hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固形がんに対するがん免疫療法の治療効果に関わる抗腫瘍免疫応答の本態解明

近年、免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果が示された。がん免疫の本態はCD8+ T細胞による細胞性免疫だが、一方で免疫応答を抑制する仕組みとして制御性T細胞が存在し、がん免疫でも重要視されている。腫瘍局所の制御性T細胞は末梢血より多く存在し、抗腫瘍免疫応答を抑制するが、その詳細な機序の検討は十分でなく、免疫チェックポイント阻害剤の効果との関連も明らかではない。制御性T細胞が腫瘍局所に多く存在する要因の詳細を解明できれば、新規治療の開発や効果予測バイオマーカーにつながる可能性がある。本研究では胃癌にフォーカスし、抗腫瘍免疫応答、特に腫瘍局所のCD8+ T細胞や制御性T細胞と腫瘍ゲノム異常との関係を検討し、それに関わる因子を同定することを目的とした。平成30年度は胃癌手術症例の臨床検体を集積し、解析の結果得られた知見を説明する機序の解明のためin vitroで検討した。臨床検体を対象とし、フローサイトメトリーを用いて評価した腫瘍浸潤リンパ球に関するデータとRNAseqのデータを統合したところ、低免疫状態だが、制御性T細胞が多く浸潤する特徴的な一群が同定された。その一群の内の約半数が特定のドライバー遺伝子(gene X)変異を有していた。Gene Xの変異がCD8+ T細胞の浸潤を抑制し、制御性T細胞を存在しやすくする可能性があると考えられた。Gene X野生型、gene X変異型の強制発現株を作成した。Gene X変異型強制発現株ではgene X野生型強制発現株に比べPI3K/AKT経路が活性化することでCXCL10/CXCL11産生が低下した。さらに活性化制御性T細胞がCD8+ T細胞より有利に生存に活用できる脂肪酸の合成が促進していた。以上よりgene Xの変異を有する癌では低糖高脂肪酸の腫瘍微小環境を作り、より制御性T細胞を生存させやすくする可能性があると考えられた。胃癌患者の臨床検体の蓄積を行い解析した。マルチカラーフローサイトメトリーを用いた活性化制御性T細胞の解析と次世代シークエンシング技術によるゲノム解析のデータを取得する事ができた。得られたデータから、制御性T細胞と腫瘍遺伝子変異や発現の違いに関してgene set enrichment analysis等で解析した。また、in vitroでの検討も実施する。臨床検体を用いた検討で得られた制御性T細胞に関わる因子について、がん細胞の強制発現株を作成し評価を実施した。制御性T細胞の生存に有利な代謝産物の産生に変化が出ることを明らかにした。これらは全て、研究計画作成時点で予定していた事であり、予定通り、順調に進呈していると考えられる。平成31年度は更に臨床検体の蓄積を行い、検討を継続する。特に免疫チェックポイント阻害剤による治療を受けた症例において、治療前後での腫瘍検体を採取し、免疫チェックポイント阻害剤に耐性の症例についても検体を蓄積し解析する。さらに前年までの臨床検体を用いた検討で得られた制御性T細胞を誘導するgene Xに関して、マウスのがん細胞の強制発現株を作成する。作成した細胞株をマウスに移植し、制御性T細胞の浸潤に変化が出るかを評価する。さらにシグナル阻害剤を投与することで腫瘍局所の制御性T細胞の浸潤に変化が出るかも評価する予定である。平成32年度は蓄積した臨床検体で、これまで検討したgene Xの変異が制御性T細胞の浸潤に関わっているかや免疫チェックポイント阻害剤治療の効果予測に関わっているかを検討する。特に免疫チェックポイント阻害剤使用後に再生検している症例の検体があれば、治療前後の検体をペアで、これまでに同定したgene Xやそのシグナルの変化、制御性T細胞の免疫学的表現型の変化を評価し臨床応用につながるかを検討する。免疫チェックポイント阻害剤治療マウスモデルを使用して遺伝子やシグナルを制御し制御性T細胞をコントロールすることで有効性が高まるかを評価する予定である。

さらに活性化制御性T細胞がCD8+ T細胞より有利に生存に活用できる脂肪酸の合成が促進していた。以上よりgene Xの変異を有する癌では低糖高脂肪酸の腫瘍微小環境を作り、より制御性T細胞を生存させやすくする可能性があると考えられた。胃癌患者の臨床検体の蓄積を行い解析した。マルチカラーフローサイトメトリーを用いた活性化制御性T細胞の解析と次世代シークエンシング技術によるゲノム解析のデータを取得する事ができた。得られたデータから、制御性T細胞と腫瘍遺伝子変異や発現の違いに関してgene set enrichment analysis等で解析した。また、in vitroでの検討も実施する。臨床検体を用いた検討で得られた制御性T細胞に関わる因子について、がん細胞の強制発現株を作成し評価を実施した。制御性T細胞の生存に有利な代謝産物の産生に変化が出ることを明らかにした。これらは全て、研究計画作成時点で予定していた事であり、予定通り、順調に進呈していると考えられる。平成31年度は更に臨床検体の蓄積を行い、検討を継続する。特に免疫チェックポイント阻害剤による治療を受けた症例において、治療前後での腫瘍検体を採取し、免疫チェックポイント阻害剤に耐性の症例についても検体を蓄積し解析する。さらに前年までの臨床検体を用いた検討で得られた制御性T細胞を誘導するgene Xに関して、マウスのがん細胞の強制発現株を作成する。作成した細胞株をマウスに移植し、制御性T細胞の浸潤に変化が出るかを評価する。さらにシグナル阻害剤を投与することで腫瘍局所の制御性T細胞の浸潤に変化が出るかも評価する予定である。平成32年度は蓄積した臨床検体で、これまで検討したgene Xの変異が制御性T細胞の浸潤に関わっているかや免疫チェックポイント阻害剤治療の効果予測に関わっているかを検討する。特に免疫チェックポイント阻害剤使用後に再生検している症例の検体があれば、治療前後の検体をペアで、これまでに同定したgene Xやそのシグナルの変化、制御性T細胞の免疫学的表現型の変化を評価し臨床応用につながるかを検討する。免疫チェックポイント阻害剤治療マウスモデルを使用して遺伝子やシグナルを制御し制御性T細胞をコントロールすることで有効性が高まるかを評価する予定である。
癌特異的HLA結合性ペプチドによる抗腫瘍免疫応答の誘導

HLAクラスII分子は、抗原提示細胞が取り込んだ抗原を、蛋白分解酵素により分解して生じたペプチドを結合し、これをCD4^+T細胞に提示して活性化する。外部より取り込んだ抗原由来のペプチドを結合しないHLA分子は、その細胞が産生する蛋白に由来するペプチドを結合している。したがって癌化にともない、癌関連遺伝子に生じたミスセンス変異に由来するアミノ酸残基の置換を有するペプチドが、HLAクラスII陽性の癌細胞表面、あるいは癌細胞を取り込んだ抗原提示細胞の表面に発現し、CD4^+T細胞に免疫応答を誘導する可能性が十分に考えられる。さらにp53の突然変異により蛋白の構造が変化して蛋白分解酵素への感受性が増し、癌細胞では正常細胞には見られないp53ペプチドが出現する可能性が考えられる。本研究は、このような癌細胞特異的ペプチドにより、抗腫瘍免疫応答が誘導されるか否かを解析することを目的として行った。その結果、以下の成果を得た。野生型Rasペプチドに弱い自己反応性を示し、癌細胞に検出される変異Ras蛋白に対応する癌特異的変異Rasペプチドにより強い応答性を示す、ヒトCD4^+αβT細胞クローンを樹立した。このT細胞は、それぞれのリコンビナントRas蛋白に対しても反応した。癌特異的変異Rasペプチド上の1アミノ酸残基を置換したアナログは、野生型ペプチドと比較して、ヒトT細胞にはるかに強い免疫応答を誘導した。健康な3人のドナーの末梢血T細胞より、HLAクラスII分子により提示された正常なアミノ酸配列を有する、3種類のp53ペプチドに特異的な、CD4^+αβT細胞クローンを樹立した。このうちの1つは、癌細胞で検出される突然変異を有するリコンビナントp53蛋白にも反応した。このようなT細胞クローンは、癌細胞表面のHLAと癌特異的ペプチドの複合体、あるいは癌細胞を貪食した抗原提示細胞上のそれを認識して、癌細胞を直接あるいは他の細胞を活性化することにより、間接的に攻撃できる可能性を秘めており、この点を今後検討する予定である。
3次元PETと受容体ノックアウトマウスを用いた高次脳機能の研究

中枢ヒスタミン神経系は視床下部後部に神経細胞を有し、吻側・尾側にバリコシチィーを有する神経線維を多く出している。本研究助成を受けて、中枢ヒスタミン神経系を例にその役割を分子レベルからPETを用いたヒト個体レベルまで広範に以下のような研究を行った。(1)3次元PETを用いた研究:3次元PETを用いて頻回の認知課題遂行時の脳血流量の変化を測定した。(2)痴呆症脳研究:ヒスタミンH1受容体はアルツハイマー病中等度進行例においては年齢・性の一致した対照より有意に大脳皮質全体において減少したのに、局所脳糖代謝率は連合野において現象するが一次感覚野や一次運動野においてはかなり保たれていた。(3)PETによる受容体占拠率の測定:抗ヒスタミン薬腹用後のヒスタミンH1受容体占拠率の測定をPETを用いておこなった。第二世代の抗ヒスタミン薬はH1受容体の30%以下を占拠したのに対し、第一世代の抗ヒスタミン薬は70%以上のH1受容体を占拠した。H1受容体占拠率と眠気の副作用の頻度はよく相関した。(4)ノックアウトマウスを用いた研究:ヒスタミンH1受容体ノックアウトマウスの行動薬理実験(自発運動量・受動回避試験・T迷路試験)を行った。オープンフィールドにマウスを置き30分間の自発運動量を測定したところノックアウトマウスはじめは動いたが時間がたつにつれて段々動きが少なくなった。ノックアウトマウスは立ち上がりの回数も少なかった。ヒスタミンH1受容体ノックアウトマウスを用いた行動薬理的実験から、ヒスタミンH1受容体ノックアウトマウス(-/-)が幾つかのストレスに対してコントロール群(+/+)と異なる反応を呈することを明らかにした。
ＤＮＡ合成を反映する新規ＰＥＴ製剤４ＤＳＴを利用した病変の悪性度評価と予後予測

本研究は、放射線診療分野におけるがん患者の個別化医療の実現を目指し、日本国内で開発されたDNA合成を反映する新規PET製剤(11C-4DST)を利用し、「病変の悪性度評価」と再発予測を行った。DNA合成を反映するPET製剤である4DSTを用いて非侵襲的にDNA合成の画像化を行い、病変個々の悪性度を病理学的診断と比較した。4DST-PET/CTにおけるDデータと血清チミジンキナーゼ値、患者の再発までの期間を比較し、4DST-PET/CTによる再発予測の可能性についても検討した。肺がん患者31名に対して4DST、FDG-PET/CTを行い、原発巣とリンパ節における病理診断との比較を行った。4DSTの転移リンパ節検出感度は82%であり、FDG(30%)と比較して優位に高値であった。一方、4DSTはリンパ節への非特異的集積を示し、特異度はFDGと比較して低値を示し、病理学的な特徴も認められなかった。しかし、4DST及びFDG検査所見と術後2年以内の再発率を比較した結果、4DSTのリンパ節への集積は、再発における最も優位な因子と考えられ(オッズ比=27)、さらに原発巣の4DST集積度(SUVmax)も優位な因子と考えられた。頭頚部腫瘍患者42名に対して、4DSTとFDG-PET/CTを施行した。病変における集積度の比較において、FDG低集積病変(SUVmax < 3)では4DST集積と高い相関性が認められたが(r=0.8)、FDG高集積例(SUVmax >3)では相関性はそれと比較して低値であった(r=0.5-0.7)。細胞増殖の間接的指標である血清チミジンキナーゼと直接的指標である4DST集積度との相関性は認められず、独立した因子と考えられた。今後は、多数例におけるより詳細な解析と臨床経過との比較によって、4DSTの臨床的意義を解明する必要があると考えられた。本研究は、放射線診療分野におけるがん患者の個別化医療の実現を目指し、日本国内で開発されたDNA合成を反映する新規PET製剤(11C-4DST)を利用した「病変の悪性度評価」と予後予測を行うものである。DNA合成を反映するPET製剤である11C-4DSTを用いて非侵襲的にDNA合成の画像化を行い、病変個々の悪性度を病理学的診断と比較する。当施設で、病変の良性・悪性の鑑別を要すると判断された患者に対し、11C-4DST-PET/CTとFDG-PET/CTを施行した。11C-4DST-PET/CTとFDG-PET/CTの画像所見を確認し、対象病変に対するそれぞれのPET製剤の集積度を半定量的評価であるstandardized uptake value(SUV)を用いて測定し、記録を行った。平成24年度は肺癌、頸部癌、骨髄腫69例に対して撮影が行われた。11C-4DSTは肺がんリンパ節転移の検出感度が非常に高く、有用性が示唆された。11C-4DSTの集積度と血清チミジンキナーゼ値との相関性は現在確認中である。対象病変は、組織採取による病理学的評価を行い、11C-4DST-PET/CTとFDG-PET/CTの画像所見との対比を行った。病理学的評価は、病理医による診断と免疫学的染色(Ki-67)に基づく細胞増殖能を示すMIB-1 indexの算出によって行う予定である。組織評価は、頸部癌、肺癌を中心に39例に関して行われた。

研究に参加した患者における臨床経過の調査は肺癌、頸部癌を中心に開始した。検査後の副作用の出現は認められていない。肺癌患者における11C-4DSTのリンパ節転移の評価に関しては、2012年10月に日本核医学会総会(札幌)で公表し、11C-4DSTの良悪性の鑑別の可能性に関しては、2012年6月に米国核医学会(マイアミ)で公表した。11C-4DST-PET/CTは肺がん患者19名(計45回)、頸部癌患者20名、骨髄腫患者30名に対して撮影を行った。また、肺がん患者に関しては、再発、予後に関する調査も開始した。当初の計画以上に進展している。一方で病理学的な検証に時間を要している。症例数が計画よりも多く、11C-4DSTの原材料を購入するために、25年度以降の予算の前倒し申請を行い、承認された。11C-4DST-PET/CT(4DST), FDG-PET/CT(FDG)の撮影。病変の良性・悪性の鑑別を要すると判断された患者に対し、4DSTの検査を行い、その後FDG検査を施行する。4DSTとFDGの画像所見を確認し、それぞれのPET製剤の集積度を半定量的評価であるSUVを用いて測定し、記録を行う。また血清チミジンキナーゼ値と4DSTの集積度との比較を行う。平成25年度の対象症例数は30例とする。対象病変は、組織採取による病理学的評価を行い、4DSTとFDGの画像所見との対比を行う。組織学的判定が困難な場合は、臨床経過や他検査所見を含め、総合的に評価を行う。研究に参加患者における臨床経過の調査。4DSTを撮影した患者に関しては、臨床経過を観察することにより再発の有無、生存期間を調査する。再発までの期間や予後とPETの集積度を比較し、その相関性を検討する。研究費は、11C-4DST-PET/CT(4DST), FDG-PET/CT(FDG)の撮影代(30人分)に対し、約30万円を使用する。また血清チミジンキナーゼ値の測定に約3万円を使用する。情報収集のための海外渡航費として約30万を使用する予定である。その他、論文作成費、消耗品購入費を予定している。原材料であるSn-4DSTは、すでに昨年度研究費で購入を行っている。
鉄の酸化ストレスによる子宮内膜症のがん化機序の解明とモデル動物の樹立

子宮内膜症からの癌化機序として遺伝子不安定性等を検討した。繰り返す月経血の逆流による酸化ストレスにより、子宮内膜症自体に遺伝子変異が生じており、脱落膜化機能に関連した遺伝子群がメチル化され発現低下していた。これはすでに子宮内膜症患者の正所子宮内膜においてもその発現変化を確認できた。毎月おこる月経血に含まれるヘモグロビンによるヘムや鉄により酸化ストレスによりG→T変異を起こし遺伝子変異が惹起された。元来胎児期から子宮内膜に遺伝子変異を有していると推定された女性が、生後に繰り返す出血により広範囲な遺伝子変異が発生し、鉄による酸化ストレスの影響を受けて子宮内膜症から発がんする機序を検討した。研究の目的卵巣子宮内膜症性嚢胞から悪性化をきたす多段階発がんの各ステップにおいて、活性酸素種によるゲノムDNAの酸化ストレスの視点から、その発がん候補遺伝子の突然変異しやすい特定部位の同定と発がんに及ぼす影響を調べる。次に「鉄」投与による卵巣明細胞腺癌の自然発がん動物モデルを作成し、がん化のメカニズムの解明と治療法を確立することを目的とする。研究成果1.「鉄」および関連遺伝子産物の局在を免疫染色と遺伝子発現で確認正常子宮内膜(増殖期、分泌期、妊娠期、閉経期)、子宮内膜症(卵巣チョコレート嚢胞、腹膜病変)(計80例)、卵巣がん(計90例:漿液性・粘液性・類内膜・明細胞腺癌)組織のパラフィンブロックおよび各種培養細胞を用いて、EMA、カルレチニン、HNF-1betaの免疫染色と遺伝子発現を検討し、明細胞腺癌における発がん機序として、子宮内膜逆流説を発生母地として立証した。2.酸化ストレス、特に「鉄(Fe-NTA)」添加により変化する遺伝子群とその突然変異の同定ARID1AおよびPIK3CA遺伝子の遺伝子変異ホットスポット領域にグアニンG→チミンT突然変異が起こっているかどうか塩基配列を調べ、それぞれtransversionとtransitionの割合を調べた。その結果、特にPIK3CAは酸化ストレスとの関連を見出した。8-oxoG特異抗体を用いた免疫染色では、子宮内膜症と明細胞腺癌に強陽性にその発現が認められた。3.HNF-1betaの過剰発現・ノックアウトによる癌細胞の性格5種類の明細胞腺癌細胞のうちHNF-1beta非発現細胞ES2および漿液性癌細胞SKOV(HNF-1beta非発現)を用いて、ウイルスベクター導入によるHNF-1beta恒常的発現株の樹立を行った結果、細胞周期停止を起すことを証明した.その後にチェックポイントを外すと細胞死が確認できた.子宮内膜症特異的転写因子HNF-1betaの発現を修飾する薬剤によるがん細胞機能評価を行った。HNF-1betaを直接抑制するあるいはその下流遺伝子発現を抑制する薬剤、試薬を培養細胞に添加しその増殖能、浸潤能、アノイキス抵抗性、抗がん剤耐性の変化を比較した。HNF-1beta下流遺伝子であるChk1を抑制するインヒビターによる抗癌活性の増強を確認した。発がん関連遺伝子(PPP2R1A、ARID1A、PIK3CA、KRAS、MAPK、PTEN)発現を調節する因子の網羅的解析を行った。その結果、これらの遺伝子変異を惹起する鉄はFe2+であり、オキシヘモグロビンの自動酸化、一部フェントン反応に依存していた。酸化ストレスが過剰に亢進している細胞は細胞死を招くが、抗酸化ストレスが発現した細胞は細胞死を免れ、遺伝子不安定性を持ったまま生存することにより癌化することが判明した。明細胞腺癌の発がんにはクロマチン再構築異常に伴う発がん遺伝子変化が強く関与している。この現象を培養細胞で再現するために、ヒト不死化卵巣表層上皮細胞OSE・明細胞腺癌細胞ES2(HNF-1beta非発現)に「鉄」を添加し、ARID1A遺伝子突然変異の確認、抗8-oxoG抗体による酸化修飾ゲノムDNAの解析、免疫沈降によるクロマチン再構築応答実験を行っている。現在継続実験中である。遺伝子操作によらない子宮内膜症がん化モデル動物の確立を検討した。C57BL/6マウスに持続的酸化ストレス状態を再現するため、約3か月間連日腹腔内「鉄」(フェジンまたはFe-NTA(硝酸第二鉄九水和物+ニトリロ二酢酸二ナトリウム))を注入し、卵巣がん、腎がん、腹膜中皮腫の発生を観察する。マウスでは悪性中皮腫や腎癌が先に発生するため、卵巣癌が発生する前に他癌死するため卵巣がん発生は確認できなかった。モデル動物を変更する予定である。

1.HNF-1betaの発現を修飾する薬剤によるがん細胞の機能を評価するため、HNF-1betaを直接抑制するあるいはその下流遺伝子発現を抑制する薬剤、試薬を培養細胞に添加しその増殖能、浸潤能、アノイキス抵抗性、抗がん剤耐性の変化を比較した。この薬剤が発見できればsiRNAを導入しなくても抗がん剤感受性促進に関する臨床的なアプローチが可能になる。。HNF-1betaのターゲット遺伝子であるChk1を同定したため、Chk1 inhibitorを投与実験を行うことができた。次に抗酸化薬やスカベンジャーを前投与することにより、「鉄」投与によるHNF-1 beta発現、遺伝子突然変異、細胞機能の抑制効果をin vitroで証明することができた。2.発がん関連遺伝子(PPP2R1A、ARID1A、PIK3CA、KRAS、MAPK、PTEN)発現を調節する因子の網羅的解析を行った。候補としてリン酸化ERKを抑制するMKP-3、PTEN活性を低下させるDJ-1などの調節因子が「鉄」の酸化ストレス下で受ける影響をどのような調べた。また、明細胞腺癌で高率に消失するestrogen receptorのメチル化調節機構を解明した。現在、エピジェネティクス機序を網羅的に解析している。3.HNF-1beta調節因子としてのClaspinタンパクの同定とその作用を調べた。明細胞腺癌で過剰発現したHNF-1betaはChk1をリン酸化するがそれを分解する系が抑制されていると考えた。Chk1と結合するタンパクを探索した結果、Claspinが候補に挙がった。Claspinはリン酸化Chk1と結合したあとユビキチン系で分解されるが、HNF-1betaによるClaspin分解抑制のため、持続性にChk1がリン酸化され、細胞周期が停止した。これが遺伝子不安定性を起こして癌化する可能性が示唆された。予想通り、ARID1AおよびPIK3CA遺伝子の遺伝子変異ホットスポット領域にグアニンG→チミンT突然変異が起こっており、それぞれtransversionとtransitionの割合を調べることができた。HNF-1betaの過剰発現・ノックアウトによる癌細胞の性格を検討し、細胞周期調節因子のリン酸化により細胞周期停止が起こるが、チェックポイント機能不全により細胞死が起こらないことを確認できた。25年度が最終年度であるため、記入しない。子宮内膜症の嚢胞内に蓄積した「鉄」によるフェントン反応の結果、活性酸素種が産生され、持続的酸化ストレス状態が惹起されるという仮説を検証した。閉経期には多くの内膜症腺管上皮細胞はこの微小環境のもとで死滅するが転写因子HNF-1betaの過剰発現能を獲得した細胞のみが、より多くの解毒酵素を産生し、生存のシグナルを獲得するとともにグリコーゲンを蓄積し生存のためのエネルギーを獲得できることが分かった。この時HNF-1beta下流遺伝子として抗アポトーシス、解毒酵素産生シグナルが関与していた。さらに、過剰な酸化ストレスにより我々が想定している発がん遺伝子のグアニン塩基Gが8-oxoGに修飾され、チミン塩基Tと誤翻訳され突然変異を起こし、抗アポトーシスを介して生存を獲得する。これが子宮内膜症からの発がん機序であるとの仮説を証明することができた点が評価される。従来ARID1Aの遺伝子変異が高率に発生することが証明されているが、この遺伝子変異も酸化ストレスで生じていることを確認することができた。
イリジウム触媒による二重結合異性化反応を利用したアリル型ホウ素反応剤の合成

本研究は、アリル型ホウ素化合物の新規合成法開発を目的とし、遷移金属触媒、とくにイリジウム、ニッケル触媒を用いた二重結合の異性化反応を利用することにより、ハイドロボレーション反応で得られるビニルホウ素化合物より一段階で目的とするアリル型ホウ素化合物への変換を達成した。さらに、イリジウム、ニッケル触媒による異性化反応の詳しい機構解明、得られたアリル型ホウ素化合物とアルデヒドなどカルボニル化合物との分子間及び分子内反応により生成するホモアリルアルコール類の立体選択性の制御、有機合成への利用を目的として調査したものである。1.シリルエノールエーテルの合成アリルシリルエーテルからシリルエノールエーテルへの異性化反応における立体選択性の発現と反応機構について詳しく調査した。その結果、[Ir(cod)_2]PF_6/2PPr_3を水素により活性化した触媒が効果的であり、1級のアリルシリルエーテルでは、アセトン、THFなど配位性の溶媒で速度論支配でトランス体を、非配位性のジクロロメタン中では速やかに熱力学的な平衡に達することがわかった。2級アリルシリルエーテルでもIr-PPr_3系は高活性を示し立体選択性はシリル基と置換基との相対的かさ高さに依存しシリル基が大きい場合はトランス体が、置換基が大きい場合はシス体が得られた。反応はπ-アリルイリジウム中間体を経由して進行しているものと考えられ、立体選択性はπ-アリル中間体の熱力学的安定性により支配され例る事がわかった。2.ジアリルエーテルの異性化反応ジアリルエーテルは本異性化反応に対して二つの反応点を有しているが、調査の結果置換基数の少ない二重結合側で異性化反応が優先的に進行しアリルビニルエーテルを与えることがわかった。3.異性化反応によるアリル型ホウ素化合物の合成プロパルギルエーテルのヒドロホウ素化反応で得られる(3-アルコキシ-1-プロペニル)ホウ素化合物より一段階で目的とするアリル型ホウ素化合物への立体選択的な変換を達成した。異性化はγ-アルコキシビニルホウ素化合物で効率よく進行し、イリジウム触媒ではトランス選択的に、ニッケル触媒ではシス選択的に異性化する事がわかった。また、本異性化反応を分子内アリルボレーション可能な基質に適用した結果、環状エーテル類の立体選択的単段階合成が達成された。本研究は、アリル型ホウ素化合物の新規短段階合成法開発を目的として、遷移金属触媒、とくにイリジウムおよびニッケル触媒を用いた二重結合異性化反応を調査するものである。また、これまであまり報告例のないアレン類の触媒的ヒドロホウ素化反応の開発にも成功し、シス体のγーアルコキシアリルホウ素化合物の一段階合成に成功した。

2級アリルシリルエーテルでもIr-PPr_3系は高活性を示し立体選択性はシリル基と置換基との相対的かさ高さに依存しシリル基が大きい場合はトランス体が、置換基が大きい場合はシス体が得られた。反応はπ-アリルイリジウム中間体を経由して進行しているものと考えられ、立体選択性はπ-アリル中間体の熱力学的安定性により支配され例る事がわかった。2.ジアリルエーテルの異性化反応ジアリルエーテルは本異性化反応に対して二つの反応点を有しているが、調査の結果置換基数の少ない二重結合側で異性化反応が優先的に進行しアリルビニルエーテルを与えることがわかった。3.異性化反応によるアリル型ホウ素化合物の合成プロパルギルエーテルのヒドロホウ素化反応で得られる(3-アルコキシ-1-プロペニル)ホウ素化合物より一段階で目的とするアリル型ホウ素化合物への立体選択的な変換を達成した。異性化はγ-アルコキシビニルホウ素化合物で効率よく進行し、イリジウム触媒ではトランス選択的に、ニッケル触媒ではシス選択的に異性化する事がわかった。また、本異性化反応を分子内アリルボレーション可能な基質に適用した結果、環状エーテル類の立体選択的単段階合成が達成された。
血管内皮細胞障害におけるミトコンドリア機能の役割検討と臨床評価、新治療の探索

糖尿病、冠動脈危険因子を複数有するハイリスク患者において、RH-PATにて評価した血管内皮機能障害は、心血管イベントの独立した有意な寄与因子であることが明らかになった。冠動脈疾患における2剤抗血小板治療に対する抵抗性は血管内皮機能障害と関連する事を示した。ヒト冠動脈血管内皮細胞において、テルミサルタン(Telmi)は、ミトコンドリア機能を増強した。Telmiにより細胞老化抑制効果、抗アポトーシス効果、血管新生増強効果が認められた。TelmiはAMPKを活性化しており、Telmiによるミトコンドリア機能増強効果や抗老化・抗アポトーシス作用は、AMPKの薬理学的・遺伝的阻害により打ち消された。末梢血白血球でミトコンドリアDNA発現量を測定し、ミトコンドリア機能関連因子,新生関連因子発現についてmRNAレベルで確認した。ミトコンドリア機能制御に関与するAMPK, eNOSのリン酸化レベルを培養ヒト血管内皮細胞においてWestern Blotで検討した。ミトコンドリア機能はミトコンドリアreductase activityをMTS assayにて測定し、ATP産生能を検討した。ミトコンドリアの酸化ストレス産生状況を検討するためMitoSOXを用いてFlowcytometryで評価し、GPX, SOD2, catalaseのmRNA発現を検討した。白血球、血管内皮細胞におけるROS産生に関してはDCF-DAを用いてFlowcytometryで測定した。ミトコンドリア膜電位変化に関してFlowcytometryで測定系を確立した。実験系の確立が出来た。CKD患者で血管内皮機能は有意に低下しており、CKD患者で末梢血管内皮能低下は心血管イベントの独立した有意な危険因子であることを明らかにした(Int J Card 2014)。運動療法に付加したスタチン投与は、冠動脈疾患患者においてHMW-adiponectinを増加させ腎機能を改善させた(J Card 2014)。糖尿病、冠動脈危険因子を複数有するハイリスク患者において、RH-PATにて評価した血管内皮機能障害は、心血管イベントの独立した有意な寄与因子であることを明らかにした(J Am Heart Assoc 2013)。Metabolic Syndrome患者において運動、食事療法介入は腹囲減少を伴って血管内皮機能障害改善に有効であることを示した(Circ J 2013)。冠動脈疾患における2剤抗血小板治療に対する抵抗性は血管内皮機能障害と関連する事を示した(Circ Cardiovasc Interv 2013)。血管内皮機能におけるミトコンドリア機能の関与について細胞レベルでの検討を行った。培養血管内皮細胞において、各腫アンギオテンシンType-1受容体拮抗薬(ARB)のミトコンドリア機能に対する効果をmitochondrial reductase活性とATP産生能で検討し、テルミサルタンがヒト血管内皮細胞ミトコンドリア機能を増強することが明らかとなった。テルミサルタンは、AMPKを活性化しeNOSの活性化リン酸化を亢進する事でミトコンドリア機能を活性化していることを示した。テルミサルタンは、酸化ストレスによる血管内皮細胞apoptosisを抑制し、酸化ストレスによる老化促進を減弱させた。テルミサルタンは、血管内皮細胞においてmitochondria biogenesisを促進する因子(TFAM, NRF1, SIRT-1, SIRT-3)の発現を亢進させた。(Atherosclerosis; 2015, 239:375-385)臨床研究において、冠動脈リスクを有するCKD患者で末梢微小血管内皮機能は低下しており、この低下した血管内皮細胞機能が将来の心血管イベント予測の独立した寄与因子で有ることを明らかにした(Int J Card. 2014;173:481-486)また、横浜市立大学との共同研究で整形外科領域下肢手術後に生じる深部静脈血栓症の発症予測にreactive hyperemia peripheral arterial tonometryで評価した末梢微小血管内皮機能が有意で独立した予測因子になる事を明らかにした(Circ J. 2014;78:1723-1732)[背景]AMP-activated protein kinase (AMPK)は血管内皮細胞やマクロファージにおいて、抗炎症効果、血管内皮機能改善効果を持つことが報告されている。アンギオテンシンII1型受容体拮抗薬(ARB)であるテルミサルタン(Telmi)は、これまでの臨床研究や基礎研究において心血管系に有益な効果を持つことが報告されている。Telmiを用いて、AMPK活性化を介した心血管系への有益な効果について検証した。[方法]培養ヒト冠動脈内皮細胞(HCAECs)に対してTelmiを投与し、ミトコンドリア機能や血管内皮機能に対する効果とAMPK活性効果との関連について検証を行った。糖尿病モデルマウスを用いてTelmiによる血管内皮機能への影響を検証した。高血圧患者において、Telmiによる血管内皮機能への影響を検証した。[結果]HCAECsにおいて、Telmiはミトコンドリア機能を増強していた。他のARBではそのような効果は認められなかった。Telmi投与により細胞老化抑制効果、抗アポトーシス効果、血管新生増強効果が認められた。HCAECsにおいてTelmiはAMPKを活性化しており、Telmiによるミトコンドリア機能増強効果や抗老化・抗アポトーシス作用は、AMPKの薬理学的・遺伝的阻害により打ち消された。糖尿病モデルマウスにおいて、Telmiは高脂肪食由来の血管内皮機能障害を改善しており、マウスの大動脈ではAMPKの活性化が認められた。

angiotensin converting enzyme (ACE)阻害薬もしくはTelmi以外のARBで治療中の高血圧患者において、Telmiへの薬剤変更により血管内皮機能の改善が認められた。[考察]TelmiはAMPKを活性化することにより、ミトコンドリア機能を亢進し心血管系に保護的な作用を示すと考えられる。[結論]AMPK活性化を介したミトコンドリア機能改善が心血管系に保護的な効果をもたらすことが期待できる。糖尿病、冠動脈危険因子を複数有するハイリスク患者において、RH-PATにて評価した血管内皮機能障害は、心血管イベントの独立した有意な寄与因子であることが明らかになった。冠動脈疾患における2剤抗血小板治療に対する抵抗性は血管内皮機能障害と関連する事を示した。ヒト冠動脈血管内皮細胞において、テルミサルタン(Telmi)は、ミトコンドリア機能を増強した。Telmiにより細胞老化抑制効果、抗アポトーシス効果、血管新生増強効果が認められた。TelmiはAMPKを活性化しており、Telmiによるミトコンドリア機能増強効果や抗老化・抗アポトーシス作用は、AMPKの薬理学的・遺伝的阻害により打ち消された。培養細胞を使用した血管内皮細胞におけるミトコンドリア機能修飾を検討した。ヒト血中白血球のミトコンドリア機能評価を実施した。培養内皮細胞においてミトコンドリア機能と細胞機能の連関を検討できている。臨床研究の成果が発表できている。動脈硬化、血管細胞生物学マウスモデルにおいて急性心筋梗塞を作成し、その際に起こる心筋障害を軽減する治療をミトコンドリア機能修飾の面から検討する。培養血管内皮細胞において細胞機能とミトコンドリア機能の変化のメカニズムを詳細に検討する。臨床研究においてヒト血管内皮機能障害を改善出来る薬剤治療を検索する。実験準備と基礎検討は、順調に経過している。実験方法の検討が順調に進行している。培養血管内皮細胞におけるミトコンドリア機能調節を検討した。臨床研究の成果が発表出来ている。基礎検討、臨床データ収集を行い、研究実施を推進し結果を更に検討する。培養血管内皮細胞におけるミトコンドリア機能制御の新たなメカニズムを検討する。ミトコンドリア機能、血管内皮機能障害・老化に関する薬効評価を行う。物品納期に時間を要したため、残高が生じた。26年度初めに速やかに執行予定である。
保育学生対象のティーチャートレーニングが幼児に対する認知・行動に及ぼす影響

平成30年度においては,平成29年度から開始した,保育学生を対象としたティーチャートレーニングの介入を引き続き行った。具体的には,教育的な機会を同等に用意する配慮から,すでに実施済みの介入群と同じ介入を,ウェイティングリスト群にも行った。その結果,ティーチャートレーニングによって,主に,ほめることやスキンシップをとることを中心とした対人報酬的なスキルが高まることが明らかとなった。また,負の罰に基づく不適切な行動への注目を除去するスキルも同様に高まっていた。応用行動分析的な知識に関する得点にも有意な向上が認められている点や,場面想定による行動レパートリーの案出の内容を考慮すると,今回実施したティーチャートレーニングは総じて,保育学生に対して概ね有効であったと考えられる。特に,不適切な行動への注目除去は,子どもへの注目が常に意識される保育学生にとっては新奇なスキルになるといえるだろう。従って,行動のレパートリーが増え,対応が多様化する点において,有意義と考えられる。介入群・ウェイティングリスト群への各介入後に,調査への同意が得られた学生には面接調査を行い,ティーチャートレーニングの学びが,子どもの行動の見立てや,保育者としての意識にどのような変容をもたらしたのかについてデータを収集した。また,介入群・ウェイティングリスト群に対して,効果維持のためのフォローアップセッションも実施した。これらについては,今後データを整理して分析する予定である。おおよそ申請した計画通りに進んでいるため。介入を行った上で挙げられうる課題としては,ティーチャートレーニングに特化した効果指標が存在しないことである。従って,新たな尺度を作成することも視野に入れながら,今年度の研究を進める。本研究では,保育者志望の学生を対象とした入職前トレーニングとして,Teacher Training(以下, TT)に基づいた心理教育的プログラムを実施し,対応の難しい幼児に対する捉え方の変容や,関わり方の多様化に焦点をあて,入職前入職後に至る影響を縦断的に明らかにすることを主たる目的とした。今年度は,TTを実施し,その短期的効果を検討した。TTは全5回から構成され,学習理論に基づいた行動変容に関する基本的な考え方,ポジティブな注目,注目の除去,指示に関するスキルの習得を目指した。具体的には,実習を控えた2017年12月ー1月にかけてTTプログラムを実施し、その事前(Time1),事後(Time2)の2時点において質問紙調査を実施した。調査対象者は,中国地方にある私立の四年制大学1校に在籍する大学生52名である(男性2名,女性50名)。学年の内訳は,2年生26名,3年生26名である(平均年齢19.92歳±1.55)。各学年ごとにランダムに介入群とウェイティングリスト群に割付した。調査内容は,保育スキル,行動変容に関する知識・理解の程度,保育者効力感,保育者志望度である。Time1からTime2にかけて,各変数の変化量を算出し,群間比較を行ったところ,不適切な行動の無視,つまり注目の除去スキルにおいて理解・習得されていることがわかった。また,介入群において,行動変容に関する知識も増大していることが示された。従って,今回用いたTTプログラムは,スキルや行動変容の仕組みを理解するという点で短期的な効果を持っているといえる。調査を行っている大学の実習スケジュールに左右されるため,当初の計画を若干修正しているものの,研究を進める上で大きな支障をもたらすような変更はない。平成30年度は,前期のうちにウェイティングリスト群への介入実施を予定している。平成29年度に蓄積したデータと総合し,縦断的な効果を検討することを目指している。これと並行して,量的な効果指標だけではなく質的な側面から変容を捉える面接調査を行うため,データ処理の補助を有効に活用していく必要がある。平成29年度はデータ収集のタイミングが合わなかったため,学会発表の機会がなかった。しかし,平成30年度には,平成29年度内に収集したデータを分析し発表を行うこととし,学会等で助言をもらいながら,介入プログラムの更なる洗練を図っていく予定である。

従って,新たな尺度を作成することも視野に入れながら,今年度の研究を進める。次年度使用額が生じた理由としては,当初計画していた国際学会での発表ができなかったことと,平成29年度はデータの収集がメインであったため,統計ソフトや分析用のパソコンを購入する必要性がなかったことが挙げられる。しかし,平成30年度においては,分析・成果報告等を行うため,そこで使用していく予定であり,また国際学会でのエントリーもすでに行っている。平成29年度に国際学会への参加を行わなかったため,その分の平成30年度への繰り越しがあったことが主たる理由である。PCの購入と,面接データの逐語録作成のために使用する予定である。
確率過程に対する統計的漸近理論とその計算機実装

確率過程に対する多くの検定統計量の分布の高次漸近展開を求めた.この結果から,拡散過程に対する検定統計量の漸近展開公式が導かれた.また,小さな拡散過程やエルゴード的拡散過程に対して,主要な判別関数の誤判別確率の高精度近似公式を求めた.さらに,時変強度関数を持つ一般のマーク付き点過程の漸近展開を求め,数式処理により展開係数の陽な表現を得た.得られた各種近似公式に対して,プログラムコードを作成し,それぞれの精度を数値的に検証した.(1)離散観測に基づく拡散モデルに対するM推定量の漸近展開の導出,(2)隠れマルコフモデルに対する推定量の漸近正規性の証明および漸近展開の導出,(3)ジャンプを持つ拡散過程の擬似最尤推定量および尤度に基づく検定統計量の漸近展開の導出,(4)様々な株価・金利・割引債に基づく金融派生商品の価格に対する統計的推定・検定理論の構築, (5)拡散過程の判別分析法の構築, (6)推定・検定・判別分析の各種手法の計算機への実装を目標とする.確率過程に対する多くの検定統計量の分布の高次漸近展開を求めた.この結果から,拡散過程に対する検定統計量の漸近展開公式が導かれた.また,小さな拡散過程やエルゴード的拡散過程に対して,主要な判別関数の誤判別確率の高精度近似公式を求めた.さらに,時変強度関数を持つ一般のマーク付き点過程の漸近展開を求め,数式処理により展開係数の陽な表現を得た.得られた各種近似公式に対して,プログラムコードを作成し,それぞれの精度を数値的に検証した.拡散過程に対する各種推測方法を計算機に実装するため,これまでの結果を整理し,具体化する作業を進行させた.特に,定常的,あるいは,エルゴード的な場合の連続観測に対する最尤推定量,擬似最尤推定量,尤度比検定統計量,ラオ検定統計量,ワルド検定統計量,修正ワルド検定統計量,ベイズ判別関数,プラグイン判別関数,尤度比型判別関数の漸近キュミュラントの計算を行い,オルンシュタイン=ウーレンベック過程,CIR過程,平方根過程などの具体的な拡散過程に対して,得られた公式が,精度の高いキュミュラントを与えるかどうか,代数的ソフトウェアによる計算や数値シミュレーションを行い検証した.また,拡散係数が小さい場合,いわゆる,small diffusionに対しても,同様に,上記の推定量,検定統計量,判別関数について,拡散過程を具体化したときのキュミュラント計算公式を求め,代数ソフトによる結果,数値シミュレーションによる結果と比較検討し,精度の高い公式を得ることができた.拡散過程が多次元である場合は,キュミュラントの陽なる表現が容易でないので,その推定方法を検討する必要があり,離散観測の場合や飛躍がある場合などと合わせて,今後の検討課題となった.εマルコフ過程をデータとする推定問題の具体的な問題として,拡散過程の漸近展開を実装するため,展開係数の表現と十分条件を再検討した.また,リスク評価法に用いる裾確率近似法について考察した.さらに,拡散過程でマークされる点過程の漸近展開も求めた.具体的には,拡散過程のM推定量の漸近展開公式とその正当性のための十分条件を再度検討した.その応用として,最尤推定量の3次の漸近展開公式の表現・十分条件を精査した.また,推定問題と異なり,検定問題やリスク評価では裾確率が問題となるが,その有力な方法であるサドルポイント法は制約条件が強く,拡散過程のような確率構造が複雑なモデルには適用できない.その困難を避けるため,Wang変換のようなサドルポイント法の近似変換について考察した.さらに,拡散過程のモーメント推定量の一般化として,拡散過程でマークされる点過程の漸近展開を求めた.金利のダイナミックスをエンピリカルデータから推測する時,その統計的なリスク評価が問題となるが,エンピリカルデータそのもののダイナミックスが複雑であるため,評価が困難であった.しかしながら,長期間のデータにエルゴード性を仮定することで,混合性を持つ確率過程に対する漸近展開を利用できることがわかり,最尤推定量の分布の高次漸近近似を求めることに成功した.また,尤度比検定統計量などの最尤推定量を利用する検定統計量に対しても,同様のアプローチでその高次漸近近似を求めることができた.この結果,金利のCIRモデルにおけるリスク評価式が明示的に求めることができた.また,株価など拡散過程でモデル化される連続時系列が,ポアソン時間などのランダム時間でサンプリングされる時,それに基づく統計量の分布に対する近似公式を導いた(Sakamoto, Y. and Yoshida, N.2008).ランダム時間の観測値に基づく統計量は,拡散過程の関数の点過程による確率積分で表現されるが,点過程に内在する確率的独立性に注目すると,混合過程に対する漸近展開を利用できることが明らかになり,結果として統計量の分布の高次漸近近似公式が得られた.状態空間に制約がなく,強度がランダムで時間的に変化することができるマーク付きポアソン過程に対して,その汎関数の特性関数と高次キュミュラントを導出する公式を求め,それを利用して,その確率分布の漸近展開を求めた.また,マリアバン解析を利用して,漸近展開の誤差項に対する数学的評価を与えた.その結果の応用範囲は実用的なモデルを含む広範なものであるが,その典型的な具体例として,モーメント推定量や最尤推定量を含む一般的な推定量のクラスであるM推定量に対して,その確率分布の高精度近似公式を求めた.

さらに,ウィな一過程の積分移動平均をポアソン時間でランダムにサンプリングした観測値に対する推定問題を考察し,そのモーメント推定量の高次キュミュラントの陽なる表現を数式処理により求めた.それを用いて確率分布の高次近似公式を求め,誤差のオーダーを証明した.状態空間が確率微分方程式の解である拡散過程であり,ポアソン過程の強度関数が状態空間の拡散過程の関数である場合の近似公式も求めた.
ウイルスに対する植物の抵抗性の分子機構

研究代表者は、Red clover necrotic mosaic virus(RCNMV)の遺伝子発現制御に関わるウイルス因子とその機構を明らかにするとともに、RCNMVのRNAサイレンシング抑制機構がこれまで知られていない新たなものであることを明らかにした。すなわち、RCNMVによるRNAサイレンシング抑制には複製酵素タンパク質成分(p27とp88)と複製酵素成分と複合体を作れる可能性のあるウイルスRNAの存在が必要であることを示した。また、Dicer様タンパク質(DCL1)に変異を持つアラビドプシスでRCNMVが効率よく複製できないことから、RCNMVはDCL1を複製に必要な宿主因子として利用し、その結果RNAサイレンシングを抑制するというモデルを提唱した。このことはウイルスRNA複製とRNAi抑制のリンクを示唆し、RNA合成装置とRNAサイレンシング装置の分子ネットワークの解明に道を開くものと考える。研究分担者は、タバコモザイクウイルスの感染が多くのmiRNAの蓄積を増大させることに着目し、弱毒ウイルスの作出と作用機構の解明研究の一環として、生物の発生・分化制御に関わるmiRNAのbiogenesisをアラビドプシスのmiRNAの一つであるmiR163を用いて研究した。その結果、miR163の成熟過程は三段階から成り、第一段階と第二段階のRNA切断にはDCL1が重要な働きをすることを明らかにした。また、植物ウイルスの感染での干渉現象をシロイヌナズナの系で再現させ、PTGSがおこらない株、サリチル酸の分解酵素を発現する株でも干渉作用が起こることを示した。TMVがコードする移行タンパク質(MP)が原形質連絡に局在する性質を利用して、原形質連絡タンパク質としてgermin like protein、ポリガラクツロナーゼβサブユニットタンパク質を見いだした。研究代表者は、Capsicum属植物のもつL3抵抗性遺伝子による壊死病斑形成(HR誘導)を促進あるいは遅延させるPMMoV-外被タンパク質(CP)のアミノ酸変異とCP立体構造上でのそれらの位置を明らかにした。そして、L3遺伝子によるウイルス抵抗性の遺伝子ドーセッジ、温度による影響を調べ、ウイルスの挙動、抵抗性およびHRの相互関係を解析できる系を構築した。また、HR関連遺伝子であるhsr203Jとhin1のホモローグphsr203とSNN-hin1をそれぞれCapsicum属植物とサムソンNNタバコから単離した。いずれの遺伝子も、Capsicum属植物におけるHR誘導と相関して発現することを明らかにした。これらにより、ジーンサイレンシングなどの手法を用い抵抗性とHRに関連する新たな遺伝子をCapsicum属植物から得るための実験材料の準備ができた。一方、宿主域をことにするトバモウイルスの研究から、宿主域の決定には、ウイルスの複製酵素、移行タンパク質(MP)、CPの複雑な相互作用が関与していることを明らかにし、トバモウイルス複製・移行における新たな機構の存在を示唆した。研究分担者は、TMVのMPをGFP遺伝子と融合させ、MPの蓄積と感染後の挙動の観察を行った。宿主植物の感染では、感染後しばらくはMP自体の蓄積が放射状にひろがっていき、それによって子孫ウイルスが移行していくこと、一方、N遺伝子が関与する場合は、感染後70時間ほどでMPの蓄積の広がりが止まり、さらには蓄積をしていたMPも減少することを確認した。この現象はN遺伝子の機能する状況のみに特異的にみられた。抵抗性反応がMPを的としている可能性が示された。N遺伝子を形質転換によって導入したタバコでも上記の現象を確認した。N遺伝子をもたないタバコも、その下流のカスケードを持ち合わせていることが示された。形質転換体によっては、最終的にウイルス感染拡大を抑えられない植物体もとれた。こうした現象も視野にいれながら、抵抗性反応の詳細の解析を続行する。プラスセンスRNAをゲノムに持つウイルスの植物への全身感染は、ウイルス因子と宿主因子の密接な相互作用によって起こり、植物の抵抗性とウイルスの積極的な侵略を反映していることが明らかになりつつある。

本研究では、これらの過程に関与するウイルス因子と植物因子の役割を抵抗性と侵略の両観点から明らかにすることを目的とする。Nicotiana benthamianaのphytoene desaturase(PDS)、ribulose bisphosphate carboxylase(rbsc)およびtom1遺伝子ホモローグのcDNAそれぞれ約400-700塩基を挿入したキメラPVXベクターをN.benthamianaに接種し、PTGSを誘導することに成功した。これらの植物にToMVを接種すると、tom1の発現が抑制された植物では、チャレンジ接種したToMV感染による病徴の軽減が認められた。すなわち、PTGSにより様々な遺伝子をノックアウトすることによりウイルスの感染に影響を及ぼす宿主遺伝子を同定できる系ができた。一方、ウイルスの細胞間移行機構の研究では、原形質連絡(PD)を構成する分子種について調べる目的で、構成的にToMVのMPを合成している植物をもちいて生化学的に原形質連絡に富む画分の調製を行った。電子顕微鏡観察によってオルガネラの夾雑物もないきれいな細胞壁がえられ、その中に原形質連絡が確認できた。高塩濃度溶液で洗うと、その画分からMPが徐々に溶出することが確認された。その溶出画分にはMPが確認でき、この中にMPと結合するタンパク質の候補があると考えられた。量的に主要な宿主タンパク質としてgerminlike proteinを同定した。さらにこの画分にファーウエスタン法によってMPと結合する性質を持つタンパク質の存在を示すデータが得られた。複製酵素が細胞間移行にも対応していることが明らかとなった。本研究目的は、プラスセンスRNAをゲノムに持つウイルスの植物への感染過程に関与するウイルス因子と植物因子の役割を抵抗性と侵略の両観点から明らかにし、ウイルス病を制御することを目的とする。RNAサイレンシング、特にVIGSを利用したウイルス感染関連宿主因子の探索研究では、チャレンジ接種用のウイルスを改良し、ウイルス感染検定を確実にかつ迅速に行える系を構築した。すなわち、外被タンパク質遺伝子をGFPで置換したToMVをTiプラスミドに挿入し、爪楊枝でアグロ接種できる系を構築した。ウイルス感染が阻害されない場合は、数日でGFP蛍光がNicotiana benthamiana(Nb)の接種葉に拡がったが、toml遺伝子ホモローグの発現をVIGSで抑制したNbではGFP蛍光は見られなかった。このことから、本系がウイルスの感染に影響を及ぼす宿主遺伝子を同定できるスクリーニング系であることが確認された。現在NbのcDNAライブラリーを構築し、スクリーニングの準備中である。
動脈管および大動脈の収縮特性の研究

以前の研究で明らかになったウサギ胎児動脈管の張力オッシレーションと同様の現象が大動脈など他の血管平滑筋において認められか否かを検討し周波数解析にて動脈管のデータと比較検討した。生後10週の雄ラット(Wister Imamichi)をペントバルビタールの腹腔内注射(50mg/kg)で麻酔した後、開腹し腹部大動脈より直径1.2mm・長さ2mmの円筒形標本を摘出し、98%窒素と2%二酸化炭素で平衡化させた灌流槽中(35°C)に固定する。酸素化潅流液(35°C)で灌流し平衡化させた後、ノルアドレナリン10^<-6>Mを含む灌流液で灌流し大動脈を収縮させる。収縮状態の大動脈にステップ状の微小長さ変化(△L:約20μm)をサーボシステムを介して与えて、張力トランスデューサーより張力変化を記録した。記録された張力変化を最大エントロピー法を用いて周波数解析した。摘出大動脈を高カリウム溶液により収縮させ同様の実験を行いノルアドレナリンによる収縮特性との比較した。アドレナリン収縮大動脈においても動脈管同様の張力オッシレーションが認められ、その周波周期もも動脈管に非常に近く30分くらいであった。しかしオッシレーションの持続は動脈管に比して短く2周期しか持続しなかった。このオッシレーションが収縮線維自体による動きか、細胞内カルシウム濃度変動によるものか断定はできないが、血管平滑筋に共通した収縮線維の特性と思われる。カリウム収縮大動脈では張力のオッシレーションは認められなかった。平成7年度の研究で明らかになった動脈管の張力オッシレーションの機序を研究することを目的とした。張力のオッシレーションという現象が、細胞膜の電位変化の影響や細胞膜を介してのイオン(カルシウムなど)濃度変化の影響によるのか、収縮線維自体の周期的結合・解離によるのか調べるためskinned fiber標本を使用することとした。妊娠ウサギより胎生28日(満期30日)の胎児を取りだした後、円筒形の動脈管(直径1.2mm、長さ1.5mm)を摘出した。胎児ウサギより摘出した動脈管を直ちにトリトンXを含むskinning液に30分から2時間浸し、skinned fiber標本を作成した。摘出した動脈管を50%グリセロール溶液に保存して、適宜実験に使用した。Skinningした動脈管内に2本のタングステン線を挿入し1本は張力トランスデューサー・ワイヤーにつなぎ、他の1本はリニアーモタ-からのワイヤーに接続し、灌流槽中に固定した。弛緩溶液の後にカルシウム10^<-6>モルを含む収縮溶液で灌流し収縮状態を開始させた。トリトンXで種々の時間処理した標本を使用したが、平滑筋細胞内物質の流出によるのかほとんど収縮張力を発生しなかった。カルモジュリンを溶液に追加したところ収縮張力が出現したが、発生張力が微小であったため周波数解析の実験には使用できないと判断した。現在、サポニンによるskinned fiber標本を作成し張力発生状態を検討している。