hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強磁性体／白金界面に誘起された磁気分極のダイナミクス

強磁性体と白金(Pt)を積層した界面においては,界面に大きな磁気モーメントが発生すること,また,界面に垂直な方向に大きな磁気異方性が発生することが知られており広く研究が進められてきた.近年になって,Pt層において大きなスピンホール効果が生じ,スピン分極した電流を磁性層に注入することで磁化方向の制御が可能であることが注目を集めている.これまでに報告されている研究では,電気的あるいは光学的な手法により磁化の挙動が検出されているが,これらの手法では,強磁性体層の挙動と分極したPtの磁気モーメントの挙動を独立に計測することが不可能である.そこで,本課題では元素選択制をもつ放射光を用いたX線磁気円二色性(X-ray magneticcircular dichroism:XMCD)を採用することで,スピン分極した電流により励起された分極したPt層の挙動を強磁性層と独立に計測し,その磁化ダイナミクスを明らかにすることを目指した.本年度は,高感度なXMCD計測のための試料作製と,XMCDによるダイナミクス計測のための計測系の構築について研究を遂行した.具体的には,Co/Pt界面を含む薄膜試料を作製し,XMCD信号強度や磁気異方性定数などの最適化を行った.また,CoPt合金からなるグラニュラー試料を用い,GHz帯の高周波磁場下でのマイクロ波アシスト磁化反転の様子について調べた.また,XMCD計測においては,高周波導入のためのプローバー作製と,ナノ集光ビームを用いたGHz帯の時間・空間分解計測系を構築した.本課題では,放射光XMCDを用いて強磁性体/Pt界面における磁化ダイナミクスを明らかにすることを目的とする.最終的なターゲットはスピン分極した電流により励起された磁化ダイナミクスおよびその制御に関する知見を得ることであるが,今年度は,被測定試料にCo-Pt合金からなるグラニュラー試料も含め,Co-Pt系のGHz帯における磁化ダイナミクスの評価を行った.XMCD測定装置中で用いるプローバーの作製や,試料構成の最適化および時分割XMCD計測手法の立ち上げについては当初の計画通りに進行させることができた.ただし,実験室レベルでの電気的・磁気光学効果による評価については,やや遅れている.上述のように,おおむね研究計画は順調に進展しており,2019年度も当初の研究計画に沿って進める.界面で分極したPt層は1nm程度と非常に薄いため,XMCDにより得られる信号が小さい.また,磁化励起のための電流による発熱の影響も大きいことから,試料構成の変更による信号雑音比の向上や測定プログラムの改良なども行っていく必要がある.強磁性体と白金(Pt)を積層した界面においては,界面に大きな磁気モーメントが発生すること,また,界面に垂直な方向に大きな磁気異方性が発生することが知られており広く研究が進められてきた.近年になって,Pt層において大きなスピンホール効果が生じ,スピン分極した電流を磁性層に注入することで磁化方向の制御が可能であることが示され,新しい磁化の制御手法として注目を集めている.これまでに報告されている研究では,電気的あるいは光学的な手法により磁化の挙動が検出されているが,これらの手法では,強磁性体層の挙動と分極したPtの磁気モーメントの挙動を独立に計測することが不可能である.そこで,本課題では元素選択制をもつ放射光を用いたX線磁気円二色性(X-ray magnetic circular dichroism:XMCD)を採用することで,スピン分極した電流により励起された分極したPt層の挙動を強磁性層と独立に計測し,その磁化ダイナミクスを明らかにすることを目指した.本年度は,高感度なXMCD計測のための試料作製と,XMCDによるダイナミクス計測のための計測系の構築について研究を遂行した.具体的には,Co/Pt界面を含む薄膜試料を作製し,XMCD信号強度や磁気異方性定数などの最適化を行い,直流電流により磁化挙動を制御できることを異常Hall効果測定による電気的計測から確認した.また,XMCD計測においては,ナノ集光ビームを用いたGHz帯の時間・空間分解計測系を構築した.さらに,高感度なナノ領域の磁化計測のためにスタティックテスターの立ち上げを行った.本課題では,放射光XMCDを用いて強磁性体/Pt界面における磁化ダイナミクスを明らかにすることを目的とする.最終的なターゲットはスピン分極した電流により励起された磁化ダイナミクスおよびその制御に関する知見を得ることである.今年度は,試料構成の最適化および時分割XMCD計測手法の立ち上げについては当初の計画通りに進行させることができた.ただし,予定していた実験室レベルでの磁気光学効果による評価については無磁場中での評価にとどまっており,やや遅れている.強磁性体と白金(Pt)を積層した界面においては,界面に大きな磁気モーメントが発生すること,また,界面に垂直な方向に大きな磁気異方性が発生することが知られており広く研究が進められてきた.近年になって,Pt層において大きなスピンホール効果が生じ,スピン分極した電流を磁性層に注入することで磁化方向の制御が可能であることが注目を集めている.これまでに報告されている研究では,電気的あるいは光学的な手法により磁化の挙動が検出されているが,これらの手法では,強磁性体層の挙動と分極したPtの磁気モーメントの挙動を独立に計測することが不可能である.

そこで,本課題では元素選択制をもつ放射光を用いたX線磁気円二色性(X-ray magneticcircular dichroism:XMCD)を採用することで,スピン分極した電流により励起された分極したPt層の挙動を強磁性層と独立に計測し,その磁化ダイナミクスを明らかにすることを目指した.本年度は,高感度なXMCD計測のための試料作製と,XMCDによるダイナミクス計測のための計測系の構築について研究を遂行した.具体的には,Co/Pt界面を含む薄膜試料を作製し,XMCD信号強度や磁気異方性定数などの最適化を行った.また,CoPt合金からなるグラニュラー試料を用い,GHz帯の高周波磁場下でのマイクロ波アシスト磁化反転の様子について調べた.また,XMCD計測においては,高周波導入のためのプローバー作製と,ナノ集光ビームを用いたGHz帯の時間・空間分解計測系を構築した.本課題では,放射光XMCDを用いて強磁性体/Pt界面における磁化ダイナミクスを明らかにすることを目的とする.最終的なターゲットはスピン分極した電流により励起された磁化ダイナミクスおよびその制御に関する知見を得ることであるが,今年度は,被測定試料にCo-Pt合金からなるグラニュラー試料も含め,Co-Pt系のGHz帯における磁化ダイナミクスの評価を行った.XMCD測定装置中で用いるプローバーの作製や,試料構成の最適化および時分割XMCD計測手法の立ち上げについては当初の計画通りに進行させることができた.ただし,実験室レベルでの電気的・磁気光学効果による評価については,やや遅れている.上述のように,おおむね研究計画は順調に進展しており,30年度も当初の研究計画に沿って進める.分極したPt層は1nm程度と非常に薄いため,XMCDにより得られる信号が小さいことから,試料構成の変更による信号雑音比の向上や測定プログラムの改良なども行っていく必要がある.上述のように,おおむね研究計画は順調に進展しており,2019年度も当初の研究計画に沿って進める.界面で分極したPt層は1nm程度と非常に薄いため,XMCDにより得られる信号が小さい.また,磁化励起のための電流による発熱の影響も大きいことから,試料構成の変更による信号雑音比の向上や測定プログラムの改良なども行っていく必要がある.今年度は試料や測定系の最適化に主に既存の装置・リソースの利用が可能であったため,新規に購入する物品が当初計画よりも少なくて済んだ結果である.今年度の進捗がはかどらなかった磁気光学効果装置の立ち上げに充当する予定である.当初物品費として計上していた微細加工用のマスク類およびXMCD計測用の冶具を,学内の施設で作製できたため,費用を低減できたことにより未使用額が発生した.また,これらの費目はその他の項に含まれているため,物品費が大きく低下することとなった.最終年度には高周波計測用の増幅器の導入を予定しており,これらの費用に充てる予定である.
大脳皮質形成を制御するＤＮＡメチル化酵素ＤＮＭＴ１の新規作用機序の解明

大脳皮質形成過程において神経幹細胞は、発生段階依存的にその分化性質を変化させ、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを順次産生してく。このような発生段階依存的な神経幹細胞の分化性質の変化が、エピジェネティクス機構により厳密に制御されていることが示唆されているが、その作用機序には不明な点が多い。申請者はエピジェネティクス修飾の一つであるDNAメチル化を担うDNAメチル化酵素DNMT1に着目して、大脳皮質形成過程の神経幹細胞の分化制御機構解明に迫った。これまでに、DNMT1がニューロン産生期において神経幹細胞のアストロサイトへの早期分化をDNAのメチル化を介して抑制していることが明らかとなっていた。これに加えて申請者は、本研究課題を通して、DNMT1がアストロサイト産生期ではニューロンへの分化を抑制しており、その作用がDNMT1のDNAメチル化活性非依存的な機構で行われていることを示唆する結果を得た。質量分析装置を用いたDNMT1の相互作用解析の結果、DNMT1がアストロサイト産生時期特異的にニューロン分化抑制因子であるRE1-Silencing Transcriptionfactor(REST)と相互作用することが得られた。マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析の結果、アストロサイト産生時期の神経幹細胞へのDNMT1のノックダウンにより発現上昇した遺伝子群には、多くのREST標的遺伝子が含まれていることが示された。これは、DNMT1が時期特異的にRESTと相互作用することでRESTの標的遺伝子の発現を抑制していること示唆しており、これによりニューロン分化を抑制していると考えられる。以上の解析を通して、DNMT1は大脳皮質形成過程の各時期において神経幹細胞の分化制御に重要な役割を担っており、発生過程依存的な神経幹細胞の分化制御に貢献していることを得ることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの成果から、大脳皮質形成過程において維持型DNAメチル化酵素DNMT1が胎生後期神経幹細胞のニューロン分化を抑制し、未分化性の維持に重要な役割を担っていることが得られている。そこで本年度は、DNMT1がどのようにしてニューロン分化を抑制するのか、その分子メカニズム解明に必要となる2つの網羅的解析を行った。1、DNMT1の標的遺伝子の探索胎生後期神経幹細胞においてDNMT1によって発現が制御されている遺伝子を明らかにするために、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を行った。胎生中期及び胎生後期神経幹細胞にDNMT1のノックダウンを誘導し、これにより発現が著しく変化する遺伝子の探索を行った。その結果、胎生中期神経幹細胞においてDNMT1は、胎生後期に発現が開始する遺伝子の発現を抑制しており、一方、胎生後期神経幹細胞では、ニューロン産生期である胎生中期において発現が観察される遺伝子の発現を抑制していることが明らかになった。これは、DNMT1が各胎生期で異なる遺伝子の発現を調節していることを示しており、胎生中期に高発現するニューロン分化誘導因子の発現調節を介してDNMT1は胎生後期神経幹細胞のニューロン分化を調節していると考えられる。2、DNMT1の相互作用因子の探索DNMT1のDNAメチル化非依存的な作用は、他の転写因子や、転写抑制因子との相互作用によってもたらされる。そこで、質量分析装置を用いて胎生後期神経幹細胞におけるDNMT1の相互作用因子の同定を試みた。その結果、ニューロン分化抑制作用を有する転写抑制因子REST (NRSF)や、Sall1を含む122個のタンパク質が同定された。DNMT1はこれらの因子と複合体を形成することにより、胎生後期神経幹細胞のニューロン分化を抑制していると考えられる。

以上の解析を通して、DNMT1は大脳皮質形成過程の各時期において神経幹細胞の分化制御に重要な役割を担っており、発生過程依存的な神経幹細胞の分化制御に貢献していることを得ることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は、マイクロアレイによる遺伝子発現解析及び、質量分析装置を用いたDNMT1の相互作用因子の探索を計画していた。研究実施計画の予定通り、2つの網羅的解析を実行でき、また次の解析に進める十分な成果が得られた。今後も研究実施計画に従い、DNMT1どのような分子メカニズムで胎生後期神経幹細胞のニューロン分化を抑制しているのかを明らかにしていく。昨年度より、DNMT1により発現が制御されている遺伝子、及びDNMT1と相互作用している遺伝子が同定できた。本年度は、クロマチン免疫沈降法によりDNMT1の標的遺伝子の同定とともに、DNMT1と協調して標的遺伝子の発現を制御する相互作用歯子の同定を目指す。
初期ノジュリン遺伝子発現を指標とするVA菌根菌共生シグナル因子の探索

初期ノジュリン遺伝子は根粒菌のマメ科植物への感染初期に宿主植物において発現する一群の遺伝子であり,近年VA菌根菌の共生過程においても発現することが明らかとなった。本年度は,この初期ノジュリン遺伝子プロモーターとβ-グルクロニダーゼ(GUS)レポーター遺伝子との融合遺伝子を有するトランスジェニック植物を作成し,これを用いてVA菌根菌共生過程における初期ノジュリン遺伝子の発現を組織化学的染色により解析し,共生シグナル因子の存在について検討した。エンドウおよびダイズのゲノムDNAを鋳型としてPCR法により初期ノジュリン遺伝子PsENOD12Aのプロモーター領域をそれぞれ増幅した。得られたDNA増幅断片を植物形質転換用バイナリーベクター中のGUS遺伝子の上流に連結してプロモーター-レポーター遺伝子を作成した。これをアグロバクテリウム法によってマメ科植物のモデル植物として注目を集めているミヤコグサ(Lotus japonicus ecotype Gifu B-129)の胚軸に感染させて,その後,ゲネチシンによるカルス選抜,再分化を経て,独立数系統のトランスジェニック植物を得た。この植物の根にVA菌根菌Glomus mosseaeと根粒菌(未同定)を接種して,プロモーター活性化に依存するレポーター遺伝子発現が見られるかどうかを組織化学的染色により調べた。接種後,20日後にGUS染色したところ根粒菌接種区で根毛先端部から根毛基部に向かっている感染糸と思われる部分が青く染まっているのが観察されたしかし,VA菌根菌の根への侵入菌糸,樹枝状体などではGUS染色は観察されなかった。また,ミヤコグサへのGlomus mosseae感染・共生過程におけるLjENOD40-1,40-2およびLjCbp1の発現についてRT-PCRで調べたところ,接種後,3,5週目でコントロールに比べ,有意な発現が見られた。VA菌根菌の感染・共生過程において初期ノジュリン遺伝子の発現誘導が見られるかどうかを以下の方法により調べた。アルファルファ(Medicago sativa L.)種子を(1)VA菌根菌Glomus mosseae資材2g(2)VA菌根菌Glomus mosseae資材を水に懸濁し,53μmふるいに通してVA菌根菌を除いたふるい液(3)根粒菌Shinorhizobiummeliloti懸濁液(7 X 10^6 cells/ml)1ml,をそれぞれ含む試験管に播種・生育させ,播種後14,16.21日目に根をサンプリングした。サンプリングした根の一部をトリパンブルー染色し,VA菌根菌の感染率を計測したところ,それぞれ17,16,24%であった。いずれの時点においても(1),(2)区で根粒の形成は認められなかった。(3)では播種後10日目には根粒形成が見られた。これらの根から全RNAを抽出し,得られた全RNAをDNase I処理して混在するDNAを消化した後,oligo(pdT)12-18をプライマーとして逆転写酵素でcDNAを合成した。これを鋳型として,初期ノジュリン遺伝子ENOD12特異的プライマーを用いてPCRを行い,生じたPCR増幅産物を2%アガロースゲルにより分析した。コントロールにはMsc27遺伝子を用いた。その結果,根粒菌S.meliloti接種区でENOD12A,Bの明瞭な発現が見られたのに対し,VA菌根菌接種区ではいずれの時点においてもそれら遺伝子の発現は見られなかった。同様の方法でエンドウ(Pisum sativum L.)についてもG.mosseae接種を行い,ENOD12AおよびENOD2遺伝子特異的プライマーでRT-PCRを行ったが,これら遺伝子の発現は見られなかった。また,ミヤコグサへのGlomus mosseae感染・共生過程におけるLjENOD
切削作業設計のための熟練技能者のノウハウの可視化と利用に関する研究

切削加工では、熟練者の技能が特に重要な役割を果たすため、彼らの知識ノウハウの取り込み方が、高度な自動化に際しての鍵となる。ところが許容される作業条件が極めて狭い範囲に限られる難削材加工等では、定性的知識がほとんど役に立たない上、いわゆるエキスパートシステムを構築することも極めて難しい状況にある。本研究では、生産加工システムにおいて、系統的な方法論の確立が最も遅れている作業設計に論理的な手法の導入するため、切削条件決定問題の中から切削力と切削温度をwell-definedな問題として抽出し、定量的な解析解を参照して切削条件選定をすることを目的とする。平成5年度に種々の切削状態に対応した切削モデルと切削温度シミュレーションの技術を主として確立したので、本年は、切削温度に加えて切削力に関するモデル化を種々の切削状態に対して確立した。また可視化のためのヒューマンインターフェィスの充実を前年度に引き続いて行った。特に材料定数や切削条件などの入力に手間取る場合が多く、この煩わしさを解消するため、入力インターファィスの改善・開発に力を入れた。これによりノウハウの対象となっている切削条件パラメータの選定が切削温度ならびに切削力にどれだけ影響するかを、CRT上で体験できるようにした。また、工具面の温度と応力を変数とする摩耗速度式を使用し、可視化によって得られた切削温度と切削力より工具摩耗を予測するシステムを確立した。特に現場での作業性を考慮して、可視化システムをパーソナルコンピュータに移植し、切削加工技術者が手軽に利用できるよう開発を重点的に進めた。これまで切削加工における作業設計は,実質的に熟練者のノウハウに依存してきた.しかし,高度な生産システムにおいて,信頼性の高い加工を実現する場合には,熟練者の知識ノウハウの取り込み方が,重要な鍵となる.そこで,本研究では,切削条件決定問題の中から切削力と切削温度をwell-definedな問題として抽出し,定量的な解析解を参照して切削条件選定におけるノウハウの本質はどのようなものかを明確にすることを目的とする.ill-definedな問題とされている切削条件決定問題の中からwell-definedな問題を抽出して切削技術者に体験させる,という当初の目的は,切削温度についてはかなり達成された.当初は,突っ切りや外周切削などの切削様式については,ほとんど考慮していなかったが,工具とホルダーの三次元形状と潤滑・冷却状態に応じて,切削様式の違いを具体的に取り込むことによって,切削様式と切削温度の関係が,CRT上で明確に体験できるようになり,標準的な切削条件選定基準と切削温度との関係が明確になった.本年度は切削温度に予定以上に重点をおいたため,切削力に関する問題の解決は,後回しになった.しかし,切削様式の相違と切削温度の関連が,熟練技術者の切削条件選択基準とよく対応することを明らかにできたことにより,ノウハウの可視化と利用に対して一つの本質的な問題が解決できた.切削加工では,熟練者の技能が特に重要な役割を果たすため,彼らの知識ノウハウの取込み方が,高度な自動化に際しての鍵となる.ところが許容される作業条件が極めて狭い範囲に限られる難削材加工等では,定性的知識がほとんど役に立たない上,いわゆるエキスパートシステムを構築することも極めて難しい状況にある.本研究では,生産加工システムにおいて,系統的な方法論の確立が最も遅れている作業設計に論理的な手法の導入するため,切削条件決定問題の中から切削力と切削温度をwell-definedな問題として抽出し,定量的な解析解を参照して切削条件選定をすることを目的とする.平成5年度に種々の切削状態に対応した切削モデルと切削温度シミュレーションの技術を主として確立したので,本年は,切削温度に加えて切削力に関するモデル化を種々の切削状態に対して確立した.また可視化のためのヒューマンインターフェイスの充実を前年度に引き続いて行った.

特に材料定数や切削条件などの入力に手間取る場合が多く,この煩わしさを解消するため,入力インターフェイスの改善・開発に力を入れた.これによりノウハウの対象となっている切削条件パラメータの選定が切削温度ならびに切削力にどれだけ影響するかを,CRT上で体験できるようにした.また,工具面の温度と応力を変数とする摩耗速度式を使用し,可視化によって得られた切削温度と切削力より工具摩耗を予測するシステムを確立した.特に現場での作業性を考慮して,可視化システムをパーソナルコンピュータに移植し,切削加工技術者が手軽に利用できるよう開発を重点的に進めた.
マイクロ空間における多段蒸留技術の開発

マイクロ空間における流体操作の応用として、マイクロ空間における蒸留操作の実現を目指した検討を行った。開発したデバイスは、マイクロ空間において気液接触、気液平衡による濃縮、それに気液分離を行う部分から構成されている。このうち蒸留デバイスの性能は、マイクロ空間における気液分離の性能に強く依存する。本研究では、流れの数値シミュレーションと水-メタノール系での実験的検討を行い、深いチャンネルを利用すれば気液分離性能が向上することを明らかにした。さらに、開発したマイクロ蒸留デバイスの多段化して動作させるため、マイクロコントローラを利用したマイクロ蒸留デバイスのための小型運転システムを開発した。このシステムは、温度制御と流量制御の2つの機能を有している。いずれもマイコンを利用したPI制御を行うことができ、安定な運転状態を保つことができる。また、パソコンとの通信機能を有しており、流量、温度のモニタリングが可能であるほか、設定値の変更を自由に行える。システム全体のサイズは、名刺大のプリント基板であり、蒸留デバイスの保温材とあわせても20cm3以下の容積となる。開発したシステムを利用した蒸留実験を水-エタノール系を例にとり実施した。このシステムではセラミックヒータによるジュール加熱を行っているため、水浴を利用した場合に比べてリアクタ上の温度分布がどれほど大きくなるかを、赤外線サーモグラフィーを利用して計測した。断熱材を施さず、運転システムを利用して温度を70°Cに保ったところ、温度の最大値と最小値の差が3度程度あることが示された。蒸留実験を行ったところ、この温度差ために分離性能の低下が見られたが、一段の蒸留としては十分な性能を示した。マイクロ蒸留デバイスは、混合、気液平衡、相分離の3つの機能を1つのマイクロチップ上で実現させたものであり、マイクロ化学プラントのための分離デバイスとして利用できる。本研究では、分離性能を向上させるため、マイクロ蒸留デバイスの最適化及びその多段化について検討を進めている。平成15年度においては、まずマイクロ蒸留デバイスの性能に強く影響する相分離部の性能を向上させるための検討を行った。気液分離用チャンネルの形状、深さと蒸留デバイス全体の性能の評価を行った結果、気液分離用チャンネルを深くすると、マイクロ蒸留デバイスの性能が格段に向上することが確認された。この理由は、気液分離デバイスの体積が大きくなったために、気液流の流速が低下したためと考えられる。一方、多段化が容易に行えるためには、マイクロ蒸留デバイスが自立的に動作する必要がある。このため、マイクロコンピュータを搭載した超小型温度調節回路を設計、製作した。この回路は、3x5cmの基板上に構成された電気回路であり、ヒーター出力制御に位相制御を、温度の制御ロジックとして、微分型P-1制御系を採用している。また、コンピュータとのインターフェースを備えており、計測した温度をコンピュータ上で観測できるほか、温度設定値や、制御ゲインなどをコンピュータからオンラインで設定することができる。このコントローラの温度変化特性を調査したところ、制御ゲインを適切に調節することにより、マイクロチップの温度を誤差1°C以内で制御できることが確認された。
筋サテライト細胞が骨格筋機能に果たす役割の解明　―キメラ筋細胞の作成と解析―

筋サテライト細胞は骨格筋に存在する幹細胞であり、骨格筋の成長・再生・肥大に重要な役割を担っている。筋サテライト細胞の数や活性は運動や食事、加齢、糖尿病などの影響を受けることが報告されている。本研究の目的は、筋サテライト細胞による骨格筋機能の維持・増進メカニズムを解明することである。最終年度は、分岐鎖アミノ酸(BCAA)飢餓とその後の再補充がタンパク質合成促進作用に及ぼす影響について検討した。マウス骨格筋より筋サテライト細胞を単離し、増殖・分化・融合を経て筋管細胞を形成させた。分化5日目の筋管細胞の培養液からBCAAを除くと、タンパク質合成促進作用の指標であるp70 S6 kinaseのリン酸化レベルが低下した。その後、BCAAを再補充するとp70 S6 kinaseのリン酸化レベルが基礎レベルよりもさらに大きく上昇した。BCAAを除く時間(飢餓時間)について検討したところ、BCAAの再補充効果は、BCAA飢餓6時間の群で最も高く、16時間では減少し3時間と同等になった。BCAA飢餓6時間の筋管細胞では、細胞のタンパク質分解機構であるオートファジーの指標となるLC3-II/LC3-Iの比が高まっていた。BCAA再補充効果におけるオートファジーの役割を検討するため、オートファジー阻害剤を添加したが、影響は認められなかった。以上の結果より、筋サテライト細胞におけるタンパク質合成促進作用に対するBCAA再補充効果には、最適なBCAA飢餓時間が存在することが明らかとなった。そのメカニズムにはBCAA飢餓によるオートファジーの亢進の影響は小さいことが示唆された。筋衛星(サテライト)細胞は骨格筋に存在する幹細胞であり、骨格筋の成長、再生、肥大に重要な役割を担っている。本研究の目的は、サテライト細胞による骨格筋機能の維持・増進メカニズムを解明することである。研究初年度には、まず加齢および糖尿病が筋サテライト細胞に及ぼす影響を検討した。老化促進マウスであるSAMP6マウス(40週齢)を実験対象とした。しかしながら、単一筋線維採取段階で筋線維にダメージが強く起こり、筋サテライト細胞の単離はできなかった。次に、糖尿病の影響について解析を行った。対象はストレプトゾトシン(STZ)投与により低インスリン高血糖状態を呈したC57BL/6マウスである。健常マウスおよびSTZ投与1週間後のマウスの長指伸筋から単一筋線維を採取し、筋サテライト細胞を単離、培養した。分化誘導4日後の筋管細胞にインスリン刺激を行い、細胞内インスリン情報伝達因子を解析した。インスリン刺激によるInsulin Receptor Substrat-1およびAktのリン酸化の上昇は、STZ投与群で低値を示した。以上の結果より、短期間の低インスリン高血糖状態に暴露された筋サテライト細胞は、in vitroで培養してもその影響が残存する可能性が示唆された。続いて、健常筋サテライト細胞から作成した筋管細胞に対する電気刺激がタンパク質合成シグナルに及ぼす影響を検討した。その結果、低周波刺激(1 Hz, 1時間)では影響が認められなかったが、高周波刺激(50 Hz, 10分間)はタンパク質合成促進作用の指標となるp70 S6 kinaseのリン酸化を上昇させた。このことは、筋サテライト細胞由来の筋管細胞は個体内の骨格筋細胞と同様にメカニカルストレスに反応することが明らかとなった。筋サテライト細胞の単離、培養、分化はおおむね順調に進展している。また、短期間の糖尿病状態が筋サテライト細胞に影響を及ぼすことを明らかした。マウスから骨格筋を採取し、in vitroで約2週間の培養後に解析を行ったが、個体内でサテライト細胞が受けた影響は残存することを示した。さらに、個体における筋収縮を模した電気刺激によるメカニカルストレスがサテライト細胞に及ぼす影響についても明らかにした。持久的運動を模した低周波刺激ではタンパク質合成シグナルは増強されないが、強縮を誘発する高周波刺激ではそのシグナルが上昇した。これらの結果は、本研究の培養骨格筋細胞モデルが個体内の骨格筋と類似の反応を呈することを示唆しており、今後の研究における重要な基礎的データとなる。一方、加齢が筋サテライト細胞に及ぼす影響については検討できなかった。その理由として、加齢が進むと筋線維(筋細胞)が脆弱化し、単一筋線維採取時のコラゲナーゼ処理によるダメージが大きいことがあげられる。筋線維はダメージを受けると強く収縮するためサテライト細胞以外の細胞(線維芽細胞など)の混入が発生し、解析することができなかった。2017年度は、分岐鎖アミノ酸(BCAA)代謝の律速酵素である分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素複合体(BCKDH)を不活性化するBCKDHキナーゼ(BDK)を欠損させたマウス(BDK KOマウス)から、筋サテライト細胞を単離しその機能を解析した。BDK KOマウスはBCKDHが活性化されているためBCAA代謝が亢進している。解析の結果、BDK KOマウスの筋サテライト細胞の増殖能および筋管細胞への分化能は、野生型マウスの筋サテライト細胞と同等であった。

さらに、これらの筋管細胞に対するBCAA刺激の影響を検討したところ、野生型マウス由来の筋管細胞に比してBDK KOマウス由来の筋管細胞は、タンパク質合成促進作用の指標であるp70 S6 kinaseのリン酸化レベルが有意に高かった。野生型筋サテライト細胞とBDK KO筋サテライト細胞を1:1で混合し、分化を誘導すると遺伝的背景の異なる核からなるキメラ筋管細胞が形成された。このキメラ筋管細胞では、BCAA刺激に対するp70 S6 kinaseのリン酸化レベルは、野生型とBDK KO筋管細胞の中間となった。以上のことから、BCAA代謝が亢進している筋管細胞は、BCAAに対する感受性が高まっている可能性が示唆された。BCAA代謝が亢進しているBDK KOマウスから筋サテライト細胞を単離し、BCAA刺激に対する反応を解析し、BCAA代謝とタンパク質合成の関係について明らかにすることができた。一方、BCAA刺激によるタンパク質合成促進作用に関わるとされているアミノ酸トランスポーター(LAT1)やキナーゼ活性を有するVps34については発現量に差が認められず、BCAA代謝が亢進している筋管細胞でBCAA感受性が高まるメカニズムにこれらの因子は関与していないことが明らかとなった。筋サテライト細胞は骨格筋に存在する幹細胞であり、骨格筋の成長・再生・肥大に重要な役割を担っている。筋サテライト細胞の数や活性は運動や食事、加齢、糖尿病などの影響を受けることが報告されている。本研究の目的は、筋サテライト細胞による骨格筋機能の維持・増進メカニズムを解明することである。最終年度は、分岐鎖アミノ酸(BCAA)飢餓とその後の再補充がタンパク質合成促進作用に及ぼす影響について検討した。マウス骨格筋より筋サテライト細胞を単離し、増殖・分化・融合を経て筋管細胞を形成させた。分化5日目の筋管細胞の培養液からBCAAを除くと、タンパク質合成促進作用の指標であるp70 S6 kinaseのリン酸化レベルが低下した。その後、BCAAを再補充するとp70 S6 kinaseのリン酸化レベルが基礎レベルよりもさらに大きく上昇した。BCAAを除く時間(飢餓時間)について検討したところ、BCAAの再補充効果は、BCAA飢餓6時間の群で最も高く、16時間では減少し3時間と同等になった。BCAA飢餓6時間の筋管細胞では、細胞のタンパク質分解機構であるオートファジーの指標となるLC3-II/LC3-Iの比が高まっていた。BCAA再補充効果におけるオートファジーの役割を検討するため、オートファジー阻害剤を添加したが、影響は認められなかった。以上の結果より、筋サテライト細胞におけるタンパク質合成促進作用に対するBCAA再補充効果には、最適なBCAA飢餓時間が存在することが明らかとなった。そのメカニズムにはBCAA飢餓によるオートファジーの亢進の影響は小さいことが示唆された。本年度は研究計画どおりに、遺伝的背景が異なるマウスから筋サテライト細胞を採取し、種々の刺激に対する反応を解析する。
エキソーム解析を利用したスキルス胃癌の原因遺伝子の解明

家族性胃癌の2家系から得た血液4サンプルの全エキソンシーケンスを行った。このうちの1家系では母系に特に罹患者が多く集積していたため患者と母に共通する胚細胞変異を抽出した。結果として117遺伝子に絞り込むことができた。これらの候補遺伝子のうち癌との関連が強く疑われるものを文献検索により選択しまず8つの遺伝子に着目し次世代シーケンサー用カスタムプライマーパネルを設計した。これを用いて家族性胃癌の追加症例を対象に現在ターゲットシーケンスを行っている。変異が体細胞変異としても存在するかを調べるためスキルス胃癌や若年発症未分化型胃癌の孤発例を対象に同じパネル用いたターゲットシーケンスも進めている。当院で診療を受けた家族性胃癌2家系の血液サンプルのエキソーム解析を平成25年度に実施しており、そのデータ解析を継続した。家系2は特に罹患者が多く集積している家系であったため、この家系内のサンプル間で共通してみられる変異の解析をおこなった。母系において特に発症者が多く集積していたため、患者と母系に共通してみられる胚細胞変異を抽出したところ、117遺伝子に絞り込むことができた。これらの候補遺伝子について、文献検索により癌との関連が強く疑われる遺伝子を抽出した。そのなかでまず8つの遺伝子に着目し、それらの蛋白コード領域を一斉にシーケンス可能な次世代シーケンサーのカスタムパネル(multiplex PCR用primer pool)をデザインし購入した。これを用いて、(1)スキルス胃癌または(2)若年発症の未分化型胃癌の孤発例を対象に、候補遺伝子が体細胞変異としても見つかるかどうかを検証予定で、現在シーケンスライブラリーの作成をすすめている。また、家族性胃癌家系の追加検索も同時にすすめており、当院で治療を受けた患者でこれまでに13例が該当した。このうち、特に遺伝性素因が強く疑われる4例について、今後エキソームシーケンスの追加を予定している。まず当院で診療を受けた患者のなかで対象者の選別を行った。現在までに、家族性胃癌の2家系を選定し、患者および家族から血液サンプル合計5検体と、腫瘍組織1検体を採取した。本学ヒトゲノム倫理審査委員会に申請し本研究の承認を得た上で、血液サンプルを研究協力機関である大阪府立成人病センター研究所に搬送し、ゲノムDNAの抽出を行った。これらのサンプルのうち、優先して解析すべきと考えられた血液4検体(家系1の1検体と家系2の3検体)を対象として、全エキソンキャプチャーおよびエンリッチメントを行った上で、次世代シーケンサーによるシーケンシングを実施した。各サンプルで14ギガベース以上の配列データが得られ、参照配列にマッピングを行った結果、目的領域(全エキソン配列)の90倍以上のデータが得られた。このデータをもとに、公共のデータベースと各種ソフトウェアを用いた解析を行い、各サンプルにおける塩基置換、挿入欠失の検出を行い、さらに既知のSNPの除外とアミノ酸変化を伴う変異の抽出を行った。母系において発症者が多く集積していたため、患者と母系に共通してみられる変異を抽出したところ、約100遺伝子に絞り込むことができた。今後は、この候補遺伝子のうち病因として可能性の高そうなものを中心に解析を続ける予定としている。申請書に記載した計画のうち平成24年度に予定した内容に加えて25年度に予定した内容の一部まで終了しているため。家系の選出は引き続き行う。これまでのサンプル解析によって得られた候補遺伝子について、さらに絞り込みと検証を行う予定である。具体的には、孤発例においても変異が一定の頻度で同定されるかなどについて検証していく。今後は得られた候補遺伝子の検証にかかる試薬(primer、抗体など)に研究費の使用を予定している。また本研究の成果を学会や論文で発表する際の費用としても使用予定である。
診断・ワクチン用ウイルス抗原タンパク質の酵母による多種類大量生産技術の開発

組換えウイルスタンパク質はワクチンや診断薬に利用されており、その低コストでの生産が求められている。本研究では,酵母におけるウイルスタンパク質の高発現系を開発した。B型肝炎ウイルスの表面タンパク質HBsLを酵母で発現させると分解されることがわかった。そこで、分解されないHBsL変異タンパク質、および、高発現によりウイルス安定発現が可能な酵母発現系を確立した。以上のことから、将来必ず現れるウイルスによる社会問題に対処する方法論が準備できた。病原性ウイルスの検出と予防には抗原タンパク質を利用した感染検査薬やワクチン開発が必要である。様々なウイルスへ対応するため,迅速な遺伝子クローニング法と抗原タンパク質の高発現系の開発を行っている。組換え遺伝子の構築法の開発においては,酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いて染色体上へ組換え遺伝子を構築する方法を開発した。これにより,B型肝炎ウイルスの表面抗原タンパク質であるHBsLをGFP融合体として発現させた。一方,耐熱性酵母Kluyveromyces marxianusにおいては,栄養要求性変異株を取得し,非相同末端結合によるランダム導入法を利用した変異遺伝子の同定を行い,新規な酵母における選択マーカー遺伝子群の準備と形質転換系を完成させた。さらに,非相同末端結合を利用し,2つのDNA断片を混合して形質転換するだけでクローニングができる新しい方法を開発した。これらの方法の開発により,多種類の遺伝子を大腸菌を使わずに酵母へクローニングし,発現させる組換え構築系を完成させた。耐熱性酵母におけるHBsLの発現でもHBsLタンパク質の分解が起こる。様々なHBsL変異体を新しいクローニング法で作成し,発現させてみたところ分解が止まる変異体を得ることができた。この変異はHBsLのC末側の変異であり,疎水性配列に関係したので,疎水性配列とタンパク分解に関連が考えられた。病原性ウイルスの検出と予防において抗原タンパク質による感染検査試薬開発とワクチン生産が重要な課題である。新型インフルエンザウイルスやパンデミックウイルスなどへの対応では,抗原性が変化するので新型ワクチン生産が間に合わず,膨大な患者数が発生し,大きな社会問題となる。この解決法として,様々な抗原タンパク質の発現系を迅速に用意すること,および,その発現系から低コストで抗原タンパク質を大量生産することが考えられる。そこで,多種の抗原配列を設計し,高生産宿主酵母に導入後,速やかに実用的な大量生産系へ移行させ,得られるタンパク質から有効なワクチンや検査試薬を探す方法論の構築が考えられる。本研究では,数十百種類のタンパク質発現系を迅速に用意し,大量生産する方法を開発することが目的である。平成24年度はB型肝炎ウイルス抗原タンパク質の酵母での発現様式の解析を行った。GFPと融合したB型肝炎ウイルスのHBsLを酵母で発現すると急速に分解されることがわかった。そこで,その分解経路を調べるため,プロテアソーム変異株,オートファジー経路変異株を用いて,調べたところ,オートファジー経路変異株の一部では分解の抑制が部分的にではあるができることがわかった。しかしながら,分解を完全に止めることはできず,さらには,オートファジー経路の遺伝子のすべてが分解を抑制できるわけではないので,この分解経路にはいままで知られていない分解メカニズムが存在するのではないかと考えた。既知分解経路ではないという仮説を証明するためには,分解されない変異株を取得する必要がある。一方で耐熱性酵母Kluyveromyces marxianusを利用してウイルス抗原タンパク質発現系を構築し,抗原タンパク質を高発現する遺伝子組換え酵母を取得することを試みている。病原性ウイルスの検出と予防のために抗原タンパク質を利用した検査薬やワクチンが開発されてきた。様々なウイルスへ対応するための迅速なクローニング法と抗原タンパク質の高発現系の開発が求められている。新しいクローニング法に関しては耐熱性酵母Kluyveromyces marxianus、および、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて完成させることができた。酵母を宿主としたB型肝炎ワクチンは日本で開発された画期的組換えワクチンであるが、その後、酵母組換えワクチン生産はほとんど成功していない。そこで、B型肝炎ワクチンとなる表面抗原タンパク質HBsLを酵母で発現させたところ、急激に分解されることを見出した。この分解経路を解析したが、既存の経路ではないことを示唆する結果を得ている。K. marxianusを宿主とし、HBsLの安定発現が可能となる変異HBsLを探索したところ、C末側の変異で安定に発現できるようになった。これにより高生産が可能となる。そこで、この変異HBsLをS. cerevisiaeに導入した。しかし、S. cerevisiaeにおいての安定発現はできず、野生型と同じように分解されることがわかった。理由はわからないが、宿主により変異体タンパク質の安定性が変わるようである。これでは、S. cerevisiaeにおける安定発現は難しいと考え、S. cerevisiaeの多コピー型プラスミドを利用し、HBsLを発現させたところ安定発現が可能となった。

C型肝炎、インフルエンザ、風疹、麻疹、日本脳炎の表面タンパク質を試したところS. cerevisiae内での発現が確認できた。これにより、多種類のウイルス遺伝子を、大腸菌を使わずにクローニングし、高発現させることができるようになった。遺伝子工学当初の目的であったPCR操作による遺伝子操作法の開発は,予定通り進行し,酵母Saccharomyces cerevsiaeにおける操作,および,耐熱性酵母Kluyveromyces marxianusにおける非相同末端結合を利用した操作ともほぼ完成させることができた。耐熱性酵母においては,形質転換系,プラスミド操作系,2種のPCR産物を混合させて形質転換させてクローニングできる新しい方法や,オリゴDNAプライマーにペプチド配列を設計してクローニングする多種のペプチド遺伝子構築法を作成できた。一方,ウイルスタンパク質の分解経路の解析においては,HBsLの分解を回避できる変異体を取得することに成功した。疎水性配列領域に変異を入れたものなので,疎水性配列とHBsLの分解に関係があると考えられる。この変異体を用いることでHBsLの安定な発現が可能となった。同様の変異を他のウイルスタンパク質に導入することで安定な発現が期待できる。B型肝炎ウイルス抗原タンパク質は,もっとも古い酵母における遺伝子組換えタンパク質の実用化例であり,日本の画期的な成功例の一つである。したがって,当初は,本組換えタンパク質を酵母で発現させることは容易なことだと考えていたが,非常に難しいことがわかってきた。B型肝炎ウイルス抗原タンパク質は酵母では容易に分解され,1日でほぼ見えなくなる。タンパク質的にも数時間で発現は確認できるものの,正常タンパク質はほとんど生産されず,急速に分解されることが確認できた。その分解経路を既知の分解経路と比較しながら調べたところ,驚いたことに,プロテアソームやオートファジー経路のメイン経路ではないことがわかってきた。これらの遺伝子破壊株による実験は,順調に進展しているので,本研究は,外来タンパク質発現における分解経路の問題点を明らかにしつつある。しかしながら,重要な点は,その分解が完全に破壊株では抑制できないことであった。オートファジー経路はすでに多くの遺伝子がわかっているが,それらの変異のほとんどは抑制できず,ほんの一部の遺伝子のみがかかわることがわかった。このことから,肝炎ウイルス抗原タンパク質の酵母における分解経路には未知の経路が関わっているのではないかという仮説で今後は進める予定である。一方,新しい酵母Kluyveromyces marxianusにおけるタンパク質発現システムの構築は予定通り進展し,新しい酵母で様々な遺伝子を発現させることができるようになった。
細胞内手術光マニュピレーター装置の開発研究

装置の開発は昨年度に基本的に終了したので、今年度は実際に使用して、その改良、改善を行った。光源はエキシマレーザーで、微細加工装置と各種レーザーを光源とする光トラッピング装置を一体化し、同一顕微鏡内に装置した。本年度も昨年度にひきつづき動作性能評価と基本特性を解析した。しかしながら細胞内光手術は、昨年度から継続中の細胞融合を主としたため、細胞表面の膜の消去、蒸散を主とし、一部細胞の核の蒸散、ミトコンドリアと予想される部分の蒸散を行ったにすぎす、十分な結果は得ていない。以下に動作評価と基本特性について報告する。(1)波長によるトラッピング力の相違アルゴン(波長540nm)、半導体(830nm、1300nm,1500nm)のレーザーを用い、微小体の光トラッピング操作を実現した。照射光強度と光トラッピングの力の水平方向成分との間には比例関係が認められ、また波長が短いほどトラップ力は大きくなることを確かめた。(2)高次横モードによる光トラッピングの実現光源にNd:YAGレーザーを用いてTEM_<01>高次モードがTEM_<00>基本モードより強い光トラッピング力を持つことを確認した。また出力10mWのNd:YAGレーザーで30分間イースト菌をトラップしたが、何等変化は観察されなかった。(3)回転操作の実現楕円状の強度分布をもつ半導体レーザーを用い強度勾配の大きい短軸方向の力が長軸方向の力より大きいことに着目しマウス赤血球を回転操作することに成功した。これにより対象物の補捉、転送操作に加え回転操作がこの技術による非接触的に行える事を実証した。(4)エキシマレーザーを用いた細胞融合法の至適条件ミエローマ細胞を対象に細胞融合率に対するレーザー光照射条件について種々検討した。本実験では1.5J^<-6>30パルスが至適条件で、この条件下で50%の細胞融合に成功した。引き続き他の細胞について同譲の実験を進めている。以上の一連の検討結果をビデオに収録することができた。本研究は、マイクロレ-ザ-光ビ-ムを用いて、個々の生体細胞のさまざまな加工や操作を非接触的に行なうための全く新しい物理的な細胞制御技術を開発し実用化することを目指したものである。本年度は昨年度までに別々に開発してきたエキシマレ-ザ-を光源とする微細加工装置と各種レ-ザ-を光源とする光トラッピング装置を一体化し同一顕微鏡視野内に装着した。試作装置の動作性能評価と基本特性を解析した。1)波長によるトラッピング力の相違:アルゴン(波長540nm),半導体(830nm,1300nm,1500nm)のレ-ザ-を用い微小体の光トラッピング操作を実現した。2)高次横モ-ドによる光トラッピングの実現。光源にNd:YAGレ-ザ-を用いてTEM_<01>高次モ-ドがTEM_<00>基本モ-ドより強い光トラッピング力を持つことを確認した。また出力10mWのNd:YAGレ-ザ-で30分間イ-スト菌をトラップしたが何等変化は観察されなかった。3)回転操作の実現。楕円状の強度分布をもつ半導体レ-ザ-を用い強度勾配の大きい短軸方向の力が長軸方向の力より大きいことに着目しマウス赤血球を回転操作することに成功した。これにより対象物の捕捉、転送操作に加え回転操作がこの技術により非接触的に行なえることを実証した。4)エキシマレ-ザ-を用いた細胞融合法の至適条件。ミエロ-マ細胞を対象に細胞融合率に対するレ-ザ-光照射条件について種々検討した。本実験では1.5J^<-6,>30パルスが至適条件で、この条件下で50%細胞融合に成功した。引き続き他の細胞について同様の実験を進めている。

(3)回転操作の実現楕円状の強度分布をもつ半導体レーザーを用い強度勾配の大きい短軸方向の力が長軸方向の力より大きいことに着目しマウス赤血球を回転操作することに成功した。これにより対象物の補捉、転送操作に加え回転操作がこの技術による非接触的に行える事を実証した。(4)エキシマレーザーを用いた細胞融合法の至適条件ミエローマ細胞を対象に細胞融合率に対するレーザー光照射条件について種々検討した。本実験では1.5J^<-6>30パルスが至適条件で、この条件下で50%の細胞融合に成功した。引き続き他の細胞について同譲の実験を進めている。以上の一連の検討結果をビデオに収録することができた。
ウシ骨格筋細胞の筋細線維ターンオーバー機構の解明

ウシ腰最長筋への持続的低周波電気刺激により,筋線維を速筋線維から遅筋線維へ誘導させる実験系を確立した。この筋線維型変移ではミオシンの変移が先行して起こり,調節蛋白質の変移は続いて進行することが示された。この時,筋形成抑制因子であるミオスタチン発現が抑制されることが明らかとなった。また,筋細胞がケモカインを産生することを明らかにし,ミオスタチンがその発現を誘導することを見出した。筋線維型変移では筋衛星細胞に加え,外来の筋原細胞の動員によって,筋細線維ターンオーバーが促進されることが明らかとなった。持続的低周波電気刺激(CLFS)によって,ウシ腰最長筋の筋線維型がFast-to-Slow変化する過程を免疫組織学的に解析したところ,30日間のCLFSによってFast型ミオシン重鎖(MyHC)陽性の筋線維割合が73%から49%に減少し,一方Slow型MyHC陽性筋線維の割合が13%から26%に増加した。また,Fast型とSlow型の双方のMyHCを有する中間型筋線維も14%から25%に増加した。この時,筋収縮調節蛋白質であるトロポニン(Tn)T-slow型とTnI-slow型の陽性反応は, slow型と中間型筋線維で検出されたが,Fast型MyHC陽性反応が優勢な筋線維ではTnT-slow、TnI-slowの陽性反応はほとんど認められなかった。筋線維型移行過程におけるTnアイソフォームの変化は,MyHCアイソフォームのFast-to-Slow変化に追随して起こることが明らかとなった。さらに,筋線維型変移部を切り出し,ミオスタチンmRNA発現を半定量的RT-PCR法により解析したところ,CLFSによる持続的な筋運動の結果,ミオスタチンmRNA発現量が減少することが判明した。このことは免疫組織化学的に筋線維のミオスタチン陽性反応が減弱することからも確かめられた。3次元解析ソフトによる画像再構築手法を検討し,データ集積を実施した。CLFSによる筋線維型変移は筋線維の全体が同調して起こるのではなく,部分的変移から筋線維全体に変移が進行する可能性が示された。ウシ骨格筋への持続的低周波電気刺激(CLFS)は,筋線維型にFast-to-Slow変化を誘導する。この時,筋線維型変移部位ではミオスタチン発現は減少するが,レセプターおよびインヒビターの発現には変動は見られなかった。CLFSはミオスタチンの発現にのみ影響を及ぼすことが明らかとなった。筋分化や筋肥大への抑制作用を持つミオスタチンの発現減弱によって,筋線維型変移の環境が誘導され,変移の進行を促進するものと考えられる。CLFSによって筋線維型変移が起きた部位では,筋線維間に多数の細胞核が観察され,筋衛星細胞の活性化の他に,外来の細胞が筋原細胞となって筋線維に融合し,筋線維型変移に介入することが示唆された。このことから,単離筋線維における筋衛星細胞の解析において外来の筋原細胞の介入を判別することが極めて困難である。筋線維単離法によって筋衛星細胞の動態を解析するためには,種々の外来筋原細胞の識別法を考案する必要がある。筋形成過程において,筋細胞からケモカインが産生され,ミオスタチンはケモカイン発現を亢進させる方向に作用することが明らかとなった。一方, CLFSによってミオスタチン発現が減少することから,筋線維型移行過程ではケモカイン発現は抑制されると考えられ,炎症性反応を抑制した状態で,筋線維のリモデリングが進行していることが示唆された。CLFSによる筋線維型変移は,筋衛星細胞の分裂増殖あるいは外来筋原細胞の介入によって筋線維に融合する細胞が増えることで,進行していくものと考えられる。本研究のCLFS条件では電気刺激の伝導が運動神経を経由するものではないため,刺激の効果がランダムに生じる。腰最長筋という大きな筋での変移部位を3次元的に見出すためには,さらに手法の開発が必要である。
生殖腺と脳における性分化機構の解明

個体の性は性染色体の組み合わせによって決定される。その組み合わせは受精時に決定されるが,これを受けて胎性期には生殖腺の性が決定され,精巣と卵巣が分化する。これら雌雄の生殖腺からはそれぞれ性ホルモンが合成,分泌されることで体全体の性が決定されるに至る。従って,生殖腺の性決定は個体の性分化にとって極めて重要なステップであることが分かる。我々は性的に未分化な生殖腺が雌雄生殖腺に分化する過程を詳細に検討することで,生殖腺の性決定を支える分子メカニズムを明らかにすることを目的に本研究を行なった。本研究では我々が見い出した核内受容体型転写因子であるAd4BP/SF-1と相互作用する因子の同定を通じ,Ad4BP/SF-1を中心とした分子メカニズムを検討した。酵母を用いたtwo-hybridscreeningにおいてAd4BP/SF-1と相互作用する因子を多数単離した。これらの因子の中には種々の転写因子や細胞増殖因子からのシグナル伝達に関与する因子が含まれていた。転写因子の中ではpaired型のhomeo domainを有する因子が単離されたが,本因子は遺伝子破壊マウスの解析から生殖腺間質細胞の分化に不可欠な因子であることが明らかにされた。また,本因子がXLAGと呼ばれる人疾患の原因遺伝子であることが患者DNAの解析から明らかになった。細胞増革因子からのシグナル伝達に関与する因子としてはβ-cateninが単離されたが,β-cateninはAd4BP/SF-1のligand binding domainと直接相互作用し,Ad4BP/SF-1による転写を活性化することが明らかになった。また,この転写の活性化が雌生殖腺の分化にとって極めて重要な位置を占めることを明らかにした。これらの結果は生殖腺の性分化メカニズムを理解する上で貴重な情報を与えるものと思われる。我々は「Ad4BP」と名付けた転写因子を見い出し、その機能と発現を解析してきた。その結果、本因子は生殖腺の発生に不可欠な因子として機能するだけでなく、視床下部一脳下垂体一性腺における内分泌機能を調節することで、生殖活動全体を統括する中心的な因子としての機能をも担うことを示唆する結果を得ることが出来た。従って、これらの研究で得られた結果から生殖腺と脳の性分化機構に関する問題点を整理することが可能であり、同時に本因子を中心とする研究によって、これらの問題点が解明されることを確信するに至った。本研究は分子レベルでの研究成果をもとに、生体へと展開することで「生殖腺と脳の性分化機構」を明らかにすることを目的に行われた。本年度は主に生殖腺の性分化機構の解析を行ってきた。生殖腺の性分化に不可欠な各種転写因子の機能と遺伝学的相互作用を検討し、遺伝子間の上下関係が明らかにされつつある。一方、Ad4BPを含む数種の転写因子に対し相互作用する転写調節因子の単離を試みたところ、複数種の新たな転写因子が単離されてきた。現在、これらの因子が生殖腺の分化過程でいかなる機能を担っているかを検討しているところである。また、これら転写因子の他に各種のシグナル分子が胎仔生殖腺で発現することが知られている。これらのシグナル分子のうち、Wnt4が生殖腺の性分化の過程で機能することが知られているが、このシグナルの標的遺伝子がDax-1遺伝子であることが明らかになってきた。この結果は生殖腺の分化過程でのシグナル分子と転写調節が結びついた初めての例であり、詳細な検討を行っているところである。本研究は性分化を支える基本プログラムを分子レベルで解明することを目的に計画されている。本年度は生殖腺の性分化に深く関与する転写因子Ad4BP/SF-1とDax-