hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
患者由来がん組織を培養可能なデバイスの開発とがん免疫療法の評価法の構築

生体内の腫瘍を模倣し、がんの微小環境を再現することで、血管網を有するがんモデルの開発を行い、併せて、患者より摘出したがん組織を培養可能なデバイスの開発を行う。まず、がん細胞株を用い、血管網の導入条件を検討した結果、がん細胞株の種類、および細胞凝集塊のサイズにより血管網の導入効率が大きく異なり、さらに血管内皮細胞の種類(静脈内皮もしくはリンパ管内皮)によっても導入効率が異なることがわかった。そこで、臍帯静脈内皮細胞を用いて血管網が導入可能ながん細胞株および培養条件の最適化を行った結果、肝臓がん細胞株を用いて細胞凝集塊への血管網の導入に成功した。マイクロ流体デバイス内でフィブリンゲルを用いて3次元的に培養を行うことで、がん細胞、線維芽細胞、および血管内皮細胞で構成した細胞凝集塊に血管網が導入でき、血液細胞を灌流することが可能であった。従って、このモデルを用いることで、血管を介してがん細胞塊に薬剤や細胞が投与可能であり、免疫細胞の機能評価が可能となる。また、がんの微小環境を模倣する目的で、がん間質線維芽細胞(CAF)の利用を試みた結果、CAFが血管新生を誘導可能であり、血管網の構築を促進することがわかった。今後、開発したモデルを用いて免疫細胞の抗腫瘍効果の評価を行い、生体内の腫瘍組織との比較を通して、どこまでがんの微小環境が再現可能であるのか評価を行う。さらに、がん患者より摘出した腫瘍組織を用いて、マイクロ流体デバイス内での培養を行い、血管網の導入を試みた。その結果、摘出した腫瘍組織に含まれる細胞によって血管新生を誘導でき、血管網が構築可能であることがわかった。しかしながら血管網の形成までに要する時間が長く、培養条件の最適化による導入効率の向上が必要である。本研究は、細胞株を用いたがんモデルの構築、免疫細胞の評価システムの構築、および患者より摘出したがん組織を培養可能なでデバイスの構築という大きく3つの課題がある。今年度は、細胞株を用いたがんモデルの構築を主とし、並行して摘出がん組織の培養デバイスの構築に取り組むことを研究計画としていた。その結果、市販の細胞を用いて、がんの細胞凝集塊に血管網を導入することに成功し、血液細胞を灌流することが可能となった。従って、細胞株を用いて、基盤となる癌モデルを構築することができ、今後の免疫細胞の評価が可能となった。さらに、並行して、がん患者より摘出した腫瘍組織の培養にも着手した。その結果、腫瘍組織に含まれる細胞によって、血管新生が誘導可能であることが明らかとなり、血管網を導入できる可能性が示唆された。現状では、導入までに要する時間の長さから、がん組織の機能を維持することは難しく、培養条件の最適化が必要であり、現在がん組織の機能評価に取り組んでいる。従って、今年度は基盤となるがんモデルを構築でき、摘出がん組織を用いても血管網導入の可能性を示しており、概ね順調に進展している。本研究は、3次元のがん組織をin vitroで培養可能な新規デバイスの開発を目的とし、特に免疫細胞(T細胞)の抗がん効果を評価可能なモデルの構築に取り組んでいる。生体内の腫瘍を模倣し、がんの微小環境を再現することで、灌流可能な血管網を有するがんモデルの開発を行い、併せて患者より摘出したがん組織を培養可能なデバイの開発を行う。これまでに、市販の細胞株を用いて3次元のがんモデルの構築を行っており、今年度は本モデルを用いたT細胞の評価に主に取り組んだ。
メソスケールの周期的プラズモン発熱を利用した微視的Soret効果の解明

本研究の目的は、DNA分子の平均末端間距離と同程度の周期で空間変動する微視的な(分子内の)温度勾配の下でDNAが示す局所的形態変化と空間移動の詳細を実験的に明らかにすることである。研究初年度(平成30年度)は以下のような基本的な物理現象の確認が達成された。(1)ポリスチレン微粒子(粒径50μm)を用いたNanosphere Lithography法により、三角格子状の銀ドメイン配列を作製した。この銀ドメイン配列の表面プラズモン効果による発熱をサーモトロピック液晶を用いて評価した。その結果、形成された温度勾配は約3 K/μm程度であった。(2)蛍光色素(SYBR Gold)標識したDNA分子(塩基対数165 kbp、平均末端間距離56μm)を7.0 wt%のPEG(ポリエチレングリコール)と混合した水溶液を銀ドメイン上におき、プラズモン発熱により発生した温度勾配下でのDNA分子の形態変化および空間移動の可視化に成功した。温度勾配の形成がない場合、DNA分子は通常のブラウン運動をしているだけである。一方、温度勾配の形成がある場合、DNA分子は銀ドメインのエッジ近傍(温度の高い部分)に近づき、その場にとどまって伸縮運動をしていることが観察された。特に温度の高い銀のエッジ部分では長いランダムコイル状の分子の伸びが確認された。上記成果については、1件の国際会議での発表を行った。研究初年度は、基本的な物理現象の確認を最優先に行い、そのための実験環境整備も行った。前倒し請求により、専用の蛍光顕微鏡を購入したため、装置のカスタマイズや使用時間を気にすることなく研究ができるようになり(購入前は学内共通設備を使用していたため、使用時間の制約があった)、予定の実験計画をおおむね順調にこなすことができた。その結果、DNAのSoret効果に由来する局所濃縮(想定される物理現象)の観察・解析のための試料作製を集中的に行い、この局所濃縮を確認することができた。平成30年度に確認ができた基本的な物理現象について、より定量的な解析を行う。具体的には、PEG濃度とともにDNA分子の局所的形態変化と空間移動距離がどのように変化するのかについて実験する。また、その実験結果を画像解析によって、DNA分子の空間移動の追跡とDNA分子の形態変化の解析を行う。さらは、温度勾配の周期と平均末端距離の比が、温度勾配下のDNA分子の局所的形態変化と空間移動距離に与える効果について、検討を開始する。DNA分子の荷電線密度と屈曲性を考慮して、上記の蛍光プローブDNA分子の局所的形態変化を自由エネルギー変化ΔGに読み替え、この自由エネルギー変化ΔGと巨視的なSoret係数(< 0)の関係を解析する予定である。

平成30年度中に前倒し請求によって蛍光顕微鏡の購入をしたことを受け、その他試薬などの消耗品の購入の予定と旅費使用の予定が更になったために次年度使用額が生じた。繰り越し分は次年度分とともに、主に試薬、基板、成果発表のための旅費に使用する予定である。
エコノイノべーションを指向した次世代酸化解媒システムの開発

分子状酸素を末端酸化剤としたバナジウム触媒による酸化的臭素化反応を開発した。触媒としてバナジン酸アンモニウム、臭化物イオン源およびルイス酸を用い、種々の芳香環、アルケン、アルキンおよびケトンに対して臭素化反応を行ったところ、対応する臭素化生成物が得られた。また、臭化物イオンの代わりにハロゲン化物イオンを用いることで、酸化的ハロゲン化が可能であることが明らかとなった。本研究では、市販されているバナジウム塩を触媒として用い、「爆発性の過酸化水素」の代わりに「分子状酸素」を用いた臭化物イオンの触媒的なプロモカチオン活性種への触媒的変換に基づく酵素機能を超えた実用的な環境調和型の次世代酸化触媒システムの開発を目的とする。本年度は、分子状酸素を用いた酸化的ハロゲン化反応に関して研究を展開した。ベンゾイル酢酸エチルを基質とし、酸素雰囲気下、バナジウム触媒を5mol%、臭化アルミニウムを55mo1%用い反応を行ったところ、95%の収率でα-プロモ体が選択的に得られた。55mol%の臭化アルミニウムによって定量的に臭素化物が得られることから、臭化アルミニウム上の二つの臭素原子が臭素源として有効であり、臭化アルミニウムはルイス酸および臭素源の両方の機能を示すことが明らかになった。このように、ケトンの選択的な触媒的臭素化に成功した。バナジウムの代わりに銅触媒を用いた臭素化反応に関し検討したところ、臭化水素酸存在下、臭素化反応が進行することが明らかになった。溶媒としては、アセトニトリルが最も適していることが判明した。基質として1-デセンを用い、臭化銅を5mol%、臭化水素酸を300mol%、酸素雰囲気下において酸化的臭素化反応を行ったところ、オレフィンの臭素化が起こり、86%の収率でvic-ジブロモ体が得られた。銅触媒も効率的に機能することが明らかとなった。医薬品や有機材料合成を含めた有機合成において、ハロゲン化物は重要な合成中間体であるとともに工業的な需要は極めて大きく、環境調和型の優れたハロゲン化プロセスの開発が切望されている。ハロゲン化物合成の従来法では、ハロゲンやN-ハロスクシンイミド等が主に用いられてきた。これらの試薬は有害であるとともに、副生成物を生じるなどの問題点を有している。また、ハロゲン化物イオンを用いた代替法では強酸化剤が量論量必要であるという問題点がある。本研究では、入手用意なバナジウム塩を触媒として用い、分子状酸素を用いた臭化物イオンの触媒的なブロモカチオン活性種への触媒的変換に基づく酵素機能を超えた実用的な環境調和型の次世代酸化触媒システムの開発を目的に、研究を展開した。昨年度開発したバナジウム触媒による触媒的酸化システムにおいて、臭化物イオンの代わりに別のハロゲン化物イオンを用いることで、ハロゲン化反応について検討を行った。基質としてプロピオフェノンを用い、バナジン酸アンモニウムメタを10mol%、テトラブチルアンモニウムヨージドを120mol%、塩化アルミニウムを120mol%用い、酸素雰囲気下で反応を行ったところ、興味深いことに、α-ヨウ素化ではなくα-塩素化が進行し、収率60%でα-塩素化体が得られた。アルゴン雰囲気下では7%のα-塩素化体しか得られなかった。触媒量を20mol%まで増加させたところ、収率は77%まで向上した。さらに、反応時間を36時間へと延長させることで98%の収率でα-塩素化体を得ることが可能となった。以上のように、分子状酸素を用いたハロゲン化物イオンの触媒的なハロゲンカチオン活性種への触媒的酸化システムを開発した。
馬の精巣におけるインヒビンの個体発生の分子生物学的解析

馬の精巣においてインヒビンの個体発生を形態学的,組織化学的,免疫組織化学的,超微形態学的および分子生物学的方法を用いて解析した.馬の胎子精巣の特徴は間質がその大部分を占めることであるが,それは出生後次第に減少する.精子発生は2歳の春から始まり9歳までは次第に活性化を増した.発達過程での最大の特徴は色素細胞の出現であった.これは生後3日目で出現し,容積的には1歳まで増加したが,数的には2ヵ月齢で最高であった.その後,減少し3歳では消失した.この細胞は形態学的,組織化学的および超微形態学的特徴から,胎子型ライディヒ細胞がマクロファージに貪食されたものが消化されつつあるものでセロイド色素と判断された.インヒビンは多くの実験動物やヒトではセルトリ細胞に局在するとされていたが,我々の免疫組織化学的研究ではセルトリ細胞とライディヒ細胞に存在し,それは後者で強く染色されることが明らかになった.そこでインヒビンのα,βAおよびβBの三つのサブユニットに対する抗体を用いて免疫組織化学的に検索した結果,これら三つのインヒビンサブユニットはセルトリ細胞のみならずライディヒ細胞にも存在することが明らかになり,そらの染色強度はライディヒ細胞で強かった.次にこれら三つのサブユニットのmRNAの発現をin-situハイブリダイゼイションで検索した結果,これらのサブユニットのmRNAもセルトリ細胞とライディヒ細胞の両者に発現していることが確認され,これらのインヒビンサブユニットがこれらの細胞で合成されていることが明らかとなった.また,これらのサブユニットはセルトリ細胞よりもライディヒ細胞で強く発現していたことから,馬精巣でのインヒビンの産主源はライディヒ細胞であることが推察された.これらが自己分泌および/または傍分泌で周囲の細胞や自分自身に影響を与えていることは推察できるがその詳細は今後の課題である.馬の精巣においてインヒビンの個体発生を形態学的,組織化学的,免疫組織化学的,超微形態学的および分子生物学的方法を用いて解析した.馬の胎子精巣の特徴は間質がその大部分を占めることであるが,それは出生後次第に減少する.精子発生は2歳の春から始まり9歳までは次第に活性化を増した.発達過程での最大の特徴は色素細胞の出現であった.これは生後3日目で出現し,容積的には1歳まで増加したが,数的には2ヵ月齢で最高であった.その後,減少し3歳では消失した.この細胞は形態学的,組織化学的および超微形態学的特徴から,胎子型ライディヒ細胞がマクロファージに貪食されたものが消化されつつあるものでセロイド色素と判断された.インヒビンは多くの実験動物やヒトではセルトリ細胞に局在するとされていたが,我々の免疫組織化学的研究ではセルトリ細胞とライディヒ細胞に存在し,それは後者で強く染色されることが明らかになった.そこでインヒビンのα,βAおよびβBの三つのサブユニットに対する抗体を用いて免疫組織化学的に検索した結果,これら三つのインヒビンサブユニットはセルトリ細胞のみならずライディヒ細胞にも存在することが明らかになり,そらの染色強度はライディヒ細胞で強かった.次にこれら三つのサブユニットのmRNAの発現をin-situハイブリダイゼイションで検索した結果,これらのサブユニットのmRNAもセルトリ細胞とライディヒ細胞の両者に発現していることが確認され,これらのインヒビンサブユニットがこれらの細胞で合成されていることが明らかとなった.また,これらのサブユニットはセルトリ細胞よりもライディヒ細胞で強く発現していたことから,馬精巣でのインヒビンの産主源はライディヒ細胞であることが推察された.これらが自己分泌および/または傍分泌で周囲の細胞や自分自身に影響を与えていることは推察できるがその詳細は今後の課題である.種々の動物の精巣におけるinhibin α-subunitの発現について多々報告されており,主にセルトリ細胞で発現するとされている。ウマの精巣におけるinhibin α-subunitの発現については報告されていない。そこで本研究ではinhibin α-subunitに対する抗血清を用いた免疫組織化学,精巣抽出液でのウエスタンブロツティング,inhibin α-subunitに特異的なcDNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションの技術を用いて1歳から9歳までのウマの精巣におけるinhibin α-subunitの発現について検索した。1.免疫組織化学では,ライディッヒ細胞とセルトリ細胞の両方にinhibin α-subunitに対する免疫陽性反応が認められた。この陽性反応は年齢や季節に関係なく認められ,それはセルトリ細胞よりもライディッヒ細胞により強く認められた。2.ウエスタンブロットでは,間質と間質を除いた残りの組織(主に精細管よりなる)の両方の分画で46kDa,56kDa,90kDa付近にバンドが認められた。56kDa,90kDaのバンドはこれまでのinhibin α-subunitの成績と一致した。3. in situハイブリダイゼーションでは,間質ではライディッヒ細胞に,精細管ではセルトリ細胞を含む精細管基底領域にシグナルが検出された。以上の結果から,成ウマの精巣ではセルトリ細胞のみならず,ライディッヒ細胞でもinhibin α-subunitが発現しており,ライディッヒ細胞でより多く発現しているであろうことが示された。

馬の精果においてインヒビンの個体発生を形態学的,組織化学的,免疫組織化学的,超微形態学的および分子生物学的方法を用いて解析した.馬の胎子精巣の特徴は間質がその大部分を占めることであるが、それは出生後次第に減少する.精子発生は2歳の春から始まり9歳までは次第に活性化を増した.発達過程での最大の特徴は色素細胞の出現であった.これは生後3日目で出現し、容積的には1歳まで増加したが,数的には2ヶ月齢で最高であった.その後,減少し3歳では消失した.この細胞は形態学的,組織化学的および超微形態学的特徴から,胎子型ライディヒ細胞がマクロファージに貪食されたものが消化されつつあるものでセロイド色素と判断された.インヒビンは多くの実験動物やヒトではセルトリ細胞に局在するとされていたが、我々の免疫組織化学的研究ではセルトリ細胞とライディヒ細胞に存在し、それは後者で強く染色されることが明らかになった.そこでインヒビンのα,βAおよびβBの三つのサブユニットに対する抗体を用いて免疫組織化学的に検索した結果,これら三つのインヒビンサブユニットはセルトリ細胞のみならずライディヒ細胞にも存在することが明らかになり,そらの染色強度はライディヒ細胞で強かった.次にこれら三つのサブユニットのmRNAの発現をin-situハイブリダイゼイションで検索した結果,これらのサブユニットのmRNAもセルトリ細胞とライディヒ細胞の両者に発現していることが確認され、これらのインヒビンサブユニットがこれらの細胞で合成されていることが明らかとなった.また,これらのサブユニットはセルトリ細胞よりもライディヒ細胞で強く発現していたことから,馬精巣でのインヒビンの産生源はライディヒ細胞であることが推察された.これらが自己分泌および/または傍分泌で周囲の細胞や自分自身に影響を与えていることは推察できるがその詳細は今後の課題である.
異方的スピングラスの逐次相転移と磁気励起

スピングラス転移に対する一軸性の異方性の影響を明らかにするため,六方晶でイジング型の希薄磁性合金ZnMnの単結晶試料を作成し, He^3-He^4希釈冷凍機を用いて0.1K<T<4.2Kの範囲で,断熱法による磁気比熱の測定を行なった.実験に用いた試料は,温度を下げるとともにTg11=0.77Kでスピンのc軸(容易軸)方向成分のみ凍結する縦スピングラス相, Tg〓=0.29Kで横方向(C〓)のスピン成分も凍結する混合スピングラス相へと2段階に逐次転移するMn濃度600ppmのものである.実験の結果得られた磁気比熱はTg11よりやや高温で最大となり, Tg11及びTg〓では特に異常は見られず滑らかに温度変化する.この様な温度依存性は通常のスピングラスと同様である.又,低温では典型的なT-リニア則に従わず, T^n(n=2),又はギャップ型のexp(-△/T),(△0.5K)によくフィットする.どちらが良い近似になっているかはより低温の比熱から明らかになるものと考えられる.いずれにせよこうした温度依存性は低温での微少な磁気励起に異方性が反映したものと考えられる.次にc軸に平行に外部磁場を加えて比熱の外場依存性を測定した.その結果, 2K以下では磁気比熱は外場とともに減少し,この負の磁場依存性はTg11近傍で偉大となることが分った.スピングラスオーダーがTg付近の比熱に強い磁場依存性をもたらすことはCuMnですでに報告されているが,特にZnMnの場合,得られたこの様な異常がスピンの縦方向成分の凍結と密接に関係するものと考えられる.現在,外場をc軸に垂直(スピンの困難軸)方向に加えて測定を行ない, ZnMnのスピングラス転移の方向依存性を比較研究すべく準備を進めている.今後,比熱の測定温度を100mK以下に拡張して,微細な低温励起の様子をより明らかにして行く計画である.スピングラス転移に対する一軸性の異方性の影響を明らかにするため,六方晶でイジング型の希薄磁性合金ZnMnの単結晶試料を作成し, He^3-He^4希釈冷凍機を用いて0.1K<T<4.2Kの範囲で,断熱法による磁気比熱の測定を行なった.実験に用いた試料は,温度を下げるとともにTg11=0.77Kでスピンのc軸(容易軸)方向成分のみ凍結する縦スピングラス相, Tg〓=0.29Kで横方向(C〓)のスピン成分も凍結する混合スピングラス相へと2段階に逐次転移するMn濃度600ppmのものである.実験の結果得られた磁気比熱はTg11よりやや高温で最大となり, Tg11及びTg〓では特に異常は見られず滑らかに温度変化する.この様な温度依存性は通常のスピングラスと同様である.又,低温では典型的なT-リニア則に従わず, T^n(n=2),又はギャップ型のexp(-△/T),(△0.5K)によくフィットする.どちらが良い近似になっているかはより低温の比熱から明らかになるものと考えられる.いずれにせよこうした温度依存性は低温での微少な磁気励起に異方性が反映したものと考えられる.次にc軸に平行に外部磁場を加えて比熱の外場依存性を測定した.その結果, 2K以下では磁気比熱は外場とともに減少し,この負の磁場依存性はTg11近傍で偉大となることが分った.スピングラスオーダーがTg付近の比熱に強い磁場依存性をもたらすことはCuMnですでに報告されているが,特にZnMnの場合,得られたこの様な異常がスピンの縦方向成分の凍結と密接に関係するものと考えられる.現在,外場をc軸に垂直(スピンの困難軸)方向に加えて測定を行ない, ZnMnのスピングラス転移の方向依存性を比較研究すべく準備を進めている.今後,比熱の測定温度を100mK以下に拡張して,微細な低温励起の様子をより明らかにして行く計画である.
片側13C置換によるTMTSF塩の異常な超伝導状態におけるNMR

(TMTCF)_2X,X=S,Se,で表記される塩は、擬1次元電子としての特徴を持っておりその低次元物性およびTMTSF塩において観測された超伝導などに興味が持たれ研究されて詳細に研究されてきた。近年のこの塩における超伝導の研究においてPauli限界を超える高いHc2や三重項超伝導など通常の超伝導とは異なる性質が報告されている。このような新奇な電子物性を微視的な観点から明らかにするためにNMRは重要なツールである。しかし、Pakeダブレットの問題等を克服するために中心C=C結合の片側のみを^<13>Cに置換することが望まれる。そこでこの同位体置換を可能にする新たなTMTSFの合成ルートを確立し、(TMTSF)_2X塩の超微細結合テンソルを決定した。このデータを用いて、(TMTSF)_2PF_6塩の低温SDWsub phaseにおける部分的な整合状態を明らかにし、また(TMTSF)_2PF_6塩の超伝導直上の非Fermi液体状態の原因が、SDW揺らぎが原因であること、そしてこの揺らぎが超伝導の発現に密接に関係していることを明らかにした。パウリ限界を超えパウリ限界を超える超伝導臨界磁場をもち三重項超伝導が指摘される(TMTSF)_2X(X=PF_6,ClO_4)塩を^<13>C-NMRを用いて検証する。^<77>Se-NMRでは微細な、スペクトルのシフトや経常変化を検出することができなかったが^<13>C-NMRなら可能となる。その目的で分子の特定の位置のみを選択的に^<13>Cに置換した分子を合成し、^<13>C-NMR-を行う。^<13>Cは、^<77>Seに比べて線幅が細くNMR Shiftの詳細な実験が可能である。しかし、現在まで行われていない理由は、TMTSF塩の超伝導塩を作ったBechgaadをしてTMTSF分子の選択的同位体置換は"難しい"といわれ現状では10%程度のエンリッチ試料の例しか報告されていない。そこで検討しているルートは、Yamadaらにより開発されたSn錯体を経由する方法で、すでに中間体(a), (b)はYamadaらの論文中で合成されている。我々は、最終段の反応条件を検討すればよいこととなる。また同位体試料の投入は、最終ステップの1つ前なので50%の収率で合成できたとして同位体に対する最終収率が25%となる。またこの合成ルートは選択的に片側のみをエンリッチすることができる。本年度は、新しいTMSTF分子の合成ルートを検証した。既知の部分のルートでも収率が再現できないことがあり、それを解決するために時間がかかったが、当初考案したルートでTMTSFが合成できることを実証した。近年、超伝導臨界磁場が、そのパウリ限界を超える超伝導体が重い電子系で報告されている。その代表的なものとして三重項超伝導が実現されているといわれるSr_2RuO_4や、超電導の秩序変数が、空間的に変調するFFLO状態が実現されているといわれるCeCoIn_5などが挙げられる。これらの物質の発見は、理論的研究を刺激し数多くの重要な知見、予測を引き出した。パウリ限界を超える超伝導体は現時点の物性物理学の最大のトピックスの1つである。有機超伝導体でもパウリ限界をこえる臨界磁場をもつ物質がいくつか報告されている。代表的なものとして(TMTSF)_2X(X=PF_6,ClO_4)塩がある。Brownらによる^<77>SeのKnight shiftの測定よりスピン帯磁率が超伝導状態で減少しないことにより三重項超伝導の可能性が指摘されこの系に対する理論的な研究が活発になされている。しかし、近年Jeromeらの測定により三重項超伝導に関して疑念もつ結果も報告されている。現状は、実験結果が混沌とした中で理論が先に走っている状況である。この問題にアプローチするために分子の特定の位置を^<13>Cに置換した分子を作成して^<13>C-NMRを計画した。

昨年度で分子の合成に成功し、本年度は、実際に(TMTSF)_2X(X=PF_6,ClO_4)塩の大型単結晶の作成し常圧にてNMRの測定を行った。その結果、従来からの未解決の問題であったSDW相内のサブフェーズについて、野村らが主張したディスコメンシュレートな構造をとっていることをNMRのスペクトルから明らかにすることができたパウリ限界を超える超伝導臨界磁場をもち三重項超伝導が指摘される(TMTSF)_2X(X=PF_6,ClO_4)塩を^<13>C-NMRを用いて検証する。^<77>Se-NMRでは微細な、スペクトルのシフトや経常変化を検出することができなかったが^<13>C-NMRなら可能となる。その目的で分子の特定の位置のみを選択的に^<13>Cに置換した分子を合成し、^<13>C-NMRを行った。昨年度までに開発した新しいTMSTF分子の合成ルートでえた片側置換TMTSF分子を用いて(TMTSF)_2X(X=PF_6,ClO_4)塩の大型単結を作成した。近年、この物質の超伝導圧力領域で非フェルミ液体的挙動が電気伝導度より報告され、SDW揺らぎとの関連性が注目されている。SDW揺らぎを直接観測する手段としNMRは最適な実験方法なので、(TMTSF)_2PF_6塩の圧力下^<13>C-NMRを行った。NiCrAlとCuBeの2重シリンダー構造の圧力CELLを用いることより室温で2.6GPaまで印加えることが可能となった。その結果、非フェルミ液体的挙動の観測される領域でSDW揺らぎがあることを見出し、また非フェルミ液体的挙動が消失する圧力でナイトシフトと(T_1T)^<-1>がほぼ温度変化せず、フェルミ液体的挙動を示し、SDW揺らぎが抑制されることを見出した。また、コリンハ因子は、超伝導の臨界圧力以上では、ほぼ一定の振る舞いをし、大きな圧力依存性は観測されなかった。このことは、SDWのネストするフェルミ面以外は、超伝導の転移温度に寄与しないことを示している。フェルミ液体的挙動の見られる圧力領域では、超伝導が消失することより、SDW揺らぎが超伝導発現のメカニズムに関与していることを実験的に明らかにした。
Advanced dynamic statistical parametric mapping to identify minimum epileptogenic lesion for seizure freedom

この研究では脳磁図の新しい解析法であるAdvanced dynamic statistical parametric mapping (AdSPM)を用いて、小児の症候性局在性てんかんの原因となる限局性皮質形成異常の病変の内部に存在する真の“発作起始部位"を描出し、術後の発作消失のための病変切除に必要な最小限の領域を描出することを目的とする。これにより従来切除術の適応にならなかった難治性てんかん患者にも切除手術の選択を提示することが可能となるのみならず、重要な機能部位にかかる病変を残して部分摘出することも可能となり、術後の後遺症のリスクから患者を開放することが可能となることが期待される。
冬眠誘導物質の肝冷保存における有用性の検討

DADLE(D-Ala2-Leu5-enkephalin)は、冬眠動物の血中に存在する冬眠誘導物質とほぼ同様の作用を有する。DADLEはオピオイド受容体を介して、心臓や肺に対して温あるいは冷虚血再潅流障害の抑制効果を有することが知られている。そこで、今回DADLEの肝温虚血再潅流抑制効果について検討した。方法:雄性WistarラットにDADLEを3、5、10、20mg/kg、あるいは生理食塩水を静注したのち92%肝部分温虚血を45分間行った。再潅流120分後に犠牲死させ血液および肝組織を採取した。血清中の肝酵素および細胞膜の過酸化障害の指標として肝組織中マロンジアルデヒドを測定し、DADLEの肝温虚血再潅流障害抑制効果の有無を検討した。まとめ:DADLEの虚血前投与により、肝部分温虚血再潅流障害の抑帯効果を認めた。D-Ala2-Leu5-enkephalin (DADLE)は、冬眠動物の血中に存在する冬眠誘導物質とほぼ同等の作用を有することが知られており、代謝抑制、細胞保護効果を有すると言われている。本研究では、DADLEが肝移植における冷保存障害の軽減に有効かを明らかにする。まず、冷保存実験に先立ち、ラットを用いた肝温阻血再潅流実験を行った結果、温阻血再潅流モデルにおいては、DADLEの効果は認めなかった。次に分離肝細胞を24時間培養した後、72時間冷保存した。保存液の違いにより、I群:生食水、II群:UW液、III群:UW液+DADLEとした。MTT法で検討した細胞のviabilityは、I群に比べII群、III群は有意に改善した。しかし、II群とIII群の間には差を認めなかった。以上より、DADLEが保存液中に添加するだけでは効果はなく、生体内すなはち肝摘出前に投与し、肝内に取り込ませる必要があることが示唆された。背景と目的冬眠誘導物質あるいはその類似物質が、臓器保護効果を有することが知られている。本研究は、かかる特性を有する物質を虚血や冷保存・再灌流障害に対する効果を確認する。1、肝虚血再灌流障害に対する肝保護効果に関する検討雄性Wistarラット(200300g)を用い、冬眠誘導物質であるdelta-0pioidであるD-Ala2-Leu5-enkephalin(DADLE)を用いて虚血再灌流障害に対する肝保護効果を検討した。方法はラット肝臓の尾状葉を除く95%の肝を阻血し、60分後解放する温虚血再灌流モデルを用いた。クランプ30分前に陰茎静脈よりDADLE1-3mg/kg+生理食塩水0.5mlまたは生理食塩水0.5mlのみ(対照群)を投与し、再灌流後30分の一般肝機能(総ビリルビン,GOT,GPT,LDH)・類洞機能(ヒアルロン酸)について検討した。結果としては、DADLE投与群と対照群の間に有意な差を認めなかった。2、DADLEの肝冷保存時の細胞保護効果に関する検討肝臓の冷保存への保護効果を分離肝細胞を用いて検討した。雄性Wistarラット(200300g)よりコラゲナーゼ灌流法により遊離肝細胞を採取し、35mmのコラーゲン被覆したシャーレ内で4時間培養(DMEM培養液、37°C、5%CO2)の後、各種臓器保存液[ウイスコンシン大学液・1.5mMDADLE添加ウイスコンシン大学液・乳酸加リンゲル液]に培養液を変え、48時間4°Cにて冷保存し、その後の生存率をMTT法にて検討した。結果として肝細胞生存率は、ウイスコンシン大学液単独使用群では75%、乳酸加リンゲル液では30%であったが、DADLE添加ウイスコンシン大学液とウイスコンシン大学液単独保存の間での差は認められなかった。
プロラクチン発現低下を起点としたダイオキシン後世代毒性発症機構の解析

高毒性ダイオキシン(2, 3, 7, 8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン; TCDD)が育児母の脳下垂体・プロラクチン(PRL)低下、並びに児の脳下垂体・成長ホルモン(GH)低下を介して児の成長停滞を惹起する可能性について研究を行った。妊娠15日目の母ラットにTCDD(経口、1μg/kg)を与えて検討した結果、出生直後の出生児死亡には胎児.新生児のGH低下が、また出生後の成長遅滞や未成熟の固着には育児母のPRL低下等の他の要因が寄与する可能性が推定された。本年度の研究では、ダイオキシン(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)の妊娠期曝露による母および児のプロラクチン(PRL発現低下の時期特異性を明らかにした。具体的には、妊娠15日目の母ラットにTCDDを投与後、妊娠18,19,20および21日目ならびに生後0,2,4,7,10,14,21および28日目の脳下垂体PRL mRNAの発現変動を解析した。その結果、母体においては妊娠期に変動は認められなかったものの、出産後7および14日目において有意に発現が低下した。PRLは、母乳分泌のみならず、育児行動発現にも必須であることから、育児母PRLの低下は児の発育を障害することが危惧される。事実、児の体重および数を解析したところ、胎児期には影響が認められなかったのに対し、出生後では体重および数ともに有意な減少が観察され、育児母体におけるPRL低下をよく支持した。TCDDの母体曝露は、児におけるPRL発現にも影響を与え、雌雄児ともにmRNAレベルでは軽微な影響に止まったものの、血中ホルモンレベルでは生後21日目において顕著な低下が確認された。児のPRL合成/分泌系の形成には、母から十分な育児行動を受ける必要があると考えられている。従って、雌雄児におけるPRL低下からも、母体PRLならびに育児行動低下が支持された。このように、本年度の研究から母体PRLの低下と児の障害との関連性を示す重要な知見が得られた。次年度は、児の障害に対する母体PRL低下の重要性を明らかにするために、育児母体にPRLを補給し、障害を消去できるか否かを検証する。これらの研究を通して、ダイオキシンによる後世代毒性発現の一部は、母体PRL低下を介して生じるとの新規学説が提示できる予定である。高毒性ダイオキシン(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin;TCDD)が育児母の脳下垂体プロラクチン(PRL)低下を介して児の成長停滞を惹起する可能性について研究を行った。当初は、PRL低下に基づく育児能力低下が主な障害要因と考えており、PRL低下の意義や機構解析を予定していた。しかし、研究開始直前の検討から、胎児・新生児の成長ホルモン(GH)低下も無視できない寄与を果たす可能性が浮上した。そこで、予定を変更し、新生児の成長状況を詳細に解析して、PRLとGHの寄与を推定する研究から開始した。その結果、妊娠期にTCDD(1μg/kg、経口投与、妊娠15日目)を与えた母ラットでは、出産直後に児のかなりが脱落(死亡)するが、その時期を乗り越えた児は死亡することなく成長することが分かった。ただ、生存児には体重/体長低下ないしその傾向が残り、成熟期に至っても学習記憶能力の有意な低下が観察され、未成熟形質の少なくとも一部は消失しないことが判明した。これらの成績から、出生直後の死亡には胎児・新生児のGH低下が、また出生後の成長遅滞や未成熟の固着には育児母のPRL低下等の他の要因が寄与する可能性が推定された。このことは、PRLとGH低下時期の観察からも支持された。すなわち、児のGHは胎児終期から出生直後に一過性に低下するのみであるのに対して、母のPRLは出産後の正常な上昇が抑圧され、これが10日間ほど継続した。育児母PRL低下の機構を明らかにするため、本ホルモンを制御するPRL放出ホルモンやドパミンの供給系がTCDDによって変動するか否かについて検討した。その結果、それらには特に変化は認められなかった。胎児/新生児のGH抑制については、GH放出ホルモン受容体の発現低下が寄与する可能性を明らかにした。本研究により、TCDDによって惹起される児の死亡、成長遅滞および未成熟の固着には母子めPRLおよびGH低下が寄与することが推定された。抑制の機構、特にPRL低下の機構は今後の課題として残った。
集団間の情報流通を考慮した集合的意思決定の理論と実験による分析

今年度の前半は理論研究(陪審定理の拡張や進化ゲーム理論)のまとめをし,いくつかの論文が査読付き国際誌に掲載された.なお,集団が特定の合意に至る確率やそれまでにかかる時間を分析するべく,選好が異なる複数集団間の確率進化ゲームを研究していたが,固定確率の一般式は導出されたが.固定時間については,固定確率よりもダイナミクスについて多くの情報が必要であることが分かり,年度内に一般式を導出するには至らなかった.以上に加え,今年度は,集合的意思決定状況において人はどのような手続きに正当性を感じるか,あるいは手続きをどのように利用して自分の意見を正当化するのかを分析すべく質問紙を用いた実験を行った.結果として,議題の構造は同じでも提示のさせ方で結果の選好に違いが生じるという古典的なフレーミング効果に加え,特定の意見を支持するにあたって特定の手続きが有意に多く用いられる(効果量も中程度)という結果も得られた.さらに,参加者に回答理由を尋ねた自由回答の結果をテキスト分析することで,議論の補強も試みた.こうした手続きの選好や手続きの戦略的な利用に関連する知見は,今後の規範理論やゲーム理論の研究に寄与する可能性がある.この結果については国内学会で報告し,論文もほぼ書きあがった.3年間を通じて、予定していたほぼすべての手法を用いて,集合的決定の研究を通して社会の様々な水準の現象の理解に取り組むという本研究課題の目的に沿った成果を挙げることができた.それらを有機的に束ねて1つの知見を生み出すまでには至らなかったが,それを今後行うための基礎となる分析枠組みや知見は提示できたと考えている.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、情報の流通や集団の構成が集合的決定の精度に与える影響を理論的に分析した。具体的には、コンドルセの陪審定理を以下のように拡張した。第一に、各人が複数の論理的に結合した議題に対して投票する状況を扱った。その結果、個人間の意思決定に相関がある場合、各個人が正答率を高める努力をしたとしても、それによって集合的決定の帰結が論理学的に一貫する確率が高まるとは限らないことが分かった。第二に、意思決定をするタイミングが人によって異なる場合を扱った。全員が同時に意思決定する場合と異なり、意思決定するタイミングが異なると、先に意思決定した個人の意見が後続する個人の意見形成に影響を与えることが考えられる。本研究では、各人がある確率で独立に意思決定し、ある確率で先行する意思決定者の意見を模倣するという状況下での多数決による集合的決定の精度を分析した。結果として、独立に意思決定をした者が全体に占める割合が低下することと、先行して意思決定した個人間で、後続する個人の意見形成に与える影響力に格差があることという2つの要因によって集合的決定の精度が劣化することが分かった。第三に、陪審定理を分業の効率性の分析に応用した。具体的には、人数が固定された集団がn個の議題を扱わなくてはならないため集団をn分割し、分割された下位集団が多数決によって集合的決定を行う場面を考える。各下位集団は多数決の決定が正しいと利益を得られるが、そうでないときは何も得られないとするとき、任意の議題数に対して、個人の正答率が0,5より大きい(小さい)場合は等分割が集団の利益を最大化(最小化)することが明らかになった。さらに、1回の意思決定ごとにコストがかかる場合に、集団成員全員による意思決定をn回繰り返すのと、n個の下位集団が同時並行で意思決定するのとでは、どちらがどのようなときに効率的かを分析した。年度前半は,昨年度の研究の拡張をした.まず、逐次的意思決定状況での集合的決定の精度であるが,昨年度のモデルに加え,複数のモデルの解析を行ったところ、模倣の仕方の仮定を少し変えるだけで、先行する意思決定者が後続の意思決定者に与える影響力の分布の関数形が異なるものになることが分かった。特に、模倣のメカニズムは異なるが、独立に意思決定する個人の頻度が同じになるように調整した2つのモデルを比較することで、後続する個人の意見形成に与える影響力に格差があることという2つの要因によって集合的決定の精度が劣化するという本研究の主張の1つの効果が明確になった。つぎに、各個人が複数の議題に対しての投票を求められているが、それらが論理的に結合している状況を扱った。この場合、各人が論理学的に無矛盾な判断をしたとしても、それを集団レベルで集約した帰結は論理学的に矛盾することがある。昨年度は、各人の意思決定に相関がある場合を扱ったが、各人の意思決定精度は定数として与えられていた。本年度はさらに、意思決定精度が特定の確率分布に従って定まると仮定した場合に、どの程度矛盾が生起するのかを評価した.今年度はさらに、プレイヤー数が有限の複数集団間での確率進化ゲームを扱った。この場合、各吸収状態への固定確率が戦略の優位を評価する基準になる。本研究では、2×2双行列ゲームの戦略の固定確率の一般式を導出した。この研究では、集団で全員が同じ行動選択をしている状況を吸収状態としているが、これを集団が合意に達している状態だと解釈すると、どのような意見が合意に達しやすいか、合意に至るまでにどれくらいの時間がかかるか、といった分析が今後可能になると考えられる。

陪審定理,判断集計,複数集団間の確率進化ゲームに関しての理論研究は概ね順調に進展し,いくつかの論文を投稿することができたが,一部不慣れな手法を用いる必要があったため,予定していた実験を行うための時間が十分にとれなかった.今年度の前半は理論研究(陪審定理の拡張や進化ゲーム理論)のまとめをし,いくつかの論文が査読付き国際誌に掲載された.なお,集団が特定の合意に至る確率やそれまでにかかる時間を分析するべく,選好が異なる複数集団間の確率進化ゲームを研究していたが,固定確率の一般式は導出されたが.固定時間については,固定確率よりもダイナミクスについて多くの情報が必要であることが分かり,年度内に一般式を導出するには至らなかった.以上に加え,今年度は,集合的意思決定状況において人はどのような手続きに正当性を感じるか,あるいは手続きをどのように利用して自分の意見を正当化するのかを分析すべく質問紙を用いた実験を行った.結果として,議題の構造は同じでも提示のさせ方で結果の選好に違いが生じるという古典的なフレーミング効果に加え,特定の意見を支持するにあたって特定の手続きが有意に多く用いられる(効果量も中程度)という結果も得られた.さらに,参加者に回答理由を尋ねた自由回答の結果をテキスト分析することで,議論の補強も試みた.こうした手続きの選好や手続きの戦略的な利用に関連する知見は,今後の規範理論やゲーム理論の研究に寄与する可能性がある.この結果については国内学会で報告し,論文もほぼ書きあがった.3年間を通じて、予定していたほぼすべての手法を用いて,集合的決定の研究を通して社会の様々な水準の現象の理解に取り組むという本研究課題の目的に沿った成果を挙げることができた.それらを有機的に束ねて1つの知見を生み出すまでには至らなかったが,それを今後行うための基礎となる分析枠組みや知見は提示できたと考えている.遅れをとっている実験研究を重点的に進める予定である.27年度が最終年度であるため、記入しない。陪審定理をもとにした研究を当初から計画していたが、予想以上に様々な拡張の余地があることが分かり、予定以上の研究成果を生み出し発表することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、選好の多様性などを考慮した理論の精緻化と共に、実証研究もすすめていきたい。
糖尿病発症時におけるがん誘発メカニズムに関する基礎的研究と食品成分による制御

食品中の変異・発がん物質であるアクリルアミド(AA)を糖尿病モデルラットに摂取させたところ、正常ラットに比べ遺伝毒性が増強する傾向が確認できた。その要因として、糖尿病モデルラットにおける薬物代謝酵素CYP2E1の活性が増強し、それによりAAがより遺伝毒性の強いグリシダミドに代謝活性化されることが示唆された。また、アクリルアミドの遺伝毒性に対して緑茶およびワサビ抽出物が強い抑制効果を示すことが確認できた。近年、疫学的な調査により糖尿病患者は非糖尿病患者に比べ、がん発症率が高いとの報告がある。しかし、糖尿病と発がんとの関係を明らかにした基礎的研究はない。したがって、糖尿病と発がんの関わりを解明し、それらの予防法を確立することは、ヒトの健康長寿を考える上で極めて重要な課題である。糖尿病発症に伴い、ペルオキシナイトライトなどの活性酸素の産生やDNA付加体の生成が生体内で起こる。ペルオキシナイトライトは二級アミンと反応すると、強力な発がん物質であるニトロソアミンを生成する。また、加熱条件下でのメイラード反応により生成する発がん物質のヘテロサイクリックアミン類やアクリルアミドが糖尿病患者生体内において生成することも考えられる。本研究では、糖尿病と発がんとの関連をin vitro、in vivo試験で明らかにし、さらに予防効果を示す食品成分を探索することを目的として実験を行った。ストレプトゾトシンを投与して作製したI型糖尿病モデルラットに一定期間、二級アミンを飲料水として自由摂取させ、各臓器におけるDNA損傷性、染色体異常誘発能検定したと強い遺伝毒性が確認できた。また、糖尿病ラットニトロソアミンを経口投与して、その毒性の変動を検定したところ、正常ラットに比べてその毒性は増強していた。以上の結果より、糖尿病患者の生体内ではニトロアミンが生成すること、またニトロソアミンを食品を通して、摂取した場合、毒性が増強することが示唆された。近年、糖尿病と日本人の死亡原因の第一位を占めるがんの間に相関があると考えられている。国立がんセンター研究所の津金昌-郎博士らは大規模な疫学的調査から、糖尿病患者は非糖尿病患者と比べて、がん発生率は高いことを報告している。しかし、糖尿病と発がんとの関係を明らかにした基礎研究は極めて少ない。本研究では、糖尿病状態において、変異・発がん物質であるアクリルアミド(AA)の遺伝毒性が変動するか否か明らかにするため、遺伝毒性試験を行った。AA単独投与及び糖尿病状態において、DNA損傷性及び小核誘発能が誘導された。糖尿病状態における遺伝毒性の増強は、糖尿病状態での活性酸素の産生が亢進され、DNA切断が起こることが考えられた。さらに、糖尿病とAA投与の複合作用により、DNA損傷性及び小核誘発能が増強した。糖尿病状態において、AAの遺伝毒性が増強した要因としてCYP2E1の関与が考えられたことから、CYP2E1の発現及び活性を検定した。その結果、糖尿病状態においてCYP2E1 mRNA発現レベル及びCYP2E1活性の上昇を確認した。CYP2E1が誘導された要因として、糖尿病状態ではインスリンの分泌が低下し、それに伴い脂質代謝の過程で生成する1ケトン体の代謝をCYP2E1が担うため、生体防御のために上昇したことが考えられた。糖尿病状態における解毒酵素の活性低下作用を評価するため、GST活性及びGSH量を測定した。その結果、総GSH量が低下するにとを確認した。この低下は、生成した活性酸素の除去にGSHが大量に使用されたためと考えられた。さらに、糖尿病とAA投与の複合効果により、正常時に比較してGST活性が低下した。以上の実験結果から、糖尿病状態ではCYP2E1が活性化し、またAAの主要な解毒機構が減弱することから、生体内ではAAの遺伝毒性が増強し、発がんリスクが高まることが考えられた。最近、糖尿病とがん発症との間に有意な相関があることを明らかになっているが、その明確な因果関係はまだ解明されていない。これまでに糖尿病により薬物代謝酵素CYPの発現が変化することが知られており、糖尿病モデルラットにおける主要なCYPの発現を検討した報告によると、ラット肝臓中のCYP1A2、CYP1B1、CYP2E1の発現量は上昇する。食品中の発がん物質であるアクリルアミド(AA)はCYP2E1により強力な発がん物質であるGAに代謝活性化されることから、糖尿病罹患者の発がん率の増加にAAをはじめとする食品由来の発がん物質の毒性変動が関与していることが示唆される。そこで本研究では糖尿病状態におけるAAのDNA損傷性と小核誘発能の変動とAAの活性化やGAの解毒に関わるCYP2E1発現及び活性、AAの主要な解毒酵素であるGSTの活性、GSTの補因子である肝臓中のGSH、酸化ストレスへの曝露指標であるGSSG量、さらに血中のAA濃度を調べた。その結果、糖尿病ラットのAA投与群においては正常群、正常群+AA投与群及び糖尿病群に比較して有意な増加がみられた。

また、肝臓におけるDNA損傷性をコメットアッセイで検定したところ、糖尿病ラットのAA投与群においては正常群、正常群+AA投与群及び糖尿病群に比較して有意な上昇がみられた。糖尿病発症におけるCYP2E1活性の変動をクロルゾキサゾンを用いて調べたところ、対照群に比較して、糖尿病群では有意なCYP2E1活性の上昇が見られた。また、CYP2E1の発現をPCRを用いて確認したところ、糖尿病群では正常群に比べて有意な発現が確認できた。以上の結果より糖尿病の発症により、AAの遺伝毒性が上昇することが明らかになり、その要因として、CYP2E1の活性化の上昇が示唆された。
真核細胞DNAポルメラ-ゼの発現調節機構

今年度は、以下の2点で研究の重要な進展があった。1)ショウジョウバエDNAポリメラ-ゼ(以下polα)とPCNA(増殖細胞各抗原:polδ促進因子)の遺伝子発現調節抑制機構:両遺伝子は共通の8塩基対TATCGATAの、促進配列(我々はDRE:DNA replicationーrelated elmentと命名した)によって支配されていることを証明したる。さらにこの配列に結合する分子量約85000のタンパク質因子のDREFを発見し、その精製法を確立した。現在DREF遺伝子の単離を試みている。すでに両遺伝子の発現がホメオドメインタンパク質の一つ(zerknulltizen)によって抑制されることを報告している。この抑制と上記DRE/DREFとの関係をしらべた結果、zenはDREFの活性低下をもたらすことを証明した。この機構は細胞分化と共役した増殖停止にとって重要であると予想される。zenはがん遺伝子relのホモログであるdorsal遺伝子により抑制的な制御を受けていることが知られている。一方、受容体型のチロシンキナ-ゼ遺伝子であるtorsoがPCNA遺伝子発現に関与していることも証明した。2)ラットDNAポリメラ-ゼβの構造と機能の解析:すでに大腸菌でこの酵素の発現と大量精製法を確立している。この酵素の結晶化に成功し、構造解析を進めており、そのサイズが120Ax63Ax39Aであることがわかった。また、部位特異的突然変異法による、プライマ-認識領域(183Argから193Aspを服務領域)の決定、部分分解によるDNA結合領域(N端より87番残基まで)の同定、さらにCーキナ-ゼによる44serと55serのリン酸化による酵素活性の失活の証明等を行った。
ものづくり教育と画像処理技術を融合させた工作機械原点計測装置の開発

○研究目的NC工作機械の工具計測装置であるベースマスターに代わり、画像処理を用いた計測方式を開発し、非接触で故障しない、安全で簡単な装置を製作することで、教育活動に貢献することを目的とする。○研究方法工作機械のほとんどは刃物を用いるため、作業操作を誤ると大変危険である。これらの操作中に、特によく事故を起こす原因として挙げられるのが、NC工作機器の刃物と材料の加工原点座標系を計測するときである。NCフライス盤の計測の際、ワーク計測器及び工具計測器などを用いる。しかし、これらの計測器は、計測器と刃物を接触させて計測を行う為、ハンドル操作を誤った場合は計測器やエンドミルを破損してしまう。そこで、ワーク計測器及び工具計測器などの接触タイプの計測に代わり画像処理を用いた計測に着目した。画像処理を用いる手法は、カメラで撮影した画像から計測を行う方式のため、非接触で安全である。ただし、従来計測に比べ精度は落ちてしまう。しかし、学生が製作するために計測する場合100分の1mmの誤差を必要することはほとんどない。本報告では、エンドミルと工作物の抽出方法と、加工原点を計測する方法について報告する。今回はその前段階として、NCフライス盤において工具計測器で計測するZ方向のみを対象とし検討をする。○研究成果従来の接触タイプの計測装置を使用することなく、画像処理を用いて非接触で計測することが可能であることが分かった。しかし、計測結果は平均で誤差が4.5mmであった。学生がNCフライス盤を使用する場合、加工物の表面自体に段差があり、計測する際にも大きな誤差が出ている。しかも、失敗しても問題ないように、工作物のサイズを加工寸法よりも大きくしているため、今回の結果の誤差は問題ではない。以上、本校の学生が使用する機器としては、実用化できると確認した。
黄色ブドウ球菌におけるメチシリン高度耐性化機構の解明

本研究はMRSAのβ-ラクタム系薬高度耐性化の遺伝的基盤を明らかにすることを目指て研究を行い、一定の成果を得た。その結果を以下3点にまとめる:1)二成分制御系遺伝子群vraSRとgraSRがMRSAのβ-ラクタムとグリコペプチドを含む多くの細胞壁合成障害系薬剤の耐性と関連する事を見出した。前者はβ-ラクタム耐性をポジチブに、後者はネガチブに制御している事を分かった。特にvraSの正常な発現は細胞壁合成障害剤に耐える(耐性になる)必須条件である事を明らかにした。つまり、この遺伝子は抗菌薬の新規ターゲットになりえる事である。2)hmrA、hmrB、mrgA、msrA3とgraFを含め幾つ遺伝子(aux或いはfem因子など)の発現レベルの相違が耐性の多様化と高度耐性化に関連していることが明らかだが、耐性株にはこれら全ての遺伝子の塩基配列には変異がなかった。これは、他の調節遺伝子群の関与を強く示唆することであり、本研究の結果から「中枢」制御遺伝子の一つであるsarH1が上記遺伝子の発現に強く関与していることを明らかにした。この遺伝子の制御機構について、現在研究を進めている。3)研究成果のもう一つ注目するべき点は、全く新たなβ-ラクタム耐性の制御機構を見出したことである。現在、研究はまだ進行中であるが、今回Type IIa SCCmec(mecAを含む)を持つ超β-ラクタム感受性臨床分離株の全ゲノム塩基配列を決定した。また、この株から薬剤の選択せずに得られた高度β-ラクタム系薬剤耐性変異株を分離し、そのゲノム塩基配列も決定した。この2株の全ゲノム塩基配列の比較研究で、高度β-ラクタム耐性は、塩基配列の変異ではなく、ゲノムのFlip-Flop逆位が制御していることを判明した。その制御機能に関する研究は今後の課題である。MRSAのβ-ラクタム系薬剤耐性はmecA遺伝子の転写とPBP2'の産生量と関係無く、耐性パターンがそれぞれの低度耐性、ヘテロ耐性、Eagle-type耐性と高度耐性がある。このような黄色ブドウ球菌におけるβラクタム耐性の多様化と高度耐性化には、調節遺伝子群に生じる遺伝学的変異が大きな割合を占めていると考え、本研究を実行することにした。本年度の研究は予定通り順調に進んでいる。主に以下の3点を報告する。1)我々が特定した二つの二成分制御系遺伝子群vraSRとgraSRがMRSAのβ-ラクタムとglycopeptideを含む多くの細胞壁合成障害系薬剤の耐性と関連する事を見出した。特にvraSの正常な発現は細胞壁合成障害剤耐性の必須条件である事を明らかにした。このことからこの遺伝子は抗菌薬の新規ターゲットになる有と考えられる。2)この二つ二成分制御遺伝子群のそれぞれ遺伝子の過剰発現、欠損及び相補(欠損株へ過剰発現プラスミドを導入した)変異株を作成した。3)vraSRとgraSRのそれぞれの制御機構については、上記の変異株を用いて、現在マイクロアレイ解析手法で解明している。このほか、完全なSCCmec(mecAを含む)を持つ超β-ラクタム感受性臨床分離株から、薬剤選択をせずに高度β-ラクタム系薬剤耐性を持つ株を分離した。この二つの株間でお互いに一定の頻度で転移することを見出した。高度β-ラクタム系薬剤耐性メ力ニズムの研究にはこの株の価値が非常に高いと考えている。