hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超低強度光・低エネルギー光による高効率フォトン・アップコンバージョンの実現

発光寿命測定より、発色団で修飾したペロブスカイトナノ粒子の発光は、していないものと比べて短寿命化しており、ペロブスカイトナノ粒子から表面に固定化された発色団へ三重項エネルギー移動が起こっていることが示唆された。発色団を修飾したペロブスカイトナノ粒子を分散した溶液に発光体として9,10-diphenylanthraceneを加え、532nmの励起光を照射したところ、433nmにアップコンバージョン発光が観測された。このアップコンバージョン発光は635nmの励起光を照射した際にも観測された。この結果より、一重項と三重項のエネルギー差が極めて小さく、またバンドギャップをハロゲン交換によって制御可能なペロブスカイトナノ粒子を用いることによって、大きなアンチストークスシフトを伴ったTTA-UCを実現可能であることが示された。本年度は、本研究の目的である低励起光強度で駆動し、かつ大きなアンチストークスシフトを示す三重項-三重項消滅によるアップコンバージョン(TTA-UC)を達成するために、ペロブスカイトナノ粒子を新規三重項増感剤として用いたTTA-UCの研究を行った。一重項と三重項の間のエネルギー差が無い・ハロゲン交換によりエネルギーバンドギャップを自在に制御可能・吸光係数が大きいといった特徴を有するペロブスカイトは、TTA-UCの三重項増感剤として優れており、上記した本研究の目的を達成することに成功した。よって本研究課題の進捗状況は、おおむね順調に進展しているといえる。本年度は、申請書の通り、凝縮系において低励起光強度で駆動し、かつ大きなアンチストークスシフトを示す三重項-三重項消滅に基づくフォトン・アップコンバージョン(TTA-UC)の達成を目標と掲げて、次の三項目について研究を実施した。1.ハロゲン化鉛ペロブスカイトのナノ結晶について三重項増感機能を検討した。ハロゲン化セシウム鉛ペロブスカイトのナノ結晶を作製し、その表面を三重項アクセプターで化学修飾すると、ペロブスカイトからアクセプター分子への三重項エネルギー移動が起こり、TTA-UC発光が得られることを見出した。この成果は三次元構造を有したペロブスカイトを用いて三重項増感を達成したはじめての例であり、ペロブスカイトの励起状態について重要な知見を与えるものである。2.凝縮系における遅い分子拡散ならびに、ドナー分子とアクセプター分子の相分離現象を解決すべく、液晶性のアクセプターを開発し、エネルギーマイグレーションを用いたTTA-UCについて検討した。液晶中での三重項エネルギーマイグレーションを、過渡吸収測定および粉末X線回折測定より評価することで、従来未解明であったTTA-UCと分子構造秩序の間の関係を明らかにした。3.UC発光色のスイッチングという新たな機能発現に成功した。結晶ならびに過冷却固体で異なる発光波長を示す蛍光性シクロファンをアクセプター、重原子効果によって基底一重項から励起三重項への直接遷移が可能なOs錯体をドナーとして用いることにより、緑色と黄色のUC発光色を熱可逆的にスイッチングすることに成功した。
複断面蛇行水路における洪水流の構造と土砂輸送メカニズムに関する基礎的研究

複断面蛇行河道における洪水流は,河道の洪水の流下能力や河床洗掘の発生に大きな影響を与えるため,その特性を解明することは河道設計において極めて重要である。しかし,現象の複雑さや影響因子の多さ,運動量や土砂輸送のモデル化に関する課題に起因する不明な点が数多く残されている。本研究は,実河川での現象を単純化した複断面蛇行水路の定常流、非定常流実験で得られている計測結果を対象として,2次元および3次元数値解析によって流れの構造や土砂輸送のメカニズムを明らかにすることを目的としている。平成20年度では,高水敷の堤防形状が低水路の形状と平行でなく,両者の間に位相差が存在する実験ケースでの計測データに対して,2次元数値解析手法の改良を進めた。乱流エネルギーを偏微分方程式から求めるSmagorinskyモデルを導入し,有効な渦動粘性係数を表現した。基礎方程式中に空隙率を導入するとともに,移流項の離散化にCIP法を用いることによって,デカルト座標系での数値解析を可能とした。計算結果と実験結果にはまだ有意な差異かおり,数値解析手法に改良の余地かおるが,得られている主な結果は以下のようである。・相対水深の小さい流れでは,低水路と高水敷との境界付近で水位が極大や極小をとる現象が観測されるが,本手法はそのような現象を再現する。しかし,本手法は横断方向の水位差を過大に算出する傾向があり,渦動粘性係数モデルの検討が必要である。・相対水深が大きい流れでは,高水敷上に水位が周辺部よりも低下する領域が形成されるようになり,その下流側で逆流域が形成される。本手法はその現象を再現するが,やはり水深を過大評価する。・本手法を実用的なツールとするためには渦動粘性係数モデルのさらなる改良が必要である。一方,現象の解明のためには3次元数値解析が不可欠である。複断面蛇行河道における流れや土砂輸送は、河道の洪水の流下能力や河床洗掘の位置や深さに大きな影響を与え,洪水の氾濫に直接的に関係している。しかし,現象の複雑さや影響因子の多さ、さらには流れや土砂輸送に対する数学的モデルの適用性等の問題により,解明すべき点が数多く残されている。本研究は,実河川での現象を単純化した複断面蛇行水路の定常流、非定常流実験で得られている計測結果を対象として、3次元数値解析によって流れの構造や土砂輸送のメカニズムを明らかにすることを目的とする。平成18年度では,研究者や研究分担者のグループが行ってきた詳細かつ膨大な計測データの再整理とテータベースの構築を進めた.また,2次元数値解析手法を開発し,計測データの信頼性を確認するとともに,2次元数値解析手法により説明される流れの特徴を整理した.主な知見は以下のようである.1,同一の水深に対する流量は洪水の増水期と減水期で異なるが,その差違は相対水深が0.3付近で最も大きくなる.ただし,水深平均した流速に着目すると,その差違が最大になる水深は低水路内の位置によって異なるこれは低水路と高水敷間の運動量交換の影響が低水路内の位置によって異なるためである.2,高水敷高さを境界面とした低水路内の上層と下層での鉛直方向の運動量輸送量は,低水路と高水敷間の水平方向の運動量輸送に比べて,小さい.非定常複断面蛇行流れにおける増水期と減水期の流れ構造の違いに及ぼす鉛直方向の運動量輸送量の影響は小さいと考えられる.3,2次元不定流解析は,複断面河道における流量や水深平均流速に見られる増水期と減水期の差違,河道貯留の発生機構をほぼ説明することができる.複断面蛇行河道における流れや土砂輸送は,河道の洪水の流下能力や河床洗掘の発生位置や深さに大きな影響を与えるため,そられの現象を解明することは河道設計において極めて重要である。しかし,現象の複雑さや影響因子の多さ,さらには流れや土砂輸送に対する数学的モデルの適用性等の問題により,未解明な点が数多く残されている。平成19年度では,研究分担者が行った定常流と非定常流に関する計測データのデータベース化を進めた。また,2次元数値解析手法を改良し,2次元数値モデルで説明される流れの特徴を整理した。流れの特徴や数値解析の結果は以下のようである。・相対水深(=高水敷上水深/低水路内水深)の小さい流れにおける主流の流速分布は,低水路と高水敷の流れの相互干渉の影響を受けて,早いあるいは遅い流速を示す区域が低水路右岸の側壁に近づくようになる。・主流速分布については,高水敷上の水深が増加するにつれて,低水路と高水敷間での運動量交換により低水路内の最大流速が水面下に移動する。・水位の上昇期と下降期において,二次流セルの形状は同様であるが,強さが異なる。・CIPスキームを用いた2次元不定流解析手法は,相対水深の小さい流れの水深分布に見られる特徴を良好に再現する。しかし,相対水深が大きくなるにつれて,流れの3次元性が強くなるため,2次元数値解析法の再現性は低下し,3次元数値解析が不可欠となる。複断面蛇行

河道における洪水流は,河道の洪水の流下能力や河床洗掘の発生に大きな影響を与えるため,その特性を解明することは河道設計において極めて重要である。しかし,現象の複雑さや影響因子の多さ,運動量や土砂輸送のモデル化に関する課題に起因する不明な点が数多く残されている。本研究は,実河川での現象を単純化した複断面蛇行水路の定常流、非定常流実験で得られている計測結果を対象として,2次元および3次元数値解析によって流れの構造や土砂輸送のメカニズムを明らかにすることを目的としている。平成20年度では,高水敷の堤防形状が低水路の形状と平行でなく,両者の間に位相差が存在する実験ケースでの計測データに対して,2次元数値解析手法の改良を進めた。乱流エネルギーを偏微分方程式から求めるSmagorinskyモデルを導入し,有効な渦動粘性係数を表現した。基礎方程式中に空隙率を導入するとともに,移流項の離散化にCIP法を用いることによって,デカルト座標系での数値解析を可能とした。計算結果と実験結果にはまだ有意な差異かおり,数値解析手法に改良の余地かおるが,得られている主な結果は以下のようである。・相対水深の小さい流れでは,低水路と高水敷との境界付近で水位が極大や極小をとる現象が観測されるが,本手法はそのような現象を再現する。しかし,本手法は横断方向の水位差を過大に算出する傾向があり,渦動粘性係数モデルの検討が必要である。・相対水深が大きい流れでは,高水敷上に水位が周辺部よりも低下する領域が形成されるようになり,その下流側で逆流域が形成される。本手法はその現象を再現するが,やはり水深を過大評価する。・本手法を実用的なツールとするためには渦動粘性係数モデルのさらなる改良が必要である。一方,現象の解明のためには3次元数値解析が不可欠である。
身体活動に伴う慢性的血液量変化とアルブミン合成,体内分布変化との関係の解析

[背景]運動トレーニングは強力な血液量増加刺激因子であることが知られている。血液量は腎臓での水・ナトリウム排泄、細胞内外での水の分布の変化など多くの要因が関与していると考えられている。しかしながら運動のいかなる要因が血液量を増加させるのか、また血液量の変化が運動能にいかに影響するかは明らかではない。[目的]このため実験は1.ラットを継続的に運動させ血液量が増加するか否かを調べ、血液量増加因子を探索するためのモデル動物、実験系として使えるかどうかを調べること、2.血漿膠質浸透圧を維持する物質として重要なアルブミンがラットの継続的運動により変化するか調べることを目的にした。[方法]Wistar系雄ラット10匹ずつを運動群、非運動群にわけた。非運動群は通常のケージ内で飼育、運動群は4週間(5日/週、1日1時間)のトレッドミルによるトレーニングを行った。トレッドミルスピードは10m/secで一定、傾斜を1週間ごとに0度より5度ずつ15度まで増加させた。3週後に運動群、非運動群ともベントバルビタール麻酔下に右大腿および外頚静脈より慢性カテーテルを留置した。第5週目に300μl採血の後、5mg/mlのEvans Blue(EB)溶液を44μl1/100g体重投与し、その後5,10,15,20分後に150μlの採血を行った。[測定]EBの消退率、血液のヘマトクリットより血液量を算出し、またcolorimetryによる血漿アルブミン、総蛋白濃度の解析から血漿中の総量を計算した。また肝臓組織中のアルブミンmRNAの発現をNothern hybridizationにより測定し、アルブミン合成を評価した。[結果・考察]運動群では非運動群に比較し血液量の増加(6.4±0.2vs4.8±0.5ml/100gbw)が見られた。またこの原因として血漿中のアルブミンの増加(0.13±0.01vs0.10±0.01)が原因として考えられた。しかしアルブミンmRNAの発現は両者に差が見られなかったが、トレーニング初期でのアルブミン合成の増加の可能性は否定できなかった。運動に伴う血液量の変化のメカニズムを研究するにあたって、ラットのトレッドミル運動は有用なモデルであると考えられる。ヒトにおける実験からトレーニング効果としての血液量の増加に血液アルブミン量の増加が関与している可能性が示唆されている。アルブミンは膠質浸透圧を維持し、1gのアルブミンは18mlの水と結合すると言われている。申請者は人において強度運動後に血液量の増加とともに血液アルブミン総量が増加することを報告し、トレーサーを用いた研究から肝臓でのアルブミン合成がこの現象に関与している可能性を示している。血液アルブミンの増加のメカニズムとしてはこのアルブミン合成の増加のほかに、血管内外のアルブミンの分布の変化の2つが大きな要因であると申請者は考えている。このメカニズムを解析するには小動物を用いた実験が必要と考えられる。今回の実験計画ではラットを使った運動トレーニングの方法を確立すること、肝臓でのアルブミン合成をアルブミンmRNAを測定し直接評価し、血液量調節との関係を明らかにすること、運動時のリンパ管系を介した間質から血管内へのアルブミンの動き、毛細血管での間質へのアルブミンの動きを定量化することの3つを大きな目的とする。実験仮説としては動物の活動性(運動量)に伴い血液量、血液アルブミンは増加し、同時に肝臓でのアルブミンmRNAが増加することを予想している。また運動により間質より血管内へのリンパ流が増加する結果、血液アルブミン総量が増加すると予想している。さらに肝臓でのmRNAが運動により増加することが実証されれば、運動により変化する因子、交感神経活動、ストレスホルモンに着目しアルブミン合成ならびに血液量変化への影響を調べている。[測定]

EBの消退率、血液のヘマトクリットより血液量を算出し、またcolorimetryによる血漿アルブミン、総蛋白濃度の解析から血漿中の総量を計算した。また肝臓組織中のアルブミンmRNAの発現をNothern hybridizationにより測定し、アルブミン合成を評価した。[結果・考察]運動群では非運動群に比較し血液量の増加(6.4±0.2vs4.8±0.5ml/100gbw)が見られた。またこの原因として血漿中のアルブミンの増加(0.13±0.01vs0.10±0.01)が原因として考えられた。しかしアルブミンmRNAの発現は両者に差が見られなかったが、トレーニング初期でのアルブミン合成の増加の可能性は否定できなかった。運動に伴う血液量の変化のメカニズムを研究するにあたって、ラットのトレッドミル運動は有用なモデルであると考えられる。[背景]運動トレーニングは強力な血液量増加刺激因子であることが知られている。血液量は腎臓での水・ナトリウム排泄、細胞内外での水の分布の変化など多くの要因が関与していると考えられている。しかしながら運動のいかなる要因が血液量を増加させるのか、また血液量の変化が運動能にいかに影響するかは明らかではない。[目的]このため実験は1.ラットを継続的に運動させ血液量が増加するか否かを調べ、血液量増加因子を探索するためのモデル動物、実験系として使えるかどうかを調べること、2.血漿膠質浸透圧を維持する物質として重要なアルブミンがラットの継続的運動により変化するか調べることを目的にした。[方法]Wistar系雄ラット10匹ずつを運動群、非運動群にわけた。非運動群は通常のケージ内で飼育、運動群は4週間(5日/週、1日1時間)のトレッドミルによるトレーニングを行った。トレッドミルスピードは10m/secで一定、傾斜を1週間ごとに0度より5度ずつ15度まで増加させた。3週後に運動群、非運動群ともペントバルビタール麻酔下に右大腿および外頚静脈より慢性カテーテルを留置した。第5週目に300μl採血の後、5mg/mlのEvans Blue(EB)溶液を44μl/100g体重投与し、その後5,10,15,20分後に150μlの採血を行った。[測定]EBの消退率、血液のヘマトクリットより血液量を算出し、またcolorimetryによる血漿アルブミン、総蛋白濃度の解析から血漿中の総量を計算した。[結果・考察]運動群では非運動群に比較し血液量の増加(6.4±0.2 vs 4.8±0.5ml/100gbw)が見られた。またこの原因として血漿中のアルブミンの増加(0.13±0.01 vs 0.10±0.01)が原因として考えられた。
HIF-1システムががんの進展に果たす役割の探究

本年度は以下の結果を得た。1.ガン細胞はワールブルグ効果と総称されるような特異なエネルギー代謝経路を持つ細胞である。申請者らはすでに樹立細胞株を用いた研究によりPGK-1やGAPDHなどの解糖系酵素の発現が低酸素状態のみならず非低酸素状態でもHIF-1に依存している場合があることを見いだしている。本研究において、グルコース代謝経路と低酸素誘導性遺伝子発現にクロストーク現象が存在することを見いだした。2.固形ガンが進展するためには血管新生が必須である。この過程にVEGFとその受容体系が果たす役割が協調されてきた。申請者らはそれのみならずHIF-1がその他の血管新生因子であるagniopoietin-1,-2やPDGF-Bに加えVEGF receptorの共役因子の発現がHIF-1の支配下にあるという結果を得た。HIF-1システムを阻害することにより血管新生誘導能や細胞運動性(浸潤性)などが抑制できるかどうかの検討を行うために、HIF-1aやFIH-1を過剰発現した、またはRNAiを用いて発現抑制した細胞株を樹立した。3.私たちは既はヒトグリオブラトーマ由来の細胞株でFIH-1の遺伝子を含む染色体の領域が欠損している例を見い出している。またFIH-1はガン抑制遺伝子として知られているpVHL(フォンヒヒッペルリンド-蛋白質)と相互作用するを私たちは証明した。FIH-1が新規のガン抑制遺伝子である可能性も示唆されたのでこの可能性を追求した。4.FIH-1過剰発現細胞株、FIH-1ノックダウン細胞株を用いた移植ガン細胞のin vivo増殖性・浸潤性に対するHIF-1とFIH-1の関与の検討によりFIH-1が少なくとも癌の進展に少なくとも抑制的な効果を及ぼすことを示唆する結果が得られた。
多能性神経幹細胞の増殖と分化の分子機構の解析

哺乳動物の中枢神経系を構成するニューロン及びグリアの多様な細胞系列は、いずれも共通の神経幹細胞より発生する。しかしながら、この多能性幹細胞についての知見は未だ限られたものに留まっている。我々は最近ラット胎児脳より多能性神経幹細胞由来の不死化細胞株を樹立し、これを用いて幹細胞よりニューロン及びグリアが発生、分化する過程を試験管内で再構成するモデル系を作成することに成功している。本研究ではこの細胞株を用いて、多能性幹細胞の増殖と分化の分子機構を解析した。分化制御分子の候補として、転写因子であるMash-1およびProx-1遺伝子に着目し、その発現動態および機能を解析した。特異抗体を用いた免疫染色法及びウエスタン解析法により、Mash-1,Prox-1両遺伝子産物が、幹細胞が分化する過程で一過的に発現誘導されることを見出した。さらにMash-1発現細胞は、幹細胞のマーカーであるネスチンの発現が陰性となるとともにProx-1を発現し、これに引き続いてニューロン、グリアへと分化した。Mash-1遺伝子の機能をさらに解析する目的で、遺伝子導入により強制発現細胞株を樹立した。Mash-1の発現により、幹細胞はネスチン陰性でしかも種々の分化マーカーを発現していない特異な細胞へと移行した。さらにMash-1の発現によってProx-1の発現が誘導された。本研究によって、中枢神経系においては多能性幹細胞からの分化過程に他段階のステップが存在し、このうちMash-1遺伝子は神経幹細胞が分化を開始する最も初期の過程で発現・機能し、Prox-1などの下流の遺伝子の発現を制御することが明らかになった。
悪性黒色腫におけるMAPキナーゼ活性化制御分子の同定

実験期間中に樹立した悪性黒色腫細胞株3株、良性の母斑細胞の細胞培養株を9株およびすでに樹立していた悪性黒色腫細胞株HM3KOおよび市販の悪性黒色腫細胞株3株を用い、培養細胞からDNAを抽出し、NRASの変異の有無を調べた。抽出したDNAを用いdirect sequence法で検討したところ、いずれの細胞においても変異は見られなかった。BRAFV600Eの変異についてはdirect sequence法にてHM3KOおよび市販の細胞株について検討したところ、HM3KOにてBRAFV600Eの変異が見られた。昨年度BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞2株、変異のない黒色腫細胞1株、BRAFV600Eの変異のある母斑細胞2株、変異のない細胞3株より蛋白を抽出し、MAPK pathway関連分子のリン酸化を見るために、MPAK測定用抗体アレイにてMAPK関連分子の検討を行った。BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞株で、多くのMAPK関連分子のリン酸化が見られ、それはBRAF変異のない黒色腫細胞株と有意な差が見られた。一方BRAFV600Eの変異のある母斑細胞株では変異のない母斑細胞株に比べてMAPK関連分子の有意なリン酸化は見られず、またERK1/2のリン酸化の誘導も生じていないことがわかった。そこで、BRAFV600Eの変異のある母斑細胞株の培養液に種々の増殖刺激因子(cAMP inducerのIBMX,下垂体エキス、増殖刺激因子のbFGF, ET-1, TPA)を各々添加し、pERKを認識する抗体でWestern blottingを施行したところ、TPA刺激にてERKのリン酸化が誘導されることがわかり、母斑細胞でBRAFV600Eに変異があってもERK1/2、MEKのリン酸化が生じないように脱リン酸化の機構が働いている場合、これはTPAで打ち消されている事が判明した。さらに既樹立した悪性黒色腫細胞株HM3KOならびに市販の悪性黒色腫細胞3株でBRAFV600Eの変異を検討したが、HM3KOのみ変異が見られた。昨年度樹立した悪性黒色腫7株、母斑細胞株9株にてNRAS変異については全てにおいて変異がなかった。MPAK測定用抗体アレイを用いたDot blot analysisにて17種類のMAPK関連分子の検討を行った。BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞株ではERK1/2, CREB, GSK3a, GSK3b, JNK, MEK,MKK3,MKK6, MSK2, mTOR, RSK1, RSK2のリン酸化が亢進しているのに対し、BRAFV600E変異のある母斑細胞株ではこれらのリン酸化が亢進していない。またBRAFV600E変異のない母斑細胞株と比較してもこれらリン酸化状態の亢進はみられ図、特にBRAFV600Eに変異があるにもかかわらずERK1/2、MEKのリン酸化の亢進がみられなかったことより、母斑細胞では脱リン酸化の機構が働いていることを昨年度明らかにしていた。そこでBRAFV600Eの変異のある母斑細胞株の培養液をO/Nで1%血清のMEMでdepriveした後、種々の増殖刺激因子(cAMP inducerのIBMX,下垂体エキス、増殖刺激因子のbFGF, ET-1, TPA)で刺激30分後にタンパクを抽出してpERKの抗体を用いたWestern blottingにて検討したところ、TPAにてERKのリン酸化が生じることがわかり、母斑細胞でBRAFV600Eに変異があってもERK1/2、MEKのリン酸化が生じないように脱リン酸化の機構が働いている場合、これはTPAで打ち消される事、TPAで活性化するリン酸化シグナルを脱リン酸化するシグナルが母斑細胞で活性化していることが判明した。BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞および母斑細胞、ならびにBRAFV600Eに変異のない母斑細胞の蛋白を用い、BRAFおよびERKに対する抗体を用いてdetergentを緩い状態とした条件で免疫沈降によりBRAFおよびERKに結合する蛋白を得、2次元電気泳動にて脱リン酸化酵素を網羅的に解析し、BRAFV600Eに変異があるにもかかわらずERK1/2、MEKのリン酸化の亢進が生じないように働いている脱リン酸化酵素を同定する。同時にnCounter装置を用い増殖・アポトーシスに関わるシグナル伝達関与遺伝子を網羅するHuman CAE (Gene)Panelを用いて遺伝子発現プロフィールも解析し、母斑細胞における自律増殖の抑制作用について明らかにしていく。また、このうちTPAで活性化されるシグナルについて注目して解析していく。今年度の実験期間中に新たに悪性黒色腫細胞株を3株、良性の母斑細胞の細胞培養株を9株樹立し、培養細胞からDNAを抽出し、BRAFV600Eの変異の有無を調べた。抽出したDNAを用いpyro sequence法で検討したところ、黒色腫細胞株では3株の内1株に、母斑細胞株では9株中3株にBRAFV600Eの変異が見られた。BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞1株、変異のない黒色腫細胞1株、BRAFV600Eの変異のある母斑細胞2株、変異のない細胞3株より蛋白を抽出し、MAPK pathway関連分子のリン酸化を見るために、MPAK測定用抗体アレイHuman MAPK Pathway phosphorylation Array C-Series(RayBiotech/abcam)を用いたDot blot analysisにて17種類のMAPK関連分子の検討を行った。

BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞株ではERK1/2, CREB, GSK3a, GSK3b, JNK, MEK,MKK3,MKK6, MSK2, mTOR, RSK1, RSK2のリン酸化が亢進しているのに対し、BRAFV600E変異のある母斑細胞株ではこれらのリン酸化が亢進していないことが判明した。BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞株で、多くのMAPK関連分子のリン酸化が見られ、それはBRAF変異のない黒色腫細胞株と有意な差が見られた。一方BRAFV600Eの変異のある母斑細胞株では変異のない母斑細胞株に比べてMAPK関連分子の有意なリン酸化は見られず、またERK1/2のリン酸化の誘導も生じていないことがわかった。これらのことより母斑細胞ではBRAFV600Eに変異があってもERK1/2、MEKのリン酸化が生じないように脱リン酸化の機構が働いていることが判明した。悪性黒色腫細胞株3株、母斑細胞株9株を樹立し、BRAFV600E変異についてpyro sequenceで検討し、黒色腫細胞株1株、母斑細胞株3株でこの変異があることを同定した。実験期間中に樹立した悪性黒色腫細胞株3株、良性の母斑細胞の細胞培養株を9株およびすでに樹立していた悪性黒色腫細胞株HM3KOおよび市販の悪性黒色腫細胞株3株を用い、培養細胞からDNAを抽出し、NRASの変異の有無を調べた。抽出したDNAを用いdirect sequence法で検討したところ、いずれの細胞においても変異は見られなかった。BRAFV600Eの変異についてはdirect sequence法にてHM3KOおよび市販の細胞株について検討したところ、HM3KOにてBRAFV600Eの変異が見られた。昨年度BRAFV600Eの変異のある黒色腫細胞2株、変異のない黒色腫細胞1株、BRAFV600Eの変異のある母斑細胞2株、変異のない細胞3株より蛋白を抽出し、MAPK pathway関連分子のリン酸化を見るために、MPAK測定用抗体アレイにてMAPK関連分子の検討を行った。そこで、BRAFV600Eの変異のある母斑細胞株の培養液に種々の増殖刺激因子(cAMP inducerのIBMX,下垂体エキス、増殖刺激因子のbFGF, ET-1, TPA)を各々添加し、pERKを認識する抗体でWestern blottingを施行したところ、TPA刺激にてERKのリン酸化が誘導されることがわかり、母斑細胞でBRAFV600Eに変異があってもERK1/2、MEKのリン酸化が生じないように脱リン酸化の機構が働いている場合、これはTPAで打ち消されている事が判明した。さらに既樹立した悪性黒色腫細胞株HM3KOならびに市販の悪性黒色腫細胞3株でBRAFV600Eの変異を検討したが、HM3KOのみ変異が見られた。昨年度樹立した悪性黒色腫7株、母斑細胞株9株にてNRAS変異については全てにおいて変異がなかった。MPAK
交差ビ-ム法による原子イオンの電子衝突励起及び2電子再結合の研究

原子イオンの電子衝突による励起および電離過程を研究する目的で、以下の装置を整備し、数種の中性原子およびイオン種について電離断面積の測定を行なった。現在イオンの励起断面積測定の準備を進めている。1.瀬谷一液岡型50cm真空分光器の入射側と射出側にそれぞれ衝突チェンバ-と位置敏感検出器を取りつけ電子衝突による極端紫外線発光スプクトルの定量測定を行い、発光断面積の決定を行なった。昨年発表したAr原子の3s電離部分断面積に続いて、今年度はKrの4s(Phys.Rev.Aに印刷中)、Neの2s、Xeの5sについて電離部分断面積の測定を行ない、発表の準備を進めている。これら希ガスの外殻s電子電離断面積は、それを衝突電子のエネルギ-の関数として表わすと、しきい値のすぐ後に大きな極大値を持つ共鳴的振る舞いを示し(但しNeは例外である)、理論的興味の対象となっている。2.電子衝撃によるイオンの発光スペクトルの定量測定に進ために、イオン源の改良を行なった。アルカリおよびアルカリ土類ゼオライトを用いる熱放射型イオン源及びReリボンによる表面電離型イオン源につき開発を試み、110μAのアルカリ及びンアルカリ土類イオンビ-ムを発生する小型のイオン源を得た。3.上記の研究と平行して、電子-イオン交差ビ-ム実験装置を用いてイオンの電離断面積の測定を行なった。昨年度のO^+.S^+.S^2に続いて、C^+.N^+.P^+;F^+.Ne^+.Cl^+,Ar^+.;Ne^<2+>.Ar^<2+>.Kr^<2+>.およびXe^<2+>1重電離断面積の測定を行ない発表した。本年度はさらに内殻電離や励起-自動電離過程に関連して、Ca^+.Sr^+.Ba^+の2重および3重電離断面積の測定を行なった。今後はイオンの励起断面積の測定を進めるとともに、上記のデ-タを総合して、イオンの電離・励起過程における共鳴現象を明らかにしたい。原子イオンの電子衝突励起過程を研究する目的で、以下のような準備実験を行った。これにもとづき現在装置の調整を進めている。1.イオン-電子交差ビーム実験装置を用いて、カルシウム1価イオンの2重電離断面積とバリウム1価イオンの3重電離断面積の測定を行った。またこれと並行して、名古屋大学プラズマ研究所の電子サイクロトロン共鳴型イオン源を用いて、S^+、S^<2+>その他1価及び2価イオンの電離断面積を測定した。これら一連の実験により、電子・イオン2重チョッピング法にもとづく信号対雑音比の改善技術を会得し、イオン-電子交差ビームによる極紫外発光スペクトル測定装置の設計に役立てた。また電離断面積の衝突エネルギー依存性の研究から、内殻電離または内殻励起に続いて起る自動電離に起因するいくつかの共鳴構造を見出した。2.瀬谷-波岡型50cm真空紫外単色光器の入射スリット側に衝突チェンバーを取付け、電子-中性原子ビーム交差衝突による極紫外発光の計測を行った。この方法による最初の例題として、アルゴン原子の3_S副殻電離に引続く3P→3_S遷移による極紫外スペクトルの発光断面積を測定した。3_S

電離の絶対断面積は、アルゴン共鳴線発光の絶対断面積へこれを規化格することにより決定された。この一連の実験により、極紫外分光と位置敏感型光子計数法の技術を会得し、電子-イオン交差ビーム衝突チェンバーの設計に役立てた。またアルゴン3_Sなど、副殻電子電離の断面積では、衝突エネルギー依存性に普通の価電子電離の場合と異なる特異な構造があることを見出した。3.以上の技術上の知見と経験をふまえて、アルカリおよびアルカリ土類イミンと電子との交差ビーム衝突チェンバーを設計し、極外単色光器に取付けた。イオン源としては、熱放射型と表面電離型の両方を試みる。第一着手として、K^+イオンの共鳴線の計測を行っている。原子イオンの電子衝突による励起および電離過程を研究する目的で、以下の装置を整備し、数種の中性原子およびイオン種について電離断面積の測定を行なった。現在イオンの励起断面積測定の準備を進めている。1、瀬谷ー波岡型50cm真空分光器の入射側と射出側にそれぞれ衝突チェンバ-と位置敏感検出器を取り付け電子衝突による極端紫外発光スペクトルの定量測定を行ない、発光断面積の決定を行なった。昨年度発表したAr原子の3s電離部分断面積に続いて、今年度はKrの4s(Phys.Rev.Aに印刷中)、Neの2s、Xeの5sについて電離部分断面積の測定を行ない、発表の準備を進めている。これら希ガス原子の外殻s電子電離断面積は、それを衝突電子のエネルギ-の関数として表わすと、しきい値のすぐ後に大きな極大値を持つ共鳴的振る舞いを示し(但しNeは例外である)、理論的興味の対象となっている。2、電子衝撃によるイオンの発光スペクトルの定量測定に進むために、イオン源の改良を行なった。アルカリおよびアルカリ土類ゼオライトを用いる熱放射型イオン源及びReリボンによる表面電離型イオン源につき開発を試み、110μAのアルカリ及びアルカリ土類イオンビ-ムを発生する小型のイオン源を得た。3、上記の研究と並行して、電子一イオン交差ビ-ム実験装置を用いてイオンの電離断面積の測定を行なった。昨年度のO^+、S^+、S^2に続いて、C^+、N^+、P^+;F^+、Ne^+、Cl^+、Ar^+、;Ne^<2+>、Ar^<2+>、Kr^<2+>、およびXe^<2+>1重電離断面積の測定を行ない発表した。本年度はさらに内殻電離や励起ー自動電離過程に関連して、Ca^+、Sr^+、Ba^+の2重および3重電離断面積の測定を行なった。今後はイオンの励起断面積の測定を進めるとともに、上記のデ-タを総合して、イオンの電離・励起過程における共鳴現象を明らかにしたい。
マイクロマシン技術を用いた革新的な宇宙Ｘ線望遠鏡の開発実証

高感度の宇宙X線観測には、天体からの微弱なX線を集光結像する望遠鏡が欠かせない。我々は世界最軽量のX線望遠鏡として、日本が世界をリードするマイクロマシン技術を用いた独自の手法を考案し、開発を進めてきた。厚み数百μmの薄い基板に、数十μmの微細穴を形成し、側壁を反射鏡として利用する。我々は本手法で世界で初めてX線反射と結像を実証してきた。本研究ではこれを発展し、1回反射型光学系の分解能と反射率の向上と、本手法で世界初の2段望遠鏡の製作に成功した。さらに側壁に重金属膜を膜付けする新プロセスの実証、世界最大の微細穴光学系となる12インチ光学系の製作、衛星搭載検討および提案も行った。本研究では、これまで世界最軽量級であった日本のすざく衛星のX線望遠鏡を、2桁軽量化しつつ、角度分解能を1桁改善した、「1000平方cmの有効面積と10秒角の角度分解能を備えたkgクラスの世界最軽量X線望遠鏡」を目的とする。具体的には(1)シリコンドライエッチングプロセスによる軽量X線反射用の微細構造の製作、(2)X線LIGAプロセスを用いた軽量X線反射用の金属微細構造の製作、(3)磁気流体を用いたエッチング面の研磨、(4)シリコン高温アニールを用いたシリコンエッチング面の平滑化、(5)塑性変形もしくは弾性変形による高精度の変形を行う。完成する望遠鏡は我々のオリジナルである。我々は今年度、(A)シリコンX線望遠鏡1段分の性能向上、(B)シリコン2段望遠鏡の組立プロセスの確立、さらに(C)Ni X線望遠鏡1段分の試作、などに取り組んだ。代表的な成果について以下、順に述べる。(A):シリコンドライエッチングはエッチングガスと側壁保護ガスを交互に導入して、垂直性の良い自由な形状の穴を掘る。以前の条件では、反射率に影響する10μm以下の粗さはアニールを加えることで1 nm rms以下に抑えられていたが、結像性能に影響する100μmスケールの粗さは150 nm rms程度と大きく、角度分解能を制限していた。そこでエッチングと保護のバランスを最適化することで、粗さを20 nm rmsと8倍改善した。さらに表面を平滑化するためのアニールの時間も最適化し、14 nm rmsを達成した。この条件で試作した4インチX線望遠鏡1段分にX線を照射した所、角度分解能は14x14 mm入射で14分角となった。ペンシルビームスキャンの結果、主原因が変形精度であると分かったため、現在は変形条件出しに着手している。(B);本格的な宇宙X線望遠鏡では収差を抑えた集光結像のため2回反射型が必要となる。そこで独自のアラインメント装置を用いて、曲率半径1000mmと333mmで曲げた2枚のシリコン基板の位置あわせを行った。可視光を用いて位置の微調整を行った結果、並進精度<2μm、回転精度<2分角を達成し、本手法で世界で初めて2段望遠鏡を完成した。今後はX線評価へと進む。(C):X線LIGAはシンクロトロン光を用いたリソグラフィーと電析を組み合わせた技術である。我々は電析中に気泡が入らないように現像から電積まで液浸で行うプロセスを確立し、望遠鏡1段分を完成した。今後はX線評価を行う予定である。これらの結果に関連して、国内学会で5件の発表と2件の招待講演を行った。また国際学会で4件の発表と1件の招待講演を行った。また4本の査読付論文が出版もしくは受理された。本研究では、これまで世界最軽量級であった日本のすざく衛星のX線望遠鏡を2桁軽量化しつつ、角度分解能を1桁改善した、「1000平方cmの有効面積と10秒角の角度分解能を備えたkgクラスの世界最軽量X線望遠鏡」を目的とする。具体的には(1)シリコンドライエッチングプロセスによる軽量X線反射用の微細構造の製作、(2)X線LIGAプロセスを用いた軽量X線反射用の金属微細構造の製作、(3 )磁気流体を用いたエッチング面の研磨、(4)シリコン高温アニールを用いたシリコンエッチング面の平滑化、(5)塑性変形もしくは弾性変形による高精度の変形、(6)原子層堆積法を用いた側壁への重金属膜付けを行う。我々は今年度、研究の集大成としてシリコン2段望遠鏡の組み立てプロセスの改良と、望遠鏡に用いる基板のエッチングおよびアニールの最適化、光線追跡シミュレーションの整備、将来の地球磁気圏ミッションや惑星ミッションに向けた装置および衛星の検討を行った。

これらに関連して、国内学会で9件の発表を行った。また国際学会で4件の発表、さらに2件の招待講演を行った。さらに1件の査読付き論文が出版され、1件を新たに投稿した。本研究では、これまで世界最軽量級であった日本のすざく衛星のX線望遠鏡を2桁軽量化しつつ、角度分解能を1桁改善した、「1000平方cmの有効面積と10秒角の角度分解能を備えたkgクラスの世界最軽量X線望遠鏡」を目的とする。具体的には(1)シリコンドライエッチングプロセスによる軽量X線反射用の微細構造の製作、(2)X線LIGAプロセスを用いた軽量X線反射用の金属微細構造の製作、(3)磁気流体を用いたエッチング面の研磨、(4)シリコン高温アニールを用いたシリコンエッチング面の平滑化、(5)塑性変形もしくは弾性変形による高精度の変形、(6)原子層堆積法を用いた側壁への重金属膜付けを行う。完成する望遠鏡は我々のオリジナルである。我々は今年度、(A)シリコン2段望遠鏡の組み立てとX線性能評価、(B)シリコン望遠鏡1段分の側壁平坦性の改善、(C)性能評価のためのX線ビームラインへのCCDの導入と光線追跡プログラムの構築、(D)惑星探査ミッションに向けた光学系デザインを含めた装置検討などに取り組んだ。これらの成果に関連して、国内学会で7件の発表と2件の招待講演を行った。また国際学会で4件の発表と1件の招待講演を行った。また3本の査読付論文が出版された。さらに1件の解説記事を学会誌に掲載し、1件の特許を出願した。当初予定の通り、今年度はシリコンX線望遠鏡1段分の性能向上、シリコン2段望遠鏡の完成、X線LIGAを用いたNiX縁望遠鏡1段分の試作に成功した。さらにこれらの成果に加えて、原子滞積法を用いたシリコンX線望遠鏡1段分へのイリジウムの膜付けと反射試験、4インチ基板用の磁気流体研磨装置の立ち上げも行った。個々の要素技術の性能改善は引き続き必要であるが、このように一連の目標以上の技術に目処を付けることができてきているため、本研究は当初の計画以上に進展していると考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定の通り、今年度は4インチシリコン2段望遠鏡の性能評価、4インチシリコン望遠鏡1段分の性能向上に成功した。さらにこれらの成果に加えて、X線CCDを用いた評価システムと光線追跡プログラムの構築、探査衛星の光学系デザインを含む装置設計を行ったほか、世界最大級となる12インチシリコン基板を用いた望遠鏡1段分の試作や、4インチ基板用の磁気流体研磨装置の立ち上げも行った。目標とする角度分解能および有効面積を達成するための、要素技術の性能改善は引き続き必要であるが、このように一連の目標以上の技術に目処を付けることができてきているため、本研究は当初の計画以上に進展していると考えている。シリコンドライエッチングを用いたX線望遠鏡1段分の性能向上に向けて、高温塑性変形の条件出しや新たな側壁の平滑化プロセスを試し、さらなる角度分解能の向上を目指す。またX線LIGAを用いたX線望遠鏡1段分の性能を評価し、シリコンとどちらがより高性能の鏡を実現できるか判断を行い、必要に応じて一つに絞り込む。さらにシリコン2段望遠鏡のX線性能を評価し、組立プロセスにフィードバックをかけつつ、性能を向上することを目指す。こうした要素技術開発と平行して、将来のX線天文衛星、惑星探査衛星や技術実証衛星に本装置を提案・検討を進める。
マルチモード情報を相互利用する確率的神経回路網に関する研究

本研究は,認知と認識のメカニズムを理解するために,人体が受容するマルチモーダル情報を処理して出力するシステムの実現を目指して開始された.ここで扱うマルチモーダル情報源は,人体の表情やその他の生体信号であり,手法としては,EMアルゴリズムに基づく確率的神経回路網とそれに関連したものを用いたものとなっている.得られた成果は次のようなものであり,いずれも論文として発表されている.(1)研究代表者が開発した高速なα-EMアルゴリズムを完成させ,その収束性の証明と高速化の条件を得た.(2)α-EMアルゴリズムによる混合エキスパート型神経回路網を用いて,双方向で他のモードに変換できるシステムの基本形を得た.(3)α-EMアルゴリズムの下部構造であるベクトル量子化と自己組織化を結合させ,{情報圧縮,表情のモーフィング,3次元表示}の三項目を同時に実現するシステムを構築した.これは,神経系の内部状態を,3次元の顔表情に実時間変換できる効果器を実現したものになっている.(4)当初の予定には入っていなかった項目であるが,ICA(独立成分分析)のための超高速化法を得ることができた.これは,α-対数に関する自然勾配をICAに適用することにより得られたものである.ICAは,機能MRIによる脳情報を抽出するための手法として中心的位置を占めており,この研究で得られた超高速ICAは,今後への大きな貢献となりうるものである.以上のように,本研究は,当初目的の他にも成果を得て終了した.本研究は,認知と認識のメカニズムを理解するために,人体が受容するマルチモーダル情報を処理して出力するシステムの実現を目指して開始された.ここで扱うマルチモーダル情報源は,人体の表情やその他の生体信号であり,手法としては,EMアルゴリズムに基づく確率的神経回路網とそれに関連したものを用いたものとなっている.得られた成果は次のようなものであり,いずれも論文として発表されている.(1)研究代表者が開発した高速なα-EMアルゴリズムを完成させ,その収束性の証明と高速化の条件を得た.(2)α-EMアルゴリズムによる混合エキスパート型神経回路網を用いて,双方向で他のモードに変換できるシステムの基本形を得た.(3)α-EMアルゴリズムの下部構造であるベクトル量子化と自己組織化を結合させ,{情報圧縮,表情のモーフィング,3次元表示}の三項目を同時に実現するシステムを構築した.これは,神経系の内部状態を,3次元の顔表情に実時間変換できる効果器を実現したものになっている.(4)当初の予定には入っていなかった項目であるが,ICA(独立成分分析)のための超高速化法を得ることができた.これは,α-対数に関する自然勾配をICAに適用することにより得られたものである.ICAは,機能MRIによる脳情報を抽出するための手法として中心的位置を占めており,この研究で得られた超高速ICAは,今後への大きな貢献となりうるものである.以上のように,本研究は,当初目的の他にも成果を得て終了した.
非一様カイラル凝縮を考慮に入れた場合のＱＣＤ相構造

今年度は、非一様カイラル相の研究として、主としてアイソスピン非対称な物質での相構造の研究を行った。これまでの非一様カイラル相の研究は、uクォークとdクォークの化学ポテンシャルが等しいというアイソスピン対称な状況を仮定しており、また非一様なカイラル凝縮としても荷電中性なもののみを考えていた。しかし現実の環境ではuクォークとdクォークの個数は異なり、また極端なアイソスピン非対称な環境下では荷電パイオン凝縮という荷電中性でないカイラル凝縮が出現することが以前の研究で示唆されていた。本研究では、アイソスピン非対称な環境での非一様相を考え、また非一様なカイラル凝縮として荷電中性なものだけでなく、荷電パイオン凝縮という荷電中性でないカイラル凝縮を考えて、非一様相の解析を行った。本研究において、アイソスピン非対称な環境において非一様な荷電パイオン凝縮が荷電中性なカイラル凝縮よりエネルギー的に有利になることや、アイソスピン非対称性により非一様相が現れる領域が減少することなどを明らかにした。本研究により得られた結果をNuclei in the Cosmos XIV(6月新潟)とInternational Nuclear Physics Conference 2016(9月Adelaide)において発表した。また、関連する研究として、有限温度・有限磁場における非一様カイラル凝縮の相図の研究も行った。この内容で論文執筆を進めていたが、発表には至っていない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
生体バリアの機能分子病理学-細胞間隙における分子通過の制御機構

タイト結合とヒト疾患の関係を検討し,以下の点を明らかにした.1.タイト結合の転写レベルの制御マウステラトーマF9細胞に転写因子HNF-4αを発現させると,occludin, claudin-6,claudin-7のタイト結合蛋白の発現が誘導され,タイト結合機能が上昇した.しかしアドヘレンス結合蛋白E-cadherinとnectinの発現は変化しなかった.一方,HNF-4αの発現によりF9細胞にCDKs阻害因子p21が誘導され,細胞の分裂が抑制された.2.血管内皮細胞のタイト結合血管内皮細胞にclaudin-5の発現を誘導すると,機能的なタイト結合が再構成された.さらにPKAが,claudin-5タンパクを標的分子としてタイト結合のバリア機能を増強し,claudin-5配列内のThr^<207>がTriton-X100非可溶性claudin-5の量やタイト結合の機能に深く関与していた.3.肝細胞のタイト結合肝再生過程では,ギャップ結合とタイト結合がダイナミックに変化する.部分肝切除と初代培養肝細胞を用いて検討したところ,この変化は,おもにp38MAPキナーゼシグナルによって制御されていた.タイト結合蛋白occludinを欠損したマウスから肝細胞を分離し,occludinの機能を検討したところ,この肝細胞では生存シグナルの伝達が低下し,アポトーシス刺激に感受性が高かった.4.その他活性化raf-1は,タイト結合蛋白の発現を低下させ上皮細胞を線維芽細胞様形態へと変化させること,ヒト子宮内膜癌が脱分化するに従い,occludinの発現が低下すること,ヒト口蓋扁桃のタイト結合発現を調べたところ,陰窩上皮に特有なclaudin種を発現していた.タイト結合とヒト疾患の関係を検討し,以下の点を明らかにした.1.タイト結合の転写レベルの制御マウステラトーマF9細胞に転写因子HNF-4αを発現させると,occludin, claudin-6,claudin-7のタイト結合蛋白の発現が誘導され,タイト結合機能が上昇した.しかしアドヘレンス結合蛋白E-cadherinとnectinの発現は変化しなかった.一方,HNF-4αの発現によりF9細胞にCDKs阻害因子p21が誘導され,細胞の分裂が抑制された.2.血管内皮細胞のタイト結合血管内皮細胞にclaudin-5の発現を誘導すると,機能的なタイト結合が再構成された.さらにPKAが,claudin-5タンパクを標的分子としてタイト結合のバリア機能を増強し,claudin-5配列内のThr^<207>がTriton-X100非可溶性claudin-5の量やタイト結合の機能に深く関与していた.3.肝細胞のタイト結合肝再生過程では,ギャップ結合とタイト結合がダイナミックに変化する.部分肝切除と初代培養肝細胞を用いて検討したところ,この変化は,おもにp38MAPキナーゼシグナルによって制御されていた.タイト結合蛋白occludinを欠損したマウスから肝細胞を分離し,occludinの機能を検討したところ,この肝細胞では生存シグナルの伝達が低下し,アポトーシス刺激に感受性が高かった.4.その他活性化raf-1は,タイト結合蛋白の発現を低下させ上皮細胞を線維芽細胞様形態へと変化させること,ヒト子宮内膜癌が脱分化するに従い,occludinの発現が低下すること,ヒト口蓋扁桃のタイト結合発現を調べたところ,陰窩上皮に特有なclaudin種を発現していた.本研究は,タイト結合とヒト疾患の関係を解明するため,タイト結合の転写レベルの制御,血管内皮細胞のタイト結合,肝細胞のタイト結合の三つの柱があり,以下に各々の成果をのべる.1.タイト結合の転写レベルの制御マウステラトーマF9細胞に核内レセプター型転写因子HNF-4αを発現させると,occludin, claudin-6, claudin-7のタイト結合蛋白の発現が誘導され,タイト結合機能の上昇した.しかし,ZO-1, ZO-2, E-cadherinの発現は変化しなかった.これは,HNF-4αが,タイト結合機能と細胞極性の確立に必要であることを示している.2.血管内皮細胞のタイト結合血管内皮細胞にclaudin-1の発現を誘導すると,機能的なタイト結合が再構成されることを示した。さらにMAPキナーゼは,claudin-1タンパクを標的分子としてタイト結合のバリア機能を増強し、claudin-1配列内のThr^<203>がTriton-X100非可溶性claudin-1の量やタイト結合の機能に寄与していることを明らかにした。3.肝細胞のタイト結合肝内胆汁うっ滞或いは肝炎により生産される増殖因子及びサイトカインは、肝細胞のギャップ及びタイト結合に対して様々な影響を与えている.初代培養ラット肝細胞に増殖因子(EGF, TGF-β)及び炎症性サイトカイン(IL-1β)を処置した結果、Cx32及びclaudin-1の発現低下或いはclaudin-2の発現増加がみられ、それら発現変化は、MAPK, PI3K,P38MAPKなどのシグナル伝達経路を介して巧妙に制御されていることが示された.本研究は、タイト結合とヒト疾患の関係を解明するため、タイト結合の転写レベルの制御、血管内皮細胞のタイト結合、肝細胞のタイト結合の三つの柱があり、以下に各々の成果を述べる。1.タイト結合の転写レベルの制御マウステラトーマF

9細胞に核内レセプター型転写因子HNF-4αを発現させると、occludin, claudin-6,claudin-7,JAM-Aのタイト結合蛋白の発現が誘導され、タイト結合機能が上昇した。しかし、Par-3,aPKC, Par-6,CAR, ZO-1,ZO-2,E-Cadherinの発現は変化しなかった。2.血管内皮細胞のタイト結合野生型またはThr207をAlaに置換したclaudin-5の発現を誘導できるラット肺血管内皮(RLE)細胞株を樹立し、claudin-5の発現によって分子サイズ選択的内皮バリアが再構成されること、claudin-5のThr207がPKAによるリン酸化部位であること、そのリン酸化が内皮バリアの制御に重要な役割を果たすことを明らかにした。3.肝細胞のタイト結合タイト結合膜蛋白occludinをマウス肝細胞に一過性あるいは恒常的に発現させて、occludinの役割を検討した。一過性に発現させた細胞では、claudin-1の細胞接着部へのリクルートが認められた。恒常的に発現させた細胞では、claudin-1の増加とclaudin-2の減少が認められ、occludinは、タイト結合におけるclaudin-1とclaudin-2の発現バランスを調節していると考えられた。タイト結合とヒト疾患の関係を検討し,以下の点を明らかにした.1.タイト結合の転写レベルの制御マウステラトーマF9細胞に転写因子HNF-4αを発現させると,occludin, claudin-6, claudin-7のタイト結合蛋白の発現が誘導され,タイト結合機能が上昇した.しかしアドヘレンス結合蛋白E-cadherinとnectinの発現は変化しなかった.一方,HNF-4αの発現によりF9細胞にCDKs阻害因子p21が誘導され,細胞の分裂が抑制された.2.血管内皮細胞のタイト結合血管内皮細胞にclaudin-5の発現を誘導すると,機能的なタイト結合が再構成された.さらにPKAが,claudin-5タンパクを標的分子としてタイト結合のバリア機能を増強し,claudin-5配列内のThr^<207>がTriton-X100非可溶性claudin-5の量やタイト結合の機能に深く関与していた.3.肝細胞のタイト結合肝再生過程では,ギャップ結合とタイト結合がダイナミックに変化する.部分肝切除と初代培養肝細胞を用いて検討したところ,この変化は,おもにp38MAPキナーゼシグナルによって制御されていた.タイト結合蛋白occludinを欠損したマウスから肝細胞を分離し,occludinの機能を検討したところ,この肝細胞では生存シグナルの伝達が低下し,アポトーシス刺激に感受性が高かった.4.その他活性化raf-1は,タイト結合蛋白の発現を低下させ上皮細胞を線維芽細胞様形態へと変化させること,ヒト子宮内膜癌が脱分化するに従い,occludinの発現が低下すること,ヒト口蓋扁桃のタイト結合発現を調べたところ,陰窩上皮に特有なclaudin種を発現していた.