hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
化学修飾STM探針によるDNA及びチトクロームCの観測

本研究において、シトシンの誘導体の化学修飾探針によってグアニン(シトシンの対核酸塩基)、グアニン誘導体の化学修飾探針によってシトシン(グアニンの対核酸塩基)の核酸モノマー識別が可能であることが示された.これは,グアニンとシトシンの間での多点水素結合による分子認識により,電子軌道の重なりが生じ,それを介したトンネル電流の増加が起こるためと思われる.これにより、化学修飾探針の化学選択性による核酸塩基認識能を用いて核酸塩基ポリマーであるDNA/RNAの配列決定に対しても本方法論が有効である可能性を示すことができた.蛋白質など,凹凸の激しい試料をSTM観察に用いた際には,探針が試料に十分近づけず,一般に分解能が低下することが知られている.そこで,本研究ではまず,生体試料を高分解能で観察するため,直径の非常に小さいカーボンナノチューブ(CNT)を探針として用いることを検討した.CNT探針は,末端にCOOH基をもつSAMで修飾した金のSTM探針上にZn^<2+>を介して両末端にCOOH基をもつCNTを固定することにより作成した.分子内にエーテル酸素を含む長鎖アルカンをこのCNT探針を用いて観察することにより,CNT探針末端のCOOH基とエーテル酸素との水素結合によるトンネル電流の促進に基づき,試料のエーテル酸素が明るいコントラストとして識別できることを示した.また,CNT探針を用いることにより,これまでのSAM修飾探針よりも高分解能が達成できることが示された.さらに,末端を化学的に修飾したCNT探針を用いて,水素結合に加え,配位結合,電荷移動相互作用に基づく化学種識別が可能であることも明らかにした.本研究において、シトシンの誘導体の化学修飾探針によってグアニン(シトシンの対核酸塩基)、グアニン誘導体の化学修飾探針によってシトシン(グアニンの対核酸塩基)の核酸モノマー識別が可能であることが示された.これは,グアニンとシトシンの間での多点水素結合による分子認識により,電子軌道の重なりが生じ,それを介したトンネル電流の増加が起こるためと思われる.これにより、化学修飾探針の化学選択性による核酸塩基認識能を用いて核酸塩基ポリマーであるDNA/RNAの配列決定に対しても本方法論が有効である可能性を示すことができた.蛋白質など,凹凸の激しい試料をSTM観察に用いた際には,探針が試料に十分近づけず,一般に分解能が低下することが知られている.そこで,本研究ではまず,生体試料を高分解能で観察するため,直径の非常に小さいカーボンナノチューブ(CNT)を探針として用いることを検討した.CNT探針は,末端にCOOH基をもつSAMで修飾した金のSTM探針上にZn^<2+>を介して両末端にCOOH基をもつCNTを固定することにより作成した.分子内にエーテル酸素を含む長鎖アルカンをこのCNT探針を用いて観察することにより,CNT探針末端のCOOH基とエーテル酸素との水素結合によるトンネル電流の促進に基づき,試料のエーテル酸素が明るいコントラストとして識別できることを示した.また,CNT探針を用いることにより,これまでのSAM修飾探針よりも高分解能が達成できることが示された.さらに,末端を化学的に修飾したCNT探針を用いて,水素結合に加え,配位結合,電荷移動相互作用に基づく化学種識別が可能であることも明らかにした.修飾分子/試料分子となるチオール部位を持つ核酸塩基を合成した.この合成した核酸塩基チオール誘導体を金表面上に自己組織化単分子膜(SAM)を形成させたものを試料として,未修飾のSTM探針と対核酸塩基チオール誘導体をSTM金探針上にSAMを形成させて作成した化学修飾探針でそれぞれ測定を行い,試料分子の見かけ上の高さの変化を比較した.二種類の核酸塩基(Adenine/Guanine以下A, Gとする)からなるSAMを試料とし,核酸塩基(Cytosine以下Cとする)で修飾した探針で測定した結果GはAよりもおよそ2倍の高さで観察されたが,未修飾探針の場合にこうした高さの違いは観察されなかった.こうした化学修飾探針による分子の見かけ上の高さの相違は,修飾分子と試料分子との間で1本の水素結合しか形成できないAとCと比べて,核酸塩基ペア同士で3本の水素結合を形成できるGとCの場合には両分子間の電気軌道の重なりが大きくなり,トンネル電流の量に違いが生じたためと考えられる.蛋白質などの凹凸の激しい試料をSTMにより観察した際には,探針が試料に十分近づけず,一般に分解能が低下することが知られている.そこで,本研究ではまず,このような試料に対しても高分解能での観察を行うため,直径の非常に小さいカーボンナノチューブ(CNT)を探針として用いることを検討した.まず,金のSTM探針を末端にCOOH基をもつSAMを用いて修飾した.この修飾探針にZn^<2+>への配位結合を利用し,両末端にCOOH基を持つCNTを固定し,透過型電子顕微鏡により確認した.さらに,分子内にエーテル酸素を含む長鎖アルカンをこのCNT探針を用いてSTMにより観察を行い,探針と試料との間の水素結合に基づき,試料のエーテル酸素原子のみが選択的に明るく観察できることを明らかにした.また,得られたSTM像においてはこれまでのSAM修飾探針よりも非常に高分解能が達成できることを示した.化学修飾STM探針の化学選択性を用いて核酸塩基種の認識を行いDNA/RNAの遺伝子情報を読み出す研究を行った.

核酸塩基モノマーであるGuanine, Adenineのチオール誘導体をそれぞれ金板上に自己組織化単分子膜(SAM)形成させたもの,及びその混合膜を試料とし,核酸塩基であるCytosineのチオール誘導体により化学的に修飾した探針を用いてSTM観察を行った.その結果,Cytosineの対核酸塩基であるGuanine分子のみが選択的に明るく観察された.また,試料として核酸塩基ポリマーである18merのPNA鎖(TTT TTT TGG TTT GGT TTT)をCytosine修飾探針で測定した結果では,Cytosineの対核酸塩基であるGuanine分子のみが選択的に明るく観察された.これは,探針上の修飾分子Cytosine部位と試料DNA/PNA中における対核酸塩基分子Guanine部位の相補的な塩基対間での多点水素結合に基づく分子認識により,電子軌道の重なりが生じ、それを介したトンネル電流の増加が起こったためGuanineを選択的に識別可能になったと考えられる.蛋白質など,凹凸の激しい試料をSTM観察に用いた際には,探針が試料に十分近づけず,一般に分解能が低下することが知られている.そこで,本研究ではまず,生体試料を高分解能で観察するため,直径の非常に小さいカーボンナノチューブ(CNT)を探針として用いることを検討した.CNT探針は,末端にCOOH基をもつSAMで修飾した金のSTM探針上にZn^<2+>を介して両末端にCOOH基をもつCNTを固定することにより作成した.分子内にエーテル酸素を含む長鎖アルカンをこのCNT探針を用いて観察することにより,CNT探針末端のCOOH基とエーテル酸素との水素結合によるトンネル電流の促進に基づき,試料のエーテル酸素が明るいコントラストとして識別できることを示した.また,CNT探針を用いることにより,これまでのSAM修飾探針よりも高分解能が達成できることが示された.さらに,末端を化学的に修飾したCNT探針を用いて,水素結合に加え,配位結合,電荷移動相互作用に基づく化学種識別が可能であることも明らかにした.
線維素溶解系因子uPARによる炎症性骨破壊発症制御機構の解明

我々は、LPSによって誘導される炎症性骨破壊においてuPARがどのような役割を担っているのかを明らかにすることを目的とし、研究を行った。最初に、LPSは破骨細胞においてuPARの発現を増加させるが、骨芽細胞では影響を及ぼさないことを発見した。次に、uPARの発現が減少しているとLPSが誘導するNF-kBの活性化は抑制され、uPARの発現が増加しているとNF-kBの活性化は促進されることを発見した。また、LPSが誘導するNF-kBの活性化及び破骨細胞への分化はuPAとuPARとの結合によって制御されることを発見した。更に、骨芽細胞においてLPSが誘導するRANKLの発現機構にもuPARが関与していることを明らかにした。成熟破骨細胞へ分化するためには、骨芽細胞が産生するreceptor activator of NF-κB ligand(RANKL)が、破骨細胞が発現するRANKに結合することが必要である。しかしながら、近年、炎症によって、RANKL/RANKを介さずに、骨吸収が誘導されることが報告されている。歯周病の原因菌であるグラム陰性細菌細胞壁成分のリポ多糖(Lipopolysaccharide; LPS)やTNF-α、IL-1などの炎症性サイトカインが、骨吸収を強力に誘導することが報告されている。このメカニズムは、LPSや炎症性サイトカインによって細胞内に伝達されたシグナルが、NF-κBを活性化させることによって、破骨細胞の分化を誘導させるためであると考えられている。更にLPSや炎症性サイトカインは、骨芽細胞にも作用し、RANKLの産生を誘導することも知られている。2011年度は、主に破骨細胞に着目し研究を行い、LPSによってuPARの発現が誘導されること及びLPSが誘導する細胞内シグナル伝達をuPARがuPA,integrin,LRPとの結合を介して制御していることを明らかにした。2012年度は、骨芽細胞に着目し、炎症による刺激によって誘導されるRANKL産生機構にuPARがどのように関わっているのかを明らかにするために野生型及びuPARの遺伝子欠損マウスから採取したカルバリアより骨芽細胞の初代培養を行い、それぞれの骨芽細胞におけるRANKL産生能の違いを検証した。その結果、uPARの欠損している骨芽細胞では、炎症によって誘導されるRANKLは、顕著に抑制された。骨芽細胞においてもuPARが欠損していると炎症によって誘導される細胞内シグナル伝達は抑制され、uPARは、骨芽細胞が惹起する骨破壊にも関与していることが実証された。近年、歯周病や関節炎などによる炎症が、過度の骨吸収を引き起こすことで、骨粗鬆症や関節リウマチのような病態をきたすことが明らかになっている。しかしながら炎症が引き起こす骨破壊進行の詳細なメカニズムは依然として明らかになっておらず、高齢化社会が進む日本においてその病因究明は急務である。現在までに、線維素溶解系因子uPARが炎症性骨破壊に関与している事を発見しており(LPSによる炎症性骨破壊における線維素溶解系因子uPARの重要性;平成21年度文部科学省科学研究費補助金)、uPARが炎症よって誘導される骨吸収において重要な制御因子である可能性を示唆している。uPARの関与する炎症性骨吸収メカニズムを明らかにすることが、骨粗鬆症や関節リウマチのような病態の新しい治療法開発の礎になると考えられる。本研究は、線維素溶解系因子uPARが炎症性骨破壊の発症をどのように制御しているのかを解明する事を目的とし研究を開始した。平成23年度は、LPSによってuPARの発現がどのように変化し、LPSが誘導する破骨細胞分化及び細胞内シグナル伝達にuPAR、uPAR結合蛋白質がどのように関与しているかを解析した。その結果、LPSの刺激によって誘導される破骨細胞分化が進むにつれてuPARの発現は増加することを発見した。また、uPARは、integrinやLRPなどのuPAR結合蛋白質を介して、LPSが誘導する細胞内シグナルを調節し、破骨細胞への分化を制御していることを明らかにした。これらの結果より、炎症によって発現が惹起されたuPARは、炎症による骨破壊を制御していることが示唆された。平成23年度は、1.LPSによるuPARの発現変化の解析、2.LPSが誘導する細胞内シグナル伝達におけるuPARの影響、3.LPSが誘導する破骨細胞分化におけるuPARとuPAR結合蛋白質との相互作用による影響について明らかにすることを目標として研究を開始した。最初に、LPSの刺激により破骨前駆細胞が破骨細胞へ分化する過程において、uPARの発現がどのように変化していくかをRT-PCR法及びウエスタンブロット法にて解析した。

その結果、LPSの刺激によって誘導される破骨細胞への分化が進むにつれてuPARの発現が増加することを明らかにした。次に、uPARと結合するintegrin及びLRPに着目し、LPSが誘導する細胞内シグナル伝達及び破骨細胞への分化に与える影響を調べた。integrinの活性化を阻害するペプチド及び中和抗体を添加すると、LPSが誘導する細胞内シグナル伝達及び破骨細胞の分化が抑制されることを確認した。また、siRNA法にてLRPの発現を抑制するとLPSによって誘導される細胞内シグナル伝達及び破骨細胞の分化が抑制されることを確認した。これらの結果より、integrinやLRPなどのuPAR結合蛋白質は、LPSが誘導する細胞内シグナル伝達を調節し、破骨細胞への分化を制御していることが示唆された。1.骨芽細胞が制御する破骨細胞分化におけるuPARの影響骨芽細胞が制御している破骨細胞分化におけるuPARの役割を明らかにするために、野生型マウス及びuPAR遺伝子欠損マウスのカルバリアより骨芽細胞を初代培養し、破骨前駆細胞であるRaw264.7 cellsと共培養を行う。それぞれの培養系にLPS及び炎症性サイトカインを添加し、破骨細胞分化能の違いを解析する予定である。2.LPS及び炎症性サイトカインの刺激により骨芽細胞が産生する破骨細胞分化誘導因子産生におけるuPARの役割野生型マウス及びuPAR遺伝子欠損マウス由来骨芽細胞を用いて、LPS及び炎症性サイトカインの刺激によって誘導されるRANKLなどの破骨細胞分化誘導因子の発現量の違いを解析する。誘導された破骨細胞分化誘導因子の発現量は、定量的RT-PCR法及びウエスタンブロット法を用いて、mRNA及び蛋白質レベルで解析する。また、その産生はどのようなシグナル伝達経路を介して行われているのかを解析し、uPARがどのように破骨細胞分化誘導因子の産生に影響を及ぼしているのかを明らかにする予定である。平成24年度においては、研究試薬(抗体\200000、siRNA用試薬\200000、培養培地\50000、細胞分化用試薬\200000、RT-PCR用試薬\50000、阻害剤\50000計\750000)、組織ガラス器具(プレパラート,コーティングプレパラート等、計\100000)、培養器具(培養皿等、計\300000)、研究成果報告旅費(\50000)等の経費が必要である。
モディファイド磁性粉末による次世代ICT社会対応GHz帯電波吸収体の開発

本研究では,磁性ソフト相・ハード相を含み,その二相組織が制御されたモディファイド磁性微粒子によって,次世代通信帯域で機能できる広帯域かつ薄型の電磁波吸収体の開発を目的とする。ハード磁性相にはハードフェライト微粉末,ソフト磁性相には水素プラズマ金属反応法などにて作製したFe合金系微粒子を用い,メカノフュージョン法などによって両相を複合化してモディファイド磁性微粒子とする。本研究は、ハイブリッド磁性微粒子を用いて高範囲な周波数で機能する電磁波吸収体の開発を行うものであり、その成果は大きな社会的波及性が期待される。研究計画において、複数の手法によりその実現を検討する計画になっており、実現性が高いと評価される。今後、関連する因子を整理し、デバイス設計理論にまで発展することが見込まれ、学術上、実際上、この分野の研究発展が期待される。
視線運動分析に基づく字幕 映像付音声教材利用の効果的英語聴解訓練システムの開発

英語字幕つきの映画が日本の英語教育に利用され始めて10年ほどたつ。学習者全員に字幕の付加の効果が期待できないことは、いくつかの研究、あるいは、筆者らの先行研究よりかなり明らかにされてきた。今までの字幕効果の研究では、視聴過程つまり、視聴者がスクリーン上の情報を処理する際に、画面上のどこを、どのくらいの時間、どのように注視しているのかというデータがほとんど皆無であった。視聴過程を分析しなければ、字幕の理解に対する効果/干渉がなぜ、どのように起きるのか解明されない。本研究では、視聴中の視線運動を明らかにすることに注目し、実験を重ね、聞き取り訓練における効果的な字幕の利用法構築を目指して、研究を行った。まず、英語上級者の視線運動が三角形の情報処理(映像->字幕の頭部分-字幕の終->映像)であることを突き止め、次に事前練習を課することにより、言語理解(聴解+読解)を高めることができた。ところが、その際、受動的な点に重きを置いた事前練習に対して、理解の伸びが確認できない学習者群がいることが判明した。この点に着目して、さらに学習者の英語習熟度に応じた事前練習を施すことにより、内容理解を高め、視線運動のパターンも上級者に近づけることができた。具体的な聴解訓練においては、英語習熟度の低い者には、比較的高い者と違い、受動的+能動的な発話練習を施すことにより、理解を高めることができるということがわかった。一方、英語のネイティブスピーカーの視線運動を調べた結果、さらに興味深いことがわかった。上級者の三角形の情報処理の上を行く、多角形の情報処理を行っていることが解明された。つまり、映像->映像->字幕->映像-映像というパターンである。字幕を部分的な確認程度しか利用しない分、時間に余裕ができ、映像を注視する時間が多くなると考えられる。この考察を進めていくと、英語のレベルが上がるに連れ、多角形の辺(角)が増えていくということになるであろうということがある程度明らかになったことも、本研究において大きな収穫である。研究補助採択決定後、実験教材を制作したが、アナログ映像にデジタルの字幕キャプションをオーバーレイするのはNECのマルチメディアラボを頻繁に使用してもかなり時間がかかった。また、画質の低下がひどくやり直しに次ぐ、やり直しでスケジュール上かなりの無理をした。夏以降断続的に予備実験を重ね、現在までに述べ10数人の大学生、英語力上位者、英語ネイティブスピーカーにて調査した。関連学会でも2度にわたって報告したが、1)英語力低位者には、習熟度に応じた適切な事前練習がなされないとキャプションは妨げにしかならず、映像をあきらめるか、キャプションをあきらめるかという選択的な情報処理をする傾向があることが明らかになった。また、アイマークレコーダーによる停留点移動、停留点時系列グラフに分析により、2)キャプションからの情報収集をより容易、適切に行えるような練習が学習者の習熟度とうまくかみ合えば、キャプション、映像という2つのシンボルシステムからの情報収集を、効果的に音声モードと補完、重複させ理解を深めていくのではないかという推察ができる程度まで明らかになった。さらに、3)映像を楽しみながら、音声英語をほとんど理解するようなレベルの英語力上位者の視線運動は、ネイティブスピーカーの視線運動と近似しており、音声を確認したり、部分的に保完したりするためにキャプションを適宜注視することがわかった。

来年度にかけて、事前の練習問題と習熟度の関係をさらに明らかにすること、映像なり、キャプションを注視することが言語、内容理解とどのように結び付いていくのかという点を少しずつ明らかにしていくつもりである。本年度は、1.実験環境の改良2.予備練習の効果ついての追試の2項目について作業が進められた。1.実験の精度を上げ、データの信頼性を高めた。改良点は、次の4点である。(1)実験視聴テンプレートの画質の向上→一部はNECに編集を依頼し、後はデジタル編集をした。(2)テンプレートの視聴内容と分析の合理化→実験のインストラクション、字幕の読み練習問題を作成し、テンプレートに組み込んだ。解析部分は各シーン20秒に絞り、分析の焦点を明確にした。(3)字幕→日本語字幕のシーンを追加して、英語字幕のシーンの視聴と比較した。(4)アイマークレコーダのレンズ→30度レンズを使用して分析角度を狭め、詳細な分析を可能にした。2.音声、映像、文字の3モードが呈示されると、初級英語学習者にとって、字幕が理解過程に干渉なった。そこで、視聴前に、語彙の紹介と説明、字幕の文字を読む練習など言語的な補足練習を施すと、練習後の3モード複合教材を視聴中の被験者の視線運動が、英語の習熟度の高い学習者と同じ様な軌跡を取るようになった。字幕上の固視点が少なく、各固視点の停留時間が伸びた。これは効率のよい読み方であり、映像をより長く見る余裕がでてきた。本年度は、映像の画質、実験内容、設定条件をかなり改善して平成6年度後半で行った実験の追試をし、データの信頼性を高めた。統計的な定量分析は、現在進行中である。本年度の目的として、学会発表が予定されていたが、1.にかなりの時間を費やし、実験データ収集までで本年度は時間切れとなった。しかし、一方では、米国の字幕映像教材の実践状況を調査し、National Captioning Instituteに連絡して関連研究のデータベースを入手するなど、本研究に必要な資料を収集することができた。今年度は、前年度行った実験を踏まえて、字幕の大きさ(小24、中32、大40ポイント)、シーンの長さを長くしたもの、日本語字幕との対比、全部の字幕vs.キーワードの字幕、それから上級者をも対象として、データ収集を行った。現在すべてのデータ処理を行っていないので、以下現在までに得られた知見について簡単に述べる。まず、字幕の大きさというのは、初級者の場合、一番大きな字幕以外は、あまり気付くことがなく、それゆえに読みにくかったという反応は、返ってこなかった。流石に40ポイントともなると約40%の者が、字幕が大きいと感じた、という感想を事後面談で述べていた。字幕の大きさが読みやすさに影響を及ぼすのではないかとの当初の予測は、はずれ、むしろ大文字と小文字がきちんと整理されているほうが読み易いといういことになるのかもしれない。また、キーワードでの提示については、初級学習者は、一般に全部の字幕が提示されたほうがわかりやすい、と述べていたのが特徴であった。ただし、すべてが提示されてもすべてが読めて、わかるというのではないが、というコメントも合わせて残していた。
キチンナノフィブリルの表面化学構造制御によるナノ複合材料の構造および機能解析

1.キチンのレベリングオッフ重合度(LODP)についてキチンのLODPについて、詳細な報告は未だになされていないため、調べることとした。カニガラおよびイカの中骨由来の乾燥と未乾燥のα-およびβ-キチン、計4種類の試料を出発物質として、塩酸による加水分解反応を行い、生成物の収率、結晶化度を調べ、重合度をSEC-MALSで追跡した。結果、未乾燥のβ-キチンの分子量低下は緩やかでLODPを示さなかったが、その他の試料はそれぞれLODPを示した。2.キチンの脱アセチル化度(DDA)の測定方法の比較研究DDAはキチンの物性を大きく左右するため、その測定方法は数多く開発されてきたが、それぞれに欠点があるため未だに一本化されていない。本研究では異なるDDAを有する試料を用いて、もっとも多用されている赤外分光法、元素分析、電導度滴定および13C固体NMRの4種類を比較した。それぞれの測定条件を最適化した末、固体NMRでえられた数値が最も文献値と一致し、元素分析と電導度滴定では誤差の縮小が困難で、赤外分光法測定の信憑性はこの中で最も低かいことがわかった。3.キチン由来の酸・塩基二元機能性触媒の開発キチンが有するアセトアミノ基をアミノ基に変換し塩基触媒としながら、酸触媒となるカルボキシル基を導入して、固体触媒を調製し多段階反応をワンポットで実現すべく研究した。部分的脱アセチル化したキチンにTEMPO触媒酸化を施したところ、ナノウィスカーが得られたが固体触媒には不向きと判断した。また、アミノ基を担持したキチンとカルボキシル基を担持したセルロースとでナノ複合エアロゲルの調製を試み、モデル反応で触媒として利用したが、残念ながら高い触媒効率が認められなかった。4.この他、針、広葉樹木粉、未乾燥パルプおよびTEMPO酸化パルプの窒素吸着法による空隙構造解析に携わり、論文発表を行った。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。1.キチンナノフィブリル(ChNF)化条件の最適化研究計画に従い部分的脱アセチル化α-キチン(PDACh)の調製条件やナノ分散条件の最適化を行った。脱アセチル化処理におけるアルカリ濃度を抑えることで、アスペクト比の高いChNFの調製を図った。また、pHや対イオンなど様々な分散条件を検討した結果、pH33.5がPDAChのナノ分散に最適であり、生物適応性の高いアスコルビン酸がChNFの分散剤として優れていることを見出した。これらの知見は、ChNFの用途拡大につながるものであり、ゲル化や、物質の吸収・分離などにも応用できる。よって、本研究は当初の研究計画を十分に満たしたものであり、その結果について国際学会などの場で発表を行った。2. ChNFとポリイソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)の複合ハイドロゲルChNFと熱応答性ポリマーであるPNIPAAmの複合ハイドロゲルを調製し、架橋様式やネットワーク構造を制御することで、ChNFによる補強効果を発現させることを目的とした。具体的に、光重合によりNIPAAmモノマーと架橋剤をChNF水分散液中に共重合させ、ハイドロゲルを調製した。開始剤の種類、試薬の濃度、紫外線照射条件などを選別・制御した結果、簡便なプロセスから、均一でタフなハイドロゲルの調製に成功した。このゲルは32°Cより高い温度条件下で白く、疎水的であり、低い温度では透明で親水的であった。3.キチン由来の酸・塩基二元機能性触媒の開発当研究室の先行研究により、ChNF表面のアミノ基は塩基性触媒としてクネーフェナーゲル縮合などの反応を促進できることが判明している。そこで、ChNF表面にカルボキシル基を導入することで、酸触媒機能をも付加し、カスケード反応をワンポットで触媒できるような酸・塩基二元機能性触媒の開発に踏み出した。触媒の比表面積を上げるため、ナノ分散させた上でエアロゲルに成形した。具体的に、天然キチンに部分的脱アセチル化とTEMPO触媒酸化を順に施し、試料1gあたりカルボキシル基とアミノ基をそれぞれ0,3mmol、0.6mmol導入した。試料の水懸濁液を高圧ホモジナイザーで処理し、透明なナノ分散液を得た。これをt-ブチルアルコールに溶媒置換し凍結乾燥したところ、高比表面積を有するエアロゲルが得られた。触媒機能の評価については新年度中に予定している。

それぞれの測定条件を最適化した末、固体NMRでえられた数値が最も文献値と一致し、元素分析と電導度滴定では誤差の縮小が困難で、赤外分光法測定の信憑性はこの中で最も低かいことがわかった。3.キチン由来の酸・塩基二元機能性触媒の開発キチンが有するアセトアミノ基をアミノ基に変換し塩基触媒としながら、酸触媒となるカルボキシル基を導入して、固体触媒を調製し多段階反応をワンポットで実現すべく研究した。部分的脱アセチル化したキチンにTEMPO触媒酸化を施したところ、ナノウィスカーが得られたが固体触媒には不向きと判断した。また、アミノ基を担持したキチンとカルボキシル基を担持したセルロースとでナノ複合エアロゲルの調製を試み、モデル反応で触媒として利用したが、残念ながら高い触媒効率が認められなかった。4.この他、針、広葉樹木粉、未乾燥パルプおよびTEMPO酸化パルプの窒素吸着法による空隙構造解析に携わり、論文発表を行った。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。未利用バイオマスであるキチンに着目しナノキチン材料調製の最適化や高付加価値利用に向けて精力的に研究に取り組んだ。先ず、キチンの脱アセチル化条件やナノ分散条件について、当初の研究計画に従って備に調べ、最適化を図った。その結果を国際学会などの場で報告を行った。次に、研究計画以上の進展として、ChNFとポリマーを複合し、熱応答性に優れた透明でタフなハイドロゲルの調製に成功した。更に、アミノ基を有するキチン材料にカルボキシル基を導入し、酸・塩基二元機能性触媒として利用することを試みた。こうした高機能性ナノキチン材料の開発はキチンの利用拡大へつながるものと信じている。ChNFとPNIPAAmの複合ハイドロゲルについて、ナノフィブリル間、ポリマー間、そしてナノフィブリルとポリマーとの間の架橋様式やネットワーク構造を制御し、ナノフィブリルの補強効果を発現させ、複合ゲルの高機能化を図りたい。また、温度やpHなどの刺激を与え、機械特性や細胞吸着性などの物性に及ぼす影響を調べる。キチン由来の酸・塩基二元機能性触媒の開発では、より多量な官能基を導入すべく調製・回収方法の再検討を行い、アルドール反応、マイケル反応などにおける触媒性能を評価することを予定している。本研究の触媒試料において、官能基は位置選択的に導入されているため、不斉触媒として機能するかどうかも含めて検討する。上記の課題について、詳細な結果得られ次第、国内外の学会で発表し、多分野の研究者の意見を取り入れ、論文にまとめて報告を行う予定である。
CASを用いたヒト気管支扁平上皮化生病変のDNA解析による癌化の検討

【対象と方法】核DNA量の測定には,Image cytometry(CAS200) Cell Analysis Systemを使用した.キャリブレーションスライド上のラット肝細胞を用いて外部標準としてDNA量を測定.H&E染色標本にて測定部位を確認した各組織100から150個の細胞の核DNA量を測定しhistogramを作製,DNApatternを分析した.DNApatternは,2C領域に単一のpeakが認められる場合をDiploidと分類し,2C領域,4C領域以外にpeakとして認められるものがある場合をNondiploidと定義した.【結果】扁平上皮化生5部位は全部位がDiploidを示した.軽度異型扁平上皮化生6部位中1部位(16.7%),中等度高度異型扁平上皮化生9部位中3部位(33.3%),扁平上皮癌4部位は全例がDNApatternはNondiploidを示した.推計学的に検討すると異型度の上昇と共にNondiploidの出現頻度は,推計学的に有意に上昇した.【対象と方法】核DNA量の測定には,Image cytometry(CAS200) Cell Analysis Systemを使用した.キャリブレーションスライド上のラット肝細胞を用いて外部標準としてDNA量を測定.H&E染色標本にて測定部位を確認した各組織100から150個の細胞の核DNA量を測定しhistogramを作製,DNApatternを分析した.DNApatternは,2C領域に単一のpeakが認められる場合をDiploidと分類し,2C領域,4C領域以外にpeakとして認められるものがある場合をNondiploidと定義した.【結果】扁平上皮化生5部位は全部位がDiploidを示した.軽度異型扁平上皮化生6部位中1部位(16.7%),中等度高度異型扁平上皮化生9部位中3部位(33.3%),扁平上皮癌4部位は全例がDNApatternはNondiploidを示した.推計学的に検討すると異型度の上昇と共にNondiploidの出現頻度は,推計学的に有意に上昇した.喀痰細胞診D,E判定および肺癌症例に気管支鏡による精査を施行,気管支分岐部の肥厚部,腫脹部を中心に積極的に生検を行うことで,扁平上皮癌のみならず扁平上皮化生,異型扁平上皮化生の局在診断が可能になってきた.採取した生検のHE染色標本を用い,CAS200,CAS Inc.,Elmhrst,ILのMicrometer Programにて各染色標本の気管支粘膜の厚さを計測した.実際には各気管支扁平上皮化生3ヵ所の厚みを測定し扁平上皮化生の異型の程度による相違を比較し以下の知見が得られた.扁平上皮化生,異型なし(N=26)では,平均82.27um,軽度異型扁平上皮化生(N=9)では,平均83.60um,中等度/高度異型扁平上皮化生(N=17)では,136.14um,であり中等度/高度異型扁平上皮化生は推計学的に有意に粘膜は厚くなっていることが確認された.正常もしくは気管支炎(N=8)では,44.75um,上皮内癌(N=2)では,315.83umであった.以上扁平上皮化生では,推計学的に有意に正常もしくは気管支炎の粘膜に比べ厚みが増しており,また扁平上皮化生は異型の程度が進行するにつれて推計学的に有意にその厚みを増していた.気管支異型扁平上皮化生の一部は前癌性病変としての性格を有している.LIFEによる蛍光内視鏡検査を施行した症例で,生検部位の病理組織学的検討にて扁平上皮化生(SM),異型扁平上皮化生(ASM),扁平上皮癌(SCC)が確認された15人を対象とした.全例喫煙者の男性で,平均年齢69.8歳,平均喫煙指数は1276であった.白色光気管支鏡の後LIFEを施行,全ての異常部位で生検を行った.気管支生検標本のパラフィン切片を用いFeulgen染色にてDNA染色を行った.Cell Analysis System(CAS200)により各組織100から150個の細胞の核DNA量を測定しDNA histogramを作製,DNApatternを分析した.【結果】ASM15部位中4部位とSCC4部位中4部位がnondiploid patternを示した.SM5部位と正常気管支・気管支炎10部位は全てdiploid patternであった.
超小型衛星の軌道高度維持および高速姿勢変更のためのスラスタ制御系に関する研究

本研究は,超小型人工衛星にスラスタ推進システムを適用し,同規模の衛星としてはこれまで成し遂げられていない軌道高度維持・高速姿勢変更の両方を同時に達成する制御技術を構築するものである.稼働中の衛星データに基づいた宇宙ダイナミクスシミュレータ,および三次元空気浮上テーブル上に再現された模擬人工衛星を用いて,本研究にて構築する制御技術を検証する.大気抵抗を考慮した高精度軌道推定手法とスラスタ自律制御理論を利用した軌道高度維持のための制御則を構築する.また,瞬間的な高トルクを発生させるスラスタと精密角度制御に優れたリアクション・ホイールを組み合わせた制御系による高速姿勢変更を実現させる.本研究は,超小型人工衛星にスラスタ推進システムを適用し,同規模の衛星としてはこれまで成し遂げられていない軌道高度維持・高速姿勢変更の両方を同時に達成する制御技術を構築するものである.稼働中の衛星データに基づいた宇宙ダイナミクスシミュレータ,および三次元空気浮上テーブル上に再現された模擬人工衛星を用いて,本研究にて構築する制御技術を検証する.大気抵抗を考慮した高精度軌道推定手法とスラスタ自律制御理論を利用した軌道高度維持のための制御則を構築する.また,瞬間的な高トルクを発生させるスラスタと精密角度制御に優れたリアクション・ホイールを組み合わせた制御系による高速姿勢変更を実現させる.
東南アジアにおける経済発展と農村の変容一10年の経験一

1.東北タイの典型的貧村であるノーンクン村では、押し寄せる商品経済に様々な形での対応を迫られている。農業では本来自給用のモチ米栽培に加えて、現金収入を得るためウルチ米の裁培を開始している。彼らにとって大きな現金収入源であった出稼ぎは減少の方向にあり、それに代わって農業日雇い(賃労働)の定着化やアヒル羽根の加工売買業と縫製業のような自営業が元気である。そして、農村と都市のネットワークはあらゆるレベルで強化されつつある。もはやノーンクン村は従来のように自分を自分で律することが困難になってきており、今後は少なくともタムボンのレベルでの動きが重要になってくるのではなかろうか。2.もともと中部タイの典型的米作農村であったランレーム村の場合は、この15年間に米作を棄てていったことによる村落社会構造への影響が議論になっている。通勤圏内への近代工場の進出、種々の農村インフォーマルセクター誕生と活性化が農業に代わる就労機会を増加させている。そして、生活スタイルの世代間関孫、人口流入が生み出す草分けの系譜と新参者の関係、さらには複雑な階層化の進行が存在する一方で、宗教活動も多様化しつつあることは、変動がいかに大きかったかを物語っているのではなかろうか。もはや農村とは呼べなくなりつつあるランレーム村の変動が1980年代後半以降のタイ経済の急成長がもたらしたものとすれば、その詳細な検討はアジア農村の変動論に寄与することになるであろう。近い将来研究成果をとりまとめ、出版する計画である。今回の2つの村における再調査プロジェクトは順調に終了した。これからは、15年前の調査データとの比較研究にとりかかり,村落の変容を検討することになる。現時点での成果概要は次の通りである。1東北タイのノーンクン村では,15年前と簡単に比較すれば,所帯数の増加,家族規模の縮小,村内婚の減少,高床式家屋の減少,個人的土地所有意識の明確化などが目立った。また,伝統的労働交換の慣行がすたれ,日層い雇用が一般化しつつある。電化後の生活様式の変化は現金支出を増加させ,ほとんどの所帯で政府機関である農業農協銀行からの借金が急速に増加してきている。ただ,少数だが,縫製業やアヒルの羽毛収集業などを営む者もでてきている。アニミズム信仰は以前として根強く残っており,モータムも繁盛している。加えて,行政の広域化が進みつつあり,村落の自律性が低下し伝統的村落が壊れつつある。2中部タイのランレーム村では,ここでも家族規模の縮小傾向がみられるが,15年前に確認できた「屋敷地共住集団」はまだ残存している。大きな変化は,稲作農家の大幅な減少で,わずか20所帯程度を残すだけである。稲作をすてた農村がどう変化するかの見本になり得る。多くが農外就労を求め、賃労働者化し始めている。通勤圏内に工場が建設され始めたのが大きな理由である。また、家内工業への従事も見受けられる。いずれにせよ,稲作農家の激減は,タイ農業の将来を案じさせる。寺院は基本的には村人の宗教生活の中心ではあるが,興味深いことに、19名(男1,女18)もの依与が存在している。急速な社会変動とおそらくは関係しているのであろう。この2つの異なったタイプの農村の変容をより詳細に比較分析し,経済発展との関係を理論つけたい。

また,伝統的労働交換の慣行がすたれ,日層い雇用が一般化しつつある。電化後の生活様式の変化は現金支出を増加させ,ほとんどの所帯で政府機関である農業農協銀行からの借金が急速に増加してきている。ただ,少数だが,縫製業やアヒルの羽毛収集業などを営む者もでてきている。アニミズム信仰は以前として根強く残っており,モータムも繁盛している。加えて,行政の広域化が進みつつあり,村落の自律性が低下し伝統的村落が壊れつつある。2中部タイのランレーム村では,ここでも家族規模の縮小傾向がみられるが,15年前に確認できた「屋敷地共住集団」はまだ残存している。大きな変化は,稲作農家の大幅な減少で,わずか20所帯程度を残すだけである。稲作をすてた農村がどう変化するかの見本になり得る。多くが農外就労を求め、賃労働者化し始めている。通勤圏内に工場が建設され始めたのが大きな理由である。また、家内工業への従事も見受けられる。いずれにせよ,稲作農家の激減は,タイ農業の将来を案じさせる。寺院は基本的には村人の宗教生活の中心ではあるが,興味深いことに、19名(男1,女18)もの依与が存在している。急速な社会変動とおそらくは関係しているのであろう。この2つの異なったタイプの農村の変容をより詳細に比較分析し,経済発展との関係を理論つけたい。1.78月を中心に2つの村の予備調査を実施した。10年間の変容を概括的に把握するとともに、次のような基本的資料を作成することができた。村落地図、家屋配置図、世帯主一覧、役員一覧。また、村民に聞き取りを行い、ここ10年間の社会的経済的な変動について基本的情報を得た。2.中部のランレーム村落(L村)は完全にバンコク首都圏に組み込まれ、近郊農村化してしまった。工場労働者をはじめ、非農業人口が増加、分譲住宅が目立つ。3.東北のノーンクン村落(N村)でも、電気、水道が導入され、生活に大きな変化が見られる。サラリーマン家庭が1戸ではあるが出現した。ただ、こうした生活はより多くの現金支出を必要とし、政府系の農業・農業組合銀行からの借り入れが目立つ。4.定期的に研究会を開催し、来年度の本調査の具体的内容の検討を開始している。とりわけ、新しい状況を踏まえ、1980年の調査時点では必ずしも必要としなかった調査項目に配慮する必要があることを確認した。ほぼ、短期間に計画通り調査は進んだといえる。15年前の調査村の再調査という研究目的が明白なためであろう。計画した1年目の予備調査は順調に終了したといえる。赤木はチュラーロンコーン大学タイ研究所で開かれたタイ文化についてのセミナーに参加し、一部今回の調査について報告した。来年度の本調査における問題点としては、通訳をかねた調査補助員をどう確保するかであろう。在バンコクの大学の学生は止めて、東北は、マハーサーラカム大、中部は、ナコーンシータマラート大の協力を得るよう進めてみようと考えている。今回の2つの村における本調査は順調に終了した。これからは、15年前の調査データとの比較研究にとりかかることになる。1.東北タイのノーンクン村では、126世帯の調査サンプルを得た。15年前と簡単に比較すれば、世帯数の増加、家族規模の縮小、村内婚の減少、高床式家屋の減少、個人的土地所意意識の明確化などが目立った。また、伝統的労働交換の慣行がすたれ、日雇い雇用が一般化しつつある。
ＥｐｈＡ２受容体の新たなシグナル伝達機構の解明とがんの浸潤・転移への関与

チロシンキナーゼ受容体EphA2は浸潤・転移性を示すがん細胞で高発現している。所属する研究室ではシグナル伝達の観点から、EphA2のがん化促進メカニズムの解析を行っている。以前の研究からEphA2はリガンド非依存的に、細胞運動・接着に関与するRhoファミリー低分子量G蛋白質RhoGとその活性化因子Ephexin4を介し、がん細胞の運動亢進及びアノイキス耐性の獲得に寄与することを明らかにしていた。本研究ではこのシグナルの抑制機構を調べるために、イヌ腎臓由来のMDCK細胞を用いた三次元培養モデルに着目した。この解析では、肝細胞増殖因子HGF刺激によるがん細胞様の浸潤形質の誘導を、シスト(上皮管腔構造)の伸長を指標として確認できる。昨年度の成果から、EphA2ノックダウンによりシストの伸長が抑制されることがわかった。そこで、野生型EphA2、897番目のセリン(S897)をアラニンに置換した変異体EphA2-SA、そしてチロシンキナーゼ活性を欠失させた変異体EphA2-KMを、それぞれEphA2ノックダウン細胞に発現させ三次元培養を行った。その結果、野生型及びKM変異体を発現させた場合のみノックダウン効果の消失が見られた。またEphexin4ノックダウンでもシストの伸長が抑制されることから、野生型Ephexin4、RhoG活性化機能を欠失させた変異体を、それぞれEphexin4ノックダウン細胞に発現させたところ、野生型を発現させた場合のみノックダウン効果の消失が見られた。さらに、HGFのRhoG活性制御におけるEphA2の関与を調べた。コントロール細胞ではHGF刺激後に、RhoG活性が上昇するのに対し、EphA2ノックダウン細胞では活性に変化は見られなかった。以上の結果から、MDCK細胞ではHGF刺激によりEphA2のS897がリン酸化され、Ephexin4/RhoG経路が活性化されることでシスト伸長を制御する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。チロシンキナーゼ受容体の一つであるEphA2は浸潤・転移性を示すがん細胞において高発現しており、がん化促進への関与が指摘されている。所属する研究室では、細胞運動・接着に関与しているRhoファミリー低分子量G蛋白質Rh(6に着目し、EphA2のがん化促進メカニズムの解析を行っている。以前我々はEphA2がRhoGの新規活性化因子Ephexin4を介してがん細胞の運動性・浸洞性を促進していることを明らかにした。しかしEphA2、Ephexin4、RhoGはがん細胞だけなく上皮組織由来の細胞株においても発現が確認されていることから、本研究ではがん化促進シグナルを抑制する分子機構の解明を目的として実験を行っている。まずEphexin4制御因子を特定するため、RhoG結合領域外で結合する蛋白質の探索を行い、Scribbleという蛋白質がPDZドメインを介してEphexin4のC末端に結合することを明らかにした。Scribbleはがん抑制因子として働くことから、IEK293丁細胞においてEphexin4と共発現させ運動性への影響を調べた。その結果Ephexin4による運動促進作用はScribbleの発現により抑制されることがわかった。次によりvivoに近い系で機能を評価するため、イヌ尿細管由来のMDCK細胞を用いた三次元培養法による解析を行った。MDCK細胞は細胞外マトリックス蛋白質に富んだ環境で培養することにより、Cystと呼ばれる、中に管腔を持つ球状構造を形成する。この手法を用いてScribbleとの結合能を欠失させた変異体、Ephexin4-ΔCを発現させたMDCK細胞を培養したととろ、Cyst構造に異常が見られた。さらにCyst形成・維持におけるEphexin4の役割を調べるため、Tet-offシステムを用いて現在実験を行っている。Tet-offシステムでは、ドキシサイクリンを培地に添加することによりCyst形成途中でも容易に蛋白質の発現抑制が可能となる。また内在性のEphA2、Ephexin4、あるいはScribbleをノックダウンしたmCK細胞も作製しており、運動性やCyst形成・維持への影響についても検証を行っている。以前の研究からEphA2はリガンド非依存的に、細胞運動・接着に関与するRhoファミリー低分子量G蛋白質RhoGとその活性化因子Ephexin4を介し、がん細胞の運動元進及びアノイキス耐性の獲得に寄与することを明らかにした。本研究ではこのシグナルの抑制機構を調べており、これまでにEphexin4と結合する抑制因子としてScribbleを特定した。しかし、EphA2との関係性、がん化前後の制御メカニズムを評価する上で最適な実験系の選定には至っていなかった。そこで上皮細胞を用いた三次元培養モデルに注目し、その有用性を検討した。この解析では、肝細胞増殖因子HGF刺激によるがん細胞様の浸潤形質の誘導を、Cyst(上皮管腔構造)表面の突起形成形を指標として確認する。そこでまず、HGF刺激によるEphA2の性質変化を確認した。

発がん性を示すEphA2ではリガンド結合時とは違い、897番目のセリンにリン酸化を受けており、この部分を特異的に認識する抗体を用いてその割合を調べたところ、刺激後に有意な上昇が見られた。この結果を受け、三次元培養モデルにおけるEphA2ノックダウンの影響を調べた。その結果、ノックダウンにより突起を形成するシストの割合は有意に減少した。また野生型EphA2を発現させた場合、この効果が消失するのに対し、発がん性を示さないEphA2の変異体を発現させても、変化は見られなかった。以上により、HGF刺激による浸潤形質の獲得にはリガンド非依存的な活性を示すEphA2が必要であることがわかった。また形質変化前後のEphA2制御メカニズムを比較評価する上で、三次元培養モデルの有用性を示すことが出来た。チロシンキナーゼ受容体EphA2は浸潤・転移性を示すがん細胞で高発現している。所属する研究室ではシグナル伝達の観点から、EphA2のがん化促進メカニズムの解析を行っている。以前の研究からEphA2はリガンド非依存的に、細胞運動・接着に関与するRhoファミリー低分子量G蛋白質RhoGとその活性化因子Ephexin4を介し、がん細胞の運動亢進及びアノイキス耐性の獲得に寄与することを明らかにしていた。本研究ではこのシグナルの抑制機構を調べるために、イヌ腎臓由来のMDCK細胞を用いた三次元培養モデルに着目した。この解析では、肝細胞増殖因子HGF刺激によるがん細胞様の浸潤形質の誘導を、シスト(上皮管腔構造)の伸長を指標として確認できる。昨年度の成果から、EphA2ノックダウンによりシストの伸長が抑制されることがわかった。そこで、野生型EphA2、897番目のセリン(S897)をアラニンに置換した変異体EphA2-SA、そしてチロシンキナーゼ活性を欠失させた変異体EphA2-KMを、それぞれEphA2ノックダウン細胞に発現させ三次元培養を行った。その結果、野生型及びKM変異体を発現させた場合のみノックダウン効果の消失が見られた。またEphexin4ノックダウンでもシストの伸長が抑制されることから、野生型Ephexin4、RhoG活性化機能を欠失させた変異体を、それぞれEphexin4ノックダウン細胞に発現させたところ、野生型を発現させた場合のみノックダウン効果の消失が見られた。さらに、HGFのRhoG活性制御におけるEphA2の関与を調べた。コントロール細胞ではHGF刺激後に、RhoG活性が上昇するのに対し、EphA2ノックダウン細胞では活性に変化は見られなかった。以上の結果から、MDCK細胞ではHGF刺激によりEphA2のS897がリン酸化され、Ephexin4/RhoG経路が活性化されることでシスト伸長を制御する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。Ephexin4の活性制御因子の候補の一つとして、Scribbleを同定する事ができた。またEphxin4の機能に与える影響の解析として、transwell migration assayや三次元培養を行い、活性制御因子である事を示す一定の結果が得られた。しかしEphA2との関与を検証する実験を予定していたが、本年度はできなかった。
植物ホルモンの新規な代謝酵素の同定と機能解析

ジャスモン酸(JA)は病傷害ストレス応答,生長などに関与する植物ホルモンである.本研究ではJAシグナルの不活性化に働くと推定したCYP94D1,CYP94D2およびILL6の機能解析を行った.CYP94D1については遺伝子発現量の調整により表現型の変化が認められた.すなわち,遺伝子欠損株ではJAへの感受性の低下,過剰発現体ではJAの水酸化物の誘導体ツベロン酸グルコシドの蓄積が見られた.ジャスモン酸は病傷害ストレス応答や成長を制御する植物ホルモンである。シグナル活性本体のジャスモン酸とイソロイシンの接合体(JA-Ile)、あるいはジャスモン酸が水酸化を受けることでシグナルの不活性化が起きると考えられている。本研究では,未解明のジャスモン酸水酸化メカニズムを明らかにすることを目的とした。ジャスモン酸水酸化酵素として推定したCYP94D1とCPY94D2の解析を行うため,昨年度はこれらの酵素遺伝子の酵母による発現を試みたが,組換えタンパク質の生産は見られず,生化学的機能の解析に至らなかった。本年度は遺伝子欠損変異体を用いたジャスモン酸シグナル感受性試験を行った。CYP94D1欠損変異体は昨年度にホモ接合体を取得済みであるため,昨年度に引き続きCYP94D2の欠損変異体のホモ接合体の取得を試みた。しかし,CYP94D2欠損変異をヘテロで持つものしか取得されなかった。eFPブラウザーにより遺伝子発現部位などを調査した結果,CYP94D2は胚発生時に特異的に発現する遺伝子であることが判明した。このことからCYP94D2は胚発生に必須の因子であり,欠損をホモで持つと致死となると考えられた。このためCYP94D2については次年度に計画している過剰発現体により機能を解析することとした。CYP94D1の欠損変異体の傷害ストレスにおけるJA類の内生量の変化を解析したところ,予想に反し変異体におけるJA-Ile水酸化体の蓄積量は高かった。また,ジャスモン酸メチルによるシロイヌナズナの根の伸長阻害が欠損変異体では穏やかな傾向が観察された。このことはCYP94D1の欠損によりJA-Ileの高まり,JAシグナルの不活性化が促進されたことを意味する。このことからCYP94D1はJA-Ileの水酸化酵素のネガティブレギュレーターとして機能する可能性が示唆された。ジャスモン酸(JA)は病傷害ストレス応答,生長などに関与する植物ホルモンである.本研究ではJAシグナルの不活性化に働くと推定したCYP94D1,CYP94D2およびILL6の機能解析を行った.CYP94D1については遺伝子発現量の調整により表現型の変化が認められた.すなわち,遺伝子欠損株ではJAへの感受性の低下,過剰発現体ではJAの水酸化物の誘導体ツベロン酸グルコシドの蓄積が見られた.ジャスモン酸は病傷害ストレス応答や生長を制御する植物ホルモンである。ジャスモン酸による遺伝子発現促進については,詳細な分子機構が明らかにされつつあるが,不活性化機構はいまだ明らかではない。最近の知見によるとシグナル本体として働くジャスモン酸とイソロイシンの接合体(JA-Ile)あるいはジャスモン酸が水酸化されることにより不活性されると考えられている。JA-Ileと異なり,ツベロン酸の生成機構は全く明らかでない。本研究ではツベロン酸生成機構の解明を目的とした。ツベロン酸の生成経路として,JA-Ile水酸化物の加水分解とJAの直接的な水酸化を想定した。JA-Ile水酸化酵素のCYP94B3と共発現が確認されているILL6は,インドール酢酸-アスパラギン酸接合体の加水分解酵素と配列類似性を示す。ILL6がJA-Ile水酸化物の加水分解酵素であると推定し,大腸菌による組換えタンパク質生産系を構築した。グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合蛋白質は可溶性タンパク質として生産された。得られたタンパク質をJA-Ileおよびその水酸化物と反応させたが,いずれの加水分解も確認されなかった。次にJAの水酸化酵素として注目したCYP94D1とCYP94D2をそれぞれ酵母においてNADPH-シトクロームP450レダクターゼと共発現させ,培地にJAおよびJA-Ileを添加してこれらの培養液中での水酸化を検討したが,水酸化は確認されなかった。酵母の無細胞抽出液中の組換えタンパク質は付加したHisタグを利用したウェスタンブロッティングによりいずれも検出されなかったことから組換えタンパク質が生産されていないことが考えられた。このため,CYP94D1とCYP94D2の遺伝子破壊株におけるツベロン酸量の解析を行うこととした。現在これらの遺伝子破壊株のホモ接合体の単離を進めている。植物の病傷害ストレス応答や成長を制御する植物ホルモンであるジャスモン酸については,活性本体であるジャスモニイルイソロイシン(JA-Ile)の生合成やJA-Ileによるシグナル伝達に関して詳細が明らかになりつつあるが,水酸化や配糖化による不活性化の分子メカニズムについては不明な点が多い.本研究ではジャスモン酸類の水酸化を担うと予想したCYP94D1およびCYP94D2の生理機能を明らかにすることを目的とした.今年度は,CYP94D1およびCYP94D2遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換体を作出し,これらにおけるジャスモン酸類の内生量について解析を行った.CaMV35S