hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクティブラーニングとe-learningによる小学生用防災教育カリキュラム開発

本年度はまずシステムを小型タブレット用に変更すること、小学校のネットワークではなくこのカリキュラム専用のネットワークを構築し、児童が入力したデータを専用サーバーで収集できるようにすることが最初の課題である。カリキュラムの内容については、昨年度は基本的に通学路で行った。そのためハザードについて発見したのかすでに知っていたのかが曖昧になった点もあった。そのため、本年度は通学路と違うエリアでフィールドワークを行いたいが、安全面の配慮から学校側との相談が必要である。認知地図の発達過程についてはより差を明確にするために、昨年度より広域な地図を描いてもらい、方向感覚の違いや地域の位置関係についての差異を見出したいと考えている。申請時には発表されていなかったより適した小型タブレットの発売が発表されたため、そちらに切り替えたことと業者による値引きが入ったことが差異となった。本年度は購入した小型タブレットにシステムを載せ替え、新宿区のネットワークとは独立した閉じたネットワークを構築して授業を行う。またフィールドワークにおいては、すべての班で購入したビデオカメラを使用して児童の行動を記録し、街の捉え方から児童のメンタルマップの分析を行う。
胃プロトンポンプの反応機構解析

1.リン酸化反応中間体形成時の酵素分子へのATP結合とその分解機構プロトンポンプ標品におけるリン酸化反応中間体(EP)の生成量とATPの結合量を定常状態にて検討した。その結果、(1)[γ-^<32>P]ATPを用いた酸安定なEPの蓄積量はα鎖1mol当たりEP結合量は0.5molであることが明らかになった。さらにMgCl_2存在下、酵素へのATPの結合は[α-^<32>P]ATPを用いるとα鎖1mol当たり0.5mol検出された。一方、[γ-^<32>P]ATPの場合、1molの結合が検出された。これらの結果から、EPを形成していない触媒サブユニットはH^+-ATPase反応のサイクル中ATPを結合していることが明らかになった。(2)ATPの結合におけるATP濃度依存性からリン酸化中間体の生成に必要な濃度は1μMであるのに対し、リン酸化中間体を生成しないサブユニットへのATPの結合は150μMを必要とした。(3)パルス-チェイス実験から、結合しているATPはEPと並列に加水分解される機構が明らかになった。2.プロトンポンプの分子観察によるポンプ分子の多量体構造FITCによってそれぞれのポンプ分子の触媒サブユニット1molに対し1mol化学修飾を施した酵素標品を用いて、可溶化後、全反射蛍光顕微鏡にて観察し、消光過程の時間経過から酵素の多重体度を解析した。(1)FITC標識した酵素分子の蛍光消光の時間経過から量子的な蛍光消光を確認した。また輝点の初期輝度分布から単量体から4量体の多量体構造が存在することを確認した。(2)酵素活性をほとんど失ったC12E8による可溶化ポンプは単量体と2量体が主要成分であるのに対し、n-octylglucosideによる可溶化画分はほぼ活性を保持しており、主に2量体と4量体が観察された。以上の結果からプロトンポンプにおいて、EP : EATPという中間体が存在すること、また活性を発現する最小機能単位は少なくとも2ないし4量体であることが示唆された。1.反応中間体形成時のATP結合プロトンポンプ標品におけるリン酸化反応中間体(EP)の生成量とATPの結合量の測定を定常状態にて検討した。その結果、(1)[γ-^<32>P]ATPを用いた酸安定なEPの蓄積量はα鎖をドデシル硫酸にて可溶化後、さらにゲルろ過にて分離後、分画したα鎖の280nmの紫外吸収と結合している^<32>Pの量比から算出した。その結果、α鎖1mol当たりEP結合量は0.5molであることが明らかになった。MgCl_2存在下、酵素へのATPの結合は[α-^<32>P]ATPを用いるとα鎖1mol当たり0.5mol検出された。

(2)ATPの結合におけるATP濃度依存性からリン酸化中間体の生成に必要な濃度は1.1μMであるのに対し、リン酸化中間体を生成しないサブユニットへのATPの結合は150μMを必要とした。2.リン酸化酵素中間体形成とルビジウムイオンの閉塞量リン酸化反応中間体経由で閉塞されるルビジウムイオンの結合に関して、定常状態における速度論解析を行った。その結果、リン酸化酵素依存的なルビジウムイオンの酵素への閉塞は観察されるが、その量は極めて低く、また完全なリン酸化酵素の分解は観察されない。ルビジウムイオンの化学量論的な結合の測定にはバナジン酸などの不可逆的なリン酸化アナログの結合が必要である。平成14年度の研究実績1.プロトンポンプの分子観察によるポンプ分子の多量体構造の検討FITCによってそれぞれのポンプ分子の触媒サブユニットのATP結合部位に存在するリシン残基にほぼ100%化学修飾を施した。修飾ポンプ標品をC12E8にて可溶化後、全反射蛍光顕微鏡にて観察し、消光過程の時間経過をモニターし、解析した。さらにn-octylglucosideによる可溶化を行い、C12E8にて可溶化した標品との比較を行った。その結果、1.プロトンポンプ標品において、FITC標識した酵素分子の蛍光消光の時間経過から量子的な蛍光消光を確認した。また輝点の初期輝度分布から単量体から4量体の多量体構造が存在することを確認した。2.C12E8による可溶化によってポンプは酵素活性をほとんど失った。一方、n-octylglucosideによる可溶化画分はほぼ活性を保持していた。可溶化画分の蛍光スポットの初期強度分布による多量体度は両者に大きな違いが見られた。C12E8では単量体と2量体が主要成分であるのに対し、n-octylglucosideでは主に2量体と4量体が観察された。以上の結果はプロトンポンプにおいて、活性を発現する最小機能単位は少なくとも2ないし4量体であることを示唆している。さらにC12E8にて可溶化した画分においても2量体が存在することから、2量体自体は活性をもたない可能性が高い。すなわちプロトンポンプは膜中では4量体で機能していることが強く示唆された。
インドシナの稲作地域における住民の意思決定要因に着目した土地利用予測モデルの構築

申請書記載のとおり、平成25年度は成果のまとめを行う年でった。本研究の目的はミクロ的分析とマクロ分析の融合による土地利用予測モデルの構築である。1年目および2年目の前半に綿密なミクロ的分析を行い、その結果を踏まえたマクロ的分析を2年目後半および、3年目の前半に実施した。これらの成果は随時学会やシンポジウムで発表し、そのたびに国内外の研究者との意見交換を行って研究を遂行してきた。ラオス南部における土地利用変化を、利用権の移転に着目してその要因を明らかにした。その結果、土地利用の変化にたずさわるステイクホルダーと、彼らが土地利用を変えて生活している要因がクリティカルに示された。すなわち、森林減少に対する国際的な危機感の高まりが後押しした各政策により住民に対して造林が求められ、個人所有のプランテーションが拡大、またこのような土地利用権の固定化によって、共有地は減少し、住民の資源利用に負担を与えているのである。この利用権を得られるかどうかは、世帯の属性のうち民族や職業が関わっており、利用権のどうするか(相続か販売か)などには属性のうち年齢や家族構成がカギとなっていることがモデルによって明確に示された。本研究の結果から示唆されるのは、1土地利用権をめぐる弱者の存在であり、直接的にはこの層に土地利用権を与え、またそれが他者によって奪われないようにする方策が必要であるということ、次に2土地利用を安定化させるにはインセンティブ設計が必要であるが、それには補助金など一時的なものではなく、長く続けられる生業という形での誘導が必要であるということが考察された。また、その生業は現地の地域資源を生かしたものであるのが望ましく、そのほうが継続も期待できる。これは仮説にすぎないが、今後の研究で実証していきたいと考えている。2014年3月にはこれらの成果をまとまた博士論文を提出し、学位を取得した。今後は研究員としてさらなる分析を加えるとともに、マクロ的分析の一般的な目的である他地域への応用を視野に入れて研究を遂行している。また、博士論文に加筆して単著での出版を目標に活動している。本年度の成果は大きく2つに分けることができる。1つ目は年度の前半に行った文献調査と、本調査への準備である。土地利用変化はすなわち資源利用の変化である。この点に再度着目し、資源利用、共有地利用に関する文献を精読することで、その後の調査方針を決定づけることができた。資源利用は、その背景である地理条件の制約から逃れ得ない。言い換えれば、地理条件を考慮することなしに資源利用をモデル化することはできない。そこで、対象地域を標高別に4段階のクラスに分類し、これまで得た地域情報をもとに年度後半の現地調査計画を再度練り直した。2つ目は年度後半に行った現地調査である。調査計画に基づき、標高の異なる4箇所でデータ収集を行った。これらのデータを解析し、現在2本の投稿論文を執筆している。稲作地域という、食料生産上重要な拠点の土地利用がどのように変化するかを知ることは広域経済圏の発展を左右する大きな課題である。稲作地域の土地利用変化を正確に読み取り、それを予測するために、新しく取り入れた4地点比較の視点が有効に働くことが期待される。採用2年目にあたる今年度は前半で成果の報告を行い、後半で本研究の核となる研究のデータ収集を終えた。本研究の目的は、フィールドで収集される質的データ(ミクロデータ)と衛星画像をはじめとするマクロデータを統合的に用いることでより正確な土地利用予測を達成することである。2011年度では予備調査として地理条件の異なる4村を対象に世帯調査を行った。2012年度ではこの予備調査の手法を改善し、チャンパサーク県内からランダムに選ばれた10村を対象に本調査を実施した。この時の結果を基に今年度は投稿と発表を行い、学位論文の執筆に入る。また、予備調査の結果から得られた成果は現在とりまとめており、2013年5月に学会にて口頭発表を行うことが確定している。本調査では対象郡内の10村から選び出した300世帯を対象に、半構造化面接を行い、属性情報とともに土地利用権の移転の起こった土地の基礎情報を得た。1000例を超える土地利用権の移転が確認され、属性情報を説明変数として土地利用権の移転を説明できるようなモデルを決定する(多肢的選択モデル)。これを土地利用の決定要因として土地利用変化の予測をより正確なものにするほか、各シナリオ下での土地利用をシミュレーションし政策や新しい制度の導入について検討を加えていきたい。私が研究を行っているラオス南部は、気候・風土の点からみてもインドシナ域を代表する特徴をもっており、本研究が完成すれば、より広い地域へ適用できる施策の立案に寄与すると考えられる。

すなわち、森林減少に対する国際的な危機感の高まりが後押しした各政策により住民に対して造林が求められ、個人所有のプランテーションが拡大、またこのような土地利用権の固定化によって、共有地は減少し、住民の資源利用に負担を与えているのである。この利用権を得られるかどうかは、世帯の属性のうち民族や職業が関わっており、利用権のどうするか(相続か販売か)などには属性のうち年齢や家族構成がカギとなっていることがモデルによって明確に示された。本研究の結果から示唆されるのは、1土地利用権をめぐる弱者の存在であり、直接的にはこの層に土地利用権を与え、またそれが他者によって奪われないようにする方策が必要であるということ、次に2土地利用を安定化させるにはインセンティブ設計が必要であるが、それには補助金など一時的なものではなく、長く続けられる生業という形での誘導が必要であるということが考察された。また、その生業は現地の地域資源を生かしたものであるのが望ましく、そのほうが継続も期待できる。これは仮説にすぎないが、今後の研究で実証していきたいと考えている。年度の前半は、研究費使用の制限もあり、主に文献調査と予備調査を行う時間にあてた。年度の後半はフィールドワークにあて、十分な研究を行うことができた。具体的には、インドシナの稲作地域における土地利用変化の特徴をつかむため標高別4地点での土地利用調査および地点間での比較を想起し、その準備を進めることができた。これまで、低標高地点での調査を行ってきたが、4地点での比較研究の視点を取り入れることで精度の高い土地利用予測モデルの構築に寄与することができると考えられる。予備調査と本調査を明確に分け、フィールド調査を行ったことで、効率よく有効なデータの取得が可能となった。また、予備調査の結果は標高別の農業と視点から新たな研究のきっかけを生んだ。成果発表の面では2011年までの成果をまとめた投稿論文が掲載決定された。年度前半は、昨年度の成果を発表する論文2本を投稿した後、現地調査を行う。地域間比較の調査を進める。年度後半はデータ解析、成果のとりまとめの後、さらに現地調査を行う。今年度の前半でデータの解析を終え、論文にまとめて投稿する。年度後半はこの論文を主幹とする博士論文の執筆に着手し、その後本研究のとりまとめを行う。また、国際学会での成果発表、および研究協定機関であるチャンパサーク大学や他の調査期間を交えたシンポジウムの場での報告も予定している。直近の活動としては、予備調査で得られた知見を学会にて発表することが決定している。2014年3月にはこれらの成果をまとまた博士論文を提出し、学位を取得した。今後は研究員としてさらなる分析を加えるとともに、マクロ的分析の一般的な目的である他地域への応用を視野に入れて研究を遂行している。また、博士論文に加筆して単著での出版を目標に活動している。
ヒト好中球のアポトーシス制御機構におけるIAP familyの役割

平成16年度科学研究費補助金を得、ヒト好中球における抗アポトーシス因子の分子生物学的動向について詳細な検討を行った。実際の生体内での炎症性疾患における好中球のアポトーシス制御の影響を検討するにあたり、in vitroでの好中球培養系の検討と共に、血管内皮とのinteractionを検討することが重要であると考えた。そのため、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)との共培養、共刺激による好中球のアポトーシス制御および抗アポトーシス因子の変化を検討するため、まず、HUVECの単離、培養系の確立、ヒト好中球との共培養系におけるcontrol設定を行った。加えて、好中球と共にヒト生体内での炎症反応を引き起こす主たる細胞である単球についても検討を行った。これまでに、抗炎症性サイトカインであるIL-10刺激により、ヒト単球はLPS刺激によるTNFα産生が著明に抑制されることが知られていた。今回、G-CSF刺激によってもヒト単球におけるLPS刺激によるTNFα産生が抑制され、その機序としてSTAT3の活性化が関与していることを明らかにした。ヒト好中球に対しG-CSF刺激によりcIAP2が増加し、その機序にSTAT3が関与していることをあわせ考えると、この結果は非常に示唆に富むものと考えられた。
身体性・スポーツ文化の本質特性～北米ネイティブの物語を参照系として～

北米ネイティブの身体性やスポーツ遊戯に関わる物語には、自然観のみならず、部族間の信念対立から生じる戦争回避の知恵を含むものがある。また、世界説明としての語りや物語の結末が、時代や地域・部族ごとに異なる点に注目すると、そこには共同体の意味をめぐる問題(イデオロギー性)、エスニシティの強化意識も浮上する。物語にみられる自然観・身体観とともにスポーツ文化の本質特性が検討される。平成19年度は、パフォーマンス文化の理論枠組みの検討と、北米西海岸沿いワシントン州、オレゴン州の7つのネイティブ保留地区において、ネイティブ自身が運営するミュージアム、教育文化センター、図書館、文化施設において現地調査を行うとともに、身体思想の特性と球技神話の類型化について分析検討した。その結果、北米ネイティブにみられる球技神話は、北米東海岸沿いに限られていることが確かめられた。具体的には次の3つである。1.モスコーギ(Muskogee/Creek Story)版-北米南東部(現任のジョージア)の部族。2.チェローキー(Cherokee Story)版-北米南東部ノースカロライナ/オクラホマ、アラバマでの収録。3.オジブウエイ(Ojibuwa,Ojibway)版-アルゴンキン語族系<北のカナダのLabrador地方から、南の米国Carolina、そして西の太平原地方>である。しかし、同じ物語でありながらも、その展開や結末には一定の違いが見られるように、それぞれの民族の生態系や価埴観などの観念形態(イデオロギー)の差異が示唆された。他方、北米西海岸沿い北部では、生の営みに関わる社会的秩序・意味づけがトーテンポールによって構築されること、また、北米西海岸沿いの南部では、温暖な気候と豊かな漁獲に恵まれた川や海と結びついた「環境世界内存在」の物語を生み出していることから、世界と対時・融合しながら生活する生態系・環境の守り手としての身体、即ち、「身体とは環境世界内存在の媒質である」という本質特性が抽出された。平成20年度は、前年度の継続研究として、アメリカ東部ノースカロライナ州とテネシー州にまたがるアパラチア山脈(グレートスモーキーマウンテン)縦谷のチェロキー・インディアン保留地において、当該民族の野外パフォーマンス(歌、踊り、語り)をはじめ、球技神話に語られるスポーツ(スティックボール)にみられる象徴性の実際を調査するとともに、観光産業(カジノ)、ネイティブ自身が運営するミュージアム、図書館などでインタビューを行った。今年度は、チェロキー族の身体パフォーマンスに語り継がれる物語を、文化的(自己)表現・アイデンティティの強化として理解し、過酷な歴史を経験したチェロキー族の上演行為の中に、民族のイデオロギー生成の契機、個人・集合意識の変容、自立への方途を見いだした。一般に、パフォーマンス概念は多様であるが、それは身体があらゆるものと関わっているであり、身体的活動がもつ本質特性を整理する意味がいっそう明らかになった。そこで、遊びから儀礼までの連続体における多様なパフォーマンス行為が「パフォーマンスとしてのミュージアム(美術館・博物館・劇場)」の構築を果たし、その運営をネイティブ自身が担うようになった時、部族の自立の過程を見ると結論づけた。チェロキー族のパフォーマンス行為は、アメリカ史の物語なしには語れないことが改めて明らかにされ、世界と対峙・融合しながら生活する生態系・環境の守り手としての身体性を越えて、より明確な共同体意識に貫かれたスポーツ行為、パフォーマンス文化の本質特性が抽出された。
視覚移動ロボットによる能動的な環境表現獲得に関する基礎的研究

本研究では、タスク明確な存在を前提として環境表現の獲得方法、利用方法について考察することを目的としてきた。具体的には、どのようにしてタスクに応じた環境表現を作成するか、タスクが変わったとき環境の表現方法も変更すべきであるが、そのメカニズムをどのように実現するか、さらにそれら環境表現の(grain scale)をどのように決定するかといった問題に対し、何らかの解答を与えることが目的であった。まず、ロボットの具体的のタスクとして、ロボットは、環境を観測し、環境内から特徴的な物体を選出する。選出された物体により表現された地図をもとに人間のオペレータが特定の物体を指定する。ロボットは指定された物体を、得られた地図をもとに探索しながら、その物体の近傍まで移動を行う。というロボットの一連の行動を想定した。このタスクに対し、用意した環境の表現は、研究代表者が以前より研究してきた、全方位の視覚情報をもとにしたパノラマ表現と、ロボットの移動中に観測される経路パノラマ表現の2種類である。本研究の成果としては、ロボットがこの2種類の環境表現をロボットの状態と環境の観測結果に応じて使い分けながら、上記のタスクを効率よく達成することを実験により確認した。詳しくは、本報告書の研究発表の項目に記載されている論文で述べている。今後の課題としては、本研究で取り上げた2種類のパノラマ表現以外の表現の利用について考察することと、環境表現の粒度に関するさらなる考察を行うことである。
実験中枢神経系奇形モデルにおける発生病態の解析と神経移植による機能回復の検討

本研究の目的は,中枢神経系奇形の発生病態を解明するとともに,何らかの治療手段により神経機能の回復をニュ-ロンの成長・発達の正常化とともにえることにある。その方法論においては,各発生病態に基づいた原因の除去とともに,神経移植等の可能性を検討するものである。さらには,予防医学的観点においては,癒合不全等に共通するovergrowthの存在に注目し,中枢神経系奇形の病態進行以前の発生段階における診断法を確立することにある。研究方法としては,動物実験による奇形モデルの確立に主眼を置き,全胚培養下における催奇実験を行った。Wister ratの胎仔を妊娠10.5日に母体外に摘出し,全胚培養下に移した。神経管閉鎖の経過を実験顕微鏡下に観察し経時的変化を追跡した。結果においては,培養条件として,20%O_2下において正常発育の経過が観察され,95%の高酵素分圧及びvit.A投与群で神経管癒合不全の発生をみた。これらの神経管癒合不全は中胚葉の発育は体筋の発達上正常過程にあることより,単なるdevelopment arrestではなく,神経外胚葉形により特異な催奇形性の要因によるものであることが推測された。また,vitamin A 100単位/ml中で妊娠9.5日から48時間培養した例において,神経管は未閉鎖状態であり,組織学的に神経極の著明な挙上,脊索の巨大不整化等の変化を認め,72時間後も同様の所見がみられた。胎仔・胎仔間移植は6例の癒合不全モデルに行い,3例に24時間の生存及び,移植神経のviabilityを確認した。全胚培養法による中枢神経系奇形の実験モデルの報告は極めて少ない。同研究成果には,本実験系の基礎デ-タが集積され,今後の奇形胎児の経時的観察,さらには移植法による胎生期奇形修復の可能性の追及に大きな手がかりが得られたものと考える。本研究の目的は、中枢神経系奇形の発生病態を解析するとともに、何らかの治療手段により神経機能の回復をニュ-ロン成長・発達の正常化とともに得ることにある。その方法論においては、各発生病態に基づいた原因の除去とともに、神経移植等の可能性を検討するものである。さらには、予防医学的観点においては、癒合不全等に共通するoverーgrowthの存在に注目し、中枢神経系奇形の病態進行以前の発生段階における診断法を確立することにある。初年度の研究成果としては、動物実験による奇形モデルの確立に主眼を置き、全胚培養下における催奇実験を行った。Wister ratの胎仔を妊娠10・5日に母体外に摘出し、全胚培養下に移した。神経管閉鎖の経過を実体顕微鏡下に観察し経時的変化を追跡した。結果においては、培養条件として、20%O_2下において正常発育の経過が観察され、95%の高酸素分圧及びVit、A投与群で神経管癒合不全の発生をみた。これらの神経管癒合不全は中胚葉の発育は体節の発達上正常過程にあることより、単なるdevelopmental arrestではなく、神経外胚葉形により特異な催奇形性の要因によるものであることが推測された。今回、本年度の同研究成果には、本実験系の基礎デ-タが集積され、今後の奇形胎児の経時的観察、さらには移植法による胎牛期奇形修復の可能性の追求に大きな手がかりが得られたものと考える。

本研究の目的は、中枢神経系奇形の発生病態を解析するとともに,何らかの治療手段により神経機能の回復をニュ-ロンの成長・発達の正常化とともに得ることにある。その方法論においては、各発生病態に基づいた原因の除去とともに、神経移植等の可能性を検討するものである。さらには、予防医学的観点においては、癒合不全等に共通するoverーgrowthの存在に注目し、中枢神経系奇形の病態進行以前の発生段階における診断法を確立することにある。本年度の研究成果として、前年度よりの研究をさらに発展させラット胎仔の全胚培養の手技の確立、デ-タの集積が行なわれ、神経管癒合不全モデルがほぼ完成された。結果においては、催奇性因子としてのVitamin A 100単位/ml中で妊娠9、5日から48時間培養した例において、神経管は未閉鎖状態であり、組織学的に神経板の著明な挙上、脊索の巨大不整化等の変化を認め、72時間後も同様の所見がみられた。妊娠0.5日目より培養を開始した例では、ほとんどVitamin Aの影響は受けていなかった。以上の結果より全胚培養を用いた二分脊椎モデルは、その発生病態解析には極めて有用な方法であると思われた、本モデルにおける組織形態学的変化の中で、二分脊椎発生病態に関し最も重要であったことは,神経板の挙上であり、これにより神経者の一次的な閉鎖障害を生ずるものと推論された。本研究の目的は,中枢神経系奇形の発生病態を解明するとともに,何からの治療手段により神経機能の回復をニュ-ロンの成長・発達の正常化とともにえることにある。その方法論においては,各発生病態に基づいた原因の除去とともに,神経移植等の可能性を検討するものである。さらには,予防医学的観点においては,癒合不全等に共通するoverーgrowthの存在に注目し,中枢神経系奇形の病態進行以前の発生段階における診断法を確立することにある。本年度の研究成果として,これまでに行ってきた胚培養下における胎仔観察のもとで,癒合不全を生じた奇形モデルに正常胎仔の脊髄を移植した。dayl1.5の癒合不全胎仔6匹に,同日の正常胎仔脊髄を実体顕微鏡下に移植した。そして,24時間後のday12.5まで観察した。結果において,胎仔・胎仔間移植は6例の癒合不全モデルに行い,3例に24時間の生存及び,移植神経のviabilityを確認した。全胚培養法による中枢神経系奇形の実験モデルの報告は極めて少ない。同研究成果には,本実験系の基礎デ-タが集積され,今後の奇形胎児の経時的観察,さらには移植法による胎生期奇形修復の可能性の追及に大きな手がかりが得られたものと考えらる。
細菌光合成系へ電子を供給するPMS-乳酸とNAD-アルコール脱水素酵素の諸性質

紅色非硫黄細菌における有機化合物からの初発電子獲得系に関する知見は限られている。Rhodopseudomonas palustris No.7の細胞抽出液中に、NAD-非依存のD-およびL-乳酸脱水素酵素(LDH)とNAD-依存性のアルコール脱水素酵素が見いだされた。その中より、D-乳酸脱水素酵素(LDH)を電気泳動的に単一なまでに精製して、その酵素化学的諸性質を中心に検討した。ゲルろ過およびSDSポリアクリルアミド電気泳動法により、本酵素の分子量は235kDaで、サブユニットの分子量は57kDaと推定された。本酵素の等電点は5.0、活性の至適温度は50°C、至適pHは8.5、D-乳酸に対するKm値は0.8mMであった。本酵素の基質特異性は狭く、L-乳酸には活性を示さなかった。本酵素はシュウ酸により可逆的に阻害され、そのKi値は0.12mMであった。本酵素の補欠分子族は、FADであることを明かにした。これとは別に、シトクロムc_2(Cyt c_2)を精製し、電気泳的に単一な標品として得ることができた。本菌のCyt c_2はすでに得られている他の光合成細菌由来のものと比較して、等電点がアルカリ性側(9.4)にあった。分子量は12.4kDa算定された。D-LDHによる乳酸の酸化反応に伴ってCyt c_2の還元が観察された。以上の結果から、本菌においては、乳酸からの電子は、D-乳酸→D-LDH(FAD)→Cyt c_2→光化学系→NADへと流れて利用されるものと推定した。なお、L-LDHとADHについては、これらの酵素が不安定であることから精製することができなかった。ADHについては、部分精製標品を用いてその性質を検討した。ADHは、エタノール以上の直鎖アルコール(C_2C_7)に対して活性を示した。本酵素は、シアン化カリウムによって強く阻害され、0.1mMで60%阻害され、2mMで完全に活性を失った。紅色非硫黄細菌における有機化合物からの初発電子獲得系に関する詳細は不明なところも多い。Rhodopseudomonas palustris No.7の細胞抽出液中には、D-及びL-乳酸に対してそれぞれNAD-非依存(フェナジンメトサルフェート)の脱水素酵素、エタノールにはNAD-依存の脱水素酵素の存在が見い出されている。これらの酵素の精製を試み、その中で、電気泳動的に単一なまでに精製することができたD-乳酸脱水素酵素(LDE)の諸性質を中心に検討した。D-LDHは、供試菌株をDL-乳酸を電子ならびに炭素源とした培地を用いて、光一嫌気下で約120時間培養した細胞を超音波破砕処理して細胞抽出液を調製し、これを硫安分画したのち、DEAEセルロース、プチルトヨパール、ハイドロキシアパタイトによる各クロマトグラフィーを用いて精製した。精製酵素は、SDS電気泳動の結果より、分子量57,000と推定した。また、等電点は5.0であり、L-乳酸に対しては活性を示さなかった。

これとは別に、シトクロムc__-_2(Cyt c__-_2)を精製し、電気泳的に単一な標品として得ることができた。本菌のCyt c__-_2はすでに得られている他の光合成細菌のものと比較して、等電点がアルカリ性側(9.4)にあった。D-LDHによる乳酸の酸化反応に伴ってCyt c__-_2の還元が観察されたことから、本菌においては、乳酸からの電子は、D-LDH→cytc__-_2→光化学系→NADへと流れて利用されるものと推定した。なお、L-LDEについては量的に少なく、不安定であることから精製できていない。また、NAD-依存アルコール脱水素酵素は、精製を試みたが、現在までのところ単一の標品として得ることができていない。紅色非硫黄細菌における有機化合物からの初発電子獲得系に関する詳細は不明なところも多い。Rhodopseudomonas palustris No.7の細胞抽出液中に見いだされているNAD-非依存のD-およびL-乳酸脱水素酵素(LDH)、NAD-依存性のアルコール脱水素酵素について、すでに電気泳動的に均一なまでに精製されているD-LDHの酵素化学的性質の詳細について検討した。本酵素は、分子量235kDaで、4つのサブユニットからなると推定された。本酵素の活性の至適温度は50°C、至適pH8.5、D-乳酸に対するKm値は0.8mMで、DL-α-ヒドロキシ酢酸に対してはD-乳酸と比較して約40%の活性を示したが、L-乳酸には活性を示さなかった。本酵素はシュウ酸により可逆的に阻害され、そのKi値は0.12mMであった。本酵素の補欠分子族は、薄層クロマトグラフィー、可視吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの結果より、FADであることを明かにした。本酵素と共役し、D-乳酸からの電子により還元されることが明かにされ、すでに電気泳的に単一な標品が得られているシトクロムc_2についてもさらにその性質が検討され、分子量は12.4kDa算定され、他の紅色非硫黄細菌由来のものとは等電点が9.4とかなり高いことを明かにした。NAD-依存アルコール脱水素酵素(ADH)については、引き続き精製を試みたが、期間内に単一の標品として得ることができなかったので、部分精製標品を用いてその性質を検討した。ADHは、エタノール以上の直鎖アルコール(C_2C_7)に対して活性を示した。本酵素は、シアン化カリウムによって強く阻害され、0.1mMで60%阻害され、2mMで完全に活性を失った。
GCP症候群の相同疾患マウスにおける責任遺伝子Gli3とShh遺伝子の発現異常

Pdn/Pdnマウスでは、責任遺伝子であるGli3の極端な発現抑制が明らかになっていたので、Gli3遺伝子の突然変異部位の特定に努めてきた。その間に、Rutherらによって、Pdnマウスでは、Gli3遺伝子のイントロンにトランスポゾンが挿入されていることが報告され、そのトランスポゾンがイントロン3に挿入されていることを明らかにしてきた。本研究において、このトランスポゾンの正確な挿入箇所と実態の解明を目指した。エクソン3と4にプライマーを設計し、LA-PCRを行った結果、約11KbのPCR産物が得られ、これをシークエンスした。その結果、エクソン4側の約10Kbが解読された。その後、エクソン3の下流1.8Kbの配列を明らかにした。結果的にはイントロン3は65.8Kbもあり、そこで、これらの塩基配列をNCBI Annotation ProjectのデータベースでBLAST検索した結果、Intron3はNW_000072に含まれることが判明した。また、Gli3遺伝子のイントロン3の上流から41286/41287bpに5442bpのトランスポゾンが挿入されていることが判明した。Pdn/Pdn, Pdn/+,+/+胎仔の遺伝子型を胎生早期より識別する簡便な方法を開発するために、トランスポゾン挿入部位の上流にプライマーF5を、下流にR6を、トランスポゾンにetn11Fを設計した。その結果、+/+では214bp(F5⇔R6)だけの、Pdn/+では214bp(F5⇔R6)と180bp(etn11F⇔R6)の、Pdn/Pdnでは180bp(etn11F⇔R6)だけのバンドが得られた。Pdnマウス胚の卵黄嚢膜からgenomic DNAを抽出し、この方法で遺伝子型を決定後、胚本体からRNAを抽出し、競合RT-PCRを行い、Gli3とShhの遺伝子発現量を測定した。Gli3遺伝子発現量は、いずれの胎齢でも、Pdn/Pdn、Pdn/+は、+/+に比べ発現抑制されていたが、Shhでは胎生9日に限って、Pdn/PdnやPdn/+は、+/+より高い値を示した。遺伝性多指症/無嗅脳症マウスのホモ型(Pdn/Pdn)は、多指症、合指症、水頭症、両眼隔開離、前額の突出など、ヒトGCP症候群と類似した表現型を持つ。また、責任遺伝子であるGli3は、ヒトGLI3と極めて高いホモロジーを持ち、両遺伝子は染色体の相同領域であるマウス染色体13A2とヒト染色体7pl3にマップされることから、Pdn/PdnはGCP症候群の相同疾患マウスと考えてきた。一方、Gli3とSonic hedgehog(Shh)遺伝子は互いに発現を抑制しあい、一部の単前脳胞症の責任遺伝子がShhであることも明かになってきた。単前脳胞症では、両眼隔が狭まり、単眼症を呈することもあるが、逆にShhの過剰発現によって、両眼隔開離を発症する可能性が考えられる。Shhは脊索および神経管のfloor plateに発現し、Gli3はfloor plateを囲む領域で発現する。

このように、Gli3とShhは相互に発現を抑制しあって脳形態形成に関与していると考えられる。無嗅脳症の発症メカニズムをGli3とShhの発現の相互関係から解明することが、本研究の最終的な目的であるが、その前に、Pdn/Pdn,Pdn/+,+/+を胎生早期から遺伝的に識別するために、Pdnマウスの遺伝子異常を調べた。Pdnマウスでは、Intronにretrotransposonが挿入されており、その結果splicingの異常が起き、異常mRNAが出来ていると報告されてきた。そこで、今年度は、Pdnマウスのgenomic DNAを抽出し、Exon3の下流域とExon4の上流域にプライマーをつくり、LA-PCRを行うと、約15Kbのバンドを得た。さらに、Exon3の約7kb下流にtransposonが挿入されており、transposonからExon4までが約3Kb、transposonの間は約6Kbであることが解った。即ち、約10KbのIntron3に約6Kbのtransposonの繰り返し配列が入っていることが明らかになってきた。遺伝性多指症/無嗅脳症マウスのホモ型(Pdn/Pdn)は、多指症、合指症、水頭症、両眼隔開離、前額の突出など、ヒトGCP症候群と類似した表現型を持つ。また、責任遺伝子であるGli3は、ヒトGLI3と極めて高いホモロジーを持ち、両遺伝子は染色体の相同領域であるマウス染色体13A2とヒト染色体7p13にマップされることから、Pdn/PdnはGCP症候群の相同疾患マウスと考えてきた。一方、Gli3とSonic hedgehog(Shh)遺伝子は互いに発現を抑制する。Shhは脊索および神経管のfloor plateに発現し、Gli3はfloor plateを囲む領域で発現する。このように、Gli3とShhは相互に発現を抑制しあって脳形態形成に関与していると考えてきた。無嗅脳症の発症メカニズムをGli3とShhの発現の相互関係から解明することが、本研究の主な目的であるが、その前段階として、PdnマウスにおけるGli3遺伝子の異常を調べてきた。Pdnマウスでは、Intron3にretrotransposonが挿入されており、その結果splicingの異常が起き、異常mRNAが出来ている。そこで、PdnマウスのIntron3およぴretrotransposonの全塩基配列を決定しようと試みたが、複雑かつ長大な配列であり、まだ解読継続中である。そこで、今年度はGli3とShhのcDNAに適当なプライマーをデザインし、RT-PCRで胎生14日から生後O日までの発現量を調べた。その結果、Gli3は胎生14日で高く、順次日を追って発現量が減少した。また、その発現量には、+/+, Pdn/+, Pdn/Pdnの順に差が認められ、Pdn/Pdnでは、+/+の1/4程度の発現量であった。一方、Shhは胎生期あるいは生後0日でも発現量に大きな変化はなく、また、期待に反して、+/+, Pdn/+, Pdn/Pdnの間に差を認めることができなかった。Pdn/Pdnマウスでは、責任遺伝子であるGliの極端な発現抑制が明らかになっていたので、Gli3遺伝子の突然変異部位の特定に努めてきた。その間に、Rutherらによって、Pdnマウスでは、Gli3遺伝子のイントロンにトランスポゾンが挿入されていることが報告され、そのトランスポゾンがイントロン3に挿入されていることを明らかにしてきた。本研究において、このトランスポゾンの正確な挿入箇所と実態の解明を目指した。エクソン3と4にプライマーを設計し、LA-PCRを行った結果、約11KbのPCR産物が得られ、これをシークエンスした。
標識遺伝子導入によるin vivo相互作用解析法の開発

本研究の目的は、我々がこれまで行ってきた抗体を用いた標的遺伝子単離法を、より効率の良い単離法にするため、転写因子にタグを付けた遺伝子を導入したトランスジェニック線虫を作製し、そのタグを利用した標的配列の濃縮を行うことである。2種類のホメオボックス遺伝子Hox(mab5,egl5),unc4にFLAGエピトープタグおよびHis6タグを結合したコンストラクトを作製し、これらの遺伝子が染色体に組み込まれたトランスジエニック個体を得た。導入遺伝子がミュータントフェノタイプをレスキューすることから、これらの遺伝子産物は正常遺伝子産物と同じ標的遺伝子群の発現制御をしていると考えられる。His6タグは他の抗体による精製と異なり、Niカラムを用いて、蛋白が変性状態で精製することが可能であることから、この方法においても有用なタグであると考えられる。また、His6タグは大腸菌、酵母、培養細胞などからの蛋白の精製に広く用いられているが、多細胞生物個体中でタグ付き蛋白が正常な機能を果たすことを示したのは、本研究が初めてであると思われる。抗体やタグを利用してアフィニテイー精製したDNAプール中に濃縮された標的配列をDNAチップを使ったハイブリダイゼーションによって特定できるかどうかの検討を行った。モデル実験として全ゲノムに特定の配列を加えたDNAをプローブとしたハイブリダイゼーションによって、10倍以下の濃縮で特定配列の特定ができることが明らかになった。またチップ作製のための短い(約100bp)ゲノム断片を含んだライブラリーを作製した。DNAシークエンサーを用いたゲノムスキャンニングによる濃縮配列検出の検討も現在行っている。
開口放出機構におけるシナプトタグミンの役割

1.正常細胞でのシナプトタグミン-クランプ機構についての検証我々は高透過細胞系を用いて、シナプトタグミン-クランプ機構を解析してきたが、本年度は、正常な細胞内でのこの機構の検証を目的として、CALI法(Chromophore-Assisted Laser Inactivation:レーザー分子機能不活性法)の確立を行った。CALI法は、正常細胞内で、レーザー照射により、マラカイトグリーン(MG)標識抗体が特異的に結合した機能分子ドメインを選択的に不活性化することが可能な実験法であり、開口放出機構研究に対する新たなブレイクスルーとして期待される。クロマフィン細胞内へのMG標識抗体導入法としてまず、Scrape-loading法を確立した。SNARE蛋白質に対する抗体をMG標識し、この方法により導入した細胞にレーザー照射を行ったところ、カテコールアミン分泌機能を抑制することに成功した。現在、抗シナプトタグミン抗体(モノクローナル抗体)を用いて、検討を進めている。2.シナプトタグミンとRACK1との相互作用RACK1はProtein kinase C(PKC)の受容体蛋白質として見出されているが、C2ドメインを持つシナプトタグミンとも結合することが知られている。組織化学実験により、クロマフィン細胞では、RACK1は、静止時、刺激時ともに細胞膜直下(F-actinと同局在)、顆粒膜、核膜周辺部に局在していた。PKCα,βは、静止時には細胞質に局在しているが、刺激時にはPKCαは細胞膜直下へ、PKCβはRACKlと同じ部位へ移行した。F-actinをモノマーへ解離させた場合、細胞膜直下に局在するRACK1の消失が観察され、PKCα,βの移行が観察されなかった。これらのことは、PKCのPACK1を介したF-actinへの結合が、開口放出のプライミング機構に重要であることを示唆している。一方、顆粒膜に局在しているRACK1は、シナプトタグミンと結合している、或いはPKCβの受容体であり、シナプトタグミンのリン酸化を促進させる役割を持つ可能性が推察された。1.シナプトタグミンへのイノシトールポリリン酸(Inositol Polyphosphates:IPS)結合による開口放出のクランプ機能を明らかにするために、IPSの細胞質内濃度変化をクロマフィン細胞において測定した。高透過性細胞にCa^<2+>刺激を行うと、細胞質内IPS濃度の一過性の上昇が観察された。この上昇は刺激後15秒以内に最高値に達し、カテコールアミン放出に先立って起こる。シナプトタグミンC2AドメインおよびC2Bドメイン抗体のCa^<2+>依存性IPS上昇への影響を解析したところ、このIPS上昇の一部分はシナプトタグミンC2AドメインへのCa^<2+>結合により、C2BドメインよりIPSが解離した結果であることが解った(投稿準備中)。この結果は、放出実験で我々が考察した、シナプトタグミン-クランプ仮説(静止レベルではC2BドメインへのIPS結合によって、分泌小胞の自発性放出が阻害(クランプ)されている。Ca^<2+>流入によるC2AドメインへのCa^<2+>結合により、IPSがC2Bドメインより解離し、IPSのクランプが解除され、分泌小胞のフュージョンが進行する)を支持するものである。2.開口放出においてシナプトタグミンとともにF-アクチンの重要性を我々はすでに明らかにしている。しかし、両蛋白間の相互作用の有無は不明である。最近、細胞骨格系画分に存在し、またシナプトタグミンと結合する蛋白質、RACK1(Receptors foractivated protein kinase)が見出され、このRACK1を介してF-アクチンとシナプトタグミンが細胞内で相互作用を持つ可能性が考えられる。そこで、免疫組織化学実験により、シナプトタグミン、RACK1、F-アクチンの細胞内局在を調べた。RACK1は静止時、刺激時ともに細胞膜直下のF-アクチンと同じ局在を示した。一方シナプトタグミンは、静止時には細胞膜周辺及び細胞質に存在しているが、刺激時に細胞質からF-アクチンの局在する細胞膜直下への移行が観察された。これらの結果は、シナプトタグミンのF-アクチン上に存在するRACK1への結合が、開口放出において重要であることを示唆しており、さらにこの点を明らかにするため、来年度も研究を継続する予定である。

組織化学実験により、クロマフィン細胞では、RACK1は、静止時、刺激時ともに細胞膜直下(F-actinと同局在)、顆粒膜、核膜周辺部に局在していた。PKCα,βは、静止時には細胞質に局在しているが、刺激時にはPKCαは細胞膜直下へ、PKCβはRACKlと同じ部位へ移行した。F-actinをモノマーへ解離させた場合、細胞膜直下に局在するRACK1の消失が観察され、PKCα,βの移行が観察されなかった。これらのことは、PKCのPACK1を介したF-actinへの結合が、開口放出のプライミング機構に重要であることを示唆している。一方、顆粒膜に局在しているRACK1は、シナプトタグミンと結合している、或いはPKCβの受容体であり、シナプトタグミンのリン酸化を促進させる役割を持つ可能性が推察された。
ウエルシュ菌に起因する鶏壊死性腸炎の新規病原因子ＮｅｔＢの病原性発現機構の解明

netB保有ウェルシュ菌は我が国でも広く存在し、健常鶏にも感染していることが明らかとなった。netBは接合性プラスミド上に存在するが、容易に伝播するものではなく、同一地域に蔓延するnetB保有株は単一ないし少数であった。NetBはニワトリが属するキジ目や一部の鳥類に限定された非常に特異性の高い毒素活性を有する孔形成毒素であった。NetBは、標的細胞の非ラフト領域において、細胞膜のコレステロールの関与無しに結合し、膜の流動性の影響を受けず近傍のモノマー同士が重合しオリゴマーを形成することが明らかとなり、NetBの細胞への結合から孔形成までの一連の分子動態の一部が解明された。1我が国で分離されたNetB産生菌の系統解析:NetB遺伝子(netB)は接合性プラスミド上に存在するため、異なる株間で比較的容易に水平伝搬が起ると考えられる。C. perfringensは鶏腸管内の常在菌であるため、単一農場内にも複数の菌株が存在する。そこで、netB保有菌の多様性をPFGE法による系統解析により調べた。同一農場で分離されたnetBを保有する4株は同一の型に分類された。一方、netBを保有しない同一農場株との相同性は低かった。異なる農場から分離されたnetB保有菌はすべて別の型に分類された。以上の結果から、netBを含む接合性プラスミドは容易に伝搬するものではなく、同一農場に定着しているnetB保有菌は単一あるいは少数であると考えられる。また、地域により異なるnetB保有菌が存在していることも明らかとなった。2細胞膜上のNetBの局在とコレステロールの関与:LMH細胞にNetBを反応させ、界面活性剤を用いて可溶化し、ショ糖密度勾配遠心にて分画後、抗NetB抗体を用いたイムノブロッティングによりNetBの細胞膜上での局在を解析した。モノマー分子および重合したオリゴマー分子は共に細胞膜上の非ラフト領域に存在し、オリゴマー化に細胞膜上のコレステロールの関与は見られなかった。このことから、NetBは細胞に結合後、膜の流動性と無関係に、非ラフト領域に留まり、重合しオリゴマーを形成することが示唆された。3NetB受容体の特定:LMH細胞を可溶化後、ショ糖密度勾配遠心により分画したのち、NetBのtoxin overlay assayにより、NetBが結合するLMH細胞膜上の分子の特定を行った。その結果、60, 53, 47, 40kDa付近の非ラフト画分に存在する分子がNetBと結合し、受容体である可能性が示唆された。NetBに対する感受性の動物種差を明らかにするため、10種類の鳥類と6種類の哺乳動物の赤血球を用いて、溶血試験を実施し、50%溶血量(HU50)を算出した。鳥類赤血球ではキジ目であるニワトリとホロホロ鳥の2種で高い感受性を示し、鳥類のなかで最大100倍程度の感受性の差がみられた。哺乳動物赤血球の感受性はニワトリと比較して1/100前後と低かった。株化細胞を用いた細胞傷害試験でニワトリ肝臓由来細胞(LMH)と10種類の哺乳動物由来細胞の50%細胞致死量(EC50)を算出した。LMH細胞では著しく高い感受性を示し(0.63μg/ml)、哺乳動物由来株化細胞ではほとんど感受性を示さなかった。以上の結果からNetBの細胞傷害作用は種特異性が高く、特にニワトリの感受性が高いことが明らかとなった。細胞膜上のNetBに結合する分子を特定するため、ニワトリ赤血球ゴーストを界面活性剤で処理し、可溶画分と不溶画分に分けた後、SDS-PAGEおよびPVDF膜に転写し、Toxin overlay assayを行った。界面活性剤としてNP-40とTriton X-114を用いたときに可溶性画分の100kDa付近にNetBと結合するバンドが検出され、NetB受容体である可能性が示唆された。単層培養したLMH細胞にNetBを反応させた後、細胞を界面活性剤で処理し、可溶性画分と不溶性画分に分け、イムノブロッティングによりNetBがLMH細胞上でオリゴマーを形成していることを確認した。我が国での、ニワトリ以外の動物におけるnetB保有菌の検出状況を調べた。壊死性腸炎と診断されたウシ24頭、ブタ14頭、カラス3羽、ペンギン10羽から分離されたC. perfringensA型菌について、いずれの株もnetBを保有していなかった。系統解析の結果、いずれの株もニワトリ由来netB保有菌とは遠縁であり、netB保有菌はニワトリ間で独自の進化を遂げている可能性が示唆された。

クロストリジウム属菌に有効とされる8種の抗生物質についてnetB保有菌11株について薬剤感受性試験を実施した。保有菌はいずれもリンコマイシンに対する耐性を保有していた。養鶏場では壊死性腸炎の治療および予防に多用されるため、広く耐性菌が出現したものと推定さる。NetBの病原性発現に関わるNetB分子上の領域を特定することを試みた。NetBに対して中和活性を有するモノクローナル抗体を作製し、NetB欠失変異体との反応性から領域を特定した。その結果、NetBを構成するアミノ酸配列において1残基目のセリンから82残基目のメチオニンおよび255残基目のアスパラギンから292残基目のロイシンに病原性発現に関与する領域が存在することを明らかにした。孔形成毒素の毒素発現機構の特徴から、受容体が種特異性を規定している可能性が高い。NetBの唯一の感受性細胞であるLMH細胞の細胞膜上に発現している種特異的な分子が受容体である可能性が高い。そこで、LMH細胞あるいはLMH細胞膜分画をマウスに免疫し、抗LMH細胞膜抗体を作製した。本抗体をLMH細胞に添加後NetBを作用させた時、陰性対照抗体と比較して、細胞生存率の有意な上昇がみられた。このことは本抗体がNetBの細胞膜への結合を特異的に阻害しており、抗体が認識する分子にNetB受容体が含まれていると考えられる。現在LCーMS解析により、本分子の特定を試みている。獣医衛生学、獣医感染症学我が国におけるNetB産生菌の疫学的解析の中で、netB保有菌のPFGEによる系統解析による同一農場での分布と拡散様式については、本研究課題内で目標とした成果がほぼ得られた。薬剤感受性についての解析を残すのみとなっている。NetBの毒性発現のための細胞膜上での分子動態解析については、細胞膜への結合後からオリゴマー形成までのメカニズムについてはほぼ解明した。応募時に予想していた細胞膜上の脂質特にコレステロールの関与が無いことが明らかとなった。このことは1つの大きな成果であるが、来年度において、特に受容体の特定に関して、応募時の「研究計画・方法」に記載した方法に多少の修正が加わることとなり、特定には至っていない。受容体への結合、オリゴマー形成、孔形成に関与するNetB分子上の領域の特定に関しては、NetBの欠失変異体の作製は終了しており、現在、モノクローナル抗体を作製中で、来年度にはNetB分子上の毒性発現に関わる領域が特定できるものと考えている。NetB受容体およびオリゴマー形成に関与する細胞膜上の領域の特定については、LMH細胞を用いたToxin overlay assayにより細胞をNP40で可溶化したときの可溶性画分にNetBと結合する分子を発見したことから、本分子がNetBの受容体である可能性が高く、来年度、この結合分子を単離し、質量分析等を実施することで、受容体を特定できると考えている。オリゴマー形成に関与する領域の特定についてはLMH細胞にNetBを添加し、可溶化後、イムノブロッティングによりオリゴマー形成を確認する系を確立することができたので、この系を用いて細胞膜上の様々な分子の除去や阻害剤を用いて、オリゴマー形成の細胞膜上のメカニズムを解明していく。NetBの受容体結合領域の特定に関しては現在、ホルマリンでトキソイド化したNetBをマウスに免疫し、モノクローナル抗体作製に取り掛かっている。来年度にはNetBを中和するクローンを選別し、組換えNetBの欠損変異体を用いて受容体結合に関与するNetB分子側の領域を特定できると考えている。