hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
In vivoでがん転移を促進するマイコプラズマ分子の構造と機能

マウスを用いたヒト大腸癌RPMI4788細胞の肺転移の実験系に関するこれまでの研究により、In vivoでマイコプラズマ由来のAg243-5分子が肺への癌転移促進作用を示すことが明らかにされた。本研究ではこの分子機構を明らかにするため、In vitroの実験系においてAg243-5が細胞にいかなる影響を及ぼすのかについて検討を進めた。サイトカインの産生に及ぼす影響を検討するために、Ag243-5投与後のマウスの脾臓および肺について,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,TNF-α,TNF-β,IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-9,IL-10,G-CSF,M-CFS,GM-CSF,LIF,TGF-βの遺伝子発現に及ぼす影響をRT-PCR法で検討した。その結果、いずれの遺伝子発現においてもヒト大腸癌RPMI4788細胞の肺転移との関連性は認められなかった。このため、当初予定していたAg243-5遺伝子のトリプトファンをコードするTGA(通常はストップコドンとして読まれる)をTGGに改変し、E.ColiでAg243-5遺伝子を発現させ、リコンビナントAg243-5を調整する計画は延期された。接着分子の発現に対する影響を検討する必要があると考えられる。ヒト末梢血リンパ球のcDNAについて、Ag243-5のホモログの有無を調べるため、Ag243-5遺伝子断片を作成し,Southern blot解析、およびAg243-5遺伝子の合成プライマーを用いたRT-PCRを行ったが、ヒトでのホモログは見いだされなかった。既知のタンパク分子データーバンクを用いたアミノ酸配列のホモロジー検索からも、何らかの機能を推測させるモチーフは得られていない。今後、本研究を推進するためには、Ag243-5の生理活性を追跡しうるIn vitroの実験システムの確立が必須であると考えられる。
インスリン経路と脂質代謝経路の相互作用に基づく神経回路スイッチ機構の解明

インスリンシグナル伝達は線虫の記憶学習を制御する。2種類存在する線虫のインスリン受容体のうち、味覚神経の細胞体に局在するタイプは学習の成立に、軸索に局在するタイプは学習後の行動出力に働く。学習に伴い、軸索で働くインスリン経路は脂質代謝経路と相互作用し、味覚神経が接続する2種の介在神経への出力を切り替えることが示唆されているが、その詳しい機構は不明である。本研究は、オミクス解析に基づく包括的解析により、記憶形成及び学習に伴う神経回路の切り替え時に働く分子経路を明らかにしたい。さらに、それらの分子の学習前後における動態を計測することで、神経可塑性を制御する分子機構の数理モデル構築に貢献したい。
幹細胞分化能の網羅的評価に向けた細胞核力学特性計測技術

本研究では、細胞のdeformability(変形能)の定量的評価を目的として、単一細胞を高密度に捕捉するマイクロキャビティアレイ基板を利用し、1万個の細胞を同時並列に吸引変形させる測定装置を開発した。さらに、共焦点顕微鏡を用いた細胞の3次元イメージングによりマイクロキャビティアレイ上に捕らえた細胞の3次元画像構築及び輝度・距離の定量的計測方法を確立した。本手法を用いて細胞のdeformabilityを網羅的且つ定量的に計測し、細胞の分化や正常細胞のがん化などの進行度とdeformabilityの相関性について評価した。本研究では、細胞のdeformability(変形能)を網羅的且つ定量的に計測する技術を開発し、細胞の幹細胞の分化や正常細胞のがん化などの進行度とdeformability(変形能)の相関性について評価することを目的とした。はじめに、細胞のdeformability(変形能)の定量的評価を目的として、単一細胞を高密度に捕捉するマイクロキャビティアレイ基板を利用し、10万個の細胞を同時並列に吸引変形させる測定装置を開発した。また、共焦点顕微鏡を用いた細胞の3次元イメージング法の検討、核質・細胞質・各種骨格タンパク質の染色法について検討を行った。撮像法および画像解析法の検討により、マイクロキャビティアレイ上に捕らえた細胞の3次元画像構築及び輝度・距離の定量的計測方法を確立した。本手法により、微細貫通孔内部への細胞の変形陥入長や細胞質と細胞核の変形長の比などについて、多数の細胞を対象として同時多並行に計測することが出来る。諸検討の後、モデル細胞としてヒト乳がん細胞MCF-7及び正常ヒト乳腺細胞MCF-10を用いて、微細貫通孔内部への細胞の変形陥入長を計測した。この結果、細胞に印加する吸引圧が大きくなるほど、細胞の変形は大きくなる傾向がある事が確認された。特に、正常細胞に比べ乳がん細胞では変形長が大きく、2種の細胞間で有意な差が確認された。これは、細胞骨格タンパク質及び核構造タンパク質の発現量に依存すると考えられたため、F-actinおよび核を染色した細胞の3次元観察を行った。この結果、MCF-7の場合では細胞質とともに細胞核も吸引圧により変形を受けていること、F-actinの発現量が正常細胞に比べて低いことが確認された。本技術により、数百から数万個の細胞の変形能を網羅的に解析可能であることが示された。さらに、技術を高度化することにより幹細胞の分化進行度の評価指標にも応用可能であり網羅的解析の実現が期待される。
甲状腺癌未分化転化前後のペア検体を用いた転化メカニズムの解明

甲状腺癌において最も発症頻度が高い乳頭癌の10年生存率は90%以上あり、甲状腺癌全体としては予後良好とされる。しかしながら、全甲状腺癌の12%程度である未分化癌は、1年生存率16%程度と予後不良である。主として未分化癌は乳頭癌を含む分化癌から転化すると考えられている。未分化転化のメカニズムには不明点が多く、そのバイオマーカーも確立されていない。本研究では、分化癌の未分化転化を規定・予測する遺伝子異常を特定し、それに基づく患者層別化により、真の高危険度乳頭癌群に対する積極的治療の検討、などの診療オプションの創造ないし確度の向上をめざす。これらを通じて、甲状腺癌患者のQOL向上に貢献したい。
脳画像の適正な社会的使用のための基礎研究

本研究では、次のプロジェクトを遂行した。(1)脳画像の効用と限界についての実践家の見解を調査した。(2)脳科学と脳画像に関する一般市民の知識についてサーヴェイ調査を行った。(3)脳画像をめぐる司法的・神経心理学的・脳神経倫理学的問題と議論の現状をサーヴェイした。(4)脳画像の責任帰属に対する心理的影響を明らかにするための実験を心理学実験を行った。(5)脳画像の信頼性と妥当性、限界についての科学コミュニケーションプログラムを構築した。(6)一般に流布している脳科学・心理学の「神話」を暴き、正しい心理学的知識の現状を市民に伝える書籍を翻訳し、出版の準備を行った。本研究は、fMRI、PET、MEGなどの脳画像技術のもたらしうる社会的・倫理的・法的問題を解決し、これらの技術と社会との望ましい関係を構築することを目的として、脳画像が責任帰属に与える心理的影響を調べる実験を中心としたいくつかの調査の結果に基づいて、脳画像の司法の場における適切な使用のあり方の提言と、脳画像についての基本的知識を市民に伝えるコミュニケーション・プログラムの開発を行っている。本年度は具体的には以下のプロジェクトを遂行した。脳画像技術の発展がもたらしうる社会レベルでの問題および倫理的問題についての文献調査と欧米の先進的研究者への聞き取り調査、ワークショップ等への参加を通じて情報を収集し、論点を整理した。研究者への聞き取り調査は、専門と人的ネットワークに応じて分担して行う。えられた知見を、戸田山が中心となって論点整理した。脳画像の責任帰属に対する心理的影響を明らかにするための実験を21年度に実施する計画であるが、そのための実験計画を策定した。そのために、数度のミーティングを実施し、実験の方法と分析手法、質問紙の作成方針について議論し、それらを確定した。また、実験のロジスティクスを検討する中で、研究分担者の追加が必要と判断したため、21年度より、八田武俊氏を分担者に追加することとした。本年度より21年度より、八田武俊氏を分担者に追加することとし、具体的には以下のプロジェクトを遂行した。脳画像の責任帰属に対する心理的影響を明らかにするため、数度のミーティングを開催し、実験の方法と分析手法、質問紙の作成方針についての議論を経て、大学生対象に実験を実施した。その結果、軽微な犯罪に関して、脳画像が責任帰属に有意な結果を与えるとの知見を得た。9月に名古屋で開催された日本神経科学会のサテライトシンポジウムとして「社会感情神経科学研究会」を開催し、そこで上記の結果の他、研究の中間総括を発表した。脳画像技術の発展がもたらしうる社会レベルでの問題および倫理的問題についての文献調査、論点整理等を引き続き実施した。脳画像の信頼性と妥当性、限界についての科学コミュニケーションプログラムについて検討した。その成果も踏まえて、脳神経科学に関する誤信念(たとえば、fMRIやPETなどの脳画像で、人間の知能レベルが測定できる、といったもの)が、大学生母集団にどの程度浸透しているのか、また、その誤信念が中枢神経系の構造と機能についての基礎的講義によってどの程度訂正されるのかについての実験調査を行い、結果を「神経科学情報に関する誤信念の浸透度とその修正可能性について」にまとめて発表した。また、イタリア・トリノで行われた科学フェスティバルEuro Science Open Forumに参加し、そこでの一般市民向け企画の中で、脳科学についてどのような一般向け情報提供がなされているかを調査したほか、本研究のいわば副産物として、ポピュラー心理学における誤信念を解説した一般向け書籍(50 great myths of popular psychology)の翻訳出版を進めた(2011年出版予定)。
波長可変遠赤外光源を用いた分光法の広帯域化と高分解能化

本研究の目的は,これまで我々が開発し使用してきた,炭酸ガスレーザー差周波型の遠赤外分光計に改良を加えることにより,(1)非線形分光の手法により分解能のより高い測定を行えるようにすること,(2)分光計の周波数域を現在の上限の6THzよりさらに高周波側へ拡張すること(3)これら成果を分子のスペクトル測定に応用すること,である。予算は年度後半に補正として認められたので,半年遅れのスタートであったが,目標(1)(2)はほぼ8割がた達成し,目標(3)では(1)の一部成果を利用して分子イオンの測定が行われ,Physical Review Letter誌に成果発表を行った。各目標にたいする成果は具体的に以下の通りである。(1)非線形分光法の1つである飽和くぼみを観測できるように,分光計に適したファブリーペロ型光共振器を設計し,反射鏡の発注を行った。これに先立ち予備的な実験を行い設計のためのデータを揃えた。また,光源の強度を強くするために,2波混合型の分光計を組立て,実際に使用できるようにしたり,光混合用のダイオードの特性を改良した。反射鏡を入手次第最終的な実験にかかる。(2)周波数を高周波側へのばすために,光混合用に出力1ワット級の半導体レーザーを用意し,これらの基本性能を調べた。また,同種レーザーと外部共振器を用いて周波数制御が行えるようにした。レーザー用の電源が2組揃ったら最終的な光混合実験を行う。(3)目標(1)で得られた光源の改良により,吸収強度の弱い分子イオンのスペクトルの測定ができた。HeH^+イオンの回転スペクトルについて周波数の測定,解析を行い発表した。
炎症による前立腺発癌機構に関する研究

「前立腺炎症後の再生における骨髄由来細胞浸潤」GFPキメララットの経尿道的LPS投与による前立腺炎症モデルにおいて、その再生過程で前立腺に浸潤する細胞をFACSにて解析したところ、腺管内に骨髄由来の細胞が浸潤していることが明らかとなった。免疫組織染色や定量的PCRより、前立腺再生腺管内に浸潤する骨髄由来細胞が上皮系のマーカーであるcytokeratin 8(CK8)を発現していることが分かった。このことは炎症により破壊された前立腺においては、浸潤した骨髄由来細胞が上皮系幹細胞となって腺管再生に寄与している可能性を示唆する。昨年度までで、我々が確立したラットの前立腺炎モデルにおいて、前立腺組織破壊からの再生過程で、Sca-1, CD117, CD133など幹細胞マーカーを発現する細胞分画が増加していることが明らかになった。平成25年度においては、これらの幹細胞の性質を有する細胞がどこから来るのかを調べるため、GFPラットの骨髄移植モデルを用いた。すなわち、ラットに全身放射照射を行い、GFPラットの骨髄を移植し、骨髄のみGFP発現のキメララットを作成した。このラットにリポポリサッカライド(LPS)を経尿道的に投与し前立腺炎を起こし、2週、8週、12週、32週目に前立腺を採取し、抗pancytokeratin抗体(luminal cell)、抗CK14抗体(basal cell)、抗GFP抗体(骨髄)を用いて蛍光免疫染色を行った。また、2週目に採取した前立腺をコラゲナーゼにて分解し、FACS ariaでCD45陰性かつGFP陽性の細胞分画をsortingした。この細胞のサイトケラチンの発現を免疫染色とqPCRで評価した。その結果、LPS投与後2週目で最も前立腺腺管は破壊されており、luminal cellへの骨髄細胞の浸潤が認められた。また、その一部にGFPとpancytokeratin共陽性細胞を認めたが、CK14とGFPの共陽性は認められなかった。8週、12週、32週目でも炎症は残存し、一部の腺管においてはGFPとpancytokeratinの共陽性細胞が認められた。さらに、sortingした細胞は蛍光免疫染色でGFPとpancytokeratinの共陽性を認め、qPCRにてluminal cellのマーカーであるCK8のmRNAレベルが上昇していることが確認された。本年度は、ラット前立腺炎モデルを用いて、前立腺炎による前立腺組織の破壊から再生の過程でどのような細胞分画が変化するか検討した。具体的には、前立腺炎を引き起こしてから2週後の前立腺組織を採取し、細切し、コラゲナーゼ処理をした後、CD45陰性の非血球系細胞の中で、前立腺の幹細胞で発現していると考えられているCD44, CD49f, Sca-1, CD117, CD133陽性細胞の変化を検討した。その結果、炎症を起こしてから2週後の組織でCD177, Sca-1共陽性の細胞分画が増加することが明らかとなり、この細胞分画が前立腺の再生に関与している可能性が考えられた。「炎症と発癌」この系において前立腺の発癌誘導剤であるPhIPを投与すると、癌には至らないまでも、前癌病変として知られるprostatic intraepithelial neoplasia (PIN)を高頻度に形成することが分かった。これらのPIN病変においては細胞増殖が亢進しており、発癌の前段階に達しているものと判断された。しかし、長期にPhIPを投与しても発癌率には有意な差を見いだし得なかった。このPhIPによる発癌誘導の系では、前立腺発癌に1年以上の期間を要してしまうため、繰り返し実験を行うことが困難である。「遺伝子改変前立腺発癌モデルの導入」Cre/LoxPシステムを用いたPTEN遺伝子の前立腺特異的ノックアウトマウスを作成し、その発癌過程を観察した。6週でほぼすべてのマウスの前立腺様病変が生じ、12週で癌を形成することが観察された。この前立腺を摘出し、浸潤する細胞を骨髄由来細胞をその表面マーカーによってsortingし、さらに種々のマーカーで分画を調べた。その結果、全細胞中の骨髄由来細胞(CD45+)の増加、CD45+細胞中のMDSC細胞(骨髄由来幹細胞)の比率の増加、CD45+細胞中の樹状細胞の増加を認めた。

発癌過程での骨髄由来細胞、免疫系細胞の浸潤が認められ、何らかの役割を果たしていることが示唆された。腫瘍炎症後の再生において、骨髄由来の幹細胞分画が重要な役割を果たしているという知見を得ることは出来たが、ラットのPhIPを用いた発癌過程は40週以上かかるため、研究はやや遅れ気味である。本年度の研究計画の一つは、フローサイトメトリーによる前立腺幹細胞の分離を機能解析である。ラット前立腺組織の細切と、フローサイトメトリーを用いてのそこからの細胞分離は技術的難度が高い。以前の研究から、LPSによる前立腺炎では約2週間目において最も上皮再生が盛んであることがわかっていたので、2週目の前立腺を用いて幹細胞マーカーの発現検討を行った。前立腺の幹細胞マーカーとしてはCD44, CD49f, Sca-1, CD117, CD133などが報告されているが、検討の結果、CD177, Sca-1共陽性細胞の存在が明らかになった。これらの細胞はソーティングが可能である。これらの細胞を可能な限り回収して3次元培養を行うことで組織再生能や多分化能の検討も可能であると思われる。今回の研究課題の中で最も重要かつ律速段階となることが予想されたところであるが、当初の予定通り結果を出すことが出来たと考える。前立腺における炎症から発癌の過程を観察することが非常に重要な研究課題であると考えているが、PhIPによる発癌はラットでしか行えない。当初の予定には無かったが、遺伝子改変マウスを用い炎症モデルの確立を進めており、まもなく出来る予定である。これを用いることによって、もっと効率的に炎症後の再生過程のおける発癌メカニズムを調べることが出来ると考えている。ローサイトメトリーによる前立腺の再生に関する細胞の同定を進めていく。本年度で見られたCD177, Sca-1陽性細胞の性質を検討していく。この細胞が十分量回収できるようであれば、これらの細胞が炎症後にどのような遺伝子が変化するのか、cDNA microarrayで検討する。また、PhIPによる萎縮性病変、前癌病変、癌組織からmicrodissectionによりDNAを採取し、DNAのepigeneticな変化と、遺伝子のコピー数の変化などを検討する。ヒトの前立腺癌手術検体から得られた癌病巣とPIN病巣におけるCGH arrayによる、遺伝子のコピー数変化の網羅的解析を予定していたが、実際のホルマリン包埋検体から抽出したDNAはかなり変性が激しく、CGH arrayにあまり適していなかったため、CGH array実験が充分に行えなかった。当初の予定にはなかった、骨髄移植ラットを用いた炎症の再生過程の実験により、新しい知見が得られたため、研究計画をややそちらにシフトし、前立腺援護の再生過程における骨髄細胞の役割を解析する研究に使用したい。また、ラットよりマウスの方が圧倒的に研究がしやすいため、PhIPを用いた発癌系を遺伝子改変マウスを用いた発癌系に変えたいと考えている。26年度の動物実験に関する予算は元々充分であるとはいえなかったので、可能であればこれらの実験動物の費用に充てたい。フローサイトメトリーによる実験の経費。
中世における「テトラビブロス」の伝承の研究

プトレマイオスによる『テトラビブロス』のアラビア語校訂版を作成する過程で初めて得られた知見は、9世紀のフナイン・イブン・イスハークが改訂したとされるアラビア語写本が全部で9種類現存することが確認できたこと、サービト・イブン・クッラ(9世紀)がナイン版にどの程度手を加えたかが判明したこと、そしてフナイン版とウマル版がともに、現存する唯一のシリア語写本から翻訳されたものではないことが判明したことである。2世紀にプトレマイオスによって書かれた占星術書『テトラビブロス』のアラビア語訳の校訂版を作り、それをギリシア語原典およびシリア語訳と比較検討することが目的である。具体的な手順は以下の4つに分けられる。(1)フナイン版アラビア語テキストの校訂版作成。(2)ウマル版アラビア語テキストの校訂版作成。(3)フナイン版とギリシア語校訂版との比較。(4)フナイン版とシリア語訳テキストとの比較。2世紀のプトレマイオスが著した『テトラビブロス』は、9世紀にアラビア語に2回翻訳されたことがわかっている。最初は、写本が現存していないが、ウマル・イブン・アル=ファッルハーンの注釈という形で残っている。2度目の翻訳はフナイン・イスン・イスハークによるものである(以後フナイン版と呼ぶ)。この写本については、今まで不明であったインドのハイデラバードにある2写本を確認するために、18年8月に現地調査を行った。その結果、サイーディーヤ図書館のハイア33と、アーサフィーヤ図書館のハイア79はともに、『テトラビブロス』ではなく、クーシュヤールの『占星術入門』であることがわかった。10世紀のイブン・アン=ナディームの『フィフリスト』によれば、サービト・イブン・クッラは『テトラビブロス』のアラビア語訳(フナイン版)の「第1巻を集めて、その意味を明らかにした」ことになっている。通常、他の者が翻訳したテキストを直す場合は「アスラハ」(修正・訂正する)、また注釈を施す場合は「ファッサラ」(説明する)という表現が使われる。したがって、サービトが行なった仕事は、そのどちらでもないように読み取れる。そこで、アラビア語写本を調べ、サービトが行なった仕事を検証してみた。フナイン版の7写本のうち2写本が本文中にサービトの「注」を入れており、ひとつが欄外にそれを書き留めている。これらの「注」は、すべて「サーピトは言った・・・」という表現で始まっており、前者では第1巻に10箇所、第2巻に2箇所、後者では第1巻に7箇所、第2巻に3箇所に見られる。これらの「注」の内容は、語句、あるいは内容の説明になっていて、しかもほとんど第1巻に集中していることから、イブン・アン=ナディームが言及している、サービトが「意味を明らかにした」テキストを伝える写本だとみなしてもよいと考えられる。2世紀にアレクサンドリアで活躍した天文学者プトレマイオスによる占星術書「テトラビブロス」の、中世における伝承過程を研究するために、今までアラビア語写本を調査してきた。昨年8月には、テヘランにおいてその調査を行なった。まず、テヘラン大学中央図書館(Central Library of Tehran University)では、新たにフナイン・イブン・イスハーク(9世紀)による翻訳改訂版の「テトラビブロス」の写本を見つけ、CDに保存してもらうよう依頼した。またアリー・イブン・リドワーン(11世紀)による「テトラビブロス注解」の写本も依頼した。それらの写本番号はそれぞれDanishgah 830と474であるが、未だに手元に届いていない。さらに、国立図書館(Milli Library)と国立マリク図書館(Milli Malik Library)においても、アリー・イブン・リドワーンによる「テトラビブロス注解」の写本(Milli 1729およびMalik 3432)を確認し、CDに記録してもらった。これらの他に、直接「テトラビブロス」とは関係ないが、偽プトレマイオスによる占星術的アフォリズムである「ケンティロクイウム」の写本(Malik 6099/4、Danishgah 1971、およびマドラサ・アリー・シャヒード・ムタッハリー図書館Sipahsalar 612)、さらにビールーニー(11世紀)の「占星術教程」(Sipahsalar 665および国民議会図書館Majlis 162)、カスラーニー(9世紀)の「質問占星術」(Milli 1011)、そして偽アリストテレスの「アフォリズム集」(Majlis 4345および5283)をCDで入手した。最初の翻訳の写本は現存しないが、ウマル・イブン・アル=ファッルハーンの注釈が全部で3写本残っている(以後ウマル版と呼ぶ)。そのうちの1写本のみに、ウマル自身の序文がつけられている。

2度目の翻訳はアル=バトリーク・アブー・ヤフヤーによるものであり、フナイン・イブン・イスハークがそれを改訂した。後者のみが8写本残っている(以後フナイン版と呼ぶ)。ウマル版はフナイン版に比べてかなり簡潔に記されており、全4部のうち第3部の最後の章は全く扱われていない。占星術・天文学の専門用の使い方についても、両者では大きく異なっている。章区分について、ギリシア語版(G)と2つのアラビア語版(U,H)を比較すると、さまざまな相違がみられる。なお、ギリシア語版は、1998年に出版されたヒューブナー版を用いた。第1部では、Uだけが、第9章を9、10、11章に、また21章を23、24、25章に分けている。したがって、G、Hが全24章であるのに対して、Uは27章からなっている。第2部では、GとUが共通しているのに対して、Hは2章と3章で節の区分が異なっている。第3部では、やはりHのみが他と異なり、G、Uの第1章に当たる部分を、章なしで第1章の前に置いている。第4部では、HのみがG、Uの1、2章をまとめて第1章としている。したがって、一般に章区分はHよりもUの方がGに近いと言える。また、フナイン版には、サービト・イブン・クッラが、一部の語彙に説明を加えている記述があり、8写本のうち5写本でそれを確認することができる。プトレマイオスによる『テトラビブロス』の2種類のアラビア語版のうち、フナイン・イブン・イスハークによって改訂された、いわゆる「フナイン版」のアラビア語写本がひとつ新たに見つかった。それは、British Library Or. 9115(ff.131b-206b、西暦1686年)である。これは、カイロ写本およびザーヒリーヤ写本にきわめて近いものであり、サービト・イブン・クッラによる解説が付いている。また、パリの国立図書館にある唯一のシリア語訳写本については、年代が必ずしもアラビア語訳以前だという確証を得ることができず、アラビア語版がシリア語版から作られたという可能性は極めて低いことがわかった。したがって、シリア語版とアラビア語版はそれぞれ別のギリシア語原典から翻訳されたと考えられ、当初予定していた、シリア語版とアラビア語版の比較検討は、あまり重要なものではなくなった。『テトラビブロス』第1巻第9章「恒星の力」から判断する限り、ウマル・イブン・アル=ファッルハーンによる「ウマル版」は、ギリシア語版とは大きく異なっており、単なる要約というよりも、現存しないパフラヴィー語版からの要約の可能性もあると思われる。また、「フナイン版」について言えば、「恒星の力」の章に含まれる、各恒星に帰される惑星の性質の記述から判断して、ギリシア語版との決定的な違いが部分的に明らかになった。もっぱら12世紀以降の写本に依存した現行のギリシア語版がどこまで正しい「原典」を伝えているかについても検討する余地がでてきたと言える。
重症肥満症に対する低侵襲外科治療効果と脂肪細胞由来ホルモン動態の解析

研究では、腹腔鏡下スリーブ状切除術(LSG)を施行した高度肥満症(BMI ≧35 kg/m2 +肥満随伴疾患)を対象に、メタボリックシンドロームの発症において重要な役割を果たすアディポサイトカインおよび摂食行動の制御にかかわるグレリン、レプチンの動態を解析する(primary point)。さらに基礎医学分野として、肥満症患者の病態形成にかかわる分子機構を解析する目的で、インスリン抵抗性関連遺伝子の遺伝子多型、分離培養した内臓脂肪初代培養細胞におけるアディポサイトカイン分泌能を検討し、さらに肥満関連遺伝子のmethylation解析とmRNAを用いたマイクロアレイ解析を行う(secondary point)。LSG群では、高レプチン、低アディポネクチンの血中動態が明らかで、対照群と比較しても有意な変化であった。レプチンとアディポネクチンの動態はin vivoとin vitroで同様の動態を示しており、これらは内臓脂肪細胞依存性に産生されている可能性が示唆された。肥満関連遺伝子多型は、LSG症例でUCP1のAG、GG型を多く認めた。UCP1の多型は、術前BMIが高い傾向が見られたが術後減量効果に差を認めなかった。レプチンとアディポネクチンの動態はin vivoとin vitroで同様の動態を示し、これらは内臓脂肪細胞依存性に産生されていた。従って、もともとアディポサイトカイン産生プロファイルが高く設定された病的肥満症では、減量手術によって遺伝子多型にかかわらずアディポサイトカイン産生プロファイルが低下し、もともとの個体に遺伝子多型にかかわらず効果が期待できる可能性がある。2011年3月までに内科的治療抵抗性の高度肥満症9名に対して腹腔鏡下スリーブ状胃切除術を施行し、検討を行った。患者背景は、平均年齢33歳(24-52歳)、男性7名、女性2名、術前平均体重143kg(99-180kg)、平均BMI47kg/m^2(41-56kg/m^2)、平均健康障害数5疾患(4-7疾患)であった。術後平均体重減少は、術後6か月36kg(22-48kg)、術後1年43kg(29-58kg)、平均超過体重減少率は、術後6か月55%(42-70%)、術後1年69%(49-87%)と著明な減量が得られた。肥満関連健康障害は、全例で改善した。血中グレリン濃度(術前16.2vs.術後10.1pg/ml, p=0.374)は、欧米の報告よりも著明に低値であった。また、胃穹窿部大彎側の胃壁内グレリン陽性細胞数は、腹腔鏡下スリーブ状胃切除術を施行した高度肥満症患者(3/10HPFs)と胃全摘を施行した胃癌患者(2/10HPFs)とで有意差を認めず、日本人におけるグレリン動態の解析に興味がある結果となった。血中レプチン濃度(30.4vs. 18ng/ml, p=0.165)は、術後に低下する傾向を示した。手術で得られた脂肪細胞からのDNAの抽出は、通常よりも不純物質が明らかに多く、基礎研究と熟練した技術を要した。われわれは、QIAGEN社製のDNeasy Tissue Kitを用いてDNA抽出行い、代表的な肥満関連遺伝子のmethylationをMethylation-specific PCR(MSP)法により解析中である。また、mRNAによるマイクロアレイ解析では、脂肪細胞から抽出したmRNAを網羅的に検索して脂肪細胞に特異的に発現している、もしくは減少している遺伝子群を同定中である。研究では、腹腔鏡下スリーブ状切除術(LSG)を施行した高度肥満症(BMI≧35 kg/m2+肥満随伴疾患)を対象に、メタボリックシンドロームの発症において重要な役割を果たすアディポサイトカインおよび摂食行動の制御にかかわるグレリン、レプチンの動態を解析する(primary point)。

さらに基礎医学分野として、肥満症患者の病態形成にかかわる分子機構を解析する目的で、インスリン抵抗性関連遺伝子の遺伝子多型、分離培養した内臓脂肪初代培養細胞におけるアディポサイトカイン分泌能を検討し、さらに肥満関連遺伝子のmethylation解析とmRNAを用いたマイクロアレイ解析を行う(secondary point)。LSG群では、高レプチン、低アディポネクチンの血中動態が明らかで、対照群と比較しても有意な変化であった。レプチンとアディポネクチンの動態はin vivoとin vitroで同様の動態を示しており、これらは内臓脂肪細胞依存性に産生されている可能性が示唆された。糖尿病を合併した症例では、特にPAI-1が有意に高値であった。肥満関連遺伝子多型は、LSG症例でUCP1のAG、GG型を多く認めた。UCP1の多型は、術前BMIが高い傾向が見られたが術後減量効果に差を認めなかった。従って、もともとアディポサイトカイン産生プロファイルが高く設定された病的肥満症では、減量手術によって遺伝子多型にかかわらずアディポサイトカイン産生プロファイルが低下し、もともとの個体に遺伝子多型にかかわらず効果が期待できる可能性がある。2研究目的:研究では、減量手術を施行した高度肥満症(BMI≧35 kg/m2+肥満随伴疾患)を対象に、メタボリックシンドロームの発症において重要な役割を果たすアディポサイトカインおよび摂食行動の制御にかかわるグレリン、レプチンの動態を解析する(primary point)。LSG群では、高Lep、低Adの血中動態が明らかで、対照群と比較しても有意な変化であった。LepとAdの動態はin vivoとin vitroで同様の動態を示しており、これらは内臓脂肪細胞依存性に産生されている可能性が示唆された。LepとAdの動態はin vivoとin vitroで同様の動態を示し、これらは内臓脂肪細胞依存性に産生されていた。これまでのところ、順調な症例集積と研究成果であり概ね順調である。しかしながら、臨床研究としては順調な部分がある反面で、手技や技術の成熟を必要とする基礎研究では成果が得られるまでさらなる研究が必要であると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。脂肪細胞からのDNAの抽出は、通常よりも不純物質が明らかに多く、熟練した技術を要する。われわれは、QIAGEN社製のDNeasy Tissue Kitを用いてDNA抽出行い、代表的な肥満関連遺伝子のmethylationをMethylation-specific PCR(MSP)法により解析する。
圧電センサによる航空機CFRP構造の衝撃損傷モニタリングの研究

本研究では,将来の航空機CFRP構造の信頼性・安全性の一層の向上を図るため,ひずみセンサを構造内に組み込んだ知的複合材構造について,運航中に衝撃荷重を自動的・実時間でモニターし,その衝撃荷重情報からCFRP構造の損傷状態を実時間で予測する評価技術を確立することを目的としている.本研究で得られた主要な成果は以下の通りである.1.解析モデルを必要としない実験的衝撃荷重同定法を構築し,この関係を用いて衝撃荷重位置・履歴の同定を行った.特に,インパルスハンマ打撃による伝達関数作成法を完成させ,この伝達関数を用いて衝撃荷重同定を行った.本手法をCFRP補強パネル,および,落錘衝撃下のCFRP積層板に適用して,高精度の衝撃荷重位置・履歴同定が可能であることを明らかにした.2. SACMA法に基づく落錘衝撃試験を行い,衝撃エネルギと最大荷重の関係,衝撃エネルギと損傷の関係を実験的に求め,解析結果とよく一致することを示した.また、超音波探傷による層間はく離の実験値と有限要素法による解析値とを比較し、はく離の大きさ・はく離形状ともよく一致する結果が得られた。3.実験的衝撃荷重同定により得られた荷重履歴より衝撃損傷の有無を容易に判定できることを示した。また、衝撃荷重同定による最大衝撃荷重の情報より,積層板内に発生する層間はく離の大きさ,および,横き裂の発生領域を実時間で予測できる手法を確立した。本研究では,将来の航空機CFRP構造の信頼性・安全性の一層の向上を図るため,ひずみセンサを構造内に組み込んだ知的複合材構造について,運航中に衝撃荷重を自動的・実時間でモニターし,その衝撃荷重情報からCFRP構造の損傷状態と残留強度を予測する解析評価技術を確立することを目的とした.本年度得られた主要な成果は以下の通りである.1.衝撃荷重を受けるCFRP積層板について,アダプティブコヒーシブモデルに基づく損傷進展解析法を提案した.本手法を落錘衝撃下のCFRP積層板に適用して,層間はく離・マトリックスき裂・繊維破断等の損傷を伴う損傷進展挙動を解析し,落錘衝撃のときの衝撃荷重履歴および損傷進展挙動を検討した.また,SACMA法に基づく落錘衝撃試験を行い,解析結果と実験結果の比較より,本解析法が航空機に用いられる多層擬似等方性CFRP板の損傷進展挙動を高精度に予測可能であることを明らかにした.2.解析モデルを必要としない実験的衝撃荷重同定法を構築した.本手法では,荷重-ひずみ関係間の変換マトリックスを実験的に求め,この関係を用いて衝撃荷重位置・履歴の同定を行った.本手法を圧電センサ埋め込みCFRP積層板,および,より複雑な構造であるCFRP補強板,アルミハニカムサンドイッチ板に適用し,インパルスハンマ打撃による検証より,高精度の衝撃荷重位置・履歴同定が可能であることを明らかにした.本手法は,有限要素モデル等の解析モデルを要しないため,解析モデルの構築が困難である複雑なCFRP構造の衝撃荷重同定法として有効となる.FRP積層板に貼付したひずみセンサより,実験的衝撃荷重同定法を用いて,落錘衝撃下の衝撃荷重履歴を同定した.実験的衝撃荷重同定法は損傷が荷重-ひずみ関係に及ぼす影響を考慮していないが,層間はく離等の損傷が比較的小さい場合には,落錘衝撃下の衝撃荷重履歴を高精度に同定可能であることを明らかにした.本研究では、将来の航空機CFRP構造の信頼性・安全性の一層の向上を図るため、ひずみセンサを構造内に組み込んだ知的複合材構造について、運航中に衝撃荷重を自動的・実時間でモニターし、その衝撃荷重情報からCFRP構造の損傷状態と残留強度を予測する解析評価技術を確立することを目的としている。本年度得られた主要な成果は以下の通りである。1.解析モデルを必要としない実験的衝撃荷重同定法を構築した。本実験的衝撃荷重同定法では、荷重-ひずみ関係間の変換マトリックスを実験的に求め、この関係を用いて衝撃荷重位置・履歴の同定を行った。

本手法をCFRP補強パネル、および、落錘衝撃下のCFRP積層板に適用して、高精度の衝撃荷重位置・履歴同定が可能であることを明らかにした。2.低速衝撃荷重を受けるCFRP積層板について、コヒーシブモデルに基づく損傷進展解析法を提案し、落錘衝撃下のCFRP積層板の層間はく離・マトリックスき裂・繊維破断等の損傷を伴う損傷進展挙動を高精度に予測することが可能となった。また、昨年度に続いて、SACMA法に基づく落錘衝撃試験を行い、衝撃エネルギと最大荷重の関係、衝撃エネルギと損傷の関係を実験的に求め、解析結果とよく一致することを示した。3.スペクトル法に基づくCFRP積層はりのラム波伝播特性解析を行い、擬似はく離を有するCFRP積層はりの実験との比較を行った。解析結果と実験結果は良い一致を示し、ラム波は主にはく離領域の後端部で反射していることを明らかにするとともに、ラム波特性よりはく離位置をかなりの精度で同定できることを明らかにした。本研究では,将来の航空機CFRP構造の信頼性・安全性の一層の向上を図るため,ひずみセンサを構造内に組み込んだ知的複合材構造について,運航中に衝撃荷重を自動的・実時間でモニターし,その衝撃荷重情報からCFRP構造の損傷状態を実時間で予測する評価技術を確立することを目的としている.本年度得られた主要な成果は以下の通りである.1.解析モデルを必要としない実験的衝撃荷重同定法を構築し,この関係を用いて衝撃荷重位置・履歴の同定を行った.特に,インパルスハンマ打撃による伝達関数作成法を完成させ,この伝達関数を用いて衝撃荷重同定を行った.本手法をCFRP補強パネル,および,落錘衝撃下のCFRP積層板に適用して,高精度の衝撃荷重位置・履歴同定が可能であることを明らかにした.2.昨年度に続いて,SACMA法に基づく落錘衝撃試験を行い,衝撃エネルギと最大荷重の関係,衝撃エネルギと損傷の関係を実験的に求め,解析結果とよく一致することを示した.また、超音波探傷による層間はく離の実験値と有限要素法による解析値とを比較し、はく離の大きさ・はく離形状ともよく一致する結果が得られた。3.実験的衝撃荷重同定により得られた荷重履歴より衝撃損傷の有無を容易に判定できることを示した。また、衝撃荷重同定による最大衝撃荷重の情報より,積層板内に発生する層間はく離の大きさ,および,横き裂の発生領域を実時間で予測できる手法を確立した。
ガス分子受容・生成系を標的とした脳微小循環血流制御機構の解明

ガス分子を生成する酵素系や受容系の多くは、他のガス生成反応と拮抗あるいは共役している例が多数存在するにもかかわらず、その生物学的・病態生理学的意義の探究はほとんどなされていない。本研究の目的は、中枢神経系(CNS)で産生される低分子ガス状メディエータの生成・受容機構を探究し、ガス分子による脳局所血流調節のメカニズムを解明することである。最近NOやCOのみならず、生体内でcysteineの分解にともなって生成される硫化水素(H_2S)が神経伝達や血管弛緩に関わる新しい分子として注目されている。そこでsGCやNOS以外のCOの標的分子の候補蛋白としてH_2S産生酵素であるcystathionineβ-synthase(CBS)に着目し、ガス状メディエータを介した情報伝達制御機構の解明を目指した。第一に、肝組織のメタボローム解析の結果から一酸化炭素(CO)がtranssulfuration pathwayを抑制することに着目し、この代謝系の律速酵素であるCBSの活性がCOにより阻害され、NOでは阻害されないCO特異的な受容体であることを見出した。これまでCOの脳血管に対する作用の検討は動物種や観察する血管のサイズ、部位、in vivoとex vivoの違い、動物の:週齢によりまちまちな知見が得られてきた。「我々は、ラット脳軟膜微小循環床でCO及びNO産生酵素の局在を検討した結果、CO産生酵素とNO産生酵素とが共存していることが判明した。さらに軟膜細動脈はHOの阻害により拡張し、局所のCO灌流により拡張が解除されることを明らかにした。NOのバイオイメージング技術を脳軟膜微小循環で施行し、脳組織におけるCOとNOのクロストークに関しての検証を行った結果、局所のHO-2から生成されるCOがNOによる血管拡張反応の抑制機構として働いていることを明らかにした。培養内皮細胞を用いた加γゴ!τoの系でもNOの生成がCOの投与により抑制されること、またCOとヘム酵素の結合を可逆的に解離できる白色光の照射により、COのNO生成抑制効果が解除できることを示した。さらに脳実質における脳血流一代謝カップリングの制御機構を徹底的に検証するため、脳表微小循環床の解析系に加えて、mouse brain slice preparationを構築した。その結果、COが脳軟膜微小循環同様tonicvasoconstrictorとして作用している証左を得た。これまでのガスシグナリングの概念は、ガス分子は比較的容易に細胞間を拡散により移動しparacrine的に作用すると考えられてきたが、これらの結果は逆にガス産生部位と受容体のanatomical proximityがガスシグナリングの重要な因子であることを強く示唆するものである。また最近NOやCOのみならず、生体内でcysteineの分解にともなって生成される硫化水素(H2S)が神経伝達や血管弛緩に関わる新しい分子として注目されている。そこでsGCやNOS以外のCOの標的分子と成りうる蛋白として脳組織内のH2S産生酵素であるcystathionineβ-synthase(CBS)に着目し、ガス状メディエータを介した情報伝達制御機構の解明を目指した。また、neurovascular metabolic couplingの分子レベルでの調節機構の実態に迫るべく、脳実質の血管作動性制御において中心的な役割を担うastrocyteのprimary cultureの実験系を確立した。そこでsGCやNOS以外のCOの標的分子の候補蛋白としてH_2S産生酵素であるcystathionine β-synthase (CBS)に着目し、ガス状メディエータを介した情報伝達制御機構の解明を目指した。第一に、肝組織のメタボローム解析の結果から-酸化炭素(CO)がtranssulfuration pathwayを抑制することに着目し、この代謝系の律速酵素であるCBSの活性がCOにより阻害され、NOでは阻害されないCO特異的な受容体であることを見出した(Shintani et al., Hepatology,2009)。

第二に、full lengthのラットCBS遺伝子を大腸菌に発現・精製し、可視分光スペクトルによるヘム軸配位子の解析を行ったところ、ヘムの2つの軸配位子のうちcysteine残基がCOと置換することが酵素反応を阻害するメカニズムであることを突き止めた。さらにCBSのN末端のヘム鉄のredox stateをH_2Sが還元型にシフトさせることにより、COによる当該酵素の阻害効果を増強するしくみがあることの証左を得た(lwabuchi et al.投稿準備中)。興味深いことに、小脳組織ではCBSがグリア細胞に、またCO産生酵素であるheme oxygenase (HO)-2がニューロンに、いずれも高発現していることが確認できた。
記憶・学習などの脳高次機能を制御する新規シグナル伝達経路の網羅的解析

前年度までに、Rho-kinaseによるSynGAP1のリン酸化によって、SynGAP1のGAP活性が低下することで、Ras/Raf/ERK経路が活性化されることを見出している。そこで、SynGAP1のリン酸化部位欠損変異体(S842A)を用い、Rasの活性化への影響を検討した。COS7細胞にMyc-SynGAP1(WTまたはS842A変異体)およびHA-Rho-Kinase -CATを共発現させた後、活性化Rasと選択的に結合するRap1-RBDを用いたプルダウン実験を行った。その結果、コントロールと比較してRho-kinase-CAT存在下で、SynGAP1のリン酸化が亢進し、活性化型Rasの結合量が増加した。一方、Myc-SynGAP1-S842A変異体では活性化型Rasの結合量の増加は認められなかった。したがって、Rho-KinaseはSynGAP1-S842をリン酸化し、SynGAP1のGAP活性を低下させることで、Ras/Raf/ERK経路を活性化させる可能性が示唆された。SynGAP1はシナプス後肥厚部に存在する足場タンパク質であるPSD95と相互作用することが知られている。そこで、Rho-KinaseのSynGAP1リン酸化によってPSD95との相互作用に影響を及ぼすかどうかを検討した。脳線条体の組織培養を行い、オカダ酸およびY27632処置を行った後、抗SynGAP1抗体を用い免疫沈降実験を行った。その結果、コントロールと比較して、オカダ酸処置によりSynGAP1とPAS95と結合量が低下し、その結合量の低下はY27632処置により抑制された。したがって、Rho-KinaseによるSynGAP1のリン酸化依存的に、SynGAP1とPSD95の結合が制御されることが示唆された。Rho-KinaseによるSynGAP1のリン酸化サイトの同定を試みた。SynGAP1をNT (PH-C2ドメイン), NTMD (PH-C2-RasGAPドメイン)、CT (Disordered-C2ドメイン)の3つのフラグメントに分割し、リン酸化タンパク質結合タンパク質である14-3-3との結合実験を行ったところ、SynGAP1-CTがRho-kinaseによるリン酸化依存的に14-3-3と結合した。質量分析によって同定されたSynGAP1の842番目のセリンをアラニンに置換した変異体S842Aを作成し、14-3-3との結合実験を行ったところSynGAP1-CT-WTと比較してSynGAP1-CT-S842A変異体では14-3-3との結合量が減少した。In vitroのリン酸化実験により、Rho-KinaseによりSynGAP1-CT-S842がリン酸化されることを確認した。生体内でRho-KinaseによるSynGAP1のリン酸化の変動を測定するために、SynGAP1の842番目のセリンのリン酸化を認識する抗リン酸化抗体(pS842)の作製を行った。COS7細胞にMyc-SynGAP1を発現させ、脱リン酸化酵素阻害剤であるオカダ酸およびRho-Kinaseの特異的阻害剤Y27632を処置し、抗リン酸化抗体でWBを行った結果、コントロールと比較してオカダ酸処置によりSynGAP1-S842のリン酸化が亢進し、そのリン酸化の亢進はY27632の処置により抑制された。COS7細胞にMyc-SynGAP1およびHA-Rho-Kinaseを共発現させた結果、コントロールと比較して、HA-Rho-Kinase-CAT存在下で、SynGAP1-S842のリン酸化が亢進した。したがって、細胞内でRho-KinaseはSynGAP1の842番目のセリンをリン酸化することが示唆された。1. Rho-KinaseによるSynGAP1のリン酸化解析前年度までのIn vitroのリン酸化実験により、研究代表者はRho-KinaseがSynGAP1のC末の842番目のセリン(S842)をリン酸化すること見出し、S842のリン酸化を認識する抗リン酸化抗体の作製を行った。そこで本年度は作製した抗リン酸化抗体を用いて、薬剤によりグルタミン酸シグナルを活性化させた際のRho-Kinaseの活性化と内在性のSynGAP1のリン酸化の解析を行う。2.樹状突起スパインにおけるSynGAP1の局在解析。前年度までにRho-KinaseによるSynGAP1のリン酸化依存的に、SynGAP1とPSDの足場タンパク質であるPSD95の結合が制御されることを見出したため、本年度は薬剤によりグルタミン酸シグナルを活性化させた際の樹状突起スパインにおけるSynGAP1とPSD95の局在を解析する。3.樹状突起スパインの形態とシナプス可塑性の解析Rho-KinaseによるSynGAP1のリン酸化が樹状突起スパイン形態へ影響を与えるかどうかを調べるため、SynGAP1のリン酸化部位欠損変異体及びリン酸化擬似変異体を発現するアデノ随伴ウィルス(AAV)作製を行う。AAVを神経細胞に導入することで、Rho-KinaseによるSynGAP1のリン酸化とスパインの形態変化、およびシナプス可塑性との関連を明らかにする。発生後期において、神経細胞は樹状突起スパインを新生し、その形態・サイズを増大させることでシナプス伝達効率を向上させ、記憶・学習などの脳高次機能を形成している。しかしながら、どのような細胞内シグナルによってシナプス可塑性が制御され、記憶・学習が形成されるのか、その理解は限定的なものであった。

我々は独自に開発したリン酸化プロテオミクス技術を用いて、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸で誘導される細胞内シグナルの網羅的探索を行った。その結果、グルタミン酸経路の下流で活性化されるCaMKIIの新規基質候補としてRhoAの特異的活性化因子GEF-H1を同定した。脳組織培養スライスに高カルシウム刺激やMNDA刺激を行ったところ、GEF-H1のリン酸化が亢進した。ヌクレオチドフリー変異体RhoA(RhoA-G17A)を用いたプルダウン法を行った結果、CaMKIIによるGEF-H1のリン酸化依存的にRho-G17AとGEF-H1の結合量が増加した。したがって、CaMKIIによるGEF-H1のリン酸化によって、GEF-H1のGEF活性が増強し、RhoA/Rho-kinase経路が活性化されることが示唆された。一方、我々は、Rho-kinaseの新規基質候補として、低分子量G蛋白質RasのGAP(GTPase活性化蛋白質)であるSynGAP1を同定した。活性化型Rasに強い親和性を持つRaf-RBD(Ras Binding Domain)を用いたプルダウン法を行った結果、Rho-kinaseによるSynGAP1のリン酸化依存的に活性化型Rasの結合量が増加した。したがって、Rho-kinaseによるSynGAP1のリン酸化によって、SynGAP1のGAP活性が減弱することで、Ras/Raf/ERK/ERK経路が活性化されることが示唆された。平成29年度は、我々が独自に開発したリン酸化プロテオミクス技術を用いて、グルタミン酸シグナルの下流でリン酸化されるタンパク質の同定を行った。その結果、CaMKIIの新規基質候補として、RhoAの特異的活性化因子であるGEF-H1を、Rho-kinaseの新規基質候補として、低分子量G蛋白質RasのGAP(GTPase活性化蛋白質)であるSynGAP1を同定した。GEF-H1のリン酸化を特異的に認識する抗体を作製し、GEF-H1の細胞内のリン酸化状態を評価した結果、高カルシウム刺激、あるいはMNDA刺激によりGEF-H1のリン酸化が亢進することが判った。ヌクレオチドフリー変異体RhoA(RhoA-G17A)を用いたプルダウン法を行った結果、CaMKIIによるGEF-H1のリン酸化によって、Rho-G17AとGEF-H1の結合量が増加した。したがって、グルタミン酸シグナルの下流で、CaMKIIがGEF-H1をリン酸化することによって、GEF-H1のGEF活性が増強し、RhoA/Rho-kinase経路が活性化されることが示唆された。また、Rho-kinaseによるSynGAP1のリン酸化によって、低分子量Gタンパク質Rasとその下流のERKの活性化が増強するという予備的な結果が得られた。以上の結果より、本年度研究開始時に立てた実施計画と目標はほぼ達成出来たと考える。前年度までに、Rho-kinaseによるSynGAP1のリン酸化によって、SynGAP1のGAP活性が低下することで、Ras/Raf/ERK経路が活性化されることを見出している。