hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
漢字圏学習者のための、日本語「漢字音」学習教材の開発

本研究では、漢字圏学習者向けの漢字学習教材教育の一提案として、漢字2字を音読みで読む熟語(以下、「漢語」とする)の読みに焦点を当て、日本語の漢字学習教材の開発を行ってきた。その主眼は、漢語は、1その多くが音読みの組み合わせで読めること(例:「筆(ひつ)+圧(あつ)→筆圧(ひつあつ)」)、2一部、規則的に音交替するものがあること((「h→p交替(例:「鉛(えん)+筆(ひつ)→鉛筆(えんぴつ)」「促音化(例:執(しつ)+筆(ひつ)→執筆(しっぴつ)」)、という2点にあったが、他方、これらの規則を実際に適用して正しく読めるようになるためには、日本語の漢字の音読みの特徴や、こうした規則と似て非なる現象、あるいは、誤解されやすい現象についての周辺的な知識を正しく持つことも、同じくらい重要という認識に至り、それらを含めた総合的な漢字音教育の内容および方法の開発を行ってきた。本年度は、こうしてこれまでに開発してきたものを、本所属機関の漢字圏向けの複数の漢字クラス(13週のコース、3日間のスポット講座等)で実際に使用しながら改善を図るとともに、実際の授業で教授者が学習者に提示する際の資料をパワーポイント等で整備することにより、新規に当該授業を担当する教授者でも扱うことが容易となるマニュアル相当も整った。本開発は、上述のとおり「漢字」の学習教材ではあるが、同時に、多くの漢字圏学習者の抱える聞き取りの難所(例:促音「っ」、濁音と半濁音の紛れ等)を、表記の側から安定されていくという試みでもあった。単に、未習の漢字語彙が読めるということにとどまらず、漢字圏学習者の総合的な日本語力の向上に、「漢字」という側面から迫ろうとした研究としても意義づけることができる。当該年度(27年度)は、漢字圏学習者の「漢語の読み(音声・表記)」をめぐる実態を解明するとともに、そうした困難点を持つ学習者に対する教授内容および方法について、具体的に検討を進めた。特に中心的に行ったのは、1漢字圏学習者の漢字学習過程の観察と、2シラバス策定である。1については、学習者の許諾を得て行った学習過程の録画記録を観察データとし、漢語や漢字の読みをめぐっての彼らの読みの誤り、音交替規則の適用上の誤り等を明らかにした。また、漢語の読みに関する協働学習の過程の「学習行動」や「学習者間の発話内容」を質的に観察し、その教育方法への検討につなげた。これらについては、日本語教育関係の学会、研究会で発表した。2については、本所属機関での漢字圏向け漢字クラス(13週の通常コース、および、3日間のスポット講座)の教育改善と並行して進めた。上記1での考察結果もふまえ、漢字圏学習者に対して必要な教授項目、それらの提示順序の検討を進め、学習者の日本語レベルにより「初中級編」と「中上級編」という大別して2系統の枠組みについて見通しが立った。この議論の過程では、学外の日本語教育関係者による授業の参与観察、事後の検討会も行って、より汎用性の高い教材開発となることを目指した。なお、当初の予定にはなかったが、近年、筆者らの所属機関では、欧米などのいわゆる非漢字圏出身でありながら、高等教育などで中国語の学習歴を持ち、それを経て新たに日本語学習を開始する学習者が増えていることから、こうした新たな学習者層に対する調査も行った。それにより、本研究課題が主たる対象とする漢字圏学習者の特徴が、一層明らかとなった。日程的な事情で、学外での調査を行うことができなかったが、本所属機関に学外の日本語教育関係者を招いての検討会を実施できたことにより、検討が進んだ。また、当初の予定になかった、漢字学習歴を持つ非漢字圏学習者の調査を行うこととなったが、このことにより、本研究課題の主たる対象者である漢字圏学習者特有の漢字学習(音声・表記)の困難点を、より明確に抽出することができた。本研究は、漢字圏学習者の読みの困難への対応策として、漢字2字の熟語(漢語)の読みにフォーカスした漢字教材の開発を行っているが、当該年度(28年度)は、特に、1)開発教材およびシラバスに基づいた教育実践を、その場やレベルを広げて行うとともに、2)これらの学習状況に関する調査を行って、その妥当性や学習上の困難点の抽出を進めた。具体的には、1)については、本所属機関の漢字圏学習者向け漢字クラス(113週の通常コース内で設置、23日間のスポット講座)を、初中級/中級/中上級それぞれのレベル別に実施し、レベルの違いに応じた適正な教育内容やボリュームの検討を行った。このほか、学外の日本語教育機関の協力を得て、短期間の「出張授業」を行った。これまでとは異なる属性の学習者に対して実践を行ったことで、本提案が汎用性を持つことの感触を得た。2)については、これまでも本提案による学習開始前の漢字圏学習者漢字の読みの困難点を探る事前テストと、授業最終日の事後テストは行っていたが、さらに、本試作教材による学習後半年および1年を経た学習者に対する遅延テスト(筆記、および、フォローアップインタビュー)を行い、学習の定着を見る機会を得た。調査からは、本教材により学習した内容は、中長期的にも維持、拡張されている様子が見られたが、ただし、学習時点で日本語力が低めだった学習者では十分ではなく、別途対応が必要なことが示唆された。

これら1)2)の成果の一部は、日本語教育関係の学会、研究会等で発表するとともに、開発教材全体の完成を目指し、試作版の改訂を行っているところである。前年度にできなかった、海外の日本語教育機関での「出張授業」が実施できたことで、本教材が目指す汎用性への道筋が得られた。ただし、学習者の日本語レベルや、教育機関ごとの授業時間確保の違いへの対応等にも配慮した教材開発のためには、一部見直しが必要である。本研究では、漢字圏学習者に対する漢字語彙教育の一提案として、漢字2字の熟語(漢語)の読みにフォーカスした漢字教材の開発を行っている。これまで、開発の中心は、規則的に音交替する部分(「h→p交替(例:「鉛(えん)+筆(ひつ)→鉛筆(えんぴつ)」「促音化(例:執(しつ)+筆(ひつ)→執筆(しっぴつ)」)をいかに効果的に指導するかにあった。しかし、こうした音交替にフォーカスした教育実践を続ける中で、新たな課題として、学習者が本来、規則のないところに音交替があるかのように誤って理解しており、それへの手当てを講じることが必要であるという認識に至った。そこで、本年度は、学習者にこうした誤解や混同が生じる要因を明らかにするとともに、新たな指導方法の開発を進めた。このような指導方法は、実際に、本研究者らの所属機関の漢字圏学習者向け漢字クラス(113週の通常コース内に設置のクラス、23日間程度のスポット講座)において、初中級/中級/中上級といった異なる日本語レベルに対応しうる形で、授業実践を行ってきた。レベルの違いに応じた適正な教育内容やボリューム等についての見通しが得られたことから、それをもとに、より汎用性の高い教材化に向けて、現在、整備を進めているところである。これらの成果の一部は、日本語教育学会で発表するとともに、他機関の日本語教育関係者との意見交換等も随時行って、教材化に向けた最終段階を迎えている。H29年度内に行った研究成果をふまえての作成教材の見直し(修正・追加)に時間を要することとなったため。本研究では、漢字圏学習者向けの漢字学習教材教育の一提案として、漢字2字を音読みで読む熟語(以下、「漢語」とする)の読みに焦点を当て、日本語の漢字学習教材の開発を行ってきた。その主眼は、漢語は、1その多くが音読みの組み合わせで読めること(例:「筆(ひつ)+圧(あつ)→筆圧(ひつあつ)」)、2一部、規則的に音交替するものがあること((「h→p交替(例:「鉛(えん)+筆(ひつ)→鉛筆(えんぴつ)」「促音化(例:執(しつ)+筆(ひつ)→執筆(しっぴつ)」)、という2点にあったが、他方、これらの規則を実際に適用して正しく読めるようになるためには、日本語の漢字の音読みの特徴や、こうした規則と似て非なる現象、あるいは、誤解されやすい現象についての周辺的な知識を正しく持つことも、同じくらい重要という認識に至り、それらを含めた総合的な漢字音教育の内容および方法の開発を行ってきた。本年度は、こうしてこれまでに開発してきたものを、本所属機関の漢字圏向けの複数の漢字クラス(13週のコース、3日間のスポット講座等)で実際に使用しながら改善を図るとともに、実際の授業で教授者が学習者に提示する際の資料をパワーポイント等で整備することにより、新規に当該授業を担当する教授者でも扱うことが容易となるマニュアル相当も整った。本開発は、上述のとおり「漢字」の学習教材ではあるが、同時に、多くの漢字圏学習者の抱える聞き取りの難所(例:促音「っ」、濁音と半濁音の紛れ等)を、表記の側から安定されていくという試みでもあった。単に、未習の漢字語彙が読めるということにとどまらず、漢字圏学習者の総合的な日本語力の向上に、「漢字」という側面から迫ろうとした研究としても意義づけることができる。
歯周炎病変部から侵入するLPSの循環系および免疫系細胞の活性化に関する研究

1.歯周治療介入による血漿中LPS、各種炎症性マーカーの変動について全身疾患を有さず、慢性歯周炎に罹患している非喫煙者17名を被験者とした。全顎のメカニカル・デブライドメントを行った。術前、術直後および術後1ヶ月の血漿LPS、血清IL-6、CRP、LBPのレベルを測定した。その結果、(1)血漿中LPSは術前17名中3名で検出された。(2)血清中のIL-6レベルの平均は術前と術直後、術直後と術後1ヶ月との間に有意差があり、術直後で高かった。血清中のLBPレベルの平均は術前と術直後、術直後と術後1ヶ月との間に有意差があり、術直後で低かった。(3)血清中のCRPレベルの平均は術前、術直後、術後1ヶ月の3者間では有意差は認められなかった。また、10名中5名の患者で術前に比べ値が低かった。歯周病患者の血漿中のLPS活性は低く、血流に侵入するLPSは微量かあるいは侵入しても、すぐに、LBPなどによって、不活性化されてしまう可能性が示された。しかしながら、血清中のIL-6レベルは、術直後有意に上昇し、LBPレベルが低下したことから、歯周病変部から侵入する、細菌あるいはLPSが全身に影響することが示唆された。2.低濃度LPSに対する全血の反応性について健常者7名から採血し、5pg/mlのAaLPS、3時間の前処理後、1ng/mlのAaLPSを添加し、培養3、6、12、20時間後の培養上清中のIL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10レベルを測定した。前処理しないものを対照とした。その結果、培養12時間後においてIL-1βとIL-6の産生量は、前処理群が有意に大きかった。歯周病患者で認められる程度の生理的血漿LPS濃度でも、単球に対するプライミング効果を有することが明らかとなり、歯周感染由来の血液中のLPSは全身の免疫炎症反応に影響を与える事が示唆された。今年度は歯周病患者の血液中の歯周炎局所由来のエンドトキシンと各種炎症性マーカーの存在と、歯周治療の介入によるそれらの変動を調べた。<材料および方法>全身疾患を有さず、慢性歯周炎に罹患している非喫煙者17名を被験者とした。平均年齢49.82±8.16歳、平均残存歯数26.12±2.99本、歯周ポケット深さ5mm以上の部位が全顎にしめる割合の平均32.65±12.18であった。まず口腔清掃指導を行い、プラークコントロールレコードが20%未満になったのちに、超音波スケーラーと手用スケーラーを用い、全顎のメカニカル、デブライドメントを行った。術前、術直後および術後1ヶ月の血漿エンドトキシン、血清IL-6およびCRPのレベルを測定した。<結果>1.血漿中エンドトキシンは術前17名中3名で検出された。術直後では術前陰性だった2名が陽性となり、術前陽性の1名が陽性であった。術後1ヶ月では、1名が陽性であった。

2.血清中のIL-6レベルの術前の平均は0.45±0.41pg/Ml、術直後3.77±2.63pg/Ml、術後1ヶ月で0.42±0.38pg/Mlであり、術前と術直後、術直後と術後1ヶ月との間に有意差があり、術直後で高かった。3.血清中のCRPレベルの平均は術前0.03±0.03mg/dl、術直後0.03±0.03mg/dl、術後1ヶ月で0.03±0.03mg/dl、3者間では有意差は認められなかった。また、10名中5名の患者で術前に比べ、値が低かった。<考察>歯周病患者の血祭中のエンドトキシン活性は低く、血流に侵入するエンドトキシンは微量かあるいは侵入しても、すぐに不活性化されてしまうのかもしれない。しかしながら、血清中のIL-6レベルは、術直後有意に上昇したことから、歯周病変部から侵入する、細菌あるいはエンドトキシンが全身に影響することが示唆された。昨年度の結果より,歯周病患者の血流に侵入するエンドトキシンは微量かあるいは侵入しても、すぐに不活性化されてしまう可能性があることが示唆されたので,血液中のエンドトキシン活性を中和するLBPの測定とin vitroの系でエンドトキシンの不活性化のメカニズムを検討した.<材料および方法>全身疾患を有さず、慢性歯周炎に罹患している非喫煙者17名(平均年齢49.82±8.16歳)を被験者とした。超音波および手用スケーラーを用い、全顎のメカニカル・デブライドメントを行った。術前、術直後および術後1ヶ月の血漿エンドトキシン、血清IL-6および,LBPのレベルを測定した。<結果>1.血漿中エンドトキシンは術前17名中3名で検出された。術直後では術前陰性だった2名が陽性となり、術前陽性の1名が陽性であった。術後1ヶ月では、1名が陽性であった。2.血清中のIL-6レベルの術前の平均は0.45±0.41pg/ml、術直後3.77±2.63pg/ml、術後1ヶ月で0.42±0.38pg/Mlであり、術前と術直後、術直後と術後1ヶ月との間に有意差があり、術直後で高かった。3.血清中のLBPレベルの平均は術前17.5±9.6μg/ml、術直後14.6±5.9μg/ml、術後1ヶ月で16.99±8.8μg/ml、術前と術直後、術直後と術後1ヶ月との間に有意差があり、術直後で高かった。4.健常者の血漿にエンドトキシンを添加し,37°Cで培養し,その活性を経時的に測定した.その結果,エンドトキシン活性は2時間で消失し,100pg/mlのエンドトキシンが血流に侵入し,1時間以内に測定しないとその血清が検出できないことが示唆された.<考察>歯周病患者の血漿中のエンドトキシン活性は低く、血流に侵入するエンドトキシンは微量かあるいは侵入しても、すぐに,LBPなどの血液中の分子で不活性化されてしまう。1.成人性歯周炎患者、早期発症型歯周炎患者および健常者のLPS, LBP, CD14濃度の測定[材料と方法](1)被験者:成人性歯周炎、早期発症型歯周炎と診断された患者、それぞれ20名、健常者10名を被験者とした。(2)リムルス試験による血清中LPSの測定ベースライン時、初期治療終了時、再評価時、外科処置終了時、メインテナンス時にそれぞれ採血を行い、血清中のLPSレベルを測定した。[結果]研究期間中を通じ、血清中のLPSレベルは検出限界以下であった。血清中のLBP, TNF-αは研究機関を通じ変動しなかった。hs-CRP、IL-6は治療後に減少する傾向が認められた。2.LPSに対する全血の反応性[材料と方法](1)被験者:糖尿病をもつ成人性歯周炎6名を被験者とした。(2)全血からのTNF-α、IL-
河川中の懸濁物質の有機物組成と起源に関する研究

(1)高瀬川水系(青森県)における全窒素および全リンの流出特性を流量と負荷量の関係式を用いてモデル化するとともに、全窒素および全リンの流出特性の違いが、河川の流域特性により説明できることを示した。(2)高瀬川水系の下流に位置する小川原湖への、主要流入河川からの全窒素および全リンの年間総流入量はそれぞれ1.1×10^3t、2.7×10tと算出された。(3)代かき期における河川への栄養塩の流出はリンは大きいが窒素は少なかった。(4)懸濁物質の有機物組成が、河川や季節により変動することを明らかにした。青森県内を流れる高瀬川水系における懸濁物質の有機物組成と起源を調べるため、高瀬川水系に含まれる河川から12地点を選び、平成21年4月から平成22年3月にかけて月に1度水試料を採取し、懸濁物質濃度、溶存有機炭素濃度、全窒素濃度、溶存窒素濃度、全リン濃度、溶存態全リン濃度、および各種無機イオン濃度の測定を行った。また、懸濁物質の有機物組成分析に用いる懸濁物質試料を1年間にわたり収集した。さらに、各採水地点上流の流域の土地利用状況を国土地理院発行の1/25000の地形図を用いて求めた。DTN濃度には季節的なサイクルが見られ、非灌漑期間中に高い傾向を示したが、負荷量で見ると降雨の影響があった採水日を除き大きな変化は見られなかった。流域内の水田面積率は6-45%、畑地面積率は0.4-25%、住宅地面積率は0.5-23%を占め、各土地利用とDTN比負荷量との関係を多重回帰分析より調べたところ、灌漑期においては住宅地・水田・畑地の寄与が高かった。特に、水田からの比負荷量は、畑地の約1.5倍、住宅地の約2倍と高い値を示した。一方、非灌漑期では、これら3種の土地利用以外に大きな排出源があることが推察された。懸濁物質の栄養塩類の挙動に対する寄与は、窒素で約2割、リンで約4割であった。湖沼のような閉鎖性水域では、一度水質が悪化するとその改善は容易ではないため、河川から流入する汚濁物質の質や量およびその起源を把握することは、水質保全にとって重要である。平成21年度の研究より、高瀬川水系における栄養塩類の動態に関する基礎的知見を得ることができた。さらに、懸濁物質の起源に関する研究に用いられる懸濁物質試料の収集され、平成22年度の研究のための準備が整った。青森県内を流れる高瀬川水系における栄養塩類の流出特性と,懸濁物質の有機物組成と起源を調べるため、高瀬川水系に含まれる河川から12地点を選び、平成21年4月から平成23年3月にかけて毎月採水を行った。採水地点において流量を測定すると共に、試料中の全窒素、溶存態全窒素、全リン、溶存態全リン,溶存有機物炭素の各濃度をそれぞれ測定した。また、懸濁物質の有機物組成分析に用いる懸濁物質試料を平成21年度より継続して1年間にわたり収集するとともに,前年度に収集した懸濁物質中の腐植をアルカリ溶液で抽出し,その質を三次元蛍光スペクトルを用いて測定した。各河川における窒素やリンの負荷量には季節的な傾向は見られなかったが、各河川において流量とそれぞれの負荷量には相関がみられ,L-Q式(L=a・Q^n【L=負荷量(g/s)、Q=流量(m^3/s)、a,n=係数】)を用いて回帰された。本モデルを用いて、平成20年における主要流入河川からの小川原湖への全窒素および全リンの総負荷量を計算したところ,それぞれ867t,17.7tと算出された。さらに、全窒素について,各河川のL-Q式で算出された係数を目的変数に,各流域の土地利用状況や河川の流域特性を説明変数にして多重回帰分析を行った結果、係数aについては水田、畑地、住宅地、森林の各面積率および家畜排泄物の窒素比負荷量を、nについてはそれぞれの面積率と家畜比負荷量の2乗と主流路長を説明変数として回帰方程式の重相関係数(R)が、aは0.998、nは0.989でa,nがそれぞれ決定した。得られた結果は,高瀬川流域における土地利用の変化が河川への栄養塩類の流出に与える影響を予測するうえで役に立つと期待される。また,懸濁物質に含まれる有機物の蛍光組成には,季節的および地理的な変動がみられ,組成の変化より懸濁物質の起源を推察できる可能性が示唆された。高瀬川流域から流出する栄養塩類の量および流出特性を調べるとともに、懸濁物質の起源を把握するために、懸濁態有機物の組成に着目し、その季節的および地理的変動を調べた。

青森県内を流れる高瀬川水系の主な支流の計12点から毎月採水を行い、全窒素、溶存態全窒素、全リン、溶存態全リンの各濃度と流量を測定するとともに、濾紙上に捕集した懸濁物質から有機物をアルカリ抽出し、紫外可視スペクトルと三次元蛍光スペクトル(EEM)を測定し、PARAFACモデルを用いた統計解析を行うことによりその組成(起源)を調べた。主要流入河川から小川原湖に流出する負荷量は、年間あたり窒素1.0×10<sup>3</sup>t、リン1.8×10tと推計された。各河川の負荷量(L)は流量(Q)を説明変数として、L=aQ<sup>n</sup>(a,nは係数)の式で回帰された。流出特性を示すa,nの変動要因を、a,nを目的変数、土地利用や流域特性を説明変数として重回帰分析を行ったところ、調査河川のTN,TP流出に関するLQ式の係数a,nの変動要因が流域特性により説明されるとともに,それらは流出過程の違いを反映してTNとTPで異なっていた。また、窒素はそのほとんどが溶存態で流出していたのに対し、リンは、約50%が懸濁態であることが明らかとなった。懸濁物質から抽出された有機物には7種の蛍光成分が確認され、それらの蛍光成分組成には、地理的および季節的な変動がみられた。得られた結果は、小川原湖流域における栄養塩の循環の解明、および、流域からの栄養塩の流出プロセスの解明に貢献するものと期待される。
タイ北部・ピン川流域の水・気候・経済・生活環境調査-環境政策提言と環境教育の展開

ピン川の源流から下流,クワン川,チェンマイ市内を流れピン川に流入するメカー運河の水質調査を行った。ピン川は,源流部では極めて良好な水質であるが,中流部への土砂流入,下流部への都市排水により著しく水質は悪化する。特に,汚濁の著しいメカー運河からの栄養塩類,有機物質,イオン成分の負荷が極めて大きい。クワンダムの下流域における農業用水利用の効率化をめざした工夫の調査を北部工業団地との水利用の競合に絡めて行った。ランプーン市におけるクワン川の水質改善運動(主に,生活排水,工業団地からの排水問題も絡む)の進展調査を市役所及びコミュニティを対象に行った。また,ランプーン市は,タイ政府が重点的にローカルアジェンダ21作成について補助金を供与しながら促してきた地城であることから,その担当である環境質促進局でランプーン市の環境改善事業及び業績の相対的な位置づけについて聞き取り調査を行った。生活文化との関連からは,プラソムやプララーをつくっている家や工場を訪れ,その分布と河川との関連を調べた。チェンマイにおけるエコツーリズムのあり方について,現地の専門家ともに共同調査研究を行った。日本に招聘した研究協力者からチェンマイの水環境・環境教育について報告を受け,ピン川流域の水環境について理解を深めた。3年間の調査研究で得た成果を中心に,チェンマイで開催された国際シンポジウム「2003International Symposium on Environmental Management : Policy, Research, and Education」で報告した。得られた調査結果から教員や住民の環境意識は高まりつつあり,学校を中心として環境学習の実践プログラムの作成に向けて研究を続けていくことの重要性が現地の研究者・教育者と確認できた。さらに本調査研究を深めていきたい。本年度は、研究の初年度であり、タイにおける研究協力者との全体計画の確認、研究計画に関する議論、基礎的野外調査、資料収集を中心に活動を行った。その結果、対象としているタイ北部のピン川およびその集水域において多くの環境関連資料およびピン川流域の気象・水理・水文・水質などの観測データを得た。ピン川における水温の連続測定を開始するとともに、現地において水質調査を行った。特に、ピン川支流(Mae Khar)からの汚濁物質の負荷が大きいことが分かった。生活との関連から、市場を回り、魚発酵食品と米麺を中心に調査した。タイ北部・東北部は稲作と漁業を基盤とする食生活で、河川水、湖水、雨など水資源と密接に関連していることがわかった。ランプーン工業団地当局および進出日本企業を訪問し廃水処理に関する調査、タイ北部およびバンコクで活動中の日本およびタイの環境NGOからの聴き取り調査を行った。さらに、チェンマイ市内の小学校、中等学校の環境教育施設の訪問および授業を参観し、授業記録をとった。購入した小学校と中等学校の「歴史」「地理」「社会」「仏教」等の教科書およびエコツアーに関する資料について、タイ語から日本語への翻訳を依頼し、内容を検討した。本年度得ることができた資料は、来年度以降の調査研究に大いに役立つと思われる。また、日本に招聘した研究協力者からタイ北部の環境・生活などについての講義を受けるとともに、ピン川流域におけるデータを得た。そして、来年度の計画について、詳細なうち合わせをすることができた。本年度は、研究の2年目であり、昨年度の研究計画に関する議論、基礎的野外調査、資料収集を基にして次の調査研究を行った。ピン川(Mae Ping)の源流から下流、クワン川(Mae Kuang)ダム湖およびクワン川、チェンマイ市内を流れピン川に流入するメカー(Mae Khar)運河の水質調査を行った。ピン川は、源流部では極めて良好な水質であるが、中流部への土砂流入、下流部への都市排水により著しく水質は悪化する。

特に、汚濁の著しいメカー運河からの栄養塩類、有機物質、イオン成分の負荷が極めて大きい。工業団地上流のクワン川ダム、下流で工業団地からの処理水が流入するクワン川の水質調査を行うと共に、ダム湖の管理事務所および下流のランプーン市を訪れ、クワン川流域の利水状況やその改善への取り組み、さらに工業団地建設後のクワン川の変貌や環境改善への取り組みについて、管理者、地方自治体、住民代表から聞き取り調査を行った。生活文化との関連からは、タイ北部・東北部では河川の水が米、魚を育み、基幹食料を供給していることや、プラソム、プララーは河川の恵みともいえる発酵食品でタイの食生活には欠かせない食品であることが分かった。プラソムやプララーをつくっている家や工場を訪れ、その分布と河川との関連を調べた。大都市や工業団地を通過した河川の水質は悪化しつつあり、食材の汚染へと直結する危険性をはらんでいることがわかった。さらに、チェンマイ市内の小学校、中等学校の授業を参観し、環境教育の授業記録をとるとともに、いくつかの教科書についてタイ語から日本語への翻訳を依頼し、内容を検討した。また、日本に招聘した研究協力者からチェンマイの水環境・食生活・環境教育について報告を受け、ピン川流域の水環境・生活文化について理解を深めた。来年度は夏に調査を継続し、チェンマイで開催される国際シンポジウムで成果を発表する予定である。本年度は,最終年度であり,得た成果のまとめに関する議論を行いつつ,基礎的野外調査,資料収集を継続して行った。昨年に引き続き,ピン川の源流から下流,クワン川,チェンマイ市内を流れピン川に流入するメカー運河の水質調査を行った。ピン川は,源流部では極めて良好な水質であるが,中流部への土砂流入,下流部への都市排水により著しく水質は悪化する。特に,汚濁の著しいメカー運河からの栄養塩類,有機物質,イオン成分の負荷が極めて大きい。クワンダムの下流域における農業用水利用の効率化をめざした工夫の調査を北部工業団地との水利用の競合に絡めて行った。ランプーン市におけるクワン川の水質改善運動(主に,生活排水,工業団地からの排水問題も絡む)の進展調査を市役所及びコミュニティを対象に行った。また,ランプーン市は,タイ政府が重点的にローカルアジェンダ21作成について補助金を供与しながら促してきた地域であることから,その担当である環境質促進局でランプーン市の環境改善事業及び業績の相対的な位置づけについて聞き取り調査を行った。生活文化との関連からは,プラソムやプララーをつくっている家や工場を訪れ,その分布と河川との関連を調べた。チェンマイにおけるエコツーリズムのあり方について,現地の専門家ともに共同調査研究を行った。日本に招聘した研究協力者からチェンマイの水環境・環境教育について報告を受け,ピン川流域の水環境について理解を深めた。さらに,カンボジアに赴き,環境教育の担当者と東南アジアにおける有効な環境教育の進め方について協議した。
低異型度腫瘍から発生する胃癌における、悪性化ドライバー変異の同定と層別化への応用

胃の異形成(dysplasia)/上皮内腫瘍(intraepithelial neoplasia)については、比較対照とした(:悪性counterpartとしての)胃の分化型粘膜内癌を含めると、40例以上となるコホートのシークエンス解析が完了し、論文を発表することができた。その中で、悪性度の決定に重要な役割を果たす体細胞変異(APC, TP53)が高頻度に且つほぼ相互排他的に起こっていることを解明し、一定の成果が得られた。Multi-regionシークエンスに適した症例数の確保には難渋したが、進行胃癌において特定のドライバー変異と共存する変異のデータベースを参照することで、候補となる変異蓄積過程を挙げることができた。これをもとに、低異型度腫瘍からの進展に関わる可能性の高い遺伝子変異との照合も今後進めていく。胃の低異型度腫瘍に幾つかあるentityのうち追求する価値の高いものを2018年度で絞り込むことができた。それを受け、2019年度(最終年度)は絞り込んだentityの症例数を増やし、ターゲットDNAシークエンスを柱としたゲノム病理学的解析を進める予定である。また、低異型度腫瘍に特徴的なドライバー変異であるAPC体細胞変異の代替マーカー(免疫染色)の確立も今後目指していく。2018年度までで解明しえた内容については学会等での意見交換も行い、臨床的に意義のある研究の広げ方を見極める。2018年度でシークエンスしえた対象症例が当初の計画よりも減少したため,シークエンス関連試薬の費用が少なく計上された.2019年度の予算にはシークエンス関連試薬を含めていなかったため,今回生じた差額については,2019年度のシークエンス関連試薬代として,もしくは代替マーカー探索及び検証の費用に充てる予定である.
免疫担当細胞における脂質ラフトの役割

ガングリオシドは血流からのリンパ球の浸潤や上皮細胞接着の阻害など炎症部位での役割が知られている。今年度は、これまで得られてきたGM3KOマウス由来の腹腔および骨髄由来マクロファージでのGM3の炎症抑制作用を確認するため、マウスマクロファージ細胞株であるRaw 264.7細胞でのLPS誘導炎症反応におけるガングリオシドGM3の作用を検討した。Raw 264.7での遺伝子編集におけるエクソン2および3でのGM3KO細胞株の作製を試みたが現在までクローンが得られていない。GM3は、LPS刺激Raw264.7細胞におけるcycloexyenase-2(Cox2)およびiNosのmRNA発現および蛋白発現とNO産生を抑制した。さらにGM3添加により、IL-1β、IL-6およびTNF-αなどの前炎症性サイトカインのmRNAおよび蛋白発現も抑制した。これら抑制は、MAPKでのシグナル伝達経路ではERK, p38, JNKのうちERKだけに抑制が見られた。またNFκBを介したLPS刺激シグナル伝達経路では、GM3はNFκBのp65(RelA)の核内移行に対する有意な抑制が見られた。また、LPS刺激およびGM3添加の有無により細胞内TLR4発現量に差異は見られなかったが、LPS刺激により増加したRaw264.7細胞膜上でのTLR-4発現量はGM3添加により抑制された。以上の結果から、GM3はNKκBおよびERKを介したシグナル伝達経路の抑制による一酸化窒素やCox-2のmRNAおよび蛋白発現を抑制することを見出した。その抑制は、シグナル伝達経路の抑制だけではなく、細胞膜上の受容体の発現抑制にも及ぶことを確認した。これらのことから、有効な抗炎症剤として有用である可能性を示唆した。ガングリオシドは細胞膜外層にするシアル酸含有スフィンゴ糖脂質であり、細胞の分化・増殖や接着の調節・制御に関わる分子である。T細胞では活性化での関与が知られており、CD4とCD8陽性T細胞ではその作用が異なることが明らかとなっているが、その他の免疫担当細胞についてその関与は明らかでない。ガングリオシド生合成はGM3合成酵素(SAT-I)によってラクトシルセラミド(LacCer)にシアル酸が転移され、GM3が合成されることによって開始される。このGM3はLipid raftと呼ばれる微小領域を形成し、そこに成長因子受容体やシグナル伝達分子、接着分子などの様々な分子を発現して、その機能を調節している。平成28年度はGM3合成酵素ノックアウト(GM3SKO)マウスから分離した腹腔および骨髄由来マクロファージの機能解析を行った。野生型およびGM3SKOマウスの腹腔マクロファージ数には有意な差は見られなかった。In vitroでの骨髄細胞からのGM-CSFおよびM-CSFによるマクロファージへの分化誘導は野生型に比べGM3SKOマウスは有意に遅れが認められた。しかしながら、腹腔および骨髄由来マクロファージの主要な表面マーカー分子発現には有意な差は認められなかった。免疫グログリン標識ビーズの貪食率および大腸菌殺菌率は野生型に比べGM3SKOマウスでは有意に抑制されていた。腹腔および骨髄由来マクロファージをリポ多糖(LPS)刺激し、炎症性サイトカイン誘導について解析を行った。腹腔および骨髄由来マクロファージ共に、代表的な炎症性サイトカインのmRNA発現は野生型に比べGM3SKOマウスでは誘導が有意に抑制された。炎症性サイトカインのタンパク産生もmRNA発現同様、野生型に比べGM3SKOマウス由来マクロファージでは有意な抑制が認められた。ガングリオシド系列のスフィンゴ糖脂質合成酵素の遺伝子欠損マウスからの腹腔マクロファージおよび骨髄からM-CSFあるいはGM-CSF誘導による骨髄培養マクロファージを用いて、貪食・殺菌作用やPAMPs刺激によるマクロファージ活性化における機能発現について検討しているが、スフィンゴ糖脂質合成酵素の遺伝子欠損マウスの供給が追い付かず、実験に必要なマクロファージの細胞数が確保できていないため、計画よりもやや進捗だ遅れている。そのため、現在マクロファージの細胞株であるRaw264.7での遺伝子編集を用いたスフィンゴ糖脂質合成酵素の遺伝子欠損クローンのクローニングを試みている。細胞培養株でのスフィンゴ糖脂質合成酵素の遺伝子欠損株が確立すれば、初代培養株と同様の実験がより速やかに進むものと考えている。平成29年度は、平成28年度に行った結果と一部相反する結果を得たので、追加の検証実験を実施した。野生型マクロファージ(WT Mφ)およびGM3合成酵素ノックアウトマウスマクロファージ(GM3KOMφ)の増殖や主要な表面マーカー分子発現には前年度同様に差異が認められなかった。しかしながら、免疫グログリン標識ビーズの貪食率および大腸菌殺菌率は、WT Mφに比べGM3KOMφでは有意に亢進されていた。さらに、一酸化窒素(NO)およびスーパーオキサイド産生においてもWT Mφに比べGM3KOMφでは有意な増加が認められた。同様に、リポ多糖(LPS)刺激における前炎症性サイトカイン誘導(TNF-α、IL-6、およびIL-1β)でも、mRNA発現は野生型に比べGM3KOマウス腹腔マクロファージでは有意な増加が認められた。同様に、これら前炎症性サイトカインのタンパク産生も、WT Mφに比べGM3KOMφでは有意な増加が認められた。上記のGM3KOMφで見られた前炎症性サイトカイン

産生増加の細胞内メカニズムの解析を目的として、細胞内シグナル関連分子の動態を検討したところ、LPS刺激GM3KOMφでは、NFκーB経路のRelAおよびIκBの発現解析からWT Mφに比べシグナル伝達分子の活性亢進が認められた。さらに、ERK、JNK、およびp38のリン酸化の発現レベルでも同様に、LPS刺激後のWT Mφに比べGM3KOMφでは発現レベルが増加したことから、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路の活性化もGMの欠損によって強く誘導されることが確認された。平成29年度は、GM3がサイトカイン産生およびその産生に関与するシグナル伝達経路を抑制していることが明らかとなった。ガングリオシド系列のスフィンゴ糖脂質合成酵素の遺伝子欠損マウスの競合実験が多く行われているため、実験に必要なマウスの供給が不足しているため、計画よりもやや進捗が遅れている。さらに、平成28年度に実施したサイトカイン実験の追加実験を行い、前回と異なる結果がでたため、その確認実験に時間と要したが、それについては確認が取れた。細胞供給の安定化のため、マクロファージの細胞株であるRaw264.7での遺伝子編集を用いたGM3合成酵素欠損株のクローニングを実施しているが、現在までクローンが得られていないことも進捗の遅れている原因となっている。現在、プロモーターを変えてのクローニング選択を実行中である。ガングリオシドは血流からのリンパ球の浸潤や上皮細胞接着の阻害など炎症部位での役割が知られている。今年度は、これまで得られてきたGM3KOマウス由来の腹腔および骨髄由来マクロファージでのGM3の炎症抑制作用を確認するため、マウスマクロファージ細胞株であるRaw 264.7細胞でのLPS誘導炎症反応におけるガングリオシドGM3の作用を検討した。Raw 264.7での遺伝子編集におけるエクソン2および3でのGM3KO細胞株の作製を試みたが現在までクローンが得られていない。GM3は、LPS刺激Raw264.7細胞におけるcycloexyenase-2(Cox2)およびiNosのmRNA発現および蛋白発現とNO産生を抑制した。さらにGM3添加により、IL-1β、IL-6およびTNF-αなどの前炎症性サイトカインのmRNAおよび蛋白発現も抑制した。これら抑制は、MAPKでのシグナル伝達経路ではERK, p38, JNKのうちERKだけに抑制が見られた。またNFκBを介したLPS刺激シグナル伝達経路では、GM3はNFκBのp65(RelA)の核内移行に対する有意な抑制が見られた。また、LPS刺激およびGM3添加の有無により細胞内TLR4発現量に差異は見られなかったが、LPS刺激により増加したRaw264.7細胞膜上でのTLR-4発現量はGM3添加により抑制された。以上の結果から、GM3はNKκBおよびERKを介したシグナル伝達経路の抑制による一酸化窒素やCox-2のmRNAおよび蛋白発現を抑制することを見出した。その抑制は、シグナル伝達経路の抑制だけではなく、細胞膜上の受容体の発現抑制にも及ぶことを確認した。これらのことから、有効な抗炎症剤として有用である可能性を示唆した。
T細胞の表皮へのホーミングの分子機構

表皮にホーミングするT細胞については主にマウスを用いて研究され、専らV_γ5^+胎仔胸腺細胞のみがその能力を有しているとみなされてきた。しかし我々は骨髄細胞や胸腺細胞(adult)も表皮に遊走することを示した。但し、通常のV_γ5^+dendritic epdermal cell(dEC)と異りTCR-αβ^+,CD8^+であった。このような表皮へのホーミングにTCRが関与していることを明らかにするためRT-PCR法を用いて表皮に遊走してくる骨髄、胸腺由来dECのTCRレパートリーを決定しようと試みたが成功しなかった。そこでこれにかわる手段として、皮膚疾患の病変部表皮に存在するT細胞に注目し、これを解析することとした。固定薬疹は薬剤摂取の度に一定の部位の表皮に傷害を認めるが、この傷害に病変部表皮に長期間残存するT細胞の関与が推察されている。そこでこの表皮T細胞の機能、TCRレパートリー、細胞接着分子について検討した。これらの細胞の反応性は何らかの自己抗学に向けられており、TCRそ斤する刺激によりケラチノサイトを傷害することがわかった。RT-PCR法を用いてTCR V_α-V_β遺伝子レパートリーを検討したところ、表皮T細胞はPBLと比べ著明な偏りが認められた。しかも薬疹歴の長い症例程、この偏りが著明で、炎症をくり返すうちに次第にレパートリーが限局化されていく可能性が示唆された。このことは少くとも固定薬疹病変部に認められるT細胞が表皮に最初に遊走する過程にはTCR V_αV_β特異性はあまり関係なく、むしろその場(表皮)においてあるT細胞が選択的に増殖する結果、レパートリーの偏りとして認められるようになると考えられた。これらの表皮T細胞はいずれもLFA-1,CLA(cutaneous lymphocyte antigen)を強く発現しており、TCR特異性よりこれらの細胞接着分子の強い発現がT細胞の表皮へのホーミングに重要と思われた。我々はこれまでの実験において種々のタイプの表皮内T細胞を樹立してきた。CD4^+自己反応性T細胞クローンを同系マウス足蹠へ移入することによりそれらは表皮を攻撃しGvH病様病変をおこすが、その病変は速やかに回復し以後その部分の表皮は同様の自己反応性T細胞による攻撃に対して抵抗性となる。その抵抗性となった表皮には表皮内T細胞が30倍以上に増加しており、この細胞が表皮抵抗性に関与していると考えられた。この細胞が表皮構築破壊後の表皮に集積する機序を明らかにするためにこの細胞をin vitroでIL-2とともに培養することによりexpandし、その表面形質、機能、細胞接着分子の発現などの検討を行った。表面形質はCD3^+、TCR-αβ^+、CD8^+でありLFA-1、LFA-3などの発現を認めた。NK様の細胞傷害活性は示さなかったが、抗CD3抗体やレクチンの存在下で様々な腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示した。しかしfreshにisolateした表皮内T細胞は、抗CD3抗体の存在下ですら細胞傷害活性は示さなかった。この細胞が表皮細胞のどのような抗原を認識しているかを明らかにするために種々の表皮細胞、HSPなどを用いてproliferation assayを行ったが、どの抗原刺激に対しても有意の増殖活性を示さず、現在この細胞が認識する抗原については不明である。そこでこの細胞がどのようなTCRを用いているかを明らかにするためfreshにisolateされた表皮内T細胞を用いて種々のモノクローナル抗体により検討した。

用いた抗体は限られたものであったがある程度heterogeneityが認められた。現在このT細胞からRNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを合成しPCR法によりこれらを増幅しTCRusageの検討を行っているところである。表皮に親和性をもち、resident cellとして存在するT細胞が表皮にホーミングする機序を明らかにするため、マウス表皮に浸潤してくるTCR-のbeta^+T細胞がどのようなTcell receptor(TCR)Valpha,Vbeta遺伝子を用いているかをRT-PCR法を用いて検討した。しかしヒトの場合と異なりマウスのValphaVbeta遺伝子レパートリーをRT-PCR法を用いて検討することは、世界の多くの研究室でも成功しておらず残念ながら我々の試みも成功しなかった。そこでそれにかわる方法としてヒトの固定薬疹病変部に皮疹消退後も長期間残存するT細胞に注目し、これらの細胞のTCR Valpha-Vbeta遺伝子レパートリーをRT-PCR法を用いて検討することとした。その結果、これらの細胞はきわめて限られたValpha-Vbeta遺伝子を用いていることがわかった。とくにVbetaよりValpha遺伝子に関して偏りが顕著であり、また薬疹をくり返した病変部より採取されたT細胞程、著明な偏りが認められた。このことはT細胞が病変部表皮に遊走するにあたってValphaVbeta特異性は必ずしも重要ではなく、病変部表皮においてくり返される抗原刺激によりクローンの増殖がおこるため、TCR Valpha・Vbeta遺伝子レパートリーの著明な偏りとして認められると考えられた。この結果については現在投稿中である。これらの表皮T細胞は、他のT細胞と比べLFA-1や、E-セレクチンのリガンドであるCLA Ccutaneouslymphocyte antiger)を強く発現しており、これらの接着分子の発現がT細胞の表皮へのホーミングにあたって重要な役割を果していると考えられた。現在、E-カドヘリンの発現についてもmRNA、蛋白レベルにて検討中である。
国民健康・栄養調査における非協力者バイアス修正のための統計手法の開発と応用

国民健康・栄養調査の協力率は長期的に低下傾向にあり、国民全体の特徴を適切に反映した統計データが得られていない可能性があることから、非協力者バイアスとその修正方法について検討した。その結果、世帯属性等により世帯別の協力状況に差があるとともに、人口当たり協力率は低下傾向で、性・調査票別に差があることが示された。また、喫煙率の非協力者バイアスは限定的である可能性が示された。さらに、多重代入法を用いて、喫煙状況別の上半身肥満率の非協力者バイアスを修正できる可能性が示された。以上の結果を参考に、少なくとも現状の協力率を維持し、統計手法の活用により非協力者バイアスを最小限に止める方策を検討する必要がある。日本では高齢化が進展し、がんや循環器疾患、糖尿病といった生活習慣病による死亡や後遺症が今後も増大することが予想される。このような疾病が社会にもたらす負担を軽減するためには、国民の健康的な生活を促進し、効果的な介入手段を用いて疾病の予防・治療を行うことが必須である。厚生労働省により毎年実施される国民健康・栄養調査(平成14年まで国民栄養調査)は、生活習慣病の予防と治療に関連する豊富なデータを収集する重要な保健統計調査である。しかし、国民健康・栄養調査(国民栄養調査)の協力率は年々低下傾向にあり、その結果、調査協力者の集団には偏りが生じ、国民全体の特徴を適切に反映したデータが得られていない可能性があることが懸念されている。そこで本研究では、国民健康・栄養調査(国民栄養調査)における協力者集団の特徴を把握した上で、国民の健康行動をはじめとする生活習慣病の要因と管理状況に関するより正確な保健統計情報を作成し提供することを目的とした。平成27年度の研究においては、まず国民健康・栄養調査(国民栄養調査)における地域ならびに世帯、個人の協力に関する背景と問題点について研究班全体で議論し、研究枠組とアプローチ方法に関する確認を行った。次に、統計法第33条に基づき、国民健康・栄養調査(国民栄養調査)と国民生活基礎調査を含む保健統計調査の調査票情報の提供を厚生労働省に申請し入手した個人レベルのデータを、統計ソフトウェアを用いて読み込んだ。昭和63年平成25年国民生活基礎調査・世帯票とのレコード・リンケージを行い、国民健康・栄養調査(国民栄養調査)における協力者と非協力者を同定し、世帯と個人の協力率の年次推移を把握した(標本抽出方法が異なる平成24年調査を除く)。協力者集団と非協力者集団の間の特徴の差に関する基礎分析と、非協力者バイアス修正のための統計手法に関する文献レビューを開始した。データの利用申請ならびに読み込み、レコード・リンケージに必要な時間を考慮して、妥当な進捗状況である。国民健康・栄養調査(国民栄養調査)における協力者と非協力者を同定し、協力率の年次推移を把握したことから、初年度の進捗としては十分であると考えられる。国民健康・栄養調査(以下、栄養調査)において国民の特徴を適切に反映した推定値が得られていない可能性があることから、海外研究機関と協力してバイアスを調整したNCD因子分布推定を進めるとともに、非協力世帯の特徴を検討した。平成22、25年栄養調査の個人データを、親標本である同年の国民生活基礎調査(以下、基礎調査)・世帯票と連結した。栄養調査の抽出単位区における基礎調査協力世帯を、栄養調査での協力状況により世帯員の全員または一部が協力した世帯(協力世帯)と、世帯員全員が協力しなかった世帯(非協力世帯)に分類した。それを被説明変数とする多重ロジスティック回帰分析を行い、世帯の特徴を示す説明変数のオッズ比を求めた。その結果、非協力のオッズ比が有意に1より大きかったのは、大都市や人口15万人以上の都市(基準値:郡部、以下の括弧内同様)、民間賃貸住宅(持ち家)、共同住宅(一戸建て)、部屋数が3室以下(7室以上)、世帯分類が単独、夫婦のみ、夫婦と未婚の子のみ、ひとり親と未婚の子のみ(三世代世帯)、65歳以上のみの世帯に非該当(該当)、世帯主の年齢が60歳未満(60歳代)、世帯主の最終学歴が中学校以下(大学・大学院卒)であった。このように、近年の栄養調査において、世帯構成や居住地、世帯主の属性などによる世帯協力状況の差が認められた。ただし、本分析の限界として、基礎調査の親標本である国勢調査のデータとの連結が不可能であり、協力率が約80%である基礎調査の時点で協力しなかった世帯が分析に含まれておらず、真の世帯分布を反映できていない可能性があることに留意する必要がある。今後の研究では、主要な健康データにおける非協力者バイアスの有無について検討し、その結果によって特定集団の抽出数の拡大や、協力率を考慮した乗数等による非協力者バイアス調整のための統計手法の開発について検討する予定である。非協力者に関する基礎分析を完了し、その研究成果を学会で発表した(優秀演題賞受賞)。海外の研究機関と協力し、バイアスを調整したNCD因子分布推定に関する論文5本をインパクトの高い国際英文学術雑誌に発表した。最終年度の研究では、主に健康指標における非協力者バイアスの有無と修正方法ならびにシステム・ダイナミックスによる協力率のシミュレーション、レコード・リンケージ手法の改善に関する検討を行った。また、海外の研究者からの協力を得て、データの制約を考慮した統計解析手法を用いて、非感染性疾患要因等を含む健康指標の長期推移と分布に関する検討を行った。

国民生活基礎調査(以下、基礎調査)の健康票と国民健康・栄養調査(以下、栄養調査)の双方の調査項目である喫煙状況を活用し、栄養調査における喫煙率の非協力者バイアスについて検討した。平成25年基礎調査の協力者のうち同年の栄養調査で抽出された者を、協力群と非協力群に分類して解析を行った結果、協力群から得られた喫煙率におけるバイアスは限定的である可能性を示した。非協力者バイアスを修正するための統計手法として、多重代入法による身体測定値の変化について検討した。平成16,19,22,25年基礎調査と栄養調査のデータを用いて、非協力群のBMIと腹囲を欠損値と見なして多重代入法で補完して解析を行った。その結果、協力群における上半身肥満率の非協力者バイアスを修正できる可能性を示した。栄養調査の標本は、国勢調査から基礎調査を通して二段階で抽出されているが、データ利用の制約により国勢調査とのリンケージが不可能である。人口当たりの協力率を算出するため、システム・ダイナミックスの手法を用いてシミュレーションを行った。その結果、栄養調査の人口当たり協力率は低下傾向にあり、性・調査票別に差があることを明らかにした。さらに、海外の研究者からの協力を得て、システム・ダイナミックスの手法を用いて昭和50年平成27年の成人BMIからエネルギーバランスを推定した。その結果、性・BMI階級によって推移が異なる可能性を示した。国民健康・栄養調査の協力率は長期的に低下傾向にあり、国民全体の特徴を適切に反映した統計データが得られていない可能性があることから、非協力者バイアスとその修正方法について検討した。その結果、世帯属性等により世帯別の協力状況に差があるとともに、人口当たり協力率は低下傾向で、性・調査票別に差があることが示された。また、喫煙率の非協力者バイアスは限定的である可能性が示された。さらに、多重代入法を用いて、喫煙状況別の上半身肥満率の非協力者バイアスを修正できる可能性が示された。以上の結果を参考に、少なくとも現状の協力率を維持し、統計手法の活用により非協力者バイアスを最小限に止める方策を検討する必要がある。国民健康・栄養調査(国民栄養調査)における非協力者バイアスの有無と修正に関する統計分析手法の構築を進める。さらに、国民健康・栄養調査(国民栄養調査)に関連する他の保健統計調査についても同様の分析を行い、より正しい保健統計情報の作成を試みる。進捗状況と分析結果の展開に応じて、先行研究のレビュー、各種セミナー等への出席、研究者との交流などを通して追加的な情報を収集し、研究に反映させる。分析結果の学会発表ならびに研究者との意見交換、学術雑誌への投稿論文の準備に着手する。健康指標における非協力者バイアスの有無に関する統計分析を完了し、その結果に応じてバイアスを調整するための統計手法を検討する。国民の平均値と分布を推定し、標本を異にするその他の大規模保健統計調査から得られる値と比較することにより、統計方法の妥当性を検討する。さらに、各指標の年次推移を示して従来のデータと比較しながら、国民の健康と健康政策の効果について議論する。
新規蛋白質濃度感受性蛍光蛋白質を用いた分化と蛋白質濃度の関係の解明

1蛋白質混雑と未分化維持、分化の関係の解明はじめに、GimRETを定常発現するES細胞の確立を試みた。作製にはレンチウイルスを用いることにした。しかし、GimRETを定常発現するES細胞は、培養開始後2週間でGimRETを発現しなくなった。これは、ES細胞では、遺伝子のサイレンシングが起こりやすいためであると考えられる。そのため、GimRETを一過性発現したES細胞をサンプルとして用いることにした。蛋白質混雑ごとにES細胞を分け、遺伝子発現を調べた。フローサイトメーターを用いて、蛋白質混雑が高い、低いで分けたES細胞の遺伝子発現を、RT-PCRを用いて調べた。結果、GimRETの蛍光強度比の高い細胞、低い細胞の間に、未分化維持に関係する遺伝子発現の差は見られなかった。2分化によるクロマチン構造の変化の検出インキュベータ付き二光子顕微鏡は、理化学研究所生命システム研究センター先端バイオイメージング研究チームにおいて、オリンパスとの共同開発により開発されたものを用いることにした。インキュベータ付き2光子顕微鏡を用いることで、GimRETを発現させたES細胞を96時間以上観察することに成功した。GimRETーH2Bを定常発現するES細胞の作製を試みたが、上記理由で、一過性発現を用いることにした。GimRET-H2Bが機能することを確認するために、一過性発現用のプラスミドを構築した。そちらをES細胞に遺伝子導入してみると、核内に局在しなかった。昨年度は、ES細胞を用いた実験以外の基盤となる技術の構築に従事し、予想通り、あるいはそれ以上の進展があった。一方で、ES細胞という、一般的に生物学の実験で用いられている細胞と異なる性質の細胞を扱うのに苦労した。例えば、1蛋白質混雑と未分化維持、分化の関係の解明の実験系において、定常発現株で簡単にサイレンシングが起きてしまうことや、また、2分化によるクロマチン構造の変化の検出の実験系において、GimRET-H2Bは、HeLa細胞では核に局在するが、ES細胞では局在しないことなどがあげられる。さらに加えて、フローサイトメーターを用いて分離したES細胞は、ほぼすべて死滅しており、さらなる条件検討が必要であると考えている。しかし、定常発現でなく一過性発現を用いて実験系を組みなおしたり、他のクロマチン蛋白質と組み合わせたGimRETを構築したりなど、申請した実験系を順次組み直し、問題点に関しては解決案をきちんと考え、本来の予定と同程度に進展できていると考えている。1蛋白質混雑と未分化維持、分化の関係の解明昨年度の結果では、GimRETの蛍光強度比の高い細胞、低い細胞の間に、未分化維持に関係する遺伝子発現の差は見られなかった。GimRETの蛍光強度比が高いか低いかで分けただけだったため、明確な違いがなかったのではないかと考えている。なので、蛍光強度比によって35段階に分けて、同様の実験を行う予定である。2分化によるクロマチン構造の変化の検出HeLa細胞において発現させたGimRET-H2Bを観察したところ、核内のGimRETの蛍光強度比は一定であった。理由としては、H2Bがヌクレオソームに取り込まれていないためではないかと考えられる。また、GimRETーH2BをES細胞で発現させた際には、核内に局在しなかった(図2b)。GimRETを融合したため、H2Bが本来の働きを行えなかったのではないかと考えられる。今後の予定としては、H2B以外のヌクレオソームに取り込まれるような蛋白質、例えば、ヒストンH4などにGimRETを融合し、ES細胞で発現させ、分化誘導を行う予定である。