hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2本鎖RNAの抗RSウイルス作用を媒介するメディエーターの解明

ヒトRSウイルス(RSV)に対する抗ウイルス作用を示す2本鎖RNA(dsRNA)がいかなるメディエーターを介するかを検索する目的で、dsRNAの受容体でありかつ抗ウイルス作用を現すToll-like receptor 3(TLR3)に着目し、TLR3をヒト培養細胞に過剰発現させて、RSV感染実験によりその抗ウイルス作用を調査した。結果は、TLR3過剰発現細胞ではコントロール細胞と比較して有意にRSV産生が抑制された。この作用へのインターフェロン-ssの関与は低く、別の因子の関与が推測された。2本鎖RNAによる抗RSウイルス(RSV)作用の分子機構を解明する目的で、2本鎖RNAの受容体として細胞表面あるいはエンドソーム内に発現しているYoll様受容体3(TLR3)の関与を調査した。ヒト肺胞上皮細胞由来A549細胞にヒトTLR3発現ベクター(pUNO-hTLR3-HA、Invivogen)をトランスフェクションし、24時間後にRSVLong株を感染させたところ、感染12、24時間後にコントロール(非過剰発現)細胞と比較して有意にRSV産生が抑制された。次に同ベクターを用いてTLR3過剰発現A549細胞クローンを樹立し、RSV感染実験を行なった。同細胞クローンではTLR3は細胞表面ではなく細胞内で過剰発現していることがフローサイトメトリーで認められた。同細胞クローンにLong株を感染させたところ、感染18、24時間後でコントロール細胞と比較して有意にRSV増殖が抑制された。TLR3はウイルス複製中に産生される2本鎖RNAを認識し、I型インターフェロン(IFN-α/β)を産生することから、TLR3過剰発現による抗RSV作用を媒介するサイトカインとしてIFN-α/βの関与を検索した。A549細胞にLong株を感染させ、感染24時間まで経時的に細胞培養液中のIFN-α/β濃度をELISAにて測定した結果、IFN-β濃度は増大したがIFN-αは検出感度以下だった。TLR3過剰発現細胞クローン及びコントロール細胞にLong株を感染させ細胞培養液中のIFN-β濃度を測定した結果、予想に反して感染24時間後にコントロール細胞でIFN-β濃度が有意に高かった。この理由として、コントロール細胞培養液中ではRSV量が有意に高いため、高タイターのRSV感染がTLR3やその他のIFN誘導受容体を刺激した結果、コントロール細胞で多量のIFN-βが放出されたと推定された。平成21年度では、2本鎖RNAによる抗RSウイルス(RSV)作用の分子メカニズムを解明する目的で、2本鎖RNA受容体の一つであるToll様受容体3(TLR3)を過剰発現させたヒト肺胞上皮細胞由来A549細胞(TLR3-A549細胞)を樹立し、これにRSVを感染させてTLR3の抗RSV作用を見出した。更にこのTLR3による抗RSV作用のメディエーターとして、過去の報告よりI型インターフェロン(IFN)、特にIFN-βの関与が疑われ、TLR3-A549細胞及びベクター発現コントロール細胞にRSVを感染させ、細胞培養液中のIFN-β濃度をELISAで測定したところ、むしろコントロール細胞培養液中のIFN-β濃度がより高値であった。平成22年度ではIFN-βの関与をより詳細に検討する目的で、培養液中に抗IFN-β抗体を添加し、RSV感染により培養液中に産生されたIFN-βを中和することで、IFN-βがTLR3の抗RSV作用を媒介しているか否かを調査した。その結果、抗IFN-β抗体を添加することによりTLR3-A549細胞及びコントロール細胞の双方でRSV産生が有意に増加することがプラークアッセイで示された。しかしTLR3-A549細胞でのRSV産生量はIFN-βを中和してもまだコントロール細胞でのRSV産生量には届かず、以上よりTLR3の抗RSV作用を媒介する因子はIFN-β以外にも存在することが示唆された。本研究ではこれまで培養細胞における2本鎖RNAによる抗RSウイルス(RSV)作用を、Toll様受容体3(Toll-like receptor 3 : TLR3)をヒト肺胞上皮細胞由来A549細胞に過剰発現させた系において、RSV感染実験により解明してきた。更にこのTLR3による抗RSV作用のメディエーターの一つとして、インターフェロン(IFN)-βの存在が明らかにされたが、これ以外のメディエーターの存在も示唆された。平成23年度ではこれまでの研究報告から、IFN-β以外のメディエーターとしてIFN-λに着目し、IFN-λ1 ELISAにてIFN-λ1の関与を調査する予定であった。しかし同ELISAがうまく作動せず、当該年度内での実施は困難であった。その代わり、別の視点からこのメディエーター問題の解明を試みた。これまでヒト

由来の培養細胞にヒトTLR3遺伝子を過剰発現させRSV感染実験を実施してきたが、RSV感染実験に頻用されるアフリカミドリザル腎細胞由来のVero細胞にTLR3遺伝子を一過性に過剰発現させてRSV感染実験を行った。Preliminaryな実験結果では、TLR3一過性過剰発現Vero細胞にRSVを感染させたところ、予想に反して感染12時間、24時間いずれにおいても、培養上清中におけるRSV産生量(real-time RT-PCRで測定されたRSVコピー数)はTLR3過剰発現群がコントロール群よりも有意に高値であった。この理由については現時点では不明であるが、RSVがVero細胞に感染するとRSVのG蛋白が変異することにより、その後のRSV感染性が低下することが報告されており(Kwilas S etal.J Virol 83:10710-8,2009)、今回Vero細胞に導入されたヒトTLR3発現がその作用に関与している可能性も考えられた。今後の研究での解明が待たれる。
タンパク質複合体形成における脱水和に着目した呼吸鎖末端酵素での電子伝達機構の解明

生体内の呼吸鎖では,ATP合成に必要なプロトン勾配を形成するため,シトクロムc(Cyt c)からシトクロムc酸化酵素(CcO)への電子伝達が必要である.過去の研究から,Cyt cからCcOへの電子伝達には,LysやGluなどの帯電したアミノ酸残基だけでなく,Ileなどの非極性のアミノ酸残基が関与し,部位特異的な複合体をしていることが明らかとなった.このように,極性残基による静電相互作用および非極性残基による疎水性相互作用がCytc-CcO複合体の形成に,重要な役割を担っているものと推定されるものの,複合体の形成の駆動力になっている相互作用は未だ明らかとなっていない.そこで,本研究では,複合体形成を熱力学的に検討するため,エンタルピー等の熱力学パラメーターの変化を求めることが可能なITCを用い,Cyt c-CcO複合体形成の駆動力になっている相互作用の検討を試みた.ITC測定を用いてCyt c-CcO複合体形成に伴うエンタルピー変化を求めたところ,吸熱反応であることを示す正の値をとり,Cyt cとCcOが1:1で複合体を形成することが明らかとなった.さらに,このエンタルピー変化からエントロピー変化を検討したところ,Cyt c-CcO複合体の形成には脱水和のエントロピー変化が主に寄与していることが明らかとなった.この結果は,Cyt c-CcO複合体形成の主な駆動力が,当初想定されていた極性残基による静電相互作用ではなく,非極性残基による疎水性相互作用に伴う脱水和であることを示すものであると考えられる.シトクロムc(Cyt c)は,電子伝達系における最後の2つの複合体であるシトクロムbc1複合体からシトクロムc酸化酵素(CcO)への電子伝達を繰り返し行うタンパク質である.このシャトル機構の効率的な進行には,Cyt cの酸化状態に依存したCcOへの親和性の制御機構が想定されているが,Cyt cのCcO結合部位の同定はなされていないため,その構造化学的な検討はほとんど行われていない.そこで本研究では,1H-15N HSQC法を用い,酸化体および還元体Cyt cのCcOとの結合部位をアミノ酸残基レベルで同定・比較することで,Cyt cのシャトル機構におけるCcOとの親和性の制御を,Cyt c-CcO間の相互作用の変化として捉えることを試みた.その結果,CcOの結合によりCyt cは,ヘムのチオエーテル結合部位周辺に構造変化を受けることが示唆された.このCcO結合部位には,Lys13やGlu90などの極性残基が多く含まれていることから,Cyt-CcO複合体は,主に静電相互作用により形成されると考えられる.さらに,極性残基だけではなくIle81などの疎水性残基も構造的な影響を受けており,CcO側の電子受容部位周辺にも疎水性残基が多く存在することを考慮すると,従来あまり注目されていない疎水性相互作用も複合体形成においては重要な寄与をしている可能性が示された.このような相互作用部位は,電子がCyt cからCcOに移動した状態に対応する酸化型Cyt cにおいても大きく変化はしないものの,そのCcO結合部位がN末端ヘリックス領域からヘム近傍に変化し,Cyt c-CcO複合体形成における主な相互作用である静電相互作用が減少することが示唆された.以上より,電子伝達に伴ってN末端ヘリックスからヘム近傍へとCcO結合部位が変化することにより,解離が促進され,効率的にシャトル機構が進行すると考えられる.生体内の呼吸鎖では,ATP合成に必要なプロトン勾配を形成するため,シトクロムc(Cyt c)からシトクロムc酸化酵素(CcO)への電子伝達が必要である.過去の研究から,Cyt cからCcOへの電子伝達には,LysやGluなどの帯電したアミノ酸残基だけでなく,Ileなどの非極性のアミノ酸残基が関与し,部位特異的な複合体をしていることが明らかとなった.このように,極性残基による静電相互作用および非極性残基による疎水性相互作用がCytc-CcO複合体の形成に,重要な役割を担っているものと推定されるものの,複合体の形成の駆動力になっている相互作用は未だ明らかとなっていない.そこで,本研究では,複合体形成を熱力学的に検討するため,エンタルピー等の熱力学パラメーターの変化を求めることが可能なITCを用い,Cyt c-CcO複合体形成の駆動力になっている相互作用の検討を試みた.ITC測定を用いてCyt c-CcO複合体形成に伴うエンタルピー変化を求めたところ,吸熱反応であることを示す正の値をとり,Cyt cとCcOが1:1で複合体を形成することが明らかとなった.さらに,このエンタルピー変化からエントロピー変化を検討したところ,Cyt c-CcO複合体の形成には脱水和のエントロピー変化が主に寄与していることが明らかとなった.この結果は,Cyt c-CcO複合体形成の主な駆動力が,当初想定されていた極性残基による静電相互作用ではなく,非極性残基による疎水性相互作用に伴う脱水和であることを示すものであると考えられる.
振動障害における末梢循環障害とサイトカインの関連

動脈硬化では、細動脈平滑筋の増殖や血管内皮の肥厚などの変化がみられる。この動脈硬化の最初のステップとしてマクロファージの血管内皮への接着分子を介した接着やサイトカインの放出が注目されている。振動刺激によって末梢循環障害が引き起こされるという機序に、サイトカイン(TNF-α、IL-1α)接着分子(ICAM,VCAM)が関与することを振動曝露前後の血中濃度変化の測定により調べた。対象は健康な学生11名(年齢22-24歳)とした。振動曝露実験振動発生装置を用いて、100Hzの正弦波を十分間与えた。姿勢は座位とし、工具のグリップを右手でしっかり握って、振動を曝露した。振動曝露前と曝露後2時間、4時間の血清を採血した。血清中のサイトカインと接着分子は、いずれもサンドイッチELISA法により測定を行った。接着分子、炎症性サイトカイン共に有意差はみられず、今回の実験からは、振動曝露との関連は見いだすことができなかった。今回の測定した接着分子の正常者の血清中濃度は、過去の研究者が求めた正常者の濃度とほぼ一致するため、実験手技自体は正確であったと思われた。今後振動の強さを変えてみたり、振動曝露時間を長くするなどして様々な条件の下で実験を行う必要があると考えられた。次に、振動障害者25名と非振動工具使用者24名について、血清中の接着因子E-selectin,VCAM-1を測定した。E-selectinとVCAM-1のそれぞれの接着分子は、両群に差はなかった。VCAM-1では、振動障害患者の値が有意に高かった。振動障害患者で、IL-1やTNF-αのようなサイトカインによって、血管内皮に発現が増加する接着因子VCAM-1が有意に高いことがわかった。これは血管内皮の障害を示していると考えられた。血管内皮は、IL-1やTNF-αなどのサイトカインや変性LDLなどさまざまの刺激によりE-selectin,ICAM-1,VCAM-1などの接着分子を発現し、白血球等との接着を生じる。これは、炎症のみならず動脈硬化の初期にもみられることがわかっている。SLEや強皮症などの総合組織疾患では、可溶性のE-selectin,ICAM-1,VCAM-1が増加し、動脈硬化ではICAM-1が増加しているといわれている。振動障害では、末梢循環障害がみられ、手指の血管の内皮の障害が考えられている。そのため、今回振動障害の末梢循環障害の接着因子との関連を調べた。振動障害患者25名と非振動工具使用者24名について、血清中の接着分子E-selectin,VCAM-1を測定した。対象者はすべて男性であった。年齢は60代70代であった。接着分子の測定はELISA法(サンドイッチ法)で行った。E-selectinは両群に差はなかった。さらに、ICAM-1についても測定した。ICAM-1では、振動障害患者と非振動工具使用者の間に有意の差はなかった。次にレイノ-現象との関連を調べた。振動障害患者でのレイノ-現象の程度とE-selectin,ICAM-1,VCAM-1との有意の関連はみられなかった。

この動脈硬化の最初のスッテプとしてマクロファージの血管内皮への接着分子を介した接着やサイトカインの放出が注目されている。振動障害でも細動脈の平滑筋の増殖や血管内皮の肥厚がみられ、振動刺激による末梢循環障害も動脈硬化の発生と似た機序で起こるのではないかと考え次のような仮説をたてた。振動刺激により血管内皮や白血球が活性化し、サイトカインが放出される。このサイトカインの働きによって、接着分子が発現され、マクロファージの血管内皮への接着分子を介した接着が生じ、さらにサイトカイン等の放出により、血管内皮が肥厚し、末梢循環障害がおこるという仮説です。振動刺激によって血管内皮の肥厚が引き起こされるという機序に、サイトカイン(TNF-α,IL-1α)接着分子(ICAM,VCAM)が関与することを振動曝露前後の血中濃度変化の測定により調べた。対象は健康な学生11名(男子6名、女子5名、年齢22-24歳)とした。振動曝露実験振動発生装置を用いて、100HZの正弦波を十分間与えた。姿勢は座位とし、工具のグリップを右手でしっかり握って、振動を暴露した。振動曝露前と曝露後2時間、4時間の血清を採血した。血清中のサイトカインと接着分子は、いずれもサンドイッチELISA法により測定を行った。コントロール群と、振動曝露群の群内で有意差のみられる変化があるかどうかを検定した。接着分子、炎症性サイトカイン共に有意差はみられず、今回の実験からは、振動曝露との関連は見いだすことができなかった。今回の測定した接着分子の正常者の血清中濃度は、過去の研究者が求めた正常者の濃度とほぼ一致するため、実験手技自体は正確であったと思われた。今後振動の強さを変えてみたり、振動曝露時間を長くするなどして様々な条件の下で実験を行う必要があると考えられた。動脈硬化では、細動脈平滑筋の増殖や血管内皮の肥厚などの変化がみられる。この動脈硬化の最初のステップとしてマクロファージの血管内皮への接着分子を介した接着やサイトカインの放出が注目されている。振動刺激によって末梢循環障害が引き起こされるという機序に、サイトカイン(TNF-a、IL-1a)接着分子(ICAM,VCAM)が関与することを振動曝露前後の血中濃度変化の測定により調べた。対象は健康な学生11名(年齢22-24歳)とした。姿勢は座位とし、工具のグリップを右手でしっかり握って、振動を曝露した。次に、振動障害者25名と非振動工具使用者24名について、血清中の接着因子E-selectin,VCAM-1を測定した。E-selectinとVCAM-1のそれぞれの接着分子は、両群に差はなかった。VCAM-1では、振動障害患者の値が有意に高かった。
化学状態によって変化する235mUと229mThの核壊変特性の解明

低エネルギー電子用の高効率分光測定器や反跳核分離装置、真空紫外光測定装置などを開発し、さらに放射化学的技法を駆使し、様々な化学状態の235mUおよび229mTh試料を調製して、その崩壊観測を実施した。235mUが化学状態に依存して半減期だけでなく、内部転換電子スペクトルも変化することを観測し、核崩壊の化学状態依存性を直接的に議論することができた。また、229mThに関しても、その崩壊事象を観測することはできなかったが、娘核種の妨害などを明確化し、今後の研究に有益な情報を得ることができた。平成25年度は、Pu-239のアルファ崩壊娘核種としてのU-235mの内部転換における化学状態依存性を観測する研究を開始した。研究を開始するにあたって、第一にPu-239から反跳してくるU-235mを捕集するための「反跳核捕集装置の開発」とU-235mから放出される低エネルギーの内部転換電子の半減期とエネルギーを測定するための「電子測定装置の開発」を行った。両装置とも設計図を自分で作成し、所属機関内の工作所に制作依頼することで低予算で作成することができた。反跳核捕集装置は、約26分と短寿命のU-235mの電子測定のために迅速に捕集板を取り外せるように設計した。作成した反跳核捕集装置の性能を評価し、捕集条件や捕集された核種の状態を調べるためにテスト実験としてTh-228という核種(アルファ崩壊娘核種はRa-224)を用いて実験を行った。Th-228の試料として、厚さや大きさを変えた電着線源試料と水酸化サマリウム共沈線源試料を作成し、反跳核の捕集効率の違いを観測した。また、その他の条件として、装置のチャンバー内の気体の圧力や印加する電圧、捕集板の材質なども変えて捕集効率を測定した。その結果から、作成した装置がアルファ崩壊反跳核を効率よく捕集するために十分な性能を持っていることを確認することができた。気体圧力によって捕集された原子の状態が異なることも確認することができた。また、効率の線源試料形状や印加電圧依存性など、実際のPu-239試料を作成するために重要な知見を得ることができた。電子測定装置に関しては、第一に検出器の選定を行い、大口径のMCP検出器を(別予算を合わせて)購入した。そして、電子測定の専門の教授と何度も相談し、検出器に合わせた低エネルギー電子測定装置の設計図を完成させた。現在、工作所にて作成中の状態である。平成25年度に制作を依頼していたマルチチャンネルプレート(MCP)を利用した低エネルギー電子測定装置のチャンバーが納品されたので、電圧印加用のニッケルメッシュの溶接や、配線などを施し、チャンバーを完成させた。焼成後、実際にMCPを取り付け、購入したターボポンプを使用して真空テストを実施した。配管の形状などを見直しつつ、現在もより単時間での高真空を実現するための改良を続けている。また、装置開発と並行して、239Pu試料の作成を行った。イオン交換を利用した精製スキームを完成させ、電着試料と水酸化物沈殿試料を作成することができた。上記の235mUから放出される低エネルギー電子測定の研究と平行して、平成26年度から229mThの壊変機構を解明するための実験も開始した。第一に、7.8 eVという真空紫外線を測定するための測定チャンバーを作成した。光電子増倍管を用いた光子測定では、通常、高電圧印加後に測定値が安定するまでに時間を要するため、短寿命核種の減衰を観測するためには高電圧を印加して安定した状態のまま測定試料を設置する必要がある。そのため、試料交換を電圧と真空を保ったままで行うことができるようにチャンバーを作成した。光子測定装置が完成したので、233Uから229mThを分離して、迅速に測定実験を行うために京都大学原子炉実験所に装置を移動させた。約200 mgの233Uを陰イオン交換カラムに吸着させ、229mThを迅速に分離すると、迅速に水酸化物サマリウム沈殿もしくはフッ化物サマリウム沈殿と共沈させ、非常に薄く均一な試料とした。乾燥後、試料を測定装置に設置し、光子測定実験を行った。様々に条件を変えて実験を続けていく予定であったが、途中で検出器が故障してしまったため、現在中断中である。235mUおよび229mThの研究成果をアメリカで開催された国際会議で発表することができた。平成27年度、235mUに関する研究においては、低エネルギーの内部転換電子分光測定装置が組みあがったため、性能試験をし、その後235mU試料を用いた本実験を実施していくことができた。最初は、検出器の性能確認のため、低エネルギーのオージェ電子を放出する核種として88Zrや51Crなどの核種を核反応により合成し、化学分離後電着することで薄い線源を作成し、測定に供した。これによってエネルギー校正やエネルギー分解能を確認した。そして、いよいよ実際に239Pu線源を用いて、平成25年度に作成した反跳核分離装置によって235mUを銅版の表面に捕集し、電子測定を行った。検出効率は立体角から計算される値とほぼ一致し、またエネルギー分解能もテストで用いた電着線源よりも良好であった。

真空下で捕集した線源や、ガス中に捕集した線源、その後塩酸ガスなどを反応させた線源など、化学状態を変化させることで、実際に半減期が誤差に対して有意に変化することを観測することに成功した。エネルギースペクトルの測定にも一部の化学状態に対して成功し、現在電子軌道状態との関連を含めた考察を進めている。成果の一部を国内やアメリカの国際学会などで報告することができ、平成25年度の成果を論文に投稿し、現在、修正中である。229mThの実験に関しては、光子測定用の検出器を新しく購入し、昨年度に引き続いての実験を再開することができた。様々に実験条件を変化させることで、過去に229mTh起源ではないかと報告された光子放出成分が娘核種のチェレンコフ光起源と考えられる結果を得ることができた。その後、過去の報告と全く同様の光子測定を実施し、さらなる確証を得ることができた。双方の研究において、新しい知見が得られたため、論文にまとめる作業を進めている。特に、235mUに関しては、非常に興味深い結果が得られており、理論家に理論的な解釈を求めており、今後の展開に期待してる。低エネルギー電子用の高効率分光測定器や反跳核分離装置、真空紫外光測定装置などを開発し、さらに放射化学的技法を駆使し、様々な化学状態の235mUおよび229mTh試料を調製して、その崩壊観測を実施した。235mUが化学状態に依存して半減期だけでなく、内部転換電子スペクトルも変化することを観測し、核崩壊の化学状態依存性を直接的に議論することができた。また、229mThに関しても、その崩壊事象を観測することはできなかったが、娘核種の妨害などを明確化し、今後の研究に有益な情報を得ることができた。計画では、平成26年度に235mUの電子スペクトル測定を達成している予定であったが、実際にはまだそこまでは達成していない。電子測定装置の完成が遅れているが、これは予算が減額された都合上、印加電圧の分圧回路等自作しなければならない部分が増加したからである。また、229mThの光子測定は計画にはなかったが、化学状態によって内部転換ではなく、ガンマ線(光子)が観測される可能性があり、非常に興味深い研究課題を思いつくことができた。そして、実際に化学状態を変更した光子測定実験を実施することができた点では計画を上回っていると考えている。成果としては、さらに実験データを増やす必要がある。放射化学平成27年度の早い時期に低エネルギー電子測定装置(MCP)が完成する予定である。完成後は、検出器のテストとエネルギーのキャリブレーションを目的としたテスト実験を最初に行う。このために加速器からプロトンビームを利用して、核反応により49Vなどの低エネルギーの電子を放出する核種を合成し、使用することを計画している。その後、実際に平成25年度に開発した反跳核捕集装置と平成26年度に作成した239Pu試料を使用して、様々な化学状態の235mU試料を作成し、その電子スペクトルおよび半減期の測定を実施する。化学状態依存性からその壊変機構の解明を目指す。229mThの光子測定は、新しく購入した検出器が取得でき次第、再開し、どの程度の半減期の範囲内の真空紫外光が放出されているのか?それとも出ていないのか?を調べる予定である。また、最近報告された紫外光の放出を観測するため、これと同様の実験も確認として実施することを計画している。もし、同様の光子放出を本実験でも確認できれば、この光子放出が229mTh起源であるとする強い証拠となる。またさらに、そこから化学状態を変化させることで229mThの壊変の化学状態依存性を世界で初めて観測することに挑戦したいと考えている。
触媒的不斉炭素ー炭素結合活性化反応を利用した歪んだ縮合多環式芳香族化合物の創製

遷移金属触媒を用いた炭素ー炭素結合活性化反応は近年盛んに研究されているが、立体的に混み合った炭素ー炭素結合を選択的に開裂し合成変換することは非常に困難であり、自在な分子変換を達成するためにも、その問題を解決することは必要不可欠である。研究代表者はそのような分子変換を達成するため、置換ビフェニレンのより混み合った炭素ー炭素結合の切断を目的とし研究を行った。研究計画に従い、オルトフェニレン架橋によりビフェニレンとアルケンを連結した基質を合成し、種々遷移金属触媒の検討を行った。その結果、ロジウム触媒を用いた場合にビフェニレンの混み合った炭素ー炭素結合開裂を起点として反応が円滑に進行し、目的物であるジヒドロベンゾフルオランテンが得られた。様々な官能基に対する耐性を有し、14例の誘導体を合成することに成功した。さらに得られた化合物とその酸化体である芳香族化合物の基礎光学特性の測定を行い、比較を行った。加えて、実験的な反応機構解析を行うことで、この分子変換におけるアルキンの配向基かつ反応点としての役割の重要性を明らかにした。更なる展開として、ビフェニレンとアルキンをオルトフェニレン架橋によりを連結した基質を合成し反応を行った。その結果、キラルなロジウム触媒存在下オルト位置換アリールアルキンを有する基質を反応させることで非常に高い収率、高いエナンチオ選択性で環化反応が進行した。さらに複数の反応点を有する基質を用いて反応を行ったところ、高い収率、高いエナンチオ選択的かつジアステレオ選択的に反応が進行した。研究計画に記載したビフェニレンのより混み合った炭素ー炭素結合の開裂を起点とする反応開発に関して、アルケンの形式的な[4+2]付加環化反応を開発することに成功し、条件検討、基質検討、反応機構解析及び基礎物性の測定を行った。その結果を国際論文誌に投稿し、cover picture及びHot paperに選ばれた。また研究計画以上の結果として、アルキン部位を導入した置換ビフェニレンを用いたエナンチオ選択的環化反応を達成している。この反応は非常に高い収率、高いエナンチオ選択性で進行し、広い官能基耐性を有している。さらに、反応点を複数持つ基質を用いた場合でも反応が円滑に進行し非常に高い収率、エナンチオ選択性及びジアステレオ選択性で目的物を与えた。現在、年内の論文投稿を目指して更なる基質適応範囲の拡大と反応の応用、反応機構解析等を行っている。さらに、アルキンを有する基質を用いて他の遷移金属触媒を用いると、非常に穏やかな条件で複数の炭素ー炭素結合が一挙に開裂し、再構築できることが明らかとなった。現在、この反応に関して条件検討を行っており、論文発表へ向けて研究を続けている。以上のことからも、当初の計画以上に研究が進展してると判断できる。現在検討を行っているエナンチオ選択的環化反応に関して、引き続き基質検討、反応の応用、反応機構解析及び基礎物性解析等を行い、論文発表を目指す。加えて新しく発見した反応に対し、温和な条件下最も効率よく複数の炭素ー炭素結合を切断し再構築するための条件を探索する。最適条件決定後、基質検を行い反応の一般性を検討する。また、NMRを用いた反応機構解析やDFT計算による遷移状態の算出などを行い、反応のメカニズムを明らかにする。最終的にはデータを全てまとめ論文発表を目指す。

この反応は非常に高い収率、高いエナンチオ選択性で進行し、広い官能基耐性を有している。さらに、反応点を複数持つ基質を用いた場合でも反応が円滑に進行し非常に高い収率、エナンチオ選択性及びジアステレオ選択性で目的物を与えた。現在、年内の論文投稿を目指して更なる基質適応範囲の拡大と反応の応用、反応機構解析等を行っている。さらに、アルキンを有する基質を用いて他の遷移金属触媒を用いると、非常に穏やかな条件で複数の炭素ー炭素結合が一挙に開裂し、再構築できることが明らかとなった。現在、この反応に関して条件検討を行っており、論文発表へ向けて研究を続けている。以上のことからも、当初の計画以上に研究が進展してると判断できる。現在検討を行っているエナンチオ選択的環化反応に関して、引き続き基質検討、反応の応用、反応機構解析及び基礎物性解析等を行い、論文発表を目指す。加えて新しく発見した反応に対し、温和な条件下最も効率よく複数の炭素ー炭素結合を切断し再構築するための条件を探索する。最適条件決定後、基質検を行い反応の一般性を検討する。また、NMRを用いた反応機構解析やDFT計算による遷移状態の算出などを行い、反応のメカニズムを明らかにする。最終的にはデータを全てまとめ論文発表を目指す。
脊椎動物の性決定に関与する細胞質因子の探索

性決定に関するこれまでの研究は、ヒトを始めとして核ゲノムに存在するマスター遺伝子を中心に進められてきた。しかし、私達は、脊椎動物のツチガエルにおいて、卵の細胞質中に性の決定を左右する細胞質因子の存在を示唆する実験結果を得た。そこで、本研究ではその実態を明らかにするため、次の3つに焦点を絞って実験を行った。1.卵に存在するバクテリア(ボルバキア)の関与無脊椎動物のハチや蝶などでは、その卵に宿主の性を変更する寄生細菌ボルバキアの存在が知られている。そこで、ボルバキアゲノムに特異的なプライマーを設計し、PCR法によってツチガエル卵での検出を試みた。その結果、2つの集団で増幅バンドが得られたが、ボルバキアゲノムとの相同性は認められなかった。2.ミトコンドリアゲノムの解析ツチガエルのミトコンドリアゲノム内に性の決定に関与する遺伝子を探索するため、正逆交雑で性比が大きく乱れる2つの集団(伊勢原と広島)について、そのゲノムを解析した。その結果、伊勢原の余剰なコントロール領域に10残基が6回繰り返し、両鎖の3つの読み枠がすべて翻訳可能な新規遺伝子を発見した。そのタンパクはマラリア原虫の未知タンパクと相同性を示す。3.母性因子の探索ZZメスとWWメスを作成し、mRNAサブトラクション法によって、W性染色体に由来し、WW卵で強く発現する母性因子の探索を行った。スクリーニングの結果、WW-(マイナス)ZZの系では、4種類のガレクチン、ミトコンドリアのチトクロームC(Cox1)、そしてprotein convertasseが単離された。一方、ZZ-WW系では、転写因子(Tf1,Hdbx,Sp1等)が単離され、ZZ卵とWW卵内における構成分子の顕著な違いが明らかとなった。また、卵巣決定期に生殖腺上皮細胞で発現するW染色体連鎖の新規糖タンパク遺伝子を発見した。性決定に関する研究は、これまでヒトを始めとして核ゲノムに存在するマスター遺伝子を中心に進められてきた。しかし、私達は、脊椎動物のツチガエルにおいて、卵の細胞質の中に性の決定に関与する細胞質因子の存在を示唆する実験結果を得た。そこで、本研究ではその実態を明らかにするため、次の3つに焦点を絞って実験を開始した。1.卵に存在するバクテリア(ボルバキア)の関与無脊椎動物のハチや蝶ではその卵に宿主の性を変更する寄生細菌ボルバキアの存在が知られている。そこで、ボルバキアゲノムに特異的なプライマーを設計し、PCR法によってツチガエル卵におけるその存在を確かめた。その結果、ボルバキアに特異的なDNA断片は検出されなかった。しかし、原核生物のリボソームRNAに特異的なプライマーでは断片の増幅が確認された。一方で、受精卵をテトラサイクリンで処理し、胚の性比を調べたが性比に変化は見られなかった。次年度は、ミトコンドリアリボソーム遺伝子の関与や、卵母細胞のステージからテトラサイクリン処理を行い、胚の性比を調べる。2.ミトコンドリアゲノムの解析ツチガエルのミトコンドリアは他の脊椎動物(16kb)に比べゲノムサイズが倍近く大きいことが知られている(30-35kb)。そこで、ミトコンドリアゲノム内に性の決定に関与する未知の遺伝子を探索するため、2集団の全ゲノムの解析を試みた。現在、ダイレクトシーケンシングによってゲノムを解析中である。3.母性因子の探索ZZメスとWW

メスを作成し、それぞれの卵のmRNAからサブトラクション法によって、性染色体に由来し、しかも強く発現する母性因子の探索を行った。ZZ卵あるいはWW卵で強く発現するそれぞれ約500のmRNA分子を単離することに成功した。次年度は、これらの発現差の再確認、性連鎖、そして遺伝子の同定を行う。性決定に関するこれまでの研究は、ヒトを始めとして核ゲノムに存在するマスター遺伝子を中心に進められてきた。しかし、私達は、脊椎動物のツチガエルにおいて、卵の細胞質中に性の決定を左右する細胞質因子の存在を示唆する実験結果を得た。そこで、本研究ではその実態を明らかにするため、次の3つに焦点を絞って実験を行った。1.卵に存在するバクテリア(ボルバキア)の関与無脊椎動物のハチや蝶などでは、その卵に宿主の性を変更する寄生細菌ボルバキアの存在が知られている。そこで、ボルバキアゲノムに特異的なプライマーを設計し、PCR法によってツチガエル卵での検出を試みた。その結果、2つの集団で増幅バンドが得られたが、ボルバキアゲノムとの相同性は認められなかった。2.ミトコンドリアゲノムの解析ツチガエルのミトコンドリアゲノム内に性の決定に関与する未知の遺伝子を探索するため、正逆交雑で性比が大きく乱れる2つの集団(伊勢原と広島)について、そのゲノムを解析した。その結果、広島は脊椎動物より2kbほど長いコントロール領域を含み、さらに、伊勢原では、その部分が重複した結果2倍以上(5kb)のサイズに達していることがわかった。この余剰なコントロール領域に含まれる配列の機能解析が必要である。3.母性因子の探索ZZメスとWWメスを作成し、mRNAサブトラクション法によって、W性染色体に由来し、WW卵で強く発現する母性因子の探索を行った。スクリーニングの結果、WW-(マイナス)ZZの系では、4種類のガレクチン、ミトコンドリアのチトクロームC(Cox1)、そしてprotein convertasseが単離された。一方、ZZ-WW系では、転写因子(Tf1,Hdbx,Sp1等)やProtein kinaseおよびTumor proteinが単離され、ZZ卵とWW卵内における構成分子の顕著な違いが明らかとなった。
精製SURを用いたKATPチャネル開閉制御機構の解明

ATP感受性カリウムチャネル(K_<ATP>チャネル)は細胞内の代謝状態を監視する分子であり、インスリンの分泌や虚血時の細胞の保護等、代謝状態に関連した重要な整理反応の基点となる。本研究ではK_<ATP>チャネルの制御サブユニットとして機能するSUR1を精製し、ATP加水分解活性を持つことを明らかにした。さらにSUR1のATP加水分解活性を詳細に解析することでSUR1によるチャネル開閉メカニズムにおいて新たな概念を提唱した。MDR1は様々な構造の化合物を細胞外へと排出するトランスポーターであり、癌の多剤耐性や投与薬物の体内動態に深く関与する。したがって、MDR1の輸送メカニズムの解明は新規薬剤の開発において重要な知見となる。MDR1の輸送基質結合部位はリン脂質2重膜中にあると考えられており、MDR1の基質輸送は周囲の脂質環境に強く影響されると予想されるが、詳細な検討はこれまでなされていない。本研究では哺乳類細胞の主要な膜の構成成分であるコレステロールに着目し、コレステロールがMDR1の基質輸送に与える影響の解明を目的とした。その結果コレステロールはMDR1とMDR1の基質結合部位を介して相互作用し、基質結合部位内部の空間を充填することで、低分子の化合物を効率よく輸送基質として認識させることが明らかとなった。また複数の薬剤においては、結合のみならず輸送の速度もコレステロールによって促進されることが明らかとなった。またこの効果はコレステロールの直接的な影響の結果であり、膜の流動性等コレステロールによる2次的な影響の結果ではないことを確認した。コレステロールによる制御は、MDR1が幅広い基質特異性を発揮するために必要なメカニズムであると思われる。1.スルフォニルウレア受容体(SUR)はATP感受性K^+チャネル(K_<ATP>チャネル)の調節サブユニットとして機能し、ATPやADPの濃度に応じてチャネルを開閉させ、インスリン分泌や細胞の虚血耐性に深く関与する。SURはABCタンパク質ファミリーに属する膜タンパク質で、17回の膜貫通部分と2つのATP結合ドメインを持つ。K_<ATP>チャネルの開閉制御にSUR1のATP加水分解が必要であると予想されるが、これまでにSURのATP加水分解活性を測定した報告はなく、その詳細は不明である。本研究ではSURを昆虫細胞発現系によって大量に発現、精製し特異的なATP加水分解活性の測定を試みた。精製SURはATP加水分解活性を持つことが明らかとなったが、活性が低く、詳細な生化学的な解析を行うことができなかった。そこでヒトの薬物排出ポンプMDR1を指標にATP加水分解活性の高感度測定系の開発を行った。現在SURのATP加水分解測定系への応用を試みている。2.MDR1は様々な脂溶性化合物を細胞内から細胞外へと輸送することで、細胞に薬剤耐性能を付与する。またMDR1は薬剤の肝臓や腎臓からの体外に排出、腸管からの吸収に関与するため、薬物の体内動態にも強く影響する。従って、薬剤がMDR1の基質になるかどうかを判定することは、より有効な投薬や新規薬剤開発において必須である。MDR1の基質輸送はATPの加水分解に依存するため、目的とする化合物が輸送基質であるかどうかを判断する上でATP加水分解活性は最もよい指標となる。現在使用される検出方法は、感度や検出時間等において充分とはいえない。本研究では活性測定に精製タンパク質を用い、二酸化チタンをヌクレオチドの分離媒体とすることで、短時間かつ高感度にMDR1特異的なATP加水分解活性を検出する方法を新規に開発しAnalyticalBiochemistryに論文として発表した。またMDR1の機能に関する総説を発表した。
歯髄の微小循環系と感染防禦機構に関する免疫組織化学的・細菌学的研究

歯髄の微小循環系,特にリンパ管の感染防禦機構に果たす役割を明らかにすることを目的として免疫組織化学的・細菌学的に検索し,以下の結果を得た.1.一般に,健常組織におけるリンパ管内皮細胞はPECAM-1のみを発現するが,炎症組織ではPECAM-1に加えてICAM-1,ICAM-3,およびVCAM-1も発現する.2.顎下リンパ節のリンパ管はPECAM-1とICAM-1を発現する.3.舌においては,上皮直下の毛細リンパ管はPECAM-1,ICAM-1,ELAM-1の3つ,またはPECAM-1とICAM-1の2つを発現するが,それ以外の集合リンパ管はPECAM-1のみを発現する.4.炎症性サイトカインの投与により,リンパ管におけるPECAM-1発現の増強,ならびにICAM-1の発現が誘導される.5.口腔常在菌のあるものは,内皮細胞における白血球接着因子の発現,ならびにサイトカインの産生を誘導する.6.健常歯髄の血管においては,PECAM-1の強い発現と,MHC class II,ELAM-1およびICAM-1の弱い発現がみられる.8.健常ならびに炎症歯髄のリンパ管では,PECAM-1の強い発現とICAM-1の弱い発現がみられる.9.血管におけるPECAM-1の発現が管腔側のみであるのに対し,リンパ管におけるPECAM-1の発現は,内皮細胞の管腔側と非管腔側の両者に見られる.10.リンパ管はdesmoplakinを発現するが血管はこれを発現しない.そのため,抗desmoplakin抗体はリンパ管と血管の鑑別に有用である.歯髄の微小循環系,特にリンパ管の感染防禦機構に果たす役割を明らかにすることを目的として免疫組織化学的・細菌学的に検索し,以下の結果を得た.1.一般に,健常組織におけるリンパ管内皮細胞はPECAM-1のみを発現するが,炎症組織ではPECAM-1に加えてICAM-1,ICAM-3,およびVCAM-1も発現する.2.顎下リンパ節のリンパ管はPECAM-1とICAM-1を発現する.3.舌においては,上皮直下の毛細リンパ管はPECAM-1,ICAM-1,ELAM-1の3つ,またはPECAM-1とICAM-1の2つを発現するが,それ以外の集合リンパ管はPECAM-1のみを発現する.4.炎症性サイトカインの投与により,リンパ管におけるPECAM-1発現の増強,ならびにICAM-1の発現が誘導される.5.口腔常在菌のあるものは,内皮細胞における白血球接着因子の発現,ならびにサイトカインの産生を誘導する.6.健常歯髄の血管においては,PECAM-1の強い発現と,MHC class II,ELAM-1およびICAM-1の弱い発現がみられる.8.健常ならびに炎症歯髄のリンパ管では,PECAM-1の強い発現とICAM-1の弱い発現がみられる.9.血管におけるPECAM-1の発現が管腔側のみであるのに対し,リンパ管におけるPECAM-1の発現は,内皮細胞の管腔側と非管腔側の両者に見られる.10.リンパ管はdesmoplakinを発現するが血管はこれを発現しない.そのため,抗desmoplakin抗体はリンパ管と血管の鑑別に有用である.1.ヒト歯髄微小循環系における白血球接着因子の発現健常歯髄と炎症歯髄の両者についてMHC classII,ELAM-1,ICAM-1,ICAM-3,PECAM-1,ならびにVCAM-1のそれぞれに対する特異的抗体によって免疫染色を行い,これまで報告のなかった歯髄血管およびリンパ管で発現される接着因子の種類を炎症時と健常時の両者で明らかにした.1)健常歯髄血管ではMHC classII,ELAM-1およびICAM-1が弱く発現され、またVCAM-1およびICAM-3は発現されない.3)健常ならびに炎症歯髄血管の両者でPECAM-1が強く発現される.4)健常ならびに炎症歯髄リンパ管の両者でICAM-1を弱く,またPECAM-1が強く発現される.2.口腔常在微生物による接着因子の発現正常歯肉線維芽細胞Gln-1が口腔常存微生物であるMyooplasm sallvarlumおよびMycoplasmatementansによってIL-6,IL-8ならびにMCP-1産生を行うことをRT-PCRおよびELISAで,ICAM-1のmRNAの転写促進とICAM-1の細胞膜での発現の見られることをRT-PCRおよび免疫染色で,さらにVCAM-1のmRNAの発現が増強されることをRT-PCRで明らかにした.1.炎症性サイトカインがリンパ管内皮細胞の白血球接着因子発現に及ぼす影響1) LPS、TNF-αおよびIFN-γを投与したマウス舌では、健常舌と比較して、PECAM-1を強く発現しているリンパ管数が増加する。2)リンパ管では通常ICAM-1の発現は観察されないがTNF-αおよびIFN-γを投与したマウス舌ではICAM-1を発現しているリンパ管が観察される。3)ヒト健常組織ではリンパ管内皮細胞はPECAM-1のみを発現するが、多数の血管がMHC classIIを発現しているヒト炎症組織のリンパ管はICAM-1,ICAM-3,PECAM-1およびVCAM-1を発現する。以上のことはリンパ管内皮細胞は通常PECAM-1以外の接着因子を発現しないものの、炎症性サイトカインの存在下で種々の接着因子を発現することを示している。

2. PECAM-1と接着する口腔常在微生物4)口腔常在微生物Staphylococcus aureusおよびMycoplasma salivariumはIgGFcと結合する。またPECAM-1はIgGFcと同じ分子の繰り返し配列を有する。本年度において上記微生物が精製ヒトPECAM-1蛋白と結合する可能性が見いだされた。また上記微生物の供試株細胞とこれらに対する酵素標識抗血清とを反応させて標識した細胞培養物を頬粘膜下に投与したマウスで、頬粘膜リンパ管内皮細胞への微生物の付着が観察された。以上のことは口腔疾患を発症させるIgGFc結合性微生物がPECAM-1を介してリンパ管内皮細胞に接着する可能性を示唆するものである。我々はこれまでの研究で、リンパ管内皮細胞について以下のことを明らかにした。1)ヒト腸管のリンパ管内皮細胞は通常PECAM-1を発現する。2)リンパ管内皮細胞のPECAM-1の発現は通常血管よりも弱い。3)ヒト舌のリンパ管のあるものはPECAM-1,ELAM-1およびICAM-1を発現する。4)ヒト腸管の炎症組織のリンパ管はPECAM-1,ICAM-1,ICAM-3およびVCAM-1を発現する。5)炎症組織のリンパ管におけるICAM-3およびVCAM-1の発現は血管よりも強い。本年度はリンパ管内皮細胞におけるPECAM-1,ICAM-1およびVCAM-1の発現について、これらの細胞内局在を免疫透過電子顕微鏡法により検索した。今回の研究の結果、これら白血球接着因子は、血管では内皮細胞の管腔側および隣接細胞との接合部位で発現されるが、リンパ管では主に基底側で強く発現されることが明らかとなった。以上の結果は、組織内にあるリンパ球がリンパ管内に取り込まれる際には、白血球接着因子を介するのであろうというこれまでの研究結果を、強く裏付けるものであり、現在このことについて投稿準備中である。申請者は平成12年度において以下のことを明らかにした.<ヒト組織内リンパ管内皮細胞の接着因子発現に関する超微細構造学的検索>(1)ヒト舌の健常組織内リンパ管はPECAM-1を細胞膜表層に発現する.(2)ヒト舌におけるPECAM-1の発現は,血管では管腔側で,またリンパ管では管腔側および基底膜側の両者で観察される.(3)ヒト舌リンパ管の基底膜側におけるPECAM-1の発現は,基底膜の有無に相関しない.(4)ヒト舌の健常組織内リンパ管はデスモプラキンを細胞質内に発現する.(5)デスモプラキンの細胞質内分布に発現部位の局在性は見られない.<ヒト歯髄微小循環系に関する光顕的検索>(6)歯髄微小循環系内皮細胞はG-CSFおよびGM-CSFを炎症の有無にかかわらず発現する.(7)歯髄リンパ管においてデスモプラキンの発現が観察される.(8)歯髄リンパ管のデスモプラキンの発現は一般組織より顕著に弱い.以上の研究成果は,リンパ管内皮細胞が基底膜側に発現したPECAM-1によって組織内リンパ球と相互作用する可能性を示唆するものである.また歯髄組織内リンパ管は他の組織内毛細リンパ管よりも脆弱であることが考えられる.
マダニ唾液腺分子の機能解明と病原体伝播に果たす役割

マダニには個体レベルで展開される宿主体表への付着・血液消化・飽血などの吸血行動を支える器官として、唾液腺や中腸が重要な役割を果たしている。本研究では、シベリアから豪州にかけて広く分布し、ヒト・動物の致死的病原体を伝播する国内最優占種マダニのフタトゲチマダニを用いて、唾液腺で産生される蛋白分解酵素とそのインヒビターに焦点をあて、これら生物活性分子(TBM)の機能解明を通して得られるマダニ特有の機能・構造に立脚した抗マダニ薬及びバベシア症ワクチンなど、マダニの寄生とバベシア症に対する制圧技術を開発する。最終年度は、in vitroの性状解明に成功している終末糖化産物受容体(RAGE)結合分子であるロンギスタチンのin vivo性状についてRAGEノックアウトマウス(RAGE KO)を用いて解析した。ロンギスタチンKdマダニ(dsロンギスタチン)の刺咬部位では、陰性対照であるマダニ(dsmalE、ロンギスタチンは正常に発現している)と比較して、寄生虫感染に特有の細胞集簇である好酸球及びマクロファージの浸潤が確認された。同時に、これらのマウス皮下におけるサイトカインを測定すると、dsma1EではI15, Tnfa, Cox2,及びMcp5の発現、蛋白レベルの産生が低値であったのに対し、dsロンギスタチンではいずれの産生も有意に高値であった。次に、野生型(Wt)及びRAGE KOにdsma1E、またはdsロンギスタチンを吸血させたところ、Wt-dsロンギスタチンの組合せでは、Wt-dsma1Eと比べて皮下に顕著な好酸球浸潤が確認されたが、RAGE KO-dsロンギスタチンとRAGE KO-dsma1Eの場合、いずれも皮下細胞数に有意な差は認められなかった。以上の成績から内在性ロンギスタチンは、吸血部位においてRAGE介在性炎症反応を減弱しているものと考えられた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。マダニには個体レベルで精妙に展開される寄生・血液消化・飽血などの吸血行動を支える器官として、唾液腺や中腸が重要な役割を果たしている。また、これら器官は、人獣の病原体を伝播するベクターとして、病原体の分化・増殖に深く関与することが見出されてきている。本研究では、国内最優占種マダニのフタトゲチマダニを用いて、唾液腺で産生される蛋白分解酵素とそのインヒビターに焦点をあて、これら生物活性分子(TBM)の機能解明を通して得られるマダニ特有の機能・構造に立脚した抗マダニ薬及びバベシア症ワクチンなど、マダニの寄生とバベシア症に対する制圧技術を開発する。本年度は唾液腺TBMからの蛋白分解酵素とそれらの内在性インヒビターを複数同定し、その中からマダニ吸血行動の特徴である「持続吸血」を支えるロンギスタチンの機能解析を実施した。フィブリノゲン変性とプラスミノーゲンをプラスミンに活性化するロンギスタチンは、宿主の炎症反応を制御するRAGE(receptor for advanced glycation end prodcuts,終末糖化産物受容体)と濃度依存的に結合することが分かった。膜鎖RAGEのVドメインと結合するロンギスタチンは、市販のRAGEと濃度及びカルシウム濃度依存的に競合結合することが確認された。ロンギスタチンとRAGEの相互作用はNF-κB転移を阻害し、正常ヒト隣帯静脈内皮細胞におけるTNF-α、cox-2、IL-4発現を下方制御することが分かった。ロンギスタチンノックダウンマダニを接着・吸血させたマウスの皮下組織では、炎症性細胞の集積が確認され、TNF-α発現は有意に増加することも判明した。免疫組織学的解析によって、炎症性細胞の出現が抑制されることが確認された。ロンギスタチンはRAGEのアンタゴニストとして作用し、NF-κBを介して炎症性サイトカインの発現を抑制するものと考えられた。マダニの持続吸血は、こうしたロンギスタチンによる一連の働きによって行われていることが分かった。本研究では、国内最優占種マダニのフタトゲチマダニを用いて、唾液腺で産生される蛋白分解酵素とそのインヒビターに焦点をあて、これら生物活性分子の機能解明を通して得られるマダニ特有の機能・構造に立脚した抗マダニ薬及びバベシア症ワクチンなど、マダニの寄生とバベシア症に対する制圧技術を開発する。本年度は、昨年度に明らかにされたRAGE (receptor for advanced glycation end prodcuts,終末糖化産物受容体)結合分子であるロンギスタチンの機能解明を引き続き行った。RAGEとカルシウム濃度依存的に競合結合するロンギスタチンを固着したヒト臍帯静脈内皮細胞. HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)は、可溶性RAGEによって有意に阻害されることが判明した。ロンギスタチンはNF-kB転移を阻害し、固着分子であるVCAM1、ICAM1及びeSelectinの発現を有意に上方制御することが分かった。

さらに、ロンギスタチンは正常ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるTNF-α、cox-2、IL-4発現を有意に下方制御することが分かった。また、腹腔常在性細胞の移動やマウスの足蹠浮腫及び肺炎モデルにおける炎症を阻害した。さらに、吸血中に宿主内に放出される内在性ロンギスタチンにはIL-5、TNF-α、Cox-2及びMCP-5の発現を有意に下方制御することも分かった。マダニが宿主に付着後1週間持続吸血できる仕組みにはロンギスタチンが重要な役割を果たしていることが示された。マダニには個体レベルで展開される宿主体表への付着・血液消化・飽血などの吸血行動を支える器官として、唾液腺や中腸が重要な役割を果たしている。本研究では、シベリアから豪州にかけて広く分布し、ヒト・動物の致死的病原体を伝播する国内最優占種マダニのフタトゲチマダニを用いて、唾液腺で産生される蛋白分解酵素とそのインヒビターに焦点をあて、これら生物活性分子(TBM)の機能解明を通して得られるマダニ特有の機能・構造に立脚した抗マダニ薬及びバベシア症ワクチンなど、マダニの寄生とバベシア症に対する制圧技術を開発する。最終年度は、in vitroの性状解明に成功している終末糖化産物受容体(RAGE)結合分子であるロンギスタチンのin vivo性状についてRAGEノックアウトマウス(RAGE KO)を用いて解析した。ロンギスタチンKdマダニ(dsロンギスタチン)の刺咬部位では、陰性対照であるマダニ(dsmalE、ロンギスタチンは正常に発現している)と比較して、寄生虫感染に特有の細胞集簇である好酸球及びマクロファージの浸潤が確認された。同時に、これらのマウス皮下におけるサイトカインを測定すると、dsma1EではI15, Tnfa, Cox2,及びMcp5の発現、蛋白レベルの産生が低値であったのに対し、dsロンギスタチンではいずれの産生も有意に高値であった。次に、野生型(Wt)及びRAGE KOにdsma1E、またはdsロンギスタチンを吸血させたところ、Wt-dsロンギスタチンの組合せでは、Wt-dsma1Eと比べて皮下に顕著な好酸球浸潤が確認されたが、RAGE KO-dsロンギスタチンとRAGE KO-dsma1Eの場合、いずれも皮下細胞数に有意な差は認められなかった。以上の成績から内在性ロンギスタチンは、吸血部位においてRAGE介在性炎症反応を減弱しているものと考えられた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。フタトゲチマダニの唾液腺より分離したロンギスタチンの機能解明によって、マダニの持続吸血を支える機能分子としてロンギスタチンが重要な役割を果たしていることを突き止めた。初年度に明らかにされたin vitroで抗炎症作用を発揮するロンギスタチンが、本年度マウスモデルにおいて浮腫や肺炎を抑制することが分かり、生体内での役割を突き止めることができた。マダニの持続吸血に必要な宿主皮下組織のBlood-pool(血液貯留庫)の形成・維持に、ロンギスタチンが必須であることが分かった。引き続き、組織学的及び免疫学的機能解析を活用して、吸血行動におけるロンギスタチンの役割をさらに明らかにする。マダニの持続吸血にロンギスタチンが重要な役割をはたしていることが判明した。最終年度は引き続き、組織学的及び免疫学的機能解析を活用して、in vivoでのロンギスタチンの役割をさらに明らかにする。