hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Fアクチン-DNGR１シグナルを標的としたクラッシュ症候群に対する新規治療法開発

本研究の目的は、以下の2点である。1クラッシュ症候群ラットモデルおける全身性炎症病態において、Fアクチン-DNGR1受容体シグナル系のメカニズムを明らかにし、その制御による多臓器障害進行と生存率の改善を評価すること。2全身炎症病態をきたす臨床患者(外傷、敗血症)におけるFアクチン-DNGR1受容体シグナル系のメカニズムを明らかにすること。本研究において、抗Fアクチン抗体の投与によるクラッシュ症候群ラットモデルの生存率改善は認められなかった。敗血症患者において、血中Fアクチン値は有意に増加しており、役割を担っている可能性が示唆された。本研究の目的は、最近DAMPsとしての潜在性を持つことが明らかにされたFアクチンが、クラッシュ症候群において、どのように炎症惹起、多臓器不全の進展に関与しているかを追求することにある。この機序が明らかにすることで、Fアクチンを標的としたクラッシュ症候群に対する新規治療薬を開拓する。本研究の焦点を以下の3つに絞り実施する。(1)クラッシュ症候群モデルにおけるFアクチンのDAMPsとしての評価:ラットクラッシュ症候群モデルで、In vivo蛍光イメージング法を用いて、受傷早期から経時的に可視化・評価し、各臓器において誘導されるFアクチン-DNGR1受容体シグナル系の動態を解析し、SIRS発症からMOFに至るメカニズムを明らかにする。また血清学的検査やReal-time PCR法、ELIZA、組織標本などの検査手法を用いて経時的に評価し、MOFのメカニズムを解明する。(2)クラッシュ症候群モデルに対する抗Fアクチン抗体、抗DNGR1受容体抗体投与おける治療効果の評価:上記の研究結果を踏まえて、抗Fアクチン抗体や抗DNGR1受容体抗体を投与し、抗炎症効果、臓器損傷抑制効果、生存率改善効果を評価する。(3)実際の筋細胞障害を伴う疾患(クラッシュ症候群を含む)の、FアクチンのDAMPsとしての評価:実際の筋細胞障害を伴う疾患(クラッシュ症候群を含む)に対して、血中Fアクチンを測定し、FアクチンがDAMPsとして作用しているかについて検証する。さらに血中Fアクチンが重症度判定などにおける有用な指標となり得るかを評価する。ラットクラッシュ症候群モデルは既に確立しており、現在上記検討を順次進めている。本研究の目的は、最近DAMPsとしての可能性を持つことが判明したFアクチンが、クラッシュ症候群においてどのように炎症惹起や多臓器障害進展に関連しているかを追求することにある。この機序が明らかとなれば、Fアクチンを標的としたクラッシュ症候群に対する新たな治療の道が拓ける。研究の焦点は、以下の3つである。(1)クラッシュ症候群モデルにおけるDAMPs(Fアクチン)の評価:既に我々が確立した、ラットクラッシュ症候群モデルを用いて、クラッシュ損傷後の血中Fアクチンの動態を経時的、定量的に測定する。(2)DAMPs (Fアクチン)の制御:クラッシュ症候群モデルに対して、抗Fアクチン抗体と抗DNGR1受容体抗体を投与し、DAMPs(Fアクチン)のリガンドとしての機能を制御することで、抗炎症効果、臓器損傷抑制効果、生存率改善効果が得られるかを評価する。(3)実際の筋細胞障害を伴う疾患(クラッシュ症候群を含む)におけるDAMPs(Fアクチン)の評価:血中Fアクチンを経時的に測定し、その重症度と予後との関係を調査することで、筋細胞障害を伴う疾患患者(クラッシュ症候群を含む)における重症度判定、予後予測などにおける有効性を評価する。現在、(3)まで評価が終了し、最終解析の段階である。クラッシュ症候群における、FアクチンのDAMPsとしての機能を明らかにし、Fアクチンを標的としたクラッシュ症候群に対する新たな治療薬を開拓するため、以下の3点に焦点を絞り順次実施している。(1)クラッシュ症候群モデルにおけるDAMPs(Fアクチン)の評価:確立したラットクラッシュ症候群モデルを用いて、クラッシュ損傷後の血中Fアクチンの動態を経時的、定量的に測定する。免疫染色法、In vivoイメージング、Real-time PCR法、ウエスタンブロット法によりFアクチンの各臓器への集積とDNGR1受容体の発現、及び炎症誘導との相関性を評価する。現在まで、おおむね順調に進展している。医歯薬学今後の研究として、以下を順次進める。

(1)クラッシュ症候群モデルにおけるDAMPs(Fアクチン)の評価:確立したラットクラッシュ症候群モデルを用いて、クラッシュ損傷後の血中Fアクチンの動態を経時的、定量的に測定する。同時に、免疫染色法、In vivoイメージング、Real-time PCR法、ウエスタンブロット法においても、Fアクチンの全身臓器への集積とDNGR1受容体の発現、及び炎症応答との関連性を評価する。(2)DAMPs (Fアクチン)の制御:クラッシュ症候群モデルに対して、抗Fアクチン抗体と抗DNGR1受容体抗体を投与し、抗炎症効果、生存率改善効果が得られるかを評価する。(3)実際の筋細胞障害を伴う疾患(クラッシュ症候群を含む)におけるDAMPs(Fアクチン)の評価:血中Fアクチンを経時的に測定し、その炎症、凝固系、重症度、予後との関係を評価する。
人工物の志向的分析-科学技術哲学への現象学的アプローチ

今年度は本研究の最終年度にあたるため、これまでの研究成果を国際学会や雑誌等において発表した。2005年12月にドイツのLitt社から出版されたPraktische Philosophie in gesellschaftlicherPerspektive(『社会的な視点からの実践哲学』)に寄稿した論文"Zeuge, Maschinen und Menschliche Autonomie"では、「技術的志向性」について発表し、ハイデガー、アレント、サッチマン、ラトゥールらの考え方を批判的に検討しながら、科学技術哲学を構築するための一つの視点を提供した。また、人工知能学会が編集した『人工知能学辞典』の項目として執筆した「サール・ドレイファス論争」では、サールとドレイファスの人工知能批判を紹介しながら、人工知能に関する哲学的議論の整理を行った。さらに、北海道大学大学院文学研究科紀要に発表した論文"LifeTechnologies and Religious Views"では、生命技術に対する人々の態度の特異性を際立たせることにより、人工物や技術一般を哲学的に把握することの可能性を検討した。また本研究では技術者倫理(工学倫理)やリスク論に関する研究もサブテーマとして設定されているが、技術者倫理に関しては、2003年10月に文献のサーベイ(「工学倫理の教科書」)を発表し、2003年11月にはビジネスエシックス研究会(アルカディア市ヶ谷)で「工学倫理と企業倫理」というタイトルで発表した。リスク論に関しては、2003年12月にワークショップ「リスクマネジメントをめぐる法と倫理」(北海道大学)において総括コメントを行い、2004年2月には、リスクマネジメント研究会(北海道大学)において研究発表「科学技術のリスク評価とリスク認知」を行った。本研究課題に関連して2004年度に行った研究の成果は、以下の4点にまとめることができる。(1)人工物に対する志向的分析、(2)人工物に関するリスク分析の哲学的基礎に関する研究、(3)技術者の行為分析としての、技術者倫理に関する研究、(4)人工物環境と生命の設計の関係に関する考察。(2)に関しては、『思想』(岩波書店)2004年7月号の特集「リスクと社会」に論文を寄稿した。本論文では、人工物の設計・製造側のリスク認知と利用者(一般市民)とのリスク認知の差異などについて論じている。また、2005年1月には、同志社大学において、講演「リスク分析の哲学と倫理学」を行った。(3)に関しては、2004年10月に出版された『電気学会誌』(2004年10月号)のゲスト・エディターとして「技術者倫理教育」の特集を企画するとともに、論文を2本投稿した。両論文の中で、技術者倫理が技術者の行為および認知の特殊性と密接な関連を持っていることを明らかにした。(4)に関しては、2005年3月末に行われる予定の国際宗教学宗教史会議第19回世界大会(IAHR TOKYO 2005)のシンポジウムで、発表"Artificial Environment and Designing Life"(人工物環境と生命の設計)を行う予定である。本発表では、生命の人工物化に関する議論の検討を通じて、人工物一般に関する哲学的分析を深める予定である。
ロタウイルスの口腔粘膜上皮感染に関する研究

ロタウイルスは乳幼児ウイルス性下痢症の主な原因であり、感染経路は糞口感染であるとされている。本研究においてはウイルスの侵入門戸である口腔粘膜上皮に対するロタウイルスの感染性について研究することを目的とした。口腔癌由来培養細胞株を用いた感染実験の結果、ロタウイルスは口腔粘膜上皮にも感染することが明らかとなった。また、これと並行して行った腸管上皮細胞における感染実験では、type IIIインターフェロンの産生に至るシグナル伝達経路の解明を試みた。平成24年度は、ロタウイルス感染に続くtypeIIIインターフェロン産生がヒト腸管上皮細胞間で異なることに着目し、1)Caco2細胞とHT-29細胞の質的違いについてPCR arrayを用いて発現に差の認められる遺伝子を探索した。その結果、RNAウイルスの増殖副産物を認識するレセプターであるRIG-I分子に類似したタンパク質PYCARDの発現がCaco2では全く認められないことが分かった。この結果をもとにCaco2にPYCARDをtransfectionし、ロタウイルス感染に伴うtypeIIIインターフェロンの産生を検索したが、typeIIIインターフェロンの産生を誘導することはできなかった。一方、ロタウイルス感染の実質的レセプターがRIG-Iであるか否かを確認するために、RIG-Iに対するsmall interfering RNA (siRNA)を用いたknockdown実験を行ったところ、コントロールと比較して優位にtypeIIIインターフェロン産生を抑制することができた。マウスとヒトの感染様式の違いを検討する目的でマウス新生児腸管を用いたex vivo感染モデルの作成を試みた。real-time PCR法では明らかなロタウイルス由来のVP6遺伝子の発現を確認することはできたものの、感染後14時間経過した段階で行った蛍光免疫染色については感染を確認することができなかった。口腔由来の上皮細胞への感染に関してはreal-time PCRおよびreverse transcriptase PCRにより確認した。また、蛍光免疫染色でも感染は確認されている。平成25年度は、口腔扁平上皮癌細胞に対するロタウイルスの感染が成立するという昨年度までの研究結果を踏まえて、ロタウイルスの感染を抑制する因子についてさらに検索した。従来から、interferon (IFN)がウイルス感染に対して極めて重要な機能を担っていることが報告されているが、申請者はtype III IFNの抗ウイルス活性に関して検索するとともに、電解酸性機能水(functional water; FW)のロタウイルス感染抑制効果についても検討した。type III IFNの効果に関してはtype I IFNとの比較を行ったが、結果としてtype III IFNはtype I IFNと比較して、抗ウイルス活性が弱いという結果を得た。また、腸管上皮細胞を用いた実験では、ロタウイルス感染後に産生される量としてはtype III IFNのほうがより大量であるが、産生は一過性であるのに対し、type I IFNは継続的に産生されることが判明した。また、type IIIIFN産生に至るシグナル伝達系に関して検索した結果、NF-kappaBに深く依存していることが分かった。FWの抗ウイルス活性に関しては新生児マウスの腸管を用いたex vivo実験を行った。その結果、腸管組織を3分間FWで処理することにより、ロタウイルスの感染を高度に抑制しうることが分かった。このことは、FWをロタウイルス感染抑制に臨床応用しうる可能性を示唆したものであり極めて興味深い。腸管上皮細胞HT-29にロタウイルスSA11株を感染させ、microarrayにより非感染細胞との間の遺伝子発現の変化を検索した結果、感染細胞でtype IIIインターフェロンmRNAの発現が高度に誘導されることを確認した。real-time PCRおよびELISA法によりtype IIIインターフェロンの発現および分泌について検討したところ、mRNAおよびタンパク質レベルでtype IIIインターフェロンが誘導されていることが確認された。この現象がHT-29特異的変化であるか否かを検証する目的で、SA11に加えてRRV株をまた、HT-29に加えてT84およびCaco2細胞を用いて同様に検索した。その結果、T84ではHT-29と同様の誘導が見られたがCaco2では全くtype IIIインターフェロンの誘導は起こらなかった。Caco2におけるロタウイルスの感染は、VP6遺伝子の発現をRT-PCRにより検出することで確認した。従って、Caco2におけるtype IIIインターフェロンの誘導の欠如はロタウイルス非感染によるものでないことが確認された。type IIIインターフェロンの誘導メカニズムを検索する目的で、HT-29にTLR3、RIG-IおよびMDA5に対するsiRNAをtransfectionし、SA11感染実験を行った。その結果、ロタウイルスの感染は主にRIG-Iにより感知されていることが解った。これらの実験と並行してヒト口腔扁平上皮癌細胞Ca9-22を用いてロタウイルスの感染実験を行い、RT-PCRによりVP6遺伝子の検出に成功している。また、マウスにおける感染実験を見据え、mouse embryonic fibroblast (MEF)の分離とこれを用いた感染実験を行った。その結果、ロタウイルス感染によりtype Iインターフェロンが産生されることを確認した。

本研究では、口腔粘膜上皮に対するロタウイルスの感染の有無について検索することを目的としている。その前段階として、ロタウイルスの本来の感染ターゲットである腸管上皮細胞を用いてロタウイルス感染を感知するレセプターがRIG-I分子であり、類縁タンパク質であるMDA5が補助的に働いている可能性を突き止めた。現時点でこれら両分子が重要であることは文献的に示されているものの、ヒト培養細胞でこの事実を再確認できたことの意義は大きいと考えている。この結果に基づき、口腔扁平上皮細胞でもこれらの分子の発現が認められるのか否か、またその下流のシグナル伝達系がいかなる分子により担われているのかを引き続き検索する予定である。当初予定していたロタウイルスの感染とそのシグナルシステムの解明という目的におおよそ沿った形で研究を進行させていると考えている。一方、マウスの口腔内に直接ロタウイルスを感作用させて口腔粘膜上皮における感染の有無を形態的に観察する実験に関しては、マウス腸管組織を摘出したex vivoモデルでの予備実験を行った。PCRでの検出には成功したものの組織染色による感染の確認には至っておらず、この点に関しては今後も検索を続けていきたいと考えている。平成23年度の研究により、ヒト腸管上皮細胞、ヒト口腔扁平上皮癌細胞およびマウスMEF細胞を用いた感染実験を確立することができた。ヒト腸管上皮細胞HT-29を用いた研究から、ロタウイルスの感染はRIG-Iにより感知されていることが解り、type IIIインターフェロン誘導のシグナル伝達系の解明に向けて大きく前進したものと考えている。また、マウスMEFを用いた研究の結果から判断して、ヒトとマウスではロタウイルス感染に対する反応が著しく異なる可能性が考えられ、ヒトにおけるロタウイルス感染とその予防を考える上で極めて重要な成果であると考えている。さらに、Caco2細胞においてはロタウイルス感染が成立しているにもかかわらずtype IIIインターフェロンの誘導が惹起されなかったという結果は、ロタウイルス感染に続くヒト細胞における抗ウイルス活性の獲得のメカニズム解明の為に極めて重要な結果であろうと考えている。以上、研究1年目の結果は、ヒト口腔粘膜へのロタウイルス感染の可能性を追求するという本研究の目的の足がかりを築くことができたものと考えている。培養腸管上皮細胞を用いたロタウイルス感染実験の結果、typeIIIインターフェロン産生が誘導されることが確認された。今後はtypeIIIインターフェロンがロタウイルスの感染を抑止しうるのかという点についてさらに検討する。
ミクロバイオセンシング機能を賦与した細胞チップの創製

本研究は細胞チップにおいて細胞の活性測定や代謝物質の検出を行うために、各チャンバー内にマイクロメートルオーダーの微小サイズのpHセンサ、酸素センサ、酵素センサを形成し、マルチバイオセンシング機能を有する新しい細胞チップを創製するものである。具体的にはポリジメチルシロキサン(PDMS)で作製したスタンプを用いるマイクロコンタクトプリンティング(μCP)技術により同一基板上の目的の位置に目的のセンサをマイクロメートルスケールで形成する。平成18年度はμCP技術を用いてDNAチップ用スライドガラス上に、pH応答性蛍光色素であるFITCを固定化したpHセンサ、酸素応答性蛍光色素であるルテニウム錯体を固定化した酸素センサを直径10μmのサイズでアレイ状に形成する技術について検討した。平成19年度は、まず10μm径でのμCP技術の完成を目指した研究を行い、pHセンサについてはスタンプ後の洗浄方法の改良、酸素センサについてはスタンプにインクを付けた後の展開・乾燥方法を新たに開発することにより、各スポットの蛍光強度のばらっきを抑制し、スポットサイズもほぼ10μmに揃えることに成功した。さらに1つのチップ上でμCPをスタンプ位置をずらして2回行うことによりマイクロ酸素センサとマイクロpHセンサが交互に並んだセンサアレイを形成することに成功し、各センサがそれぞれ影響されることなく酸素濃度、pHの変化に応答することも実証した。本年度は、μCP技術を用いてDNAチップ用スライドガラス上に、pH応答性蛍光色素であるFITCを固定化したpHセンサ、酸素応答性蛍光色素であるルテニウム錯体を固定化した酸素センサを直径500μm及び10μmのサイズでアレイ状に形成する技術を確立した。そして共焦点レーザ方式の蛍光マイクロアレイスキャナを用いて蛍光応答特性を評価した。均一なインク溶液(蛍光色素)の転写が行えるようにインク台の形成方法について検討した。スピナーにより薄く展開したインク台と、レンズクリーニング用ティッシュにインクを含浸させたインク台とで比較したところ後者の方が均一に塗布できた。500μm径でスタンブした場合、ばらつきも小さく、pH、酸素濃度の変化を蛍光強度の変化としてとらえることができた。10μm径でスタンプした場合、蛍光強度のばらつきは大きくなったが、pH、酸素濃度変化に応じて蛍光強度の変化が確認できた。昨年度はμCP技術を用いてDNAチップ用スライドガラス上に、pH応答性蛍光色素であるFITCを固定化したpHセンサ、酸素応答性蛍光色素であるルテニウム錯体を固定化した酸素センサを直径500μm及び10μmのサイズでアレイ状に形成する技術について検討した。本年度は、まず10μm径でのμCP技術の完成を目指した研究を行い、pHセンサについてはスタンプ後の洗浄方法の改良、酸素センサについてはスタンプにインクを付けた後の展開・乾燥方法を新たに開発することにより、各スポットの蛍光強度のばらつきを抑制し、スポットサイズもほぼ10μmに揃えることに成功した。
一般日本人女性における潜在性動脈硬化と脳萎縮の実態解明

本研究は、高齢化が進行している日本人一般女性集団を対象とし、潜在性動脈硬化、脳萎縮、認知機能障害の実態と関連要因を明らかとし、その予防法を解明することを目的とする。当初より基盤A研究2期分で目標対象者数800名に対して調査を実施する予定であり、平成27-29年度は第1期にあたる。第1期では、草津市住民基本台帳より60ー85歳の女性を無作為抽出し、同意を得た266名に対して、胸腹部CT、頭部MRI、頚部超音波、認知機能検査、身体機能評価、血圧、心電図、血液・尿検査、など多岐にわたる調査を実施した。平成30-33年度も、第2期として、さらに約500名に対して調査を実施する予定である。まず本研究実施に関して滋賀医科大学倫理委員会の承認を得た。その後、草津市住民より、住民基本台帳法に則り、閉経後の60歳から85歳の一般住民女性約3000名を無作為に抽出した。研究実施予定人数は約800名である。本研究代表者・分担研究者らが過去に実施した、同地域から無作為抽出した一般住民男性における疫学研究では、応諾率は約30-40%であったため、これを考慮し対象者の抽出を図った。5歳年齢階級毎の対象者数がほぼ均等になるように抽出した。無作為抽出された対象者には郵便及び電話で研究への参加を依頼した。調査および分析プロトコールは、本研究代表者・分担研究者らが同地域一般住民男性において既に実施した、または実施中の疫学研究の際に用いた、標準化されたプロトコールに基づき作成した。検査内容は、胸腹部CT検査、頭部MRI検査、認知機能検査、頚動脈エコー検査、血圧測定、心電図、血液・尿検査、活動量・歩数検査、等である。その後、平成27年11月21-22日にテストランを実施。問題点について検討し、調査および分析プロトコールを確定させた。平成27年12月から実調査を開始した。調査は土・日曜と2日連続して実施した。調査場所は、滋賀医科大学病院に隣接する滋賀医科大学アジア疫学研究センター内の疫学研究専用クリニックである。対象者には、調査実施前に、研究者から研究内容の説明を行い、研究参加の同意を得た。将来の関連遺伝子検査を含め、胸腹部CT検査、頭部MRI検査など、個別の項目について分割して同意を得た。撮影された胸腹部CT画像、頭部MRI画像、頸部超音波画像等については、順次、精度管理を行いつつ研究者等による各種計測を実施した。血清脂質、血糖値等、主要な血液検査項目については十分な精度管理の下、順次測定を行った。検査結果については、医師が最終判定を行い、コメントと共に対象者に返却した。研究実施計画に従い概ね適切に研究が実施されたため。本研究は、世界で最も高齢化が進行している我が国の一般女性集団を対象として、潜在性動脈硬化、無症候性脳血管障害、脳萎縮、認知機能障害の実態と関連要因を明らかとし、日本人女性における動脈硬化性疾患および認知症の予防方法を解明することを目的としている。平成27年度と同様に、草津市住民基本台帳より60ー85歳の女性を無作為抽出し、同意を得た方に対して調査を継続した。これまでに約150名に対して調査を完了しており、概ね計画通りに研究を進展できた。平成27年度と同様に、本研究代表者・分担研究者らが同地域住民一般男性の疫学研究で用いたプロトコールを基に昨年度確定したプロトコールに従い、調査および分析を行った。調査は土、日曜日に、滋賀医科大学病院に隣接する滋賀医科大学アジア疫学研究センター内疫学研究専用クリニックにて行われた。対象者には、調査実施前に研究内容の説明を行い、研究参加の同意を得た。将来の関連遺伝子検査を含め、個別の検査項目に対して分割して同意を得た。調査項目は、胸腹部CT画像、頭部MRI画像、頚部超音波画像、認知機能検査、身体機能評価検査、血圧測定、心電図検査、血液・尿検査などである。撮影された胸腹部CT画像、頭部MRI画像、頸部超音波画像などについては、精度管理を行いつつ、引き続き各種計測を実施した。画像診断結果、血液検査結果などについては、医師が最終判定を行い、コメントと共に対象者に返却した。研究実施計画に従い、概ね適切に研究を進展できたため。本研究は、高齢化が進行している我が国の一般女性集団を対象として、潜在性動脈硬化、無症候性脳血管障害、脳萎縮、認知機能障害の実態と関連要因を明らかとし、日本人女性における動脈硬化性疾患および認知症の予防方法を解明することを目的としている。当初より目標対象者数を800名としており、基盤A研究2期分で目標達成予定であった。平成27-29年度はその第1期調査にあたる。平成27、28年度と同様に、本年度も草津市住民基本台帳より60ー85歳の女性を無作為抽出し、同意を得た方に対して調査を継続した。本年度は122名に対して調査を実施し、平成27-29年度(第1期調査)で約270名に対して調査を完了した。本年度も本研究代表者・分担研究者らが同地域住民一般男性の疫学研究で用いたプロトコールを基に平成27年度に確定したプロトコールに従い、調査および分析を行った。調査は、土、日曜日に、滋賀医科大学病院に隣接するアジア疫学研究センター内の疫学研究専用クリニックで行った。

将来の関連遺伝子検査を含め、個別の検査項目に対して分割して同意を得た。調査項目は、胸腹部CT画像、頭部MRI画像、頚部超音波画像、認知機能検査、身体機能評価検査、血圧測定、心電図検査、血液・尿検査など多岐にわたる。撮影された胸腹部CT画像、頭部MRI画像、頸部超音波画像などについては、精度管理を行いつつ、引き続き各種計測を実施した。画像診断結果、血液検査結果などは、医師が最終判定を行い、コメントと共に対象者に返却した。平成30年度以降も、引き続き第2期調査として、平成33年度までにさらに500名に対して調査を実施し、当初からの目標である計800名(第1期、第2期合わせて)に対して調査を終了し、データ解析や学会・論文発表による研究成果の報告を行っていく。本研究は、高齢化が進行している日本人一般女性集団を対象とし、潜在性動脈硬化、脳萎縮、認知機能障害の実態と関連要因を明らかとし、その予防法を解明することを目的とする。当初より基盤A研究2期分で目標対象者数800名に対して調査を実施する予定であり、平成27-29年度は第1期にあたる。第1期では、草津市住民基本台帳より60ー85歳の女性を無作為抽出し、同意を得た266名に対して、胸腹部CT、頭部MRI、頚部超音波、認知機能検査、身体機能評価、血圧、心電図、血液・尿検査、など多岐にわたる調査を実施した。平成30-33年度も、第2期として、さらに約500名に対して調査を実施する予定である。本申請研究費により、平成27年度と同様に、調査実施を継続する。平成28年度では約150人の調査を予定している。調査場所は、引き続き滋賀医科大学アジア疫学研究センターおよび滋賀医科大病院である。対象者には、研究者から研究内容の説明を行い、研究参加の同意を得る。撮影された胸腹部CT画像、頭部MRI画像、頸部超音波画像等については、順次、精度管理を行いつつ研究者等による各種計測を実施する。画像診断結果、血液検査結果等については、医師が最終判定を行い、コメントと共に対象者に返却する。調査により得られた情報は、順次データクリーニングを行い、データベース化を行う。前年度末までに既に収集されデータベース化されている情報に基づき、各種潜在性動脈硬化指標、無症候性脳血管障害、脳萎縮、認知機能低下の日本人女性における実態と関連要因について横断的解析を予備的に行う。また、主に米国との比較を行うために、MESA研究の研究者等と打ち合わせを行うと共に、予備的解析を進める。予備解析の成果は、国際学会等での発表を進めていく。本申請研究費により、平成28年度と同様に調査を継続する。撮影された胸腹部CT画像、頭部MRI画像、頸部超音波画像などについては、精度管理を行いつつ、引き続き各種計測を実施していく。画像診断結果、血液検査結果等については、医師が最終判定を行い、コメントと共に引き続き対象者に返却していく。また、前年度までに収集され、データベース化されている情報に基づき、また、主に米国との比較検討を行うために、MESA研究の研究者等とも打ち合わせを行っていく。今後数年かけて収集された情報のデータベース化を行い、日本人女性における、各種潜在性動脈硬化指標、無症候性脳血管障害、脳萎縮、認知機能障害の実態解明と関連要因の解明について予備的な横断的解析を進めていく。予備解析の成果は、国際学会などで発表を行っていく。
不確かさを包容するモデル駆動開発機構に関する研究

本研究は「不確かさ」を包容する新たなソフトウェア工学の確立を狙って実施した。言語理論や形式手法の中で「不確かさ」を扱えるようにすることにより、不確かさを含んだ設計モデルの整合性検証、設計とコードのトレーサビリティ検証、設計モデルからの「不確かさ」の着脱などが可能となった。具体的には、インタフェース機構Archface-Uを提案し、不確かさが存在しても要求分析・設計・実装が継続できるモデル駆動開発機構を提供することができた。H28年度までに、「不確かな要求分析・設計・実装の着脱支援」「不確かさを含む要求・設計モデルの整合性検証」「不確かさを考慮した要求・設計とコードのトレーサビリティ検証」「不確かさの着脱を考慮した設計モデルからのコード生成」「Git連携による不確かさのマネジメント機構」などの主要技術を開発した。最終年度のH29年度(および繰り越し処理を実施したH30年度)は、本研究の集大成となる「不確かさを抱擁するソフトウェア開発環境iArch-U」(初版はH28年度にオープンソースソフトウェアとしてGitHubより公開)のブラッシュアップを行うと共にドキュメントやプロモーションビデオを整備した。ツールやビデオの完成度は高く、ソフトウェア工学分野における最高峰の国際会議であるICSE2019のツールデモ論文として採録された。また、H30年度は、オープンコーディングの手法を用いて不確かさに関する実証評価を主要オープンソースソフトウェアを対象に実施した。研究成果は、国際会議(ICSE2017ワークショップMiSE2017研究論文、ICSE2018ポスター論文、ICSOFT2018研究論文、ICSE2019ツールデモ論文)、国内シンポジウム、国内研究会などで発表した。なお、ICSOFT2018で発表した論文はSelected Paperとして推薦されている。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。ソフトウェア開発は「不確かさ」との闘いである。しかし、従来のソフトウェア工学は「不確かさ」を単に避けるべきものとし、技術的にきちんと扱って来なかった。本研究では「不確かさ」を包容する新たなソフトウェア工学の確立を狙う。「不確かさ」を取り込んだモデル駆動開発支援系、プログラミング言語処理系、検証系を提供する。具体的には、研究代表者が提唱するインタフェース機構Archfaceを発展させ、不確かさが存在しても要求分析・設計・実装が継続できるモデル駆動開発機構を提供する。H26年度は、課題1(不確かな要求分析・設計・実装の着脱支援)、課題2(不確かさを含む要求・設計モデルの整合性検証)、課題3(不確かさを考慮した要求・設計とコードのトレーサビリティ検証)の3つの課題に取り組んだ。不確かさを表現するインタフェース機構Archface-Uを開発するとともに、一部プロトタイプ実装(iArch-U)を行った。Archface-Uを導入することにより、不確かさを「要求モデル」「設計モデル」「コード」にまたがった横断的関心事として、追加、削除することが可能となる。モデルおよびコードの同期はArchface-Uで宣言されたアーキテクチャ点により行われる。また、不確かさを含んだ場合のソフトウェア検証が可能となる。研究成果は、国際会議論文(ICSE 2015ポスタートラック、ICSE 2015ワークショップMiSE等)に採録された。言語理論や形式手法の中で「不確かさ」を扱えるようにすることにより、不確かさを含んだ設計モデルの整合性検証、設計とコードのトレーサビリティ検証、設計モデルからの「不確かさ」の着脱などが可能となる。H27年度までに、課題1(不確かな要求分析・設計・実装の着脱支援)、課題2(不確かさを含む要求・設計モデルの整合性検証)、課題3(不確かさを考慮した要求・設計とコードのトレーサビリティ検証)、課題4(不確かさの着脱を考慮した設計モデルからのコード生成)、課題5(不確かさの影響分析)の5つの課題に取り組んだ。また、不確かさを包容する、設計、プログラミング、テストを支援する統合開発環境iArch-UをEclipse上に実装した。H27年度は、モデル検査、単体テスト支援を新規機能として追加した。研究成果は、国際会議(ICSE 2015ポスタートラック、ICSE 2015ワークショップMiSE、SANER2016ポスタートラック)、国内シンポジウム(FOSE 2015)、国内研究会(情報処理学会ソフトウェア工学研究会)などで発表した。ソフトウェア工学研究会(2016年3月)で発表した論文「LTSA連携による不確かさを包容した自動モデル検査」(発表者はB4学生)は2015年度の学生研究賞を受賞した。研究および統合開発環境iArch-Uの実装は順調に進んでいる。2016年度はiArch-Uの実装をさらに推し進め、年度内に正式に公開したいと考えている。また、電子情報通信学会ソフトウェアサイエンス研究会(2015年5月)および同知能ソフトウェア工学研究会(2016年3月)にて、本研究に関する招待講演を行った。

言語理論や形式手法の中で「不確かさ」を扱えるようにすることにより、不確かさを含んだ設計モデルの整合性検証、設計とコードのトレーサビリティ検証、設計モデルからの「不確かさ」の着脱などが可能となる。具体的には、インタフェース機構Archface-Uを提案し、不確かさが存在しても要求分析・設計・実装が継続できるモデル駆動開発機構を提供する。H28年度までに、「不確かな要求分析・設計・実装の着脱支援」「不確かさを含む要求・設計モデルの整合性検証」「不確かさを考慮した要求・設計とコードのトレーサビリティ検証」「不確かさの着脱を考慮した設計モデルからのコード生成」「Git連携による不確かさのマネジメント機構」などの技術を開発してきた。H28年度は、さらに、オープンソースソフトウェア(OSS)のコミットログやコードリポジトリをマイニングし、現実のプロジェクトでどのような不確かさが生じ、どう解決されたのかについて、実証的な分析を実施した。H28年度の最大の業績は、不確かさを包容する、設計、プログラミング、テストを支援する統合開発環境iArch-UをOSSとしてGitHubから公開したことである。研究成果は、国際会議(ER2016ポスタートラック、ICST2017ポスタートラック)、国内シンポジウム(SES2016、FOSE2016)、国内研究会などで発表した。日本ソフトウェア科学会論文誌への採録、ICSE2017ワークショップMiSEへの論文採録も決定している。また、ソフトウェア工学研究会(2015年7月)で発表した論文「不確かさを包容した開発プロセスとその支援環境iArch-U」(発表者は修士学生)は情報処理学会2016年度コンピュータサイエンス領域奨励賞を受賞した。研究および統合開発環境iArch-Uの実装は順調に進んでいる。2016年度はOSSとしてGitHubから正式に公開した。英語版の公式Webサイトを開設し、研究成果を世界に公開した。また、日本ソフトウェア科学会論文誌への採録、ICSE2017ワークショップMiSEへの論文採録が決定している。研究表彰に関しては、今まで情報処理学会より2016年度コンピュータサイエンス領域奨励賞を、同ソフトウェア工学研究会より2014年度および2015年度学生研究賞を受賞している。本研究は「不確かさ」を包容する新たなソフトウェア工学の確立を狙って実施した。言語理論や形式手法の中で「不確かさ」を扱えるようにすることにより、不確かさを含んだ設計モデルの整合性検証、設計とコードのトレーサビリティ検証、設計モデルからの「不確かさ」の着脱などが可能となった。具体的には、インタフェース機構Archface-Uを提案し、不確かさが存在しても要求分析・設計・実装が継続できるモデル駆動開発機構を提供することができた。
マウスの色素細胞分化において細胞間情報伝達に関与する遺伝子

多細胞生物の特徴の一つは細胞間に相互作用の見られることであり、細胞間の情報伝達を介して発生分化が行われ、細胞の機能が発現する。マウスの毛包にある色素細胞の形質発現はその細胞自身の遺伝子の働きのみでなく毛の成長過程における周囲の毛包近傍の細胞の遺伝子作用によって決定されることが知られている。この現象は多細胞生物における細胞間相互作用の研究に好適の系であると思われる。我々はすでに毛包細胞において作用するa遺伝子座の産物A因子が色素細胞の表面にあるα-MSH(色素細胞刺激ホルモン)の受容体においてのα-MSHと競合し、色素細胞におけるcAMPのレベレを低下させ、メラニン合成のタイプを決定していることを明らかにしている。この研究においてはさらに細胞間情報伝達物質であるA因子のcDNAのクローニングを行い、a遺伝子座の構造と機能を解明することを目的とした。先づ遺伝子型A^y/aのマウス皮膚ホモジエネートを遺伝子型a/aのマウスに注射し、前者のマウス皮膚に存在すると思われるA因子に対する抗体の作製を行なった。その抗体を用いて、抗原の存在部位を組織化学的に検索したところ、真皮の毛包近傍の細胞が陽性であることが分かった。この位置は従来の研究結果から予想されるA因子産生細胞のそれと一致する。さらに遺伝子型A^y/aマウスの皮膚からポリA^+RNAを抽出し、逆転写によって、cDNAライブラリーを作製し、λgt11でクローンを化した。その中から上記抗体を用いてスクリーニングを行った結果、約2.8KbpのA^y11と750KbpのA^y9の2クローンを分離した。インシツハイブリダイゼーションの結果、A^y11は真皮の細胞と反応し、A^y9は色素細胞と反応するので、A^y11がA因子のcDNAであり、A^y9は色素細胞における二次的な遺伝子発現の結果生成されたmRNAに由来するものと推定された。マウス色素細胞分化の最終段階において合成されるメラニンの型は,細胞膜上MSHホルモン受容体におけるMSHと毛包細胞から伝達されるa遺伝子座の産物との競合的相互作用によって調節されると考えられる.本研究の目的の一つはa遺伝子座の構造解析であり,本年度においては,1.a遺伝子座の優性対立遺伝子A^yをもつ致死黄色マウス(A^y/a)の皮膚を劣性ホモ(a/a)のマウスに注射して免疫し,ハイブロドーマを作成して抗A^y産物モノクロナール抗体を調整した.2.致死黄色マウス(A^y/a)の皮膚からmRNAを分離して, cDNAライブラリーを作成し,現在上記モノクロナール抗体を用いてスクリーニングを行なっている.一方,器官培養および細胞培養の実験から,致死黄色マウス(A^y/a)の色素細胞はMSH,コレラトキシン,フオルスコリン, cAMPのいづれにも反応して合成するメラニンの型を黄色から黒色に変換するが, e遺伝子座の突然変異によって黄色メラニンを合成しているマウス(劣性黄色, e/e)の色素細胞はMSH,コレラトキシン,フオルスコリンに反応せず, cAMPにのみ反応することが明らかとなった.この結果からe遺伝子はマウス色素細胞において,アデニレートシクラーゼの機能を支配していると考えられるので, e遺伝子の構造をも解析する目的で,3.前に分離した野性型マウス(E/E)の培養色素細胞からクローニングによってMSHによく反応してcAMPレベルを上昇させる細胞株を樹立し,この細胞を劣性黄色マウス(e/e)に注射して免疫し,ハイブリドーマを調整して抗Eモノクロナール抗体を作製した.

現在この抗体を用いて色素細胞のcDNAライブラリーから, E遺伝子のcDNAをクローニングしている.多細胞生物の特徴の一つは細胞間に相互作用の見られることであり、細胞間の情報伝達を介して発生分化が行われ、細胞の機能が発現する。マウスの毛包にある色素細胞の形質発現はその細胞自身の遺伝子の働きのみでなく、毛の成長過程における周囲の毛包近傍の細胞の遺伝子作用によって決定されることが知られている。この現象は多細胞生物における細胞間相互作用の研究に好適の系であると思われる。我々はすでに毛包細胞において作用するα__-遺伝子座の産物A因子が色素細胞の表面にあるα-MSH(色素細胞刺激ホルモン)の受容体においてα-MSHと競合し、色素細胞におけるCAMPのレベルを低下させ、メラニン合成のタイプを決定していることを明らかにしている。この研究においてはさらに細胞間情報伝達物質であるA因子のCDNAのクローニングを行い、α__-遺伝子座の構造と機能を解明することを目的とした。先づ遺伝子型A__-^y/a__-のマウス皮膚ホモジェネートを遺伝子型a__-/a__-のマウスに注射し、前者のマウス皮膚に存在すると思われるA因子に帯する抗体の作製を行った。その抗体を用いて、抗原の存在部位を組織化学的に検索したところ、真皮の毛包近傍の細胞が陽性であることが分かった。この位置は従来の研究結果から予想されるA因子産生細胞のそれと一致する。さらに遺伝子型A__-^y/a__-マウスの皮膚からポリA^+RNAを抽出し、逆転写によってcDNAライブラリーを作製し、λgt11でクローン化した。その中から上記抗体を用いてスクーリングを行った結果、約2.8kbpのA^y11と750kbpのA^y9の2クローンを分離した。インシツハイブリダイゼーションの結果、A^y11は真皮の細胞と反応し、A^y9は色素細胞と反応するので、A^y11がA因子のcDNAであり、A^y9は色素細胞における二次的な遺伝子発現の結果生成されたmRNAに由来するものと推定された。
CUL3型ユビキチンE3複合体による新規増殖シグナル制御の解明と乳癌治療への応用

現在、乳癌に対する分子標的薬は初期投与では著効するが、薬剤耐性や副作用の問題があり、乳癌特異的な分子標的薬の開発標的となる新規な細胞増殖制御機構の導出が重要である。本研究では、当該ユビキチンE3複合体依存的な増殖シグナル制御機構を分子レベルで詳細に解明し、乳癌治療に応用することを目的とする。具体的には、当該ユビキチンE3複合体CUL3/BTBP/Rhoが標的とするprotein kinase/phosphataseを同定する。次に、同定したprotein kinase/phosphataseに関して、Rho proteinとの結合阻害剤を新しい乳癌治療薬のシーズ化合物として導出する。
気相中の衝突素過程における化学反応ダイナミックスの速度論的研究

気相の原子・分子の反応機構解明は様々な現象に関わる重要課題である。申請者は,1回の衝突で起こる化学反応や物理現象を化学反応速度論的手法により解明してきた。反応速度論の研究は,1850年以来長い歴史があるにもかかわらず,化学種の濃度経時変化を高精度で測定しても,併発するすべての反応の速度定数の和である総括速度定数しか得られないため,分岐比・収率が未知な反応が多数存在する。本研究では,反応で生成する酸素原子のスピン-軌道相互作用で生じる微細構造の相対生成収率を決定し,生成機構との関係を解明する。また,反応で生成する硫黄分子について,独自の解析法「プロファイル積分法」により振動緩和機構を解明する。
超熱分子ビームによる次世代ナノファブリケーションの実空間"その場"観察

超熱分子ビームによる次世代ナノプロセスの走査型プローブ顕微鏡を用いた実空間"その場"観察法を開発した.放射光光電子分光と相補的に利用することで,超熱分子ビームによる表面反応選択性の空間情報を検証することを試みた.放射光ビームラインにおいてSi(111)-7×7表面等の原子像観察に成功するとともに,Si(111)-7×7表面の室温酸化反応における酸素分子の並進運動エネルギーに依存した表面形状の違いを見出した.超熱分子ビームによる次世代ナノプロセスの走査型プローブ顕微鏡を用いた実空間"その場"観察法を開発した.放射光光電子分光と相補的に利用することで,超熱分子ビームによる表面反応選択性の空間情報を検証することを試みた.放射光ビームラインにおいてSi(111)-7×7表面等の原子像観察に成功するとともに,Si(111)-7×7表面の室温酸化反応における酸素分子の並進運動エネルギーに依存した表面形状の違いを見出した.本研究の目的は、超熱分子ビームによる次世代ナノファブリケーションの実空間"その場"観察の実現である。平成19年度においては、(i)超熱分子ビーム精密照射システムの開発、(ii)超熱分子ビームによるナノファブリケーションの実空間"その場"観察システムの開発を中心に行った。10^<-8>Pa以下の超高真空において液体He温度から1200°C程度まで温度制御ができ、1mm以下の領域に放射光および超熱分子ビームを精度良く位置合わせ可能な精密照射システムを開発した。2000°C以上の高融点金属材料の加熱処理を可能とするために電子ビームによる過熱機能もシステムに付加することができた。実空間観察のシステムは、信号系ノイズ対策としてフィルターを導入することにより鮮明な画像を得る機能を付加すると伴に、探針の製作、評価法を確立することに成功した。さらに、システムの開発と平行して具体的な実空間観察の対象として(i)Si(111)-7x7表面、旨(ii)Ge(001)-2x1表面の酸素吸着過程における酸素分子の並進運動エネルギーの効果を放射光リアルタイム光電子分光によって調べ、吸着量および吸着状態の時間変化というプローブ顕微鏡では得ることのできない相補的な情報を得ることに成功した。超熱分子線による並進運動エネルギーによって化学結合状態および膜厚を原子層レベルで制御でき、通常のガス吸着とは異なる化学反応を誘起できることを明らかにした。これらの研究成果の多くは、既にいくつかの学会において報告しており、現在、順次論文発表するために投稿準備中である。本研究の目的は、超熱分子ビームによる次世代ナノファブリケーションの実空間"その場"観察の実現にある。近年の電子デバイスの超高集積化に見られるように固体表面の薄膜の厚さは数ナノメートルに達しており、組成や膜厚を特定領域に原子・分子レベルで高度に制御することが必要不可欠となっている。超熱分子ビームを用いて気体分子の並進運動エネルギーを反応に必要な値に選択すれば、原子レベルの表面化学反応の制御が実現でき、熱反応等では不可能な機能性超薄膜の形成も期待できる。これまで固体表面の酸化反応に及ぼす並進エネルギーの効果を放射光リアルタイム光電子分光によって明らかにしたが、光電子分光では反応後の組成や化学結合状態のスペクトルを基にした間接的かつ表面の"平均的な"情報であった。光電子分光で発見した超熱分子ビーム照射後の反応選択性を顕微分光学的手法によって実空間"その場"観察し、超熱分子ビームの照射に特有な表面反応を利用した次世代ナノファブリケーションを実現する。平成20年度においては、(i)超熱分子ビーム精密照射システムを整備し、その基本性能の評価を行った。(ii)超熱分子ビームナノプロセスの実空間"その場"観察システムを整備した。(iii)HOPGやSi(111)-7×7のSTMによる原子像観察に成功し、放射光ビームラインにおける実空間"その場"観察実験に必要な基本性能の評価を行った。本研究の目的は、超熱分子ビームによる次世代ナノファブリケーションの実空間"その場"観察の実現である。近年、極薄膜の組成および膜厚を特定領域に原子レベルで制御することが、ナノデバイス開発にとって不可欠となっている。分子ビームの並進運動エネルギーを利用すれば、熱反応では困難な空間選択的表面化学反応の実現が期待できる。これまで放射光リアルタイムXPS(SR-XPS)によって、反応時間に伴う吸着量および化学結合状態を詳細に調べてきたが、平均的な空間情報であった。そこで、並進運動エネルギーに依存した表面形状の違いを走査型トンネル顕微鏡により原子レベルで"その場"観察をする。SR-XPSと相補的に実験を進めることで、表面化学反応機構の全体像を詳細に明らかにする。当該年度に実施した研究は以下の通りである;1.Si(111)-7×7表面の室温酸化に関して、反応量、初期吸着確率および化学結合状態に及ぼす酸素分子の並進運動エネルギーの効果をSR-XPSの観測データから明らかにした。2.SPring-8のBL23SUのSUREAC2000に走査型プローブ顕微鏡システムを導入し、表面化学反応の"その場"原子分解能観察を放射光ビームラインにおいて実現した。3.レストアトムとSi^<4+>を含む酸化物の共存を示唆するSR-XPSで見出したバックフィリング室温酸化条件に関して、7×7構造と7×7のアドアトムに沿う一次元状酸化物の存在をリアルタイムSTM観察によって確認した。

4.並進運動エネルギーが0.06eVと2.3eVの条件におけるSi(111)-7×7表面の室温酸化に関して、分子線照射後の表面形状に明瞭な違いがあることを見出した。5.実空間観察の実験対象として、Ge等のさまざまな産業応用上重要な固体表面酸化反応の並進運動エネルギー効果をSR-XPSで詳細に調べた.
腸管病原性大腸菌ＩＩＩ型分泌装置による宿主獲得免疫の制御機構と感染における意義

本研究において、多くの病原性グラム陰性菌が保有するIII型分泌装置(TTSS)が、感染した宿主の免疫系、特に獲得免疫をどのように制御しているのかについて検討を行った。TTSSを保有する菌として、腸管病原性大腸菌(EPEC)とマウスに感染するCitrobacter rodentiumを用いて実験を行った。今回我々は、マウスによるin vivo、および単離した細胞を用いたin vitroの両環境において、これらの菌が宿主の獲得免疫のうち、TTSSを用いて特にTh2分化を誘導していることを明らかにした。また一部のTh2サイトカインは、病原性を亢進させていることも明らかとなった。近年、粘膜病原細菌の感染戦略が分子レベルから個体レベルに至るまで、詳細に明らかになってきた。その中で、とくに粘膜病原細菌が保有するIII型分泌機構によって宿主の機能を操作し、感染を成立させていることが明らかになっている。しかしながら、III型分泌機構が宿主の免疫機構をどのように制御しているかに関しては、未だに不明な点が多い。そこで、III型分泌機構を保有する病原性大腸菌(enteropathogenic E. coli; EPEC)をモデルとして、どのように宿主の免疫系、特に獲得免疫系を制御しているかについて研究を行った。まず、実際EPECのIII型分泌機構が宿主の獲得免疫系に影響を与えている可能性について検討を行った。EPECのマウス感染モデル菌であるCitrobacter rodentium (C. rodentium)の野生型とIII型分泌装置欠損株をマウスに投与した。3週間後、獲得免疫系の重要な指標であるT細胞の分化バランスを測定した結果、今まで報告されている通りどちらの株でも強いTh1反応が見られたが、野生株のみTh2細胞の分化が観察された。次にEPEC、骨髄由来樹状細胞および単離したナイーブT細胞を用いることで、in vivoでの現象をin vitroで再現する系を構築した。これにより、EPECが分泌するエフェクター分子のうちあるエフェクター(X)が樹状細胞のIL-12およびIL-27の産生を抑制することで、特異的にTh2分化を誘導していることが明らかとなった。さらに、C. rodentiumでXの欠損株を作成してマウスに投与したところ、in vivoでもエフェクターXがTh2分化に関与していることが明らかとなった。その結果、腸管病原性大腸菌はIII型分泌機構を用いて、Th2分化を誘導することで、感染を有利にしていることを明らかにした。腸管病原性大腸菌(EPEC)がどのように宿主の免疫系、特にT細胞の分化を制御しているかについて、検討を行った。まず、EPECのマウスモデル菌であるCitrobacter rodentiumを用いて、III型分泌装置によってT細胞分化を制御しているかについて検討した。Citrobacter rodentiumを投与後3週間の後、腸間膜リンパ節からリンパ球を精製しCitrobacter rodentiumで再刺激した。その結果、野生株投与群のみTh2サイトカインの誘導が見られた。また、C. rodentiumに対する抗体価を測定したところ、野生株分はIII型分泌装置欠損株よりTh2型の抗体が有意に高かった。これらの結果から、野生型はIII型分泌装置を用いて、Th2分化を誘導していることが示唆された。また、EPEC、樹状細胞およびナイーブT細胞を用いて、in vivoと同様の現象をin vitroにおいても再現できる実験系を確立した。次に、III型分泌装置から分泌されるエフェクタータンパク質のうち、どのエフェクターがTh2分化を誘導しているかを探索した。様々なエフェクター変異株を用いた結果、IE6という領域にコードされたnleEおよびnleBが、Th2分化に関わっていることを突き止めた。また、これらの遺伝子は、樹状細胞からのIL-12やIL-27の産生を抑制することで、Th2を誘導していることが示唆される結果が得られている。若干の遅れはあるものの、おおむね予定通りの進行具合である。やや遅れいてる理由として、当初は、Th2分化を誘導している因子は1種類ではないかと予想していたが、検討の結果、2種類の因子が関わっていた。そのため、これらを同定するまでに、必要以上に変異株を作成する必要があり、また、変異株作成が予想以上に困難を伴ったことも、原因の一つであると考える。今年度は、EPECのnleEやnleEによって誘導されるTh2分化が、実際感染においてどのような効果があるかを検討する。特に、Th2サイトカインであるIL-4,IL-5,IL-13などが、C. rodentiumの感染にどのように影響するかは、ほとんど明らかになっていない。そこで、C. rodentiumを感染させるときに、これらのTh2サイトカインをマウスに投与して、感染における影響を観察する。また、C. rodentiumにおいても同様にIE6変異株およびnleEやnleBの相補株を作成し、感染実験を行う。

これにより、生体内においてもnleEやnleBがIL-12の産生抑制およびTh2分化に関与しているかについて検討を行う予定である。しかし、当初はCD11c-DTRマウスを用いて、樹状細胞を除去したときのTh分化を見る予定だったが、研究室の都合上困難になったので割愛する。また、Th2分化を誘導するエフェクター分子を特定できたが、当初の予定では、これらの詳細な機能解析を行う予定であった。しかし、今年になって他の研究グループから、かなり詳細な報告がなされてしまったため、この機能解析を行うことを取りやめたため、24年度に未使用額が生じた。そのため、次年度には、EPECがなぜTh2分化を誘導するのかについての追加実験を行うこととした。主に、実験で使用する、実験用マウス、サイトカイン測定用のELISA、リコンビナントタンパク質および酵素・試薬類を購入する。具体的には、マウスに投与するサイトカイン類(IL-4, IL-5, IL-13)やIL-4測定用ELISAまたTh2サイトカイン阻害剤などである。また、通常使用するプラスティック類(ピペット、シャーレ、フラスコ、ディッシュ、チップなど)も常時購入予定。また、研究論文の作成および投稿料などにも使用する予定である。さらに、必要があれば、サイトカインの網羅歴な解析や、マイクロアレイを用いた受託解析にも使用する予定である。さらに、未使用額の分についての追加実験のために、マウス実験においてTh2サイトカインを阻害する薬剤およびTh2サイトカインの中和抗体などの購入や、トランスウェルを購入する予定である。