hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精密質量データ解析法の開発と環境化学物質モニタリングへの応用

固相吸着法などで採取した大気や水試料を加熱脱着法により直接、測定装置に導入することで、迅速かつ網羅的な分析を可能にした。膨大な種類の化学物質を分離測定するために多次元ガスクロマトグラフィ-飛行時間型質量分析法を用いた。測定データから任意の物質情報を抽出あるいは除去する手法を開発し、特に質量欠損の利用は、炭化水素由来のマススペクトルをほぼ完全に除去可能にした。未知物質の同定には質量分解能3万程度の測定が有効であった。非負制限因子分解(NMF)法の応用により、連続するモニタリングデータから差を検出する手法を開発した。また、データ比較のためには必須の保持時間合わせの手法も新たに開発した。ガスクロマトグラフィー高分解能質量分析法(GC-HRTOFMS)の能力を最大限活用した物質の検索・同定が可能な高精度な網羅的分析法や,物質組成や量の変化を高感度に検出・識別できる精密質量データの解析法を提案し,測定データからの物質の発掘や検索・同定において精密質量データを用いることの優位性を明らかにすることを目的とし、今年度は、基礎的な装置構成やモニタリング、測定条件の設定のための検討を行った。まず、GCx(GC)-HRTOFMSの測定条件を検討し、第一カラムに長さ45m、内径0.25mm、膜厚0.1umの微極性カラム(5%-フェニル/メチルシリコーン)、第二カラムに長さ1m、内径0.1mm、膜厚0.1umの中極性カラム(50%-フェニル/メチルシリコーン)を採用した。大気試料は、北海道の4地点(岩見沢、北見、帯広、札幌)と埼玉県(加須)、茨城県(つくば)で開始した。Tenax-TA捕集管に0.5L/分で7日間捕集を行い、並行してハイボリュームエアサンプラー(ダイオキシン類・PCB測定用)による大気捕集を行った。水試料は千葉県下の河川(一宮川)および最終処分場の処理水採水口と周辺河川から採水し、ポリジメチルシロキサン撹拌子による抽出(試料量50ml、室温(25°C前後)、NaCl添加(30%w/w)、回転数1500rpm程度、抽出時間6時間、pH未調整、n=5)とトルエンによる液-液抽出を行った。データ解析手法の検討では、ボロノイ分割によるピーク領域判定と頂点移動法による2次元クロマトグラムの保持時間合わせ、データ間の差の検出法として非負因子分析による因子分解(NMF)の応用について基礎検討を行い、ソフトウェアのプログラミングを開始・改良を継続中である。本研究では,ガスクロマトグラフ-高分解能飛行時間型質量分析計(GC-HRTOFMS)の環境分野への活用の高度化を図り,研究分野の開拓に繋がる手法の開発を目指し,GC-HRTOFMSの能力を最大限活用した物質の検索・同定が可能な高精度な網羅的分析法や,物質組成や量の変化を高感度に検出・識別できる精密質量データの解析法を提案し,測定データからの物質の発掘や検索・同定において精密質量データを用いることの優位性を明らかにすることを目的としている。ケーススタディとして,廃棄物処分場,環境監視地点などにおける大気および水環境中の化学物質の網羅的モニタリングおよび異常検出とその原因解析を行い,提案する手法の妥当性と有用性について検証中である。今年度は、水質の抽出条件の検討を中心に行った。抽出は、ポリジメチルシロキサン撹拌子によるスターバー抽出(試料量50ml、室温(25°C前後)を基本とし、アセトン及びNaCl添加(30%w/w)、回転数1500rpm程度、抽出時間18-24時間とした。これにより、POPs類およびポジティブリスト農薬の70-80%をカバーする抽出を可能にした。昨年度に引き続き、北海道の4地点(岩見沢、北見、帯広、札幌)において大気のサンプリングを実施した。水試料は千葉県下の最終処分場の処理水採水口と周辺河川および埼玉県の河川から採水した。埼玉県河川水の採水は、化学成分の変動解析のため2週間おきに実施した。データ解析手法の検討では、ボロノイ分割によるピーク領域判定と頂点移動法による2次元クロマトグラムの保持時間合わせ、データ間の差の検出法として非負因子分析による因子分解(NMF)の応用について昨年度から引き続き検討を行い、ソフトウェアのプログラミングを開始・改良を継続中である。昨年度遅れていた環境試料の採取が始まり、試料測定も軌道に乗りはじめたことより、計画は概ね順調に進捗している。本研究では、ガスクロマトグラフ-高分解能飛行時間型質量分析計(GC-HRTOFMS)の能力を最大限活用した物質の検索・同定が可能な高精度な網羅的分析法や、物質組成や量の変化を高感度に検出・識別できる精密質量データの解析法を提案し、測定データからの物質の発掘や検索・同定において精密質量データを用いることの優位性を明らかにすることを目的に、ケーススタディとして、廃棄物処分場,環境監視地点などにおける大気および水環境中の化学物質の網羅的モニタリングおよび異常検出とその原因解析を行った。今年度は、引き続き、埼玉県下の河川定点より水質を2週間おきに採取し、これまでに決定した条件により、スターバー抽出-加熱脱着-多次元ガスクロマトグラフィ-高分解能飛行時間が経質量分析法によりノンターゲット分析を行った。蓄積したモニタリングデータの一部を用い、非負値行列因子分解法(NMF)による差の検出およびノイズの分離の検討を実施した。その結果、質量分析データをそのまま利用した差の検出(時系列挙動によるデータの類型化)には成功したものの、分析装置の感度と質量精度、保持時間精度により解析結果が大きく左右される課題が明らかになった。

この補正のためには内標準物質の添加などによる補正が有効であると示唆された。また、市販の解析ソフトウェアにも実装可能な精密質量に基づく二次元ガスクロマトグラムの保持時間補正のためのプログラムを開発した。固相吸着法などで採取した大気や水試料を加熱脱着法により直接、測定装置に導入することで、迅速かつ網羅的な分析を可能にした。膨大な種類の化学物質を分離測定するために多次元ガスクロマトグラフィ-飛行時間型質量分析法を用いた。測定データから任意の物質情報を抽出あるいは除去する手法を開発し、特に質量欠損の利用は、炭化水素由来のマススペクトルをほぼ完全に除去可能にした。未知物質の同定には質量分解能3万程度の測定が有効であった。非負制限因子分解(NMF)法の応用により、連続するモニタリングデータから差を検出する手法を開発した。また、データ比較のためには必須の保持時間合わせの手法も新たに開発した。主力装置であるGCxGC-HRTOFMSの不調(TDUユニットの故障、イオン源の電流リークなど)が相次いだことにより、サンプルの実測が遅れ、当初予定より実モニタリング情報の収集に遅延が発生した。今年度は、前半まで定点観測地点において定期的な試料採取を進め、並行してGC(xGC)-HRTofMSにより精密質量測定を行う。得られたデータをNMFを応用した自作の「差の解析プログラム」にかけ、特徴的なマススペクトル(成分)の抽出や物質検索を実施する。このとき、質量分解能がデータ解析に及ぼす影響についても観察し、環境モニタリングにおいて精密質量データを活用することの有効性を評価考察する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。環境リスク、環境分析装置の保守について、メーカーおよび内部の熟達者の協力を得ることが可能になり、今後は試料の測定数を加増させる予定である。また、差の検出のためのアルゴリズムとして、新たに非負制限因子分解法(NMF)を取り入れ、有効性の検討に入る。基本部分のプログラムは予備的に作成済みであることから、27年度以降には、その検証が可能になる見込みである。分担研究機関においては、網羅分析用のモニタリング手法による大気と水質試料のサンプリングを引き続き継続し、データを収集しながら同時に解析を実施する予定である。
小児潰瘍性大腸炎に対する糞便移植と腸内細菌叢の検討

潰瘍性大腸炎に対する糞便移植については、2017年度末までに合計9例に対して実施した。比較的軽症の患者で早期に移植した場合は良好な結果が得られた。しかし、糞便移植を希望する患者の多くは、複数の内科的治療を尽くしても治療が奏功せず、外科的大腸全摘術を回避する目的であり、その場合の治療成績は不十分だった。糞便移植の治療成績は、小児潰瘍性大腸炎の1例に対し、反復して糞便移植を行ったことの有効性をPediatrics International誌に報告した。また、2016年にはカナダで開催されたWCPGHANで5例に対する成績を報告した。便処理法の研究成果は2017年に米国のAIBDで報告した。本研究では、本邦の小児潰瘍性大腸炎における糞便移植の有用性・安全性を明らかにするとともに、本邦小児潰瘍性大腸炎患者における腸内細菌叢の特徴と移植による変化を明らかにすることを目的とし、小児潰瘍性大腸炎患者に対して糞便移植を実施している。反復して糞便移植を行ったことにより治療効果が得られた先行症例について、その有効性と、糞便移植による腸内細菌叢の劇的な変化をPediatrics International誌に報告した。現在は、この結果を踏まえて、反復して複数回の糞便移植を行うプロトコールで糞便移植研究を行うこととしている。平成27年度には、安全かつ適切に、移植便の前処理ができるように、前処理に必要な物品や容器などの設備投資を行い、糞便移植を実施できる体制を整えた。また、腸内細菌叢の解析に必要な検体採取解析に至る体制の整備、解析のために必要な便検体の採取プロトコールについて検討を重ね、その体制を整えた。平成27年度末までに、予定した3例の小児潰瘍性大腸炎の新規症例の導入に加え、1例の超早期発症の炎症性腸疾患症例に対して糞便移植を開始し、現在、解析に必要な便検体の採取を行っているところである。腸内細菌叢に関する解析には時間を要するため、まだ解析はできていないが、保存された検体を用いて、今後、解析を行う予定である。また、平成28年度には、新たに5例の新規症例に対する糞便移植の導入を目指して研究を継続する方針である。平成27年度には、糞便移植に必要な設備投資を行い、安定的に前処理を行える環境を整えることができた。また、腸内細菌叢の検討に関して、プロトコールの作成に時間を要したが、検体採取のタイミングおよび検査実施に向けた体制を整えることができた。さらに、実際に平成27年度に目標としていた3例に対する糞便移植を実施し、加えて、超早期発症の小児炎症性腸疾患児に対する糞便移植も1例に対して実施することができた。したがって、現在までの進捗状況としては、概ね順調に進展しているものと考えている。2013年に糞便移植を開始した先行症例1例では、インフリキシマブ、アザチオプリン、タクロリムスを使用してもステロイド依存性に再燃を繰り返していた11歳の女児に対し、父をドナーとする糞便移植を反復施行することによって、ステロイドの離脱と、インフリキシマブ、アザチオプリンでの寛解維持が可能となった。2015年からは、抗菌薬(バンコマイシン、メトロニダゾール、リファンピシン)による前処置後に糞便移植を反復施行するプロトコールで糞便移植を開始し、潰瘍性大腸炎の男児4例と乳児期発症の炎症性腸疾患の女児1例に対して実施した。その結果、ステロイド依存性に再燃を反復していた潰瘍性大腸炎の男児1例では、無投薬での寛解維持が可能となった。残る4例は、いずれも十分な効果が得られず、1例が生物学的製剤の導入、3例が外科的大腸全摘術(1例は手術予定)となった。糞便中の腸内細菌叢の解析を行ったところ、注入した移植便を保てずにすぐに排泄してしまった乳児期発症の1例では全く腸内細菌叢組成に変化が見られなかったが、それ以外の4例では実施前よりもドナー細菌叢に組成が近似する傾向が見られた。以上のように、潰瘍性大腸炎患者における糞便移植は通算で、6例中2例に改善効果を認めた。うち1例は手術治療が考慮されていたが、手術を回避し既存治療での寛解維持が、別の1例では無投薬での長期寛解維持が、それぞれ可能となった。その一方で、その他の症例では糞便移植によって、糞便中の菌叢組成にドナーに近似する変化が認められたが、臨床的な改善には結びつかなかった。その理由としてドナー細菌叢側の問題があるのか、病態に細菌叢以外の要因が関与しているのかはまだ明らかとなっていない。今後、さらに症例を蓄積し、奏功例と無効例での細菌叢の比較などの解析を進めていく必要がある。上述の通り、通算で、6例に糞便移植を実施し、うち2例に改善効果を認めた。また、抗菌薬による前処置を変更し、新たなプロトコールで2例に対して糞便移植を実施中である。成人に比べて、罹患者数の少ない小児の潰瘍性大腸炎患者を対象とした研究であり、研究への参加を希望する患者の組み入れに当初の予想よりも時間を要したため、当初の予定よりも研究の進捗状況はやや遅れている。潰瘍性大腸炎に対する糞便移植については、2017年度末までに合計9例(うち3例はVEO-IBD)に対して実施した。

本研究の特徴としては、糞便移植実施前に抗菌薬による腸管前処置を行っていること、さらに、腸内細菌の多くを占めるとされる嫌気性菌を保持するため、通常は大気下にて行われている便の採取からブレンダーでのミキシングに至る処理を、嫌気環境を保って行っていること、そして、便移植を単回ではなく、複数回反復して行っていることである。しかし、糞便移植を希望する患者の多くが、内科的治療を尽くしても治療が奏功せず、外科的大腸全摘術を回避する目的であり、そういった症例の治療成績は不良と言わざるを得なかった。一方で、比較的早期に介入した患者では、比較的良好な結果が得られており、患者のQOLの改善にも寄与することができた。糞便移植がどのような症例に適しているのかを含め、研究を継続する。潰瘍性大腸炎に対する糞便移植については、2017年度末までに合計9例に対して実施した。比較的軽症の患者で早期に移植した場合は良好な結果が得られた。しかし、糞便移植を希望する患者の多くは、複数の内科的治療を尽くしても治療が奏功せず、外科的大腸全摘術を回避する目的であり、その場合の治療成績は不十分だった。糞便移植の治療成績は、小児潰瘍性大腸炎の1例に対し、反復して糞便移植を行ったことの有効性をPediatrics International誌に報告した。また、2016年にはカナダで開催されたWCPGHANで5例に対する成績を報告した。便処理法の研究成果は2017年に米国のAIBDで報告した。平成28年度は、引き続き、糞便移植を継続し、年間5例の新規導入を目標とする。平成27年度と同様に、臨床的症状スコアを定期的に評価し、内視鏡的な粘膜治癒の有無、他の治療薬の減量離脱効果を含めて、臨床的治療効果を評価する。さらに、便中の腸内細菌叢の解析を進め、検討を行う。まず、移植前の小児潰瘍性大腸炎患者の腸内細菌叢を検討することにより、本邦の小児潰瘍性大腸炎患者における腸内細菌叢の細菌組成の異常の有無、また腸内細菌数の低下の有無、多様性の低下の有無などを評価する予定である。また、糞便移植に伴い、それらの構成細菌にどのような変化が見られたか、糞便移植が奏功した患者と奏功しなかった患者で歳があるのかなどについて分析し、糞便移植の治療効果を高めるための方法について、検討する。これらの研究成果をまとめて、英文の論文として医学雑誌に投稿することを目標とする。今後、臨床効果を高めるために、ドナー細菌叢の検討を進めるとともに、新たな抗菌薬前処置法による治療効果や、便処理法の違いが与える影響についての検討を重ねる予定である。今年度は、便移植研究の実施体制を整えるために必要な設備投資を行った。一方で、最も費用がかかる便検体の腸内細菌の解析を行うための費用に関しては、関係機関と調整を進め、実際の解析開始は次年度に持ち越す形となった。腸内細菌の解析は、試薬等の費用が高額であるため、貴重な研究費を必要な腸内細菌叢の解析に充てられるように、今年度分の支出を極力少なくなるようにしたため、次年度使用額が生じる結果となった。また、糞便移植に関する研究報告を古くから行っているオーストラリアのT. Borody教授の施設の視察についても、先方の事情もあり、次年度に行う予定となった。さらに次年度には国際学会での研究成果の発表を目指している。本研究費のもとで、小児潰瘍性大腸炎患者に対する糞便移植をこれまでに計7例に対して実施してきており、その成績を国内外の学会で発表してきた。外科的手術回避目的で糞便移植を実施したものの改善が得られず、手術に至った症例もあったが、糞便移植が奏功し、薬物治療なしでの寛解を達成した症例もあった。
準周期振動と部分同期現象について

近年、3次元以上の準周期振動を発生する力学系には、アーノルド共鳴ウェブと呼ばれる複雑な部分同期現象という極めて複雑な分岐現象を呈することが、離散系の解析によって明らかとなった。この現象においては、n次元トーラスの発生する領域においては、(n-1)次元トーラスの発生する領域がパラメータ空間内において蜘蛛の巣状に交錯する。そして、これまで、3ートーラスを発生する沢山の離散力学系が提案され、3ートーラス内部に発生する2ートーラス部分引き込み領域の解析が行われてきた。しかしながら、現実の系を記述する連続時間力学系のアーノルドウェブの解析は、数値積分による不可避な計算誤差と、それに伴う膨大な計算量という2つの問題から、その詳細な解析は行われていなかった。通常の非線形系は滑らかな非線形項を含むため、リアプノフ指数を計算するためにはルンゲ・クッタ法のような数値積分法を用いる必要があった。本研究では、極めて簡素な電子回路モデルとしてヒステリシスを含む区分定数回路を提案し、その電子回路に発生するアーノルド共鳴ウェブの構造を明らかにした。この電子回路においては、区分的に陽に解析解を導出することができ、さらに、各々の区分定数枝をよぎる時、陽にこれらの解析解を接続することが可能である。これによって、この連続時間力学系のリアプノフ指数を離散力学系のそれとほぼ同程度の精度と計算量によって求めることが可能である。当該年度は、3個のヒステリシスを含む自律系によって表される区分定数回路を提案し、系統的な計算機アルゴリズムによってリアプノフ解析を行い、リアプノフダイヤグラムを作成した。そして、従来法では不可能であった詳細なリアプノフダイアグラムを導出することに成功した。そして、これまでの解析では明らかにされていなかった、準周期振動の部分同期現象がヒステリシスを伴うことを明らかにした。これまで、矩形波外力によって励振される非自律系区分定数微分方程式によって表される区分定数回路と、3つのヒステリシス発振器によって構成される自律系区分定数微分方程式によって表される区分定数回路を提案し、それぞれの解析手法を用いることにより、リアプノフダイアグラムを作成した。これらの発振器においては、3つの非共鳴な周波数成分からなる3ートーラスが発生することが確認され、分岐パラメータ平面上において、2ートーラス部分同期引き込み領域が蜘蛛の巣状(web状)に発生することが明らかにされた。自励系、非自励系共に、区分線形系の解析解を用いて系統的に計算する計算機アルゴリズムを提案し、この方法を用いて多数のリアプノフダイアグラムを求めた。具体的には、過渡状態、定常状態共に1000万回のポアンカレ写像の固有値を平均して求め、リアプノフ指数を計算し、そのリアプノフ指数の絶対値が1/100万より小さいとき、リアプノフ指数を0と見なした。蜘蛛の巣状に交錯する2ートーラス部分同期引き込み領域の交点にはChenciner bubblesと呼ばれる周期解が発生することを確認した。さらに、3ートーラスの発生領域の近傍においてはカオス現象が発生することを明らかにした。本研究で明らかにしようとしていた計画は概ね解決することが出来た。従来は、離散系、すなわち、現実には存在しない力学系のアーノルド共鳴ウェブの解析が行われてきた。これに対し、本研究では実際に物理実験において観測が可能な電子回路を用いてアーノルド共鳴ウェブを計算機実験において詳細に観察することに成功した。これまでの非線形力学系のカオス現象の解析の歴史を鑑みると、そのカオスの発生を証明するために、より簡素な力学系が用いられた。区分定数回路というのは、電子回路を究極的に簡略化した電子回路モデルで、それぞれの枝上において得られる解析解を解析的に接続することが出来、そのヤコビアン行列も陽に導出することが可能である。しかしながら、これまでの筆者らの研究では、自律系と非自律系の解析を独立に行っていた。これに対し、筆者らはこれまでの自律系、非自律系によって表される電子回路を解析しているうちに、これらの系のリアプノフ指数を統一的な方法で計算するアルゴリズムを考えついた。今年度の研究においては、自律系、非自律系のアーノルド共鳴ウェブを系統的な導出するアルゴリズムを提案し、準周期振動の部分同期現象とカオスを観察する。アーノルド共鳴ウェブは数学モデルである写像の解析によって明らかになった準周期振動の分岐の構造である。従来、2つの基本周波数成分からなる準周期振動はアーノルドタンと呼ばれる無限個の同期引き込み領域を呈するが、3つ以上の基本周波数成分を含む準周期振動は部分同期現象を発生し、その同期引き込み領域は蜘蛛の巣状に交錯する。これが、アーノルド共鳴ウェブである。しかしながら、従来の研究においては、アーノルド共鳴ウェブの解析は写像に基づいて行われ、実際の電気回路から導かれるアーノルド共鳴ウェブの解析は、著しく精度の低いものばかりであった。その理由は、一般に非線形微分方程式の解析はルンゲ・クッタ法のような数値積分を使って行われるが、この場合、数値積分の量が膨大となることと数値誤差の累積という大きな2つの問題点があったためである。これに対し、応募者らは、区分定数回路と呼ばれる著しく単純な回路を用いれば、写像のそれとほぼ同程度の計算量と精度でアーノルド共鳴ウェブの計算が行うことができることに気づいた。当該年度は、ある3つの独立した周波数成分からなる準周期振動を呈する区分定数回路を設計し、その回路の解を求めるためのプログラムを作成した。

また、アーノルド共鳴ウェブを図示するためにリアプノフ指数と呼ばれる特性乗数を計算する必要があるが、これを求めるための一般化されたアルゴリズムを作成した。また、回路実験を行い、3-トーラスが部分同期する様子を観察した。当該年度の研究計画は、対象とする区分定数回路の解軌跡を求めるプログラムを作成すること、グラムシュミットの正規直交化アルゴリズムを用いてリアプノフ指数を求める手続きを作成すること、回路実験によって解の振る舞いを観察することであった。これらのプログラムは予定通り作成することができた。また、回路実験においては、ポアンカレ断面を導入すると、3つの基本的な周波数成分からなる準周期振動の場合には点列は断面状を覆い、2つの基本的な周波数成分からなる準周期振動に対しては、点列は閉曲線を構成することが確認された。2つの周波数からなる準周期振動にはアーノルドの舌と呼ばれる複雑な同期引き込み領域が生じることが知られているが、3つ以上の周波数からなる準周期振動にはアーノルド共鳴ウェブと呼ばれるはるかに複雑な同期現象が生じることが知られている。ここでは例えば3つの周波数からなる準周期振動においては3つの周波数成分のうち2つの周波数成分からなる部分同期現象が生じることが明らかにされ、この部分同期引き込み領域がパラメータ空間内において蜘蛛の巣状に縦横無尽に交錯する。これらの現象は、主に数学モデルである写像のみの解析によって調べられてきたが、実物理系を記述する連続力学系のアーノルド共鳴ウェブの解析は、計算コストと精度の問題から、ほとんど解析が行われていなかった。さらに、実際の実験による観察も行われていなかった。本研究では、Tsuboneらが提案する区分定数回路と呼ばれる著しく単純な電気回路を用い、数値的および回路実験によってアーノルド共鳴ウェブを観察することを目的としている。区分定数発振器の基本はオペレーショナルコンダクタンスアンプを用いたヒステリシス発振器の結合系からなり、その回路を記述する微分方程式の右辺は区分的に定数によって与えられる。この著しく単純な回路においては、解が数値積分を用いずに陽に解くことが出来る。さらに、この陽に導出された解は、区分定数系の折れ線上で解を解析的に接続することが出来る。このような解を用いれば、区分定数系のリアプノフ指数は写像のそれとほぼ同じ計算量と精度で導出することが可能である。さらに、区分定数回路は回路実験においても容易に実現することが出来る。本研究は、実回路のアーノルド共鳴ウェブを区分定数回路を用いて、数値的、および、実験的に観察することを目的としている。リアプノフ指数を効率的に求めることが本研究のカギである。リアプノフ指数とは近傍に存在する解が拡大的か縮小的かを表す平均量で、ShimadaとNagashimaが提案する方法で効率的に求めることが可能である。現在までの研究において、このリアプノフ指数を求めるため、2つの解軌跡の変分を微小に離れた2つの初期値から出発する解の差を用いて計算をした。そして、2パラメータ分岐図をリアプノフ解析により求め、アーノルド共鳴ウェブを観察することに成功した。一方、回路実験においても、3つの振動周波数からなる3次元トーラスと、部分同期した2次元部分同期引き込み現象の観察に成功している。
音声言語の理解のメカニズムにおける音韻情報の役割の普遍性と個別性に関する研究

平成13年度の研究成果は以下の通りである。第1点は、心内辞書における語彙に接近する際のモーラの役割を検証した。この研究は音声の連続体の中から単語を切り出すことが可能となる分節のメカニズムに関わる研究で、これまでの研究では言語のリズムと関連する音韻単位によって分節が行われるとしてきたが、語彙内においては語境界をモーラの音韻単位が担うことを明らかにした。西欧の言語によって検証が行われているPWC (Possible-word constraints)が日本語においても適用できることを明らかにした。第2点は、「音素の活性化に基づく語彙選択」がモーラ言語である日本語においても観察されるか否かを検証した。本研究では、まず日本語の伝統的な言語遊戯である「語呂合わせ」に着目して、モーラに加えて子音及び母音の交替が存在する事実を明らかにした。次に、「語彙の再構築」という実験手法を用い、日本語話者でも音素レベルで活性化が起こる可能性を明らかにした。第3点は、第2点を更に進展させたもので、現代の言語遊戯の代表とも言える「駄洒落」に着目して、その構造を語彙認識の観点から明らかにしたものである。インターネット上の駄洒落データベースの分析を行い、基本的には「語呂合わせ」と同様な構造が存在することを明らかにした。つまり、現代日本人が日常に楽しむ言語遊戯は、音素レベルで起こる可能性が存在する。第4点は、心内辞書内における音韻表示の普遍性の問題である。モーラ言語とされる日本語話者の心内辞書においてモーラ以外の音韻単位である音節と音素の2つの単位に着目して、幼児、児童、成人、バイリンガル話者などを対象に検証を行い、(1)音節構造内における音節とモーラの発達の順序は、音節からモーラへ移行する可能性と(2)ローマ字を認識する以前の段階で、日本語話者の児童は、音素認識が存在する可能性を明らかにした。本年度の研究実施計画は、(1)日本語話者は連続音声に対してこれまで明らかにしたモーラ以外の音韻単位の認識が存在するか否かについてReconstruction(語彙の復元)の手法により、(2)シラビーム方言話者は音節の音韻単位の認識が存在するか否かについて、tappingの手法により、(3)英語及び日本語話者の心内辞書における音韻単位の認識をメトロノームの手法により、(4)日本語話者の語彙認識ではピッチアクセントの情報が関与するか否かをGatingの手法により、それぞれ調査を実施した。その結果、(1)では、日本語話者は従来のモーラに加えて、音素レベルでの認識が存在する可能性が明らかとなった。つまり、日本語話者は、通常はモーラを中心に据えて分節を行うが、音素についての認識も併存することを示唆している。その成果は、米国音響学会で発表後、Journal of Memory and Languageに投稿済みである。(2)では、青森市の高校生を対象に日本語、英語、スペイン語の言語を用いて調査を実施した。現在データの解析中である。(3)では、米国の大学生はモーラの認識が少ないことが明らかになった。その成果は、Labphon及び国内の学会で発表を行う予定である。(4)では、熊本市の大学生及び栃木、茨城県に在住する大学生を対象に実験を実施し、すでに東京方言について明らかになっている成果と比較検討を行った。今回調査を行った話者は無アクセント方言であるため、東京方言話者と比較してピッチアクセント情報が語彙選択に関与する程度が低いことが明らかになった。これは、語彙認識とピッチアクセントの間には実は密接な関係が存在することを示唆するもので、従来の言語学におけるピッチアクセントの新たな機能が見出されたと言えよう。

その成果は、米国のJournal of Phoneticsに投稿し、現在印刷中である。1.語彙認識と音韻単位に関する研究初年度では「語彙の再構築」の手法により日本語話者の音素認識の可能性について実証的に検証したが、2年度ではこの研究を更に進め、日本の江戸時代に流行した語路合せに基づく絵地口が音素認識と密接な関連があることを明らかにし、日本語話者はこれまでモーラを基本として音韻認識をすると考えられていたが、音素認識が存在することを明らかにした。現代日本語の言語活動における駄洒落の中で音素認識が重要な役割を担っていることに着目した研究を実施した。駄洒落は世界の5000とも言われる言語の大半の言語活動に認められる普遍的な言葉遊びの1つである。2年度の研究では駄洒落のデータ・ベースの分析を行い、音素認識が重要な役割を演じていることを解明した。語彙認識と音韻単位の関係に認められる制約を明らかにする研究を実施し、日本語話者はモーラに基づく制約に基づいて連続音声を分節する可能性が高いことを明らかにした。2.バイリンガル話者の音韻単位に関する研究成人の日英語バイリンガル話者に対する音節構造内の音韻単位の認識のメカニズムを解明する調査を行った。その結果、モノリンガル話者は日本語と英語に対してモーラを認識するが、バイリンガル話者は英語に対して音節を認めることを明らかにした。成人に加えて小学生の帰国子女の日英語バイリンガル話者を対象として日本語、英語、スペイン語の3言語を用いて音節構造内の音韻単位の認識のメカニズムを解明する調査を行った。その結果、小学生のバイリンガル話者と成人のバイリンガル話者は、音韻単位の認識のメカニズムは同一であることを明らかにした。バイリンガル話者の音韻単位の認識のメカニズムを明らかにする一環として、米国人のモノリンガル話者による実験を実施したが、英語のモノリンガル話者は、モーラの認識が欠如している可能性について明らかにした。今回の研究では、過去の科研の研究成果を踏まえた上で,以下の3つの未解決のテーマについて研究を行った。第1のテーマは、語彙認識のメカニズムにおけるプロソディの情報の役割に関するものである。過去の日本語のアクセント研究は、主にアクセント体系や方言の差異を記述することに主眼が置かれており、語彙認識の観点からその役割を検証したものは少ない。本研究では東京方言と無アクセント方言とされる熊本方言、栃木方言、茨城方言の各話者を対象に単語の語頭のアクセント情報と語彙認識の関係について検証を行なった。その結果、ピッチアクセント情報は、話者によって利用の仕方に程度の差は存在するものの語彙選択に関与することを明らかにした。第2のテーマは、日本語の語彙に接近する際のモーラの役割を明らかにすると共に、語彙認識のメカニズムの普遍的な問題である「音素の活性化に基づく語彙選択」がモーラ言語である日本語においても観察されるか否かという問題を検証した。この問題は、語彙認識のメカニズムの普遍的モデルを構築する上で極めて重要な問題である。本研究では、日本語の言語遊戯である語呂合わせや駄酒落における音素の役割の分析、「語彙の再構築」と呼ばれる心理言語学的実験手法を通じて明らかにした。
分子機能定量可能な局所拡大撮像SPECTのための画像再構成アルゴリズムの開発

局所拡大撮像のためのデータ欠損(トランケーション)を許すSPECT画像再構成アルゴリズムを開発し、これを高感度撮像のためにマルチピンホールコリメータを取り付けた検出器複数個からなる検出系のSPECTシステムに応用した。コンピュータシミュレーションを行った結果、脳の局所領域において、トランケーションの影響が無く、S/Nの十分に高い、高解像度の画像が得られることを確認できた。ヒトのような大きな被写体の局所生理機能を高解像度かつ定量的に撮像するSPECT装置を開発することが目的である。大きな被写体の局所を小視野で撮像した場合、データ欠損(トランケーション)よって、アーチファクトや画素値が過大評価され、定量的な画像が得られない。本年度は、まず、トランケーションがあっても正確な画像を得るための画像再構成アルゴリズムを次の状況に対して開発した。1.撮像小視野が被写体の外側を含む場合、(1)パラレルホールコリメータ付き小視野高解像度検出器による高解像度撮像、および(2)ピンホールコリメータによる拡大高解像度撮像したデータを画像再構成する。2.撮像小視野が被写体の外側を含まない場合、被写体全体をトランケーションなく撮像可能なパラレルホールコリメータ付き大視野検出器で得られたデータを利用して、小視野高解像度撮像データを画像再構成する。東芝SPECT装置を用いて、脳ファントムをピンホールコリメータで局所拡大高解像度撮像し、開発した画像再構成アルゴリズムで収集したデータを画像再構成して、トランケーションの影響なく再構成画像が得られることを実験にて実証した。これにより装置実現の可能性が確認できた。また、最適な装置設計をスムーズに行うには、より現実的なモンテカルロシミュレーションを効率良く行う必要がある。そのため、今年度は、複数コンピュータから成るPCクラスターによる高速シミュレーション環境を整備した。ヒトのような大きな被写体の局所領域を、高解像度かつ高いS/Nでデータ収集するための撮像条件を検討するために、コンピュータシミュレーションを行った。検出器の回転角度は180度回転とした。シミュレーションの結果、従来の円軌道撮像では、検出器およびコリメータが撮像対象から大きく遠ざかるため、解像度と感度の両方が大きく低下した。したがって、被写体の輪郭に沿った軌道で撮像するのが、高解像度かつ高いS/Nで撮像する上で重要であることが明らかとなった。撮像システムを輪郭に沿った撮像ができるように、また、画像再構成プログラムが輪郭に沿って撮像した投影データを画像再構成できるように対応する必要がある。今後の開発方針が明らかとなった。高解像度定量撮像のために、吸収補正、散乱線補正、コリメータの開口補正を画像再構成プログラムに組み込んだ。開発した画像再構成プログラムを評価するためにファントム実験を行った。従来の画像再構成法では、トランケーションの影響で、再構成画像においてアーチラァクトおよびカウントの過大評価が見られた。それに対して、開発した手法で再構成した画像では、アーチラァクトなく、再構成画像のカウントも真値に近かった。また、生体への利用可能性を評価するために、トランケーションの有る状態でラットを撮像した。従来法で画像再構成した場合、開発した手法で画像再構成した場合よりも再構成画像のカウントが高かった。開発した画像再構成法によって、トランケーションの影響が抑制されて画像の定量精度が改善された。ファントムおよびラット撮像実験によって、開発した画像再構成アルゴリズムの有効性が確認できた。SPECT撮像において、ヒトのような大きな被写体の局所領域をピンホールコリメータなどを使用して拡大撮像した場合、データ欠損(トランケーション)が生じるため、従来は正しい画像が得られなかったが、トランケーションを許す画像再構成法が開発され、局所領域の超高解像度画像が得られるようになった。しかしながら、高解像度撮像であるため、単純なシングルピンホールコリメータのような検出器構成では十分な感度がなく、S/Nの良い画像は得られない。さもなければ、長時間の撮像を要する。本年度は、マルチピンホールコリメータ取り付けた検出器複数個から構成された検出器システムの導入を検討し、そのための画像再構成アルゴリズムを開発した。ヒト脳を模倣した数値ファントムを用いて、コンピュータシミュレーションを行い、検出器システムの構成および開発した画像再構成アルゴリズムを評価した。検出器の構成は、32mm×32mmの検出器に対して、9個のピンホールを有するコリメータを取り付ける。この検出器を脳の周りに複数個配置する。検出器は隣の検出器と60度の角度をもって配置される。脳の中央付近を撮像する場合は、6個の検出器で脳を囲む。脳の辺縁付近を撮像する場合は、完全に脳を囲まないが検出器4個を配置する。この検出器システム構成に対応する再構成画像アルゴリズムを開発し、シミュレーションを行った。視野において、トランケーションの影響がなく、S/Nの十分に高い、高い解像度の画像が得られることが確認できた。
ホール型イオン推進機における電極形状の最適化に関する研究

本科学研究費補助金により,1kW級のホール型イオン推進機を製作した。またそれと同時に,推進機の作動に必要な直流電源,熱式流量制御器および電離真空計などを購入して実験を行った。現有の真空チャンバおよび排気装置を利用することができたため,速やかに実験を行うことができた。本推進機を設計する際に,加速チャンネルの長さを変化させて実験を行うことができる点が1番の特徴であった。実験の結果,推進効率が加速チャンネルの長さに対して最大値を持つという結果が得られ,作動に最適なチャンネル長さが存在するという,我々の仮説の実験的な裏付けが得られた。特にチャンネル長の可変領域が0ミリから10ミリであるのに対して,最適チャンネル長がその中央付近の6ミリであったため,今後更に実験を進める上でたいへん都合がよい設計であったと言うことができる。また放電電流・電圧の振動も捉えることができ,今後のプラズマ不安定性の研究の基礎データを得ることができた。これらの結果は,日本航空宇宙学会・関西中部支部講演会や宇宙輸送シンポジウムでその一部を発表したが,今後はいくらかの解析的な考察も加えた上で,来年度の学会や,学術雑誌等でその成果を発表して行く予定であり,またこの推進機を利用して,さらに物理現象(電磁流体流れやプラズマ不安定性など)についての研究を行い理解を深めて行くつもりである。
遠地実体波の解析による大地震の断層面形状とすべり分布の同時推定手法の開発

大地震がどのような断層面形状を有し、断層面形状とすべりの時空間分布がどのような関係にあるのかを明らかにするために、遠地実体波を用いて断層面形状と曲面上のすべり量の時空間分布を同時に求める新しい震源過程解析手法を提案する。開発した手法を実地震に適用して、その有効性を確認した上で、断層面形状の変化が動的な破壊伝播に及ぼす影響について精査し、複雑な大地震の成長過程の特徴を明らかにする。
小分子系に対応した走査型アトムプローブ測定手法の開発とその生体分子への応用

走査型アトムプローブはアトムプローブをもとに代表者らが開発した装置である。走査型アトムプローブによって分子性試料の分析を行うための手法の開発を行なった。試料分子の担持体にカーボンナノチューブを用いることで、基本的な生体分子としてアミノ酸16種類について、マススペクトルを得るための条件を見出すことができた。分子性の試料の電界蒸発にあたっては、分子の拡散と試料先端部への移動が重要であり、低温への冷却はむしろ分析を困難にすることが明らかとなった。最適な電界蒸発のトリガー手法の選択のために、電圧/レーザーのトリガーを交互に印加してマススペクトルを同時取り込みし比較できるようなシステムを構築した。質量分析は微細領域での高感度元素分析ができるキャラクタリゼーション手法として広く認知されている。有機物、生体関連分子の化学分析においては、元素分析とは別に分子種の特定ができることが望まれており、分子イオンの検出を主眼においたソフトイオン化手法の確立が望まれている。本研究で用いられる走査型アトムプローブ(Scanning Atom Probe, SAP)はアトムプローブ(Atom Probe, AP)を元にして、APにおける試料形状への制約を取り払った装置である。SAPを有機分子の分析に適用するにあたり、H25年度はアミノ酸のなかでも小分子のものを保持するための下地物質として親水性のポリマーについて検討を行った。親水性ポリマーとして、構造が既知の合成高分子のなかからポリアクリル酸、ポリビニルアルコールについて金属探針へのコーティングを行い、アトムプローブで分析を行った。その結果、低質量領域にのみマスピークを持つ非常に単純な質量スペクトルを与えることが確認された。小分子量の分子は蒸気圧が高いために、予備排気中に試料分子の脱離が進行し、探針への保持が難しいことが、小分子量試料のイオン収量が小さい原因であると考えられる。マトリックスとして用いることで、アミノ酸の中でも小分子量のものの脱離を抑制しアトムプローブ分析ができるようになると期待される。また、H25年度はカーボンナノチューブに代わる担持体としてカーボンファイバーを使用するための予備分析も行った。カーボンファイバーは種々のグレード、製法のものが入手できる。それらをアトムプローブで分析した結果、その中にカーボンナノチューブと同等のスペクトルを与えるものが見つかった。今後、カーボンファイバーを担持体に用いてアミノ酸を分析できるかどうかを検討したい。有機物、生体関連分子の化学分析においては、元素分析とは別に分子種の特定ができることが望まれるので分子イオンの検出を主眼においたソフトイオン化手法の確立が望まれている。本研究で用いられる走査型アトムプローブ(Scanning Atom Probe, SAP)はアトムプローブ(Atom Probe, AP)を元にして、APにおける試料への制約を取り払った装置である。APは個々の原子を電界蒸発と呼ばれる現象により陽イオンとして取り出し、直接的に逐一検出する装置である。電界蒸発によるイオン生成においては、試料が気体、原子状態であることは必要なく、固体状態の試料の最外表面から個々の分子あるいは原子がイオン化して蒸発することが特徴である。SAPを有機分子の分析に適用するにあたり、H24年度は試料保持温度の調節機構の設計と組込み、試料を担持する下地素材の前処理の検討、生体分子の例としてアミノ酸のなかでの分析候補分子の探索を行なった。試料温度調節機構は従来室温で行なってきたAP分析を低温で行うことで試料分子の蒸発脱離を抑制し、また分子の拡散を制御するためのものである。冷却機構の組み込みにより、室温-150°Cでの測定が可能であることを確認した。固体試料ではなく分子系の試料をAP/SAP分析する際に試料物質をカーボンナノチューブに担持することが有効であるが、カーボンナノチューブをわずかに親水性に改質することでアミノ酸のような極性の大きい分子の保持性が高まることが確かめられた。また、アミノ酸を網羅的に分析しライブラリを構築するための予備実験として、分子量が小さく蒸気圧の高いアミノ酸について単量体、二量体、三量体などのAP分析を行なった。質量分析は微量高感度の元素分析、分子構造解析ができる分析手法であり、イオン化手法としてマイクロビームを用いれば二次イオン質量分析法(SIMS)のように空間分布の情報も得られるようになる。本研究課題の研究手法である、アトムプローブ(AP)の場合、固体試料の先端の極微小領域での質量分析データが原子レベルの位置情報と共に得られる特徴があり、試料形態についてAPはSIMSと補完的な関係にある。本研究課題は走査型アトムプローブ(SAP)の開発、試料ハンドリング手法の開拓などによって、金属あるいは共有結合結晶などのバルク物質に限定されてきたAPの分析対象を、通常の化学試料(小分子)や生体分子へと広げようとするものである。平成26年度はアミノ酸の分析ライブラリを完成させるための測定を進めるなかで、試料の担持方法などについて新たな知見を得ることができた。担持体としてカーボンナノチューブを用いる場合、部分酸化による親水化の処理を行ってきたが、担持方法を改良すれば、これを行わなくても十分なイオン収量が得られることが判明した。よって、既に得られている分析データにつき、新たな条件での再測定により改良できる見込みが現われた。装置面での研究については、電界蒸発トリガー方法に関して、APの黎明期から使われてきた電圧パルスに対して、近年、通常のバルク試料の分析において主流となっているのは短パルスレーザーである。

しかし、小分子系についてはまだどちらも適用例が少なく、未知の部分が多い。そこで、二つのトリガーを交互印加して同一試料から両者のデータを一度に収集できるようシステムを改造し、運用できることを確かめた。本システムは、本課題で分析対象とする小分子系に対して二つのトリガー手法を比較、選択する上で明解な指針を与えるものと考える。平成27年度は平成26年度に続き、走査型アトムプローブ(以下SAP)によるアミノ酸の分析に取り組む上で、試料保持温度の検討、またリフレクトロン型高分解能SAPと二次元位置敏感型イオン検出器による直接投影型SAPとを連携させることに取り組んだ。試料の担持条件と試料保持温度の検討では、担持体であるカーボンナノチューブ(CNT)を親水化しなくとも担持のための試料溶液のpHあるいは塗布条件の検討により、親水化を省略できることが確認された。CNTの表面を損わずにAP分析することで夾雑イオンの検出を抑制できることが確かめられた。温度条件については、金属、あるいは無機半導体などの試料の場合と異なり、冷却するよりも室温付近での分析がイオンの収率から好適であることが分った。上記のような分析条件の検討ではリフレクトロン型高分解能SAPを用いたが、ここではパルス電界蒸発のためのトリガーに電圧パルスを用いた。一方、近年主流となった二次元検出器を用いる直接投影投影型アトムプローブでは高い質量分解能を得るためにはレーザーパルスでのトリガーがほぼ必須となっている。二つの装置のデータを連携させるには、いずれかの装置で電圧パルスとレーザーパルスを併用して結果を直接比較できることが望ましい。平成26年に二次元検出器による直接投影型SAPにおいてレーザーパルスと電圧パルスを1パルス毎に交互に用いて測定できるシステムを構築したので、これをアミノ酸を担持した試料に適用したところ、電圧パルスのシーケンスで得られるマススペクトルとレーザーパルスのシーケンスで得られるマススペクトルが優位に異なり、トリガー手法によって脱離するイオン種がが異なることが分った。このトリガーシーケンスを制御することで分子内の電荷移動についての知見が得られると期待される。(平成27年3月に補助事業の1年間の延長を申請し、3月20日に承認された。)走査型アトムプローブはアトムプローブをもとに代表者らが開発した装置である。走査型アトムプローブによって分子性試料の分析を行うための手法の開発を行なった。試料分子の担持体にカーボンナノチューブを用いることで、基本的な生体分子としてアミノ酸16種類について、マススペクトルを得るための条件を見出すことができた。分子性の試料の電界蒸発にあたっては、分子の拡散と試料先端部への移動が重要であり、低温への冷却はむしろ分析を困難にすることが明らかとなった。最適な電界蒸発のトリガー手法の選択のために、電圧/レーザーのトリガーを交互に印加してマススペクトルを同時取り込みし比較できるようなシステムを構築した。
Electroporation法を用いた高効率の遺伝子導入による虚血心筋内の血管新生

虚血心筋に対する治療は薬物、カテーテル治療、冠動脈バイパスがその中心で、transmyocardial revascularization(TMR)も検討されているが、その役割は補助的である。1990年より血管新生療法が導入され、FGF、VEGF、HGFなどの血管新生因子とこれらの発現遺伝子を用いた遺伝子治療の研究が進められている。我々はnakedDNAと植物レベルで遺伝子導入効率向上に成功したelectroporation法に着目し、ラットの下肢虚血モデルでVEGF発現遺伝子のnakedDNAが筋肉内投与で虚血下肢に発現し、血管新生を起こし、下肢血流を改善することを証明し、虚血性心疾患治療の基礎を築いた。現在、心筋虚血の治療法に応用を試みている。1990年前後より血管新生療法が導入され、FGF、VEGF、HGFなどの血管新生因子とこれらの発現遺伝子をもちいた遺伝子治療の研究が進められている。我々はnaked DNAと植物細胞レベルで遺伝子導入効率向上に成功したelectroporation法に着目し、"平成12年度基盤研究(C)Electroporation法を用いた遺伝子導入による虚血心筋内の血管新生"の補助のもとに研究を推進させた。我々はラットの下肢虚血モデルにおいて、VEGF発現遺伝子のnaked DNAが筋肉内投与で虚血下肢に発現し、血管新生を起こし、下肢血流を改善することを証明し、虚血性心疾患に対する治療法としての確立の基礎を築いた。Electroporation法は筋肉内投与に比べて高い遺伝子導入効率を示し、その有用性が確認された。引き続き犬を用いた動物の虚血心モデルを作成し、遺伝子導入によって心筋収縮能、組織血流量、血管構築形態与える影響を検討した。我々はElectroporation法を用いた遺伝子導入による虚血心筋内の血管新生の臨床応用が可能との結論し、注入するVEGF発現遺伝子のnaked DNAの投与量と遺伝子発現と臨床効果に関する情報を得たが、動物生体内のelectroporationの刺激様式、出力と遺伝子導入効率の関係が課題であった。今回の検討ではElectroporationの刺激様式と出力の至適条件を求め、Electroporation法を用いた遺伝子導入による虚血心筋内の血管新生治療は導入効率を最適化し、心筋に対するelectroporationが完全内視鏡下あるいは経カテーテル的に可能である事を検討した。1990年より血管新生療法が導入され、FGF、VEGF、HGFなどの血管新生囚子とこれらの発現遺伝子を用いた遺伝子治療の研究が進められている。我々はnakedDNAと植物レベルで遺伝子導入効率向上に成功したelectroporation法に着日し、ラットの下肢虚血モデルでVEGF発現遺伝子のnakedDNAが筋肉内投与で虚血下肢に発現し、血管新生を起こし、下肢血流を改普することを証明し、虚血性心疾患治療の基礎を築いた。
着床不全に対する新規治療法の開発とその臨床応用

ヘパリンの着床周辺期子宮内膜に及ぼす影響を明らかにするため、子宮内膜間質細胞(HESCs)脱落膜化機構に与える影響を検討した。培養上清中のPRL値は、ヘパリンを添加すると上昇した。また過酸化水素を添加することにより誘導されるアポトーシス細胞は、ヘパリンを添加すると減少した。FOXO1とMn-SODの発現はヘパリンを添加するとさらにその発現は増強した。anti-apoptotic因子のbclー2の発現もヘパリンの添加により濃度依存性に増強した。以上の結果よりヘパリンはHESCsの脱落膜化を促進し、さらには酸化ストレス抵抗性を高め、その適切な使用が着床率を向上させる可能性が示唆された。分離・培養したヒト子宮内膜間質細胞(HESCs)を8-bro-cAMPとmedroxyprogesterone acetate(MPA)の両者にて脱落膜化刺激を行い、両者から0、3、6日目にtotalRNA抽出を行った。脱落膜化の確認は、3・6日目の培養上清を採取し、脱落膜化マーカーであるプロラクチン、IGFBP-1の分泌が上昇している事を確認した。同様に3・6日目に培養細胞のタンパク精製を行い、Western blot法にてFOXO1の発現が脱落膜化刺激で誘導されることを確認した。形態学的に脱落膜化したHESCsは、大型で敷石状の脱落膜化細胞に特徴的な形態を示していた。脱落膜化群とcontrol群からmRNA抽出し、Realtime-PCR法にてFOXO1のmRNAの発現が脱落膜化刺激により誘導されていることを確認した。上記の方法で脱落膜化を確認した3症例を用いMicro-array解析を行い、10個の有意に発現が変動するmicroRNAを確認した。ヘパリンはこれまでに抗リン脂質抗体症候群などの凝固異常を合併した妊婦や習慣性流産や子宮内発育遅延などの産科合併症症例に対して投与が行われ一定の効果を示してきた。また明らかな凝固異常がない習慣性流産の症例にヘパリンが投与されその臨床効果も報告されている。そのためそのヘパリンの作用機序は現在一般的に知られている抗凝固作用以外にも、抗炎症作用や免疫制御作用等が想定されている。また近年のデータでは反復着床不全例に対して黄体期にヘパリンを投与する事により着床率の上昇さらには生産率の上昇が報告されている。本研究ではヘパリンの脱落膜化細胞への直接的作用を培養細胞にて検討し、着床不全症例に対する有効性に関して基礎的に証明を行い、さらにはその細胞内メカニズムを明らかにする事により、これまで経験学的に使用されていた着床不全症例に対するヘパリン投与に関してその分子生物学的メカニズムを明らかとし、これまで経験学的に行われてきたこの治療に対して科学的根拠を持たせる事を目的とした。本研究によりヘパリンを添加する事により子宮内膜脱落膜化細胞はFOXO1⇒SOD2の発現を促進する事により、酸化ストレス抵抗性を増強する事が明らかとなった。このことはヘパリンが子宮内膜の酸化ストレス抵抗性を増強する事により着床に有利に作用している可能性が示唆された。本研究ではこれまでに我々が明らかとした脱落膜化メカニズムの知見を基に、着床不全に対する治療法の確立を目的とし、平成23年度は1.脱落膜化へのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)の作用2.脱落膜化へのヘパリンの作用とその細胞内シグナルに関してin vitroに研究を行い、以下の知見を得た。1.の研究においては、hCGは現在その由来の違いによりrecombinant-hCG(rhCG)とurinary-hCG(uhCG)の2種類が使用されているが、脱落膜化マーカーである培養上清中のPRL値は脱落膜化刺激によりその濃度は上昇し、uhCGを添加するとさらに上昇したが、rhCGを添加すると逆に抑制された。また酸化ストレスよって誘導されるアポトーシス細胞はrhCGを添加すると減少したが、uhCGを添加すると逆に増加した。Mn-SODの発現は脱落膜化刺激により誘導され、rhCGを添加するとさらにその発現は増強され、uhCGを添加すると逆に抑制されることが明らかとなった。以上の結果よりhCGの由来により脱落膜化細胞に与える影響は異なることが明らかとなった。2.の研究では、脱落膜化刺激により上昇する培養上清中のPRLはヘパリンを添加するとさらに上昇した。また酸化ストレスにより誘導されるアポトーシス細胞は、ヘパリンを添加すると濃度依存性に減少した。FOXO1とMn-SODの発現は脱落膜化刺激により誘導され、高濃度のヘパリンを添加するとさらにその発現は増強した。anti-apoptotic因子のbcl-2の発現もヘパリンの添加により濃度依存性に増強した。