行28cm,高さ20.5cm)に対して大きくなり、可動域が狭くなって行動が鈍くなり行動認識ができなくなってしまった。ガラス水槽(幅60cm,奥行30cm,高さ36cm)を用いたところ、ラットの行動は改善し、起立、歩行、走行、跳躍について認識できるようになった。2)行動解析:起立後後肢を気にする行動や四肢を振るといった痛みに対する細かな行動は、四肢が体幹部の陰影に隠れてしまい、認識不可能であった。睡眠、起立、歩行、跳躍など大きな動作を認識することは可能であるが、解析中にラットの認識が出来なくなり、誤解析することが多く、監視を必要とした。考察、結論: Home Cage Scanはラット及びマウスの行動解析に開発されたが、白色で大型のラットの行動を長時間、長期間解析するのは難しいと考えられる。解析結果を得る為の環境設定に莫大な時間がかかり、手動解析に比べて優れているとは言い難い。Home Cage Scanは動物の行動を2Dでとらえるため、手動解析で可能であった痛みに関する詳細な行動の解析は難しい。
粥状硬化の発生,進展における中膜平滑筋細胞の脂質過酸化とその調節機構の意義

1952年、Glavindらによって動脈硬化症の発生における脂質過酸化(LP)の重要性が提唱されて以来、多くの研究者によりその見解は支持されて来たが、LPが動脈壁のどの部分(組織,細胞)に発生しているかなど、硬化病変との直接的な関連については、未だ不明の点が多い。そこで本研究では、動脈硬化病変の中核を成す粥状硬化巣におけるLPの発生部位を、生体内にあってLPの最も有効な消去,防御因子であるglutathione peroxidase(GSH-PO)の局在の変動との関連から追求した。《材料及び方法》殆ど硬化性病変を示さない成人大動脈4例,種々の段階の粥状硬化病変を示す大動脈13例を対象とし、H&E染色標本による通常病理組織検査の他、当研究室で作製した抗ヒトGSH-POを用いた酵素抗体法("ABC"法)でGSH-POの局在観察をも行った。《結果及び考察》正常大動脈壁では、その内膜にも中膜にも殆どGSH-PO局在を認めなかったが、粥状硬化巣では、その主体をなす"泡沫細胞(foam cells)"に顕著なGSH-PO局在を認めた。"泡沫細胞"は、その病変の初期では主としてマクロファージMΦよりなり、後に中膜から内膜へと遊走して来る中膜平滑筋細胞(MSMC)が主体を占めるとされているが、これらの全ての細胞、及び泡沫化以前の、種々の程度の脂肪変性細胞にも顕著なGSH-PO局在を認めた。即ち、正常状態では殆どその局在を示さない細胞に、硬化病変の出現と共にGSH-PO局在発現をみた訳である。ラット肝における【CCl_4】(顕著なLPを起すことで知られている)による脂肪肝の実験などを通し、脂質過酸化物(GSH-POの基質)により、同酵素の合成促進乃至誘導が起ることが知られており、GSH-POの発現をみた"泡沫細胞"では盛んなLPが発生していることが示唆された。また、ラット腹腔MΦにp-bromophenacylbromideを投与(アラキドン酸カスケード抑制とLP産生も阻害)により生じたGSH-PO合成阻害は、脂質過酸化物,アラキドン酸の投与で回復をみた。
大腸切除術後高齢者の生活機能の回復・維持を目指すフォローアッププログラムの開発

本研究は、外来通院している大腸切除術後高齢者における自宅での生活の実態と生活機能の回復や維持に影響する要因を明らかにし、支援のあり方を検討することを目的としている。インタビューとアンケートによる調査を実施した結果、手術後の生活の状態に影響する要因は、原疾患や術式の影響以外に、個々の生活歴や価値観によって多様性がみられた。その中でも共通した要因として、併存疾患・運動機能・運動習慣・役割・趣味・意欲・病気や加齢に対する受け止め・サポート状況などが抽出された。地域で生活する大腸切除術後高齢者に対する効果的な情報提供や相談場所の確保の必要性が示唆された。我が国では高齢化の進行と医療技術の進歩に伴い、根治目的で手術を選択する高齢者の割合が増えてきている。一方で高齢者の場合、治療経過は良好であっても手術をきっかけに活動範囲が縮小し、生活機能の低下、フレイルの状態を招きさらに活動性の低下が進むという悪循環に陥る恐れが大きい。また急性期病院では在院日数の短縮化に伴い、外来で生活機能をフォローアップしていく必要性に迫られている。しかし、高齢者に対するサポート体制は十分に整っているとは言えず、高齢者の変化に気づきにくい現状がある。本研究の目的は、外来通院している大腸切除術後高齢者に焦点を当て、手術後の自宅における生活の実態を明らかにするとともに、手術後の生活機能の回復や維持に影響する要因を明らかにすることである。そして、外来における手術後の高齢者の生活機能の維持や回復への効果的な働きかけのあり方を検討し、フォローアッププログラムの試案を作成する。平成28年度は、大腸切除術後高齢者における退院後の生活機能や生活の広がりの実態やそれらへ影響する要因を明らかにする目的で、関連する情報の収集や文献検討を実施した。また併せて、大腸切除術後高齢者に対し、身体状況や生活に対する認識に関するインタビューと、アンケート調査を行った。アンケートでは基本属性の他に、(社)日本理学療法士協会開発のアセスメントセット『Elderly-Status Assessment Set(E-SAS)』を参考に、「生活空間(Life-Space Assessment:LSA)」「人とのつながり(Lubben Social Network Scale-6)」「入浴動作能力」等を測定し、生活の状態を把握した。得られたデータについて現在分析を進めており、今後関連学会で発表する予定である。当初の予定期間よりも、データ収集に時間を要したことが主な要因として挙げられる。本研究の目的は、外来通院している大腸切除術後高齢者における自宅での生活の実態と生活機能の回復や維持に影響する要因を明らかにし、支援のあり方を検討することである。高齢化の進行と医療技術の進歩に伴い、根治目的で手術を選択する高齢者の割合が増えてきている。しかし高齢者の場合、治療経過は良好であっても手術をきっかけに活動範囲が縮小しやすい。活動性の低下は生活機能の低下にもつながるため、退院後の継続した支援は重要である。まず調査準備として関連する情報の収集や文献検討を行った。その後、大腸切除術後高齢者に対し、身体状況や生活に対する認識についてインタビューとアンケート調査を実施し、手術後の生活活動に影響を与える要因を抽出した。アンケートでは基本属性の他、(社)日本理学療法士協会開発のアセスメントセット『ElderlyStatus Assessment Set(E-SAS)』を参考に、「生活空間(Life-Space Assessment:LSA)」「人とのつながり(Lubben Social Networ k Scale-6)」「入浴動作能力」等を測定し、生活の状態を把握した。対象は10名で74歳93歳の高齢者である。手術後の生活の状態に影響する要因には、原疾患や術式の影響以外に個々の生活歴や価値観によって多様性がみられたが、併存疾患・運動機能・運動習慣・役割・趣味・意欲・病気や加齢に対する受け止め・サポート状況などが抽出された。手術後に身体的変化を実感した高齢者の中には、1年程度で変化に適応する者がいる一方、不安を抱えながら自らで模索し数年かけて回復の道を辿る者もいた。これらの結果より、地域で生活する大腸切除術後高齢者に対し、効果的な情報提供や相談場所の確保の必要性が示唆された。データの分析を進め、大腸切除術高齢者の生活機能に影響する要因を抽出し、それを基に退院後の生活をフォローアップするためのプログラム案を作成する。作成した案について、術後の高齢者看護の経験を持つ看護師や老年看護の専門家より意見聴取を行い、内容を精錬させる。老年看護学当初の計画では研究資料の整理やデータ入力補助等で生じる人件費を見積もっていたが、確保が困難であり人件費が発生しなかったため、次年度に使用する研究費が生じた。次年度は、学会へ参加し関連領域の動向を把握するとともに、関連学会での発表を行うための国内旅費を計上する。また、研究資料の整理やデータ入力等の補助を得て研究を遂行する。
薬剤師に関わるディスコミュニケーションの研究-ヒューマニズム教育構築に向けて-

患者との治療的関係構築が可能な薬剤師養成には、科学的知識以外に臨床心理学的・精神医学的・倫理学的な知識と訓練が不可欠である。本研究は薬剤師が遭遇している対患者・対スタッフとのコミュニケーション障害・困難・失敗、倫理的問題の調査結果という実践データを基に、独・米での医療人養成教育プログラムも参照して、新たな対人援助職としての薬剤師養成のための教育内容を策定を試みた。結果として、臨床心理学的・精神医学的知識の教育・態度涵養と共に、薬剤師自身の振り返り、倫理的課題も組み込んだ議論を通した学びが必要であること、指導者養成も含めた教育システムの構築は薬学教育における喫緊の課題であることが示唆された。研究開始初年度であるため、まず研究代表者・研究分担者・連携研究者が一堂に会して話し合い、相互の課題認識を共有し、実際的な研究のロードマップを作成した。初年度の目標として、現場で発生している問題=臨床素材の収集に努めることとし、薬剤師および薬学生を対象とした質問紙および面接調査を実施することを決定した。薬剤師対象の調査としては、申請時の研究代表者・研究分担者・連携研究者に加えて、大阪薬科大学から2名連携研究者を追加して、臨床心理学的・精神医学的・倫理学的な観点から、薬剤師が遭遇する可能性のあるディスコミュニケーション場面を想定した具体事例55項目を作成し、そういった経験の有無についての質問紙調査を計画した。調査対象として、ディスコミュニケーションを体験している可能性が高いと考えられた在宅薬剤師を選び、在宅薬学会会長に調査依頼した。関連会社において、ネット上に質問紙をアップし、調査を実施することが可能であることがわかったため、作成した質問紙を日本在宅薬学会のホームページ上に公開して、会員による回答を依頼した。同時に面接あるいは電話調査の依頼も行った。現在調査は進行中であり、結果の分析が待たれる。一方、薬学生対象の調査については、26年度中に実施できなかった。文献や海外視察による研究については、倫理的な課題について、心理臨床場面での倫理的課題の教育方法を参考にするため、参考図書を購入し、文献研究を行った。また海外での薬学教育の在り方を知るため、ドイツ・ハイデルベルグ大学薬学部スタッフにインタビューして、コミュニケーション教育についての取り組みを調査した。シンポジウムについては、薬剤師でもある弁護士による基調講演を中心とした企画を実施する予定であったが、日程の都合がつかず次年度に持ち越しとなった。2015年度は、前年度末に作成した、薬剤師が現場で遭遇している可能性があるディスコミュニケーション場面の仮想事例55項目について、日本在宅薬学会会員を対象として質問紙調査を実施した。しかし、例数が少なかったため、大阪府薬剤師会にも協力依頼し、同会会員にもネット上でのアンケート調査を実施した。結果については、量的データについて、日本在宅薬学会会員のみを対象としたものについては図書「薬剤師のこれから」中に、全員の分析結果については、日本薬学会でのポスターとして発表した。また、回答者の中から面接調査への協力者を募って代表者が面接し、質問紙の自由記述も併せて、個別事例の検討として日本薬学会でポスター発表した(量的データと連番発表)。全項目について経験者が存在しており、7割以上の薬剤師が経験した項目もあるなど、想像以上に薬剤師はディスコミュニケーションに遭遇していることが明らかになり、本研究を進める意義が確認された。文献・海外調査については、7月にアメリカで、医学教育における医療面接の教育方法について代表者が調査し、その内容と薬学教育への示唆について上記の図書中にまとめた。また同様の内容について、ドイツ・ハイデルベルグ大学でも実地調査を行った。昨年度実施できなかった、薬剤師でもある弁護士によるシンポジウムについては、薬剤師対象の研修会に形式を替えて、2016年1月16日に大阪国際交流センターにて実施した。「薬剤師業務の倫理的問題ー心理・倫理・法的側面からの検討ー」というタイトルで、研究代表者と弁護士を講師として、グループワークを中心に仮想事例についての対応の検討をした。分担者が所属する大学の学生も含め、30名弱が参加し、好評を得た。薬学生対象の調査については、実習時期がバラバラであることもあり、2015年度も実施できなかった。当初計画では、3年目には具体的な教育プログラムを実施して、その成否を検討することとしていたが、質問紙調査で十分な回答数を得ることに時間を要し、教育プログラム作成にはまだ至っていない。また、面接調査についても、応諾者が全国に散らばっている上、対象者自身が多忙であるため、面談予定がなかなか立たず、少しずつしか進展していない。学生を対象とした調査については、学生が実習を終了する時期がバラバラで一斉に質問紙調査を実施することが困難である上、質問内容の焦点が絞り込めていないことから実施できていない。また、心理的・法的・倫理的問題についてのワークショップは開催したものの、対象は薬剤師・薬学生であったため、一般人を啓蒙することを目的とした、ヒューマニズム教育をテーマとしたシンポジウムは未開催のままである。薬剤師がディスコミュニケーションに遭遇していることが判明したうえ、厚生労働省から提出された、かかりつけ薬剤師・健康サポート薬局の制度は、薬剤師が対人援助職として機能することを強く求めているため、本研究の実施は社会的要請だと考えられる。そこで2016年度は、過去2年間に得た知見に基づき、具体的な教育モデルを作成することに努めた。

具体的には、ドイツ・ハイデルベルグ大学に出張し、臨床実習開始後の学年で実施しているMedi-KIT方式と、大学入学後の基礎課程において、医療心理学を享受する際に用いているTeaching Family方式について、授業実施の方法やその時の注意事項を聞き、薬学教育に応用するプログラムを策定した。前者は各診療科ごとに医師・コミュニケーション担当教員と67名の学生がグループとなって、模擬患者と学生医師の面談→医師役学生の自己分析と他の学生のディスカッション→模擬患者からのフィードバックと全体の話し合い、の手順を繰り返すことで、医学的知識と臨床的スキル、さらにコミュニケーション能力と態度の涵養を同時に行うプログラムである。それに対して医療心理学講座で開発中のTeaching Family方式では、1組の模擬家族を設定し、彼らやその家族が経験する医学的問題への医療者(主として医師)の関わり方を、学生の面前でロールプレイすることによって、臨床経験のない学生に対して、知識を具体化し、患者心理や医療者のコミュニケーションスキルを理解させることを目的としている。これらは、臨床経験のない薬学生と、現場での経験を持つ薬剤師に対する卒後教育の方法として応用可能であり、研究計画の具体化に向けて、現行の研究組織に薬局薬剤師・大学の薬学部などの新たな協力者を加えて、次年度以降の研究実施に向けた組織を形成した。患者との治療的関係構築が可能な薬剤師養成には、科学的知識以外に臨床心理学的・精神医学的・倫理学的な知識と訓練が不可欠である。本研究は薬剤師が遭遇している対患者・対スタッフとのコミュニケーション障害・困難・失敗、倫理的問題の調査結果という実践データを基に、独・米での医療人養成教育プログラムも参照して、新たな対人援助職としての薬剤師養成のための教育内容を策定を試みた。結果として、臨床心理学的・精神医学的知識の教育・態度涵養と共に、薬剤師自身の振り返り、倫理的課題も組み込んだ議論を通した学びが必要であること、指導者養成も含めた教育システムの構築は薬学教育における喫緊の課題であることが示唆された。全体の研究計画立案の時点までは順調に進展したが、構成員が多忙であることも有り、薬剤師を対象とした調査については、質問紙の項目作成にかなりの時間を要してしまった。またネット調査として実施することを決めたが、在宅薬学会から指定を受けた、ホームページを構築する会社のかなりの不手際のため、調査の開始が実質的に年度末となってしまった。このため、データの分析を行うことができておらず、次のステップに進めていない。面接調査についても、この質問紙調査の対象者に対して実施する予定であったため、結果として、一例も面接を実施できていない。しかし、調査の大枠は既に出来上がっており、また質問紙については、ネット調査である分、結果入力の手間もないため、今後はある程度の進展が見込める。薬学生対象の調査については、実習時期がバラバラであり、また実習前後に一堂に会する機会があるかどうかが大学ごとに異なるため、どのタイミングで誰を対象に調査を実施するかについて実際的な課題があり、実施に至らなかった。一方、文献研究や海外視察など、臨床素材を集めるという部分以外では、一定の進展をみた。
脱細胞喉頭土台を用いた喉頭全摘後の喉頭再生に関する研究

目的:喉頭全摘後の喉頭再生を目的とし、脱細胞技術を用いた脱細胞喉頭土台を作成し、免疫抑制剤のいらない移植医療の実現を目指す。(1)喉頭の脱細胞技術の確立:ラット喉頭を用いた脱細胞法には機械的、化学的、酵素的な手法があるが、最も頻用され臨床的のも簡便と思われる化学法、酵素法のうち、SDS, RNAase, DNAase, Tritonなどを用いた脱細胞を試みた。結果、SDSへの浸潤を7日間行う事により最も簡便かつ十分な脱細胞がえられることがわかった。脱細胞土台において、声帯粘膜内の細胞は完全に消失したが、軟骨細胞は一部残存した。しかし、MHC class Iの発現は検出されず、DNAの定量でもDNA残存量はごくわずかであった。一方、細胞外マトリックスであるヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチンなどはよく維持されており、喉頭移植に適した土台が得られたと考える。(2)脱細胞喉頭土台の適合性の確認:脱細胞した喉頭土台を他のラットの腹部皮下、大網にそれぞれ移植し、生着度、拒絶反応の有無を確認した。非脱細胞喉頭を移植すると異物反応と炎症反応が著明で、膿瘍形成をきたしたが、脱細胞喉頭土台移植では炎症細胞は軽度で、異物反応はほぼ問題なかった。(3)脱細胞喉頭土台による喉頭移植実験:ラットを用い脱細胞喉頭土台の喉頭移植を試みたが、脱細胞土台の軟骨面における強度は問題なかったものの、粘膜面の強度が脆弱であり、脱細胞土台の縫縮が問題になった。粘膜面の保持のためにSDS浸潤期間を調整しなおしたが、脱細胞効果、粘膜維持効果のバランスが難しく、今後の課題となった。喉頭脱細胞方法の確立を試みた。脱細胞のための試薬、濃度、要する時間の最適化を行うため、試薬としてSDS, RNAase, DNAase, Tritonなどを用い、各濃度と組み合わせを用いて、ラット喉頭を脱細胞した。結果、SDS浸漬法が最も組織構築への損傷をおこさずに効率よく脱細胞出来る事がわかった。続いて、SDSの浸漬時間を1日、3日、7日にわけて検討したところ、3日目においては細胞成分(DAPI染色)の残存が認められたが、7日目にはほぼ脱細胞が完了していた。ただし軟骨細胞は一部残存した。細胞骨格である粘膜固有層、筋層は形態的に温存され、コラーゲン線維、弾性線維、ヒアルロン酸の温存が確認された。免疫応答については、MHC class Iの発現が3日目では残存するものの、7日目で消失した。DNA定量については、やはり3日目では残存するものの、7日目ではほぼ消失した。以上の事より、ラット喉頭の脱細胞にはSDS浸漬法が適しており、効果は7日間で最も効率がよく、また細胞骨格であるコラーゲン、エラスチンなどの細胞外マトリックスも最大限保持されていた。軟骨細胞の一部残存は他の方法による報告でも指摘されており、軟骨細胞を完全に除去するのは難しいと考えられるが、残存細胞に免疫応答性はないことが確認できたので、本法が十分有用であると考える。ただし、ラット喉頭での方法論は確立したが、これが大型動物でどうかは今後の検討課題であり、引き続き検討を行っていく予定である。脱細胞の最適化を行い、動物への移植実験を行う予定であったが、脱細胞技術の確立に予定以上の時間を要した。脱細胞の方法を多くし過ぎた結果であったが、そのおかげで安定した方法論が確立した。本研究は、喉頭全摘後の喉頭の再生を目指し、近年発達してきた脱細胞技術を用いた脱細胞喉頭土台を作成し、そのFeasibilityを検証するものである。ポイントとしては、脱細胞技術の確立があり、拒絶反応を起こさない脱細胞喉頭土台を作成することが重要である。まず、ラット摘出喉頭に対する脱細胞法を各種検討した。試薬としてアルカリ、酸、非イオン性界面活性剤(Triton X100)、イオン性界面活性剤(SDS:ドデシル硫酸ナトリウム)、デオキシコル酸などを試し、脱細胞性、脱免疫応答性、組織維持性を様々な角度から検討した。その結果、SDS浸漬を7日間行う事で90%の脱細胞が可能であった。一部軟骨細胞が残存するが、MHCクラスI抗原への抗原性は示さず、DNA定量でもほぼ残存なく、免疫応答性に問題ないと思われた。その後さらなる長期浸漬を行っても、軟骨細胞は残る事と、組織構築に必要なコラーゲン線維、エラスチン線維、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックスの損耗が激しくなるため、7日間浸漬をもって至適条件とした。さらに、本当に免疫応答性がないかを検討するため、作成した脱細胞喉頭土台をラットの背部皮下、および腹部への移植実験を行った。まず、脱細胞していない喉頭をそのまま移植すると、高率に潰瘍形成、軟骨膜破壊、血管侵入などの拒絶反応が認められた。脱細胞土台を同様に移植すると、個体によっては潰瘍形成や炎症細胞浸潤が認められた。脱細胞の指摘条件を設定することができた。拒絶反応の確認をしているところであり、おおむね順調に進展している。

(1)喉頭の脱細胞技術の確立:ラット喉頭を用いた脱細胞法には機械的、化学的、酵素的な手法があるが、最も頻用され臨床的のも簡便と思われる化学法、酵素法のうち、SDS, RNAase, DNAase, Tritonなどを用いた脱細胞を試みた。結果、SDSへの浸潤を7日間行う事により最も簡便かつ十分な脱細胞がえられることがわかった。脱細胞土台において、声帯粘膜内の細胞は完全に消失したが、軟骨細胞は一部残存した。しかし、MHC class Iの発現は検出されず、DNAの定量でもDNA残存量はごくわずかであった。一方、細胞外マトリックスであるヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチンなどはよく維持されており、喉頭移植に適した土台が得られたと考える。(2)脱細胞喉頭土台の適合性の確認:脱細胞した喉頭土台を他のラットの腹部皮下、大網にそれぞれ移植し、生着度、拒絶反応の有無を確認した。非脱細胞喉頭を移植すると異物反応と炎症反応が著明で、膿瘍形成をきたしたが、脱細胞喉頭土台移植では炎症細胞は軽度で、異物反応はほぼ問題なかった。(3)脱細胞喉頭土台による喉頭移植実験:ラットを用い脱細胞喉頭土台の喉頭移植を試みたが、脱細胞土台の軟骨面における強度は問題なかったものの、粘膜面の強度が脆弱であり、脱細胞土台の縫縮が問題になった。粘膜面の保持のためにSDS浸潤期間を調整しなおしたが、脱細胞効果、粘膜維持効果のバランスが難しく、今後の課題となった。初年度は方法論の確立に時間を要したが、今後は予定通り動物実験をすすめていく予定である。拒絶反応の有無について追加の確認をしたうえで、喉頭土台の移植実験へ移る予定である。今年度は喉頭の脱細胞法の確認のために時間を費やし、全体のスケジュールとしてはやや遅れている。動物を使った慢性実験を行う予定であったが、そこまでいかず、これに用意していた経費が執行されなかったため、次年度への繰り越しが発生した。研究分担者の金丸先生の実験がやや遅れており、その経費分持越しとなった。来年度に実験消耗品に使う予定である。上記のごとく、慢性実験用経費が余剰になっている。脱細胞の手法は確立できたので、次年度は移植を含めた慢性実験をすすめる予定であり、余剰金はH29年度請求金額とともにこれに充当していく予定である。