hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハイスループット１分子ひっぱり試験による結合力スペクトルの測定とアッセイ応用

本研究では、抗原抗体反応等の分子間相互作用の質的評価手法の研究として分子ひっぱり試験法の研究を行った。ひっぱり試験法に用いるマイクロビーズへの抗体固定化法を確立し、これによるひっぱり試験プラットフォームを確立した。また、これによりマウスIgGと抗マウスIgGの間に生じる相互作用力を力学的に解析した結果、数10pN100pN程度であることが示唆され、原子間力顕微鏡を用いた先行例とも整合する数値を得ていることから、提案手法を確立できたと言える。H27年度は抗体修飾粒子の作製に取り組み、粒子の作製技術を確立した。カルボキシル基修飾粒子表面に共有結合により抗体を固定化する方法と物理吸着により抗体を固定化する方法を検討した。物理吸着により抗体を固定化した粒子については蛍光標識抗体を用いることで抗原との反応性を確認し、従来法のイムノアッセイに匹敵する検出感度を有することを確認している。引っ張り試験に関してはH28年度の早い時期に着手する予定であるが、これに先立ち微粒子の物性測定を行いこれに基づく発生引っ張り力を試算した。この結果得られる引っ張り力は数fN数100pNの間であると試算され、従来の原子間力顕微鏡で得られている生体分子相互作用力の測定に適した範囲で精密に引っ張り力を制御可能であることがわかった。H27年度に完了すべき粒子の開発は達成されており、H28年度の研究実施に必要な準備だてが順調に進展していると考える。粒子表面への抗体固定化法を確立し、これらを抗原によりカップリングした複合体の作成技術を確立した。これをマイクロチャンバー内に封入することで、微粒子の挙動を独自の観察装置により可視化し粒子挙動を観察した。具体的には抗マウスIgGヤギIgG抗体を固定化した微粒子をマウスIgGによりカップリングしこれを用いることで分子結合力の測定を行った。この結果分子の結合力は数10pN100数十pNに分布すると試算された。これは原子間力顕微鏡を用いた先行研究例で報告されている結合力と整合性があることから、本開発技術による測定の正確性が示されたと言える。この実験では粒子の立体的配置の制御が困難であり、結合部に対して必ずしも垂直な引っ張り力を印加することができないことが課題であることが判った。この改良として、粒子対粒子を基板対粒子の結合にすることで、引っ張り力の印加方向を安定化する方法を検討した。これによりよりハイスループットな実験を実現でき、一度に数10結合以上の多量の引っ張り試験を実施できる系を確立した。本系においても同じく数10pNから100数10pNの結合力を示唆する結果を得ている。また、非特異的結合は特異的結合に比べ圧倒的に結合力が弱いことも本系による解析で明らかになった。本系においては抗原の非添加に於いても多くの結合粒子を生じることがわかっており、この改良に取り組んだもののこの点は課題として残った。基盤的な技術はH27年度中に揃えることができた。H28年度は粒子の反応性の評価と計画していた力学測定に取り掛かることができる。マイクロシステム試薬等を有効に活用したことで当初購入予定であった消耗品費が節約された。計測装置の高感度化の必要性が認められるため、レーザー等の備品や計測用カメラを新たに購入する予定である。
間葉系幹細胞培養上清を用いた新規動脈硬化性疾患の治療法の開発及び作用機序の解明

間葉系幹細胞培養上清(MSC-CM)の静脈内投与によって、動脈硬化モデルマウスにおける動脈硬化巣の形成が抑制された。MSC-CMは血管内皮細胞(EC)における接着関連分子の発現を抑制し、マクロファージ(Mφ)におけるM1マーカーの発現を抑制し、M2マーカーの発現を向上するといった抗炎症作用を示した。さらにこの抗炎症作用における分子機序を明らかにし、MSC-CMに含まれる蛋白質・エクソソームの両者が抗炎症作用に寄与していることも明らかにした。MSC-CMによる抗動脈硬化作用は、EC及びMφに対する抗炎症作用によってもたらされていることが示唆された。間葉系幹細胞(MSC)は液性因子の産生によって抗炎症、免疫調整作用を示すことが知られており、本研究は、塞栓誘発の懸念が無い間葉系幹細胞培養上清(MSC-CM)を用いた、動脈硬化性疾患に対する新しい予防法および治療法の開発を目的としている。平成27年度は、動脈硬化に対するMSC-CMの作用をin vitroおよびin vivoにおいて検証した。in vitro試験において、MSC-CMは炎症性刺激下にて、初代培養大動脈内皮細胞(EC)の接着関連分子の発現を低下し、初代培養マクロファージ(Mφ)の形質を炎症誘発性のM1型から炎症抑制性のM2型へ転換した。したがって、MSC-CMがEC、Mφに対する抗炎症作用を有することが明らかとなった。一方、MSC-CMはMφのアセチルLDLの取り込み能を向上したことから、Mφの泡沫化を促す可能性も示唆された。in vivo試験において、下肢虚血モデルマウスおよび動脈硬化モデルマウスを用いてMSC-CMの作用を検証した。下肢虚血モデルマウスに200μLの10倍濃縮MSC-CMを尾静脈から1回投与した結果、投与から1週間後の下肢の所見や血流量に変化は認められず、血管新生作用は認められなかった。一方、動脈硬化モデルマウスに、200μLの10倍濃縮MSC-CMを尾静脈から週2回、13週間投与した結果、MSC-CM投与群では大動脈および大動脈弁におけるプラークが減少し、MSC-CMの投与が動脈硬化の進行を抑制することが明らかとなった。また、マウス血管壁における接着関連分子の発現が低下し、血管壁内へのMφの集積が低下した一方で、血中コレステロール値には変化が無かった。したがって、MSC-CMの抗動脈硬化作用の機序として、血管壁近傍における抗炎症作用が関与していることが示唆された。平成27年度は動脈硬化の形成、進展に対するMSC-CMの作用をin vitroおよびin vivoで検証することを計画していた。in vitro試験においては、初代培養大動脈ECにおける接着関連分子の発現や、初代培養Mφの形質や泡沫化に対するMSC-CMの作用を検証した。その結果、本研究の遂行における重要な知見として、MSC-CMがECおよびMφに対する抗炎症作用を示すことが明らかとなった。また、平成27年度に計画していたECと免疫細胞の接着強度に対するMSC-CMの作用については、後述するin vivo試験を優先し、平成28年度に実施することとした。in vivo試験においては、下肢虚血モデルマウスおよび動脈硬化モデルマウスに対するMSC-CMの作用を検証した。その結果、本研究の遂行における重要な知見として、MSC-CMが動脈硬化モデルマウスに対して、プラークの形成を抑制することが明らかとなり、その作用機序として血管近傍における抗炎症作用が示唆された。平成27年度は実験計画の大部分を予定通り遂行し、本研究における目的の達成に繋がる有用な知見を多く得ることができた。したがって、本研究における現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると判断される。間葉系幹細胞(MSC)は液性因子の産生により、抗炎症、免疫調整作用を示す。本研究は、塞栓誘発の懸念が無い間葉系幹細胞培養上清(MSC-CM)を用いた、動脈硬化性疾患に対する新規予防法及び治療法の開発を目的として行った。平成27年度は動脈硬化の形成、進展に対するMSC-CMの作用を検証した。in vitro試験では、MSC-CMが血管内皮細胞(EC)及びマクロファージ(Mφ)に対する抗炎症作用を示すことを明らかにし、in vivo試験ではMSC-CMの尾静脈頻回投与が、動脈硬化モデルマウスにおける動脈硬化の進行を抑制することを明らかにした。そこで平成28年度は当初の計画通り、MSC-CMに含まれる有効成分の同定および詳細な作用機序の解明に取り組んだ。超遠心によりMSC-CMを蛋白質画分とエクソソーム(Exo)画分に分離し、ヒト大動脈EC及びマウス骨髄由来Mφを各画分中で培養し、炎症関連遺伝子の発現及び分子経路を解析した。ECにおいては、MSC-CMの蛋白質・Exo画分いずれも、TNFα刺激により上昇した接着関連分子(ICAM-1、VCAM-1)の発現を有意に抑制し、p65 (NFκB経路)、JNK(MAPK経路)のリン酸化を抑制した。Mφにおいては、蛋白質画分のみがLPS刺激で上昇したM1マーカー(TNF-α、IL-6)の発現を有意に抑制し、JNKのリン酸化を抑制するとともに、M2マーカー(MRC1、SR-A1)の発現を有意に上昇させ、STAT3 (JAK-STAT経路)のリン酸化を促進した。平成28年度は実験計画の大部分を予定通り遂行し、本研究における目的の達成に繋がる有用な知見を多く得ることができた。本研究で得られた知見は、動脈硬化性疾患に対する新規予防法および治療法の開発に繋がると期待される。

間葉系幹細胞培養上清(MSC-CM)の静脈内投与によって、動脈硬化モデルマウスにおける動脈硬化巣の形成が抑制された。MSC-CMは血管内皮細胞(EC)における接着関連分子の発現を抑制し、マクロファージ(Mφ)におけるM1マーカーの発現を抑制し、M2マーカーの発現を向上するといった抗炎症作用を示した。さらにこの抗炎症作用における分子機序を明らかにし、MSC-CMに含まれる蛋白質・エクソソームの両者が抗炎症作用に寄与していることも明らかにした。MSC-CMによる抗動脈硬化作用は、EC及びMφに対する抗炎症作用によってもたらされていることが示唆された。MSC-CMにはエクソソーム、タンパク質、低分子化合物など様々な成分が含まれており、平成28年度はMSC-CMに含まれる有効成分の同定および詳細な作用機序の解明に取り組む。有効成分の同定のため、MSC-CMから分離した成分もしくは特定の成分の働きを阻害したMSC-CMを用いてECやMφに対するin vitro試験を行い、有効成分の絞り込みを行う。エクソソームは超遠心によって、低分子化合物は限外濾過によって分離し、タンパク質については中和抗体を用いて候補成分の働きを特異的に阻害する。また、プラーク形成のきっかけとなるECへの免疫細胞の接着強度を共培養系で評価する手法を確立し、接着強度に対してMSC-CMやMSC-CM由来成分が及ぼす影響を検証する。in vitro試験で高い有効性を示す成分が見つかれば、in vivoでの作用を動脈硬化モデルマウスを用いて検証する。平成27年度の検証において、MSC-CMの抗動脈硬化作用には、血管壁近傍における抗炎症作用が寄与していることが示唆された。そこで、分子レベルでの詳細な作用機序を解明するため、ECやMφにおけるNFκB経路、JAK-STAT経路、PI3K-Akt経路など、免疫反応全般に関与する細胞内シグナル伝達系に対するMSC-CMやMSC-CMに含まれる成分の関与を検証する。動脈硬化は様々な要因が複合的に関わって進行する病態であるため、抗炎症作用以外の機序についても検証を行う。ECが産生する一酸化窒素(NO)は、血小板凝集、単球浸潤の抑制によって抗動脈硬化作用を示すため、NOの産生にMSC-CMが与える影響を検証する。また、T細胞は免疫寛容性を示す制御性T細胞へ分化することで抗動脈硬化作用を示すため、制御性T細胞への分化や、マウス血中での制御性T細胞数にMSC-CMが与える影響を検証する。基礎医学血管内皮細胞と免疫細胞の接着強度を評価する試験を平成27年度に実施することを計画していたが、in vivo試験の実施を優先し、平成28年度に実施することとしたため、試験の実施に必要と思われる予算を次年度に持ち越すこととした。また、平成28年度に実施予定のMSC-CMに含まれる有効成分の同定試験において、新たに抗体アレイ解析、miRNAアレイ解析が必要だと考えられた。これらの解析に必要な予算を確保するため、平成27年度の予算を次年度に持ち越すこととした。血管内皮細胞と免疫細胞の接着強度を評価する試験において、細胞の採取に必要な実験動物の購入、細胞の培養および細胞の蛍光標識に必要な試薬の購入に用いる。
コロイド組成の異なる農耕地土壌からの硝酸態窒素流出量の比較-イオン交換樹脂埋設法による低コスト硝酸態窒素流出量の測定-

1.目的と実験方法本研究ではイオン交換樹脂を充填したバッグを土壌中に埋設し、土壌中を溶脱する成分をイオン交換・回収する方法を用いて、コロイド組成の異なる黒ボク土壌からの硝酸態窒素流出量を比較した。これによって、土壌の荷電特性の違い(陰イオン交換能を持つか否か)が硝酸塩の溶脱にどのような影響をあたえるかを明らかにした。コロイド組成の異なる4種の黒ボク土(結晶粘土質多腐植質、結晶粘土質非腐植質、アロフェン質多腐植質、アロフェン質非腐植質)を円筒につめ、最上部にNaNO_3,KCL,CaHpO_4を施肥した後、デントコーンを栽培した。イオン交換樹脂バッグによって回収された硝酸態窒素および陽イオン(NH4^+、Ca^<2+>、K^+,Na^+)の量(溶脱量)を測定し、植物による窒素吸収量および土壌地租無機化量と土壌無機態窒素量を測定した。2.結果と考察(1)施肥N量(2.1gN/plant)と土壌無機化N推定量の合計は、3.4g5.2g/plantで、そのうち3040%が硝酸態窒素として溶脱し、5060%がデントコーンによって吸収された。土壌中でアロフェンによる正荷電が発現していると考えられるアロフェン質非腐植質土壌において、溶脱N割合が最も低く(29%)、植物のN吸収量も最も多かった。一方、正荷電の発現の無い結晶粘土質土壌では、腐植の多寡に係わらず、溶脱N割合は高く(33%38%)、植物のN吸収量は少なかった。また、アロフェン質多腐植質土壌では、植物のN吸収・溶脱N量ともに結晶粘土質土壌より多かった。これらの結果より、正荷電を持つアロフェン質土壌では、畑状態での硝酸態窒素の溶脱が相対的に抑制され、植物による窒素吸収利用率は高くなることが明らかとなった。しかし、腐植が多いと、正荷電発現は減殺され、溶脱N量は結晶粘土質土壌と変わらないことが明らかとなった。したがって、アロフェン質の非腐植土壌は農耕地からの硝酸態窒素流出を抑制する効果があると判断された。
イヌ悪性メラノーマに対する化学修飾microRNA-205の治療効果

本研究は、miR-205BPのイヌ自然発症悪性メラノーマに対する増殖抑制効果を検証することが目的である。研究項目としてはRNase耐性化学修飾miRNAであるmiR-205BPの自然発症での治療効果を検証した後、腫瘍組織中のmiR-205の発現量および病理組織学的特徴とmiR-205BPの治療効果との関連について解析することとなっている。27年度は5-10頭の自然発症犬メラノーマに対してmiR-205BPの投与試験を行う予定であったが、実際には局所投与3頭、全身投与3頭の組み入れを行った。予備試験では、導入試薬としてリポフェクタミンを用いたが、今回はmiR-205BP単独で局所投与を行ったところ、3頭中1頭で完全寛解となり肉眼的な腫瘍が消失した。この結果から、in vitroで認められていたmiR-205BPのRNase耐性が、in vivoでも同様に認められる可能性が示唆された。また、トランスフェクション試薬を使用せずに臨床効果を認めたことから、何らかのメカニズムでmiR-205BPが細胞内に直接取り込まれている可能性がある。一方、全身投与を行った3頭では、臨床効果を認めなかった。原因の一つとして投与量の問題が考えられる。今回は10nmol/kgにて投与したが、副作用に注意しつつ増加していく必要があるかもしれない。また、全身投与時にはポリエチレンイミンによる導入試薬を用いたが、これにより肝臓に集積してしまい、局所濃度が上昇しなかった可能性も考えられる。これらについては、in vivo imaging等の利用が可能であれば今後考慮してみたい。また、局所投与でトランスフェクション試薬を用いなくても効果を認めたことから、トランフェクション試薬を用いずに投与することも考慮する必要があるかもしれない。ほぼ予定していた試験組み入れ数を確保できた。本研究は、microRNA-205の化学修飾物質であるmiR-205BPの犬自然発症悪性メラノーマに対する増殖抑制効果を検証することが目的である。miR-205BPは、化学修飾によって血中のリボヌクレアーゼに対する耐性を持つことから、microRNAの生体への投与において極めて有利である。当初の研究予定では、研究期間終了までに局所投与症例5-10頭、全身投与症例5-10頭を組み入れる予定であったが、28年度は昨年度と合わせて、局所投与10症例、全身投与5症例を組み入れた。局所投与でのmiR-205BPに対する反応率は10頭中5頭で認めた。また10頭中4頭で完全寛解となり、投与部の肉眼的腫瘍が消失した。これらから犬自然発症悪性メラノーマに対するmiR-205BPの効果が確認された。局所投与での副作用については認められなかった。しかしながら全身投与を行った5頭では、腫瘍の縮小効果が認められなかった。局所投与では効果が認められていることから、何らかのドラッグデリバリーの問題である可能性が高いと考えられた。今回はトランスフェクション試薬としてリポフェクタミンあるいはポリエチレンイミンを使用したが、これらが肝臓等で集積してしまい病変部での濃度が十分ではない可能性、あるいは投与量自体が不足している可能性等が考えられた。今年度については腫瘍選択性を持つドラッグデリバリーシステムの使用を検討したいと考えている。ほぼ予定通りの組み入れ症例数を確保している。具体的には、RNAase耐性化学修飾miRNAであるmiR-205BPの腫瘍内投与を5-10頭、静脈内投与を5-10頭組み入れる予定であった。最終的には局所投与10頭、静脈内投与3頭の組み入れを行った。局所投与の結果は10頭中4頭で完全奏効(Complete Response: CR)、1頭で部分奏効(Partial Response: PR)、1頭で安定(Stable Disease: SD)、3頭で進行(Progressive Disease: PD)、1頭で判定不能(投与期間不足)であった。副作用については、投与部位、全身とも全く認めなかった。局所投与した10頭中7頭では、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミンを用いた。また、3頭ではトランスフェクション試薬を用いずに投与を行った。トランスフェクション試薬を用いることなく1頭でCRとなっていることから、何らかのメカニズムでmiR-205BPが細胞内に直接取り込まれている可能性がある。全身投与については3頭組み入れを行ったが、全頭でPRとなり、臨床効果を認めることができなかった。原因としては投与量の不足や肝臓等一部の臓器への集積などが考えられる。今後については、miR-205の全身の組織分布や、投与量の増量等を考慮する必要があると考えられる。引き続き試験組み入れ症例の確保に努力する。引き続き症例数の確保に努力する。獣医臨床腫瘍学組織中microRNA濃度の測定について、サンプルがある程度まとまってから行うこととした。そのため、次年度に測定する予定である。次年度使用額については少額であり、研究の遅れ等によるものではない。組織中microRNAの測定に利用予定。次年度も適切に使用する予定である。
分子および化学反応の局所的電子構造の解析と設計

本研究では,実験化学者と理論化学者が議論を重ね,既成理論の深化と展開を通して新たな化学の普遍的原理を発見し,発展させるための研究を行ってきた。主な成果は,1.従来の分子軌道法に新たな工夫を加えることによりπ電子エネルギーの意味と加成性について有用な知見を得た。2.シクロペンタジエン誘導体の最高被占軌道が置換基の存在によってどのように変形するかを摂動理論的見地から明らかにし,環化付加における面選択性の起源を明らかにした。3.優れた脱離能を有するヨードニオ基を含むβ置換ビニルヨードニウム塩の加溶媒分解の機構を解明した。4.平面四配位白金(II)錯体および関連錯体の単分子捩れ回転異性化について密度汎関数法による構造およびエネルギー計算とHartree-Fock法の分子軌道を用いたWalsh diagramにより解析し,配位子を適切に選べば四面体構造が最安定となるPt(II)およびPd(II)錯体が存在しうることを理論的に予測した。5.実験的に中間体を単離し,その構造,安定性,反応性を調べることが困難である遷移金属錯体触媒について,Pd(II)π-アリル錯体の還元的脱離反応とsp^3性C-H結合の活性化を例に,非経験的分子軌道法が反応の分子機構を解明するうえできわめて有用であることを示した。6.ペンタメチルシクロペンタジエニル補助配位子をもつモリブデンおよびタングステンの硫黄錯体を合成し,その高次混合金属クラスター化と電子論的安定性について検討した。7.捩れたπ電子系化合物であるオクタヒドロ-4,4'-ビフェナンスリリデンは,分子内立体障害のために不斉原子をもたないが光学活性異性体を与える興味深い化合物であり,理論計算による絶対立体化学の決定が正しいことを実験的に証明した。本研究は,Frontier軌道理論の基本概念を踏襲しながら,現代化学の精緻な諸問題をとり扱うことができる新しい軌道理論の構築を目的としている。精密な数値計算の結果から化学の研究に真に有用な情報をとり出すための簡便な理論的手法の導出,簡略化したモデル系について理解した結果を複雑な実現系に応用して,反応にける種々の選択性を支配する因子を解明・評価するための理論的手法の開発を実験,理論の両面から検討した。本年度の研究成果の代表的なものをあげると,(1)化学相互作用の局所性を表現する相互作用軌道対の方法を発展させ,アリル金属化合物の反応性がある空間方向に特異的であり,実験事実が中心金属のルイス酸性を評価することにより説明できることが示した。(2)トロポンとケテン類の反応が、従来から考えてきたような[8+2]型の協奏的付加ではなく,[2+2]型の付加環化から[1,7]転移を経由しておこる反応であることを明らかにした。(3)ジェミナル位にある二つのσ結合間の電子の非局在化を考慮することにより,ビシクロ[1.1.0]ブタンの橋頭位炭素の四面体配置の反転できることを示した。(4)平面4配位白金(II)錯体cis-[Pt(YH_3)_2(PH_3)_2](Y=Sn,Si,C)の単分子異性化反応について非経験的分子軌道計算を行い,安定構造と遷移状態を求めることにより,初めてその反応経路を明らかにした。(5)カルボキシル基やオレフィン二重結合のπ

軌道を非対称化する分子の立体的環境に由来する反応の面選択性について考察し,実験結果を説明するとともに,これを拡張して新しい軌道立体効果の考えを提案した。本研究では,実験化学者と理論化学者が議論を重ね,既成理論の深化と展開を通して新たな化学の普遍的原理を発見し,展開させるための研究を行ってきた。主な成果は,1.従来の分子軌道法に新たな工夫を加えることによりπ電子エネルギーの意味と加成性について有用な知見を得た。2.シクロペンタジエン誘導体の最高被占軌道が置換基の存在によってどのように変形するかを摂動論的見地から明らかにし、環化付加における面選択性の起源を明らかにした。3.優れた脱離能を有するヨードニオ基を含むβ置換ビニルヨードニウム塩の加溶媒分解の機構を解明した。4.平面四配位白金(II)錯体および関連錯体の単分子捩れ回転異性化について密度汎関数法による構造およびエネルギー計算とHartree-Fock法の分子軌道を用いたWalsh diagramにより解析し,配位子を適切に選べば四面体構造が最安定となるPt(II)およびPd(II)錯体が存在しうることを理論的に予測した。5.実験的に中間体を単離し,その構造,安定性,反応性を調べることが困難である遷移金属錯体触媒について,Pd(II)π-アリル錯体の還元的脱離反応とsp^3性C-H結合の活性化を例に,非経験的分子軌道法が反応の分子機構を解明するうえできわめて有用であることを示した。6.ペンタメチルシクロペンタジエニル補助配位子をもつモリブデンおよびタングステンの硫黄錯体を合成し,その高次混合金属クラスター化と電子論的安定性について検討した。7.捩れたπ電子系化合物であるオクタヒドロ-4,4'-ビフェナンスリリデンは,分子内立体障害のために不斉原子をもたないが光学活性異性体を与える興味深い化合物であり,理論計算による絶対立体化学の決定が正しいことを実験的に証明した。
クロロフィル蛍光を用いた、光合成活性の評価とパラメタリゼーション

植物のCO_2交換過程の制御は気孔の開閉と葉内におけるCO_2同化の2つのプロセスによって決定されている。近年、植物による制御を表す関数として気孔コンダクタンスと光合成のサブモデルを組み込むことで、植物個葉や群落での光合成速度や蒸散速度の同時推定が可能になってきた。しかし、実際の植物はどのようなパラメータをとるものなのかについての情報があまりにも少ないまま、モデルを使ったシミュレーションが先行しているのが現状である。そこで植物個葉のガス交換測定と併行したクロロフィル蛍光の測定によって、気孔開閉によらない光合成活性のうち電子伝達速度に関する特性を直接評価し、これをガス交換測定から得られる知見と合わせることによって、光合成速度制御の原因について解析することを目的として研究を行ってきた。平成13年度は、野外の様々な環境条件下において、個葉のガス交換速度およびクロロフィル蛍光の特性を測定し、放射環境・温度・湿度・土壌水分といった環境条件や植物の生理的条件、あるいは種の違いなどによってその特性がどのように変化するのか、についての情報を集めた。測定は、瀬戸内気候区内の緑地帯に生育する樹木を中心に行い、年変化を含む長期的なデータを収集した。また同時に微気象各項目および土壌水分条件を連続モニターした。また室内における環境制御実験を行い、水分条件、温度・光条件や、各個葉の特性の違いが、個葉のガス交換速度およびクロロフィル蛍光の特性をどのように決定しているのかについての詳細なデータを収集した。さらに、これらのデータにもとづいて、気孔開閉によらない光合成活性を評価し、この特性をパラメータ化することによって光合成モデル中の各パラメータの挙動について解析した。またこのようにして同定されたガス交換特性パラメータの挙動が、どのように実際の光合成速度や蒸散速度を制御しているのかについて、数値実験による解析を行った。そこで植物個葉のガス交換測定と併行したクロロフィル蛍光の測定によって、気孔開閉によらない光合成活性のうち電子伝達速度に関する特性を直接評価し、これをガス交換測定から得られる知見と合わせることによって、光合成速度制御の原因について解析することを目的として研究を行っている。平成12年度は、まず個葉上でのガス交換速度とクロロフィル蛍光の同時測定にあたって、安定したパラメータ群を得られる測定条件の確定を行った。また瀬戸内気候区内の緑地帯に生育する樹木を中心に、野外の様々な環境条件下において、個葉のガス交換速度およびクロロフィル蛍光の特性を測定し、放射環境・温度・湿度・土壌水分といった環境条件や植物の生理的条件、あるいは種の違いなどによってその特性がどのように変化するのか、についての情報を集め(観測は継続中)、同時に微気象各項目および土壌水分条件を連続モニターするための観測システムを立ち上げた。またポット苗を用いて土壌水分制御実験を行い、土壌の乾燥が光合成速度を制御している各要因にどのような影響を与えるのかについての情報を収集した。これらの特性をパラメータ化することによって光合成モデル中の各パラメータの挙動について解析中である。
放射光・中性子・電子線を用いた軌道自由度観測技術の開発

強相関電子系においては、電子のもつ3つの内部自由度(電荷・スピン・軌道)とそれらの結合状態が、系の物性に決定的な影響を与えるため、これらの秩序状態を観側することか重要になる。しかしなから、電荷とスピンの自由度に比べ、軌道自由度を観側する実験的手法は非常に限られており、多くの点で理論的な予測の中での定性的な議論にとどまってきた。そこで本研究では、放射光中性子・電子線というプローブを複合的に用いた、軌道自由度観測のための実験手法ならびに理論的解析手法を開発することを目的とした。この目的の達成のため、まず本研究組織は以下の5つの研究グループに分かれて各手法の先鋭化を図り、それぞれ開発した手法を持ち寄り、同一の試料に対し適用し、複合的に軌道状態を観測する試みを行ってきた。以下は、この3年間での得られた代表的な成果を各グループ別に列記したものである。1.試料作成・基礎物性グループ:遷移金属酸化物や希土類化合物の単結晶育成の大型化と純良化に成功した。2.放射光実験グループ:干渉法という新しい共鳴X線散乱法を開発することにより、強軌道秩序を観側することに成功した。層状Mn酸化物の磁気コンプトンプロファイルの異方性側定を行い、軌道秩序状態を定量的に決定し、そのホール濃度依存性を明らかにした。3.中性子散乱グループ:層状Mn酸化物の軌道状態を、偏極中性子散乱と粉末中性子散乱をマキシマムエントロピー法により解析した。4.電子線回折グループ収束電子回折法による電子密度分布の解析のためのソフトウエアの開発を行い、Mn酸化物の軌道秩序相における電子密度分布解析に成功した。5.理論研究グループ軌道秩序、揺らぎを測定する手段としての共鳴X線散乱に対する一般論の構築をおこなった。本研究組織は5つのグループに分かれている。以下、それぞれの今年度の研究成果について述べる。1.結晶作成・基礎物性測定グループ遷移金属酸化物(LaSrMnO3,YVO3など)や希土類化合物(DyB2C2,HoB2C2)の単結晶育成の大型化と純良化に成功し、それらを放射光・中性子・電子線実験用の試料として提供した。2.放射光実験グループYTiO3,LaMnO3,YVO3,LaSrMnO3人工超格子,DyB2C2,HoB2C2,CeB6の共鳴X線散乱実験に成功し、それらの軌道秩序状態を明らかにした。特に、干渉法という新しい共鳴X線散乱法を開発することにより、強的軌道秩序を観測することに成功した。一方、軌道の励起を観測する目的で、非弾性X線散乱実験をLaMnO3に対して行った。LaSrMn2O7における磁気コンプトンプロファイルの異方性測定を行い、その軌道秩序状態を定量的に決定した。また、そのホール濃度とともに、軌道状態の変化を観測することに成功した。3.中性子散乱グループTbBaCo2O6の金属絶縁体転移を中性子散乱実験から明らかにした。4.電子線回折グループ収束電子回折法による電子密度分布の解析のためのソフトウエアの開発を行い、LaCrO3の結晶構造パラメーター及び、電子密度分布の解析を行った。5.理論研究グループ軌道秩序、揺らぎを測定する手段としての共鳴X線散乱に対する一般論の構築を行った。また、LaMnO3における軌道励起と非弾性X線散乱に対する理論の構築を行った。本研究組織は5つの研究グループに分かれている。1.結晶作成・基礎

物性測定グループ遷移金属酸化物、希土類化合物の単結晶育成の大型化と純良化を行い、下記のグループに試料の提供を行った。2.放射光実験グループ巨大磁気抵抗を示す擬立方晶マンガン酸化物の軌道・電荷整列の磁場効果を共鳴散乱法で観察した。DyB2C2の四重極子秩序に関連して、Dyを非磁性のYで30%希釈したDyO. 7YO. 3B2C2について共鳴X線散乱を行い、Dyの四重極子秩序と磁気秩序の観測に成功した。立方晶のDyB6の実験は無数のドメインが出現したため,失敗に終わった。分子軌道計算をもとに理論的プロファイルを求め、磁気コンプトンプロファイルの異方性の解析を行った。7T-超伝導マグネットを高分解能コンプトンスペクトロメーターに設置し、その再立ち上げを行った。La_<2-2x>Sr_<1+2x>Mn_2O_7(x=0.3)の単結晶試料において、磁気コンプトン散乱の異方性を測定した。実験装置開発として、極低温クライオスタットと低温高圧実験装置の開発を行った。3.中性子散乱グループ強磁性を示す層状マンガン酸化物の軌道状態を、偏極中性子散乱と粉末中性子散乱とMEMで解析した。4.電子線回折グループ多波動力学回折理論による回折強度計算の高速化のためlinux-alphaワークステーションを購入し、これに対応して解析ソフトウェアの改良を行い、解析の適用範囲を広げた。収束電子回折法によるLaCr03の3次元的電子密度分布解析を行い、解析法を確立した。収束電子回折法によりLaMn03軌道整列相の電子密度分布解析を行い、Mn3+イオンのeg電子の軌道整列に直接対応する電子密度分布の異方性を検出することに成功した。5.理論研究グループ層状マンガン酸化物におけるスピン波の中性子散乱実験を解析することで、軌道状態の系統的な変化を明らかにし、これを説明するために量子軌道液体状態を提唱した。共鳴X線散乱の一般式をペロフスカイト型チタン酸化物に適用し、実験結果の解析を行うことで軌道秩序の型に関する知見を得た。本科研費研究の最後の年であった。当初計画していた、軌道自由度を放射光・中性子・電子線というプローブを通しての観測技術の開発は、そのほとんどが達成できたと考えている。今後、これらの成果に基づき、軌道自由度が創る物理を構築していく予定である。以下、今年度の研究成果について述べる。1.結晶作成・基礎物性測定グループにおいては、遷移金属酸化物、希土類化合物の単結晶育成の大型化と純良化を行い、放射光・中性子・電子線グループに試料の提供を行った。2.強的軌道秩序系ペロフスカイト型マンガン酸化物の薄膜試料を用いて、共鳴X線散乱(RXS)機構の研究を行った。3.Y_<1-x>CaxTiO_3系において、x(ホール濃度)の増加と共に、軌道秩序がどのように消失していくかを調べた。その結果、軌道秩序と磁気秩序・IM転移の関連が明らかになった。5.昨年度開発した、高圧・低温の極限条件下でのRXS法を利用して、EA_2CuCl_4の圧力下での軌道秩序の研究を行った。その結果、約4Gpaの圧力下で軌道秩序の融解が起こっていることを明らかにした。6.PrFe_4P_<12>において、PrのL3吸収端でRXS測定を行い、本系の特異な相転移がPrの四極子秩序に基づくものかどうかを実験的に検証した。
肝傷害誘導モデルマウスを用いたin vivoにける肝臓分化誘導法の確立

ガンシクロビル(GCV)の投与依存的に肝芽細胞への障害を誘導することのできるAfp-TKマウスを用いて、胎仔肝臓への肝芽細胞移植による肝臓補完の概念実証試験を実施した。レシピエントとしてAfp-TKマウス(♂、ヘテロ)とIQIマウス(♀)を交配し、胎生12.5日目に母体の腹腔内へGCVを50mg/kgBWで投与し、Afp-TKマウスマウス胎仔肝臓における緩慢な障害誘導を実施した。またドナー細胞として、全身性にEGFPを発現するPgkEGFPマウスの胎生13.5日目肝臓より、E-cadherinを発現する肝芽細胞を分取した。レシピエントが胎生13.5日目となるタイミングにおいて麻酔下で母体を開腹し、子宮筋膜を切開して羊膜に包まれた胎仔を露出させた後、実体顕微鏡下でその肝臓に1匹当たり1x10e5個ずつドナー細胞を直接注入した。細胞移植後に胎仔を腹腔内に戻し、麻酔からの覚醒を確認した後、帝王切開を行う胎生19.5日まで通常通りの飼育を行った。帝王切開後、蘇生した胎仔より肝臓を採取し、抗EGFP抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、移植細胞のレシピエント肝臓への寄与を確認した。その結果、EGFPを発現する移植細胞由来の肝実質細胞がレシピエント肝臓組織に寄与しており、Afp-TKマウス胎仔では同腹内の野生型マウス胎仔に比べて、その寄与率が高いことを確認した。また、同肝臓中にはEGFPを発現する胆管様構造も存在し、二分化能を有する肝芽細胞がレシピエント肝臓中で実質細胞と胆管細胞のいずれにも分化していることを確認することができた。これらの結果より、Afp-TKマウスを用いた胎仔肝臓補完技術が、マウスやヒトの多能性細胞由来肝芽細胞にも応用できる可能性が示唆された。胎生14.5日目のTK-NOGマウス胎仔肝よりRNAを回収し、HSV-TKの発現をRT-PCRによって確認した。その結果、肝障害が誘導される成体のTK-NOGマウス肝臓組織と比較して、胎仔肝でのHSV-TK発現量は非常に低いことを確認した。胎仔期に肝臓形成不全を誘導するのは困難であると推測されたものの、肝臓形成不全が起こることを期待して妊娠個体へのGCV投与を行った。胎生10.5日目と12.5日目にGCVを投与し、胎生14.5日目で肝臓発生への影響を観察したところ、雌雄とGCV投与の有無に関係なく肝臓形成不全の表現型は観察されなかった。以上の結果より、TK-NOGマウス胎仔へのGCV投与による肝臓形成不全の誘導は難しいものと判断した。TK-NOGマウス胎仔肝の形成不全を誘導できなかった原因として、HSV-TK遺伝子の発現量が十分でなかったことが挙げられる。そこで肝芽細胞においてアルブミン(TK-NOGマウスのプロモーター配列)の倍以上の発現量を示す、αフェトプロテイン(Afp)に着目した。先行報告よりマウスAfpプロモーター配列をクローニングし、この配列下にGFPをつなげたプラスミドベクターを構築し、Afp陰性のマウス胎仔繊維芽細胞(MEF)とAfp陽性のマウス肝臓細胞株(C3H)に導入してプロモーター活性を検証した。その結果、MEFではGFPの発現が見られないのに対し、C3HではGFPの発現が見られることを確認した。現在、このプロモーター配列にHSV-TK遺伝子をつなげたTgを構築し、新規肝臓形成不全マウス(Afp-TKマウス)の作製を進めている。TK-NOGマウスを用いた研究の推進は難しいことが明らかになったものの、新規肝臓形成不全マウス(Afp-TKマウス)の作製も同時に進めているため、研究全体の進捗には特に問題ない。マウスαフェトプロテイン(Afp)プロモーター配列にHSVtk遺伝子をつなげたTgを構築し、新規肝臓形成不全マウス(AfpーTKマウス)を作製した。マウスゲノムへのTg挿入及び次世代へのTg伝達を3ラインで確認し、この3ラインについて、胎仔肝臓におけるHSVtk遺伝子の発現量を定量的RTーPCRによって解析した。結果、3ライン中2ラインが、TKーNOGマウス成体肝臓におけるHSVtk遺伝子の発現量と比較して、6割程度の発現量を示すことを確認した。そこでこの2ラインについて、妊娠中の母体にGCVを投与し、胎仔肝臓の形成不全を誘導できるか検証を行なった。胎生9.5日目の母体に100mg/kgBWでGCVを腹腔内投与し、胎生12.5日目にサクリファイスしたところ、いずれのラインでも肝臓の形成不全を示す胎仔を確認した。ジェノタイピグの結果、肝臓形成不全を示した胎仔はいずれもTg個体であり、特に一方のライン(S12)では雌雄に関係なく、安定して肝臓の形成不全を誘導できることを確認した。しかしながら、肝臓形成不全を誘導したTg胚は出生に至らず、胎生致死となることも確認された。これは肝臓の消失とともに、Afpを発現する胚体外組織(特に羊膜)への障害が原因であるものと推測された。そこでGCVの投与量と投与のタイミングについて詳細な検討を行い、胎生12.5日目に50mg/kgBWでGCVを腹腔内投与することにより、胎仔肝の肝芽細胞に障害を誘導した上で、胎生致死を回避できることを確認した。本研究課題の鍵となる胎仔

肝臓の形成不全を薬剤投与依存的に誘導できるマウスの開発に成功した。今後はこのマウスを用いたin vivo分化誘導系の検証試験を進めていく。ガンシクロビル(GCV)の投与依存的に肝芽細胞への障害を誘導することのできるAfp-TKマウスを用いて、胎仔肝臓への肝芽細胞移植による肝臓補完の概念実証試験を実施した。レシピエントとしてAfp-TKマウス(♂、ヘテロ)とIQIマウス(♀)を交配し、胎生12.5日目に母体の腹腔内へGCVを50mg/kgBWで投与し、Afp-TKマウスマウス胎仔肝臓における緩慢な障害誘導を実施した。またドナー細胞として、全身性にEGFPを発現するPgkEGFPマウスの胎生13.5日目肝臓より、E-cadherinを発現する肝芽細胞を分取した。レシピエントが胎生13.5日目となるタイミングにおいて麻酔下で母体を開腹し、子宮筋膜を切開して羊膜に包まれた胎仔を露出させた後、実体顕微鏡下でその肝臓に1匹当たり1x10e5個ずつドナー細胞を直接注入した。細胞移植後に胎仔を腹腔内に戻し、麻酔からの覚醒を確認した後、帝王切開を行う胎生19.5日まで通常通りの飼育を行った。帝王切開後、蘇生した胎仔より肝臓を採取し、抗EGFP抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、移植細胞のレシピエント肝臓への寄与を確認した。その結果、EGFPを発現する移植細胞由来の肝実質細胞がレシピエント肝臓組織に寄与しており、Afp-TKマウス胎仔では同腹内の野生型マウス胎仔に比べて、その寄与率が高いことを確認した。また、同肝臓中にはEGFPを発現する胆管様構造も存在し、二分化能を有する肝芽細胞がレシピエント肝臓中で実質細胞と胆管細胞のいずれにも分化していることを確認することができた。これらの結果より、Afp-TKマウスを用いた胎仔肝臓補完技術が、マウスやヒトの多能性細胞由来肝芽細胞にも応用できる可能性が示唆された。Afp-TKマウスについて、現在までに次世代へのTg伝達と、胎仔肝におけるTgの発現を確認している。今後は母体へのGCV投与による肝臓形成不全の誘導を行い、多能性幹細胞の移植による肝臓補完を進めていく。胎仔肝形成不全を誘導した胎仔肝臓の補完を行う方法として、当初は胚盤胞補完を計画していた。この計画を変更し、胎生期の肝臓に細胞を移植することで補完を行えるか検証を進める。胎仔肝臓に細胞を移植するため、子宮外発生法(Ex utero法)の技術を導入する。その上で、まずマウス胎仔肝より単離した肝芽細胞を、胎仔肝形成不全を誘導したAfpーTKマウス胎仔に移植し、胎仔肝臓の補完を行えるか検証実験を行う。その結果を判断し、マウスやヒトのiPS細胞より作製した肝芽細胞による胎仔肝臓の補完の可能性について検討する。必要物品の購入を行なった際に余剰金が発生した。(理由)必要物品の購入を行なった際に余剰金が発生した。(使用計画)消耗品の購入に充てる。消耗品の購入に充てる。
データ駆動型 IMC アプローチに基づく個別学習における学習支援システムの構築

高度情報通信社会の急激な発展によって,遠隔学習や家庭学習にもコンピュータ技術や情報通信技術が導入され,個別学習の形態が少しずつ変化してきている。そのような中で,学習支援システムの果たす役割は極めて大きく,その構築法が重要となってきている。そこで,本研究では教員と学習者で構成されるコラボレーションを一つのフィードバックシステムとして捉え,そこにシステム理論(制御理論)的アプローチを導入することで,実際の『教員-学習者』間の関係に近い学習環境を提供する学習支援システムの構築について研究を行った。本研究では,制御手法の一つである内部モデル制御(IMC)とデータ駆動型アプローチを統合したデータ駆動型IMCの考え方に基づいて,学習支援システムの構築について考察した。具体的には,教員と学習者で構成されるコラボレーションを一つのシステムとして捉え,教員に代わる学習支援システムの中に,学習者モデルを構築し,これを内部モデルとするIMC系を構築した。学習者は一種の非線形システムと捉えられるため,学習者モデルを「データ駆動型アプローチ」を導入した。さらに,学習支援度調節部が備えられており,学習者モデルの逆システムに相当する部分とフィルタによって構成している。このとき,フィルタの設計は学習支援度に大きく関係しているので,フィルタパラメータの調整に「1-パラメータチューニングによるパフォーマンス駆動型アプローチ」を導入した。構築した学習支援システムの有効性を,大学(教育学部)におけるアルゴリズム学習のにフローチャート作成に適用し,学習者に対する最適な支援の可能性について検討した。この研究成果については,国内の学会(日本教育工学会),ならびに国際会議(情報技術と教員養成のための国際会議)において発表した。本研究で開発する学習支援システムの核となるデータ駆動型IMCアプローチのアルゴリズムの部分について考察した。具体的には,中学校技術科の木材加工における組み立てプロセスを取り上げ,そこでの学習者モデルをデータベースを用いて構築した。このシステムでは,生徒の能力(チェックシートによる回答)をもとに,その生徒のテストの得点を予測することができるかどうかを評価した。このときのチェックシート項目の設定,ならびに定量化が重要であり,中学校教員との討議を設けながら,この点に十分な時間をかけた。その結果,若干の試行錯誤は繰り返したものの,概ね良好に予測できるシステムが構築でき,当初想定していた結果が得られたと考えている。ただ,生徒の生理的な情報を効率的に取り入れる方法については,ニューラルネットワークなどを用いた方法など,現在も検討を重ねている。この情報がチェックシートの回答と同様に,学習者モデルの説明変量に加えられれば,より精度の高いシステムになると考えている。一方,学習支援度調節部の構築方法についても考察した。具体的には,1ーパラメータチューニングによるパフォーマンス駆動型アプローチに基づいた構築方法を確立した。この学習支援度調節部のみを単体で評価することができないので,十分な評価ができていないが,上述の学習者モデルを内部モデルとして含ませる形で統合し,学習支援システムとしての評価を行いたいと考えている。平成23年12月までに,学習者モデルの構築がある程度完成しており,平成24年1月3月において,支援度調節部の構築を行った。これらは当初の予定通りに進めることができ,その結果(成果)も概ね良好であると判断している。開発済みの「学習者モデル」と「学習支援度調節部」とを早急に統合する。とくに,学習者モデルを内部モデルとして統合する点が重要であり,この点に十分な時間をかけて研究を進めたいと考えている。システムが構築できた後に,中学校生を対象とした学習において,本システムを適用し,これを評価・検証したいと考えている。当初の計画では,小学校の算数ドリルの学習に適用することを考えていたが,小学生より中学生の方が,より信頼性の高いデータが得られると判断し,この部分を当初計画から変更する予定である。また,この研究成果を国内外の学会等において積極的に発表し,教育工学,および制御工学のそれぞれの研究者からの評価を受けたいと考えている。学習支援システムの評価・検証の際に必要となるコンピュータの購入費用に35万円程度,および研究協力者金に30万円程度,また先に述べたように,本研究成果に対して,研究者からの評価を受けるために,学会発表旅費として,国内旅費45万円,外国旅費40万円程度を見込んでいる。
手づたえ教示のデータロボティクス

本研究ではロボットを使用して人間の動作を抽出し、忠実に再現する「モーションコピーシステム」に関する工学基盤を拡張するとともに、手づたえ教示を効率良く実現するためのデータロボティクスの方法論を明らかにすることを目的としており、本年度において次のような研究実績を得ることができた。1.手づたえ教示/被教示装置の試作開発研究代表者が開発に成功している「モーションコピーシステム」のコンセプトを応用し、位置・速度情報に加えて力情報を精度良く取得する外骨格アームとタブレットを統合したシステムを開発した。本システムでは動作データ抽出時にアームによる拘束が生じるため、超小型力覚センサとモーションキャプチャシステムを統合した非拘束型のシステムも開発を行った。さらに、機能的電気刺激によるシステムについても試作を行い、基本特性について確認した。2.動作データに潜む「特徴量」抽出方法の開発多くのデータから特徴量を抽出する手法はディープラーニングをはじめとする人工知能技術により行うことが可能であるが、モデルがブラックボックス化されてしまうことが問題となっている。そこで、本年度の研究では動作の「特徴量」を抽出するための新しい人工知能技術の研究を行い、「要素記述法」の開発に成功した。本手法はブラックボックス化することなく、データから対話的にモデルを構築することを可能にしている。なお、本年度において10回の研究ミーティングを開催し、研究代表者、分担者、協力者間での成果の共有、逐次確認を行い、工学、神経心理学、神経内科学の密な連携の下で研究を推進した。手づたえ教示/被教示装置として、従来研究による基盤を応用した外骨格アーム型のシステムに加え、非拘束型のシステム、さらには機能的電気刺激によるシステムについても試作開発を行い、多面的に動作データの抽出方法について検討を行った。さらに、本研究で開発した「要素記述法」によりデータから対話的にモデルを構築することが可能になった。この技術は、研究代表者の有する「応用抽象化と総合デザイン」方法論が基盤となっているばかりではなく、永守賞を受賞したことからも明らかなように、産業応用面での優位性も高く評価された。この高いレベルでの総合デザイン方法論を動作データの特徴量抽出に応用することにより、構築されるシステムそのものも高性能化が見込まれ、当初の計画以上の成果が得られることが期待されるため。研究期間の2年目においては、手づたえ教示/被教示装置によるデータ抽出・再現の自由度を増やすことを目的とし、初年度試作したシステムの評価をフィードバックしつつ、アクチュエータ・センサの配置や機構について検討を進める。システムの改良と併行して、動作習得における神経心理学的モデルを構築するための被験者試験を行う。最終的には、電気機器システムを直接人間の状態把握に応用するという方法論を一般化し、電気工学と神経心理学をつなぐための応用抽象化と総合デザインに関する学理を明らかにすることを目指す。
染色体凝縮制御因子による増殖制御機構

染色体凝縮から細胞分裂に至る過程は、サイクリンーCDC2/28キナ-ゼにより制御され、さらに動物細胞ではRCC1が染色体凝縮を制御している。一方、酵母においてサイクリンーCDC28キナ-ゼの活性は、接合因子による情報伝達系により制御され、この伝達系に関与する遺伝子SRM1がRCC1と相同性があることが明らかになった。本研究では、染色体凝縮からサイクリンーCDC28/2キナ-ゼ活性化に至る制御機構を解明する目的で、酵母の接合因子シグナル伝達経路におけるSRM1とサイクリンーCDC28キナ-ゼとの関係について解析を行なった。酵母と動物細胞のCDC2キナ-ゼによる制御機構が類似していることを確認する目的で、G1期で増殖を停止する酵母のcdc28温度感受性変異株に、Hela細胞由来のcDNAライブラリ-を導入し、高温での増殖を回復させる遺伝子(CDK2)を分離した。CDK2のアミノ酸配列は、G2期で働くヒトCDC2と60%、G1期で働くXenopus Eg1キナ-ゼと90%同一であった。従って、G1期で作用するヒトCDK2キナ-ゼが酵母のG1期の制御を行なうことが明らかになった。さらに、CDC2ーキナ-ゼ・ファミリ-に属するSGV1ーキナ-ゼが、酵母のG1サイクリンを制御することを示した。次に、SRM1と相互作用する同定する目的で,温度感受性srm1変異の抑圧変異ssr1を分離した.SSR1遺伝子はmRNAスプライシングに関与するSPP81遺伝子と同一で,マウスのPL10タンパクと49%の相同性をもつATP依存性RNA helicaseをコ-ドすることが明かとなった。
TRPV1とTRPA1の相互作用による侵害刺激受容の分子機構の解明

TRPは、6回膜貫通領域を有する非選択性陽イオンチャネルである。その中で、カプサイシン、熱刺激や酸刺激により活性化するTRPV1と、冷刺激やワサビ・シナモンの辛味成分により活性化するTRPA1は、侵害刺激および温度の受容体として重要な役割を果たしている。本研究では、両者が共発現する感覚神経細胞があることに着目し、両者の機能的な連関による侵害刺激受容のメカニズムがあるという新規の仮説を検証している。培養細胞にTRPV1のみ、TRPA1のみ、あるいは両受容体を発現させた異所性発現系にパッチクランプ法を適用して、電気生理学的機能を解析した。その結果、TRPA1リガンドであるアリルイソチオシアネートを適用すると、TRPA1のみ発現する場合よりTRPA1とTRPV1の両受容体を発現する場合に大きい活性化電流が認められた。上記の結果は、マウスより単離した感覚神経細胞を用いた解析でも観察された。また、アリルイソチオシアネートによるマウスの疼痛関連行動が、TRPA1欠損マウスのみならず、TRPV1欠損マウスでも減弱していることが観察され、TRPA1の機能的発現にTRPV1が関与することと合致する結果が得られた。さらに本研究を進める間に、第一級アルコールが炭素数依存的にTRPA1を活性化することを見出した。TRPA1を発現させた培養細胞にパッチクランプ法を適用し、第一級アルコールによる活性化電流を確認し、TRPA1活性化に重要なアミノ酸を同定した。一方、マウスTRPA1は第一級アルコールによる活性化能がヒトTRPA1より弱く、マウスにおいて強い疼痛関連行動を起こさないことが明らかとなった.第一級アルコールは、皮膚や眼、鼻の炎症を引き起こすことが知られており、ヒトにおいてはその反応にTRPA1が関与する可能性が示唆された。本研究では、両者が共発現する感覚神経細胞があることに着目し、両者の機能的な連関による侵害刺激受容のメカニズムがあるという新規の仮説を検証することを目的とする。一方、TRPV1リガンドによる活性化はTRPV1の存在により影響されなかった。感覚神経では、TRPA1発現細胞はほぼすべてTRPV1を発現していることが報告されており、上記の結果はTRPA1機能にTRPV1の存在が必要であることを示唆するものである。TRPV1とTRPA1の物理的な結合を免疫沈降法により検討したが、両者の結合は認められなかった。今後、電気生理学的解析で得られたTRPV1によるTRPA1機能の増強メカニズムについて、マウス感覚神経細胞の電気生理学的解析やマウス個体を用いた痛み関連行動解析も含めて解析する。TRPV1とTRPA1が機能的に連関している可能性を分子のレベルおよび個体のレベルにおいて示した本研究結果は、侵害刺激受容の分子機構を明らかにする上で非常に重要であると考えられる。今後は、TRPA1タンパク質の発現量やTRPA1活性を調節する因子に対するTRPV1の関与について解析を進め、このメカニズムを明らかにする予定である。

培養細胞にTRPV1のみ、TRPA1のみ、あるいは両受容体を発現させた異所性発現系にパッチクランプ法を適用して、電気生理学的機能を解析した。その結果、TRPA1リガンドであるアリルイソチオシアネートを適用すると、TRPA1のみ発現する場合よりTRPA1とTRPV1の両受容体を発現する場合に大きい活性化電流が認められた。上記の結果は、マウスより単離した感覚神経細胞を用いた解析でも観察された。また、アリルイソチオシアネートによるマウスの疼痛関連行動が、TRPA1欠損マウスのみならず、TRPV1欠損マウスでも減弱していることが観察され、TRPA1の機能的発現にTRPV1が関与することと合致する結果が得られた。さらに本研究を進める間に、第一級アルコールが炭素数依存的にTRPA1を活性化することを見出した。TRPA1を発現させた培養細胞にパッチクランプ法を適用し、第一級アルコールによる活性化電流を確認し、TRPA1活性化に重要なアミノ酸を同定した。一方、マウスTRPA1は第一級アルコールによる活性化能がヒトTRPA1より弱く、マウスにおいて強い疼痛関連行動を起こさないことが明らかとなった.第一級アルコールは、皮膚や眼、鼻の炎症を引き起こすことが知られており、ヒトにおいてはその反応にTRPA1が関与する可能性が示唆された。