hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物ホルモンの新規な代謝酵素の同定と機能解析

プロモーターの制御下にそれぞれの遺伝子をおいた発現プラスミドを調製し,アグロバクテリウム法によりシロイヌナズナを形質転換した.得られたT2世代の植物を用いて,CYP94D1およびCYP94D2遺伝子発現量をリアルタイムPCR法により定量した.その結果,CYP94D1過剰発現体では,野生型植物の41-144倍,CYP94D2過剰発現体では野生型植物の1.9-2.2倍に遺伝子発現量が増加していた.発芽後4週間後の各植物体の地上部より植物ホルモンを抽出し,UPLC MS/MSを用いて定量すると,CYP94D2過剰発現体ではジャスモン酸類水酸化物の内生量に変化はなかったが,CYP94D1過剰発現体ではCYP94D1発現量に応じた12-OH JAの配糖体である12-OH JA-Glcの内生量の増加が認められた.このことから,CYP94D1過剰発現体では,12-OH JAあるいはこの類縁体が蓄積し,12-OH JA-Glcの蓄積が導かれたことが示唆された.すなわち,CYP94D1がジャスモン酸類の水酸化にかかわる可能性を示すことができた.生物化学昨年度はCYP94D2の欠損変異体の取得に至らず,若干の遅れとしたが,本年度の解析の結果,当該遺伝子欠損は致死的で取得できないことが判明したため,解析内容から除外することとした.本年度は当初計画にて予定していたCYP94D1欠損変異体の解析を行い,本酵素がジャスモン酸とイソロイシンの接合体を水酸化する酵素のネガティブレギュレーターとして機能する可能性を示唆することができた.次年度はCYP94D1とCYP94D2の各遺伝子をそれぞれ過剰発現させたシロイヌナズナを用いて解析することを予定している。現在これらの遺伝子を導入した形質転換体の選抜中であり,次年度にこれらの解析を実施できる状況である。以上のことから現在のところ順調に研究を進めており,おおむね順調であると考えている。平成24年度は,ターゲットとしたモノオキシゲナーゼであるCYP94D1とCYP94D2,ツベロン酸-Ileの加水分解酵素と推定したILL6の組換えタンパク質の生化学的機能解析を予定していた。本年度は予定通り,これらの酵素生産系を構築し,それぞれの機能解析を実施した。結果としては,想定した結果が得られなかったが,CYP94D1とCYP94D2については酵素の生産がおこなわれなかったことが活性が得られなかった原因であると考えており,次年度以降予定しているの変異体や過剰発現体の解析により結論を導くことができると考えている。ILL6についてはタンパク質の生産がおこなわれているにもかかわらず,活性が見られなかったため,想定していたツベロン酸-Ileの加水分解酵素ではないと考えられる。このため,以降の解析はCYP94D1とCYP94D2の機能解析に注力すべきと判断し,ILL6の変異体の解析は実施しないこととした。平成24年度の計画ではCYP94D1とCYP94D2遺伝子の変異体の単離も予定していた。シロイヌナズナの変異体のバンクよりCYP94D1とCYP94D2の欠損株の種子を購入し,CYP94D1についてはホモ接合体の単離に成功している。CYP94D2については,現在ホモ接合体の単離作業を行っているところである。CYP94D2のホモ接合体の単離作業のみが計画より若干遅れているが,次年度以降に挽回が十分可能であると考えている。
渡名喜島(沖縄県・島尻郡)の民家・集落の空間構成に関する研究

沖縄の民家は、「石垣と福木に囲まれた赤瓦の二棟型住居」と一般的には認識されているが、われわれの久米島における悉皆調査の結果は、実に多様であった。沖縄の民家はこの多様さの中に、家づくりの共通性があり、それらの原理や原則をもとにバリエーションとして建築的表現がなされている。昭和56年より調査を行っている久米島では、民家構成の原理・原則的なことがらがいくつか抽出されたが、同じ地域の隣の島であるこの島と比較してさえ異った事柄があらわれることから、これらが琉球弧の東西1200kmにわたって点在する離島すべてに共通するかは不明である。文献上からは、空間構成の原理に共通性があるように思われるのだが、形態的には地域的な特徴が顕著にあらわれているように思われる。<集落>一島一村一部落の渡名喜島は、自然環境の厳しさからか、他の島では見られない独特の景観を呈していた。日本の民家の敷地は、道より高いのが一般的であり、沖縄地方においても同様であるが、この島では逆に道より低い位置にある。敷地を掘り下げることによって建物を侵害する潮風を防ぎ、また台風による破壊から免れている。このような特異な形態を可能とした条件は、敷地が厚い砂質層であるため敷地内の水はけが良く、敷地を堀り下げても浸水することがほとんどなかったからである。敷地が下がっている家は全民家の72%であり、最も深いものは、1.8mも下がっている。<民家>屋敷内の建物配置は、沖縄地方の典型的配置である。敷地囲いは、四方を囲まれているものが、全体の79%と圧倒的に多い。主屋の91%が南面している。ほとんどの民家が二番座までの構成であり廊下を付随したものが多い。久米島のように生活の場としての裏座敷でなく、そのほとんどが収蔵スペースであり巾が狭い。平面的には、北西の角が欠け、南面が揃って、これも久米島民家とは異なっている。本研究は2年間にわたり、今年度がその最終年度である。以下その概要を報告する。1.渡名喜村の村落史渡名喜村がいつ頃から発生したかは定かでない。「球陽」(197375年編集)に渡名喜島の人々の善行談が見られるのが文献として最も古い。かつて、島内に古文書があったと見られるが、飢饉の折の養蚕に古文書が蚕の床として使用され、消滅したと伝えられている。したがって、遺跡時代(渡名喜島で最も古い貝塚が3千数百年前とされている)から球陽の間を埋める文献は少なく、集落の発生,移動については口伝から想像で推定する結果となった。2.伝統的住居の特質民家の実測から、詳細な屋敷構成と平面形ならびに構法の特質を知ることができた。その特徴の1つが、敷地の断面形が、すべて道より12メートル低くなり、その周囲を石垣と福木の防風林で囲った構造である。そのためのさまざまな工夫が見られる。特徴の2は、屋敷内の家屋配置と主屋の平面形である。配置では、北西角のフール(豚便所)の前が作業スペースとして確保されていること。主屋の平面形では、居住部分と炊事部分が南面に一直線に配置されていることである。この例は一般的な沖縄型住居にはきわめて少ない。3.集落構成と景観集落の実施

踏査からさまざまな情報を得ることができた。その1つが道の特質とそのメモリアルな意味である。形態的特質は、近代都市計画に見られるような美しい井然型の形態であるが、実際に歩いてみると微妙に変化し、複雑な美しい景観を生みだしている。メモリアルな意味として、街路の一部が広場となり拝所や井戸に接している。これらで行なわれる年間の祭礼は、村落の歴史の再現とも見られる。実地踏査は集落構成要素集積図として'86年の姿を記録した。
糖尿病性腎症におけるmicroRNAによるRAGEシグナルをターゲットとする治療

マウスの糖尿病性腎症モデルにおいて、終末糖化産物受容体(RAGE)を欠失させると、尿中アルブミンおよび糸球体硬化症が減少することが報告されている。マイクロRNA(miRNA)は、転写後に遺伝子発現を調節する小型非翻訳性RNAの一種であり、糖尿病性腎症(DN)の発症および進行において役割を果たすことも示されている。この研究の目的は、RAGEを欠失させる事により線維化促進性miRNAの発現をどのように変化させるかを解析し、メサンギウム細胞(MC)におけるこれらのmiRNAの役割を分析することである。我々は、TGF-βの存在下または非存在下で、高グルコースの条件下でRAGEノックアウト(KO)MCにおける線維症に関連するmRNAおよびmiRNAの発現を分析した。糖尿病性腎症と関連があることが知られているいくつかのmiRNAの発現の変化をPCRで定量した。これらの中で我々は、miR-214がRAGE KO細胞において70から100倍劇的に野生型MCよりも発現が上昇されていることを見出した。miR-214の過剰発現は、野生型MCにおいて線維化促進性遺伝子の発現を低下させた。一方、miR-214のノックダウンは線維性遺伝子の発現を増加させた。miRNA機能検証用3'-UTRレポーターアッセイを用いて、RAGEおよびRhoAシグナル伝達の下流にあるDiaph1がmiRNA-214の標的となることを確認した。以上の結果から、miR-214は、RAGE KO MCにおいて劇的に過剰発現され、そしてMCにおいてDiaph1を標的とすることによって少なくとも部分的に抗線維化作用を有すると考えられた。このことは、疑似miRNA-214を用いた糖尿病性腎症に対する新たな治療法の開発につながる可能性がある。この研究結果は2019年4月14日にオーストラリアで開催された国際腎臓学会で発表した。当初の計画でも、初年度はRAGEノックアウトメサンギウム細胞を用いて、糖尿病性腎症の進展に関与するRAGEシグナルに関連するmiRNAを網羅的に解析し、その候補のmiRNAを探索することであった。当該年度において、この候補であるmiRNA-214を見出し、メサンギウム細胞を用いて機能評価を行い抗線維化作用がある事を確認した。またmiRNA-214の標的候補遺伝子であるDiaph1をデータベースから同定し特別なアッセイ系を用いて標的であることを確認した。これらの結果はすべてin vitroで行われており、当初の計画と一致している。これまでの研究結果から同定したmiRNA-214の発現と糖尿病性腎症との関連性を動物モデルを用いて解析する。まず、8週齢のKKAyマウスとKKTaを自然経過で飼育し20週齢でマウスを屠殺し、腎組織、血液を採取し、同定したmiRNAと腎線維化・炎症に関連するmRNAとの関連を解析する。次に、miRNAによる糖尿病性腎症の治療の効果を検討する。12週齢のKKAyマウスを疑似miRNA投与群,抗miRNA投与群と非標的コントロール投与群に分け、各々の薬剤を尾静脈より定期的に静脈投与する。20週齢でマウスを屠殺し、腎組織、血液を採取し治療効果を解析する。

またmiRNA-214の標的候補遺伝子であるDiaph1をデータベースから同定し特別なアッセイ系を用いて標的であることを確認した。これらの結果はすべてin vitroで行われており、当初の計画と一致している。これまでの研究結果から同定したmiRNA-214の発現と糖尿病性腎症との関連性を動物モデルを用いて解析する。まず、8週齢のKKAyマウスとKKTaを自然経過で飼育し20週齢でマウスを屠殺し、腎組織、血液を採取し、同定したmiRNAと腎線維化・炎症に関連するmRNAとの関連を解析する。次に、miRNAによる糖尿病性腎症の治療の効果を検討する。12週齢のKKAyマウスを疑似miRNA投与群,抗miRNA投与群と非標的コントロール投与群に分け、各々の薬剤を尾静脈より定期的に静脈投与する。20週齢でマウスを屠殺し、腎組織、血液を採取し治療効果を解析する。平成30年度に学会発表する予定であったが、miR-214以外にもmiR-199aの発現上昇も認めたため、両者のmiRで解析を進めた為、平成30年度には発表せずに未使用額が生じた。最終的にはmiR-214にフォーカスを絞り、平成31年度4月の国際腎臓学会で発表を行った。未使用額は平成31年度の学会発表の旅費の経費に充てる事とする。
素粒子の質量の階層性

トップクォークの質量が、WやZゲージボゾンと同じオーダーであることから、フェルミオン質量の問題は、世代間のそれと同時に世代内でのそれも加わった。本研究は、フェルミオンの質量の階層的構造が、超対称性理論、動的ヒッグス模型を踏まえて、漸近非自由な動的ゲージ理論の可能性、力と物質の統一理論を視野に入れて、究極理論を追及・検討することを目標とする。具体的には、フェルミオン質量の階層性の検討とそれに関連するゲージ対称性、およびくりこみ群などの非摂動論的手法で検討し、フェルミオンの質量の起源を追求した。大統一理論という点からは未だ多くの課題を残すものの、フェルミオンの質量の階層性の起源、ならびに動的ゲージ粒子の非摂動論的取扱い、これと関連するアノマリーの探究という面では新しい知見を得た。平成6、7、8年度の三年間の研究成果を以下に記す。(1)フェルミオン質量の階層性の起源として、高次元相互作用項が統一エネルギースケールとプランクスケールの比の因子の可能性を検討した。(井沢健一・高橋智彦両氏との共同研究)(2)ニュートリノ質量と質量混合:中間スケールのある超対称性模型を再検討し、超対称性模型の可能な物質場の存在形態を検討した。(佐藤丈・高橋智彦氏との共同研究)(3)ベクター的な物質場を仮定(1TeV近辺)し、非漸近自由なゲージ理論でも、第3世代のボトムとタウの質量比を再現することを示した。(佐藤丈・大野木哲也・T.Takeuchi氏との共同研究)(4)動的ゲージ粒子と漸近非自由性との関係、nonlinear sigama模型を用いて示し、動的ゲージ理論は、Cut-off理論として記述されることを示した。(谷口祐介・谷村省吾氏との共同研究)(5)漸近非自由理論では、湯川結合定数とゲージ結合定数の比が、Infrared(IR)Fixed Pointをもち、低エネルギーの物理が予言できることを指摘した。(佐藤丈・吉岡紘一氏との共同研究)トップクォークの質量が、WやZゲージボゾンと同じオーダーであることから、フェルミオン質量の問題は、世代間のそれと同時に世代内でのそれも加わった。(佐藤丈・吉岡紘一氏との共同研究)(1)フェルミオン質量の階層性の検討1:1世代を統一する対称性としてS0(10)を選び、最小限必要なヒッグス場だけを導入した(minimal S0(10))。この対称性群がいわゆるPati-Salam対称群を経由して標準対称性へという最も簡単な連鎖を考えた。第3世代を他の世代から区別する世代量子数(所謂Peccei-Quinn対称性)を導入し、ヒッグス粒子とフェルミオンに適当な量子数を課し、望ましい質量行列の構造が原理的に出てくることを示した。この際フェルミオン質量行列の階層性の起源は、高次元相互作用項に表れる大統一理論のエネルギースケールとブランクスケールの比、1/100の因子に由来する。(井沢健一氏(現東大理)と高橋智彦氏(京大理)との共同研究)(2)さらに実際この模型で現実のフェルミオンの質量を再現することを示した。具体的には、湯川結合定数に対するくりこみ群による解析を行って実際に実験値を再現できることを示した。さらに、従来のGUT模型SU(5)では右巻きニュートリノはないのでニュートリノは質量を持たないが、我々のS0(10)、ニュートリノ質量やニュートリノ混合が起こる事を示した。ニュートリノが質量や混合角が存在は、太陽ニュートリノや大気中のニュートリノなどの実験から示唆されている。この2・3年で実験から決着がつくであろう。

(京都大学、井沢健一氏(D3)と修士2年の高橋智彦氏との共同研究)(3)上記の仕事からニュートリノ質量やその質量混合が現実的であろうという予想がより確信される。そこで右巻きニュートリノの存在という条件下で、超対称性模型の再検討を行った。この場合、予想される右巻きニュートリノの質量にあたる中間スケールのある模型が自然であるので、超対称性模型で可能なシナリオを検討した。(高橋智彦氏・佐藤丈氏(京大理)との共同研究)(4)なお1994年4・5月は学振海外派遣でカナダ・アメリカ合衆国に滞在し、トロント大学(Prof.B.Holdom)フェルミ研究所(Prof.Nambu)研究所、LBL(Prof.Suzuki)を訪問、「フェルミオンの質量の階層性」の講演と討論は有意義であった。特に滞在中トップクォークイベントの可能性を示す実験が報告された。Holdom氏とともにこの実験結果の解釈を巡って共同研究を続行している。またバ-クレイでのSuzuki教授やChanowitz教授とヒッグス粒子とWZゲージ粒子の同等性理論の議論も参考になった。この成果の一部を物理学会で発表した。また南部教授とフェルミオンの質量をめぐるホリゾンタル対称性について、Wolfenstein教授とのニュートリノに関する議論など、上記(3)への研究の発展に寄与する議論ができた。(1)今年度は超対称性理論に絞った。また今まではゲージ結合定数が漸近自由の範囲に限ったが以下の理由から統一スケールまでに何らかの物質場が存在する方が有利であると判断した。1)フェルミオン質量の階層性並びにCPの破れの導出:2)超対称性の動的破れの胴出3)超紐理論などでは3世代で終わらない、また最近のDualiy考察に従えば漸近自由にこだわる必要はなくなった。また中間スケールの存在は一方ニュートリノの質量とも関連して有望である。なお、Peskin-Takeuchiの制限からその物質場の候補はカイラル的なものは許されずベクター的である。(2)この観点からベクター的な物質場を仮定(1TeV近辺)して、繰り込み群の処方でゲージ結合定数を分析した。第4世代(並びに反第4世代)を導入すると、ゲージ結合定数が統一スケールで殆ど発散することを示した。(3)この非漸近自由なゲージ理論の枠内で、第3世代のボトムとタウの質量比が再現できる可能性を導いた。これは、物質場の統一理論であるS0(10)などでは最小超対称性理論の枠内にとどまる限り導出できなかった。最近のCDFグループの実験(ジェット生成のexcess)は漸近自由度ゲージ結合定数を示唆してい可能性もあり、我々の分析が面白くなるかもしれない。(5)ニュートリノ質量と質量混合:右巻きニュートリノを入れて超対称性模型の再検討を行い、中間スケールのある模型で超対称性模型の可能なシナリオ、物質場の存在に対する可能性を検討した(高橋智彦氏・佐藤丈氏(京大理)との共同研究)(6)なお1995年6,7月、Summer Visitorとして米国FNALを訪問、CDFグループとの交流、理論部のBardeen教授等から刺激を受けた。更に、Takeuchi Oonogi両研究員とともに、トップ・ボトムフォークとタウレプトンの質量比について、漸近自由の枠を越えた超対称性統一論理で検討した。
芳香植物の栽培環境による香気ケモタイプの変動とそれがヒトの心理・生理に及ぼす影響

芳香植物のローマンカモミールについて,蛍光灯またはLEDを用いて順次光質(白色・青色・赤色)を変える処理を行ったところ,その香気ケモタイプ(香気成分組成)は照射中の光質だけでなく,前歴の光質の影響を受けて変動することが分かった.光質の組み合わせ処理により芳香植物の香気ケモタイプを制御できる可能性が示された.また,26種類のラベンダー精油について,香気ケモタイプをもとに主成分分析を用いてグループ化すれば,ヒトへの心理・生理効果を分類できることが明らかとなった.ラベンダー精油は多くのケモタイプが存在する.ラベンダー精油を主成分分析によって類似したケモタイプごとに分類することで,精油のアロマコロジー(芳香心理生理学的)効果も分類することができると考えた.日本の市場で入手できた27種類のラベンダー精油を実験に供試し,GCおよびGC-MS分析を行った.得られた香気成分組成からケモタイプに分類するために,主成分分析を行った.その結果,スコアプロット上の精油の位置関係からラベンダー精油をいくつかのケモタイプに分類できることが明らかになった.主成分分析の結果とアロマコロジー効果の関連性を検証するために,特徴的なラベンダー精油を選んで官能試験を行った.サンプルとして,ラベンダー精油7種類と対照区(純水)との合計8試験区を設定した.精油は,閾値付近の濃度である100,000倍に希釈した.30分の官能試験の間,被験者の心電図R-R間隔から自律神経活動の変化を測定し,精神的負荷として百ます計算を行わせた.被験者は試験開始10分後から試験終了まで,呈示されたサンプルの香気を嗅いだ.試験前後での被験者のストレスおよび疲労度,気分状態の変化をそれぞれ唾液アミラーゼ濃度の測定,フリッカーテスト, POMS(Profile of Mood State)によって評価した.7種類の精油に対する官能試験の結果,同じ商品名で販売されている精油であっても,得られるアロマコロジー効果が異なることが認められた.精油の中には覚醒効果を持つものもあった.また,性別の違いがアロマコロジー効果に影響を及ぼすことも分かった.自律神経活動と唾液アミラーゼ濃度の測定結果より明らかとなったアロマコロジー効果は,主成分分析で得られたスコアプロット上の精油の位置関係と関連性が認められた.本研究は,生花あるいはそれらの精油について,1栽培環境と花の香気成分組成(ケモタイプ)との間の関係を明確にすること,また,2ケモタイプの異なる生花やその精油の香気のヒトへの心理・生理的影響を明らかにすることを目的に行った.最終年度である平成25年度は,バラ生花(品種:ウィッシング)と花弁から水蒸気蒸留で得られたハイドロゾルについてヒトの心理・生理に及ぼす影響を調査した.その結果,バラ生花の香気吸入には鎮静効果があること,ハイドロゾルの香気吸入には興奮効果があることが示唆された.また,測定前後での唾液アミラーゼ濃度の比較により,香気呈示による被験者の心的疲労の低減作用を検討したところ,生花香気による心的疲労の低減効果が示唆された.また,POMSの解析結果より,生花でのみC(Confusion,心的な混乱を示すパラメータ)得点の減少傾向が観察できた.初年度平成23年度には,ローマンカモミールを用いて光質が香気成分組成に及ぼす影響を調べた.6週間の栽培の間,2週間間隔で3期間の光質を変える処理を行った結果,前歴の光質が香気成分組成に影響することを明らかにした.平成24年度の実験では,27種類の市販ラベンダー精油について,主成分分析によって類似したケモタイプに分類すれば,精油の芳香心理生理学的効果を分類することができるかどうかを調査した.自律神経活動と唾液アミラーゼ濃度の測定結果より,芳香心理生理学的効果は,主成分分析で得られたスコアプロット上の精油の位置関係と関連性があることが分かった.精油を採取するには相当量の栽培個体が必要なことから,同一材料で試験できなかったが,栽培環境によって変動したケモタイプを香気成分の主成分分析で事前に分類すれば,ヒトに対する心理生理学的効果が判別できることが分かった.芳香植物のローマンカモミールについて,蛍光灯またはLEDを用いて順次光質(白色・青色・赤色)を変える処理を行ったところ,その香気ケモタイプ(香気成分組成)は照射中の光質だけでなく,前歴の光質の影響を受けて変動することが分かった.光質の組み合わせ処理により芳香植物の香気ケモタイプを制御できる可能性が示された.また,26種類のラベンダー精油について,香気ケモタイプをもとに主成分分析を用いてグループ化すれば,ヒトへの心理・生理効果を分類できることが明らかとなった.平成23年度は,ローマンカモミールを用いて光質が葉の揮発(香気)成分組成に及ぼす影響を調査した.園芸用培地を入れた4号のプラスチック鉢で栽培した.1処理区当たり5株を栽培し,ガスクロマトグラフィー(GC)分析は無作為に株を選んで3反復行った.環境調節が可能な室内で,明期16時間・28°C,暗期8時間・18°Cで栽培した.光源には白色(W),青色(B),赤色(R)の蛍光灯を用いた.光強度はすべての区で同一(200マイクロモル毎平方メートル毎秒)とした.得られた成果の概要は以下の通りである.6週間の栽培の間,2週間間隔で3期間の光質を変える9つの処理区(WWW,WBW,WRW,BBB,BWB,BRB,RRR,RWR,RBR)を設けた.

最初(第1期)と最後(第3期)の光質を同一にすることにより,揮発成分の生合成が当該処理中の光質のみの影響を受けるのか,前処理の影響も受けるのかを明らかにできる.GC分析の結果,44の揮発物質が検出された.栽培開始4週間後(第2期終了後)と6週間後(第3期終了後)のGC分析結果を比較したところ,ほとんどの処理区において,揮発成分の生合成は前処理の影響を受けた.BBB区とBRB区を例に挙げると,トランスーピノカルベノールはBRB区の6週間後の含有量(ピーク面積値)がBBB区より有意に低かった.これは,第2期の光質が第3期の生合成に影響したことを示唆している.揮発成分は基質と酵素によって生成されるが,量的にどちらが変動しても生成量は変化する.光質は両者の生成に影響することが明らかとなった.光質処理は前歴の影響を受けるという本実験の結果については,基質の生合成量は処理中の光質により短時間に切り替わるが,酵素は生成,分解に時間がかかるため,光質が切り替わっても前の光質で(好適に)生成された酵素が残り,前歴として影響するものと考えられた.本研究テーマは大きく2つの実験で構成される.1つは栽培環境によるケモタイプの変動であり,もう1つは得られた複数のケモタイプがヒトの心理生理の及ぼす影響の解明である.H23年度にローマンカモミールを用いて,主として前者の実験を行った.H24年度は,香気成分組成が微妙に異なるケモタイプがヒトの心理生理に及ぼす影響の解析手法の開発に重点を置いた.国際学会での発表に繋がる成果を上げた点は評価できるが,用いた精油は市販のラベンダー精油であった.同じ植物材料でケモタイプの環境変動とそのケモタイプの心理生理に及ぼす影響を解明すべきであるが,実験に必要な精油を確保するには,植物の栽培規模を大きくする必要があり,現有の実験施設ではそれが難しいことが分かった.当初の計画の修正を余儀なくされたが,研究成果は伴っていると判断した.
ヒトアポ蛋白A1遺伝子組込みによる実験的高HDL血症マウスの作成

ヒト高比重リポ蛋白(HDL)粒子の基本構造蛋白であるアポAIの合成分泌およびその体内動態を明らかにするため,その遺伝子をトランスジェニックマウスに組み込み,アポ蛋白AIの合成分泌メカニズムの解明にとりかかった。ヒトアポ蛋白AI遺伝子はすでに海外にて同定されているので,当該施設に書面にて協力を求め,そのDNAを取得した。平成2年度はMTTプロモ-タ-にヒトアポ蛋白AIのDNAを融合させる段階であったが手技上の問題で本段階をくりかえしている。そこで本研究の最終目標が高HDL血症モデルの作成にあるので,すでに報告の見られる外因性高インスリン血症とショ糖投与の組み合わせにとWistar系雄ラットに高HDL血症と作成し,その発症メカニズムを追求した。その結果,血中HDLの上昇には高インスリン血症と二糖規としてのショ糖の摂取が必要な事が見出された。さらに臨床上HMGーCoA環元酵素阻害剤が血中HDLーコレステロ-ルを上昇せしめる報告が存在するので上記と同系のラットに本薬剤を投与したが,HDLーコレステロ-ルの上昇は認められなかった。今後は引き続き,ヒトアポ蛋白AI遺伝子の発現を目ざして上記の手技を確立し,高HDL血症モデルの作成を行う予定である。われわれはヒトにおいて抗動脈硬化作用を持つと考えられている高比重リポ蛋白(HDL)粒子の代謝機構を研究し、ヒトの動脈硬化予防をはかるため、以下の研究をすすめた。先ず、ヒトHDL粒子の基本構造蛋白であるアポ蛋白AIの合成、分泌、そして体内動態を知るため、その遺伝子をトランスジェニックマウスに組み込み、アポ蛋白AIの合成メカニズムの解明にとりかかった。ヒトアポ蛋白AI遺伝子はすでに海外にで同定されているので、当該施設に書面にて協力を求め、そのDNAを取得した。現在、MTTプロモーターにヒトアポ蛋白AIのDNAを融合させる段階である。この段階に成功すればマイクロインジェクションの手法を用いてヒトアポ蛋白遺伝子を本マウスに発現させ、ヒトアポ蛋白AIを合成分泌するマウスを作成する予定である。ヒトアポ蛋白AI遺伝子はすでに海外にて同定されているので、当該施設に書面にて協力を求め、そのDNAを取得した。現在、MTTプロモ-タ-にヒトアポ蛋白AIのDNAを融合させる段階である。この手技に成功すればマイクロインジェクションの手法を用いてヒトアポ蛋白遺伝子を本マウスに発現させ、ヒトアポ蛋白AIを合成分泌するマウスを作成する予定である。さらに本マウスのリポ蛋白組成を検索し、ヒトアポ蛋白AIが存在することを確認した後、そのHDL代謝について放射性アセテ-トとロイシンを本マウスに投与し、HDL粒子の生成と代謝を観察したい、生合成過程が明らかとなった時点で、次に本マウスにコレステロ-ル負荷を行い、そのコレステロ-ル処理能についての観察を行い、コレステロ-ル代謝におけるヒトアポ蛋白AIの役割を明らかにしたい。
大気圧走査電子顕微鏡を利用したニューロン微細構造観察のための新技法の確立

大気圧走査電子顕微鏡(Atmospheric scanning electron microscope; ASEM)と呼ばれる新型の電子顕微鏡を用いて培養ニューロンのもつ微細構造を観察する方法を確立することを目指した。電子線を透過する耐圧薄膜を備えた専用ディッシュに、ポリ-D-リジンによるコーティングを施し、マウス胎仔由来の大脳皮質ニューロンを培養した。得られたニューロン試料に対してリンタングステン酸染色を行うことにより、糸状仮足のASEM検鏡に成功した。この検鏡法を、軸索ガイダンス因子ネトリン-1が大脳皮質ニューロン軸索シャフトにおいて示す糸状仮足生成促進作用の解析に活用した。本研究では大気圧走査電子顕微鏡(Atmospheric scanning electron microscope; ASEM)と呼ばれる新型の電子顕微鏡により、培養ニューロンにみられる種々の微細構造を観察するための技法を確立することを目指す。ASEMでは、電子線を通す窒化シリコン製耐圧薄膜を備えた専用ディッシュを利用して、大気圧下においた試料の観察を行う(Nishiyama et al. (2010) J. Struct. Biol. 169, 438-449)。旧来の走査電子顕微鏡に必要とされる試料の前処理が不要であり、簡便かつアーティファクトの少ない状態で観察ができることなど多くの利点があるが、生物学・生命科学分野における活用例は未だ少数であった。近年我々は軸索ガイダンス因子ネトリン-1が大脳皮質ニューロンで示す作用に関する研究に取り組んでおり、その中でも特に大脳皮質ニューロン軸索において、シャフト上の糸状仮足生成に端を発する分枝形成の促進作用に注目している。本研究ではASEM用の薄膜ディッシュ上において、ポリ-D-リジンによるコーティングの利用により、マウス胎仔・ハムスター新生仔の大脳皮質に由来するニューロンの初代分散培養を行う方法をまず確立した。薄膜ディッシュ上で5日間の培養を行ったニューロンに、グルタルアルデヒドによる固定とリンタングステン酸による染色を施した試料を用いると、ASEM画像が取得できた。この方法を利用し、胎生16日(E16)マウス大脳皮質由来の培養ニューロンにおいて、軸索ガイダンス因子ネトリン-1による刺激に反応して軸索シャフトに生じた多数の糸状仮足をASEMにより観察した。またASEMに適した退色防止剤を探索する目的で、各種抗酸化剤について電子線照射によるダメージを抑制する効果の評価を行った。我々は軸索ガイダンス因子ネトリン-1が大脳皮質ニューロンで示す生理作用に関する研究を進めており、近年はおもに光学顕微鏡を用いた形態学的解析を行ってきた。その結果より、ネトリン-1が胎生14日(E14)マウス大脳皮質由来の培養ニューロンにおいては軸索の伸長、E16マウス大脳皮質ニューロンにおいては軸索側枝の形成を促進することが示唆されている。本研究においてASEMによる糸状仮足の観察を行ったところ、E16マウス大脳皮質ニューロンをネトリン-1で刺激すると、軸索側枝形成に先立って軸索シャフト上の糸状仮足生成が促進されることが確認された。一方、E14ニューロンではネトリン-1処理の有無にかかわらず無刺激の状態においても、軸索シャフトに糸状仮足様の微細な突起が認められた。E14マウス大脳皮質ニューロンにおいて得られた結果が予想に反するものであったことから、研究計画を変更してその確認と追究にあたり、ネトリン-1非依存的な糸状仮足様突起の存在を定量的解析によって示した。これに伴い、当初は当該年度中に実施する予定であった、大脳皮質ニューロン試料における免疫ASEM法の確立を目指した研究には遅れが生ずることとなった。本研究では齧歯類大脳皮質より調製した培養ニューロンを用いて、大気圧走査電子顕微鏡(Atmospheric scanning electron microscope; ASEM)と呼ばれる新型の電子顕微鏡によるニューロン微細構造の可視化に取り組んでいる。近年我々は軸索ガイダンス因子ネトリン-1が大脳皮質ニューロンで示す生理作用について形態学的手法により追究しており、胎生14日(E14)マウス大脳皮質由来の培養ニューロンにおいては軸索伸長、E16マウス大脳皮質ニューロンでは軸索分岐形成がネトリン-1によって促進されること、また、ネトリン受容体の一つであるDCC (deleted in colorectal cancer)がこれらの両方に関与していることを示唆する結果を得ている。本研究課題においてはこれまでの光学顕微鏡を用いた画像解析の弱点を補完するため、ASEMを活用した糸状仮足の可視化による解析を行った。E16マウス由来の培養ニューロン軸索においては、ネトリン-1刺激時に認められる分岐形成が、シャフト上の糸状仮足生成に端を発する「軸索側枝形成」と呼ばれる様式に従うものであることが示された。またこのネトリン-1依存的な糸状仮足生成に対するDCCの関与も確認された。一方、E14ニューロンではネトリン-1処理の有無にかかわらず、軸索シャフト上に多数の糸状仮足様突起が認められた。このことから、軸索シャフト上の側枝密度および糸状仮足密度の変化に対する、軸索伸長の寄与についても評価を行った。これらの研究結果からは、大脳皮質ニューロンの発生過程においてネトリン-1の示す作用が軸索伸長促進から軸索側枝形成促進へと転ずる可能性が考えられた。さらにこの転換と、大脳皮質ニューロンを構成する多種多様なポピュレーションとの関連にも興味が持たれることとなった。

本研究の成果発表の過程でいくつかの追加実験の実施を求められたことから、これを実施するために研究期間の延長を申請し承認されたところである。本研究では大気圧走査電子顕微鏡(Atmospheric scanning electron microscope; ASEM)と呼ばれる新型装置による培養ニューロン微細構造の可視化を目指した。これは電子線を通す耐圧薄膜を備えたディッシュを用いて溶液中など大気圧下試料の電子顕微鏡観察を行うものであるが、生命科学分野における活用法は未開拓であった。今回まずマウス胎仔・ハムスター新生仔大脳皮質由来の培養ニューロンにリンタングステン酸染色を施し、糸状仮足のASEM観察に成功した。デキストロース・没食子酸プロピルは撮像時の添加で退色防止効果を示した。近年我々はニューロン軸索の分岐形成に注目しているが、これには成長円錐を介する様式と、軸索シャフトに糸状仮足が生じ、その一部が後に側枝となる様式の二通りが知られる。従ってシャフト上の糸状仮足生成は側枝形成の初期段階といえる。大脳皮質ニューロンでは、軸索ガイダンス因子ネトリン-1による側枝形成の促進が知られる。先に確立したASEM検鏡法を利用すると、胎生16日(E16)マウス大脳皮質ニューロンの軸索シャフトで、30分のネトリン-1刺激による糸状仮足の増加が観察された。一方、E14ニューロン軸索シャフトにはネトリン-1の有無に依らず糸状仮足様突起が認められた。ASEM観察と微分干渉画像の定量的解析より以下の結論を得た。1)大脳皮質由来の培養ニューロンで軸索伸長促進と軸索側枝形成促進という二つの異なるネトリン-1作用がみられた。2)ネトリン-1はE14ニューロンで軸索伸長、E16ニューロンで側枝形成を促進し、大脳皮質ニューロンにおけるネトリン-1の作用が発生段階で変化する可能性が考えられた。3)ネトリン-1受容体の一つDCCが軸索伸長と側枝形成の両方に関与することが示唆された。最終年度はこれらの成果を原著論文にまとめた。大気圧走査電子顕微鏡(Atmospheric scanning electron microscope; ASEM)と呼ばれる新型の電子顕微鏡を用いて培養ニューロンのもつ微細構造を観察する方法を確立することを目指した。電子線を透過する耐圧薄膜を備えた専用ディッシュに、ポリ-D-リジンによるコーティングを施し、マウス胎仔由来の大脳皮質ニューロンを培養した。得られたニューロン試料に対してリンタングステン酸染色を行うことにより、糸状仮足のASEM検鏡に成功した。この検鏡法を、軸索ガイダンス因子ネトリン-1が大脳皮質ニューロン軸索シャフトにおいて示す糸状仮足生成促進作用の解析に活用した。研究初年度にあたる平成26年度は当初の研究実施計画に沿って、まずマウス胎仔・ハムスター新生仔大脳皮質由来の初代分散培養ニューロンをASEM専用薄膜ディッシュ上で培養する方法を確立した。次いで、一般染色法としてリンタングステン酸染色を行った試料を用いることにより、培養ニューロンのASEM画像が得られることを確認した。
犬における同種凍結神経移植の有用性

1.凍結神経片を用いた同種神経移植後の機能回復同種凍結神経移植法における機能回復の程度を調べる目的で,ラットを用いて同種凍結神経移植を行った。その結果,浅部痛覚は移植後56週目より出現し,平均110日目には回復が認められた。運動機能回復の指標としたsciaticfunction indexに関しては,個体のばらつきが大きく,客観的評価に用いることは困難であると考えられた。2.成熟ラットのシュワン細胞の培養法軸索の再生に大きな役割を果たしているシュワン細胞の培養法に関して4種類の方法を試み,比較・検討した。その結果,Calderon-Martinezらが報告した生体におけるシュワン細胞の増殖刺激を必要としない神経片の培養法を行うことによって最も良好な成績が得られた。3.ビーグル成犬のシュワン細胞の培養法ラットで成功したシュワン細胞培養法がビーグル成犬においても可能か否かを検討した。その結果,Calderon-Martinezらの方法によって全体の細胞に対しておよそ90%の割合でシュワン細胞を得ることができた。4.凍結神経移植片と培養シュワン細胞の併用法同種凍結神経移植法と培養シュワン細胞の併用について,共培養および神経片への直接的培養細胞注入の2種類の方法を用いて検討した。その結果,共培養では神経片の内部にはシュワン細胞は認められなかった。シュワン細胞を直接注入した神経片では,神経片の中にシュワン細胞と考えられる核や細胞質の明確な細胞が多数生存していることが確認された。本研究では,ラットを用いた基礎的検討によって同種凍結神経移植法が感覚機能の回復に有用であること,成熟動物のシュワン細胞培養が可能であることが確認された。さらに,シュワン細胞の培養法が成犬においても可能であること,培養シュワン細胞を併用するためには移植片への直接注入が有効であることが明らかとなった。1.凍結神経片を用いた同種神経移植後の機能回復SDの雄ラット15頭(自家移植群12頭,同種移植群3頭)を用い,自家移植群では坐骨神経を大腿骨骨幹付近で510mm切除し,この神経片を液体窒素を用いた凍結融解処理を施したのち,元の位置に戻して神経上膜縫合を行った。同種移植群では坐骨神経を大腿骨骨幹付近で67mm切除し,間隙にあらかじめ凍結保存しておいたSDラットの坐骨神経を自然融解した後,移植した。術後は両群ともに6日毎に患肢の神経学的検査を行い,機能回復を評価した。その結果,自家移植群では移植後平均110日目に,同種移植群では移植後平均74日目に肢端の浅部痛覚がほぼ回復した。2.末梢神経再生促進のためのシュワン細胞培養実験にはSDの雌ラット3頭を用いた。ハロタン麻酔下で坐骨神経を切断し,術後約40時間後にラットを安楽死し、切断した遠位端より末梢測の坐骨神経を無菌的にすばやく取り出し,細切した。コラゲナーゼおよびトリプシン処理後に10%FCS-DMEM-S.P.を用いて,CO_2インキュベーター(10%CO_2)で培養を開始した。培養開始後7日間は培地にAra-Cを加え,その後810日間,培地にフォルスコリンを加え、細胞を増殖させた。本実験では,培養前に坐骨神経を切断しシュワン細胞を活性化させることにより,少ないながらも有効にシュワン細胞を得ることができた。また,酵素処理のための組織片の細分化の際には,神経を細かく裂き綿状にするなどの工夫を行い,成ラットのシュワン細胞の培養に成功した。

凍結神経束に自家のシュワン細胞を植えることを予定しているため,adult rat由来のシュワン細胞の培養法の確立が必要である。これまでの実験からDMEM+10%FCSの培地を用いて培養し,シュワン細胞の増殖を選択的に促進するフォルスコリンを用いて増殖させる方法が容易であることが判明したが,問題として残っているのは線維芽細胞の混入であった。そこで,線維芽細胞を除去するために,線維芽細胞に対する抗体(抗Thy1.1抗体)を用いた除去法の確立を試みた。抗Thy1.1抗体で処理したシュワン細胞と未処理のシュウン細胞についてギムザ染色と抗S100b抗体(シュワン細胞),抗Vimentin抗体(線維芽細胞)を用いて免疫染色を実施した結果,ギムザ染色において未処理のものでは多数の線維芽細胞が認められたが,抗Thy1.1抗体で処理したものでは線維芽細胞はほとんど認められなかった。また,免疫染色においても同様の結果が得られたことから,線維芽細胞を除去するために抗体を用いる方法は非常に有用であることが明らかとなった。2.凍結神経束とシュワン細胞の共培養培養したシュワン細胞を凍結神経束内に植えることを目的として,一80°Cで保存しておいた凍結神経束約1cmと培養したシュワン細胞とをDMEM+10%FCS培地内で6日間共培養した。培養後,神経束にHE染色を施し,組織学的検索を実施した結果,神経束内に培養シュワン細胞を確認することはできなかった。以上の結果より,単純な共培養ではシュワン細胞は凍結神経束内に移動しないことが判明した。・ビーグル成犬シュワン細胞の培養我々は,犬の神経損傷に対して同種凍結神経移植に培養自家シュワン細胞を併用することで,より早い機能回復を目指している。今回、成犬シュワン細胞の培養法と培養シュワン細胞の同種凍結神経移植片内での生存性について検索した。成犬シュワン細胞の培養はCaldeon-Martinezら(2002)の方法に基づいて行った。まずはじめに,無菌的に採材したビーグル成犬の坐骨神経から結合組織や神経上膜を可能な限り除去し,ハサミで約1mm^3の大きさに細切した。次に,細切した神経組織を10%FCS添加DMEM内で2週間explantationを行った後,ディスパーゼとコラゲナーゼで酵素処理を行い細胞を分散させた。この際,混入する線維芽細胞はAra-Cの使用と,シュワン細胞と線維芽細胞のディッシュへの接着性の違いを利用した方法で除去した。ただし,線維芽細胞を100%除去することは困難であった。その後,フォルスコリンを使用してシュワン細胞を増殖させた。本法に基づいて得られた細胞は免疫染色でシュワン細胞のマーカーであるS100B抗体陽性であることが確認された。さらに,本培養細胞浮遊液を同種凍結神経に注入し,培地内でインキュベート(37°C,10%CO_2,7日間)した結果,移植片内には多数のシュワン細胞が生存していることが確認された。以上の結果より,Calderon-Martinezらの方法が成犬シュワン細胞の培養に応用できること,またこの方法で培養されたシュワン細胞を同種凍結神経束内に注入すると,生きた自家シュワン細胞を持った移植片として使用可能であることが示された。
アポトーシス抑制分子EATの生体内機能ならびに疾病における分子機構の解明

EAT/mcl1遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、本遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウス(Tg)では、膵ラ氏島の過形成が生じることが知られている。本研究では、EAT/mcl1の発生段階および個体レベルでの機能を更に詳細にするために、胚性幹細胞(ES細胞)においてEAT/mcl1を欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行った。Cre-loxPシステムを用いてEAT/mcl1遺伝子をマウス個体、ES細胞においてコンディショナルにノックアウトするために、EAT/mcl1のexon 1をloxPで挟むような変異を導入するターゲッティング・ベクターを導入することによりES細胞(TT2細胞)の一方の対立遺伝子に変異を導入することに成功した。11個のES細胞のクローンが得られ、5個のES細胞をマウス初期胚(胚盤胞)へ注入することによりキメラマウスを得た。それらより3ラインのマウスのラインを確立した。これらのマウスをCre recombinaseを発現するトランスジェニック・マウスと交配することにより以下のマウスを得た。1)EAT/mcl1のexon 1が破壊されたマウス(EAT/mcl1遺伝子1個のみ破壊されたヘテロ接合性のノックアウトマウスであり、表現形は、現在のところ、形態学的には野生形と同様と考えられる。このことはEAT/mcl1の発現量が通常の1/2となってもマウスは、正常に発生.分化することを示唆している)。2)EAT/mcl1のexon 1の両端にloxP配列が挿入されたマウス(このマウスは、両アレルとも正常なEAT/mcl1を有するが、臓器特異的Creトランスジェニック・マウスの交配により、コンディショナル・ノックアウトを作成することが可能である)。また、MEOXマウス(胎生5日目以降に、胚盤葉上層(将来、胎仔となる領域)特異的にCre recombinaseを発現するマウス)の導入を終了した。EAT/mcl-1(EAT)遺伝子は、細胞のアポトーシスにおいて重要な役割を持つとされるbcl-2遺伝子ファミリーに属する。近年、網膜変性における細胞欠損が主にアポトーシスによるものであることが明らかとなり、Bcl-2ファミリー遺伝子の役割が注目されている。今回我々はEATトランスジェニックマウス(Tgマウス)を用いて、光刺激による網膜細胞死におけるヒトEAT遺伝子の影響を調べた。マウスを常時照明(400-500lux)をうける、恒温ケージで飼育した。Tgマウス群(Tg群)および対照マウス群を連続した照明刺激のもとで飼育した後網膜電位図を施行し、組織検査のために眼組織を摘出した。網膜電位図の反応では、平均スコアはTg群(0.79)では対照群(1.69)に比して有意に(P<0.01)低かった。電気生理学的な機能障害発生率は対照群では0.0199/マウス-週(95%信頼区間0.0035-0.0364)でTg群では0.0495/マウス-

週(95%信頼区間0.0347-0.0500)であった。組織学的検索では、平均スコアはTg群(1.43)では対照群(2.31)に比して低い傾向があった(P=0.065)。組織学的な障害発生率は対照群では0.0042/マウス-週(95%信頼区間0-0.0120)でTg群では0.0419/マウス-週(95%信頼区間0.0286-0.0500)であった。Kaplan-Meierの生存曲線は連続光刺激に対して、対照群に比してTg群で組織学的障害の程度が大きい(P=0.0241,Mantel-Cox log rank test)ことを示し、網膜電位図で認められた機能障害は細胞死によるものと考えられた。光刺激による網膜細胞死がEAT遺伝子によって促進されることが示された。発生過程でプログラムされた細胞の死として、アポトーシスは定義される。この機構は、生理的に細胞を除去する場合に利用される。生理的だけではなく病的な変性、虚血、感染症に伴った細胞の死もアポトーシスであるであることが明らかになったきた。アポトーシスを生じる過程の中で、bcl-2ファミリーに属する分子はアポトーシスを促進・阻害を決定し、重要な位置を占める。そのような観点から、アポトーシスの機構を考慮しながら、bcl-2ファミリーのひとつであるヒトEAT遺伝子を標的分子として各種疾患の機序またその治療を押し進める上での分子基盤を明確にすることが本研究の目的である。その目的のために、マウス個体におけるEAT遺伝子のコンディショナル・ターゲッティングとEATを標的とした治療法の開発を進めている。Cre-loxPシステムを用いてES細胞のEAT遺伝子をコンディショナルにノックアウトする。Bcl-2関連遺伝子群の重要な機能ドメインであるBH1BH2ドメインを含むexon2の両側にloxP配列を挿入したターゲッティングベクターの作製を成功した。このターゲッティングベクターを用い、ES細胞において相同組換えを終了した。相同組換えを生じさせたES細胞を胚盤胞に入れ、現在、生殖系列へのtransmissionを進行させている。これらのことにより,目的の臓器,組織でEAT遺伝子を破壊することが可能となる。さらに、ES細胞において、二つのアリールのEAT遺伝子のノックアウトを進めている。EAT遺伝子のない状態で、ES細胞が生存できるか、また分化過程におけるアポトーシスを検討する。アポトーシスを生じる過程の中で,bcl-2ファミリーに属する分子はアポトーシスを促進・阻害を決定し,重要な位置を占める.そのような観点から、アポトーシスの機構を考慮しながら,bcl-2ファミリーのひとつであるヒトEAT遺伝子を標的分子として各種疾患の機序またその治療を押し進める上での分子基盤を明確にすることが本研究の目的である.その目的のために、マウス個体におけるEAT遺伝子のコンディショナル・ターゲッティングとEATを標的とした治療法の開発を進めている.
iPS細胞を応用した表皮水疱症の根本的治療法の開発

表皮水疱症は、真皮-表皮境界部を構成する蛋白の先天的欠損や構造異常により皮膚の脆弱性を生じ、容易に水疱や潰瘍を形成する疾患である。近年造血幹細胞移植を始めとした細胞療法が注目されているが、生着不全のリスクなどが課題として存在する。そこで、近年本邦で開発された人工多能性幹細胞(iPS細胞)の知見を応用して、大量の細胞を造血系細胞へ分化誘導させることでその問題を解決する発想に至った。正常マウスiPS細胞を血球系前駆細胞へ分化させ、17型コラーゲン欠損マウスや17型コラーゲンヒト化マウスに移植したところ、一部で欠損17型コラーゲンのわずかな発現が確認された。同系マウス由来の正常遺伝子を有するiPS細胞(GFP+TgマウスおよびCD45.1発現マウス)に対し、Lhx2遺伝子導入による血球系分化誘導を行った。血球系前駆細胞への分化効率をフローサイトメトリーで検討したところ、15-30%であった。これらの細胞はin vitroで各血球系への分化能を確認した。こうして得られたiPS細胞由来造血前駆細胞を、17型コラーゲン欠損表皮水疱症マウス(n=3)に移植したところ、全例が2週間以内に死亡した。また、17型コラーゲン欠損表皮水疱症マウスの繁殖が困難であり、実験遂行に必要な匹数を十分確保することができなかった。そこで当初の研究計画の予定通り、17型コラーゲンヒト化マウス(マウス17型コラーゲンは欠損しているものの、ヒト17型コラーゲンを発現しているマウス。繁殖が容易かつ、移植細胞由来のマウス17型コラーゲンの発現を同様に検討することが可能)を移植対象とし、サポーター細胞として17型コラーゲン欠損マウス骨髄細胞と混合して移植したところ(n=10)、移植後200日の時点で生存率は約50%となり、未治療群と比較して生存予後の改善傾向がみられた。GFP+Tgマウス由来iPS細胞から誘導した造血幹細胞を移植した群においては、フローサイトメトリーでiPS細胞由来末梢血細胞の割合を解析したところ、10.3±4.8%にとどまった。移植後の上皮化皮膚においては、RT-PCRにて2匹にわずかなマウス17型コラーゲンmRNAの発現が確認されたが、現時点で明瞭なマウス17型コラーゲンの発現を、免疫蛍光抗体法で確認されなかった。iPS細胞由来幹細胞移植群と、従来の骨髄移植群で出現するドナー由来表皮角化細胞の分子学的差違を検討するため、各々の細胞を分離抽出し、マイクロアレー法で解析したところ、iPS細胞由来角化細胞でCXCL9などの発現上昇が確認された。また、17型コラーゲンヒト化マウス(マウス17型コラーゲンは欠損しているものの、ヒト17型コラーゲンを発現しているマウス)を移植対象とし、サポーター細胞として17型コラーゲン欠損マウス骨髄細胞と混合して移植した。移植後4週間後の時点での末梢血キメラ形成率は12.2 ±5.26 % (n=10)であった.移植後200日の時点で生存率は約50%となり、未治療群と比較して生存予後の改善傾向がみられた。移植後の上皮化皮膚においては、RT-PCRにて2匹にわずかなマウス17型コラーゲンmRNAの発現が確認されたが、マウス17型コラーゲンの発現を、免疫蛍光抗体法および電子顕微鏡解析で確認されなかった。iPS細胞由来幹細胞移植郡と、従来の骨髄移植郡で出現するドナー由来表皮角化細胞の分子学的差違を検討するため、各々の細胞を分離抽出し、マイクロアレー法で解析したところ、iPS細胞由来角化細胞でCXCL9などの発現上昇が確認された。26年度が最終年度であるため、記入しない。皮膚科学26年度が最終年度であるため、記入しない。

移植対象となる17型コラーゲン欠損マウスの確保の点では当初の研究計画が遂行困難になっているが、当初の予定通り移植レシピエントを17型コラーゲンヒト化マウスに設定したことで、移植効率やドナー由来蛋白の発現検討、生存曲線作成やマイクロアレー解析などが順調に遂行されている。26年度が最終年度であるため、記入しない。マウス実験に関しては、17型コラーゲン欠損マウスでの実験系をすすめ、また現在主に進行している17型コラーゲンヒト化マウスにおける研究遂行・解析を継続する。また、倫理審査委員会の承諾を得た上で、正常ヒトiPS細胞を血球系に分化誘導し、ヒト血球系が生着しうる免疫不全NOGマウスに異種移植する。マウスでの実験系と同様に、移植後のヒト表皮角化細胞構成蛋白の発現を検討する。また、申請者らは申請者らの施設では重症表皮水疱症への造血幹細胞移植に向けた取り組みを推進しており(清水宏代表:平成24年度日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(A))、これらによって得られた知見を応用して、最終的にはヒトiPS細胞を用いた造血幹細胞移植による難治性皮膚疾患の治療を目指して基礎的知見を蓄積する。平成25年度においては17型コラーゲン欠損マウスの成長・生存が低調であったため、iPS細胞の購入維持、関連物品に必要な経費が当初の予想よりも少なかった。そのため次年度使用額が生じた。平成26年度においては17型コラーゲン欠損マウスに加えて、17型コラーゲンヒト化マウスの繁殖向上を予定しており、繰り越された研究費を同関連物品で使い切る計画である。