hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異方性結晶を対象とする可視～真空紫外域連続偏光発光・励起分光測定系の開発

これら目的を達成するため、まずVISVUV連続偏光発光・励起分光計を購入(一部製作)する予定であったが、金額の問題で購入困難となってしまい、かねてより構想のみ行っていた超高真空フランジに作り付けたVISVUV分光器の自作に計画を変更した。この構想は本目的に適していたが設計は全く行っていなかったため、H27(初)年度は前提とする真空槽内に組込み可能かを光源追跡法のシミュレーションによって検討し、変形チェルニ・ターナ型分光器で可能であることを確認し、また光学素子の配置や曲率等の数値を決定した。H28年度は、偏光子部分の基本設計を行うとともに、分光器本体のマウントなど具体的な設計を行った。ミラーマウントや光学調整機構・波長掃引機構などを組込んでも実際に真空槽内に配置できるかを3D-CADを用いて行い、空間の取り合いから光学素子の配置と曲率を一部変更した。また、最終設計において曲率(磨き)の誤差を調整機構で修正可能であることも光源追跡で確認した。これらの結果を受け、H29(最終)年度では、H28年度より順次発注した光学素子やCCD検出器に合わせてマウント部分他、分光器の各パーツの製作を全て行った。その結果、分光器の組立及び粗い調整は完了しているが、SR施設でのビームタイムには間に合わなかったため、次年度で分光器の最終調整と発光測定を行う予定である。今日、紫外線(UV)の領域でもLEDなど半導体素子への期待は大きい。しかし、UVで使う材料の光学的な性質を知るには、よりエネルギーの高い真空紫外光(VUV)まで調べることが必要である。そこで発光がVUVでも偏光特性も含めて測定ができる分光器系を構築し、理想的な紫外光源であるシンクロトロン放射光の施設で運用することを目標にした。その結果、分光器の構築にほぼ目処を付けることが出来るところまで達した。最難関と予想している偏光子部分をどう組み込むかを、28年度前半に解決する予定である。その結果、28年度後半には光学部品の発注やその他部品の製作まで行い、できるだけ早くVUV分光器を作製する予定である。VUV分光器の製作にあたり、使用する超高真空部品・既製品の光学部品と整合性を持つ機械的な設計はほぼ完了しており、H29年度(最終年度)は、1)部品類の購入と2)工作のために部品図作製3)工作依頼4)組み立てと調整5)簡易制御ソフト作成6)実験現場への持ち込み7) AlGaN偏光発光測定の手順となる。2)を最優先にH29夏を目標に1)4)を、秋を目標に4),5)を行い、H29年度後半に確保予定のマシンタイムで6),7)を行う予定とする。7)で偏光発光をうまく捉えることが出来るかは未知の課題であるが、偏光を考慮しないAlGaN発光測定は使用予定のビームラインにて過去に多くの実績を持っているため、1)5)の部分(特に2)と4))の進行が最大課題となると考えている。真空紫外分光学上述したように、購入予定だったVUV分光器が購入困難となったため、自作に変更した。そのため、当該年度は設計に集中することになり、購入予算がまるまる次年度に繰り越しとなったため。上述のようにVUV分光器を自作することに計画変更したため、真空部品・光学部品の決定と購入や部品の機械製作など大部分が次年度にずれ込んだため。自作分光器の設計が28年度中に終わると、高価な光学部品の購入、部品製作依頼などに次年度使用額の殆ど投入することになると予想し計画している。平面ミラー等の光学部品・超高真空部品・偏光子及びVUV分光器に組み込む受光素子の購入、学内および外部への部品の工作依頼及び旅費を計画している。
Intraoperative real-time non-invasive cerebral blood flow analysis by Laser Speckle Contrast Imaging

脳血管障害や脳腫瘍などに対して開頭手術を行う際には脳血管の走行を理解することが大変重要です。手術の前に検査を行いますが、手術中にも脳血管・脳血流を簡便に確認できる手法の開発を目指して研究を計画しました。具体的には、手術中の脳に特殊なレーザー光を当ててカメラで撮影し、光の反射を解析する画像処理によって血管と血流を見つけるものです。薬剤を使用せず、非接触の検査であるため患者さんへの負担や侵襲はありません。
ヒアルロン酸ノックダウンマウスの老化機構の解明及び抗加齢医薬開発への活用

マウスに4-メチルウンベリフェロン(MU)を経口投与すると,アンチエイジング物質である高分子多糖のヒアルロン酸(HA)の合成が特異的に抑制され, HAノックダウンマウスを作製することができる。本マウスの皮膚には皺及び乾燥の老化症状を認め,老化モデルマウスである。本研究ではHAノックダウンマウスの病態形成の分子機構を解析した。最初にHAノックダウンマウスの臓器のHA含量を解析した。その結果,皮膚のHA含量は著明に減少していた。またHAの減少による角層水分含量の低下も著明であった。しかも脳を除く他の臓器のHA含量も同様に減少していた。次に皮膚におけるHA合成酵素(HAS13), HA分解酵素(Hyal14)及びHAレセプター(CD44, RHAMM)の発現変動を解析した。その結果, HAノックダウンマウスの表皮及び真皮におけるHAS-2,表皮におけるRHAMMの各遺伝子の転写は何れも抑制していた。その際, HAS-2では転写因子のde novoな合成を必要とせず,既存の転写因子のリン酸化の関与が考えられた。RHAMM遺伝子の転写の抑制には, de novoの転写因子の合成が必要であった。またHAノックダウンマウスの皮膚に発現する遺伝子の網羅的解析を行った結果,発現が有意に変動するもの61種を見出した。特にtoll-like receptor 3の減少は著しく,炎症誘発による皺形成への関与の可能性を考えた。チロシン脱リン酸化酵素,サイクリンY, Rho等の癌遺伝子も著明に減少していた。すでに我々は腫瘍細胞の増殖と転移がMUにより抑制することを報告しており,各癌遺伝子の発現減少はその病態に関わると考えた。一方,ストロメライシン3は著明に亢進し,細胞外マトリックスの分解を促進し,皺形成を促進すると考えた。最後に,各種分子量のHA及び網羅的解析で見出した老化関連遺伝子を生体皮膚に投与し,本マウスの皮膚の老化の治療を行った。経口摂取,外用及び皮内注入した結果,高分子HAを皮内に注入した場合のみアンチエイジング効果を認め,内服や外用効果は全く老化症状の軽減は認められなかった。老化関連遺伝子(V型及びVII型コラーゲン, RHAMM, toll-like receptor 3,サイクリンY, Sir7等)のタンパクの生体皮膚への導入もアンチエイジング効果を全く示さず,単独での導入は治療に直結せず,幾つかの遺伝子の組み合わせによるカクテル療法が必要と考えられた。高分子多糖のヒアルロン酸(HA)は生体のアンチエイジングにとって非常に重要な物質である。しかし,HAの重要性は認識されているものの,アンチエイジングの作用に関する分子機構の詳細は依然として不明であり,アンチエイジング研究及びその他のHA関連研究の進歩を遅らせている。申請者らは,これまで存在の知られていなかったHA合成の阻害剤の探索を行い,4-メチルウンベリフェロン(MU)という物質がHA合成を特異的に阻害することを先駆けて突き止めた。しかもMUをマウス投与して,HA合成が特異的に抑制され,皮膚の菲薄・粗造化及び乾燥の皮膚老化症状と跛行など膝関節の老化症状を認めるマウス「HAノックダウンマウス」を作製した。本研究では,このマウスを新規老化モデル動物と位置づけ,その病態の分子機構を解明する。しかもこのマウスをアンチエイジング効果判定動物として活用し,新規アンチエイジング医薬の発掘・開発を行う。

経口摂取,外用及び皮内注入した結果,高分子HAを皮内に注入した場合のみアンチエイジング効果を認め,内服や外用効果は全く老化症状の軽減は認められなかった。老化関連遺伝子(V型及びVII型コラーゲン, RHAMM, toll-like receptor 3,サイクリンY, Sir7等)のタンパクの生体皮膚への導入もアンチエイジング効果を全く示さず,単独での導入は治療に直結せず,幾つかの遺伝子の組み合わせによるカクテル療法が必要と考えられた。4-メチルウンベリフェロン(MU)を投与して作製したHAノックダウンマウスの皮膚は菲薄化と粗造化が必発する。また,本マウスの中には跛行する物もおり,皮膚や関節にヒトの老化と類似した変化が生じていると予想される。本年度はその病態解析を行なった。HAノックダウンマウスから臓器を採取,解析した結果,皮膚水分含量は著明に減少し,HA減少による包水性の低下が予想された。一方,皮膚の弾性低下,メラニン色素産生の変動,炎症の誘発等は認められなかった。そこで,HA関連酵素(HA合成酵素(HAS1-3),HA分解酵素(Hyal1-4))の発現を解析した結果,HAS2の発現のみ抑制されていた。この結果は皮膚の培養細胞レベルでも同様であり,転写阻害剤アクチノマイシンD共存下では抑制効果が完全に消失したことから,MUは転写レベルでHAS2遺伝子の発現を抑制してHAの発現を抑制している機構が考えられた。また,病理組織像では表皮及び真皮の薄化が著明であり,老化皮膚の類似の変化を認めた。表皮ではケラチン14が増強し,ケラチン1は低下しており,表皮の非薄化は分化亢進によると考えられた。一方,真皮では,I型やIII型コラーゲンなどの皮膚に主要なコラーゲンに変化は無かったが,同じく皮膚の構築に重要なV型やVII型コラーゲンの発現低下を認めた。我々はVII型コラーゲンの低下が皮膚の老化に関与していることを既に見出しており,MUも皮膚の老化と類似の反応を誘導している可能性が示された。本年度は,第1に,昨年度同様HAノックダウンマウスの組織の病理組織学解析を行った。その結果MUにより角質水分量の著明減少,弾力には影響が無いこと及び真皮の萎縮を見出した,何れもMUによるヒアルロン酸合成の低下を反映していた。また汗腺が拡張していた。拡張の原因はMUの過剰投与によるMUの汗管内への充満であった。投与量を10mg/g体重から5mg/g・体重にすると改善され,今後この条件での解析を進めた。またMUによるヒアルロン酸低下は抱水性を低下させ,その結果膝軟骨を菲薄化させた。本ノックダウンマウスは跛行するものが多く,その原因と考えた。第2に,昨年度同様本マウス特異的遺伝子の発現解析を行った。ヒアルロン酸合成酵素HAS-2遺伝子の発現抑制が転写レベルで行われることは既に見出していたので,本年度ルシフェラーゼアッセイ法及びゲルシフトアッセイ法により更に詳細に解析し,少なくとも2ヶ所のMUの応答配列を同定した。現在,転写因子の性質等の解析を進めている。また網羅的解析では,MUにより発現が消失するもの61種を見出した。toll-like receptor 3の減少は興味深く,加齢による皮膚の皺形成や炎症誘発に関与する可能性を考えた。
ライフスタイルと末梢血白血球分布及びDNA安定性との関連性に係わる追跡研究

本年度のインフォームドコンセントが得られた146人の男性従業員(2060歳)に対し自記式質問紙法を用いて調査を行った。調査内容は年齢、身長、職種、喫煙・飲酒・栄養バランスなどの生活習慣状況、既往歴、現病歴、投薬状況、家族病歴等であった。ライフスタイルは森本の八つの健康習慣指数(HPI)を用いて評価した。対象者のうち、良好なライフスタイルを有する者は24人(16.4%)、ライフスタイル中庸の者は74人(50.7%)、ライフスタイル不良の者は48人(32.9%)であった。ライフスタイルの詳細な内容について以下の通りである。1.喫煙者43人(29.5%)、平均喫煙本数18.2±7.6(標準偏差)、平均喫煙年数24.8±11.6(標準偏差)。2.ほぼ毎日飲酒している者38人(26.0%)。3.ほとんど運動しない人者79人(54.1%)。4.睡眠時間7時間未満の者103人(70.5%)。5.一日9時間以上の勤務者53人(36.3%)。6.ストレス多いと感じている者52人(35.6%)。7. 6ヶ月前と比較して、体調がよくなったと回答した者7人(4.8%)、悪くなったと回答した者26人(17.8%)。各被験者より10mlの血液を採集し、白血球計数(cells/μL)を行った。結果、白血球は5913.0±1434.6、好塩基球は33.7±18.8、好酸球は173.0±136.1、好中球は3374.8±1088.5、リンパ球は2015.1±591.5、単球は317.3±118.5(平均値±標準偏差)であった。リンパ球サブセットの分布を測定した。コメットアッセイ(comet assay)法でBaseline DNA損傷量の測定した結果、%DNA in tailの平均値は2.32±1.32(標準偏差)。現在、DNA損傷量と健康習慣及び白血球サブセット間の関連性を解析中である。本年度のインフォームドコンセントが得られた160人の男性従業員(2060歳)に対し自記式質問紙法を用いて調査を行った。対象者のうち、良好なライフスタイルを有する者は32人(20.0%)、ライフスタイル中庸の者は87人(54.4%)、ライフスタイル不良の者は41人(25.6%)であった。喫煙者46人(28.7%)、平均喫煙本数17.8±6.4(標準偏差)、平均喫煙年数25.1±11.9(標準偏差)。(2)ほぼ毎日飲酒している者39人(24.4%)。(3)ほとんど運動しない人者71人(44.4%)。(4)睡眠時間7時間未満の者28人(17.5%)。(5)一日9時間以上の勤務者45人(28.1%)。(6)ストレス多いと感じている者42人(42.0%)。(7)6ヶ月前と比較して、体調がよくなったと回答した者13人(8%)、悪くなったと回答した者18人(11.2%)。コメットアッセイ(comet assay)法でBaseline DNA損傷量とDNA損傷修復能の測定した結果、%DNA in tailの平均値は1.53±1.07(標準偏差)、10分間の平均DNA損傷修復率は約83%であった。現在、DNA損傷量と修復力、健康習慣及び白血球サブセット間の関連性を解析中である。

7. 6ヶ月前と比較して、体調がよくなったと回答した者7人(4.8%)、悪くなったと回答した者26人(17.8%)。各被験者より10mlの血液を採集し、白血球計数(cells/μL)を行った。結果、白血球は5913.0±1434.6、好塩基球は33.7±18.8、好酸球は173.0±136.1、好中球は3374.8±1088.5、リンパ球は2015.1±591.5、単球は317.3±118.5(平均値±標準偏差)であった。リンパ球サブセットの分布を測定した。コメットアッセイ(comet assay)法でBaseline DNA損傷量の測定した結果、%DNA in tailの平均値は2.32±1.32(標準偏差)。現在、DNA損傷量と健康習慣及び白血球サブセット間の関連性を解析中である。
難治性鼻腔NK/T細胞性リンパ腫の血清EBウイルスDNA解析と治療法改善への応用

鼻腔原発の悪性リンパ腫は、従来、進行性鼻壊疽、致死性正中肉芽腫などと呼ばれ、壊死を伴い浸潤性の発育を特徴とし、治療抵抗性の疾患とされてきた。1990年代に入りその多くが悪性リンパ腫であることが判明し、血管破壊性に腫瘍が増殖するという特徴から、1994年のREAL分類ではAngio-centric T-cell lymphomaと命名された。その後の分子生物学的検索により、本疾患ではT細胞受容体の再構成が認められず、NK細胞の表面形質であるCD56が高率に陽性であることから、2001年のWHO分類ではExtranodal NK/T-cell lymphoma,nasal typeとされた。本疾患では高率にEpstein-Barr virus(EBV)感染が腫瘍細胞に認められることが知られており、本疾患の発症および予後に関連があると考えられる。したがって本研究は鼻腔NK/T細胞性リンパ腫において治療前後および経過観察中の患者血清中のEBVDNA量と予後の関連を検討することを目的とした。昨年度は当院で治療した35例のExtranodal NK/T-cell lymphoma, nasal typeの治療成績を検討した。その結果、5年の時点で累積生存割合、無増悪生存割合、局所制御割合はそれぞれ47.3%,42.9%,65.2%であった。局所制御には放射線治療は有効であり、50Gy以上の照射線量が望ましいと考えられた。さらに、鼻腔のみに限局した照射野では不十分であり、鼻腔に加えて上顎洞など周囲の副鼻腔まで含めた照射野を用いることが重要であることが示唆された。照射線量に関する考察はこれまで幾つか報告されているが、照射野の重要性を確認した報告は皆無であり、今後の本疾患に対する治療において重要な知見である。本疾患の発症頻度の低さのため十分な検体を確保して、研究を促進することができなかったが、本年度はこれまで採取した6名の鼻腔NK/T細胞性リンパ腫における血清中のEBVDNA量の変化を測定した。治療中の増悪などにより、2名で治療後の評価が不可能であった。解析数が少ないため、これまでのところ血清中のEBVDNA量の変化と予後についての断定的な関係は確認できていないが、今後もさらに検討を続けていく予定である。鼻腔原発の悪性リンパ腫は、従来、進行性鼻壊疽、致死性正中肉芽腫などと呼はれ、壊死を伴い浸潤性の発育を特徴とし、治療抵抗性の疾患とされてきた。その後の分子生物学的検索により、本疾患ではT細胞受容体の再構成が認められず、NK細胞の表面形質であるCD56が高率に陽性であることから、2001年のWHO分類ではExtranodal NK/T-cell lymphoma, nasal typeとされた。本疾患は頻度が低いため、現時点で標準治療は確立していない。本研究は鼻腔NK/T細胞性リンパ腫において治療前後および経過観察中の患者血清中のEBV DNA量と予後の関連を検討する。その結果、比較的予後良好な患者群と不良な治療抵抗性の一群とを早期に区別し、治療の個別化、再発の早期診断に役立てることが最終目的である。研究期間の3年間において、鼻腔NK/T細胞性リンパ腫における治療前後の血清中のEBV DNA量の変化を測定することを目的とした。前記目的を達成するため、本年度は以下の様な研究を行った。本年度は1例の患者しか来院しなかったため、末梢血5mlをEDTA入りのスピッツに採取後1600gで遠沈させ、血清をポリプロピレンのチューブへ移して使用するまで-20度で保存した。数例の症例が蓄積したところで、凍結保存しておいた血清からキットを用いてDNAを採取する予定である。来年度以降、EBVのBamHI-WおよびEBNA-1と2つの領域にプライマーを設定して血清中のEVB DNAを増幅を行う。Real-time quantitative PCRにはABI Prism 7700 Sequence Detector(PE Biosystems)を用いてデータの収集を行う。得られだPCRのデータをSequence Detection System(PE Biosystems)を用いて解析し、臨床診断に役立つか否か検討する予定である。したがって本研究は鼻腔NK/T細胞性リンパ腫において治療前後および経過観察中の患者血清中のEBV DNA量と予後の関連を検討することを目的とした。

研究当初、患者血清を採取・保存し研究することを目的としていたが、本疾患の発症頻度の低さのため十分な検体を確保して、研究を促進することができなかった。そこで、本年度は当院で治療した35例のExtranodal NK/T-cell lymphoma, nasal typeの治療成績を検討した。その結果、5年の時点で累積生存割合、無増悪生存割合、局所制御割合はそれぞれ47.3%, 42.9%, 65.2%であった。局所制御には放射線治療は有効であり、50Gy以上の照射線量が望ましいと考えられた。さらに、鼻腔のみに限局した照射野では不十分であり、鼻腔に加えて上顎洞など周囲の副鼻腔まで含めた照射野を用いることが重要であることが示唆された。照射線量に関する考察はこれまで幾つか報告されているが、照射野の重要性を確認した報告は皆無であり、今後の本疾患に対する治療において重要な知見である。鼻腔原発の悪性リンパ腫は、従来、進行性鼻壊疽、致死性正中肉芽腫などと呼ばれ、壊死を伴い浸潤性の発育を特徴とし、治療抵抗性の疾患とされてきた。1990年代に入りその多くが悪性リンパ腫であることが判明し、血管破壊性に腫瘍が増殖するという特徴から、1994年のREAL分類ではAngio-centric T-cell lymphomaと命名された。その後の分子生物学的検索により、本疾患ではT細胞受容体の再構成が認められず、NK細胞の表面形質であるCD56が高率に陽性であることから、2001年のWHO分類ではExtranodal NK/T-cell lymphoma,nasal typeとされた。本疾患では高率にEpstein-Barr virus(EBV)感染が腫瘍細胞に認められることが知られており、本疾患の発症および予後に関連があると考えられる。したがって本研究は鼻腔NK/T細胞性リンパ腫において治療前後および経過観察中の患者血清中のEBVDNA量と予後の関連を検討することを目的とした。昨年度は当院で治療した35例のExtranodal NK/T-cell lymphoma, nasal typeの治療成績を検討した。その結果、5年の時点で累積生存割合、無増悪生存割合、局所制御割合はそれぞれ47.3%,42.9%,65.2%であった。本疾患の発症頻度の低さのため十分な検体を確保して、研究を促進することができなかったが、本年度はこれまで採取した6名の鼻腔NK/T細胞性リンパ腫における血清中のEBVDNA量の変化を測定した。治療中の増悪などにより、2名で治療後の評価が不可能であった。解析数が少ないため、これまでのところ血清中のEBVDNA量の変化と予後についての断定的な関係は確認できていないが、今後もさらに検討を続けていく予定である。
生物活性物質の生理適合化学選択性を評価する分子センシング

生物活性物質の分析において,生理適合選択性を評価できる定量分析法を作る目的で,化学物質とリセプターとの結合に続く生体内情報伝達過程を含めた分析法の創製を行った.チャンネル蛋白に基づくイオンチャンネルセンサーによる神経伝達物質をアゴニスト選択性の評価法,カルシウム受容蛋白カルモデュリンを例に蛋白質/蛋白質の選択的相互作用のSPRによるin vitro観測法を開発し,カルシウム情報伝達系のイオン選択性を評価することを可能にした.更にインシュリン情報伝達系を例に,リセプターの自己リン酸化,更に,その結果誘起する標的蛋白質との2段階のリン酸化蛋白質/蛋白質相互作用のプロセスのin vitro SPRセンサー,及びin vivo単一細胞での当該蛋白質リン酸化過程の可視化のための分子認識プローブ蛍光試薬開発も行った.生体系の情報変換に基づく分析法は(1)リセプターバインディングアッセイ法と比べ,より生理適合的な情報が得られる.(2)レセプターバインディングアッセイでは得られないアゴニスト,アンタゴニストの区別が可能である.(3)バイオアッセイでは困難な,分子レベルでの情報を得ることができる.生体内情報伝達に基づく分析法のアプローチは一般的であり,内分泌系,神経系,免疫系,Ca^<2+>シグナル系などにわたり,このほかに抗原特異的IgEのスクリーニング法,多剤耐性膜蛋白の一次能動輸送に基づく抗ガン剤,抗生物質のスクリーニング法なども行った.生物活性物質の分析において,生理適合選択性を評価できる定量分析法を作る目的で,化学物質とリセプターとの結合に続く生体内情報伝達過程を含めた分析法の創製を行った.チャンネル蛋白に基づくイオンチャンネルセンサーによる神経伝達物質をアゴニスト選択性の評価法,カルシウム受容蛋白カルモデュリンを例に蛋白質/蛋白質の選択的相互作用のSPRによるin vitro観測法を開発し,カルシウム情報伝達系のイオン選択性を評価することを可能にした.更にインシュリン情報伝達系を例に,リセプターの自己リン酸化,更に,その結果誘起する標的蛋白質との2段階のリン酸化蛋白質/蛋白質相互作用のプロセスのin vitro SPRセンサー,及びin vivo単一細胞での当該蛋白質リン酸化過程の可視化のための分子認識プローブ蛍光試薬開発も行った.生体系の情報変換に基づく分析法は(1)リセプターバインディングアッセイ法と比べ,より生理適合的な情報が得られる.(2)レセプターバインディングアッセイでは得られないアゴニスト,アンタゴニストの区別が可能である.(3)バイオアッセイでは困難な,分子レベルでの情報を得ることができる.生体内情報伝達に基づく分析法のアプローチは一般的であり,内分泌系,神経系,免疫系,Ca^<2+>シグナル系などにわたり,このほかに抗原特異的IgEのスクリーニング法,多剤耐性膜蛋白の一次能動輸送に基づく抗ガン剤,抗生物質のスクリーニング法なども行った.1.インシュリンとリセプターとの結合に続く標的蛋白質(IRS-1)のリン酸化というインシュリン情報伝達に基づき,生理適合性を有するアゴニスト・アンタゴニスト選択性評価法を開発した.インシュリンリセプターの標的蛋白質として12残基からなるIRS-1の断片ペプチドを用い,インシュリン刺激による断片ペプチドのリン酸化量を測定した.新規糖尿病治療薬トログリタゾンがインシュリンリセプターには直接作用しないことを明らかにした. (Anal.Chem.70,2345-2352(1998))2.アゴニスト結合によりイオンチャンネルを透過するイオン量を指標としたアゴニスト選択性を評価する方法を開発した.興奮性シナプスに存在するグルタミン酸リセプターの一種であるNMDAリセプターを用い,内部にCa^<2+>を含有したNMDAリセプター包埋リポソームを作製し,このリポソームにアゴニストを投与したときに放出されるCa^<2+>イオンをイオン選択性電極で検出した.本法がCa^<2+>透過量に基づくアゴニスト選択性を評価できる検出システムであることを示した.(J.Pharm.Biomed.Anal.,19,205-216(1998))3.ラザロシド(Las)はドーパミンをH^+濃度勾配をエネルギーとして,またバクテリオロドプシン(bR)は光エネルギーを利用してH^+を輸送する能動輸送蛋白質である.Las,bRを同時包埋したリポソームを作製し,光照射によりbRが生起したH^+濃度勾配により,リポソーム内に能動輸送されるドーパミンをサイクリックボルタンメトリーにより定量検出した.外部溶液の85%のドーパミンがリポソーム内に輸送されることがわかった. (Biosensors&Bioelectronics,13,1157-1164(1998))1.インシュリン(Ins)情報伝達過程のチロシンリン酸化を可視化する蛍光プローブ分子を開発した.IRS-1のチロシンリン酸化部位を含む合成リン酸化ペプチドpY939とP13-kinaseのSH2N蛋白質をそれぞれテトラメチルローダミン(T)とフルオレセイン(F)で蛍光標識した(T-pY939,F-SH2N).F-SH2NーT-pY939錯体形成によるドナーFとアクセプターTの相互近接により,蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が誘起された.

このFRETはIns濃度依存的に解消されることから,FRETpairはIns情報伝達のリン酸化を可視化する蛍光プローブ分子となることが分かった.(Anal.Chem.71,3948-3954(1999))2.表面プラズモン共鳴(SPR)法によるIns情報伝達過程のアゴニスト選択性評価法を開発した.Insとリセプター及びその基質となるY939を一定時間反応させ,SH2Nを添加した溶液を,pY939を固定化した金薄膜表面上にフローセルを用いて一定時間流したところ,Ins濃度に依存したSPR応答を得た.Ins様作用を持つIGF-I,IGF-IIはIRを介した情報伝達系を活性化するが,4価バナジウムイオン,チアゾリジン系糖尿病治療薬はSPR応答変化を示さないことからPI3-kinase以降の情報伝達系に作用していることが分かった.(Anal.Chem.72,6-11(2000))3.SPR法によるカルモジュリン(CaM)とその標的ペプチドM13との相互作用に基づく生理適合的金属イオン選択性を評価した.33種類の金属イオン選択性評価を行い,Sr^<2+>,Ba^<2+>,Cd^<2+>,Pb^<2+>,及びランタノイドイオンがCa^<2+>と同様にカルシウム情報伝達系を活性化することを示した.(Biochem.Biophys.Acta,1434,211-220(1999))1.サイクリックGMP(cGMP)の蛍光プローブ分子を開発した.cGMPの結合によるPKGIαの構造変化を蛍光シグナルとして検出するために,緑色蛍光蛋白質(GFP)の変異体であるCFPおよびYFPを,PKGIαのN-及びC-末端に連結した.この融合蛋白質をコードするcDNAを哺乳類細胞にトランスフェクションし,cGMPの結合により蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が増加することを確認した.cGMPに対する応答は可逆的で,細胞内のcGMP濃度変動に対応できるプローブ分子であることを明らかにした.(Anal.Chem.72,5918-5924(2000))2.蛋白質のスプライシング反応を用いた蛋白質-蛋白質間相互作用検出法を開発した.プローブ分子として,スプライシングを起こす蛋白質VDEのN末側にGFPのN末側を,VDEのC末側にGFPのC末を結合した.これらプローブを相互作用する蛋白質カルモジュリンとM13ペプチドに連結し,大腸菌内で発現させた.カルモジュリンとM13存在下では510nmの蛍光極大が観測された.蛋白質相互作用により,VDEのN末とC末が近接しスプライシング反応が起こり,GFPが形成されることを確認した.本法は細胞種を問わず原理的にいかなる蛋白質-蛋白質間相互作用を解析できる一般性のある方法であることを示した.(Anal.Chem.72,5151-5157(2000))3.血清中の抗原特異的イムノグロブリンE(IgE)の定量法を開発した.高親和性IgEリセプター(FcεRI)はIgEのFc部位と特異的に結合するリセプターである.抗原がIgEに結合するとマスト細胞上のFcεRIが架橋し,細胞内カルシウム濃度が上昇する.このカルシウム濃度変化を指標として,抗原特異的IgE濃度を測定した.(Anal.Chem.72,2653-2658(2000))
イネ配偶体型花粉不稔遺伝子の単離

マップベース法によるイネの配偶体型花粉不稔遺伝子の単離を行う。本来、T-DNAやTos17などのタグ系統では遺伝子単離は容易であるが、完全なものではない。それを補完するために、本研究では日本型品種台中65号へのガンマ線照射により誘発された突然変異系統を解析し、生殖研究リソースとして拡充していく。平成20年度は、以下の成果を得た。・新たな遺伝子としてgps14を同定し、染色体9に位置づけた。・gps4の高精度連鎖解析を開始した。gps4ヘテロ(06PSM338-9)に0. glumaepatulaイントログレッション系統(glumIL 127)を交雑したF1に由来する1152個体からなるF2分離集団を育成し、gps4を挟み込むDNAマーカー間(RM6370とRM8207との間)で組換えを持つ個体を172個体得た。これらの個体の花粉稔性を調査し、きらにDNAマーカーを利用した遺伝子の候補領域の絞り込みを行っている。・gps6の高精度連鎖解析を開始した。gps6ヘテロ(06PSM343-5)にO. meridionalisイントログレッション系統(merIL 27)を交雑して得た1536個体からなるF2分離集団を育成した。各個体について、花粉、葉、および種子を採取した。本研究では、イネ配偶体型花粉不稔遺伝子の単離を行っている。本年度は、1)ヒノヒカリ交雑集団を利用した初期マッピング、2) gps5の高精度マッピング、3)他の遺伝子の分離集団の確保、4)花粉不稔遺伝子オーソログの探索、などを行った。その結果、以下の成果を得た。・ヒノヒカリ交雑集団を利用した初期マッピングをgps7とgps12に関して試みた。その結果、これまでの4個(gps4、gps5、gps6、gps13)に加え、gps7を染色体2に、gps12を染色体8に位置づけた。・gps5の高精度連鎖解析については、十分量の種子が得られなかったため、行わないこととし、高精度連鎖解析用の種子確保に努めた。その結果、gps4とgps6の高精度連鎖解析用集団を得た。・gps7は雑種F1花粉不稔遺伝子S22の近傍にマップされたため、別プロジェクトにて進行中のS22の高精度連鎖解析と連携して連鎖解析を進めた。具体的には、S22の高精度連鎖解析用のDNAマーカーがT65-ヒノヒカリの交配組み合わせで多型を示すことを期待し、シーケンス解析によるマーカー作成を試みた。データの詳細は整理中であるが、おそらく10kbに1個程度のSNPが見つかる程度であり、この交配組み合わせによる高精度連鎖解析を多くの集団で継続するのは困難であると考えられた。
神経細胞の樹状突起に発生する活動電位

神経細胞は細胞体、樹状突起、軸索から構成される。これまでの一般常識では、神経細胞は樹状突起でシナプス入力を受け、細胞体で入力の統合が行われ、その結果として細胞内の電圧が活動電位の閾値を超えると細胞体と軸索の境界部(軸索小丘)で活動電位が発生するものと考えられてきた。しかし最近になって、樹状突起にも活動電位が発生することが海馬や大脳皮質の錐体細胞においては示された。われわれの研究対象とする網膜アマクリン細胞は軸索突起を持たないが活動電位が記録される。そこでアマクリン細胞の樹状突起に活動電位が発生するかどうかを直接樹状突起からの記録を行って検証した。まず、細胞体から樹状突起への活動電位の伝導様式を明らかにするため、細胞体で記録された活動電位波形を用いて細胞体を電位固定(Action Potential Clamp)し、樹状突起の電位変化を記録した。樹状突起で記録される活動電位の波形はTTXを投与すると振幅が大幅に減少した。このことから、樹状突起への活動電位の伝導には、電位依存性Na電流による自己再生的な過程が関与していることが明らかになった。樹状突起への活動電位の伝導は樹状突起に電流注入を行って膜電位を変化させると修飾を受けた。さらに、細胞体をAction Potential Clampし、その際に記録している樹状突起へGABAを投与したところ、活動電位の閾値が上昇し、振幅が減少した。GABAによる影響は、同時に樹状突起に正の電流注入を行うことで回復した。これらの結果から、アマクリン細胞樹状突起への活動電位の伝導は、電位依存性Na電流を介した自己再生的な過程によるものであること、樹状突起へのGABAのシナプス入力によって活動電位の伝導が修飾されることが明らかになった。
能動的DNAフォールディング制御ポリプレックスによる高効率遺伝子導入の実現

本研究では、電荷中和されたpDNAが規則的に折れたたまれるという特性を能動的に制御することにより、ポリプレックス内でのDNA分子フォールディングの制御による転写過程の効率化を通した高効率遺伝子導入を実現する。これまでに申請者がナノファイバー状ポリプレックスを形成することが明らかとしているカチオン性高分子(多分岐PEGを末端にもつpoly(L-lysine):maPEG-PLL)を基盤として、ポリプレックス表面での多分岐PEG密度を制御することによるポリプレックス形態(DNAフォールディング)制御を検討する。本年度は、前年度までに多分岐PEG部をもたないカチオン性高分子(poly(L-lysine)ホモポリマー:PLL)の添加によりアスペクト比を制御したポリプレックスの機能評価及び温度応答性高分子とPLLからなるブロック共重合体合成方法の確立を行った。maPEG-PLLとPLLを種々比率で混合した水溶液とpDNA水溶液を、混合溶液中のLysine残基数とDNAのリン酸エステル基数が等しくなるよう混合することによってポリプレックス溶液を調製した。maPEG-PLL含率が30, 60, 90, 100%のポリプレックスについて核酸分解酵素耐性、RT-PCR、細胞取込、培養細胞に対する遺伝子導入効率の評価を行い、ポリプレックス形態(アスペクト比)と酵素反応性に相関があることが明らかとなった。また、伸長した形態は、細胞取込では不利となると、転写効率には有利な効果があり、結果としてナノロッド状ポリプレックスが最も高い遺伝子発現効率を示すことが確認された。さらに、能動的形態制御のために温度応答性高分子であるpoly(N-isopropylacrylamide)をRAFT重合により合成し、その片末端からPLL部を重合することによって目的とするブロック共重合体合成が可能であることを確認した。ポリプレックス形態(アスペクト比)が、期待したとおりのポリプレックス機能に大きな影響を示すことが確認された。この結果は論文発表するに至った。また、多分岐PEGのポリプレックス表面での立体反発(排除体積)効果による機能制御が可能であることが確認されたことから、DNAフォールディングの能動的制御のための温度応答性高分子とポリカチオンからなるブロック共重合体合成にも取り組み、その合成方法を確立するに至った。今年度中に温度応答性高分子とカチオン性高分子からなるブロック共重合体を利用したDNAフォールディングの能動的制御が可能であることを明らかとし、今年度後半から最終年度である来年度にかけて培養細胞系での機能評価を行い、最終年度にはin vivoにおける機能評価を行っていく予定である。本年度は、多分岐PEG部をもたないカチオン性高分子(poly(L-lysine)ホモポリマー:PLL)の添加による制御を検討した。得られた種々maPEG-PLL含率のポリプレックス水溶液について評価を行った。Dyeexclusion assayによりmaPEG-PLL含率が30%以下に低下するとDNA凝縮が生じるが、30%以上においては効果的なDNA凝縮抑制が確認された。そこで、maPEG-PLL含率が30, 60, 90, 100%のポリプレックスについて原子間力顕微鏡観察により平均アスペクト比を評価した結果、maPEG-PLL含率の低下によりDNAフォールディングによるポリプレックス形態の変化(ナノファイバーからナノロッドへ)が生じ、maPEG-PLL含率によるポリプレックスのアスペクト比が制御可能であることが確認された。多分岐PEG部をもたないカチオン性高分子の添加による制御を検討した結果、期待したとおりのポリプレックス形態制御が可能であることが確認された。これは、ポリプレックス形態(DNAフォールディング)において、多分岐PEG部が重要な役割を果たしているというだけでなく、その役割がポリプレックス表面での立体反発(排除体積)効果であることを示すもので、今後、検討してDNAフォールディングの能動的制御への戦略が妥当であることを裏付けるものである。maPEG-

PLLとPLLを種々比率で混合した水溶液とpDNA水溶液を、混合溶液中のLysine残基数とDNAのリン酸エステル基数が等しくなるよう混合することによってポリプレックス溶液を調製した。maPEG-PLL含率が30, 60, 90, 100%のポリプレックスについて核酸分解酵素耐性、RT-PCR、細胞取込、培養細胞に対する遺伝子導入効率の評価を行い、ポリプレックス形態(アスペクト比)と酵素反応性に相関があることが明らかとなった。また、伸長した形態は、細胞取込では不利となると、転写効率には有利な効果があり、結果としてナノロッド状ポリプレックスが最も高い遺伝子発現効率を示すことが確認された。さらに、能動的形態制御のために温度応答性高分子であるpoly(N-isopropylacrylamide)をRAFT重合により合成し、その片末端からPLL部を重合することによって目的とするブロック共重合体合成が可能であることを確認した。ポリプレックス形態(アスペクト比)が、期待したとおりのポリプレックス機能に大きな影響を示すことが確認された。この結果は論文発表するに至った。また、多分岐PEGのポリプレックス表面での立体反発(排除体積)効果による機能制御が可能であることが確認されたことから、DNAフォールディングの能動的制御のための温度応答性高分子とポリカチオンからなるブロック共重合体合成にも取り組み、その合成方法を確立するに至った。今後は、種々アスペクト比のポリプレックスについて培養細胞系での遺伝子ベクターとしての機能評価(細胞取込、遺伝子発現等)を行うとともに、DNAフォールディングの能動的制御のために、温度応答性高分子とカチオン性高分子からなるブロック共重合体の合成を検討する。この段階までの平成30年度中に行い、その後、種々アスペクト比のポリプレックスのin vivoにおける機能評価、温度応答性高分子とカチオン性高分子からなるブロック共重合体とmaPEG-PLL混合系でのポリプレックス形成、in vitro機能評価を行っていく予定である。今年度中に温度応答性高分子とカチオン性高分子からなるブロック共重合体を利用したDNAフォールディングの能動的制御が可能であることを明らかとし、今年度後半から最終年度である来年度にかけて培養細胞系での機能評価を行い、最終年度にはin vivoにおける機能評価を行っていく予定である。
静脈麻酔薬のノルアドレナリントランスポーターに対する作用機序の解析

生体におけるノルアドレナリン性神経の働きは交感神経系の根幹となってその調節を行っているばかりでではなく、下行性疼痛抑制系を構成するなど様々な機能に関与している。ノルアドレナリントランスポーター(以下NAT)はシナプスにおけるノルアドレナリンの神経伝達の終了に大きな役割を持っている。一方、麻酔薬は興奮期に一過性の精神運動興奮作用や交感神経刺激作用を発現し、一部の麻酔薬においては痙攣を誘発する作用を持つなど麻酔管理上好ましくない生体の反応を認める。しかしこれらの作用の機序は現在まで解明されていない。精神を昂揚させたり心悸興奮作用を有するコカインや三環系抗うつ薬は古くからNATの機能を抑制することが知られている。筆者らは今回麻酔薬のすでに述べた作用がNATをはじめ、その他の相同性の高いモノアミントアンスポーター機能の抑制に起因すると考え、麻酔薬とトランスポーター蛋白との相互作用を分子レベルで検討した。その結果、(1)静脈麻酔薬(プロポフォール、ケタミン)がノルアドレナリントランスポーターを抑制する結果を明らかにした。(Minami et al.,1996,Hara et al.1998,Hara 2001,In press)(1)静脈麻酔薬(プロポフォール、ケタミン)に長時間反応させた細胞を用いて[3H]-ノルアドレナリンの細胞内取り込みに対する影響を調べた結果その取り込みが増加していた。(Hara et al.,In press)(3)さらに長時間反応させた紬胞からNATmRNAを調製し、NAT遺伝子の塩基配列に基づいて作成したNATcDNAに対する2つのプライマーを用いてRT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)法でmRNAを定量し、麻酔薬の長時間作用によるmRNAの変動を調べた結果、NETmRNAは増加していることが明らかとなった(Hara et al.,In press)。これらのことは、プロポフォール、ケタミンを長時間使用するとそのNETの発現量に影響を与えていることを示唆しており、これらのNETの静脈麻酔薬の長時間使用による薬理効果の変化に何らかの影響を与えていると考えられた。現在、これらの実験結果を基に鎮痛薬トラマドールにもNETの機能に影響するかどうかを検討している(Sagata et al.,In press)。生体におけるノルアドレナリン性神経の働きは、交感神経系の根幹となってその調節を行っているばかりではなく、下行性疼痛抑制系を構成するなど様々な機能に関与している。ノルアドレナリントランスポーター(以下NAT)は、シナプスにおけるノルアドレナリンの神経伝達の終了に大きな役割を持っている。一方、麻酔薬は興奮期に一過性の精神運動興奮作用や交感神経刺激作用を発現し、一部の麻酔薬においては痙攣を誘発する作用を持つなど、麻酔管理上好ましくない生体の反応を認める。今回我々は、ノルアドレナリントランスポーター(NAT)を発現している副腎髄質細胞を用いて静脈麻酔薬のノルアドレナリン取り込みに対する影響の検討した。その結果、静脈麻酔薬(プロポフォール、チオペンタール、ジアゼパム)は[^3H]-NAの細胞内取り込みを抑制した。また、NATのアミノ酸配列から、三環系抗うつ薬(デシプラミン)の結合部位が推定されている[^3H]-デシプラミンのNATへの結合に及ぼす静脈麻酔薬の影響を調べ、これらが非拮抗阻害であることが示された。また、静脈麻酔薬の長時間作用がNATに及ぼす影響の検討するために、長時間反応させた細胞からNATmRNAを調製し、NAT遺伝子の塩基配列に基づいて作成したNATcDNAに対する2つのプライマーを用いてRT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)法でmRNAを定量し、麻酔薬の長時間作用によるmRNAの変動を調べた。その結果、プロポフォールはNATmRNAを増加させた(Anesthesiology 93:1329,2000)。さらに私たちは筋弛緩剤についても検討を続け、パンクロニウムがNATに影響を及ぼすことも確認している(Anesth Analg.Vol.91:546-551,2000)。今後はさらに麻酔薬のNorepinephrine Transporterに対する影響を検討していく予定である。(Minami et al.,1996,Hara et al.1998,Hara 2001,In press)

(1)静脈麻酔薬(プロポフォール、ケタミン)に長時間反応させた細胞を用いて[3H]-ノルアドレナリンの細胞内取り込みに対する影響を調べた結果その取り込みが増加していた。(Hara et al.,In press)(3)さらに長時間反応させた紬胞からNATmRNAを調製し、NAT遺伝子の塩基配列に基づいて作成したNATcDNAに対する2つのプライマーを用いてRT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)法でmRNAを定量し、麻酔薬の長時間作用によるmRNAの変動を調べた結果、NETmRNAは増加していることが明らかとなった(Hara et al.,In press)。これらのことは、プロポフォール、ケタミンを長時間使用するとそのNETの発現量に影響を与えていることを示唆しており、これらのNETの静脈麻酔薬の長時間使用による薬理効果の変化に何らかの影響を与えていると考えられた。現在、これらの実験結果を基に鎮痛薬トラマドールにもNETの機能に影響するかどうかを検討している(Sagata et al.,In press)。
大学生に対する料理手引書を用いた食育の取組とその効果にみる健康と食習慣影響の究明

目的:食生活が乱れがちな大学生が食生活に関心を持ち努力することによる健康に及ぼす影響を,研究協力者に対して料理方法や食材について個別に指導し,研究開始前,開始半年後の健康状態を比較することで明らかにする。方法:福岡教育大学在校生3,000名を対象に21年5月に自言己式の食生活上の実態調査を行い同時に研究対象者の募集を行った。男1018人,女1351人,合計2369人の有効回答を得た。対象者の平均年齢は20.2歳であった。研究対象者は希望者の中から男15人,女24人,合計39人(平均年齢は21.1歳)であった。研究対象者に対し20年6月と21年1月に健康調査(身長,体重,血圧,骨量,唾液アミラーゼ検査,EDI-91調査,UPI調査,血液検査)を行い,2回の調理実習を行った。同時に「レシピ集」作成の協力を依頼した。結果:食生活実態調査から料理は好きですかという設問には69.7%は料理は好きと答えたが,自炊は順調にいっていますかという設問には,いいえ29.5%,自炊はしていない46.1%であり,自炊者は少なかった。その原因として,時間がない24.3%,料理がめんどう19.6%,疲れて作りたくない21.6%,洗い物がめんどう14.3%などが多かった。レシピ集がほしいという希望は81.2%あり,潜在的な自炊希望者は多いと考えられた。研究協力者に行った栄養指導と調理実習の前後の2回の健康調査の結果は骨量及び総蛋白,K,ヘモグロビンでは有意に改善が見られた。体重,血圧,総コレステロール,LDLコレステロール,AST,γ-GPTでは値が上昇したが,年始直後の検査のためと考えられた。EDI-91調査ではやせ願望,体型への不満が改善した。UPI調査ではストレスの低下を認め有意な改善が見られた。学生と協力して「学生の作成した学生の求めるレシピ集」を作成し,印刷後配布した。またWeb上でも公開した。今後も改訂を重ねる予定である。
急性膵炎発症におけるカルシウムなどの細胞内情報伝達系の役割に関する研究

急性膵炎の発症には消化酵素の分泌障害が引き金になっている事が考えられており、さらに高カルシウム血症、CCKなどの分泌刺激も膵炎発症、重症化に関与している事が明かになってきている。CCKなどの分泌刺激は膜に存在するCCKreceptorと結合し、IP_3などに伝達され、さらに細胞内遊離カルシウム濃度を上昇させ分泌刺激を伝達する。今回、細胞内遊離カルシウムなどの細胞内刺激伝達系が急性膵炎hの発症に関与しているか、さらにどのような機序で関与しているのかを検討した。急性膵炎においては外分泌機能の障害が先行し、これを誘因として発病する可能性が高い事がこれまでに明らかに成りつつある。動物実験モデルとしては、セルレイン膵炎、CDE膵炎などにおいてこのような機序が明かにされてきた。今回の研究において、膵管閉塞モデルにおいても他のモデルと同様に分泌障害が起こっている事明かにした。さらに人においても動物と同様に閉塞により膵外分泌障害を受ける事を明らかにした。急性膵炎モデルにおける細胞内遊離カルシウムにおける検討では、モデルによりCCKなどの刺激に対するカルシウムの反応は異なっている。CDE膵炎では、細胞内細胞カルシウム動態の変化は比較的小さいが、セルレイン膵炎では、CCKreceptorの減少にともないカルシウム反応の低下がみられた。膵管閉塞モデルにおいても、外分泌障害は主に細胞内カルシウム上昇以後の過程における障害が中心である事が明かとなった。これらの結果から急性膵炎の原因により細胞内刺激伝達の膵炎発症に対する役割は異なるが、ヒトの膵炎発症の原因と内最も頻度の高いものとして考えられている膵管閉塞における膵腺房細胞内の病態が明かになり、膵炎発症における膵腺房細胞内の変化の重要性が示唆された。1膵炎モデルにおける検討(1)マウスCDE(choline-deficient ethionine-supplemented diet)膵炎では、CDE摂取24時間後、48時間後とも、CCK-8の刺激による膵腺房細胞のアミラーゼ分泌能は低下していたのに対し、細胞内カルシウム動態は影響が少なかった。即ちCCK10pMではoscillation、CCK100pMでは急峻な上昇と漸減というパターンを有していた。CCK100pM投与時の細胞内カルシウムのピーク値はCDE48時間では正常より低下していたが、有意差はなかった。またoscillationの周期、振幅にも差がみられなかった。CDE膵炎における刺激分泌連関の抑制は、細胞内カルシウム以降(以外)の経路が主な原因であると示唆された。ラット膵管結紮膵炎では、膵管結紮により、閉塞開放後もCCK-8刺激による膵外分泌機能は著明に抑制されていた。膵管閉塞ラットより分離した膵腺房細胞を用いた研究では、CCK-8のみでなくCalcium ionophore A23187、およびPMA刺激によるアミラーゼ分泌も著明に抑制され、膵管閉塞による膵外分泌機能障害は細胞内カルシウムの上昇、protein kinase C機構よりもさらに分泌過程の先の部分の障害と考えられた。2 Humanにおける検討膵頭十二指腸切除後の患者の膵管チューブからのアミラーゼ分泌は、手術前の膵管の閉塞あるいは狭窄により大きな影響を受け、閉塞を認めた患者ではアミラーゼ分泌は正常の患者の約1/10程度まで減少していた。Humanにおける分泌障害の機序については今後さらに検討する予定である。急性膵炎の発症には消化酵素の分泌障害が引き金になっていることが考えられており,さらに高カルシウム血症,CCKなどの分泌刺激も膵炎発症・重症化に関与している事が明らかになってきている。CCKなどの分泌刺激は膜に存在するCCK-Reaeptorと結合し,IP_3などに伝達され,さらに細胞内遊離カルシウム濃度を上昇させ分泌刺激を伝達する。

今回,細胞内遊離カルシウムなどの細胞内刺激伝達系が急性膵炎の発症に関与しているか,さらにどのよう関与しているのかを検討した。ラットにおける膵管閉塞の影響を見るとCCK系の刺激による外分泌機能は障害されており,腺房細胞を使った杯宮によりCCK刺激により細胞内カルシウム濃度は上昇するが,それ以後の分泌過程における機能障害が重要であることが明らかとなった。セルレイン膵炎では,CCKのCCK-reaeptorへの結合が減少し,細胞内カルシウムの上昇は膵炎発症の後期まで保たれているが,外分泌機能障害は早期より認められた。ヒトにおける検討では,膵管閉塞群で著明な外分泌機能の低下を認めるが,膵管狭窄群においても著明な外分泌機能障害を認めた。これらの結果から急性膵炎の原因により細胞内刺激伝達系の膵炎発症に対する役割は異なるが,ヒトの膵炎発症の原因の内,最も頻度の高いものとして考えられている膵管閉塞における膵腺房細胞内の病態が明らかになり,膵炎発症における膵腺房細胞内の変化の重要力が示唆された。