hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内共生細菌から探るミトコンドリアタンパク質輸送制御系の進化的形成解明

ミトコンドリアの共生進化には2つの未解明な問題がある。一つは共生体ゲノムのほとんどが宿主の染色体遺伝子に転移したこと。二つ目は転移した遺伝子のタンパク質が、初期のミトコンドリア内に輸送されるシステムが構築されたこと。本研究では後者に注目する。真核生物と細胞内共生細菌ウォルバキア(あるいはボルバキアとも呼ぶ)のタンパク質をモデルとし、生物情報学と実験的解析からミトコンドリアの新しい進化的概念の提唱や実証を行った。この結果、ミトコンドリア輸送制御システムに類似性を持つウォルバキア遺伝子を複数発見した。また、ウォルバキア感染モデル哺乳動物細胞培養系の構築に成功した。本研究では、ミトコンドリアタンパク質輸送制御因子の1つであるミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ(MPP)のホモログ分子をウォルバキアから発見することで、この輸送制御関連分子の進化的な解明を目的としている。まず、出芽酵母のMPPのアミノ酸配列とゲノム解析が完了した7種のウォルバキアタンパク質を用いてBLAST解析を行なった。その後、FASTA解析を行ない、MPPサブユニットの1つであるβMPPの活性部位モチーフがウォルバキアのタンパク質にも存在するか確認した。また、ミトコンドリアとウォルバキアが進化的に近い関係なのかを確認するために、出芽酵母、ヒトのMPPとウォルバキアのMPP類似タンパク質、その他の細菌でのMPP類似タンパク質をClustalWで相同性解析し分子系統樹を作成した。その結果、7種類のウォルバキアタンパク質がβMPPの活性部位と類似したアミノ酸配列を持っており、別の相同性が低い7種類のウォルバキアタンパク質でもβMPPの活性部位モチーフを持っていた。また系統樹解析より、酵母とヒトのMPPはウォルバキアのMPP類似タンパク質と近いことが確認された。7種類のウォルバキアタンパク質はβMPPと同じ機能を持っている可能性があると考える。このことからウォルバキアにはMPPに類似したタンパク質を持っているということが言える。また、系統樹より、ヒトと酵母のβMPPはウォルバキアと近縁な関係にあることが分かった。また、MPPのサブユニットであるαMPPとβMPPが早い段階で枝分かれしていることから、それぞれが独立して進化していったのではないかと考えられる。生物情報学的解析から、まず、酵母ミトコンドリアプロセシングぺプチダーゼ(MPP)α、βサブユニット(αMPP、βMPP)のウォルバキアにおける類似分子を検索した。αMPPと比較的優位な相同性を示す遺伝子は発見できなかったが、βMPPでは2種類の相同性を示す分子が存在した。いずれもβMPPに特有の活性部位モチーフを保持しており、同一の祖先分子に由来する可能性が示唆された。次に、ミトコンドリアタンパク質を外膜から膜間空間に透過させるチャネルタンパク質Tom40、内膜のチャネルタンパク質Tim23の類似遺伝子をウォルバキアゲノムから検索した。いずれもアミノ酸配列で低い相同性分子が得られた。興味深いのは、膜タンパク質であるトランスポーターや電子伝達系のチトクロム酸化酵素サブユニットとの類似性が認められた。このことは、ミトコンドリアの共生進化の段階で、内在性の膜タンパク質が機能進化し、TomやTim複合体を形成した可能性が考えられる。実験的解析では、まず、細胞内ウォルバキアを高感度で検出するための抗体の作成を行った。結果、ウォルバキア表面タンパク質(WSP)に対する特異的な抗体をマウスから作成する事ができた。また、マウス繊維芽細胞に対してウォルバキアを作用させ、宿主が哺乳動物細胞であるウォルバキアの感染モデル培養細胞系を構築することに成功した。目的としたミトコンドリアとウォルバキア遺伝子の進化的比較解析の一部が遂行できなかったため。細胞生物学ミトコンドリア輸送関連に関わる因子のなかで、これまでのMPPに加え、TimやTom因子のウォルバキアホモログの進化的解析と実験的な機能の相補性解析をすすめる。
複合糖質における糖鎖構造の多様性とその病態的意義

研究は以下のように大きく3グル-プに分かれ、総合プランとしてグル-プI、IIを主軸とし、グル-プIIIで得られた情報をもってグル-プI、IIの活動をバックアップしその促進をはかるように計画、実施した。グル-プI:腫瘍細胞あるいは生殖細胞の糖鎖抗原の解析とモノクロ-ナル抗体の作製。癌細胞の抗体の網羅と硫酸化糖鎖に対応するモノクロ-ナル抗体(神奈木)、胃癌・大腸癌の糖鎖抗原の解析とモノクロ-ナル(山口)、ヒト腺ガンの糖鎖抗原とそのモノクロ-ナル抗体(今井)、精子表面の糖鎖抗原とモノクロ-ナル抗体(辻)グル-プII:各細胞の膜系糖鎖の構造の多様性とその機能および病態的意義マウス小腸粘膜の糖鎖の多様性(村松、小沢)、シビレエイ電気器官のニコチン性アセチルコリン受容体の糖鎖(林)、マウスリンパ組織からの免疫系細胞の膜の抗原タンパク質の糖鎖(中島)、神経系細胞特にシナプスの糖鎖(黒田)グル-プIII:複合糖鎖の微量かつ簡単な構造解析法を開発し^1HーNMRによるそのデ-タを蓄積する。特にシアル酸をもつオリゴ糖の分析法を研究する(荒田、高橋、石原)研究の成果の詳細は別研究は以下のように大きく3グル-プに分かれ、総合プランとしてグル-プI、IIを主軸とし、グル-プIIIで得られた情報をもってグル-プI、IIの活動をバックアップしその促進をはかるように計画、実施した。特にシアル酸をもつオリゴ糖の分析法を研究する(荒田、高橋、石原)研究の成果の詳細は別研究は大きく以下の3グル-プに分かれて実施した。総合プランとしてグル-プI、IIを主軸とし、グル-プIIIは、方法に関して得られた情報を生かしてグル-プI、IIの活動をバックアップし、その促進をはかった。癌細胞の抗体の網羅と硫酸化糖鎖に対応するモノクロ-ナル抗体の作製(神奈木)。胃癌・大腸癌の糖鎖抗原の解析とモノクロ-ル抗体(山口)。ヒト腺癌の糖鎖抗原(YH206)とそのモノクロ-ナル抗体(今井)。精子表面の糖鎖抗原とモノクロ-ナル抗体(辻)。グル-プII:各細胞の膜系糖鎖の構造の多様性とその機能および病態的意義。マウス小腸粘膜の糖鎖の多様性(村松)。シビレエイ電気器官のニコチン性アセチルコリン受容体の糖鎖(林)。マウスリンパ組織からの免疫細胞の膜の抗原タンパク質の糖鎖(中島)。神経系細胞特にシナプスの糖鎖(黒田)。グル-プIII:複合糖黒だの微量かつ簡便な構造解析法を開発し、特にシアル酸をもつオリゴ糖の分析を研究(高橋、石原)。HNMRによるオリゴ糖構造のデ-タの蓄積(荒田)研究は大きく以下の3グル-プに分れて実施した。総合プランとしてグル-プI,IIを主軸とし、グル-プIIIで得られた情報をもってグル-プI,IIの活動をバックアップしその促進をはかった。癌細胞の抗体の網羅と硫酸化糖鎖に対応するモノクロ-ナル抗体、オリゴ糖と脂質の結合(神奈木)、胃癌・大腸癌の糖鎖抗原の解析とモノクロ-ナル抗体(山口)、ヒト腺ガンの糖鎖抗原(YH206)とそのモノクロ-ナル抗体、CEA糖鎖を認識するMoAbに対する抗イディオタイプ抗体(今井)、精子表面の糖鎖抗原とモノクロ-ナル抗体(辻)。*糖鎖抗原の解析から、モノクロ-ナルの作成に進み、その臨床的応用をめざす。グル-プII:各細胞の膜系糖鎖の構造の多様性とその機能および病態的意義マウス小腸粘膜の糖鎖の多様性(小沢)、シビレエイ電気器官のニコチン性アセチルコリン受容体の糖鎖(林)、マウスリンパ組織からの免疫系細胞の膜の抗原タンパク質の糖鎖(中島)、神経系細胞特にシナプスの糖鎖(黒田)。*グル-プIIIの開発した糖鎖解析法を応用して糖鎖を同定した後、その多様性の病態的意義を研究した。グル-プIII:複合糖鎖の微量かつ簡単な構造解析法を開発し^1HーNMRによるそのデ-タを蓄積した。特にシアル酸をもつオリゴ糖の分析法を研究した(荒田、高橋、石原)。*グル-プIおよびIIの班員のニ-ズに答えて糖鎖構造解析法の高度な完成をめざした。

研究は以下のように大きく3グル-プに分かれ、総合プランとしてグル-プI、IIを主軸とし、グル-プIIIで得られた情報をもってグル-プI、IIの活動をバックアップしその促進をはかるように計画、実施した。グル-プI:腫瘍細胞あるいは生殖細胞の糖鎖抗原の解析とモノクロ-ナル抗体の作製。癌細胞の抗体の網羅と硫酸化糖鎖に対応するモノクロ-ナル抗体(神奈大)、胃癌・大腫癌の糖鎖抗体の解析とモノクロ-ナル抗体(山口)、ヒト腺ガンの糖鎖抗原とそのモノクロ-ナル抗体(今井)、精子表面の糖鎖抗原とモノクロ-ナル抗体(辻)グル-プII:各細胞の膜系糖鎖の構造の多様性とその機能および病態的意義マウス小腸粘膜の糖鎖の多様性(村松、小沢)、シビレエイ電気器官のニコチン性アセチルコリン受容体の糖鎖(林)、マウスリンパ組織からの免疫系細胞の膜の抗原タンパク質の糖鎖(中島)、神経系細胞特にシナプスの糖鎖(黒田)グル-プIII:複合糖鎖の徴量かつ簡単な構造解析法を開発し^1HーNMRによるそのデ-タを蓄積する。特にシアル酸をもつオリゴ糖の分析法を研究する(荒田、高橋、石原)研究の成果の詳細は別
超臨界流体を用いた生体高分子系材料のナノ構造制御とバイオマス有効活用への応用

近年、バイオマスや環境汚染物質の分解に高圧熱水を用いる研究がなされている。本研究では、食品廃棄物やバイオマス由来の食品循環資源素材から、高圧熱水によって、バイオケミカルリサイクルに適した部分分解物を得る技術を確立することを目的とし、食品循環資源モデルとして可溶性デンプンを選び、高圧熱水による部分分解反応について反応速度論的に解析した。カラムオーブン(160210°C)内に設置したステンレスパイプに、HPLCポンプを用いて、0.1%(w/v)の可溶性デンプン溶液を連続的に供給した。管内圧力は背圧調節弁を用いて2545MPaに維持した。流出液中の還元糖(還元末端基)濃度をソモギー・ネルソン法により求め、還元末端基濃度の定常状態での部分分解反応における種々のパラメータを算出した。160190°Cでの条件で可溶性デンプンの高圧熱水処理を行った結果、滞留時間の増加に伴い、還元末端基濃度が増加した。しかし、200°C以上の高圧熱水処理では、滞留時間の増加とともに、還元末端基濃度が極大を示したのち減少した。この結果から190°C以下では主にデンプンの加水分解反応が進行し、200°C以上では還元末端基濃度を増加させる加水分解反応と同時に、減少させる糖骨格分解反応も生じることが示唆された。分解反応のみかけの反応初速度は顕著な温度依存性を示し、イオン積の挙動と対応しているように思われた。また、反応速度定数の温度依存性がアレニウスプロットにより良好に記述され、活性化エネルギーは105170kJ/molの値を示した。これらの値は亜臨界水による二糖の加水分解における活性化エネルギーの報告値とほぼ等しいことから、二糖の加水分解と本質的に同じ反応機構であると考えられた。活性化体積については、160°Cおよび170°Cでの値と180°C以上での値とに差が認められ、180°C以上では反応機構が異なることが示唆された。超臨界水や、温度・圧力が臨界点よりも低い高圧熱水(亜臨界水)は、常温常圧の水と比較してイオン積の増加、誘電率の減少、有機物の溶解度の増加等の現象が見られる。水のイオン積が増加すると、水素イオンと水酸イオンによる生物素材の加水分解が顕著となる。洗米排水や米ぬかスラリーなどのバイオマスを超臨界水あるいは亜臨界水で処理することによって、生体高分子を部分分解して機能性を付与した材料に変換する技術を構築することを目的とした。高圧ポンプ、背圧調節弁などを組み合わせて、35MPaまでの高圧処理のできるバッチ式超臨界水処理システムを構築した。試料として米ぬかスラリーを選び、180°C、35MPaで30分高圧熱水処理を施したところ、部分分解物として単糖およびオリゴ糖を得ることができた。250°C、35MPaで30分同様の処理を施したところ、分解がさらに進行してオリゴ糖がほとんど消失した。以上の結果から、水しか使わず高圧高温条件を活用することによって、オリゴ糖を多く含んだバイオマス部分分解物を得る技術が構築できる可能性が示された。ナノ構造材料の素材としてオリゴ糖を用いて、ナノ空間の形成条件および構造制御法について実験的に検討を進める予定である。水は通常水素イオンと水酸イオンに乖離しており、常温常圧においても弱酸あるいは弱アルカリとして振舞う。

超臨界水や高圧熱水においては、水のイオン積が増加し、水素イオンあるいは水酸イオンによる加水分解作用が顕著となる。水の加水分解作用を利用してバイオマスの有効活用を図る場合には、バイオマスを再利用可能な状態の素材に変換する必要があるが、温度・圧力の条件によっては分解反応が進みすぎて再利用できない状態になってしまう。昨年度高圧処理の可能なバッチ式超臨界水処理システムを用いて高圧熱水処理を試みたが、本年度では、より安定的に反応系を制御できる連続式の処理システムを構築した。試料溶液を昇圧ポンプに導入し恒温槽内に装着したステンレスパイプへ送液する形式とした。圧力は背圧調節弁によって保持した。反応はステンレスパイプ内で進行し、背圧調節弁から連続的に排出される反応液をサンプリングした。代表的な生体高分子系材料である可溶性デンプンを試料とし、25MPaで高圧熱水処理を施したところ、140°Cの条件では、若干の還元糖濃度の上昇が認められた程度であったのに対し、180°Cの条件では、顕著に還元糖濃度が上昇した。このことから、高温高圧条件での反応を活用することによって、生物学的に再利用可能な状態のバイオマス分解物を得ることができることが確認された。
逆転および分断化ｔＲＮＡ遺伝子の成立におけるイントロンスプライシング機構の役割

C. merolaeの核ゲノムには、分断化tRNA遺伝子に加え逆転tRNA遺伝子が多数存在する。両tRNAの前駆体はBHBモチーフというtRNAイントロンスプライシング酵素が認識部位する高次構造を形成することから、当該酵素によって成熟化し、進化的にも関連性も高いと考えられる。本研究は、C. merolaeの細胞内で、重複する分断化tRNA遺伝子から逆転tRNAが形成されうることを実験的に示した。本研究では、極限環境微生物である始原紅藻C. merolaeの逆転tRNA遺伝子(circularly permuted tRNA gene)が、遺伝子重複により生じたタンデムtRNA遺伝子から成立したとする仮説の検証を実験的に解析した。仮説の基礎となった知見の一部は海外の学術雑誌および学会で発表した。これまでに、人工的に構築したタンデムtRNA遺伝子をC. merolae細胞内に導入し、その発現と成熟過程を生化学的に調べた。その結果、導入したタンデムtRNA遺伝子からは、逆転tRNA遺伝子から転写された場合と同様の環状RNA中間体を経由して機能的な配列と構造を有した成熟体tRNAが形成されることが明らかとなった。さらに興味深いことに、タンデムtRNA遺伝子からは環状RNA中間体を経由しない通常のプロセシング経路からの成熟体tRNAも形成された。以上の結果から、予想された逆転tRNA遺伝子の成立モデルが細胞内でも再現可能であること、2つの経路(環状RNA中間体を経由する場合としない場合)で成熟体tRNAが形成可能であることが示された。特に、「2つの経路(環状RNA中間体を経由する場合としない場合)で成熟体tRNAが形成可能である」という発見は、tRNA遺伝子構造のダイナミックな転換期に、細胞にとって必須のタンパク質合成を担う機能性tRNA分子の確実な供給を保障することを示唆するものであり、「タンデムtRNA遺伝子からの逆転tRNA遺伝子成立モデル」の可能性を支持する実験的証拠の一つであると言える。一方で、本研究結果はモデルの過程の一部を証明したに過ぎず、今後は他のステップの検証を目的とした実験や推察も必要である。本研究では、酸性の極限環境に生育する始原紅藻Cyanidioschyzon merolaeの逆転tRNA遺伝子(circularly permuted tRNA genes)が、遺伝子重複により生じたタンデムtRNA遺伝子から成立したとする仮説の検証を実験的に行った。昨年に引き続き、人工的に構築したいくつかのタンデムtRNA遺伝子をシゾン細胞に導入し、そこから抽出したRNAを鋳型に逆転写およびその産物のシーケンシングを行い、その成熟過程を推察した。その結果、逆転tRNA遺伝子同様、環状のRNA中間体を経て成熟体tRNAが形成され、その形成効率は比較的高いことが分かった。したがって、想定した条件が揃いさえすれば、モデルにしたがい、タンデムtRNA遺伝子から逆転tRNA遺伝子が派生し得ると考えられる。また、この実験に際し、イントロンを除去したtRNA遺伝子も人工的に構築して導入したところ、転写および成熟体の発現が確認された。すなわち、C. merolaeでは様々な形態のtRNA遺伝子の発現が可能であることが分かった。逆転tRNAのプロセシングに関わる酵素群のリコンビナントタンパク質の調製を引き続き進めているが、今年度も活性型のものは取得できなかった。手法を変更して進めている。すでに調製できた酵素については基質tRNAに対する特異性を解析した。本研究課題では、始原紅藻Cyanidioschyzon merolaeの核ゲノムに見られる「逆転tRNA」の成熟化と成立過程を明らかにすることを目的として実験を進めてきた。当該tRNAの成熟化過程には、他生物にも見られる一般的なtRNAのプロセシング酵素群が関与すると考えられている。特にtRNAイントロンスプライシング酵素は中心的な役割を果たした可能性が明白であることから、C. merolae由来のこの酵素の調製と特性に関する解析は、逆転tRNA遺伝子の成立過程の解明のためにも急務である。しかし、これまでに大腸菌や培養細胞、in vitro系など、様々なタンパク質発現系を用いたリコンビナントタンパク質の調製を試みたが、いずれも活性型酵素は調製できなかった。異生物細胞内における本酵素のRNA代謝への影響が非常に大きいことが予想される。そこで、平成27年度はC. merolae細胞内での発現系の構築に着手した。現在、遺伝子の構築途中である。イントロンスプライシング酵素以外にも、tRNAプロセシング酵素が関与すると予想され、それらの酵素タンパク質の調製も試みた。その結果、あるtRNAプロセシング酵素のホモログとされるC. merolaeのタンパク質にはRNA切断活性がないことが明らかとなった。この結果から、相同性解析では検出されない、全く異なる性質の酵素の存在が示唆された。また、当該遺伝子群の形成において、イントロンを含む重複tRNA遺伝子からの逆転tRNAの形成の可能性を検討したところ、非常に高い効率で成熟体tRNAが形成される可能性が明らかとなった。このことから、我々のモデルは正当性が高いと考えられる。以上の結果から、tRNA遺伝子の進化には、イントロンとそのスプライシング機構が深く関わっていることが示唆された。本研究結果をもとに、様々な変異体tRNA遺伝子を構築し、C. merolae細胞に導入したところ、興味深い現象が見られた。今後はその詳細を解析していく。

両tRNAの前駆体はBHBモチーフというtRNAイントロンスプライシング酵素が認識部位する高次構造を形成することから、当該酵素によって成熟化し、進化的にも関連性も高いと考えられる。本研究は、C. merolaeの細胞内で、重複する分断化tRNA遺伝子から逆転tRNAが形成されうることを実験的に示した。本研究課題のうち、一部は比較的順調に進み、昨年から引き続き行っている解析データも十分に得られつつある。解析途中ではあるが、それらの結果を用いて論文作成の準備にあたっており、次年度には学術雑誌への投稿を目指す。一方、RNAプロセシング酵素の調製に関する実験は昨年同様、期待通りには進まず、更に新たな手法の導入を予定している。昨年度は申請者が、入院のため傷病休暇を急遽余儀なくされたこともあり、連続的に行う実験の遂行が不可能であった。次年度は特に注力して実験を行い、研究課題の遂行を目指したい。分子生物学一部の実験については解析データが比較的順調に得られているため、次年度内の学術論文の作成を目指す。実験系が構築されているため、実験補助の方などを有効に起用し、必要なデータの収集をスムーズに行っていきたい。初年度からトライしているが、期待通りに結果が得られない課題については、さらに新たな手法を取り入れることで実験の遂行を目指したい。最終年度であるため、特に注力して実験を進める。本研究成果は国内の研究者が参加する学会において発表を行い、更なる研究の発展を目指すべく、アドバイス等をもらう。遺伝子重複により生じたタンデムtRNA遺伝子から成立したとする仮説の検証については比較的計画通りに進んでいる。データ収集を更に進めることで、提唱したモデルの妥当性の解析を進めていく必要がある。逆転または分断化tRNA遺伝子の成立には、その前駆体tRNAのプロセシングサイトを形成する特有のRNAモチーフと、一般的なtRNAイントロンスプライシング装置によるプロセシング機構の存在と共進化が重要な役割を果たしたと予想される。本研究では、スプライシング酵素による詳細な酵素反応メカニズムや基質認識機構の生化学的解析、および構造解析を目的として、リコンビナントタンパク質の調製を試みた。本研究費の採択によって、真核細胞を用いたリコンビナントタンパク質の受託合成の利用が可能となった。複数のサブユニットからなるスプライシング酵素のリコンビナントタンパク質の調製を試みた結果、残念ながら可溶性画分が十分に得られず、その酵素溶液を用いたin vitroプロセシングアッセイを行った結果、期待される切断活性は全く検出されなかった。この結果は、未同定のサブユニットの存在を示唆するのかもしれない。未知のサブユニットタンパク質との共発現により可溶化可能な活性型の酵素タンパク質が得られるのかもしれない。今後はサブユニット構成についての再検討を試みる。3年目に実施予定であった人工的な逆転または分断化tRNA遺伝子の構築が一部完成した。
過硝酸溶液を用いた新規殺菌方法のインプラント周囲炎治療法への応用

近年の研究でPNAのS.gordniiに対する効果は明らかにされており、今回の実験では、より口腔内の状態に近い状態の細菌感染したチタン表面に対するPNAの殺菌効果を評価し、さらなるインプラント周囲炎治療への応用を検討することを目的とする。チタン表面に形成したバイオフィルムに対する新規殺菌方法の開発を行うために、チタン表面上でStreptococcus mutans(S.mutans)のバイオフィルム形成モデルを作製し、PNA溶液と各種消毒薬の殺菌力の評価を行う。さらに、歯石およびセメント付着状態そしてファインバブル使用時でのPNA溶液と各種消毒薬の殺菌力の評価を行う。この研究を行うことにより、インプラント周囲炎に感染したインプラント表面の細菌を殺菌、かつ正常細胞への影響が小さい安全な消毒薬の開発への一助となり、最終的にはインプラント周囲炎罹患率を減少させ、口腔内の長期的な安定に寄与する一端となると考えられる。アルミナサンドブラスト処理(RS(rough surface)群)したTiディスクに対して、強固なバイオフィルムを形成することで知られる口腔内細菌であるStreptococcus mutansの培養を行う。その後、Tiディスク表面に対し、生理食塩水(S群)、クロルヘキシジン(CHX群)およびPNA(P群)の3種類の薬液を作用させ、走査電子顕微鏡(SEM)を用いた表面形態評価、Real-time PCR法を用いた遺伝子定量解析、Colony forming unit(CFU)を用いた生菌数の評価、及び菌体外多糖類(EPS)の評価を行い、除菌効果の検討を行う。予定通り、過去の研究と異なる菌種の培養法および軟組織関連細胞の培養などが進められたチタンディスク上で培養したS.mutansのバイオフィルムに対するPNAの殺菌効果(歯石様物質,セメントあり)をSEM(表面形態評価)、PCR(遺伝子定量解析)、CFU(生菌数の評価)、EPSで評価を行う近年の研究でPNAのS.gordniiに対する効果は明らかにされており、今回の実験では、より口腔内の状態に近い状態の細菌感染したチタン表面に対するPNAの殺菌効果を評価し、さらなるインプラント周囲炎治療への応用を検討することを目的とする。予定通り、過去の研究と異なる菌種の培養法および軟組織関連細胞の培養などが進められたチタンディスク上で培養したS.mutansのバイオフィルムに対するPNAの殺菌効果(歯石様物質,セメントあり)をSEM(表面形態評価)、PCR(遺伝子定量解析)、CFU(生菌数の評価)、EPSで評価を行う海外出張旅費のレートの関係で残金がでたが、ほぼ予定通りに使用している
酵素の工業利用のためにＡＴＰ依存性のリン酸化酵素をピロリン酸依存性に改良する方法

リン酸化酵素は、リン酸基の転移反応を触媒するが、ほとんどの場合ATPからリン酸基を受け取る。酵素は穏やかな条件で目的産物を純度良くつくるので工業的にも利用されるものの、リン酸化酵素ではATPにかかる費用がその利用の妨げになる。本研究では、より安価な化合物であるピロリン酸を利用する新規リン酸化酵素の立体構造に基づいて、ピロリン酸を利用する酵素をたくさん得ることを目指した。平成29年度は、前年度に得たピロリン酸依存性イノシトールリン酸化酵素(PPi-IK)の構造情報に基づいて、ATP依存性酵素のピロリン酸依存性への改良と、ゲノムデータベースにおける新たなピロリン酸依存性酵素の探索を行った。酵素改良については、いくつかの類似酵素に対してPPi-IKのピロリン酸認識に特徴的な残基を導入したり、PPi-IKと類似酵素とのキメラ酵素を作製するなどして、新たなピロリン酸依存性酵素の作製を試みたが、目的の活性を示す酵素は得られていない。一方、酵素改良の代わりに、ゲノムマイニングを利用することで新たなピロリン酸依存性酵素を見出すことに成功した。PPi-IKのピロリン酸認識に特徴的な残基を指標にして、ゲノムデータベースから新規のピロリン酸依存性酵素を探索した。その結果、特徴的な残基をもつピロリン酸依存性酵素の候補が、50個見つかった。いくつかの候補を大腸菌で発現させて活性を確認したところ、実際にピロリン酸を選択的に利用してリン酸化反応を行うことが分かった。さらに、その生成物はPPi-IKと異なっていた。今回の結果から、PPi-IKに特徴的な残基を目印にすることで、ゲノムデータベースから様々な基質をピロリン酸依存的にリン酸化する酵素が次々に見つかると期待できる。これまでに得られた成果を論文にまとめ、Nature Communications誌にオンライン掲載された。29年度が最終年度であるため、記入しない。ほとんどのリン酸化酵素は、ATPから別の分子へのリン酸基転移反応を触媒する。酵素は穏やかな条件で目的産物を純度良くつくるので工業利用されるが、リン酸化酵素ではATPにかかる費用が工業利用の妨げになる。本研究では、ATP依存性のリン酸化酵素を改良し、より安価な化合物であるピロリン酸を利用できるようにすることを目指す。2016年度は、ピロリン酸依存性リン酸化酵素がピロリン酸を利用できる構造的要因を明らかにするため、我々が同定した新規ピロリン酸依存性イノシトールリン酸化酵素(PPi-IK)のピロリン酸類似体との複合体構造を決定した。この構造からPPi-IKのピロリン酸認識に関わる残基が判明したが、ピロリン酸結合部位の1つのアルギニン残基の側鎖が定まった構造をとっておらず、ピロリン酸認識への関与は不明だった。一方、他の実験で決定した硫酸イオンとの複合体構造では、このアルギニンはピロリン酸類似体と同じ場所に結合した硫酸イオンと相互作用していた。このことから、このアルギニンもピロリン酸認識に関わると思われる。また、このアルギニンが実際の酵素反応に関わることも変異体解析により確かめた。次に、ピロリン酸認識に関わると考えられる残基の保存性を、PPi-IKが属するリボキナーゼファミリーの酵素において調べた。その結果、上記のアルギニンを含む塩基性の3残基がATP依存性酵素では保存されておらず、PPi-IKに特徴的であることが分かった。この3残基は、ATP依存性酵素をPPi依存性へ改良する足がかりになると期待できる。PPi-IK以外の新規リン酸化酵素についても研究を行い、リン酸化酵素の知見を広げてきた。ADP依存性の遊離セリンリン酸化酵素の構造解析を行い、基質認識や反応触媒機構に関する知見を得た。この内容をまとめた論文は、ACS Chemical Biology誌に受理された。ピロリン酸依存性酵素への変換においては、酵素改良については道半ばであるものの、PPi-IKの基質複合体構造からピロリン酸依存性酵素に特徴的な残基を決定しており、着実に進展している。また、別のADP依存性遊離セリンリン酸化酵素について、結晶構造から得た反応機構などに関する知見をまとめ、ACS Chemical Biology誌に発表することができた。この様な成果から、進捗状況は概ね順調であると判断した。

その結果、特徴的な残基をもつピロリン酸依存性酵素の候補が、50個見つかった。いくつかの候補を大腸菌で発現させて活性を確認したところ、実際にピロリン酸を選択的に利用してリン酸化反応を行うことが分かった。さらに、その生成物はPPi-IKと異なっていた。今回の結果から、PPi-IKに特徴的な残基を目印にすることで、ゲノムデータベースから様々な基質をピロリン酸依存的にリン酸化する酵素が次々に見つかると期待できる。これまでに得られた成果を論文にまとめ、Nature Communications誌にオンライン掲載された。これまでに、結晶構造から明らかになったPPi-IKに特徴的な3残基を、リボキナーゼファミリーのいくつかのATP依存性酵素へ導入し、ピロリン酸依存性への変換を試みている。しかし、目的の活性を有する変異型酵素は得られていないので、今後はピロリン酸結合部位にさらなる点変異を加えたり、タンパク質のドメインを入れ替えるような大きな改良を加えたりして、ピロリン酸依存性への改良を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
咀嚼運動と記憶・認知機能の関連

多くの先行研究が咀嚼運動と記憶・認知機能の関連を示唆している。本研究の目的は咀嚼運動が短期記憶形成に及ぼす影響を機能的MRIにより検討することである。短期記憶課題のみを行った場合と、咀嚼運動、手指タッピング運動後に短期記憶課題を行った場合の正答率を比較し、咀嚼運動特異的に短期記憶形成促進作用があるかどうか検討した。それぞれの運動課題後の記憶課題の正答率の方が、記憶課題のみを行ったときよりも高く、さらに咀嚼運動の方が手指タッピング運動よりも正答率向上効果が高い傾向を示すことが明らかになった。本研究より、咀嚼機能向上は記憶形成を促進させる可能性が示唆された。咀嚼課題の記憶促進効果を検証する目的で、健常被験者6名により以下の行動実験、fMRI実験を行った。【行動実験】各運動課題が記憶課題に及ぼす影響を算出するため、各記憶課題(N-back課題、咀嚼課題+N-back課題、手指タッピング課題+N-back課題)の正答率を算出し(それぞれ78.6%、94.6%、86.3%)、各運動課題後の記憶課題の正答率から記憶課題(N+back課題)のみの正答率を引いた。まず、それぞれの運動課題後の記憶課題の正答率と記憶課題の正答率を比較したが(paired t-test)、各正答率に有意差はみられなかった。しかし、運動課題後の正答率の方が高く、その中でも咀嚼課題後の正答率の方が、手指タッピング課題後の正答率より高かった。次に、運動課題の正答率向上効果を比較するため、[(咀嚼課題+N-back課題の正答率)- (N+back課題の正答率)]と[(手指タッピング課題+N-back課題の正答率)- (N+back課題の正答率)]を比較した(paired t-test)。これには有意差をみとめなかった(p=0.154)。【fMRI実験】作業記憶の責任領域である背外側前頭葉前部皮質を関心領域とし、N-back課題時の脳賦活領域を検出し、この領域を機能的関心領域とした(fROI)。行動実験から、咀嚼課題の方が手指タッピング課題より、記憶課題の正答率向上効果が高いことから、咀嚼課題後のN-back課題時の脳活動から手指タッピング課題後のN-back課題時の脳活動を比較し、fROI内で咀嚼課題の作業記憶促進効果を検証し、右側の背外側前頭葉前部皮質[(x, y, z) =(40, 30, 42) MNI coordinate, p=0.035 uncorrected, z=2.27]に、咀嚼課題の作業記憶促進効果を認めた。近年のEEGを用いた機能画像研究では、手の反復運動に比べ、咀嚼運動を行うと、その後の短期記憶課題の正答率が向上し、記憶・認知機能関連の活動が高まったと報告されている。しかし、咀嚼運動で特異的に誘発される記憶・認知機能領域は未だに確認されていない。よって、咀嚼運動の比較対象として、咀嚼運動と同等の負荷を伴う運動を決定し、その運動が短期記憶課題の成績に及ぼす影響を、咀嚼運動が及ぼすものと比較する必要がある。本年度は、咀嚼運動と同等の負荷を伴う運動と咀嚼運動の決定を行った。fMRIで脳活動を計測する場合、咀嚼運動による頭部の動きがアーティファクトを発生し、実験結果の精度を低下させることが知られている。よって、頭部の動きをできる限り低減するため、ガム咀嚼、タッピング、クレンチングといった様々な咀嚼運動を検討した。その結果、開口を伴わないタッピングが適していることがわかった。次に、開口を伴わないタッピングと同等の負荷を伴う運動(手指の回転運動、指のタッピング運動など)を検討した。それぞれの運動負荷の評価は、各運動に関わる筋肉の血流増加量を測定して比較した。血流増加量の計測には、近赤外光を用いたレーザー組織血液酸素モニターによって行った。開口を伴わないタッピング時には、両側の咬筋を測定した。手指のタッピングの場合、深指屈筋を測定した。タッピングに参加する手指の数が2本の場合、開口を伴わないタッピングと同程度の血流変動を認めた。

よって、開口を伴わないタッピングと同等の負荷を伴う運動として、第3,4指のタッピングを用いることとした。倫理委員会申請が遅れており、実験課題が決定しても、fMRIデータ取得に至らなかったため。現在、倫理委員会はプレ診査が終わった段階で、本審査で許可か出ればfMRIデータが取得できる段階である。これを踏まえ、次年度では、短期記憶課題に対し、「咀嚼」と「咀嚼と同等の負荷を伴う手指のタッピング運動」のそれぞれが、どのような影響を及ぼしているのか、fMRIによる脳活動計測によって検討する。fMRIより、咀嚼運動と関連する記憶・認知機能領域を検出し、これが、咀嚼運動に特異的であるかどうか、対象運動(手指のタッピング運動)と比較検討する。また、これらの認知・機能領域は、咀嚼運動領域、もしくは対象運動領域とどのような機能的神経回路を形成しているか解明する。このため、DCM解析を代表とする脳領域間結合解析を行い、記憶・認知機能を亢進させる咀嚼運動特異的神経回路の存在を検討する。更に、咀嚼運動をマウスピースなどで阻害した場合、短期記憶課題の成績に影響を及ぼすのかどうか検討する。もし、影響が確認できた場合、マウスピースでの咀嚼阻害前後で脳活動がどのように変化するのかfMRIによる脳活動計測によって検討する。fMRIデータ取得の際のMRスキャナ使用料、被験者への謝金、研究打ち合わせのための旅費、データ保存用のハードディスクに使用予定である。
脂肪細胞への運命決定と分化ポテンシャルを規定するエピジェネティック制御機構の研究

発生分化関連転写因子の発現制御にH3K4me3(活性型)とH3K27me3(抑制型)が同時に起こるBivalent修飾の重要性が提唱されている。ES細胞、マウス白色脂肪組織内前駆細胞や、マウス胎児線維芽細胞MEFでPPARγ1プロモーターにBivalent修飾を認めた。MEFの脂肪分化ではH3K27me3が減少しH3K4me3の活性型に変化した。PPARγ1のBivalent修飾の変化は分化刺激であるDMI刺激に非依存性であった。PPARγ1プロモーターのbivalent修飾は、前駆脂肪細胞/幹細胞の未分化状態におけるPPARγの発現ポテンシャルを規定するヒストン修飾である可能性が示唆される。(A)脂肪細胞分化のポテンシャルにおけるエピジェネティクス制御の検討脂肪細胞分化のマスターレギュレータであるPPARγ1プロモーターのbivalent修飾は、前駆脂肪細胞/幹細胞の未分化状態におけるPPARγの発現ポテンシャルを規定するヒストン修飾である可能性が示唆された。脂肪細胞分化を制御する転写因子PPARγのプロモーターをクロマチン免疫沈降(ChIP)で検討したところ、ES細胞、マウス胎児線維芽細胞(MEF)、マウス白色脂肪組織由来の脂肪前駆細胞において、PPARγ1プロモーターにBivalent修飾(H3K4me3(+), H3K27me3(+))を認めた。一方マウス白色脂肪組織成熟脂肪細胞や未分化状態の3T3-L1、C3H10T1/2細胞では活性型H3K4me3(+)のみを認めた。MEFの脂肪分化では、PPARγ1プロモーターのH3K27me3が減少し、H3K4me3(+)は維持された。このBivalent修飾の変化は分化刺激であるDMI刺激に非依存性であった。H3K27me3の特異的な脱メチル化酵素Jmjd3とUtxをノックダウンしたところ、分化に伴うPPARγ1プロモーターのH3K27me3の消失が減弱し、脂肪細胞分化におけるPPARγとその標的遺伝子の発現誘導および、中性脂肪の蓄積が抑制された。また、この抑制はPPARγの強制発現でレスキューされた。脂肪細胞分化のプロセスには(1)PPARγ1プロモーター領域のH3K27脱メチル化酵素によるBivalent修飾の解消と、(2)分化刺激(DMI刺激)の両方が必要であることが示唆された。脂肪細胞分化のマスターレギュレータであるPPARγ1のプロモーターおけるヒストン修飾状態をChIP-qPCRにより解析した。多能性幹細胞であるES細胞に加えて、脂肪組織内の前駆脂肪細胞、胎児線維芽細胞において、H3K4me3とH3K27me3が同時に生じるbivalent修飾が観察された。一方、脂肪組織内の成熟脂肪細胞や未分化状態の3T3-L1、C3H10T1/2細胞ではH3K4me3のみを認めた。H3K27脱メチル化酵素のノックダウンでPPARγ発現と脂肪細胞分化が抑制され、トランスクリプトーム上もPPARγノックダウンとオーバーラップすること、PPARγの過剰発現で表現型がレスキューされた。以上からPPARγ1のプロモーターのbivalent修飾が各種細胞におけるPPARγ発現や脂肪細胞分化のポテンシャルを規定している可能性が示唆された。糖尿病・代謝内科(A)脂肪細胞分化のポテンシャルにおけるエピジェネティクス制御の検討(A2)MEF細胞の分化における血清中成分によるエピゲノム制御の探索を行った。血清中にヒストン修飾の解消を規定する成分を探索するために、FBSの活性因子などを除去したcharcoal stripped FBSやboiled FBSなどによるPPARγの発現・脂肪細胞分化及びヒストン修飾の変化をChIP-qPCR解析法により検討した。また、血中成分で、脂肪細胞分化に必需なレギュレーターあるIGFIなど各種活性因子による脂肪細胞分化のポテンシャルの制御をChIP-qPCRにより検討した。研究計画に従って実験を進めて結果が得られている。(A)脂肪細胞分化のポテンシャルにおけるエピジェネティクス制御の検討(A1)MEFの脂肪細胞分化におけるBivalent解消と遺伝子発現を結ぶメカニズムを解明する。H3K27Ac, H3K9Ac, PolII及びヒストンアセチル化酵素の結合、クロマチンオープン状態などにより、Bivalent解消後からPPARγの発現上昇及び脂肪細胞の分化を制御するエピジェネティック機構を検討する。(A2) MEF細胞の分化における血清中成分によるエピゲノム制御を探索する。血清中にヒストン修飾の解消を規定する成分を探索するために、FBSの活性因子などを除去した血清によるPPARγの発現・脂肪細胞分化及びヒストン修飾の変化を検討する。また、IGFIやHGFを含む各種活性因子による脂肪細胞分化のポテンシャルの制御をChIP-qPCRやマイクロアレイにより検討する。

(B)筋細胞分化/脂肪細胞分化スイッチにおけるクロマチン制御の役割を検討する。筋細胞分化のマスターレキュレーターであるMyod1の過剰発現によりMEF細胞は筋細胞へ分化する。その際にMyod1、PPARγプロモーターのヒストン修飾変化をChIP-qPCR法により解析し、エピジェネティックによる筋細胞と脂肪細胞分化のスイッチの変化を検討する。(C)血管内皮細胞からの脂肪細胞分化のエピジェネティクス制御機構について、HUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)の脂肪細胞分化の各段階におけるエピジェネティクス変化を検討する。近年脂肪組織中の血管内皮細胞が白色脂肪細胞及び褐色脂肪細胞を産生すると報告された。HUVECにおいてTGF-β2、BMP4添加後、脂肪分化刺激後など各段階におけるヒストン状態やヒストン修飾変化を検討する。siRNAや過剰発現を用いて、各段階においてヒストン修飾酵素により脂肪細胞分化の制御を検討する。
発達障害児の地域社会で自立・自律生活できる能力を育てる看護支援システムの開発

1.生涯型看護支援プログラムの開発:発達障害児が将来、自立・自律生活を営むための研修内容を構築した。最終年度は、調理に特化し、記録用紙とマニュアルを作成した。2.看護師研修プログラムの開発:看護支援の目的・方法などに関する研修資料と指導計画を作成した。(体的な支援内容、注意事項の説明など)3.研修用ITプログラムの開発:上記の資料をホームページ(HP)に掲載して、ダウンロードして利用できるようにした。不当アクセスの防止のため、パスワード管理も準備した。(1)20年度:生涯型看護支援プログラムと評価尺度の作成1)生涯型看護支援プログラムの開発(1)生涯型看護支援プログラム専用の生活行動尺度を作成する(2)生涯型看護支援プログラム(支援の内容・方法・組織など)を作成する2)ITを用いた遠隔支援方法(支援用ITプログラム)の開発(1)遠隔支援およびそれに必要な支援内容を調査・検討できるプログラムを作成する(2)1)-(1),(2)を対象者が自宅で自己評価・自主訓練できるソフトを作成する→4と同時に配信(2)21年度:看護師研修プログラムと評価尺度の作成3)看護師研修プログラムの開発(1)1)-(1)で作成した尺度の使用方法・評価方法に関する研修資料と指導計画を作成する(2)1)-(2)で作成した看護支援の目的・方法・留意事項などの研修資料と指導計画を作成する4)ITを用いた遠隔研修方法(研修用ITプログラム)の開発(1)3)-(1),(2)に関して研修を受けた看護師が自宅研修できるソフトと指導計画を作成する5)研修効果尺度(研修評価用・支援評価用)を作成する(3)22-23年度:看護支援システムの実践・評価6)看護師研修プログラムの実践・評価(1)看護師を対象者にして、3),4)を用いた研修を行う(2)生涯型看護支援プログラムを実践後、研修内容および研修効果を5により評価・検討する7)生涯型看護支援プログラムの実践・評価(1)発達障害児と家族を対象として、1,2を用いた支援を行う(2)支援を実践後、発達障害児と家族への支援の効果を評価・検討する(4)24年度:研究結果の統合分析・最終まとめ・発表・報告1.生涯型看護支援プログラムの開発:発達障害児が将来、自立・自律生活を営むための研修内容を構築した。20年度は初年度であり、下記のような看護支援システムの開発に不可欠なインフラ整備に従事した。1.生涯型看護支援プログラムに用いる評価尺度の開発準備1)発達障害児が地域社会で自立・自律生活する際の現実課題を把握するため、グループホームの支援従事者7名、中学・高校の特別支援に従事する教諭2名、先の研究(厚労科研H16-医療-023)でグループホームでのモデル実践に従事した看護師1名からの聞き取り調査・分析を行った。2)項目作成のため、1)の結果および厚生労働省の障害程度区分認定の概況調査票・認定調査票を検討して作成した調査紙により、中学3年生高校3年生の知的障害児の保護者を対象とした調査を行った。全国特別支援学校知的障害教育校PTA連合会に所属する高校から47都道府県に各100件前後の配布ができるよう、各1,2校を窓口として、計5583通を配布した。21年度になってから配布した窓口校もあり、21年4月末現在、回収数443件(回収率8%)で、現在回収継続中である。紙面調査の一部の協力者(20名程度)への紙面調査の補足のための聞き取り調査は21年度前半期に変更した。2,支援用ITプログラムの準備・開発具体的には、過去に開発したプログラムを利用した看護実践の紹介、研究成果によるソフトウェアを配信の準備(使用に関する契約書の作成、パスワード管理など)をした。広報は1-2)の調査校およびメールを記載して聞き取り調査協力を承諾した対象者、過去の研究協力者(保護者)および地域のボランティアセンター、公的および民間の福祉機関に対して行った。2)SKYPEおよびYahoo Messengerを活用したwebによる遠隔支援・教育の環境準備を行った。平成21年度は本研究2年目であり、下記のような看護支援内容の開発に従事した。1.平成20年度に試作した生涯型看護支援プログラムの改良通、回収数539件(回収率10.5%)を得て、数量化可能な部分について統計分析を行った。また、その結果および自由記載内容を検討し、この調査記載で追加調査協力の内諾を得られた回答者の中から、子どもの障害が軽度および中等度の保護者48名を抽出して、質的な内容を補足するために、メールによる聞き取り調査を依頼し、14名(回収率29.2%)から協力を得た。必要時には追加質問を行い、聞き取り回数は15回/名、平均1.9回であった。それらに基づき、看護専門職が判断した対象者ニーズだけでなく、保護者が共通してもつ対象者の自律・自立に関する価値観の把握を行い、保護者がプログラムに意欲的に取り組むために必要な要素の把握も行えた。

結果、保護者・看護師・介護ヘルパーが共有できる試作アセスメント用紙を作成した。2.支援用ITプログラムの準備・開発過去の研究成果の掲載と実践普及のために立ち上げた専用HP (http://uribow.org)更新を継続して行うほか、システム面では、遠隔支援・教育の準備として、セキュリティエリア内にe-learningシステムを整えた。また、webによる遠隔支援・教育の実践準備として、研究者および研究協力者間の会議には必ず、SKYPEを使用し、交信のトレーニングも行った。(1)看護師研修プログラムの開発1)作成した尺度の使用方法・評価方法に関する研修資料と指導計画の作成:対象者の生活能力に応じて設定した課題を13個程度含んだ日課を容易に作成できる記録用紙やマニュアルの試作を行った。2)看護支援の目的・方法などに関する研修資料と指導計画の作成(日課・注意事項の説明、業務内容と流れなど):食事、保清、環境整備などの主な生活行動を含む日課モデルを容易に作成できる記録用紙やマニュアルの検討。(2)研修用ITプログラムの開発1)自宅で研修・評価できるソフト(画像、映像、ナレーションの資料)の作成と指導計画の作成:検討結果、研修看護師用は実用的ではないと判断し、一方で、研修者を対象とした視覚教材ではなく、プログラム対象者を対象としたものが有用であると考え方針転換を行った。また、双方向の通信ツールがあれば、安全面にも配慮した有効な支援が行え、対象者の抱える課題にも即時的に対応することができると考えられ、次年度の課題とした。(3)研修効果尺度(研修用・実践用)の作成1)内容理解度、指導能力、実践技術、指導効果などの数量化尺度について、次年度に向けて、完成を急ぐこととなった。今回の対象は、これまで5年間にわたり関わってきたため、日常生活行動・発達段階など観察・評価しやすかった。しかし、スケールの一般化のためには、初対面の対象を効果的に評価できる必要があると考えられた。(4)その他1)研修の受け入れ人数:プログラム計画などビジョンが明確になるまで、研修1回1名が有効であると考えられた。2)プログラムの効果査定:対象者の課題達成率の集計を行い、効果査定の明確化を行う必要性が示唆された。(1)看護師研修プログラムの開発1)作成した尺度の使用方法.評価方法に関する研修資料と指導計画の作成:対象者の生活能力に応じて設定した課題を13個程度含んだ日課を容易に作成できる記録用紙やマニュアルの試作を行い、十分に活用できた。最終年度では、これを活用した最終検討を行うが、大きな項目については、共有し、詳細項目は個別設定する予定である。2)看護支援の目的・方法などに関する研修資料と指導計画の作成(日課.注意事項の説明、業務内容と流れなど):食事、保清、環境整備などの主な生活行動を含む日課モデルを容易に作成できる記録用紙やマニュアルの検討を行った。最終年度である次年度は、これを活用した最終検討を行う。(2)研修用ITプログラムの開発
天然化合物を用いた特異的サイトカイン産生制御療法の開発

1)IL-17産生を抑制するソウジュツ成分Atractylodinの投与は腸炎モデルで抗炎症効果を発揮した。AtractylodinはIL-17を産生するTh17細胞の分化に関与するIL-6の産生を抑制していた。更に、AtractylodinはIL-6のmRNA発現に関与する転写因子の活性化には影響を与えずgenome DNA上のIL-6 promoterと転写因子NF-kBの結合を阻害していた。2)腸内細菌代謝産物である酢酸は大腸粘膜上皮細胞においてtubulin alphaアセチル化を介しRap1活性化を阻害することによりflagellin刺激によるIL-8の産生を抑制することを解明した。平成25年度の研究の結果、以下のことを解明できた。1.AtractylodinはIL-6 mRNA発現に対してTNFalpha刺激2時間後までは影響を与えず、6-18時間後に生じる発現上昇を抑制する。2.Reporter assayではAtractylodinはTNFalpha刺激によるIL-6 promoter依存luciferase発現には影響を与えない。3.AtractylodinはIL-6 mRNA stabilityにも影響を与えない。4.TNFalpha刺激により活性化される転写因子、NF-kappaBのDNA結合能力をAtractylodinは阻害しない。5.しかし、ChIP assayで検討したところ、TNFalpha刺激6時間後、NF-kappaBとゲノム上のIL-6 promoterの結合はAtractylodinにより阻害される。以上の結果からAtractylodinはIL-6 mRNA発現に必要な転写因子であるNF-kappaBそのものの活性化には影響を与えずIL-6 promoter上でepigeneticな影響をもたらすことによりNF-kappaBとIL-6 promoterの結合を阻害しTNFalpha刺激6時間後以降のIL-6 mRNA発現上昇を抑制することが示唆された。他にも腸内細菌が産生する短鎖脂肪酸の中で量が最も多い酢酸の抗炎症作用の分子機序を以下の通り解明した。平成24年度の研究の結果、以下のことを解明できた。1)Atractylodinは活性化T細胞においてIL-6の産生を抑制することでIL-17の産生を抑制する一方、IFNgamma・IL-4・IL-2の産生に与える影響は小さかった。2)Atractylodinは活性化T細胞だけではなくTNFalphaで刺激した線維芽細胞でもIL-6の産生を抑制した。3)腸炎モデルマウスで検討したところ、腸炎発症初期には線維芽細胞でIL-6が産生されることが分かったため、線維芽細胞を用いてAtractylodinによるIL-6産生制御の機序を分子レベルで検討した。その結果、TNFalpha刺激2時間以内に見られるIL-6 mRNA発現誘導には影響を与えず、TNFalpha刺激6ー18時間後にみられるIL-6 mRNAレベルの上昇を劇的に抑制することが分かった。4)ハプテン-タンパク複合体を蛍光観察できる腸炎モデルでAtractylodinの治療効果を検討したところ、ハプテン-タンパク複合体が形成される粘膜においてAtractylodinはステロイドと同等な腸炎発症抑制効果を示した。更に腸炎に伴う下痢・体重減少についてもAtractylodinはステロイドと同等な改善効果を示した。1.AtractylodinはTNFαで刺激したprimary fibroblastsにおいて1プラスミド上のIL-6 promoterの活性化に影響を与えなかった。2IL-6 prototerを活性化する代表的な転写因子であるNF-kBの転写能活性化およびDNA結合能活性化に対して、いずれも影響を与えなかった。3しかし、ゲノムDNA上のIL-6 promoterへのNF-kBの結合をTNFα刺激6時間後に抑制していた。以上からAtractylodinはTNFα刺激6時間後にゲノムDNA上のIL-6 promoterのepigeneticregulationに対して作用を発揮していることが示唆された。Epigenetic regulationは主にヒストンの修飾(アセチル化やメチル化など)を介して行われるため、今後はAtractylodinがどのようなヒストン修飾に対して作用を発揮しているかについて更なる解析が必要であると考えられた。2.腸内細菌の主要な代謝産物である酢酸は脱アセチル化酵素HDAC6の活性を阻害しtubulinαのアセチル化を誘導することによりT細胞で転写因子NFATの活性化を制御する作用を有している。このtubulinαアセチル化をバイオマーカーとして大腸における酢酸の影響を評価したところ、盲腸側で上皮間T細胞だけでなく粘膜上皮細胞でもtubulinαアセチル化が誘導されていた。粘膜上皮細胞での酢酸の作用を解析したところtubulinαアセチル化を介してflagellin刺激によるIL-8の産生を抑制していた。但し、粘膜上皮細胞ではtubulinαのアセチル化によりNFATの活性化ではなくRap1の活性化が制御される結果としてflagellin刺激による転写因子AP-1の発現が抑制されていた。

名古屋大学大学院医学系研究科消化器内科学講座のホームページ消化器内科学Atractylodinの作用部位を特定できた。酢酸の抗炎症作用を分子レベルで解明できた。Atractylodinがサイトカイン産生に与える影響についてT細胞以外の線維芽細胞でも確認することができ、タンパクレベルだけでなくmRNAレベルでも評価することができた。また、腸炎モデルマウスでAtractylodinの治療効果を確認できた。更にAtractylodin以外にもEleutheroside Bにサイトカイン産生制御作用があることを示唆する結果を得ることができた。1.Atractylodinの作用機序を分子レベルで解明する。AtractylodinはIL-6 promoterのepigeneticな修飾に影響を与えると考えられる。Epigeneticな修飾としてgenome DNAのメチル化およびヒストンのアセチル化・メチル化が知られている。TNFalpha刺激後に生じるこれらのepigeneticな修飾を調べ、更にAtractylodinが与える影響とその仕組みを解明する。2.サイトカインの産生を制御する天然化合物の同定を更に進める。T細胞・マクロファージだけでなく線維芽細胞もサイトカインを産生することが分かった。これらの細胞における様々なサイトカインの産生を指標としてスクリーニングすることによりサイトカインの産生を特異的に制御する天然化合物を同定する。1)AtractylodinがIL-6の発現をmRNAレベルで抑制する機序を分子レベルで解明する。2)生薬成分など天然化合物のスクリーニングを進め、AtractylodinやEleutheroside B以外にサイトカイン産生制御作用を有する化合物を同定する。3)新たに同定された化合物のうち、優れた抗炎症効果が期待できるものについてはAtractylodin同様に作用機序の解明と治療効果の検証を行う。該当なし