hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポップカルチャー・ワールド概念を用いたポップカルチャー美学の構築に関わる基盤研究

本基盤研究は、28年度に交付の通知を受け、最終年度も研究実施計画に書いた全ての事業を滞りなく実施することができた。具体的に時系列順に記述すると、研究会の一環として、9月3日から7日にかけて京都精華大学の研究分担者・佐藤守弘(視覚文化班)を代表として5名の講師による公開の連続講演「都市とポピュラー文化」を開催し、研究者の他、京都精華大学の大学院生12名による発表を行い、参加者による討議・考察を行った。11月には京都で研究会を開催し、2月に開催した公開の研究集会に向けての打ち合わせと来年度のセルビアでの国際美学会ラウンドテーブルの企画会議を行った。25年度27年度にわたって実施した一般基盤研究A「ポピュラーカルチャーの美学構築に関する基盤研究」から継続して開催している一般公開の研究集会、「インスタ映えの美学ー溶解する『写真』と『現実』」を2月24日に横浜・関内駅のグランベル横浜ビル大会議室にて開催した。研究分担者・佐藤守弘がコーディネーターを務め、約50名の一般参加者・研究者・学生を集めた。研究グループのほかに特別ゲストとして、松蔭浩之氏(現代美術家・写真家)を迎え、前川修氏(神戸大学)、増田展大氏(立命館大学)がパネリストとしてそれぞれ発表を行ったほか、研究代表者、分担者の全員を加えた討議を行った。4時間にわたり発表・議論を繰り広げた様子をレポートにまとめ、年度末の研究成果報告冊子に加え公刊した。また、全ページを横浜都市文化ラボ(代表:室井尚)のホームページにてPDF版で公開している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本基盤研究は28年度に交付の通知を受け、1年目は研究実施計画に書いたすべての事業を行うことができた。具体的には、7月にソウルで行われた国際美学会にてラウンドテーブルを組織し、研究代表者・分担者による研究発表を行った。研究会の一環として、9月5日から9日にかけて連続で、京都精華大学の研究分担者・佐藤守弘(視覚文化班)を代表とする5名の講師による連続講演「都市とポピュラー文化」を行い、12月には国際美学会の総括、1月には研究分担者・吉岡洋(理論班)による研究発表を行い、また2月の研究集会に向けての打ち合わせを重ねた。25年度27年度にわたって実施した一般基盤研究A「ポピュラーカルチャーの美学構築に関する基盤研究」に引き続き、一般公開の研究集会「ゲームの美学ーゲーム的リアリズム2.0」を2月11日に横浜駅東口のヨコハマプラザホテルにて開催。産業班である吉田寛がコーディネーターを務め、約100名の一般参加者を集めた。研究代表者、分担者のほか、特別ゲストとしてゲーム研究者の入江哲朗氏(東京大学博士課程)、マーティン・ロート氏(ライプツィヒ大学)、簗瀬洋平氏(ユニティ・テクノロジーズジャパン)、井上明人氏(関西大学/立命館大学)、さらに映像出演で、国内外から高い評価を受けるゲームクリエイターの小島秀夫氏(コジマプロダクション)が参加し、約5時間にわたり議論を繰り広げた。研究集会の動画はYoutubeにて全編を公開している。一年間の総括として研究成果報告書を公刊し、広く社会に向けて成果を発表することができた。こちらも、全ページを横浜都市文化ラボ(代表:室井尚)のホームページにて公開している。上記概要でも記したように、本事業の1年目は研究実施計画に書いたすべての事業を無事に行うことができた。研究代表者、各研究分担者の研究もさらに深化し、その成果を内外に広く公開することができた。他方において、各研究分野をひとつの統括的な視点に統合するという点において、まだ数多くの課題が残されているとも言える。残された研究期間中にそれら個別の研究を、より一般的で包括的な理論へとの接合するための努力を積み重ねていきたい。本基盤研究は28年度に交付の通知を受け、1、2年目は研究実施計画に書いたすべての事業を滞りなく実施することができた。具体的に時系列順に記述すると、6月末から7月はじめにリトアニアのカウナス工科大学にて開催された第13回国際記号学会にて我々のラウンドテーブルを組織し、研究代表者・分担者・協力者らによる研究発表を行った。また、研究会の一環として、9月11日から15日にかけて連続で京都精華大学の研究分担者・佐藤守弘(視覚文化班)を代表とする5名の講師による公開の連続講演「都市とポピュラー文化」を開催し、研究者の他、京都精華大学の大学院生約20名による発表を行い、参加者による討議・考察を行った。12月には京都で研究会を開催し、国際記号学会の総括を行ったほか、1月には横浜で研究分担者・秋庭史典(歴史班)による研究発表および2月に開催した公開の研究集会に向けての打ち合わせを行った。25年度27年度にわたって実施した一般基盤研究A「ポピュラーカルチャーの美学構築に関する基盤研究」から継続して開催している一般公開の研究集会、「音とともに生きるー文化的実践としてのポピュラー音楽」を2月17日に横浜・関内駅のグランベル横浜ビル大会議室にて開催した。研究分担者・佐藤守弘がコーディネーターを務め、約100名の一般参加者・研究者・学生を集めた。研究グループのほかに特別ゲストとして、ブロードキャスターのピーター・バラカン氏、輪島裕介氏(大阪大学)、増田聡氏(大阪市立大学)が参加、また研究協力者として音楽班の安田昌弘(京都精華大学)と研究分担者の秋庭史典がパネリストとしてそれぞれ発表を行ったほか、研究代表者、分担者の全員を加えた討議を行った。

4時間にわたり議論を繰り広げ、その様子のすべてを冊子にまとめ公刊した。また、全ページを横浜都市文化ラボ(代表:室井尚)のホームページにてPDF版で公開している。上記概要にも記したように、本事業の2年目も研究実施計画に書いたすべての事業を滞りなく実施することができた。研究代表者、各研究分担者の研究もさらに深化し、その成果を紙版、電子版の報告書の出版によって内外に広く公開することができた。課題としては、新たな課題や問題が見いだされる中で、とりわけアニメ、マンガを含めた多様なポップ・カルチャー全般の研究にとっては限られた現在の研究体制では不足する点が感じられ、本研究を継続発展させていくためには、新たな研究メンバーを加入させるなど、研究体制をさらに広げて行くことが求められる。本基盤研究は、28年度に交付の通知を受け、最終年度も研究実施計画に書いた全ての事業を滞りなく実施することができた。具体的に時系列順に記述すると、研究会の一環として、9月3日から7日にかけて京都精華大学の研究分担者・佐藤守弘(視覚文化班)を代表として5名の講師による公開の連続講演「都市とポピュラー文化」を開催し、研究者の他、京都精華大学の大学院生12名による発表を行い、参加者による討議・考察を行った。11月には京都で研究会を開催し、2月に開催した公開の研究集会に向けての打ち合わせと来年度のセルビアでの国際美学会ラウンドテーブルの企画会議を行った。25年度27年度にわたって実施した一般基盤研究A「ポピュラーカルチャーの美学構築に関する基盤研究」から継続して開催している一般公開の研究集会、「インスタ映えの美学ー溶解する『写真』と『現実』」を2月24日に横浜・関内駅のグランベル横浜ビル大会議室にて開催した。研究分担者・佐藤守弘がコーディネーターを務め、約50名の一般参加者・研究者・学生を集めた。研究グループのほかに特別ゲストとして、松蔭浩之氏(現代美術家・写真家)を迎え、前川修氏(神戸大学)、増田展大氏(立命館大学)がパネリストとしてそれぞれ発表を行ったほか、研究代表者、分担者の全員を加えた討議を行った。4時間にわたり発表・議論を繰り広げた様子をレポートにまとめ、年度末の研究成果報告冊子に加え公刊した。2年目である今年度は、計画書に書かれた通り、国際記号学会(場所はリトアニアに変更)にてラウンドテーブルを組織する。国内では、昨年同様、研究分担者、協力者による研究会を年3回開催し、各自の研究成果を発表し議論を積み重ねていく。横浜で2回(うち1回は9/1115に連続で京都精華大学の研究分担者・協力者による連続講義を横浜での研究会にあてる)、京都で1回開催する。またこれまで続けてきた一般開放する大規模な研究集会に関しても、新しい企画の下に実施し、その内容を広く社会に発信していきたい。最終年である今年度は、計画書に書いた通り、国内での研究会を3回開催し、各自の研究成果を発表し多様な聴講者とともに議論を積み重ねていく。横浜で2回(うち1回は京都精華大学の研究分担者・協力者による連続講義を横浜での研究会にあてる)、京都で1回開催する。
経口心不全治療薬開発に向けたナトリウム利尿ホルモン発現調節メカニズムの解明

ナトリウム利尿ペプチドANP, BNPは、心不全にて血中濃度が上昇し重症度のマーカーになるとともに治療薬としても使用されている。そこで、ANP, BNPが生体内でいかに発現調節されているのかを検討した。結果、ANP, BNPの心不全時の発現は3つの転写因子がエンハンサー部に結合すること、機械刺激がANP, BNP発現のシグナル誘導にかかわることを示した。以上の結果により心不全における重要な適応現象であるANP,BNP発現誘導がメカニカルストレスで活性化される因子を通しておこることを明らかにした。この成果はこれらのシグナルを標的とした心不全治療薬開発につながると期待されます。高齢化社会の進行とともに心不全患者数は増加傾向にあり、その治療法の開発は保健衛生上きわめて重要な課題である。ナトリウム利尿ホルモンは心臓から分泌され、心不全時にその発現が顕著に誘導される。そのため心不全重症度の分子マーカーとして広く臨床応用されているだけでなく、その利尿作用・血管拡張作用等により心不全治療にも使用されている。しかし心不全時におけるその発現誘導のメカニズムは意外なことに不明である。ナトリウム利尿ホルモンの心不全治療における有用性は明らかであるが、ペプチドであるため注射剤しか使用できない。一方、経口ネプラマイシン阻害剤はペプチドホルモンの分解酵素を阻害し血中ペプチドホルモン濃度を上げ心血管イベントを減少させることが報告された。しかし、そのナトリウム利尿ホルモンに対する特異性は疑問視されている。そこでより直接的にナトリウム利尿ホルモンを発現誘導させる薬剤を開発するために、心不全時のナトリウム利尿ホルモンの発現メカニズムを検討し、その誘導に重要な遺伝子部位の同定に成功している。本事業では、同定された制御部位の狭小化を行ったうえで制御部位アッセイ系の高感度化、制御タンパク質の精製・同定、さらにこれらの活性制御につながるシグナル経路の同定を行い、ナトリウム利尿ホルモン活性化シグナル系を創薬標的とした新たな心不全治療薬の開発を行うことを目的とする。27年度は、ナトリウム利尿ホルモン誘導にかかわる部位の狭小化を行うため、多数の変異体を作成し生体内・生体外で活性誘導アッセイを進め狭小化に成功した。さらに、本調節部位に結合するタンパク質を精製し、数種の候補制御タンパク質の同定に至った。狭小化された制御遺伝子部位をもとに、ウイルスヴェクターを使用した活性制御タンパク質アッセイ系を新たに構築し、制御機構の解明をさらに進めていく予定である。研究開始時に、エンハンサー領域は600bp程度(CR9領域)まで狭められており、結合タンパク質精製のためのプローブとしては適切な塩基長であった。しかし、ネガティブコントロールとして使用するプローブの設計、結合する転写因子の種類および数の推定のために、さらなる領域の狭小化が必要であった。そこで30bp単位の欠損部を有するCR9変異体を10種程度作成し、生体内・生体外でそのエンハンサー活性を計測した。結果、CR9領域内の120bpの範囲に活性部位が2か所存在し、それぞれが必須であることが明らかとなった。そこで、この120bpを制御タンパク質のアッセイ系用の遺伝子領域として利用することとした。同時に、CR9配列をビオチン化核酸として合成し、精製用プローブとして利用して活性制御タンパク質の同定を行った。結合タンパク質の精製原料としては、大動脈縮窄により作成したマウス心不全心及びラット培養心筋細胞を使用した。それぞれのホモジネートから収縮タンパク質を沈殿分離した後、造影剤を使った密度勾配により分画を行った。各分画において上記で合成したビオチン化DNAプローブとストレプトアビジンビーズによる結合タンパク質のアフィニティ精製をおこなった。高塩および尿素の2段階で溶出を行い、それぞれに含まれるタンパク質をショットガンプロテオミクスにより定性した。この操作を心不全6検体、心筋細胞で10検体繰り返し、再現性良く結合するタンパク質を約10種検出した。これらの候補遺伝子のアデノウイルス発現ヴェクターを作成しCR9および狭小化CR9レポーターを発現する培養細胞に導入した。我々は、直接的にナトリウム利尿ホルモンを発現誘導させる薬剤を開発するために、心不全時のナトリウム利尿ホルモンの発現メカニズムを検討し、その誘導に重要な遺伝子部位の同定に成功した。本事業は、同定された制御部位の狭小化を行ったうえで制御部位アッセイ系の高感度化、制御タンパク質の精製・同定、さらにこれらの活性制御につながるシグナル経路の同定を行い、ナトリウム利尿ホルモン活性化シグナル系を創薬標的とした新たな心不全治療薬の開発を行うことを目的として開始した。同定したエンハンサー領域の2本鎖DNAをプローブとして、BNP産生刺激であるカテコラミンを投与した心筋細胞および圧負荷等を施した心臓組織からエンハンサー結合タンパク質の同定を溶液ショットガン法で行った。最終の結合タンパク質候補として残った10個のタンパク質をすべてアデノウイルスの発現ヴェクターに組み込み、組み合わせとサブトラクションによりBNP発現誘導に必要十分な3種のタンパク質の同定に成功した。残された課題はこれらの3種のタンパク質の活性化につながる経路を同定し、BNPの転写活性化へのシグナル因子を同定し心不全の治療標的とすることである。そのために、細胞のストレッチ実験系や圧チャンバーによる気圧上昇実験系など複数のBNP上昇系の確立に着手した。今後、BNP上昇につながる共通経路の同定を複数のシステムで進めていく予定である。

心臓負荷および心不全によって生体内でANPおよびBNPを上昇させる分子メカニズムは多くの研究がなされたにもかかわらず、いまだ不明であった。具体的には、細胞レベルでは遺伝子上流解析にてある程度確からしい部位が見つかっていたが、生体内の心臓負荷の状態では活性化されず、生体内で真にANP/BNPの産生を増加させている転写制御部位は不明であった。我々は本事業開始前に、心不全においてANP/BNP上昇にかかわるDNA領域が直列に並んだANP/BNP遺伝子領域の20kBpも上流の部位に存在し、ANP/BNP両方の転写活性に寄与することを世界に先駆けて明らかにした。本事業においては、生体内での高感度エンハンサー領域同定法の確立と、同定されたエンハンサー領域の狭小化を行った。そして、複数の実験系によりこの部位が生体内ので心不全状態でのANP/BNP発現に重要であることを明らかにした。さらに、28年度において質量分析装置を駆使した生化学的解析によりこのエンハサー領域に結合するタンパク質の同定に成功した。エンハンサーに結合し機能する分子の同定は本事業の最も重要なステップであり28年度に到達できたこととなる。今後はこれらのタンパク質の活性化につながる心臓独自のシグナル伝達経路の同定を行う。そのために必要な複数のANP/BNP産生増加系の確立を進める。最終年度にはシグナル分子の同定に至ると期待される。ナトリウム利尿ペプチドであるANP, BNPは、心不全時に血中に分泌されその病態改善に働くため治療薬としても利用されている。さらにその血中濃度は心不全の重症度マーカーとしても広く臨床利用されている。そのためANP, BNPの発現のメカニズム解明は心不全の病態を知るうえで極めて重要である。我々は、長年不明であった心不全時のANP, BNP誘導に必要かつ十分に機能しているエンハンサー配列が、ANP, BNP遺伝子の20kbも上流に存在することを見出した。そこで、本事業においてその活性化メカニズムを解析した。狭小化したエンハンサー領域をプローブとした結合タンパク質を質量分析により網羅的に解析することにより3つの転写因子が同定された。これらの3つの転写因子を同時発現させるとエンハンサー活性が強力に誘導され、ANP, BNPの発現が上昇した。また、心筋細胞に張力をかけるモデル、気圧を上げるモデル、カテコラミン刺激を与えるモデルなどANP, BNP発現誘導を誘導するそれぞれの実験系において3つの転写因子のうちどの一つが欠けても誘導が阻害されることが示された。さらにカテコラミン刺激においては、ミオシン阻害剤により心筋収縮性を止めるとシグナルが伝搬しないことが確認され、生体内に置いてもこれらの転写因子の活性を制御するのはメカニカルなシグナルが重要であることが示唆された。
急速な農耕地拡大で絶滅が危惧されるベトナム・ラオスの天敵・中立昆虫相の解明

ベトナムおよびラオスの高標高地において、農生態系およびその周辺環境の昆虫相を網羅的に調査し、その生物多様性を評価した。農薬を使用していない地域では農薬を使用している地域と比べて豊かな生物多様性が見られ、害虫・益虫・ただの虫を問わず未記録や未記載の分類群が多数確認された。とくに、周辺環境に二次林や原生林が存在すると、地域全体の種多様性が上がることも見いだされた。このような地域は計り知れない昆虫資源を有していることが推測されるが、当地の昆虫相のインベントリーはようやく始まったばかりである。1)ベトナム北部,サバ(6月)サバを拠点として,チュンチャイ,タフィン,バンホーなどの主要な農村の農地を視察し,昆虫の調査を行った.圃場としては水稲が主たる作物で,その他トウモロコシなどを急斜面に栽培していた.殺虫剤の使用はほとんどないとのことだったが,周辺の二次林が極めて限られるため,生物相は比較的単調である.また,ベトナム最高峰のファンシーパンのふもとでも調査を行った.この調査では,全体を通じて約1万点の試料が得られ,現在標本作製と同定作業を行っている.カメムシ目コバンムシ科,チョウ目ヤガ科,コウチュウ目コガネムシ科,クワガタムシ科,クロツヤムシ科,ハチ目ヒメバチ科で分布や生態に関する新たな知見が得られたので,学術雑誌や学会で報告した.2)ベトナム南部,ダラットチューヤンシン国立公園(2月)南部の高原野菜の生産地として有名なダラットから,チューヤンシン国立公園にかけて幹線道路沿いの集落で調査を行った.ダラットでは,アブラナ科,ネギ類,ウリ類を多く栽培しており,農薬の散布回数も非常に多いため昆虫相は極めて貧弱であったが,主要部を離れるとコーヒーのプランテーションが中心で,現在も火を入れて開墾を行っている.乾季であり,調査適期とはいえなかったが,小型甲虫類をはじめ2,000個体ほどの試料を得ることができた.そのうち,ゾウムシ類の多くは未記載種であると考えられる.また,ロンアン省の水田で寄生蜂類の調査を実施した.当地では極めて多量の殺虫剤を散布しているが,まれに防除が行き届いていない水田があり,そのような場所ではメイガ類やイネウンカ類が多発していた.イネウンカ類の寄生蜂の水田カマバチが100個体ほど得られた他,東南アジアでは数個体しか確認されていないカマバチ寄生性のトビコバチ類が数百個体得られた.これらの集団遺伝構造はイネウンカ類の移動性を反映するとされるが,ベトナム南部の状況は明らかでないため,現在解析中である.(1)ラオス水田:ラオス北部の高標高地域は6月前後が苗代の育成期及び移植期にあたる.バンムアン村,バンドクマイ村で農家に聞き込みを行い,農薬使用の有無,主要な害虫の情報を得た.一部裕福な農家以外では殺虫剤を使用しておらず,セジロウンカの被害が顕著であった.水田周辺で水生昆虫や寄生蜂類を中心に試料を得た.ラオス水田の寄生蜂は過去にほぼ調べられておらず,貴重な試料になったといえる.また,サラサヤンマの仲間などトンボ目の未記載種も得られており,保全の観点からも当地の生物相調査の意義が高いと考えられる.森林:村落周辺の生活林,および材木の出荷で利用されている伐採林において,食植性昆虫,土壌性昆虫,それらの寄生蜂類を得た.マレーゼトラップや衝突版,ライト採集なども活用し,網羅的な試料収集を行った.(2)ベトナム水田:ベトナム北部の水稲の収穫期(9月)などに調査を行った.ハノイ及びサパ近郊で水田の昆虫を網羅的に採集した.昨年度の調査でベトナム南部で得られたイネウンカの高次寄生者はほぼ未記載種であった.その対応関係を明らかにするため寄主を飼育し,成虫および高次寄生者を得た.イネウンカ類,メイチュウ類の寄生蜂が多数得られた.森林:ファンシパン山の山麓(標高1800m)でクワガタムシ科を中心とした食材性甲虫およびそれらの寄生蜂の調査を行った.調査地は20世紀に入るまで原生林的環境であったと考えられ,樹齢数百年はありそうな巨大なツバキの仲間の倒木が散見されるが,現存する株はもうみられない.そのような大木を好むクワガタムシ類のうち,インドシナ初記録となる分類群が本調査で見出された.クワガタムシ類の生物地理を考察するうえで極めて貴重な発見といえる.

これまでの2年間で調査を行っていない地域と季節に焦点を絞り,野外調査を実施した.すなわち,ベトナム北部の北西部山地帯・東部低地帯(5月下旬から6月中旬・7月上旬から中旬),およびベトナム南部の山地帯(12月中旬から下旬)において網羅的な昆虫相調査を行った.農耕地およびそれを取り巻く自然環境が本研究の一貫した調査地および調査環境であり,本年度もそのような環境での調査を重視した.主な研究対象の昆虫類は,植食性昆虫,食材性昆虫,水生昆虫,寄生性昆虫であり,本年度はとくに寄生蜂類,訪果性昆虫,土壌性昆虫の調査を,捕虫網による採集とともにライトトラップ,衝突板トラップ,果実トラップなどの各種トラップ類も併用して,精力的に行った.各昆虫群とも充分な試料が得られ,得られた個体数は数千にも及んだ.これらの中にはベトナムもしくはインドシナで未発見であった種ばかりでなく,100種以上の未記載種(新種)も含まれていた.現地調査における標本収集と並行して,世界各地の研究機関に収蔵されている標本調査も併せて行った.これらの標本調査により,ベトナムやラオスで採集されたものの学名未決定であった種の正体が,数多くの昆虫群で明らかとなった.さらに,これまでの調査で確認された種や採集された標本について,これらの情報をデータベース化した.データベースの内容には,種名(学名),分類学的位置,標本の採集データ(個体数,採集地,採集年月日,採集者),発表された論文などが含められており,このデータベースはインターネット上で近々公開予定である.また,海外学術調査の成果公表や調査実施国への成果還元のために名古屋議定書に関する情報収集に務め,これに関するワークショップや勉強会を開催した.26年度が最終年度であるため、記入しない。農学26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度の調査の実施目標をおおむね達成し,圃場や周辺環境から豊富な研究試料を得ることができた.しかしながら,2月は調査地の乾季にあたるため,特に山間部の網羅的な調査には不向きであった.過去にこのような時期の多様性調査があまり行われていなかったことと,寄生蜂調査は計画を変更してメコンデルタ周辺の水田で行うなど的確な判断ができたため,結果的に調査成果は予想以上に得られた.対象分類群ごとの調査適地や好適な環境が明らかになったため,昨年より効率的な調査が実施できたと考えられる.特に,ラオスではトンボ目やチョウ目,小型の甲虫目,アリガタバチ科をはじめとしたハチ目で合計すると数百種の未記載種・未記録種を得ることができた.だが,数万点におよぶ試料の仕分けや標本作製を中心に進めてきたため,成果物を活用した論文発表は逐次行っているものの,件数が十分伸びていない.最終年度は,現地での調査だけでなく,これまでに整理できた試料の活用も重要な課題となる.26年度が最終年度であるため、記入しない。ベトナムにおける調査地は,昨年調査を実施した地点で概ね問題ないと思われるが,殺虫剤の施用も含めた農地の管理方法と昆虫相との関わりを把握するために,低地の圃場の生物相も理解しておいた方がよい.今後は山間部の調査地へ移動する際に,平地の農耕地にも立ち寄って調査する.最終年度の今年度は,これまでに行っていない時期と地域に焦点を絞って現地調査を行う.すなわち,北ベトナムにおいて初夏に集中的な調査を行うとともに,晩夏から初秋にかけての南ベトナムに赴くことで,地理的・季節的に調査範囲を広げて新知見の蓄積を試みる.また,食材性甲虫とその寄生蜂の探索や果樹に関わる昆虫に目を向け,対象とする分類群の幅も広げる.これまでに蓄積された試料と今年度得られる成果物を合わせて論文の作成・発表を行いつつ,種および標本の情報を電子化し,一般公開へ向けたデータベースの構築を行う.そのうえで,本課題の全期間をとおして得られた結果から総合的に考察を行い,ベトナム・ラオスの農耕地における天敵・中立昆虫の多様性を評価する.26年度が最終年度であるため、記入しない。
細菌のトキシン-アンチトキシン遺伝子群のバイオフィルム形成における役割

バイオフィルム(生物膜)とは、微生物が細胞外多糖などと共に、界面や固体物表面に高密度に存在している構造体を示す。本申請では、バイオフィルムの形成と抗生物質に抵抗性を示すために重要な役割を果たしている、細菌のトキシン-アンチトキシン(TA)遺伝子群について、分子生物学の手法を用いて研究した。その結果、トキシン遺伝子の機能が相当部分で重複していて、バイオフィルム形成に複雑に寄与していることが示唆された。さらにトキシン遺伝子の活性化によって、バイオフィルム形成に関与する遺伝子が発現変動していることも判明した。大腸菌K12を用いて、トキシンーアンチトキシン遺伝子群とバイオフィルムの関連性について研究した。バイオフィルムは、発酵工業の分野などでは人類に対して有益なあることもあるが、食品や医療の分野で負の面も多く持ち合わせる。従って、バイオフィルム形成を自由に調節する方法や、完全に除去する方法を開発する必要があるが、その形成過程や微生物細胞以外の包含物質に不明な点も多く、方法を確立するための障壁となっている。それでも近年、細菌のTA遺伝子がバイオフィルム形成に重要な役割を果たしている可能性が示唆されており、注目されている。本年度はまず、大腸菌K12のII型トキシン遺伝子を過剰発現するベクター19個を作成した。作成の元となったベクターは、ドキシサイクリンにて発現誘導が可能なベクターpHN1271である。作成したベクターを大腸菌K12に導入し、過剰発現させたところ、目論見通り多くの遺伝子で生育阻害がみられた。当初予定では、アンチトキシン遺伝子に対する、アンチセンスRNAサイレンシングによって同様の表現型を生成する予定であったが、残念ながら抑制効率の問題だろうが、予想通りの表現型を生成できず、代替として上記のような過剰発現によることとなった。次いで、上記の過剰発現がバイオフィルムに対してどのような影響をおよぼすかどうかについて検討した。バイオフィルム形成の実験条件については、様々な培養容器(つまりバイオフィルムを形成させる表面)を用意し、最もバイオフィルム形成能が優れているプラスチック製のマイクロタイタープレートを探しだした。予想通り、いくつかの遺伝子でバイオフィルム形成に正の影響が現れた。バイオフィルム(生物膜)は、微生物が細胞外多糖や核酸などと共に、界面や固体物表面に高密度に存在している構造体である。バイオフィルムは、食品の腐敗、医療器具(カテーテルなど)の汚染、人体組織表面(歯など)における疾病の原因となることが知られている。また、バイオフィルム内の微生物は抗生物質や免疫機能、加熱に対して抵抗性を示し、その除去が困難である。そこで、有効な除去法の開発にむけた、バイオフィルムに関する基礎的な研究が必要である。そこで、近年バイオフィルムの形成に重要な役割を果たしていることが分かってきた、細菌のトキシン-アンチトキシン(TA)遺伝子について、大腸菌を用いて研究する。昨年度は、大腸菌K12系統の代表株であるMG1655を用い、そのゲノム上に存在するII型TA遺伝子のT遺伝子を過剰発現するベクターを19個すべて作成した。ベクターを用いて過剰発現を実施したこところ、予想通り幾つかの遺伝子でバイオフィルムの形成が促進された。本年度は、それらベクターでT遺伝子を過剰発現し、細胞を半致死状態に置いた時に、どのような大腸菌宿主遺伝子がどのような発現調節を受けるかを解析した。具体的には、T遺伝子を過剰発現した細胞としなかった細胞を用意し、双方からmRNAを精製して、次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析(RNA-seq)に供した。その結果、多数の遺伝子がT遺伝子によって発現調節を受けていることが判明した。中でも、ストレス応答因子、セルエンベロープに関する遺伝子が多数調節されていた。また、複数のT遺伝子で共通して発現調節される遺伝子が多数存在していたことから、T遺伝子の機能が相当部分で重複している可能性が示唆された。当初予定では、トランスクリプトーム解析にはマイクロアレイを用いる予定であったが、次世代シーケンサー(Miseq)を使う環境が容易に整ったため、そちらに変更した。次世代シーケンサーでの解析のほうが、マルチプレックス解析が可能で、多検体の処理と比較検討が容易なため、より多くのデータを取得することができたと考えられる。この実験の結果、多数の遺伝子がT遺伝子によって発現調節を受けていることが判明した。それらの遺伝子の中には、想定通りの遺伝子と想定外の遺伝子が混在しており、現在詳細を解析中である。以上の解析は、当初の予定通りで、このことから概ね順調に実験が実施できていると言える。ただし、T遺伝子を過剰発現し、細胞を半致死状態に置いた時に現れる多様な表現型を解析する予定であったが、これは思うような表現型が現れず、現在も研究を続行している。来年度はトランスクリプトーム解析と、現れる表現型の結果を照らしあわせて、新しい知見の発見に繋げたい。バイオフィルムとは、微生物が細胞外多糖や細胞外DNAなどと共に、界面や固体物表面に高密度に存在している構造体を示す。バイオフィルムは汚水処理などバイオテクノロジーの分野では人類に対して有益な面もあるが、医療器具(カテーテルなど)や人体組織表面(歯など)における病原菌の住処になり、重篤な感染症を引き起こすことがある。本研究では、単一細菌由来のバイオフィルム形成系として野生型大腸菌株MG1655を使い、バイオフィルム形成に関連があると考えられているtoxin-antitoxin遺伝子(以降TA遺伝子)の役割を解析することで、それぞれの遺伝子がバイオフィルム形成にどのように関与しているのか解析した。本研究では、大腸菌が持つtypeIIのTA遺伝子19個の中からバイオフィルムの増加に繋がる遺伝子を絞り、またそれらのT遺伝子がどのような遺伝子と連動しているかを一部明らかにすることができた。

Miseqによる遺伝子解析の結果によって、通常の大腸菌と比較して、T遺伝子を過剰発現させた大腸菌ではバイオフィルムの形成量が増加あるいは変化しないに関わらず、膜タンパク質や膜輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現量が増加している事が分かった。加えて、T遺伝子の過剰発現によってバイオフィルムの形成量が変化しない大腸菌においては、酸化還元酵素をコードする遺伝子の発現量も増えていることが分かった。これは、バイオフィルム内外で大腸菌同士が細胞間シグナルを伝達する為に、膜タンパク質や酸化還元酵素が活発に発現しているのではないかと考えられる。バイオフィルム(生物膜)とは、微生物が細胞外多糖などと共に、界面や固体物表面に高密度に存在している構造体を示す。本申請では、バイオフィルムの形成と抗生物質に抵抗性を示すために重要な役割を果たしている、細菌のトキシン-アンチトキシン(TA)遺伝子群について、分子生物学の手法を用いて研究した。その結果、トキシン遺伝子の機能が相当部分で重複していて、バイオフィルム形成に複雑に寄与していることが示唆された。さらにトキシン遺伝子の活性化によって、バイオフィルム形成に関与する遺伝子が発現変動していることも判明した。アンチセンス法によるサイレンシングが、予定通り機能しない問題が判明したが、代替措置として過剰発現による実験に変更したところ、予定していた解析がこなせることが判明した。それ以外では、予定通りの数のベクターの構築、ベクターのバリデーション、バイオフィルムに与える影響を解析することが出来た。上述のように、表現型の解析に現在苦心している。様々な角度からの解析を継続していく。具体的には、静菌的抗生物質に対する耐性細胞(persister cells)の出現頻度確認、寒天培地による鞭毛・Twitching運動性確認、イムノブロッティングや電子顕微鏡による鞭毛タンパク質の調査、コンゴレッド含有寒天培地を用いたcurliの確認、ヘキサンによる細胞表面の疎水性調査、生化学的な細胞外多糖の定量などである。それによって、本年度実施したトランスクリプトーム解析と、現れる表現型の結果を照らしあわせて、新しい知見の発見に繋げたい。また、大腸菌だけでなく、多種の微生物からなるバイオフィルムに関しても同様にトランスクリプトーム解析を実施する予定である。微生物学当初計画では、DNAマイクロアレイによってトランスクリプトーム解析を行う予定であったが、それよりも多彩な情報が得られると期待される次世代シークエンサーによるRNA-seqが使用可能になったので、RNA-seqによる解析を第一に行う。これによってトキシン遺伝子の過剰発現がどのようにバイオフィルム形成に影響を与えているか、分子生物学的考察が得られると期待される。また、バイオフィルム形成に影響のあるトキシン遺伝子について、全て、ペアになるアンチトキシン遺伝子と共に欠損させた変異体を構築する。
マイクロインジェクションによるRIの細胞内局所注入および細胞内局在制御技術の開発

本研究では、マイクロインジェクションによるRIの細胞内局在制御技術確立のため、蛍光標識抗体を合成し、細胞内注入方法や細胞内局在制御に関する検討を実施した。一部の細胞に注入による傷害が認められたが、ヒトがん細胞の核及び細胞質に対して蛍光標識抗体を注入した結果、蛍光は拡散することなく核及び細胞質に局在した。また、RI標識抗体として、64Cu標識抗体を高い標識率で合成することができた。これらの結果より、マイクロインジェクションによりRI標識抗体を細胞内で局在化できる可能性が見出された。申請者はマイクロインジェクションによるRI標識抗体の細胞内注入および細胞内局在制御技術確立のため、平成25年度は蛍光色素を用いた細胞質、核に対する注入方法の検討および蛍光標識抗体による細胞内局在制御に関する検討を実施した。リン酸緩衝液に溶解した蛍光色素fluoresceinisothiocyanate (FITC, 10 mg/ml, Mw:389.38)をヒト食道癌細胞株KYSE30の核および細胞質へ注入し5分後に観察した結果、核内注入を行った場合には核における強い蛍光が認められ、細胞質注入を行った場合には細胞全体に広がった蛍光が認められた。これらの結果より、核および細胞質への選択的注入が可能であり、蛍光による確認が可能であることが示された。さらに、注入成功率を算出したところ、核内注入で75.1±7.6% (n=6)、細胞質注入で85.5±6.6% (n=6)であった。抗体による細胞内局在制御に関する検討では、抗アクチン抗体(細胞質局在用)および抗ヒストン抗体(核内局在用)に対して、蛍光色素(Oyster-488, Mw:1050)を標識し、蛍光標識抗体を調製した後、各々(4 mg/ml)を細胞内注入し、細胞内蛍光分布を観察した。注入30分後に細胞を撮像したところ、抗ヒストン抗体では核内に、抗アクチン抗体では細胞質に蛍光の局在が認められた。一方、FITCを細胞内注入した場合には、注入30分後では蛍光の細胞内拡散および消失が認められた。抗体の場合には蛍光が拡散することなく、注入部位に局在したことから、抗体を用いることによって抗体標識物の細胞内局在を制御できる可能性が示唆された。申請者はマイクロインジェクションによるRI標識抗体の細胞内注入及び細胞内局在制御技術確立のため、平成26年度はマイクロインジェクションによる細胞侵襲性、細胞内注入量を検討し、更に64Cuを使用したRI標識抗体の合成を行った。細胞侵襲性は、リン酸緩衝液に溶解したfluoresceinisothiocyanate (FITC、100 μg/ml)をKYSE30細胞に注入後、細胞形態を継時的に観察し、全注入細胞数に対する正常細胞数の割合を算出した。その結果、注入から9時間経過後における正常細胞数の割合は89.9%(n=59)となり、約10%の細胞侵襲性が認められた。細胞内注入量は、これまでに申請者が使用するマイクロインジェクションシステム(エッペンドルフ社製)又はこれに類似したシステムを用いた注入液量測定の前例がないため、本研究では新たに化学発光によるAdenosine triphosphate (ATP)の高感度測定法を応用した測定法を考案し、測定を試みた。具体的には、ATP(100 mM)を10μlの超純水中に注入し、10μl中のATP濃度をluciferin-luciferase法によって測定後、ATP濃度の希釈率から注入液量を算出した。その結果、注入量は24.1±14.1 pl/回であった。この体積は1細胞体積に比べ非常に高い。FITCの注入時、針先からFITCの漏出が観察される場合があったことから、ATPの漏出が高値の原因であると考えられる。今後、蛍光色素とATPとを混合し、針先からの漏出が無いことを確認した後に注入を行うことで、正確な注入量の測定を行う予定である。64Cuを使用したRI標識抗体の合成は、二官能性キレート薬であるDOTAを結合させた抗体を調製した後、64Cuを標識した。その結果、標識率54.7%で64Cu標識抗体を合成することができた。申請者はマイクロインジェクションによるRIの細胞内注入及び細胞内局在制御技術確立のため、蛍光色素を用いた細胞質、核に対する注入方法の検討、蛍光標識抗体の合成及び細胞内局在制御に関する検討及びRI標識抗体の合成を実施した。蛍光色素の一つであるFluorescein isothiocyanate(FITC)をヒト食道がん細胞の核及び細胞質へ注入した結果、核及び細胞質における蛍光が認められ、マイクロインジェクションによる核及び細胞質への選択的注入が可能であることが示された。FITC注入の成功率は、65.2±20.3%(N=23)であり、さらに細胞侵襲性を検討したところ、約10%で細胞形態に異常が認められた。次に、蛍光標識抗体を合成し、細胞内局在制御について検討したところ、蛍光色素同様に核及び細胞質への選択的注入が可能であり、さらに蛍光標識抗体では、蛍光が拡散することなく、注入部位に局在した。また、64Cuを用いてRI標識抗体を合成したところ、標識率54.7%で合成することができた。以上の結果より、RI標識抗体を細胞内で局在化できる可能性が見出された。しかしながら、蛍光標識抗体の場合、マイクロインジェクション時にガラスキャピラリー先端が詰まり、蛍光標識抗体が放出されない事例が多数発生した。

この問題の解決なしには研究を先に進められないため、平成27年度はガラスキャピラリー先端における詰まりを解消するための方法を探索した。視認不可能な微小固形物の影響を考慮し、0.22μmフィルタろ過後、15,000g、30分間の遠心分離を行った上清を使用したが、改善は認められなかったため、微小固形物による影響の可能性は低いと考えられる。抗体溶液の濃縮に伴う粘度上昇の影響を考慮し、今後ガラスキャピラリー内に親水性処理を施し、改善を試みる予定である。本研究では、マイクロインジェクションによるRIの細胞内局在制御技術確立のため、蛍光標識抗体を合成し、細胞内注入方法や細胞内局在制御に関する検討を実施した。一部の細胞に注入による傷害が認められたが、ヒトがん細胞の核及び細胞質に対して蛍光標識抗体を注入した結果、蛍光は拡散することなく核及び細胞質に局在した。また、RI標識抗体として、64Cu標識抗体を高い標識率で合成することができた。これらの結果より、マイクロインジェクションによりRI標識抗体を細胞内で局在化できる可能性が見出された。研究の達成度が遅れてしまっている理由として、調製した蛍光標識抗体がガラスキャピラリー先端に詰まってしまう事例が多数発生し、蛍光標識抗体の細胞内注入を思うように実施できず、蛍光標識抗体の細胞内分布の経時的変化や注入する蛍光標識抗体の濃度に依存した蛍光輝度値の変化等について検討できていないことが挙げられる。蛍光標識抗体は標識反応後リン酸緩衝液を使用して余分な蛍光色素を洗浄・除去し、溶液中に存在する微粒子を除くため、孔径0.22μmのフィルタを用いたろ過精製を行い、更に15,000g、20 minの遠心分離を行ったものの上清を注入用サンプルとした。そのため、ガラスキャピラリー先端が詰まる原因として、注入用サンプルの冷蔵保管中に蛍光標識抗体もしくは分解により生じた蛍光色素等が凝集体を形成し、ガラスキャピラリー先端に詰まった可能性が考えられる。孔径0.22μmフィルタろ過による精製は注入用サンプルの損失につながるため、細胞内注入実施前の遠心分離によって凝集体を沈殿させることで改善を図る予定である。医歯薬学本研究課題の今後の推進方針として、先ず研究遂行の妨げとなっている蛍光標識抗体のガラスキャピラリー先端における詰まりの解消に取り組む。その後、蛍光標識抗体の細胞内注入後の経時的な細胞内分布の変化や細胞内に注入する蛍光標識抗体の濃度に依存した蛍光輝度値の変化、細胞内注入液量について検討し、RI標識抗体を細胞内注入した際のRI注入量やRIの細胞内分布の変化を予測するための基礎データを得る。蛍光標識抗体による基礎データの収集が終わり次第、RI標識抗体の合成及び細胞内注入に移行する。平成26年度に確立した方法を用いて64Cu標識抗体を合成した後、細胞内注入を行い、細胞内の放射能をガンマカウンタで測定する。これにより細胞内へのRI注入を確認し、注入RI量の実際値を求め予測値と比較する。以上の検討が終了した後、RI標識抗体を細胞内局在させた場合の放射線バイスタンダー効果の有無について検討する。マイクロインジェクションは注入成功率や注入量のバラツキ、細胞侵襲性等の面で実験者の技術に依存する点があるため、マイクロインジェクション技術の向上にも引き続き取り組む。
サブサハラ・アフリカにおける民主化、民族的情実及び国際開発援助

昨年度2月に、国際ジャーナル(Education Economics)に投稿した論文の主なコメントは、自民族を偏重した政策はどういうメカニズムで働いているのかに関する質問であった。そのため、本研究員はセンサスデータなどを使い、それらの地域では自民族以外の民族も恩恵を受けていること、そしてそれらの地域住民が公共部門に雇用される確率も高くなっていることから、学校建設などの教育の供給側の政策とともに、公共部門雇用の優遇策など教育の期待収益率を上げる需要側の要因も作用している可能性も示した。そして、本研究員は新しい分析結果を五月にスベンで開催していた国際会議「Development in the Face of Global Inequalities」にて研究成果を口頭発表した。再投稿した論文にも会議で頂いた助言を反映した。再投稿した結果、2017年10月に採択になった。本研究員は次に、ケニアにおける紛争や市民を対象とした暴力に焦点を当て、干ばつと格差の観点からこれらの衝突が発生するメカニズムを分析した。実証結果から、旱魃が生じる際に、湿潤地帯では実際に土地無し農民の多い地域で武力衝突の発生件数が多くなっていることがわかった。一方、乾燥地帯の武力衝突は、旱魃が生じることで水資源へのアクセスの不平等な地域ほど発生件数が増加することがわかり、そして隣接地域で旱魃が生じた時にも発生件数が増加する可能性があることも示した。本研究員はその分析結果を使い、今年度8月に特殊研究報告を開催した。助言を頂いた後に、英語校正をいただき、海外ジャーナル(Journal of Peace Research)に投稿した。投稿した結果は拒否となり、査読者が指摘した点を踏まえ、現在論文の修正を行っている。平成30年度4月までに、論文の修正を完成させ、他のジャーナルの再投稿する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究員は平成28年度はまず、ケニヤに注目し、家計調査データを使い、教育水準における民族間格差を分析した。分析結果より、民族的情実によって、大統領と同じ民族の人は、ほかの民族の人に比べ、より高い教育年数、より高い確率で初等教育を修了したことが明らかになった。加えて、初期状態のほうが民族的情実より教育水準への効果が大きいことを示した。上記の分析結果を用いて、平成28年度6月に立命館大学・びわこ草津キャンパスにて開催された国際開発学会で口頭発表を行った。コメントを得た上で、論文の修正を行い、平成28年度7月、ワークショップIを開催した。また、同年度12月に、オーストラリア・アフリカ学会で口頭発表を行い、助言を頂いた上で、ジャーナル投稿を行った。平成29年2月に、国際ジャーナル(Education Economics)に投稿した結果、修正および再提出となり、査読者が指摘した点を踏まえ、現在改訂に取り込んでいる。平成29年5月までに完成することを目指している。本研究員は、次に、ケニヤにおける道路建設に焦点を当て、民主化により、道路建設に関する資源配分はどう変化したのか、それに、その背景にどうのう動機があるのかを検証した。分析した結果、大統領と同じ民族の人が過半数以上住んでいるDistrictは、より多くの道路建設支出を受けていた。しかし、民主化により、民族的情実の度合が変化しておらず、資源配分のターゲットが変化したことを示した。本研究員は、その分析結果を使って、平成28年度11月広島大学・東広島キャンパスで開催していた国際開発学会・全国大会で口頭発表を行った。助言を頂いた後に、次年度1月にワークショップIIを開催し、現在論文の修正を行っている。平成29年度4月までに、論文修正を完成させ、英語校正をして頂き、海外ジャーナルに投稿する予定である。本研究員は計画どうりに、2016年5月までに、ケニヤに関する家計調査データを収集した。2016年6月からデータ整理およびデータ分析を同時進行し、分析結果をまとめた。その分析結果を用いて、2016年6月に国際開発学会で発表し、同年度7月には最初の論文に関する研究報告(Workshop I)を実施した。また、同年度12月に、オーストラリア・アフリカ学会で口頭発表を行い、その後、ジャーナル投稿を行った。国際ジャーナル(Education Economics)に投稿した結果、修正および再提出となり、査読者の改訂意見を踏まえた改訂作業を進めている。また、夏にケニアへの現地調査を実施し、論文の実証結果と現地での観察の整合性を確認するとともに、新たな研究のためのデータ・資料収集を行った。その成果をもとに、2016年11月に国際開発学会にて学会発表を行い、次年度1月には新たな論文に関する研究報告(Workshop II)を実施して、投稿に向けた改訂作業を進めている状況である。以上を踏まえ、本研究員は計画どうりに、研究結果を出しつつあり、その結果を積極的に、国内および海外学会へ発信することから、研究の進捗状況を順調であると判断する。

そして、本研究員は新しい分析結果を五月にスベンで開催していた国際会議「Development in the Face of Global Inequalities」にて研究成果を口頭発表した。再投稿した論文にも会議で頂いた助言を反映した。再投稿した結果、2017年10月に採択になった。本研究員は次に、ケニアにおける紛争や市民を対象とした暴力に焦点を当て、干ばつと格差の観点からこれらの衝突が発生するメカニズムを分析した。実証結果から、旱魃が生じる際に、湿潤地帯では実際に土地無し農民の多い地域で武力衝突の発生件数が多くなっていることがわかった。一方、乾燥地帯の武力衝突は、旱魃が生じることで水資源へのアクセスの不平等な地域ほど発生件数が増加することがわかり、そして隣接地域で旱魃が生じた時にも発生件数が増加する可能性があることも示した。本研究員はその分析結果を使い、今年度8月に特殊研究報告を開催した。助言を頂いた後に、英語校正をいただき、海外ジャーナル(Journal of Peace Research)に投稿した。投稿した結果は拒否となり、査読者が指摘した点を踏まえ、現在論文の修正を行っている。平成30年度4月までに、論文の修正を完成させ、他のジャーナルの再投稿する予定である。本研究員は現在、国際ジャーナル(Education Economics)に投稿した論文の改訂をすでに完成させ、英語校正していただき、再提出する段階である。2017年4月から、Workshop IIで報告した論本の改定作業を進めていると同時に、2017年7月に予定している特殊研究報告のためのデータ整理を行っている。2017年5月から6月まで、データ分析を完成させ、関西・開発ミクロ経済研究会や国際開発学会で報告する予定である。また、5月にスベンで開催される国際カンファランスで口頭発表を行うことも予定している。その後、2017年8月までに、3つ目のテーマを完成させ、9月・10月には3つのテーマを取りまとめ作業を行う。博士論文のまとめ作業を行いながら、国内及び海外学会で口頭発表を行い、助言をいただく予定である。助言をいただいた上で、Workshop IIと特殊研究報告で報告した論文を改訂し、海外ジャーナルに投稿することを目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ポラリトニック近接場顕微鏡の開発

近接場顕微鏡においては、波長以下のナノサイズの光源をいかにして発生させるかが鍵となる。さらに、そのナノ領域からの信号光は極めて微弱であり、光源は非常に高強度で明るい必要がある。本研究では、貴金属のプラズモンポラリトンを活用することで可視域でのナノサイズの増強光源を発生させ、紫外・深紫外においては、新規な材料としてアルミニウムやシリコンの誘電率分散を活用すること、近赤外・赤外ではフォノンポラリトン共鳴を活用することなどを提案し、紫外可視赤外でのナノサイズ増強光源実現し装置開発および分光応用を行った。本年度は、ユニバーサルSPMコントローラを導入し、全く新規にチューニングフォークを用いたAFMを構築した。AFM像の取得が可能な段階に来ているが、今後さらなるノイズ対策を必要とする。一方、分光システムとして、まず紫外域に関して、既設のピコ秒グリーンレーザーの2倍波(266nm)及びDUVアルゴンイオンレーザーを活用し、DUVラマン分光顕微鏡を構築した。種々のアミノ酸、DNA、細胞などについてデータ取得・評価を行った。近赤外域に関しては、超短広帯域パルスレーザーを用いることで、非線形分光法(広帯域CARS)の実験を行い、オシレータのみで広帯域CARSを実現した。また、同レーザー光の振幅・偏光・位相をコントロールする光学系の設計・最適化を行った。これらの近赤外レーザー分光システムも今後、上記のSPMへの導入を行う。また、可視域に関しては、既存の近接場顕微級を用いることで、局所的に近接場領域で生じる温度上昇の効果がラマン分光などの近接場計測に及ぼす影響の評価を行った。具体的には、近接場金属プローブに光照射を行うと、有限要素法による計算から、照射強度に依存して、1000K程度までプローブ先端の温度が上昇することがわかり、実験的にも先端温度の評価を行いよい一致をみた。今後、この局所的な温度の効果を用いた、空間分解能の向上や近接場での電場増強効果への影響などを検討する。これらの検討は、既存の可視近接場顕微鏡を用いたものであるが、今後紫外域・近赤外一赤外などの波長域にも生かされるものである。一方、この熱源を用いた一つのアプリーケーションとして、ナノ加工を提案し、カーボンナノチューブを局所的に切断できることを示した。本成果は論文としてアクセプトされるに至っている。本年度は、これまでに開発してきたチューニングフォーク方式のAFMに広帯域レーザーパルスを導入することで、広帯域コヒーレントアンチストークスラマン散乱(BBCARS)のシステムを構築した。広帯域レーザーパルスとしては、10fsのオシレータおよびフォトニック結晶ファイバ(PCF)による白色光の2者について同時開発した。DNAや液晶分子を評価サンプルとして用いることで、指紋領域の顕微BBCARSスペクトルを取得することに成功した。本成果は論文掲載された。さらにSPMと融合することで近接場BBCARSおよび非線形分光を開発中である。近接場非線形分光においては金属製近接場プローブ自身からの非線形発光が背景光となりSNRを制限することが考えられる。そこでBBCARSに時間分解検出を適応することでプローブパルスに遅延を与えることで、背景光とCARS信号の時間領域での分離を試みた。逆にこのような広帯域な非線形発光はナノサイズの新たな光源ともとらえることができるため、その発光を効率よく発生させるプローブの開発を目指し、種々のプローブについて非線形発光の比較を行った。DUVラマンにおいても同様にSPMへの融合に取り組んでいる。また、昨年度示した近接場プローブ先端での局所的な温度制御を近接場ラマン測定に適用し、局所的な温度に依存してラマンスペクトルにシフトが現れることを確認した。さらに、金属プローブによる近接場分光全般において、金属プローブの光照射によるプラズモンポラリトンの高効率化は必須である。よって高効率プラズモン励起を行うために、励起レーザーの偏光制御を行った。偏光制御を行ったビームの集光スポットでの電場の偏光に関する知見を得るために、単一分子の蛍光イメージングを行った。本成果も論文掲載された。昨年度は近接場プローブ自身からの非線形発光を背景光ととらえ、分離除去する手法に注力したのに対し、今年度はこの非線形発光を積極的に検出感度の増幅に使う技術の探索を行った。これは、検出したい信号光に対し、プローブの非線形発光が極めて強い場合において、それら2者がコヒーレントに干渉することを利用し、即ち微弱な信号を増幅するというアイデアに基づく。そこで、高効率でこのプローブからの非線形発光を生じさせるように装置開発を行った。

具体的には、ビームの偏光を位相偏光素子により広帯域光にも対応したラジアル偏光ビームを作成し、かつ種々の光学素子を通した後に高NA対物レンズで集光下スポットにおいて、フーリエ限界パルスとなるよう、液晶空間光変調器で広帯域光の位相を補正した。これにより、集光スポットにおいてほぼフーリエ限界パルスである、10fsのパルス幅を実現した。さらに、集光スポットにプローブを配置することで、高効率で非線形発光が発生することを確認した。その非線形発光の干渉オートコリレーションを測定することで、この非線形発光も10fs程度であることがわかった。つまり、ナノサイズかつ10fsという極限的時空間領域にフォトンを制御できた。また、オートコリレーションには別の干渉成分が微弱ながら重複して検出されており、こちらはプローブのプラズモン応答に関する情報を含んでいるものと考えられ、プラズモン寿命と電場増強度等に関する知見が得られるものと期待される。また、可視近赤外領域における、従来より開発してきたプラズモン増強にもとづく先端増強ラマン分光法においては、極めて大きな進展があった。つまり、近接場プローブの再現性の低さから、本手法の幅広い分析技術としてのポテンシャルがつぶされていたが、極めて簡便かつほぼ100%の再現性で先端増強効果を得られるプローブ開発技術を構築し、20nmの空間分解能でイメージングが行えることを示した。