hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
確率分布のダイナミクスに基づいた確率制御手法の高度化

一方で,本研究の目的は確率システムの過渡的な挙動を確率分布や確率密度の観点から解析および制御する手法を確立することであり,本年度は解析手法を開発することを目的としていた.本年度得られた結果は,密度関数を用いた確定システムの有限時間安定性の条件や一次元確率システムを主な対象とする有界性の条件である.これらの結果により,システムの過渡的な挙動に関する一定の知見は得られたものの,当初の計画からすると若干の遅れが見られる.そのため,総合的に判断して進捗がやや遅れていると判断した.ただし,本年度に得られた知見に基づいて,上記の結果をより一般的な結果に拡張するための方策は既に検討済みであり,次年度以降,より一般的な確率システムに対する研究に取り組む予定である.来年度以降は本年度に得られた結果をより一般的な確率システムの場合に拡張する研究に取り組む.有限時間安定性と密度関数の関係については,確定システムの場合,密度関数の遷移を特徴付ける作用素を用いてシステムの収束性を解析できることがわかっている.今後はその知見に基づいて確率システムに対して同様の解析を行い,有限時間安定な確率システムの過渡応答の性質を明らかにすることに取り組む.また,確率システムの有界性について本年度は一次元のシステムに対する条件を示したが,今後は多次元の場合に対する条件を示すことに取り組む.そのための方策としてリャプノフ関数のような関数を用いる方策を検討している.また,これらの二つの課題に取り組み,確率システムの過渡的な挙動の解析法を示すとともに,それらの結果に基づいた制御手法の開発にも取り組む予定である.さらに,システム群の制御などへの応用も検討している.本研究課題に関連する国際学会への参加を予定していたが,研究計画の若干の変更により,参加を見送ったことと,コンピュータの購入を予定していたが,同様に研究計画の変更によって購入を見送ったことにより,次年度使用額が生じた.次年度において,本年度に参加を見送った代わりに別の国際学会への参加を予定しているため,未使用額はそのための旅費に使用する予定である.
植物ケツムDNA上に存在するtRNAと相同性を持つ反復配列の解析

本研究代表者らがタバコの染色体DNAよりクローニングした反復配列はtRNA相同領域、tRNA非相同領域、TTGの繰返しという3つの領域からなっていた。この構造は、これまでに動物で見いだされているSINEの構造と極めて類似しており、これからこの反復配列が植物におけるSINEであることが明らかとなった。本研究代表者らはこのSINEをTS配列と名付けた。また、tRNAにおいて保存されている塩基が、TS配列のtRNA相同領域にも保存されていたことより、TS配列がtRNAを起源としていることが強く示唆された。この結果より、tRNAと相同性を持つSINEが動物のみならず、植物にも存在することが示された。TS配列はtRNA相同領域内にRNAポリメラーゼIIIで転写されるプロモータの共通配列と類似の配列を含んでいたが、実際TS配列はin vitroにおいてRNAポリメラーゼIIIによって転写された。TS配列は調べた限りのナス科植物の染色体上に存在していたが、さらにナス科以外の植物について調べたところ、TS配列はヒルガオ科の植物であるアサガオの染色体DNA上にも存在していた。このことから、TS配列はナス科、ヒルガオ科が属する管状花植物に広く存在するものと考えられた。次にデータベースを検索したところ、すでに報告されているいくつかのナス科植物の塩基配列中にTS配列が含まれていた。これらのTS配列の塩基配列と本研究代表者らがタバコ染色体よりクローニングしたTS配列の塩基配列とを比較したところ、TS配列は少なくとも2つのサブグループにわけられた。それぞれのサブグループの塩基配列のdivergencyが異なることから、それぞれのサブグループはそれぞれ異なる時期に増幅したと考えられる。さらに、一方のサブグループはtRNA相同領域を欠失しているという特徴をもっていた。
腸内細菌を標的とした自己免疫疾患の治療法の確立

自己免疫疾患の発症機序の詳細は未だ不明であり、現在その治療の中心は免疫抑制療法であるが、感染症等の重大な副作用を生じうるため、病態に即した選択的治療法の開発が望まれている。近年、腸内細菌をはじめとした常在微生物が宿主の免疫系の発生や恒常性維持に寄与することが報告されている。また臨床的にも炎症性腸疾患のみならず関節リウマチ等の腸管外の自己免疫疾患と腸内細菌との関連を示唆する報告がなされているが、その因果関係やメカニズムは解明されていない。申請者らは全身性自己免疫疾患の病態解明を目指して、リンパ球減少下に生じる生理的なリンパ球増殖反応であるLymphopenia-induced proliferation (LIP)によって誘導される自己免疫疾患モデルマウスを解析した。BALB/cヌードマウスに野生型マウス脾細胞由来のCD4陽性CD25陰性T細胞を移入すると、抗核抗体産生、胃炎・腸炎・唾液腺炎、卵巣炎などの全身性および臓器特異的自己免疫疾患が生じる。その発生機序として、移入細胞がLIPを経て濾胞性ヘルパーT細胞様の働きを持つPD-1陽性CXCR5低発現のCD4陽性細胞を生じ自己抗体産生を促進すること、またその経路に腸内細菌の存在が重要であることを見出した。さらに本モデルマウスに対して複数の抗生剤を経口投与することにより全身性自己抗体産生および胃炎・腸炎の発症が抑制されることを明らかにした。さらに抗生剤投与前後の糞便より抽出した16S rRNAに対するPCRおよびメタゲノム解析により、腸管滅菌による腸内細菌の数および多様性の減少が観察された。以上の内容についてScientific Reports誌に発表した。将来の治療開発に向けて、腸内細菌が全身性自己反応性T細胞の誘導に寄与する機序およびヒト自己免疫疾患におけるLIPと腸内細菌の関与について、今後さらなる検討を要する。全身性エリテマトーデスなどの全身性自己免疫疾患の病態は今なお不明な点が多く、根治療法は確立されていない。現在行われている免疫抑制療法は感染症等の重大な副作用を生じうるため、病態に即した選択的治療法の開発が望まれている。申請者らは全身性自己免疫疾患の病態解明を目指してリンパ球減少誘導性自己免疫モデルマウスを解析し、リンパ球減少下の生理的なリンパ球増殖反応によって自己反応性の濾胞性ヘルパーT細胞が出現すること、またその経路に腸内細菌の存在が重要であることを見出した。さらに本モデルマウスおよび古典的自然発症ループスモデルマウスに対して複数の抗生剤を経口投与することにより自己免疫疾患発症が抑制される事象を明らかにしてきた。本研究は、腸内細菌が自己免疫へ寄与する経路の解明、さらにヒト自己免疫疾患における腸内細菌の意義を検討し、腸内細菌を標的とした新規治療法開発の基礎を築くことを目的とする。平成28年度は、BALB/cヌードマウスにBALB/c野生型マウス脾細胞由来のCD4陽性CD25陰性T細胞を移入することで全身性および臓器特異的自己免疫疾患を発症するモデルマウスを用いて、種々の抗生剤の経口投与による腸管滅菌が、全身性および臓器特異的自己抗体産生と各臓器障害の発症に及ぼす影響について検討した。さらに同モデルマウスに対する抗生剤投与による腸内細菌叢の変化について、抗生剤投与前後の糞便サンプルに対する16S rRNAメタゲノム解析を用いて明らかにした。上記内容の一部についてScientific Reports誌に発表した。1-4種の抗生剤の組み合わせ投与による腸管滅菌による、抗核抗体すなわち全身性自己抗体と、抗胃壁抗体などの臓器特異的自己抗体の抑制効果を明らかにした。各臓器障害については、抗生剤投与によって改善するものと増悪するものが見られ、自己抗体産生以外の経路においても、腸内細菌が各臓器の自己免疫病態に直接的もしくは間接的に影響を及ぼしている可能性が示唆された。4種の抗生剤投与による腸管滅菌について、抗生剤投与前、投与2、4週後のマウスの糞便サンプルに対する16S rRNA解析を行うことにより、腸内細菌の変化を同定した。

さらに本モデルマウスに対して複数の抗生剤を経口投与することにより全身性自己抗体産生および胃炎・腸炎の発症が抑制されることを明らかにした。さらに抗生剤投与前後の糞便より抽出した16S rRNAに対するPCRおよびメタゲノム解析により、腸管滅菌による腸内細菌の数および多様性の減少が観察された。以上の内容についてScientific Reports誌に発表した。将来の治療開発に向けて、腸内細菌が全身性自己反応性T細胞の誘導に寄与する機序およびヒト自己免疫疾患におけるLIPと腸内細菌の関与について、今後さらなる検討を要する。抗生剤の各種組み合わせおよび各臓器ごとに異なる治療効果が得られたことから、各臓器ごとに疾患発症、病態形成に影響を与える特異的な抗生剤の組み合わせを検討する。同時に、糞便に対する16S rRNAメタゲノム解析およびPCR法を用いた細菌叢解析を行うことにより、全身性自己免疫および各種臓器特異的自己免疫疾患発症に寄与する特異的な細菌または細菌叢の変化を明らかにする。並行して、腸内細菌叢変化による代謝の変化が獲得免疫や全身状態に与える影響について、遺伝子機能データベースを用いて明らかにすることを目指す。
生態系の時間軸構造の解明-放射性炭素分析による生態系炭素循環解析手法の構築-

大気二酸化炭素中に含まれる大気核実験起源の放射性炭素(^<14>C)は、第2次世界大戦後の米ソ冷戦時に増加したのち単調に減少しており、炭素循環に関する時間軸として用いることができる。本研究は、このユニークな指標(△^<14>C値)を用いて水域生態系(河川生態系)および陸上生態系(森林生態系)の中に時間軸を明示し、食物網を通じてどのような炭素循環が成り立っているかを明らかにした。(1)河川生態系における炭素放射性同位体(△^14C)の利用:河川生態系では、近年炭素・窒素安定同位体比(δ^13C,δ^15N)を用いた研究が盛んにおこなわれているが、新たな指標として△^14C値を導入し、河川生態系において食物網を記述する。(2)河川生態系研究における炭素安定同位体比(δ^13C)と炭素放射性同位体(△^14C)の関係について:琵琶湖流入河川において、主要な一次生産者である付着藻類の光合成速度および炭酸供給速度に関係する、開空度と流速の異なる4つの微地形において、δ^13C値と△^14C値の変化を調べる(3)森林土壌生態系における炭素放射性同位体(△^14C)の利用:1960年頃に針葉樹から広葉樹(CBサイト)または広葉樹から針葉樹(BCサイト)に樹種交替したサイト、および樹種交替していないサイト(針葉CCサイト、広葉BBサイト)の計4サイトで植物遺体、土壌腐植、土壌層および土壌動物群集の解析を行う。(4)森林土壌生態系における炭素放射性同位体(△^14C)の利用:北大苫小牧研究林において、土壌を利用する土壌動物における△14C値を解析し、大気二酸化炭素(CO_2)の△^14C値の継時変化から、土壌動物が利用した炭素年齢(carbon age)を推定する。(5)食物網研究における炭素放射性同位体(△^14C)の利用:茨城県北茨城市に位置する小川を調査地とし、森林生態系が発達する過程での土壌と植物体への炭素蓄積が、動物による有機物利用のあり方を変化させるのかを検討する。具体的には、森林伐採からの経過年数の異なった複数の森林で、捕食者としてのクモに対して、樹上性の昆虫と飛翔性の昆虫を比較し、食物網構造を△^14C、δ^13C、δ^15N値を用いて解析する。(6)研究(1)から(5)に基づき、△^14C、δ^13C、δ^15Nの3つのパラメータを用いて食物網を解析する方法の優位性に関してまとめる。地球規模の環境変動下において、生態系の炭素循環解明は非常に重要な研究課題になってきている。しかしながら、生態系の炭素循環を生態学的側面および物質動態的側面の両面から研究するのは容易ではない。一方、大気CO_2の放射性炭素14(Δ^<14>C)値は米ソ冷戦下の大気核実験によって近年大きく変化したことが知られている。CO_2を光合成によって固定した植物、それを利用した動物、さらにそれらが分解された有機物は、もともとの大気のΔ^<14>C値を保存しているため、炭素循環において「時間軸を表す時計」として用いることができる。そこで本研究では、^<14>Cの天然存在比を用いた生態系研究の手法を構築し、生態系の時間軸構造の解明を目指す。本年度は、研究を効率的に行なうために、京都大学生態学研究センターに新たなグラファイト精製用ガラスライン及びグラファイト化用電気炉・ターゲット作成設備を設置し、グラファイトを精密かつ迅速に作成するための前処理方法を確立した。そして水域生態系研究として、琵琶湖集水域犬上川および芹川における研究を開始した。水域生態系では、付着藻類、水生昆虫群集、魚類を対象として^<14>C分析を行なうとともに、食物網構造研究手法として定着している炭素・窒素の安定同位体分析も行なった。陸域生態系としては、土壌有機物の分解過程が重要であるため、北大苫小牧演習林において植物遺体(枯死した葉、枝リター)、土壌腐植、土壌層および土壌動物群集の分析前処理を行った。生成されたグラファイトは、国立環境研究所の加速器質量分析計(AMS)を用いて分析予定である。また、^<14>C天然存在比を用いた研究の有効性をアピールするため、学会発表および論文発表を行った。大気CO_2の放射性炭素14(Δ^<14>C)値は米ソ冷戦下の大気核実験によって大きく変化したことが知られている。光合成によって固定された有機物は、もともとのCO_2のΔ^<14>C値を保存しているため、炭素循環において「時間軸を表す時計」として用いることができる。本年度は犬上川および芹川において、上流域における食物網を示す同位体マップおよび流下過程に沿った食物網の同位体マップの変化を調査した。その結果、付着藻類は地下由来の無機炭酸を示す低いΔ^<14>C値を持っていたのに対し、粒状有機炭素は陸上由来の有機炭素を起源とする高いΔ^<14>

C値を示すことがわかった。これらを利用する水生昆虫、魚類も含んだ生物群集において、Δ^<14>C値と窒素同位体比(δ^<15>N)より推定した食物網と、炭素安定同位体比(δ^<13>C)と窒素安定同位体比(δ^<15>N)より推定した食物網を比較したところ、両河川において違いがみられた。Δ^<14>C値およびδ^<13>C値による違いは、その同位体決定機構の違いによることが考えられたが、これについては21年度に集中的に比較検討することとした。また、陸域生態系に関しては、北大苫小牧研究林および八ヶ岳において植物遺体、土壌腐植、土壌層および土壌動物群集の解析を行った。その結果、広葉樹と針葉樹の違いが土壌動物の多様性の違いを生み、それによって土壌有機炭素動態が影響を受けることが示唆された。さらに本年度から、森林伐採からの経過年数によって森林の食物網構造がどのように変化するかというテーマに関する調査を開始した。予備的データからは、時系列に伴って生物群集のΔ^<14>C、δ^<15>N、δ^<13>Cが変化し、これらを用いた食物網構造解析の有用性が示唆された。琵琶湖流入河川において、流程に沿った粗粒状有機炭素(CPOM)および礫上付着物(Epilithon)のΔ^<14>C値の変化を調査した。その結果、CPOMは陸上由来の値を示すΔ^<14>C値を示したのに対し、EpilithonのΔ^<14>C値は河川間によって異なり、また下流に至る程上昇することがわかった。また、芹川の小流程を用いてEpilithonのδ^<13>C値およびΔ^<14>C値の変化を見たところ、δ^<13>C値は開空度および流速によって変化したが、Δ^<14>C値はそれらに影響を受けなかった。この事実は、しばしばδ^<13>C値が変動する河川においても、Δ^<14>C値は食物網解析の炭素源推定に用いることが出来る可能性を示した。また、北大苫小牧演習林において植物遺体、土壌腐植、土壌層および土壌動物群集の解析を行った。樽前山の噴火以来針葉樹林であったサイトでは、土壌腐植および土壌層の炭素蓄積量は高く、かつΔ^<14>Cプロファイルは大気CO_2のΔ^<14>C値をほぼ反映していた。それに対し、広葉樹林の履歴がある森林については土壌腐植および土壌層のΔ^<14>Cプロファイルは大きく撹乱を受けていた。これは、広葉樹に多い土壌動物の混合効果によって土壌有機炭素蓄積構造が影響を受けたことを示唆する。さらに、食物網構造をΔ^<14>C、δ^<15>N、δ^<13>Cの3つのパラメータを用いて解析する手法を、森林伐採からの経過年数の異なった複数の森林で適用した。樹上捕食者であるクモのΔ^<14>C値は、樹上生食連鎖由来の「新しい炭素資源」と、土壌から羽化する土壌腐食連鎖由来の「古い炭素資源」を混合して利用する事実を明確に示した。一方、森林伐採からの経過年数によっての変化は見られなかった。この結果は、少なくとも森林の二次遷移課程を通じて食物網を流れる炭素の年代は、森林伐採からの経過年数ではなく、捕食者の餌の選好性に影響されることを示した。
痴呆関連ペプチドによる新規抗痴呆薬の開発研究

痴呆関連ペプチドによる研究の一環として内在性μ-オピオイド受容体作動薬endomorphin-1および-2に着目し、それらの短期および長期記憶に及ぼす作用を検討した.さらに,新規抗痴呆薬についての探索研究を行った.1)Endomorphin-1および-2による短期および長期記憶障害はμ-オピオイド受容体拮抗薬β-funaltrexamineの併用により有意に改善された.3)ドパミンD2受容体作動薬RU24213はendomorphin-1あるいはendomorphin-2による長期記憶障害に対してほとんど影響しなかったが,ドパミンD2受容体拮抗薬(-)-sulpirideはendomorphin-2による長期記憶障害を改善した.以上の結果より,endomorphinsによる記憶障害にはμ1-オピオイド受容体,ドパミンD2受容体とコリン作動神経系の関与が示唆された.さらに,μ1-オピオイド受容体拮抗薬の新規抗痴呆薬としての有用性が示唆された.痴呆関連ペプチドによる研究の一環として内在性μ-オピオイド受容体作動薬endomorphin-1および-2に着目し、それらの短期および長期記憶に及ぼす作用を検討した.さらに,新規抗痴呆薬についての探索研究を行った.1)Endomorphin-1および-2による短期および長期記憶障害はμ-オピオイド受容体拮抗薬β-funaltrexamineの併用により有意に改善された.3)ドパミンD2受容体作動薬RU24213はendomorphin-1あるいはendomorphin-2による長期記憶障害に対してほとんど影響しなかったが,ドパミンD2受容体拮抗薬(-)-sulpirideはendomorphin-2による長期記憶障害を改善した.以上の結果より,endomorphinsによる記憶障害にはμ1-オピオイド受容体,ドパミンD2受容体とコリン作動神経系の関与が示唆された.さらに,μ1-オピオイド受容体拮抗薬の新規抗痴呆薬としての有用性が示唆された.痴呆関連ペプチドによる痴呆モデル動物作製に関する研究の一環として内在性μ-オピオイド受容体作動薬endomorphins(endomorphin-1および2)に着目し,それらの短期および長期記憶に及ぼす作用を,それぞれ自発的交替行動および受動的回避学習を指標にして検討した.1)自発的交替行動に及ぼす作用2)受動的回避学習に及ぼす作用以上の結果より,endomorphinsはμ-オピオイド受容体を介して短期および長期記憶を障害させることが示唆された.内在性μ-オピオイド受容体作動薬(endomorphin-1およびendomorphin-2)の学習・記憶障害誘発作用におけるμ-オピオイド受容体サブタイプとコリン作動神経系の関与について行動薬理学的に検討した.Endomorphin-1およびendomorphin-2によって自発的交替行動は有意に減弱したが,自発運動はほとんど影響されなかった.μ_1-オピオイド受容体拮抗薬naloxonazine単独は,自発的交替行動や自発運動にほとんど影響しなかった.Endomorphin-1による自発的交替行動の低下はnaloxonazineにより有意に抑制されたが,endomorphin-2による自発的交替行動の減少はnaloxonazineによる影響を受けなかった.Endomorphin-1およびendomorphin-2による自発的交替行動の低下は,コリンエステラーゼ阻害薬physostigmineの併用により抑制される傾向が見られたが,自発運動については変化が見られなかった.なお,physostigmine単独は,自発的交替行動や自発運動にほとんど影響しなかった.以上の結果より,内在性オピオイドによる記憶障害には,μ_1-オピオイド受容体とコリン作動神経系の関与が示唆された.内在性μ-オピオイド受容体作動薬(endomorphin-1および-2)の学習記憶障害誘発作用におけるドパミン受容体サブタイプの関与について明確にした.3.ドパミン受容体作動薬・拮抗薬単独は,受動的回避学習にほとんど影響しなかった.以上の結果より,ドパミンD2受容体を刺激すると,endomorphin-1ではなく,endomorphin-2による受動的回避学習障害が惹起されることが示唆された.
血液一滴による脳の機能状態モニタリング

独自に開発したペプチド抽出法を用いた血漿中のペプチドの分析によって、Brain-specific angiogenesis inhibitor 1, Secretgranin-1, 2, Neurograninをはじめとした約15種類の脳特異的に発現している可能性の高い分泌タンパク質由来のペプチドの直接検出に成功した。また、海馬、大脳皮質、視床下部の凍結切片約1mg(1mm径×1mm厚)より、酵素消化、分画、高感度LC-MSを組み合わせた分析において、6,000種類を超えるタンパク質を、同様の技術でマウス髄液より約500種類のタンパク質の同定に成功した。さらに、分担研究者・板倉との共同研究のもと、ペプチドマイクロダイアリシスにて生きた状態での脳内分泌液を採取しLC-MS分析を行いAngiotensinogen Apolipoprotein-E,Selenoprotein Pをはじめとする神経細胞に作用する可能性の高い約10種類の分泌タンパク質を含む約230タンパク質の同定に成功した。さらに、K+投与によって、一部のタンパク質に量的な変動を検出した。タンパク質の機能状態(切断、修飾等)の比較分析:血液中のタンパク質は非常に複雑な切断や修飾を受けているため、酵素消化をベースにした従来のショットガンプロテオミクス技術では、高性能質量分析計をもってしてもその複雑さを紐解くことは非常に困難である。このため、試料中のタンパク質を電気泳動し、短冊状に切り出した各ゲル中のタンパク質をゲル内酵素消化して同定するGeLC-MS/MS技術により血清を分析した。その結果、例えば補体C3やアルブミンが非常に多様な切断を受けていることが分かった。そこで、この方法に安定同位体標識法(ジメチル化)を組み合わせて、疾患特異的な切断ならびに修飾を詳細に分析する技術を開発した。本年度で脳組織ならびに脳髄液、さらにペプチドマイクロダイアリシスの詳細なプロテオーム解析が可能となった。また、血液中で検出された脳で特異的に発現していると考えられるタンパク質の種類も増えた。今後は、脳組織、髄液、ペプチドマイクロダイアリシスの検出感度向上と、各種分析に本年度確立した安定同位体標識法を組み合わせることを行い、血液とその他の試料における同時検出を目指す。血漿中のペプチドをより高感度で分析するために、2013年に独自に開発したペプチド抽出法の各ステップを見直し、より効率的なペプチド抽出法の開発を進めた。その結果、従来見えていなかったペプチドの検出が可能となった。一方、分析対象である血漿中のペプチドは、採血前の体内と同じ状態である必要がある。この点に関しては正確な評価は非常に難しいところであるが、採血後のタンパク質・ペプチドの分解について、平成29年度、タンパク質分解酵素阻害剤を添加した市販の採血管2種類と、従来の血漿採取用EDTA採血管で採血した血漿中のペプチドの比較分析を開始した。脳の機能状態を解析するためには脳の各部位、脳髄液、ペプチドマイクロダイアリシスで採取した溶液中のペプチドを分析する必要がある。しかし、いずれも微量であるため、ペプチドを損失することなく効率よく抽出して分析する技術が要求される。そこで、まずはマウスの脳全体のホモジネート(脳3mgに相当する量)を対象にペプチド分析を行った。その結果、921種類のタンパク質に由来する2,488種類のペプチドの同定に成功した。この中には既知のペプチドホルモン6種類が含まれていた。次に、脳の凍結切片から線条体を切り出し、その中の約0.5mgからペプチドの分析を行った結果、神経ペプチド前駆体タンパク質5種類を含む796種類のペプチド(253種類のタンパク質に由来)の同定に成功した。さらに、上記のペプチド分析法を基盤にペプチドの比較解析法を確立し、水中拘束ストレスマウスとコントロールマウスの凍結切片から切り出した海馬数mgを対象に比較解析を行った。その結果、神経ペプチド前駆体とホルモン前駆体タンパク質5種類を含む54種類のタンパク質に由来する131ペプチドの高精度な比較解析を実現し、約20種類のストレスに伴って増加するペプチドの同定に成功した。本研究は血液と脳組織の両方を分析する必要がある。こうした中、本年度は血液ならびに脳の凍結切片で切り出した微量組織を対象にした高感度な比較分析法の確立に成功した。

このため、試料中のタンパク質を電気泳動し、短冊状に切り出した各ゲル中のタンパク質をゲル内酵素消化して同定するGeLC-MS/MS技術により血清を分析した。その結果、例えば補体C3やアルブミンが非常に多様な切断を受けていることが分かった。そこで、この方法に安定同位体標識法(ジメチル化)を組み合わせて、疾患特異的な切断ならびに修飾を詳細に分析する技術を開発した。本年度で脳組織ならびに脳髄液、さらにペプチドマイクロダイアリシスの詳細なプロテオーム解析が可能となった。また、血液中で検出された脳で特異的に発現していると考えられるタンパク質の種類も増えた。昨年度確立した血液ならびに脳組織を対象としたペプチド分析技術をもとに、安定同位体標識法を組み合わせた比較分析法を確立し、高精度で高感度な比較分析を実現する。また、タンパク質の存在量ならびに機能状態の解析法を確立する今後は、脳組織、髄液、ペプチドマイクロダイアリシスの検出感度向上と、各種分析に本年度確立した安定同位体標識法を組み合わせることを行い、血液とその他の試料における同時検出を目指す。国内出張に係る旅費が当初予定よりも少し少なかったため次年度使用額が生じた。次年度、消耗品として使用する。本年度は分担研究者が担当しているペプチドマイクロダイアリシスの改良ならびに試料調製法の改良を行い、LC-MS、前分画部分の最適化による高感度化を来年度行う予定であった。しかし、順番を入れ替えてLC-MS、前分画部分の最適化を先に行った。このため、分担研究者の使用分を次年度に使用することとした。次年度、上記の最適化した方法を用いてペプチドマイクロダイアリシスで採取した試料の好感度分析を行い、その方法を基盤にマイクロダイアリシスと試料調製の改良を行う。
白血球の遊走方向を決める細胞極性蛋白質複合体の作用機構

体内に微生物が侵入すると、白血球の一種である好中球が微生物の侵入部位(炎症部位)へ素早く遊走して貪食・殺菌を行う。この細胞の遊走過程を「ケモタキシス(走化性)」と呼ぶ。正しくケモタキシスするためには「方向の決定」と「運動性の亢進」が必要であるが、「遊走方向」を制御する機構については不明な点が多い。好中球の主な走化性因子の受容体はGiと共役する7回膜貫通型の受容体(GPCR)である。本研究では、走化性因子により活性化したGiシグナルにより、遊走好中球の前方にリクルートされたmInsc蛋白質が、進化的に保存されたPar蛋白質複合体を介して好中球の遊走方向を制御する機構を明らかにした。白血球の一種である好中球は、体内に侵入した細菌や真菌などの外来微生物を貪食し殺菌する役割を担う細胞である。好中球がその機能を発揮するためには、ケモタキシス(chemotaxis:走化性)により微生物の侵入部位へ素早く到達することが必要不可欠であり、この過程は生体防御ひいてはヒトの生存にとって必要不可欠である。ケモタキシスを誘導する走化性因子の受容体は、すべて7回膜貫通型であり、その全てが3量体G蛋白質のGiと特異的に共役する。細胞が正しくケモタキシスするためには「方向の決定」と「運動性の亢進」が必要であるが、「遊走方向」を制御するメカニズムについては、ほとんど分かっていない。本研究の目的は、Giの役割に着目し、好中球の遊走方向を決定するための分子機構を解明することである。これまでの解析により、細胞極性を制御するアダプター蛋白質であるmInscがパートナー分子であるLGN/AGS3への結合を介し、走化性因子の刺激に依存して好中球の前方へ集積すること、この集積がケモタキシスの際の「遊走方向の決定」に重要な役割を担うことこと等を明らかにしてきた。mInscーLGN/AGS3複合体は、好中球の前方でpseudopod (偽足)を安定化することにより、方向性の維持に機能することを見出していたが、本年度はさらにmInscの下流でpseudopodを安定化するための下流のターゲット蛋白質についてマススペクトロメトリーを用いた解析によりその候補分子を同定した。好中球は、私たちの体を循環する白血球のおよそ60%を占める細胞であり、その機能は、体内に侵入した細菌や真菌などの微生物を、貪食して殺菌することである。その機能を発揮するためには、ケモタキシス(chemotaxis:走化性)により微生物の侵入部位へ素早く到達することが必要不可欠であり、この過程は生体防御ひいては人間の生存にとって不可欠な現象である。ケモタキシスを誘導する走化性因子の受容体は、すべて7回膜貫通型で、その全てが3量体G蛋白質のGiと特異的に共役する。これまでの解析により、細胞極性を制御するアダプター蛋白質であるmInscが、走化性因子の刺激に依存して好中球の前方へ集積すること、この集積はmInscのパートナー分子であるLGN/AGS3への結合に依存していることを見出した。さらにmInsc欠損マウスの好中球ではケモタキシスの効率が低下しており、「遊走方向の決定」の異常がその原因であることが分かった。このmInsc欠損好中球の遊走方向の異常は、野生型mInscの過剰発現により回復したが、一方でLGN/AGS3に結合できないmInsc変異体の過剰発現では回復させることができなかった。以上の結果から、走化性因子依存的なmInscーLGN/AGS3複合体の形成がケモタキシスの際の「遊走方向の決定」に重要な役割を担うことが示唆された。

細胞が正しくケモタキシスするためには「方向の決定」と「運動性の亢進」が必要であるが、「遊走方向」を制御するメカニズムについては、ほとんど分かっていない。本研究の目的は、Giの役割に着目し、好中球の遊走方向を決定するための分子機構を解明することである。これまでの解析により、細胞極性を制御するアダプター蛋白質であるmInscがパートナー分子であるLGN/AGS3への結合を介し、走化性因子の刺激に依存して好中球の前方へ集積すること、この集積がケモタキシスの際の「遊走方向の決定」に重要な役割を担うことこと等を明らかにしてきた。mInscーLGN/AGS3複合体は、好中球の前方でpseudopod (偽足)を安定化することにより、方向性の維持に機能する。そこで、本研究では、mInscの下流のターゲット蛋白質についてマススペクトロメトリーを用いてその候補分子の探索を行い、得られた候補分子についての解析を進めた。mInscは、ケモタキシスの過程で、アクチンの再編成を制御するいくつかのタンパク質と協調的に機能し、pseudopodの伸長を維持すること等が明らかになった。医歯薬学本研究の目的であるGiシグナルの下流で好中球の遊走方向を決定するための分子機構としてmInscーLGN/AGS3複合体の役割を見出していたが、本年度はこの好中球の遊走を制御する全く新しいGi特異的なシグナル伝達機構について、さらにmInscの下流でpseudopodを安定化するための下流のターゲット蛋白質の候補を見出すことができた。本研究の目的である、Giシグナルの下流で好中球の遊走方向を決定するための分子機構としてmInscーLGN/AGS3複合体の役割を見出し、好中球の遊走を制御する全く新しいGi特異的なシグナル伝達機構を明らかにすることができた。本研究では、遊走方向を制御するmInsc複合体の下流のターゲット分子の候補を見出すことができた。今後の推進方策として、これらの候補分子がどのように機能しているのかについて明らかにすることができれば、遊走方向の制御機構についてさらに理解を深めることができると考えられる。本研究では、遊走方向を制御する蛋白質複合体を見出すことができた。一方で、その下流のターゲットについては未だ不明である。今後の推進方策として、下流のターゲットを明らかにすることができれば、遊走方向の制御機構についてさらに理解を深めることができると考えられる。分子生物学的、生化学的な実験を行うために「消耗品費」を「酵素」、「電気泳動試薬」、「一般試薬」、「DNA合成」に使用する。また、本研究で明らかにする蛋白質間相互作用の意義を細胞生物学的に解析するために、「実験動物」及び「細胞培養の試薬」、細胞培養の無菌的操作のための「プラスチック器具」に使用する。また、本研究では、他の分野の研究者との共同研究を予定しているため、「研究打ち合わせ」のための経費を、研究成果を発表し議論するための「学会出席・発表」の経費、また論文発表に必要な「研究成果投稿料」に研究費の使用を計画している。
プロトプラスト融合を利用したカキの種間雑種作出及び倍数性育種に関する研究

2倍体のカキ属種D.glandulosa(2n=30,x=15)と6倍体のカキ品種D.kaki cv.Jiro(2n=90,x=15)のプロトプラストを単離し、電気融合した。改変KM8p培地で培養し、得られたカルスの相対核DNA含量をフローサイトメーターで測定した。約9割のカルスの核DNA含量がD.glandulosaとD.kaki cv.Jiroの核DNA含量の和であり、8倍体種間雑種カルスであると考えられた。カルスのRAPD分析を行ったところ、8倍体カルスはいずれもD.glandulosaとD.kaki cv.Jiroの双方に特異的バンドを有しており、種間雑種カルスであることが確認できた。また8倍体カルスのうち約17%のカルスは継代4回後に、染色体の偶発的倍加が起こり、16倍体になったことが明らかとなった。種間雑種カルスのうち16倍体1系統を含む約4割の系統から不定芽分化が認められた。得られたシュートのRAPD分析及びPCR-RFLPクロロプラストDNA分析から、種間雑種シュートは両親の核ゲノムを持っているが、葉緑体ゲノムはD.glandulosa由来のゲノムしか持たず、葉緑体ゲノムの選択的排除が起こった可能性が示唆された。。またフローサイトメーター分析によりシュートの倍数性は維持されていることが確認できた。16倍体シュートからの発根は認められなかったものの、8倍体シュートからは正常に発根し、その染色体数は両親の和である2n=120であることが明らかとなった。以上の研究より、プロトプラスト融合によりカキにおいて初の種間雑種が作出され、またこれまで存在しなかった倍数性のカキが得られた。。
マトリクク中に孤立した生体高分子単一分子鎖の伝導特性評価

本研究では量子ビームの誘起する物理化学反応とそのダイナミクスを応用し、孤立したナノ構造体の電子伝導特性を評価する技術の開発を行った。時間分解分光法(TAS法)と時間分解マイクロ波吸収伝導度測定法(TRMC法)の複合利用による伝導特性評価法は、従来ほとんどのナノ構造体の直接観察・評価法として用いられてきた、電子・プローブ顕微鏡とその拡張技術とは完全に異なる物性(特にキャリア移動度)評価法であり、従来の手法で常に問題となってきた固体内・界面相互作用等の影響を解決する強力な手法となる。かかる見地から、本研究では凝縮相中に孤立して存在するナノ構造体の過渡状態、特にその伝導特性を反映する1複数電子酸化或いは還元状態を、光・放射線化学反応を応用して創り出し、高速過渡分光法と時間分解マイクロ波吸収伝導度測定法を用いた、生成過渡種の電気伝導度評価の2手法を組み合わせることにより、σ・π共役高分子及びカーボンナノチューブ・DNA複合体などの電子・正孔伝導特性の評価を行った。これら高分子・ナノ構造材料の構造体内電荷移動特性は、バルク固体内のそれに比較し1010^3程度高い値を示し、これら材料の電荷輸送材料としての高いポテンシャルが示された。特に様々な共役高分子材料系において、TRMC法を用いて単一分子鎖の伝導特性評価を行った場合と、それぞれのバルク移動特性を評価した場合の比較において、ポリシラン・ポリフルオレンなど特定の材料系において特に高いポテンシャルを有する可能性が示唆された。
大腸菌の全プロテァ-ゼの構造の機能

大腸菌には30種以上のプロテア-ゼが存在するが、その中で必須であるのはわずか3種類である。これは、プロテア-ゼが相互にその複雑な作用を補あっていることを示している。一細胞におけるプロテア-ゼの相互的な役割を明らかにすることを目的とし、存在する全てのプロテア-ゼ遺伝子をクロ-ニングして一次構造を決定すること、および、その欠失変異株を得ることを試みている。本研究は地道な積み重ねが必要であり、1年間で具体的な成果を挙げることはできない。計画に述べた具体的な作業がどの程度進行しているかを報告する。(1)既知プロテア-ゼ遺伝子のクロ-ニングと一次構造の解析ーこれまで既知プロテア-ゼの5クロ-ンを取得した。その中でapeAについてはじめて全DNA構造を明らかにした。(2)未知プロテア-ゼの検索ー500株のSDS感受性形質伝換株からなるバンクを作製した。バンク株の活性を種々の基質を用いて測定しているが現在のところ新してプロテア-ゼは見いだされていない。(3)欠失変異株の作製ークロ-ニングできた5種のうち、細胞表層に存在する4種のプロテア-ゼについてその欠失変異株を作製した。いずれも単独では生育になんら影響を与えなかった。4種中3種までの同時欠失変異も生育になんら影響を与えなかった。現在4種の組合せ変異株の作製を試みている。本研究過程において、上記(2)のバンク中SDS感受性の顕緒なクロ-ンについては、機能を明らかにする目的で検討を行った。その結果、94.3minの<kil>___ー(溶菌リポタンパク質)および、35.0minの<aceP>___ー(acetete permease)を新しく同定し、それらのDNA一次構造等を明かにした。
腰椎分離症の発生メカニズムの解明

研究期間中,主に以下の3点について新たな知見が得られた。(1)小学生以下の低年齢でみられる腰椎分離症は第5腰椎にすでに終末期として見つかる場合が多く,必ずしもスポーツ活動などと関連せず無症候性に発生することもあり,また潜在性二分脊椎と合併していることが多く,このような症例においては遺伝的要因が示唆された。(2)腰椎分離症の好発部位である第5腰椎周辺の後方要素の血管分布は主に4つのパターンに分かれており,これまでの教科書的なパターンは約半数にしかみられないことが判明した。(3)これらのうちの1つの血管分布のパターンが腰椎分離症と関連していることが明らかとなった。最尾側腰椎である第5腰椎(以下L5)周辺は腰椎分離症や,変性疾患(椎間板,椎間関節)の好発部位でもある。我々はL5が解剖学的に他の椎体と異なる点として,周辺血管,特に後方要素の血管分布に注目し,これを詳細に評価した。当院で大腸癌術前検査のため腹部骨盤造影CT検査を受けた300名の患者を対象として,multi-detector CTを用いてL5周辺の血管を観察した。分節動脈はL1からL4までの90%以上の症例にみられた一方,L5では10%未満(右側5.0%,左側8.3%)しかみられなかった。またL5後方成分への骨外血管供給に関して,頭側(上関節突起周辺部)にはL4分節動脈由来が90%以上であったが,尾側(下関節突起周辺部)には腸腰動脈由来が60%前後(右側63.0%,左側57.3%)であり,全体的にこれまでの教科書通りの血管支配がみられたものは約60%のみであり,L5周辺の血管支配についてはvariationに富んでいることが判明した。よって,L5の血管支配は他高位と相違点が多く,これらが疾患発症への影響を与えている可能性があると考えられる。現時点における300例での検討においては,14例(4.7%)でL5分離症がみられたが,現在のところ上記血管支配について有意な差はみられていない。腰椎分離症の一般成人における頻度は6%と言われており,現時点ではやや少ない頻度での検討になっているので,さらに症例数を増やして検討していく予定である。腰椎分離症(分離症)は疲労骨折の一つと考えられているが,その発生機序については謎が多い。本研究では,1最尾側腰椎である第5腰椎(以下L5)周辺は分離症や,変性疾患(椎間板,椎間関節)の好発部位でもあり,L5が解剖学的に他の椎体と異なる点として,周辺血管,特に腰椎後方要素の血管分布に注目し,これを詳細に評価した。続いて,2分離症と腰仙椎移行部のこれらの血管分布の違いからみた関連性について検討した。研究1に関しては,323名(男性203名,女性120名),平均年齢66.5歳(1589歳)を対象とした結果,L5椎弓への血管分布のcombinationは主に4つのパターンに分かれ,教科書的な第4腰動脈と腸腰動脈の組み合わせは約半数(52%)しかみられなかった。研究2に関しては,上記対象群のうちL5分離症を認めた14例を対象とした結果,(1) L5分離症例14例において,第5腰動脈は全症例で後方要素まで観察できなかった。(2) L5後方要素への血管分布は第4腰動脈+腸腰動脈(右7例,左6例),第4腰動脈からの分布のみ(右3例,左7例),その他(右4例)であった。(3)左側のL5分離症例で第4腰動脈のみしか後方要素への分布がみられなかったpatternが,他と比較し有意に(p = 0.018, χ二乗検定)多かった。上記の結果から,やはり発育期における骨形成と何らかの関わりがあると考え,低年齢(小学生以下)発症の分離症症例のみを対象とした解析を追加した結果,低年齢発症の分離症は有意に男児に多く,潜在性二分脊椎の合併が多くみられた(90%以上)ことを報告した。脊椎外科申請した内容の平成25年度分はほぼ終了しており,現時点ではおおむね順調に進展しているといえる。300例の検討では分離症の頻度が4.7%とこれまでの報告(日本成人においては約6%)と比較してやや低く,もう少し母集団のn数を増やして検討したい。また,平成26年度以降に予定していた動物を用いた検討「動物を用いた脊椎栄養血管とparsの骨癒合への影響の検討」を推進する。

平成25年度予定であった動物実験が平成26年度より開始することになったため,平成25年度に購入予定であった動物を購入しなかったため。追加解析,動物実験における動物購入に使用予定である。また学会発表・論文など誌面での発表予定である
可視光線重合特性に優れた新規モノマ-の合成と歯科領域への応用に関する研究

光重合は印刷、エレクトロニクス、歯科医療など広範な分野に応用されているが特に耐水性が要求される分野以外はアクリレ-ト系モノマ-が利用されており吸湿性、機械的強度に問題が残されている。この問題を解決する目的で新規な光重合用モノマ-として一分子中にアクリル基とメタクリル基を有するトリエチレングリコ-ルアクリレ-ト・メタクリレ-ト(TEGAMA)を合成し、可視光線による光重合性や、架橋体の機械的性質を対応するジメタクリレ-ト体(TEGDMA)、ジアクリレ-ト体(TEGDA)と比較検討した。0.5Wt%のCQとN,Nージメチル安息香酸エチルを光開始剤として添加し可視光線を照射して光重合した。照射時間よる残存モノマ-量と側鎖の未反応二重結合率の測定から、照射時間の延長によりTEGAMA重合率がTEGDMAより高くなることがわかった。また、TEGAMAの重合機構はメタクリレ-ト基同士がある程度優先して重合し側鎖に残存するアクリレ-ト基に反応性があるため架橋が進行するものと推察した。架橋体の吸水率、乾燥及び吸水状態の圧縮強度を評価したところTEGAMAレジンの吸水率、乾燥時の強度はTEGDMAレジンと同程度であり、また吸水による強度低下率もTEGDAレジンに比べ少ないことがわかった。以上から、アクリレ-ト・メタクリレ-トは光照射の延長によりジメタクリレ-トの重合率と光硬化されたアクリレ-トポリマ-の吸水性、強度を改善できるモノマ-であると結論した。可視光線により効率よく重合を開始する系の探索を目的として、重合開始剤系の選定及びモノマ-の合成を行った。可視光線重合開始剤系として、光増感剤であるカンファ-キノン(CQ)と組み合わせる芳香族置換三級アミンの構造について、電子スペクトルの変化より検討した。三級アミンの芳香環の置換基がカルボキシル基、アルデヒド基及びカルボン酸エステルであるような電子受容性基の場合、CQとの間に暗状態で電荷移動型錯体の形成が示唆された。一方、無置換及び電子供与性のメチル基で置換された芳香環を有する三級アミンを用いた場合には、光照射状態での電子移動が主として生起することを見出した。この可視光線重合開始剤系を用いてトリエチレングリコ-ルジメタクリレ-ト(TEGDMA)の光重合特性を示査走査熱量計により重合熱を測定することにより評価した。その結果、CQとN,Nージメチルアミノ安息香酸もしくはそのエチルエステルとの組み合わせが最も重合開始効率の良いことを見出した。さらにCQと三級アミンのモル比が等しい場合、重合率が高くなることが認められ、これよりCQと三級アミンの錯形成はほぼ1:1であると考えられる。また、良好な光重合特性と機械的強度の架橋重合体を形成する新規モノマ-として、一分子中にアクリル基とメタクリル基の両方を有するアクリレ-ト・メタクリレ-トを合成した。トリエチレングリコ-ルに順次メタクリル酸クロリド、アクリル酸クロリドを塩酸捕捉剤の存在下で反応させることにより高収率でモノマ-(TEGAMA)を得る条件を見出した。TEGAMAの光重合特性をTEGDMAと比較すると、開始剤系を選定することにより重合速度及び重合率が向上することが認められた。また重合架橋物の機械的強度においてもTEGDMAに匹敵する値が得られた。これにより、TEGAMAが可視光線重合モノマ-として優れた特性を有すると結論した。

この問題を解決する目的で新規な光重合用モノマ-として一分子中にアクリル基とメタクリル基を有するトリエチレングリコ-ルアクリレ-ト・メタクリレ-ト(TEGAMA)を合成し、可視光線による光重合性や、架橋体の機械的性質を対応するジメタクリレ-ト体(TEGDMA)、ジアクリレ-ト体(TEGDA)と比較検討した。0.5Wt%のCQとN,Nージメチル安息香酸エチルを光開始剤として添加し可視光線を照射して光重合した。照射時間よる残存モノマ-量と側鎖の未反応二重結合率の測定から、照射時間の延長によりTEGAMAの重合率がTEGDMAより高くなることがわかった。また、TEGAMAの重合機構はメタクリレ-ト基同士がある程度優先して重合し、側鎖に残存するアクリレ-ト基に反応性があるため架橋が進行するものと推察した。架橋体の吸水率、乾燥及び吸水状態の圧縮強度を評価したところTEGAMAレジンの吸水率、乾燥時の強度はTEGDMAレジンと同程度であり、また吸水による強度低下率もTEGDAレジンに比べ少ないことがわかった。以上から、アクリレ-ト・メタクリレ-トは光照射の延長によりジメタクリレ-トの重合率と、光硬化されたアクリレ-トポリマ-の吸水性、強度を改善できるモノマ-であると結論した。
数学科協働的学習におけるヘルプ・シーキングの研究

本研究は,これまで日本の数学教育の現場では積極的な価値があまり認められていなかった援助要請について見直しを行い,特に,中学校数学におけるこれからの協働的学習においてどのようにして生徒たちからの能動的な援助要請を促進したらよいかを,教育現場のデータの分析を通して探究するものである.本研究は,これまで日本の数学教育の現場では積極的な価値があまり認められていなかった援助要請について見直しを行い,特に,中学校数学におけるこれからの協働的学習においてどのようにして生徒たちからの能動的な援助要請を促進したらよいかを,教育現場のデータの分析を通して探究するものである.
早期産児におけるグルココルチコイドレセプター遺伝子メチル化の解析

NICUに入院した新生児(早産・低出生体重児)において、グルココルチコイドレセプターという物質の遺伝子が出生後4日間にメチル化という修飾を受けることが判明した。これはその遺伝子の発現が抑制されることを意味しており、グルココルチコイドすなわちステロイドの効果が出にくくなることになる。これは虐待を受けた子のDNAにみられる変化と同じで、将来的な認知能力との関連も示唆されている。今回の研究で解析した症例においてはこの遺伝子変化と入院中のステロイド使用との間に関連がみられており、ステロイド抵抗性との関連が証明された。昨年度達成した分を検証したところ、一部分のデータに不明瞭な部分がみつかった。DNAの精製法を途中から変更したところ解析精度が上昇したのだが、古い精製法を用いた結果と新しい精製法を用いた結果に相違がみられた。そこですべての検体ではじめから新しい方法で精製したサンプルを用いて同一方法で同時に再解析を行った。その結果は驚くべきことに正常新生児では4日間でDNAメチル化に変化はなく、早産児においてのみ多くの領域でメチル化の増加がみられた。その結果、生後4日の時点で早産児は正期産児に比べてグルココルチコイドレセプター遺伝子プロモーターが高いメチル化を示していた。この結果をうけて、さまざまな周産期因子との関連を解析した。4日間のメチル化の増加と有意な相関を示したものとして、アプガースコア、在胎週数、NICU入院、子宮内発育遅延があげられた。一方、今回われわれが解析しているグルココルチコイドレセプター遺伝子は末梢血におけるもので、その高メチル化はグルココルチコイドレセプターの細胞表面の発現をおさえることによるグルココルチコイド抵抗性を意味すると考え、早産児に好発する相対的副腎機能不全による病態である慢性肺疾患、晩期循環不全の発症との関連を解析した。その結果、4日間で有意なメチル化の上昇を示し、さらに生後4日の時点で正期産児に比べて早期産児で有意に高いメチル化を示していた4か所の部位の生後4日目の時点のメチル化率を用いてその後の慢性肺疾患、晩期循環不全の発症を予測することができた。以上のことから早産児においては出生後4日間の環境によりグルココルチコイドレセプター遺伝子に変化をきたし、新生児期の合併症、特に相対的副腎不全によるものの発症に関与しているものと思われた。初年度はなるべく多くの症例で解析を行い、方法論の確立と大まかな傾向をつかむことを目標とした。正常新生児30例、早産児30例、発達遅滞児10例、正常小児10例での解析を行うことができた。方法論はおおむね確立することができ、早産児では正常新生児に比べて出生時にGR遺伝子プロモーターのかなり広い領域で高いメチル化を示していることが判明した。そして出生後4日間でメチル化はかなり変化することも判明した。一方、早産で出生したのち6歳で発達遅滞を呈している3名で(ADHD1名、アスペルガー障害1名、低IQ1名)同年齢のコントロール群に対して著明に高いGR遺伝子メチル化が観察された。そしてそのメチル化のパターン(GR遺伝子プロモーターには38箇所のCpGサイトがあり、個々の部位のメチル化率を個別に算出しており、そこにみられる高メチル化部位のパターンがみられる)が出生時の早産児におけるそれと一致していた。以上の所見から考えられることは、早産児は早産に至る過程ですでに多大なストレスにさらされることでGR遺伝子プロモーターに変化をきたしている。そして出生後の環境によりある程度修正される。ところが修正されないものや新たに出生後環境により修飾される部分もあり将来的な発達遅滞の原因となることがある。来年度はこの結果をふまえて早産児における解析を増やし、周産期因子の関連をしらべるとともに、末梢血GR遺伝子メチル化に伴う末梢のグルココルチコイド抵抗性の結果として考えられる炎症の遷延をサイトカインの測定をとおして解析していく。1、24年度の目標としたGR遺伝子メチル化解析方法の確立であるが、試行錯誤の末に簡便で効率的な方法を開発することができた。適切なプライマーを設計し、さらにPCR反応を2回行うことが重要であった。さらに増幅したDNA断片を電気泳動後に染色する方法が従来の臭化エチジウムではなくステインブルーという色素を用いる方法を用いることでダイレクトシークエンスの精度、再現性が飛躍的に向上した。ここまでで1年半が必要であった。2、25年度の目標は早期産児におけるGR遺伝子メチル化の変化を検出することで、正期産児と早産児それぞれにおいて出生直後と生後4日にGR遺伝子メチル化を測定した。正期産児では4日間で全く変化はみられなかったが、早産児では33CpGサイト中12サイトで有意にメチル化の上昇が観察された。わずか4日間で明らかな変化が認められたことは予想以上で、入院期間中はさらに変化が強くなることは想像に難くない。