hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化の機能解明とその遺伝子工学への応用

本国際共同研究では翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化の機能解明と遺伝子工学の産物即ちリコンビナント蛋白質の効率良いチロシン硫酸化を目的として研究した。2年目で最終年度の本年度は、チロシン硫酸化の機能解明を中心に行った。特にチロシン硫酸化は蛋白質の分泌のためのシグナルではないかということから、ゴルジ体に見出した硫酸化チロシン蛋白質結合蛋白質(レセプター蛋白質)の諸性質について以下のように研究した。タンパク質が様々な機能を発現する際、翻訳後修飾と呼ばれる調節機構がある。この一つにチロシンの硫酸化がありフィブリノーゲンなどの分泌性タンパク質に関与している。この硫酸化は、トランスゴルジネットワーク中で3'-ホスホアデノシン5'-ホスホサルフェートを硫酸供与体としTyrosylprotein sulfotransferase(以下TPSTと略)によって修飾される。すでに我々は、牛肝臓ゴルジ体画分中に硫酸化チロシンに対して結合親和性を示す分子量175Kの膜結合型タンパク質が発見した。これを、硫酸化チロシンタンパク質binding proteinと呼び以下TyrSPBPと略す。我々は、硫酸化チロシンタンパク質の多くが、分泌性タンパク質でありTPSTがトランスゴルジネットワーク中に存在することから、このTyrSPBPもトランスゴルジネットワーク中に存在し、分泌性タンパク質の細胞外輸送の調節に関与しているのではないかと考えた。今回、このTyrSPBPに注目し、結合親和性について検討した。このTyrSPBPは、糖鎖を持つ膜内在性の糖タンパク質であることはすでに報告した。そこで、はじめに、TyrSPBPの精製途中のミクロソーム画分中でトリプシン処理をしTyrSPBPの結合性について検討した。さらに、この糖鎖がその特異的機能を発揮するのに大きな役割をするのではないかと考え可溶化した後、グリコシダーゼで糖鎖を除去し結合性を見た。本蛋白質の精製は、牛肝臓のTyrSPBPを可溶化した後硫酸化チロシン(TyrS)をリガンドとするアフィニテイークロマトグラフィーにより溶出し、ヒドロキシアパタイトを用い、エレクトロエリューションによって単一化した。今回、抗TyrSPBPモノクローナル抗体は、分子量175KのTyrSPBPを免疫し作製した。精製過程における溶出画分、ミクロソーム画分をトリプシンで処理し、これらのTyrSとの結合性を検討した。その結果、TyrSPBPは、ミクロソーム画分中の親水性部位にTyrS結合部位を持つことが明らかとなった。次に、抗TyrSPBPモノクロナル抗体のTyrSPBPに対する活性をELISAで調べた。ELISAを行うに当たり、イムノプレートの固体化抗原としてTyrSPBPを直接固定化させたものと、さらにチロシンが硫酸化されている分泌性タンパク質の牛由来のフィブリノーゲンをまず固定化したあとTyrSPBPを間接的に結合させたものとの2つで行った。その結果、TyrSPBPを直接固定化させたものよりどちらもフィブリノーゲン結合型の方が高い価になった。これは、TyrSPBPをフィブリノーゲンに結合させることによって立体構造が維持され抗体が認識しすくなっていると考えられた。さらに非特異的抗原としてフィブリノーゲン、牛血清アルブミンを用いたところ活性はほとんど見られなかった。次に、ミクロソーム画分をトリプシン処理したものを抗原として用い、同様な方法でアッセイしたところフィブリノーゲンに結合した方が価が高くなった。この理由も前述の様に、立体構造維持が考えられた。次に、TyrSPBPを種々のグリコシダーゼで処理し、TyrSとの結合性を検討した。エンドHグリコシダーゼ処理による結果、TyrSPBPの結合性が全く見られないことからN型糖鎖が失われると同時にTyrSの結合親和性も失われることが明らかになった。結論として、TyrSPBPはTyrS蛋白質を認識するのにN型糖鎖を必要とすることが明らかになった。さらに抗TyrSPBPモノクローナル抗体よりTyrSPBPがTyrSPと結合した立体構造を維持した状態の方が結合性は高く、さらにこの抗体は、分子量175kのTyrSPBPだけでなくトリプシン処理した分子量約90K,85KのTyrSPBPにも結合した。さらにこれらモノクローナル抗体の抗原認識部位には糖鎖が関与していることが考えられた。

我々は、硫酸化チロシンタンパク質の多くが、分泌性タンパク質でありTPSTがトランスゴルジネットワーク中に存在することから、このTyrSPBPもトランスゴルジネットワーク中に存在し、分泌性タンパク質の細胞外輸送の調節に関与しているのではないかと考えた。今回、このTyrSPBPに注目し、結合親和性について検討した。このTyrSPBPは、糖鎖を持つ膜内在性の糖タンパク質であることはすでに報告した。そこで、はじめに、TyrSPBPの精製途中のミクロソーム画分中でトリプシン処理をしTyrSPBPの結合性について検討した。さらに、この糖鎖がその特異的機能を発揮するのに大きな役割をするのではないかと考え可溶化した後、グリコシダーゼで糖鎖を除去し結合性を見た。本蛋白質の精製は、牛肝臓のTyrSPBPを可溶化した後硫酸化チロシン(TyrS)をリガンドとするアフィニテイークロマトグラフィーにより溶出し、ヒドロキシアパタイトを用い、エレクトロエリューションによって単一化した。今回、抗TyrSPBPモノクローナル抗体は、分子量175KのTyrSPBPを免疫し作製した。精製過程における溶出画分、ミクロソーム画分をトリプシンで処理し、これらのTyrSとの結合性を検討した。その結果、TyrSPBPは、ミクロソーム画分中の親水性部位にTyrS結合部位を持つことが明らかとなった。次に、抗TyrSPBPモノクロナル抗体のTyrSPBPに対する活性をELISAで調べた。ELISAを行うに当たり、イムノプレートの固体化抗原としてTyrSPBPを直接固定化させたものと、さらにチロシンが硫酸化されている分泌性タンパク質の牛由来のフィブリノーゲンをまず固定化したあとTyrSPBPを間接的に結合させたものとの2つで行った。その結果、TyrSPBPを直接固定化させたものよりどちらもフィブリノーゲン結合型の方が高い価になった。これは、TyrSPBPをフィブリノーゲンに結合させることによって立体構造が維持され抗体が認識しすくなっていると考えられた。さらに非特異的抗原としてフィブリノーゲン、牛血清アルブミンを用いたところ活性はほとんど見られなかった。次に、ミクロソーム画分をトリプシン処理したものを抗原として用い、同様な方法でアッセイしたところフィブリノーゲンに結合した方が価が高くなった。この理由も前述の様に、立体構造維持が考えられた。次に、TyrSPBPを種々のグリコシダーゼで処理し、TyrSとの結合性を検討した。エンドHグリコシダーゼ処理による結果、TyrSPBPの結合性が全く見られないことからN型糖鎖が失われると同時にTyrSの結合親和性も失われることが明らかになった。結論として、TyrSPBPはTyrS蛋白質を認識するのにN型糖鎖を必要とすることが明らかになった。さらに抗TyrSPBPモノクローナル抗体よりTyrSPBPがTyrSPと結合した立体構造を維持した状態の方が結合性は高く、さらにこの抗体は、分子量175kのTyrSPBPだけでなくトリプシン処理した分子量約90K,85KのTyrSPBPにも結合した。
発癌・転移におけるレーザー照射の影響に関する実験的研究

I.マウスLewis肺癌細胞(AHHYG-1)を用い,腫瘍に対する機械的圧迫刺激と炭酸ガスレーザーおよびNd-YAGレーザー減量術の血液中癌細胞及び肺転移に対する影響を,ヒグロマイシン耐性遺伝子(HYGR)導入癌細胞を用いて検討した.癌細胞の検出にはHYGRを指標としたnestedprimer PCR法を用いた.【結果及び考察】癌細胞を接種してから2,3週目に圧迫刺激,レーザー減量術を加えたところ,血液中癌細胞の陽性率は増加を示した.しかし肉眼的肺転移結節を計測したところ,転移数の有意な増加は認められなかった.一方,A11HYG-1癌細胞の実験的肺転移の形成効率を検討した結果,転移効率は0.1%以下であった.これらのことから悪性腫瘍の手術操作時には血液中に癌細胞の散布が起こるが,必ずしも転移には結びつかないことが明らかとなった.この結果より本実験系においてはレーザー照射は転移促進,抑制に関わることはないものと考えられた。II.レーザー照射の影響をリンパ節転移から捉えることを目的とし,平成9年よりF344ラットにおいて4NQO誘発舌扁平上皮癌からの細胞株を作成を試み、親株から血行性+リンパ行性転移能を有するRSC3LM株,血行転移性のRSC3E2R株,非転移性のRSC3E2株を分離した.各細胞の性質は足蹠部(f,p.)接種ではLM株,E2R株ともに膝窩リンパ節転移を認めたが,下腹部皮下接種ではLM株のみ鼠径リンパ節転移を認めた.標識細胞のf.p.接種では3時間後に全ての細胞で下腿部集合リンパ管,膝窩リンパ節に陽性像を認めた.またLM株は他の細胞と比べ高い遊走能と活性型MMP2の発現を認めた.以上よりf.p.接穂による膝窩リンパ節転移はリンパ管内接種に類似した実験的リンパ節転移であり,自然リンパ節転移の原発巣におけるリンパ管内進入過程には遊走能及び活性化MMP2等が関与している可能性が示唆された.このモデルにてレーザーの影響を検討したが,本系においてはレーザー照射群と対照群(自然転移群)との間に転移数の有意な差は認められなかった。I.平成9年よりF344ラットにおいて4NQO誘発舌扁平上皮癌からの細胞株を作成を試みてみているが、現在までに舌癌細胞株(RSC3)が樹立された.本年度はさらにこの細胞株からリンパ節転移能を有する細胞株の樹立を試みている.これは高頻度にリンパ節転移がみられる転移モデルを作成し、このモデルによりレーザー照射の影響をリンパ節転移から捉えることを目的としている.KSNヌードマウスを用い、継代培養を行っているが血行性転移またリンパ行性転移かは不明であるが、結果的にはリンパ節転移みられる細胞株の樹立が得られるものと考えている.同時にこの転移が血行性転移またリンパ行性転移かを検討中である.またWister系ラットを用い、4NQO誘発舌扁平上皮癌、白板症モデルの樹立を現在行っている.この系では頸部リンパ節での転移のメカニズムの検討のためのモデル作成を目的としている.II.レーザーを含む手術操作が癌の転移に及ぼす影響を検討するための実験モデルの作成を行っている.

Hyg耐性遺伝子導入マウスLewis肺癌転移性細胞株をBALB/cマウスに移植している.HYGを指標としPCR法にて処置前後の血中癌細胞数、肺転移結節数、肺重量の測定を行う予定である.I.レーザー照射の影響をリンパ節転移から捉えることを目的とし,平成9年よりF344ラットにおいて4NQO誘発舌扁平上皮癌からの細胞株を作成を試み、親株から血行性+リンパ行性転移能を有するRSC3LM株,血行転移性のRSC3E2R株,非転移性のRSC3E2株を分離した.各細胞の性質は足蹠部(f.p.)接種ではLM株,E2R株ともに膝窩リンパ節転移を認めたが,下腹部皮下接種ではLM株のみ鼠径リンパ節転移を認めた.標識細胞のf.p.接種では3時間後に全ての細胞で下腿部集合リンパ管,膝窩リンパ節に陽性像を認めた.またLM株は他の細胞と比べ高い遊走能と活性型MMP2の発現を認めた。以上よりf.p.接穂による膝窩リンパ節転移はリンパ管内接種に類似した実験的リンパ節転移であり、自然リンパ節転移の原発巣におけるリンパ管内進入過程には遊走能及び活性化MMP2等が関与している可能性が示唆された.適切な実験モデルが作製されたことから,今後このモデルにてレーザーの影響を検討する.II.マウスLewis肺癌細胞(AHHYG-1)を用い,腫瘍に対する機械的圧迫刺激と炭酸ガスレーザーおよびNd-YAGレーザー減量術の血液中癌細胞及び肺転移に対する影響を,ヒグロマイシン耐性遺伝子(HYGR)導入癌細胞を用いて検討した.癌細胞の検出にはHYGRを指標としたnested primer PCR法を用いた.【結果および考察】癌細胞を接種してから2,3週目に圧迫刺激,レーザー減量術を加えたところ,血液中癌細胞の陽性率は増加を示した.しかし肉眼的肺転移結節を計測したところ,転移数の有意な増加は認められなかった.一方、A11HYG-1癌細胞の実験的肺転移の形成効率を検討した結果,転移効率は0.1%以下であった.これらのことから悪性腫瘍の手術操作時には血液中に癌細胞の散布が起こるが,必ずしも転移には結びつかないことが明らかとなった.その原因として血液中へ移行した癌細胞数が転移の成立に必要な細胞数に達していなかった可能性が示唆された.今後さらに検討を要する.I.マウスLewis肺癌細胞(AHHYG-1)を用い,腫瘍に対する機械的圧迫刺激と炭酸ガスレーザーおよびNd-YAGレーザー減量術の血液中癌細胞及び肺転移に対する影響を,ヒグロマイシン耐性遺伝子(HYGR)導入癌細胞を用いて検討した.癌細胞の検出にはHYGRを指標としたnestedprimer PCR法を用いた.【結果及び考察】癌細胞を接種してから2,3週目に圧迫刺激,レーザー減量術を加えたところ,血液中癌細胞の陽性率は増加を示した.しかし肉眼的肺転移結節を計測したところ,転移数の有意な増加は認められなかった.一方,A11HYG-1癌細胞の実験的肺転移の形成効率を検討した結果,転移効率は0.1%以下であった.これらのことから悪性腫瘍の手術操作時には血液中に癌細胞の散布が起こるが,必ずしも転移には結びつかないことが明らかとなった.この結果より本実験系においてはレーザー照射は転移促進,抑制に関わることはないものと考えられた。II.レーザー照射の影響をリンパ節転移から捉えることを目的とし,平成9年よりF344ラットにおいて4NQO誘発舌扁平上皮癌からの細胞株を作成を試み、親株から血行性+リンパ行性転移能を有するRSC3LM株,血行転移性のRSC3E2R株,非転移性のRSC3E2株を分離した.各細胞の性質は足蹠部(f.p.)
多バンド強相関電子系の軌道磁性の理論

幾何学的にフラストレートした構造をもつ3次元パイロクロア格子上の強相関電子系の磁気的性質、および相互作用する電荷自由度の性質を解析的、数値的アプローチによって研究した。幾何学的フラストレーションと同時に重要な軌道自由度を取り入れるため、d軌道のt2g多重項に対応する3つの軌道をもつハバード模型を3次元パイロクロア格子上で考察し、強相関効果を原子内クーロン相互作用についての摂動展開によって調べた。3つの軌道の間の相互作用は、同一軌道内クーロン相互作用、異なる軌道間クーロン相互作用、フント結合、電子対ホッピングの全てを考慮し、パイロクロア格子で現れる、12本の1電子バンドの全てを取り入れて、2次の自己エネルギー補正を計算した。自己エネルギーの波数依存性を無視した局所近似を行った範囲では、自己エネルギーのエネルギー依存性から計算した化学ポテンシャルの繰り込みから判断すると、電子間相互作用の強さが典型的な物質バナジウムスピネルの場合の50%程度まで、このアプロ-チが有効であることを示している。一方、同じく自己エネルギーのエネルギー依存性から有効質量を計算した。その結果は、電子間相互作用による有効質量の増大因子は、実験値に比べてかなり小さく、バナジウムスビネルで観測された巨大な電子有効質量には、同一原子内のみならず、原子間の電子相関の波数依存性を取り入れることが重要であることが分かった、波数依存性を取り入れた計算への拡張は現在実行中である。幾何学的にフラストレートした遷移金属酸化物に見られる特異な磁気的性質および比熱の異常を本年度は研究した。まず、ZnV_2O_4などのスピネル酸化物反強磁性体の基底状態を調べるために、パイロクロア格子上のハイゼンベルク模型を理論的に調べた。その結果、スピン液体基底状態においてスピンカイラリティーの励起が重要な役割を果たしており、3波数のスピン2量体構造の長距離秩序がカイラリティーの揺らぎによって安定化されることを発見した。さらに、1つの副格子は2量体構造の相転移点でも乱れたままであり、ずっと低温になって初めて長距離秩序を持つことを判った。さらに、関連した金属LiV_2O_4において実験的に見出された重い電子的振る舞いを理解するために、縮退したt_<2g>軌道が磁気的性質にどのような役割を果たすかを乱雑位相近似によって研究した。t_<2g>軌道の関与する軌道帯磁率およびスピン帯磁率を計算した。その結果、複雑なバンド構造に由来して、帯磁率の波数依存性が非常に小さく局所的なスピン揺らぎが大きいことを発見した。
神経プレート技術を用いた一細胞レベル神経回路構築

従来神経細胞は一度培養すると位置を変更できず、ランダムに形成された回路のみを解析対象としていた。本研究では神経細胞の細胞体・軸索・樹状突起を、生きたまま動的に変えることを世界で初めて実現する。神経回路中の要素である単一神経細胞を個別に選択し組み合わせるという電子回路工作のような方法論で神経回路を構築することを初めて提案している点で独創的であり、神経科学における新たな実験系を構築に資する。本研究の目的は、神経回路を一細胞レベルで設計・構築可能にするデバイスを開発することである。本手法で構築した神経回路に機能的なシナプス結合が構築されることを示し、また他種類の神経細胞にも適用可能であることを示す。平成30年度は回路構築プロセスの安定化として神経細胞が載ったプレートの三次元形状および回路基盤の改良を行い、かつ構築した神経回路の機能解析としてアデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子工学技術による神経活動の評価を行った。また、得られた研究成果を査読付き国際論文誌において発表した。神経細胞が載ったプレートから神経細胞の細胞体および神経突起が脱走する現象が稀に見られたことから、マイクロ加工技術を用いてプレートの側面に脱走防止用のマイクロサイズの壁面を設け、細胞非接着性の分子を修飾するプロセスを開発した。また、単一の神経細胞が形状制御された状態で載ったプレートを組み合わせて回路を作る際の、回路の基盤となるマイクロ構造を開発した。これらの技術により安定してプレートを組み合わせることが可能となった。また、三次元的に回路を組み立てるための三次元回路基盤を二光子レーザーリソグラフィ技術を用いて構築する技術を開発し、電動マイクロピンセットによって神経細胞を三次元回路基盤へ配置可能なことを示した。最後に遺伝子工学技術によって蛍光たんぱく質を発現させた神経回路の活動を評価可能であることを示した。平成29年度は(i)回路構築プロセスの安定化、(ii)構築した神経回路の機能解析を行った。ラット初代培養海馬神経細胞のために設計したプレートについて、神経細胞の軸索・樹状突起・細胞体がプレートの形状によって制御できる収率を定量化した。この結果はデバイスを改良のための基礎となる。また、神経細胞を組み合わせて回路の構造を構築するとき、回路構造が細胞の牽引力や培養液のせん断力により容易に崩壊しうることも判明しているため、回路を安定化させるために、プレートを埋め込む回路基板を開発した。このとき、回路基板にパターン可能な細胞非接着材料の検討、およびプレートの固定化が可能な基板形状の至適条件の検討を行った。回路構築安定化デバイスの開発後、免疫染色によるシナプス形成の評価およびCa 2+イメージングによる神経回路の活動解析を行った。本研究の目的としていた、(i)回路構築プロセスの安定化、(ii)構築した神経回路の機能解析を行うことができたため、計画は進展している。具体的には、ラット初代培養海馬神経細胞のために設計したプレートについて、神経細胞の軸索・樹状突起・細胞体がプレートの形状によって制御できる収率を定量化した。また、回路を安定化させるために、回路基板にパターン可能な細胞非接着材料の検討、およびプレートの固定化が可能な基板形状の至適条件の検討を行い、プレートを埋め込む回路基板を開発した。本研究ではさらにプレートそのものの三次元形状の改良を行い、神経細胞がプレートからはみ出さないようにする壁を設ける検討を行った。従って、当初の計画以上に進展していると考えている。

また、単一の神経細胞が形状制御された状態で載ったプレートを組み合わせて回路を作る際の、回路の基盤となるマイクロ構造を開発した。これらの技術により安定してプレートを組み合わせることが可能となった。また、三次元的に回路を組み立てるための三次元回路基盤を二光子レーザーリソグラフィ技術を用いて構築する技術を開発し、電動マイクロピンセットによって神経細胞を三次元回路基盤へ配置可能なことを示した。最後に遺伝子工学技術によって蛍光たんぱく質を発現させた神経回路の活動を評価可能であることを示した。本研究で問題となっている、神経細胞が載ったプレートの安定化をさらに高めるk風が必要であると考えている。マイクロマニピュレーションによって神経回路を構築した後の、細胞のけん引力および培養液に引きずられる力に抗する、生体適合性の高い回路基板を開発する。また、神経細胞同士を組み合わせて神経回路を構築した後の回路の動態を、アデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子工学技術によって可視化する。当初の計画通り、将来的な実用上で有用なiPS細胞由来神経細胞に適する神経プレートの開発を行い、神経回路の構築手法の確立を目指す。最終的に、本研究で得た知見を論文としてまとめ、世界に発信する。
ハイペロン-核子-核子系の連続状態,弱崩壊とハイペロン-核子相互作用

1.ハイパートリトンの弱崩壊この弱崩壊過程の解析には3つの部分-即ち、(a)始状態のハイパートリトンの束縛状態、(b)Λ-核子間の弱相互作用、(c)さらに終状態の3核子系連続状態-各々の研究が必要である。(a)は宮川(研究代表者)(b)はBarcelona、Washingtonのグループ、(c)はKrakow、Bochumのグループが中心になって行なった。現実的なハイパートリトン波動関数および正確な3核子連続状態を使った初めての計算である。その結果、終状態相互作用の効果は非常に大きく無視できないことが解った。また、Λが中性子と弱相互作用して崩壊する過程(n-induced decay)および陽子と相互作用して崩壊する過程(p-indeced decay)はこれまで実験的に識別でき、相互作用の性質の重要な情報源の一つと考えられてきたが、この系では両者は区別不可能であることが実際の数値計算で明らかになった。ΛΝΝ-ΣΝΝ結合系の連続状態を調べる上で、ΛΝ-ΣΝ部分系のt行列の振る舞いを知ることは決定的に重要である。技術的には、運動量の複素平面上に解析接続する必要があるため注意を要する。今回、Nijmegen Soft core potentialによるoff-shell t行列を調べ、ΛΝthresholdおよびΣΝthreshold双方の近傍に(非物理領域ではあるが、物理領域からそれほど遠くない位置に)、特異点が存在することを確認した。
次世代ヒト化マウスを用いたヒトアレルギー性喘息モデルの確立と創薬への応用

研究代表者が開発したNOG hIL-3/GM-CSF Tgマウス(hIL3/GM Tg)はヒトマスト細胞、好塩基球の分化効率が高く、in vivoでこれらの脱顆粒を惹起できるヒトアレルギーモデルマウスである。本研究ではこれまでに、hIL3/GM Tgへ好酸球を誘導するIL-5遺伝子を導入したhIL3/GM/IL5 triple-Tgマウスを作製し、ハウスダストマイト(HDM)またはIL-33の気管内投与によるヒトアレルギー性喘息モデルの確立を試みてきた。hIL3/GM Tgまたはtriple TgマウスにヒトIL-33を投与したところ、肺胞洗浄液中に多量のヒトT細胞、マスト細胞など炎症性細胞の浸潤やゴブレット細胞過形成、ペリオスチンの亢進が認められ、ヒトIL-13やIL-5が顕著に亢進した。またtriple Tgマウスの気管支では多数のヒト好酸球浸潤が認められた。さらに抗ヒトIL-13抗体を投与して喘息病態が改善されるか、すなわち抗体医薬の治療モデルとして利用可能か検討したところ、T細胞、好酸球などのヒト細胞浸潤、ゴブレット細胞過形成、ペリオスチン産生が阻害され、喘息病態が顕著に改善された。最終年度である平成30年度は、hIL3/GM TgおよびhIL3/GM/IL5 triple-Tgマウスにおけるヒト好酸球の脱顆粒および気道過敏性を解析した。IL-33投与後に好酸球顆粒の一つであるEDNを測定したところ、triple-TgマウスのBAL中で顕著に産生が亢進していた。またメサコリン吸入後の気道過敏性は、IL3/GM Tgおよびtriple-Tgの両者で亢進することを確認した。以上の結果から、本研究にて開発したヒト化気管支喘息モデルマウスは、創薬の薬効評価前臨床モデルとして利用できる可能が考えられた。本研究成果は、平成30年度に国際誌に報告した。今年度は、NOG IL-3/GM-CSF TgマウスおよびNOG IL-3/GM-CSF/IL-5 Tgマウスへ臍帯血由来ヒト造血幹細胞を移植したヒト免疫系マウスを作製し、これらヒト化Tgマウスの骨髄、末梢血、脾臓を採取し、ヒトCD45陽性細胞を指標としたヒト白血球キメラ率の測定およびヒトリンパ球系マーカー、ミエロイド系マーカーを用いた各細胞系列への分化能をフローサイトメトリーにて解析した。その結果、いずれのTgマウスにおいてもヒトマスト細胞、顆粒球の亢進を認め、特にIL-3/GM-CSF/IL-5 Tgマウスでは、好酸球分化が顕著に亢進した。次にこれらヒト化Tgマウスを用いてハウスダストマイト(HDM)投与による喘息モデルの樹立を試みた。HDM気管内投与後に喘息病態であるリンパ球、好酸球の肺組織への浸潤を調べたところ、nonTgマウスに比べてIL-3/GM-CSF TgマウスおよびIL-3/GM-CSF/IL-5 Tgマウスにおいて若干の亢進は認められたが、有意な差は見られなかった。一方で、喘息病態のインデューサーとしてヒトIL-33サイトカインを用い、同様の処置により喘息病態の誘導を試みたところ、IL-3/GM-CSF Tgマウスにおいて肺組織へのリンパ球、マスト細胞の浸潤に加え、ヒトIL-13の亢進、ゴブレット細胞過形成やペリオスチンの亢進といった喘息患者で見られる病態を再現することに成功した。また、IL-3/GM-CSF/IL-5 Tgマウスでは上記の病態に加えて顕著な好酸球浸潤を認めたことから、ヒト好酸球性喘息の病態が再現された。本モデルは、喘息治療薬の前臨床モデルとして利用出来る可能性を秘めており、次年度から喘息治療薬である抗IL-13抗体投与による薬効評価解析を実施する。当初はHDMの気管内投与による喘息誘導モデルマウスの作製を計画していたが、ヒト化Tgマウスで顕著な病態は観察されなかった。しかしながら、ヒトIL-33による喘息誘導には成功し、喘息患者で観察されるいくつかの病態を再現することが出来たため、計画はおおむね順調に進行していると考えられた。昨年度までにNOG IL-3/GM-CSF TgマウスおよびNOG IL-3/GM-CSF/IL-5 Tgマウスへ臍帯血由来ヒト造血幹細胞を移植したヒト免疫系マウスを作製し、これらへヒトIL-33サイトカインを気管内投与したヒト喘息モデルの作製に成功した。このモデルは、気管支へのヒトT細胞浸潤、杯細胞過形成、BAL中のIL-13, IL-5の亢進、ヒト好酸球の浸潤などヒトの病態と類似した症状を示すことから、前臨床薬効評価モデルとしての応用が期待される。今年度はNOG IL-3/GM-CSF Tgマウスへ抗IL-13抗体を投与し、喘息症状が改善されるか検討した。ヒト化NOG IL-3/GM-CSF TgマウスへIL-33を3日間連続で気管内投与して喘息症状を起こすと同時に、抗ヒトIL-13抗体を腹腔内投与した。その結果、抗IL-13抗体を投与したマウス群ではT細胞、好酸球、好塩基球、マスト細胞の浸潤、杯細胞過形成、ペリオスチン産生が顕著に抑制され、ヒト化マウスの喘息症状が著しく改善された。さらに抗IL-13抗体投与により、CD4 T細胞からのIL-

4産生も抑制されたことから、本喘息モデルはTh2細胞を介した病態形成が主体となっていると考えられた。次年度は気道過敏性やBAL中の好酸球顆粒の測定などさらに詳細な喘息病態の解析を行うことで、当該モデルの有用性を明らかとし、速やかに論文化できるよう進めていく。今年度は予定していた抗IL-13抗体の投与試験を実施し顕著な効果が得られたことから、前臨床薬効評価モデルとしての応用が期待できる。さらに病態解析に関するデータも蓄積され、次年度での論文化の目処も立った。研究代表者が開発したNOG hIL-3/GM-CSF Tgマウス(hIL3/GM Tg)はヒトマスト細胞、好塩基球の分化効率が高く、in vivoでこれらの脱顆粒を惹起できるヒトアレルギーモデルマウスである。本研究ではこれまでに、hIL3/GM Tgへ好酸球を誘導するIL-5遺伝子を導入したhIL3/GM/IL5 triple-Tgマウスを作製し、ハウスダストマイト(HDM)またはIL-33の気管内投与によるヒトアレルギー性喘息モデルの確立を試みてきた。hIL3/GM Tgまたはtriple TgマウスにヒトIL-33を投与したところ、肺胞洗浄液中に多量のヒトT細胞、マスト細胞など炎症性細胞の浸潤やゴブレット細胞過形成、ペリオスチンの亢進が認められ、ヒトIL-13やIL-5が顕著に亢進した。またtriple Tgマウスの気管支では多数のヒト好酸球浸潤が認められた。さらに抗ヒトIL-13抗体を投与して喘息病態が改善されるか、すなわち抗体医薬の治療モデルとして利用可能か検討したところ、T細胞、好酸球などのヒト細胞浸潤、ゴブレット細胞過形成、ペリオスチン産生が阻害され、喘息病態が顕著に改善された。最終年度である平成30年度は、hIL3/GM TgおよびhIL3/GM/IL5 triple-Tgマウスにおけるヒト好酸球の脱顆粒および気道過敏性を解析した。IL-33投与後に好酸球顆粒の一つであるEDNを測定したところ、triple-TgマウスのBAL中で顕著に産生が亢進していた。またメサコリン吸入後の気道過敏性は、IL3/GM Tgおよびtriple-Tgの両者で亢進することを確認した。以上の結果から、本研究にて開発したヒト化気管支喘息モデルマウスは、創薬の薬効評価前臨床モデルとして利用できる可能が考えられた。本研究成果は、平成30年度に国際誌に報告した。今後は、IL-33を投与したヒト喘息モデルマウスを用いて、喘息治療薬の評価系として利用出来るか検討する。具体的には、重傷喘息患者に用いられる抗ヒトIL-13抗体の投与により症状が緩和されるか、あるいは副作用について解析することにより、前臨床モデルとしての適性評価を行う。気道過敏性評価などより詳細な病態の解析を行い、速やかに論文化する。高速冷却遠心機を計上していたが、代替品の使用が可能となったことから購入しなかった。そのため、物品費使用額が当初計画から削減された。次年度使用額が生じた理由は、当初計画していたkit類や消耗品の購入を別の研究費で代替可能であったため。繰り越した費用については、次年度以降にかかる試薬類や受託解析などに使用する計画である。
暑熱負荷による唾液腺幹細胞の増殖と分化の誘導－新たなドライマウス改善方法の開発

ラットや培養細胞を用いた検討から、温熱刺激は、唾液腺の腺房細胞のアクアポリン5(AQP5、水を移動させるチャネル)の発現亢進と同組織の血管新生および血管のAQP1の発現亢進を介して、唾液分泌機能を向上させる事が知られている。今回、温熱刺激は唾液腺の幹細胞の増殖を抑制するが、その結果、唾液腺幹細胞から増殖した新生細胞の分化を促進する可能性が考えられた。さらに、ラットの自発運動により唾液腺でAQP1の発現と血管新生が促進され、唾液分泌機能が亢進することが示唆された。社会的な問題となっているヒトの口腔乾燥症に対し、その症状を改善する方法として運動を含む温熱刺激が有用である可能性がある。本年度は実験動物の唾液腺(個体レベル)および単離した唾液腺幹細胞において、温熱刺激が唾液腺幹細胞の増殖と分化に及ぼす影響を検討することを目的としたが、個体レベルでの繰り返し暑熱曝露の影響を主に検討した。ウィスター系雄性ラット(10週齢)を用いた。ラットを環境温24°C、明暗周期12:12時間、自由摂食・摂水下で飼育した。1週間後、暑熱馴化群(HE)は32°Cの高温環境で5日間飼育し、対照群(CN)は24°Cで飼育した。また、暑熱曝露の深部体温への影響を確認するため、テレメトリーシステムにより腹腔内温を測定した。ラットの腹腔内には暑熱曝露開始の日からブロモデオキシウリジン(BrdU)(細胞新生のマーカー)を5日連続で50mg腹腔内投与した。暑熱曝露開始から6日後にラットを麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドを灌流した後、顎下腺を摘出した。顎下腺の凍結切片を作成し、BrdUの染色を行った。染色した切片は共焦点レーザー顕微鏡で観察した。さらに、顎下腺からパラフィン切片を作成し、細胞増殖マーカーであるKi67で染色した。暑熱暴露によりHEの腹腔内温はCNに比較して約0.4度上昇した。顎下腺において、HEのBrdU陽性細胞数はCNに比べて減少する傾向があった。また、Ki67陽性細胞数も減少する傾向にあった。これら結果は、暑熱暴露はラット顎下腺の細胞増殖を抑制する可能性を示唆する。一般的に幹細胞などの未分化な細胞では増殖シグナルの抑制により分化が促進することから、暑熱暴露によるラット顎下腺の幹細胞増殖抑制は唾液腺幹細胞の分化を意味する可能性がある。加えて、培養したラット唾液腺幹細胞の増殖と分化に対する培養温度の影響の検討するため、唾液腺幹細胞塊(Salisphere)の形成を確認した。多くのSalisphereが幹細胞マーカーであるc-Kitに陽性でった。個体レベルでの暑熱曝露による唾液腺幹細胞の増殖と分化についての基本的検討はほぼ終了しており、得られた結果も十分に理解されるため、「進捗状況はおおむね順調に進展している」と判断される。培養したラット唾液腺幹細胞の増殖と分化に対する培養温度の影響の検討においては、Salisphereの形成は期待通り確認できたものの、その数とサイズが安定せず、予想よりそれぞれ少なく小さかった。今後の培養温度に関する検討に向け、唾液腺からの幹細胞のサンプリングと培養によるSalisphereの形成方法の改善(習熟)が望まれるため、この部分の研究の進捗状況は「やや遅れている」と判断される。しかしながら唾液腺幹細胞の細胞内増殖・分化シグナルに関する検討も進んでいるため、本年度の進捗状況は全体として「進捗状況はおおむね順調に進展している」と考えている。本年度は実験動物の唾液腺(個体レベル)および単離した唾液腺幹細胞において、温熱刺激が唾液腺幹細胞の増殖と分化に及ぼす影響を検討することを目的とし、その研究を継続したが、唾液腺幹細胞塊(Salisphere)の形成を安定的に得ることが困難であった。そこで、本年度は暑熱曝露と類似する刺激である運動に注目し、運動トレーニングによるラットの唾液分泌量や唾液分泌に重要な役割を果たす水チャネルであるアクアポリン(AQP)などの機能性タンパク質の発現変化を解析した。Wistar系ラットを環境温24±1°Cで1週間飼育した後、自発運動トレーニングを開始した。40日間の自発運動トレーニング後にラットを全身麻酔し、塩酸ピロカルピン(0.5mg/kg)を腹腔内投与して唾液分泌量を測定した。また、経心脱血後にラット顎下腺を摘出し、AQPなどのmRNAとタンパク質発現量を解析した。自発運動トレーニングによりピロカルピン誘発性の唾液分泌量が有意に増加し、唾液中のNa+濃度やタンパク質濃度を低下した。また、運動トレーニングによりの顎下腺の血管内皮細胞に発現するAQP1のmRNAおよびタンパク質発現量が増加した。さらに、血管新生の調節に関与する血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の発現量が顕著に上昇した。自発運動トレーニングはラットの唾液分泌機能を亢進し、その機序として顎下腺のAQP1やVEGFの発現上昇が関与する可能性が示唆された。さらに、温熱刺激による唾液腺幹細胞の増殖、分化の制御に関わる細胞内情報伝達系を考察するため、異なった実験系を用いて以下の検討を行った。温度感受性受容器の一つであるTRPV1のアゴニストであるカプサイシンおよび熱刺激をマウス線維芽細胞に負荷した。カプサイシンと熱刺激は両者ともMAPキナーゼを活性化し、細胞骨格の維持に関与するアクチンの重合を促進した。

カプサイシンはHSP70のみを誘導したが、熱刺激はHSP70とHSP90を誘導した。また、熱刺激はTRPV1の発現を抑制した。個体レベルでの暑熱曝露による唾液腺幹細胞の増殖と分化についての基本的検討はほぼ終了しており、得られた結果も十分に理解されるため、「進捗状況はおおむね順調に進展している」と判断された。培養したラット唾液腺幹細胞の増殖と分化に対する培養温度の影響の検討においては、Salisphereの形成は期待通り確認できたものの、その数とサイズが安定せず、予想よりそれぞれ少なく小さかった。本年度も唾液腺からの幹細胞のサンプリングと培養によるSalisphereの形成方法の改善を目指したが十分に安定した結果を得ることは困難であった。したがって、この部分の研究の進捗状況は「やや遅れている」と判断される。しかし、上述の問題点により研究の遅れ補填すべく、将来に向けたより簡便なドライマウス(口腔乾燥症)の治療法開発のため、暑熱曝露と類似しより簡便に応用可能な運動トレーニングよる唾液腺機能変化についての個体レベルでの研究を追加し、良好な結果を得た(学会発表済み、論文投稿中)。さらに、温度刺激による細胞内増殖・分化シグナルに関する関連する研究も並行して遂行し、良好な結果を得た(国際雑誌への公表済み)。これらから、本年度の進捗状況は全体として「進捗状況はおおむね順調に進展している」と判断しても良いと思われる。これまで、温熱刺激が唾液腺幹細胞の増殖・分化に与える影響を検討するため、ラットの顎下腺から唾液腺幹細胞を分離し、唾液腺幹細胞塊を得る研究を行って来たがその形成を安定的に得ることができなかった。本年度は顎下腺を得るラットの週齢や性別を変えて同様の検討を継続したが、安定した結果が得られなかった。そこで、昨年度得られた運動トレーニングによるラット唾液腺機能の変化について、そのメカニズムを水チャネルであるアクアポリン(AQP)などの発現部位と、血管新生の面から詳細に検討し、これまでのデータと合わせて最終的な報告をした。昨年度と同様にラットをランニングホイール付きケージで飼育し、自発運動トレーニングを開始した(運動群、5日間で400m以上走った動物を対象とした)。対照群の飼育ケージではホイールを固定し自発運動ができない状況とした。40日間の自発運動トレーニング後にラットの顎下腺を摘出し、解析に用いた。顎下腺のAQP1のmRNAおよびタンパク質の発現量は対照群に比べ運動群で有意に増加することが確認され、その発現は血管内皮細胞に局限していた。唾液腺の腺房を中心に発現するAQP5のmRNAおよびタンパク質の発現量は自発運動により変化しなかった。血管新生に重要なVEGFは唾液線の漿液細胞、導管、毛細血管に発現し、そのタンパク量は運動群で有意に増加した。さらに、血管内皮細胞のマーカーであるCD31の陽性細胞数は運動群の顎下腺で有意に増加した。また、唾液分泌刺激となるアセチルコリン受容体のM1およびM3ムスカリン受容体のmRNAの発現量は運動群と対照群で差はなかった。これら結果は、ラットでは長期間の自発運動により唾液腺での血管新生が誘導され毛細血管でのAQP1の発現量が増加することを示唆する。運動トレーニングによる唾液腺分泌機能の向上は毛細血管からの水の供給能力が亢進するためと考えられた。
アメーバ共生細菌プロトクラミジアアンキリンエフェクターの機能解析

以下の2点についてこれ迄に明らかにした。1.札幌の河川水より分離・株化したアメーバに共生する偏性細胞内寄生性細菌Protochlamydia R18株のドラフトゲノムを決定し、比較ゲノム解析より蛋白蛋白相互作用に深く関わるアンキリン(Ank)モチーフやロイシンリッチリピート(LRR)を持つ分子をコードする計38つの遺伝子を同定した。2.同定したAnkやLRRを持つ分子をコードする共生細菌の遺伝子がアメーバ内で実際に発現していることをRT-PCRにて確認した。現在、Protochlamydia R18ドラフトゲノム情報を基にカスタマイズしたDNAマイクロアレイを用いてアメーバ内での共生細菌の遺伝子発現変化の網羅的な解析を進めている。水系環境より難培養性細菌Protochlamydia (プロトクラミジア)R18が共生するアメーバ株を樹立した。一方、真核生物のさまざまな蛋白には約30残基のアンキリンリピートが存在し(Ank)、蛋白と蛋白の相互作用を担う。一部の細菌にも見られるが、レジオネラには菌体を細胞質から隔絶する小胞(LCM)の裏打ち構造に必須なユビキチンの集積を誘導するF-box領域を備えたユニークなAnkが存在する。この蛋白はレジオネラのアメーバのみならずヒトマクロファージ内での生存に必須である。興味深いことにゲノムがオープンになったアメーバ内に見いだされたProtochlamydia UWE25株にもF-box Ankが存在することが明らかされた(Science, 2004)。また我々が株化したProtochlamydia R18はアメーバ内でLCMを全く形成しなかった。F-box Ankが存在すると予想されるProtochlamydia R18は何故アメーバ内でLCMを形成しないのだろうか。我々は宿主が競合するレジオネラに対抗あるいはレジオネラと共存するためと仮説を立て検証する。まず次世代シークエンサーによりProtochlamydia R18のドラフトゲノムを得、そのゲノム解読から、ゲノムの特徴を明らかにするとともにAnkドメインを保有する機能蛋白つをコードする遺伝子の同定を行った。次世代シークエンサーにより、795本のコンディグを得た。予想されるゲノムサイズはProtochlamydia UWE25とほぼ同じサイズで2,999,361bpと予想された。またアメーバ内環境の最適化に必須なIIIならびにIV型分泌装置は保存されていた。Ankドメインを保有する機能蛋白をコードする8つの遺伝子を異なるコンディグ上に同定した。しかしながら一部の遺伝子の発現しか確認できなかった。研究計画では、以下の2つの点に焦点を絞り研究を実施する予定であった。1.独自に株化したアメーバ内に見いだされた難培養性共生細菌Protochlamydia R18のドラフトゲノムの決定。2.ドラフトゲノム解析よりAnkドメインを持つ機能蛋白をコードする遺伝子の同定しその発現を確認すること。その結果、次世代シークエンサーにより、795本のコンディグを得た。しかしながら一部(ank0317とank1707)の遺伝子の発現しか確認できなかった。これらの結果よりおおむね順調に進展していると自己評価した。Protochlamydia R18のドラフトゲノム解読から同定されたAnkドメインを保有する機能蛋白をコードする8つの遺伝子の中から発現が確認された遺伝子(ank0317とank1707)を、アメーバならびにヒト細胞に発現させ、レジオネラに対する抵抗獲得性について細胞・分子レベルにて明らかにしてゆきたい。補助事業を辞退するため
新バイオ資源フトモモ科メラルーカの有効利用

熱帯泥炭土壌は植物遺骸から出来ており、炭素の巨大な貯蔵庫となっている。しかし、泥炭土壌地域は水管理状態あるいは生態系の変化によって大きな炭素の発生源となることもある。これら熱帯泥炭湿地の多くは、1970年代に入り農地へと開発が進められた。しかし、これら開発地の多くは荒廃地として放置され、大きな炭素の発生源と変わっている。湛水状態、乾燥、酸性硫酸塩土壌、さらに野火の発生が多発しているこれら荒廃地にMelaleuca cajuputiがパイオニア的植物として二次林を形成している。泥炭荒廃地の持続的土地利用を目的に、極悪環境下に置いても十分成育出来るMelaleuca cajuputiの有効利用を目的に研究を行った。Meulaleuca cajuputiの生理・生態特性についての研究はほとんど見られない。そこで、強酸性硫酸塩土壌にMelaleuca cajuputiを造林し、現在の荒廃地を持続的な生態系として利用するための基礎研究を行った。湛水、乾燥条件下におけるMelaleuca cajuputiの成育特性の解析、造林するための基礎知見を得るためにアルミニウム耐性、湛水状態における根の生理特性、野火へのMelaleuca cajuputiの適応機構、炎と高温に対する種子の発芽能維持機構、造林時における植栽方法について調査、実験を行い、多くのMelaleuca cajuputiに対する基礎知見を得ることができた。さらに、Melaleuca cajuputiの生理特性に関する基礎研究を行った。現地で、樹木の水分ストレス状態、成育状態を連絡的に測定する事は非常に困難である。そこで、筆者らが開発した、樹木の直径変化測定装置を取り付け、現地で測定を行った。その結果、茎直径変化による水ストレス指標は、蒸散の低下や生長率、光合成の低下と関連づけられることが明らかになった。荒廃地を修復することを目的に、13種の有用樹木・果樹の光合成特性測定を行った。光強度を02000μmol/m^2/sec、二酸化炭素は350950ppmに変化させて測定を行った。その結果、Melaleuca cajupute, Acarcia mangium, Shorea roxburghir, Alstonia sphlata, Oil Palm, Para rubberの樹木の光合成特性が非常に高い事が明らかになった。Melaleuca cajuputeは湛水、乾燥、また野火の遭遇においても非常に強く生き残るでき、今後Melaleuca cajupute材の有効利用について、研究していく必要がある。タイ・ナラチワのBacho泥炭地域(酸性硫酸塩土壌)および泥炭地域の周りに発達している浜堤上に生育しているMelaleuca cajuputiの現存量の測定を行った。各地域で平均的な大きさのMelaleuca cajuputi 2本を選び、地上部(茎・枝および葉)、地下部(根)を採集し、各部位の乾物重の測定、および葉面積、地上部・地下部の形態測定を行った。

また、泥炭地域においては5mx5mのコドラート内の地上部を皆伐し、茎・枝および葉の乾物重および葉面積の調査を行った。Melaleuca cajuputiの体内水分状態および成長速度を測定するために、茎直径の連続測定を開始した。茎の直径は長野らによって開発された渦電流素子を用いて行っている。Melaleuca cajuputiの茎・幹直径変化の計測はタイの研究フィールドおよび東京農業大学のガラス室で栽培されているMelaleuca cajuputi(水耕栽培および土耕栽培)を用いて測定を行っている。現在準備を進めているが、各種水分ストレス状態におけるMelaleuca cajuputiの生理特性(蒸散・光合成特性)を測定するための準備を行っている。酸性硫酸塩土壌(ナラチワ・ナラチワ・To Daeng湿地)の荒廃地で、森林再生のための植栽試験を行った。この試験地は雨季に湛水するため、湛水ストレスを弱めるためにマウンドを作り、植栽試験を行った。次年度に植栽試験の結果を調査し、Al過剰を主とした土壌の強酸性化に伴うストレスと湛水ストレスを区別し、植栽樹種の酸性硫酸塩土壌への耐性を評価する予定である。1)ナラチワ県の泥炭湿地土壌、砂質土壌、酸性硫酸塩土壌の土壌水中のAl濃度を測定した。泥炭湿地と砂質土壌では10-30μMolAl、酸性硫酸塩土壌では0.2-7mMolAlであった。酸性硫酸塩土壌ではAl過多が植物の成育阻害要因となると考えられる.そこでMelaleuca cajuputiの適応機構を明らかにするために、Al耐性を水耕実験で調査した。8種について調査したが1mMolのAlに対して耐性を持つことが明らかになった.現在Alストレスへの耐性機構について研究を行っている.2)地域住民による泥炭湿地生態系への現時点での主要影響要因である野火と湿地の代表的二次林であるメラルーカの発達との関係性に焦点を絞り調査を行った.4年前に野火により焼失した二次林に固定調査枠を設定し、枠内に生育するすべての木本性植物の種名、樹高、生活形、樹形、位置、活力度について調査を行った。メラルーカに関しては、野火後の一斉発芽以後、わずかな萌芽樹を除いて、新たな発芽は皆無であった。3)メラルーカの生育特性を明らかにするために、現地で、メラルーカの光合成特性についての測定を行った。また、メラルーカの基礎的生理特性を得るために、温室で栽培している供試体を用いて、温度(10°C35°C)、光強度(02000μmol/m2/sec)、二酸化炭素濃度(0750ppm)による光合成特性の測定を行った.これら基礎データを用い、各気候帯におけるメラルーカ生物生産量の推定を行う予定である。メラルーカの物質生産と環境;Melaleuca cajuputiの物質生産と環境の関係を明らかにするために、タイ国ナラチワの泥炭湿地林に生育するM. cajuputiの光合成特性についての実験を行った。同時に泥炭湿地林に生育している各種樹木の光合成特性の測定を行った。
古人骨のライフヒストリー研究の新展開―未成年人骨の生物考古学の確立を目指して―

大阪府堺市に位置する堺環濠都市遺跡喜運寺墓地は、堺市立埋蔵文化財センターによる発掘調査が行われ、17世紀半ば19世紀の江戸時代人骨が出土した。これらの人骨は喜運寺墓地内の一角を子墓として分割されていた区域から出土したものである。本研究では、出土人骨の最小個体数と死亡年齢構成を復元し、骨病変の復元を行った。その結果、最小個体数は107体で、出生前後の個体が占める割合が高く、乳児には齲蝕を認めた。本研究では、未成年人骨の生物考古学的研究として、大阪府堺市堺環濠都市遺跡喜運寺墓地から出土した未成年人骨を調査した。出土人骨の個体数推定は、頭蓋、骨盤、四肢長骨でもっとも残存する部位を最小個体数としたが、左右残存する部位については標識再補法に基づき、最尤個体数(本来の母集団を形成する個体数)を推定した。次に、本研究では歯の形成や萌出、四肢長骨の骨端の癒合、骨計測値に基づいて死亡年齢推定を行った。全身の部位でもっとも残存する部位は側頭骨であった。右107個、左107個であり、最小個体数は107体であった。左右各107個のうち、対で出土しているのは87対であり、この値から最尤個体数を算出すると126136体(95%の信頼区間)であった。次に、側頭骨が残る107体のうち、歯や骨計測値から86体の死亡年齢の推定を行った。歯の残存しない個体については、側頭骨の計測値に基づいた回帰分析とベイズ推定から死亡年齢の推定を行った。その結果、出生前後の個体が占める割合が高く、埋葬人骨の95%以上が6歳以下であった。堺環濠都市遺跡から出土した江戸時代人骨の大部分は未成年であり、95%以上が6歳以下であった。この傾向は、既往の堺市内の近世墓地発掘調査事例も含めて、他の江戸時代の遺跡には認められないものである。例えば、17世紀後半の東京都の一橋高校地点遺跡から出土した人骨209体のうち、未成年は118体(56.5%)、5歳以下の個体は77体(36.8%)であった。すなわち、堺環濠都市遺跡(SKT871地点・喜運寺墓地)から出土した人骨の死亡年齢構成は、未成年、特に胎児や乳児の割合が高く、他の遺跡との違いは顕著であった。本研究では、未成年人骨の生物考古学的研究として、(1)大阪府堺市堺環濠都市遺跡喜運寺墓地から出土した未成年人骨を調査した。(2)次に、未成年人骨の死亡年齢推定法を考案した。側頭骨錐体から1ヶ月単位で死亡年齢が推定できることを明らかにした。現在、論文を準備中である。(3)東海市長光寺から出土した江戸時代の未成年人骨の整理と分析を行った。本研究は、生物考古学の新手法に基づき、大阪府堺市に位置する堺環濠都市遺跡喜運寺墓地から出土した江戸時代人骨を調査した。具体的には、1.古人骨の個体数推定に,生態学におけるPetersen/Lincolnの標識再捕法の応用を試み,最尤推定に基づく遺跡全体の個体数を算出した。2.未成年人骨の部位別の保存率を求め,個体数算出の基礎データとした。3.骨成長や歯の形成・萌出を手がかりに,未成年人骨の死亡年齢推定法の検証と新手法の開発を行った。

その結果、全身の部位でもっとも残存する部位は側頭骨であり、右107個、左107個、最小個体数は107体であった。左右各107個のうち、対で出土しているのは87対であり、この値から最尤個体数を算出すると126136体であった。次に、出土人骨の大部分は未成年であり、95%以上が6歳以下、その中でも出生前後の個体が占める割合が高かった。これは出生にともなう子どもの高い死亡率を裏付ける結果であった。この結果は、既往の堺市内の近世墓地発掘調査事例も含めて、他の江戸時代の遺跡には認められないものであった。例えば、17世紀後半の東京都の一橋高校地点遺跡から出土した人骨209体のうち、未成年は118体(56.5%)、5歳以下の個体は77体(36.8%)であった。19世紀の山梨県塩川遺跡は、出土人骨124体のうち未成年は28体(22.6%)、幼児以下は6体(9.6%)であった。喜運寺墓地から出土した人骨の死亡年齢構成は、未成年、特に胎児や乳児の割合が高く、他の遺跡との違いは顕著であった。以上、平成23年度の成果として、子どもの骨資料から過去の人類集団のライフヒストリーを復元し、これまでの人類学や考古学で焦点が当たらなかった子どもの死亡パターンについて新知見を得ることができた。古人骨は古代に生きた人々の体そのものであり,容貌,身長,性別,死亡年齢,出自,由来,生活痕とともに,時には骨に残る病気など,古代人の生老病死の様子を物語る。鎌倉市に所在する遺跡からは,これまでに数千を超える中世人骨が発掘された。特に,由比ヶ浜海岸に面し,旧市街のほぼ中央を南北に流れる滑川から西の由比ヶ浜地域は,中世には前浜といわれ,古くから人骨が出土することで知られた地域である。本研究では,聖マリアンナ医科大学に所蔵の中世人骨を資料にし,死亡年齢構成,骨病変,形態の分析を行った。結果,中世鎌倉人は日本列島の人類集団の中でもっとも短命傾向が強く,特殊所見として刀創を認めた。また,頭蓋形態は長頭で低身長も中世人の特徴である。本研究の所見は,近隣の中世遺跡から出土した人骨の所見と共通しており,中世鎌倉の都市化による生活状況の悪化を原因と想定して矛盾はない。生物考古学環濠都市から出土した江戸時代人骨に関する古人口学的研究に区切りをつけることができた。また、齲蝕などの古病理学的なデータも収集した。研究の過程において、未成年人骨の年齢推定に関わる新知見が得られ、その結果を法医学の雑誌に発表した。堺環濠都市から出土した江戸時代人骨に関する古人口学的研究に区切りをつけることができ、未成年人骨の年齢推定に関わる新知見が得られたが、長光寺の人骨の整理と分析は終了していない。堺環濠都市から出土した江戸時代人骨の研究を一段落させ、論文として成果をまとめることができた。2012年5月には日本考古学協会においてその成果を発表する予定である。また、本研究に付随し、最尤個体数や年齢推定における新手法を未成年人骨の研究に応用することができた。この手法により、次年度以降の研究を飛躍的に発展させることができると思われた。後は、未成年人骨の齲蝕に関わるデータの解析を終わらせ、国際誌に論文を投稿する予定である。また、愛知県東海市から出土した未成年人骨の分析に着手する。今後は、未成年人骨の死亡年齢推定法に関わるデータの解析を終わらせ、国際誌に論文を投稿する予定である。東海市長光寺から出土した未成年人骨の整理を行い、古人口学的研究をすすめたい。また、胎児人骨の年齢推定法に関わる論文を執筆する。研究手法と資料の両面から未成年人骨の生物考古学の発展に新しいアプローチを試みたい。本年度の助成金を次年度に繰り越したのは、堺環濠都市遺跡出土人骨の研究が早めに目処がついたためである。その分、次年度に論文執筆などの成果発表を行い、同時に東海市出土人骨の資料整理を通して研究の発展を目指したい。