hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熱可塑性樹脂と熱伝導部材を用いた術中変形可能な新しい人工弁輪の開発

僧帽弁形成術の際に弁輪縫縮や形成後の長期安定性を期待して人工弁輪縫着が行われているが、現在までに40種類以上の人工弁輪が市販され最適な人工弁輪は未だ結論がでていない。人工弁輪縫着後に僧帽弁接合長の不足や僧帽弁前尖の前方運動により、僧帽弁逆流が制御されず人工弁輪変更や追加手技を必要とする場合がある。人工弁輪の変更で逆流を制御できる場合があるが、人工心肺時間の延長、僧帽弁組織への侵襲、コストの問題がある。これまでに縫着後に自在に変形できる人工弁輪は報告がない。今回我々は熱可塑性素材を用いた新規人工弁輪の開発と臨床応用の可能性について検討した。新規人工弁輪は熱可塑性素材であるポリカプロラクトン(融点60°C)を弁輪の骨格とし、ニクロム線に直流電流を通電し加熱変形し手術中に自在に何度でも変形できる。本研究では変形により僧帽弁接合様式の変化、加熱変形時の各弁輪部分温度と周囲組織への加熱の影響、人工弁輪の物性試験、変形後人工弁輪の心サイクルでの耐久性の有限要素法による解析を行った。ブタ心臓を用いた検討にて人工弁輪を変形することにより僧帽弁接合様式と弁尖から中隔までの距離を変化させることが確認された。人工弁輪加熱の際に被覆材により人工弁輪の外装の温度は40°C以下であり、病理組織にて僧帽弁輪への熱侵襲は確認されなかった。物性試験では、人工弁輪として十分な耐久性をもち、種々の形態に変形したあとも耐久性が保たれることを有限要素法を用いたシュミレーションにて明らかにした。ex vivoでの検討は終了しており、今後の生体ブタでの実験の準備が整っているため。長期耐久性と生体内での機能を生体ブタを用いて検討する。具体的には全身麻酔下で人工心肺心停止のもと上記熱可塑性リングを僧帽弁に縫着し、前後の心機能評価および3週間後の組織変化を評価する予定。申請者は現在まで多数の僧帽弁形成術を行ってきたが、手術の標準化のため人工腱索長を確実に、簡単に行う器具を開発し、最近ではチューブを用いた人工腱索再建術式を報告してきた。しかし時に難しい弁形成術が必要なことがある。これは弁組織が小さかったり、逆に大きすぎたりすることによることが多い。また弁は左右非対照のことも多い。水テストの時インクテストで弁の接合が深く修正されていることを確認するが、弁によっては一部浅い接合にとどまり遠隔期に不安を残す。たとえ熟練者によってでなくとも、弁形成術が再現性をもって容易に行われるためには、弁輪縫着後でも弁輪形態を自由に変化させができることが望ましいと考え、本研究課題を着想するに至った。当該年度では越可塑性僧帽弁用人工弁輪を完成させ、ブタ摘出心を用いた各種僧帽弁疾患を模した状態に対する効果を確認することが目的であった。まず正常なブタ心を用いた熱可塑性人工弁輪の変形にともなう僧帽弁接合様式の検討を行い、人工弁輪の変形様式の違いにより弁接合弁が増加したり減少したりすることが確認できた。これらは、インクテストにより詳細な接合面の深さの測定を行うことで証明された。部分的な弁逸脱モデルはにおいても、人工弁輪の変形による逆流のコントロールのコントロールも可能であることがわかった。熱可塑性僧帽弁用人工弁輪の強度測定を施行したり、人工弁にかかるストレスをコンピュータシュミレーションから算出することで、生体に使用した場合の耐久性にも問題がないことが確認できた。当該年度の実績は次年度の生体内への植え込み実験に通じる点で重要であった。可塑性僧帽弁用人工弁輪を完成させ、ブタ摘出心を用いた各種僧帽弁疾患を模した状態に対する効果を確認することが目標であったため、おおむね達成している。

物性試験では、人工弁輪として十分な耐久性をもち、種々の形態に変形したあとも耐久性が保たれることを有限要素法を用いたシュミレーションにて明らかにした。ex vivoでの検討は終了しており、今後の生体ブタでの実験の準備が整っているため。1)モック回路を用いた試作品の耐久性の検討:ブタ摘出心を用いて僧帽弁の手術を行い、左心房と左室に人工心臓を用いたモック回路の一部を接続。弁の動きをエコーで可視化して評価する。また人工心臓の一回拍出をmaxまで上げて弁機能と耐久性を確認する。(2)ブタ心臓手術における有効性評価:完成したデザインを元に作成した人工弁輪を、ミニブタに植え込み、6ヶ月後犠牲死させ人工弁輪の形体変化、構造変化を確認する。長期耐久性と生体内での機能を生体ブタを用いて検討する。具体的には全身麻酔下で人工心肺心停止のもと上記熱可塑性リングを僧帽弁に縫着し、前後の心機能評価および3週間後の組織変化を評価する予定。旅費と消耗品が想定よりも安価におさまったため次年度使用額が発生した。次年度使用額は翌年度分として請求した助成金と合わせて、ブタの心臓手術に際してより手術の精度を向上させるための体外循環回路の購入に充てる予定とする。ブタ摘出心を用いた僧帽弁の手術の際に使用するモック回路の一部を、従来の回路で代用できたため、次年度使用額が生じた。翌年度計画している、実際の生体ブタの心臓手術の際に使用する人工心肺回路の費用に充てることができる。
マイクロディスク光共振器の極限微小化とその光機能集積回路への応用

発光・受光素子をモノリシックに集積可能な半導体基板上に低損失で高いQ値を有する微小な光ディスク共振器を形成して、低しきい値レーザ、波長分波、分岐、スイッチングなどの機能を有する光集積回路を実現するために基礎を確立することを目的として研究を進め、以下の成果を得た。1)マイクロディスク共振器の微小化限界の解明二つの平坦な全反射鏡と凹面鏡からなるマイクロディスク共振器の共振器損失の解析を行い、凹面鏡の曲率半径を最適化することで、低い共振器損失を保ちながら数ミクロン程度まで微小化できることを示した。2)光導波路との結合方式の提案マイクロ光ディスク共振器と入出力光導波路とを近接させることによる結合方式について検討し、サブミクロンの微細加工技術により数%程度の結合が可能であることを示した。3)マイクロディスク共振器レーザの試作電子ビーム直接描画による共振器パターン形成と反応性イオンビームエッチングによる反射鏡形成によって、素子サイズ50ミクロン及び100ミクロンのマイクロディスク共振器を製作した。活性領域にGaInAs/GaAs歪み量子井戸構造を導入して、電流注入によりレーザ発振を実現した。4)ドライエッチング側面の評価と低損失化の検討しきい値電流密度の実測値から、ドライエッチングによって形成された全反射鏡の反射率を評価し、74%程度であることを明らかにした。また、3次元粗さ測長器を用いて、実際に加工側面の粗さが10ナノメートル程度であることを実測し、その低減化により反射率の向上が可能であることを示した。
地域の社会文化的行動様式からみた医療施設計画研究

初年度には途上国型「癒しの環境」研究として、バングラデッシュ農村部での伝統助産婦による分娩と都市部産科病院での病院分娩を比較した。また、スリランカではその殆どが施設分娩であることから、病院の大小や病院へのアクセス、療養環境が施設選択に与える影響を調べた。第2年度は先進国医療施設型のフィンランドを事例として、先進国でも分娩の環境には家庭回帰が見られることを、病院のしつらえを限りなく家庭に近づける事例を用いることにより実証した。最終年度の今年はオランダにおいて、助産婦の活動を追跡することを中心に、家庭分娩が望まれる理由、その環境、社会的背景を調査・分析した。全分娩の1/3が家庭分娩であり、その背景に助産婦の社会的地位が高いこと、オランダの地理的条件が、緊急時に患者を早急に病院へ搬送することができることなどがある。それだけではなく、サービスを受ける側の意識に分娩は病気ではないので病院は必要なしとの判断が働いていることも確認された。今年度は同時に、周辺のヨーロッパ諸国の状況を示し、何故似たような地理的・文化的背景を持ちながらオランダが特異な例であるかを証明した。3年間に途上国および先進国の自宅型・施設型分娩の比較を行った。出産の場の選択にあたっての行動様式は、地域の社会や文化に依拠しながら、お産は「家庭的な」雰囲気のなかで行われることを最良とする文化の多いことがわかった。同時に社会の発展段階により、「安全」に対する要求が高まり、その「安全」の確保が充分な段階になると再び「家庭的な」環境を求めることとなる。今後の日本を始めとする先進国型医療施設の技術進歩に伴い、医療技術の優先度はある程度弱まり、より患者の療養環境を重視する声が高まることと思われる。分娩環境のこのような文化・社会・経済状況の違いの中での相違は、産科の療養環境を越えて広く一般医療の患者環境に示唆を与えるものである。分娩・出産を例に取り、文化的に似通っていながらも、経済・教育・健康指標の異なるスリランカとバングラデッシュをとり上げ、保険医療施設への期待度と施設の選択行動に違いを見出した。スリランカでは、県の保険局を対象に地域での分娩状況ヒアリングを行い、保険局、公的病院、私立病院での分娩の現場を妊婦・スタッフ双方から調査した。バングラデッシュでは、農業を主な産業とした村における、トラディショナルバースアテンダント(伝統的助産婦)および、彼女らによって出産を終えた母親を対象に、分娩場所に対する意識調査を行った。スリランカでの施設選択行動は予想以上に先進国よりあったのに対し、バングラデッシュは古典的な自宅での分娩を主体とする、途上国型であった。この二カ国を事例としてとり上げたことにより、経済・教育水準・健康指標が与える影響がより明確になった。スリランカでは95%の妊産婦が施設内分娩を行っているのに対し、バングラデッシュでは調査対象地域の7割が在宅分娩を行っていた。ヒアリング調査によると、スリランカでは女性の家庭内での地位上昇、教育の普及、プライマリヘルスケアの推進が同時期に起こり、施設分娩を促進していった。スリランカでは在宅分娩を非衛生的なものと捉えている一方、バングラデッシュではより日常的な環境での出産という、肯定的な捉え方も見られた。昨年度まで行ったバングラデッシュ・スリランカでの途上国型「癒しの環境」研究は、バングラデッシュから研究協力員を招くことによって継続中である。平行して、今年度は先進国型の「癒しの環境」を探究した。療養環境をより純粋な形で文化・行動・居住環境の側面から観察するには、医療技術の影響は極力排除したい。よって、病ではない出産を例に採り上げる。本年度は調査対象に先進国・施設型のフィンランドを具体例とし選び、来年度行う先進国・在宅型のオランダでの事例と対比させる。本年度はフィンランドでのフィールド調査を中心に行った。国土にまばらに分布する人口をカバーするために、地方都市では地域中核総合病院以外に医療を受ける選択肢はない。そのような現状下、大半の住民は出産場所を選ぶことはないものの、病院の中でより「家庭的な」環境をつくるように努力している。これは先進諸国でひとつの流れとなってきている、日々の生活の中で産む傾向にも即している。一方で、都市部の高機能病院志向も見られる。フィンランドの調査から、周辺諸国から影響を受けやすい小国にとっては療養環境の選択行為も流行に押し流される場合があり、それは病室のしつらえから細かい分娩方法にまで、多岐にわたる。同時に今年度すすめた文献調査では、おなじような小国でもオランダは歴史的に在宅分娩が盛んであり、周辺諸国への影響は大きなものである。来年度にはこのオランダでの実例をもとに、途上国在宅分娩型から先進国在宅分娩型までの、社会変遷の中での癒しの環境モデルを構築する。

全分娩の1/3が家庭分娩であり、その背景に助産婦の社会的地位が高いこと、オランダの地理的条件が、緊急時に患者を早急に病院へ搬送することができることなどがある。それだけではなく、サービスを受ける側の意識に分娩は病気ではないので病院は必要なしとの判断が働いていることも確認された。今年度は同時に、周辺のヨーロッパ諸国の状況を示し、何故似たような地理的・文化的背景を持ちながらオランダが特異な例であるかを証明した。3年間に途上国および先進国の自宅型・施設型分娩の比較を行った。出産の場の選択にあたっての行動様式は、地域の社会や文化に依拠しながら、お産は「家庭的な」雰囲気のなかで行われることを最良とする文化の多いことがわかった。同時に社会の発展段階により、「安全」に対する要求が高まり、その「安全」の確保が充分な段階になると再び「家庭的な」環境を求めることとなる。今後の日本を始めとする先進国型医療施設の技術進歩に伴い、医療技術の優先度はある程度弱まり、より患者の療養環境を重視する声が高まることと思われる。分娩環境のこのような文化・社会・経済状況の違いの中での相違は、産科の療養環境を越えて広く一般医療の患者環境に示唆を与えるものである。
小学校存続活動を契機とした持続的居住支援システムの有効性と課題

本研究は,小学校の存続が地域の居住環境の持続につながるという観点から、小学校存続のために他地域からの移住者や児童数を増やす取り組みを行っている6地域を調査し、地域住民・学校・行政の関係性、存続活動の効果、地域コミュニティへの影響等を考察してきた。その結果、1)学校と地域住民が連携して移住世帯の生活支援にあたっていること、2)学校存続のための活動を通して地域力が向上していること、3)活動の成果として他地域からの児童数が増えており学校の存続には一定の役割を果たしていることが明らかになった。学校存続のために住民組織が自主的に活動している事例を研究対象としているが,中山間地域において学校統廃合が進み,学校がなくなる地域が多く発生してきている状況がある。年6回の研究会を開催し,あらためて学校存続と地域力の関係性について整理を行い,学校存続活動の意義を明らかにすることに加え,廃校になった場合の地域への影響についても検討を加えることとした。その上で,以下の調査および作業を実施した。1)住民組織が地域の空き家を活用し転入者を増やしながら学校の存続に取り組んでいる事例のヒヤリング調査:徳島県美波町伊座利地区の「伊座利の未来を考える推進協議会」,愛媛県伊予市双海町の「まちづくり学校双海人」を訪問し,住民組織の設立経緯や取り組み内容,住宅提供の実態,学校教育への影響,地域の生活環境などについて聞き取りを行った。2)住民組織が学校存続のために居住支援活動を行っている事例の抽出:これまで分析を行ってきた広島県内の3事例のほかの事例を随時把握し,その特徴について整理し,データベース化している。3)廃校になった地域の人口動態調査:広島県三次市をモデルとして,国勢調査をもとに人口推移と学校の統廃合の関係を分析している。4)伊座利地区調査で,山村留学から転入に至るケースが明らかになったため,研究対象として山村留学に取り組む住民組織を含め,検討を行うこととした。5)転入者受け入れの関連事例の視察調査:中山間地域への都市部からの転入が多く見られる徳島県神山町を対象に,空き家をオフィスとして活用した事例や東京から移転してきた企業について視察および聞き取りを行った。2年目に計画していたヒヤリング調査を1年目に実施できたことに加え,研究会での検討を踏まえ,当初計画になかった統計的調査や関連事例調査を実施することができた。一方で,1年目に計画していた自治体調査が行うことができなかったため,2年目に実施する予定である。背景として,学校存続のために住民組織が自主的に活動している事例を研究対象としているが,中山間地域において学校統廃合が進み,学校がなくなる地域が多く発生してきている状況がある。1年目の調査結果を踏まえ,2年目は他地域からの移住促進につながる取り組みとして,家族方式による山村留学に着目して調査研究を行った。また,廃校になった場合の地域への影響についても検討するために,小学校存続と人口動態の関係についての分析も行った。これらを推進するために,今年度は7回の研究会を開催した。具体的には,以下の調査および作業を実施した。1)家族方式の山村留学に取り組んでいる事例の抽出:インターネット等を用い,山村留学家族方式に取り組んでいる事例を把握した。2)山村留学家族方式に取り組んでいる事例のヒヤリング調査:山梨県早川町,および高知県馬路村魚梁瀬地区を訪問し,教育委員会や小中学校,地域住民,保護者を対象に,取り組み経緯や内容,住宅提供の実態,学校教育への影響,地域の生活環境などについて聞き取りを行った。3)全国の山村留学制度の実態把握のためのヒヤリング調査:NPO法人全国山村留学協会を訪問し,山村留学の発足の経緯や運営体制,各自治体との関係等について聞き取りを行った。4)廃校になった地域の人口動態調査:広島県三次市をモデルとして,国勢調査をもとに人口推移と学校の統廃合の関係について分析を行った。当初,住民組織の活動を評価するために,比較対象として自治体の施策を把握することを予定していたが,定住促進に関わる施策は多くの自治体で多様に実施されている現状がある。焦点を絞るために,自治体による定住促進につながる活動として山村留学を新たに位置づけて,自治体調査を実施した。その補足のために,山村留学協会への調査も追加した。自治体調査の中では,取り組みに関わっている住民組織の調査もあわせて実施することができた。居住環境の持続性が課題となる人口減少地域では子どもの減少が顕著であり、小学校の統廃合問題が必然的に発生する。しかし,統廃合により教育の機会が失われた地域に,子育て世代が移り住む可能性は低く,地域に学校が無くなることで高齢化が加速度的に進むことが予想される。本研究は,小学校存続のために他地域からの移住者や児童数を増やす取り組みを行っている地域を調査し、地域住民・学校・行政の関係性、存続活動の効果、地域コミュニティへの影響等を考察してきた。調査を実施した地域は以下の通りである。1住民組織が地域の空き家等を活用し転入者を増やしながら学校存続に取り組んでいる事例:徳島県美波町伊座利地区、愛媛県伊予市双海地区、2家族方式の山村留学に取り組んでいる事例:山梨県早川町、高知県馬路村魚梁瀬地区、鹿児島県屋久島町、三重県いなべ市立田地区。またあわせて、マクロ的アプローチとして学校が廃校となった地域の人口動態分析を試みた。

それらの結果、1)他地域からの移住者を受け入れるためには、学校と地域住民が連携して移住世帯の生活支援にあたっていること、2)移住者の存在も含め、学校存続のための活動を通して地域力が向上していること、3)家族方式山村留学は試行的に移住体験ができるプログラムであり、移住へのきっかけとなる、あるいは関係人口増加につながる可能性があること、4)活動の成果として他地域からの児童数が増えており学校の存続には一定の役割を果たしていること、さらには学校教育の活性化につながっていること、等が明らかになった。また、移住者の居住支援システムとしては、学校存続に関わる活動の体制や取り組み内容はそれぞれ地域状況により異なっており、住民組織、学校、個々の地域住民、行政等の各主体と移住者との様々な関係性により、移住生活がサポートされていることが明らかになった。本研究は,小学校の存続が地域の居住環境の持続につながるという観点から、小学校存続のために他地域からの移住者や児童数を増やす取り組みを行っている6地域を調査し、地域住民・学校・行政の関係性、存続活動の効果、地域コミュニティへの影響等を考察してきた。その結果、1)学校と地域住民が連携して移住世帯の生活支援にあたっていること、2)学校存続のための活動を通して地域力が向上していること、3)活動の成果として他地域からの児童数が増えており学校の存続には一定の役割を果たしていることが明らかになった。本年度も,引き続き定期的に研究会を開催し,以下の調査を実施する。1)新たな類似事例の抽出およびヒヤリング調査2)1年目に実施した調査(徳島県美波町,愛媛県伊予市双海町)の追加調査3)廃校と人口の関係を見る統計調査4)住民組織の活動と比較するため,自治体を対象とした定住促進施策に関する調査本年度も,引き続き定期的に研究会を開催し,1,2年目に実施した調査結果を整理した上で不足データの追加調査,および廃校と人口の関係をみる統計データの分析を行う。その上で,得られたデータをもとに,学校存続と他地域からの転入システムの関係を考察し,人口減少地域における地域生活持続のための居住支援のあり方について検討を行う。建築計画1年目に予定していた中国・四国・九州地方の自治体を対象とした質問紙調査およびヒヤリング調査を実施しなかったため,旅費および資料整理のための謝金が計画時より下回った。調査対象事例を山村留学を実施している地域に絞ったため,調査件数が予定より少なくなり,旅費が計画時より下回った。自治体対象の調査を2年目に実施する計画であるため,1年間に計上していた予算を2年目に使用する計画である。人口動態の統計的分析を行うにあたり,資料整理作業者への謝金に使用する計画である。また,成果を広く公表していくために,本研究で取り上げた事例に関する印刷物を作成する計画である。
単一心筋細胞の細胞内灌流法による起電性イオン交換機転の定量的解析

心筋細胞内のCa濃度の調節は、細胞の収縮やいろいろな細胞応答にとって最も基本的なものである。細胞内のCaイオン濃度は静止時に0.1μM程度であり、これは細胞外の濃度の10^4分の1である。これを維持するための細胞膜の機転として、Na/Ca交換機転が考えられる。我々はNa/Ca交換にともなって発生する膜電流を記録し、その逆転電位を測定することによって、NaイオンとCaイオンの交換比率を確定することを研究目的とした。Na/Ca交換電流は既に心筋細胞と眼桿体細胞外節で記録されている。その電流は細胞内外のNaとCaに依存し、LaやNiなどの重金属イオンによって抑制される。しかし、依然として最も基本的な逆転電位とイオン濃度の関係を調べる必要があった。実験にはモルモット心より単離した心室筋を用い、これにパッチクランプ法を適用した。細胞内にNaイオンを負荷した状態で、細胞外にCaを与える前後の電流の差をNa/Caイオン交換電流として記録しているが、一定のCaを細胞外に与え続けているにもかかわらず、測定される電流は時間と共に数十秒の過程で減衰し、一定の電流値に達する。この機序として、イオン交換機転によって運ばれたCaが細胞内に蓄積したか、あるいは細胞内のNaイオンの減少があったことが結論された。そこで、交換比率3Na:1Ca交換の平衡電位を計算によって求め、その電位を保持電位としたところ、ランプパルスで記録される電流-電圧曲線の時間的な変化はほとんど認めることがなかった。Na/Ca交換電流をNi感受性の電流成分として記録したところ、逆転電位はNa濃度変化、Ca濃度変化の実験で理論値とよく一致することが証明された。我々の測定している電流が確かにNa/Ca交換に基づくものであることと、その交換比率は3Na/1Caであることを結論した。Kimuraら(1986,1987)の報告したNa^+及びCa^<2+>感受性電流の逆転電位を測定することによって、この電流がNa-Ca交換機転に基づくとする仮説を検証し、Na^+とCa^<2+>の交換比率(stoicheiometry)を決定することができた。モルモットの単一心室筋細胞にwhole-cell膜電位固定法と細胞内潅流法を適用し、広い範囲の外液Na^+,Ca^<2+>濃度で誘発される電流を記録した。阻害剤であるNi^<2+>存在下、非存在下の電流電圧曲線の交点より逆転電位を測定した。細胞内液のCa濃度〔Ca〕iはEGTAあるいはBAPTAで調整した。細胞内液のNa^+濃度(〔Na〕i)を10mM、〔Ca〕iを153nM、外液のNa^+濃度(〔Na〕o)を140mMとし、〔Ca〕oを0.1mMから1-20mMに増加すると、+38mVの保持電位でCa濃度依存性に外向き電流が発生するが、この電流は時間依存性に減衰し、それにともなって逆転電位も変化した。この変化は細胞内のCa^<2+>の蓄積とNa^+の減少によることが示唆されたので、持続的なイオンフラックスを抑制する目的で、Na-Ca交換機転を活性化する場合に、保持電位を3Na:1Caの交換比率で与えられる平衡電位にした。逆転電位の値は、外液Ca^<2+>0.5-20mMの範囲で理論上の平衡電位とよく一致した。〔Ca〕iが153nMでは、逆転電位より負電位側で見られる内向き電流の増加が多くの実験で顕著でなかった。

内向き電流に対する細胞内Ca^<2+>の閾値が150nMあたりにあることが予想された。一定細胞内液潅流下に、〔Ca〕oを一定にした状態で〔Na〕oを増加し、Na-Ca交換による主として内向き電流を記録する実験についても同様な方法で、逆転電位の測定を行った。それらは外液Na^+30-140mMの範囲で理論上の平衡電位とよく一致した。以上の結果に基づいて、我々は外液CaやNaによって誘発された電流は確かにNa-Ca交換機転に基づく電流であり、交換比率は3Na:1Caであると結論した。心筋細胞内のCa濃度の調節は、細胞の収縮やいろいろな細胞応答にとって最も基本的なものである。細胞内のCaイオン濃度は静止時に0.1μM程度であり、これは細胞外の濃度の10^4分の1である。これを維持するための細胞膜の機転として、Na/Ca交換機転が考えられている。我々はNa/Ca交換にともなって発生する膜電流を記録し、その逆転電位を測定することによって、NaイオンとCaイオンの交換比率を確定することを研究目的とした。Na/Ca交換電流は既に心筋細胞と眼桿体細胞外節で記録されている。その電流は細胞内外のNaとCaに依存し、LaやNiなどの重金属イオンによって抑制される。しかし、依然として最も基本的な逆転電位とイオン濃度の関係を調べる必要があった。実験にはモルモット心より単離した心室筋を用い、これにパッチクランプ法を適用した。細胞内にNaイオンを負荷した状態で、細胞外にCaを与える前後の電流の差をNa/Caイオン交換電流として記録しているが、一定のCaを細胞外に与え続けているにもかかわらず、測定される電流は時間と共に数十秒の過程で減衰し、一定の電流値に達する。この機序として、イオン交換機転によって運ばれたCaが細胞内に蓄積したか、あるいは細胞内のNaイオンの減少があったことが結論された。そこで、交換比率3Na:1Ca交換の平衡電位を計算によって求め、その電位を保持電位としたところ、ランプパルスで記録される電流ー電圧曲線の時間的な変化はほとんど認めることがなかった。Na/Ca交換電流をNi感受性の電流成分として記録したところ、逆転電位はNa濃度変化、Ca濃度変化の実験で理論値とよく一致することが証明された。我々の測定している電流が確かにNa/Ca交換に基づくものであることと、その交換比率は3Na/1Caであることを結論した。
相互作用タンパク質の同定に基づくフィトクロム情報伝達機構の解析

光合成を行う植物にとって光環境の正確な認識と適切な生理応答は、生存と種の繁栄に重要である。フィトクロムは植物の主要な光センサーであり、光受容による構造変換が信号伝達の中心的な役割をもつ。フィトクロムが物理的な光シグナルを細胞内でシグナルを発信する機構については未知な部分が多い。ここでは、フィトクロムとの相互作用タンパク質を単離同定することで、フィトクロム信号伝達の解明を目指した。フィトクロムのタンパク質相互作用を研究する上で、光受容能をもつフィトクロム分子を対象として取り扱うことが必須である。そこで、ヘムオキシゲナーゼとフィトクロモビリン合成酵素をフィトクロムアポタンパク質とともに共発現させることによって、短時間に大量の光受容能をもつフィトクロムを精製することに成功、論文により発表した。フィトクロムと相互作用する因子の単離のアプローチとして、1)エピトープを付与したフィトクロムを発現する植物個体を利用して植物体内での複合体を分離解析する方法、2)酵母two-hybridによる方法、3)精製フィトクロムを利用した生化学的方法を試みた。1)については、形質転換系統において導入遺伝子が機能的であることを検証した。2)については、有力な相互作用因子として新規なジンクフィンガーモチーフをもつ転写因子様タンパク質を単離した。この候補について、3)の方法により光質特異的相互作用を検出できた。また、この遺伝子を破壊したシロイヌナズナは花成遅延が観察されることから、光生理応答への密接な関与が予想された。上記の成果に加えて、我々が最初に材料としたシロイヌナズナ以外に、トウモロコシ、エンドウ、トマトについてもフィトクロム発色団生合成に関わる酵素の遺伝子と変異体同定を行い公表した。特にトマト由来の遺伝子は他の植物由来のものと比べて、大腸菌における可溶性タンパク質としての発現効率において優れていた。本研究では、光受容能を持つシロイヌナズナのフィトクロムを大量かつ容易に得るために、本年度、大腸菌を宿主として、発色団合成酵素とフィトクロムの共発現系を構築した。発色団生合成酵素は、藍藻およびシロイヌナズナ由来のヘムオキシゲナーゼとビリン還元酵素を利用した。フィトクロムはシロイヌナズナのphyAおよびphyBタンパク質の色団領域含むN末端側発を用いた。発現させたフィトクロムタンパク質を分離精製し分光分析を行ったところ、フィトクロムに特徴的な赤色光/遠赤色光可逆性を示した。また、大腸菌培養液250mLから、フィトクロムが最大で1mg得られた。これにより、大腸菌発現系を用いて光受容能を持つフィトクロムを大量に発現精製する系が構築できた。PΦB-PHYB(N651)およびPCB-PHYB(N651)の暗反転速度をin vitroで測定した。これにより、PΦB-PHYB(N651)よりもPCB-PHYB(N651)の方が暗反転速度は遅いこと、つまりPfr型が安定に保持されることがわかった。また、胚軸伸長を指標としたシロイヌナズナの発色団改変植物体を用いた生理応答から、phyBの暗反転速度の違いによると思われる胚軸伸長抑制が観察された。これにより、発色団としてPΦBを持つ植物は、暗所でPfr型を素早く消失させることにより、暗期と明期を区別していることが示唆された。また今回、PΦBを発色団に持つシロイヌナズナのフィトクロムの暗反転をin vitroにおいて測定したのは、我々が初めてである。

構築した光受容能を持つフィトクロム発現系およびブロッコリー粗抽出液を用いて、プルダウン法により、フィトクロムとの光質特異的相互作用因子の単離同定を試みている。本研究では、植物の赤色・遠赤色光の受容体フィトクロムにおける細胞内シグナルの発信機構を相互作用するタンパク質因子の同定し分子的な実体として解明することを目的とした。本年度は、昨年度単離したフィトクロム相互作用因子の発現解析と突然変異体と遺伝子発現が過剰になった形質転換体を利用し、その生理機能の評価を進めた。相互作用因子の遺伝子の時期および組織レベルにおける発現特異性をRT-PCR法とGUSレポーター遺伝子を用いて調べた。フィトクロムは基本的には全ての組織で存在するが、この遺伝子は、維管束や根に強く発現していた。両者の発現が一致する組織では相互作用が期待される。次に、相互作用因子に対する遺伝子のT-DNA挿入変異体を取得した。単離した因子に対する遺伝子は、シロイヌナズナでは2コピー存在したため、掛け合わせによって両遺伝子をともに各二重変異体を作成した。表現型の解析を行ったところ、二重変異体は光周期による花成促進に異常を示した。このことは、我々の単離した相互作用因子が光受容体と機能的にも関連することを示唆する。また、GFP融合タンパク質を作成し、相互作用のおこる細胞内での部位を調べた。暗所では核に、遠赤色光では核内でスペックルを形成し、赤色光ではタンパク質の特定の細胞内局在が失われるという結果を得た。これまでに、フィトクロム分子に関しては、生理応答の検討などにより、発色団結合領域、信号伝達領域、あるいは信号伝達の調節に必要な領域など分子解剖が試みられている。我々の単離した相互作用因子がフィロクロムのどの領域と相互作用しうるかを酵母2ハイブリッド法により調べたところ、フィロクロムのC末端に強く、N末端側に弱く相互作用した。現在、フィトクロム相互作用因子と、フィトクロムあるいは花成関連遺伝子との3重変異体を作成して、その相互作用と表現型の生物学的な評価を加えている。
数理モデルに基いた流れ場の種類によらない新しい層流-乱流遷移CFDモデルの構築

本研究では、流れ場の種類によらないチューニングフリーな層流-乱流遷移を予測する数値流体計算モデルのを構築を目指している。本年度は、代表的な既存の遷移モデルの一つであるγ遷移モデル(Menter et al. 2015)を有限体積法数値計算ソルバーに実装し、テスト計算を行うことで既存モデルの理解に努めた。また既存モデルの中で重要な役割を果たしている物理量を理解することで、提案する遷移モデルに応用可能な物理量(特徴的なレイノルズ数)の絞り込みを行った。既存の遷移モデルでは、遷移の臨界点を決定付けるのに実験や経験則に基づいた臨界指数が多く用いられている。そのため、場合によっては計算する流れ場に応じて臨界指数を調整する必要があり、未知の流れ場に対しては正しい臨界指数設定を行うことは基本的に不可能である。そこで本研究では、層流-乱流遷移現象がもっとも重要なユニバーサリティクラスの一つであるDirected Percolation (DP)クラスに属することに注目し、既存の遷移モデルに用いられている経験的な臨界指数をDPクラスの臨界指数の置き換えることで、チューニングフリーな層流-乱流遷移を予測する数値流体計算モデルのを構築を目指している。今年度はまず既存の遷移モデルの実装を行い、既存モデルの中で重要な役割を果たしている特徴的な物理量を理解することで、提案する遷移モデルでも注目するべき物理量の絞り込みを行った。具体的には、既存のモデルではいくつかの特徴的なレイノルズ数を定義し、臨界指数を主流の乱流強度や圧力勾配の関数として実験や経験則に基づいて与えている。また層流-乱流遷移現象とDPの関係について議論されている先行研究でも特徴的なレイノルズ数が定義されている。本年度は、これらの先行研究で示されている特徴的なレイノルズ数に加えて、新しいレイノルズ数の定義もいくつか考案した。当初の研究計画では、一年目にチャネル流れの詳細な数値計算を行い、DPクラスに属する臨界指数と遷移に関係する重要な物理量との関係を導き出し、その後既存の遷移モデルをベースに新しい遷移モデルの構築を行う予定であった。しかし、今年度はまず手持ちの数値計算ソルバーに既存の遷移モデルを実装し、既存モデルの中で重要な役割を果たしている物理量を理解することで今後着目すべき物理量の絞り込みを行った。実際に新しいモデルを構築する際には、既存のモデルの中で用いられている経験則に基づく臨界指数をDPクラスの臨界指数に置き換える計画である。よって今年度行ったことは当初の計画では二年目以降に行う予定であった内容のものであり、全体的な進捗具合としては妥当なものであると考えられる。いくつかの先行研究では、層流-乱流遷移現象において特徴的なレイノルズ数とDPの臨界指数との関係を実験や数値計算によって示している。しかし、これらのレイノルズ数を直接用いて汎用的な数値計算用の遷移モデルを構築することは困難であり、新しい特徴的なレイノルズ数の定義が必要となる。そこで今後はまずLardeauら(2012)が行った平板乱流境界層のLES(Large Eddy Simulation)を参考に同様のLESを行い、今年度絞り込まれた特徴的なレイノルズ数定義の候補が実際にDPの臨界指数に関係した振る舞いを示すかを検証する。Lardeauら(2012)の研究では平板上に逆圧力勾配を与えることにより剥離流れを誘発し、層流-乱流遷移を起こしている。一般に、高精度に層流-乱流遷移の数値計算を行うにはDNS(Direct Numerical Simulation)が必要であるが、Lardeauら(2012)はLESでも層流-乱流遷移を捉えることが出来る格子点数とサブグリッドスケールモデルを示している。また上述の通り、先行研究で示された特徴的なレイノルズ数を用いて汎用的な数値計算用の遷移モデルを構築することは困難ではあるが、先行研究と同じ流れ場に限定した場合には、これらの特徴的なレイノルズ数を用いた遷移モデルを構築することは可能である。よって前述のLES計算に加えて、ある流れ場に特有な遷移モデルをまず構築し、提案手法(DPの臨界指数を用いての遷移モデルの構築)が実際に実現可能であるかを検証する。

具体的には、既存のモデルではいくつかの特徴的なレイノルズ数を定義し、臨界指数を主流の乱流強度や圧力勾配の関数として実験や経験則に基づいて与えている。また層流-乱流遷移現象とDPの関係について議論されている先行研究でも特徴的なレイノルズ数が定義されている。本年度は、これらの先行研究で示されている特徴的なレイノルズ数に加えて、新しいレイノルズ数の定義もいくつか考案した。当初の研究計画では、一年目にチャネル流れの詳細な数値計算を行い、DPクラスに属する臨界指数と遷移に関係する重要な物理量との関係を導き出し、その後既存の遷移モデルをベースに新しい遷移モデルの構築を行う予定であった。しかし、今年度はまず手持ちの数値計算ソルバーに既存の遷移モデルを実装し、既存モデルの中で重要な役割を果たしている物理量を理解することで今後着目すべき物理量の絞り込みを行った。実際に新しいモデルを構築する際には、既存のモデルの中で用いられている経験則に基づく臨界指数をDPクラスの臨界指数に置き換える計画である。よって今年度行ったことは当初の計画では二年目以降に行う予定であった内容のものであり、全体的な進捗具合としては妥当なものであると考えられる。いくつかの先行研究では、層流-乱流遷移現象において特徴的なレイノルズ数とDPの臨界指数との関係を実験や数値計算によって示している。しかし、これらのレイノルズ数を直接用いて汎用的な数値計算用の遷移モデルを構築することは困難であり、新しい特徴的なレイノルズ数の定義が必要となる。そこで今後はまずLardeauら(2012)が行った平板乱流境界層のLES(Large Eddy Simulation)を参考に同様のLESを行い、今年度絞り込まれた特徴的なレイノルズ数定義の候補が実際にDPの臨界指数に関係した振る舞いを示すかを検証する。Lardeauら(2012)の研究では平板上に逆圧力勾配を与えることにより剥離流れを誘発し、層流-乱流遷移を起こしている。一般に、高精度に層流-乱流遷移の数値計算を行うにはDNS(Direct Numerical Simulation)が必要であるが、Lardeauら(2012)はLESでも層流-乱流遷移を捉えることが出来る格子点数とサブグリッドスケールモデルを示している。また上述の通り、先行研究で示された特徴的なレイノルズ数を用いて汎用的な数値計算用の遷移モデルを構築することは困難ではあるが、先行研究と同じ流れ場に限定した場合には、これらの特徴的なレイノルズ数を用いた遷移モデルを構築することは可能である。よって前述のLES計算に加えて、ある流れ場に特有な遷移モデルをまず構築し、提案手法(DPの臨界指数を用いての遷移モデルの構築)が実際に実現可能であるかを検証する。研究を進める順番を当初の計画と入れ替えたため、初年度に購入する予定であったワークステーションの購入を次年度に見送った。ワークステーションは来年度行う予定のLESの準備計算、および計算結果の可視化に使用するため、繰り越された研究費は次年度に購入するワークステーション代にあてる。
臨界角プリズムを用いた超高精度角度センサとのその自律校正システムの試作研究

超精密角度センサの1号器の性能試験と校正実験の結果をもとに、臨界角プリズムの個数を増やした2号器の設計製作を行った.1号器センサはその特性の詳細な検討の結果,センサの安定性は,線形誤差の自律校正の繰り返し性から判断して、最大値で5/100秒であった.また,平均感度は4回の繰り返しで2/10000の誤差があった.その原因の一つと考えられる電源ラインのノイズと校正系に入る外乱振動の除去に努めて自律校正システムの安定性を高めることと,センサ自身の不安定性の要因である光源の指向角の変動の除去が今年度の課題であった.まず自律校正システムの安定性を向上するために電源ラインのノイズ対策などを施した結果,線形誤差の校正結果の繰返し精度は最大偏差値で3/100秒,自乗平均では1/100以下となるなど,目標を達成することができた.つぎに,センサ光源の変動の対策として、変動補償用の受光系を追加して補正を行った結果,平均感度のばらつきが1.1/10000以内に納り,±1.5分の測定範囲を想定すると測定範囲の両端で1/100秒の誤差となり、これも目標をほぼ達成できた.実施した研究によって,次の2点の新しい知見が確認された.1)角度センサの平均感度と線形誤差に関する自律校正システムが実現され、それによって角度センサの有する分解能と安定性の限界まで校正が可能であること.2)臨界角プリズムを利用した新しい原理の角度センサが1/100秒単位の精度と分解能を持つこと.3)さらなる高精度化には,プリズム面の形状精度の向上が必要になる.超精密角度センサの1号器の性能試験と校正実験の結果をもとに、臨界角プリズムの個数を増やした2号器の設計製作を行った.1号器センサはその特性の詳細な検討の結果,センサの安定性は,線形誤差の自律校正の繰り返し性から判断して、最大値で5/100秒であった.また,平均感度は4回の繰り返しで2/10000の誤差があった.その原因の一つと考えられる電源ラインのノイズと校正系に入る外乱振動の除去に努めて自律校正システムの安定性を高めることと,センサ自身の不安定性の要因である光源の指向角の変動の除去が今年度の課題であった.まず自律校正システムの安定性を向上するために電源ラインのノイズ対策などを施した結果,線形誤差の校正結果の繰返し精度は最大偏差値で3/100秒,自乗平均では1/100以下となるなど,目標を達成することができた.つぎに,センサ光源の変動の対策として、変動補償用の受光系を追加して補正を行った結果,平均感度のばらつきが1.1/10000以内に納り,±1.5分の測定範囲を想定すると測定範囲の両端で1/100秒の誤差となり、これも目標をほぼ達成できた.実施した研究によって,次の2点の新しい知見が確認された.1)角度センサの平均感度と線形誤差に関する自律校正システムが実現され、それによって角度センサの有する分解能と安定性の限界まで校正が可能であること.2)臨界角プリズムを利用した新しい原理の角度センサが1/100秒単位の精度と分解能を持つこと.3)さらなる高精度化には,プリズム面の形状精度の向上が必要になる.今年度はまず,3回反射の臨界角プリズムを用いた超精密角度センサの1号器の光学系の設計製作を行うとともに,そのセンサの検出部の電子回路の製作を行った.また,線形誤差の校正のためのレバーシステムを設計製作し,自律校正用の計算機プログラムを製作した.ついで,試作したセンサのドリフト特性を調べ,線形誤差の自律校正を行い,2/100秒の分解能と精度を保証できるという結果を得た.設計値の1/100秒の精度に達していないのは主として,電源ラインのノイズと校正系に入る外乱振動である.現在,電源系に混入するノイズを除去して,目標の1/100秒の信頼性を達成するための対策を準備している.この他に,校正系に混入する外乱振動の除振対策を検討している.これらの対策の効果により1/100秒を超える安定性が保証できれば,センサ光源の指向角のドリフト,光学系ベースの熱変形による光学部品の姿勢変化などによるセンサ自体のドリフト性能の向上も有効になり,臨界角プリズムの個数を増やした2号器の設計製作に掛かれる.一方,絶対校正のためのシステムの設計製作も完了し,予備実験を行った.この予備実験では,約20分の測定範囲を与えて,その平均感度を2/10000の信頼性で知ることが出来た.この精度は測定範囲両端での誤差に直すと±6/100秒となり,線形誤差の精度に比べると十分ではない.この主原因は,校正に要する時間が長すぎてドリフトの影響がそれだけ強くなることにある.また,モータから生じる電磁ノイズもセンサの分解能と精度に悪影響を及ぼしていることが判明した.これらのドリフトとノイズ低減を中心とした対策を行って,もう一桁高い精度を実現すべく現在,システムの改善を計画している.今年度は,昨年度試作した超精密角度センサの1号器の性能試験と校正実験の結果をもとに,臨界角プリズムの個数を増やした2号器の設計製作を行った.1号器センサはその特性の詳細な検討の結果,センサの安定性は,線形誤差の自律校正の繰返し性から判断して,最大値で5/(100)秒であった.また,平均感度は4回の繰返しで2/(10000)の誤差があった.

その原因の一つと考えられる電源ラインのノイズと校正系に入る外乱振動の除去に努めて自律校正システムの安定性を高めることと,センサ自身の不安定性の要因である光源の指向角の変動の除去が今年度の課題であった.まず自律校正システムの安定性を向上するために電源ラインのノイズ対策などを施した結果,線形誤差の校正結果の繰返し精度は最大偏差値で3/(100)秒,自乗平均では1/(100)以下となるなど,目標を達成することができた.つぎに,センサ光源の変動の対策として,変動補償用の受光系を追加して補正を行った結果,平均感度のばらつきが(1.1)/(10000)以内に納り,±1.5分の測定範囲を想定すると測定範囲の両端で1/(100)秒の誤差となり,これも目標をほぼ達成できた.実施した研究によって,次の2点の新しい知見が確認された.1)角度センサの平均感度と線形誤差に関する自律校正システムが実現され,それによって角度センサの有する分解能と安定性の限界まで校正が可能であること.2)臨界角プリズムを利用した新しい原理の角度センサが1/(100)秒単位の精度と分解能を持つこと.
金属における新しい配向相転移のメカニズムに関する研究

本年度は、乱れた4面体の存在によるクラスター殻原子の変位の様子及び、温度低下に伴う構造変化を定量的に明らかにすることを目的として、40Kから室温までの温度範囲でZn6Sc立方晶の単結晶X線回折データを収集した。測定はシンクロトロン軌道放射光X線を用い、相転移に伴うZn6Sc立方晶の高精度の単結晶回折データ収集を行った。単結晶試料は前年度に作製したTc=157Kで明瞭な相転移を示すものを用いた。Tc以下では分域構造をとるため単結晶を用いた構造解析が非常に困難であるが、転移点頂上では立方晶を保ったまま超格子反射位置の散漫散乱はほぼ発散しBraggピークに近くなる。本研究ではmerohedral twinとして超格子構造の解析し、原子変位パラメータの形状及び、原子変位パラメータの3次元形状を決定した。そして、4面体配向の乱れによりどの方向にどの程度原子が変位し、どのように短距離秩序が伝搬するのかを原子レベルで考察した。この結果、転移点直上の160Kにおいて4面体配向が規則化しており、さらに、第1殻であるdodecahedronのZn原子に平均原子位置からの大きな変位が見られた。また、180K以上においても同様にdodecahedronの大きな原子変位が観測され、4面体の存在によりdodecahedronが強く変形していることが分かった。以上より、対称性の低い4面体が周りのdodecahedronを強く変形することで周囲の4面体に応力場を形成すること、隣り合うクラスター間の弾性エネルギーを下げるように4面体が反対向きに規則化することで短距離秩序が形成されていくことが判明した。昨年度および今年度での研究によって、合金において初めての「無拡散型規則-不規則相変態」のメカニズムを原子レベルで解明しすることができ、当初予定していた研究目的を達成したと言える。同様の正二十面体が準周期配列した準結晶において、同様の構造相転移が起こるのか次の研究課題である。本研究で得られた知見を準結晶構造の理解にフィードバックさせたい。本年度はZn_6Sc立方晶の配向相転移のメカニズムに関して放射光X線回折、散漫散乱および中性子弾性散乱を用いて研究を行った。さらに最近米国の研究グループによりZn_<88>Sc_<12>正二十面体準結晶が発見された。この準結晶はZn_6Scと同様の局所構造をもち同様の相転移を示す可能性があり、本研究課題に大きく関連する物質である。したがって本研究計画に加え、この準結晶の構造精密化および構造の乱れを評価することを目的として、単結晶X線回折測定および散漫散乱測定を行った。まず、低温・高圧領域においてどのような超格子構造をとるのかを明らかにすることを目的として、放射光単結晶X線回折を行った。この結果、25GPaの高圧領域で新しい規則相を観測した。また、常圧下、転移点直上で単結晶X線回折のデータ収集を行った。転移点直上においては格子ひずみがなく立方晶として超格子構造を解くことができ、四面体配向の秩序の詳細が明らかになることが期待される。一方、高温相においてZn4四面体配向が動的に乱れていることを明らかにするため中性子準弾性散乱測定を行った。この結果、室温で準弾性散乱が観測され、転移点に近づくにつれ減少し、転移点以下で準弾性散乱が消失することが分かった。この結果は、まず室温における四面体配向の乱れが動的なものであることを示すものである。以上より、四面体の動的な情報が得られ、温度圧力変化に伴い、さまざまな配向秩序を形成することを明らかにした。また、Zn_<88>SC_<12>正二十面体準結晶に関して、放射光散漫散乱測定を行った。この結果、準結晶に特徴的なフェイゾン揺らぎに起因する異方的な散漫散乱を観測し、フェイゾン弾性定数を見積もった。

以上より、対称性の低い4面体が周りのdodecahedronを強く変形することで周囲の4面体に応力場を形成すること、隣り合うクラスター間の弾性エネルギーを下げるように4面体が反対向きに規則化することで短距離秩序が形成されていくことが判明した。昨年度および今年度での研究によって、合金において初めての「無拡散型規則-不規則相変態」のメカニズムを原子レベルで解明しすることができ、当初予定していた研究目的を達成したと言える。同様の正二十面体が準周期配列した準結晶において、同様の構造相転移が起こるのか次の研究課題である。本研究で得られた知見を準結晶構造の理解にフィードバックさせたい。
ストレプトコッカスのバイオフィルム感染関連蛋白質ComAの基質認識機構の解明

バイオフィルムがひきおこす様々な感染症に関与しているにもかかわらず、これまで生化学研究が進んでいなかったグラム陽性菌のQuorum-Sensingのシグナル産生ペプチダーゼの基質認識機構をStreptococcus属細菌のComAではじめて明らかにした。(ComAはN末側にペプチダーゼドメイン(PEP)をもつABCトランスポーター)PEPは、基質ComCの切断部位近傍のGly-Gly配列だけでなくN末領域の広い領域(-4から-15)にある保存性の高い4つの疎水性残基を特異的に認識することが判明した。このような基質認識機構はきわめてめずらしい。昨年度は、S.pneumoniaeを含め数種のStreptoeoceus属細菌のPEPについて基質認識機構を中心とした系統的な機能解析を行った。6種類のPEPと4種類のComCを用いて合計24種類のPEP-ComCの組み合わせで酵素反応を行ったところ、いずれにおいてもComCがGly-Gly配列のC末側で特異的に切断されていた。さらにそれぞれのComCに対する活性の傾向が異なる2種類のPEPの各基質に対する酵素反応の速度論的パラメーターを求めたところ、活性が低かったものも含め、全ての組み合わせで、PEPはComCに対して高い親和性を示した。これらめ結果からStreptococcus属細菌のPEPに共通の基質認識機構の存在が示唆された。この機構を解明するために、まずStreptococcus属細菌のComCのアミノ酸配列を比較行ったところ、切断部位のN末側に保存性残基が多いことがわかった。そこでこの領域の残基を各々Alaに改変した変異型ComCをそれぞれ作製し、活性測定を行った。その結果、これまでに明らかになっている基質切断部位近傍のGly-Gly配列だけでなくPhe-15、Leu-12、Leu-7、Ile-4、4つの高度に保存された疎水性残基もPEPによる基質認識に重要であることが判明した。次にCDスペクトル測定からComCは単独ではランダムな構造であるが、PEPに結合するとそのN末領域がヘリックス構造を形成することが明らかとなった。このことからPhe-15、Leu-12、Leu-7、Ile-4の4つの疎水性残基が、両親媒性ヘリックスの疎水面を形成することが予測された。以上の結果から、PFPの基質ComCは通常はランダムな構造を取っているが、PEPに結合するとN末領域がヘリックス構造を形成することが明らかとなった。またPEPは、単にこのヘリックス上の疎水面を結合するのではなく、これら4つの保存された残基を特異的に認識していることが判明した。以上よりPEPの基質認識機構とPEPに結合したComCの取る構造が明確となり、PEPの阻害薬開発のための基盤となる情報が得られた。これまでにStreptococcus属細菌のPEPに共通する基質認識機構として、PEPがComCの切断部位近傍のGly-Gly配列のみならず、ComCのN末領域が形成する両親媒性ヘリックスの疎水面を特異的に結合することを明らかにした。その過程で複数のStreptococcus属細菌のPEPとComCの組み合わせを用いて酵素反応を行い速度論的パラメーターを求めたところ、k_<cat>/K_mが低い組み合わせでは低活性はk_<cat>が小さいことに起因しており、PEPのComCに対する親和性はむしろ高い傾向にあった。上述のようにPEPとの親和性は各ComCに共通のN末領域の結合の寄与が大きいことからComCのC末端領域がk_<cat>に影響すると考えられた。この仮定を証明するためにS. pneumoniaeのPEPおよびS. mutansのPEPいずれに対してもk_<cat>の低かったS. gordoniiのComCのC末側にk_<cat>の高かったS. pneumoniaeの配列をつなぎ換えたキメラ基質を作製し活性測定を行った。その結果S. pneumoniaeのComCと同様のk_<cat>が得られ、確かにComCのC末端領域がk_<cat>を決めていることが明らかとなった。以上の基質認識機構の詳細を調べるためにはPEPの立体構造の解明が必要不可欠である。そこで、これまでに解析を行った中で最も熱安定性の高かったS. mutansのPEPを結晶化し、MAD法により1.9Åの分解能で構造決定を行った。S. mutansのPEPは、他のパパイン様のシステインプロテアーゼと同様のフォールド構造をもち、活性中心ではCys17、His96、Asp112がcatalytic triadを形成していた。これらの結果からPEPは、他のパパイン様システインプロテアーゼと同様の反応機構でComCを切断すると考えられた。

以上によりPEPの反応メカニズムおよび基質認識機構の概要が判明し、さらには構造学的知見が得られ、阻害薬開発に必要となる情報のいくつかが得られた。