hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光架橋反応を用いた１９ＦーＮＭＲによる核酸類検出法の開発

また、小分子型の核酸検出プローブとしてビスベンジイミド誘導体を報告しており、バルジアウトした塩基を識別することに成功した。その他、化学反応を組み込んだケミカルシフトの変化を用いた検出法という概念は核酸類の検出だけでなく、様々な分子の検出にも利用可能であり、OPA反応を改良することにより遊離アミノ酸を19F NMRにより同時一斉検出可能であることを実証した。19F NMRのケミカルシフトを用いた核酸類検出法は、生体バックグラウンドが皆無であり、高い生体透過性を有することから、生体内などの夾雑試料中での核酸検出法として注目されている。本研究では、夾雑試料中でもB/F分離可能な大きなケミカルシフトの変化(8.0 ppm)を誘起可能な新規核酸類検出法(19F NMRを用いた核酸類検出法)を開発した。さらに、実際の生体内に存在する核酸濃度は低い為、増幅系を組み込んだ配列選択的な核酸類検出法を開発し、最終的にnmスケールの核酸類の検出にも成功した。5トリフルオロチミジンを標的架橋ピリミジンとして用い実際に366 nmの光照射を行ったところ、光架橋により8 ppmのケミカルシフト変化が見られ、既存の核酸検出プローブの約16倍のケミカルシフト変化を示した。現時点で世界最高のシフト幅を実現できているものと考えられ、in vivoなど夾雑試料中での核酸検出に向けて重要な反応開発に成功していると考えられる。またDNA結合小分子にフッ素を埋め込んだ人工小分子を設計・合成しそれを用いることで配列選択的なイメージングが可能であることも実証できており、これらも併せて当初の計画以上に進展していると判断した。平成27年度の成果より、nMオーダーの少量RNAを増幅しながら19FNMRを用いてシグナル解析可能であることを見出している。そこで、本手法による細胞内RNA検出の可能性を探るため、ヒト細胞内で比較的細胞内の存在量の多い、28S rRNAを標的とするプローブを合成する。報告されている28SrRNA用の蛍光プローブ(Abe H. et al., PNAS, 2006)を参考に配列設計を行う。標的配列をもつ合成オリゴRNAを用いてプローブの機能評価(19F NMRによる標的RNA検出能力)を行った後、パラホルムアルデヒド等で固定したヒト白血球細胞(HL60)の懸濁液に添加・光照射後、19F NMR測定を行い、そのケミカルシフト変化から、細胞内RNA検出能力を評価する。28年度が最終年度であるため、記入しない。核酸化学26年度開発した二つの反応系、1光架橋により8 ppmのケミカルシフト変化を誘起できる光クロスリンクを用いた核酸検出系、2フッ素を埋め込んだ人工核酸結合小分子を用いた配列選択的イメージング系、これらについて、様々な反応系(配列、周辺環境、濃度)について反応解析を行いながら、ケミカルシフト誘起の機構、配列選択的なDNA結合に関する分子機構を明らかにする。またこれらの機構に基づいて分子開発、核酸検出に関するシステム開発を行い、例えば8 ppmのケミカルシフト変化を誘起できる光クロスリンクを用いた核酸検出であれば実際にナノメートルオーダーのマイクロRNAを夾雑物の中から検出できるか検討を行う。
環太平洋北部地域の僻地教育に関する比較研究

本年度の研究では過去2年間の研究の継続として、環太平洋北部地域、特にアラスカ、ロシアマガダン地域のへき地の様相を浮きぼりにすることによって我が国のへき地諸学校と地域の文化的教育的機能の特徴を明らかにしよと努めている。本研究の視点は、シベリア、アラスカ、北海道という三極関係の中での小規模校の比較研究から浮びあがってくる「地域社会と学校」「自然の中での子どもの生活」「少数、先住民族の教育(アイヌ、シベリア諸族、エスキモー)」等の問題を通して、地域社会の教育力の回復、自然環境を守る教育、差別の克服といった課題の克服に向けられている。平成7年6月に、後藤、門脇がマガダン国際教育大学をベースにして現地調査および関連文献の収集を実施した。また、後藤はアラスカの小規模校の訪問調査を平成8年3月に実施し、学校の雰囲気を授業場面の直接観察を通して資料の収集を進め、さらに、学校関係者およびアラスカ大学側研究分担者から、地域住民の様子について説明を受け、関連資料の入手をした。北極圏内にあるこの地域(アナクトビックパス村)は交通の便は非常に限られた地理的条件にあるが、コンピユ-タシステムを導入した教育を進めており、インターネットの導入のため基礎作りを進めている。医療面に関しては月2回の訪問医師に依存しているが、医療的サービスについては細かな配慮がされている。たとえば、口蓋裂の子どもの例を見てみると、かなり早い時期に外科的手術を受けており、会話面でも問題がない程度にまで指導がされている。また、障害をもつ子どもや発達の遅れた子ども達が健常な子ども達と一緒に教育を受けるインクルージョンの取組はかなり定着していることが観察されている。これらに関する資料さ我国の教育制度との関連の中で、さらに掘り下げる予定にある。今年度の研究では上記の取組とあわせて、主として、自然科学的知識がアラスカ僻地の子ども達と北海道僻地の子ども達との間で、どのような違いをもった形で習得されているかを、北海道とアラスカの研究分担者によって進められた。アラスカ大学側からは研究協力者、マクミラン助教授が北海道の僻地小規模校で調査のための実験をした(平成7年12月来日)。北海道教育大学側からは田中実、高嶋幸男の両名が平成8年3月にアラスカの僻地小規模校を訪問し同様の観点から調査資料の収集のための実験を実施した。これらの資料は北海道とアラスカ僻地の児童・生徒の特徴的差異を浮きぼりにするために用いられる予定にある。今年度の調査研究では遠隔地教育に関する資料の収集もあわせて、行なわれた。この分野に明する研究と実践の成果は、時に、アラスカにおいて優れており、興味ある資料が得られている。今後、これらの資料を検討することによって、北海道の広域性からくる教育的取組の不十分さを克服する手がかりを得ることが期待できる。アラスカの場合、日本に比較してかなり早い時期にパソコン通信などの通信手段や、これらのハードウエアシステムの整備が促進され、このシステムを学校教育に導入してきた経緯がある。アラスカに所在する僻地校は主に、ハイウエイジャンクション周辺の交通要所箇所、軍事基地周辺、観光産業地、従来のアラスカネイティブの村など、約190箇所に散在している。アラスカでは日本に比較して交通手段の制約や、文化的・言語的に日本では考えられないほど多様な社会環境が存在し、教育事情もこれらの環境の影響を強く受けていることが明らかにされた。たとえば、各僻地校間の距離は数10kmから100km以上の距離があり、学校間のコミュニケーションが不自由であること、軍事基地周辺の学校では生徒の転出入がきわめて頻繁であることによる教育効率上のハンディがあったり、ネイティヴの村にある学校では基本的英語教育に加えて全く文法構造の異なるネイティブの言語や伝統的生活風土や文化習慣の学習を受けてイル。現在、これらの知見を媒介にして、北海道の僻地教育の特徴を浮きぼりにする段階にまできている。また、アラスカ大学と北海道教育大学は短期交換留学を進め双方の僻地校での教育実習を実施して来ている。これらの実践の成果の検討に着手し、双方の教育の特徴を学生達の目を通して明らかにしようとしている。

たとえば、口蓋裂の子どもの例を見てみると、かなり早い時期に外科的手術を受けており、会話面でも問題がない程度にまで指導がされている。また、障害をもつ子どもや発達の遅れた子ども達が健常な子ども達と一緒に教育を受けるインクルージョンの取組はかなり定着していることが観察されている。これらに関する資料さ我国の教育制度との関連の中で、さらに掘り下げる予定にある。今年度の研究では上記の取組とあわせて、主として、自然科学的知識がアラスカ僻地の子ども達と北海道僻地の子ども達との間で、どのような違いをもった形で習得されているかを、北海道とアラスカの研究分担者によって進められた。アラスカ大学側からは研究協力者、マクミラン助教授が北海道の僻地小規模校で調査のための実験をした(平成7年12月来日)。北海道教育大学側からは田中実、高嶋幸男の両名が平成8年3月にアラスカの僻地小規模校を訪問し同様の観点から調査資料の収集のための実験を実施した。これらの資料は北海道とアラスカ僻地の児童・生徒の特徴的差異を浮きぼりにするために用いられる予定にある。今年度の調査研究では遠隔地教育に関する資料の収集もあわせて、行なわれた。この分野に明する研究と実践の成果は、時に、アラスカにおいて優れており、興味ある資料が得られている。今後、これらの資料を検討することによって、北海道の広域性からくる教育的取組の不十分さを克服する手がかりを得ることが期待できる。アラスカの場合、日本に比較してかなり早い時期にパソコン通信などの通信手段や、これらのハードウエアシステムの整備が促進され、このシステムを学校教育に導入してきた経緯がある。アラスカに所在する僻地校は主に、ハイウエイジャンクション周辺の交通要所箇所、軍事基地周辺、観光産業地、従来のアラスカネイティブの村など、約190箇所に散在している。アラスカでは日本に比較して交通手段の制約や、文化的・言語的に日本では考えられないほど多様な社会環境が存在し、教育事情もこれらの環境の影響を強く受けていることが明らかにされた。たとえば、各僻地校間の距離は数10kmから100km以上の距離があり、学校間のコミュニケーションが不自由であること、軍事基地周辺の学校では生徒の転出入がきわめて頻繁であることによる教育効率上のハンディがあったり、ネイティヴの村にある学校では基本的英語教育に加えて全く文法構造の異なるネイティブの言語や伝統的生活風土や文化習慣の学習を受けてイル。現在、これらの知見を媒介にして、北海道の僻地教育の特徴を浮きぼりにする段階にまできている。また、アラスカ大学と北海道教育大学は短期交換留学を進め双方の僻地校での教育実習を実施して来ている。これらの実践の成果の検討に着手し、双方の教育の特徴を学生達の目を通して明らかにしようとしている。本概要は、昭和25年以来取り組んできた本学僻地教育研究施設の僻地教育研究の集大成として計画された3カ年計画の初年度のまとめである。本研究では、環太平洋北部地域、特に、アラスカ、ロシア・マガダン地域のへき地教育に関する比較分析を通して、我が国のへき地諸学校と地域の文化的、教育的機能の様相を浮きぼりにしようとしている。
ミクロコンポジットを用いた高分子系複合材料の界面効果に関する解明

複合材料の界面特性を解明するために、主にシラン処理されたガラス繊維を用いて繊維埋蔵したミクロコンポジットから、分子論的および機械的評価を行うことにした。両者の結果から複合材料の強化繊維と樹脂間に形成される界面領域の構造とその機能性について検討した。そのために、分子論的評価では主に顕微FTIRを用いた。機械的界面評価には繊維埋蔵引張あるいは引抜試験およびマクロ的物性として試験片径2mm8mmの一方向繊維強化複合材料を用いて試験を行った。界面組成として、シラン剤以外に共存物質としてフィルムフォーマの効果を調べた。シラン剤では水溶液中で予め縮合させて、その縮合体の効果を知ることにした。表面処理に伴う界面強度と複合材料特性の関係を知るために、複合材料のき裂進展との関係を調べた。上記のように、界面構造と界面強度及びマクロ物性を調べることによつて次のような結論が得られた。(1)シラン剤とフィルムフォーマの界面強化効果は第一にシラン剤とフィルムフォーマ間に相互作用が働くこと。第二にフィルムフォーマとマトリックス樹脂間に相互作用が働くことであった。(2)シラン剤の縮合体オリゴマーはある程度の分子量では界面強度を増すことが分かった。それ以外に、ガラス繊維に結合していない物理吸着分子は樹脂に対して硬化促進させる可能性を示すことも分かつた。(3)シラン剤縮合体によって界面強度を向上させても、複合材料強度はむしろ向上しないことがわかった。その際、その破断はき裂進展が通常と異なる挙動をすることが分かった。複合材料の特性解明には繊維あるいはウィスカ形態の強化材料とマトリックス材料間の界面効果が重要である。そのために、種々の複合材料における界面について今まで検討されてきた。その中でプラスチックをマトリックスとする高分子基複合材料では他のセラミックや金属をマトリックスとする複合材料に比べて界面構造と強化機構について明瞭でない。そこで、本研究では繊維近傍の界面領域の構造変化と界面せん断応力とその分布についてミクロコンポジットを用いて検討することにした。繊維の表面処理としてはシラン処理を取り上げ、界面領域における挙動を検討した。顕微FTIRを用いることによってシラン処理繊維の近傍にある樹脂はマトリックス樹脂と異なる構造を有していた。この異なる構造を有する樹脂領域を樹脂変性界面領域と名づけた。この領域はシラン剤の処理量に応じて大きくなった。最大の広さとしてビニールエステル樹脂ではおよそ200μmから300μmを示した。シラン剤は一般的にガラス繊維と固着するが、その一部はガラス繊維と固着することなく、物理化学的に界面に存在する。このような結合状態の相違は界面強化に著しく影響した。しかし、界面領域の広さにはこのような結合状態の差異は影響しないことが分かった。したがって、樹脂変性界面領域の形成は界面強化に影響しないものの、複合材料の破壊過程における凝集破壊進展には影響を及ぼすものと推測された。複合材料の重要な材料特性として取り上げられる破壊靭性では凝集破壊が寄与しやすいので、樹脂変性界面領域は破壊靭性に影響を及ぼしやすいと見られた。本年度では、1.それらの処理されたシラン剤が樹脂に及ぼす効果について顕微FTIRから検証することにした。2.シラン剤を水溶液中で予め縮合させて、繊維上でガラス繊維と結合しやすい構造を検討することにした。3.樹脂と直接反応し得るシラン剤の割合を検証できる方法を模索した。以上についてそれぞれ次のような結論が得られた。

1.ガラス繊維上のシラン剤が樹脂の硬化反応に影響して、100μm程度の幅を有する樹脂変性領域が繊維束周辺に形成することが分かった。その変性領域の幅は繊維上のシラン剤の結合性によらず、シラン剤の量に依存した。この変性域はシラン剤による繊維束周辺の局所的異常性がもたらしたと見られた。2シラン剤を水溶液中で攪拌させ、縮合体オリゴマーを生成させ、繊維に処理した。その結果、分子量とともに化学的結合の割合が増えるのではなく、むしろある分子量を超えるとガラス繊維の結合率を低下させることが分かった。分析の結果、界面の強度は縮合体の分子量とシラノール基の存在割合に影響されることが分かった。3.シラン剤と樹脂の反応割合を検討するために、シラン処理後のガラス繊維に蛍光プローブであるジメチルアミノナフタレンスルフォニルクロリド(DNS)を反応させた。蛍光顕微鏡を用いて蛍光の定量化を試みた。その結果、この方法はシラン剤処理層の樹脂に対する反応性を調べるのによい方法であることが認められた。複合材料の界面特性を解明するために、主にシラン処理されたガラス繊維を用いて繊維埋蔵したミクロコンポジットから、分子論的および機械的評価を行うことにした。両者の結果から複合材料の強化繊維と樹脂間に形成される界面領域の構造とその機能性について検討した。1999年度、2000年度の成果を元に、最終年度にあたる本年度では、1.シラン剤と共存して用いられるフィルムフォーマの効果について顕微FTIRから検証する。2.シラン剤を水溶液中で予め縮合させて、繊維上でガラス繊維と結合しやすい構造を検討することにした。3.シラン剤の界面強化作用を解明する以外に、複合材料の破壊に及ぼす効果について検討した。1.ガラス繊維上に処理されたシラン剤とフィルムフォーマが熱可塑性樹脂マトリックスに対して界面強度を示すための条件は次の2点でであった。シラン剤とフィルムフォーマ間に相互作用が働くこと。フィルムフォーマとマトリックス樹脂間に相互作用が働くこと。後者については顕微赤外分析によって拡散現象が見られた。2.シラン剤に少量の水を加えて攪拌させ、縮合体オリゴマーを生成させ、繊維に処理した。それ以外に、ガラス繊維に結合していない物理吸着分子は樹脂に対して硬化促進させる可能性を示すことも分かった。3.界面強度を向上させるシラン剤縮合体を処理すると、複合材料強度はむしろ向上しないことがわかった。しかし、その破断はき裂進展挙動を通常とは異にすることが分かった。この結果から、き裂進展を制御することが出来ると見られた。
衝撃波干渉加熱に及ぼす高温化学反応の影響に石する研究

本研究は要するに衝撃波誘起干渉流れ場の空力加熱現象に及ぼす高温効果を行らかにする目的で、研究対象を『衝撃波の斜面への入射によって生じた非定常空力加熱現象に及ぼす高温効果』にしぼって研究を試みた。高温効はまず、並進及び回転エネルギーに加えて振動エネルギへのエネルギ移動が現れる。これは分子の温度が高くなるために、分子を構成する原子が振動し、それにエネルギを蓄えることができるからである。本研究では、振動エネルギを考慮した場合(ここでは振動平衝)と振動エネルギを考慮しない場合について、入射衝麹波マっハ数3の垂直衝撃波が角度35度の斜面に入射する際に生じる非定常空力加熱現象について数値計算を行った。その結果、衝撃波が入射すり気体の初期温度が高い際には、振動エネルギを考慮した場合は、それを考慮しない場合と比較して、はじめの入射衝撃波による熱流束上昇が抑えられ、逆に三重点からの滑り面が斜面上に入射するところで生じる熱流束のピーク値は顕著に大きくなり、初めの熱流束のピーク値よりはるかに勝っていることが明かとなった。この傾向は初期温度が高くなるほど顕著であった。これにより、衝撃波干渉による空力加熱現象のひとつである、衝撃波の斜面への入射によって生じた非定常空力加熱現象において高温効果を考慮することが非常に重要であることが明かとなった。本研究では、購入物品の計算スピードの制約もあって、上記のような衝撃波誘起非定常空力加熱の高温効果について数値計を行ったが、この現象に於いては上に述べたように顕著な高温効果が認められるので、工学上有意義な知見が得られたものと考える。また、高温効の研究と平行して、このような衝撃波誘起非定空力加熱現象の数値計算に及ぼす格子分解能の影響について検討を行い、その重要性を明らかにした。
個体レベルにおけるMAPキナーゼカスケードによるシグナル伝達機構

・線虫のMAPキナーゼホスファターゼとして、新規にvhp-1を同定した。vhp-1欠失ホモ個体は幼虫初期から中期の間において発生を停止するが、この表現型は線虫MAPキナーゼカスケードの因子であるMLK-1(MAPKKK)、MEK-1(MAPKK)、KGB-1(JNK MAPキナーゼ)の変異によって抑圧された。また、生化学的解析から、VHP-1はKGB-1のキナーゼ活性を負に制御することが判明した。これらのことから、VHP-1はMLK-1-MEK-1-KGB-1キナーゼカスケードを抑圧することにより、幼虫初期での発生停止がおきないように制御する因子であることが示唆された。さらに、線虫の自然免疫機構において、NSY-1-SEK-1-PMK-1キナーゼカスケードが重要な役割を果たしているが、VHP-1がこのカスケードを負に制御する因子として働くことも明らかにした。・JNKの足場蛋白質であるヒトJIP3の線虫ホモログUNC-16は、線虫JNKのひとつJNK-1およびMAPKK JKK-1とともにシナプス小胞の局在制御に関与することがこれまでに明らかになっている。UNC-16に結合する因子として、キネシン軽鎖KLC-2と、オートファジーを制御するプロテインキナーゼUNC-51の結合蛋白質UNC-14を同定した。klc-2およびunc-14変異体では、unc-16変異体と同様にそれぞれシナプス小胞の局在が異常になった。キネシンとUNC-16の複合体はUNC-14を適切な位置に局在化させることによりシナプス小胞の局在を制御すると考えられる。MAPキナーゼカスケードは、細胞の増殖・分化など多様な生命現象に必須のシグナル伝達経路である。そのうち、p38 MAPキナーゼカスケードは、種を越えて進化的に保存されたシグナル伝達経路であり、様々な環境ストレスにより活性化することが知られている。しかしながら、個体レベルでのp38 MAPキナーゼカスケードの機能については、ほとんど明らかになっていない。そこで、線虫をモデル動物として、アルセナイトストレス応答におけるSEK-1 MAPキナーゼキナーゼ、PMK-1 MAPキナーゼからなるp38 MAPキナーゼカスケードと転写因子Nrf2の線虫ホモログであるSKN-1との関係について解析を行なった。ほ乳動物のNrf2は、ストレスにより核移行することが知られている。そこで、SKN-1::GFP遺伝子を作成し、野生型とsek-1変異体においてアルセナイトストレスによるSKN-1::GFPの局在変化を調べた。その結果、野生型の線虫ではアルセナイトストレスによりSKN-1::GFPが核移行するのに対し、sek-1変異体ではアルセナイトストレスによるSKN-1::GFPの核移行は観察されなかった。また、活性化したPMK-1は、in vitroでSKN-1をリン酸化することが明らかとなった。以上の結果より、線虫においてSEK-1、PMK-1からなるp38 MAPキナーゼカスケードが転写因子SKN-1のリン酸化を介した核移行制御を行なうことで、アルセナイトストレス応答を行なっていることが示唆された。MAPキナーゼ(MAPK)カスケードは、MAPK、MAPKキナーゼ(MAPKK)、MAPKKキナーゼ(MAPKKK)という三種類のキナーゼによって構成され、増殖因子やサイトカインなどの刺激および様々な環境ストレスによって活性化し、多様な応答を制御する。MAPKは、MAPKKによってリン酸化されると活性化するのに対して、MAPKホスファターゼ(MKP)によって脱リン酸化されると不活性化する。

したがって、MAPKの活性は、MAPKKによるリン酸化とMKPによる脱リン酸化のバランスによって制御されており、MKPはMAPKに依存した応答反応の調節において重要である。しかしながら、個体レベルにおけるMKPの機能については不明な点が多い。そこで、我々は、線虫MKPであるVHP-1の機能解析を行った。vhp-1欠失変異体は幼虫期に発生を停止するが、この変異表現型はJNK様MAPKをコードするkgb-1、MKK7型MAPKKをコードするmek-1、MLK型MAPKKKをコードするmlk-1それぞれの機能欠損変異によって抑圧される。mek-1欠失変異体およびmlk-1欠失変異体では、野生型と比較してKGB-1の活性が低下していたことから、KGB-1、MEK-1、MLK-1がキナーゼカスケードを構成していると考えられる。また、KGB-1MAPKカスケード構成因子の欠失変異体は重金属に対して高い感受性を示すが、この重金属感受性はvhp-1欠失変異によって部分的に抑圧される。これらの結果から、KGB-1MAPKカスケードによって制御されるストレス応答の統合および調節において、VHP-1が中心的な役割を果たしていると考えられる。
慢性的成人病の病態予測に向けた生体レドックス解析法の開発

1.病態マウスにおけるレドックス解析アシル保護ヒドロキシルアミンプローブ(1-acetoxy-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine: ACP)は生体内で速やかに加水分解され、ヒドロキシルアミンCPHを生じる。ここではCPHが生体内のレドックスに応じて酸化体CPになりESRシグナル強度に変化をもたらすことを期待する。ESRシグナルの分布はESR画像解析装置で求めた。健常マウスではACPを腹腔内、あるいは静脈内投与したところ、上腹部でESRシグナルが検出され、それは徐々に減少した。X線を全身照射した放射線障害マウスおよびリポポリサッカライド処理で作成した敗血症モデルマウスでは、シグナルの減少が遅くなった。これら障害モデルマウスの肝のCPとCPHの総量は健常マウスと変わらなかったことからESRシグナル強度は生体内レドックスを反映することが示される。アンギオテンシンIIで作成した高血圧マウスでもシグナルの減少が遅くなり、生体レドックスが酸化状態に傾いていることが示唆された。II.プローブの改良生体内で非特異的に起こる酵素的還元を回避するために、ニトロキシル基に隣接してスピロシクロヘキシル基を導入した水溶性プローブを作成した。このプローブは肝ホモジネート中で既存のプローブより消失速度が遅かった。それに対し、アスコルビン酸や活性酸素(ヒドロキシルラジカルおよびスーパーオキシドラジカル)との反応選択性は既存のプローブと同様であった。マウス体内のグルタチオン量をブチオニンスルフォキシミン(BSO)処理で減少させたところ、静脈内投与したニトロキシルプローブ3-carbamoyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-N-oxylのESRシグナルの消失が遅くなり、ニトロキシルラジカルの還元速度がグルタチオン量に影響されることがわかった。アシル保護ヒドロキシルアミンプローブ1-acetoxy-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine(ACP)を健常マウスへ静脈内投与したところ、胸部から腹部にかけてニトロキシルラジカルのシグナルの分布が観察され、それは投与約5分後から40分後までほとんど変化がなかった。容器に入れたニトロキシルプローブの標準溶液をマウスと共に測定することで、ESR画像のシグナル強度をマウス間で比較することができた。X線7.5Gy照射後4日目のマウスにACPを静脈内投与し、ESRシグナル分布の時系列画像を非照射マウスの場合と比較した。ACP投与約10分後から20分後にかけてX線照射マウスでは非照射マウスに比べて胸部から上腹部にかけてのシグナル強度が強く、X線照射で還元能の衰えを画像解析できる可能性が示された。生体内での代謝酵素によるニトロキシル基の還元を立体障害により減じるために、ニトロキシル基に隣接する炭素にシクロヘキシル環を付けたニトロキシルプローブをデザインした。このプローブのESRシグナルは線幅が広く、in vivoにおける検出には困難が予想されるものの、マウス肝ホモジネート中のESRシグナルの減衰は従来のメチル基保護のものより抑制され、有効性が示された。疾患モデルマウスにおけるESR画像:酸化的ストレスの関わる疾患としてリポポリサッカライド(LPS)の腹腔内投与により敗血症モデルマウスを作成し、in vivo ESRによる生体レドックスの測定が可能か否かを検討した。アシル保護ヒドロキシルアミンプローブ1-acetoxy-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine(ACP)を静脈内投与して胸部から腹部にかけてのESR画像を経時的に撮像した。健常マウスでは投与直後に上腹部で現れたESRシグナルが時間と共に減少したのに対し、LPS処理マウスではそのシグナルが持続した。活性酸素消去剤(カタラーゼ及びSOD)あるいはNO合成酵素阻害剤(L・NAME)の投与でLPS処理マウスでもシグナルの持続が見られなくなり、活性酸素並びにNOの関与でシグナルの持続が起こることが示唆された。

プローブの体内動態:ACPを投与後、時間を追って肝臓における加水分解体の総量(ニトロキシルラジカル+ヒドロキシルアミン体)を測定したところ、上記ESR画像の測定時間全体に亘ってLPS処理マウスでは健常マウスより多かった。しかし、その量はいずれのマウスでも同じように時間と共に減少した。このことは、ESR画像で見られたシグナルの持続時間の違いが単なるプローブの分布の違いではないことを示す。プローブの改良:昨年還元酵素回避能を持つことが示された2位と6位にスピロシクロヘキシル環を付けたピペリジンニトロキシルラジカルについて、活性酸素との反応性を調べた。4位の置換基がhydroxy基のものはシステイン存在下スーパーオキシドラジカルとの反応でも、またヒドロキシルラジカルとの反応でもESRシグナルを減じ、プローブとして有効であることが示唆された。
高密度集積ミクロカプセルを用いた電気応答による薬物放出制御

蛍光マーカーを修飾したウシ血清アルブミンを封入した電気応答交互累積膜ミクロカプセルを調製することができた。蛍光顕微鏡および走査型電子顕微鏡で観察するとおよそ5-10マイクロメートルのミクロカプセルが観察された。また、作製したミクロカプセルを静電的相互作用によって電極表面に固定化した後に、+0.7 Vの電位を印加すると電極表面のミクロカプセルがほぼ溶出することがわかった。FITC修飾ウシ血清アルブミン(FITC-BSA)を炭酸カルシウム粒子に封入した。その粒子上にPSS/PEI交互累積膜を調製した後に、TEMPO修飾PAAおよびPEIを用いて(PEI/PSS)2(PEI/TEMPO-PAA)4交互累積膜を調製した。さらにEDTAで処理を行うことで、炭酸カルシウム粒子を除去して、目的のFITC-BSAを封入した電気応答ミクロカプセルの作製を試みた。作製したミクロカプセルの確認は、蛍光顕微鏡および走査型電子顕微鏡で行った。その結果、およそ5-10マイクロメートルのミクロカプセルが観察された。さらに、ミクロカプセル内部にFITC-BSAと考えられる蛍光が観察されたことからFITC-BSA封入した電気応答ミクロカプセルの作製が確認された。次に、作製したミクロカプセルの電極表面の固定化および電気応答による放出を試みた。固定化および放出の確認は水晶振動子ミクロバランス法を用いて行った。水晶振動子上にPEIを被覆した後に、ミクロカプセル溶液で処理を行ったところ、およそ35 ng程度のミクロカプセルの固定化が確認された。ミクロカプセルを固定化した水晶振動子に+0.7 Vの電位を印加するとほぼすべてのミクロカプセルが溶出することがわかった。また、放出されたミクロカプセルのFITC-BSAの蛍光を調べることで放出量について評価した。電位の印加の有無による蛍光強度を比較すると電位の印加によって520 nm付近のピークの増加することがわかった。この結果から、FITC-BSAが放出されていることが示唆された。2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシルを修飾したポリアクリル酸(TEMPO-PAA)およびポリエチレンイミン(PEI)を用いて炭酸カルシウム粒子上に交互累積膜を作製した。その後、EDTA溶液で核を除去して(TEMPO-PAA/PEI)4/TEMPO-PAA交互累積膜ミクロカプセルを調製した。作製したミクロカプセルの確認は原子間力顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて行った。AFMの観察はミクロカプセルを雲母基板上に滴下し、完全に乾燥した後に行った。この結果から、作製した電気応答ミクロカプセルは、直径が2-7マイクロメートルで膜厚が58.5 ±0.8 nmであった。また、FITCを修飾したPEI(FITC-PEI)とTEMPO-PAAで(TEMPO-PAA/FITC-PEI)4/TEMPO-PAA交互累積膜ミクロカプセルを作製して蛍光顕微鏡で観察した。この結果、水溶液中においても球状の2-6マイクロメートルのミクロカプセルが確認された。これらの結果から、目的の電気応答ミクロカプセルが作製できることがわかった。次に、作製したミクロカプセルを金基板への固定化を試みた。基板への固定化および電解による崩壊の確認は水晶振動子ミクロバランス(QCM)法を用いて行った。正確な重量を調べるためにQCM測定は乾燥状態で行った。初めに、金水晶振動子をPEI溶液で処理してPEI膜を被覆した。次に、(TEMPO-PAA/PEI)4/TEMPO-PAAミクロカプセル溶液に浸して固定化した。このときのミクロカプセルの固定化量は、284 ±23 ngであった。さらに、ミクロカプセルを固定化した金薄膜に+0.2 - +0.8 Vの電位を掃引した後に、ミクロカプセルの固定化量は、62 ±6 ngであった。これらの結果からおよそ78.2%のミクロカプセルが崩壊したことがわかった。平成24年の研究内容は、電気応答ミクロカプセルの固定化および崩壊については、期待通りの結果を得ているが、薬物の封入および放出についての知見が得られていない。今後、たんぱく質やモデル化合物を封入した電気応答ミクロカプセルの作製を行う。平成25年度は平成24年に達成できなかった薬物の封入および放出について全力を尽くす。その後、封入薬物の漏出が報告されている交互累積膜ミクロカプセルの性能改善を目指す。本研究ではミクロカプセルからの漏出を抑えるために、ポリアクリル酸およびポリジアリルアミンマレイン酸コポリマー(PDAMA)へTEMPOの修飾することで高分子の電荷を調節して、最適なミクロカプセルの作製条件について検討する。PDAMAは両性高分子であるため、TEMPOの修飾率を変化させることで様々な割合に電荷量を制御した高分子が合成できる。この高分子を利用することで漏出が少なく崩壊しやすい電気応答ミクロカプセルが作製できると考えられる。

膜の作製方法によって漏出の改善が達成できないときは、ミクロカプセルを基板表面に固定化して高分子被覆した後、EDTAによる炭酸カルシウムの溶解を行って封入された薬物の漏出を抑制する。固定化したカプセルを膜で被覆することで十分な漏出抑制効果が期待できる。平成24年度に予定していたミクロカプセルへの薬物封入および放出の検討を延期することによって生じた未使用額を平成25年度請求額合わせ平成25年度の研究遂行に使用する予定である。平成24年度にシステム顕微鏡を購入して、大型機器の設備は整っているため、平成25年度は、主にQCMプローブ、AFMカンチレバー、蛍光色素などの消耗品を購入する。また、旅費としてASiAN ANALYSIS XII(Fukuoka)、日本薬学会第134年会(熊本)などを予定している。
骨形成因子阻害剤の投与による髄膜炎後蝸牛骨化の予防

細菌性髄膜炎の重篤な後遺症として両側高度感音性難聴がある。有効な治療法は確立されておらず、髄膜炎後におこる蝸牛骨化のため、人工内耳埋め込み術も難しい場合が多い。本研究にて、Lipopolysaccarideを髄腔内に投与することにより、新しいモルモットの髄膜炎後難聴・蝸牛骨化モデルを作成した。また骨形成因子阻害剤であるNogginを正常ラットおよびモルモットに投与してその蝸牛形態や聴力に影響を与えないことを確認した。今後は蝸牛骨化モデル動物にNogginを投与して、蝸牛骨化を抑制できるかどうか、検討を行う予定である。今年度はラット蝸牛に対してNogginが与える影響の有無と、Noggin投与の指摘濃度を決定するための実験を行った。Wistar系ラット7週齢を麻酔後、ABR(トーンバースト、4000Hz,16000Hz)にて聴力域値正常(40dBで波形が確認される)ものを実験に使用した。その後右耳後部を切開し、耳骨胞にドリルで小孔をあけた。正円窓を確認して、カテーテルを挿入し、開窓部は結合組織で閉鎖した。カテーテルは骨胞にデンタルセメントで固定し、Osmotic mini pump(Alzet)にRecombinant Mouse Noggin(R&D Systems)を充填させたものを背部に留置し、カテーテルと接続させた。Nogginの投与法は10、30、100μg/mL、0.5μL/時間、2週間の持続投与とした。カテーテル挿入し、蝸牛にnogginを持続注入させる手技がまだ安定しておらず、聴力が低下するもの、この操作により蝸牛骨化がみられるものがまだみられる。一部のラットでは蝸牛の形態変化を伴わず、聴力も低下しない所見が得られたが、この先の実験に使用できるほど安定しないため、動物をモルモットに変更し、同様の手技での実験を試みているところである。モルモットでは蝸牛にカテーテルを挿入する手技がラットよりはるかにやりやすく、今後予定していた実験をモルモットでもやっていく予定である。ただしモルモットの髄膜炎モデルはこれまで作っていなかったため、今回はモルモット蝸牛に直接LPSを注入し、蝸牛骨化を試みる実験も始めている。今年度はモルモット蝸牛に対してNogginが与える影響の有無と、Noggin投与の指摘濃度を決定するための実験を行った。Hartley系モルモット8週齢を麻酔後、ABR(トーンバースト、4000Hz, 16000Hz)にて聴力域値正常(40dBで波形が確認される)ものを実験に使用した。カテーテルは骨胞にデンタルセメントで固定し、Osmotic mini pump(Alzet)にRecombinant Mouse Noggin(R & D Systems)を充填させたものを背部に留置し、カテーテルと接続させた。モルモットは前年度のラットと比較して、蝸牛内にカテーテル挿入し、nogginを持続注入させる手技は容易であった。Nogginによる聴力の低下はほとんどみられなかった。また内耳に形態学的な変化ももたらさなかった。またモルモットの髄膜炎モデルはこれまで作っていなかったため、今回はモルモット蝸牛に直接LPSを注入し、蝸牛骨化を試みる実験を行った。約30%の動物で蝸牛の骨化がみられた。骨化を起こす確率をさらに上げることが今後の課題である。またLPS投与モルモットに対してNogginがどの程度骨化を抑制するか検討する予定である。
言語実験の場としての六朝楽府に関する研究

本研究は六朝楽府を主な研究対象とし、新たな言語表現が生み出されるメカニズムを明らかにすることを目的とした。研究成果の大部分は「六朝楽府訳注」「何遜詩訳注」の形で公表した。これらの「訳注」の作成にはできるだけ詳細な【語釈】を付した。実はこの【語釈】は本研究の最も重要な成果である。それぞれの語の意味だけではなく、どのような歴史的背景を持つのかを可能な限り具体的に追跡して記述した。これら語誌的な記述を収集し整理することによって六朝楽府に現れる言語表現の一覧が出来上がるはずであり、今の段階では整理がまだまだ不充分ではあるが、おおよそ700語あまりの項目を立てられるだけの資料を収集できた。本研究は主に六朝楽府を研究対象とし、新たな言語表現が生み出されるメカニズムを究明することを目的とする。平成26年度は六朝楽府を読み進めるに際し、「1先行研究の収集と整理2『楽府詩集』訳注の作成3六朝楽府の語彙の収集と整理」の3項目を研究実施計画としていた。そこで本年度はまず計画2に該当する成果として「六朝楽府訳注(15)」「六朝楽府訳注(16)」を公表し、六朝楽府13首の詳細な訳注を作成した。この内、(16)の訳注で扱った陳後主叔宝「臨高台」詩に見える「日落雲傍開」という句について、作中人物が夕陽に敢えて背を向け、沈んでいく太陽の光に照らされる自然物を描写している点に注目した。また、「開」という語が具体的にどのような意味を表すのかを検討し、計画1により先行研究の収集と整理を行った。その結果、六朝期から唐代までの夕景を描写する詩には「返照」「反景」という語がしばしば用いられるが、六朝から初唐にかけての詩では作中人物の視線がほとんどの場合夕陽に向けられており、敢えてそれに背を向けた描写は稀であることが分かった。盛唐の詩人である杜甫は「返照」の語を好んで用いたが、キ州に寓居していた時期になって初めて夕陽に背を向ける描写を試み、「返照」と題する詩では「返照開巫峡」という句で陳後主と同じように「開」という動詞を、恐らくは「明るい」という意味で用いていた。これらの内容を「杜甫『返照開巫峡』について」という論文にまとめて発表した。本研究は六朝楽府を主な研究対象とし、新たな言語表現が生み出されるメカニズムを明らかにすることを目的とする。平成27年度は前年度に引き続き六朝楽府を読み進めるに当たり、「1先行研究の収集と整理2『楽府詩集』訳注の作成3六朝楽府の語彙の収集と整理」の3項目を研究実施計画としていた。計画1については、近年中国に於いては『建安文学全書』(河北教育出版社)、『梁簡文帝集校注』(南開大学出版社)など六朝文学に関する著作が盛んに刊行される状況にあり、これらを逐次購入することに努めた。計画2については、「六朝楽府訳注(17)」「六朝楽府訳注(18)」を公表し、計18首の作品に詳細な訳注を作成した。これらの訳注の作成を通し、「所与の題材による作詩活動」という着想を得たので、現在はこの着想をより具体的にまとめること、着想に沿った資料の収集と整理を行いつつある。計画3については上の訳注作成により六朝楽府に用いられる語彙を更に集めることができたので、以前の収集と合わせて語彙集の充実を図りながら、もう少し使い勝手の良い形式を考えているところである。本研究の基盤であり根幹となる「『楽府詩集』訳注の作成」が本年度も20首程度しか進めることができず、当初の計画よりもやや遅れていると言わざるを得ない。しかし、基盤であり根幹であるからこそできる限り詳細な訳注を作成しなければならないと考えている。また、訳注作成作業を通して「所与の題材による作詩活動」に関与した複数の詩人たちが題材にまつわる文献的知識を共有していることが次第に明らかになってきたため、訳注を作成するに際して、その文献的知識がどのような過程を経て共有されるに至ったかまでも考慮に入れなければならず、調査に必要な時間が却って増えてしまったとも言える。「研究実績の概要」で言及したように本研究の目的として「新たな言語表現が生み出されるメカニズムを明らかにする」ことを挙げたが、この目的にやや近付くことのできる着想を得たことは当初の計画に沿ったものであると思う。前年度に引き続き『楽府詩集』に収められた六朝楽府詩の訳注を作成する作業を中心に研究を進めた。その成果として「六朝楽府詩訳注(二十)」「六朝楽府詩訳注(二十一)」を「中国中世文学研究」68号・69号に掲載した。本研究の課題「言語実験の場としての六朝楽府に関する研究」に即し、詩に用いられた語句について先行例の有無、来歴などの語誌情報をできるだけ詳細に検討して訳注を作成した。これらの訳注によって六朝楽府詩に於ける詩的言語の継承と発展の過程の相をある程度見通すことができるようになった。また、先行例を持たない新しい語が集中的に現れる詩篇、詩篇の一部を抽出することによっていわゆる言語実験がどのような条件の下で可能になるのかを観察できた。

これらの研究成果を踏まえ、新たに「何遜詩訳注(一)」を作成し、楽府詩だけでなく六朝詩全体を俯瞰するための視座を設定しようと考えた。何遜は六朝詩と唐詩との結節点に位置する詩人のひとりであり、彼をモデルケースとして六朝詩に於ける言語実験がどのように唐詩に受け継がれたか、或いは受け継がれなかったかを観察できるだろうと予想できるからである。『杜甫全詩訳注(三)』(下定雅弘・松原朗編講談社学術文庫)に共訳者として参加した。杜甫が『文選』を介して六朝詩の成果を吸収した上で、自らの詩作に活用した詩人であるという観点から本研究の成果を訳注の作成に活かせたと思う。本研究の基礎的作業は六朝楽府詩の訳注作成だが、研究の目的と照らし合わせてみると、詩に現れる語句の内、どれが当時の一般的な語句であり、どれがあまり先行例のない「実験的」語句なのかを見極める必要がある。そのため、ほとんどすべての語句について先行例の有無の確認から始めなければならず、この作業に予想よりも遥かに膨大な時間を取られてしまった。先行例のある語句であっても、どのような詩人たちによって受け継がれてきた語句なのか、継承の過程で語句の意味に変化がなかったか、などの確認に時間が掛かってしまった。本研究は六朝楽府を主な研究対象とし、新たな言語表現が生み出されるメカニズムを明らかにすることを目的とした。研究成果の大部分は「六朝楽府訳注」「何遜詩訳注」の形で公表した。これらの「訳注」の作成は、もちろん作品の内容を分かり易い日本語に翻訳する作業が中心になるが、本研究の目的に即し、できるだけ詳細な【語釈】を付した。実はこの【語釈】は本研究の最も重要な成果である。それぞれの語が作中でどのような意味で用いられているのかを明らかにするだけではなく、どのような歴史的背景を持つのかを可能な限り具体的に追跡して記述した。当然のことながら、六朝というほぼ400年に及ぶ時間の中で、それらの詩的言語は大きく1既存の詩語、2既存の詩語に一部改変を加えたもの、3詩人が新たに創作したものの3つグループに区分でき、通時的に唐代以降の文学作品に引き継がれたものもあれば、その場限りで消えていったものもある。六朝楽府の訳注を作成するという作業を通じて抽出した語句に対し、上に述べたような語誌的な記述を加え、整理することによって六朝楽府に現れる言語表現の一覧が出来上がるはずであり、今の段階では整理がまだまだ不充分ではあるが、おおよそ700語あまりの項目を立てられるだけの資料を収集できた。この資料を基礎にして何遜詩の訳注を作成する作業を研究に加えた。まだ不充分な資料ではあるが、六朝詩を読解するのにどの程度有効であるかを確認してみたかったからである。読解を完了した作品数はまだあまり多くないのだが、これまでの研究成果を踏まえることにより、従来の読解とは異なる解釈が可能になった作品もいくつかあり、かなり有効なのではないかという手応えを感じている。これらの「訳注」の作成にはできるだけ詳細な【語釈】を付した。それぞれの語の意味だけではなく、どのような歴史的背景を持つのかを可能な限り具体的に追跡して記述した。これら語誌的な記述を収集し整理することによって六朝楽府に現れる言語表現の一覧が出来上がるはずであり、今の段階では整理がまだまだ不充分ではあるが、おおよそ700語あまりの項目を立てられるだけの資料を収集できた。本研究の基礎作業である「『楽府詩集』
抗腫瘍性サイトカイン細胞障害機序のリポソ-ム膜システムによる解析

研究代表者は、抗腫瘍性サイトカインの細胞障害機序の詳細がほとんど不明である現状を踏まえ、その点を明らかにするため、リポソ-ム膜システムの導入を計画し、研究分担者と協力して次の点を明らかにした。1.種々リポソ-ム膜システムの活用による抗腫瘍性サイトカインの膜作用機序の解析:まず、腫瘍壊死因子及びインタ-フェロンの膜作用に対する膜脂質組成の影響を検討し、ホスファチジルセリン(PS)が最も有効な制御因子であることを見出し、これらサイトカインに対する腫瘍細胞の感受性が、PSによって制御されている可能性を示唆した。次にこれらサイトカインの膜存在状態と膜作用性との関連性について検討を加え、膜内への陥入度と膜作用性が相関し、それが抗腫瘍作用スペクトルの差異に反映されるとの知的を得た。2.腫瘍細胞内導入リポソ-ムの活用による抗腫瘍性サイトカインの腫瘍細胞障害作用機序の解析:本課題を円滑に遂行するため、まず、マクロファ-ジを用いて検討を加え、有効な蛍光プロ-ブ封入りポソ-ムの調製に成功した。そして、そのリポソ-ムの細胞内動態を顕微蛍光法により解析し、エンドサイト-シスの有無の判定システム及び細胞内動態の速度論的解析システムを確立した。現在、このシステムを腫瘍細胞に導入し、抗腫瘍性サイトカイン細胞障害作用の主要経路及び主要反応の検討を行っている。3.リポソ-ム膜結合型サイトカインの調製及びその活用による抗腫瘍性サイトカインの作用機序の解析:現在、ILー4が、末梢血単球の殺腫瘍活性及びTNFやILー1産生を抑制すること、リポソ-ムに封入したILー4も同様の作用を発現することを見出している。そこで、リポソ-ム膜結合型ILー4を調製し、その作用機序解析を開始した。1、種々リポソ-ム膜システムの活用による抗腫瘍性サイトカインの膜作用機序の解析まず、腫瘍壊死因子及びインタ-フェロンの膜作用に対する膜脂質組成の影響を検討し、ホスファチジルセリン(PS)が最も有効な制御因子であることを見い出し、これらサイトカインに対する腫瘍細胞の感受性が、PSによって制御されている可能性を示唆した(BI,1990)。次に、これらサイトカインの膜存在状態と膜作用性との関連性について検討を加え、膜内への陥入度と膜作用性が相関し、それが抗腫瘍作用スペクトルの差異に反映されるとの知見を得た(TNF and Related Cytokines,1990)。パ-ソナルコンピュ-タ-一式は、リポソ-ム膜システムを用いた膜作用性解析結果の整理に、アスピレ-タ-は、リポソ-ムの調整に利用した。2.腫瘍細胞内導入リポソ-ムの活用による抗腫瘍性サイトカインの腫瘍細胞障害作用機序の解析本課題を円滑に遂行するため、まず、マクロファ-ジを用いて検討を加え、有効な蛍光プロ-ブ封入リポソ-ムの調製と共に、そのリポソ-ムの細胞内動態を顕微蛍光法により解析し、エンドサイト-シス後の挙動を明確に判定できるシステムを確立した。現在、このシステムを腫瘍細胞に導入し、抗腫瘍性サイトカイン細胞障害作用の主要経路及び主要反応の検討を開始している。1.腫瘍細胞内導入

リポソ-ムの活用による抗腫瘍性サイトカインの腫瘍細胞障害作用機序の解析本課題を円滑に遂行するため、まず、マクロファ-ジを用いて検討を加え、有効な蛍光プロ-ブ封入リポソ-ムの調製に成功した。そして、そのリポソ-ムの細胞内動態を顕微蛍光法により解析し、エンドサイト-シスの有無の判定システム及び細胞内動態の速度論的解析システムを確立した。現在、このシステムを腫瘍細胞に導入し、抗腫瘍性サイトカイン細胞障害作用の主要経路及び主要反応の検討を行っている。2.リポソ-ム膜結合型サイトカインの調製及びその活用による抗腫瘍性サイトカインの作用機序の解析現在、ILー4が、末梢血単球の殺腫瘍活性及びTNFやILー1産生を抑制すること、リポソ-ムに封入したILー4も同様の作用を発現することを見出している。そこで、リポソ-ム膜結合型ILー4を調製し、その作用機序解析を開始した。今後、リポソ-ム封入及び膜結合型サイトカインの腫瘍細胞障害機序を検討する。そのために、リポソ-ム腫瘍細胞内動態の速度論的解析システムの確立、リポソ-ム封入及び膜結合型サイトカインの腫瘍細胞内取り込み及び腫瘍細胞増殖抑制機能の検討、リポソ-ム封入及び膜結合型サイトカイン腫瘍細胞内動態の速度論的解析等を行う。そして、これらの結果をもとに、サイトカインの腫瘍細胞における細胞障害活性発現機序を分子論的に解明する。
嘔吐するモデル動物スンクスのトランスクリプトーム解析によるPONVの機序解明

術後悪心嘔吐(PONV)は全身麻酔覚醒後に生じる合併症の1つである.だがその分子生物学的機序は明らかになっていない.スンクスはラットやマウスと違い,容易に嘔吐行動が生じる哺乳類である.本研究はこのスンクスにイソフルラン麻酔下に下腹部手術を施し,スンクスPONVモデルを確立した後に,脳幹の嘔吐中枢である孤束核(NTS)のゲノム網羅的な遺伝子発現変化(トランスクリプトーム解析)を行い,PONVの分子遺伝学的機序を解明するものである.最終年度は5匹のスンクスを用いて,これまでのデータの拡充を行った.行動実験では無処置群,偽手術群,PONVモデル群,ニコチン陽性対照群の4つを設定した.全身麻酔からの覚醒後の嘔吐行動は無処置群で0回,偽手術群で6回,PONVモデル群で6回,陽性対照群で12回であった(中央値).さらにわれわれはNTSを切り出し,RNA-seqを行った.遺伝子発現レベルの比較と引き続くパスウェイ解析から,ゴナドトロピン刺激ホルモン情報伝達系がPONVと関連することを突き止めた.さらにパスウェイ中のEGR1転写因子に着目し,4群のスンクスNTSで偽手術群,PONVモデル群,ニコチン陽性対照群で発現が増加していることをデジタルPCRで確認した.科研費による支援は2018年度で終了するが,今後はsiRNAを用いて,脳内でin vivo遺伝子ノックダウンを行い,EGR1遺伝子の発現抑制が,スンクス嘔吐行動を抑制するかを確認してゆく予定である.またこれまでの成果は2019年10月の米国麻酔学会で発表予定である.初年度はスンクスではなく,基礎研究で頻用されているラットを用いて行った.嘔吐代替行動としてカオリンペレットの異食を観察した.7群の実験条件を設定し(各群N=6-10),モルヒネ投与やPONVモデル,シスプラチン投与(陽性対照)で異食が増加することを観察した.次にモルヒネ投与群と生食投与群のみに着目して,ヒトでは嘔吐中枢である孤束核を切り出して全量RNAを抽出した後,次世代DNAシークエンサを用いてトランスクリプトーム解析(RNA-seq)を行った.解析の結果,13種類の遺伝子の発現が両群間で高度に差があることが判った.複数のホメオボックス遺伝子の発現が増加しており,解釈に難渋したが,パスウェイ解析でドーパミン代謝経路の3つの遺伝子発現が孤束核で高度に変化していることが明らかになった.またパスウェイ解析で上流の転写因子PHOX2Aが関係していることも明らかになった.これまでの研究からはPONVのラット代替行動であるカオリンペレットの異食ではモルヒネ投与による孤束核でドーパミン代謝経路の変容が関与することが明らかになった.この知見は麻酔覚醒後の手術患者のPONVの脳内機序でドーパミン経路が重要な役割を果たしていることを示唆していると思われた.興味深い結果を得ることができている.平成28年度のラットの異食実験を基盤に,平成29年度は嘔吐するモデル動物スンクス(Suncus murinus, Her系,メス)を用いて術後悪心嘔吐(PONV)モデルを開発した.イソフルラン麻酔下に下腹部正中切開と縫合を行い,麻酔から覚醒させ,30分間チャンバー内で観察したところ,retchingやvomitingを惹起させることに成功した.対照としてナイーブ群,イソフルラン麻酔のみの偽手術群を設定した.PONVモデルと偽手術群はナイーブ群に比べて嘔吐行動が増加した.さらにわれわれはPONVを起こしたスンクスの嘔吐中枢である脳幹の孤束核から全量RNAを抽出して,次世代DNAシークエンサによるRNA-seqを実施した.各群3つのreplicateとして全量RNAを50ngをインプットした.1サンプルあたり2X100bpリードを40,000,000本シークエンスした.スンクスには参照ゲノムがないので,デノボ・アセンブリを行うことにして,東北大学東北メディカルメガバンクのスーパーコンピュータを用いてTrinityソフトウエアでコンティグを作成した.404,438個のコンティグが作成できた.N50は1,085であった(N20は3038,N80は296であった).現在,TrionateソフトウエアでPONV発症時に発現変化する遺伝子の群間差を検討しているところである.またスンクスのゲノムのドラフト配列を国内の研究者から譲渡する予定である.本研究の現在までのデータは平成30年秋の北米神経科学会(カルフォルニア州サンディエゴ市)で発表し,学会参加者からの批評を受け議論する予定である.東北大学医学部動物実験施設や東北大学メディカル・メガバンク機構の研究協力により,予想以上のデータを獲得できた.術後悪心嘔吐(PONV)は全身麻酔覚醒後に生じる合併症の1つである.だがその分子生物学的機序は明らかになっていない.スンクスはラットやマウスと違い,容易に嘔吐行動が生じる哺乳類である.