hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クラウド型高速シーケンシングアノテーションシステムの開発研究

近年登場した次世代シーケンサーと呼ばれるDNA解読装置の登場で、ゲノム科学や分子生物学に必要なゲノム/遺伝子の塩基配列の解読能力は飛躍的に向上した。しかし、その膨大な配列データを解析する計算機システムや情報解析を行う人員の不足という事態がおこった。我々は以上の問題を解決するためにDDBJ Read Annotation Pipeline(通称DDBJパイプライン)を開発、インターネット上で公開している。DDBJパイプラインは、計算機処理のためのコマンド操作が苦手な生物学の実験研究者でもパソコンのマウス操作で扱えるように設計され、解析処理は国立遺伝学研究所のスパコンシステムを利用している。高速シーケンサー由来塩基配列解析システム、DDBJパイプラインについて平成25年度の実績についてDDBJパイプラインの機能拡張として多型解析やde novoアセンブル配列の遺伝子構造解析といったより高度な解析機能の追加を行った内容で、DNA Research誌に掲載された(DNA Res. 2013Aug;20(4):383-90.)。さらに、ヒト白血球型抗原(Human Leukocyte Antigen; HLA)のタイピングをDDBJパイプラインの解析機能として追加した。DDBJパイプラインの解析機能に新たにこの件に関しては共著者として論文が投稿中である。また、DDBJパイプラインのバーチュアルマシン(VM)化を行っている。近年VMという並列計算機の管理する情報技術が登場しており、DDBJパイプラインも、外部解析プログラムの導入やプログラム群のパッケージ化による高性能な環境への移植性の向上を目指して対応中である。1)高速シーケンサー由来塩基配列解析システム、DDBJパイプラインについて平成24年度においてはパイプラインの機能拡張として多型解析やde novoアセンブル配列の遺伝子構造解析といったより高度な解析機能の追加を行った。以上の内容で論文を執筆し、DNA Research誌に投稿、受理された(現在掲載巻は未定)。2)高速シーケンサー由来の塩基配列データによる多型データベースを構築近縁生物種間のSingle Nucletide Polymorphism (SNP)等の変異解析は高速シーケンサーの登場によって加速された研究分野である。しかし変異の判断基準は、解析プログラムや設定値の違いで個々の研究で異なる。研究代表者らは公開配列データを用いて共通の手順で解析することでゲノム横断的な解析になると考えた。平成24年度においてはDDBJより公開されているイネ品種678系統をもとに多型データを解析している。ヒト6番染色体上のHLA領域は高頻度に多型を示し、100以上の疾患および薬剤副作用と関連してゲノム医学的に重要とされている。ヒトゲノム中のHLA領域の配列と次世代シーケンサーによって解読された個々人のゲノム配列を比較し、遺伝子型を判定する。今後日本人固有の遺伝子型のデータを充実させ、個の医療に繋がることを目的としている。20行程のコマンドラインのツールがユーザーが操作しやすいグラフィックユーザーインターフェイスによって、利便性が向上した。また、DDBJパイプラインは解析の計算処理を国立遺伝学研究所のスパコンシステムで行っていた。このため、スパコンを他のユーザーが利用していると処理が遅延したり、個人情報保護の観点からパイプラインの利用をためらうユーザーの声もあった。このため今年度計画に沿ってDDBJパイプラインの仮想マシン(VM)開発を行った。これはパイプラインの機能を切り出してパッケージ化することで複数の計算処理の実行環境の中から環境を選択でき、個々のユーザーの目的に合ったパイプラインを構築できる。現在DDBJパイプラインと合わせて公開している。DDBJパイプラインは開発だけでなく、自らも利用しており、共同研究によるゼニゴケのトランスクリプトーム解析やフグの性決定遺伝子単離の解析にも用いている。以上の内容より、論文の共著、著作、学会発表、パイプライン講習会を行った。ゲノム情報解析DDBJパイプラインの全容をまとめた論文はDNA Research誌(DNA Res. 2013 Aug;20(4):383-90.)に掲載された。平成24年5月現在の登録ユーザー数は464名となり、実際に利用されている。また、DDBJパイプラインの新たな利用法としてヒト白血球型抗原(Human Leukocyte Antigen; HLA)のタイピングをDDBJパイプラインの解析機能として追加した。HLAの遺伝視座はヒトゲノム中で高度な多型性を示す領域で、100以上の疾患、薬剤副作用との関連を示す。タイピングのプログラム自体は、Hosomichiら(BMC Genomics 2013, 14:355)によって発表されたものであり、当初の計画には含まれていなかったが、成果物の新たな利用法になると考え、追加し公開した。現在共同研究として論文を一報投稿中である。DDBJパイプラインのバーチュアルマシン(VM)化は、今年度から来年度にかけて行う。現在、国立遺伝学研究所のスパコンシステムの利用も考慮の上、スパコン上の領域の確保など調整中である。

パイプラインのプログラム群のVMパッケージ化も現在行っている最中である。1)高速シーケンサー由来塩基配列解析システム、DDBJパイプラインについて平成24年度の目的はDDBJパイプラインにおける「高次解析実行環境の整備」だった。高速シーケンサーの解析は基本的に初期段階で膨大な配列データによる参照配列へのマッピングやde novoアセンブルといった比較的コンピュータに負荷がかかるが一元的な処理が行われる。この処理は基礎解析パイプラインとしてすでに構築ずみであったが、実際に研究者が望むデータはマッピングによる配列間の違いの検出結果や遺伝子発現、アセンブルされた配列中の遺伝子情報など、さらにもう一段階上の二次解析による結果である。また、これらの解析は研究の流行で多様化が進む可能性がある。これらの解析をサポートできたため利用者の利便性は向上したと考えている。またこれた高次解析のパイプラインはWebアプリケーションのGalaxyを基礎としており、エンジニア以外の人物でも部分的な改良が可能で、今後の解析多様化にも対応できると考えている。また、DDBJパイプラインの利用登録者は平成25年5月現在関係者を除き約140人となっており活用が広まりつつある。また、論文も受理されたいるため順調であると考える。2)高速シーケンサー由来の塩基配列データによる多型データベースを構築平成24年度の目的は「データ整備、多型検出基準の策定」であった。公開されているイネ品種678系統の高速シーケンサーによって解読された塩基配列データを完全決定された日本型イネ品種日本晴にマップを行ったデータと(独)農業食品産業技術総合研究機構果樹研究所より提供された高速シーケンサー配列とサンガー法のシーケンシングによる多型情報を元に基準を設定、個々の配列の不正確な塩基の除去と3x以上の重なりでマップされた領域のみの多型を検出した。以上より順調に進行していると考える。ひきつづき解析パイプラインのバーチュアルマシン(VM)化を行う。高速シーケンサーによる解読データは装置の高性能化が続くかぎり増加すると考えられる。それに伴い、DDBJパイプラインもVMという並列計算機の管理する情報技術を、"外部解析プログラムの導入の簡便化"および"プログラム群をパッケージ化してより高性能な環境への移植性の向上"を目的として導入を計画中である。VM化することで実際に計算処理を行う計算機を選択することが可能となる。個人情報につながるヒト
有機塩素系溶剤の完全光分解と無害化(発生活性種の金属および担持金属による捕促)

1.不燃性で、毒性の少ない有機塩素系溶剤(フロン、四塩化炭素、クロロホルム、パークロロエチレンなど)は化学的に安定であるために対流圏では分解されず、成層圏まで到達し、そこで紫外光によって分解され、塩素原子を放出する。ハロゲン原子は成層圏でオゾン層を接触的に破壊する。オゾンは短波長の光を吸収するが、オゾン層の破壊によって地表での有害紫外線の増強が懸念されている。現在、これらの化合物に替わる溶剤の開発が進められているが、因難を極めている。本研究では、有機塩素系溶剤の完全無害化プロセスを確立し、少なくとも閉鎖系では使用可能にすることを目的とした。2.有機塩素系溶剤を光反応セル(パイレックス製、光源:低圧水銀ランプ)中で酸素と水蒸気の存在下で分解し、発生する含塩素活性種を充填カラム内の金属粉末と反応させて金属塩とし、含炭素活性種を炭酸ガスに変換した。反応は閉鎖循環系で行った。気相成分はガスクロによって、金属に捕捉された塩素は酸に溶解後イオン選択性電極で定量した。3.捕捉剤として種々の遷移金属(鉄、コバルト、ニッケン、銅、亜鉛、マンガン、バナジウム、チタン、クロム)の粉末を用い、光分解によって発生した活性種を捕捉した。最適条件では、20Wの低圧水銀ランプを30分点灯すると気相中のハロゲンは完全に消失し、CO_2のみが検出された。フロンの変換率は100%であった。金属による活性種の捕捉は、金属の酸化反応によって誘発された。つまり、これは金属の酸化とC1_2やOC1_2などの活性種の還元から成るレドックス反応である。金属による捕捉効果はその表面の活性に依存し、例えばSiO_2上に分散した金属による捕捉効果が最高であった。
水晶体におけるマイクロRNAの同定と機能解析および白内障関連遺伝子の解明

水晶体の加齢および白内障発症に関与するマイクロRNA(miRNA)の発現とその機能およびmiRNAの標的遺伝子の予測を行った。とくにmiRNA29a,29cが、白内障や後発白内障発症に関与する遺伝子の制御を行っている可能性を発見した。加齢白内障は、喫煙・紫外線・酸化的ストレス等が危険因子とされているが、これらは水晶体上皮細胞(LEC)の遺伝子変化を引き起こし、LECの持つ代謝、抗酸化機構・分化に障害が生じ、水晶体混濁つまり白内障を発症すると推測される。近年、蛋白質コード遺伝子のsilencingに働くmicroRNA(miRNA)があり、そのRNA機能は多くの生理過程の制御で基本的な働きを担うことが明らかにされている。このmiRNAは、蛋白質をコードしないが、機能性RNAとして標的蛋白質の主に翻訳レベルにおいて、様々な遺伝子発現を制御している。本年度の研究では、まず胎生16日、生後4、16週齢のSprague-Dawleyラット水晶体上皮細胞のRNAを、採取しmiRNAの網羅的発現解析を、Agilent社製のMicroarray解析にて施行した。このアレイは少量のRNA量から解析できるという点で、大変有用な方法である。生後2倍以上、発現が上昇したmiRNAは、rno-miR-204, miR-339-3p, let-7b, let-7c, miR-29a, miR-29cであった。生後2倍以上、発現が減少したmiRNAは、rno-miR-551b,451, 126であった。これらの結果は、リアルタイムPC法にて確認し、同様の結果が得られた。また、白内障動物モデルである、Shumiya Cataract Rat水晶体では、白内障を有する水晶体上皮細胞において、miR-29a, miR-29c, miR-126の発現が有意に減少していた。これらの結果より、水晶体の発達、白内障発症に、miRNAの関与があることが示唆された。今後、ヒト白内障試料を採取し、白内障とmiRNAの関与を検討する。これら結果が得られれば、白内障発症メカニズムの解明につながる可能性がある。前年度の研究により水晶体の発達、白内障発症に、miRNAの関与があることが示唆された。本年では、水晶体の加齢および白内障発症に関与するマイクロRNA(miRNA)の大規模発現解析(マイクロアレイ)の結果より、miRNAの標的遺伝子予測の結果を検討した。白内障動物モデルであるShumiya Cataract Rat(SCR)をもちいた、実験にて変動がみられたmiRNAには、miR29a,29c,126,551bがあったが、Sanger miBase Softwareにより、これらmiRNAが制御する遺伝子のうち白内障に関連なるものとしてperoxiredoxin6や、Tropomyosin,TGF-βなどが予測された。実際に、これら遺伝子をmiRNAが制御しているかどうか検討することを目的とし、miRNAパスウエイの抑制をmiRIDIAN miRNA mimicsを用いて行なった。miR551bを抑制するとターゲット遺伝子として予測された水晶体の抗酸化タンパクであるPeroxiredoxin6(Prdx6)の発現上昇がみられた。またmiR29cを抑制するとTropomyosinの発現上昇がみられた。Prdx6およびTropomyosin発現変化は、白内障動物モデルのSCRの水晶体においても観察された。よってmiR551bはPrdx6の翻訳を制御し、miR29cはTropomyosinを翻訳レベルで制御することが分かった。現在、miRNAを模倣したこの分子を細胞に直接導入し、特定のmicroRNAの活性をアップレギュレートしてmiRNAが持つ生物学的な影響を調べている。前年度までの研究により水晶体の発達、白内障発症に、miRNAの関与があることが示唆された。miRNAパスウエイの抑制をmiRIDIAN miRNA mimicsを用いて行なった。その結果、ラット水晶体上皮細胞(LEC)に、miR551bを抑制すると、抗酸化蛋白であるPeroxiredoxin6(Prdx6)の発現が上昇し、miR29cを抑制すると、細胞骨格蛋白であるTropomyosinの発現が、低下した。miRNA 29cを模倣したこの分子(miRNA precursor)を細胞に直接導入し、miRNA 29cの活性をアップレギュレートした。ラット水晶体には、Tropomyosinの発現はわずかであるが、白内障動物モデルShumiya Cataract Rat(SCR)水晶体において,白内障を有する水晶体(SCR+)においては、Tropomyosinの発現が上昇する。このSCR+LECに、miR29cprecursorをトランスフェクションし過剰発現すると、Tropomyosinの発現が減少した。よって、これらの結果よりmiRNA551bはPrdx6を、miRNA29cはTropomyosinを翻訳レベルで制御することが分かった。SCR水晶体において、Tropomyosinの発現を免疫組織化学染色法で確認した。Tropomyosinは、白内障を有しない水晶体(SCR-)のLECの細胞質および表層皮質にわずかに発現している。しかし、SCR+の水晶体では、発現量が増加していた。

さらに、200-400J/m^2のUV-Bを培養LECに照射すると、miR29cのmRNA発現が減少し、TropomyosinのmRNA発現が上昇した。よって、miR29cは、紫外線などのストレスにより、Tropomyosinをはじめとする遺伝子の翻訳制御を行っている可能性がある。
新規プロテアーゼMSPの遺伝子導入による脳損傷・修復への関与の解明

MSP (myelencephalic-specific protease)はラット、ヒトの脳、脊髄白質に多く含まれ、特にオリゴデンドロサイト、マイクログリア、ニューロンに多く認められ、トリプシン様の活性を持つことから基底膜や他の細胞外マトリックス構成分を変成させoligodendrocyteの増殖、突起の伸展分化やミエリンの水解・代謝あるいは神経成長やシナプス可塑性などのremodelingに関与している可能性がある。昨年度までに、われわれは、小泉塞栓子法によるラット中大脳動脈閉塞虚血モデルを作製し、MSP mRNAの発現をin situ hybridization法によって確認した。MSPは梗塞周囲のペナンブラに相当する部位のオリゴデンドロサイトや脳梁、白質線維にそって特異的に発現し、損傷3時間後から発現がみられ、24時間から3日をピークに減衰した。MSP (mBSP)蛋白抗体を作製し蛍光二重染色を行うとmRNAと同じ細胞に発現しており、蛋白発現のピークは7日目にみられた(Mol Brain Res 126:129-136,2004)。また、ラット凍結脳損傷モデルでは、MSP mRNAは脳挫傷直下のオリゴデンドログリア,損傷部周囲の脳梁、白質線維に沿って損傷後7目をピークに発現していた。MSP蛋白蛍光二重染色にてmRNA発現細胞と一致して蛋白発現が同じく7日をピークにみられ、オリゴデンドロサイトのマーカーであるCNPase発現細胞とも一致が確認された。Western Blottingでは、19kD(3時間ピーク)と37,40,50kD(6時間と5日にピーク)の比重の異なるfragmentの発現がみられ、前駆型や修飾型などの存在が考察された(J Neurotrauma; 22:501-510,2005)。これらの結果から、MSPが脳虚血後の脱髄、オリゴデンドロサイトあるいはaxonの損傷修復(ミエリンの再髄鞘化や神経突起の成長)に関与する可能性が示され、細胞外にも発現がみられたことからMSPはミエリン関連蛋白や細胞外マトリックス蛋白のturnoverに関連していることが示唆された。白質線維の損傷に際しての発現をさらに分析するために、Marmarouらのラットびまん性脳損傷モデルを改良したモデルですでに我々は鍍銀染色とAPP染色で軸索損傷を組織学的に証明している(Restr Neurol Neurosci 16:9,2000)が、約20%の致死率であったことから、より再現性の高いfluid percussion injuryを用いたびまん性脳損傷を用いて、Dragonfly社のfluid percussion injury装置を実験室に設置することとした。本装置を用いてKitaらの方法(Int J Legal Med 113:221-228,2000)をもとに、ウィスターラット頭頂部に骨窓を開けてcentral fluid percussion(最大陽圧100mg、最大陰圧160mg)を加えることにより、くも膜下出血、脳梁や脳幹点状出血、脳室内出血を認め、電顕的に軸策損傷が観察されるびまん性脳損傷の作成が可能である。残念ながら、本研究の期間内には結果を出せなかったが、このラットを用いてMSPのmRNAおよび蛋白について発現を確認し、引き続き、MSPのliposomeを用いた脳室内遺伝子導入を進めた後、siRNAによる抑制による影響について検討する予定である。

白質線維の損傷に際しての発現をさらに分析するために、Marmarouらのラットびまん性脳損傷モデルを改良したモデルですでに我々は鍍銀染色とAPP染色で軸索損傷を組織学的に証明している(Restr Neurol Neurosci 16:9,2000)が、約20%の致死率であったことから、より再現性の高いfluid percussion injuryを用いたびまん性脳損傷を用いて、Dragonfly社のfluid percussion injury装置を実験室に設置することとした。本装置を用いてKitaらの方法(Int J Legal Med 113:221-228,2000)をもとに、ウィスターラット頭頂部に骨窓を開けてcentral fluid percussion(最大陽圧100mg、最大陰圧160mg)を加えることにより、くも膜下出血、脳梁や脳幹点状出血、脳室内出血を認め、電顕的に軸策損傷が観察されるびまん性脳損傷の作成が可能である。残念ながら、本研究の期間内には結果を出せなかったが、このラットを用いてMSPのmRNAおよび蛋白について発現を確認し、引き続き、MSPのliposomeを用いた脳室内遺伝子導入を進めた後、siRNAによる抑制による影響について検討する予定である。近年分離された新規プロテアーゼであるMSP(myelencephalic-specific protease)はラット、ヒトの脳、脊髄白質に多く含まれ、特にオリゴデンドロサイト、マイクログリア、ニューロンに多く認められる。トリプシン様の活性を持つことから基底膜や他の細胞外マトリックス構成分を変成させoligodendrocyteの増殖、突起の伸展分化やミエリンの水解・代謝あるいは神経成長やシナプス可塑性などのremodelingに関与している可能性がある。しかし、脳損傷時にどのような働きをしているかについては、未だ明らかでない。われわれは、まず小泉塞栓子法によるラット中大脳動脈閉塞虚血モデルを作製し、MSP mRNAの発現をin situ hybridization法によって確認した。MSPは梗塞周囲のペナンブラに相当する部位のオリゴデンドロサイトや脳梁、白質線維にそって特異的に発現し、損傷3時間後から発現がみられ、24時間から3日をピークに減衰した。MSP(mBSP)蛋白抗体を作製し蛍光二重染色を行うとmRNAと同じ細胞に発現しており、蛋白発現のピークは7日目にみられた(Mol Brain Res 126:129-136,2004)。また、ラット凍結脳損傷モデルでは、MSP mRNAは脳挫傷直下のオリゴデンドログリア,損傷部周囲の脳梁、白質線維に沿って損傷後7日をピークに発現していた。MSP蛋白蛍光二重染色にてmRNA発現細胞と一致して蛋白発現が同じく7日をピークにみられ、オリゴデンドロサイトのマーカーであるCNPase発現細胞とも一致が確認された。Western Blottingでは、19kD(3時間ピーク)と37,40,50kD(6時間と5日にピーク)の比重の異なるfragmentの発現がみられ、前駆型や修飾型などの存在が考察された(J Neurotrauma ; in press)。これらの結果から、MSPが脳虚血後の脱髄、オリゴデンドロサイトあるいはaxonの損傷修復(ミエリンの再髄鞘化や神経突起の成長)に関与する可能性が示された。
レーザー光照射による機能性アルミニウムアノード酸化皮膜の創製

1.石英窓付き電解セルおよび電解セル移動システム(X-Zステージ+パーソナルコンピュータ)を作製し、それらが正しく作動することを確かめた。2.中性のホウ酸塩溶液中でアノード酸化を行なって化成電位100Vのバリヤー型アノード酸化皮膜を形成したのち、試料を10%-H_2SO_4および0.46M-(COOH)_2溶液に移してYAGレーザー照射下でアノード酸化を行なうことにより、レーザー照射部のみに局部的に多孔質アノード酸化皮膜を化成できることがわかった。定電位アノード酸化を行なった場合には、アノード電流は通常のアノード酸化の場合に比べて小さく、皮膜生長速度が小さかった。また、レーザー照射部の皮膜/素地金属界面は凸凹を示した。3.多孔質アノード酸化皮膜の成長速度が、レーザー照射下で小さくなる原因について調べたところ、試料表面に局所的にバリヤー型皮膜が残存しており、これがアノード酸化のさいのAl^<3+>イオンあるいはOH^-イオンの移動を妨げているためと推測された。4.アリザリンレッドS溶液に上記試料を浸漬し、試料の染色を試みたところ、局部部に染色できることがわかった。また硫酸溶液中で生成した皮膜の方がしゅう酸溶液中で得られた皮膜より濃く染色された。5.多孔質皮膜化成試料にYAGレーザーを照射して試料の`部分封孔'を試みたが、うまく封孔することができなかった。
都道府県立高校の学校設置者移管に見るローカル教育ガバナンスの構造変容

本研究では都道府県立高校の学校設置者移管を主たる事例に、過疎地域のローカル教育ガバナンスの構造変容を比較実証的に解明する。構造変容を解明するために注目するポイントは、1高校の旧設置者である都道府県との政府間関係の変化、2高校の設置者になることに伴う自治体内の教育行財政の変化、3自治体内外の教育アクターの関係構造の変化である。前記の目的達成を図るために、ローカル教育ガバナンスにおける1政府間関係、2教育行財政、3教育アクター関係の構造変容を解明すべく、3年間でいくつかの自治体を対象に比較実証研究を実施する。最終年度では理論研究に取り組み、4年間の研究成果の公表を進める。
超高速インターネットに適用するスケーラブルIPルーティング制御

インターネットに使用する基幹的通信機器であるIPルータ(インターネット用ルータ)の技術開発の中心は、高速化にあることはいうまでも無い。10Gbpsや40Gbpsの回線制御を可能とする高速化はその代表である。しかし今世紀に入ると、高速アクセスサービス競争の激化を背景として急速に幹線への負荷が増大し、また、Peer通信など少数の通信が、全体の3割程度に達するような利用形態が拡大する傾向が明らかになる。この事実は、従来のIPルータ主体のインターネット幹線では、経済的な運用が困難と予測するまでに至っている。このような急激な環境の変化は、インターネット幹線に採用する技術を抜本的に変えることを要請する。IPパケット中継を基本とするインターネットであっても、増加するトラヒックの全てをパケット中継(Packet Forwarding)に基づくより、トラヒックの特徴に合わせて積極的に光中継を活用することの有利性も無視できなくなる。近年光伝送関係機器の価格低下が著しいことも、この選択の妥当性を説明するものとなっている。このような革新的技術の実現と評価は、次世代ネットワークの中心技術となるものであり、世界から高い評価を受けている。これにより、本研究課題の目標を達成した。米国NSFがvBNS(very highspeed Backbone Network Service)の運用を開始して以来、世界の研究ネットワークは超高速化している。1999年からは、カナダCANARIEプロジェクトでCA^*net3と称する1Gb/s以上の超高速研究ネットワークが運用され、欧州(TEN-155)、ドイツ(DFN)、フランス(RENATER)、オランダ(SURFNET)、,北欧(NORDUnet)でもこれを追随する超高速化が検討されている。このような超高速回線を使用するインターネットの主要な技術開発課題は、超高速回線間にインターネット・パケット(IPパケット)をルーティングする役割を担うルータの性能限界を打破することである。即ち、現在17MPPS(million packet per second:17MPPSは10Gb/sの回線速度に相当する)の能力を限界とする性能を、当面40Gb/sの速度が制御できる能力に向上させ、更に高速回線に対しても目処を持つことである。このために本年度は、国立情報学研究所(千代田区一ツ橋に所在)と国立天文台(三鷹市に所在)間に、NTTの協力を得て、実証評価用の光ケーブルを設け、国立情報学研究所が保有する波長多重伝送装置(WDM)により10Gb/sの回線を構成した。具体的には、以下の研究活動を行った。(1)国立情報学研究所と国立天文台の間に構成する実証評価伝送路の特性を、購入機材を用いて解析した。(浅野、魚瀬)(2)特性解析の結果、波形歪が許容限界を超えることが判明したために、国立情報学研究所から国立天文台、並びに逆方向の夫々の特性を補償するために、等価回路を設計した。これを特注し、伝送特性の改善が図られることを確認した。(浅野、魚瀬)(3)共有メモリ型のルーティング制御装置を実装して、実証回線で基本特性の評価を実施した。(漆谷)(4)前述のカナダCA^*net3と米国Abileneの合同研究会合が8月にカナダ・トロント市で開催され、光(フォトニック)研究ネットワークを可能とするルータ開発が検討され、本研究成果を方向すると共に技術検討を集中的に実施した。(松方、趙、漆谷)(5)同時に、IPv6を取り上げ、このために必要となるルータの開発目標を検討した。(松方)以上により、平成12年度に計画した予備検討を予定通り実施すると同時に、世界の研究ネットワークに関係する研究者と技術検討を実施し、光ネットワークの実用化に必要となる研究課題を検討し、将来の基礎を築いている。世界の研究ネットワークは超高速化し、次世代ネットワークの実現を目指している。平成14年1月から国立情報学研究所がSupersSINETの稼動を始めているが、世界の研究ネットワークも同様に新たな運用を開始している。米国Abilene、カナダCA*net4、欧州GEANT、オランダSURFNET等がその代表であるが、共通するのは、10Gbpsの通信速度を採用していいることである。

このような超高速回線を使用するインターネットの主要な技術開発課題は、超高速回線間にインターネット・パケット(IPパケット)をルーティングする役割を担うルータのパケット制御性能を向上することと、超高速インターネットのIP制御に光通信特有の機能を導入することである。前者は、現在10Gbpsの物理速度に匹敵する25MPPS(million packet per second)の能力を限界とする性能を、40Gbps以上の制御を可能とする高速化を実現することである。後者は、超高速通信網が採用する光伝送手段である光ファイバ伝送路あるいは波長パスの制御を高速に実現することで、オプティカル・ネットワーク技術の開発を行うものである。このために本年度は、国立情報学研究所が保有するCISCO12406と米国Calient社製の光クロスコネクトを用いて光技術を用いるルータ(λルータ)を構成するために、両社を相互に制御するためのインタフェース・ソフトウェアを試作した。同時に、λルータの制御機能を測定する環境を、汎用パソコンを使用し試作した。(研究代表者:浅野、研究分担者:松方、藤野)平成13年9月11日の同時多発テロの影響で、米国Internet2並びにカナダCANARIE年次大会の開催が中止されたが、国際技術開発の場であるIEFTにて本研究開発の成果を報告し(研究分担者:松方)、アジア大洋州における学術研究ネットワーク開発研究組織であるAPANにて同様に報告した。(研究分担者:松方)また、欧州のオプティカル・ネットワークを開発しているDANTEと研究開発協力に関して会合を持ち、次年度の開発体制を検討した。(研究代表者:浅野)以上により、平成13年度の計画を予定通り実施すると同時に、世界の研究ネットワークに関係する研究者と技術検討を実施し、オプティカル・ネットワークの実用化に必要となる研究課題を検討し、研究を進展した。世界の先端的ネットワーク開発は、光通信技術を活用する全光ネットワーク(ファトニック・ネットワーク)の実現に向かっている。平成14年1月から国立情報学研究所はSuperSINETの運用を始めているが、これはフォトニック・ネットワークの実用化前夜に相当する技術によるものであるが、世界をリードするネットワーク構成として注目を集めている。欧米でも、カナダCA*net4やオランダSURFnetで光技術の活用を開始しようとしているが、本研究はこれらの構想を先導する位置づけとなっている。即ち、フォトニック・ネットワークに採用する超高速ルータを、単に速度に見合うように高速化するだけでなく、光技術との整合に配慮して光ルータ(フォトニック・ルータあるいはλルータ等とも呼ばれる)として実現するための基礎評価を行うことを目的としている。(2)平成14年度に設備備品として購入したDWDM制御プレーン・ユニット一式は、既存の日本電気製DWDM(C-Band/ L-Band用)に負荷するためのインタフェースを持つ制御コンピュータである。本装置をDWDM伝送系の管理システムとなるソフトウェアを開発し、既存の2式のDWDMを管理する機能と、ルータならびにOXCと統合制御を実現するためのGPMLSによる信号制御を実装した。(研究分担者:趙、計、魚瀬)
ショウジョウバエの聴覚行動を制御する神経回路基盤の解明

特定の二次聴覚神経の遮断を行った個体を用いた行動実験を行うため、まずは条件検討を行った。神経伝達を阻害する蛋白質であるShi^<ts1>、テタヌス毒素、内向き整流カリウムチャネルを時期特異的に二次聴覚神経AMMC-B1に発現させ、雌雄間の配偶行動が音により促進される効果を解析した。その結果、本行動実験においては、テタヌス毒素が最も効率的に阻害効果を示すことが判明した。よって今後の解析においては、テタヌス毒素を用いて神経伝達阻害を行う。また、ショウジョウバエの配偶行動を活性化するために重要な音要素を体系的に同定するため、求愛歌音の改変を行った。求愛歌を構成するパルスソングやサインソング、といった種に特徴的な音要素の波形、パルス波どうしの間隔の周期的な振動パターンを改変した人工音を作成した。野生型個体を用いて、これら人工音が雌雄の配偶行動を活性化する度合いを定量化した結果、パルス波どうしの適正な間隔が,雌雄の配偶行動活性化に必要であることが判明した。以上,本年度の成果により、特定の二次聴覚経路の遮断効果を行動レベルで解析するための基礎データを得ることができた。今後はこの知見を利用し、それぞれの二次聴覚神経が形成する神経経路で行われる処理様式や機能の解明に取り組む予定である。二種類の遺伝学的手法である、GAL4/UAS法とLexA/lexAop法を組み合わせることで、ショウジョウバエの脳において一次聴覚神経の線維と空間的に接する神経線維を高精度でスクリーニングした。まずはLexA転写因子により一次聴覚野があらかじめGFP標識され、かつGAL4転写因子依存に赤色標識タンパク質DsRedを発現するショウジョウバエ系統を遺伝学的に作成した。次にそのショウジョウバエ系統に対して、脳画像データベースから選出したショウジョウバエGAL4系統を順次交配させ、摘出した脳を用いて抗体染色を行い標識された神経線維を共焦点顕微鏡により三次元的に解析した。現在までに67系統のGAL4系統を解析し、ショウジョウバエの脳における二次聴覚野として同定されているIVLP、一次聴覚野として同定されているAMMC内部の領域Aと食道下神経節を結ぶ新規な二次聴覚神経を同定した。また、音刺激に依存した求愛行動の変化を簡便に解析できる実験系を確立した。まずどのような音刺激が有効かを解析した。白色雑音、合成したパルス音、録音したショウジョウバエの求愛歌を雌雄に聞かせ、音刺激前後の雌雄の行動を録画後に解析したところ、録音した求愛歌が最も効率よく求愛行動を誘発することが示された。また、来年度以降の解析は30°Cという高温下や19°Cという低温下で行う必要があるため、この行動解析系の温度依存性を検討した。その結果、それらの温度においても求愛歌に依存した求愛行動の活性化が確認された。以上の結果により、来年度行う予定の、シナプス伝達遮断実験の予備実験が完成した。
抗体の特異性を利用したタンパク質の一次構造解析

トリペプチド配列を特異認識する抗体の作成を2年連続して試みたが、トリペプチドの配列の前後に隣接するアミノ酸残基により抗体のエピトープに対する親和性が大きく影響されるため、トリペプチドだけをエピトープとして認識する抗体も作成できなかった。また、疎水性の高い3アミノ酸が連続する配列を認識する特異抗体を作成することもできなかった。従って、抗体ライブラリーでプロテインチップを作成しても、抗体との反応性のみ(すなわちチップの反応性のパターンだけ)からペプチドの一次構造を推定することは困難と思われた。タンパク質のアミノ基FITCを用いて化学修飾し、プロテアーゼで消化後にさらにPITCにより新出のアミノ基を化学修飾し、抗PITC抗体カラムに通じることにより、アミノ末端由来ペプチドを得る事は可能であったが、抗体カラムが安定性でないこと、再利用も困難なことから実用化にはさらなる工夫が必要と考えられる。検出系としてMALDI-TOFを用いることの可能な系(ゲノムデータベース等により質量数からだけでもある程度配列分析が可能な場合)では、比較的微量サンプルに対する化学修飾の条件を標準化することができれば、実用化もある程度可能であると思われた。また、微量化するには反応条件のさらなる検討が必要であるが、抗体カラムの代わりに固相化された活性カルボキシル基とODSカラムを併用して、アミノ基のブロックされたペプチドを選択的に濃縮することも可能であり、今後の検討課題である。アセチル化アルブミンをラットに免疫し、アセチル化されたアミノ末端アミノ酸に特異的なモノクローナル抗体の産生を試みたが、特異的な抗体は得られなかった。そこで、タンパク質を酵素消化後に、アミノ末端由来のペプチドだけを特異的に回収する方法の開発を試みた。まず、ラットをPTH化ラットアルブミンで免疫し、ハイブリドーマを作製、同抗原でスクリーニングし、抗PTH抗体を産生するクローンを作製した。ハイブリドーマ培養液からIgGを精製し、固定化カラムを作製し、アミノ末端由来ペプチド単離用カラムとした。次に、コブラ毒から精製した蛇毒成分を還元、ピリジノエチル化後、FITCでアミノ基を化学修飾した。ついで、Asp-Nで消化後、PITCでPTH化し、上記抗体カラムに通じた。すどおり分画のアミノ酸配列分析により、アミノ末端ペプチドに対応する配列を確認することができた。原理的には、アミノ末端がブロックされているタンパク質からもアミノ末端由来のトリプシン分解断片だけを単離できるので、得られたペプチドをマススペクトル分析することによりブロックされたアミノ末端に関する情報が得られるはずである。これらの知見に基づき、新年度は、各ステップでの実験条件をオプチマイズするとともに、系を微量化し、実用的な条件を確立したい。また、同様の手法でカルボキシル末端に対する化学修飾を試みたが、他のアミノ酸残基の側鎖に対する副反応などにより芳しい結果は得られなかった。これについては、さらに他の修飾試薬を検討している。蛋白質中のアミノ酸配列から3アミノ酸残基から構成される配列だけを特異的に認識する抗体を作製する目的で、モデル蛋白質の2カ所に対応するペプチド(を合成し、ラットアルブミンに結合させ、ラットリンパ節法によりモノクローナル抗体を作製した。アルブミンに結合させたペプチドをマイクロタイタープレートに固相化しスクリーニングして得られた抗体には、3アミノ酸よりなるペプチドのみと反応する有効な抗体は得られなかった。抗原ペプチドの抗原配列が3アミノ酸残基では、特殊な場合を除き、抗体との結合が弱いと思われる。分子間相互作用解析装置を利用して、抗原と抗体の結合解離過程を直接解析すれば、結合が弱くても相互作用を解析することは可能かもしれないが、一次構造解析に利用するには、もう少し長い配列が必要と思われる。抗PITC抗体を固定化したカラムを用いる化学修飾試薬に対する抗体を蛋白質の末端構造解析に利用する試みを、コブラ毒素のひとつであるカルディオトキシンに適用し、アミノ末端由来ペプチドを単離し、ペプチドシーケンサによりそのアミノ末端を決定することができた。微量化にはマススペクトル分析を試みているが、一般化するには、MALDI-TOFが苦手とする分子量500以下の低分子ペプチドの分析法を工夫する必要のあることが新たな問題点として浮かび上がってきた。この点について新年度に更に工夫を試みたい。また、限定分解に必要なプロテアーゼのレパートリーを増やすことも検討課題である。

また、微量化するには反応条件のさらなる検討が必要であるが、抗体カラムの代わりに固相化された活性カルボキシル基とODSカラムを併用して、アミノ基のブロックされたペプチドを選択的に濃縮することも可能であり、今後の検討課題である。
モガムリズマブ治療後のB型肝炎ウイルス再活性化メカニズムの解明

1) CCR4抗体モガムリズマブ投与後のHBV再活性化リスク:全身化学療法後のB型肝炎ウイルス(HBV)の再活性化は、HBs抗原陽性患者のみならず、HBV既往感染(HBc抗体陽性and/or HBs抗体陽性)患者においても生じ、劇症肝炎の発症は致死的な合併症となる。今回、CCR4抗体モガムリズマブ投与後の免疫モニタリングに関する多施設共同観察研究(MIMOGA研究:UMIN000008696)登録例を対象とし、HBV既往感染歴を有するATLにおける、モガムリズマブ投与後のHBV再活性化リスクを評価した。全102例の登録例のうち、各施設のHBV血清マーカーを用いた評価で、3例(8.8%)がHBs抗原陽性で、1例がoccult HBV(HBV DNA検出)で、39例(38%)がHBV既往感染と判断された。HBV既往感染39例中34例が少なくとも1回以上のHBV DNAモニタリングが実施された。HBV再活性化は、モガムリズマブ投与後にHBV DNA量が1.3 log IU/mL以上になった場合と定義された。HBV DNAのフォローアップ中央値は467日で、HBV再活性化を3例(8.8%)に認めた。現在、保存検体を活用した、HBV再活性化リスク因子の同定を検討中である。2)全身化学療法前後のHBc抗体価の推移:高感度HBc抗体の有用性日本肝臓学会総会にてパネルディスカッション(英語)のセッションで発表予定である。保存検体を用いた附随研究のデータ解析が遅れている。附随研究として、保存検体を用いた、高感度系のHBV血清マーカーの測定を予定している。がん化学療法後のB型肝炎ウイルス(HBV)再活性化は、HBs抗原陽性例だけでなく、HBV既往感染例からも起こる(de novo B型肝炎)ことが判明しており、とくにCD20モノクローナル抗体であるリツキシマブ併用化学療法がリスク因子であることが報告されてきた。最近になり、CCR4モノクローナル抗体である、モガムリズマブ併用化学療法後のHBV再活性化が報告されつつあるが、そのリスクについてはよくわかっていない。今回、HBs抗原陽性の成人T細胞白血病リンパ腫(ATL)に対する、モガムリズマブ単剤療法後に重篤な肝障害を発症した1例を経験した。抗ウイルス薬によりHBV DNAは低いレベルまでコントロールした状態でのモガムリズマブ投与であったが、2回投与後に劇症肝炎を発症、幸いにも死亡には至らなかった。その発症機序は不明であるが、モガムリズマブよる免疫賦活作用がHBV感染肝細胞への攻撃に寄与した可能性が考えられた(第78回日本血液学会学術集会2016年、および第18回国際ヒトレトロウイルスHTLV会議東京2017年にてポスター発表)。また、モガムリズマブ投与後の免疫モニタリングに関する、多施設共同前方視的研究(MIMOGA study、UMIN000008696)に登録された、HBs抗原陽性およびHBV既往感染例のHBV再活性化のリスクを評価する附随研究を計画中である。これまでに収集されたデータより、登録時のHBV感染状況としては、75例中2例(2.6%)がHBs抗原陽性であり、30例(40.0%)がHBV既往感染であった。モガムリズマブ投与後のHBV再活性化のメカニズム解明のためには、正確なリスク評価が重要であり、HBs抗原陽性例およびHBV既往感染例に対する、再活性化対策の有用性の検証も行っていく予定である。多施設共同前方視的観察研究における附随研究について、プロトコール改訂作業を完了し、参加施設においてIRB審査中である。今回、モガムリズマブ投与後の免疫モニタリングに関する、多施設共同前方視的研究(MIMOGA study、UMIN000008696)に登録された、HBs抗原陽性およびHBV既往感染例のHBV再活性化のリスクを評価する附随研究を実施中である。MIMOGA studyにおいて、2012年8月から2017年4月までに登録された、モガムリズマブ投与予定の成人T細胞白血病リンパ腫102例を対象とし、登録時のHBV血清マーカーを評価した。評価可能96例中3例(3.1%)がHBs抗原陽性であり、38例(39.6%)がHBV既往感染であった。現在、HBV再活性化イベントおよび再活性化に関連するリスク因子の同定に向けた、保存血清の解析を準備中である。リツキシマブに比較して、モガムリズマブ単剤あるいは併用化学療法におけるHBV再活性化リスクおよびその臨床的特徴に関するエビデンスを示す。多施設共同臨床研究のデータ収集が遅れている。1) CCR4抗体モガムリズマブ投与後のHBV再活性化

リスク:全身化学療法後のB型肝炎ウイルス(HBV)の再活性化は、HBs抗原陽性患者のみならず、HBV既往感染(HBc抗体陽性and/or HBs抗体陽性)患者においても生じ、劇症肝炎の発症は致死的な合併症となる。今回、CCR4抗体モガムリズマブ投与後の免疫モニタリングに関する多施設共同観察研究(MIMOGA研究:UMIN000008696)登録例を対象とし、HBV既往感染歴を有するATLにおける、モガムリズマブ投与後のHBV再活性化リスクを評価した。全102例の登録例のうち、各施設のHBV血清マーカーを用いた評価で、3例(8.8%)がHBs抗原陽性で、1例がoccult HBV(HBV DNA検出)で、39例(38%)がHBV既往感染と判断された。HBV既往感染39例中34例が少なくとも1回以上のHBV DNAモニタリングが実施された。HBV再活性化は、モガムリズマブ投与後にHBV DNA量が1.3 log IU/mL以上になった場合と定義された。HBV DNAのフォローアップ中央値は467日で、HBV再活性化を3例(8.8%)に認めた。現在、保存検体を活用した、HBV再活性化リスク因子の同定を検討中である。2)全身化学療法前後のHBc抗体価の推移:高感度HBc抗体の有用性日本肝臓学会総会にてパネルディスカッション(英語)のセッションで発表予定である。保存検体を用いた附随研究のデータ解析が遅れている。ウイルス側および宿主側のリスク因子の解明のために、保存検体の活用をすすめる。附随研究として、保存検体を用いて、高感度系のHBV血清マーカーを測定する予定である。附随研究として、保存検体を用いた、高感度系のHBV血清マーカーの測定を予定している。保存検体を用いた、附随研究の対象数が予定よりも少なかったため保存検体の追加測定が遅延したため。高感度系HBVマーカーおよびHBV特異的CTLアッセイ系の測定を予定している。保存検体を用いた附随研究の進捗が遅れ、HBV関連マーカーの測定キット購入が必要となった。今年度に、保存検体を用いたHBV再活性化マーカーの測定を行う
中世イタリア地方領域国家の法的多元性と運用実態

本研究では14世紀末から15世紀のフィレンツェ共和国の支配領域の法的多元性に目を向けて、その多元性を容認する法的・行政的システムと支配の実態とを分析した。その結果として、フィレンツェが従属都市に法的自律性を認めつつ、領域支配の実質的集権化を試みる一方、従属都市がフィレンツェのエリート層とのパトロネジを活用して、自分達の権利や利益を守ろうとしていたことを明らかにした。本研究の目的は、14世紀末から15世紀のフィレンツェ領域の法的多元性に特に目を向け、その多元性を容認するシステムと、支配の実態とを分析することにある。これは、応募者が継続的に研究している中世末期イタリアの都市社会における人的ネットワークとその政治的・社会的機能の解明から発展したものである。研究にあたっては、支配都市であるフィレンツェと、これに従属した都市に焦点を当て、フィレンツェの支配下における都市社会の支配的階層の対応あるいは変化を解明しようとしている。特にピサとアレッツォについてフィレンツェ支配の影響と在地社会の対応を探るべく、フィレンツェ国立文書館、アレッツォ国立文書館、ピサ国立文書館で史料を調査し、イタリアの実証的な地方史をより大きなヨーロッパ中世史の議論に結びつけることに努めている。本年度は領域支配の中心としてのフィレンツェの都市整備について考察をまとめたうえ、3回の出張を通して、フィレンツェ国立文書館における史料の調査と収集を行った。第1回の調査では、フィレンツェの都市法から領域支配に関する意識や都市の位置づけに関する意識を探るべく、Statuti del Comune di Firenzeシリーズに含まれる1415世紀の都市法を調査し、1355年法に初めてコンタードの行政機構であるレーガ(同盟)とその構成についての詳述が見えることを確認した。更に俗語の都市法とラテン語の都市法とを比較し、異同を検証した。第2回の調査ではこうした結果を受け、アレッツオでの調査を変更して、引き続きフィレンツェの1415年法を調査すると共に、既に検討中の領域共同体条例改変記録の一帳簿(Miscellanea Repubblicana 144)について、領域行政と無関係であるにもかかわらず挿入されているフィレンツェ学問所のギリシャ語教師雇用記事の背景を検証するため、学問所に関する政策・決議の記録やSignori e collegiシリーズに含まれるいくつかの史料の内容を検討したが、現在のところ雇用記事の背景となる記録は確認出来ていない。第3回の調査は、第2回の調査を補足するものとして行い、領域支配政策に関わるUfficio delle CastellaおよびMonte comune e graticole, Parte IIのシリーズの複数の史料を調査した。その内容分析は現在進行中である。また、都市整備や領域行政に関する諸史料を含むCapitano di Parte Guelfa, Numeri Rossiのシリーズの記録を調査し、14世紀中葉に領域の道路や橋の管理・維持にフィレンツェ政府が大きな関心をはらい、細かな規定を設けていたことを検証できた。本年度は昨年度の結果を踏まえつつ、2回の出張を通して、フィレンツェ国立文書館とピサ国立文書館における史料の調査と収集を行った。第1回の調査では、フィレンツェ国立文書館において、14世紀から15世紀前半に制定された法規定の中から領域支配に関する情報を得るべく、Provvisioni、Protocolli、Duplicati、Libri fabarumといった法令発効に関わる史料を調査した。また昨年度に引き続き、都市整備や領域行政に関する諸史料を含むCapitano di Parte Guelfa, Numeri Rossiの記録を精査し、こうした問題に関わるフィレンツェ当局の関心や意識を、史料の中の文言から検証することを試みた。また、ピサ国立文書館における調査では、フィレンツェ国立文書館には存在しない、ピサの都市法とその改変記録が所蔵されていることを確認した。第2回の調査ではこうした結果を受け、フィレンツェ国立文書館でのProvvisioniや都市法の調査を継続するとともに、ピサ国立文書館においてはComune di Pisaのシリーズに所蔵されている15世紀の都市法改変記録を調査した。ピサでの史料調査の結果、ピサがフィレンツェに征服された後、根本的にピサの都市法を変え、また行政組織をもドラスティックに変える試みがなされたことを史料の内容から確認できた。こうした調査の結果の一部は、マイクロフィルムおよび電子体情報としての複製を文書館に依頼したので、これを入手し次第、より入念な分析を試みる予定である。本年度も昨年度の結果を踏まえつつ、2回の出張を通して、フィレンツェ国立文書館における史料の調査と収集を行った,第1回の調査では、フィレンツェ国立文書館において、14世紀から15世紀前半に制定された法規定の中から領域支配に関する情報を得るべく、昨年に続いてProvvisioni registri、Provvisioni protocolli、Provvisioni duplicati等の史料を調査し、領域行政の現場と中央政府とのつながりを探った。またStatuti delle comunita autonomee soggetteに含まれる、アレッツォの都市法の内容を調査した。今回は日程上、ピサ国立文書館での調査は行えなかったので、来年度にその調査を継続する予定である。こうした調査の結果として確認された史料の一部は、マイクロフィルムおよび電子体情報としての複製を文書館に依頼した。

最終年度である本年度は、これまでの調査結果を踏まえつつ、研究の締めくくりとして9月にフィレンツェとアレッツォの国立文書館での史料の調査と収集を行った。フィレンツェでは領域共同体からの請願の内容とそれに対する対応から、フィレンツェ側の領域意識を探るべく、14世紀後半から15世紀前半のProvvisioni registri、Provvisioni protocolli、Provvisioni duplicati等の法令作成記録を調査した。また、5月に国際東方学者会議シンポジウムで報告した際、人的ネットワークを通じたフィレンツェとアレッツォの非公式な結びつきと、その行政への影響について質問を受けたことを踏まえ、アレッツォ国立文書館で15世紀前半の評議会議事録を調査し、アレッツォの都市行政に関わる問題について、フィレンツェの有力市民に対する書簡による働きかけが行われていたことを確認した。こうした調査の結果として確認された史料の一部は、フィレンツェ国立文書館については電子体情報としての複製を依頼し、アレッツォ国立文書館については、持参のデジタルカメラによって撮影した。帰国後、これらの史料の具体的な分析と考察を行ったが、11月のイタリア近現代史研究会における報告の際の質問を受けた関連史料の確認や、自分で撮影した史料の一部不鮮明な部分の再確認が必要となったため、2012年3月に再度、フィレンツェとアレッツォへの出張を行い、文書館で史料を確認して、分析・考察結果の最終的な検証を行った。