hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜タンパク質の動態解析のための次世代固体ＮＭＲ測定技術の開発

本研究の目的は、固体NMRによるタンパク質動態解析に高速測定技術を導入し、膜タンパク質等の高難易度試料を実用的に解析可能な手法を開発することであった。動態解析において重要であるタンパク質立体構造について、平成26年度の研究により、常磁性緩和促進による構造情報と立体構造予測手法を組み合わせることで、従来法より少ない情報から効率的に決定できる手法を開発した。平成27年度では、構造計算に使用した構造制限が妥当性であることを、数値解析により示した。また、高速多次元スペクトル測定技術である圧縮センシングを、七回膜貫通型タンパク質であり、光遺伝学への応用が期待されているナトリウムイオンポンプ型ロドプシンの測定に適用した。その結果、3次元CANCO測定のサンプリング点を10分の1まで圧縮した場合においても、スペクトルの特徴を保持したまま再構成可能であることを明らかにした。平成26年度に行なった、常磁性緩和促進の応用による測定時間短縮の結果も踏まえると、トータルで測定時間を16分の1まで短縮することに成功した。また、これらの技術は動態解析の基盤であるため、大きな意義があると考えている。動態解析については、本研究開始と同時に納入された固体NMR装置の安定稼動まで時間を要したため、十分な成果は得られていない。しかし、上述の通り解析技術の基礎は構築できており、近いうちに動態解析についても進展を遂げられるだろう、と考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。・常磁性緩和促進を用いた固体NMR測定感度の改善固体NMR法は膜タンパク質等の不溶性分子の動態を解析できる強力な手法であるが、原理的に感度が低く、動態を解析する際の大きな障害となっている。NMRにおいて測定の律速となっているのは励起状態からの緩和過程(縦緩和過程)である。よって、これを短縮することができれば、積算効率が向上し、感度が改善される。常磁性体存在下において、緩和時間が短縮される常磁性緩和促進という現象が知られている。そこで、これを用いた感度改善を試みた。常磁性を示すCu2+イオンをEDTAにキレートさせたCuEDTAを調製し、DMPC, DMPA混合脂質リポソームに再構成した膜タンパク質halorhodopsinと混合した。CuEDTAを5 mM添加することで、縦緩和時間が56 %に短縮された。つまり、感度を30%向上させることに成功した。・常磁性体を用いた立体構造情報の収集タンパク質の立体構造情報は、その動態を解析する上で重要な情報である。特に遠位の情報は、二次構造間やドメイン間、モノマー間等の相互作用を反映するため特に重要である。固体NMRによって遠位の情報を収集することは可能であるが、感度等が問題となり難しい場合が多い。溶液NMRにおいて常磁性体と核の相互作用を用いることで、遠位の情報を簡便に収集する手法は確立されている。しかし、固体NMRでは応用例が少なく、最適な実験方法や情報の取り扱い方について、検討すべき事項が多く残されている。そこで常磁性を示すMn2+を用いたを立体構造情報収集について研究をおこなった。EDTAタグを用いてモデルタンパク質GB1のシングルシステイン変異体にMn2+を結合させ、固体NMRスペクトルを測定した。信号強度とMn2+-核間距離に相関が見られた。さらにこの情報を用いた立体構造計算手法についても確立することができた。本研究課題の目標は、固体NMR法の高感度化と、それを基盤とする膜タンパク質動態解析手法の確立である。現在主流の構造・動態解析手法である結晶構造解析や溶液NMR法と比べ、固体NMR法の感度は低く、実用的な解析のためには高感度化が必須である。当初の計画通り、常磁性体による緩和促進効果を用いることで、膜タンパク質試料の測定感度を改善することに成功した。加えて、タンパク質の動態と密接な関係がある立体構造に関して、常磁性体を用いた情報収集と、それを基にした立体構造計算手法を確立した。

立体構造情報についても、固体NMRが低感度であることや、その信号が縮退しやすいことにより、その収集は難しいとされている。確立した手法により、この問題は軽減されると考えられる。こちらは当初の予定には含まれていないが、常磁性体の応用として非常に重要であると考え研究を実施し、良い成果が得らえた。以上を踏まえて、当初の計画以上に進展している、と判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。感度改善について目処が立ったため、これを活かした動態解析手法の確立を目指す。具体的には、短時間での測定が必要な重水素交換実験を、NMRの高速データサンプリング法を適用して行う。この方策は一般に感度の低下を招くが、これまでの研究によって実現された感度改善により、その欠点を補うことが可能であると考えられる。光駆動型のアニオンポンプ型膜タンパク質であるhalorhodopsinをモデルに重水素交換実験をおこない、光反応に伴う構造変化を追跡する。これにより、手法の確立のみならず、未だに詳細が不明瞭なhalorhodopsinのアニオン輸送メカニズムの解明も目指す。
数論的ゼータ関数間の独立性について

本年度は研究実施計画に掲げた5つの目標のうち、目標5“多重Steuding予想の算術パラメーター化"について2つの結果が得られた。との間に、半平面Rs>1における値分布の独立性が成立することを証明した。2018年4月、Yoonbok Lee氏(韓国、Incheon大)との共同研究において、この結果の多次元化に成功した。即ち、有理数体Q上独立な任意個数の代数的無理数α_jに付随するHurwitzzeta関数とζ(s)との間に同様の稠密性が成立することを証明した。この結果を2018年9月にリトアニアで開催された研究集会において報告し、さらに論文を雑誌Journal of the Mathematical Society of Japanに投稿している。次に2つ目の結果を紹介する。2006年に私と名越弘文氏(群馬大)は、実指標に付随するDirichlet L関数が指標の変動に伴う普遍性を有すること、即ち、任意の正則関数は適当な実指標に付随するDirhclet L関数で一様近似できることを証明した。今年度、我々はこの結果を複数個のL関数に対し拡張することに成功した。その応用として、2次体の類数の分布について、これまでに確認されていない独立性を得ることに成功した。この結果についての論文は雑誌Mathematishe Zeitschriftに投稿中である。本年度は研究実施計画に掲げた5つの目標のうち,目標1“Riemann zeta関数ζ(s)の零点虚部をパラメーターとしたときの同時普遍性"と目標5“多重Steuding予想の算術パラメーター化"に関する研究に進展が見られた。まず目標1に関わる実績について報告する.Riemann予想を仮定したとき,ζ(s)の複素零点は1/2+iγという形で表される.報告者は2005年に零点虚部γをパラメーターとしてRiemann zeta関数の普遍性が成立すること,すなわち与えられた正則関数f(s)に対し適切なγを選べば,f(s)はζ(s+iγ)により一様近似できるという結果を得ている.報告者は本年度,同様の性質が複数のDirichlet L関数に対して同時に成立することを証明し,この結果を平成28年9月にリトアニアで開催された研究集会で報告した.さらにHurwitz zeta関数も同様の性質を示すことを証明し,この結果を平成28年10月に京都大学数理解析研究所で開催された研究集会で報告した.次に目標2についての実績を報告する.1980年代,Gonek, BagchiらによりDirichlet指標χをパラメーターとしてDirichlet L関数L(s,χ)が普遍性を示すことを証明した.私と名越弘文氏(群馬大)はこの性質が複数のDirichlet L関数に対し同時に成立することを証明している.本年度,この結果についての論文が雑誌Monatshefte fur Mathematikに掲載された.研究実施計画では掲げた本年度の目標を2つ掲げている.研究実績の概要で述べたように,目標1についてはかなりの進展が見られたが,その一方で目標2“異なるゼータ関数の零点虚部をパラメーターとしたときのζ(s)の挙動の比較"についてはほぼ手付かずのままである.平成29年度に手をつける予定であった目標を先取りしたとはいえ,全体としてみると,研究計画の遂行はやや遅れていると言わざるを得ない.本年度は研究実施計画に掲げた5つの目標のうち、目標1“Riemann zeta関数ζ(s)の零点虚部をパラメーターとしたときの同時普遍性"、目標3“ゼータ関数の零点におけるEuler-Zagier和の値分布目標"、5“多重Steuding予想の算術パラメーター化"に関する研究に進展が見られた。まず目標13に関わる実績について報告する。Riemann予想を仮定したとき、ζ(s)の複素零点は1/2+iγという形で表される。報告者は2005年に零点虚部γをパラメーターとしてRiemann zeta関数の普遍性が成立すること、すなわち与えられた正則関数f(s)に対し適切なγを選べば、f(s)はζ(s+iγ)により一様近似できるという結果を得ている。報告者は本年度、δを2以下の正定数としたとき、同様の性質がζ(s+iδγ)に対しても成立することを証明した。更にその応用として以前から予想していたEuler-Zagier型2重ゼータ関数の値分布の稠密性を証明することに成功した。この結果を平成29年8月に名古屋大学で開催された研究集会で報告した。次に目標5についての実績を報告する。報告者は2014年に2つの保型L関数のペアの垂直方向への平行移動により任意の正則関数のペアが一様近似できるという同時普遍性定理を得ている。私と名越弘文氏(群馬大)はこの性質がより一般的なSelberg類に属するゼータ関数のペアに対しても成り立つことを証明している。本年度,この結果についての論文が雑誌Acta Mathmatica Hungaricaに掲載された。実績の概要で記述したように、目標13については研究手法に大きな進展を得ることができた。関連する結果について本手法を適用することで多くの改良が得られると期待している。また今年3月より、Yoonbok Lee氏(韓国、POSTECH)との共同研究を開始した。複数のHurwitzゼータ関数の値分布という目標5に関連する題目を扱っている。既に論文1本を執筆中であり、今年度中に更なる結果を得ることが期待される。

一方で、残りの目標24については遅れがちな状況である。単独での研究はこれらのテーマに集中したい。本年度は研究実施計画に掲げた5つの目標のうち、目標5“多重Steuding予想の算術パラメーター化"について2つの結果が得られた。との間に、半平面Rs>1における値分布の独立性が成立することを証明した。2018年4月、Yoonbok Lee氏(韓国、Incheon大)との共同研究において、この結果の多次元化に成功した。即ち、有理数体Q上独立な任意個数の代数的無理数α_jに付随するHurwitzzeta関数とζ(s)との間に同様の稠密性が成立することを証明した。この結果を2018年9月にリトアニアで開催された研究集会において報告し、さらに論文を雑誌Journal of the Mathematical Society of Japanに投稿している。次に2つ目の結果を紹介する。2006年に私と名越弘文氏(群馬大)は、実指標に付随するDirichlet L関数が指標の変動に伴う普遍性を有すること、即ち、任意の正則関数は適当な実指標に付随するDirhclet L関数で一様近似できることを証明した。今年度、我々はこの結果を複数個のL関数に対し拡張することに成功した。その応用として、2次体の類数の分布について、これまでに確認されていない独立性を得ることに成功した。この結果についての論文は雑誌Mathematishe Zeitschriftに投稿中である。まずは上述した目標2と目標3“ゼータ関数の零点におけるEuler-Zagier和の値分布"に取り組み,本年度後半からは目標4“保型L関数のフーリエ係数の符号が示す独立性の解明"に取り組む予定である.目標5についてはY. Lee氏との共同研究を中心に考えている。単身での研究については、今年度前半は目標2に後半は目標4に集中する所存である。平成28年夏に松本耕二教授(名古屋大学)還暦記念研究集会を平成29年8月に実施することが決まり,私は運営委員の一員となりました.科研費の使用期限である平成29年2月の時点では海外ゲストの枠がまだ確定しておらず,研究集会実施予算の不足という万が一に備えて次年度使用額を生じさせた次第です.(理由)平成30年10月に京都大学数理解析研究所(以下RIMS)で開催される研究集会“解析的整数論とその周辺"の代表者を務めることが決まっております。講演募集期間は5月から7月末までですが、十分な講演者数に達しなかった場合、海外講演者を募る可能性があります。RIMSからの補助だけでは十分ではないため、不測の事態に備えて次年度使用額を生じさせた次第です。(使用計画)研究集会の海外講演者のための費用として、40万円程度を想定しております。それ以外の用途は、9月にリトアニアで開催される研究集会への参加、一昨年購入予定であったレーザープリンタの購入を検討しています。現時点では研究集会の実施予算不足の可能性は非常に低いです.昨年度購入予定であったパソコンの購入と,9月にポーランドで開催される研究集会への参加を検討しています.
免疫担当細胞の膜チャネル特性へのレーザ光照射の影響

低出力レーザ光が及ぼす免疫担当細胞への影響は、ヒト単球を洗浄培養した後、低出力レーザ光(波長:594,780nm)をフィルタならびに照射時間を調節して照射を行い、各々の照射エネルギーに対する活性度を活性酸素発生量から評価した。その結果、可視光の波長域よりも長波長である780nmの近赤外光の方が活性作用が高いこと、また780nmでも58J/cm^2の範囲でピークを示すことが窺われ、それより高いエネルギーでは低下する傾向が見られた。これらのことから、マクロファージの前駆細胞である単球の活性度は低出力レーザ光の波長やエネルギーに依存することが窺われた。一方、パッチクランプ法による細胞膜特性の検討では、単一チャネル法によってパイロットスタディとして赤血球を用いてレーザ光照射の影響を検討した。その結果、波長670nmの赤色レーザ光の照射では照射エネルギーが0100mJ/cm^2の範囲で印加電圧に対してほぼ比例して膜のイオン電流が変化した。また、負の印加電圧においては光照射によって若干膜電流の増加が窺われた。膜抵抗の変化は印加電圧の減少に伴って減少する傾向があり、さらにレーザ光照射によってそれは増加する傾向が見られた。波長594nmのオレンジ色のレーザ光照射の場合は全体として赤色レーザ光と同様に印加電圧にほぼ比例する傾向が見られたが、35105mJ/cm^2の照射エネルギーにおいて膜のイオン電流値の正負が反転する現象が見られ、さらに照射エネルギーを増加すると再び電流値は反転し元に戻る現象が見られた。この際、反転時の膜の抵抗値は正負いずれの印加電圧においても負の値を生じる結果が得られた。これらのことから、この範囲のエネルギーレベルにおいて細胞膜の脱分極も含めた何らかの作用が生じた結果によるものと考えられ、さらに膜の電気容量などの詳細な作用メカニズムの解析の必要性が示唆された。低出力レーザ光と臨床で注射薬として認可されている細胞賦活剤プラトニンとを併用した光免疫療法において、免疫担当細胞の1つであるマクロファージの活性はより高まり、担癌マウス腫瘍部の瘢痕化、封じ込めや、さらに腫瘍部が脱落する結果が得られ、治療の可能性が窺われた(研究発表参照)。また、この際低出力のレーザ光のみでもその活性化の傾向が見られたことから、低出力レーザ光が及ぼす免疫担当細胞の活性効果を検討し、そのメカニズムを明らかにすることの重要性が窺われた。そこで、今年度はまずマクロファージの活性作用についての検討を行った。実験は、マクロファージの前駆細胞である単球をヒト血液から分離採取して洗浄後、培地RPMI1640(0.1%血清含)で懸濁して、細胞数を10^5cells/wellとし45分間培養した。その後、低出力レーザ光(波長:594nm,780nm)をフィルタならびに照射時間を調節して照射を行い、各々の照射エネルギーに対する単球の活性度を活性酸素量を計測することによって評価した。その結果、可視光の波長域よりも長波長である780nmの近赤外光の方が活性作用が高いこと、また780nmでも510J/cm^2の範囲でピークを示すことが窺われ、それより高いエネルギーでは低下する傾向が見られた。したがって、次年度はこれらの波長やエネルギー範囲を中心にパッチクランプ法を用いてイオンチャンネルや膜電位などの膜特性を検討し、レーザ光が及ぼす免疫担当細胞のメカニズムの詳細を明らかにする計画である。

低出力レーザ光が及ぼす免疫担当細胞への影響は、ヒト単球を洗浄培養した後、低出力レーザ光(波長:594,780nm)をフィルタならびに照射時間を調節して照射を行い、各々の照射エネルギーに対する活性度を活性酸素発生量から評価した。その結果、可視光の波長域よりも長波長である780nmの近赤外光の方が活性作用が高いこと、また780nmでも58J/cm^2の範囲でピークを示すことが窺われ、それより高いエネルギーでは低下する傾向が見られた。これらのことから、マクロファージの前駆細胞である単球の活性度は低出力レーザ光の波長やエネルギーに依存することが窺われた。一方、パッチクランプ法による細胞膜特性の検討では、単一チャネル法によってパイロットスタディとして赤血球を用いてレーザ光照射の影響を検討した。その結果、波長670nmの赤色レーザ光の照射では照射エネルギーが0100mJ/cm^2の範囲で印加電圧に対してほぼ比例して膜のイオン電流が変化した。また、負の印加電圧においては光照射によって若干膜電流の増加が窺われた。膜抵抗の変化は印加電圧の減少に伴って減少する傾向があり、さらにレーザ光照射によってそれは増加する傾向が見られた。波長594nmのオレンジ色のレーザ光照射の場合は全体として赤色レーザ光と同様に印加電圧にほぼ比例する傾向が見られたが、35105mJ/cm^2の照射エネルギーにおいて膜のイオン電流値の正負が反転する現象が見られ、さらに照射エネルギーを増加すると再び電流値は反転し元に戻る現象が見られた。この際、反転時の膜の抵抗値は正負いずれの印加電圧においても負の値を生じる結果が得られた。これらのことから、この範囲のエネルギーレベルにおいて細胞膜の脱分極も含めた何らかの作用が生じた結果によるものと考えられ、さらに膜の電気容量などの詳細な作用メカニズムの解析の必要性が示唆された。
色素上皮由来因子受容体の機能性アプタマーによる抗動脈硬化作用

動脈硬化症の進展阻止が期待される蛋白質として色素上皮由来因子(Pigmentepithelium-derivedfactor以下PEDF)とその受容体に着目した。PEDF受容体を刺激しうるアゴニストとなりうるDNAアプタマーを作製し、血管障害保護作用について検討をおこなった。近年、生活習慣の欧米化に伴い、高血圧、高脂血症、糖尿病、肥満といった動脈硬化を促進させる疾患が年々増え続けている。動脈硬化を基盤とした疾患としては、心筋梗塞をはじめとした心血管イベントや脳血管障害などがある。治療方法としてはバルーンカテーテルによる経腔的血管形成術が一般的であるが、その後の再狭窄を伴う血管のリモデリングが問題となっており、効果的かつ臨床応用可能な新規治療法の開発が必要とされている。本研究は、色素上皮由来因子(PEDF)の受容体を刺激しうるアゴニストとして機能性アプタマーを作製し、血管のバルーン障害後に生じるリモデリングに対する保護的効果について検討する。さらにPEDF受容体機能性アプタマーの血管障害保護の分子メカニズムを明らかにするとともに、当該アプタマーの動脈硬化への治療応用の可能性を模索する。同定されたPEDF受容体のクローニング及び発現と受容体機能の評価をin vitroでおこなった。手法としては培養細胞のPEDF受容体をsiRNAを用いたknock-downをおこない、該当受容体のknock-downに伴うPEDFの作用の変化をreal-time PCR法、3H-thymidin取り込み法による増殖アッセイでおこなった。本年度は同定されたPEDF受容体のクローニング及び発現と受容体機能の評価をin vitroでおこなった。二つのPEDF受容体について、培養細胞における発現が確認されたので、受容体の発現をsiRNAによるknock-down効果を利用し、PEDF受容体の発現抑制に伴うPEDF作用の変化を解析している。まずはreal-time PCR法による各遺伝子発現の変化、3H-thymidine取り込み法によるアッセイをおこなっている。また、次年度に予定しているアプタマーの作製に必要な、受容体のクローニング、受容体蛋白質の発現精製もおこなっている。In vitroにおけるPEDF受容体の機能解析をさらに進めるとともに、得られたPEDF受容体蛋白質を用いて受容体に対するアプタマーの作製をおこなう。得られたアプタマーのスクリーニングにより、受容体に対する機能的アプタマーを選別し、in vitro, in vivoの系で血管障害保護効果を検討する。まずアプタマーの作製に必要なPCR法の酵素、消耗品及び受容体の固定化に要するカラム樹脂、試薬を購入する。アプタマーが得られた後に、アプタマーとPEDF受容体のBIACOREによる解析に必要なスライド、消耗品を購入する。選別したアプタマーはまずin vitroの培養細胞の系で効果を確認後、動物を用いた検討をおこなうので、順次必要とされる培養細胞の培養用培地、試薬、動物購入の費用として用いる。
Ctf4タンパク質がrDNA複製阻害に伴うDSB修復を促進する分子機構の解明

本研究では、複製装置の構成因子であるCtf4タンパク質が、複製阻害時のDNA二重鎖切断(DNA double-strand break, DSB)の削り込みを抑制し相同組換えを抑制することによって、DSBを正しく修復するために必要であることを明らかにした。さらに複製阻害時のDSBは、これまでG2/M期でのDSB修復に必要な相同組換え経路によって修復されると考えられてきた。しかし、複製阻害時のDSB修復には相同組換え因子は必要ではなかった。よって、複製阻害時のDSBは、これまで知られていない新規の経路によって修復されることを明らかにした。DNA複製装置の進行は様々な原因によって阻害され、DNA損傷の中で最も重篤であるDNA二重鎖切断(DSB)を引き起こす。DSBは正確に修復されなければ、ゲノム構造の再編成を誘導し多くの疾患の原因となる。しかし、複製阻害によって形成されるDSB修復機構はまだ十分に理解されていない。出芽酵母のrDNAは、rDNA配列が150コピー連なった反復構造をとっている。rDNAではDNA複製期にプログラムされた複製阻害が起こり、DSBが形成される。さらに、このDSBの修復に伴ってコピー数の変動が起こることが知られている。我々は先行研究において、出芽酵母の非必須遺伝子欠損株ライブラリー(約4,800変異体)を用いて、異常なrDNAコピー数変動が起こっている変異体を探索した。このスクリーニングの結果は本年度、Saka et al., Nucleic Acids Research 2016に論文投稿した。スクリーニングの結果、ctf4遺伝子欠損株ではrDNAコピー数が過剰増幅していることが明らかとなった。本研究では、Ctf4タンパク質がrDNAでの複製阻害に伴って形成されるDSB修復に関与するかを調べた。その結果ctf4遺伝子欠損株では、野生型よりも多くのDSBが形成されるだけでなく、DSB末端が削られたDSB修復中間体が蓄積していることが明らかとなった。これらの結果を報告するため、現在論文作成中である。計画していた実験をほぼ予定通りに行なうことができ、期待通りの結果を得られた。DNA複製装置の進行は様々な原因によって阻害され、DNA損傷の中でも最も重篤であるDNA二重鎖切断(DNA double-strand break, DSB)の形成に繋がる。DSBは、ゲノム構造の再編成を誘導し、癌や多くの疾患の原因となることから正確に修復されなければならない。しかし、複製阻害に伴って形成されるDSBの修復機構についてはまだ十分に理解されていなかった。本研究では、部位特異的な複製阻害及びDSBが高頻度で形成される出芽酵母のrDNAリピート領域を用いて複製時のDSB修復機構の解明を目指した。我々は先行研究において、複製装置の構成因子であるCtf4が欠損するとrDNAの異常な増幅が起こることを明らかにした(Saka et al., Nucleic Acids Research 2016)。さらに、申請者は先行研究においてCtf4タンパク質がrDNAの複製阻害点でのDSB修復に重要であることを示した。そこで、本研究では、Ctf4がDSB修復を促進する分子機構を解明することを目指した。その結果、ctf4変異体では野生型よりも多くのDSBが複製阻害点で形成されていた。さらに、相同組み換え反応の重要な中間体である削り込みを受けたDSB中間体が、野生型ではほとんど形成されていないのに対してctf4変異体では非常に高いレベルで形成されていた。よってCtf4タンパク質は、複製阻害時にDSBが形成されることを防ぎ、さらにDSBが削り込みを受けて相同組換えによって修復されることを抑制する重要な因子であることが明らかとなった。Ctf4タンパク質は複製装置において複製ヘリカーゼとDNA polymerase alphaとをつなぎ止める役割がしられていることから、複製阻害時に複製装置を安定的に維持することによりDSBおよびその削り込みを防いでいるというモデルを立てることができた。計画していた実験をほぼ予定通りに行うことができ、研究結果をまとめて論文投稿を行った。現在、査読コメントに対応すべく実験を遂行中である。DNA複製装置の進行が阻害されると、DNA二重鎖切断(DNA double-strand break, DSB)が生じる。DSBはゲノム再編成を誘導し、癌や多くの疾患の原因となることから正確に修復されなければならない。しかし、複製阻害時のDSB修復機構についてはまだ十分に理解されていない。出芽酵母のリボソームRNA遺伝子(rDNA)は、約150個のrDNA配列が連なった領域である。さらにこの領域では、複製阻害点において高頻度で複製阻害が起きDSBが生じることが知られていた。しかし、この修復機構については不明であった。そこで申請者は、rDNAをモデル領域とし複製阻害時のDSB修復機構を明らかにすることを目指した。先行研究において、複製装置の構成因子であるCtf4タンパク質が欠損するとrDNAの異常な増幅が起こることを明らかにした(Saka et al., Nucleic Acids Reserach 2016)。このrDNA過剰増幅は、DSB修復異常によって起こる可能性が考えられたためctf4変異体解析を行った。すると、ctf4変異体では、野生型では見られない異常なDNA分子が検出された。このDNA分子を同定したところ、これはDSB末端の片方の鎖が削られた分子であり、相同組換えによるDSB修復において形成される重要な中間体であることが判明した。

そしてこの分子が野生型ではほとんど形成されていなかったことから、Ctf4タンパク質は複製阻害時のDSBが削り込みを受けて相同組換えによって修復されることを抑制する役割があることを明らかにした。これらの研究成果を、論文としてまとめ発表した(Sasaki and Kobayashi, Molecular Cell 2017)。本研究では、複製装置の構成因子であるCtf4タンパク質が、複製阻害時のDNA二重鎖切断(DNA double-strand break, DSB)の削り込みを抑制し相同組換えを抑制することによって、DSBを正しく修復するために必要であることを明らかにした。さらに複製阻害時のDSBは、これまでG2/M期でのDSB修復に必要な相同組換え経路によって修復されると考えられてきた。しかし、複製阻害時のDSB修復には相同組換え因子は必要ではなかった。よって、複製阻害時のDSBは、これまで知られていない新規の経路によって修復されることを明らかにした。現在のところ、きわめて順調に研究が進行し、論文作成に取り組んでいる。今後は、Ctf4がどのような分子機構で正確なDSB修復を促進しているかを、複製因子及びDSB修復因子などのDNA結合量を野生型とctf4遺伝子欠損株で解析する予定である。本研究から、Ctf4タンパク質が複製阻害時にDSB形成を抑制しDSB修復を促進するモデルを提唱することができた。今後は、このモデルを検証するための実験を遂行し、Ctf4の作用機構の詳細を明らかにしたい。分子生物学平成27年度の計画予定として、2次元電気泳動の条件の検討が必要と考えたため電気泳動装置等を計上した。しかし、予想よりも速やかに最適条件を確立できたため未使用額が生じた。本研究結果をまとめて論文を作成し投稿した結果、査読コメントに対応する実験を行うために必要以上の時間を要しているため。Ctf4タンパク質がDSB修復を促進する分子機構を明らかにするため、複製因子及びDSB修復因子などのDNA結合量をクロマチン免疫沈降法で解析することとし、未使用額はその経費に充てることとしたい。また、論文投稿のため国際学会に参加することとし、そのためにも未使用額を当てることとしたい。査読コメントに対応するための実験に必要な試薬の購入に使用する予定である。
配位不飽和有機金属の物性と反応

配位不飽和有機金属錯体とくにクラスター錯体の構造、電子状態、反応性ならびに物性を明らかにすることを目的として研究を進め、錯体の配位不飽和性の配位子依存性、金属原子依存性ならびに酸化状態依存性とその機構を以下のように明らかにした。1.マンガンカルボニル複核錯体の光脱カルボニル反応により生ずる配位不飽和性マンガン複核錯体を単離し、X線回折法によりその構造を明らかにして、配位不飽和性が金属原子間結合の多重度増大をもたらしていることを示した。また、配位不飽波マンガングラスター錯体とピリジン、ホスフィン等の配位子との配位平衡を測定解析し、エンタレピー・エントロピー変化の大きさを評価した。2.新規白金複核錯体を合成し、その結晶構造を調べ、白金原子一次元鎖構造を見出した。この錯体が溶液内で自己会合平衡を示すことを見出し、この自己会合と結晶内白金原子一次元鎖形成の要因となる電子状態上の特徴を明らかにした。またこの錯体の酸化に伴って配位不飽和性が増大し、会合性が著しく増大することを見出した。3.ロジウム複核錯体類の一電子酸化物における金属原子間結合の電子配量が配位子に依存して変化することを見出し、その機構を解析した。4.新規コバルト・ロジウム混合三核錯体を合成し、その分子構造を明らかにするとともに、それらの電気化学的挙動を調らべ、可逆な一電子酸化・還元を見出し、その電子の金属原子依存性を解析した。5.金属表面の持つ配位不飽和性と解媒作用の関係を明らかにするため、ニッケル表面における水素分子の化学吸着の電子状態を求め、相互作用フロンティアー軌道理論にもとづいて化学吸着を電子論的に解析した。配位不飽和有機金属化合物とくにクラスター錯体の構造,電子状態,反応性ならびに物性を明らかにすることを目的として研究を進め,配位不飽和性の特質が以下に述べるように明からとなった.1.配位不飽和性複核マンガンカルボニル錯体を合成し,これと種々の配位子との結合・解離平衡を解析し,配位不飽和性の尺度の定量化を試みるとともに,安定な配位不飽和性錯体における金属・配位子間結合エンタルピーが通常の結合エンタルピーよりもやや小さいことを見出した.2.新規白金クラスター錯体を合成し,そのX線構造解析により,その結晶中において白金原子1次元鎖の形成されていることを見出した.また,この錯体は溶液中で会合オリゴマーを形成することを見出し,その会合エネルギーを測定した.この会合平衡ならびに結晶中の1次元鎖形成の駆動力が白金原子の配位不飽和性によりもたらされ,電子論的には5dー6p混成が重要であることが明らかになった.3.金属触媒表面における分子の活性化の機構を電子論的に明らかにすることを目的としてニッケルクラスター表面への水素分子の吸着と吸着に伴う電子構造の変化を分子軌道論によって取り扱かい,相互作用フロンテイアー軌道法にもとづいて解析し,吸着サイトに依存した活性化機構の差違を明らかにした.4.上述の本年度研究成果にもとづき,次年度においては,(1)配位不飽和性マンガンクラスター鎖体の反応性の配位子依存性,(2)配位不飽和性白金クラスター錯体の酸化と新規錯体の合成,(3)これらの研究の進展に必要なX線構造解析,ならびに(4)配位不飽和性クラスター錯体の電子構造と反応性の特質の電子論的立場からの解析について研究を進める計画である.配位不飽和有機金属とくにクラスター錯体の構造、電子状態、反応性ならびに物性を明らかにすることを目的として研究を進め、配位不飽和性の配位子依存性や金属原子依存性が以下の点で明らかとなった。

1.アルセニド架橋マンガンカルボニル複核錯体の光化学反応について調らべ、相応するホスフイド架橋錯体に比較して一次光化学反応生成物の反応性が著しく高いことを見出し、クラスター錯体の配位不飽和性が架橋配位子に依存して大きく変化することを見出した。2.2価白金複核錯体の一電子酸化に伴う配位不飽和性の変化について研究を進め、酸化により複核錯体が会合して四核錯体を形成すること、ならびにこの四核錯体はもとの中性複核錯体に比較して著しく高い配位不飽和性を示し、中性複核錯体と会合し、六核、八核の多核体を可逆的に形成することを見出した。3.一連の新規コバルト・ロジウム混合三核クラスター錯体を合成し、それらの分子構造を明らかにし、それらの電気化学的酸化還元挙動、ならびに一電子酸化物のESRを調らべ、ロジウム原子数の増大にともない錯体のイオン化ポテンシアルが大きくなること、またロジウム原子数に依存して最高被占軌道の入れ替りの起ることを見出した。4.2価ロジウム複核錯体の一電子酸化物におけるロジウム原子間結合の電子配置が、架橋配位子と軸配位子に依存して変化することを見出した。これが、ロジウムと架橋配位子とのパイ相互作用ならびにロジウムと軸配位子のシグマ形相互作用によることを明らかにした。以上、クラスター錯体の配位不飽和性が酸化(電子脱離)にともなって増大すること、酸化に際し脱離する電子の軌道が配位子と金属原子種に依存して入れ替ること、金属カルボニルグラスター錯体の配位不飽和性が架橋配位子に依存して変化することを明らかにした。
シロザケの環境収容力と個体群密度効果に関する生態学的研究

本研究では、生育環境とリンクした環境収容力の変化が動物の個体群動態、特に個体群密度効果に及ぼす影響を明らかにした。(1)北太平洋におけるプランクトン食サケ属魚類(ベニザケ、シロザケおよびカラフトマス)のバイオマスは気候変動とリンクして、1980年代以降著しく増加した。(2)北太平洋におけるカラフトマスの環境収容力を差分型ロジステック曲線とリッカー型再生産曲線から奇数年級群と偶数年級群に分けて算定し、気候変動指数である冬季アルーシャン低気圧の強さとの関係を求めた結果、両者には顕著な正の相関が観察され、長期的な気候変動に応じてサケ属魚類の環境収容力も変化することがわかった。(3)1950年級群以降の北海道系シロザケには個体群密度効果が観察される。北海道11河川に回帰したシロザケ雌4歳魚の平均体長と個体群サイズは顕著な負の相関を示し、個体群サイズと回帰親魚の平均成熟年齢との間には顕著な正の相関が観察された。これらのことは、北海道系シロザケは回帰量の増加に伴い、体サイズが小型化し、成熟年齢が高齢化していることを表している。なお、1997年以降回帰量は減少傾向を示しているが、それに伴って体サイズは再び増加傾向に転じている。(4)鱗分析からバック・カリキュレーションにより各年帯の成長量を推定すると、各年齢魚とも3歳時から回帰前年までの成長が以前に比べて減少していることがわかった。このことは北海道系シロザケがベーリング海に分布しているときに成長減少を起こしていることを表している。(5)石狩川へ回帰したシロザケ雌4歳魚の体サイズ(体長、体重)、肥満度および繁殖形質(生殖腺指数、卵数、卵サイズ)を1950年代と1980年代で比較したところ、体サイズは有意に小型化しているが、肥満度と繁殖形質には顕著な差が観察されなかった。すなわち、最近北海道系シロザケに観察されている個体群密度効果は個体レベルでの成長量の低下現象に止まっていると見なされる。(6)1990年代後半以降、北太平洋は新たなレジームシフトにより環境収容力は減少傾向に向かっているが、アラスカ湾におけるサケ属魚類の摂餌生態は1997年および1999年以降明らかに変化しつつある。すなわち、シロザケを除くサケ属魚類5種はそれまでイカ類(Berryteuthis anonychus)を卓越的に摂餌していたが、それが胃内容物から消失し、代わってオキアミ類や端脚類などの動物プランクトンが餌生物に卓越するようになった。また、シロザケはそれまでクラゲ類を卓越して摂餌していたが、他魚種と同様に動物プランクトンを摂餌するようになった。その結果、種間の餌ニッチ重複度は著しく高くなった。(7)安定同位対比分析から、サケ属魚類の栄養段階はシロザケ-カラフトマス、ベニザケ、ギンザケおよびスチールヘッドトラウトの順に位置づけられた。(8)これらの結果は、1999年のNPAFC国際シンポジウムおよび2000年のPICES会議などの国内外の学会・シンポジウムにおいて発表し、高い評価を得た。

すなわち、シロザケを除くサケ属魚類5種はそれまでイカ類(Berryteuthis anonychus)を卓越的に摂餌していたが、それが胃内容物から消失し、代わってオキアミ類や端脚類などの動物プランクトンが餌生物に卓越するようになった。また、シロザケはそれまでクラゲ類を卓越して摂餌していたが、他魚種と同様に動物プランクトンを摂餌するようになった。その結果、種間の餌ニッチ重複度は著しく高くなった。(7)安定同位対比分析から、サケ属魚類の栄養段階はシロザケ-カラフトマス、ベニザケ、ギンザケおよびスチールヘッドトラウトの順に位置づけられた。(8)これらの結果は、1999年のNPAFC国際シンポジウムおよび2000年のPICES会議などの国内外の学会・シンポジウムにおいて発表し、高い評価を得た。環境収容力の変化と動物の個体群動態、特にシロザケの個体群密度効果との関係を明らかにした。(1)リッカー型再生産曲線から求めた日本系シロザケ個体群の環境収容力とその生残率は1981年級群以降著しく増加し、1960-1970年代の12倍および3倍に達した。これらは、1976年レジームシフト以降の気候変動とリンクする冬季アルーシャン低気圧の勢力増大に起因することが明らかとなった。生残率の上昇は野生魚においても観察され、北太平洋におけるプランクトン食サケ属魚類(ベニザケ-シロザケ-カラフトマス)のバイオマスは1980年代以降著しく増加した。(2)その結果、個体群密度効果に基づく個体レベルでの成長減少が生じ、回帰親魚の小型化・高齢化が観察されるようになった。具体的には、北海道系シロザケ4歳雌親魚の尾叉長は1970年代以前(70cm以上)に比べて1980年代以降(65cm以上)では5cm以上も減少し、個体群サイズとの間には負の相関が観察された。また、同一年級群の平均成熟年齢と個体群サイズとの間には顕著な正の相関が観察された。(3)安定同位体比分析による種間の栄養レベルから検討した結果、海洋生活期のサケ属魚類はネクトン食(ギンザケ-マスノスケ-スチールヘッドトラウト)の方がプランクトン食に比べて明らかに高い栄養ニッチを示すことが分かった。(4)エル・ニーニョ現象はアラスカ湾に生息するサケ属魚類の摂餌生態と成長に影響を及ぼすことも分かった。エル・ニーニョ現象の影響を受け高水温となった1997年のアラスカ湾のサケ属魚類では、例年卓越的に摂餌する栄養価の高いヒメドスイカが胃から消失した結果、摂取エネルギー量の減少により成長が著しく低下した。(5)これらの研究成果は、1999年9月日本水産学会秋季大会や同年11年アラスカ州ジュノーで開催されたサケ科魚類の生産変動に関するNPAFC国際シンポジウムにおいて発表し高い評価を得た。本研究では、生育環境とリンクした環境収容力の変化が動物の個体群動態、特に個体群密度効果に及ぼす影響を明らかにした。(1)北太平洋におけるカラフトマスの環境収容力を差分型ロジステック曲線とリッカー型再生産曲線から奇数年級群と偶数年級群に分けて算定し、気候変動指数である冬季アルーシャン低気圧の強さとの関係を求めた結果、両者には顕著な正の相関が観察され、長期的な気候変動に応じてサケ属魚類の環境収容力も変化することがわかった。(2)1950年級群以降の北海道系シロザケには個体群密度効果が観察される。北海道11河川に回帰したシロザケ雌4歳魚の平均体長と個体群サイズは顕著な負の相関を示し、個体群サイズと回帰親魚の平均成熟年齢との間には顕著な正の相関が観察された。
持続感染培養系を用いたノロウイルスの変異機序の解明

マウスノロウイルス(MNV)持続感染細胞の培養上清中ウイルスRNAの総量は、死細胞数と高い相関関係を認めた。透過型電顕解析では二重膜小胞内にウイルス粒子を認め、抗MNV血清と細胞質小胞マーカーを用いた間接二重蛍光抗体法では、MNV抗原がRab7の分布とほぼ一致することが示された。以上の知見からMNV持続感染培養系の生活環は、RAW264.7細胞が死細胞から放出されたMNVをエンドサイトーシスにより取り込んでRab7陽性後期エンドソームに貯蔵する。細胞の多くはMNVが増殖することなく壊死するが、一部の細胞ではMNVが増殖してアポトーシスを引き起こし、新たなウイルスの供給源になると考えられる。マウスノロウイルス(MNV)2株について持続感染細胞の樹立を試みた。樹立された2種の細胞は、以下のように異なる性状を示した。MNV-1持続感染細胞(MNV-1CC細胞)は接着(二次元)増殖性を示し、その増殖能は未感染RAW264.7細胞の47%であった。また、培養上清中のウイルスRNA総量は播種直後に9.2E+6コピー、7日目に3.5E+8コピーであった。一方、MNV-S7持続感染細胞(MNV-S7CC細胞)は浮遊または接着(立体)増殖性を示し、その増殖能は未感染RAW264.7細胞の72%であった。また、培養上清中のウイルスRNA総量は播種直後に5.7E+8コピー、7日目に7.7E+10コピーであった。MNV-S7CC細胞について蛍光顕微鏡と透過電子顕微鏡にて観察を行った。抗MNV血清を用いた間接蛍光抗体法によるとほぼ全ての細胞がMNV抗原陽性で、抗原は細胞質内で顆粒状に分布していた。透過型電子顕微鏡で形態がしっかり保持されている細胞を観察すると、感染細胞では認められなかった電子密度の高い集塊を認めた。その集塊部分を拡大して観察すると、20 nm強のウイルス粒子と考えられる粒子の集合体が観察された。MNV-S7CC細胞の培養上清を試料としてネガティブ染色を行って観察すると、MNVと思われる丸い粒子(35.4±2.4 nm)を観察することができた。MNV-1CC細胞は細胞増殖が悪くウイルス産生量が少ないことから継代培養を一時中止しているが、MNV-S7CC細胞は26ヶ月、130継代に及んでいる。カリシウイルス科ウイルスの持続感染細胞樹立についての報告は確認できないため、本報告が世界初の事例になると思われる。マウスノロウイルス持続感染細胞の培養上清中ウイルス量を定量RT-PCR法によるウイルスRNA量で評価すると、培養時間とウイルスRNA量に高い相関(決定係数=0.95)が認められた。このウイルスRNA量は生細胞数(決定係数=0.67)よりも死細胞数と高い相関(決定係数=0.92)を示した。一生細胞当たりのウイルスRNA量は播種直後2.6E+4コピー、24時間後に最低の1.3E+4コピー、その後増加して144時間後に1.2E+5コピーに達した。培養時間と一生細胞当たりのウイルスRNA量には高い相関(決定係数=0.997)が認められた。電子顕微鏡解析において、初感染細胞ではウイルス増殖に伴って細胞質に膜様構造物が形成されるが、持続感染細胞では膜様構造物を認めずにウイルス粒子が細胞質内小胞に集積して存在していた。その顆粒の存在部位を特定するために細胞内小胞マーカーとウイルス抗原に対する二重蛍光抗体法を行った持続感染細胞の共焦点レーザー顕微鏡解析をおこなった。その結果、後期エンドソームであることが明らかになった。当初計画では遺伝子解析を中心に進める予定であったが、以下の理由で実施できなかった。代わりに研究協力者の行う電子顕微鏡解析を中心に据えて研究を進め、新たな知見が得られたので「やや遅れている」という評価とした。平成27年3月31日付で岩手医科大学を辞職し、4月1日付で国立感染症研究所に着任した。内定通知は2月20日付と1ヶ月で引っ越す必要があり、教員一名から成る講座であり後任が居なかったこと、遠距離の異動であったことから実験機器と試料の速やかな移動ができなかった。そして、すべての移設が完了したのは平成27年11月26日であった。一方、国立感染症研究所では前任者が実験を行っていなかったため、実験スペースの確保には任期付研究員が任期満了となる平成27年度末まで待つ必要があった。さらに、職務内容と職責が大きく変わってエフォートは当初計画の15%から5%へ減らさざるを得なかった。以上が当初計画通りに研究が進んでいない背景、理由である。我々が樹立したマウスノロウイルス(MNV)持続感染細胞は、MNVの急性感染に比べて生体における慢性感染に近いモデルと考えられる。そこで、MNVがRAW264.7細胞に持続感染する機序の解明を目的として性状解析を行った。MNV-S7持続感染細胞の培養上清中ウイルスRNAの総量は指数関数的に増加しており、生細胞数よりも死細胞数と高い相関関係を示した。ただし、培養上清中ウイルスRNA量から推定される感染価は実測に比べて9-100倍高い値であり、不完全干渉(DI)粒子の存在が示唆された。抗MNV血清を用いた間接蛍光抗体法ではウイルス抗原が細胞質で顆粒状に分布していた。そこで、各種細胞質内小胞マーカーとの局在を共焦点レーザー顕微鏡で解析すると、Rab7の分布と一致した。

透過電子顕微鏡観察では細胞質内小胞にウイルス粒子を貯蔵する以外は形態が正常な細胞が大多数を占めたが、細胞質で多数のウイルス粒子を認めるアポトーシスを起こした細胞も少数認めた。持続感染細胞が産生するMNV-S7にプラック変異株が存在するか確認するため、初感染と継代数が25、50、130の培養上清を被験材料としてプラックアッセイを行った。しかし、プラック径が明瞭に異なるものは見出されなかった。MNV持続感染細胞はRAW264.7細胞にMNVを感染させ、生存した細胞を継代して樹立した。そのため、細胞のウイルス感染抵抗性が重要な鍵と考えられる。そして、MNVに感染抵抗性を示すRAW264.7細胞は、死細胞から放出された多数のDI粒子を含むMNVをエンドサイトーシスにより取り込んでRab7陽性後期エンドソームに貯蔵する。細胞の多くはMNVが増殖することなく壊死するが、一部の細胞はMNVが増殖してアポトーシスを引き起こし、新たなウイルスの供給源となる。このサイクルにより培養細胞におけるMNVの持続感染が成立すると推察される。マウスノロウイルス(MNV)持続感染細胞の培養上清中ウイルスRNAの総量は、死細胞数と高い相関関係を認めた。透過型電顕解析では二重膜小胞内にウイルス粒子を認め、抗MNV血清と細胞質小胞マーカーを用いた間接二重蛍光抗体法では、MNV抗原がRab7の分布とほぼ一致することが示された。以上の知見からMNV持続感染培養系の生活環は、RAW264.7細胞が死細胞から放出されたMNVをエンドサイトーシスにより取り込んでRab7陽性後期エンドソームに貯蔵する。細胞の多くはMNVが増殖することなく壊死するが、一部の細胞ではMNVが増殖してアポトーシスを引き起こし、新たなウイルスの供給源になると考えられる。本年度計画した2つの課題の内「持続感染細胞の細胞増殖能とウイルス増殖能の関係を明らかにする」は予定通りに実施して結果を得た。もう一つの「持続感染細胞の形態学的解析」もほぼ予定通りの進捗であるが、免疫電顕法による観察が条件検討の段階で止まっている。しかし、電子線トモグラフィー解析により免疫電顕法に依らない細胞内ウイルス粒子同定ができている。そのため、免疫電顕法と同等以上の確証が得られたと考えている。マウスノロウイルス持続感染細胞は培養上清中ウイルスRNA量で100倍異なる2株を作出している。そこで、2株の持続感染細胞を用いてウイルス排除可能な薬剤の探索を試みる。そのためには各薬剤の細胞毒性濃度をWST法により決定し、毒性を示さない濃度での抗ウイルススクリーニングを行う。評価は定量RT-PCR法による培養上清及び細胞内ウイルスRNA量の測定で行う。平成28年度よりマウスノロウイルスの研究経験者一名を分担研究者に加える。分担経験者にはこれまで継代の度にストックしてきた培養上清を試料として、プラックアッセイ、ウイルスゲノムシークエンス解析を担当して貰い、ウイルスの性状変化の有無について明らかにする。実験動物学MNV-S7CC持続感染細胞は100継代、2年以上の培養できていることから、シードロットを作製してその細胞が産生するウイルスの全長ゲノム解析を行う。また、継代毎に保存している培養上清中ウイルスの全長ゲノム解析を1、51、101継代目について行い、変異の程度を考慮して他継代時の培養上清中ウイルスについてもゲノム解析も行う。
在日日系ブラジル人第二世代のエスニック・アイデンティティ及び日本社会への適応

多くのブラジル人は、1990年当初、一時的な滞在目的で来日しているとはいえ、ほとんどが日本滞在を延長している状態である。一時滞在という人の意識と滞在長期化という実態の間にみられるギャップは、在日ブラジル人の子どもたちが抱える問題を悪化させているといえる。日本での生活の中で、彼・彼女らは学校と家庭の間で、日本とブラジルの習慣・言語・文化の狭間で生きており、今後日本社会で生活していく上で悩む者が増加している。一般に移民は祖国とのつながりや、母国からの延長として捉えられることが多いのに対し、移民第二世については、「祖国」というのは一つのシンボルにすぎない。ブラジルの日系二世・三世の特殊な問題として、ブラジルで生まれ、成長の過程で両親などから日本の文化や習慣、場合により日本語も教えられている。このような彼・彼女らのアイデンティティはどこにあるのだろうか。現在日本におけるブラジル人人口は30万を超えており、その一つの特徴としては、19歳未満の数が、全体の在日外国人の中でも、多いことである。日本に在住する外国籍者は、2005年12月現在、200万人を越えているが、そのうち、13%(約27万人)が19歳未満である。一方、在日ブラジル国籍者の22%(約6万7千人)が19歳未満である。本調査では、この日系ブラジル人の子どもが日本において、母語とアイデンティティの保持がどのように教育と関係しているかに注目している。現時点では、この子どもの多くは、ポルトガル語が母語であり、ブラジルが祖国であると一般的に認識されている。しかし、この傾向も徐々に薄れてくると予測ができる。18年度は、在日ブラジル人子弟の比較研究として、ブラジルにおけるエスニック学校9校(日本系6校、スペイン系1校、ドイツ系1校、スイス系1校)を対象に調査を実施した。調査期間は2007年3月5日31日。ブラジルにおけるエスニック学校では、それぞれの学校の特徴はあるが、全体的にブラジル社会で通用する一流のブラジル教育を目指しており、その中で日本やドイツなどの文化・言語を付け加えるような形でカリキュラムが組まれている。ここでは、日本語やドイツ語はプラス・アルファの教科であり、日系・ドイツ系の子どもなどに祖国への帰国を前提とする教育ではなく、ブラジル人としての教育に重点がおかれている。在日ブラジル人の一つの特徴としては、19歳未満の数が、全体の在日外国人の中でも、多いことである。ブラジル国籍者は31万人に達しており、22%(約6万7千人)が19歳未満である。なお、9歳未満の子どもに焦点を当てると、在日ブラジル人人口の15%(約4万8千人)がその年齢にあたる。ほとんどが日本の小・中学校で教育を受けている、またはこれから受けるだろうと推測できる。そのなか、日本学校での様々な問題を抱える子供が圧倒的に多いことは事実である。しかし、すべてのブラジル人児童・生徒をひとくくりにして教育の問題を論ずるのは妥当ではない。子どもの日本語能力のレベルや日本社会への適応の差は大きい。また、親の日本滞在歴、就労の状況や生活の安定度により、子どもの教育に様々な影響が及ぼされているのである。一方、在日ブラジル人の子供が直面する様々な問題にもかかわらず、日本の大学や専門学校に進学した若者が徐々に現れているのも事実である。本年度は、日本で高校以上の教育を受けている在日ブラジル人の若者を対象に調査を実施した。日本国内調査は、静岡県、愛知県、東京でインタビューを行った。また、比較のため、日本の学校で勉強をした経験があり、ブラジルへの帰国後、現地の大学に進学した若者への調査を実施した。ブラジル調査は、2006年12月にパラナ州でインタビューを行った。ここで、彼・彼女らがどのような問題に直面してきたか、またどのように乗り越えてきたかに焦点を当て、在日ブラジル人第二世代の現状を考察・分析した。また、本人の自己意識(アイデンティティ)から、彼・彼女らの日本社会への適応、そして今後どのような生活を目指しているのかを紹介した。多くのブラジル人は、1990年当初は一時的な滞在目的で来日しているとはいえ、ほとんどが日本滞在を延長している状態である。現在でも日本滞在が一時的なものであると意識している人もいるが、実態としては、日本滞在は長期化し、すでに永住過程に入っているケースが増加している。一時滞在という人の意識と滞在長期化という実態の間にみられるギャップは、ブラジル人の子どもたちが抱える問題を悪化させているといえる。在日ブラジル人の子どもたちの大多数は、家庭ではポルトガル語で育てられると同時に、その多くは日本の学校に通い、日本語で教育を受けている。その上、多くの子どもたちはブラジルよりも日本での生活が長く、教育も主に日本語で受けている。しかし、日本の学校には通わず、在日ブラジル人学校に通い、日本にいながらブラジルの教育制度の下、全てポルトガル語で教育を受けている子どもたちもいるのが現状である。現時点で、在日ブラジル人学校の役割として、ブラジルへの帰国を予定している家族の子どもの教育場として挙げられる。

しかしながら、在日ブラジル人の現状、特に日本で育っている子どもたちのことを考えると、在日ブラジル人学校が現状のままで存続するのは難しくなる一方であると言える。それは、この子どもたちが日本に永住し、日本の大学への進学や就職をする場合、ポルトガル語でブラジルの教育のみを受けていれば、困難が多いことは予想されるからである。