hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固体フッ素樹脂原料を用いた低環境負荷型バルクシリコン太陽電池表面処理技術の開発

大気圧近傍での動作が可能であり、エッチャント原料としてパーフルオロカーボンガス等の地球温暖化係数の高いガスを一切用いないドライ環境ドでの太陽電池用結晶シリコン表面処理技術を開発した。本手法により、太陽電池特性を悪化させるシリコンウエハ表面上の加工変質層の高能率除去、ならびにウエハ表面へのテクスチャ作製による表面反射率の低減を達成した。またエッチング挙動とプロセス条件の関係性を系統的に解明した。本年度は,固体フッ素樹脂原料の連続供給・冷却機能を具備したプラズマ処理装置を設計・製作した.製作した装置のプラズマ駆動電源には,汎用性の観点から13.56MHzを採用し,最大1KWの投入が可能となっており,また処理面積の大面積化を考慮してXYステージを搭載した装置システムを構築した.設計製作したプラズマ装置を用いて,幅10cm,長さ約2cmにわたり安定な大気圧近傍のプラズマを発生させることに成功した,また固体フッ素原料としてPTFE(ポリテトラフルオロエチレン)樹脂を採用し,PTFE表面とプラズマの反応により生じる生成分子種を同定するため,フーリエ変換赤外吸収分光法によりガス分析を行った.その結果,プラズマ雰囲気を希ガスのみで構成した場合には,PTFE表面から生成されるガス種は,フルオロカーボン系のガスのみであり,とりわけCF_4の生成が認められた.一方,プラズマ雰囲気中に酸素を混合した場合,PTFEから生成されるガスの主成分は,COF_2であることが分かった.また雰囲気への酸素添加によりPTFE表面からの反応ガスの生成量が飛躍的に増大することが明らかになった.この増大傾向は,プラズマへの投入電力が小さい時ほど顕著であった.生成が確認されたCOF_2は,Siのエッチングガスとして利用可能であり,CF_4に比べて格段に地球温暖化係数(GWP係数)が低いため,酸素添加によりGWP係数の低いエッチャントガスを,より効率的に生成できるということが分かった.一方,水素をプラズマ雰囲気中に混合した場合には,PTFE表面からのF引き抜き反応が予想される分析結果を得た.本年度は,太陽電池製造プロセスとしての適用性を実証することを目的として,シリコンのエッチング実験を行った.典型的なエッチング速度は,13.56MHzの電源を用い,酸素濃度5%,投入電力150Wの条件において0.7μm/minであった.ここでバルクシリコン太陽電池の変換効率の高効率化のためには,表面反射率の低減は必須である.そこでまず,プラズマ生成パラメータと表面粗さの相関を調べた.その結果,投入電力を一定とし処理時間を変化させた場合,処理時間の増大に伴って表面粗さが増大すると同時に,表面粗さの空間周波数も長周期化することが分かった.一方,処理時間を一定とし,投入電力を変化させた場合,表面粗さは投入電力の増大に伴って増加し,空間周波数は大幅に変化しない事が明らかとなった.次に各電力にて形成されたSi表面の可視光領域での絶対光反射率を分光光度計にて測定した.未処理の鏡面Si(001)ウェハでは,可視光領域で反射率が,67%から40%を示すのに対し,高電力条件で処理したSi基板では,その反射率を4%未満まで低下させることに成功した.また表面加工変質層を持つアズスライスSiウェハに対して本手法を適用し,加工変質層除去を試みた.その結果,Si表面に残存する変質層の完全除去が可能であることを確認し,形成された表面は無歪みであることが明らかとなった.本手法で得られたSi表面にてショットキーダイオードを作製し,その電流電圧特性を評価した.その結果,加工変質層の存在するSi表面では,一切整流性が観察されないが,本手法により加工変質層を除去することにより再現性良く整流性のあるダイオードを作製することができた.この電流電圧特性から求められるダイオード因子は,同一の仕様を持つ市販の鏡面加工Siウェハを用いた場合と比べ遜色のないものが得られた.本年度は,処理速度のさらなる高速化を狙うため,プラズマ励起周波数に60MHzのVHF帯を採用し,その加工特性に検討を加えた.周波数をRF(13.56MHz)からVHFに上昇させることで,プロセス雰囲気中の酸素濃度やプロセス全圧等について,安定にグロー放電を生成しうる条件の自由度が向上する効果があることを明らかにした.VHFプラズマではRFプラズマに比べ空間的に局在化する傾向があり,エッチング後のSi表面プロファイルから得られる最大エッチングレートは,VHFでは,RFの約3倍の値が得られた.このことは,VHFの採用により,より小さな体積空間に大きな電力を投入可能となったことを示唆しており,プラズマの発光輝度はRF励起に比べ5倍以上に達することを確認した.一方,放電ギャップを一様に保てば,VHF励起プラズマの生成面積を拡大することに支障は無く,これまでに40cmまでプラズマ幅の拡大に成功している.ここで表面粗さの観点では,VHF処理したシリコン基板の方が,RF処理した場合に比べて小さいことが明らかとなった.

このVHF励起プラズマにおいて,PTFE固体原料から生成されるエッチャントガスは,RF励起プラズマと同様にCOF_2であること,さらに本プロセス中では,SiF_4を生成することでSiのエッチングが進行していることをFTIR吸収分光法により明らかにした.さらに太陽電池用基板の大半が多結晶Si基板であることから,基本的な面方位である(110),(111),および(100)単結晶Si基板を用いて,本手法のエッチングレートと表面粗さの面方位依存性を調査した.提案する本プロセスでは,得られるエッチングレートおよび面粗さに面方位依存性は無い事が明らかとなり,ごの結果を踏まえて,太陽電池用多結昴Si基板の処理に本手法を適用し,面内一様な処理特性が得られる事を明らかにした.
凍結による生体組織レベルの細胞膜損傷の評価と保湿剤による損傷低減効果

本研究では,高細胞密度である生体組織レベルの試料における細胞同士の接触状態が凍結解凍過程において細胞膜損傷に与える影響を,配向と細胞密度を制御した単層培養細胞を用いて検討した.更に,保湿剤であるヒアルロン酸の細胞膜近傍の水和による生存率改善の可能性を探った.その結果,細胞密度が高くなると細胞膜損傷が増すこと,そして,細胞配向と凍結順序により損傷程度が異なることが示唆された.更に,ヒアルロン酸に細胞膜への凍結保護効果があることが明らかとなった.本研究では,高細胞密度である生体組織レベルの試料における細胞同士の接触状態が凍結解凍過程において細胞膜損傷に与える影響を,配向と細胞密度を制御した単層培養細胞を用いて検討した.更に,保湿剤であるヒアルロン酸の細胞膜近傍の水和による生存率改善の可能性を探った.その結果,細胞密度が高くなると細胞膜損傷が増すこと,そして,細胞配向と凍結順序により損傷程度が異なることが示唆された.更に,ヒアルロン酸に細胞膜への凍結保護効果があることが明らかとなった.生体組織レベルの凍結保存において低生存率である理由として,高細胞密度による細胞同士の接触機会増加が挙げられるが,一方で,保湿剤のピアルロン酸ナトリウム(HA)添加による細胞間の水和促進により細胞膜損傷を低減できる可能性がある.本研究では,組織を模した単層培養細胞を凍結保存し,解凍後の生存率と2次元生存分布を蛍光染色画像の解析により明らかにし, HAによる膜損傷の低減効果を評価することを目的とする.本年度は,配向制御された単層培養細胞を凍結・解凍し,蛍光画像により生存率測定を行い,更にHA添加による生存率改善効果について調べた.研磨紙で溝加工し滅菌された細胞培養用カバースリップ(Nunc, 24×24×0.2mm)表面上でヒト皮膚繊維芽細胞を5×10^5cells/cm^2で24h培養し配向試料とした.試料1枚に凍結保護液(10%ジメチルスルホキシド含有培養液)を加え,配向に対し方向を与えて冷却速度0.3°C/minで-185°C以下まで凍結させた.試料を解凍し,生細胞と死細胞をそれぞれCalcein-AMとDAPI(同仁化学)で蛍光二重染色し,蛍光倒立顕微鏡とデジタルCCDカメラを介し,画像処理・解析システムに蛍光画像と位相差画像を取り込み合成し,生死細胞数から生存率を算出した.また,同じ試料を用い,HA(濃度:00.5wt%)を加えた凍結保護液における凍結(冷却速度:0.3,3°C/min)解凍後の生存率も調べた.その結果,方向を与えて凍結すると溶液効果による生存率の低下がみられた,そして,細胞の配向に対し垂直に凍結方向を与えて冷却することにより生存率が改善されることが示唆された.更に,適切な濃度のHA添加により生存率が改善されることが示唆された.組織レベルの試料において一部でしか凍結保存が確立されていない要因の1つとして,懸濁細胞と組織の構造的違い,即ち,細胞密度の増加に伴う細胞同士の接触機会の増加が挙げられる.しかし,これが凍結解凍後の細胞生存に及ぼす影響とメカニズムについては不明である.また仮に,細胞密度の増加が細胞外の氷晶形成時に細胞膜損傷の増大を引き起こすならば,ヒアルロン酸等の保湿剤を添加することで細胞間隙や膜近傍における水和を促進し細胞膜損傷を低減できる可能性がある.本研究では,生体組織を模し得る試料として配向と細胞密度を制御した単層培養細胞を用いて凍結保存し解凍後に生存状態の2次元分布を蛍光染色画像の解析により明らかにし,細胞膜損傷の有無と生存の関連性について調べ,そして,ヒアルロン酸の添加による膜損傷の程度の違いと生存率を評価することを目的とする.本年度は,昨年と同様に配向制御された単層培養細胞を凍結し,解凍後に蛍光画像による生存分布の観測と生存率の局所的測定と全体的測定を行った.それと並行し,凍結保護物質としてヒアルロン酸を用いた場合の生存率改善効果と蛍光標識ヒアルロン酸の細胞への取り込みを調べた.その結果,非配向単層培養細胞では細胞密集により生存率が局所的に低くなったが,高密度の場合に配向細胞の方が非配向細胞と比べ全体的な生存率が高くなった.更に,ヒアルロン酸の細胞内における損傷低減効果が明らかとなった.また,蛍光ヒアルロン酸の細胞への取り込みが観察されたことから,保護作用に貪食が関与していることが示唆された.組織レベルの試料において一部でしか凍結保存が確立されていない要因の1つとして,懸濁細胞と組織の構造的違い,即ち,細胞密度の増加に伴う細胞同士の接触機会の増加が挙げられる.しかし,これが凍結解凍後の細胞生存に及ぼす影響とメカニズムについては不明である.また仮に,細胞密度の増加が細胞外の氷晶形成時に細胞膜損傷の増大を引き起こすならば,ヒアルロン酸等の保湿剤を添加することで細胞間隙や膜近傍における水和を促進し細胞膜損傷を低減できる可能性がある.本研究では,生体組織を模し得る試料として配向と細胞密度を制御した単層培養細胞を用いて凍結保存し解凍後に生存状態の2次元分布を蛍光染色画像の解析により明らかにし,細胞膜損傷の有無と生存の関連性について調べ,そして,ヒアルロン酸の添加による膜損傷の程度の違いと生存率を評価することを目的とする.本年度は,凍結保護物質(ジメチルスルホキシド)にヒアルロン酸を添加した場合の高密度単層培養細胞の凍結解凍後における生存率と膜損傷の程度の違いを評価するため,解凍後における蛍光画像による細胞生存率と細胞残存率の測定を行った.

その結果,ヒアルロン酸を添加した場合の方が添加しない場合よりも凍結解凍後の生存率が高くなった.しかも,細胞の凍結解凍による剥がれや脱落を示す細胞残存率も同様の結果となった.このことから,ヒアルロン酸を添加することで高細胞密度の場合の細胞膜の損傷と細胞内凍結による損傷が低減されることが明らかとなった.よって,ヒアルロン酸の水和作用を利用することで,細胞密度の高い組織レベルの試料において,細胞外の氷晶形成から細胞膜を守り,細胞内では氷晶が形成されにくくなることで,凍結保存における生存率の改善が期待される.
銀河面中の分子雲における分子雲衝突と大質量星形成の観測的研究

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。銀河系内の大質量星形成と分子雲衝突の関係を統一的・定量的に理解することを目指すために、本年度はまず、CO分子輝線サーベイとしてはかつてなく高角分解能でかつ広域に渡るFUGINプロジェクトの膨大なデータを取り扱うための解析環境(ワークステーション)の整備を行った。これを用い、効率的なデータ解析を行うためのfitsデータの生成、および分子雲の構造同定アルゴリズムを適用するために必要なスクリプトの作成を行った。これらの作業は概ね完了させた。そしてFUGINデータ内に含まれている領域Spitzer bubbleN4, N10, N14, N46の解析を個別に行った。その結果、これらの領域でも分子雲同士の衝突を示す証拠を得ることができた。これにより、これらの領域における先行研究で挙げられていた大質量星形成シナリオの問題点が解消される見込みである。特にN4における成果については研究会「天の川銀河研究会2017」(鹿児島大学)や日本天文学会2018年春季年会(千葉大学)にて口頭発表した。また、これらは現在投稿論文としても準備中である。この他にも、FUGINデータによって発見された他領域の分子雲衝突の結果についてミニワークショップ「分子雲衝突と大質量星形成」(北海道大学)にて口頭発表を行い、FUGINデータから同定した分子雲についてもワークショップ「Science Workshop 2018 on FUGIN: The Galactic Plane Legacy Survey for Molecular Clouds」(名古屋大学)にて初期成果を公表した。本研究課題で挙げた本年度の当初目標は、「1.対象の天体の領域の3次元データ(position - position - velocity)を生成する」,「2.領域中の分子雲を同定する」,「3.分子雲の可視化、及び物理量を導出する」,「4.分子雲衝突の傍証となるブリッジ成分や相補的分布をアルゴリズムにより見出す(分子雲衝突の検証を行う)」である。1と2に関しては概ね完了した。3については、可視化に関しては問題なく遂行可能であるが、物理量に関しては天体までの距離の不定性(例えばnear or far問題など)のため統一的に決定することができず遅れをとっている。これらの解決策については現在他の研究者らと議論している。4については既存のアルゴリズムの組み合わせで自動で行うのは難しいと判断し、保留としている。そのため、「研究が当初計画どおりに進まない時の対応」として予定していた個別領域での論文化をまず推進した。まずはH29年度で遂行できなかった「分子雲衝突の傍証となるブリッジ成分や相補的分布をアルゴリズムにより見出す(分子雲衝突の検証を行う)」の解決を目指す。そのために、アルゴリズム的に分子雲衝突の傍証を検出するのではなく、機械学習を導入して検出するように方法を変更した。先行研究で知られている分子雲衝突天体の分子雲データなどを教育データとして、FUGINの膨大なデータから類似した特徴を持つ領域を自動で選定するものを予定している。この導入と解釈のために、有志で行われている機械学習の勉強会に参加する。そして、個別天体としての成果およびFUGINデータ全域を通して明らかになった研究結果を投稿論文として執筆していく。また、国内外の研究会および学会にてこれらの成果発表を行っていく。
プラズマ周辺部に発生する揺動を活用した新たなELM制御法の開発

国際熱核融合実験炉ITER(及びそれ以降のDEMO炉)の標準運転シナリオにも採用されている閉じ込め改善モード(Hモード)では、プラズマ周辺部に輸送障壁が形成されることで高いプラズマ性能が得られる。これまでの研究により、プラズマ周辺部に自発的に発生する径電場によって通常モード(Lモード)の輸送特性を支配する乱流揺動が抑制されると考えられてきたが、揺動が抑制される物理機構については完全に解明されて無い部分もあり、物理解明に基づく将来の炉心プラズマの性能予測の向上が期待されている。本研究では、JT-60Uにおける高分解能での周辺径電場計測結果を基に、イオン及び電子の熱輸送と粒子輸送のそれぞれに対する径電場構造の非一様性効果を理論モデルに基づいて比較検証した。特に、JT-60U装置において固有な時間スケールの長いイオン系の熱輸送の改善が顕著な閉じ込め改善状態について、多スケールの乱流輸送状態に対する径電場のシアー、及び曲率の効果の影響を無次元パラメータを用いてスケールした結果、イオン及び電子の熱輸送と粒子輸送のそれぞれに影響する複数の乱流揺動の存在が示唆された。さらに、径電流を実験的に評価し理論モデルと比較検証した結果、高速イオンに起因する径電流はLモードのグローバル構造と矛盾しないが、実験値と比べて12桁小さく、かつ井戸型の径電場を形成する局所ピークする径電流構造を持たず、タイムスケールも異なることから径電場の遷移を引き起こす駆動力としては不十分であることが分かった。また、Hモードで観測される負電場構造の形成には、NBIによる追加熱・粒子補給による圧力勾配、あるいは乱流起因による駆動機構が示唆され、ペデスタル制御法を開発する上で重要な知見が得られた。本研究結果は、印国で開催された第27回IAEA核融合エネルギー会議及びプラズマ核融合学会でポスター発表を実施した。国際熱核融合実験炉ITER(及びそれ以降のDEMO炉)で想定されている標準的な運転モードでは、プラズマ周辺部において発生する大振幅のELM(Type-I ELM)によるダイバータ板の損耗が懸念されている。本研究では、炉心級プラズマの低衝突頻度領域においても実現可能な高性能でかつType-I ELM無しでも定常性を有する代替え運転モードを新しく開発するために、これまでに世界各国で得られているI-mode, QH-mode, Grassy/Type-II ELMsについて、その発生機構の物理解明を総合的に実施している。なかでも特に着目するのは粒子輸送特性の増加であり、これにはプラズマ周辺部における径電場構造の変化と乱流揺動特性との相関が重要であると考えられる。そこで、JT-60Uの既存データを用いた閉じ込め改善モード(Hモード)の発生に重要な径電場の構造についてシアー及び曲率に着目した解析を実施した。その結果、ペデスタル部における規格化されたイオン温度勾配のピーク値位置においては電場シアよりも曲率の方がより重要な役割を果たしていることを示唆する実験解析結果が得られた。Hモードのプラズマ周辺部の径電場に関して、核融合学会年会でシンポジウム講演を行うとともに、International ITER schoolで招待講演を行った。乱流輸送に関するNIFS及び九大との共同研究を実施し、共同研究論文の作成を実施した。当初想定していた外国装置での実験は先方の事情により不可となったので、JT-60Uの既存データを生かした解析により新しい研究成果が得られ始めているので、本研究課題は概ね順調に進展していると考えられる。本研究で特に注目する点は、粒子輸送を増加させつつ熱輸送を低減できる運転モードの開発であり、これにはプラズマ周辺部における径電場構造の変化と乱流揺動特性との相関の物理解明が重要であると考えられる。そこで、JT-60Uにおける高分解能での周辺径電場計測結果をもとに、閉じ込め改善モード(ELMの無いHモード)の発生に重要な径電場構造について1階微分(電場シアー)だけでなく2階微分(電場曲率)に着目した解析を進めたところ、ペデスタル部における規格化イオン温度勾配のピーク位置は、電場シアよりも電場曲率項が極大となる位置と強く相関していることから、曲率項の主要な役割が示された。また理論モデルから予測される径電場のシア及び曲率による非一様性効果によってペデスタル部のイオン熱輸送係数は新古典レベルまで低減することが分かった。本研究結果は、米国物学会及びプラズマ核融合学会でポスター発表するとともに、サイエンスレポート誌に掲載された。当初想定していた外国装置での実験が、先方の事情により不可能となったのが、JT-60Uの既存実験データを生かして、より新しい知見が得られたので、本研究課題は概ね進展していると考えられる。

本研究では、炉心級プラズマの低衝突頻度領域においても実現可能な高性能でかつType-I ELM無しでも定常性を有する代替え運転モードを新しく開発するために、これまでに世界各国で得られているI-mode, QH-mode, Grassy/Type-II ELMsについて、その発生機構の物理解明を総合的に実施している。本研究で特に注目する点は、粒子輸送を増加させつつ熱輸送を低減できる運転モードの開発であり、これにはプラズマ周辺部における径電場構造の変化と乱流揺動特性との相関の物理解明が重要であると考えられる。そこで、JT-60Uにおける高分解能での周辺径電場計測結果をもとに、閉じ込め改善モード(ELMの無いHモード)の発生に重要な径電場構造について、境界輸送障壁形成に対する径電場構造の非一様性効果を理論モデルに基づいて比較検証した。その結果、イオン及び電子の熱輸送と粒子輸送のそれぞれに影響する複数の乱流揺動の存在が示唆された。本研究結果は、英国で開催された第44回プラズマ物理に関する欧州物理学会(EPS-PPD)での招待講演及びプラズマ核融合学会でポスター発表すると共に、NF及びPPCF誌に掲載された。当初想定していた外国における装置を用いた実験が、先方の事情により不可能となったので、JT-60Uの既存実験データを生かして、より新しい知見を得ることができた。そのため、本研究課題は概ね進展していると考えられる。国際熱核融合実験炉ITER(及びそれ以降のDEMO炉)の標準運転シナリオにも採用されている閉じ込め改善モード(Hモード)では、プラズマ周辺部に輸送障壁が形成されることで高いプラズマ性能が得られる。これまでの研究により、プラズマ周辺部に自発的に発生する径電場によって通常モード(Lモード)の輸送特性を支配する乱流揺動が抑制されると考えられてきたが、揺動が抑制される物理機構については完全に解明されて無い部分もあり、物理解明に基づく将来の炉心プラズマの性能予測の向上が期待されている。本研究では、JT-60Uにおける高分解能での周辺径電場計測結果を基に、イオン及び電子の熱輸送と粒子輸送のそれぞれに対する径電場構造の非一様性効果を理論モデルに基づいて比較検証した。特に、JT-60U装置において固有な時間スケールの長いイオン系の熱輸送の改善が顕著な閉じ込め改善状態について、多スケールの乱流輸送状態に対する径電場のシアー、及び曲率の効果の影響を無次元パラメータを用いてスケールした結果、イオン及び電子の熱輸送と粒子輸送のそれぞれに影響する複数の乱流揺動の存在が示唆された。さらに、径電流を実験的に評価し理論モデルと比較検証した結果、高速イオンに起因する径電流はLモードのグローバル構造と矛盾しないが、実験値と比べて12桁小さく、かつ井戸型の径電場を形成する局所ピークする径電流構造を持たず、タイムスケールも異なることから径電場の遷移を引き起こす駆動力としては不十分であることが分かった。また、Hモードで観測される負電場構造の形成には、NBIによる追加熱・粒子補給による圧力勾配、あるいは乱流起因による駆動機構が示唆され、ペデスタル制御法を開発する上で重要な知見が得られた。本研究結果は、印国で開催された第27回IAEA核融合エネルギー会議及びプラズマ核融合学会でポスター発表を実施した。
文理解過程に働く予測的処理

人間の文理解過程において先行する文脈情報による予測が、後続する文の理解過程に与える影響及び文中の動詞特性の影響について検討した。実験の手法として、眼球運動測定装置によるVWP(VisualWorldParadigm)法や文完成課題などを用いた。刺激文として統語的構造に多義性を持つ文、語省略のある文、意味不整合語を含む文を使用した。その結果、先行情報の内容と後続の文処理との関係が種々明らかとなった。統語的に多義性のある言語材料として左右枝分かれ構造を対象に眼球運動計測実験を行った。具体的には、先行刺激による、いずれかの構造へのプライミングの有無および、韻律情報(第一要素および第二要素におけるピッチ幅の拡大の有無)を操作し、これらの相互作用のあり方を検討した。H22年度に行った実験においては、プライミング効果が独立して観察されたが、韻律情報の影響との関わりについては明確な知見が得られたとは言い難いが、現時点での結果を国際学会(CUNY Conference on Human Sentence Processing)におけるポスター発表にて報告した。今後に予定している動詞活用実験による理解過程実験のために、日本語の動詞データベースを以下の手順により作成した。(1)約78万語を網羅したNTTデータベースから全動詞約5千語を抽出した。(2)古語、方言、統語的複合動詞(歩き始めるなど)、「がる」の付く「痛がる」などの動詞を除外した。(3)表記が異なる動詞(会う、逢う)、送り仮名の異なる動詞(行う、行なう)については同一の語とした。(4)語末拍子音と直前の母音によりI類動詞を抽出した。ただし子音が/r/で母音が/i,e/の動詞については、視察によりI類か、II類に分類した。(5)各動詞にアクセント型、単語属性(親密度、頻度、心象性など)の情報を付加した。その結果7割近くがI類、残り3割がII類動詞であった。このデータベースを用いることにより動詞の活用に関する心内処理過程を明らかにすることが可能となった。被験者の眼球運動を自然な形で測定できる装置(Tobii)を導入し、拡張PWI法を確立するための予備実験を開始した。1)左右枝分かれ構造の曖昧性のある文の処理に関する、視覚文脈情報と韻律情報の相互作用を眼球運動測定実験に基づいて引き続き進めた。本年度は、視覚情報により想起されるコントラスト情報と韻律情報により示されるコントラスト情報が整合している場合としていない場合の要因の組み合わせに多様性を持たせ、複数の実験を行った。その結果言語外情報としての視覚情報とパラ言語情報としての予測的処理の関係を明らかとした。2)文の理解・生成において単語間の統語構造を割り出すためには、動詞のもつ意味、統語、音韻情報の処理が必要であり、その際の予測・利用の容易性に影響を及ぼす要因を検討を進めている。日本語の自他対応動詞(ex.切れる/切る)は類似の意味、音韻情報をもつが、統語情報は異なる。本年度は、自他対応動詞の処理容易性について、失文法患者を対象に文完成課題を行った。その結果、統語処理の複雑さより、語長や、類似語(自他対応動詞対)の存在が文処理に影響を及ぼすことが明らかとなった。3)予測的文処理過程を観測するために眼球運動測定装置(Tobii)と心理実験ソフト(e-prime)の連携スクリプトの作成を行った。また、取得データのビジュアライズ化をはかるため、停留時間の分布、停留点のプロット、注視時間の解析プログラムを作成し取得データの妥当性の検討とデータ特性の洞察を容易とした。これによりマルチモーダルな刺激、ビデオによる言語外情報の提示による実験が効率的に実施可能となった。また、予測的処理における言語外情報、言語知識の利用を明らかにするための未知語処理に関する実験パラダイムを考案した。なお、上記の成果は、国内外の学会発表及び論文投稿した。1)左右枝分かれ構造の曖昧性の処理過程を明らかにするため、前年度の条件を拡張し、視覚文脈情報と韻律情報のコンフリクトについて眼球運動測定実験により検討した。また、同じ実験パラダイムを用い、複合語の前部要素のアクセント情報を利用した複合語構造の予測可能性及び主語目的語関係節の処理負荷・効率性を調べる実験を成人および小学校低学年児童に行った。この結果、6から7歳児では、成人とは異なった情報の利用のあり方が示唆された。これら結果を国際学会で発表した。2)先行文の情報の冗長性による予測処理をVWP(Visual-World Paradigm)により検討した。文処理における語省略の影響を32名の被験者により実験した。その結果、聴取している音声にしたがって眼球が動く傾向が強くあらわれ、予測的な処理を反映した運動は観測されなかった。この結果は、Kamide et al.(2008)やIto & Speer(2008)による予測定処理を反映した眼球運動がVWPで観測されという結果と異なるものである。この相違についてはさらなる検討が必要である。

未知語や意味不整合語を含む文のオンライン処理を眼球運動測定により観測し、文脈処理がどのように進行するかの時間的側面を検討した。3)文の理解・生成における統語構造の予測には、動詞の持つ意味、統語、音韻情報を適切に処理する必要がある。統語構造の予測の容易さに影響を及ぼす動詞の特性について、失文法患者1例を対象に文完成課題実験を行った。その結果自他対応動詞(ex.閉まる/閉める)の処理に困難があり、なかでも非対格自動詞(ex.閉まる)の統語構造の予測・決定が困難であった。これは文のD構造からS構造が導かれる過程の複雑性から解釈できることを示した。また、動詞の長さや形態の処理も予測に影響をもつことを明らかとした。これは認知神経心理学研究会の発表賞を受けた。予測的処理に関わる情報の影響が明らかになりつつある。得られた成果をもとに国内外の研究者と情報交換を行い、今後の共同研究の計画について発展的検討を行うことができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)国内外の研究者との共同プロジェクトとして、本科研終了後にもさらなる発展あるいは新規研究計画につなげることにつとめる(2)健常者と失文法患者の対照実験をさらに強化する。(3)眼球運度測定装置を用いた新実験を推進する。
RBタンパク質の機能ドメインの解析

我々はRBタンパク質がM期特異的cdc2キナ-ゼによってin vitroでリン酸化されることを以前に示してきたが,in vivoではRBタンパク質のリン酸化はG_1/S期の境界線から始まりM期まで続く。そして,RBタンパク質による増殖抑制活性がこのリン酸化で解除されると推定される。そこで,G_1/S期特異的なものを含むすべてのRBキナ-ゼを検出することを試みた。その過程で,マウスFM3A細胞のcdc2キナ-ゼがMonoSカラムクロマトグラフィ-でG_1/SとG_2/M特異的な2つのピ-クに分かれ,RBキナ-ゼのピ-クはその2つの間に現れることを見出した。RBタンパク質上にはcdc2キナ-ゼの基質になるための共通配列をもつ部位が11ケ所に存在するが,それらの部位を含む合成ペプチドはすべてこのRBキナ-ゼのピ-ク分画でリン酸化された。さらに,このピ-クとほぼ重なる領域にサイクリンAが検出された。一方,RBタンパク質をリン酸化するキナ-ゼが抗RB抗体によってRBタンパク質と共沈殿されることも見出した。その活性は特にG_1/S期に強いこともわかった。以上の結果はG_1/S期にRBタンパク質をリン酸化する酵素がcdc2キナ-ゼであることを示唆しているけれども,in vivoとin vitroでリン酸化部位が一致するか否か,さらに,そのcdc2キナ-ゼに含まれているサイクリンの種類なども今後明らかにせねばならない。また,我々は,RBタンパク質のC末端から317個のアミノ酸をもつポリペプチドを大腸菌で発現させ,これを用いてRBタンパク質に対するモノクロ-ナル抗体を作製することにも成功した。これらの抗体はRBタンパク質の免疫沈降にも使えることがわかった。
肝細胞の癌化に伴うTGF-β応答性喪失のメカニズム―Src kinase分解酵素の関与―

これまで肝細胞癌ではTGF-βに対する反応性が低下しており、そのことが自律的細胞増殖の一因である事を示して来た。そして、TGF-βに対する反応性が保たれている細胞株ではSrc蛋白がTGF-βにより減少する事から、TGF-βにより誘導されるSrc分解酵素が存在する可能性が考えられ、TGF-βによる細胞増殖調節機構において重要な役割を果たしている可能性がある。本研究の目的は、このSrc分解酵素を同定することである。当初、Src分解酵素活性測定系の確立を目指しそれなりの活性が得られたが、その後測定系の再現性が乏しく、現在の処、充分に安定した結果を得られていない。今後もSrc分解酵素活性測定系の確立に向けて検討を行なう予定である。一方、その後の検討で、TGF-βによるSrc分解亢進の主なメカニズムは、むしろTGF-βによりSrc ubiquitinationが亢進し、proteosomeにより分解されるubiquitin-proteosome系が関与することによる可能性が強いことが判明してきた。現在、HepG2細胞を用いてTGF-βによるSrc ubiquitination亢進のメカニズムについても明らかにしつつある。肝細胞癌では、TGF-betaに対する反応性が低下していることを、私共は明らかにしてきた。また、肝細胞癌ではSrcが過剰に発現されており、Srcの分解の低下がその一因であることを示して来た。免疫組織化学的な検討では、肝細胞癌の先進部でSrcの発現が特に強いことを見い出しており、Srcの発現が癌の浸潤能に関与している事を示すものと思われる。これまで私共は、Srcの分解に関与するproteinaseが存在することを想定して、そのproteinaseの同定すべく研究を行なって来た。しかし、その後の検討で、そういったproteinaseよりもむしろ、proteosome-ubiquitinationsystemによるSrcの分解がTGF-betaによって制御されている可能性が示唆される結果を得ている。今後、proteinaseの同定のみならず、protcesome-ubiquitination systemについても検討を行なって行く予定である。
陰茎海綿体平滑筋細胞を用いた海綿体再生による難治性勃起障害治療法の開発

糖尿病モデルラットにおいて私達は、(2)糖尿病発症8週後には、陰茎海綿体内の平滑筋の減少と結合組織の相対的増加が認められる。(3)糖尿病発症812週後の間に、勃起機能に重要な静脈閉鎖機構が阻害され、海綿体洞からの血液の流出が生じる。(4)その結果、糖尿病発症12週以後、勃起時の海綿体内圧が低下し、顕著な勃起障害が出現する。以上より、糖尿病ラット陰茎では、陰茎海綿体平滑筋の減少およびそれに伴う勃起障害の発症時期に比較して、糖尿病のごく早期からIGFBP-3の発現量の増加を認め、糖尿病でのIGFBP-3の発現量の増加は勃起障害の結果ではなく原因のひとつであることが示唆された。(Urology 2007,Soh, et. al.)この実験結果を踏まえて、糖尿病モデルラットの陰茎において認められたIGFBP-3の高発現が、ヒトにおいても同様であるのかを確認するために、ヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMC-1)を用いて、糖尿病モデルとして、高グノコース刺激を加えることによりヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMc-1)内でのIGFBP-3の発現量の変化および平滑筋細胞の障害の程度とIGF-Iの細胞増殖能を検討した。結果、ヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMC-1)は高グルコース刺激により細胞内のIGFBP-3の発現量が増加しており、そのIGFBP-3の発現亢進により、増殖因子としてのIGF-1の作用が低下していると考えられ、ヒトにおいてもラットと同様に、糖尿病における陰茎海綿体平滑筋減少との関連が示唆された。私達はヒト陰茎海綿体平滑筋細胞を用いて、高血糖状態での平滑筋細胞の障害の程度とinsulin-like growthfactor-1(IGF-1)の細胞増殖能を検討した。【対象と方法】今回用いた細胞は、大阪大学大学院医学系研究科器官制御外科学(泌尿器科学)のグループが独自に分離培養したヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMC-1)である。方法はOCSMC-1を正(5.6mM)または高(25mM)血糖下で、それぞれにIGF-1を0,0.1,1,10ug/mlを加えた後、1,3,6,12日間培養を行った。細胞障害性はMTT Assayにて評価した。【結果】OCSMC-1の障害は、1日間の培養では正常血糖状態と高血糖状態に差を認めなかった。しかし、3,6,12日間の培養では高血糖状態において明らかにOCSMC-1の増殖は抑制されていた。また、正常血糖状態においてはIGF-1を加えることによりOCSMC-1の増殖能の亢進が認められ、その効果は1,3,6,12日間の培養期間中持続したが、期間が延びるほど細胞増殖効果は低下する傾向を示した。高血糖状態におけるIGF-1の細胞増殖効果も同様に、1,3,6,12日間の培養期間中OCSMC-1の増殖能の亢進が認められた。しかし最大投与量である10ug/mlを加えた群は0.1および1ug/mlを加えた群よりも効果が低下していた。【結論】ヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMC-1)は高血糖刺激により細胞傷害活性が亢進し、増殖能が抑制されており、糖尿病における陰茎海綿体平滑筋減少との関連が示唆された。また、IGF-1は正常血糖状態および高血糖状態のいずれにおいてもOCSMC-1の増殖能を亢進させており、EDの予防や難治性のEDに対する治療に結びつく可能性が示唆された。

糖尿病モデルラットにおいて私達は、(2)糖尿病発症8週後には、陰茎海綿体内の平滑筋の減少と結合組織の相対的増加が認められる。(3)糖尿病発症812週後の間に、勃起機能に重要な静脈閉鎖機構が阻害され、海綿体洞からの血液の流出が生じる。(4)その結果、糖尿病発症12週以後、勃起時の海綿体内圧が低下し、顕著な勃起障害が出現する。以上より、糖尿病ラット陰茎では、陰茎海綿体平滑筋の減少およびそれに伴う勃起障害の発症時期に比較して、糖尿病のごく早期からIGFBP-3の発現量の増加を認め、糖尿病でのIGFBP-3の発現量の増加は勃起障害の結果ではなく原因のひとつであることが示唆された。(Urology 2007, Sohetal.)この実験結果を踏まえて、糖尿病モデルラットの陰茎において認められたIGFBP-3の高発現が、ヒトにおいても同様であるのかを確認するために、ヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMC-1)を用いて、糖尿病モデルとして、高グルコース刺激を加えることによりヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMC-1)内でのIGFBP-3の発現量の変化および平滑筋細胞の障害の程度とIGF-Iの細胞増殖能を検討した。結果、ヒト陰茎海綿体平滑筋細胞(OCSMC-1)は高グルコース刺激により細胞内のIGFBP-3の発現量が増加しており、そのIGFBP-3の発現充進により、増殖因子としてのIGF-Iの作用が低下していると考えられ、ヒトにおいてもラットと同様に、糖尿病における陰茎海綿体平滑筋減少との関連が示唆された。
Cryptococcus症の危険因子としての抗サイトカイン自己抗体の解析

クリプトコックスを含む感染症に抗サイトカイン自己抗体が関与している可能性があると考え、血清中の抗IFN-γ抗体測定の目的で、Luminexマルチプレックス法による測定系の確立を行った。まず、リコンビナント-ヒトIFN-γをマルチプレックスビーズにアミンカップリング法で固定化させた。IFN-γを固定化させたビーズにより抗IFN-γ抗体が検出できるかどうかを、マウス由来抗ヒトIFN-γ抗体を用いて評価した。5×10^3/wellのビーズで抗ヒトIFN-γ抗体1μg/mlと2μg/mlを測定したところ、蛍光強度はそれぞれ2200、8800と抗ヒトIFN-γ抗体の濃度が高いほど蛍光強度が強くなったことから、ビーズとIFN-γのアミンカップリングは成功していると考えた。次に、患者血清中に抗IFN-γ抗体が存在するかどうかを、比較的患者数の多い肺結核および肺非結核性抗酸菌症患者の血清を用いてIFN-γを固定化させたビーズを用いてマルチプレックス法で測定したが、いずれの血清でも抗IFN-γ抗体は検出されなかった。抗酸菌感染症患者の血清では抗IFN-γ抗体は検出されなかったが、クリプトコックス症患者の保存血清を前向きに収集しており、上記測定系を用いて解析予定である。また、GM-CSFやTNF-αなど他のサイトカインに対する自己抗体の測定系の確立を行っている。さらに患者側要因だけではなく、菌側の病原因子を解析するため、当院で今までに分離されたクリプトコックス68株の遺伝子型を解析し、MLST(Multi locus sequence typing)ではST5が63株、ST2、ST4、ST32が1株ずつ、ST43が2株で、URA5-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)ではVNIが66株、VNIIが2株という結果であった。血清中の抗サイトカイン自己抗体を検出するためのビーズを作成中である。まずは血清内の抗IFN-γ抗体を検出するために、Multiplexアッセイ用ビーズにrh IFN-γを吸着させ、それがマウス由来の抗ヒトIFN-γ抗体を検出できるかどうかを確認している。抗サイトカイン自己抗体として抗IFN-γ抗体を選択した理由としては、抗IFN-γ抗体は真菌症のみではなく、抗酸菌感染症など他の感染症でも検出されうる可能性があること、また、抗IFN-γ抗体の測定キットとしてELISAのプレートが市販されていることから、Multiplex法の確立を確認するためには最も最適な抗サイトカイン自己抗体と考え、選択した。具体的には、COOH-ビーズをEDC(エチルカルボジイミド)とS-NHS(スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド)で活性エステル化し、rh IFN-γと反応させることでrh IFN-γをCOOH-ビーズに固定化させた(アミンカップリング)。次に、COOH-ビースへのrh IFN-γの固定化が成功しているかどうかを、PEを結合した抗ヒトIFN-γ抗体を用いて確認を行っているが、現在、アミンカップリングが安定しておらず、他の研究機関とも相談し、吸着させるrh IFN-γの種類や濃度を変更しながら、アミンカップリングについての条件検討を行っている最中である。アミンカップリングはこの研究の根幹となる部分であるため、様々な条件で試行し、最も安定した結果が得られる最適な条件を見つけ出す必要がある。抗サイトカイン自己抗体の測定を行う患者血清は、順調に収集できている。Bioplexアッセイ用ビーズへのrhIFN-γの吸着(アミンカップリング)にばらつきがあり、吸着させるrh IFN-γの種類や濃度を変更して試行しているが、抗IFN-γ抗体を安定して検出できていない。現在、他の研究機関にも相談し、最適な条件を検討中である。本研究では、血清中の抗サイトカイン自己抗体を検出するためのビーズ作製が最も重要なステップである。抗サイトカイン自己抗体としては抗インターフェロン-γ(IFN-γ)抗体を候補としている。2016年度は、血清中の抗サイトカイン自己抗体を検出するためのBioplexアッセイ用ビーズの作製段階において、COOH-ビーズをEDC(エチルカルボジイミド)とS-NHS(スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド)で活性エステル化し、rh INF-γと反応させることでrh IFN-γをCOOH-ビーズに固定化させるアミンカップリングが順調にいかず、ビーズ作製のための条件調整に難航した。2017年度はアミンカップリングに成功し、抗サイトカイン抗体検出用のビーズが抗IFN-γ抗体を検出できることを、抗ヒトIFN-γ抗体を用いて確認できた。今後は、実際の臨床検体である患者血清を用いて患者血清中の抗IFN-γ抗体を測定する予定である。当初は2年間の補助事業期間であったが、上記のように研究に遅延があったため、補助事業期間を延長した。2016年度にBioplexアッセイ用ビーズの作製に遅延があり、全体としての進捗が遅くなった。2017年度にビーズが作製でき、今後は臨床検体の測定に移行するため、今後の研究は予定通り遂行できると考えている。

IFN-γを固定化させたビーズにより抗IFN-γ抗体が検出できるかどうかを、マウス由来抗ヒトIFN-γ抗体を用いて評価した。5×10^3/wellのビーズで抗ヒトIFN-γ抗体1μg/mlと2μg/mlを測定したところ、蛍光強度はそれぞれ2200、8800と抗ヒトIFN-γ抗体の濃度が高いほど蛍光強度が強くなったことから、ビーズとIFN-γのアミンカップリングは成功していると考えた。次に、患者血清中に抗IFN-γ抗体が存在するかどうかを、比較的患者数の多い肺結核および肺非結核性抗酸菌症患者の血清を用いてIFN-γを固定化させたビーズを用いてマルチプレックス法で測定したが、いずれの血清でも抗IFN-γ抗体は検出されなかった。抗酸菌感染症患者の血清では抗IFN-γ抗体は検出されなかったが、クリプトコックス症患者の保存血清を前向きに収集しており、上記測定系を用いて解析予定である。また、GM-CSFやTNF-αなど他のサイトカインに対する自己抗体の測定系の確立を行っている。さらに患者側要因だけではなく、菌側の病原因子を解析するため、当院で今までに分離されたクリプトコックス68株の遺伝子型を解析し、MLST(Multi locus sequence typing)ではST5が63株、ST2、ST4、ST32が1株ずつ、ST43が2株で、URA5-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)ではVNIが66株、VNIIが2株という結果であった。ビーズへのサイトカイン吸着の確立は、他の研究機関に問い合わせながら試行し、今年度の早い段階での確立を目指す。患者血清は順調に収集できており、抗サイトカイン自己抗体用ビーズが完成すれば、解析自体は短期間で可能と考える。GM-CSF欠損マウスについては、現在、NIHからの譲渡、および当研究施設での飼育についての手続きを進めている。2017年度に作製したBioplexアッセイ用ビーズを用いて、患者血清中の抗IFN-γ抗体を測定する。動物実験については、GM-CSF欠損マウスを用いる予定であるが、実験施設の管理の面で難航している。遺伝子欠損マウスの入手が困難な場合は、免疫抑制マウスなどを用いて代理の実験を行う予定である。研究の進行がやや遅れており、そのために計画していた必要額よりも使用した金額が少なかったため。本年度は、初年度の研究(抗サイトカイン自己抗体測定用ビーズの作製)の遅延が影響し、当初予定していた臨床検体中の抗サイトカイン自己抗体の測定やマウスを用いた動物実験を行わなかったため、測定用ビーズやサイトカインなどの試薬の追加購入、マウスの購入を行っておらず、計画していた必要額よりも使用した金額が少なかった。研究の進行とともに研究試薬などは当初の計画通り必要になるため、物品費として使用する予定である。研究の進行とともに、研究試薬などは当初の計画通り必要になるため、物品費として使用する予定である。補助事業期間延長承認(承認日:平成30年3月20日)
植物起源炭化水素による汚染大気中のオゾン生成最適化に関する研究

都市の汚染大気におけるオゾンの光化学生成に関わるプロセスを明らかにするために、これまで知られている窒素酸化物(NO_x)や人為起源の非メタン炭化水素(NMHC)の他に植物起源のNMHCの寄与を季節変化を含めて調べることを目的とする。そのために、オゾンの光化学生成に不可欠な炭素数210までの炭化水素の連続測定装置を構築し、都市大気の観測を開始した。特に植物起源の炭化水素として、イソプレン、αピネン、βピネンに注目し、他の炭化水素(主に人為起源)との比や、NO_xとの比を調べ、オゾンの日中の生成量との関係を調べる。また、NMHCの測定のほかに大気中のオゾン濃度、NO_xおよび全天日射量、オゾンの光解離に関わるB領域紫外線強度、NO_xの光解離に関連のあるA領域紫外線強度の自動連続測定も実施した。データは一分毎にパーソナルコンピュータに記録されている。これらの測定データをもとに都市大気におけるオゾンやその前駆物質の季節変化、日変化を調べるとともにオゾン濃度の日中の増加量がオゾンの前駆物質であるNMHCやNO_xの濃度とどのような関係にあるか、またNMHCがNO_xに対して相対的に増加することによりオゾンの生成量にどのような影響を与えるかを調べている。全ての測定装置が完成したのが昨年冬であるため、季節変化を議論できるには至っていないが、観測は継続中であり、光化学モデルの構築と測定データをモデルに取り入れたデータ解析を行う予定である。昨年秋の交付決定後、NMHCの測定システムの構築にとりかかった。測定システムは大気試料サンプリングユニット、分析ユニットで構成される。大気試料サンプリングユニットは、ポンプで吸引した試料空気をエアロゾル、水蒸気、オキシダントを除去した後、濃縮部(吸着剤を充填したU字管を摂氏-60度に冷却し大気中のNMHCを吸着させ、一定量の試料大気を吸引後加熱し捕集されているNMHCなどの試料をガスクロマトグラフィーに送る)から構成される。また分析ユニットは水素炎イオン化検出器付ガスクロマトグラフィー(GC/FID)、データ処理部から構成される。GCのキャリアガスは高純度のヘリウムを用い、さらに活性炭などによる精製を施し、ノイズの軽減し感度の向上に努めている。現在、マニュアルによる測定システムの組み立てが終わり、標準ガスを用いたシステムの測定精度、検出限界の試験を実施している。この試験が終わり次第、外気の分析を実施し、都市大気中のNMHCの組成の定量とその季節変化を観測する。また、外気の分析を行いながら同時に試料吸引ポンプ、バルブ、濃縮・脱着をタイマー制御し自動化を進める準備を並行して行う予定である。また、これらと並行して大気中のオゾン濃度、窒素酸化物濃度(NOX)の自動連続測定を実施している。データは一分毎にパーソナルコンピュータに記録し、都市大気におけるその季節変化、日変化を調べるとともに本研究の目的であるオゾン濃度の日中の増加量がオゾンの前駆物質であるNMHCやNOXの濃度とどのような関係にあるか、またNMHCがNOXに対して相対的に増力することによりオゾンの生成量をどのような影響を与えるかを調べる。都市の汚染大気中のオゾンの光化学生成の季節変化を説明するうえで、植物起源の炭化水素の寄与を調べることを目的とし、オゾンの光化学生成に不可欠な非メタン炭化水素(NMHC)の連続測定を実施した。炭素数210までの炭化水素の連続自動測定装置を構築し、連続測定を3時間毎に実施している。外気の分析を行いながら同時に試料吸引ポンプ、バルブ、濃縮・脱着をタイマー制御し自動化したものであるう。特に植物起源の炭化水素として、イソプレン、テルペンに注目し、他の炭化水素(主に人為起源)との相対的濃度の変化を調べている。また、これと並行して大気中のオゾン濃度、窒素酸化物濃度(NO_x)および全天日射量、オゾンの光解離に関わるB領域紫外線強度、NO_xの光解離に関連のあるA領域紫外線強度の自動連続測定を実施している。

これらの測定データをもとに都市大気における季節変化、日変化を調べるとともにオゾン濃度の日中の増加量がオゾンの前駆物質であるNMHCやNO_xの濃度とどのような関係にあるか、またNMHCがNO_xに対して相対的に増加することによりオゾンの生成量にどのような影響を与えるかを分析した。これまでの結果では、冬から春にかけて植物起源と考えられるイソプレンの増加が観測されており、詳細な解析が必要であるが、季節進行にともなう植物起源の炭化水素の増加が、冬から春、夏にかけてのNO_xに対するNMHCの相対的な増加に寄与している可能性がある。
寄生性細菌の上皮細胞付着機構に関する研究

我々は齧歯類の肺炎病原菌、CAR(カー)バチルスのin vitro感染系を確立し、位相差検鏡下で培養細胞に本菌が付着・増殖する様態をリアルタイムに観察することができる。本研究では、本菌の上皮細胞付着に関わる細菌側の分子を探索するため、本菌のゲノムシークエンスを行い約140万塩基対の環状DNA完全配列と約1,200のコード領域を得た(ほとんどのコード領域は既報の遺伝子との相同性が低い)。発現遺伝子の網羅的解析のためDNAチップをデザインした。マウス・ラットの肺炎病原菌CARバチルスは、純培養ができず増殖や感染の機構は不明である。我々は本菌のラット分離株をVero E6細胞に加えてin vitro感染系を確立した。本菌は位相差顕鏡下で、培養細胞に付着・増殖する様態、そして細胞及び菌の死をリアルタイムに観察することができる。本研究は、本菌の細胞付着に関わる細菌側の分子候補を探索することを目的とした。本菌のゲノム情報は16S rRNA遺伝子配列以外、全く知られていなかったため、昨年度に本菌のゲノムシークエンスを東京大学新領域創生科学研究科オーミクス情報センターの服部正平教授との共同研究として行なった。その際、培養細胞の上清を使うことにより本菌を培養細胞なしに単独で増殖させる条件を発見し、培養細胞ゲノムの混入がない高純度の菌ゲノムDNAを抽出して全長約140万塩基対のドラフトシークエンスを得た。本年度はギャップクロージングと低クオリティ部分の再シークエンスを行い、最終的にCARバチルスの環状DNA完全配列を得ることができた(全長1,439,084塩基)。プラスミドは持っていなかった。MetaGeneAnnotatorを用いてオープンリーディングフレームを抽出し、nrデータベースを対象にBLAST解析を行ったところ、34のtRNA、1つのrRNAセット、約1,700のコード領域を確認できた。ほとんどのコード領域は既報の遺伝子との相同性が低く、CARバチルスは今までに解析された細菌ゲノムとは異なる独特のゲノムを持つと推定された。当初はRNAseqを行う予定であったが、参考にできる菌が見当たらないため、複数の培養条件における本菌の発現遺伝子を網羅的に比較することに方針を変更し、コード領域などの塩基配列からDNAチップをデザインした。今後、このDNAチップを使用して本菌の細胞付着分子に関する発現遺伝子の探索を進めていく。我々は本菌をVero E6など数種の培養細胞に加えてin vitro感染系を確立した。本菌は培養顕微鏡下で視認可能な大きさとなって培養細胞に付着・増殖するが、この様態は位相差顕鏡で容易に観察可能で、4週間4ステージにわたる菌増殖、細胞への付着と増殖、そして細胞及び菌の死をリアルタイムに確認することができる。本研究ではこの系を用いてこの寄生性細菌が上皮細胞に付着する機構を明らかにするために、定着に必要な細菌側の分子候補を探し出すことを目的とした。本菌のゲノム情報は、16S rRNA遺伝子配列以外、全く知られていなかったため、平成24年度はまず本菌のゲノムシークエンスを行なった。当初は培養細胞上で増殖した菌からゲノムDNAを抽出する予定であったが、細胞培養上清を使って同菌を培養細胞なしに単独で10<8>/mlまで増殖させる条件を見つけ出し、培養細胞のゲノムDNAの混入のない高純度のゲノムDNAを抽出することができた。ゲノムシークエンシングは東京大学新領域創生科学研究科オーミクス情報センターの服部正平教授との共同研究の下、Roche社の454 GS FLX+を用いて、全長1,435,797塩基のドラフトシークエンスを得ることができた。いままでに分かった本菌のゲノムの特徴は、1.既知遺伝子とのblastpの値が極めて低いこと、2.ゲノムが小さいこと、3.鞭毛遺伝子が見当たらないことなどである。現在、ギャップ部位のシークエンシングや低クオリティ部位の再シークエンスなどを進めている。CARバチルスの単独培養系を確立することができ、高純度の同菌ゲノムDNAを抽出し、全ゲノムのドラフトシークエンシングを既に終え、平成23年度の目標をクリアしているため。補完的な部分塩基配列のシークエンシングも進行中で、2012年5月には完全長ゲノムシークエンスが判明する予定である。CARバチルスは、16S rRNA遺伝子配列解析から推定されたのと同様、ゲノムDNAのblastp解析からも、類縁菌のゲノム情報がほとんど調べられていない未知の肺炎菌であることがわかった。ドラフトの段階ではあるが、CARバチルスが属すると考えられるCytophaga-FlavobacteriumグループのFlavobacterium johnsoniaeで報告されている滑走機構に関わる遺伝子群と類似性がある遺伝子も存在しないようである。我々の系で全く新しい付着・運動機構が見出せる可能性は高い。