hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臓器移植後HHV-6中枢神経系感染症の病態解明ならびに診断治療指針の確立

1.造血幹細胞移植、生体肝移植後のHHV-6再活性化とサイトカインの関連性ウイルス分離、血清診断、リアルタイムPCR法によるウイルスDNAモニタリングを行なった。一年間に約30例を解析、そのうち約40%でHHV-6感染を確認したが、中枢神経系合併症を来たした症例はなかった。これらの患者から経時的に採取された血清を用いサイトカイン濃度を測定し、HHV-6再活性化にはIL-6、TNF-αの二つのサイトカインが重要な役割を演じていることが示唆された。2.成人造血幹細胞移植後HHV-6脳炎症例のウイルス学的解析2名の造血幹細胞移植後脳炎患者のウイルス学的解析依頼を受け、ウイルス分離、血清診断、髄液中ウイルスDNAモニタリングを実施。2例とも血液からのウイルス分離は陰性で、抗体価の有意上昇も認められなかったが、急性期髄液中には多量のHHV-6DNAが存在し、ガンシクロビル治療によりviral loadが急速に低下して行くことが明らかとなった。今後臨床像、種々の検査所見との関連性を解析する予定である。3.造血幹細胞移植後のHHV-6ならびにCMV、EBV再活性化HHV-6についてはこれまで同様移植後2週から3週に再活性化のピークを認めたが、EBV、CMVについては明らかなピークは認められなかった。3種類のウイルスとも、移植後約2ヶ月間にほぼ半数の患児で再活性化が認められた。原疾患と再活性化の頻度について解析した結果、EBVは非悪性腫瘍群で有意に再活性化の頻度が高く、HHV-6については悪性腫瘍群で有意に高頻度だった。HLAタイピングについての解析では、EBV感染がミスマッチ群で有意に高頻度、CMVとHHV-6については有意な相関はなかった。さらに、ドナーグラフとの種類については、HHV-6感染のみが臍帯血移植群、非血縁群、血縁群の順に高頻度であったが、他の2種類のウイルスではそのような傾向はなかった。1.小児造血幹細胞移植患者から経時的なサンプリングを行い、血液からのHHV-6分離、抗体価測定によりウイルス感染の有無を決定。同時に採取した血清を用い種々のサイトカインを測定し、ウイルス再活性化とレシピエントの血中サイトカイン動態を解析した。その結果、TNF-α、IL-6の上昇がウイルス再活性化に先行し、ウイルス感染後はIL-6の上昇が持続することが明らかとなった。2.大阪赤十字病院血液内科から2名の造血幹細胞移植後脳炎患者のウイルス学的解析依頼を受け、ウイルス分離、血清診断、髄液中ウイルスDNAモニタリングを実施。2例とも血液からのウイルス分離は陰性で、抗体価の有意上昇も認められなかったが、急性期髄液中には多量のHHV-6 DNAが存在し、ガンシクロビル治療によりviral loadが急速に低下して行くことが明らかとなった。3.これまで報告された造血幹細胞移植後のHHV-6脳炎は殆どが成人例である。我々はこれまで多数の小児例を解析してきたが、移植後のHHV-6脳炎症例は経験していない。そこで、同様のウイルス学的解析方法を用いて、小児例と成人例のHHV-6感染症、特に脳炎の発症頻度、症状に差があるかどうか明らかにするため前方視的研究を開始した。

今年度は、研究計画書を本学倫理委員会に提出し承認を得た後、本外血液内科で臍帯血移植を受けた2例について経時的にサンプリングし解析した。そのうちの一例は、移植後2週間目と1ヶ月目にウイルスが分離された。このように長期間ウイルス血症が続く(あるいは反復)することは小児例では極めて稀である。発熱、下痢、肝機能障害は認めてものの、脳炎症状は認められなかった。今後、本研究を継続し多数例を解析する予定である。臓器移植後のHHV-6中枢神経感染症の病態解明を目指し引き続き小児、成人造血肝細胞移植患者から経時的なサンプリングを行いウイルス分離、血清診断、リアルタイムPCR法によるウイルスDNAモニタリングを行なった。小児はこの一年間に約30例を解析、そのうち約40%でHHV-6感染を確認したが、中枢神経系合併症を来たした症例はなかった。一方成人例は残念ながら症例数が少なく3例のみであったが、3例とも神経症状はなかった。これらの患者から経時的に採取された血清を用いサイトカイン濃度を測定し、HHV-6再活性化にはIL-6、TNF-αの二つのサイトカインが重要な役割を演じていることが示唆された。他施設からHHV-6脳症を疑われて検査依頼があった成人造血肝細胞移植患者の中で、HHV-6感染が証明された8例の髄液中サイトカインを測定した。これまではELISA法によりサイトカイン濃度を測定していたが、その場合は検査あたり50100μlの検体が必要なため複数のサイトカインについて包括的に解析するのは困難だった。そこで今年度の研究では、フローサイトメーターを使ったCytometric Beads Array (CBA)システムを用いて一度に6種類の炎症性サイトカイン測定を試みた。その結果それら8例では髄液中IL-8とIL-6の上昇が認められた。IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-12は殆ど検出されなかった。今後、成人のその他疾患患者の髄液中サイトカイン値を測定し比較するとともに、各患者の臨床症状との関連性について詳細に解析してゆく予定である。対象は造血幹細胞移植を受けた小児51名(男児:28例、女児:23例、平均年齢:8±5.4歳)。患児の背景(原疾患、ドナーグラフト種類、HLAタイピング)についてはカルテを基に後方視的に調べた。全血200μ1からDNAを抽出し、リアルタイムPCR法にてEBV、CMV、HHV-6 DNA量を測定。HHV-6についてはウイルス分離、抗体測定も行った。EBVは1000コピー/μgDNA、CMVは100コピー/μgDNA、HHV-6は10コピー/μgDNAを感染ありと規定しウイルス再活性化状況を解析。サイトカインとの関連性解析の際には、HHV-6のみウイルス分離と血清診断の成績も加味して判定した。血清中サイトカインについては6種類(IL-8,IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α,IL-12p70)をCytometric Beads Arrayにて測定した。ウイルスDNA量を基準として各ウイルス再活性化状況を解析した結果、HHV-6についてはこれまで同様移植後2週から3週に再活性化のピークを認めたが、EBV、CMVについては明らかなピークは認められなかった。3種類のウイルスとも、移植後約2ケ月間にほぼ半数の患児で再活性化が認められた。
自立循環都市ディスカッションツールの開発

本研究の目的は、既成市街地における環境負荷低減型のまちづくり、自立循環型都市構築を実現するため合意形成ツール、すなわちディスカッションツールを開発することにある。ツールはデルフト工科大学にて開発されたDCBAメソッドをベースに、日本の状況、特に地方都市の既成市街地の自立循環性向上を対象テーマとし、ツールに必要な情報の整理、ワークショップ手順の整理、ワークショップの成果物のまとめ方などの整理・開発を行った。研究の実施においては、埼玉県北部に位置する本庄市の既成市街地、東小学校校区を対象とした。東小学校校区は市役所も立地する中心市街地に位置する。初年度から市役所の協力を得て、地域住民、行政関係者、環境NPO、大学関係者、通学者が参加するワークショップを開催した。初年度から2年は議論するテーマを環境関連に絞り必要な情報整理、手法の開発を行い、最終年度は快適性や経済性など、その他のテーマも含めた総合的なディスカッションツールとして開発し、ワークショップを開催して使いやすさ、効果を検証した。本研究は、地域住民や行政担当者、地元産業界、環境NPO関係者といった地域のステイクホルダーの参加のもと、将来の持続可能な都市に向けて合意可能なシナリオ作成を可能にするディスカッションツールを開発することを目的としている。オランダの環境技術に関するディスカッションツールであるDCBAメソッドは、環境共生団地として名高いニューランドやエコロニアの開発に活用され大きな成果を上げている。そこで本年度はこのDCBAメソッドを日本版にアレンジし、これを用いて対象都市における複数回のワークショップを行い、結果を踏まえて漸次改良していくという方法を採った。本年度の研究成果として、以下のような点が挙げられる。(1) DCBAメソッドの日本語化と日本技術水準での改訂DCBAメソッドの開発者であるデルフト工科大学名誉教授ケース・ダウフェスタイン氏を招聘し、手法の開発プロセスや活用事例の紹介、日本型アレンジに際しての留意事項など、助言を頂いた。これを踏まえDCBAメソッドの日本語化と日本技術水準での改訂を行った。(2) DCBAメソッドの、市民の議論スキルを考慮した改造作成した手法を用いて、地域のステイクホルダーの参加のもと全4回のワークショップを行った。参加者には毎回、手法の理解度や意識の変化などについて事前・事後のアンケートを行い、これを踏まえDCBAメソッドの市民の議論スキルを考慮した改造を行った。(3)持続可能な地域像の作成に向けた協力者の発掘研究グループは、本庄市の環境NPO団体主催の植林活動・農作業などへ参加し、会場でチラシの配布などワークショップの広報を行った。こうした活動を通し環境に対する関心の高い市民を協力者として発掘することができた。また、ワークショップの参加者からは手法に対する高い支持を得、大半の参加者に全4回を通し続けての参加協力を得た。平成22年度は、本庄東小学校区をケーススタディの対象エリアとして、緑化、交通と並び、対象エリアにおける重点項目として抽出されたエネルギーに関するワークショップを行いその目標レベルを設定した。さらに昨年度からの各ワークショップ成果を重ね合わせ、本庄東小学校区における多主体参加型環境共生都市ビジョンを作成した。その後、ワークショップの成果発信の場として、同フィールドにおける他の調査・研究と連携して、市民に向けた研究報告会を開催し、作成したビジョンを市民に広く発信すると共に、ビジョンに対する意見聴取を行った。同時に環境共生型まちづくりにおける合意形成ツールとして、日本型DCBAメソッドの開発を行った。日本型DCBAメソッドでは、各ワークショップ、行政関係者、有識者へのヒアリングの成果を基に、手法の構成、資料の内容、レベル設定の工夫を行い、一般的な日本人の議論スキルに応じた手法の改良を行っている。また、これらの手法を活用した合意形成の場において情報提供をバックアップするシナリオ研究では、交通に係るエネルギーに着目し、東京都市圏パーソントリップ調査を基に交通需要推計モデルを構築し、そのモデルを用いて、旧本庄市における日常生活圏単位での現状のトリップエネルギー分布の把握を行った。その後、都市構造と路線バスそれぞれについて再編シナリオを設定し、構築した交通需要推計モデルから、シナリオごとのトリップエネルギー削減効果の検証を行い、都市構造と路線バスの再編を組み合わせた総合的な対策の有効性を示した。現在、環境問題の深刻化から環境負荷低減に向けた取り組みは、建物単体規模での省エネルギー化のみならず、環境基本計画の策定など都市・地方自治体といった広域な規模で進められている。多くの地方都市では、環境問題に加え直面する課題は多岐に渡るが、優先順位の低さや市民の認知度の低さなどから、今一つ実行に向けて具体的な取り組みが進んでいない。計画的に環境対策を実行するには、行政、地域住民、NPO団体など多主体参加のもとで、取り組むべき課題の優先順位を整理し、地域の将来像を共有するためのコミュニケーションが重要になる。

本研究では、オランダにおけるDCBAメソッドを、地方都市の低炭素化に向けた既存市街地再整備方針立案手法として活用する。その成果を基に日本に適した環境配慮型まちづくりにおける合意形成手法を開発し、自立循環都市シナリオ作成支援技術の確立を行う。平成23年度では昨年度までに開発されたDCBAワークショップ手法の問題点の改良を行った。特に地域の現状を把握し、認識を高める為の手法としてキャプション評価法およびKJ法の手法を一部取り入れた。また、対象とするテーマについても、環境的側面だけでなく既存の都市評価指標手法で採用されている項目も合わせて取り入れ、より総合性を高めた手法に改良した。この改良した手法を用い、昨年度と同様の埼玉県本庄市本庄東小学校区にてDCBAワークショップを開催し、改良したDCBAワークショップ手法の有効性を検証した。
超高感度ピクセル型光検出器の開発

本研究は、このEB型センサーにおいて、半導体素子としてセグメント化されたアバランシェダイオード(AD)を用いることにより、位置情報を有する超高感度ピクセル型光センサーを開発しようとするものである。セグメント化されたADを適用することには二つの意義があると考えられる。高い精度の2次元位置情報を得られることはもちろんの事、それに加えて大きな受光総面積を持ちながら、独立した各個半導体素子(ピクセル)の容量を小さく保つことによって、優れたノイズ特性、高速の応答性などが達成できる大きな可能性を有することがあげられる。EB型センサの要素技術は、光電面、電子軌道設計、半導体素子よりなる。光電面としては初期の試作は、通常のバイアルカリを用いた。また構造としては高い磁場中での使用を考慮して、光電面と半導体素子を近接配置する近接集束型電子レンズのタイプを採用した。また半導体素子としては、最小厚の不感層を実現しかつ電子打ち込みに起因する損傷を抑える構造として、裏面照射形のアバランシェダイオードを、8×8のマルチピクセル化したものを新たに設計・試作した。プロトタイプEB型センサのパルス光応答特性を通常のPMTとの比較で示すと、EB型センサは、ライズタイム、フォールタイムそれぞれにおいて400ps程度とPMTに対し極めて高速であることを確認できる。現在のところこの応答特性はSi製の半導体素子で制限されており、化合物系半導体素子を用いることで、さらに高速化できることが期待される。少数フォトンを入射したときのパルス波高分布を比較検討すると従来のPMTで容易でなかった入力されたフォトン数の弁別が、本研究にて開発されたセンサの最終試作品においては、その明確な識別が10フォトン程度まで可能なことがわかる。ここまでの高いフォトン弁別能力と分解能を持つ光センサーはいまだかって存在しなかった。これはその大きな初段増幅度によって当該タイプのセンサの電子増倍ゆらぎが本質的に小さいこと、独立した半導体素子(ピクセル)のサイズが小さく従ってその容量が小さいことに負っている。高い初段増幅と近接収束の利点を生かしたことで、高い時間分解能も比較的容易に達成できた。シングルフォトン入力に対するタイミング測定の結果を右に示す。100ピコ秒以下の高い分解能が得られている。磁場特性についの性能比較においては、下図に示すように、PMTは0.002T程度の磁場強度においてそのゲインが初期値の50%程度までの低下を示し、0.01T程度でほぼ使用不能となるが、今回開発されたセンサーではテストに使用した磁場発生装置の上限である1.5Tまで、ほぼゲインの劣化がないことが確認された。このように、今回開発された超高感度光センサは、種々の特性において現在広く使用されているPMTよりも本質的な優位性を示すことがはっきりと示された。

初年度に当たる今年度は、本研究で開発すべき高感度ピクセル検出器の構成について、まず検討を行った。高い位置分解能と同時にシングルフォトンレベルの高感度を実現するために、電子管内部にピクセル化された半導体センサーを内蔵する、いわゆる電子打ち込み型を採用することとした。半導体センサーとしては高いノイズ特性が期待できるアバランシェフォトダイオード(APD)を応用する。ここで問題となるのは光センサーとして開発されたAPDでは、電子打ち込みで使われる光電面からの低エネルギー電子検出に対して適切な構造をしていない点である。APDの感光面表層の不感領域(電極等)が低エネルギー電子の通過を妨げ、高い検出効率が期待できない。そこでまず専用のAPDを開発することから着手することとした。開発に当たっては、各種の条件を変えたテストサンプルを作り、その半導体センサーとしての性能を評価することで、最適化を行う手法を取った。いくつかの構造についてはコンピュータによるシミュレーション等を行い、テストサンプルの構造をリーチスルータイプなどに絞り込んだ。本開発の応用ではAPDはピクセル分割化されている必要があり、そのためのR&Dも重要な課題である。テストサンプルではこれについても、4×4の分割タイプでいくつかの条件を設定し、ピクセル間の不感領域の大きさや相互のクロストークなどの評価を行った。できあがったテストサンプルの評価により、実用に堪える構造の分割APDの製造についてはめどがついた。またこの評価の過程で、ピクセルからの配線が大きなクロストークの要因になりうることが明らかとなり、次年度からの実用サイズのセンサー開発への課題となった。前年度のAPD構造の検討から、いわゆる逆リーチスルー構造が本開発のような電子打ち込み型の検出器にとって公的であることがわかってきた。今年度はこの構造を持つ8x8=64のセグメントを持つ2次元APDアレイを製造しその特性を評価するとともに、満足のいくものについては実際にフォトカソードを持つ電子管の中へ実装して性能評価した。ブレイクダウンまでに30倍以上ゲインが確認され、時間特性も信号立ち上がり2ナノ秒が得られた。またピクセル間のデッド領域も10ミクロン以下と良好であった。このAPDを通常のマルチアルカリフォトカソード光電面を持つ、近接型電子管に実装し、HPD(ハイブリッドフォトディテクタ)するに当たり、信号の取り出しを可能とするために積層セラミックによるステムを新たに開発した。試作された電子管について量子効率の測定を行い400nm以下の波長で20%を超えることが確認された。さらにゲインとし電子打ち込みから1300、APDのアバランシェより17、総合で2x10^4以上のゲインが測定された。フォトンカウンティング性能についての評価は、シングルフォトンに対するパルス波高分布の幅として評価されるが、これが電子打ち込み電圧およびAPD電圧に対してきわめて鋭敏に反応することが見出された。
化学物質人体影響の定量的評価のための複合細胞培養システムの開発研究

まず,市販の膜型培養器を用い,モデル小腸膜(ヒト大腸ガン由来Caco-2細胞)とモデル標的臓器細胞(ヒト正常二倍体線維芽細胞TIG-1)からなる簡便な静置型二層培養システムを開発した.4つのモデル化学物質について,TIG-1細胞増殖阻害で定義されるED50値は,二層培養では単層培養(Caco-2膜無し)と比較して,経口吸収率を反映して高濃度側に変化し,Caco-2膜を導入することで,毒性発現における経口吸収率の補正を行うことができ,in vivo毒性の予測性が向上することが確認できた(AATEX誌掲載).この検討で,ある化合物については,in vivoの小腸で近年報告されているような,代謝と極性輸送(体外側への選択的排出)が間接的に観測された.そこで,体内解毒酵素として有名なチトクロ.ムP450によって代謝活性化を受け強力な発ガン物質への変化する事が知られているBenzo[a]pyreneをモデル化学物質として用い,標的臓器細胞としてTIG-1の代りに肝臓ガン由来のHep G2細胞を用いて同様の検討を行った.すると,Caco-2細胞にもHep G2に劣らないチトクロ.ムP450活性が観測され,しかもそれはBanzo[a]pyreneによって強力に誘導された.さらに,また,Benzo[a]pyreneの代謝によって生じる毒性物質は,主としてCaco-2膜の上側にのみ現れ,下側(体内側)には,1/10以下しか出現しなかった.このように人体内外のバリア.として働く細胞と臓器細胞とを適切に組み合わせ,in vitro培養系として使用することで,小腸での代謝・極性輸送,肝臓での代謝といったin vivoで見られる極めて複雑な過程を,ある程度再現可能であることが示された(第14回日本動物実験代替法学会ゴ.ルデンプレゼンテ.ション賞受賞,投稿準備中).さらに,小腸と肝臓・その他臓器からなる灌流培養システムを製作し,モデル化学物質として,小腸でその大部分が吸収され,肝臓での代謝活性化を受け,肝特異的な毒性を発現するアセトエミノフェンを用いて,検討を行った(動物細胞工学ハンドブック掲載).その結果,Caco-2膜を導入したシステムの方が,Caco-2膜無しのシステムに比べて,毒性が早く強力に発現するという興味深い結果となった.この原因を探るために,アセトエミノフェンの代謝活性化に最も深く関与するチトクロ.ムP450 3Aの活性を,両細胞について測定したところ,Caco-2膜に非常に高い活性が測定され,これが強力にアセトエミノフェンの代謝活性化を行ったために,上述の結果となったと推察された.この系では,高密度培養を用いたが,各コンパ.トメント内を攪拌していなかったために,細胞活性の維持が3日程度が限界であった.そこで,システム全体を旋回攪拌する新規システムを開発し,Benzo[a]pyreneをモデル物質として,検討を進めている.まず,市販の膜型培養器を用い,モデル小腸膜(ヒト大腸ガン由来Caco-2細胞)とモデル標的臓器細胞(ヒト正常二倍体線維芽細胞TIG-1)からなる簡便な静置型二層培養システムを開発した.4つのモデル化学物質について,TIG-1細胞増殖阻害で定義されるED50値は,二層培養では単層培養(Caco-2膜無し)と比較して,経口吸収率を反映して高濃度側に変化し,Caco-2膜を導入することで,毒性発現における経口吸収率の補正を行うことができ,in vivo毒性の予測性が向上することが確認できた(AATEX誌掲載).この検討で,ある化合物については,in vivoの小腸で近年報告されているような,代謝と極性輸送(体外側への選択的排出)が間接的に観測された.そこで,体内解毒酵素として有名なチトクロ.ムP450によって代謝活性化を受け強力な発ガン物質への変化する事が知られているBenzo[a]pyreneをモデル化学物質として用い,標的臓器細胞としてTIG-1の代りに肝臓ガン由来のHep G2細胞を用いて同様の検討を行った.すると,Caco-2細胞にもHep G2に劣らないチトクロ.ムP450活性が観測され,しかもそれはBanzo[a]pyreneによって強力に誘導された.さらに,また,Benzo[a]pyreneの代謝によって生じる毒性物質は,主としてCaco-2膜の上側にのみ現れ,下側(体内側)には,1/10以下しか出現しなかった.このように人体内外のバリア.として働く細胞と臓器細胞とを適切に組み合わせ,in vitro培養系として使用することで,小腸での代謝・極性輸送,肝臓での代謝といったin vivoで見られる極めて複雑な過程を,ある程度再現可能であることが示された(第14回日本動物実験代替法学会ゴ.ルデンプレゼンテ.ション賞受賞,投稿準備中).さらに,小腸と肝臓・その他臓器からなる灌流培養システムを製作し,モデル化学物質として,小腸でその大部分が吸収され,肝臓での代謝活性化を受け,肝特異的な毒性を発現するアセトエミノフェンを用いて,検討を行った(動物細胞工学ハンドブック掲載).その結果,Caco-2膜を導入したシステムの方が,Caco-2膜無しのシステムに比べて,毒性が早く強力に発現するという興味深い結果となった.

この原因を探るために,アセトエミノフェンの代謝活性化に最も深く関与するチトクロ.ムP450 3Aの活性を,両細胞について測定したところ,Caco-2膜に非常に高い活性が測定され,これが強力にアセトエミノフェンの代謝活性化を行ったために,上述の結果となったと推察された.この系では,高密度培養を用いたが,各コンパ.トメント内を攪拌していなかったために,細胞活性の維持が3日程度が限界であった.そこで,システム全体を旋回攪拌する新規システムを開発し,Benzo[a]pyreneをモデル物質として,検討を進めている.本年度は,小腸からの吸収と肝臓での代謝・毒性発現を再現することを目的として,2細胞からなる簡単な灌流培養システムを構築した.モデル小腸上皮としてヒト大腸ガン由来C2BBel細胞を,モデル肝細胞としてヒト肝ガン由来HepG2細胞を,それぞれ膜上,マイクロキャリアー上で高密度培養し,生理的な回路からなる灌流培養システムに組み込んだ.高密度培養されたHep G2細胞の活性維持が課題であったが,モデル肝組織コンパートメントの形状に工夫を施すことで,1週間程度までは活性を保持したまま安定に培養可能であることが示された.モデル化学物質としては,小腸からよく吸収され,肝で代謝活性化をうけ,肝で毒性を発現するような物質,すなわちベンツピレン・アフラトキシン.・アセトアミノフェンの3種をまず検討した.ベンツピレンは小腸における吸収時に代謝を受け無毒化された.アフラトキシンについては,小腸での代謝の結果,小腸にて主に毒性発現し,短時間では肝組織への障害が見られなかった.小腸における代謝無毒化・活性化は薬物のバイオアベイラビリティーを評価する上で近年注目されており,我々が観察した現象を非常に興味深いものではあったが,本年度においては,これらの現象が顕著にはみられなかったアセトアミノフェンを用いて,3日間の本実験を行った.その結果,吸収を考慮することで,毒性発現への時間的な遅れと,絶対的な毒性強度の低下を定性的ではあるが再現することが出来た.アセトエミノフェンの毒性発現は,解毒と代謝活性化のバランスによって決定されているため時間依存性が高く,これらの機構を解明・記述することは臨床上も意義深い.次年度においては,排泄過程を付加した上で,繰り返し投与時における毒性発現における非線型性を観察出来るようなシステムと運転条件を用いて,本研究のようなバイオロジカルな実験系の優位性を示したいと考えている.まず,市販の膜型培養器を用い,モデル小腸膜(ヒト大腸ガン由来Caco-2細胞)とモデル標的臓器細胞(ヒト正常二倍体線維芽細胞TIG-1)からなる簡便な静置型二層培養システムを開発した.4つのモデル化学物質について,TIG-1細胞増殖阻害で定義されるED50値は,二層培養では単層培養(Caco-2膜無し)と比較して,経口吸収率を反映して高濃度側に変化し,Caco-2膜を導入することで,毒性発現における経口吸収率の補正を行うことができ,in vivo毒性の予測性が向上することが確認できた(AATEX誌掲載).この検討で,ある化合物については,in vivoの小腸で近年報告されているような,代謝と極性輸送(体外側への選択的排出)が間接的に観測された.そこで,体内解毒酵素として有名なチトクロ.ムP450によって代謝活性化を受け強力な発ガン物質への変化する事が知られているBenzo[a]pyreneをモデル化学物質として用い,標的臓器細胞としてTIG-1の代りに肝臓ガン由来のHep G2細胞を用いて同様の検討を行った.すると,Caco-2細胞にもHep G2に劣らないチトクロ.ムP450活性が観測され,しかもそれはBanzo[a]pyreneによって強力に誘導された.
テネイシンによる糸球体障害修復機構の研究

1)細胞外マトリックス分子テネイシンに焦点を当て、テネイシン欠損マウスとそのコンジェニックマウスにハブ毒によって実験的糸球体腎炎を誘発したところ、正常群では、病理所見および臨床所見共に時間経過と共にほぼ完治したが、欠損群では悪化し、4ヵ月後には腎機能障害によって全て死亡した。病理所見では、欠損群の糸球体は、線維化が激しく硬化していた。2)時間経過に伴う糸球体における種々の因子および細胞増殖変化を測定したところ、欠損群では、メサンギウム細胞の増殖が悪く、これに伴ってPDGF-BBの発現が減少していた。一方、TGF-βは正常群では細胞増殖に伴った発現調節されていたが、欠損群では、時間経過と共にむしろ発現が増加する傾向が観察され、これに伴って、フィブロネクチンや4型コラーゲンの発現量も増加していた。3)正常およびテネイシン欠損マウス糸球体からメサンギウム細胞(メ細胞)を単離培養して樹立した細胞株を用いて、この細胞の増殖に対するサイト力インの影響を観察した。正常メ細胞は、PDGF-BBに良く反応して増殖するが、欠損メ細胞は、殆ど反応しなかった。しかし、テネイシン上での培養によって欠損メ細胞はPDGF-BBへの反応性を回復し正常メ細胞と同様に増殖した。一方、これらの細胞増殖は抗-テネイシン抗体によって抑制された。4)ハブ毒で誘発した実験的糸球体腎炎モデルおよびテネイシン欠損マウスを用いて、テネイシンがメサンギウム細胞の増殖に必要なシグナル伝達を調整していることを示したが、正常マウスにハブ毒によって糸球体腎炎を誘発した後、テネイシン機能を中和する抗-テネイシン抗体を投与すると、対象群では時間経過とともに腎臓の機能が正常に戻るが、投与群ではテネイシン欠損マウスの場合と同様、腎臓の機能低下(アルブミン尿、血中尿素量の増加)が観察された。以上のことより、糸球体腎炎の修復過程においてテネイシンは、メサンギウム細胞の増殖に関連した重要な働きを持っていることが再確認された。5)テネイシン欠損マウスから樹立したメサンギウム細胞の培養細胞株を用いて、テネイシンのPDGFやTGF-βの受容体発現に対する影響をPCR法を用いて解析したところ、テネイシンは、これらの受容体の発現調節に関与しているらしいことを示唆する結果を得た。6)成果の論文発表を行った。以上、糸球体腎炎の創傷治癒において、テネイシンはサイトカインに対するメサンギウム細胞の反応性を調整するという重要な役割を演じていることが示された。

2)時間経過に伴う糸球体における種々の因子および細胞増殖変化を測定したところ、欠損群では、メサンギウム細胞の増殖が悪く、これに伴ってPDGF-BBの発現が減少していた。一方、TGF-βは正常群では細胞増殖に伴った発現調節されていたが、欠損群では、時間経過と共にむしろ発現が増加する傾向が観察され、これに伴って、フィブロネクチンや4型コラーゲンの発現量も増加していた。3)正常およびテネイシン欠損マウス糸球体からメサンギウム細胞(メ細胞)を単離培養して樹立した細胞株を用いて、この細胞の増殖に対するサイトカインの影響を観察した。正常メ細胞は、PDGF-BBに良く反応して増殖するが、欠損メ細胞は、殆ど反応しなかった。しかし、テネイシン上での培養によって欠損メ細胞はPDGF-BBへの反応性を回復し正常メ細胞と同様に増殖した。一方、これらの細胞増殖は抗-テネイシン抗体によって抑制された。以上、糸球体腎炎の創傷治癒において、テネイシンはサイトカインに対するメサンギウム細胞の反応性を調整するという重要な役割を演じていることが示された。1)本年度は、前年度の成果の論文発表を行った(別刷り代支払)。2)ハブ毒で誘発した実験的糸球体腎炎モデルおよびテネイシン欠損マウスを用いて、テネイシンがメサンギウム細胞の増殖に必要なシグナル伝達を調整していることを示したが、正常マウスにハブ毒によって糸球体腎炎を誘発した後、テネイシン機能を中和する抗-テネイシン抗体を投与すると、対象群では時間経過とともに腎臓の機能が正常に戻るが、投与群ではテネイシン欠損マウスの場合と同様、腎臓の機能低下(アルブミン尿、血中尿素量の増加)が観察された。以上のことより、糸球体腎炎の修復過程においてテネイシンは、メサンギウム細胞の増殖に関連した重要な働きを持っていることが再確認された。3)テネイシン欠損マウスから樹立したメサンギウム細胞の培養細胞株を用いて、テネイシンのPDGFやTGF-βの受容体発現に対する影響をPCR法を用いて解析したところ、テネイシンは、これらの受容体の発現調節に関与しているらしいことを示唆する結果を得た。現在は、この現象を更に詳細に検討中である。
生体組織病態検出のための散乱光ゆらぎイメージング技術の確立

組織を透過した散乱光強度ゆらぎ解析による組織診断イメージング技術の確立のために、高時間分解能、多点の光子計数システムを試作し光子相関解析を行った。さらに、定量的なイメージングを行うために、散乱光の時間分解解析と光子相関解析とを同時に出来るシステムを構築した。そのシステムを用いて組織模擬散乱体と生きたラット腹部の計測を行った。その結果、皮膚表面から腹部内部の血流に支配されるゆらぎの計測と同時に血液の吸収などに依存する吸収係数および組織の構築などに依存する散乱係数を決定し画像化することが出来た。この技術をガンなどの病態の評価へと応用することにより新しい光学的診断技術が確立すると考えられる。生体組織の血流速あるいは弾性的性質のイメージングを行う手法の確立のために、本年度は、相互相関計測が可能で、さらに同時に空間的に異なる位置で測定することができる多チャンネル相関計測システムを試作した。FPGA(field-programmable gate array)を用い2.08nsのサンプリングタイムで4チャンネル(あるいは1.04nsで2チャンネル)の光子の検出タイミングを同時に記録し、そこからそれぞれのチャネルの自己相関関数とそれらのチャンネル間の相互相関関数をソフトウエア的に計算するシステムを完成させた。検出器を選択することにより相互相関計測をせずとも100ns程度までの時間分解能で自己相関計測が可能であることがわかった。さらに1.04nsのサンプリングで、ピコ秒パルス光に対する時間応答の計測が可能であることも確かめた。しかし、ピコ秒パルスを用いた時間応答測定と光子相関測定の同時測定では、相関関数の振幅が得られなかった。これは、ピコ秒レーザーがトランスフォームリミットの光パルスでないこと、モードロック光と言っても理想的に各縦モードの位相が安定していないことによるのではないかと推定される。この4チャンネル測定システムにより、イントラリピッド溶液の計測を行った。光源に対し異なる距離に検出ファイバを設置し、それぞれの検出ファイバにはコリメータレンズ系を入れた。それによる非接触測定では、溶液からの距離を離すと表面の反射などによると考えられる強いアーテファクトがデータに重畳した。このアーティファクトはレンズ系と対象物を接近させると減少し、この影響を無視するためには、ほとんど接触する距離まで近づける必要があった。入射検出間距離が30mm程度の距離までは良いS/Nであった。相関関数の時間遅れが大きな部分で、時間軸のスケーリング則に理論との食い違いが見られた。人上腕でも計測した。生体組織の血流速や組織の弾性的な性質をイメージングできる拡散相関分光法を確立するために、本年度は、主としてシステム構築を行った。単一縦モードの近赤外レーザーを用い、シングルモードファイバに結合しその強度を2分岐ファイバに導く。このうち一方を実際のサンプル照射にもう一方を強度のモニターを行うようにし、より安定な測定が可能となるようにした。さらに、サンプルからの散乱光をシングルモードファイバで受光し単一光子検出器へと導いた。光子信号は、当初予定していたカウンタボードではなく、FPGAベースのロジックアナライザを用いることを試みた結果、良好な計測が可能で有ることが示され、今後行う検出系の多重化に有効であると考えられた。最初、検出器には半導体単一光子検出器を用い計測を試みたが、アフターパルスが大きく寄与することにより、マイクロ秒オーダーの自己相関関数計測は難しいことがわかった。そのため、新たに最新の光電子増倍管モジュールを用いることによりその問題が解決され、0.2マイクロ秒程度まで自己相関関数で解析できることがわかった。このシステムでの実際の測定は、単散乱領域で計測の精度を確かめ、さらに、生体模擬試料の散乱係数に近い1%イントラリピッド溶液を用いた。1%イントラリピッド溶液については、時間応答関数の測定を行い単散乱領域で得た結果を用いて理論と合わせる予定で有るが、検出カウントの時間的な変動が予想より大きいこと、さらにレーザー光強度を適正な検出光強度になるように調整するための光学系が必要なことがわかった。相関測定の最小時間精度(0.2us)でほぼ問題ないことも確かめた。理論的な解析のために、GPGPUを用いたモンテカルロ計算のプログラムを作成し、時間応答関数とシミュレーションとを比較した。GPGPUを用いることにより計算速度を大きく向上できることが示された。生体組織の血流速あるは弾性的性質のイメージングを行うための手法の確立として、前年度までにマルチチャンネルの光子相関計数システムを試作した。本年度は、パルス入射光の散乱光時間応答関数との同時測定による光学定数の同定を行い、定量的イメージングへの基礎技術を確立した。また、光子相関計数システムの検証のために近赤外蛍光ゆらぎ測定を行い、近赤外蛍光分子の定量法への応用を議論した。

最初に近赤外蛍光ゆらぎの測定により、光子相関システムが1ns近い時間分解能を有し、時間分解計測と相関計測を同一のシステムで計測可能であることが示された。しかし、ラット組織の計測には時間分解能が不足するため、相関測定と時間分解測定は別々のシステムで同時に測定する系を作ることにした。同一の単一モード光ファイバに単一縦モードレーザとピコ秒レーザパルスを入射し、全く同じ光学系で組織などの試料に光を照射した。検出ファイバに接続した検出器からの信号を2つに分け光子相関測定と時間分解測定を並行して行った。その結果時間分解計測から光学定数を決定しつつ同時に散乱体の動態を知る光子相関も測定できる新しいシステムができた。in vivo計測としてラット腹部について計測した。時間分解計測から得られた散乱係数吸収係数は、別のさらに速い時間分解計測システムで計測したものとかなり異なった。そのため散乱係数と吸収係数の定量的な評価は断念し、光学パラメータの変化の指標として時間分解計測の結果を解釈することにした。その結果死亡時のラット腹部の経時計測から、光学定数の変化は少ないにもかかわらず相関関数の遅い部分に大きな変化が見られ、循環の停止によるもの以外に、組織の粘弾性的性質が変化していることが示唆された。最終的に複数の点での計測を行い、相関関数の減衰時間でのマッピングにより動態のイメージングを行うことができた。医用生体光学当初予定していたより、多チャンネル計測システムの構築に時間がかかった。特に、FPGAを用いたシステムを初めて導入したため、その回路設計とその検証に時間を要した。しかしながら、今までよりも極めて安価で高性能な光子相関計測システムを構築することができることが分かり、イメージングを行うために必須な技術の一つをクリアしたと言える。全体計画のうち実験による実証部分が、これらの構築に要した時間のため十分ではなく、その意味でやや遅れていると自己評価を行った。検出器および光源の問題を解決すべく物品を購入するのに時間を要したことが主たる原因である。多チャンネル化されたシステムを持ちい、動きに不均一性のあるモデルファントムを計測し、相関関数の変化を解析する。特に、比較的小さな領域に散乱体溶液を入れる一方、全体はゲルに散乱体を入れ遅いゆらぎを持つようなファントムを構成することにより、組織の中の一部に動きの早い部分があるような状況を模擬する。この解析には過去に行った、不均一な吸収体が時間応答関数に対しておよぼす影響の解析を用いる。吸収体を通過する際の部分光路長などを用いて、動きのある領域の定量化につなげて行く予定である。また、現在ある検出チャンネルのうち2つのチャンネルの検出器の特性はあまり良くないため、ここを新しくすることにより、同時測定の精度をあげたい。時間応答の計測を同時に行うことが難しかったため、入力をパルス光と単一モードCW光の2系統を切り替え、時間応答関数と相関関数の計測を同じ光学系で別々に行うことにより、定量化するために必要な距離情報を得たい。光量を増加させることによりより長い距離での測定も試みたい。
デュアルトレーサー法による転移性骨腫瘍の内部照射療法と増強効果の研究

乳癌、前立腺癌は早期に骨転移を認めても患者の平均余命は比較的長い。従って、骨転移に起因する疼痛を効果的に軽減することは生活の質を維持するのに極めて重要である。近年、骨組織のハイドロオキシアパタイトCa10(PO4)6(OH)2の結晶と交換反応をする骨親和性放射性薬剤が開発された。一つはCaと同じアルカリ土類金属のストロンチウム-89(Sr-89 chloride,半減期:50.5日)であり半減期が長く、γ線を放出しない欠点があった。もう一つはサマリウム-153リン酸化合物(Sm-153 EDTMP,半減期:1.9日)であり半減期が短く、γ線を放出するが、β線のエネルギーが弱い欠点があった。これらの骨親和性の放射性薬剤は臨床的には骨の疼痛軽減効果を認めるも、骨髄抑制の副作用があり投与量当たりの骨摂取量を増強させる必要がある。我々は低Ca飼料および低リン酸飼料を作製し、これらの飼料で飼育したラットで放射性のCaおよびリン酸の骨摂取がどの様に変化をするか検討した。8週令のウィスター系雄ラット(n=18)を対照群(C),低Ca群(A)および低リン酸群(B)に分けて特殊飼料で2週間飼育した。Tc-99mMDPおよびCa-47chlorideをそれぞれ静注し、24時間後の全身骨摂取を測定した後、屠殺して、Ca-47の大腿骨摂取を測定した。Tc-99mMDPの全身骨摂取(%)はC群: 51.7±2.7, A群: 49.6±3.5, B群: 63.9±5.6 (p<0.01)であった。またCa-47chlorideの全身骨摂取(%)はC群: 80.2±2.7, A群: 93.7±3.1 (p<0.01), B群: 72.3±4.3 (p<0.01)であった。また、Ca-47の大腿骨摂取(% dose/g)ではC群: 3.76±0.33, A群: 4.27±0.15 (p<0.01), B群: 3.09±0.18 (p<0.01)であった。以上の結果より2週間の特殊飼料による飼育で低リン酸群(B)では対照群(C)に比べて全身骨で34.0%のTc-99mMDPの摂取増強が認められた。また低Ca群(A)では全身骨で16.3%,大腿骨で13.4%のCa-47摂取の増強が認められた。我々の方法は簡便に骨親和性放射性薬剤の骨摂取を増強させることができ、内部照射療法に応用可能である。

我々の方法は簡便に骨親和性放射性薬剤の骨摂取を増強させることができ、内部照射療法に応用可能である。放射性薬剤体内分布のオートラジオグラフィによる定量評価の検討骨親和性放射性薬剤の体内分布において、標的病変およびその他の臓器への分布が内部照射の計算に不可欠である。Tc-99m標識化合物などのγ線放出性の放射性核種はシンチレーションカメラあるいはカウンターで画像化もしくは計測ができるが、β線放出性の放射性核種の体内分布の画像化は通常、オートラジオグラフィで行われている。しかし、放射能の定量化は必ずしも容易ではない。1)今回、ウィスター系ラットで放射性薬剤投与後、麻酔下でドライアイスで冷却したヘキサン(約-70°C)にて凍結した後、ミクロトームを用いて厚さ20μmの凍結切片を作製し、オートラジオグラフィ専用フィルムに密着された。1週間2ケ月露光した後、現像してオートラジオグラムを作製した。2)オートラジオグラムの定量化はオートラジオグラムをイメージスキャナー(Epson GT-8000)でスキャンし、フィルム上の放射能分布の黒化の程度をデジタル変換し、パーソナルコンピュータ(Macintosh Performa 5210)にデータをとり込んだ。ラットの放射性薬剤体内分布の状態をデジタル画像表示するとともに既知標準線源による累積放射能とフィルムの黒化度(ディジタル値)の関係を調べた。累積放射能と黒化度の間には良好な正の相関が認められた。しかし、累積放射能が高くなるにつれて黒化度が、低値になる傾向があり、注意が必要であった。既知標準線源の作製の仕方によっても若干、黒化度が異なる傾向が認められた。今回の結果から、β線のみ放出する放射性核種ではその体内分布をオートラジオグラムで評価する場合は高放射能度の領域では低放射能度領域に比べて、若干、過小評価する傾向にあることが判明した。βおよびγ線も放出する放射性核種であれば摘出標本およびシンチレーションカメラでγ線を測定でき、その分布をより正確に評価できる可能性がある。乳癌、前立腺癌の骨転移の疼痛軽減治療としてβ^-線を放出する骨親和性放射性薬剤(ストロンチウム-89;Sr-89chloride,サマリウム-153標識リン酸化合物;Sm-153EDTMP)が使用され、その効果が報告されている。しかし、骨髄抑制の副作用があり投与量当たりの骨摂取量を増強させる必要がある。これまで副甲状腺ホルモンや男性ホルモンが併用されてきたが、期待された効果が得られなかった。我々はCaおよびリン酸含有量の異なる飼料で飼育したラット群で同じアルカリ土類金属のカルシウム-47(Ca-47chloride)とテクネチウム-99m標識リン酸化合物(Tc-99mMDP)の骨摂取がどのように増強されるか検討した。1)放射性薬剤のラットの全身分布Tc-99mMDPをラット尾静脈から投与し、24時間後に麻酔下で全身シンチグラムを撮像し、デジタル画像化して、全身の放射能に対する全身骨への分布状態を評価した。90%以上の放射能が骨に認められた。従って24時間後の放射能の全身残留率は全身骨摂取(global skeletal uptake : GSU)を反映していることが分かった。2)24時間後のTc-99mMDPとCa-47chlorideの骨摂取8週令のウィスター系雄ラット(n=18)を対照群(C),低Ca群(A)および低リン酸群(B)に分け、特殊飼料で2週間飼育した。Tc-99mMDPおよびCa-47chlorideをそれぞれ静注し、24時間後の全身骨摂取(GSU)を測定した後、屠殺して、Ca-47の大腿骨摂取(FU)を測定した。Tc-99mMDPのGSU(%)はC群:51.7±2.7,A群:49.6±3.5,B群:69.3±5.6(p<0.01)であった。またCa-47chlorideのGSU(%)はC群:80.2±2.7,A群:93.7±3.1(p<0.01),B群:72.3±4.3(p<0.01)であった。また、Ca-47のFU(%dose/g)はC群:3.76±0.33,A群:4.27±0.15(p<0.01),B群:3.09±0.18(p<0.01)であった。
アレルギー発症におけるサイトカインと免疫レセプターのクロストーク機構の解明

アレルギー炎症は抗原によって誘発され、活性化した様々な免疫系細胞の産生するサイトカインによって増悪される。免疫レセプターの下流で機能するSLP-76ファミリーシグナル分子であるMISの発現誘導はプロモーターに存在するSTAT結合配列にサイトカイン受容体シグナルを伝達する転写因子であるSTAT5が結合することによっておこる。STAT5を活性化するサイトカインであるIL-3,IL-2,IL-15によってマスト細胞、NKおよびNKT細胞ではMISTの発現増強・誘導が認められる。免疫レセプター刺激によるこれら細胞の活性化におけるMISTの役割をについてMIST欠損マウスを用いて解析した結果、マスト細胞においては高親和性IgEレセプターを介した脱顆粒やサイトカイン産生を正に制御しており、同じファミリーのシグナル分子であるSLP-76と協調してマスト細胞の活性化に関与していた。NKT細胞においてもMISTはT細胞レセプター刺激によるIFN-γやIL-4の産生に必要なシグナル分子であることが判明した。一方、NK細胞の活性化においてはMISTは活性化型NK細胞レセプターのシグナル伝達をSrcファミリーキナーゼであるFgrと協調して抑制していた。すなわち、MISTはサイトカインによる免疫レセプターシグナルの調節に関与する分子であり、サイトカインによるアレルギー炎症の増悪に関与していることが強く示唆された。今後、MISTの機能阻害あるいは発現阻害をターゲットにした薬剤を開発することにより、アレルギー炎症の増悪を抑制することが可能になるものと期待される。サイトカインと免疫レセプターシグナルを結ぶ分子としてMISTの機能について、MIST遺伝子の翻訳開始コドンを含む第二エクソンをEGFP遺伝子に置換したMIST欠損マウスを用いて解析を行い、本年度は以下の知見を得ることができた。1.EGFPの発現を指標にMISTの発現を解析した結果、IL-3で誘導した骨髄マスト細胞,IL-2およびIL-15で誘導した脾臓ならびに肝臓NK細胞、NKT細胞に強い発現が認められ、一方、抗CD40抗体およびIL-4,IL-5刺激したB細胞ならびにGM-CSFで骨髄から誘導した樹状細胞には発現が検出されなかった。また、T細胞には弱い発現が観察され、一部のサブセットに発現している可能積が考えられ、したがって、MISTの発現はサイトカインシグナルだけでなく、血球系特異的因子によっても制御されていることが判明した。2.MIST欠損マウスにおけるマスト細胞機能について抗原特異的IgE感作による受身全身および皮膚アナフィラキシー反応を解析したところ、正常マウスに比較し、これらの反応が減弱していることが明らかになった。FcεRI刺激による骨髄マスト細胞の脱顆粒反応およびIL-6,TNFの産生が正常マウスに比べ、有意に低下していた。また、FcεRI架橋によるNF-κBの活性化がMIST欠損マスト細胞では低下していることが明らかになった。3.MIST欠損マウスでは抗原特異的な一次抗体反応は正常であるが、いわゆる記憶T細胞が関与する二次反応が野生型マウスと比較して著明に低下しているという特異な現象を見出した。脾臓中の抗原特異的T細胞数を調べた結果、抗原反応性細胞はMIST欠損マウスにおいて、免疫10日後では野生型と同程度認められたが、免疫10週後では野生型より有意に少なかったことから、MISTは抗原特異的な記憶T細胞の分化・維持に関与しているものと考えられた。4.メラノーマ細胞の実験的肺転移系で、MIST欠損マウスは腫瘍転移抵抗性を示した。MIST欠損NK細胞では野生型よりも強いNK活性、IFNγ産生が認められ、またNKT細胞でもNK受容体刺激によるIFNγは亢進していたが、逆にT細胞受容体シグナルは著しく低下していた。アレルギーの発症にはマスト細胞やNKT細胞などの様々な免疫系細胞が関与している。これらの細胞にはIgEや抗原に対する免疫レセプターが発現しており、レセプターを介したシグナルにより活性化がおこる。SLP-76とMISTは免疫レセプターからのシグナル伝達に関与する分子構造上類似したアダプター分子である。本年度は、SLP-76、MIST

単独および二重欠損マウス由来の免疫系細胞を用いて、SLP-76とMISTの機能的類似性や相違を検討し、免疫レセプターを介した細胞の活性化機構について以下の知見を得た。1.SLP-76/MIST単独または二重欠損マウスの脾臓細胞数は、野生型マウスに比べ、MIST、SLP-76、SLP-76/MIST欠損の順に増加していた。各種血球細胞系列に特異的に反応する抗体を用いてFlow Cytometryにより、増加している細胞系列について解析したところ、B細胞数がMIST欠損では野生型の約1.6倍、SLP-76欠損では約3.4倍、SLP-76/MIST二重欠損では約5.3倍に増加していることが明らかになった。2.高親和性IgE受容体を介したマスト細胞の脱顆粒反応は、SLP-76とMISTの遺伝子量(gene dosage)に依存して低下し、二重欠損では脱顆粒反応がほとんど認められないことが判明した。3.NKT細胞の分化はSLP-76欠損マウスでは認められず、一方MIST欠損マウスではNKT細胞分化の亢進が観察された。NKT細胞のT細胞レセプター刺激によるIL-4産生を解析したところ、マスト細胞の場合と同様、SLP-76とMISTの遺伝子量依存的にIL-4産生が低下した。4.SLP-76欠損マウスでは、胸腺においてCD4^-CD8^-細胞からCD4^+CD8^+細胞への分化が認められなかった。しかしながら、SLP-76/MIST二重欠損マウス胸腺においては、わずかにCD4CD8細胞への分化が回復した。以上の結果から、MISTとSLP-76はマスト細胞やNKT細胞のシグナル伝達においては協調的に機能しているが、NKT細胞や胸腺におけるT細胞分化に関与するシグナル伝達においてはSLP-76とMISTは逆の機能をもつことが示された。細胞系列やその分化段階によるSLP-76とMISTの機能的類似性と相違はFgrなどの相互作用するシグナル分子の差異に起因する可能性が示唆された。SLP-76ファミリーアダプター分子であるMIST遺伝子の転写制御領域には、サイトカイン受容体下流の転写因子であるSTAT5が結合する。そこで、活性型STAT5b-Tg/MIST欠損マウスにおける免疫反応を解析することによって、活性型STAT5によっておこる免疫異常に、どのようにその下流分子であるMISTが関与しているか検討した。その結果、活性型STAT5b-Tgマウスで見られる末梢メモリーT細胞の増加、骨髄大型プレB細胞を含む末梢B細胞ならびに腹腔B1細胞の増加などの分化異常がMISTを欠損させることによって部分的に回復することから、MISTはサイトカイン刺激に伴うSTAT5の活性化によっておこる様々な免疫系細胞の分化・活性化に関与していることが明らかになった。
実験的アレルギー性結膜炎モデルの作成とその応用

アレルギー性結膜炎に対するsubstance Pの役割についての検討を行った。その結果、抗原により誘発された結膜の血管透過性の亢進は、capsaicinの連投により有意に抑制された。モルモット結膜中のsubstance P含量は、抗原の点眼により減少した。さらに、substance Pの結膜下注射および点眼により、用量依存的な結膜炎を惹起し、結膜の血管透過性も亢進した。Substance Pにより誘発した結膜炎では、眼瞼および眼球結膜において著明な浮腫が観察されたが、ヒスタミン誘発結膜炎とは異なり、すべての例で充血は生じなかった。結膜中のヒスタミン含量は、抗原点眼およびcompound 48/80の結膜下注射により有意に減少し、涙液中のヒスタミン含量も抗原点眼前と比較し増加した。しかし、substance Pの注射では結膜中のヒスタミン含量の減少および涙液中のヒスタミン含量の増加を示さなかった。抗原点眼により生ずる血管透過性の亢進は、選択的かつ強力なNK-1受容体拮抗薬であるFK888の静脈内投与で有意に抑制された。これらの結果より、substance Pは抗原によるアレルギー性結膜炎のいくつかの症状の原因であること、およびアレルギー性結膜炎反応において、substance Pが結膜中の肥満細胞への作用によるものでなく、血管のNK-1受容体を介して結膜の血漿漏出を誘発したことが示唆された。ヒスタミンが実験的アレルギー性結膜炎に重要な役割を演じていることを報告してきたが、substance Pもその役割の一端を担っているのではないかと考え、以下の実験を行った。実験動物としては、雄性モルモットを用いた。アレルギー性結膜炎はegg alguminと百日咳死菌浮遊液を用いて感作し、感作成立後抗原をchallengeすることにより作成した。結膜炎の症状は、score付けで行い、結膜からの血管透過性の亢進はエバンスブルーを静脈内投与することにより行った。結膜もしくは涙液中のヒスタミン含量は高速液体クロマトグラフで、substance Pの含量はELISAを用いて測定した。さらに、結膜下にsubstance Pを投与することにより、用量依存的な結膜炎を惹起し、結膜の血管透過性も亢進した。抗原点眼により生ずる血管透過性の亢進は、選択的かつ強力なNK_1受容体拮抗薬であるFK888の静脈内投与で有意に抑制された。これらの結果より、substance Pは抗原によるアレルギー性結膜炎のいくつかの症状の原因であること。アレルギー性結膜炎反応においてsubstance Pが結膜中の肥満細胞への作用によるものでなく、血管のNK_1受容体を介して結膜の血漿漏出を誘発したことが示唆された。ヒスタミンがアレルギー性結膜炎に重要な役割を演じていることを既に報告したが、今回の実験で、substance Pもその役割の一端を担っていることを見出した。そこで、モルモットを用いてsubstance P誘発結膜炎に対する詳細な検討を行うとともに、各種抗アレルギー薬の影響を検討した。Substance Pを点眼すると6mg/mlの濃度で5分から20分をピークとする結膜