hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パーキンソン病における包括的脳機能画像探索研究

線条体には多くのドパミン神経が存在し、線条体は脳全体の神経と連絡を持っている。そのため、ドパミンは運動や認知、報酬、学習など様々な脳機能と関連があるととされている。ドパミン神経の生物学的意義を知るには、生体においてドパミン神経シナプス前膜上に存在するドパミントランスポーターについて画像を用いて評価する方法が有効である。我々は健常者30名にドパミントランスポーター画像を撮像し、知能評価としてWAIS-IIIを用い、知的機能とドパミン神経との関連について調査した。線条体は尾状核と被殻に分けられるが、知的機能と関連しているのは尾状核であることが判明した。また右尾状核のドパミン機能は図形を用いた知的機能と、左尾状核は言語に関する知的機能と関連していることが判明した。パーキンソン病は黒質線条体ドパミン神経の脱落が特徴である神経変性疾患である。パーキンソン病におけるドパミン神経脱落を調査することで、同疾患におけるドパミンの役割のみならず、ドパミンの生理学的機能についても知ることが出来る。パーキンソン病患者50名について、抗パーキンソン病治療薬を休薬した後、脳血流画像とドパミントランスポーター画像を撮像した。線条体ドパミトランスポーターン結合率が関連する脳領域を、脳血流画像を用いて探索した。同側の補足運動野を含めた前頭前野と関連があることが判明した。この変化がパーキンソン病の臨床症状とどのような関連があるか調査を行っていく。健常者ドパミントランスポーター画像は30名撮像が終了している。パーキンソン病については症例を増やしているところであるが、概ね終了出来る見通しである。ドパミントランスポーター画像については、様々な評価法があり、関心療育の取り方、年齢や施設間格差の影響を調整する方法などが存在するため、最適な方法を調査する必要がある。また、パーキンソン病におけるドパミントランスポーター結合率と相関する脳領域について臨床症候との関連を調査する必要がある。パーキンソン病は黒質線条体ドパミン神経(ドパミン節前神経)の脱落と同部位でのレビー小体の神経細胞内蓄積が起こる神経変性疾患である。ドパミン節前神経の脱落は運動症状に関連していると考えられている。ドパミントランスポーターはドパミン節前神経終末に存在するため、ドパミン節前神経のバイオマーカーであり、パーキンソン病の診断画像検査として臨床的に確立している。我々は線条体ドパミントランスポーター結合率が脳にどのような血流の変化をもたらすかを明らかにすることで、ドパミン節前神経の機能を明らかにすることを目的として調査を行った。50名のパーキンソン病について、脳血流画像とドパミントランスポーター画像の両者を1年以内に撮像した。パーキンソン病においては、線条体ドパミントランスポーター結合率は同即の前頭葉脳血流と正の相関を認めた。これはパーキンソン病がドパミン節前神経である黒質線条体ドパミン神経の選択的脱落を原因とし、基底核ー大脳皮質回路を経由して、前頭葉に神経活動が統合的に関連していることの裏付けとなった。線条体ドパミントランスポーター結合率と前頭葉脳血流の多寡が非運動症状と関連しているという仮説を立て、抑うつ、幻覚、疼痛、睡眠障害、嗅覚障害、便秘、起立性低血圧などの非運動症状の有無を調査している。これらの結果は日本パーキンソン病・運動障害疾患学会および国際パーキンソン病および関連疾患学会において発表した。パーキンソン病がドパミン節前神経の選択的障害があることから、ドパミン節前神経が脳全体にどのような影響を与えているのかが明らかとなった。つまり、黒質線条体ドパミン神経の活動は同即の前頭葉の活動と強く関連していることが判明した。今後この連関がどのような臨床症状と関連し、その病態を明らかにする。また、治療によって変化しうる脳領域を知ることで、どのような薬剤がどのような症状に有効かが間接的に説明できるようになる事が期待される。

同側の補足運動野を含めた前頭前野と関連があることが判明した。この変化がパーキンソン病の臨床症状とどのような関連があるか調査を行っていく。健常者ドパミントランスポーター画像は30名撮像が終了している。パーキンソン病については症例を増やしているところであるが、概ね終了出来る見通しである。線条体ドパミントランスポーター結合率と前頭葉血流はドパミン節前神経のみが選択的に障害されるパーキンソン病において成立すると考えられる。一方ドパミン節前と節後神経の両者が傷害されうるパーキンソン症候群ではこの相関関係が成り立たないと仮説が立てられる。そこでパーキンソン病のみならずパーキンソン症候群においても同様にドパミントランスポーター画像と脳血流画像を撮像し、線条体ドパミントランスポーター結合率と前頭葉血流を計算取得し、疾患における総意を検討すると同時にその臨床的意義を探索する。ドパミントランスポーター画像については、様々な評価法があり、関心療育の取り方、年齢や施設間格差の影響を調整する方法などが存在するため、最適な方法を調査する必要がある。また、パーキンソン病におけるドパミントランスポーター結合率と相関する脳領域について臨床症候との関連を調査する必要がある。米国での研究打ち合わせを行う予定であったが、実現しなかったため。ソフトウェアのアップグレードをまだ行っていないが現時点では解析は可能である。本年度は研究継続のために米国での研究打ち合わせを行う予定。また、動作解析のために新たなソフトを購入する予定である。ソフトウェアのアップデートを行うと結果が変わってしまう可能性が有り、アップデートすることができなかった。次年度はウィンドウズ7のサポートが終了することによって複数のソフトウェアもアップデートしないとならない。
フランスにおける私学助成法制の現代的展開とその憲法原理的考察

研究最終年度たる今年度は、昨年度に引き続き、収集すべき関係文献・資料の目録を作成し、これに従って、国立国会図書館や他の国立大学等の国内施設も利用しつつ、基本的な文献資料の収集に努めた。また、これと並行して、昨年度収集した文献資料の整理・読解に本格的に着手し、分析の前提となる基礎資料の作成を進めた。集積した資料の量はなにぶん膨大であり、未だそのすべてにわたる十分な分析はなしえていないため、詳しい検討内容の公表は、なお後日の課題としてある。ただ、例えば、1850年法(ファルー法)の制定に関わる政治的・社会的背景と議会審議の動向や、1993年94年のファルー法の改定をめぐる世論の動きと公法学上の議論(憲法院判決の検討)等に関して、その検討の一部を、来年度刊行予定の自著の記述に織り込むことにしている。本研究に関わるフランス教育法制改革の課題は、以下のように素描できる。大革命以来、典型的な近代国家のモデルを維持してきたフランスにおいて、国家による学校教育の掌握と「自由」教育(=カトリック教育)の排斥・周辺化の政治的試みが断続的に現われてきた。しかし、現代に至り、公役務たる教育の有効性、教育の平等の実現等の要請が高まるにつれ、公立学校と私立学校との闘争という古典的図式は後景に退き、むしろ、公教育制度全体の機能の向上を基礎に、両者の平等・衡平な発展のための制度改革が不可欠なものとなっている。そこでは、分権化改革により権限を増す地方公共団体と、財政支援を必要とする私教育部門との関係性の中で、公教育制度の全般的な運用に目配りすべき現代国家の教育機能の再定義が、緊要な課題として浮上することになる。1994年のファルー法改定論議で顕わになったものこそ、この困難な問題なのであった。教育の「公共性」の再定義と言い換えることもできるこの問題の洞察にとって、ファルー法改定論議は非常に重要な意義をもつものであると見られる。この点を中心に、今後さらに検討を進めたい。本研究は、フランスにおける私学助成法制の歴史的な展開過程を明らかにし、その現代的特質を分析することで、私学助成改革論議の意義とその行方を見定めることを目的とするものである。研究初年度たる今年度は、まず、日本国内およびフランス共和国における各種資料の収集にかかる具体的な予定をたてることから始めた。その後、収集すべき関係文献・資料の目録を作成し、これにしたがって、フランスの私学助成法制の歴史的変遷や、分権化改革等に伴うその現代的変容の概要を分析するための基本的な文献資料の収集に努めた。また特に、近時、公立学校でのスカーフ着用の禁止が法制化された問題をめぐり、政教分離(ライシテ)との関係におけるフランス公教育法制の制度枠組みと、憲法・行政裁判例の蓄積のなかで合意が形成されてきた制度運用にも、大きな変容が見られたことから、その点にかかわる仏語文献の収集と分析にも力を注いだ。さらに、フランス共和国に赴き、近時の情勢にかかる情報収集に努めるとともに、パリ市の国立図書館等において、国内で入手困難な資料等の収集に当たった。今年度収集した文献資料については、目下、その読解・分析作業を継続中である。研究完成年度たる来年度に向けて、さらに充実した研究を遂行できるよう、準備に努めたい。
ミトコンドリアに内在する長鎖非コードＲＮＡの同定と機能解析

ミトコンドリア内には多様な非コードRNA (ncRNA)が存在する。これまでに、長鎖非コードRNA (lncRNA)やマイクロRNA (miRNA)が報告されているが、それらの機能については未だに明らかにされておらず不明な点が多い。本研究では、正常および代謝性疾患モデルマウスの肝細胞ミトコンドリアに存在するncRNAをRNA-seq法にて網羅的に解析し結果をデータベスとして登録することを目指す。さらに代謝性疾患で発現量が著しく変化するncRNA候補を選定し、相互作用分子の解析、および過剰発現やsiRNAを用いたノックダウン等の方法によってそれらの機能を明らかにすることを目的とする。今回、モデルマウスとして正常C57BL/6のほかに、肥満モデルとしてC57BL/6-ob-/ob-、糖尿病モデルとしてC57BL/6-db-/db-、非アルコール性脂肪肝(NASH)モデルとしてC57BL/6-NASHを用いた。各モデル肝ミトコンドリア画分に含まれるncRNAのRNA-seq解析がほぼ終了し、それぞれのモデルで1万種以上のncRNAが発現していることが明らかになった。現在、それぞれの発現量の比較解析を進めている。次に、特にNASHモデルに注目し、発現量が異なるncRNAを数個選定した。それらの機能を明らかにする目的で、各々について発現用レンチウイルスベクターを作製した。現在、ES細胞およびマウス3T3-L1細胞の脂肪細胞分化モデルを用いて、ncRNAクローン発現の脂肪細胞分化や脂肪合成に与える効果を観察している。研究は概ね順調に進行しているが、いくつか問題が発生したため研究計画を一部変更した。当初、遺伝的バックグランドが同じ4種のモデルマウスの入手を試みたが、C57BL/6-ob-/ob-およびC57BL/6-db-/db-については入手できないことが判明したため、主たる比較解析を正常C57BL/6とC57BL/6-NASHとの間で行うこととし、ob-/ob-およびdb-/db-のデータをリファレンスとすることとした。次に、lncRNAの発現が確認できない問題が生じた。既報に従い発現用レンチウイルスベクターを作製したが、いずれのクローンにおいても発現細胞中に目的のlncRNAトランスクリプトが検出できなかった。その原因は特定できていない。そこで、lncRNAについては過剰発現系により各クローンの機能を明らかにすることを断念し、siRNA法等を用いたノックダウン解析に切り替えることとした。正常および3種の代謝疾患モデルマウスの肝ミトコンドリア画分に含まれるncRNAをデータベース化し登録準備する。正常C57BL/6とC57BL/6-NASHとで比較し、発現量がNASH特異的に顕著に増減するlncRNAおよびmiRNAクローンを選定する。特にNASHで特異的に高発現しているクローンに注目し、siRNAなどを用いたノックダウン法や、miRNAについては過剰発現系を用いて細胞増殖、細胞死、ATP産生およびROS産生、脂肪細胞の分化プロセスや脂肪代謝系に及ぼす影響を解析する。同時に、正常およびC57BL/6-NASHのミトコンドリア機能複合体の解析をすすめる。免疫沈降法などにより、各呼吸鎖複合体、β酸化複合体などの精製標品を調製し、複合体の分子性状を解析し、さらに、複合体に含まれるlncRNAやmiRNAを検出し同定する。同定されたncRNAについて、過剰発現系やsiRNAを用いた解析などから複合体構成や機能発現における役割を評価する。

次に、lncRNAの発現が確認できない問題が生じた。既報に従い発現用レンチウイルスベクターを作製したが、いずれのクローンにおいても発現細胞中に目的のlncRNAトランスクリプトが検出できなかった。その原因は特定できていない。そこで、lncRNAについては過剰発現系により各クローンの機能を明らかにすることを断念し、siRNA法等を用いたノックダウン解析に切り替えることとした。正常および3種の代謝疾患モデルマウスの肝ミトコンドリア画分に含まれるncRNAをデータベース化し登録準備する。正常C57BL/6とC57BL/6-NASHとで比較し、発現量がNASH特異的に顕著に増減するlncRNAおよびmiRNAクローンを選定する。特にNASHで特異的に高発現しているクローンに注目し、siRNAなどを用いたノックダウン法や、miRNAについては過剰発現系を用いて細胞増殖、細胞死、ATP産生およびROS産生、脂肪細胞の分化プロセスや脂肪代謝系に及ぼす影響を解析する。同時に、正常およびC57BL/6-NASHのミトコンドリア機能複合体の解析をすすめる。免疫沈降法などにより、各呼吸鎖複合体、β酸化複合体などの精製標品を調製し、複合体の分子性状を解析し、さらに、複合体に含まれるlncRNAやmiRNAを検出し同定する。同定されたncRNAについて、過剰発現系やsiRNAを用いた解析などから複合体構成や機能発現における役割を評価する。少額のため物品購入ができなかった。次年度の物品費に充てる。
空間変調モンテカルロ法による臨界現象の研究

臨界現象研究の新しい空間変調モンテカルロ法を考案し,その特性を検討した.臨界現象では秩序変数の長距離揺らぎが重要であるが,フラストレート系では非自明の量が秩序変数になる.モンテカルロ・シミュレーションで短距離秩序構造を発見可能だが、通常の周期境界条件を課した有限系のシミュレーションでは,許される波数が特定のものに制限され,シミュレーションを行う系を単位胞とする「結晶」の波数空間におけるreduced BZでの,k=0モードの揺らぎしか扱えない.各単位胞ごとの位相を変調する変数を導入することによって,k≠0の長波長揺らぎが扱える.ただし,長波長揺らぎ間の相互作用は無視されるので,有限サイズスケーリングの併用は必要である.この「位相」概念は,XYスピン系では自然に導入できるが,Ising系などの離散的な対称性をもつ場合でも,類似の変調概念を導入できる.このような位相変調変数を用いたシミュレーションは,拡張アンサンブルとして取り扱うことができ,位相変調変数のヒストグラムを取ることによって,その分布関数に,長距離揺らぎに関する情報が含まれているため,臨界現象の情報を引き出せる.上記の検討結果に基づき,2次元XYスピン系の位相変調アルゴリズムを用いたプログラムの開発した.これまでの予備的な計算では,非整合構造をもつ2次元反強磁性三角格子モデルで,整合構造(AFT120°構造)に対する結果(Miyashita and Shiba,1994,J.Phys.Soc.Jpn.53,1145)とコンシステント(T_<KT><T_C)であったが,依然として,相転移の性格に関して明確な結論を下せていない.この点に関しては,アルゴリズムを改良した計算を行い,相転移の性格についてなお詳細な分析を行っている.臨界現象研究の新しい空間変調モンテカルロ法を考案し,その特性を検討した.臨界現象では秩序変数の長距離揺らぎが重要であるが,フラストレート系では非自明の量が秩序変数になる.モンテカルロ・シミュレーションで短距離秩序構造を発見可能だが、通常の周期境界条件を課した有限系のシミュレーションでは,許される波数が特定のものに制限され,シミュレーションを行う系を単位胞とする「結晶」の波数空間におけるreduced BZでの,k=0モードの揺らぎしか扱えない.各単位胞ごとの位相を変調する変数を導入することによって,k≠0の長波長揺らぎが扱える.ただし,長波長揺らぎ間の相互作用は無視されるので,有限サイズスケーリングの併用は必要である.この「位相」概念は,XYスピン系では自然に導入できるが,Ising系などの離散的な対称性をもつ場合でも,類似の変調概念を導入できる.このような位相変調変数を用いたシミュレーションは,拡張アンサンブルとして取り扱うことができ,位相変調変数のヒストグラムを取ることによって,その分布関数に,長距離揺らぎに関する情報が含まれているため,臨界現象の情報を引き出せる.上記の検討結果に基づき,2次元XYスピン系の位相変調アルゴリズムを用いたプログラムの開発した.これまでの予備的な計算では,非整合構造をもつ2次元反強磁性三角格子モデルで,整合構造(AFT120°構造)に対する結果(Miyashita and Shiba,1994,J.Phys.Soc.Jpn.53,1145)とコンシステント(T_<KT><T_C)であったが,依然として,相転移の性格に関して明確な結論を下せていない.この点に関しては,アルゴリズムを改良した計算を行い,相転移の性格についてなお詳細な分析を行っている.
発癌の分子メカニズムの違いに着目した大腸癌TGF-βシグナル伝達経路の新たな分類

申請者らは、TGF-βシグナル伝達経路に異常を有する大腸癌には、2つの異なる発癌の分子メカニズムが存在することに着目し、「TGF-βシグナル伝達経路に異常を有する大腸癌は、シグナルの受容体であるTGFBR2もしくはACVR2Aに遺伝子変異をもつ群(受容体変異群)と、細胞内におけるシグナル伝達の調節因子であるSMAD2もしくはSMAD4に遺伝子変異をもつ群(調節因子変異群)とに分類することができる」という仮説を立て、本研究を企画した。本研究の目的は、「受容体変異群と調節因子変異群について、病理像・臨床像・人種差・蛋白質発現を解析し、発癌の分子メカニズムの違いに着目した大腸癌TGF-βシグナル伝達経路の分類における研究基盤を確立すること」である。本年度に予定していた、以下の4点について解析を行い、英文雑誌に投稿した。(1)SMAD2またはSMAD4に遺伝子変異をもつ群(調節因子変異群)の病理像の解明(2)調節因子変異群の臨床像の解明(3)調節因子変異群の人種差(4)調節因子変異群の遺伝子変異と蛋白質発現の解明本年度に予定していた、以下の4点について解析を行い、英文雑誌に報告した。(1)SMAD2またはSMAD4に遺伝子変異をもつ群(調節因子変異群)の病理像の解明(2)調節因子変異群の臨床像の解明(3)調節因子変異群の人種差(4)調節因子変異群の遺伝子変異と蛋白質発現の解明本年度は、以下の4点について解析を行い、学会報告および英文雑誌への報告を行う予定である。(1)TGFBR2もしくはACVR2Aに遺伝子変異をもつ群(受容体変異群)の病理像の解明(2)受容体変異群の臨床像の解明(3)受容体変異群の人種差(4)受容体変異群の遺伝子変異と蛋白質発現の解明申請者らは、TGF-βシグナル伝達経路に異常を有する大腸癌には、2つの異なる発癌の分子メカニズムが存在することに着目し、「TGF-βシグナル伝達経路に異常を有する大腸癌は、シグナルの受容体であるTGFBR2もしくはACVR2Aに遺伝子変異をもつ群(受容体変異群)と、細胞内におけるシグナル伝達の調節因子であるSMAD2もしくはSMAD4に遺伝子変異をもつ群(調節因子変異群)とに分類することができる」という仮説を立て、本研究を企画した。(1)TGFBR2もしくはACVR2Aに遺伝子変異をもつ群(受容体変異群)の病理像の解明(2)受容体変異群の臨床像の解明(3)受容体変異群の人種差(4)受容体変異群の遺伝子変異と蛋白質発現の解明翌年度、論文の英文校正などの費用として使用する計画です。
口腔癌におけるCCR10陽性制御性T細胞誘導による腫瘍免疫回避機構の解明

口腔扁平上皮癌組織における制御性T細胞に関する解析を行った。CCR10を発現するCD4陽性制御性T細胞が癌の間質に浸潤していることがわかった。癌の間質にCCR10陽性CD4陽性制御性T細胞が存在することから、癌細胞もしくは癌周囲の環境がCCR10陽性CD4陽性制御性T細胞を誘導し、腫瘍免疫からの寛容を得ている可能性が示唆された。制御性T細胞(Treg)は、免疫抑制機能に特化したT細胞サブセットの一つである。近年、癌細胞がTregを利用して腫瘍免疫を抑制することが分かってきた。そこで、Tregにおけるケモカインおよびケモカイン受容体の発現に着目し、口腔扁平上皮癌におけるTregの局在とその病態との関係を解析し、役割を解明することを目的とし、実験をすすめている。今回、口腔扁平上皮癌の癌組織において、ケモカイン受容体CCR10を発現する制御性T細胞の顕著な浸潤を認めた。そこで、口腔扁平上皮癌におけるCCR10陽性制御性T細胞の局在を明らかにすることにより、癌細胞の腫瘍免疫の抑制機構を解明していく。そこで、口腔扁平上皮癌におけるCCR10陽性制御性T細胞の局在、また、CCR10のリガンドであるCCL27、CCL28の産生細胞を明らかにすることにより、癌細胞の腫瘍免疫の抑制機構を解明していく。そこで、口腔扁平上皮癌におけるCCR10陽性制御性T細胞の局在を明らかにすることにより、癌細胞の腫瘍免疫の抑制機構との関連を調べている。口腔扁平上皮癌の臨床検体のパラフィン切片を用いて、CCR10陽性細胞の染色を行い、組織内での局在、臨床病期、予後などとの相関をみている。少数例では、CCR10発現細胞の数で予後と強い相関がありそうであったが、多数例では、有意差はあるものの、強い相関はみられなかった。CCR10だけでなく、そのほかの因子も検討していく必要がある。また、レセプターの染色は可能となったが、リガンドであるCCL27、CCL28の染色条件が整わず、安定性が得られていない。近年、様々な癌で、免疫担当細胞が浸潤していることが分かってきている。口腔扁平上皮癌の癌組織中にも、様々な種類の免疫担当細胞の浸潤が認められる。免疫担当細胞のひとつである制御性T細胞は、免疫抑制機能に特化したT細胞サブセットであり、癌が制御性T細胞を誘導して、腫瘍免疫を抑制することが考えられている。制御性T細胞が発現するレセプターの違いで、さらに様々な種類のサブセットに分けられ、これまでに、CCR4陽性Foxp3陽性T細胞の浸潤が多いと、予後不良になることを見出してきた。そこで、口腔扁平上皮癌における制御性T細胞におけるケモカインレセプターの発現とその局在に着目し、研究をすすめた。未治療の状態で切除された口腔扁平上皮癌の検体を用いて、免疫組織染色を行い、解析を行った。CD4陽性Foxp3陽性制御性T細胞は癌の間質に存在した。さらにCD4陽性Foxp3陽性制御性T細胞におけるケモカインレセプターの発現について免疫組織染色を行ったところ、CCR10を発現するCD4陽性制御性T細胞が著明に浸潤していることがわかった。癌の間質にCCR10陽性CD4陽性制御性T細胞が存在することから、癌細胞もしくは癌周囲の環境がCCR10陽性CD4陽性制御性T細胞を誘導し、腫瘍免疫からの寛容を得ている可能性が示唆される。また、CCR10陽性CD4陽性制御性T細胞自体も腫瘍の成長を誘導する因子を産生し、腫瘍増殖に関与している可能性が考えられる。リガンド産生細胞の同定をすすめることで、癌の病態形成との関連について検討している。腫瘍組織標本の切片からのmRNAの抽出が困難であり、遺伝子レベルでの発現の解析が遅れている。引き続き、免疫組織染色、real-time PCRなどで、制御性T細胞と腫瘍の関係について検討を行っていく。

特にリガンドに関しては、染色に安定性を得ることができないため、安定性の得られる実験方法への変更、もしくは、ほかの関連する因子を検討し、統計学的に解析し、臨床病期や分化度、予後などとの相関の有無を調べていく。外科系歯学今年度に引き続き、本研究で使用予定の設備は、当研究室および共同研究施設に完備されているため、必要な研究費は主に消耗品である。大量の組織切片作製のため、ガラス器具関連が必要となる。浸潤細胞や産生細胞の同定を行うための免疫組織染色、FACSおよびELISAでは、各種細胞マーカーに対する抗体が必要となる。また、real-time PCR解析では、遺伝子工学関連の試薬が必要となる。以上の計画で研究費を使用していく予定である。今年度の目標は、CCR10陽性細胞の局在および遺伝子レベルでの発現の確認までを予定していた。組織染色の条件検討に時間を費やしているため、現在、口腔扁平上皮癌の臨床検体のパラフィン切片を用いて、CCR10陽性細胞の染色を行い、組織内での局在について、検討しているところである。目標としていたmRNA解析まで行うことができず、mRNA解析で必要な試薬の購入まで到達しなかった。目標としていた研究成果を得ることができず、論文投稿に至らず、論文投稿費を使用することができなかった。リガンドの染色に安定性がなく、安定する条件を検討しており、発現細胞や組織の同定まで至らなかった。パラフィン切片からのRNA精製が困難であり、現在、条件を検討しており、その後のreal-time PCRに必要な試薬などの購入まで到達しなかった。今年度に引き続き、本研究での使用予定の設備は、当研究室および共同研究施設に完備されているため、必要な研究費は主に消耗品となる。ガラス器具関連、免疫組織染色、re-al-time PCR解析で必要な遺伝子工学関連試薬の購入にあてていく予定である。引き続き、免疫組織染色を行い、どのような種類の細胞浸潤がみられるかをさらに検討していく予定である。また、組織染色が確認されたケモカイン、ケモカインレセプターに関し、腫瘍組織標本の切片からmRNAを調整して、real-time PCR解析により、mRNAレベルでの発現を確認していく。発現細胞や組織の同定のために必要な抗体や、RNA精製のためのキット、その後の遺伝子解析に必要な試薬などの消耗品の購入を行う予定である。今年度は、遺伝子解析まで研究をすすめていきたかったが、免疫組織染色の条件検討に時間を要したため、組織染色までとなった。今年度に引き続き、本研究で使用予定の設備は、当研究室および共同研究施設に完備されているため、必要な研究費は主に消耗品である。浸潤細胞の同定を行うための免疫組織染色、FACSおよびELISAでは、各種細胞マーカーに対する抗体が必要となる。
聴覚の情報表現に基づく機能性音声デザイン機構の研究

申請者の発明によるSTRAIGHTと時変多属性任意事例数モーフィングを利用することにより、様々な機能を有する音声による表現を探索的に研究するための基盤を実現した。また、それらの利用を促進するために、必要となる音声の物理特性、発声・調音器官、聴覚機構と機能を対話的に探求することのできる環境を構築し、オープンソースとして公開した。また、具体的な機能音声の実現例として、強い印象を与える歌唱で多用されるグロウル発声の特徴を、任意の歌唱に付加することのできるシステムを実現した。自然な文字である手書き文字よりも、適切にデザインされた活字は遥かに読み易い。音声言語も、適切にデザインすることにより、自然な肉声そのままのものよりも、明瞭に聴き取ることができ、内容を良く理解し記憶でき、より深い感動を得、心の平安を得、警戒心を喚起できるなど、用途に応じたものとすることができる可能性がある。本研究課題では、申請者らが進めている、聴覚と同型の情報表現に基づく最新の音声分析・変換・合成技術(STRAIGHTを分析・合成の基盤とし、時変多属性かつ任意事例数での外挿を可能とするように拡張されたモーフィング技術)を利用することにより、用途に応じた機能を有する音声のデザインを可能とするシステムのプロトタイプ構築を目的として研究を進めた。初年度は、探査的研究用基盤システムの構築を狙い、その第一段階として、科学技術計算環境であるMatlabの実時間入力機能と、イベント駆動型プログラムを利用した一群のツールを整備した。このツールは、既に確立されている技術を、対話的に直感的な操作で利用できるようにしたものであり、広く公開している。とくに、音声信号からリアルタイムで声道形状を推定し表示するシステムは、非常に高い関心を呼び、Edinbrough大学をはじめとした海外の教育研究機間においても活用されている。さらに、この声道形状推定の過程で求められるパラメタを応用することで、STRAIGHTによる分析結果を、声道形状を介して操作する方法を発見した。この表現は、これまでモーフィング応用の際の大きな障害となっていた参照点の設定を不要とする可能性があり、重要な突破口が開かれたと言える。申請者らが発明したTANDEM-STRAIGHTを中核として、拡張されて時変多属性任意事例数への適用と外挿が可能となったモーフィングおよび高速高精度高時間分解能の新しいF0抽出法とを加えて統合することにより、前意識的影響を定量化するための基盤となる対話的システムを構築する。このシステムを用いて、卓越した声を含む多様な音声資料の分析と探索的検討を進めることにより、目標とする機能を有する音声をデザインするための基礎データを蓄積する。引き続きこれらの基礎データに基づき、機能性音声デザインのためのパラメタ操作の体系とインタフェースを構築し、生成した刺激を用いた主観評価実験を進め、機能を実現するデザインテンプレートの作成を行う。このような計画に基づいて研究を進めることにより、音声の高感度の調査と制御、歌唱音声など卓越した音声の印象操作を行うGUIの実現という成果を得た。さらに、これらの検討の過程で、音声生成過程をシミュレートするGUIにおいて、これまで内外で広く用いられていた声帯音源モデルに根本的な欠陥があることを発見し、それを解決する閉じた数式による表現を得た。この数式による表現は、画期的な研究パラダイムを構築する可能性を有するものであり、新たな挑戦的萌芽研究の提案に結びついた。このように、本課題は、当初目的とした成果を達成しただけではなく、新たな研究パラダイムにつながるという、当初の予定を超える大きな成果を生みだした。達成目標として挙げた、(1)前意識的影響を定量化する実験手法および音声加工ツール、(2)好感度を改善する音声のデザインテンプレートの作成、(3)警戒心を喚起する音声のデザインテンプレートの作成。可能であれば、安心感や信頼感を促進する音声のデザインテンプレートの作成を狙うとした各項目の根幹となる、探査的研究用基盤システムの構築が大きく進展した。これには、二つの要因が関わっている。一つは、研究のツール開発のために用いている科学技術計算環境であるMatlabにおける実時間プログラムのための枠組みの確立である。これにより、探索的な検討のスループットを大きく向上させることができた。その結果、もう一つの要因である、声道形状を介したSTRAIGHTパラメタの操作が可能となり、デザインテンプレートの検討を効率化することが可能となったのである。さらに、この要因は、拡張された時変多属性任意事例数モーフィングを利用する上で障害となっていた、参照点の付与という操作を取り除くことにつながる。さらに、自励振動子と近似時変フィルタおよび局所的時間軸伸縮を用いることにより、実時間で品質劣化を招かずに音声に強い印象を与える属性を付与する方法を実現する枠組みを構築した。その上、短時間Fourier変換における巧妙な工夫により、STRAIGHTを凌ぐ品質での分析合成を可能とするCheap Trickという方法も発明されるに至った。

この方法は、これまでSTRAIGHTに基づいて開発されて来た、モーフィング等、様々な応用技術においてSTRAIGHTを置き換えることも可能である。これらは、当初計画していた予想を超える成果であり、本課題を大きく進展させるものである。音声情報処理平成27年度は、前年度で得られた声道形状を介した操作体系を、その数理的背景にあるLSP(Line Spectrum Pair)を介することにより、時変多属性任意事例数モーフィングの自動化と、適切なユーザインタフェースの概念化の検討を進め、実際に利用可能なプロトタイプの提供までを目指す。また、この際、スペクトル推定部分に分担者の森勢によるCheap Trickの組み込みを進める。その際に、システムのパラメタを適切に設定するため、本格的な主観評価実験を行い、結果を資料化する。また、こうして構築したプロトタイプを利用することにより、様々な機能を有する音声のデザインテンプレートを作成する。初年度の終盤において、本課題の成果の応用可能性を大きく広げる可能性のある情報表現と操作体系に関する発見があった。また、新たなスペクトル推定法の発明という、予想を大きく超える成果が得られた。これらを踏まえ、この新しい表現と操作体系に基づく基盤アルゴリズムとソフトの開発を重点化することとした。そのため、当初計画していた主観評価実験を、初年度は予備実験の規模にとどめ、次年度に、この新しく構築した基盤アルゴリズムとそれに基づくソフトを対象として、本格的な主観評価実験を行うこととした。そのために、初年度の規模を縮小した分を、次年度使用額とすることにより、次年度の実験の規模の拡大を可能とした。初年度に発見された情報表現と操作体系に基づいて基盤アルゴリズムとそれに基づく応用システムのソフトを開発し、評価する。そのために、開発の各段階で必要となる主観評価実験を本格化し、それらに基づいて、目標とするデザインテンプレートを拡充する。これらに、前述の次年度使用額を活用することで、より充実した成果とすることを狙う。
G蛋白質制御カリウムチャネルの生理的活性調節機構の解析

心房筋に存在するG蛋白制御カリウムチャネル(G protein-gated K^+ channel : K_G)電流に.は、relaxationと呼ばれる特徴的な電位依存性特性が存在する。これは膜電位を脱分極させた後、急に過分極させると緩徐な時間経過で電流増加(relaxation)することを指すが、アフリカツメガエル卵母細胞に再構成したK_Gではrelaxationが見られないため、心房筋に存在する何らかの分子がこの現象に関与していることが示唆されていた。本研究において、研究代表者は細胞質G蛋白サイクル調節蛋白(Regulators of G protein signalling ; RGS)が、K_G電流のrelaxation現象を再構成することを見いだした(The Journal of Physiology,2001)。さらには、膜電位依存性の細胞内Ca^<2+>上昇が、カルモデュリン(CaM)を介してRGSを活性化させることにより脱分極電位でG蛋白質サイクルが負に調節され活性型K_Gの数が減少することによりrelaxationが誘起されることを明らかにした(Circulation Research,2001)。即ちこれはRGSによってK_GチャネルではなくG蛋白質サイクルが膜電位依存性に調節されるという全く新しい概念を提起するものとなった。さらに研究代表者はRGS蛋白質がCa^<2+>/CaMによって活性化される分子機構について解明した。これにはホスファチディルイノシトール3リン酸(PIP_3)によるRGSの機能抑制と、Ca^<2+>/CaMによるこの脱抑制のメカニズムが働いていることが分かった(Proceeding of National Academy of Sciences, USA.,2002)。G蛋白制御カリウムチャネル(G protein-gated K^+ channel : K_G)は、G蛋白質のβ_γサブユニットが直接結合することにより活性化される。心臓では洞房結節と心房筋に存在しアセチルコリン(ACh)の刺激を受けたムスカリン(m_2)受容体刺激よって活性化され、膜を過分極させることにより徐脈を惹起する。中枢神経系では、GABAなどの抑制性神経伝達物質の刺激により遅延性抑制性シナプス後電位(slow IPSP)の形成する。心房筋に存在しAChで誘導されるK_G電流には、relaxationと呼ばれる特徴的なゲート機構が存在することが報告されていた。心房筋の膜電位を脱分極させた後、急に過分極させると瞬間的にある値まで内向き電流の増加が見られ、その後緩徐な時間経過で電流増加(relaxation)が見られる。アフリカツメガエル卵母細胞に再構成したK_Gではrelaxationが見られないため、心房筋に存在する何らかの分子がこの現象に関与していることが示唆されていた。本研究において、我々は細胞質G蛋白サイクル調節蛋白(Regulators of G protein signalling RGS)が、K_G電流のrelaxation現象を再構成することを見いだした(Inanobe et al. 2001)。さらに我々は、膜電位依存性の細胞内Ca^<2+>上昇が、カルモデュリン(CaM)を介してRGSを活性化させることを見出し、G蛋白質サイクルがRGSによって見かけ上膜電位依存性に調節されるために、G蛋白質サイクルの効果器であるK_Gがrelaxationという膜電位依存性性質を示すということを明らかにした(Ishii et al.,2001)。さらに我々はこのCa^<2+>/CaM依存性のRGSの活性化には、ホスファチディルイノシトール3リン酸(PIP_3)によるRGSの抑制と、Ca^<2+>/CaMによるこの脱抑制のメカニズムが存在していることを見出した(Ishii et al.,2002)。
NF-κBにより誘導される細胞死抑制シグナルの解析

TNFα刺激依存性に誘導される活性酸素(ROS)に対するNF-κBによる抑制のメカニズムを検討したところ、c-FLIPを過剰に発現させることによりROS蓄積が抑制されること、およびNF-κB欠損細胞でのみc-FLIPがTNFα刺激後、早期にカスパーゼ非依存性に分解されることが明らかとなった。また、マイクロアレイ解析を行った結果、複数の抗酸化遺伝子がTNFα刺激に伴い、NF-κB依存性に発現が誘導されることが明らかとなった。以上を総合するとNF-κBの新たな機能としてTNFα刺激依存性に誘導されるc-FLIPの分解の抑制と抗酸化遺伝子の発現上昇を介して、ROS産生を抑制していることが明らかとなった。染色体転座の認められる急性巨核芽球性白血病で生じるOTT-BSAC(MALあるいはMKL1)融合遺伝子の機能解析を行った結果、血小板の成熟に伴い発現するglycoprotein VIのプロモーターをOTT-BSACはBSACに比較し、強力に活性化することが明らかとなった。このプロモーター領域には、BSACファミリーが活性化することの知られているCArGbox配列が存在しないことより、プロモーター領域の種々の欠失変異体を作製し検討した結果、二つの領域がその活性化に必要であることが明らかとなった。現在そのエレメントおよび結合する転写因子について解析中である。BSACノックアウトマウスを作製したが、胎生3.5日で既に致死であることが明らかとなった。
ビタミンE欠乏性網膜色素変性症のトランスジェニックマウスの作成、治療法の研究

相同組み替えによりα-TTP遺伝子を欠損させたES細胞を宿主胚に注入し、偽妊マウスの子宮に移植してα-TTP遺伝子欠損のキメラマウスを作成した。次に、これらのキメラマウスの中でES細胞が生殖細胞へと分化した個体を野生型マウスと交配させることによりα-TTP遺伝子ヘテロ欠損マウスを得た。さらに、このα-TTP遺伝子ヘテロ欠損マウス同士を交配させ、ついにα-TTP遺伝子ノックアウトマウスを完成させた。現在、網膜および中枢神経の病理検索、体性感覚誘発電位、網膜電図により解析中である。また血清α-トコフェロールのみならずγトコフェロールも低値である事を発見したため、その代謝経路について検索中である。正常ヒト組織、ラットにおいてin situ hybridization法、Northern blot法を施行し、網膜、小脳、脊髄にα-TTPの発現を確認し報告した。後根神経節、末梢神経には発現していなかった。さらにin situ hybridizationを用いて小脳のバーグマングリアにα-TTPの局在発現を証明した。3)α-TTP遺伝子変異患者の剖検検索我々の経過観察していたH101Qのα-TTP遺伝子変異を持つ患者さんが不幸にして亡くなられ、剖検の機会を得た。中枢神経および網膜の病理検索を行い、後索、Purkinje細胞、外側膝状体、網膜視細胞外節内節の短縮、網膜色素細胞におけるリポフスチンの多量集積を認めた。更に、経口ビタミンE投与により後根神経節のビタミンEは正常化して、治療が有効であったことを報告した。1)変異αTTP遺伝子タンパク(αTTP)遺伝子のベクターの構築2)αTTP遺伝子タンパクの抗ぺプチド抗体の作成発症機序の解明にはヒトαTTP遺伝子タンパクの抗体が必要不可欠であり、αTTP遺伝子タンパク遺伝子のN末端、C末端のぺプチドを合成してrabbitに免疫することにより抗ぺプチド抗体の作成を作成した。得られた抗血清はαTTP遺伝子タンパクのrecombinantタンパクに反応し、現在抗体の精製と免疫組織化学を進めている。3)アルファートコフェロール転移タンパク(αTTP)遺伝子のHis101Gln変異によるビタミンE欠乏の機序の検討。我々の発見した変異遺伝子(His101Gln)をCOS7細胞にtranfectionしたところタンパク自体は野生型と同様に発現していた。そして得られたrecombinantタンパクの機能を、donor vesicleであるliposome分画からacceptor vesicleであるheavy membrane分画への移行機能でみると野生型のわずか11%しかなく、変異タンパクの機能不全であることが疑われた。さらに、肝腫瘍細胞系にtransfectionしてさらにその詳細な機序を検討している。相同組み換えによりα-TTP遺伝子を欠損させたES細胞を宿主胚に注入し、偽妊娠マウスの子宮に移植してα-TTP遺伝子欠損のキメラマウスを作成した。次に、これらのキメラマウスの中でES細胞が性殖細胞へと分化した個体を野性型マウスと交配させることによりα-TTP遺伝子へテロ欠損マウスを得た。さらに、このα-TTP遺伝子へテロ欠損マウス同士を交配させついにα-TTP遺伝子ノックアウトマウスを完成した。現在、α-TTP遺伝子型が+/+,+/-(ヘテロ),-/-(ホモ)の3群各群48匹を、餌がαトコフェロール(α-T)欠乏食を基礎にして、α-Tを加えない群、α-Tを加えた群、α-Tを過剰に加えた群、γトコフェロールを加えた群の4群に分け、合わせて12群を形成した。検索事項としてマウスの行動異常、体性感覚誘発電位、,網膜電図をモニターする予定で準備を進めている。さらにl-2か月ごとに各群2-4匹の網膜及び中枢神経の病理検索を行い発症の確認と病変分布、性状を検討する。

2) α-TTPの網膜、中枢神経系における発現部位の同定正常ヒト組織、ラットにおいてNorthern blot法を施行し、網膜、小脳、脊髄にα-TTPの発現を確認した。後根神経節、末梢神経には発現していなかった。さらにin situ hybridizationを用いて小脳のバーグマングリアにα-TTPの局在発現を証明した。次に網膜におけるα-TTPの発現部位の検索したい。我々の経過観察していたH101Qのα-TTP遺伝子変異を持つ患者さんが不幸にして亡くなられ、剖検の機会を得た。中枢神経および網膜の病理検索を行い、後索、Purkinje細胞、外側膝状体、網膜視細胞外節内節の短縮、網膜色素細胞におけるリポフスチンの多量集積を認めた。作成したα-TTP遺伝子ノックアウトマウスを約1年間、餌がαトコフェロール欠乏食にて飼育した。α-TTP遺伝子型がホモの群に行動異常を認めたためα-TTP遺伝子型が+/+、-/-(ホモ)の2群各12匹の神経、網膜の病理学的検索を行ったが、現在のところ明かな病理学的変化は認めていない。更に機能異常の検索として体性感覚誘発電位、網膜電図を試みている。α-TTP遺伝子変異患者では血清αトコフェロールのみならずγトコフェロールも低値であったが、α-TTP遺伝子ノックアウトマウスにおいてもγトコフェロールは異常低値であった。γトコフェロールは新しい利尿ホルモンLLU-αの前駆体であり、γトコフェロールの欠損舌患者およびノックアウトマウスにおいてはその体液調節異常を検索中である。
生合成力を活用した複雑精緻な構造を有する生理活性ジテルペノイドの創製

当研究課題において,強力な生理活性物質類を含むユーフォルビア科植物から生理活性ジテルペノイドに焦点を絞り,化合物の骨格構築に関与するジテルペン環化酵素遺伝子の取得と機能解析を目的とした。ハナキリン(Euphorbia milli),アオサンゴ(E. turicalli)を研究材料として入手し,地上部について次世代シーケンサによる網羅的mRNA発現解析を行った。両植物からそれぞれ4万を超える遺伝子情報を入手し,各種解析からジテルペン環化酵素様遺伝子をハナキリンから4種,アオサンゴから3種取得した。アオサンゴからカウレン生合成酵素を同定し,ハナキリンから機能未知ジテルペン環化酵素を見出した。初年度の研究計画に基づき,ユーフォルビア科植物のハナキリンとミルクブッシュの2種の植物から茎頂を含む地上部をそれぞれサンプリングしてRNA抽出を行った。バイオアナライザーによるRNA純度チェックを行い,定法に従い次世代シーケンス(pair-end法)でRNAseq解析を行った。両植物サンプルからRaw Read数8千万以上を確認し,contig数として5万以上を得た。BLAST解析とHMMER解析よりテルペン生合成にかかわるcontigを検索し,ハナキリンからは約40 contig,ミルクブッシュからは約20 contigの情報を得た。ハナキリンからはテルペン環化酵素様のタンパク質をコードし,なおかつ翻訳アミノ酸数が500以上のペプチドをコードする遺伝子を7種,ミルクブッシュからは同様のペプチドをコードする遺伝子4種選抜し,これら11種類のcDNAのクローニングを行った。現在,順次大腸菌による異種組換えタンパク質生産の実験に移行しているところである。本研究の遂行上新たにEuphorbia科植物を選抜して次世代シーケンサに供試したところ,これまでデータベースが整い,次世代シーケンサで得た情報よりも,Euphorbia科植物特異的なジテルペン環化酵素様遺伝子が多数取得できたことは,2年目以降に実施する機能未知ジテルペン環化酵素の構造と機能を解析する上での最初のハードルを突破できた。これまでの様々な(ジ)テルペン環化酵素の遺伝子クローニングと組換えタンパク質生産,標識化技術と多次元NMRを駆使した構造解析法は当該研究チームでは着実に実績を上げてきたので,今後も順調に研究が前進すると判断している。ユーフォルビア科植物から,アオサンゴ(別名ミルクブッシュ,Euphorbia tirucalli)とハナキリン(Euphorbia milli)の地上部で発現するmRNAの網羅的解析を次世代シーケンサにて行い,得られたデータのトリミング処理,de novoアッセンブル処理,ORF予測,予測アミノ酸配列への変換処理を行い,両植物サンプルからおよそ4万程度の配列をそれぞれ得た。これらのアミノ酸配列をswissprotデータベースからBLASTP検索,HMMERによる活性部位などのモチーフ相同性解析などから(ジ)テルペン環化酵素遺伝子候補をアオサンゴから5種(EtDTCL-1,-2,-3,-4,-5とそれぞれ命名),ハナキリンから11種(EmDTCL-11,-12,-13,-14,-15,-16,-21,-22,-23,-24と命名)を選抜した。これらのうち,TargetP検索で葉緑体移行シグナルを持つことが示唆されたのは,アオサンゴからはEtDTCL-1.-2,-4の3種類,ハナキリンではEmDTCL-15,-22,-23,-23の4種であった。これらの遺伝子について大腸菌による組換えタンパク質生産を試みた結果,EmDTCL-15, EmDTCL23およびEmDTCL-24について成功した。これらの酵素について基質ゲラニルゲラニル2リン酸(GGDP)と反応させたところ,EmDTCL-15とEmDTCL23に生成物が確認されたが,構造は未解明のままである。EmDTCL-24についてはGGDPとの直接の反応が確認できず,生成物も検出されなかった。そこでGGDPから1段階環化反応の進んだコパリル2リン酸(CDP)を基質に反応を行ったところ,ent-CDPのみから新たな化合物が検出されたが,syn-CDPからは生成物が得られなかった。2種のユーフォルビア属植物から(ジ)テルペン環化酵素様遺伝子を取得し,全てではないがcDNAクローニングからORFの取得,そして組換えタンパク質の生産とその酵素活性を2年目で進めることが出来た。組換え酵素により生成した化合物のGC-MS解析から,ライブラリや標品と一致するものではなかった。したがって,新規ジテルペン化合物の可能性もあるので次のステップ(構造解析)に進むべき課題となることから,概ね順調と判断した。これらのアミノ酸配列をswissprotデータベースからBLASTP検索,HMMERによる活性部位などのモチーフ相同性解析などから(ジ)テルペン環化酵素遺伝子候補をアオサンゴから5種(EtDTCL-1,-2,-3,-4,-5とそれぞれ命名),ハナキリンから11種(EmDTCL-11,-12,-13,-14,-15,-16,-21,-22,-23,-24-25と命名)を選抜した。

これらのうち,TargetP検索で葉緑体移行シグナルを持つことが示唆されたのは,アオサンゴからはEtDTCL-1.-2,- 4の3種類,ハナキリンではEmDTCL-15,-22,-23,-23の4種であった。これらの遺伝子について大腸菌による組換えタンパク質生産を試みた。アオサンゴから得られたEtDTC1は,機能解析の結果ent-CDPを基質とする単機能型ent-カウレン合成酵素(EtKS)と判明した。EtDTC4およびEtDTC-5に関しては大腸菌による組換えタンパク質生産が困難であり、他の宿主ーベクター系で生産を試みる必要が生じた。ハナキリンより得られたEmDTCL-15およびEmDTCL-23では,組換えタンパク質生産が不安定であり,酵素生成物の大量生産が困難であった。EmDTCL-24についてent-CDPから新たな化合物が検出され,完全C-13標識体の合成からNMR測定を行い、カウレン骨格でもピマラジエン骨格でもない構造未知のジテルペン化合物である可能性が示された当研究課題において,強力な生理活性物質類を含むユーフォルビア科植物から生理活性ジテルペノイドに焦点を絞り,化合物の骨格構築に関与するジテルペン環化酵素遺伝子の取得と機能解析を目的とした。ハナキリン(Euphorbia milli),アオサンゴ(E. turicalli)を研究材料として入手し,地上部について次世代シーケンサによる網羅的mRNA発現解析を行った。両植物からそれぞれ4万を超える遺伝子情報を入手し,各種解析からジテルペン環化酵素様遺伝子をハナキリンから4種,アオサンゴから3種取得した。アオサンゴからカウレン生合成酵素を同定し,ハナキリンから機能未知ジテルペン環化酵素を見出した。今後は,大腸菌および酵母菌を用いた組換えタンパク質の生産と酵素反応のチェック,酵素反応生成物の確認と完全C-13標識化,多次元NMRによる構造解析を進めることになる。標識化に必要な原材料(組換え酵素および出発原料の標識メバロン酸)は,初年度において既に大量に準備されている。進捗状況記載の通り,構造を明らかにしなければならないジテルペン化合物を生成する酵素を取得した。3年目(最終年度)は,当初の予定通り13C標識化化合物の酵素合成と多次元NMRにより構造を決定する予定である。生物有機化学(当初)初年度は直接経費(1,500,000円)を計上したが,研究の実施過程において成果発表を行わずに実験消耗品を購入するなどの計画変更に伴い,旅費として計上した20万円を物品費に充当したため,次年度使用額が生じた。残額は次年度と合算して適正に使用する予定である。当初配分額(1,500,000円)1.3%程度の残金(2万円余)を平成28年度の経費(直接経費1,100,000円)に組み込み,適切に使用する予定である。
ナトリウム利尿ペプチド系の心臓保護作用の解明-受容体遺伝子欠損マウスを用いた検討

Guanylyl Cyclase(GC)-Aは心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)と脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)の受容体である。GC-A遺伝子欠陥マウス(KO)では野生型に比較して心重量・体重量比が著明に大きくまた心臓繊維化も明らかに亢進していた。われわれはこのマウスにおける心筋細胞肥大及び間質の繊維化について研究を進め、以下に述べる新しい知見を見出した。1)GC-A KOの心臓におけるアンギオテンシン系の関与を検討する目的でこのマウスにアンギオテンシンII受容体拮抗薬を経口投与したところ、心肥大・心臓繊維化は著明に改善した。一方、ヒドララジンや6-OHDA投与では心肥大・繊維化の改善は全く認められなかった。2)GC-A KOの心臓におけるアンギオテンシン1型受容体遺伝子発現を検討したところ、野生型と同程度の発現量が検出された。一方、1型及び3型コラーゲン遺伝子発現やTGF-b遺伝子発現は著明に亢進していた。3)GC-A KOとアンギオテンシン(AT)1a受容体ノックアウトマウスの2系統のマウスを掛け合わせることによりGC-A(ナトリウム利尿ペプチド受容体)とAT1a受容体の双方を欠損したマウスを作製した。このマウスでは心臓肥大や繊維化はGC-Aノックアウトマウスに比較して減少しており、アンギオテンシン受容体拮抗薬投与の効果に一致する結果であった。4)GC-A KOとGC-A心筋細胞特異的発現マウス2系統のマウスを掛け合わせることにより、心筋細胞にのみGC-Aを発現し他の非心筋組織(繊維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞など)にはGC-Aを欠損しているマウスが得られる。このマウスを解析したところ、GC-A KOの心筋細胞肥大が抑制されていた。この結果より、これまで不明であった心筋細胞そのものにおけるGC-Aの意義が解明された。以上の検討により、内因性のナトリウム利尿ペプチド-GC-A系が心肥大・線維化に抑制的に働き心臓保護作用を有することが証明された。ナトリウム利尿ペプチド系はすくなくとも3種類のリガンド(ANP、BNP、CNP)と3種類の受容体(GC-A、GC-B、クリアランス受容体)からなる血圧・体液量調節系である。我々はすでにBNP遺伝子過剰発現マウス、BNP遺伝子欠損マウス、GC-A遺伝子欠損マウスの作製に成功し、ナトリウム利尿ペプチド系の生理的意義を明らかにしている。今回これらのマウスを用いてナトリウム利尿ペプチド系の病的心臓における意義を検討するが、その前段階としてマウスにおける実験的冠動脈閉塞再開通モデル作成法を確立した。この方法では従来までの方法と異なり虚血再灌流後長期的に観察することが可能であり、遺伝子操作マウスと組み合わせることで再灌流障害に及ぼす特定遺伝子の影響を直接検討することができる。次にナトリウム利尿ペプチド系とレニン・アンギオテンシン系との拮抗作用を検討する目的でGC-A遺伝子欠損マウスとAT1a受容体遺伝子欠損マウスとを掛け合わせdouble knockout miceの作製に成功した。現在その心・血管表現系を検討中である。さらにGC-A遺伝子欠損マウスの体液量調節障害を証明し、内因性ナトリウム利床ペプチド系の体液量調節における意義を明らかにした。また心臓特異的GC-A