hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高レベル放射性廃棄物の先進的ガラス固化方法の開発

使用済核燃料の再処理によって発生する高レベル放射性廃棄物からマイナーアクチニド元素(MA)を分離することは,廃棄物発生量の低減や地層処分の安全性向上につながることに加え,核燃料資源の利用率向上に寄与する可能がある.MAの分離法として最も成熟した技術の一つに,溶媒抽出法であるTALSPEAK法があるが,有機相-水相間の金属の分配挙動は複雑であり,モデル計算による分配の予測は全くできない状態にある.本研究では,分配挙動の解明に必要と考えられる,高濃度乳酸ナトリウム溶液からの金属分配挙動について調べた.有機相には,リン酸系抽出剤であるHDEHP (Diethylhexyl phosphoric acid)を使用し,金属にはMAと分配挙動が類似のEuを用いた.HDEHP濃度を変化させた試験より,0.01M以下程度の低HDEHP濃度領域では,乳酸ナトリウムを含まない系と同様にEu^<3+>+3(HDEHP)_2⇔Eu(DEHP)_3(HDEHP)_3+3H^+の反応によりEuは抽出されたが,実用上重要となる高濃度領域では,上記反応から予測されるEu分配比([Eu]_<org>/[Eu]_<aq>)よりも実験値が減少することがわかった.また,この分配比の減少はトレーサー量から10mMまでのいずれのEu濃度においても確認された.Eu分配比の減少理由を明らかとするため,Naの有機相への分配によるEuとの競合について検討を行った.この結果,Na分配比はEu分配比と比べて小さな値であったが,系に多量に存在するため,EDEHPの一部がNaの抽出に消費され,Eu分配比を減少させる要因となっていることがわかった.一方で,Eu分配比の減少を完全に説明するには,乳酸の分配や,分配に伴う抽出平衡定数および活量の変化を検討する必要性が示唆された.使用済核燃料の再処理によって発生する高レベル放射性廃液を安全に地層処分するためには,廃液を長期的に安定なガラス固化体とすることが必要不可欠である.廃液に含まれる元素のうち,白金族およびMoは,ガラスから析出し,固化体の製造妨害や水への溶解性の増加などの問題を引き起こす要因となる.よって,継続的に安全なガラス固化体を作製するためには,これらの元素をガラスから分離除去する技術の開発が重要となる.本年度は,溶融したガラスに含まれる白金族およびMoを,空気雰囲気下において,溶融したCuへと抽出し,ガラスから分離除去する技術について研究を行った空気雰囲気下では抽出剤であるCuが酸化してしまうため,還元剤であるSiをCuに化合させたCu_5Siを抽出剤として使用することとした.熱重量分析の結果,1000°C以下の温度範囲において,Cu5_Siの酸化速度は十分に遅く,空気雰囲気下においてもCuを良好に金属状態に保持できることを明らかとした.白金族の代表としてPdを使用し,Pdを含むホウケイ酸ガラス粉末にCu_5Siを混合して1200°Cで4時間加熱した結果,Pdの82%を抽出し,金属塊としてガラスから分離除去できた.また,Cuについても,投入量の87%を金属塊として分離できた.MoO_3の溶解したホウケイ酸ガラスからもCu_5Siを使用することで,Moを抽出できることを示した.Moの抽出率は,還元剤としてSiを別途ガラスへ添加することで増加し,最大で68%を抽出分離できた.このときのCuの除去率は95%であった.これらの除去率は,いずれもAr雰囲気下での除去率と同程度であり,Cu_5Siを使用することで,より実用に近い空気雰囲気下においても,白金族およびMoを効率よく除去できることがわかった.これらの結果は,2009年10月に米国で開かれる国際会議Materials Science&Technology 2009において発表する計画である.使用済核燃料の再処理によって発生する高レベル放射性廃棄物からマイナーアクチニド元素(MA)を分離することは,廃棄物発生量の低減や地層処分の安全性向上につながることに加え,核燃料資源の利用率向上に寄与する可能がある.MAの分離法として最も成熟した技術の一つに,溶媒抽出法であるTALSPEAK法があるが,有機相-水相間の金属の分配挙動は複雑であり,モデル計算による分配の予測は全くできない状態にある.本研究では,分配挙動の解明に必要と考えられる,高濃度乳酸ナトリウム溶液からの金属分配挙動について調べた.有機相には,リン酸系抽出剤であるHDEHP (Diethylhexyl phosphoric acid)を使用し,金属にはMAと分配挙動が類似のEuを用いた.HDEHP濃度を変化させた試験より,0.01M以下程度の低HDEHP濃度領域では,乳酸ナトリウムを含まない系と同様にEu^<3+>+3(HDEHP)_2⇔Eu(DEHP)_3(HDEHP)_3+3H^+の反応によりEuは抽出されたが,実用上重要となる高濃度領域では,上記反応から予測されるEu分配比([Eu]_<org>/[Eu]_<aq>)よりも実験値が減少することがわかった.また,この分配比の減少はトレーサー量から10mMまでのいずれのEu濃度においても確認された.Eu分配比の減少理由を明らかとするため,Naの有機相への分配によるEuとの競合について検討を行った.この結果,Na分配比はEu分配比と比べて小さな値であったが,系に多量に存在するため,EDEHPの一部がNaの抽出に消費され,Eu分配比を減少させる要因となっていることがわかった.
モード解析による骨成熟過程の評価

本研究は顎矯正手術を施行した患者を対象に、振動解析法の一つであるモード解析を適用し、術後経過に伴う骨形成過程が歯列の振動特性にどのような影響を与えるかを経時的に評価したものである。本研究結果より、歯列が振動しやすい周波数、歯列の振動の止まりやすさおよび歯列の振動様相が術後経過とともに特徴的に変化することが示され、これより顎矯正手術後の骨形成過程が非侵襲的なモード解析により評価できる可能性があることが示唆された。初めに、振動解析システムの改良を行った。すなわち、振動解析用ソフトをインストールしたノート型パソコンの導入であり、これまで振動計測を行う場所とそのデータを解析する場所とが異なっていたが、これにより、振動計測を行ったその場においてデータの解析が行える環境が整った。チェアサイドにおける即時的な骨成熟過程の評価を行うという目的を達成可能なシステムにさらに一歩前進できたと考えられる。次に、上顎に対する顎矯正手術が行われた顎変形症の女性の被験者に対し、術前および術後3、6、12ヶ月経過時において既に振動計測を行いデータが得られているものに関してのデータ解析を行った。実際の振動計測は本年度は2名の被験者に対し行った。そのうちの1名は左側唇顎口蓋裂の女性であり、上顎に対する顎矯正手術後20ヶ月経過時の振動計測であった。術前および術後4ヶ月経過時の振動計測は既に行っていた。もう1名は上顎に対する顎矯正手術が予定された両側性唇顎口蓋裂の男性であり、術前および術後1ヵ月後に振動計測を行った。本症例に関しては今後も引き続き定期的な振動計測およびデータ解析を行っていく予定である。これまでに顎矯正手術が施行され1年以上の経過を追って振動解析ができた症例は本年度において2症例となっている。この限りにおいては、術後経過に伴うデータの変化は同様の傾向にあると考えられている。この結果は次年度において日本口蓋裂学会学術大会、およびInternational Confederation for Cleft Lip and Palate and Related Craniofacial Anomalies Cleft2009において発表する予定である。本年度は、昨年度にデータ採得し解析した結果をまとめ、日本口蓋裂学会およびInternational Confederation for Cleft Lip and Palate and Related Craniofacial Anomalies Cleft2009において成果発表を行った。顎矯正手術を施行した2名の被験者(内1名は左側唇顎口蓋裂患者)を対象に、手術後における上顎歯列の振動特性の経時的変化をモード解析を用いて明らかにすることを目的とし、術前、術後3ヶ月および1年以上経過時における固有振動数、減衰比およびモードシェープについて比較検討を行った。その結果、両被験者ともに、術後3ヶ月時においては術前に比べ減衰比が増加し、固有振動数が減少したが、術後1年以上経過時においては、再び減衰比は減少し、固有振動数は増加していた。またモードシェープについては、術後1年以上経過時には両被験者ともに安定した剛体様モードを示していた。これらの結果から顎矯正手術後において、モード解析を適用し歯列の振動特性を経時的に計測することで、術後経過、すなわち骨成熟過程が非侵襲的な方法で評価できるのではないか、ということが示唆された。また本研究課題の延長として、本研究と同様の振動計測システムを応用することで、4名の上顎欠損患者を対象にコバルトクロム合金、白金加金合金およびチタン合金により作製された3種類の金属床上顎顎義歯が、上顎歯列の振動特性に与える影響について解析し、どの金属材質で作製した上顎顎義歯が上顎歯列の長期保存の観点からより適当であるかをin vivoにより評価することを試みた。本年度は、顎矯正手術を施行した両側唇顎口蓋裂患者1名を新たに被験者として振動解析を行った。これまで計3名の振動解析を行ったが、今後の課題として、モード解析を適用し骨成熟過程を非侵襲的な方法で評価する上で、歯に固定された矯正装置、特にワイヤーの結紮力および手術時に骨に付着された固定用プレートおよびスクリューが歯列の振動特性に与える影響について明らかにすることが必要であると考察された。また、矯正装置が装着された歯列の振動解析を行う上で、矯正装置が装着された部分を除くわずかに残った歯面からの振動応答を、よりノイズの少ない状態で計測できるシステム、すなわち、より細かな部分を正確に加振するインパクトハンマによる加振方法の工夫および振動を受信するレーザー出力器固定方法の改良が望まれた。また、本研究課題の延長として、本研究と同様の振動解析システムを応用することで、4名の上顎欠損患者を対象にコバルトクロム合金、白金加金およびチタン合金により作製された3種類の金属床上顎顎義歯が、上顎歯列の振動特性に与える影響について解析し、どの金属材質で作製した上顎顎義歯が上顎歯列の長期保存の観点からより適当であるかを評価した。その結果、上顎歯列の振動特性、すなわちモードシェープ、減衰比および最大変位量の観点から、チタン合金を使用した上顎顎義歯が最も好ましいことが示唆された。
風力発電施設によるオジロワシ個体群への影響の評価と悪影響軽減に向けた基礎的研究

風車衝突事故によるオジロワシ個体群への影響評価で対象とすべき集団について、遺伝的側面から検討した。北海道北部とロシア極東の地域繁殖集団間には遺伝的な分化傾向が認められ、ロシアでの繁殖(越夏)個体が渡来する越冬期に北海道北部で風車に衝突死したオジロワシの多くは、北海道北部地域の繁殖集団に帰属する可能性が高いことが示された。本研究の結果から、北海道北部で多発している風車衝突事故による影響評価は、インパクトがとくに大きいと考えられる同地域の繁殖集団と、渡り個体が越夏するロシアの繁殖集団とを対象に実施される必要があると考えられた。1北海道において風車に衝突死したオジロワシの由来(ロシア極東地域で繁殖する渡り鳥か北海道産の留鳥か)を、遺伝子型から特定することを目指し、カムチャッカ半島やアムール川下流域などの繁殖地で羽などのDNA試料を採集した。ミトコンドリアDNA調節領域の塩基配列を決定したところ、北海道で主要なタイプと同様なハプロタイプが多かった。一方、越冬期に北海道北部地域で風車衝突事故により死亡したオジロワシのミトコンドリアDNAは、当該地域で繁殖している集団のハプロタイプの出現頻度と類似した。北海道北部地域のオジロワシでは他の地域で確認されていない固有のハプロタイプの頻度が高く、今回解析したロシア産の個体にもこのタイプはみられていない。したがって、風車に衝突死したオジロワシには北海道北部地域産の留鳥が多く含まれている可能性が考えられた。2本研究や既存研究で定期的な鳥類の死骸探索調査が実施され、衝突事故の発生状況がある程度正確に把握されている北海道日本海側の風車群を対象とし、衝突事故の発生しやすい風車の立地条件を明らかにするための解析を試みた。対象とした各風車周辺の立地特性を表す指標値のうち、鳥類の衝突事故が確認された風車と確認されていない風車とで有意差のあったものを説明変数とし、事故の有無を目的変数としたロジスティック回帰分析を行った。ただし今回は対象となる風車数が少ないため、複数の説明変数を用いた解析はできなかった。オジロワシではモデルの精度を表すAUCが0.7以上(妥当以上の精度)の説明変数が8つあり、これらのうち赤池情報量規準(AIC)による適合度が最も高かったのは海からの距離で、その他に風車周辺の急傾斜地の面積や斜面の多様度に関わる変数の適合度が高かった。また、これらの解析はオジロワシの他5種の中大型鳥類を対象として行い、適合度の高い説明変数は種によって異なった。本研究は1)風力発電施設がオジロワシ個体群にもたらす影響を評価する上で、適切な対象集団を決定すること、2)オジロワシの風車衝突率を推定し、衝突事故の発生条件を明らかにすること、を主な目的としている。平成24年度は、目的1)については極東地域に生息するオジロワシ個体群の遺伝構造を明らかにするために、DNA試料の採集および遺伝子型判定を行った。ロシアで採集されたものも含め188試料を収集し、このうち130試料についてはミトコンドリアDNA調節領域540bpの塩基配列が、94試料については17種類のマーカーを用いたマイクロサテライトDNAの遺伝子座がそれぞれ決定された。ミトコンドリアDNAでは北海道内で11種類のハプロタイプが確認され、ロシアの繁殖地ではこのうちの3種類のみが確認されていることから、北海道に独特のタイプが存在する可能性がある。また、繁殖地域間における遺伝的分化係数(Fst)から、北海道内には遺伝的に異なる複数の局所集団の存在する可能性が示唆された。さらに、近年の営巣情報がほとんどないロシア沿海州地域におけるDNA試料の採集に向け、当該地域で巣を探索し、2ヶ所の営巣と複数の潜在的な営巣地を確認した。目的2)においては、北海道北部日本海側にある風力発電施設3ヶ所で、6月から3月までに月一回の鳥類の死骸探索調査および鳥類の飛翔行動調査を行うとともに、オホーツク海側の一施設で11月から3月まで同様な調査を行った。また、Kitano&Shiraki(2013)の衝突率推定モデルでは、補正値の一つである死骸残留率は非積雪期のデータから導かれたものであったが、季節変化が大きく影響する可能性が考えられたため、積雪期に死骸消失実験を実施して残留率を算出した。その結果、非積雪期に比べ早期の消失率が著しく高いことが明らかになった。今後はこの結果を挿入して改善したモデルを提唱する。風力発電施設建設による影響評価の対象とすべきオジロワシの集団について明らかにし、また北海道の風力発電用風車に衝突死したオジロワシの帰属集団を推定するために、平成26年度はロシアのサハリン南部と沿海州の繁殖地域で営巣木を探索し、巣の下でDNAサンプル用の羽を採集した。

そして、これまでに得られたカムチャッカ半島とアムール川下流部を含むロシア極東地域と北海道の繁殖個体、および風車衝突事故による死亡個体を含む北海道越冬個体のサンプルを用い、ミトコンドリアDNA調節領域500bpの塩基配列を決定するとともに、マイクロサテライトDNAの17遺伝子座についてフラグメント解析を行った。ミトコンドリアDNAに基づく遺伝的分化係数FSTは北海道と極東ロシアの繁殖集団間の弱い分化を、マイクロサテライトDNAに基づくFSTは上記繁殖集団間の中程度の分化を、それぞれ示した。さらに、マイクロサテライトDNAによる北海道とロシア極東地域間の世帯当たり移住数Nmは0.59と少なかった。これらの結果から、北海道とロシア極東地域の繁殖集団は強いレベルではないものの遺伝的に分化し、遺伝的交流の頻度は低い可能性が示された。一方、本研究で実施した風力発電施設における鳥類の死骸調査の結果や環境省保護増殖事業の内部資料などの情報から、平成26年度末までに北海道内で風車衝突事故により死亡したオジロワシの確認数は最低40個体だった。ほとんどの事故が発生した、越冬期の北部地域の施設で衝突死した16個体について、ミトコンドリアDNAのハプロタイプの頻度とマイクロサテライトDNAのアレル頻度を算出し、当該地域で繁殖する集団の各頻度と比較したところ類似しており、有意差はなかった(p>0.05)。一方、極東ロシア地域の繁殖集団の各頻度とは有意に異なった。以上のことから、越冬期に風車に衝突死した個体の多くは北海道、とくに北部地域で繁殖する集団由来である可能性が示唆された。鳥類生態学ロシア産オジロワシ個体のDNA解析がやや遅れている。ロシア産個体のDNA試料はCITES等の許可を取得して日本で実験を行う予定であったが、許可の取得準備に手間取ったことなどから、今回はモスクワ大学に在籍するロシア人研究協力者が実施することになった。採集したロシア産試料の解析実験は既に実施されているが、ミトコンドリアDNA解析では塩基配列が決定できていない試料があり、マイクロサテライトフラグメント解析ではPCR増幅ができていない遺伝子座があるため、解析のために十分なデータが揃っていない。一方、当初の計画では平成24年度に実施する予定だったサハリンで繁殖するオジロワシのDNA試料の現地サンプリングは、調査地域おける油田開発事業の影響やロシア人研究協力者の都合により平成25年度も実施できなかった。予定していたロシア国サハリンおよびマガダン地域におけるオジロワシDNA試料のサンプリングは、ロシア人研究協力者の都合により延期となったが、新規調査地としてロシア国沿海州地域においてオジロワシの巣の探索および巣の周辺における羽サンプルの採集を実施した。ロシア繁殖地域におけるDNA試料の採集およびその解析がやや遅延しているものの、おおむね順調に進行しているといえる。ロシア産個体のDNA解析実験は、平成26年度もロシア人研究協力者がモスクワ大学で継続する。実験の一部がうまくいっていない理由は現在のところ不明であるが、もし夏までに良好な成果が得られなかった場合はモスクワ大学に赴き、日本で成功しているのと同じ条件で実験を試みる。また、試料が入手できていないサハリンの繁殖集団については、平成26年度にロシア人研究者に同行して現地で採集を行う予定にしているが、もしこのサンプリングが実施できなかった場合には、ロシア国内の博物館等に所蔵されているサハリン産オジロワシの剥製の羽等をDNA解析試料として提供してもらえるよう、研究協力者に依頼している。
理想境界の理論

本研究の目指すところは理想境界の一般理論の構成にあるが,当面の課題として,本年度の研究目的とした,空間の固有境界及びその上の各種の調和構造が事実に指定した理想境界とどの様に係わるかを明らかにする問題に於て,特に理想境界としてロイデン境界及びマルチン境界を取った場合に以下に述べるような成果を得た.n次元(n≧2)ユークリッド空問R^n内の領域Mのロイデン調和境界Δ_p(M)(1<p<∞)の連結性が,M上非定数のpディリクレ積分有限な指数pのA調和測度が存在しないと言うコンデンサー問題の解決と同等となることを示した.Mが有界で相対境界∂Mが連結ならどの程度Δ_p(M)の連結性が出るかについて基本定理,B^nをR^nの単位球とするときΔ_p(B^n)は1<p<2なら非連結2≦p<∞なら連結,を得ていたが,これをMがC^2級の∂Mを持つ場合,更に一般にMがリプシッソ領域の場合に拡張した.特にMが連続領域ならばΔ_p(M)(2≦p<∞)が連結となると言うほぼ最終的と思える結果を得た.他方R^nの領域M上に,ポテンシャルをラドン測度μに持つシュレ-ディンガー方程式(-Δ+μ)u=0を考えるとき,この解空間がブルロ-空間を作るための条件をカト-族の立場から考察した.それを応用してμの孤立特異点の上にマルチン極小境界点が唯一点乗ると言うピカ-ル原理の成立条件をを調べ,各種の十分条件を得たが,特にn=2の場合μ≦0ならば無条件にピカ-ル原理が成立することを発見し,又n≧3でも孤立特異点の周りでμが回転不変ならμ≦0ならばやはりピカ-ル原理が成立することを示し,一般のn≧2の場合への量子力学や原子炉工学の立場からみても興味があると思われる問題提起を行った.本研究の目指すところは理想境界の一般理論の構成にあるが,当面の課題として,本年度の研究目的とした,空間の固有境界及びその上の各種の調和構造が事実に指定した理想境界とどの様に係わるかを明らかにする問題に於て,特に理想境界としてロイデン境界及びマルチン境界を取った場合に以下に述べるような成果を得た.n次元(n≧2)ユークリッド空問R^n内の領域Mのロイデン調和境界Δ_p(M)(1<p<∞)の連結性が,M上非定数のpディリクレ積分有限な指数pのA調和測度が存在しないと言うコンデンサー問題の解決と同等となることを示した.Mが有界で相対境界∂Mが連結ならどの程度Δ_p(M)の連結性が出るかについて基本定理,B^nをR^nの単位球とするときΔ_p(B^n)は1<p<2なら非連結2≦p<∞なら連結,を得ていたが,これをMがC^2級の∂Mを持つ場合,更に一般にMがリプシッソ領域の場合に拡張した.特にMが連続領域ならばΔ_p(M)(2≦p<∞)が連結となると言うほぼ最終的と思える結果を得た.他方R^nの領域M上に,ポテンシャルをラドン測度μに持つシュレ-ディンガー方程式(-Δ+μ)u=0を考えるとき,この解空間がブルロ-空間を作るための条件をカト-族の立場から考察した.それを応用してμの孤立特異点の上にマルチン極小境界点が唯一点乗ると言うピカ-ル原理の成立条件をを調べ,各種の十分条件を得たが,特にn=2の場合μ≦0ならば無条件にピカ-ル原理が成立することを発見し,又n≧3でも孤立特異点の周りでμが回転不変ならμ≦0ならばやはりピカ-ル原理が成立することを示し,一般のn≧2の場合への量子力学や原子炉工学の立場からみても興味があると思われる問題提起を行った.
Muller cell cone の免疫組織学的検討

近年,中枢神経系にも幹細胞が存在し,成体でも持続的にニューロンが新生されることが報告され再生医療の面からも注目されている。成体脳の中でニューロンの新生が起こるのは、海馬の顆粒細胞下帯と脳室下帯である。中枢神経の一つである感覚網膜においても網膜と毛様体の境界部いわゆるciliary marginal zone(CMZ)には神経細胞,グリア細胞,視細胞への分化能を有する網膜幹細胞が存在し,成体となっても再生していることが報告されている。また角膜も結膜との境界部である角膜輪部に幹細胞が存在し,オキューラーサーフェスの構造および機能維持に関与していることが報告されている。幹細胞はこのようなCMZや角膜輪部などの組織の境界部以外に,小腸の陰窩(crypt),毛胞,皮膚の真皮などのように陥凹した部位にも存在し,また骨髄幹細胞のendosteal nicheのように低酸素部位に存在することが多いことが知られている。筆者らは,陥凹して低酸素状態にあるという幹細胞ニッチェとしての解剖学的な特徴を併せ持つ中心窩およびその近傍にも網膜幹細胞様の未分化な細胞が存在するのではないかと考え,研究を行なってきた。我々は以前にサル眼の組織切片を用いた研究で,神経幹細胞のマーカーであるNestinの染色が中心窩外層に多くみられること, real-time PCRで中心窩が他の網膜部位よりもNestinの発現が多いことを報告し,特発性黄斑円孔の閉鎖との関連を考察した。今回,サル眼黄斑部網膜における,分化ニューロンおよびグリア細胞のマーカーを用いた免疫染色を行い,網膜の中心窩およびその近傍における神経分化機構について検討した。組織切片の免疫染色の結果,中心窩のMuller cell coneの内層に一致してGFAP陽性細胞が明瞭に観察された。また,このGFAP陽性部位は外網状層と外顆粒層の境界部の深層毛細血管網にも連続した染色性が見られた。中心窩網膜の最内層では一層のTUJ-1陽性細胞がみられ,それが周囲の神経節細胞層と連続していた。また, GFAP陽性部位はCRALBPと共染色されなかったが,最内層部位はTUJ-1と共染色された。また,染色性は弱いが視細胞層にもradial方向に走行するGFAP陽性細胞が見られた。Nestin陽性細胞は網膜外層を中心に発現が見られ,一部GFAPと共染色された。Muller cell coneの外層にではNestinと錐体のマーカーであるArrestin 4が共染色されたが中心窩外は染色性が弱かった。中心窩錐体の軸索であるヘンレ層もNestin陽性であった。傍中心窩の神経節細胞層と内顆粒層にはKi67陽性細胞が散在性に認められた。今までの結果から, Muller cell coneは単一の細胞の集合ではなく,内層のGFAP陽性部位と外層のNestin陽性部位に分けられることがわかった。GFAP陽性部位は免疫染色結果および細胞の形態からastrocyteの可能性が高いと考えられる。視細胞層に伸びたGFAP陽性細胞は形態的にradial gliaの可能性が示唆される。Muller cell cone外層のNestin陽性部位は周囲の視細胞層とは異なり, NestinとArrestin 4の共染色部位が明瞭に観察されたことより,中心窩の視細胞層には未分化な錐体細胞が存在する可能性が示唆される。中心窩ではこれらの未分化な細胞群が周囲の感覚網膜にニューロンを供給し,中心窩の形態維持および再生に関与している可能性があり,さらに異なった神経幹細胞のマーカーで中心窩網膜の免疫組織を行う予定である。また,中心窩だけではなく,視神経乳頭周囲,網膜最周辺部の組織切片を用いて同様の検討を行い,比較検討する予定である。

今回,サル眼黄斑部網膜における,分化ニューロンおよびグリア細胞のマーカーを用いた免疫染色を行い,網膜の中心窩およびその近傍における神経分化機構について検討した。組織切片の免疫染色の結果,中心窩のMuller cell coneの内層に一致してGFAP陽性細胞が明瞭に観察された。また,このGFAP陽性部位は外網状層と外顆粒層の境界部の深層毛細血管網にも連続した染色性が見られた。中心窩網膜の最内層では一層のTUJ-1陽性細胞がみられ,それが周囲の神経節細胞層と連続していた。また, GFAP陽性部位はCRALBPと共染色されなかったが,最内層部位はTUJ-1と共染色された。また,染色性は弱いが視細胞層にもradial方向に走行するGFAP陽性細胞が見られた。Nestin陽性細胞は網膜外層を中心に発現が見られ,一部GFAPと共染色された。Muller cell coneの外層にではNestinと錐体のマーカーであるArrestin 4が共染色されたが中心窩外は染色性が弱かった。中心窩錐体の軸索であるヘンレ層もNestin陽性であった。傍中心窩の神経節細胞層と内顆粒層にはKi67陽性細胞が散在性に認められた。今までの結果から, Muller cell coneは単一の細胞の集合ではなく,内層のGFAP陽性部位と外層のNestin陽性部位に分けられることがわかった。GFAP陽性部位は免疫染色結果および細胞の形態からastrocyteの可能性が高いと考えられる。視細胞層に伸びたGFAP陽性細胞は形態的にradial gliaの可能性が示唆される。Muller cell cone外層のNestin陽性部位は周囲の視細胞層とは異なり, NestinとArrestin 4の共染色部位が明瞭に観察されたことより,中心窩の視細胞層には未分化な錐体細胞が存在する可能性が示唆される。中心窩ではこれらの未分化な細胞群が周囲の感覚網膜にニューロンを供給し,中心窩の形態維持および再生に関与している可能性があり,さらに異なった神経幹細胞のマーカーで中心窩網膜の免疫組織を行う予定である。また,中心窩だけではなく,視神経乳頭周囲,網膜最周辺部の組織切片を用いて同様の検討を行い,比較検討する予定である。免疫染色に使用する抗体が予想より安価であったことと,切片作成を一部業者に委託する予定だったが,当研究室で施行したことで,実際の使用金額が予定より少なくなった。ただし,今後は新たな抗体を複数種類購入する予定であることから,多くの支出が予想される。
免疫不全マウスを用いたエキノコックス症病態モデルの開発

最初に重症免疫不全症疾患モデル(SCID)マウスであるC.B-17/Icr-scidとNOD/shi-scid(以下NOD-scid)の多包虫Echinococcus multilocularisに対する感受性を比較した。感染9,12週後に多包虫の重量を比較したところ、いずれにおいてもNOD-scidの方が有意に高い値を示した。これはscid遺伝子の作用にマクロファージ機能の減退、補体活性の低下などが加わった複合的な結果であると推察された。そこで、NOD-scidにおける多包虫の発育と増殖を観察した。感染1,2,3週のNOD-scidと対照群NOD/Shi-+/+(以下NOD-+/+)では多包虫重量および形態には大きな差異は認められず、NOD-+/+においてはrEm-18抗原に対する抗体さえ発現していない。これは感染虫体の前顕性期prepatent periodにあたり、宿主側免疫系が抗原認識中でいまだ抗体産生に至っていない状態と考えられた。感染6週以降のNOD-scidでは多包虫の多房化と原頭節形成が著しく活発に進行し、この寄生虫の無性生殖的増殖態度が典型的に現れた。NOD-scidは多包虫の発育・増殖に対して極めて寛容であり、ヒトの多包虫症を研究する上で重要な感染動物モデルとなる可能性を有していた。さらに、NOD-scidとNOD-+/+における多包虫の多房化と原頭節形成の程度を数量化する試みがなされた。感染6週以降NOD-scidでは病巣面積に対する嚢胞数の比率が極端に高くなって多房化指数が上昇し、NOD-+/+では宿主炎症性組織の増加による病巣面積が上昇するにもかかわらず嚢胞数にはほとんど変化が無いため多房化指数は逆に減少した。原頭節形成指数でもNOD-scidの方がNOD-+/+よりかなり高い数値で推移した。多包虫の増殖・発育を指数化することは宿主感受性比較・感染時期の推定・薬物効果判定などに有効な手段になると期待された。本年度は免疫不全マウスを用いて多包虫の増殖・発育過程を調べた。使用したマウスは、塩野義製薬で開発された非肥満糖尿モデルNOD/Shiにscid遺伝子が導入されたNOD/Shi-scidである。このマウスは機能的なT細胞およびB細胞が欠如しており、人のsevere combined immunodeficiency diseaseに類似した症状を呈する。このマウス(1群5匹)の腹腔に多包虫症患者より分離されて継代されているEm-K株を感染接種した。対照群にはNOD/Shiマウス(1群3匹)が用いられた。感染1,2,3,6,9,12週で回収された多包虫の重量を秤量し、組織標本を作成して形態学的な観察をするとともに、採取した血清についてEm-18抗原を用いたELISA法による抗体測定を実施した。多包虫重量はNOD/Shi-scidでそれぞれ0.10,0.12,0.17,0.98,3.64,11.58gとなり、感染9週より急激な増量をみた。一方、NOD/Shiでは0.06,0.22,0.23,0.47,0.97,1.10gで、緩やかな上昇しか見られなかった。

形態的には、NOD/Shi-scidの6週以降で多房化の進行と同時に、活発な原頭節形成が観察された。NOD/shiでは炎症性細胞の浸潤が強く現れ、多包虫の発育や増殖が強く抑制されていた。NOD/Shi-scidではB細胞が欠損しているのでIgGが産生されず、予想通りEm-18に対する抗体は認められなかった。しかし、NOD/Shiでは、感染6週より急激な抗体の上昇が確認された。これらの結果より、NOD/Shi-scidは多包虫疾患モデルとして極めて有用なマウスであることが判明した。この成果は平成16年4月4日の寄生虫学会にて報告される。本テーマは次年度で、nudeマウスやC.B-17/Icr-scidとの比較も計画されている。多包虫は特異な発育様式を呈する。原頭節は終宿主において成虫になる能力と、中間宿主において嚢胞になる能力の二方向性を有していると考えられてきた。この性質の真偽を確認するため、スナネズミの腹腔で増殖させた多包虫を摘出してホモゲナイズし、ペルコール比重法により原頭節と嚢胞の分画を別々に得た。それぞれをマイクロチャンバーに封入し、DBA/2Jマウスの腹腔に移植して経時的に取り出し観察した所、原頭節は膨化後、変性萎縮してしまい嚢胞へ分化することは無かった。他方、嚢胞をマイクロチャンバーに封入したものでは、多数の嚢胞を産生していた。嚢胞は嚢胞より生れ、原頭節は成虫にのみ発育するという単純な結論ではあるが、これまでの通説が覆る可能性を有している。現在、追加試験を実施中である。多房化のメカニズム、転移現象の有無、原頭節のアポトーシス等については次年度に計画している。最初に重症免疫不全症疾患モデル(SCID)マウスであるC.B-17/Icr-scidとNOD/Shi-scid(以下NOD-scid)の多包虫Echinococcus multilocularisに対する感受性を比較した。感染9,12週後に多包虫の重量を比較したところ、いずれにおいてもNOD-scidの方が有意に高い値を示した。これはscid遺伝子の作用にマクロファージ機能の減退、補体活性の低下などが加わった複合的な結果であると推察された。そこで、NOD-scidにおける多包虫の発育と増殖を観察した。感染1,2,3週のNOD-scidと対照群NOD/Shi-+/+(以下NOD-+/+)では多包虫重量および形態には大きな差異は認められず、NOD-+/+においてはrEm-18抗原に対する抗体さえ発現していない。これは感染虫体の前顕性期prepatent periodにあたり、宿主側免疫系が抗原認識中でいまだ抗体産生に至っていない状態と考えられた。感染6週以降のNOD-scidでは多包虫の多房化と原頭節形成が著しく活発に進行し、この寄生虫の無性生殖的増殖態度が典型的に現れた。NOD-scidは多包虫の発育・増殖に対して極めて寛容であり、ヒトの多包虫症を研究する上で重要な感染動物モデルとなる可能性を有していた。さらに、NOD-scidとNOD-+/+における多包虫の多房化と原頭節形成の程度を数量化する試みがなされた。感染6週以降NOD-scidでは病巣面積に対する嚢胞数の比率が極端に高くなって多房化指数が上昇し、NOD-+/+では宿主炎症性組織の増加による病巣面積が上昇するにもかかわらず嚢胞数にはほとんど変化が無いため多房化指数は逆に減少した。原頭節形成指数でもNOD-scidの方がNOD-+/+よりかなり高い数値で推移した。
正常上皮細胞と変異細胞間の細胞競合を利用した新規がん予防・治療法の開発

がん化の初期段階で生じた変異細胞が、正常上皮細胞層から排除されるという細胞競合が知られている。本研究では、細胞競合のメカニズム解明および、これを利用した新規がん予防・治療法の開発を目的とした。ファージ抗体ライブラリを用いて、細胞競合を制御する可能性のある細胞膜分子の抗体を探索した結果、がん遺伝子Ras変異細胞を特異的に認識する抗体を得、抗原として細胞膜タンパク質collagen XVII (COL17A1)を同定した。哺乳動物上皮細胞およびマウス組織において、変異型Rasの発現に伴ってCOL17A1の発現が上昇すること、また、COL17A1がRas変異細胞の増殖に関わることが明らかとなった。がん化の初期段階において、細胞層に生じた変異細胞と周囲の正常細胞との間に起こる「細胞競合」によって、上皮細胞層からがん変異細胞が排除されることが明らかとなっており、この排除機構の破綻ががんを誘発する一因と考えられる。しかし、この細胞競合を惹起するシグナル、また正常細胞と変異細胞が互いの違いを認識する分子メカニズムは未だ不明である。本研究課題ではこの認識メカニズムの解明および細胞競合現象を利用した新規がん予防・治療薬の開発を目的としている。具体的には、細胞間認識に関わる細胞膜分子(細胞競合制御因子)を同定するため、ファージ抗体ライブラリを利用した細胞競合マーカー抗体のスクリーニングを行ってきた。前年度中に、スクリーニング実験系の立ち上げはほぼ完了している。実験系としてテトラサイクリン誘導性RasV12発現MDCK細胞を用い、変異細胞特異的(cell autonomous)、または細胞競合特異的(non-cell autonomous)に発現・局在変化する細胞膜分子(細胞競合制御因子)に対する抗体クローンの単離を行ってきた。このスクリーニングにより、これまでに複数の候補クローンを取得することができた。そのうち1つのクローンについては、MDCK細胞の細胞抽出液を用いた免疫沈降および質量分析によって、ターゲット分子の同定を行った。現在は質量分析によって得られたターゲット候補分子について解析を行っている。また、ヒト上皮細胞における細胞競合の解析を行うため、前年度中にヒト膵管上皮細胞(HPDE6)のテトラサイクリン誘導性RasV12安定発現株による細胞競合モデルシステムを樹立した。今後、これまでのMDCK細胞実験系に加えて、このHPDE6細胞を用いてスクリーニングを行う予定である。前年度に立ち上げた、細胞競合制御因子に対する抗体をターゲットとしたスクリーニングでは、ファージ抗体ライブラリを用いた以下の細胞パンニングを行っている。まず、単一培養下の正常MDCK細胞にファージ抗体ライブラリを反応させ、結合するファージクローンを除去(pre-clear)する。その後、正常細胞とRasV12変異細胞の共培養下の細胞に、pre-clear後のライブラリを反応させ、結合したファージクローンを大腸菌に感染させて増幅させる。本操作を複数回行繰り返し、得られた抗体クローンを用いて、共培養下の細胞に対する免疫染色を行い、RasV12変異細胞または共培養時に特異的な染色を示す抗体を選出する。さらに、クローンの抗体可変部の遺伝子配列を解析し、重複クローンの排除を行う。この一連の過程において、pre-clearおよびその後の結合反応の条件の改良、免疫染色の手法や画像取得法の改良、クローンの遺伝子配列解析法の簡略化に成功し、より効率良くスクリーニングを行うことが出来るようになった。また、スクリーニング系の立ち上げまでは計画通りであるが、前年度中に候補抗体クローンを得ることができ、ターゲット分子の同定・解析まで進捗した。さらに、ヒト上皮細胞における細胞競合の解析を行うため、ヒト膵管上皮細胞(HPDE6)よる細胞競合モデルシステムを樹立し、スクリーニングに応用することで、より汎用的な抗体の取得が可能になった。本研究課題ではこの認識メカニズムの解明および細胞競合現象を利用した新規がん予防・治療法の開発を目的とし、細胞間認識に関わる細胞膜分子(細胞競合制御因子)を同定するためのスクリーニングを行ってきた。28年度中にファージ抗体ライブラリを用いた細胞競合制御因子抗体のスクリーニング実験系を立ち上げた。実験モデルとしてテトラサイクリン誘導性RasV12発現MDCK細胞を用い、変異細胞特異的(cell autonomous)、または細胞競合特異的(non-cell autonomous)に発現および局在変化する細胞膜分子に対する抗体クローンを免疫染色によって同定、単離する。29年度はこのスクリーニングを引き続き行い、得られた候補抗体クローンについて、ターゲット分子を免疫沈降と質量分析によって同定した。その結果、collagen XVII (COL17A1)が、RasV12発現に伴って細胞膜上で発現上昇することを突き止めた。さらに、マウス組織中でもRas変異に伴うCOL17A1発現上昇が起こっていることを確認した。現在、Ras変異に伴うCOL17A1発現上昇のメカニズムおよび生理学的意義について詳細な解析を行っている。これまでのスクリーニングに加え、29年度は細胞膜ラフト分画を抗原として作製したモノクローナル抗体によるスクリーニング系も立ち上げ、同様に細胞競合制御因子抗体の探索を行っている。今後も2つのスクリーニング系を平行して行う予定である。

本研究では、細胞競合のメカニズム解明および、これを利用した新規がん予防・治療法の開発を目的とした。ファージ抗体ライブラリを用いて、細胞競合を制御する可能性のある細胞膜分子の抗体を探索した結果、がん遺伝子Ras変異細胞を特異的に認識する抗体を得、抗原として細胞膜タンパク質collagen XVII (COL17A1)を同定した。哺乳動物上皮細胞およびマウス組織において、変異型Rasの発現に伴ってCOL17A1の発現が上昇すること、また、COL17A1がRas変異細胞の増殖に関わることが明らかとなった。細胞間認識に関わる細胞膜分子(細胞競合制御因子)を同定するため、ファージ抗体ライブラリを利用した細胞競合マーカー抗体のスクリーニングを引き続き行い、さらなる候補分子の取得を目指す。ライブラリの種類およびパンニング条件を変えることにより、多様な抗体クローンの取得を試みる。また、これまでのスクリーニングでは細胞競合モデルとしてMDCK細胞を用いているが、MDCK細胞は、抗体認識やRNAiの効果などがヒトまたはマウスの細胞と異なる場合がしばしばある。そのため、スクリーニングで取得した抗体の汎用性や、ターゲット同定後の機能解析を考えると、ヒトまたはマウスの細胞を用いることが望ましい。これに対応するため、ヒト上皮細胞株による細胞競合モデルを樹立することができた。次年度ではこのヒト上皮細胞株によるスクリーニングも行っていく。さらに、上記のスクリーニングで取得した抗体が、ヒトまたはマウスの上皮組織中の変異細胞(超早期がん細胞)を検出し得るかどうかを検証するため、当研究室にて確立したマウスin vivo細胞競合モデルの組織切片や、ヒト上皮組織切片などに対し、取得抗体を用いた組織染色を行う。細胞生物学
新開発三内標準法による放射化分析の基礎および応用研究

この研究は、新らたに導入した三つの内標準法、すなわち安定同位体希釈放射化分析法、内標準法および内基準法による放射化分析の基礎検討と、広範な実試料分析への応用を通して、それらの有用性を広く示すとともに、それらの普及化を図ることを究極目標としている。これら新開発三内標準法では比較試料は試料と同じ化学組成をもっており、分析対象元素の絶対濃度は試料および比較標準が別々に異なった粒子線束で照射されても、極めて簡易な関係式を用いて直接求めることができるという共通的特色をもっている。そこでこの研究においては、これら三方法の有用性をそれぞれ別々に立証するため、敢えて性質が両極端に異なる荷電粒子、または光量子を広範な試料に照射して以下のような研究を継続実施してきた。(1)自己遮へい無視系安定同位体希釈放射化分析法の開発と、その光量子放射化への応用、(2)安定同位体希釈放射化分析法による生物試料中のストロンチウムの荷電粒子放射化分析、(3)内標準法による種々のアルミニウム合金中のチタン,クロム,鉄,銅,ガリウムおよびジルコニウムの荷電粒子同時放射化分析、(4)安定同位体希釈放射化分析法による環境試料、すなわち石炭フライアッシュ、河口および池沈積物中のカルシウム,ルビジウム,ストロンチウムおよびセリウムの光量子同時放射化分析、(5)内標準法による環境試料、すなわち池、湖および河口沈積物中のクロム,コバルト,ニッケル,亜鉛,ヒ素,ルビジウム,ストロンチウム,イツトリウム,ジルコニウム,ニオブ,セシウム,セリウムおよび鉛等多元素高精度光量子放射化分析、(6)内標準法による環境試料、すなわち二種類の海岸沈積物中の上記13元素およびアンチモン,バリウムの機器光量子放射化分析。結果として、三内標準法のいづれでも分析対象元素は効果的に、そして極めて容易に高精度で分析できることが立証され、これからの新らしい分析技術として確立された。
トウモロコシにおける新たな生体防御機構の解明

トウモロコシにおいてストレスが二次代謝に及ぼす影響を解析した.その結果,傷害ストレスがヒドロキシ桂皮酸類とチラミンとのアミド化合物であるp-クマロイルチラミンおよびフェルロイルチラミンの集積を誘導することが見いだされた.これらの化合物の蓄積にはヒドロキシ桂皮酸類のCoAエステルとアミンを縮合させ,アミド化合物を生成する酵素が関与すると考え,この酵素活性の検出を試みた.この酵素活性の名称はhydroxycinnamoyl-CoA:tyramine hydroxycinnamoyltransferaseとなる.この酵素活性は未処理葉にはほとんど存在せず,傷害処理によって顕著に誘導された.さらに,この酵素を部分精製し,その特徴を解析したところ,CoAエステル側ではフェルロイル-CoAとシナポイル-CoAがよい基質であり,アミン側ではチラミンに加えてトリプタミンがよい基質となった.また,化合物の集積は一過的であったため,トウモロコシにはアミド化合物の代謝機構が存在していることが示唆された.このアミド化合物の代謝が,トウモロコシの細胞壁の強化に関与しているものと考えられたため,細胞壁の変性についても検討した.まず,傷害処理を施したトウモロコシからのプロトプラストの遊離のしやすさを測定した.その結果,傷害から時間が経過するのにしたがってプロトプラストの遊離数が減少することがわかった.したがって,傷害処理後,細胞壁がプロトプラストの遊離に用いる酵素に対して耐性を持つように変化したものと考えれる.また,蛍光顕微鏡による組織の観察の結果,傷害処理を施した葉の細胞壁には自家蛍光発する化合物が集積していることが明らかとなった.この蛍光物質はヒドロキシ桂皮酸のアミドの代謝物であるものと想定された.さらに,ヒドロキシ桂皮酸アミドの取り込みにはペルオキシダーゼが関与する可能性があるので,その活性の測定を行った.その結果,ペルオキシダーゼ活性の顕著な増加が観察された.以上の結果から,トウモロコシにおけるヒドロキシ桂皮酸アミドの誘導は細胞壁強化の強化をもたらし,生体防御に貢献しているものと推察された.トウモロコシにおいてストレスが二次代謝産物に与える影響について解析したところN-p-coumaroyltyramineおよびN-feruloyltyramineが傷害処理によって誘導されることが見いだされた.これらの化合物の蓄積にはavenanthramide類の場合と同様にヒドロキシ桂皮酸類のCoAエステルとアミンの縮合を触媒する酸素活性が関与すると考え,tyramine:hydroxycinnamoyl-CoA N-hydroxycinnaoyltransferase(THT)活性の測定を行った.その結果,この酵素活性も傷害処理によって顕著に誘導されることが見いだされた.さらに,この酵素を塩析及び陰イオン交換クロマトグラフィーによって部分精製し,この部分精製酵素を用いて基質特異性を解析した.ヒドロキシ桂皮酸類のCoAエステル側ではferuloyl-CoAおよびsinapoyl-CoAが良い基質であった。また,アミン側ではtyramineおよびtryptamineが良い基質となった.このtryptamineに対する活性は部分精製した酵素を実験に用いたため,2種類の酵素によって触媒されている可能性が想定された.しかし,tyramineとtryptamineはこの酵素反応において相互に競合したため,両基質に対する反応は同一の酵素によって触媒されていると考えられる.したがって,このTHTはアミド合成酵素の中では,アミンに対して比較的広い基質特異性を持つ酵素であることが推察された.トウモロコシにおいてストレスが二次代謝に及ぼす影響を解析した.その結果,傷害ストレスがヒドロキシ桂皮酸類とチラミンとのアミド化合物であるp-クマロイルチラミンおよびフェルロイルチラミンの集積を誘導することが見いだされた.これらの化合物の蓄積にはヒドロキシ桂皮酸類のCoAエステルとアミンを縮合させ,アミド化合物を生成する酵素が関与すると考え,この酵素活性の検出を試みた.この酵素活性の名称はhydroxycinnamoyl-CoA:tyramine hydroxycinnamoyltransferaseとなる.この酵素活性は未処理葉にはほとんど存在せず,傷害処理によって顕著に誘導された.さらに,この酵素を部分精製し,その特徴を解析したところ,CoAエステル側ではフェルロイル-CoAとシナポイル-CoAがよい基質であり,アミン側ではチラミンに加えてトリプタミンがよい基質となった.また,化合物の集積は一過的であったため,トウモロコシにはアミド化合物の代謝機構が存在していることが示唆された.このアミド化合物の代謝が,トウモロコシの細胞壁の強化に関与しているものと考えられたため,細胞壁の変性についても検討した.まず,傷害処理を施したトウモロコシからのプロトプラストの遊離のしやすさを測定した.その結果,傷害から時間が経過するのにしたがってプロトプラストの遊離数が減少することがわかった.したがって,傷害処理後,細胞壁がプロトプラストの遊離に用いる酵素に対して耐性を持つように変化したものと考えれる.また,蛍光顕微鏡による組織の観察の結果,傷害処理を施した葉の細胞壁には自家蛍光発する化合物が集積していることが明らかとなった.この蛍光物質はヒドロキシ桂皮酸のアミドの代謝物であるものと想定された.さらに,ヒドロキシ桂皮酸アミドの取り込みにはペルオキシダーゼが関与する可能性があるので,その活性の測定を行った.その結果,ペルオキシダーゼ活性の顕著な増加が観察された.以上の結果から,トウモロコシにおけるヒドロキシ桂皮酸アミドの誘導は細胞壁強化の強化をもたらし,生体防御に貢献しているものと推察された.
細胞接着面のラベルフリー定量的可視化法の開発

本研究では、光干渉法をベースとした細胞接着面のイメージング法を、装置・解析の両面から更に発展させ、より高コントラスト且つ定量的な計測が行えるようにした。さらに本手法を用いて、様々な細胞種の接着と機能との定量相関の取得に挑んだ。特に、がん細胞においては、接着面積と転移能との定量相関を初めて見出し、ラベルフリーの細胞接着のスクリーニング法としての応用可能性を示すことに成功した。本研究の目的は、細胞-外部環境間接着の定量的可視化を行うための新規光イメージング法を開発することにある。特に本研究では、反射型干渉顕微法(RICM)と呼ばれる手法をベースとする。本手法では、光干渉に基づき、細胞膜-基板間距離に応じた像コントラストをラベルフリーに得ることができる。まず本年度は、RICMを発展させた共焦点型の反射型干渉法を用いて、がん細胞-ゲル基板間接着の高コントラストイメージングを行った。本手法では、共焦点検出位置にピンホールを配置することで、迷光を排除し、細胞-基板界面からの光干渉シグナルを高効率で得ることができる。本手法を用いて、異なる転移能を有するがん細胞のゲル基板上の接着様式を比較したところ、高転移性のがん細胞ほど大きな接着領域(contact area)を示す傾向があることがわかった。現在はこの統計データを解析しているとともに、他の機能性基板でも同様の傾向があるかどうかを検証している。またガラス基板上ではあるが、細胞-基板接着面由来のラマン散乱光が検出可能であることも見出した。また本年度は、反射型干渉法と原子間力顕微鏡を組み合わせた新規細胞-基板間接着評価システムの構築と評価も行った。ここでは、細胞を原子間力顕微鏡のカンチレバーに固定し、基板に押し付ける。その後、細胞-基板間の接着面を光干渉法でモニターしつつ、細胞を基板から脱離することで、接着力と接着面積・形状との定量相関が得られると考えられる。実際構築したシステムを検証したところ、1共焦点光学系や2低反射材でコートしたカンチレバーを用いることで、細胞-基板間接着面の光干渉像が高コントラストで得られることがわかった。今後は本システムを駆使して、様々な細胞の接着強度と接着面積との相関を得たいと考えている。平成27年度は、まず前年度までに構築した光干渉によるイメージング装置と、表面処理した機能性基板を組み合わせ、様々な細胞の接着面の定量計測に挑んだ。具体的には、メラノーマ細胞(B16-F10,B16-F1)、乳腺上皮細胞胞(MCF10A)、Tリンパ球性白血病由来細胞(CCRF-CEM)など、接着性および浮遊性細胞の接着ダイナミクスを系統的に計測した。その結果、光干渉信号を理論に基づき定量解析することで、接着性細胞が基板に物理吸着してから、細胞接着分子による接着の形成に至る過程を観察することに成功した。さらに本光干渉画像から、接着様式が切り替わるために要する時間を、染色を用いずラベルフリーに定量決定できることも示した。また平成27年度は、上記の光干渉システムに加えて、原子間力顕微鏡、ラマン散乱検出装置を組み合わせた新規の細胞接着評価装置の構築にも挑んだ。原理的には本装置により、細胞ー基板間の接着面積の定量計測に加えて、細胞-基板間の接着力や、接着面にある化学種の同定を、同一細胞を用いて行うことが可能である。実際に本装置を用いて、フィブロネクチンやアルブミンなどで表面処理した基板に対するメラノーマ細胞を計測し、細胞ー基板間の力学的相互作用を定量評価できることを示した。以上により、光干渉法をベースとした細胞接着面の定量計測法を確立し、様々な細胞機能を評価する上での物理指標をラベルフリーに得ることができることを示すことに成功した。本年度は、がん細胞-基板接着の定量的可視化法の確立を目的としていた。これまでに共焦点型の反射型光干渉法を駆使して、ゲル基板をはじめ様々な基板を用いて光干渉像の取得が可能であることを示した。また、当初平成27年度に予定していた課題を前倒しで実施し、原子間力顕微鏡と反射型干渉法を組み合わせた新規顕微システムの構築に成功した。以上から本研究は概ね予定通り進展していると言える。生物物理化学今後は構築した光干渉システムを更に改良しつつ、様々な細胞種と外部環境間の接着面のイメージングに挑んでいきたいと考えている。ここでは蛍光イメージングなども組み合わせることで、接着分子による特異的接着領域と、分子間力などの物理的相互作用による接着領域とを区別して検収することにも挑みたいと考えている。これにより細胞-外部環境間接着に寄与する力学的相互作用の包括的理解を目指す予定である。平成26年度は、イメージング用の高強度可視光レーザーを購入予定であったが、スループットの大きな光学部品の導入することで、より安価で飛躍的なコントラストの向上が見込まれたため見送った。H27年度もイメージング法の更なる高コントラス化や高速化を目指し、光学部品や光源などを中心に予算を使用する予定である。