hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＨＢ－ＥＧＦ前駆体切断機構を利用したＳＨＥＤＤＩＮＧ活性可視化と腫瘍転移予測

上皮細胞増殖因子(EGF)ファミリーは、ファミリーはI型膜タンパク前駆体として合成され、細胞外領域で切断されてより受容体活性の強い遊離型となる。これをエクトドメインシェディング(ここでは単にシェディングと呼ぶ)といい、様々な外的要因によって誘発される。今までEGFファミリーシェディング活性は、in vitro系を用いた細胞集団での評価が主流であり、かつそれぞれの活性を単独に解析するしかなかった。さらに生体内活性については、その経時的解析手法がないために生体内評価も困難であった。今回我々は、今までに明らかにしてきたシェディング後のHB-EGF前駆体カルボキシル基末端側ペプチド(CTF)が核膜へ逆行輸送される機序とsplit GFP技術を利用して蛍光シグナルで時空間的に腫瘍細胞のシェディング活性を可視化することを目指したが、十分な蛍光シグナルを得ることができなかった。そこで次案の戦略として、HB-EGF前駆体の細胞膜内外に2つの異なる波長の蛍光タンパク質を挿入する(このプローブをFluhembと呼ぶ)ことでシェディング前後のこれら蛍光タンパク質から発する蛍光シグナル強度比を算出し、それよりシェディングを可視化する方法を検討した。その結果、強力なシェディング誘発剤のひとつであるホルボールエステル刺激によって細胞株に導入したFluhembの蛍光シグナル比が変化し、それが経時的に観察できることが確かめられた。この変化はホルボールエステルに限らず、従来シェディング誘導因子として知られている増殖因子などの生物活性因子や細胞剥離といった物理的刺激でも認められ、HB-EGF前駆体シェディングの様子を再現、可視化できていると考えられた。この技術によって今まで不可能であった生体内でのEGFファミリーシェディングの経時的観察も可能になると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今までメタロプロテアーゼのEGFファミリーshedding活性とそれに引き続く一連の生物活性は、in vitro系を用いた細胞集団での評価が主流であり、かつそれぞれの活性を単独に解析するしかなかった。さらに生体内活性については、その経時的解析手法がないためにin vivo系評価も困難であった。今回我々は、今までに明らかにしてきたshedding後のHB-EGF前駆体カルボキシル基末端側ペプチド(CTF)が核膜へ逆行輸送される機序を利用して蛍光シグナルで時空間的に腫瘍細胞のshedding活性を可視化し、上記一連の生物活性をこのシグナル検出に集約することを目指し、以下の実験を行った。HB-EGF前駆体細胞内領域での蛍光タンパク質挿入部位を検討するために、細胞膜直下から一アミノ酸ずつずらして緑色蛍光タンパク質遺伝子AzamiGreenをHB-EGF前駆体遺伝子に挿入し、HT1080細胞に導入した。その結果、4か所においてフォルボールエステル刺激による蛍光シグナルの核への移行が認められた。さらにこの4種類のAzamiGreen挿入HB-EGF前駆体遺伝子(proHB-EGF-mAG)発現レンチウイルスベクターを作成し、wound healingアッセイによる細胞移動と蛍光シグナルの細胞内局在性について検討した。それより、いずれのproHB-EGF-mAGにおいても細胞間ギャップ部位に位置する細胞において核での蛍光シグナル増強が確認された。よって蛍光タンパク質程度の挿入でもCTFが核へ移行するのを阻害することはない事が確認された。また、フォルボールエステルだけではなく、wound healingアッセイによる細胞移動刺激においても蛍光シグナルの核への局在を見ることができ、さらにsplitGFPを用いた機能特異的な蛍光イメージングが期待できた。proHB-EGF-mAG遺伝子の細胞内導入が予想以上に時間を要したため、年度末に予定していたsplitGFP遺伝子導入の時期が2カ月ほど遅れてしまったため。

年度初めまでに遺伝子導入を完了し、8月までにwound healingやマトリゲル浸潤アッセイを用いた蛍光シグナルと細胞移動との相関性についてタイムラプス顕微鏡にて確認する。9月からは本システム導入癌細胞を用いたヌードマウスへの移植を行い、癌細胞浸潤領域や遠隔転移巣におけるsplitGFPシグナルについて観察を行う。同時にEGF領域を除いたプローブ作成もすすめ、増殖活性に影響の少ないプローブ構築を目指す。
機能探索分子の活用によるニコチン性受容体を介して発現される神経保護作用機構の解明

1)神経保護作用を有するニコチン性受容体サブユニットの決定:初代培養大脳皮質神経細胞において、ニコチン性受容体刺激-による神経保護作用の少なくとも一部はα4β2サブユニットを介して発現することを明らかにした.2)ニコチン及びその関連物質のβシート構造形成に対する効果の検討:蛍光色素であるthioflavin Tを用いてβシート構造形成について再検討した。いずれのAβfragmenβシート構造を形成した。コンゴレッドは著明にその構造形成を減少させたが、ニコチンは影響を与えなかった。また、βシート構造の形成過程に対しても、ニコチンは影響を与えなかった。ニコチンの神経保護効果は、βシート構造形成を減少させることで発揮されるという説は我々の系では否定された。3)ニコチン受容体刺激とPI3キナーゼ系との関連:Aβ神経毒性は、グルタミン酸毒性に対するニコチンの保護作用は、PI3キナーゼの拮抗薬であるLY294002により抑制された。PI3キナーゼによりリン酸化されるAktのリン酸比を認めた。PI3・キ+ーゼは細胞生存に関わると考えられ、ニコチン受容体刺激による神経保護効果がこの系を介する可能性が示唆された。4)ドパミン受容体刺激とグルタミン酸神経毒性:ドパミンD2受容体の刺激薬であるブロモクリプチン、キピロールはグルタミン酸毒性を抑制した。さらにカルシウムイオノフォア、NO生成試薬である.NOC18やperoxynitrite生成試薬であるSIN-1により誘発される神経細胞死抑制も。抑された。と.の効果はD2アンタゴニストで抑制された。さらにD1アゴニストでは神経保護効果は認めなかった。D2アゴニスの神経保護効果はLY294002により抑制された。またAktのリン酸化を終めた。D2受容体刺激による神経保護効果がPI3キナーゼ系を介する可能性が示唆された。抑された。
圧力誘起磁気相転移を示す重い電子系イッテルビウム化合物の微視的研究

結晶構造が斜方晶ε-TiNiSi型をとる重い電子系Yb化合物YbRhsb,YbNiSn,YbPtA1は、磁気転移温度の圧力依存性から、近藤効果、結晶場効果及びRKKY相互作用の競合を理解する上で格好の物質群と考えられる。本年度は圧力誘起磁気相転移を示すYbRhSbの、常圧及び高圧相での中性子散乱と、YbRhSbより単位胞体積の大きいYb系新化合物の探索を計画した。前者はこれまでに常圧での測定を行い、低温で磁気モーメントがb軸方向に向いた反強磁性秩序をとることが分かった。また後者について、Rhより原子半径の大きいIrを置換することにより、結晶構造が同じ新物質YbIrSbを見出した。YbIrSbはYbRhSbに比べて約1.2%単位胞体積が大きい。さらに磁化率及び比熱測定から、3.7Kで反強磁性転移を示す重い電子系化合物であることを明らかにした。体積が増加したにもかかわらず磁気転移温度がYbRhSb(転移温度2.7K)よりも高いことから、YbIrSbも圧力下で相転移を示すと期待される。封管ブリッジマン法を用いた結晶育成環境を整備し、圧力誘起磁気相転移を示すYbRhSbの単結晶育成及び新規Yb化合物の物質探索を行った。新物質開発については、単一相の試料が得られなかったため、今後は育成条件の最適化を行う。3つめのCe_2Pt_3Si_5は、Snフラックス法を用いた単結晶育成に成功し、物性測定により6.3Kで反強磁性に転移することを明らかにした。さらに、高温ではc軸に向きやすい磁気モーメントが、反強磁性状態ではb軸に平行に整列することが分かった。また、この物質も近藤格子化合物である。以上の結果について学会発表を行い、論文は現在投稿中である。
中国における制度の地域差が日系子会社経営に与える影響

計画経済から市場経済に移行する過程にある中国では、様々な要因が日系子会社の業績に影響を与えることがインタビュー調査及び質問票調査から明らかになった。中でも、経済取引を規定する法体系の未整備、法の運用の不透明さ、中国市場での競争の激しさ等が日系子会社の業績に負の影響を与え、現地政府の外国企業に対する支援、官僚や取引企業との人的関係等が日系子会社の業績に正の影響を与えることが明らかになった。本研究は,移行経済における公式的及び非公式的制度の地域差が,取引費用の上昇を通じて,外国企業のパフォーマンスにどのような影響を与えうるのかを理論的,実証的に分析することを目的として始められた。まず徹底的な先行研究のレビューを行うことで,「巨大な移行経済においては制度の地域差が存在しうる」,「制度の地域差は,地域ごとに異なったベスト・プラクティスを外国企業に要求する」,「制度の地域差は外国企業のパフォーマンスに影響を与える」という命題を導出した。ついで,導出された命題を検証するために,中国現地において日本企業の中国子会社を対象にインタビュー調査を行った,インタビューは,東北地区4社,北京地区4社,長江デルタ16社,珠江テルタ5社の合計29社に対して行った。インタビュー調査の結果,いくつかの成果が得られた。まず,中国のような巨大な移行経済においては,歴史的・地理的・政治的・文化的な要因から,公式的及び非公式的制度に地域差が存在することが確かめられた。このため,現地子会社は地域ごとに柔軟な対応をしていく必要があることが分かった。また,制度が外国企業のパフォーマンスに与える影響についても,いくつかの重要な発見があった。たとえば,地方政府の外国企業に対するサポート,官僚や取引企業との人的関係,現地パートナーの活用などは外国企業のパフォーマンスに正の影響を与えうる。一方で,リーガル・フレームワーク,官僚の自由裁量などはパフォーマンスに負の影響を与えうることが分かった。これ以外にも移行経済における外国企業のパフォーマンスに影響を与えうる要因が見出された。次年度の課題は,インタビュー調査を通して発見された事項を質問票調査によって検証していくことである。本研究は、移行経済における公式的及び非公式的制度の地域差が、取引費用の上昇を通じて外国企業のパフォーマンスにどのような影響を与えるのかを理論的、実証的に分析することを目的として始められた。本年度は、昨年度の現地インタビュー調査から得られた知見を、より大きいサンプルで実証することを主たる目標とした。昨年度の調査から、中国内に地域ごとの制度のばらつきはあるが、それは地域特性であると同時に属人的な性格を持ったものであることが分かった。そのため、地域特性を強調するより、日系子会社が直面する制度が、それぞれの経営にどのような影響を及ぼすかに関して実証分析を行うこととした。データの収集は、インタビュー調査から得られた知見をもとに作成した質問票を用いた。最終的に229社から有効な回答を得た。その結果、競争力の源泉となる経営資源を持つ日系子会社ほど業績が良いことが分かった。しかし、中国における経済活動を規定する法体系の未整備あるいは制度的弱さを考慮すると、この関係がモデレートされることもデータから示された。すなわち、法体系の弱さに直面している日系子会社は、たとえ競争力の源泉となる経営資源を持っていても、それが業績につながらないことがあることが分かった。さらに、現地地方政府の外国企業に対する態度も、経営資源と業績の関係をモデレートすることも分かった。すなわち、現地地方政府からのサポートを受ける場合、中国現地での経営ノウハウがなくとも、満足した業績を上げられることがデータから示された。本研究は、経営資源と中国現地法人の業績との正の関係が、中国の未発達な制度によってモデレートされるということを実証的に示したという点で、移行経済における子会社経営に関する研究に一定の貢献をしたと思われる。
美術教育における単元の組織化と展開に関する多様性の研究

本研究は、初学者や初任者が図画工作・美術の授業づくりにおいて理解しにくい教育プログラムを取り上げ、多様な構成法を便宜的に7群にまとめ分析し、授業づくりの理論的根拠を提示しようとした。最終年度の平成22年度の研究過程を通して、単元構成における「題材」概念の解明と考察が不可欠であることを突き止めた。結果、それまでの臨画法や写生画法、構想画法という伝統的な構成から、課題・問題解決的な授業構成や対話型授業構成法が試みられるにつれ、単元構成の中心概念である「題材」概念は変容しつつあるとする特質を明らかにした。本研究の目的は、初学者や初任者が授業づくりにおいて理解しにくい教育プログラムを取り上げ、その単元(題材・教育プログラム)の構成法の特徴を分析し、能力・学力形成との観点から、図画工作・美術科の授業づくりの理論的根拠を提示することにある。そのため、多様な構成法を便宜的に7群に分け、分析・考察している。平成20年度の研究期間内では、第1群の「ワークショップ型」「プロジェクト型」と第2群の「五感」等を取り上げ、文献・資料研究のほか、研究協力を得て実践校の現地調査とその単元構成法を分析・考察する計画であった。第3群以降の構成法については、成果を踏まえ、次期研究構想を立てた。成果として、「五感」については、「身体」との関連から検討し、「イメージと感性をひらく身体的アプローチの探究」(国際美術教育学会、8月)と、「造形・図工活動における導入時のショート・エクササイズの開発と実践評価」(美術科教育学会、3月)の研究発表を行いった。「プロジェクト」については、戸倉上山田中学校での実践を中平千尋氏(桜ヶ岡中学校)から、「まちかど美術館」に関する実践を栗城敦志氏(加須小学校)から、神宮前小学校での実践を山田和弘氏(お茶の水小学校)から調査し、プロジェクト型実践法をまとめた。さらに、苅谷剛彦氏、市川伸一氏・他による「学力低下論争」にみる学力観と、プロジェクト、ワークショップ型授業の特徴、学力・能力形成の考察をするための基本文献を収集し、その関連を考察している段階である。なお、ワークショップに関しては、次年度以降に研究する変更をした。初学者や初任者が授業づくりにおいて理解しにくい教育プログラムを取り上げ、その単元(題材・教育プログラム)の構成法の特徴を分析し、能力・学力形成との観点から、図画工作・美術科の授業づくりの理論的根拠を提示してきた。方法として、多様な構成法を便宜的に7群に分け、分析・考察してきた。本年度は、ワークショップとプロジェクト等を取り上げ、文献・資料研究のほか、第3群以降の構成法については、次期研究構想のなかで検討していく。成果として、ワークショップとプロジェクトについて、今日的な美術動向と美術館教育普及等の社会教育、学校内授業がリンクし、新たな活動形態が提案されている現状を捉えることができた。「ワークショップ」は「体験・参加型学習」といわれ、その構成法は自己形成・成長、エコロジーや環境教育、こころとからだ、心理学、合意形成、ビジネスでの問題解決技法など、「包括的な方法」となる。さらには、身体や感性(感情、情動)、グループ間での対人関係、霊/精神性(スピリチュアリティ)の諸側面までを重視することもある。美術教育実践ではアート・ワークショップとして扱われている。「プロジェクト」は1930年代の活動主義運動、1940年代の生活適応教育運動へと展開し、戦後には「プロジェクト」を冠した教科統合の原理や、1980年代以降のコンピュータや情報テクノロジーが高度に発達した「ポスト産業社会」の可能性と緊要性に応えた「学習者主導のプロジェクト」など、思考と感情、観念と行為、個人と社会という二項対照的な要素を包括的に含み容れて展開された。こうした多様な学習が包含された美術教育の実践にみる構成法は、アート・プロジェクトとして展開され、「教育美術」や「美育文化」に具体例を見出される。本研究は、初学者や初任者が図画工作・美術の授業づくりにおいて理解しにくい教育プログラムを取り上げ、その単元(題材・教育プログラム)の構成法の特徴を明らかにすることにある。このため、多様な構成法を便宜的に7群にまとめ分析し、授業づくりの理論的根拠を提示しようとした。最終年度の平成22年度は、これまでの研究実績を踏まえ、資質・能力論に関する文献考察と種々の単元構成法の関係を整理し、成果を学会発表等によって公表し、成果と課題点の両面から本年度の研究を総括した。この総括過程を通して、単元構成における「題材」概念の解明と考察が不可欠であることを突き止めた。つまり、文献研究の成果によると、第二次世界大戦までは、単元構成は「業・図」「教材」「題目」等が混在した。戦後、教材(経験)単元の導入後、「題材」主義に向かい、「題材」の意味や機能について、多くの課題点が議論された。

やがて、「中学校美術指導資料」(文部省1982)によって「題材」概念が教育行政側から提示され、以後指導計画・授業づくりの中心概念となったと理解される。しかし、万博(1970)後、題材内容にイベント・祭典の要素が組み込まれ、「プロジェクト」「ワークショップ」等の授業展開とともに、「題材」概念が変容しつつある。それまでの臨画法や写生画法、構想画法という伝統的な単元構成は、課題・問題解決的な授業構成や対話型授業構成法が試みられるにつれ、「題材」概念が変容していること示している。ゆえに、学校図画工作科・美術科の「題材」概念は、受容・成立・変容したと仮説立てられる。この題材概念に着目するという着想を得て、その成立過程の解明と課題点の整理を通し、美術教育における単元構成の特徴を史的・質的に把握すべきであるとする教科内容学上の研究課題の存在が明確となった。
人工一次元π電子系の創出とその電子状態の完全制御

直線的な単原子ステップが平行かつ均一に走る単結晶の微傾斜面上に、炭化水素分子を吸着・拡散させ、ステップでトラップすることで一次元的に配列し、基板を加熱して脱水素化を図り、炭素の一次元構造を形成した。供給する分子の種類や量、基板の材質や面方位、加熱温度や温度勾配などの諸条件を変えることで、その構造を制御することに成功した。基板としてPt(997)面やNi(755)面、Si(111)やSi(100)の1.5°off面などを、炭化水素分子としてプロピレンやベンゼンなどを用いることで、zigzag端やarmchair端を持つグラフェンのナノリボンやその他の一次元構造が形成されることが確認され、現在、それらの電子構造の観察を進めている。本研究では、直線的な単原子ステップが平行かつ均一に走る金属単結晶の微傾斜面上に、炭化水素分子を吸着・拡散させ、ステップでトラップすることで一次元的に配列し、基板を加熱して脱水素化を図り、原子スケールの幅を持った炭素の一次元構造を形成する。供給する分子の種類や量、基板の加熱温度などの諸条件を変えることでその構造を制御し、一次元π電子系の電子構造をコントロールし、更に、ホウ素や窒素で炭素を置換することによりホールや電子などキャリアをドープして、電子バンドのフィリングを調整することで、最終的には電子物性を制御することを目指している。平成22年度は、一次元構造の形成とその構造制御の手法の確立を試みた。PtとNiの(111)面の微傾斜面であるPt(997)面やNi(755)面にプロピレンやベンゼンを吸着させ、比較的低い温度でアニールして脱水素化を図ったところ、幅がステップ間隔と一致する極めて均一なナノリボン状のグラフェンが形成された。Pt(997)面上では、プロピレンを用いた場合にはモアレパターンが観察されたことから非整合のジグザグ端を持ったグラフェンリボンが、ベンゼンを用いた場合にはモアレパターンは観られないことから整合性の良いアームチェア端を持ったグラフェンリボンが形成されたものと考えられる。非常に形状の揃ったグラフェンリボンが得られ、また、そのエッジの構造を制御することに初めて成功したという意味で、大変意義深い結果が得られたと考えている。更に、これらのグラフェンリボンの電子構造を調べるために光電子分光測定を行ったが、基板のPtやNiのdバンドのcross sectionが大きすぎて、グラフェンの電子バンドを直接観察することは出来なかった。そこで現在、金属以外の基板で微傾斜面が得られないか、実験を進めているところである。グラフェンはSiの100倍という高い移動度を有するため、デバイスの高速化や省電力化を可能にする次世代デバイス材料として注目を集めているが、ギャップレスの電子構造が実用化の障害となっている。グラフェンをナノリボン化すればバンドギャップの導入が可能であり、デバイス応用の実現に大きく前進する。デバイス応用を考えた場合、非金属の基板上にグラフェンを形成する必要がある。そこで、Siの基板表面を処理して安定な微傾斜面を出し、その上にグラフェンナノリボンを形成することを試みた。Si(100)の1.5°off基板を超高真空中で通電加熱して表面のSiO_2層を除去し、原子スケールで平坦な清浄表面を形成したところ、ステップの形状は電流の方向に強く依存し、電流の方向がステップに対して垂直な場合にはステップがジグザグに、平行な場合には比較的真っ直ぐなステップが得られた。表面には2×1構造のdimer列がステップに直行する面と、平行な面とが交互に現れた。大部分はdimer列がステップに直行する面であったが、ステップ端付近には平行な面も残り、また、ステップは完全に直線にはならなかった。得られた微傾斜面にベンゼンを吸着させると、2×1構造のon-topサイトに分子1個が結合し1基板を加熱して脱水素化を図ると、dimer列と同じ方向に結合して伸びる一次元構造が形成された。一方、Si(111)の1.5°off基板を用いて同様の表面処理を行ったところ、ステップが直線的且つ平行に走る理想的な微傾斜面が得られ、表面にプロピレンを吸着させたところ、7×7構造のon-topサイトに分子1個が結合し、基板をアニールして脱水素化を図ったところ、比較的均一なリボン状の構造が形成された。これらの結果から、Si(100)よりSi(111)の微傾斜基板の方がデバイス応用を目的としたグラフェンナノリボンの形成に適していることが判った。
オランダ農業モデルの批判的検証とオルタナティブ・モデルの可能性

本研究は、選択と集中による効率的経営と規模拡大を通じた輸出志向型の農業工業化および産官学連携による関連産業・支援産業のクラスター化で特徴づけられるオランダ農業の実態を明らかにすることで、同モデルを日本に適用しようとする近年の政策言説を批判的に検証するとともに、同国で実際に展開される多様なオルタナティブ農業の可能性を明らかにすることで、オランダ農業モデルの重層性を示し、結果的に日本農業の将来方向性と政策論に示唆を与えることを目的としている。2018年度は、第一に、前年度までに実施した文献調査および現地調査(伝統的果樹地帯および大規模施設園芸地帯のクラスター事業、福祉農業の諸事例)の成果を整理・分析するとともに、地域食農ガバナンスの構築に取り組んでいるエーデ市、アーネム市、および両者を含むヘルターランド州でそれぞれ政策担当者にヒアリング調査を行った。第二に、主流のオランダ農業モデルを特徴づけるフードバレー事業とその拠点であるワーヘニンゲン大学の教育研究活動の歴史的経緯を内部資料等に依拠して整理しながら、オランダ国内・ワーヘニンゲン大学内でさまざまな意見の対立が今日に至るまで見られることを明らかにした。第三に、以上の成果を大学紀要に38頁に及ぶ大部の論文にまとめ発表した。最後に第四に、本研究の発展的継続を企図し、2019年度以降の研究課題として「オランダにおける地域食農政策の展開と食料市民の形成に関する研究」を設定、その準備作業としてワーヘニンゲン大学から研究インターンとして受け入れた修士学生とともに、アーネム周辺およびロッテルダム周辺の都市農業や地域食農ガバナンスに関連した取り組み事例の情報を、自治体資料およびネット情報をもとに収集した。本研究は選択と集中による効率的経営と規模拡大を通じた輸出志向型の農業工業化、産官学連携による関連産業・支援産業のクラスター化(フードバレー)を特徴とするオランダ農業に着目し、それを日本農業の「活性化策」「競争力強化策」の参考モデルとみなす政策論的言説の批判的検証を試みると同時に、オランダで同時に追求されてきた多様なオルタナティブ農業の有効性と可能性の中から日本農業の方向性について一つの視座を確立しようとするものである。平成28年度は、第一に、本研究に関する問題意識と情報を共有するため、オランダの研究協力者と複数回にわたり打合せを行った。第二に、日本国内で流布されている「オランダ農業モデル」論を整理すると同時に、日本で紹介されていない「オランダ農業モデル」をめぐるオランダ国内での議論や研究動向について文献調査を行った。第三に、研究協力者らと共同で現地予備調査を行い、「オランダ農業モデル」の評価について関係者・関係機関へのヒアリング調査を実施し、論点を整理した。それを踏まえ、オランダ・ワーヘニンゲン大学の大学院生にグループワークとして課題を提示し、オランダ農業モデルとくにフードバレー事業に関する調査報告書を作成した。第四に、研究協力者が指導する大学院生が来日した折、日本でフードバレー構想を進めている新潟市を一緒に訪問し、関係者へのヒアリング調査を実施、調査報告書を作成した。なお、研究協力者の招へい、研究協力者が指導する大学院生の招へい及び国内現地調査については、スーパーグローバル大学創成支援事業の一環として京都大学とワーヘニンゲン大学との間で進めている国際連携教育プログラムにも関わるため、その関連予算を充当することができた。研究計画に従って文献調査、1回のオランダ現地予備調査、1回の国内現地調査を実施したが、本格的なオランダ現地調査を実施するには至らなかった。そのかわり、研究協力者が所属しフードバレー事業の中軸でもあるワーヘニンゲン大学の大学院生向けグループワーク課題として調査報告を委託し、十分な量と質の情報や理論的考察を含んだ報告書を作成することができた。平成29年度は、前年度に実施した文献調査ならびに現地予備調査を踏まえ、6月と9月にオランダの伝統的果樹地帯と大規模施設園芸地帯のクラスター事業、ならびに同国で広がりを見せている福祉農業(ケアファーミング)の諸事例を現地研究協力者(Dr Joost Jongerden、ワーヘニンゲン大学)とともに調査するとともに、オランダにおけるオルタナティブ農業モデルを相対化するために、零細性や協同性など、むしろ日本との共通性を多分に持つイタリア・ローマ近郊のオルタナティブ農業や生消提携の取り組みについて、現地研究協力者(Prof Maria Fonte、ナポリ大学/アメリカン大学ローマ校)とともに調査を行った。文献調査および現地調査を踏まえたコンセプト・ペーパーの執筆には至らなかったが、本研究の一環として、国際比較の視点から日本農業の現段階と担い手の特徴を析出することを目的に、ワーヘニンゲン大学の研究者(Prof Paul Hebinck)が中心となって編集した国際学術誌(Journal of Rural Studies、当該分野のトップジャーナルの一つ)の特別号に寄稿し、掲載されることになった。9月のオランダ渡航では当初、ワーヘニンゲン大学の専門家育成プログラムとして計画されていた、オランダ農業モデルの日本農業への適用可能性に関する集中コースにオブザーバー参加し、日蘭両国から参加する利害関係者との意見交換を含めた参与観察を行う予定だったが、諸事情により次年度以降に延期となった。そのため、参与観察を含めた言説分析を行い、その成果をコンセプト・ペーパーにまとめるという当初の計画が達成できなかった。

同集中コースのコーディネーター研究者(Prof Jos Verstegen)とは引き続き情報交換を進める予定である。他方、当初は予定していなかった、イタリアにおけるオルタナティブ農業モデルの現地調査を実施する機会があり、オランダのオルタナティブ農業モデルを相対化する視点を得ることができた。また、日本農業の現状を国際比較の視点から理論的・実証的に把握するための論文執筆の機会を得ることができた。これは、いずれのオランダ農業モデルであれ、その適用可能性を検証する上で欠かせない作業であり、それゆえ、本研究の一部と位置付けることにした。とはいえ、そのための作業に時間を要したことも、上記コンセプト・ペーパーの執筆と発表に十分な時間を割くことができなかった要因の一つとなった。本研究は、選択と集中による効率的経営と規模拡大を通じた輸出志向型の農業工業化および産官学連携による関連産業・支援産業のクラスター化で特徴づけられるオランダ農業の実態を明らかにすることで、同モデルを日本に適用しようとする近年の政策言説を批判的に検証するとともに、同国で実際に展開される多様なオルタナティブ農業の可能性を明らかにすることで、オランダ農業モデルの重層性を示し、結果的に日本農業の将来方向性と政策論に示唆を与えることを目的としている。2018年度は、第一に、前年度までに実施した文献調査および現地調査(伝統的果樹地帯および大規模施設園芸地帯のクラスター事業、福祉農業の諸事例)の成果を整理・分析するとともに、地域食農ガバナンスの構築に取り組んでいるエーデ市、アーネム市、および両者を含むヘルターランド州でそれぞれ政策担当者にヒアリング調査を行った。第二に、主流のオランダ農業モデルを特徴づけるフードバレー事業とその拠点であるワーヘニンゲン大学の教育研究活動の歴史的経緯を内部資料等に依拠して整理しながら、オランダ国内・ワーヘニンゲン大学内でさまざまな意見の対立が今日に至るまで見られることを明らかにした。第三に、以上の成果を大学紀要に38頁に及ぶ大部の論文にまとめ発表した。最後に第四に、本研究の発展的継続を企図し、2019年度以降の研究課題として「オランダにおける地域食農政策の展開と食料市民の形成に関する研究」を設定、その準備作業としてワーヘニンゲン大学から研究インターンとして受け入れた修士学生とともに、アーネム周辺およびロッテルダム周辺の都市農業や地域食農ガバナンスに関連した取り組み事例の情報を、自治体資料およびネット情報をもとに収集した。平成29年度は、第一に、これまで実施した先行研究調査、予備的現地調査、委託調査の結果を踏まえ、日蘭両国の「オランダ農業モデル」に関する言説分析を行うとともに、その成果をコンセプト・ペーパーとして国際学会等で発表するための準備を進める。第二に、オランダ農業の典型モデルおよびオルタナティブ・モデルに関する現地調査と実態分析を行う。資料整理および英文校閲等のために研究補助員を雇用する。
担癌生体内樹状細胞のクロスプレゼンテーションによる癌特異的キラーT細胞の誘導機構

担癌状態での癌抗原特異的キラーT細胞の誘導過程において、樹状細胞による癌抗原のクロスプレゼンテーション制御に関する分子メカニズム解明を行った。その結果、担癌環境下で高産生される事が知られているIL-6の存在下では、樹状細胞の抗原提示能が減弱すること、抗腫瘍免疫にとって重要なType1免疫応答において、NK2R依存的な神経ペプチドシグナルが樹状細胞の機能制御に関与する事を見いだした。今後、樹状細胞の機能制御を介した癌抗原特異的キラーT細胞の担癌生体内誘導法を確立することで、癌免疫治療への応用が期待できる。本年度、仮想癌抗原として卵白アルブミン(OVA)を発現する癌細胞株(EG7)について、放射線照射あるいは抗癌剤処理によりアポトーシスを誘導した。またOVAそのものをFITC標識した。これらのFITC-OVAあるいはEG7をCFSEラベルした後、マウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)に添加し、これらの貪食能についてフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー顕微鏡により評価した。その結果、BMDCによるアポトーシスを誘導した癌細胞の貪食およびOVA抗原の取り込みが時間依存的に認められた。さらにTLRリガンド刺激やサイトカイン処理によるBMDCの活性化レベルを評価したところ、TLR刺激の種類依存的な貪食能・取り込み効率の低下、細胞表面MHCレベルの増加、およびIL-12を含むType-Iサイトカイン産生誘導が認められた。次にEG7を貪食したBMDCとOVAペプチドを特異的に認識するCD8+T細胞(OT-1)を共培養し、クロスプレゼンテーションによるOT-1の反応性をin vitro培養系で評価し、BMDCに取り込ませる癌細胞の最適条件を決定した。マウス生体内にEG7を取り込ませたBMDCを投与し、生体内における癌抗原特異的キラー細胞の誘導・活性化能の評価をOVA-テトラマー陽性CD8+T細胞の誘導効率を調べることにより行った。癌抗原特異的キラーT細胞の活性化に対して、CpG等のTLR刺激やIL-6等のサイトカイン刺激を細胞培養系あるいは担癌マウス生体内に加えることで、樹状細胞のクロスプレゼンテーション能が制御可能であることが示唆された。今後、本事象に関して詳細なメカニズムを解明するとともに、ヒト樹状細胞を用いた検証も行ない、癌治療に有効なクロスプレゼンテーション制御機構を明らかにする。生体内に発生した癌細胞の排除は、いかに癌特異的キラーT細胞を効率よく誘導し、活性化できるかが非常に重要である。本研究では、担癌状態での癌抗原特異的キラーT細胞の誘導過程において、樹状細胞による癌抗原のクロスプレゼンテーション制御に関する詳細な分子メカニズムについて解明を行った。前年度までの実験結果をもとに、樹状細胞の抗原提示機構に対して、TLR刺激およびサイトカインシグナルが影響しているかどうか検討した。その結果、樹状細胞による抗原ペプチドの提示については、複数のTLRシグナルによる相乗的な増強効果を認め、エンドサイトーシス/ファゴサイトーシスによる抗原の取り込みも非常に重要であることが分かった。また癌抗原特異的キラーT細胞の誘導過程において重要なタイプ1サイトカインであるIFN-γのSTAT1を介した信号伝達経路により、樹状細胞に神経ペプチド受容体の一つであるNK2Rが発現増強することを見出した。さらにレトロウイルス感染法によりNK2R分子を過剰発現させた樹状細胞は、抗原ペプチド提示能が増強することが明らかとなり、NK2Rを介した神経ペプチドシグナルが樹状細胞の機能制御機構に関与することが示唆された。健常人ボランティアより提供されるヒト末梢血よりヒト樹状細胞を誘導した。このヒト樹状細胞をIFN-γやOK432などのサイトカインあるいは免疫アジュバントを用いて処理を行ったところ、ヒト癌抗原特異的T細胞が効率良く誘導できることがわかった。さらにヒト樹状細胞においても、IFN-γやpolyICなどのTLR刺激により、前述のNK2R分子の発現増強が確認された。従って、本マウス樹状細胞を用いた実験系で得られた実験結果が、ヒト樹状細胞においても有効である事が明らかとなり、今後、樹状細胞の機能制御を介したヒト癌抗原特異的T細胞誘導の機序解明と疾患治療への応用が期待される。
PVAカプセルへの植物細胞の固定化に関する研究

ポリビニルアルコール(PVA)はビニロンや接着剤などの原料として、工業的に安価に大量生産されており、生物に対する毒性がないため、生体触媒の固定化担体として有用であり、廃水処理をはじめとして様々にその応用が検討されている。申請者らもこれまで、反復凍結融解法により調製したPVAゲルへの生体触媒の固定化について研究し、その有用性について明らかにしてきた。(Arigaら,J.Ferment.Technol.,65,651-658(1987),Arigaら,J.Ferment.Bioeng.,68,293-295(1989)申請者らは最近、冷却したメタノール中にPVA溶液を滴下することによって、PVAカプセルが作製できることを見出し、PVAカプセル中に酵素を固定化し、活性、安定性等に対するカプセル調製条件の影響を検討した。(Arigaら,J.Ferment.Bioeng.,78,74-78(1994)カプセルはタンパク質などの分子量の大きな分子の物質移動に対して、ゲル状固定化担体に比べ有利であり、これまで様々に研究されてきた。しかしながら、PVAカプセルについてはこれまで、その調製の試みさえ報告がない。また、植物細胞の固定化については十分研究されているとは言えず、簡便な新しい固定化法の開発が望まれていた。そこで、本研究のではタバコ細胞をモデル細胞として、PVAカプセルへの植物細胞の固定化を試み、最適固定化条件を検討するとともに、固定化植物細胞による生理活性物質の生産について検討した。タバコ細胞はメタノール中での固定化にも関わらず、PVAカプセル中において増殖し、二次代謝産物であるスコポレチンを生産することが分かった。スコポレチンの繰返し生産を試みるため、繰返し回分培養を行なったが、スコポレチンの生産に対して培地交換の影響が見られた。そこで、培地の交換率を検討したところ、繰返し生産することができた。以上のようにPVAカプセルは植物細胞の固定化担体として有用であり、培養条件を最適に制御することにより有用二次代謝産物を連続的に生産することが可能と思われる。
マイクロ波照射処理した同種骨の有用性の検討及び骨内部温度変化のシミュレーション

1.【緒言】マイクロ波加温処理した骨の有効性、安全性を検討した。またマイクロ波による骨内部温度変化のシミュレーションを試みた。2.【方法】(1)細菌試験:マイクロ波加温装置、光ファイバー温度計で構成した。黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌・MRSA Mu50、腸球菌γ型、大腸菌を使用し、生理食塩水に懸濁した。懸濁液温度を80°Cまで加温後、経時的にサンプリングし、希釈、培養、コロニー数をカウントした。(2)強度試験:牛大腿骨中央を用いた。同一大腿骨の一方を未処理群、もう一方を処理群とし、従来の加温処理装置およびマイクロ波発生装置を用い加温した。静的荷重試験はインストロン試験機を使用し、硬さ試験はビッカース微小硬さ試験機を用いた。(3)有限要素法により骨加温モデルを作成し、物性値として比誘電率・比透磁率を、荷重として電場を与え、電磁場解析プログラムにより磁場解析を行った。次に物性値を与え、熱伝導解析プログラムにより熱伝導解析を行った。立方の骨を切り出し、マイクロ波を照射し骨の中心、および右・後・左・下の各中心部分の計5点を測定した。電子レンジと骨の同サイズに骨加温モデルを作成し、解析より得られた温度と実際の温度を比較し、解析の信頼性を評価した。3.【結果】(1)全ての菌において、80°Cで菌は認められなかった。(2)圧縮強度・最大歪・ヤング率は両処理群ともに、未処理群との統計学的有意差を認めなかった。ビッカース硬さは有意差が認められた。(3)解析による骨内部温度分布の予測が十分に可能であると考えられた。4.【結論】マイクロ波照射による、80°C、10分間の加温処理には、殺菌効果がある事を確認した。マイクロ波加温装置を利用した加温は、移植骨の力学的強度に与える影響が少ないことがわかった。マイクロ波による骨内部温度変化のシミュレーションが行える可能性が示唆された。1.【緒言】冷凍同種骨移植による感染性疾患の伝播や細菌汚染を克服する新い方法として、マイクロ波加温処理法を確立するため、(1)マイクロ波加温処理した、ウシ皮質骨の力学的強度につき検討し、また(2)マイクロ波による80°C・10分間の加温処理の殺菌効果につき検討した。2.【方法】(1)ウシ大腿骨の骨幹部中央より約80mmの皮質骨を中央より2等分し、未処理群、処理群とした。加温処理には工業用マイクロ波発生装置(Micro Denshi MOH-1500E)を用い、光ファイバー温度計(FISO OSR System)を使用し、80°C・10分間維持されたことを確認した。静的荷重試験は精密万能試験機(INSTRON 4467)を、硬度試験はビッカース微小硬さ試験機(Akashi MVK-HO)を用いた。(2)表皮ブドウ球菌、MRSA・Mu50、腸球菌γ型、黄色ブドウ球菌、大腸菌を培養し、生理食塩水(100ml)に懸濁した。試薬ビンに、サンプリングチューブ6本、温度センサ、攪拌用チューブを挿入し、サンプリングチューブの一方は外に出し、シリンジを装着した。装置内を熱風により80°Cに加温しておき、懸濁液温度を80°Cまで加温後、出力を手動制御にて80°Cに保持した。実験開始時、懸濁液の温度が40°C、50°C、60°C、80°C、80°C・10分(加温過程)、加温処理後24時間、48時間にサンプリングし、希釈、培養、コロニー数をカウントした。3.【結果】(1)圧縮強度・最大歪・ヤング率は、未処理群と統計学的有意差を認めなかった。ビッカース硬さはマイクロ波処理群で4.1%低下したが、力学的強度に与える影響はわずかであった。(2)全ての菌において、60°Cで急激に生菌数が減少し、80°Cで菌は認められなかった。80°C・10分処理、加温処理後24時間、48時間にも菌が増殖することはなかった。

立方の骨を切り出し、マイクロ波を照射し骨の中心、および右・後・左・下の各中心部分の計5点を測定した。電子レンジと骨の同サイズに骨加温モデルを作成し、解析より得られた温度と実際の温度を比較し、解析の信頼性を評価した。3.【結果】(1)全ての菌において、80°Cで菌は認められなかった。(2)圧縮強度・最大歪・ヤング率は両処理群ともに、未処理群との統計学的有意差を認めなかった。ビッカース硬さは有意差が認められた。(3)解析による骨内部温度分布の予測が十分に可能であると考えられた。4.【結論】マイクロ波照射による、80°C、10分間の加温処理には、殺菌効果がある事を確認した。マイクロ波加温装置を利用した加温は、移植骨の力学的強度に与える影響が少ないことがわかった。マイクロ波による骨内部温度変化のシミュレーションが行える可能性が示唆された。
統合失調症の脳内ネットワークに関する多面的研究:形態・生理・機能的アプローチ

先行研究として,fMRIが病状の進行や治療効果の指標となりうるかを検討するために,健常者におけるストゥループ課題による脳賦活の再現性について検討した.結果,ストゥループ課題による前部帯状回と背外側前頭前野の賦活とその再現性の高さが確認された.また脳波研究では,健常者および統合失調症患者を対象に,アンフェタミン投与による脳皮質機能変化を,脳波の複雑性解析を用いて検討した.結果,アンフェタミンは健常の脳皮質機能を低下させる傾向がある一方,統合失調症においては脳皮質機能において効果的に作用する傾向が見られた.先行研究として,fMRIが病状の進行や治療効果の指標となりうるかを検討するために,健常者におけるストゥループ課題による脳賦活の再現性について検討した.結果,ストゥループ課題による前部帯状回と背外側前頭前野の賦活とその再現性の高さが確認された.また脳波研究では,健常者および統合失調症患者を対象に,アンフェタミン投与による脳皮質機能変化を,脳波の複雑性解析を用いて検討した.結果,アンフェタミンは健常の脳皮質機能を低下させる傾向がある一方,統合失調症においては脳皮質機能において効果的に作用する傾向が見られた.fMR I研究:fMRIは,認知プロセスを研究する一般的な非侵襲的ニューロイメージングモダリティーとしての地位を確立しつつある.病状の変化や治療効果などの経時的変化の検討には高い試験・再試験信頼度が要求されるが,血流変化(BOLD activation)は,技術的(磁場の不均一性,体動),生理学的(呼吸,心拍の影響),心理的(覚醒水準,学習効果)要因の影響を受ける.従って我々は,まず本研究の目的を達成すための先行研究として,健常者における認知制御課題(Stroop課題)中のBOLD signalの再現性について検討した.結果,Stroop課題による前部帯状回と背外側前頭前野における脳賦活の再現性が確認され,fMRIが病状の進行や薬物療法の効果を検討する有用なバイオマーカーとなりうる可能性を示唆した.(現在投稿中)脳波研究:我々はこれまでに統合失調症の脳内ネットワーク障害の解明を目的に,安静時脳波のエントロピー解析を行った.当該年度では,統合失調症患者および健常者を対象に,アンフェタミン(d-amphetamine:AMPH)を用いて前頭葉におけるドーパミン(DA)神経活動を変化させ,それに伴う聴覚性誘発電位変化(抑制性ニューロンであるGABA神経活動の同期生発火で,脳機能を反映するガンマオシレーション)を,脳波の複雑性の定量化を可能にするサンプルエントロピー解析を用いて評価し,統合失調症におけるDA神経ネットワーク異常の神経基盤の解明を目指した,結果,健常者ではアンフェタミンの投与によりガンマオシレーションの複雑性が増加したのに対し,統合失調症患者ではアンフェタミン投与による複雑性の変化は乏しくむしろ低下する傾向がみられた.この結果は,脳機能と脳内ドーパミンレベル間にある逆U字型仮説に一致することから,予備的検討ではあるが,サンプルエントロピー解析が統合失調症におけるドーパミンのガンマオシレーションに対する影響の検討において有用であることが示された.fMRI研究:fMRIは,認知プロセスを研究する一般的な非侵襲的ニューロイメージングモダリティーとしての地位を確立しつつある.病状の変化や治療効果などの経時的変化の検討には高い試験・再試験信頼度が要求されるが,血流変化(BOLD activation)は,技術的(磁場の不均一性,体動),生理学的(呼吸,心拍の影響),心理的(覚醒水準,学習効果)要因の影響を受ける.従って我々は,まず本研究の目的を達成するための先行研究として,健常者における認知制御課題(Stroop課題)中のBOLD signalの再現性について検討した.結果,Stroop課題による前部帯状回と背外側前頭前野における脳賦活の再現性が確認され,fMRIが病状の進行や薬物療法の効果を検討する有用なバイオマーカーとなりうる可能性を示唆した.脳波研究:我々はこれまでに統合失調症のドーパミン神経ネットワーク障害の解明を目的に,安静時脳波のエントロピー解析を行ってきた.当該年度では,統合失調症患者(10名)および健常者(9名)を対象に,アンフェタミンによるドーパミン神経活動の賦活による脳波変化をサンプルエントロピー解析(複雑性の指標)を用いて評価した.結果,健常者ではアンフェタミンの投与によりガンマオシレーションの複雑性が増加したのに対し,統合失調症患者ではアンフェタミン投与による複雑性の変化は乏しくむしろ低下する傾向がみられた.この結果は,脳機能と脳内ドーパミンレベル間にある逆U字型仮説に一致するものであり,サンプルエントロピー解析が統合失調症におけるドーパミンのガンマオシレーションに対する影響の検討において有用であることが示された.fMRI研究: fMRIは,認知プロセスを研究する非侵襲的ニューロイメージングモダリティーとしての地位を確立しつつあり,病状の変化や治療効果などの経時的変化の検討には高い試験・再試験信頼度が要求される.しかし,血流変化(BOLD activation)は技術的問題点(磁場の不均一性,体動)や生理学的(呼吸,心拍の影響)・心理的(覚醒水準,学習効果)要因の影響を大きく受けることが知られている.我々は先行研究として,健常者における認知制御課題(Stroop課題)中のBOLD signalの再現性について検討した.結果,Stroop課題による前部帯状回と背外側前頭前野における脳賦活の再現性が確認され,fMRIが病状の進行や薬物療法の効果を検討する有用なバイオマーカーとなりうる可能性を示唆した(現在論文投稿中)

.脳波研究:統合失調症における認知機能低下のメカニズムに,前頭葉でのドーパミン神経ネットワークの障害が示唆されている.本研究では,統合失調症患者および健常者を対象に,アンフェタミン(d-amphetamine:AMPH)を用いて前頭葉におけるドーパミン神経活動を変化させ,それに伴う聴覚性誘発電位変化(抑制性ニューロンであるGABA神経活動の同期生発火で,脳機能を反映するガンマオシレーション)を,脳波の複雑性の定量化を可能にするサンプルエントロピー解析を用いて評価し,統合失調症におけるドーパミン神経ネットワーク異常の神経基盤の解明を目指した.当該年度には統合失調症患者(15名)および健常者(15名)とデータの集積は終え,現在データの解析中である.現在被検者が統合失調症患者(10名)および健常者(9名)と若干予定より少なくなっている。しかし順調に進んでおり、データ収集の完了とほぼ同時に結果の考察が可能な状態にある。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き対象を増やし、研究を継続する予定である。当研究はピッツバーグとの共同研究であるため、きめ細やかにコミュニケーションをとりながら行う。
若年性パーキンソン病(AR-JP)の原因遺伝子パーキンの変異及び機能解析

若年性パーキンソン病(AR-P)の原因遺伝子パーキンはユビキチンリガーゼであることが我々の研究グループにより報告されている.Loss-of-function型変異効果が予想されるAR-JPではパーキン蛋白が分解する基質が分解されずに蓄積することで細胞死が誘導されることが予想される.従って,その基質同定が最重要課題である.そこでヒト脳cDNA libraryを用いてYeast two hybrid screeningを行い14種のクローンを単離できた.そのうち既に基質候補として報告されているCDCrel-1を我々も単離できており,1)CDCrel-1がシナプス小胞に関する分子でありexocytosisに関与すること,2)パーキン蛋白の局在もシナプスにあること,3)神経細胞でシナプスが特によく発達していることを含めてパーキン蛋白のexocytosisの関与について検討した.方法としてはヒトGrowth hormone (GH)をtracerにパーキンcDNAとdouble transfectionを行い脱分極化及び非脱分極化で高感度ELISAにてヒトGHを測定した.CDCrel-1についてはoverexpression状態であってもexocytosisの抑制は観察されなかったが,パーキン蛋白のRING fingerドメインに変異を持つ変異パーキン蛋白ではドミナントネガティブ効果的にexocytosisを抑制した.これら結果からはパーキン蛋白はシナプスにあってexocytosisに関与していることが予想された.更に我々は理化学研究所脳科学センターの高橋良輔先生との共同研究でERストレスに関与するパエル受容体もその基質の一つであることを報告している.実際にパーキン遺伝子変異を確認できているAR-JP剖検脳を用いて免疫組織化学的検討を行った.用いた4例について検討したところexon 2に変異のある1症例にパエル受容体の蓄積を認めた.他の症例においてはその蓄積を認めなかった.少なくともパエル受容体の蓄積を1例に認めたことは基質候補して可能性の高い事を示す.この1例のみにパエル受容体の蓄積を認めたことの解釈としては,この症例が最も変異効果が強く殆どの分子が存在しないことにある.更に症例の蓄積を行いパエル受容体について検討する予定である.変異については700例の症例について行い劣性遺伝性であれば約50%の頻度で変異が存在していることがわかった.また優性遺伝性を示す家系でも変異が存在していた.この解釈としてはcarrierであっても年齢などの効果により発症しうることを示している.つまりパーキン遺伝子のcarrierもパーキンソン病発症の危険因子となることが予想された.現在変異-臨床型について詳細な検討を加えている.若年性パーキンソン病(AR-P)の原因遺伝子パーキンはユビキチンリガーゼであることが我々の研究グループにより報告されている.Loss-of-function型変異効果が予想されるAR-JPではパーキン蛋白が分解する基質が分解されずに蓄積することで細胞死が誘導されることが予想される.従って,その基質同定が最重要課題である.そこでヒト脳cDNA libraryを用いてYeast two hybrid screeningを行い14種のクローンを単離できた.そのうち既に基質候補として報告されているCDCrel-1を我々も単離できており,1)CDCrel-1がシナプス小胞に関する分子でありexocytosisに関与すること,2)パーキン蛋白の局在もシナプスにあること,3)神経細胞でシナプスが特によく発達していることを含めてパーキン蛋白のexocytosisの関与について検討した.方法としてはヒトGrowth hormone (GH)をtracerにパーキンcDNAとdouble transfectionを行い脱分極化及び非脱分極化で高感度ELISAにてヒトGHを測定した.CDCrel-1についてはoverexpression状態であってもexocytosisの抑制は観察されなかったが,パーキン蛋白のRING fingerドメインに変異を持つ変異パーキン蛋白ではドミナントネガティブ効果的にexocytosisを抑制した.これら結果からはパーキン蛋白はシナプスにあってexocytosisに関与していることが予想された.更に我々は理化学研究所脳科学センターの高橋良輔先生との共同研究でERストレスに関与するパエル受容体もその基質の一つであることを報告している.実際にパーキン遺伝子変異を確認できているAR-JP剖検脳を用いて免疫組織化学的検討を行った.用いた4例について検討したところexon 2に変異のある1症例にパエル受容体の蓄積を認めた.他の症例においてはその蓄積を認めなかった.少なくともパエル受容体の蓄積を1例に認めたことは基質候補して可能性の高い事を示す.この1例のみにパエル受容体の蓄積を認めたことの解釈としては,この症例が最も変異効果が強く殆どの分子が存在しないことにある.更に症例の蓄積を行いパエル受容体について検討する予定である.変異については700例の症例について行い劣性遺伝性であれば約50%の頻度で変異が存在していることがわかった.また優性遺伝性を示す家系でも変異が存在していた.この解釈としてはcarrierであっても年齢などの効果により発症しうることを示している.つまりパーキン遺伝子のcarrierもパーキンソン病発症の危険因子となることが予想された.現在変異-臨床型について詳細な検討を加えている.我が国をはじめ世界各国からの若年発症のパーキンソン病患者約700例ついて変異解析を行ったところ劣性遺伝が疑われる家系では51%にParkin遺伝子変異を認めた.また一見すると優性遺伝と思われる家系においてもparkin遺伝子変異が存在することが少数ではあるが認められた.更にanticipation疑われる家系についてもparkin遺伝子変異を認めた.血縁結婚を認めない若年性パーキンソン病においては複合ヘテロ接合体で変異を持つことを確認した.また挿入変異を認める家系も存在し,RT-PCRで。