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分子時計のシグナル伝達に関する研究

分子時計のシグナル伝達に関して、中枢の視交叉上核と末梢臓器の末梢時計はいかように違うのであろうか。時計遺伝子は全身の大部分の細胞に発現し、その多くがリズミックに発現しているが、中枢時計ではこの振動幅が大きいと言われている。また、末梢臓器の時計は自律振動能が弱く、中枢時計の支配下にあり、末梢時計は毎日中枢時計からの指令をもらってやっと動くような時計と考えられる。我々は、肝臓における時計遺伝子のリズムが交感神経により制御されることを、時計遺伝子の発現、神経切断実験等で証明した。さらに、メラトニンが視交叉上核を介し全身の交感神経活動を制御することを証明した。また、我々はマウス髄液内マイクロダイアリシスプローブで数ヶ月もメラトニンとともにコルチコステロン分泌をモニターできる系を開発した。コルチコステロンは副腎皮質から分泌されることがわかっているので、この新しい末梢時計の指標により、末梢時計の解明が進むことが期待される。さらに前年度我々は、時計シグナルが細胞周期を転写レベルの制御によって行っていることを明らかにしたが、もしそれが正しいなら、分裂が亢進している精巣や胸腺などの臓器では、時計遺伝子の発振はどうなっているのかが注目される。しかし、急速に分裂する臓器では、時計遺伝子は一定であり、細胞周期とリンクしていない。これを解釈するのに、発生や臓器特異的な生物時計(24時間周期のPer遺伝子、2時間周期のHes遺伝子)の選択の可能性を明らかにした。肝臓の時計遺伝子のリズムが交感神経により制御されることを、時計遺伝子の発現、神経切断実験等で証明した(Terazono et al. PNAS,2003)。さらに、メラトニンが視交叉上核を介し全身の交感神経活動を制御することを証明した(J.Physiol,2003)。また、我々はマウス髄液内マイクロダイアリシスプローブで数ヶ月もメラトニン分泌をモニターできる系を開発した。これにより、松果体よりのメラトニン分泌は、アミン神経性制御性と非神経制御性の2峰性の分泌があることが初めて解明された(Nakahara et al. PNAS,2003)。これにより、従来は行動リズムしかなかったリズムモニターを、初めて直接ホルモンで見ることが可能となった。さらに、マウスの肝広範切除術を用い、細胞分裂と生態リズムの関係を検索した。この系では、70%以上の肝細胞が有糸分裂に入ることで、細胞周期と体内時計の相関を考えるのに理想の系である。無リズムのCry1Cry2ダブルノックアウトマウスでは、切除後のM期流入が遅れることがわかった。また、マウスの肝切除後の再生過程で、時計が細胞周期関連遺伝子を制御し、Cyclin B1、Cdc2 kinaseの活性を制御する。特にwellは時計遺伝子の形成するコア・ループに直接制御されることを発見した(Science,2003)。長年の課題である、時計遺伝子発現を可視化して、約10年前に樹立した脳スライスカルチャー培養系に応用し、リアルタイムモニター系を確立し数ケ月に及ぶリズム観察が可能な視交叉上核のスライスカルチャー系を確立し、超高感度CCDカメラを組み合わせ、世界で初めて、時計細胞一個レベルでの遺伝子転写発現のリズムを観察し、細胞相互のリズム伝達機構の解明に成功した(Science,2003)。

また、我々はマウス髄液内マイクロダイアリシスプローブで数ヶ月もメラトニンとともにコルチコステロン分泌をモニターできる系を開発した。コルチコステロンは副腎皮質から分泌されることがわかっているので、この新しい末梢時計の指標により、末梢時計の解明が進むことが期待される。さらに前年度我々は、時計シグナルが細胞周期を転写レベルの制御によって行っていることを明らかにしたが、もしそれが正しいなら、分裂が亢進している精巣や胸腺などの臓器では、時計遺伝子の発振はどうなっているのかが注目される。しかし、急速に分裂する臓器では、時計遺伝子は一定であり、細胞周期とリンクしていない。これを解釈するのに、発生や臓器特異的な生物時計(24時間周期のPer遺伝子、2時間周期のHes遺伝子)の選択の可能性を明らかにした。
腎移植におけるDNAタイピングの重要性

HLA抗原型と腎移植成績との相関はクラス【I】抗原系よりもクラス【II】抗原系の方が大きく、更に血清学により定義されているクラス【II】抗原型であるDR抗原型、DQ抗原型よりも混合リンパ球培養反応(MLC)により定義されるD抗原型の方が相関が大きい。しかしD抗原型を決定するMLC反応はその手技が複雑なため、実際の腎移植ではDR抗原型が指標として用いられてきた。一方このHLAクラス【II】領域内にはDR,DR【II】,DQ,DPなど偽遺伝子などを含めると15個以上の遺伝子が存在することがわかってきた。そこで我々はまずHLA-D抗原型と遺伝子上の多型との相関をサザンブロット法により解析した。用いたクラス【I】,クラス【II】及びその周辺遺伝子座由来の10種のプローブの内、D抗原型と最もよい相関を示したのはDQβ須cDNAプローブであった。当初もう一方の最有力侯補と考えられたDRβ須cDNAプローブは検出し得る遺伝的多型がD抗原型よりも更に粗く、本研究の目的には不適当であった。DQβ須cDNAプローブと5種の制限酵素を用いたサザンブロット法により既知の19種のD抗原型をすべて区別することができた。このHLA抗原型のDNAタイピング法はその手技もさほど複雑ではなく、要する時間も比較的短時間で済むという利点がある。今回我々の確立したDNAタイピング法は移植腎提供者と受容者間のマッチングに新たな有力な方法を提供したことになると考える。一方、本法確立の過程で我々は同一D抗原型内に更に遺伝子上の多型が存在することを見いだした。つまり、DW4抗原型内には4型のそれぞれ違った遺伝子型が存在していた。このような本法によってのみ検出可能な遺伝的多型はDW2,DW8,DW10,DW15,DW17内にも見られた。現在までの段階ではこの新たな遺伝的多型と腎移植成績との相関がD抗原型との相関よりも高いのかどうかは不明である。
20世紀前半期東アジアにおける交通環境の整備と消費生活の変容

本年度の課題は、第一に、「台湾鉄道貨物統計のデータベース」を完成させること、第二に、中国において戦時期の鉄道統計資料を発掘することであった。しかし、本年度中の日中間の一連の政治的情勢を鑑み、第二の課題はやむなく断念することとなった。代わりに、第三の課題として、植民地朝鮮の石炭消費に関する研究を行った。第一の課題について。昨年度より引き続き台湾鉄道貨物輸送データベースの構築を行った。想定よりも多くの統計入力が必要であったため、上記年度全てにわたる「全駅・全貨物発着データ」の入力までは終えられなかったが、当該期間中の貨物輸送量データおよび代表年度「全駅・全貨物発着データ」の入力は完成した。このデータベースと、博士課程在籍中に作成した朝鮮のデータベースは、20世紀前半期東アジアの基礎的な流通統計として極めて価値のあるものであると自負している。将来的に公開することを考えており、当面はこれらを利用した分析および成果の公表を行っていく予定である。第三の課題について。既に「穀物」「綿布」という人々の生活(衣・食)に深くかかわる最終消費財の流通・消費の変容に関する研究をおこなっていたが、それに加え「住」にかかわる消費財として「石炭」を選び、その消費動向と流通について研究を行った。これは植民地期を通じて朝鮮の石炭消費が急激に増加することが、一方では「工業化」にともなう動力源として、他方では冬季の暖房燃料として消費が増加している点に着目したものである。鉄道統計等から、石炭の暖房燃料としての需要が高まっていること、そしてそれがとくに1920年代後半から朝鮮半島北部で採掘されるようになった朝鮮有煙炭の朝鮮内消費によって実現されていたという分析結果を得た。急遽変更・計画した研究であったためにまだ分析が不十分な点も残されているが、今後、同課題で研究を続け、活字として成果を公表できる目途は立ったと考えている。25年度辞退25年度辞退本年度の課題は、第一に、「台湾鉄道貨物統計のデータベースの構築」を開始すること、第二に、その完成までの間、既に完成させている朝鮮の国有鉄道(朝鮮総督府鉄道局の管理鉄道)のデータベースと朝鮮総督府農林局『農家経済調査概況』等を利用して、「朝鮮における鉄道敷設地域と非敷設地域間での消費生活の変容」に取り組むことであった。第一の課題については、ほぼ予定通りに作業を進めることができ、第二の課題についてはその中間成果を報告することができた。その他、昨年度に京都大学大学院経済学研究科に提出した博士学位論文に収録した論文の修正とその成果報告も行った。以下、それぞれについて、進捗状況および成果について記述する。第一の課題について。日本で所蔵が確認されている台湾総督府交通局鉄道部『鉄道年報』の19001938年度版の収集をおこない、データベースの構築を開始した。完成までにはまだ時間を要するが、従前の計画に従って、来年度中には作業を終え、分析に着手できるように準備を続けていく。第二の課題について。本課題の実現のため、より具体的には次の三つの課題を掲げていた。(1)朝鮮総督府農林局『農家経済調査概況』の収集と分析。(2)韓国国立中央図書館(旧朝鮮総督府図書館)に所蔵されていた、植民地期朝鮮の私設鉄道会社・朝鮮鉄道株式会社の『業務統計書』に関する統計資料の収集。(3)米国国立公文書館等での戦時期鉄道貨物輸送に関する資料調査。(2)、(3)は、現在すでに完成させている朝鮮国有鉄道の貨物輸送統計データベースを補強するため、私設鉄道のデータ、および戦時期のデータを加えるために掲げた課題であり、これらを(1)で挙げた資料等と結びつけることで、全体の課題である「朝鮮における鉄道敷設地域と非敷設地域間での消費生活の変容」について迫ろうという計画であった。(1)については、京都大学農学部図書室にて同資料の複写をおこなった。しかし、まだ同資料を利用した分析にまでは至っていない。(2)については、7月中旬に韓国国立中央図書館で調査をおこない、収集した資料をもとに貨物輸送統計のデータベースを作成、それを利用した分析した中間成果について、学会発表をおこなった。(3)については、戦時期の鉄道貨物輸送に関する新たな資料発掘を期待して7月下旬から8月上旬にかけて米国で行ったものであるが、鉄道輸送の全体像がわかるような資料の発見には至らなかった点は残念である。その他、博士論文のうち、2本の論文が未公表であったので、それらを公表することをおこなった。一つは、植民地期朝鮮における鉄道敷設の展開を、その沿線人口の変化との関係のなかで論じたもの(なお、この論文は上記した今年度の第二の課題の基礎的研究として位置づけられる)を、学会誌に投稿、審査を受けた上で掲載されることになった。もう一つは、鉄道貨物輸送の全体像を、独自に推計したトン当単価を利用して明らかにしようとした研究を、推計をより精緻化した上で、学会で報告をおこなった。第一の課題について。

想定よりも多くの統計入力が必要であったため、上記年度全てにわたる「全駅・全貨物発着データ」の入力までは終えられなかったが、当該期間中の貨物輸送量データおよび代表年度「全駅・全貨物発着データ」の入力は完成した。このデータベースと、博士課程在籍中に作成した朝鮮のデータベースは、20世紀前半期東アジアの基礎的な流通統計として極めて価値のあるものであると自負している。将来的に公開することを考えており、当面はこれらを利用した分析および成果の公表を行っていく予定である。第三の課題について。既に「穀物」「綿布」という人々の生活(衣・食)に深くかかわる最終消費財の流通・消費の変容に関する研究をおこなっていたが、それに加え「住」にかかわる消費財として「石炭」を選び、その消費動向と流通について研究を行った。これは植民地期を通じて朝鮮の石炭消費が急激に増加することが、一方では「工業化」にともなう動力源として、他方では冬季の暖房燃料として消費が増加している点に着目したものである。鉄道統計等から、石炭の暖房燃料としての需要が高まっていること、そしてそれがとくに1920年代後半から朝鮮半島北部で採掘されるようになった朝鮮有煙炭の朝鮮内消費によって実現されていたという分析結果を得た。急遽変更・計画した研究であったためにまだ分析が不十分な点も残されているが、今後、同課題で研究を続け、活字として成果を公表できる目途は立ったと考えている。今年度掲げた2つの課題のうち、1つ目の課題は計画通りに進行していること、2つ目の課題も総合的な成果報告までには至らなかったものの、資料収集を終えた点、また基礎となるデータベースの作成(朝鮮の私鉄の貨物輸送統計のデータベースの作成)、その分析と報告ができたという点で、おおむね順調に進展していると評価できる。作成したデータベースと収集した資料を組み合わせて分析することで、来年度前半にはその成果を公表できるまでに進んでいる。戦時期の鉄道貨物輸送統計については米国で資料調査をおこなったものの、大きな成果が挙げられなかった点が残念ではあるが、次項12で記述するように別の場所で資料発見の可能性についての情報を得、対応策を立てることができた点も結果的に評価できる。25年度辞退引き続き、「台湾鉄道貨物統計のデータベースの構築」を継続し、来年度中の完成を目指す。そしてこれまでの朝鮮での研究を踏まえた上で比較研究に取り組みはじめることが第一の課題となる。第二の課題は、今年度の研究内容を収集した資料と合わせて分析した上で、学術雑誌に投稿し公表していくことである。以上は従前の計画通りであるが、変更点は次の点である。今年度、戦時期に関する資料発掘を米国でおこなったが、期待通りの成果をあげることができなかった。従前の計画では、来年度も米国での調査を予定したが、中国での資料調査に変更したいと考えている。中国には、旧南満洲鉄道株式会社が所蔵していた資料が、いくつかの大学図書館もしくは公共図書館に分散して所蔵されており、その中に旧日本植民地の戦時期鉄道資料も一部含まれているとの情報を得ることができたので、中国史研究者に協力を得ながら、それらの資料調査を行いたいと考えている。なお出張先の変更のみで経費の仕様内訳に変更の予定はない。25年度辞退
新規構造を持つ担子菌由来亜鉛プロテアーゼの結晶構造解析

プロテアーゼは生体の内外でたんぱく質を分解するという、生命に必須な機能を持つ重要なたんぱく質ファミリーである。なかでも、亜鉛プロテアーゼは、至適pHが中性から弱アルカリ性にあるのが特徴で、一次構造の相同性や亜鉛の配位構造などによって分類されている。本研究の担子菌由来の亜鉛プロテアーゼは、舞茸子実体中に豊富に存在し、抽出が比較的容易なため、その応用も検討されているたんぱく質である。また、Aspzincinと呼ばれるファミリーに属しているが、その構造は解析されておらず、亜鉛配位子も確定していなかった。本研究ではこの分子の構造構築原理ならびに基質認識機構を解明する目的で、3次元構造を解明することを目指した。破砕した舞茸子実体からカラムクロマトグラフィーにより試料を抽出し、結晶化を行った結果、4種類の結晶系で結晶を得ることができた。これらの試料を基に、大型放射光施設SPring-8の理研ビームラインIで多波長異常分散法を行うことにより、良好な電子密度図を得ることができ、分子構造を解明することができた。得られた構造には、4本のストランドと1本のヘリックスからなる上部ドメインと4本のヘリックスからなる下部ドメインがあり、それをつなぐ長いヘリックスが存在している。亜鉛配位子は新規なモチーフHEXXH+GTXDXXYGであった。リジン残基のアミノ末端側を切断するこの酵素の基質認識には、亜鉛イオンの傍らに設けられたS1'ポケットが重要な役割を果たしていることを示唆した。このポケットの深さによって、同じ極性を持つアルギニン残基が入っても、亜鉛との位置関係によって反応中間体を安定に保持することができない。また、このポケットのふたの部分にあたる位置にチロシン残基が存在していることがわかった。この残基は長い側鎖のリジンの認識や、反応中間体の安定に寄与するものであることを明らかにした。担子菌マイタケを破砕しカラムクロマトグラフィーにより抽出した亜鉛プロテアーゼ(以下、GFMEP)の結晶化を行い、ほぼ同じ結晶化条件から4種の異なる結晶系の単結晶を得ることに成功した。これらのうち、六方晶系に属する結晶を用いて、本タンパク質中に含まれる亜鉛原子に対する多波長異常分散実験を、放射光実験施設において行い、良好な電子密度図を得ることができた。引き続き、分子モデルを作成し、2.5オングストローム分解能で精密化することに成功した。得られた分子モデルは、これまで得られている多くの亜鉛プロテアーゼの構造とは多くの点で異なっていた。特に、活性中心を形成している亜鉛原子周辺の構造は、これまでにないグルタミン酸側鎖の二葉(biloave)配位となっていて、アスパラギン酸側鎖が配位するサーモリシンの一葉配位とは異なる。このグルタミン酸側鎖は、これまで10残基程下流にあるグルタミン酸であると考えられていたが、今回の解析によって正しい配位子を決定できたことも収穫の一つである。また、リジン残基に対する特異性は、酸性アミノ酸残基が密集するS1'ポケット部によって提示されている。これは、活性中心のすぐ傍らにあって、リジン残基のアミノ末端側を切断するのに好都合である。このポケットは同じアルカリ性側鎖を持つアルギニン残基に対する親和性をも持ちうるが、その側鎖の長さの違いのため、切断されるカルボキシル基を活性中心に正しく配位させられないような構造をとって、二つのアルカリ性側鎖を弁別していることも明らかになった。一方、多くの類似点も見られた。全体構造はアミノ末端側の残基からなるドメインとカルボキシ末端からなるドメインの2つの領域から形成されており、その間に基質結合領域がある。各ドメインは他のプロテアーゼに見られるように、それぞれβリッチな構造、ループやヘリックスに富んだ構造を持っている。次年度は、これらの解析の結果を受けて、残り3種の結晶系の構造についても詳細に検討するとともに、基質複合体や亜鉛原子の置換などを含めた解析を継続していく計画である。

リジン残基のアミノ末端側を切断するこの酵素の基質認識には、亜鉛イオンの傍らに設けられたS1'ポケットが重要な役割を果たしていることを示唆した。このポケットの深さによって、同じ極性を持つアルギニン残基が入っても、亜鉛との位置関係によって反応中間体を安定に保持することができない。また、このポケットのふたの部分にあたる位置にチロシン残基が存在していることがわかった。この残基は長い側鎖のリジンの認識や、反応中間体の安定に寄与するものであることを明らかにした。
化学場がもたらすベシクルの新しい変形ダイナミクス

細胞の変形などのダイナミクスをソフトマター物理の観点から理解する為には、化学的な刺激に対するソフトマターメソ構造体の応答を理解することが不可欠である。本研究では化学刺激により膜分子の幾何学的形状が変化することを基盤とした膜変形ダイナミクスの解明を試みた。その結果、アニオン性脂質を含むモデル生態膜に水酸化物イオンを含む化学刺激を与えると、膜面上での孔開閉を制御できることが分かった。さらにこの孔形成はアニオン性脂質と水酸化物イオンの相互作用による膜面積収縮に起因することを明らかにした。これは、生命機能の制御機構を化学場によるソフトマターの非平衡構造形成という観点から明らかにする為の第一歩である。本研究では、ソフトマター物理を生命系へと展開するために、化学的な刺激に対するソフトマターメソ構造体の応答を理解することを目指している。本研究代表者はフランスのチームとの共同研究により、モデル生体膜にpH勾配を与えると膜表面でのpHの伝搬に強く結合して膜変形挙動が大きく変化することを見いだしている。これは、化学刺激により膜分子の幾何学的形状が変化するために膜変形が誘起されることを示している。そこで、平成25年度はpHと膜の変形量の関係を定量的に測定し、そこからpH変化による脂質分子面積の変化を膜弾性エネルギーモデルにより評価することで化学刺激を脂質分子の形状変化へと置き換える。このような実験・解析を化学刺激種や脂質のイオン性を変化させて行ない、得られた脂質の幾何学的変化が脂質分子のイオン基の乖離状態から見積もったイオン半径と整合するか検討した。様々な化学刺激種と脂質のイオン性との組み合わせで実験を行なう中で、特定の組み合わせに於いては化学刺激によりモデル生体膜表面に孔が空くことがわかった。これまでに脂質の幾何学的形状と温度による膜面積の変化を結合することでモデル生体膜表面に孔を開けることに成功しているが、今回観察された化学刺激による孔形成に於いても、化学修飾により膜分子の断面積と幾何学的形状が変化していることが孔形成に密接に関係していることが予想される。このため、化学刺激種と脂質のイオン性の組み合わせ等について、膜面上に孔を開けるための条件を詳細に調べた。本研究では、「化学刺激を分子形状の幾何学的変化に置き換えることにより、その膜変形ダイナミクスを膜弾性エネルギーモデルで理解できる」というコンセプトを検証し、化学場がもたらすユニークな膜変形ダイナミクスを解明することを目的としているが、今回得られた結果はこのコンセプトの妥当性を裏付ける大きな鍵となると期待される。平成25年度にはpHと膜の変形量の関係を定量的に測定し、そこからpH変化による脂質分子面積の変化を膜弾性エネルギーモデルにより評価することで化学刺激を脂質分子の形状変化へと置き換えることを試みた。その結果、様々な化学刺激種と脂質のイオン性との組み合わせで実験を行う中で、特定の組み合わせにおいては化学刺激によりモデル生体膜表面に孔が空くことがわかった。これまでに脂質の幾何学的形状と温度による膜面積の変化を結合することでモデル生体膜表面に孔を開けることに成功しているが、この化学刺激による孔形成においても、化学修飾により膜分子の断面積と幾何学的形状が変化していることが孔形成に密接に関係していることが予想される。平成26年度は、前年度の研究成果を受け、さらに発展させるために不均一モデル生体膜に化学刺激を与えた場合の膜変形や孔形成について研究を進めるため、この準備としてアニオン/中性脂質,カチオン/中性脂質,アニオン/カチオン性脂質の三種類の組み合わせにおいて、化学刺激を与えるに十分な大きさや強度の二成分モデル生体膜を作製した。さらにこれらに種々の化学種による刺激を与えて膜変形や孔形成について研究を進める予定であったが、産前・産後休暇及び育児休暇のため、平成26年度は2ヶ月間で研究を一時中断することになった。本研究では、ソフトマター物理を生命系へと展開するために、化学的な刺激に対するソフトマターメソ構造体の応答を理解することを目的としている。平成25年度にはpHと膜の変形量の関係を定量的に測定し、そこからpH変化による脂質分子の断面積の変化を膜弾性エネルギーモデルにより評価することで化学刺激を脂質分子の形状変化へと置き換えることを試みた。様々な化学種と脂質イオン性との組み合わせで実験を行なう中で、特定の組み合わせにおいては化学刺激により膜表面に孔が開くことがわかった。この化学刺激による孔形成において、化学修飾により膜分子の断面積と幾何学的形状が変化していることが孔形成に密接に関係していることが予想される。平成26年度は、前年度の研究成果を受け、さらに発展させるために不均一モデル生体膜に化学刺激を与えた場合の膜変形や孔形成について研究を進めるため、準備としてアニオン/中性脂質,カチオン/中性脂質,アニオン/カチオン性脂質の三種類の組み合わせにおいて、化学刺激を与えるに十分な大きさや強度の二成分モデル生体膜を作製した。

平成27年度は、平成26年度の結果を受けて、さらに種々の化学種による刺激を与えて膜変形や孔形成について研究を進めた。その結果、アニオン/中性脂質から成る二成分ベシクルに陽イオンを作用させることでベシクル膜面上に孔が開くことが明らかとなった。また、この二成分ベシクルに孔を開けるためには、二種類の脂質が相分離をしている必要があることも実験より明らかにすることができた。平成26年度に遂行予定であった研究計画は、平成26年6月平成27年3月の間産前産後及び育児休業のため一時中断していた。平成27年4月より研究を再開し、平成26年度に遂行予定であった研究計画をほぼ遂行することができたため。本研究では、ソフトマター物理を生命系へと展開するために、化学的な刺激に対するソフトマターメソ構造体の応答を理解することを目的としている。また、これまでの研究から化学刺激により膜分子の幾何学的形状が変化するために膜変形が誘起されることを見いだしている。平成25年度にはpHと膜の変形量の関係を定量的に測定し、そこからpH変化による脂質分子の断面積の変化を膜弾性エネルギーモデルにより評価することを試みた。その結果、特定の組み合わせにおいては化学刺激によりモデル生体膜表面に孔が開くことがわかった。これまでに脂質の幾何学的形状と温度による膜面積の変化を結合することでモデル生体膜表面に孔を開けることに成功しているが、この化学刺激による孔形成においても、化学修飾により膜分子の断面積と幾何学的形状が変化していることが孔形成に密接に関係していることが予想される。平成26年度は、前年度の研究成果を受け、不均一モデル生体膜に化学刺激を与えた場合の膜変形や孔形成について研究を進めるため、準備としてアニオン/中性脂質,カチオン/中性脂質,アニオン/カチオン性脂質の三種類の組み合わせにおいて、化学刺激を与えるに十分な大きさや強度の二成分モデル生体膜を作製した。平成27年度は、種々の化学種による刺激を与えて膜変形や孔形成について研究を進めた。その結果、アニオン/中性脂質から成る二成分ベシクルに化学刺激を与えることでベシクル膜面上に孔が開くことが明らかとなった。平成28年度は、モデル生体膜への化学刺激による孔形成が、化学刺激が膜面積収縮を誘起することによって起きていることを実験的に明らかにした。この結果を受けて、本研究により発見された「化学刺激による膜面上での孔形成」はアニオン性脂質が化学修飾されることにより、脂質間に働く静電斥力と立体斥力のバランスが崩れたことに起因すると予想するに至った。細胞の変形などのダイナミクスをソフトマター物理の観点から理解する為には、化学的な刺激に対するソフトマターメソ構造体の応答を理解することが不可欠である。本研究では化学刺激により膜分子の幾何学的形状が変化することを基盤とした膜変形ダイナミクスの解明を試みた。その結果、アニオン性脂質を含むモデル生態膜に水酸化物イオンを含む化学刺激を与えると、膜面上での孔開閉を制御できることが分かった。
ナノテクノロジー粒子状化学物質とアレルギー発症に関する研究

ナノテクノロジー仕様の酸化チタン及び酸化亜鉛をそれぞれ、8μg/50μlをNC/Ngaマウスに5日間連続点鼻し、さらに11日目にチャレンジ投与した喘息発症実験で、12日目に肺の組織学的検討と供に肺胞洗浄液の細胞分画を観察した。また、我々がこのマウスを用いて、ダニタンパク質抽出液Df抗原を点鼻し作成した、喘息モデルに対して、酸化チタン40μg/50μlを11日目のDfチャレンジ投与の直前に点鼻投与し、肺胞洗浄液中の細胞分画への影響を検討した。その結果、酸化チタンは肺胞マクロファージに取り込まれ一部気管支周囲に炎症細胞の浸潤があり、NO合成酵素の一つであるiNOSが一部誘導されていたが、酸化亜鉛にはそのような作用は認められなかった。また、酸化亜鉛、酸化チタンによる肺胞洗浄液細胞分画は、ほとんどがマクロファージであり好酸球の増加は認められなかった。Df点鼻投与により発症した喘息モデルでは、肺胞洗浄液中には、多数のマクロファージ、好中球、好酸球の浸出が認められたのに対して、酸化チタンをチャレンジ前投与した場合、マクロファージ、好酸球の浸出を抑制した。以上より、酸化チタンには、吸入毒性がある可能性があるが、易アレルギー性は少ないと思われた。しかしながら、酸化チタンにはiNOS誘導のようなTh1刺激作用があり、好酸球の浸潤を抑制する作用があることから、喘息を抑制する可能性がある。治療面への応用を考慮し、この後、さらに検討する必要があると思われる。カゼイン投与ラット腹腔浸出好中球を用いて、ルミノール依存性化学発光を好中球活性化の指標とし、ナノテクノロジー粒子状化学物質である酸化亜鉛、酸化チタンの刺激作用を検討した。その結果、酸化亜鉛は、好中球化学発光増強作用があり、その作用は、グルタチオンの添加でさらに増強された。それに対し、酸化チタンは化学発光抑制作用がありグルタチオン添加においても抑制作用に変化は認められなかった。このことより、酸化チタンは電子の授受に関与する可能性があり、抗酸化作用を有ることが示唆された。また、アトピー性皮膚炎や喘息の実験モデルとして知られているNC/Ngaマウスを用いた喘息発症実験では、5日間8μgを経鼻投与し、11日目にチャレンジ投与し、12日目に肺の組織学的検討と供に肺胞洗浄液の細胞分画を観察した。その結果、酸化チタンは肺胞マクロファージに取り込まれ一部気管支周囲に炎症細胞の浸潤があり、NO合成酵素の一つであるiNoSが一部誘導されていた。しかしながら、肺胞洗浄液中に好酸球の増加は認められなかった。このことから、酸化チタンには、吸入毒性がある可能性があるが、易アレルギー性は少ないと思われた。今後、慢性曝露実験による肺毒性作用を検討する必要があると思われる。
歯周疾患の病態形成機構における口臭原因物質メチルメルカプタンの機能的役割と意義

口臭原因物質は、メチルメルカプタンを中心とする硫化化合物である。幾つかの報告は、口臭症患者のメチルメルカプタン量と歯周疾患の病態に正の相関関係の存在することを示している。ごく最近、メチルメルカプタンは、幾つかの歯周病原性細菌が産生することが明らかとなった。これらの知見から、メチルメルカプタンは、歯周病原性細菌由来の病原性因子として、本疾患の病態の成立・進行に密接に関係している可能性を考察した。歯肉溝や歯周ポケット底部の粘膜上皮細胞は、細胞死が亢進していることが明らかにされている。しかしながら、細胞死が如何なる機構で誘導されているか完全には理解されていない。そこで、このメチルメルカプタンが、上皮細胞に傷害誘導能を有するか否か検討をした。その結果、強い傷害作用を有することが明らかとなり、その傷害作用は、ネクローシスにより制御されていることが明らかとなった。また、歯周疾患は、歯肉の炎症と骨吸収を特徴とする慢性感染症である。近年の歯周病研究の結果から、本疾患は、歯周病原性細菌が有するリポ多糖(LPS)等が、骨吸収活性を有する炎症性サイトカイン(IL-1、TNF-α、並びに、IL-6)を誘導し、強い炎症が惹起されることが示されている。また、これらの炎症サイトカインは、マクロファージが大量に産生することが示されている。また、本細胞のアポトーシスは、炎症反応の終焉に重要であることが示されている。そこで、このアポトーシスの抑制は、炎症の終息を阻害することになり、そのような作用をメチルメルカプタンが有するか否か、マクロファージ様細胞Raw264.7細胞を用い検討した。その結果、メチルメルカプタンは、Raw264.7細胞において、一酸化窒素誘導性アポトーシスを強く阻害することを明らかにした。一方、歯周疾患は、歯肉の炎症と骨吸収を特徴とする慢性感染症である。近年の歯周病研究の結果から、本疾患は、歯周病原性細菌が有するリポ多糖(LPS)等が、炎症性サイトカイン(IL-1、TNF-α、並びに、IL-6)を誘導し、強い炎症が惹起されることが示されている。また、これらの炎症サイトカインは、骨吸収活性を有することから、歯槽骨に破骨細胞が誘導され、歯槽骨が吸収されることも明らかにされている。ゆえに、メチルメルカプタンが、歯周疾患の病態の成立・進行に密接に関係しているか否か検討することを目的とし、マクロファージ様細胞Raw264.7細胞のサイトカイン誘導について検討している。その結果、Raw264.7細胞は、メチルメルカプタンの刺激によりTNF-αを産生することが明らかとなった。又、骨吸収活性に関与するか否かについては、Raw264.7細胞からクローニングした破骨細胞に分化能を有する細胞群を、用いて検討している。破骨細胞の分化は、ODF/LANKLにより誘導されことが示されている。

そこで、ODF/LANKLとメチルメルカプタンを共刺激し検討したところ、メチルメルカプタンは、ODF/LANKL誘導性破骨細胞の分化を増強することが明らかとなった。口臭原因物質は、メチルメルカプタンを中心とする硫化化合物である。幾つかの報告は、口臭症患者のメチルメルカプタン量と歯周疾患の病態に正の相関関係の存在することを示している。ごく最近、メチルメルカプタンは、幾つかの歯周病原性細菌が産生することが明らかとなった。これらの知見から、メチルメルカプタンは、歯周病原性細菌由来の病原性因子として、本疾患の病態の成立・進行に密接に関係している可能性を考察した。一方、歯周疾患は、歯肉の炎症と骨吸収を特徴とする慢性感染症である。近年の歯周病研究の結果から、本疾患は、歯周病原性細菌が有するリポ多糖(LPS)等が、炎症性サイトカイン(IL-1、TNF-α、並びに、IL-6)を誘導し、強い炎症が惹起されることが示されている。また、これらの炎症サイトカインは、骨吸収活性を有することから、歯槽骨に破骨細胞が誘導され、歯槽骨が吸収されることも明らかにされている。ゆえに、メチルメルカプタンが、歯周疾患の病態の成立・進行に密接に関係しているか否か検討することを目的とし、マクロファージ様細胞Raw264.7細胞のサイトカイン誘導について検討している。その結果、Raw264.7細胞は、メチルメルカプタンの刺激によりTNF-αを産生することが明らかとなった。また、慢性炎症疾患の病巣においてマクロファージのアポトーシスが強力に抑制されていることが明らかとなっている。そこで、このメチルメルカプタンがRaw264.7細胞のアポトーシスを阻害することを明らかにした。このアポトーシス抑制作用は、Casepase-8と-3を阻害することによるものであることを示した。現在、この作用に、メチルメルカプタン誘導性TNF-αがオートクライン機構で関与するか否か検討している。
ドイツ語圏における神話・伝説素材の作品化に見られる集合的記憶の諸相

本プロジェクトは、ドイツ語圏の文学作品において神話や伝説素材がどのように採りこまれて作品成立に至っているかを観察し、そこにドイツ人の過去と密接に関連している集合的記憶や想起といった概念がどのように作品に反映されているかを明らかにするものである。この目的を達成するために、文学集団ヴィーナー・グルッペに影響された小説家や詩人、ラディカルな言語実験で知られる作家、戦間期から戦後にかけて人気を博した劇作家のそれぞれの作品を対象にして個々にケーススタディを行い、神話・伝説素材の伝承する集合的記憶の今日的意味を明らかにしつつ新たな解釈を試みた。中世英雄叙事詩『ニーベルンゲンの歌』を再作品化する形で悲劇に描いた劇作家F.ヘッベルの生誕200年に当たる2013年、毎年開催される「ニーベルンゲン演劇祭」でも、そのヘッベルの悲劇三部作『ニーベルンゲン』のうちの第1部と第2部の現代における翻案Born To Dieが上演され、その舞台を鑑賞することができことは大きな成果であった(2013年7月6日、7日、ドイツ・ヴォルムス市において園田、山本が鑑賞)。ヘッベルの戯曲はキリスト教世界と異教の世界の対立を、キリスト教世界の優位という結末へと導くことで、閉じた完全な世界を描いている。しかし龍退治や陰謀・暗殺によるジークフリートの死などの冒険的要素に満ちた躍動的な文学空間は、視覚映像化されて新たな生命を獲得する可能性に満ちている。今回の現代版ヘッベルの注目すべき特徴は、そもそも「記憶Gedaechtnis」として刻まれたテクストとしての戯曲から、「想起するerinnern」行為そのものとしての演劇、つまり「記憶Erinnerung」の実践への展開として、伝統的な小道具から高度な視覚映像技術に至るまで様々な媒体が、イメージ喚起装置として用いられ、高い効果を上げていることであった。語りの多層化や聖堂の側面を利用したスクリーン上での映写などがヘッベルの物語の相対化に寄与する一方で、低くなった舞台全体を覆うぬかるんだ泥、足下から音がせりあがってくるように響く和太鼓などは、遠大な時間的隔たりを一気に縮め、暴力や戦闘を暗示させる原初的な場を呈示し、そこに観客をいわば引きずりおろす役割を果たしていたと言える。演劇こそ記憶の呼び戻しに大きくかかわる文化装置だという認識を得た。また、山本の論文(『トーマス・クリングと中世』)は中世素材の現代における再作品化の意義を主題としており、本研究の一個のケーススタディとしての意味を持つ。ループレヒターは、神話的語り口を歴史的な語り口と融合させ、新しい表現形式へと発展させたオーストリアの作家コンラート・バイヤーの研究を行った。ウィーン文学館、資料館、オーストリア国立図書館訪問による資料収集・分析を通じて準備したシンポジウム『コンラート・バイヤー:テクスト・図像・音声』(9月20日)で『コンラート・バイヤーにおける表現原則としての偶然性』の題で講演を行い、現地の研究者と意見交換した。バイヤーの例えば小説モンタージュ『ヴィトゥス・ベーリングの頭』は、ロシア帝国の航海士ベーリングが、ロシア-アメリカ間の航路を発見したという歴史的業績だけでなく、極限の体験やそれに伴う極端な思考形式が神話と深く結び付く様子をあわせて表現した。この点において、本作品は神話・伝説素材と歴史というそれぞれの集合的記憶が融合し作品化された一例として捉えることができる。山本は、『ニーベルンゲンの歌』および『哀歌』に関するこれまでの研究を整理し、平成26年度日本学術振興会研究成果公開促進費により単著として出版した。また、『ニーベルンゲンの歌』の近代以降の受容史研究の成果を、論考「破滅の神話ー近代以降の『ニーベルンゲンの歌』受容とドイツ史」にまとめ、西山(編)『カタストロフィと人文学』に掲載した。一方、戦争という新しい集合的記憶の克服を行おうと試みた前衛作家アルノ・シュミットの調査を犬飼が行った。シュミットが作品執筆の際に神話・伝説素材を投影・描出した風景を撮影・記録した様子を整理・展示した特別展『風景写真家としての作家アルノ・シュミット』、戦時中の記憶と伝説素材を織り交ぜて作品とした短篇『ポカホンタスのいる湖景』の初演劇化作品初演、作家研究全体の足がかりとなる『アルノ・シュミット生誕100周年記念展』オープニングイベントなどを訪問し、資料収集および各研究者との意見交換などを行った。ループレヒターは、1960年代に言語実験の中心的存在となったヴィーン・グループに寄り添う形で活動を展開したコンラート・バイアーのテクストを取り上げ、歴史的な素材や人物が実験文学的手法によってどのように民族や神話的文脈に移し替えられるか、またその際いかに様ざまな変化を遂げるかといった点を追究した。山本は、中世盛期から後期にかけての英雄伝説素材の持つ歴史性を検証するとともに、『ニーベルンゲンの歌』が再発見された18世紀半ば以降のニーベルンゲン素材受容を検証し、その問題点と近代ドイツ史に与えた影響の俯瞰的視点からの総括を試みた。犬飼は、ドイツ語圏後期モダニズム文学における記憶概念の変遷に注目し、アルノ・シュミットの作品の中に、二大大戦をめぐる個人的記憶と神話や歴史に関わる集合的記憶の同時的企図による新たな散文形式を見出した。園田は、ドイツ人が共有するナチズムの集合的

記憶に関わる文学における一形態として、ニーベルンゲン伝説素材の作品化という側面から深く追究されていない、1950年代当時最多観客動員数を誇ったツックマイアーの演劇作品『悪魔の将軍』を取り上げ、その時々の歴史に左右されつつ好んで使用されてきたニーベルンゲン素材が意外にも当作品全体に重大な影響を及ぼす核心的モティーフであることを突きとめ、著者が期待し、かつ作品が形式として打ち出そうとしている事実の象徴的表現であるということと、それを受け留める読者側の受容の実態との間に生ずる齟齬の中に、ニーベルンゲンを巡る文化的記憶としての本作の問題性が横たわっている点を新たな批判的読解に結び付けた。本プロジェクトは、ドイツ語圏の文学作品において神話や伝説素材がどのように採りこまれて作品成立に至っているかを観察し、そこにドイツ人の過去と密接に関連している集合的記憶や想起といった概念がどのように作品に反映されているかを明らかにするものである。この目的を達成するために、文学集団ヴィーナー・グルッペに影響された小説家や詩人、ラディカルな言語実験で知られる作家、戦間期から戦後にかけて人気を博した劇作家のそれぞれの作品を対象にして個々にケーススタディを行い、神話・伝説素材の伝承する集合的記憶の今日的意味を明らかにしつつ新たな解釈を試みた。新規テキストの読解および解釈に予定していたよりも時間がかかっており、一定の公開しうる成果が出るまでにはもう少々の時間を要する。本プロジェクトの主要メンバー二人が、専門とする作家ないしは領域においてテーマに関連する資料や媒体を求めて行った研究旅行によって各自の成果が得られたことが何よりも大きい。ドイツ語圏近現代文学当初予定していた研究対象の絞り込みを行い、その解釈に集中する。そして、引き続きテクスト研究を行う。本プロジェクトの主要メンバー二人が、ヘッベルによる悲劇『ニーベルンゲン』の新たな舞台を渡独の際に鑑賞する機会を得たことによって、本来、平成26年度に行う予定でいたヘッベル作の再作品化の検討のほうを平成25年度に繰り上げて行ったため当初の計画とは異なってしまったが、第2年度に行う予定でいたヘッベル作の再作品化についての検討は行うことができた。また、今年度以降研究を推進するための書籍および資料や機器を購入することができた。研究に必要な文献は大方揃えられた。しかし、今後研究の進捗状況に応じてさらなる文献等の購入の必要性が生じるかもしれないこと、また、それらを分類・整理するための人件費等も必要になることが予想されるなどの理由から、残額を持ち越すこととした。また、平成27年度にドイツから研究者を招聘してのコロキウムの開催を計画しており、その招聘および謝礼金のために平成26年度分の分担金を持ち越すこととした。当初平成25年度に計画していたロマン派の作家フケーによる『北方の英雄』3部作を対象とし、テクスト研究を行う。また、昨年度中に観劇したヘッベルの戯曲についての解釈をテキストと演出の分析をもとに引き続き行う。書籍・資料購入、資料整理、印刷費の補填などに充てる予定。また、上述の通り、開催予定のコロキウムの講師謝礼などに使用する予定。研究に必要な基礎文献は昨年度中にほぼ揃えることができた。しかし、今後研究の進捗に応じて更なる文献購入の必要性が生じることが予想されるため、今年度の書籍・資料購入費を十分なものにするため、残額を持ち越すこととした。書籍・資料購入に充てる予定。
電磁力エアロブレーキングの減速開始高度を制御する新技術の開発

希薄大気中での電磁力ブレーキングにおける電磁力発生機構の解明を目指し、アーク風洞実験とその数値シミュレーションを実施した。これまでの我々の解析的研究において、希薄気流中での電磁力発生には、気流中の絶縁境界の役割が重要であると予想されていた。この予想を実証するため、アーク気流の絶縁境界位置を変化させ、全抗力が受ける影響を調べた。結果として、実験および計算とも、電磁力により全抗力が増加した。また、計算では、絶縁境界が試験模型に近づくことで、大きな電磁力が発生し、前述の解析予想の裏付けを得られた。しかし、実験では、流れが予想よりも濃く、電磁力による抗力増大は、絶縁境界位置に敏感ではなかった。本研究の目的は、高々度希薄領域での電磁力ブレーキングで発生すると予想される臨界高度の物理機構をアーク風洞実験(電磁力測定、トムソン散乱法による電子諸量測定)および粒子計算を用いて解明し、その適用高度を向上させる技術を提案することである。1.アーク風洞実験について希薄プラズマ気流生成用の1kW級のアルゴン作動アークジェットの製作と試運転を行った。また、0.5Tのネオジウム磁石を搭載可能な直径22mmのセラミック製の鈍頭試験模型を製作した。さらに、試験模型の全抗力(空力抵抗と電磁力の合力)および磁石にかかる電磁力の二種類を計測可能な振子式抗力測定装置を製作した。アークジェットおよび抗力測定装置は、問題なく動作したが、真空チャンバーに転倒の危険性があることが発覚したため、本実験はまだ行えていない。現在、チャンバーを改修中であり、次年度の6月から実験を行う予定である。トムソン散乱法については、計測用のYAGレーザー、ICCDカメラ、分光用の光学部品の購入を行った。現在、購入した光学部品を組んで、散乱光取得用のトリプル分光器を自作中である。以上より、本実験のための準備はほぼ終わり、次年度の6月からデータを取得する予定である。2.粒子計算について既存の粒子計算手法では、本研究が対象とする連続流と希薄流の境界領域において、電子に関する諸量の誤差が大きく、電子物理量の定量的評価が難しい。そこで、電子を流体的に取り扱い、さらに電子流体と重粒子(粒子的に取り扱う)間のエネルギー緩和を正確に取り扱えるモデルを開発した。このモデルは、我々が初めて提案したモデルであり、本研究が対象とする希薄流領域(クヌーセン数0.010.1程度)において、電子温度の高精度計算が初めて可能になった。この成果は、3月の衝撃波シンポジウムで発表した。以上により、アーク気流実験を検証可能な粒子コードの開発はほぼ完了した。実験は、希薄プラズマ気流中での電磁力計測に必要な準備が完了した。本実験については、本年度(平成27年度)後半に真空チャンバーに転倒の危険があることがわかり、現在改修中のため、まだ行えていないが、改修が終わり次第(次年度(平成28年度)6月を予定)、すぐにデータを取得できる。また、トムソン散乱法による電子諸量計測は、必要な機器の購入を問題なく終え、散乱光取得用の分光器の自作も順調に行えており、真空チャンバー改修が終わり次第、この計測も開始できる段階にある。粒子計算は、電子諸量を精度よく扱える計算モデルの開発に成功し、アーク気流実験を検証できるコードの開発がほぼ終わり、予想以上に進んでいる。以上より、実験には真空チャンバーのトラブルによる若干の遅れがあるものの、計算が予想以上に進んでいることもあり、全体としては概ね順調に進んでいる。希薄アーク気流中での電磁力発生実験を行い、抗力を測定した。また、電子温度・密度計測のためのレーザートムソン散乱計測系の構築を終えた。1.抗力測定について開発済みのアーク希薄風洞・振子式抗力測定装置を用いて、希薄弱電離プラズマ気流中での電磁力発生実験を行い、試験模型にかかる抗力を測定した。また、数値計算を用いて実験をシミュレートし、実験結果との比較を行った。この実験の目的は、高々度希薄領域での電磁力発生のキー・メカニズムと予想される気流中での絶縁境界の役割「絶縁境界が機体に近づくことで、ホール効果による電流散逸が抑えられ、強いホール電場が発生し、大きな電磁力が得られる」を実証することである。そこで、風洞の背圧を1560 Paの範囲で変化させ、気流境界(絶縁境界)の位置を試験模型に近づけ、発生する抗力の変化を調べた。実験では、どの圧力下でも電磁力により全抗力は20%程度増加した。また、この値は、数値シミュレーションにより予想される値の24倍程度も大きかった。但し、数値計算で予想された、絶縁境界が模型に近づくことで、大きな電磁力が発生する現象は、実験では観測できなかった。この原因は、実験気流が計算で予想されたよりも濃く、希薄効果が顕著でなかったことが予想される。このため、次年度は、気流の流量・放電電流を抑えた実験を行い、さらに試験模型に搭載する磁石を強めて、より希薄効果の顕著な気流での実験を行う。2.レーザートムソン散乱による電子温度・密度計測について試験気流の絶縁境界位置・磁気相互パラメーター・ホールパラメータ・電磁力による電子温度・密度の変化を調べるため、レーザートムソン散乱を行う。本年度は、トリプル分光器の自作・レーザー導入出光学系・散乱光取得光学系の構築を行い、トムソン散乱計測実施のための準備は全て終えた。次年度前半から実験を実施できる予定である。

前年度に発生した真空チャンバーの不具合の改修のため、抗力計測実験の実施が遅れた。その影響を受け、当初予定していたレーザートムソン散乱計測実験を本年度に実施できなかった。しかし、レーザートムソン散乱計測に必要な計測系の構築は、既に完了している。このため、次年度初頭から計測実験を開始し、当初予定していた物理量の計測を前半中に終え、遅れを取り戻すことができる予定である。昨年度までの研究では、アーク希薄風洞を開発し、ネオジウム搭載型試験模型を用いて、抗力測定を実施した。この計測は、「背圧の上昇により気流境界(絶縁境界)が試験模型へ近づくと、ホール効果による電流散逸が抑え込まれ、大きな抗力増大が得られる」との連続流解析予測に基づいて行われた。しかし、磁場印加により大きな抗力増大が得られたものの、予測に反して、絶縁境界位置の依存性は確認できなかった。この原因は、気流が予想以上に濃いため、ホール効果が小さく、電流散逸が弱いためと考えられた。なお、ホール効果を無視した粒子計算解析を行ったところ、抗力増大の実測値がほぼ再現できたことからも、ホール効果が予想よりも弱かった可能性が高い。そこで本年度は、流量を絞って、より希薄な気流状態での試験を試みたが、流量低減はアーク不着火の頻発を招き、定量的な評価を行えなかった。このため、大きい磁石を用いてより強磁場を印加し、ホール効果の影響を強めることを試みることにした。なお、この試験では、トムソン散乱による電子諸量測定には、10分間程度の長時間計測が必要なこと、およびコイルを用いたさらなる強磁場印加も睨み、模型内部を水冷する新設計の模型を開発した。開発した試験模型は、JAXAの750 kW大型アーク風洞を用いた3 MW/cm2の強加熱試験に供され、熱破壊や磁石の熱消磁が起こらないことが確認できた。次に、この模型を使用して、電磁力発生実験を行い、絶縁境界位置の影響の再検証を予定していたが、電磁力発生に必要となるセラミックスカバーが予想外の長納期であったため、試験は来年度行うことになった。また、トムソン散乱による電子諸量計測については、現在試験を実施中であり、上記の抗力計測結果を裏付ける計測結果が得られつつある。以上のように、計画は遅れてはいるが、現在は順調に進んでおり、研究目的を達成できる予定である。希薄大気中での電磁力ブレーキングにおける電磁力発生機構の解明を目指し、アーク風洞実験とその数値シミュレーションを実施した。これまでの我々の解析的研究において、希薄気流中での電磁力発生には、気流中の絶縁境界の役割が重要であると予想されていた。この予想を実証するため、アーク気流の絶縁境界位置を変化させ、全抗力が受ける影響を調べた。結果として、実験および計算とも、電磁力により全抗力が増加した。また、計算では、絶縁境界が試験模型に近づくことで、大きな電磁力が発生し、前述の解析予想の裏付けを得られた。しかし、実験では、流れが予想よりも濃く、電磁力による抗力増大は、絶縁境界位置に敏感ではなかった。アーク気流実験において、真空チャンバーの背圧を制御し、プルーム境界(電気的絶縁境界)を動かして、高々度希薄領域での高度変化を模擬する。
基質特異性の精査によるβ結合二糖類加水分解酵素活性中心のSubsite 研究

起源の異なるβグルコシダーゼのうち、精製が未実施であった、酵素について,すべて電気泳動的に単一にまで精製をすることができた。この結果得られた10種の精製酵素を用いて,加水分解活性,アスコルビン酸への糖転移活性に関する、基質特異性の精査を行ない,同じGHファミリーに属していても、基質特異性の認識の差により,いくつかのグループに細分類できることを明らかにした。さらに,このグループの代表例3種について、酵素反応のKinetics解析も行なった。昆虫ハスモンヨトウガ蛹由来のβ-N-acetylglucosaminidaseについて,PNP-trimethylglucosaminiumがどういう作用を示すか検討したところ,加水分解はほとんどされず,本酵素のPNP-β-N-acetylglucosaminide加水分解反応の阻害剤となることが判明した。その阻害活性は,TMG-chitotriomycinほど強くはないことも明らかにできた。平成27年度の目標のうち,【2-1】起源の異なるGlcaseの糖転移活性、加水分解活性の基質特異性の精査についてはほぼ100%達成でき,【1-1】既存糖質加水分解酵素のPNP-triethylglucosaminium分解活性能の確認はほぼ達成,できていることから、ほぼ順調に進展していると判断できる。糖質加水分解酵素(GH)の一種,βグルコシダーゼのアスコルビン酸(AA)への糖転移活性の詳細検討を行う過程で,起源の異なるβ-グルコシダーゼの糖質加水分解活性及び糖転移活性における糖供与体選択性や配糖化位置選択性が異なることを明らかにしてきたが,その過程で,GHファミリー3に属し,異なる遺伝子にコードされる2種類のβ-グルコシダーゼをPenicillium multicolorに見出し,そのうち102 kDaの酵素PmβGlcase102Kが,加水分解反応及び糖転移反応においてp-nitrophenyl β-D-glucopyranoside (pNPG)やindicanなどの芳香族配糖体に対し高い基質特異性を示す一方,セロオリゴ糖やβ-グルコ二糖を基質として殆ど利用しないことが分かった。さらに、基質濃度を変化させて速度論的研究について詳細に実施したところ、これまで報告のあるβグルコシダーゼと、大きく異なることが確証できた。βグルコシダーゼに関しては、興味深い知見が多く得られており、それをPNP-TMG分解酵素研究に応用可能と考えている。現在PNP-TMG分解酵素の取得に向けて、PNP-TMG資化性菌の取得を開始し、いくつかの菌の取得ができつつあり、最終年度で新規酵素の取得とその解析が可能と考えている。これまでの研究において,Penicillium multicolorが生産するp-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (pNPG)分解酵素として2種類の精製酵素を得ていたが,それらとは異なる基質特異性を示すpNPG分解酵素を本菌株の酵素製剤中に存在することを明らかにし、その酵素を、各種クロマトグラフィーで電気泳動的に単一にまで精製した。精製酵素のN末端アミノ酸配列分析の結果から,本酵素はこれまでに報告のあるGH5に属するβ-ジグリコシダーゼであると判明した。続いて,本酵素の基質特異性を精査したところ,加水分解反応においてはβ-グルコオリゴ糖よりも芳香族配糖体であるpNPGに高い分解活性を示し,L-アスコルビン酸を糖受容体とした糖転移反応においてはpNPGよりもセロビオースを糖供与体としたときの方が高い糖転移活性を示すことが明らかになった。PNP-trimethylglucosaminiumが昆虫由来のGlcNAcaseの阻害剤として作用することが判明したことから、この基質を資化する微生物を発見できれば、新規酵素の発見につながることが大いに期待できる。従って,既存のGlcNAcaseの中に本基質を加水分解できる酵素を引き続き探索するとともに,本基質を資化できる微生物を単離することを試みる。その際には、本基質を用いた集積培養,涵養培養により実験を進める。微生物の資化実験をすでに開始しているが、それを継続することによりPNP-TMG資化性菌取得を達成し、その菌株が保有する酵素を精査していく予定である。生物有機化学,応用微生物学、27年度に予定していた,微生物の資化実験がその他の実験との兼ね合いで実施できず,その実験に必要な試薬類の購入を28年度に持ち越したため。資化性菌取得実験を次年度まで継続し行う際の培地成分の購入を行うため28年度に資化実験を実施する際に購入する。年度始めにに培地などの試薬類を購入する