hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規シナプス伝達修飾分子LGI1/ADAM22/23の構造基盤の解明

LGI1は、ヒトでてんかんを引き起こす30以上の変異が報告され、また、辺縁系脳炎を引き起こす自己抗体の主要な標的であることが知られている。つまり、LGI1がヒトの神経活動に重要な役割を担うことは明白である。これまでに我々は、LGI1ノックアウト(KO)マウスが生後三週間以内にてんかん発作により全て死亡すること、LGI1がシナプス膜貫通蛋白質ADAM22、ADAM23と複合体を形成すること、そして、AMPA型グルタミン酸受容体の機能制御を行うことを見出してきた。しかしながら、LGI1の機能阻害とてんかん発症の分子病態メカニズムは未だ明らかではなかった。申請者はヒトでてんかんを引き起こすLGI1変異体の分泌活性を網羅的に検討し、分泌型と分泌阻害型に分類した。次に、生理機能への変異の影響を評価するため、分泌阻害型、分泌型変異体LGI1を発現するトランスジェニックマウスを作成した。LGI1変異体のヘテロ接合型マウスは、ペンチレンテトラゾールに対する痙攣感受性が野生型に比べ高かったことから、ヒトのてんかんモデルマウスとなることが示された。次に、マウス脳内でのLGI1変異体の機能欠損を生化学的、組織化学的に調査した結果、野生型LGI1がシナプス間隙へ分泌され、ADAM22、ADAM23と結合するのに対し、分泌不全型変異体は構造異常のために小胞体に留まり、最終的には分解されること、分泌型変異体はADAM22との結合が選択的に阻害されていることを見出した。以上の結果はLGI1の変異によって引き起こされるてんかんが、分泌不全、タンパク間相互作用不全を原因とする構造病(conformational disease)であることを示し、LGI1/ADAM22による脳の興奮性シナプス伝達制御機構の重要性が示された。さらに分泌不全型変異体の培養細胞からの分泌が、ある小分子により促されることも見出した。これは、LGI1変異によって引き起こされるてんかんの治療法に知見を与えるものである。本研究では、てんかん関連分泌蛋白質LGI1のシナプスにおける生理的機能の解明を個体、細胞、分子レベルの縦断的解析により試みている。ヒトにおいて、てんかんを引き起こすLGI1の一塩基アミノ酸置換の多くはLGI1の分泌を阻害するが、本研究において、未評価の変異体から分泌活性を有する複数のLGI1変異体を新たに見出した。これら変異体ではシナプス間隙におけるLGI1の主要な生理機能の欠損が推測される。in vitroで作製したLGI1とADAM22の複合体の分子量をショ糖密度勾配遠心分離法によって同定したところ、あるLGI1変異体AではLGI1がホモ2量体化し、ADAM22との複合体形成が野生型と比較して約40%阻害された。よって変異Aによる、てんかん発症の原因としてADAM22との結合力の低下が示唆された。生理条件下におけるLGI1変異体Aの機能評価のために我々はLGI1変異体Aのトランスジェニック(Tg)マウスを作成した。LGI1ノックアウトマウスのてんかん発作がこの変異体Aによってもレスキューされないことを確認し、この変異体マウスを新たな疾患モデルマウスと位置づけることが可能となった。ショ糖密度勾配遠心分離法により脳内(in vivo)の蛋白質複合体の質量分布を網羅的に解析する実験系を立ち上げ、現在、野生型と変異体での蛋白質複合体形成の違いを検討している。一方、分泌阻害型のLGI1 E383A変異体のTgマウスも作成した。脳内でのLGI1結合蛋白質複合体を精製し、質量分析により蛋白質の同定を行ったところ、野生型では検出されない分泌過程に関与する複数の蛋白質が変異体では検出された。よって、分泌阻害の原因として分泌過程の蛋白質との結合強度の変化が考えられる。このようにLGI1変異体マウスを蛋白質レベルで解析し、てんかんの病態機構、および、LGI1の生理機能を明らかにしつつある。本研究では、てんかん原因分泌蛋白質LGI1のシナプスにおける生理的機能の解明を個体、組織、分子レベルの縦断的解析により試みている。我々はヒトで報告されたLGI1のてんかん変異体、特に単一アミノ酸変異に着目した。アミノ酸変異による蛋白質構造、および蛋白質-蛋白質相互作用への影響が、LGI1の生理的な機能に関与すると考えられるためである。これまでに我々はLGI1変異体の分泌活性を網羅的に検討し、多くがLGI1の分泌を阻害し、変異体A,Bが分泌活性を保持していることを見出した。そこで、生理機能への変異の影響を評価するため、分泌阻害型の変異体X曳分泌型の変異体Aのトランスジェニック(Tg)マウスを作成した。LGI1ノックアウト(KO)マウスのてんかん発作がこれらTgマウスによって機能回復されなかったため、これらTgマウスは疾患モデルマウスといえる。野生型と異なり、変異体XはTgマウス脳内で小胞体に局在していた。変異体X特異的な結合蛋白質として、小胞体関連分解(ERAD)に関する蛋白質を同定した。また、蛋白質の折り畳みを促す小分子(化学シャペロン)により培養細胞からのLGI1変異体Xの分泌が促進された。以上の結果から、LGI1の分泌を阻害する変異によるてんかん発症は、LGI1のconformational diseasesであると考えられる。一方、変異体AではADAM22とLGI1変異体との結合が特異的に阻害されていた。

この結果はLG1/IADAM22蛋白質相互作用の低下が、LGI1を介したシナプス伝達の機能阻害を起こし、てんかんを誘因ことを示唆する。以上の2つのTgマウスの結果から、LGI1の分泌、およびADAM22との結合の重要性が示された。このようにLGI1変異体マウスを蛋白質レベルで解析し、てんかんの病態機構、および、LGI1の生理機能を明らかにしつつある。LGI1は、ヒトでてんかんを引き起こす30以上の変異が報告され、また、辺縁系脳炎を引き起こす自己抗体の主要な標的であることが知られている。つまり、LGI1がヒトの神経活動に重要な役割を担うことは明白である。これまでに我々は、LGI1ノックアウト(KO)マウスが生後三週間以内にてんかん発作により全て死亡すること、LGI1がシナプス膜貫通蛋白質ADAM22、ADAM23と複合体を形成すること、そして、AMPA型グルタミン酸受容体の機能制御を行うことを見出してきた。しかしながら、LGI1の機能阻害とてんかん発症の分子病態メカニズムは未だ明らかではなかった。申請者はヒトでてんかんを引き起こすLGI1変異体の分泌活性を網羅的に検討し、分泌型と分泌阻害型に分類した。次に、生理機能への変異の影響を評価するため、分泌阻害型、分泌型変異体LGI1を発現するトランスジェニックマウスを作成した。LGI1変異体のヘテロ接合型マウスは、ペンチレンテトラゾールに対する痙攣感受性が野生型に比べ高かったことから、ヒトのてんかんモデルマウスとなることが示された。次に、マウス脳内でのLGI1変異体の機能欠損を生化学的、組織化学的に調査した結果、野生型LGI1がシナプス間隙へ分泌され、ADAM22、ADAM23と結合するのに対し、分泌不全型変異体は構造異常のために小胞体に留まり、最終的には分解されること、分泌型変異体はADAM22との結合が選択的に阻害されていることを見出した。以上の結果はLGI1の変異によって引き起こされるてんかんが、分泌不全、タンパク間相互作用不全を原因とする構造病(conformational disease)であることを示し、LGI1/ADAM22による脳の興奮性シナプス伝達制御機構の重要性が示された。さらに分泌不全型変異体の培養細胞からの分泌が、ある小分子により促されることも見出した。これは、LGI1変異によって引き起こされるてんかんの治療法に知見を与えるものである。本研究ではLGI1てんかん原因変異体のトランスジェニックマウスを作製し、脳内でLGI1変異体のADAM22との結合がLGI1野性型に比べ特異的に減少していることを見出した。この結果はLGI1/ADAM22蛋白質相互作用の低下が、LGI1を介したシナプス伝達の機能阻害を起こし、てんかんを誘因することを示唆する。このような結果はマウス作製前には予想されなかったことでありぐ本研究は計画以上の成果を上げていると考えられる。本研究ではLGI1単一アミノ酸変異体のトランスジェニックマウスの解析により、LGI1結合蛋白質と、てんかん発症の関連について明らかにしつつある。マウスを作製していない変異体でも、in vitroの実験からアミノ酸変異で異なる蛋白質複合体の形成が示唆されている。今後はこれら変異体のトランスジェニジクマウスを作製、解析し、複数の変異体の結果を統合することで、LGI1を焦点とするシナプス伝達の分子機構を明らかにする。
テラヘルツパルスを用いた超高速実空間イオン制御に関する研究

本研究では、テラヘルツ波により超イオン伝導体内のイオン(可動イオン)をポテンシャルから脱出させ、サブピコ秒という短い時間内に動かす。このとき、可動イオンのポテンシャル内での振動状態が変化し、イオンがポテンシャルを脱出し伝導するとその振動現象は見えなくなる。この可動イオンのポテンシャルからの脱出・伝導を、その確固たる証拠としてスペクトル変化とマクロな電流検出により観測する。
環境細菌の生態学的振舞の最初期過程に関する分子生物学的解析

Pseudomonas属細菌は植物関連物質のエチレン、アミノ酸、リンゴ酸に誘引応答をすることを見出した。そしてその走化性センサーとしてP.aerugionsa PA26541(エチレン)P.putida Pput_3489(アミノ酸)、P.aeruginosa PA2652(リンゴ酸)の特定に成功した。また、トリクロロエチレン(TCE)分解細菌のP.putida F1のTCE走化性を解析し、その正の走化性センサーとしてPput_6181、負の走化性センサーとしてPput_3489を特定した。Pseudomonas aeruginosaの植物関連物質に対する走化性応答を調べたところ、植物ホルモンであるエチレン、ジカルボン酸であるリンゴ酸、クエン酸に走化性応答を示すことを見いだした。P.aeruginosaの走化性センサー遺伝子破壊株ライブラリーをスクリーニングした結果、エチレンの走化性センサーとしてTlpQ、リンゴ酸の走化性センサーとしてTlpRを特定した。データベースに対して相同性検索を行ったところ、植物成長を促進するPseudomonas fluorescens及びPseudomonas putida、植物病原菌であるPseudomonassyringaeがTlpQのホモログを有していることが分かった。それら細菌株のエチレンに対する応答を調べたところ、いずれの細菌株もエチレンに対して誘引応答を示すことが分かった。今後、エチレン走化性が植物との相互作用にどのような役割を果たしているのか調べてみたい。トリクロロエチレン(TCE)分解菌P.putida F1はトルエン存在下で培養するとTCEに対する正の走化性を示すことが知られている。しかし、その走化性センサーはまだ特定されていない。そこで、定量的RT-PCRを用いてF1株が持つ走化性センサー遺伝子の中でトルエン曝露で転写が誘導されるものを選択した。選択された6遺伝子をそれぞれクローニングしP.aeruginosaに導入した。得られた形質転換株のTCE走化性を調べた結果、Pput4894がTCE走化性センサーであることが分かった。F1株の遺伝子破壊株を用いた解析もその結果を支持した。これまで増殖基質となる物質を中心に走化性の解析をおこなってきたが、本年は植物-運動性細菌の相互作用を念頭に置き、植物由来の物質に対するPseudomonas aeruginosaの走化性を網羅的に解析した。その結果、糖類、有機酸の多く、植物ホルモン(エチレンは除く;エチレンには正の走化性を示すことが分かっている)に対して顕著な走化性応答を示さなかった。しかし、植物浸出物の主要成分のひとつであるリンゴ酸に誘引応答を示すことを見いだした。遺伝学的解析からTlpRがリンゴ酸の走化性センサーであることを特定した。Pseudomonas putidaやPseudomonas fluorescensもリンゴ酸に誘引されること、またいずれの株もTlpRのホモログを有していることから、平成21年度は各Pseudomonas株のTlpRと植物との相互作用に焦点を当て、研究を行う。また、リグニン関連物質であるサルチル酸(これは植物のシグナル物質でもある)およびヒドロキシ安息香酸に対し負の走化性応答を示すことが分かった。走化性センサー遺伝子破壊株ライブラリーを用いた分析では、走化性センサーを特定することができなかった。このことは複数の走化性センサーがこの負の走化性応答に関与していることを意味していると考えている。次年度は、この走化性センサーを特定する。植物成長促進効果を持つPseudomonas fluruorescensの植物相互作用の最初期段階に寄与すると考えられる走化性応答について検討した。P.fluorescensは植物根から分泌されるクエン酸、リシゴ酸などのカルボン酸およびアミノ酸に対して強い走化性を示すことが判明した。PseudomonasaerugiDosaではT1pRと呼ばれる走化性トランスデューサーが有機酸に対する走化性のセンサーとして機能することが知られている。P.fluorescens t1pRホモログを有しているので、その遺伝子をクローニングし、P. aeruginosaのt1pR変異株で発現させて解析した結果、有機酸センサーとして機能することが確認された。今後、t1pRを焦点をあて、植物-微生物相互作用と走化性との関連について解析を進めていく。ついで、in situバイオレメディエーションにおける汚染物質分解細菌と汚染物質との遭遇を高めることを目的にトリクロロエチレン(TCE)分解細菌Pseudomonas putidaのTCE走化性について解析した。P.putidaは高濃度のTCEに対し負の走化性を示し、走化性トランスデューサーPctAがそのセンサーとして機能していることが分かった。そしてpctA遺伝子を破壊することにより、親株が忌避していた濃度のTCEに対し、誘引応答を示すようになることが分かった。
ロードデンドロン属(ツツジ・シャクナゲ)における遠縁交雑と倍数性育種

これらのなかでHym×Rhod(及びその逆交雑),Hym×Pent,Tsut×Pent及びRhod×Pentには親和性があり多くの朔がえられたが,Rhod×HymとRhod×Pentの種子は発芽しなかった。またPent×Hym,Pent×Rhod及びTsut×Rhodには親和性がなく,種子はえられなかった。当然予想されるようにRhod内での遠縁交雑は,亜属間交雑よりも成功度が高かったが,しかしHym,Pent及びTsut内での種間交雑に比べると劣っていた。これはRhod内での種間の遺伝的分化が進んでいるためと考えられた。得られた雑種のなかでHym×Rhod,Hym×Pentに基づく後代から優れた黄色園芸系がえられるものと予測されるが,Tsut×Pentの後代の大半は残念ながら葉緑素を欠いており,生育が悪かった。したがって,これについては,このような欠陥のない組合わせを探るべく,広範な検討が必要であろう。またRhod内の交雑でも優れた黄やブルーの誕生が予測されるが,後者についてはピンク系の細胞質の導入が旺盛な生育をもたらす点が注目された。一方常法のコルヒチン処理による倍数体化を試みたが,鹿児島の夏は高温に過ぎ,処理植物が枯死するためうまくいかなかった。そこで組織培養中での倍化に切りかえることとし,その第一歩として多芽体の形成について検討した。その結果サイトカイニンの単独添加がよいことが判った。また予備的実験であるが,0.05%のコルセミドの35日処理で倍数体らしきものがえられている。平成3年度は研究計画のうち、特に重要な遠縁交配に力点を置いた研究を行った。総交配花数は3,810花であった。その結果Hymenanthes亜属(以下Hym)、Rhododendron亜属Rhododendron節(Rhod)、Pentanthera亜属Pentanthera節(Pent)及びTsutsutsi亜属Tsutsutsi節(Tsut)の4つの異亜属異節間交配でRhod×Hym及びその逆交配、Rhod×Pent(逆交配は不可)、Hym×Pent(逆交配は不可)、Tsut×Pentの5交配組合わせで結〓可能なこと、その平均結〓率は391%の範囲にあることを明らかにした。しかしTsut×Rhodは結〓しなかった。またRhod節内の種間交配を含む遠縁交配では、平均結〓率66%という結果をえた。これらのことは本属における異亜属間交配で、どのような組合せの成功率が高いかを明示したものである。またRhod節内の平均結〓率が66%であったことは、節内でのゲノム分化が可なり進んでいることを示すものとみられた。しかしながら、実生が得られた組合せはHym×Rhod、Hym×Pent、Tsut×Pent及びRhod節内交配で、Rhod×Hym及びRhod×Pentは種子は得られたものの発芽しなかった。したがって、これらでは胚培養による雑種胚の救済が必要であると思われた。いずれにしても黄色系のHym×Rhod、Hym×Pent及びRhod節内交配で雑種実生が得られたことは、優れた濃黄の園芸種の作出がこのような遠縁交配で可能なことを示したものである。一方、倍数体化については常法による処理法では成功率が低いことが判った。しかしながら、幸に無菌培養系を確立することができたので、この培養系に対しコルセミド処理を行ったところ、0.05%の35日処理で多数の倍化個体と思われる異常個体を認めた。この倍数体化は、本研究の今一つの大きな柱でもあるので、今後更に広範な追求を行いたいと考えている。

平成4年度は前年度の遠縁交雑のなかで、親和性が高く特に有望と考えられた組合わせに重点を置いて、交雑を行った。総交雑花数は4118花であった。その結果は前年度とほぼ同様で実生がえられたのはHymenanthes亜属(以下Hym)×Rhododendron亜属Rhododendron節(以下Rhod)、Hym×Pentanthera亜属Pentanthera節(以下Pent)及びTsustsutsi亜属Tsutsutsi節(以下Tsut)×Pentの3組合わせで、Rhod×Hym及びRhod×Pentは結〓をしないか、結〓をし種子がえられても発芽しなかった。一方Rhod節内での遠縁交雑で特に問題となったのはブルー系の花色を狙った交雑で、耐暑性の育種素材として優れた素材がない点であったが、新しく導入した品種青嵐が特に花粉親として広い親和性を持ち、実生の生育もよいことが判明した。またブルー系の育種では花色の上では一歩後退するものの、ピンク系に非常に丈夫なものがあるので、これらを素材として新しくピンク×ブルー(及びその逆)の交雑を行ったが、予期した通りその実生は丈夫で、多数の優れた中間育種素材がえられるものと期待している。次に倍数体化に関しては無菌培養条件の検討を行い、初代培養の外植体は必ずしも生長点そのものでなくとも、芽鱗を数枚はがした腋芽でも十分に使用に耐えること、zeatin1.02.0mg・l^<-1>添加のAnderson培地で生長率が高いことを明らかにするとともに、継代培養ではzeatin2.05.0mg・l^<-1>添加の修正Andersonは培地でシュートの増殖率が高いことを明らかにした。なお、0.05%35日のコルセミド処理で培化個体と考えられる異常個体が出現したことは、昨年度の総括で述べた通りであるが、これらについては現在無菌培養系より取り出して馴化を行っているところで、近く染色体数の検定に入りうるものと考えている。
消費者行動的視座からの広告とセールス・プロモーションの関係性に関する実証的考察

本年度は、セールス・プロモーションの一要因としての価格に着目し、価格と広告の関係性及び価格と製品品質に関してまとめた。価格と製品品質の関係性については、製品品質に価格が及ぼす影響はどのような広告出稿をするかにも関わってくると考えられため、レビューを行った。価格と広告の関係性に関しては、Schindler(1994)を参考に価格が小売広告においてどのような意図からどのように提示されるべきかについての検討を行った。その結果、価格訴求型の広告において押さえられるべき点として大きく分けると、(1)外的参照価格の表示、(2)ディスカウントの表現の仕方、(3)出稿媒体の選択の3つがあることが示された。また、価格訴求型の広告において、包括的な視点からどのような点が重要視されるべきか、広告表現において押えるべき点は何なのかという視点からの実証的な研究が見られないことを指摘している。(この成果は『日経広告研究所報』197号「小売広告と価格提示をめぐる一考察」に掲載されている。)また、価格と製品品質の関係性については、(1)製品カテゴリーに依存する要因、(2)購買状況に依存する要因、(3)消費者特性に依存する要因によっては価格が製品の品質表示機能を担う場合があり、これはまた製品ライフサイクルの段階とも関係していることを示した。また、ブランド名が機能する場合には価格の品質表示機能が働かないことを示し、その一方で、近年の日本においてブランドの信頼性を凋落させるような、企業の倫理観を問われる事件が相次いでいることを指摘した。(この成果は、日経産業消費研究所の『消費&マーケティング』197号「品質表示機能としての価格の役割」に掲載されている。)今後、消費者の品質知覚に及ぼす広告と価格設定の影響(主効果及び交互効果)についての検討を重ねた上で、今年度行うことができなかったため、今後これらのレビューを踏まえたメタ分析を行い、モデルの構築を試みる必要がある。本年度は、どのようにセールス・プロモーションとしての価格設定(価格プロモーション)と広告出稿を連携性の問題に関連して、価格-品質関係についての先行研究を踏まえて、広告が価格-品質関係に及ぼす影響を組み込んだモデルの構築を試みた。価格と消費者の知覚品質との関係性を反映したグーテンベルグ仮説では、価格の変化に対するマーケット・シェア及び売上に対する効果は線形ではなく二つの屈折点を持った非線形の関数で表され、中央部分が両端よりも緩やかな傾きを持つとしている。一方、Simon(1989)は、価格が消費者によって品質の指標、即ち消費者が「高価格製品は高品質である」、「低価格製品は低品質である」と判断する価格の品質バロメータとしての機能を加味した価格反応関数を示している。このような価格に依存した品質評価は経時的に一定ではなく、品質に対する不確実性が最も高い最初の購買時は価格の持つ品質バロメータとしての機能が働くが、製品の使用経験や商品知識が増すにつれ消費者の品質に対する不確実性は減少し、価格は品質バロメータとして機能しなくなり、価格反応関数の左端(低価格時の購買量)は上昇する。以上の議論を踏まえたモデルとして、最上、柿島、上田(1997)のSAFEモデルがあるが、このモデルではマーケティング変数を表す項は価格反応関数の左端の形状に影響を与えうる項ではなく、消費者への広告露出により消費者の商品知識が向上する為消費者の品質に対する不確実性は減少し低価格時の売上数量は増加する点を記述していない。従って本研究では、この点を改善した非線形回帰モデルを定式化し、実証分析(データはパネルデータ(衣料用洗剤・集計レベル))を行い、一部仮説どおりの結果を得られた。上記の内容は「価格設定及び広告出稿の連携性に関するモデル構築の試み」(日本商業学会東日本大会2000年11月25日明治学院大学)にて報告を行った。)

今後、消費者の品質知覚に及ぼす広告と価格設定の影響(主効果及び交互効果)についての検討を重ねた上で、今年度行うことができなかったため、今後これらのレビューを踏まえたメタ分析を行い、モデルの構築を試みる必要がある。
根尖孔外バイオフィルムが根尖病巣に及ぼす影響

根尖性歯周炎の難治化には根尖孔外に存在するバイオフィルムが関与していることが報告されている。そのため、我々は根尖孔外バイオフィルムを形成する動物実験モデルを開発した。本研究では、そのモデルにおいてガッタパーチャポイントを引き抜く改良モデルの開発と、ガッターパーチャポイントが根尖病巣に及ぼす影響について検索した。マイクロエンド用の器具を用いることで、ガッタパーチャポイントを引き抜くモデルの開発に成功し、そのモデルを用いて、ガッタパーチャポイントの有無によって根尖病巣サイズに影響がないことが明らかとなった。ラットの下顎第一臼歯に根尖孔外バイオフィルムを形成し、根尖孔外バイオフィルムが根尖病巣におよぼす影響を検索している。本研究で用いたモデルでは、根管充填材を根尖孔を越えて挿入することにより、根管充填材自体が細菌バイオフィルム進展の足場となり、根尖孔外バイオフィルムを形成する。このモデルでは、根尖孔外バイオフィルムだけでなく、根尖孔を越えて挿入された根管充填材も根尖病巣に何らかの影響を及ぼすことが考えられる。そこで、根尖孔外バイオフィルムを形成した後、根管充填材を除去することにより、根管充填材の影響を排除した状態で、根尖孔外バイオフィルムが根尖病巣に及ぼす影響を評価することを目的とした。根尖病巣のみ形成した群(NC群)、根尖孔外バイオフィルムを形成し、根管充填材を除去しない群(PC群)ならびに根尖孔外バイオフィルムを形成し、2週後に根管充填材を除去した群(実験群)のそれぞれの根尖病巣体積を経時的に測定したところ、露髄後8週においてPC群、実験群はNC群に対して有意に病巣体積が拡大したが、PC群と実験群の間に有意差は認められなかった。このことから、根尖孔を越えて挿入された根管充填材は、根尖病巣体積については影響がないことが示唆された。この結果は、日本歯科保存学会2014年度秋季学術大会で発表した。本研究の目的は、難治性根尖性歯周に関与する根尖孔外バイオフィルムの難治化のメカニズムを解明することである。ラットの臼歯に実験的に根尖病巣を惹起した後、根尖孔を越えてガタパーチャポイントを挿入し、一定期間放置することによって根尖孔外バイオフィルムが形成できることが既に報告している。次の段階として、根尖孔外バイオフィルム形成後にガッタパーチャポイントを引き抜き、根管治療を行い、治癒過程の変化を組織学的に追うことで、根尖孔外バイオフィルムの難治化のメカニズムが解明されるものと考える。ラットに一度挿入したガッタパーチャポイントを引き抜くことは、手技的に非常に困難ではある。なぜなら、ガッタパーチャポイントを挿入し、一定期間放置することにより、髄腔内に食片が圧入するからである。そこで本研究では、マイクロエンド用のエキスカベータを使用し、食片を除去し、ガッタパーチャポイントの断端を明示した後、エキスカベータの先端をガッタパーチャポイントに引っ掛けて引き抜く方法を考えた。この方法により、安定してガッタパーチャポイントを引き抜くことが可能となった。本研究において、ガッタパーチャポイントを引き抜くモデルが確立された。また、このモデルを用いてガッタパーチャポイントを引き抜いた群と、引き抜かなかった群において、根尖病巣体積の変化を調べたところ、有意な差を認めなかった。このことから、根尖孔外にまで挿入されたガッタパーチャポイント自体には根尖病巣体積に影響を及ぼさないことが明らかとなった。ラット臼歯の根尖孔を越えて挿入した根管充填材を除去することは、手技的に非常に困難であると考えられたが、顕微鏡治療用の器具(マイクロスコープ、OKマイクロエキスカ)を用いることで、安定して根管充填材を除去することが可能となった。27年度が最終年度であるため、記入しない。歯内療法今後は、根尖孔外バイオフィルムの存在下における根尖病巣周囲での免疫反応を組織学的、免疫組織学的に検索する予定である。
粉粒体の動力学

本研究では、粉粒体の多彩で複雑な構造を「非弾性衝突球の集団」という近似で理解する為に、統計力学的なアプローチを用いた。アプローチでは相互作用をする単純な要素をたくさん集める事により、多体の効果として集団的な非自明な性質を説明する。例えば、気体、液体、固体、などは、原子が多数集合して、物質になることにより生じる性質だが、個々の原子は固体、液体、気体、という性質を保有しているわけではない。あくまで、原子と言う粒子が多数、集合する事により、液体性、固体性、気体性、という非自明な効果が現れるのである。この様な方向性を追求するため、本研究計画では多粒子系のニュートン方程式を数値的に計算する計算機シミュレーションを行なった。数値計算の利点はいろいろな場合、つまり、振動下の粉体層、傾斜板上の粉粒体流(雪崩や土石流のモデル)、気相流動層、などの研究を全て「非弾性衝突をする剛体球」という枠組の中で統一的に議論できた。実験ではこの様なアプローチは困難である。同じ粉粒体を粒子を用いて、これらの現象を全て実験することは困難だからである。また、現実の粉粒体粒子は決して理想的な「非弾性衝突剛体球」ではあり得ないが、数値シミュレーションの中であれば、いくらでも、理想的な非弾性衝突球のシミュレーションを行なう事が出来た。
腫瘍抵抗性宿主遺伝子を保持する野生マウス由来の新しい系統の育成と遺伝子的解析

1.マウス肺腫瘍発生に関与する宿主の抵抗性遺伝子の同定マウス肺腫瘍発生に関与する宿主の主要遺伝子Pas-1の染色体上の位置の同定が完了した.第6染色体上のK-ras遺伝子座下流に存在が推定されたが、遺伝子そのものの同定にはいたらなかった.肺腫瘍発生抵抗性の野生マウス系統には、この主要遺伝子Pas-1の抵抗性の対立遺伝子座が存在することが示唆された。今回得られた知見をもとにして、抵抗性の対立遺伝子座を保持するPas-1コンジェニック系統の育生を開始した.2.特に東南アジア産野性マウス集団には,肺腫瘍発生に対して抑制的に働く複数の遺伝子が存在することが判明したが,それらの遺伝子群は従来報告されている遺伝子とは染色体上の位置が異なる独自の遺伝子であることが判明した.3.発がん研究に用いられる新しい系統の育成H-2^<h4>ハプロタイプを保持している新しいH-2コンジェニック系統の育成が完了した.現在さらに,この系統に肺腫瘍発生に関与する可能性が示唆されているclassII遺伝子の導入を試みている.1.野生由来の新たな近交系系統の育成(近交系化およびSPF化)が完了し,これらの新たに育成された系統について,発がん実験を行った.その結果,野生由来の系統はいずれも肺腫瘍低発系であった.さらにこれらの系統を肺腫瘍高発系のA/Wyと交雑試験を行った結果,東南アジア産野生マウス由来の系統には,肺腫瘍発生に対し抑制的に働く複数の遺伝子の存在が推定された.2.東南アジア産野生マウス由来のゲノムを1/4保持する,リコンビナント・コンジェニック系統の育成を行い,4系統が新たに近交系化された.3.A/Wy系統とC57BL系統を用いた連鎖試験によりPas-1遺伝子のマッピングを行い,染色体上の位置をほぼ確定した.4.マウス肺腫瘍発生に関与する宿主の主要遺伝子Pas-1の染色体の位置の同定が完了した.第6染色体上のK-ras遺伝子座下流に存在が推定されたが,遺伝子そのものの同定にはいたらなかった.しかしながら,今回得られた知見をもとにして,Pas-1コンジェニック系統の育成を開始することができる.5.特に東南アジア産野生マウス集団には,肺腫瘍発生に対して抑制的に働く複数の遺伝子が存在することが判明したが,それらの遺伝子群の染色体上の位置の同定はまだできていない.I.マウス肺腫瘍発生に関与する宿主の遺伝子の同定について第6染色体上のK-ras遺伝子座近傍に肺腫瘍発生に関与する宿主遺伝子の存在およびその染色体上の位置がほぼ確定できたが,遺伝子そのものの同定にはいたらなかった。また,特に東南アジア産野生マウス集団には,肺腫瘍発生に対して抑制的に働く複数の遺伝子が存在することが判明したが,それらの遺伝子群の染色体上の位置の同定はまだできていない.II.発がん研究に用いられる新しい系統の育成(1)H-2^<h4>ハプロタイプを保持するA系H-2コンジェニック系の育成:マウスの肺腫瘍発生にはH-2遺伝子複合体が関与していることがわかっているが,H-2遺伝子複合体内のどの遺伝子が実際に関与しているかは,依然として不明である.クラスII遺伝子の遺伝子産物であるE分子の多型性と,肺腫瘍発生率に関連があることが示唆されたので,Eα遺伝子座の5'末端に欠損があるH-2ハプロタイプを保持しているコンジェニック系統を新たに育成を試み,系統化が完了した.現在この系統を用いた発がん実験を開始している.(2)肺腫瘍発生に抑制的に働く遺伝子を保持する野生由来の系統(BGR系統)と,従来の実験用近交系で肺腫瘍発生高発系であるA/Wy系統との交雑による,リコンビナントコンジェニック系統の育成を行い,これまでに数lineが近交系化された.1.マウス肺腫瘍発生に関与する宿主の抵抗性遺伝子の同定マウス肺腫瘍発生に関与する宿主の主要遺伝子Pas-1の染色体上の位置の同定が完了した.第6染色体上のK-ras遺伝子座下流に存在が推定されたが、遺伝子そのものの同定にはいたらなかった.肺腫瘍発生抵抗性の野生マウス系統には、この主要遺伝子Pas-1の抵抗性の対立遺伝子座が存在することが示唆された。今回得られた知見をもとにして、抵抗性の対立遺伝子座を保持するPas-1コンジェニック系統の育生を開始した.2.特に東南アジア産野性マウス集団には,肺腫瘍発生に対して抑制的に働く複数の遺伝子が存在することが判明したが,それらの遺伝子群は従来報告されている遺伝子とは染色体上の位置が異なる独自の遺伝子であることが判明した.3.発がん研究に用いられる新しい系統の育成H-2^<h4>ハプロタイプを保持している新しいH-2コンジェニック系統の育成が完了した.現在さらに,この系統に肺腫瘍発生に関与する可能性が示唆されているclassII遺伝子の導入を試みている.
振動センサーを用いた東洋紡型補助人工心臓の血液ポンプ停止を検知するシステムの開発

研究目的体外設置型、空気駆動式であるニプロ補助人工心臓(ventricular assist device : VAD)の駆動チューブの外れや屈曲は血液ポンプの駆動停止に直結するが、これらの異常を検知する機能がない駆動装置(VCT-50x)が臨床で用いられている。本研究では、ニプロVADの血液ポンプおよび駆動チューブの振動に着目し、振動センサーを用いてニプロVADの駆動状態をモニタリングすることが可能か検討を行った。研究方法振動センサーを駆動チューブに取り付けてニプロVADの駆動状態を監視する装置を試作した。その後、モック回路を用いて、(1)駆動チューブを屈曲させたとき、(2)駆動チューブを駆動装置から外したときにおける試作機の動作について確認を行った。併せて、離脱目的でオフテストを施行する患者の駆動チューブに振動センサーを取り付け、ポンプ駆動停止中における試作機の動作について確認を行った。研究成果モック回路を使用した実験から、駆動条件や屈曲位置に関係なく、駆動チューブが駆動装置から外れたり完全に閉塞したりしたときはもちろんのこと、駆動チューブの不完全な閉塞も検知させることが可能であることが確認された。オフテスト施行中の患者で装置の動作を確認したところ、振動の検知に自己心の拍動の影響は全く受けないことが確認された。以上のことから、振動センサーを用いてニプロVADの駆動状態を監視することは可能であることが示唆された。
グラフェン原子層境界における谷分極伝導

本研究では、グラフェンを中心に原子層物質の電気伝導、電子状態、光応答など量子物性を新学術領域内外の研究者と協力しながら理論的に研究し、以下の成果を得た。グラフェン層境界における電気伝導の層数および境界の原子構造依存性を有効質量理論により調べた。単層2層グラフェン境界においては谷に依存した強い異方性、谷分極伝導が示されたが、層数の増加と共に異方性の度合いは小さくなることを示した。また扁平したカーボンナノチューブを閉じた端のある2層グラフェンと見なしその境界条件を有効質量近似の方法により導いた。特に電子状態変化の大きい肘掛け椅子とジグザグ型ナノチューブに着目し、2層グラフェンをずらした場合の電子状態の変化を、境界での反射係数と量子化条件により再現した。特にディラック点と線形分散状態に注目し、カイラル状態を示した。これは片方の線形分散だけが境界条件を満たすためである。また、AB積層の場合にエネルギーギャップを示した。これは結合状態が境界条件を満たし伝導帯が常に0エネルギーから始まるのに対し、反結合状態は境界条件を満たさず価電子帯が下がるためである。グラフェンに代表される層状物質の凝集力はファンデアワールス力として説明されており機械的な加圧や層間への物質挿入による変更が可能であるが、本研究では新たに光学励起による層間距離の変調を探索した。具体的には極性を持つ層状材料(ヘキサゴナル窒化ホウ素)に光学フォノンを誘起することで、各層に動的双極子を発生し、層間引力増強にいたる可能性を見出した。2次元新物質における層状距離制御の新たな方法として赤外レーザー照射を提唱し、実験的研究を提案した。さらにグラフェンナノリボンの光物性の再検討を行った。光を入射した際の光電場のグラフェンナノリボン付近での動的変調などを主に調べた。グラフェンを用いたテラヘルツ発光素子を提案し特許を出願した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、グラフェン原子層境界の問題を中心にグラフェンの電気伝導、電子状態など量子物性を理論的に研究し、エッジレスグラフェンリボンの電子状態の解明などを、領域内の実験、理論グループと連携しながら推進する。今年度は特に扁平したカーボンナノチューブの電子状態を有効質量近似の方法により計算した。肘掛け椅子とジグザグ型ナノチューブが扁平すると電子状態が大きく変化するが、カイラルナノチューブが扁平した場合、電子状態がほとんど変わらないことを示した。面間の相互作用は近接したカーボン原子間の飛び移り積分で与えられるが、距離と共に指数関数的に減衰する。有効質量近似で面間の相互作用は有効ポテンシャルとして表されるが、そのフーリエ変換の最大項だけ考えても、良い近似となっている事を示した。有効ポテンシャルの谷間成分はジグザグ型のナノチューブで非常に大きくカイラル角と共にすぐに減衰する。一方谷内成分は肘掛椅子型付近で大きく比較的ゆっくり減衰するが、カイラルナノチューブでは両者とも無視できるほど小さい。また、層状物質層間引力の光増強を第一原理計算によりシミュレーションした。グラフェンに代表される層状物質において光学励起による層間距離の変調を探索した。従来、高強度レーザー照射により凝集系の結合破壊や層状構造の解離が起こることはよく知られている。一方、電子励起を引き起こす周波数に近い周波数の光を定常的に照射し、原子核周りの電子雲の振動を誘起することにより、希ガス原子間の動的双極子引力を増強できることを示した。さらに、光学フォノンモードを励起する共鳴波数のレーザーを照射した場合の2層ヘキサゴナル窒化ホウ素層間距離が縮む様子をシミュレーションし、元の層間距離より10%以上もの収縮を予測した。

さらにグラフェンナノリボンの光物性の再検討を行った。光を入射した際の光電場のグラフェンナノリボン付近での動的変調などを主に調べた。グラフェンを用いたテラヘルツ発光素子を提案し特許を出願した。本研究で計画した研究のうち、エッジレスグラフェンリボンの電子状態について有効質量近似の方法で調べ、以下を明らかにした。肘掛け椅子型およびジグザグ型ナノチューブが扁平した場合、扁平した領域の構造によりエネルギー分散は大きく変化する。一方、カイラルナノチューブでは層間相互作用の効果は非常に小さくエネルギー分散は元のナノチューブとほとんど変わらない。大面積グラフェンの高品質化に関する研究については、A03班(応用班)長谷川グループと共同でレーザーを用いた品質改善に関する議論を行っている。その中で、高強度レーザー照射による層状物質層間引力の光増強を第一原理計算によりシミュレーションし、光学フォノンを誘起することで、各層に動的双極子を発生し、層間引力増強にいたる可能性を示した。以上のようにおおむね当初計画通り研究が進んでいる。これらの成果は論文、口頭により発表している。27年度が最終年度であるため、記入しない。扁平したカーボンナノチューブは、閉じた端を持つ2層グラフェンと見なすこともできる。そこでは層間相互作用がある2層グラフェンの中央部分と、曲率がある単層グラフェンの端部分を境界条件で接続する。これまで肘掛け椅子型およびジグザグ型ナノチューブが扁平した場合エネルギーバンド構造の大きな変化を示したが、閉じた端を持つ2層グラフェンの観点から、この結果を理解する。また、グラフェンナノリボンの光物性の再検討を行う。従来の理論的研究では光吸収スペクトルと言った静的な性質が主であったが、光を入射した際の光電場のグラフェンナノリボン付近での動的変調などを第一原理シミュレーションにより調べる。
海洋天然物ラメラリンを構造モチーフとする新規抗がん性物質の設計と合成

海洋天然物ラメラリンDは、各種がん細胞に対して強い細胞毒性を示す。また、この化合物は悪性度の高い多剤耐性がん細胞にも有効である。研究代表者らは、ラメラリン系天然物の抗がん活性に着目し、化学合成や構造活性相関研究を行ってきた。一方、Baillyは、細胞毒性発現の作用機序は、カンプトテシン系抗がん剤の分子標的であるトポイソメラーゼI阻害である事を報告した。我々は、Baillyらとの共同研究により細胞毒性とトポイソメラーゼI阻害の間には、明確な相関があることを明らかにした。また、分子動力学シミュレーションにより、トポイソメラーゼI-DNA-ラメラリンD三元複合体モデルを提案した。今回、このモデルに従って、有効なラメラリンDアナローグとして1-デアリールラメラリンDおよび1位置換1-デアリールラメラリンDを設計し、それらのアナローグの効率的な合成法の検討を行った。その結果、N-ベンゼンスルホニル-3-ブロモピロールの位置選択的リチオ化反応を鍵反応とする、8段階での1-デアリールラメラリンDの合成法の開発に成功した。また、1-デアリールラメラリンDの保護前駆体の求電子置換反応が、1位で選択的に進行する事を見いだした。さらに、求電子置換反応で得られた1位臭素化体と各種ボロン酸とのパラジウム触媒クロスカップリング(鈴木・宮浦反応)が、CsF-Ag_2Oを添加剤として用いる条件下、高収率で進行することを見いだした。このようにして得られた化合物のイソプロピル保護基を三臭化ホウ素で脱保護することにより、目的の1-デアリールラメラリンDおよび1位置換1-デアリールラメラリンDの合成を達成した。これらのアナローグの各種がん細胞に体する細胞毒性試験は現在進行中である。Hela細胞を用いた予備的な細胞毒性試験において、1-デアリールラメラリンDはラメラリンDと同等の細胞毒性を示すことが明らかになっている。ラメラリンは、14-phenyl-6H-[1]benzopyrano[4',3':4,5]pyrrolo[2,1-a]-isoquinolin-6-oneを基本骨格とする多環性海洋天然物である。現在までに基本骨格上の水酸基およびメトキシ基の位置が異なる30種以上の天然物が単離されている。これらの多くが強い細胞増殖抑制作用を示すことが知られており、ラメラリンは新規抗がん剤のリード化合物として注目されている。1993年、Baillyらはラメラリンによる細胞増殖阻害の主要な作用機序がトポイソメラーゼI阻害であることを報告した。また、我々はBaillyらとの共同研究によりラメラリンD-DNA-トポイソメラーゼI複合体の理論モデルを提案した。このモデルに基づき天然物を凌駕する活性を持つラメラリンアナローグを設計・合成することが本研究の目的である。平成18年度においては、ラメラリンの平面5環性骨格のDNAへのインターカレーションを妨害していると考えられた1位アリール基を除去した1-デアリールラメラリンDの合成法の検討を行った。その結果、N-ベンゼンスルホニル-3-プロモピロールを出発物質として8段階で1-デアリールラメラリンDの合成に成功した。

今後は、この手法を利用して多様な1位置換-1-デアリールを合成し、in vivoでの活性を評価する予定である。海洋天然物ラメラリンDは、種々のがん細胞に対しで、強い細胞毒性を示す。また悪性度の高い多剤耐性がん細胞に対しても有効である。その主要な作用機序は、臨床で用いられているカンプトテシン系抗がん剤の分子標的であるトポイソメラーゼIの阻害である。分子動力学シミュレーションにより得られたトポイソメラーゼI-DNA-ラメラリンD三元複合体モデルに基づき、実用化の可能性のあるラメラリンアナローグとして1-デアリールラメラリンDおよび1位置換1-デアリールラメラリンDを分子設計した。昨年度、N-ベンゼンスルホニル-3-ブロモピロールを出発物質とする8段階での1-デアリールラメラリンDの合成に成功した。また、1-デアリールラメラリンDの保護前駆体の求電子置換反応が、1位で選択的に進行する事を見いだした。今年度は、1位置換体の合成法の拡張を目的として、O-保護-1-ブロモ-1-デアリールラメラリンDと種々のボロン酸誘導体のパラジウム触媒クロスカップリング反応(鈴木・宮浦反応)を試みた。その結果、基質の立体障害のため通常の条件ではカップリング生成物は得られなかったが、CsF-Ag_2Oを添加剤とする条件下、高収率で目的物が得られることを見いだした。また、N-ベンゼンスルホニル-3、4-ジブロモピロールを出発物質とするラメラリンO、P、Q、Rの効率的な合成法の開発にも成功した。今回分子設計・合成したラメラリンアナローグについては、文部科学省がん特定領域研究化学療法情報支援班に総合的な抗がん活性の評価を依頼中である。研究代表者らによるHela細胞を用いたMTTアッセイの結果では、1-デアリールラメラリンDは、天然物ラメラリンDと同等の活性を示す事が明らかになっている。
有機硫黄、セレン化合物の組織化と新合成試剤開発の研究

1.ピリジン環(py)の3-または4-位にPhSO基を導入し、グリニヤール試薬と反応させるとグリニヤール交換反応により3-及び4-ピリジルグリニヤール試薬が容易に発生し、各種のアルデヒド、ケトンとカルボニル基への付加反応を行うことを見いだした。また、この方法により光学活性の3-,4-PyS(O)Tol-pが合成できた。2-ピリジルの反応では配位子同士のカップリング反応により2-置換ピリジンが高収率で得られた。また、2-PyS(O)PhはLDAでリチオ化するとピリジン環の3-位が選択的にリチオ化され、親電子剤との反応により3-位が容易に置換され、後、グリニヤール試薬との反応により軸不斉を持つ2-フェニルピリジンが容易に得られた。この反応より光学活性な2,3-ビスジp-トリルピリジンとp-TolMgBrの反応で、位置選択的に3-位のp-TolSO基を除き、光学的に純粋な2-PyS(O)Tol-pを得ることに初めて成功した。2.光学活性な2-PyS(O)Tol-pをリチウムイソプロピルアミド(LDA)でα-リチオ化、各種アルデヒドと反応させると、高選択的にスルフィニル基のα-位にフェニルアルコキシル基が導入でき、絶対配置の決定、n-BuLiの脱スルフィニル化による光学活性α-フェニル-β-ピリジルエタノールの合成等を行った。3.チアントレンやセレナントレンのモノスルホキシドとLDA、(PhS)_2等の親電子剤との反応によりチアントレン等の4,6-位に位置選択的に二置換基を導入した。また、この4,6-二置換チアントレンモノオキシド)とBuLiによる環縮小反応で、1,9-位に硫黄、セレン官能基を有するジベンゾチオフェン、セレノフェンの合成に成功し、これらを用いた熱、光分解で[3.4,bc]チエノチオフェン、セレノセレノフェンの合成に成功した。1)ピリジン環を有するスルフォキシドの組織化と立体化学の研究ピリジン環を有するスルフォキシドを合成し、組織的に機能化させることにより各種の新規な反応を見いだした。ピリジン環のα-、β-、γ-位にスルフィニル基[RS(0)-]を導入したのち、lithiumdiisopropylamide(LDA)のような強塩基と反応させると、スルフィニル基のα-位のプロトンが位置選択的に引き抜かれて、カルバニオンが生成し、各種の親電子試剤(アルデヒド、ケトン、ジスルフィド、シリル基)との反応で、ピリジン環の望む位置にこれらの置換基を導入できる事を見いだした。更に、グリニャ-ル試薬、有機リチウム等を反応させると、硫黄原子上で置換反応が起こり、脱スルフィニル化したピリジンの誘導体の合成、またはリガンドカップリング反応による、アリルピリジル、ビピリジル類が高収率で得られることが見いだされた。光学活性なスルフォキシドを用いると、不斉誘導反応が起こり光学活性中心を2ケ有する化合物が得られた。この化合物を用いたリガンドカップリング反応では、不斉原子と軸不斉を併せて持つ化合物が合成できる事を見いだした。更に、光学活性なピリジルメチルーpートリルスルフォキシドの不斉アルド-ル反応を用い高い不斉収率で光学活性なアルコ-ルを合成した。2)チアントレン、セレナントレンのリチオ化と位置選択的置換基導入反応

チアントレン、セレナントレン等を組織的に研究し、その特性を生かした、有機反応試薬としての用途を見いだすことを目的とした。チアントレン、セレナントレンはいずれも酸化電位が低く容易に、電子の授受を行う。チアントレン、セレナントレンを酸化しオキシドとしたのち、LDAを用いてリチオ化、親電子試薬との反応で、これらの化合物の1、9-位に容易に置換基を導入できること、更に、有機リチウム試薬との反応で、環縮小したジベンゾチオフェン、セレノフェンが得られ、これらの化合物は電子の良い運搬体になるという興味ある事実を見いだした。1.硫黄官能基を有するピリジン環や他の複素芳香環化合物の活性化と新しい反応の研究・・・ピリジン環の2位にスルフイニル基を導入し、有機リチウムやグリニヤ-ル試薬を反応させると、硫黄上での置換反応を経て配位子間でのカップリング反応が起こり配位子の種類によって、bipyridyl,arylpyridineが収率良く得られることを見いだした。つぎに、2ーarylsulfinylpyridineを用いてLDA(lithiumdiisopropylamide)で3位をリチオ化し、光学活性なpートリ-ルメンチルエステを反応させ,2,3ーbisarylsulfinylpyridineを2ケのdiastereomerとして得、2つを分離後、グリニヤ-ル試薬と反応させると3位のスルフィニル基が選択的に反応し光学的に純粋な2ーarylsulfinylpyridineが初めて収率良く得られた。次にarylmethyl pーtolyl sulfoxideとLDAとの反応によるαーsulfinylcarbanionを発生させアルデヒドとの反応の立体選択性を検討した結果、アリル基が2ーpyridyl、Nーmethylimidazolyl基を用いると高い立体選択性が得られ、立体選択性は温度にも依存することも判った。生成物の絶対配置はxー線回折により決定した。また、グリニヤ-ル試薬を用いた脱スルフイニル化反応によっても絶対配置を決定した。LAH(lithiumaluminumhydride)を用いた還元反応では硫黄上での還元反応と同時に脱スルフイニル化も容易に起こる事も見いだした。2.チアンスレン環の反応性の検討・・・ThianthrenemonooxideとLDAの反応でリチオ化した後、ジスルフィド等の親電子試薬と反応させると、thianthreneoxideの4,6ー位に置換基が容易に導入でき、しかも、nーBuLiとの反応では環縮小した1,9ージ置換dibenzothiopheneをかなりの収率で与える事を見いだした。置換基が硫黄、セレンの場合熱、光反応によりこのジベンゾチオフェンより各種の新しい複素環化合物が合成出来ることを見いだした。1.ピリジン環(py)の3-または4-位にPhSo基を導入し、グリニヤール試薬と反応させるとグリニヤール交換反応により3-及び4-ピリジルグリニヤール試薬が容易に発生し、各種のアルデヒド、ケトンとカルボニル基への付加反応を行うことを見いだした。また、この方法により光学活性の3-、4-PyS(0)Tol-pが合成できた。2-ピリジルの反応では配位子同士のカップリング反応により2-置換ピリジンが高収率で得られた。また、2-PyS(0)PhはLDAでリチオ化するとピリジン環の3-位が選択的にリチオ化され、親電子剤との反応により3-位が容易に置換され、後、グリニヤール試薬との反応により軸不斉を持つ2-フェニルピリジンが容易に得られた。この反応より光学活性な2,3-ビスジp-トリルピリジンとp-TolMgBrの反応で、位置選択的に3-位のp-TolSo基を除き、光学的に純粋な2-PyS(0)Tol-pを得ることに初めて成功した。
開口放出の直接観察によるβ細胞内情報伝達系の解明

本研究の目的は、各種ラジカルの膵β細胞におけるインスリン放出への関与を明らかにすることである。この目標のために、一酸化炭素、活性酸素ラジカル、ビタミンEのβ細胞の顆粒に対する効果を調べた。これらのラジカルはいずれもβ細胞の脱顆粒を引き起こすことがわかった。また、ランゲルハンス島を含む膵組織切片をMCLAを含む溶液中に置き、その発光をフォトンカウンティングカメラによって捉えた。グルコース刺激をすると、組織全体の発光量が増大し、その増加量はランゲルハンス島を中心とした領域で最も大きかった。これによって、グルコース濃度の上昇は膵組織全体の活性酸素ラジカルの発生に結びつくことが証明された。しかし、その発生はランゲルハンス島に限局せず外分泌組織の領域にも広がることも分かった。活性酸素ラジカルはβ細胞の脱顆粒を引き起こす力があるが、血中グルコースの作用はβ細胞のみに限局せず、外分泌組織中の血管内皮等に働いて、活性酸素ラジカルを発生させ、それによってインスリン放出が促進される経路が存在することが考えられた。αトコフェロールはβ細胞の脱顆粒を誘発した。この作用は溶液中に加えたウシ血清アルブミン(BSA)の種類によって大きく変化した。ラジカルが単に細胞破壊因子としてあるだけでなく、生理活性を持つ信号分子としての意義を持つ可能性があること、また、β細胞がラジカルに対する特異な感受性を持つこと、さらに、通常、ラジカル消去能をもつと考えられている化学物質がβ細胞に対してはラジカル種として作用することが明らかになった。本研究は、膵臓組織片内のランゲルハンス島を高倍率ビデオ顕微鏡によって直接観察し、分泌顆粒の開口頻度から分泌量の定量をして、細胞レベルでの分泌制御のメカニズムを明らかにしようとするものである。NOやO_2が生理的な分泌のための信号として作用することを証明しようとするものである。今年度は以下のことができた。(1)ラット膵臓組織を細片化し、細胞内の分泌顆粒の開口放出を画像変化として捉えられるときに、実際にインスリンが放出されていることを、そばにおいた抗体感作血球の溶血反応によって証明できた。(2)NOやO_2などのラジカルは酵素反応によって生成され、これらの酵素はCa^<2+>存在下にグルコースから作られるNADPHによって活性化されると考えられる。この証明の一つとして温度を25度に下げたところ、開口放出の遅延成分だけが選択的に抑制されることがわかった。(3)フォトカウンティングカメラを用いたルミノール化学発光法によって、グルコース刺激した時のβ細胞におけるNOの発生を画像的に検出する試みをおこなった。発光は島を中心とした領域から認められβ細胞からのものであることが示唆された。(4)波長340nmの光をβ細胞に照射して、光化学的にラジカルを生成させると、脱顆粒が起こることがわかった。以上の研究によって、1)グルコースによるラジカルの発生と、2)ラジカルによるインスリン放出の惹起、の2項目が証明できた。これは、β細胞がラジカルを作りやすく、そのラジカルを細胞内信号として使っている可能性を強く示唆するが、なお、非生理的なものである可能性ものこされている。来年度はその点を解析する。この目標のために、一酸化窒素、活性酸素ラジカル、ビタミンEのβ細胞の顆粒に対する効果を調べた。この過程で、強力なラジカル消去剤を作るのに成功した。また、グルコース刺激をしたときのラジカルの発生を2次元イメージとして捉える仕事を昨年に続けておこなった。ランゲルハンス島を含む膵組織切片をMCLAを含む溶液中に置き、その発光をフォトンカウンティングカメラによって捉えた。