hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非定常熱線法による高温材料の熱三定数の同時測定に関する研究

しかし、マグネシア質の比熱容量は400°C以上でやや減少するという異状な温度依存性を示した。4)今後、あらかじめ熱線が埋設できないような成形体に対して、熱拡散率の算出に必要な任意時間における熱線上昇温度を測定する方法について検討し、本測定方法の確立を図る。
末梢組織炎症による歯痛伝達への修飾作用とセロトニン受容体の関与

末梢組織の炎症による歯痛伝達への修飾作用に対するセロトニン受容体の役割を明らかとするために,手掌皮膚へカラゲニン投与により急性炎症を誘発させ,免疫抗体染色法を用いて,カラゲニン投与による第一頸髄角(C_1)領域で5-HT_3受容体の数的変化がタンパクレベルで起きているか否かを検討した。Witar系雄性ラット(300-320g,6匹)を麻酔後,前肢足底へ0.9%-NaCl(対照群)と起炎物質カラゲニン(6mg/0.15cc,実験群)をそれぞれ皮下投与した。カラゲニン投与による炎症の指標は,薬物皮下投与前後の前足掌の厚さを計測することで炎症性浮腫の形成を定量化した。24時間後,動物を深麻酔し,ホルマリン灌流固定後にC_1領域を取り出し,前額断厚さ40μmの凍結切片を作成した。続いて,両群において5-HT_3受容体抗体に反応させ,ABC法処置後,DAB染色により受容体の発現(陽性細胞)を判定し,定量化・2群間において比較解析した。その結果,実験群のC_1領域炎症側の5-HT_3受容体陽性細胞は,対照群と比較して有意に増加しており(対照群65.7±6.5v.s.実験群99.2±7.6 cells/section, p<0.01,n=18,増加率51.0%),C_1領域の浅層(I-II層)において特に強い増加が観察された(増加率I-II層53.5%,III-V層34.6%)。C_1領域非炎症側においては,対照群と実験群との間で有意な変化は観察されなかった。以上の結果より,前肢皮膚へのカラゲニン投与24時間後の炎症は,C_1ニューロンにおける5-HT_3受容体のタンパクレベルでのup-regulationを誘引することが判明した。すなわち,遠隔皮膚の炎症により,5HT_3受容体を介するセロトニン作動性下行性疼痛抑制系が賦活化され,その結果,歯痛伝達が抑制される可能性が示唆された。末梢皮膚の急性炎症が歯痛伝達にどのような修飾作用をもたらし,その効果にセロトニン受容体が関与するか否かを検討するため,今年度はマルチバレル微細電気泳動投与法(イオントフォレーシス法)を用いて,前肢皮膚へのカラゲニン皮下投与後の歯髄電気刺激に応答するC_1ニューロン活動の変化とセロトニン受容体の関与を経時的に電気生理学的に解析した。麻酔・前処置後,マルチバレル電極にて歯髄電気刺激に応答するC_1ニューロン放電を細胞外記録し,これをコントロール(皮下投与前)とした。ラット前肢足底へ0.9%NaCl(対照群)と起炎物質カラゲニン(6mg/0.15cc,実験群)をそれぞれ皮下投与し,1分後,5分後,10分後,以後10分ごとに最大60分まで経時的に記録し,放電頻度の経時的変化率(コントロールに対する%変化)について比較解析した。その結果,対照群では薬物投与前後のC_1ニューロン放電頻度に有意な変化は観察されなかったが,実験群では1分後から有意な抑制効果(抑制率63.5%)が観察され,その効果は60分後まで持続していた。次に,実験群ラットにおいて,5-HT_3受容体拮抗薬ICS-205930を電気泳動的に前投与し,カラゲニン皮下投与後の歯髄刺激に応じるC_1ニューロン活動の変化を解析した結果,全例において,カラゲニン皮下投与によるC_1ニューロン放電頻度の抑制は有意にブロックしていた(脱抑制効果)。以上の結果より,前肢皮膚へのカラゲニンによる急性炎症は,C_1ニューロンにおける歯痛伝達を有意に抑制し,その反応は5-HT_3受容体を介した下行性疼痛抑制系により発現される可能性が示唆された。また,この効果は,拡延性疼痛抑制制御diffuse noxious inhibitory controls(DNIC)が駆動された結果生じた可能性も考えられる。

その結果,実験群のC_1領域炎症側の5-HT_3受容体陽性細胞は,対照群と比較して有意に増加しており(対照群65.7±6.5v.s.実験群99.2±7.6 cells/section, p<0.01,n=18,増加率51.0%),C_1領域の浅層(I-II層)において特に強い増加が観察された(増加率I-II層53.5%,III-V層34.6%)。C_1領域非炎症側においては,対照群と実験群との間で有意な変化は観察されなかった。以上の結果より,前肢皮膚へのカラゲニン投与24時間後の炎症は,C_1ニューロンにおける5-HT_3受容体のタンパクレベルでのup-regulationを誘引することが判明した。すなわち,遠隔皮膚の炎症により,5HT_3受容体を介するセロトニン作動性下行性疼痛抑制系が賦活化され,その結果,歯痛伝達が抑制される可能性が示唆された。
DNA塩基配列情報に基づく文化財害虫の新規データベース構築

文化財の虫害を未然に防ぐ予防的保存の実践において、文化財害虫の発生を早期に把握することは重要である。本研究は、文化財害虫について形態的特徴による同定法では分類が困難な幼虫や脱皮殻あるいは排泄物から遺伝子(DNA)を抽出し、DNA情報に基づき文化財害虫を同定する手法を確立することを目的としている。今年度は以下の項目について研究を進めた。1.文化財害虫の標本コレクションの整備:日本国内で文化財への加害事例の多い昆虫の中から8目20科52種を主要な文化財害虫として選定した。該当する52種の文化財害虫を収集し、DNA塩基配列解析に供するためのDNA情報証拠標本の作製・整備を進めた。2.標本コレクションの形態同定:収集した文化財害虫(DNA情報証拠標本)について、それぞれの文化財害虫が属する分類群ごとに特有の形態学的な特徴を記載し、種の同定を行った。種の同定とあわせて害虫の形態写真および生態学的情報(生息地、食性など)を記録・記載し、データベース構築を進めた。3.標本コレクションのDNA塩基配列解析:形態同定を終えた文化財害虫(DNA情報証拠標本)の同一試料から、形態分類の指標とならない体節の一部を採取しDNA抽出に供した。文化財害虫のDNAバーコーディングに用いる対象領域は、動物の標準的なバーコード領域であるミトコンドリアシトクロームCオキシダーゼサブユニットI遺伝子の約650塩基対とし、ポリメラーゼ連鎖反応に用いる酵素や反応条件についての条件検討を行い、標準法を確立した。4. DNA塩基配列情報の登録とデータベース構築:得られたDNA塩基配列情報は、国立遺伝学研究所(DDBJ)に登録し、採集データ(採集地、採集年月日、採集者名)、同定データ(分類群名、同定者名、同定年)、DDBJ登録番号、各保管機関の証拠標本番号を基礎情報とした独自のデータベース構築を進めた。文化財害虫の収集と標本の整備は、当初の計画の通り順調に遂行することが出来ている。標本コレクションのDNA塩基配列解析も概ね順調に進められている。文化財害虫の収集と標本の整備は、8目20科52種を主要な文化財害虫として選定している。この中には入手することが容易ではない対象も存在するため、今年度は比較的入手が困難な対象を中心に収集・整備を進める予定である。標本コレクションのDNA塩基配列解析も概ね順調に進められているが、個体サイズの小さい標本で形態学的な特徴を損なわない範囲でDNA抽出用の試料を調整するため、そこからDNAを抽出することはより精度の高い操作を求められる。今年度は、特にこれらの標本試料を優先して作業を進める予定である。
新規ベンゾ(a)ピレンDNA付加体形成メカニズムの解明と遺伝毒性予防食品の探索

煙草煙や加熱食品に含まれる発がん物質であるベンゾ(a)ピレン(BaP)は、DNA付加体形成による遺伝子毒性の主要因である。DNA付加体形成の主成分である7,8-diol-9,10-epoxy BaP(BPDE)は、BaPがダイオキシン受容体(AHR)を介して誘導するCYP1A1によって形成されると言われてきた。しかしながら、申請者らのCyp1a1遺伝子欠損マウスの結果は、CYP1A1以外の酵素の存在を明らかにしたが、分子の同定には至っていない。そこで本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的とする。目的達成には、変異原性のインディケーター試験にも使用されている32Pポストラベル法によるDNA付加体検出よりも簡便かつ迅速な検出法が有用である。平成30年度では光センシングシステムを利用した導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法の確立を試みた。導波モードのセンサーチップにBPDE付加体含有DNAサンプルを固定しBPDE抗体で反応後、HRP標識2次抗体とAEC反応による検出法はBPDE付加体含有DNAサンプルを検出することができたが、シグナル値/ネガティブ値(S/N比)が低かった。そこで現在BPDE抗体にHRPを標識し、サンドイッチ法を用いることでS/N比が改善できるかを検討している。簡易DNA付加体検出法の確立に時間を要すると判断し、平成31年度より遂行予定であったDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いてBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成への影響を検討し、DNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出した。本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的としており、目的達成を実現するにあたり、DNA付加体検出をより簡便かつ迅速にする必要があると考え、H30年度において導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法を確立することを研究遂行計画とした。当初の計画では導波モードセンサーの検出系として(1)センサーチップにBPDE付加体含有DNAサンプルを固定しBPDE抗体と反応後、HRP-AECによる検出(2)BPDE抗体を固定したセンサーチップを用いてヌクレアーゼP1処理し、5'末端標識したBPDE付加体含有DNAサンプルを検出する2つの方法のいずれかで検出が可能であると考えていたが、実際に検討したところ(1)はS/N比の低値、(2)はバックグランド値の高値といった問題が生じることが明らかになった。そこでこれらの問題を解決する為にBPDE抗体にHRPを標識し、サンドイッチ法を用いることで改善できるかを現在検討しており、ELISAでの検討ではこれらの問題を改善できることを確認したが、導波モードでの検討を現在遂行しており、導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法はまだ確立しておらず、当初の計画からやや遅れている。簡易DNA付加体検出法の確立に時間を要すると判断し、平成31年度より遂行予定であったDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いてBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成への影響を検討し、DNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出し、DNA付加体形成メカニズムの解明は当初の計画より進展している。これらのことから現在までの進捗状況は、総合的におおむね順調に進展していると評価した。(平成31年度)平成31年度では導波モードセンサーを用いた簡易DNA付加体検出法の検出感度の問題点をBPDE抗体のHRP標識を用いたサンドイッチ法により改善し、導波モードセンサーを用いた簡易DNA付加体検出法を早急に確立する。検出感度の改善が困難な場合は、ビオチンアビジン反応を利用したポリマーHRP標識BDPE抗体を作成し検出感度の問題の改善を試みる。平成30年度の先行研究においてDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出した。そこで平成31年度では関与が確認できた阻害剤に対する分子のsiRNAを用い、DNA付加体形成の抑制を再確認し候補分子を決定する。候補分子の阻害剤、siRNAを用いBaP代謝産物およびDNA付加体をHPCLおよびUPLC/MS/MSによって解析し、新たなDNA付加体形成メカニズムを提示する。(平成32年度)DNA付加体形成に影響を及ぼすファイトケミカルの探索をする。がん予防が期待できる代表的なファイトケミカルであるポリフェノール、カロテノイド、イオウ化合物、テルペン類、β-グルカン、更にこれらに加え、候補分子に対する阻害効果を示す報告があるファイトケミカルをスクリーニングの対象とする。ELISA法による候補分子の酵素活性の阻害効果と、確立した簡易DNA付加体検出法用いDNA付加体形成抑制効果を測定することで、DNA付加体形成を抑制する食品成分を検索する。次にin vivoでのファイトケミカルのDNA付加体形成および発がんへの効果をDNA付加体形成と腺がん発症のモデル動物であるCyp1a1遺伝子欠損マウスを用い検討する。これら研究成果を原著論文として英文専門誌に報告する。

しかしながら、申請者らのCyp1a1遺伝子欠損マウスの結果は、CYP1A1以外の酵素の存在を明らかにしたが、分子の同定には至っていない。そこで本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的とする。目的達成には、変異原性のインディケーター試験にも使用されている32Pポストラベル法によるDNA付加体検出よりも簡便かつ迅速な検出法が有用である。平成30年度では光センシングシステムを利用した導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法の確立を試みた。導波モードのセンサーチップにBPDE付加体含有DNAサンプルを固定しBPDE抗体で反応後、HRP標識2次抗体とAEC反応による検出法はBPDE付加体含有DNAサンプルを検出することができたが、シグナル値/ネガティブ値(S/N比)が低かった。そこで現在BPDE抗体にHRPを標識し、サンドイッチ法を用いることでS/N比が改善できるかを検討している。簡易DNA付加体検出法の確立に時間を要すると判断し、平成31年度より遂行予定であったDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いてBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成への影響を検討し、DNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出した。本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的としており、目的達成を実現するにあたり、DNA付加体検出をより簡便かつ迅速にする必要があると考え、H30年度において導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法を確立することを研究遂行計画とした。当初の計画では導波モードセンサーの検出系として(1)センサーチップにBPDE付加体含有DNAサンプルを固定しBPDE抗体と反応後、HRP-AECによる検出(2)BPDE抗体を固定したセンサーチップを用いてヌクレアーゼP1処理し、5'末端標識したBPDE付加体含有DNAサンプルを検出する2つの方法のいずれかで検出が可能であると考えていたが、実際に検討したところ(1)はS/N比の低値、(2)はバックグランド値の高値といった問題が生じることが明らかになった。そこでこれらの問題を解決する為にBPDE抗体にHRPを標識し、サンドイッチ法を用いることで改善できるかを現在検討しており、ELISAでの検討ではこれらの問題を改善できることを確認したが、導波モードでの検討を現在遂行しており、導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法はまだ確立しておらず、当初の計画からやや遅れている。簡易DNA付加体検出法の確立に時間を要すると判断し、平成31年度より遂行予定であったDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いてBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成への影響を検討し、DNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出し、DNA付加体形成メカニズムの解明は当初の計画より進展している。これらのことから現在までの進捗状況は、総合的におおむね順調に進展していると評価した。(平成31年度)
I型糖尿病の発症に関与するオーファン受容体の機能解析

I型糖尿病(Typel diabetes,T1D)は年間発症率こそ10万人あたり12人(日本)であるが、腎症や網膜症、神経障害などの合併症を伴う重篤な自己免疫疾患であり、負担の少ない予防・治療法の開発が急務課題となっている。2007年、高密度完全ゲノム関連試験法によるSNPs解析で、新規な疾患感受性遺伝子KIAA0350が同定された。KIAA0350に関しては、非常に有力なSNPマーカー(非翻訳領域、イントロン)が同定され、その一次構造解析から、1)II型膜タンパクであること、2)細胞外領域にC型レクチンドメインを持つこと、3)ヒトからマウスまで種を超えてITAM配列を持つことが確認されている。しかし、発現プロファイルやリガンドを含め、T1Dにどのように関わっているのかという生理的な機能は一切明らかにされていない。本年度の研究では、(1)KIAA0350mRNAがT1D発症後(NODマウス)の膵臓にて高発現していること、(2)当初の予想とは異なり、KIAA0350蛋白の細胞外への分泌、あるいは細胞表面での発現は認められず、細胞質内に局在が確認されること、(3)KIAA0350は細胞質内で約25kDaのタンパク質と会合すること、また、その会合には種を超えて非常に高い相同性を持つN末が重要であること、を明らかにした。現在、会合する25kDaのタンパク質の同定を行っており、引き続きKIAA0350の生理的な機能をin vivoの培養系から遺伝子改変マウスを用いた個体レベルの解析で明らかにしていく予定である。I型糖尿病(Type1 diabetes, T1D)は年間発症率こそ10万人あたり12人(日本)であるが、腎症や網膜症、神経障害などの合併症を伴う重篤な自己免疫疾患であり、負担の少ない予防・治療法の開発が急務課題となっている。2007年、高密度完全ゲノム関連試験法によるSNPs解析で、新規な疾患感受性遺伝子KIAAO350が同定された。KIAAO350に関しては、非常に有力なSNPマーカー(非翻訳領域、イントロン)が同定され、その一次構造解析から、1)II型膜タンパクであること、2)細胞外領域にC型レクチンドメインを持つこと、3)ヒトからマウスまで種を超えてITAM配列を持つことが確認されている。本年度の研究では、(1)KIAAO350 mRNAがT1D発症後(NODマウス)の膵臓にて高発現していること、(2)当初の予想とは異なり、KIAAO350蛋白の細胞外への分泌、あるいは細胞表面での発現は認められず、細胞質内に局在が確認されること、(3)KIAAO350は細胞質内で約25kDaのタンパク質と会合すること、また、その会合には種を超えて非常に高い相同性を持つN末が重要であること、を明らかにした。現在、会合する25kDaのタンパク質の同定を行っており、引き続きKIAAO350の生理的な機能をin vitroの培養系から遺伝子改変マウスを用いた個体レベルの解析で明らかにしていく予定である。
上りたくなるデザイン追究に基づく健康階段施策の開発

これまで研究代表者らは、広告クリエーターと共同で階段にユニークな装飾や特殊な仕掛けを施すことで、楽しみながら階段を上る運動を誘発するデザインの確立を目指してきた。本研究では、階段にユニークな装飾と、電子(RFID)タグを貼付した靴とのインタラクティブな仕掛けを組み合わせることで、歩きたくなる行動をデザインするシステムの開発に成功した。今後も楽しみながら階段上りや歩行運動を誘発するデザインの原型としての活用が期待される。これまでに、研究代表者らは独自に考案した広告医学という概念のもと、広告におけるデザイン手法を活用して行動変容を実現するツールの有用性を明らかとしてきた。本研究では、広告クリエーター等と共同で階段にユニークな装飾や特殊な仕掛けを施すことで、楽しみながら階段上り運動を誘発するデザインの確立を目指している。28年度では、まず大学内の階段を頻繁に利用する医学部学生、事務関係者協力者にグループインタビューを実施し、階段の利用頻度や、階段を登るためのインセンティブになりうる要件の基礎調査を行った。得られた調査結果を踏まえ、1.興味深い画像を投影する手法、2.移動時にメッセージが配信される手法、の2つに開発の焦点を絞り、システム開発に進んだ。具体的には、まずラズベリーパイを活用したIoTツールを制作し、特定の写真や絵を歩行者が目にする壁面に投影するための基盤を構築した。本システムでは、画像が注意を引きやすい画風に変換されるなど、映像を楽しみながら歩行することが可能となる。また、RFIDとセンサーを活用し、移動距離に応じたメール配信イベントを引き起こすための、プラットフォームの構築を進めた。本システムにより、特定の2地点間移動と楽しむ仕掛けの発生をリンクさせることが可能となる。以上により、複数類型の健康啓発ツールの基礎開発が完了した。得られた成果は、超異分野学会など複数の研究会にて学会発表にてその予備的知見を報告した。以上を通じて、日頃の運動不足の解消に有益な階段のあり方を決定する。自然に健康づくりが促進されるツールの例証として、「階段」という対象物からその基盤構築を試みることを通じ、病のない社会を実現するためデザインの手法で予防を実現するまちづくりへ活かす生活環境のデザイン体系の提案を目指す。デザイン類型を複数考案し、基礎検証を開始している。順調に進展している。本研究では、広告クリエーターと共同で階段にユニークな装飾や特殊な仕掛けを施すことで、楽しみながら階段を上る運動を誘発するデザインを確立を目指してきた。まず、実験の場となる大学構内のキャンパスでのフィールドワークをクリエイターとともに実施し、介入対象となりうる階段の選定、廊下や教室の選定を行った。次に、電子(RFID)タグを貼付した靴・GIFアニメーション付きメール、健康クイズなどの階段への掲示、電子ミラーなどの素材を活用したコンテンツを制作し、広告クリエーター等と共同で数名の被験者とともに現場検証を実施し、コンテンツ内容のブラッシュアップを行った。最終年度では、開発したシステムを活用したウォーキングイベントを大学内向けに実施し、30名規模の体験ツアーによる検証実験を行った。その結果、一人あたり3000歩程度の歩行を誘発し、伴って階段昇降を大幅に増加させることに成功した。なお、検証に際しては、被験者の頭部にカメラを装着することで、実験中の視線の評価など行動学的な評価を行った。これらの様子は動画として撮影を行い、ウェブ配信を行う予定である。以上の結果から、階段にユニークな装飾と、電子(RFID)タグを貼付した靴とのインタラクティブな仕掛けを組み合わせることで、歩きたくなる行動をデザインするシステムの開発に成功した。今後、作製したツールを活用したβテストをラボ内で進め、センサー等により効果の比較検証を行うことで、その有用性の基礎検証をすすめる。また、将来的な実装を想定し、階段等に実装する際に想定される規制等の調査も並行してすすめていく。再生医学、広告医学28年度のシステム開発部分において、βテスト段階を設定することが望ましいと判断し、βテスト段階では、医学部学生を活用することで人件費および外注費用を抑えることが出来た。βテストを終え、システムの本格稼働のための費用として人件費、表示する画像などのコンテンツなどのデザインに関する委託費用を中心に執行する予定である。
高張滲透圧剤による血脳開門開放の病態解明と治療への応用

1,(1)正常ラットを用いた高張滲透圧剤による血脳関門開放の病態について各種滲透圧溶液、注入条件により検討した結果、高張溶液の浸透圧濃度に比例してtracerの血管外漏出を認めた。(2)血脳関門破綻の局在は、毛細血管のみならず、arteriole,venuleにも認め、HRPを用いた電顕微細局在は、血管内皮細胞間隙のみならず内皮細胞内Vesicleにも認め、血管外漏出の局在としてこの両者が考慮された。(3)【Na^+】-【K^+】-ATPase活性は、高張溶液動注30分後でとくに低下を認めなかった。2,(1)ヒト悪性脳腫瘍を対象とし20%マンニットールとともにACNUを動注し、経時的に血中、腫瘍組織内濃度を測定した。malignant astrocytomaの辺縁部腫瘍実質組織では、血中濃度に対し48倍の高濃度を示した。しかし腫瘍中心部の壊死性組織、腫瘍内のう胞液では血中とほぼ同程度か、低値であった。(2)ACNUの腫瘍組織内移行濃度とmannitol CECTにおける腫瘍の増強効果とは相関し、腫瘍部のmannitol enhanced CT値/plain CT値の比が2以上の著明な増強効果を示した例に高濃度のACNU腫瘍内濃度を示した。(3)実験脳腫瘍による水溶性薬剤シスプラチン(CDDP)の腫瘍組織内移行については、25%,20%マンニットールのいずれの併用動注でも高濃度の腫瘍内移行がみられたが、25%マンニットールでは周辺正常脳へも著明に移行するため、neurotoxityの面から20%マンニットールが臨床例の治療に適切である。3.(1)手術、放射線療法とともに20%マンニットール、ACNU併用動注による悪性oliomaの治療では、ACNU単独動注に比較して有意に生存期間の延長を認めた。手術後腫瘍残存を認めた10例中5例で、CT上50%以上の縮少を認め、この中2例は完全消失した。(2)20%マンニットール、ACNU内頚動注では、一過性神経脱落症状を7%に認め、すべて2-3日で改善し比較的安全と考えられる。
廃棄系バイオマスを用いた環境調和型多機能水処理剤の開発と高分子材料への展開

オカラなどの廃棄系バイオマス(WB)は水中の可溶性色素や金属イオンを吸着でき,特に,オカラは凝集能も有することから,少なくとも三機能を有した多機能水処理剤への応用が示唆された。また,マイクロ波加熱法の使用によりWBを短時間で効率良く液状化でき,容易にポリウレタンフィルム(PUF)を合成できた。得られたPUFの機械的性質は,アカマツなどから合成したものと同程度であった。さらに,密閉系で液状化することで開放系より効率よく液状化できることもわかった。最後に,コメ粉等のWBはイオン液体中で容易に効率よくグルコースにまで分解できたが,バイオエタノールの生成にまでは至らなかった。25年度は,廃棄系バイオマスであるオカラのもつ可溶性色素吸着能と金属イオン吸着能に注目し,染色色素であるクリスタルバイオレットに対する吸着特性と金属イオンとして原発問題で話題にあがっているセシウムイオンに対する吸着能について評価した。今回対象とした可溶性色素であるクリスタルバイオレットの吸着特性を調べるに当たり,pHの影響やオカラ添加量の影響など基本的吸着条件について検討した。また,対象金属イオンに用いたセシウムイオンの吸着については,クリスタルバイオレットと同様に基本的吸着条件について検討した。その結果,いずれも場合にもオカラに対して比較的良好な吸着結果が得られた。廃棄系バイオマスであるオカラに対して,これまで検討してきた結果をまとめるとオカラは,カオリン懸濁液中のカオリン懸濁粒子を凝集沈殿させる能力と有色溶液から可溶性色素を吸着できる能力並びに溶液中に溶存している金属イオンを吸着できる能力の三つを兼ね備えていることが明らかとなった。現時点ではこれら3つの能力を示す成分が同一のものであるのか,あるいは,独立した成分であるのかは不明である。今後明らかにしていきたい。ただ,オカラを過塩素酸処理した後,試料として吸着試験に供すると少なくとも色素結合能は低下する減少が確認されており,色素分子の吸着成分としてタンパク質が関係していることが示唆された。一方,廃棄系バイオマスに対するマイクロ波加熱法を利用した液状化に関する研究については,コメ粉を試料とし最適液状化条件等について検討したところ,通常のヒーターや油浴などを使用した外部加熱法に比べ短時間で液状化できることが分かった。また,得られた液状化物から合成したポリウレタンフィルムはアカマツなども木材由来のものから合成したものと同等な機械的性質を示した。以上のことから,本研究は概ね予定通りに進行している。廃棄系バイオマスとしてオカラを使用し,このオカラのもつ可溶性色素吸着能と重金属イオン吸着能について評価した。可溶性色素としてはオーラミン色素を使用し,オカラに対する基本的吸着条件(pHの影響やオカラ使用量と色素吸着能の関係など)について検討した。また,重金属イオンの吸着については,試料として,亜鉛イオンやストロンチウムイオンを用いて,色素吸着能と同様に重金属イオン吸着の可能性について検討した。その結果,いずれも比較的良好な結果が得られた。廃棄系バイオマスであるオカラに対して,これまで検討してきた結果をまとめるとオカラは,カオリン懸濁液中のカオリン懸濁粒子を凝集沈殿させる能力と有色溶液から可溶性色素を吸着できる能力並びに溶液中に溶存している亜鉛イオンなどの重金属イオンを吸着できる能力の三つを兼ね備えていることが明らかとなった。現時点ではこれら3つの能力を示す成分が同一のものであるのか,あるいは,独立した成分であるもかは不明である。一方,廃棄系バイオマスのマイクロ波加熱法を利用した液状化に関する研究については,タケ粉末を試料とし最適液状化条件等について検討したところ,通常のヒーターや油浴などを使用した外部加熱法に比べ短時間で液状化できることが分かった。また,このことはマイクロ波加熱法が通常使用されている外部加熱法に比べて省エネであり有利であることも示している。平成26年度は廃棄系バイオマスであるオカラのもつ可溶性色素吸着能に注目しマラカイトグリーン(MG)色素に対する吸着特性について評価した。また,コメ粉を高分子材料へ展開するためにマイクロ波加熱法による密閉系での基本的液状化条件について検討した。さらに,オカラのイオン液体中での基本的分解条件の検討およびバイオエタノール生成条件などについても検討した。その結果,オカラへのMG色素の吸着特性では,弱酸性域でMG色素はオカラに吸着すること,MG色素は数分以内にオカラに吸着すること,MG色素量に対してオカラの使用量が13%程度で済むこと等が明らかとなった。

また,コメ粉のマイクロ波加熱法による密閉系での最適液状化条件について検討した結果,反応温度を190°C,コメ粉とPEG400使用量の比が1:3,硫酸触媒の使用量3%,分解時間10分という最適液状化条件が得られた。一方,1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムクロリド(BMIC)など6種のイオン液体を用いてコメ粉のグルコースへの分解効率の違いについて調べた結果,BMICが最も効率よくグルコースへ変換できることがわかった。また,イオン液体中でのコメ粉の分解反応条件について検討した結果,反応温度100°C,反応時間50分という条件で回収率が約70%であることがわかった。さらに,発酵という手段を使用せずイオン液体中,無触媒下でバイオエタノールを生成できるかどうか検討したところ,今回の実験条件ではバイオエタノールを検出することができなかった。そのため,イオン液体中,無触媒下でのバイオエタノール生成条件の探索が今後の課題として残った。以上のことから概ね本研究は予定通りに進行した。研究者情報低負荷型環境材料本研究では,廃棄系バイオマスを用いた環境に優しい高性能多機能水処理剤への応用を考えている。平成24年度,25年度ともに,試料としてオカラを使用し,このオカラに可用性色素吸着能や金属イオン吸着能を有することを明らかにしており,また,対象色素や金属イオンの種類も増えたことを踏まえると概ね計画通りに進行している。これまでに得られた検討結果を考察するとオカラには凝集能,可溶性色素吸着能,金属イオン吸着能の少なくとも3つの機能を有していることが明らかとなりつつあり,また,その吸着に関与している成分がオカラに含まれるタンパク質である可能性が示唆されている。従って,当初の計画に沿って概ね進行していることから,環境に優しい高性能水処理剤への展開としては「研究の目的」の達成度は概ね順調に進展していると言える。一方,化学を変えると言われるほど急展開を見せているマイクロ波加熱法を用いた廃棄系バイオマスの液状化に関する検討事項についても,コメ粉などを試料としヒーター等を利用した外部加熱法に比べ短時間で効率よく液状化できることを明らかにしており,液状化に関しても「研究の目的」の達成度はおおむね順調に進展していると言える。本研究では,廃棄系バイオマスを用いた環境に優しい高性能多機能水処理剤への応用を考えている。平成24年度は試料としてオカラ等を使用し可用性色素吸着能や重金属イオン吸着能を有することを明らかにしており概ね計画通りに進行している。これまでに得られた検討結果を考察するとオカラには凝集能,可溶性色素吸着能,重金属イオン吸着能の少なくとも3つの機能を有していることが明らかとなりつつあり,当初の計画に沿って進行しており,環境に優しい高性能水処理剤への展開としては「研究の目的」の達成度はおおむね順調に進展していると言える。一方,化学を変えると言われるほど急展開を見せているマイクロ波加熱法を用いた廃棄系バイオマスの液状化に関する検討事項についても,タケ粉末などを試料としヒーター等を利用した外部加熱法に比べ短時間で効率よく液状化できることを明らかにしており,液状化に関しても「研究の目的」の達成度はおおむね順調に進展していると言える。オカラには凝集能,可溶性色素吸着能,重金属イオン吸着能の少なくとも3つの機能を有していることが分かってきた。
イマチニブ血中濃度モニタリングと薬物動態関連遺伝子解析に基づく個別治療戦略の開発

慢性骨髄性白血病株K562細胞のIM耐性(K562-IM)細胞を樹立し、さらにIM耐性獲得CML患者の骨髄単核球を用いて、標的細胞内濃度の規定因子の一つと考えられるP-gp, BCRP及びOCT1のIM耐性獲得への寄与について検討した。K562/IMはIM感受性K562細胞(親株)に比べ45倍のIM耐性を示した。また、K562/IMはP-gp及びBCRPを過剰発現していたが、OCT1に発現亢進は観察されなかった。K562/IM細胞内のIM濃度をHPLCにより定量したところ、親株に比べ有意に低下していたことから、P-gpあるいはBCRPによるIM排泄亢進が推察された。P-gp阻害剤(CyA)及びBCRP阻害剤(FTC)を用いて、K562/IMにおけるIM感受性並びに細胞内IM濃度の改善効果について検討したところCsAのみが有意な効果を示した。また、K562/VCR及びK562/BCRPにおいても同様の検討を加えたところ、K562/VCRではCsA添加により有意な改善効果が認められたが、K562/BCRPではFTC添加による改善効果は観察されなかった。すなわち、P-gpがIMの細胞外排泄の主要な役割を担っていることが強く示唆された。一方、OCT1阻害剤であるamantadineを用いた阻害実験より、OCT1によるIMの細胞内への輸送機能はK562/IMと親株との間で有意差は観察されなかった。さらに、IM耐性獲得前後のCML患者の骨髄単核球におけるP-gp mRNA発現量について検討したところ、IM耐性獲得後に有意なP-gp mRNAの増加が観察された。以上の結果より、P-gpの発現増大に伴う標的CML細胞内IM濃度の低下がIM耐性に強く関与することが示唆された。P-gpはIMによる治療効果及び耐性獲得における有用な分子マーカーになり得る可能性を示した。
癌遺伝子rasの機能標的の探索

本研究の研究計画においては、癌遺伝子rasの分裂酵母ホモログであるras1の機能標的を、two-hybridsystemの手法を用いて明らかにすることを予定した。ところが、本年度初頭、コールドスプリングハーバー研究所のM.Wiglerらにより、ras1の標的が、蛋白質燐酸化酵素であるbyr2であるらしいことが、やはりtwo-hybridsystemを用いて明らかにされた。従って、本研究は計画の変更を余儀なくされた。以前より進めていたふたつのアプローチでrasの周辺を探ることとした。ひとつは、ras1の優性不能(dominant negative)変異体を分離することである。ras1欠損株は細胞形態が丸く、接合不能、胞子形成効率が著しく低下するという表現型を持つ。ras1にランダムに変異を導入し、野生株に導入したときに接合不能の表現型を引き起こすものを分離した。くわしい解析の結果、これらは、ras1の活性化型変異体のほかに、ras1を負に制御するgap1、ras1を正に制御するste6、および未知のras1活性化因子とそれぞれ不活性な複合体を作ると思われるものであった。現在、最後のクラスのものの多コピー抑圧遺伝子を分離することにより、新たなras1の活性化因子を同定することを試みている。もうひとつのアプローチは、ras1変異株と同じ表現型(形態異常及び接合不能)を持つものとして分離された、ral変異株の解析である。ral1遺伝子のクローニング及び塩基配列解析の結果、この遺伝子が出芽酵母のCDC24遺伝子産物とアミノ酸レベルでの相同性を持つ蛋白質をコードすることが分かった。CDC24はrhoファミリーの低分子量GTP結合蛋白質であるCDC42のGDP-GTP交換因子であると考えられている。先に述べたbyr2を介する情報伝達系が胞子形成及び接合に必要な情報を伝えているのに対し、ral1はras1のもうひとつの未知な標的の下流に位置し、形態の調節に関わっていると思われる。
第一級β－アミノ酸を活性中心とした実用的な不斉有機分子触媒の創製

平成24年度に得られた知見を基に、さらに多様な第一級βーアミノ酸を合成し触媒として用いた。α位およびβ位の両方に置換基を導入した触媒の場合、マロン酸エステルのシクロヘキセノンへのマイケル付加反応においては、置換様式がアンチよりもシンである場合にマイケル付加体の不斉収率が35% ee程度向上することが分かった。触媒のα位置換基としては立体的に小さいほど、マイケル付加反応の不斉収率が向上したことから、β位にのみ置換基を有する第一級βーアミノ酸塩触媒が高い不斉収率を与えることが期待された。平成24年度に合成したβ位のみ置換した触媒は有機溶媒への溶解度が低く、触媒としての評価は困難であったが、高い溶解度を持つ触媒を設計・合成してマイケル付加反応に適用したところ、期待通り高エナンチオ選択的にマイケル付加体を得ることが出来た。当初計画していた研究を発展させ、実験およびDFT計算による反応機構解析を行った結果、立体制御機構に関して重要な知見が得られ、信頼性の高い反応機構および遷移状態を提案することができた。続いて、種々合成した第一級βーアミノ酸塩触媒を用い、アルデヒドのニトロアルケンへの不斉マイケル付加反応を行った。その結果、α位のみに置換基を導入した触媒は低いエナンチオ選択性を示すものの、β位にも置換基を導入したanti体触媒は高い不斉収率でマイケル付加体を与えることが分かった。一方、syn体触媒はanti体触媒よりも低い不斉収率を与えた。また、β位にのみ置換基を有する触媒の場合も、中程度のエナンチオ選択性を示した。これらの結果は、触媒に導入した置換基の置換様式を考慮した反応の立体制御機構の推測に有用であった。以上のように、本研究を当初計画通りに実施し、さらに計画を越えて展開することにより、第一級βーアミノ酸の構造が反応に及ぼす影響について重要な知見を得た。25年度が最終年度であるため、記入しない。第一級β-アミノ酸を活性中心とした、高活性かつ高立体選択的であり実用的な不斉有機分子触媒を創製することを目標に研究を進めた。平成24年度には2-シクロヘキセノンへのマロン酸ジメチルによるマイケル付加反応を題材に、共役エノンを効果的に活性化するための不斉有機分子触媒の開発に取り組み、触媒として用いる第一級β-アミノ酸の構造が反応の収率や立体選択性に与える影響を調査した。既知法により、α位またはβ位、およびその両方に置換基を導入した様々な構造を持つ第一級β-アミノ酸を合成し触媒として用いた。まず、α位にのみ置換基を有する種々の第一級β-アミノ酸を触媒として用い反応を行ったところ、マイケル付加体は低収率(30ー40%)で得られるのみであり、不斉収率も低い値(1ー34% ee)を示した。次に、α位とβ位の両方に置換基を有する触媒を用いたところ、収率は同程度(20ー29%)に留まるものの、不斉収率は大幅に向上(14ー77% ee)することが分かった。この時、α位の置換基が立体的に小さくなるほど高い不斉収率を与えたため、続いてβ位にのみ置換基を有する触媒を用いて反応を行った。しかしながら、これらの触媒は有機溶媒への溶解度が低いために反応はほとんど進行せず(収率5ー7%)、不斉収率もほとんど発現しない(0ー24% ee)結果となった。

以上の結果から、α位の置換基は小さいが脂溶性の高いβ位置換型第一級β-アミノ酸が本反応に有効な不斉触媒となることが示唆された。このことは、我々がこれまでに得た結果である、β位にシロキシメチル基を有する脂溶性の高い第一級β-アミノ酸を触媒とした場合に高収率かつ高立体選択的(収率71%, 93% ee)にマイケル付加体が得られたことと合致している。以上のように平成24年度の研究から、第一級β-アミノ酸を不斉有機分子触媒として設計する際の重要な知見を得た。平成24年度には、種々の合成法により、α位またはβ位、およびその両方に置換基を導入した第一級β-アミノ酸を合成し、シクロへキセノンへのマロン酸ジメチルのマイケル付加反応に対して不斉有機分子触媒として用いることで、共役エノンを活性化する不斉有機分子触媒として最適な第一級βーアミノ酸の構造を調べることを計画していた。研究は計画通りに実施され、様々な置換様式を持つ第一級β-アミノ酸を立体選択的に新規合成することに成功し、その不斉有機分子触媒としての性能を評価することができた。その結果、触媒のα位には置換基を持たないが脂溶性の高い第一級β-アミノ酸が本反応に対する不斉触媒として有望であることが示唆され、我々がこれまでに合成に成功していた第一級β-アミノ酸が触媒として有効であるという知見が得られた。現在、計算化学者との共同研究により反応の遷移状態の解析に取り組んでおり、触媒である第一級β-アミノ酸の構造が反応に及ぼす影響について理論的な側面からも調査を進めている。研究期間中に合成した種々の第一級β-アミノ酸は、我々がすでに合成していた触媒と比較すると、シクロへキセノンへのマロン酸ジメチルのマイケル付加反応において、反応速度、得られるマイケル付加体の収率、立体選択性のいずれにおいても大幅に低い値を与える結果となったため反応条件の詳細なスクリーニングを行うまでには至らなかったが、様々な第一級β-アミノ酸を立体選択的に合成する技術が蓄積され、平成25年度に計画している研究への重要な足掛かりとなった。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展していると評価した。平成24年度の計画が順調に進展していることから、引き続き計画通りに研究を進めていく。平成25年度はアルデヒドのβ-ニトロスチレンへのマイケル付加を題材に、アルデヒドから発生したエナミンを利用する不斉有機分子触媒として最適な第一級β-アミノ酸の構造を調べる。また、触媒となる第一級β-アミノ酸は平成24年度に実施した方法で合成する。まず、反応を単純にするため、生成物であるマイケル付加体の不斉点が一つになるようにイソブチルアルデヒドを基質として反応を行い、触媒の構造が反応の収率や立体選択性に与える影響について調査する。続いて、非対称なα位分岐型アルデヒドを基質として用いて同様のスクリーニングを行い、第一級β-アミノ酸の構造がジアステレオ選択性を含めた立体選択性に与える影響について調査する。可能であれば、β-ニトロスチレンの他に求電子剤となる基質との反応へと展開し、第一級β-アミノ酸の不斉有機分子触媒としての適応範囲を拡大に取り組みたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ATF3による成人T細胞白血病細胞運命制御

HTLV-1はCD4^+T細胞に感染後、長い潜伏期間を経て成人T細胞白血病(ATL)を引き起こすが、発がん機構の全貌はいまだ明らかになっていない。ATF3はATF/CREBファミリーに属する塩基性ロイシンジッパー(bZip)構造の転写因子である。このファミリーの転写因子は、細胞内外の刺激に対して迅速に反応する初期応答遺伝子であり、結合配列TGACGT(C/A)(G/A)を介して標的遺伝子の転写制御を行い、生体応答のgatewayとして機能している。ATF3は、bZip構造を介して、c-Jun、ATF2、JunB、JunDなどと複合体をつくり、ATF/CREモチーフやAP-1配列をもつ遺伝子プロモーターの転写制御を行う。ATF3はがん遺伝子としての性質をもつが、がん抑制遺伝子として作用するという報告もあり、細胞依存性に細胞増殖と細胞死という2つの異なる細胞運命に関与する。HTLV-1による発がん機構へのATF3の関与を調べるために種々のT細胞株におけるATF3の発現をmRNAおよびタンパク質レベルで検討したところ、HTLV-1感染T細胞株で特異的にATF3の発現が亢進していた。健常人PBMCとCD4^+T細胞では発現がみられなかったが、PHA刺激PBMCには発現が観察され、ATL症例のPBMCにも発現がみられた。ATL症例のリンパ節や浸潤皮膚組織のATL細胞の核にATF3の発現がみられた。ATF3遺伝子にはP1とP2の2種類のプロモーターが存在するが、HTLV-1感染T細胞株やATL細胞は2つのプロモーターで制御されていた。HTLV-1感染やTaxによりATF3のP1およびP2プロモーターは活性化された。P2プロモーターの解析より、Tax応答領域は-92/-84bpにあるATF/CREモチーフであり、HTLV-1感染T細胞株、ATL細胞、Tax発現T細胞株の核抽出液ではこの配列にATF1/ATF2/ATF3/CREB1/c-Jun/JunB/JunDの結合が観察された。Taxはp38、JNK、ERKの活性化を誘導し、これら3種のMAPKの各阻害剤はHTLV-1感染T細胞株におけるATF3の発現を抑制した。さらに、p38やCREBの優性抑制変異体はTax誘導性ATF3プロモーター活性や感染T細胞株におけるATF3プロモーター活性を阻害した。ATF3遺伝子ノックダウンは感染T細胞株の増殖を特異的に抑制し、ATF3の標的遺伝子GADD153の発現やBakの発現を増強し、Bcl-2の発現を抑制した。ATF3はTax依存性のHTLV-1のLTRプロモーター活性を増強し、ATF3遺伝子ノックダウンは感染T細胞株のTaxの発現を抑制した。
LIMキナーゼとSlingshotの結合タンパク質の同定

私たちは、細胞内アクチン骨格の脱重合・切断因子であるコフィリンを不活性化するLIMキナーゼ(LIMK)と活性化するSlingshot(SSH)の機能解析を行ってきた。コフィリンは、アクチン骨格のダイナミクスを調節する重要な因子の一つであるが、その活性の時間的・空間的な制御機構は未だ不明な点が多く残されている。細胞への増殖因子刺激において、LIMKは低分子量G蛋白質Rhoファミリーの下流で活性化されコフィリンをリン酸化(不活性化)するが、細胞内のコフィリンは全体として脱リン酸化(活性化)される。これは、SSHが協調したシグナルによって活性化されているためと考えられる。SSHはPI3キナーゼの下流で活性化されることが明らかとなっているが、Rhoファミリーの活性化とどのように連動しているかは不明であった。本研究は、protein Aの一部とカルモジュリン結合ペプチドの配列をタンデムに並べた精製用タグ(TAP-tag)を付加したLIMKとSSHを用いて、これらの活性調節因子、局在を規定する足場蛋白質の同定を試みた。この方法により、これまで非特異的に吸着した蛋白質によって隠れていた特異的な結合蛋白質の候補を、LIMK,SSH各々において検出することに成功した。それらを質量分析機によって解析した結果、SSHに結合した蛋白質の一つが、低分子量G蛋白質Rhoファミリーの活性化を行うグアニンヌクレオチド交換因子の一つであることが明らかとなった。これは増殖因子の刺激によってSSHと同様にラメリポディアに局在変化することから、SSHをラメリポディア内に集積させ、LIMKによってリン酸化されてアクチンから遊離したコフィリンを効率良く再活性化させる働きを持つことが示唆される。また、LIMKについては、LIMドメインに特異的に結合していると思われる蛋白質を検出していたが、質量分析による解析の結果、非特異的に吸着したものであることが明らかとなった。私たちは、細胞内アクチン骨格の脱重合・切断因子のコフィリンを不活性化するLIMキナーゼ(LIMK)と活性化するSlingshot(SSH)を発見しその機能解析を進めてきた。本研究は、LIMKやSSHの活性調節因子、局在を規定する足場タンパク質を同定し、コフィリンによるアクチン骨格再構築の時間的・空間的な制御機構の解明を目的とする。より生理的な相互作用をする分子を検索するため、新たな同定方法として2段階精製を行うアフィニティータグを付加したLIMKとSSHのプローブを作製し、培養細胞より結合タンパク質を精製する方法を導入した。LIMKのN末端のLIMドメインは、LIMKの活性や局在を調節する機能を持つことが明らかとなったため、最初にLIMドメインにprotein Aの一部とカルモジュリン結合ペプチドの配列をタンデムに並べた精製用タグ(TAP-tag)を付加した発現プラスミドを作製した。これをヒト培養細胞に発現させ、細胞内で結合したタンパク質のアフィニティー精製を行った。IgG固相化担体とカルモジュリン固相化担体を用いて精製を行った結果、LIMドメインに特異的に結合していると考えられるタンパク質が検出された。これまで、1段階の精製では非特異的吸着によるバックグラウンドが高く微量の結合タンパク質の検出は困難であったが、この方法は非常にバックグラウンドが低く有効であることが確かめられた。今後、検出されたタンパク質を質量分析機により同定するためスケールアップを行う予定である。また、SSHも同様の解析を行い、細胞内で結合し活性を調節する足場タンパク質等の同定を進める予定である。
ラン科植物における転写後修飾によるエピジェネティックなクロマチン動態の研究

インド原産を含む23種(Cymbidium12種およびDendrobium11種)のランを用いて、細胞周期が活発である体細胞分裂、減数分裂、花粉分裂のそれぞれの組織から染色体または核の標本を作製し、各種ヒストン修飾抗体で免疫FISHを行い、蛍光顕微鏡でクロマチンのエピジェネティックな動態を観察した。ヒストンのメチル化、リン酸化、アセチル化に注目しつつ、ヘテロクロマチンやユークロマチンといったクロマチン構造の変化を可視化した。また、それらの雑種を用いて、雑種形成に伴うゲノムのエピジェネティックな変化も調べた。体細胞分裂中期から後期にかけての染色体では、ユークロマチン特異的なヒストン修飾が観察されなかったことから、この期間は転写的に不活性であることを示し、アセチル化特異的なヒストン抗体を用いた実験からは、細胞分裂期の各ステージが進むにつれてアセチル化が減少していき、後期ではなくなることが分かった。ヒストンリン酸化抗体(H3S10ph、H3S10phK14ac)で中期染色体の動原体周辺を検出することができ、細胞分裂が進行するにつれてリン酸化されたヒストンは減少した。特に、H3S10phK14acは植物における染色体のセントロメアを同定する細胞学的マーカーとして有効であることが分かった。花粉粒分裂Iにおけるクロマチン動態に関して、ユークロマチン特異的なヒストン抗体(H3K27me3)では花粉粒分裂の前中期染色体においてシグナルが強く検出された。一方、ヘテロクロマチン特異的なヒストン抗体(H3K9me1)では生殖核に、H3K9me2では栄養核に、H3K27me1では両方にシグナルが検出された。このように、花粉形成におけるヒストンのエピジェネティックな変化を、小胞子分裂や栄養核・精核におけるクロマチンの状態を転写活性と関連づけることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、インド原産絶滅危惧種のラン科植物の染色体レベルでのゲノム構造を分子細胞遺伝学的に調べることを目的として研究を進めた。多様な表現型を示すランにおいて、その多様性の原因を特にクロマチン構造のエピジェネティックな変化に注目して行った。実験に用いた植物は、主としてCymbidiumあるいはDendrobium属に所属し、観賞用または医薬用として経済的に重要なものであった。第1課題では、核型や染色体の同定がなされていないこれらの種において、45Sおよび5S rRNA遺伝子をプローブとしてFISH法を用いて染色体上にマッピングを行った。Cymbidiumはすべて2n=40、Dendrobium属は2n=38であった。さらに、Dendrobium nobileにおいては2倍体と4倍体の間でrDNA領域に注目しが、明瞭な差異は見られなかった。第2課題として、DNAのメチル化が各染色体でどの程度おこっているか、2倍体種と4倍体種の両方が揃うDendrobium nobileを用いて抗メチル化シトシン抗体を使った免疫染色法で染色体上に可視化したが、標本が悪かったため倍数化による影響ははっきりしなかった。さらに、蘭科植物においてエピジェネティックなクロマチン動態の有力な証拠となるヒストン修飾に関して予備的な実験を行った。市販の各種ヒストン修飾抗体を用いて。植物種によるユウクロマチン部位とヘテロクロマチン部位の検出パターンが差異を明らかにした。実験に必要な材料は各地で開催されたラン展や全国のラン販売業者から入手することができ、研究はスムーズに進んだ。