hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性酸素により生じた変異誘発物質の排除機構

ROSあるいは8-oxoGを生じさせないような新たな変異株の網羅的検索:大腸菌内で活性酸素(ROS)あるいは8-oxoGの生成に関わる遺伝子を網羅的に検索するため、ROSあるいは8-oxoG増加によるmutT欠損株の突然変異の上昇が、目的遺伝子の欠損によって抑制されると想定し、その表現型(突然変異)を指標にして変異株を検出する系を構築した。網羅的欠損株ライブラリーであるKeio clone(3909 clones)を用い、全cloneのmutT geneを1つ1つ、P1 transductionによってCm^r geneに置き換えた二重変異株を作成した。それらの中から自然突然変異頻度がmutT遺伝子欠損導入によっても、なお低い株をリファンピシリン耐性を指標として網羅的に検索した。現在、全部で14個の変異株を分離できたが、そのうち10個はenergy metabolismに関与する遺伝子、残り4個は膜構造に関連する遺伝子におちた。これら14個の遺伝子それぞれについて、現在個別に解析を進めている。その他の研究成果:上記の他にROSにより酸化損傷を受けたRNAに対応する生体防御機構の解析で新たな進展が見られた。8-oxoGを含むRNAオリゴマーをプローブに用い、ヒト細胞抽出液から8-oxoGを特異的に認識し結合する新規のタンパクを同定した。このタンパクは8oxoGを含む1本鎖のRNAおよびDNAオリゴには結合するが、2本鎖DNAには結合しない。また、このタンパクを欠損する変異株は野生株に比べ低濃度の過酸化水素水に対し抵抗性を示した。このことから、このタンパクはアポトーシスを介して、酸化RNA特異的な防御を荷うことが考えられる。これまでの研究で、mutT欠損の影響を増幅する新たなトランスポーター変異株を分離した(J.B.C. 288 32952, 2013)。ことからこのトランスポーターが細胞内ヌクレオチドプール中の酸化ヌクレオチドを積極的に排出するのではないかと考え、平成28年度の研究計画として、細胞のヌクレオチドプール中の酸化ヌクレオチドの定量を、アイソトープとHPLCによる分離法を用いて野生株と変異株(mutT単独株、mutT-msbA(ts)二重変異株、mutT-norM二重変異株、mutT変異-msbA過剰発現株、mutT変異-norM過剰発現株、mutT変異-msbA過剰発現-norM過剰発現株)の計7株で試みた。しかし酸化ヌクレオチドの定量はその量が極めて小さいことより技術的に困難であることが判った。そこで、29年度の研究計画を前倒し、大腸菌の変異株ライブラリーにmutT変異をすべて導入し、mutT変異による自然突然変異を増幅、あるいは抑制する変異がないかをリファンピシリン耐性株の出現頻度をメルクマールに網羅的に検索する計画に移行した。これまでのところ全3,909株のうち1,430株をスクリーニングし(2017年4月段階)、自然突然変異を抑制あるいは増幅していると思われる候補株を数株同定できた。「研究実績の概要」項目で記載した通り、29年度の研究計画を前倒しmutT変異による自然突然変異を増幅、あるいは抑制するものがないかを網羅的に検索し、これまでのところ全3,909株のうち1,430株をスクリーニングし(2017年4月段階)、自然突然変異を抑制あるいは増幅していると思われる候補株を数株同定できた。現状のスピードでも今年度末には全変異株ライブラリーのスクリーニングが完了可能である。ヌクレオチドプール中の酸化ヌクレオチドの定量を、アイソトープを用いて野生株と変異株で試みたが、その量が極めて小さいことより技術的に困難であることが判った。そこで29年度の研究計画を前倒し、網羅的な変異株の構築そしてそれら二重変異株の自然突然変異率の測定を進めてきた。

現在、ほぼ半分をスクリーニングできたが、網羅的検索という労働依存型であるので、今後はさらに1名を加えスクリーニングを行う予定で、秋頃までに全ライブラリーのスクリーニングを完了する。その後は同定された個々の変異がどのようにmutT変異による自然突然変異の上昇をさらに増幅、あるいは抑制するのかを分子レベルで解析する予定である。平成29年度予定の研究を前倒しで遂行中であり、平成28年度中に支出を予定していた分が節約できた。「今後の推進方策」で記載した通り、平成29年度には謝金を予定しているので平成28年度中の節約分をそちらに回したい。
4次元幾何計算の数値的安定化とその応用

本年度の研究実績は次のとおりである.1.今までに本研究で設計・実装してきた4次元凸包の構成アルゴリズムを応用して,3次元の基本的幾何図形のロバストな計算法を構成した.この中には,3次元ドロネー図3次元ラゲールドロネー図,'3次元最遠点ドロネー図,3次元最遠点ラゲールドロネー図,およびこれらの双対である各種3次元ボロノイ図が含まれる.これらのうち,各種ドロネー図は十分なロバスト性が確認できたので,ウェブページを通してソースコードを公開した.2.実装した4次元凸包の計算時間をさらに短縮するために,遅延評価を用いた加速法を再検討した.加速の基本アイデアは,まず浮動小数点方式で計算し,精度が不足だとわかったら多倍長計算に切り替えるという方針である.ここで精度不足か否かをていねいに判定すると多倍長計算は減らせるが,判定に時間がかかる.逆に,粗く判定すると,判定は短時間にできるが,多倍長計算が増えるこの判定の四つのバリエーションを比較・検討し,粗すぎずていねいすぎない判定が最もよいことが確認できた.3.空間に時間軸を加えた4次元空間で結晶成長ボロノイ図を構成する高速近似算法を設計.実装した.これは,偏微分方程式の差分解法を利用したもので,ディジタル画像処理的な手法の組合せで実現できるために,ロバストなソフトウェアが得られた.これを応用して,.悪意をもって邪魔をするロボットの間をかいくぐる障害物回避経路の計算にも成功した.本年度の研究実績は次のとおりである.1.今までに本研究で設計・実装してきた4次元凸包の構成アルゴリズムを応用して,3次元の基本的幾何図形のロバストな計算法を構成した.この中には,3次元ドロネー図3次元ラゲールドロネー図,'3次元最遠点ドロネー図,3次元最遠点ラゲールドロネー図,およびこれらの双対である各種3次元ボロノイ図が含まれる.これらのうち,各種ドロネー図は十分なロバスト性が確認できたので,ウェブページを通してソースコードを公開した.2.実装した4次元凸包の計算時間をさらに短縮するために,遅延評価を用いた加速法を再検討した.加速の基本アイデアは,まず浮動小数点方式で計算し,精度が不足だとわかったら多倍長計算に切り替えるという方針である.ここで精度不足か否かをていねいに判定すると多倍長計算は減らせるが,判定に時間がかかる.逆に,粗く判定すると,判定は短時間にできるが,多倍長計算が増えるこの判定の四つのバリエーションを比較・検討し,粗すぎずていねいすぎない判定が最もよいことが確認できた.3.空間に時間軸を加えた4次元空間で結晶成長ボロノイ図を構成する高速近似算法を設計.実装した.これは,偏微分方程式の差分解法を利用したもので,ディジタル画像処理的な手法の組合せで実現できるために,ロバストなソフトウェアが得られた.これを応用して,.悪意をもって邪魔をするロボットの間をかいくぐる障害物回避経路の計算にも成功した.1. 4次元凸包の理論的に最も高速な構成法である逐次添加法を,有限精度の計算環境で安定して動作するソフトウェアとして実装するために二つの方針を平行して検討した.その第一は位相優先法(位相構造の一貫性を優先させることによって矛盾の発生を防ぐ方法)に基づく実装法で,第二は整数帰着法(すべての判定を整数計算に帰着させて誤差の発生を防ぐ方法)に基づく実装法である.両者の性能を比較した結果,最終的性能では位相優先法の方がすぐれていると予測されるが,実装の容易さまで考慮に入れた場合はまず整数帰着法でソフトウェアを試作すべきであるという結論に達した.そしてその方針でプログラミングを開始した.2.整数帰着法に必要な多倍長計算の高速化を図った.この計算に必要なのは計算結果の値そのものではなくて,その符号であるという点に着目し,剰余計算を利用して単精度計算に帰着させることによって計算時間を短縮する方針を採用し,その有効性を確かめることができた.3. 4次元凸包を3次元空間へ射影することによって四面体格子構造を構成し,それを有限要素法・境界要素法の格子として利用する際の問題点を検討した.この方法で各種の偏微分方程式を解き,その性能を調べることができる.それによって,3次元空間で望ましい格子を得るためには,4次元空間でどのように点を配置して凸包問題を解けばよいかに関する指針を与えるアルゴリズムを構成した.1.昨年度に,4次元凸包の理論的に最も高速な構成法である逐次添加法を,有限精度の計算環境で安定して動作するソフトウェアとして実装するために二つの方針を平行して検討したが,本年度は,その評価結果に基づいて,整数帰着法によるアルゴリズムを実装した.これは,4次元凸包の位相構造の決定のためのすべての判定計算を整数計算に帰着させて誤差と矛盾の発生を防ぐアルゴリズム設計法である.この方法では,入力データに例外的な配置が生じている場合にはそのことも厳密に認識できるため,例外処理が必要となる.この例外処理を回避するために,実装では記号摂動法も組み込んだ.これによって比較的短いプログラムでありながら,どのような入力に対しても安定して動作するシステムができ上がり,計算実験によってもこれを確かめることができた.次年度は,このソフトウェアの高速化をはかる予定である.

2.4次元凸包を3次元空間へ射影することによって四面体格子構造を構成し,それを有限要素法・境界要素法の格子として利用する実験を行ない,3次元空間で望ましい格子を得るためには,4次元空間でどのように点を配置して凸包問題を解けばよいかに関して検討した.特に,(i)一定密度のランダムな点配置,(ii)3次元整数格子点に規則的に置いた点を4次元へもち上げた配置,(iii)代表的結晶構造を真似た配置について得られた四面体メッシュの質を評価した.その結果,結晶構造に基づくものが一般的によいメッシュとなるが,境界形状が複雑な場合には,境界付近でさらに改良が必要であることなどが明らかになった.本年度の研究実績は次のとおりである.1.今までに本研究で設計・実装してきた4次元凸包の構成アルゴリズムを応用して,3次元の基本的幾何図形のロバストな計算法を構成した.この中には,3次元ドロネー図,3次元ラゲールドロネー図,3次元最遠点ドロネー図,3次元最遠点ラゲールドロネー図,およびこれらの双対である各種3次元ボロノイ図が含まれる.これらのうち,各種ドロネー図は十分なロバスト性が確認できたので,ウェブページを通してソースコードを公開した.2.実装した4次元凸包の計算時間をさらに短縮するために,遅延評価を用いた加速法を再検討した.加速の基本アイデアは,まず浮動小数点方式で計算し,精度が不足だとわかったら多倍長計算に切り替えるという方針である.ここで精度不足か否かをていねいに判定すると多倍長計算は減らせるが,判定に時間がかかる.逆に,粗く判定すると,判定は短時間にできるが,多倍長計算が増える.この判定の四つのバリエーションを比較・検討し,粗すぎずていねいすぎない判定が最もよいことが確認できた.3.空間に時間軸を加えた4次元空間で結晶成長ボロノイ図を構成する高速近似算法を設計・実装した.これは,偏微分方程式の差分解法を利用したもので,ディジタル画像処理的な手法の組合せで実現できるために,ロバストなソフトウェアが得られた.これを応用して,悪意をもって邪魔をするロボットの間をかいくぐる障害物回避経路の計算にも成功した.
梁山伯祝英台伝説の文化空間－中国四大伝説の生成と伝播に関する包括的研究

もともと南中国で流行し始めた地方色豊かな梁山伯、祝英台にまつわる伝説・物語が、千年以上の時間をかけて中国を代表する無形文化遺産へと昇格していく過程を解明するため、文献資料、映像・画像資料の体系的な収集と整理、作品の解読と考察、中国での梁祝故事の受容と民間信仰の実態調査を踏まえ、浙江省寧波で発生した物語が全国へ展開していった可能性が高いことを明らかにした。また、物語の主要な舞台が浙江であることから越劇の演目に取り上げられ、1940年代以降、映画作品としての流通し、メディアと権力両方からのバックアップを得て、中国の四大伝説へと変貌を遂げる過程を明らかにした。梁山伯祝英台伝説は、中国の四大伝説乃至四大愛情物語の一つとされるが、本研究では南中国で流行した本来ローカルな梁祝故事が、後に中国を代表する物語(無形文化遺産)に昇格していくプロセスと理由を解明することを目的とする。梁祝故事の歴史的な変遷を解明することによって中国の従来の文学史や演劇史、芸能史の研究に対して歴史の書き直しを迫るだけでなく、中国における「伝統」とされているものの本質を問いなおすとともに、中国の無形・有形の文化遺産の調査や保護、活用に関する問題提起へと発展していく研究となる。本研究課題ではそのための具体的な方途として、平成27年度は、1)文献資料の体系的な収集と整理を行い、『中国戯曲志』、『中国曲芸志』や『梁祝文化大観』などから梁祝故事を抽出し、基本情報のデータベースを作成した。2)現地調査や中国関係の書店を通じて、梁祝故事や各種の愛情故事の演劇、講唱芸能、テレビドラマ作品の映像資料を収集し、謝金を用いて「借妻」、「半把剪刀」などいくつかの関連する作品を電子化し整理した。3)越劇の「梁山泊祝英台」などいくつかの作品について、校注を加えてテキストを整理し、一部を研究協力者とともに訳出した。4)中国における梁祝故事の受容と民間信仰の実態を調査するために、梁祝故事の発祥地の一つとされる浙江省の寧波市を訪れ、関連する高橋鎮や咸祥鎮の寺廟などにおいて史跡や旧正月に上演される演劇の実地調査を行った。本務校の業務と旧正月の日程の関係で、予定していた浙江省の3つの調査地点のうち、寧波でしか調査が出来なかったが、現地調査は今後挽回が可能である。校訂・解読作業については、当初、年代の古い『同窗記』から着手する予定であったが、方言を解する研究協力者の協力が平成27年度後半から得られることになったため、近代の脚本から校訂・解読することに変更した。調査項目が若干入れ替わってはいるものの、研究計画全体から見れば問題無く、順調に進展していると判断できる。本研究課題ではもともと南中国で流行し始めた地方色豊かな梁山泊祝英台の二人にまつわる伝説・物語が、千年以上の時間をかけて中国を代表する物語(中国の無形文化遺産)へと昇格していくプロセスと理由を解明することを目的としている。梁祝物語の歴史的な変遷を解明することによって、中国の従来の文学史や演劇史、芸能史の研究に対して新たな知見を提示し、中国における「伝統」とされているものの本質を問いなおすとともに、中国の無形・有形の文化遺産の調査や保護、活用に関する問題提起にもつながる研究となる。本研究課題ではこれを実現するための具体的な方途として平成28年度は、1)文献資料の体系的な収集と整理前年度に引き続き、中国の中山大学古文献研究所などと協力しながら梁祝故事を含む俗文学の文献資料を調査し、ジャンル・演目・上演地点などの基本情報を整理して電子化した。2)映像資料の体系的な収集と整理中国へ現地調査に赴き、映像資料(DVD・VCD)を収集し、基本情報を整理して伝統芸能映像資料データベースの充実化をはかった。3)作品(文献・映像)の解読と考察研究協力者の施盛凱氏の協力を得て関連する中国の地方劇・甬劇の整理を進め、「借妻」などの校注、翻訳を作成した。4)中国での梁祝故事の受容と民間信仰の実態調査梁祝故事の発祥地とされる江蘇省の宜興、浙江省の杭州、上虞で梁祝遺跡の現地調査を実施し、梁祝信仰や伝承、物語について先行研究(周静書1999、渡邊明次2006)や地元の人間の口碑を照らし合わせ、遺跡の現状や変化について検証した。5)まとめと成果発表1成果の一部を上田望「「梁山伯と祝英台」物語の文化空間」(西村聡編『言語文化の越境、接触による変容と普遍性に関する比較研究』、金沢大学人間社会学域人文学類、2017年1月、pp45-54)として公表した。おおむね順調に進展している。平成27年度に実施できなかった浙江省の調査地点に加え、平成28年度は江蘇省の調査地点を踏査したが、河南省の汝南、山東省の諸城については平成29年度に調査を完了する予定である。校訂・解読作業については、選択した作品に若干入れ替わりがあるが、研究計画全体から見れば大きな問題無く、順調に進展している。

本研究課題ではもともと南中国で流行し始めた地方色豊かな梁山伯、祝英台にまつわる伝説・物語が、千年以上の時間をかけて中国を代表する物語、そして無形文化遺産へと昇格していく過程と理由を解明することを主たる目的としていたが、三年間の研究期間でほぼ所期の目的を達成することができたと考える。1.文献資料、映像・画像資料の体系的な収集と整理中国の中山大学古文献研究所、北京師範大学、国会図書館などで梁祝故事を含む俗文学の文献資料を調査し、ジャンル・演目・上演(口述)地点などの基本情報を整理して電子化した。また、北京、上海、広州、寧波において映像資料(DVD・VCD)を購入・収集し、基本情報を整理して伝統芸能映像資料データベースの充実化をはかった。また写真などの画像資料についても整理を進め、金沢大学総合基盤メディアセンターの協力の下、横断検索が可能なデータベースを構築した。2.作品の解読と考察、中国での梁祝故事の受容と民間信仰の実態調査研究協力者の施盛凱氏の協力を得て関連する中国の地方劇・甬劇の整理を進め、「借妻」の校注、翻訳を作成した。また、梁祝故事の発祥地とされる江蘇省の宜興、浙江省の杭州、上虞で梁祝遺跡の現地調査を実施し、梁祝信仰や伝承、物語について先行研究(周静書1999、渡邊明次2006)や地元の人間の口碑を照らし合わせ、遺跡の現状や変化について検証した。3.まとめ収集した文献資料や映像資料を総合的に分析し、広範囲にわたる物語の異同から、浙江省寧波で発生した物語が全国へ展開していった可能性が高いことが確かめられた。また、物語の主要な舞台が浙江であることから越劇の演目に取り上げられ、1940年代以降、映画作品としての流通と中国共産党のお墨付きというメディアと権力両方からのバックアップを得たことで、一気に中国の四大伝説へと変貌を遂げる過程を明らかにした。もともと南中国で流行し始めた地方色豊かな梁山伯、祝英台にまつわる伝説・物語が、千年以上の時間をかけて中国を代表する無形文化遺産へと昇格していく過程を解明するため、文献資料、映像・画像資料の体系的な収集と整理、作品の解読と考察、中国での梁祝故事の受容と民間信仰の実態調査を踏まえ、浙江省寧波で発生した物語が全国へ展開していった可能性が高いことを明らかにした。また、物語の主要な舞台が浙江であることから越劇の演目に取り上げられ、1940年代以降、映画作品としての流通し、メディアと権力両方からのバックアップを得て、中国の四大伝説へと変貌を遂げる過程を明らかにした。平成28年度は前年度に引き続き、文献資料の体系的な収集と整理、映像資料の体系的な収集と整理、作品(文献・映像)の解読と考察を進めていく点は同じである。現地調査については、調査地域を拡大し梁祝故事の発祥地とされる河南省の汝南、山東省の諸城・微山、江蘇省の宜興の4地点について夏と冬に二度の現地調査を実施する計画である。またその研究成果の一部を日本国内で開催される国際学会で発表する予定である。最終年度にあたる平成29年度は残された2省の現地調査に加え、文献資料と映像資料の整理と統計処理、作品(文献・映像)の解読と分析の結果を総合して梁祝故事の伝播分布地図を作成し、故事の伝播した地域を確定する作業を行う。成果の発表については、1梁祝故事の代表的な戯曲作品を選び原文と注釈、日本語訳文を付し、報告書『梁祝故事戯曲選』として公表する。2本研究で収集整理したデータを、金沢大学の中国伝統芸能映像資料データベースを通じて情報発信する。3中国の梁祝故事の研究者の協力も得つつ本研究を総括し、最終報告書『梁山伯祝英台伝説の文化空間』を完成させ公刊する。中国文学平成28年度に二度予定していた中国での現地調査のうち、第2回目については中国広州の中山大学から大量の俗文学に関する資料収集について便宜を図って貰えることになったことから急遽調査地を河南・山東から広州に変更したために旅費で次年度使用額が生じた。平成29年度に河南・山東の二地点の遺跡を調査することで執行する。
海底漏出気泡サイズの数式モデル開発

海底でCCSを行うにあたり、圧入したCO2の漏えいによる周辺生物への影響が心配されている。気泡サイズは海中の気泡上昇速度や気体の海水への溶解速度に大きく関わるため、海水への環境影響にとって重要なパラメータとなる。そこで様々な砂を底部に詰めた縦長の水槽を用い、底部から気体を注入して、堆積物上層から水中に漏出する際の気泡サイズを計測した。また気固液三層流の数値計算法には格子ボルツマン法を用い、流体が粒子に与える力を計算して運動方程式を直接解き、さらに粒子同士の衝突を扱うことのできるアルゴリズムを開発した.海底でCCSを行うにあたり,圧入したCO2の漏えいによる周辺生物への影響が心配されている.気泡サイズは海中の上昇速度や溶解に大きく関わるため,海水への環境影響にとって重要なパラメータとなる.そこで本研究では,砂堆積物から放出される気泡サイズを計測し,気泡サイズの決定メカニズムについて考察した.実験には外径10cm×10cm,内径9cm×9cmで高さ138cmの水槽を用いた.まず水槽内に砂をいれ上から水を注ぎ,水槽の下部から乾燥させた空気を圧入し,砂表面から出てくる気泡をCCDカメラで撮影した.流量は100,200,300,400,500ml/minの5段階とし,各ケースについて50300個の気泡についてサイズを計測した.砂は全て1.0kgずつ用意し砂の高さを8.1(±0.5)cm,砂表面からの水の高さを92(±0.5)cmとした.実験には細砂(粒3000μm),珪砂(粒径751200μm),豊浦砂(粒径300μm),苫小牧の海底砂の4種類を用意し,ふるいを用いて粒径分布の異なるいくつかの試料に分けた.その結果、砂の粒径の小さい豊浦砂や細砂(小)を使用したときは大きい気泡が多くなり,逆に細砂(大)や苫小牧の砂など粒径が大きい砂で比較的小さい気泡が出ていることがわかった.数値計算法には格子ボルツマン法を用いた.また気固液三層流のシミュレーションを行うにあたり、流体が粒子に与える力を計算し、運動方程式を直接解くことで粒子の動きを考える.粒子同士の衝突および粒子と壁面の衝突が起きる.粒子同士および粒子と壁面の衝突の過程としては、(1)運動方程式による粒子の移動と位置の記憶,(2)衝突の有無の判定,(3)一番目に衝突するものの選定,(4)衝突後の位置への移動といった手順で、1タイムステップ内に複数粒子と衝突することも扱えるアルゴリズムを開発した.海底でCCSを行うにあたり、圧入したCO2の漏えいによる周辺生物への影響が心配されている。また気固液三層流の数値計算法には格子ボルツマン法を用い、流体が粒子に与える力を計算して運動方程式を直接解き、さらに粒子同士の衝突を扱うことのできるアルゴリズムを開発した.海底でCCSを行うにあたり,圧入したCO2の漏えいによる周辺生物への影響が心配されている.気泡サイズは海中の上昇速度や溶解に大きく関わるため,海水への環境影響にとって重要なパラメータとなる.そこで本研究では,砂堆積物から放出される気泡サイズを計測し,気泡サイズの決定メカニズムについて考察した.実験には外径10cm×10cm,内径9cm×9cmで高さ138cmの水槽を用いた.まず水槽内に砂をいれ上から水を注ぐ.そして水槽の下部から乾燥させた空気を圧入し,砂表面から出てくる気泡をCCDカメラで撮影した.画像粒子性状解析ソフトを用いて写真から気泡の最大径2×aと最少径2×bを求め気泡を回転楕円体と見なして気泡の体積を求め,求まった体積を球体を仮定してその直径を求める.流量は100,200,300,400,500ml/minの5段階とし,各ケースについて50300個の気泡についてサイズを計測した.砂は全て1.0kgずつ用意し砂の高さを8.1(±0.5)cm,砂表面からの水の高さを92(±0.5)cmとした.実験には細砂(粒径3000μm),珪砂(粒径751200μm),豊浦砂(粒径300μm),また実際の苫小牧の海底砂の4種類を用意し,さらにふるいを用いて粒径分布の異なるいくつかの試料に分けた).その結果、砂の粒径の小さい豊浦砂や細砂(小)を使用したときは大きい気泡が多くなり,逆に細砂(大)や苫小牧の砂など粒径が大きい砂で比較的小さい気泡が出ていることがわかった.物理場を決定するパラメータを求め、これを変化させることができる条件になるべく、実験材料を準備し、また高さ2m程度のアクリル製の水槽を製作した。水槽の底にガラスビーズ、あるいは粒子径分布のわかっている砂を敷きつめ、その下のチャンバーに気体を注入し、砂層表面から水中に漏出する気泡系を画像処理によって計測した。同時に、マイクロスケールの気液二相流格子ボルツマン法を改造し、砂層あるいはガラスビーズ層から漏出する気泡径を解析する数値解析法を開発した。全て予定通り順調に進んだ。

最終年度の2年目となる25年度は、予定通り、24年度に開発した数値計算コードを用いてシミュレーションを行う。上記実験により数値計算結果を検証することができれば、その後、さらにパラメータを変化させたい場合は、この検証済みの計算コードによって数値シミュレーションすることでケース数を増やして気泡径に関するデータベースを構築する。最終的にこのデータベースから、海底漏出気泡サイズに関して、バッキンガムのπ定理に従った複数の無次元数を使った数式モデルを作成する。マイクロスケールの砂層中気固液三相流数値解析コードを用いた計算の高速化のため、GPU計算機を購入する。またGPU計算機で効率よい計算を実現するため、上記コード(プログラム)をGPU用に変更する。これは外注とする。計算の実施には修士学生をバイトで雇用するため、謝金を計上する。また研究成果発表のため、学会参加費と旅費を計上する。
遺伝子発現から見た血圧調節ホルモン量の運動後回復過程とトレーニング効果

血圧調節ホルモンについて運動回復過程を分析し、正常血圧群では血中ANP濃度が運動直後上昇し、右心房含量が低下のした。高血圧群ではbasalの血中ANP濃度は高いが、運動直後は低下し、心臓含量には有意な変化が見られなかった。mRNAについては明確な結果が得られなかったので引き続き分析を行っている。本研究は運動時に重要な循環系調節を行うANP,BNPの遺伝子発現を近年開発され普及しているリアルタイムPCR法を主として利用して運動回復期の遺伝子発現を定量的に研究するものである。運動の回復期の遺伝子発現調節(合成速度)の理解が深まれば、競技指向でも健康志向でもトレーニング頻度(つまり休息期の時間)を合理的に決定することができるようになる。また、トレーニング効果発現の原理を示す一つのモデルとなる。平成21年度は基礎的な実験を行った。8週齢のウイスター系雄ラットを購入し、大型バケツを用いて35度の水中でラットに30分、または3時間の水泳を行わせた。その直後および24時間後に麻酔下で開腹し、心臓から採血した。その後心臓を摘出し、心臓から右心房、左心房、右心室を切り分けた。これらを液体窒素で冷凍し-80度で冷凍保存した。血液は遠心分離し血漿を-80度で冷凍保存した。これらは一括して測定に用いた。ANP,BNPの測定ではまず採取した組織を5分間ボイルし、分解酵素を失活させた。その後ポリトロンあるいはバイオマッシャーを用いてホモジナイズし、上清を採取した。これらからSepPak C18を用い、ANP、BNPを抽出した後、これらの濃度を放射免疫測定法(RIA),または酵素免疫測定法(EIA)によって測定を行った。ANPmRNA、BNPmRNAの測定では採取した右心房、左心房、右心室、左心室から一部を切りとり-80度で冷凍保存した。その後核酸抽出用セパゾールを用いてRNAを抽出した。RNAからcDNAを作り、その後リアルタイムPCR法によってANPmRNA、BNPmRNAを測定を行った。現在引き続き測定を行っている。本研究は運動時に重要な循環系調節を行うANP,BNPの遺伝子発現を近年開発され普及しているリアルタイムPCR測定装置によるRT-PCR法を主として利用してmRNAを定量的に測定するとともに実際に合成されたANP,BNPを酵素免疫測定法や放射免疫測定法を用いて測定することにより、運動回復期の遺伝子発現を定量的に研究するものである。現在高血圧患者に運動療法も行われていることから、高血圧ラットも用いて、高血圧時の運動についてのデータも取得することを計画しているのであるが、平成22年度はまず正常血圧ラットについて運動時間とANP,BNPの分泌の関係を検討するためウイスター系雄ラットを用いて、30分あるいは3時間の水泳をおこなわせた。その運動直後、および24時間後にラットを麻酔し採血および心臓を摘出した。これらの検体を冷凍保存後、血中のANP,BNP濃度、心臓の各部位(右心房、左心房、右心室、左心室)のこれらホルモンの含量を酵素免疫測定法や放射免疫測定法により定量した。また心臓の各部位からRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCR法によりANPmRNA,BNPmRNAを測定した。現在、この測定を引き続き行っており、データがまとまった段階で日本運動生理学会、日本体力医学会での学会発表、またこれらの学会誌に投稿する予定である。現在高血圧患者に運動療法も行われていることから、高血圧ラットも用いて、高血圧時の運動についてのデータも取得すること目的に平成23年度は実験を行い運動時間とANP,BNPの分泌の関係を検討した。高血圧ラットを用いて、3時間の水泳をおこなわせた。また心臓の各部位からRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCR法によりANPmRNA,BNPmRNAを測定している。これらのデータにより、運動中のANP,BNPの分泌部位に関する知見が得られ、今後の研究を進めるためのターゲットが明らかになる。

現在、この測定を引き続き行っており、データがまとまった段階で日本運動生理学会、日本体力医学会での学会発表、またこれらの学会誌に投稿する予定である。
ゼブラフィッシュ背側決定における微小管依存性背側決定因子輸送機構の解明

生物の発生過程において、各機関の配置、向きを規定する体軸の決定は非常に重要である。モデル生物ゼブラフィッシュの背腹軸決定機構は、過去の研究から受精直後に決定することが明らかとされている。さらなる研究の結果、背側構造を誘導し背腹軸を決定する背側決定因子が受精卵の卵黄植物極に局在しており、その因子によりcononical wnt pathwayが活性化されて背側特異的遺伝子が誘導されることがわかった。近年の報告から、wntファミリープロテイン、Wnt8aがその母性発現における植物極への局在と背側特異的遺遺伝子の発現誘導機能から背側決定因子であると広く認識されるようになった。しかしwnt8a機能欠損変異は致死性であるため、実際に母性にwnt8aの機能を欠損させた場合の背腹形成への影響は不明であった。当研究では生殖腺移植技術を用いてWnt8aを母性に欠損した変異体を作り出すことに成功した。その表現型を観察したところ、従来の予想とは異なりwnt8aの母性欠損は背腹軸へ影響しなかった。このことは背側決定因子として広く信じられてきたwnt8aが背腹軸に影響しない、もしくは同等の機能を持つ因子が存在するため背腹軸形成にとって必須ではないことを意味する。これは従来の背腹発生のモデルを覆し得る新たな知見である。今後wnt8aに代わる背側決定因子の探索を改めて行うことで、ゼブラフィッシュ背腹軸形成機構の解明を進めていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。当研究では27年度において、ゼブラフィッシュの初期発生における背腹軸形成の分子機構について調査した。過去の研究から、背腹軸形成には発生における主要なシグナル因子Wntの一種であるWnt8aが背腹軸決定因子として機能することが示唆されている。しかしwnt8a欠損が致死性を示すこと、またWnt8aを認識する抗体が開発されていないことから、Wnt8aの機能及び動態は明らかとなっていない。背側決定因子Wnt8aの発現を母性に欠損させた場合の背腹軸への影響を調査するため、wnt8a欠損変異をheteroにもつ個体同士を交配し、生まれた変異ホモ胚を用いてGermline Replacement法を行った。この技法は変異胚から将来生殖腺へと分化する細胞を取り出し、正常な胚へと移植することで、生殖腺が遺伝的に変異胚由来のキメラ胚を作製する技術であり、このキメラ個体からは変異胚由来の卵を得ることができる。この技術により、本来致死性変異であるため観察できなかったwnt8a遺伝子を母性に欠損した卵を産むキメラ個体を作成した。今回作成した母性wnt8a欠損卵の調査で長く不明であったwnt8aの初期発生における機能が明らかになることが期待できる。Wnt8aの局在解析に向け、タグ付きWnt8a発現トランスジェニック系統を用いた、タグ付きWnt8a発現系統の作成も行った。27年度にこの系統の作製に成功しており、タグ付きWnt8a発現は野生型Wnt8a発現と同じ表現型を示すことを確認している。この系統を用いることで、Wnt8aの動態が明らかになることが期待できる。研究の大きな目的の一つであった、wnt8aの機能の解析に不可欠な、wnt8a機能欠損変異ホモの卵を産むキメラ個体の作製に成功した。現在生まれた卵の表現型を解析中である。同時に発生初期におけるWnt8aの局在を調べるため、Wnt8aにタグペプチドを付加したトランスジェニック系統の開発も行った。Wnt8aは現在まで有効な抗体の開発がなされておらず、生体中での局在解析が不可能である。そのため、Wnt8aの局在解析にはタグ付きWnt8aを発現する系統の開発が必要である。27年度中に、タグ付きWnt8a発現系統の開発を完了しており、またこのWnt8aが野生型Wnt8aと同じ機能を保持していることをmRNA injectionによる表現型解析から確認している。今後初期胚中でのWnt8aの局在をこの系統を用いて解析していく。これらの解析によりwnt8aが初期発生においてどのように機能しているか、28年度に詳細に解析する。

このことは背側決定因子として広く信じられてきたwnt8aが背腹軸に影響しない、もしくは同等の機能を持つ因子が存在するため背腹軸形成にとって必須ではないことを意味する。これは従来の背腹発生のモデルを覆し得る新たな知見である。今後wnt8aに代わる背側決定因子の探索を改めて行うことで、ゼブラフィッシュ背腹軸形成機構の解明を進めていく。27年度にwnt8a母性欠損変異卵を産むキメラ個体、及びタグ付きWnt8aを発現するトランスジェニック系統を作製した。これらを用いて、Wnt8a欠損の影響、及びWnt8a局在を解析することでwnt8aの機能を解析していく。さらに、当研究室では微小管を可視化したトランスジェニック系統を過去に開発している。この系統と背腹軸に異常がある変異体を掛け合わせたり、このトランスジェニック系統の胚に対して背腹軸に異常を引き起こすことが分かっている薬品で処理したりした場合の植物極微小管への影響をlive imagingで解析し、植物極微小管に関係する分子の調査を行う。現在までに、背腹軸欠損変異体hecateやカルシウムシグナル抑制剤Thapsigargin処理胚において、植物極微小管が短いままで一方向への伸長が観察されなくなることをlive imagingで確認しており、同様の手法で植物極微小管に異常のある変異体及び試薬を解析することで植物極微小管の分子メカニズム解明を目指す。さらに、Wnt8aは分泌タンパク質であることから、その輸送には膜輸送がかかわることが予想されている。Wntの輸送タンパク質として知られている膜貫通タンパク質をコードするwntlessが1細胞期の胚中で発現していることを過去に確認しており、WntlessがWnt8a輸送に機能する可能性が示唆されている。wntless欠損も致死性であることから、wntlessを任意の時期に発現するトランスジェニック系統を開発し、wntless欠損をrescueすることで成魚まで生存するwntless欠損変異体を作成することを計画している。wntlessを母性に欠損した胚を手に入れ、背腹軸、Wnt8a局在に影響が出ているか調査する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
「1945年前後」「1949年前後」の台湾映画統制に関する基礎研究

隣接領域の研究者を招聘し、以下3回のワークショップを実施した。12018年9月1日(土)「変容する現代中国と映画の実践」場所:日大文理学部、報告者と報告題目:阿部範之(同志社大学)「中華人民共和国の映画産業と政治的画期ー社会主義化、改革開放、WTO加盟」、佐藤賢(明海大学)「中国独立ドキュメンタリーの歴史と現在ー80年代、90年代、ゼロ年代以降」22018年10月28日(日)「映像における「過去」表象ーA.バザンとA.クルーゲ」、場所:日大文理学部、報告者と報告題目:竹峰義和(東京大学)「廃墟としての過去ーアレクサンダー・クルーゲの映像作品における歴史表象」、大久保清朗(山形大学)「死を復元するということーアンドレ・バザンにおけるドキュメンタリー映画論について」32018年11月11日(日)「日台関係の連続と不連続(19401970年代)」場所:日大文理学部、報告者と報告題目:林果顕(台湾・政治大学)「戦後台湾における日本出版物の輸入政策及び日本との交渉(1945-1972)」、菅野敦志(名桜大学)「1940年と1964年の〈東京オリンピック〉と台湾人選手」以上により、本研究課題を推進する上で具体的な資料情報および方法論上の示唆を得た。さらに、「戒厳令解除」前後の連続と不連続についても研究の射程を伸ばすことで、「1945年/1949年」前後の特徴を捉えることができるのではないか、という着想から、移行期の変化が最もよく反映されたと思われるドキュメンタリー映画の監督3名に試験的にインタビューを実施し、雑誌上で成果を公開した。また、「1945年/1949年」前後に関する論文2編が英語論文集の2つの章という形式で刊行され、戒厳時期映画統制の典型事例たる国歌フィルムに関する論文の中国語版がウェブジャーナルに掲載された。病気療養から復帰することはできたが、長距離出張や長時間調査には不便があるため、当初予定していたマルチ・アーカイブ方式による実証的な手法は使いにくい状況にある。他方、昨年度予定していながら実施できなかった隣接領域の研究者を招聘してのワークショップは、計3回(招聘した研究者は計6人、うち海外からの招聘者1人)実施することで、新たな研究成果や方法論から多くを学ぶことができた。そこで得た知見をもとに、必ずしもアーカイブに依らないデータの活用、インタビューやコンテンツの内容分析、人物研究といった方法で、別の角度から本研究課題にアプローチできるのではないかという手がかりを得た。昨年度の病気療養による遅れは完全に取り戻せたとは言い難いが、新たな視角や方法論上の示唆を得たことにより、研究課題を一定前に進めることができた。インタビューや内容分析、人物研究など新たな手法を取り入れることで、本研究課題に別の角度からアプローチすることを試みたい。すなわち、「1945年/1949年」、「中国大陸/台湾」を時間的空間的に跨いだ映画人や映画作品に着目する。具体的には、台湾台中出身で重慶で抗日映画監督としてデビューし1949年以後も大陸にとどまったが、後に国民党や台湾、日本とのつながりを問題視され反革命の罪で逮捕弾圧された何非光(1913-1997年)、中国厦門出身で1949年以後国民党による映画機関の接収責任者として来台したが、後に共産党スパイとして逮捕処刑された白克(1914-1964年)の事例に着目する。両者は「1945年/1949年」「中国大陸/台湾」を交差する形で鏡像のような関係をもっており、異なる時空間における映画統制の連続と不連続を統制の対象となる映画人の側から考察する上で有意な事例であると思われる。同様に、統制の対象となる映画作品に関しては、抗戦勝利後中国における最大のヒット作『一江春水向東流』の中国大陸版(1947年、蔡楚生・鄭君里監督)とその数年後に製作された台湾版(1965年、張英監督)に着目する。両作品もまた「1945年/1949年」「中国大陸/台湾」を交差する鏡像のような関係にある。以上のような人物研究や内容分析というアプローチをとることで、これまで主としてアーカイブ資料を使用してきた本研究課題において、公文書では光の当たりにくい映画統制の連続と不連続について新たに考察が可能になるのではないかと考えている。平成27年度は研究会3回と国外調査1回を実施した。概要は以下の通りである。1)研究会:12015年7月13日(月)ステファン・コルキュフ氏(リヨン東アジア研究所)講演「多元的なナショナル・アイデンティティフィケーションから地政学的な境界性へ」。22015年10月3日(土)「中国語圏映画史研究の最前線」ワークショップとして以下3名の報告を得た。蓋暁星(東京大学大学院博士後期課程)「日本における中国映画『青い凧』の受容」、黄耀進(早稲田大学非常勤講師)「見るものと見られるものー映像における帝国「視点」の形成とその転換(日本内地から植民地台湾まで)」、趙斉(東京大学大学院博士後期課程)「香港映画にみる中華伝統建築イメージの創出ー1960年代ショウ・ブラザーズの歴史映画を例に」。同時に、以下2名のコメンテーターを含めた議論を行った。劉文兵(東京大学総合文化研究科学術研究員)、大黒岳彦(明治大学情報コミュニケーション学部)。

32015年12月12日(土)「政治的画期の前後を考えるー日本とチベットの場合」と題して、以下2名の報告を得た。高岡裕之(関西学院大学)「昭和期日本の文化運動と大衆文化ーその戦前と戦後」、大川謙作(日本大学)「チベット史における1950年代の意味:「改革」と「解放」の語りから」。同時に以下2名のコメンテーターを含めた議論を行った。村上大輔(早稲田大学)、古川隆久(日本大学)。2)調査:2015年9月6日12日、台湾の国史館、国家図書館、国家電影中心における档案および映像資料調査を実施した。3度の研究会を通じて、本研究を推進するための新たな視角と知見を得ることができた。調査では、予定される研究時期・研究対象のうち、19491953年の省政府・国民党政権中央に関する部分の基礎調査を実施することができた。平成27年度に当初予定していた研究時期・研究対象は19451947年台湾行政長官公署及び19471949年台湾省政府の映画統制政策及び実施状況であったが、調査中に判明した「反共抗ソ総動員運動」と映画統制との強い関連を示す資料に着目し、蒋介石のリーダーシップによる大陸時期と台湾撤退後の映画統制に関する連続性について、先行して調査を実施した。当初計画にあった時期と対象が後回しになったという意味では進捗にやや遅れが見られるが、当初計画時には想定されていなかった事実関係を発見することでき、蒋介石の関与による1945年前後、1949年前後の映画統制における連続性という新たな視角を得たという意味で、研究全体としてはおおむね順調に進展していると言える。海外調査と国内ワークショップを各1回、海外での成果報告と国内講演会を各2回、実施した。概要は以下のとおりである。1.海外調査:8月6-17日、台湾の国家図書館・国立台南芸術大学・国家電影中心・国史館の各所にて資料調査を実施した。3.国内ワークショップ:9月23日、日本大学文理学部、ワークショップ「植民地期台湾映画フィルムの研究ーアニメーション史や音楽学の視点で考える」。報告者:とちぎあきら(フィルムセンター主任研究員)「フィルム・アーキビストは台湾で見つかった戦前日本アニメーション映画をどう見たか」、劉麟玉(奈良教育大学)「国策映画の音楽学的分析『南進台湾』」、葛西周(東京芸術大学)「植民地期台湾の文化映画における音楽ー『全台湾』を中心に」。コメンテーター:西村正男(関西学院大学)、町田祐一(日本大学)、宮川渉(明治大学)。4.国内講演会:5月30日、日本大学文理学部4号館412教室、アルノ・ナンタ氏(フランス国立科学研究センター研究員)講演「フランスにおける植民地主義とプロパガンダ」。10月13日、日本大学文理学部本館1階B会議室、水野直樹氏(京都大学名誉教授)講演「戦時プロパガンダ『望楼の決死隊』をめぐってー朝鮮映画との交錯を読み解く」、同事前学習会10月12日。平成28年度は、19451947年の中国における国民党政権中央およびその映画統制政策と実施状況に関する史料を収集調査分析するのが研究計画申請時の予定であったが、前年度に明らかになった「反共抗ソ総動員運動」と映画統制との関係について、さらに研究を深化させることを優先した。当初予定とは異なる展開となったが、蒋介石の映画統制への関与という新たな視点で、1945年前後・1949年前後の連続性を明らかにすることができた。
HTLV-1ぶどう膜炎患者前房浸出細胞におけるサイトカイン遺伝子発現の解析

現在までヒトT細胞性白血病ウイルス1型(HTLV-1)ぶどう膜炎(HU)の発症機構の解析を目的に、患者臨床検体を用いて分子生物学的研究を行ってきた。ぶどう膜炎の発症には種々のサイトカインが関与していることが多数報告されている。またHU患者の前房浸出細胞から樹立したHTLV-1感染T細胞クローンにおいて、種々のサイトカインが構成的に発現していることを共同研究者が明らかにした。そこで我々はHU患者の眼炎症局所の浸出細胞におけるサイトカインの発現とその調節を明らかにすることを目的に、新鮮前房浸出細胞および末梢血単核球におけるサイトカイン遺伝子発現をRT-PCR法を用いて解析し、前房浸出細胞のサイトカイン発現の特徴を明らかにした。その結果前房浸出細胞においては、IL-6mRNAの発現が大多数の患者で検出されたが、IL-1α、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-αの発現は検出されなかった。一方HU患者の末梢血単核球においては、IL-1α、IL-6、IFN-γおよびTNF-αの構成的発現が検出された。これはHTLV-1無症候性キャリアにも共通する特徴であったが、HU患者ではIL-6の発現が高い傾向が明らかになった。また、このようなサイトカイン発現パターンは、前房浸出細胞由来HTLV-1感染T細胞クローンと一致するものであった。以上の結果から、末梢血およびT細胞クローンにおけるサイトカイン発現様式はHTLV-1感染によるものと考えられたが、眼内の浸出細胞では、サイトカイン遺伝子発現が抑制されていることが示唆された。現在この免疫抑制機構に関する解析を進めている。
ヒトIAP遺伝子の単離とヒト腫瘍との関連

ヒトを含むすべての脊椎動物は、親から子へ垂直伝達される内在性のレトロウイルス遺伝子を持っている。しかしながら、ヒトにおける内在性レトロウイルス遺伝子の、種類・構造・類縁関係や、腫瘍との因果関係については不明な点が多い。マウス・ハムスターなどのゲッ歯目動物の染色体上に多数存在している小胞内A粒子(IAP)遺伝子は、A型の内在性レトロウイルス遺伝子で、トランスポゾンのようにinsertion mutagenとして、細胞癌遺伝子を活性化できることが示された。したがって、内在性レトロウイルス遺伝子は細胞癌化に関与している可能性がある。われわれは一昨年、ハムスターIAP遺伝子の全塩基配列(7951bp)を決定した。その結果、IAP遺伝子はB型・D型レトロウイルす遺伝子により近い内在性レトロウイルス遺伝子であることを明らかにするとともに、逆転写酵素(pol)をコードする領域は、レトロウイルス間でよく保存されていることを確認した。この経験をもとに、ハムスターIAP遺伝子のpolをプローブにして、ヒトDNA中にIAP遺伝子に似た遺伝子を見い出すことができた。そこで、これらの遺伝子とヒト癌との関連を明らかにする第一歩としてクローニングを行なった。その結果、これらの遺伝子はその両端に約970bpのLTRを持つ全長約9kbの遺伝子で、正常人のDNA中にパプロイドゲノム当たり50コピー存在しており、IAP(A型)遺伝子のみならず、MMTV(B型)遺伝子にもよく似ていることを明らかにした。そして、推定されるプライマーtRNAがリジン(K)tRNAであったことから、これらの遺伝子をHERV-K遺伝子と命名した。現在、HERV-K遺伝子の全塩基配列を決定するとともに、ヒト癌に特異的なHERV-K遺伝子の発現・転移・増幅を調べることにより、ヒト癌との因果関係を明かにする研究を進行させている。
原発性免疫不全症における遺伝子変異の修復による自己細胞再生療法の開発

我々はBTK遺伝子のexon6-19とその隣接遺伝子TIMM8Aを含むゲノム領域、およびGFP、ハイグロマイシン耐性遺伝子を搭載したHD-Ad.AAV.BTKベクターを作製した。このベクターを感染させた臍帯血由来CD34陽性細胞から755個のハイグロマイシン耐性赤芽球コロニーを得て、そのうち4個のコロニーでBTK遺伝子座における相同組み換えを認めた。同様に感染させたCD34陽性細胞から分化誘導したCD19陽性細胞においても相同組み換えを検出した。本ベクターにより造血幹細胞における相同組み換えによるBTK遺伝子の変異修復を行える可能性を示した。正常ヒト男性臍帯血より磁気ビーズを用いてCD34陽性造血幹細胞を分離し、ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを感染させた。メチルセルロース培地ヘサイトカイン、ハイグロマイシンを添加しコロニーアッセイ法による培養を行った。3週間の培養によりハイグロマイシン耐性コロニーを得た。播種細胞数に対し3.6x10^<-5>の頻度でベクター搭載遺伝子の組込みをPCRにより確認し、このうち0.7%でBTK遺伝子のターゲティングを認めた。造血前駆細胞コロニーを認め、相同組換え細胞の造血前駆細胞への分化能が証明された。これまで正常ヒト造血幹細胞でのウイルスベクターを用いた遺伝子ターゲティングの報告はなく、本研究で初めて相同組換えが証明された。また、本ベクターを用い、造血幹細胞を対象としたターゲティングによるBTK遺伝子変異の修復が可能であることを示した。現在、LAM-PCR法によりランダムな組込みでの遺伝子挿入部位の検出を行い、本ベクター機能の解析を行っている。GFP搭載レンチウイルスベクターを造血幹細胞に感染させヒト化マウスへ移植したところ、GFP陽性の血球細胞が認められた。現在、BTK-cDNA搭載レンチウイルスベクターを用い、同様の実験を行っている。iPS細胞に関しては、健常人由来iPS細胞を入手しフィーダー細胞との共培養とサイトカインの組み合わせによる分化誘導を試み、in vitroでのB細胞への分化誘導系の確立を行っている。また、XLA患者由来線維芽細胞を採取し、現在患者由来iPS細胞を作成中である。In vitroでのB細胞分化能を評価するため、フィーダー細胞を用いずにCD34陽性造血幹細胞よりIgM陽性未熟B細胞まで分化する培養系を確立した。ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを感染させた正常ヒト男性臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞を本培養系で培養し、ハイグロマイシンによる薬剤選択を行った。5週間の培養後、ハイグロマイシン耐性CD19陽性B細胞でBTK遺伝子へのターゲティングを認め、相同組換えCD34陽性細胞が造血前駆細胞のみならず、B細胞系への分化能を持つことを証明した。コロニーアッセイ法で得られた遺伝子導入造血前駆細胞コロニーでの、LAM-PCRによる遺伝子挿入部位の検討では、遺伝子内外ともに挿入が認められた。複数のコロニーで同一部位への挿入が認められ、遺伝子導入は非ランダムであると考えられた。現有のベクターはCMVプロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子を搭載しているが、プロモーターのメチル化による発現低下や、薬剤選択が長期間必要であるという問題があった。そのため、新たに哺乳動物細胞内で恒常的な発現が得られるEF1プロモーター、および薬剤選択を短期間で行える利点のあるピューロマイシン耐性遺伝子を搭載したヘルパー依存型アデノ.AAVV.BTKベクターを作成した。iPS細胞を用いた研究では、骨髄線維芽細胞よりXLA患者由来iPs細胞株を樹立した。iPS細胞よりB細胞へ誘導する培養系の確立を目指し、現在検討を続けている。ヒト化XLAモデルマウスでは、BTK-cDNA搭載レンチウイルスベクターの改変を行い、遺伝子導入およびB細胞分化の検討を続けている。相同組換え効率の上昇を図るため、改良型ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを作製した。具体的な改良点として、恒常的な発現制御が期待できるEF1プロモーター下に、GFP遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、非特異的な組換えを除くため、単純ヘルペスウイルス1型ーチミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を搭載した。また、相同組換え修復後の遺伝子配列の検出を考慮して、ベクターに搭載する遺伝子領域および配列を変更した。BTK遺伝子をターゲットとした人工ヌクレアーゼを作製し、特異的なDNA切断を誘導できることを確認した。この人工ヌクレアーゼとヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを併用することで、相同組換え効率の上昇が認められるかを検討中である。臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞と同様に、In vitroでフィーダー細胞を用いずに骨髄CD34陽性造血幹細胞よりB細胞系へ分化誘導研究を行い、分化能を評価するための培養系を検討中である。

iPS細胞を用いた研究では、正常ヒトiPS細胞株を用いて、iPS細胞よりB細胞へ誘導する培養系の確立を目指し、iPS細胞よりCD34陽性細胞を誘導し、その後CD34陽性造血幹細胞よりB細胞へ分化誘導する系を応用して現在検討中である。ヒト化XLAモデルマウスでは、BTK-cDNA搭載レンチウイルスベクターの改変を行い、遺伝子導入およびB細胞分化の検討を続けている。CD34陽性造血幹細胞よりIgM陽性未熟B細胞まで分化誘導するフィーダー細胞を用いない培養系に関し、より最適な培養条件を検討し、効率よくB細胞を誘導しうる培養系を確立した。本培養系を用い、BTK遺伝子へ相同組換えによりターゲティングされた造血幹細胞の、B細胞系への分化能を検討した。正常ヒト男性臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞を培養し、ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを感染させ、ハイグロマイシンによる薬剤選択を行った。適切な薬剤選択条件を検討し、5週間の培養後、ハイグロマイシン耐性CD19陽性B細胞でBTK遺伝子へのターゲティングの成否を調べた。前年度は検体数がわずかであったため、今回複数の検体で検討し、BTK遺伝子へのターゲティングを証明した。これにより、相同組換えされたCD34陽性細胞が造血前駆細胞のみならず、B細胞系への分化能を持つことを証明し、本ベクターを用いた遺伝子修復により、B細胞系の分化停止を修復しうる可能性を示した。また、相同組換え効率の改善を図るために、恒常的な発現制御が期待できるEF1プロモーターおよびピューロマイシン耐性遺伝子を搭載したヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを作製したが、更なる効率向上を目指し最適なプロモーター、薬剤選択遺伝子を検討している。ヒトBTK遺伝子を標的とした部位特異的なDNA切断を誘導する人工ヌクレアーゼを作製した。この人工ヌクレアーゼとヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを併用することで、相同組換え効率の上昇が認められるかを検討した。結果、ヒト臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞でアデノベクター単独と比べ相同組換え効率の上昇が認められた。ヒト臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞と同様に、In vitroでフィーダー細胞を用いずに骨髄CD34陽性造血幹細胞よりB細胞系へ分化誘導研究を行い、相同組換えの起こった細胞の分化能を評価するための培養系を検討した。26年度が最終年度であるため、記入しない。小児科学26年度が最終年度であるため、記入しない。CD34陽性造血幹細胞でのターゲティングによる遺伝子修復能を証明し、その細胞がB細胞系へ分化しうることを示した。また、患者由来iPS細胞株を樹立した。更なる機能向上を目指し、新たなウイルスベクターを作成した。