hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝細胞がんの肝内転移の分子機構の解析と、診断、治療への応用

既に確立した肝内転移モデルと、LPA-Rho-p160ROCKを介した細胞運動性が肝内転移に重要な役割を果たしているという知見を基に検討を行った。高転移性肝がん細胞株KYN2はインテグリンを介した基質との接着によりカドヘリン系の不活化、細胞の分散、高い細胞運動性を示すが、このときαカテニンの減少と、c-Srcの活性化が認められた。この細胞に、c-Srcの機能抑制型遺伝子変異体を導入すると、ラフリングが消失し、stress fiberと明瞭な接着斑の形成がみられ、細胞運動能は低下した。C-Srcの活性化が、接着班のtumoverに関わっている可能性が示唆された。また、カドヘリン系、インテグリン系に細胞骨格系も合わさった複雑な相互作用が、がん細胞の運動性、そして浸潤・転移に深く関わっている事を示していると考えられた。また、別の高転移性肝がん細胞株Li7を用いたSCIDマウス肝内転移モデルにおいて、Rhoキナーゼ特異的阻害薬であるY-27632投与が肝細胞がんの肝内転移に対する治療として有効であることが示された。異なる転移性を示す肝がん細胞株ならびに組織における遺伝子発現解析をDifferential Display法にて行い、同定された分子の浸澗・転移性への関与を、ヒトがん組織、転移モデルを用いて検討した。肝がんの非腫瘍部で高発現を示すcloneは、全長と推測されるcloneを得たが、novel geneであった。臨床パネルの検討では、門脈浸潤陽性症例、肝内転移陽性症例、低分化症例で腫瘍部の発現が有意に低下する傾向を示した。肝がんで高発現を示すcloneとして同定された4回膜貫通型蛋白tetraspaninの一つCO-029は、これまで報告されているCD9,CD82(KAI1)とは異なり、腫瘍部で高発現を示すと共に、転移を有する腫瘍で発現が亢進していた。免疫組織学的にもその傾向が確認された。転移性を示さないKIM-1細胞株に対して、CO-029遺伝子を安定的に導入し、軽度ではあるが転移性の獲得が認められ、CO-029の転移への関与が示された。既に確立した肝内転移モデルと、LPA-Rho-p160ROCKを介した細胞運動性が肝内転移に重要な役割を果たしているという知見を基に、以下の検討を行った。1)高転移性肝がん細胞株KYN2が、基質との接着により、カドヘリン系の不活化、細胞の分散、高い細胞運動性を示す機構につき検討した。KYN2は基質との接着によりαカテニンの減少と、c-Srcの活性化が認められたが、この現象は、機能抑制型抗インテグリン抗体(抗β1+β5)により抑制された。さらにc-SrcはEカドヘリン、βカテニンと共沈することを示したが、その直接の基質については特定できなかった。C-Srcの活性化が、接着班のturnoverに関わっている可能性が示唆された。

また、カドヘリン系、インテグリン系に細胞骨格系も合わさった複雑な相互作用が、がん細胞の運動性、そして浸潤・転移に深く関わっている事を示していると考えられた。2)別の高転移性肝がん細胞株Li7を用いたSCIDマウス肝内転移モデルにおいて、Rhoキナーゼ特異的阻害薬であるY-27632(ウェルファイドより供与)持続投与による転移抑制効果につき検討した。in vitroにおいて、Y-27632はLPA刺激により誘導されるLi7の葉状突起形成、分散を抑制した。in vivoにおいて、対照群では肉眼的および組織学的肝内転移の頻度はそれぞれ4/10、9/10であったが、治療群では、0/8、4/8と明らかに減少していた。さらに、対照群で形成された腫瘍は周囲肝組織に浸潤性に発育する傾向にあったが、治療群で形成された腫瘍は周囲肝組織に対し圧排性に発育する傾向にあり、増殖パターンに変化がみられた。以上より、肝細胞がんの肝内転移に対する治療として、Y-27632投与が有効であることが示唆された。異なる転移性を示す肝がん細胞株ならびに組織における遺伝子発現解析をDifferential Display法にて行い、同定された分子の浸潤・転移性への関与を、ヒトがん組織、転移モデルを用いて検討した。肝がんの非腫瘍部で高発現を示すcloneは、全長を得たが、novel geneであり、DRH1(Down-regulated in HCC)と命名した。ヒトがん組織30症例の検討では、門脈浸潤陽性症例、肝内転移陽性症例、低分化症例で腫瘍部の発現が有意に低下する傾向を示した。DRH1は、染色体15qに位置し、HL-60細胞をビタミンD3で処理すると誘導される遺伝子として同定されたVDUP1とアミノ酸レベルで41%の相同性があることが示された。肝がんで高発現を示すcloneとして同定された4回膜貫通型蛋白tetraspaninの一つCO-029は、同じファミリーに属しこれまで報告されているCD9,CD82(KAI1)とは異なり、腫瘍部で高発現を示すと共に、肉眼型が多結節癒合型を示す腫瘍、転移を有する腫瘍で発現が亢進していた。免疫組織学的にもその傾向が確認された。術後follow upが可能であった45症例においてCO-029蛋白発現陽性症例と陰性症例間での生存曲線を比較し、CO-029陽性症例では陰性症例に比し、生存、無再発生存ともに短い傾向を認めた(P=0.038,P=0.055)。同所性移植肝内転移モデルにて、転移性を示さないKIM-1細胞株に対して、CO-029遺伝子を安定的に導入し解析を行った。CO-029遺伝子導入株では、軽度ではあるが伝移性の獲得が認められ、CO-029の転移への関与が示された。しかし、他のtetraspaninで報告されているような、増殖性、基質への接着性に関しては、有意な変化は認められず、転移性獲得のメカニズムは明らかではなかった。
微小球光共振器作製の研究

フェニルトリエトキシシラン(PTES)を原料として、シリコンオリゴマー(Si-O-Si)の骨格にフェニル基を導入した有機・無機ハイブリッド材料からなる微小球の作製を検討した。温度に対して脆弱な色素分子を導入するため、低温で合成できる「ゾル-ゲル法」を適用した。本作製方法では(1)原料であるPTESの加水分解・縮重合のプロセス、(2)重合の進んだPTESオリゴマー溶液をアンモニア水に滴下して微小球にするプロセスの2段階にわけることができる。本作製方法では、さらにプロセス(2)を2種類の方法、(A)液相法(エマルション法)と(B)気相法(振動オリフィス微小液滴発生法)を開発した。(A)液相法では多量の微小球を一度に合成できるが、サブミクロンから数十ミクロンまでの粒径の微小球が同時に生成する。一方、少量づつしか作製できないものの、光共振器に適する粒径110μmの範囲を精密に制御し、粒径のそろった微小球の作製法として(B)気相法の開発にも成功した。プロセス(1)では、低分子量と高分子量のオリゴマーを水/アルコール溶媒への溶解度の差を利用して分別し、高分子量のオリゴマーのみを用いて微小球を合成した。このため、サブミクロンの球は排除することができ、さらに添加したレーザ色素(ローダミン6G)もマトリックスとの親和性からより高濃度で、かつモノマー状態で含有されることがわかった。一方、微小球を合成する際、一部の微小球の内部に空孔が生じる問題も判明したが、密度の異なる溶液中で遠心して分別する手法により、球の真比重(1.30)に近い微小球のみを選択することを可能にした。これにより均一で真球度が高い粒径110μmの微小球の作製に成功した。これらの微小球を用いた光共振効果の基本的確認はすでに行っており、材料パラメータとの対応を検討する段階に到っている。サブミクロンから数十ミクロンまでの粒径の微小球がこの方法で同時に生成するが、光共振器に適する粒径は110μmである。このため、まずプロセス(1)で低分子量と高分子量のオリゴマーを水/アルコール溶媒への溶解度の差を利用して分別し、高分子量のオリゴマーのみを用いて微小球を合成した。このため、サブミクロンの球は排除することができ、さらに添加したレーザ色素(ロ-ダミン6G)もマトリックスとの親和性からより高濃度で、かつモノマー状態で含有されることがわかった。

これらの微小球を用いた光共振効果の基本的確認はすでに行っており、材料パラメータとの対応を検討する段階に到っている。フェニルトリエトキシシラン(PTES)を原料として、シリコンオリゴマー(Si-O-Si)の骨格にフェニル基を導入した有機・無機ハイブリッド材料からなる微小球の作製を検討した。温度に対して脆弱な色素分子を導入するため、低温で合成できる「ゾル-ゲル法」を適用した。本作製方法では(1)原料であるPTESの加水分解・縮重合のプロセス、(2)重合の進んだPTESオリゴマー溶液をアンモニア水に滴下して微小球にするプロセスの2段階にわけることができる。本作製方法ではミさらにプロセス(2)を2種類の方法、(A)液相法(エマルション法)と(B)気相法(振動オリフィス微小液滴発生法)を開発した。(A)液相法では多量の微小球を一度に合成できるが、サブミクロンから数十ミクロンまでの粒径の微小球が同時に生成する。一方、少量づつしか作製できないものの、光共振器に適する粒径110μmの範囲を精密に制御し、粒径のそろった微小球の作製法として(B)気相法の開発にも成功した。プロセス(1)では、低分子量と高分子量のオリゴマーを水/アルコール溶媒への溶解度の差を利用して分別し、高分子量のオリゴマーのみを用いて微小球を合成した。このため、サブミクロンの球は排除することができ、さらに添加したレーザ色素(ローダミン6G)もマトリックスとの親和性からより高濃度で、かつモノマー状態で含有されることがわかった。一方、微小球を合成する際、一部の微小球の内部に空孔が生じる問題も判明したが、密度の異なる溶液中で遠心して分別する手法により、球の真比重(1.30)に近い微小球のみを選択することを可能にした。これにより均一で真球度が高い粒径110μmの微小球の作製に成功した。
IRFをターゲットとしたミクログリアによる神経障害性疼痛発現メカニズムの解明

神経損傷時にミクログリア細胞を活性化状態へと移行させる遺伝子制御メカニズムの解明を目的として、転写因子interferon regulatoryfactor (IRF)に着目し、詳細な解析を行った。その結果、神経損傷時に、IRF8およびIRF5が脊髄ミクログリアで発現増加し、P2X4受容体などの疼痛関連因子の発現増加を介してミクログリアを活性化状態へと移行させ、神経障害性疼痛発症に重要な役割を果たしていることが明らかになった。ミクログリア細胞に対してIRF8分子を強制発現させ、他のIRF転写因子ファミリーの発現変化を検討した。その結果、IRF8の発現増加に伴い、IRF1,IRF5,IRF7およびIRF9の顕著な発現増加が観察された。そこで、生体内(in vivo)でもこうした発現制御メカニズムが機能しているか否か検討するため、既に脊髄ミクログリアにおいてIRF8の発現増加が観察されることを明らかにした神経障害性疼痛モデル動物を用いて検討を行った。その結果、野生型マウスの脊髄内ではIRF1,IRF5,IRF7およびIRF9の発現増加が観察されたが、IRF8欠損マウスの脊髄内においては、これら因子の発現増加がほぼ完全に消失した。そこで、特に顕著な発現変化が観察されたIRF5に関して、in situ hybridization法を用いて脊髄における発現細胞種の特定を行った。その結果、ミクログリアが細胞種特異的にIRF5を発現していることが明らかになった。次に、培養細胞を用いてshRNAによるノックダウン実験を行い、IRF5の機能解明を試みた。その結果、IRF8の強制発現によって発現講導されたP2X4受容体やIL-1βなど様々なミクログリア機能分子は、IRF5の発現抑制に伴って、顕著に抑制された。以上の結果から、神経損傷後、脊髄ミクログリアで発現増加したIRF8は、IRF5など他のIRFファミリー転写因子の発現増加を介してミクログリアを活性化状態へと移行させていると考えられる。本研究は、神経障害性疼痛を含めた種々の中枢性疾患発症に寄与していることが明らかになっているミクログリアの活性化状態への移行に重要な役割を果たしている細胞内シグナルとしてIRF転写因子ネットワークを特定したという点で非常に有用な研究であり、神経障害性疼痛の全容解明に向け、大きく前進することが期待される。中枢性疾患発症時に、ミクログリア細胞を活性化状態へと移行させる遺伝子制御メカニズムの解明を目的として、転写因子interferon regulatoryfactor (IRF)に着目し、特に神経障害性疼痛発症に寄与する活性化ミクログリア内で働く転写因子ネットワークの解明を目指した。神経障害性疼痛モデル動物の脊髄ミクログリアにおいて、IRFファミリーの一つであるIRF5の発現増加が観察され、その発現増加はIRF8欠損マウスでは完全に消失した。一方、レンチウィルスベクターを用いて、ミクログリア細胞にIRF8を強制発現させると、IRF5が発現誘導され、またクロマチン免疫沈降法やルシフェラーゼアッセイ法等の解析の結果、IRF8がIRF5の発現を直接制御していることが明らかになった。次に、脊髄ミクログリアに発現するIRF5が疼痛発症に寄与するか否か検討するため、IRF5のsiRNAを作製し、神経障害性疼痛モデル動物の脊髄腔内に投与した。その結果、脊髄IRF5の発現抑制に伴い、神経障害に起因する疼痛行動が顕著に抑制されたことから、ミクログリアに発現するIRF5が疼痛発症に寄与していると考えられた。そこで、培養ミクログリア細胞を用いて、IRF5の役割について検討した。その結果、疼痛発症に重要な役割を果たしているP2X4受容体の発現増加にIRF5が関与している可能性が示唆された。以上の結果から、末梢神経損傷後、脊髄ミクログリアで発現増加したIRF8-IRF5軸がP2X4受容体などの疼痛関連因子の発現誘導を介してミクログリアを活性化状態へと移行させ、神経障害性疼痛発症に重要な役割を果たしていると考えられる。本研究により、種々の中枢性疾患発症に寄与していることが明らかになっているミクログリアの活性化状態への移行にIRF転写因子ネットワークが重要な役割を果たしていることが初めて特定された。平成23年度の研究計画内容と照らし合わせ、ほぼすべての研究計画を実行していると共に、想定していた結果(もしくはそれ以上)が得られていることから、順調に進展していると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画を作成する際、熟考を重ねたこともあり、これまで得られた結果はほぼ想定内のものであることから、平成24年度も当初の研究計画に沿った内容で遂行する予定である。
構成的考証法の基盤

コミュニケーション基盤構築の初期段階を支援するために,演劇ワークショップと会話情報学技術を組み合わせた協調的思考支援の枠組み(構成的考証法)の基礎の確立を目指した取り組みを行った.伝承会話の分析,人狼ゲーム参加者の心的状態のモデリング,解釈の多重化による理解の深化の分析,サービス待ち行動の文化依存性の分析,構成的考証法支援システムのプロトタイピングを行った.構成的考証法の方法論の骨子となる知見が得られ,今後の研究発展のための礎を築かれた.本研究では,参加者が演劇ワークショップを繰り返すことで,題材の理解を深化させ,それをエージェントによる再現可能なミニストーリーとして部品化し,再利用可能な解釈アーカイブとして集積し,コミュニケーション基盤の初期段階開発のための資源として活用できるようにするための構成的考証法の基礎作りに取り組む.平成27年度は,システムのプロトタイピングとワークショップによるフィージビリティスタディを行った.ワークショップでは,各参加者に題材となるテキストを予習してもらった上で,登場人物の役を一つ割り当て,その視点からの解釈を演劇として表現してもらう.この様子を,Kinectによるグループ演技キャプチャシステムでキャプチャし,得られた各参加者の行動を会話エージェントに投影し,没入型インタラクション環境に表示し,客観視点と主観視点を切り替えながら討論できるようにした.資料をもとに議論をする議論フェーズ(30分程度),議論の結果を踏まえて演劇を行う演技フェーズ(20分程度),自分たちの演技をエージェントに再生させることで客観視点や他者の主観視点から演技を確認できる演技投影フェーズ(10分程度)からなる予備実験を行った.演技フェーズでは,演技行動のみ,コメント行動のみ,アイドリング行動のみ,セリフのみ,演技行動+ think aloud,演技行動+セリフ,演技行動+コメント行動,アイドリング行動+セリフ,アイドリング行動+コメント行動の9個のパターンの行動が観察され,演技による議論の深化,主観/客観視点の比較に基づくイメージ変化,主観視点の交代による内面理解,演技による暗黙的な意見表出などによる,理解の深化が観察された.基本的な構想の骨格部分のプロトタイピングができたこと,予備実験により構成的考証法の有用性が示唆されたことは大きな進捗であったと考えている.他方,情景の構築や修正に手間がかかること,モーションキャプチャの品質を高める必要があること,アーカイビングフェーズの実装と有用性検証についてまだ見通しが得られていないことなど,今後取り組むべき課題も明確になった.参加者の視点に依存したコミュニケーションシーンのとらえ方の違いに着目した.ショッピングシーンを題材とした参加者実験を行い,参加者と同一の文化背景に基づく接客をする店員の担当する窓口と,参加者と異なる文化背景に基づく接客をする店員の担当する窓口を設けて,アバターとして参加する参加者の行動観察と事後の質問紙調査を行った.複数台の端末から仮想空間内に同時並行参加できる手軽な実験用環境を構築して,二つの窓口でアイテム販売を行う仮想的なショップを生成し,文化的背景の違いを対照できるようにした.インタラクション以外で文化的背景の影響が生じないよう,ミニマルデザインの手法を用いて容姿に非依存の合成キャラクタを制作した.参加者実験において,窓口の順番待ちで,列並びを日本文化と,店員の視線を中心とする非言語的なコミュニケーションを基本とするタイ文化の行動様式の差が,第一人称視点からの観察でより明確に把握できることを示唆する観察結果が得られた.また,いずれの文化圏も割り込みを許さない公正な店員の選好が高いことが判明した.第三人称視点のほうがより大きな気づきをもたらすことも分かった.この研究をさらに発展させるための基盤として,インタラクションデータからのマイニングパッケージの整備,参加者に共有基盤がどの程度構築されたかを推定する認知科学的手法の研究,参加者とエージェントに共有基盤を確立させるための意図推定に基づくインタラクション手法の研究,仮想空間のカメラワークの生成支援システムと仮想シーンの構成とインタラクション生成を支援するシステムの試作も行った.以上で得られた知見に基づいて,構成的考証法を用いたコミュニケーション基盤構築手法を取りまとめ,研究提案を行った.コミュニケーション基盤構築の初期段階を支援するために,演劇ワークショップと会話情報学技術を組み合わせた協調的思考支援の枠組み(構成的考証法)の基礎の確立を目指した取り組みを行った.伝承会話の分析,人狼ゲーム参加者の心的状態のモデリング,解釈の多重化による理解の深化の分析,サービス待ち行動の文化依存性の分析,構成的考証法支援システムのプロトタイピングを行った.構成的考証法の方法論の骨子となる知見が得られ,今後の研究発展のための礎を築かれた.情景の構築や修正を容易にすること,モーションキャプチャの品質を高めること,アーカイビングフェーズの実装と有用性検証を行うこと,登場人物の心的状態の核心に迫ることなどを視野に入れ,実装とより本格的な検証実験の実施に取り組む.会話情報学
A1蛋白質-テロメア-テロメレース3者複合体の構造解析とテロメレース阻害法の開発

A1タンパク質と同じRRM型に属するMusashiタンパク質に関し、標的RNAとの複合体の立体構造を、ロングレンジの構造情報を活かす事で決定する事に成功した。この手法でA1蛋白質-テロメア-テロメレース3者複合体の構造解析を行った結果、A1タンパク質はテロメアDNAとテロメラーゼRNAをブリッジしている事が分かった。これよりA1はテロメラーゼをテロメアDNAまでリクルートする働きを持つ事が示唆された。さらにデコイ核酸によるテロメレース阻害戦略の有効性も示唆された。テロメレースは、テロメアDNAに作用してこれを伸長する事で癌の原因となっている。申請者等はhnRNPA1タンパク質(以下A1タンパク質)が、テロメアDNA及びテロメレースRNA(テロメレースの構成成分)と相互作用する事で、テロメレースの活性の発現を引き起こしている事を見出した。本研究では、A1タンパク質-テロメアDNAの2者複合体、A1タンパク質-テロメレースRNAの2者複合体、及びA1タンパク質-テロメアDNA-テロメレースRNAの3者複合体に関して、立体構造及び相互作用の解析をNMR法によって行った。以上3つの系において、DNAないしはRNAを滴定していき、それに伴うA1タンパク質の構造・相互作用の変化を、同タンパク質のHSQCスペクトルを用いる事で、追跡・モニターした。その結果3者複合体中において、A1タンパク質がその2つの核酸結合ドメインを用いて、テロメアDNAとテロメレースRNAをブリッジしている事を定量的に明らかにできた。またPRE、PCS及びRDCを用いた方法論の有用性の検証を、別のRNA結合タンパク質を用いて進行させた。また培養癌細胞においてA1遺伝子をノックダウンすると、A1タンパク質による上記のブリッジが生じなくなり、その結果テロメレースの活性が低下して、最終的にテロメア長の短小化が生じる事を示唆する結果を得つつあった。この作業仮説を確定させる第一歩として、今回HeLa細胞に対してA1遺伝子のsiRNAを導入し、A1遺伝子の発現をRNAi法によって阻害した。そしてこの際にテロメア長の短小化が実際に生じているのかを、T-OLA法によって定量的に調べた。その結果siRNA導入後の日数に依存して、短小化が生じている事が伺えた。現在得られた結果の再現性の検証を行っている。我々はhnRNPA1タンパク質(以下A1タンパク質)が、テロメアDNA及びテロメレースRNA(テロメレースの構成成分)と相互作用する事で、テロメレースの活性の発現を引き起こしている事を見出した。今年度は前年度に引き続きA1タンパク質-テロメアDNA-テロメレースRNA3者複合体の立体構造の解析を行った。構造解析に際しては、NOEに基づいたショートレンジの距離情報(約5Å)に加えて、ロングレンジの構造情報の抽出も類縁タンパク質を用いて試みた。MTSL分子をタンパク質のシステイン残基に結合させる事で常磁性中心を導入し、常磁性緩和促進(PRE)を観測する事により、ロングレンジの距離情報(約25Å)の抽出を行った。またタンパク質を配向させて残余双極子結合(RDC)を観測する事により、各コンポーネンの相対配向に関する情報の抽出を行った。A1(及び類縁)タンパク質はBD1、BD2の2つのドメインからなるので、本系で扱う3者複合体は、実際には4つのコンポーネントからなる。この様なマルチドメイン・マルチコンポーネントの系の構造決定をNMR法によって行う事は、これまで困難であった。通常の構造解析に用いられるNOEに基づいたショートレンジの距離情報には、各コンポーネント間の相対配置を直接規定する情報が含まれないのがその原因であった。各コンポーネント間にまたがるロングレンジの構造情報を抽出する事で、この問題を克服できると考え、解析を進行させている。またタンパク質に対して高い親和性を有するおとりの核酸(デコイ核酸)を、核酸の2次構造予測プログラムを用いながらデザインした。このデコイ核酸がA1タンパク質を引きつけてしまえば、A1タンパク質がテロメレースの活性の発現を引き起こす事が妨害され、結果的にテロメレースの活性が阻害されると考えている。本研究ではA1タンパク質-テロメアDNA-テロメレースRNAの複合体における相互作用様式を、NMR法によって構造学的な見地から解析し、A1タンパク質がテロメレースの活性の発現を引き起こしている仕組みに迫った。常磁性緩和促進及び残余双極子結合を用いたロングレンジの構造情報の取得に関しては、A1タンパク質と同じRRM型の類縁タンパク質であるMusashiを用いて方法論の確立を行った。NOEから得られるショートレンジの構造情報に、これらの情報を加味する事で、Musashiタンパク質とその標的RNAの複合体の立体構造を決定する事に成功した。RNAのグアニン塩基を、タンパク質の2つのフェニルアラニン環が両側からサンドイッチする事で認識するという新しい分子認識様式が見出された。

さらに同タンパク質がいかにして4残基ないしは3残基からなる特定の塩基配列を特異的に認識するのかに関し、そのメカニズムが明らかになった。A1タンパク質-テロメアDNA-テロメレースRNAの複合体に関し、ショートレンジの構造情報とケミカルシフトパータベーションから得られた情報に、ロングレンジの構造情報を加味して総合的な考察を行った。その結果A1タンパク質の2つのRRM型ドメインの内、片方がテロメアDNAと結合し、同時にもう片方がテロメレースRNAと結合する事が構造学的に可能であり、実際にそのような相互作用様式をとっている事が強く示唆された。また標的配列に近い親和性を有する別の核酸を添加すると、タンパク質の奪い合いが生じて、本来の相互作用が妨害される事が実験的に確認された。以上より、おとりの核酸(デコイ核酸)によりA1タンパク質の働きを妨害する事によってテロメレースの活性の発現を阻害し、この事によって癌治療を目指すというストラテジーは有望であると考えられた。
オリゴデンドロサイトにおける内向き整流性カリウムチャネルの制御と細胞死との関連

中枢神経の髄鞘形成細胞オリゴデンドロサイト(OLGs)において、TNFレセプターへのリガンド結合によってスフィンゴミエリナーゼが活性化され、セラミドが作られることによって細胞死が誘発される。我々は、アポトーシス過程においてp38MAPKの活性化が重要であることを証明し、またセラミドによるRas-Raf-1を介した内向き整流性カリウム電流(I_<Kir>)の抑制メカニズムを明らかにしてきた。近年MAPKレベル(p38/ERK)とチャネルとの相互作用が報告されているので、セラミドによるI_<Kir>抑制とp38MAPKの活性化との関係、及びOLGsにおいてI_<Kir>抑制がどのように細胞死メカニズムに関与しているのかを解析した。p38MAPK阻害剤のSB203580前処置によりセラミドのI_<Kir>抑制作用が減弱し、またアンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense-ODNs)を処置し蛋白発現を抑制させたところセラミドによるI_<Kir>の抑制は認められなかった。またERK2阻害剤やantisense-ODNsを用いた同様な実験ではI_<Kir>抑制は認められなかったので、OLGsにおいてp38MAPKの活性化がI_<Kir>抑制メカニズムに関与していることを明らかにした。一方、Ba^<2+>の細胞外投与によるI_<Kir>抑制によりOLGsのアポトーシスが誘発されることがTUNNEL染色により明らかになった。細胞外K^+の上昇によっても同程度のアポトーシスが誘発されるので、細胞の脱分極によってもアポトーシスが誘発されることが考えられた。Ba^<2+>により30分間脱分極刺激を与えたときにもアポトーシスが誘導されたことから短時間の脱分極によりアポトーシスのシグナルが動くことがわかった。以上よりOLGsにおけるセラミドによるアポトーシス過程において、p38MAPKの活性化とそれによる細胞の脱分極が重要であることがわかった。我々は、オリゴデンドロサイト(OLGs)におけるセラミドによるアポトーシスカスケードにおいてp38MAPKの活性化が細胞死に重要であること、またセラミドによるRas-Raf-1を介した内向き整流性カリウム電流(I_<Kir>)の抑制メカニズムを明らかにしてきた。近年MAPKレベル(p38/ERK)とチャネルとの相互作用が報告されているので、セラミドによるI_<Kir>抑制とp38MAPKの活性化が関連しているのかを調べ、OLGsにおけるI_<Kir>抑制がどのように細胞死メカニズムに関与しているのかを明らかにするため実験を行った。p38MAPKの阻害剤であるSB203580の前処置によってセラミドによるI_<Kir>抑制が抑えられ、またp38MAPKのantisense oligodeoxyribonucleotides(antisense-ODNs)を処置し蛋白発現を抑制させることに成功し、このようなOLGsにセラミドを処置するとI_<Kir>の抑制は認められなかった。またERK2の阻害剤やantisense-ODNsを用いた同様な実験ではI_<Kir>抑制に変化は認められなかった。すなわちOLGsではp38MAPKの活性化がI_<Kir>抑制メカニズムに関与していることを明らかにした。OLGsにおけるKirサブタイプの発現とKir抑制の生物学的意義については現在検討中である。
脱分化脂肪細胞集塊(C-DFAT)を用いた新規骨再生療法の開発

現在、口腔内疾患により失われた顎骨組織を再生させる手段がTissue engineeringの3要素を基盤に研究されている。その中でも特にiPS細胞の登場以来、細胞移植療法に注目が集まっているが、その際に不可欠な人工足場材は移植細胞数や細胞機能を制限するという問題点があり、これらを全て解消するような理想的なものが存在しないのが現状である。そこで本研究では多分化能を持つ組織幹細胞様細胞の一つである脱分化脂肪細胞(de-differentiated fat cell: DFAT)から脱分化脂肪細胞集塊Cluster of DFATs/ECM complex (C-DFAT)を形成することで可能となる人工足場材を用いない細胞移植療法に着目し、C-DFATの樹立及びC-DFATの骨形成能をin vitro, in vivoにおいて網羅的に解析し、安全・効率的かつ予知性の高い理想的な骨再生療法の基盤確立を行うことを目的としている。現在、Matsumotoらの方法に準じて、rat DFAT分離・培養を以下の方法で成功し、その細胞を用いてC-DFATの形成に着手している。1)Wistar系ラットの鼠径部より脂肪組織採取、2)0.1% Collagenase Iを用いて、37°C, 1時間gentle shaking、3)Filtrate後、135gで3分間遠心、4)維持培地にて1週間天井培養、5)フラスコを反転し、継続して培養。当初の計画通り、概ね進行しているが、未だC-DFATの樹立に至っていないため。3.in vivo実験系でのラット頭蓋骨欠損モデルを用いたC-DFATの骨形成能の組織・放射線学的解析現在、口腔内疾患により失われた顎骨組織を再生させる手段がTissue engineeringの3要素を基盤に研究されている。3.in vivo実験系でのラット頭蓋骨欠損モデルを用いたC-DFATの骨形成能の組織・放射線学的解析(理由)当該年度に行う実験に使用する試薬の一部に関して、当教室で保存されていた試薬にて一部対応できたため。当該年度に参加予定だった学会に次年度参加することになったため。(使用計画)実施計画どおりの内容で問題なく執行予定である。
肝幹細胞における増殖制御機構の解析と幹細胞移植モデルの開発

研究代表者らは、初代肝幹細胞を分離・培養して、目的分子の発現を修飾することで肝幹・前駆細胞の増殖制御に関わる分子機構の解明を試み、2つの転写因子Prox-1とSall4がそれぞれ、増殖と胆管細胞分化を制御することを発見した。また肝幹/前駆細胞を肝障害マウスに移植して肝不全を治療しうる動物モデルの構築も試み、高度の肝ドナーキメリズムと長期の治療効果が得られる細胞移植系を確立することに成功した。我々は当該研究において、初代肝幹細胞を分離・培養し、これに対して目的分子の発現を修飾することで肝幹/前駆細胞の増殖制御に関わる分子機構について解明を試み、さらに、その結果得られた知見をもとに、肝幹/前駆細胞の増殖活性を亢進・制御した細胞を肝障害マウスに移植し、致死的肝不全を治療しうる動物モデルの構築を目指す研究を行い、今年度の成果として下記を得た。(1).マウス肝前駆細胞・肝幹細胞の分離、培養とウイルスベクターによる遺伝子導入/siRNA系を用いた目的遺伝子の肝幹細胞増殖に対する機能のスクリーニング:マウス胎仔肝臓から高速セルソーターを用いて、初代肝幹/前駆細胞が高濃度に純化された画分を分取し、増殖もしくは肝細胞への分化を誘導する培養実験系を既に確立していた。肝幹/前駆細胞に対して、分化・増殖に関与することを我々が予想している遺伝子の強制発現およびノックダウンをレトロウイルス・レンチウイルスベクターによって行った。その結果、転写因子Prox-1はLr-h-1と協調的に機能し肝幹/前駆細胞の増殖を正に調節していることを示した(Hepatology, 2008)。さらに転写因子Sall4は肝幹/前駆細胞の胆管への分化を正に誘導することを示した(Gastroenterology, 2009)(2).肝幹細胞を用いた細胞移植系の開発と移植後の細胞動態の解析:研究代表者は成体由来肝細胞を用いて、高度の肝キメリズムが得られる移植系を独自に確立した。高脂血症を呈するApoE欠損マウスに対して野生型肝細胞を移植したところ、高脂血症が治癒し、移植した細胞がレシピエント肝で1年以上にわたって肝細胞として機能することを示した(第12回日本肝臓学会大会にて発表)。本移植系を用いて、増殖誘導効果を有する標的分子を強制発現及びknock downした肝幹/前駆細胞を移植し、そのドナーキメリズム・増殖性・終末分化に関して検証しており、次年度も継続して行う予定である。我々は当該研究において、初代肝幹細胞を分離・培養し、これに対して目的分子の発現を修飾することで肝幹/前駆細胞の増殖制御に関わる分子機構について解明を試みつつ、肝幹/前駆細胞の増殖活性を亢進・制御した細胞を肝障害マウスに移植し、致死的肝不全を治療しうる動物モデルの構築を目指す研究を行い、今年度の成果として下記を得た。(1).マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養と遺伝子導入/siRNA系を用いた目的遺伝子の肝幹細胞増殖に対する機能のスクリーニング:マウス胎仔肝臓から初代肝幹/前駆細胞が高濃度に純化された画分を分取し、増殖もしくは肝細胞への分化を誘導する培養実験系を確立した。この中で、CD13をマーカーとして分取するとより濃縮した画分が得られることを発見した(Journal of Hepatology, 2009)。さらに肝幹・前駆細胞に対して、分化・増殖に関与することを予想している遣伝子の強制発現およびノックダウンを行った。その結果、転写因子Sall4は肝幹・前駆細胞の胆管細胞への分化を正に調節していることを示した(Oikawa et al.Gastroenterology, 2009)。(2).肝幹細胞を用いた細胞移植系の開発と移植後の細胞動態の解析:研究代表者は成体由来肝細胞を用いて、高度の肝キメリズムが得られる移植系を確立した。高脂血症を呈するApoE欠損マウスに対して野生型肝幹・前駆細胞を移植したところ、高脂血症が治癒し、移植した細胞がレシピエント肝で1年以上にわたって肝細胞として機能することを示した(第95回日本消化器病学会総会にて発表)。さらに、成体マウス月刊蔵から分離した肝幹・前駆細胞についても検討し、移植細胞が長期間肝臓を再構築できることを示した(Kamiya et al.Gastroenterology, 2009)。(3).肝幹細胞とマトリックス担体を用いた肝小葉類似組織構築系の開発:肝幹・前駆細胞をマトリジェルと共に培養することによって、試験管内で肝細胞への誘導が促進され、類洞様の構築をとることを示した。このように、本研究計画は目標を概ね達成できたが、致死的肝疾患治療モデル構築に関しては、今後もさらなる検討が必要であると考えられる。
国際移民の比較制度分析-日伯間の移民制度の変容とコミュニティ

本研究は、研究代表者が長年進めてきた国際移民・国際労働力移動と近年取り組んでいる比較制度分析研究の結節点で、経済のグローバル化に共進行する移民制度の変容と国内政治との関連を研究した。モノ・カネ・ヒトが国境を越えるグローバル時代の成立と、そのもとで進行する労働者階級の移動・越境に注目し、既存の概念の変容と新しい課題を実証的な国際比較と制度連関から考察した。本研究は、日本で就労するブラジル人労働者が日本とブラジルの間を行き来している状況を鑑みて、日伯の間には国境を越えて労働市場が成立していると考える。この国境をまたいで成立している労働市場において、労働力輸出国であるブラジルから労働力輸入国である日本の具体的な工場(就労場所)に労働者を送り込む日伯の組織的なつながり労働力輸出機構と把握し、この労働力輸出機構が一つの制度となっていることから、この制度の変化を比較制度分析の手法から分析することを通して、日本における外国人労働者の定着についての基本モデルを把握しようとするものである。日本が少子高齢化社会を迎えてきている現状においては何らかの形で外国人の手を借りなくては日本の産業は成り立たなくなってきている。近年、規制緩和が一気に進んだが、こうした規制緩和政策で外国人を受入れるのではなく、外国人の権利にも配慮した受入のあり方についても本研究は検討を加える。本年度は、全体の研究テーマである国際移民の比較制度分析のモデル的事例を研究し、発表した。それが『大原社会問題研究所雑誌』573号に掲載された、「総合デカセギ業の誕生-日系旅行社の変容とブラジル日系コミュニティの資本蓄積」である。この研究では、日本とブラジルの間のデカセギ労働者の斡旋システム、とりわけブラジル国内におけるデカセギ就労希望者の募集の仕組みが、1980年代にデカセギが始まっていこうにどのように変容したのかを、時間の経過の中でデカセギ就労希望者の募集の仕組みを一つの制度と捉え、ほぼ5年おきごとにこの制度がどのような機能を果たしいかなる外在的条件によって成立していたのかを比較することで、制度全体の変容過程と変化の方向性をモデル化した。比較制度分析を取ることによって、制度が時代に合わせて(外部環境の変化に合わせて)自らを改編しつつ生き延びていくあり方を明らかにし、従来言われているデカセギ者の日本での定着化が起こらないことを明らかにした。ただし、本研究はあくまでデカセギ就労者の斡旋システムの変容を示したに過ぎず、コミュニティそのものがどこまで変化したのか、という点にまでは踏み込めていない。この点は、論文中にも書いてあるように、次年度以降の課題として残されている領域である。このように本年度の研究は、比較制度分析が日伯間の人の移動の説明枠組みとして有効な枠組みであることを示すことに成功しているとも言え、19年度以降の現地コミュニティ調査で明らかにしなくてはならない課題もまたはっきりした。上記の、日伯間の具体的な移民制度の研究の他に、先進国における移民の現状に関する研究も文献研究ではあるが行った。本年度は、ブラジルにおける移民制度の具体的な今の状況を確認するために、サンパウロ市内で日本就労者を集めている日系旅行社45社と、サンパウロから100キロほど離れたモジダスクルーゼス市内で日本就労者を集めている日系旅行社6社に、日本へデカセギに行く者の状況とどのような仕組みで日本就労者を集めているのかを聞き取り調査してきた。また、サンパウロ市内で日系コミュニティが発達しているビラカロン、リペルダージ、サウージ、カーサベルデにおいて不動産業を営む10社の不動産業者に、日本からデカセギで帰国した者たちが、日本就労の成果を不動産投資に向けているかどうかの聞き取り調査を行った。さらに、現地の日系コミュニティがどのような状態になっているのかについて、岩手県人会、宮城県人会、そして大会県人会を対象にして聞き取り調査を行った。日伯間の移民制度とは、具体的には、現地における日系旅行社と日本国内の業務請負業者の連携によって形成されるものである。本年度の調査研究によって、従来は日系コミュニティ内の閉じたビジネスとして日本就労者への斡旋が行われていたものが、日本からの海外送金を目当てにしてブラジルの都市銀行が日本就労者向けのデカセギローンを用意して金融の国際化に対応している現実をうかがい知ることができた。今年度の研究成果の一部は、12月に東京大学出版会より出した単著『越境する雇用システムと外国人労働者』において既に公表し、日系コミュニティの変容がビジネスの上でも確認されていることを紹介した。昨年度に引き続き、ブラジルにおける現在の日本就労を目指すデカセギ者の募集活動状況を現地の日経旅行社・デカセギ旅行社への聞き取り調査を重ねた。今年度は、これまでの旅行社および県人会組織への聞き取り調査にとどまらず、サンパウロ領事館への聞き取り調査も行い国として外国人労働者の日本への流入に対してどのようなコントロールを行っているのかについても聞き取り調査を行った。本研究を通して得られた知見は、筆者が委員を務めていた厚生労働省「研修・技能実習生制度研究会」において国境を越えて入ってくる労働者の適切な規制のあり方にも用いられ、平成20年度中に国会に上程される法改正にも寄与することができた。

本研究の国への貢献はこれだけにとどまらず、経済産業省が行っているグレーター・ナゴヤ・イニシアティブにはブラジル人労働者の正社員モデル作りとして「国際的な人材活用:外国人労働者受け入れガイドブック」の作成に結実した。同じく委員を務めている国土交通省における第一回国土形成計画(全国計画)のための「社会経済研究会」での活動を通して、具体的な政策や政策基盤の基礎となる考え方も提供した。また、国以外にも日本経団連、日本商工会議所、経済同友会、そして日本貿易協会が共同で設立した日本経済調査協議会が「外国人労働者受け入れ政策の課題と方向」を打ち出すにあたって専門知識を提供するとともに、その執筆にも関わり研究成果が社会的に還元されるよう努めた。もちろん、学術研究としても一本の査読論文、3本の依頼論文の他に3冊の図書が発行されている。さらに、学会報告等も含めると、本研究の研究成果は学術的にも積極的に公表することに努めた。今年度は、4年の研究期問のなかで、3年目に当たる年であり、1年目、2年目で収集したデータに基づいて研究成果を出すことができた。最終年次である来年度の研究成果数はさらに増える予定である。ブラジルでの聞き取り調査の継続を通して、リーマンショック後の日本の製造業がどのようにブラジルでの出稼ぎ労働力集めをしていたのかを、日系旅行会社、サンパウロ領事館、そしてブラジルにある各県人会に聞き取り調査を行い、過去に聞いてきた動向が、どのように経済危機を通して再編されたのかを研究した。世界同時不況の影響は、ブラジルの人集めでも如実に影響が出ており、多くの日系旅行社が店を閉めていた。しかし、このことは日系旅行社のリクルーティング能力が減少したことを意味しない。むしろ、旅行社が電話一本で行うブローカー業に変化することを通して、アンダーグラウンドに潜ったような状況になっただけであり、日本の経済活動が戻り始めると、再び旅行社が増加することが目に見えるような形になることが判明した。しかしながら、旅行業は絶えず変化しており、とりわけブローカー業を中心とした日系旅行社がツーリズムに力を入れた観光旅行社の顔を持とうと変化し始めているのは、大きな兆候であった。ここには、単に旅行社の生き残り戦略だけでなく、出稼ぎから帰国したかつての日本就労者がもちこんだ新しい価値観、エコツーリズムの影響が大きく見て取れた。ブラジルにおけるエコツーリズムの最先端を出稼ぎ旅行社が担う、という出稼ぎをつうじたトランスナショナルな価値の伝汎の一形態を見いだすことのできる現象を捉えることができた。
凍結耐性パン酵母に関する基礎研究

1.凍結貯蔵後の酵母を電顕観察した結果、凍結非耐性酵母は、凍結貯蔵期間の延長に伴い、核膜の消失、ミトコンドリアの変形やその内部構造の崩壊が顕著となった。凍結耐性酵母ではこのような損傷は少なかった。また、凍結貯蔵後には、細胞からのカルシウムイオンおよび紫外吸収物質の漏洩がみられ、この漏洩量も凍結非耐性酵母の方が大きく、酵母の膜系は大きな損傷を受けることが確認された。2.DNaseI阻害法で測定した結果、-20°Cで-7日間凍結貯蔵後の酵母から調製した無細胞抽出液では、未凍結酵母に比べ、抽出液中のアクチンによるDNaseI阻害活性は約50%に低下した。凍結耐性酵母では、解凍後、培地中で30°C、2時間保温した後に無細胞系を調製するとDNaseI阻害活性は回復したが、非耐性酵母では、回復しなかった。3.両酵母から無細胞抽出液を調製してゲルろ過を行い、解糖系の各酵素活性およびアクチンの溶出パターンを調べた。両酵母で2つのアクチンのピークが検出され、非耐性酵母では凍結貯蔵後に両ピークとも低下したことより、アクチンの凍結損傷が著しいものと考えられる。解糖系酵素活性測定の結果、未凍結の酵母では、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼは本来の分子量よりも高分子量側に溶出され、アクチンの溶出位置とも一致したことより、これらはアクチンなどの蛋白質と複合体を形成し、会合状態で存在していることが示唆された。凍結貯蔵後の非耐性酵母から調製した無細胞系ではヘキソキナーゼおよびピルビン酸キナーゼ活性の低下、ホスホフルクトキナーゼ活性の低分子量側へのシフトなどが観察された。特にホスホフルクトキナーゼは解糖系の中間付近に位置し、律速段階でもあるので、その解離は解糖系の効率に大きな影響を与えると思われる。このため、凍結非耐性酵母では凍結貯蔵後に発酵力が低下するものと考えられる。1.凍結貯蔵後の酵母を電顕により観察した結果、凍結非耐性酵母は、凍結貯蔵期間の延長に伴い、核膜の消失、ミトコンドリアの変形やその内部構造の崩壊が顕著となった。アクチン特異的な蛍光色素で染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果、凍結貯蔵後には若干の蛍光強度の低下、すなわちアクチンと蛍光色素の結合の低下がみられた。低下の程度は、凍結非耐性酵母の方が大きかった。また、凍結貯蔵後には、細胞からのカルシウムイオンおよび紫外吸収物質の漏洩がみられ、この漏洩量も凍結非耐性酵母の方が大きく、凍結貯蔵により酵母の膜系は大きな損傷を受けることが確認された。2.DNaseI阻害法で測定した結果、-20°Cで7日間凍結貯蔵後の酵母から調製した無細胞抽出液では、未凍結酵母に比べ、抽出液中のアクチンによるDNaseI阻害活性は約50%に低下した。凍結耐性酵母では、解凍後、培地中で30°C、2時間インキュベートした後に無細胞系を調製するとDNaseI阻害活性の回復が認められたが、非耐性酵母では、ほとんど回復しなかった。3.両酵母から無細胞抽出液を調製してゲルろ過を行い、解糖系の各酵素活性の溶出パターンを調べた。

その結果、未凍結の酵母では、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼは本来の分子量よりも高分子量側に溶出され、その溶出位置は、アクチンの溶出位置とも一致したことより、これらの酵素は、アクチンなどの蛋白質と複合体を形成し、会合状態で存在していることが示唆された。凍結貯蔵後の非耐性酵母から調製した無細胞系ではヘキソキナーゼおよびピルビン酸キナーゼ活性の低下、ホスホフルクトキナーゼ活性の低分子量側へのシフトなどが観察された。このため、凍結非耐性酵母では凍結貯蔵後に発酵力が低下するものと考えられる。さらに詳細に検討中である。パン酵母の凍結損傷の機構を解明するために通常のパン酵母(D)と耐凍性パン酵母(DFT)について、未凍結および凍結貯蔵後のパン酵母から調整した無細胞抽出液のゲルろ過を行い、解糖系の九つの酵素の溶出パターンを調べた。同時にアクチン特異的な蛍光色素を用いてアクチンの溶出パターンも調べた。両酵母で2つのアクチンのピークが検出され、Dでは凍結貯蔵後に両ピークとも低下したが、DFTは低下しなかった。これより、Dではアクチンの凍結損傷が著しいものと考えられる。解糖系の酵素については、ヘキソキナーゼおよびエラノーゼ活性は、両酵母で凍結貯蔵中に低下したが、低下の程度はDにおいて大きかった。解糖系の律速段階であるホスホフルクトキナーゼは本来の分子量(720,000)よりも高分子側にも活性のピークが検出され、他の酵素あるいは蛋白質と会合状態で存在していることが考えられる。Dでは高分子側にあった活性のピークが凍結貯蔵後には低分子側へ移動したことより、本酵素が、凍結貯蔵後には会合状態から解離したものと考えられる。グルタールアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼも本来の分子量(144,000)よりも高分子側に活性のピークが検出されたが、凍結貯蔵後の変化はなかった。ピルビン酸キナーゼ活性は、Dでは凍結貯蔵後に低下したが、DFTでは低下しなかった。以上の結果より、凍結貯蔵および解凍によりヘキソキナーゼの細胞外への漏洩、ホスホフルクトキナーゼの解離、他の数種の酵素活性の低下が起こるために、解糖系の効率が低下し、発酵能も低下するものと推察される。特にホスホフルクトキナーゼは解糖系の中間付近に位置し、律速段階でもあるので、その解離は解糖系の効率に大きな影響を与えているものと思われる。また、DとDFTにおける凍結貯蔵後の発酵能低下の差は、解糖系の解離の程度やヘキソキナーゼ活性およびホスホフルクトキナーゼ活性の低下の程度が異なるためであると考えられる。
2次非線形光学性を持つ電界分極石英ガラスファイバーを用いたWDM用光学素子の開発

マルチメディア時代を迎えて、より多くの情報を高速で通信することが不可欠となっている。この問題を解決するために、様々な光通信方式の提案がなされている。本研究では、石英ガラスファイバーに熱ポーリングによって2次非線形光学性を付加した新しい波長分離素子の開発を目的とした。実際にはまず、石英ガラスファイバーにKrF(248nm)エキシマレーザをフォトマスクを用いて櫛形になるように照射した。照射したKrFエキシマレーザ光が当たる部分だけ屈折率が通常よりもほんのごくわずかだが大きくなることが確認できた。次にこの試料を熱ポーリングすることによって2次非線形光学性が発現する事が確かめられた。作成した試料に電極を取り付けパルス電圧によって屈折率を変調することを試みたが、予定した値を出すことができなかった。その原因は2点あった。1つは得られた2次非線形光学性が弱かったことである。この対処法としては照射する光の波長をより短くすることによって克服することが可能であると考えられる。第2点は、2次非線形光学性領域の微細構造が設計どおりにできていないことである。これは使用したフォトマスクの性能が悪かったためであり、位相マスク等を用いることで克服することが可能であると考えられる。今後、さらに研究を進め、当初の目的である550V程度の印加電圧で50nm程度の波長域を挿引する事のでき、100光波以上の波長を分離することのできるWDM用波長分離素子の試作を行っていく予定である。石英ガラスに熱を加えながら高電圧を印加する(熱ポーリング)事により2次非線形光学性が発現する。純度が高く光学素子として利用できる合成石英ガラスにおいては通常は2次非線形光学性が発現しない。しかし我々は石英ガラス中に2次非線形光学性の原因であるSiO-とH+をKrFエキシマレーザーを照射して導入することにより極めて大きな2次非線形光学性を発現させることに成功した。また一度できた2次非線形光学相に再度KrFエキシマレーザーを照射することにより、極めて効率よく消去することに成功した。石英ガラスを用いて光信号を変調するには微細構造を作製する必要があるが今回の2次非線形光学相の消去法法は極めて簡単に行うことができるため、実用上大変有意義である。この2つの2次非線形光学相の生成、消去技術を利用して線幅50μmの微細構造を作製することに成功した。今後更なる精密化を行い変調効率を増加することが来年の課題である。
バクテリア染色体の分配機構とこれに関わる染色体領域の研究

大腸菌の細胞周期において、複製した染色体は極めて正確に娘細胞に分配される。この過程で染色体の複製起点(oriC)領域は細胞の中央から両極へと移動する。このことは、oriCの近傍にoriC領域の移動に関わるシス領域があることを示唆している。本研究では、このシス機能部位の同定を行った。染色体の一部を切り出し、その領域を第2の染色体として細胞内に保持させる、染色体分断株という独創的な変異株を作成する系を確立した。これら変異株について染色体分配に異常が生じているか否かを解析し、本年度までに染色体のoriC領域の細胞中央から両極方向への移動に関わるシス領域が染色体の89.189.5minの約15kbの範囲内に存在するという結果を得た。本年度はこの15kbの範囲内について多数の染色体欠失株を作成し、それぞれの株についてoriC領域の両極方向への移動が阻害されているか否かを解析した。この結果、大腸菌の染色体分配においてDNA分配にシス位で機能する46bpの配列を同定した。さらに、細胞中央から両極方向へ移動する機能を失った分配の変異プラスミドを用い、この変異をシス位で相補できる配列として、46bpの配列の中からヘアピン構造をとりうる25bpの配列を同定した。これらの結果より、migSと命名したたった25bpの配列が、染色体の細胞中央から両極方向への移動にシス位で機能する配列であることが示された。高コピー数のプラスミド上にクローニングしたmigS配列によってoriC領域の両極方向への移動が阻害されたことから、migS配列を認識して染色体の分配に機能するタンパク質の存在が示唆された。以上の結果より、migS配列は大腸菌においていわゆるセントロメアとして働く配列であると結論した。