hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海水の光学的特性が太平洋の十年規模変動に及ぼす影響

一方、(1)亜熱帯セルの強化は赤道付近(南北5度)に限定、(2)海面水温分布に南北非対称性が出現、(3)西部太平洋赤道域では混合層深度が増大、という海洋単体モデルとは異なる特徴が見られた。これは、熱帯太平洋の海面水温低下に伴う結合プロセスにより、南太平洋収束帯(SPCZ)が強化され、それに伴って赤道付近で貿易風が強化するとともに、南緯10度付近で貿易風が弱化したためである。この大気場の南北非対称性に伴う海面熱フラックスの変化が海面水温分布に南北非対称性を生じさせ、南緯10度付近の貿易風の弱化によって海洋表層の極向きエクマン輸送が弱まった結果、エクマン境界層深度の減少に伴う極向き輸送の強化を相殺したと考えられる。次に、時間変動場への影響を評価したところ、混合層深度の減少に伴って広い海域で海面水温変動の振幅の増大が見られるとともに、亜熱帯セル強度の十年規模変動が変調されることがわかった。以上より、熱帯太平洋の短波吸収におけるクロロフィル分布の大気海洋結合系への影響については、平均場、変動場のいずれにおいても有意なインパクトがあることが認められた。このことは、結合モデルを用いた熱帯の長期変動のモデリングにおいて、海水の光学的特性の取り扱いが重要であることを示している。当初の計画では、平成23年度は新IY10スキームを導入した結果をコントロールランと比較することとしていた。今年度までに海洋大循環モデルおよび海洋物質循環モデルを用いた比較は終了し、大気海洋結合モデルを用いた比較についても結合モデルへのスキームの導入、長期積分まで終了した。以上から、研究は概ね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度は、大気海洋結合モデルへの新IY10スキームのインパクトを解析し、単体モデルで明らかになった亜熱帯セルの変化が結合系でどのように変調され、その結果、大気の循環場(降水量・風系)にどのような変化を生じさせるかを明らかにする予定である。また、成果のとりまとめを行う。
膜ラフトを介した植物病害抵抗性機構の解明とその育種利用

膜ラフトはステロールとスフィンゴ脂質から形成される主に細胞膜上に存在する小さな膜ドメインであり、数多くの膜タンパク質の足場となることで、様々な細胞内反応に関与することが報告されている。最近の研究から、植物の耐病性に関与する受容体や低分子量Gタンパク質であるOsRac1などが膜ラフトに存在する可能性が報告された。しかしながら、膜ラフトがいかに植物の免疫機構を制御するかにっいては未だ明らかとなっていない。そこで本研究では、膜ラフト形成に重要であると考えられるスフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸を改変することで、膜ラフトとイネの耐病性との関係について明らかにしようと試みた。イネには2因子のスフィンゴ脂質脂肪酸2-ヒドロキシラーゼ(OsFAH1, OsFAH2)が存在する。RNAi法を用いてOsFAH1とOsFAH2をダブルノックダウンさせたところ、イネの2-ヒドロキシ脂肪酸を有したスフィンゴ脂質が減少することで膜ラフトが減少することを明らかにした。また、膜ラフトがイネいもち病菌耐性に必須であり、そのメカニズムは低分子量Gタンパク質OsRac1とNADPHオキシダーゼOsRbohsが病害応答時に膜ラフトに局在することによる活性酸素種(ROS)シグナリングの活性化によるものであることを示した。さらに、イネに9つ存在するOsRbohsのうちどれが病害応答性膜ラフト局在型OsRbohであるか決定するために、RNAi法を用いたノックダウン体を作製し解析した結果、osRbohBとosRbohHがイネにおける病害応答性膜ラフト局在型OsRbohであるという知見を得た。以上の結果から、スフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸が形成する膜ラフトは、イネ耐病性に重要なOsRaclとOsRbohB/Hの足場となることでROSの産生を促し、耐病性に寄与することを明らかとした。(抄録なし)膜ラフトは主にスフィンゴ脂質とステロールから構成される細胞膜上の小さなマイクロドメインであり、様々な因子の相互作用の足場として機能することで、植物の自然免疫機構など多くの細胞内反応の活性化に役立っている。しかしながら、膜ラフトがいかにして耐病性に寄与するかについては未だ明らかとなっていない。そこで、膜ラフトの形成に関与しているとin vitroで報告されているスフィンゴ脂質の2-ヒドロキシ脂肪酸に着目し、改変することで膜ラフトとイネの自然免疫機構との関連について調べた。イネに2つ存在するスフィンゴ脂質脂肪酸2-ヒドロキシラーゼ(OsFAH1, OsFAH2)に対してRNAi法によるノックダウン系統を作成したところ、OsFAH1は基質特異性を持たないが、OsFAH2は20h:0,22h:0のみの合成に関与することを見出した。また、十分に2-ヒドロキシ脂肪酸量の低下したダブルノックダウン系統では、in vivoでの細胞膜の相が不秩序になっていた。これは、スフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸が植物細胞レベルで膜ラフト形成に貢献していることを意味している。さらに、ダブルノックダウン系統ではエリシターの1つであるキチンを処理した際、イネの耐病性関連遺伝子であるPAL1とPBZ1の発現パターンが乱れていることも明らかとなった。以上の結果から、スフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸の低下による膜ラフト欠損はイネの自然免疫機構に影響を与えていることが明らかとなった。膜ラフトは主に細胞膜上に存在する小さな膜ドメインであり、数多くの膜タンパク質の足場となることで、植物の耐病性など様々な細胞内反応に関与することが報告されている。しかしながら、膜ラフトがいかに植物の免疫機構を制御するかについては未だ明らかとなっていない。イネには2因子のスフィンゴ脂質脂肪酸2-ヒドロキシラーゼ(OsFAH1,0sFAH2)が存在する。RNAiを用いたダブルノックダウン系統(OsFAH1/2-KD)の中から、2-ヒドロキシ脂肪酸を有したスフィンゴ脂質が減少した系統を得た。そのOsFAH1/2-KD系統を用いた解析から、イネの細胞においてスフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸が膜ラフト形成の重要なファクターであることを示した。さらに、ラフト領域が含むと考えられている界面活性剤不溶画分(DRM)におけるプロテオーム解析やイムノブロット解析から、低分子量Gタンパク質OsRac1や活性酸素種(ROS)を生成するOsRbohがイネの膜ラフトに局在することを明らかとした。また、OsRac1とOsRbohがラフトに局在することが病害応答時のROSの産生に必須であることも明らかにした。さらに、イネいもち病菌の感染実験から、スフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸が形成する膜ラフトがイネの耐病性に重要であるという知見も見出した。以上の結果から、膜ラフトはイネ耐病性に重要なOsRac1やOsRbohの足場となることでROSの産生を促し、耐病性に寄与することが明らかとなった。

最近の研究から、植物の耐病性に関与する受容体や低分子量Gタンパク質であるOsRac1などが膜ラフトに存在する可能性が報告された。しかしながら、膜ラフトがいかに植物の免疫機構を制御するかにっいては未だ明らかとなっていない。そこで本研究では、膜ラフト形成に重要であると考えられるスフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸を改変することで、膜ラフトとイネの耐病性との関係について明らかにしようと試みた。イネには2因子のスフィンゴ脂質脂肪酸2-ヒドロキシラーゼ(OsFAH1, OsFAH2)が存在する。RNAi法を用いてOsFAH1とOsFAH2をダブルノックダウンさせたところ、イネの2-ヒドロキシ脂肪酸を有したスフィンゴ脂質が減少することで膜ラフトが減少することを明らかにした。また、膜ラフトがイネいもち病菌耐性に必須であり、そのメカニズムは低分子量Gタンパク質OsRac1とNADPHオキシダーゼOsRbohsが病害応答時に膜ラフトに局在することによる活性酸素種(ROS)シグナリングの活性化によるものであることを示した。さらに、イネに9つ存在するOsRbohsのうちどれが病害応答性膜ラフト局在型OsRbohであるか決定するために、RNAi法を用いたノックダウン体を作製し解析した結果、osRbohBとosRbohHがイネにおける病害応答性膜ラフト局在型OsRbohであるという知見を得た。以上の結果から、スフィンゴ脂質2-ヒドロキシ脂肪酸が形成する膜ラフトは、イネ耐病性に重要なOsRaclとOsRbohB/Hの足場となることでROSの産生を促し、耐病性に寄与することを明らかとした。計画通りOsFAHの発現が抑制されたトランスジェニック植物が作成できたため、以降の実験をスムーズに遂行することができた膜ラフトの可視化、タンパク質解析、及び病原菌の感染実験等が順調に行え、イネのスフィンゴ脂質2・ヒドロキシ脂肪酸が膜ラフトを介して耐病性に寄与しているという仮説の証明が達成されつつあるため。・キチンエリシターで処理した際のタンパク質量の変化をWTとOsFAH doubleノックダウン系統で網羅的に比較する。・イネの耐病性に重要な役割を果たし、かつ膜ラフトに局在することが生化学的に報告されている低分子量GTPase,OsRac1の挙動、及びその相互作用因子群との関わりをWTとOsFAH doubleノックダウン系統で比較する。抵抗反応時において膜ラフトに局在するタンパク質を特定し、その解析を行う。またその際のラフトを形成する脂質の変化も追う。(抄録なし)
網膜血管リモデリングにおける酵素学的硝子体融解法の効果に関する研究

実験的網膜静脈分枝閉塞症モデルの確立: Brown Norway ratを用い、全身麻酔の後、網膜静脈に対し光凝固を行い、光凝固の後走査型レーザー検眼鏡にて血流の途絶の有無について蛍光眼底造影を行いながら確認した。光凝固後早期(13日)には強い網膜滲出性剥離をきたし、約7日目には網膜剥離の消退を認めた。光凝固の照射範囲を12象限に限定することで、網膜剥離の程度は軽減した。実験的BRVOモデル網膜血管の組織学的検討:網膜血管内腔は高度に赤血球の凝集性変化が見られた。光凝固後1週間では一部に血管内皮間に間隙が見られた。明らかなtranscellular poreは確認されなかった。ラットにおけるenzvmatic vitreolvsisの確立:0.01IU,0.05IU,0.1Uのプラスミンを注入し,網膜の組織学的検討を行った。0.01Uのプラスミンでは25%の後部硝子体剥離作製率であったのに対し、0.05U、0.1Uのプラスミンでは高率(50-75%)に後部硝子体剥離が確認できた。実験的網膜静脈分枝閉塞症モデルでのenzymatic vitreolysisの血管再構築における影響の検証:0.05Uプラスミンを前投与したラットに対し、aで作製した方法と同様に光凝固を行ったところ、網膜剥離の有無では明らかな統計的有意差を認めなかったものの、術後早期の滲出性網膜剥離は軽減する傾向にあった。Bvacizumab注入によるラット脈絡膜毛細血管の形態変化:ラット眼内にbevacizumabを注入し、脈絡膜毛細血管の窓構造の変化を検討したところ、投与後1,3,7日では有意に窓講造が減少した。14,28日後には回復し、可逆的変化であると考えられた。自己骨髄幹細胞移植によるenzymatic vitreolysis処理後の網膜表層の血管再構築に与える効果の検証:移植細胞は網膜表面に限局しており、明らかな網膜内取り込みは確認されなかった。今後、同様の方法にてサイトカインの輸送効率の向上を目的とした実験を行っていく予定である。実験的網膜静脈分枝閉塞症モデルでのenzymatic vitreolysisの血管再構築における影響の検証:本研究はプラスミンによる後部硝子体剥離作製の促進とプラスミンによる血栓溶解作用を目的として行なったものである。結果としては術後の黄斑浮腫改善効果においてプラスミンは通常の硝子体手術療法と比べ有意な改善効果は見いだせなかった。●実験的網膜静脈分枝閉塞症モデルの確立Brown Norway ratを用い,ketami,xylazineにて全身麻酔の後、網膜静脈に対し光凝固を行う。スリットランプ下に前置レンズを用い眼底を観察した後、上方の網膜静脈に対し,約4乳頭径はなれた部位でレーザー凝固を施行。光凝固の後走査型レーザー検眼鏡にて血流の途絶の有無について蛍光眼底造影を行いながら確認した。●実験的BRVO

モデル網膜血管の組織学的検討網膜組織の検討には一般的な切片作製による検討に加え,レクチン染色による血管内染色法により光学顕微鏡的な血管構築の変化を観察した。またさらに微細構造の観察のために透過型電子顕微鏡による観察と、マイクロスライス法を用いた網膜血管の内腔の走査型電子顕微鏡に夜観察を行った。●ラットにおけるenzvmatic vitreolvsisの確立00.1IU,0.05IU,0.1Uのプラスミンを注入し,網膜の組織学的検討を行った。至適濃度を決定した後にSF6ガスを注入したガスタンポナーデ法による後部硝子体剥離作製の検討を行った。●Bvacizumab注入によるラット脈絡膜毛細血管の形態変化ラット眼内にbevacizumabを注入し、脈絡膜毛細血管の窓構造の変化を検討したところ、投与後1,3,7日では有意に窓講造が減少した。14,28日後には回復し、可逆的変化であると考えられた。実験的網膜静脈分枝閉塞症モデルにおいてプラスミン投与およびガスタンポナーデによる後部硝子体剥離による網膜硝子体界面の変化と内境界膜のMMP-2による変化にともなう、血管再構築の変化を観察した。血管内皮の構造と血管の成熟化の指標となる基底膜、pericyteの存在とその構造については現在も検討中である。今後は実験モデルの安定化が重要となる。また、並行して行ったbevacizumabの脈絡膜血管への影響については、有意なfenestrationの減少を観察することができ、bevacizumabの臨床応用の際の、注意喚起に有用であると考えられた。自己骨髄幹細胞移植によるenzymatic vitreolysis処理後の網膜表層の血管再構築に与える効果の検証については現在も継続中である。昨年度に引き続き、実験的網膜静脈分枝閉塞症モデルにおいて、プラスミン投与およびガスタンポナーデによる後部硝子体剥離作製後網膜硝子体界面の変化、および内境界膜をMMP-2により処理した後の変化にともなう、血管再構築の変化を観察した。MMP-2投与により、網膜表面の基底膜は消化されうるが、その安全域が狭く、網膜組織への侵襲が大きく、評価系として実用化は困難であった。血管損傷後の経過観察機器として、新規に硬性内視鏡を用いた眼底観察装置を構築し、より非侵襲的検査法を確立できた。本検査法により、血管再構築のin vivo評価が可能となり、どの時期で血管内皮の構造変化を検討すべきかを再評価した。現在も血管の成熟化の指標となる基底膜、pericyteの存在とその構造については検討中である。また、一昨年前より並行して行ったbevacizumabの脈絡膜血管への影響については、有意なfenestrationの減少を観察することができ、bevacizumabの臨床応用の際の、注意喚起に有用であると考えられた。さらに、網膜内に投与する薬剤の徐放作用を目的として、ゼラチンをトランスグルタミナーゼで架橋し、網膜表層に貼付する手法を考案し、並行し解析を行なっている。今後、網膜血管の再構築のみならず、網膜組織の修復(円孔、裂孔の修復)も視野に入れ、現在も研究を遂行中である。
魚類のエラにおけるアンモニア排泄機構の解明

窒素代謝の最終段階として,硬骨魚類はエラから直接アンモニアを排泄することが知られているが,その分子メカニズムは明らかにされていない。一方,脊椎動物に広く保存されているRhファミリー分子が,アンモニア輸送活性を持つことが近年明らかになった。このファミリーが硬骨魚類のアンモニア排泄を担うという仮説を立て,これを検証するために,全ゲノムが解読されているトラフグを用いて研究を行った。データベース検索により,フグゲノム上にはRhAGのオーソログが1つ(fRhag),RhBGが1つ(fRhbg),RhCGが2つ(fRhcgl,2),それぞれ存在することが明らかになった。これら全分子についてノーザン解析を行った結果,全ての遺伝子がエラに強く発現していた。次にこれらの遺伝子の組織内での発現部位を明らかにするために,in situ hybridizationを行った。その結果,Rhagはpillarcellに,Rhbg及びRhcg2はpavement cellに,Rhcg1はmitochondrion-rich cell(MRC)にそれぞれ発現が見られた。更に免疫染色を行った結果,Rhagはpillarcellのアピカル膜とバソラテラル膜の両方に局在することが明らかになった。Rhbg及びRhcg2はpavement cellのバソラテラル膜,アピカル膜にそれぞれ局在していた。またRhcg1はMRCのアピカル膜に局在していた。また,これらの分子が実際にアンモニア輸送活性を持つかどうかを確認するため,アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現実験を行った。その結果,全ての分子にメチルアンモニア輸送活性が確認された。以上の結果から,Rhファミリーが硬骨魚類のエラからのアンモニア排泄に重要な役割を果たしていることが示唆された。
国語、国史、固有法-法におけるナショナルな自己意識の成立と展開-

本研究は、ナショナルな自己意識の展開過程を、独自の言語・歴史・法が持つ意義を切り口に、また西洋と日本の比較を考慮しつつ、明らかにすることをめざした。全体の中で議論された論点は数多いが、主な個別成果を列挙すれば、まず西洋古代については、古代ローマの家が、ローマ市民と非ローマ市民の結婚などの場合に、新入者を排除する機能と彼らを市民団に統合する機能の両面を持っていたことが指摘された。古代末期から中世初期の部族法典については、ゲルマン的慣習法の成文化から古代末期ローマの法文化の影響を受けた国王立法の性格の強いものへと学説のとらえかたが変化してきたことが示され、法典が部族集団を形作るという視点が打ち出されるとともに、それらがほとんどすべてラテン語で書かれたことの意味が論議された。中世ドイツの歴史叙述については、それらが「ドイツ国」の歴史としてでなく、古代以来のローマ帝国の歴史として書かれていたことが確認され、中世後期になっても歴史叙述に見られる「ドイツ」意識は、国制と関係する性格が弱く、ドイツの外での事件と結びついて表明され、各地方によって多様なものであったことが指摘された。その一方で、国王を頂点とし、そこからレーン制度を通じて委任されて行使される流血裁判権の系列を国制の基軸とする、という明快な国制像を示す法書「ザクセンシュピーゲル」においては、国家の範囲は実質的にドイツ王国に限定されていることが指摘され、法とナショナルな意識の関係の一端が示された。日本については、明治日本における「国史学」の成立に、漢学と国学、考証と名教という二つの対立軸が複雑にかかわったことが指摘され、その結果登場したアカデミズムの国史学がナショナルな物語とは基本的に距離をおくものであったことが示された。初年度にあたって、研究視角の明確化をはかるために、特定の時代、特定の地域、特定の問題について個別研究の報告をえ、全体の討論によって、それを異なる時代、異なる地域と比較すべく努めた(比較史)。都合二度の全体合宿研究会で、報告されたテーマは、以下の通りである。18世紀プロイセンの理性法およびランド法におけるFamilie、19世紀ドイツ諸都市における都市の類型と市民意識に関する最近の研究動向、中世教会法およびローマ法学におけるaccusatioとinquisitio、皇帝カール4世のプラハ宮廷と標準ドイツ語、ヨーロッパ諸言語における「官吏」・「官庁」対応概念の史的研究、帝政後期ローマにおける警察組織の形成、中世の法と国制--ザクセンシュピーゲルの場合などである。方法的には、概念史や国制史の手法を用いて、共通の概念をもちながら、その意味付与においてさまざまに異なっていること、その際の国制史的背景が討論を通じて次第に明らかにされつつある。今年度の成果として特筆すべきは、十分な研究蓄積がなかった古代末から中世初期について史料的な検討がなされ、いわば横のつながりの共通モデルとしてのポリスに対して、縦の官憲的なつながりの共通モデルとしての後期ローマ帝政の意義が確認されたことである。たとえば、inquisitioは、ローマ共和政末の刑事手続の中で萌芽的に認められた、宣誓の上で証言させるという手続が、帝政期のローマで成熟・完成し、それが中世の諸国家、教会を通じて保存されて、中世中期以降、大陸では糾問主義手続、イングランドでは陪審裁判へと発展していった。近世・近代のイングランド人は、周知のように、陪審制を固有の法制度として捉え、陪審制はナショナルな法意識の形成に決定的な意味をもった。これは一例にすぎないが、個別研究、討論を通じて得られた問題視角をより深めて行くことが、次年度の課題である。

前年度にさまざまに提出された概念史の研究成果を受けて、今年度はさらにそれに異なった時代、異なった国との比較史的検討を加えるという作業を行った。都合2回の全体研究会において、たとえば、18世紀近世ドイツの家と家族の研究を受けて、それと古代ローマにおける家長との比較、後者がいかなる意味でモデルたりうるか、中世以降の受容史のと、各国ごとの偏差が問題にされた。また、前年度の19世紀ドイツ諸都市の構造と市民意識の研究成果を受けて、中世イタリアの都市の統治構造や市民意識、それと中世ドイツの諸都市との対比、さらにはそれらのモデルともなった古代ローマの共和政との比較がなされ、連続性と変容が析出された。また、「租税」や「貢納」といった概念についても、古代のいわゆる「エヴェルジェティスム(恵与慣行)」の制度化の側面からも、古代ローマにおける共和政から元首政期、さらには専主政期の変化を経て制度化される様が国制史の背景を踏まえながら具体的に跡づけられ、さらに、それが教会あるいはゲルマン人諸国家を通じて伝えられてゆく過程が示され、そこから、中世後期・近代への展望が示された。また、「行政」あるいは「官僚制」については、「家産官僚制」のモデルともいうべき近代フランスの官僚制について具体的イメージを与える報告がなされ、それをめぐって、近代の官僚制との違い、プロイセン絶対王政期の官僚制との比較、あるいは、中世教会のある種の官僚システムとの対比がなされた。ここでは、とりわけ、官僚制の十全の機能が自律的・自発的なものではなく、私人あるいは当事者の対立・紛争を背景とした、彼らの積極的関与を前提とするものであったこと、その点はモデルとしての専主政期ローマにも認められることが明らかにされた。これらの研究をさらに深め、さらに、同時に進められている言語・国語史の研究と総合して、総括的な展望を提示することが次年度の課題である。本年度は、計画の最終年度であるので、具体的な個別報告とともに、各研究班ごとに総括的な議論がなされ、更に全体での総括的討論が行われた。個別報告としては、西洋古代の政治体の基本単位であった「家」について、ヘルクラネウム出土の文書を史料に検討がなされ、特権化・差別機能と平準化・上昇機能という「家」の二面性が指摘されるとともに、ローマ人と非ローマ人のようにエトノスを異にする人間の間の関係における、「家」の意味が議論された。西洋中世初期の部族法典については、その身分編成の解釈をめぐる学説史が考察され、それぞれの学説におけるラテン語とゲルマン語の位置づけや、部族法典と当時の「現実」との関係・距離について、議論がなされた。中世ドイツの国家形成と「国史」の関係については、10世紀から12世紀ごろまでにドイツで成立した歴史叙述を中心に検討され、それらにおいては、歴史は「ドイツ国」の歴史としてではなく、「ローマ史」・「ローマ帝国の歴史」として書かれていることが、確認された。また、13、14世紀のいくつかの歴史叙述を素材に、そこにおける「ドイツ像」が検討され、地理的空間としてドイツが観念されていても国制との結びつきは弱いこと、ドイツ人意識の具体的ありかたは地方によって多様であることが指摘された。日本史については、明治日本における『大日本史料』編纂などの修史事業の検証を通じて、近代日本における「国史学」の形成過程とその特徴が論じられた。
硫酸化糖脂質と基底膜ミラニンとの相互作用-^1H-NMR法による立体化学的研究

1.本研究は、基底膜の細胞接着タンパク質であるラミニンと硫酸化糖脂質との溶液中での相互作用を、NMR法を用いて立体化学的に検討することを目的としている。これに先立ち、硫酸化糖脂質の立体構造に関する情報を得る目的で、硫酸基の分子内水素結合への関与を検討した。高塩濃度環境下で生育する高度好塩菌172株の主要な極性脂質として存在する硫酸化糖脂質(S_2DGA)は、一つの糖残基中に2つの硫酸エステルを含む、非常に高度に硫酸化された新しい構造(HSO_3)_2-2,6Manalpha-2Glcalpha-1Archaeolをもつことを、^1H-および^<13>C-NMR法を用いて明らかにした。このようなビス硫酸化糖脂質は、硫酸基のおよぼす影響を検討するうえで重要なモデル化合物であると考えられる。S_2-DGAの水酸基の^1H-chemical shiftの解析から、mannnose(Man)の3位の水酸基が水素結合に関与していることが明らかになった。^1H間の距離情報を与えてくれるNOEスペクトルを測定することによりS_2-DGAの立体構造を検討した結果、水素結合の相手は、Manの2位に結合した硫酸基であると考えられた。また、Manの6位のみが硫酸化されたモノ硫酸化糖脂質(S-DGA)のNOEスペクトルをS_2-DGAと比較検討した結果、2位が硫酸化することにより、Manのグリコシド結合部の立体構造が変化することが示唆された。2位の硫酸基は、立体構造に少なからず影響を与え、分子内水素結合を形成することによりその構造を安定化に寄与していると考えられる。さらに、分子間相互作用においても、その安定化に影響を与えていることが期待される。
魚類の温度適応における地球温暖化と気候変動の影響

変温動物における高温ストレスに対する適応機構は地球温暖化に関する研究を行う上で重要な研究課題である。ゆっくりと徐々に温度を変化させる高温順化過程において,特定の遺伝子発現が生じ,順化を促すメカニズムが推定される。熱ショックタンパク質は数時間で誘導される特徴をもつことが知られていることから,熱耐性の誘導との間に密接な関係があることが推定されている。そこで,高温順化と熱耐性との関係をゼブラフィッシュのモデルを用いて調べた。その結果,ゼブラフィッシュの温度順化の上限は36°Cであり,この上限の温度への順化適応ではhsc70の遺伝子発現は誘導される一方,hsp70の遺伝子発現は低下する現象を見いだし,hsc70が高温順化に関与することが推定された。また,オートファジーは細胞内タンパク質分解に関与する重要な細胞応答であり,環境適応に関わる機能である。高温順化に伴ってシャペロン介在性オートファジーが誘導されることがわかった。すなわち,hsc70が細胞質内の基質タンパク質に会合し,リソゾームへのタンパク質の移行を促進し,リソゾーム内でのタンパク質の分解が進行するというオートファジーの分子メカニズムを魚類を用いて明らかにした。このオートファジーの誘導が,高温順化時における飢餓と高温ストレスに対する耐性に寄与する生物応答が推定された。熱ショックタンパク質は数時間で誘導される特徴をもつことが知られていることから,熱耐性との間に密接な関係があることが推定されている。高温順化に伴ってオートファジーが誘導されることがわかった。このことを解析するためには,さらに他の分子マーカーを用いた解析が必要であり,今後継続して進めている。分子シャペロンによって誘発されるオートファジーの分子メカニズムについて,ゼブラフィッシュモデルを用いて解析を進めている。この研究によって,高温順化時における飢餓と高温ストレスとの関連性を明らかにすることが期待される。
冷戦時代の台湾海峡危機の再検証～マルチ・アーカイブ研究による外交史的分析～

本研究では、冷戦期の第一次台湾海峡危機、第二次台湾海峡危機に焦点を当て、マルチ・アーカイブ調査に基づいて外交史研究を行ってきた。特に、1東アジアの冷戦において、台湾海峡危機がいかに位置づけられるのか、2米ソ冷戦の対立構造に組み込まれていった蒋介石の率いる国民党政府(国府)が、冷戦における国共内戦や、そのなかで発生した台湾海峡危機をいかに捉えていたのか、について焦点を当てた。また、1950年代から60年代に至る東アジアの国際関係の推移のなかで、3なぜ台湾海峡危機が「熱戦化」することがなかったのか、についても分析した。さらに、「大陸反攻」をめぐる米台間の立場の違いを明らかにした上で、41950年の蒋介石の「大陸反攻」をめぐる姿勢の変遷、5さらには、台湾海峡危機を経て、中国と台湾の対立の構造がいかに変化したのか、などについても分析を試みた。本年度は米国、中国、台湾においてアーカイブ調査を実施するとともに、専門家との意見交換の機会を持った。まず、2018年8月、米国(ワシントンDC)に数週間滞在して、米国国立公文書館(NARA)で改めて関連の史料収集を行った。また、ジョージ・ワシントン大学のナショナル・セキュリティー・アーカイブなどで史料収集を行った。また、2018年12月、中国(北京・上海)に滞在した。上海では、華東師範大学当代文献史料中心や、上海市トウ案館などで史料収集を行った。なお、北京では、ごく限定的に外交部トウ案館が公開されているものの、実際の利用は困難な状況にある。このため大学や研究機関の関連の専門家や研究協力者(社会科学院王鍵氏)との意見交換などを中心として、党や軍関連の書店などでの史料収集を行った。さらに、2019年3月、台湾(台北)の中央研究院、国史館などで史料収集を行うとともに、専門家や研究協力者(国立政治大学林果顕氏)との意見交換を実施した。本年度は、追加のアーカイブ調査として、米国(ワシントンDC)のナショナル・アーカイブなどにおいて史料調査を行った。また、台湾、中国においてもアーカイブ調査を行った。それらを踏まえて、また、その成果の一部を英語で発表するとともに、目下のところ、学術誌への日本語論文(2本分)の投稿を準備している。また、これまでの本研究におけるマルチアーカイブ調査の蓄積に基づき、目下のところ、研究成果を書籍化するために、専門の編集者と相談しつつ、準備を進めている。今後は研究成果の書籍化などに向けて、引き続き改稿作業を進めるとともに、学術誌などでの発表を準備するとともに、必要に応じて、米国、台湾、中国などにおいて補足的なアーカイブ調査を実施していく予定である。本研究の目的は、米ソ冷戦時代の国際関係の枠組みを踏まえた上で、冷戦期における第一次[1954-55]/第二次[1958]台湾海峡危機の発生によって、米国、中国、台湾の三者の外交関係がいかに展開したのかに焦点を当て、米国はもとより中国や台湾の一次資料を用いた実証研究に基づく外交史的分析を試みることにある。平成26年度は、アジアにおける冷戦のなかで、なぜ台湾海峡危機だけが「熱戦化」しなかったのかという問題意識を踏まえて、台湾海峡危機をめぐる米国、中国、台湾の3者の動向について多角的な分析を行ってきた。特に、米国政府の中国・台湾政策に加えて、台湾の蒋介石政権の政策的な意図に焦点を当てて、主に台湾側の視点からの研究を行った。具体的には、台湾海峡危機に直面して、1台湾側が米国政府の対応をいかに受けとめて、どのような対応を取ったのか、2台湾側は米国と同盟関係にあったものの、「大陸反攻」を反対されて、限定的な外交の選択肢しか持ち得なかったなかで何を追求しようとしたのか、3台湾側が、当時の冷戦下の米ソ関係の対立構造や東アジアの国際関係をいかに捉え、そのなかで同危機をいかに位置づけていたのか等について分析を行った。その一環として、先ず、台湾海峡危機に関する外交史研究の英語及び中国語の先行研究のレビューを行うとともに、研究の全体の分析枠組みについて検討した。それらを踏まえて、台湾における現地調査を実施するとともに、資料の整理と読み込み作業を行った。さらに、これまで既に収集した資料との統合作業を進めて、関連の論文の執筆を進めて、その研究成果の一部を発表した。台湾海峡危機では相互の抑止力が作用して直接的軍事衝突が回避された。このことから中国と台湾の紛争回避のための歴史的教訓を有している。その意味において、本テーマは、現代の中国をめぐる国際関係(中国外交、両岸関係等)を研究する上でも非常に役立った。平成27年度は産・育児休業(平成27年1月21日平成28年3月31日)のため、研究活動を一時的に休止した。平成28年4月には仕事復帰をしたため、改めて延長申請(31年度)を行う予定である。今年度は産・育児休業のため、研究活動を一時的に休止中であるが、前年度までの研究はおおむね順調に進展している。本研究の目的は、米ソ冷戦時代の国際関係の枠組みを踏まえた上で、冷戦期における台湾海峡危機の発生によって、米国、中国、台湾の三者の外交関係がいかに展開したのかに焦点を当て、米国はもとより中国や台湾の一次資料を用いた実証研究に基づく外交史的分析を試みることにある。その一環として、引き続き関連の先行研究のレビューを行って、研究の全体の分析枠組みについて検討した。

それを踏まえて、台湾における現地調査を実施して、主に国家档案局、国史館、国民党党史館、中央研究院近代史研究所档案館等において一次史料の収集を実施した。それによって、194050年代の米国=台湾間の外交交渉記録や談話記録をはじめとして、国民党中央常務委員会、外交部、国防部等の関連史料を収集した。調査実施後には、史料の整理と読み込み作業を行うとともに、これまで既に収集した史料との統合作業を進めて、関連の論文の執筆を通じて研究を進めた。本年度は、主に「蒋介石日記」をはじめとする台湾側一次史料等に基づいて、第一次台湾海峡危機時期における大陸沿岸諸島の防衛問題をめぐる蒋介石側の立場や認識を外交史的に跡付けることに力点を置いた。特に、第一次台湾海峡危機直前のアメリカの「台湾中立化」の解除の時期に焦点を当て、金門・馬祖島をはじめとする大陸沿岸諸島の防衛をめぐって米国側と協議を重ねていた蒋介石側の立場や認識について分析にした。さらに、大陳島をめぐる防衛問題に焦点を当てることによって、なぜ蒋介石が大陳島からの撤退を拒むことになったのか、そのことがその後の状況にどのような影響を及ぼしたのかという点についても分析を行った。その上で、危機の発生後に浮上した大陸沿岸諸島の撤退問題をめぐる蒋介石側の立場や対米認識の変化等についても検証した。以上のような研究成果の一部を学術誌に投稿したが、査読審査と改稿作業を経て、次年度の掲載が正式に決定した。平成29年度は、引き続き台湾において関連史料の収集を継続するとともに、収集した一次史料の整理や読み込み作業を踏まえて論文執筆作業を行ってきた。特に、現地調査では、主に国家档案局、国史館、国民党党史館、中央研究院近代史研究所档案館等において一次資料の収集を実施した。その際には、冷戦史に関する国際ワークショップのカウンターパートでもある、研究協力者の林果顕(国立政治大学台湾史研究所副教授)の協力を得て、台湾における一次資料の収集を重点的に実施した。また、これまで進めてきた研究成果の一部は、査読と改稿を経て、学術誌『アジア経済』(2017年9月号)への掲載が決定した。本研究では、1950年代の二度にわたる台湾海峡危機をめぐる米台関係の展開に焦点を当て、米国政府及び国府の対応について論じた。特に、台湾海峡危機における蒋介石の対応を分析の主軸に据えて、米国側の立場を踏まえつつ、主に台湾側の一次史料等を用いて、国府の立場について分析を行なった。その際、米ソ冷戦の対立構造のなかに組み込まれつつあるなかで、蒋介石自身が、冷戦や国共内戦をどのように位置づけていたのかについて検討した。それとともに、「大陸反攻」をめぐる米台間の立場の違いを明らかにした上で、蒋介石の「大陸反攻」の変遷についても分析を行なった。また、台湾海峡危機が「熱戦化」に至らなかった背景や、台湾海峡における対立の構造がいかなる変化を遂げたのか等についても分析を試みた。本研究では、特に、台湾の国史館所蔵の「総統トウ案」や「副総統トウ案」、中央研究院近代史研究所トウ案館所蔵の「中華民国外交部トウ案」の外交交渉記録、国民党党史館における中央常務委員会記録や、スタンフォード大学フーバー研究所所蔵の「蒋介石日記」等を用いて分析を行なった。従来の先行研究の主な焦点は、米国側や中国側の対応及び米中関係の展開が中心となってきた。その一方で、蒋介石をはじめとする国府の側が、実際に同危機をいかに捉えていたのかについては、従来、殆ど焦点が当てられることはなかった。
慢性関節リウマチ滑膜病変部に発現されるインターロイキン12に関する研究

慢性関節リウマチ(RA)の滑膜病変部におけるIL-12の発現と、その滑膜浸潤T細胞に対する役割を検討した。RAおよび変形性関節症(OA)の滑膜細胞より分離したmRNAよりcDNAを作成し、RT-PCR法により誘導性分子であるIL-12p40のmRNAレベルにおける発現を比較し、RA滑膜がより強くIL-12p40mRNAを発現していることを明らかにした。また、RA滑膜分離細胞は無刺激下で機能的蛋白であるIL-12p70を産生していたが、OAではその産生は極めて少ないか、検出されなかった。免疫組織学的検討では、RA滑膜におけるIL-12産生細胞は主に滑膜表層下のリンパ球湿潤周囲部に分布する大型滑膜細胞であった。さらに、抗IL-12抗体と抗CD68抗体との二重染色法により、産生細胞の大部分はマクロファージ系細胞であり、一部樹状細胞様の細胞が含まれることが明らかになった。さらに、RAの分離滑膜細胞にIL-12を添加し、培養上清中に分泌されるIFN-γ産生量に及ぼす影響をみたが、IL-12は0.5pg/mlの低濃度でIFN-γの産生を誘導し、濃度依存性に強いIFN-γ産生誘導を認めた。また、その誘導はPMAとA23187による刺激と比較すると、IL-12はIL-2、IL-4を誘導せずIFN-γに特異的であることが明らかになった。RA滑膜細胞をIL-2とともに14日間培養した後の非付着性細胞は90%以上がCD4陽性T細胞であったが、IL-2とともにIL-12を添加することにより、T細胞のIFN-γ産生能は増強し、抗IL-12抗体添加により減弱した。しかし、IL-4添加の影響はなかった。以上より、RA滑膜の主にマクロファージ系細胞により産生されるIL-12は、滑膜浸潤T細胞のIFN-γ産生を増強し、Thl型サイトカイン・パターンの維持に関与していることが示された。平成8年度の主な研究実績は、慢性関節リウマチ(RA)の病変部位である滑膜でのインターロイキン-12(IL-12)の発現と、IL-12の滑膜でのINF-γ優位なTh1型反応の維持への関与を明らかにしたことである。1.RA滑膜病変部におけるIL-12発現の増強(1)RA患者の関節液、血清中のIL-12p40およびp70の蛋白濃度は、対照とした変形性関節症(OA)に比較して有意に増加していた。現在ELISA測定系におけるリウマトイド因子の干渉について検討中である。(2)RA滑膜ではIL-12p40のmRNA発現が検出されたが、OAではp40mRNAは検出感度以下であった。(3)RAの滑膜分離細胞の無刺激下のIL-12p70蛋白産生は、OA滑膜細胞に比較すると増強していた(平均20.3±4.3 vs 7.2±2.6pg/ml)。(4)免疫組織染色法による検討では、RAの滑膜組織の陽性細胞は主に表層下に認めた。OAでは陽性細胞は稀であった。(5)RA滑膜より継代化した線維芽細胞は、IL-1またはTNF-αで刺激した場合でも、IL-12p40mRNA

発現およびIL-12p70蛋白産生は認めなかった。従って、マクロファージ系細胞がRA滑膜でのIL-12の主な産生細胞と考えられるが、現在さらに分離した滑膜マクロファージの産生を検討中である。2.IL-12のRA滑膜でのTh1型反応維持への関与(1)RAの滑膜T細胞の増殖はIL-12により濃度依存性に増強されたが、IL-2、IL-15に比較するとその作用は弱かった。(2)RA滑膜分離細胞の培養において、IL-12はT細胞サイトカイン中IFN-γを選択的に増強した。現在RA滑膜細胞をIL-2で2週間培養後得られるT細胞を用いて、IL-12のIFN-γ産生Th1クローンの維持に及ぼす影響について検討を始めている。平成9年度の主な研究実績は、慢性関節リウマチ(RA)の病変部位である滑膜でのインターロイキン-12(IL-12)発現細胞の同定と、滑膜でのIFN-γ優位なTh1型反応の維持に対するIL-12の関与を明らかにしたことである。(1)抗CD68抗体、抗IL-12抗体による二重免疫組織染色法による検討を行い、RAの滑膜組織の陽性細胞は主に表層下のリン°球浸潤部位周囲に分布するCD68陽性のマクロフB-ジ系細胞と、CD68陰性樹状細胞であることが明らかにされた。(2)RA滑膜細胞細胞をIL-2のみで2週間培養した後に回収したT細胞(CD3陽性細胞>90%)はCD4陽性細胞が95%以上で、IFN-γ優位なTh1型反応を示していた。この培養系にIL-12、抗IL-12、IL-4を添加しIFN-γ産生Th1型サイトカイン・°ターンの維持に及ぼす影響を検討した。IL-12によりT細胞のIFN-γ産生能は増強し、抗IL-12により減弱、IL-4では影響はなかった。昨年度に得られた結果とあわせ、慢性期RA滑膜ではマクロフB-ジ系細胞と樹状細胞よりIL-12が産生され、T細胞のIFN-γ産生とTh1クローンの機能を増強することにより、局所でのTh1型免疫反応を維持する重要な因子であることが示された。現在、培養中にIL-12を添加するなど条件を変え、滑膜T細胞より関節軟骨に分布する2型コラーゲン特異的なT細胞クローンの確立を試みている。しかしながら、滑膜T細胞の反応性が乏しいことから、有意に特異的なクローンは得られていない。
固体密度プラズマにおける複素導電率測定と詳細物理モデルの構築

本研究では、原子間相互作用が強く、中距離秩序性が保たれている固体、液体状態と、原子は励起状態、イオン化状態にあり、原子間力や秩序性が無視できる通常のプラズマの中間状態にあるwarm dense matterと呼ばれる状態について、その物性値を明らかにし、詳細物理モデルを構築することを目的としている。特に、今年度は、従来から多くのデータが存在する水銀を対象に、超短パルスレーザー照射による、高温でのデータ評価と、第一原理的計算から得られる物理モデル、既存の実験データを利用した半経験的な実験式から得られるパラメータモデルを構築することを行った。超短パルスレーザー照射による高温高圧化での実験では、1ピコ秒以下で金属絶縁体遷移が起きていること、また、プローブ光の反射位相面がその遷移にともない急激にシフトすることが明らかになった。この遷移にともなう反射率の変化は赤外可視全域にわたるため、超短パルスレーザーのような広帯域光の光遮断スイッチに適している。この機構を元に、フェムト秒レーザー用プラズマデバイスを試作し100fs入力で50fs出力のようなポストパルスカット光学素子を開発した。一方、理論モデル構築では、Snの状態方程式を、低温側の得られている蒸気圧、潜熱データなどからの外挿により決定する手法を確立し、それを用いた流体コードにより、膨張フロントにおいてシャープな密度とびか存在する密度分布が得られることが明らかになった。現在、この確証を実験的に求めることを行っている。また、Hgについての第一原理的な計算から状態方程式を求める手法では、水銀原子がクラスタを構成していく数を増やしていくことで、励起状態のエネルギーが交差することを明らかにし、その効果を入れたことで、初めて実験データを再現できる水銀の2層流体状態の状態方程式が計算できることを明らかにした。この研究の中で、今年度の目標は安定で広帯域なプローブ光の発生とそれを利用した広帯域ポンププローブ計測システムの構築があった。既存のレーザーシステムにフォトニッククリスタルファイバーを用いた広帯域光発生部を付け、それによる5001000nmの広帯域プローブ計測が可能になった。この過程で、フォトニッククリスタルファイバーの入射端面における光学破壊がもとで白色光の出射強度が制限される問題が発生しているが、これに関しては、別途シリコンオイルを用いた液的レンズという新しいアイデアを導入することで解決策を試みている。また、鏡面反転型Sagnac干渉計を用いたポンププローブ法も考案し、テストを開始している。また、初期に固体である表面が、高温化され膨張した低密度成分が現れ、プローブ光はそれらを積分状態で観測することになるが、この初期の固体表面を保っている時間を知るために、Fresnel反射則を使ったデータの再構築により明らかにする方法を開発し、高温、固体密度状態を実験上区別して議論できるようになった。また、実際の超短パルスレーザー照射されだwarm dense matterの広帯域プローブ計測に関しては、金を対象に3波長を切り出す形で計測が行われ、745、780,850nmと比較的狭い範囲の波長変化でも反射特性に大きな違いが出ていることが分かった。特に、一般的なプラズマの自由電子密度が決める臨界密度の概念とは逆に、長波長の光が高密度領域まで浸入している観測データが得られている。これは、電子のlocalizationを検証している大きな証拠であると考えている。一方、データ解析法/モデリングとしては、断熱膨張により、液-気体2相流領域に状態が入ったことを検出する光散乱開始時刻のモデリングが可能な液的形成、2相流領域の状態方程式を構築し、Snについて実験で得られている積分された光学特性をよく説明できるようはなった。

この研究は、固体からプラズマ化されるまでの等密度変化させた場合の物質定数、その後断熱膨張過程の定数変化をフェムト秒ポンププローブ計測で測定するものであるが、今年度は、計測システムのより高精度化を目指して、1)増幅システムの増強、プローブ光の強度安定化、2次元反射率顕微イメージ観測系の構築、コーティング=>測定まで非大気開放で計測するシステムの構築などを行なっている。これらにより、以下のような成果を得ている。1)Hgのwarm dense matter領域でのポンププローブ計測を初めて行い、照射後の金属-絶縁体転移と思われる反射率の低下を観測。この転移時間は140ピコ秒に及んで変化していることがわかった。また、常圧下のHgより高い反射率を持つ物質が観測された。2)Hgと同類の電子構造を持つZnについて、ポンプ照射にともなう高温高圧下での複素屈折率測定を行なった。まだ1波長での観測ではあるが、Hg同様の金属-非金属転移を示す誘電率実部の負から正への変化が観測された。これはHgで提唱されている6s-6p準位間の重なりによる転移の説明を裏付けるものであり、このモデルが初めて他の金属で証明されたことになる。今後の多波長データ観測を行い、より詳細な議論を行なう。3)SnやWの状態方程式を、実験データからの外挿、理論モデルから推測されるスケーリングなどを用いて構築した。それによると、気液二相流体の状態では、予測通り音速の低下が起き、超短パルスレーザー照射後の断熱膨張過程では、断熱曲線が臨界点の高密度側で二相流体に接する場合には、膨張前面に密度のシャープな壁ができ、逆に低密度側ではなだらかな密度分布になることが分かった。また、その平坦な密度領域は、固体の数分の1の密度を持ち、光学的には濃度が高い状態であることが分かった。これは、以前行なわれた海外の実験データの解釈を変更させる可能性があり、現在追試実験を行なっている。4)多波長同時二次元反射率測定のための高強度フェムト秒白色光発生では、フォトニッククリスタルファイバの入射断面での光破壊がこれまで大きな制限を生んでいたが、その部分を液体で覆うことにより、高い白色光発生が可能になることが分かった。本研究では、原子間相互作用が強く、中距離秩序性が保たれている固体、液体状態と、原子は励起状態、イオン化状態にあり、原子間力や秩序性が無視できる通常のプラズマの中間状態にあるwarm dense matterと呼ばれる状態について、その物性値を明らかにし、詳細物理モデルを構築することを目的としている。特に、今年度は、従来から多くのデータが存在する水銀を対象に、超短パルスレーザー照射による、高温でのデータ評価と、第一原理的計算から得られる物理モデル、既存の実験データを利用した半経験的な実験式から得られる物理モデル、既存の実験データを利用した半経験的な実験式から得られるパラメータモデルを構築することを行った。超短パルスレーザー照射による高温高圧化での実験では、1ピコ秒以下で金属絶縁体遷移が起きていること、また、プローブ光の反射位相面がその遷移にともない急激にシフトすることが明らかになった。この遷移にともなう反射率の変化は赤外可視全域にわたるため、超短パルスレーザーのような広帯域光の光遮断スイッチに適している。
葉緑体核様体の分子構築の研究

葉緑体DNA(cpDNA)は数多くのタンパク質とともに高次の複合体(葉緑体核様体)を形成しており,これがcpDNAの機能的な単位となっている。核様体はプラスチドから葉緑体等への分化の過程で,ダイナミックな形態変化を遂げ,特に,盛んに複製される時期には,プラスチド包膜に結合する。こうした動的変化の基礎となる,葉緑体核様体の基本的な構造を明らかにするため,核様体を構成するタンパク質のcDNAの単離と核様体構成成分の集合状態の分析を行った。1。プラスチド核様体を構成するタンパク質は,植物の発達に伴って著しく変化することがわかった。プラスチド核様体から塩処理により遊離される70kDaタンパク質についてウェスタン法で調べたところ,エチオプラスト核様体では主成分であるが,葉緑体の発達に伴って,存在量が減少することがわかった。また,包膜に存在するDNA結合タンパク質PENDタンパク質のcDNA単離し,その性質を調べた。2。若い核様体に対する抗体を用いてcDNAライブラリの発現スクリーニングを行い,10個の新規cDNAクローンを得た。3。以前の研究で得られていたPDlが,50kDaの核様体タンパク質をコードしていることがわかった。また,PD3も核様体タンパク質をコードするが,さらに,200kDaの前駆体から,プロセシングにより,N末端側の130kDaとC末端側の60kDaのヘプチドが生ずること,根粒では,別のプロセシングにより,N末端側の55kDaのペプチドだけが存在することが判明した。なお,PDl,PD3タンパク質は核様体を塩処理しても容易には遊離せず,特別な構造をつくっていることが考えられた。以上,核様体の構造は極めて複雑であること,その構成が植物の発達に伴い変化することを明らかにした。葉緑体核様体の分子構築を解明するため,本年度の研究では,核様体構成タンパク質のcDNAを得て,核様体におけるその存在様式を検討した。PD1とPD3は,昨年本研究室で得られたcDNAにコードされたタンパク質で,本年度は,これらを大腸菌で発現させたものを抗原として抗体を作成し,葉緑体の各画分との反応性を調べた。PD1は,2個のAT-hookモチーフの他,疎水領域を持つ新規の核様体タンパク質で,計算による分子質量は約35kDaであるが,電気泳動では50kDaと同等の泳動度を示した。PD3は,5個のAT-hookモチーフと4組のC2C2フィンガーをもつタンパク質で,前駆体ポリペプチドは180kDaであるが,葉緑体内では,トランジットペプチドの切断と,プロセシングにより,130kDaと40kDaとして核様体に存在していた。40kDaポリペプチドはストロマにも検出された。このほかに,核様体をNaClにより処理すると,DNAの遊離に伴って,70kDaタンパク質が特異的に遊離することが判明した。この新規タンパク質は,DNAとタンパク質を集合させて核様体構造をつくるために重要なタンパク質と考えられる。このタンパク質のアミノ末端配列を決定し,またこのタンパク質に対する抗体を作成した。この抗体を用いてcDNAのスクリーニングを進めており,いくつかの候補クローンが得られている。なお,上記のPD1,PD3タンパク質はいずれも,塩処理によって核様体から遊離することなく,極めて強固に結合していることがわかった。今後は,さらに多くのcDNAの単離を目指すとともに,核様体の中でのこれらのタンパク質の存在状態を調べていく。1。2。3。
マイクロデバイスを用いた細胞融合に基づく細胞機能制御に関する研究

マイクロオリフィスが作る電界集中を用いた高収率電気細胞融合法を確立した。それを用い,ES細胞と体細胞の融合を行ったところ,融合後5日程度で,付着平坦化/球状化を繰り返す不安定な挙動を示し,1週間程度で,初期化された細胞に特徴的な細胞塊を形成するのが観察された。また,これと同じサンプルではないが,融合産物から初期化を示すレポータの発行が観察された。同様の装置でB細胞とミエローマ細胞の融合を行ったところ,5%という高い収率でハイブリドーマのコロニーが得られた。これらは,筆者らの電気融合法が細胞初期化や高収率抗体生産へ道を開く物であることを示している。本研究は,申請者らが開発したマイクロデバイスを用いた高収率電気細胞融合法を用いて,融合後の融合細胞の個々の細胞の挙動を経時的に観察し,細胞融合に関する生物学的知見を得るとともに,マイクロメートルスケールのオリフィスを核の融合を阻害する隔壁として利用することにより遺伝情報の混合を伴わない細胞融合・細胞質移植等の新しい手法を開発し,これらを用いた細胞の機能制御の方法とその再生医療への展開を探求することを目的として推進している。まず,初年度(平成23年度)の研究においては,融合細胞の挙動の経時観察を容易に行えるようなチップの開発を行った。これは,チップ面に垂直に立てられた壁面に,電界集中を作るためのオリフィスを持つ,という3次元のマイクロ構造であるが,われわれは,自己形成メニスカスのモールディングで作製する手法を開発した。このチップを使うと,2種類の細胞を,オリフィスをはさんで,必ず1:1で,高い収率で融合できることが示された。融合後の経時観察については,次の結果が得られた。すなわち,融合時点で融合されるのは細胞膜のみで,かつ,オリフィス径を細胞核の径よりも小さく作っているため,核はオリフィス両側にわかれて存在する。しかしながら,時間の経過とともに,融合した細胞は,チップ壁面に付着して増殖を始めるので,融合細胞はオリフィスのどちらか側に抜けてしまい,従って核同士も融合してしまう。このオリフィスを抜けた融合細胞のその後を追ったところ,多くの細胞に対して,分裂・増殖が観察された。すなわち,1:1で融合した細胞の多くは(少なくとも数世代にわたっては)生存をする。このような事実は,本研究のような高い収率で必ず1:1の融合を実現できる手法を用いて始めて得られる結果である。今後,ES細胞と体細胞をオリフィスをはさんで融合し,ES細胞の持つ因子により,体細胞の初期化が生ずるかを,核の融合を許すような条件,および,オリフィスをはさんで核が独立したままで存在する条件,の両方の条件に関して,研究していく予定である。平成24年度においては,外来遺伝子による汚染なしに細胞初期化を行う手段として,核が通り抜けられないくらい小さいオリフィスをはさんでES細胞と体細胞をオリフィスをはさんで融合し,ES細胞の持つ因子により,体細胞の初期化を行う方法に関する研究を行った。その過程において,ナロウイングスリットと呼ばれる新規な構造の作法を開発した。これは,次第に狭くなるスリット構造を3次元リソグラフィー技術によって製作するもので,広いところで高収率な融合を行い,狭いところで融合細胞間の膜融合状態を保ったまま,かつ核が融合しないように培養することが可能になる。本年度は,この細胞融合の大量並列性の応用として,B細胞とミエローマとの融合による抗体産生を試みた。本法は,高収率で必ず1:1での融合が可能であり,1:1のヘテロカリオン(4n)は,多数:多数(6n以上)に比べて高い生存率が期待できる。実際,2000個のオリフィスから,100個程度のコロニーが得られた。これは数%の収率に相当し,従来法の0.1%程度を大きく上回り,リンパ節からのモノクローナル抗体作製を可能にする数字である。来年度は,研究室に継代されていたES細胞の問題により,今年度に進まなかった,遺伝子混合をともなわない融合を用いた細胞初期化をめざす。