hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳動物初期胚におけるコレステロール輸送と膜機能に関する研究

透明帯除去後の8細胞期までのマウス胚を顕微鏡にて測定し、球体と考えた場合の胚あたり総細胞表面積(TA)、胚あたり総細胞体積(TV)を、未受精卵、受精卵、2細胞胚、4細胞胚、8細胞胚でそれぞれ求めた。次に培養液中にlow density lipoprotein(LDL)を添加し、胚培養を行ったところ、体外受精からLDL添加培養液中で発育した胚のblastocyst率は濃度依存性に低下したが、前核期に採卵した場合には抑制が見られず、blastocyst時期に採卵した胚のhatching後のoutgrowthは濃度依存性に有意に増加した。よって初期胚の細胞表面積は増加しているものの、細胞膜の構成成分である脂質の添加による発育促進効果はblastocyst時期以後に初めて見られるという結果が得られた。次いでこの受精卵の細胞膜上のコレステロール値に影響を与える重要な因子の一つであるマクロファージの、マウス子宮内における変化を観察した。マウスマクロファージに特異的なモノクローナル抗体F4/80、BM8を用いて免疫組織科学を行った。その子宮単位面積あたりのマクロファージの絶対数および分布を定量的に求めたところ、子宮筋層にはほとんど存在せず、非妊娠時と交尾後1日目の子宮内膜内にびまん性に認めた。また着床後の5,7日目では脱落膜周囲および非着床部位にはわずかに存在し、脱落膜内にはほとんど認めなかったが、10,14日目では脱落膜周囲に多く認めた。このことからマクロファージは脱落膜が形成されるにしたがって、周辺から侵入してくると予想された。ヒト体外受精・胚移植法における着床率を改善する方法を見つけるために、in vitroにおける細胞膜に生じるfragmentationなどの形質膜の変性の原因を脂質代謝の変化による影響という仮定を立て、これを証明するための基礎的検討として、8細胞期までのマウス胚細胞体積と表面積の変化を測定し、さらに胚へ脂質を補給する目的で、肝臓から末梢組織への脂質輸送の担い手であるlow density lipoprotein(LDL)を培養液に添加し、胚発生に及ぼす影響を検討したところ、発育率の改善は認めなかった。しかしblastocyst時期に採卵した胚のhatching後のoutgrowthは濃度依存性に有意に増加した。したがって初期胚の細胞表面積は増加していたが、細胞膜構成成分である脂質の添加による発育促進効果はblastocyst時期以後にはじめてみられると思われる。この原因を調べたところ、blastocyst時期までにはLDL recepterの発現がほとんどみられないことがわかった。通常LDLの取り込みはreceptorを介して行われるが、LDL receptorノックアウトマウスでは生殖能は保たれており、胚発育のためにLDL receptorが必須ではないことがわかっている。しかしLDLに含まれるアポB蛋白のノックアウトマウスでは生殖能が失われていることからも、胚発育においてLDLは重要な役割を持つものである。さらに検討を加えるためにまずマウスにおける子宮膜間質細胞in vitro脱落膜化モデルの作成に成功し、これを用いて初期胚との共培養を行い、着床過程における胚と子宮内膜間質細胞との相互作用を研究している。

次いでこの受精卵の細胞膜上のコレステロール値に影響を与える重要な因子の一つであるマクロファージの、マウス子宮内における変化を観察した。マウスマクロファージに特異的なモノクローナル抗体F4/80、BM8を用いて免疫組織科学を行った。その子宮単位面積あたりのマクロファージの絶対数および分布を定量的に求めたところ、子宮筋層にはほとんど存在せず、非妊娠時と交尾後1日目の子宮内膜内にびまん性に認めた。また着床後の5,7日目では脱落膜周囲および非着床部位にはわずかに存在し、脱落膜内にはほとんど認めなかったが、10,14日目では脱落膜周囲に多く認めた。このことからマクロファージは脱落膜が形成されるにしたがって、周辺から侵入してくると予想された。
アンチモン-遷移金属間結合のメスバウアー分光法による研究

アンチモン-金属結合をもつ化合物中のアンチモンの価電子分布に関する情報を、^<121>Sbメスバウアー分光法により得て、アンチモン-遷移金属間結合について次の知見を得た。(1)Ph_3Sb-M(CO)_5(M=Cr,Mo,W)とPh_3Sb-M(CO)_4(M=Fe,Ru)の^<121>SbメスバウアーパラメータはPh_3SbがM(CO)_5またはM(CO)_4断片と結合することにより、Ph_3Sbの電子が金属Mに流れ、その流れ方はCr<Fe,他方でMo<W<Ru≪Feであることを明らかにした。その結果、^<121>Sbメスバウアー異性体シフトはSb^<III>とSb^Vの中間の値を示している。なお、鉄に向かうほど電子が流れ易いことがあきらかになったが、この順は金属MのAllred-Rochowの電気陰性度の増大する順と一致し、さらにSb-M結合距離の減少する順とも一致している。(2)Rf_2Sb^V(FeCpL_2)(Rf=マーチンリガンド,L_2=(CO)_2,(CO)(PPh_3),dppe)の^<121>Sbメスバウアーパラメータは[Rf_2Sb^<III>]とRf_2SB^VX(X=Tol,Cl,Br)の値の中間であった。これからFeCpL_2断片はアンチモン(V)に通常の配位子Xより、かなり大きな電子供与をしていることが明らかである。このようにアンチモンの電子状態が結合する金属や金属断片の種類に強く影響されていることが^<121>Sbメスバウアー分光法により有効に研究されることがわかった。
仮想スリット画像を使用した簡便で高精度なＭＴＦ解析法の開発

Digital Radiography(DR)の解像特性は、一般的にPresampled Modulation Transfer Function (MTF))で表わされる。DR画像においてエッジ法は、画像取得が容易で世界的にも主流となっている。しかしながらエッジ法は、解析の手法が煩雑なため高い精度を持ってMTF測定を行うのは難しい。本研究では、エッジデバイスを使用したMTF測定において、従来とは異なるアプローチによる“仮想スリット"画像を使用した簡便で高精度なMTF解析法の開発を行った。この新しい解析法は、DRシステムの性能評価ならびに保守、管理などが簡便に行える。本研究では、エッジデバイスを使用したMTF測定において、従来の方法とは異なるアプローチによる“仮想スリット"画像を使用した簡便で高精度なMTF解析法の開発を目的とする。この新しい解析法は、DRシステムの性能評価ならびに保守、管理などに利用できる。平成24年度は測定手順と理論の確立の確立するために数値画像を使用したシミュレーションを行った。シミュレーションの結果から、新しい方法は従来の方法に比較して精度が良いことが示された。これらの成果は第68回日本放射線技術学会総会学術大会(横浜)で口頭発表にて報告した。これらの研究のサブテーマとしてDRシステム(Computed Radiography)の読み取り方向がMTFに及ぼす因子を分析も同時に行った。これらの内容はOptical Engineering 51(11) (2012)(査読付き)として報告した。平成25年度はDRシステム(間接型FPD)を使用した実測による検討を行った。新しい方法は、従来の方法と比較し簡便でノイズに低く抑えることが分かり、実測でも本手法が実用的で有用であることが示された。これらの成果は、ICMP2013(Brighton Center, UK)で口頭発表にて報告した。さらに平成26年度には、MBEC2014のポスター発表ならびにプロシーディングス(査読有)に投稿している。最終的には新たなデータを加え論文化する予定である。○研究の目的ディジタルX線画像の解像特性は、一般的にPresampled Modulation Transfer Functionで表わされる。MTF測定には様々な方法があるが、ディジタルX線画像においてエッジ法は、スリット法と比較すると画像取得が容易で世界的にも主流となっている。しかし、一方でエッジ法は、解析の手法が煩雑なため臨床病院で高い精度を持ってMTF測定を行うのは難しい。○24年度の研究成果シミュレーションにて新しいMTF解析の手順の完成、理論の確立を行った。新しい方法を使用すると、従来の方法と比較するとすべての空間周波数領域でより正確なMTFを示した。これらの結果からも、新しい方法は、従来のエッジ法と比較して、簡便さのみならず精度においても改善できることが判っており、従来の方法にとって代わる可能性がある。この内容については、第68回日本放射線技術学会総会学術大会にて報告を行い、現在論文化を進めている。また、これらの研究がうまく進まない場合に、用意していたテーマについても同時に進めており論文1)として報告した。○測定手順と理論の確立24年度は測定方法と理論を確立するために、この方法のシミュレーションを予定していたが、ほぼ計画通りに進行している。○ディジタルX線撮影システムを使用した実測による検討24年度のシミュレーションの結果に基づいて、本大学にあるCR装置でデータ収集を行い解析する。さらに、間接型FPD、直接型FPDなどの装置については、純真学園大学に設置されていないため、近隣の病院の装置をお借りしてデータを収集する。さらに、本アルゴリズムを使用したMTFの自動解析ソフトを作成についても現在検討中である。旅費(成果発表ならびに資料収集)40万円PC関連30万円デシケータなどの物品10万円関連図書7万円翻訳・校閲10万円論文投稿10万円
酸素活性種の電子移動特性と制御

金属酸素錯体活性種の反応を理解する上で最も基本的反応である電子移動反応の特性を明らかにすることは不可欠である。これまでは、種々の酸素活性種およびその金属錯体の電子移動特性とその制御法を明らかにすることを目的として、スーッパーオキシドイオン金属錯体およびSODモデルに関する研究を行ってきた。一方、高原子価鉄およびマンガンオキソポルフィリンはP450酵素反応に見られるように、生体内において基質酸化反応における酸化活性種として重要な役割を果たしている。これまでその生成は過酸化物などの強力な活性酸素種との反応によつて行われてきたため電子移動特性ついて不明な点が多く残されていた。そこで金属ポルフィリンを電子移動酸化し、生成する不安定過渡種の同定を各種分光学的手法により行うことにより電子移動過程に関する系統的な検討を行うと共に、高原子価金属ポルフィリンを触媒とする水を電子供給源とした反応系の構築を目指した研究を行った。実際に水から電子を取り出すためには、水の酸化触媒の開発が不可欠である。本研究では、マンガンポルフィリン錯体をゼオライトに担持すると、一電子酸化剤よる水の4電子酸化による酸素発生の触煤として機能することを見出した。一方、その逆反応は酸素の4電子還元による水の生成である。生体系ではチトクロームcオキシダーゼを用いて酸素の4電子還元が行われている。このモデル系を構築し、複核のコバルトポルフィリン錯体を用いると、コバルト間が酵素を取り込むのにちょうど適した距離になる場合に効率良く酸素の4電子還元反応が起こることを見出した。我々はこれまで電子移動過程の金属錯体による触媒制御に関し、理論的かつ実験的研究を行ってきた。近年、金属酸素錯体活性種については種々のタイプのものが単離され、その構造が解明されるようになったが、その電子移動特性についてはまだ全く手つかずの状態と言える。初年度は、種々の酸素活性種およびその金属錯体の電子移動特性とその制御法を明らかにすることを目的として研究を行った。その結果、活性酸素種のスーパーオキシド(O_2^*)が、スカンジウムイオン(Sc^<3+>)と錯形成することを見出し、溶液系で、しかも常温でのESR観測に初めて成功した。O_2^*はSc^<3+>のみならず各種金属イオンと錯形成し、その配位結合の強さはO_2^*金属錯体のESRのg因子(g_<zz>成分)の大きさおよびO_2の電子移動還元反応の活性化エネルギーの大きさと強い相関関係があることを見出した。これにより、各種金属イオンのルイス酸性の強さを定量的に評価でき、その結果は、O_2の電子移動還元反応の制御のみならず一般のルイス酸触媒反応の制御にも利用できると考えられる。各種金属酸素錯体活性種の同定は、本年度導入した超電導核磁気共鳴装置を用いて行った。本研究では酸素活性種の電子移動特性の解明とその制御を目的とし、酸素活性種特にスーパーオキシドイオンの金属錯体の電子移動特性とその制御法について研究を行った。その結果、活性酸素種のスーパーオキシド(O_2^-)が、スカンジウムイオン(Sc^<3+>)と錯形成することを見出し、溶液系で、しかも常温でのESR観測に初めて成功した。O_2^-はSc^<3+>のみならず各種金属イオンと錯形成し、その配位結合の強さはO_2^-金属錯体のESRのg因子(g_<zz>成分)から簡単かつ定量的に評価できることがわかった。これにより、各種金属イオンのルイス酸性の強さを定量的に評価でき、その結果は、O_2の電子移動還元反応の制御のみならず一般のルイス酸触媒反応の制御にも利用できる。

また、イミダゾレート架橋し、かつ配位サイトを有するスーパーオキシド不均一化酵素(SOD)のモデル錯体を初めて合成することに成功し、世界最高のSOD活性を実現することができた。さらにSOD触媒サイクルにおけてZn(II)イオンはO_2^-と錯体を形成することにより、O_2^-の還元を活性化することがわかった。一方、人工光合成モデルとして亜鉛ポルフィリン-フラーレン連結分子などを合成し、その光電荷分離後の逆電子移動過程において、酸素が触媒として機能することを発見した。金属酸素錯体活性種の反応を理解する上で最も基本的反応である電子移動反応の特性を明らかにすることは不可欠である。昨年度は、種々の酸素活性種およびその金属錯体の電子移動特性とその制御法を明らかにすることを目的として研究を行った。その結果、活性酸素種のスーパーオキシド(O_2^-)が、各種金属イオンと錯形成し、その配位結合の強さはO_2^-金属錯体のESRのg因子(g_<zz>成分)の大きさおよびO_2の電子移動還元反応の活性化エネルギーの大きさと強い相関関係があることを見出した。これにより、各種金属イオンのルイス酸性の強さを定量的に評価できた。本年度は、昨年度に得られた知見を基に、各種ルイス酸によるO_2の電子移動還元反応の制御のみならず有機合成反応において用いられる有機スズ化合物などの一般のルイス酸触媒反応の制御も対象として研究を進めた。また、スーパーオキシド不均一化酵素(SOD)触媒機構では、O_2^-の酸化と還元の両方をいかに活性化できるかが不明であったが、SOD触媒サイクルにおいてZn(II)イオンはCu(II)イオンの還元電位を正側にシフトさせることによりO_2^-の酸化を活性化し、一方O_2^-と錯体を形成することにより、O_2^-の還元を活性化することを見出している。本年度は、このSOD触媒サイクルにおけるZn(II)イオンの役割についてさらに理解を深めるためセミキノンラジカルアニオン(Q^-)の不均化反応においてのZn(II)イオンの役割を明らかにした。これまでは、種々の酸素活性種およびその金属錯体の電子移動特性とその制御法を明らかにすることを目的として研究を行ってきた。一方、高原子価鉄およびマンガンオキソポルフィリンはP450酵素反応に見られるように、生体内において基質酸化反応における酸化活性種として重要な役割を果たしている。これまでその生成は過酸化物などの強力な活性酸素種との反応によって行われてきたため電子移動特性ついて不明な点が多く残されていた。本年度は、金属ポルフィリンを電子移動酸化し、生成する不安定過渡種の同定を各種分光学的手法により行うことにより電子移動過程に関する系統的な検討を行うと共に、高原子価金属ポルフィリンを触媒とする水を電子供給源とした反応系の構築を目指した研究を行った。実際に水から電子を取り出すためには、水の酸化触媒の開発が不可欠である。そこで、マンガンポルフィリン錯体をゼオライトに担持すると、一電子酸化剤よる水の4電子酸化による酸素発生の触媒として機能することを見出した。一方、その逆反応は酸素の4電子還元による水の生成である。生体系ではチトクロームcオキシダーゼを用いて酸素の4電子還元が行われている。
ソフト水熱プロセスによるRNaseの不活化と新しい滅菌法の開発に関する研究

分子生物学的コンタミネーションであるRNase (リボヌクレアーゼ, RNA分解酵素)は、熱などに対して非常に安定で破壊されず、雑菌混入を防ぐために行われる通常のオートクレーブ滅菌(121°C、0.2MPa、20min)処理では、器具や溶液中のRNaseを完全に除くことはできない。本研究の成果は、ソフト水熱プロセスにより水蒸気密度を変化させ、121°C、0.2MPa、20minでも不可逆的に失活することを示しそのメカニズムを解明した。【目的】分子生物学的コンタミネーションであるRNase (ribonuclease: RNA分解酵素)は、熱などに対して非常に安定で破壊されにくく、各種微生物の混入を防ぐために行われる通常のオートクレーブ滅菌(飽和蒸気、121°C、0.2MPa、20min)処理では、器具や溶液中のRNaseを完全に除くことはできないとされている。発表者らは、水熱プロセスの研究により、150°C以下の非常にマイルドな水熱プロセス(以下、ソフト水熱プロセスと記す。)により、RNaseの不活化ができる可能性を示唆した。本研究の目的は、ソフト水熱プロセスによるオートクレープ滅菌処理により、器具や溶液中の混入微生物の滅菌はもとよりRNaseの不活化の可能性を示し、新しいソフト水熱プロセス滅菌法を開発することにある。【方法】予備実験として通常のオートクレーブ滅菌(飽和蒸気、121°C、0.2MPa、20min)と乾熱滅菌(乾熱、180°C、常圧、60min)処理でのRNaseの不活化の評価を行う。次に基礎実験として、バッチ式ミニオートクレニプによる平衡系により、それぞれ温度、圧力、蒸気飽和度を変化させることにより、RNaseの不活化を考察し、これらの反応メカニズムを解明した。ソフト水熱プロセス領域でのRNaseの不活化の評価は、SDS-PAGE、PAGE電気泳動および分光光度計で分析を行い、RNaseの不活化の効果を明らかにした。【結果および考察】通常のオートクレープ滅菌と乾熱滅菌では、処理直後はRNaseは失活するが、時間の経過と共に酵素活性が回復することを示し、既往の滅菌方法では失活できないことを確認した。さらに、RNaseの酵素活性は、蒸気飽和度を増加させることにより、110°C、0.14MPa、20minでも不可逆的に熱失活することを示した。これは、蒸気飽和度の変化により、RNaseが折りたたみとS-S結合組替による修復できる可逆的熱失活かち、ペプチド結合の加水分解による不可逆的熱失活が起こっていることを明らかにした。新しい滅菌法により、エンドトキシンやプリオン等の異型蛋白質の不活化にも応用できることを示唆した。【目的】エンドトキシン(Lipopolysaccharides :内毒素)は、強い耐熱性を有しその不活性化には過酷な条件下での加熱処理(250°C, 30min)が必要である。この乾熱法では金属やガラス製等の耐熱性容器・器具類にしか適用できない。また、医薬品GMPおよび治験薬GMPにより、無菌製剤において製品や製造環境についてエンドトシン管理に高い技術と信頼性が要求されている。我々は、ソフト水熱プロセスによる新たな高圧水蒸気滅菌のメカニズムを明らかにし、140°C以下の比較的低温度領域で器具や溶液中のエンドトキシンを不活性化できる新しい滅菌法を開発した。【方法】USPRSE(2000EU/ml)10μlをバイアル(5ml)に滴下し、安全キャビネット内で24時間自然乾燥させた後にエンドトキシンフリー水を滴下し容器内を所定の蒸気飽和度として、所定条件の水熱処理を行った。水熱処理後のエンドトキシンは分析範囲になるようにエンドトキシンフリー水で希釈しよく攪拌した後に、200μlをエンドトキシンバッファー200μlで溶解したES-24Sに添加し攪拌後、EG ReaderSV-12で定量化した。【結果および考察】エンドトキシンの毒素活性は、130°C,60minないし140°C, 30minの密閉系で蒸気飽和度を充分高くすることにより不活性化した。また、同条件下の流通系でも不活性化した。さらに、エンドトキシンフリー水は、同条件下で製造出来ることを示した。エンドトキシンの不活性化の境界条件は、高蒸気飽和度下で130°C, 60minないし140°C, 30minであり、ソフト水熱プロセスのもとで蒸気飽和度を制御することにより劇的に不活化することを示した。そのメカニズムは、リピドAの乖離分散とリピドAの加水分解によると考えられる。
イオノミクス・メタボロミクス解析によるRILsを用いた大豆青立ち耐性機構の解明

大豆では品質低下・減収を招く「青立ち」現象(莢先熟)が多発している。遺伝的特性と青立ち抵抗性の生理生化学的機構の関係を明らかにするため、青立ち抵抗性の異なるRILs(組換え自殖系統群)を用い摘莢処理によって青立ちを発生させ、イオノミクスおよびメタボロミクスの手法を用いて青立ち程度と養分吸収や代謝経路を解析した。その結果、青立ち発生しやすい大豆RILは茎の有機酸・アミノ酸代謝が高まり、窒素含有率が上昇した。これは青立ちによって子実より茎へ養分が転流し、茎で窒素代謝が高まるためと考えられた。大豆では莢が成熟しても茎葉が枯死しない「青立ち」現象(莢先熟)が多発し、コンバイン収穫の困難化や刈り遅れによる品質低下、裂莢による減収を招いている。青立ちの発生程度は環境的要因ばかりでなく遺伝的要因の影響を受けることが知られており、青立ち発生機構の解明が求められている。近年、青立ち抵抗性の異なる品種・系統の交雑に由来するRILsから、青立ち抵抗性に関するQTLが近年見いだされた。青立ちはシンクソース関係が崩れることにより起こりやすくなることから、本年度はこのQTLと青立ちの発生程度とシンク-ソースバランスとの関係を明らかにするため、RIL系統の結莢期に莢切除をおこない、青立ち発生程度について調査を行った。これまで共同研究者は青立ち耐性に関わるQTLは3つほど明らかした。青立ち指数を用いて青立ち発生程度について評価を行い、遺伝子座A>B>C(未発表のため正式名を示さず)の順に青立ち耐性が強くなった。摘莢率が高くなるほど青立ち程度が大きくなり、50%摘莢でどのRILsでも再現性が良く青立ちが発生した。このときのRILsグループの発生程度の順番はQTL解析から推測される順番と関係があった。このことから、各QTLの青立ち耐性に対する効果は異なることが明らかになった。また、予備試験として青立ち耐性が大きくことなるRILsを用いて開花期の茎基部の代謝産物プロファイルを調査した結果、青立ち耐性が強いRILsはオルニチン、グリシン、リジン、アルギニン、グアニン、アデニンなどの代謝産物と関係性が見られた。これらのことからアミノ酸代謝や核酸代謝などが関わっていることが考えられた。減収を招く大豆の「青立ち」現象(莢先熟)について、近年、青立ち抵抗性の異なる品種・系統の交雑に由来するRILsを作成し、QTL解析を進め、青立ち抵抗性に関する3つのQTLを見出している。青立ちの原因の一つとして結莢期までのソース・シンクのアンバランスが考えられ、このRILsを用いて異なるソース・シンクバランスにおいて青立ち程度と各QTLが関わる代謝について、メタボロミクスを用いて代謝産物を網羅的に解析し、遺伝的特性と青立ち抵抗性の生理生化学的機構の関係を明らかにする。本研究では大豆「タチナガハ/東北129号」に由来するRILsを供試し、結莢期に0100%の莢切除を行い、青立ち発生程度と結莢期の茎の代謝産物についてGC-MSで調査した。その結果、1)RILsの親品種について青立ちが発生する摘莢率を調査したところ、50%摘莢率で青立ち程度の品種間差異が見やすくなった。2)青立ち耐性に関わる3つのQTLが組み合わさるように9グループのRILsの摘莢率と青立ち発生程度をみると、東北129号のQTLが多く組合わさったものが青立ち抵抗性が強い傾向にあると推定された。3) QTLの青立ち抵抗性の強さはqGSD1が強いことが示された。しかし、qGSD1とqGSD2が東北129号由来、qGSD3がタチナガハ由来のQTLの組み合わせの場合、青立ち抵抗性が強くなる傾向にあった。4)このときの各RILsでの茎の代謝成分について主成分解析をおこなった。主成分1の値が大きくなると、青立ち程度も大きくなることから、主成分1が青立ち程度と関係があると考えられた。5)主成分1への代謝産物の寄与率はアミノ酸、有機酸等が高く、青立ち程度が高い場合、アミノ酸代謝が高まることにより、アミノ酸の炭素骨格の供給源にとなるTCA回路の活性も付随して高まったものと考えられた。収量の低下をまねく大豆の「青立ち」現象(莢先熟)について、近年、青立ち抵抗性の異なる品種・系統の交雑に由来するRILsを作成し、QTL解析を進め、青立ち抵抗性に関する3つのQTLを見出している。青立ちの原因の一つとして結莢期までのソース・シンクのアンバランスが考えられ、このRILsを用いて異なるソース・シンクバランスにおいて青立ち程度と各QTLが関わる元素について、イオノミクスを用いて網羅的に元素を解析し、遺伝的特性と青立ち抵抗性の生理生化学的機構の関係を明らかにする。本研究では大豆「タチナガハ/東北129号」に由来するRILsを供試し、結莢期に0100%の莢切除を行い、青立ち発生程度と結莢期の茎の元素含有率についてICP-MSで調査した。その結果、1)RILsの親品種について青立ちが発生する摘莢率を調査したところ、摘莢率100%ではタチナガハと東北129号ともに青立ちが発生し、品種間差異が見られなかったが、50%摘莢率で青立ち程度の品種間差異および各RILsグループ間差異も得られたことから、青立ち抵抗性機構の解析には50%摘莢率で評価することとした。2)青立ち

耐性に関わる3つのQTLが組み合わさるように8グループのRILsの摘莢率と青立ち発生程度をみると、東北129号のQTLが多く組合わさったものが青立ち抵抗性が強い傾向にあった。3)050%摘莢率の各RIlLsでの茎の元素含有率と青立ち指数でモデル解析を行ったところ、元素含有率から青立ち指数を推定することができ、数種類の元素が青立ち発生程度と強い関係が見られた。大豆では品質低下・減収を招く「青立ち」現象(莢先熟)が多発している。遺伝的特性と青立ち抵抗性の生理生化学的機構の関係を明らかにするため、青立ち抵抗性の異なるRILs(組換え自殖系統群)を用い摘莢処理によって青立ちを発生させ、イオノミクスおよびメタボロミクスの手法を用いて青立ち程度と養分吸収や代謝経路を解析した。その結果、青立ち発生しやすい大豆RILは茎の有機酸・アミノ酸代謝が高まり、窒素含有率が上昇した。これは青立ちによって子実より茎へ養分が転流し、茎で窒素代謝が高まるためと考えられた。H2526年度おいては、RILs栽培時の青立ち程度と栽培特性の調査および莢切除による影響の評価を行い、その茎葉の養分元素と代謝産物について包括的に解析を行い、青立ちが発生するシンク・ソースバランスの乱れに関わる養分元素や代謝産物の特定を行う計画であった。そこで、青立ち耐性の異なるRILsの親品種を用い、結莢期の茎のサンプリングと莢切除を行い、ソース・シンクのアンバランスが起こり青立ちが発生する莢切除割合を予定通り明らかにすることができた。青立ち耐性の異なるRILsの複数系統を選択し、青立ちが発生するシンク・ソースバランスを変えることにより、青立ちに対する各QTLの抵抗性とそれに関わる代謝について調査することができた。予定した包括的な養分元素の分析については、連携研究者が異動や大学で管理しているICP-MSの故障などにより時間をとられ、分析に遅れが見られるが、サンプルの酸分解を進めており、ICP-MSの準備ができ次第、分析を開始する。おおかたは計画通り進行していると考える。土壌肥料昨年度まではRILs系統群の栽培を行い、青立ち耐性について結莢期の茎葉サンプルを用いて評価を行ってきた。本年度は更に青立ち耐性に関わるQTLの代謝に関わる効果を明らかにするため、NILs(準同質遺伝子系統)を用いて昨年度と同様に、養分元素および代謝産物ついて網羅的に解析をおこなう。特に代謝産物ばかりでなく養分元素の包括的解析についても更に分析を進め、青立ち耐性と代謝機能との関連性を明らかにする予定である。H25年度おいては、RILs栽培時の青立ち程度と栽培特性の調査および莢切除による影響の評価を行い、その茎葉の養分元素と代謝産物について包括的に解析を行い、青立ちが発生するシンク・ソースバランスの乱れに関わる養分元素や代謝産物の特定を行う計画であった。そこで、耐性の異なるRILsの複数系統を選択し、結莢期の茎のサンプリングと莢切除を行い、ソース・シンクのアンバランスが起こり青立ちが発生する莢切除割合を予定通り明らかにすることができた。
RNA酵素の遺伝子治療への応用のための研究

ヘアピン型リボザイムは,2つのステムルーブdomainからなり(domain I,II),domain Iにおいて切断反応が起こる.昨年度において,申請者は3つめのdomain(domain I')をdomain IIの3'側に接続した新規ヘアピン型リボザイムを構築した.この3つのdomainよりなるリボザイムは,転写反応中にdomain I'において,自己切断(セルフトリミング)を起こし,3'側に付加するベクター由来の余分な配列を切り落とし,本来の2つのdomainよりなるリボザイムを生成しすることができた.さらにこの切り出されたリボザイムは,標的RNAを目的部位で切断することができた.また,このヘアピン型リボザイムは,標的RNAと2ヶ所で計14塩基対を組み切断するが,以前に申請者は,3ヶ所で計19塩基対を形成する新規ヘアピン型リボザイム(three-way ribozyme)を構築した.このthree-way ribozymeは,切断活性が高いため,細胞内における遺伝子発現制御に用いる場合に有用であると考えられた.そこで,自己切断活性を有する3つのdomainよりなるリボザイムが,転写中の自己切断によって,three-way ribozymeを切り出すように,3つのdomainよりなるリボザイムを変換した.このthreedomain ribozymeは,DNAからの転写に続く自己切断によって,three-way ribozymeを切り出すことができた.この切り出されたthree-way ribozymeは,ヒト誘導型一酸化窒素合成酵素のmRNAを切断することができた.今回構築したリボザイムは,ベクター由来の配列を自己切断によって切り落とし,活性の高いthree-way ribozymeを放出するものであり,今後リボザイムを応用するにあたり非常に有用であると考える.ヘアピン型リボザイムは,2つのステムループdomainからなり(domain I,II),domain Iにおいて切断反応が起こる.domain IIの5′側にdomain Iが接続しており,その接続部位で折れ曲がり,2つのdomain同志が相互作用することでRNAが切断される.平成9年度において,申請者は,3つめのdomain(domain I′)をdomain IIの3′側に接続した新規ヘアピン型リボザイムを構築した.この3つのdomainよりなるリボザイム配列をコードしたDNAを,プラスミドに組み込み,runoff transcriptionを行った.その結果,転写中にdomain I′において,自己切断(セルフトリミング)が起こり,3′側に付加するベクター由来の余分な配列が切り落とされ,本来の2つのdomainよりなるリボザイムが生成した.この切り出されたリボザイムは,標的RNAを切断することができた.リボザイムを細胞内で作用させる場合,リボザイム遺伝子を細胞内に導入し,転写によって目的のリボザイムを発現させる場合がある.DNAとして細胞内に導入する方法の欠点として,本来のリボザイム配列の下流に,ベクター由来の長い配列が付加し,その結果,転写されたリボザイムによる標的RNAの切断が阻害される.本年度に構築したセルフトリミング活性を有した新規リボザイムは,3′側に付加した余分な配列を自己切断し,それによって切り出されたリボザイムが,標的RNAを切断することが可能である.そのため,今後このリボザイムの細胞内での応用が可能であると思われる.また,1つのリボザイムによって,転写後の自己切断とその後の標的RNAの切断を行なうリボザイムの構築は初めてであり,構造活性相関の点からも,興味深いリボザイムであるといえる.ヘアピン型リボザイムは,2つのステムルーブdomainからなり(domain I,II),domain Iにおいて切断反応が起こる.昨年度において,申請者は3つめのdomain(domain I')をdomain IIの3'側に接続した新規ヘアピン型リボザイムを構築した.この3つのdomainよりなるリボザイムは,転写反応中にdomain I'において,自己切断(セルフトリミング)を起こし,3'側に付加するベクター由来の余分な配列を切り落とし,本来の2つのdomainよりなるリボザイムを生成しすることができた.さらにこの切り出されたリボザイムは,標的RNAを目的部位で切断することができた.また,このヘアピン型リボザイムは,標的RNAと2ヶ所で計14塩基対を組み切断するが,以前に申請者は,3ヶ所で計19塩基対を形成する新規ヘアピン型リボザイム(three-way ribozyme)を構築した.このthree-way ribozymeは,切断活性が高いため,細胞内における遺伝子発現制御に用いる場合に有用であると考えられた.そこで,自己切断活性を有する3つのdomainよりなるリボザイムが,転写中の自己切断によって,three-way ribozymeを切り出すように,3つのdomainよりなるリボザイムを変換した.このthreedomain ribozymeは,DNAからの転写に続く自己切断によって,three-way ribozymeを切り出すことができた.この切り出されたthree-way ribozymeは,ヒト誘導型一酸化窒素合成酵素のmRNAを切断することができた.今回構築したリボザイムは,ベクター由来の配列を自己切断によって切り落とし,活性の高いthree-way ribozymeを放出するものであり,今後リボザイムを応用するにあたり非常に有用であると考える.
食物抗原によるアトピー性皮膚炎発症のメカニズム及び治療法に関する基礎的検討

食物アレルギー発症のメカニズムを明らかにする目的で、腸管上皮に恒常的に発現しているIL-7がナイーブCD4^+T細胞の増殖分化に与える影響を検討した。IL-7、IL-4はヒト臍帯血CD4^+T細胞を抗原刺激の非存在下で増殖させ、IL-7はTh0タイプのサイトカイン産生能を、IL-4はTh1タイプのサイトカイン産生能のみを誘導し、IL-7によって誘導されるIL-4産生細胞はすべてCD31陰性であることを報告した。CD31陰性T細胞を臍帯血より分離し、IL-4とIL-7で培養したところIL-7はCD31陰性細胞を維持しこの分画にIL-4産生能を誘導した。IL-4はCD31陰性細胞にCD31を誘導する効果がありIL-4産生能は誘導されなかった。これらの結果よりCD31を介する刺激のIL-4産生能獲得に対する抑制的関与が示唆された。また、IL-4やIL-7により抗原刺激の非存在下でIFN-γ産生能を獲得したナイーブT細胞を用いてIFN-γ産生の分子機構を検討した。末梢血より樹立したTh1細胞クローンと比較し、抗原刺激の非存在下でIFN-γ産生能を獲得したT細胞のIFN-γ遺伝子上流域はメチル化されており、DNase I hypersensitivity assayでもTh1クローンのIFN-γ産生に使用されているプロモーター領域が使用されていない可能性が示唆された。従って、ヘルパーT細胞のIFN-γ産生の分子機構にはその分化様式に応じて多様性が認められた。次に、食事アレルギー患者の末梢血より単核球を分離し該当抗原で刺激した培養上清中のサイトカインを測定することにより、末梢血中の食物抗原特異的T細胞の頻度とサイトカイン産生を検討した。この実験系では測定するサイトカインが微量のため、加える抗原の中に微量のエンドトキシンが混入していても測定系に影響を与えるため現在再検討中である。ヒトナイーブT細胞のサイトカイン産生能獲得機構を明らかにする目的で、以下の実験を行った。1)ヒト臍帯血よりナイーブCD4+T細胞を分離精製し、抗原刺激のない存在下でIL-7と培養し、これらの細胞が新しくIL-4、IL-5、IFN-γなどのサイトカイン産生能を獲得することを明らかにした。2)また、IL4と培養した場合にはIFN-γの産生能は獲得されたが、IL-4、IL-5は産生しなかった。3)実験に用いたIL4とIL-7の濃度では、ナイーブT細胞の増殖は同程度であった。4)このサイトカイン産生プロフィールの違いの原因を検索する目的で細胞表面マーカーの解析を行ったところ、IL-7によって誘導されたIL-4産生細胞は全てCD31陰性であった。5) IL-4と培養した場合にはCD31陰性細胞は消失していた。これらの事実は腸管の上皮細胞が恒常的にIL-7を発現している事を考慮すると、食事アレルゲンが最初に生体内に侵入してくる場所には、あらかじめIL-7でプライムされ、IL4を産生ずるようになったナイーブCD十T細胞が存在する事を示唆しており、食事アレルギーの発症病態を考える上で興味深い。平成11年度はヒトナイーブT細胞のサイトカイン産生能の獲得機構を明らかにする目的で以下の実験を行った。

1)昨年度ヒト臍帯血CD4+T細胞を用いた実験により、IL-7によって誘導されるIL-4産生細胞はすべてCD31陰性であることを明らかにした。従って、CD31の発現調節を明らかにする目的で、CD31陰性細胞を臍帯血より分離し、IL-4とIL-7で培養した。IL-7は最初に存在したCD31陰性細胞を維持しこの分画にIL-4産生能を誘導した。IL-4はCD31を細胞表面に誘導する効果があり、CD31陽性細胞にはIL-4産生能は誘導されなかった。CD31を介する刺激がIL-4産生能に抑制的に関与している可能性が示唆された。3)食事アレルギー患者の末梢血より単核球を分離し、該当抗原で刺激培養上清中のサイトカインを測定することにより、末梢血中の食物抗原特異的T細胞の頻度を測定する実験系を検討した。この実験系では測定するサイトカインが微量のため、加える抗原の中に微量のエンドトキシンが混入していても測定系に影響を与えることが明らかになり、現在再検討中である。
哺乳類卵母細胞における休眠維持機構の解明

哺乳類卵母細胞は、体細胞に囲まれた卵胞として発育を開始し、成熟後に排卵するが、その過程で発育を始めたうち99%以上が選択的に消失する。しかし、その選抜機構はほとんど明らかにされていない。そこで本研究では、卵母細胞の休眠維持と活性化機構の解明を目的とした。まず、酵素処理を必要としない卵胞の分離法を開発することで、効率的に卵胞を回収することが可能となった。次に、分離した卵胞における卵母細胞核の形態を観察し、休眠/活性化状態との関連を解析した。その結果、休眠している原始卵胞における卵母細胞核はユークロマチン形態を示すことから、卵母細胞の休眠にはクロマチン形態が関連することが示唆された。哺乳類の卵母細胞は性成熟前の個体では、卵胞上皮細胞(顆粒層細胞)に取り囲まれた卵胞として第一減数分裂前期で停止した状態で休眠している。性成熟後に性周期に伴い一部の卵胞が発育を開始し排卵に至るが、発育を開始した卵胞のうち99%が選択的に消失する。卵母細胞の休眠と卵形成に伴う選択的消失は性周期を有する多くの動物種において共通の現象であり、優良な子孫を残すための戦略の一つであると考えられるが、その制御因子や分子メカニズムはほとんど明らかにされていない。そこで本研究では、卵形成の初期段階である原始卵胞における卵母細胞の休眠維持およびその後の選択的消失メカニズムを明らかにし、その生理的役割の解明を目的としている。休眠中の原始卵胞における卵母細胞がどのような状態(形態的および分子的特徴)で生体内に存在しているか、またその状態が休眠中のすべての卵母細胞で均質であるか明らかにされていない。そこで、本年度においては、哺乳類の原始卵胞における卵母細胞の休眠状態を解析するため、休眠中のマウス原始卵胞における卵母細胞がどのような状態で生体内に存在するか解析することを目的とした。まず、原始卵胞が存在すると予想される発生ステージ(胎児期後期、新生児期、春季発動時、性成熟後)のマウス卵巣からの卵母細胞の回収条件を確立した。次に、回収した卵母細胞の形態を分類するため、形態的特徴の一つであるクロマチン形態を解析するため、卵母細胞における核染色条件を確立した。本年度の研究目的は休眠中のマウス原始卵胞における卵母細胞がどのような状態で生体内に存在するか解明することであり、具体的にはマウス卵巣に存在する休眠中の卵母細胞の形態および分子的特徴を明らかにすることである。上記研究目的を達成するための研究計画は、クロマチン形態を指標としたマウス卵母細胞の形態的特徴の同定を行ったが、分子的特徴の解析を完了していないため進展がやや遅れていると考えられる。哺乳類の卵母細胞は、性成熟後に性周期に伴い休眠する原始卵胞から一部の卵胞が選抜され発育を開始した後、卵胞成熟により排卵に至るが、発育を開始した卵胞のうち99%が選択的に消失する。卵母細胞の休眠、活性化と選抜は性周期を有する動物種共通の現象であり、優良な子孫を残す戦略の一つであると考えられるが、その制御機構はほとんど不明である。そこで本研究では、卵形成の初期段階である原始卵胞における卵母細胞の休眠維持と卵発育を開始する活性化機構の解明を目的としている。原始卵胞は新生児期に形成を完了し、性成熟後の卵巣まで維持されるが、形成直後には休眠機構が正常に機能しない卵母細胞が存在し、個体の性成熟過程で休眠が維持できない卵母細胞は消失していくと考えられる。性成熟期個体の原始卵胞における卵母細胞は全て転写活性型のNSN型のクロマチン構造をとることから、クロマチン構造が休眠の維持機構に関与する可能性が考えられる。しかし、新生児期における卵母細胞のクロマチン構造は明らかにされていない。そこで本年度は、原始卵胞の休眠維持機構におけるクロマチン構造の関与を明らかにするために、マウス新生児期、性成熟期の原始卵胞、一次卵胞の卵母細胞のクロマチン構造を、核のDNA染色を中心に解析した。その結果、新生児期、および性成熟期ともに原始卵胞の卵母細胞はNSN型が100%、転写不活性型のSN型が0%であった。一方、一次卵胞ではSN型の卵母細胞が新生児期では4.3%、性成熟後では33.3%であった。この結果から、原始卵胞にはSN型のクロマチン構造をもつ卵母細胞が、存在しない、または休眠が維持できず一次卵胞へと発育してしまう可能性が考えられ、原始卵胞における卵母細胞の休眠におけるNSN型のクロマチン形態の関与が示唆された。

本研究課題の今後の推進方策として、H29年度の研究実施計画である卵母細胞休眠維持機構の解明を試みる。具体的には、1. RNAシーケンスを用いた卵母細胞における遺伝子発現プロファイルを行うことで、休眠中の卵母細胞の分子的特徴を明らかにし、2.卵母細胞における休眠を調節する候補分子を絞り込む。さらに、3.卵母細胞において休眠調節候補因子の遺伝子ノックダウンもしくはノックアウトを用いて生理的機能を解析することで、卵母細胞における休眠調節メカニズムを解明する。本年度において、卵母細胞の回収法および核染色法を確立したことにより、本年度はより効率的な解析が可能となる見込みがあると考えられる。生命科学
疾病媒介蚊の産卵および卵黄形成のメカニズムについて

1.native-PAGEを用いてLDHに対する阻害程度でLDH阻害物質の活性を間接的に判定した。この阻害物質は2種類の異なった分子量のタンパク質からなり、主に消化管の胃嚢と中腸に存在し腸管内に分泌されること、細胞内では可溶性分画中、つまりCytosolに主に分布することを明らかにした。現在のところ、低分子タンパク質はTrypsin-likeプロテアーゼであることが判明したが、高分子タンパク質については検討中である。2.3属6種の蚊幼虫のピルビン酸-NADH系への偏り(NADH/NAD^+)とLDH阻害活性との間には非常に高い相関関係(r=0.934)があることから、Cytosol内での拮抗作用によって、乳酸-NAD^+反応系が阻害されることを示唆した。チカイエカどは、LDHが触媒する反応系は乳酸側へ偏っているが、乳酸もピルビン酸もともに蓄積していないこと、LDHとNADHを競合するalpha-グリセロリン酸(alpha-GPDH)の活性がLDHより高いことから、LDH触媒系を通らずにalpha-GPDH系によってNADH→NAD^+の反応が行われTCAサイクルへとつながるものと推察された。3.チカイエカのメスは、蛹期まで増加し続けた中性脂肪が羽化と同時に急激に低下し、代わりにalpha-GPDHの活性が高まった。さらに、その直後の羽化1日目にはすでに卵黄の蓄積が確認されたことから、羽化直後は脂肪を燃料として卵黄形成のためのエネルギーが作り出されていると推察した。これら一連の実験結果から、チカイエカのメスは、炭水化物から脂肪へとスムーズにエネルギー転換を行うことで無吸血ステージでの卵巣発育を可能にしていると思われる。これはヒトの妊娠中のエネルギー代謝にも見られ非常に興味深いところである。
フルカラー表示のための芳香族スピロ構造をもつ耐熱性有機EL材料の開発

液晶の次世代の表示素子である有機ELは、フルカラーの商業化が進展するなかで、用いられる材料のさらなる高性能化と長寿命、安定性が求められている。このため、本研究は、耐熱性および非晶質性に優れた材料を開発すべく、安定な芳香族化合物を三次元的なスピロ構造に組み入れた新規物質を開発してきた。審査中の論文を含めて、冊子体の論文成果について順に述べる。1.安定で耐熱性に優れるホール輸送材として、スピロ炭素を3つ持つトリスピロの新たな物質を合成できた。この基本骨格である炭化水素は新規物質であり、今後の耐熱性電子材料の基盤物質として利用されよう。また、得られたホール輸送材は、ガラス転移点170度Cもある高い値(分子量1796で真空蒸着できる世界記録か)を示し、なおかつ優れたEL特性を示した。我々の分子設計の考え方の正しさを例証できた。2.スピロ構造を構築するためのフルオレンのアセタールの新合成法を見いだした。この物質は、教科書的な従来合成法では作れない。有機ケイ素化合物と電気化学法の組み合わせでのみ達成できた。3.スピロ構造を進化させたプロペラン構造を持つ耐熱性ホール輸送材を合成できた。ホール輸送材単位を1つ、2つ、3つもつ系を考案し類例のない試みで、我々の分子設計、すなわち耐熱性の炭化水素コアと非晶質性のための官能基を周辺に配置する考え方は、作業仮説から理論として認められたい(印刷中)。4.耐熱性、非晶質性の実現に他の方法はないかとして、あまり省みられなかったシクロ重合の新しい方法など合成でき、いくつかのオリゴマーでも耐熱性はあがることがわかった(審査中)。次世代の表示素子である有機EL(Electroluminescence)は、フルカラーでの実用化目前で、耐熱性や非晶質性にすぐれる有機材料が求められている。本研究は、積層型有機EL素子のホール輸送材および発光層材料に用いるべく、芳香族スピロ構造を活用して新規有機材料の開発を行ってきた。主な成果を述べる。(1)ホール輸送材としてのテトラアエニルベンジジン(TPD)のスピロ環をもつ二量体の系は、考案した4系列のうち今年度計画の残された1つを予定通り合成でき、学会発表した。合成・構造・物性について、この分野でのパラダイムとすべく、データの吟味を急ぎ、一流雑誌への投稿準備を急いでいる。(2)上記の拡張であるスピロ三量体の系は、トルキピンを用いることでTPD三量体化物の最初の例として合成できた。この合成にはケトン体と我々のいう「スピロ化剤」が必要で、後者は準備段階から2年かけてついて合成できたことに負う。これは今後の展開にとって財産である。目的物の耐熱性は良好で、150°C以上の使用に耐え、このクラスでは世界最高レベルであった。また、ELデバイスとしての評価は、満足すべき結果であった。それゆえ、この知見を速報として発展する準備をしている。(3)発光層材料として、我々が独自展開している蛍光性にすぐれるジベンゾ[g, p]クリセンの系は、耐熱性をもたせるための二量体への変換が予想外に難渋しており、種々の工夫で対処している。他方で、ホール輸送材とする試みを行ったところ、いくつかの誘導体の中から、すぐれたEL特性を示すものが見つかった(2003.春学会発表)。この中で置換体を設計する一つの指針を得た。まだまだ、おいそれと物性を予測できるほどにはこの分野は成熟していない。現在、こちらからアプローチすることを企て、楽しみながら研究の展開を行っている。

次世代の表示素子である有機ELは、フルカラー表示の商業化が始まる中で、用いられる材料のさらなる長寿命化が求められている.このため、本研究は、耐熱性及び非晶質性に優れた材料として、特に芳香族の構造を三次元的なスピロ構造に組み入れた新規物質を開発してきた.最終年度の成果を述べる。(1)積層型有機EL素子の耐熱性向上のために、我々はテトラフェニルベンジジン誘導体の二量体化物および三量体化物を多数開発してきた.EL特性は、いずれも標準以上であり、特にガラス転移温度の向上は、我々独自のアプローチができた.即ち、耐熱性のコア分子に非晶質性の自由回転分子を結合させるという分子設計法は特筆されよう.ただし、総合論文の投稿は2004年中までにしたい。(2)芳香族スピロ構造と関連する我々独自のジベンゾクリセンの化学は進展できた.これの含窒素アナローグを一例ながら合成でき端緒を作れた(2004年秋学会発表予定)。(3)スピロビフルオレンの基となるフルオレンの化学を活用して、新規な縮合型ポリフルオレンを考案し合成できた(2004年春学会発表).これの発光材料としての応用を企業との共同研究で行なうところまでこぎつけた.
抗癌剤の薬効評価のための癌微小環境を模倣した擬似癌組織の構築

個々の癌患者に適した抗癌剤を高い精度で判別できる試験法の開発を目指し、癌細胞と間質細胞(癌間質線維芽細胞と単球)を用いて癌微小環境を模倣した擬似癌組織を構築した。同擬似組織を用いた検討により、間質細胞の存在によって癌細胞の抗癌剤に対する感受性が著しく変化することが分かった。また、基板上に固定化した単球と癌細胞から成る培養系を確立し、単球の影響により抗癌剤の薬効が促進されること、および、単球近傍に存在している癌細胞のみがその影響を受けることを明らかにした。これら、間質細胞の影響を考慮した本培養システムは、抗癌剤試験の精度向上に大きく寄与すると考えられる。個々の癌患者に適した抗癌剤を高い精度で判別できる新規の薬剤評価法の開発を目指し、癌微小環境を模倣した擬似癌組織を構築するとともに、癌細胞の周囲に存在する間質細胞が抗癌剤の薬効に及ぼす影響を検証した。昨年度決定した培養デザインに基づき、ゲルで包埋した癌細胞の上部に癌間質線維芽細胞を、また、下部に単核細胞を配置することで擬似癌組織を構築した。同擬似組織を用いた検討により、線維芽細胞によって、抗癌剤シスプラチンの殺細胞効果が抑制されること、及び、単核細胞によって、癌細胞内の特定の酵素が活性化され、抗癌剤のプロドラッグであるドキシフルリジンの殺細胞効果が増強されることが分かった。また、これら二種類の薬剤を同時に用いた場合の相乗効果を明らかにした。さらに、単核細胞による影響がどの程度離れた癌細胞にまで作用するかを検証するため、固定化単核細胞と癌細胞から成る共培養系を構築した。基板上への単核細胞(浮遊細胞)の固定化は、昨年度確立した細胞膜に親和性を有する試薬とアルブミンフィルムを組み合わせる手法を用いた。同共培養系の癌細胞を抗癌剤に暴露後、死滅した癌細胞を可視化することで、単核細胞の近傍に位置する癌細胞のみが死滅することを明らかにした。以上の結果は、間質細胞の存在により癌細胞の抗癌剤に対する感受性が著しく変化することを明確に示しており、より生体の環境に近い擬似癌組織を用いて抗癌剤の薬効評価を行うことの重要性を示唆する貴重な知見を得ることができた。また、これらの結果に加えて、効率よく癌細胞と間質細胞を分離するために必要となる抗体固定化法の確立や担癌マウス作製のためのノウハウの習得などを行い、in vivo系と本擬似癌組織の双方における抗癌剤の薬効を比較して擬似組織の有効性を検証するための道筋をつけることができた。研究代表者らは近年、血清アルブミンを原料として作製した架橋アルブミンフィルムにより、細胞の接着挙動を人為的に制御する方法を開発した。本研究は、癌組織を一度細胞レベルにまで分解した後、同フィルムを利用して、抗癌剤の薬効評価に適した形に組織を作り変える技術を構築し、この再構成した擬似癌組織を用いて、個々の癌患者に適した抗癌剤を投与前に判別できる新規の薬剤評価法を確立することを目的とする。この目的を達成するためには、癌組織を構成している各種細胞を抗体を利用して分離する技術、浮遊細胞を基板上に固定化する技術、癌細胞の周囲に間質細胞を配置する技術を確立することが求められる。これら各要素技術に関して、H24年度における研究成果の具体的内容は以下の通りである。1固定化した抗体の安定性や配向は、細胞の分離効率に大きな影響を及ぼす。そこで、より効率的な細胞分離を実現するために、抗体の配向を制御しながら基板上に抗体を安定に固定化する新規方法の確立に向けた検討を行った。2血液細胞を基板上に固定化して癌組織内の血管系を模倣することを考えているが、血液細胞は浮遊細胞なので、基板上に接着できない。この問題を解決するために、細胞膜に親和性を有する化学試薬、アルブミンフィルム、インクジェット印刷技術を組み合わせ、基板上の任意の位置に浮遊細胞を配列することに成功した。3癌間質線維芽細胞や単核細胞の株化細胞をモデルとして用い、癌細胞の周囲にこれらの細胞を配置して、擬似癌組織を構築するための培養デザインの検証を行った。さらに、癌細胞のみの場合と癌細胞の周囲に間質細胞が存在する擬似癌組織の場合とでは、癌細胞の増殖や抗癌剤の薬効が異なることを明らかにした。4癌モデル動物の作製に向けて、ノウハウを有する研究者(獣医学部や企業)とコンタクトを取り、意見交換を行った。研究全体としては、順調に進展していると判断する。その根拠について、個別の要素技術ごとに以下に記す。1抗体を利用した細胞分離技術に関しては、分離効率の飛躍的な向上を目指し、新規の抗体の配向制御技術の確立や固定化抗体の安定化に挑戦している。