hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NK細胞療法における最適なドナー選定方法とキメラ型人工受容体発現の新手法の開発

がん・白血病に対するNK細胞療法の開発のため、NK細胞機能を予測する遺伝的因子に関して検討した。健常成人の解析では、NKG2D遺伝子型の与える有意な影響を確認した。さらにKIR遺伝子ハプロタイプによるサイトカイン産生能の相違も観察された。ヒト同種造血細胞移植コホートにおける検討では、ドナーKIR遺伝子ハプロタイプが移植成績に有意な影響を及ぼしていることが判明した。上記に加え、抗原特異的な殺傷能を与えるキメラ抗原受容体(CAR)を、Trogocytosis現象を利用しNK細胞へ発現させる新手法を検討した。一定の発現は得られるが十分なレベルとは言えず、さらなる改良が必要と考えられた。健常者における刺激型NK細胞受容体群の遺伝的プロファイルとNK細胞機能解析次年度にはサイトカイン産生の定量を行う予定である。また測定人数の増加を目指したい。現在のところ、まずはK562(Original)にCAR遺伝子およびコントロール遺伝子を導入し、2種類のBulk株からLimiting dilution methodによりそれぞれクローン化を行い、高発現株をいくつか得ることが出来た。現在Trogocytosisについて検証中である。また次年度には、上記の通り、NK細胞のFeeder cell lineであるK562-mb15-41BBL細胞をベースにした新たなDonor cell lineを作製する。【1】健常者における刺激型NK細胞受容体群の遺伝的プロファイルとNK細胞機能解析約40人の健常者から協力を得て末梢血を採取した。以下の通りに解析は進んでいる。【2】Trogocytosis-based CAR transfer:donor-cell lineの作製とキメラ型受容体Transfer K562にCAR遺伝子(anti-CD19-BB-z)およびコントロール遺伝子(anti-CD19-truncated)を導入した。それぞれ2種類のBulk株からLimiting dilution法によりクローン化を行い、いくつかの高発現株を得た。Trogocytosisについて検討したところ、CARの転送(Trogocytosis)を確認できた。しかしながら、Trogocytosis後のNK細胞のCD19抗原特異的活性化が明白でなく、反応の検出系の再検討だけでなく、さらなるCAR発現量の向上が必須と思われ、現在改善に向けて新たに娘株を樹立中である。またNK細胞を効率的に刺激できるFeeder cell line K562-mb15-41BBL細胞をベースにした新たなDonor cell lineを作製することも検討する。本研究では、がん・白血病に対するNK細胞療法の有効性向上を目指し、NK細胞機能を予測する遺伝的因子に関する検討、およびNK細胞に抗原特異的な殺傷能を与えるキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor: CAR)の新たな導入法について検討した。まず、健常成人における刺激型NK細胞受容体群の遺伝的プロファイルとNK細胞機能との関係について検討した。KIRおよびNKG2D遺伝子タイピングと並行して、NK細胞活性化受容体群の発現量、殺傷能(CD107a誘導)、活性化能(CD25/CD69誘導)、サイトカインおよびケモカイン産生能(cytokine beads array)、体外増幅能(K562-mb15-41BBL共培養)を測定し、遺伝的プロファイルとの相関を検討した。Trogocytosis現象を利用したCAR遺伝子の新規導入法の開発のため、Donor-cell(キメラ抗原蛋白の提供側細胞)としてK562にCAR遺伝子(anti-CD19-BB-z)をレトロウイルスで導入し、検討に用いた。KIR遺伝子型の実臨床上の意義の検討のため、造血器腫瘍に対するヒト同種造血細胞移植をモデルとして、KIR遺伝子型と移植後再発やGVHDなどとの関係を解析した。健常成人NK細胞のIn vitro解析では、NKG2DハプロタイプのNK細胞機能に与える有意な影響を確認した。さらにKIR遺伝子型やKIRハプロタイプによるサイトカイン産生能の相違が観察された。TrogocytosisについてはDonor-cellにおけるCAR発現の増加によりTrogocytosisの向上が得られたが、臨床応用上は十分なレベルとは言えず、今後さらなる改良が必要と考えられた。ヒト同種移植の検討では、当施設で行った同種造血幹細胞移植コホートにおいて、ドナーDNAを用い15のKIR遺伝子をタイピングし、ハプロタイプやKIRミスマッチの有無を判定し、臨床成績との相関を検討したところ、ドナーKIR遺伝子ハプロタイプが移植成績に有意な影響を及ぼしていることが判明した。より多数かつ背景因子の揃った別コホートで検討を重ねるべきと考えられた。計画書に記載した内容に、わずかに遅れた形で進んでいる。【1】のテーマについては当初の予定数には達しており、またサイトカイン解析も実施済みである。現在、KIRタイピングおよびNKG2Dタイピングによる群分けに基づき、NK細胞機能への遺伝的素因の影響について、刺激前定常状態の横断的比較、刺激前後の増減率、また刺激後の横断的比較検討を実施中である。

小児血液学「健常者における刺激型NK細胞受容体群の遺伝的プロファイルとNK細胞機能解析」については、概ね予定通りに進んでおり、現在統計学的処理を含めて、検討中である。現時点では計画の変更・見直しは不要と考えている。今年度中の論文発表を目指していく。「Trogocytosis-based CAR transfer:donor-cell lineの作製とキメラ型受容体Transfer」については、研究のさらなる発展のために、CAR遺伝子移転後のNK細胞機能解析にさらなる工夫が必要と考えているが、現在鋭意検討中である。新たなdonor-cell lineの作成について、進行速度を上げられるように努力する。計画書に記載した内容に、わずかに遅れた形で進んでいる。【1】健常者における刺激型NK細胞受容体群の遺伝的プロファイルとNK細胞機能解析、においては、NK細胞を刺激した細胞培養液上清の採取保存は行っているが、サイトカイン測定がまだである。健常者被験者数もさらに増やしたい。計画よりもやや進行が遅れていることで物品費購入を中心に予定よりもわずかに少ない支出となった。今後の推進方策については、上記したとおりである。現時点では計画の変更・見直しは予定していない。Trogocytosisについては、研究のさらなる発展のために、CAR遺伝子移転後のNK細胞機能解析にさらなる工夫が必要と考えている。今後さらに詳細に検討したい。本年度に持ち越された解析、研究計画を遂行する。また研究成果の発表に際する支出も増加する予定であり、計画通りに執行可能と考えられる。計画よりもやや進行が遅れていることで、計画よりも少ない支出となった。特に、サイトカイン測定などの比較的高額の解析が平成26年度に持越しになったため、支出額が見積もりより小さくなったと思われる。平成26年度に持ち越された解析(サイトカイン測定など)を行うため、持ち越した費用が使われる予定である。
核酸と生体高分子との規則的コンポジットの調製

DNAの構造に起因する新しい機能性物質を開発する為に、次のDNA含有コンポジットの調製を行った。1.DNA-コラーゲンフィブリルの調製と構造制御サケ白子由来のDNA、プラスミド由来で形状の異なる3種類のDNAとコラーゲンの複合体形成につき検討した。その結果、DNA-コラーゲン複合体の形成過程や構造は、DNAの形状により制御できる事が示唆された。2.DNAおよびDNA複合体の構造制御とアフィニティ分離用素材としての利用(1)DNA-合成高分子複合体従来行ってきた紫外線照射による不溶化DNA含有複合体、透析膜併用法に加え、DNA-ポリアクリルアミド複合体、DNA-ポリビニルアルコール相互網目(IPN)膜等を調製し、アフィニティ分離用素材としての利用を検討した。(2)DNA-金属複合体(3)ゾル-ゲル法によるDNA-シリカ複合体有機無機複合材料の有力な合成手段である「ゾル-ゲル法」を応用してDNAとシリカを成分とする有機無機複合材料を調製し、アフィニティ分離用素材として好結果を得た。3.イオン伝導性DNAコンポジットの調製電解質材料としてポリエチレンオキシド(PEO)とイオン液体を用いてDNAと複合化させ様々なタイプの電解質フイルムを作製した。コラーゲンは動物蛋白質の約3分の1をしめるほど生体にとって主要な物質であり、その繊維化にかんしては、生医学材料としての重要性から国内外で数多くの研究がなされている。現在まで当研究室で、DNAがコラーゲンの線維化を促進し、さらに完全な横紋構造を持つ巨大なDNA-コラーゲン複合体線維を形成することを明らかにしたことは規則的に配列したDNA分子を含むコンポジットを形成させたことで光化学材料、電子材料の可能性を開いた面で極めて重要である。さらに、コラーゲン水溶液をDNA水溶液中に押し出すと、DNA-コラーゲン複合体が形成されることが明らかとなり、この方法によりDNA-コラーゲン複合体のフィルム、繊維、ゲル等を調製できることがわかった。また、最近DNAに紫外線を照射する事により水不溶性のフィルムを容易に調製できる事、また、ガラスビーズ、不織布等の担体に結合させ得る事がわかった。さらにダイオキシン、PCB、ベンゾピレン等の環境ホルモン類がこれらの素材にインターカレートにより吸収されることがわかった。主としてこれらの知見をもとにして次の研究を行った。(1)DNA-コラーゲンフィブリル調製法の検討と構造制御コラーゲン溶液へのDNAの混合比、DNAの種類等によりどのような構造のDNA-コラーゲンフィブリルが形成されるか調べ、光機能性電子材料等開発の基礎研究としてDNA-コラーゲンバイオコンポジットの構造制御の方法を検討した。(2)固定化DNAの構造制御紫外線照射により不織布(セルロース)や多孔質ガラスビーズ(無機材料)に固定化したDNA含有コンポジットの調製法と構造制御法を検討し、環境ホルモン類の選択的な集積・除去能との関係を明らかにした。DNAの構造と機能を保持したまま水不溶性の機能性素材を開発しようという試みの中で、我々のグループは、酸性多糖アルギン酸を用いることにより、DNAを2本鎖構造を保ったまま不溶化でき、DNA-アルギン酸複合体よりなる繊維やフィルムを調製できることを明らかにした。一方、上記の研究の過程でDNAは代表的な構造タンパク質であるコラーゲンとの規則構造をもつ複合体にもでき、特に医用高分子や光電気化学の分野で極めて有望な複合素材ができることも明らかとなった。また、紫外線照射により水不溶性のDNAフィルムを簡単に調製できる事、さらにこの方法によりDNAをセルロース不織布、ガラスビーズ等、様々な材料に結合させることができる事などが明らかになった。この紫外線照射により不溶化したDNAは分子間で架橋した興味深い構造をしているが、DNAのB型構造は維持している。これらの紫外線照射による不溶化DNAにはダイオキシン、PCB、ベンツピレン等の平面構造をとる内分泌撹乱化学物質(環境ホルモン)が選択的に吸収される。この現象はDNA塩基対のスタッキングの間に、平面構造をとる芳香族化合物がインターカレートする現象を利用したもので、DNAならではの現象と言える。

このような状況のもと、本研究では上記の成果をさらに発展させ、DNAを含む各種の機能性複合素材を開発し、例えば各種の環境ホルモン類を集積・除去するような素材、さらにはすぐれた光特性、電気特性をもった材料などを開発するための基礎研究として、DNA-コラーゲンコンポジット等各種のDNA含有バイオコンポジットの調製法とDNA構造の関係を明らかにする為の次の研究を推進した。(1)DNA-コラーゲンフィブリル調製法の検討と構造制御(2)紫外線照射法によるDNAの構造制御(3)ゾルーゲル法によるDNA-シリカコンポジット(4)DNA-金属コンポジット(5)体内接着材としてのDNA-キトサン二層式膜これらの研究により、DNA含有バイオコンポジットの構造制御を自由に行えるようになり優れた機能性素材開発のシーズになるものと思われる。我々のグループは、DNAが代表的な構造タンパク質であるコラーゲンと規則構造をもう複合体を形成し、特に医用高分子や光電気化学の分野で極めて有望な複合素材ができることを明らかにした。また、紫外線照射により水不溶性のDNAフィルムを簡単に調合できる事、さらにこの方法によりDNAをセルロース不織布、ガラスビーズ等、様々な材料に結合させることができる事などが明らかになった。この紫外線照射により不溶化したDNAは分子間で架橋した興味深い構造をしているが、DNAのB型構造は維持している。これらの紫外線照射による不溶化DNAにはダイオキシン、PCB、ベンツピレン等の平面構造をとる内分泌撹乱化学物質(環境ホルモン)が選択的に吸収される。この現象はDNA塩基対のスタッキングの間に、平面構造をとる芳香族化合物がインターカレートする現象を利用したもので、DNAならではの現象と言える。このような状況のもと、今年度は上記の成果をさらに発展させ、DNAを含む各種の機能性複合素材を開発し、例えば各種の環境ホルモン類を集積・除去するような素材、さらにはすぐれた光特性、電気特性をもった材料などを開発するための基礎研究として、特に、1)DNA-コラーゲン複合体の調製と構造制御2)DNA及びDNA-合成高分子複合体ゲルの調製とダイオキシン誘導体除去素材としての利用につき研究を進めた。我々のグループは、以前、DNAが代表的な構造タンパク質であるコラーゲンと規則構造をもつ複合体を形成し、特に医用高分子や光電気化学の分野で極めて有望な複合素材ができることを明らかにした。また、紫外線照射により水不溶性のDNAフィルムを簡単に調合できる事、さらにこの方法によりDNAをガラスビーズ等、様々な材料に結合させることができる事などが明らかになった。これらの紫外線照射による不溶化DNAにはダイオキシン、ベンツピレン等の平面構造をとる内分泌撹乱化学物質(環境ホルモン)が選択的に吸収される。この現象はDNA塩基対のスタッキングの間に、平面構造をとる芳香族化合物がインターカレートする現象を利用したもので、DNAならではの現象といえる。
中性子スピン干渉による多重連結量子井戸中の定在波生成所時間に関する研究

多重連結量子井戸は、静磁場では↑スピンは多重の量子井戸、↓スピンは一つのポテンシャルのみを感じるFabry-Perot磁気多層膜を用いて実現する。「膜内の定在波はどのくらいの時間でできるか?」の疑問に対して実験的に答えを得るために、まだ中性子が量子井戸ポテンシャル場にいる間に、ポテンシャルを変動させてやり、そのポテンシャル場を透過した中性子のスピンプリセッションを測定する。Fabry-Perot磁気多層膜を透過するラーモア歳差回転中性子の回転角は井戸の数が増加するに従って比例的に増えるが、その透過確率は適当な層数(10層程度)以上はほとんど変化しない。Fabry-Perot磁気多層膜内に束縛される中性子の時間は、ラーモア歳差角から計算すると、2μsec程度までは実現可能となる。1MHzでポテンシャルを変化させれば、Fabry-Perot膜内に一気に(つまり1μsecより小さい時間で)定在波ができるのか、それとも、↑↓位相差で計算されるような時間スケールで、つまり各量子井戸ごと進むごとに定在波ができているのが分かる。そこで、イオンビームスパッタ法を用いて、MHzオーダーでかっ低磁場で機能するFabry-Perot磁気多層膜の実現を背景に、高性能な中性子偏極モノクロメータ開発した(Physica B 350)。またこの偏極ミラー開発の過程で、世界最高性能のNiC/Tiスーパーミラー(Nucl.Instr.Meth.Phys.Res.A.529)やNiC/Ti多層膜モノクロメータ(Physica B 350)の実現にも成功した。次にMHzの振動外場磁場の開発を行った。中性子によるMHzの振動を確認するために、高周波共鳴スピンフリッパーの開発を行い、0.1μsecの時間分解能で中性子を検出可能な、2次元の位置検出型高速中性子計測を冷中性子スピン干渉計に導入し、磁気シールドによるスピン干渉計の高性能化もテストした。これらは、共鳴中性子スピンエコー装置の試作器開発に役立ち、共鳴スピンエコー法における位相補正のシミュレーション(Nucl.Instr.Meth.Phys.Res.A.529)やパルス源における世界初の共鳴中性子スピンエコー法の実証実験に貢献した。「膜内の定在波はどのくらいの時間でできるのか?」この疑問に対して実験的に答えを得るために、まだ中性子が量子井戸ポテンシャル場にいる間に、ポテンシャルを変動させてやり、そのポテンシャル場を透過した中性子のスピンプリセッションを測定する。磁場中でラーモア歳差運動を行う中性子の波動関数は、↑↓スピン中性子波動関数の重ね合わせで考えられ、そのラーモア歳差回転角はその波動関数の期待値から求められる。そしてFabry-Perot磁気多層膜内に束縛される中性子の時間は、ラーモア歳差角から計算すると、2μsec程度までは実現可能となる。本年はまず、イオンビームスパッタ法を用いて、1MHzでかつ低磁場で機能するFabry-Perot磁気多層膜の実現を背景に、高性能な中性子偏極ミラーを開発すること中心に行った(Physica B, in press)。そのような高速中性子計測に対応した冷中性子スピン干渉計の開発や磁気シールドによるスピン干渉計の高性能化も試みた。また偏極ミラー開発の過程で、世界最高性能のNiC/Tiスーパーミラー(Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. A. in press)やNi/Ti多層膜モノクロメータ(Physica B, in press)の実現にも成功した。

次にMHzの振動外場磁場の開発を行った。中性子によるMHzの振動を確認するために、高周波共鳴スピンフリッパーの開発を行い、0.1μsecの時間分解能で中性子を検出可能な、2次元の位置検出型高速中性子計測を冷中性子スピン干渉計に導入し、磁気シールドによるスピン干渉計の高性能化もテストした。これらは、共鳴中性子スピンエコー装置の試作器開発に役立ち、共鳴スピンエコー法における位相補正のシミュレーション(Nucl.Instr.Meth.Phys.Res.A.529)やパルス源における世界初の共鳴中性子スピンエコー法の実証実験に貢献した。
ミトコンドリア遺伝子送達システムの開発と骨格筋における遺伝子発現の検証

多彩な機能を有するミトコンドリア(Mt)での遺伝子発現を実現するため、『骨格筋Mtへの遺伝子送達』および『Mt遺伝子発現』を可能とする革新的基盤技術の開発を到達目標とした。本研究では、ハイドロダイナミクス法を利用した骨格筋Mtへの遺伝子導入技術の確立に成功し、Mt特異的遺伝子発現プラスミドを骨格筋Mtへ送達し、in vivoにおけるMt遺伝子発現を実現した。本研究で開発したMt標的型遺伝子発現システムは、Mtを標的としたライフサイエンス、遺伝子治療、疾患モデル動物の作出に大きく貢献する事が期待される。本申請研究では、多彩な機能を有するミトコンドリア(Mt)での遺伝子発現を実現するため、『骨格筋Mtへの遺伝子送達』および『Mt遺伝子発現調節』を可能とする革新的基盤技術の構築を行う。H23年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。2.骨格筋Mtを標的とした核酸送達の検討:ハイドロダイナミクス法を利用した骨格筋Mtへの核酸送達を試みた。投与体積、投与速度、投与量などを最適化する事でMtへの送達核酸量を飛躍的に上昇させる事に成功した。また、FISHを利用して骨格筋に送達されたpDNAを可視化することに成功した。3.核酸パッケージング:Mt転写因子TFAMでパッケージングしたpDNAナノ粒子がin vitro転写反応で高い転写活性能を示し、Mt内での遺伝子発現活性に有望である事が見いだされた。また、オリゴ核酸封入DF-MITO-Porterを構築し、従来型キャリアと比較して効率的なMt移行を達成する事を確認した。さらに、内因性mtRNAを標的としたMt遺伝子抑制を試み、本システムによってMt遺伝子調節が可能である事が示唆された。H25年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。Mtを標的とした核酸送達の最適化: MITO-Porterとハイドロダイナミクス法を統合した肝臓および骨格筋を標的とした核酸送達システムの構築を検討した。はじめに、静脈内投与経路からMITO-Porterを投与し、肝臓Mtへの送達に関する基礎情報を取得した。種々の検討の結果、静脈投与経路を介して肝臓Mtへの分子送達を可能とするin vivo適応型のMITO-Porterの構築に成功した。一方で、核酸ナノ粒子を搭載したMITO-Porterをハイドロダイナミクス法により投与した場合には、Mtへの核酸導入効率がハイドロダイナミクス法と比較して著しく低下してしまった。そのため、in vivoにおけるMt遺伝子発現制御検証時の核酸導入はハイドロダイナミクス法を用いて実施する事とした。in vivoにおけるMt遺伝子発現制御の検証:天然型mtDNAの大部分を保持したΔmtDNA(約10,000bp)を有するMt発現DNAベクターの構築を試みたが、mtDNAの有する配列の一部が大腸菌株の増殖を阻害し目的のベクターの構築は達成できなかった。そのため、新たにMt特異的プロモーターHSP、転写・翻訳の過程に必要と考えられる配列3'UTRtRNAなどの最小領域を基盤遺伝子骨格に有するMt遺伝子発現pDNAを設計した(レポータータンパク質Xをコード)。構築したMt遺伝子発現pDNAをハイドロダイナミクス法を用いて肝臓および骨格筋内部へ送達し、in vivoにおけるMt遺伝子発現を検証した。逆転写リアルタイムPCRによって目的のmRNAが産生されている事を確認した。さらに、外来タンパク質Xの発現を肝臓および骨格筋で確認する事に成功した。H24年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。Mtを標的としたin vivoにおける核酸送達の検討:当初計画では、骨格筋Mtへの核酸導入による遺伝子発現の検証を行う予定であったが、骨格筋Mtの単離効率が低く遺伝子発現評価が困難になると予想された。そのため、Mt遺伝子発現評価の標的臓器として新たに肝臓にも着目してMtへの核酸送達を試みた。投与体積、投与速度、投与量など種々の条件を検討しハイドロダイナミクス法による肝臓Mtへの核酸導入に成功した。Mt遺伝子発現制御の検証(in vitro & in vivo):アンチセンスRNA (ASO)をMITO-Porterを用いて細胞Mtに送達し、標的mRNAの発現量を定量的RT-PCRにより評価した(遺伝子発現抑制の検証)。その結果、ASO導入により40%の抑制効果が認められ、さらに標的mRNAがコードする内因性Mtタンパク質の発現量の低下が観察された。

一方で、送達分子にMt特異的プロモーターLSPおよびMtコドンを有するGFP発現プラスミド(pLSP-mtGFP)を用いた場合(遺伝子発現の検証)、生細胞Mt内でのGFP発現は確認されなかった。Mt選択的リガンドの探索は、評価系の構築に成功しDNAよりもRNAの方がMt送達に適していることを見出した。特定の配列を決定していないが、H24年度中に候補配列を絞り込む予定である。骨格筋Mt標的型DDSに関しては、in vivo投与方法の検討から開始し、ハイドロダイナミクス法が骨格筋Mtへの核酸送達を可能とする事を示した(前倒しで行った項目)。また、核酸パッケージングに関してはTFAMが外来遺伝子の転写活性化に有利である事、オリゴ核酸送達によるMtRNAの標的化が可能である事を示した。本件は、核酸パッケージングに留まらず遺伝子調節の評価まで確立しており、本申請研究を大幅に進めることができたと考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。さらに、細胞系ではあるがリポソーム型人工核酸送達キャリアを用いたMt遺伝子発現の抑制を世界で初めて達成した。また、骨格筋Mtへの核酸導入を前倒しで行ったため(H23年度)、H24年度までに当初計画の骨格筋に加え肝臓を標的としたMt核酸送達法を確立することができた。そのため、最終年でのin vivo遺伝子発現制御に関する準備は盤石であると考えている。一方、遺伝子発現の検証に関しては、送達する遺伝子ベクターの再設計などが必要であることが確認されたが、最終年で到達目標を達成すべく万全な計画を立案している。今後は、『in vivo適応型Mt核酸送達システムの開発』および『Mt内での遺伝子発現の検証』を中心に研究を進める予定である。1.H23年度に構築したMt送達が可能な核酸搭載MITO-Porterの核酸送達能の向上を図る(in vitro)。具体的には、Mt選択的アプタマーおよび種々のMt targeting signal RNA/Proteinをキャリアの表面に配置しMt移行能を向上させる。本検討で構築したキャリアとハイドロダイナミクス法を組み合わせ骨格筋Mtを標的としたDDSの構築へと発展させる(in vivo)。2.最適化した核酸搭載MITO-Porterを用いて、生細胞Mtにおける遺伝子発現を検証する。また、H23年度にMt-RNA標的が可能である事が確認できているのでオリゴ核酸送達の検討も並行して行う予定である。『in vivo適応型Mt核酸送達システムの開発』に関しては、MITO-Porterとハイドロダイナミクス法を統合した骨格筋および肝臓Mtを標的とした核酸送達システムを構築する。Mtに送達された核酸量は定量的PCRによって測定する予定である。『Mt内での遺伝子発現の検証』に関しては、送達遺伝子ベクターを改良し生細胞および組織での遺伝子発現を評価する予定である。具体的には、遺伝子ベクターにプロモーター部分のみを付加するのではなく、天然型mtDNA (16,300bp)の大部分を保持したΔmtDNA(約10,000bp)に外来タンパク質をコードするMt遺伝子コドンを挿入したMt発現DNAベクター(ΔmtDNA-mtGFP)を設計する。
カワカイメンにおけるプロトニューロンの解析-ニューロンの分子進化-

カイメンを用いた研究は、遺伝子レベルでの解析が殆ど行われていず、手法も確立されていない。本年度我々は、1.ESTライブラリーの中に見いだしたneuropeptide関連分子の発現を解析する手法として、芽球よりhatchしたカワカイメンに対するwhole mount in situ hybridization法を新たに確立した。2.さらに、光を乱反射する芽球の殻を固定後取り除き、TSA systemを用いた蛍光による検出を用いたdual color in situ hybridizationの系も確立した。Ef_092095_P21(ヒドラneuropeptideに非常に低い相同性のあるクローン),Ef_023025_G08(neuropeptideのアミド化を担う酵素;PAM/PAL)、Ef_203_I06(neuropeptideの分泌顆粒膜に存在するcytochrome b561)は、それぞれ、hatch後7日のカイメンにおいて、形態的に識別可能な食細胞:choanocyteでは発現せず、体に散在する大型細胞でやや弱い発現があった。Dual color in situ hybridizationを行ったところ、Ef_023025_G08とEt_203_I06の発現パターンが一致する事が明らかになった。即ち、アミド化neuropeptideを発現していると期待される細胞がカイメンにも存在する。カイメンの体に散在する細胞は形態的に6種類ほど報告されているが、現在、我々はcell type specific molecular markerを探索しており、得られたmarker遺伝子、シグナル関連遺伝子との共発現等を解析することで、アミド化neuropeptideを発現していると期待される細胞のcell type、また、どの様なシグナルとしてアミド化neuropeptideを用いているのかを解析する予定である。
精神分裂病患者における変異遺伝子の制限酵素断片長多形解析

Reverse Cloning法を用いて、分裂病病因遺伝子をクローニングし、その構造解析かつ、変異性を明らかにするという目的で当研究を行っている。現在までのところ、健常人10人のゲノムDNAを混合し、制限酵素Sau3AIにより切断、コスミドを用いゲノムライブラリーを作成した。また文書にて同意を得た分裂病患者の血液からゲノムDNAを抽出。その抽出した分裂病患者のゲノムDNAをプローブとして用い、上記のゲノムライブラリーのスクリーニングを行っているところである。同意の得られた分裂病患者から順次スクリーニングを行っているが未だ小数例でもあり、明確な結果は得られていない。今後例数を増やして更に当研究を継続していく予定である。
第7番染色体に存在すると推測される口腔癌増殖抑制遺伝子のクローニング

第7番染色体上の対立遺伝子の欠失は多くの種類の腫瘍で高頻度に起きており、これらの欠失の集積部位には癌抑制遺伝子が存在すると考えられている。口腔癌に関しては、未だに第7番染色体の詳細な検討が行なわれていなかったので、私達の研究グループは口腔扁平上皮癌についてPCR-LOH assay法により調べ、第7番染色体短腕のLOHの集積状況を検討した。その結果、7q31.1-31.2領械にはLOHが集積しており、その部位に癌抑制遺伝子が存在する可能性があることを見出し、また、臨床諸所見との相関関係の検討からその役割は増殖制御機能であろうと推測した。次ぎに、染色体7q31.1-31.2領域にLOHが検出された同一患者の腫瘍組織と正常組織から抽出・精製したDNAとRNAを用いて以下の実験を行なった。1)正常組織と腫瘍組織のRNAを用いてdifferential dysplay法を行ない、腫瘍組織にはないが正常組織にあるmRNAのcDNAを12種類得た。しかし、いずれもFluorescence in situ hybridization(FISH)法により7番染色体由来であることを確認できなかった。2)別の患者のサンプルを用いてdifferential dysplay法を行ない、腫瘍組織にはないが正常組織にあるmRNAのcDNAを3種類得た。3)正常組織と腫瘍組織のDNAを用いてRepresentative differential analysis法(RDA法)を行ない、腫瘍組織には無いが正常組織にあるDNA断片を2種類得た。4)2)で得られたcDNAと3)で得られたDNA断片をhybridizeしたところ、相同性を有するDNA断片が1種類得られた。5)このDNAの塩基配列を決定した。現在、得られたDNAをプローブとして各種腫瘍や組織での発現状態を調べ、この遺伝子の役割を調査中である。染色体7q31.1-31.2領域にLOHか検出された同一患者の腫瘍組織と正常組織から重出・精製したDNAとRNAを用いて以下の実験を行った。1)正常と腫瘍両方のRNAそれぞれについて、RT-PCR法を用いたdifferential display法を行い、腫瘍組織にはないが、正常組織にはあるmRNAのcDNAを12種類得た。2) 1)で得られた個々のcDNAをプローブとしてFish法を行い、染色体上で、7q31.1-3 1.2領域に由来するcDNAであることを選別・確認したが、上記12種類のcDNAの内に、目的とするcDNAが存在することを確信できなかった。3)別の患者のサンプルを用いて再度1)2)を繰り返し、候補となるcDNAを3種類得た。4)正常と腫瘍からのDNA両方共を使ったPCR法によるRepresentational difference analysis法(RDA法)により腫瘍組織にはないが、正常組織にはあるDNAの断片を増幅した。現在、4)で得られたDNA断片を用いてFish法を行い、染色体上で、7q31.1-31.2領域に由来するDNAであることを選別・確認するとともに、3)で得られたcDNAとの相補性を検討している。染色体7q31.1-31.2領域にLOHが検出された同一患者の腫瘍組織と正常組織から抽出・精製したDNAとRNAを用いて以下の実験を行った。2)別の患者のサンプルでdifferential dysplay法を行い、腫瘍組織にはないが正常組織にあるmRNAのcDNAを3種類得た。このうち、1種類がFluorescence in situ hybridization法(FISH法)で7番染色体由来であることが確認できた。

5)このDNAを用いて、腫瘍組織と正常組織での発現の有無と、genomic DNA上での存在の有無の確認とsequenceを行っているところである。第7番染色体上の対立遺伝子の欠失は多くの種類の腫瘍で高頻度に起きており、これらの欠失の集積部位には癌抑制遺伝子が存在すると考えられている。口腔癌に関しては、未だに第7番染色体の詳細な検討が行なわれていなかったので、私達の研究グループは口腔扁平上皮癌についてPCR-LOH assay法により調べ、第7番染色体短腕のLOHの集積状況を検討した。その結果、7q31.1-31.2領域にはLOHが集積しており、その部位に癌抑制遺伝子が存在する可能性があることを見出し、また、臨床諸所見との相関関係の検討からその役割は増殖制御機能であろうと推測した。次ぎに、染色体7q31.1-31.2領域にLOHが検出された同一患者の腫瘍組織と正常組織から抽出・精製したDNAとRNAを用いて以下の実験を行なった。1)正常組織と腫瘍組織のRNAを用いてdifferential dysplay法を行ない、腫瘍組織にはないが正常組織にあるmRNAのcDNAを12種類得た。しかし、いずれもFluorescence in situ hybridization(FISH)法により7番染色体由来であることを確認できなかった。2)別の患者のサンプルを用いてdifferential dysplay法を行ない、腫瘍組織にはないが正常組織にあるmRNAのcDNAを3種類得た。3)正常組織と腫瘍組織のDNAを用いてRepresentative differential analysis法(RDA法)を行ない、腫瘍組織には無いが正常組織にあるDNA断片を2種類得た。4)2)で得られたcDNAと3)で得られたDNA断片をhybridizeしたところ、相同性を有するDNA断片が1種類得られた。5)このDNAの塩基配列を決定した。現在、得られたDNAをプローブとして各種腫瘍や組織での発現状態を調べ、この遺伝子の役割を調査中である。
肝臓プロテインアルギニンホスファターゼに関する分子生物学的研究

我々の研究室では、独自に精製したホスホアルギニンホスファターゼの基質特異性を研究し、本酵素がペプチド中のホスホアルギニンにも作用するプロテインアルギニンホスファターゼであることを発見した(J.Biochem.1996印刷中)。当該研究は本酵素をコードするcDNAを単離して、その一次構造を決定することにより酵素の細胞内における機能を推定することを目的として行われた。まず本酵素の部分アミノ酸配列を決定して、これに対応するオリゴヌクレオチドを合成し、^<32>Pで標識してプローブを作成した。ラット肝臓cDNAライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法によりcDNAを単離し、これをプラスミドにサブクローニングして、さらにデレーションクローンを作成した。サンガー法によるシークエンス反応を行い、DNAシークエンサーを用いて、塩基配列を決定した。データベースを用いたホモロジーサーチの結果、このcDNAは癌抑制遺伝子産物p53の選択的タンパク質分解系を構成する酵素の遺伝子と相同性の高い塩基配列をもつことがわかった(未発表)。このことは、本酵素が癌抑制遺伝子産物p53の選択的分解制御系に関与していることを示唆している。但し、今回得られたcDNAは、部分アミノ酸配列をもとに単離されたものであるため、このcDNAが本当に本酵素の遺伝子をコードしてるかを確認するために、クローン化したcDNAのリーディングフレームを発現ベクターにサブクローニングして、大腸菌に融合タンパク質として発現させるなどして酵素活性を検出する必要がある。現在この実験を計画している。
CRISPR-Cas9システムを用いた遺伝性角膜疾患に対する画期的根治療法の開発

平成30年度はCRISPR-Cas9とHDRによる遺伝子編集がin vivoでも機能するか、モデル動物を用いた検討を行った。TGFBI関連角膜ジストロフィーの1病型である格子状角膜変性症(TGFBI R124C変異)のモデルマウスを東京大学農学部藤井渉博士との共同研究により作製した。マウスの交配をすすめたところ、ワイルドタイプのマウスでは角膜混濁が生じなかったが、ホモのR124Cマウスは生後40週で約70%のマウスで角膜に混濁が生じていた。組織学的検討を行ったところ、混濁部位はHE染色においてエオジン好性に染色された。コンゴーレッド染色は陰性であったが、マッソントリクローム染色では淡く染色が見られた。電子顕微鏡での観察も行ったが、無構造、不定形の沈着物が上皮下に多数観察された。ワイルドタイプとホモR124Cマウス間において、角膜におけるTGFBIの遺伝子発現量に差異は見られなかったが、タンパクレベルではホモR124Cマウスの角膜において、TGFBIタンパクの発現増加が見られ、生成された変異体TGFBIタンパクの分解が阻害されている可能性が考えられる。ヒト格子状角膜変性症では、角膜びらんがよく見られるが、R124Cマウスにおいては角膜びらんは見られなかった。創傷治癒モデルを角膜上皮に作製すると、ワイルドタイプと比較して、R124Cマウスでは著明に角膜上皮の創傷治癒遅延が認められ、TGFBI変異によるなんらかの細胞遊走阻害や接着阻害が生じている可能性が考えられた。現在本モデルマウスの角膜局所におけるCRISPR-Cas9とHDRによる遺伝子編集が可能か検討するため、現在コンストラクトを作製し、in vivoにおける遺伝子導入の検討を開始している。モデルマウスを作製し、その評価をほぼ終了し、論文作成に着手していること。また治療法確立のため、遺伝子編集のコンストラクトを作製し、in vivoの検討を開始していること。平成31年度は、モデルマウスの論文作成とマウス角膜における遺伝子編集の検討を行う。概ね予定通り使用したが、11万ほど余った。来年度は様々な試薬が必要となり全て使用されると考える。
エチレン応答性トランス因子(EREBP)遺伝子の構造解析

1)タバコの祖先種であるN.sylvestrisのゲノムライブラリーを、タバコEREBP1-4のcDNAをプローブとしてスクリーニングを行い、λ18a、λ18c、λ15Lの3つのクローンを得た。ORFの推定アミノ酸配列はEREBP2,3,4のcDNAのそれらに対し、それぞれ92%,93%,77%の同一性を示した。いずれの遺伝子にもイントロンは存在せず、それらの5'非転写領域には、お互いに相同な領域は認められなかった。また、プロモータ領域の配列を解析した結果、単離決定した領域には塩基性PRタンパク質で認められたようなエチレン応答性シス因子(AGCCGC配列)は存在しないことが明らかとなった。進士らによりEREBP遺伝子そのものもエチレンにより誘導を受け、また根や培養細胞において発現することが認められているが、上記の結果よりこれらEREBP遺伝子の発現制御はAGCCGC配列を介した制御とは異なる機構によっている可能性が示唆された。2)単離したEREBP2,3,4遺伝子それぞれについて0.6-1.5kbのプロモータ領域とGUS遺伝子の融合遺伝子を構築し、形質転換タバコ植物を作成した。形質転換タバコを用い、エチレンに対する応答を調べた結果、EREBP2-4いずれの形質転換体も強弱はあるものの、エチレンにより発現が誘導されることを認めた。なお、EREBP3遺伝子がもっとも顕著なエチレン誘導性を示した。一方、組織特異的な発現を検討した結果、いずれの遺伝子も培養細胞で強く発現していることを認めた。また、EREBP3ならびに4は根においても培養細胞とほぼ程度に強く発現していることを認めた。
酵母キラー蛋白質の感受性細胞侵入機構の解析

本研究では、酵母由来の抗菌蛋白質zymocinが、感受性酵母の細胞表層に結合後、細胞内に毒素サブユニットを侵入させる機構を明らかにする。提案者は、現在、zymocinの侵入過程を次のように推測している。「zymocinのキチナーゼ活性で細胞表層がかく乱されると、細胞表層の再構築が誘導される。その際細胞壁合成酵素が細胞内・表層を循環する。このメンブラントラフィックを利用して、毒素ドメインが細胞内に侵入する。」本研究ではこの仮説を検証するために、zymocin処理をした出芽酵母細胞を用いて、zymocinと細胞壁合成酵素の細胞内局在変化を解析することで、その侵入過程を明らかにする。細胞のキチン合成酵素Chs3pの局在輸送が、zymocin処理によりかく乱されること、細胞表層のChs3pが細胞内輸送される際に、zymocinサブユニットが細胞内に侵入する可能性を想定している。そこで、平成19年度は、野生株のCHS3遺伝子にGFPを修飾した株を作り、zymocin処理後のzymocinサブユニット局在変化の解析を行った。細胞分画試料の抗GFP抗体によるウエスタン解析で実施したところ、密度勾配遠心で最も重い画分のChs3p量が、zymocin処理によって減少していた。この画分には、ゴルジトランスに局在するKex2pが局在していることは確認できたが、Kex2pはより軽い画分にも分布しており、Chs3p局在の変化は他のオルガネラ膜画分で起きたと考えられる。MPK1は、また細胞表層の再構築の際にCHS3の発現を制御する。mpk1とchs3多重破壊株のzymocin感受性を調べたところ、mpk1単独破壊に比べて強く、chs3遺伝子破壊株と同等の耐性を示し、Chs3pが感受性に重要な役割を果たすことが明らかになった。R.Scheckmanらは、Cell wall integrity経路の上流に位置するRho1とPkc1がChs3の局在を変化させることを示している。平成20年度は、ZymocinによってRho1とPkc1の下流にあるMAPキナーゼであるMpk1がリン酸化(活性化)されることが確認されたが、Mpk1遺伝子破壊株でも、ZymocinによるChs3の細胞内局在変化は生じていた。従って、ZymocinによるChs3の細胞内局在変化も、Rho1とPkc1が支配している可能性が高く、21年度にその確認を行う。また、Mpk1遺伝子破壊株はZymocin耐性を示したため、zymocinが細胞内に侵入する程度に変化があるか解析を試みた。しかし、今回細胞内局在変化を観察した1時間のzymocin処理では、細胞内のzymicinがウエスタン解析で検出できるほど高くはならなかった。キラータンパク質zymocinが、標的の酵母Saccharomyces cerevisiae(SC)細胞内に毒素を輸送する機構を解析した。Zymocinは3つのサブユニット[キチナーゼホモログ(α)、tRNA分解活性(γ)、機能未知(β)]から構成されるが、SCの細胞外から処理したzymocinは、αとγは細胞の膜画分に移行し、βは結合しないことを、zymocinの各サブユニットに対する抗体を使い、処理細胞内画分のウエスタン解析と、細胞の免疫染色で確認した。一方、細胞表層の健全性を守るPKC経路は、センサーが得た情報をリン酸化でRholp→Pkclp→→Mpklpに伝える。Rholp, Pkclpは細胞表層へ細胞壁合成酵素を輸送し、Mpklpは、合成酵素の転写活性化を司る。センサーやMPR1遺伝子破壊株(mpklΔ)、pkcl変異株はzymocin耐性を示し、zymocinの毒性発揮に標的細胞のPKC経路活性化が必要であることが示された。細胞壁合成酵素を細胞表層へ輸送できなくなったrhol変異株はzymocin耐性を示したことから、zymocinの持つキチナーゼ活性で細胞表層が浸食された結果、PKC経路が活性化され、細胞壁合成酵素の細胞表層への輸送が誘導されると考えた。野生株でもmpklΔ株でも、zymocin処理により、小胞体に蓄積されていたGFP-Chs3p量が減ることから、合成済みのChs3pは、zymocin処理により細胞表層へ輸送された可能性がある。さらに、zymocinのγサブユニットが細胞内に入る手段として、zymocin処理で表層へ送られたChs3pが細胞内へ輸送されると同時にzymocinが細胞内へ侵入すると予想した。
高速情報処理システムの開発とその生体信号処理系への応用に関する研究

生体信号処理系へ応用を目的とする高速情報処理システムの開発を大別すると、ハ-ドウェアを用いた処理部とソフトウェアによる処理部になる。ハ-ドウェアの高速処理は並列処理による高速の生体信号デ-タの取り込みである。デ-タ量が多いので、ハ-ドロジックによる高速処理を実現した。この論理回路の高速急を実現するためのシミュレ-ションを行い、良好な結果を得た。さらに、電磁結合の大容量メモリとニュ-ロコンピュ-タの設計を行った。生体信号としてEKGを体表面から取り込むための体表面電極群を開発した。この装置は従来のセンサ-の欠点を全て除き、臨床的にも良好なEKGを探取することができる。さらに、大容量記憶装置として電気的磁気的に結合した読み出し専用メモリを設計し、シミュレ-ションも行った。体表面電位図を高速に表示するための並列処理手法を開発し、そのソフトウェアも作成した。実測電位図からブレ-クスル-現象が正確に測定されることを確認し、その結果を学会に報告した。体表面電位図から心起電力を逆問題として推定する手法も研究し、その結果も学会に報告した。視覚的に自然な電位分布を表示するために高速の補間法を開発し、通常の補間法よりも数十倍の処理速度を持つアルゴリズムを作成した。生体機能の高速処理を基本とする高速生体信号処理装置のアルゴリズムを開発し、種々の生体信号に適用しパタ-ン認識実験を行った結果は良好であるが、生体信号の不規則な変化によって結果が異るので、この欠点を除くシステムの開発を検討する。生体の不規則性の原因である筋肉振動に関してモデルを作成し、その解析を行った結果、実験の内容を説明することが可能になった。その理論と実験との比較も学会に研究報告を行った。さらに並列処理を高速に行い、生体内で行われている処理のメカニズムを解理し、それに対応する信頼性の高いシステムを開発するための基礎研究を行う。高速情報処理システムの開発はハードウエアとソフトウエアに分けられる.ハードウエア面として,研究代表者が開発した超高感度マルチセンサ(USAPatent No.4517983)は128個の可動素子によって構成され,各可動素子の内部にはセンサーと高感度増幅器を搭載する.これを用いて体表面心臓電位を測定し,高精度に表示した.表示方法には,体表面電位分布の連続的経時変化をカラーグラフィック装置で表示するための並列処理システムを開発した.この並列処理システムは16台のマイクロコンピュータから成り,それぞれのCPUはメモリと浮動少数点演算機能を有するので高速処理が可能である.ソフトウエアの開発として,高速補間法を導入し,そのハードウエア化も実現した.この成果は学会に発表した.この手法を用いると,約300倍程度の高速で体表面心臓電位分布図の補間値を求めることが可能になった.体表面電位センサーと動的コンピュータグラフィックス表示法に関してはホストンで開催されたIEEE, BMEの国際会議の紹待講演で発表した.さらにマルチセンサーの精度を向上するために,人間の筋肉が機械系のインターフエイスで発生する筋肉振動を解析しその発生原因を明確にした.その結果をドイツで発表したが,欧米と日本でも大きな反響があり,さらに精度の高い結果を求めて発表する予定である.さらに高速の情報処理を目標として,ガリウム・ひ素論理回路の高速化を提案し,そのシミュレーションも行い,学会誌に報告した.この手法も現実に使用可能な装置が実現出来るように研究が進展している.この他に心電図と心〓図の情報を結合して心電図逆問題の解析に良好な結果が得られている.

逆問題解は臨床学的にも有意義であるので,大きな計算機を使用しても行うべき重要な問題であり,医学的にも貴重な結果が得られつつあり,近く国際会議で発表する予定である.生体信号処理系への応用を目的とする高速情報処理システムの開発を大別すると、ハードウェアを用いた処理部とソフトウェアによる処理部になる。ハードウェア面では、大容量のデータを高速に処理し、高精度表示を実現するために高速直接補間法のアルゴリズムを開発し、これをハードウェアで実現するためのロジックを集積回路を用いて製作した。この回路はパイプライン処理を用いるので非常に高速処理が可能であるので、これを多く用いた並列処理を実現するために、集積回路化が必要であるので、その設計を計算機でシミュレーショをしながら実行し、最終的なパターン設計図が完成した。さらに、高速の生体信号処理システムを実現するためには、大容量高速の記憶部を必要とする。電気的・礎気的な結合方式を用いた三次元メモリの基礎的研究も行った。このメモリは共振状態と非共振状態に対応して情報を記憶し、高速にメモリへのアクセスが可能である。コンピュータによるシミュレーションの結果、アクセス時間が10ナノ秒で数百メガバイトの記憶容量を持つメモリが設計可能である事が明らかになった。ソフトウェア面では、生体の重要な情報収集機能である聴覚の働きから母音識別を容易に行うソフトウェアを作成した。さらに、体表面心臓電気現象を解析するための高速心臓電位推定のためのソフトウェアも開発した。体表面心臓電位測定装置と心臓磁気測定装置からの情報を総合的に取り入れて、体内の電気量分布を解析し、これを効果的に表示するソフトウェアを作成した。これを用いて、ダイポールの場合の心臓電位を高速に推定する事が可能になった。さらに、16台のコンピュタを用いた並列計算方式による高速処理装置のための実用的ソフトウェアを開発した。この実現のために上記の高速直接補間法のハードウェアを効果的に用いたので、通常のマイクロコンピュータのみの処理速度に対して10倍以上の高速処理システムを開発した。高速情報処理システムの開発を大別するとハ-ドウェア処理部とソフトウェア処理部に分かれる。ハ-ドウェアを用いて高速に生体信号を取り込みディスクにデ-タを貯える。この処理の高速化を実現するために、高度の並列処理装置を用いた。ハ-ドロジックで高速処理を実現した。さらに生体信号を採取する際に生体表面に発生する筋肉振動を詳細に検討し、良好なECGとEMGを取り込むセンサの改良を行った。表面に分布する生体信号は時間的に変化するので、それらの処理を並列処理によって行った。これらの情報処理には生体内部の神経回路で行われている超並列処理が有効であるので、ニュ-ロンコンピュ-ティングの新しい方式を提案し、その基礎実験を行った。ニュ-ロン間の結合に電気磁気学的結合が実現性があり有効であることが明らかになった。これをハ-ドウェアで実現するために空間的に電気信号の発生器と受容器を配置して、神経回路のように信号を伝送することを実験的に確認した。さらに、生体信号を取り込む大容量の高速メモリの動作の基礎研究も行った。
母体末梢血中胎児有核細胞の有効な分離・濃縮法の開発とその出生前診断への臨床応用

1.有核赤血球に特異的な抗体を組み合わせることで、FACSを用いて妊婦末梢血より有核赤血球を分離・濃縮することができた。2.正常妊婦では、妊婦末梢血中の有核赤血球の存在比率は妊婦の経過に伴い有意に減少する傾向があった。3.男児を妊娠している妊婦末梢血からFACSにより分離・濃縮された有核赤血球に対して、FISH法により胎児細胞の同定を行ったところ、平均3.3個のY染色体陽性細胞が確認できた。正常妊婦の末梢血中に存在する有核赤血球の約5%が胎児由来であり、残りの多くは母体由来であった。4.本法による胎児性別診断のspecificityは100%であり、sensitivityは88%、negative predictive valueは86%,positive predictive valueは1005であった。以上より、妊婦末梢血からFACSを用いて有核赤血球を分離・濃縮することができ、FISH法による胎児細胞の同定も可能であった。特に、染色体異常に対する出生前診断のスクリーニングに近い将来応用できることが示唆された。しかし、純粋な胎児細胞を分離・濃縮しなくては、遺伝子診断をはじめとした本法による出生前診断へのさらなる応用は難しいと考えられ、新たな抗体の開発や分離・濃縮法のさらなる改善が望まれる。本研究は、母体末梢血中の胎児有核細胞の有効な分離・濃縮法を開発し、その上で出生前診断への臨床応用を行うために、FACS(Fluorescence activated cell sorter)を用いた胎児有核赤血球の分離・濃縮法を確立することを目的とした。今年度は、FACSを用いて有核赤血球を有効に分離するための表面マーカーの選択とその標識物質の最適な組合せの同定、および細胞選別のためのFACSの各種パラメーターの設定を行った。対象は、末梢血中に有核赤血球の出現している血液疾患患者2名、非妊娠成人3名、妊婦(妊娠9-33週)10名、胎児(妊娠17-40週)8名の計23名とした。本人・家族の十分なinformed consentを得た後、採取した検体血をFicol-Hypaque法にてpre-separationし、ついで各種表面マーカーを様々な標識物質で標識した抗体と結合させ、FACSVantage(Becton Dickinson社)でSortingを行った。その結果、血液疾患患者のGPA陽性かつCD71あるいはCD36陽性細胞群に有核赤血球が選択的に分離・濃縮されており、これらの表面マーカーの組合せが特に有用と考えられた。非妊娠成人のGPA陽性CD71陽性細胞分画は0.009%と極めて低いのに対し、胎児では0.78%、妊婦では0.11%検出され、各選別分画で形態学的に有核赤血球が確認された。Y染色体特異的probeを用いたfluorescence in situ hybridization分析により、男児を妊娠中の妊婦のGPA陽性細胞選別分画でsignal陽性の胎児由来細胞を容易に同定できた。以上の今年度の研究によって、今後さらに改善する必要はあるものの、母体末梢血中胎児有核赤血球を有効に分離・濃縮するためのFACSのSorting条件をほぼ確立できたと考えられた。以上のように、今年度は概ね当初の計画どおりに進行することができた。2.正常妊娠では、妊婦末梢血中の有核赤血球の存在比率は妊娠の経過に伴い有意に減少する傾向があった。正常妊婦の末梢血中に存在する有核赤血球の約5%が胎児由来であり、残りの多くは母胎由来であった。4.本法による胎児性別診断のspecificityは100%であり、sensitivityは88%、negative predictive valueは86%、positive predictive valueは100%であった。

以上より、妊婦末梢血からFACSを用いて有核赤血球を分離・濃縮することができ、FISH法による胎児細胞の同定も可能であった。特に染色体異常に対する出生前診断のスクリーニングに近い将来応用できることが示唆された。しかし、純粋な胎児細胞を分離・濃縮しなくては、遺伝子診断をはじめとした本法による出世前診断へのさらなる応用は難しいと考えられ、新たな抗体の開発や分離・濃縮法のさらなる改善が望まれる