hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝性脊髄小脳変性症の新規治療ターゲット探求のための新規原因遺伝子探索

もう一つの遺伝子に関しては他家系は収集できていないものの、他疾患として報告されてきていたこともあり、遺伝子変異と臨床肖像の相関を確認していく。候補遺伝子の抽出のみの家系においては、同様の臨床症状を呈する家系を集積しさらに遺伝子の絞り込みを行う。また同定された遺伝子の細胞内動態を確認し。治療ターゲットの抽出を試みる。
生活習慣病における心房細動発症メカニズムの解明と発症予測

心房細動の病態解明を目的として、前年度に引き続きマイクロRNAの関与に着目して研究を行い、特にバイオマーカーとしての血中マイクロRNAの応用を検討した。さらに、心房細動の進展および全身性合併症のメカニズムの1つとして、血中遊離DNA(セルフリーDNA)の関与についての検討を行った。今までの研究において確立した心房性不整脈のマウスモデル(横行大動脈縮窄モデル・糖尿病モデル)から得た心房組織中のマイクロRNA発現変化をもとに網羅的解析を行い、マイクロRNAをベースにしたパスウェイ解析ツールであるmiR-Path DIANAを用いて、網羅的に解析した。その結果、複数の疾患モデルで共通して変化するパスウェイを発見し、現在各パスウェイの中心分子について心房細動における詳細な病態生理メカニズムの解明を行っている。また、心房細動では全身の軽微な炎症反応が生じ、凝固能亢進・腎機能低下・血管内皮機能低下など、様々な合併症を生じることが知られている。我々は心房細動が炎症を惹起するメカニズムとして、セルフリーDNAに着目し、心房細動患者では血中セルフリーDNAが増加すること、心房筋細胞の細胞株であるHL-1細胞の高頻度刺激にてセルフリーDNAが放出されることを明らかにした。セルフリーDNAのなかでもミトコンドリア由来セルフリーDNAは心房細動で特異的に放出されること、マクロファージにおける炎症性サイトカインの発現を誘導することが明らかとなり、心房細動において全身性合併症が生じる主要な機構であると考えられた。さらに、心房細動に合併する心原性脳梗塞について、凝固因子Xa活性を評価する研究を並行して行い、Xa活性を簡便に評価する新手法を開発した。1)心房細動の病態に関与するマイクロRNAの網羅的解析とパスウェイ解析心房細動の発症及び慢性化に関与するメカニズムとして心房リモデリングが知られている。我々は心房リモデリングにおけるマイクロRNAの発現変化がどのようなシグナルを介して心房機能を制御するか検討するため、横行大動脈縮窄モデルおよび糖尿病モデルの心房組織のマイクロRNAの網羅的解析を行い、miRPath-DIANAを用いてパスウェイ解析を行った。その結果、新たに2つのパスウェイが心房リモデリングに関連するものとして同定された。現在両パスウェイにおける中心的分子に焦点をあてて機能解析を行っている。2)セルフリーDNAを介した心臓と他臓器のコミュニケーションおよび心房細動のバイオマーカーとしてのセルフリーDNA心房細動症例および健常者の血漿中セルフリーDNAを定量したところ、心房細動患者では有意に濃度が上昇していた。また、心房細動を模したモデルとしてマウス心房筋細胞株であるHL-1細胞を高頻度ペーシング刺激し、培地中のセルフリーDNAを定量したところ、時間依存的にセルフリーDNAが増加していた。研究は順調に進行しており、マイクロRNAを介した心房細動の進展メカニズム解析に加え、セルフリーDNAを介した心臓と他臓器の臓器間コミュニケーションの点でも新知見が得られている。研究の最終段階として、以下の検討を行う。1)心房細動のバイオマーカーとしてのマイクロRNA・セルフリーDNAの臨床的有用性の検討今までに同定した心房細動のバイオマーカーとなるマイクロRNA・セルフリーDNAについて、複合的評価によって心房細動発症予測が可能となるか、より多数例での検討を進める。2)心房細動と全身的合併症に関連するセルフリーDNAの関与の検討と治療ターゲットの探索引き続き、ミトコンドリア由来セルフリーDNAが心房細動においてどのように全身炎症を惹起するのか、さらにメカニズムを明らかにする。また、ミトコンドリア由来セルフリーDNAの放出経路などに着目し、新規治療ターゲットの探索を行う。心房細動の病態を解明するため、特にマイクロRNAの関与・pannexinの関与について着目して研究を行い、バイオマーカーとしてのマイクロRNAの応用を検討した。さらに付加的な研究として、心房細動に合併する血栓形成に着目し、心原性脳梗塞の病態解明とリスク評価についての検討を行った。心房細動の発症及び慢性化に関与する重要なメカニズムとして心房リモデリングが知られており、これは心房の炎症・線維化に代表される構造的リモデリングと、心房内伝導障害に代表される電気的リモデリングに分けられる。我々は心房リモデリングに心房内のマイクロRNA発現変化が関与していることに着目し、マウス高脂肪食負荷モデル(HFDモデル)ではmiR-27bの発現が上昇し、Cx40の発現を低下させて心房内伝導障害を来すことを明らかにした。さらに、バイオマーカーとしてのマイクロRNAの有用性の検討のために心房細動症例における末梢血でのマイクロRNA発現変化とマウス心房細動モデルにおけるマイクロRNA発現変化についてそれぞれ網羅的解析を行い、その後個別の発現量解析によって新たな4つのマイクロRNAを同定した。今後各マイクロRNAの機能解析を行う予定である。さらにpannexinに関しては、心筋虚血および心臓圧負荷に対してpannexin-1が心保護的に作用していることを明らかにし、それぞれその詳細なメカニズムの解明を行っている。また、心房細動の合併症として、心房内での血栓形成による心原性塞栓症がある。我々は当初予定に追加して心原性脳梗塞に関与する心房内血栓形成の評価とそのメカニズムの解明を行い、ソニー株式会社が開発した誘電コアグロメーターを用いて血栓形成傾向の鋭敏な評価を試みた。血液の誘電率変化の微分波形より全血凝固能評価の指標を確立し、高齢者など脳梗塞リスクの高い症例では血液凝固能も亢進していることを明らかにした。

1)心房細動の病態に関与するマイクロRNAの同定と、バイオマーカーとしてのマイクロRNAの応用:心房細動の発症及び慢性化に関与する重要なメカニズムとして心房リモデリングが知られており、これは心房の炎症・線維化に代表される構造的リモデリングと、心房内伝導障害に代表される電気的リモデリングに分けられる。我々は心房リモデリングに心房内のマイクロRNA発現変化が関与していることに着目した。マウス心房細動誘発モデルの中で実際に心房頻拍が効率に誘発されたHFDモデルと圧負荷モデルを用いて、心房組織でのマイクロRNA発現変化と、臨床例における末梢血でのマイクロRNA発現変化についてそれぞれ網羅的に解析を行った。各網羅的解析によって発現変化が見られたマイクロRNAのターゲット遺伝子の探索を行い、機能解析を進めている。2)心臓圧負荷に対するPannexin-1の作用:我々はPannexin-1ノックアウトを用いて心筋虚血に対するpannexin-1の作用について検討し、pannexin-1が低酸素刺激によってATPを細胞外に放出して心保護作用を示すこと、及びIKATPチャネルとの相互作用により活動電位短縮に寄与することを明らかにした。現在、心臓圧負荷に対する作用を検討しており、Pannexin-1ノックアウトマウスでは心機能が急激に低下することを明らかにし、現在そのメカニズムを検討している。3)心房細動に合併する心原性脳梗塞のリスク評価:我々は、心原性脳梗塞のリスク評価として、ソニー株式会社が開発した誘電コアグロメーターを用いて血栓形成傾向の評価を行い鋭敏な評価指標を確立した。引き続いて、血液凝固過程における凝固因子Xaに着目し、Xa活性を評価する指標を発見した。現在、Xa阻害作用のある抗凝固薬を用いて、Xa活性およびその阻害薬の評価が可能か検討している。心房細動の病態を解明するため、前年度に引き続きマイクロRNAの関与・pannexinの関与に着目して研究を行い、特にバイオマーカーとしての血中マイクロRNAの応用を検討した。さらに付加的な研究として、心房細動における血中遊離DNA(cell-free DNA)の関与についての検討を行った。今までの研究において確立した心房性不整脈のマウスモデル(横行大動脈縮窄モデル・高脂肪食負荷モデル)から得た心房組織中のマイクロRNA発現変化と、心房細動患者および健常者の血清中のマイクロRNA発現変化をそれぞれ網羅的に解析し、どちらの検討でも発現変化が見られたマイクロRNAを抽出し、さらによりについてそれぞれ網羅的解析を行い、その後個別の発現量解析によって新たな4つのマイクロRNAを同定した。今後各マイクロRNAの機能解析を行う予定である。さらにpannexinに関しては、心筋虚血および心臓圧負荷に対してpannexin-1が心保護的に作用していることを明らかにし、それぞれその詳細なメカニズムの解明を行っている。また、心房細動では炎症性サイトカイン発現の増加・腎機能低下・血管内皮機能低下など、全身に様々な変化を合併することが知られている。
グラム陰性菌における新たな外膜小胞産生機構の解明とワクチン応用への理論的基盤構築

本研究は、グラム陰性菌における外膜小胞(OMV)の産生機構の解明とワクチン応用への理論的基盤の構築を目的とする。本年度の研究計画は、1) OMVに対する宿主細胞の免疫応答の解明,2) OMVを介した細菌由来分子の宿主細胞への取り込み経路の解明、の2項目である。1) OMVに対する宿主細胞の免疫応答の解明HlyF産生・非産生株から回収・精製したOMVについて、腸管上皮由来のCaco-2細胞を用いた添加実験を実施した。その結果、HlyF産生株由来のOMVを添加した細胞は、24時間後、細胞内に空胞の形成が確認され、その後、細胞は死滅に至った。さらに、添加前、添加後30分、1時間、2時間後における各種炎症性サイトカイン(IL-6、IL-8、IL-18、IL-1β、TNFα、INF-γなど)についてリアルタイムPCRによる遺伝子発現の動態解析を行った結果、添加前に比べ、大きな発現変動は確認されなかった。そのため、添加後に測定するタイムポイントを増やし(4時間、8時間、12時間)、再度、免疫応答に関する検証を行う。2) OMVを介した細菌由来分子の宿主細胞への取り込み経路の解明OMVはエンドサイトーシスによって宿主細胞内に取り込まれると推定されている。そこで、まずはOMVに内包されることが確認されているHlyEについて、そのC末端側に緑色蛍光タンパクGFPを付加したHlyE-GFP融合タンパク質産生株を作成を試みた。しかしながら、HlyF-GFP融合タンパク質産生株の作成まで至らず、現在、別の蛍光タンパクを用いて、融合遺伝子作成を試みている。本年度に実施予定であった「OMVを介した細菌由来分子の宿主細胞への取り込み経路の解明」について、本実験に使用するHlyF-GFP融合タンパク質産生株の作成まで至らなかったため。本研究の今後の研究推進については、研究分担者である相川知宏博士と実施状況の確認を踏まえ、逐次、相談・検討しながら当初の研究計画に沿って遂行していく。平成30年度に予定していた「OMVを介した細菌由来分子の宿主細胞への取り込み経路の解明」については、HlyF-GFP融合タンパク質産生株の作成まで至らなかったため、現在、別の蛍光タンパクを用いて、融合遺伝子作成を試みている。本研究における今年度の研究実施計画は、1)HlyFによる外膜小胞(OMV)産生誘導メカニズムの解明と、2)OMV産生誘導条件の至適化の2つである。まず、1)HlyFによるOMV産生誘導メカニズムの解明については、OMVのペプチドグリカン(PG)およびリポ多糖(LPS)の糖鎖について札幌医大の白石宗博士の協力のもと、HlyF産生・非産生株における違いを確認した。その結果、HlyF産生株由来のOMVにおいては、LPSのリピドA部分に関連する特定の糖鎖が有意に検出され、HlyFによる糖鎖構造の変化が起きていることが示唆された。また、RNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析では、HlyF産生・非産生株において複数の遺伝子発現の変動が確認されたが、本解析については、再度データを取得して再現性を取る必要がある。次に、2)OMV産生誘導条件の至適化については、上記の遺伝子発現解析による結果が不十分なため、次年度に改めて実施する予定である。平成29年度は1)HlyFによるOMV産生誘導メカニズムの解明と、2)OMV産生誘導条件の至適化の2つを研究計画として掲げていたが、糖鎖分析やRNA-seqなどのデータに関する検証が遅れたため、2)OMV産生誘導条件の至適化の検討までは至っていない。

本年度は、研究実施計画に掲げていた2つの項目のうち、一方のみしか達成することができなかった。しかしながら、現在、データの追加により、次年度の上半期内で達成することが可能である。次年度および以降の研究実施については、研究分担者である相川知宏博士および白石宗博士の両名の協力のもと、当初の計画通り遂行していく。本研究の今後の研究推進については、研究分担者である相川知宏博士と実施状況の確認を踏まえ、逐次、相談・検討しながら当初の研究計画に沿って遂行していく。平成30年度に予定していた「OMVを介した細菌由来分子の宿主細胞への取り込み経路の解明」については、HlyF-GFP融合タンパク質産生株の作成まで至らなかったため、現在、別の蛍光タンパクを用いて、融合遺伝子作成を試みている。本年度は研究実施計画の一部の解析が未遂行であったため、次年度の上半期に、未遂行分の実施を予定している。
巨大ひずみ加工による水素貯蔵合金の開発

本研究では、加工しても形状が変わらない巨大ひずみ加工法を利用して水素貯蔵特性の向上を目指すことを目的とした。巨大ひずみ加工法として超高圧ねじり変形(High-Pressure Torsion:HPT)法と呼ばれる加工技術を利用した。この加工法は延性が低く強度の高い材料にも適用でき、格子欠陥が導入できることが特徴である。水素貯蔵合金には高強度で低延性の金属間化合物(FeTiやMg2Niなど)が適することが知られている。本研究では、前年度作製し、組織観察や硬度測定したTiFe金属間化合物の水素吸蔵・脱蔵特性をシーベルト型装置を用いて調べ、水素吸蔵・脱蔵メカニズムを考察した。1.HPT加工したFeTiは活性化処理することなく水素吸蔵・脱蔵特性を示した。水素吸収量は1.7wt%とほぼ理論値(1.9wt%)に近い量となった。2.HPT加工によるひずみ量の依存性を回転数010回転として調べたところ回転数が1/4回転でも水素吸蔵・脱蔵を示すことが分かった。3.HPT加工したFeTi金属間化合物は長期に大気中に曝した後でも活性化処理することなく水素吸蔵・脱蔵特性を示した。4.X線回折(XRD)、透過電子顕微鏡(TED)、走査電子顕微鏡(SEM)とともに、X線光電子分光法(XPS)、オージェ電子分光法(AES)で表面および内部組織観察を行ったところ、HPT加工で導入された格子欠陥により水素原子の拡散が高速に起こり、Fe酸化物の表面偏析が誘発され、同時に微小クラックが異種の酸化物の周りに形成されることで水素透過能が高まり、TiFeの内部にできた格子欠陥(たとえば転位)に水素がトラップされて圧力変化に対する水素脱像・吸蔵機能が高まったことが原因と考察された。HPT加工をFeTi合金に適用したところ、活性化処理することなく水素吸蔵・脱蔵特性を示すことが分かった。HPT加工技術による水素貯蔵特性の高性能化が科学的証明されたばかりでなく、FeとTiのみのレアアースを含まない極めて安価な水素吸蔵合金の開発に成功できたことで、実用的にも水素ステーションなどの水素エネルギー貯蔵技術の大幅なコストダウンが期待できる結果となった。本研究成果は、日本経済新聞(平成25年2月26日(火)朝刊)や讃費新聞(平成25年3月16日(土)朝刊)などでプレスリリースを行った。また、本研究開発技術の有効利用を目指して特許出願も行った。実用性を考慮して、HPT加工の大型化とともに、水素エネルギー貯蔵技術に適用していく場合の材料製造技術の開発が望まれる。本研究では、加工しても形状が変わらない巨大ひずみ加工法を利用して大量の格子欠陥を導入し、水素貯蔵特性の向上を目指すことを目的とする。巨大ひずみ加工法として超高圧ねじり変形(High-Pressure Torsion : HPT)法と呼ばれる加工技術を利用する。本研究では、いろいろな純金属にHPT加工して付与ひずみに対する硬度変化を調べ、透過電子顕微鏡を用いて組織観察するとともに、HPT加工した純Mgの水素吸蔵量を調べた。得られた結果は以下の通りである。1.30種類の純元素の試料をHPT加工したところ、硬度は低融点金属を除いてひずみとともに上昇し定常値に飽和した。Mgやアルミニウムの低融点金属は付与ひずみとともに、いったん硬度は上昇し、最大値を示した後に減少して定常値になることがわかった。2.定常状態での硬度値は原子結合力と相関関係があるとともに、定常状態での結晶粒径も原子結合力で一義的に表されることが示された。3.純MgをHPTしたところ、定常状態では約1ミクロンの微細結晶粒径となった。また一部転位フリーの再結晶粒が観察された。4.3MPa,150度Cで水素吸蔵試験したところ、10回転した試料では約6.9wt%の水素が吸収されることが分かった本研究では、加工しても形状が変わらない巨大ひずみ加工法を利用して水素貯蔵特性の向上を目指すことを目的とした。巨大ひずみ加工法として超高圧ねじり変形(High-Pressure Tbrsion: HPT)法と呼ばれる加工技術を利用した。水素貯蔵合金には高強度で低延性の金属間化合物(たとえば、FeTiなど)が適することが知られている。本研究では、前年度のMg結果をもとに結晶粒界が水素貯蔵に効果的であることが分かったので、水素貯蔵特性を上げるべく、FeTiを含めた金属間化合物でナノ結晶粒の創製を試みた。1.金属間化合物FeTiのバルク試料を溶解鋳造法で作製し、6GPaのもと室温にてHPT加工した。回転数は010回転とし、硬度測定、X線回折(XRD)、透過電子顕微鏡(TEM)観察を行った。硬度は、HPT加工前の340HVから加工後には1000HVを超えた。加工前に存在した水素化物は高圧付与で消失した。TEM観察によれば、10nm程度のナノ結晶粒領域、1μm以下の超微細粒領域およびアモルファス領域が試料中に混在することが確認された。2.純Alと純Niの粉末からなる混合粉末を6GPaのもと100回転のHPT加工を573Kで施した。xRD解析、TEM観察からAl_3Ni_2の金属間化合物と純Niのナノ結晶の生成が確認された。

673Kで焼鈍することにより試料全体でAINi金属間化合物に変態することが知られた。HPT加工によりナノ結晶粒(20nm)の金属間化合物が生成し硬度は920HVに達した。この後673Kで焼鈍することで結晶粒径は大きく成長するものの、50nm程度に成長することが分かった。HPT加工によりナノ結晶粒の生成が可能であることを示した。本研究では、加工しても形状が変わらない巨大ひずみ加工法を利用して水素貯蔵特性の向上を目指すことを目的とした。巨大ひずみ加工法として超高圧ねじり変形(High-Pressure Torsion:HPT)法と呼ばれる加工技術を利用した。この加工法は延性が低く強度の高い材料にも適用でき、格子欠陥が導入できることが特徴である。水素貯蔵合金には高強度で低延性の金属間化合物(FeTiやMg2Niなど)が適することが知られている。本研究では、前年度作製し、組織観察や硬度測定したTiFe金属間化合物の水素吸蔵・脱蔵特性をシーベルト型装置を用いて調べ、水素吸蔵・脱蔵メカニズムを考察した。1.HPT加工したFeTiは活性化処理することなく水素吸蔵・脱蔵特性を示した。水素吸収量は1.7wt%とほぼ理論値(1.9wt%)に近い量となった。2.HPT加工によるひずみ量の依存性を回転数010回転として調べたところ回転数が1/4回転でも水素吸蔵・脱蔵を示すことが分かった。3.HPT加工したFeTi金属間化合物は長期に大気中に曝した後でも活性化処理することなく水素吸蔵・脱蔵特性を示した。4.X線回折(XRD)、透過電子顕微鏡(TED)、走査電子顕微鏡(SEM)とともに、X線光電子分光法(XPS)、オージェ電子分光法(AES)で表面および内部組織観察を行ったところ、HPT加工で導入された格子欠陥により水素原子の拡散が高速に起こり、Fe酸化物の表面偏析が誘発され、同時に微小クラックが異種の酸化物の周りに形成されることで水素透過能が高まり、TiFeの内部にできた格子欠陥(たとえば転位)に水素がトラップされて圧力変化に対する水素脱像・吸蔵機能が高まったことが原因と考察された。当初水素貯蔵特性について調べる予定であったが、装置の使用に制限があり関連のデータが得られていない。2012年3月に高速で水素貯蔵特性が測定できる装置が関連機関に導入されたので、特性評価の迅速化が期待できる。HPT加工をFeTi合金に適用したところ、活性化処理することなく水素吸蔵・脱蔵特性を示すことが分かった。HPT加工技術による水素貯蔵特性の高性能化が科学的証明されたばかりでなく、FeとTiのみのレアアースを含まない極めて安価な水素吸蔵合金の開発に成功できたことで、実用的にも水素ステーションなどの水素エネルギー貯蔵技術の大幅なコストダウンが期待できる結果となった。本研究成果は、日本経済新聞(平成25年2月26日(火)朝刊)や讃費新聞(平成25年3月16日(土)朝刊)などでプレスリリースを行った。また、本研究開発技術の有効利用を目指して特許出願も行った。実用性を考慮して、HPT加工の大型化とともに、水素エネルギー貯蔵技術に適用していく場合の材料製造技術の開発が望まれる。
TiAl化合物基合金における高温α相の分解過程の解明

本研究では次世代の高温用構造材料として実用化が期待されているTiAl基化合物基合金の特性発現のための組織制御に資することを目的として、この材料の特徴であるAl濃度の高い高温α相のα→α_2+γ反応経路に沿った分解過程を連続冷却および直接焼入/等温時効の両方から検討して以下に示すことを明かにした.まず、2元系Ti-48at%Al合金を用いてα相の分解によって形成される組織は、拡散変態によって生じるα_2/γラメラ組織とマッシブ変態によって生じる塊状あるいは針状のγ単相組織となり、連続冷却曲線(CCT)と等温変態曲線(TTT)を作成してラメラ開始線(Ls)およびマッシブ変態開始線(Ms)を求めた.また、第3元素としてNbおよびMoを添加すると、CCTにおけるLs線は長時間側に移行するのに対し、TTTにおけるLs線は短時間側に移行する.これは、前者の場合、第3元素の添加により拡散が遅滞してラメラの形成をが抑制されるため、一方、後者の場合は、第3元素の添加により焼入温度までの急冷中に未変態α相中で発生する双晶の密度が著しく増大してγ相の析出に対する核生成サイトが増加するためである.また、2元系合金におけるMs温度は約1273Kであり、第3元素の添加にともなってMs温度は上昇する.以上の結果から、これまで明確ではなかったα相の分解によって形成される組織は、2つの変態モードの組み合わせによって生じていること、また、実用化を目指して必ず添加される第3元素の組織形成に及ぼす効果を明かにした.本研究では次世代の高温用構造材料として実用化が期待されているTiAl基化合物基合金の特性発現のための組織制御に資することを目的として、この材料の特徴であるAl濃度の高い高温α相のα→α_2+γ反応経路に沿った分解過程を連続冷却および直接焼入/等温時効の両方から検討して以下に示すことを明かにした.まず、2元系Ti-48at%Al合金を用いてα相の分解によって形成される組織は、拡散変態によって生じるα_2/γラメラ組織とマッシブ変態によって生じる塊状あるいは針状のγ単相組織となり、連続冷却曲線(CCT)と等温変態曲線(TTT)を作成してラメラ開始線(Ls)およびマッシブ変態開始線(Ms)を求めた.また、第3元素としてNbおよびMoを添加すると、CCTにおけるLs線は長時間側に移行するのに対し、TTTにおけるLs線は短時間側に移行する.これは、前者の場合、第3元素の添加により拡散が遅滞してラメラの形成をが抑制されるため、一方、後者の場合は、第3元素の添加により焼入温度までの急冷中に未変態α相中で発生する双晶の密度が著しく増大してγ相の析出に対する核生成サイトが増加するためである.また、2元系合金におけるMs温度は約1273Kであり、第3元素の添加にともなってMs温度は上昇する.以上の結果から、これまで明確ではなかったα相の分解によって形成される組織は、2つの変態モードの組み合わせによって生じていること、また、実用化を目指して必ず添加される第3元素の組織形成に及ぼす効果を明かにした.
高校の理科、社会科(教員)のための生命倫理、生命工学に関する教材の開発

高校において生命倫理に関する教育が、現在どの程度行われているのか、そして今後どのように発展していくべきかを知るために、オーストラリア、ニュージーランド、日本で高校での生命倫理教育に関する国際調査を行った。7月から11月に、日本の全高校の約20%にあたる1400校(回収率(生物、社会):40%,27%)、ニュージーランドすべての338校(55%、26%)、オーストラリアでは528校(48%、22%)にアンケート用紙を送付した。アンケートはA4サイズで3ページ、表裏に印刷し、生物科と社会科の教師一人ずつにアンケートを渡すことをお願いした手紙とともに校長宛に送付した。一般的に、社会科の教師よりも理科の教師の方が、生命倫理に関する教育を、授業に積極的に取り入れており、また、オーストラリア、ニュージーランドの教師の方が日本の教師よりも積極的だった。今後、生命倫理に関する教育をさらに取り入れていくことには、多くの教師が賛成していたが、日本の理科の教師が、この様な問題は、理科と社会両方の教科で取り扱うべきだと答えていた一方、ニュージーランド、オーストラリアの理科の教師は、理科の授業で取り扱うべきだと答えていた。さらに、それぞれの教師の生命倫理に対するイメージ、生命倫理に関する教育が必要だと思う理由を尋ねた質問から、日本の教師の生命倫理に対する理解度は、ニュージーランド、オーストラリアの教師に比べて、初期の段階にあり、やや、あいまいであるということがわかった。今調査結果に基づき、8月から9月に生命倫理教育における補助教材を作成し、日本(500校)、ニュージーランド(160校)、オーストラリア(160校)の高校へ配布した。これは、生命倫理の概念、動物の権利、生殖技術、遺伝病、バイオテクノロジーなどについての最新の情報と、わかりやすい解説を記述したものである。現在、各国の教師から、この教材に対する意見、改善点が寄せられている。また、これら一連の研究に関して、教師と討論も行っている。今調査の詳細は拙著「Bioethics for the People by the People」の中で報告されており、また、補助教材等も含めた一連の研究結果は、平成7年度に日本語と英語で出版する予定である。
日米の知的所有権係争とその企業提携・政策協調へのインパクト

1.1982年のIBM産業スパイ事件以後、日米企業間の知的所有権紛争が多発するようになった。本研究では、それらの主要事例(コンピュータOS、アモルファス合金、光ファイバー、半導体、カメラの自動焦点機構等をめぐる紛争)についてケース・スタディをおこない、事実関係の明確化に努めた。2.1を土台にして、日米知的所有権紛争(民間レベル)の全体的なトレンドの究明を試みた。紛争領域のハイテク産業全体への拡張、サブマリン特許の脅威の存在、アメリカの特許裁判の動向(均等論の普及と損害賠償の高額化)等が明らかになったが、それらは日本企業にとっての困難が一過性のものではなく、今後も続く可能性を示唆している。3.日米企業間の知的所有権紛争は、日米両国の知的所有権制度のあり方と密接にかかわっている。その関係を意識しつつ、制度調整をめぐる政府レベルの対立と妥協についての実態究明にあたった。なお、ガットのウルグアイ・ラウンドやWIPOにおいても知的所有権制度のハ-モナイゼーションをめぐる国際交渉がなされてきたので、それらの特徴と問題点の検討作業もおこなった。4.留意すべきことに、日米の民間レベルの知的所有権紛争は、両国企業間の提携関係の発展を促す要因となってきた。また、政府レベルでの制度調整の動きは、それ自体、日米政策協調の新たな前進を物語る。対立の日本にとっての重大さと当時に、対立を通して協調が進む関係にも注意を寄せることが、問題解決の方向を探る上で重要だと思われる。日米知的所有権粉争の全体像をつかむには、政府レベル、企業レベルの双方に目配りしなければならない。当初予定にしたがって、その両レベルでの日米の軋轢の歴史と現状を明確にするための作業に取り組んだ。すなわち、第一に、日米両国における知的所有権制度ならびに運用基準の史的変遷と現状の把握に努めた。そのこと自体が、現在両国間に残されているハーモナイゼーション上の懸案事項の確認につながった。ただし、発展途上国を含む全世界的規模でのハーモナイゼーションのあり方を考える上で重要だと思われるウルグアイ・ラウンドのTRIP交渉、WIPOの特許調和条約交渉等についての立ち入った考察は、今後の課題として残されている。第二に、日米の民間レベルの知的所有権粉争について代表的な事例のサーベイをおこなった。これを通じて、各ケースの個別的特徴だけでなく、全体としての大きな趨勢もある程度明らかになってきた点が、新たな知見として特筆に値しよう。以後も引き続いてより鮮明な把握を目指すことになるが、1)対日知的所有権攻勢をかけるアメリカ側の主体が、日本企業と製品シェアを争う競合企業だけでなく、特許を保有していても関連製品をつくっていないメーカーや個人発明家にまで広がってきている事実、2)まだ製品ができていないアイデア段階で特許申請がなされたり、機能の未分明な遺伝子が出願されるといった早期の技術囲い込みが目立ってきている事実、が注目される。特許制度の変質をもたらしたり、アメリカの国策としての産業競争力強化の方針に背反したりする可能性がある変化なので、その客観的意味を注意深く検証する必要があるものと考える。当初予定にしたがって、主に2通りの作業を並行的に進めた。すなわち、第一に、前年度に引き続き、日米の民間レベルにおける知的所有権紛争に関するケース・スタディをおこなった。取り上げた個別事例の豊富化によって、紛争の全体的なトレンド(製品技術だけでなく製造技術までが問題にされる傾向、米国特許侵害裁判での「均等論」の普及と損害賠償の高額化、ペーパー特許やサブマリン特許の脅威の増大等)をより明確にできたが、それは日本企業の苦境を一過性の災難であるかにみなす一部の論調が根拠を欠いた希望的観測にすぎないこと、ならびに企業まかせでは済まされない制度上の問題に留意する必要を教えるものとなっている。

第二に、知的所有権制度の国際的ハーモナイゼーションについて、歴史的経緯(パリ条約改正問題の推移等)を明らかにした上で、現況の考察、とくにGATTのTRIP交渉とWIPOの特許調和条約交渉における南北間・先進国間の利害対立とその妥協の模様の吟味を試みた。世界的な経済厚生の増大につながる知的所有権制度のあり方を模索することは、ポスト冷戦の世界秩序形成にとって重要な一環をなすものと思われるが、そうした望ましい制度のデザインに進むための前提である実情の正確な認識はひとまず達成できたと考える。知的所有権の保護強化は、知的生産物の過少生産を避けるために欠かせない条件である一方、保護が行き過ぎれば人類の生活向上に寄与する科学技術の潜在的可能性がせばめられることにもなりかねない、諸刃の剣である。それだけに周到な検討が必要だとの思いを強くしながら、日米の制度調整を含む国際的なハーモナイゼーションの問題に今後さらに深く切り込んで行きたいと考えるものである。ほぼ当初予定どおりに、次の3つの作業を並行的に進めた。第1に、過去2年間の作業を受け継ぐ形で、知的所有権にかかわる企業間レベルならびに政府間レベルの双方での日米紛争の実態をより明確につかみ、個別事例の特質と同時に紛争の全体的なトレンドを明らかにするように努めた。第2に、特許や知的所有権にかかわる経済理論のありかを探り、その上で現実との対比を通じてそれらの吟味をおこなう作業に着手した。本格的研究は今後を期さざるをえないが、技術的普及と発明奨励の矛盾、テクノ・グローバリズムとテクノ・ナショナリズムの相克など、深めるべき点を明確にできたのは一応の収穫だと考える。第3に、本研究の最終年度として、研究成果の集約作業にあたった。日米間での知的所有権係争の激化に注目し、実情把握と知的所有権の経済的意味の解明に努めることが、本研究の主題であった。そのためには、米国企業の知的所有権戦略が「戦略法務」の一環をなし、米国政府の知的所有権戦略が産業競争力強化政策の一翼に位置づけられている事情を勘案して、アメリカ側の企業・国家戦略の総体にまで視線を配る必要があるということで、日米ハイテク摩擦全般を常に意識した広がりのある視野での考察を心がけるようにした。そうしたアプローチを採用した単著として1994年12月に『日米ハイテク摩擦と知的所有権』(有斐閣)を刊行できたのは、本研究に負うところが大である。
中世末期フランドル代表制における農村地区

本研究は、中世末期(14-15世紀)のフランドル代表制活動を、これまであまり注目されてこなかった農村地区(シャテルニー)を中心に分析することによって、この時期、すなわちブルゴーニュ家の政治的統合の時期における低地(ネーデルランド)の地方自立主義(パルティキュラリスム)的な構造を、より明確で具体的な形で提示することを目的としている。その際、シャテルニーの中で最も政治的に顕著な役割を果たし、大都市とも並ぶ特権的な地位を得た「ブルフセ・フレイエ」の統治機関であり代表制活動の担い手である参審人団の構成と活動に分析対象を絞り、前年度2004年9月から本年度2005年8月末まで、ベルギー王国ヘント大学を拠点に、関係未刊行史料、とりわけシャテルニー会計簿(ブリュッセル国立総合文書館およびブリュッヘ国立文書館所蔵)の調査を行った。ブルフセ・フレイエの参審人団の人的構成については、現在、ヘント大学で進行中のフランドル・エリートのプロソポグラフィー研究計画との協力のもとに解明を進め、その成果の一部(14世紀末-15世紀中葉)については、史学会第103回大会西洋史部会(2005年11月東京)において報告を行った。この時の質疑を参考に大幅な加筆を施した論文を準備中である。また、研究の中心としたシャテルニー会計簿について、史料論的問題を研究ノートとしてまとめた(2006年3月刊行予定)。さらに、ブルフセ・フレイエの参審人団と諸都市の紛争について、「14-15世紀フランドルのシャテルニーと都市」と題し、2006年3月「構造史研究会」および「ブルゴーニュ公国史研究会」において報告を行った。そこでは、ブルゴーニュ家の君主による臨時課税の増加が、シャテルニーと都市の対立を引き起こして、彼らパルティキュラリスム側の連帯を掘り崩したという見通しを提示した。本研究は、中世末期のフランドル代表制活動を農村地区(シャテルニー)を中心に分析することによって、この時期における低地(ネーデルランド)の地方自立主義(パルティキュラリスム)的な構造を、より明確で具体的な形で提示することを目的としてきた。本年度は、計画初年度であり、まず、代表制活動における農村地区の位置づけを概観するために、多くの農村地区の中でも最も顕著な役割を担っていた「ブルフセ・フレイエ」について、中世中期に遡るこの地区組織の形成と発展、及びフランドル伯領全体の代表制集会「四者会議」におけるこの地区と大都市との関係を分析した。その結果、主として、1.ブルフセ・フレイエは農村地区でありながらフランドル代表制において大都市と並ぶ地位を獲得したが、その背景では、この地区の沿岸湿地の開拓の中で組織された自由人裁判共同体の機関(シャテルニー参審人団)が司法・行政的に都市の自治機関と同じ権限を整備していったということが重要である。2.大都市と並んで「四者会議」に参加したブルフセ・フレイエは、しかし、会議の一翼をなす都市ブリュッヘとの利害対立を抱え、15世紀初頭には毛織物業をめぐって大規模な紛争に至るが、政治的地位を元に農村としては異例の自己主張を通すことが出来た、ということを明らかにし、雑誌論文としてまとめた。これによって、次年度以降、15世紀中期の都市と農村地区の対立局面を分析する上で、重要な手がかりが得られた。なお、この分析のため、国内では未所蔵の資史料を収集する必要があり、また次年度に予定する研究の準備も兼ねて、8月から9月にかけてベルギー国ヘント大学を拠点に調査旅行を行った。本研究は、中世末期のフランドル代表制活動を、これまであまり注目されてこなかった農村地区(シャテルニー)を中心に分析することによって、この時期、すなわちブルゴーニュ家の政治的統合の時期における低地(ネーデルランド)の地方自立主義(パルティキュラリスム)的な構造を、より明確で具体的な形で提示することを目的としている。計画第二年度である今年度は、フランドル農村地区の中で最も顕著な役割を果たした「ブルフセ・フレイエ」について前年度に行った概観をもとに、より詳細にフランドルの都市と農村の関係を考察するため、14世紀末から15世紀中期までのブルフセ・フレイエと都市ブリュッヘの対立を前者の観点から捉えなおすことに焦点を絞り、未刊行史料の調査に着手した。9月以降ベルギー国ヘント大学を拠点に、同大学の研究者から示唆を受けながら、ブルフセ・フレイエ関係史料として最も重要なシャテルニー会計簿(ブリュッセル国立総合文書館およびブリュッへ国立文書館所蔵)の分析を進めているところである。同史料は代表制研究の観点からみると、シャテルニーにおける会合の形態・参加者についてのみならず、シャテルニー行政自体の運営のあり方、都市との対立の諸原因と対立の経緯についても多くの貴重な情報を含んでいるため、中世末期のフランドル代表制においては都市だけではなく農村地区も積極的に活動を展開しており、両者が多様な関係を取り結んでいたこと、また、この時期に進展していくブルゴーニュ家による低地の中央集権化と都市・農村関係の変化とが相互に影響を及ぼしあっていたことを明らかにできるであろう。

その際、シャテルニーの中で最も政治的に顕著な役割を果たし、大都市とも並ぶ特権的な地位を得た「ブルフセ・フレイエ」の統治機関であり代表制活動の担い手である参審人団の構成と活動に分析対象を絞り、前年度2004年9月から本年度2005年8月末まで、ベルギー王国ヘント大学を拠点に、関係未刊行史料、とりわけシャテルニー会計簿(ブリュッセル国立総合文書館およびブリュッヘ国立文書館所蔵)の調査を行った。ブルフセ・フレイエの参審人団の人的構成については、現在、ヘント大学で進行中のフランドル・エリートのプロソポグラフィー研究計画との協力のもとに解明を進め、その成果の一部(14世紀末-15世紀中葉)については、史学会第103回大会西洋史部会(2005年11月東京)において報告を行った。この時の質疑を参考に大幅な加筆を施した論文を準備中である。また、研究の中心としたシャテルニー会計簿について、史料論的問題を研究ノートとしてまとめた(2006年3月刊行予定)。さらに、ブルフセ・フレイエの参審人団と諸都市の紛争について、「14-15世紀フランドルのシャテルニーと都市」と題し、2006年3月「構造史研究会」および「ブルゴーニュ公国史研究会」において報告を行った。そこでは、ブルゴーニュ家の君主による臨時課税の増加が、シャテルニーと都市の対立を引き起こして、彼らパルティキュラリスム側の連帯を掘り崩したという見通しを提示した。
造血幹細胞ニッチとしての巨核球の機能の解明

本研究では造血幹細胞の恒常性維持において巨核球が果たす機能とその分子機構を解明することを目的とする。本年度は巨核球が造血幹細胞ニッチとして機能を発揮するうえでCLEC-2とその下流シグナルが必要であり、特に各種のニッチシグナル、とりわけトロンボポエチンの発現を介して造血幹細胞を維持している可能性が示唆された。昨年度の造血幹細胞機能維持に巨核球が必要である知見と合わせると、新しい造血幹細胞のニッチとして幹細胞由来の分化血球である巨核球が重要な役割を果たしていると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はまず骨髄における造血幹細胞と巨核球の空間的近接度に関しての解析を行い、造血幹細胞と巨核球は統計学的に有意に接近して存在することを確認した。また、培養で誘導した巨核球や骨髄から直接単離した巨核球が各種の造血幹細胞ニッチ因子を発現していることを確認した。以上のことから造血幹細胞ニッチとして巨核球は機能しうると考えられる。計画通り巨核球分化に伴って発現が上昇するCLEC-2がこれらの形質に貢献しうるかの解析を巨核球・血小板特異的CLEC-2欠損マウスを用いて開始しており、来年度には報告できる予定である。計画通り造血幹細胞ニッチとして巨核球が機能することを支持するデータを得ており、CLEC-2ノックアウトマウスをはじめとした動物モデルを用いた分子遺伝学的解析も順調に開始できているため。誘導的巨核球欠損マウスを用いた巨核球ニッチの機能の検証と、巨核球が分泌するサイトカインセットが果たす役割のin vitroの解析を組み合わせることで確証を得ながら研究推進を図る。
座骨神経血流の神経性調節機構に関する研究

麻酔、人工呼吸下のラットを用いて坐骨神経血流のレーザードップラー法で記録し、坐骨神経血流調節について次の二点を明らかにした。1.坐骨神経血流調節に関与する神経線維の種類および起始部を同定した。第11胸髄第1腰髄前根刺激により、坐骨神経血流は一過性の血圧上昇反応に伴い増加したのち減少した。血流減少反応は、ノルアドレナリン作動性交感神経による血管収縮の結果であった。第6腰髄前根刺激により、血圧反応とは関係なく座骨神経血流は増加した。この血流増加反応は、コリン作動性ムスカリン受容体遮断薬のアトロピン静脈内投与により消失した。第3腰髄第1仙髄後根刺激により、血圧変化を伴わずに坐骨神経血流は増加した。この血流増加反応は、CGRP受容体拮抗薬の局所投与により消失した。以上の結果から、坐骨神経血流は、第11胸髄第1腰髄の前根から出る交感神経血管収縮神経、第6腰髄の前根から出る副交感神経血管拡張神経、第3腰髄第1仙髄の後根に入るCGPR含有求心性神経血管拡張神経、により支配されていることが分かった。2.皮膚や筋への体性感覚刺激が、軸索反射性機序により坐骨神経局所血流を調節することを明らかにした。ラットの腰仙髄に入出力する後根および前根を切断して、中枢神経系を介する反応が起こらない状態で実験を行った。大腿内側部の皮膚に分布する伏在神経の切断中枢端に電気刺激を加えると、血圧の変化を伴わずに坐骨神経血流が増加した。この血流増加反応はCGRP受容体拮抗薬の局所投与により消失した。このことから、坐骨神経血管支配神経の中に含まれるCGRP含有求心性神経は、伏在神経にも軸索側枝を伸ばし、この求心性神経の軸索反射性調節により、坐骨神経血管を拡張させて坐骨神経血流を増加させることが分かった。ハロセン麻酔、人工呼吸下のラットを用いて、坐骨神経の血流をレーザードップラー法で記録し、坐骨神経内血管に対する交感および副交感神経性調節と体性神経の逆行性調節を調べる目的で、第11胸髄第2仙髄前根および後根の電気刺激を行った。その結果、以下の点が明らかになった。1.第11胸髄から第1腰髄の前根の電気刺激では、刺激開始後、すぐに血圧上昇が起こり、血圧上昇に伴って坐骨神経血流の増加がみられた後、神経血流は減少した。2.第6腰髄前根の電気刺激では、血圧の変動とは関係なく坐骨神経血流は増加した。この坐骨神経の血流増加反応はアセチルコリンのムスカリン受容体遮断薬であるアトロピンの投与により消失した。3.第3腰髄から第1仙髄の後根の電気刺激では、血圧の反応とは関係なく、坐骨神経血流は増加した。この後根刺激による坐骨神経血流の増加反応は、10秒間の電気刺激にもかかわらず数分間も持続した。この後根刺激による坐骨神経血流の増加反応は、サブスタンスP拮抗薬の影響は受けなかったが、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の拮抗薬の局所投与により消失した。

4.以上の結果より、坐骨神経の血管は、第11胸髄から第1腰髄から起始する交感神経により血管収縮性に、第6腰髄から起始する副交感神経によりコリン作動性血管拡張性に、第3腰髄から第1仙髄に入力する求心性神経の逆行性興奮によりCGRP作動性血管拡張性に支配されていることがわかった。麻酔、人工呼吸下のラットを用いて坐骨神経血流をレーザードップラー法で記録し、坐骨神経血流調節について次の二点を明らかにした。1.坐骨神経血流調節に関与する神経線維の種類および起始部を同定した。第11胸髄第1腰髄前根刺激により、坐骨神経血流は一過性の血圧上昇反応に伴い増加したのち減少した。血流減少反応は、ノルアドレナリン作動性交換神経による血管収縮の結果であった。第6腰髄前根刺激により、血圧反応とは関係なく坐骨神経血流は増加した。この血流増加反応は、コリン作動性ムスカリン受容体遮断薬のアトロピン静脈内投与により消失した。第3腰髄第1仙髄後根刺激により、血圧変化を伴わずに坐骨神経血流は増加した。この血流増加反応は、CGRP受容体拮抗薬の局所投与により消失した。以上の結果から、坐骨神経血流は、第11胸髄第1腰髄の前根から出る交感神経血管収縮神経、第6腰髄の前根から出る副交感神経血管拡張神経、第3腰髄第1仙髄の後根に入るCGRP含有求心性神経血管拡張神経、により支配されていることが分かった。2.皮膚や筋への体性感覚刺激が、軸索反射性機序により坐骨神経局所血流を調節することを明らかにした。ラットの腰仙髄に入出力する後根および前根を切断して、中枢神経系を介する反応が起こらない状態で実験を行った。大腿内側部の皮膚に分布する伏在神経の切断中枢端に電気刺激を加えると、血圧の変化を伴わずに坐骨神経血流が増加した。この血流増加反応はCGRP受容体拮抗薬の局所投与により消失した。このことから、坐骨神経血管支配神経の中に含まれるCGRP含有求心性神経は、伏在神経にも軸索側枝を伸ばし、この求心性神経の軸索反射性調節により、坐骨神経血管を拡張させて坐骨神経血流を増加させることが分かった。
細胞融合における極性形成機構の解明

筋芽細胞は細胞間で融合し、極性的な細胞伸長を経て、細長い多核の細胞融合体(筋管)を形成する。しかし、筋管形成を司る分子機構は不明である。筋管形成の過程において、細胞膜内層に通常局在するリン脂質ホスファチジルセリン(PS)が一過的に細胞膜外層に表出し、細胞融合を促進する働きをする。前年度において、PSの細胞膜内外層の非対称性の維持および筋管の形態形成に必須なリン脂質フリッパーゼとして、ATP11A/CDC50A複合体を同定した。また、リン脂質フリッパーゼ依存的に筋管形態を制御する因子として機械受容イオンチャネルPIEZO1を同定した。本年度は、生理的な細胞過程におけるリン脂質フリッパーゼとPIEZO1の機能連関について解析した。マウス筋芽細胞株C2C12およびヒト初代筋芽細胞を用いて、経時的な顕微鏡観察および生化学的な解析を行った。筋管形成時の一過的なPS表出とほぼ同時期に活性化されるカスパーゼによって、リン脂質フリッパーゼ複合体の主要ユニットのATP11Aが分解されることが分かった。さらには、PSの局在観察とカルシウム動態の同時計測により、PSを表出する筋芽細胞においてのみ、PIEZO1を介したカルシウム流入が顕著に阻害されることを観測した。今回の研究結果から、筋管形成の過程において、PSが細胞膜外層に表出する際にPIEZO1の活性化は一過的に抑制される状態になるが、リン脂質フリッパーゼがPSを細胞膜内層に局在化させることでPIEZO1は再び活性化可能な状態に戻るという一連の現象を明らかにした。以上から、「リン脂質フリッパーゼ依存的な細胞膜PSの非対称分布がPIEZO1の機能を巧みに制御することで、正しい筋管の形態形成をもたらす」という知見を得た。本研究に関する論文をNature communicationsに発表した。29年度が最終年度であるため、記入しない。細胞融合は生物の個体形成時に広く見出される生命現象である。しかし細胞膜融合の根幹である膜脂質再編成の機構、また細胞融合を経て固有の形態へと至る仕組みは不明である。そこで膜脂質の挙動と細胞動態の相関に焦点を当て、細胞膜二重層の内層にリン脂質を非対称に分布させるリン脂質フリッパーゼに着目した。細胞膜融合および細胞極性形成の機構の解明を目指して、リン脂質フリッパーゼを中心とした膜脂質環境、およびリン脂質フリッパーゼに依存して機能する因子を解析した。筋芽細胞C2C12の細胞融合による筋管形成において、リン脂質フリッパーゼの主要ユニットP4-ATPaseと補助ユニットCDC50について、遺伝子発現量解析、共免疫沈降実験、遺伝子欠損解析を行った。リン脂質フリッパーゼ複合体を形成するATP11AとCDC50Aの欠損により、過剰な細胞融合および筋管特有の極性的な細胞伸長の阻害が誘導されるとともに、細胞膜内層に通常局在するリン脂質のホスファチジルセリン(PS)が細胞膜外層へ表出した。リン脂質フリッパーゼ欠損による筋管の形成阻害の原因を解析するために、同様な表現型を示す因子を探索した。細胞膜に局在する機械受容チャネルPIEZO1を欠損する細胞は、リン脂質フリッパーゼ欠損細胞に類似する細胞融合の昂進と極性伸長の阻害を示した。リン脂質フリッパーゼとPIEZO1チャネルの機能連関が示唆されたため、ATP11AおよびCDC50A欠損細胞についてPIEZO1のチャネル活性を解析した。PIEZO1活性化剤により誘起されるカルシウム流入は、リン脂質フリッパーゼ欠損細胞で顕著に抑制された。さらにリゾPSを細胞外液に添加すると、野生型細胞のPIEZO1チャネル活性は低下した。以上から、リン脂質フリッパーゼを介した細胞膜PSの非対称分布がPIEZO1チャネルの機能および筋管形成を制御するという機構が示唆された。本年度は、リン脂質フリッパーゼに依存して機能する新規因子として機械受容イオンチャネルPIEZO1の同定に成功した。PIEZO1活性化剤により誘導されるカルシウムイオンの細胞内流入は、リン脂質フリッパーゼの欠損およびリゾホスファチジルセリンの添加によって抑制されることを明らかにした。筋芽細胞の細胞融合による筋管形成モデルにおいて、リン脂質フリッパーゼとPIEZO1チャネルの機能的連関が細胞融合の制御および細胞形態の調節に重要な役割を担うことを示した。これらの研究成果について、学術雑誌および学会で発表した。以上から、本研究は順調に進展していると判断した。

筋管形成時の一過的なPS表出とほぼ同時期に活性化されるカスパーゼによって、リン脂質フリッパーゼ複合体の主要ユニットのATP11Aが分解されることが分かった。さらには、PSの局在観察とカルシウム動態の同時計測により、PSを表出する筋芽細胞においてのみ、PIEZO1を介したカルシウム流入が顕著に阻害されることを観測した。今回の研究結果から、筋管形成の過程において、PSが細胞膜外層に表出する際にPIEZO1の活性化は一過的に抑制される状態になるが、リン脂質フリッパーゼがPSを細胞膜内層に局在化させることでPIEZO1は再び活性化可能な状態に戻るという一連の現象を明らかにした。以上から、「リン脂質フリッパーゼ依存的な細胞膜PSの非対称分布がPIEZO1の機能を巧みに制御することで、正しい筋管の形態形成をもたらす」という知見を得た。本研究に関する論文をNature communicationsに発表した。細胞膜リン脂質によるPIEZO1のチャネル機能への影響を詳細に解析する。筋管形成におけるPIEZO1を介した細胞内シグナル伝達系を解析し、細胞融合および細胞極性形成との関連を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。