hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規なシリルボランおよびスタニルボラン配位子の開発とその金属錯体合成への展開

既に報告されているトリシクロヘキシルホスフィン-ハロボランの二電子還元反応によってボリル陰イオンを発生させ,これとケイ素-水素結合を有するクロロシラン類を反応させることによって,新規なシリルボランを合成した.より立体障害の小さい,トリメチルホスフィン-ハロボランを用いたボリル陰イオンの発生は成功しなかった.合成したシリルボランのケイ素-水素結合,およびホウ素-水素結合が金属錯体と反応し得ることに着目し,数種の金属錯体との反応を試みた.6属金属ヘキサカルボニルとの光反応では,光照射によって生じた空の配位座に,シリルボランがホウ素-水素結合を通して金属に配位した,「ボランσ錯体」の生成が分光学的に確認されたが,この生成物は,おそらくホスフィンの立体障害のために単離できる安定性を持っていなかった.また金属上にアルキル基を有する鉄,タングステン,およびモリブデン錯体との反応では,シリルボランのケイ素-水素結合が金属に酸化的付加し,続いてアルキル基が脱離した,シリル錯体の生成が確認された.この化合物は,電気的に極めて陽性なボリル基を含むシリル錯体として,その反応性に興味がもたれる.現在この化合物の単離・同定を行なっている.また今後,スタニルボランの合成を行なうと共に,シリルボランと様々な遷移金属錯体(これまでに我々がホウ素化合物,ケイ素化合物と反応することを見い出している錯体を中心に)との反応を行なっていく予定である.本研究を遂行するにあたって,はじめにボラン類と金属錯体の反応による,ボリル錯体の合成法の確立と,生成する錯体の構造および反応性の検討を行い,続いてシリルボラン,スタニルボランの合成について検討した.(1)ボリル錯体の合成とその構造ボラン-ホスフィン付加物は極めて安定なホウ素化合物であり,同時にアルカンと等電子的な化合物である.本研究では電子豊富なモリブデン,タングステン,および鉄のメチル(カルボニル)錯体トリメチルホスフィンボランとを光照射下に反応させる事により,新規なボリル金属錯体を合成することに成功した.この反応はsp^3型ボランのホウ素-水素結合が切断されると同時に金属-ホウ素結合が形成されるという全く新しいタイプの反応であり,同時に金属錯体によるアルカンの活性化およびシラン類の活性化と関連深いものである.そこで,続いてこの反応をケイ素部位とホウ素部位を同時に含むシリルボランおよびその類縁体であるスタニルボランに応用することを考えた.(2)シリルボランの合成初めにホスフィンボランをハロゲン化してクロロボランまたはヨードボランを合成し,これを低温で還元して4配位ボリル陰イオンを発生させることを試みた.このタイプの陰イオンは,かさ高いホスフィンを有するボランで,今本らによって合成されている.続いて発生した陰イオンとクロロシラン類との反応により,シリルボランを合成した.現在のところ目的化合物の単離には至っていないが,シリルボラン生成の証拠を得ている.今後この化合物と金属錯体との反応を検討する予定である.既に報告されているトリシクロヘキシルホスフィン-ハロボランの二電子還元反応によってボリル陰イオンを発生させ,これとケイ素-水素結合を有するクロロシラン類を反応させることによって,新規なシリルボランを合成した.より立体障害の小さい,トリメチルホスフィン-ハロボランを用いたボリル陰イオンの発生は成功しなかった.合成したシリルボランのケイ素-水素結合,およびホウ素-水素結合が金属錯体と反応し得ることに着目し,数種の金属錯体との反応を試みた.6属金属ヘキサカルボニルとの光反応では,光照射によって生じた空の配位座に,シリルボランがホウ素-水素結合を通して金属に配位した,「ボランσ錯体」の生成が分光学的に確認されたが,この生成物は,おそらくホスフィンの立体障害のために単離できる安定性を持っていなかった.また金属上にアルキル基を有する鉄,タングステン,およびモリブデン錯体との反応では,シリルボランのケイ素-水素結合が金属に酸化的付加し,続いてアルキル基が脱離した,シリル錯体の生成が確認された.この化合物は,電気的に極めて陽性なボリル基を含むシリル錯体として,その反応性に興味がもたれる.現在この化合物の単離・同定を行なっている.また今後,スタニルボランの合成を行なうと共に,シリルボランと様々な遷移金属錯体(これまでに我々がホウ素化合物,ケイ素化合物と反応することを見い出している錯体を中心に)との反応を行なっていく予定である.
新規な一時的保護基を用いる糖誘導体の合成

今年度は、平林らによって見いだされた新規リン酸化糖脂質(FEBSLett.,2001,497,141-147)の合成研究を更に発展させた。この化合物はヒト臍帯血から見いだされ、グルコースがボスファチジン酸に結合した構造(ボスファチジルグルコシド:PG)が提唱されている。また、そこから一つのアシル基が外れたリソ体も極めて興味深い活性を有することが示唆されている。PGおよびそのリソ体(Lyso-PG)の研究を行う上で、その安定性が重大なネックになっている。それをふまえ、安定性の向上が見込まれる種々の類縁体のデザインと合成もあわせて行った。研究実施内容は以下の通り:1)不飽和脂肪酸を有するものを含め、一般性の高いPGの合成法を確立した。過年度に検討したグルコースのアセチル基を選択的に除去する条件を更に最適化し、望む生成物を再現性よく得ることができるようになった。2)合成したPGとその酵素的脱アシル化によって得られるLyso-PGのNMR解析およびモデリングを行った。それにより、特徴的な分子内水素結合の存在が示唆された。3)一部グリセロール部位のラセミ化が進行している問題点も、新規合成ルートの開発により完全に解決した。4)エステル結合をエーテル結合、アミド結合に置き換えた類縁体蛍光ラベル化誘導体、樹脂に固定化するための脂肪酸部分の官能基化についても成功した。5)これらのプローブを用いて、生物学的、神経科学的検討や抗体作成の試みが共同研究により進行している。合成研究、共同研究の成果、ともに現在論文投稿準備段階にある。今年度は、平林らによって見いだされた新規リン酸化糖脂質(FEBS Lett.,2001,497,141-147)の本格的な合成研究を行った。脂質マイクロドメイン(ラフト)を形成して細胞内シグナル伝達に関与することが明らかにされつつあり、その機能解明に興味が持たれる、昨年度、脂肪酸部分が全て飽和された構造をもつ類縁体について合成研究を行い、基本的な合成戦略を確立した。これを用い、ホスファチジルグルコシドの合成を完成させた。本物質のNMRデータから、以前に報告されていた構造を証明した。今年度は更に不飽和脂肪酸を有するPGの合成を試みた。すなわちグルコースからt-ブチルオルトエステルを経由して得られる亜リン酸化グルコース誘導体を用いて、ピバリン酸クロリドを活性化剤として不飽和ジアシルグリセロールとの縮合を行った。得られた生成物を更にヨウ素で酸化しリン酸ジエステルとした。昨年度検討したグルコースのアセチル基を除去する条件を用い、望む生成物を得た。なお、上記検討の過程において一部グリセロール部位のラセミ化が進行していることが見出されたので、新たな合成経路で光学的に純粋なジアシルグリセロールを合成した。また、エステル結合をエーテルに置き換えた類縁体、光プローブ化誘導体、樹脂に固定化するための脂肪酸部分の官能基化について基礎検討を行った。
口腔癌の病因因子についての日本とロシア(シベリア地方)間の地理病理学的比較研究

口腔癌の臨床病理像には国により地方により差がみられるが、以下の研究を始める第一歩として口腔癌の多数例についての地理病理学的研究を行う。口腔癌の発生は外因性因子が作用して起こるが、まだその明確なものは同定されていない。今回の研究は口腔癌の発生を腫瘍ウイルスであるヒトパピローマウイルス(HPV)の面から、口腔内多発癌および口腔癌と喉頭癌の重複癌についてはloss of heterozygosity(LOH)を用いて検討した。HPVには多種類あるので、HPV・DNAがロシア人・中国人・沖縄住民の口腔癌でどのような頻度で,またどのような型が多いかを検討し、すでにデータが得られている私達の日本人の口腔癌に関するデータと比較して口腔癌の起こり方を検索した。口腔癌は前癌性病変である白板症などの病変から発生するときは多発するととが知られており、field cancerizationの概念として提唱されている。これは外来性因子か口腔粘膜を広い範囲にわたって癌発生の準備状態にするためと考えられる。日本人の口腔癌を用いてマイクロディセクション法によるLOHを用いて、多発癌を起こす機序を癌抑制遺伝子の面から検索した。口腔癌と喉頭癌が重複して発生することがよく知られているが、その機序はよく分かっていない。LOHを用い、日本人とロシア人で比較しながら検索している。1)白板症の癌化の過程でどのような遺伝学的な変化が起こっているのかを明らかにする為に、われわれは白板症とその後に発生した初期癌のパラフィン包埋ブロックを用いてマイクロディセクションし、^<32>Pでラベルした33個のマイクロサテライト・マーカーでPCR-based LOH解析を行った。白板症で最も高い頻度でLOHがみられた染色体は9p21で、66.7%であった。次は3p14-25の61.5%,4q31-32の45.5%と17p12-14の44.4%であった。白板症中の初期癌化巣で最も高い頻度でLOHがみられた染色体は9p21で、91.7%であった。次は3p14-25の76.9%、4q31-32の54.5%、17p12-14の66.7%、5q21-23の50%、6p25-27の44.4%、6q21-23の40%と11q23の40%であった。(in submittion)2)60例の口腔内に生じた節外性リンパ腫と顎下・頚部に生じた節性リンパ腫の臨床病理像を比較した。(Oral Med.Pathol.5:15-23,2000)口腔癌の臨床病理像には国により地方により差がみられるが、以下の研究を始める第一歩として口腔癌の多数例についての地理病理学的研究を行う。HPVには多種類あるので、HPV・DNAがロシア人・中国人・沖縄住民の口腔癌でどのような頻度で、またどのような型が多いかを検討し、すでにデータが得られている私達の日本人の口腔癌に関するデータと比較して口腔癌の起こり方を検索した。口腔癌は前癌性病変である白板症などの病変から発生するときは多発することが知られており、field cancerizationの概念として提唱されている。これは外来性因子が口腔粘膜を広い範囲にわたって癌発生の準備状態にするためと考えられる。
津軽半島における大気バイオエアロゾル観測：リンゴ感染症原因菌監視システムの構築

研究代表者らのこれまでの実績として、代表者小林(環境生物工学)、分担者當房(大気物理化学)、連携研究者牧(バイオエアロゾル学)、岩坂(大気物理学)は、以前から大気バイオエアロゾル(大気浮遊微生物)の研究をともに実施しており、黄砂付着バイオエアロゾル等の採集と生物分析を行ってきた。研究代表者らの所属機関、弘前大学のある津軽半島地域(青森県)において、リンゴは地域に特有な最も重要な農資源であり、日本においても、特に東アジアを対象とした重要な輸出農作物の一つである。しかしながら、平成28年6月頃、津軽半島地域において、胞子を形成する糸状菌が原因のリンゴ黒星病の感染被害が報告され、感染症原因菌の大気を介した拡散が問題となっている。本研究課題実績として、定点観測など大気バイオエアロゾルを採集・生物分析し、分担者の佐野(植物病理学)とともにリンゴ感染症原因菌の探索と濃度を測定を試みる。さらに、分担者の島田(気象学)とともに風向・風速の気象シミュレーションから拡散する地域を予測する。本研究課題実績は、リンゴ感染症の拡大の防止や農薬散布の適時化と軽減のために、大気バイオエアロゾル学、リンゴ病理学、気象学、大気物理化学(氷晶活性:霜沈着)などの研究者が一同に会して、感染症原因菌の観測と拡散地域予測を実施・検討することにある。本研究課題実績のアウトプットは、津軽半島地域特有の農資源リンゴの機能性活用するための社会システム研究およびリンゴ栽培等個性豊かな津軽半島地域社会形成を支える技術基盤開発である。2018年度に津軽半島地域において大量発生した黒星病(病原菌名Venturia inaequalis)の大気バイオエアロゾル採集を実施した。採集場所は、弘前大学農園、理工学2号館11階踊り場、リンゴ倉庫、日本海上(南極観測船(砕氷艦)しらせ訓練航海船上)で行った。2018年度に実施した多くの大気バイオエアロゾルサンプルから、2018年度に大量発生した黒星病の原因菌であるVenturia inaequalisをターゲットとした生物分析をメタゲノム解析法と分離培養同定解析法を用いて行う。(1)研究打ち合わせ研究者それぞれの役割分担や計画について研究打ち合わせを行った。弘前大学所属の代表者小林と分担者佐野および島田は、採択発表後、弘前にて行った。弘前大学以外の分担者の當房は代表者の小林が當房の所属する国立極地研究所にて打ち合わせを行い、連携研究者の牧と岩坂は、それぞれ都合のつく日時に弘前に来ていただき、上記研究打ち合わせを行った。(2)大気バイオエアロゾル定点観測システムの確立現在市販されている大気バイオエアロゾル観測装置、微生物センサおよびリアルタイム浮遊菌カウンタを購入し、弘前市において2番目に高い建物である弘前大学理工学部2号館屋上に設置し、研究開始半年後から定点観測を検討した。平成29年度の設備備品はこれらの大気バイオエアロゾル計測装置購入にあてた。2号館屋上には、風速や気温などの気象観測装置類が設置してあり、設置許可などの問題はなかったが、ドラフトチェンバーなどが設置されているため、コンタミの可能性があり、最上階のベランダにて実施することとした。分担者の島田研究室は、同2号館の11階にあり、屋上における定点監視・観測の継続的実施に支障が出た場合、そのまま11階の島田研究室のベランダに監視・観測場所を移動する。また、それらの気象データとともに研究代表者現有のエアロゾル計測装置(OPC)も設置し、大気バイオエアロゾルのみならず、気象データも含めた定点観測システムを設置・検討した。自家蛍光を測定し、大気バイオエアロゾル濃度を想定できる装置を購入し、弘前で二番目に高い弘前大学理工2号館最上階にてサンプリング・観測する体制を整えた。また、自由対流圏の大気バイオエアロゾル採集のための準備として、無人機用の大気バイオエアロゾルサンプラーの開発も実施した。さらに、そのサンプリングのために鯵ヶ沢における現地調査と交渉を行った。

採集場所は、弘前大学農園、理工学2号館11階踊り場、リンゴ倉庫、日本海上(南極観測船(砕氷艦)しらせ訓練航海船上)で行った。昨年度実施した定点観測(弘前大学理工2号館)および自由対流圏サンプリングのための鯵ヶ沢における事前交渉と準備を整える。2018年度に実施した多くの大気バイオエアロゾルサンプルから、2018年度に大量発生した黒星病の原因菌であるVenturia inaequalisをターゲットとした生物分析をメタゲノム解析法と分離培養同定解析法を用いて行う。初年度として観測装置・サンプリング装置の購入・準備、サンプリング地点の交渉を行い、観測を開始する計画であったが、観測の開始が次年度に繰り越されたため、フィルターやフィルターホルダー、分析に関する消耗品経費が次年度に繰り越された。次年度使用額が生じた理由は、2018年に本研究課題であるリンゴ感染症である黒星病が大発生して、そのサンプリングに追われ、生物分析などの解析が行えなかったことである。使用計画は、2019年も黒星病の発生が予測されており、そのサンプリングと生物分析に用いる。
eラーニング連携型SNSの開発とそれを用いた家庭学習支援地域コミュニティの形成

家庭学習を支援する地域コミュニティの形成について、学習課題、協力の得やすさ、効果、効率、個人情報保護、安全などの面から検討を重ね、実行可能性と持続可能性の高いモデルを探った。当初考えていた不特定多数の住民参加を織り込んだ開放的なモデルは、検討の結果、安全面や運用面などで課題が多いことが明らかになった。そのため、学校のクラスをコミュニティの基本単位とすることにして学習者集団である児童に支援者集団である担任と保護者を加えたモデルを考えた。そして、平成22年度は新教育課程への対応としてそれまでの習得型学習支援に加え活用型や探究型学習の支援をも視野に入れたシステムのプロトタイピングを行った。今回のプロトタイプでは、(1)習得・活用・探究型学習の支援、(2)学習状況のモニタリング支援、(3)情報のフィルタリング、(4)ポイント制を用いた協力促進などに対応した。研究協力校の協力を得てインスペクション法で評価した結果、プロトタイプは改良の余地が残されていることが明らかになった。学習のタイプ(習得型、活用型、探究型)の違いにより、児童、教員、保護者などの間での情報の流れや交流・支援のあり方を変えていく必要があるが、その方法論の検討が不十分でインストラクショナルデザインをベースにした再吟味が必要であった。また、年度更新に対応できるユーザ管理のあり方についても検討が必要であった。システムの完成度が不十分であったため、試行は小規模で実験的なものに留めざるをえなかった。しかし、教育支援におけるSNS活用の可能性と課題については確認でき、今後の研究へと繋げる見通しを得ることができた。家庭学習を支援する地域コミュニティ(実践共同体)のあり方について、協力の得やすさ、効果、効率、個人情報保護、安全などの面から検討を重ね、実行可能性の高いモデルを探った。その結果、当初の計画で想定していたような不特定多数の住民参加を織り込んだ開放的なモデルは課題が多いことが明らかになった。そこで、学校のクラスをコミュニティの基本単位とすることにして、学習者集団である児童に、支援者集団である担任と保護者を加えたモデルを考えて行くことにした。そして、コミュニティ内での情報の流れや交流・支援のあり方を、児童:児童、児童:教師、児童:その児童の保護者、児童:他の児童の保護者、教師:保護者、保護者:保護者などの場合にわけて分析・整理した。以上の検討を踏まえて、eラーニング連携型SNSシステムの仕様設計とプロトタイピングを行った。本プロトタイプは、オープンソースのOpenPNE Usagiをベースとしており、通常のSNSに加えて以下の機能を備えている。(1)eラーニング連携、(2)モニタリング/フィルタリング、(3)学習ポイント加算先で述べたように、同じコミュニティのメンバーであっても児童、教員、保護者など立場の違いによって上述のように情報の流れや交流・支援のあり方を変えていく必要がある。このような機能を既存のSNSシステムは備えていないため、それをシステムにどのように取り込み実装していくかを課題として、現在、プロトタイプの改良を行っている。平成20年度に引き続き、家庭学習を支援する地域コミュニティ(実践共同体)のあり方について、協力の得やすさ、効果、効率、個人情報保護、安全などの面から検討を重ね、実行可能性の高いモデルを探った。不特定多数の住民参加を織り込んだ開放的なモデルは課題が多いことが明らかになっていたため、学校のクラスをコミュニティの基本単位とすることにして、学習者集団である児童に、支援者集団である担任と保護者を加えたモデルを考えた。そして、コミュニティ内での情報の流れや交流・支援のあり方を、児童:児童、児童:教師、児童:その児童の保護者、児童:他の児童の保護者、教師:保護者、保護者:保護者などの場合にわけて分析・整理し、システムの構想を練り、プロトタイピングを行った。現在、通常のSNSに加えて以下の機能を備えたものを開発中である。(1)eラーニング連携、(2)モニタリング/フィルタリング、(3)学習ポイント加算同じコミュニティのメンバーであっても児童、教員、保護者など立場の違いによって上述のように情報の流れや交流・支援のあり方を変えていく必要がある。このような機能を既存のSNSシステムは備えていないため、それをシステムにどのように取り込み実装していくかを課題としてプログラムの改良を続けているが、依然として改善の余地は大きいと感じている。実行性の高いシステムの完成を目指して努力を続けているところである。

学習のタイプ(習得型、活用型、探究型)の違いにより、児童、教員、保護者などの間での情報の流れや交流・支援のあり方を変えていく必要があるが、その方法論の検討が不十分でインストラクショナルデザインをベースにした再吟味が必要であった。また、年度更新に対応できるユーザ管理のあり方についても検討が必要であった。システムの完成度が不十分であったため、試行は小規模で実験的なものに留めざるをえなかった。しかし、教育支援におけるSNS活用の可能性と課題については確認でき、今後の研究へと繋げる見通しを得ることができた。
超臨界二酸化炭素中の新規な光触媒反応の開発と解析

本研究は、超臨界二酸化炭素を溶媒として用い、新規な光触媒反応系を探索し解析することを目的とする。このため、内部攪拌可能な高圧光照射セルを試作し、光還元反応系と酸化反応系を検討した。まず超臨界二酸化炭素/水/TiO_2触媒系での二酸化炭素の光還元反応を検討したが、顕著な効果が今のところ認められておらず研究を続行している。ついで、低温におけるレーザー励起によるシクロヘキサンの自動酸化系を超臨界二酸化炭素媒体中で検討した。このため、高圧における基質および酸素、さらに基質-酸素の相互作用下における超臨界二酸化炭素中の光吸収挙動、共存する水による媒体物性の変化、触媒の溶媒状態、および触媒自身の光吸収や相平衡への影響、反応の進行に伴う相挙動の変化などに観点を起きつつ検討を進めた。照射用の光源としてはKrFエキシマーレーザーを用いた。シクロヘキサンと酸素を含む高圧二酸化炭素の光吸収は系の圧力の影響を強く受け、100atm程度の圧力下の光吸収は主に酸素のヘルツベルグ帯への吸収であると判明した。反応の主要生成物はシクロヘキサン、シクロヘキサノンである。全圧の増加にともない生成物収量が増加するが、これは主に光吸収量の増加のためであり、光量子収率は大略0.2程度であった。これはエチレンなどの量子収率の数倍であり、基質にによる反応性の差異があることが明らかとなった。さらにコバルト塩を中心として触媒添加効果を検討したが、今のところ顕著な効果は得られていない。さらに温度を上昇させるなどの条件変化を試みている。本年度の結果では顕著な触媒効果は見いだせていないものの、系における酸素や基質の光吸収挙動を考えあわせ、超臨界二酸化炭素が一つの溶媒系となり得ることを明らかにした。
生体内遺伝子導入による難治性血管病の分子病態解明と局所遺伝子療法の開発

生体内遺伝子導入法を用いて傷害血管壁における炎症性増殖性病変の分子病態解明と新規治療法の開発を目的とした。4.血管新生因子Angiopoietin-1を局所導入すると抗炎症・抗血栓作用が発揮された。新規のスタチンの慢性および急性投与により抗炎症・抗血栓作用が発現した。現在その分子機構を解析中である。5.糖尿病性傷害血管壁では細胞外マトリクスの沈着が亢進している。可溶型TGF-β受容体を導入してTGF-βの作用を阻害すると、炎症性増殖性病変が消失した(投稿準備中)。6.細胞内信号伝達分子の機能を抑制できる変異体を用いて不全心筋の信号伝達機構を解析した。生体内遺伝子導入法を用いて傷害血管壁における炎症性増殖性病変の分子病態解明と新規治療法の開発を目的とする。今年度は、(i)血管壁に傷害が加わった時最初に起る反応である血栓を抑制するために、組織因子の生理的拮抗分子であるTFPI(Tissue factor pathway inhibitor)に着目した。遺伝子導入では傷害直後の血栓を抑制できないため、組換え蛋白と遺伝子導入の併用療法の有用性を検証した。組換えTFPI蛋白を病変局所に20分間灌流すると24時間後でも傷害血管壁の組織因子活性は抑制されていた。24時間以降は遺伝子導入したTFPIの効果が出現した。それぞれ単独でも内膜肥厚を抑制したが、両者を併用すると相加効果が認められた。組換えTFPI蛋白と遺伝子導入の併用は実用的な抗血栓戦略である。(ii)TFPIやCNP(C-type natriuretic peptide)遺伝子を導入した線維芽細胞と生体材料を複合したハイブリッド型細小人工血管では抗血栓性が出現した。(iv)細胞外マトリクス蓄積が内腔狭窄と血管弛緩機能喪失の大きな原因である可能性がある。細胞外マトリクス産生を抑制するため細胞内キナーゼ活性を欠失した変異型TGF-受容体(野生型受容体機能を抑制)、さらに細胞外領域のみの可溶型受容体を作製し、その有用性を肝線維症モデル他で確認した。来年度は傷害血管壁における線維化の意義を検討する。(i)CNP(C-type natriuretic peptide)遺伝子を導入すると細胞増殖抑制活性は弱いにもかかわらず極めて強い内膜肥厚抑制効果をラット頚動脈およびブタ冠動脈で観察した。CNPには抗血栓・抗炎症作用があるとの仮説を検証した。ウサギ頚動脈にバルーン傷害を加え同時にCNPを導入して7日後(炎症反応が最大となる時期)、血管を狭窄してシアストレスを加えると対照血管では血栓の形成とその解離が観測されるが、CNP導入血管では血栓形成は完全に抑制された。エピネフリン存在下でもその抑制効果は影響を受けなかった。接着分子ICAM-1,VCAM-1の発現およびマクロファージの浸潤で血管壁の炎症を評価するといづれの指標もCNP導入血管では強く抑制された。傷害が加わるとiNOS(inducible nitric oxide synthase)の発現が誘導されるが、CNP導入血管ではその誘導がさらに亢進し、その結果NO産生量が約2倍に上昇した。NO産生抑制剤を投与すると、抗血栓作用も抗炎症作用も消失した。以上から、CNP遺伝子を傷害血管壁に導入するとCNPの直接作用に加えて、iNOS発現が亢進し(その分子機構は不明)NO産生が増加して、主に同系を介して抗炎症・抗血栓作用を生じることが明らかとなった。CNP遺伝子導入の有用性をさらに支持する結果となった。(論文投稿中)生体内遺伝子導入法を用いて傷害血管壁における炎症性増殖性病変の分子病態解明と新規治療法の開発を目的とする。(i)血小板活性化因子水解酵素(PAF-AH : Platelet activating factor acetylhydrolase)はPAFのみならずPAF様のリン脂質を不活性化する。糖尿病動物の傷害血管壁に遺伝子導入すると強力な抗炎症・抗血栓作用が発揮された。この抑制作用はカテコラミン負荷でも消失せずNOにも依存していなかった。血清内の酸化脂質プロフィールには変動がなく、血管壁内のLDLの総量にも変化がなかったが酸化LDLが有意に減少していた。糖尿病性傷害血管壁(コレステロール負荷は加えていない)における酸化脂質の存在が明らかになるとともにその病的意義が示唆される結果である。PAF-AHの局所導入法はすぐれた治療法となる可能性がある(投稿準備中)。現在これらの治療効果の分子基盤を検討中である。(ii)

血管新生因子であるAngiopoietin-1を局所導入すると抗炎症・抗血栓作用が発揮された。新規のスタチンの慢性および急性投与により抗炎症・抗血栓作用が発現した。現在これらの作用の分子機構を解析中である。(iii)細胞外マトリクス蓄積が内腔狭窄と血管弛緩機能喪失の大きな原因である可能性がある。とくに糖尿病性傷害血管壁では細胞外マトリクスの沈着が亢進している。可溶型TGF-β受容体を用いて治療効果の判定とその分子機構を解析した(投稿準備中)。(iv)細胞内信号伝達分子を抑制できる変異体を組み込んだアデノウイルスを利用して不全心筋の信号伝達機構を解析した。
トマト野生種の自家不和合性遺伝子導入による新遺伝子型トマトの開発に関する研究

本研究は,遺伝子導入法により植物の生殖様式を遺伝的に制御し,自家和合性の栽培植物を自家不和合性に形質転換することによって,従来一部の植物に限定されていたハイブリッド種子の生産をより広範な植物に応用するための技術を開発することを目的としている.トマト野生種が属するナス科植物は配偶体型自家不和合性を有し,この自家不和合性は1遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって支配されている.このS遺伝子には,雌蕊で特異的に発現するリボヌクレアーゼ(S-RNase)がコードされており,トマト野生種からS-RNaseのcDNAクローンやゲノミッククローンが得られている.本研究では,アグロバクテリウム法によってS-RNase遺伝子を栽培種トマトに導入して得た形質転換体における導入遺伝子の発現を解析した.また,栽培種トマトにおける自家和合性の遺伝的要因を明らかにするため,トマト栽培種と野生種の交雑後代における自家不和合性形質の遺伝的分離ならびに雌蕊におけるS-RNaseの発現とその酵素活性について調査した.その結果,S-RNase遺伝子を導入したトマト栽培種の形質転換体において,ノーザンおよびサザン解析からS-RNase遺伝子がシングルコピーとしてトマトゲノム内に導入されており,雌蕊の花柱で特異的に発現していることが確認された.しかしその発現レベルは野生種と比べてかなり低いことから,本研究で用いたS-RNase遺伝子のプロモータ領域には発現を促進するエンハンサー領域が含まれていないものと推察された.トマト品種の雌蕊におけるS-RNase活性を調べた結果,その活性がほとんど検出されないことから,トマト栽培種の自家和合性はS-RNase遺伝子の発現が抑制されているためと推察された.また,トマト栽培種と野生種の交雑後代(BF1)においては,自家不和合性個体と自家和合性個体がおよそ1:1で分離しており,トマト栽培種の遺伝的背景を持ち自家不和合性のトマト品種を交配育種法によっても育成することができる可能性が示唆された.本研究は,遺伝子導入法により植物の受精様式を遺伝的に制御するための技術開発を目的としており,自家和合性の植物を自家不和合性に形質転換することにより,従来一部の植物に限定されていたハイブリット種子の生産が,より広範な植物にも適用できる可能性がある.トマト野生種Lycopersicon peruvianumは配偶体型自家不和合性を有し,その雌蕊で発現しているリボヌクレアーゼ(S-RNase)が自己花粉管の伸長阻害に関与していることが明らかにされている.本年度においては,このトマト野生種の花柱cDNAライブラリーからスクリーニングして得たS6とS7-RNaseのcDNAクローンを用いて,センスとアンチセンスcDNAをバイナリーベクターのT-DNA領域に挿入した.また,S-RNaseのプロモーターを得るため,それぞれの5'上流域に相当するゲノムシークエンスを得て,これらの塩基配列の解析を行なった.さらに,これらS-RNaseプロモーターの発現強度や発現組織特異性を明らかにするため,レポーター遺伝子(GUS)を連結し形質転換体を得る実験が進行中である.トマト栽培種ではアグロバクテリウムによる遺伝子導入法が既に確立されているが野生種L.peruvianumではまだ実験例が少ないことから,本年度においてはこの野生種における効率的な形質転換系の開発をおこなった.その結果,この野生種においても栽培種と同程度の形質転換体が効率的に得られることが明らかになった.今後は,構築したバイナリーベクターを用いてトマトの栽培種ならびに野生種へのS-RNase遺伝子の導入を行ない,得られた形質転換体における自家不和合性形質の発現を解析する予定である.本研究は,遺伝子導入法により植物の生殖様式を遺伝的に制御し,自家和合性の栽培植物を自家不和合性に形質転換することによって,従来一部の植物に限定されていたハイブリッド種子の生産をより広範な植物に応用するための技術を開発することを目的としている.トマト野生種が属するナス科植物は配偶体型自家不和合性を有し,この自家不和合性は1遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって支配されている.このS遺伝子には,雌蕊で特異的に発現するリボヌクレアーゼ(S-RNase)がコードされており,トマト野生種からS-RNaseのcDNAクローンやゲノミッククローンが得られている.本研究では,アグロバクテリウム法によってS-RNase遺伝子を栽培種トマトに導入して得た形質転換体における導入遺伝子の発現を解析した.また,栽培種トマトにおける自家和合性の遺伝的要因を明らかにするため,トマト栽培種と野生種の交雑後代における自家不和合性形質の遺伝的分離ならびに雌蕊におけるS-RNaseの発現とその酵素活性について調査した.その結果,S-RNase遺伝子を導入したトマト栽培種の形質転換体において,ノーザンおよびサザン解析からS-RNase遺伝子がシングルコピーとしてトマトゲノム内に導入されており,雌蕊の花柱で特異的に発現していることが確認された.しかしその発現レベルは野生種と比べてかなり低いことから,本研究で用いたS-RNase遺伝子のプロモータ領域には発現を促進するエンハンサー領域が含まれていないものと推察された.トマト品種の雌蕊におけるS-RNase活性を調べた結果,その活性がほとんど検出されないことから,トマト栽培種の自家和合性はS-RNase遺伝子の発現が抑制されているためと推察された.

また,トマト栽培種と野生種の交雑後代(BF1)においては,自家不和合性個体と自家和合性個体がおよそ1:1で分離しており,トマト栽培種の遺伝的背景を持ち自家不和合性のトマト品種を交配育種法によっても育成することができる可能性が示唆された.本研究は,遺伝子導入法により植物の受精様式を遺伝的に制御し,自家和合性の植物を自家不和合性に形質転換することにより,従来一部の植物に限定されていたハイブリット種子の生産をより広範な植物に適用するための技術開発を目的としている.トマト野生種Lycopersicon peruvianumは配偶体型自家不和合性を有し,その雌蕊で発現しているリボヌクレアーゼ(S-RNase)が自己花粉管の伸長阻害に関与していることが明らかにされている.本年度は,トマト野生種の花柱cDNAライブラリーからスクリーニングして得たS6とS7-RNaseのcDNAクローンを用いて,センスとアンチセンスcDNAをバイナリーベクターのT-DNA領域に挿入し,栽培種のトマト品種に遺伝子導入を行なった.また,野生種L.peruvianumについても同様な遺伝子導入実験を行なった.これらの遺伝子導入組織から植物体の分化が認められ,現在試験管内培養で生育中である.今後,これら形質転換体について導入遺伝子の発現や自家不和合性形質の変化について調査する予定である.また栽培種のトマト品種において,花柱におけるS-RNase蛋白質の検出を行ない,この花柱蛋白質ではリボヌクレアーゼ活性が低いことを明らかにし,トマト栽培品種が自家和合性であるのはこのためであることが判明した.さらに,トマト栽培品種と自家不和合性のトマト野生種との交配後代における遺伝子分析から,自家和合性個体と不和合性個体の分離が認められ,自家和合性をもたらす遺伝的要因が存在することが示唆された.これらの要因を明らかにするため,トマト栽培品種からS-RNase蛋白質をコードする遺伝子の単離を行ない,その遺伝子の構造解析を現在行なっている.本研究は,遺伝子導入法により植物の生殖様式を遺伝的に制御し,自家和合性の栽培植物を自家不和合性に形質転換することによって,従来一部の植物に限定されていたハイブリッド種子の生産をより広範な植物に応用するための技術を開発することを目的としている.トマト野生種が属するナス科植物は配偶体型自家不和合性を有し、この自家不和合性は1遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって支配されている.このS遺伝子には,雌蕊で特異的に発現するリボヌクレアーゼ(S-RNase)がコードされており,トマト野生種からS-RNaseの_cDNAクローンやゲノミッククローンが得られている.本研究では,アグロバクテリウム法によってS-RNase遺伝子を栽培種トマトに導入して得た形質転換体における導入遺伝子の発現を解析した.また,栽培種トマトにおける自家和合性の遺伝的要因を明らかにするため,トマト栽培種と野生種の交雑後代における自家不和合性形質の遺伝的分離ならびに雌蕊におけるS-RNaseの発現とその酵素活性について調査した.その結果,S-RNase遺伝子を導入したトマト栽培種の形質転換体において,ノーザンおよびサザン解析からS-RNase遺伝子がシングルコピーとしてトマトゲノム内に導入されており,雌蕊の花柱で特異的に発現していることが確認された.
オミックス解析によるイネのいもち病侵入抵抗性関連因子の探索

イネといもち病菌の相互関係において、侵入は宿主特異性を決定する最も重要な段階である。イネの侵入抵抗性は重要な防御応答であるが、その機構には不明な点が多い。本研究では、イネに対して病原性および非病原性のいもち病菌のゲノム構造を次世代シークエンサー解析により比較し、いもち病菌を接種したイネのトランスクリプトームおよびプロテオームを比較解析した。この結果、我々はいくつかの重要因子候補を特定することに成功した。これらの成果は、イネに強力な耐病性を付与するための基礎的知見となることが期待される。昨年度の結果から、イネいもち病菌(イネ菌)とキビいもち病菌(キビ菌)はゲノム構造が類似しているにもかかわらず、宿主特異性は厳密に決まっており、キビ菌はイネ葉鞘細胞に全く侵入できないことが明らかにされている。ところが、イネ葉鞘を長軸方向に切断処理すると、約20%のキビ菌が侵入可能となり、イネ組織内に感染菌糸を進展させることが今年度の研究から明らかになった。この現象には傷害刺激関連ホルモンが関与すると推定し、傷害応答に関与するエチレンの前駆体(ACC)およびジャスモン酸とともに、その他植物ホルモンがイネへのキビ菌侵入を可能にする作用を有するか否かを検討した。この結果、傷害応答関連ホルモンは全く効果を示さなかったのに対して、意外なことにサイトカイニンがこの効果を有することが明らかになった。これらの結果から、サイトカイニンがイネへのいもち病菌侵入を助長する可能性があると考え、イネ菌あるいはキビ菌を接種18時間後のイネにおけるトランスクリプトームを解析し、サイトカイニン関連遺伝子の発現変化を検討した。この結果、サイトカイニンの1つであるcis-zeatinの不活化に関わるcis-zeatin O-glucosyltransferase(cZOGT)をコードする遺伝子がイネ菌接種時特異的に発現誘導されることが明らかになった。さらに、いもち病菌がイネに侵入可能となる条件下(イネ菌接種、切断処理およびcis-zeatin処理)において、いずれの場合にも同様にcZOGTの発現が顕著に誘導されることが明らかになった。以上の結果から、サイトカイニンは、いもち病菌の侵入を助長する作用を持ち、イネ菌およびキビ菌の宿主特異性を決定する因子の1つである可能性が高いと考えられた。今年度は、昨年度に引き続き、ゲノム構造が酷似しているにもかかわらず宿主特異性が厳密に決まっているイネいもち病菌(イネ菌)とキビいもち病菌(キビ菌)をイネに接種し、プロテオームおよびトランスクリプトーム解析を行った。この結果、イネ菌あるいはキビ菌を接種したイネにおけるトランスクリプトームの比較により、宿主因子である可能性が知られているトランスポーターのホモログの1つに関して、遺伝子発現がイネ菌接種により上昇する事が明らかになった。いもち病菌接種におけるこの遺伝子発現の変化をreal-time PCRにより定量的に確認したところ、イネいもち病菌を接種した時にのみ発現が有意に上昇する事が確認された。この結果から、この輸送タンパク質は本来の機能に加えて、病原菌によって発現誘導され、感染に必要な栄養源を獲得するために利用される宿主因子である可能性が強く示唆された。さらに、イネ菌あるいはキビ菌を接種したイネよりタンパク質を抽出し、2次元電気泳動によって発現するタンパク質を比較するプロテオーム解析を行ったところ、高い再現性で発現に顕著な差異のあるタンパク質が少なくとも16個見出された。このうち、4つは同一遺伝子由来のペプチド断片を含むタンパク質であり、根粒菌の共生関係成立に重要な役割を果たすことが知られている膜タンパク質であることが明らかになった。このタンパク質は、いずれの菌を接種した場合にも発現が変動し、2次元電位泳動により異なるスポットとして同定されることから、何らかの修飾を受けていると推定された。このタンパク質の機能は今後さらに詳細に検討する必要がある。3年間の研究から得られた知見は、いずれもイネいもち病を感染初期段階で阻止する強力な耐病性をイネに付与できる可能性を秘めており、耐病性イネ作出のための有力な方策となることが期待される。宿主の異なるいもち病菌5菌群(Magnaporthe oryzae;イネ菌、アワ菌、キビ菌、シコクビエ菌およびM. grisea;メヒシバ菌)の計6菌株について次世代シーケンサーを用いたリシーケンス解析を行った。イネ菌株KEN53-33、84-10Bの2菌株と参照ゲノムである70-15(MG8)を比較すると、SNPを含む遺伝子の割合がそれぞれ全遺伝子の11.1、10.6%と低かった。イネ菌株同士の場合と比較して、アワ菌(37.9%)、キビ菌(34.3%)由来のM.oryzaeではSNPの割合が高かった。

さらにシコクビエ菌(61.8%)メヒシバ菌(73.7%)では極めて多くの遺伝子にSNPが確認された。これに加えて、各菌株のゲノム解析から得られた8つのハウスキーピング遺伝子配列を用いた系統解析の結果から、キビ菌がイネ菌に最も近い菌群と考えられたことから、アワ菌を用いる計画を変更して以後の解析をキビ菌を用いて行うこととした。ゲノム解析の結果を用いて、イネ菌株では保存されている一方、他の全菌株で共通に欠失していた遺伝子を探索したところ、40の遺伝子がこれに該当し、この中にはAvr-PitaやBAS1等のエフェクタータンパク質をコードする重要遺伝子が含まれていた。したがって、これらの遺伝子には、イネ菌の宿主特異性に関与する因子が含まれている可能性が考えられる。さらに、世代シーケンサーによるイネの遺伝子発現応答を解析する前段階として、イネ菌またはキビ菌を接種したイネにおける転写物をマイクロアレイによって解析した。この結果、イオントランスポーター、転写因子および抗菌性タンパク質をコードする複数の遺伝子がキビ菌接種によって特異的に発現上昇することが明らかになった。今後、これらの結果との整合性を確認しながら次世代シーケンサーによる転写物解析を行う必要がある。本研究の目的は、植物の強力な防御応答の1つであるにもかかわらず、現在までほとんど未解明のままである植物の侵入抵抗性の分子基盤を明らかにすることである。この目的を達成するため、オミックス解析手法を用いて、侵入抵抗性に関与するイネ側の重要因子を単離するとともに、これらの情報をもとにしてイネいもち病菌がイネの侵入抵抗性を回避する機構の理解を目指している。今年度得られた結果より、非病原性いもち病菌に対するイネの侵入抵抗性は、葉鞘を長軸方向に切断処理することによって打破され、キビ菌の侵入が可能となることが明らかになった。この現象を手掛かりとして、イネの侵入抵抗性を打破することに関与する因子を探索したところ、植物ホルモンの1つであるサイトカイニンの関与が強く示唆された。さらに、サイトカイニンはイネ菌がイネに侵入する際にも蓄積が誘導されることが明らかになり、サイトカイニンは宿主特異性を決定する重要な因子である可能性が示された。これらの結果から、イネ菌の何らかの作用によりイネにサイトカイニンが蓄積され、その結果侵入抵抗性機構が抑制されるものと推定された。以上の結果から、いもち病菌の何らかの作用によって蓄積されたサイトカイニンが侵入抵抗性を打破する可能性が強く示唆された。サイトカイニンのこのような役割はこれまで全く知られておらず、新規の発見である。また、イネ細胞へのサイトカイニンの蓄積は、いもち病菌がイネの侵入抵抗性を回避する機構の1つと考えられ、しかも宿主特異性の決定要因である可能性が高い。さらに解析を進めることにより、本研究の目的であるイネのいもち病侵入抵抗性とイネ菌がそれを回避する機構の分子基盤の重要な一部が確実に明らかにできると考えられる。以上の通り、本年度に実施した研究は概ね計画通りに進行しており、得られた研究成果は本研究の最終的な目標に向けて順調に進展していると言える。本研究の目的は、現在までほとんど未解明のままである植物の強力な防御応答である侵入抵抗性の分子基盤を明らかにすることである。
ヒト乳癌転移の分子機構の解明

CAFsを含めた癌微小環境が、近傍の癌細胞にEMTを誘導し癌細胞の浸潤能を亢進させることにより転移形成を誘導し、遠隔臓器に到達した癌細胞は、METを介してその増殖能を高めることが推測される。しかしながら、申請研究の結果では、CAFsによるEMTの誘導は顕著ではなく、対照的に細胞と細胞の接着促進が転移能の獲得に重要であることを示唆するものであった。今後は数種類の癌細胞を用いて、単一癌細胞がより浸潤しやすく転移しやすいのか、あるいは接着しクラスターを形成している癌細胞が、転移しやすいのか、明らかにする必要がある。また今後のより詳細な分子レベルの解析が必要である。癌の遠隔臓器への転移は癌患者の死亡率の90%に起因する。しかしながら、癌が遠隔臓器に転移するメカニズムは明らかでなく、転移の早期診断法や有効な治療法も乏しい。従来より癌細胞の転移能力の獲得には、癌細胞内に蓄積されたgeneticあるいはepigeneticな変異の蓄積や、変異が入る細胞の起源が重要と考えられてきた。例えば、癌幹細胞などの特定の細胞に変異が入った場合は、より転移が生じ易いと予測されている。また最近の数々の報告は、癌微小環境が癌細胞の転移促進に寄与していることを提案している。癌内微小環境は、血管細胞、炎症免疫細胞や繊維芽細胞などの多数の非癌細胞により構成されている。申請者のグループは、転移能の極めて弱いDCIS(Ductal CarcinomaIn Situ)由来のヒト乳癌細胞株が、マウスに癌内線維芽細胞(Carctnoma-associated fibroblasts;CAFs)と共移植された時、正常の線維芽細胞と共移植された時と比較して、転移が顕著に亢進されることを見出した。転移能の亢進した乳癌細胞には間葉系のマーカーの発現が亢進していることが示唆された。現在、CAFs由来のどんな液性因子が近傍の乳癌細胞に作用して、転移能を亢進させているのか調査している。またCAFsとの相互作用により転移能の亢進した転移癌細胞と、正常線維芽細胞との相互作用により教育された癌細胞の遺伝子プロファイルを比較検討することにより、CAFsで誘導された転移癌細胞の特性を追及中である。癌微小環境が乳癌転移に関して重要な役割を演じていることは多くの研究により示唆されている。申請研究では癌微小環境中に多数存在する癌内線維芽細胞に焦点を絞り研究をすすめた。癌内線維芽細胞が癌細胞の浸潤・転移を促進することを示唆した論文は複数あるが、適切なコントロールベースでin vivoで癌内線維芽細胞の転移促進能を各転移段階で注意深く示した論文はない。今回我々は、高度免疫不全NOD/SCID/γCnull(NOG)マウスを使用したtumour xenogarftの系を用い、CAFsが弱転移性ヒト乳癌細胞と移植された場合、非癌部より抽出された対照線維芽細胞と共移植された場合に比較して、転移が顕著に増加することを観察している。癌内線維芽細胞を有した原発巣に存在する癌細胞は、対照線維芽細胞と共移植された癌細胞と比較して、より浸潤性が高いことが、組織上観察された。またこれらの癌細胞が、顕著に上皮間葉移行を伴っているか否かを調査するために、上皮細胞マーカーであるE-cadherinで免疫染色を試みた。まだ途中経過であるが、両群におけるE-cadherinの発現様式の差はその染色に不均一性があることより、切片上で単純に発現量として比較することが容易ではないことが分かった。今後は上皮間葉移行に関して詳細に調べる為に、間葉系のマーカーであるvimentinなどに対する抗体を用いた免疫組織染色を施行予定である。mesenchymal phenotypeが癌内線維芽細胞により、近傍の癌細胞に教授される可能性も検討する。癌内線維芽細胞と癌細胞の相互作用を媒介して浸潤・転移を促進する因子を同定する。癌の遠隔臓器への転移は癌患者の死亡率の90%に起因するが、そのメカニズムは明らかでなく、転移を有効に治療することは極めて困難である。近年、癌微小環境が癌浸潤・転移に密接に関与し重要な役割を演じていることが明らかになった。申請者はこれまでに癌微小環境の主要な構成細胞である癌内繊維芽細胞(carcinoma-associated fibroblasts; CAFs)に焦点をあて研究を進め、乳癌の浸潤・転移を促進する分子機構を明らかにしてきた。申請研究では、CAFsで誘導されるヒト乳癌転移の分子メカニズムをより詳細に解明しその治療標的を明確にし、癌細胞およびCAFsの両方を標的とする癌浸潤・転移に対する新規の診断や治療の開発に役立てることを目標にした。申請者はCAFsとヒト乳癌細胞を免疫不全マウスに共移植後に成長した癌塊より癌細胞を抽出した。CAFsとinteractionした癌細胞は癌化の過程で、細胞接着能を亢進し浸潤能や転移能を顕著に促進していた。この結果は、CAFsを含めた癌微小環境が癌細胞に上皮間葉移行を誘導し、癌細胞の浸潤・転移能を促進するという現在主流とされる考えと反するものであった。申請研究では、CAFsの乳癌細胞の浸潤や転移における影響を、in vitroおよび動物モデルを使った実験にて検討することを目的にした。

また、CAFsが癌細胞に上皮間葉移行を誘導し、かつ遠隔臓器で間葉上皮移行を起こしている可能性を検討した。結果として、CAFsより促進される乳癌転移は上皮間葉移行に依存していない可能性が示唆された。原因遺伝子やシグナル等に関していは今後の詳細な検討が必要であるが、上皮系の形態を示した乳癌細胞の浸潤・転移機構が示唆された。癌の遠隔臓器への転移は癌患者の死亡率の90%に起因するが、そのメカニズムは明らかでなく、転移を有効に治療することは極めて困難である。近年、癌微小環境が癌浸潤・転移に密接に関与し重要な役割を演じていることが明らかになった。申請者はこれまでに癌微小環境の主要な構成細胞である癌内繊維芽細胞(carcinoma-associated fibroblasts; CAFs)に焦点をあて研究を進め、乳癌の浸潤・転移を促進する分子機構を明らかにしてきた。申請研究では、CAFsで誘導されるヒト乳癌転移の分子メカニズムをより詳細に解明しその治療標的を明確にし、癌細胞およびCAFsの両方を標的とする癌浸潤・転移に対する新規の診断や治療の開発に役立てることを目標にした。申請者はCAFsとヒト乳癌細胞を免疫不全マウスに共移植後に成長した癌塊より癌細胞を抽出した。CAFsとinteractionした癌細胞は癌化の過程で、細胞接着能を亢進し浸潤能や転移能を顕著に促進していた。この結果は、CAFsを含めた癌微小環境が癌細胞に上皮間葉移行を誘導し、癌細胞の浸潤・転移能を促進するという現在主流とされる考えと反するものであった。CAFsを含めた癌微小環境が、近傍の癌細胞にEMTを誘導し癌細胞の浸潤能を亢進させることにより転移形成を誘導し、遠隔臓器に到達した癌細胞は、METを介してその増殖能を高めることが推測される。しかしながら、申請研究の結果では、CAFsによるEMTの誘導は顕著ではなく、対照的に細胞と細胞の接着促進が転移能の獲得に重要であることを示唆するものであった。今後は数種類の癌細胞を用いて、単一癌細胞がより浸潤しやすく転移しやすいのか、あるいは接着しクラスターを形成している癌細胞が、転移しやすいのか、明らかにする必要がある。また今後のより詳細な分子レベルの解析が必要である。原発巣での上皮間葉移行および遠隔臓器での間葉上皮移行は、癌細胞転移の中心的な役割をしていると信じられている。また、癌細胞が細胞接着能を維持したまま、クラスター形成し浸潤・転移するモデルも知られている。今後はCAFsを中心とした癌微小環境がどのようにこれらの癌細胞の浸潤・転移形式に影響するのか、またその分子機構の解析が重要である。またこれらの研究の方向性は今後新規診断や治療の開発に有用であると思われる。27年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍生物学免役不全に移植されたヒト癌細胞が癌を形成することは、良く知れれている。しかしながら、ヌードマウスのような部分的に免疫能を欠損したマウスを使用して、癌細胞の転移形成を安定して検出することは容易ではない。今回申請者らは、T,Bおよびnatural killer (NK) cellsのすべての免疫細胞を欠損したNOGマウスを使用し、従来弱(非)転移性のヒト乳癌細胞が癌内線維芽細胞と共に移植された場合、顕著に転移を形成することに成功している。転移の効率が弱いなどのトラブルシューティングを1年程度で行い、現在は転移作成の系は安定してる。