hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラクトグラフィ(破面情報解析)による審美的インレー修復のセメントラインの強化

採取した2級セラミックインレー臨床症例のレプリカを用いて,フラクトグラフィ解析およびセメントの摩耗量をレーザー変位計によって測定したところ,機能咬頭側で非機能咬頭側と比べて有意に大きな摩耗量を認め,さらに摩耗量の変化としてのセメントラインの経時的劣化は三段階の劣化様式を示した。第一期はセメントの摩耗による垂直方向の急速な劣化の進行,第二期はセラミックスの辺縁から内部に微少な亀裂が進展していく緩やかな劣化,第三期は,第二期までのセメントの摩耗で露出した辺縁が微小破折を繰返すことによって,明らかな辺縁劣化へと進行する時期であった。続いてin vivoでのセメントラインの劣化の3つのステージをシミュレートできるin vitro辺縁劣化試験法および辺縁劣化非破壊的定量法を考案し,レジン合着材の疲労劣化試験とセメントラインのフラクトグラフィ解析を実施した。本試験法にてin vitroの辺縁の疲労劣化を検討したところ,セメントラインの幅が100μmでは200μm以上の場合に比べて,劣化が有意に少ないことが示され,100μm以下のセメントラインを実現することが辺縁劣化を防止し,セメントラインを強化するのに有効であることが示唆された。さらに,第3ステージではインレー辺縁に存在する微少亀裂が急速に成長し,辺縁破折,セメントライン上部の拡大,急速な辺縁劣化をきたすことが明らかになった。また,探針でのセメントラインの検査では,先端径の大きさ(120μm500μm)が水平ギャップ幅の検知に有意に影響を与え,170μm200μmの先端径の探針を用いることで,目標とする100μm前後のセメントラインをmodified USPHS criteriaのAlfaとBravoの判定境界とすることができることがわかった。以上のように,本研究は,口腔内での審美的インレー修復の経時的劣化様式を明らかにし,さらにその劣化様式をシミュレートできるin vitroでの辺縁劣化非破壊的定量法を考案し,さらにフラクトグラフィ解析からセメントラインの強化と経時的辺縁劣化の早期検知についての提言を行った。本年度は臨床経過例のレプリカの採取,セメントの磨耗量の測定,臨床経過例のセメントラインのフラクトグラフィ解析,合着用レジン材料を用いた疲労亀裂進展試験ならびに実験レジン材料の調整を行った。その結果以下に示す知見が得られた。採取した2級セラミックインレー臨床症例のレプリカを用いて,セメントの磨耗量をレーザー変位計によって測定したところ,機能咬頭側で非機能咬頭側と比べて有意に大きな磨耗量を認めた。さらに磨耗量の変化としてのセメントライン経時的劣化は三段階の劣化様式を示した。第一期はセメントの磨耗によって垂直方向に急速に劣化が進行し,第二期では劣化は緩やかになるもののセラミックスの辺縁から内部に微少な亀裂が進展していく。第三期は,第二期までのセメントの磨耗で露出した辺縁が微少破折を繰返すことによって,明らかな辺縁劣化へと進行する時期であった。また,セメントラインの幅が大きくなるほど辺縁劣化も激しくなる傾向を示し,セメントラインの幅が辺縁劣化の大きなファクターであることが示唆された。合着用レジン材料の疲労亀裂進展試験を行ったところ,コンポジットレジンやセラミックスの疲労亀裂進展試験条件の適用では安定した亀裂の進展が困難であった。

これはセメント材料特有の試料作製時の欠陥や接着性モノマーの存在による物性への影響などが原因と考察しており,現在,試料の作製方法,試験片の形状,角荷条件の見直しをすすめ,制御プログラムの一部変更も視野に入れて,亀裂試験の安定を図っているところである。実験材料の作製では現在材料の試作を行っており,今後,亀裂進展試験結果のフィードバックとともに作業を進めていく予定である。本年度は前年度明らかになったin vivoでのセメントラインの劣化の3つのステージ、すなわちセメントの摩耗によって垂直方向に急速に劣化が進行する第一期、劣化は緩やかになるもののインレー体の辺縁から内部に亀裂が進展していく第二期、第二期までのセメントの摩耗で露出した辺縁が微少破折をしながら明らかな辺縁劣化へと進行する第三期,をシミュレートできるin vitro劣化試験法の確立を行い、併せてレジン合着材の疲労劣化試験とセメントラインのフラクトグラフィ解析を実施した。その結果以下に示す知見が得られた。口腔内での経時的辺縁劣化を定量的かつ形態的に再現したin vitro劣化試験法を確立できた。また,本試験法にてin vitroの辺縁の疲労劣化を検討したところ、セメントラインの幅が100μmでは200μm以上の場合に比べて、劣化が有意に少ないばかりか、in vivoでの第3期セメントラインの幅が大きくなるほど辺縁劣化も激しくなる傾向を示し,100μm以下のセメントラインを実現することが辺縁劣化を防止し、セメントラインを強化するのに有効であることが強く示唆された。しかしながらセメントラインの幅が大きくなる審美的インレーの平均セメントラインは170220μmであり、やはりセメントライン自身の強化が不可欠であると考えられる。セメントラインの劣化のフラクトグラフィ解析ではミクロな亀裂の進行がセメントラインの劣化のトリガーになり、構成要素の検討と別途にセメントラインの強化法の必要性を伺わせている。今後,本年度の結果をフィードバックしながらセメントラインの強化法についてさらに検討を進めていく予定である。昨年度までの研究で、in vivoでのセメントラインの劣化が3つのステージからなること、また、そのフラクトグラフィ解析から、in vivoでの経時的辺縁劣化を定量的かつ形態的に再現したin vitro劣化試験法を確立でき、セメントラインの幅が100μmでは200μm以上の場合に比べて、劣化が有意に少ないこと、さらに第3ステージではセメントライン幅と相関して辺縁劣化が激しくなる傾向を示した。そこで本年はin vitro劣化試験の結果を踏まえ、再度in vivoでのセメントライン劣化のメカニズムをフラクトグラフィにて解析するとともに、臨床的なセメントラインの劣化の検知法、とくに探針の先端径や拡大鏡を用いた臨床評価の有効性について検討した。その結果、第3ステージではインレー辺縁に存在する微少亀裂が急速に成長し、辺縁破折、セメントライン上部の拡大、急速な辺縁劣化をきたすことが示された。また、探針でのセメントラインの検査では、先端径の大きさ(120μm500μm)が水平ギャップ幅の検知に有意に影響を与え、170μm200μmの先端径の探針を用いることで、目標とする100μm前後のセメントラインをmodified USPHS criteriaのAlfaとBravoの判定境界とすることができることが示唆された。しかしながら、垂直ギャップ幅の検知には先端径は影響を与えず、さらに、探針の診査に拡大鏡など視覚的な検査を併用しても判定境界に影響を及ぼさなかった。
家畜の遺伝子疾患および不良形質の分子基盤の解明とその予防に関する研究

黒毛和種のライソゾーム病については、全ゲノム解析データに基づいて、当初最も疑わしいと疾患と考えられていたガラクトシアリドーシスおよびシアリドーシスの原因遺伝子であるCTSAおよびNEU1の配列をイントロン領域も含め詳細に調査した。その結果、NEU1遺伝子には候補となりうる変異は認められなかったが、CTSA遺伝子のイントロン12のスプライシング領域にスプライシングに影響を与える可能性がある候補変異(c.1252-12C>G)が認められた。この候補変異の遺伝子型を識別するTaqManプローブを作成して、臨床的な健康な黒毛和種集団を調査したところ、同変異を保有する牛はある程度高い比率で存在したため、同疾患の原因にはなっていないと示唆された。黒毛和種の白質変性症については、これまでの免疫組織化学の実験結果から、メープルシロップ尿症の可能性があることが示唆されていたため、同疾患に関わる数種の遺伝子群を調査したが、この牛の全ゲノムデータの質にも問題があるため、現在までに候補となる変異を選択できていない。また、本年度については、黒毛和種の虚弱子牛症候群の主要原因となっているイソロイシルrRNA合成酵素異常症の変異保有牛の検索を加えて、同疾患のキャリア率算定のための迅速遺伝子型検査法を開発し、同疾患のヘテロ接合体キャリア率の調査を開始した。さらに、本年度新たに、本研究予算によって、新たに1件(犬の遅発型神経セロイド・リポフスチン症)について、次世代シーケンサーを用いた全ゲノムシーケンス解析を実施することができた。現在、本疾患に関連する遺伝子(十数種類)を調査して、原因変異の候補となる配列を選択しているところである。黒毛和種の2疾患(ライソゾーム病および神経白質変性症)については、現在までに原因変異は同定されていないが、全ゲノムデータを用いて、着実に候補遺伝子の調査を進められている。また、黒毛和種の生産性に影響を及ぼす遺伝的不良形質であるイソロイシルrRNA合成酵素異常症のヘテロ接合体牛の検索と分子疫学調査を、本研究プランに新たに加えることができた。さらに、新たに犬の遅発型神経セロイド・リポフスチン症の全ゲノムシーケンスデータを取ることができたため、これまで調査している疾患(オロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症)ともに解析は着実に進められる。牛の2疾患(ライソゾーム病および神経白質変性症)については、全ゲノム解析データに基づいて、その中から候補となる変異を選択してその真偽について個別に評価し、原因変異同定を目指す。伴侶動物の先天代謝異常症(ライソゾーム病、オロット酸尿症、メチルマロン酸尿症、等)についても、全ゲノム解析データに基づいて、その中から候補となる変異を選択してその真偽について個別に評価し、原因変異同定を目指す。黒毛和種のイソロイシルrRNA合成酵素異常症に関するヘテロ接合体キャリアの分子疫学調査を実施し、同疾患原因変異が同定された年(2013年)前後の変異アレル頻度の変化を明らかにするとともに、生産性への影響を評価する。平成29年度は、当初の計画を少し変更して、まず黒毛和種のライソゾーム病およびもう一つの神経変性性疾患の2疾患を先行して解析することとした。それは、一部の犬のオロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症は、別の研究費で全ゲノム解析がきる可能性が浮上したため(本研究費では予算的に今年度2解析しか実施できないため)、本計画においては他の研究計画で実施できない牛の2疾患を優先して解析した。黒毛和種のライソゾーム病に関しては、すでにこれまでの研究によって、症例の父牛の精液を確保しており、この精液から抽出したDNAおよび発症子牛のパラフィンブロック包埋組織から抽出したDNAを用いて、全ゲノム解析を実施した。現在、これらの全ゲノム配列データを基にして、ライソゾーム病の候補となる数十種の遺伝子を精査しているところである。もう一つの黒毛和種の疾患は、未同定(確定診断できていない)の神経白質変性症を起こす致死性疾患である。組織学的特徴から数種の遺伝性神経変性疾患が示唆されている。症例のパラフィンブロック大脳組織について、各種抗体を用いた免疫染色を実施することによって、本疾患は当初強く予想されたカナバン病ではなく、メープルシロップ尿症の可能性が高いことが判明した。また、この症例のパラフィンブロック標本から抽出したDNAを用いて、全ゲノム解析を実施した。現在、前述の黒毛和種2頭を対象として、メープルシロップ尿症の原因となりうる数種の遺伝子について、原因変異を検査しているところである。当初予定した解析の順序を変更したものの、平成29年度は黒毛和種の2疾患(ライソゾーム病および神経白質変性症)の次世代シーケンサーによる全ゲノム解析を実施できた。今後はこのデータに基づいて、着実に進めることが可能となった。また、神経白質変性症ついては、これまでは数種の疾患が候補となっていたが、各種関連蛋白に対する免疫組織化学染色よって、メープルシロップ尿症にある程度絞り込むことができたため、全ゲノム解析データと総合して、原因変異同定への明確な道筋がついた。

その結果、NEU1遺伝子には候補となりうる変異は認められなかったが、CTSA遺伝子のイントロン12のスプライシング領域にスプライシングに影響を与える可能性がある候補変異(c.1252-12C>G)が認められた。この候補変異の遺伝子型を識別するTaqManプローブを作成して、臨床的な健康な黒毛和種集団を調査したところ、同変異を保有する牛はある程度高い比率で存在したため、同疾患の原因にはなっていないと示唆された。黒毛和種の白質変性症については、これまでの免疫組織化学の実験結果から、メープルシロップ尿症の可能性があることが示唆されていたため、同疾患に関わる数種の遺伝子群を調査したが、この牛の全ゲノムデータの質にも問題があるため、現在までに候補となる変異を選択できていない。また、本年度については、黒毛和種の虚弱子牛症候群の主要原因となっているイソロイシルrRNA合成酵素異常症の変異保有牛の検索を加えて、同疾患のキャリア率算定のための迅速遺伝子型検査法を開発し、同疾患のヘテロ接合体キャリア率の調査を開始した。さらに、本年度新たに、本研究予算によって、新たに1件(犬の遅発型神経セロイド・リポフスチン症)について、次世代シーケンサーを用いた全ゲノムシーケンス解析を実施することができた。現在、本疾患に関連する遺伝子(十数種類)を調査して、原因変異の候補となる配列を選択しているところである。黒毛和種の2疾患(ライソゾーム病および神経白質変性症)については、現在までに原因変異は同定されていないが、全ゲノムデータを用いて、着実に候補遺伝子の調査を進められている。また、黒毛和種の生産性に影響を及ぼす遺伝的不良形質であるイソロイシルrRNA合成酵素異常症のヘテロ接合体牛の検索と分子疫学調査を、本研究プランに新たに加えることができた。さらに、新たに犬の遅発型神経セロイド・リポフスチン症の全ゲノムシーケンスデータを取ることができたため、これまで調査している疾患(オロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症)ともに解析は着実に進められる。牛の2疾患(ライソゾーム病および神経白質変性症)については、全ゲノム解析データに基づいて、候補遺伝子を精査して、原因変異を同定していく。原因変異あるいはハプロタイプが確定できれば、種雄牛および繁殖牛群における調査を実施する。さらに、受精卵の作成を試みて、変異胚の成熟を調査することにより、本疾患の胚発生への影響についても調査する予定である。犬および猫の先天代謝異常症(ライソゾーム病、オロット酸尿症、メチルマロン酸尿症、等)については、今後実施する次世代シーケンサー解析および他の関連研究で実施した解析結果などに基づいて、候補遺伝子を探索して、原因変異を同定していく。さらに、同定できた変異は随時分子疫学調査および疾患予防研究に展開していく予定である。牛の2疾患(ライソゾーム病および神経白質変性症)については、全ゲノム解析データに基づいて、その中から候補となる変異を選択してその真偽について個別に評価し、原因変異同定を目指す。伴侶動物の先天代謝異常症(ライソゾーム病、オロット酸尿症、メチルマロン酸尿症、等)についても、全ゲノム解析データに基づいて、その中から候補となる変異を選択してその真偽について個別に評価し、原因変異同定を目指す。黒毛和種のイソロイシルrRNA合成酵素異常症に関するヘテロ接合体
超微量ミックスト‐フロー=ラマン装置によるチトクロムP‐450中間体の構造決定

1共鳴ラマン分光法によって単寿命中間体の構造解析を行なうためには、中間体の可視-紫外吸収スペクトルに関する正確な情報を得る事が必要である。そこで、最初にチトクロームP-450cam(P-450cam)高酸化状態の吸収スペクトル決定を行なった。low spin ferric P-450camと有機過酸(m-chloroperbenzoic acid)との反応をラピッド-スキャン法で観測した結果、これまで存在が指摘され続けていながら、その吸収スペクトルが確立していなかった高酸化状態の一つが、370nmと694nmに吸収極大を持つものである事を今回初めて明らかにした。このスペクトルは、P-450と同様に第5配位子にチオレートアニオンを持つchloroperoxidaseのcompound I中間体(CPO I;lambda_<max>=367,688nm)と酷似している。室温、水溶液中でCPO Iの活性部位は,Fe=O構造である事を我々は既に報告しており、今回確認されたP-450camの中間体も同様のものである事が期待される(投稿中)。2次に、超微量ミックスト-フロー=ラマン装置による共鳴ラマンスペクトル測定の諸条件の確立および、本装置の性能の検討をかねて、既にラマンスペクトルが得られているCPO IおよびCPO II(chloroperoxidaseのcompound II中間体)の共鳴ラマンスペクトルの励起波長依存性を調べた。この結果、(1)CPO Iの400nm付近における吸収スペクトルのピークは、少なくとも二つ以上の異なった電子遷移からなる事、(2)CPO IIの活性部位構造は、他のペルオキシダーゼ類のcompound IIとは、かなり異なったものである事、の2点を強く示唆する結果を得た。本研究の課題であるP-450高酸化状態の共鳴ラマンスペクトル測定については、上述した結果をふまえて、予備的な測定を既に行ない、スペクトルのS/N比を向上させるべく、さらに実験を継続している。
細胞接着斑裏打ち蛋白質ビネキシンの生理機能の解析

細胞の移動、運動能力は、動物の生体内において創傷治癒、がんの浸潤、血管新生などさまざまな重要な役割を持っている。細胞の移動、運動能力を制御、阻害することができれば新しい抗転移剤、抗がん剤の開発に貢献できると考えられる。本研究では申請者らがこれまでに単離していた新規接着領域裏打ち蛋白質ビネキシンのノックアウトマウス、ノックダウン細胞を用い、ビネキシンの創傷治癒過程、細胞のがん化などにおける役割の解明を目指した。1)創傷治癒過程の解析-ビネキシンノックアウトマウスと培養表皮細胞を用い、ビネキシンが上皮細胞増殖因子受容体の活性化と局在を制御することで、in vitroにおいてもin vivoにおいても創傷治癒を促進することを明らかにした。また、上皮細胞増殖因子受容体の活性化レベル上昇のメカニズムについても解析した。2)細胞増殖シグナルの足場依存性-ビネキシンによるERK活性化の足場非依存性誘導について検討し、ビネキシンがERKの不活性化過程を抑制していることを明らかにした。また、ERKの不活性化過程が細胞増殖シグナルの足場依存的制御に寄与していることを接着系動物培養細胞で初めて示した。3)細胞骨格と細胞接着における機能-細胞の運動、浸潤能が高いHT1080細胞のビネキシンβの発現を抑制したところ、細胞の接着そのものには影響しなかったが、細胞の伸展を抑制した。これには活性型低分子量Gタンパク質の量が局所的に減少していることが関与していた。また、低分子量Gタンパク質の下流でアクチン重合を制御するWAVE2とビネキシンが特異的に結合し、そのリン酸化と量を制御していることも明らかにした。細胞接着、細胞増殖、細胞骨格の制御に関わることが示唆されている細胞接着斑裏打ち蛋白質ビネキシンの機能について解析を行っている。今年度はこれまでに報告してきたビネキシンによるERK活性化の足場非依存性誘導について、そのメカニズムの解析を行った。その結果ビネキシンはNIH3T3細胞内で、ERKの活性化因子を調節するのではなく、不活性化因子、つまりフスファターゼによるERKの不活性化を抑制していることを明らかにした。しかもこの不活性化の抑制にはビネキシンとERKとの直接結合が重要であること、ERK特異的フォスファターゼであるMKP3の強制発現によって解除されることが明らかとなった。このことから、NIH3T3細胞においてはERKの活性化因子の細胞接着依存性だけでなく、不活性化因子すなわちフォスファターゼも細胞接着依存的に作用し、ビネキシンはそのステップに影響することでNIH3T3細胞内におけるシグナル伝達の制御に関わることが示唆された。一方、ビネキシン遺伝子の破壊細胞を用いた細胞運動実験では、個体の創傷治癒実験とは異なりビネキシンの消失により細胞運動が亢進することを示唆する結果を得た。このことから、細胞によって異なるメカニズムでビネキシンが細胞運動を制御する可能性も考えられる。次年度以降にさらに解析を行い、この仮説について検証する。細胞は、移動先端部で新たな細胞接着を形成して基点を作り、細胞骨格が引っ張り力を発生して細胞全体を引き寄せることで移動している。このような協調した動きは細胞接着、細胞骨格系の分子と増殖因子シグナルとのクロストークによって制御されている。本研究では、細胞接着、細胞増殖、細胞骨格の制御に関わることが示唆されている細胞接着斑裏打ち蛋白質ビネキシンの機能について、そのメカニズム解明を目指している。今年度はこれまでのビネキシン遺伝子ノックアウト細胞だけでなく、RNA干渉法によるビネキシン遺伝子発現抑制手法を用いて、ビネキシン遺伝子の機能解明を行なった。細胞の運動、浸潤能が高いHT1080細胞のビネキシンの発現を、SiRNAで抑制するとともに抑制した細胞にアデノウイルスを用いてビネキシン遺伝子を再発現させた。

これらの細胞を用いて細胞の接着、伸展について調べたところ、ビネキシンの発現抑制は細胞の接着そのものには影響しなかったが、コラーゲン上での細胞の伸展を抑制した。ビネキシンによる伸展制御のメカニズムについて検討したところ、活性型低分子量Gタンパク質の量が局所的に減少していることが明らかとなった。また、細胞の伸展膜の形成に重要な役割を果たしているWAVE2とビネキシンが特異的に結合し、そのリン酸化と量を制御していることも示した。以上、本研究により、低分子量Gタンパク質の活性調節またはWAVE2の制御を介して、ビネキシンは細胞の伸展制御に関わっていることが示された。細胞接着、細胞骨格系の分子と増殖因子シグナルとのクロストークは細胞運動、細胞の分化、増殖など様々な現象を制御されている。本研究では、細胞接着、細胞増殖、細胞骨格の制御に関わることが示唆されている細胞接着斑裏打ち蛋白質ビネキシンについて、ノックアウトマウスやRNA干渉法による発現抑制手法を用いて、その機能解明を目指している。今年度はアクチン細胞骨格の増強が分化に伴って起こり、それがさらに引き金となって分化が進行する骨格筋細胞分化のシステムにおけるビネキシンの機能について検討した。ラット由来筋芽細胞であるL6細胞は低血清培地で培養することで骨格筋細胞に分化する。このとき、ビネキシンの発現量が増加していることを見出した。この骨格筋分化系においてビネキシンの発現を抑制すると、アクチン細胞骨格の形成が阻害されるとともに、分化マーカーであるmyogeninの発現誘導が抑制された。骨格筋への分化の際にはp38MAPKやRhoシグナル、MRTFなどのシグナル伝達系が寄与していると報告されている。これらのシグナル伝達系がビネキシンの発現抑制よって影響を受ける可能性についても検討し、すでに候補シグナルを同定している。以上の結果から本研究により、ビネキシンはこれまで報告してきたような細胞運動や細胞伸展過程において重要な役割を担っているでなく、骨格筋細胞の分化過程においても重要な役割を果たしていることが示された。細胞は、移動先端部で新たな細胞接着を形成して基点を作り、細胞骨格が引っ張り力を発生して細胞全体を引き寄せることで移動している。このような細胞の移動、運動の制御は細胞接着、細胞骨格系と増殖因子シグナル伝達系のクロストークによって行なわれている。本研究ではこれまでに作製しているビネキシンのノックアウト細胞、ノックダウン細胞、強制発現細胞を用いて細胞接着、細胞骨格とシグナル伝達とのクロストーク機構の解明を試みた。1)創傷治癒過程の解析ビネキシンノックアウトマウスとビネキシン発現抑制培養表皮細胞を用いたin vivo,in vitroの創傷治癒モデルにおいて異常が見られている。このメカニズムについて検討したところ、創傷治癒に必要な上皮細胞増殖因子受容体の活性化と移動先端部への局在がビネキシンによって制御されていることが分かり、創傷治癒の新しい調節メカニズムを見出した。2)ノックアウト細胞を用いた解析これまでにビネキシンノックアウト細胞において、細胞外マトリクスフィブロネクチンの繊維化が亢進していることが明らかとなった。
Bargaining with Delay in Litigation

本研究では、訴訟における裁判の遅延が訴訟の結果と効率性に与える影響を実証的に分析する。裁判の遅延は、裁判所が取り扱う膨大な訴訟件数と裁判官の不足に起因しており、関係者すべての時間コストを増大させることから、重要な社会経済的な問題として広く議論の対象となっている。しかし、裁判の遅延が実際に訴訟プロセス全体にどのような影響を与えているか、効率性を損なっているかは明らかでない。例えば、裁判の遅延により原告と被告の双方が長期にわたる裁判プロセスを敬遠すれば早期に和解が成立しうる。本研究では、米国フロリダ州における医療過誤に関する訴訟データを用い、裁判の遅延が訴訟プロセスに与える厚生効果を推定する。
プリオン増殖阻害に関わるエピゲノム遺伝子制御の解明

長期間にわたりプリオン増殖阻止現象を示す化合物の作用機序を解明するため、化合物投与マウスおよび対照マウスの脳組織について染色体DNAのエピゲノム修飾を解析した。メチル化DNA免疫沈降法+プロモーターアレイでメチル化マッピングを、クロマチン免疫沈降法+プロモーターアレイ解析でヒストン修飾マッピングを行った。さらに、同組織材料を用いてDNAアレイ解析とマイクロRNAアレイ解析で遺伝子発現プロファイリングを行った。これらの結果を相互に照らし合わせて、候補遺伝子群を抽出した。申請者は生体において不活性物質であるセルロース誘導体化合物の末梢体内への投与により、脳内プリオン増殖が抑制され、ほぼ一生涯にわたり発症が阻止されること、さらに投与マウスの仔マウスでも脳内プリオン増殖抑制が起こることを発見した。このプリオン増殖抑制機序には、マクロファージ系細胞に関連する液性因子群が働いている。申請者は、長期間かつ世代を超えるプリオン増殖阻止現象に、液性因子群によるエピジェンテックなクロマチン修飾が関与していると考えている。本申請研究では、セルロース誘導体化合物投与マウスおよび仔マウスのプリオン易障害性脳領域の染色体DNAのゲノムワイドなエピゲノム修飾を解析し、この仮説を調べる。当該年度は、セルロース誘導体化合物をマウスに単回皮下投与後の2年間にわたり経時的に採取した脳組織と、セルロース誘導体化合物を単回皮下投与後に妊娠させ得られた仔マウスの生後経時的に採取した脳組織と、未投与の対照群の脳組織を用いて、高密度メチル化領域をメチル化DNA免疫沈降(MeDIP)法+プロモーターアレイで解析しメチル化マッピングを行った。また、同じ脳組織材料を用いて、各種の化学修飾特異的かつヒストンバリアント特異的な抗ヒストン抗体を用いてクロマチン免疫沈降(ChIP)法+プロモーターアレイ解析によるヒストン修飾マッピングを行った。さらに、同じ脳組織材料を用いてDNAマイクロアレイ解析で遺伝子発現プロファイリングを行った。当該年度は、セルロース誘導体化合物をマウスに単回皮下投与後の2年間にわたり経時的に採取した脳組織と、セルロース誘導体化合物を単回皮下投与後に妊娠させ得られた仔マウスの生後経時的に採取した脳組織と、未投与の対照群の脳組織を用いて、低密度メチル化領域をMicroarray-based Integrated Analysis of Methylation by Isoschizomers (MIAMI)法+プロモーターアレイで解析しメチル化マッピングを行った。また、高密度メチル化領域をメチル化DNA免疫沈降(MeDIP)法+プロモーターアレイで解析を開始した。一方、同じ脳組織材料を用いて、ヒストン修飾マッピングを行うためクロマチン免疫沈降(ChIP)法+プロモーターアレイ解析を開始した。各種の化学修飾特異的かつヒストンバリアント特異的な抗ヒストン抗体を用いて解析中である。申請者は生体において不活性物質である糖誘導体化合物の末梢体内への投与により、脳内プリオン増殖が抑制され、ほぼ一生涯にわたり発症が阻止されること、さらに投与マウスの仔マウスでも脳内プリオン増殖抑制が起こることを発見した。本申請研究では、糖誘導体化合物投与マウスおよび仔マウスのプリオン易障害性脳領域の染色体DNAのゲノムワイドなエピゲノム修飾を解析し、この仮説を調べた。糖誘導体化合物をマウスに単回皮下投与後の2年間にわたり経時的に採取した脳組織と、糖誘導体化合物を単回皮下投与後に妊娠させ得られた仔マウスの生後経時的に採取した脳組織と、未投与の対照群の脳組織を用いて、高密度メチル化領域をメチル化DNA免疫沈降(MeDIP)法+プロモーターアレイで解析しメチル化マッピングを行った。これらの結果を相互に照らし合わせて、バイオインフォーマティクス解析により有意な候補遺伝子を多数抽出した。各候補遺伝子について、定量的PCRとウエスタンブロットで発現を確認中である。

神経化学平成25年度の計画と照らし合わせて、低密度メチル化領域の解析は予定通り終了し、高密度メチル化領域のマッピングならびにヒストン修飾マッピングは予定のほぼ7割を消化した。また、DNAマイクロアレイ解析による遺伝子発現プロファイリングは、予定通りに進行した。総合的には、ほぼ予定通りに研究が進んでいる。ほぼ予定通りに研究が進んでいるため。残っているメチル化マッピングならびにヒストン修飾マッピングをできるだけ早期に終了させ、DNAメチル化、ヒストン化学修飾そして遺伝子発現プロファイルを相互に照らし合わせて、数理的解析・バイオインフォーマティクス解析により有意な候補遺伝子を抽出する。候補遺伝子について、定量的PCRや塩基配列決定などにより確認・特定作業を行い、さらにタンパク質レベルでの発現を確認する。メチル化マッピングならびにヒストン修飾マッピングを継続し、次年度内には解析を終了させる予定である。さらに、次年度にはエピゲノム解析と同じ脳組織材料を用いてDNAマイクロアレイ解析で遺伝子発現プロファイリングをおこなう。DNAメチル化、ヒストン化学修飾そして遺伝子発現プロファイルを相互に照らし合わせ、数理的解析・バイオインフォーマティクス解析により有意な候補遺伝子を抽出する。終了年度内には、候補遺伝子について、定量的PCRや塩基配列決定などにより確認・特定作業を行い、さらにタンパク質レベルでの発現を確認する。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額と合わせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。次年度の研究費の8割は、アレイ解析ならびにプロファイリングを専門とする技術補佐員の人件費に充て、残り2割はアレイ解析用消耗品に使用する。
腎癌転移における腫瘍血管内皮細胞－がん細胞クラスターの役割解明

がんの進展・転移にはがん細胞とがん間質細胞の相互作用が重要である.がんの血管を裏打ちする腫瘍血管内皮細胞も間質細胞の一つであり,様々な異常性を示す.申請者らは腫瘍血管内皮細胞ががん細胞とクラスターを形成する性質をもつこと,様々な接着因子や増殖因子を高く発現すること,薬剤抵抗性があることなどを見出してきた.本研究では,がん細胞が腫瘍血管内皮細胞とクラスターを形成することで転移先臓器へと移動する血液中において細胞死から逃れ,遠隔臓器に転移巣を形成すること,さらに薬物治療に対する耐性を示すという仮説を立て,がん進展・転移における腫瘍血管内皮細胞の新しい役割を分子基盤とともに解明することを目指す.がんの進展・転移にはがん細胞とがん間質細胞の相互作用が重要である.がんの血管を裏打ちする腫瘍血管内皮細胞も間質細胞の一つであり,様々な異常性を示す.申請者らは腫瘍血管内皮細胞ががん細胞とクラスターを形成する性質をもつこと,様々な接着因子や増殖因子を高く発現すること,薬剤抵抗性があることなどを見出してきた.本研究では,がん細胞が腫瘍血管内皮細胞とクラスターを形成することで転移先臓器へと移動する血液中において細胞死から逃れ,遠隔臓器に転移巣を形成すること,さらに薬物治療に対する耐性を示すという仮説を立て,がん進展・転移における腫瘍血管内皮細胞の新しい役割を分子基盤とともに解明することを目指す.
シベリア湿地帯からの温室効果ガス・メタン放出評価のための土壌微生物生態解析

シベリア湿地土壌サンプルにFISH法を適用した場合、極限的な環境に生息している微生物群はRNA含量が少ないために、従来のFISH法では十分な輝度が望めなく、適用はむずかしいことがこれまでの研究で分かった。そこで本研究ではRNA含量が少ない微生物に対しても適用可能な高感度のFISH法を開発し、シベリア湿地帯からの温室効果ガス・メタン放出を評価するための土壌微生物生態を解析することを目的としている。蛍光標識の代わりに抗DIG-アルカリフォスファターゼ(AP)標識等の酵素をプローブに付加して使用すれば、高感度に微生物を検出することが可能と考えられた。しかし、この手法をリゾチーム処理した大腸菌に適用したが、検出はできるものの、高感度までには至らなかった。また、メタン生成細菌などへの適用に対してプローブの浸透性が問題であり、凍結・融解法などの種々の方法で試みたものの、まだプローブを浸透させるまでには至っていない。そこで、より高感度な検出が可能であるCARD-FISH法を用いて、微生物を検出するための手法について検討を行った。CARD-FISH法適用のためには、標的微生物の細胞壁を適切に処理し、酵素を菌体内に浸透させる必要がある。メタン生成古細菌の代表的細胞壁構造(シュードムレイン、Sレイヤー、メタノコンドロイチン、シース)をもつ6種の純菌を選択し、それぞれについて細胞壁処理方法の検討を行ったところ、Sレイヤー、メタノコンドロイチンは無処理で検出することができ、シュードムレイン、シースはそれぞれの細胞壁に対して特異的に働く酵素を用いることで検出が可能となった。純菌で得られた知見をもとに、環境サンプルへの適用を試みたところ、ARC915プローブに反応するメタン生成古細菌と思われる微生物を高感度に検出することができ、さまざまな環境中からメタン生成古細菌を検出することが可能であることが示唆された。地球温暖化の原因物質である温室効果ガスCO_2、メタンの加速的な増加が認められている。自然環境中で最も大きなメタン放出源のひとつとして挙げられているのが、自然湿地帯や水田などの自然・人工湿地土壌である。その中でロシア・シベリア湿地帯は広大な面積を有し、そこから発生しているメタンガスの総量は、地球全土からの総メタン生成量のかなりの部分を占めると推定される。このシベリア湿地帯は、地球温暖化が進むと凍土の期間は短くなり、メタンが放出される期間が長くなって、地球温暖化が益々加速するのではないかと大変に心配されている。従って、これらの懸念を明らかにし、対策する必要性があるかどうかを明確にするためには、シベリア湿地帯のメタン放出に関与する微生物群集の動態を解析することが重要となる。

自然環境中で最も大きなメタン放出源のひとつとして挙げられているのが、自然湿地帯や水田などの自然・人工湿地土壌である。その中でロシア・シベリア湿地帯は広大な面積を有し、そこから発生しているメタンガスの総量は、地球全土からの総メタン生成量のかなりの部分を占めると推定され、シベリア湿地帯のメタン放出に関与する微生物群集の動態を解析することが重要となる。シベリア湿地土壌サンプルにFISH法を適用した場合、極限的な環境に生息している微生物群はRNA含量が少ないために、従来のFISH法では十分な輝度が望めなく、適用はむずかしいことがこれまでの研究で分かった。そこで本研究ではRNA含量が少ない微生物に対しても適用可能な高感度のFISH法を開発し、シベリア湿地帯からの温室効果ガス・メタン放出を評価するための土壌微生物生態を解析することを目的としている。本年度は、より高感度な検出が可能であるCARD-FISH法を用いて、微生物を検出するための手法について検討を行った。CARD-FISH法適用のためには、標的微生物の細胞壁を適切に処理し、酵素を菌体内に浸透させる必要があり,メタン生成古細菌に着目した。メタン生成古細菌の代表的細胞壁構造(シュードムレイン、Sレイヤー、メタノコンドロイチン、シース)をもつ6種の純菌を選択し、それぞれについて細胞壁処理方法の検討を行ったところ、Sレイヤー、メタノコンドロイチンは無処理で検出することができ、シュードムレイン、シースはそれぞれの細胞壁に対して特異的に働く酵素を用いることで検出が可能となった。純菌で得られた知見をもとに、環境サンプルへの適用を試みたところ、ARC915プローブに反応するメタン生成古細菌と思われる微生物を高感度に検出することができ、さまざまな環境中からメタン生成古細菌を検出することが可能であることが示唆された。
大正期生まれ教団首脳のライフコ-ス

予定の2年間で、真宗大谷派元宗務総長・嶺藤亮(大正3年生、故人)、日本基督教団前世界宣教協力委員長・岩村信二(大正9年生)、金光教元教監・安田好三(大正10年生、故人)、曹洞宗宗議会議員・朝日泰峯(大正11年生)、立正佼成会理事長・長沼基之(大正12年生)神社本庁副総長・岡本健治(大正13年生)の6師の面接調査を実施し、つぎの諸点が明らかになった。(以下頭文字を用いて示す。)(1)家族・親族等のマイクロ環境の影響は、親の職業を嗣ぐ形で宗教家になった場合に顕著で、とくにMとIの場合、宗教家となる構えは少年期までに形成されたもののようである。両者ともにマイクロ環境の人物がアイデンティフィケ-ションの対象となっている。また、AもOも父の希望に添うて宗教家となったことは、マイクロ環境の道筋方向づけ機能を示唆している。(2)中学校以上の学校や研修のための道場、あるいは職場といった比較的身近な環境、さらに数団という宗教家にとっての大環境は、ともに青年期以後に経験されるメソ環境であって、教団人の自己形成のために例外なく大きな意義をもつことが判明した。調査対象の6人は、いずれもメソ環境の挑戦に積極的に応戦することによって、宗教家そして教団リ-ダ-としての資質に磨きをかけた。(3)戦争体験という過去のマクロ環境のいわば後遺症は、Y、A、O、Nに明瞭に現れている。この4人に共通するのは、職務にたいする滅私奉公的な姿勢であって、前3者の場合これを強く支えたのは生き残り者の負い目感であった。MとIは軍隊に入る前に独自の価値体系を体得していたので、戦争体験の影響は表層的なものに止まった。本年度は真宗大谷派の元宗務総長(A)嶺藤亮、金光教元教監(B)安田好三、立正佼成会理事長(C)長沼基之の3師を取り上げた。真宗大谷派は9千近い寺院を擁する既成仏教系の大教団、金光教は約1,500の教会を傘下にもつ教派神道系の中規模教団、そして立正佼成会は戦中期に発足したいわゆる新宗教の代表的教団であり、3師のそれぞれの役職は所属教団の事務と行政面の最高ポストである。3師には所属教団の伝統と教義・儀式儀礼・組織の差に加えて、同じ大正期生まれでも生年に差があり、かつ出発点において教団との関係に差があった。(A)嶺藤は1914(大正3)年9月真宗寺院の長男として生まれ、(B)安田は1921(大正10)年7月日蓮宗の家に生まれ、(C)長沼は1923(大正12)年10月のちに立正佼成会の副会長となる長沼妙佼の甥として生まれた。(C)長沼は戦後中国大陸から復員ののち、叔母の養子のような立場で教団の中枢にあり、1952(昭和27)年には29歳で理事長となった。叔母亡きあとは会長の信任をえて、教団の発展とともに歩んで今日に至っている。これにたいして、(A)嶺藤は教学の研鑚の好きな父の影響のもとに成育し、大谷大学在学中曽我量深・安田理深師らの薫陶を受け、1958(昭和33)年、43歳の時から大谷派の宗議会議員として宗政にかかわり始め、1974(昭和49)年から6年間、59歳から65歳まで宗務総長としていわゆる大谷派紛争の収拾に骨身を削った。

(B)安田は戦中の緑で金光教教師となり、40歳台の半ば頃から教団行政にかかわり始め、1974年から10年間、52歳から62歳まで教監として教団の諸改革を成功させた。(A)においては18歳から24歳にわたる修学期に、(B)においては20歳から24歳の軍隊時代に、のちに教団行政を担当するときの基本的態度が形成されたようである。本年度は神社本庁副総長(D)岡本健治、曹洞宗宗議会議員(E)朝日泰峯、日本基督教団前世界宣教協力委員長(F)岩村信二の3師を取り上げた。神社本庁は7万9千余の神社を包括する神社神道系の巨大教団、曹洞宗は傘下に1万5千近い寺院を擁する既成仏教系の巨大教団、そして日本基督教団は1,500近い教会を包括するプロテスタント・キリスト教の代表的教団である。3師はそれぞれの教団において頗る重要な地位を占め、大きな影響力をもっている。3師は所属教団の伝統を異にするのみならず、成育の背景の点で(E)朝日は農山村寺院の三男、(D)岡本は地方都市職工の長男、(F)岩村は大都市キリスト教会牧師の長男という差異があり、最終学歴も(E)(D)は(宗門立)大学専門部、(F)は官立大学大学院・米国大学大学院といった差異があるが、生年は(F)の1920(大正9)年、(E)の1922(大正11)年、(D)の1924(大正13)年3月、と隔たりが小さい。3師が所属する教団では、宗教家としての職業的地位を子に世襲させる伝統が規範として成立しているわけではないが、その家系の伝統に由来する親の期待に添うて宗教家となった点では、3師とも軌を一にしている。宗教家としての人間形成については、(F)岩村は父、伯父、祖父母といった近親に、(E)朝日は大学専門部での師や先輩、道場での修業に、(D)岡本は職場での日常的訓練と上司先輩の感化に負うところが大きい。戦争体験は(E)と(F)では後遺症的インパクトをもち、自己にたいする倫理的要請をきびしいものにしているが、(F)では何のインパクトもなかったといってよい。
スピン角度分解光電子分光で探るレーザー光による光誘起スピン電流の電子スピン制御

光と物質中の電子のスピンを利用したオプトスピントロニクスは、光伝達などの通信用デバイスや新奇多機能性デバイスの有力な技術として最近注目を集めている。これまでの研究では、光をトリガーとして固体中に発生する光誘起スピン偏極電気伝導が発生するか否かといったスピン生成に着目した研究が主であった。しかしながら、スピントロニクスデバイスには、スピン生成、スピン制御、スピン検出といった3つの必須構成要素がある。この内、スピン制御の手法として、光の入射角および偏光性を利用することが期待されているが、この技術的確立には、発生するスピン偏極電流のスピン方位およびスピン偏極度が如何に変化するかを明らかにする事が必須である。本研究では、光励起で生成される正孔(光誘起スピン偏極電気伝導の源)と光電子の一対一対応に着目し、これまで明らかとなっていない光の入射角・偏光依存性によるスピン偏極電流のスピン方位・偏極度を、スピン分解光電子分光法を用いて明らかにすることを目的とする。本研究では、その目的を達成するために初年度に光の入射角依存性の測定を可能にするための装置開発が必須であった。そこで、本年度はその主要部分となるシステムの設計および構築を行った。その結果、設計を完全に終えることができ、システム構築のための部品を揃えることができた。翌年度から、これらを組み立て、その評価を行い、その後、トポロジカル絶縁体Bi2Se3などを用いて光誘起電流のスピン方位の完全決定の実験を行う予定である。本年度までに、光の入射方向可変システムの設計・導入・評価まで行う予定であったが、物品の納期が大幅に遅れたことと、本研究の主要装置である6eVレーザーが故障し、稼働しない状態が続いているために全体的に遅れが生じている。2019年度では、購入した装置の部品の組み立てを行い、確実に稼働することを確認後、Bi2Se3などの試料を用いて光スピン偏極電流のスピン方位の決定を行う予定である。
大正末期から昭和初期における「作問中心の算術教育」実践に関する史的研究

本研究は、わが国における問題設定活動の初源的形態とも言える奈良女子高等師範学校附属小学校の実践「作問中心の算術教育」に視座を置き、大正末期から昭和初期にかけて主張された様々な算術教育思潮及び算術教育実践が生活算術として統合されていく過程について考察することである。具体的には、以下の点について研究を行った.・生活算術が展開されていた時期,「作問中心の算術教育」の中心的実践者である清水甚吾の算術教育の実際について明らかにする.・大正末期から昭和初期にかけて展開された算術教育実践(生活算術)と「作問中心の算術教育」との間の関連性を明らかにすることにより,「作問中心の算術教育」が生活算術の形成に果たした役割について考察する.・児童作問を意図したカリキュラムの水準においてはじめて学習材として採用した緑表紙教科書に対する「作問中心の算術教育」の影響を考察する.本研究を通して,以下のことを明らかにすることができた.大正期末期に一定の成果をあげた清水甚吾の算術教育実践は,昭和期に入ると当時の国定算術教科書との関連性,実行可能性に関する諸問題を解決する必要性に迫られ,その過程で「作問中心の算術教育」実践の内的変容を余儀なくされたが,清水が提唱する算術教育論は岩下吉衛,藤原安治郎,稲次静一等,当時を代表する生活算術の実践家に影響を与えた.ただし,それは清水の実践そのものではなく各実践家の立場に基づき捉え直されたものであった.様々な算術教育において取り入れられた児童作問は,その後,緑表紙教科において「数理思想の開発」の観点から意図したカリキュラムに位置づけられた.本研究は、わが国における問題設定活動の初源的形態とも言える奈良女子高等師範学校附属小学校の実践「作問中心の算術教育」に視座を置き、大正末期から昭和初期にかけて主張された様々な算術教育思潮及び算術教育実践が生活算術として統合されていく過程について考察することである。具体的には、以下の点について研究を行った.・生活算術が展開されていた時期,「作問中心の算術教育」の中心的実践者である清水甚吾の算術教育の実際について明らかにする.・大正末期から昭和初期にかけて展開された算術教育実践(生活算術)と「作問中心の算術教育」との間の関連性を明らかにすることにより,「作問中心の算術教育」が生活算術の形成に果たした役割について考察する.・児童作問を意図したカリキュラムの水準においてはじめて学習材として採用した緑表紙教科書に対する「作問中心の算術教育」の影響を考察する.本研究を通して,以下のことを明らかにすることができた.大正期末期に一定の成果をあげた清水甚吾の算術教育実践は,昭和期に入ると当時の国定算術教科書との関連性,実行可能性に関する諸問題を解決する必要性に迫られ,その過程で「作問中心の算術教育」実践の内的変容を余儀なくされたが,清水が提唱する算術教育論は岩下吉衛,藤原安治郎,稲次静一等,当時を代表する生活算術の実践家に影響を与えた.ただし,それは清水の実践そのものではなく各実践家の立場に基づき捉え直されたものであった.様々な算術教育において取り入れられた児童作問は,その後,緑表紙教科において「数理思想の開発」の観点から意図したカリキュラムに位置づけられた.本研究は、大正末期から昭和初期にかけて主張されたさまざまな算術教育思潮および算術教育実践が、互いの中に共通する足場を見出し、生活算術として統合されていく過程で、奈良女子高等師範学校附属小学校の「作問中心の算術教育」が果たした役割を明らかにすることを目的としている。具体的には、以下の3点を明らかにする。(1)当時の主要な算術教育思潮と「作問中心の算術教育」との間の関連性を考察する。(2)当時の各県の教育会誌に掲載されている算術教育実践を収集、分析することを通して、算術教育実践に「作問中心の算術教育」が及ぼした影響の内実を同定する。(3)上述した手順を通して明らかにすることができるであろう奈良女子高等師範学校附属小学校の「作問中心の算術教育」の普及過程の実際を通して、「作問中心の算術教育』が生活算術の形成に果たした役割を明らかにする。本年度は、主として上述した(2)の課題に答えるために、各県の教育会が出版していた会誌の所在に関する情報収集とその整理に努めるとともに、山形県、兵庫県、香川県、福井県の教育会誌について掲載されている算術教育に関する論説について調査を実施することができた。たとえば、山形県の教育会誌から奈良女子高等師範学校附属小学校で実施されていた算術教育に通ずる実践を見出すことができた。大正末期に全国的に普及したと言われている「作問中心の算術教育」も昭和期に入るとさまざまな批判にさらされ衰退していったと算術教育史では一般的に捉えられている。しかし、実際の普及過程が十分に明らかにされているわけではない。来年度も本年度の研究を継続することによって、「作問中心の算術教育」の普及過程、および何が普及したのか、ということについて明らかにしていきたい。本研究は、大正末期から昭和初期にかけて主張されたさまざまな算術教育思潮および算術教育実践が、互いの中に共通する足場を見いだし、生活算術として統合されていく過程で、奈良女子高等師範学校附属小学校の「作問中心の算術教育」が果たした役割を明らかにすることを目的としている。具体的には、以下の3点を明らかにすることを目的としている。

(1)当時の主要な算術教育思潮と「作問中心の算術教育」との間の関連性を考察する。(2)当時の各県の教育会誌に掲載されている算術教育実践を収集、分析することを通して、算術教育実践に「作問中心の算術教育」が及ぼした影響の内実を同定する。(3)上述した手順を通して明らかにすることができるであろう奈良女子高等師範学校附属小学校の「作問中心の算術教育」の普及過程の実際を通して、「作問中心の算術教育」が生活算術の形成に果たした役割を明らかにする。本年度は、昨年実施した各県の教育会誌に掲載されている算術教育に関する実践を継続して収集した。また、初等教育研究会編「教育研究」に掲載されている算術教育に関する論説を収集、分析した。また、生活算術として位置づけられている藤原安治郎、稲次静一の算術教育論における作問の位置について考察した。藤原においては作問中心の算術教育の基本的枠組みを受け入れながらも、算術書による系統と作問による系統との間の実践的課題を解決する方策として作問を労作的方法として位置づけようとしていた。また、稲次は清水が取り組んだ算術の新系統の構想に賛同していた。また、藤原、稲次の算術教育教育論においては、作問は一般化と特殊化(数理化と生活化)という文脈の中に位置づけられている。この位置づけは、作問が数学的活動の中に正当な場を見いだす上で重要な意味を持つものである。本研究は、大正末期から昭和初期にかけて主張された様々な算術教育思潮及び算術教育実践が、互いの中に共通する足場を見いだし生活算術として統合されていく過程で、奈良女子高等師範学校附属小学校の「作問中心の算術教育」が果たした役割を明らかにすることである。具体的には、以下の3点を明らかにすることを目的とした。(2)当時の各県の教育会誌に掲載されている算術教育実践を収集、分析することにより、当時の算術教育実践に「作問中心の算術教育」が及ぼした影響の内実を同定する。(3)上の(1)、(2)の分析結果を総合することによって、「作問中心の算術教育」が生活算術の形成に関して果たした役割を明らかにする。本年度は、上述した研究(1)と(2)を通して得られた結果を整理し、昭和初期の生活算術の形成過程を作問主義算術教育のそれと関連づけながら考察した。ただし、生活算術という算術教育の実体があるのではなく、いわば当時の算術教育実践の傾向であり、その実践の様は実に多様である。例えば、岩下吉衛の算術教育においては生活と数理が分化され現実生活を重視するが、数理との関連づけが未だ不十分な生活算術であった。藤原安治郎と稲次静一は生活と数理を分化させながらも両者を統合する過程として算術教育を構想していた。本年度は、生活算術の実践において大きな役割を果たしたとされている岩下、藤原、稲次、三氏の算術教育実践を中心として、多様な姿を呈した生活算術と作問主義算術教育との関係について分析することを通して、作問主義算術教育の形成過程について考察した。
動物リン脂質中間代謝諸酵素に関する分子生物学的検討

本研究では、ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)とホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)について検討した。両者とも脂質性シグナル分子代謝酵素であるが、当研究室が初めてcDNAクローニングに成功し、新知見を発表してきた。PAPに関しては、マウス35kDa酵素のクローン化成功後、2種のヒトPAPアイソザイムのクローン化を報告し、2a,2bと命名した。これらは表面膜を6回貫通する新しい糖タンパクである。2a,2bは転写調節機構、基質特異性が異なり分化した機能を持つ。これらの成果により、新しい触媒機序を共有するPAP-2スーパーファミリーの存在と、PAPの細胞分化、生殖細胞移動制御などにおける予想外の機能が明らかになった。現在PAPのKOマウス作成、PAP安定発現フィブロブラストの解析が進行中である。DGKについては、DGK-デルタ型のクローン化を報告した。我々の成果を基礎にして、8種類の興味ある構造を持つアイソザイムから成る、DGK遺伝子ファミリーの全貌が明らかになった。DGK-アルファのリンパ球活性化時のトランスロケーション、触媒部位の同定を報告した。またDGK-アルファ、ベータ、ガンマ型に存在するEF-ハンドのカルシウム結合能の比較検討を行った。現在DGKの機能ドメインと結合する制御タンパクを酵母two-hybrid系で検索中である。ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)とホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)の分子生物学的検討を行っている。1.DGK.第4番目のアイソザイムDGKδのcDNAクローニングに成功した(坂根等、JBC印刷中)。この酵素はPHドメインを持つほか、そのC-端配列がチロシンキナーゼのEPH-ファミリーと高い相同性を示す。その他の構造上の特徴から、このアイソザイムは、これまでクローン化されたαからγまでのDGKとは区別されるサブファミリーに属することが分かった。DGKαのIL-2シグナル伝達における役割を、スペインのグループとの共同研究により明らかにした(Flores et al.JBC印刷中)。T-cell receptor活性化時に、DGKαの核マトリックスへの移行が、PI turnoverやチロシンリン酸化とは別のメカニズムで起こることを発見した(和田等、執筆中)。α、β、γの3種のEFハンドはCa^<2+>結合に対する親和性とCa^<2+>結合時のconformation変化が互いに異なることが分かった(山田等執筆中)。英国との共同研究によりDGKγのヒト染色体マッピングを行った(Curr.Eye Res.14,1041,-95).2.PAPブタ胸線細胞表面膜結合性の糖蛋白質である、35kDa酵素のN-端配列が、マウス培養細胞でH_2O_2により誘導される部分的cDNAクローン(HIC53)の内部配列と一致することを発見した。PCR増幅により得られたヒトとマウスのcDNAを293細胞で発現させたところ、PAP活性が検出できた。HIC53の機能は不明であり、またreading frameに誤りがあったが、この酵素の最初のクローニングに成功した(甲斐等投稿準備中)。ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)とジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)の二つのリン脂質合成酵素について検討した。PAPについては、表面膜結合性の2型酵素が35kDaの糖蛋白質であることを確定し、初めてcDNAクローニングを行った(甲斐等JBC,271,18931,-96)。現在2種類のヒト2型PAPをクローン化してa,bと命名した(未発表)。両者とも6回膜を貫通し、N-,C-端ともに細胞内に配向する新規分子であるが、他研究室の結果よりPAP2aはDrosophilaの生殖細胞移動を制御するwunen(Nature 385,64,-97)のホモログであり、さらにPAP-2bはラット小腸粘膜細胞分化時に誘導されるDri遺伝子(JBC,271,29928,-96)と同じものであることが分かった。本研究の予想外の結果により、PAPが細胞の発生、分化などに直接関与していることが明らかとなった。