hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者の音響的特徴抽出に基づく高齢者音声認識インタフェースに関する研究

高齢者音声の認識率改善を目的として、そのために、高齢者音声の音響的な特徴を調査した.まず、聴取実験によって高齢者音声と非高齢者音声の聴感的な違いを調べ、しゃがれ声、不明瞭な声、遅い発声が高齢者の特徴であることを示した.次に、それぞれの特徴に対応する音響的特徴を調べた.その結果、パワースペクトルの高域部の上昇、声帯発声のゆらぎ、音素間の遷移の緩慢さ、発話速度が遅くリズムが不規則であることが高齢者音声の音響的特徴であることがわかった.高齢者音声の認識率改善を目的として、そのために、高齢者音声の音響的な特徴を調査した.まず、聴取実験によって高齢者音声と非高齢者音声の聴感的な違いを調べ、しゃがれ声、不明瞭な声、遅い発声が高齢者の特徴であることを示した.次に、それぞれの特徴に対応する音響的特徴を調べた.その結果、パワースペクトルの高域部の上昇、声帯発声のゆらぎ、音素間の遷移の緩慢さ、発話速度が遅くリズムが不規則であることが高齢者音声の音響的特徴であることがわかった.本研究は、高齢者用の音声認識インタフェースを実現するための要素技術研究であり、高齢者音声の音響的特徴を明らかにすることが目的である。平成19年度は主に以下の項目の研究を行った。(a)高齢者音声データベースの整備高齢者音声の分析には、音声データベースが不可欠であるが、これまで保有したデータは年齢分布の偏りが大きく、特に80歳代のデータが少なかった。平成19年度は年齢層の偏りを緩和すべく、新たに男声21名、女声29名の収録を行った。これによって、50歳代80歳代男声87名、女声79名のデータベースを作成することができた。80歳以上についても、男女各13名分収録した。(b)高齢者音声を特徴付ける表現語の抽出高齢者音声の聴感的特徴が明らかになれば、それに対応する言葉をデータベースから集め、分析することによって、音響的特徴を抽出できる。そのために、高齢者音声と非高齢者音声の聴感的特徴を区別するための表現語を抽出する方法を開発した。数冊の辞書から音声の性質を表現する言葉を抜き出し、その中からアンケートで年齢に関係する言葉を抽出した。次に聴取実験によって、抽出した表現語と各年齢層の話者の音声との相関関係を求めた。そして、クラスタ分析の手法によって類似した概念の表現語をまとめて絞り込み、高齢者および非高齢者それぞれの表現語を求めた。最後に、高齢者および非高齢者を区別するための表現語対として整理した。結果として、男声に対して10対、女声に対して11対の表現語対が得られた。本研究は、高齢者用の音声認識インタフェースを実現するための要素技術研究であり、高齢者音声の音響的特徴を明らかにすることが目的である。平成20年度は主に以下の項目の研究を行った。1.高齢者音声を特徴付ける表現語平成19年度に抽出した高齢者音声の特徴の体系化を行った。大まかに述べると、高齢者音声の特徴は「しゃがれ」「メリハリの無さ」「発声の遅さ」である。2.「しゃがれ声」の音響特徴の検討医学的な知見によると、「しゃがれ声」は原因別に「がらがら声(R)」「息漏れのある声(B)」「弱々しい声(A)」「気張った声(S)」に分類される。試聴によって高齢者音声データを分類した結果、RとBに該当する音声が多いことがわかった。Rに分類されたデータを音響分析した結果、母音などの定常部のスペクトルの周期的な揺らぎが観測された。また、Bに該当するデータは、有声部のスペクトルにおいて4kHz以上のエネルギー値が高いことが観測された。3.「メリハリの無い声」の音響特徴の検討「メリハリの無さ」は、高齢化によって発声器官の動きが緩慢になることが原因である。したがって、音声の時問遷移に特徴が現れると考え、音素境界部における「スペクトル遷移」「パワー遷移」「フォルマント遷移」と聴覚的メリハリ度合いの関係を調べた。その結果、これら全てが、メリハリ度と強い相関があることがわかった。また、メリハリ度とピッチ変化も関係があることが判明した。平成21年度は主に以下の項目の研究を行った。1.高齢者音声の音響的特徴の抽出平成20年度の研究により、高齢者音声の聴覚的特徴は「しゃがれ」「メリハリの無さ」「発声の遅さ」であることがわかった。当年度は、各聴覚的特徴に対応する音響的特徴を抽出した。(1)しゃがれた音声は、周波数スペクトルの4kHz以上の成分が大きい。したがって、全スペクトルパワーに対する4kHz以上のパワーで、しゃがれ度を定量化できる。また、ガラガラ声はスペクトルの時間軸上での微細変動によって生ずる。これは、変動量を表現するSpectrum PQで定量化できる(2)音声は音韻が時間的に結合しているものとみなせるが、調音器官の衰退によって各音韻の発声があいまいになるとメリハリの無い声になる。メリハリ度を表現する音響物理量として隣接音韻間の「スペクトル遷移量」と「スペクトル遷移速度」を提案した。そして、「スペクトル遷移量」はメリハリ度と関係があり、「スペクトル遷移速度」はメリハリ度および年齢と相関があることを示した。

(3) 1秒間に発声するモーラ(音節)数であるmora/secによって、発声速度が表現できる。高齢化と共にmora/secは減少する。そして、各音韻の持続時間のバランスが崩れ、これが「たどたどしい」聴感印象につながる。高齢者はゆっくり発声することによって、メリハリ度を改善している。2.評価システム上記1.で抽出した音響物理量によって高齢者音声を補正し、音素認識評価を行ったところ、高齢者音声の認識率が向上した。また、高齢者音声の補正により、聞きやすさが改善することを確認した。
ゲノム編集技術を基盤とした次世代型トランスジェニック動物作製技術の開発

遺伝子機能の解析法として外来遺伝子の挿入は有効な手段である。両生類においては、メガヌクレアーゼISce-Iや精子核移植法によるトランスジェネシスが主流である。しかしながら、この方法は挿入されるコピー数やゲノム上の位置を指定できない。加えて、位置効果により外来遺伝子がF1以降にサイレンシングを受けるとの報告が多数ある。ヒトのAAVS locusやマウスのRosa26への外来遺伝子導入に相当する、「Safe harbor system」が逆遺伝学的ストラテジーを用いた今後の両生類研究において必要不可欠であるが、未だ確立されていない。そこで、外来遺伝子を安定的に発現する個体レベルでのシステムを確立するため、ネッタイツメガエルのセーフハーバー領域へのリコンビナーゼの認識配列の挿入をCRISPR-Cas9を用いて試みた。すでに研究室では、CRISPR-Cas9を用いた標的遺伝子へのレポーター遺伝子の挿入システムを確立しており、この方法を用いてセーフハーバー領域へのレポーター遺伝子のノックインを実施した。ノックインが成功すれば目にRFPが発現するはずであったが、明確な蛍光を観察することはできなかった。一方、実験個体においてゲノム配列を確認したところ、予定されている配列が検出されたため、ノックイン自体は成功していることが確認できた。これらの結果から、セーフハーバーと考えられた候補の部位においてもノックインされたレポーター遺伝子の構造によって、発現が抑制されている可能性と、挿入される際にレポーター遺伝子等に予期せぬ変異が導入されている可能性が考えられた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ダイズのクロロフィル蓄積変異体における分子遺伝学的および生化学的な特徴付け

ダイズ遺伝資源には子葉や種皮にクロロフィルを蓄積する品種・系統が数多く存在する。これらはstay-green変異体と呼ばれ、老化に伴うクロロフィル分解の抑制に起因する。これらの遺伝的要因を明らかにすることは,現行の青ダイズよりもクロロフィル含量を高めた系統を育成できる可能性がある。本研究は,種皮のみにクロロフィルを蓄積させる因子(Gsc1)の機能を解明するためファインマッピングによるGsc1遺伝子の単離を試みた。青ダイズの一つ天津大青豆と黄ダイズ品種いちひめとの間に作製した約1,200のF3個体を養成し,F4種子の表現型をもとにGsc1遺伝子のファインマッピングを進めた結果、Gsc1遺伝子が座乗する領域を約37 kbpにまで狭小化することに成功した。ダイズゲノムデータベースに基づき当該領域に座乗すると予測される5つの遺伝子について両親間で配列を比較した。その結果,CAAXプロテアーゼをコードする一つの遺伝子にのみ,塩基置換による違いが認められた。そこで,天津大青豆が持つ当該遺伝子を黄ダイズにおいて過剰発現させてみたところ,種皮にクロロフィルの蓄積が認められた。これらのことから,当該遺伝子をGsc1の責任遺伝子とした。ダイズ遺伝資源においてGsc1遺伝子に認められた変異の分布を確認したところ,種皮のみにクロロフィルを蓄積する遺伝資源全てが天津大青豆と同じGsc1遺伝子型を持つことを明らかにした。また,黒や茶色の有色種皮も持つ遺伝資源の中にも天津大青豆と同じGsc1遺伝子型を持つものがあることが分かった。さらに,野生ダイズについて同様に変異を確認したところ,野生ダイズのほぼすべてが天津大青豆と同じGsc1遺伝子型を持つことも明らかになった。これらのことから,種皮緑形質をもたらすGsc1遺伝子は野生ダイズに由来するものであることが明らかになった。ダイズにおけるstay-green変異には、二対の劣性遺伝子d1d2により支配される核型と細胞質因子CytGにより支配される細胞質型、加えて種皮特異的にChlの蓄積が認められるG因子の存在が報告されている。また、核型と細胞質型stay-green変異体では種子におけるChl組成(Chl a/b比)に違いがあることが分かっている。これらstay-green変異体の解析は、ダイズ種子におけるChl代謝の知見の獲得および高Chl含有の青ダイズの育成につながることが期待される。本研究ではこれらのstay-green変異体ダイズを用いて、生化学的および生理学的側面からダイズにおけるstay-green変異の特性評価を行った。核型と細胞質型stay-green変異体ダイズの子葉と種皮におけるChlの定量解析の結果、両変異体共に同一種子中において子葉と種皮の間に大きなChl a/b比の差が存在した。また、子葉のChl a/b比について、核型と細胞質型stay-green変異体ダイズを比較したところ、大きな差が存在する一方、種皮においては同様のChl a/b比を示した。そこで、ウエスタンブロット解析を用いて、これらの変異体の子葉における集光性タンパク質を検出したところ、核型stay-green変異体ダイズにおいてのみ、完熟種子においてLHCIが検出された。このことから、核型と細胞質型stay-green変異体の子葉におけるChl組成の違いはLHCIの分解抑制の有無によるものであると考えられた。また、種皮緑品種系統ダイズの種皮におけるChlの定量解析の結果、核型および細胞質型stay-green変異体ダイズの種皮と同様のChl a/b比を示した。これらのことから、Chlの生合成およびその分解機序が種皮と子葉の間で大きく異なる可能性が示唆された。ダイズの主要なsta-green変異体においてクロロフィルの蓄積様式において生理学的な特徴づけを行うことができた。特に、集光性タンパク質の蓄積様式が異なることでタンパク質複合体に含有するクロロフィル組成に大きな違いもたらすことが明らかになってきた。特に、核型stay-green変異体ではクロロフィルaの方がクロロフィルbに比べ、選択的に保持させることが明らかになった。一方、同じ核型stay-green形質のものでも遺伝資源によってクロロフィル組成に違いがあることも明らかになった。ダイズのstay-green形質を理解するため,種皮のみが緑色を呈する系統を用いその遺伝因子の単離を試みた。具体的には種皮緑色形質に係る遺伝因子のファインマッピングを交雑分離集団(109のF2個体および1,615のF3個体)を用いて行った。その結果,責任遺伝子の座乗域を37 kbpにまで狭小化することに成功した。ダイズゲノムデータベースから当該領域には6つの遺伝子が座乗することが明らかになっていた。そこで,種皮が緑色もしくは無色となるNILを用い,これら6つの遺伝子について発現解析を行った。その結果,いずれの遺伝子においてもNIL間で発現レベルに差異は認められなかった。そこで,これらの遺伝子について配列を解析を行ったところ,一つの遺伝子にのみNIL間で塩基置換を確認した。さらに,NILにおいて種皮組織からRNAを抽出し,本遺伝子のcDNAを作製し配列を確認したところ,この塩基置換によってスプライシングのパターンが変化しその結果,コードされるアミノ酸配列が異なることが明らかとなった。このことから,種皮緑形質に関する責任遺伝子は当該遺伝子あると結論付けた。さらに,本遺伝子の機能を確認するため,種皮緑形質を持つ系統から当該遺伝子のゲノム領域をクローニングし,ダイズ形質転換を行うためのベクター構築を行った。

さらに,このベクターをアグロバクテリウムへ導入し種皮が無色のダイズ品種へ形質転換を行った。現在,この形質転換個体を養成中である。現段階で目的形質を規定すると考えらえる遺伝子を特定し,その機能多型まで特定している。また,これらの変異はダイズの遺伝資源に存在する他の種皮緑形質を伴う品種・系統についても同様に保存されていることも確認している。ダイズ遺伝資源には子葉や種皮にクロロフィルを蓄積する品種・系統が数多く存在する。これらはstay-green変異体と呼ばれ、老化に伴うクロロフィル分解の抑制に起因する。これらの遺伝的要因を明らかにすることは,現行の青ダイズよりもクロロフィル含量を高めた系統を育成できる可能性がある。本研究は,種皮のみにクロロフィルを蓄積させる因子(Gsc1)の機能を解明するためファインマッピングによるGsc1遺伝子の単離を試みた。青ダイズの一つ天津大青豆と黄ダイズ品種いちひめとの間に作製した約1,200のF3個体を養成し,F4種子の表現型をもとにGsc1遺伝子のファインマッピングを進めた結果、Gsc1遺伝子が座乗する領域を約37 kbpにまで狭小化することに成功した。ダイズゲノムデータベースに基づき当該領域に座乗すると予測される5つの遺伝子について両親間で配列を比較した。その結果,CAAXプロテアーゼをコードする一つの遺伝子にのみ,塩基置換による違いが認められた。そこで,天津大青豆が持つ当該遺伝子を黄ダイズにおいて過剰発現させてみたところ,種皮にクロロフィルの蓄積が認められた。これらのことから,当該遺伝子をGsc1の責任遺伝子とした。ダイズ遺伝資源においてGsc1遺伝子に認められた変異の分布を確認したところ,種皮のみにクロロフィルを蓄積する遺伝資源全てが天津大青豆と同じGsc1遺伝子型を持つことを明らかにした。また,黒や茶色の有色種皮も持つ遺伝資源の中にも天津大青豆と同じGsc1遺伝子型を持つものがあることが分かった。さらに,野生ダイズについて同様に変異を確認したところ,野生ダイズのほぼすべてが天津大青豆と同じGsc1遺伝子型を持つことも明らかになった。これらのことから,種皮緑形質をもたらすGsc1遺伝子は野生ダイズに由来するものであることが明らかになった。本解析を進める中で核型stay-green変異体と黄ダイズの交雑分離集団においてstay-green形質をもたらす新規の遺伝子の存在が明らかになった。新規のstay-green形質は種皮にのみクロロフィルを蓄積させる特徴を持っていた。そこで、本遺伝子をGsc1遺伝子と名付け交雑分離集団を用い当該遺伝子のマッピングを進めている。今後は、解析集団の規模を拡大し、ファインマッピングを行い新規遺伝子の同定を試みる。作出した形質転換体の表現型を確認し,当該遺伝子が種皮緑形質を規定することを明らかにすることに加え,その遺伝子の機能解析も併せて行う。
不規則系列上の離散分布モデルに関する統計的推測の研究

確率変数列などの不規則な構造上に現われる連などの離散パターンやスキャンと呼ばれる複数の離散パターンの起こる回数やそれらが観測されるまでの待ち時間などの厳密な確率分布の研究とそれに基づいた統計的推測の研究を行い、さまざまな新しい成果を得た。この研究では、とくに離散パターンの待ち時間問題や離散パターンの生起数などの問題を、いくつかの停止時間を用いて統一的かつ有効に扱い、解析的な方法を用いて理論的な成果を得た。また、そのうちのいくつかの結果は、数値計算にも有効であることを示した。確率変数列、確率ベクトル列、有向グラフなどの不規則な構造上に現われる離散パターンやscanと呼ばれる複数の離散パターンの起こる回数やその待ち時間などの離散確率分布の研究とそれに基づいた統計的推測の研究を行う。この研究では、とくに離散パターンの待ち時間問題や離散パターンの生起数などの問題を、いくつかの停止時間を用いて統一的かつ有効に扱うことを目的とする。具体的には、次の5点にまとめることができる。(1) Start-up demonstration testについて、従来、理論的な困難さから見送られてきたような制約、たとえば一定の長さの過去の歴では捉えることができないような制約の下で研究を行う。(2) 2次元の格子点上に配置された離散確率変数族の中にある2次元の離散パターンが出現する確率の計算を行う。(3)いくつかの停止時間の関数として記述できるような離散確率変数の確率分布を統一的に計算することのできるアルゴリズムを開発する。(4)いくつかの離散パターンの待ち時間の同時分布の研究を行う。その際、「各離散パターンは他のパターンの部分パターンではない」という制約を外して議論する。(5)その他、不規則系列上の離散分布論の基礎理論へ貢献する。1.Start-up demonstration testについて、従来、理論的な困難さから置くことを見送られてきたような制約、たとえば、各時点においてそれまでの成功数の和がそれまでの失敗数の和を常に超えているというような、一定の長さの過去の履歴では捉えることができない制約の下で厳密分布の導出およびアルゴリズムの開発を行った。応用として、次のような問題を解決した。start-up demonstrationtestにおいて、起動の成功数の和が失敗数の和を常に上回りながら、一定回数の成功連を観測したときにはその装置をacceptし、観測の途中で失敗数の和が成功数の和を上回ったときにはその装置をrejectし、さらに、あらかじめ決められた試行数に達してもacceptもrejectもできないときには実験を打ち切るという3種の結果を想定した実験を行い試行回数のデータをとる。このデータに基づいて起動の成功確率の推定々最尤法によって行う方法を開発した。また、この方式で成功確率を推定するとき、推定量の振る舞いをシミュレーションによって調べた。2.2つの離散パターンが現れるまでの待ち時間の同時分布を調べた。今までの研究では、2つのパターンが互いにもう1つのパターンを含まないという技術的な制約の下で研究されていたが、本研究では2つのパターン間の関係について全く制約を置かなかった。そのため、厳密同時分布が相当複雑な形をしているが、同時分布から周辺分布をすみやかに出すことができる。さまざまな不規則系列上のパターンについての厳密分布を調べ、母数の統計的推測に利用することができるように理論的な研究を行った。主な研究手法は数え上げ組み合わせ論ではなく、条件付き期待値のstepwise smoothingによる解析的なアプローチであり、具体的に次のような成果が得られた。1.高次マルコフ連鎖における長さkの連の待ち時間分布において、従来計算が困難であった、kの値がマルコフ性の次数mに比べて大きい場合について、厳密な確率母関数の計算法を与えた。kの値がいくら大きくても、マルコフ性の次数mまでの長さの連の待ち時間分布の確率母関数を用いて、長さkの連の待ち時間分布の確率母関数を記述することができる。従来、kが大きいときには、確率母関数族についての大規模な連立方程式を解くことが必要であったが、mが適当な大きさであるときには、これが回避できることが分った。2.多値マルコフ連鎖上の、与えられた長さの連の数の同時分布を、さまざまな数え方に対応して統一的に調べた。確率母関数の漸化式、二重母関数、モーメントなどの結果を与えた。3.複合パターンについて、起こる回数が与えられたときの試行回数の分布と、試行回数が与えられたときの生起回数の関係を母関数によって与えた。4.多値マルコフ連鎖上の複合パターンに関する同時分布を、さまざまな数え方に対応して調べた。二重母関数(確率母関数の母関数)や確率母関数の漸化式などを具体的に与えた。さまざまな不規則系列上のパターンについての厳密分布を調べ,母数の統計的推測に利用することができるように理論的な研究を行った.主に用いた研究手法は,条件付き期待値のstepwise smoothingと確率過程の弱収束であり,主とした成果は次のようなものである.

1.連続変量確率変数列をあるレベルtで切ることによって離散化するとき,この離散確率変数列で起こる離散パターンの数は,レベルtを時間とした確率過程と捉えることができる.観測値の数を大きくしていくとき,この確率過程が離散パターンに依存したガウス過程に弱収束することを示すことができた.2. 2値のマルコフ試行列において,一定の長さの履歴では捉えることができない制約の下での連の待ち時間分布の導出を行った.具体的には,観測中,常に1の数が0の数を上回っている状態を保ちながら,はじめて長さkの1の連が観測されるまでの待ち時間の確率などを計算することができた.3. 2値の高次マルコフ試行列において,全く制約を置かない2つの離散パターンの待ち時間の同時分布を導出した.このような問題は今まで多くの研究者によって研究されていたが,計算が複雑になるため,2つのパターンの間に包含関係が成り立たないという制約が置かれるのが普通であった.4.条件付き確率母関数の方法を用いて,古典的な誕生日問題やクーポン集めの問題を一般化したものの確率分布を求めた.さまざまな不規則系列や不規則な構造体の1つである高次マルコフ木の上で観測される複合パターンに関する統計量やスキャン統計量の厳密分布および厳密分布間の関係について研究し、理論的な成果を得た。方法は、条件付き確率母関数や、条件付き2重確率母関数の方法をグラフィカルモデル上で使えるように拡張し、条件付き期待値のstepwise smoothingの性質を使った解析的なアプローチを用いた。具体的には、次のような結果が得られた。1.独立な多値試行列上で複数の離散パターンを同時に考え、与えられた試行数までのパターンの観測数の確率分布と、複数のパターンに対してそれぞれそれが与えられた回数だけ起こるまでの待ち時間の確率分布の間の関係を、それぞれの2重確率母関数によって明らかにした。この結果は非常に一般的な結果であり、一般化された誕生日問題、クーポン収集問題などの複雑な問題に理論的な見通しを与えるだけでなく、計算にも有効である。2.高次マルコフ木によって与えられるグラフィカルモデル上で、連やスキャン統計量の厳密分布を導出するための理論的な結果を与えた。これは、不規則系列上で研究されている条件付き確率母関数の方法を有向木のグラフィカルモデルへ拡張したものであるが、所謂線形から非線形への拡張であるので、易しい拡張ではない。この結果の1つの応用として、有向木の形をしたシステムの信頼度の計算があるが、そのためのアルゴリズムおよび具体的な計算例も提供することができた。
りん酸化によるCa^<2+>チャネル活性化の分子機構を明らかにする:チャネルサブユニットCACNA1Cりん酸化可能部位のりん酸化による機能調節について

多くの興奮性細胞において細胞内カルシュウム(Ca^<2+>)濃度の上昇と濃度制御は、それらの機能発現および細胞生存において中心的役割を担っている。細胞外からのCa^<2+>流入は、主にL-type Ca^<2+>チャネルを介して行われている。このL-type Ca^<2+>チャネルより流入するCa^<2+>量は、L-type Ca^<2+>チャネルの持つ不活性化という性質により調節されている。すなわち、Ca^<2+>チャネルが開きCa^<2+>の細胞内への流入が始まると同時にCa^<2+>を通さない"チャネルが閉じた状態"に戻る"不活性化"により、過剰な流入を防ぐ機構がL-type Ca^<2+>チャネルに備わっていることが知られている。これまでの研究によりL-type Ca^<2+>チャネルを構成するα1cサブユニット上にあるリン酸化部位とβ2aサブユニットが不活性化に関与している可能性が示されていた。本研究においては、L-type Ca^<2+>チャネルを構成する二つのサブユニット(α1c、β2a)クローンを用いリン酸化によるL-type Ca^<2+>チャネルの制御機構についてつぎの点を明らかにした。1)チャネル本体として単独で機能し得るα1cサブユニット単独でリン酸化による活性化が生じる。2)β2aサブユニットは用量依存的にα1cサブユニットを通るCa^<2+>電流を増強する。3)リン酸化による活性化は発現させたβ2aサブユニットの量により異なる。4)過剰にβ2aサブユニットを発現させた状況においてはリン酸化による活性化がみられなくなる。この結果より、β2aサブユニットがα1cサブユニットの発現量を調節するという今までの知見に加え、α1cサブユニットリン酸化による機能修飾に関与していることが初めて明らかとなった。細胞外カルシュウムイオンの流入経路であるカルシュウムチャネルは、チャネル孔を形成するα-subunitとその機能および形質膜への発現調節にかかわるβ,γ,δ-subunitsより形成されている。β-subunitは心筋α-subunitのカルシュウムイオン流入量の調節に重要な役割を持っていることが知られており、心筋収縮力の調節の手段としてβ-subunitを心筋細胞に導入することも検討されている。私たちは、α-subunitのリン酸化とβ-subunitがそのチャネル機能にどのように関わっているのかを検討している。これまでの研究の結果、α-subunitにおけるリン酸化によるカルシュウムチャネル活性化にはβ-subunitの量的な関与があることが示されている。1)カルシュウムチャネルα-subunit単独では、リン酸化による活性化は生じない。4)α-subunitリン酸化部位を他のリン酸化を受けないアミノ酸に置換すると、リン酸化部位を持つβ-subunit発現量に関わらず、リン酸化による活性化は消失する。5)α-subunitリン酸化部位を他のリン酸化を受けないアミノ酸に置換すると、カルシュウムチャネル活性化にみられたβ-subunitの量的な関与が消失する。これらの結果よりカルシュウムチャネル活性化におけるβ-subunitの役割は、α-subunitのリン酸化部位と密接に関わっていることが明らかとなった。細胞外カルシュウムイオンの流入経路であるカルシュウムチャネルは、チャネル孔を形成するα-subunitとその機能および形質膜へ発現調節にかかわるβ,γ,δ-subunitより形成されている。

β-subunitは心筋α-subunitのカルシュウムイオン流入量の調節に重要な役割を持っていることが知られており、心筋収縮力の調節と手段のしてβ-subunitを心筋細胞に導入することも検討されている。私たちは、α-subunitのリン酸化とβ-subunitがそのチャネル機能にどのように関わっているのかを検討し平成14年度平成15年度の研究によりα-subunitリン酸化部位とβ-subunitの関係について以下のことを明らかにした。1)α-subunitリン酸化部位を他のリン酸化を受けないアミノ酸に置換すると、リン酸化部位を持つβ-subunit発現量に関わらず、リン酸化による活性化は消失する。2)α-subunitリン酸化部位を他のリン酸化を受けないアミノ酸に置換すると、カルシュウムチャネル活性化にみられたβ-subunitの量的な関与が消失する。今年度の研究においては、カルシュウムチャネル活性化をもたらすリン酸化とβ-subunitの量的関係について蛋白リン酸化酵素(A-kinas)の阻害剤H-89を用いて検討した。その結果2)過剰なβ-subunit存在とα-subunitの発現により活性化されたカルシュウム電流は、H-89により抑制される。3)β-subunitとα-subunitの等量な発現により活性化されたカルシュウム電流は、細胞内cAMP過剰状態ではH-89により抑制されるが、cAMPがなければ抑制されない。これらの結果より、β-subunitはbasal levelでのカルシュウムチャネルα-subunitリン酸化を制御する機能を持つことが推察された。
最終集束レンズに加速管を用いたガスイオンナノビーム形成技術に関する研究

実験室に設置可能な小型のMeVイオンマイクロビーム形成装置の開発を目標に、MeVへの拡張可能な数100keVのイオンマイクロビームの形成用の加速レンズ系を設計・製作した。具体的には、既存の2段加速レンズに高エネルギー用の強電位勾配型の単一ギャップ第3加速レンズを付加した3段加速レンズ系を開発した。この3段加速レンズを搭載した数100keVイオンミクロビーム形成装置によりイオンマイクロビームを形成した実験結果から、このエネルギー領域における加速レンズ系の有効性を実証するとともに、MeV領域のイオンマイクロビーム形成のための3加速レンズ系の基本構造を決めた。H23年度に開発した電極間間隔が15mmの単一ギャップ加速レンズ(以下、単一ギャップ第3加速レンズ)について、レンズの側面に2気圧のSF6(絶縁ガス)を封入して電圧印加試験を行った結果、200kVまで印加でき、一般的な加速管の13倍、既存の従来型複数電極の加速レンズ(以下、複数電極第3加速レンズ)の4倍に相当する高電圧勾配13.3kV/mmを達成した。これにより、単一ギャップ第3加速レンズを用いた3段加速レンズ系全体の縮小率が目標の1000を達成できる見通しが得られた。また、既存のプラズマ型イオン源と2段加速レンズに複数電極第3加速レンズ又は単一ギャップ第3加速レンズを組み合わせられる300keVガスイオンマイクロビーム形成装置(以下、マイクロビーム形成装置)を構築した。更に、鋭いナイフエッジをイオンビームに対して垂直に移動し、この下流に置いたファラデーカップで測定したビーム電流の変化から10nmの分解能でビーム径を測定する装置を開発した。複数電極第3加速レンズを用いたマイクロビーム形成装置で2段加速レンズに20kV、複数電極第3加速レンズに143kVを印加することで水素イオンビームを加速・集束し、ビーム径測定装置により評価した結果、直径は19μmであり、マイクロビーム形成装置の各部分が正常に動作することを確認した。これにより、単一ギャップ第3加速レンズを用いた場合にはさらに高縮小率が見込めるため、より小さいビームの形成が可能であることが分かった。H25年度は3段加速レンズ系により300keV領域でのサブミクロン径の形成見通しと小型MeVイオンマイクロビーム形成装置のレンズ系の基本設計を目的とした。サブミクロンビーム形成のための3段加速レンズ系において、前年度に顕在化したレンズ系の軸調整とビーム径測定時間の短縮に関する課題の解決を夫々行った。前者では、レンズ系の高精度調整及び固定用の部品を開発し、位置精度数10μmで光軸の調整を行った。後者では、静止したビームに対してナイフエッジをその端面に垂直な方向に移動させて下流に到達するビームの強度変化から径を測定するこれまでの方法に替えて、レンズ系の下流に設置した静電デフレクターでビームを静止したナイフエッジに対して走査する装置を開発した。これにより測定時間が一分程度から10秒程度に短縮でき、レンズ系の集束パラメータの最適化が容易になった。また、マイクロビーム形成実験の中で、昨年度に形成したビーム径19μm以下に縮小できない主な原因が装置内の残留ガスに起因したビーム散乱によるハローであることを明らかにした。この対策として、イオン源からレンズ系に流出するガスの低減により装置内の真空度を向上し、単一ギャップ第3加速レンズ及び既存の多段第3加速レンズの夫々を使用した3段加速レンズ系において、150keV以下でビーム径4μmを形成した。これにより300keV領域でサブミクロン径を形成できる見通しを得た。3年間の研究を通じて高電位勾配型の単一ギャップ第3加速レンズを開発し、既存の2段加速レンズ系と組み合わせて高縮小率の3段加速レンズ系を構築した。また、この第3加速レンズと既存の多段第3加速レンズを使用した夫々の3段加速レンズ系によりサブミクロン径を形成できる見通しが得られた。これらの第3加速レンズの性質を基に本研究の最終目標の小型MeVイオンマイクロビーム形成装置の集束レンズ系の基本設計を行った。以上の様に、当所の目標を達成した。本研究の最終目的は、実験室への設置が可能なMeV領域の小型ガスイオンナノビーム形成装置を開発し、ガスイオンナノビームを形成することである。本研究費の範囲では、要素技術として世界最高レベルの高い電圧勾配を持つ300kV用の加速管を開発し、既に開発を終了した二段加速レンズ系との組み合わせにより、世界で初めて加速管を最終レンズとした300keV領域のガスイオンナノビーム形成装置を開発する。初年度のH23年度は、300kV用の加速管を設計・製作した。具体的には、種々な形状の電極に対して有限要素法により電場計算を行い、その結果を基に静電レンズ計算コードを用いて、レンズパラメータの縮小率、集束点と収差計算の基となる球面及び色収差係数の計算を行った。

加速管を集束レンズとして使用する場合、電極間を長く、縮小率を大きくすると集束点がレンズの間に形成される。また、電極形状に依存して収差が大きくなり、縮小率通りのビーム形状が形成できない。これらを考慮してレンズパラメータ用いたビーム径や集束点の計算を基に電極形状の最適化を行い、電極間の長さが15mm、電場勾配が20kV/mm、且つ収差が10nm以下となるイオンビーム加速部分の電極形状を求めた。一方、加速管の絶縁に関しては、加速電極間が15mmでは300kVの電圧を印加することが困難でると予想できたため、加速電極部の電極間を短く、絶縁物部は樹脂製の絶縁物の耐圧に合わせて電極間を長くする形状を、更に絶縁物も耐圧が上がる形状を各々考案した。これらの要素を組み合わせて最終的に加速管を設計・製作した。加速管の組み立てに際しては、独自に考案し製作した治具を用いて、光軸をマイクロメートルレベルで調整した。H24年度の計画では、単一ギャップ第3加速レンズの電圧印加試験の実施、既存の2段加速レンズ系と組み合わせたマイクロビーム形成装置の構築、当装置によるマイクロビームの形成実験の実施を目標とした。電圧印加実験では高電位勾配が得られることを確認し、マイクロビーム形成装置の構築では、2段加速レンズ系に単一ギャップ第3加速レンズ又は複数電極第3加速レンズを組み合わせられるようにして、ほぼ計画通りに進捗した。マイクロビーム形成については、複数電極第3加速レンズを用いて行った動作実験の後、イオン源に電力を供給する発電機が故障し、修理に時間を要したため以降の実験ができなかったが、単一ギャップ第3加速レンズを用いることで10μm径以下のビーム形成が可能な見通しを得た。H23年度の研究計画目標である、最高レベルの高い電圧勾配を持ち、且つ最高電圧300kV用の集束レンズ用の加速管の設計・製作を実施した。単一ギャップ第3加速レンズの使用により、マイクロメートル径以下のイオンビームの形成を目指す。また、複数電極第3加速レンズはレンズに入射するイオンビームの発散角を制御する絞り電極のうち、比較的開口径の大きなものを使用でき、集束点でビーム電流を得やすい利点があるため、当所の予定に加えてこのレンズを用いたビーム径の縮小化の実験を行う。当加速管について電圧印加試験を行い、実際に高電場勾配型の加速管であることを確認する。さらに、既存の二段加速レンズ系と加速管を組み合わせて、300keV小型ガスイオンナノビーム形成装置を開発し、ビーム径の測定実験を行う。イオンマイクロ・ナノビームの形成に関する実験を遂行するための消耗品等に使用するとともに、国内外での成果発表に使用する。ビーム電流や荷電粒子を用いたビーム径の測定実験を行なうためのビーム径測定装置を購入する。また、学会での研究成果発表や本研究に関連する情報収集を行うための旅費として使用する。
クリニカル・インディケーターの施設間比較による診療の質評価に関する研究

本研究では、わが国で有効に活用可能なクリニカル・インディケーターを設定するために、諸外国における事例の収集を行い、研究班員がこれを評価し、基本的な臨床評価指標のセット(Basic clinical Indicators)の案を作成した。この作業と並行して、胃癌、直腸癌、胆石症について、術後合併症の発生率等のインディケーターを設定し、協力病院の診療録調査を実施して、施設間比較を行った。また、平成16年度は、インディケーターの追加・拡大を図るため、褥瘡の発生率をインディケーターとして、協力病院の褥瘡に関するデータ調査を実施し、施設間比較を試行した。これらの試行研究を通じて得られた知見は、以下の通りである。1)各施設の診療機能・役割は異なるため、有効なクリニカル・インディケーターは共通ではない。したがって、候補となるインディケーター(Basic Clinical Indicators)を設定しておき、各施設が自院に適用可能なインディケーターを設定して使用する方式が適当であると考えられる。2)同一のインディケーターについての計算方法は施設によって異なってはならない。したがって、インディケーターの定義、計算方法を明確に定め、標準化を図ることが必要である。3)インディケーター算出のために、その都度新たにデータを収集することは、各施設の負担が大きい。設定したインディケーター算出に必要なデータは、日々の診療の流れの中で、必ず収集されるように記録様式を定めておくことが求められる。4)急性期病院へのDPC支払い方式の導入が促進される流れにあって、同制度下で提出が求められる電子ファイルは、一種の標準化された症例DBと解釈できる。したがって、この標準データから算出可能なインディケーターを設定することはインディケーターの普及・活用の観点から重要である。また、これらをDPC提出データの設計に反映させることも重要である。5)電子カルテは、インディケーター算出の強力なツールとなり得る。機能の組み込みは今後の検討課題であろう。本研究は、(1)臨床的に均質な患者群の設定、(2)クリニカル・インディケーターの設定、(3)協力病院からの実診療データの収集、(4)クリニカルインディケーター等の施設間比較、(5)分析と考察の5段階に分かれる。平成14年度は大学病院2施設、一般病院3施設の計5病院が協力施設として参加し、これらから診療情報、医療費情報が89,915症例収集された。これらのデータは研究の基礎となるため、その精度は極めて重要である。したがって、初年度は病院から提出されたデータの精度に重点を置き、エラーの割合、エラーの理由、エラー検出のためのロジックの検討を行った。データ入力漏れや明らかな異常値など容易に発見されるエラーのほか、病名コード化についての施設による認識の相違や、主病名と手術名の不整合、主病名の選択に関する疑義などさまざまなデータ精度上の問題点が明らかとなった。また、厚生労働省が使用することを推進しているメディスの標準病名マスター上に、病院で運用している多くの病名がいまだ整備されていない問題も明らかとなり、今後の標準病名マスターの整備が期待される。患者群の設定に関しては、臨床的に十分均質であるかは検証されていなものの、平成15年度より開始される特定機能病院の包括支払い方式で使用されるDPC分類および、重症度を考慮したDisease staging法による患者分類を使用することとした。

並行して、クリニカル・インディケーターの選定のための文献調査が行われ、JCAHOが開発したIMsystem、ORYXシステム、ACHS(The Australian Council on Healthcare Standards)による20領域にわたるクリニカル・インディケーター等が、筆者らが1997年に調査したクリニカル・インディケーターと合わせて検討された。本研究は、(1)臨床的に均質な患者群の設定、(2)クリニカル・インディケーターの設定、(3)協力病院からの実診療データの収集、(4)クリニカルインディケーター等の施設間比較、(5)分析と考察の5段階に分かれる。平成15年度は、(1)については、研究の方法論を明確にするため、対象を胃癌、直腸癌、胆石症、乳癌の4疾患に絞って検討することとした。(2)については諸外国のインディケータの事例の収集を行い、とくにオーストラリアのインディケータについて全訳して検討するとともに、わが国の1100病院を対象に、クリニカル・インディケータの把握状況および使用している具体的なインディケータに関する調査を実施した。(3)については、平成14年度に収集した診療情報、医療費情報をさまざまな角度から分析した。とくにデータの精度チェックについて、昨年度提案された主診断名と手術名の不一致情報を用いたエラー情報のスクリーニング手法について、胃癌、直腸癌、胆石症について具体的な分析を行、精査が必要な症例データのスクリーニング手法について一定の成果が得られている。(4)については、胃癌、直腸癌、胆石症について、収集された症例データに含まれる主診断名、副診断名の情報から、術後合併症をロジカルに判定することを試みた。結果を班員の臨床医による診療録の確認から得られた術後合併症の状況と比較対照し、判定精度の検討を行っている。現時点では両者の一致率は低いが、その理由として考えられる症例データにおける副診断名の精度、診療録見直し時における臨床医の確認漏れなどについて、さらに検証を進めることを検討している。術後合併症は、その発生をできるだけ減少させることが医療費逓減の観点からも重要である。研究班ではそのような動機付けを与える支払い制度についても議論がなされており、その結果は、DPCの合併症有無の分岐ロジックにも反映し得る重要な知見と考えられる。本研究では、わが国で有効に活用可能なクリニカル・インディケーターを設定するために、諸外国における事例の収集を行い、研究班員がこれを評価し、基本的な臨床評価指標のセット(Basic clinical Indicators)の案を作成した。この作業と並行して、胃癌、直腸癌、胆石症について、術後合併症の発生率等のインディケーターを設定し、協力病院の診療録調査を実施して、施設間比較を行った。また、平成16年度は、インディケーターの追加・拡大を図るため、褥瘡の発生率をインディケーターとして、協力病院の褥瘡に関するデータ調査を実施し、施設間比較を試行した。これらの試行研究を通じて得られた知見は、以下の通りである。1)各施設の診療機能・役割は異なるため、有効なクリニカル・インディケーターは共通ではない。
重症薬疹における抗原提示細胞のアクセサリー分子の発現と抗ＴＮＦα抗体療法の検討

本研究は重症薬疹におけるTNFαをはじめとしたサイトカインの関与を検討するとともに、抗原提示細胞のアクセサリー分子の発現などを含めた免疫細胞の変化を検討した。血清サイトカインに関しては薬疹型を播種状紅斑丘疹(MP)、多形紅斑(EM)、Stevens-Johnson症候群(SJS)、中毒性表皮壊死症(TEN)、薬剤性過敏症症候群(DIHS/DRESS)に分けて、各患者の発症期/急性期と回復期のサイトカインプロファイルを調べた。薬疹の急性期では全般的に炎症性サイトカインが上昇しており治療に伴って回復期に正常範囲に戻る傾向を示すこと、炎症性サイトカインの上昇の程度は必ずしも薬疹の重症度と相関しないことより、炎症性サイトカインは薬疹の病態形成には関与するが、発症機序においてはサイトカインだけでなく他の因子の関与が考えられた。また重症薬疹の中でもSJS/TENとDIHS/DRESSでは異なるサイトカインプロファイルを呈した。SJS/TENと比較してDIHS/DRESSの急性期にはIL-5・IL-9・IL-13などのTh2サイトカイン、IL-10およびHMGB1が有意に上昇しており、DIHS/DRESSでは急性期にHMGB1がTh2細胞の活性化とHHV-6の再活性化に関与するとともに、Th2サイトカインとIL-10のバランスが病態形成に深く関わっている可能性が示唆された。アクセサリー分子の発現の変化を含めた抗原提示細胞の数と機能に関しては薬疹の型および時期によって大きく変動していることが判明したが、詳細な検討は今後の課題であると考えられた。研究初年度に当たる当該年度は既存の保存検体の解析、新たな実験系の立ち上げ、新規の検体確保に重点を置いて研究を推進させた。本研究では重症薬疹患者の末梢血単核球に発現するアクセサリー分子を調整する因子として、TNFαをはじめとした血清サイトカインのバランスが重要である。そのため、当研究室がすでに確保・保存してある血清中の各種サイトカイン濃度をELISAなどを用いて測定して臨床経過と比較検討することによって、病態へ及ぼす影響を検討した。新規実験系の立ち上げとしては、薬疹患者の末梢血単核球に発現したアクセサリー分子の発現を検討するために、PCRと免疫染色の実験系の開始および最適化を図った。患者血液から末梢血単核球を単離し、PCRで複数のアクセサリー分子の発現量の変動を検討した。また免疫染色に関しては重症薬疹発症初期の患者から生検により得られた皮膚検体を凍結保存しておき、組織中の末梢血単核球に発現したアクセサリー分子を検討した。本研究を推進するためには既存の凍結保存血清だけでなく、重症薬疹患者の皮膚生検検体および治療に伴う経時的な血清および末梢血単核球が必要となる。しかしながら重症薬疹の発症頻度は年間に100万人当たり数名程度と低く、検体確保が困難であることが当初より予想された。そのため必要十分な検体数を確保できるよう研究初年度より検体確保に重点を置き、研究の重要性・必要性を患者に説いて、同意を得られるよう努力した。既存検体の解析はほぼ終了し、疾患群および時間経過によるサイトカインプロファイルの検討は平成24年度の国際学会で発表済みである。新規実験系の立ち上げとしてPCRと免疫染色を開始し、研究の手法として使用中である。新規検体の確保に関しては、一定数の検体を確保することができた。今後も重症薬疹患者が受診した際には継続して検体の確保に努める予定である。現在は患者の全末梢血単核球から抽出したRNAに対してPCRで解析を進めているが、対象とすべきアクセサリー分子を限定した後には、磁気細胞分離法を用いて抗原提示細胞およびT細胞を単離することで、各々の細胞集団に特異的に発現したアクセサリー分子を検討する予定である。また免疫染色に関しても多重染色を併用することで、実際の皮膚における上記細胞群の分布および発現を検討する予定である。

さらにTNFαなどの既存のサイトカインだけでなく、血清中の新規サイトカインやケモカインなども追加で検索することにより、多角的に重症薬疹の発症機序および病態を検討する。上記推進方策に基づき、実験においてはプライマー、抗体などの消耗品を中心に研究費を使用する予定である。平成24年度は薬疹関連の国際学会への参加費として研究費の使用を節約したため、繰越金が生じた。平成25年度は国際薬疹学会および薬疹を扱う国際学会がいくつか開催される予定であるため、論文化されていない重症薬疹に関する最新の知見を得たり、既に得られたいくつかの結果を発表するために、平成24年度からの繰越金も含めて、国際学会への参加費の一部として充填する予定である。
わが国における樹木衰退と土壌酸性化との関連性の評価と対策に関する研究

本研究で得られた主要な結論を以下に要約する。(1)六甲山系で樹木衰退度の異なる12地点で土壌を採取し、土壌および間隙水の化学特性を分析した。多くの土壌pH(H20)ならび間隙水pHが4前後を示すこと、塩基飽和度はほとんど10%以下であること等から、六甲山系の土壌は樹木衰退度に関わらず土壌の酸性化が進行していることが分かった。(2)樹木の衰退と関連があるとされる土壌特性をいくつかピックアップし、各調査地点の土壌酸性化度に関するランク付けを行った。その結果、土壌の酸性化が顕著であり樹木に影響を与えやすいと診断された地点と、実際の樹木衰退とは比較的良い一致を示した。(3)名古屋市において土壌酸性化が見られる地点として熱田神宮を選定し、境内で樹木衰退度の異なる4ヶ所から土壌を採取し化学特性を分析・定量して、土壌酸性化と樹木立ち枯れとの関連について考察した。その結果、樹木の立ち枯れが見られる地点(2)が他の地点よりもpH(H20)が低く、土壌が強く酸性化していることがわかった。(4)間隙水pHも土壌pHと同じく地点(2)の土壌に低い数値がみられた。中でも枯損木周辺土壌の間隙水pHが低い。間隙水中の栄養塩濃度も、地点(2)の土壌が他の土壌よりもはるかに低いことがわかった。カラムを用いた土壌酸性化加速実験から、地点(2)で今後土壌の酸性化がさらに進行すると、Al濃度が急激に増加し樹木への影響がさらに顕著となる可能性が高いことを示した。(5)ライミングを行った土壌は、ライミングを行わなかった土壌と比較して塩基飽和度が大幅に向上する正の効果が現れた。しかし、過剰のCaが土壌粒子に吸着されることで樹木に必要な元素であるMgまでもが土壌粒子から溶出してしまうという弊害も生むことが分かった。(6)土壌酸性化評価モデル(修正SMARTモデル)をライミング効果が評価できるように再構築し、そのモデルを用いていくつかのシナリオのもとにシミュレーションを行った。その結果、ライミングによる直接的な酸緩衝機能よりも有機酸や微生物等による、酸性化の進行程度が与える影響の方が強いということ、すでに酸性化が進行している六甲山系の土壌の場合、酸性化の進行が激しいシナリオを想定すると、ライミングを行っても酸性化を緩和することはできないくらい土壌が酸性化していること等を明らかにした。樹木衰退が報告されている神戸市六甲山系および名古屋市の熱田神宮において、衰退木および健全木の周辺土壌(16地点)を採取し、土壌および間隙水の化学特性を分析した。得られた結果および結論を以下に要約する。(1)六甲山系では多くの土壌pH(H20)ならびに間隙水pHが4前後を示し、塩基飽和度はほとんどが10%以下であること等から、樹木衰退度の違いに関わらず土壌の酸性化が顕著であることが分かった。

間隙水中Al濃度、Al^<3+>濃度が1mg/Lを超える濃度が検出されたことから、土壌がアルミニウム緩衝領域にあることは明らかである。(2)樹木の衰退と関連があるとされる土壌特性をピックアップし、六甲山系の各調査地点の土壌酸性化度に関するランク付けを行った。その結果、土壌の酸性化が顕著であり樹木に影響を与えやすいと診断された地点と実際の樹木衰退の程度とは比較的良い一致を示した。(3)熱田神宮の境内土壌では、樹木衰退の周辺土壌でのみ土壌の酸性化が顕著であった。このことは、土壌酸性化と樹木衰退との関連性を強く示唆していると言える。しかし、交換性Alはほとんど検出されず、アルミニウムの毒性が樹木衰退に関連しているとは考えられない。交換性、間隙水ともにMg濃度が低く、栄養塩としてのMgの欠乏が樹木に悪影響をもたらしている可能性を示唆した。(4)六甲山系で採取した土壌については、森林土壌をO層、A層、B層に分けて採取分析しCa,Mg,K,Na,Alの動態を考察した。その結果、O層は下部2層とは異なり塩基成分を多く含むがpHは最も低いこと、O層とA層では陽イオンの交換能が異なる可能性があること、等を示した。本研究で得られた主要な結論を以下に要約する。(1)土壌酸性化が顕著な六甲山系の土壌に対して、炭酸カルシウムによるライミングを行う効果を確認・評価するためカラム実験を実施した。ライミングを行った土壌は、ライミングを行わなかった土壌と比較して塩基飽和度が大幅に向上する正の効果が現れた。しかし、過剰のCaが土壌粒子に吸着されることで樹木に必要な元素であるMgまでもが土壌粒子から溶出してしまうという弊害も生むことが分かった。さらに、カラム実験によるライミングではカラム流出液pHを中性に近づけるまでの効果には至らなかった。(2)O層土壌の上部にライミングすると、下部にあるA層土壌の塩基飽和度の回復が充分ではなかった。(3)これまでの研究において開発した土壌酸性化評価モデル(修正SMARTモデル)をライミング効果が評価できるように再構築した。構築したライミングモデルはライミングによる土壌回復の機構を比較的良好に表現できた。添加した石灰は、Ca^<2+>とCO3^<2->に解離し、ともに土壌溶液中のpHを中性に近づける働きをする。O層土壌に吸着されたり、H+と反応したりして、酸緩衝が行われ、A層土壌に流達するが、塩基飽和度の低い土壌に石灰を添加するとその酸緩衝機能はほとんどO層で消費され、樹木が水分を吸収するA層の酸緩衝能力の回復には至らないというプロセスもモデルは良好に表現していた。(4)モデルによるライミング効果発現の様子は設定するシナリオによって変化した。ライミングによる直接的な酸緩衝機能よりも有機酸や微生物等による、酸性化の進行程度が与える影響の方が強いということがわかった。(5)すでに酸性化が進行している六甲山系の土壌の場合、酸性化の進行が激しいシナリオを想定すると、ライミングを行っても酸性化を緩和することはできないくらい土壌が酸性化していることがわかった。
凝集蛋白質の蓄積とプリン代謝物質との関連性はあるか

機構が解明されている新規¥キサンチン酸化還元酵素の強い阻害剤をALSのG1H-G93Aモデルマウスに経口投与し、その病状の進展遅延効果が確認された。効果の機構として、活性酸素生成抑制による可能性、またはプリンの代謝的な効果による変性タンパクの蓄積抑制の可能性を考え、モデル実験により予備的検討を行った。プリン代謝産物の濃度変化を追跡しアデニンヌクレオチドの分解によるヒポキサンチンの増加が認められた。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、脊髄前角細胞死による運動ニューロン麻痺を引き起こす神経変性疾患で、難病に指定されている。本研究では、近年日本各社で新規開発された抗痛風薬(キサンチン酸化還元酵素XORの阻害剤)をALSのモデルマウスに経口投与したところ、発症遅延、体重減少遅延、死亡遅延、が確認され、新規抗痛風薬は、ALS治療薬として期待され、国際特許出願(JST支援)したが米国(US8,318,792B2)および日本(特許5110536号)において本研究実施期間内に特許は受理された。XORの阻害剤効果の機構については、XORが阻害され、その酵素が生成しうる活性酸素の生成を抑制することによりSOD1変性タンパクの凝集を抑制する可能性が、またはXORの阻害により、活性酸素とは別のなんらかの代謝的な効果に基づく、SOD1変性タンパクの凝集の抑制の可能性が考えられる。本申請に基づき1年間の間に、その方向性を定める以下の予備的検討を行った。神経細胞の存在する正常マウスの脳組織を用い、抗XOR抗体を用いウェスタンブロット染色を試みたが、XORは検出できなかった。前核細胞での細胞組織の染色はわずかに染色されたが、検出限界と思われ、存在の可能性は少ないと考えられた。一方、活性酸素超産生のトランスジェニックマウスでは神経系になんら障害を見いだしていない。一方、網状赤血球をモデルとして、アデニンヌクレオチド、IMP、ヒポキサンチン、キサンチン、イノシン、尿酸、の濃度変化を追跡したところアデニンヌクレオチドの分解とともにヒポキサンチンの増加が認められた。また同じ系でユビキチン化蛋白質の分解をSDSーPAGEで追跡したところ時間経過とともに観察され、本系が適することが確認された。凝集タンパク質の除去に用いるATPの効果的維持の機構と結びつくという仮説に一致し、今後の研究方向を示唆した。