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北欧における社会生活に活きる初等中等教育の様相と効果に関する研究

年度当初に予定していた,1フィンランドにおける理念的・政策的背景についてのインタビュー調査,2新教育課程基準のもとでの授業過程の観察,教科書の分析,3記述型課題の開発による集団調査の試行に加えて,特別支援学校における聞き取り調査や,高校生に対する試行的な面接調査も実施することができ,フィンランドの「社会生活に活きる教育」の様相と効果についての多面的な検討が進んでいるため。本研究では,北欧における「社会生活に活きる教育」の様相と効果を,(1)教育理念・政策,(2)授業過程等の様相,(3)各児童・生徒への効果の点から明らかにする。(1)教育理念・政策「汎用的コンピテンス」にもとづく教育の実施状況を明らかにするために,自治体連合の教育政策・教育財政担当者に面接調査を行った結果,各自治体が新たな教育課程基準の導入を模索する中で,教科統合的な学びがさらに拡大する実態が明らかになった。また,「汎用的コンピテンス」の測定方法の開発や教育の質保証の取組との関連性を検討するために,学校の評価方法や,学力調査に関する教育政策文書の分析と学校での聞き取り調査を行った結果、プロセスを重視した評価という従来の特徴が強化されるとともに、学力調査も教育課程基準の枠組みに合わせて転換が図られていることが明らかになった。(2)授業過程や教師の授業観フィンランドの小学校・中学校・高校,4校で新教育課程基準下の授業過程を観察し,教師への面接調査を実施した。その結果,小中学校では,1児童の自律性を重視した学習,2日常的テーマをもとに各教科の内容の統合をめざす学習など,より焦点化された取り組みが進められていること,高校では,1生徒の動機づけを高めるなどの目的で学習内容と日常的事象との関連づけが図られていること,2ICT機器の活用が進む一方で「教育学が工学に先行する」必要性も認識されていることなどが明らかになった。(3)児童・生徒に対する効果フィンランドの「教科統合型学習」を中心とした授業が各児童・生徒に及ぼす効果を検討するために,小学校3,5年生を対象に,社会性や対人関係に関連する内容(汎用的コンピテンス)や,数学的思考に関連する概念的理解(深い理解)を多面的に測定する集団調査を,前年度とは異なる地域に拡大し,「深い理解」を測る新規の記述型課題も開発して実施した。年度当初に予定していた,(1)フィンランドの自治体関係者へのインタビュー調査や,評価方法と教育の質保証の取り組みとの関連性の検討,(2)新教育課程基準のもとでの授業過程の観察と教師への面接調査,(3)記述型課題を用いた集団調査を実施する対象の地域的拡大と新規課題の開発・実施など,フィンランドの「社会生活に活きる教育」の理念・政策的背景,様相と効果についての多面的な検討が進んでいるため。本年度の研究の進展を生かして,1フィンランドの教育の理念的・政策的背景については,国際的議論や北欧レベルでの議論との関連や,他の北欧諸国の目標との比較でどのような特徴を持つのかなどについて発展的な検討を行う。次に,2授業過程の観察や教科書の分析については,当該授業を実施した教師への面接調査なども加えて詳細な検討を行う。さらに,3児童・生徒に対する記述型課題の実施による効果の検証については,実施地域・実施校を拡大するとともに,「汎用的コンピテンス」や「深い理解」に関する新たな課題を開発・実施して検討を行う。以上を通じて,北欧の初等中等教育における「社会生活に活きる教育」の様相と効果について,多面的かつ体系的に研究を推進する。本年度の研究の進展を生かして,(1)フィンランドの教育理念
地理学習を支援する自己説明による知的学習環境の構築

本年度我々は,自己説明を用いた学習支援環境の試作を行った.特に,我々はインタフェースの部分に着目し,自己説明の可視化の手法を提案し,システムを試作した.文字を用いて紙に作文を行うような感覚で自己説明を行うよりも,マウスやグラフィカルな画面を用いてインタフェースを工夫することにより,学習者の負担を減らす効果をあるのではないか,と考えた.我々の提案は,自己説明をグラフの描画のような方法で行う,と言ったものである.我々は,ワークステーション上に,Tcl/Tkを用いて自己説明支援システムの試作を行った.この試作したシステムを用いて,評価等を行った.さらに,我々はこの自己説明の可視化手法の有効性を確かめるために,認知実験を行った.実験は,本学の学生等の協力によって行った.実験は,我々の手法を用いて学習を行ったグループと,従来の手法で学習を行ったグループの間の比較を調べることを基本として行った.実験の結果,我々の提案した手法の有用性が確かめられた.本年度の研究成果を論文(電子情報通信学会論文誌(採録決定)),国際会議(IEEE SMC'96),研究会等(日本教育工学会全国大会,日本認知科学会大会等)で,速報性に配慮して広く公開した.また,他大学等の研究者らとの間で,議論を重ね,他研究者らとの交流の成果を研究への反映した.本年度我々は,自己説明を用いた学習支援環境の試作を行った.特に,我々はインタフェースの部分に着目し,自己説明の可視化の手法を提案し,システムを試作した.文字を用いて紙に作文を行うような感覚で自己説明を行うよりも,マウスやグラフィカルな画面を用いてインタフェースを工夫することにより,学習者の負担を減らす効果をあるのではないか,と考えた.我々の提案は,自己説明をグラフの描画のような方法で行う,と言ったものである.我々は,ワークステーション上に,Tcl/Tkを用いて自己説明支援システムの試作を行った.この試作したシステムを用いて,評価等を行った.さらに,我々はこの自己説明の可視化手法の有効性を確かめるために,認知実験を行った.実験は,本学の学生等の協力によって行った.実験は,我々の手法を用いて学習を行ったグループと,従来の手法で学習を行ったグループの間の比較を調べることを基本として行った.実験の結果,我々の提案した手法の有用性が確かめられた.本年度の研究成果を論文(電子情報通信学会論文誌(採録決定)),国際会議(IEEE SMC'96),研究会等(日本教育工学会全国大会,日本認知科学会大会等)で,速報性に配慮して広く公開した.また,他大学等の研究者らとの間で,議論を重ね,他研究者らとの交流の成果を研究への反映した.
相対論的効果を導入したスピン依存伝導の理論と第一原理計算手法の確立

本年度の研究では、密度汎関数法に基づく物質の電子状態の第一原理計算により、電子のスピン軌道相互作用に起因する物理特性・現象である結晶磁気異方性、および、スピンホール効果の物質依存性を明らかにした。具体的には、高磁気異方性が期待されるL10型構造のFePt, CoPt, FePd, MnAl規則合金、および、正方晶Fe-Co合金に着目し、その結晶磁気異方性エネルギーをスピン軌道相互作用に関する二次摂動のエネルギー変化を見積もることによって評価・分析を行った。その結果、FePtやCoPt合金ではPt原子の大きなスピン軌道相互作用によって結晶磁気異方性がもたらされているのに対し、FeCoやMnAl合金ではスピン軌道相互作用は小さいものの結晶磁気異方性の発現に有利なバンド構造を有していることが分かった。ただし、本来は不規則合金であるFe-Co合金では、電子の散乱に基づく寿命を無視できず、それが結晶磁気異方性に重大な影響を与えることが明らかになった。特に、FeCoやMnAl合金の結晶磁気異方性のメカニズムが解明されたことは、将来、希土類・貴金族などの希少元素を用いない新しい磁石材料を理論的に設計するための指針として重要な成果である。さらに、同じスピン軌道相互作用を起源とする非磁性金属のスピンホール効果にも着目し、Pd-Ag、Pd-Pt、Pt-Au合金のスピンホール伝導度、および、電流-スピン流変換効率の指標となるスピンホール角の定量評価を行った。その結果、高濃度合金では内因性機構に基づくスピンホール効果によって高いスピンホール角が期待され、高効率な電流-スピン流変換が期待できることを示した。本研究によって得られた成果は優れた特性を有する磁石材料や電流-スピン流変換材料の開発に大きく貢献するものである。昨年度までに構築した結晶磁気異方性や電気伝導度テンソルの第一原理計算の手法の枠組みを応用し、本年度では遷移金属合金の結晶磁気異方性エネルギーやスピンホール伝導度の計算を実行した。その結果から、実際に高特性を有する材料を開発するための指針を提案し、当初の研究目標を達成することができたと言える。さらに、最近1・2年の間に急激に重要性を増している希少元素フリーの磁気異方性材料の開発に関する研究にも取り組み一定の成果を上げることができた。したがって、本年度は当初の計画以上に研究が進展したと判断できる。本年度は研究実施計画に沿い、スピン軌道相互作用による相対論的な補正を考慮した第一原理電子状態計算のプログラムを開発した。バンド計算手法はタイトバインディング線形マフィンティン軌道法を採用し、さらに不規則合金系の計算を可能とするためにコヒーレントポテンシャル近似を用いる方法が組み合わされている。この手法を応用し、久保・グリーンウッドの公式を用いてFe-Ni合金の異方性磁気抵抗効果に基づく磁気抵抗比の第一原理的な定量評価を行った。なお、異方性磁気抵抗効果とは強磁性体の磁化の向きに対して、電気伝導度テンソルの対角成分が変化する現象のことを言う。これは相対論的効果が電気伝導に与える影響の一つであり、産業的にもセンサー等への応用が期待されている重要な物理現象である。Fe-Ni合金の異方性磁気抵抗効果の磁気抵抗比の定量的な評価を行った結果、抵抗比のNi濃度依存性は既存の実験結果とその大きさ、および、傾向について概ね一致する計算結果が得られた。さらに磁気抵抗比以外にも元の電気抵抗率に対するスピン軌道相互作用の補正はその定量性を問う上で無視できないことが分かった。これらの結果は強磁性体のスピン伝導について、スピン軌道相互作用の重要性を示すと同時に、信頼性の高い定量評価手法を開発することができたことを示唆している。これは新規材料の物理特性の予測等への応用が期待される。また本研究では、スピントロニクスの応用上非常に重要である高スピン分極材料について、ハーフメタル性が期待されるCo_2MnSiの伝導特性の定量評価を行い、理論的な立場から実用材料の基礎的性質についての提言を行った。本年度の研究では、電子の運動に対する相対論的な補正であるスピン軌道相互作用を導入した物質の電子状態計算の手法を用い、不規則合金の結晶磁気異方性の定量評価を行った。具体的には、高磁気異方性材料として期待されるL1_0型FePt合金と呼ばれる物質に着目し、その一軸異方性定数の規則度依存性を第一原理計算によって見積もった。ここで、一軸異方性定数とは、強磁性体の磁化を容易軸方向と困難軸方向に向けた場合における単位体積当たりのエネルギー差で定義される。これまでもL1_0型FePt合金の規則構造に関しては第一原理計算によって現実物質の一軸異方性定数の定量評価が行われた報告例は数多くある。しかし、実験によって得られる測定値との不一致が問題となっており、その原因の一つとして、実際に作製される試料には結晶の乱れの影響が挙げられる。したがって、結晶の不規則性の影響を考慮した磁気異方性の再検討を行うことが重要であると考えられる。そこで、L1_0型FePt合金の一軸異方性定数の規則度依存性の評価を行ったところ、一軸異方性定数は規則度の変化に対して単調に振る舞うことが分かった。さらには、一軸異方性定数は規則度のべき乗でフィッティングすることが可能であり、およそ、規則度の2乗に比例していることが明らかとなった。またその他にも、本年度の研究では、線形応答理論に基づく久保ストレダ公式を用いてFe-Ni合金の伝導度テンソルの第一原理的な評価等を行い、実験事実を再現できる結果が得られた。

本年度の研究では、密度汎関数法に基づく物質の電子状態の第一原理計算により、電子のスピン軌道相互作用に起因する物理特性・現象である結晶磁気異方性、および、スピンホール効果の物質依存性を明らかにした。具体的には、高磁気異方性が期待されるL10型構造のFePt, CoPt, FePd, MnAl規則合金、および、正方晶Fe-Co合金に着目し、その結晶磁気異方性エネルギーをスピン軌道相互作用に関する二次摂動のエネルギー変化を見積もることによって評価・分析を行った。その結果、FePtやCoPt合金ではPt原子の大きなスピン軌道相互作用によって結晶磁気異方性がもたらされているのに対し、FeCoやMnAl合金ではスピン軌道相互作用は小さいものの結晶磁気異方性の発現に有利なバンド構造を有していることが分かった。ただし、本来は不規則合金であるFe-Co合金では、電子の散乱に基づく寿命を無視できず、それが結晶磁気異方性に重大な影響を与えることが明らかになった。特に、FeCoやMnAl合金の結晶磁気異方性のメカニズムが解明されたことは、将来、希土類・貴金族などの希少元素を用いない新しい磁石材料を理論的に設計するための指針として重要な成果である。さらに、同じスピン軌道相互作用を起源とする非磁性金属のスピンホール効果にも着目し、Pd-Ag、Pd-Pt、Pt-Au合金のスピンホール伝導度、および、電流-スピン流変換効率の指標となるスピンホール角の定量評価を行った。その結果、高濃度合金では内因性機構に基づくスピンホール効果によって高いスピンホール角が期待され、高効率な電流-スピン流変換が期待できることを示した。本研究によって得られた成果は優れた特性を有する磁石材料や電流-スピン流変換材料の開発に大きく貢献するものである。平成23年3月11日に発生した東日本大震災により、研究施設、および、設備が甚大な被害を受けた。約3ヵ月に渡り研究活動の休止を余儀なくされ、当初の研究計画を見直さざるを得ない状況となった。したがって、本年度は当初の研究計画を多少変更し、スピン軌道相互作用を導入した電子状態計算の方法を用いてFePt、CoPt、FePdなどの遷移金属合金の結晶磁気異方性の定量評価を中心に行った。しかし、当初の研究目的である電気伝導度テンソルの評価についても、その方法論を確立することができたため、本研究はおおむね順調に進展していると判断される。昨年度までに構築した結晶磁気異方性や電気伝導度テンソルの第一原理計算の手法の枠組みを応用し、本年度では遷移金属合金の結晶磁気異方性エネルギーやスピンホール伝導度の計算を実行した。その結果から、実際に高特性を有する材料を開発するための指針を提案し、当初の研究目標を達成することができたと言える。さらに、最近1・2年の間に急激に重要性を増している希少元素フリーの磁気異方性材料の開発に関する研究にも取り組み一定の成果を上げることができた。したがって、本年度は当初の計画以上に研究が進展したと判断できる。震災の影響による計算機環境の復旧の遅れにより、平成23年度に予定していた「計算プログラムの並列化」に関してはその目的を達成することができなかった。計算プログラムの並列化が達成されれば、これまでよりも高効率な計算を実行することが可能であるため引き続き取り組む予定としている。
麻疹ウイルスと自然免疫の相互作用に関する研究

1.麻疹ウイルスの病原性におけるインターフェロン(IFN)の役割を調べるために、麻疹ウイルス株間(IC-B野外株、Edmonston(Ed)ATCC株、Ed tag株)でIFN-αに対する抵抗性に差があるか検討した。IC-B株はIFN-αの存在の有無にかかわらずほぼ同等の増殖を示したのに対し、Ed ATCC株の増殖はIFN-α存在下で軽度低下し、Ed tag株の増殖は1万分の1以下に低下した。2.パラミクソウイルス科のウイルスは、P遺伝子領域にコードされているV蛋白やC蛋白によりIFNに抵抗する。麻疹ウイルスのV蛋白にも同様の活性があることが報告されている。IFN抵抗性を検討したところ、IC-B株、Ed ATCC株のV蛋白はIFN-αのシグナル伝達を阻害したが、Ed tag株のV蛋白は阻害しなかった。Ed ATCC株とEd tag株のV蛋白には3アミノ酸の違いがあるが、このうち110番目、272番目のアミノ酸が同時に置換することが抗IFN活性を失うのに必要であった。3.パラミクソウイルス科の多くのウイルスのV蛋白では、V蛋白に特異的なC末端領域が抗IFN活性に重要である。V蛋白のキメラ分子、truncated分子、部位特異的変異導入分子を作製し、それらの抗IFN活性を調べることにより、麻疹ウイルスではV蛋白のN末端領域(P蛋白とV蛋白の共通領域)だけでも抗IFN活性を示すことが分かった。また、P蛋白も抗IFN活性を示した。これらの結果はニパウイルスと類似している。4.単独では抗IFN活性を示さないEd tag株のN末端領域に、Ed ATCC株のC末端領域を結合させたキメラ分子が抗IFN活性を示したことから、麻疹ウイルスV蛋白のC末端領域も抗IFN活性に寄与していると考えられた。2.パラミクソウイルス科の多くのウイルスは、V蛋白やC蛋白によりIFNに抵抗する能力を持つ。IFNで誘導されるレポーター遺伝子の発現を指標にIFN抵抗性を検討したところ、IC-B株、Ed ATCC株のV蛋白はINF-αのシグナル伝達を阻害したが、Ed tag株のV蛋白は阻害しなかった。Ed ATCC株とEd tag株のV蛋白には3アミノ酸の違いがあるが、このうちの2個の置換が抗IFN活性を失うのに必要であった。3.パラミクソウイルス科の多くのウイルスのV蛋白では、C末端領域が抗IFN活性に重要であることが示されている。V蛋白のキメラ分子、truncated分子、部位特異的変異導入分子を作製し、それらの抗IFN活性を調べることにより、麻疹ウイルスではV蛋白のN末端領域とC末端領域の両方が抗IFN活性にとって重要であることが示された。4.それぞれの麻疹ウイルス株のC蛋白も軽度の抗IFN活性を示した。しかし、Ed ATCC株とEd tag株のC蛋白の配列は同一であり、両者のインターフェロン感受性の違いを説明できなかった。1.麻疹ウイルスの病原性におけるインターフェロン(IFN)の役割を調べるために、麻疹ウイルス株間(IC-B野外株、Edmonston(Ed) ATCC株、Ed tag株)でIFN-αに対する抵抗性に差があるか検討した。

麻疹ウイルスのV蛋白にも同様の活性があることが報告されている。IFN抵抗性を検討したところ、IC-B株、Ed ATCC株のV蛋白はIFN-αのシグナル伝達を阻害したが、Ed tag株のV蛋白は阻害しなかった。Ed ATCC株とEd tag株のV蛋白には3アミノ酸の違いがあるが、このうち1110番目、272番目のアミノ酸が同時に置換することが抗IFN活性を失うのに必要であった。3.パラミクソウイルス科の多くのウイルスのV蛋白では、V蛋白に特異的なC末端領域が抗IFN活性に重要である。V蛋白のキメラ分子、truncated分子、部位特異的変異導入分子を作製し、それらの抗IFN活性を調べることにより、麻疹ウイルスではV蛋白のN末端領域(P蛋白とV蛋白の共通領域)だけでも抗IFN活性を示すことが分かった。また、P蛋白も抗IFN活性を示した。これらの結果はニパウイルスと類似している。4.単独では抗IFN活性を示さないEd tag株のN末端領域に、Ed ATCC株のC末端領域を結合させたキメラ分子が抗IFN活性を示したことから、麻疹ウイルスV蛋白のC末端領域も抗IFN活性に寄与していると考えられた。
シナプス可塑性の誘導における内因性カンナビノイドの役割

<目的>内因性カンナビノイドは、脳の様々な領域において逆行性シグナルとして働いている。シナプス後ニューロンから放出され、それがシナプス前終末に存在するカンナビノイド受容体を活性化し、神経伝達物質の放出を抑制する。また、シナプス可塑性の誘導にも関与していることが報告されている。本研究では、培養海馬ニューロンを用い、内因性カンナビノイドの放出メカニズムについて詳しく検討した。<方法>ラットおよびマウスの海馬ニューロンを単離培養し、ニューロン・ペアよりIPSCを記録し、IPSCの振幅の変化を指標にしてシナプス後ニューロンからの内因性カンナビノイドの放出量を測定した。また、phospholipase C(PLC)産物であるジアシルグリセロールにより活性化されるTRPC6チャネルを強制発現させ、生きた細胞1個のPLC活性をリアルタイムでモニターした。<結果および考察>(1)Gq共役型受容体(group I代謝型グルタミン酸受容体など)の活性化と脱分極が同時に起こると内因性カンナビノイドが多量に放出された。(2)受容体活性化による内因性カンナビノイドの放出はPLCβ1欠損マウスでは消失していた。(3)受容体活性化により引き起こされる内因性カンナビノイドの放出は、細胞内Ca^<2+>濃度に強く依存していた。(4)TRPC6電流を指標としてPLCβ1活性を調べたところ、受容体を介するPLCβ1の活性化が細胞内Ca^<2+>濃度に強く依存し、また、脱分極によるCa^<2+>濃度上昇により著しく増強されることが示された。以上より、内因性カンナビノイドの合成・放出の律速酵素と考えられるPLCβ1が、生理的範囲において強いCa^<2+>依存性を示すため、細胞内Ca^<2+>濃度上昇と受容体活性化が同時に起こると強く活性化され、多量のカンナビノイドが放出されると考えられた。内因性カンナビノイドはシナプス後ニューロンから前ニューロンへの逆行性シグナルとして機能することが最近明らかとなった。海馬では、シナプス後ニューロンの脱分極やグループI代謝型グルタミン酸受容体(I-mGluR)およびM1/M3ムスカリン受容体の活性化により内因性カンナビノイドが放出され、それがシナプス前終末のカンナビノイド受容体タイプ1(CB1)に結合し伝達物質の放出が抑制される。これらの現象は一過性であると考えられている。しかし、ごく最近になり、内因性カンナビノイドがシナプス可塑性を誘導する可能性が示唆された。本研究では、培養海馬ニューロンを用い、シナプス可塑性の誘導における内因性カンナビノイドの役割について検討した。シナプス後ニューロンより内因性カンナビノイドを放出させ、それによりシナプス可塑性が誘導されるかどうか調べた。I-mGluRおよびムスカリン受容体のアゴニストを投与すると、内因性カンナビノイドが放出され、シナプス伝達は抑制された。アゴニストを除去すると、シナプス伝達は部分的に回復するが、元のレベルにまでは戻らなかった。しかし、カンナビノイド受容体アンタゴニストを投与するとシナプス伝達は完全に回復した。したがって、I-mGluRなどの受容体活性化により生ずる長期抑圧様現象は内因性カンナビノイドの持続的放出によるものであり、シナプス伝達が可塑的に変化したことによるものではないと考えられた。
副甲状腺ホルモンの骨形成促進作用とエストロゲンによるその増幅機序に関する研究

我々は骨芽細胞において、TGFβ特異的SmadであるSmad3が骨形成に重要な分子であることを解明した。そこで、骨芽細胞における副甲状腺ホルモン(PTH)のSmad3に及ぼす影響とその生理的意義、特に骨形成促準機序における関与の有無を検討した。PTHはSmad3 mRNA発現と蛋白産生を濃度と時間依存性に促進した。PTH前処置やSmad3過剰発現はdexamethasoneやetoposideにより誘導されるapoptosisを抑制し、dominant negative型Smd3deltaCはPTHの抗apoptosis作用を阻害した。以上よりSmad3はPTHの抗apoptosis作用に関与すると考えられた。さらにSmad3反応領域を含むluciferase assayにて、PTHはTGFβによる転写活性促進を有意に増強し、そしてTGFβ誘導性のコラーゲン合成を有意に促進した。以上よりPTHはSmad3の転写活性促進を介してTGFβの骨形成促進作用を増強することが示された。本研究で見出した.PTH-Smad3 axisは骨形成シグナルとなる可能性があり、PTHの骨形成促進機序に関与すると考えられる。またPTH及びSmad3過剰発現は骨芽細胞のβ-catenin発現を促進する結果を得、PTHの骨形成促進機序にWnt-β-cateninシグナルの増強が関与する可能性を提起した。一方、骨芽細胞におけるPTHとエストロゲンの相互作用に関しては、エストロゲンはPTHの増殖抑制作用を直害し、またPTHはエストロゲン存在下で骨芽細胞機能を促進する結果を得た。そしてこの機序にエストロゲンにより骨芽細胞から産生が促進されるIGF-IとIGF結合蛋白-5が関与することを見出した。TGFβは骨組織に豊富に含まれ、in vivoで骨形成を促進する。我々はTGFβ受容体特異的SmadであるSmad3の恒常的過剰発現が骨芽細胞のコラーゲン合成、ALP活性そして石灰化を促進することを示し、骨芽細胞においてSmad3が骨形成に重要な分子であることを解明した。本研究では骨芽細胞における副甲状腺ホルモン(PTH)のSmad3に及ぼす影響とその生理的意義、特に骨形成促進機序としての関与の有無を検討した。PTHは骨芽細胞株において、Smad3 mRNAと蛋白産生を濃度と時間依存性に促進した。PTH前処置やSmad3過剰発現はdexamethasoneやetoposideにより誘導される骨芽細胞の死細胞数を減少させ、dominant negative型Smad3DCはPTHの抗apoptosis作用を阻害した。さらにSmad3反応領域を含むluciferase assayにてPTHはTGFβによる転写活性促進を有意に増強し、そしてTGFβ誘導性のコラーゲン合成を有意に促進した。なおPTHはTGFβの増殖抑制作用を増強することはなかった。以上より、PTHはSmad3の転写活性促進を介してTGFβの骨形成促進作用のみを増強することが示唆された。本研究で我々が見い出したPTH-Smad3 axisは骨芽細胞において抗apoptosis作用及びTGFβ誘導性骨形成促進作用の増強という骨形成シグナルとなる可能性があり、PTHの骨形成促進機序に関与すると考えられる。昨年度の研究において、副甲状腺ホルモン(PTH)はTGFβ特異的SmadであるSmad3発現を促進し、このSmad3がPTHの抗apoptosis作用に関わっていることを示した。本年度の研究では、PTHはSmad3発現促進のみならずTGFβ誘導性のSmad3転写活性を増強する作用を有することをSmad3反応領域を含むluciferase assayにより示し、そしてこれによりTGFβ誘導性のコラーゲン合成を促進することを見出した。

即ち、PTH-Smad3 axisは骨芽細胞において抗apoptosis作用とTGFβ誘導性骨形成促進作用の増強という骨形成シグナルとなり、PTHの骨形成促進機序に関与することを証明した。またPTH及びSmad3過剰発現は骨芽細胞のβ-catenin発現を促進する結果を得、PTHの骨形成促進機序にWnt-β-cateninシグナルの増強が関与する可能性を提起した。一方、骨芽細胞におけるPTHとエストロゲンの相互作用に関しては、エストロゲンはPTHの増殖抑制作用を阻害し、またPTHはエストロゲン存在下で骨芽細胞機能を促進することを示した。そしてこの機序にエストロゲンにより骨芽細胞から産生が促進されるIGF-IとIGF結合蛋白-5が関与することを見出した。以前我々はエストロゲンがPTHの破骨細胞分化促進作用を阻害することを示したが、本年度の研究より骨形成系においてもPTHとエストロゲンは相互作用を有し、これによりエストロゲンはPTHの骨形成促進作用を増強する作用を有することを見出した。本研究により、PTHの骨形成促進機序とエストロゲンによるその増幅機序の一端が解明された。
禅宗修行僧における血清脂質と食餌因子の関係についての研究

我国においても食生活の欧米化に伴い、狭心症、心筋梗塞等の虚血性心疾患の発生頻度が年々上昇している、我々の研究成果を基に上記症の根底をなす動脈硬化発症につき、ことに血清コレステロール代謝に注目し、まず食餌因子の血清コレステロールに与える影響について検討を試みることにした。従来より食餌性の諸因子が血清コレステロール、ことにLDLコレステロールに影響を与えることが知られている。我々は動物性食物の摂取がほとんど無い禅宗修行僧に注目し、彼等の血清脂質と食餌成分とを比較検討し、合わせて外国人および日本人修行僧の比較を試みた。<結果>京都市内の禅寺修行僧を対象に検討とたところ(平均年令29.7才)血清総コレステロール値135,1mg/dlでLDL値は73mg/dlであった。一方コントロールの成人男子は血清コレステロール値が188.9mg/dlでLDLが108.6mg/dlであり、明らかに修行僧の血清コレステロール値ことにLDLコレステロール値は低値を示した。次に外国人、日本人の同居する禅寺において検討したところ、外国人の総コレステロール値は149mg/dl、LDL値は77mg/dl、日本人のそれは150mg/dl、82mg/dlであった。一方コントロールのそれは187mg/dl、112mg/dlであり、人種差が影響していないことが判明した。また禅寺に入山前後で食餌成分の影響を検討したところ、入山前総コレステロール、LDL値は166mg/dl、92mg/dlで6ケ月後に136、77mg/dlに低下している事が判明した。食餌分析の結果、総摂取カロリーには変化が少ないが、禅僧はコレステロールの摂取がほとんど無くしかも動物性食物の摂取が無いためと思われるが、不飽和脂肪酸の摂取が多く、それに比して飽和脂肪酸の摂取が少ない事が明らかとなった。現在動物を用いて飽和脂肪酸を多く含んだ食事、逆に不飽和脂肪酸を多く含んだ食事により、血清コレステロール値の変動を検討する予備実験を進めている。近年食生活の欧米化に伴い,狭心症,心筋梗塞等の虚血性心疾患が増加している.我々の研究成果を基に上記症の根底をなす動脈硬化発症につき,ことに血清コレステロール代謝に注目し,まず食餌因子の血清コレステロールに与える影響について検討を試みることにした.従来より食餌性の諸因子が血清コレステロール,ことにLDLコレステロールに影響を与えることが知られている.そこで本年度は動物性食物を摂取しない禅宗修行僧に注目し,彼等の血清脂質と食餌成分とを比較検討した.〈結果〉まず京都市内にある禅寺修行僧18名を対象に調査を行なったところ,血清コレステロール値は135.1mg/dlでLDLコレステロールは73.0mg/dlであった.一方,対照は血清コレステロールが188.9mg/dlでLDLコレステロールが108.6mg/dlであり,明らかに修行僧の血清コレステロール値,ことにLDLコレステロール値は低値を示した.それぞれの食餌を分析したところ,摂取カロリーにはさして変化は認められなかったが,脂肪酸摂取において修行僧はP/S比の高い脂肪酸すなわち不飽和脂肪酸を多く摂取していること,また修行僧に動物性蛋白,脂肪の摂取はなく,従ってコレステロールの摂取量もほぼ0であった.次に外国人と日本人との間に人種差が存在しているかどうかにつき,小浜市内の禅寺で修行している僧について検討したところ,外国人,日本人僧ともに145mg/dl前後の血清コレステロール値であり,対照が190mg/dlであったことから明らかに低値であることがわかり,人種差は存在しないことがわかった.

京都の僧との違いは年令によるものであった.彼等の内分泌,肝,腎機能には障害がなく食餌によると思われた.我々は予備研究として現在永平寺に入山前後での修行僧の血清総コレステロール値, LDLコレステロール値の変動と食餌の関係について検討中である. 63年度はこの方面について研究予定である.我国においても食生活の欧米化に伴い、狭心症、心筋梗塞等の虚血性心疾患の発生頻度が年々上昇している。我々の研究成果を基に上記症の根底をなす動脈硬化発症につき、ことに血清コレステロール代謝に注目し、まず食餌因子の血清コレステロールに与える影響について検討を試みることにした。従来より食餌性の諸因子が血清コレステロール、ことにLDLコレステロールに影響を与えることが知られている。我々は動物性食物の摂取がほとんどない禅宗修行僧に注目し、彼等の血清脂質と食餌成分とを比較検討し、合わせて外国人および日本人修行僧の比較を試みた。〈結果〉京都市内の禅寺修行僧を対象に検討したところ(平均年齢29.7才)血清総コレステロール値135.1mg/dlでLDL値は73mg/dlであった。一方コントロールの成人男子は血清コレステロール値が188.9mg/dlでLDLが108.6mg/dlであり、明らかに修行僧の血清コレステロール値ことにLDLコレステロール値は低値を示した。次に外国人、日本人の同居する禅寺において検討したところ、外国人の総コレステロール値は149mg/dl、LDL値は77mg/dl、日本人のそれは150mg/dl、82mg/dlであった。一方コントロールのそれは187mg/dl、112mg/dlであり、人種差が影響していないことが判明した。また禅寺に入山前後で食餌成分の影響を検討したところ、入山前総コレステロール、LDL値は166mg/dl、92mg/dlで6ヶ月後に136、77mg/dlに低下している事実が判明した。食餌分析の結果、総摂取カロリーには変化が少ないが禅僧はコレステロールの摂取がほとんどなくしかも動物性食物の摂取がないためと思われるが、不飽和脂肪酸の摂取が多く、それに比して飽和脂肪酸の摂取が少ない事が明らかとなった。現在動物を用いて飽和脂肪酸を多く含んだ食事、逆に不飽和脂肪酸を多く含んだ食事により、血清コレステロール値の変動を検討する予備実験を進めている。
IL-33依存性気道炎症おける血小板関与の解析

アレルギー疾患の病態形成に血小板が関連することが知られているが、そのメカニズムについては、不明である。本研究では、血小板中に全長のIL-33が発現することを見出した。さらに、血小板由来IL-33は、マウス喘息モデルを用いての検討により、生物学的活性を有しており、Type2炎症に深く関わり、アレルギー性気道炎症の病態形成に関与することを明らかとした。喘息発作時に血小板の活性化や凝固系の亢進を認めること、抗血小板薬が喘息症状を改善することより、喘息発作の増悪に血小板の活性化が関与することが示唆されている。しかし、その機序については、不明な点が多い。今回、血小板中アレルギー疾患で重要なサイトカインIL-33蛋白発現を認める予備データを得た。IL-33蛋白の局在は、核内に発現するが、今回無核の細胞である血小板におけるIL-33蛋白発現を認めることより、アレルギー疾患発症に血小板関与の可能性を示唆してる。具体的には計画書の通り、1血小板におけるIL-33発現機構の解明、2血小板におけるIL-33蛋白分泌機構の解明を中心に検討を行った。1については、ヒト巨核球細胞株MEG-01、マウス骨髄巨核球を用いて発現について検討を行った。また、生体内環境に応じて発現量変化の有無を各種サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-9,IFN-γ)を添加細胞培養しIL-33発現量をフローサイトメトリーで評価した。MEG-01を用いて、IL-33発現をウエスタンブロットで検討を行った結果、核分画には発現を認めず、細胞質分画に全長IL-33発現を認めた。マウス骨髄巨核球の免疫染色でも、細胞質に一致してIL-33の発現を確認した。サイトカイン添加MEG-01での検討では、用いたサイトカイン刺激では、IL-33発現量に有意な差を認めなかった。2については、MEG-01及びヒト血小板分離後、トロンビンを添加し、血小板を活性化し上清中のIL-33の測定を行った。両細胞共に上清中にIL-33を認めた。当初の実験計画通り、実験を実施し、マウス及びヒト血小板中に全長のIL-33を認めたこと、血小板の活性化に伴い分泌されることが確認された。また、巨核球では、細胞質にIL-33を認めた。血小板は、巨核球細胞質のfragmentationにより産生されることより上記の結果は、矛盾しない。アレルギー疾患で血小板の活性化や凝固系の亢進を認めること、マウスモデルを用いての検討により、血小板を減少させると喘息様の気道炎症が軽症化することが知られている。アトピー性皮膚炎や喘息発作の増悪に血小板の活性化が関与することが示唆される。初年度、申請者は、血小板に全長のIL-33蛋白が恒常的に発現していること、IL-33依存性プロテアーゼ誘導気道炎症において血小板減少を惹起するとアレルギー性炎症の指標となる好酸球浸潤が軽減することを発見、報告した。次年度、研究実施計画に基づき、1血小板由来IL-33の標的細胞の同定、2血小板を標的とした新規アレルギー薬の開発について検討を行った。マウスモデルを用いて、フローサイトメトリーで、血小板と標的細胞(T cell ,B cell,好酸球,好塩基球など標的細胞と考えられ細胞)の複合体を検出を行た。しかし、学科内教員で産前産後休暇、育児休暇教員が発生し、代用授業の増加のため当初計画実施が困難となった。本年度より、教員補充が行われ、今後実施できる体制は整い、本年度実施予定である。学科内教員で産前産後休暇、育児休暇教員が発生し、代用授業の増加のため当初計画実施が困難となった。本年度より、教員補充が行われ、今後実施できる体制は整った。昨年度までの研究により、血小板がIL-33を有することが明らかとなったことから、In vivoでの以下の検討を行った。1血小板減少IL-33依存性気道炎症マウスモデルを用いて血小板由来IL-33の関与についての検討:セリンプロテアーゼであるパパインを野生型マウスに経鼻投与すると好酸球を主体としたType2炎症が惹起されるが、IL-33欠損マウスでは、炎症が軽度であることから本モデルを用いて血小板由来IL-33の関与について検討を行った。抗血小板抗体を用いて血小板減少モデルを作成後、パパインにて気道炎症を惹起すると好酸球の浸潤が有意に低下した。また、Type2炎症に関わる肺組織におけるIL-4、IL-5、IL-13mRNA発現の有意な低下が認められた。また、組織においては、気道上皮杯細胞低下を認める。野生型マウスを用いてパパインと野生型マウス血小板を経鼻投与するとIL-33欠損マウス血小板投与に比して有意に好酸球の浸潤が増加した。2血小板由来IL-33の標的細胞の同定:血小板は、白血球と複合体を形成し、様々な炎症に関与することが知られている。そこで、血小板由来IL-33の標的細胞の同定を行うため、プロテアーゼ惹起気道炎症マウスモデルを用いて、肺胞洗浄液や肺組織内の血小板ー白血球複合体検出を行った。T細胞やB細胞に比して有意にlineage陰性分画

単核球分画に血小板ー白血球複合体を認めた。以上のことより、血小板由来IL-33が肺でのType2炎症へ関与することが明らかとなった。アレルギー疾患の病態形成に血小板が関連することが知られているが、そのメカニズムについては、不明である。本研究では、血小板中に全長のIL-33が発現することを見出した。さらに、血小板由来IL-33は、マウス喘息モデルを用いての検討により、生物学的活性を有しており、Type2炎症に深く関わり、アレルギー性気道炎症の病態形成に関与することを明らかとした。当初の計画書通り、本年度は、1血小板由来IL-33標的細胞の同定2血小板を標的細胞とした新規アレルギー治療の開発を実施する。プロテアーゼ惹起IL-33依存性好酸球モデルを用いて、血小板の有無によりエフェクター細胞の同定および抗血小板薬を投与し、炎症の程度を評価する。具体的には、血小板の有無により肺でのILC2、好塩基球数をフローサイトメトリーで評価、また、mRNAの発現量により標的細胞を同定する。また、抗血小板をマウスに投与し、同モデルでの好酸球浸潤の程度を評価し新規治療法を開発を目指す。今後、以下の2点について検討を行う。1血小板由来IL-33の標的細胞の同定、マウスモデルを用いて、フローサイトメトリーで、血小板と標的細胞の複合体を検出を行う。また、各細胞を単離し、血小板と共培養を行い、血小板由来IL-33の標的細胞の同定を行う。2血小板を標的とした新規アレルギー薬の開発について検討を行う。気道炎症モデルマウスに抗血小板薬を投与し、気道炎症の程度を細胞数、組織、mRNAなどで評価し、臨床応用を目指した薬剤のスクリーニングの検討を実施する。免疫本年度予定の実験は順調であったこと、次年度の計画の血小板由来IL-33標的細胞の同定血小板由来IL-33標的細胞の同定を実施するが、想定されている標的細胞の種類が多く、同定用抗体額が当初予定よりも約1000千円程度多くかかる見込みであるため、前年度実施の培養実験でスケール少量にしたことで、使用試薬量が予定使用量より少量で実施できた。学科内教員で産前産後休暇、育児休暇教員が発生し、代用授業の増加のため当初計画実施が困難となった。本年度より、教員補充が行われ、今後実施できる体制は整っため、延長申請を行い、本年も研究計画に基づき検討を行う。当初の計画書通り、次年度は、血小板由来IL-33標的細胞のフローサイトメーターを用いて同定を行う。また、標的細胞をセルソーターで分離し、血小板との共培養をおこなう。1血小板由来IL-33の標的細胞の同定。マウスモデルを用いて、フローサイトメトリーで、血小板と標的細胞の複合体を検出を行う。標的候補細胞が多種のため、標識抗体の購入を行う。薬剤購入、mRNA定量用のプラーブなど炎症評価用試薬の購入する。
フッ素化反応による炭素材料の表面構造制御と電極特性

1)表面フッ素化による石油コークスの表面構造変化石油コークスおよび1860°C、2100°C、2300°C、2600°C、2800°Cにおける熱処理で黒鉛化した石油コークスの表面構造をフッ素ガスおよびCF4ガスを用いるプラズマフッ素化で変化させ、その表面構造変化とリチウム二次電池負極特性を調べた。表面フッ素化を行った石油コークス試料のフッ素含有量は1at%以下で、プラズマフッ素化の場合よりフッ素ガスによる表面フッ素化の場合が表面フッ素量は多い。XPSによる表面分析ではすべての試料でフッ素が検出され、フッ素化温度が上がるにつれて、またプラズマフッ素化の場合はフッ素化時間が長くなるにつれて表面フッ素濃度は高くなった。表面フッ素化によって比表面積は減少し、またラマンスペクトルより表面付近の構造の乱れが大きくなることがわかった。透過型電子顕微鏡による観察より、石油コークスのエッジ面は黒鉛化過程で閉じた構造に変化することおよび表面フッ素化でこの閉じた構造が破壊されることがわかった。(2)表面フッ素化石油コークスの有機溶媒中にける電極挙動1MLiClO_4エチレンカーボネート(EC)/ジエチルカーボネート(DEC)中における石油コークス試料のサイクリックボルタンメトリーでは未処理石油コークスと1860°C、2100°C熱処理石油コークスでは変化が見られなかったが、2300°C、2600°C、2800°Cで黒鉛化した試料ではリチウム機運0.6Vに現れるECの還元分解のピークが小さくなり、フッ素化の効果が観察された。60mA/g、150mA/gにおける定電流放電では、2300°C、2600°C、2800°C熱処理試料で初期クーロン効率が大幅に上昇し、フッ素化の効果が現れた。これは高温熱処理によって生じた石油コークスのエッジ面の閉塞構造がフッ素化によって開かれ、表面被膜の生成とリチウムイオンの挿入が容易になったためと考えられる。石油コークスおよびこの石油コークスを1860°C、2300°C、2800°Cで熱処理して黒鉛化したものを150°C、200°C、300°Cで3x10^4Paのフッ素ガスを用いて2分間した。フッ素化石油コークスのフッ素含有量は未処理物を除いて0.30.6at%と小さく、また、XPSで求めた表面フッ素は高温で黒鉛化したものほどフッ素濃度が小さい。Fls電子の結合エネルギーは689-687eVで、C-F結合は共有結合に近い。また、フッ素化により表面酸素が減少した。BET表面積は未処理石油コークスを除いて、フッ素化によりほとんど変らないかまたは幾分増加した。黒鉛化した石油コークスでは表面積増加の傾向がみられた。全細孔容積も同様の傾向を示した。LiClO_4を電解質とするエチレンカーボネート/ジエチルカーボネート中における電位走査法による実験では1860°C熱処理物が最も溶媒の還元分解が少なく、熱処理温度が高くなるにつれて溶媒分解の電流が大きくなった。これは熱処理による石油コークスの黒鉛化過程で表面酸素が除去され、同時に炭素-炭素結合の生成による端面(エッジ面)の閉塞が起こるためと考えられる。すなわち、1860°C熱処理物のように表面が幾分乱れた構造を持っ炭素材料の方が、溶媒和したリチウムイオンが端面に収容されやすく、溶媒の還元による表面被膜の生成が容易であると考えることができる。これは定電流充

放電による結果ともよく一致した。初期クーロン効率は1860°C熱処理物石油コークスで最も高く90%であったが2300°C、2800°C熱処理物ではそれぞれ72%、65%であった。表面フッ素化の効果はとくに300°Cでフッ素化した試料で顕著に現れた。電流密度60mA/g、150mA/gにおける2300°C熱処理石油コークスの初期クーロン効率は84.1、83.3%、2800°C熱処理物の場合は83.6、79.5%に上昇した。これはフッ素化反応によって石油コークス端面の閉塞構造が破壊され、溶媒分解による被膜生成が容易になったためと考えられる。(1)石油コークスおよびこの石油コークスを2100°C(PC2100)、2600°C(PC2600)で黒鉛化したものをフッ素ガス(3x10^4Pa)を用いて200°C、300°Cで2分間フッ素化し、2800°Cで黒鉛化したもの(PC2800)は400°Cでフッ素化した。フッ素含有量は200°Cでフッ素化した場合は検出限界内(0.2at%以下)であったが、300°Cでフッ素化すると0.3-0.4at%のフッ素が検出された。表面フッ素濃度は4.9-17.8at%で黒鉛化度の高いPC2600の方がフッ素濃度が低くフッ素ガスと反応しにくいことがわかった。C-F結合は共有結合で、フッ素化により表面酸素濃度も減少した。フッ素化により表面積に大きな変化は見られなかったが、ラマンシフトより表面構造の乱れが増加することが示された。透過型電子顕微鏡による観察ではPC2800の表面は黒鉛化過程における酸素除去反応で閉じた構造になっているが、フッ素化により表面閉塞構造が炭素-炭素結合の裂断により開いた状態になっていることがわかった。(2)表面フッ素化によりPC2600の初期クーロン効率は電流密度60、150mA/gでそれぞれ12、26%上昇し、電流密度が大きいほど高くなった。また、電流密度が大きくなるとフッ素化の効果がより明確に現れ、放電容量も増加した。インピーダンス測定より、フッ素化石油コークスの電荷移動抵抗が減少し、反応速度が増加することが示され、高電流密度における放電容量の上昇とよく一致していることがわかった。(1)CF_4を用いるプラズマフッ素化による石油コークスの表面構造の変化石油コークスおよび1860°C、2300°C、2800°Cにおける熱処理で黒鉛化した石油コークスの表面構造をCF_4ガスを用いるプラズマフッ素化で変化させ、その表面構造変化と有機溶媒中における電極特性を調べた。プラズマフッ素化を行った石油コークス試料のフッ素含有量はフッ素ガスによる表面フッ素化の場合より少ない。フッ素化時間15分の試料ではフッ素は検出されず、30分と60分間フッ素化の試料で0.10.7at%のフッ素が黒鉛化処理温度の低い試料で検出された。XPSによる表面分析ではすべての試料でフッ素が検出され、フッ素化時間が長くなるにつれて表面フッ素濃度は高くなった。フッ素化によって比表面積は減少し、またラマンスペクトルより表面付近の構造の乱れが大きくなることがわかった。(2)プラズマフッ素化石油コークスの有機溶媒中における電極挙動
ヒト耳介弾性軟骨細胞の三次元形態形成に関わるアクアポリン分子種の同定

ヒト耳介軟骨膜組織ならびに培養軟骨膜細胞におけるAQP1の発現が免疫・蛍光染色とwesternblot法で観察された。軟骨膜細胞におけるAQP1遺伝子発現抑制は,二次元培養での増殖と軟骨細胞分化には影響しないが,typeIcollagenへの接着能および移動能を有意に低下させ,三次元培養での組織形成能と軟骨分化を有意に低下させた。ヒト耳介軟骨膜細胞おけるAQP1の発現は,接着能と移動能促進を介し軟骨膜細胞の軟骨組織形成に重要な役割を演じることが明らかとなった。AQP1は,耳介軟骨膜細胞の間葉系組織幹細胞機能を利用した新たな再生医療の確立のための,重要な標的遺伝子の一つと考えられる。弾性軟骨の再生医療は未だ臨床応用には遠く新たな発想によるブレークスルーが切望さている。細胞接着・移動能は軟骨形態形成の主要要素である。最近、生命現象に必須な水分子の特異的細胞膜チャンネルであるアクアポリンaquaporin (AQP)に関節軟骨細胞の接着や移動能の亢進など予期せぬ機能があることが報告された。今回、その情報を弾性軟骨膜細胞へ発展させ、1)ヒト耳介軟骨膜細胞におけるAQP発現のスクリーニング、2)AQP1遺伝子発現抑制による細胞外基質接着性と細胞移動能への関与、3)AQP1遺伝子発現抑制による三次元的形態形成を明らかにすることで弾性軟骨再生医療の新展開へ繋げることを目的とした。1)小耳症および副耳から得られた培養ヒト耳介軟骨膜細胞に組織幹細胞、軟骨前駆細胞性格を有することを確認した。2)培養ヒト耳介軟骨膜細胞におけるAQP1遺伝子発現抑制実験による結果からAQP1遺伝子は細胞増殖能および二次元培養での軟骨細胞分化に影響しないことを確認した。3)培養ヒト耳介軟骨膜細胞におけるAQP1遺伝子発現抑制実験による結果からAQP1遺伝子は細胞接着能及び細胞移動能に関与することが明らかとなった。さらに最終年度には、4)培養ヒト耳介軟骨膜細胞におけるAQP1遺伝子発現抑制実験による結果からAQP1遺伝子は三次元形態形成に深く関わることが明らかとなった。今後、この情報を基に足場を必要としない三次元形態形成がAQP1遺伝子の強制発現により可能であるか実証する必要がある。組織工学的手法を用いた軟骨再生には、1)細胞供給源、2)足場、3)成長因子の3要素が必要である。足場としては、多種類の材料が開発され評価されている一方で、どれも秀でたものがないのが現状である。細胞接着・移動能は形態形成の主要要素である。ここで視点をかえ、足場材料のみに三次元形成を求めずに、細胞自身のもつ組織形成能力について検討を行うことで、足場材料を利用しないで三次元構築が可能となることが予想されうるAQP1分子にたいして、1)ウサギ耳介軟骨細胞におけるAQP発現のスクリーニング、2)AQP1遺伝子のknock downによる細胞外基質接着性と細胞移動能の評価、3)AQP1遺伝子のknock downによる三次元的形態形成能を評価を行った。耳介組織は軟骨膜層と軟骨基質層に分けられるが、何らかのトリガーで軟骨細胞が増殖する際に、軟骨膜層に存在する軟骨前駆細胞にAQP1に発現を認めた。さらに経時的な評価では軟骨基質層への移動にAQP1の発現を認めた。また、軟骨細胞にはAQP1の発現を強く認め、AQP1のもともともつ特性である細胞膜チャンネル分子としての水代謝能力が弾性軟骨組織の維持に役立っていることが予想された。AQP1遺伝子のknock downにより細胞外基質接着性と細胞移動能は低下し、さらに三次元培養による軟骨再生組織の形態形成不全を認めた。組織工学的手法に必要とされる足場やフィーダー細胞によることなく三次元培養が可能となる布石と成りえることが考えられうる。細胞接着と移動能は軟骨を含めた組織再生・形態形成において重要な役割を演じていることが知られており(Schmal H et al.Tissue Eng 2006)、今検討によりAQP1は軟骨組織の再生や形態形成におけるキー分子の一つであることが推測される。足場材料のみに三次元形成を求めずに、AQP1分子種における細胞自身のもつ組織形成能力について検討を行うことで、足場材料を利用しないで三次元構築が可能となることが予想されうるに至った。AQP1分子が細胞接着、移動能に関与することが証明できたため、組織工学的手法に必要とされる足場やフィーダー細胞によることなく、AQP遺伝子導入によるAQP1の強発現による三次元培養が可能か検討行う。

一方、関節及び弾性軟骨組織は血行のない組織であり、その代謝が如何に行われているかは、謎の多いところである。我々は弾性軟骨細胞にAQP1が存在していることを既に蛋白ならびにmRNAレベルで確認している。AQP1のもともともつ特性である細胞膜チャンネル分子としての水代謝能力が弾性軟骨組織の維持に役立っていることが予想されるため、今回の研究成果は弾性軟骨細胞のin vivoでの代謝メカニズムに関する解明の一歩と成りえるよう検討を行っていく。1)ヒト耳介軟骨細胞におけるin vivoとin vitroでのAQP発現のスクリーニング:小耳症患者から得られたヒト耳介軟骨組織と耳介軟骨膜培養細胞におけるAQP 10種の蛋白及びmRNA発現解析2)培養ヒト耳介軟骨膜細胞での強制発現による細胞接着性と移動・浸潤能を亢進させるAQP分子種の選別:ヒト耳介軟骨膜培養細胞への10種のAQP遺伝子導入によるにおけるA)II型コラーゲン・フィブロネクチンへの接着能、B) Scratch法による細胞移動能、C)Matrigel invasion assayによる浸潤能の解析3)選別されたAQP分子種の三次元的形態形成促進効果の確認:選別AQP遺伝子導入耳介軟骨細胞をscaffoldと共にヌードマウス皮下に摂取し三次元的形態形成を計測
拡張アンサンブル密度汎関数分子動力学法によるATP加水分解の研究

昨年開発した、密度汎関数法(DFT)と拡張アンサンブル法を合体した手法は、大変有効であるが、計算時間が多くかかるという難点があった。よって、密度汎関数法の部分をタイトバインディング法(DFTB)で置き換えた新手法を開発した。これによって、大規模分子系でもDFTの場合より、大幅な計算時間の短縮が可能となった。特に、本申請の最終目標である、酵素分子と水分子の存在下でのATPの加水分解に関する計算に適した手法の開発に成功したと言える。また、拡張アンサンブル法の方は、焼き戻し傘サンプル法(simulated tempering umbrella sampling)からレプリカ交換傘サンプル法(replica-exchange umbrella sampling)に置き換えた。これによって、手法の汎用性が更に高まった。この新手法を以前と同じ、水中のマロンアルデヒドのプロトン移動の自由エネルギー計算に適用して、その有効性を確かめているところである。この系での計算の有効性が確かめられたならば、予定していた水中のATPの加水分解の計算を始める予定である。ATPの計算に移る場合、拡張アンサンブル法としては、まず、レプリカ交換分子動力学法を適用し、それで、うまく行けば、レプリカ交換傘サンプル法で置き換える予定である。そして、十分なデータが得られたら、加水分解の自由エネルギーを計算し、実験結果と直接比較する。そして、いよいよ、酵素分子と水分子の存在下でのATPの加水分解の拡張アンサンブルシミュレーションの準備を始める。25年度が最終年度であるため、記入しない。