hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
霊長類が真菌の多様性維持に果たす役割の解明

申請者らは、ニホンザルが非常に多様なキノコを採食することを明らかにしたが、本研究では、この次の段階の研究として、ニホンザルの糞の存在によって土壌中の真菌相が変化することを実験的に証明することを目的とした。屋久島で30個のサルの糞を採取した。これらの糞を顕微鏡観察すると、胞子が見つかり、また死細胞の染色液で染まらなかったことから、サルが生きた状態で胞子を運んで糞とともに排泄することが確認された。さらに、このサルの糞を、5つの条件を設けて土壌に接種した。接種後、1月、3か月、1年後の土壌を採取した。土壌および糞のDNA解析により、糞の接種で土壌中の真菌相にどのような変化が起きたのかを明らかにする。本研究の目的は、森林生態系の中で、哺乳類が真菌の多様性の維持に貢献していることを示すことである。ニホンザルが多様なキノコを頻繁に食べることが知られている屋久島で、サルの糞の存在によって土壌中の真菌相が変化することを、実験的に証明することを目指す。本年度は、以下の二つの取り組みを行った。屋久島の西部林道で2013年6月、7月、9月に各10個の排泄直後のサルの糞を採取し、調査ステーションに持ち帰った。そのうち一部をエタノール保存した後、以下の4つの処理を行った。(1)土壌に安置し、それ以上動物の撹乱を受けないように、幅20cm程度のプラスチック製の籠で糞を覆う。(2)土壌に安置し、(1)の籠と同じ大きさのアクリル製の透明の箱で覆う。(3)オートクレーブで滅菌し、冷えた後、(2)同様に土壌安置。(4)蒸留水と糞の懸濁液を、軌道振とう機で60rpm、30分間攪拌した上澄み。さらにコントロールとして(5)何も置かず、籠だけを設置する条件を設定する。屋久島国有林275林班内で、これらの籠・箱を設置し、同時にその場所の土を採取してエタノールで保存した。付置後1か月、3か月後に付置場所の土壌を回収し、同様に保存した。採取した糞を顕微鏡観察したところ、ほとんどの糞で胞子が観察され、死細胞を染色するトリパンブルーで染色されなかったことから、サルが生きた胞子を運ぶことまでは確認することができた。また、回収した土壌および糞からのDNAの抽出が完了した。2014年度に、設置後1年の土壌の回収と、シーケンスを行う予定である。ニホンザルが多様なキノコを頻繁に食べることが知られている屋久島で、サルの糞の存在によって土壌中の真菌相が変化することを実験的に証明することを目指して研究を行った。屋久島の西部林道で2013年6月、7月、9月にそれぞれ10個の排泄直後のニホンザルの糞を採取し、調査ステーションに持ち帰った。そのうち一部をDNA抽出用に保存した後、以下の4つの処理を行った。(1)プラスチック製の籠で覆う、(2)(1)の籠と同じ大きさのアクリル製の透明の箱で覆う、(3)オートクレーブ滅菌後、(2)同様に土壌安置。(4)蒸留水と糞の懸濁液を攪拌した上澄みをアクリル箱で覆う、さらにコントロールとして(5)何も置かず、籠だけを設置する条件を設定する。屋久島の森林内でこれらの処理を行い、処理直前、1ヵ月後、3ヵ月後、1年後に箱・籠付近の土を採取してエタノール保存した。採取した糞を顕微鏡観察したところ、ほとんどの糞で胞子が観察され、死細胞を染色するトリパンブルーで染色されないことから、サルが生きた胞子を運ぶことが確認された。糞および採取した土からDNAを抽出し、ITS領域を増幅して電気泳動して真菌のDNAがこれらのサンプルに含まれていることを確認した後、シーケンスのために真菌のバーコード領域であるITS1F_KYO1およびITS2_KYO2-nexRプライマでPCR増幅を行った。現在、京都大学霊長類研究所の次世代シーケンサMiseqでシーケンスを行っている最中である。哺乳類の糞を土壌に接種することで、土壌中の真菌の趣向性にどのような変化が起こるかを、今後分析していく。生態学予定通り野外実験を完了できた。本年度予定していたDNA試料の抽出が、一部終わらなかったため。DNA試料の抽出に用いる。
新たな環境強変異原物質、ニトロベンズアントロンの生成と生物学的影響評価

3-NBAの肺内投与では、6mg/rat投与で全例が投与開始6カ月以内に死亡し、肺には、強い肺胞炎と扁平上皮化生がみられた。肺腫瘍として、扁平上皮がんは、雌の1.5mg投与で21例中3例、2.5mg投与で33例中11例に認め、雄の1.5mg投与では25例中3例に観察している。また、雌の1.5mg投与と2.5mg投与の各1例の肺に腺がんを観察した。3-NBA吸着炭粉を経気道肺内投与したラットは投与後1週間以内に死亡した。原因は不明であるが、炭粉のみ、あるいは3-NBAのみを同用量投与したラットでの死亡例は見られない。反復投与終了1日後から12週後までの肺、肝、腎におけるDNA付加体のうち、Retention time56分から58分に検出されている3つの主要なピークの合計は、臓器別では腎で高く、投与終了後でも各臓器のDNA付加体には明らかな減少が見られず、一定のレベルで推移している。(安達)大気浮遊微小粒子の変異原性の起源とそれに影響を及ぼす因子を解明するため、種々の条件でPM2.5とPM10について捕集し、その変異原性及びPAHs濃度の変動を観測した。その結果、気象要素やSO2等の変異原性や変異原物質の二次生成に対する影響が明らかにされた。高感度ニトロアレーン分析法であるRed-HPLC/CLD法を、2-及び3-NBAと1-及び2-ニトロトリフェニレン(NTP)の分析に応用した。これらの異性体について分離が出来、高感度分析が可能であった。さらに、既知ニトロアレーンとの分離も良好であり、同時分析が可能であることを見出した。また、定量限界は既往のGC/MSやHPLC/FLD法より10100倍高く、再現性も相対標準偏差5%以下と良好であった。この方法により、通常の方法による15分のサンプリングで大気浮遊粒子中のニトロアレーンの定量分析が可能となった。(稲津)3-NBAの肺内投与では、6mg/rat投与で全例が投与開始6カ月以内に死亡し、肺には、強い肺胞炎と扁平上皮化生がみられた。(稲津)ニトロベンズアントロン(NBAs)の中でも最も高い変異原性を示す3-NBAは、環境中に存在するモノニトロ体の中で最強の変異原性を示す化合物であり、既知の化合物の中で最も強いとされている1,8-ジニトロピレンと比較すると、TA98及びYG1024菌株に対し同程度であるか、わずかに強い。ベンズアントロン(BA)と二酸化窒素の光反応生成物は高い変異原比活性を示し、主生成物は2-(3.7%)及び3-NBA(0.7%)である。一方、二酸化硫黄の共存下では2-NBAの生成が抑制され、3-NBAの生成が促進される。BA-NO_2-O_3系の暗反応では光反応に比べ反応は遅いものの、反応生成物の変異原比活性は非常に高い値を示す。主生成物は3-NBAであり、2-NBAは痕跡程度生成するにすぎない。反応は光反応におけるラジカル反応の機構でなくイオン反応の機構によるものと思われる。3-NBAについての動物発癌実験をラットへの経気道肺内投与及び腹腔内投与、マウスへの皮下投与を行い、それぞれ腫瘍発生を観察した。肺内投与及び腹腔内投与後には衰弱が観察され、衰弱は投与回数が増えるに伴って顕著となり、死亡例が出現した。

肺内投与では肺に強い炎症と扁平上皮化生が認められ、投与完了後には重層化や角化を伴い、乳頭状を示す例もみられた。肺腫瘍は実験開始後234日目に最初の例を観察し、7から9ヶ月までに2.5mg投与の雌2例に扁平上皮がん、また、雌で肺に2例の腺がんを認めた。腹腔内投与では、肺内投与と同様にラットに著しい衰弱が発現し、死亡例が認められた。皮下投与後6ヶ月における腫瘍発生例は極めて少なかった。3-NBAの肺内投与では、6mg/ml投与で全例が投与開始6ヵ月以内に死亡し、肺には、強い肺胞炎と扁平上皮化生がみられた。肺腫瘍として、扁平上皮がんは、雌の1.5mg投与で21例中3例、2.5mg投与で33例中11例に認め、雄の1.5mg投与では25例中3例に観察している。また、雌の1.5mg投与と2.5mg投与の各1例の肺に腺がんを観察した。3-NBA吸着炭粉を経気道肺内投与したラットは投与後1週間以内に死亡した。原因は不明であるが、炭粉のみ、あるいは3-NBAのみを同用量投与したラットでの死亡例は見られない。反復投与終了1日後から12週後までの肺、肝、腎におけるDNA付加体のうち、Retention time56分から58分に検出されている3つの主要なピークの合計は、臓器別では腎で高く、投与終了後でも各臓器のDNA付加体には明らかな減少が見られず、一定のレベルで推移している。(安達)大気浮遊微小粒子の変異原性の起源とそれに影響を及ぼす因子を解明するため、種々の条件でPM2.5とPM10について捕集し、その変異原性及びPAHs濃度の変動を観測した。その結果、気象要素やSO2等の変異原性や変異原物質の二次生成に対する影響が明らかにされた。高感度ニトロアレーン分析法であるRed-HPLC/CLD法を、2-及び3-NBAと1-及び2-ニトロトリフェニレン(NTP)の分析に応用した。これらの異性体について分離が出来、高感度分析が可能であった。さらに、既知ニトロアレーンとの分離も良好であり、同時分析が可能であることを見出した。また、定量限界は既往のGC/MSやHPLC/FLD法より10100倍高く、再現性も相対標準偏差5%以下と良好であった。この方法により、通常の方法による15分のサンプリングで大気浮遊粒子中のニトロアレーンの定量分析が可能となった。(稲津)3-NBAの肺内投与では、6mg/rat投与で全例が投与開始6ヵ月以内に死亡し、肺には、強い肺胞炎と扁平上皮化生がみられた。
病原体の侵入を細胞壁が感知する機構および意義

植物は、病原体由来の成分を直接的に認識する免疫システムに加えて、細胞壁を利用して病原体の侵入を間接的に感知するシステムを備えている。これまでに植物の細胞壁多糖類であるオリゴガラクツロン酸(OG; oligogalacturonic acid)が、膜受容体であるWAK(wall-associated kinase)を介して自身によって認識され、DAMP(damage- associated molecular pattern)として機能していることが見出されてきた。植物の細胞壁には、オリゴガラクツロン酸以外に多様な多糖類があり、それらもDAMPとして機能する可能性が考えられる。そこで、オリゴガラクツロン酸以外の細胞壁多糖類がDAMP活性を有するかを、活性酸素種(ROS)生成の誘導活性を指標にして解析を行った。その結果、オリゴガラクツロン酸以外で、シロイヌナズナまたはゼニゴケに対してDAMP活性を有する多糖類があることを見出すことに成功した。活性を示した細胞壁多糖類について、活性本体を調べるための更なる解析を進めている。また、リン酸化プロテオームの変動解析により同定した、オリゴガラクツロン酸刺激によりリン酸化制御を受ける因子の幾つかについて、T-DNA挿入変異体を単離し、形質転換体を作出して、詳細な機能解析を進めた。その結果、幾つかの新奇因子については、病害抵抗性に関与していることが分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。そこで、オリゴガラクツロン酸以外の細胞壁多糖類がDAMP活性を有するかを検証するための系の確立を行った。オリゴガラクツロン酸処理は活性酸素種(ROS)生成を誘導することが知られているため、活性酸素種(ROS)生成を計測する系の確立を試み、シロイヌナズナおよびゼニゴケを材料にROS生成を経時的に計測する系の確立に成功した。現在、この確立した系を用いて、細胞壁多糖類のROS生成誘導能の検証を進めている。また、DAMP応答に関わる制御因子の同定を目的として、シロイヌナズナをオリゴガラクツロン酸で処理し、リン酸化プロテオームの変動解析を行った。その結果、オリゴガラクツロン酸刺激によりリン酸化制御を受ける因子を多数同定することに成功した。当初の予想に反し、イネに対してDAMP活性を示した糖鎖Xのシロイヌナズナに対する活性を我々の解析システムでは検出することが出来なかった。そこで、シロイヌナズナを用いて糖鎖Xに対する応答を確実に解析する系の再確立が必要となった。それに伴い、予定していた一部のリン酸化プロテオーム解析およびそれ以降の解析に遅れを生じている。シロイヌナズナの場合、調製した糖鎖Xを外部より与えると、何らかの理由(調製法・安定性・受容体へのアクセスなど)で上手く応答しないことが考えられた。そこで、自身の細胞壁から糖鎖Xを代謝酵素活性を利用して任意に生じさせる形質転換シロイヌナズナの作出を試みた。予備実験により、得られた形質転換体を用いることで、糖鎖Xに対する応答を解析できることを確認した。現在、この形質転換体を用いたリン酸化プロテオーム解析を行う準備を進めている。
シリコンナノ結晶を用いた薄膜トランジスタに関する研究

シリコンナノ結晶はその興味深い電気的、光学的、量子的性質から次世代のナノメートル構造を有する電子、光デバイスの材料として注目が集まっている。また本研究では気相中でシリコンナノ結晶の堆積を行っているため、シリコンナノ結晶の溶液を簡単に作製でき、最近盛んに研究が行われているナノプリンティング等の溶液プロセスの技術を応用することにより、薄膜トランジスタ等電子デバイス作製時の価格を抑えることが出来ると考えられる。これらの要因によって本研究で作製されるシリコンナノ結晶は次世代の電子デバイスの材料として非常に有望であると考えられる。しかしシリコンナノ結晶膜中の粒界と空隙、またシリコンナノ結晶自身の自然酸化膜に起因する低い電気伝導度が実際のデバイス応用の際、問題となることを以前の研究で明らかにした。そこで、これらの問題点を解決するためのデバイスプロセスに関して研究を行った。シリコンナノ結晶膜中の粒界と空隙を減少させるためにレーザによるアニーリングに関する研究を行った。レーザからの熱エネルギーによりシリコンナノ結晶の溶融、再結晶化が起き、複数のシリコンナノ結晶の結合によって粒界と空隙が減少すると考えられる。AFM測定の結果よりレーザアニーリングによりシリコンナノ結晶の粒径が増大し、粒界と空隙が減少していることを明らかにした。また電気測定や熱シミュレーションにより、レーザ強度やシリコンナノ結晶膜厚の依存性について明らかにした。さらにシリコンナノ結晶の自然酸化膜の除去に関する研究も行った。従来のHF溶液を用いる方法だと全てのシリコンナノ結晶が基板から剥離してしまうという問題点があったので、今回の研究ではHF蒸気によるエッチングと無水HFによるエッチングの二種類のエッチング方法の実験を行った。それぞれのHF処理直後の電気特性の向上が観測され、有用なエッチングプロセスであることを明らかにした。
教育寮の鍵管理を利用した学生の生活指導

○研究目的学寮の学生指導においては、寮生が健全な生活を送れるために日々の指導や精神的ケアを行う必要がある。その手段の一つに登下校における寮生の在室確認業務があり、これには鍵受けボックスに居室の鍵が収められているか否かを目視によって確認することで対応している。特に寮生が集中する登校の時間帯には確認ミスにより病気や寝坊で遅刻する寮生に対するケアが遅れることがある。このようなことから本研究では在室確認業務の負担を軽減し、学生に対する指導や精神的ケアの迅速性向上を図ることを目的としてRFID (Radio Frequency Identification)を応用した鍵管理システムを構築した。○研究方法本研究で用いたRFIDとは電磁波によりRFタグに記録されたデータを非接触で読み書きが可能で、電磁波の届く範囲内であれば複数のRFタグの情報を一度に読み込むことができるシステムである。RFタグは鍵に付随するキーホルダー内に組込まれている上、鍵自体が金属であるためにタグの情報を正確に読取ることが比較的困難である。そこで、本システムではアンテナの配置や台数を検討した上で検知の正確性を図った。更に、RFタグから得られた鍵の有無情報を既存のWebとデータベースが機能しているサーバに蓄積させ、登下校時間の表示や、顔写真による本人確認が可能な機能等を組み込んだ学内教職員向けのWebアプリケーションを作成した。○研究成果登下校時における在室確認業務が所要時間で1/5に短縮された。また、Webアプリケーションからの顔写真確認機能などを付加したことにより、当直教員の学生指導に利便性が図れた他、閉寮時の退出確認業務や休講時、体調不良などでの居残り確認などを一目で把握できるようになったため、問題のある学生への対応が迅速に行えるようになった等の成果が得られた。更に、学内LANと連携させたことで学校全体での情報共有が可能なため、寮務担当教職員以外にも担任などへの情報提供ツールとして有効である。
噴火タイプの推移予測に向けた火道流・噴煙連結モデルの開発研究

1次元気液2相火道流モデルを開発し,定常的な溶岩ドーム噴火のマグマ溜まりの圧力変動に対する安定性と爆発的噴火への遷移条件を明らかにした.また,爆発的噴火に対して準1次元火道流モデルを適用し,爆発的噴火の噴出条件と火口の形状の関係を明らかにした.さらにその準1次元火道流モデルの火口における出力値を3次元非定常噴煙モデルの入力値として用いることによって,爆発的噴火における噴煙柱崩壊条件を予測する理論モデルを確立した.1次元気液2相火道流モデルを開発し,定常的な溶岩ドーム噴火のマグマ溜まりの圧力変動に対する安定性と爆発的噴火への遷移条件を明らかにした.また,爆発的噴火に対して準1次元火道流モデルを適用し,爆発的噴火の噴出条件と火口の形状の関係を明らかにした.さらにその準1次元火道流モデルの火口における出力値を3次元非定常噴煙モデルの入力値として用いることによって,爆発的噴火における噴煙柱崩壊条件を予測する理論モデルを確立した.本研究では,研究代表者のグループがこれまでに開発した火道中のマグマ上昇(「火道流」)モデルと火山噴煙モデルを連結・統合することによって,観測されるマグマ溜りの圧力変動と地表における噴火タイプの推移の関係を明らかにすることを目的とする,具体的には,主に,(課題1)定常火道流モデルの火口における出力値を3次元非定常噴煙モデルの入力値として用いることによって,定常的な爆発的噴火における噴煙のダイナミックスとマグマ溜まりの圧力の関係を明らかにする,(課題2)気液2相の速度差と圧力差を考慮した火道流モデルの安定性解析に基づいて,定常的な溶岩ドーム噴火のマグマ溜まりの圧力変動に対する安定性と爆発的噴火への遷移条件を明らかにする,という2つの課題を解決する.平成21年度は,(課題1)については,1次元定常火道流モデル(Koyaguchi,2005)を火口の形状を考慮した場合に拡張し,「マグマ溜まりの圧力を入力値として与えたときの火口直上での噴出速度・圧力」を求め,さらに既存の1次元定常噴煙モデルに基づいて「噴煙柱崩壊による火砕流発生条件」を推定するところまで終えた.また,降下火砕堆積物のデータから火口からの噴出率を推定する手法開発を行った.(課題2)については,気相と液相の速度差のみを考慮した定常火道流モデルを幅広いパラーメータ範囲で解析し,マグマの性質と溶岩ドームの空隙率の関係を明らかにした.また,予察的研究によって,気液2相間に速度差と圧力差がある場合の定常火道流に関する従来の数値解法の問題点を明らかにし,この問題を解決する新しい数値解析法を開発した.本研究では,研究代表者のグループがこれまでに開発した火道中のマグマ上昇(「火道流」)モデルと火山噴煙モデルを連結・統合することによって,観測されるマグマ溜りの圧力変動と地表における噴火タイプの推移の関係を明らかにすることを目的とする.具体的には,主に,(課題1)定常火道流モデルの火口における出力値を3次元非定常噴煙モデルの入力値として用いることによって,定常的な爆発的噴火における噴煙のダイナミックスとマグマ溜まりの圧力の関係を明らかにする,(課題2)気液2相の速度差と圧力差を考慮した火道流モデルの安定性解析に基づいて,定常的な溶岩ドーム噴火のマグマ溜まりの圧力変動に対する安定性と爆発的噴火への遷移条件を明らかにする,という2つの課題を解決する.本年度は,(課題1)については,火口の形状を考慮した1次元定常火道流モデル(Koyaguchi et al.,2010)に基づいて「マグマ溜まりの圧力を入力値として与えたときの火口での噴出速度・圧力」を求め,さらにその結果を火口における条件として,3次元噴煙モデルに基づいて「噴煙柱崩壊による火砕流発生条件」を推定する計算を行った.(課題2)については,気相と液相の速度差を考慮した非定常モデルを開発し,溶岩ドームの噴火の安定性について数値的解析を開始した.また,浅間火山および霧島火山の噴出物の岩石学的性質から,これらの火山における噴火タイプの推移に伴う気泡の形成過程と脱ガス過程を再現する研究を開始した.本研究では,研究代表者のグループがこれまでに開発した火道中のマグマ上昇(「火道流」)モデルと火山噴煙モデルを連結・統合することによって,観測されるマグマ溜りの圧力変動と地表における噴火タイプの推移の関係を明らかにすることを目的とする.具体的には,主に,(課題1)定常火道流モデルの火口における出力値を3次元非定常噴煙モデルの入力値として用いることによって,定常的な爆発的噴火における噴煙のダイナミックスとマグマ溜まりの圧力の関係を明らかにする,(課題2)気液2相の速度差と圧力差を考慮した火道流モデルの安定性解析に基づいて,定常的な溶岩ドーム噴火のマグマ溜まりの圧力変動に対する安定性と爆発的噴火への遷移条件を明らかにする,という2つの課題を解決する.本年度は,(課題1)については,火口の形状を考慮した1次元定常火道流モデル(Koyaguchi et al., 2010)に基づいて「マグマ溜まりの圧力を入力値として与えたときの火口での噴出速度・圧力」を求め,さらにその結果を火口における条件として,3次元噴煙モデルに基づいて「噴煙柱崩壊による火砕流発生条件」を推定する計算を行い,典型的地質条件に関する噴火タイプ推移条件を特定した.結果の一部については,論文・学会で公表した.(課題2)については,気相と液相の速度差を考慮した非定常モデルを開発し,溶岩ドームの噴火の安定性について数値的解析を行った.

その結果,マグマ中の斑晶量によって噴火推移メカニズムが変化することを明らかにすることができた.以上の理論的研究に加え,浅間火山2004年噴火および霧島新燃岳2011年噴火の地質・岩石学的および地球物理的観測研究を実施し,これらの火山噴火における噴火タイプの推移予測性について考察を行った.
NICU看護師による注射・採血実施の普及のための意識改革を含む教育パッケージ

本研究の目的は、本邦においてNICU看護師による注射・採血実践に合意形成されていない現状を踏まえ、NICU看護師が抱える漠然とした不安や看護管理者の認識を明らかにした上で現状に即した教育パッケージを開発し、臨床現場へ導入し、評価することである。平成30年度は、注射・採血の実施者となるNICU勤務の看護師3施設10名(経験年数1から17年)へのインタビュー調査を実施した。日常的に実施している処置は、血糖測定9名、足底採血6名、静脈採血2名であった。看護師による注射・採血処置を比較的積極的に導入している施設の看護師からは、これらの処置は看護ケアの一貫である、患者アウトカム向上に貢献する、看護師の知識技術向上につながるとの見解を得たが、実施までの系統的教育と自信につながる承認が必要であることも明らかとなった。看護師による注射・採血処置を行っていない看護師からは、細い血管を潰してしまう恐怖、医療過誤への不安、医師が行うほうが安全、看護師の負担増大が語られた一方、看護師も処置ができることで患者へ役立つこともあると考えていることが分かった。これまでに実施したNICU看護師長へのアンケート調査の結果と合わせると、処置実施体験がある看護師は、看護師が担うことでの大きなメリットを感じており、そうでない看護師は、処置は医師の仕事であるとして抵抗感を持っており、二極化していることが分かった。このことを踏まえた意識改革を含むトレーニング教材を開発中である。なお、昨年度までに実施した研究について学会発表を行った。平成29年度の研究代表者の病気療養により、NICU看護師向け注射・採血実施のためのトレーニング教材の開発と検証が遅延し、研究計画全体が遅れたままである。注射・採血の実施者となるNICU勤務の看護師へのインタビュー調査結果を踏まえ、NICU看護師向け注射・採血実施のためのトレーニング教材を開発し、オンライン上で公開する。教育効果を評価すべく検証を行う。臨床実践導入をさせていただける施設の募集を行う。平成28年度は、NICU看護師の注射・採血実施におけるコンピテンシーを明らかにするために、国内外の教科書、ガイドライン、関連法規等を収集して分析を行った。米国、オーストラリア、ニュージランド等、看護師免許の更新制をとっている国々では、継続教育を提供する企業によって看護師が担う医療処置のマニュアルが教材として作成され、公開されていた。これらを参考に、日本国内で勤務するNICU看護師の注射・採血の知識・技術のアセスメントツールを作成中である。国内のNICU看護師が注射・採血を実施しない理由を明らかにする目的で看護管理者へのインタビューを計画し、プレテストとして総合周産期母子医療センター勤務の看護管理者1名へ聞き取り調査を行った。この施設においては注射・採血は看護業務として移行中であること、看護管理者自身はNICUでスタッフナースとして勤務していた際に注射・採血を日常的に実施していたことが分かった。このことから、看護管理者自身の臨床経験と注射・採血を看護業務とする意向に関連があると考えた。当初の予定を変更し、総合周産期母子医療センター(約100施設)の看護管理者対象のアンケート調査を実施すべく準備することにした。平成29年度以降の計画を円滑に進行するため、すでに新生児への注射・採血が看護師の業務として定着している国々の研究者との情報交換と研究への助言を受けられる体制づくりを目的に、国際学会で日本の新生児看護学の学術的成果と臨床実践の現状を発表した。また、国内の関連学会へ参加し、次年度以降のデータ収集における協力施設の確保に努めた。次年度以降開発を予定している注射訓練用シミュレータ及びe-learning教材に関する技術提供のため、所属大学にて行われた産学連携会議において参加企業数十社に構想をプレゼンし、うち数社と今後の計画を話し合った。研究代表者の所属異動と異動先での人員体制の変更が重なり、研究実施体制を整えるのに予想以上の時間を要してしまった。本研究の目的は、本邦においてNICU看護師による注射・採血実践に合意形成されていない現状を踏まえ、NICU看護師が抱える漠然とした不安や看護管理者の認識を明らかにした上で、現状に即した教育パッケージを開発し、臨床現場へ導入し、評価することである。平成29年度は、NICU看護師長を対象としたアンケート調査を全国の周産期母子医療センター407施設に依頼し、104施設が調査協力を承諾し、95名より回答を得た。NICUで看護師が担っている処置は「血糖測定」69名(72.6%)、「静脈ルートからの注射」51名(53.7%)と半数以上であったのに対し、「静脈採血」6名(6.3%)、「末梢静脈路確保」4名(4.2%)と少数であった。NICU看護師による注射・採血が実践されない理由として、「医師の業務と確立している」との回答が81名(85.3%)で最多であり、「難易度が高い」59名(62.1%)、次いで「経験不足」56名(58.9%)、「技術不足」52名(54.7%)であった。「NICU看護師が注射・採血を実施すべきか」との問いに対し、「思う」17名(17.9%)、「思わない」28名(29.5%)、「どちらともいえない」47名(49.5%)であった。

児の睡眠覚醒パターンや痛みケアへの配慮を考え、看護師による実施を推進する意見がある反面、難易度の高さ、看護業務の多忙さ、医師と看護師の役割分担から、看護師が実施すべきでないとの意見があった。加えて、注射・採血の実施者となるNICU勤務の看護師へのインタビュー調査を計画し、現在継続中である。研究代表者の療養により、本年度に公開予定であったNICU看護師向け注射・採血実施のためのトレーニング教材の開発が遅延している。本研究の目的は、本邦においてNICU看護師による注射・採血実践に合意形成されていない現状を踏まえ、NICU看護師が抱える漠然とした不安や看護管理者の認識を明らかにした上で現状に即した教育パッケージを開発し、臨床現場へ導入し、評価することである。平成30年度は、注射・採血の実施者となるNICU勤務の看護師3施設10名(経験年数1から17年)へのインタビュー調査を実施した。日常的に実施している処置は、血糖測定9名、足底採血6名、静脈採血2名であった。看護師による注射・採血処置を比較的積極的に導入している施設の看護師からは、これらの処置は看護ケアの一貫である、患者アウトカム向上に貢献する、看護師の知識技術向上につながるとの見解を得たが、実施までの系統的教育と自信につながる承認が必要であることも明らかとなった。看護師による注射・採血処置を行っていない看護師からは、細い血管を潰してしまう恐怖、医療過誤への不安、医師が行うほうが安全、看護師の負担増大が語られた一方、看護師も処置ができることで患者へ役立つこともあると考えていることが分かった。これまでに実施したNICU看護師長へのアンケート調査の結果と合わせると、処置実施体験がある看護師は、看護師が担うことでの大きなメリットを感じており、そうでない看護師は、処置は医師の仕事であるとして抵抗感を持っており、二極化していることが分かった。このことを踏まえた意識改革を含むトレーニング教材を開発中である。なお、昨年度までに実施した研究について学会発表を行った。平成29年度の研究代表者の病気療養により、NICU看護師向け注射・採血実施のためのトレーニング教材の開発と検証が遅延し、研究計画全体が遅れたままである。平成28年度実施予定であった調査を早期に完了すべく、下記2点について現在準備中である。1. NICU看護師の注射・採血に関する知識・技術の現状把握のためのアセスメントシート作成2. NICUの看護管理者への調査のためのアンケート作成平成29年度はNICU看護師向け注射・採血実施のためのトレーニング教材を作成する。オンラインでの公開を12月までに行い、使用実績の調査を行なう。継続中である注射・採血の実施者となるNICU勤務の看護師へのインタビュー調査を進める。その結果を踏まえ、NICU看護師向け注射・採血実施のためのトレーニング教材を開発し、オンライン上で公開する注射・採血の実施者となるNICU勤務の看護師へのインタビュー調査結果を踏まえ、NICU看護師向け注射・採血実施のためのトレーニング教材を開発し、オンライン上で公開する。教育効果を評価すべく検証を行う。臨床実践導入をさせていただける施設の募集を行う。NICU看護師の注射・採血の知識・技術に関する調査と看護管理者への意識調査について、平成28年度中に終えることができなかった。また、資料整理のためのスキャナー機器や消耗品が未購入である。よって、その費用を次年度へ繰り越した。
交通施設整備が周辺地域の土地利用に及ぼす影響に関する研究

1.交通施設の整備がその周辺地域の土地利用に及ぼす影響に関する一連の研究として,北大阪急行電鉄の完成が沿道の土地利用や住宅立地に及ぼす影響を明かにしモデルを行った.また,同電鉄江坂駅建設の影響を建設前後について従来よりミクロなレベルで住宅,業務などの業種別に立地行動をデータ化・比較分析し,地理的要因との関連も明らかにした.2.都市圏における都市高速道路の建設が周辺地域に対して騒音・大気汚染などの公害問題やまちづくりの面で重大な問題を起こし,同事業の遂行を著しく困難なっている一方,地域住民の都市高速道路に対する評価は明らかになっていないことに鑑み, 2種類の住民意識調査を行った.まず,交通渋滞が頻発している一方で都市高速道路がなく,道路整備が不十分な南大阪40地区の調査では都市高速道路の影響,必要意識,望ましい立地距離等を明らかにした.また,既に都市高速道路の建設されている大阪府下の5地区の調査では,都市高速道路の物理的影響,利便性,地区への影響などに対する評価意識,計画発表から共用開始に至までの住民意識の変化などを明らかにし,この2つの調査結果をもとに都市高速道路の周辺整備のありかたについて提言を行った.また,これらの住民意識データと既建設地区におけるヒアリング結果,各地の紛争地域の事例収集などから,ゲーミングシミュレーションを行い,住民投票システムの導入等の合理的な事業手続きについて明らかにした.3.都市高速道路の渋滞が日常化し,その本来の機能が著しく損なわれている現状に鑑み,マイカー通勤者の代替手段として通勤高速バスを導入した場合の沿線地域の交通需要の変化に与える影響の予測手法について研究を進め,交通手段選択構造を明らかにした.また,混雑料金の導入によるピーク交通量の削減を考え,これに対するドライバーの意識の調査・分析,混雑料金算定のための費用曲線の推定を順次行った.1.交通施設の整備がその周辺地域の土地利用に及ぼす影響に関する一連の研究として,北大阪急行電鉄の完成が沿道の土地利用や住宅立地に及ぼす影響を明かにしモデルを行った.また,同電鉄江坂駅建設の影響を建設前後について従来よりミクロなレベルで住宅,業務などの業種別に立地行動をデータ化・比較分析し,地理的要因との関連も明らかにした.2.都市圏における都市高速道路の建設が周辺地域に対して騒音・大気汚染などの公害問題やまちづくりの面で重大な問題を起こし,同事業の遂行を著しく困難なっている一方,地域住民の都市高速道路に対する評価は明らかになっていないことに鑑み, 2種類の住民意識調査を行った.まず,交通渋滞が頻発している一方で都市高速道路がなく,道路整備が不十分な南大阪40地区の調査では都市高速道路の影響,必要意識,望ましい立地距離等を明らかにした.また,既に都市高速道路の建設されている大阪府下の5地区の調査では,都市高速道路の物理的影響,利便性,地区への影響などに対する評価意識,計画発表から共用開始に至までの住民意識の変化などを明らかにし,この2つの調査結果をもとに都市高速道路の周辺整備のありかたについて提言を行った.また,これらの住民意識データと既建設地区におけるヒアリング結果,各地の紛争地域の事例収集などから,ゲーミングシミュレーションを行い,住民投票システムの導入等の合理的な事業手続きについて明らかにした.3.都市高速道路の渋滞が日常化し,その本来の機能が著しく損なわれている現状に鑑み,マイカー通勤者の代替手段として通勤高速バスを導入した場合の沿線地域の交通需要の変化に与える影響の予測手法について研究を進め,交通手段選択構造を明らかにした.また,混雑料金の導入によるピーク交通量の削減を考え,これに対するドライバーの意識の調査・分析,混雑料金算定のための費用曲線の推定を順次行った.交通施設整備は、その地域のアクセシビリティーの変化を通じて、土地利用のパターンを変えるのみでなく、その沿道の経済活動の変化を促進させるこのような影響を明らかにするために、(1)北大阪急行沿線の人口、就業構造土地利用動向等について調査分析し、その結果の一部を「鉄道施設整備による沿線地域の住宅立地について」として、日本都市学会年報に発表した。(2)市街地における交通混雑渋帯解消のために高速道路の建設が急務となっているが、都市高速道路に対する地域住民の評価は明確になっていない。このために、道路等の施設整備に対する住民意識調査を行った。調査の対象とした堺市東部地域は鉄道駅を中心とした比較的小規模の市街地とその間を埋める緑地、農地からなっていて大規模な開発はあまり進んでいないが、近年人口や産業の集積が進み、今後の都市基盤の整備・拡充・更新が課題となっている。この地域の市街地の度合、産業活動、土地利用、住環境などの地域特性の特徴的な40ゾーンを選び各種都市施設の現状の評価、都市高速道路やその他の交通施設の整備や住民参加のあり方等について分析した。調査結果から都市高速道路は車の利用者と非利用者で、その必要性意識が異なり、これを反映して地区特性(鉄道など他の代替交通手段の整備状況,商業,業務活動)との関連が大きいことがわかった。これらの結果から地区特性をもった住民グループを抽出し、住民・行政・事業者をプレイヤーとするゲーミングシュミレーションによる計画の策定、合意形成の手法を提案した。(3)新しい交通システムとしての通勤高速バスを導入した場合、沿線地域の交通需要の変化に与える影響の予測手法について研究を進め、アクセス交通手段の選択構造をある程度明らかにすることができた。成果の一部は世界通会議(1986年5月バンクーバー)で発表した。
首都圏における住宅市場の動学分析

本研究は, 1986年から2010年までの不動産取引データにもとづいて,首都圏という共通の生活圏(あるいは労働市場)をもつ住宅市場の住宅価格と家賃に関する価格指数を行政市区単位ごとに作成し,世帯構成の動態変化にともなう住宅需要への影響や資産税制ならびに土地利用規制などによる住宅供給への影響,また住宅市場リスクなどに着目しながら,首都圏における空間的な住宅市場のダイナミクスについて理論的・実証的な分析を行った。本研究は世帯構成の動態変化にともなう住宅需要への影響や資産税制ならびに土地利用規制などによる住宅供給への影響に着目しながら,首都圏における住宅市場のダイナミクスについて理論的・実証的な分析を行うことを目的としている。本研究を進めるきっかけとなった論文「資産税制とバブル」が収められている『財政政策と社会保障』が,2010年初頭,内閣府プロジェクト『バブル・デフレ期の日本経済と経済政策』の一環として慶応義塾大学出版会から出版された。本研究は,「資産税制とバブル」をベースにして,第1章コミュニティの属性と住宅需要,第2章土地利用規制と資産税制,第3章住宅市場とバブル,第4章VARによる効率性の検証,第5章シミュレーションによる都市住宅市場の動学分析,第6章ヘドニック分析による投資的要因の検証,第7章住宅供給の価格弾力性の推計とその要因,以上7つの章から構成されている。昨年度は中神によって土地税制や土地利用規制旨に関する先行研究などのサーベイなどが行われ,また井上・中神を中心に第6章と第7章に関する計量分析が同時に進められた。現在,それぞれ「不動産投資情報と住宅価格」,「土地利用と住宅供給」のタイトルでまとめられつつあるが,まだ投稿の段階には至っていない。また,第5章の住宅市場のシミュレーション分析に関連して,近年のDSGEモデルが本研究に応用可能であるかどうかの検討を昨年度末から始めた。さらに,昨年度研究を続けるなかで住宅需要の動学的な分析にも目を向けることになり,これに関しては清水を中心としてその分析が進められている。本研究の目的は,世帯構成の動態変化にともなう住宅需要への影響や資産税制ならびに土地利用規制などによる住宅供給への影響に着目しながら,首都圏における住宅市場のダイナミクスについて理論的・実証的な分析を行うことである。2010年初頭内閣府プロジェクト『バブル・デフレ期の日本経済と経済政策』の一環として慶応義塾大学出版会から出版された『財政政策と社会保障』所収の「資産税制とバブル」をさらに発展させることを目指している。当初予定した内容は,第1章コミュニティの属性と住宅需要,第2章土地利用規制と資産税制,第3章住宅市場とバブル,第4章VARによる効率性の検証,第5章シミュレーションによる都市住宅市場の動学分析,第6章ヘドニック分析による投資的要因の検証,第7章住宅供給の価格弾力性の推計とその要因,以上7つの章であった。しかし研究を進めていくなかで,骨格そのものは変わらないものの,いくつかの修正が行われようとしている。第5章では住宅需要の動学的な側面を扱うこととし,清水を中心に分析が進められている。また,第5章で扱うこととされたシミュレーション分析については,それに替わって住宅市場が経済厚生に及ぼす動学的な影響について理論的かつ実証的な研究も加える方向で研究が進んでいる。具体的には,第8章では土地利用規制とりわけ都市税制が経済厚生に及ぼす効果について理論的な分析が,また第9章ではDSGEを住宅市場に応用して住宅価格の変動が経済厚生に及ぼす影響について実証的な分析が進められている。なお,前者については中神が,また後者については井上が主として担当している。3年目に入り研究を進めていくうえで若干の変更を迫られた。その大きな理由として首都圏における住宅市場の動学的な分析を行うためにはより空間的な要素を強調する必要があると感じたからである。プロジェクトの前半は住宅市場のファイナンス的な側面を軸に分析を進めていたが,マクロ経済のなかの住宅市場分析と首都圏という空間的な住宅市場分析との違いを多少なりとも際立たせる必要がある,そうでなければ本プロジェクトの意義が薄れてしまうのではないかと考えたのである。そこで,第1章(コミュニティの属性と住宅需要),第2章(土地利用規制と資産税制),第3章(住宅市場とバブル)で予定されていた内容についてはひとつの章に整理し,新たに第2章で住宅価格の動きを評価する指標である使用者費用と価格家賃比率について考察し,第3章において住宅市場におけるリスクの問題を取り上げ,とくに空間的なリスクがもたらす価格への影響について考察を加えた。いずれも首都圏における空間的な住宅市場の動学分析を行ううえで大切な内容を含むものである。その変更を受けて,当初予定されていた第5章については空間的な住宅市場の分析を行うには無理があるとの理由から削除し,第4章では第1章から第3章までの基礎理論をベースとしたデータによる記述的統計による分析を行う。

第5章GVARによる効率性の検証,第6章ヘドニック分析による投資的要因の検証,第7章住宅供給の価格弾力性の推計とその要因,第8章土地利用規制とりわけ都市税制が経済厚生に及ぼす効果,第9章ではDSGEを住宅市場に応用して住宅価格の変動が経済厚生に及ぼす影響について実証的な分析が行われる。
難治性疾患に対するmiRNA補充療法の開発

本研究では、miRNA補充療法のプラットホーム開発を行い、既存の手法では完治ができない特発性肺線維症や肺がんなどの難治性疾患治療の臨床応用を目指した。その結果、Pre-miR-451の構造に着目し、30塩基まで短縮化することに成功した。この短縮型mimic miRNAは、in vitro及びin vivoの検討から、自然免疫応答が低減される核酸であることが明らかとなった。さらに、本プラットフォーム構造によって作製したmicoRNA-34aは、Ras導入マウス肺がん発生モデルで治療効果を示し、ghRNAがmiRNA補充療法における製剤プラットフォームとして臨床応用可能であることが示された。項目1 Dicer活性の低いがん細胞でも効果を発揮する補充型miRNAプラトフォームの開発:一般的にがん細胞は、Dicerの活性が低いため、miRNAの発現量が低下していると考えられている。従ってmiRNAの補充療法を考えた際は、Dicer非依存的なmiRNAのAgo2の取り込みが重要と考える(Nature 425:584,2010, Science 328:1694,2010)。このような背景の中、今年度は、特殊な構造をとるmiRNAの開発に成功しghRNAと命名した。また、Dicer -/-細胞の作製にも成功し、ghRNAがDicer非依存的に作用することが明らかになった。項目2疾患細胞特異的に発現する分子を同定し、それに結合可能なペプチドを単離:今年度は、EGFRに結合するペプチドの単離を行った。項目3エクソソーム成分に類似した脂質をコンジュゲートしたmiRNAの開発:エクソソームは、RNaseに抵抗性で、生理的に存在する生体内成分であることから、理想的なmiRNA/siRNAのドラッグデリバリーシステムと考えられるが、一方で生体成分であるがゆえにMHCクラスI,IIの発現があり、生物製剤として免疫拒絶の問題がある。したがって、エクソソームに類似した人工的物質を作ることが理想的である。今年度は、BONAC社の協力を得てエクソソームと同サイズの粒子を作製することに成功した。項目4特発性肺線維症(IPF)及び肺がんに対するmiRNA補充療法の非臨床開発:今年度は、まず活性化Rasによる肺腺癌モデルでの検討を行った。DDSとしてはキトサンを用い、標的miRNAにはmiR-34aを用いて検討を開始している。microRNA(miRNA)は20塩基長前後の小RNAで、生体の様々な生理活性を制御する。従来の手法では標的にできない分子に対してmiRNAを用いた治療が期待されている。これまで、我々は、種々の疾患における臨床応用を前提にして研究を行い(1)エクソソームを利用したmiRNAのDrug delivarysystem(DDS)の開発、(2)標的細胞指向性の核酸医薬品の開発、(3)治療標的となるmiRNAの単離を行ってきた。この研究成果を踏まえ、本研究では、(1)人工エクソソームの開発、(2)Dicer非依存型miRNAの開発、(3)ペプチド付加型miRNAの開発を行う。これらの成果によって、局所ならびに全身投与のmiRNA補充療法のプラットホーム開発を行い、既存の手法では完治ができない特発性肺線維症や肺がんなどの難治性疾患治療の臨床応用を目指した。平成27年度は、(1)Dicer活性の低いがん細胞でも効果を発揮する補充型miRNAプラトフォームの開発、および(2)特発性肺線維症(IPF)及び肺がんに対するmiRNA補充療法の非臨床開発の検討を主に行ってきた。その結果、我々が開発した短鎖型核酸医薬は、現在報告されているRNA干渉型の核酸医薬として最も小さく、免疫応答性が低く抑えられている事が明らかになった。また、短縮化に伴い一本鎖ヘアピン構造の大部分がガイド鎖で構成されることから、パッセンジャー鎖による望まない遺伝子抑制が消失しており、その点でも副作用が抑えられた核酸医薬となっている事が示された。研究計画に沿って順調に進展している。これまで、我々は種々の疾患において、臨床応用を前提に研究を行い(1)エクソソームを用いたmiRNAのDrug deliverysystem(DDS)の開発、(2)標的細胞指向性のmiRNAの開発を行ってきた。この研究成果を踏まえ、本研究においては、臨床応用可能で、特許性のあるmiRNA補充療法のプラットホーム開発を行い、既存の手法では完治ができない特発性肺線維症や肺がんなどの難治性疾患治療の臨床応用を目指す。平成28年度は、以下の検討を行った。(1)Dicer活性の低いがん細胞でも効果を発揮する補充型miRNAプラトフォームの開発:抗腫瘍効果と標的分子が明らかなmiR-34a及びmiR-29bを用いて検討し、loop sequenceの重要な配列を同定し、さらにDicer非依存的なmiR-144の配列を参考にして検討を行った。また、Ago familyを完全に欠失した細胞とDicerを欠失した細胞を作成し、新規の補充型miRNAの標的遺伝子の抑制効果も検討した。(2)特発性肺線維症マウスモデルでの検討:補充型miR-29bの最適な配列を決定し、ブレオマイシン誘発マウス肺線維症モデルを用いて検討を行った。(3)肺がんモデルマウスでの検討:RAS変異肺がんモデルマウスを用いてmiR-34aの投与検討を行った。

以上の結果から、局所ならびに全身投与のmiRNA補充療法のプラットホームを開発する事ができた。今回我々の開発した新規のmiRNAプラットホームは、guide hairpin RNAと命名した。今後はさらに、本miRNAによる補充療法を難治性疾患治療に応用していく。本研究では、miRNA補充療法のプラットホーム開発を行い、既存の手法では完治ができない特発性肺線維症や肺がんなどの難治性疾患治療の臨床応用を目指した。その結果、Pre-miR-451の構造に着目し、30塩基まで短縮化することに成功した。この短縮型mimic miRNAは、in vitro及びin vivoの検討から、自然免疫応答が低減される核酸であることが明らかとなった。さらに、本プラットフォーム構造によって作製したmicoRNA-34aは、Ras導入マウス肺がん発生モデルで治療効果を示し、ghRNAがmiRNA補充療法における製剤プラットフォームとして臨床応用可能であることが示された。研究項目14においていずれも計画に沿って進展している。出来る限り早期の臨床応用を目指している。そのために、DDSに関しては重要な課題と考えている。従って平成28年度は、従来の研究計画に加えて、AAVベクターやHSVウイルスを利用した遺伝子送達の手法も視野にいれて研究を行っていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。人体病理学我々が目指すのは、早期の臨床応用である。そのためには、研究項目14のすべてが必要である。特に項目1のmiRNAプラットフォームはほぼ完成形になっている。そこで、今後はこのmiRNAを、どのように病変部に送達していくのかがポイントになる。研究計画にも記載したが、そのためには、エクソソームを用いること、やペプチドを使い臓器特異性を付加すること、を考慮している。一方で、これ以外にLNPの技術を用いることも、研究の進展によっては考慮していく。また、将来の薬品化のことも考慮し、個々の技術の特許化も行っていく。予定していた実験計画に遅れが出たため。未使用の端数額を繰り越ししたため。引き続き実験を継続する。27年度の消耗品とし合算して使用する。
酢酸菌のセルロ-ス生合成に関与する遺伝子の解析とクロ-ニング

酢酸菌の産生するバクテリアセルロ-スは、工業材料として有望であるが生産コストの低減が課題である。我々は酢酸菌のセルロ-ス産生能を改善することを目的として、遺伝子組換え技術による育種改良を試みている。これまでに我々はセルロ-ス産生酢酸菌自身において遺伝子操作を可能とする宿主ーベクタ-系を開発した。今回は、実際にセルロ-ス生合成遺伝子のクロ-ニングを行う前に予備的にモデル実験を行った。モデル実験では、ショットガンクロ-ニング法によってセルロ-ス産生酢酸菌のもつロイシン合成遺伝子(βーイソプロピルマレ-トデヒドロゲ-ゼ遺伝子)をクロ-ニングした。ロイシン非要求性であるセルロ-ス産生酢酸菌(Acetobacter xylinum)ATCCー10245のト-タルDNAをMarmur法により分離精製し、回収した。これを制限酵素Bam HI,Sal Iをそれぞれ単独に用いて断片化し、各断片をプラスミドベクタ-pUC18に連結した。ロイシン要求性である大腸菌(Escherichia coli)HB101,C600をHanahan法に従って処理しコンピテント菌を調製した。これからとト-タルDNA断片が挿入されているベクタ-を混合し導入させた。その中でロイシン非要求性に形質転換した株をM9最小培地(ロイシンを含まず)で選択した。形質転換させた結果、Bam I挿入ベクタ-を用いた大腸菌C600形質転換体の中からロイシン非要求性に転換している菌株が得られた。この菌が持っているプラスミドDNAは9.2kbのサイズでありベクタ-pUC18のサイズ(2.7kb)より大きかった。このプラスミドをpUL1と命名した。プラスミドpUL1を再びロイシン要求性の大腸菌C600に導入させたところ、大腸菌C600は非要求性に形質転換した。したがって、このpUL1中に酢酸菌A.xylinum ATTCCー10245のロイシン合成遺伝子が含まれているといえる。次にpUL1の制限酵素切断地図を作成した。挿入した酢酸菌のDNA断片部分は6.5kbであり、この部分にロイシン合成遺伝子が存在する。さらにこの挿入部分上の位置を特定するため、pUL1を制限酵素HindIIIで小さな断片に切断し数種類の小型のベクタ-を作成した。大腸菌C600を形質転換させた結果、3.8kb(pUL1より小さなサイズ)のプラスミドを所有する形質転換が得られた。このプラスミドをpULH1とした。pULH1の制限酵素切断地図から、pULH1は大腸菌プラスミドpUF106とpUL1の1.15kbの部分からなることがわかった。この1.15kbの部分にロイシン合成遺伝子が存在している。この遺伝子が実際に酢酸菌ATCCー10245の遺伝子であることをビオチンを用いたサザンハイブリダイゼ-ションによって確認した。

大腸菌C600を形質転換させた結果、3.8kb(pUL1より小さなサイズ)のプラスミドを所有する形質転換が得られた。このプラスミドをpULH1とした。pULH1の制限酵素切断地図から、pULH1は大腸菌プラスミドpUF106とpUL1の1.15kbの部分からなることがわかった。この1.15kbの部分にロイシン合成遺伝子が存在している。この遺伝子が実際に酢酸菌ATCCー10245の遺伝子であることをビオチンを用いたサザンハイブリダイゼ-ションによって確認した。酢酸菌Acetobacter acetisubsp.xylinumIFO 3288が7種のプラスミドDNAを保有していることを確認し、分子サイズの大きなものからpFF17とした。pFFプラスミドは種々の制限酵素切断部位をもつこと、比較的分子サイズが小さいこと、また酢酸菌由来であることからベクタ-として利用できると考えた。しかし、pFFプラスミドはベクタ-として必要な遺伝学的マ-カ-が不明なため、大腸菌プラスミドのアンピシリン耐性遺伝子をマ-カ-として利用することを考えた。酢酸菌プラスミドpFFと大腸菌プラスミドpUC18とを連結し、キメラプラスミドを作成した。これらのキメラプラスミドを大腸菌Escherichia coliJM109内に導入させ、回収して解析した。回収したキメラプラスミドをセルロ-ス産生酢酸菌ATCC 10245への導入を試み、そのうち最も効率のよかったpAcc2を実用的てシャトルベクタ-としてpUF106と再命名した。酢酸菌ATCC 10245から回収したpUF106が再び大腸菌JM109へ導入できることを確認した。このようにpUF106は酢酸菌-大腸菌間のシャトルベクタ-として機能した。このベクタ-を用いて遺伝子クロ-ニングを行なうためには、高い形質転換効率(遺伝子導入効率)が必要である。当初の遺伝子導入法には、酢酸産生の酢酸菌に関して報告されている方法を用いたが、我々はセルロ-ス産生酢酸菌に適した方法を検討するため、この方法の種々の方法を変えてみた。コンピテント菌の調整溶液の塩化カルシウム濃度は0mMの場合が最も形質転換効率がよい。コンピテント菌とベクタ-の混合後に添加するポリエチレングリコ-ル(PEG)4,000の濃度は30%の場合がもっともよい。これらの条件ではベクタ-DNA 1μg当りの形質転換株の数が10^4個を越えており、この宿主-ベクタ-系は十分実用になると思われる。セルロ-ス産生酢酸菌Acetobacter xylinum ATCC 10245のゲノムDNAをMarmur法により分離・精製した。ゲノムDNAを制限酵素BamHI、SalIにより切断し生成した断片を、同じ制限酵素で切断したベクタ-DNA pUL1とT4 DNAガ-ゼを用い連結した。作成した組換えDNAを、Hanahan法によりコンピテントな状態にしたロイシン要求性(Leuー)の宿主大腸菌Escherichia coli C600に導入させた。ロイシンを含まないM9最少培地上で培養し、現われたロイシン非要求性(Leu+)の形質転換体が保有するプラスミドDNAを解析した。制限酵素BamHIを用いて作成した組換えDNA試料をロイシン要求性の大腸菌に導入したところ、ロイシン非要求性の形質転換体が現われた。