hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト血漿リポ蛋白ならびに赤血球の氷温保存法の臨床的応用

氷温技術は添加物を必要としない上温度管理のみで農水産物の食品の鮮度を保ちながら長期保存、熟成、緩徐な発酵に極めて有効である。従ってヒト血清、血漿など比較的安定した生体試料の保存には氷温技術はかなり有効であるが、リパーゼやリポ蛋白等低温にも強い酵素や保存により重力の影響のでる試料では有効とは言えず、一般に-80°Cにおける凍結・溶解を繰り返して測定結果に影響を与える試料の他は保存効能に大差を認めない。この他氷温技術の臨床的応用は臓器移植、再生医学への応用である。これ迄の私共の得た研究成果から判断して、低温による生体代謝の抑制や低温に対する生体防御による応用に加え、生体試料の臓器保存、再生医学への応用であり、生体試料の再生能力が要求される。これ迄の氷温技術のこの分野への応用は極めて少数例を除いて充分とは言い難い。氷温の生物学的メカニズムは、温度に依存する遺伝子の働きや温度と酵素反応の関係にさかのぼって科学的に解明する必要があることが明らかとなった。本年は温度と生物反応を明らかにするため培養肝細胞の動態を重点的に検討した。従来の氷温庫ではCO_2細胞培養装置がなく低温での同一条件による培養状態を検討することができなかったがこの装置を組み込んだ氷温庫を作成し実験した。その結果(1)37°Cでは4時間以降培養肝細胞の培養率が70%に対し氷温では6時間以降でも1020%であった。(2)フィブロネクチン量は氷温では低値を示した。(3)氷温下での細胞接着にはインスリン、デキサメサゾン及びグルカゴンが必要で成長ホルモンは抑制効果を示した。(4)膜酵素活性は培養日数を経るにつれて回復した。(5)低温により細胞増殖は抑制され、常温で亢進した。現在この実験系を用いて温度とmRNA発現量との関係を検討中であり温度と遺伝子発現・酵素発現・生物反応・生物反応の関係をより明らかにする予定である。[ヒト血漿成分ならびに赤血球の氷温保存の基礎的検討]健常ならびに高脂血症を示す男性(2535歳)ボランティアより同意を得て400ml採血し、血漿と赤血球分離を行い滅菌した小試験管に分注日から、6月まで冷室(4°C)、凍結(-80°C)、氷温(-0.2°C)保存し、経時的に血漿成分を分析した。[血漿の氷温保存]これまで血漿、血清に関する評価に耐え得る氷温保存データがなく、氷結点の測定が必要であった。二宮産業製NH-60ペルチェ式氷温庫を使用。佐藤計量器製作所の電子式温度記録計(SKR-100PC)にセンサー測温抵抗体(Ptloo)を使用し基礎的検討を行った。健常成人氷結点血漿:-0.4-0.5°C血清:-0.3-0.4°C[赤血球の氷温保存効果]氷温保存は赤血球の長期保存において既報に近い良好な結果を示すことが確認され有効なことが確認された。[成績結果]1)健常成人の血漿ならびに血清の氷結点は-0.3-0.5°Cであった。2)血液生化学検査(28項目)では冷凍、氷温、冷蔵の各保存方法において30日目までは大きな差は認めなかった。3ヶ月以後は電解質検査には差を認めなかったが、酵素検査では冷凍・氷温・冷蔵の順で検査値が減少する傾向が認められた。3)血清脂質のうちHDL-C、LDL-Cに関しては、冷凍保存と氷温保存で同様な変化を示したが、6ヶ月では氷温保存で低下傾向が認められた。LDL-Cにおいて冷蔵保存による変化が特に強かった。4)細菌に対する氷温保存効果は6月まで菌の増殖はみられず、氷温保存はリポ蛋白の長期保存性に優れている可能性がある。5)凍結保存における融解の繰返しLDL-C値が大きく低下した。6)赤血球の氷温保存効果について既報に近い良好な結果を確認した。[目的]氷温技術は農畜水産領域や食品業界において応用され、氷温(0°Cから氷結点まで)管理することにより添加物もなく安全で長期に亘り鮮度の保持ならびに熟成、発酵などにも応用されてその応用発展には目覚ましいものがある。この氷温技術は近年医学、歯学、獣医学などの領域で応用が試みられ成果を収めつつある。しかしながら医学領域における氷温技術応用による生体臓器・組織に関する研究報告は少ない。今回ヒト血漿リポ蛋白ならびに赤血球の氷温保存法の臨床的応用を試みたのでその成果を報告する。[報告]健康成人男性よりACD加にて全血200ml採血し血漿成分を、また常法により50ml採血して血清を得た。いずれも無菌的にこれらの試料を分注し、冷凍はサンヨー超低温フリーザーMDF-U581ATによる-80°Cで電子冷却方式氷温庫(NH-60、二宮産業株式会社)で氷温帯-0.1°C(設定)温度変動幅±0.3冷蔵は日立R-826CXで4°Cで保存した。試料は生化学的臨床検査(28項目)において検討した。

細菌学的検査は5%羊血清寒天培地等で行い、LDL-CはコレストLDLキット(第一化学)、HDL-Cはデタミナ-L HDL-L、アポ蛋白A,A2,B,C2,C3,Eは市販キット(第一化学)を用いた。HDL-CおよびLDL-LキットHPLC(東ソー製)との相関はそれぞれy=0.881x+2.70,y=0.802x+3.38であった。氷結点はセンサー付電子式温度記録計(Pt100付SKR-100Pc)にて測定した。[結果](1)健常人血漿・血清の氷結点は-0.3-0.5°Cであった。(2)無菌的処理を行うと氷温保存で180日まで無菌保存が可能であった。(3)冷凍、氷温、冷蔵保存において健常人の血液の生化学的臨床検査値は1ヶ月値までは大きな差異を認めないが、3ヶ月、6ヶ月と時間の経過に伴い一般に無機物を除き、冷凍、氷温、冷蔵の順で検査値が減少し、特に酵素に関する検査において著明であった。(4)アポ蛋白についても(3)と同様であった。(5)HDL,LDLに関しては3ヶ月までは氷温保存は冷凍保存とほぼ同様な保存性を示すが6ヶ月では低下した。冷蔵では1ヶ月までであった。(6)冷凍・解凍の繰り返し実験では、リポ蛋白中でLDLが最も影響を受けた。赤血球の氷温保存は山村一らの方法(低温医学14(4)116120,1988)に準じて行い既報のように氷温保存により、輸血用赤血球は従来の冷蔵保存より保存期限を2-3週間延長できる可能性を認めた。[結論]氷温保存はヒト生体試料の保存に経時的、質的に効果的であることが明らかとなった。氷温技術は添加物を必要としない上温度管理のみで農水産物の食品の鮮度を保ちながら長期保存、熟成、緩徐な発酵に極めて有効である。従ってヒト血清、血漿など比較的安定した生体試料の保存には氷温技術はかなり有効であるが、リパーゼやリポ蛋白等低温にも強い酵素や保存により重力の影響のでる試料では有効とは言えず、一般に-80°Cにおける凍結・溶解を繰り返して測定結果に影響を与える試料の他は保存効能に大差を認めない。この他氷温技術の臨床的応用は臓器移植、再生医学への応用である。これ迄の私共の得た研究成果から判断して、低温による生体代謝の抑制や低温に対する生体防御による応用に加え、生体試料の臓器保存、再生医学への応用であり、生体試料の再生能力が要求される。これ迄の氷温技術のこの分野への応用は極めて少数例を除いて充分とは言い難い。氷温の生物学的メカニズムは、温度に依存する遺伝子の働きや温度と酵素反応の関係にさかのぼって科学的に解明する必要があることが明らかとなった。本年は温度と生物反応を明らかにするため培養肝細胞の動態を重点的に検討した。従来の氷温庫ではCO_2細胞培養装置がなく低温での同一条件による培養状態を検討することができなかったがこの装置を組み込んだ氷温庫を作成し実験した。その結果(1)37°Cでは4時間以降培養肝細胞の培養率が70%に対し氷温では6時間以降でも1020%であった。(2)フィブロネクチン量は氷温では低値を示した。(3)氷温下での細胞接着にはインスリン、デキサメサゾン及びグルカゴンが必要で成長ホルモンは抑制効果を示した。(4)膜酵素活性は培養日数を経るにつれて回復した。(5)低温により細胞増殖は抑制され、常温で亢進した。現在この実験系を用いて温度とmRNA発現量との関係を検討中であり温度と遺伝子発現・酵素発現・生物反応・生物反応の関係をより明らかにする予定である。
新規抗癌剤Ecteinascidin 743の効率的合成法の開発

昨年度に合成経路を確立した環状アセタールを加熱条件に付したところ、脱水を伴うジアルデヒドの生成と生じたアルデヒドに対するフェノールへの環化反応が進行し、五環性骨格の構築に成功した。得られる化合物は不安定であったので、更に1potにてRed-A1を作用させアルデヒド、アミド、カーバメート部位を一挙に還元することに成功した。そしてシアン化物イオンを用いてイソキサゾリジンを開環することで鍵中間体へと導くことに成功した。そして先行研究の条件を参考にシステインユニットとの縮合、硫黄原子を含む10員環ラクトンの構築、下部テトライソキノリンユニットの導入を経て、Ecteinascidin 743の全合成を達成した。続いてHaliclonin Aの合成研究に着手した。芳香族化合物に対してBirch還元と続くアルキル化により多置換シクロヘキサンを調製し、閉環メタセシス反応を経ることで飽和17員環を有する二環性エノンへと導いた。そしてエノンに対して永田試薬を作用させたところ、シアン化物イオンの共役付加と生じたエノラートのプロトン化が共に架橋鎖を避ける面より進行し、シクロヘキサン上の連続する二つの不斉炭素を立体選択的に構築することに成功した。続くビシクロ[3.3.1]骨格の構築はシラン還元を適応すること円滑に進行することを見いだし、目的の三環性骨格の構築に成功した。ラクタム窒素原子のアルキル化は塩基性条件では達成できなかったものの、形式的な還元的アルキル化によりこの課題を克服することができた。すなわち先に合成したラクタムと対応するアルデヒドの混合物を酸性条件下加熱したところ脱水縮合が進行し対応するエナミドが得られた。そして得られたエナミドに対して室温にてトリエチルシランを作用させたところ目的の第三級アミドを良好な収率にて得ることができた。ecteinascidin 743の効率的な主骨格の構築法を確立することに成功し、見事その全合成を達成しました。更に新たな研究テーマにも果敢に挑戦し、短い期間でhaliclonin Aの三環性骨格の構築法の確立に成功した。今回合成法を確立した三環性化合物は、その側鎖の両末端に酸素官能基を有しており、それを足がかりとすることで更なる炭素鎖の伸長が可能であると考えている。一方、側鎖の不飽和結合部位の伸長を段階的に行っていることから効率性に問題があるので、より直接的な増炭法の確立が必要だと思われる。市販の3-メチルカテコールより8段階にて調整可能な文献既知の芳香族アルデヒドを2段階にて対応する臭化ベンジル誘導体へと導いた。この臭化ベンジル誘導体を用いた不斉アルキル化はオルト位に存在するヨウ素原子の立体障害により困難が予想されたが、京都大学の丸岡らにより開発された不斉相間移動触媒を用いることで円滑に進行し、目的のアミノ酸誘導体を定量的、かつ高い光学純度にて合成することに成功した。窒素原子をメチルカーバメートとして保護した後に別途グルタミン酸より7段階にて調製したアミンとの縮合を行った。得られたアミドは再結晶により精製することで、目的物を単一のジアステレオマーを得ることに成功した。続く酸性処理により得られたエナミドをHeck反応の条件に付したところ、添加剤としてテトラブチルアンモニウムクロリドを用いることで反応は円滑に進行し、目的のビシクロ[3.3.1]骨格の構築に成功した。得られたエナミドを、酸性条件下、より立体障害の少ないα面より選択的に還元することで、C環上に存在する3つの不斉炭素の構築に成功した。塩基性条件下にて一級水酸基のアセチル基を除去した後にSwern酸化を行ったところ、生じたアルデヒドに対する窒素原子からの環化が進行し、5員環のヘミアミナールが得られた。得られたヘミアミナールからの脱水反応の検討は困難を要したが、トルエン還流下にて触媒量のカンファースルホン酸を作用させることで脱水反応が進行し、中程度の収率ではあるが分子間Heck反応の前駆体である5員環エナミドの構築を達成した。前年度に合成法を確立した5員環エナミドに対するA環ユニットの立体選択的な導入の検討を行った。基質である5員環エナミド自体が反応性に乏しいことに加え、目的に関して二重結合の異性化やエビ化が懸念されたため、A環ユニットとしては温和な条件でのHeck反応の進行が報告されているジアゾニウム塩を選択し、対応するアニリンのジアゾ化と続くHeck反応を1ポットで行うことを計画した。当初はジアゾ化に関して再現性に問題があり、その検討には困難を要したが、種々溶媒や温度等を検討したところ、まずTHF溶媒中0°Cにてアニリンのジアゾ化を行い、続いて系中に5員環エナミドのアセトニトリル溶液を加えることで調製した混合溶媒中、室温にて反応を行うことで目的のHeck反応が再現性よく進行し、A環ユニットの立体選択的な導入に成功した。得られたHeck反応成績体に対して、生じた二重結合の酸化的開裂を行うこととした。しかしこの二重結合は非常に大きな立体障害の影響で反応性に乏しく、その検討には困難を要した。まず比較的立体障害の影響を受けにくいと考えられるオゾン酸化を行ったところ電子豊富な芳香環の損壊が競合したので、四酸化オスミウムを用いた二重結合のジオール化を試みることとした。

先述の立体障害のため検討には困難が伴ったが、最終的にオスミウムのリガンドとしてキヌクリジン、添加剤としてメタンスルホンアミドを加える条件に付すことで反応が円滑に進行し、目的のジオールが単一の異性体として高収率にて得られることを見いだした。続いてジオールの酸化的開裂を試みた。酸化剤として四酢酸鉛を用いた際には複雑な混合物が得られるのみであったが、THF溶媒中過ヨウ素酸を作用させたところ、ジオールの酸化的開裂と生じたジアルデヒドの水和が進行した環状セタールが高収率にて得られた。昨年度に合成経路を確立した環状アセタールを加熱条件に付したところ、脱水を伴うジアルデヒドの生成と生じたアルデヒドに対するフェノールへの環化反応が進行し、五環性骨格の構築に成功した。得られる化合物は不安定であったので、更に1potにてRed-A1を作用させアルデヒド、アミド、カーバメート部位を一挙に還元することに成功した。そしてシアン化物イオンを用いてイソキサゾリジンを開環することで鍵中間体へと導くことに成功した。そして先行研究の条件を参考にシステインユニットとの縮合、硫黄原子を含む10員環ラクトンの構築、下部テトライソキノリンユニットの導入を経て、Ecteinascidin 743の全合成を達成した。続いてHaliclonin Aの合成研究に着手した。芳香族化合物に対してBirch還元と続くアルキル化により多置換シクロヘキサンを調製し、閉環メタセシス反応を経ることで飽和17員環を有する二環性エノンへと導いた。そしてエノンに対して永田試薬を作用させたところ、シアン化物イオンの共役付加と生じたエノラートのプロトン化が共に架橋鎖を避ける面より進行し、シクロヘキサン上の連続する二つの不斉炭素を立体選択的に構築することに成功した。続くビシクロ[3.3.1]骨格の構築はシラン還元を適応すること円滑に進行することを見いだし、目的の三環性骨格の構築に成功した。ラクタム窒素原子のアルキル化は塩基性条件では達成できなかったものの、形式的な還元的アルキル化によりこの課題を克服することができた。すなわち先に合成したラクタムと対応するアルデヒドの混合物を酸性条件下加熱したところ脱水縮合が進行し対応するエナミドが得られた。そして得られたエナミドに対して室温にてトリエチルシランを作用させたところ目的の第三級アミドを良好な収率にて得ることができた。不斉相間移動触媒を用いた効率的な非天然型アミノ酸の調製法を確立し、更に当初の計画通りに分子内Heck反応によるビシクロ[3.3.1]骨格、および不安定だと予想された5員環エナミドの構築を行うことができたから。エナミドに対するHeck反応によるA環ユニットの導入、及び高い立体障害を有する二重結合の酸化的開裂に成功した。残るB環の構築を行い、その後の変換に関しては過去の知見を活用することで本天然物の全合成は十分可能であると考えられる。ecteinascidin 743の効率的な主骨格の構築法を確立することに成功し、見事その全合成を達成しました。更に新たな研究テーマにも果敢に挑戦し、短い期間でhaliclonin Aの三環性骨格の構築法の確立に成功した。ビシクロ[3.3.1]骨格を有するエナミドの合成法を確立できたので、引き続き天然物の全合成に向けた検討を行っていく。すなわち修士の際に見いだしたジアゾニウム塩とエナミドとのHeck反応を本基質に適応することでA環ユニットの導入を行い、二重結合の酸化的開裂を行うことでB環の構築を目指す。また、平行してエナミド合成法の短行程化、効率化を検討していく。
低アレルゲン化ワクチンを用いたアレルゲン免疫療法によるイヌアレルギー治療への挑戦

近年,I型アレルギーであるイヌアレルギーの患者数が急増している。我々は,IgE抗体との結合親和性を低下させた低アレルゲン化ワクチンを開発し,重篤な副作用であるアナフィラキシーを引き起こすことなく,アレルゲン免疫療法によりアレルギー反応を寛容化に導くことを目指している。本研究では,同定されている7種のイヌアレルゲンの中で最もアレルゲン活性が高いCanis familiarisallergen 1(Can f 1)と,他の動物由来アレルゲンとのアミノ酸配列相同性が高く,交差反応性を有することが報告されているCan f 6の2種のアレルゲンを研究に用いる。当該年度は,昨年度X線結晶構造解析により得られた遺伝子組換え型Can f 6の立体構造をもとに,ネコアレルゲンのFel d 4との三次構造および配列類似性を考慮して交差反応性に関与している可能性がある3箇所のIgE認識部位を予測した。次に,予測した部位の連続したアミノ酸3残基をそれぞれアラニンに置換した3種類の変異体Can f 6(mu-1, mu-2,及びmu-3)を作製した。そこで、これら変異体のIgE反応性を調べたところ,顕著に減少した。しかし,IgE反応性低下の程度は,変異を導入した部位や使用した血清に大きく依存することが判った。Can f 6は複数のエピトープを含むアレルゲンであり,Can f 6反応性血清にはCan f 6エピトープを認識するIgEが様々な量で含まれると考えられる。また,予測したエピトープがFel d 4に対するIgE交差反応性に部分的に関与していることを明らかにした。作製した変異体によるIgE反応性の低下は,Can f 6が構造を維持しているか否かに大きく依存しており,Can f 6が正しい三次構造を形成していることがIgEエピトープとして働くために重要であるということを明らかにした。前年度実績よりCan f 1のArg152がIgE結合性に重要であることが示唆されたためin vitroのIgE反応性を調べたが,顕著なアレルゲン活性の低下が認められなかった。そこで、Can f 6と同様に交差反応性を利用したIgEエピトープの予測を行った。Can f 1は,human tear lipocalin (hTLC)と60%の相同性を有し,且つネコアレルゲンFel d 7と交差反応性を示すことが報告されている。本研究では,Can f 1, Fel d 7,及びhTLC間でシークエンスアラインメントを行い,それらのデータをもとにIgEエピトープ予測を行い,予測された連続するアミノ酸5残基をアレルゲン活性のないhTLC型に置換したCan f 1変異体(Can f 1 Mu1 Can f 1 Mu4)の作製を行った。患者血清を用いたIgE結合親和性の評価を行ったところ,Mu3において大きく親和性が低下しており,Mu3の置換領域が主要IgEエピトープであることが示唆された。一方,Can f 6は,X線結晶構造解析により得られた立体構造をもとに,Fel d 4との三次構造および配列類似性を考慮して交差反応性に関与している可能性がある3箇所のIgE認識部位を予測し,連続したアミノ酸3残基をそれぞれアラニンに置換した3種類の変異体Can f 6(mu-1, mu-2,及びmu-3)を作製した。IgE反応性を調べたところ顕著な減少がみられたが,低下の程度は変異を導入した部位や使用した血清に大きく依存した。従って,Can f 6は複数のエピトープを含むアレルゲンであり,Can f 6反応性血清にはCan f 6エピトープを認識するIgEが様々な量で含まれると考察された。以上の成果は,Scientific Reports, 9(1), 1503, 2019年に報告した。Can f 1については, Can f 1変異体Mu-3を用いたアレルギー免疫療法の評価を行う。野生型Can f 1をアジュバンド(水酸化アルミニウム)と共にマウス腹腔内に投与することにより免疫感作を行い,イヌアレルギーモデルマウスを作製する。免疫感作終了後,Mu-3をマウス腹腔内に投与し,末梢血を採取する。末梢血中の抗体,及び各種サイトカインを定量するとともに,可能ならばフローサイトメトリーを用いてCD4+CD25+T細胞(制御性T細胞,Treg)の割合を測定し,イヌアレルギーモデルマウスにおける免疫寛容の誘導(アレルゲン免疫療法の効果)の有無を確認する。Can f 1の結晶化については,引き続き結晶化条件を検討する。結晶化条件の検討は,Can f 6の結晶化条件を参考にし,HAMPTON社の結晶化スクリーニングキットを用いて行う。一方,Can f 6については,RS-ATL8を用いた野生型および変異型Can f 6(mu-1, mu-2,及びmu-3)のin vitroアレルゲン活性の評価を行う。さらに,可能ならば,変異型Can f 1を用いたアレルギー免疫療法の評価と同時に,変異型Can f 6を用いたアレルギー免疫療法の評価も行う。I型アレルギーは,好塩基球やマスト細胞上のIgE抗体とアレルゲンが架橋することにより惹起される即時型の過敏症であり,主な治療法として抗アレルギー薬が用いられるが,症状の緩和が目的であるため完治は見込めない。

一方,完治が見込める治療法として,低濃度のアレルゲンを直接体内に投与しアレルギー反応を寛容化に導くアレルゲン免疫療法があるが,本法はアレルゲンを直接体内に投与する治療法であるため,重篤な副作用であるアナフィラキシーを引き起こす危険性がある。より安全にアレルゲン免疫療法を行うためには,アナフィラキシー活性を低下させた低アレルゲン化ワクチンの開発が必須である。そこで我々は,先進国において患者数が急増しているI型アレルギーのイヌアレルギーに注目し,IgE抗体との結合親和性を低下させた低アレルゲン化ワクチンの開発を目指した。本研究では,同定されている7種のイヌアレルゲンの中で最もアレルゲン活性が高いCanis familiarisallergen 1(Can f 1)と,他の動物由来アレルゲンとのアミノ酸配列相同性が高く,交差反応性を有することが報告されているCan f 6の2種のアレルゲンを研究に用いた。Can f 1では,IgEエピトープ予測サーバーを利用して,B細胞エピトープを予測した。予測したアミノ酸残基をアラニンに置換した変異型Can f 1を作製し,変異型Can f 1のIgE結合親和性,及びラット培養マスト細胞株RS-ATL8細胞を用いて,変異型Can f 1による脱顆粒能を評価した。Can f 6では,X線結晶構造解析により立体構造を決定した後,交差反応性が報告されてるネコアレルゲンFel d 4,及びウマアレルゲンEqu c 1のアミノ酸配列を利用してIgE抗体とアレルゲンとの結合部位であるB細胞エピトープを予測し,本エピトープを欠損させた変異体を作製した。Can f 1では,アレルゲンの交差反応性とIgEエピトープ予測サーバーを用いて得られたアミノ酸残基をAlaに置換した6種類の変異型Can f 1を作製した。ELISAによりイヌアレルギー患者血清中のIgEとの結合親和性を評価したところ,R152Aが野生型Can f 1と比較してIgE結合親和性が約10%低減した。また,多重変異型Can f 1(R152A/K49A, R152A/H86A, R152A/R111A)を作製し,同様の実験を行った結果,R152A/R111Aが18%の低減を示した。次に,ラット培養マスト細胞株RS-ATL8細胞を用いて,野生型及び変異型Can f 1の脱顆粒能を測定した結果,多重変異型Can f 1は,野生型Can f 1と比較して有意に脱顆粒能が低減されることが判明し,特にR152A/R111Aが最も脱顆粒能の低減を示した。一方,Can f 6では,Can f 6の結晶化とX線結晶構造解析(SPring-8)を行ったところ,分解能2.35Åの結晶構造を得ることができた。Can f 6の立体構造は,リポカリンファミリーで高度に保存されたβ-barrel構造とそれに付随するα-helix構造を有した構造であることが判明した。次に,Can f 6のIgEエピトープを同定するために,得られた立体構造とネコアレルゲンFel d 4,及びウマアレルゲンEqu c 1との交差反応性を利用し,上記3種間でアミノ酸配列のアラインメントを行った。その結果,高度に保存された領域を同定することができ,その領域内のアミノ酸残基をIgEエピトープと予測した。次に,予測した領域をCan f 6の立体構造上にマッピングし,溶媒面に露出しているアミノ酸残基を選択し, Can f 6のIgEエピトープとして絞り込み,それらのアミノ酸残基をAlaに置換した変異体を作製した。近年,I型アレルギーであるイヌアレルギーの患者数が急増している。
ジーンチップを用いた機能性食品因子の解析

食生活の欧米化などにより、高脂血症患者の数は増加している。新たな脂質代謝改善の試みとして、核内受容体LXRの機能が注目されている。LXRは酸化コレステロールをリガンドとして活性化される核内受容体で、その応答遺伝子が脂質代謝調節に深く関わっている。応答遺伝子として各種ABCトランスポーター遺伝子が挙げられ、そのうちのABCA1は細胞内のコレステロールを排出し、HDL産生に寄与し、ABCG5/G8は体外へのコレステロール排出に関与する可能性が示唆されている。従って、これらトランスポーターの発現を正に制御する食品因子は脂質代謝を改善する可能性を秘めている。しかしその一方で、LXRは転写因子SREBP-1cの発現を促進し、脂肪酸合成を亢進することが報告されている。この効果は肝臓で著しく、肝臓における中性脂肪合成、含量を増加させ、脂質代謝改善に対して逆効果をもたらす。この様な背反する機能がどの様なバランスのもとに保たれているかについて検証する目的で、マウスにLXR合成リガンドを経口投与し、各種臓器における応答遺伝子のプロファイルを検討した。肝臓、小腸、脂肪組織からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析に供した。これまで報告のある応答遺伝子の発現亢進が確認され、実験系として機能していることが確認され、さらに膨大なデータについて現在解析を進行している。同様の実験系で、食品因子による遺伝子応答を検討する評価が可能となった。食生活の欧米化などに伴い、高コレステロール血症患者の数は増加している。血液中のコレステロールの大半は低密度リポタンパク質(LDL)の形で存在し、細胞膜表面に存在するLDL受容体により細胞内へと取り込まれる。従って、この受容体の発現を亢進させ、血液中のLDL濃度を下げる機能を持つ食品成分は、生活習慣病を軽減させる機能性食品素材となりうる。この考えに基づき、候補化合物を探索した結果、胆汁酸にLDL受容体mRNA発現を増加させる効果のあることが認められた。この効果の詳細を培養細胞Hep G2を用い、分子細胞生物学的手法により解析したところ、胆汁酸はLDL受容体mRNAの半減期を延ばしていることが明らかになった。さらに、この機構を解析したところ、胆汁酸は細胞内シグナル伝達のMAP kinase経路を活性化しており、この経路を阻害剤で阻害すると効果は見られなくなった。一方、胆汁酸は新規核内受容体FXRのリガンドとして本受容体を活性化し、コレステロール、胆汁酸代謝関連遺伝子の転写を制御することが知られている。胆汁酸の持つこの様な機能は上記の知見に関与していないことも我々は明らかにした。上記実験結果に基づき、胆汁酸のMAP kinase経路活性化能を模倣した機能を持つ食品素材を探索する評価系をジーンチップを用いて構築している。
ガラクトサミン誘発肝細胞APOPTOSISの発現機構の解析

ガラクトサミン(GalN)によって誘発されるマウス肝細胞のAPOPTOSISの発現様式および発現機構に関する一連の研究成果は以下の通りである。マウス初代培養肝細胞では、5mM以上のGalNの添加によりAPOPTOSISが誘発され、LDHの逸脱に先立つかなり早い時期からDNAのfragmentationが発現し、36時間以降まで維持された。また、20mM GalNの添加では、APOPTOSISの誘導とともにNECROSISによる細胞死が確認され、NECROSIS像の増加と併行してLDHの逸脱も増加した。GalNはin vitroと同様in vivoでも肝細胞のAPOPTOSISを誘発し、3g/kg投与群では24時間後のAPOPTOSISの誘発に続いて48時間後にNECROSISに移行することが確認できた。また、血清GPT値の上昇はDNAのfragmentationの発現とは一致せず、肝細胞のMECROSISとほぼ一致することが確認された。また、本実験系ではAPOPTOSISの発現にFas,p53等の関与はなく、新たなAPOPTOSIS関連蛋白の発現もないことが示唆された。本実験系における[Ca^<2+>]iの上昇機構およびAPOPTOSISとNECROSISとの関係等については今後の課題である。なお、発現機構の比較の目的で行なったT-2トキシン誘発リンパ球APOPTOSISならびに5-Azacytidine誘発神経系細胞APOPTOSISに関する研究成果も得た。化学物資によるAPOPTOSISの発現機構を解析する目的で、ガラクトサミン(GalN)とマウス肝細胞との組み合せの系を中心に研究を行なった。本年度に得られた成績は下記の通りである。(1)GalNマウスは初代培養肝細胞にAPOPTOSIS惹起することが、形態学的および生化学的に初めて明らかにされた。また、GalNの添加量によっては、APOPTOSISとNECROSISの双方が観察された。APOPTOSISとNECROSISの分岐の機構について検討中である。(2)細胞傷害の指標である細胞から培養液中へのLDHの逸脱(24Hr)にかなり先立って、生化学的にはGalN添加3hr後から、また、形態学的には12hr後から、DNAの断片化が発現した。(3)上記の実験系におけるAPOPTOSISの発現は、カルモヂュリン阻害剤の同時投与によって抑制されたが、カルシウムチャンネル阻害剤によっては抑制されなかった。目下、細胞内カルシウムの量と分布の推移について詳細に検索中である。(4)GalNによる肝細胞のAPOPTOSISの誘発およびカルモヂュリン阻害剤あるいはカルシウムチャンネル阻害剤によるその修飾については、in vivoでも基本的に同様なことが確認された。(5)APOPTOSIS関連遺伝子の発現の有無を検討中である。(6)GalN以外の化学物質によるAPOPTOSISの誘導(5-Azacytidineによる神経系細胞のAPOPTOSISおよびT-2 toxinによるリンパ球のAPOPTOSIS)についても検討し、GalN誘発肝細胞APORTSISの発現機構との比較を試みている。マウス初代培養肝細胞では、5mM以上のGalNの添加によりAPOPTOSISが誘発され、LDHの逸脱に先立つかなり早い時期からDNAにfragmentationが発現し、36時間以降まで維持された。また、血清GPT値の上昇はDNAのfragmentationの発現とは一致せず、肝細胞のNECROSISとほぼ一致することが確認された。

また、本実験系ではAPOPTOSISの発現に、Fas,p53等の関与はなく、新たなAPOPTOSIS関連蛋白の発現もないことが示唆された。本実験系における[Ca^<2+>]iの上昇機構およびAPOPTOSISとNECROSISとの関係等については今後の課題である。なお、発現機構の比較の目的で行なった。T-2トキシン誘発リンパ球APOPTOSISならびに5-Azacytidine誘発神経系細胞APOPTOSISに関する研究成果も得た。
温熱と電気刺激が血管機能に与える影響 －運動が困難な者への応用を目指して－

血管の最内層にある血管内皮細胞の機能低下は動脈硬化の初期段階で発生し,血管内皮機能の改善は動脈硬化の予防につながることが明らかにされている.我々は,30分間の温熱刺激(温熱条件),電気刺激(電気条件)および温熱刺激と電気刺激の併用(併用条件)が,血管内皮機能の指標である血流依存性血管拡張反応(Flow-mediated dilation:FMD)に与える効果を検討した.その結果,併用条件においてのみFMDは刺激前と比較し,刺激後に有意に増加を示した.本研究により,温熱刺激と電気刺激の併用は急性に非活動部位の血管拡張能を増加させ,血管内皮機能の改善に有効である可能性が示唆された.血管の最内層にある血管内皮細胞の機能低下は動脈硬化の初期段階で発生し,血管内皮機能の改善は動脈硬化の予防につながることが明らかにされている.我々は,30分間の温熱刺激(温熱条件),電気刺激(電気条件)および温熱刺激と電気刺激の併用(併用条件)が,血管内皮機能の指標である血流依存性血管拡張反応(Flow-mediated dilation:FMD)に与える効果を検討した.その結果,併用条件においてのみFMDは刺激前と比較し,刺激後に有意に増加を示した.本研究により,温熱刺激と電気刺激の併用は急性に非活動部位の血管拡張能を増加させ,血管内皮機能の改善に有効である可能性が示唆された.血管機能の維持・改善は,国民の健康維持のみならず医療費の面でも重要な課題である.有酸素性運動は血管機能の改善に有効であるが,超高齢化社会の進展により運動実施が困難な者も急増しており,運動の代わりとなる介入方法の早期開発が求められている.そこで本研究では,温熱や電気刺激などの物理刺激に対する血流量と血流パターンの変化に着目し,温熱と電気刺激を組み合わせた新しい介入方法が,血管機能に与える影響(急性効果と慢性効果)とその作用機序を明らかにすることを目的とする.具体的には,下肢における1温熱刺激のみ,2電気刺激のみ,3温熱と電気刺激の併用,の3種類の試行の違いが,大腿動脈の血流量,血流パターンおよび血管機能の指標である“血流依存性血管拡張反応(Flow-Mediated Dilation:FMD)"に与える影響を比較する.本年度は,これらの3つの試行の違いが血流量,血流パターンおよび血管機能に与える急性効果を明らかにすることとした.予備実験の結果より,測定部位を大腿動脈から上腕動脈に変更した.また,温熱刺激と電気刺激の刺激部位を同一とするため,温熱刺激の方法を変更した.本研究に必須の超音波診断装置(Vivid i)が事務手続きの都合により納入が遅れた(すでに納入済み)ために,やや実験の開始が遅れていたが,新しい超音波画像の解析ソフトの使用により解析時間の大幅な短縮が可能であり,現在の進行状況においても計画実施に問題はないと考える.血管内皮機能の維持・改善は、国民の健康維持のみならず医療費の面でも重要な課題である。有酸素性運動は血管内皮機能の改善に有効であるが、超高齢化社会の進展により、運動実施が困難な者も増加しており、運動の代わりとなる介入方法の早期開発が求められている。本研究では、温熱や電気刺激などの物理刺激に対する血流量と血流パターンの変化に着目し、温熱と電気刺激を組み合わせた新しい介入方法が、血管内皮機能に与える影響を明らかにすることを目的とする。本研究では、30分間の1温熱刺激のみ(温熱条件)、2電気刺激のみ(電気条件)、3温熱と電気刺激の併用(併用条件)、の3種類の試行が、血管内皮機能の指標である「血流依存性血管拡張反応(Flow-mediated dilation: FMD)」に与える影響を比較した。また、皮膚血流計を用いて、介入中の皮膚血流量を測定した。その結果、FMDは温熱条件と電気条件では、介入前と比較して介入後に有意差を認めなかった。一方、併用条件のFMDは、介入前と比較して介入後に有意に増加を示した。介入肢の皮膚血流量は温熱条件および併用条件において、安静時と比較して介入中に有意に増加した。また、併用条件の皮膚血流量は、温熱条件および電気条件と比較して有意に高値を示した。温熱刺激および電気刺激は血管内皮機能の改善に有効であるが、臨床においては電気刺激による血圧上昇に注意が必要な者や、感覚鈍麻した者もいることから、各刺激の温度や強度は必要最小限に抑えることが望ましいと考えられる。本研究により、温熱刺激と電気刺激の併用は、皮膚血流量の増加を引き起こすことにより、単独の刺激よりも効果的に血管拡張能を増加させ、血管内皮機能の改善を引き起こすことができる可能性が示された。運動生理学平成25年度において,下肢における1温熱刺激のみ,2電気刺激のみ,3温熱と電気刺激の併用,の3種類の試行の違いが,上腕動脈の血流量,血流パターンおよび血管機能の指標である“血流依存性血管拡張反応(Flow-Mediated Dilation:FMD)"に与える急性効果を検討した.予備実験の結果より,測定部位を大腿動脈から上腕動脈に変更し実験を実施している.また初期の計画では,温熱刺激と電気刺激の刺激部位が異なっていたため,刺激部位を同一にすることとした.そのため,温熱刺激の方法を,温水に刺激部位を直接浸す方法から,温水を循環させたカフを巻く方法に変更した.また現在,超音波診断装置によって得られた画像を解析するソフトの有用性を確認している所である.

今までは超音波画像をマニュアルで解析していたため,血流パターンやFMDの解析に大幅な時間を要していたが,ソフト使用により解析時間を短縮することが可能と考えられる.本研究に必須の超音波診断装置(Vivid i)が事務手続きの都合により納入が遅れた(すでに納入済み)ために,やや実験開始が遅れていたが,解析時間の短縮により現在の進行状況においても計画実施に問題はないと考える.平成26年度では,温熱刺激と電気刺激を併用する受動的なトレーニングを行うことが,上腕動脈の血管機能に与える影響を明らかにすることとする.昨年度に引き続き,計画に基づき実験を遂行するが,刺激部位,および温熱刺激の方法については以下の通り変更し,1)温熱刺激のみ,2)電気刺激のみ,3)温熱刺激と電気刺激の併用.の実験を行う.1)温熱刺激:前腕部に42°Cの温水を循環させたカフを装着する.2)電気刺激:前腕部に電極を配置し他動的に筋収縮を行う.3)温熱刺激と電気刺激の併用:前腕部における温熱刺激および電気刺激を同時に行う.これら3種類の試行の受動的トレーニングの前後で,血管機能の指標である“血流依存性血管拡張反応(Flow-Mediated Dilation:FMD)"を上腕動脈にて測定する予定である.当初,超音波診断装置(Logiq e)を新規購入する予定であったが,より本研究に適した循環器専門の超音波診断装置(Vivid i)のほぼ未使用の中古品を同講座所属の研究者と共同購入することになったため,超音波診断装置の金額が変更となり,研究費の一部を次年度使用額として繰り越すこととなった.研究の遂行に必要な消耗品の購入,人件費などは,当初の計画通りに使用する予定である.最終年度である本年度は,本研究課題に関する研究打ち合わせや研究成果の発表に伴い,国内外旅費,英文校正料,投稿料などが必要となる.そのため,これらの成果報告のための経費に,研究費を充当する予定である.
日本語形式意味論とその哲学的含意の研究

日本語は思考の論理的表現には適さないとしばしば言われてきた。そうした主張の理由として挙げられてきたものには、(1)可算/非可算の区別がない、(2)単数/複数の区別がない、(3)確定/不確定をしるしづける明確な指標がない、といったものがある。本研究は、こうした主張が、論理についてのあまりにも狭い見方に依存していることを示す。この見方によれば、基礎的述定は単称的であり、複数や非可算の述定はすべて単称述定に還元されるべきである。複数論理の出現は、こうした見方を過去のものとする。本研究は、複数論理をメタ言語とする日本語意味論の構成により、日本語への上のような見方がまちがいであることを示した。研究第二年目の本年度において、形式意味論上の課題としては、日本語における量化に集中的に取り組み、「どのも」に典型的にみられるような単称量化と、「すべて」「大部分」といった量名詞を用いる量化の両方を統一的に扱う理論を構成した。その過程で、単称量化と疑問文の双方に「どのN」といった形の表現が現れることに注目して、さらには、量化と疑問の意味論を統合する視点を獲得した。他方、哲学的含意の側面の研究としては、日本語と哲学の言語という問題、記述の理論との関係などについての研究も行った。以上について、さらに詳しく述べるならば、次のようになる。(1)日本語における量化と疑問の意味論については、現在、大部の英語の原稿Singular Quantification in Japaneseが存在する。その最初の7章は、現在、研究代表者のウェッブサイトで公開中である。(2) 2013年夏にアテネで開催された世界哲学会議で行った講演"Creatingaphilosophical language --lessons from the Japanese experiences"および同年9月における教育思想学会でのコメント「日本語での哲学その過去と将来」は、日本語の意味論的特性と日本における哲学のあり方の関係についても考察している。(3) 2014年3月に日本大学で開催したワークショップWorkshop on Early Analytic Philosophyでは、形式意味論において大きな影響をもった、20世紀初頭のラッセルの記述の理論を中心に、初期分析哲学と現在の形式意味論との関係についても論じられた。研究第一年目の本年度においては、過去十年以上にわたる研究代表者による日本語意味論の研究を再検討し、多くの改訂を行い、その成果の一部を英語論文としてまとめた。また、こうした再検討の結果から示唆された新たな研究の方向性について、二度にわたる国際的なワークショップにおいて発表を行った。さらに、日本語意味論から得られる知見が、日本語に対する一般的理解にどのような寄与を行いうるのかについて論じた、日本語の論文も発表した。以下に、その各々について、より詳しく述べる。(1)論文“Indirect Passives and Relational Nouns (II)"においては、日本語に特徴的な間接受身の意味論的特性を説明するために、関係名詞(relational noun)というカテゴリーを立て、その特性について詳しい記述を行った。この論文を書くにあたっては、研究協力者ラヨス・ブロンス氏との議論がきわめて有益であった。(2)二つの研究発表“From Philosophy to Japanese Semantics (and Back)"および“On Singular Quantification in Japanese"は、いずれも日本語名詞句の意味論にかかわるものであり、前者では、「S+こと」という形の名詞句の一般的取り扱いを、後者では、「どの+N」という形の名詞句を用いた量化についての新しい理論を、それぞれ提案した。後者は、トロント大学のByeong-Uk Yi氏を招いて行った共同研究に負う所が大きい。(3)論文「複数論理と日本語意味論」(西日本哲学会編『哲学の挑戦』所収)においては、(1)および(2)における理論的枠組みとして用いた複数論理(plural logic)の、哲学一般および、日本語話者の言語意識への寄与について論じた。本研究の目的は、研究者がこれまで行ってきた、日本語を対象とする形式意味論における成果をもとに、精密であって包括的な意味論的理論を構成するとともに、理論の哲学的基礎、ならびに、理論からの哲学的帰結の吟味を行うことを目指した。これら三つの側面のすべてにおいて、一定の成果が得られたと確信している。(A)まず、意味論そのものについては、複数論理をメタ言語に採用することが、日本語名詞句の意味論、とりわけ、量化の扱いについて、きわめて有効であることを立証できた。細部にまでわたる具体的な分析としては、項をとる関係名詞の意味論、日本語の量化表現の体系的分析の二つが、本研究の大きな成果である。(B)次に、本研究において構成した意味論的理論の哲学的基礎に関しては、二つの方向で研究を行った。

ひとつは、複数論理の哲学的基礎に関してのものであり、もうひとつは、言語の存在論および認識論にとって重要な区別であるタイプとトークンについての検討である。後者は、トークン生成子(token generator)という新しい概念の提案と、それをもとにした言語の同一性についての新しい見方の展開という形を取った。(C)最後に、日本語の意味論的研究からの帰結として、近代日本における哲学とその媒体である日本語との関係について考察を行い、二つの国際学会において、その成果を発表した。最終年度においては、一方で、三年間にわたる研究の成果となる、日本語における量化についての包括的な英文モノグラフの準備を行うとともに、日本語におけるmass/countの区別についての研究を行った。これらの研究は、近いうちに公表される予定である(前者の一部はすでに公表されている。)本研究に関連するものだけには限らないが、本研究の成果の多くは、未公刊のものも含めて、ここに公表されている。哲学本研究は、日本語意味論を具体的に構成することと、日本語意味論がもちうる哲学的含意を明らかにすることという、二つの部分からなる。本年度は、そのどちらに関しても、計画以上に研究を進めることができた。とりわけ、このことは、前者の部分について言える。すなわち、昨年度より着手されていた、量化の取り扱いに関して、予想されていたよりも急速に理論を展開することに成功したことが、このように評価する最大の理由である。当初考えていた、単称量化と量名詞による量化を統合することのみならず、日本語の量化と疑問の意味論のあいだに存在する密接な関係を反映するような理論の可能性が明らかとなったことは、大きな成果である。後者の課題についても、日本の哲学の特性と日本語との関係について、国際的な場所で議論することは、今後の研究のための大きな刺激となった。本研究は、日本語意味論を具体的に構成することと、日本語意味論がもちうる哲学的含意を明らかにすることという、二つの部分から成る。本年度は、そのどちらに関しても、おおむね計画通りに研究を進めることができた。とりわけ、本年二月にトロント大学のByeong-Uk Yi氏を招聘して、講演ならびにワークショップを開催したことは、研究の進展におおいに役立った。前者の、日本語意味論の具体的構成という点について言えば、一方では、動詞句の意味論にとってのひとつの要である態(voice)のなかでも重要な受身についての、研究代表者の過去の研究を整備したが、これは、次年度以降の態一般についての研究への基盤となるはずである。また、他方では、日本語名詞句の意味論にとっての中心問題である量化の取り扱いに着手し、一定の成果を収めたことも本年度の研究成果である。
電子部品用多層キャリアテープにおける帯電防止対策の最適化

本研究では低密度ポリエチレン(LDPE)と帯電防止剤を混練したエチレン酢酸ビニル共重合体(EVA)複合層を用いて空間電荷を測定した。また,帯電防止剤濃度を変化させた試料の体積導電率を測定し,その導電率差からEVA/LDPE界面付近に蓄積する電荷量を数値計算した。その結果,電圧履歴が異なるにも関わらず,界面付近およびLDPE中の空間電荷はほぼ同様な分布を示した。これは電圧印加による影響よりも,体積導電率の増加をもたらす帯電防止剤の拡散による影響が大きいものと考えられた。また,EVA側にのみ帯電防止剤が配合された状態でLDPEと接合された場合を仮定し,試料内の導電率分布に基づく蓄積電荷量を数値計算した。その結果,界面付近における電荷の挙動は空間電荷測定の結果と定性的に一致した。さらに,それらを比較することにより,およその拡散係数を算出することができるものと考えられた。電子部品などのパッケージフィルムは多重構造となっており,使用目的によっては帯電が障害となるため,エチレン酢酸ビニル共重合体(EVA)などの融着層に帯電防止剤を配合する。内部混練型帯電防止剤の場合,成形後にベース樹脂に混練された帯電防止剤が内部から表面にブリードアウトすることにより帯電防止効果が発現する。一方,融着層と構造層の接着を確保するために中間層として帯電防止処理を施さない低密度ポリエチレン(LDPE)のような材料を使用する。この場合,中間層/融着層からなる複合層が存在することになり,融着層の添加剤が濃度拡散によって中間層へも移行し,帯電防止効果が損なわれる恐れがある。したがって,最適濃度設計のためには中間層への添加剤の拡散過程を正確に把握する必要がある。そこで本研究ではLDPEと帯電防止剤を混練したEVA複合層を用いて空間電荷を測定した。また、EVA側にのみ帯電防止剤が配合された状態でLDPEと接合された場合を仮定し,試料内の導電率分布に基づく蓄積電荷量を数値計算した
バベシア原虫感染に対する宿主防御免疫機構の解明と新規ワクチンの開発

本研究は、新興人獣共通感染症の原因原虫でもあるネズミバベシア原虫(バベシア原虫属の実験モデル原虫として知られる)に焦点を当て、宿主防御免疫機構の解明と新規組換えワクチン開発を目指して企画した。本年度に実施した研究内容と得られた研究成果は以下の通りである。宿主防御免疫機構の解明:1)NK細胞の解析。BALB/cマウスにNK特異抗体(anti-asialo GMI抗体)を頻回投与したところ、NK細胞の特異的欠損が認められた。NK細胞欠損(処置群)と非欠損(非処置群)マウスにそれぞれネズミバベシア原虫(B.microti)を感染させたところ、感染初期においては処置群の方が非処置群と比べ感受性が高い結果が得られた。これらの結果より、NK細胞がネズミバベシア原虫感染において少なくとも感染初期においては宿主の防御免疫に関わっていることが示唆された。2)マクロファージ細胞の解析。BALB/cマウスにCondronate liposmeを投与したところ、体マクロファージ細胞の特異的欠損が認められた。マクロファージ欠損(処置群)と非欠損(非処置群)マウスにネズミバベシア原虫を感染させたところ、感染初期・中期・後期に渡り、処置群の方が非処置群と比べ感受性が顕著に高い結果が得られた。これらの結果より、マクロファージ細胞はネズミバベシア原虫感染において中心的な感染防御免疫担当細胞であることが強く示唆された。ワクチン候補分子の探索:ネズミバベシア原虫と進化的に近縁な多くの原虫でワクチン候補の一つとして知られているApical Membrane Antigen1(AMA1)の同定とクローニングを試みた。他の近縁原虫で保存されている領域にプライマーを設計し、デジェネレートPCR法にて標的遺伝子の増幅を行ったところ、B.microti由来のAMA1遺伝子(BmAMA1)の同定に成功した。BmAMA1遺伝子を大腸菌で発現し組換えBmAMA1タンパク質を作出した。また、組み換えBmAMA1タンパク質をマウスに頻回免疫し、特異抗血清を作出した。この血清を用いて、虫体におけるBmAMA1タンパク質の同定に成功した。本研究では、新興人獣共通感染症の原因原虫でもあるネズミバベシア原虫(バベシア原虫属の実験モデル原虫として知られる)に焦点を当て、次のように宿主防御免疫機構の解明と新規組換えワクチン開発を試みる。1.マウスに非致死性の弱毒Babesia microtiを感染させた後に、致死性の強毒Babesia rodhainiを感染させたところ、100%のマウスが防御された(未処置対象群では、100%のマウスが死亡した)。この結果より、マウスが弱毒Babesia microtiに感染することにより、Babesia microtiのみならず、異種のBabesia rodhainiに対する防御免疫が誘導されていることが示唆された。2.Babesia microtiとBabesia rodhainiよりそれぞれmRNAを抽出し、cDNAに変換した後にファージベクター挿入し、それぞれのcDNAライブラリーを構築した。3.Babesia microtiの分泌抗原を多量に含有する感染血漿分画にて免疫して得た血清(分泌抗原に対する抗体を含有する)を用いてBabesia microtiのcDNAライブラリーをイムノスクリーニングしたところ、幾つかの分泌抗原をコードする遺伝子の同定に成功した。今後各分泌抗原の特性解明を行う予定である。本研究では、新興人獣共通感染症の原因原虫でもあるネズミバベシア原虫(バベシア原虫属の実験モデル原虫として知られる)に焦点を当て、宿主防御免疫機構の解明と新規組換えワクチン開発を試みる。1.宿主防御免疫機構の解明:IFN-γ欠損マウス、機能性T細胞とB細胞を欠失しているSCIDマウス、NK細胞を人為的に排除したマウス、およびマクロファージを人為的に排除したマウスにそれぞれBabesia microtiを感染させたところ、いずれのマウス群でも免疫健全マウス群と比べパラシテミアの有意な上昇が認められ、IFN-γ、T細胞/B細胞、NK細胞、およびマクロファージ細胞がそれぞれバベシア感染防御に重要な役割を果たしていることが示唆された。そのなかでもマクロファージを排除したマウスにおけるパラシテミアの上昇が特に顕著で、一部のマウスは死に至った。この結果より、種々の免疫担当細胞のなかでもマクロファージ細胞は宿主の感染防御においてもっとも重要な役割を果たす可能性が示唆された。2.ワクチン候補遺伝子の同定・クローニング:ネズミバベシア原虫と進化的に近縁な多くの原虫でワクチン候補の一つとして知られているApical Membrane Antigen1 (AMA1)の同定とクローニングを試みた。他の近縁原虫で保存されている領域にプライマーを設計し、デジェネレートPCR法にて標的遺伝子の増幅を行ったところ、Babesia microti由来のAMA1遺伝子(BmAMA1)の同定・クローニングができた。

BALB/cマウスにNK特異抗体(anti-asialo GMI抗体)を頻回投与したところ、NK細胞の特異的欠損が認められた。NK細胞欠損(処置群)と非欠損(非処置群)マウスにそれぞれネズミバベシア原虫(B.microti)を感染させたところ、感染初期においては処置群の方が非処置群と比べ感受性が高い結果が得られた。これらの結果より、NK細胞がネズミバベシア原虫感染において少なくとも感染初期においては宿主の防御免疫に関わっていることが示唆された。2)マクロファージ細胞の解析。BALB/cマウスにCondronate liposmeを投与したところ、体マクロファージ細胞の特異的欠損が認められた。マクロファージ欠損(処置群)と非欠損(非処置群)マウスにネズミバベシア原虫を感染させたところ、感染初期・中期・後期に渡り、処置群の方が非処置群と比べ感受性が顕著に高い結果が得られた。これらの結果より、マクロファージ細胞はネズミバベシア原虫感染において中心的な感染防御免疫担当細胞であることが強く示唆された。ワクチン候補分子の探索:ネズミバベシア原虫と進化的に近縁な多くの原虫でワクチン候補の一つとして知られているApical Membrane Antigen1(AMA1)の同定とクローニングを試みた。他の近縁原虫で保存されている領域にプライマーを設計し、デジェネレートPCR法にて標的遺伝子の増幅を行ったところ、B.microti由来のAMA1遺伝子(BmAMA1)の同定に成功した。BmAMA1遺伝子を大腸菌で発現し組換えBmAMA1タンパク質を作出した。また、組み換えBmAMA1タンパク質をマウスに頻回免疫し、特異抗血清を作出した。この血清を用いて、虫体におけるBmAMA1タンパク質の同定に成功した。