hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子ターゲティングによるイネゲノムへの任意の塩基置換変異の導入

本研究の目的は、相同組換えによる遺伝子ターゲティングを用いて、イネの標的遺伝子の塩基を予めデザインした塩基に置換して、遺伝子の機能解析や発現制御を行うための「塩基置換法」を開発して、イネのゲノム配列を自由に改変することである。本研究では遺伝子ターゲティングだけでなく、P1ファージのCre/lox系を用いた部位特異的組換えの技術に関しては、現在までに当該研究室では部位特異的組換え酵素Cre遺伝子を過剰発現させたイネのカルス及び植物体は、しばしば成育阻害が現れることが分かっている。そこで本課題では塩基置換用基本ベクターに組み込んだCre遺伝子は、その発現を制御できるよう、エストラジオールにて誘導できるよう工夫している。昨年度までに作成したベクターを用いて、エストラジオールによるCre遺伝子の誘導システムが有効に作用するための種々の条件を検討した。Cre遺伝子及びその発現誘導システムを有するブラスミッド(pXVE-Cre)を作成しマーカー遺伝子(ハイグロマイシン耐性遺伝子)が2つのlox配列で挟まれている構造を持ったトランスジェニックイネ(ターゲティングによりAdh2遺伝子領域内に点変異が導入されている)よりカルスを誘導して、pXVE-Creを導入した。ゲノム中にpXVE-Creをもったイネのカルスを選抜して、エストラジオール含有培地上でCre遺伝子の発現を誘導し、PCRによって2つのlox配列で挟まれているマーカー遺伝子が除去されたものを複数選抜することに成功した。さらに得られた部位特異的組換えが生じた個体の次世代を展開し、新たに導入したpXVE-CreのT-DNAも持たない完全なマーカーフリー個体を得た。この完全なマーカーフリー個体は、34bpのlox配列とターゲティングにより導入された点変異以外のゲノム構造は野生型と同等であると考えられ、相同組換えを介したターゲティングと部位特異的組換えを組み合わせて、目的の変異を任意の部位のみに導入することに成功した。これによりイネゲノムを自在に改変し点変異の様な小さな変異の導入や大規模な欠失を含むあらゆる変異を導入するための基盤技術となると期待される。従来までの、T-DNAやトランスポゾンの挿入による変異体作出、またはEMSなどの変異誘導剤による変異導入はいずれも偶然に期待して、大規模なスクリーニングを経て目的の変異体を作出・入手していたが、たとえ目的の遺伝子内に変異が導入されていても、複数のT-DNAがゲノム上に挿入していたり、また偶然に因っているために真に目的とした変異が得られる可能性は非常に低かった。しかしながら、本研究では遺伝子ターゲティングにより目的の変異をゲノム上の任意の部位に導入し、部位特異的組換えにより不要なマーカーを除去することで、真の目的通りの変異を得ることに成功した。本研究では遺伝子ターゲティングだけでなく、P1ファージのCre/lox系を用いた部位特異的組換えの技術に関しては、現在までに、当該研究室では部位特異的組換え酵素Cre遺伝子を過剰発現させたイネのカルス及び植物体は、しばしば成育阻害が現れることが分かっている。そこで、エストラジオールによるCre遺伝子の誘導システムが有効に作用するための種々の条件を検討することにした。Cre遺伝子及びその発現誘導システムを有するプラスミッド(pXVE-Cre)を作成し、マーカー遺伝子(ハイグロマイシン耐性遺伝子)が2つのlox配列で挟まれている構造を持ったトランスジェニックイネよりカルスを誘導して、pXVE-Creを導入した。また、新たに導入したpXVE-CreのT-DNAのコピー数を検討したことろ、複数コピーのT-DNAが導入されていることが分かった。得られた部位特異的組換えが生じた個体の次世代を展開し、新たに導入したpXVE-CreのT-DNAも持たない完全なマーカーフリー個体を得たいと考えている。次に塩基置換法を様々な遺伝子に応用可能とするためにまずノックアウト変異体作出用の基本ベクターを改変した。基本ベクター内Cre遺伝子の発現誘導に必要なXVE融合タンパク遺伝子とCre遺伝子を組み込んだ。改変したベクターを用いて相同組換えによるターゲティングを行った後、Cre遺伝子の発現をエストラジオールにて一過的に誘導して2つのlox間に挟まれたマーカー遺伝子等を除去することが可能となる。上記のpXVE-Creプラスミドを新たに導入した実験で得られた培養条件を用いて、ターゲティング後に部位特異的組換え系を誘導できれば、新たな形質転換も不要であるだけでなく、Cre遺伝子を持ったT-DNAが新たに導入されることもないので、効率良くマーカーフリー個体を得ることが可能である。現在は誘導型Cre遺伝子を持った基本ベクターの構築が完了した。

本研究では遺伝子ターゲティングだけでなく、P1ファージのCre/lox系を用いた部位特異的組換えの技術に関しては、現在までに当該研究室では部位特異的組換え酵素Cre遺伝子を過剰発現させたイネのカルス及び植物体は、しばしば成育阻害が現れることが分かっている。そこで本課題では塩基置換用基本ベクターに組み込んだCre遺伝子は、その発現を制御できるよう、エストラジオールにて誘導できるよう工夫している。昨年度までに作成したベクターを用いて、エストラジオールによるCre遺伝子の誘導システムが有効に作用するための種々の条件を検討した。Cre遺伝子及びその発現誘導システムを有するブラスミッド(pXVE-Cre)を作成しマーカー遺伝子(ハイグロマイシン耐性遺伝子)が2つのlox配列で挟まれている構造を持ったトランスジェニックイネ(ターゲティングによりAdh2遺伝子領域内に点変異が導入されている)よりカルスを誘導して、pXVE-Creを導入した。ゲノム中にpXVE-Creをもったイネのカルスを選抜して、エストラジオール含有培地上でCre遺伝子の発現を誘導し、PCRによって2つのlox配列で挟まれているマーカー遺伝子が除去されたものを複数選抜することに成功した。さらに得られた部位特異的組換えが生じた個体の次世代を展開し、新たに導入したpXVE-CreのT-DNAも持たない完全なマーカーフリー個体を得た。この完全なマーカーフリー個体は、34bpのlox配列とターゲティングにより導入された点変異以外のゲノム構造は野生型と同等であると考えられ、相同組換えを介したターゲティングと部位特異的組換えを組み合わせて、目的の変異を任意の部位のみに導入することに成功した。これによりイネゲノムを自在に改変し点変異の様な小さな変異の導入や大規模な欠失を含むあらゆる変異を導入するための基盤技術となると期待される。従来までの、T-DNAやトランスポゾンの挿入による変異体作出、またはEMSなどの変異誘導剤による変異導入はいずれも偶然に期待して、大規模なスクリーニングを経て目的の変異体を作出・入手していたが、たとえ目的の遺伝子内に変異が導入されていても、複数のT-DNAがゲノム上に挿入していたり、また偶然に因っているために真に目的とした変異が得られる可能性は非常に低かった。しかしながら、本研究では遺伝子ターゲティングにより目的の変異をゲノム上の任意の部位に導入し、部位特異的組換えにより不要なマーカーを除去することで、真の目的通りの変異を得ることに成功した。
リポペプチドを提示するMHCクラス１分子の同定

アカゲザルエイズモデルにおいて、Nefタンパク質由来N末端5-merペプチドにミリスチン酸が付加されたリポペプチド(C14nef5)が細胞傷害性T細胞の標的となることが明らかとなり、C14nef5特異的T細胞株の活性化を指標にリポペプチド提示分子の同定を進めた。アカゲザル単球に反応する数千のハイブリドーマクローンの解析からT細胞株の抗原認識を阻害するモノクローナル抗体を単離し、その生化学的解析からMHCクラス1様の分子を認識することが明らかとなった。そこでアカゲザル個体の遺伝学的解析からリポペプチド抗原提示分子をコードする遺伝子候補を絞り込んだ。さらにアカゲザル末梢血単核球からcDNAライブラリーを構築し、候補遺伝子の単離を進めた。その結果、遺伝子B*nov1を導入したアカゲザル腎上皮細胞株は、C14nef5リポペプチド抗原をT細胞株に提示できることがわかった。一方、別途樹立したC14nef5特異的T細胞株についても上記阻害抗体がT細胞活性化阻害能を有することを確認した。このT細胞株を活性化できるアカゲザル個体と活性化できないアカゲザル個体を同定し、特定のハプロタイプ上に抗原提示分子をコードする遺伝子が高い確率で存在することが判明した。そのdeep sequencingを行い、候補遺伝子4つを絞り込んだ。そのうちの1つはアカゲザル腎上皮細胞株に遺伝子導入することにより、T細胞株へのリポペプチド抗原提示能が構築された。この候補遺伝子はB*nov1とは異なるものであることから、第2のリポペプチド抗原提示分子が存在する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。ミリスチン酸付加Nefペプチド特異的T細胞株(SN45)に対し、抗原提示できるドナー個体(活性化個体)と抗原提示できないドナー個体(非活性化個体)を選別し、それぞれについてMHCクラス1領域遺伝子のタイピングを実施した。その結果、8頭の活性化個体のうち6頭がA1*002:01ハプロタイプを有するのに対し、解析した14頭すべての非活性化個体のおいてA1*002:01ハプロタイプを認めなかった。統計学的検証の結果、活性化個体は有意にA1*002:01ハプロタイプを有すると結論された。他方、アカゲザル単球を認識するモノクローナル抗体を多数樹立し、そのなかからSN45に対するリポペプチド抗原提示を阻害する8抗体を単離し解析した結果、そのうち4抗体はインテグリン分子を、また2抗体はMHCクラス1様分子を認識することがわかった(残り2抗体の認識抗原は不明)。MHCクラス1様分子を認識すると考えられる2抗体についてその認識抗原の同定を進めた結果、ひとつは古典的あるいは非古典的MHCクラス1重鎖を認識し、もうひとつはアカゲザルベータ2ミクログロブリンを特異的に認識することが判明した。以上の遺伝学的また免疫生化学的解析から、SN45に対しリポペプチド抗原を提示する分子はMHCクラス1遺伝子領域によりコードされる産物であると結論づけた。またT細胞抗原受容体を欠損したT細胞株(J.RT3)に、SN45より単離したT細胞抗原受容体遺伝子を再構築すると、わずかな抗原特異的応答を観察した。さらにこのトランスフェクタントにCD8分子を再構築すると、強い抗原特異的応答を認めた。この結果からMHCクラス1様分子:リポペプチド抗原複合体の認識には、T細胞抗原受容体とCD8分子が関与している可能性が示された。遺伝学的解析と免疫生化学的解析を併用して、リポペプチド抗原提示分子をコードする遺伝子候補を数候補まで絞り込んだ。しかしアカゲザルクラス1分子の複雑性から一部の遺伝子の単離が難航していて、律速段階となっている。

単離が難航している遺伝子については、通常のアプローチでは困難と判断すれば、人工遺伝子を用いることで対応する。すべての候補遺伝子が揃った段階でT細胞アッセイを組み、抗原提示分子を同定する。分子同定が完了すれば、X線結晶構造解析、テトラマー作製ならびにトランスジェニックマウスの樹立へと研究を展開する。
Flt3-ligandを用いた樹状細胞と特異的T細胞誘導による癌性腹膜炎の制圧

<はじめに>昨年度,我々は,Flt-3 ligandによるDCの誘導実験,GM-CSFとIL-4を用いたDCの誘導実験との比較から,GM-CSFとIL-4を用いた方法がより優れていると判断した。また,胃癌症例の末梢血液よりPBMNCを採取しGM-CSFとIL-4を用いてDCを誘導することに成功,更にこのDCと初代培養したauto-tumor cell,PBMNCより自己腫瘍細胞障害活性に優れたCTLを誘導することに成功した。これらのin vitroにおけるDC-induced CTLの抗腫瘍効果を踏まえ,本年度,我々は,Scid mouse in vivoにおけるDC-induced CTLの効果を検討した。<方法>進行胃癌症例の腹水または胸水より自己腫瘍細胞を,末梢血液よりPBMNCをそれぞれ採取した。PBMNCより,昨年度,我々の開発した方法でDC,及びDC-CTLを誘導した。また,自己腫瘍細胞のScid mouse背部皮下への移植を試みた。その結果,5例中1例で,Scid mouse背部皮下への生着が確認された。この症例に対して,(1)DC及びCTLであることの確認(2)in vitroにおける抗腫瘍活性(3)DC-CTL,MLTC-CTLをそれぞれ1x10^7個を経静脈投与したときのScid mouse移植自己腫瘍への抗腫瘍効果につきそれぞれ検討した。<まとめ>現在,これらin vitro,Scid mouse in vivoにおける抗腫瘍効果については,英文誌への投稿準備中である。また,これらの実験結果を踏まえ,進行再発胃癌を対象とした臨床試験を計画中である。胃癌に対する免疫療法として,患者末梢血からのdendritic cell(DC)を用いたCTLの誘導をこれまでに3例に試みた。また,この誘導したCTLを用いてin vitroにおける抗腫瘍効果を検討してきた。【方法】DCの誘導:胃癌腹膜播種転移を有する症例の癌性腹水より,胃癌細胞を採取,同症例の末梢血液よりPBMCを分離する。Group1:FLT-3ligandとともに4日間培養し,DCを誘導する。Group2:GM-CSF及びIL-4とともに4日間培養しDCを誘導する。DCの同定は,細胞形態,FACScanによるCD83,MHC class IIの解析,S-100蛋白免疫染色にて検討,比較した結果,Group2のGM-CSF,IL-4によるDCの誘導効率が優れていると判断した。DC-MLTCの誘導:胃癌細胞をMMC(100ng/ml)処理後,DC,PBMCとともに培養し,DC-MLTCリンパ球を誘導した。更に,固層化CD3,IL-2を用いて14日間培養し,DC-MLTC-CTLを誘導した。In vitro study:DC-MLTC-CTLのautologous tumorkillingactivity(ATK活性)を測定した。抗CD8,抗classI抗体を用いたATK活性の抑制と,他癌細胞株に対する細胞障害活性を測定した。【結果】PBMCより,樹状突起を有する特異な細胞形態を示すS-100蛋白染色陽性細胞が誘導された。Group2でのDC誘導効率は,CD83(+)HLA-DR(+)細胞78%であった。DC-MLTC-CTLはCD8(+)細胞が72.8%であり,ATK活性は,53.6±7.0%であった。このATK活性は,抗CD8,抗class-I抗体によりそれぞれ87.3%,89.7%阻害された。他の胃癌細胞株5種,肺癌細胞株2種,口腔扁平上皮癌株1種に対しては傷害活性をほとんど示さなかった。【まとめ】患者末梢血よりGM-CSF,IL-4により効率よく樹状細胞を誘導することができた。さらに,固層化CD3,IL-2を用いて大量にCTLを誘導することができた。今後は,このCTLを用いて,Scid mouse in vivoにおける抗腫瘍効果を検討したのち,ヒト胃癌症例における抗腫瘍効果を検討していく予定である。<結果>(1)DC及びCTLであることの確認

GM-CSFとIL-4により誘導された細胞は,形態学的,S100蛋白を用いた免疫染色,CD86とHLA-DRを用いた表面マーカーのTwo color解析より,DCであることが確認された。またDC-CTLは,68%がCD8陽性であった。(2)in vitroにおける抗腫瘍活性このDC-CTLの自己腫瘍細胞障害性は55.0%であり,この障害活性は,抗CD8抗体,抗HLA-DR抗体により特異的に阻害された。(3)DC-CTL,MLTC-CTLをそれぞれ1x10^7個を経静脈投与したときのScid mouse移植自己腫瘍への抗腫瘍効果自己腫瘍移植後Day 80において腫瘍体積は,コントロール群109+/-30.4cm^3,DC-CTL投与群77.9+/-18.2cm^3,MLTC-CTL投与群79.3+/-21.0cm^3,とDC-CTL群で,最も強い抗腫瘍効果が得られた。<まとめ>現在,これらin vitro,Scid mouse in vivoにおける抗腫瘍効果については,英文誌への投稿準備中である。また,これらの実験結果を踏まえ,進行再発胃癌を対象とした臨床試験を計画中である。
東南・南アジア地域における小学校教師の持つ数学教育観が授業に与える影響の比較研究

1.調査枠組み杢研究課題は、開発途上国の初頭数学教育における教師や授業(「実施されたカリキュラム」)を研究対象とした。しかし調査枠組みとしては、途上国の数学教育の総体を視野に入れるために、同じ研究機関内の科研「開発途上国における理数科教育協力の評価指標に関する実証的研究」(基盤研究(B)(2)、研究課題番号:16402046、研究代表者:岩崎秀樹)との間で、「意図されたカリキュラム」や「達成されたカリキュラム」を視野に入れた研究を行つた。その過程と成果は、本研究の目的にも述べているように参加各国の内発的発展に寄与すべく、常時メーリングリストによって、研究分担者・協力者間で共有化された。2.調査ツールの開発調査ツールとして、授業観察表に加えて、インタビュー項目を開発した。そこでは小学校教師の数学教育観・児童観を把握することを目的とした。3..海外における調査の実施当初の表題にある地域のほかに、アフリカ2カ国を調査対象国に含め、中国、フィリピン、タイ、バングラデシュ、ガーナ、ザンビアという6つの調査対象国において本調査を行った。4.調査結果および今後の予定1、2、3を二年次研究成果報告書を2006年5月に取りまとめ、その成果を、筑波大学CRICEDと共同で主催した国際シンポジウム(2007年1月実施、参加者約90名)にて公表した。現在、理数科教育協力の分野では.、日本政府が盛んに国際協力事業を展開している。そのための基礎的資料となること、また内発性をキーワードに、新たな研究協力の可能性を開いたことが、その意義である。具体的な研究成果は、各国の教師や授業の比較を通して、教師関連文脈(カリキュラム、勤務条件、教師教育など)、教師と教授(教師経験、数学に関連する信念など)、教授言語(日常語と教授言語、文化的適切性)、研究手法などの要因を明らかにしたことである。同時に、研究協力の今後の方向性に関して意見交換を行い、特に教師の置かれている社会的文脈と教授言語について研究課題が示唆された。1.調査枠組みの設定本研究課題は、直接的は開発途上国の初等数学教育における授業(「実施されたカリキュラム」)を研究対象とするものである。しかし調査枠組みとしては、途上国の数学教育の総体を視野に入れるために、同じ研究機関内の科研「開発途上国における理数科教育協力の評価指標に関する実証的研究」(基盤研究(B)(2)、研究課題番号:16402046、研究代表者:岩崎秀樹)との間で、「意図されたカリキュラム」や「達成されたカリキュラム」を視野に入れた。その結果は、2004年5月30日に広島大学で行われた研究集会において研究分担者間で共有化された。2.調査ツールの開発調査ツールとして、授業観察チェックリストおよび教師・校長用質問紙を開発した。前者は、授業の導入-展開-まとめの構造、学習形態などを把握する調査ツールであり、後者は、小学校教師の数学教育観を把握するものである。3.海外における調査の実施当初の表題にある地域のほかに、アフリカ2カ国を調査対象国に含め、6つの調査対象国において調査を行った。具体的には次のとおりである。ミャンマー:2004年9月15日10月7日中国:2004年11月1日11月19日バングラデッシュ:2004年11月25日12月7日タイ:2004年12月11日12月19日

ザンビア:2005年1月15日1月30日ガーナ:2005年2月11日2月26日4.調査結果および課題に関する共通認識の形成1、2、3の研究実績を踏まえ、2005年3月15日17日に広島大学において、調査対象国の研究協力者を招聘し、研究集会を行った。そこでは、調査の枠組み、調査・分析結果と問題点、今後の方向性などに関して意見交換が行われ、関係者間で共通認識が形成された。その成果は、平成17年5月末までに研究成果報告書として取りまとめられる予定である。1.本年度調査枠組み本研究課題は、開発途上国の初等数学教育における授業(「実施されたカリキュラム」)を研究対象とするものである。しかし調査枠組みとしては、途上国の数学教育の総体を視野に入れるために、同じ研究機関内の科研「開発途上国における理数科教育協力の評価指標に関する実証的研究」(基盤研究(B)(2)、研究課題番号:16402046、研究代表者:岩崎秀樹)との間で、「意図されたカリキュラム」や「達成されたカリキュラム」を視野に入れた研究を行っている。その過程と成果は、常時メーリングリストによって、研究分担者・協力者間で共有化されている。2.調査ツールの開発調査ツールとして、今年度は分数に焦点を絞ったテスト、そのテスト項目における子どもの理解度を測定するNewman Procedureを用いたインタビュー、そして教師に対するインタビューを開発した。前二者は、平行して行われている研究にて用いられ、それに対して後者は、小学校教師の数学教育観・児童観を把握するものである。3.海外における調査の実施当初の表題にある地域のほかに、アフリカ2カ国を調査対象国に含め、6つの調査対象国において調査を行った。具体的には次のとおりである。フィリピン:2006年1月1217日中国:2005年9月1825日バングラデッシュ:2005年11月917日タイ:2005年11月1421日ザンビア:2005年10月1623日ガーナ:2005年11月2129日4.調査結果および今後の予定1、2、3の研究実績を踏まえ、2005年12月1113日に広島大学において、調査対象国の研究協力者を招聘し、研究集会を行った。そこでは、今回の調査・分析結果と問題点、今後の方向性などに関して意見交換が行われた。その成果は、平成18年5月末までに二年次研究成果報告書として取りまとめられる予定である。また三年次には、調査を補足的に行うにとどめ、むしろシンポジウム(2007年1月予定)を開催することで、本研究成果の公表と今後の研究課題の明確化に力を注ぐ。
トレシルクロリド法で細胞接着タンパク質を表面固定したインプラント周囲の組織反応

今回われわれは、トレシルクロリド法を用いて、チタン製スクリューに細胞接着タンパク質を固定し、その後,ラットの上顎第一臼歯抜歯窩に埋入することで、チタンと上皮の付着が確認された。今後は、チタンと軟組織の接着により、インプラント周囲炎の軽減につながる可能性が示唆された。1.細胞接着タンパク質を固定化したインプラントの作成(早川)1)細胞接着因子の濃度,反応時間,反応温度などに関する基礎データをもとに、骨折などの手術で金属製プレートを固定する際に用いる長さ6ミリ、直径1.5ミリの純チタン製のネジ(インプラントの代用)に対し、トレシル化処理を施行。トレシル化処理したネジを細胞接着タンパク質(コラーゲン等)と反応させ、タンパク質を化学結合によりネジ表面に固定化し、固定化された細胞接着因子の数や固定化状態をフーリエ変換赤外分光分析(FT-IR)、X線マイクロアナライザー(XPS)、原子間力顕微鏡(AFM)・(いずれも現有)によって観察・確認した。2動物の顎骨への埋入実験(廣田、小澤)1)トレシル化処理を施行し、細胞接着タンパク質(コラーゲン等)を固定化した、純チタン製のネジを動物のどの部位に埋入するのか、適当か検討を重ねた。(顎骨内の抜歯窩や口蓋骨などの適応部位を模索)2)検討の結果、動物の口蓋骨に純チタン製のネジを埋入し、粘膜上皮とチタンの結合も見るために、ネジの一部は粘膜上で口腔内に露出する状態とした。3)動物に埋入し、一定期間を経過させ、生体との適合性を検討した。3.短期経過例の観察(廣田、小澤)1)一定期間後(1週、2週)埋入していた、ネジを周囲組織と一塊にして摘出した。2)通法に従って、非脱灰薄切切片を作成し、染色後、光学顕微鏡を用いて、骨および軟組織との接触率を測定するとともに,組織学的検討を進める予定であるが、現在標本作製中である。1.細胞接着タンパク質を固定化したインプラントの作成(早川)1)細胞接着因子の濃度,反応時間,反応温度などに関する基礎データをもとに、骨折などの手術で金属製プレートを固定する際に用いる純チタン製のネジ(インプラントの代用)数種類に対し、トレシル化処理を施行。トレシル化処理したネジを細胞接着タンパク質(コラーゲン等)と反応させ、タンパク質を化学結合によりネジ表面に固定化した。(顎骨内の抜歯窩や口蓋骨などの適応部位を模索)2)検討の結果、動物の口蓋骨・抜歯窩に純チタン製のネジを埋入し、粘膜上皮とチタンの結合も見るために、ネジの一部は粘膜上で口腔内に露出する状態とした。3)動物に埋入し、一定期間を経過させ、生体との適合性を検討したが、短期経過例は良いが、長期経過例は、動物の咬合に伴い脱落してしまうことが相次いだ。そのため、ねじの種類を変更したりしながら実験を重ねた。4)一定期聞後埋入していた、ネジを周囲組織と一塊にして摘出した。

2)通法に従って、非脱灰薄切切片を作成し、染色後、光学顕微鏡を用いて、骨および軟組織との接触率を測定するとともに,組織学的検討を進める予定であるが、現在標本化まで進み適切な染色法を検討しています。長期経過例では、ネジを動物の顎骨に埋めた後、咬合が原因と思われるネジの脱落が多発し、予定通りに実験が進まなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。動物に埋めたネジの脱落を防ぐために、餌の形態やネジの形態さらには実験動物の変更を踏まえて実験を進めて行くつもりである。
近代的家族像の歴史研究としての20世紀前半における英国精神分析の動向

精神分析の動向を分析のディスクールに差し戻して普遍化しようとする力に逆らって、「論争」前後の分析理論と実践に立ち入り、その規範的家族像を分析当事者である分析家の家族像とあわせて検討することで、長いスパンの近代家族史のうちに歴史化する。
胃がんの単一細胞解析と組織プロファイリングによる薬剤感受性・耐性機構の解析

本課題は消化器がんの遺伝的組織内多様性を単一細胞レベルで解析することを基礎的なコンセプトとして実施された。当初は胃がんをモデルとして組織内クローナリティの変化と薬物耐性解析を実施する計画であったが実施困難であり、大腸がんをモデルとしてがん幹細胞性を中心に組織内クローナリティの解析を実施した。ヒト大腸がんの臨床検体よりCD44陽性細胞集団を分離しオルガノイド形成させることに成功した。また、CD44陰性細胞集団に対しても上皮間葉転換を誘導することで同様にオルガノイドを形成することを見出し、その過程にTWIST1およびTGF-βシグナルが関連していることを示した。当該年度は、担当者の当該施設研究初年度であり、寄付金(委任経理金)および他の研究費により基本的な研究環境の整備を実施した。また、当施設医学研究院共同実験設備の利用により単細胞レベルでの遺伝子解析研究に必要な基礎実験を開始し、ヒト検体での検討にむけて九州大学病院において臨床研究倫理審査をうけこれを通過した。現在までに、末梢血循環がん細胞と考えられる細胞の単細胞分離に成功しており、検証実験を実施中である。当初計画通り胃がんの生検組織を対象に単一細胞解析を計画し、まず手術検体をもちいた単一細胞解析を試みたが、腫瘍細胞の分離は困難であった。生検組織での同様の解析を計画するにはさらに困難を伴うと予想された。現在は、同じ消化管癌である大腸がんの手術検体を用いた単一細胞解析を試みており、一定の進捗が得られている。反復生検による解析には、得られる細胞数の面から依然困難が予想され、手術検体を用いた単回の解析を行っている。単回解析では、予定したクローナリティ解析と薬剤耐性の推定は困難で、現在は組織内のがん細胞多様性と幹細胞性についての解析を主に進めている。本研究は、胃がんに対して反復生検した試料をもちいることを基礎に計画された。しかし、まず胃がんの手術検体を用いて単一細胞解析を試みるも線維化が強いなどの影響で解析が困難であった。そのため同じ消化管癌である大腸癌の手術検体を用いた単一細胞解析を試み、一定の成果を得た。しかし大腸癌についても、生検試料を用いた解析は得られる細胞数が少ないことが問題で実現困難であると判断され、手術検体を用いざるをえなかった。手術検体では一人の被験者から反復して試料を得ることは不可能であり、単回の解析で可能なクローナリティ解析として組織内のがん細胞多様性と幹細胞性についての解析を実施した。その結果、患者由来大腸癌組織から得られたCD44陽性細胞に対して幹細胞性を確認し、また、CD44陰性細胞に対して上皮間葉転換を誘導する刺激を与えることで幹細胞性を示唆する形質を獲得することを確認した。この過程にTGFβシグナルが関与していることを示した。一方で、循環血中がん細胞に関する研究は、予定されていた他予算による研究プラットホームの獲得がならず、同様のアイデアを腹水中のがん細胞・非がん細胞の単細胞解析へ移行して実施した。現在までに腹水中のマクロファージが線維芽細胞へ形質転換し、これを癌細胞株とともにマウス異種移植することで腫瘍形成能を高めることなどを確認した。胃がん組織からの細胞採取が困難であったため、対象を大腸がんに変更したこと、予備実験として手術検体からの採取を実施したが、これ以上小さな組織からの細胞採取が困難であると予想されたことから、大幅な計画変更を余儀なくされた。また、当該研究施設の改修計画に基づいて現在の研究スペースから別スペースへのプラットホーム一部移転を進めていたにもかかわらず、施設改修自体が実施されないこととなり、現在の研究スペースへの復帰が必要となるなど、大きな労力を要した。末梢血循環がん細胞に関する研究は、共同実験施設の実験機器が使用不可となったことから研究の進捗は得られていない。消化器癌がん細胞の組織内多様性を単一細胞解析により明らかにするアイデアを保持し研究を推進する計画であるが、得られる細胞数の技術的な問題点があり、今後も手術検体を用いた単回解析が中心となる見込みである。がん幹細胞性と上皮ー間葉遷移・末梢血循環がん細胞の関連を中心に解析を継続する。諸事情により当初使用予定であった研究環境・スペースが使用できなくなり、十分な研究スペースの確保が困難となったため、基本的な研究環境の整備に予想以上に時間を要している。他の研究費・委任経理金で実施中の別研究と平行しての基礎実験に時間を要しているため、研究スペースの移転・復帰等で環境整備を実施したため。これらにかかる諸経費の多くは別予算から支出された。平成26年度より新たな研究スペースが利用可能となるため、研究環境の整備が進み、進捗も改善する見込みである。基礎実験の進捗にともなって当該研究としての支出が必要となる見込みである。

使用予定であった研究スペースが使用できなくなったため、寄付金(委任経理金)・他研究費により運営されている別研究と平行して基礎実験を実施中で、諸経費はこれらの別経費より支出された。新たな研究スペースの確保に伴い進捗の改善が見込まれ、また基礎実験の進捗にともなって当該研究としての支出が必要となる見込みである。平成25年度に必要と見込まれた支出が本年度に計画される。
進化的アルゴリズムとタブーサーチを用いた希望実現型時間割作成法に関する研究

時間割にはさまざまなものがあり,また,時間割にはさまざまな要望を取り入れないといけないという制約がある.これらを整理するというのがまず最初のステップであった.時間割はその上でサービスを受けるもの(学生,受講者,患者など),その上でサービスを行う者(教員,発表者,医者など)およびサービスを行う組織(学校,学会,病院など)を考える必要があると考えた.そこで,これらの別々の立場からの希望を受け入れ,それらをハード制約およびソフト制約に分けて考え,時間割を構成する方法をまとめた.次に,学会時間割編成の研究を行った.学会時間割は,多数の発表論文を数日間の並列セッションに割り当てる割り当て問題である.ハード制約としては,同じ発表者が同じ時間帯の別のセッションで同時に発表することがないようにすることである.また,ソフト制約としては,なるべく類似の論文を同じセッションに配置すること,同じ部屋で類似するセッションが継続的に行われること,同じ時間帯にあまり類似するセッションがパラレルに開かれないようにすることなどである.FalkenauerのGGAをベースにした方法と,Kohonenの自己組織化マップ(SOM)をベースにした方法の2つを提案した.GGAでは,問題を2段階のGGAを続けて行うように分割した.ハード制約を回避する方法として,論文・セッションを配置後,可能な場所に移動するという方法をとったが,この手法を用いれば,同じ時間帯の別の部屋に同一発表者の論文が配置される可能性は低い.次に,SOMをベースにした方法においては,SOMのグリッドをそのままセッションとして扱う方法を提案した.まだ改善の余地はあるが,新しい編成方法の提案として注目されている.時間割にはさまざまなものがあり,また,時間割にはさまざまな要望を取り入れないといけないという制約がある.これらを整理するというのがまず最初のステップであった.時間割はその上でサービスを受けるもの(学生,受講者,患者など),その上でサービスを行う者(教員,発表者,医者など)およびサービスを行う組織(学校,学会,病院など)を考える必要があると考えた.そこで,これらの別々の立場からの希望を受け入れ,それらをハード制約およびソフト制約に分けて考え,時間割を構成する方法をまとめた.次に,学会時間割編成の研究を行った.学会時間割は,多数の発表論文を数日間の並列セッションに割り当てる割り当て問題である.ハード制約としては,同じ発表者が同じ時間帯の別のセッションで同時に発表することがないようにすることである.また,ソフト制約としては,なるべく類似の論文を同じセッションに配置すること,同じ部屋で類似するセッションが継続的に行われること,同じ時間帯にあまり類似するセッションがパラレルに開かれないようにすることなどである.FalkenauerのGGAをベースにした方法と,Kohonenの自己組織化マップ(SOM)をベースにした方法の2つを提案した.GGAでは,問題を2段階のGGAを続けて行うように分割した.ハード制約を回避する方法として,論文・セッションを配置後,可能な場所に移動するという方法をとったが,この手法を用いれば,同じ時間帯の別の部屋に同一発表者の論文が配置される可能性は低い.次に,SOMをベースにした方法においては,SOMのグリッドをそのままセッションとして扱う方法を提案した.まだ改善の余地はあるが,新しい編成方法の提案として注目されている.本年度行った研究は次のとおりである.まず,希望実現型時間割作成法のコンセプトの確立を中心に研究を行った.まず,希望を取り入れることが本質的に重要な問題と,可能であれば取り入れる必要があるような,むしろ制約充足をより重要な問題とする問題とに分類して考えた.それぞれのカテゴリーの問題に対して,遺伝的アルゴリズムを用いるためのエンコーディングを提案した.その1つは,割り当てられるオブジェクトを,希望をベースに割り当てる再の割り当てる順番をコード化するもの,もう1つは,時間割そのものを3次元遺伝子コードとして扱い,その中での遺伝的オペレーションを考案した.このような,多数の時間割候補を並列的にシステムの中に抱えてそれらの組み合わせによる進化により優れた時間割を作成するということそのものは,問題の規模が大きくなると,計算量が非常に大きくなるため,たとえば,学科程度の大きさの時間割を作ることに限定せざるを得ないが,一般的に複数の学科や学部の時間割を同時に作ることは大きな困難が伴うであろうことを考慮すれば,あえて全学的なシステムを目指さず,学科単位でこのような手法を用いることの方が優れているともいえよう.次に,学会などの時間割を作成する問題を取り上げて考えた.これは,類似のテーマの発表を同じセッションに入れるということと,発表者が複数の論文を発表する場合や司会を兼ねる場合に,同じ時間帯に別のセッションでの講演とならないことがハード制約であり,ソフト制約は多数考えられる.こうしたグルーピングに属する時間割問題では通常の遺伝的アルゴリズムが必ずしも有効に働かないため,グルーピング遺伝的アルゴリズムという概念を取り入れることにより,効率的に遺伝的アルゴリズムでの時間割作成ができるような手法を現在研究中である.コンピュータによる自動時間割作成法において,遺伝的アルゴリズムやタブーサーチを含む,いわゆるメタヒューリスティックな手法についての方法論を整理し,システム制御情報学会誌において最近の成果を明らかにした.この種の時間割作成問題にGAなどの手法を適用する際には,ハード制約を満足させるために,遺伝的操作の後に補助的な操作が必須であることを明らかにした.次に,学会などの時間割作成問題を精力的に扱ってきた.学会時間割作成問題において,論文をグルーピングしてセッションを構成する問題と,セッションをさらにグルーピングして学会プログラムを編成する,ハイブリッドな方法を考案し,特に,論文のグルーピングによるセッション構成問題に対する具体的な方法を論文によって提案した.

まず,グルーピング問題においては,通常の遺伝的アルゴリズムを有意に適用することは困難であり,FalkenauerのGGAが有効であることを実証した.次に,GGAを学会の時間割編成問題に適用するためのエンコーディングやオペレーションの考察を行った.その際,論文ごとに数個あるキーワードを用いて類似性の高い論文をセッションに集めるという方法をとった.数値例において,比較的単純に思いつくGAの適用と,この論文での提案によるGGAによる適用による性能の比較をおこなったところ,GGAにおいては,非常に少ない世代数で適応度が最適に近い値になることを確認した.こうやって作成したセッションの組み合わせによっては,同じ時間帯に別の場所で同一人物が発表を行うというハード制約に触れる時間割ができることもあるが,それについては,セッションの配置という次の段階での問題で解決をする予定である.今年度は学会時間割編成に的を絞って研究を行った.学会時間割は,多数の論文発表を数日間の並列セッションに割り当てる割り当て問題である.ハード制約としては,同じ発表者が同じ時間帯の別のセッションで同時に発表することがないようにすることである.また,ソフト制約としては,なるべく類似の論文を同じセッションに配置すること,同じ部屋で類似するセッションが継続的に行われること,同じ時間帯にあまり類似するセッションがパラレルに開かれないようにすることなどである.FalkenauerのGGAをベースにした方法と,Kohonenの自己組織化マップ(SOM)をベースにした方法の2つを提案した.GGAでは問題を2段階のGGAを続けて行うように分割した.まず,第1段階では,論文を重なるキーワードによりグルーピングし,それをセッションとした.その際の適応度に工夫をおこなって,人間が手作業で行う方法に勝る結果を得た.次に第2段階では,論文をカテゴリーキーワードと名づけた,キーワードをさらにグループ化したカテゴリーをベースにしてセッションを配置した.ここでは,同じグループとして,同一の部屋の同一日の午前(あるいは午後)とした.ハード制約を回避する方法として,論文・セッションを配置後,可能な場所に移動するという方法をとったが,この手法を用いれば,同じ時間帯の別の部屋に同一発表者の論文が配置される可能性は低い.次に,SOMをベースにした方法においては,SOMのグリッドをそのままセッションとして扱う方法を提案した.SOMは類似するものが近いところに配置されるということ,配置されるものの個数は各ユニット間で平均化されるという特徴があり,時間割編成にはそのまま当てはまると考えた.実際に行ってみると,全く同じキーワードの論文が多数あるような場合があって,必ずしも均等化されなかったが,新しい編成方法の提案として注目されている.
ケンブリッジ学派の多様性とその展開-思想、理論、政策の複合的研究-

本研究は、マーシャル、ピグー、ケインズを中心とするケンブリッジ学派の多様性とその展開を思想、理論、政策という複合的観点から研究し、学派としての内容とその本質を批判的に評価することを目的にした。我々は、従来の研究成果、準備状況をふまえ、マーシャル経済学によるケンブリッジ学派の創設過程、マーシャル経済学の継承と変容、ケインズ革命の形成過程における、ケンブリッジ学派の多様性とその展開の実態を理論的、歴史的・政策的コンテキストのなかで複合的に検証する作業を進めた。西沢は、マーシャルによる経済学の制度化、マーシャル学派の形成過程、および創設期の厚生経済学の研究を進め、平井は、『貨幣論』から『一般理論』への展開を大著『ケイセズの理論』として上梓し、さらに戦間期ケンブリッジの社会哲学について研究を進めた。袴田は資料に即してカーンの理論的貢献を解明し、ジョーン・ロビンソン、ショーブについての研究を進め、藤井はマーシャル経済学における標準化と外部経済論の意義を再評価し、費用論争のなかでマーシャル経済学がいかに「デフォルメ」されるかを検証し、小原はデニス・ロバートソンと景気変動論の研究を進めた。我々は、資料収集を精力的に進め研究環境の整備をはかるとともに、国際ワークショップ、国際セミナーを定期的に行い、マルクッゾ、ロセッリ(ローマ)、アレーナ(ニース)、ダルデイ(フィレンツェ)、ラファエリ(ピサ)、バックハウス(バーミンガム)、ピーデン(スターリング)、ドーントン(ケンブリッジ)、グレーネヴェーゲン(シドニー)ら、この分野で世界をリードする研究者と共同研究のネットワークを形成した。本研究は、マーシャル、ピグー、ケインズを中心とするケンブリッジ学派の多様性とその展開を思想、理論、政策という複合的観点から研究し、学派としての内容と本質を批判的に再検討することを目的にしている。我々は、従来の研究経過・準備状況をふまえ、マーシャル経済学によるケンブリッジ学派の創設過程、マーシャル経済学の継承と変容、「ケインズ革命」の形成過程における、ケンブリッジ学派の多様性とその展開の実態を理論的、歴史的・政策的コンテキストのなかで複合的に検証する作業を進めた。西沢は、マーシャルによる経済学の制度化の過程、マーシャル学派の形成過程を資料に即して検証し、またマーシャル、ピグーと人的資本、将来世代の問題について研究を進めた。平井は『貨幣論』から『一般理論』への展開を大著『ケインズの理論』として上梓した。袴田は資料に即してカーンの理論的貢献を解明し、ショーブの講義ノートの研究を手がけた。藤井はマーシャル経済学における標準化と外部経済論の意義を再評価し、マーシャル経済学が費用論争のなかでいかに「デフォルメ」されるかを検証した。小原はロバートソンと景気変動論の研究を進めた。我々は資料収集を精力的に進め、研究環境の整備をはかるとともに、平成14年12月に国際ワークショップ、平成15年2月に国際セミナーを行い研究上のネットワークの構築においても一定の成果を得た。資料収集は主に、ケンブリッジ大学のマーシャル図書館、大学文書室、キングズ・カレッジ、トリニティ・カレッジの文書室で行われた。また国際ワークショップには、イギリスからM.ドーントン、G.ピーデン、イタリアからC.マルクッゾ、T.ラファエリ、国際セミナーにはイギリスからD.コラード、オーストラリアからA.フィッツギボンズを招聘し、多くの参加者を得て、ケンブリッジ学派の多様性と展開について議論を深めた。本研究は、アーシャル、ピグー、ロバートソン、カーン、ケインズらを中心とするケンブリッジ学派の多様性とその展開を、思想、理論、政策という複合的観点から研究し、学派としての内容と本質を批判的に再検討することを目的にしてきた。我々は従来の研究経過と内外の研究成果を踏まえ、シジウイック、マーシャルによるケンブリッジ学派の創設過程、マーシャル経済学の形成と変容、ケインズ革命、不完全競争論の形成過程における、ケンブリッジ学派の多様性とその展開の実態を、思想的・理論的、政策的・歴史的コンテキストのなかで複合的に検証する作業を進めた。西沢は、マーシャルによるケンブリッジ学派の創設過程の実態を資料に即して跡づけ、その成果を報告し、また創設期の厚生経済学の研究を進めた。

平井は、『貨幣改革論』から『貨幣論』、そして『一般理論』への展開におけるいくつかの側面について研究成果を報告し、さらにケンブリッジ学派の社会哲学について研究を進めた。袴田はケインズ革命におけるカーンの理論的貢献について克明に跡づけ、藤井はマーシャルの産業経済学とその継承、断絶の側面について研究を進めた。我々の研究は、昨年来の国際的な協働のもとに進められ、西沢、平井は国際学会で報告を重ね、また平成15年12月には、イタリアからマルクッゾ、ロセッリ、ダルディ、フランスからアレーナ、イギリスからバックハウス、フレッチャーを招聘して国際ワークショップを開催し、ケンブリッジ学派の多様性とその展開について議論と理解を深めた。本研究は、マーシャル、ピグー、ケインズらを中心とするケンブリッジ学派の経済学の多様性とその展開を、思想、理論、政策という複合的観点から資料に即して内在的に研究し、学派としての実態と本質を批判的に再検討することを課題にしてきた。これまでの研究成果を踏まえ、西沢はマーシャル、レイトン、ピグーを中心に産業経済学、創設期の厚生経済学の研究、平井はケインズ、ホートリーを中心に「ケインズ革命」の研究、袴田はカーン、ジョーン・ロビンソンを中心に、藤井はマーシャルの産業経済学を中心に、そして小原はロバートソンを中心に、理論と歴史のコンテキストに即した研究を進めた。平成16年度は、これまでの研究の総括をし、研究課題のなかでとくに「厚生経済学と福祉国家」に焦点を当てた。そして年度末の2月に、"Cambridge School of Economics : Welfare Economics and the Welfare State"と題して国際ワークショップを行い、大きな成果を得ることができた。海外からマルクッゾ教授(ローマ大学)、バックハウス教授(バーミンガム大学)、グレーネヴェーゲン教授(シドニー大学)、ミドルトン教授(ブリストル大学)、ボワイアノフスキー教授(ブラジリア大学)、オマール教授(ヨーク大学、カナダ)を招聘し、国内では塩野谷祐一教授(一橋大学)をお招きして、「厚生経済学と福祉国家」の考え方・枠組み、マーシャル、ピグー、ボブソンにおける厚生経済学と福祉国家、ピグー、ベヴァリッジ、ケインズにおける雇用政策と福祉国家等に関して内容的にうまく組み合わされた報告ときわめて有益な議論が展開された。このワークショップで西沢、平井は報告をし、袴田、藤井はコメントを行った。その成果は、何らかの形で公刊したいと考えている。
糖尿病影響下における外傷性脳損傷の増悪機序の解明

外傷性脳損傷は転倒転落や交通事故で生じ、その重症度の判定は死因や後遺障害の診断に必要である。既存疾患が損傷の重症度に影響を及ぼす場合があり、糖尿病患者では循環障害や炎症の遷延によって損傷が重症化することが考えられる。本研究では、既存疾患の糖尿病が外傷性脳損傷の重症度に及ぼす影響を明らかにするため、糖尿病マウスと非糖尿病マウスに外傷性脳損傷を作成し、神経機能の変化と脳挫傷体積の差異を比較した。II型糖尿病マウスKK-Ay及び非糖尿病マウスC57BLを三種混合麻酔で全身麻酔し、頭頂部の頭皮を小切開して頭蓋骨の一部を露出し、頭頂骨に直径5 mmの骨窓を形成した。脳挫傷作成装置を用い、硬膜の上から一定強度の外力を加えて大脳に脳挫傷を作成した(controlled cortical impact model)。また、骨窓作成のみのマウスをシャム群、何も処理を行っていないマウスを未処理群として比較をした。体重を測定し、高性能コンパクトMRIシステム(Bruker社製Icon1T)を用いて頭部を撮像して脳挫傷の体積を測定した。また、神経機能の変化をNeurological Severity Score、モーリスの水迷路、強制水泳試験、Beam Walkingで評価を行った。糖尿病マウスでは、非糖尿病マウスと比較し、外傷性脳損傷を受傷後に体重が有意に減少し、MRI撮像による脳挫傷体積は有意に増大、NNSは有意に悪化した。モーリスの水迷路、強制水泳試験、Beam Walkingは糖尿病マウスと非糖尿病マウスで有意な差は認められなかった。従って、既存疾患の糖尿病は外傷性脳損傷を重症化させる要因であることが示唆された。本年度は糖尿病マウスと非糖尿病マウスに外傷性脳損傷を作成し、動物行動実験及びMRI撮影画像からの解析を中心に行った。その結果、既存疾患の糖尿病は外傷性脳損傷を重症化させる要因であること示唆するデータを得ることができた。さらに、免疫染色による神経細胞・炎症細胞の観察を実行中であるため、本研究はおおむね順調に進展していると判断される。引き続き免疫染色による神経細胞・炎症細胞の観察を行い、神経機能および脳内微小環境異常を細胞レベルで調査し、糖尿病による外傷性脳損傷の増悪の実態と機序を解明させる。おおむね予定通り使用したが、試薬や動物の単価が高く、ちょうどに合わせるのは不可能であった。次年度も予定通り主に試薬、動物等の購入に充てる。
自然発症関節炎モデルにおける関節炎惹起性ＣＤ４Ｔ細胞の認識する自己抗原の同定

自己免疫疾患における疾患惹起性T細胞の自己抗原特異性の解明は、病態理解の為の重要な課題であるが、これまで技術的に困難であった。我々は、T細胞シグナル減弱化による自己反応性T細胞の取得、レトロジェニックマウス作成によるTCRの疾患惹起性の検討、特異的自己抗体の選択的産生による標的抗原の同定という新規の方法を開発し、実際に関節リウマチの標的自己抗原としてRPL23A分子を同定した。この方法によりこれまで原因不明であった種々の自己免疫疾患の病因性T細胞の標的抗原が明らかになると期待される。昨年度に引き続き、自己免疫性関節炎を起こすSKGマウスの、関節炎惹起性TCRとその認識抗原に関して、解析を行っている。平成25年度の成果としては、平成24年度に確立した、自己抗原スクリーニング系を用いて関節炎惹起性T細胞抗原を検索した。関節炎に罹患したSKGマウスの自己抗体を用いた免疫沈降法を利用して関節炎惹起性T細胞抗原を絞り込んだところ、自己抗原Xが候補として残った。自己抗原Xのリコンビナント蛋白は、関節炎惹起性T細胞ハイブリドーマを刺激した。さらに自己抗原X由来ペプチドライブラリーをスクリーニングし、自己抗原X中のエピトープペプチドを決定した。以上の結果を、平成25年1月にkeystone meetingで発表した。自己免疫性関節炎を起こすSKGマウスの、関節炎惹起性TCRとその認識抗原に関して、解析を行っている。平成24年度の成果としては、関節炎惹起性TCRを発現するハイブリドーマを確立し、そのTCRが認識する自己抗原をスクリーニングする方法を確立した。具体的には、ハイブリドーマと抗原提示細胞の共培養系に、抗原の候補となる蛋白質を加えて24時間培養し、その上清を回収する。その上清中のIL-2濃度をELISAで測定することで、ハイブリドーマが活性化したかどうかを確認することができる。さらに、このスクリーニング法を用いて、SKGマウスの関節炎罹患関節から樹立した滑膜細胞から調整した細胞破砕液中に、抗原の候補となる蛋白質が含まれることを明らかにした。さらに抗原を絞り込むために、現在その細胞破砕液から抗原の含まれる分画を抽出しようとしている。本研究において我々は、T細胞シグナル減弱化による自己反応性T細胞の取得、レトロジェニックマウス作成によるTCRの疾患惹起能の検討、選択的に産生した特異的自己抗体による標的抗原の同定という新規の方法を開発し、実際に関節リウマチの標的自己抗原としてRPL23A分子を同定した。免疫学当初の最大の目的であった、疾患惹起性T細胞の認識する自己抗原を同定出来たため平成24年度の研究計画に記載していた通り、関節炎惹起性抗原スクリーニングシステムの確立と、抗原の候補蛋白質を含む細胞破砕液の同定は完了した。現在、抗原同定のためのスクリーニングを精力的に行っている。今回同定した自己抗原Xに反応するT細胞が実際にヒト関節リウマチ患者においても存在するか否かを検討する。また、X特異的T細胞がいかにして疾患を引き起こすのか、胸腺での負の選択を免れるのか、を明らかにする。研究計画書に記載していたように、今後は、抗原の候補蛋白質を含む細胞破砕液の分画化を進め、各々の分画に抗原が含まれているかどうかを検討する。また、自己抗体を利用した抗原同定も同時に試みる。必要最小限の物品購入に抑えたため。関節炎マウスの解析に必要なマウスの維持や、物品購入に使用する。また、国内、海外学会での研究成果の発表に必要な旅費などに使用する。次年度の研究費は、上記の生化学的、細胞分子生物学的実験を遂行するために必要な消耗品を購入することに主に使用する。学会参加費や、論文発表時にも適宜使用する。