hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
mRNA品質管理機構におけるユビキチン化の新規機能の解析

生命現象の基盤となる遺伝子発現の正確性は、細胞の保持する様々な品質管理機構によって保証される。我々は、mRNAの分解促進に加えて、翻訳抑制とタンパク質の分解が異常mRNA由来の遺伝子産物の発現抑制に重要であることを明らかにしてきた。我々は、連続した塩基性配列を持った新生鎖がリボソームトンネルと静電相互作用する結果、翻訳伸長反応が阻害されることを明らかにした。また、翻訳アレストの結果、1mRNAの分子内切断と、2合成途中の新生鎖のプロテアソームによる迅速な分解が起こることを見出した。さらに、翻訳伸長途中で停滞したリボソームが各サブユニットに解離し、60Sサブユニット上の新生鎖がユビキチン化後にプロテアソームによって迅速に分解されることが明らかになった。本研究では、翻訳伸長段階での異常を認識し、異常なmRNAとタンパク質を排除する品質管理機構の解明を目的とする。特に、NGDにおける分子内切断反応に必須なE2/E3ユビキチンライゲースUbc4/Hel2の機能解析を行い、ユビキチン化がmRNA分子内切断を引き起こす分子機構を明らかにする。東京都総合医学研究所の佐伯泰博士との共同研究により、ユビキチン化の標的候補となるリボソームタンパク質を決定した。その結果、Hel2の標的因子として40Sリボソームサブユニット中の特異的リジン残基が複数箇所同定された。同定されたユビキチン化されるリジン残基について、アルギニン残基への置換変異体を作製し、mRNA品質管理機構(mRNAの分子内切断:NGD)とタンパク質品質管理機構(新生鎖の分解:NGPD)の効率を検討した。その結果、Hel2による40Sリボソームサブユニット中の特異的リジン残基のユビキチン化が、タンパク質品質管理機構(新生鎖の分解:NGPD)に必須であることが明らかになった26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。正確な遺伝子発現は生命現象の根幹であり、その破綻や異常は様々な疾患の原因となる。遺伝子発現の各段階でのエラーや外界からのストレスによって、さまざまな異常mRNAや異常タンパク質が合成されるだけでなく、タンパク質のフォールディングにも異常が生じる。細胞の保持するmRNA品質管理機構は、DNA上の変異やスプライシング反応等のエラーによって合成される様々な異常mRNAを認識し排除する。タンパク質の品質も新生鎖の段階から監視されるが、新生鎖とmRNAの品質管理の関係に注目する研究は皆無であった。申請者は、異常新生鎖の認識とmRNAの品質管理との密接な関係を見いだした。また、異常なmRNA由来の新生鎖の分解機構やmRNA切断における新生鎖の機能を明らかにした。リボソームが連続した塩基性配列を持った新生鎖を合成すると、翻訳伸長段階で停止(翻訳アレスト)する。その結果、No-Go-Decay(NGD)と呼ばれるmRNA品質管理機構によってmRNAが切断される。さらに、リボソームが各サブユニットに解離し、60Sサブユニット上の新生鎖がユビキチン化された後にプロテアソームによって迅速に分解される(NGPD)。最近申請者は、この異常新生鎖による翻訳アレストの結果としてmRNAとタンパク質の品質管理機構が作動するためには、E3ユビキチンライゲースHel2による停滞したリボソーム上の標的因子のユビキチン化が必須であることを見出した。東京都総合医学研究所の佐伯泰博士との共同研究により、ユビキチン化の標的候補となるリボソームタンパク質を決定し、Hel2によるリボソームサブユニット中の特異的リジン残基のユビキチン化が、タンパク質品質管理機構(新生鎖の分解:NGPD)に必須であることが明らかになった。その結果、Hel2による40Sリボソーム

サブユニット中の特異的リジン残基のユビキチン化が、タンパク質品質管理機構(新生鎖の分解:NGPD)に必須であることが明らかになった26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。東京都総合医学研究所の佐伯泰博士との共同研究により、ユビキチン化の標的候補となるリボソームタンパク質を決定した。その結果、Hel2の標的因子として40Sリボソームサブユニット中の特異的リジン残基が複数箇所同定された。同定されたユビキチン化されるリジン残基について、アルギニン残基への置換変異体を作製し、mRNA品質管理機構(mRNAの分子内切断:NGD)とタンパク質品質管理機構(新生鎖の分解:NGPD)の効率を検討している。現在までに、Hel2によるリボソームサブユニット中の特異的リジン残基のユビキチン化が、タンパク質品質管理機構(新生鎖の分解:NGPD)に必須であることが明らかになった。東京都総合医学研究所における質量分析の高い感度と正確性が、研究の進展に大きく寄与した。Hel2が翻訳アレスト状態のリボソームを認識し、標的因子をユビキチン化することで、mRNA品質管理機構へと導く分子機構の理解を目指し、平成26年度は以下の研究を行う。Hel2が翻訳アレスト状態のリボソームを認識し、品質管理へと導く機構を明らかにする。Hel2によるユビキチン化の標的因子の同定と、ユビキチン化の機能を解明する。:Hel2によってユビキチン化されるリボソームタンパク質のリジン残基を同定し、アルギニン残基へ置換することで、mRNA分子内切断と新生鎖のプロテアソームによる分解における機能を明らかにする。Hel2によってユビキチン化された新生鎖のmRNA分子内切断における機能解析:Hel2は新生鎖自身をユビキチン化するため、mRNA分子内切断における機能を解析する。具体的には新生鎖内の全てのリジン残基をアルギニンに置換した変異体を用いて、翻訳アレストに起因するmRNA分子内切断の有無を解析する。
少数分子生体システムの再構成－複合体構成分子の数の制御と理論検証－

少数の分子のターンオーバーで機能するべん毛輸送系の分子機構の解明を目指した。反転膜により制御が可能なin vitro蛋白質輸送計測系を構築し、この系が細胞内と同様の機能を保持することを実証した。この系とin vivoでの1分子計測、生化学・遺伝学実験から、細胞質中の輸送ATPase蛋白質の新たな役割、輸送のエネルギー源、輸送順序を決めるしくみを明らかにした。また、輸送シャペロンが構造変化により相互作用を制御し、少数の基質が優先的に輸送されるしくみを解明した。さらに、高速AFMを高度化し、蛋白質の構造変化や離散集合過程を直接可視化し、少数分子が関わる生体現象の素過程ダイナミクスを明らかにした。細菌べん毛蛋白質輸送システムは多機能性分子で構成され、各々が少数分子のターンオーバーにより機能する。本研究では、このシステムを再構築し、システムの構造を明らかにすると共に、構成要素の数、種類、エネルギー源に操作を加えて応答を観測し、構成サブユニットがターンオーバーしながら作動する機構、基質蛋白質数をモニターしながら発現系にフィードバックする機構の解明を目指している。以下に今年度の成果を記す。・輸送システムの再構築のために、FliO,FliP,FliQ,FliRの4種類およびさらにFlhA、FlhBの6種類の膜蛋白質を共発現するプラスミドを作成した。しかし、大腸菌内で4種類を共発現させると溶菌した。また、個々の遺伝子を別々に発現させた場合も、増殖が著しく減少あるいは停止した。一方、無細胞発現を試みたところ、FliO、FliQについて成功した。・輸送シャペロンFliT、FlgNと輸送装置蛋白質の相互作用を調べなところ、FliTがFliIの異なる場所に結合し、輸送基質の有無により結合場所が変わることがわかった。また、FlgNとFlhAの相互作用を見い出し、その部位も特定した。さらにFlgNがFliTと同様にC末領域で相互作用相手とその強さを制御することを示唆する結果が得られた。・細胞観察用の広範囲スキャナーおよび高速AFM/蛍光顕微鏡複合装置の設計と製作を行った。テコの原理に基づく変位拡大機構を用いて40μm×40μmの範囲を観察できるスキャナーを設計、製作した。逆伝達関数法によるスキャナーの振動抑制を行い、10秒以下の高速イメージングを達成し大腸菌の観察とリゾチームによる枯草菌の溶菌過程の観察に成功した。複合機の製作は、レンズ駆動を見直してミラー駆動による光学トラッキングを導入し、動作確認後、ミラー駆動を採用したスタンドアローン型高速AFMを試作した。細菌べん毛蛋白質輸送システムは多機能性分子で構成され、輸送シャペロンや可溶性輸送装置蛋白質など、少数分子のふるまいがべん毛全体の構築や本数決定に大きく影響する。本研究では、このシステムを再構築し、システムの構造を明らかにすると共に、構成要素の数、種類、エネルギー源に操作を加えて応答を観測し、輸送装置の作動機構、基質蛋白質数をモニターしながら発現系にフィードバックする機構の解明を目指している。・クラスII分子の輸送に固定される変異を導入した菌から、輸送能を保持した反転小胞膜系の作成に成功した。ATP添加によりFlgDの輸送が開始し、イオノフォアであるCCCP添加で輸送が停止することを確認した。また、ATP濃度に依存した輸送量の増加を観測した。さらに電子顕微鏡観察により反転小胞膜にべん毛基部体が逆向きに刺さっている状態を確認した。・べん毛基部に局在するFliIの数を測定し、FliI6リングに加えてFliH2FliI複合体が16分子程度がC ringやFlhAに局在することを明らかにした。FRAP実験からべん毛基部に組み込まれたFliI6リングはターンオーバーしないこと、FliH2FliI複合体は離合集散することを明らかにした。また、FliIのATP加水分解反応で生じる自由エネルギーはプロトン駆動力で動く輸送ゲートの活性化に利用されることを示唆する結果を得た。・輸送シャペロンFlgNがループ構造変化により大きく形を変え、相互作用を制御することを示唆する結果を得た。また、FlgN/FlgK複合体のFlhACへの結合親和性はFliT/FliD複合体に比べて僅かに高く、FliS/FliC複合体に比べて14倍程高いことを見出し、FlhACへの結合親和性の違いでべん毛の構築順序が決まることが示唆された。・高速AFMを用いた可溶性輸送装置蛋白質複合体の観察から、FliI複合体のリング形状が添加ヌクレオチドと塩濃度により大きく変化することを見出した。べん毛輸送システムの働きで行われる細菌べん毛形成は、輸送シャペロンや離合集散する可溶性輸送装置蛋白質など、多機能性を有する少数分子のふるまいが大きく影響する生命現象である。本研究では、べん毛輸送システムを再構築し、システムの構造を明らかにすると共に構成要素の数・種類・エネルギー源を操作して輸送を測定し、輸送装置の作動機構、べん毛形成の分子機構、べん毛本数決定のしくみを明らかにすることを目的としている。・反転膜小胞人工系を用いた輸送計測から以下の多くのことを明らかにした。1)FliI単独の添加では輸送量は変化せず、FliH-FliI複合体の添加で輸送が桁違いに促進されることを発見。

2)膜電位、pH差、ATP濃度を変化させた輸送実験から、FliIによるATP加水分解エネルギーのみで輸送が駆動されることを発見。3)輸送によるフックの再構築に成功し、人工系で連続的な輸送が起きることを証明。4)フック蛋白質FlgEの輸送がフックキャップ蛋白質FlgDにより促進されることを発見。5)ロッド形成がFlgE輸送に大きく影響することから、クラスII蛋白質にも輸送順序決定機構があることを示唆。6)FliKの添加により輸送基質特異性の切替えに成功。7)蛍光ラベルを導入した基質の輸送に成功・構造に基づく輸送シャペロンFlgNの変異実験から、FlgNのヘリックス1と2の間のループ欠損により、自身の集合体形成能、輸送装置蛋白質や輸送基質蛋白質との相互作用が大きく変化することを見出した。・輸送ATPase複合体の構造変化観察のため、40°Cで観察可能な高速AFMチャンバーを開発。・細胞観察のため蛍光像と高速AFM像を同時観察するシステムの改良を行った。また、探針に金コロイドを付着させて探針増強蛍光を起こし、AFMのイメージング領域のみ蛍光像増強を行うシステムを開発したべん毛輸送システムの働きで行われる細菌べん毛形成は、輸送シャペロンや離合集散する可溶性輸送装置蛋白質など、多機能性を有する少数分子のふるまいが大きく影響する生命現象である。本研究では、べん毛輸送システムを再構築し、システムの構造を明らかにすると共に構成要素の数・種類・エネルギー源を操作して輸送を測定し、輸送装置の作動機構、べん毛形成の分子機構、べん毛本数決定のしくみを明らかにすることを目的としている。以下に今年度の主要な成果を記す。反転膜小胞人工系を用いた輸送計測から以下のことを明らかにした。1)FliKの添加による輸送基質特異性切替え実験から、FliKの添加のみで特異性切替えが起こること、FliKの量に応じて形成されるフックの長さの分布がin vivo実験と同様に変化することを示し、反転膜系がin vivo状態における基質特性スイッチを再現できることを示した。2)精製したロッド-フック型蛋白質、フィラメント型蛋白質、輸送シャペロン、輸送系細胞質蛋白質、およびFliKを加えて輸送を開始させ、べん毛軸構造を反転膜内に作成することに成功した。3)クラスII蛋白質である、distal rod蛋白質、proxymal rod蛋白質、フック蛋白質に輸送順序があり、輸送装置と輸送基質蛋白質のみで輸送順序が決定されることを明らかにした。4)反転膜内へ輸送された基質を基質にラベルした蛍光物質の蛍光により検出することに成功した。少数の分子のターンオーバーで機能するべん毛輸送系の分子機構の解明を目指した。反転膜により制御が可能なin vitro蛋白質輸送計測系を構築し、この系が細胞内と同様の機能を保持することを実証した。この系とin vivoでの1分子計測、生化学・遺伝学実験から、細胞質中の輸送ATPase蛋白質の新たな役割、輸送のエネルギー源、輸送順序を決めるしくみを明らかにした。また、輸送シャペロンが構造変化により相互作用を制御し、少数の基質が優先的に輸送されるしくみを解明した。さらに、高速AFMを高度化し、蛋白質の構造変化や離散集合過程を直接可視化し、少数分子が関わる生体現象の素過程ダイナミクスを明らかにした。細菌べん毛蛋白質輸送システムは多機能性分子で構成され、各々が少数分子のターンオーバーにより機能する。
関節リウマチ関連遺伝子ぺプチジルアルギニンデイミナーゼタイプ4に関する研究

ケースコントロール関連解析法によりRA関連遺伝子として、PADI4を同定し、PADI4の機能として、RAの病態と深く関与していることが予測されたため、その遺伝子改変マウスである、mouse Padi4ノックアウトマウスを作製した。その遺伝的背景を、C57BL6とDBA1Jに置換し、関節炎誘導実験を行ったところ、関節炎のスコアが低下し、自己抗体である、抗コラーゲン抗体の産生量も減少した。PADI4遺伝子改変マウスの作製とそれを用いた実験PADI4遺伝子ノックアウトマウスを作製した。PADI4遺伝子を欠失させ、その代りにネオマイシン遺伝子を導入し、PADI4ノックアウトマウスを作製した。遺伝的背景がES細胞由来の129S1とB6の混合であるため、遺伝的背景をB6に置き換える必要がある。そこでスピードコンジェニック法を用いて、B6バックグラウンドに置き換えた。このマウスを用いて以下の実験を現在実施している。(1)8週齢B6バックグラウンドPADI4KOマウスとコントロールであるB6マウスより胸腺を取り出して、ジーンチップによろ発現解析を行ったが、明確な違いはみられなかつた。今後、ほかの組織や週齢でも同様に発現を調べる予定である。(2)関節リウマチのモデル動物にコラーゲン誘導関節炎(collagen-induced arthritis ; CIA)があり、これはコラーゲンを実験動物に投与することで人工的に関節炎を起こさせる方法である。これをPADI4ノックアウトマウスで実施した。まずはその条件を検討するため、投与を行ったところ、B6マウス、B6バックグラウンドマウスは一般的にCIAに用いられる系統ではあるが、投与後の死亡率がやはり同様に一般的に用いられるDBA1Jマウスよりも高く、30%ほどになることがわかった。そのため関節炎を発症しても統計学的に有意であることを証明するためにはかなりの個体数をCIA実験のために用いる必要がある。この問題を解決するために、個体数をたくさん用いてCIA実験を行うが、同時に遺伝的背景を死亡率が低いDBA1Jに変更するため、平行してDBA1Jバックグラウンドヘのスピードコンジェニックを実施している。1.PADI4遺伝子改変マウスの作製PADI4遺伝子ノックアウトマウスを作製した。遺伝的背景をB6に置き換えるため、スピードコンジェニックを行い、B6バックグラウンドに置換した。B6-Padi4KOマウスの表現型の解析を実施した。各組織(脾臓、胸腺、皮膚、リンパ節、脳、関節)を切片にし、HE染色法にて構造的な違いを調べたが、皮膚以外に、特にKOマウスに特徴的な構造は観察されなかった。脾臓より、脾細胞を取り出し、細胞分画を行い、T細胞、B細胞、マクロファージ、単核球などの比率を調べたが、これに関しても特に違いは見いだせなかった。B6よりもコラーゲン関節炎誘導による関節炎発症率のよい、DBA1Jマウスへのバックグラウンド改変も同時に行った。2.CIAマウスの作製ノックアウトマウスをもちいて関節炎モデルマウスであるコラーゲン誘導関節炎マウスの作製をおこなった。コントロールとしてB6マウスを用い、PADI4を欠損したマウスに関節炎導入をおこなった。PADI4を欠損することで関節炎が抑制されることがわかった。また、抗コラーゲン抗体価を測定したところ、KOマウスでは低い傾向が観察された。現在、抗CCP抗体価を測定し、自己抗体産生にどのような影響があるか、検討中である。PADI4の酵素活性を抑制するための中和抗体の作製を目的とし、PADI4モノクローナル抗体の作製を行っている。HisタグをつけたPADI4を発現ベクターに組み込み、大腸菌に強制発現し、精製をおこなった。PADI4KOマウスに精製His-PADI4タンパクを導入し、現在、モノクローナル抗体を作成し、反応性を確認している。PADI4遺伝子改変マウスの作製とそれを用いた関節炎誘導実験PADI4遺伝子ノックアウトマウスを作製した。(1)関節リウマチのモデル動物にコラーゲン誘導関節炎(collagen-induced arthritis;CIA)があり、これはコラーゲンを実験動物に投与することで人工的に関節炎を起こさせる方法である。まずはその条件を検討するため、投与を行ったところ、B6マウス、B6バックグラウンドマウスは一般的にCIAに用いられる系統ではあるが、投与後の死亡率が同様に一般的に用いられるDBA1Jマウスよりも高く、30%ほどになることがわかった。また関節炎の発症率も低く、3060%程度であった。

そのため有意差検定で有意であることを示すためには個体数を増やす必要がある。(2)関節炎モデルマウスで調べられる自己抗体の指標として知られている、anti-CII antibodyの値を調べたところ、IgMクラス、IgGクラスともにKOマウスでは低下することがわかった。(3)CIAマウスに最適なDBA1Jバックグラウンドへのスピードコンジェニックを実施し、DBA1Jバックグラウンドへの置換が完了し、CIA実験を実施したところ、KOマウスでは平均スコアが有意に下がる傾向が確認できた。Padi4遺伝子の関節炎への関与を確認できた。
高エネルギービームを用いた高性能電気二重層キャパシタ用炭素材料の開発

本研究では、種々の多環式芳香族化合物の蒸着膜へのイオンビーム照射によって生じるカーボンのミクロ及びナノ形状を電子顕微鏡観察することによって、その形状制御因子を明らかにし、イオンビームを利用したカーポンマイクロ・ナノ構造体の構築を試みた。(1)デカサイクレン蒸着膜へのイオンビーム照射によるカーボンナノファイバーの作製デカサイクレン(多環式芳香族化合物の一種)を真空蒸着すると、円筒状ナノワイヤーが生じ、これにイオンビームを照射すると炭化が生じてカーボンナノファイバーが生成することを明らかにした。また、この炭化がイオンビーム照射で生じた分子間環化脱水素反応によるものであることを明らかにした。さらに、前駆体であるデカサイクレンナノワイヤーはデカサイクレン蒸気が基板上で凝縮して生じた過冷却液滴の表面から気相に向かって層状に成長することを明らかにした。(2)多環式芳香族化合物蒸着膜へのイオンビーム照射によるカーボンマイクロ・ナノ構造体の作製種々の多環式芳香族化合物を真空蒸着したところ、(1)蒸気が基板上で直接結晶化して生じた平坦な蒸着膜、(2)蒸気が凝縮してできた液滴が固化して生じた結晶粒を持つ蒸着膜の2タイプが得られた。これら蒸着膜にイオンビームを照射すると、水素及びヘテロ原子の脱離に伴う炭化が進行した。ヘテロ原子の脱離によって蒸着膜は著しく体積収縮したが、水素原子の脱離による体積収縮はほとんど見られなかった。このため、ヘテロ原子を含まない平坦な蒸着膜にマスクを通してイオンビーム照射すると、マスクパターンと同じ形状のカーボンマイクロパターンが得られた。一方、ヘテロ原子を含有し、結晶粒を持つ蒸着膜にイオンビームを照射すると、結晶粒が萎縮・融合し、3次元カーボンナノネットワークが得られた。このカーボンナノネットワークは活性炭並みの高い電気容量を持っていただけでなく、電気化学的に安定であった。
連続変位クラスター変分法による金属ガラス形成系の微視構造の研求

金属ガラスの微視構造は結晶格子とは異なり、非周期的な原子の変位によって記述される。これをシミュレートする為に、連続変位クラスター変分法を用いてプログラムコードの開発を行い、原子間にレナードジョンズポテンシャルを仮定した二次元正方格子系を対象に計算を行った。母格子の格子点からの変位分布がほぼGaussian分布をしていること、原子サイズの差が大きくなるにつれて、分布がより散漫になることを確認した。さらに、自由エネルギーを格子定数の関数として算出し、この極小値から平衡格子定数を求め、温度依存性から熱膨張係数を導出したが、温度と共に熱膨張係数の増大を示すなど、計算結果は妥当なものであった。次に、Fe-Ni系の電子状態計算から得られた原子間ポテンシャルを代入して第一原理計算を行い、熱膨張係数に関する計算結果をDebye-Gruneisenモデルのそれと比較した。計算結果はオーダーも傾向も一致した。さらに、一次変態を記述する自由エネルギーを均一系の自由エネルギーとしてPhase Field法の計算を行った。昨年度までの研究で導出したGeneral PhaseDiagramを参照にしてガラス転移温度よりも高温状態から冷却し、ある温度に保持したときのガラス核の生成の空間分布、およびその時間発展過程について考察を行った。これらの計算より、クラスター変分法、連続変位クラスター変分法、経路確率法、Phase Field法を統合した計算が、ガラス転移の熱力学・動力学に対して、self consistentな結果を提供することを確認した。ガラス形成能の優れた金属ガラスを得るための経験則は提唱されているが、その物理的根拠は必ずしも明らかになっていない。その一つの大きな理由は、微視的な原子配列と安定性に関する統計熱力学からの理解が不足していることによる.本研究では、結晶周期を有する合金系の相安定性・相平衡の理論計算に大きな威力を発揮してきたクラスター変分法を、トポロジカルに乱れた構造に対して拡張した連続変位クラスター変分法を応用ることにより、平衡状態図と微視構造および金属ガラスの形成能の相関を理論的に明らかにすることにある.連続変位クラスター変分法の計算は、これまで二次元系(正方格子)でしか経験がないために、本年度は、これを三次元系に拡張する計算を開始した.特に対称性の高い立法晶を最初のターゲットとし、擬化学近似法を用いた定式化を行った.又、連続変位クラスター変分法で高精度の計算を実行するためには、従来のクラスター変分法に比してさらに多くの変数を導入せねばならならず、この為には高速で信頼し得る計算機の活用が必須である.この為、並列計算機を購入しチューニングを開始した.さらに、予備計算の一つとして、二次元正方格子を対象にして短範囲散漫散乱強度の計算を行い、構成元素の原子サイズの差に伴う局所緩和を考慮したときと、そうでないときの強度分布の相違点について詳細を検討した.又、局所変位を考慮した散漫散乱強度を、多元系合金の短範囲散漫散乱強度に焼きなおして一般的な定式化を試みた.ガラス形成能の優れた金属ガラスを得るための経験則は提唱されているが、その物理的根拠は必ずしも明らかになっていない。その一つの大きな理由は、微視的な原子配列と安定性に関する統計熱力学からの理解が不足していることによる。本研究の最終目的は、結晶周期性を有する合金系の相平衡の理論計算に大きな威力を発揮してきたクラスター変分法の、トポロジカルに乱れた構造に対する拡張版である連続変位クラスター変分法を応用することにより、平衡状態図と微視構造および金属ガラスの形成能の相関を理論的に明らかにすることにある。しかし、連続変位クラスター変分法は、現実の合金系への適用がなされておらず、従って初期の目的として、従来のクラスター変分法がガラス転移の平衡論的な大枠を記述し得るか否かに焦点を絞って計算を行った。L10-disorder変態が、結晶-液体転移と同じく一次変態であることに着目し、L10規則相の自由エネルギーを、クラスター変分法の四面体近似式を用いて定式化を行った。長距離規則度を一般化された規則度と定義し、全ての短範囲規則度で微分極小化することにより、自由エネルギーを温度と規則度の関数として算出した。次に、各規則度に対する自由エネルギーの温度依存性を求めた。それぞれの自由エネルギーと液体のそれとの交点が、各規則度における融点を表す。これはT0状態図と称されているが、T0状態図には、ガラス転移に特徴的な三重臨界点が再現できた。この点を理想ガラス転移温度に対応させることができる。さらに、経路確立法を用いて、いろいろな冷却速度における、規則度の温度依存性を算出した。原子移動の素過程に、粘性の温度依存性を反映させることにより、ガラス転移に伴う内部状態の凍結を再現することができた。これらの結果は、クラスター変分法や経路確率法が、ガラス転移の平衡論的及びkineticsの大枠を記述できるものであることを示唆している。ガラス形性能の優れた金属ガラスを得るためには、微視的な原子配列と相安定性に関する統計熱力学からの理解が必須である。本研究では、合金系の相安定性・相平衡の理論計算に大きな威力を発揮してきたクラスター変分法を、トポロジカルに乱れた構造に拡張した連続変位クラスター変分法を応用することにより、平衡状態図と微視構造および金属ガラスの形成能の相関を理論的に明らかにする。この為に、連続変位クラスター変分法の確立を図り、他の手法との比較検討を行う。

特に本研究の初期においては、クラスター変分法と経路確率法の範疇でガラス転移の記述を行い、後期においては原子間ポテンシャルを導入して具体的な系への拡張を図ることを目的とした。クラスター変分法と経路確率法を用いて、ガラス転移に関する平衡論と動力学の大枠の記述を行った。クラスター変分法を用いた計算では、理想ガラス転移が規則-不規則系のスピノーダルオーダリングに対応することを明らかにし、T_0ダイアグラムを理論的に導出した。さらに、Generalized stability diagramを算出し、ガラス領域、欠陥結晶領域、過冷液体領域などを、温度と規則度(欠陥量)のダイアグラムの可視化を行った。又、経路確率法を用いて、スピンフリップの素過程に粘性効果を導入することから、冷却速度とガラス転に温度の実験結果を定性的に再現した。又、連続変位クラスター変分法のガラス転移への応用計算を行った。レナード・ジョーンズポテンシャルを用いて2次元系の計算を行い、T0ダイアグラムを算出した。金属ガラスの微視的過程を明らかにすることを目的として、クラスター変分法と経路確率法を用いた計算を行った。クラスター変分法が特長とする規則j-不規則系の取り扱いを液体-ガラスー固体転移にマップするのが一つの骨子である。多くの一次変態をする規則-不規則系に見られるスピノーダルオーダリングが熱力学的に理想ガラス転移に対応することを明らかにした。さらに、kineticsの側面をシミュレーションするために、クラスター変分法を時間領域に拡張した経路確率を用いて、高温不規則相(液相に対応)領域から種々の速度で冷却するシミュレーションを行った。スピンフリップ確率に熱活性性の温度依存性を導入し、スピノーダルオーダリング温度(理想ガラス転移温度)、で、フリッピングの確率が0(即ち活性化エネルギーが無限大)になるように設定すると、冷却に伴い、規則席が徐々にロックされていく様子をシムミュレートすることができた。又、冷却制度が速くなる程、ロックの始まる温度が高温側にシフトする実験結果も再現できた。従来のクラスター変分法では原子の位置は固定されており、格子点から変異することは許されていない。これに対して、連続変化クラスター変分法を用いると原子変異の影響を考慮することができる。特に、ガラス転移機構を明確にするためには、このような原子変位の導入が必須と思われる。2次元正方格子を対象に連続変位クラスター変分法の定式化を行った。原子間相互作用ポテンシャルにはレナードジョーンズポテンシャルを仮定した。これまでのシミュレーションでは、規則度の物理的意味が明快ではなかったが、連続変位クラスター変分法の範疇で、規則度に対して原子変位の意味を付与することが可能になった。金属ガラスの微視構造は結晶格子とは異なり、非周期的な原子の変位によって記述される。これをシミュレートする為に、連続変位クラスター変分法を用いてプログラムコードの開発を行い、原子間にレナードジョンズポテンシャルを仮定した二次元正方格子系を対象に計算を行った。母格子の格子点からの変位分布がほぼGaussian分布をしていること、原子サイズの差が大きくなるにつれて、分布がより散漫になることを確認した。
ヒトナチュラルキラーT細胞を用いた細胞免疫療法の開発

ヒトナチュラルキラーT(NKT)細胞の血液悪性腫瘍に対する抗腫瘍効果について検討した。NKT細胞は、CD1d分子に拘束され糖脂質を認識するが、CD1d分子を発現した腫瘍細胞を直接傷害することが我々も含めて報告されている。しかしCD1d分子を高発現しているB細胞性腫瘍などに対して直接の細胞傷害活性がみられない場合がある。これに関して、腫瘍細胞によるNKT活性化の抑制メカニズムが考えられた。実際、NKT細胞はCD1d分子を発現したCEM, MOLT4, JurkatといったT細胞性腫瘍株に対しては高い細胞傷害活性を示すが、同様にCD1d分子を高発現している、RAMOS, IM9, BALL1などのB細胞性腫瘍株に対しては細胞傷害活性が認められない。これに対し、NKT細胞が発現している可能性がある抑制性のNKレセプターを介した抑制の可能性があるか否かを検討した。Va24+/Vb11+TCRを持ったNKT細胞においては、抑制性NKレセプターであるNKG2Aの発現が確認された。またそのリガンドであるHLA-E分子の発現を調べると、細胞傷害活性がみられる細胞株のいずれもHLA-E分子を発現しておらず、またB細胞性腫瘍株を中心とするCD1d分子の発現がみられるが細胞傷害活性がみられない腫瘍株においては、HLA-E分子を発現していることが確認された。このことより、腫瘍細胞株に発現するHLA-E分子は、NKT細胞の発現するNKG2Aなどの抑制性NKレセプターと相互作用し、NKTの活性化を抑制し、抗腫瘍作用からエスケープしている可能性が示唆された。今後、より解析を進め、抑制性NKレセプターに対するシグナルを阻害する等により、より効率よくNKT細胞による癌免疫療法を発展させたいと考える。急性T細胞性リンパ性白血病患者末梢血4例よりNKT細胞の樹立を行った。患者末梢血より単核球を分離し、a-galactosyl ceramide(a-GalCer)を添加して培養し1週間ごとに培養細胞に放射線照射しa-GalCerを添加した自己単球を加えた。2回目以降の刺激培養には、IL-2,IL-7,IL-15も添加した。培養細胞はVa24TCRとVb11TCRの共発現をマーカーに純化していった。患者白血病細胞4例中2例においてCD1d分子が発現していた。また、樹立した自己NKT細胞は、CD1d分子を発現した自己白血病細胞に細胞障害活性を示した。また、この細胞障害活性は、抗CD1d抗体によって阻害されるため、T細胞レセプターとCD1d分子を介した細胞障害活性であることが推測された。また白血病細胞がCD1d分子を発現していない場合は、NKT細胞は自己白血病細胞を傷害することができなかった。自己NKT細胞は、細胞表面マーカーがCD4-CD8-(double negative: DN), CD4+, CD8+の亜分画が存在した。このいずれの分画も細胞障害活性を示した。しかし刺激によるサイトカイン産生においては、DN NKT細胞とCD8+NKT細胞が主にTh1型のサイトカインであるIFN-gを大量に賛成したのに対し、CD4+NKT細胞はTh1型サイトカインであるIFN-gの他にTh2型のサイトカインであるIL-4やIL-13も同時に大量に産生した。従って、いずれの亜分画も細胞障害活性を持つものの、生体内におけるTh1型の腫瘍免疫を誘導する必要性を考えると、実際の治療においては、DN NKTあるいはCD8+NKTといった亜分画を用いることが好ましいと考えられる。今回の検討では、患者由来の自己NKT細胞が自己白血病細胞を効率よく障害されることが確認できた。

今後、リン鼠yう応用へ向けてよりこの免疫細胞療法を発展させていきたい。ヒトナチュラルキラーT(NKT)細胞の血液悪性腫瘍に対する抗腫瘍効果について検討した。NKT細胞は、CDld分子に拘束され糖脂質を認識するが、CDId分子を発現した腫瘍細胞を直接傷害することが我々も含めて報告されている。しかしCDld分子を高発現しているB細胞性腫瘍などに対して直接の細胞傷害活性がみられない場合がある。これに関して、腫瘍細胞によるNKT活性化の抑制メカニズムが考えられた。実際、NKT細胞はCDld分子を発現したCEM,MOLT4,JurkatといったT細胞性腫瘍株に対しては高い細胞傷害活性を示すが、同様にCDld分子を高発現している、RAMOS,IM9,BALL1などのB細胞性腫瘍株に対しては細胞傷害活性が認められない。これに対し、NKT細胞が発現している可能性がある抑制性のNKレセプターを介した抑制の可能性があるか否かを検討した。Va24+/Vbl1+TCRを持ったNKT細胞においては、抑制性NKレセプターであるNKG2Aの発現が確認された。またそのリガンドであるHLA-E分子の発現を調べると、細胞傷害活性がみられる細胞株のいずれもHLA-E分子を発現しておらず、またB細胞性腫瘍株を中心とするCDld分子の発現がみられるが細胞傷害活性がみられない腫瘍株においては、HLA-E分子を発現していることが確認された。このことより、腫瘍細胞株に発現するHLA-E分子は、NKT細胞の発現するNKG2Aなどの抑制性NKレセプターと相互作用し、NKTの活性化を抑制し、抗腫瘍作用からエスケープしている可能性が示唆された。今後、より解析を進め、抑制性NKレセプターに対するシグナルを阻害する等により、より効率よくNKT細胞による癌免疫療法を発展させたいと考える。
近世の寺社と御師的宗教者による廻檀・配札活動についての研究

第1に、原田家の4000点の御札のカードを取って、撮影を実施した。それによって明治維新を境にして御札の形態、量が大幅に変化することを確認できた。遠方の寺社の御師による活動が減り、近隣の寺社の御札が増加することも確認できた。第2に、尾張藩と遊行上人の活動、英彦山の山伏組織について資料を収集した。第3に、神子や女性宗教者について研究会を重ねて、女性宗教者の家族形態の多様性を知ることができた。また尾張藩の寺社行政について史料を検討し、自国と他国の宗教者への対処の相違を明らかにできた。(1)御師的宗教者の資料を収集するために、秋葉寺、甲賀市教育委員会所蔵の資料、愛知県史編纂室所蔵のマイクロフィルム資料の史料調査を行なった。秋葉寺では住職より、明治以降の歴史と行事の聞き取りを実施した。甲賀市教育委員会では、近世の多賀坊人の史料を閲覧して、坊人子孫の家を訪問し、版木、仏像を見ることができた。甲賀の住人のなかに、複数の寺社と契約して、配札を実施する人たちがいたことを確かめることができた。御師的宗教者は、必ずしも寺社に支配されていたわけではなかった。(2)原田家所蔵の御札コレクションの整理を実施した。整理のための特別な封筒を作成し、調査項目とカードを決定して整理を行った。一点一点をカード化しはじめた。カードをとりながら、明治維新の転換期が、御札の盛衰、形態変化をもたらすことをある程度確かめることができた。遠隔の立山、富士などの霊山系の御札は急激に無くなり、近郊の神社、寺院が出す御札は衰えない傾向はあった。(3)近世の宗教史の専門家を集めて研究会を実施した。信州の神子と舞太夫の活動を歴史的に追及していくと、戦国時代末の印内、博士村につながることが議論された。近世の御師的宗教者については、民俗学からは「民間宗教者」という用語が出されており、近世史からは「身分的周縁」に含まれる存在とされてきたが、「勧進」の面が捉えきれていない。18世紀は、近世的勧進が体制化する時代であって、多くの宗教者、芸能者は、公権力によって勧進が認可されて、勧進にのめりこむ。寺社修復のための勧化も一般化していく時代であった。(1)原田家所蔵の御札コレクションの整理を行った。約4000点あるコレクションの3000点ほどのカード取りを終えることができた。カードを取った分の一部は、エクセルによってデータ入力を行った。今回のカード取りによって、予想以上に遠隔地の寺社を含む多様な御札があることがわかった。近世には多くの御師的な宗教者が東三河地域を廻っていたこと、寺社参詣が頻繁に行われていたことを確認できた。(2)大学院生とともに京都大学法学部所蔵『尾張寺社方覚書』を解読し、読み下し文を作成した。この史料は尾張藩寺社奉行が持っていた寺社行政に関するマニュアルで、貴重なものである。これを検討することによって尾張藩が藩内に各宗派の触頭を設けて寺社行政を進めており、近世後期には他国からの宗教者の侵入を警戒したことがわかった。(3)近世宗教史を専門とする研究者の会合を実施することができた。如来教教祖の研究と、御嶽講における行者の役割についての発表があった。近世の勧進概念をめぐって討論を行った。「民間宗教者」「芸能的宗教者」よりも「勧進の宗教者」がより適切な用語であるころが確認できた。(4)英彦山関係の史料を収集する機会があった。また恐山の霊場を実地調査して、聞き取り調査を行った。地元の研究者と交流し情報交換することもできた。後者において曹洞宗寺院とのかかわりを知ることができた。(5) 2010年国際宗教史会議で「日本の宗教学」「マックス・ミュラーの影」の発表を行い、本研究の成果の一部を公表した。(1)東栄町原田家の御札コレクション約4000点の整理と撮影を実施して、カード取りと写真撮影を完了することができた。カードにもとづき、研究協力者に手伝ってもらい約4000点のデータベースをつくりあげた。そこからわかることは、(1)明治維新を境に御札の形態・量が変化することである。とりわけ秋葉山、立山、金比羅、熊野など近世後期に盛んになった山岳霊場、神宮寺などの御札は、明治維新を境に数が減少することを確認できた。これは、山岳霊場や習合的な寺社の御師的宗教者が、消滅したこととよると思われる、

(2)明治10年以降、熱田、津島、豊川稲荷の御札が増えるが、近代的な講社が復興と対応するものであろう、(3)近郊の寺社から発給される御札は、近代になって増加している点が注目される。遠隔地からの配札が激減し、その空白を埋めるようにして近郊の寺社が活躍した結果だと解釈できる。(2)本山・本所に編成された芸能的宗教者が身分集団を形成して、妻、子も同じく祈祷・祓・芸能を行ない、身分集団に含まれる場合が多いことが、神事舞太夫、梓神子、当山派修験、吉田家配下の神子などの事例によって理解された。それと比較して津島天王社の御師を調べると、津島天王社の神職であり、家族が廻檀・配札に関わることがない。英彦山の場合-山組織が確立して、配札も組織的に運営されていることがわかった。また甲賀町甲南町の史料調査によって、多賀大社の坊人は、配札を専門に請け負っており、多賀大社に属する宗教者であるわけでなかった。これは配札活動じたいが、専門化した形態ということができよう。(3)近世の宗教者の活動を特徴付けるものが「配札」「祈祷」であったのが、近代になると教導職に見られるように「教化」が期待され「雑誌」が刊行された。「御札」が近代以降に減少する社会的要因を考えていきたい。
シナジー解析による高齢者起立動作のモデル化

本研究は,高齢者個々人の状態に応じた適切な起立支援方法を決定するため,起立支援を受ける高齢者の起立動作をモデル化することを目的に,立ち上がり動作時の筋肉の共同発揮に着目した動作解析を行った.解析の結果,高齢者の起立動作は大きく分けて三つの動作より成ることが,それに対応する筋肉共同発揮現象より明らかになった.また解析したモデルから筋電位波形を再構築することで,起立動作モデルの妥当性を確認した.本研究は,高齢者個々人の状態に応じた適切な起立支援方法を決定するため,起立支援を受ける高齢者の起立動作をモデル化することを目的に,立ち上がり動作時の筋肉の共同発揮に着目した動作解析を行った.解析の結果,高齢者の起立動作は大きく分けて三つの動作より成ることが,それに対応する筋肉共同発揮現象より明らかになった.また解析したモデルから筋電位波形を再構築することで,起立動作モデルの妥当性を確認した.本研究は,高齢者個々人の状態に応じた適切な起立支援方法を決定するため,起立支援を受ける高齢者の動作をシナジー仮説の知見を用いて工学的にモデル化することを目的とする.具体的には,シナジー仮説の知見をロボット工学における人間の動作を規範とした多自由度制御問題の解決手法と捉え,人間の起立動作の筋力駆動パターンをモデル化する.更に高齢者の身体状態を筋力駆動特性(例えば発揮できる力,反応速度)として表現することで,高齢者個々人の身体状態を考慮した起立動作モデルを開発することを目指している.本年度は,以下について研究を行った.1.起立支援装置を用いた高齢者の起立動作解析開発中の起立支援機構を用い,実際に日常生活にて起立動作に支障がある高齢者に,装置の補助を受けながら起立動作をしてもらい,その時の高齢者の身体の動きおよび床・椅子にかかる力を,三次元モーションキャプチャ装置および体圧測定装置を用いて測定した.得られたデータを基に,コンピュータシミュレーション上に構築した人間モデルを用いて,高齢者の起立動作を解析し,特に起立動作に大きく影響するとされる腰,膝,足首関節周りの筋力評価,および,起立動作時の安定性に影響する体のバランス指標として,体の重心位置を導出した.2.シナジー仮説を用いた起立動作のモデル化1.にて導出した高齢者の腰,膝,足首周りの筋力評価データを基に,シナジー仮説に基づき,各筋力の駆動パターンの波形を抽出するために必要なシナジー数の導出を試みた.特に本年は,シナジーの個数別に交差検証を行い,その決定係数にて各シナジー個数別のシナジー数を評価した.本研究は,高齢者個々人の状態に応じた適切な起立支援方法を決定するため,起立支援を受ける高齢者の動作をシナジー仮説の知見を用いて工学的にモデル化することを目的とする.具体的には,シナジー仮説の知見をロボット工学における人間の動作を規範とした多自由度制御問題の解決手法と捉え,人間の起立動作の筋力駆動パターンをモデル化する.更に高齢者の身体状態を筋力駆動特性(例えば発揮できる力,反応速度)として表現することで,高齢者個々人の身体状態を考慮した起立動作モデルを開発することを目指している.本年度は,以下について研究を行った.1.シナジー仮説を用いた起立動作のモデル化昨年度実施した「起立支援装置を用いた起立動作解析」にて導出した被験者の腰,膝,足首周りの筋力評価データを基に,シナジー仮説に基づき,各筋力の駆動パターンの波形を抽出するために必要なシナジー数の導出を試みた.特に本年は,昨年度実施したシナジー数の評価結果を基に,使用するシナジー数を決定した.2.高齢者起立モデルの構築1.においてシナジー抽出の際に算出された発火強度と発火タイミングに従い,筋電位波形の再構築を行った.再構築の結果,筋力評価に用いた各筋力波形に関して,強度,タイミング共にほぼ再現できた.また,起立動作モデルとシナジーの発火タイミングを時系列で評価し,各動作フェーズにおけるシナジーの役割を推定した.さらに,各動作フェーズが持つ動作の性質を明らかにすることで,起立動作を異なる動作フェーズの連続としてモデル化することの妥当性を明確にすることができた.
幅広い応用力を秘めた三次元培養心筋組織作成の試み

三次元人工心筋組織を作成する為の至適な培養条件(コラーゲンの種類やマトリゲル使用の有無)について検討した。自家製のコラーゲンを用い、マトリゲルを使用した組織が、これまでに報告されてきた人工心筋組織に近い性質を持つことが明らかとなった。しかし、収縮力が小さい、カルシウムに対する反応性が乏しいなどの問題は残存しており、コラーゲンやマトリゲル以外の条件の最適化が必要なことも同時に明らかとなった。三次元培養心筋組織(Engineered Heart Tissue ; EHT)を作成する為の条件を可能な限り変更し、至適な培養条件を決定する事を目標に検討を行った。人工心筋組織の作成および検討は従来の方法を踏襲して行った。即ち、新生児ラットの心臓から単離した細胞とコラーゲンを混合した心筋細胞混合物をドーナツ型の鋳型内で培養することにより人工心筋組織を作成し、培養12日目に等尺性収縮力測定を行った。組織形成に影響を与える可能性がある(1)コラーゲンの種類、(2)コラーゲンの濃度、(3)細胞数について(1)肉眼的観察、(2)顕微鏡的観察、(3)収縮力測定試験、(4)分子生物学的手法を用いて検討した。コラーゲンの種類については購入可能な6種類のコラーゲンについて検討した。6種類中3種類のコラーゲンではコラーゲンの濃度、細胞数を変化させても肉眼的にリング状の組織の形成は確認できなかった。従って、それ以降の検討は残りの3種類のコラーゲンを用いて施行した。それら3種類のコラーゲンで作成したEHTは顕微鏡的に培養初期には細胞の拍動が観察され、培養の継続と共に一体化した拍動、また、収縮力測定を行う時期には肉眼的にも拍動が確認できる組織が形成された。しかし、従来のコラーゲンを用いた組織では、ほぼ全ての組織で測定が可能な収縮力を発生していたのに対して、これらの組織では約半数で収縮力の測定が出来なかった。また、本来持つはずのカルシウムに対する収縮力の上昇も認めなかった。リアルタイムRT-PCRによる検討ではカルシウムハンドリングを司る遺伝子の発現がこれまで報告されてきたEHTの発現パターンが異なる事が明らかとなった。現在はこれらの問題点を改善するべく、培養条件の更なる検討を継続している。これまで、三次元培養心筋組織を作成する為の至適な培養条件を探ってきたが、従来の報告より小さな収縮力しか発生しない、また、カルシウムに対する収縮力の上昇も認めないという問題点が改善できずにきた。今回の検討ではその原因の可能性がある、(1)コラーゲンの種類、(2)マトリゲル(細胞外マトリックスや成長因子の抽出物)の添加の有無に関して、(1)肉眼的観察、(2)顕微鏡的観察、(3)収縮力測定試験、(4)分子生物学的手法を用いて検討した。本年度は、購入可能な2種類のコラーゲンについて従来報告されている自家製のコラーゲンと比較検討した。それら3種類のコラーゲンで作成したものは顕微鏡的に培養初期には細胞の拍動が観察され、培養の継続と共に一体化した拍動、また、収縮力測定を行う時期には肉眼的にも拍動が確認できる組織が形成された。しかし、従来のコラーゲンを用いて作成した組織を含め、全ての組織において、従来の報告より小さな収縮力しか確認出来なかった。リアルタイムRT-PCRによる検討では組織内の心筋細胞の割合が従来のコラーゲンを用い、マトリゲルを添加した組織で大きく、その原因がアポトーシスが抑制されていることが原因であることが明らかとなった。また、収縮タンパクの発現についても同様の条件で作成された組織でその他と比較して多いことも明らかとなった。カルシウムハンドリングを司る遺伝子の発現についは、今回検討した3つのコラーゲン内でほぼ同様の発現パターンであり、これまで報告されてきた発現パターンと異なることが明らかとなった。これらの結果から、小さな収縮力しかない、また、カルシウムに対する収縮力の上昇も認めないという問題点の原因はコラーゲン以外にも存在すると言うことが明らかになった。
血管肉腫に対するPI3K経路阻害剤とエピジェネティクス制御化合物の併用効果の検討

本研究では皮膚血管肉腫細胞株に対するPI3K経路阻害剤とエピジェネティクス制御化合物の併用効果について解析を行った。皮膚血管肉腫細胞株に対しエピジェネティクス制御化合物のうち、ヒストン脱アセチル化阻害剤が増殖抑制効果を示し、細胞周期停止を誘導することが明らかになった。細胞周期停止に関わる分子の解析を行い、ヒストン脱アセチル化阻害剤はサイクリンD1を下方制御することでG1期細胞周期停止を誘導し、p21を上方制御することでG2/M期細胞周期停止を誘導することを見いだした。血管肉腫細胞株に対しヒストン脱アセチル化阻害剤とPI3K阻害剤の併用による増殖抑制は相加効果を示した。血管肉腫細胞株(ISOS-1, ISO-HAS)に対する80種類のエピジェネティクス制御化合物による増殖抑制効果をWST-8アッセイで評価した。80種類のエピジェネティクス制御化合物のうち増殖抑制効果の高かった3つのHDAC阻害剤を選び細胞周期解析を行った。ISOS-1ではG1細胞周期停止が誘導され、ISO-HASではG2/M細胞周期停止が誘導されていることが示唆された。今後は細胞周期停止に関与するタンパクの同定をウエスタンブロッティングを用いて解析する方針である。また、細胞増殖抑制に最も関与するHDACを同定し、PI3K/mTOR阻害剤との併用効果の検討を行う方針である。所属部署から他施設へ転勤になり実験の日々の継続が困難となったため。平成28年度に血管肉腫細胞株に対して80種類のエピジェネティクス化合物による増殖抑制効果をWST-8アッセイで評価した。80種類のうち増殖抑制効果が強く示された3種類のHDAC阻害剤効果を細胞周期解析を用いて行った。ISOS-1細胞ではG1期細胞周期停止が誘導され、ISO-HAS細胞ではG2/M期細胞周期停止およびアポトーシスが誘導されることを確認した。3種類のHDAC阻害剤すべてで細胞周期停止およびアポトーシスの効果を確認したため、Romidepsinのみに絞って更なる解析を行った。細胞周期停止に関与する分子の同定をウエスタンブロッティングで行った結果、ISOS-1細胞では、Romidepsinは濃度依存性にサイクリンD1の発現量を低下させた。ISO-HAS細胞では、Romidepsinは濃度依存性にp21の発現量を増加させた。さらにRT-PCR法を用いて解析を行い、ISOS-1細胞ではRomidepsinは濃度依存性にcyclinD1のmRNAの発現量を低下させ、ISO-HAS細胞ではp21のmRNAの発現量を低下させた。次にPI3K-mTOR経路阻害剤とHDAC阻害剤の併用効果をWST-8アッセイを用いて検討した。ISOS-1細胞においてPI3K阻害剤LY294002とHDAC阻害剤Romidepsinの併用は相加効果を示した。1.細胞周期停止に関与するタンパクの同定をウエスタンブロッティングを用いて解析するとともに、siRNAを用いて細胞周期停止に関わるHDACを同定する。2.3つのHDAC阻害剤とPI3K阻害剤、mTOR阻害剤、PDK1阻害剤を併用し、増殖抑制効果をWST-8アッセイを用いて検討するとともに、細胞周期・アポトーシス解析をフローサイトメトリーを用いて解析する。皮膚腫瘍学血管肉腫細胞株の増殖が遅く、80種類のエピジェネティクス制御化合物による増殖抑制効果の検討に時間を要したため、予定してたウエスタンブロッティングを遂行することができなかったため。H28年度に行う予定であったウエスタンブロッティング解析から開始し、研究計画の遂行のために研究費を使用する予定である。
咀嚼機能の変化が全身の健康状態に及ぼす影響に関する縦断調査

本研究では、高齢者の咀嚼機能の変化が全身の健康状態にどのような影響を与えるのかを調べるために、縦断研究を行った。また、縦断研究以外に年度ごとのデータを用いた断面調査も併せて行い、客観スケールで評価した咀嚼機能と全身の身体的・精神的・社会的健康状態との関連性について明らかにした。咀嚼機能の測定パラメーターは現在歯数、咬合面積、最大咬合力、咀嚼スコアであった。一方、全身の身体的・精神的・社会的健康状態の測定パラメーターは、高次ADLを評価する老研式活動能力指標、認知機能を評価するHDS-R、QOLを評価するPGCモラールスケール、食生活などの健康習慣の獲得状況であった。平成11年度の断面調査の結果より、咀嚼機能評価値は食事ならびに間食摂取状況などの食生活と密接に関係していることが明らかになった。また、平成12年の断面調査では身体的・社会的健康状態と密接な関連を有する老研式活動能力指標スコアと各咀嚼機能評価値との間には男女とも有意な相関関係が認められた(P<0.01)。また、QOLレベルを表わすPGCモラールスケールと咀嚼機能との関係では、「老化に対する態度に関わる因子」との関連性が認められた。また、認知機能を表わすHDS-Rと各咀嚼機能評価値との間にも有意な関連性が認められた(P<0.01)。以上、各年度データによる断面調査の結果では、咀嚼機能と高次ADL、認知機能、QOLレベルはいずれも有意な関連性が認められた。最終年度の平成13年度では、これらのデータの蓄積から縦断研究を実施した。この結果、研究期間内に観察された咀嚼機能の変化は、高次ADLならびに認知機能の変化と有意に関係しており(P<0.05)、咀嚼機能が歯科治療などによって改善されると、高次ADLや認知機能も向上することが示された。これらの結果より、高齢者の咀嚼機能の改善は歯科保健状態だけでなく、全身の健康状態の向上にも寄与することが示唆された。本研究は、高齢者の咀嚼機能の状況と全身の健康状態の関連性に関する縦断研究の初年度にあたるため、調査地域の高齢者の咀嚼機能と全身の健康状態についてべ一スラインサーベイを実施し、両者の関連についてcross-sectionalと解析を行った。対象者は、277名(男性114名、女性163名)の前期高齢者であった。調査項目は、感圧フィルムを用いた咬合力測定、摂取可能食品調査による咀嚼スコア算出、PGCモラールスケールを用いたQOL評価ならびに生活習慣等であった。Cross-sectional解析の結果、地域高齢者の咀嚼スコアは、PGCモラールスケールで評価されたQOLレベルと有意な関連性を示した。PGCモラールスケールの3つの階層(心理的動揺・安定に関わる因子、老化に対する態度に関わる因子、孤独感・不安感に関わる因子)のうち、特に「老化に関わる因子」が咀嚼スコアと密接に関連していた。