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作業療法に用いる作業の特性の違いと脳内準備活動について-脳磁場計測による検討-

作業療法で用いる様々な作業活動を行う際に,脳内のどの部位に,どのような変化が生じるのかを明らかにし,作業療法訓練前後でその変化を比較することは,作業療法のエビデンスを確立するために非常に重要な課題である。我々は脳磁場計測(MEG)と機能的近赤外イメージング装置(fNIRS)を用いて,作業活動の種類による脳内賦活特性の違いを明らかにするための第一段階として,作業種目の違いによる脳内準備電位の時間的空間的変化について調べることとした。まず,MEGについては測定準備,測定,解析に熟練を要するため、同学高次脳センターの協力を得て,MEGにおける基本的パラダイムを用いて測定と解析を繰り返し,一連の測定準備,測定,解析技術を習得した。さらに今年度は,単関節運動(手関節背屈)と複合関節運動(前方リーチ)について,自発的条件での運動誘発電位の比較を行った。測定回数は筋電図onsetにて,一条件一セットの有効データ数を50回として,3セットの測定を行った。その結果,自発的条件特有の運動準備電位と考えられる波形を得ることができ,さらに,MEG測定における高難易度課題であるリーチング動作での有効データを得ることが可能となった。今後は,統計的解析が可能な有効データ数を蓄積し,結果を吟味したうえで成果を報告したいと考える。また,リーチング動作時のMEG測定が可能となったことによって,様々な操作対象にリーチする段階での脳内準備電位を比較することが理論的には可能であり,次の段階での課題であると考えている。一方,今年度は,島津製作所の協力でfNIRS(島津製作所製マルチチャンネルOMM3000)を使用することが可能となり,MEGが不得意とするダイナミックな活動時の脳内活動の変化を研究対象とすることが可能となった。fNIRSを用いた研究成果は第45回日本生体医工学会(2006年5月15-17日)などで発表したほか,第41回日本作業療法学会(2007年6月22-24日)でも発表予定である。平成16年度における本研究課題の進行状況は,まず被験者の上肢機能レベルを評価するための測定機器(OG技研社製徒手筋力測定装置)を購入し,現存(京都大学医学部保健学科所有)の上肢機能検査と組み合わせた上肢機能評価システムを準備した。また,精神認知機能に対する簡易スクリーニング検査については現存(京都大学医学部保健学科所有)の評価方法を用いることで測定の準備を完了した。上記の上肢機能評価システムと精神認知機能評価システムを組み合わせて使用することにより,被験者の上肢機能レベル,および精神認知機能レベル(つまり,上肢操作能力のレベル)を簡易に評価することが可能となった。次に,脳磁場計測については本学高次脳研究センター所有の脳磁場測定装置を使用することになっているが,装置使用の操作と結果の解析には熟練した手続き的技能が必要であり,平成16年4月から平成17年3月まで本学高次脳研究センター専属技術者の協力を得て脳磁場測定装置を実際に使用し,測定結果を解析するための学習を行った。加えて,測定結果の解析にはMRI装置を用いた脳診断画像が必要であり,MRI測定装置操作についての操作技能を学習する必要があった。この装置操作に関しても本学高次脳研究センター専属技術者の協力を得て,測定手順の学習を繰り返し行った。上記の過程を経て,一連の脳磁場測定装置およびMRI測定装置の操作と測定結果の解析が可能となったが,いま少しの専属技術者の助力が必要な段階にある。平成17年度は,脳磁場計測装置(本学高次脳研究センター所有)の実際的な操作と結果解析技術の習熟を試みた。本年度は脳磁場計測装置(MEG)を用い,本学高次脳研究センターで認められた体性感覚誘発MEG課題,および運動関連MEG課題について,センター専属技術者の監視のもとに,主検査者として測定と結果解析を反復して行った。結果の正確性に影響する大きな課題としてアーチファクトの除去,頭位変化の影響の除去が残存した。また,結果をより確実なものとするための電極貼り付け方法や,グラフ解析をより正確に行うためのソフトウェアの操作習熟などの課題はクリアできた。MRI装置の操作に関しては付属するマニュアルを参照すれば独力で行えるレベルとなった。上肢機能評価および精神認知機能評価システムは十分に独力で行える程度に習熟が得られた。これらをふまえて,平成18年度の課題は上述した課題をクリアし,本研究課題を実際に施行し結果を解析するまでを独力で行い,成果を報告することである。また,平成17年度より島津製作所製光トポグラフィーマルチチャンネルシステム(fNIRS)を不定期ながら使用できる機会を得ており,動的かつ迅速な解析能力に長けた本システムを,時間および空間解像能に長けたMEGと併用することにより,より有用な結果が得られるものと期待している。

まず,MEGについては測定準備,測定,解析に熟練を要するため、同学高次脳センターの協力を得て,MEGにおける基本的パラダイムを用いて測定と解析を繰り返し,一連の測定準備,測定,解析技術を習得した。さらに今年度は,単関節運動(手関節背屈)と複合関節運動(前方リーチ)について,自発的条件での運動誘発電位の比較を行った。測定回数は筋電図onsetにて,一条件一セットの有効データ数を50回として,3セットの測定を行った。その結果,自発的条件特有の運動準備電位と考えられる波形を得ることができ,さらに,MEG測定における高難易度課題であるリーチング動作での有効データを得ることが可能となった。今後は,統計的解析が可能な有効データ数を蓄積し,結果を吟味したうえで成果を報告したいと考える。また,リーチング動作時のMEG測定が可能となったことによって,様々な操作対象にリーチする段階での脳内準備電位を比較することが理論的には可能であり,次の段階での課題であると考えている。一方,今年度は,島津製作所の協力でfNIRS(島津製作所製マルチチャンネルOMM3000)を使用することが可能となり,MEGが不得意とするダイナミックな活動時の脳内活動の変化を研究対象とすることが可能となった。fNIRSを用いた研究成果は第45回日本生体医工学会(2006年5月15-17日)などで発表したほか,第41回日本作業療法学会(2007年6月22-24日)でも発表予定である。
刺激応答性近赤外色素－高分子複合材料の開発と生体応用

pH変化に応答し、発光性を変化させる近赤外シアニン系色素を開発した。緩衝溶液中で吸光度、発光強度を測定したところ、分子内求核性官能基の違いにより、pH応答領域が異なることを明らかにした。また、吸光度、発光強度ともpH変化に鋭敏に応答し、その応答は可逆であった。腫瘍細胞共存下においても、その応答性は損なわれず、色素はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、エンドソーム中の低pHに応答して発光することがわかった。ポリエチレングリコールを複合化させたハイブリッド材料は光腫瘍イメージングに適用でき、腫瘍の可視化が可能であった。pH応答性を示す色素のうち、腫瘍近傍の弱酸性を認識して応答するものは少ない。また、生体イメージングに利用可能な近赤外色素に限れば、ほとんど知られていない。それゆえ、そのような応答をする色素を開発できれば、腫瘍の高コントラストな可視ニアにつながると言える。本課題では、近赤外色素インドシアニングリーン(ICG)の構造に着目し、ベンゾインドールの窒素原子上に求核置換基を持つ色素を設計、合成した。この色素は求核置換基の水素原子がプロトンとして脱離し、ベンゾインドールのイミン部位に分子内求核付加することで、近赤外領域に示す光吸発光特性を失う。求核置換基としてメルカプト基を有する色素は、中性環境では閉環構造となり、近赤外領域に吸発光特性を示さないが、弱酸性環境(pH 6以下)で近赤外領域に吸発光特性を示すことを見出した。また、PEG化した色素は水中で自己集合体を形成したが、pH応答性を失うことはなかった。PEG化したICG誘導体を造影剤として用いる光腫瘍イメージングの結果、腫瘍の可視化が可能であることを示した。また、PEGの長さが長くなるにつれて腫瘍への集積性が高くなることを示した。これらのpH応答性ICGは、自己集合体の疎水性コアにおいて徐々に開環構造が優先されることを見出した。疎水性分子とPEGの複合材料が形成する自己集合体内部にこれら色素を取り込ませることで、この予期しなかった開環構造への変化を抑制できることも見出した。本課題では昨年度、pH応答性ICG類縁体を合成し、腫瘍近傍の弱酸性に応答し、近赤外領域に吸発光特性を示すことを明らかにした。特にメルカプト基を有する色素が望む応答に近いことを見出した。これらは当初研究計画に記載した内容が順調に進捗していることを示す。また、本課題では昨年度、合成したICG類縁体を用いる光腫瘍イメージングも行い、造影剤として機能することも見出した。このことは、当初記載した平成28年度の研究計画に含まれており、計画以上に進捗していることを示す。さらに、本課題では昨年度、合成したICG類縁体が高分子自己集合体の疎水性コア内部で予期しない開環構造への変化を起こすことを見出した。また、疎水性分子ーPEGの複合体が形成する自己集合体に内包させることで、この現象を抑制できることも見出した。このことは当初研究計画に含まれていない新しい知見の発見であり、計画以上に進展していると言える。本年度は、開発したpH応答性色素の詳細な物性評価を行うと共に、生体内外でのpH応答を評価した。ベンゾインドール環の窒素原子上に求核性置換基である3-アミノプロピル基、3-ヒドロキシプロピル基および3-メルカプトプロピル基を有する近赤外シアニン色素を開発した。これらの色素はおのおの、pH 7-9, 5-8, 3-6で開環状態の発光性色素と閉環状態の非発光性色素の平衡状態になる。色素を含む緩衝液を酸性と塩基性に交互に変化させても、いずれの色素も吸光度や発光強度は大きな減衰を示さなかった。このように本年度計画通りpH応答性色素の詳細な物性を明らかにした。pH応答性色素をHeLa細胞に37°Cで播種したところ、時間経過と共に発光量が増大した。エンドサイトーシスにより色素が取り込まれ細胞内の低pH環境を認識することを明らかにした。なお、ヒドロキシ基を有する色素は中性条件でも一部正電荷を持つ開環構造を取るため、この構造を有する色素が細胞表面のリン脂質に由来する負電荷と相互作用し吸着することも見出した。このように本課題では、開発した色素が細胞存在下においてもpH応答性を示すだけでなく、電荷が挙動制御に影響を与えることを見出した。ポリエチレングリコールを結合させたpH応答性色素を担がんマウス(HeLa細胞)に投与したところ、腫瘍集積性を示し、光イメージングにおいて腫瘍の可視化に成功した。このことは計画通り光腫瘍造影剤を開発できたことを示す。指標となる色素を結合させ、生体内でのpH応答性を確認することが重要である。本萌芽研究では、申請当初目標に掲げたpH応答性色素の開発とそれを造影分子として有する光腫瘍造影剤の開発に成功した。実用的な造影剤開発に、このシーズを活かすことが今後の課題である。なお、本成果は2016年度特許公開され(特開2016-160194)、現在論文投稿中である。

腫瘍細胞共存下においても、その応答性は損なわれず、色素はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、エンドソーム中の低pHに応答して発光することがわかった。ポリエチレングリコールを複合化させたハイブリッド材料は光腫瘍イメージングに適用でき、腫瘍の可視化が可能であった。平成28年度は、疎水性分子とPEGの複合材料が形成する自己集合体に内包させたpH応答性ICGを用いる光腫瘍イメージングを行い、これらが有望な造影剤であることを示す。また、時間経過とともに観測されていた開環構造への変化を、様々な疎水性分子の構造と比較し系統立てて考察することを目指す。平成28年度は、合成したpH応答性ICGを用いる光腫瘍イメージングを検討し、実際に腫瘍近傍のpHに応答しているのかどうか明らかにしたい。特に、pH応答性を持たない色素と複合化し、これを内部標準とする評価系を構築して、上記の評価に適用する。これらを精査し、腫瘍のみを高コントラストに可視化できる光腫瘍造影剤を開発する。有機合成化学
グルタミン酸の興奮毒性に拮抗する内因性アミノ酸の存在様式と機能的役割

1.目的大脳皮質で主要な興奮性伝達物質候補であるグルタミン酸は脳虚血などの病的状態においては神経毒として作用し、神経細胞の壊死を起こすことが知られている。さらにこの作用はN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体の賦活によりCa^<2+>の過剰流入を引き起こすことによって生じると推定されている。最近、トリプトファン代謝産物であるキヌレン酸が脊髄においてNMDA受容体に作用しグルタミン酸に拮抗することが報告された。キヌレン酸は内因性物質であるから脳内でグルタミン酸の興奮毒性に拮抗し神経細胞死の抑制等、重要な機能的役割を担っていることが想定される。本研究では、このような内因性物質の存在様式と機能的役割を明らかにするため、グルタミン酸、キヌレン酸及びその類似アミノ酸が大脳皮質にどの程度存在するのかを明らかにしようとした。2.方法麻酔したネコの大脳皮質視覚野にプッシュプルカニュラを設置し、人工脳脊髄液で視覚野を潅流し回収した潅流液を高速液体クロマトグラフィにて測定した。次に、光刺激を与えた場合、あるいは外側膝状体を電気刺激した場合、各種アミノ酸の濃度が変化するかどうかも解析した。さらに、潅流液をCa^<2+>フリ-とした場合この変化が生じなくなるかどうかを観察した。3.結果回収した潅流液より17種のアミノ酸の濃度を測定できた。このうち外側膝状体電気刺激によって有意に増加したものは、グルタミン酸、アスパラギン酸及びガンマアミノ酪酸(GABA)のみであった。但し、アスパラギン酸の増加は変動が大きく光刺激の場合は必ずしも有意ではなかった。また、これらの増大Ca^<2+>依存性であることが判明した。4.結論ネコ大脳皮質視覚野でグルタミン酸が興奮性伝達物質らしいことが示された。キヌレン酸等は計測できず今後の課題として残った。
イオンビームを用いたナノ領域の化学形態分析法の開発

本研究では、ナノ領域において化学状態分析可能なナノビーム分析システムの構築を図った。ナノビーム形成システムと、PIXE法、RBS法、off-Axis STIM法等のイオンビーム分析法を組み合わせることにより、水素から重金属までの同時分析により、ナノ領域での化学状態分析を可能とした。ナノビーム形成のために、ダイナミトロン加速器のイオン源、加速管に改良を加えることで、安定度と輝度を向上させた。またマイクロビーム分析システムにおいても寄生磁場の除去を図り、最終的に400×400nmの空間分解能を実現した。開発したナノビーム分析システムを、黄砂の個別粒子分析に応用した。黄砂粒子には、シリコン、カルシウム、酸素、炭素、水素が多く含まれていた。黄砂粒子中のアルミニウム、シリコン、カルシウムの元素濃度の比率は、中国大陸と日本の土壌の組成の違いを表していた。カルシウムと塩素の濃度は、中国大陸から日本までの飛来経路によって異なっていた。黄砂粒子はマンガンや亜鉛等の元素を含んでいた。これは黄砂粒子が日本に飛来する経路において、人為起源のエアロゾルと混合・反応を起こすためであると考えられる。これらのことは、ナノビームを用いた個別粒子分析をすることにより明らかになったものであり、ナノビーム分析システムは、これらのメカニズム解明において非常に有効であると考えられる。ナノビーム分析システムを酸化皮膜層分析に応用した。酸化層の厚みだけでなく、元素分布についてもナノ領域において調べることが可能であった。酸化皮膜層はCrの濃度により大きく影響を受けることが分かった。このように、本研究で開発したナノビームシステムはこれらの研究で非常に役に立つと考えられる。本研究では、加速器からの陽子ビームを数十ナノメートルのスポットに絞り込んで試料表面を二次元走査するナノ陽子ビームラインを構築し、PIXE法をはじめとする種々のイオンビーム分析システムを組み合わせることにより、ナノ領域の空間分解能で元素の分布測定することにより、環境水中の各種化学条件下における核燃料物質や有害元素の化学形態を調べることの出来る分析システムを構築することを目的とします。ナノビーム形成のためには加速器をはじめとする機器の安定化が必要不可欠です。そこで、本年度は、加速器の電圧安定化、ビームライン制御電源の安定化を図りました。その結果、ビーム径が400×400nm^2のナノビームを数10pAの強度で得られるようになり、サブミクロンの分解能で分析が可能となりました。更に、グリッドシャドー法を用いてナノビーム形成システムの寄生、国有収差を測定したところ、収差は十分に小さく抑えられており、数10ナノメートルのビーム径を達成するだけの性能を備えていることが分かりました。この事は、加速器のビーム輝度を向上させることにより、ナノビーム領域での高感度分析が可能であることを示しています。次に、ナノイオンビーム分析システムの開発を行いました。ナノメートルの空間分解能で化学状態を分析するには、水素から重金属を同時に分析する必要があります。そこで、Na以上の元素を分析可能な、PIXE法、He以上の軽元素を分析可能なRBS法、水素分析が可能なoff-axis STIM法の3種のイオンビーム分析法を組み合わせることにより、水素から重金属までを分析することの可能なシステムを構築しました。ここでは、マルチパラメータデータ収集システムを導入することにより、3種のイオンビーム分析を同時に行う事が可能となりました。現段階ではナノビームシステムのビーム強度はまだ十分でないため、分析時間が長くなることが考えられましたが、ビームのスキャンパターンにSTIM法にて測定した試料形状を反映させるシステムを新たに開発することにより、測定時間短縮を達成しました。

本研究では、加速器からの陽子ビームを数十ナノメートルのスポットに絞り込んで試料表面を二次元走査するナノ陽子ビームラインを構築し、荷電粒子励起X線分光(PIXE)法をはじめとする種々のイオンビーム分析システムを組み合わせ、ナノ領域の空間分解能で測定することにより、環境中の核燃料物質や有害元素の化学形態を調べることの可能なシステムの構築することを目的とします。本年度は昨年度に引き続き、高強度のナノビーム形成のために最も必要な加速器の電圧安定度の向上を図りました。高電圧印可時の各種情報を多次元に取り込み解析することにより、電圧変動の原因を突きとめ、改善を図った結果、ナノビームラインにおいても、ビーム量の変動は±20%以下となり、安定したナノビームの形成が可能となりました。さらに、昨年度に開発したナノイオンビーム分析システムを環境試料分析へ応用しました。黄砂は自然現象ですが、中国の工業地帯の上空を通過する際に、人工的な汚染物質との混合により変性を起こすために、黄砂中に含まれる元素の情報だけでなく、その化学状態は、黄砂の環境への影響を評価上で非常に重要な意味を持ちます。エアロゾルは、今回開発した極薄膜上にインパクターを用いて収集し、ナノイオンビーム分析システムにより、Na以上の元素はPIXE法、He以上の軽元素はラザフォード後方散乱(RBS)法、水素の分析はoff-axis透過イオン分光(STIM)法により行いました。軽元素の分析においては、薄膜中の軽元素がバックグラウンドとなりますが、今回開発した薄膜を用いることによってその大輻な低減がなされ、黄砂中の軽元素のイオンビーム分析が初めて可能となりました。これにより黄砂の輸送中の変性の状況を捉えることが出来きました。
ICUにおける多職種回診を基盤とした米国式治療バンドル導入の効果に関する検討

本研究計画は「世界標準の治療の提供」と「日本発のデータを世界に向けて発信」する事を目標として、多職種回診を基盤とした、ケアバンドルなどの医療システム導入による効果測定を目標としている。今年度はデータ発信に向けた体制構築を一つの主眼とした。具体的には日本集中治療学会が主導するデータベース事業であるJIPADの入力体制を確立し、ICUのベンチマークを可能とした。このデータベースから得られる内容を基に今年度に数多くの発表を国内外で行った。チェックリストと各種プロトコールに関しての作成・運用開始も本年度に多く行い、人工呼吸器装着時のチェックリスト・抜管チェックリスト・搬送チェックリスト・中心静脈穿刺時チェックリストなどを逐次的にICU内に導入し、その一部はICUから病院全体に広まり、マキシマルバリアプレコーションの定着に貢献した。特にせん妄防止の取組に関しては(株)ヤマハの共同研究を背景として、多くの取り組みを行い、選択された患者群におけるせん妄発生率を大きく低下させることに成功した。新しい取り組みに対する定期的なレビューと見直しは、歴史的に日本が不得意としていた側面であると思われる。我々は取り組みの一部が意図された形でしっかり実行されているかを評価するに当たって、auditスタイルを導入した。定期的に多職種で集まり、ランダムに抽出された症例を対象に各種取組が正しく行われているかを検証し、更なる発展に向けたコメントをまとめたレポートを作成するというauditは欧米諸国においては質改善の重要なステップとして定着しているが、今年度このauditを場合によっては事務職員も招いて行い、数々の貴重な意見を得ることが出来た。多くの新しい取組を施行し、その内容の一部は成果の発表に結びつけることが出来た。バンドルのさらなる導入に向けて多職種チームによる会合を効果的に行うための話し合いが既に開始されている。物品に関しては以前に運営費で購入した機器を今年度は使用した。その他のデータ入力者に関しても他の研究人の合算で雇用したために今年度には剰余金が発生した。
胃・腸特異的カルパインの機能解析

カルパインは細胞質内に存在し、Ca^<2+>により活性を制御されるプロテアーゼである。細胞質内のタンパク質に直接作用し、その活性・構造を変換・制御するモジュレータ・プロテアーゼである。哺乳類細胞では14種類の遺伝子が存在し、約半数は、組織特異的に発現する。これらは、発現組織の機能との密接な関係が予想されるため、その生理機能に大きな興味が持たれている。我々が発見したnCL-2/-2'は、胃や腸に発現が限定されるのみならず、胃の上皮層ピット細胞に極めて限定的に局在し、細胞移動や粘液分泌に重大な機能を果たすことが強く示唆された。胃や腸は食品の消毒、免疫、消化という非常に重要な機能を果たす故に、胃酸や粘液の分泌など極めて特殊化した機能を有する。これらの事実を合わせると、この胃・腸特異的カルパインの生理機能の解明は胃・腸の機能の新しい理解にもつながると考えられる。そこで本研究は、遺伝子改変マウスを用いて、胃・腸特異的カルパインの生理機能を解析した。消化管特異的カルパインnCL-2/-2'は、未だにヒト疾患との関連性は見出されていない。しかしながら、骨格筋特異的カルパインp94の欠損が筋ジストロフ・f-を発症することを考えると、nCL-2の欠損が胃腸の機能を不完全なものとすることは必須と考えられる。そこで、まず疾患という生物現象と関連づけるために、遺伝子改変マウスを用いた詳細な解析を行なった。次に、その分子機構の解析を行い、胃腸の機能にどのように関わっているかを解析した。nCL-2/-2'のC105Sノックインマウスは、共同研究によりホモマウスの作出を完了した。このマウスは、平常状態においては、一見、全く正常のマウスと変わらない。そのため、様々なストレスをかけた結果、ストレス性の胃出血がやや高い傾向であることが判明した。よって、nCL-2は胃・腸の防御機能に密接に関与することが強く示唆された。細胞骨格系タンパク質、情報伝達系酵素・転写因子などに直接作用し、これらの活性・構造を変換・制御するモジュレータープロテアーゼである。哺乳類細胞では14種類の遺伝子が同定され、スーパーファミリーを形成している。中でも組織に特異的に発現が見られる組織特異的カルパインがいくつか発見されており、その組織との機能と密接な関係が予想されるため、その生理機能に大きな興味が持たれている。我々が発見したnCL-2/-2'やnCL-4は、胃や腸に発現が限定されるのみならず、興味深い構造をもつ選択的スプライス産物が同時に発現している。さらに最近我々は、nCL-2/-2'が胃の上皮層ピット細胞に極めて限定的に局在することを見出し、細胞移動や粘液分泌に重大な機能を果たすことが強く示唆された。胃腸は食品の消毒、免疫、あるいは消化という様々な点で非常に重要な機能を果たす組織であり、それ故に胃酸や粘液の分泌など極めて特殊化した機能を有する。そこで本研究は、遺伝子改変マウスとDNAチップテクノロジーを用いて、胃・腸特異的カルパインの生理機能を解明することを目的とした。

まず疾患という生物現象と関連づけるために、遺伝子改変マウスを用いたアプローチを開始した。nCL-2/-2'のC105Sノックインマウスは、共同研究によりホモマウスの作出を完了し、胃・腸の形態学的・機能的解析をおこなった。その結果、ノックインマウスでは、ストレス下での胃出血傾向が、野生型マウスに比べて著しいという興味深い表現型を示すことが判明した。現在、その分子機構を解析中である。カルパインは細胞質内に存在し、Ca^<2+>により活性を制御されるプロテアーゼである。細胞骨格系タンパク質、情報伝達系酵素・転写因子などに直接作用し、これらの活性・構造を変換・制御するモジュレータープロテアーゼである。哺乳類細胞では14種類の遺伝子が同定され、中でも組織特異的に発現が見られるカルパインがいくつか発見されており、その組織の機能との関連で、生理機能に大きな興味が持たれている。我々が発見したnCL-2/-2'やnCL-4は、胃や腸に発現が限定されるのみならず、興味深い構造をもつ選択的スプライス産物が同時に発現している。最近、nCL-2/-2'が胃の上皮層ピット細胞に極めて限定的に局在することを見出し、細胞移動や粘液分泌に重大な機能を果たすことが強く示唆された。胃や腸は食品の消毒、免疫、あるいは消化という様々な点で非常に重要であり、それ故に胃酸や粘液の分泌など極めて特殊化した機能を有する。そこで本研究は、遺伝子改変マウスとDNAチップテクノロジーを用いて、胃・腸特異的カルパインの生理機能を解明することを目的とした。ヒト疾患の症例などの記述の一切無いnCL-2/-2'及びnCL-4に関しては、遺伝子改変マウスを作成し、その表現型を見ることが、その生理機能解析において極めて重要と考えられるため、本年度は、ホモマウスの作出を完了しているnCL-2/-2'のC105Sノックインマウスについて、主に胃・腸の形態学的・機能的解析をおこなった。さらに、nCL-2の作用機序を明確にするため、マイクロアレイ解析、ツーハイブリッドスクリーニングなどを行った結果、小胞体の逆輸送に関与すると考えられるβ-COPと相互作用することが見出された。今後はこの生理的意義を明確にしていきたい。細胞質内のタンパク質に直接作用し、その活性・構造を変換・制御するモジュレータ・プロテアーゼである。哺乳類細胞では14種類の遺伝子が存在し、約半数は、組織特異的に発現する。これらは、発現組織の機能との密接な関係が予想されるため、その生理機能に大きな興味が持たれている。我々が発見したnCL-2/-2'は、胃や腸に発現が限定されるのみならず、胃の上皮層ピット細胞に極めて限定的に局在し、細胞移動や粘液分泌に重大な機能を果たすことが強く示唆された。胃や腸は食品の消毒、免疫、消化という非常に重要な機能を果たす故に、胃酸や粘液の分泌など極めて特殊化した機能を有する。これらの事実を合わせると、この胃・腸特異的カルパインの生理機能の解明は胃・腸の機能の新しい理解にもつながると考えられる。そこで本研究は、遺伝子改変マウスを用いて、胃・腸特異的カルパインの生理機能を解析した。消化管特異的カルパインnCL-2/-2'は、未だにヒト疾患との関連性は見出されていない。
超高速分子ディスプレイを用いた分子知能機械の研究

バイオ環境(電解質水溶液)中のクーロンポテンシャルのプロジェクションをナノメートル分解能および高速に行うことを原理とした「分子機械のラピッド・プロトタイピング」(設計技術の基盤研究)と,「分子機械の知能化」を目指した応用研究の2つの構成からなる.構築するバーチャル電極ディスプレイは,狙った分子近傍の電場を120 nm以下の空間分解能で1分子当たり10 nsの高速に任意に操作する.この超高速ディスプレイを用いて,分子モーター,DNA構造体など分子機械の機能化を,その場で上書きし,分子機能をラピッドプロトタイピングする設計論を目指すものである.バイオ環境(電解質水溶液)中のクーロンポテンシャルのプロジェクションをナノメートル分解能および高速に行うことを原理とした「分子機械のラピッド・プロトタイピング」(設計技術の基盤研究)と,「分子機械の知能化」を目指した応用研究の2つの構成からなる.構築するバーチャル電極ディスプレイは,狙った分子近傍の電場を120 nm以下の空間分解能で1分子当たり10 nsの高速に任意に操作する.この超高速ディスプレイを用いて,分子モーター,DNA構造体など分子機械の機能化を,その場で上書きし,分子機能をラピッドプロトタイピングする設計論を目指すものである.
交感神経活動の超慢性記録法の開発

本研究の目的は、ラットの交感神経活動を長期間連続測定する方法を開発することにある。近年、交感神経系は脾臓のNK細胞活性などの免疫機能あるいは肥満成因にかかわるエネルギー代謝調節など比較的長い時間のオーダーで機能調節に直接関与していることが示されてきた。これら長期間の植物性機能調節に関与する自律神経系の全容を明らかにするには月オーダーの交感神経活動の実測を行うことが必要である。第一に、腰部交感神経活動測定用慢性埋め込み型電極の開発とラット腰部交感神経の解剖図作成を行った。神経電極の開発をすすめたが、良好な結果は得られなかった。検討の結果、ステンレス製の電極が有効であった。また、ラットの筋肉血管の収縮に関与する交感神経系の走行を明らかにする目的で、腰部交感神経系の解剖図を作成した。第二に、ラットの自由行動下における腰部交感神経活動と下肢血流量の同時測定を行った。上記の方法を用いてラット睡眠時の腰部交感神経活動と循環動態の変化を観察した。結果、ラット睡眠REM期において下肢血流量は減少し同時に腰部交感神経活動が増加した。下肢筋肉血流量の調節は交感神経支配であることが示された。第三に、ラットのトレッドミル運動時の腎交感神経活動と循環動態の変化を観察した。上記の方法を腎臓交感神経活動測定に応用した。ラットのトレッドミル運動時に外来のノイズの混入無しで良好な腎交感神経活動の測定に成功した。以上、自由行動下のラットの腰部交感神経活動と腎交感神経活動の慢性記録の方法を確立できた。問題点として、現在計測可能期間が約1週間程度であり、目標の1カ月測定に至っていない。今後の検討を要する。今後の検討を要する。交感神経系は、循環あるいは消化吸収などの植物性生理機能を秒から分オーダーの比較的短い時間の機能調節に関与すると考えられてきた。しかし、近年、交感神経系は脾臓のNK細胞活性などの免疫機能あるいは肥満成因にかかわるエネルギー代謝調節など比較的長い時間のオーダーで機能調節に直接関与していることが示されてきた。本研究の目的は、ラットの交感神経活動を1ヶ月以上連続測定する方法を開発することにある。本年度は電極の開発を行った。電極素材として、1)導電性の糸、2)導電性のシリコンシ一ト、3)導電性の塗料を検討した。結果:電極の作成の容易さという点で3)の導電性塗料が優れていると結論した。具体的は、Electrodag423(日本チアソン株式会社)のものを使用した。本製品はカーボン塗料であり、電極抵抗は数十オーム以下である。カーボンを選定した理由は生体内での酸化が少ないからである。現在5×4mmのシートにカーボン塗料を平行にラインを引き、フレキシブルコード(Cooner社製)を接着した。生体内埋め込みを試みたが、現在成功には至っていない。電極の接合部の不安定さが原因と考えられる。引き続き検討をおこなう。

本研究の目的は、ラットの交感神経活動を長期間連続測定する方法を開発することにある。本年度は昨年度に続き電極及び手術手技の改良を中心に研究を進めた。本年度検討した項目と結果は以下の通りである。●フィルム型導電性シリコン神経電極の開発1.超薄型の神経電極を作成する。薄型絶縁シートにステンレススティール電極を張り付け、小型電極を開発した。結果、絶縁に用いたノリ(アロンアルファ、エポキシ樹脂)が導電性を持ち、電極間抵抗が減少し、良好な活動電位の記録は出来なかった。2.金メッキ電極を作成する。柔らかい銅銭に金メッキをし小型電極の開発を試みた。結果、金メッキにより安定した電極-神経間電位を得ることができず、良好な活動電位の記録は出来なかった。現在ステンレススティール製電極をもちいた電極開発を継続している。●手術手技の確立3.長期間慢性電極埋め込み手術手技の確立電極と神経の間の電極抵抗を減少させるために、神経剥離の方法を検討している。手術顕微鏡約40倍で神経を傷つけることなく剥離する方法を確立した。また、電極の移動を最小にする、電極セルロースパッチを開発した。長期間の測定が必要な理由は次に点にある。交感神経系は、循環あるいは消化吸収などの植物性生理機能を秒から分オーダーの比較的短い時間の機能調節に関与すると考えられてきた。しかし、近年、交感神経系は脾臓のNK細胞活性などの免疫機能あるいは肥満成因にかかわるエネルギー代謝調節など比較的長い時間のオーダーで機能調節に直接関与していることが示されてきた。これら長期間の植物性機能調節に関与する自律神経系の全容を明らかにするには月オーダーの交感神経活動の実測を行うことが必要である。本年度度は昨年度に続き手術手技及び実際の慢性留置実験を中心に研究を進めた。●新型電極の開発当初、フィルム型導電性シリコン神経電極の開発をすすめたが、良好な結果は得られなかった。試行錯誤の末、ステンレス製の電極が有効であった。●手術手技の確立長期間慢性電極埋め込み手術手技の確立:電極と神経の間の電極抵抗を減少させるために、神経剥離の方法を検討している。●長期埋め込み実験最長1ヶ月にわたる、腎交感神経活動の測定に成功した。しかし、平均で、約10日程度であり、安定した測定には至らなかった。また、腰部交感神経活動の測定も試みた。約7日程度の長期測定に成功した。当初の目的に1ヶ月の安定した測定方法の開発には、継続した検討が必要である。
「繊維強化複合材料の空気圧式高速衝撃試験機の試作」

本研究は高速の飛翔体が衝突し貫通をともなう場合のような衝撃負荷をうける繊維強化複合材料の貫通抵抗や衝撃吸収性の評価のための衝撃試験機を試作し、これを用いて複合材料の衝撃試験法を確立することを目的としている。本研究費により製作されている衝撃試験機に本年度新たに速度計測装置を取り付けた。発射速度は衝突体が発射孔において200mmの間隔で設置されている2つのHe-Neレ-ザ光を横切る時間間隔より測定される。これにより試験機の空気圧の限界で得られる飛翔体の速度を十分正確に計測できる。また試験片を貫通した後の飛翔体の速度および外部からの試験片の破壊現象の観察は高速度カメラにて撮影される連続写真により行われる。高速度カメラは225コマで最高35000コマ/sの速度で撮影することができる。炭素繊維/エポキシ強化積層板および炭素繊維/PEEK強化積層板に直径10mmの鋼球を最高220m/sの速度で衝突させた。さまざまな繊維配向の積層板の貫通破壊時の積層板のエネルギ-吸収量を計測し、貫通限界曲線を作成した。吸収エネルギ-は衝突の前後における鋼球の運動エネルギ-の差から算出した。同一の繊維配向であれば積層板の厚さに吸収エネルギ-量がほぼ比例することがわかった。また炭素繊維/エポキシ積層板では衝撃速度が増加するにつれ吸収エネルギ-量が減少し、層間剥離の面積も減少した。しかし炭素繊維/PEEK積層板では実験を行った衝撃速度範囲で逆に吸収エネルギ-が増加する傾向があった。また貫通後の積層板の衝撃面裏側は衝撃速度が増加するにつれてひし形から帯状に剥がれる傾向がある。このため衝撃面裏側に織物のプリプレグを積層した積層板を用いれば裏側の損傷域が貫通孔近傍付近にのみに限定されることが明らかになった。本研究は高速で運動する飛翔体が衝突する場合のような衝撃負荷をうける繊維強化複合材料の強度および衝撃吸収性の評価のための衝撃試験機を試作し、これを用いて複合材料の衝撃試験方法を確立することを目的とする。本年度は特に衝撃試験機本体の試作を行った。衝撃試験機は外径5、10mmの弾丸を長さ2mの加速チューブ中で空気圧により加速発射し、試験片に衝突させることにより衝撃負荷を与えるものである。発射速度は加速する空気圧の調節により定められる。加速チューブを交換することにより発射する弾丸の直径を変えることができる。発射するための最高使用圧力を3.6MPaとした。また改良を加えることを前提としてそれぞれの部品をボルト結合した。弾丸の発射性能試験を行ったところ次のような結果を得た。直径10mmの鋼球および同径で長さ30mmの鋼製円柱の場合、加速圧力1.3MPaでそれぞれ215m/sおよび122m/sの速度が得られた。また直径5mm、長さ20mmの鋼製円柱の場合、同じ圧力で加速したとき137m/sの速度が得られた。これらの数値は理論的に予想される値の約80%以上に達しており、所要の性能が得られていると考えられる。しかし直径5mmの鋼球では2.0MPaの圧力で266m/sの速度しか得られず300m/sの速度に達しなかった。ただし最高使用圧力に近い3.5MPaで300m/sの速度を得ることができた。1.3MPa程度の圧力により300m/sの速度で5mmの鋼球を発射させるために今後、構造の変更、窒素ガスなどを使用するなどして改良を行う。衝撃試験装置から直径5、10mmの小型の飛翔体が高速で発射されるため高い応答性を持つレーザを用いた計測方法が適切であり、次年度において試作する。また数種類の試験片支持台を試作し高エネルギーの衝撃に対する複合材料の標準的試験方法を提案する。提案する試験方法により繊維強化複合材料の衝撃強度および衝撃吸収性について考察する。

しかし炭素繊維/PEEK積層板では実験を行った衝撃速度範囲で逆に吸収エネルギ-が増加する傾向があった。また貫通後の積層板の衝撃面裏側は衝撃速度が増加するにつれてひし形から帯状に剥がれる傾向がある。このため衝撃面裏側に織物のプリプレグを積層した積層板を用いれば裏側の損傷域が貫通孔近傍付近にのみに限定されることが明らかになった。
不連続群および保型形式の整数論

研究実施計画の第一の部分については、織田は西ドイツのアイヒシュタット・カトリック大学のJ.Schwermer氏との共同研究で次数2のジ-ゲル・モジュラ-多様体の混合ホッジ構造と保型形式の関連を調べた。また将来より進んだL関数の研究のための準備として、ある種のp進群のwhittaker関数の多重Mellin変換を調べた。川又は3次元のQ-Fano多様体でp=1となるものを調べ、その特異点のindexとK^3がある定数でおさえられることを示した。実施計画の第二の部分については、予定外の研究上の進展がいくつかあった。組み紐群の射影有限化への、有理数体Qの絶対がロア群への作用に関連して、射影直線からn点をぬいた開曲線の基本群のメタア-ベル化へのガロア群の作用を、千葉大学・教養部の寺杣友秀氏との共同研究で調べた。これは高次元のFermat多様体の虚数乗法論と深い関係があることがわかり、伊原康隆やG.Andersonのやった3点の場合の研究の自然な一般化を与えている。この種の問題をさらに一般に考えるためには、タイヒミュラ-群の射影有限化への絶対ガロア群の作用を考えることがひとつの自然な方向となる。これについては、A.Grothendieckがひとつの研究計画を提出している。この計画では必ずしもGal(Q^^-/Q)の作用が厳密に定義されていないが、これを、Stackのetaleホモトピ-型を定義して、きちんと定義し、いくつか基礎的で重要な結果を得た。また、河澄はこれに関連して、1次元複素射影空間のn点のmoduli空間のホモトピ-型を調べた。
CHIME年代に基づくアジア大陸東縁の二畳紀末基盤岩の対比

日本列島の基盤岩類の地質調査を行うと共に,中国山東半島・福建省,コリア半島の嶺南地塊と京畿地塊,日本列島の肥後変成帯・南部北上帯およびロシア極東地域の基盤岩についてCHIME年代測定と蛍光X線分析を実施した。本研究で測定した年代データは13,000個を越える。主要な研究成果は以下の通りである。(1)南部北上帯,薄衣礫岩中のトーナル岩礫は258247Maの年代を示す。これより,礫岩の後背地の花崗岩類は固結直後に急速に隆起・削剥したこと,南部北上帯とロシアシホテアリン地域は二畳紀花崗岩活動において類縁であることを報告した。(2)愛知県東部,音羽-本宮山地域の領家変成岩に貫入する花崗岩質脈は変形脈と非変形脈で年代が異なることを明らかにし,領家帯が約90Ma前に高温の変形条件から脆性的な変形条件に移行したと結論した。(3)中国の福建省内陸部および日本列島の美濃帯・手取層群の後背地にはコリア半島の京畿地塊・嶺南地塊と同等なジュラ紀花崗岩類が広く分布したことを明らかにした。(4)コリア半島の瑞山地域の瑞山花崗片麻岩は約17億年前に生じて約2.5億年前にモナザイトが再結晶するような高度変成作用を被っていること,花崗片麻岩に随伴する準片麻岩は古生代の堆積岩が約2.5億年前に変成したものであることを明らかにした。これにより,コリア半島の京畿地塊と嶺南地塊に,二畳紀末のグラニュライト角閃岩相の高変成度変成岩が広く分布することが確実となり,日本列島の飛騨変成帯との対比が可能になった。(5)熊本県中央部の肥後変成帯をコリア半島の二畳紀沃川帯に対比するモデルの基になった約2.5億年のジルコンは砕屑粒子あることを明らかにした。グラニュライト相変成鉱物とフォリエーションを形成しているモナザイトは約1.2億年であり,九州の肥後変成帯は年代的・岩石学的に東北日本の阿武隈変成帯に対比できることを示した。科学研究費補助金の交付を受けて,日本列島の二畳紀末基盤岩類と推定されてきた隠岐道後の飛騨帯,九州の肥後変成帯および中部地方領家帯南縁部の地質調査を実施し,また,コリア半島・シホターリン・日本列島の変成岩・花崗岩類・堆積岩の岩石記載とCHIME年代測定を行った。平成12年度の主な成果は以下のとおりである。(1)コリア半島京畿地塊の堆積岩源変成岩の変成年代は,隠岐道後の飛騨変成岩と同様,約2.5億年前である.また,両者とも1.8-1.7億年前の花崗岩の貫入を受けている点は共通している.京畿地塊の2.5億年前の変成岩は花崗片麻岩(約20億年前の花崗岩が約17億年前に変成したもの)を基盤としているが,隠岐道後の飛騨帯からは先カンブリア紀の基盤岩類は見つかっていない.

(2)肥後変成岩中のジルコンは約1.2億年から19.6億年までの幅広い年代スペクトルを持つが,量的には2.5億年の粒子が多い。2.5億年の粒子は,ジルコンの再結晶が期待できない低変成度岩にも存在して,マグマからの晶出を意味するコンセントリックな成長累帯を保持している。また,累帯ジルコンの古い年代領域と約120Maのリムの間に250Maの領域が存在するケースは稀である。約250Maのジルコンは砕屑粒子と結論され,大多数のモナザイト粒子に共通する1.2億年が肥後変成作用の時期であることが判明した.従って,九州の肥後変成帯をコリア半島の二畳紀沃川帯に連続させるモデルは成立しない.(3)美濃帯や手取層群のジュラ紀末堆積岩中にジュラ紀初頭(約1.8億年)の花崗岩礫が多産することが判明した.これと,約20億年のジルコン,17億年と2.5億年のモナザイトが共存している点から,ジュラ紀における日本列島の後背地はコリア半島の京畿地塊と同等な地質帯であったと推定される.平成13年度は,日本列島の基盤岩類の地質調査を行うと共に,コリア半島の嶺南地塊と京畿地塊,日本列島の肥後変成帯の基盤岩についてCHIME年代測定と蛍光X線分析を実施した。主要な研究成果は以下の通りである。(1)コリア半島の瑞山地域の京畿地塊は準片麻岩と瑞山花崗片麻岩からなる。CHIME年代測定から,瑞山花崗片麻岩は約17億年前に生じたこと,両者は約2.5億年前にモナザイトが再結晶するような高度変成作用を被っていることが明らかになった。準片麻岩に含まれるジルコンの年代累帯解析から,それぞれの粒子のコアが440±90Ma前までは別々の岩石として存在していたことが判明し,準片麻岩は古生代の堆積岩が約2.5億年前に変成したものであることが実証できた。平成12年度の研究成果と合わせて,これまで始生代と推定されてきたコリア半島の京畿地塊西部と嶺南地塊北西部には,原生代中期の花崗岩原変成岩とそれを不整合に覆う古生代の堆積岩が分布し,共に二畳紀末にグラニュライト角閃岩相の高度変成作用を受けたと結論した。(2)熊本県中央部に分布する肥後変成岩中のジルコンは約1.2億年から19.6億年までの幅広い年代スペクトルを持つが,量的には2.5億年の粒子が多い。2.5億年の粒子は,ジルコンの再結晶が期待できない低変成度岩にも存在し,マグマからの晶出を意味するコンセントリックな成長累帯を保持すので,砕屑粒子であることが判明した。変成岩中のモナザイト粒子の年代は1.2億年である。モナザイトはグラニュライト相変成鉱物と共にフォリエーションを形成しており,高変成度の肥後変成作用が1.2億年前に生じたことが確実になった。従って,九州の肥後変成帯をコリア半島の二畳紀末沃川変成帯に連続させるモデルは成立しない。
植物感染性線虫の植物感染機構の総合的解析と作物への応用研究

本研究では、まず植物の線虫誘引・忌避物質の同定を目指している。また、線虫感染に関わる植物側因子の解析を進め、線虫感染機構の全体像を明らかにすることを第一目標としている。これまでに、センチュウの誘引物質の単離のために、シロイヌナズナの種子が利用できることが明らかとなった。シロイヌナズナの種子ムシゲルには、線虫誘引活性が有り、PFゲル上で、線虫誘引活性を示す。また、種子を種皮と胚に解剖して誘引活性を試験したところ、種皮に誘引活性が有ることが明らかとなった。さらに、ムシゲルが精製できない突然変異体シロイヌナズナ等の種子では、線虫誘引活性が見られなかった。これらのことから、種皮から分泌されるムシゲルに誘引活性が有ることが明らかとなった。一方、植物側因子の探索として、センチュウのエフェクター蛋白質を回収し、その同定を進めている。一方、作物生産への応用研究も行っている。誘引・忌避物質の同定により、線虫トラップの開発や、線虫を作物に寄せ付けない農業技術の開発等、応用研究を展開する。そのために、誘引剤を浸潤させたようなセンチュウホイホイを開発中で、センチュウのトラップ用の穴を開けた様々な種類のセラミックスを作成し、今後、その評価を行う予定である。さらに、線虫感染機構の知見を応用し、線虫感染抵抗性品種を作出し、評価まで行う。これまでに、シロイヌナズナのara6突然変異体はセンチュウ感染抵抗性を示すことが我々の試験でわかっている。このことから、トマトのara6突然変異体をCRISPR技術により作成中である。形質転換体が確立次第、センチュウ感染抵抗性試験を行いたいと考えている。本研究では、以下のような研究項目を計画し、実施しているが、それぞれについて、順調に結果がでており、概ね順調に進展している。1:線虫誘引・忌避物質の同定と農学的線虫対策応用研究(基礎研究・応用研究)I:ダイズの根端抽出液を大量に調整し、誘引物質を精製する。II:種子ムシゲルの誘引物質の同定と、その構造の多様性について、多種植物を用いて解析する。III:ケミカルライブラリーを用いた線虫誘引・忌避物質の同定を行う。IV:圃場を用いて、誘引・忌避物質を利用した、線虫感染低減のための農業技術開発を行う。2:線虫感染に関わる植物側遺伝子の分子機構の解明(基礎研究)I:エフェクター遺伝子の植物内での分子機構の解明(シロイヌナズナ):既に我々が同定しているエフェクター蛋白質、MJD15とMSP7の植物細胞内ターゲット因子として、これまでに、それぞれ、MAPKKKとB3転写因子を見出している。本研究では、これらのシグナル伝達因子群の分子遺伝学的機能解析を行う。II:高温による線虫抵抗性打破の分子機構の解明(トマト);トマトのMi線虫抵抗性系統(農業品種)は、高温処理で抵抗性が打破される。そこで、高温経験時のエピジェネティックな状態をゲノムワイドに解析する。また、RNAの発現パターンも網羅的に調査し、併せて解析することで、高温による線虫感染抵抗性打破機構を解明する。III: EMS,γ線由来の線虫感染抵抗性作物系統のスクリーニング;Mi線虫抵抗性トマトにも感染するような強力な感染力を持つMi線虫感染抵抗性を打破する線虫系統が世界各地で出現し、問題になっている。そこで、トマトとキュウリの変異源処理済みラインに、Mi線虫抵抗性打破線虫を感染させ、線虫感染抵抗性を示す作物系統の選抜を行う。3:線虫抵抗性トマトの作出とその農学的評価それぞれの研究項目について、順次、研究を進めていく。特に、線虫誘引物質の同定は予想以上に進んでおり、論文執筆を進めていく。また、誘引物質を浸潤させたセラミックスは、プレート内では、センチュウ誘引活性を示せており、今後、ポット栽培や圃場での試験を行い、より、農業現場に近い状況での有用性を明らかにして、実装に近づけたいと考えている。また、センチュウエフェクター蛋白質も、候補を単離後、シロイヌナズナの結合因子の同定と、その遺伝学的解析が進んでおり、H31年度中には論文としてまとめたいと考えている。抵抗性トマトの作出についても、CRISPR変異体の候補は得られており、現在、系統化を進めているところである。本年度は、ホモ個体が完成する予定であるので、種子が得られ次第、センチュウ感染抵抗性試験を行い、その効果を検証したいと考えている。

誘引・忌避物質の同定により、線虫トラップの開発や、線虫を作物に寄せ付けない農業技術の開発等、応用研究を展開する。そのために、誘引剤を浸潤させたようなセンチュウホイホイを開発中で、センチュウのトラップ用の穴を開けた様々な種類のセラミックスを作成し、今後、その評価を行う予定である。さらに、線虫感染機構の知見を応用し、線虫感染抵抗性品種を作出し、評価まで行う。これまでに、シロイヌナズナのara6突然変異体はセンチュウ感染抵抗性を示すことが我々の試験でわかっている。このことから、トマトのara6突然変異体をCRISPR技術により作成中である。形質転換体が確立次第、センチュウ感染抵抗性試験を行いたいと考えている。本研究では、以下のような研究項目を計画し、実施しているが、それぞれについて、順調に結果がでており、概ね順調に進展している。1:線虫誘引・忌避物質の同定と農学的線虫対策応用研究(基礎研究・応用研究)I:ダイズの根端抽出液を大量に調整し、誘引物質を精製する。II:種子ムシゲルの誘引物質の同定と、その構造の多様性について、多種植物を用いて解析する。III:ケミカルライブラリーを用いた線虫誘引・忌避物質の同定を行う。IV:圃場を用いて、誘引・忌避物質を利用した、線虫感染低減のための農業技術開発を行う。2:線虫感染に関わる植物側遺伝子の分子機構の解明(基礎研究)I:エフェクター遺伝子の植物内での分子機構の解明(シロイヌナズナ):既に我々が同定しているエフェクター蛋白質、MJD15とMSP7の植物細胞内ターゲット因子として、これまでに、それぞれ、MAPKKKとB3転写因子を見出している。本研究では、これらのシグナル伝達因子群の分子遺伝学的機能解析を行う。II:高温による線虫抵抗性打破の分子機構の解明(トマト);トマトのMi線虫抵抗性系統(農業品種)は、高温処理で抵抗性が打破される。そこで、高温経験時のエピジェネティックな状態をゲノムワイドに解析する。また、RNAの発現パターンも網羅的に調査し、併せて解析することで、高温による線虫感染抵抗性打破機構を解明する。III: EMS,γ線由来の線虫感染抵抗性作物系統のスクリーニング;Mi線虫抵抗性トマトにも感染するような強力な感染力を持つMi線虫感染抵抗性を打破する線虫系統が世界各地で出現し、問題になっている。そこで、トマトとキュウリの変異源処理済みラインに、Mi線虫抵抗性打破線虫を感染させ、線虫感染抵抗性を示す作物系統の選抜を行う。3:線虫抵抗性トマトの作出とその農学的評価それぞれの研究項目について、順次、研究を進めていく。特に、線虫誘引物質の同定は予想以上に進んでおり、論文執筆を進めていく。また、誘引物質を浸潤させたセラミックスは、プレート内では、センチュウ誘引活性を示せており、今後、ポット栽培や圃場での試験を行い、より、農業現場に近い状況での有用性を明らかにして、実装に近づけたいと考えている。また、センチュウエフェクター蛋白質も、候補を単離後、シロイヌナズナの結合因子の同定と、その遺伝学的解析が進んでおり、H31年度中には論文としてまとめたいと考えている。抵抗性トマトの作出についても、CRISPR変異体の候補は得られており、現在、系統化を進めているところである。