hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キメラマウスにおける気道過敏性の研究

1.研究の目的気道の過敏性は、自律神経支配以外に肺・気道を構築している気道平滑筋、気道上皮マクロファージ、マスト細胞・好酸球・リンパ球などの細胞レベルで決定されている可能性がある。そこで気道過敏性の高いA/Jマウスと低いC3Hマウスの間でキメラマウスを作製し、キメラ状態になっている肺気道の過敏性を測定し、上述の仮説を検証するこの研究は将来、肺移植に際してdonorの肺気道の過敏性が選択因子となるかどうか判断基準を与えると期待される。2.方法気道過敏性の測定は、マウス専用の気道過敏性測定装置を作製し、メサコリン吸入に対する気道の反応性をKonzett Rossler法により測定した。メサコリン吸入により起こる気道閉塞が生み出す空気のoverflowが出現するまでのメサコリン吸入量を過敏性の指標とした。気道過敏性の高いA/Jマウスと低いC3H/Heマウスのメスからそれぞれ受精卵を採取し、混合培養して8細胞期目にPHAを加えて受精卵を融合させた。融合卵の偽妊娠状態のICRメスマウスの子宮内に注入し着床させた。3.結果と考察(2)A/JとC3H/Heのキメラマウスは、3回の実験を試みたが1匹しか生まれなかった。このA/J←→C3Hキメラマウスの気道過敏性は、A/JとC3Hの間の値を示した。A/JとC3Hを交配して生まれたF1は、常染色体劣性遺伝により気道の過敏性は低いことが知られているが、キメラ状態では過敏性は中間を示すことが分かった。キメラ状態となっていると予想される肺移植患者の気道過敏性を考える上で参考となる結果である。1.マウスの気道過敏性を調べるために、マウス用のレスピレーターと吸入気のoverflowを測定する装置を作製した(Konzett Rossler法)。2.純系のA/J,DBA/2,C3H/He,C57BL6マウスに10mg/mlのメサコリン溶液を吸入させ、気道の閉塞を示し吸入気のoverflowが始まるまでの吸入量を算出した(非特異的気道過敏性)。その結果、A/J,DBA/2のメサコリン吸入単位は、7.60と7.47であり、C3H/He,C57BL6の13.60,15.33に比べ有意に低値であった。すなわち、A/J,DBA/2は気道過敏性が高いマウスであることを示している。この結果は、アセチルコリンを吸入ではなく静注して調べた報告と一致しているが、我々の方法はメサコリンを吸入させた成績であり、臨床検査の方法により近いと言える。3.各マウスにマウス抗DNP-Ascaris monoclonal IgE抗体を静注して受身感作を行い、Ascaris抗原を吸入させ、Konzett Rossler法により抗原に対する特異的気道過敏性を調べた。その結果は、各マウス郡で有意な差は認められなかった。4.現在、A/JマウスとC57BL6マウスを交配したF1マウスとそれらのキメラマウスを作製中である。次年度は、F1マウスとキメラマウスの気道過敏性を調べ比較する予定である。1.平成7年度において、マウスの気道過敏性測定装置を作製し、Konzett Rossler法によりマウスの気道過敏性を測定したところ、マウス純系のうちA/JとDBA/2がメサコリンに対して気道過敏性が高く、C3H/HeとC57BL6が低いことが明かとなった。

そこで気道過敏性の高いA/Jマウスと低いC3H/Heのキメラマウスを作製し、気道と肺がキメラ状態にある時、気道過敏性はどのような影響を受けるか検討した。2.方法A/JおよびC3Hマウスのメスにヒトゴナドトロピンを注射し排卵させ、それぞれ受精させた後2日目に卵管と子宮を取り出し、洗浄して受精卵を採取した。A/JとC3Hの受精卵を混合し、8細胞期目にPHAを加え融合させた。融合卵を偽妊娠状態のICRメスマウスの子宮内に注入し着床させた。A/J、C3HおよびA/J【tautomer】C3Hキメラマウスにメサコリンを吸入させ、Konzett Rossler法により気道の過敏性を測定した。3.結果と考察キメラマウスの作製を3回試みたが、得られたのは1匹だけであった。それは毛の色がモザイク状に黒と白のまだらであることから確認できた。A/J、C3H、A/J【tautomer】C3Hキメラのメサコリン気道過敏性は、それぞれ10.9U、16.6U、11.4Uを示し、キメラマウスの過敏性は、A/JとC3Hの間にあることが分かった。A/JとC3Hを交配させた時の子(F1)は、常染色体劣性遺伝により気道は過敏性は低いと報告されているが、キメラ状態ではその中間になる可能性が示された。臓器の移植を受けた患者は、移植臓器の組織細胞がキメラ状態に存在していると予想されるが、キメラマウスは、そのモデルとなることが期待される。
急性脳障害における初期細胞応答メカニズムの解析と神経保護

脳梗塞モデルラットおよびマウスに置いてリン脂質代謝酵素群の一つであるDGKzetaが神経細胞の核から細胞質並行することを明らかにしてきたが、興奮毒性依存的細胞死において核から細胞質へ移行後DGKzetaがポリユビキチン化により速やかに分解され、この分解がRbのリン酸化の亢進を誘導し、細胞周期が期に移行することをあきらかにした。この現象はDGKzetaノックアウトにおいてさらに誘導されやすく、細胞死そのものも引き起こされやすいことが明らかとなった。DGKzetaの核細胞質間の輸送はQip1, NPI1を基軸としたインポーチン依存的な輸送経路を利用し、その複合体形成にNucleosome assembly protein NAP1-L1及び-L4と細胞質で結合することが必要である可能性を結合因子探索の結果から明らかにした。さらに独立して、Cdc42Rac1 GAPタンパクの一つであるIQGAP1 DGKzetaの新たな結合蛋白として同定しマクロファージにおいて細菌由来内毒素であるリポポリサッカライド(LPS)によってこのDGKzeta-IQGAP1複合体形成が惹起されること、DGKzeta-IQGAP1結合依存的にLPSによるRac1の活性化が誘導され、特にファゴサイトーシスを制御していることを明らかにした。申請者は外傷および脳動脈の閉塞や破綻に起因する脳卒中など急性脳障害における初期細胞内での脂質代謝酵素群シグナル伝達の解明を目的として、初年度は以下の研究を行った。脂質代謝酵素の一つであるジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ζが一過性脳虚血刺激後、スライス培養、初代神経細胞でも核外輸送される。この機構を解明するために、輸送単体である種々のimportinおよびCrm1との結合解析を生化学的に行い、DGKζの核-細胞質間輸送パートナーが少なくともQip1,NPI1により核内輸送され、Crm1依存的に核外輸送されることが明らかとなった。また結合蛋白因子を探索した結果、細胞質にてNucleosome assembly protein(NAP)1-L1及び-L4と細胞質で結合し、NAP大量発現時にはDGKζの核内輸送担体との結合が阻害されることで細胞質に留まることを明らかにした。DGKζは虚血処理後海馬ニューロンにおいて速やかに核内から消失し、その後細胞質にてタンパク質の分解が起きることを明らかにしてきたが、DGKζの発現が減少した神経細胞ではその後サイクリンDの発現上昇が確認された。このタンパク質分解はHEK293などを用いた発現系や初代ニューロンを用いた系でも認められ、グルタミン酸処理において引き起こされること、核外輸送阻害により減少することを明らかにした。申請者は脳動脈の閉塞や恒常性の破綻に起因する脳卒中など、急性脳障害における細胞内での初期脂質代謝酵素群シグナル伝達の解明を目的として、初年度より引き続き以下の研究を行った。リン脂質代謝酵素の一つであるジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ζが虚血処理後海馬ニューロンにおいて速やかに核内から消失し、その後細胞質にてタンパク質の分解が起きることを明らかにしてきたが、この現象はマウス海馬を用いた癩痛モデルにおいても同様にDGKζの核-細胞質間輸送と細胞質における分解が確認された。またDGKζノックアウトマウス由来神経細胞を用いて興奮毒性処理を行うと、野生型に比べ細胞死が誘導されやすくなることを見出した。個体においても、DGKζノックアウトマウスはカイニン酸処理における癩痛誘導が引き起こされやすいことも明らかにし、現在、国際誌に論文を投稿中である。初年度に行ったDGKζ結合タンパクを探索した結果、新たに低分子量Gタンパク質であるRacl/Cdc42のGAPタンパクの一つであるIQGAPIを同定した。様々な刺激実験を行った結果、マクロファージにおいて最近由来内毒素であるリポポリサッカライド(LPS)によってこのDGKζ-IQGAPl複合体形成が惹起されること、DGKζ-IQGAPI結合依存的にLPSによるRaclの活性化が誘導され、特にファゴサイトーシスを制御していることを明らかにし、国際誌に発表した。

申請者は脳動脈の閉塞や恒常性の破綻に起因する脳卒中など、急性脳障害における細胞内での初期脂質代謝酵素群シグナル伝達の解明を目的として、一年目および二年目より引き続き以下の研究を行った。リン脂質代謝酵素の一つであるジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ζが虚血処理後ラット海馬ニューロンおよびカイニン酸誘導性痙攣モデルのマウス海馬ニューロンにおいて速やかに核内から消失し、その後細胞質にてタンパク質の分解が起きることを明らかにした。これはHEK293細胞を用いた再構成系の実験から、DGKζがポリユビキチン化されること、核内輸送シグナルを欠失したDGKζではポリユビキチン化が顕著に起きることが示唆され、マウス海馬ニューロンにおいても内在性DGKζがポリユビキチン化されることを明らかにした。DGKζノックアウトマウス由来神経細胞を用いて興奮毒性処理を行うと、野生型に比べ細胞死が誘導されやすくなること、個体においても、DGKζノックアウトマウスはカイニン酸処理における癲癇誘導が引き起こされやすく、そのメカニズムの一端として、Rb遺伝子産物のリン酸化(Ser807/811)のリン酸化が更新し、通常細胞周期が停止している海馬ニューロンがS期に移行すること細胞周期停止機構が破綻し、細胞死開始が早まっていることを明らかにした。これらの研究成果を国際誌に投稿し、受理された。細胞を用いた機能解析やノックアウトマウスを用いた性状解析がよく進み、一定の結果を得ていること、ユビキチンリガーゼの同定には至っていないが、その時に得たその他の結合タンパク質とDGKζの結合様式やその生理的な意義などが進み、それらを国際誌に発表するに至っていることから、今のところ計画以上に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。まず、DGKζの虚血性神経細胞死に関する論文発表に専念する。また、ユビキチンリガーゼの同定を行うために、さらなる結合タンパク質の探索を、条件を変更して行う。例えば架橋剤を用いて弱く結合している因子も免疫沈降してくる、もしくは虚血脳の細胞抽出液を用いる、など。さらにいくつか虚血時に活性が上がることが知られているユビキチンリガーゼが報告されていることから、それらの遺伝子をクローニングし、各々のユビキチンリガーゼ活性がDGKζを基質となし得るか確認していく。
スピン生成と緩和の光制御と応用

本研究では、InGaAs量子井戸やGaNを代表的な材料とする非磁性の化合物半導体のキャリアスピンのダイナミクスとその制御性を調べた。InP基板上にInGaAs層6.5nmとInP層10.0nmを269周期重ねたInGaAs/InP量子井戸の時間分解吸収測定では、明瞭なスピン緩和過程が観測された。今回明らかになったInGaAs/InP量子井戸の温度依存性は、既に報告されているGaAs/AlGaAs量子井戸の温度依存性と類似しており、30K以下では温度依存性がなく、30K以上では強い温度依存性を持つことがわかった。スピン緩和機構としてはD'yakonov-Perel'効果、Elliott-Yafet効果、Bir-Aronov-Pikus効果などが考えられるが、前者の二つは温度依存性を持ち、後者は温度依存性を持たない。これから30K以下ではBAP効果、30K以上ではDP効果とEY効果が関与していることが明らかになった。量子ドットのスピン緩和に関しては、基底準位と第一励起準位が明瞭に分離される高均一量子ドットを用いて、そのスピン緩和時間の温度依存性を測定した。その結果、音響フォノン散乱がスピンの緩和に深く関与していることが明らかになった。窒化物半導体では六方晶GaNと立方晶GaNのスピン緩和時間の測定に成功した。六方晶GaNでは、スピン偏極率の緩和時間は0.47psという極めて高速であることがわかった。このスピン緩和は、温度を上げるとさらに速くなり、225Kまでスピン偏極が観測された。準安定な立方晶構造(閃亜鉛鉱型)の立方晶GaNでは、8nsという極めて遅いスピン緩和が観測された。立方晶GaNのスピン緩和時間も始めての測定報告である。このように本研究によって、スピンの生成と制御に関して極めて重要な情報が得られた。本研究では、InGaAs量子井戸やInAs量子ドットを代表的な材料とする非磁性の化合物半導体のキャリアスピンのダイナミクスとその制御性を調べる。実験的には、時間分解フォトルミネッセンス法と時間分解吸収測定法を用いてピコ秒からフェムト秒領域のスピンダイナミクスを解明する。スピン緩和過程は従来のエレクトロニクスの主要な高速限界であったRC時定数に束縛されないという利点があり、また、量子ドット中のスピンを用いた量子コンピューティングは従来の情報処理技術を大幅に越える計算能力を秘めている。今年度は、まず波長1.55mに対応するInGaAs量子井戸と青紫光の0.4mに対応するGaN系材料のスピンダイナミクスを測定するための基礎的な検討を行なった。その結果、GaN系材料の従来の計測では、重い正孔と軽い正孔の準位がエネルギー的に混じっている可能性が高いことから、実験技術的には、光パルスのスペクトル幅を狭める必要があることがわかった。また、エピ上で空間的に組成ゆらぎがあるとするとスピン偏極の生成は原理的に困難になるので、来年度は、Inを含まないGaNでスピン偏極の観測を行える測定系の構築を進めることになった。InGaAs/InP量子井戸の研究では、GaAs系材料に比べてバンドギャップの大きさが半分であることから、価電子帯と伝導帯のバンドミキシングが大きくなりElliott-Yafet効果が大きくなることがわかっている。GaAs量子井戸で支配的であったDyakonov-Perel効果の寄与も大きいと考えられる。そこで、来年度は、スピン緩和時間のキャリア濃度依存性や温度依存性の測定を行い、スピン緩和のメカニズムを解明を進めることになった。

今年度の主たる実験研究であるInAs量子ドット中の電子の緩和過程の研究においては、準位の量子化により、フォノンボトルネック現象が存在することが時間分解測定によって明らかになった。本研究では、InGaAs量子井戸やGaNを代表的な材料とする非磁性の化合物半導体のキャリアスピンのダイナミクスとその制御性を調べる。InGaAs量子井戸のキャリアスピンの緩和時間は数ピコ秒程度と極めて高速であるため、高い時間分解能(200fs)を持つ時間分解吸収測定を用いた.既に報告したように室温でのInGaAs/InP量子井戸のスピン緩和時間は5.2ピコ秒であり、GaAs量子井戸よりも短い。今回の計測では、13Kでのスピン緩和過程を測定した。InP基板上にMOCVDを用いてInGaAs層6.5nmとInP層10.0nmを269周期重ねたInGaAs/InP量子井戸の時間分解吸収測定では、明瞭にスピン緩和過程が観測された。得られたスピン緩和時間は26.2ピコ秒であった。室温よりも遅くなる点はGaAs量子井戸での観測結果と似ている。GaAs量子井戸では、20K以上ではD'yakonov-Perel'効果が支配的である可能性が高い。今後、スピン緩和時間の温度依存性を測定しスピン物性を解明する。GaN系材料については、これまでにInGaNではスピン偏極が観測されないことを報告した。窒化物半導体ではGaAsとは異なり、Aバンド(重い正孔)、Bバンド(軽い正孔)から1対1の比率で逆向きのスピンが励起される。この二つのバンドのエネルギー差は10meVと小さいため、In組成の空間ゆらぎが生じるInGaNではスピン偏極の観測は困難である。しかし、GaNではAバンドの選択的な励起によってスピン偏極の生成が期待できる。本研究では、まずGaNのフォトルミネッセンススペクトルを測定した。MOCVD法によってサファイア基板上に成長したGaN(厚さ2.2ミクロン)では、A励起子とB励起子の発光が明瞭に分離して観測された。この高品質なサンプルでスピン偏極の観測を行う予定である。本研究では、InGaAs量子井戸などの非磁性の化合物半導体のキャリアスピンのダイナミクスとその制御性を調べている。今年度は、波長1.55ミクロンに対応するInGaAs量子井戸のスピン緩和時間の温度依存性を測定し、低温域でのスピン緩和機構を明らかにするとともにワイドギャップ半導体であるGaNのスピン緩和時間の測定に成功した。GaNのスピン緩和時間の測定系の時間分解能は0.15psである。スピン偏極率の緩和時間は単一指数関数近似で0.47psという極めて高速であることがわかった。これは、GaNで初めての十分な時間分解能でのスピン緩和の観測である。GaNのスピン緩和時間は、温度を上げると短くなり、225Kまでスピン偏極が観測された。本研究では、InGaAs量子井戸やInAs量子ドット、窒化物半導体などの非磁性の化合物半導体のキャリアスピンのダイナミクスとその制御性を調べてきた。実験的には、時間分解フォトルミネッセンス法と時間分解吸収測定法を用いてピコ秒からフェムト秒領域のスピンダイナミクスの解明に取り組んだ。今年度は、ワイドギャップ半導体であるバルク
チャネルロドプシンによる網膜変性保護機構の解析

チャネルロドプシン(ChR2)遺伝子導入後のRCSラットは視覚誘発電位が回復し、神経節細胞の機能が保持されていることが確認出来た。また、免疫組織学的評価により、ChR2は、神経節細胞の二次変性抑制にも効果的であると考えられた。そこで、マイクロアレイによる解析を行った結果、イオンチャネルに関連する遺伝子群、シグナル伝達に関与する遺伝子群が有意に減少していたことより、ChR2が網膜内で光活性化イオンチャネルとして機能することによって、イオンチャネルおよびシグナル伝達に関する遺伝子の発現が減少したものと考えられた。平成23年度には、遺伝的視細胞変性ラット(RCSラット)の網膜へアデノアソシエイトウイルスベクターを用いて、ChR2遺伝子を導入した。遺伝子導入を行ったRCSラットは視覚誘発電位の回復を示した。また、免疫組織学的評価により神経節細胞の生存維持に対して重要な役割をもつp65の発現が神経節細胞層に強く見られたことから、神経節細胞保護に伴う視細胞の二次変性抑制にも効果的であり、神経節細胞保護機能と生存維持の効果を高めることが出来ると考えた。今年度は、神経細胞保護効果に対する特異的タンパク質の検出、およびメカニズムの解明を行う為、遺伝子を導入した遺伝盲ラットの網膜を採取し、マイクロアレイによる解析を行った。ChR2とVenusの融合遺伝子とVenus遺伝子を導入した網膜を比較した結果、発現遺伝子パターンは類似していたが、ChR2V遺伝子導入群のみで増加した遺伝子は437個、減少した遺伝子は755個であった。また、増減した遺伝子の特徴はVenus遺伝子を導入した網膜では、免疫に関与する遺伝子の発現増加が認められたのに対し、ChR2とVenusの融合遺伝子を導入した網膜では、これらの発現増加は認められなかった。ChR2V遺伝子導入群では、イオンチャネルに関連する遺伝子群、シグナル伝達に関与する遺伝子群の発現が有意に減少していた。これらの結果をまとめると我々がすでに報告している、「ChR2遺伝子導入によって免疫学的な副作用は見られない(Sugano E., et al, Gene Therapy)」という結果が、マイクロアレイの解析によっても得られた。また、ChR2が網膜内で光活性化イオンチャネルとして機能することによって、イオンチャネルおよびシグナル伝達に関係する遺伝子の発現が減少したものと考えられた。チャネルロドプシンー2タンパク質の発現による網膜神経節細胞の保護効果について遺伝的視細胞変性ラット(RCSラット)を用い、検討を行った。RCSラットの硝子体内にチャネルロドプシンー2遺伝子をコードしたアデノ随伴ウイルスを投与した。遺伝子導入後のRCSラットは、視覚誘発電位の回復を示し、神経節細胞の機能が保持されていることが確認できた。神経節細胞数がチャネルロドプシン投与群では、コントロール群に比べ多く残存している事より、更に凍結切片を作製し免疫組織化学的に検討した結果、神経節細胞の生存維持に対して重要な役割をもつp65の発現が神経節細胞層に強く見られた。その一方でチャネルロドプシンを導入していないラットでは、GFAPおよび、GSの反応が網膜全層に見られた。GFAPは網膜のアストロサイトやミューラー細胞のストレス状態の指標とされ、RCSラットの視細胞変性過程において発現が亢進することが報告されている。よって、神経節細胞の生存維持が網膜内層の他の神経細胞へのストレスを緩和している可能性が示唆された。また、ウエスタンブロッティングにより検討した結果でも、免疫染色の結果と同様、GFAPタンパク発現量がチャネルロドプシン2を遺伝子導入したラット群では、コントロール群に比較し少ない事が分かった。これらの結果から、チャネルロドプシンー2の発現により網膜全層に渡り保護効果に関与する因子が発現する事が示唆された。この保護因子の誘導は、神経節細胞保護に伴う視細胞の二次変性抑制にも効果的であると考えられ、神経節細胞保護機能と生存維持の効果を高めることが出来ると考える。今後は、遺伝子導入ラットの網膜を採取し、二次元電気泳動とウェスタンブロッティングによりチャネルロドプシンの発現によって増加または減少した特異的なタンパク質の検出を行い、網膜における神経細胞の変性に関するメカニズムを解明する。平成23年3月11日に発生した東日本大震災、および4月7日に発生した地震により、実験棟への立ち入りを制限された。また、制限解除後も実験機器の8割が破損、損失し、培養細胞及び飼育実験動物等の試料も死滅した。その為、実験機器修理、新しい試料の入手、遺伝子導入動物の作製等、実験環境の整備に期間を要し、本課題の今年度の研究計画を達成することが困難であった。震災の影響による損傷した機器の修理や、損失したサンプルの入手に時間がかかったことから研究計画の遂行に遅れが生じている為、平成23年度に計画していた遺伝子導入ラットの網膜からの神経細胞保護効果に対する特異的タンパク質の検出、およびメカニズムの解明を行う。また、それらの結果より、細胞死抑制効果のある因子を見出し、培養細胞へエレクトロポレーション法で導入し、安定的に継続して因子を発現する細胞株を作製する。

この細胞株に酸化ストレス、あるいは神経細胞生存を阻害する要因等を与え、細胞生存保護効果について検討を行う。研究計画を遂行する為に、次年度ではラット飼育の環境を整備し、より多くの遺伝子導入ラットの作製、試料の採取を行う事とする。その為、RCSラット及びラット飼育用ケージラック、試料の購入を予定している。また、ウイルス精製の為のプラスミド抽出試薬、細胞培養用品の購入とタンパク質解析試薬等の消耗品の購入を行う。それらの研究結果を報告する為、学会発表(成果発表旅費使用予定)と論文投稿(論文投稿料使用予定)を行う予定である。
受容体チロシンキナーゼのポリユビキチン化を触媒する酵素群の同定とその機能解析

我々は、血小板由来増殖因子(PDGF)受容体をはじめとする殆どの受容体チロシンキナーゼが、リガンド刺激依存性にポリユビキチン化すること、およびポリユビキチン化した受容体は、細胞内で26Sプロテアソームによって速やかに分解されることを発見した。そして、このリガンド依存性ポリユビキチン化とそれに引き続くプロテアソームによる活性化した受容体の分解という現象は、全く新しいタイプの受容体チロシンキナーゼの細胞内シグナル伝達抑制機序の一つであることを報告してきた。本研究は、以上のような我々自身の研究成果を踏まえ、受容体チロシンキナーゼのユビキチン化の分子機構を明らかにし、その人為的制御を通して、種々の生命現象ならびに病態における受容体のユビキチン化の機能的意義を解明することを企図したものである。平成8年度の研究では、ウサギ網状赤血球溶解液中に存在するEGF受容体のイソビトロでのユビキチン化を促進する酵素活性を担う蛋白質の精製を種々のクロマトグラフィーを用いて行なった。粗精製された蛋白質は、リコンビナントのE1(ユビキチン活性化酵素)およびUBC4(ユビキチン結合酵素)の両者の存在下で、自己リン酸化した受容体にユビキチン分子を共有結合させる活性を有していることが判明し、おそらく未知のユビキチンリガーゼ(E3)の一種であると考えられた。既に知られている蛋白質のアミノ末端を認識するE3と異なり、一連の膜蛋白質を認識する機能を有するものと思われる。今後はこの蛋白質のさらなる精製を試み、高度に精製された蛋白質の部分アミノ酸配列をもとに、オリゴヌクレオチドプローベを作製し、cDNAライブラリーのスクリーニングを行ない、これらプローベと特異的に結合する細胞内蛋白質のcDNAを同定する予定である。
遺伝子形質の自然伝播を利用する環境浄化微生物の分子育種技術の開発に関する研究

本研究の目的は、これまで環境バイオテクノロジーの基本概念として提案されたことがなかった微生物が持つ環境浄化遺伝子の自然伝播系を活用する工学技術の基礎を確立することである。また、環境において生物を育種するための技術体系を開発することである。このために、実際に自然界においてなされている環境浄化遺伝子の自然伝播の経路および媒体について科学的な解明を行うとともに、環境浄化微生物の環境内育種のための遺伝的形質の自然伝播の促進手法を研究期間内に明らかにすることを目的とした。本研究では以下の研究成果を得た。(1)既に分離した嫌気性水銀耐性細菌においても新たに分離できた好気性水銀耐性細菌においても、水銀耐性遺伝子オペロンはクラスIIトランスポゾン上にコードされていることを明らかにできた。(2)上記トランスポゾンは分離できた何れの水銀耐性細菌においても染色体上に存在することを明らかにした。また、このトランスポゾンの内部には細菌型イントロンがコードされており、遺伝子の広範囲な伝播に何らかの関与をしていることが示唆された。(3)プラスミドによる接合伝達性、既知のトランスポゾンとの関連性、および新規な接合性トランスポゾン(conjugative transposon)を含む可能性などを明らかにするために、水銀耐性オペロンを含む被伝達領域のDNAの塩基配列を決定した。(4)水銀耐性オペロンがクラスIIトランスポゾンを介して自然界でどのようにして他種の細菌に伝播されるかについて、水銀耐性遺伝子を持たない複数の細菌保存株との組み合わせによるメーティング実験系および細菌イントロンのスプライシングおよびホーミングに関する実験系を確立した。本研究で確立できた実験系は実際の耐性遺伝子の伝播のメカニズムを解明するための研究に役立てることが可能であると考えられる。本研究の初年度である平成11年度は以下の課題について研究を実施した。(1)細菌の水銀耐性遺伝子オペロンコードする伝達媒体の同定。(2)プラスミドによる接合伝達性、既知のトランスポゾンとの関連性、および新規な接合性トランスポゾン(conjugative transposon)を含む可能性などの解明。(3)自然界における細菌間での水銀耐性オペロン伝播のメカニズムの解明。これらの課題について、平成11年度に得られた研究の成果は以下の通りである。(1)既分離の嫌気性水銀耐性細菌においても新たに分離できた好気性水銀耐性細菌においても、水銀耐性遺伝子オペロンはClassIIトランスポゾン上にコードされていることが明らかになった。(3)プラスミドによる接合伝達・既知のトランスポゾンによる伝達との関連性、および新規な接合性トランスポゾン(conjugative transposon)を含む可能性などを明らかにするために、水銀耐性オペロンを含む被伝達領域のDNAの塩基配列を決定した。(4)水銀耐性オペロンが自然界でどのようにして他種の細菌に伝播されるかについて、水銀耐性遺伝子を持たない複数の細菌保存株との組み合わせによる、メーティング実験を現在手がけており、実際の耐性遺伝子の伝播のメカニズムを解明するための研究を開始した。

(1)既に分離した嫌気性水銀耐性細菌においても新たに分離できた好気性水銀耐性細菌においても、水銀耐性遺伝子オペロンはクラスIIトランスポゾン上にコードされていることを明らかにできた。(2)上記トランスポゾンは分離できた何れの水銀耐性細菌においても染色体上に存在することを明らかにした。また、このトランスポゾンの内部には細菌型イントロンがコードされており、遺伝子の広範囲な伝播に何らかの関与をしていることが示唆された。(3)プラスミドによる接合伝達性、既知のトランスポゾンとの関連性、および新規な接合性トランスポゾン(conjugative transposon)を含む可能性などを明らかにするために、水銀耐性オペロンを含む被伝達領域のDNAの塩基配列を決定した。(4)水銀耐性オペロンがクラスIIトランスポゾンを介して自然界でどのようにして他種の細菌に伝播されるかについて、水銀耐性遺伝子を持たない複数の細菌保存株との組み合わせによるメーティング実験系および細菌イントロンのスプライシングおよびホーミングに関する実験系を確立した。本研究で確立できた実験系は実際の耐性遺伝子の伝播のメカニズムを解明するための研究に役立てることが可能であると考えられる。
早期教育・中学校・高等学校の英語教育における実態と将来像の総合的研究(海外子女教育を含む)

本研究は,大学英語教育のさまざまな実態と将来像のアンケートによる分析(教員の立場,学生の立場)につづく中学校・高等学校の英語教育の実態と将来像の分析である.それに加えて,早期教育と海外子女教育の経験者にそれぞれの問題意識を問うている.中・高教員には,項目70につき,各約2700名と3100名に問いあわせをし,回収率34.4%, 45.6%を得ている.早期英語教育は,項目36, 480名中21.7%からの回答を得た.海外子女教育については項目33, 1100名中50.8%の回答を得た.回答内容は,中・高英語教員に対しては,授業,教材,教育メディア,生徒,大学入試,研修,外国人英語教員,全般と展望である.早期教育については,授業,効果と指導法,教材と教育メディア,周囲の反応,開始時期,教員資格,海外子女教育経験者には,現地の教育,日本人の国際理解教育,海外派遣前と帰国後の英語教育観の変化などについて回答を求めた.最後に全体像と提言を行って,英文要約を付している.全体像として,英語教育の現状がよくないこと,問題点が多種多様である.中学では授業時間不足が最大の問題,高校はクラスサイズ,意欲の不足,入試改善の要,英語教育の改善進まず,授業改善進行中,目標はコミュニケーション能力の改善と文化・事情の理解に中心があった.希望としては,中学の英語力につけ,圧倒的に中学では4時間,英語必修論,海外研修,外国人の導入,教員の英語運用力の育成などになる.早期英語教育については音声面の効果,学習開始年齢と早期教育の必要性,海外子女教育については,日本の英語教育の現状に不本意である旨が述べられている.提言は,中学の英語授業の増加を,クラスサイズの縮小,教員研修制度の充実,外国人英語教員の導入を,学習指導要領の改善の方向,必要科目,入試改善,早期英語教育の推進,国際理解教育の振興が述べられている.本研究は,大学英語教育のさまざまな実態と将来像のアンケートによる分析(教員の立場,学生の立場)につづく中学校・高等学校の英語教育の実態と将来像の分析である.それに加えて,早期教育と海外子女教育の経験者にそれぞれの問題意識を問うている.中・高教員には,項目70につき,各約2700名と3100名に問いあわせをし,回収率34.4%, 45.6%を得ている.早期英語教育は,項目36, 480名中21.7%からの回答を得た.海外子女教育については項目33, 1100名中50.8%の回答を得た.回答内容は,中・高英語教員に対しては,授業,教材,教育メディア,生徒,大学入試,研修,外国人英語教員,全般と展望である.早期教育については,授業,効果と指導法,教材と教育メディア,周囲の反応,開始時期,教員資格,海外子女教育経験者には,現地の教育,日本人の国際理解教育,海外派遣前と帰国後の英語教育観の変化などについて回答を求めた.最後に全体像と提言を行って,英文要約を付している.全体像として,英語教育の現状がよくないこと,問題点が多種多様である.中学では授業時間不足が最大の問題,高校はクラスサイズ,意欲の不足,入試改善の要,英語教育の改善進まず,授業改善進行中,目標はコミュニケーション能力の改善と文化・事情の理解に中心があった.希望としては,中学の英語力につけ,圧倒的に中学では4時間,英語必修論,海外研修,外国人の導入,教員の英語運用力の育成などになる.早期英語教育については音声面の効果,学習開始年齢と早期教育の必要性,海外子女教育については,日本の英語教育の現状に不本意である旨が述べられている.提言は,中学の英語授業の増加を,クラスサイズの縮小,教員研修制度の充実,外国人英語教員の導入を,学習指導要領の改善の方向,必要科目,入試改善,早期英語教育の推進,国際理解教育の振興が述べられている.わが国の中学校・高等学校の英語教育は現実にどうなっているか、問題点は何か、また將来像はどうなるだろうか。これらの問題を全国的に調査・分析することは、国際化が激しい今日のわが国にとって重要なことである。討議をするにも基礎資料として役に立つものがまず第一に必要であるからである。すでに、過去4年に亘り、大学の英語教員と学生の英語教育に対する実情と意識調査をし、多方面に重要参考資料として活用されている報告書を作成している。今回は、この線にのって、日本の英語教育の全体像の把握へと一歩を進めたところに意義がある。本調査は、全国国公私立の中学校・高等学校英語専任教員約7万人中、その8.6%にあたる6000人を無作為抽出し、中学・高校ほゞ同数、年齢・性別にも考慮をし、アンケートを配布した。項目は70項目あり、9章,あなた自身について,英語の授業について,教材について,教育メディアについて,生徒について,大学入学試験について,教師自身および研修について,外国人英語教員について,英語教育全般と將来の展望より成り立っている。当初計画通り、発送を終了し、返信を待つことになるが、3分の1の返信を期待している。この他に早期英語教育の適正年齢,その方法,英語教育全体の見通し等について、すでに実施している私立,公立小学校英語担当教員,及び熱心な私塾,研究所員など、計500名にアンケートを出す予定で準備中である。また、海外の日本人学校で教えた経験のある教員900名に対して、日本人の外国語教育はどうあるべきか、その長所や欠点などについても質問を用意している。これは本年度から来年度にかけて完成実施を目指している。

これらの返事は、すべてコンピューターに入れ、分析し、最終的には全員の討義による解説を付して、研究報告書にまとめられることになる。昭和62年度末完成を目指している。本研究は,大学英語教育の実態と将来像のアンケートによる分析(教員篇,学生篇)につづく大学入学以前の時期におけるわが国英語教育の実情と将来像をえがくことが主たるテーマである.約70項目のアンケートを全国各地域の中学・高校の英語専任教員約5000人を無作為に抽出し,返答を求めたところ,その約40%が回答を寄せた.中学・高校ともにほぼ半分である.その内容は,英語教育の目的,教授法の改良,教材,L.L.を使用しての状況,教員の海外研修状況,生徒への評価,クラスの規模など現状のあらゆる問題を取り扱ったつもりである.そのテーマは,できるだけ,過去4年に亘る大学英語教育改革のためのアンケートによる現状及び未来像への調査結果と比較できるようにした.これは1人の人間がどのようにしてことばを学習し習得するかを調べること,教育行政・教育政策と関ってくる.たとえば,生徒・学生は4技能のうち,もっとも身につけるのが日本語への翻訳力の養成にエネルギーが注がれる授業に不満を持ち,話す,聞く能力を身につけることを希望する.教員は,大学に近ずくほど教養中心的であり,読みの正確さに留意することが望ましいと考える.現在は,教養中心からコミュニケーション中心に語学教育は移行していくその分岐点にあるだろう.小学校及び幼稚園児童を対象に教えている英語教員約500人,海外子女教育に從事した小学校・中学校教員約500名を対象に,それぞれアンケート項目を作成し,英語教育の目的とその達成の方法について意見を求めている.その結果についても,前と同じようなことを感じさせられる.国際教育,異文化間コミュニケーション教育の登場がこのたびの調査から肯定される.
相互結合された複雑系のシンクロナイゼーションに基づく状態予測

本研究では,複雑系の研究分野において研究されてきたカオス的挙動を示す複雑系を結合した際に生じるサブシステム間の同期現象を応用した複雑系の状態予測(anticipating synchronization)を複雑系の予測器設計問題として捉え,非線形むだ時間システム,とりわけ,むだ時間を含む複雑系に対する新たな制御理論の創出を目的としている.本年度においては,16年度の結果を発展させ,とりわけ次の事柄について成果を得ている.1.同期機構のロバスト性に関する考察本年度は,各サブシステムのパラメーターが公称モデルと異なる場合,サブシステム間のモデル化誤差が生じる場合のそれぞれについて,安定性の検証を行うため,Lyapunov-Krasovskiiの安定性定理に基づき,漸近安定あるいは実用安定であるための十分条件を導出した.その結果,16年度に得た成果よりも緩和された条件の導出が行えた.2.同期と予測に関する実験的検証本年度においては,理論的解析と平行して,電気回路を用いた検証実験を行った.むだ時間要素をDSP,あるいはBBD素子を用いて近似的に実現し,Anticipating synchronizationに基づく状態予測が実システムで構成可能であることを確認している.実験結果については,更なる検証が必要であるが,一定の成果を得ている.3.同期予測機構を併用した制御系設計理論Anticipating synchronizationに基づく状態予測を用いた制御系設計手法として,同期に基づく状態予測器を併用した制御系設計法を提案した.この手法は,非線形システムのオブザーバに基づく制御系設計に対応し,拡張分離原理が成立することを示した.複雑系の研究において,むだ時間の存在により低次元システムにおいてもカオス的挙動が生じることが知られている.また,カオス系を複数結合する際に,そこにむだ時間を介在させることで,複雑系の同期に基づいた予測が生じることが報告されている.このように,非線形システムにおけるむだ時間の存在は,有限次元とは異なる現象が生じることが知られている.本研究は,特に応用物理の分野において実験的に研究されてきたカオス系の同期に基づく状態予測であるAnticipating synchronizationを複雑系の状態予測器の設計問題として捉え,カオス力学系と制御理論の双方からアプローチすることにより,非線形むだ時間システム,とりわけむだ時間を含む複雑系に対する新たな制御理論の創出を目的としている.本年度においては,研究代表者らが導出したシンクロナイゼーションに基づく同期現象の発生可能性とその限界に関する十分条件の緩和を行うため,システムパラメータ変動や外乱などの摂動を有するむだ時間非線形システムに対するロバスト安定性,および実用安定性のための条件の導出を行った.この結果,Anticipating synchronizationの際のカップリングゲインの設計が低次の線形行列不等式(LMI)に帰着できることを示した.また,ここで得られたシンクロナイゼーションに基づく状態予測器の設計理論の応用として,入力むだ時間非線形システムに対する制御系設計法を提案した.これら一連の成果については,17年8月の国際会議において採択されており,発表を行う.さらに,本年度は17年度に行う実験的検証のための準備として,実験装置の製作に着手した.本研究では,複雑系の研究分野において研究されてきたカオス的挙動を示す複雑系を結合した際に生じるサブシステム間の同期現象を応用した複雑系の状態予測(anticipating synchronization)を複雑系の予測器設計問題として捉え,非線形むだ時間システム,とりわけ,むだ時間を含む複雑系に対する新たな制御理論の創出を目的としている.本年度においては,16年度の結果を発展させ,とりわけ次の事柄について成果を得ている.1.同期機構のロバスト性に関する考察本年度は,各サブシステムのパラメーターが公称モデルと異なる場合,サブシステム間のモデル化誤差が生じる場合のそれぞれについて,安定性の検証を行うため,Lyapunov-Krasovskiiの安定性定理に基づき,漸近安定あるいは実用安定であるための十分条件を導出した.その結果,16年度に得た成果よりも緩和された条件の導出が行えた.2.同期と予測に関する実験的検証本年度においては,理論的解析と平行して,電気回路を用いた検証実験を行った.むだ時間要素をDSP,あるいはBBD素子を用いて近似的に実現し,Anticipating synchronizationに基づく状態予測が実システムで構成可能であることを確認している.実験結果については,更なる検証が必要であるが,一定の成果を得ている.3.同期予測機構を併用した制御系設計理論Anticipating synchronizationに基づく状態予測を用いた制御系設計手法として,同期に基づく状態予測器を併用した制御系設計法を提案した.この手法は,非線形システムのオブザーバに基づく制御系設計に対応し,拡張分離原理が成立することを示した.
言語間におけるライティング能力の双向性に関する研究:L2からL1へ

本研究の目的は、「言語間のライティング能力の双向性」について、特に、英語ライティング訓練/経験(L2)の日本語ライティング(L1)への影響を精査することであった。本研究は英語圏の大学への留学経験のある学生と経験のない学生との比較(被験者は大学34年生と社会人の計26名)、海外にて高校教育を受けた学生と受けていない学生との比較(被験者は大学1年生、19名)、の二つのリサーチを行った。データ収集と分析は基本的には先行研究(小林・リナート、科学研究成果報告書、2004年)と同様であるが、今回は「作文評価」も導入した。最初の研究では、海外留学経験者による日本語議論文には以下のようなテキストの特徴がL2からL1へ転移されていた:1)議論には賛成意見のみでなく反論と反駁の記述、2)導入段落(introduction)では何が問題であるのかissueを明確化、3)結論は、日本語的結論の特徴を控える傾向(例えば、将来の展望のを含まない)。また高い評価を得たL2議論文は導入段落と英語力と高い相関を示した。次の研究では、帰国生によるL1とL2作文の両方に共通するテキストの特徴として説明文より議論文の選択、パラグラフに基づいた明瞭な文構成や反論/反駁の導入が頻繁にみられた。これはL2で習得した英語ライティングの書き方を日本語に転移したと考えられる。また評価では、英語力と英語作文力が非常に優れており、日本語作文力に関しては高校で教育を受けた学生と比較しても違いは見られなかった。帰国生の場合、L1とL2ライティングは高い相関を示した。これらの結果とインタビューの分析を基に、どのような要因によって言語間におけるディスコースの特徴の転移が可能になるのか、そのモデルを提案した:1)L1とL2ライティング訓練/経験の内容と量(メタ知識とスキーマ化に関連),2)英語力、3)専門領域での高度な訓練、4)個人の内的要因(動機や態度)。これらの要因が個人のテキスト構築に大きな役割を果たしていることを明らかにした。本年の目標は、本研究の目的を達成するために、方法論を確立し、データ収集を行うことであった。方法論に関しては、課題(トピック)の決定と実験参加者の選択がもっとも重要なことであり、課題については予備調査(アンケートでトピッの難易度を調査)を行い、そして実際にデータを集めた上で決定した。選択したトピックは二つで、一つは高齢者と家族の同居についての是非、もう一つは早期外国語教育の是非であり、ともに社会的にも高い関心をよび、争点がある話題として議論文には適切であると判断した。実験参加者の選択については、英語ライティング経験が豊かな学生として英語圏に少なくとも1年間留学した経験のある学生7名(おもに大学4年生)と英語ライティング経験が比較的少ない学生を3名、計10名を被験者として選んだ。データは、一人につき2回の実験を行って収集した。1回目では日本語による小論文を書かせ、そのプロセスをビデオで記録し、ライティング終了後、すぐにインタビューを行った。約一週間後、同じ手順で英語の小論文とインタビューデータを収集した。一人の被験者の実験にかかった時間は56時間であった。実験では日本語課題を英語より先に与えたが、これは英語で書く影響をできるだけ少なくするためであった。

また書く状況を自然体にするために学生による電子辞書の使用を容認した。現在はデータを整理し、先行研究(小林・リナート、1415年度科学研究費研究成果報告書)の分析方法を使い、分析を始めている。データ量としてはまだ不十分なので、17年度は英語圏に留学経験のある学生で英語力の高い大学院生を実験に参加させ、一方英語ライティング経験が少ない学生の数も増やし、データ量をより高める予定である。17年度は、研究実施計画にそってデータ収集を継続する一方、国内外での研究発表を通して、言語間におけるライティング能力(特に修辞的特徴)の双向性について理論化を試みた。まずデータに関し、16年度と同様の方法にて、計11名(海外留学経験者3名、非経験者8名)から日本語と英語エッセイおよびインタビューデータを収集し、16年度のデータ10人分と併せて分析した。この分析はまだ完了してはいないが、以下の傾向が見られた:(1)前回の研究(大学1年生を対象)と同様に、3、4年生によるL1とL2ライティングにも両言語によるポジティブな相互作用があるが、大学1年生と比べると、英語ライティングの影響が大きい、(2)英語ライティングの修辞的特徴(意見表明、反論を含む論理構成、トピックセンテンス等)のL1への転移には様々な要因が影響する。例えば、英語ライティング訓練/経験、日本語小論文訓練/経験の程度、海外留学志望の有無、英語能力レベル等である。海外留学は、L2ライティングについてのメタ知識獲得と授業レポートなどの実際的なライティングを通して、その知識のスキーム化に役立つ一方、L1への転移には個人の動機や見方など情意的要因の影響も見逃せない。前回((L1からL2へ)と今回(L2からL1へ)の研究結果を併せて考察すると、転移の双向性には以下のような諸要因があると考えられる:(1)L1とL2ライティング訓練/経験の内容と量(メタ知識とスキーマ化に関連)、(2)ライティングが行われるソーシャル・コンテクスト、(3)個人の内的要因(L1とL2ライティングの見方、好み、価値観)(4)英語能力。特に、個人の内的要因は、L1とL2ライティング訓練/経験から強く影響を受けており、テキスト構築における修辞的特徴の選択/決定に大きな役割を果たしている。18年度は、長期海外留学経験者や帰国子女からデータを収集し、現在までに収集したデータと比較分析し、L1とL2ライティング能力の転移の双向性にかかわるパラメーターをより精査していく予定である。18年度は、研究計画に従って帰国子女(海外での高等学校留学経験者)に関するデータ(作文、作文プロセスのビデオ、インタビュー)を収集する一方、イギリス/アイルランド応用言語学会にて16&17年度に実施した研究の発表を行った。まずはデータ収集であるが、先攻研究(14年度15年度)の大学1年生と比較するために、海外の高校を卒業または勉強した経験のある大学1年生8名よりデータを収集した。しかし被験者の数をさらに増やすため、19年度入学予定の新1年生(3名が帰国子女経験者)を加えたい。このためしばらく研究を継続する予定である。以下は主な結果と考察である。(1)主張に対立する反論/反駁の説明がグループ(2)の日本語文のうち60%に見られた。非海外経験者グループ(1)と比べると2倍の多さであり、これは英語ライティングで得た知識をL1へ転移させた結果と考えられる。
脱毛症マウス系統における毛胞形成異常機構のキメラによる解析

本研究で使用した脱毛症マウス系統C3H/HeN-Barは、当実験動物室で維持していたC3H/HeN系統のコロニーに発見された縮れ毛の個体より育成したものである。この脱毛および縮れ毛の形質は、C3H/HeN系統との交配試験の結果、常染色体上の単一の半優勢遺伝子(Bare,Bar仮名称)によって引き起こされていることが判明した。ホモ個体(Bar/Bar)の場合には、出生後、最初に生えてくる毛が既に著しく縮れており、成長とともに脱毛して、生後30日頃には完全に禿げになることが判った。また、ヒゲの形態についても、出生時で著しく縮れていた。皮膚の状態は比較的なめらかで、炎症や著しい角化は認められず、表皮の角化細胞の異常ではないと予想された。ヘテロ個体(Bar/+)では縮れ毛となるが、その程度は個体により異なっていた。ホモ個体の皮膚を光顕および電顕で調べたところ毛包の内根鞘のハックスレ-層とヘンレ層を構成する細胞に異常を認めた。さらに、マウス毛包ケラチンに対する抗体により免疫組織学的に調べたところ、内根鞘の抗体陽性細胞の形態が著しく乱れているのが観察された。次にC3H/HeN-Bar/BarとBALB/cA系統との間で集合キメラマウスを作製した。キメラ個体では、体全体が縮れ毛となる個体や一部に縮れ毛を持つ個体が得られた。ヒゲについても異常に曲がったヒゲと正常な形態のヒゲを持ったキメラ個体が得られた。体全体が縮れ毛となったキメラ個体では、生後30日で部分的な脱毛が観察された。以上の結果から、C3H/HeN-Barにおける脱毛症は、ホルモン等の全身的な液性因子の異常ではなく、毛を形成するハードケラチン合成細胞の分化および機能に異常があると考えられる。
自己集合型自立有機ナノシートの創製

アルキル側鎖を有するフラーレン五重付加体のカリウム塩R5C60Kについて,有機溶媒に溶解したのち水を徐々に添加することで,最大で2マイクロメートルの直径を有する球体を形成することを発見した.この球体はろ過に引き続く乾燥の後も形状を維持し,さらに内部の水を失わずに保持することが明らかとなった.本成果から五重付加型フラーレンから形成する自己集合体が構造的な剛直性を有することが支持された.アルキル側鎖を有するフラーレン五重付加体のカリウム塩R5C60Kについて,有機溶媒に溶解したのち水を徐々に添加することで,最大で2マイクロメートルの直径を有する球体を形成することを発見した.この球体はろ過に引き続く乾燥の後も形状を維持し,さらに内部の水を失わずに保持することが明らかとなった.本成果から五重付加型フラーレンから形成する自己集合体が構造的な剛直性を有することが支持された.自己組織化科学