hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
求心性迷走神経を介した末梢ホルモン受容―中枢伝達―摂食行動連関の解明

よって、H25年度は、このOXTの摂食抑制経路を「遺伝子発現解析」と「生理・行動解析」を組み合わせて解析する。当初H24年度計画は、求心性迷走神経内の神経伝達物質の変動をDNAマクロアレー等を用いて解析をし、摂食を調節する神経伝達物質をスクリーニングする予定であった。一方で、求心性迷走神経に強力に作用し、満腹感を誘導する分子(オキシトシン)を発見し、こちらの研究を大きく伸展させた。オキシトシンは限局した迷走神経に作用して強力に摂食量を抑制させることから、求心性迷走神経から脳(延髄孤束核)へ満腹シグナルを伝達する神経伝達物質の探索・解析に非常に有用なツール化合物になると考えられる。1)迷走神経に作用する摂食調節性末梢因子を探索し、その応答する神経細胞のその他因子への応答性から特徴を解析する。2)満腹時、空腹時のマウスのNodose ganglionに発現しているmRNA量を、DNAマイクロアレーにて解析し、その発現量の変化から摂食調節に関与している神経伝達物質を探索する。マイクロアレー結果を定量的PCR法にて再解析する。3)第4脳室もしくは延髄孤束核へ神経伝達物質を投与し摂食量の変化を解析する。4)摂食調節性末梢因子投与後の摂食量変化に対して、候補神経団津物質の受容体阻害剤や中和抗体を第4脳室/延髄孤束核へ投与の効果を検討する。実験に必要な実験動物、各種試薬・消耗器機等を購入する。DNAマイクロアレー解析を外部業者に委託依頼する。本研究に関連する学会への参加・研究成果報告のための参加費・旅費を計上する。さらに、論文投稿費、英文校閲費、本実験関連資料費をその他として計上する。
DE-Sinc法の展開

近年,高橋・森によって数値積分用に提案された二重指数関数型変数変換を,Stenger等によって開発されたSinc数値計算法に組み入れることによって,高精度の数値計算法(DE-Sinc法と呼ばれる)が得られることが分かってきた.本研究では,積分方程式,常微分方程式,Poisson方程式に対するDE-Sinc法を設計し,その理論解析を与えた.また,本件と関係して,大規模連立一次方程式の数値解法に関しても新しい高速解法を提案した.近年,高橋・森によって数値積分用に提案された二重指数関数型変数変換を,Stenger等によって開発されたSinc数値計算法に組み入れることによって,高精度の数値計算法(DE-Sinc法と呼ばれる)が得られることが分かってきた.本研究では,積分方程式,常微分方程式,Poisson方程式に対するDE-Sinc法を設計し,その理論解析を与えた.また,本件と関係して,大規模連立一次方程式の数値解法に関しても新しい高速解法を提案した.DE-Sinc法に関連する以下の3つの成果を得た:(1)特異核を持つ第二種積分方程式に対するDE-Sinc数値計算法の提案とその理論誤差解析弱特異核を持つ第二種積分方程式に対するSinc数値計算法は,Volterra型の場合にRileyによって提案され,非常に高精度であることが数値実験を通して報告されており,粗雑ではあるが誤差の理論解析も行われていた.これに対して,我々は,DE変換を用いたSinc数値計算法をFredholm型も含む場合に提案した.また,その理論誤差解析を厳密な形で与えた.特に,Rileyの論文における「未知関数に対する仮定やサンプリング数の大きさに関する制限」といった不自然な仮定を取り除いた形での収束定理を与えることに成功した.Sinc数値計算法の基礎はSinc関数近似(Sincサンプリング公式)である.これに対して,最近,Sinc関数をGauss関数を用いて局所化した核を用いるサンプリング公式がQian等によって提案され,帯域制限された関数族に対しては,Fourier解析を用いた精緻な誤差解析が与えられていた.これに対して,我々は,複素解析を用いた誤差解析手法により,Qian等の結果を拡張することに成功した.近い将来,この理論に基づいて,「Sinc数値計算法」に替わる「Sinc-Gauss数値計算法」が確立されることが期待される.(3)1次元Poisson方程式に対するSinc法の准最適性の証明Poisson方程式に対するSinc数値計算法および誤差解析はStengerによって確立されている.これた対して,我々は,1次元の場合ではあるが,この誤差が准最適であることを証明した.DE-Sinc法に関連する以下の3つの成果を得た:(1)DE-Sinc関数近似法やDE積分公式が有効になる関数族の明確化従来,Sinc数値計算法においては,SE変数変換を用いた方法に関しては,その手法が有効となる関数族がStenger等にとって明確にされていた.これに対して,DE変換を用いた方法に関しては,これまで明確とは言えない状況が続いていた.これに対して,本研究では,DE-Sinc関数近似法やDE積分公式が有効,つまり,誤差がexp(-cn/log(n))のオーダーで減衰する関数族を明確にした.(2)特異摂動2点境界値問題に対するDE-Sinc法提案特異摂動2点境界値問題に対して,Stenger等によってSinc法が提案され,その誤差がexp(-c√n)のオーダーであることが示されていた.本研究では,変数変換をDE変換に代えることによって,誤差のオーダーがexp(-cn/log(n))に改良できること数値実験を通して示した.従来の数値計算法では解が端点特異性を持つ場合,その性能が極端に落ちるが.本法ではそのような性能の劣化は起きない.(3)線形方程式系の数値解法,GIDR(s,L)法の提案,偏微分方程式にSinc法を適用する場合,大規模な疎な係数行列をもつ線形方程式系を解く必要が生じる.2008年に,線形方程式系の数値解法として非常に性能のよいIDR(s)という方法が提案された,しかしながら,係数行列が歪対称に近い場合には性能が極端に落ちることも報告されていた.我々は安定化多項式の次数を上げて,これに対処できるGIDR(s,L)を提案し,数々の数値実験によってその有効性を実証した.DE-Sinc法に関運する以下の3つの成果を得た:(1)第二種積分方程式に対するSinc数値計算法の厳密理論誤差解析第二種積分方程式に対するSinc数値計算法(Sinc-Nystroem法,Sinc選点法)がRashidinia-Zarebnia(SE変換の場合)やMuhammad et al(DE変換の場合)によって提案され,非常に高精度であることが数値実験を通して示され,誤差の理論解析も行われてきた.しかしながら,それらの理論においては(1)未知関数に対する仮定,(2)積分方程式を離散化して得られる線形方程式系に関する仮定が含まれており,厳密な意味での理論解析とは言い難い面があった.これに対して,本研究ではこれらの仮定を必要としない厳密な誤差評価を与えた.(2)常微分方程式の初期値問題に対する様々なSinc数値計算法の比較検討(3)線形方程式系の数値解法,GBi-CGSTAB(s,L)法の改良前年度,線形方程式系の数値解法として非常に性能のよいGBi-CGSTAB(s,L)法を提案した.しかしながら,s,Lが大きい場合には偽収束(アルゴリズムが生成する残差は小さいにも関わらず,真の残差は小さくない状況)が起こることが分かってきた.
グルタミン合成酵素多重遺伝子族の機能分化とその生理的意義の研究

昨年度の研究から、トウモロコシの細胞質基質局在型グルタミン合成酵素(GS1)アイソザイムのうち、不安定型であるGS1dと安定型であるGS1a間の、酵素化学的性質(比活性、熱安定性、Mg^<2+>,Mn^<2+>要求性)の違いには、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖の性質が深く関与していることが示された(論文作成中)。そこで今年度は、このアミノ酸側鎖の立体構造上での位置を含め、植物GS分子の高次構造を明らかにするためトウモロコシGSの結晶化を試みた。大腸菌での発現系を用いて数百mgのGS1を精製し、スパースマトリックス法を用いたクリスタルスクリーンで初期条件を探索した。その後、沈殿剤の濃度・種類、塩濃度、緩衝液のpH・種類等を検討した。その結果、透明度の高い、0.1mm程度の結晶を得たが、予備的なX線照射の結果では散乱X線強度は弱く、空間群、格子定数を求めるには至っていない。昨年度の研究に引き続き、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖のみを安定型(GS1a:Ile_<161>)から不安定型(GS1d:Ala_<161>)へ置換したGS1a161IAタンパク質の物性について解析を行った。その結果、不安定化した置換体GSlはゲルろ過での挙動により、8量体構造が容易に崩れてしまうことが明らかとなり、このアミノ酸側鎖がサブユニット間での相互作用に関与していることが示唆された(論文作成中)。窒素同化系などへ還元力を供給する、フェレドキシン分子種の中から維管束鞘細胞特異的に発現する分子種の遺伝子を単離し、その発現様式を明らかにした。トウモロコシの細胞質基質局在型グルタミン合成酵素(GS1)アイソザイムのうち、窒素源に対する応答性の異なる誘導型GS1(GS1c,GS1d)と構成型GS1(GS1a,GS1b)の、酵素化学的性質(比活性、熱安定性、Mg^<2+>,Mn^<2+>要求性)の違いを律する領域・アミノ酸残基の同定を試みた。GS1a,GS1dをタンデムに連結したプラスミドを構築し、recA^+大腸菌内での相同組替えにより、任意の場所で組換えを起こしたGS1a/GS1dのキメラ酵素を多数作製した。キメラ酵素の2価金属イオン依存的な安定性を調べ、安定性に変化を与える領域を絞り込んだ。次に、その領域内で、GS1aとGS1dの間で保存されていない7つのアミノ酸残基についてGS1a上のアミノ酸を順にGS1d型へ置換し、その影響を調べたところ、GS1aのlle_<161>からAla_<161>への置換体で安定性が大きく低下した。このことは、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖の性質が、GS1a,GS1d間での2価金属イオン依存的な安定性の違いに深く関与していることを示唆している(投稿準備中)。植物GSの翻訳後レベルでの活性制御機構、特にフィードバック阻害について調べたところ、植物のGSはAlaとADP,AMP、またカルバミルリン酸(CP)とADP,AMP共存在下で累積的フィードバック阻害を受けること、興味深いことにAlaとCP存在下では相乗的フィードバック阻害を受けることが明らかとなった。このことは植物GSが、細胞内の窒素・エネルギーレベルによって活性レベルで強い制御を受けることを示唆している(論文作成中)。窒素と炭素代謝のクロストーク機構研究の発端とすべく、糖合成の鍵酵素であるスクロースリン酸合成酵素が多重遺伝子族を構成することを見出し、発現様式の違いを明らかにした(報文1)。窒素のサイトカイニンを介した情報伝達に関わると考えられる、二成分情報系因子のホモログの遺伝子を見出し、その発現様式を明らかにした(報文2)。窒素同化系などへ還元力を供給する、フェレドキシン分子種の中から維管束鞘細胞
食事からの抗酸化物質摂取総量の推算を可能とする食品の抗酸化能データベースの構築

食品の抗酸化能データベースの構築について検討し、以下の成果を得た。(1)食品の抗酸化能測定方法であるORAC法の測定結果が希釈倍率に影響されることを明らかにし、方法を改良して分析精度を向上した。(2)肉、魚類等の動物性食品の中には、野菜、果物類に匹敵する抗酸化能を有する食品があることを明らかにした。(3)動物性食品の抗酸化能に寄与する物質として一部のアミノ酸が考えられることを示した。(4)調理により抗酸化能が増加する場合と減少する場合があることを示した。今後、食事からの抗酸化物質の摂取が健康に及ぼす影響を明らかにするための疫学研究の基礎データとなる食品の抗酸化能データベースを更に拡充したい。野菜・果物を中心とした食品に含まれる抗酸化物質は健康の維持・増進に大きく寄与することが期待されている。食品には多種類の抗酸化物質が含まれているが、「総量としてどの程度の抗酸化物質を摂取すれば健康を維持・増進できるか」について、現時点では確たる科学的根拠は得られていない。これまで研究代表者はORAC法を用い代表的な野菜・果物の抗酸化能を測定し、それらからの抗酸化物質一日摂取総量を推算してきた。本研究はそれをさらに発展させ、野菜・果物以外の食品を含む食事全体からの抗酸化物質摂取総量の推算を可能とするため、「食品の抗酸化能データベース」を構築することを目的とする。4年計画の2年目である当該年度は、まず、代表的な飲料のORAC値の測定を行った。茶飲料、野菜ジュース、果物ジュースのORAC値が7μmolトロロックス相当/mL程度であるのに対し、コーヒーのORAC値は50μmolトロロックス相当/mLで、他の飲料より高い傾向が認められた。国民健康・栄養調査の食品群別栄養素等摂取量に基づき計算すると、これら飲料からの抗酸化物質摂取量は一般的な野菜・果物からの抗酸化物質摂取量に匹敵すると考えられた。次に、食品に含まれる抗酸化物質間の相互作用について解析するため、9種類の抗酸化物質の標準品を用いた検討を行った。2つの抗酸化物質溶液を混和した場合、概ね理論通りのORAC値が得られたが、1割程度の相乗・相殺作用が認められる組み合わせがあった。最後に、ケーキをモデルとして調理の影響について予備的検討を行った。4種類のケーキを作成し、調理前と調理後のORAC値を比較した結果、調理による30-70%程度のORAC値の増加が認められた。これは水分の揮発だけでは説明できず、調理中に新たな抗酸化物質が生じている可能性が考えられた。食品には多種類の抗酸化物質が含まれているが、「総量としてどの程度の抗酸化物質を摂取すれば健康を維持・増進できるか」について、現時点で確たる科学的根拠は得られていない。4年計画の3年目である当該年度は、種々の食品の抗酸化能を測定しデータベースの拡充を行った。しかし、まだ全食品群を網羅できていないため、次年度も引き続き食品の抗酸化能測定を実施する予定である。また、調理が食品の抗酸化能に及ぼす影響について検討した結果、抗酸化能が増加する場合と減少する場合が認められた。これは加熱等により、抗酸化物質が分解・流出して失われるだけでなく、新たな抗酸化物質が生成する可能性を示唆していると考えらえた。4年計画の1年目である当該年度は、広範な食品について抗酸化能の測定を行い、データ数の充足を図る計画であった。しかし、抗酸化能の測定法として用いるORAC法に以下の問題があることが明らかとなったので、その原因の究明および改良を行った。

ORAC法では、食品から抗酸化物質を含む抽出液を作成し、そこに含まれている抗酸化物質の総量をTroloxの量に換算する。抽出液の抗酸化能が高い場合は適宜希釈した後に測定が行われるが、このとき採用した希釈倍率により、希釈前の抽出液の抗酸化能が異なる計算結果となる場合がある(抗酸化物質標準品を用いた検討では最大1.9倍の誤差が認められた)。これは、試験溶液の抗酸化能と抗酸化物質濃度との関係が非線形であることが原因であり、基準とするTroloxの濃度を決め希釈倍率を収束することで抽出液の抗酸化能が一定値となるよう改良を加えた。次年度以降は、この改良ORAC法を用いて当初の計画を達成できるよう研究を推進する。野菜・果物を中心とした食品に含まれる抗酸化物質は健康の維持・増進に大きく寄与することが期待されている。食品には多種多様な抗酸化物質が含まれているが、「総量としてどの程度の抗酸化物質を摂取すれば健康を維持・増進できるか」について、現時点で確たる科学的根拠は得られていない。これまで、研究代表者はOxygen Radical Absorption Capacity(ORAC)法を用い、代表的な野菜・果物の抗酸化能を測定し、それらからの抗酸化物質一日摂取総量の検討を行ってきた。本研究は、それをさらに発展させ、野菜・果物以外の食品を含む食事全体からの抗酸化物質摂取総量の推算を可能とする「食品の抗酸化能データベース」を構築することを目的として実施した。4年計画の4年目である当該年度は、今まで抗酸化活性が比較的小さいと考えられており、網羅的な抗酸化能の評価が不十分であった動物性食品(魚介類、肉類、卵類、乳類)について、重点的に検討した。動物性食品のH-ORAC値(親水性抗酸化物質の総量を反映)は、最大値を比較すると野菜・果物に及ばないものの、平均的な野菜・果物の数値と同程度のものが多数存在した。一方、動物性食品のL-ORAC値(親油性抗酸化物質の総量を反映)は、野菜・果物の最大値を超える食品が存在した。これらのことから、現在ほとんど注目されていない動物性食品が、抗酸化物質摂取総量へ及ぼす寄与は少なくない可能性が考えられた。動物性食品の抗酸化能がどのような物質に由来するかについては充分な検討が行えなかったが、20種類の必須アミノ酸についてORAC値を測定した結果、5種類のアミノ酸(Cys、Met、Tyr、Trp、His)に抗酸化活性が認められており、これらを含むたんぱく質・ペプチドの寄与が示唆された。食品分析1年目に、抗酸化能の測定法として用いるORAC法にメソッドとしての問題点があることが明らかとなり、その原因究明および改良を行ったため、当初の研究計画よりやや遅れている。1年目に、抗酸化能の測定方法として用いるORAC法に再現性に関する問題点があることが明らかとなり、その原因究明および改良を行った。そのため、当初の研究計画より全体的にやや遅れている。研究実績の概要で述べたように、抗酸化能の測定法として用いるORAC法に問題点があることが明らかとなった。構築する「食品の抗酸化能データベース」の信頼性を確保するために、まずORAC法の問題点の原因解明および改良を行った。そのため、当初計画していた広範な食品について抗酸化能の測定は部分的にしか行えていない。次年度以降、改良したORAC法を用いて、当初の計画を達成できるよう研究を推進する。
製品に対する環境・安全規制がパーツ供給企業に与える影響に関する研究

本研究は実証分析研究と理論研究の2つのパートからなり、実証分析の方を先に進め、実証分析の知見を活かして理論モデルを構築するかたちで研究を進めている。本年度の前半は実証研究に向けてデータ整備と基礎的な統計分析を行いつつ、書籍購入や学会参加などを通して、実証研究・理論研究の両方に関する情報収集を行った。特に、6月末に開催された環境資源経済学の世界大会で聞いた研究報告から理論研究に関するヒントを得ることができるなど、有意義なものであった。実証分析では、自社の製品・サービスに対して、顧客から環境負荷低減に関する取り組みを要求されたことが、製品・サービスの環境負荷(温室効果ガス・化学物質)を低減させるR&Dを行う確率をあげるかどうか検証している。温室効果ガスについては、取り組み要求がR&Dを促すことを強く支持する結果を得ることができなかった。要求の有無に関係なくR&Dを行う企業がそれなりにいることを示唆しているかもしれない。また、化学物質に関する分析結果は判然とせず、結果の解釈を注意深く検討しているところである。理論研究の方は、世界大会で聞いた研究報告から得たヒントをもとに検討し、部品の環境または安全に関する品質が部品の需要量に影響を与える状況を、部品の品質と最終財生産者にとっての部品の私的価値(≒需要量)の関係がある状況としてモデル化する方向でモデルの構築を始めた。ある品質以下なら部品が需要されなくなる状況を品質規制の導入と捉えられる。今後は、それを利用して、品質規制の有無でサプライヤーの部品に対するR&Dのインセンティブがどのように変わるか、部品の品質と部品への需要の関係性の違い(例えば、品質規制さえクリアしていれば問題なしだとか、品質が高い方が魅力的だとか)が、品質規制がR&Dのインセンティブに与える影響をどのように変えるのかを分析する予定である。遅れている大きな要因は以下の2つである。1つ目は、大学を異動して、これまでと違う授業を複数担当して授業準備などに時間をとられたことで、想定していたより研究に時間をさけなかった。2つ目は、実証分析研究で、推定が終わって結果を解釈する段階で処置変数(説明変数)を「自社の製品・サービスに対して、(環境負荷情報の開示を含む)顧客から環境関連の取り組み要求があったかどうかのダミー変数」から「自社の製品・サービスに対して、顧客から環境負荷低減の取り組み要求があったかどうかのダミー変数(環境負荷情報の開示を含まない)」を変えて推定しなおしたため、時間がかかってしまった。上記のように処置変数を変えた理由は、理論研究では顧客へ納入するパーツの環境負荷を低減するR&Dに着目する予定であるので、実証研究もそれに合わせた方が良いと判断したからである。以上の2つの要因から、本年度中に実証分析の論文を完成させることができなかった。ただし、理論研究については、環境資源経済学の世界大会でサプライチェーンに関する研究報告を聞くことで、研究に対する良いヒントが得られ、現状は想定していたより順調に進んでいる。以上のように、実証分析の研究は遅れているものの、理論研究は想定より順調なため、全体としてやや遅れていると判断した。実証分析については、当初の計画では海外の学会で発表を予定していたが、報告申し込み時期に論文が出来上がっていなかったので、学会発表は行わず論文執筆に注力する。分析結果の解釈などを取りまとめて今年度内に(できれば今年中に)論文化し、研究雑誌に投稿する。理論研究についても環境資源経済学の世界大会で得た着想を生かしてモデルを構築して、今年度中に分析の大枠を終わらせる。なお、計画通り進めることも大事であるが、理論研究に関するヒントを実証分析にも利用することになったので、計画で予定していなかった理論研究と実証研究の相乗効果にも期待して、実証分析の方にやや重点を置いて進める予定だが完全にどちらかに集中することなく進める。

遅れている大きな要因は以下の2つである。1つ目は、大学を異動して、これまでと違う授業を複数担当して授業準備などに時間をとられたことで、想定していたより研究に時間をさけなかった。2つ目は、実証分析研究で、推定が終わって結果を解釈する段階で処置変数(説明変数)を「自社の製品・サービスに対して、(環境負荷情報の開示を含む)顧客から環境関連の取り組み要求があったかどうかのダミー変数」から「自社の製品・サービスに対して、顧客から環境負荷低減の取り組み要求があったかどうかのダミー変数(環境負荷情報の開示を含まない)」を変えて推定しなおしたため、時間がかかってしまった。上記のように処置変数を変えた理由は、理論研究では顧客へ納入するパーツの環境負荷を低減するR&Dに着目する予定であるので、実証研究もそれに合わせた方が良いと判断したからである。以上の2つの要因から、本年度中に実証分析の論文を完成させることができなかった。ただし、理論研究については、環境資源経済学の世界大会でサプライチェーンに関する研究報告を聞くことで、研究に対する良いヒントが得られ、現状は想定していたより順調に進んでいる。以上のように、実証分析の研究は遅れているものの、理論研究は想定より順調なため、全体としてやや遅れていると判断した。実証分析については、当初の計画では海外の学会で発表を予定していたが、報告申し込み時期に論文が出来上がっていなかったので、学会発表は行わず論文執筆に注力する。分析結果の解釈などを取りまとめて今年度内に(できれば今年中に)論文化し、研究雑誌に投稿する。理論研究についても環境資源経済学の世界大会で得た着想を生かしてモデルを構築して、今年度中に分析の大枠を終わらせる。なお、計画通り進めることも大事であるが、理論研究に関するヒントを実証分析にも利用することになったので、計画で予定していなかった理論研究と実証研究の相乗効果にも期待して、実証分析の方にやや重点を置いて進める予定だが完全にどちらかに集中することなく進める。環境資源経済学の世界大会への出張費が想定よりも若干少なく済んだため、多少余ることになった。次年度使用額については、分析結果の解釈・政策的含意を引き出すのにヒントになりそうな資料購入に使う予定である。
グラフェンの生体内重合物質感受性と感染力センサーへの適用に関する基礎的研究

細菌によって形成されるバイオフィルム中の有機ポリマー(EPS:多糖,タンパク質,核酸,脂質)が,グラフェン上に付着しやすいことは初年度(2017年度)に明らかとなった.このときに用いたグラフェン試料はCVD法により形成された市販品であり,品質は確かなものであったが,市販品であるため,製造法に関する情報が部分的に秘匿され,また,単価が高く,本研究が目指すバイオフィルムセンサー開発という観点からは,必ずしもベストのものではなかった.そのため,2018年度は,ノーベル賞英国の二人の学者が獲得した際に用いたスコッチテープにより,グラファイトからの機械的剥離を繰り返す方法で作製したグラフェンおよび,より容易に安価で高品質で入手可能なグラフェン粉末(nano powder)を,コーティング剤としてすでに本研究者が産学連携で開発を進めてきたシラン系樹脂中に分散させ,コンポジットコーティング材とし,これを各種材料上に塗布して,バイオフィルム形成能,EPSとの結合力などを,モデル菌としての大腸菌(グラム陰性菌),表皮ブドウ球菌(グラム陽性菌)を用いて検討した.その結果,(1)機械剥離法によるグラフェン作製は,テープ剥離繰り返し数の増加とともに,グラフェンに近づき,その結果バイオフィルム形成能がグラファイトから純粋なグラフェン膜に近づくととともに(剥離回数を増加させるとともにの意)バイオフィルム形成能が向上することが確認された.(2)純粋なグラフェン膜と比較すると,バイオフィルム形成能は弱いものの,グラフェン分散シラン系樹脂コーティング試料においても,ある程度バイオフィルム形成能およびEPS結合力が良好であることが確認できた.(3)評価法としてクリスタルバイオレットを用いた染色法を用いたが,染色の色の変化でバイオフィルム形成能を評価する指標を作ることができた.バイオフィルムセンサーの作製が本研究の最終的な目的である.そのために,(1)バイオフィルム形成が起こりやすいグラフェン膜,あるいはグラフェンコーティング膜(コンポジットを含む)を安定的に形成させる必要性がある.(2)センシング技術の原理的確立を達成する.という二つの目標を本研究は必然的に有している.このうち,(1)グラフェン膜作製については,容易にまた安価に作製できるグラフェン分散シラン系コンポジットコーティング膜の作製とそのセンシングへの利用の可能性を確認したこと.(2)センシングに必要なパラメーターとして,染色に伴う色の発現をあらわすL*a*b*により,グラフェン上のバイオフィルム形成進行度をセンシングすることができることを確認したこと.の二点が挙げられる.また,最終年度に向けて,(1)より機械的に強い二層グラフェンをCVDにより作製する共同研究を産業技術総合研究所(つくば)と開始し,安定的に二層グラフェン膜を入手し,バイオフィルム形成のセンシングを原理的に確認できる体制ができたこと.(2)センシングの方法として,染色-色差のみでなく,電気的な信号(抵抗値)で評価できることが予備実験で確認できたこと.(3)電気化学的な測定法のうち,ポテンシオメトリーによりバイオフィルムの形成進行度をセンシングできる技術を実験室において確立し,これをグラフェン研究に適用できる可能性ができたことがあげられる.(2)と(3)については予備実験における確認段階であり,これから本格的な研究を開始するが,センサー製作という最終段階につながる成果と計画となることが予想されるため,予想以上に進展し,最終年度の成果に期待できる状況にあると考えている.最終年度である2019年度はこれまでに得られた知見を基に,センサー製作の基礎的な確立を目指して検討を行いたいと考えている.センサリングの可能性としてあげられるのは以下の三つである.(1)染色による色差センサーの確立:クリスタルバイオレットによる染色をグラフェン膜あるいはグラフェン分散シラン系コンポジットコーティング膜に適用し,色の変化を色差として測定し,これを評価の指標とする技術の確立.これについては原理的には可能であることを2018年度に明らかにしたため,さらに踏み込んでセンサーとしての活用の可能性を模索する.(2)直流抵抗,インピーダンスセンサーの確立:グラフェン膜,あるいはグラフェン分散シラン系コンポジット皮膜によるバイオフィルム形成度の測定を行い,原理的に,バイオフィルム形成と抵抗変化との相関を明らかにし,これをセンサーとして確立する技術を検討する.グラフェン分散シラン系コンポジットコーティング膜については,予備実験の結果,簡単な装置を用いて,直流抵抗値で評価できる可能性が大きく,鋭意検討を始めている.また二層グラフェン試料についても,同様の検討を始めている.交流についてはこれからの検討事項となるが,相関がとれれば,センサーの製作に移行したいと考える.(3)電気化学センサーの確立:現在別の系で,電気化学測定の一つの方法であるポテンシオメトリー法によって,バイオフィルム形成度の評価ができることが明らかとなっている.そこで,この手法を二層グラフェン膜試料およびグラフェン分散シラン系コンポジットコーティング膜に応用してセンサリングの確立可能性を検討する.またサイクリックボルタンメトリー,クロノアンペロメトリー法など,電流を流す形式のセンサーの検討も併せて行い最終年度の検討としたいと考えている.初年度においては,CVD法によりガラス上に形成させた単層グラフェン,5層グラフェン,グラファイトを外部の企業に委託して試料として用意し,そのバイオフィルム形成挙動を,フロー型のバイオフィルムリアクターを用いて調べた。グラフェンおよびグラファイトはそれぞれラマンシフトにおいて,2700カイザー付近の2Dバンドピークと1600カイザー付近のGバンドピークが特徴であり,単層グラフェンが完全に形成されると,2Dバンドピークが顕著となる。

このような受け入れ状態のままの飼料についてバイオフィルムを形成させると,グラファイト上においては,バイオフィルムが形成されにくく,一週間浸漬させた状態でも,元々の材料の2DバンドピークとGバンドピークが消えなかった。しかし,グラフェンを形成させた試料については,1日浸漬の場合でも,2Dバンドピーク,Gバンドは完全に消え去り,バイオフィルム由来のピークが認められるようになった。この事実から,グラフェンは当初の予想と反して,極めてバイオフィルム形成が起こりやすい材料であることが示唆された。これを確かめるために,別のグラフェン作製法として知られるテープ剥離法を用いて,グラフェンの作製を試みた。バイオフィルム形成は,フロー型の時に用いた環境細菌(常在菌)ではなく,代表的なグラム陰性菌の大腸菌とグラム陽性菌の表皮ブドウ球菌であり,バイオフィルム作製は,静置法(Pipet法)によって作製された。機械的なテープ剥離法によると,剥離回数が増加すると,転写されたグラファイトは次第に薄層になっていき,グラフェンに近づいて行く。剥離回数の増加とともに,グラフェン形成への傾向が認められ,バイオフィルム形成についての感受性が高くなることがこの方法によっても認められた。グラフェンはバイオフィルムを形成しやすいか,あるいは形成しにくいかについての最終的な確定については,初年度の実験事実を待たなければならなかった。当初バイオフィルム形成が起こりにくいことが予想された。この場合,感染がグラフェン上では起こりにくいことを意味するため,インプラント等の生体材料に抗バイオフィルム材料としての使用が考えられた。しかし,実際には極めて高い感受性を有することがわかった。当初から,予備実験を通じて,この結果が出た場合の今後の計画についても構想していた。それはグラフェンのセンサーとしての応用である。バイオフィルムセンサーとして,例えばインプラントのような体内に挿入する材料のバイオフィルム形成については,感染センサーとして,また体外の,バイオフィルムが引き起こす様々な材料の腐食とか,材料劣化についてのセンサーとしても用いることができる可能性がある。このグラファイトのセンシングについては,現在までの進捗状況では,ラマン分光による解析とクリスタルバイオレットによる染色の二つが想定される。後者は視覚に近いと言われるLab色差系を用いて定量的に評価することが可能となった。一方で前者については,定性的にはその進行度を評価することは比較的容易であるが,定量性に欠けるのが現在のところの欠点である。細菌によって形成されるバイオフィルム中の有機ポリマー(EPS:多糖,タンパク質,核酸,脂質)が,グラフェン上に付着しやすいことは初年度(2017年度)に明らかとなった.
腎移植レシピエントにおける妊娠・出産の体験

本研究の目的は、腎移植後に妊娠・出産を経験したレシピエントの体験を質的に明らかにすることである。生体腎移植施行後、妊娠・出産し、現在育児中にある女性3名のライフヒストリーを構成した。移植前は子どもを授かることをあきらめていたレシピエントは、移植によって、子どもを産み、育てることができたことに感謝し、生きがいを感じていた。一方、多忙な子育てにより健康管理が不十分となり、腎臓が悪くなることへの不安や恐怖を抱いていることが明らかとなった。移植医療の著しい進歩に相まって、臓器移植患者(レシピエント)の妊娠・出産も増加しているが、臓器移植後の妊娠・出産に関する看護支援についての既存の研究は乏しく、レシピエントの心理的側面に焦点を当てた研究は国内外ともに行われていないのが現状である。臓器移植後のレシピエントがより安全に安心して妊娠・出産ができるよう支援する必要があり、臓器移植後に妊娠・出産を経験したレシピエントの体験と心情の解明が期待される。本研究では、我が国における腎移植後に妊娠・出産を経験したレシピエントの体験と心情を質的に明らかにすることを目的としている。看護師が臓器移植後の妊娠・出産についての専門的知識を持ち、レシピエントの心情を理解してケアすることは臓器移植後に妊娠・出産するレシピエントのQOLを高めることにつながると推察される。腎移植後に妊娠・出産を経験したレシピエントの腎移植前から出産に至るプロセスにおける心情と体験が明らかとなれば、プロセスに応じた看護介入が行え、レシピエントの妊娠・出産に対するリスクの回避ができる他、レシピエントの精神的負担の軽減、家族への支援、QOLの向上につながると考える。平成23年度は、森ノ宮医療大学研究倫理部会の承認を得て研究を開始した。腎移植後に妊娠・出産を経験したレシピエント3名に約30分1時間の半構造的面接を実施した。また、移植年月日や移植部位、レシピエントとドナーとの関係、出産日など、基本的情報を調査した。現在インタビューデータを逐語録に起こし、質的帰納的に分析を進めている。平成24年度は、腎移植後に妊娠・出産を経験したレシピエントへのインタビューデータをもとにライフヒストリーを構成した。<疾患罹患から腎移植に至るまで><腎移植後から妊娠までの時期><妊娠から出産までの時期><出産後から現在までの時期><現在という時間>の5つの時間に着目し、質的帰納的に分析を進めた。<出産後から現在までの時期>においては、育児中の腎移植レシピエントの体験として≪子どもがいる幸福≫≪自分が腎移植レシピエントであるがゆえの気がかり≫≪出産後度重なる身体の不調≫≪子ども中心の生活で不十分な健康管理≫≪子どものために避けたい入院≫≪必要とする医療的サポート≫≪周囲に支えられている自分≫の7カテゴリーが抽出された。一方、多忙な子育てにより健康管理が不十分となり、腎臓が悪くなることへの不安や恐怖を抱いていた。子どものために健康でありたいと思う気持ちが、レシピエント自身の健康管理行動につながるよう支援していく必要があると考える。本研究課題は報告時である平成24年度が最終年度のため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
２４時間周期で揺らぐタンパク質の制御機構

本研究では、シアノバクテリア時計タンパク質KaiCの機能に重要な周期的な揺らぎを生み出す構造要因を探索し、その機能解析にもとづいて、生物時計発振メカニズムを明らかすることを目指した。KaiCは類似した2つの構造(CIおよびCII部分)で構成され、6分子のKaiCがリング状に集合した六量体を形成する。CII領域にはリン酸化部位やATP結合ドメインが局在する。C末端領域は、KaiAやKaiBが結合するとされる分子表面近傍に配置され、KaiAの結合による構造変化を通してリン酸化やATPase活性が促進されると考えられる。C末端領域欠失した変異タンパク質を用いてリン酸化とATPase活性を測定した結果およびKaiAとKaiBとの相互作用解析の結果、C末端領域は特にリン酸化制御において重要であることが示唆された。また、C末端領域に結合するKaiAの解析にも踏み込んだ。あるアミノ酸残基変異株は、KaiCのC末端領域に結合しリン酸化促進機能はもつものの、生物時計再構成においては機能しないという性質が明らかとなった。KaiAの機能はリン酸化の促進と考えられているが、生物時計発振メカニズムにおいては他の機能も検討する必要があることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、シアノバクテリア時計タンパク質KaiCの機能に重要な周期的な揺らぎを生み出す構造要因を探索し、その機能解析に基づいて、生物時計発振機能メカニズムを明らかすることを目的とした。KaiCは、類似した2つの構造(CIおよびCII部分)で構成され、6分子のKaiCがリング状に集合した六量体を形成する。CII領域にはリン酸化部位やATP結合ドメインが局在し、C末端領域はKaiAやKaiBが結合するとされる分子表面近傍に配置されていると想定され、KaiAの結合による構造変化を通じてリン酸化やATPase活性が促進されると考えられる。平成23年度は、C末端領域を欠失させた変異型KaiCタンパク質を精製し解析することを目指した。実験開始後、目的のタンパク質の精製において、当初計画していたタンパク質発現系では、タンパク質の収量と精製度が不十分であることが判明した。そこで、発現系の変更を検討し、アフィニティ用のタグ融合部位を変更することにした。そのため、全体計画を変更し、計画の一部を翌年度に繰り越すこととなった。変更後、大腸菌で変異型KaiCを発現精製したところ、解析に十分な収量と精製度をもつタンパク質を得ることができたので、KaiAおよびKaiBと相互作用、リン酸化状態、ATPase活性の測定を実施した。また、3つのKaiタンパク質を用いた生物時計再構成系による24時間周期の概日リズムの確認を実施した。当初の計画を変更したものの、再検討し方法を変更したことで、目的のタンパク質を得ることができた。得られた変異型タンパク質の解析により、C末端領域の重要性が明らかとなった。さらに、Kaiタンパク質の相互作用を繰り返す生物時計再構成系において、同調メカニズムの解明につながる知見を見いだすことができた。Kaiタンパク質による生物時計発振機能メカニズムを明らかにするには、解析で得られた結果をもとに、さらに詳細な解析が必要である。今後は、他の変異型タンパク質の利用およびシアノバクテリア細胞における解析も含めて検討したい。
心筋繊維の力学に基づいた左心室シミュレ-ション・システムの構築

平成元年度(研究初年度)の研究にてヒト心臓左心室の力学的モデルおよびそれと連動する循環器系システムのモデルを構築した。またこれら二つのモデルを組み合わせることによりヒト心臓左心室のサイクル挙動を再現できる数値シミュレ-ション・システムの骨格を作り上げることができた。この段階でシミュレ-ション・システムは、心機能の評価のための重要な因子の一つである心内圧ー心容積関係をよい精度で再現することができた。ただし、研究の初年度は、このようなシステムの可能性を第一次近似的にチェックするため、多くの仮定、出来るだけの単純化を用いている。ここで一つの大きな単純化は、左心室の形状を回転楕円体として取り扱い、変形後も楕円体形状を保つとしていることである。確かに正常な左心室の形状近似としては妥当なものであるが、病態によりその形状は複雑に変化する。すなわち、このシミュレ-ション・システムの医療に対する適用を考えるとき、任意形状を取り込むことができ、これにより局所的(局部的)な変形あるいは応力などを見積もることができることは大変重要なことである。そこで平成2年度(研究第2年度)では、左心室の形状を考慮しうるシステムを構築することを試みた。このため左心室変形解析法として有限要素法を採用した。ただし、3次元解析は最初の段階では複雑すぎ、本システムの開発の方向を見失う恐れがあったので、まず左心室赤道面形状に注目し、2次元平面ひずみ仮定により形状を取り入れたシステムを構築した。次の段階として、3次元形状を考慮したシステムについてもある一定の成果を得た。ここでは、形状のみでなく、心筋の配向および電気刺激の伝播経路も考慮した。このようにして構築された本システムは、いまだ実際の診療には役立つまでには至っていないが、その可能性を十分示した。当初の予定通りパ-ソナルコンピュ-タPC9801RA2(日本電気製)ディスプレイTVー453m(日本電気製)、数値デ-タプロセッサPC-98XL2ー03およびソフトウェア日本語MS・OS/2(Ver.1.0)を購入した。これらの設備を用いて、ヒト心臓左心室の力学的モデルおよびそれと連動する循環器系モデルを構築した。左心室の力学モデルでは、特に活性化応力の導入に注意が払われた。また循環器系モデルでは、動脈硬化等循環器系トラブルの影響を取り入れうる形を採用した。また、このシミュレ-ションシステムにて得られるサイクル変形挙動は、パソコン画面上にアニメ-ションとして映像化できた。さらに、この画像と心エコ-法にてin vivo、非侵襲、非観血的に測定され、ビデオにリアルタイム挙動の形で収録された心臓左心室の変形挙動と同一画面上に重ね合せるシステムが構築できた。このように本研究は当初の予定にほぼ沿った形で順調に進められている。これらの研究過程で新たに得られた知見は以下の通りである。(1)実際のヒト心臓左心室の変形挙動は大変複雑に見えるが、その基本的特徴は比較的簡単な力学的モデルで再現できることが分った。(2)左心室シミュレ-ションシステムの信頼性の高いものとするために、心エコ-法よりも更に解像度の高い正確な心臓形状変化デ-タが望ましく、そのため三重大学医学部に新たに設置されたMR機の使用を検討している。次年度は、このシミュレ-ションシステムにより正確な左心室形状を取り入れるため、有限要素解析法を導入する。ここでのポイントは、一般の工業用材料に見られない活性化応力の取り扱いである。平成元年度(研究初年度)に、ヒト心臓左心室の力学的モデルおよびそれと連動する循環器系システムのモデルを構築した。またこれら二つのモデルを組み合わせることによりヒト心臓左心室のサイクル挙動を再現できるシミュレ-ション・システムの骨格を作り上げることができた。

ただし、研究の初年度は、このようなシステムの可能性を第一次近似的にチェックするため、多くの仮定、出来るだけの単純化を用いている。ここで一つの大きな単純化は、左心室の形状を回転楕円体として取り扱い、変形後も楕円体形状を保つとしていることである。確かに正常な左心室の形状近似としては、妥当なものであるが、病態によりその形状は複雑に変化する。そこで平成2年度(研究第2年度)には、左心室の形状を考慮しうるシステムを構築することを試みた。このため左心室変形解析法として有限要素法を採用した。ただし、3次元形状および3次元解析は最初の段階では複雑すぎ、本システムの開発の方向を見失うおそれがあったので、まず左心室赤道面形状に注目し、2次元平面ひずみ仮定により形状を取り入れたシステムを構築した。また、このシステムにて得られた変形挙動を、心エコ-法で撮影した左心室赤道面の形状と比較し、その妥当性を確認した。次の段階として、現在、3次元形状を考慮し、3次元有限要素法を用いたシステムについてもある一定の成果を得た。ここでは、形状のみでなく、心筋の配向および電気刺激の伝播経路も行慮した。この結果については、いまだ実験結果との比較検討を行っていない。また、心臓挙動計測についても現在通常の方法で得られているデ-タは、十分とは言えないので、現在最も注目されている磁気共鳴映像法を用い、これに指標を入れることにより心臓壁の局所変形デ-タが得られるようした。本システムは、いまだ実際の診療には役立つまでには至っていないが、その可能性を十分に示している。
ビリベルジン/ビリルビン酸化還元系を応用した急性肺傷害に対する新しい治療法の開発

出血性ショック蘇生は肺の炎症を引き起こし急性肺傷害(ALI)をきたす。ヘム代謝産物であるビリベルジンは抗炎症作用、抗酸化作用を示す。われわれは、ラット出血性ショック蘇生モデルにおけるALIに対するビリベルジン静脈内投与の効果について検証した。出血性ショックによって、肺の組織傷害度スコア、細胞浸潤、肺重量、炎症性メディエータの発現、DNA酸化損傷マーカー発現のいずれも有意に増加していた。これに対して、ビリベルジン投与群では、上記いずれの値も全て改善が認められた。出血性ショック蘇生後肺傷害に対するビリベルジン投与は抗炎症・抗酸化用を介して肺保護作用を示すと考えられた。出血性ショックにおいては蘇生にいったん成功しても全身性の炎症が誘発され、その結果、肺に好中球が浸潤・集積し、活性化された好中球より発生する活性酸素は肺上皮細胞を傷害し急性肺傷害を引き起こす。ヘムの代謝産物であるビリベルジンは、ビリベルジン/ビリルビン酸化還元サイクルを介して強力な抗酸化作用を示す。平成25年度の研究ではラット出血性ショック蘇生誘発急性肺傷害モデルに対してビリベルジンを静脈内投与して肺傷害に対する効果について検証した。ビリベルジン(35/mg/kg)を出血性ショック開始1時間前にラット尾静脈より投与した。本投与量では、血漿ビリルビン濃度は生理的範囲の濃度に留まった。出血性ショックによって、肺の組織傷害度スコア、細胞浸潤、肺重量(Wet/dry比)、炎症性メディエータ(TNF-alpha;, iNOS)の発現、DNA酸化損傷マーカー(8-OHdG)発現はいずれも有意に増加していた。これに対して、ビリベルジンを投与すると、上記いずれのパラメーターも全て改善が見られた。さらに出血性ショック蘇生後にビリベルジンを投与しても肺傷害に対する保護作用を示すことを確認した。尚、Sham opeラットにビリベルジンを投与しても生理学的・生化学的に何らの異常も認められなかった。以上より、出血性ショック蘇生後急性肺傷害に対するビリベルジン投与は抗炎症と抗酸化のメカニズムを介して肺保護作用を示すと考えられた。出血性ショックでは蘇生に成功しても全身性炎症反応の亢進の結果、肺に好中球が浸潤・集積する。肺で活性化された好中球から発生する活性酸素による酸化ストレスは肺胞上皮細胞を傷害し、その結果急性肺傷害(Acute Lung Injury:ALI)が発症する。申請者らは、ラット出血性ショック蘇生誘発ALIモデルを作成し、このモデルにストレス蛋白Heme Oxygenase-1(HO-1)の酵素反応産物の一つであるビリベルジンを投与したところ、ビリベルジン/ビリルビン酸化還元サイクルを介して酸化ストレスを抑制することによりALIを改善することを明らかにした。しかし、ビリベルジン単独ではALIの肺胞上皮細胞傷害を完全に抑えることはできなかった。HO-1のもう一つの代謝産物であるCOはCOヘモグロビンを形成し酸素運搬を阻害することにより致死効果をもたらす有毒ガスである。しかし、COは極低濃度では抗炎症・抗アポトーシス作用を示すことが報告されている。最近、体内に投与すると極微量のCOを遊離するCO-releasing molecule(CORM)が開発された。そこで、申請者らはCORMをラットに投与しその体内動態を調べた。その結果、CORMの投与は動脈血中COヘモグロビンレベルを有害なレベルまで上昇させることなく、肺組織のCO濃度を有意に上昇させることを見出した。今後、CORMをALIモデルに投与して治療効果があるかを検討していく予定である。麻酔・蘇生学平成25年度は、ビリベルジンをラット急性肺傷害モデルに投与して、1.ビリベルジンが炎症・酸化ストレスを軽減することにより急性肺傷害を改善し、2.その改善作用には細胞内情報伝達系PI3/Akt Pathwayが関与していることを、PI3/Akt Pathwayのリン酸化をWestern blotで示すことにより明らかにすることを当初の目標とした。目標の1は達成できたが、2については未だ、研究半ばの段階である、したがって概ね順調に進展しているとした。ビリベルジンのALI改善効果への細胞内情報伝達系PI3/Akt Pathwayの関与をPI3/Akt Pathwayのリン酸化で示す。さらに、PI3/Akt Pathwayの関与をさらに明らかにするために、PI3阻害剤の投与がビリベルジンの急性肺傷害効果を消滅させるかについて検討する平成25年度助成金を物品の購入費および旅費として使用した結果、物品の単価、旅費の金額との関係により端数として差額3円が生じた。物品費、旅費、人件費・謝金、その他いずれの項目において3円は単独で使用する金額としてはあまりにも小さく使用できなかったため平成26年度に繰り越すこととした。平成26年度の物品費の消耗品(試薬)購入費として使用する。
魚類の性分化過程と生殖機能の遺伝的・環境的制御メカニズムの解明

メダカとトウゴロウイワシ類をモデルとして、「水温に対する性分化・生殖機能関連遺伝子の発現動態とその調節」、「生殖腺における高温起因のアポトーシス誘発機構」、「環境的性決定機構におけるストレス応答のメカニズム」および「生殖腺の温度感受性と性分化機構における中枢神経系の役割」について解析し、魚類の性分化過程と生殖機能の遺伝的・環境的制御における水温の分子生物学・生化学・生理学的作用機序の解明に資した。本研究では、魚類の性分化過程と生殖機能の遺伝的・環境的制御の分子生物学・生化学・生理学的背景の解明を目標としている。温度に対する性分化・生殖機能関連遺伝子の発現動態とその調節については、まず、温度依存型性決定を示すペヘレイOdontesthesbonariensisにおける生殖腺刺激ホルモン(FSH・LH)の受容体遺伝子のクローニングと構造解析および雌誘発温度、性的中立温度と雄誘発温度での性分化における発現量を測定し、精巣分化には低レベルのFshとLhβサブユニット遺伝子の発現と高レベルのLh受容体遺伝子の発現が関与していると判明した。また、本種のcyp11a1とcyp11b1遺伝子のクローニングと構造解析および性分化時期における発現量を測定し、精巣分化(dmrt1, amh, sox9, nr5a1, sf-1)のと卵巣分化(cyp19a1a)の関連のマーカー遺伝子の発現量と照らし合わせた結果、雄誘発温度ではcyp11b1の発現が高く、精巣分化に重要な役割を担うことが示唆された。さらに、遺伝型・温度依存型性決定および高温感受性関連遺伝子の探索について、異なる水温でのペヘレイ仔魚のDNAマイクロアレイ解析を行った結果、多数の候補遺伝子を同定し、発現解析では特にndrg3、pen-とhsp90遺伝子は性分化との関連性が示唆された。なお、温度依存型性決定を持つペヘレイとは対照的に遺伝的性決定を持つ同族のパタゴニアペヘレイO.hatcheriとの交雑種における性分化過程の組織学的プロセスおよび水温の影響を明らかにした。メダカOryzias latipesについては、生殖細胞の高温感受性ならびに突然変異の発生率を左右するY型DNAポリメラーゼの一種であるRev1遺伝子のクローニングと構造解析し、リアルタイムPCR法により高温ストレス下個体の生殖腺における本遺伝子の発現が優位に上昇することを見出した。また、メダカの成魚を16週間3638°C下で高温曝露し、組織学的解析および生殖細胞特有のVasa遺伝子の発現解析を行った結果、生殖腺は1週間より退行変性し、46週間で生殖細胞の数が著しく減少することが判明した。研究では、魚類の性分化過程と生殖機能の遺伝的・環境的制御の分子生物学・生化学・生理学的背景の解明を目標としている。本年度では、まず、遺伝的性決定機構および環境依存的性決定機構を併せ持つ南米原産のパタゴニアペヘレイ(Odontesthes hatcheri)の性分化関連遺伝子の発現動態について、遺伝的性関連マーカーを受け継ぐ本種の系統(Ehi-M13)で精査したところ、抗ミュラー管ホルモン(Anti-Mullerian hormone, "amh")遺伝子のデュープリケイト遺伝子は存在することが示唆された。そこで、両amh遺伝子を詳細に調査し、塩基配列の同定、発生段階における発現動態、生殖腺の性分化過程とタイミングとの関連性やin situハイブリダイゼーション法による組織上のmRNAの検出、さらに遺伝的性関連マーカーおよび表現型性との関連性などの結果から、デュープリケイトのamh遺伝子は通常雄雌両法に存在するamhとは異なり、遺伝型雄特有の遺伝子であることが判明した。加えて、FISH法による染色体核型解析を行った結果、本遺伝子はパタゴニアペヘレイのY染色体と思われる染色体の一本のみに存在することから"amhy"遺伝子と命名し、本種の雄化決定遺伝子であることが明らかになった。なお、amhyは現在発見されている他の雄化決定遺伝子(sry、dmy)のような転写因子と異なりホルモンであることから大変注目されている。一方、ペヘレイ(O.bonariensis)の繁殖能力に及ぼす高水温の影響を把握するために、下垂体、脳および生殖腺における生殖腺刺激ホルモン(GtH)βサブユニット遺伝子(FSH-β、LH-β)ならびに糖タンパク質ホルモンαサブユニット遺伝子(GPH-α)の発現部位を精査し、さらに発現動態に及ぼす高水温の影響を明らかにした。本研究では、遺伝的性決定機構および温度依存的性決定機構を併せ持つ南米原産のパタゴニアペヘレイOdontesthes hatcheriには、抗ミュラー管ホルモン(Anti-Müllerian hormone; amh)遺伝子の雄特異的な重複遺伝子(amhy)が存在することが判明した。さらにその転写産物が性分化時期に特異的に発現すること、本遺伝子の翻訳阻害により雄性分化が阻害され雌性分化が促進されることを発見し、amhyが本種の精巣決定遺伝子であることを実証した。一方、性決定機構が極めて強い温度依存性を示す近縁種のペヘレイOdontesthes

bonariensisでは、高温が誘起する雄性分化時に、ストレスホルモンであるコルチゾルと雄性ホルモンである11-ケトテストステロン(11-KT)が上昇することを明らかにした。また、外因性コルチゾルを孵化稚魚に投与したところ、高温刺激なしでも11-KTの代謝酵素遺伝子である11-β水酸基脱水素酵素(hsd11b2)mRNA量および11-KT量が上昇することが明らかとなった。従って、本種では、高温によるコルチゾル量増加によりhsd11b2 mRNA量の上昇が誘起され、結果として11-KT量が増加し雄化が引き起こされると考えられた。さらに、ペヘレイにおいてもamhyホモログの単離に成功し、成魚を用いて本遺伝子と表現型性の関連を調査したところ、amhyは雄の表現型性と強くリンクしていることが明らかとなった。amhyを保持する孵化稚魚を性的に中立な水温で飼育したところ、amhy mRNAは性決定/性分化時期の生殖腺において安定的に発現し、これらの個体は100%雄へと分化したことから、本遺伝子は性決定機構が極めて強い温度依存性を示すペヘレイにおいても雄性分化に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。最初に挙げられた各々の課題について確実に成果を上げている。また、本研究の成果をトップレベルの科学雑誌を含む国際ジャーナルおよび学会発表にてコンスタントに公開している。24年度が最終年度であるため、記入しない。現時点で特に推進方策の変更が必要はないと判断しているので、概ね当初計画の通りで実施する予定。