hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
離島火山活動のリモートモニタリングの実現

現在、この絶好の機を逃さないよう、急遽、西之島近海における観測計画を立てているところである。平成29年度は本科研費の最終年度であるが、この再活発化により、開発した本離島火山観測システムによる、西之島近海におけるリアルタイム観測ならびに取得データの評価の実施など、当初設定した目標を遂行できる見込みとなった。本研究計画は、自律型海上プラットフォームのウェーブグライダー(Liquid Robotics Inc.)を利用した離島火山観測システムを開発し、2013年11月から活発な活動が続く東京都の離島の西之島火山の観測を実施し、その実用性を評価するものである。本システムには火山監視に必要な、画像撮影用カメラ、空中及び水中での音波測定用の空振計とハイドロフォン、山体崩落等による津波発生の検知用のGPS波浪計を装備し、またリアルタイム監視のために、空振計、ハイドロフォン及び波浪計のデータを衛星通信で継続的に伝送する機能を持つ。今年度は2017年12月1日から12月13日までの期間、西之島周辺での観測・調査を行なった。この調査では、12月4日早朝から8日午前10時頃までの4日間に西之島火口を中心とする半径5 kmの円周軌道を5周して、映像観察及び水中・空中音波観測を実施した。タイムラプスカメラによる映像撮影は周回軌道上にあった12月4日早朝から8日午前中まで続けられた。カメラは可視光カメラであるため画像が見られるのは昼間だけであり、平均すると島をはっきり捉えられるのは1日に10時間以下であった。映像観察中の4日14時頃から日没までの17時頃まで、火口からの噴気活動を捉えた。噴気活動は連続的ではなくかなり断続的な活動であり、噴気の高さは最大で500 m程度と眺望された。一方、空振観測のための2台の空振計記録は、1日から10日までの期間、衛星経由で取得された。両方の空振計に記録されたシグナルの有無を検証するため、4-20 Hzのバンドパスフィルターをかけた後の記録で相関解析を行った。結果は、4日14時から19時45分の期間で相関パターンが見られた。それ以外では2日にも微弱なシグナルが得られた。特に4日14時からの相関パターンについては、カメラによる噴気活動が認められた期間に対応する。観測システムは計画通り、2015年には開発と製作を終了し、2016年10月に西之島火山近海において試験観測を実施し、ほぼ設計通りにシステムが機能することを確認している。2017年12月には、西之島火山近海での13日間の観測・調査を実施し、観測期間中の12月4日午後14時から発生した火口付近の噴気活動を捉えることに成功した。西之島の火山活動は、2017年4月20日に再噴火した後、1ヶ月毎の海上自衛隊の航空撮影観測によれば、8月半ばまでは活発な噴火活動が確認されていたが、9月以降は噴火の形跡は見られないと報告されていた。一方で、4月20日の噴火活動により、気象庁による入山規制が為され、近傍での観測は制限されていた。12月の本観測はこのような常用の中での実施となり、本観測システムが目指す完全無人の自律観測が実現されたことになる。
卓越したスポーツ指導者のコーチング熟達化過程の質的分析による支援プログラム開発

本研究の目的は,スポーツ指導者の熟達化過程のモデル構築および育成プログラム開発である。日本で優れた指導実績を残しているエキスパート指導者を対象とし, 1対1,深層的,半構造的インタビューにより調査を行った。同時に,調査対象指導者による指導を受けた経験を持つ選手を対象とし,選手の視点から捉える指導者の思考・行動について調査を行った。得られたデータは質的データ分析法を通して多角的に指導熟達化モデルとして構築された。分析の結果,最終的に指導熟達化モデルは,前年度までの研究成果を受け,(1)指導者としての意識変革,(2)関係再構築への認識,および(3)指導役割の取り込み,の3つのカテゴリーから構成されることが明らかとなった。本研究では,スポーツ指導者の熟達化の問題を,(1)知識の変容,(2)感覚の変容,(3)行動の変容,(4)表現の変容,及び(5)関係性の変容,の5つの熟達化の要素に基盤をおいたスポーツ学研究に基づき,選手時代等からエキスパート指導者に至るまでの体験をもたらす多様な場における相互作用の様態を多角的に捉え直すことを目的としている。指導者がいかにしてそれぞれの節目における変容の体験を成長に結び付けていったのか分析することにより,優れた指導に結びつく行動を生起させる指導者の意識過程全体がを明らかにすることを目指して調査が進められた。具体的には,日本で優れた指導実績を残しているエキスパート指導者5名を対象とし,1対1,深層的,半構造的インタビューインタビューにより分析を行った。同時に,調査対象指導者による指導を受けた経験を持つ選手5名を対象とし,選手の視点から捉える指導者の思考・行動について分析を行い,多角的にコーチング・メンタルモデルの構築を進めた。エキスパート指導者の熟達化過程,特に指導者としてのキャリアパスにおける心理的体験に着目して分析を進めた。最終的には,(1)卓越した選手を継続して育成し,チームの勝利という成果を継続しておさめているエキスパート指導者の優れた思考・行動特性の獲得過程の解明とモデル化,および(2)選手に利用可能な指導者熟達支援プログラムの開発・提案を視野に入れた成果に結びつけるよう,初年度としての基礎準備作業を進めた。本研究では,スポーツ指導者が指導者として成長していく,指導熟達化の問題について,選手として体験した内容からエキスパート指導者に至るまでの体験内容を詳細に分析することで,スポーツ指導の場における教え学ぶ相互作用の全体を多角的に捉え直すことを目的としている。指導者がいかにしてそれぞれの節目における変容の体験を成長に結び付けていったのか分析することにより,優れた指導に結びつく行動を生起させる指導者の意識過程全体が明らかにされた。具体的には,日本で優れた指導実績を残しているエキスパート指導者4名を対象とし,1対1,深層的,半構造的インタビューにより調査を行った。同時に,調査対象指導者による指導を受けた経験を持つ選手4名を対象とし,選手の視点から捉える指導者の思考・行動について調査を行った。得られたデータは質的データ分析法を通して多角的にコーチング・メンタルモデルとして構築された。分析は,エキスパート指導者の熟達化過程,特に指導者としてのキャリアパスにおける心理的体験に着目して進められた。分析の結果,今年度の段階においては,(1)選手の技能向上とチームのパフォーマンス向上に向けたエキスパート指導者の優れた思考・行動特性の獲得過程の解明とモデル化,および(2)選手に利用可能な指導者熟達支援プログラムの開発・提案を視野に入れたカテゴリーの精査,の作業が行われ,2年目としての作業が進められた。具体的には,スポーツ指導者が指導者として成長していく,いわゆる指導熟達化の問題に焦点を当て,選手として自身が体験した事実内容から,エキスパート指導者に至るまでの体験内容を詳細に分析することで,スポーツ指導の場における教え学ぶ相互作用の全体を多角的に捉え直す作業である。最終年度である本年度は,日本で優れた指導実績を残しているエキスパート指導者3名を対象とし,1対1,深層的,半構造的インタビューにより調査を行った。同時に,調査対象指導者による指導を受けた経験を持つ選手3名を対象とし,選手の視点から捉える指導者の思考・行動について調査を行った。特に,エキスパート指導者の熟達化過程の中でも,指導者としての成長過程における心理的体験に着目して進められた。分析の結果,最終的に指導熟達化モデルは,前年度までの研究成果を受け,(1)指導者としての意識変革,
唾液中フェニトイン濃度を用いた薬物性歯肉増殖症の発症機構に関する研究

フェニトインは、その有効性の高さから広く使用されていう抗てんかん薬である。フェニトインは長期間にわたって連用される薬剤であるため短期間の観察では不十分である。そこで、フェニトインの連用による歯肉増殖症の発症を予防するために、薬物濃度と歯肉増殖症の関連を明らかにする目的で、平成18年度に引き続いてフェニトイン濃度と歯肉増殖症の関係を定期的に観察した。本研究の主旨を十分説明した上で、保護者および本人の協力の得られた新潟大学医歯学総合病院小児歯科診療室を受診中の抗てんかん薬フェニトイン服用中の小児を対象とし、3か月毎にフェニトインの経口投与量、経口投与からの経過時間を記録し、座位にて安静時唾液を5-10ml採取した。また、口腔内診査、口腔内写真撮影、印象採得を繰り返し行い、歯肉の変化量について増加の有無、増加率を算出した。以上により継続的に得られたデータを評価した結果、経口投与後に歯肉増殖症が発症するまでの期間は症例により様々であること、歯肉増殖は口腔内均一に生じる訳ではなく、歯列不正部やプラークコントロール不良部に一致して顕著にみられること、フェニトイン経口投与量に変化がなくても、永久歯の萌出に伴って、萌出部位の歯肉増殖が見られるようになる傾向があることがわかった。乳歯から永久歯への交換に伴い長期にわたって歯肉に生理的な変化が見られる小児においては、更に長期間の観察が望ましい。今後も被験児の試料採得を継続して行い、観察を続ける予定である。抗てんかん薬フェニトインの連用による歯肉増殖症の発症を予防するために、薬物濃度と歯肉増殖症の関連を明らかにする目的で、唾液中フェニトイン濃度と歯肉増殖症の関係を定期的に観察した。本研究の趣旨を十分説明した上で、保護者および本人の協力の得られた、新潟大学医歯学総合病院を受診中の抗てんかん薬フェニトイン服用中の小児を対象とした。対象者には小児歯科診療室を3か月毎に受診してもらい、各受診時に座位にて安静時唾液510mlを採取し、直ちに-20°Cにて凍結保存した。得られた試料は、酵素免疫分析法にて唾液中フェニトイン濃度の測定を試みているところである。各受診時には、フェニトインの経口投与量、経口投与からの経過時間を記録し、萌出歯の歯種、Probing Index、Gingival Bleeding Index、Plaque Ihdex、Bone Index、歯の動揺度を測定した。また、歯肉の状態を正確なデータとして保存するため、デジタルカメラを用いて一定の撮影条件の下に上下顎歯列の口腔内写真を撮影・記録し画像データとし、上下顎の印象採得を行い研究模型を作成した。得られた画像データの分析は、グラフィックソフトAdobe Photoshopを用いて映像処理を行い、歯肉の変化について歯冠の幅を基準値として歯肉面積を算出し、その増加の有無、増加率を算出した。その結果、歯の萌出と歯肉増殖症の発症には何らかの関連性がある可能性が示唆された。フェニトインは長期間にわたって連用される薬剤であり、短期間の観察では不十分であることから、今後も同様な観察を続ける予定である。
渓流沿い植物における狭葉化の適応的意義と遺伝的背景

渓流沿い植物とは、降雨に伴う川の増水によって周期的に水没する渓流帯にのみ生える特殊環境植物のことである。これらの植物は幅の狭い流線型の葉(狭葉)など独特の形態を備えることによって急流の抵抗に耐えている。渓流沿い植物はサボテン科のように特殊環境に適応した一つの祖先種がたくさんの種に分化したのではなく、様々な植物種から独立に何回も進化したことになる。このことは、同じ選択圧下における独立の適応進化過程を複数取り上げることを可能とする。申請者は、鹿児島県屋久島に自生する渓流沿い植物種:ヤクシマダイモンジソウを材料として同種内の林下型(広葉型)との交配実験、生態調査などを行ってきた。その結果、ヤクシマダイモンジソウでは狭葉がたった一つの優性遺伝子によって支配されているらしい(F2世代でl:1や3:1の様な単純な割合に分離する)ことを突き止めた。また、ヤクシマダイモンジソウでは、狭葉と広葉の集団内多型が渓流沿いで見られるが、台風などによる大規模な増水の後には広葉の方が狭葉よりも大きな被害(葉がちぎれるなど)を受けていることも観察した。本年度は、屋久島においてヤクシマダイモンジソウの狭葉型と広葉型の共存する集団を個体識別した上で継続的に観察し、狭葉をもつ個体の生存力と繁殖力を広葉をもつ個体のそれと比較することによって、狭葉を支配する遺伝子をもった個体の適応度を定量的に推定することを試みてきた。これまでの調査データを整理し、とくに増水による葉の損失率、死亡率等を狭葉型と広葉型で比較した結果、増水を経験した個体では、狭葉型の適応度は広葉型の5-7倍になることが分かった。増水を経験していない個体群では、逆に広葉型の適応度の方が狭葉型の3倍程になる。あわせて狭葉化の遺伝子を特定するために,AFLP遺伝マーカーの開発を行った。今後、F2個体を使って狭葉化遺伝子のQTL解析を行う予定である。鹿児島県尾久島においてヤクシマダイモンジソウおよびホソバハグマ・キッコウハグマには葉型にしたがったすみわけが見られる。ヤクシマダイモンジソウは渓流沿いに細葉型と広葉型の個体が同所的に生息しているため、大雨の直後に観察を行うことで被害の差を葉型別に比較することが可能である。本年度は、ヤクスギランド・つつじ河原および荒川ダム周辺でヤクシマダイモンジソウの葉形情報を含む詳しいマップを作成した。また、これらの植物群について、その狭葉化を支配する遺伝子数を推定する目的で古典遺伝学的解析を行っている。その結果、ヤクシマダイモンジソウでは細葉型が一つの優性遺伝子の支配されていること、一方、アイノコハグマの子孫は連続的な葉型の分離を示し、こちらは複数の遺伝子が狭葉化を支配しているという結果が得られている。ホソバハグマ群については、複数の遺伝子で細葉が支配されているので、いったいいくつの遺伝子が関与しているのか、そして各々の遺伝子の細葉に対する効果はどのくらいあるのかを知る必要がある。また、ヤクシマダイモンジソウについては一遺伝子支配であるらしいことがわかったので、その遺伝子に近傍に分子遺伝学的マーカーを見出して,遺伝子を分子遺伝学的に特定したい。いずれの植物群についても、まずそのためには詳細な遺伝子マップを作成する必要がある。現在では、AFLPと呼ばれるほうほうが、この遺伝子マップを作成するためのマーカーとしては優れていることが示されている。今年度は、ABI社製377型DNAシーケンサーと専用のキットを用いてAFLP解析を行うべく、予備実験を行った。いずれの植物群についても複数の多型バンドを検出できることがわかった。

増水を経験していない個体群では、逆に広葉型の適応度の方が狭葉型の3倍程になる。あわせて狭葉化の遺伝子を特定するために,AFLP遺伝マーカーの開発を行った。今後、F2個体を使って狭葉化遺伝子のQTL解析を行う予定である。
ベリーの幾何学的位相情報の工学的応用に関する研究

これまで量子力学やゲージ理論などの純粋な基礎物理学上の問題として研究されてきたベリーの幾何学的位相が3次元微細構造体の精密干渉計測という工学的応用の現実的問題において物体の表面形状の局所的勾配に関する有用な情報を与えることを理論と実験により示した.ベリー位相干渉顕微鏡を試作し,ベリー位相情報の工学的応用の可能性を実証した.1.光子スピン方転位相の検出実験微細3次元構造を持つ物体に円偏光を入射すると物体表面の局所的勾配に応じた波動ベクトルの向きの変化に伴う「光子スピン方転位相」と呼ばれるベリー位相が出現することの実験的検証をおこなった.2.光学系中の光子スピン方転位相の計算コードの開発結像系中の光学素子による光子スピン方向転換や偏光状態の変化を光線追跡しベリー位相を定量評価するための計算モデルを提案し,それに基づくシミュレーションコードを開発した.3.ベリー位相と動的位相の分離技術の確立物体表面の局所的勾配情報を与える2次元ベリー位相像と物体表面までの距離情報を与える動的位相像を分離して精密検出するための偏光制御ヘテロダイン干渉技術を開発した.4.3次元微細構造のベリー位相情報への変換技術の確立物体の3次元微細構造の情報を2次元ベリー位相像に変換するための非平面光路の干渉結像技術を開発した.5.ベリー位相干渉顕微鏡の試作前記3.と4.の技術に基づく偏光制御ベリー位相干渉顕微鏡を設計・試作した.6.3次元微小物体のベリー位相像の観察試作した偏光制御ベリー位相干渉顕微鏡による3次元微小物体のベリー位相像を可視化しその観察と評価実験を行なった.これまで量子力学やゲージ理論などの純粋な基礎物理学上の問題として研究されてきたベリーの幾何学的位相が3次元微細構造体の精密干渉計測という工学的応用の現実的問題において物体の表面形状の局所的勾配に関する有用な情報を与えることを理論と実験により示した.ベリー位相干渉顕微鏡を試作し,ベリー位相情報の工学的応用の可能性を実証した.1.光子スピン方転位相の検出実験微細3次元構造を持つ物体に円偏光を入射すると物体表面の局所的勾配に応じた波動ベクトルの向きの変化に伴う「光子スピン方転位相」と呼ばれるベリー位相が出現することの実験的検証をおこなった.2.光学系中の光子スピン方転位相の計算コードの開発結像系中の光学素子による光子スピン方向転換や偏光状態の変化を光線追跡しベリー位相を定量評価するための計算モデルを提案し,それに基づくシミュレーションコードを開発した.3.ベリー位相と動的位相の分離技術の確立物体表面の局所的勾配情報を与える2次元ベリー位相像と物体表面までの距離情報を与える動的位相像を分離して精密検出するための偏光制御ヘテロダイン干渉技術を開発した.4.3次元微細構造のベリー位相情報への変換技術の確立物体の3次元微細構造の情報を2次元ベリー位相像に変換するための非平面光路の干渉結像技術を開発した.5.ベリー位相干渉顕微鏡の試作前記3.と4.の技術に基づく偏光制御ベリー位相干渉顕微鏡を設計・試作した.6.3次元微小物体のベリー位相像の観察試作した偏光制御ベリー位相干渉顕微鏡による3次元微小物体のベリー位相像を可視化しその観察と評価実験を行なった.本年度(初年度)は、原理確認と実験の準備のための基礎検討を中心として以下の研究を実施した。1.基礎原理の実験的検証(1)非平面3次元光路を持つ立体干渉計を構築し、微細3次元構造を持つ物体に円偏光を入射させ、物体表面の局所的勾配に応じた波動ベクトルの向き(光子スピン方向)の変化に伴う光子スピン方転位相が出現することを実験的に確認した。(2)傾いた鏡面物体を回転させて光子スピン方転位相を測定することにより、物体の局所的勾配と光子スピン方転位相の量的関係を把握し予測値とほぼ一致することを確認した。(3)直線偏光の偏光面の回転角をアナライザーで直接測定し光子スピン方転位相が偏光面の回転により導入されることを確認した。2.光学系の中の屈折・反射による光子スピン方向転換や偏光状態の変化を追跡しベリー位相を定量評価するための計算モデルとシミュレーションコードの開発幾何光学的光線に基づくモデルと回折を考慮したモデルを併用し、計算効率の高いシミュレーションコードを開発した。3.物体表面の勾配情報を与える2次元スピン方転位相像と物体表面までの距離情報を与える動的位相像を分離して精密検出する偏光ヘテロダイン干渉技術の開発干渉縞から検出される位相は動的位相と光子スピン方転位相の重量したものとなる。光子スピン方転位相は円偏光に対して生じることに着目し、入射光の偏光状態を制御してこれらを分離する技術を確立した。これまで量子力学やゲージ理論などの純粋な基礎物理学上の問題として研究されてきたべリーの幾何学的位相が3次元微細構造体の精密干渉計測という工学的応用の現実的問題において物体の表面形状の局所的勾配に関する有用な情報を与えることを理論と実験により示し,ベリー位相情報の工学的応用の可能性を開拓した.その具体的な内容は以下の通りである.1.光子スピン方転位相の検出実験微細3次元構造を持つ物体に円偏光を入射すると物体表面の局所的勾配に応じた波動ベクトルの向き(光子スピン方向)の変化に伴う「光子スピン方転位相」と呼ばれるベリー位相が出現することの実験的検証.2.光学系中の光子スピン方転位相の計算コードの開発

結像系中の光学素子による光子スピン方向転換や偏光状態の変化を追跡しベリー位相を定量評価するための計算モデルとシミュレーションコードの開発.3.ベリー位相と動的位相の分離技術の確立物体表面の勾配情報を与える2次元ベリー位相像と物体表面までの距離情報を与える動的位相像を分離して精密検出する偏光ヘテロダイン干渉技術の開発.4.3次元微細構造のベリー位相情報への変換技術の確立物体の3次元微細構造の情報を2次元ベリー位相像に変換するための偏光制御型の干渉結像技術の開発.5.ベリー位相干渉顕微鏡の試作前記3.と4.の技術に基づく偏光制御ベリー位相干渉顕微鏡の設計・試作.6.3次元微小物体のベリー位相像の観察試作した偏光制御ベリー位相干渉顕微鏡による3次元微小物体のベリー位相像の観察と評価実験の実施.
HIV-1感染抵抗性因子Rac2によるウイルス増殖制御様式の解明

サイトカイン産生制御においてRac2が関与する細胞内情報伝達経路を特定した。また、その産生パターンからHIV-1感染抵抗性の分子機序として、Rac2による炎症性サイトカイン発現制御機構の関与が示唆された。Nefと同様にオートファジー制御因子として働くウイルスタンパク質を同定した。さらに、Rac2はウイルスタンパク質との相互作用を介してオートファジーに影響を与え、結果としてウイルス増殖の制御に関与しうることが示唆された。最終年度に実施した研究の成果Rac2が構成因子となるNADPHoxidaseにはオートファジー誘導能が報告されているが、HIV-1感染時にRac2依存的オートファジーが起こるのかについて報告はない。Rac2がHIV-1感染抵抗性因子であることを我々は発見しており、抵抗性の基盤となる分子作用機序として、Rac2のオートファジー制御によるウイルス分解の促進が考えられた。そこで、交付申請書のH24年度研究計画・方法の通り、Rac2のオートファジー制御活性の検出を試みたが、Rac2過剰発現細胞などにおいてRac2による顕著なオートファジー制御活性を認めることはできなかった。しかし、HIV-1がコードする種々の制御/アクセサリータンパク質を用いた解析の結果、Rac2はVprと結合すること、Nefと同様、Vprはオートファジーを制御することを発見した。これは本研究で初めて明らかにされたVpr活性である。その後、VprがRac2の活性化に影響すること、およびVprはRac2の細胞内局在を変化させることが分かった。以上から、Rac2自身にオートファジー制御能は認められないものの、制御能を持つVprとの相互作用を介して間接的にオートファジーに関与する可能性が示唆された。Rac2/Vprの機能的相互作用を世界に先駆けて明らかにできた点で意義深く、ウイルス制御に向けた新たな展開に繋がる重要な知見が得られた。研究期間全体を通じて実施した研究の成果平成23年度にはサイトカイン産生におけるRac2の新機能を発見すると共に、Rac2が発揮するHIV-1感染抵抗性の分子機序として、Rac2による炎症性サイトカインの発現制御機構が示唆された。平成24年度にはNefと同様、Vprがオートファジー制御因子として働くこと、Rac2はVprと結合することでオートファジー制御に関与しうることが示唆された。低分子量Gタンパク質であるRac2がCCR5発現を減少させ、かつCCL5発現を上昇させることでHIV-1感染抵抗性因子として働くことを以前に発見している。また、上記機構に加えて、別の機構の関与を示唆する結果が得られている。本研究の目的はこの未知の機構を明らかにすることである。HIV感染への炎症性サイトカインの関与について数多く報告があり、Rac2による抗HIV-1活性の分子機序の一つである可能性がある。そこで、交付申請書の通り、平成23年度はRac2による炎症性サイトカイン産生の制御機構について解析した。まずRac2発現を抑制した細胞と親細胞にLPSを加え培養し、経時的に上清中のTNF alphaとIL6を定量した。Rac2抑制によりTNF alpha発現量が数千倍上昇し、IL6は1/20程度に低下していた。次に、上記細胞のサイトカインmRNAを定量したところ、上清中のサイトカイン量と正に相関した。従ってRac2による制御はmRNA発現の段階であることが分かった。LPS刺激後に阻害剤により転写を抑制し、mRNAの分解を定量したところ、Rac2に非依存的であった。つまり、Rac2によるmRNA発現調節は転写開始の段階であることが示唆された。次に、LPS刺激時に活性化されるシグナル分子の解析により、Rac2はMAPKおよびIRFの活性化に寄与しないが、NFkBの活性を持続させることが分かった。持続された活性が幾つかの下流の遺伝子群の発現に必要であり、結果としてIL6およびTNF alphaの転写が制御されていると分かった。本研究によりサイトカイン産生におけるRac2の新機能が発見でき学術的に意義が深く、また、Rac2が担うHIV-1感染抵抗の分子機序として、Rac2による炎症性サイトカインの発現制御機構が示唆された点、重要な知見である。平成23年度においては、Rac2による炎症性サイトカイン産生の制御機構について解析し、それがHIV-1感染抵抗性因子としての分子機序として機能しうるのか検討することを計画した。計画した研究を実行できた点、またほとんどの実験において詳細な比較解析に資する結果が得られた点、評価できる。炎症性サイトカイン産生を刺激する際に主にLPSを使用することで再現性の高い結果を得ることができ、実績報告ではおもにそれについて記述したが、実際はLPS以外のサイトカイン誘導刺激についても実験を行っており、LPS使用時の結果との比較解析を完了している。これらについて当初の研究計画よりも進行している。現在、得られた知見を公開すべく、論文を作成している。本研究の申請書では、Rac2が関与する宿主免疫システムの理解を学術的な特色・目的の一つとして挙げた。

本研究により炎症性サイトカイン産生におけるRac2の新たな機能を解明できた点、計画通り進行していると考えられる。また、これらの結果はHIV-1感染症にとどまらず、サイトカイン産生の異常に起因すると考えられている様々な疾患(クローン病等)に対する基礎医学研究にも貢献することができ、学術的に大変重要な知見と位置付けられる。さらにRac2が関与すシグナル伝達経路の同定のみならず、その作用機序にまで迫れた点当初の計画よりも進行することができた。これまでのところ本研究の交付申請書の計画に沿って研究が進んでいる。第一に優先する研究として申請書に記載した平成24年度の研究計画に沿い研究を進めていく。また、平成23年度に得られた成果を論文として発表する。その成果は24年度に計画されている研究と密接につながっており、両成果を同時に考察することで、本研究課題である、HIV-1感染におけるRac2機能全体像の解明を相乗的に遂行できるものと期待される。そこで、23年度に得られた成果をさらに発展させる研究を同時に行う。特に、Rac2発現を抑制した細胞にLPS刺激を施した際、発現を抑制していない細胞に比べて数千倍の発現増強が確認されたTNF alphaの産生について、より理解を深めていく。この分子機序は23年度に明らかにした分子機構に加えて、さらに別の機構の関与も示唆される結果を得ている。TNF alphaがHIV-1感染に関与することからも、Rac2によるTNF alpha発現制御の理解を深めていくことは重要であり、かつ本研究の元来の計画に沿ったものである。平成23年度に生じた「次年度使用額」は、可能な限り効率よく研究費を使った結果として生じた残額(1,802円)であり、24年度に価格の高い物品を購入するため等に生じたものではない。24年度の研究費と合わせて有効に研究に活用する。平成24年度も申請書に記載した研究計画に従い研究を進める。具体的にはまず、Rac2がオートファジーを促進するか調べる。次に、Rac2とNefとの結合を共免疫沈降法により調べ、結合に必要なドメインを決定する。さらに、Rac2機能がNefの共発現により抑制されるのか調べる。別に、末梢血単核球にHIV-1またはNef欠損HIV-1を感染させ、各ヒトのRac2発現量依存的なオートファゴソームの形成・機能が認められるか検討する。また、Rac2の効果がNef依存的に抑制されるか調べる。以上の実験のために次のものを研究費により購入する。Rac2およびNef発現ベクターを作成・調整するためのオリゴDNA、ベクター、各種酵素類、コンピーテントセル、大腸菌用培地、抗生物質、DNA抽出試薬および一般試薬、作成した発現ベクターを細胞に導入するための導入試薬、オートファジー関連因子であるLC3タンパク質を検出するための抗体、および蛍光ラベル化された2次抗体、オートファジー阻害薬、培養細胞のための培養用培地、血清、プラスチック製品。共免疫沈降法に使用する各種抗体、ビーズ。ウイルス調整のための試薬類。HIV-1定量のためのp24 ELISA
哺乳類卵の減数分裂制御に対するＬＴＲトランスポゾンの関与の検討

寄生遺伝子と考えられているLTR-トランスポゾン(Te)が哺乳類卵の減数分裂制御に寄与するかを、ブタ卵を用いLTR-Te抑制に関与するpiRNA合成系への関与が精巣で示されているMaelstrom(MAEL)を用いて調べた。ブタMAELをクローニングし、ブタ卵とブタ精巣のMAELは分子量が異なることがわかった。ブタ卵の減数分裂を通してmRNAは存在し、タンパク質は減数分裂の進行に伴い減少した。MAELの発現制御により機能解析を行ったが、紡錘体微小管に変化は無く減数分裂の進行は影響を受けていなかった。以上より、LTR-Teの哺乳類卵の減数分裂制御への寄与を示すには至らなかった。本研究では寄生遺伝子と考えられているLTR-Teが哺乳類卵の減数分裂に寄与している可能性を探ることを目的とし、人為的にLTR-Teの量を変化させ、卵の減数分裂に起こる変化を調べることとした。そこで当初はLTR-Te抑制に関与するpiRNA合成系の因子であるPIWIの人為的変化を行ったが、予定通りのLTR-Teの変動を得ることができなかった。そこで当初の予定を変更し、同じpiRNA合成系への関与が雄で示されているMaelstrom(MAEL)を用いることにし、既に昨年度にMAELのクローニングは終了し、遺伝子バンクに登録されている配列と1塩基異なることを見出している。本年度は哺乳類卵における存在、変動、局在等の結果に加え、MAELのmRNAとアンチセンスRNAをin vitro合成し、ブタ卵への注入実験を行い、減数分裂進行に対する作用を調べた。その結果、mRNAは減数分裂を通して存在し、タンパク質は減数分裂の進行に伴い発現が減少することが判明した。また、ブタ卵母細胞のMAELはブタ精巣のMAELと分子量が異なることがわかった。次にMAELの発現阻害および過剰発現により機能解析を行った。核相観察の結果、減数分裂の進行は影響を受けていなかった。また、MAELを過剰発現させた卵母細胞の紡錘体を確認したが、微小管に変化はなかった。MAEL抗体による卵母細胞の内因性MAEL局在は検出が困難であったため、FLAGタグを付加したMAELを発現し局在を確認したところ、細胞質全体に存在しgranule状に局在してはいなかった。以上より、ブタ卵母細胞にMAELは存在し、減数分裂の進行に伴い発現が低下すること、ブタの卵母細胞と精巣のMAELは分子量が異なることから、ブタのMAELにはisoformが存在することが示唆された。しかし、MAEL発現抑制や過剰発現は減数分裂や微小管に影響を与えなかったこと、またgranule状に局在していないことから、卵母細胞内でMAELはgerm granuleの構成因子として機能している可能性は低いと考えられた。本研究では、哺乳類ゲノム中に多数存在し、通常は寄生遺伝子として我々に害を与えると考えられている内在性レトロウイルス由来のLTR転移因子(LTR-Te)が、実は害を与えるのみではなく哺乳類がこれを利用し、我々の生理作用に関与しているとの報告に注目し、予備実験の結果も踏まえ、LTR-Teと減数分裂再開に関連があるとの仮説を立て研究を行った。具体的には人為的にLTR-Teの量をさせた卵に起こる変化を詳細に調べること目的とした。ブタ卵を材料に用い、LTR-Teの量を変化させる方法として、当初はLTR-Te抑制に関与するpiRNA合成系の因子であるPIWIの人為的変化を計画した。しかしPIWI発現量の人為的変化では期待通りのLTR-Teの変動を得ることができなかった。そこで当初の予定を変更し、同じpiRNA合成系への関与が雄で示されているMaelstrom(MAEL)を用いることにし、ブタMAELの遺伝子をクローニングした。その結果、遺伝子バンクに登録されているブタMAELの遺伝子配列は1塩基間違っていることを見出した。また、哺乳類卵におけるMAELの存在、変動等を調べた。その結果、哺乳類卵には2種類の分子量のMAELが存在し、そのいずれも精巣内のMAELとは分子量が異なること、卵の成熟開始とほぼ同時に恐らくリン酸化されSDS電気泳動ではシフトアップが起こること、成熟に伴い発現量が減少することを哺乳類卵で初めて明らかにした。なお、免疫染色によるMAELの局在の解析も試みたが信頼のおけるシグナルが得られなかった。今後MAELのmRNAとアンチセンスRNAをin vitro合成し、ブタ卵への注入実験を行いLTR-Te量を変化させ、減数分裂進行に対する作用を調べていく予定である。LTR-Teの量を変化させる方法として、当初はLTR-Te抑制に関与するpiRNA合成系の因子であるPIWIの人為的変化を計画した。

すなわちブタPIWIであるpPIWIL1およびpPIWIL2の遺伝子をクローニングし、この発現を抑制してpiRNA合成系を阻害することによってLTR-Teの発現を高める予定であった。しかしPIWI発現量の人為的変化では期待通りのLTR-Teの変動を得ることができなかったことは誤算であり、そのため順調に推移しているとは判断し難い状況である。なお上にも記したが、当初の予定を変更し同じpiRNA合成系への関与が雄で示されているMAELを用いることにして、ブタMAELの遺伝子クローニングにとりかかった。これは既に終了しており、遺伝子バンクに登録されているブタMAELの遺伝子配列が1塩基間違っていることを見出すに至っている。さらに、哺乳類卵におけるMAELの存在、変動等も既に調べ、結果を得ているため、達成度としてはやや遅れているとした。今後MAELのRNAをin vitro合成し、ブタ卵への注入実験を行いLTR-Te量を変化させ、減数分裂進行に対する作用を調べていく予定である。なお、作成するRNAは全長のmRNAおよび部分配列に対するアンチセンスRNAとする。全長mRNAは過剰発現に、アンチセンスRNAは発現抑制に使用する。また、免疫染色によるMAELの局在解析では信頼のおけるシグナルが得られなかったため、FLAGをタグを付加したMAELを発現するmRANの合成も行い、抗FLAG抗体を用いてMAELの局在解析も行う予定である。MAELの発現量を人為的に変化させLTR-Teを操作できるかを確認した上で、卵の減数分裂の進行を核相観察と免疫ブロットによる減数分裂関連因子の動態解析により、また紡錘体の形態などについて、光学顕微鏡による染色体の状態観察と紡錘体構成因子の免疫染色と通して詳細に調べていく予定である。研究材料のブタ卵は屠場(東京芝浦臓器:品川)より購入した卵巣(1個250円)より採取する。試薬としては遺伝子工学用の各種制限酵素、DNA/RNAの合成/分解酵素、PCR用プライマーが主で、卵培養、免疫ブロット、免疫染色、酵素活性測定の試薬が加わる。またキットとしてRNAのin vitro合成、免疫ブロットのバンド検出などが必要になる。抗体は、減数分裂の状態を調べるための細胞分裂関連因子、およびタグに用いるFLAGに対する免疫ブロット用、免疫染色用の一次抗体、および検出用の二次抗体である。プラスチック器具としてはチップ、各種チューブ、培養シャーレ、ろ過滅菌フィルター、注射筒、ポリ手袋等で、多くは使い捨てとせざるを得ず、毎月大量に消費する。さらに顕微注入用のピペット作成、および卵操作用のキャピラリーピペットの作成用にガラス器具としてガラス管、パスツールピペットも必要になる。以上、次年度の研究費は大部分がお消耗品費とする必要があり、本研究で得られた結果を国内の学会で公表するための国内旅費を5万円、また、本実験の遂行にあたり、実験補助をお願いする場合があり謝金を5万円計上し、残りを消耗品費とする。
不均質媒質の拡散現象の数理的研究

土壌のような不均質媒質における汚染物質の拡散現象に関して、古典的な偏微分方程式である移流拡散方程式は有効なモデルではないことが知られており、保全対策のための有効な数理的基盤を与えるために連続時間ランダムウォークによるミクロモデルとマクロモデルとしての非整数階拡散方程式の研究を実施した。成果は以下の通りである:1.ミクロモデル(連続時間ランダムウォーク)とマクロモデル(非整数階拡散方程式)を関連付けて研究し、より精度のよいモデル化を提案した。2.モデルの精密な数学解析特に、解の一意存在や漸近挙動を明らかにした。3.汚染源決定逆問題の数学解析、数値手法の開発。環境問題の研究には政策など社会との強い関りを持つ面もあるが、それらの整備を合理的に支えるためにも定量的な数理的研究の推進が強く求められている。本研究では、以下の環境問題に関連した不均質媒質の拡散現象の数学・工学・産業を横断した数学協働研究体制を目指している:(1)土壌などの環境問題に代表される大規模系を取り扱うために連続時間ランダムウォークモデルなどのミクロレベルでの確率論的手法とマクロレベルでの非整数階の偏微分方程式論を総合したモデルの構築。当該年度ではフラクタルモデル、多孔性媒質モデルなど可能な複数のモデルのサーベイを行い、時間空間方向に複数の非整数階の微分の項を含む方程式の数学解析も実施した。(2)そのような非整数階の偏微分方程式の解の一意存在や漸近挙動、および非整数階の非線形システムが与える力学系などの研究を実施した。(3)前段階で確立された非整数階偏微分方程式論に基づいて汚染源決定などの環境問題における逆問題手法の数学解析の実施。さらに、数学解析の結果を実験と比較するために、工学・数学の連携による共同研究を行い、特にラボ実験の結果の解析・整理を行った。欧米では非整数階拡散方程式の物理的研究は多くあるものの偏微分方程式論的な研究は極めて少なく、この分野でイニシャチブを確保するために連携を密に保つためことに努めた。本研究では、以下の環境問題に関連した不均質媒質の拡散現象の数学・工学・産業を横断した数学協働研究体制を目指した:(1)土壌などの環境問題に代表される大規模系を取り扱うために連続時間ランダムウォークモデルなどのミクロレベルでの確率論的手法とマクロレベルでの非整数階の偏微分方程式論を総合したモデルの構築。その結果、非整数階偏微分方程式に関して今後の研究の数学的な研究の基礎となる理論が確立できた。(3)前段階で確立された非整数階偏微分方程式論に基づいて汚染源決定などの環境問題における逆問題手法の数学解析を行った。環境研究には政策など社会との強い関りを持つ面もあるが、それらの整備を合理的に支えるためにも定量的な数理的研究の推進が強く求められている。平成23年度にフラクタルモデルなど可能な複数のモデルのサーベイを行い、時間空間方向に複数の非整数階の微分の項を含む方程式をモデルとすることにした。(2)そのような非整数階の偏微分方程式の解の一意存在や漸近挙動、および非整数階の非線形システムが与える力学系などの研究を開始した。(3)前段階で確立された非整数階偏微分方程式論に基づいて汚染源決定などの環境問題における「逆問題手法」の開発。

欧米では非整数階拡散方程式の物理的研究は多くあるものの偏微分方程式論的な研究は極めて少なく、この分野でイニシャチブを得るために物理的な観点での研究者との連携を密に保つためことが重要であり、専門的知見の提供を仰いだ。ラボ実験を通じての物理モデル式と現象の照合がうまくいっていること、ならびに数学理論の構築も進んでいることから。最大の課題の1つであるモデル式の確立に概ね成功したことから。(1)モデル式の精密化(2)ラボ実験とのモデル式の照合(3)フィールド実験との照合(1)モデル式である時間と空間方向に複数の非整数階の微分の項を含む微分方程式の解の一意存在などの理論の完成(2)ラボ実験でのデータとの照合とモデル式の修正(3)関連する逆問題の数学解析(1)モデル式の精密化:研究打ち合わせ旅費を形上した。また、工学など異分野での知見のとりこぼしをなくし、優先権を確保するための講演や専門的知見の提供をあおぐための旅費と講演謝金を形上した。(2)ラボ実験とのモデル式の照合、(3)フィールド実験との照合:研究打ち合わせ旅費を計上した。ラボ実験をもとにした議論が一層重要になるので研究打ち合わせ旅費を計上した。該当分野の数学解析の研究は世界的にみて極めて数少ないが、物理的な研究成果は欧米では充実している。本研究計画で挙げる成果を国際基準で評価するために欧米の専門家を1週間程度招聘するための招聘旅費を計上した。研究代表者または分担者が1回7日程度、ヨーロッパに出張する。物理・工学分野の関連する広範知見の収集のために専門的知識の提供をうけるための講演謝金を形上した。研究課題に関する、物理などの関連分野における文献などは数多い。それらの知見を学習するための図書購入費も計上してある。
入院から在宅への移行支援における継続看護支援モデルの構築

本研究では、入院から退院、在宅療養に至る過程における退院の決定、退院計画、退院指導、退院後のケア継続の現状と課題を明らかにし、療養者・家族が安心して円滑に在宅療養に移行できるための継続看護支援モデルの構築を図ることを目的とした。1.平成17・18年度は近畿県内の訪問看護ステーションにおける移行支援、連携について調査を実施した。訪問看護ステーションからみた病院の退院指導についての問題点として、在宅生活に対応していないこと、退院指導の習熟度が不十分であると退院後の不安が高いことが明らかになった。移行支援の連携は、病院からの場合と居宅介護支援事業所からの場合が半数ずつであった。訪問看護ステーションへの連携を医療機関がとってくる場合と居宅介護支援事業所の場合による連携状況を検討した結果、療養者の主疾患の違い、訪問看護師の退院前訪問および合同カンファレンスの実施率が医療機関の場合に高く有意な差が見られた。2.平成19年度は、近畿県内の一般病床200床以上を有する病院の地域医療室および退院支援看護師に対する調査を実施した。退院指導は、病棟看護師と退院調整看護師の双方が実施していた。また、病院における退院調整は、MSWと退院調整看護師が中心であり、地域との調整はMSWが中心的役割を担っていた。3.以上の結果より、MSWや病棟の医師、看護師、関係職種との調整、スクリーニングシートや連携パスの活用、院内の情報システムの活用、地域の関係機関との連携による退院調整看護師を有効に機能させるための継続看護支援モデルを構築した。本研究では、入院から退院、在宅療養に至る過程における退院の決定、退院計画、退院指導、退院後のケア継続の現状と課題を明らかにし、療養者・家族が安心して円滑に在宅療養に移行できるための継続看護支援モデル(以下、支援モデル)の構築を図ることを目的とする。平成17年度は、近畿県内の訪問看護ステーションにおける移行支援、連携について質問紙調査を実施した。調査は、調査1として平成17年12月の訪問看護の実績および退院指導の問題、調査2として、12月の新規利用者についての入院中の看護援助、退院調整と退院指導の内容、連携活動について調査を行った。<調査結果>調査は、近畿圏のWAMネットに登録されている訪問看護ステーション1065箇所に調査票を郵送して、郵送にて回収した。回収状況は、353施設より回答が得られた(回収率33.1%)。新規利用者調査(調査2)は、317人の回答が得られた。調査1のステーションの訪問看護の1ヶ月の利用者数は平均52.0(SD35.1)人、新規利用者数は平均1.4人であった。退院前病棟訪問は、96.9%が必要と答え、必要な状況は、医療依存度が高い(83.3%)、家族の不安(72.2%)、本人の不安(67.9%)、病状が不安定(66.7%)の項目が多くなっていた。退院指導に訪問看護師が関わることの必要性は、90.1%が必要と答えていたが、問題として、病院からの要望がない(58.6%)、依頼から退院までの期間が短い(53.4%)、採算が取れない(46.9%)、時間が取れない(42.9%)が挙げられていた。調査2の新規利用者の年齢は、平均75.1歳、要介護度は、要介護4と5をあわせて40.0%であった。介護保険利用55.8%、医療保険利用が31.9%であった。医療処置は70.3%にあり、褥創、膀胱留置カテーテル、疼痛管理、在宅経管栄養、在宅酸素が主な内容であった。退院指導に対する要望は38.8%に見られ、訪問看護師が関わるとよい退院指導は42.9%に見られた。

移行支援の連携は、病院からの場合と居宅介護支援事業所からの場合が半数ずつであった。訪問看護ステーションから入院中に退院前病棟訪問が行われたのは46.4%、関連機関との合同カンファレンスは30.6%で実施されていた。<今後の研究課題>調査の詳細な分析を行い、退院指導への訪問看護師の関与について基礎資料を作成する。また、支援モデルの構築のために、看護職と介護支援専門員による連携について、比較分析を行う。その結果より、次年度の取組みとして、訪問看護の退院指導への参加による効果について介入調査を行う予定である。本研究では、入院から退院、在宅療養に至る過程における退院の決定、退院計画、退院指導、退院後のケア継続の現状と課題を明らかにし、療養者・家族が安心して円滑に在宅療養に移行できるための継続看護支援モデル(以下、支援モデル)の構築を図ることを目的とする。平成18年度は、17年度に実施した近畿県内の訪問看護ステーションにおける移行支援、連携についての調査結果の分析を行った。<調査結果>調査は、近畿圏のWAMネットに登録されている訪問看護ステーション1065箇所に調査票を郵送して、郵送にて回収した。回収状況は、353施設より回答が得られた(回収率33.1%)。新規利用者調査(調査2)は、317人の回答が得られた。調査1のステーションの訪問看護の1ヶ月の利用者数は平均52.0(SD35.1)人、新規利用者数は平均1.4人であった。退院前病棟訪問は、96.9%が必要と答え、必要な状況は、医療依存度が高い(83.3%)、家族の不安(72.2%)、本人の不安(67.9%)、病状が不安定(66.7%)の項目が多くなっていた。退院指導に訪問看護師が関わることの必要性は、90.1%が必要と答えていたが、問題として、病院からの要望がない(58.6%)、依頼から退院までの期間が短い(53.4%)、採算が取れない(46.9%)、時間が取れない(42.9%)が挙げられていた。調査2から新規利用者の年齢は、平均75.1歳、要介護度4と5をあわせて40.0%であった。介護保険利用55.8%、医療保険利用が31.9%。医療処置は70.3%にあり、褥創、膀胱留置カテーテル、疼痛管理、在宅経管栄養、在宅酸素が主な内容であった。退院指導に対する要望は38。8%に見られ、訪問看護師が関わるとよい退院指導は42.9%に見られた。退院指導の実施率は、医療処置が必要な場合で66.5%、常時介護を要する場合で59.3%であった。習熟度は十分が35.3%と低い状況であった。訪問看護ステーションへの連携を医療機関がとってくる場合と居宅介護支援事業所の場合による連携状況を検討した結果、療養者の主疾患の違い、訪問看護師の退院前訪問および合同カンファレンスの実施率が医療機関の場合に高く有意な差が見られた。<今後の研究課題>調査結果から看護職と介護支援専門員による連携について比較分析を行ない、さらに文献検討より、支援モデルの構築のために、次年度の取組みとして、訪問看護の退院指導への参加による効果ついて調査を行う予定である。本研究では、入院から退院、在宅療養に至る過程において、療養者・家族が安心して円滑に在宅療養に移行できるための継続看護支援モデル(以下、支援モデル)の構築を図ることを目的とする。平成19年度は、近畿県内の一般病床200床以上を有ずる病院の地域医療室および退院支援看護師に対する調査を実施した。
口腔癌進行におけるｐ６３の発現消失とＷｎｔシグナルの活性化

TP63(p63)はTP53(p53)がん抑制遺伝子ファミリーの1つで、外胚葉性上皮組織(皮膚や口腔)の発生に不可欠な遺伝子である。p63は多くの口腔癌の高分化型で高発現するが、浸潤した細胞では消失するので、悪性化を抑えると推測される。本研究では癌の浸潤と関係するWnt/β-cateninシグナル伝達とその標的遺伝子発現からp63の作用を解析した。その結果、p63はシグナル伝達には影響せず、主要p63タンパク質(ΔNp63α)がTCF(DNA結合タンパク質)と相互作用し、Wnt標的遺伝子の活性化を阻害することがわかった。p63はこの作用により口腔癌の進行を抑制する可能性が強い。TP63(p63)はがん抑制遺伝子TP53(p53)ファミリーに属するが、p63の癌での変異はまれで、口腔・咽頭由来の扁平上皮癌の高分化型で高レベルに発現する。扁平上皮癌の悪性転化とp63の発現消失は相関するので、p63による遺伝子発現の調節に着目した。下咽頭由来扁平上皮癌細胞FaDuでp63のノックダウンを行い、遺伝子発現プロファイルを行った結果、p63ノックダウン細胞では(1)p63標的遺伝子NOTCH1, JAG2 ,COL7A1,などの発現が1/2ー1/3に低下した、(2) p53標的遺伝子のGADD45A, BAXが1/5以下に低下した、(3)未分化ケラチノサイト(基底細胞)に特異的なKRT5, KRT14などの発現が1/3ー1/7に低下した、(4) Wntシグナル標的遺伝子で、癌の浸潤を誘導するMMP7(Matrix metalloproteinase-7)の発現は5倍以上亢進した、(5)その他のWnt標的遺伝子CCND2, Mycなどは1/2ー1/6に低下した。これらの結果から、(A)p63はp63標的遺伝子およびp53標的遺伝子の一部を発現増強する、(B)p63はケラチノサイト幹細胞(基底細胞)に特異的な遺伝子発現と密接に関連する、(C)p63はMMP7を抑制し、p63の消失による悪性転化を合理的に説明できる、(D)p63はWnt標的遺伝子を発現増強する、などが示唆された。TCF/LEF-結合配列(Wntシグナル標的遺伝子配列:WRE)を用いたLucレポータ・アッセイにより、p63のアイソフォームのうちΔNp63αだけがWRE依存性に遺伝子発現増強作用を示した。核抽出液での免疫沈降によりTCF-4とΔNp63αの会合が確認された。そこでクロマチン沈澱法(ChIP)によりp63、TCF-4、βカテニンについて解析したところ、ΔNp63αがTCF-4、βカテニンとともに特定のWRE配列に結合し、Wntシグナルを増強している可能性が示唆された。ただし、MMP7の上流にはp53/p63標的配列(p53RE)のクラスターがあり、ΔNp63αが結合して発現を抑制する可能性も考えられた。p63 (TP63)はp53ファミリーの遺伝子で、ケラチノサイト幹細胞で発現し、細胞増殖能の維持や分化の制御に重要である。また、口腔、皮膚、乳腺に由来するがんで高発現し、細胞の腫瘍化にも深く関係している。扁平上皮がん細胞FaDuでp63をノックダウンし、遺伝子発現プロファイルを解析したところ、CCND2(cyclin D2)、SNAI2/SLUG、DKK3を含むWntシグナル標的遺伝子の発現低下が見られ、RT-PCRなどで確認された。Wnt response element (WRE)配列によるルシフェラーゼ遺伝子レポーター・アッセイで、扁平上皮がんで最も優勢に発現しているΔNp63αアイソフォームがTCF4とβカテニン存在下で強く発現誘導した。ΔNp63αはGSK-3βの脱リン酸化酵素であるprotein phosphatase 2A (PP2A)の制御因子B56α(PPP2R5A)と結合することが報告されており(Patturajan M, Cancer Cell. 2002;1(4):369-79)、実際PP2Aで免疫沈降するとB56αとΔNp63αが共沈した。しかし、細胞質と核内でのPP2Aの活性はp63ノックダウンにより影響を受けず、GSK-3βのリン酸化も、βカテニンの核移行も、変化しなかった。すでに報告されているように(Drewelus I, Cell Cycle. 2010;9(3):580-87)

核抽出液から免疫沈降するとΔNp63αはTCF4と結合していたが、βカテニンとΔNp63αの結合は検出されなかった。多くの組織の腫瘍化過程でAPCの変異などによるWntシグナル伝達の活性化が起こるが、p63が発現している扁平上皮がんでは、核内でΔNp63αがTCF/LEFと相互作用してWnt標的遺伝子発現を増強すると考えられる。p63(TP63)はp53(TP53)癌抑制遺伝子ファミリーの1つで、口喉咽頭由来の扁平上皮癌、尿路上皮癌の高分化型の癌細胞で高レベル発現する。p63の発現消失が癌の悪性転化を誘導する機構を明らかにするため、本研究を行った。1.扁平上皮癌細胞でp63をノックダウンし、遺伝子発現プロファイル解析を行った。p63標的遺伝子、p53標的遺伝子、分化関連遺伝子に加えて、Wnt/β-カテニン標的遺伝子に再現性のある変化が認められた。しかし、一部のWnt/β-カテニン標的遺伝子(MMP7、AXIN2等)ではp63による発現抑制が、他方(CCND2、SNAI2等)では発現促進が示唆され、RT-qPCRでも確認された。2.標準ベクターとして用いたpGL3-OT-lucはWnt response element (WRE)を3コピー持ちルシフェラーゼ(luc)を発現する。HEK293ではβ-カテニン依存性luc発現がp63の主要アイソフォームΔNp63αによって活性化された。しかし、pGL3-OT-lucにp53ファミリー結合モチーフ(p53FM)の存在を見出し、これを欠失させるとΔNp63αによる活性化が消失した。また、SAOS2細胞ではp53FMの有無に関わらず、β-カテニン応答性のluc発現をΔNp63αが抑制した。3.MMP7およびCCND2の制御領域に存在するWRE配列について、p63の影響を検討した。どのWREもβ-カテニンで活性化され、ΔNp63αはこれを抑制した。4.FaDu細胞でp63をノックダウンし、免疫染色と細胞質/核画分によりシグナル伝達系の変化を解析した。p63とβ-カテニンの核移行に関連性はなかった。以上の結果はp63が核内でWREを抑制することを示し、p63の消失によるWnt/β-カテニン経路の増強が浸潤能を獲得する機構の1つと考えられる。細胞生物学扁平上皮癌においてp63(ΔNp63α)がTCF/LEFと結合することによりWntシグナルを増強する機構が明らかになりつつある。従来はWnt標的遺伝子MMP7がp63により抑制されていることからp63はWntシグナル伝達を抑制すると考えられてきた。しかし、本研究によりMMP7遺伝子上流配列にこれまで知られていなかったp53REのクラスター領域が検出され、この領域におそらくp53RE抑制型のΔNp63αが直接結合していることが強く示唆された。p63によるWntシグナル増強作用とMMP7抑制作用が矛盾なく説明されつつある。本研究はp63の発現調節がWnt/βカテニンシグナル伝達系を介して口腔癌の発症に関係するものと考えて発案した。つまり口腔癌発症において、Wntシグナルがp63により直接調節される機構を想定していた。実際p63ノックダウン細胞ではWnt/βーカテニンシグナルターゲット遺伝子(CCND2, SNA12,DKK3等)ではグローバルな発現解析の結果強い翻訳抑制がみられた。さらにΔNp63とTCF-4及びβカテニン遺伝子を導入した細胞を用いたLucレポーター解析でWnt/βカテニンシグナルターゲット遺伝子発現が、強く活性化された。ところがChIP解析を行うとWREに結合するLEF/TCFβーカテニン複合体とはWRE上では結合していないことが判明した。