hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クローン技術の実用化が家畜集団の繁殖構造に及ぼす影響

肉用牛の育種で想定される3つの場面を取り上げ、クローン家畜の利用によって期待される効果と弊害を統計遺伝学的手法によって評価した。1.クローン牛のコマーシャル利用クローン牛をコマーシャル利用することで、もっとも期待される効果は、生産物の斉一性が高まることである。そこで、クローン個体の相同性について、個体間の表現型値の相関と個体間の表現型値の差の標準誤差に基づいて検討を加えた。その結果、クローン牛のコマーシャル利用は、確かに生産物の斉一性を向上させるが、この技術のみによって十分な斉一化が可能であるとは言えないこと、とくに多くの経済形質のように中程度の遺伝率を持つ形質では、クローン個体の利用による斉一性の向上は直感的に期待されるほど大きくは望めないことが明らかになった。2.クローン検定クローン技術の育種的利用として、候補畜のクローンを多数作りそれらを検定して候補畜を検定する方法(クローン検定)の選抜の正確度を従来の後代検定と比較した。その結果、クローン検定は、一見すると従来の後代検定よりも正確度が高いように思えるが、優性効果が存在する場合には後代検定の正確度のほうが高くなる場面があることが示された。3.クローン種雄牛の利用まず、クローン種雄牛を作る価値のあるスーパー種雄牛が得られる確率を決定論的モデルによって試算したところ、その確率は遺伝的改良が順調に進んでいる集団では極めて低いことが明らかになった。つぎに実際にクローン種雄牛を供用した場合に生じる集団の遺伝的構造の変化について、現実の黒毛和種の血統データを用いたシミュレーション実験によって検討した。その結果、ドナー種雄牛を利用した集団に対して、そのクローン種雄牛を供用すると、集団の有効な大きさの縮小や遺伝的多様性の低下など育種を行っていく上で望ましくない変化が生じることが予想された。本年度は、(1)クローン技術の育種への利用に関する基礎情報の収集、(2)わが国の肉用牛の代表的な品種である黒毛和種における繁殖構造の調査、(3)黒毛和種の育種においてクローン生産された種雄牛が利用されることで生じる繁殖構造の変化に関する試算、の3点について研究を進めた。得られた結果の概要は、以下の通りである。(1)クローン技術の育種への利用に関する基礎情報の収集主に国外における文献を収集し、クローン技術の育種への利用方法について調査した。その結果、クローン技術は、(1)同一の遺伝子構成を持つ個体が得られることによる選抜の正確度の向上を利用したクローン検定、(2)種畜の選抜に際して、候補畜のクローン個体について枝肉成績を評価できることを利用した検定、などの利用方法が考えられているが、わが国のように種畜(とくに種雄牛)のクローンを生産し、育種に利用しようとする発想はほとんどないことが明らかになった。(2)黒毛和種における繁殖構造の調査アニマルモデルBLUP法による種牛評価が開始されて以来(1991年)、黒毛和種の遺伝的に有効な個体数(集団の有効な大きさ)は激減し、現時点では20を下回っていることが明らかになった。その主な原因は、能力の優れた種雄牛に供用が集中したことにあると考えられた。(3)黒毛和種の育種においてクローン生産された種雄牛が利用されることで生じる繁殖構造の変化集団の有効な大きさN_eは、種雄牛の数N_mと種雄牛当たりの後代数の変動係数V_kを用いて、近似的にN_e=4N_m/(V^2_k+1)と書ける。

もし、黒毛和種集団で供用が集中している種雄牛のクローンを生産し、それらを種雄牛として供用すれば、V_kが増大し、集団の有効な大きさは減少する。供用頻度について上位数頭の種雄牛をクローン増殖することを想定して試算したところ、集団の有効な大きさは激減することが明らかになった。肉用牛の育種で想定される3つの場面を取り上げ、クローン家畜の利用によって期待される効果と弊害を統計遺伝学的手法によって評価した。1.クローン牛のコマーシャル利用クローン牛をコマーシャル利用することで、もっとも期待される効果は、生産物の斉一性が高まることである、そこで、クローン個体の相同性について、個体間の表現型値の相関と個体間の表現型値の差の標準誤差に基づいて検討を加えた。その結果、クローン牛のコマーシャル利用は、確かに生産物の斉一性を向上させるが、この技術のみによって十分な斉一化が可能であるとは言えないこと、とくに多くの経済形質のように中程度の遺伝率を持つ形質では、クローン個体の利用による斉一性の向上は直感的に期待されるほど大きくは望めないことが明らかになった。2.クローン検定クローン技術の育種的利用として、候補畜のクローンを多数作りそれらを検定して候補畜を検定する方法(クローン検定)の選抜の正確度を従来の後代検定と比較した。その結果、クローン検定は、一見すると従来の後代検定よりも正確度が高いように思えるが、優性効果が存在する場合には後代検定の正確度のほうが高くなる場面があることが示された。3.クローン種雄牛の利用まず、クローン種雄牛を作る価値のあるスーパー種雄牛が得られる確率を決定論的モデルによって試算したところ、その確率は遺伝的改良が順調に進んでいる集団では極めて低いことが明らかになった。つぎに、実際にクローン種雄牛を供用した場合に生じる集団の遺伝的構造の変化について、現実の黒毛和種の血統データを用いたシミュレーション実験によって検討した。その結果、ドナー種雄牛を利用した集団に対して、そのクローン種雄牛を供用すると、集団の有効な大きさの縮小や遺伝的多様性の低下など育種を行っていく上で望ましくない変化が生じることが予想された。
高等植物のシンク器官発達における糖シグナリングの役割

シロイヌナズナを用いて独自に作製したアクティベーションタギングラインからのシンク器官の発達異常を示す突然変異体unsの単離と解析を進めた。劣性の変異株uns1では、切り取り葉を糖処理したときに通常見られる糖誘導性遺伝子の発現誘導のなかで、β-アミラーゼとカルコン合成酵素遺伝子の発現が特異的に低下し、ADPグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子の発現誘導は影響されなかった。uns1変異株は葉のクロロフィル含量が低下し光合成機能の発達異常や稔性の低下による種子収量の低下などの表現型を示すことから、UNS1が糖シグナルの受容もしくは伝達に中心的な役割を果たし、葉が糖の転流を受けシンクとして発達していく過程や花粉または胚などのシンクの発達過程に重要な因子であることを示唆する。またuns1変異は4番染色体の分子マーカーGA1から5cM,mi87から3.5cMの距離に位置することを明らかにした。一方、同タギングラインから、種子サイズの大きな突然変異体#C712を単離した。この変異体では花の構造に異常が見られ自家受粉の効率が低下し低稔性を示す。しかし発達できた胚は野生型より30%ほど大きい。また、切り取り葉でのβ-アミラーゼ遺伝子の糖誘導性が高い。現在戻し交配等を進め、複数の表現型の連鎖やT-DNAによりタギングの可能性などを解析している。シロイヌナズナのCol-0系統を用いて、独自に作製したアクティベーションタギングラインの中からシンク器官の発達異常変異体を単離するため、葉の機能発達異常、低稔性や雄性不稔性、種子の発達異常、などの形質を示す突然変異体のスクリーニングを試み、候補となる劣性もしくは優性の変異体を選抜し、さらにこの中から切り取り葉での糖誘導性のアミラーゼ活性上昇やアントシアニン蓄積増加などに異常がみられる変異体を2次選抜した。これらスクリーニングされた変異体は、糖シグナリングに異常がみられると推定されることからuns(unusual sugarresponse)変異体と命名し、シロイヌナズナのストックセンターに登録した。uns1変異は劣性の変異だが、変異とT-DNAの挿入は連鎖していなかった。uns1は稔性が低く自家交配するものの次世代の種子の収量は顕著に低下していた。切断葉でのβ-アミラーゼやアントシアニン合成系遺伝子の糖誘導性発現のレベルが低下していた。in vitro培地上での生育は、糖濃度が低いときに葉のクロロフィル含量が低下しpaleleaf表現型を示すが、糖濃度の増加に従いその表現型は軽減され、またこのときearly flowering表現型が観察された。一方、土栽培条件下ではpaleleaf表現型を示さないが、late flowering表現型を示した。uns16変異体とuns21変異体の表現型も、葉のクロロフィル含量が野生型植物体より低下する生育条件や切り取り葉における糖応答性などはuns1変異体と良く似ていた。しかしこの他いくつかの類似点と相違点が観察された。uns16変異体は稔性や花成、劣性変異であるなどの点がuns1変異体と類似していたが葉の形態がuns1と明らかに異なった。uns21変異体は、半優性の変異であり、ホモの種子は発芽せず、花成は正常、稔性が正常、であることなどがuns1やuns16変異体と異なっていた。これらの変異体はいずれも別個の遺伝子の変異であると推定され、その遺伝子は糖シダナリングがシンク機能に積極的に関わる部分に関連が深い役割をもつと推定される。
複素統計多様体上のコントラスト関数の構成と応用

本研究の目的は情報幾何学に現れる幾何構造を再検討し,その基礎理論を構築することであった.従来の情報幾何学と微分幾何学の一般論を統合することにより,複素統計多様体上にコントラスト関数を構成し,複素多様体上の様々な共形構造の解明を目標とした.特に今年度はHermit計量を持つ統計多様体上にコントラスト関数を構成し,その幾何学的性質を解明し,さらにその結果を応用することであった.Hermit計量を持つ複素多様体上にコントラスト関数を構成することは今一歩で結果が出ていないが,今年度はコントラスト関数の応用については数多くの結果が得られた.まず第1の結果として,コントラスト関数から決まる距離型の関数を用いて,(-1)-共形平坦な統計多様体上にVoronoi図を構成した.これは,コントラスト関数から自然に決まる曲率型のテンソルと,統計多様体の共形平坦性、具体的なVoronoi図構成のアルゴリズムの性質など,様々な要因が非常に上手く合さった結果であり,大変に有意義なものと思われる.また,ガンマ分布族のなす統計多様体について,その幾何学を解明した.特に幾何学的なダイバージェンスと統計学的なダイバージェエンスの関係,エントロピーの幾何学的意味など,多くの結果が得られた.今回得られた結果は,統計的推論や検定理論,情報理論などへのさらなる応用が期待されている.今後の研究が待たれるところである.Hermite計量を持つ統計多様体上のコントラスト関数も,近日中に結果が得られるものと期待している.本研究代表者のこれまでの研究によって,Norden計量を持ち双対正則射影平坦な統計多様体上には,複素アファインはめ込みを用いてコントラスト関数を構成できることがわかっていた.この手法を拡張させ正則共形平坦性,正則射影平坦性を持つNorden多様体上にコントラスト関数を構成した.またこの問題を解決するために,複素共形構造を特徴付ける正則共形曲率テンソルを構成し,複素余次元2のアファインはめ込みの構成を行った.正則共形曲率テンソルはSingh A.L.およびSingh S.D.の研究によって提唱されていたが,本研究では彼らの定義を修正し,アファイン微分幾何学などにより自然に応用できるものにした.さらに幾何学的ダイバージェンスと呼ばれるコントラスト関数の場合に,そのBartlettテンソルを決定した.このテンソルはアファインはめ込みの存在や正則共形平坦性などの様々な平坦性などとも密接な関係があり,アファインはめ込みの構成とBartlettテンソルの決定は必要十分な関係にあることもわかる.また関連した研究として,Norden計量を持つ複素統計多様体の構成を行った.具体的には任意の統計多様体に対して,その接束への水平持ち上げから常にNorden計量を持つ複素統計多様体が得られることが分かった.これらの研究成果は学術雑誌への投稿準備中である.また接束上の統計多様体に関しては現在も関連研究を継続している.本研究の目的は情報幾何学に現れる幾何構造を再検討し,その基礎理論を構築することであった.従来の情報幾何学と微分幾何学の一般論を統合することにより,複素統計多様体上にコントラスト関数を構成し,複素多様体上の様々な共形構造の解明を目標とした.特に今年度はHermit計量を持つ統計多様体上にコントラスト関数を構成し,その幾何学的性質を解明し,さらにその結果を応用することであった.Hermit計量を持つ複素多様体上にコントラスト関数を構成することは今一歩で結果が出ていないが,今年度はコントラスト関数の応用については数多くの結果が得られた.まず第1の結果として,コントラスト関数から決まる距離型の関数を用いて,(-1)-共形平坦な統計多様体上にVoronoi図を構成した.これは,コントラスト関数から自然に決まる曲率型のテンソルと,統計多様体の共形平坦性、具体的なVoronoi図構成のアルゴリズムの性質など,様々な要因が非常に上手く合さった結果であり,大変に有意義なものと思われる.また,ガンマ分布族のなす統計多様体について,その幾何学を解明した.特に幾何学的なダイバージェンスと統計学的なダイバージェエンスの関係,エントロピーの幾何学的意味など,多くの結果が得られた.今回得られた結果は,統計的推論や検定理論,情報理論などへのさらなる応用が期待されている.今後の研究が待たれるところである.Hermite計量を持つ統計多様体上のコントラスト関数も,近日中に結果が得られるものと期待している.
ヒアルロン酸による関節破壊抑制のメカニズム解析

ヒアルロン酸をサイトカイン刺激軟骨細胞に添加することで軟骨基質分解酵素の発現が抑制され、その作用は使用濃度、分子量に比例して増加することを細胞レベルで確認した。また、手術によるラット変形性膝関節症モデルの膝へのヒアルロン酸投与試験においても同様に濃度依存的、分子量依存的な関節保護効果を確認した。ヒアルロン酸の早期変形性関節症治療薬としての可能性を見出した。変形性関節症(OA)は、整形外科領域では最も頻度の高い骨・関節疾患である。現在、関節破壊の進行例に対し細胞外マトリックス成分であるヒアルロン酸の関節内投与治療が行われている。その作用は、ヒアルロン酸の保水性および弾性保持によると考えられているが、ヒアルロン酸の作用に関して興味深い論文が最近報告された(Am J Sports Med. 2009 ; 37 Suppl 1 : 81S-87S.)。これは、羊OAモデルにOA手術時からヒアルロン酸を経時的に投与すると12週目の時点において、ヒアルロン酸投与群では膝関節の軟骨表層面の破壊抑制が見られた、すなわち関節破壊が起こる早期からのヒアルロン酸投与がOAの進行を抑制した報告である。このほかにもヒアルロン酸が炎症を抑制する方向に働くとする培養細胞での報告がある。今回、我々はヒアルロン酸によるアグリカナーゼ遺伝子の発現抑制メカニズムを解明するとともに変形性関節炎の早期治療薬としての可能性を追求するべく、今年度以下の研究を実施した。1.ヒアルロン酸の分子量と炎症性サイトカインによるアグリカナーゼ発現抑制効果との関連の検討分子量の異なるヒアルロン酸を軟骨細胞(OUMS-27)炎症性サイトカイン(IL-lbeta、TNF-alpha)刺激試験系に添加しADAMTS mRNAの発現をreal-time RT-PCR法により定量的に評価した。その結果ヒアルロン酸の分子量が300、800、2700kDaと大きくなるほどADAMTS4、9のmRNA発現量が減少した。特にADAMTS9mRNA発現抑制にはヒアルロン酸の前処理が有効であった。ヒアルロン酸添加濃度の検討では、低濃度ではその抑制効果は確認されず、1mg/ml以上で抑制効果が確認された。2.ラット変形性関節炎モデルへのヒアルロン酸投与による関節破壊抑制効果の検討ラット膝関節の前十字靱帯および内側側副靭帯を切除後に内側半月板を除去し、ラット変形性関節炎モデルを作製した。比較として反対側肢には膝蓋靭帯切開までの処置を行うsham手術例を作製した。今年度はまず手術群と非手術群における関節破壊の程度を比較した。我々はヒアルロン酸(HA)による変形性関節炎(OA)早期病態でのアグリカナーゼ遺伝子の発現抑制を来すメカニズムを解明するとともに変形性関節炎のアップストリーム治療薬としての可能性の追求を目的とし、以下の研究を実施した。1.HAの分子量と炎症性サイトカインによるアグリカナーゼ発現抑制効果との関連の検討変形性関節炎の初期には関節軟骨を形成する細胞外マトリックスの分解が炎症性サイトカインの刺激により発現誘導されたアグリカナーゼにより生じていると考えられる。HAには軟骨保護作用、炎症抑制作用が確認されているが軟骨細胞でのアグリカナーゼ(ADAMTSファミリー)発現抑制については充分に解析が進んでいない。そこで分子量の異なるHAを軟骨肉腫細胞株(OUMS-27)炎症性サイトカイン(IL-1beta、TNF-alpha)刺激試験系に添加しADAMTSファミリーmRNAの発現抑制をreal-time RT-PCR法により定量的に評価した。その結果同一濃度ではヒアルロン酸の分子量が300、800、2700kDaと大きくなるほどADAMTS4、9のmRNA発現量が減少してくることを確認した。特にADAMTSgmRNA発現抑制にはヒアルロン酸の前処理が有効であることを確認した。ヒアルロン酸添加濃度を検討した所、1mg/mlで抑制効果が確認された。ヒト膝関節内ヒアルロン酸濃度は2-5mg/ml程度であることを考慮すれば生理的濃度域での投与が有効であることの傍証と考えられる。2.ラットOAモデルへのヒアルロン酸投与による関節破壊抑制効果の検討ラット膝関節の前十字靱帯および内側側副靭帯を切除後に内側半月板を除去し、ラットOAモデルを作製した。比較として反対側肢には膝蓋靭帯切開までの処置を行い、sham手術例を作製した。ラットOAモデルの膝関節腔内にHAを投与し、関節軟骨保護効果をマンキンスコア測定により比較した。その結果ヒアルロン酸の分子量が300、800、2700kDaと大きくなるほど関節軟骨保護効果が大きいことを確認した。3-炎症性サイトカイン刺激下でのメカニカルストレスのアグリカナーゼ発現への影響の解析炎症性サイトカイン(IL_1beta、TNF-alpha)刺激条件下でメカニカルストレスを加えるとADAMTS4、5、MMP-13mRNA発現が有意に減少することを確認した。

この作用には阻害剤を用いた解析からメカノリセプターが関与すること、細胞内シグナル因子としてカルシウムの関与があることを明らかにした。我々はヒアルロン酸(HA)による変形性関節炎(OA)早期病態でのアグリカナーゼ遺伝子の発現抑制メカニズムを解明するとともに変形性関節炎のアップストリーム治療薬としての可能性の追求を目的とし、以下の研究を実施した。1.ラットOAモデルへのヒアルロン酸投与による関節破壊抑制効果の検討ラットOAモデルの膝関節腔内にHAを投与し、関節軟骨保護効果をOARSIスコア測定により比較した。その結果ヒアルロン酸の分子量が300、800、2700kDaと大きくなるほど関節軟骨保護効果が大きいことを確認した。また主要な軟骨基質成分であるアグリカンの分解断端の減少を免疫組織染色により確認した。2.炎症性サイトカイン刺激下でのメカニカルストレスのアグリカナーゼ発現への影響の検討炎症性サイトカイン(IL-1beta、TNF-alpha)刺激条件下でメカニカルストレスを加えるとADAMTS4、5、MMP-13mRNA発現が有意に減少することを確認した。更にメカノセンサーであるTRPVファミリーの関与を明らかにした。研究業績に記載した3項目を3年間で解析することを当初の予定としていた。開始2二年間で3項目に関してほぼ必須とされるデータを取得している。24年度が最終年度であるため、記入しない。軟骨細胞に対するメカニカルストレスの影響をカスケードの下流ではなく、メカノリセプターとそのシグナル分子の段階で行う。また同様の系へのヒアルロン酸の影響を明らかにしていきたい。より初期病変へのアップストリーム治療法の確立に役立てる為に分子レベルでのさらに網羅的な解析を行いOAの病変とヒアルロン酸、メカニカルストレスの関係を明らかにしていきたい。
好気的微生物反応を利用した生物系廃棄物の燃料化

本研究では,まず生物系廃棄物は乾燥すれば燃料として利用可能な発熱量を保有することを試料分析に基づいて示した。また,好気的微生物反応を利用すれば乾燥が効率よく行えることを理論的に示した。続いて,乾燥という物理現象について既存の数理モデルを整理して実験結果と合致するシミュレーションプログラムを作成した。また,様々な実験を通して好気微生物反応における有機物分解,酸素消費,発熱および温度変化に関する数理モデルを構築した。以上の結果を踏まえ,好気的微生物反応を利用した生物系廃棄物の乾燥をシミュレーションするプログラムを作成した。実験結果と比較の結果,妥当なプログラムが作成できたことが確認できた。本研究は、既存の堆肥化技術を応用した新しい固形燃料製造技術の開発を目指すものである。具体的には堆肥化反応(好気的微生物反応)で普遍的に観察される「有機物分解に伴う発熱・昇温」と「好気的条件を維持するための通気」を効果的にコントロールすることによって効率よく対象となる生物系廃棄物を乾燥処理して燃料として価値のある製品を得る方法を検討するものである。本研究では、1.生物系廃棄物の発熱量測定、2.対象廃棄物からの水分蒸発の定式化、3.反応材料の熱的特性および生物反応特性の把握、ならびに4.反応のシミュレーションプログラムの構築とその妥当性の検証を柱としている。このうち、1.については昨年度中に検討を終え、対象とした生物系廃棄物は乾燥させれば燃料として十分利用可能な発熱量を保持していることが把握でき、本研究が目指す技術が幅広い生物系廃棄物に適用可能であることを示した。また、2.については昨年度「反応しない材料=発熱しない材料」を用いた乾燥実験で乾燥過程を定式化したので、本年度は「反応する材料=発熱する材料」で乾燥実験を行い、昨年度の結果と比較を行った。その結果、反応する材料を用いた場合には通気や周辺環境に比べて温度が高くなるため、反応しない材料に比べて乾燥が早く進むことが確認できた。また、通気量と乾燥速度の関係についても調べ、通気量が多い方が短時間で乾燥は進むが、温度上昇が鈍くなるために単位通気量あたりの水分持出量は少なくなることも明らかとなった。3.についてはすでに材料分解量、酸素消費量ならびに発熱量の関係を明らかにしており、今年度はこれに加えて酸素消費と材料昇温の関係についても把握した。また、4.を行うに当たりモデル廃棄物の比熱測定も行った。4.についてはプログラムの作成に着手したところであり、最終年度に完成させたいと考えている。本研究は、堆肥化技術を応用した新しい固形燃料製造技術の開発を目指すものである。具体的には堆肥化反応(好気的微生物反応)で普遍的にみられる「有機物の生物分解に伴う発熱・昇温」と「好気的条件を保持するための通気」を効果的に制御することにより効率よく廃棄物を乾燥処理して燃料価値のある製品を得る方法を検討するもので、1.生物系廃棄物の発熱量評価、2.対象材料からの水分蒸発の定式化、3.反応材料の熱的特性および生物反応特性の把握、ならびに4.反応のシミュレーションとその妥当性の検証を柱として研究を推進することとしている。このうち、1.については数種類の生物系廃棄物について発熱量を測定した。いずれも乾燥させれば燃料として十分利用可能な発熱量を保持していることが把握でき、本研究で目指す技術は幅広い生物系廃棄物に適用できる可能性があることを明らかにできた。2.については短時間では堆肥化反応(生物分解反応)をしない材料(木くず)を用いた乾燥実験を行い、反応に伴う発熱がない場合の乾燥過程について定式化と検証を行った。その結果、材料乾燥速度には材料含水率、通気の湿度ならびに反応温度が大きく関わることが明らかとなった。また、これら影響因子の影響を数理モデルとして示すことができた。3.については生物反応特性のうち材料分解量、酸素消費量および発熱量との関係を実験的に把握できた。これにより、2.の定式化を、堆肥化反応をする(反応中に発熱・昇温のある)材料を用いた場合にも適用できる形に発展させる途が開けた。4.については1.3.の検討が進んだ段階で検討する予定である。本研究の目的は,生物系廃棄物を乾燥すれば燃料として利用可能な発熱量を保有することを明らかにし,また当該廃棄物を好気的微生物反応に伴う発熱を利用して乾燥させる場合の運転管理条件と乾燥・反応の進行との関係をシミュレーションするためのプログラムを提示することであった。なお,本研究においてはこの反応を行う反応器として通気反応塔に絞って検討することとした。初めに熱量計を用いていくつかの生物系廃棄物試料の発熱量を測定し,それぞれが燃料として利用可能な程度に発熱量を保有していることを示した。また,シミュレーションプログラムの構築に関しては,まず微生物反応がない単純乾燥の場合について,シミュレーションプログラムの作成と実験を行い,両者を比較しながら精度よいシミュレーションプログラムを構築した。

次いで,このプログラムに微生物反応に関わる関数を組み込むため,材料の比熱ならびに有機物分解にともなう酸素消費量と発熱量との関係を実験的に明らかにした。以上の結果を総合して,好気的微生物反応を伴う乾燥と反応の過程をシミュレーションするプログラムを作成した。また,モデル生物系廃棄物を使用した乾燥実験を行って乾燥と反応の時間進行を調べた。実験結果とシミュレーション結果を比較したところ,材料の乾燥状況や温度変化など,実験値に近いシミュレーション結果を得ることができた。この研究の成果を活用すれば,試行錯誤的に数多くの実験を行わなくても,通気反応塔やこれと類似の乾燥形式を持つ反応器で生物系廃棄物を乾燥させる場合の適正な運転管理条件や適正な反応器の設計ができるようになる。環境・衛生工学当初計画で平成25年度は2つのサブテーマを掲げていた。1つ目は「反応材料の熱的特性および生物反応特性の把握」であった。これは後に着手するシミュレーションプログラム構築の基本となるものである。このうち、熱的特性については比熱と発熱量を把握できているため当面はこれで十分である。一方、生物反応特性については有機物分解、酸素消費、発熱および材料の温度上昇の関係は把握できた。ただし、有機物含有量と酸素消費速度や発熱速度の関係についてはまだ十分把握できていない部分もあるため、最終年度に検討を行う。2つ目は「反応のシミュレーションと妥当性の検証」であった。このうちシミュレーションプログラムについては作成に着手している。ただ、一部に不具合があり完全なものにするにはもう少し時間がかかる見込みである。一方、妥当性を検証するのに必要な乾燥実験についてはデータを取得済みのため、おおむね終了していると言ってよい。当初計画で平成24年度は3つのサブテーマを掲げて研究を遂行することとしていた。1つめは、各種生物系廃棄物の発熱量評価であった。当研究室で模擬廃棄物として使用しているドッグフードと木くずの混合物、その堆肥化物、下水汚泥、生ごみ、豚ふんおよびその堆肥化物について発熱量を調べた結果、いずれも乾燥状態では燃料として使用可能な発熱量を有することがわかった。2つめは、生物系廃棄物からの水分蒸発の定式化であった。まずは生物分解せず自己発熱のない材料を想定し、材料含水率、通気中相対湿度および温度が乾燥速度に影響すると仮定した数理モデルを構築した。これに基づいて通気反応塔(カラム型反応器)内での乾燥の進行をシミュレーションするプログラムを作成した。そのシミュレーション計算結果を、短期間では生物分解せず自己発熱のない木くずを材料として用いたカラム乾燥実験の結果と比較し、シミュレーションが比較的精度よく行えることを確認した。なお、この部分の成果については廃棄物資源循環学会の研究発表会において口頭発表するとともに、雑誌の記事として基本的な考え方を紹介した。3つめのサブテーマは反応材料の熱的特性および生物反応特性の把握であった。このうち熱的特性については検討することができなかった。
メタボローム解析ビックデータによる機能性ベース食品全成分評価システムの構築と応用

生活習慣病の増加等により、食品機能性に対する需要が高まっている。食品の最たる特徴は、多彩な成分の含有であり、この点に機能性利用の潜在的な発展性が存在する。一方、現在の研究は、含有成分の一端に由来するものが主流であり、全体像は手つかずである。その主因は、食品中の膨大な成分の機能性を網羅的に評価できないことにあった。本研究では、メタボローム解析により取得した成分データを化合物ライブラリーとして使用することで、食品全成分を機能性ベースで網羅的に評価できる新規システムを構築する。また、その応用により、複数食品の混在下及び生体内代謝で生じる機能性成分を解明し、現実の食に即した機能性成分の提示を試みる。
高次構造変換によるヒアルロン酸糖鎖の受容体識別機構

ヒアルロン酸は、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に連結した単純な組成を持つ高分子多糖で、糖鎖-糖鎖間の相互作用により、ナノスケールのフィブリルを形成することが知られている。また、ヒアルロン酸はその濃度や鎖長によって高次構造と物性が著しく変化して、その単調な組成からは想像し得ないほど多彩な生物活性が発揮されると考えられる。そこで本研究において、そのような多様な構造変化に関する基礎的情報を収集するとともに、受容体によるリガンド認識や活性が巧みに制御される機構について解明を試みた。走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いて、ヒアルロン酸の濃度や鎖長を変化させた際の構造変化について解析を行った。その結果、ヒアルロン酸の濃度や糖鎖長に相関して球状構造の直径が増加することを明らかにした。さらに、表面プラズモン共鳴法(SPR)により、ヒアルロン酸糖鎖長や濃度、更には結合分子との会合状態が受容体のリガンド結合に与える影響について動力学的解析を行った。ヒアルロン酸や結合分子との会合体をセンサーチップ上に固定し、アナライトとしてヒアルロン酸受容体CD44融合蛋白質プローブ(CD44Ig)を用いて、リガンドー受容体相互作用に関する動力学的解析を行った結果、CD44Igはヒアルロン酸結合分子であるバーシカンの濃度増加に依存してヒアルロン酸に対する結合が増強した。この結果から、ヒアルロン酸とその結合分子との会合状態によるヒアルロン酸構造変化が、受容体のヒアルロン酸認識の促進に働くことが示唆された。更に、CD44発現細胞を用いて、SHAP-ヒアルロン酸複合体を被覆した基質に対する細胞接着性を評価した。その結果、ヒアルロン酸単独を被覆した基質に比して、より強い細胞接着活性を示すことを明らかにした。このことは、ヒアルロン酸結合分子SHAPによる高分子会合体の形成が、CD44とヒアルロン酸の相互作用を介した細胞認識を増強することを示唆している。ヒアルロン酸糖鎖の受容体識別機構を解明するため、表面プラズモン共鳴法による動力学的解析を行った。本実験に用いるアナライトとして、CD44ヒアルロン酸受容体の細胞外領域をイムノグロブリンFc領域に結合した融合タンパク質を用いた。融合タンパク質は、発現ベクターを遺伝子導入した動物細胞の培養上精からプロテインGセファロースアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより単離・精製した。またRHAMMヒアルロン酸受容体はヒアルロン酸結合ドメインであるカルボキシル末端側領域をGST融合タンパク質として大腸菌内で発現後、細胞可溶化画分から定法に従い単離・精製した。更に、ヒアルロン酸結合性細胞外マトリックス分子としてバーシカンを対象に、ヒアルロン酸-受容体相互作用に対する増強効果を検討するため、バーシカンのアミノ末端領域に存在するヒアルロン酸結合ドメインをヒスチジンタグとの融合タンパク質として動物細胞で発現した。バーシカン融合タンパク質は、培養上精からニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより単離・精製した。一方、ヒアルロン酸標品として糖鎖長の異なる三種類(平均分子量1000kDa,150kDa,6.8kDa)をビオチン化してストレプトアビジンセンサーチップ上に固相化した。これら糖鎖長の異なるヒアルロン酸に対する二種のヒアルロン酸受容体の結合を表面プラズモン共鳴装置により解析した。その結果、何れのヒアルロン酸受容体融合タンパク質も、ヒアルロン酸固相化センサーチップに親和性を示した。

この結果を受け、現在、詳細な動力学的解析を行っており、さらに今後バーシカンヒアルロン酸結合ドメイン共存下での結合の変化についても解析する予定である。ヒアルロン酸糖鎖長と高次構造との関係解明を目的に、糖鎖長の異なる3種のヒアルロン酸(平均分子量1000kDa,6.8kDa,1.7kDa)をマイカ基盤上に塗布し、乾燥後、原子間力顕微鏡による三次元構造の観察を行った。1μg/mlの低濃度では、ヒアルロン酸は何れのサイズにおいても直径50nm以下の球状構造として観察できた。球状構造のサイズはヒアルロン酸の濃度の上昇に伴って増加する傾向が認められた。しかしながら、10μg/ml以上の濃度においては球状構造のサイズ上昇は認められなかった。本研究の結果において、ヒアルロン酸が球状構造として観察されたことから、ヒアルロン酸とマイカ基盤との親和性を変化させることにより、ヒアルロン酸構造を変化させて観察できることが推察された。一方、表面プラズモン共鳴装置によりヒアルロン酸標品に対する受容体蛋白質の親和性について検討した。上記糖鎖長の異なる三種類のヒアルロン酸標品をビオチン化してストレプトアビジンセンサーチップ上に固相化した。これら糖鎖長の異なるヒアルロン酸に対する受容体CD44の親和性を検討した結果、何れのヒアルロン酸標品に対しても結合が認められた。しかしながら、ヒアルロン酸結合分子であるバーシカンプロテオグリカンの共存下及び非共存下でCD44のヒアルロン酸親和性を評価した結果、今回検討した結合条件下では、ヒアルロン酸固相化センサーチップに対するCD44の親和性に、バーシカンの相加的並びに相乗的効果は認められなかった。今回の結果から、ヒアルロン酸、CD44、バーシカンの量的関係を更に詳細に検討することの重要性が示唆された。
角膜上皮再生,治療における水晶体上皮由来増殖因子の影響について

LEDGF(lens epithelium derived growth factor)は近年精製され,growth/adhesive factorとしてだけでなく,survival factorとして作用する事が知られ,注目を集めている.免疫染色によりLEDGFが角膜にも存在することは確認されているが,角膜におけるLEDGFの作用は不明であった.本研究では正常ラットおよび糖尿病角膜症モデルラットの角膜上皮を全剥離し,LEDGFの点眼投与による創傷治癒に対する効果を検討した.糖尿病角膜症モデルラットは50%ガラクトース含有食を8週間投与して作製した.n-heptanolにより角膜輪部に至るまで角膜上皮細胞を全層剥離させたフルオレスセイン染色像を12時間毎に撮影し、上皮欠損の占める割合で治癒過程を評価した。対照は,LEDGFの融合蛋白であるGST(Glutamate S transferase)投与群とLEDGF-antibody投与群とした.正常ラットの結果では,LEDGF-antibody投与群は他群よりも有意に治癒が遅延し,糖尿病角膜症モデルでは有意にLEDGF投与群の治癒が早かった.LEDGFは角膜においても新規な創傷治癒薬となることが期待される.以上の結果は水晶体研究会,日本眼科学会にて報告した.今後,Western blotによる比較,角膜培養細胞における解析を加えていく予定である.
クロザピン誘発性流涎症の発現機序およびリスク因子解明を目的とした研究

【研究目的】本研究では、クロザピン(CLZ)の副作用の中でも発現率の高い、CLZ誘発性流涎症に着目し、流涎症の重症度に影響を与える因子を探求することを目的に研究を実施した。【研究方法】測定系の構築:クロザピンならびに代謝物(デスメチル体ならびにオキシド体)の血中濃度ならびに唾液中濃度を測定法(UPLC)を構築するため、前処理、測定方法を検討した。また、血中濃度などに影響を与える可能性がある薬物トランスポーターの遺伝子多型の測定法も検討した。【研究結果】唾液ならびに血液中薬物濃度の測定方法を構築するため、前処理・測定溶媒・測定方法を検証した結果、下記の測定系を構築した。1検体に酢酸エチルとトリスバッファーを加え、10分間攪拌させて後で前処理を行った後、上層を抽出2抽出液にリン酸バッファー(pH=2)を加え、10分間攪拌させて後で前処理を行った後、下層を抽出3抽出液を窒素ガスで乾固(40°C条件下)した後、溶離液で再溶解34mMリン酸緩衝液(pH=2)とアセトニトリル(73%/27%)の混合液を移動相とし、測定遺伝子多型の測定方法を構築するため、測定方法を検証した結果、下記の測定系を構築した。検体(全血)からゲノムDNAを抽出した後、ライトサイクラーを使用し、Premix Ex Taq、TaqManプローブ、テンプレートDNAでPCR反応液を調製し、PCR反応を行うことで、ABCB1の遺伝子多型の解析が可能となった。【研究成果】本検討で、各測定方法が構築されたことで、前向きの臨床研究が実施可能となった。本研究は、クロザピンと代謝物の血液中・唾液中濃度と流涎症の自記式評価尺度の相関性を評価することで、流涎症の原因となる物質と重症度に影響を与える因子の同定を目的としている。現在、当院の自主臨床研究審査委員会の承認を得て、臨床研究を実施中であり、データが蓄積され次第、報告する予定である。
ニューモシスチス・カリニの薬剤耐性に関する研究

ニューモシスチス・カリニ(Pc)は日和見な病原体であり、HIV感染症を含む免疫不全症例において重篤な感染症を惹起する。Pc肺炎に対する治療・予防の第一選択として、ST(sulfamethoxazole/trimethoprim)合剤が利用される。同剤を構成するsulfamethoxazole及びtrimethoprimの標的は、葉酸の合成経路における主要酵素であるdihydropteroate synthase(DHPS)及びdihydrofolate reductase (DHFR)である。私達は、これまでに、PcにおけるDHPS領域のアミノ酸変異がPc肺炎に対するST合剤の治療成績低下と関連することを報告した。今回、PcにおけるDHFR領域のアミノ酸変異の有無とPc肺炎に対するST合剤の治療結果との関連性を解析した。その結果、同領域のアミノ酸変異は認められたが、ST合剤による治療成績低下との関連性は見られれなかった。今後は、さらに解析する検体及び症例数を増やして、薬剤標的酵素のアミノ酸変異とST合剤による治療成績低下との関連性を検討していくことが重要である。Pcと同様に酵母様真菌に属するクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cn)も、気道を侵入門戸として免疫不全症例に対して重篤な感染症を惹起する。今回、HIV感染症を含む免疫不全症例におけるPc及びCnの気道定着の状況を検討した。その結果、HIV感染症に対して、Pcの気道定着例を認めたが、Cnの気道定着例は見られなかった。それ故、気道定着を考慮して、Pc肺炎の診断は検査結果と臨床所見に基づいて総合的に判断する必要がある。平成15年8月より、タイ国ランパン病院においてHIV感染者を対象としたコホート研究を開始し、喀痰誘発法を用いたPcの薬剤標的酵素のアミノ酸変異の有無を解析してる。現在、対象症例を登録中である。開発途上国におけるニュモシスチス・カリニ(Pc)肺炎症例より呼吸器検体を採取する方法として、現地における医療経済情勢の見知から喀痰誘発法を選択した。同法によって得られる喀痰を利用してPcにおけるサルファ剤標的酵素であるdihydropteroate synthase(DHPS)の核酸増幅が可能であるかを検証した。具体的な方法としては、当研究所附属病院において新規に診断治療を受けられたPc肺炎症例(気管支肺胞洗浄液を用いてPc肺炎の診断が確定された)3例を対象とした。Pc肺炎の診断確定後に、超音波ネブライザーを利用して3%食塩水を吸入して喀痰を誘発し、検体として喀痰を前半と後半に分けて採取した。粘液溶解処理・核酸抽出処理を施行した後にDHPS領域の核酸を増幅するためにnested PCR反応を行った。得られたPCR産物を用いてDHPS領域の塩基配列及びアミノ酸配列の解析を施行し、遺伝子変異及びアミノ酸変異の有無を検討した。その結果、喀痰として検体が得られた場合、nested PCR法によってDHPSの塩基配列及びアミノ酸配列の解析が可能であった。経時的に検体を採取した場合、Pc肺炎に対する治療(ST合剤)を施行した第18日目においても同領域の塩基配列及びアミノ酸配列の結果が得られた。今回得られた塩基配列及びアミノ酸配列としては変異は見られなかった。ニューモシスチス・カリニ(Pc)と同様に酵母様真菌に属するクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cn)のHIV感染症を含む免疫不全症例における気道定着を検証した。具体的な方法として、肺陰影の診断

目的に気管支肺胞洗浄液(BALF)を採取した88症例(基礎疾患:HIV感染症33例、非HIV免疫不全症45例、原発性肺疾患10例)を対象とした。各群において、BALFを用いたCnの塗沫染色・培養同定・抗原検出・核酸(ribosomal DNA)増幅(PCR)の検査結果と診断された肺疾患名及びその治療歴との関連性に関して解析検討した。その結果、HIV感染群における2例に対して、染色・培養・抗原・核酸の検査結果全てが陽性を示し、肺Cn症の診断と治療が行われた。HIV感染群におけるCnの気道定着例は認められなかった。非HIV免疫不全群における1例において、Cnの核酸検査のみ陽性を示したが、Pc肺炎と診断されCn治療は施行されておらず、気道定着例と判断された。原発性肺疾患群でのCnの気道定着例は見られなかった。
パルス強磁場中電子輸送現象測定による鉄系超伝導体の量子化磁束の研究

本研究では,鉄系超伝導体の量子化磁束の振る舞いについて熱磁気効果(特にネルンスト効果)測定の手法を用いてアプローチするためにパルス強磁場中熱磁気効果測定装置を開発することを目的とした。ネルンスト電圧は磁場と垂直方向に温度勾配をつけた際に生じる起電力であるので,本研究で開発する熱磁気効果測定装置の核は,パルス強磁場中での正確な温度計測にある。測定用プローブの先端部分は,熱浴となる熱伝導率の良いサファイア基板,試料をマウントするエポキシ樹脂およびでヒーターとなる小型のフィルム上ストレインゲージで構成される。この測定システムを用いて,鉄系超伝導体の熱輸送現象の測定には至らなかったが,半金属のビスマスを用いたパルス磁場中電気抵抗測定に成功した。ネルンスト電圧は磁場と垂直方向に温度勾配をつけた際に生じる起電力であるので,本研究で開発する熱磁気効果測定装置の核は,パルス強磁場中での正確な温度計測にあるといえる。特に導体試料では,パルス磁場発生に伴う渦電流により試料が発熱する可能性があるため,試料形状を工夫して渦電流の影響を極力小さくして,且つ測定中の温度勾配を一定に保つ必要がある。本研究では,まず測定用プローブの作製から実施した。その先端部分は,熱浴となる熱伝導率の良いサファイア基板,試料をマウントするエポキシ樹脂およびヒーターとなる小型のフィルム上ストレインゲージで構成される。温度勾配は当初極低温用熱電対を用いて計測する予定であったが,適切な熱電対の入手が困難であったため,試料の両端に市販のチップ型セルノックス温度センサーを取り付けて温度測定を行った。パルス磁場の測定には,サファイア基板付近に取り付けたピックアップコイルを用いて行い,50テスラまでの正確な磁場測定を可能にした。測定システムは,スコープコーダDL850(横河メータ&インスツルメント社製),ローノイズ電圧アンプ(シグナルリカバリー社製)および既設の測定機器を組み合わせ,GPIBを介した測定プログラムを作成した。この測定システムを用いて,鉄系超伝導体の熱輸送現象の測定には至らなかったが,比較的大きな熱起電力を示す半金属のビスマスのパルス磁場中輸送測定に成功した。本研究では,鉄系超伝導体の量子化磁束の振る舞いについて熱磁気効果(特にネルンスト効果)測定の手法を用いてアプローチするためにパルス強磁場中熱磁気効果測定装置を開発することを目的としている。本年度は(1)測定用プローブの作製,(2)測定システムの構築を中心に実施した。温度勾配は極低温用熱電対を用いて計測する予定であるが,適切な熱電対の入手が困難であったため,現在のところその導入には至っていない。測定システムは,本年度購入したスコープコーダDL850(横河メータ&インスツルメント社製),ローノイズ電圧アンプ(シグナルリカバリー社製)および既設の測定機器を組み合わせ,GP-IBを介した測定プログラムを作成した。この測定システムを用いて,熱輸送現象の測定には至っていないが,半金属のビスマスを用いたパルス磁場中電気抵抗測定に成功した。パルス磁場中での温度計測に低温用熱電対を用いることを計画していたが,その入手が困難であったため測定装置の完成には至っていない。熱電対の代わりに小型の抵抗温度計(Cernox)を取り付け温度計測の問題を解決した上で,まずは磁場中で大きな熱起電力変化が観測される熱電変換材料の1つであるBi-Sb合金を用いて,パルス強磁場中での温度計測技術を確立させる。その後,ランタン系あるいはビスマス系の銅酸化物超伝導体を用いてネルンスト効果を測定し,既に報告されている結果と比較することでパルス強磁場中熱磁気効果測定技術の確立にフィードバックさせる。さらに鉄系超伝導体について同測定を実施し,量子化磁束の運動を考慮した鉄系超伝導体の磁場-温度相図の完成を目指す。

クライオスタット製作のための各種材料およびガラスデュワーの購入費用として20万円を計上している。また,武漢(中国)で開催されるRHMF2012および韓国で開催されるICM2012の国際会議での旅費・研究成果発表費用として30万円を計上している。その他,国内会議・研究打ち合わせの旅費に10万円,研究成果を学術論文として発表するための投稿及び別刷り代として10万円を計上している。
インド・アジャンター石窟壁画消失メカニズムの解明に向けた微生物生態学的調査

インド共和国にあるアジャンター石窟寺院には貴重な壁画群が存在する。しかし、石窟内部で広く確認される黒色物質が、壁画上に粘着して土壁そのものを溶解して壁画を消失させるという深刻な被害をもたらしており大きな問題となっている。本研究では、現地から採取した黒色物質の微生物および理化学性解析から、1黒色物質は微生物バイオフィルムであり、2黒色物質のある土壁ではセルロース量が減少していること、などが明らかとなった。かつて石窟内にいたコウモリの糞尿による水分や有機物の供給が微生物バイオフィルムの基となり、バイオフィルム内の微生物がスサを分解して壁画の剥落(消失)が引き起こされていたのではないかと考えられた。インド共和国のアジャンター石窟寺院は、壮麗な壁画群を有し世界的な注目を集めている。これらの壁画群は、経年による物理化学的な要因などいくつかの要因が複合的に重なり損傷を受けている。なかでも、石窟内部で広く確認され、コウモリの排泄物に起因するとされている黒色物質は、壁画上に粘着して、壁画が描かれている土壁そのものを損傷させることで問題となっている。本研究は、この黒色付着物質に対して、微生物群集構造を解明して、構成する菌群の代謝様式や生理学的性質から壁画消失のメカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は、微生物の培養を経ないで黒色物質に含まれる微生物群集を解析する非培養法を実施した。冷凍保存した各試料から核酸(DNA)を抽出し、細菌および菌類(カビや酵母)を標的とした遺伝子増幅(PCR)を行い、産物をパイロシーケンス解析に供した。解析の結果、劣化が進行している部位や進行していない部位から採られた試料でも、細菌種として、Lactobacillus属菌、Enhydrobacter属菌、Bacillus属菌などが共通して認められた。菌類も同様に、劣化が進行している部位や進行していない部位から採られた試料でもLecanicillium属菌が優占することが多かった。劣化の進行度合いに関わらず、類似する微生物が土壁上に分布していることが示唆された。特に、Lactobacillus属菌は乳酸を生成する細菌群として知られ、酸による土壁の劣化も予想される。しかし、土壁上に乳酸菌が分布するという生態学的な妥当性についてはさらに検討する必要が有り、培養法も含めた方法で検証する予定である。土壁には植物残渣が含まれているためセルロース分解を行う微生物についても検討を進める予定である。インド共和国マハーラーシュトラ州北部に位置する仏教石窟寺院の一つであるアジャンター石窟寺院は、紀元前2世紀から後6世紀の間に描かれた壮麗な壁画群を有し、歴史学、美術史学などをはじめ多分野において世界的な注目を集めている。しかし、これらの壁画群は、経年による物理化学的な要因、モンスーンなどによる気候要因、過去の修復作業による人的要因、生物的要因など多くの要因が複合的に重なり損傷を受けている。そのなかでも、石窟内部で広く確認され、コウモリの排泄物に起因するとされている黒色物質は、壁画上に粘着して、壁画が描かれている土壁そのものを溶解して消失させるという深刻な被害をもたらすことで大きな問題となっている。本研究は、アジャンター石窟壁画を消失させている黒色付着物質に対して、微生物群集構造を解明して、構成する菌群の代謝様式や生理学的性質から壁画消失のメカニズムを明らかにすることを目的としている。平成24年度は、現地調査および試料採集を行った。現地調査から、黒色物質の分布はかつてコウモリが生息していたとされる位置と一致していることが観察された。また、壁画層下地の土壁では、現在でも植物材料が分解されずに存在しているが、劣化が進行している黒色物質の付近では周囲より植物材料の分解が進行していることが観察された。採取した黒色物質は光学顕微鏡観察によって微生物バイオフィルムであることが明らかとなり、土壁の分解は微生物に起因した生物劣化であることが示唆された。黒色物質の詳細な微生物群集構造を明らかにするため、培養法および非培養法による解析を進めている。インド共和国に位置するアジャンター石窟寺院は、紀元前2世紀から後6世紀の間に描かれた壮麗な壁画群を有し、歴史学、美術史学などをはじめ多分野において世界的な注目を集めている。なかでも、石窟内部で広く確認される黒色物質は、壁画上に粘着して、壁画が描かれている土壁そのものを溶解して消失させるという深刻な被害をもたらすことで大きな問題となっている。本研究は、この黒色付着物質に対して、微生物群集構造を解明して、構成する菌群の代謝様式や生理学的性質から壁画消失の原因を明らかにすることを目的としている。3年間の主な研究成果として、現地から採取した試料の微生物および理化学性解析から、以下の点が明らかとなった。

1採取した黒色物質の光学顕微鏡観察では、膨大な数の微生物群が確認された。これは、黒色付着物質が微生物バイオフィルムと同一であり、土壁の分解は微生物に起因した生物劣化であったこと、2土壁のセルロース含量測定から、土壁内に含まれるセルロース量は劣化の進んでいる土壁で有意に減少することが確認され、スサ(植物残差)の分解に伴い土壁の剥落が引き起こされていたことが示唆されたこと、3生物活性の測定や培養法による生菌数の測定から、採取したバイオフィルム内の微生物は活性を有していない(死滅している)という結果が得られたこと、である。これらの結果から、かつて石窟内にコウモリが棲息していた時に糞尿による水分、有機物および無機塩類が供給され、それが微生物バイオフィルムとなって壁画の土壁のスサを分解しながら劣化(土壁の剥落)を引き起こしたと考えられた。本研究によってコウモリ-微生物バイオフィルムによる壁画劣化の機構の一部が明らかとなった。文化財保存科学研究計画にある黒色粘性物質等の劣化した試料について非培養法を用いた微生物群集構造解析を順調に進めることができた。また、試料の理化学性や微生物活性についても解析を進めることができ、土壁の消失に関わる可能性が高い微生物種の推定をさらに進めることができた。以上、おおむね当初計画の通りに進展している。平成24年度研究計画では、黒色バイオフィルムを採取して、1非培養法を用いた黒色付着物質の微生物群集構造解析、2生物物理化学的性質の解析、を行うこととした。アジャンター石窟寺院の現地調査を遂行し、壁画の土壁の劣化因子と考えられる黒色物質の状態観察と試料採取を行うことができた。非培養法では当初予定していたクローン解析よりもさらに情報量の多い次世代シーケンス解析を実施することができた。非培養法を用いた微生物群集構造解析の結果、計画の段階で推定していた壁画消失に関わると想定される3つの微生物群(硝化細菌、硫黄細菌、有機酸生成糸状菌および細菌)のうち硝化細菌や硫黄細菌の分布はほとんど認められず、乳酸菌のような有機酸を生成する微生物群が検出されている。また、劣化の進んだ試料は、劣化を受けていない試料に比べ、土壁に含まれる植物残差量が少ないことが目視観察によって明らかとなったため、セルロース分解に関わる微生物群についても検討を進める予定である。平成25年度は、再度黒色バイオフィルムを採取して、壁画消失に関わると想定される3つの微生物群(硝化細菌、硫黄細菌、有機酸生成糸状菌および細菌)に焦点をあて、培養法を用いて黒色バイオフィルムからの微生物分離とその生理生態学的解析を行う。硝化細菌、硫黄細菌、有機酸生成糸状菌および細菌については、定量的な評価も行う。さらにバイオフィルム総体の硝化活性、硫黄酸化活性についても検討を行う。また、初年度で得られた実験結果から乳酸菌が分布していることが示されたため、これらの菌群を対象とした解析を進める予定である。得られた各種細菌・糸状菌で、分類学的に新規性の高い菌株に関しては、必要性に応じて分類学的研究を行う。該当なし