hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HTLV-1母子感染の総括

日野,辻,片峰らは,長崎で年間15,000例の妊婦の抗体検査を継続して行っている.抗体陽性率は4-5%で,未だ明らかな減少傾向はみられない.長期母乳栄養児の感染率約17%に対して,人工栄養児の感染率は,約3%だった.臍帯血の検査から,人工栄養児の感染の大部分は少なくとも子宮内感染ではなさそうに見えた.1987年に高抗体価妊婦は,感染を起こしやすいと報告したが,米国との合成ペプチドを用いた共同研究により,母乳哺育群では高env抗体価は感染と相関し,人工栄養群では高抗体価は非感染と相関した(投稿準備中).このことは,三好らの抗体分画による感染防御動物実験と一致する.日野らは,高感度半定量PCRによって,抗HTLV-1抗体価とPCRによる感染細胞数が非常によく相関すること(r>0.8)を見つけた(投稿中).三好らは,HTLV-1感染日本人より及びHTLV-2感染米国人より精製したIgGを注射したウサギに,それぞれメラネシア株HTLV-1に感染した細胞,HTLV-2に感染した細胞を24時間後に与え,感染防御能を観察した.一條らは,抗HTLV-1抗体の感染阻止能をin vitroで検査した.XC細胞融合阻止反応では,HTLV-1感染に有効なのは抗env^<175-199>に対する抗体であったが,キャリアのPBL培養による抗原発現阻止では,抗p19^<100-130>が有効であることがわかった.永田らは,過去23,000例の妊婦調査を行い,抗体陽性5.5%であった.これら小児の追跡により,人工栄養5.8(6.7)%,短期母乳栄養3.4(4.2)%,長期母乳栄養25(14)%の結果を得ている(括弧内は後方視).人工栄養と短期母乳栄養に有意差はなかったが,長期母乳栄養では有為に感染率が高かった.武(班友)らは,母親の感染経路を詳細な個別調査によって行い,51/246(約20%)が性交による感染であると考えた.日野,辻,片峰らは,長崎で年間15,000例の妊婦の抗体検査を継続して行っている.抗体陽性率は4-5%で,未だ明らかな減少傾向はみられない.長期母乳栄養児の感染率約17%に対して,人工栄養児の感染率は,約3%だった.臍帯血の検査から,人工栄養児の感染の大部分は少なくとも子宮内感染ではなさそうに見えた.1987年に高抗体価妊婦は,感染を起こしやすいと報告したが,米国との合成ペプチドを用いた共同研究により,母乳哺育群では高env抗体価は感染と相関し,人工栄養群では高抗体価は非感染と相関した(投稿準備中).このことは,三好らの抗体分画による感染防御動物実験と一致する.日野らは,高感度半定量PCRによって,抗HTLV-1抗体価とPCRによる感染細胞数が非常によく相関すること(r>0.8)を見つけた(投稿中).三好らは,HTLV-1感染日本人より及びHTLV-2感染米国人より精製したIgGを注射したウサギに,それぞれメラネシア株HTLV-1に感染した細胞,HTLV-2に感染した細胞を24時間後に与え,感染防御能を観察した.一條らは,抗HTLV-1抗体の感染阻止能をin vitroで検査した.XC細胞融合阻止反応では,HTLV-1感染に有効なのは抗env^<175-199>に対する抗体であったが,キャリアのPBL培養による抗原発現阻止では,抗p19^<100-130>が有効であることがわかった.永田らは,過去23,000例の妊婦調査を行い,抗体陽性5.5%であった.これら小児の追跡により,人工栄養5.8(6.7)%,短期母乳栄養3.4(4.2)%,長期母乳栄養25(14)%の結果を得ている(括弧内は後方視).人工栄養と短期母乳栄養に有意差はなかったが,長期母乳栄養では有為に感染率が高かった.武(班友)らは,母親の感染経路を詳細な個別調査によって行い,51/246(約20%)が性交による感染であると考えた.
新しい神経伝達制御因子・2-アラキドノイルグリセロールの生理的役割の解明

今回の研究により以下の点を明らかにした。1.NG108-15細胞を高カリウム溶液で刺激して脱分極させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を、2-アラキドノイルグリセロールが強く抑制することを明らかにした。同様の抑制は電位依存性カルシウムチャンネル(N型ないしQ型)の阻害剤でも観察されることから、2-アラキドノイルグリセロールは電位依存性カルシウムチャンネル(N型ないしQ型)を抑制していることが考えられた。電位依存性カルシウムチャンネルの活性化は神経伝達物質の放出に必須であることから、2-アラキドノイルグリセロールには神経伝達物質の放出を制御するという役割のある可能性がある。2.2-アラキドノイルグリセロールを蛍光誘導体に変換し、逆相HPLCで分析する方法を確立した。3.この方法を用いて、ラット脳に含まれるモノアシルグリセロールを詳しく調べ、2-アラキドノイルグリセロールが最も主要な分子種であることを明らかにした。4.脳ホモジネートをカルシウムの存在下インキュベートすると2-アラキドノイルグリセロールが大量に生成することを見い出した。2-アラキドノイルグリセロールは細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に伴って生成する可能性がある。
シナプス接着蛋白Ｃａｄｍ１の自閉性障害変異導入マウスにおける分子病態の解析

自閉性障害患者は年々増加傾向にあるといわれている。自閉性障害は、脳発達障害であり、遺伝及び環境要因が関与し、分子病態の把握は難しい。原因候補遺伝子の多くは、脳で機能しており脳内で蛋白質複合体形成やシグナル伝達に影響する可能性が強く考えられる。本研究では、自閉性障害の分子病態の解明を目指し、これまで見出してきた候補遺伝子のひとつであるCADM1に注目し、複数のCadm1遺伝子改変マウスを用いて、Cadm1蛋白質複合体の形成及び局在の変化を可視化し、変異の影響を解析した。その結果、Cadm1変異蛋白質は、一部がシナプスに局在せず、神経細胞の成熟、Cadm1複合体の形成に影響を及ぼしていた。自閉性障害は、脳発達障害であり、遺伝子の関与が示唆されている。しかしながら、原因候補とされる遺伝子が多く存在し、それらの統一的見解が未だ見出せていない。そこでこれまで見出してきた候補遺伝子のひとつであるCADM1遺伝子改変マウスおよび自閉症状が多く見られる結節性硬化症の原因遺伝子TSC1遺伝子改変マウスを用いて、自閉性障害と小胞体ストレス、小胞体ストレスによる膜輸送障害について解析することを目的としている。Cadm1C末端の結合蛋白であるmulti-PDZ蛋白Mupp1のPDZ領域をリガンドとしたPull-down法を行い、複合体形成するシナプス受容体について解析したところ、これまで知られている分子以外の存在が明らかとなった。今後自閉性障害でのCadm1の変異の存在が、複合体に及ぼす影響(複合体形成不全)について調べる。昨年度に行ったCadm1(Y251S)-ノックイン(KI)マウスの行動については、B6へのバッククロス後に再解析を行った。その結果、WTと比較し、KIマウスの社会行動性に障害が見られ、近年、自閉性障害の指標とされている超音波音声にも違いが見られた。また、Cadm1-KIマウスと、昨年度作製したCadm1プロモーターの制御下でのGFPを発現させたトランスジェニックマウスとの交配によるCadm1陽性の神経回路網の可視化では、神経の成熟に問題があることが示された。自閉性障害への小胞体ストレスの影響を脳・神経細胞での可視化するために、Cadm1-KIマウスとTSC-1/TSC-2を欠失したノックアウト(KO)マウスとの交配を進めており、マウス超音波音声に違いが見られた。次年度に遺伝型の異なるマウスを用いた組織学的および細胞学的解析を行う。脳発達障害である自閉性障害は、遺伝的要因および環境要因が関与しており、その包括な分子病態の把握は困難である。これまで、我々は、自閉性障害患者に見出した変異CADM1のIn vitro培養系での解析とCadm1-KOマウスの解析から、変異CADM1がLoss-of-function加え、小胞体ストレス(Gain- of-function)を誘導することを明らかにしてきた。シナプス接着蛋白RA175(現在Cadm1と呼ばれている)は、シナプス形成に関与する接着蛋白であり、イムノグロブリンスーパーファミリーに属している。Cadm1の細胞内領域のC末端PDZ結合モチーフはシナプス前膜および後膜においてscaffold蛋白を介して様々なシナプス受容体、チャンネルと複合体を形成し、機能シナプスを形成すると考えられているものの、その複合体の構成蛋白および機能には不明な点が多く残されている。本研究は、作製したCadm1変異導入ノックイン(Y251S-KI)マウスを用いて、小胞体ストレスと分子病態との関係を解明することを目的とし、Cadm1C末端のPDZ結合領域を介する複合体(シナプス受容体、チャンネル)の形成および輸送の可視化により、変異の影響を解析する。本年度は、Cadm1変異KIマウスの行動解析を行い、社会性や繰り返し行動が現れた。しかしながら個体数及びC57BL6系統へのバッククロスが十分でなかったことから現在引き続き繁殖を行い、再度解析を行う。Cadm1変異KIおよびKOマウスの脳から分離した神経細胞を用いた解析では、シナプスマーカー等の特異抗体を用いた免疫染色法により両者ともにシナプス障害が起きていることが示唆された。また、Cadm1プロモーターの制御下でGFPの融合蛋白を発現させたトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。次年度にGFP標識-神経細胞を分離し解析する。自閉性障害は、遺伝要因が示唆される。今まで脳機能に関与する原因候補遺伝子が多く見出されているものの、一つの遺伝子に集約されず未だ統一的見解が存在しない。これまで、本研究では、Cadm1ノックイン(KI)マウスの行動解析により、社会行動性に障害や、近年自閉性障害の指標とされているマウス間の超音波音声にも違いを検出した。また、Cadm1がmulti-PDZ protein(MUPP1)が結合すること、そしてMUPP1のPDZ領域には様々な分子が結合して複合体を形成することを明らかにしてきた。本年度は、Cadm1KIマウス、Cadm1ノックアウト(KO)マウス、Cadm1-GFP-TgマウスおよびCadm1KI-GFP-Tgマウスの脳を用いて、自閉性障害と小胞体ストレスによる膜輸送障害とシナプス機能障害との関係を解析した。マウスから取り出したGFP陽性神経細胞における変異蛋白やシナプス受容体の膜輸送障害を可視化したところ、変異Cadm1蛋白の大部分は、シナプスに局在せず、細胞体に留まっていた。

これは培養細胞セルラインを用いた結果と一致しており、機能障害の中でLoss-of-functionだけでなく、Gain-of-functionの可能性がさらに示唆された。Cadm1変異が及ぼす複合体形成への影響については、in vitroにおいて野生型に比較し変異型の結合が弱い傾向が表れたものの、顕著な差を見出すことができなかったことから、実験条件の再検討が急がれる。また、昨年度の解析においてマウス超音波音声に違いが見られたCadm1KI/TSC-1-2KOマウス由来の様々な遺伝型の異なるマウス個体を用いた組織学的では、神経細胞の樹状突起の伸長およびシナプスに差が見られた。アメリカ疾病予防管理センターの統計等において年々増加傾向にあるといわれている自閉性障害は、遺伝的な要因と環境的な要因とが複雑に絡み合って引き起こされていると推測されている。現在に至るまで報告されてきた自閉性障害に関与が示唆される遺伝子および蛋白質は、多数存在し、それらのほとんどが脳、神経において機能している。これまでに我々が自閉性障害患者に見出してきた複数の遺伝子変異(Cadm1)についても同じように脳で機能しており、多数の候補遺伝子および蛋白質との複合体形成などによる関与の可能性が強く考えられることから、解析を行ってきた。本課題では、自閉性障害に関与するCadm1遺伝子改変マウス(Cadm1変異(Y251S)-導入マウス、Cadm1-欠損マウスおよびCadm1-GFP-Tgマウス)を用いて、自閉性障害におけるシナプス障害との関係を、Cadm1複合体形成不全と複合体の膜輸送障害の解析を通して観察を行った。Cadm1複合体の構成分子には、MPDZなどを含むPDZ領域を有する足場蛋白質が存在し、神経細胞上で、複数のシナプス関連分子との接点となっていることが明らかとなった。自閉性モデルマウスとして作成されたCadm1変異(Y251S)-導入マウスを用いたCadm1変異における複合体の影響についての解析では、昨年度から検討を重ねているが、培養細胞系への遺伝子導入による過剰発現と異なり、顕著な差が検出されなかった。Cadm1変異(Y251S)-導入マウスを用いた小胞体ストレスの検出についても微弱なシグナルの検出となり、解析方法の検討を急いでいる。自閉性障害患者は年々増加傾向にあるといわれている。自閉性障害は、脳発達障害であり、遺伝及び環境要因が関与し、分子病態の把握は難しい。原因候補遺伝子の多くは、脳で機能しており脳内で蛋白質複合体形成やシグナル伝達に影響する可能性が強く考えられる。本研究では、自閉性障害の分子病態の解明を目指し、これまで見出してきた候補遺伝子のひとつであるCADM1に注目し、複数のCadm1遺伝子改変マウスを用いて、Cadm1蛋白質複合体の形成及び局在の変化を可視化し、変異の影響を解析した。その結果、Cadm1変異蛋白質は、一部がシナプスに局在せず、神経細胞の成熟、Cadm1複合体の形成に影響を及ぼしていた。
肺癌浸潤部における癌細胞・宿主間質細胞相互応答に関わる遺伝子群の解析

肺癌の進展、特にこれまでの研究で明らかにしてきた活性型ゼラチナーゼの発現亢進を含め肺癌浸潤部局所での浸潤に有利な微小環境形成に関わる癌細胞・宿主間質細胞間応答において重要な役割を演ずる遺伝子群を明らかにすることを目的とし研究を遂行し、以下の成果を得た。3.生体内での癌組織における遺伝子発現を非侵襲的かつ機能的に推定する核医学的イメージング法の検討を行った。FDGやMIBIをプローブに用いたPETによる解析の有用性が示された。非小細胞性肺癌の進展に関わる遺伝子群の同定とその局在解析を目的に、前年度のc-DNAマクロアレイ法による遺伝子発現プロファイリング解析により選別された12種の新規遺伝子群の非小細胞性肺癌浸潤部組織における発現を、Taq Manプローブ法によるリアルタイムreverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)法(ABI社製Prizm7700により解析)を用い検証した。Membrane-type 1 matrix metalloproteinase(MT1-MMP)、MMP-3、Jagged-1、Jagged-2、Notch4遺伝子の浸潤性肺癌における発現亢進と、Ezrin(Villin2)遺伝子の非浸潤性肺癌(細気管支肺胞上皮癌)における発現亢進がリアルタイムRT-PCR法でも確認され、これら遺伝子群が非小細胞性肺癌浸潤部における癌細胞・宿主間質細胞間の相互応答に際して重要な役割を演じていることが示唆された。非小細胞性肺癌浸潤部の新鮮凍結切片の癌細胞部組織とその周囲の反応性間質細胞部組織を、Rnaseフリー下で、別々に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により収集し、Taq Manプローブ法ならびにサイバーグリーンプローブ法によるリアルタイムRT-PCR法による遺伝子発現の定量解析法を確立した。ハウスキーピング遺伝子であるG3PDH遺伝子の発現解析を終え、現在、上記の新規遺伝子群の浸潤部局所における細胞レベルでの定量的遺伝子発現解析を精力的に行っている。
近世南アジア海上交易品の調達過程における諸集団間関係の変化に関する史的研究

本研究課題は、近世日本で主に刀装の素材として用いられた熱帯アジア産の鮫皮について、その重要な産地であった南インド・コロマンデル海岸から主要消費地たる日本に至るまでの調達過程を、当時コロマンデル海岸と日本の双方に活動拠点をもっていたオランダ東インド会社の史料群を精査することにより明らかにすることを目指すものである。2018年度には、まず需要側の視点から見た鮫皮の産地および入手ルートの変化を明らかにするため、日本側の状況に関する情報を整理することから着手した。これと平行して、関連する刊行史料と最新の研究動向をフォローするための二次文献を整備した。本研究においてとくに重要な資料となるオランダ東インド会社史料のうち、17世紀後半から18世紀にかけてのコロマンデル海岸関連文書を中心に、ハーグの国立文書館をはじめとするオランダの図書館・文書館等において調査し、必要な文書類を主にデジタル・データのかたちで収集した。また、オランダにおいて2度の研究報告を実施して、海外の研究者と議論を交わし情報交換を行う機会を得た。当時のオランダ東インド会社はコロマンデル海岸各地に散らばる複数の商館をもっていたが、この間に調査・収集した資料・文献の分析解読を進めるなかで、鮫皮の調達における各商館の重要性には差異があったことが明らかとなった。また、コロマンデルと日本のみならず、交易および情報の中継地としてのバタフィアの重要性や他産地との関係性を考慮する必要が改めて確認された。研究実施計画に沿って資料調査を実施するとともに、諸資料の分析を進めて海外での研究報告も行うことができたため。2019年度はこれまでに入手した資料・文献の分析をさらに進める一方で、研究実施計画にしたがって資料調査を行う。初年度の進展状況からみて、2年目の研究計画を大幅に変更する必要はないと考えている。国際学会に参加するための旅費を他の資金(科研費に採択されなかった場合に備えて応募していた民間の研究者海外派遣助成)によって賄うことができたことにより、次年度使用額が発生した。当該助成金については、主として、初年度の調査実施によってその重要性が一層明らかとなったオランダでの追加調査とデジタル資料利用のために使用する計画である。
住宅一都市政策の公共的合理性の転換の研究

住宅政策はこれまでの階層別住宅供給体制から地域別住宅供給体制へと転換しつつある。この転換の様相を「室間の戦略」の観点から分析し、公共的合理性の諸相をあきらかにした。(i)階層別住宅供給体制での「合理性」は,配分の合理性であり,その公準は,自助と福祉である。住宅をベースとしてのこの合理性の限界は,高齢者住宅の問題にあらわれている。そこでは,一方は「自助」の限界に対して,「地域ネットワーク」による介護・介助への志向にみられる「ネットワーキング」の協同性があり、他方には,都市施設との有機的な連携としてのシニアハウジングがある。いずれも、住戸単位の供給をこえて、別種の"協御性"にむかってひらかれつつある。(ii)建築協定などにみられる「自己組織的合理性」は、その展開によって自己組織性の様々な困難につきあたっている。それは,建築自由の原則・所有権の自立と自己組織化との対立であり、注目すべきは、自己組織化の運動は、居住をベースとした新しい地域活動へと転態している。(iii)カンナーシティなど既存住宅地の更新は、室間の戦略が顕在化しにくく、そこには借地権などの既存の私的権利にはばまれている。最も注目すべきは、ここで、住民の合意をとりつけるべく、地域居住像の合理性が形成されねばならないということである。所有の個的性格が、地域単位への展開をさまたげているが、これまでの住宅供給体制の限界がここにあるのであり、依然として「生成する合理性」にむかって、政策的な隘路が存在する。(iv)の「操作的合理性」は、総合設計制度によって、都市計画的に(iii)の隘路を解消しようとしているが、地域の室間像が明示化されない。以上のように、転換の局面は、一方で、都市計画的な手法による全体化の論理による展開と,一方で,ネットワーキングなどの居住点をベースとした住戸単位から地域単位への展開によって進行しつつある。本研究は、住宅政策が都市政策にリンケ-ジする様相を、「空間の戦略」という観点から分析しようとするものである。ここにいう「空間」とは、物に囲われた部分のみならず、非物体的に物質性としての空間である。これによって、ダウンゾ-ニングの計画技術にみられるように、容積率の操作性を、空間の戦略の一つのフェイズとして分析しうるのである。このようにして、一方では、神戸市の住宅政策を極とし、他方で福山市の住宅政策をもうひとつの極とすると、リンケ-ジの様相に4つのフェイズが存在することが明らかになった。(i)住システムが量的供給を軸としている「合理性」,(ii)都市内部での住宅地域の空間の安定化を確保しようとする「合理性」,(iii)インナ-シティ問題のように、既成市街地再開発における「合理性」,(iv)「総合設計制度」の運用にみられる「合理性」である。(i)は、専ら、自助を福祉の配分の合理性が問題とされ、古典的な住宅政策の体系のなかで完結している。(ii)は、建築協定制度のように、住環境という公準のもとに、空間の安定化をはかる「合理性」であり、私的所有の自由と対立する側面をもつ。一般に、集合住宅施設は、この段階の「合理性」の闘争の場であり、これとの対応の上で問題化すると、個と全体との独特の関係性があらわれてくる。(iii)は、空間の流動化をはかる「合理性」であり、たとえば、不動産の証券化にみられる法技術が実体化しようとする局面であって、資本と土地の対立の場として「合理性」が構成される。(ii)よりも、公益性、公共性がとわれる。(iv)は、ダウンゾ-ニングもその一例であるが、空間の操作性によって、都市形質の形と可能性を構想するもので、ここでは、(i)・(ii)・(iii)の基本的な要素を組みかえて、住宅政策が都市政策となってくる。以上のフェイズが重要であり、これらの相互関連と独立性が分析されるのが、次年度の研究である。

最も注目すべきは、ここで、住民の合意をとりつけるべく、地域居住像の合理性が形成されねばならないということである。所有の個的性格が、地域単位への展開をさまたげているが、これまでの住宅供給体制の限界がここにあるのであり、依然として「生成する合理性」にむかって、政策的な隘路が存在する。(iv)の「操作的合理性」は、総合設計制度によって、都市計画的に(iii)の隘路を解消しようとしているが、地域の室間像が明示化されない。以上のように、転換の局面は、一方で、都市計画的な手法による全体化の論理による展開と,一方で,ネットワーキングなどの居住点をベースとした住戸単位から地域単位への展開によって進行しつつある。
象牙質接着システムの長期接着疲労耐久性評価法の確立

本年度実験の目的は,試作されたペースト/ペーストタイプ光硬化型グラスアイオノマーセメント(GIC)の有用性を調べるために,接着界面の形態学的観察ならびにCa分布,Fの歯質拡散性を計測するとともに,接着強さの測定を行った.実験材料には,レギュラー(FR-100)とフロー(FF-101)の2種類の光硬化型GIC、コントロールとして,粉/液タイプ光硬化型GICのFuji II LC(GC)と従来型GICのFuji Type II (GC)を用いた.接着界面の観察およびCa, Fの測定のために、各セメントを充填したウシ歯冠象牙質試料を37°C精製水中に1日保管後,アルゴンイオンエッチングを施し,EPMA-8705(Shimadzu)にて,接着界面のCaとFの点面分析を行った.剪断接着試験ではウシ歯冠部象牙質を#600の耐水研磨紙にて研磨し,接着面積をφ4.6mmに規定し,各歯面処理後に37°C精製水中に1日,1週,1ヶ月保管後インストロン型万能試験機にて,C.H.S.1mm/minで,剪断接着強さを算出した.接着界面の観察では,Fuji II LCに約1μm弱の明瞭な樹脂含浸層様構造物が観察されたのに対し,ペースト/ペーストタイプGICでは,明瞭な構造物は観察されないもののそれぞれ良好な接合状態を示した.象牙質へのFの平均拡散距離は,1週水中保管後で接着界面からFR-100で8.98μm, FF-101で8.53μmと,Fuji II LCの5.09μmを超える値が示された.ペースト/ペーストタイプGICの剪断接着強さは,粉/液タイプGICに比較し有意に高い値が示され,本材料の操作性及びぬれの良さによる優れた窩壁密着性が接着強さを上昇させる要因になっていることが考えられた.以上の結果から,新規2種ペースト/ペーメトタイプ光硬化型GICは,優れた歯質接着性,フッ化物(F)徐放性,操作性を有する修復材料であることが示された.歯科領域において用いる材料は"咬合"という繰り返し行われるストレス荷重下で微視的亀裂の発生と成長に始まり、巨視的な力学的条件依存の亀裂伝播を経て、最終不安定破壊に至る。一連の疲労破壊の挙動を呈する繰り返し応力に対する接着部の疲労耐久性から接着修復物の長期安定性を検討する目的で、本年度は抜去天然人歯を用い、通常臨床で遭遇するアブフラクションに対する歯頸部修復を想定したシミュレーション実験を行った。人工的くさび状欠損の形成;歯軸に対して45度に植立されたヒト下顎小臼歯の頬側咬頭に電気油圧式サーボ疲労試験機を用い、咀咽咬合をシミュレ-ションした最低応力(τ_<min>)、最大応力(τ_<max>)を一定とした繰り返し圧縮応力を負荷し、経時的な状態を咀嚼するため0回から1000万回までの任意負荷回数で毎時頬舌側の形態学的変化のレーザー顕微鏡による観察とレプリカを採得し電子顕微鏡にてさらに観察を行った。エナメル-セメント境においてセメント質最表層に網目状の亀裂の発生を認め、疲労回数の増加に伴い亀裂の増加、微細化が観察された。一方、象牙質表層ではsmear層の脱落、細管の開口が認められ、エナメル-象牙質境直下の象牙質に剥離上のへき開型の亀裂が観察された。本結果よりくさび状欠損の形成、拡大の一因として咬合が関与し引張り疲労応力により歯頸部に応力が集中しくさび状欠損を形成、あるいは進行させる可能性が示唆された。本年度実験の目的は、リン酸処理、セルフエッチングプライマーで処理した脱灰エナメル質に対し、光軸方向(Z方向)へ分解能を持ち、共焦点で画像表示が可能な走査型共焦点レーザー顕微鏡を用い、各種歯面処理剤の歯面の粗〓化による表面積増加程度を研削群と非研削群で比較、検討をした。新鮮ヒト抜去小臼歯の頬側面からエナメル/象牙質試片を切り出し、ポリッシングブラシで清掃後、超音波にて洗浄した非研削群と、鏡面研磨を行った研削群に分け、試料とした。レーザー顕微鏡で、3種歯面処理材を各業者指定処理時間施す前と後で画像取り込み、表面性状を3次元的に観察、任意3点で表面積測定を行ない、各処理群間で比較した。同時にSEM観察を行なった。表面処理には、リン酸エッチングとして35%および65%リン酸水溶液(P35,P65)、セルフエッチングプライマーとしてMega Bond Primer : SEを施した。処理後、リン酸処理群では精製水にて水洗後、乾燥し、セルフエツチングプライマーでは有機溶媒にてレジン成分を除去後、計測に供した。研削群、非研削群ともいずれの処理群においても表面性状の変化が認められ、処理前に比べ処理後のエナメル質表面積は増加した。研削群では処理後の輝度像において脱灰したエナメル表層に小柱が明瞭に観察され、P35>P65>SEの順に有意に高い(p<0.05)表面積増加率が示された。なかでもリン酸処理群では、セルフエッチングエッチングプライマーに比較し大きな表面積増加率を示した。非研削群ではP65がP35よりも有意差はないものの、高い表面積の増加を示し、またSEは最も小さな値であった。

レーザー顕微鏡を用いて各種酸処理により脱灰されたエナメル質を表面解析した結果、セルフエッチングプライマーよりもリン酸処理でより大きな表面積の増加が観察され、その有用性が示唆され、象牙質表面にも応用できるものと考えられた。本年度実験の目的は,試作されたペースト/ペーストタイプ光硬化型グラスアイオノマーセメント(GIC)の有用性を調べるために,接着界面の形態学的観察ならびにCa分布,Fの歯質拡散性を計測するとともに,接着強さの測定を行った.実験材料には,レギュラー(FR-100)とフロー(FF-101)の2種類の光硬化型GIC、コントロールとして,粉/液タイプ光硬化型GICのFuji II LC(GC)と従来型GICのFuji Type II (GC)を用いた.接着界面の観察およびCa, Fの測定のために、各セメントを充填したウシ歯冠象牙質試料を37°C精製水中に1日保管後,アルゴンイオンエッチングを施し,EPMA-8705(Shimadzu)にて,接着界面のCaとFの点面分析を行った.剪断接着試験ではウシ歯冠部象牙質を#600の耐水研磨紙にて研磨し,接着面積をφ4.6mmに規定し,各歯面処理後に37°C精製水中に1日,1週,1ヶ月保管後インストロン型万能試験機にて,C.H.S.1mm/minで,剪断接着強さを算出した.接着界面の観察では,Fuji II LCに約1μm弱の明瞭な樹脂含浸層様構造物が観察されたのに対し,ペースト/ペーストタイプGICでは,明瞭な構造物は観察されないもののそれぞれ良好な接合状態を示した.象牙質へのFの平均拡散距離は,1週水中保管後で接着界面からFR-100で8.98μm, FF-101で8.53μmと,Fuji II LCの5.09μmを超える値が示された.ペースト/ペーストタイプGICの剪断接着強さは,粉/液タイプGICに比較し有意に高い値が示され,本材料の操作性及びぬれの良さによる優れた窩壁密着性が接着強さを上昇させる要因になっていることが考えられた.以上の結果から,新規2種ペースト/ペーメトタイプ光硬化型GICは,優れた歯質接着性,フッ化物(F)徐放性,操作性を有する修復材料であることが示された.
KCNQ2遺伝子変異に起因する小児てんかんの病態解明

KCNQ2(電位依存性K+チャネルサブユニット)の遺伝子変異は新生児発症てんかんの原因として知られており,ある種のK+チャネルの機能低下を引き起こす。この疾患の発症時期は神経伝達物質γ-アミノ酪酸(GABA)が興奮性として働く時期と一致するため,GABAが疾患に関与する可能性がある。そこで患者から発見された変異と同様の遺伝子変異を持つマウスを作成し,海馬のGABA神経回路に関する電気生理学実験を行った。その結果GABA作動性神経細胞におけるK+チャネルの機能が遺伝子変異により低下し, GABA放出を亢進することを発見した。過剰なGABAは新生児発症てんかんに寄与すると考えられる。電位依存性カリウムイオンチャネルサブユニットKV7.2をコードする遺伝子KCNQ2の変異は良性家族性新生児けいれん(BFNE)および新生児てんかん性脳症(EIEE)を引き起こすことが知られている。これらの疾患は生後一週間以内に発症する新生児発症型てんかんである。神経伝達物質GABAは成熟した神経細胞では抑制性として働くが、新生児期には興奮性として働く。この興奮性は脳の発達にとって重要だが、バランスが破綻するとてんかんの原因になりうる。また、発達期の脳内では主に神経ネットワークの構築が行なわれており、カリウムチャネルは中枢神経のシナプス形成に重要な役割を果たしている可能性がある。KCNQ2遺伝子変異によって新生児期のGABA性神経ネットワークがどのように変化するかを明らかにするために、EIEE7、BFNE患者に見つかったKCNQ2遺伝子変異と同じ変異を持つノックインマウスを作成した。さらにこれらのマウスのGABA作動性神経細胞を生体下で特定するために、同神経細胞特異的にヴィーナス蛍光タンパクを発現するVGAT-Venusマウスと交配させた。これによりKcnq2遺伝子に変異を持ち、GABA作動性神経細胞特異的に蛍光を発するモデルマウスの作成に成功した。このマウスを使用して、生後1週齢マウス海馬のKcnq2 mRNAの発現量を調べたが、Kcnq2遺伝子変異によって発現量に差はなかった。一方、免疫組織化学染色の結果、生後1週齢の海馬CA1領域のほとんどすべての細胞にKV7.2が発現しており、GABA作動性神経細胞にも発現していることを確認した。そこで海馬の急性脳スライスを作成して電気生理学的にGABA作動性神経細胞の活動電位電流を調べたところ発火頻度が有意に増加していることを確認した。作成したモデルマウスを使用して引き続き計画に従い研究を行う。電位依存性カリウムチャネルサブユニットのひとつKV7.2(KCNQ2)をコードする遺伝子KCNQ2のミスセンス変異は良性家族性新生児けいれん(Benign Familial Neonatal Epilepsy; BFNE)および新生児てんかん性脳症7型(Early Infantile Neonatal encephalopathy type 7; EIEE7)を引き起こすことが知られている。これらの疾患は生後一週間以内に発病する特徴があり、遺伝氏変異型てんかんとして最も早い。一方で、神経伝達物質γーアミノ酪酸(GABA)は成熟した脳では抑制性として働くが、新生児期の未熟な神経細胞では興奮性として働く。この興奮性は脳の発達にとって重要だが、過剰な興奮はてんかんの原因になりうる。また、発達期の脳内では神経ネットワークの構築が行われており、カリウムチャネルは神経同士のシナプス形成に重要な役割を果たしている可能性がある。KCNQ2遺伝子変異によって新生児期のGABA性神経ネットワークがどのように影響を受けるかを明らかにするために、BFNE、EIEE7患者に見つかったものと同様の遺伝子変異を持つノックインマウスを作成した。さらにこれらのマウスのGABA作動性神経細胞を生理学的条件下で同定するために、同神経細胞特異的にヴィーナス蛍光タンパクを発現するVGAT-Venusマウスと交配させた。これによりKcnq2遺伝子変異を持ち、GABA作動性神経細胞特異的に蛍光を発するモデルマウスの作成に成功した。このマウスを用いてKCNQ2遺伝子変異による新生児期のGABA性ネットワーク構築とKcnq2遺伝子変異の関連性を調べる。Kcnq2遺伝子変異型M-チャネルのポア付近の3次元モデルを作成し正常型と比較した。GABA作動性神経細胞のM-channelの機能低下を明らかにした。同細胞の自発的活動電位電流の頻度が増加していることを明らかにした。錐体細胞におけるGABA性シナプス後電流の頻度が増加していることを明らかにした。上記は当初の計画通り進行している。しかし、3次元モデル作成ソフトウェアによるモデルには有意な構造変化が見えず、リース期限が来たため、この部分の研究よりも動物実験を優先した。KCNQ2

遺伝子変異によって新生児期のGABA性神経ネットワークがどのように影響を受けるかを明らかにするために、BFNE、EIEE7患者に見つかったものと同様の遺伝子変異を持つノックインマウスを作成した。さらにこれらのマウスのGABA作動性神経細胞を生理学的条件下で同定するために、同神経細胞特異的にヴィーナス蛍光タンパクを発現するVGAT-Venusマウスと交配させた。これによりKcnq2遺伝子変異を持ち、GABA作動性神経細胞特異的に蛍光を発するモデルマウスの作成に成功した。このマウスを用いてKCNQ2遺伝子変異による新生児期のGABA性ネットワーク構築とKcnq2遺伝子変異の関連性を調べる。新所属先動物施設へのマウスの移送が完了し、交配に成功した。昨年度における研究結果でKcnq2遺伝子変異マウスの海馬CA1領域錐体細胞におけるGABA性シナプス後電流の頻度が増加していることを明らかにし、また幼若期の同細胞においてGABAが興奮性であることを電気生理学的に示すことに成功したので、これらが「てんかん発作」に寄与しうるか確認した。Kcnq2遺伝子変異マウスの海馬急性脳スライスに対する細胞外電気記録を行い、CA1領域において無Mg2+および低Ca2+組成の人工脳脊髄液を使用することで「てんかん様発作」の誘導に成功した。さらにGABAA受容体アンタゴニストによる「てんかん様発作」の持続時間の短縮を確認した。同組成の人工脳脊髄液では野生型のマウスにおいててんかん様発作は見られなかった。これまで得られた実験データの解析を行い、これらをまとめた。電位依存性カリウムイオンチャネルサブユニットをコードするKCNQ2遺伝子変異は新生児発症てんかん(良性家族性新生児けいれんおよび新生児てんかん性脳症7型)の原因として知られており,KCNQ2が構成するM-channelの機能低下による神経細胞の過剰興奮が疾患に関与していると考えられてきた。これらの疾患は生後一週間以内に発症する特徴があり、遺伝子変異型てんかん症として最も早くに発病する。一方で、神経伝達物質γーアミノ酪酸(GABA)は成熟した脳では抑制性神経伝達物質として働くが、新生児期の未熟な神経細胞では興奮性として働く。この興奮性は脳の発達にとって重要だが、過剰な興奮は転換の原因になりうる。また、発達期の脳内では神経ネットワークの構築が行われており、カリウムイオンチャネルは神経同士のシナプス形成に重要な役割を果たしている可能性がある。KCNQ2遺伝子変異により新生児期のGABA性神経回路がどのように影響を受けるかを明らかにするために、良性家族性新生児けいれん患者にみつかったものと同様の遺伝子変異を持つノックインマウスを作成した。
尿路感染症を引き起こす大腸菌(E.coli)の簡易迅速検査法の開発

1.PCR法による病原因子遺伝子の分布解析2.発現レベルでのType1 piliの迅速検査法の検討Type1 piliを尿から直接検出することで大腸菌による尿路感染症を迅速に検査する方法を検討した。Type1 piliのreceptorは膀胱の上皮細胞上に広く分布するmannoseであることがわかっている。そこでmannose残基を表面にもつモルモット赤血球と大腸菌との凝集反応を、実際の尿路感染症患者尿および健常者尿を直接検体に用いて検討した。その結果、培養検査との比較から感度85.7%、特異性56.1%であり、今回検討の方法では偽陽性率が高く、このままでは実際に臨床応用することは困難であると考えられた。これは赤血球表面に多数存在する糖鎖やタンパク質の影響を受けたためと推察された。現在、mannoseをコーティングしたラテックス粒子を用い、mannose以外の因子の影響を受けないような凝集反応を考案中である。
プロテアソーム構築中間体に着目したタンパク質分解装置の全体構造の解明

本研究はタンパク質分解酵素複合体である26Sプロテアソームの構造解析を行い、その機能を明らかにするものである。本年度は、複合体を形成するサブユニットとシャペロンの組み合わせをもとに、Hsm3とRpt1のC末端ドメインの共発現系を構築し安定な複合体を得た。まず、Hsm3単独構造を2.0Å分解能で決定し、Hsm3が11のHEATリピートからなるC字型の構造をとることを明らかにした。次にHsm3-Rpt1C複合体構造を、3.8Å分解能のデータにメチオニンマーキング法を応用することにより決定した。この結果、Hsm3のC字型構造の中央部分にRpt1Cは結合することが明らかとなった。本複合体構造と、Rptサブユニットと同じくAAA ATPaseファミリーに属し、すでに構造決定されているHslUの六量体リング構造を用いて、Hsm3とRptリング(Rpt1-6の六量体リング)構造の結合モデルを作製した。このモデルからHsm3がRpt1と結合するとともにRpt2とも相互作用することを明らかにした。本研究結果からHsm3がRpt1とRpt2の相対的な位置を決定するシャペロンであることが示された。また昨年度に引き続き20Sプロテアソームのαリングを構成する7種のαサブユニットと、αリング形成を補助するシャペロンPba3/4共存下における形成中間体解析を行った。この結果、新たにβ2及びβ3サブユニットの共存によりαリングを含む中間体及びさらに分子量の大きな複合体の形成量が増加することを確認した。αリング複合体は、二次元電気泳動により、すべてのαサブユニットと、β2、β3及びPba3/4が含まれていることを確認できた。本研究結果より、各αサブユニットとαリングは平衡状態を取っており、Pba3/4がαサブユニットの正しい配置を補助し、βサブユニットがこれを固定していることが示唆された。本研究は、タンパク質分解酵素複合体である26Sプロテアソームの構造解析を行い、その機能を明らかにすることを目指している。本年度は、プロテアソーム専用シャペロンとプロテアソームサブユニットから成る複合体を作製し、サブ複合体の安定化条件の検討を行ってきた。しかし、19S制御複合体のサブユニット単独の精製及び安定化が困難であることから、これらのより安定な精製方法の確立に取り組むとともに、プロテアソームのアッセンブリー原理を探索するために、すでに発現系が構築されている7種類のαサブユニットを用いて、αリング形成機構の解析を行った。立体構造が類似した7つのαサブユニットは各々が特定の位置に厳密に配置して、プロテアソームαリングを形成するが、その分子集合機構は明らかでない。また単独では不安定なサブユニットが安定化される仕組みも不明である。そこでまずαサブユニット集合を補助するシャペロン分子に着目し、αリング構築機構の解析を行った。また、7つのαサブユニットを混合することで形成される中間体を捉え、安定なサブ複合体形成条件の探索を行った。シャペロン分子を用いた安定な複合体形成を試みた結果、専用シャペロンPba3/4がα4とα5サブユニットの間の相互作用を強化することでαリング形成を補助していることを明らかにした。Pba4とα4の相互作用界面に位置する残基はα4に特異的であり、Pba4がα4を認識することによりα5との結合が強化されていると考えられる。さらに、各サブユニットを混合したαリング再構成実験の結果から、α4、α5以外のαサブユニットはその大部分がαサブユニット複合体を形成していないことが示された。つまりα4、α5以外のサブユニットは、単独の状態とリングを形成した状態の平衡にあるものと考えられる。

本研究結果より、各αサブユニットとαリングは平衡状態を取っており、Pba3/4がαサブユニットの正しい配置を補助し、βサブユニットがこれを固定していることが示唆された。
日本中世政治・社会・軍事史料の国際的情報化の研究

Ron外国人特別研究員(COE)の研究業績について報告する。1.研究分担者Ron外国人特別研究員(COE)は、前近代日本の史料遺産プロジェクトの日本史グロッサリーデータベースプロジェクトに参加し、中世歴史用語、軍事史・武道史関係用語などについての英語の標準的用語の集成とデータベース化の検討を行った。ここでは約6000用語の編集・改訂を行い必要に応じて注釈を書き加えた。また、欧米における前近代日本学研究関連文献に見られる歴史用語・語彙の翻訳状況に関する情報収集【第5回国際研究集会(7月、史料編纂所)、プリンストン大学、コロンビア大学、イェール大学、ハーバード大学での意見交換会(10月)において、グロッサリーの紹介と、アメリカ日本学研究における前近代史・思想史用語・語彙の英語への翻訳状況について、意見交換することによって、より具体的なデータベース作成作業のための方針を立てることができた。2.中世政治社会史の国際的視角からの研究を、学位論文で取り組んだ鎌倉幕府と武士階級の宗教的編成の研究を一層展開して行った。また笠懸・流鏑馬・犬追物を例とする軍事関係の文化に関する様々な研究も行った。さらに、鎌倉幕府史料を国際的に情報発信する方策を他研究者のJMPグロッサリー編集を通して担当グロッサリーを作成した。3.新たに、中世後期の軍事史・武士史・武道史の研究のための史料を収集・分析した。特に甲州流軍学・島津家文書をとき武士の心得書として流布した「甲陽軍艦」の注釈的研究に取り組んだ。これらの史料は軍事組織における軍略や武芸・道具などの詳細な情報を提供しており、また中世軍事上要となる宗教についても研究した。軍隊を守衛するため及び敵軍の敗退のための密教儀式についても資料収集を行った。16世紀には弓矢・剣・槍・薙刀・鉄砲等の分類が系統立てて行われていた。4.「甲陽軍艦」の注釈・翻訳研究を行い、中世軍事史・武士史の重要史料の研究として論文にまとめた。「甲陽軍艦」の部分的翻訳及び、日記・軍記における翻訳は今後も継続して行われるであろう。海外の研究者にとって中世後期を理解する上で不可欠な戦国史料に関してはほとんど触れられていないのが現状であり、今後翻訳プロジェクトが継続してゆく事を希望5.鎌倉幕府研究、中世軍事史、武士史研究による歴史語彙・歴史用語の翻訳語集成の成果を日本史グロッサリーデータベースプロジェクトを通じて公開する予定である。
骨髄増殖性腫瘍におけるドライバー変異クローンの腫瘍化メカニズムの解明

近年の研究から、健常人末梢血中には、白血病の要因となるゲノム変異(ドライバー変異)が、想定以上に高頻度で存在すること(CHIP)が明らかになった。CHIPの存在はすなわち、ドライバー変異自体は、造血器腫瘍発生のための必要条件ではあっても十分ではなく、発症のためには他の"何らかのメカニズムが必要、ということである。CHIPが加齢変化として不可避である以上、この"何らかのメカニズム"こそが、腫瘍発生機序の解明や新たな治療戦略構築の鍵となる。我々は、このような腫瘍化のメカニズムを理解するモデルとして、以前から本態性血小板増多症(ET)の発症について研究を行っている、ETのドライバー変異であるJAK2変異を有するクローンは、造血幹細胞(HSC)のレベルから存在しているが、この段階ではまだ増殖能力は低く、正常のHSCよりも少ない。しかしながら、HSCから分化して前駆細胞のレベルになると、増殖能力を獲得し、正常クローンを遙かに凌ぐ数となる。このような過程を理解するためには、どの段階でJAK2変異クローンが増殖能力を獲得するかを正確に把握する必要がある。したがって、我々はまず、血小板分化を運命づけられた前駆細胞(MegP)を前方視的に定義できるマーカーを同定することを目的に研究を行い、これに成功した。実際、ET患者骨髄においては、HSCからMegPの段階になると急激に増殖能を高まることを示した。これらの細胞集団を、正常クローンとJAK2変異クローンとに分けて、単一細胞レベルで解析することによって、JAK2変異クローンがどのように増殖能を獲得するか、すなわち腫瘍化のメカニズムを解明に取り組んでいる。本課題の目的の達成のためには、まず、ETや他の造血器腫瘍患者から採取した骨髄液から、造血幹細胞(HSC)や各前駆細胞集団を純化し、シングルセルレベルでの解析を行う必要がある。当初の計画では、シングルセルへの単離作業を、微小流路を利用したFluidigm C1systemを用いて行う予定としていたが、条件検討の段階において、インプットした細胞に対する解析対象となる細胞の比率が低いことが問題となり、HSCやMegPのような希少な細胞の解析には最適ではない、と判断し、実験手法を変更することとしたため、研究の進捗に若干の遅れを来している。新たに採用したBD Rhapsodyでは、20万個以上用意された微小ウェルに対して蒔かれた細胞を回収することで、理論上インプットした細胞の殆ど全ての細胞が解析可能になり、最大約2万個の細胞を解析できる(以前の計画では1実験96細胞)。しかも、解析遺伝子もこれまでの計画の96遺伝子から400遺伝子以上と、より多くの遺伝子の発現を評価できる。この系によって増幅されたcDNA産物を、次世代シークエンサー(illumina Nextseq)を用いてRNAシークエンス(RNAseq)を行うことで、シングルセルレベルでの網羅的遺伝子発現プロファイルを取得する。JAK2V617F変異ゲノムは、転写産物として存在するため、この時点で、正常及び変異クローンを識別することが可能である。このようにして得られた全トランスクリプトームデータから、1同じJAK2V617F変異クローンで、HSCレベルと、増殖能力を獲得する前駆細胞レベルの細胞では何が違うのか、2同じ造血幹細胞集団でも、正常クローンと変異クローンではどのようにお異なるメカニズムを利用しているのか、について、バイオインフォマティクス的手法を用いて明らかにする。当初の計画では、シングルセルへの単離作業を、微小流路を利用したFluidigm C1

systemを用いて行う予定としていたが、条件検討の段階において、インプットした細胞に対する解析対象となる細胞の比率が低いことが問題となり、HSCやMegPのような希少な細胞の解析には最適ではない、と判断し、実験手法を変更することとしたため、研究の進捗に若干の遅れを来している。新たに採用したBD Rhapsodyでは、20万個以上用意された微小ウェルに対して蒔かれた細胞を回収することで、理論上インプットした細胞の殆ど全ての細胞が解析可能になり、最大約2万個の細胞を解析できる(以前の計画では1実験96細胞)。しかも、解析遺伝子もこれまでの計画の96遺伝子から400遺伝子以上と、より多くの遺伝子の発現を評価できる。この系によって増幅されたcDNA産物を、次世代シークエンサー(illumina Nextseq)を用いてRNAシークエンス(RNAseq)を行うことで、シングルセルレベルでの網羅的遺伝子発現プロファイルを取得する。JAK2V617F変異ゲノムは、転写産物として存在するため、この時点で、正常及び変異クローンを識別することが可能である。このようにして得られた全トランスクリプトームデータから、1同じJAK2V617F変異クローンで、HSCレベルと、増殖能力を獲得する前駆細胞レベルの細胞では何が違うのか、2同じ造血幹細胞集団でも、正常クローンと変異クローンではどのようにお異なるメカニズムを利用しているのか、について、バイオインフォマティクス的手法を用いて明らかにする。
B12酵素とその分子シャペロン様再活性化因子との超分子複合体の立体構造解析

我々は不活性化されたB_<12>補酵素関与ジオールデヒドラターゼ(DD)ホロ酵素を再活性化するDD再活性化因子(DDR)を発見し、生化学的および結晶構造学的解析を行って作用機作を明らかにしてきた。本研究では、DDおよびDDRの結晶構造解析の結果からDD-DDR複合体の形成に重要であると予測されるアミノ酸残基に変異を導入した変異型蛋白質の作成と機能解析、ATPアナログ結合型DDRの結晶構造解析、DD-DDR超分子複合体の結晶化、の3点について研究を行った。まず、変異型DDRと野生型DDを共発現した大腸菌の透過性菌体の系を用いて、グリセロールで不活性化されたDDの再活性化を調べた結果とDDおよびDDRの立体構造から、DD-DDR複合体中ではDDRのGluβ31に代わって、DDのGluβ97がMg^<2+>を介してDDRαサブユニットと相互作用し、DDRβサブユニットの解離が起こることが示唆された。また、グリセロールデヒドラターゼ(GD)およびGD再活性化因子(GDR)の精製蛋白質も用いて調べたところ、DDRはGDを再活性化できるが、GDRはDDを再活性化できないという再活性化因子の特異性は酵素との複合体形成能によって決定されていることが強く示唆された。これは立体構造に基づく両者の接触面積の計算結果からも支持された。よって、再活性化には安定な酵素一再活性化因子複合体の形成が不可欠であると結論できた。先に、ADP結合型DDRの立体構造を報告したが、再活性化の分子機構解明のためにはATP結合型の構造解析が必要である。今回は、ATP-y-S結合型DDRについて約3Åの分解能で結晶構造解析に成功した。さらに、DD-DDR超分子複合体の構造解析のために、複合体形成の過程で解離するDDRβサブユニットを系外へ除くことにより複合体を安定化し、結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。(1)ジオールデヒドラターゼの再活性化における酵素と再活性化因子との超分子複合体の生成と役割B12酵素は触媒反応中に機構依存的不活性化を受け易い。この不活性化は反応中間体の副反応のためにラジカルが消滅する結果,補酵素が損傷を受け、酵素蛋白質から離れないために起こる。我々は不活性化されたジオールデヒドラターゼ(DD)の再活性化に関与する蛋白質因子DDRを発見し、これがATP依存的に損傷コファクターを酵素から解離させることにより酵素を再活性化するという機構を報告してきた。本年度は、DDとDDRとの超分子複合体の生成およびそのサブユニット構造を解析し、両者がサブユニットスワッピングにより、順次1:1次いで1:2複合体を生成することを明らかにした。これまでに明らかにしてきたDDとDDRの立体構造に基づいて精密作用機構を考察し、酵素とDDRとの間に複合体が形成され、この複合体において両者のαサブユニットの間に大きな立体反発が誘起される結果、不活性化されたコファクターが酵素から解離するという分子機構を提唱するに至った。(2)メチオニンシンターゼレダクターゼの分子シャペロン様作用B12関与メチオニンシンターゼは、酵素反応中に超活性種であるcob(I)alaminを生成するため不活性化を受け易い。酸化により不活性化された酵素はメチオニンシンターゼレダクターゼ(MSR)によって還元的に再活性化される。ヒトMSRはヒト酵素に特異的で、大腸菌酵素は再活性化しない。昆虫細胞で高発現させたヒト酵素は粗抽出液中で非常に不安定であるが、ヒトMSRはこれを安定化する作用を示した。また、MSRがNADPH存在下でアクアコバラミンを還元し、ホロ酵素化を促進する、いわゆるホロ酵素合成酵素として機能することを見出した。よって、MSRはメチオニンシンターゼの分子シャペロン様の作用をもつことが明らかとなった。

先に、ADP結合型DDRの立体構造を報告したが、再活性化の分子機構解明のためにはATP結合型の構造解析が必要である。今回は、ATP-y-S結合型DDRについて約3Åの分解能で結晶構造解析に成功した。さらに、DD-DDR超分子複合体の構造解析のために、複合体形成の過程で解離するDDRβサブユニットを系外へ除くことにより複合体を安定化し、結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。