hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳癌組織における腫瘍内浸潤樹状細胞の成熟化のメカニズムと予後との関連

乳癌組織を用いて免疫染色を行い、未熟樹状細胞はおよびCD1aで、成熟樹状細胞はCD83を用いて標識した。その結果樹状細胞の成熟度とCD83の発現とには相関が認められた。またVEGFとTGFβの発現とCD83の発現とには負の相関が認められた。一方、CD1aやS100とには相関が認められなかった。つまりVEGFとTGFβの発現は樹状細胞の成熟のメカニズムに関与していることが示された。CCR6), CCR7, macropharge MIP-3aの発現と樹状細胞の成熟度とに相関は示されなかった。さらに腫瘍内成熟浸潤樹状細胞の多寡が進行乳癌患者の重要な予後因子の1つであることが証明された。現在-80度で凍結された乳癌組織を、凍結ミクロトームを使用して5-7 μmの連続切片を作成している。乳癌組織は脂肪含有率が極めて高く、切片作成にはやや難渋している。作成切片に対して適宜免疫組織学的染色を行っている。免疫染色は間接酵素抗体法にて行っている。なお、陰性対照試験は、一次抗体としてPBSを用い、同様の操作を行うこととしている。染色不良な切片も存在するため、その原因を探るべく、染色条件などを適宜変え、繰り返し染色を行っているが、まだばらつきが多いのが現状である。また、並行して乳癌組織本体、ならびにリンパ節に対しRT-PCR法を用いてCC-chemokine receptor 6 (CCR6)、CC-chemokine receptor 7 (CCR7)、macrophage inflammatory protein-3α(MIP-3α)、macrophage inflammatory protein-3α(MIP-3β)の発現を検索している。凍結標本を試料とし、GTC-CsCl法にて超遠心機を用い、total RNAを抽出している。その5μg(mRNA約500ng相当)からAMV transcriptaseを用いてcomplementDNA(以下cDNA)を合成している。合成したcDNAの1/10量をtemplateとしてCCR6、CCR7、MIP-3α、MIP-3βそれぞれの増幅用primerおよびβアクチン増幅用primerを用いてpolynerase chain reaction法(PCR法)に準じて遺伝子増幅を行っている。現在最先端の実験情報が得られる学会にも積極的に参加し、情報の収集に努めている。昨年に引き続き、現在ー80度で凍結された乳癌組織を、凍結ミクロトームを使用して5-7μmの連続切片を作成している。乳癌組織は脂肪含有率が極めて高く、切片作成にはやや難渋しているが、切離スピードの調整ならびに組織をスライドグラスに付着させるための筆の改良に伴い、精度が徐々に向上している。作成した切片に対して適宜免疫組織染色を行っている。染色精度も徐々に向上しているが、比較的長期保存された標本も多く、未だ染色不良となる切片も存在する。染色条件などを適宜変え、繰り返し染色を行っているが、まだばらつきが多いのが現状である。また、平行して乳癌組織本体、ならびにリンパ節に対しRT-PCR法を用いてCC-chemokine recepter 6(CRR6)、CC-chemokine recpter 7(CCR7)、macrophage inflammatory protein-3α(MIP-3α)、macrophage inflammatory protein-3β(MIP-3β)の発現を検索している。当初の予想より発現頻度が低いことが徐々に明らかとなってきた。理由は現在探索中である。さらに凍結標本を試料とし、GTC-CsC1法にて超遠心機を用い、total RNAを抽出している。その5μg(mRNA約500ng相当)からAMV transcriptaseを用いてcomplemantDNA(以下cDNA)を合成している。合成したcDNAの1/10量をtemplateとしてCCR6、CCR7、MIP-3α、MIP-3βそれぞれの増幅用primerおよびβアクチン増幅用primerを用いてpolynerase chain raction法(PCR法)に準じて遺伝子増幅を行っている。それぞれのケモカインで、発現頻度に大きな差があることが明らかとなってきた。さらに、腫瘍本体部とリンパ節間でも差があることが判明したことは興味深い成果である。また最先端の実験情報が得られる学会にも引き続き、積極的に参加し、情報の収集に努めている。-80度で凍結された乳癌組織を用い免疫染色を行った。その際未熟樹状細胞はCD1aで、成熟樹状細胞はCD83で標識させた。切除リンパ節にも染色を行い、腫瘍本体とリンパ節間の成熟度程度を検索した。次いでVEGF、TGFβの発現も検索し、樹状細胞の成熟度との相関を調べた。続いてRT-PCR法、ELISA法を用いて腫瘍本体、リンパ節におけるCCR6、CCR7、MIP-3α、MIP-3βの発現の有無を検索した。さらに腫瘍内のHER2/neuの発現を免疫染色して検索(1+の際にはFISH法を用いて確認)した。すべてのデータを患者予後と比較し、腫瘍本体内あるいはリンパ節における成熟樹状細胞の存在が予後因子となり得るかを検証した。CD1a、CD83共に染色は一部を除き良好であった。腫瘍本体とリンパ節間の発現率にも正の相関が認められた。またVEGF、TGFβの発現検索において、共にCD1aとは相関がみられなかったが、CD83とは負の相関が認められた。

すなわちVEGF、TGFβの発現は樹状細胞の成熟度に依存していることが証明された。また腫瘍本体、リンパ節におけるCC-chemokine receptor 6 (CCR6)、CC-chemokine receptor 7 (CCR7)、macrophage inflammatory protein-3α(MIP-3α)、macrophage inflammatory protein-3α(MIP-3β)の発現の検索においては、いずれも発現が低率であり、腫瘍本体ならびにリンパ節共に、その発現とには相関が認められなかった。患者予後との相関を検索したが、CD1a発現を認める未成熟樹状細胞の多寡と患者予後(健存率および生存率)とに相関はみられなかったが、CD83発現を認める成熟樹状細胞の多寡と患者予後とには相関が認められた。すなわち、成熟樹状細胞が発現している症例の方が、予後が良好であるとの結果が得られた。ホルモンレセプター、HER2発現と樹状細胞発現との相関は証明されなかった。乳癌組織を用いて免疫染色を行い、未熟樹状細胞はおよびCD1aで、成熟樹状細胞はCD83を用いて標識した。その結果樹状細胞の成熟度とCD83の発現とには相関が認められた。またVEGFとTGFβの発現とCD83の発現とには負の相関が認められた。一方、CD1aやS100とには相関が認められなかった。つまりVEGFとTGFβの発現は樹状細胞の成熟のメカニズムに関与していることが示された。CCR6), CCR7, macropharge MIP-3aの発現と樹状細胞の成熟度とに相関は示されなかった。さらに腫瘍内成熟浸潤樹状細胞の多寡が進行乳癌患者の重要な予後因子の1つであることが証明された。現在当初の予定より染色がやや遅れている。さらに免疫染色も切片の状態不良、あるいは染色条件が一定でない等の理由で不安定であるため、安定化に時間を費やし、実験は遅れている。凍結標本を試料とし、グアニンイソシアネート/セシウムクロライド法(GTC-CsC1法)にて超遠心機(33,000rpm)を用い、total RNAを抽出しているが、保存状態がやや悪い標本もあり難渋している。PCRはDNA Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus)を用いてCCR6、CCR7、MIP-3α、MIP-3βは25サイクル(94°C2分、55°C2分、72°C2分)βアクチンは22サイクル(94°C2分、55°C2分、72°C2分)を反応させているが、反応不良な材料もあり、同実験はやや遅延している。しかし、それぞれのケモカインで、発現頻度に大きな差があることが明らかとなり、さらに、腫瘍本体部とリンパ節間でも差があることが判明したことは興味深い成果である。外科学今後は上記実験を安定化に努め、一連の実験を完了させる予定である。
肺癌発生における環境要因に関する日米中国の比較研究

近年肺癌の増加は他臓器関に比し,特に著しいので,その増加の要因を明らかにすることが,緊急に必要と考えられる.第一は喫煙であるが,他の環境要因解析のため,本邦と米国・中国における地理病理学的研究を行い,それらを比較検討するものが目的である.肺癌の増加は日本以外の両国においても著しく,特に女性の非喫煙者肺癌増加が本邦さらに米国においても顕著である.昭和60年9月,米国国立癌研究所より上記問題の比較研究の提案があり,昭和61年度予備調査を行った.中国については,昆明医学院にて肺癌症例の調査を行い,女性肺癌発生率が男性よりも高い地区であることが半明したので,今後その地区において発生要因を検討する.方法:米国国立癌研究所のPiantadosiらは米国の肺癌死亡率をSEA(State Economic Area;1つないし複数のcountryから成る)ごとに白人男性の肺癌SMRについてMap studyを行った.Piantadosiらの論文と同様のモデル式での研究を行うことを計画し,昨年度,市町村毎の肺癌死亡率(昭和44ー53年)を,市町村毎の各種行政統計ゲータ(昭和49ー51年)からできるだけ寄与率が高くなるように説明変数を選んだ.更に,今年は, "Special difference"という隣接市町村との依存性・関連性の変数を導入して寄与率の向上を計った.結果:3341市町村のうち,既知の肺癌関連変数および経口暴露領域の変数が総て揃っている市町村は, 598しかなかった.しかし,肺癌死亡率(SMR)の分布は,全市町村でのものに近似していた.各市町村に隣接する市町村での平均肺癌SMR(男女計)と, SMRとの相関係数は0.36(P<.001)であった.SMR=5.847×「都市近郊」(2.35)-0.138×「大気汚染地域」(-0.05)+6.920×「石炭鉱山町」(1.54)+0.078×「総熱量」(2.67)-0.339×「総炭水化物量」(-2.54)-0.824×「総脂肪量」(-2.54)-0.00003×「食料費」(-0.15)+0.633×Special diff.(12.15)+23.694(1.58)重相関係数(R)=0.607注:( )内はt値今後の課題(1)米国での寄与率は90%で,上記の36%という成績のさらに改善が望まれる.(2)総脂肪量の係数がマイナス,何故か.(3)市町村ごとにではなく,医療圏ごとにデータを再分類し予測式をつくる.中国における比較研究は昭和62年度計画が出来上がったので,次年度にその結果が期待される.近年肺癌の増加は他臓器関に比し,特に著しいので,その増加の要因を明らかにすることが,緊急に必要と考えられる.第一は喫煙であるが,他の環境要因解析のため,本邦と米国・中国における地理病理学的研究を行い,それらを比較検討するものが目的である.肺癌の増加は日本以外の両国においても著しく,特に女性の非喫煙者肺癌増加が本邦さらに米国においても顕著である.昭和60年9月,米国国立癌研究所より上記問題の比較研究の提案があり,昭和61年度予備調査を行った.中国については,昆明医学院にて肺癌症例の調査を行い,女性肺癌発生率が男性よりも高い地区であることが半明したので,今後その地区において発生要因を検討する.方法:米国国立癌研究所のPiantadosiらは米国の肺癌死亡率をSEA(State Economic Area;1つないし複数のcountryから成る)ごとに白人男性の肺癌SMRについてMap studyを行った.Piantadosiらの論文と同様のモデル式での研究を行うことを計画し,昨年度,市町村毎の肺癌死亡率(昭和44ー53年)を,市町村毎の各種行政統計ゲータ(昭和49ー51年)からできるだけ寄与率が高くなるように説明変数を選んだ.更に,今年は, "Special difference"という隣接市町村との依存性・関連性の変数を導入して寄与率の向上を計った.結果:3341市町村のうち,既知の肺癌関連変数および経口暴露領域の変数が総て揃っている市町村は, 598しかなかった.しかし,肺癌死亡率(SMR)の分布は,全市町村でのものに近似していた.各市町村に隣接する市町村での平均肺癌SMR(男女計)と, SMRとの相関係数は0.36(P<.001)であった.SMR=5.847×「都市近郊」(2.35)-0.138×「大気汚染地域」(-0.05)+6.920×「石炭鉱山町」(1.54)+0.078×「総熱量」(2.67)-0.339×「総炭水化物量」(-2.54)-0.824×「総脂肪量」(-2.54)-0.00003×「食料費」(-0.15)+0.633×Special diff.(12.15)+23.694(1.58)重相関係数(R)=0.607注:( )内はt値今後の課題(1)米国での寄与率は90%で,上記の36%という成績のさらに改善が望まれる.(2)総脂肪量の係数がマイナス,何故か.
分相によるガラスの高機能化

ボロシリケート系、ホスホボロシリケート系ガラス、フェニル系有機無機ナノハイブリッドガラスについて、当該分相構造のダイナミックス及び当該分相構造中に析出したYBO_3、TiO_2結晶の示す物性を、発光、光触媒能、導電性の観点より検討した。溶融法によって作製されたガラスにおいて、アナターゼ型TiO_2結晶が単相で析出することを見出し、当該結晶は、多孔化のための酸処理後も失われないことを明らかにした。(1)分相構造および分相ダイナミクス熱履歴(ガラス融液の冷却速度、分相処理温度)や組成の異なるガラスを系統的に作製して、ホウ素の配位数について軟X線スペクトルと第一原理計算であるDV-Xαを用いて解析を行った。その結果、軟X線スペクトルにおける199eV付近のピークは4配位ホウ素、203eV付近のピークは3配位ホウ素であることが明かとなった。また、xNa_2O-(1-x)B_2O_3(x=0-03)ガラスの軟X線スペクトルよりNa_2Oが増加すると4配位ホウ素の割合は増加し、分相後の当該ガラスにおける4配位ホウ素も増加することも分かった。(2)分相構造の特徴を生かしたガラスの高機能化(1)発光特性歪みを有する蛍光結晶は、希土類イオンのf-f遷移の縮退が解けることで発光の輝度が著しく増大する。また歪みや配向は分相構造のサイズに大きく依存すると考えられる。分相構造中にYBO_3:Eu3^+赤色発光ナノ結晶を析出させる際に、ガラス転移温度よりやや高い温度で、試料の一端に加重をかけることによって延伸し結晶に歪みを与えることを試みた。加重をかけて得た試料において、蛍光強度の増加が観測された。当該ガラスについて得られた蛍光スペクトルの590nm付近の強度(0成分)と610nm付近の強度(R成分)を解析し、結晶の歪みと蛍光強度の関係を解明することを試みている。(2)イオン伝導性R_2O-P_2O_5-SiO_2-Al_2O_3系ガラスについてのプロトン伝導性について検討を行った。その結果、Al_2O_3の添加は、著しく耐水性を向上することが明らかとなった。また、アルカリ金属酸化物成分(R_20)において、Na_2O-K_2Oのように複数の成分にした場合、顕著にプロトン伝導の輸率が増大した。また、当該ガラス電解質による500°Cにおける発電特性は、0.4mA/cm^2の電流密度で0.2mW/cm^2であった。(1)分相構造および分相ダイナミクス熱履歴(ガラス融液の冷却速度、分相処理温度)や組成の異なるボロシリケートガラスを系統的に作製して、ホウ素の空間的な繋がり方を^<11>Bの2D相関NMR分光スペクトルより明らかにした。この際、21.8Tの強磁場のNMR測定装置を用いて精密に解析を行った。この結果、分相において酸に対する可溶相であるアルカリボレート相中のBはリング状にて存在していること、酸に対する不溶相であるシリカリッチ相中のBは、孤立した状態でSiと結合していることを明にした。(2)分相構造の特徴を生かしたガラスの機能性向上(1)発光特性分相構造中にYBO_3:Eu^<3+>赤色発光ナノ結晶を析出させる際に、ガラス転移温度よりやや高い温度にて延伸することで、分相構造中に析出した結晶を延伸方向に配列させることを試みた。発光スペクトルより得られるR/O(R:赤色発光成分、O:オレンジ発光成分)比より、ひずみの程度を解析したが延伸による顕著な歪みの効果は観測できなかった。(2)イオン伝導性アルカリリンケイ酸ガラスの分相により誘起される高極性の連通空間をプロトン伝導のパスとする新しい燃料電池電解質の作製を試みた。[Al]/[P]に対して導電率は、Al=0のガラスに比べて、Al量が増加すると最大で導電率は1.5桁低下した。さらに、アルミナ添加により混合アルカリ効果が顕著になった。これは、アルカリイオンが、シリカサイトに同形置換したAl近傍に束縛されることに基因するものと考えられる。(3)可視光応答高効率光触媒酸化チタンと酸化タングステンを含むガラスを作製して、分相構造中で結晶析出させることで、可視光活性光触媒ガラスを作製することを試みた。具体的には、TiO_2-WO_3-SiO_2-B_2O_3系ガラスを1000°C、15時間熱処理することにより、アルカリボレート相中にTiO_2、WO_3の結晶が同時に析出することを明らかにした。(1)分相構造および分相ダイナミクス燃料電池用電解質として重要なリンケイ酸ガラス系に焦点をあてて検討を行った。

当該ガラスのSpring8のSynchrotron radiation X-ray diffraction (SRXRD)の解析により、P=Oと添加したMg及びCaの配位状態とプロトン導電性との関連性を見いだした。さらに、当該ガラスの分相構造中にSnP2O7結晶を析出させることによって、著しいプロトン伝導性の向上が見られた。また、ゾルゲル法によって作製したフェニル基含有ガラスについて、コートするプラスチックス基板の当該ガラスの分相に及ぼす効果を明らかにした。(2)分相構造の特徴を生かしたガラスの機能性向上1発光特性分相構造中にYBO3:Eu3+赤色発光ナノ結晶を析出させる際に、当該ナノ結晶のY3+の位置にLa3+やSm3+などイオンサイズの違う希土類イオンを置換することによって、当該ナノ結晶に歪みを与え、発光強度、発光特性の変化を検討したが、これらイオン添加による構造の歪みに基づく発光強度の増大は観測されなかった。2イオン伝導性今年度も昨年度に引き続いて、分相により誘起される高極性の連通空間をプロトン伝導のパスとする新しい燃料電池電解質ガラスの作製を試み、白金電極を蒸着したガラスに水素雰囲気下で直流を印加し、電場による効果について検討した。さらに、ガラスに高い成形性を付与するアルカリ土類金属イオンの添加効果の検討を、Mg及びCaについて行い、Caを添加した場合の方が2桁程度、プロトン導電率が高いことを見いだした。3高効率光触媒アナターゼ型チタニア結晶析出の条件を検討した結果、TiO2-SiO2-B2O3-K2O系ガラスにおいて、アナターゼ型チタニア結晶が単相にて析出することを明らかにしたが、光触媒能の向上も顕著には見られなかった。本年度の研究計画の(2)(1)発光特性について、延伸による歪みの効果は観測されなかったことが、若干問題ではあるが、次年度はケミカルドーピングによる手法を用いて、発光特性の歪みの効果を検討したい。その他の研究計画については順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね申請書に基づく研究計画に沿って研究を進めていきたい。
平安期貴族社会における禁忌意識の構造―服喪・斎戒・物忌に着目して―

人の死に際して服喪を行う時、日常生活を構成する衣食住及び公的活動は一時的に禁忌(タブー)の対象となる。本研究は、平安期貴族社会を主たる対象として、服喪同様、一時的に日常生活を禁忌の対象とする諸慣習(斎戒・物忌)の実態を検討し、それら慣習の背後にある禁忌の意識を構造的に把握した上で、死に伴う禁忌の特性、及びそこから窺える死に対する意識を明らかにするものである。
大学コミュニティにおける留学生のコミュニケーションに関する研究

1目的および方法本研究の目的は、留学生も含めた日本の理工系研究室における言語使用の実態を、環境的要因も含めた文脈の中でその特徴と時間軸に沿った変化の様相から総合的に明らかにすること、および、環境である当該の「研究室文化」に関して具体的に記述することである。昨年度までに引き続き、2研究室をフィールドに、留学生5名、日本人学生3名、教員4名計12名に対して、定期的なインタビューおよび会話データ収集を行い、主に言語面と「研究室文化」の観点から分析した。2言語面からの分析日本語学習歴、研究室参入までは同様の経過をたどった3名の非漢字圏出身の留学生のうち、日常的なコミュニケーション、研究活動のすべてにおいて日本語を使用言語とした留学生と、研究室参入後日本語を使用する頻度が少なくなり英語中心となった留学生の主な相違点は、研究室における留学生の占める割合、教授の方針、研究室内を中心としたネットワーク形成の成否であることを実証的に明らかにした。日本人学生の英語使用に関する抵抗感は、一方の研究室では来日当初に留学生にとっての日本語習得の強い動機となったが、他方では、研究室に留学生の割合が増加するに伴い、抵抗感が薄れ英語を日常的に使用し、意識面でも変化したことが観察された。また、英語コース等の制度的な言語環境とは別に、個別コミュニケーションにおいては対象留学生の日本語能力に応じて、日本語あるいは英語が様々な割合で使用され、その割合は会話参与者の言語能力が大きな選択要因となるものの、場面毎、あるいは意図的に選択されている場合も観察された。3「理工系研究室文化」に関する分析行動の望ましさとしての明示的・非明示的な規範意識を構成員の自発的語りから抽出し整理した。また、理工系研究室間において、役割分担(M1が行事の幹事役等)や研究指導体制(教授、助教授等が専門ごとに率いる、同一テーマで研究する上級生が下級生を指導する)等の共通する部分と、教授の指導方針のような固有な部分とについて具体的に記述した。本研究は、大学コミュニティ、特に研究室内における大学院レベルの研究留学生、教官、日本人学生間のコミュニケーションを研究対象にし、理工系留学生を研究室に加入した時点から3年間にわたって追跡調査しようというものであり、今年度はその初年度にあたる。まず、今年度は、調査協力者となる理工系研究留学生を1名に限定してスタートした。研究留学生およびその所属研究室(指導教官、研究室メンバー)へ協力依頼した後、双方の協力了承が得られるまで、十分な時間をかけて趣旨説明をした。了承が得られた後、調査対象研究室の背景情報(構成メンバー、日課、研究の進め方など)の聞き取り調査を行ない、当該研究室の特性を配慮した定期的な生のコミュニケーション資料収集可能なアクティビティーを決定し、収集スケジュールを検討、決定した。現在、留学生と教官間、留学生と日本人学生間の生のコミュニケーションデータを、ICレコーダーを主に使用して収集し始めたところである。データは、今後文字化し、コードスイッチング、フォリナートーク、ディスコースのポライトネス、待遇レベル管理、談話管理などの観点から詳細にまた包括的に分析し、その特徴と時間軸に沿った変化の様相を、環境的要因も含めた文脈の中で総合的に明らかにする予定である。本研究は、大学コミュニティ、特に理工系研究室内における大学院レベルの研究留学生、教官、日本人学生間のコミュニケーションを研究対象に、理工系留学生を研究室に加入した時点から最長3年間追跡調査するケーススタディである。2年目の今年度は、調査協力者となる理工系研究留学生を1名増やし、調査協力者の核となる留学生は合計2名となった。

前年度と同様、研究留学生およびその所属研究室(指導教官、研究室メンバー)へ協力依頼した後、双方の協力了承が得られるまで十分趣旨説明をし、了承が得られた後、調査対象研究室の背景情報(構成メンバー、日課、研究の進め方など)の聞き取り調査を行った。当該研究室の特性を配慮した定期的な生のコミュニケーション資料収集可能なアクティビティーを決定し、収集スケジュールを決定したうえで、留学生と教官間、留学生と日本人学生間の生のコミュニケーションデータの収集(ICレコーダーを主に使用)、および、留学生、指導教官、また、当該留学生との接触頻度の高い日本人学生に対して、できごとの確認および各自の感想・意見等についての定期的なインタビューを実施している。得られた2種類のデータは、言語学的側面(場面による言語選択、フォリナートーク、待遇レベル管理)、談話的側面(トピック管理、発話権の獲得、ポライトネス等)、異文化理解的側面(異文化接触スキル、関係性の構築過程、相手文化に対するイメージの変化、カテゴリー化、共感性等)から詳細にまた包括的に分析し、その特徴と時間軸に沿った変化の様相を、環境的要因も含めた文脈の中で総合的に明らかにする予定である。大学内の2カ所の理工系研究室をフィールドとし、研究室構成メンバーに対する定期的なインタビューデータ(3ヵ月に1回)および自然会話データを前年に引き続き収集した。調査協力者は研究室の構成メンバーの変化に対応して、研究室1では、教員2、留学生1、日本人学生1、研究室2では、教員2、日本人学生2、留学生4と増加し、研究室内のコミュニケーションの様相および研究室構成員の意識に関するデータを蓄積した。その結果から、1言語的分析各メンバー間の使用言語(日本語・英語)選択の最大の要因は留学生の日本語能力であるが、日本語能力初級の留学生に英語で話しかけられた日本人学生には、英語を選択する者とフォリナートークの日本語を使用する者があり個人差がみられた。また、留学生の研究室配置後の日本語習得には、研究室の構成メンバー比、研究室の日本人学生の英語力、研究室の国際的雰囲気等が関与することが明らかになった。留学生数が少なくかつ研究室の日本人学生に英語が通じないため自分が日本語を習得するしかないと初期の段階で決心したと留学生が語る研究室1では留学生の日本語能力の上達が早く現在では英語は全く使用されていない。一方留学生数の方が日本人学生数を上回る研究室2では日本語と英語が併用され、メンバーの組み合わせによって使用言語のパターンが決まっている。日本語の基本的スピーチレベルについては、留学生の日本語能力が低い場合には相互に丁寧体が基本となっている。2談話の分析会話の主導権、トピック、ポライトネス等に注目して、会話参加者の社会的上下関係、知識量の差、母語話者/非母語話者という要因も視野に入れつつ会話データの分析を進めている。3「研究室文化」について定期的なインタビューから、研究室の行事とその意味、役割分担、研究室内での行動に関するオリエンテーション、研究・学習ストラテジーの指導体制、研究室内の人間関係への期待、研究室に留学生を受け入れることの意味についての分析をまとめている段階である。
不死化T細腋クローンを用いたがんとウイルス感染症の免疫遺伝子治療

悪性腫瘍と難治性ウイルス感染症に対する免疫遺伝子治療の開発の目的で研究を遂行し、以下の結果が得られた。1)転写因子であるWT1は多くのがん細胞で高発現されているが正常細胞にはほとんど発現されていないことから、WT1はがん免疫療法の理想的標的抗原と考えられた。そこでWT1由来ペプチドを作製し、WT1特異的HLA-A24拘束性CD8陽性細胞傷害性T細胞(CTL)クローンを樹立した。このCTLクローンの細胞傷害性を検討したところ、白血病細胞や肺癌細胞に対してHLA-A24拘束性に細胞傷害性を示すことが示された。2)同様に、hTERTが広く悪性腫瘍細胞に高発現していることから、HLA-A24アンカーモチーフを有するhTERTペプチド特異的CTLクローンを樹立し、悪性腫瘍細胞に対する細胞傷害性を検討した。その結果、hTERT特異的CTLは多くのがん細胞をHLA-A24拘束性に傷害することが明らかとなった。3)WT1特異的ならびにhTERT特異的CTLクローンにHerpesvirus saimiri(HVS)を接種し、HVSによってこれらのT細胞クローンを不死化させた。不死化CTLは、本来の機能を維持したまま長期間の培養が可能であった。4)Herpes simplex virus thymidine kinase(TK)遺伝子をレトロウイルスベクターを用いて不死化CTLに導入した。現在、TK遺伝子導入不死化CTLの生体内でのがん細胞増殖抑制効果とガンシクロビルによる人為的排除を、ヒトがん細胞移入SCIDマウスの実験系で検討中である。5)さらに、同様の実験系でエイズの原因ウイルスであるHIVに対する新たな免疫遺伝子治療の基礎的研究を行なっている。がんとウイルス感染症の新たな免疫遺伝子治療の開発を目的に研究を行い、下記の研究成果を得た。1)急性白血病で高率に発現されるWT1のアミノ酸配列から、日本人の約60%が陽性であるHLA-A^*2402結合モチーフを同定した。2)このモチーフを有する9merペプチドを作製し、健常者末梢血単核球から誘導した樹状細胞(DC)にパレスし、自己CD8陽性T細胞をくり返し刺激した。この方法によって、WT1ペプチド特異的HLA-A24拘束性細胞傷害性T細胞クローンTAK-1を樹立した。3)TAK-1は、WT1を発現したHLA-A24陽性白血病細胞に対して特異的に細胞傷害性を示し、正常細胞には全く傷害性を示さなかった。4)健常者骨髄細胞の増殖にも全く影響は認められなかった。5)TAK-1を新世界猿のウイルスであるHerpesvirus saimiri(HVS)により不死化させた。HVS不死化TAK-1は、抗原刺激なくして長期間培養でき、本来のTAK-1同様の抗原特異性を示した。5)この不死化TAK-1に自殺遺伝子を導入する目的で、Herpes simplex virus-1由来thymidine kinase(tk)遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターを作製した。現在、このベクターを用いて不死化TAK-1にtk遺伝子を導入している。以上の結果から、新たなヒト白血病特異的標的抗原が明らかとなり、自殺遺伝子を導入したHVS不死化細胞傷害性T細胞は、白血病に対する免疫遺伝子治療に有用であると考えられる。現在同様の方法で、EBウイルスおよびヒトサイトメガロウイルス特異的不死化T細胞を用いた免疫遺伝子療法の開発に取り組んでいる。

そこでWT1由来ペプチドを作製し、WT1特異的HLA-A24拘束性CD8陽性細胞傷害性T細胞(CTL)クローンを樹立した。このCTLクローンの細胞傷害性を検討したところ、白血病細胞や肺癌細胞に対してHLA-A24拘束性に細胞傷害性を示すことが示された。2)同様に、hTERTが広く悪性腫瘍細胞に高発現していることから、HLA-A24アンカーモチーフを有するhTERTペプチド特異的CTLクローンを樹立し、悪性腫瘍細胞に対する細胞傷害性を検討した。その結果、hTERT特異的CTLは多くのがん細胞をHLA-A24拘束性に傷害することが明らかとなった。3)WT1特異的ならびにhTERT特異的CTLクローンにHerpesvirus saimiri(HVS)を接種し、HVSによってこれらのT細胞クローンを不死化させた。不死化CTLは、本来の機能を維持したまま長期間の培養が可能であった。4)Herpes simplex virus thymidine kinase(TK)遺伝子をレトロウイルスベクターを用いて不死化CTLに導入した。現在、TK遺伝子導入不死化CTLの生体内でのがん細胞増殖抑制効果とガンシクロビルによる人為的排除を、ヒトがん細胞移入SCIDマウスの実験系で検討中である。5)さらに、同様の実験系でエイズの原因ウイルスであるHIVに対する新たな免疫遺伝子治療の基礎的研究を行なっている。
p53遺伝子欠失マウスを用いた口腔癌発症機序の解析

p53遺伝子欠失C57BL/6マウス(p53^<-/->マウス)および正常C57BL/6マウスの口腔粘膜上皮細胞を用い、主として細胞周期制御機構の面から発癌機序を解析し、以下のような結果が得られた。1 p53^<-/->マウスから採取した口腔粘膜上皮細胞は、正常マウスのそれと比べて増殖能が高く、かつ培養可能期間が長かった。ただし、両者には形態学的な違いはみられなかった。2培養細胞にEGF,IL-1αなどの成長因子を添加すると、p53^<-/->マウス由来の口腔粘膜上皮細胞の増殖速度が正常マウス由来のものと比較して有意に律速された。3フローサイトメトリーによって細胞周期を検討したところ、p53^<-/->マウスの口腔粘膜上皮細胞では成長因子の添加によりG1期が短縮しており、G1停止が起こりにくくなっていることが判明した。4 p53^<-/->マウスの舌に発癌物質である4NQOを7日間塗布した後、c-myc,c-fosmRNAの発現を検討したところ、4NQO処理によってc-mycmRMの発現はp53^<-/->マウスおよび正常マウスいずれにおいても増強された。一方、c-fosmRNAの発現は、p53^<-/->マウスで抑制され、正常マウスでは変化がみられなかった。5 4NQOで処理した口腔粘膜上皮では、p21がp53依存性に発現が誘導されたが、p57の発現はp53非依存性であった。以上の結果から、口腔粘膜の癌化にはp53が関与する経路とp53非依存性の経路の異常の両方が関与している可能性が示唆された。p53遺伝子欠失C57BL/6マウス(p53^<-/->マウス)および正常57BL/6マウスの口腔粘膜上皮細胞を用い、主として細胞周期制御機構の面から発癌機序を解析し、以下のような結果が得られた。1p53^<-/->マウスから採取した口腔粘膜上皮細胞は、正常マウスのそれと比べて増殖能が高く、かつ培養可能期間が長かった。3成長因子によるp53^<-/->マウス口腔粘膜上皮細胞の増殖能の律速は、成長因子のレセプターの増加によるものではなかった。4フローサイトメトリーによって細胞周期を検討したところ、p53^<-/->マウスの口腔粘膜上皮細胞では成長因子の添加によりG1期が短縮しており、G1停止が起こりにくくなっていることが判明した。5p53^<-/->マウスの舌に発癌物質である4NQOを7日間塗布した後、c-myc,c-fosmRNAの発現を検討したところ、4NQO処理によってc-mycmRNAの発現はp53^<-/->マウスおよび正常マウスいずれにおいても増強された。
ヒアルロン酸の分子量低下に伴う顎関節破壊のメカニズムに関する研究

われわれはこれまでの研究において関節の潤滑に重要な役割を有するヒアルロン酸の分子量が顎関節症患者において有意に低下していることを明らかにしており(Takahashi T, et al. J Oral Pathol Med 33:224-229, 2004)、本研究では低分子化したヒアルロン酸が破骨細胞の分化・機能の活性化に関与し、関節破壊に関与しうるとの仮説を立てて、破骨細胞様細胞に対する様々な分子量のヒアルロン酸の影響について分子生物学的手法を用いて実験を行った。本年度も継続してマウスの破骨細胞前駆細胞cell lineであるRAW264.7細胞を用い、破骨細胞分化誘導因子であるreceptor activator of NF-κBligand(以下RANKL)および各分子量の鶏冠由来のヒアルロン酸4種類の存在、非存在化に培養を行い、分子生物学的手法を用いて、酒石酸耐性酸フォスファターゼ(tartrate-resistant acid phospatase、TRAP)染色、骨吸収活性測定、RT-PCR法による破骨細胞分化マーカーの測定、Western blotting法による細胞シグナル伝達経路の解析を行った。その結果、分子量8kDa以下の低分子量のヒアルロン酸が、RANKL誘導かの破骨細胞の分化、さらに骨吸収能に対して増強作用を有することが示唆された。またこの増強作用は低分子量ヒアルロン酸が破骨細胞前駆細胞上のRANKL分子の発現を活性化し、RANKL-RANK signaling cascadeを介してその下流の分子であるc-Srcの発現やp38のリン酸化を生ずる結果であることが示唆され、これらの研究成果はJ Biol Chemに掲載された。本研究によって、顎関節症においてはヒアルロン酸が低分子化を起こし、破骨細胞の活性化を惹起することにより関節破壊を起こす可能性を世界に先駆けて示した。われわれはこれまでの研究において関節の潤滑に重要な役割を有するヒアルロン酸の分子量が顎関節症患者において有意に低下していることを明らかにしており(Takahashi T, et al. J Oral Pathol Med 33 : 224-229,2004)、本研究では低分子化したヒアルロン酸が破骨細胞の分化・機能の活性化に関与し、関節破壊に関与しうるとの仮説を立てて、破骨細胞様細胞に対する様々な分子量のヒアルロン酸の影響について分子生物学的手法を用いて実験を行った。本年度はまずマウスの破骨細胞前駆細胞cell lineであるRAW264.7細胞を用い、破骨細胞分化誘導因子であるreceptor activator of NF-κBligand(以下RANKL)および各分子量の鶏冠由来のヒアルロン酸4種類の存在、非存在化に培養を行い、分子生物学的手法を用いて、酒石酸耐性酸フォスファターぜ(tartrate-resistant acid phospatase、TRAP)染色、骨吸収活性測定、RT-PCR法による破骨細胞分化マーカーの測定、Western blotting法による細胞シグナル伝達経路の解析を行った。またこの増強作用は低分子量ヒアルロン酸が破骨細胞前駆細胞上のRANKL分子の発現を活性化し、RANKL-RAML signaling cascasdeを介してその下流の分子であるc-Srcの発現やP38のリン酸化を生ずる結果であることが示唆され、これらの研究成果をJ BioL Chemに投稿中である。

われわれはこれまでの研究において関節の潤滑に重要な役割を有するヒアルロン酸の分子量が顎関節症患者において有意に低下していることを明らかにしており(Takahashi T, et al. J Oral Pathol Med 33:224-229,2004)、本研究では低分子化したヒアルロン酸が破骨細胞の分化・機能の活性化に関与し、関節破壊に関与しうるとの仮説を立てて、破骨細胞様細胞に対する様々な分子量のヒアルロン酸の影響について分子生物学的手法を用いて実験を行った。本年度も継続してマウスの破骨細胞前駆細胞cell lineであるRAW264.7細胞を用い、破骨細胞分化誘導因子であるreceptor activator of NF-κBligand(以下RANKL)および各分子量の鶏冠由来のヒアルロン酸4種類の存在、非存在化に培養を行い、分子生物学的手法を用いて、酒石酸耐性酸フォスファターゼ(tartrate-resistant acid phospatase、TRAP)染色、骨吸収活性測定、RT-PCR法による破骨細胞分化マーカーの測定、Western blotting法による細胞シグナル伝達経路の解析を行った。その結果、分子量8kDa以下の低分子量のヒアルロン酸が、RANKL誘導かの破骨細胞の分化、さらに骨吸収能に対して増強作用を有することが示唆された。またこの増強作用は低分子量ヒアルロン酸が破骨細胞前駆細胞上のRANKL分子の発現を活性化し、RANKL-RANK signaling cascasdeを介してその下流の分子であるc-Srcの発現やp38のリン酸化を生ずる結果であることが示唆され、これらの研究成果はJ Biol Chemに掲載された。本研究によって、顎関節症においてはヒアルロン酸が低分子化を起こし、破骨細胞の活性化を惹起することにより関節破壊を起こす可能性を世界に先駆けて示した。
らせん高分子集合体を反応場として利用する精密重合システムの開発

本研究においては、カチオン重合の立体選択性を高度に制御可能なキラル反応場を構築しうる高分子の合成を目的とした。例えば、キラルな集合体を形成しうるらせん高分子としてポリフェニルアセチレンやポリイソシアナートなどが一般的に知られている。しかし、そのらせん構造は比較的柔軟であり、反応場形成のためには剛直性が不十分である可能性がある。そこで、嵩高いキラル置換基を容易に導入可能なボロン酸エステルに着目した。主鎖に直接置換したボロニル基を有するビニルポリマーを合成することができれば、ヒドロベンゾインなどの嵩高いキラルジオールをボロニル基に導入することにより、主鎖周辺に高度な不斉空間を構築可能であると考えた。そこで、アルケニルボロン酸エステルをモノマーとして用いたラジカル重合に関して詳しく検討を行った。ラジカル開始剤であるアゾビスイソブチロニトリルの存在下、アルケニルボロン酸エステルのトルエン溶液を加熱したところ効率よくラジカル重合が進行し、数平均分子量が一万を超えるポリマーを与えた。この重合反応に関して、汎密度関数法を利用した量子化学計算により詳しく検討した。その結果、ホウ素が有する隣接炭素ラジカルの安定化効果が鍵となってラジカル連鎖成長反応が効率よく進行していることが示唆された。可逆的付加開裂連鎖移動機構に基づくラジカル重合制御を試みたところ、連鎖移動剤とモノマーの初期濃度比に対して直線的に数平均分子量が増加し、重合度のチューニングが可能であることが示された。今後は得られたポリマーのホウ素上へのキラルジオール導入を検討し、主鎖近傍における高度な不斉空間の構築を行うとともに、これをキラル反応場として利用した立体選択的重合を試みる予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
乳歯幹細胞を用いた脳梗塞細胞療法の開発

ヒト乳歯歯髄幹細胞を用いて脳梗塞モデルラットへ移植実験を行ったところ、コントロール群と比較し、有意な運動麻痺の改善を示し、梗塞領域の有意な減少も認めた。免疫組織学的にもコントロール群と比較し、神経細胞・神経前駆細胞・血管内皮細胞・SDF-1・VEGFの発現上昇を認めた。ヒト乳歯は、抜歯後は医療廃棄物となるため採取にあたり侵襲もなく、倫理的にも問題にはならない。そのような組織を脳梗塞治療に用いる可能性を見出すことができたことは画期的な出来事である。現在その成果を論文投稿中である。脳梗塞に対する乳歯歯髄細胞の効果を検討するため、ヒト乳歯歯髄よりヒト乳歯歯髄細胞を採取し、経代を行った後、38代目の1×10^6個の細胞を2μ1のPBSに希釈し、ハミルトンシリンジを用いて、中大脳動脈閉鎖術を行ったラット脳梗塞モデルへ術翌目に移植を行った。移植直前より経時的に術後15日目まで行動観察し、運動機能の改善状況をスコアリングしたところ、乳歯歯髄細胞移植群は、PBS群と比較して有意な回復を認めた。また術後16日目にて4%パラフォルムを用いて灌流固定を行い、30%シュークロースにて浸透させ、凍結ブロックを作成し、さらに一片が20μmの凍結切片を作成。その切片を用いて、doublecortin(神経前駆細胞マーカー)、NeuN・neurofilament H(神経細胞マーカー)、VEGF、SDF-1にて免疫組織化学的検索を行った。また移植したヒト乳歯歯髄幹細胞より、VEGF、SDF-1の発現が認められた。このことは、ヒト乳歯幹細胞は梗塞領域において神経栄養因子であるVEGF、SDF-1をリリースしていることを示唆している。また凍結切片を100μmずつ、ヘマトキシリン・エオジン染色にて染色し、NIHイメージを用いて梗塞領域を計測したところ、ヒト乳歯歯髄細胞移植群は、PBS群と比較して有意な縮小を認めた。以上の結果から、ヒト乳歯歯髄幹細胞は脳梗塞に効果を発揮する可能性が示唆された。今後はさらなるメカニズムの解析を行う予定である。脳梗塞は現在、世界の死因第2位である。また罹患者は年々増加し、多くの場合後遺障を伴うため画期的な治療法開発が急がれている。現在、脳梗塞への細胞療法として骨髄幹細胞が用いられ一定の効果を挙げている。しかし骨髄幹細胞は採取の際、骨髄穿刺を要し患者負担は大きく,また神経再生能も患者ごとのバラツキが大きく問題点もある。しかし歯髄幹細胞は,骨髄幹細胞より高い多分化能を持ち、in vitroにて血管誘導能および神経誘導能を示し、またブタ歯髄由来CD31^-SP細胞を下肢虚血マウスに移植すると血管新生を促進する(Iohara K et al ; Stem cells 2008)。そこで我々は脳梗塞ラットに同細胞を移植したところ運動機能が改善し梗塞体積が縮小することを発見した(Sugiyama M etal ; Tissue Enginnering Part A 2011)。また乳歯は脱落後、廃棄されるため患者負担はなく増殖能が早く免疫原性も低い(Nakamura S et al ;J Endod. 2009)。よって乳歯幹細胞は脳梗塞治療に最も適した細胞源となる可能性を秘めている。よって、本研究ではヒト乳歯歯髄幹細胞を用いた新たな脳梗塞治療法の確立を目指した。免疫組織学的にも神経細胞・神経前駆細胞の発現上昇と認めた。現在その成果を、論文投稿中である。
良性病変および正常細胞に出現する DNA aneuploidyに関する研究

他施設の設備を使用してもラット正常組織からDNA aneuploidy(DA)が出現することを確認した。ラット正常組織にみられたDAについてpropidium iodide(PI)以外の蛍光色素を用いて検討した。DAPIとアクリジン・オレンジ(AO)を試みたが、DAPIの測定は失敗した。AOに関しては容易に測定できたが、PIで単峰性(蛍光ヒストグラム上)の試料が二峰性になるなど検討事項が複雑化したにとどまった。AOの染色結果はDNAの高次構造を反映していると思われたが、文献は乏しく、この現象を正しく理解するにはAOについての基礎的検討がさらに必要と思われた。また、ラット脾臓細胞、ヒト抹消血リンパ球、ニジマス赤血球のDNAについて、DNA不安定性を比較する目的で0.4%の塩酸(ヒト胃酸濃度)を37°Cで様々な時間作用させ、PI染色して蛍光量をFCMで測定した。その結果、ラットの細胞にのみ短時間処理によって蛍光量の10-20%増加が起こったが、処理時間が10分を越えると蛍光量は経時的に(最長30分観察)小さくなった。塩酸処理時間が長くなるにつれてcoefficient of variation(CV)は大きくなった。また、二峰性のヒストグラムは得られなかった。以上の実験を含め、ラット正常組織にみられたDAはDNAの不安定性が異なる二群の細胞が混在すれば起こりうるといえるが、CVを小さく保ち、かつ、通常の細胞よりも多い蛍光量を示すための条件はとても厳しいものと思われた。したがって、ある多細胞個体(ラット、ヒトなど)の休止期体細胞が全て同じDNA量を持つという仮説が偽である可能性は消えていない。このことを確かめるためには、蛍光強度が異なる細胞群を分離しそれぞれのDNA量を生化学的に直接測定する必要があると思われた。
微生物を利用した簡便かつ網羅的な環境ホルモン検出法の開発

ダイオキシン受容体は、リガンドであるダイオキシン類が結合して初めて標的遺伝子の調節DNA配列に結合する。本研究ではこの性質を利用することにした。リガンドであるダイオキシン様物質の存在に応答して受容体が結合した標的DNA配列を、タグ付き受容体の精製を通して単離し、PCRにて増幅させる(転写因子標的DNA濃縮法)。これによって、試料中にごく微量でも存在するダイオキシン類を間接的に検出するという手法である。前年度に、Hisタグ付きのダイオキシン受容体AhR、および、共役受容体ArntをコードするDNA断片を酵母内強制発現ベクターヘサブクローニングしていた。今年度は、まず、標的DNA配列(DRE)を持つプラスミドの作製を行った。AhRおよびArntのヘテロダイマーが結合するDREを持たせたプラスミドを作製した。今後、これと、標的配列を持たないもう一つのプラスミドを、AhR-His、および、Arntを発現する組換え酵母に保持させる予定である。また、酵母のアミノ酸合成遺伝子をノックアウトしながら目的遺伝子をノックインすることができる汎用ベクターを構築した。このベクターに、酵母内で強制発現できるようデザインしたAhR-HisおよびArnt遺伝子を挿入した。一方、構築した発現遺伝子の産物が望む機能(二量体化と標的DNAへの結合)を発揮することを確認するために、大腸菌内で大量発現させ、転写因子標的DNA濃縮実験を行った。しかし、標的DNAであるDREを有意に濃縮することはできなかった。現在、ダイオキシンを用いて、二量体化を促進して同様の実験を行っているところである。リガンドであるダイオキシン様物質の存在に応答して受容体が結合した標的DNA配列を、タグ付き受容体の精製を通して単離し、PCRにて増幅させる。(発現遺伝子の構築)ダイオキシン受容体AhR、および、共役受容体ArntをコードするcDNAを鋳型として、リガンド結合、および、二量体化に必要なN末領域をコードするDNA断片をPCRクローニングした。AhRにのみHisタグを付加した上で、酵母内強制発現ベクターへ両受容体DNAをサブクローニングした。さらに、これらの発現遺伝子の両端にアミノ酸合成に関与する遺伝子の一部を付加させた。(組換え酵母の作出)構築した発現遺伝子のうち、Arntの発現遺伝子断片を酵母に導入し、現在、組換え酵母の選抜を行っているところである。得られた酵母には、さらにAhRの発現遺伝子断片を導入する予定である。(標的DNA配列を持つプラスミドの作製)AhR、および、Arntのヘテロダイマーが結合する標的DNA配列を持たせたプラスミドを作製した。これと、標的配列を持たないもう一つのプラスミドをAhRおよびArntを発現する組換え酵母に保持させる予定である。
CRF受容体発現調節機構に関する研究

[目的]クッシング病下垂体腺腫細胞とラット下垂体ACTH細胞におけるCRF受容体発現調節機序の違いを遺伝子及白レベルで調べ,ACTH分泌異常症及びクッシング病下垂体腺腫の病態生理解明の一助とする。[方法と結果]1ヒトCRFタイプ1受容体遺伝子は12個のエクソンからなることが明かとなったが,現在5'側を含むDNA採取を試みている。2 CRF-cAMP系は正常ACTH細胞におけるCRF受容体遺伝子発現及び蛋白レベルをdown-regulateし,クッシング病下垂体腺腫細胞におけるそれらをup-regulateさせた。一方糖質コルチコイドやAVPは双方の細胞においてもそれらをdown-regulateさせた。いずれの場合もCRF受容体mRNAレベルの変動が早いため,転写レベルよりもmRNAの安定性への影響と思われた。3坑CRF受容のC端抗体を家兎に免役して作成し,CRF受容体のRIAを確立して受容体蛋白の定量化に成功した。この抗体はCRF-R1とR2の双方の受容体に交叉した。正常ACTH細胞でのCRFによるCRF受容体への影響を見てみると,やはり蛋白レベルでもdown-regulationがおこることが証明された。[考察]正常ACTH細胞において,CRFはCRF受容体を遺伝子および蛋白レベルの双方でdown-regulateする。このことは視床下部性下垂体機能低下症でCRF試験にACTHが反応することの説明となる。このメカニズムの主な因子はc AMP-CREBの系と考えられる。一方,ACTH細胞が腫瘍化すると,この系を介して逆にup-regulateされ,ネルソン症候群への進展への一つの因子になりうる。今後はCRF受容体遺伝子の転写活性因子及びmRNAの安定化および不安定化のメカニズムについてさらに検討を加えることが必要と思われる。【目的】ヒト及びラット下垂体前葉ACTH細胞におけるCRF受容体発現の生理的及び病態生理的調節機構を解明する。【方法と結果】(1)ヒトゲノムライブラリーからType1 CRF受容体遺伝子のクローニングを試みた。その結果、少なくとも11個のexonが存在すること、CRF受容体遺伝子の全長は7kb以上あると考えられた。(2)ラット副腎を全摘し、糖質コルチコイドのネガティブフィードバックを解除すると、下垂体前葉のtype1 CRF受容体mRNAレベルは速やかに減少し、術後14日目でコントロールレベルに回復した。(3)ラット下垂体前葉培養細胞のtype1 CRF受容体mRNAレベルは、CRF、VP、cAMPによりdown-regulateされた。一方、培養したCushing病下垂体腺腫細胞では、VPでdown-regulateされたが、CRF、cAMPでは逆にup-regulateされた。デキサメサゾンは両方の細胞共、type1 CRF受容体mRNAレベルをdown-regulateさせた。【考案】(1)type1 CRF受容体遺伝子の5′側は未だ十分な長さのDNAがとれていない。今後プライマーを変え、更に長いDNA採取を試みる。(2)下垂体ACTH細胞のType1 CRF受容体遺伝子発現は、cAMP系によりdown-regulateされるが、Cushing病のように腫瘍化すると、cAMP以降のステップでの異常が原因でup-regulateされる。一方Cキナーゼ系は腫瘍化してもdown regulation作用は変わらない。このような腫瘍化によるcAMP以降のメカニズムの異常が、ネルソン症候群のような腺腫の増大に関与している可能性について、今後更に検討する予定である。[目的]クッシング病下垂体腺腫細胞と正常下垂体ACTH

細胞におけるCRF受容体発現調節機序の違いを遺伝子及び蛋白レベルで調べ,クッシング病の病態生理解明の一助とする。[方法と結果]1)CRF受容体遺伝子発現を調節するsecond messengerを調べたところ,CRF-cAMP系が正常ACTH細胞におけるこの遺伝子発現のdown-regulationに,又クッシング病下垂体腺腫細胞でのup-regulationに関与していることがin vivo及びin vitroの系で証明された。2)坑CRF受容体C端抗体を家兎に免疫して作成し,CRF受容体のRIAを確立して受容体蛋白の定量化に成功した。この抗体はCRF-R1とR2の双方の受容体に交叉した。正常ACTH細胞におけるCRFによるCRF受容体への影響を見てみると,やはり蛋白レベルでもdown-regulationがおこることが証明された。3)クッシング病下垂体腺腫細胞のCRF受容体遺伝子発現は,正常下垂体細胞と異なりCRF-cAMP系でup-regulateされるが,バゾプレッシンや糖質コルチコイドでは正常下垂体細胞と同様にdown-regulateされた。[考察]正常ACTH細胞におけるCRFによるCRF受容体のdown-regulationは,遺伝子および蛋白レベルの双方で見られることが明らかとなった。このメカニズムの主な因子はcAMP-CREBの系と思われる。一方,ACTH細胞が腫瘍化すると,この系を介して逆にup-regulateされるようになることが示され,ネルソン症候群への進展への一つの因子と思われた。今後はCRF受容体遺伝子の転写活性因子及びmRNAの安定化および不安定化のメカニズムについてさらに検討を加えることが必要と思われる。