hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病モデルマウスにおける抗酸化物質ルテインによる網膜神経保護 効果の解析

その病理的機序は未だ明らかではないが、糖尿病では全身性に酸化ストレスが蓄積し、これが病態に関与するとされている(Danfona et al Lancet 1996)。網膜は中枢神経系の一部であり、一度傷害されると通常は再生しない。そこで、網膜病変の進行を、特に初期から予防することは、視機能予後を守ることに貢献し重要である。本研究の目的は、糖尿病による視機能障害や神経網膜障害に、酸化ストレスがいかに関与するかを、抗酸化物質ルテインを用いて明らかにすることであった。まず、糖尿病誘導後、網膜内酸化ストレスが増強し、網膜内層の視機能低下をきたすこと、ルテインの摂取により、それらが抑制されることを確認した。次に、酸化ストレスから、網膜視機能低下をきたす機序について検討し、糖尿病誘導後にERK(Extracellular Signal-regulated Kinase)の活性亢進と、それに起因するシナプス前物質であるシナプトフィシンの発現低下がみられ、ルテインの摂取がそれらを抑制することを明らかにした。さらに、糖尿病誘導後に見られた、網膜内層の菲薄化、神経節細胞数の減少などの神経細胞死に起因する病理組織学的変化も、ルテインの摂取により回避されることを確認した。本研究により、糖尿病網膜における酸化ストレスを基点とする視機能低下、網膜神経変性のメカニズムの一端を明らかにすることができた。昨年度、糖尿病による視機能低下をルテインが抑制することを明らかにしたが、本年度はそれに至る分子生物学的機序を明らかにすることを目標とした。網膜内タンパクを定量することにより、酸化ストレスを起点とする視機能低下のメカニズムの一端を明らかにすることができ、おおむね目標は達成された。また、病理組織的解析も行い、細胞死とそれに起因すると考えられる組織学的変化を確認できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまで、研究計画をほぼ予定通り進めることができた。本年度は網膜細胞の器官培養及び神経系細胞株(PC12細胞)、網膜神経節細胞株(RGC5細胞)を使用し、ルテインが直接的に神経細胞の保護効果を示すか確認する。また、糖尿病による病理組織変化・細胞死のメカニズムをマウス網膜、培養細胞を用いて解析する。具体的には、カスペース、BaxなどのBc1-2関連分子などを指標にイムノブロット法、RT-PCR、免疫染色などを用いる予定である。
ミトコンドリア機能を制御する還元力ネットワークとその光環境応答の解明

植物体内のレドックス状態は、様々な外的環境要因によって変化する。この変化に対し、様々な生体反応に関わるタンパク質は柔軟に活性を調節することが必要である。タンパク質のレドックス制御に中心的な役割を果たすのがチオレドキシン(Trx)である。私は、未開の領域である植物ミトコンドリアのTrxシステムを介したレドックス制御について、生化学と生理学の両側面からアプローチする研究を行っている。昨年度(平成22年度)に、Trxアフィニティクロマトグラフィー法とプロテオミクスにより、ミトコンドリア可溶性画分のタンパク質のTrx標的候補を網羅的に捕捉・同定した。今年度は、これに引き続いて、ミトコンドリア膜画分のTrx標的候補の捕捉・同定を進め、ミトコンドリアのTrx標的候補のリスト作成を完了した。また、得られた標的候補のうち、AOX、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH)について、組換え体タンパク質を用いた詳細な生化学解析を行い、AOXとIDHはTrx依存的な還元を受けることを明らかにした。さらに、昨年度に作成したミトコンドリアのTrxの欠損株シロイヌナズナについて、実際にTrxがノックアウトされていることを、RT-PCRとウェスタン解析により確認した。この変異株は、現在までにテストした条件では、表現型の変化が確認されていない。今年度、生体内のタンパク質のレドックス状態を分析する実験系を構築できた。今後は、作成した変異株で、Trx標的タンパク質のレドックス状態がどのように影響を受けているのかを明らかにすることで、実際の植物体内でのミトコンドリアTrxシステムの環境応答・生理意義を解明できると期待できる。私は平成22年度、ミトコンドリアに局在するタンパク質のうち、どのようなタンパク質がTrxの標的としてレドックス制御を受けるのかを調べた。そして、受入研究室で考案されたTrxアフィニティクロマトグラフィーとプロテオミクス技術を駆使することにより、これまで報告されていない新規のミトコンドリアタンパク質をTrxの標的候補として同定できた。これらの結果は、日本植物学会で発表した。また、実際の生体内でのミトコンドリアのTrxシステムの生理意義を調べるため、ミトコンドリア局在型Trxをノックアウトしたシロイヌナズナを作成した。その他、以前から私が進めていたミトコンドリアの光環境応答に関する研究について、2本の原著論文と2本の総説を発表した。また、国際会議でポスター発表を行い、ベストポスター賞を受賞した。
分子配列制御によるフタロシアニン薄膜太陽電池の高機能化

結晶成長や分子配向を制御した膜構造の異なるフタロシアニン薄膜光電池を作製し、その光電気特性と配向構造の関係について検討した。ITOガラス上に蒸着したチタニルフタロシアニン(TiOPc)、アルミクロロフタロシアニン(AlPcCl)およびフッソ化バナジルフタロシアニン(VOPcFx:x=13)膜は、多結晶膜から形成されていた。150°Cに保った各種アルカリハライド上に蒸着したこれら3種のフタロシアニン膜は矩形結晶から形成され、下地結晶の周期構造に依存したエピタキシャル構造をとって配向成長した。ITO上に蒸着した多結晶膜とアルカリハライド上で作製した配向膜を電極とした湿式電池(ITO/Pc/0.5mMI_2,0.1M KI/Pt)を作製し、暗時および光照射時の電流-電圧特性から電池の性能を評価した。TiOPcおよびAlPcCl膜を用いた電池では、光照射時にカソーデックな光電流が認められTiOPcおよびAlPcCl薄膜はp型の半導体特性を示した。一方、VOPcFx膜を用いた電池では、光照射時にアノーデックな光電流が認められVOPcFx薄膜はn型の半導体特性を示した。光照射によるキャリアーの生成機構を光電流アクションスペクトルから検討した。無配向膜では溶液側から光照射した光電流アクションスペクトルは、膜の光吸収スペクトルと類似しているが、ITO側から光照射したときには約1/3の電流が得られるのみであった。即ち、TiOPcと溶液との界面がキャリアの光生成の活性領域であることが明かとなった。一方、配向膜ではいずれの側から光照射しても光電流アクションスペクトルと膜の吸収スペクトルは類似し、さらにITO側から光照射したときの方が大きな光電流が得られた。矩形結晶から形成される配向膜では結晶間の隙間を通じて溶液がITO近傍まで進入し、ITO近傍のTiOPcと溶液界面で生成したキャリアが光電流に有効に寄与することが明かとなった。配向膜を用いた湿式電池の性能パラメータの値は、いずれも無配向膜と比較して増大し、特に入射光強度に対する変換効率(η)は、TiOPc膜で6倍、AlPcCl膜で7倍、VoPcFx膜では300倍と著しく向上し、分子配向の顕著な効果を示した。
個体化の原理に関する哲学史の再構築：トマスからスアレスまで

1、個体化論の分析としては、(1)トマス・アクィナスとボナヴェントゥラを対象として、両者において個体化が何を意味しているのかを比較した。ボナヴェントゥラは「個体化」をより正確には「個体性」の意味合いで考えているのに対して、トマスは個体化をあくまで何かの「個体化」として考えているという解釈を様々なテクストを用いて支持した。(2)14世紀のトマス主義者であるリューベックのヘンリクスというスコラ学者の個体化論を対象として、トマスの個体化論がヘンリクスにおいてどのように受容および変容しているのかを分析した。トマスは個体を「抽象化」しているのに対して、ヘンリクスは個体を「数量化」しているという整理によって両者の個体化論の違いを明らかにすることを試みた。2、天使論の分析としては、(1)ボナヴェントゥラ、トマス・アクィナス、ドゥンス・スコトゥスという三人のスコラ学者を対象として、天使の種が一つか複数かという議論を哲学史的な観点から分析した。この分析からは、哲学的な知と天使論という神学的な知の間に或る種の連続性を認めるか認めないかという点を再考する機会が与えられた。より個別的には、(2)トマス・アクィナスの天使論に焦点を当てて、種が個であるという種の個体説を以上の(1)から得た知見の下に再検討した。(3)西洋近世のスコラ学者フランシスコ・スアレスの天使論に焦点を当てて、天使の種に関する彼の思想的立場を分析するとともに、以上の(1)から得た知見と突き合せる作業を行った。3、翻訳研究として、(1)トマス著『「魂について」註解』、(2)ドゥンス・スコトゥス著『「命題集」註解(オルディナティオ)』、(3)ペトルス・ヨハニス・オリヴィ著『第三任意討論集』の翻訳研究を進め、大学紀要にその成果を発表した。すべて本邦初訳である。当初の研究実施計画においては、1、ドゥンス・スコトゥスの翻訳研究を進めること(上記「研究実績の概要」の3の(2)に対応)、2、トマスの個体化論が14世紀のトマス主義者であるリューベックのヘンリクスにおいてどのように受容されているかを分析すること(上記「研究実績の概要」の1の(2)に対応)、3、西洋中世哲学における天使論そのものの分析(上記「研究実績の概要」の2の(1)(2)(3)に対応)を予定していた。1に関しては『オルディナティオ』以外の翻訳研究には進展がなかったことが問題点として残るが、2、3に関しては当初の研究実施計画の実現を達成することができた。加えて、上記の「研究実績の概要」における1の(1)、3の(1)(3)の研究を行うことができた。よって、全体としては研究の進捗状況がおおむね順調に進展していると判断する。スコトゥス著『オックスフォード講義録』、スアレス著『形而上学討論集』の翻訳研究を、次年度以降の研究に支障がない範囲で可能な限り進めていく。1、個体化の原理という概念の分析として、(1)トマス・アクィナスの天使論に焦点を当てて、任意の形相の非受容性の根拠が個体化の原理の本質的な規定であるという解釈を論文で発表した。(2)トマスの個体化理論全体において非受容性の根拠を見出す解釈を論文で発表した。(3)トマスとボナヴェントゥラの天使論を範囲として、ボナヴェントゥラは個体化の二元的な原理(すなわち形相と質料)を被造物に対して一様に適用しているのに対して、トマスは個体化の一元的な原理(質料、形相、存在など)を神をも含めた様々な事物に多様な仕方で適用しているという解釈を学会発表で提示した。(4)トマスとボナヴェントゥラの魂論を範囲として、ボナヴェントゥラは質料と形相が相互に切り離しえないことを強調するのに対して、トマスは魂の個体化の始まりと終わりにわたる全体を根拠づけようとしているという解釈を研究発表で提示した。ボナヴェントゥラはドゥンス・スコトゥスに影響を与えた先駆者の一人であるため、(3)および(4)はスコトゥス研究にそのまま資するものである。2、個という概念の分析として、(1)個という概念をトマスの哲学体系において超越概念として捉えるという解釈を論文で発表した。(2)トマスによる天使の種別化に焦点を当てて、テクストごとにトマスの論証手順が異なるという解釈、およびトマスは本質そのものを体現する個体という意味で例化不可能な個体概念を想定しているという、生物学哲学の知見を参照した上での解釈を研究発表で提示した。3、翻訳研究として、(1)トマス著『定期討論集霊的被造物について』、(2)スコトゥス著『「命題集」講義録』、(3)バウムガルテン著『形而上学』の翻訳研究を進め、大学紀要にその成果を発表した。特に(1)の文献については今年の研究成果により完訳を果たすことができた。当初の研究実施計画においては、1、ドゥンス・スコトゥスの翻訳研究を進めること(上記「研究実績の概要」の3の(2)に対応)、2、トマスの天使論において個体化の原理という概念を分析すること(上記「研究実績の概要」の1の(1)に対応)、3、個体化の原理という概念に関するトマスとボナヴェントゥラの比較研究(上記「研究実績の概要」の1の(3)および(4)に対応)、4、西洋中世哲学における天使論そのものの分析(上記「研究実績の概要」の2の(2)と3の(1)に対応)を予定していた。

1に関しては『「命題集」講義録』の該当箇所すべての翻訳が完了しているわけではないこと、そして『「命題集」講義録』以外の著作の翻訳研究には着手していないことが問題点として残るが、2、3、4に関しては当初の研究実施計画の実現を達成することができた。加えて、上記の「研究実績の概要」における1の(2)、2の(1)、3の(3)の研究を行うことができた。よって、全体としては研究の進捗状況がおおむね順調に進展していると判断する。1、個体化論の分析としては、(1)トマス・アクィナスとボナヴェントゥラを対象として、両者において個体化が何を意味しているのかを比較した。ボナヴェントゥラは「個体化」をより正確には「個体性」の意味合いで考えているのに対して、トマスは個体化をあくまで何かの「個体化」として考えているという解釈を様々なテクストを用いて支持した。(2)14世紀のトマス主義者であるリューベックのヘンリクスというスコラ学者の個体化論を対象として、トマスの個体化論がヘンリクスにおいてどのように受容および変容しているのかを分析した。トマスは個体を「抽象化」しているのに対して、ヘンリクスは個体を「数量化」しているという整理によって両者の個体化論の違いを明らかにすることを試みた。2、天使論の分析としては、(1)ボナヴェントゥラ、トマス・アクィナス、ドゥンス・スコトゥスという三人のスコラ学者を対象として、天使の種が一つか複数かという議論を哲学史的な観点から分析した。この分析からは、哲学的な知と天使論という神学的な知の間に或る種の連続性を認めるか認めないかという点を再考する機会が与えられた。より個別的には、(2)トマス・アクィナスの天使論に焦点を当てて、種が個であるという種の個体説を以上の(1)から得た知見の下に再検討した。(3)西洋近世のスコラ学者フランシスコ・スアレスの天使論に焦点を当てて、天使の種に関する彼の思想的立場を分析するとともに、以上の(1)から得た知見と突き合せる作業を行った。3、翻訳研究として、(1)トマス著『「魂について」註解』、(2)ドゥンス・スコトゥス著『「命題集」註解(オルディナティオ)』、(3)ペトルス・ヨハニス・オリヴィ著『第三任意討論集』の翻訳研究を進め、大学紀要にその成果を発表した。すべて本邦初訳である。当初の研究実施計画においては、1、ドゥンス・スコトゥスの翻訳研究を進めること(上記「研究実績の概要」の3の(2)に対応)、2、トマスの個体化論が14世紀のトマス主義者であるリューベックのヘンリクスにおいてどのように受容されているかを分析すること(上記「研究実績の概要」の1の(2)に対応)、3、西洋中世哲学における天使論そのものの分析(上記「研究実績の概要」の2の(1)(2)(3)に対応)を予定していた。1に関しては『オルディナティオ』以外の翻訳研究には進展がなかったことが問題点として残るが、2、3に関しては当初の研究実施計画の実現を達成することができた。加えて、上記の「研究実績の概要」における1の(1)、3の(1)(3)の研究を行うことができた。スコトゥス著『「命題集」講義録』、それとは別の著作である『形而上学問題集』における個体化の原理に関する箇所の翻訳研究を、次年度以降の研究に支障がない範囲で可能な限り進めていく。スコトゥス著『オックスフォード講義録』、スアレス著『形而上学討論集』の翻訳研究を、次年度以降の研究に支障がない範囲で可能な限り進めていく。
吸血昆虫類における人血液同定法の改良ーヒト特異DNAプルーブの利用ー

吸血性昆虫の代表として蚊を用いて、その抱血されている血液についての由来動物種の判明のために、核酸を利用する方法を試みた。具体的にはKpnー1 familyのプルーブを用い、フィールドでの採集蚊を対象とした場合に利用でき得る、ドットブロットハイブリダイゼーション法およびビオチン・アビジン標識法の組み合わせについて検討した。今回の課題研究により判明した事項は以下の如くである。1.血液サンプルを識別するにニトロセルロース膜を用いたドットブロット法が可能であった。2.また、放射性標識の代わりにビオチン標識を用いることが可能であった。3.ひと血液より分離したDNAの検知可能最小濃度は数ng/μlであった。4.血液においてヒトとサル間の識別は現在不可能であったが、イヌ、ウシ、ブタ、ラット、ヒツジとは識別可能であった。5.吸血蚊1匹より抽出できた血液由来のDNA量は1.24.6μgであった。6.吸血蚊においてもヒト由来のものは陽性、ウシ由来のものは陰性であり、本法の応用が可能であった。7.吸血乾燥蚊においても同様の結果であった。また、今後の展開については以下の如くである。1.更にサルとの弁別が可能になるべく他のプローブについても検討する2.ハイブリダイゼーイョン時の温度などの反応条件についても改良の検討をおこなう。吸血蚊より採取したヒト血球をプロテアーゼ処理した後, 1.グアニジンーHCl, 2.フェノールクロロホルム, 3.ホルムアミドーLiClの方法によってDNAを抽出,精製した.各試料をブロッテング, 80°Cベーキングすることによってニトロセルロース膜またはナイロン系膜に吸着,固定させた.DNAプルーブとして1.ヒトKpn-1断片(1.7kb)2.ヒトε_1遺伝子(2.7kb)3.ヒトε_1遺伝子Acc-1断片(0.5kb)をビオチン標識したものを使用した.これらのプルーブはいずれも,ドットハイブリダイゼーション法によってヒト血球由来DNAをngのオーダーで検知することが可能であった.ヒトとそれ以外の動物種のDNAを区別する目的でヒト,イヌ,ウサギ,マウスの血球DNAを試料として上記ハイブリダイゼーションを行なった. Kpn-1DNA及びε_1.7kbプルーブを用いた場合ヒトDNAと動物DNAを区別することができない. ε_10.5kbプルーブを使用した場合,反応の強弱(発色の程度)を指標として両者を識別することができる.現在種々のストリンジェンジーの条件下での反応および反応混液の改良を試みている.吸血後長期間を経て劣化している試料及び乾燥血液から抽出したDNAについてこの検知方法の有効性を検討した.乾燥血液からのDNAであれば2年以上経過している試料から抽出されたものでも充分反応性が認められることが判明した.吸血性昆虫の代表として蚊を用いて、その抱血されている血液についての由来動物種の判明のために、核酸を利用する方法を試みた。フィールドから採取した吸血蚊について、その血液が人由来であるか、家畜等の他種動物由来であるかを識別する方法の確立を目指している。今回下記の二つの問題解決に重点をおいてヒト特異DNAプルーブを利用した検知方法の改良を試みた。即ち、第一はプルーブに放射性標識が用いられる煩わしさ、第二はヒト特異配列を持つ適切なDNA断片を選び出すこと、の二点である。結果1.ヒトkpn-1、免疫グロブリンε1の各遺伝子についてニックトランスレーションによるビオチン標識を行った。その際、ハイブリダイゼーション液のプルーブの濃度を200ng/mlとした。人血液からプロテアーゼkなどを用いて抽出したDNAをsimple dilutionによって希釈した各1μlのドットについてハイブリダイゼーションを行なったところ、数ng10ng/μl量のDNAが検知可能であることが判明した。なお、蚊一個体当りの吸血血液DNA量は1.2μg4.6μgであり、十分検知が可能である。2.ヒト、サル、イヌ、ウシ、ブタ、ラット、ヒツジの各血液より抽出したDNAについて上記3種プルーブの特異性を検定した。kpn-1プルーブはヒト特異的であったが、他の二つのプルーブはそれら獣血と交叉反応を示した。kpn-

1プルーブはヒト-サル間識別はなし得ないが、その他の獣類血とヒトを明確に識別することができる。吸血蚊中のヒト血球からのDNAは吸血後数日を経た乾燥血液を用いても被験資料として供用可能であることから、これまで進めてきた免疫化学方法と併用すれば、フィールドでのhuman blood indexの算出に有用であると思われる。
不分離染色体の起源はミトコンドリアDNA多型のへだたりに起因するか

Down症候群を代表とする染色体不分離に起因する染色体異常症では、母親の加齢に伴ってトリソミーが増加する。このことは、染色体不分離が卵子形成過程で高頻度に生じていることを示している。現在までの染色体不分離に関する説は、1)成熟分裂期染色体の早期分離説、2)紡錘系の形成不全あるいは退行変性説などが存在する。しかし、明らかなリスクファクターとしての加齢現象を直接説明出来るものではない。我々は、卵子形成期の染色体分離過程に必要なエネルギーの供給不全が本病態の本質と位置づけ本研究を計画した。現在までにDown症(21トリソミー)12例、13トリソミー3例、18トリソミー4例とその他の染色体異常症(Digeorge症候群3例、Vaterassociation2例、Prader-Willi曲症候群3例)の患者由来のDNAよりミトコンドリアDNAのセグメントの塩基配列の偏りを、PCR-SSCP法により検索し、塩基置換が疑われた症例では分離後サブクローンし、塩基配列の決定を行った。その結果、これら染色体不分離をもつ個体の母親では、正常人ですでに病的点変異として報告されているものに、A3243G(MELASですでに報告されているtRNALeu(UUR)遺伝子)、今まで報告されていない多型としてT4386C.A4343G(tRNAGln遺伝子)、G5773A(tRNAAsn遺伝子)、A8348G.A8296G(tRNALys遺伝子)、G12192A、A12172G(tRNAHis遺伝子)、T12311C(tRNALeu(ASN)遺伝子)、G15927A(tRNAThr遺伝子)などが判明した。新たに判明したミトコンドリアDNAの多型は、ミトコンドリアエネルギー代謝にどのような影響があるのか、現在この多型がどのような頻度で正常人にみられるのか検証中である。Down症候群を代表とする染色体不分離に起因する染色体異常症では、母親の加齢に伴ってトリソミ-が増加する。現在までの染色体不分離に関する説は、1)成熟分裂期染色体の早期分離説、2)紡錘糸の形成不全あるいは退行変性説などが存在する。ミトコンドリアは、真核生物のエネルギー産生の中核であり、固有のDNA(ミトコンドリアDNA)を有している。ミトコンドリアDNAは、ヒストンなどの保護蛋白には裏打ちされず、また、γDNAポリメラーゼをそのDNA複製に利用するため、核DNAと異り変異が早い。ミトコンドリアDNA異常症の研究を続けていくなかで、ミトコンドリアDNAは、一個体でも加齢とともに変異を起し、その変異の蓄積が加齢に伴いエネルギー不全状態を来していること症例がが存在する。このことから、染色体不分離を来す個体には、ミトコンドリアDNAの特別の多型を遺伝的に持ち、それに加齢現象が負荷されることで、エネルギー不全状態が起りうると推測される。最近、臨床的にミトコンドリア脳筋症を疑われる個体で、染色体不分離による18トリソミ-とDown症を続けて出産されたことより、染色体不分離の成因にエネルギー不全が重要であると考え検索を開始した。現在までにDown症(21トリソミ-)12例、13トリソミ-3例、18トリソミ-4例とその他の染色体異常症(Digeorge症候群3例、Vater association2例、Prader-Willi症候群3例)の患者由来のDNAよりミトコンドリアDNAのセグメントを分離サブクローンし、塩基配列の決定を行っている。その結果、これら染色体不分離をもつ個体の母親では、正常人ですでに病的点変異として報告されているものに、A3243G(MELASですでに報告されているtRNALeu(UUR)遺伝子)、今まで報告されていない多型としてT4386C.A4343G(tRNAGln遺伝子)、G5773A(tRNAAsn遺伝子)、A8348G.A8296

G(tRNALys遺伝子)、G12192A、A12172G(tRNAHis遺伝子)、T12311C(tRNALeu(ASN)遺伝子)、G15927A(tRNAThr遺伝子)などが判明した。新たに判明したミトコンドリアDNAの多型は、ミトコンドリアエネルギー代謝にどのような影響があるのか、現在この多型がどのような頻度で正常人にみられるのか検証中である。
植物の環境ストレス耐性に関与する転写因子遺伝子の機能解析

モデル植物のシロイヌナズナをはじめ様々な植物において、複数の耐性遺伝子を一度に働かせる転写因子を導入する遺伝子組換え技術がストレス耐性植物の作出に有効であることが確認されている。本研究課題では、その一環として、イネの低温ストレスで機能するシス因子に結合するトランス因子(転写因子)の単離を目指している。本年度は、低温ストレス誘導性に関わる新規シス因子の一つJRC2606のプロモーター領域から単離されたOsDREB1J及びOsRAP2.4Aについて、ゲルシフトを用いたin vitro系及び酵母を用いたin vivoの系結合性を確認する実験を行ったところ、これらのタンパク質はDREに特異的に結合していることが確認された。転写活性化能を調べる実験を酵母とイネプロトプラストで行った結果、OsDREB1Jは転写活性化因子として機能するが、OsRAP2.4Aは転写抑制因子として機能することが明らかになった。さらに、これらの転写因子の機能を解析するために、イネとシロイヌナズナの形質転換体を作製して解析した結果、OsRAP2.4Aを高レベルで発現している形質転換イネ及びシロイヌナズナは生長の遅れを示し、発現レベルが高くないものでは生長の遅れは見られなかった。OsRA.P2.4Aを過剰発現するシロイヌナズナについて高塩・乾燥耐性を調べた結果、中程度にOsRAP2.4Aを発現しているものは耐性が上昇していたが、逆に高レベルで発現しているものでは耐性が減少していた。Pham博士の研究データを引き継ぎ、イネの低温ストレスで機能するシス因子の探求と解明を進めていく予定である。これまでに低温ストレス誘導性に関わる新規のシス因子を同定し、このシス因子を含むJRC2606,JRC0528,JRC0332遺伝子のプロモーター領域を用いて、酵母のワンハイブリッドスクリーニング法により、このシス因子に結合するトランス因子を探索した。本年度は、JRC2606のプロモーター領域を用いてOsDREB1J及びOsRAP2.4Aを単離した。両遺伝子は共にAP2ドメインというDNA結合領域を持つ転写因子であり、OsDREB1JのホモログであるOsDREB1AはDREというシス因子に結合することが知られている。両遺伝子の単離に用いたJRC2606のプロモーター領域にはこのDREに相当する配列が存在していたので、このDREに変異を与えたコンストラクト(JRC2606-M)を用いて実験した結果、OsDREB1J, OsRAP2.4Aは結合しなかった。これらの結果より、OsDREB1J, OsRAP2.4AはJRC2606のプロモーター領域内のDREに結合していると予想された。
IgE依存性反応の二面性―IgE依存性反応抑制機構の解析

我々は従来、IgE自体によるマスト細胞や好塩基球の表面FιεRI発現増加誘導の結果として、IgE依存性細胞活性化が増強することを報告し、この機構がI型アレルギー疾患の病態において増悪・遷延化に関与することを論じてきた。本研究では、IgE依存性のマスト細胞・好塩基球の反応が、実際には複雑なシステムであるとの仮説の下でIgE-FιεRI依存性反応の抑制性調節及びその関連の解析を行い、下記の結果を得た。1.細胞表面IgE量は、3050%の変化であっても細胞機能に有意な影響を与えることを明らかにした。すなわち、副腎皮質ステロイド剤はin vitroでマウス培養マスト細胞のFιεRI表面量を3050%減少させるとともに、抗原依存性脱顆粒を減弱させた。2.IgE-FιεRI依存性の活性化抑制機構である脱感作の至適誘導条件を、ヒト末梢血好塩基球を用いて決定するとともに、IgE表面量の増加した好塩基球においては活性化のみならず脱感作も増強していることを見出した。さらに、このような好塩基球脱感作は刺激閾値以下の慢性刺激により誘導することができ、誘導後は強力なIgE依存性刺激に対して完全に無反応に持ち込むことが可能であった。3.ヒト好酸球においても、マスト細胞同様に、IL-4とIgEが微量のFιεRI表出に関与し、持続的な発現を誘導することを見出した。以上の結果から、マスト細胞・好塩基球などのFιεRI発現細胞のIgE-FιεRI依存性反応は、活性化という一面にとどまらず、外的因子から様々な調節を受けるとともに、しかも自身が抑制機能をも包含するという複雑なシステムであることが明らかとなった。本研究の成果は、IgE依存性アレルギー疾患の治療戦略において、IgE-FιεRI依存性細胞活性化を抑制する新たなアプローチにつながりうる点で、有意義なものと考えられる。慢性低レベルのIgE依存性刺激がヒト好塩基球に対し脱顆粒を直接引き起こすことなく反応性を持続的に抑制しうるという脱感作現象を解析し、以下の結果を得た。1)好塩基球における脱感作誘導においては、細胞周囲の環境が重要であることを見出した。すなわち、簡単な組成の緩衝液ではなく、様々な栄養素が添加された培養液が適している。培養液のいずれの成分が脱感作促進に関与するのかを現在解析中である。2)IgE依存性刺激として、特異抗原(リコンビナントダニ抗原)と抗IgE抗体のいずれも強力に脱感作を誘導することができた。いずれの因子も濃度依存的に脱感作を誘導するが、閾値に近い濃度でも、充分な脱感作(後で強力なIgE依存性刺激を加えても脱顆粒が全く見られない)が誘導されることを見出した。脱感作の充分な誘導には4時間以上の処理が必要であった。3)強力に脱感作を誘導された好塩基球においては、ヒスタミン含有量、光顕で見た形態および表面IgE量、FcεRI発現量に変化が見られなかった。また、抗IgE抗体で脱感作された好塩基球表面には、抗IgE抗体が持続的に結合したままであり、internalizationを受けていないと考えられた。以上の結果から、好塩基球の脱感作は、生理的条件に近い培養条件でIgE結合物質により有効に誘導されることが判明した。そして、その誘導には、細胞表面の表面IgE量やFcεRI発現量の変化ではなく、おそらくは細胞内のシグナル伝達系の変化が関与すると考えられた。

臨床的に、低レベルの抗原曝露は現実に起こりうるものであり、そのような環境で好塩基球において誘導されうる脱感作現象は、アレルギー疾患の病態に何らかの関与をしていることが推測される。我々は従来、IgE自体によるマスト細胞や好塩基球の表面FcεRI発現増加誘導の結果として、IgE依存性細胞活性化が増強することを報告し、この機構がI型アレルギー疾患の病態において増悪・遷延化に関与することを論じてきた。本研究では、IgE依存性のマスト細胞・好塩基球の反応が、実際には複雑なシステムであるとの仮説の下でIgE-FcεRI依存性反応の抑制性調節及びその関連の解析を行い、、下記の結果を得た。1.細胞表面IgE量は、3050%の変化であっても細胞機能に有意な影響を与えることを明らかにした。すなわち、副腎皮質ステロイド剤はin vitroでマウス培養マスト細胞のFcεRI表面量を3050%減少させるとともに、抗原依存性脱顆粒を減弱させた。2.IgE-FcεRI依存性の活性化抑制機構である脱感作の至適誘導条件を、ヒト末梢血好塩基球を用いて決定するとともに、IgE表面量の増加した好塩基球においては活性化のみならず脱感作も増強していることを見出した。さらに、このような好塩基球脱感作は刺激閾値以下の慢性刺激により誘導することができ、誘導後は強力なIgE依存性刺激に対して完全に無反応に持ち込むことが可能であった。3.ヒト好酸球においても、マスト細胞同様に、IL-4とIgEが微量のFcεRI表出に関与し、持続的な発現を誘導することを見出した。以上の結果から、マスト細胞・好塩基球などのFcεRI発現細胞のIgE-FcεRI依存性反応は、活性化という一面にとどまらず、外的因子から様々な調節を受けるとともに、しかも自身が抑制機能をも包含するという複雑なシステムであることが明らかとなった。本研究の成果は、IgE依存性アレルギー疾患の治療戦略において、IgE-FcεRI依存性細胞活性化を抑制する新たなアプローチにつながりうる点で、有意義なものと考えられる。
高圧を用いたランタン銅酸化物系の超伝導と逐次構造相転移に関する研究

本研究はLa_<2-x>M_xCuO_4(M=Ba,Sr)系における超伝導と正方晶-針方晶転移および斜方晶-低温斜方晶転移との関連性を明らかにすることを目的としている。これまでに、La-Ba(M=Ba)系における後者の構造相転移に伴ってフェルミ準位での状態密度N(O)が減少するため、超伝導転移温度Tcが大きく低下することを明かにしてきた。本研究では、始めに低温X線回折実験から、N(O)の減少は構造相転移によりCu-O面内の酸素が二つの非等価なサイトに分かれることに関係することを指摘した。その後、熱膨張率の測定から高圧下での構造相転移の様子を詳細に調べ、x=0.125のごく近傍を除き、構造相転移と超伝導が競合していることを確認した。一方、x=0.125の試料では2GPaの高圧によって構造相転移を完全に抑制しても、Tcは10K程度までしか回復しないことが明らかとなった。このことは、x0.125の試料では構造相転移以外にも超伝導を抑制する機構が存在することを意味する。そこで、高圧下での電気抵抗の温度依存性を詳しく測定したところ、x=0.125の試料に限って電子系に強い散乱が働いていることが分かった。その具体的散乱機構を明かにすることが今後の課題となっている。一方、La-Sr系の正方晶-斜方晶転移を熱膨張率から調べた結果、ある臨界圧力Pc以上で正方晶相が低温まで安定化することが分かった。この高圧下の正方晶相でもバルクの超伝導が見られること、また、常圧の正方晶相(x>0.2)の超伝導はギャップレスとなっているがバルク的であることを確認した。さらに、高圧下でのTcの圧力依存性を精密に測定し、Pc以下の圧力下では構造相転移温度が減少するにしたがってTcは増加するが、斜方晶相が消失し正方晶相となると(P≧Pc)その圧力係数が非常に小さくなることを見つけた。この結果から、斜方晶相では酸素八面体が傾くことによって超伝導が抑制されることを始めて明らかにした。本研究の目的は(La_<1-x>Ba_x)_2CuO_4系における正方晶-斜方晶、斜方晶-(低温)正方晶転移と超伝導との関連性を明らかにし、ペアリング機関に関する知見を得ようとするものである。後者の構造相転移と超伝導との関係については、現在までに、この構造相転移に伴うフエルミ準位での状態密度N(0)の減少が超伝導を抑制することを明らかにした。相転移に伴ってN(0)が減少することは、この構造相転移には電荷密度波の形成が伴っていることを意味していると思われる。また、高圧下でのTcのBa濃度依存性から低温-正方晶への転移機構は6.25%Baのところで特に強いこと、さらに、この濃度以上では試料そのものが不安定となること等が明らかとなってきた。6.25%という濃度は16個のLaのうち1個をBaで置き換えたときの濃度に相当し、このようなLaとBaが特定の整数比となる試料で転移機構が強くなっていることは、この構造相転移の機構を明らかにする上で重要な手がかりを与えてくれると考えられる。

現在、6.25%付近の試料について回折実験を行い、LaをBaで置換していくときBa原子が結晶中にどのように入っていくかを調べている。一方、正方晶-斜方晶転移と超伝導との関連性を調べるため、28Kbarの圧力を加えて正方晶相を低温まで安定化させ、Tcの圧力依存性を測定した。その結果、正方晶相でのTcの圧力係数が斜方晶相での値よりかなり小さくなっているが分かった。この結果は、正方晶相に比べ斜方晶相では超伝導が抑制されていることを意味しており、今後、正方晶-斜方晶転移に伴って生ずる物理量の変化とTcの関係を詳細に調べることで、超伝導のペアリング機構に関する重要な知見が得られるものと期待できる。本研究は(La_1-_xM_x)_2CuO_4(M=Ba,sr)系における正方晶ー斜方晶(To)、斜方晶ー(低温)正方晶(T_1)転移と超伝導との関連性を明らかにすることを目的としている。これまでに、後者の構造相転移(M=Baのときに起こる)に伴うフェルミ準位での状態密度N(0)の減少により超伝導が大きく抑制されること、また、高圧実験からT_1での転移機構は6.25%Baのところで特に強いことを明かにしてきた。今年度は、低温Xー線回折実験を行い、T_1以下の結晶構造はこれまで言われてきた正方晶ではなくPccnタイプの斜方晶であり、格子定数aとbの差が、超伝導転移温度Tcが最も低くなるx=0.0625で一番小さいことを見つけた。これらの結果は、CuーO面内の2種類の酸素サイト間での電荷の再配分のためにN(0)の減少が起き、Tcが低下するというモデルを強く支持する。また、試料の一部はT_1で構造変化を起こさないことも確認できた。現在、この点も含め高圧下でのT_1における構造相転移の様子を詳しく調べている。一方、圧力下での熱膨張率の測定から、高圧下では(高温の)正方晶相が低温まで安定化することを確認した。また。高圧下でのマイスナ-信号の測定からTcの圧力依存性を精密に測定し、圧力と共にToが減少するにしたがってTcは増加するが、斜方晶相が消失し正方晶相となると、その圧力係数が零となることを確認した。この結果から、斜方晶相では超伝導が抑制されていることが結論できた。今後、正方晶ー斜方晶転移に伴って生ずる物理量の変化を調べ、斜方晶相における超伝導抑制の原因を明らかにしたい。本研究はLa_<2-X>M_XCuO_4(M=Ba,Sr)系における超伝導と正方晶-斜方晶転移、斜方晶-低温斜方晶転移との関連性を明らかにすることを目的としている。これまでに、後者の構造相転移(M=Ba)に伴ってフェルミ準位での状態密度N(O)が減少するため超伝導転移温度Tcが大きく低下すること、N(O)の減少はCu-O面内にできる非等価な酸素サイトと関係すること等を示してきた。今年度は、熱膨張率の測定から高圧下での構造相転移の様子を詳細に調べ、x=0.125のごく近傍を除くと構造相転移と超伝導が競合していることを改めて確認した。一方、x=0.125の試料では2GPaの高圧によって構造相転移を完全に抑制しても、Tcは10K程度までしか回復しないことが明かとなった。このことは、x0.125の試料では構造相転移以外にも超伝導を抑制する機構が存在することを意味する。そこで、高圧下での電気抵抗の温度依存性を詳しく測定したところ、x=0.125の試料に限って電子系に強い散乱が働いていることが分かった。この散乱機構とTcの大きな低下との関連性を調べることが今後に残された課題となっている。一方、正方晶-斜方晶移転を熱膨張率から調べた結果、ある圧力Pc以上で正方晶相が低温まで安定化することを確認した。また、この高圧下の正方晶相でもバルクの超伝導が見られることを反磁性の測定から明らかにした。
遷移金属ダイカルコゲナイドにおける光誘起バレー分極の制御に関する研究

本研究では、単層遷移金属ダイカルコゲナイド(TMDC)において、運動量空間におけるバレー自由度を利用する新たな光エレクトロニクス技術を開拓することを目的として研究を進めた。その主要な成果として、代表的な単層TMDCの1つである単層二セレン化タングステンにおける励起子(電子と正孔の水素原子様の束縛状態)のバレー分極度が、多層グラフェンとの積層による電荷密度、励起子線幅、励起子寿命の変調を通じて制御できることを見出した。本研究では、電子の未利用自由度であるバレー自由度を利用する新たな光エレクトロニクス技術を開拓することを目的として研究を進めている。27年度はまず、MoS2やWSe2などの単層遷移金属ダイカルコゲナイドを機械的剥離により基板上に作製し、電荷注入のため、それを透明電極上に転写することを試みた。その結果、グラフェン上への転写が可能であることを確認できた。また、別の電荷注入手段として、電子線リソグラフィを用いて、単層遷移金属ダイカルコゲナイド上に電極を直接形成する技術についても新たに導入し、電界効果トランジスタを形成し、それが動作することを室温条件下で確認した。また、低温条件下での顕微光学測定に用いるクライオスタット中に電流導入配線を行い、ゲート電圧を変えながら低温条件下で偏光分解分光測定を行う装置系の構築を進めており、28年度前半に完成できる見込みである。これにより、28年度後半には、電荷密度を変えながら低温条件下で光学測定を行うことが出来るようになると期待される。なお、作製した単層遷移金属ダイカルコゲナイド試料に対してクライオスタット中、低温・電荷注入条件下での光学測定のテスト実験を行った結果、当該装置で、実際に試料に電荷注入を行いながら低温条件下で一連の光学測定を行えることまで確認できている。また、そのなかで、電極作製時に試料が経験する様々な化学処理が、試料の品質に影響を与えている可能性が示唆された。27年度の研究計画においては、単層遷移金属カルコゲナイドに電荷注入するための基盤技術を構築する予定であったが、それらの技術の確立はおおむね順調に進んでいる。また、電荷注入条件下での低温光学測定を行うための実験系の立ち上げについても、上記のとおり順調に構築が進んでいることから、進展状況を、おおむね順調に進展している、とした。28年度の前半は、電荷注入実験のための試料上電極の作製において、できる限り試料の品質を高く保ったまま最終的な光学測定を行えるようなプロセスを確立することを目指し、電極作製手順における各プロセスが試料の品質に与える影響について詳細に検討した。その結果、輸送特性の計測は安定的に可能となったものの、微細加工プロセス(特に、電子ビームリソグラフィを行うためのレジストの塗布と現像のプロセス)が想定以上に試料にダメージを与えてしまい、特に低温条件下で試料固有の光学スペクトル情報を得ることが難しいことが明らかとなった。そこで、28年度の後半に予定していた電荷注入条件下での低温光学測定実験を29年度に延期し、試料ダメージを避けるための追加的な技術検討を進めた。一方、様々な単層遷移金属ダイカルコゲナイド試料の基礎的な電気化学物性についての知見を得るため、様々なpH条件の常温水溶液中での単層遷移金属ダイカルコゲナイドの光物性についての測定が可能な実験系の確立と、それを用いた各種単層遷移金属ダイカルコゲナイドの光学測定についても進めた。また、励起子バレー分極の緩和メカニズムについて実験と理論両面からの検討を進め、様々な実験条件(励起子密度、キャリア密度)下でのバレー緩和時間とその温度依存性を理解・予測することが可能となった。試料作製技術の確立は28年度の前半に完了することを予定していたが、予想以上に電極作製プロセスが試料にダメージを与えることが明らかとなったため、28年度の後半には、それを回避するための新しいプロセスの検討を行った。それに伴い、28年度の後半に予定していた電荷注入条件下でのバレー分極測定を29年度に延期したため、やや遅れている、とした。しかしながら、基礎的な電気化学物性の検討や、励起子バレー分極の理解については順調に進んでおり、29年度に研究を行うことで、当初の目的を達成できると考えている。本研究では、単層遷移金属ダイカルコゲナイドにおいて、電子の未利用自由度であるバレー自由度を利用する新たな光エレクトロニクス技術を開拓することを目的として研究を進めてきた。特に、電荷密度の変調が励起子バレー分極に与える影響を調べるため、電荷注入のもとで光学測定を行うための電界効果トランジスタデバイスの作製を進めたが、試料上電極の作製プロセスに起因する試料ダメージの影響により、プロセス後の試料では、欠陥準位からの発光が支配的となってしまい、固有の励起子スペクトルに関する検討を行うことが難しいことが引き続き課題となっていた。そこで、本年度の研究では、別の研究で見出された遷移金属ダイカルコゲナイドとグラフェンの積層構造化による電荷密度変調効果に着目し、電荷密度の変調が励起子バレー分極に与える影響を調べた。その結果、電子ドープ条件下で励起子バレー分極度の変調が確認され、特に、電荷密度の増加のもとで理論的に予想されていた100K程度の温度領域でのバレー分極度の大幅な向上が確認された。

これらの結果について詳しい解析を行ったところ、観測されたバレー分極度の大きな変化は、励起子のバレー分極緩和に影響を与えると予想される積層構造化に起因する励起子発光寿命の変化や励起子線幅の変化だけでは説明することができず、電子ドープによる相互作用の変調が生じたことを示すものであることがわかった。これらの結果は、原子層物質積層という物質工学的手法により励起子のバレー分極のエンジニアリングが可能であることを示すものである。本研究では、単層遷移金属ダイカルコゲナイド(TMDC)において、運動量空間におけるバレー自由度を利用する新たな光エレクトロニクス技術を開拓することを目的として研究を進めた。その主要な成果として、代表的な単層TMDCの1つである単層二セレン化タングステンにおける励起子(電子と正孔の水素原子様の束縛状態)のバレー分極度が、多層グラフェンとの積層による電荷密度、励起子線幅、励起子寿命の変調を通じて制御できることを見出した。28年度の前半は、電極作製手順における各プロセスが試料の品質に与える影響を明らかにし、出来るかぎり試料の品質を高く保ったまま最終的な光学測定を行えるようなプロセスを確立する。その後、27年度に構築した光学実験系を用いて、単層遷移金属ダイカルコゲナイドにおける低温条件下での電荷密度と光物性の相関を明らかにする。電荷密度変調に用いる電解質としては、通常の電解質に加えて、室温程度それ以下の温度かつ真空中でも液体で存在するイオン液体を用いる事で、クライオスタット中の低温条件下、かつ巨大電荷密度変調下での各種光学測定実験を可能にする。光学測定においては、円偏光励起によって単層遷移金属カルコゲナイド物質中にバレー分極状態を誘起し、発光の各円偏光ヘリシティ成分を各種偏光素子を用いて分解しイメージング測定を行う。温度及び電荷密度の変化に対して、バレー分極率や励起子寿命などがどのように変化するかを観測することで、バレー分極状態の制御への手がかりを得る。28年度に技術検討を行った試料表面のダメージを避けて固有の光学特性を測定するための電極作製プロセスを用いて電流注入用の単層遷移金属ダイカルコゲナイド試料を作製し、本研究でこれまでに構築した光学実験系を用いて、低温条件下での電荷密度とバレー分極物性の相関を明らかにする。電荷密度変調に用いる電解質としては、イオンゲルを用いることで、クライオスタット中の低温条件下、かつ大幅な電荷密度変調下での各種光学測定実験を行う。光学測定においては、円偏光励起によって単層遷移金属ダイカルコゲナイド物質にバレー分極状態を誘起し、発光の各円偏光ヘリシティ成分を各種偏光素子を用いて分解し測定を行う。温度及び電荷密度の変化に対して、バレー分極率や励起子寿命などがどのように変化するかを観測し、バレー分極状態の制御への手がかりを得る。ナノ物質科学27年度は、予算の効率的かつ無駄のない使用のため、最適な光学測定装置構成の検討にあたって、まずは現有の機器を使い回すことで多くの試行錯誤を行ったため、一定の次年度使用額が生じた。28年度は、当初28年度後半に予定していた実験を29年度に延期し、実験については、既存設備による試料上電極の作製に関するプロセスの検討を集中的に行ったため、次年度使用額が生じた。27年度に行った検討により、最適な装置構成と仕様の詳細が判明したため、これらの金額は28年度に使用する予定である。
感染性cDNAを応用した新世代ワクチン:遺伝子補強型狂犬病経口ワクチンの開発

本研究では、逆遺伝学的手法を用いて、新世代の経口不活化ワクチンの開発を試みた。すなわち、我が国の現行の動物用ワクチン株であるRC-HL株遺伝子に、高い免疫原性を有する遺伝子を追加あるいは交換した遺伝子補強型の感染性cDNAクローンを作出し、既存の概念と異なる新世代ワクチンの開発を目指した。我が国の動物用狂犬病ワクチンの製造株で、哺乳マウスに対してのみ病原性を示す、弱毒型のRC-HL株は、培養細胞で良好に増殖するが、免疫原性が低い。一方、その親株で成熟マウスに病原性を持つ、強毒型の西ヶ原株は、免疫原性は高いが、培養細胞での増殖性がきわめて低い。そこで、まず両株の全遺伝性状を比較検討した。その結果、両株の間では、免疫原性に関与する糖(G)蛋白質をコードするG遺伝子で最も変異の激しいことを明らかにした。つぎに、本研究の核心部である、RC-HL株による感染性cDNAクローンの作出を試みた。この作製に約2年を要したが、ついにcDNAからのRC-HL株の回収に成功し、逆遺伝学的手法を確立した。狂犬病ウイルスとしてはConzelmanらに次いで世界で2例目である。さらに、G遺伝子のみ西ヶ原株由来、残りの4つの遺伝子はすべてRC-HL株由来のキメラウイルスの回収に成功した。キメラウイルス、R(G)は、RC-HL株やリコンビナント(r)RC-HL株と同様に培養細胞での増殖性が良好であった。そこで、西ヶ原株、RC-HL株、rRC-HL株およびR(G)株のマウスに対する免疫原性を調べた。その結果、キメラウイルス、R(G)株は西ヶ原株と同等の高い免疫原性と、RC-HL株と同じ培養細胞での増殖性を保持していることが明らかになった。以上の如く、RC-HL株を基盤にした感染性cDNAを初めて確立することが出来た。また、ワクチン製造にとって好都合な免疫原性が高く、培養細胞での増殖性の良い生物性状を持ったキメラウイルスの作出にも成功した。したがって、作出したキメラウイルス及び確立できた逆遺伝学的手法は、新世代ワクチンの開発に応用できるものと思われた。ただ、今回作出出来たキメラウイルスは、成熟マウスに対する病原性を獲得しており、病原性関連遺伝子領域の改変が必要である。また、逆遺伝学的手法を用いて、さらに免疫原性の高い、キメラウイルスやタンデムウイルスを作出する足掛かりが得られたので、さらなる研究の継続を希望する。犬、家畜及び野生動物に対する安全性、経済性及び有効性の優れた経口ワクチンの開発と実用化を目的として、まず、現在わが国で使用されているワクチン製造株のRC-HL株及びその親株である西ヶ原株から各ゲノム遺伝子をクローニングする。これらに組換え及び点変異により弱毒並びに高い中和抗体を誘導するエピトープをコードする遺伝子領域をさらに加え、高力価で、強い抗体産性能を有する遺伝子補強型の狂犬病ウイルスの感染性cDNAを作出する。

本年度は以下の結果が得られ、また実験が進行中である。1、RC-HL株とその親株の西ヶ原株の各ゲノム遺伝子を比較したところ、両株間の各コード領域の相同性は塩基配列で98.6%99.2%と良く保存されていた。しかし、G遺伝子では比較的低い相同性であった。中でも、その変異はアセチルコリン受容体との推定結合領域に集中していることに注目された。2、感染性cDNAの作出のために、N,P,L遺伝子をT7プロモーター遺伝子を保持した発現ベクターに組み込んだ。4、T7プロモーター遺伝子を保持した発現ベクターにRC-HL株の全遺伝子をカッセト方式で組み込み中である。本研究は、我が国の動物用ワクチン株であるRC-HL株遺伝子に高い中和抗体を誘導するエピトープをコードする遺伝子領域をさらに加えた遺伝子補強型の狂犬病ウイルスの感染性cDNAクローンを作出し、新生代ワクチンの開発実用化を目的としている。1、感染性cDNAの作出のために、N、P、L遺伝子をT7プロモーター遺伝子を保持した発現ベクターにそれぞれ組み込みヘルパープラスミドを構築した。3、N、P、Lの各ヘルパープラスミドとミニゲノムプラスミドをBHK細胞に導入し,ルシフェラーゼの強い発現から各ヘルパープラスミドの機能性を確認した。4、T7プロモーター遺伝子を保持した発現ベクターにRC-HL株の全遺伝子をカッセト方式で組み込みフルゲノムプラスミドを構築した。5、ヘルパーおよびフルゲノムプラスミドをBHK細胞に導入し、RC-HL株ウイルス粒子の回収を試みている。今後、ウイルス粒子の早期回収とG遺伝子を補強あるいは5'末端に移動させた遺伝子を保有したウイルス粒子を回収し、それらの生物性状を検討し、次世代ワクチンの製造株を作出する予定である。本研究は、我が国の現行の動物用ワクチン株であるRC-HL株遺伝子に、高い免疫原性を有する遺伝子を追加あるいは交換した遺伝子補強型の感染性cDNAクローンを作出し、既存の概念と異なる新世代ワクチンの開発実用化を目指している。そのためには、任意に遺伝子操作されたキメラ狂犬病ウイルスの回収が最大のポイントであり、本年度は以下の如くそのキメラウイルスの作出に成功した。1.RC-HL株のN,P,L遺伝子を組み込んだ発現ヘルパープラスミドとRC-HL株の全遺伝子を組み込んだ発現フルゲノムプラスミドをBHK細胞に導入後、神経系の培養細胞、NA細胞と共培養した結果、ウイルスが回収された。2.回収されたウイルスは、野生型のRC-HL株に無い、予め挿入しておいた制限酵素切断部位を保持しており、フルゲノムプラスミドから作出された再構成型のRC-HL株であることが確認された。3.同様の手法で、G遺伝子のみを強毒の西ヶ原株、他の遺伝子を全て弱毒のRC-HL株由来のキメラウイルスを回収した。4.さらに、G遺伝子を二重に配置したウイルスの回収を試みたが、今のところ成功していない。5.野生型の西ヶ原株及びRC-HL株、再構成RC-HL株、キメラウイルスの4株の免疫原性をマウスで調べたろころ、キメラウイルスの免疫原性が西ヶ原株と同様に高いことが確認された。以上の結果から、RC-HL株の感染性cDNAが初めて確立され、それらが新世代ワクチンとして応用できる可能性が伺われた。