hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織培養による重金属のヒト気道に及ぼす影響に関する研究

気道組織とクロムなどの重金属の反応機序を、よりin vivoに近い反応条件下でin vitroでの解析を行うために、組織培養を用いて気道組織の気道内腔面側にのみ重金属を反応させる実験系を確立することを目的として以下の検討を行った。5週齢のハ-トレ-系モルモットをネンブタ-ル麻酔下に開腹し、腹部大動脈を切断、失血死させ、鼻中隔粘膜と気管を採取した。各々の組織の小片を線毛上皮面が上になるように、その反対側をデイッシュ内に作製したコラ-ゲン・ゲル・マトリックス(Cellmatrix^<(R)>TypeI-A)上に接着させ、37°C、5%CO_2の条件で培養した。培養液としてはPenicillin-G(200unit/ml)、Streptomycin sulfate(200μg/ml)が含まれた10%FBS添加Eagle's MEM液を使用した。コラ-ゲン・ゲル・マトリックスの再構成用緩衝液として2.2%NaHCO_3および200mM HEPESを含む0.05N NaOH溶液を使用したものをI群、200mM HEPESを含む0.08N NaOH溶液を使用したものをII群として、両群のコラ-ゲン・ゲル上培養の経過を検討した。培養後の組織の接着はI群での培養の方が良好であった。組織よりの線毛上皮細胞やfibroblastのコラ-ゲン・ゲルへの遊出・定着は鼻粘膜ではI群で培養3日目で著明となり、8日目では組織全周に認められたが、II群では8日目でも部分的に認められるのみであった。両群とも遊出した線毛上皮細胞や組織辺縁に活発な線毛運動が観察された。これらの線毛打数を培養経過にしたがって測定した。気管では線毛上皮細胞やfibroblastの遊出、定着が培養5日目にI群で組織全周に認められたが、II群では8日目でも認められなかった。培養経過中の培養組織の病理組織変化に関しては現在詳細に検討中であるが、I群のコラ-ゲン・ゲル上組織培養法により目的とした気道組織と重金属との反応の実験系ができると考える。今後、この実験系により重金属との反応機序の解析、ヒト組織を用いた検討を行う。重金属を負荷する実験の前段階として,手術時に採取されたヒトの下鼻甲介粘膜を組織培養し,組織片およびその線毛細胞・線毛機能の変化を検討した。ヒト下鼻甲介粘膜の組織片をCO_2インキュベータ内で培養し,その経時的変化,また培養液,温度やPHによる影響の検討を行った。培養液中に約12mm^3の組織片をおくと,fibroblastとともに組織片の周囲に線毛細胞が遊出する。この期間は培養液の種類により異なり,F-10培地よりもCMRL培地での遊出の方が早期であった。CMRL培地(含Pc100unite/ml)では培養後2週間頃より組織片から線毛細胞の遊出が始まり,単一線毛細胞の線毛打数測定が26週間可能であった。なお,組織片がディシュ内に定着するのに47日間かかった。現在,この培養組織片を病理織織学的に検討中であるが,安定した培養条件下で重金属を負荷して,その反応を検討するためには512日間位の範囲で実験する必要があると考える。組織片より遊出し,ディシュに定着した線毛細胞の線毛打の方向は遊出初期はもとの組織片に向うメタクローナルウェーブを示すが,次第に各細胞が離れて方向性が不定になる。もとの組織片に近位のものは線毛打数が多く,そのバラツキも少ないが,遠位のものは打数が減少してバラツキも大きくなる。温度変化による影響では28°Cから38°Cまでは温度が上昇すると線毛打数も増加するが,43°Cでは全例停止する。これは温度を下げても不可能性の変化であった。測定器内のCO_2濃度を制御してpHを変化させ,線毛打数の変化をみるとpHを下げるに従って打数は減少し,pH6.4では約40%が停止または測定不能となった。したがって,ヒト下鼻甲介粘膜に重金属負荷を与えて線毛打数の変化を検討する際には,以上の結果をふまえて,一定の培養液,温度,pH下で行う必要がある。上述したControl studyのデータを基にして重金属との反応機序を今後検討する。

コラ-ゲン・ゲル・マトリックスの再構成用緩衝液として2.2%NaHCO_3および200mM HEPESを含む0.05N NaOH溶液を使用したものをI群、200mM HEPESを含む0.08N NaOH溶液を使用したものをII群として、両群のコラ-ゲン・ゲル上培養の経過を検討した。培養後の組織の接着はI群での培養の方が良好であった。組織よりの線毛上皮細胞やfibroblastのコラ-ゲン・ゲルへの遊出・定着は鼻粘膜ではI群で培養3日目で著明となり、8日目では組織全周に認められたが、II群では8日目でも部分的に認められるのみであった。両群とも遊出した線毛上皮細胞や組織辺縁に活発な線毛運動が観察された。これらの線毛打数を培養経過にしたがって測定した。気管では線毛上皮細胞やfibroblastの遊出、定着が培養5日目にI群で組織全周に認められたが、II群では8日目でも認められなかった。培養経過中の培養組織の病理組織変化に関しては現在詳細に検討中であるが、I群のコラ-ゲン・ゲル上組織培養法により目的とした気道組織と重金属との反応の実験系ができると考える。今後、この実験系により重金属との反応機序の解析、ヒト組織を用いた検討を行う。
データ主導アプローチによる脳神経細胞の周期的同期発火現象の生理／数理的モデリング

イメージングデータの事前処理として,画像強度の不均性やモーションアーチファクトなどの実用的な補正方法の開発を行った。そして,イメージングデータの分散や時間依存相互相関などの統計量マップを用いて脳幹内の呼吸活動生成部位におけるニューロンとアストロサイトを効率的に識別する方法を確立した。生理学的には遅い周期で活動し,ニューロンネットワークと弱く結合するアストロサイトネットワークの存在を示唆する結果や,呼吸バースト毎に活性化するニューロンの組み合わせが異なるという知見を得ることが出来,今後のニューロンネットワークの数理モデリング研究に新たなパラダイムをもたらす可能性のある成果を得ることが出来た。本年度、モデリンググループにおいてはカルシウムイメージングデータの基本的特性の調査とデータの事前処理の検討を行った。イメージングデータの計測においては左上のピクセルから順にメモリーに取り込むため、同一のtime frameであっても最大でサンプリング周期分だけの時間差が生じることや、レーザー走査法にも複数の方法があり、データの取り込みにおいてもS/N比の向上のため数種類の方法で信号の積算や平均加算を行うことが計測システムの分析で判明した。ピクセル間に時間差を残したままでは、相互相関や因果性の解析は行えないので時間差を補正する線形補間アルゴリズムやカルマンフィルターによる平滑補完法を開発した。そして、シミュレーションによりサンプリング間隔と補完性能の関係を調べ、時間差補正の必要性を示した。また、イメージングデータからニューロンとアストロサイトに相当する部位を検出する必要があるので、信号の分散値の空間マップからニューロンとアストロサイトに相当するピーク検出を行うアルゴリズムを開発した。微分法による検出法、ガウス関数のフィッティングによる方法を検討し、計算コストと検出性能について調べ、実データへの適用を行った。実験計測グループではラット脳幹の呼吸活動を計測するために、なるべく少ない積算や平均加算で計測ができるよう適切なサンプルの作成方法、計測装置のパラメーターの組み合わせの検討を行い、安定してデータ計測をおこなえる環境の整備を行った。本年度は、ニューロンとアストロサイトの活動を区別して計測することができるGFAP-GFPマウスを用いてカルシウムイメージング法により多数のニューロンとアストロサイトの活動を同時計測を行ない、一部のアストロサイトが呼吸に同期した活動を呈することを観察した。GFAP蛍光画像よりアストロサイトの部位を特定することができ、舌下神経根からのシグナル時系列とカルシウムイメージングの相互相関解析により呼吸活動に関係するニューロンとアストロサイトを検出することができる。そして、GFAP蛍光画像と相関マップの差分から呼吸に関係するニューロンを検出することができる。しかし、これらの解析には複数のアプローチがあり、最適な方法を模索する必要があった。また、GFAP蛍光画像と相関マップからニューロン、アストロサイトを検出するための二値化法として濃度ヒストグラムの勾配に基づく方法、2グループ間の分散を用いる判別分析法などを検討し、閾値決定の半自動化方法を開発した。脳幹内の呼吸活動生成部位の1つであるPreBötCにおけるニューロンとアストロサイトの識別においては, Oragon green BAPTA-1 (OGB-1)蛍光ライブイメージングデータの分散マップと時間依存相互相関マップ,アストロサイトに特異的に発現させたEGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)あるいはRFP (Red Fluorescent Protein)イメージの強度マップを用いたアストロサイトと吸息性ニューロンを検出する方法を提案した。そして,ニューロンネットワークの活動周期に比べて遅い周期で活動し、ニューロンネットワークと弱くカップリングするアストロサイトネットワークの存在を示唆する結果を得られた。ニューロンネットワークの詳細な研究において,呼吸バースト毎に活性化するニューロンの組み合わせが異なり,また,各々のニューロンのオンセット,オフセット時刻も異なることが見いだされた。これは,定常なニューロンネットワークは存在せず,従来の周期論的な概念に基づくネットワークのモデリングでは対応できないことを示す重要な発見である。26年度が最終年度であるため、記入しない。情報量統計学26年度が最終年度であるため、記入しない。計測システムのパラメーターや特性について仕様書に記載されていない情報が必要となりメーカーのドイツ本社への問い合わせなどに多くの時間を費やす必要があり、実験計測のスケジュールに遅れが生じたため。データ解析においてはデータの事前処理に時間差補正など当初の計画外のプロセスが必要なことが判明したため。本年の研究において時系列解析のアプローチによるモデリングやパラメーター推定の研究の前に、GFAP蛍光画像と相関マップの画像解析(二値化法)において解決すべき問題がいくつか見つかり、それらの解決方法を検討する必要があったため。カルシウムイメージングによって計測されるニューロンやアストロサイトの活動の物理的特性を明らかに,各々の活動と相互作用を考慮に入れ,より現実に近いニューロンネットワークモデルを構築する。そして,ニューロンとアストロサイトの集団的活動と大域的な活動の対応をつける。実験グループにおいては,自発的周期性活動と外部から様々な点に対して網羅的に与えた電気刺激に対する応答を計測する。カルシウムイメージングでは,ニューロンを取り巻くアストロサイトの活動も計測し,ニューロン-アストロサイト間の相互作用の情報を検出する。

これまで計測されたカルシウムイメージングデータにおいて、複数のニューロンとアストロサイトの相関関係と動力学的な因果関係を調べる。そして、階層神経モデルにおいてデータから推定可能なパラメーターを特定し、推定可能な部分においてモデルの同定を試みる。推定が困難な部分については適切なノンパラメトリック関数で置換する。実験においては。ニューロンとアストロサイトの間の情報伝達機構を解析するために、ニューロンとアストロサイトとは、トランスミッターを介して情報のやり取りをしているとの仮説に基づき、各種トランスミッター受容体の特異的な阻害剤を用いた薬理実験を行い、呼吸ニューロン、呼吸出力への影響を解析する。26年度が最終年度であるため、記入しない。データ解析用ワークステーション、実験動物の購、カルシウム指示薬等の購入、データ解析ソフトの更新のライセンス料、学術論文の出版費用、学会参加や研究打ち合わせのための旅費の支出を予定している。実験動物の調達などに遅れがあり年度内に終了しなかった実験を翌年度に行うために、実験動物や薬品類を購入するために予算を確保する必要があったため。イメージングデータ解析とモデリングの研究計画とリンクするように、実験のスケジュールを決めて適切に予算の執行を行う。
博物学の中の文学―経験的事実と文学の関係

本研究は17世紀から19世紀までの博物学者の著作における文学的要素が果たした意義について、通時的分析を行うことを目的とする。平成30年度は、Gilbert WhiteのThe Natural History and Antiquities of Selborneが採る書簡体形式が、植物と動物、生物と人間などを繋ぐネットワーク的想像力の発露の場として適切なものであったことを明らかにした。イギリスでは、大英図書館と王立協会の図書館で18世紀の書簡体の流行とその社会的・文化的影響、自然哲学研究における書簡体の位置づけに関する資料を収集した。調査の結果、博物学の専門書において書簡体形式の採用が非常に特殊なことであることがわかった。そこで、Whiteの他の著作物および伝記や手紙を調べたところ、Whiteの書簡体に対するこだわりが浮かび上がった。更に、18世紀イギリスの郵便事情や、手紙のマニュアル、手紙がもたらした社会的・文化的変化について調べた。また、Whiteの論文が掲載された王立協会のPhilosophical Transactionsでの書簡体形式の論文の受容状況やその特徴について資料を調査した。書簡体をめぐる18世紀の社会、文化および自然科学界の文脈を辿った結果、他人や社会、専門家集団などとの繋がりに書簡体の価値が見出されていたのはもちろんのこと、当該作品は種類の異なる話題や議論を包含する書簡体という柔軟性のある媒体によって、複数の観察報告がゆるやかな繋がりを持つような効果を上げることに成功していることが明らかになった。書簡体形式がもたらすゆるやかなつながりが、この作品を現代のエコロジー概念に近づけていることがわかった。また、Whiteが執着した書簡体形式は、図鑑的に博物学誌を書く18世紀の博物学研究の主流に対するカウンター・ナラティブとしてもとらえられるという考察に至った。平成30年度の研究に関しては、概ね計画通りに進めることができた。しかし、未完となっている平成29年度の研究として挙げていたJohn Rayの作品分析をGilbert Whiteへと繋がる博物学者の系譜の中に取り入れた形で研究を進めることができなかったため、このような進捗状況と判断した。平成31年度は、Charles KingsleyとPhilip Henry Gosseの博物学の著作分析を中心に研究を進めてゆく予定である。近代科学が勃興し、博物学が動物学や生物学へと高度化してゆく流れの中で、科学ナラティブとは異なる文学的表現を用い、想像力をも介入させた分析を行うことの意味を考察する予定である。その際に、Kingsleyが創設した自然科学と文学と芸術の発展のためのイギリスのChester Societyを訪れ、Kingsleyに関する資料を収集する予定である。また、平成31年度は、本研究の最終年度となるため、平成29年度からスタートしたイギリスの博物学における文学的想像力と経験的事実の関係についての研究のまとめとして、17世紀のJohn Rayから19世紀のKingsleyとGosseに至る博物学者の系譜を意識した考察を行いたい。本研究は、17世紀から19世紀までの博物学者の著作における文学的要素が果たした役割とその意義について、通時的分析を行うことを目的とする。平成29年度は、資料の分析を中心的に行った。主にJohn Rayに着目し、はじめにThe Wisdom of God Manifested in the Works of the Creation、次にObservations in the Low Countries and Catalogue of Plants Not Native to Englandを精読し、文学的表現とみられる部分を抽出し、分析した。The Wisdom of Godでは、比喩表現を使う際と、自然を創り上げた神の御業やその叡智に言及する際に、文学的な要素が見られた。17世紀科学革命以降、人間による自然の資源の利用が積極的に行われるようになっていったが、そのような自然の搾取に繋がる行為に関しては、「大工」の譬えを使って説明を行っている。「大工」の譬えの使用は、同時代を代表する実験派の学者であるRobert Boyleにも共通することであることがわかった。しかしながらスペインでは、「大工」という職業がヨゼフ崇拝に結びつき、ヨゼフ表象が植民地開拓などにも積極的に利用されていたのに対し、イギリス17世紀の自然に関する研究においては、両国の宗教的な違いもあり、表象への広がりは全く見られないことが判明した。このため、文学的表現の利用という観点に加え、表象の忌避という点から、Thomas SpratのHistory of the Royal Societyなど他の関連資料の考察を行った。これらの資料からは、自然の仕組みやその構成要素を詳らかにする際には文学的な表現は避けられ、文学的表現の不使用は、自然に関する学問の発展に結びつけられていることが明らかになった。海外での資料調査を予定していたが、時間が取れず断念した。また、17世紀に至るまでの科学史を把握し、王立協会メンバーの研究動向をおさえることにかなりの時間がかかったため、収集した資料の分析に取り掛かるのが遅くなった。Rayの著作に立ち戻り、分析結果をまとめるところまで至らなかったため、このような進捗状況と判断した。

そこで、Whiteの他の著作物および伝記や手紙を調べたところ、Whiteの書簡体に対するこだわりが浮かび上がった。更に、18世紀イギリスの郵便事情や、手紙のマニュアル、手紙がもたらした社会的・文化的変化について調べた。また、Whiteの論文が掲載された王立協会のPhilosophical Transactionsでの書簡体形式の論文の受容状況やその特徴について資料を調査した。書簡体をめぐる18世紀の社会、文化および自然科学界の文脈を辿った結果、他人や社会、専門家集団などとの繋がりに書簡体の価値が見出されていたのはもちろんのこと、当該作品は種類の異なる話題や議論を包含する書簡体という柔軟性のある媒体によって、複数の観察報告がゆるやかな繋がりを持つような効果を上げることに成功していることが明らかになった。書簡体形式がもたらすゆるやかなつながりが、この作品を現代のエコロジー概念に近づけていることがわかった。また、Whiteが執着した書簡体形式は、図鑑的に博物学誌を書く18世紀の博物学研究の主流に対するカウンター・ナラティブとしてもとらえられるという考察に至った。平成30年度の研究に関しては、概ね計画通りに進めることができた。しかし、未完となっている平成29年度の研究として挙げていたJohn Rayの作品分析をGilbert Whiteへと繋がる博物学者の系譜の中に取り入れた形で研究を進めることができなかったため、このような進捗状況と判断した。平成29年度に予定していた海外での資料収集を平成30年度に行い、引き続きRayの博物学研究の中の文学的表現の分析のまとめを行いたい。また、平成30年度に中心的に研究する予定のGilbert WhiteおよびErasmus Darwinに関する資料収集も行い、博物学における文学的表現の復活の背景を探る予定である。本研究は通時的な分析を中心とするものであるため、ある程度、時代を跨いでの考察が必要となる。平成30、31年度の両年度で扱う18、19世紀の博物学の著作の分析によって、17世紀の文学的表現回避の先鋭化の意味が明らかになる部分があると予想されるため、研究を形にする作業は期間の後半になる予定である。平成31年度は、Charles KingsleyとPhilip Henry Gosseの博物学の著作分析を中心に研究を進めてゆく予定である。近代科学が勃興し、博物学が動物学や生物学へと高度化してゆく流れの中で、科学ナラティブとは異なる文学的表現を用い、想像力をも介入させた分析を行うことの意味を考察する予定である。その際に、Kingsleyが創設した自然科学と文学と芸術の発展のためのイギリスのChester Societyを訪れ、Kingsleyに関する資料を収集する予定である。
ハイブリッドゲルによる新規陰イオン吸着剤の開発

剥離させた層状複水酸化物(LDH)を孤立したナノプレート状態で、アガロースゲル内に均一に分散させたハイブリッドゲルを合成し、陰イオン吸着特性を検討した。粉体でのLDHと比較して、外表面が増加したことによる特殊な吸着はみられなかったが、未乾燥ゲルでも乾燥ゲルでもハイブリッドゲル内のLDHへのアクセスは良好であることがわかった。また、酸濃度をコントロールしての再生処理では、結晶性の低いLDHほど酸による溶解損失が多くなることが分かった。高分子ゲルー層状複水酸化物複合体の陰イオン吸着剤・繰返し使用を想定して、層状複水酸化物(LDH)での繰返し処理検討を行った。まず、炭酸イオンを含有する炭酸型LDHを合成し、脱炭酸と同時に目的イオン(本検討では塩化物イオン)と交換する方法で処理した。得られたLDHを、炭酸ナトリウム水溶液で処理して塩化物イオンを炭酸イオンで交換して脱着し、その後、上記の脱炭酸の方法で再び塩化物イオンを含有させるという処理を繰り返した。脱炭酸処理には、酢酸緩衝液にNaClを加えた水溶液(A液)とHCl水溶液をエタノールで希釈した液(B液)を用いて比較した。高結晶性炭酸型LDHで、かつ酸の量が適正範囲であれば、酸による溶解減量はほぼなく、炭酸イオンから塩化物イオンへの100%近い交換が報告されているが、低結晶性LDHが用いられる状況も想定されることから、結晶性による相違を比較した。低結晶LDHでは脱炭酸処理において、プロトンがLDHの金属水酸化物層を溶解させる反応に、高結晶性LDHと比べてより多く使われ、その分、炭酸イオンを二酸化炭素ガスとして系外に追い出す脱炭酸効率が落ち、結果として塩化物イオンへの交換率とLDHの回収率が低下する傾向がみられた。繰返し交換全体においては、B液のほうが、低結晶LDHに適していることも示唆された。また、アガロースーLDHナノコンポジットのハイブリッドゲルを乾燥させてからの復水再生検討も行った。大気中で風乾後、風乾物または様々に復水させたものを、硫酸イオンの吸着を行って、ゲル状態のままのものと比較し、その性能を評価した。いずれも、元の乾燥前状態での単位重量当たりの吸着量で比較すると、吸着量が1/5から1/3となっており、単純な風乾では吸着能力の低下があることが分かった。しかし、風乾で大幅に重量を減少できるメリットはあった。以上、吸着剤応用に資する有益な知見を得た。剥離させた層状複水酸化物(LDH)をナノプレート状態でマトリックスに分散・固定するため、LDHコロイドを高分子ヒドロゲルであるアガロースゲルと液状物状態を経由して複合し、ハイブリッドゲルを作製した。ハイブリッドゲルは、初期においては、最短辺が10mm以下になるように切断していたが、専用の治具を作製してからは、各辺が約3mmの立方体になるように切断してから用いた。ハイブリッドゲルでの陰イオン吸着量は、粉体のLDHと同様、24h以内には、ほぼ平衡に達して一定値となった。この結果より、吸着検討は24hを目安にして検討することとした。まず、5mMのNa2SO4溶液に硝酸を加えて、初期pHを2から6の間で調整し、Mg-Al系LDHとZn-Al系LDHを用いたハイブリッドゲルで耐酸性を検討した。バッチ式での吸着実験においては、LDHのバッファー効果によってpHが上昇する。より高いpHで溶解するMg-Al系LDHのハイブリッドゲルにおいても適当な条件では、多少の酸が加わっても十分に吸着を示すことが分かった。陰イオン間の相違の検討では、ハイブリッドゲルにおいてもイオン間の吸着のしやすさは粉体の場合と同じであった。さらに、Mg-Al系LDHでのハイブリッドゲルにおいて、LDH含有量を変化させて、吸着性能を検討した。LDH含有量が低いと吸着量能力が低かったが、乾燥状態の重量比でLDHとアガロースが1:1前後では、粉体のLDHとLDH換算では、ほぼ同等な吸着能を示すようになることが分かった。以上より、粉体との比較において著しい吸着能力向上はみられていないが、高分子ゲルは成形やハンドリング等において興味深く、バインダーとしての特性は良好であるこが分かったので、バインダーとしての観点からの検討を中心に進めていくこととした。アガロースゲルー層状複水酸化物(LDH)複合体を乾燥させて、LDHに入れた陰イオンの徐放性を検討した。調整してすぐの未乾燥の複合体ゲル(ハイブリッドゲル)と比較して、風乾した場合は吸着能力が著しく低下することが分かっていた。これは、空気中のCO2が水を介して炭酸イオンとなり、LDH内の陰イオンと交換してしまうためであったと推察された。適当な結晶度のLDHにおいては、アガロースゲルに複合しても、真空乾燥や110°Cでの乾燥(空気中)であれば、吸着能力の低下はほぼ起きないことを検討により見出した。

徐放においても乾燥過程で炭酸イオンが混入すれば、LDHに保持していた目的陰イオンが遊離してしまうので、110°Cで乾燥を行った。未乾燥ゲルの状態で、十分にSO42-、HPO42-、NO3-を複合体内のLDHに含有させてから(初期LDHは塩化物イオン含有型)乾燥させ、0.075M Na2CO3あるいは0.15M NaCl水溶液中で徐放性を検討した。ハイブリッドゲル乾燥物は、対応するLDH粉体と比較したが、徐放する速度に顕著な差はなかった。しかし、逆に、上の結果は、複合体ゲル乾燥物内へアクセスは阻害が小さいことを意味しており、アガロースは吸着剤バインダーとして有効である可能性を示している。実際に、アガロースゲルーLDH複合ゲルの乾燥体(真空乾燥物)を用いて、B(OH)4-、F-、NO3-の吸着除去を検討したところ、いずれも水質汚濁法での基準値以下まで処理水の濃度を下げる能力を示した。以上、全研究期間を通じて、未乾燥ゲルでも乾燥ゲルでもハイブリッドゲル内のLDHへのアクセスは良好であることが分かった。また、最後に、アガロース溶液にLDHが懸濁した液状物をポリウレタンのスポンジに含浸させた後、冷却して固化させたユニークな複合体を作製することにも成功した。化学吸着剤としての再生・繰返し使用を想定した検討では、LDHにおいて目的陰イオンの吸着と脱着の繰返し処理を行った。塩化物イオンをLDHから炭酸イオンで脱着する処理と、逆に酸を用いた脱炭酸反応経由で塩化物イオンを再挿入する処理を繰返した。結晶性の相違による反応性の違いを明らかにし、応用に資する有益な知見を得た。また、アガロースーLDHナノコンポジットゲルを乾燥させてから用いる検討を行い、その吸着能力の性状を把握した。以上の通り、当初の計画に沿って順調に進展している。ハイブリッドゲルの吸着特性について、当初の計画において必要な検討は完了した。すなわち、モデル的な陰イオンおよびイオン径の大きな陰イオンであるヨウ化物イオンを用いて、粉体のLDHとハイブリッドゲルにおける吸着性能を比較検討し、かつ、ハイブリッドゲルにおけるLDH含有量を変化させての検討で、ハイブリッドゲルの吸着剤としての特性を把握することができた。また、Mg-Al系LDHとZn-Al系LDHを用いたハイブリッドゲルでの検討も計画通り行い、一定の成果を得た。平成26年度は、当初の予定にあった(1)乾燥させたハイブリッドゲルの徐放性の検討と(2)ハイブリッドゲルの機械的強度向上の検討を行う。(1)では、LDHナノプレートを用いたナノコンポジットのハイブリッドゲルまたはそれに準じた複合材で、徐放性の検討を行う。高分子ゲルをLDHのバインダーとして利用するという観点から、平成25年度のハイブリッドゲルの乾燥・復水再生利用の検討と関連付けながら検討を進める。(2)では、アガロース以外の高分子若しくは多孔体について、アガロースとの混合利用などを検討する。また、最終年度であるので、状況に応じて全体を補足する検討も適宜行う。平成25年度は、高分子ゲルをバインダーとして利用する観点から、当初予定の(1)吸着剤としての繰返し使用の検討と(2)層状複水酸化物ー高分子ゲル複合体であるハイブリッドトゲル乾燥物の水での膨潤再生の検討を行う。
可視光の不規則照射による紫外線応答類似反応の誘導

1.紫外線による形態異常が発生する植物の生理的条件と環境条件: 1ブロッコリ`ピクセル',`ハイツ',`ドシコ',キャベツ`サクセション',コールラビ'アスルスター'を白色LED下で4週間育苗した後に,太陽光下に6時間静置したところ,ブロッコリ'ピクセル'に葉焼けが発生した.このときのUV-B強度は0.6-1.6W/m2であった.2UV-B光源を用いて,葉への障害の発生条件について検討した.UV-Bの強さは0.3ー1W/m2の範囲で検討した.苗の育苗時のストレス条件により,葉に障害が発生するUV-B強度が異なるようであった.全くストレスが加わらない白色LEDのみによる育苗では,0.3W/m2の3時間照射で葉の褐変などの傷害が発生した.また,傷害は若い葉ほど発生が少なかった.播種3週間後と4週間後の本葉の抽出液の吸光度を調べたところ、葉中のフェノール物質の蓄積量が齢と共に低下することが明らかとなった.3単独の照射と比較して、UV-Bに白色光を組み合わせた照射で葉焼けの程度が有意に低く抑えられた.また,暗期明け直後と日中の照射を比較したところ,暗期明け直後に傷害が強く発生し,これには葉の就眠運動が関係していることが推察された.2.紫外線照射によるROS発生の定量: ROSの検出のため蛍光色素を用いた実験系の各種条件を設定した.3.各種紫外線LEDを用いて波長特異性の解明:1各種紫外線の照射装置として,太陽光と同等の光強度で照射が可能な310nmと340nmのLED照射装置を開発した.これらは,カブの芽生えへの照射実験により効果を検証中である.2遺伝子発現解析により,これまでのところ,UV-Aの照射によりROSシグナル伝達系と関係のある一酸化窒素が応答に関わっていることが明らかになった.今年度は,主に実験系の確立を目指し,紫外線が葉に傷害を与える条件をほぼ確定することができた.また,紫外線を照射する各種の装置を開発し,試験運転をしているところである.また白色光をプロジェクタを用いて変則照射するための装置も完成している.これらにより,各種データは取れ始めているのでこれらの実験に関しては順調にすすんでいる.とくに弱い各種のストレスによって紫外線に対する耐性が高まっていることが示唆されるデータも得られている.一方活性酸素の測定方法については,今のところ十分な感度を得られておらず,改良がまだ必要である.これまでに確立した紫外線による傷害が発生する条件において,生理学的な変化を調べるとともに遺伝子発現解析を行う.それと同時にプロジェクタをもちいた可視光の変則照射実験を行い,紫外線応答との比較を行う.活性酸素の測定については,さらにプロトコールを見直し,正確な定量が可能となるよう実験を継続する.1.紫外線による形態異常が発生する植物の生理的条件と環境条件: 1ブロッコリ`ピクセル',`ハイツ',`ドシコ',キャベツ`サクセション',コールラビ'アスルスター'を白色LED下で4週間育苗した後に,太陽光下に6時間静置したところ,ブロッコリ'ピクセル'に葉焼けが発生した.このときのUV-B強度は0.6-1.6W/m2であった.2UV-B光源を用いて,葉への障害の発生条件について検討した.UV-Bの強さは0.3ー1W/m2の範囲で検討した.苗の育苗時のストレス条件により,葉に障害が発生するUV-B強度が異なるようであった.全くストレスが加わらない白色LEDのみによる育苗では,0.3W/m2の3時間照射で葉の褐変などの傷害が発生した.また,傷害は若い葉ほど発生が少なかった.播種3週間後と4週間後の本葉の抽出液の吸光度を調べたところ、葉中のフェノール物質の蓄積量が齢と共に低下することが明らかとなった.3単独の照射と比較して、UV-Bに白色光を組み合わせた照射で葉焼けの程度が有意に低く抑えられた.また,暗期明け直後と日中の照射を比較したところ,暗期明け直後に傷害が強く発生し,これには葉の就眠運動が関係していることが推察された.2.紫外線照射によるROS発生の定量: ROSの検出のため蛍光色素を用いた実験系の各種条件を設定した.3.各種紫外線LEDを用いて波長特異性の解明:1各種紫外線の照射装置として,太陽光と同等の光強度で照射が可能な310nmと340nmのLED照射装置を開発した.これらは,カブの芽生えへの照射実験により効果を検証中である.2遺伝子発現解析により,これまでのところ,UV-Aの照射によりROSシグナル伝達系と関係のある一酸化窒素が応答に関わっていることが明らかになった.今年度は,主に実験系の確立を目指し,紫外線が葉に傷害を与える条件をほぼ確定することができた.また,紫外線を照射する各種の装置を開発し,試験運転をしているところである.また白色光をプロジェクタを用いて変則照射するための装置も完成している.これらにより,各種データは取れ始めているのでこれらの実験に関しては順調にすすんでいる.とくに弱い各種のストレスによって紫外線に対する耐性が高まっていることが示唆されるデータも得られている.一方活性酸素の測定方法については,今のところ十分な感度を得られておらず,改良がまだ必要である.

これまでに確立した紫外線による傷害が発生する条件において,生理学的な変化を調べるとともに遺伝子発現解析を行う.それと同時にプロジェクタをもちいた可視光の変則照射実験を行い,紫外線応答との比較を行う.活性酸素の測定については,さらにプロトコールを見直し,正確な定量が可能となるよう実験を継続する.
アデノシンA2a受容体ノックアウトによるα-シヌクレイン神経毒性緩和機序の解明

パーキンソン病は病理学的に黒質線条体系のドパミン神経細胞の脱落と神経細胞内におけるα-シヌクレイン凝集体の形成によって特徴付けられる。マウスにおいてアデノシンA2a受容体の発現を欠損させることにより、α-シヌクレインによって惹起されるドパミン神経細胞の脱落が抑制されることが報告されている。本研究課題では、パーキンソン病治療におけるアデノシンA2a受容体抑制の神経保護作用を明らかにすることを目的とした。具体的には、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウス脳の中脳黒質にアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いてα-シヌクレインを発現させることにより、α-シヌクレインによって惹起されるドパミン神経細胞変性、α-シヌクレイン凝集体形成および炎症細胞の集簇に対するアデノシンA2a受容体抑制の効果を解析することを目的とした。はじめに、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスをC57BL/6系統のマウスと交配を繰り返し、コントロールの野生型マウスと系統を揃えた。並行して、より目的遺伝子の高発現を実現させるため、アデノ随伴ウイルスを血清型9に変換する作業を行った。作製したAAVをアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスおよびコントロールマウスに接種し、接種後2、4、8週間後、脳を採取した。採取した脳の浮遊切片を作製し、α-シヌクレインに対する抗体を用いて免疫染色を行い、α-シヌクレインが適切に黒質緻密部で発現されているか観察した。得られた脳組織をチロシン水酸化酵素に対する抗体で免疫染色し、残存するドパミン神経細胞数をステレオロジーシステムで定量的に計測した。また、抗Ser129リン酸化α-シヌクレイン抗体を用いて線条体を免疫染色し、ステレオジーシステムで定量している。データの総括作業を行っている。本研究課題は、パーキンソン病治療におけるアデノシンA2a受容体抑制の神経保護作用を明らかにすることを目的としている。アデノシンA2a受容体ノックアウトマウス脳にα-シヌクレインを発現させることにより、α-シヌクレインによって惹起されるドパミン神経細胞変性および炎症細胞の集簇に対するアデノシンA2a受容体抑制の効果を解析する。α-シヌクレインの発現は、2つの方法で行う。ひとつはアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いて黒質ドパミン神経細胞にA53T変異型α-シヌクレインを発現させる。もうひとつは、予め調製しておいたα-シヌクレイン凝集物をマウス線条体に接種し、α-シヌクレインのプリオン様伝播を引き起こさせる。これらの動物モデルにおいて、運動機能、ドパミン神経細胞の脱落、ミクログリア・アストロサイト集簇の変化を経時的に評価する。平成27年度は、実験に用いる材料の準備を行う予定であった。具体的には、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスの準備とα-シヌクレイン発現用AAVの調製を行動計画とした。本実験では、ノックアウトマウスの効果を明らかにするために野生型マウスと比較しなくてはならない。購入したアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスの遺伝背景をC57BL/6に戻し交配を繰り返して変換している。また、AAVは血清型9が効率よくマウスのドパミン神経細胞に感染することが報告されている。当初の計画では、従来使用していた血清型2のAAVを使う予定であった。しかし、α-シヌクレインを高効率でドパミン神経細胞に発現させることが重要なため、従来の血清型2から血清型9のAAVを使用する方針に変更した。現在、AAVべクターを改変する作業を行っている。本実験では、対照コントロールとして野生型マウスが必要である。そのため、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスの系統を、入手しやすい野生型マウスと揃えなくてはならない。C57BL/6系統との交配を5回予定しているが、交配に時間がかかっている。また、マウス脳で目的遺伝子をより高く発現させるため、従来の血清型2のアデノ随伴ウイルスから血清型9に変換する作業を進めている。血清型9のベクターは市販されていないことからベクター構築及びウイルスの作製に時間を要している。ひとつはアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いて黒質ドパミン神経細胞にA53T変異型α-シヌクレインを発現させる方法である。もうひとつは、予め調製しておいたα-シヌクレイン凝集物を外部からマウス線条体に接種し、α-シヌクレインのプリオン様伝播を引き起こさせる方法である。平成28年度には、前年度から引き続き実験材料の作製を行い、入手したアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスの戻し交配を行い、遺伝背景をC57BL/6に変換した。また、目的遺伝子を高い効率でドパミン神経細胞に発現させるため、AAVベクターを従来の血清型2から血清型9に改変したウイルスの作製を行った。

実験材料の準備が整ったので、ホモのアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスとコントロールである野生型マウスの黒質ドパミン神経細胞にAAVを用いてA53T変異型α-シヌクレインを発現させるところから本実験に着手した。経時的な変化を観察するため、ウイルス接種後2週、4週、8週などで脳を採取し、α-シヌクレインによって惹起されるドパミン神経細胞の変性・脱落について、アデノシンA2a受容体の発現欠損が与える影響の有無を解析中である。具体的な進捗状況として、本実験を開始する前に、局所接種の座標及びウイルス接種量を確認する実験を行った。新たに作製したA53T変異型α-シヌクレインを発現する血清型9のAAVを、マウスの中脳黒質に接種した。23週間後に脳を採取し、α-シヌクレインに対する抗体を用いて免疫組織学的に検討した。α-シヌクレインの発現が、一側の黒質にできるだけ限局し、十分に観察されているか評価し、局所接種の座標及び接種ウイルス量の調節を行った。この予備実験を何度か繰り返し、局所接種の座標とウイルス接種量を決定した。次に、予備実験の条件に従い、C57BL/6に戻し交配したホモのA2a受容体ノックアウトマウス及びコントロールである野生型マウスに、このAAVを接種した。現在、経時的に脳を採取し、ドパミン神経細胞変性に違いがあるか解析中である。本研究課題は、パーキンソン病治療におけるアデノシンA2a受容体抑制の神経保護作用を明らかにすることを目的としている。方法として、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウス脳の中脳黒質にアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いてα-シヌクレインを発現させることにより、α-シヌクレインによって惹起されるドパミン神経細胞変性および炎症細胞の集簇に対するアデノシンA2a受容体抑制の効果を解析する。はじめに、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスをC57BL/6系統のマウスと交配を繰り返し、コントロールの野生型マウスと系統を揃えた。並行して、より目的遺伝子を高発現させるため、アデノ随伴ウイルスを血清型9に変換する作業を行った。作製したAAVをアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスおよびコントロールマウスに接種し、接種後2、4、8週間後に脳を採取した。採取した脳の浮遊切片を作製し、α-シヌクレインに対する抗体を用いて免疫染色を行い、α-シヌクレインが適切に黒質緻密部で発現されているか確認した。ウイルス接種が適切と判断され、α-シヌクレインの発現も適当と判断される脳組織を抽出した。得られた脳組織をチロシン水酸化酵素に対する抗体で免疫染色し、残存するドパミン神経細胞数をステレオロジーシステムで定量的に計測している。また、アストロサイトなどに対する抗体で免疫染色を行い、グリア細胞の集簇の変化について解析を行っている。現在、得られたデータの評価作業を行っている。AAVを用いて目的遺伝子を脳に発現させる場合、目的とした部位にウイルスが接種され、適切な範囲に拡散している必要がある。本研究では、中脳の黒質緻密部という非常に小さな領域に発現させなくてはならない。加えて、マウスを対象としているため、脳が小さく、局所発現の技術的な難易度が高い。そのため、接種したマウスは個々に脳組織をα-シヌクレインに対する抗体で免疫染色し、発現している部位および発現程度を評価しなくてはならない。
血管新生過程における情報伝達因子の構造学的研究

血管新生過程は様々な蛋白質因子および遺伝子による複雑な情報伝達系によって制御されている。これらのコンポーネントがどのようにかかわり合って血管構造が構築され、どのような機構によって維持されているのかを理解するためには、遺伝子レベルの解析に加えて、分子と分子の接触によってもたらされる情報伝達機構を詳細に(原子および電子の移動のレベルで)解析しなければならない。本研究は血管新生メカニズムにおける成長因子angiopoietinおよびその受容体Tie2の役割を構造学的な見地から明らかにすることを目的として実験を進めてきた。成長因子angiopoietinは様々な状態の多量体構造を形成し容易に不活性するため、受容体Tie2の立体構造解析を中心に実験を進めた。大腸菌および酵母を利用した大量発現系ではTie2細胞外ドメインは可溶化分画として回収できなかったが、ドメインごとに短く切ることで調製が可能となった。これまでに立体構造解析をおこなったligandの選択性に関与すると考えられるドメイン5に加え,ligandとの結合に必須であるドメイン1の発現を行い、高純度まで精製することに成功した。ゲルろ過クロマトブラフィーの結果からはこのドメイン1は溶液中で2量体を形成している可能性が高い。これまでに結晶構造が明らかになっているいくつかの受容体Tyrキナーゼの複合体では成長因子との複合体形成時にのみ2量体を形成するのが一般的である。これらのことから、Tie2は既知のものとは異なる2量体形成およびそれと密接に関連する受容体の活性化機構が示唆される。本研究は血管新生メカニズムにおける成長因子angiopoietinおよび受容体Tic2の役割を構造学的な見地から明らかにすることを目的としての蛋白質複合体の結晶構造の解析を行うことをめざしている。本年度は受容体Tie2の試料調製を中心に実験を進めてきた。Tie2は1124残基からなる細胞膜貫通型の受容体で、ユニークなマルチドメイン構造をもつことがアミノ酸1次配列の解析から分かっている。しかし細胞外領域のどのドメインがligandとの相互作用に関与するのかなどの性質はいっさい明らかになっていない。そこで一連のdeletion mutantの作成を大腸菌の大量発現系をもちいて試みた。そのうちドメイン1およびドメイン5に関しては蛋白質のrefoldingをおこなうことで調製できたが、その他に関してはすべて封入体となった。ちなみにFiedler et al.の最新の報告(印刷中)によると、ドメイン1はリガンドとの結合に関与し、ドメイン5はリガンドのセレクションに関与しているようだ。ドメイン5に関しては、X線回折実験に適した良好な結晶が得られ、大型放射光施設SPring-8を利用して原子分解能(1.0Å)での構造解析に成功した。Tie2のリガンドであるangiopoietin-1およびangiopoietin-2についてはhuman由来のcDNAがすでに得られている。だが、これらの蛋白質は生理的には糖鎖やdisulfide結合などの修飾を受けている状態にあると考えられるため、酵母Pichia pastorisを用いた発現系の構築を行った。現在発現レベルを確認中である。現在の血管新生研究は分子生物学的研究が主流となり、血管新生過程の分子機構解明へむけ急速に進みつつある。しかし、これらのコンポーネントがどのようにかかわり合って血管構造が構築され、どのような機構によって維持されているのかを理解するまでにはまだまだ時間がかかると思われる。本研究は血管新生メカニズムにおける成長因子angiopoietinおよび受容体Tie2の役割を構造学的な見地から明らかにすることを目的としての蛋白質複合体の結晶構造の解析を行うことをめざしている。本年度も昨年度に引き続きIigandである成長因子angiopoietinおよび受容体Tie2およびの試料調製を中心に実験を進めてきた。Tie2は1124残基からなる細胞膜貫通型の受容体で、ユニークなマルチドメイン構造をもつことがアミノ酸1次配列の解析から分かっているが、ligandとの結合に必須であるドメイン1およびligandの選択性に関与すると考えられるドメイン5の調製を昨年度から引き続きおこなった。タンパク質のrefolding条件の改良などで90%以上の収率で調製する条件を決定できた。さらに、ドメイン5+6およびドメイン58に関してもrefoldingに成功したが、現段階ではまだ活性は確認できていない。angiopoietin-1およびangiopoietin-2については酵母Pichia pastorisを用いた発現系の構築を行ったが発現は確認できなかった。現在結晶化を視野に入れてangiopoietin-1およびangiopoietin-2およびTie2の細胞外ドメイン全体部分の昆虫細胞をもちいた大量発現系の構築の準備を行なっている。それと同時に、refoldingした試料に関しては昨年度に立体構造決定をおこなったドメイン5に加えてドメイン1の結晶化も目指している。

大腸菌および酵母を利用した大量発現系ではTie2細胞外ドメインは可溶化分画として回収できなかったが、ドメインごとに短く切ることで調製が可能となった。これまでに立体構造解析をおこなったligandの選択性に関与すると考えられるドメイン5に加え,ligandとの結合に必須であるドメイン1の発現を行い、高純度まで精製することに成功した。ゲルろ過クロマトブラフィーの結果からはこのドメイン1は溶液中で2量体を形成している可能性が高い。これまでに結晶構造が明らかになっているいくつかの受容体Tyrキナーゼの複合体では成長因子との複合体形成時にのみ2量体を形成するのが一般的である。これらのことから、Tie2は既知のものとは異なる2量体形成およびそれと密接に関連する受容体の活性化機構が示唆される。
樹脂構造体を用いたがんの早期診断のための安価なマイクロ予備濃縮器の検討

平成30年度には、PDMSとNOA63の2つのポリマを利用するダブル転写法によるマイクロ構造体を有するマイクロ流体デバイスの作製例はあまりないため、平成29年度に確立した作製プロセスの信頼度の確立が必要である。そのため平成29年度に確立した作製プロセスの再現性の確認実験をまず行った。実験には設計した形状と配置がそれぞれ違う5種類のSiベースのマイクロ予備濃縮器全てにおいてダブル転写法を応用し、5種類のポリマベースのマイクロ予備濃縮器を得ることを目標とした。作製プロセス中Siベースのマイクロ予備濃縮器をPDMS樹脂に浸す工程と、PDMSベースの凹型のマイクロ予備濃縮器をNOA63樹脂に浸す工程で気泡の影響を防ぐためゆっくりデバイスを入れる必要があり、デバイスの作製時間がかかる(当工程は数時間かかる)問題と少しノウハウ的な要素があるが、問題なく5種類のNOA63からなるポリマベースのマイクロ予備濃縮器が得られた。さらにSiベースマイクロ予備濃縮器の構造体との寸法を比較すると、構造体の寸法(高さと幅)はSi構造体よりポリマ構造体が数μm小さくなっていたが、デバイスの性能に影響がないと判断する。次に作製されたポリマベースのマイクロ予備濃縮器の性能を確認するためガス吸着と分析実験を行った。5ppbのトルエンガスサンプルをポリマベースのマイクロ予備濃縮器に吸着させ、ガスマスクロマトグラフィーを用いて分析を行った。その結果、NOA63樹脂の成分とトルエンが同時に検出された。ガスサンプルの脱着のためにはデバイスを300°Cに加熱するが、その際にNOA63からも化学成分が出ることがわかった。そのためSiベースマイクロ予備濃縮器におけるガス脱着温度(300°C)をポリマベースマイクロ予備濃縮器に適する温度に変える課題が明らかになった。今後本問題を解決するため加熱温度条件を見直す予定である。平成28年には当初の予定通り、まず実験系を構築した。購入したガスクロマトグラフィのセットアップ(組立、ガスライン、制御ソフトなどの設定)を行った。設定後、ppmオーダーのトルエンガスを用いて動作確認を行った。マイクロ予備濃縮器に吸着された揮発性有機ガスの脱着するためには300度以上の加熱が必要であり、現状ではサース性の治具を用いるため少なくとも1時間ほどの時間がかかる。脱着時間ををより短時間させるためマイクロ予備濃縮器に備えるマイクロヒータの検討を行った。材料はPtとCuを検討した。適切なマイクロヒータ線の厚みや幅を求めるため5分以内に300度まで加熱可能という条件の下で検討を行った。シミュレーションモデルでは厚さを0.5μm、5μm、10μmの3種類を考慮した。また、マイクロヒータ線の幅は、50μm、75μm、100μmの3種類を検討した。シミュレーションでは1.0Vを印加し、5分間の時間変化に対する温度変化を計算した。その結果、マイクロヒータの材料がPtで線幅が50μm、75μm、100μmの場合、印加電圧1Vでは300度まで達成できなかったが、厚さが0.5μmの場合、電圧を10Vに上げることで100秒ほどで300度まで加熱できることがわかった。一方、マイクロヒータの材料がCuであり、線幅が50μmの場合、厚さが0.5μmではやはり10Vまでの電圧が必要であることがわかった。しかし、マイクロヒータ部分の最高温度が1240°Cまで上がり、Cuの融点が約1085°Cであるため断線する恐れがあるため印加電圧を下げる必要ある。厚さ10μmと5μmの場合は300度まで達する時間が約25秒と75秒であった。しかし、Cuを5μmまたは10μmの厚さまで形成するためにはめっき工程が必要である。マイクロヒータの幅が75μmと100μmの場合も11ー35秒で300度を得ることが確認できた。予定通りマイクロ予備濃縮器の作製プロセスの案も提案できている。実験系の構築も修了している。またマイクロヒータの検討も順調であるため概ね順調に進展していると判断する。平成29年度にはマイクロ予備濃縮器の作製プロセスの確立を行った。PDMSとNOA63の2つのポリマを使用するダブル転写法によるマイクロ流体デバイスの作製例はあまりなく、初めての試みだったため作製に必要なプロセス条件の確立ができた。そのため作製されたデバイスの評価は次年度になる予定である。樹脂によるマイクロ予備濃縮器性能の比較評価のためSi微細構造体からなるマイクロ予備濃縮器6モデルとカーボンナノチューブからなるマイクロ予備濃縮器1モデルも作製した。作製されたSiとカーボンナノチューブベースのマイクロ予備濃縮器において濃度1ppbのVOCガスが3種類混合されたガスサンプルを用いて性能確認も行った。その結果、Siベースのマイクロ予備濃縮器では千鳥配置をした2つのモデルを使用した場合のみ1ppm濃度の検出能力を持つガスクロマトグラフィーにより1ppbの混合ガスが検出された。さらにカーボンナノチューブベースのマイクロ予備濃縮器においても1ppbの混合ガスが1ppm濃度の検出能力を持つガスクロマトグラフィーにより検出できた。これらの結果はシミュレーションによる計算結果とも一致し、我々が提案した花びら型の微細構造体設計結果の優位性を証明することになる。本実験結果は既存の研究報告にはなかったものであり、論文としてまとめて発表する予定である。また樹脂によるマイクロ予備濃縮器の性能評価の指標にもなるため有意義な実験結果を得たと考える。

さらにカーボンナノチューブベースのマイクロ予備濃縮器の性能がSiベースのマイクロ予備濃縮器の性能より優れた性能を示した結果も我々のシミュレーションによる計算結果とも一致するもので初めて実験で確認できた。マイクロ流体デバイスの作製法において2つのポリマを使用するダブル転写法は初めての試みであるため作製プロセスの確立に予定より時間がかかったためマイクロ予備濃縮器の性能評価までは至らなかった。そのためやや遅れていると判断する。平成30年度には、PDMSとNOA63の2つのポリマを利用するダブル転写法によるマイクロ構造体を有するマイクロ流体デバイスの作製例はあまりないため、平成29年度に確立した作製プロセスの信頼度の確立が必要である。そのため平成29年度に確立した作製プロセスの再現性の確認実験をまず行った。実験には設計した形状と配置がそれぞれ違う5種類のSiベースのマイクロ予備濃縮器全てにおいてダブル転写法を応用し、5種類のポリマベースのマイクロ予備濃縮器を得ることを目標とした。作製プロセス中Siベースのマイクロ予備濃縮器をPDMS樹脂に浸す工程と、PDMSベースの凹型のマイクロ予備濃縮器をNOA63樹脂に浸す工程で気泡の影響を防ぐためゆっくりデバイスを入れる必要があり、デバイスの作製時間がかかる(当工程は数時間かかる)問題と少しノウハウ的な要素があるが、問題なく5種類のNOA63からなるポリマベースのマイクロ予備濃縮器が得られた。さらにSiベースマイクロ予備濃縮器の構造体との寸法を比較すると、構造体の寸法(高さと幅)はSi構造体よりポリマ構造体が数μm小さくなっていたが、デバイスの性能に影響がないと判断する。次に作製されたポリマベースのマイクロ予備濃縮器の性能を確認するためガス吸着と分析実験を行った。5ppbのトルエンガスサンプルをポリマベースのマイクロ予備濃縮器に吸着させ、ガスマスクロマトグラフィーを用いて分析を行った。その結果、NOA63樹脂の成分とトルエンが同時に検出された。ガスサンプルの脱着のためにはデバイスを300°Cに加熱するが、その際にNOA63からも化学成分が出ることがわかった。そのためSiベースマイクロ予備濃縮器におけるガス脱着温度(300°C)をポリマベースマイクロ予備濃縮器に適する温度に変える課題が明らかになった。今後本問題を解決するため加熱温度条件を見直す予定である。今後、平成29年度には提案したマイクロ予備濃縮器の作製プロセスに基づいて樹脂を用いたマイクロ予備濃縮器を作製する。そのため、必要な条件出しを行う。条件出しの際には必要に応じて本研究に協力している韓国化学研究院情報電子素材研究センタの薄膜材料研究グループと協力しながら実験を進める。場合によっては韓国化学研究院を訪問し、共同実験を行う予定である。次に樹脂を用いたマイクロ予備濃縮器の性能評価に先立ってSiからなるマイクロ予備濃縮器の作製を評価も行う。評価には総6種類の設計モデルにおいて作製と評価を行い、樹脂を用いたマイクロ予備濃縮器の性能評価時指標として用いる。今後、平成29年度に確立したマイクロ予備濃縮器の作製プロセスに基づいて6種類の樹脂ベースのマイクロ予備濃縮器の作製を行い、マイクロ予備濃縮器の性能評価を行う予定である。