hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リボソームの異常と疾患：新たな疾患「リボソーム病」発症の分子機構

リボソームはすべての生物に不可欠なタンパク質の合成工場である。最近、リボソームの異常が細胞のがん化や骨髄不全などの原因となる可能性が示された。本研究は、リボソームの異常に起因する「リボソーム病」発症の分子機構を解明することを目的とした。ゼブラフィッシュを用いた疾患モデルの解析により、リボソーム病発症に関わる重要な因子を同定した。また、研究推進に不可欠なデータベースの整備を行った。リボソームは、すべての生物に不可欠なタンパク質の合成装置である。本研究は、ゼブラフィッシュを用いてリボソームの異常に起因する「リボソーム病」発症の分子機構を解明することを目的とする。1.DBA発症の分子機構ダイヤモンドプラックファン貧血(DBA)発症の分子機構を解明するために、ゼブラフィッシュのDBAモデル(RPS19ノックダウン胚)を用いて、ポリソーム解析およびポリソームmRNAのプロファイリングを行った。その結果、ノックダウン胚において40Sリボソームサブユニットの形成が低下していること、また、いくつかの遺伝子で翻訳活性が大きく変動していることを見出した。2.p53活性化機構の解析リボソームタンパク質の欠損によるp53の活性化機構を調べるために、リボソームタンパク質欠損モデル(RPL11ノックダウン)とp53遺伝子欠損モデル(p53 null)を作製した。また、ベクターを用いたRNAiにより、組織特異的にRP遺伝子を欠損したモデルの作製も試みた。これらの変異ゼブラフィッシュは、今後p53活性化機構を解析する有用なツールとなる。3.核小体タンパク質の解析リボソームの異常により核小体ストレスが生じ、p53の活性化が起こると推測される。そこで、RPL11ノックダウンにおける核小体タンパク質遺伝子の転写活性を調べた。その結果、wdr36、wdr55、bap28、bop1、pes、gnl3、bxdc1などの遺伝子の発現が上昇していることが明らかになった。1.DBAモデルのポリソーム解析ダイヤモンド・ブラックファン貧血(DBA)のゼブラフィッシュモデルからポリソーム画分を調製して、ここから抽出したmRNAのプロファイルをDNAチップにより解析した。その結果、RPS19の欠損により翻訳が変動した造血に関連すると思われる遺伝子を見出した。この遺伝子はRP欠損の下流にあるDBA発症に関わる重要な因子と考えられる。2.RP/p53二重欠損モデルの解析RP欠損とp53経路の活性化の関係を調べるために、p53遺伝子欠損ゼブラフィッシュを用いてRPL11遺伝子をノックダウンした。その結果、野生型でRPL11をノックダウした場合に見られる表現型の一部が回復することが明らかになった。これまでの知見とは異なり、p53経路およびp53非依存の経路の両者が、RP欠損による造血異常や発がんに関与している可能性が示された。3.RNA修飾欠損モデルの作製・解析ゼブラフィッシュを用いて、rRNAの修飾に働くsnoRNA(U26、U44、U78)の生成を阻害した。その結果、頭部や尾部、色素沈着などに異常を認め、1週間で致死となることが明らかになった。U26snoRNAの発現を阻害した胚からリボソームRNAを抽出して、質量分析計により解析したところ、U26の標的部位におけるRNA修飾の低下を検出した。これは、脊椎動物の初期発生におけるRNA修飾の重要性を明らかにした最初の報告である。1. RP/p53二重欠損モデルの解析リボソーム病発症とp53の関連を調べるために、ゼブラフィッシュでリボソームタンパク質(RP)遺伝子とp53の両者を同時に欠損したモデルを作製した。Rps3、rps24、rpl35、rpl35a、rplp1の5種類のRP遺伝子を、p53に変異を持つゼブラフィッシュでノックダウンした結果、頭部や尾部の形態異常に回復が見られた一方、赤血球の産生はほとんど回復しなかった。また、野生型においてRP遺伝子とp53を同時にノックダウンした場合も同様の結果が得られた。次に、リボソームの翻訳活性が発症に関与している可能性を検討するために、rpl35aをノックダウンしたDBAのゼブラフィッシュモデルに、タンパク質合成を活性化することが知られているアミノ酸(ロイシン、アルギニン)を処理したところ、形態の異常および造血異常ともに回復が見られた。これらのことより、DBAの発症にはp53に依存しない経路が関与しており、リボソームの翻訳活性そのものが重要であることが示唆された。2.ポリソームmRNAの解析リボソームによる翻訳調節機構を調べるためにリボソームと結合したmRNAを次世代シーケンサーで解析した。

rps19をノックダウンしたDBAモデルおよびU26 snoRNAの発現を抑制したRNA修飾欠損モデルからポリソームを調製し、リボソームに結合したmRNAの量的変動を調べた。その結果、DBAモデルおよびRNA修飾欠損モデルにおいて翻訳効率が変動(2倍または1/2)したと考えられる遺伝子を各々246個と252個同定した。今後、パスウェイ解析等でこれらの遺伝子を絞り込むことにより、リボソーム病発症に重要な因子が同定されると期待できる。DBAモデルのポリソームmRNAの解析、RP/p53:二重欠損モデルの作製、RNA修飾欠損モデルの作製・解析において、研究は順調に進んでおり重要な成果も得られている。しかし、RP/p53二重欠損モデルの解析、先天性角化不全症(DC)モデルの解析においては、ポリソーム解析は行ったものの翻訳効率が変動した遺伝子の同定には至っていない。25年度が最終年度であるため、記入しない。RP/p53二重欠損モデルおよび先天性角化不全症モデルにおけるポリソームmRNAの解析を進める。また、DBAモデルのポリソームmRNAの解析は次世代シーケンサーも併用して行う。これらの解析により、病態にリンクして翻訳効率が変動した遺伝子を同定する。
光分子集積を指向した金属錯体の光融解と光結晶化

本研究では、原子価互変異性平衡を示すコバルト錯体結晶において、ns-パルスのワンショット照射により室温において結晶が光融解すること新現象を見出した。この光融解現象は3Kにおける光照射実験により、分子内における電子移動がそのトリガーとして働いていることが証明された。また融解後の結晶化は実験温度に強く依存し、分オーダーでの光発生種のトラップにも成功した。これまでに固体や液体、溶液における化学的、電気化学的、熱的及び光により誘起される電子移動に関する膨大な研究がされ、多くの物質的、現象論的、理論的知見が得られた。電子及び電子移動の理解は、物質やそれが発現する諸現象や機能に関する理解を深める上で絶え間なく発展すべき基本的課題である。その根底には、多くの分子や分子集団が系の自由エネルギーを最小にする方向で結合をくみ上げ、分子構造を形成し、最も安定な電子配置を達成する自然の選択が存在する。従って通常の分子内での電子配置の再配列、結合の再構築を行うためには大きなエネルギーを必要とする。一方本研究で対象とする金属と酸化還元活性ジオキソレン配位子はエネルギー的に近接した金属由来のd軌道と配位子由来のπ軌道を有する結果、僅かな外場により分子内電子移動が生じ、異なる電子配置を有する二つの(若しくはそれ以上の)互変異性体を形成する。この僅か一電子の再配置は、スピン、電荷分布、電気双極子、極性、分子構造の変化をもたらす。本研究では、「この単一分子上での変化は、適切な分子集合体を構築することでマクロ世界へと転写しうる。またこれは光によっても引き起こされる」という発想のもと研究を展開した。本研究の構成は、光誘起融解及び結晶化の(1)実現と(2)制御からなる。そのための実験としては、既に合成及び熱的な同期変換に成功している前述のコバルト錯体等を用いた光照射実験を行うと共に光誘起融解及び結晶化実現のための物理化学的条件を見出し制御する研究を行うこととした。本研究では、光融解・結晶化の実現のために、low-spin-[Co^<III>(DTBSQ)(DTBCat)(C120py)](DTBSQ=3,6-di-t-butylsemiquinonate;DTBCat=3,6-di-t-butylcatecholato;C120py=3,5-didodecyloxy-pyridine)の薄膜結晶に対し、3Kにおいて532nmのパルス光を照射した所、high-spin-[Co^<II>(DTBSQ)_2(C120py)]の光生成を確認すると共に、この光誘起相が250Kという極めて高い温度域まで存在しうることを明らかにし、光融解・光結晶化実現のための礎を築く実験結果を得ることに成功した。平成22年度からの研究により室温における光融解・結晶化を実現し目標を達成した。本研究では、[Co(3,6-DTBQ)_2(C12Opy)_2]錯体のls-[Co^<III>]を含む紫色薄膜(20μm)試料は303Kにおいてone-shotの523nmレーザー光照射により光バルク融解し緑色のhs-[Co^<II>]液体を与えた。融解した液体は1.9秒の半減期で結晶化し再び紫色ls-[Co^<III>]を与える。言い換えるならば光により分子状態並びにその集積状態を一電子移動により制御できたと言える。興味深いことに299Kにおいて266mJ/cm^2・pulseの光照射よっては光融解せず、明らかなthresho1dを有する光誘起現象であることを示した。この光融解は熱的融解が生じる368Kまでの幅広い領域で生じることも確かめ、実験温度により光量に閾値が存在すること、融解から自発的に結晶化が起き、その結晶化速度が実験温度に依存することも見いだした。本研究では、本光融解・結晶化過程の機構を探索すべく3Kにおける光照射実験も行った。3Kにおいて測定された薄膜の吸収スペクトルは、ls-[Co^<II>]に特徴的なIVCT吸収帯を2500nm付近に示し、10,50,100,159,186,2l3,266,及び372mJ/cm^2・pulseの逐次照射によるIVCT吸収帯の減衰がみられ、光によるhs-[Co^<II>]の生成が確認された。興味深いことに、この光誘起VTは186mJ/cm^2・pulseに閾値を有し、光によるhs-[Co^<II>]の発生が証明された。この光発生したhs-[Co^<II>]は13時間後も維持されていた。更にこの光発生hs-[Co^<II>]は続く3Kからの加熱によっても容易に緩和せず、250K付近までその安定性を示した。これは過去の例を大幅に凌駕する熱安定性であり、光による励起種のトラップに成功したといえる。
グアバ茶による新しい動脈硬化予防法の開発に向けた研究

低比重リポタンパク(LDL)の酸化はアテローム性動脈硬化の引き金の一つとして働くが、この過程に白血球型12-リポキシゲナーゼが重要な役割を果たしていることが知られている。本研究でグアバ葉抽出物がこの酵素を阻害すること、酵素過剰発現細胞によるLDL酸化を抑制すること、またマウスに経口投与すると動脈硬化が予防されることを証明した。さらに、抽出物中の主な本酵素阻害成分としてケルセチンとエチルガレートを同定した。12/15-リポキシゲナーゼはアラキドン酸に酸素1分子を添加して、ヒドロペルオキシ酸、すなわち過酸化脂質を生成する酵素である。申請者らはこれまでに、この12/15-リポキシゲナーゼを過剰発現させたマウスマクロファージ由来J774A.1細胞を用い、本酵素がマクロファージによるLDLの酸化、すなわち動脈硬化の進行に必須であることを明らかにしてきた。さらに、グアバ茶に含まれるポリフェノール画分が、この12/15-リポキシゲナーゼの阻害作用を有することを明らかにした。そこで、グアバ茶に含まれるポリフェノールの動脈硬化予防効果を証明するために、本計画ではまずグアバポリフェノールによる12/15-リポキシゲナーゼの阻害様式と酵素阻害の特異性について検討した。その結果、グアバポリフェノールは12/15-リポキシゲナーゼを可逆的に阻害するが、阻害様式は単純な競合阻害ではなく、酵素反応中の失活、いわゆる酵素の自殺を早めることにより最終生成物の産生量を抑制していることが示された。酵素活性を50%阻害する濃度(IC_<50>値)は20μg/mlであった。さらにグアバ葉中のポリフェノールとして同定された成分の12-LOX阻害効果を調べると、ケルセチンが最も強く阻害し、そのIC_<50>は1.6μMであった。グアバポリフェノールは12/15-リポキシゲナーゼ以外にも、血小板の凝集に関わる血小板型12-リポキシゲナーゼ、炎症のメディエーターとして働くロイコトリエンの生成に関わる5-リポキシゲナーゼなども効率よく阻害し、12/15-リポキシゲナーゼへ阻害の特異性は観察されなかった。実際にグアバポリフェノールを投与した動脈硬化早期発症モデルマウスの大動脈の動脈硬化病変は、非投与群と比べて有意に減少した。以上より、グアバポリフェノールは各種リポキ・シゲナーゼを阻害し、動脈硬化発症モデルマウスの動脈硬化を軽減させることが示唆された。アテローム性動脈硬化の危険因子の一つとして知られる低比重リポタンパク(LDL)は、酸化LDLとなってはじめてマクロファージ上に存在するスカベンジャー受容体に認識されるようになり動脈硬化原性を発揮する。このLDLの酸化に関わっているのが、マクロファージに高いレベルで発現している12/15-リポキシゲナーゼと呼ばれる酵素である。すなわち、本酵素の働きを抑制すればLDLの酸化は抑制され、動脈硬化は予防できると考えられ、実際にこのことは本酵素のノックアウトマウスを使った実験で確認されている。申請者らは昨年度の本計画でグアバ葉中に見出されるこの12/15-リポキシゲナーゼの阻害活性について検討し、その阻害様式と阻害の酵素特異性を明らかにした。また、実際にグアバ葉抽出物をアポEノックアウトマウス投与し、非投与群と比べ動脈硬化の進行が有意に抑制されていることを確認した。本年度は12/15-リポキシゲナーゼ過剰発現マウスマクロファージ様細胞を用いて、LDLの本細胞による酸化が抑制されるかどうかを調べたところ、本酵素を阻害する濃度のグアバ葉抽出物の添加によりLDLの酸化は抑制された。この効果は細胞を予めグアバ葉抽出物で2時間処理しておき、その後細胞を洗浄してからLDLを添加しても認められたことから、グアバ葉抽出物はLDLの自動酸化を抑制するいわゆる抗酸化剤として働いているのではないことが確認された。しかしながら、昨年度の研究でグアバ葉抽出物中に含まれる12/15-リポキシゲナーゼ阻害活性をもつ物質の一つとして検討したケルセチンは、本酵素を阻害する濃度では細胞によりLDLの酸化を抑制しなかった。また、グアバ葉抽出物による本酵素の阻害活性はケルセチンでは10%程度しか説明できず、グアバ葉抽出物中には、ケルセチン以外のLDL酸化を抑制する成分が含まれている可能性が示唆された。

申請者らは昨年度までの本計画でグアパ葉中に見出されるこの12/15-リポキシゲナーゼの阻害活性について検討し、12/15-リポキシゲナーゼ過剰発現マウスマクロファージ様細胞を用いて、本酵素を阻害する濃度のグアバ葉抽出物の添加によりLDLの酸化が抑制されること、この効果は細胞を予めグアバ葉抽出物で2時間処理しておき、その後細胞を洗浄してからLDLを添加しても認められたことから、グアバ葉抽出物はLDLの自動酸化を抑制するいわゆる抗酸化剤として働いているのではないこと、また実際にグアバ葉抽出物をアポEノックアウトマウス投与すると、非投与群と比べ動脈硬化の進行が有意に抑制されていることを確認した。グアバ葉抽出物中に含まれる有効成分の一つとして同定されていたケルセチンは、グアバ葉抽出物による本酵素の阻害活性の10%程度しか説明しなかったため、本年度は抽出物から逆相HPLCを組み合わせることにより本酵素を強力に阻害する成分を単離した。高分解能質量分析法ならびにプロトン核磁気共鳴法により構造決定を行ったところ、この成分がエチルガレートであることが明らかとなった。本成分によりグアバ葉抽出物による12/15-リポキシゲナーゼ阻害活性の60%程度を説明でき、主要な有効成分であることが示された。また、この成分は12/15-リポキシゲナーゼ過剰発現マウスマクロファージ様細胞によるLDLの酸化を有意に阻害した。以上より、グアバ葉抽出物中に含まれる抗動脈硬化性の有効成分がエチルガレートであることが強く示唆された。今後はアポEノックアウトマウスを用いて本成分の有効性を検討する予定である。
医療的ケア児の在宅療養における訪問看護師と相談支援専門員の連携課題及びその対処

本研究は、医療的ケア児の在宅における医療ケアを担っている訪問看護師と、居宅サービスの計画を立案している相談支援専門員との連携に関する課題を明らかにすることを目的としている。平成31年度は、相談支援専門員に対して半構造化面接調査を実施し、訪問看護師と連携を取る上での課題や対処について明らかにする。平成32年度は、訪問看護師に対して半構造化面接調査を実施し、相談支援専門員と連携を取る上での課題や対処について明らかにする。平成33年度は、訪問看護師および相談支援専門員が互いに連携を取る上での課題と対処を比較し、その差異を明らかにすることで、訪問看護師と相談支援専門員の連携強化の方向性を見い出す。
肺修復細胞移植治療法の開発

ウイルスベクターを用いずに術後急性期から慢性期を通して肺組織修復が可能な治療法開発を目的とし、KGF遺伝子導入培養型肺胞上皮細胞を用いて実験を行った。1.培養II型肺胞上皮細胞へのKGF遺伝子導入LacZを有するプラスミドにKGF, HGF遺伝子を組み込みLipofection法で培養ラットII型肺胞上皮細胞へ遺伝子導入を行った。In vitroにおける遺伝子導入効率は、約10-20%であった。またSDS-PAGEにて培養細胞からの導入遺伝子由来蛋白質の分泌を確認した。2.遺伝子導入細胞の肺内分布確認1x10^6個の遺伝子導入処理細胞を緩衝液に浮遊させ、末梢静脈より注入し肺へ移植した。X-Gal染色にて、移植後の遺伝子導入細胞の分布状況、経時的増殖状況を検討した。部分的に細胞が塊状となって存在するところが確認され、移植後に経時的に移植細胞が増殖した可能性も考えられた。3.研究の意義末梢静脈からの細胞浮遊液注入により、細胞が生着し、局所での目的蛋白質の分泌が得られることは、肺組織修復を促進する上において、非常に有用な治療手段となりうることが確認できた。従来肺組織への遺伝子導入法は肺組織への直接的DNA注入もしくは経気道的投与が中心に用いられてきており、肺損傷を来さず、また気道への刺激物質の注入を行わずに遺伝子導入とほぼ同様の効果が得られる点において、新しい概念の有用治療法と考えられる。今後はバルーン付きカテーテルなどを用いて、左右の肺を別々に選択的に投与する方法の開発が必要になると考えられる。1.培養II型肺胞上皮細胞へのKGF遺伝子導入LacZを有するプラスミドにKGF,HGF遺伝子を組み込みLipofection法で培養ラットII型肺胞上皮細胞へ遺伝子導入を行った。2.遺伝子導入細胞の肺内分布確認1x10^<-6>個の遺伝子導入処理細胞を緩衝液に浮遊させ、末梢静脈より注入し肺へ移植した。
養護施設におけるストレス・トラウマ対処プログラムの開発と定着化に関する研究

研究の目的は、児童支援はソーシャルスキル(SST)と学習支援を行い、職員支援では子どもの心を育てる力を培う研修会(新人研修と全体研修)を実施することにより、児童養護施設で生活する子どものストレス・トラウマを軽減する。まず職員研修の新人研修(進藤担当)の内容は「仕事をするということ」「発達に応じた躾と社会性」「ストレスとその対処」で、養護施設で働くことについて考えてもらった。また職員全体研修では、「子どもの愛着の事例検討(浦田氏)」「不登校事例検討(松永氏)」「子どもの権利擁護(尾里氏)」「身体のリラクセイション(花田氏)」「思春期の事例検討(山﨑氏)」「食品の扱い方等(村田氏)」「性化行動について(山喜氏)」「子どもの問題と行動分析(向笠氏)」で、初年度は知識が中心であったが、研修を重ねるにつれて、職員の要望により事例検討が増えていった。講師は継続的学習の視点から同じ方に依頼した。研修前に職員の要望を聞き取りしてから講師に依頼をした。職員研修のマネジメントは進藤が担当した。児童支援のSSTの内容は、「気持ちのよい挨拶をしよう(6月)」「温かい言葉かけ/ふわふわことばのシャワーをかけよう(7月)」「やさしい頼み方(9月)」「怒りについて知ろう(10月)」「怒りのレベルはどれくらい?(12月)」「いやな気持ちを切り替えよう(1月)」「相手の気持ちを想像しよう(2月)」「自分の良いところをみつけよう(3月)」で、SSTは必要なテーマを職員と相談しながら選択した。これまでの3年間は緒方氏(元教員)が担当していたが、施設職員でできるように30年度の担当は、施設の心理療法士と保育士(交代しつつ)が協力して実施した。学習支援では月に4回程度であり宿題を中心に学習している。89月は大舎からユニット制(小規模化)への引っ越しで研修の実施ができなかった。本年度の目標は、児童支援では1ソーシャルスキルSSを行う。職員支援では1研修会(新人研修と全体研修)と2事例検討会を行う。実施したのは,職員対象のプログラムでは新人研修(1年未満と13年未満)と全体研修である。新人研修は進藤が担当し,内容は「仕事をするということ」(5月)「自分の育ちを振り返ってみよう」(6月)「発達に応じた躾と社会性」(7月)「ストレスとその対処」(9月)「子どもの心を育てるということ」(10月)「発達障害の理解の仕方」(11月)「思春期の子どもとの付き合い方」(1月)である。全体研修では、「子どもの権利擁護と個人情報」(6月:尾里育士氏),「子どもの愛着事例ワーク」(6月:浦田英範氏),「からだのリラクセーション」(9月:花田利郎氏),「子どもの行動観察とその分析」(11月:向笠章子氏)に,「養護施設の子どもと性について」とその「事例ワーク」(12月:塩田規子氏)に,「思春期の事例対応ワーク」(2月:山﨑由紀氏)を実施した。次に、児童SSTでは,緒方鈴子氏が担当し,プログラムは,5月は「自分の良い所をみつけよう」(低・中学年)「友だちの良いところを見つけよう」(高学年),6月は「上手な聞き方」(低学年)「優しい頼み方」(中・高学年),7月は「自分の良いコーピングを決めよう」(低学年)「良いコーピングを決めやれるようになろう」(中・高学年),8月は「あたたかい言葉かけ」,10月は「怒りについて考えよう」,11月は「自分の気持ち、相手の気持ち」(低学年)「自分を好きになろう」(中・高学年),12月は「自分の気持ちを表現しよう」,1月は「怒りについて考えよう」(低・高学年)「言葉つかいを考えよう」(中学年),3月は「仲間の誘い方」(低学年)「相手の気持ちを理解しよう」(中学年)「トラブル解決法」(高学年)を実施した。さらに学習支援(毎月)と登山(年に1回)も実施した。今年度に実施した成果は質問紙による職員評価で測った。まず職員支援について新人研修のでは「仕事に対する意識付け」が最も役に立ったという声が多かった。研修の場があることで安心して子どもへの対処が出来たようで本年度は退職する新人はいなかった。次に全体研修では,特記すべきは養護施設勤務の塩田規子氏から職員の技術をあげるためには事例検討が(職員のスキルの向上に)良いということで当職員の意識を変えた。その後は事例検討を希望する職員が増えた。ストレスチェックではストレスが高くても感じない職員がみられたので定期的な必要性を感じた。次に子どものSSTについての評価は緒方氏と職員の記録により考察を行った。緒方氏の記録から子どもの実態は,自分の気持ちは怒りの表情カードばかりを選び自分の良いところは「ない」と答える子どもが大半であった。またイライラした時のコーピングには『なぐる。蹴る。どなる』が良いという子が半分以上いるという。実践の目標は1子どもが少しでも自分の良いところを自覚し,自分を好きになり自尊感情を高められるように2イライラを人や物に当たるのではなく、自分に適した良いコーピングで治め、落ち着いた生活が送れるようになるように学習を進めた。

その成果は,1学習内容に反発したり,反抗的な学習態度をとったりする子が減ってきた。2表情カードの怒りの表情ばかりではなく,楽しい表情を選ぶ子も出てきた。また職員の記録からみて最も効果があったのは「良いコーピング」選びと「怒りのコントロール」を考えることである。これはトラウマと関係が深いので対処法を考える力は必要不可欠である。そのために同じテーマを繰り返して取り上げるようにした。残された課題は1自分が怒っているという自覚は持てているようであるが実際にコントロールできない。2子どもが生きていく上で必要な「自尊心」の感情が低いことである。全体的には成果はみられる。本年度の目標は、児童支援ではソーシャルスキルSSを行う。職員支援では子どもの心を育てる力を培う研修会(新人研修と全体研修)を実施した。職員研修の新人研修は進藤が担当し,内容は「仕事をするということ」「自分の育ちを振り返る」「発達に応じた躾と社会性」「ストレスとその対処」「子どもの心を育てる」「思春期との付き合い方」「1年を振り返る」である。全体研修では、「子どもの愛着事例ワーク」(6月:浦田英範氏),「子どもの権利擁護と個人情報」(7月:尾里育士氏),「からだのリラクセーション」(9月:花田利郎氏),「ペアレントトレーニング」(10月),「思春期の事例対応ワーク」(2月:山﨑由紀氏),「里親制度について」(1月:山本裕子氏),「子どもの行動分析と事例ワーク」(2月:向笠章子氏),「大人になることと事例ワーク」(2月:山喜高秀氏)を実施した。次に、児童SSTでは,緒方鈴子氏が担当し,その内容は,5月は「イライラしないで」(低学年)「友だちの良いとこ見つけ」(高学年),6月は「気持ちよく挨拶をしよう」(低学年)「目の上の人への挨拶を知ろう」(中学年)「上手な聴き方が出来る」(高学年),7月は「ふわふわ言葉のシャワーをかけよう」(低学年)「優しい頼み方について考えよう」(中・高学年),8月は「ストレスと良いコーピング」(低学年)「自分の良いところを見つけよう」(中・高学年),10月は「上手な聴き方」(低学年)「誘い上手・誘われ上手」(中・高学年),12月は「仲間の誘い方」(低学年)「上手な頼み方、断り方」(中・高学年),1月は「いろいろな気持ち」(低学年)「自分の気持ちの伝え方」(中・高学年),2月は「怒りのコントロール」(低・中・高学年),3月は「自分の良いところ」(低学年)「自分を好きになろう」(中・高学年)を実施した。さらに学習支援(毎月)と登山(10月)も実施した。今年度も質問紙による職員評価で測った。まず職員支援について新人研修では8名と多かったが「仕事に対する意識付け」が良かったという声が多かった。問題として考えていることが話せる研修を目指した。またストレスチェックと施設に多いストレスの出来事について話し合う機会を持った。一方で2名の職員が子どもの施設は難しいと退職したが、頑張る方が多かった。次に全体研修では、昨年の塩田規子氏からの影響で職員の技術をあげるためには事例検討が(職員のスキルの向上に)良いということで当職員の意識を変え、事例検討に積極的に参加した。そのために各研修に事例検討を実施した。自立支援計画の学習のために救世軍施光寮へ職員を伴い研修に行った。次に子どものSSTについての評価は緒方氏と職員の記録により振り返る。授業態度については始まりは集まりにばらつきがありスムーズではないが、進みはほぼ予定通りになり終わりも時間通りに終われるようになった。授業のやり方に慣れてきた。
自然環境下における海底メタンハイドレートの成長融解速度に関する実験的研究

海底メタンハイドレートが堆積物中に形成するすべてのパターン(形状)をTHF水溶液とガラスビーズを用いたモデル実験により再現することに成功した。この結果、結晶成長速度と異なる粒径の混合比を変数として、形のダイアグラムにまとめ上げるとともに、パターン形成の定性モデルを提案した。さらには、ゲスト分子の拡散律速の影響を低濃度THF水溶液を用いた実験と、THFと水の二相境界面における実験により明らかにした。海底堆積物中に大量に存在するメタンハイドレートは、巨大な温暖化ガス源として気候変動との関連で注目されている。メタンハイドレートはゲスト分子としてメタンを包接した結晶であるため、メタンガスの取り込みや放出の理解には成長や融解過程の理解が重要であるが、海底下の長い時間スケールの現象のためあまり良く分かっていない。海底メタンハイドレートは様々なパターン(層状、粒状、団塊状、空隙状)で堆積物中に発見されているが、ガスハイドレートの成長実験で空隙状が再現され、研究代表者によるモデル実験により層状が再現されたことを除くと、他のパターンの再現には至っていない。成長過程の理解には、モデル実験の構築が重要であり、本研究はすべてのパターンを再現することを目的に、THF水溶液とガラスビーズをモデル系として、一方向凝固法という手法により成長するTHFハイドレートのパターンの観察を行った。ここで、粒径2μmと50μmの混合ビーズ中での実験の結果、上記のすべてパターンを再現することに成功した。これにより、海底メタンハイドレートの多様なパターン形成は、堆積物の粒径の分布が重要な役割を果たしていることを示唆する結果を示した。さらに本研究は、メタンガスと水の境界面ででの成長過程を理解するために、THFと水の濃度境界層における成長実験を行った。堆積物モデルは粒径2μmのビーズである。これにより、濃度境界層に沿って膜状ハイドレートが成長することで層状を形成し、また、絶え間ない核形成による多結晶集団の増殖によって粒状パターンを形成することに成功した。以上の二つのモデル系により海底メタンハイドレートの特徴的なパターンを形成したことは、従来理解が困難であった海底堆積物中での長い時間スケールにおけるメタンハイドレートの成長の速度論の理解へ向けた大きな前進と考える。海底メタンハイドレートは、温暖化ガスの巨大なリザーバーであり、気候変動との関連で注目されている。海底コアの掘削調査では、メタンハイドレートは層状、粒状、塊状、分散状などの多様な形状で見つかる。ところが、堆積物モデル中での生成実験は分散状の微結晶を作りだすのみであり、多様な形状の生成要因は未だ理解されていない。メタンハイドレートの生成実験の困難は成長速度が極めて遅い点にある。本研究ではこの困難を克服するためにハイドレート化に最適な組成の水-テトラヒドロフラン(THF)系を用いるという独自の工夫を行った。さらに独自の工夫として、堆積物モデルとしてガラスビーズを使用した。堆積物の粒径は分布をもつので、粒径の異なるガラスビーズを混合した。このビーズの混合比とハイドレートの成長速度を変数として一方向凝固実験を行った。自然界での成長を再現するには、低速での長時間実験が重要である。一昨年の研究では、低温の実験装置に霜が徐々に付着して観察が困難になるという問題と、THFが接着剤を分解するため実験用セルが破損するという問題により長時間実験は困難であった。また、使用していた駆動系では成長速度の下限値は0.4μm/sであった。装置の気密性と実験用セルの対THF性についての対策を徹底的に行い、10日以上の連続実験を行うことを可能とした。さらに駆動系をより高精度なものに交換することで成長速度の下限値は0.04μm/sまで到達した。これにより低速での成長をその場観察した非常に重要なデータを得ることに成功した。以上により本研究ではハイドレートの多様な形状を全て再現することに初めて成功した。また、形状と生成条件の関係を表すダイアグラムが完成した。さらに氷の霜柱の形態形成理論を応用して、それぞれのパターンの形成過程の定性モデルを提案した。この研究成果は、結晶が経験してきた環境変化の履歴情報をハイドレート形状から読み出す糸口になる可能性がある。海底メタンハイドレートは、堆積物中に層状、粒状、塊状、分散状などの多様な形状で見つかる。結晶成長過程の形態形成を理解することは、生成のダイナミクスや環境条件を知る上で重要であるが、よく分かっていない。申請者は、THF水溶液とガラスビーズを混合したモデル系でのハイドレート成長実験により、すべての形状を再現し、定性的な形態形成モデルを提案した。ところが、系の単純化のためTHF-17H2Oという結晶組成の溶液を用いため、本年度は低濃度THF水溶液を用いてゲスト分子の拡散律速性の影響を評価する実験を行った。粒径2ミクロンのビーズを用いると層状の構造を形成するが、このときTHF濃度を低くすると、層構造の幅が狭くなることを実験的に示した。

これは成長界面におけるTHF濃度の低下により成長が抑制された影響と考えられる。一方、層の間隔はTHF濃度によらず変わらなかった。このことから、濃度によらないファクターである含水比の分布が支配要因であると結論付けた。次に、ビーズに粒径分布があるときに形成する粒状や塊状という不定形の定量的評価法は確立していないので、今年度は画像処理・解析法を以下のとおり確立した。画像の二値化とノイズ(極めて小さな光の点)の除去の後、画像の特徴の支配要因である大きな結晶領域を抽出するために、平均面積をしきい値とする方法と全面積の90%まで採用する方法で大きな結晶領域を抽出した。そして、ハイドレートの凍上量、平均粒径や粒子数等を定量化し、成長速度依存性を示した。この結果、解析値のオーダーレベルが明確に3領域に分かれ、低速成長の塊状構造、中速の粒状、高速の分散状を定量的な方法で分類することに成功した。これは見た目の判断に依存しない点で優れており、他のモデル系や試掘の結果との比較に生かされるものと期待できる。さらに、実験的に形態を定量的に特徴付けたことで、今後、理論研究の進展を促すと期待する。
非対称電子移動ユニットの集積による異方性電子機能の創出

中心対称性をもたない物質は、電場などの外場に応答して様々な機能を示す。このような複合機能性材料の開発においては、物質の対称性の制御と電気双極子の配向制御が不可欠である。従来の物質における対称性制御は、イオンや分子を熱エネルギーや電場によって変位させることに基づくものが主であった。本研究では、分子内非対称電子移動を示す多核錯体ユニットの外部刺激応答性をトリガーとし、分子内電子配置や分子間相互作用をスイッチングすることで物質の対称性を変換・制御することを目的とする。平成30年度は、外部刺激誘起二電子移動によって水素結合アクセプター性を変換可能なシアン化物イオン架橋環状四核錯体の水素結合による集積化についてさらに検討を行った。具体的には、環状四核錯体を水素結合アクセプターとして用い、二官能性水素結合ドナーであるアミノ安息香酸との複合化を行った結果、一次元水素結合集積構造をもつ1:2ドナーアクセプター系を得ることに成功した。本化合物は、脱溶媒によって1次元から0次元へ大きく構造変化するとともに、水素結合様式の変換に伴う電子移動挙動のスイッチングを示す。さらに、環状四核錯体の電子状態変化に伴い、pKaが一程度変化することを実験的に明らかにした。一方、ナノ粒子の異方性配列の達成を目的とし、有機ナノケージ分子に球対称ナノ粒子を包接した物質の合成を新規に行った。TEM、AFMなどの各種測定によりキャラクタリゼーションを行った結果、金ナノ粒子@ナノケージ分子が得られることを明らかにした。本研究は、非対称電子移動を示す多核錯体やナノ粒子を異方集積化することで、非対称電子状態に特有の機能を発現させることを目的としている。本年度は、非対称電子移動ユニットからなる錯体の集積化をさらに一般化させるとともに、外部刺激に伴う電子状態変化、化学的性質の変化について実験的に明らかにすることに成功した。さらに、球対称ナノ粒子の分子間相互作用に違法性をもたせる手法として、有機ナノケージ分子をもちいた新たな手法を開発した。本年度の成果は、今後行う非対称電子機能探索の礎となるものであり、順調に研究が進展していると考えられる。今後は、非対称電子移動ユニットからなる多核錯体を屈曲型水素結合ドナー分子で集積化したシステムの溶液中における凝集・離散挙動を明らかにする。また、光異性化を利用した溶液中のpH制御を基盤とし、上記の凝集・離散挙動を光照射によって制御することを目指す。また、ナノ粒子@ケージ分子については、表面状態を精密に設計・制御することで、最密充填構造と異なる集積構造の達成や、粒子間距離の制御に基づくプラズモン共鳴の異方的結合について検討を進める。キラリティーと電場や磁場などの外場との相互作用の基づく電子機能の開発には、物質の対称性を高度に制御することが重要である。本研究では、非対称電子移動ユニットが示す指向性電子移動に着目し、分子における電子配置の動的制御を基盤とする対称性制御を達成する。さらに、そのような電子系アシンメトリーユニットを異方集積化し、電気・磁気双極子の配向を制御することで、異方性電子機能の発現を目指す。平成28年度は、主に電子系アシンメトリーユニットの合成について研究を行った。具体的には、分子内で指向性電子移動を示す新規鉄ーコバルト環状四核錯体の合成を行った。シアン化物イオンで架橋された鉄ーコバルト錯体は、補助配位子によって各金属イオンの酸化還元電位を適切に制御することで、熱・光に応答して分子内電子移動を可逆に示すことが知られている。本研究では、補助配位子としてテトラメチルフェナントロリンを用いた新規環状四核錯体を合成した。本錯体は、温度変化により分子内電子移動を伴う急激な構造相転移を示し、反磁性状態と常磁性状態を可逆に変換可能であることを見出した。さらに、電気化学測定から本錯体が可逆な四段階一電子酸化還元反応を示し、非対称な構造・電子状態をもつ混合原子価状態を与えることも見出した。今後は、本錯体の混合原子価状態の単離と集積化について検討する。また、外部刺激に誘起される分子内一電子移動によって構造・電子状態の対称性変換を目的とし、シアン化物イオン架橋直線型三核錯体の合成を行った。その結果、シアン化物イオン架橋鉄コバルト三核錯体を得た。しかしながら、本錯体は温度変化に伴う分子内電子移動を示さなかった。これは、鉄イオンとコバルトイオンの酸化還元電位が比較的離れていることに起因すると考えられる。今後は、補助配位子を最適化することで分子内指向性電子移動を示す非対称電子移動ユニットを開発する。本研究は、非対称電子移動ユニットの異方性集積により集積体における電気・磁気双極子の背向を制御することで、異方性電子機能を発現させることを目的とする。研究の推進方法としては、以下の三つのステップに分けて行う。1)電子系アシンメトリーユニットの構築と外部刺激誘起電子状態変換の達成、2)電子系アシンメトリーユニットの水素結合による集積化と次元性制御法の確立、3)集積体における指向性電子移動に基づく動的対称性制御と異方性電子機能の発現。本年度は、1)の電子系アシンメトリーユニットの構築について検討を行った。その結果、外部刺激誘起電子移動を示す新規環状四核錯体の合成に成功した。本錯体は四段階の可逆な酸化還元挙動を示し、非対称な構造・電子状態をもつ混合原子価状態を与えることから、電子系アシンメトリーユニットとして有用である。

また、外部刺激誘起電子移動を示す直線型三核錯体の合成について検討を行った結果、シアン化物イオン架橋直線型三核錯体を得ることに成功した。本錯体は、外部刺激誘起電子移動を示さないものの、本研究で見出した三核錯体合成法を基に補助配位子を最適化することで、目的の電子系アシンメトリーユニットが得られると考えられる。中心対称性をもたない物質は、電場などの外場に応答して様々な機能を示す。このような複合機能性材料の開発においては、物質の対称性の制御と電気双極子の配向制御が不可欠である。従来の物質における対称性制御は、イオンや分子を熱エネルギーや電場によって変位させることに基づくものが主であった。本研究では、分子内非対称電子移動を示す多核錯体ユニットの外部刺激応答性をトリガーとし、分子内電子配置や分子間相互作用をスイッチングすることで物質の対称性を変換・制御することを目的とする。平成29年度は、外部刺激誘起一電子移動によって分子対称性を変換可能なシアン化物イオン架橋直線型三核錯体の電子状態制御、および電子移動ユニットの水素結合による集積化にいて検討を行った。直線型三核錯体については、補助配位子として水素結合ドナーサイトをもつ配位子からなる三核錯体を合成した。さらに、錯体合成時に適切な塩基を共存させることで非対称電子状態をもつ三核錯体が得られることが示唆された。しかしながら、単結晶構造解析には成功しておらず、今後さらに検討を進める。一方、電子移動ユニットの水素結合による集積化については、環状四核錯体を水素結合アクセプターとして用い、様々な架橋性水素結合ドナー分子で集積化することで、集積構造の次元性制御が可能となることを見出した。さらに、集積構造における水素結合強度変化と分子内電子移動が連動することで、特異な多重安定性を示すことも見出した。本研究は、非対称電子移動ユニットの異方性集積により、集積体における電気双極子の配向を制御することで異方性電子機能を発現させることを目的とする。研究ステップとしては、1)非対称電子移動ユニットの構築と電子移動制御、2)電子移動ユニットの集積構造制御、3)集積体における指向性電子移動による異方性電子機能の発現、に従って推進する。本年度は、1)について複数のユニットを合成するとともにその電子移動制御についてさらに研究を進めた。さらに2)について研究を着手し、電子移動ユニットの水素結合集積化法の確立と集積構造制御を達成した。本年度に確立した水素結合集積系の構造制御法は、違法性集積体の構築の基盤となるものであり、順調に研究が進展していると考えられる。
高深度キノーム解析による淡明腎細胞癌分子標的薬感受性マーカーの同定と耐性克服

本研究計画では、淡明腎細胞癌における網羅的キナーゼ情報(=キノーム情報)を取得し、キナーゼ阻害剤感受性マーカーと耐性克服標的の同定を目的とする。淡明腎細胞癌の切除組織片からのコンディショナルリプログラミング法による癌組織由来細胞株の樹立を2018年10月までに完了した。最終的に、178個の癌検体から25細胞株の作成に成功した。そのうち淡明型腎細胞がんの17細胞株に対して、スニチニブ、アキシチニブ、エベロリムス、カボザンチニブの薬剤感受性試験を行った。17株の凍結ストックから再融解後、11株については上記4剤の薬剤感受性データの測定に成功した。一部の細胞株では再融解後に細胞増殖が認められなかったため、今回の解析計画から除外した。その結果、11株それぞれで上記4剤に異なった感受性パターンが観測され、当初の狙いである薬剤感受性メカニズムの比較解析を実施し得るサンプル(感受性株、耐性株)が整備できた。薬剤感受性データを取得した11株のうち、十分なタンパク質量の確保できた10株についてプロテオミクス解析、リン酸化プロテオミクス解析を進めた。LC-MS/MSによる測定の結果、プロテオミクス解析からは6486タンパク質、リン酸化プロテオミクス解析では33652リン酸化部位(うちClass1部位は21407部位)がそれぞれ同定された。今後、得られたデータを統合し、薬剤感受性群、耐性群それぞれにおけるキノーム活性変動を、研究代表者が報告済みの活性プロファイリング法で算出予定である。また基質タンパク質側のリン酸化ネットワーク構造の変化に関する解析を、PHOTON法(Cell Systems, 2016)により実施する。これらの解析結果から、耐性群で活性化しているリン酸化シグナルネットワークを抽出する予定である。腎細胞癌の70%を占める淡明腎細胞癌への分子標的薬として承認されていたマルチキナーゼ標的薬、スニチニブ・アキシチニブには肝機能障害など重篤な副作用を引き起こす事が知られていた。しかしマルチキナーゼ標的薬への薬効診断・耐性克服標的は未だ十分でなく、さらなる研究が必要とされていた。本研究計画では、申請者が構築した世界最高深度チロシンリン酸化プロテオーム解析を基盤として淡明腎細胞癌における網羅的キナーゼ情報(=キノーム情報)を取得し、マルチキナーゼ標的薬に対する感受性マーカーと耐性克服標的の同定を目的とする。まず、淡明腎細胞癌の切除組織片から、コンディショナルリプログラミング(Conditional Reprogramming: CR)法による癌組織由来細胞株の樹立を行う。CR法では人工多能性幹細胞培養条件下で初代培養を行う事で、高効率に患者癌部からの細胞株樹立を可能としている。CR法で得られた癌組織由来細胞株は元の患者における薬剤感受性を引き継いでおり、CR法細胞株によって肺がんにおける新規耐性克服標的の発見が報告されている事からも、本研究計画に適した実験材料であると言える。これまでに淡明型腎細胞がん手術検体より21株のCR細胞株を樹立したため、2017年度までに計画に十分な細胞株が得られた。また活性化キノームプロファイルに必要なデータ処理に関する研究を2017年度中に完了させた。これらの実績を踏まえて、2018年度はCR細胞株リン酸化プロテオームと、そのキノームプロファイルを進める。2017年には、リン酸化プロテオーム解析・チロシンリン酸化プロテオーム解析を組み合わせた、活性化キノームプロファイルに関する研究を完了させ、Scientific Reports誌に発表した。この結果、本研究計画に必用なデータ処理に関する基盤が構築された。淡明腎細胞癌に対する分子標的薬であるスニチニブ、アキシチニブ、エベロリムス、カボザンチニブをCR法細胞株に対して処理し、細胞増殖阻害効果を増殖アッセイにて検証する。現在までに、増殖アッセイの結果から算出したIC50に基づいて細胞株を薬剤感受性群と耐性群との分類が完了している。現在、リン酸化プロテオーム用サンプルの前処理を進めており、計画通りの進展といえる。

今後、得られたデータを統合し、薬剤感受性群、耐性群それぞれにおけるキノーム活性変動を、研究代表者が報告済みの活性プロファイリング法で算出予定である。また基質タンパク質側のリン酸化ネットワーク構造の変化に関する解析を、PHOTON法(Cell Systems, 2016)により実施する。これらの解析結果から、耐性群で活性化しているリン酸化シグナルネットワークを抽出する予定である。樹立したCR法細胞株を可溶化し、タンパク発現プロテオーム用、リン酸化プロテオーム用、チロシンリン酸化プロテオーム用の前処理をそれぞれ行う。各種プロテオーム解析を遂行する。得られたプロテオームデータを統合し、薬剤感受性群、耐性群それぞれにおけるキノーム変動を取得する。またリン酸化修飾の変動情報を利用して活性化キノームプロファイルを行う。キナーゼ活性・リン酸化修飾の情報から、耐性群で活性化しているリン酸化シグナルネットワークを暴き出す。リン酸化プロテオーム解析の前処理が2018年度に変更になったため、その分の金額を2018年度に移行させた
植物フラボノイドクエルセチンの強心作用と分子メカニズムに関する研究

本研究の目的は、植物フラボノイドであるクエルセチンが持つ抗腫瘍作用や心臓血管保護作用とは別の機序で心臓に対する直接的な陽性変力作用を持つことを証明することである。昨年度までにサルコメア収縮および細胞内カルシウム動態の計測を行い、クエルセチンが心筋細胞レベルで陽性変力作用を持つことを証明し、マウス個体へ投与することにより、左心収縮能が改善すること、クエルセチンの血中濃度の測定、またクエルセチンの代謝物であるタマリキセチンとイソラムネチンの血中濃度の測定を行った。本年度は血中濃度の測定を行うことができた代謝物であるタマリキセチンとイソラムネチンを用いてサルコメア収縮および細胞内カルシウム動態の計測を行い、タマリキセチンとイソラムネチンが心筋細胞レベルで陽性変力作用を持つことを証明することができ、クエルセチンとその代謝物であるタマリキセチンとイソラムネチンが心筋細胞に影響を与えることで心収縮力を増強させていることを証明することができた。細胞内カルシウム濃度を直接的に測定することで、心筋細胞における収縮力の増強は細胞内カルシウムトランジェントの増強によるものであることを証明し、かつクエルセチンはカルシウム感受性と最大収縮力を変化させない薬剤ということを証明できたため、細胞内カルシウムトランジェントが増強する機序を探るため、サルコメア関連タンパクとそのリン酸化に関する定量をマウス心筋細胞を用いて行った。心筋トロポニンIのリン酸レベルはクエルセチンの濃度に関係なく、変化しないという結果となっため、ベータ刺激作用による可能性が低いことを示した。以上の結果を学術誌に報告し、国際学会において発表を行った。タマリキセチンとイソラムネチンが心筋細胞に影響を与えている可能性が高く、その正確なデータを収集しているところである。当初計画していた研究計画に関してはほぼ達成することができた。また学術誌への論文掲載が完了している状態である。2017年度には国際学会における発表を行った。現在さらなるエビデンスの確立のために追加の実験を行なっているところである。心不全モデルマウスを用いた実験を行うことで、実投与によるクエルセチンの効力と心機能の改善率を明らかにする予定である。またタマリキセチン、イソラムネチンを用いた心筋細胞の実験を行うことでクエルセチンの代謝物が心収縮力に影響を与えていることを正確に証明しようと計画している。本年度は単一心筋細胞におけるサルコメア収縮および細胞内カルシウム動態の計測を行うことクエルセチンが心筋細胞レベルで陽性変力作用を持つことを証明することができた。細胞内カルシウム濃度を測定し、一部仮説と反する結果となっているが、更なるデータ採取を行うことで、その分子メカニズムを証明することが可能であると考えている。また、実投与によるクエルセチンの効力をMモード心エコーによって測定することにより左心室収縮機能が改善することを証明することができた。また正常野生型マウスにクエルセチンを急性単回静脈内投与した後、採血を行い、HPLCでクエルセチンとその代謝産物であるタマリキセチンとイソラムネチンの血中濃度の測定を行い、その時間経過とともに血中濃度が変化していくことを証明することができた。来年度も当初の計画に沿って本研究課題を進めていく予定である。平成28年度に予定していた研究計画はほぼ達成できている。データの解釈にやや難渋することがあったが、データを追加することで、その分子メカニズムを証明することが可能であると考えている。本研究の目的は、植物フラボノイドであるクエルセチンが持つ抗腫瘍作用や心臓血管保護作用とは別の機序で心臓に対する直接的な要請変力作用を持つことを証明することである。昨年度はサルコメア収縮および細胞内カルシウム動態の計測を行い、クエルセチンが心筋細胞レベルで陽性変力作用を持つことを証明し、マウス個体へ投与することにより、左心収縮能が改善することとクエルセチンの血中濃度の測定、またクエルセチンの代謝物であるタマリキセチンとイソラムネチンの血中濃度の測定を行った。細胞内カルシウム濃度を測定することで、心筋細胞における収縮力の増強は細胞内カルシウムトランジェントの増強によるものであることを証明した。細胞内カルシウムトランジェント増強の原因を探るため、マウス心筋のスキンドファイバー実験において力学的効果を検討したところ、クエルセチンは相対張力-pCa関係と最大張力発生能に影響を与えない結果となり、クエルセチンはカルシウム感受性と最大収縮力を変化させない薬剤ということを証明できた。そこで、細胞内カルシウムトランジェントが増強する機序を探るため、サルコメア関連タンパクとそのリン酸化に関する定量をマウス心筋細胞を用いて行った。

当初計画していた研究計画のほぼ全てを達成することができた。また学術誌への論文掲載が完了している。国際学会における発表を行った。本研究の目的は、植物フラボノイドであるクエルセチンが持つ抗腫瘍作用や心臓血管保護作用とは別の機序で心臓に対する直接的な陽性変力作用を持つことを証明することである。昨年度までにサルコメア収縮および細胞内カルシウム動態の計測を行い、クエルセチンが心筋細胞レベルで陽性変力作用を持つことを証明し、マウス個体へ投与することにより、左心収縮能が改善すること、クエルセチンの血中濃度の測定、またクエルセチンの代謝物であるタマリキセチンとイソラムネチンの血中濃度の測定を行った。本年度は血中濃度の測定を行うことができた代謝物であるタマリキセチンとイソラムネチンを用いてサルコメア収縮および細胞内カルシウム動態の計測を行い、タマリキセチンとイソラムネチンが心筋細胞レベルで陽性変力作用を持つことを証明することができ、クエルセチンとその代謝物であるタマリキセチンとイソラムネチンが心筋細胞に影響を与えることで心収縮力を増強させていることを証明することができた。細胞内カルシウム濃度を直接的に測定することで、心筋細胞における収縮力の増強は細胞内カルシウムトランジェントの増強によるものであることを証明し、かつクエルセチンはカルシウム感受性と最大収縮力を変化させない薬剤ということを証明できたため、細胞内カルシウムトランジェントが増強する機序を探るため、サルコメア関連タンパクとそのリン酸化に関する定量をマウス心筋細胞を用いて行った。心筋トロポニンIのリン酸レベルはクエルセチンの濃度に関係なく、変化しないという結果となっため、ベータ刺激作用による可能性が低いことを示した。以上の結果を学術誌に報告し、国際学会において発表を行った。タマリキセチンとイソラムネチンが心筋細胞に影響を与えている可能性が高く、その正確なデータを収集しているところである。当初計画していた研究計画に関してはほぼ達成することができた。また学術誌への論文掲載が完了している状態である。2017年度には国際学会における発表を行った。現在さらなるエビデンスの確立のために追加の実験を行なっているところである。平成28年度は当初の計画通りスキンドファイバー実験による心筋細胞内収縮装置の収縮機能とカルシウム感受性の評価を行い、クエルセチンの強心作用に関する作用メカニズムを明らかにし、また心不全モデルマウスを用いた実験を行うことで、実投与によるクエルセチンの効力と心機能の改善率を明らかにする予定である。心不全モデルマウスを用いた実験を行うことで、実投与によるクエルセチンの効力と心機能の改善率を明らかにする予定である。またタマリキセチン、イソラムネチンを用いた心筋細胞の実験を行うことでクエルセチンの代謝物が心収縮力に影響を与えていることを正確に証明しようと計画している。研究協力をしている九州大学大学院臨床薬理学講座で実験を行い、試薬等を借用することが可能であった。また当初の実験計画で予定していた実験データを得ることが想定より順調に行うことができたため、実験材料・試薬等の費用の一部が使用されなかった。