hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
急冷凝固アルミニウム合金粉末の押出成形による耐熱高強度材料の試作

高速度モータを用いた遠心噴霧式急冷凝固粉末作製装置を試作し、Al-1.8%Cr-1.7%Zr合金およびAl-Si合金(Si:018%)の急冷凝固粉末を作製するとともに、同粉末の熱間押出成形法について研究を行った。さらに得られた急冷凝固粉末の押出成形材(P/M材)と比較用の鋳造材の押出成形材(I/M)材の耐熱性ならびに強度特性についての評価をも実施した。その研究結果を箇条書きすると、次のようになる。(1)18,000rpmで高速回転しているグラファイト製の円盤上に、直径0.5mmφのノズルから合金溶湯を噴射し、遠心力によって飛散させ、上から吹きつける窒素ガスによって急冷凝固させ粉末とする技術を確立した。(2)ダイス形状ほかの熱間押出条件について研究を重ね、Al-Cr-Zr合金圧粉体を450°Cで、Al-Si合金圧粉体を512°Cで押出成形することができた。(3)Al-Cr-Zr合金の場合、I/M材に較べ、P/M材の結晶粒は微細であり、押出直後のマイクロビッカース硬さは64(I/M材では32)であった。300、400、500°Cで36hrの焼なまし後のマイクロビッカース硬さは60、54、43であり、耐熱性に優れていることが示された。以上の本研究結果、急冷凝固アルミニウム合金粉末の押出成形によって、強度と耐熱性に優れた材料を作製しうることが明らかとなったが、さらに急冷凝固粉末作製方法ならびに押出成形法について改善を進めるとともに、急冷凝固粉末および熱間押出材の電子顕微鏡観察を実施することによって、本研究はさらに発展することであろう。63年度には、62年度に試作した遠心噴霧式急冷凝固粉末作製装置の改造を行うとともに熱間押出機用のダイスおよび粉末混合装置を新しく設計製作し、急冷凝固粉末作製から押出成形までの全工程のプロセス技術を確立した。そこで耐熱高強度材料として期待されるAlーCrーZr合金の急冷凝固粉末を作製し、押出成形した材料の顕微鏡組織観察ならびに機械的特性および耐熱性の評価を行った。結果を箇条書きにすると以下のようになる。1.改造した遠心噴霧式急冷凝固粉末作製装置によって、作製したAlー1.8%Crー1.7%Zr合金急冷凝固粉末の形状は、粒度の細いものは涙滴状ないし棒状であり、粗いものは板状であった。2.Alー1.8%Crー1.7%Zr合金の急冷凝固粉末をよく混合した後、直径、24.5mmφに圧粉成形して、直径50mmφのAl円筒に挿入し、押出温度450°C、押出圧力27.5kgf/mmの条件によって10mmφの丸棒に押出すことができた。(これをP/M材、鋳造材を押出成形したものを、I/M材とする。)3.I/M材に較べ、P/M材の結晶粒は微細であり、押出直後のマイクロビッカース硬さは64(I/M材では32)であった。300、400、500°C、36hrの焼なまし後のマイクロビッカース硬さは60、54、43であり耐熱性に優れていることが示された。4.90%冷間圧延によって、P/M材の硬さは64から71に上昇し400°Cまでの1hrの焼なましではほとんど軟化せず、さらに温度が上るにつれ、わずかずつ軟くなった。
産業プラント保全作業の認知人間工学的検討および認知行動モデル化

本研究は、産業プラントの保全作業におけるヒューマン・エラー防止および作業効率向上を念頭に置き、認知人間工学的観点から保全作業について検討すること、とくに保全作業における人間の認知行動を明らかにし、認知行動モデルを導出することを目的としている。平成12年度は、平成11年度研究の成果を踏まえ、プラント保全の中でも「調整」型の技能を要する作業におけるヒューマン・ファクターについて実験的に検討した。本研究結果によれば、プラント保全における調整型技能作業は、大きく3つのステップによってなされることが判った。第1段階は人間-道具系の能力限界を超えている場合である。この状況では、作業者は人間-道具系の許容内に調整量が収まるまで、闇雲に作業を続ける。第2段階は調整量が人間-道具系の許容内にあるものの、作業者が作業完了までに心理的距離を感じている場合である。この段階では、作業者は自身の内在基準に従って作業を行い、必ずしも精緻な作業結果を導くわけではないが、ある程度は正確に、しかも一様な作業結果を導く。第3段階は作業者が作業完了までに心理的な距離をほとんど感じていない場合である。この段階では、自信の経験・知識等に基づき慎重に作業を行う。本年度は、これらの結果を基に調整型技能作業の特性を認知行動モデルとして表現した。3段階それぞれの特性を考慮し、それらに相応しい作業改善がなされることが望まれる。一方、作業の背後に存在する要因についても検討した。実験的検討では、作業者の性格が作業に大きく影響を及ぼしていることが判った。また、分析的検討では、作業の背後に存在する要因は多数あるものの、それらが構造的に関係し合っていることが判った。作業の背後要因の分析的検討結果を構造モデルとして表現した。(742字)本研究は、産業プラントの保全作業におけるヒューマン・エラー防止および作業効率向上を念頭に置き、認知人間工学的観点から保全作業について検討すること、とくに保全作業における人間の認知行動を明らかにし、認知行動モデルを導出することを目的としている。平成11年度は、プラント保全作業に関してヒューマン・ファクターの観点からの質的分類を行った。その結果、ラスムッセンによるSRKモデルとほぼ同様の分類がなされたものの、技能ベース段階においては「調整作業」という概念を導き出した。なお本研究では、調整作業とは「作業結果に潜在的な過不足生があるような作業」と定義づけた。調整作業段階で発生するエラーについて、実際のプラントで発生する不具合から考えてみると、プラントを実際に稼動するまで発見されない場合が多く、悪質なエラーであることが判った。そこで、プラント保全の中でも、先ずは、特に調整作業に関する人的特性の把握が重要と考え、作業を認知行動の観点からモデル化する際の知見を得るために基礎実験を行った。平成12年度は、実験条件を変えながらさらに実験を重ね、調整作業をはじめ保全作業における認知行動のモデル化を図る予定である。また、保全作業におけるPerformance Shaping Factorについても検討し、それが保全作業にどのような影響を及ぼすかについても検討したい。それらを踏まえ、保全作業における認知行動モデルにPerformance Shaping Factorを加味した、ヒューマン・ファクターの観点から見た保全作業提案し、プラント保全におけるヒューマン・エラー防止や作業効率向上のための一助としたい。(698字)本研究は、産業プラントの保全作業におけるヒューマン・エラー防止および作業効率向上を念頭に置き、認知人間工学的観点から保全作業について検討すること、とくに保全作業における人間の認知行動を明らかにし、認知行動モデルを導出することを目的としている。(742字)
重金属フィルタを用いたX線スペクトルによる胸部画像診断システムの開発

本研究では、高エネルギー領域に吸収端を持つ重金属フィルタと低エネルギー領域に吸収端を持つ希土類元素フィルタを組み合わせることによって,極めて狭い範囲に限定され,しかも特性X線を主とするX線スペクトルを形成した.このX線スペクトルとデジタル検出器の特性を組み合わせた新しい胸部診断システムの開発について、理論と実験を通して研究を行った.1.70KeV以上のエネルギーをカットするタングステン(W)と低いエネルギー領域をカットするガドリニウム(Gd),バリウム(Ba),ホロニウム(Ho)などの希土類元素を組み合わせた,エネルギー幅の少ないX線スペクトルの計測を行った.これらの計測から,フィルター厚とX線吸収の割り合い,X線のエネルギーの関係,X線管の負荷率,模擬病変の画像特性などの関係について明らかにした(東田,小段,豊福,坂本,赤坂).2.重金属を組み合わせたX線スペクトルを用いて、ファントム画像および胸部病変を持つ患者の撮影を行い,従来の撮影法と本研究で開発した新しい胸部診断システムの比較を行った.撮影したこれらの写真の読影を行い,病変の検出に関する解析を行った(寺嶋,東田).胸部撮影に最適な,特性X線を主とした極めてエネルギー幅の少ないX線スペクトルの形成と,デジタルシステムの画像処理に関して,理論と実験を通して以下の研究を行った.1.胸部撮影に最適なX線スペクトルを形成するため,70KeV以上のエネルギーをカットするタングステン(W)と低いエネルギー領域をカットするガドリニウム(Gd),バリウム(Ba),ホロニウム(Ho)などの希土類元素を組み合わせ,特性X線を主としたX線スペクトルを測定した.測定は、胸部撮影で用いられる電圧領域(100kV150kV)におけるX線スペクトルの計測,またタングステンフィルターと希土類フィルターを組み合わせたX線スペクトルの計測を行った.これらの計測から,フィルター厚とX線吸収の割り合い,X線のエネルギーの関係,X線管の負荷率,患者被ばくなどの関係について明らかにした(東田,小段,豊福,坂本,赤坂).2.タングステンフィルターと希土類フィルターを組み合わせたX線スペクトルを用いて、写真コントラストおよび粒状特性等を含む画像特性の測定を行った(東田,坂本,).3.画像医学会などの関連する学会・研究会に出席し、X線スペクトル、画像評価に関係する研究者と情報交換を行った(東田,坂本,寺嶋).本研究では、高エネルギー領域に吸収端を持つ重金属フィルタと低エネルギー領域に吸収端を持つ希土類元素フィルタを組み合わせることによって,極めて狭い範囲に限定され,しかも特性X線を主とするX線スペクトルを形成した.このX線スペクトルとデジタル検出器の特性を組み合わせた新しい胸部診断システムの開発について、理論と実験を通して研究を行った.1.70KeV以上のエネルギーをカットするタングステン(W)と低いエネルギー領域をカットするガドリニウム(Gd),バリウム(Ba),ホロニウム(Ho)などの希土類元素を組み合わせた,エネルギー幅の少ないX線スペクトルの計測を行った.これらの計測から,フィルター厚とX線吸収の割り合い,X線のエネルギーの関係,X線管の負荷率,模擬病変の画像特性などの関係について明らかにした(東田,小段,豊福,坂本,赤坂).2.重金属を組み合わせたX線スペクトルを用いて、ファントム画像および胸部病変を持つ患者の撮影を行い,従来の撮影法と本研究で開発した新しい胸部診断システムの比較を行った.撮影したこれらの写真の読影を行い,病変の検出に関する解析を行った(寺嶋,東田).
ＲＮＡ基質結合場に非天然型活性中心を導入する新しい酵素作製原理の開発

本研究ではRNAとペプチドの複合体(RNP)を基本骨格として、基質選択性を有するRNA基質結合場の近傍に触媒分子を導入することで基質と触媒分子の近接効果により触媒活性を発揮するRNPを作製するという、新しい酵素作製原理の開発を目的とした。基質結合性RNP(RNPリセプター)には詳細な三次構造情報がないため合理的な設計が難しい。そこで様々な三次構造をもつ触媒分子を導入したRNPリセプターライブラリーを構築し、それらの触媒活性を指標にしたスクリーニングを行うことで触媒活性を発揮するRNPの獲得を目指した。RNPを構築するRNAサブユニットとペプチドサブユニットはそれぞれ個別のライブラリーを構築できる。構築した各ライブラリーを組み合わせてRNPを形成することで、分子種数が飛躍的に増大したRNPライブラリーを簡便に構築することが可能である。森井らが報告したATP結合性RNPリセプターには多様な三次構造、基質親和性をもつRNAサブユニットが存在することに着目し、ATP結合場を有するRNAライブラリーとして用いた。また、RevペプチドのN末端に加水分解触媒として機能すると期待できるジメチルアミノピリジン、ビピリジン、そしてヒスチジンを様々なペプチドリンカーを介して修飾し、構造多様性を持つ触媒分子修飾ペプチドライブラリーを構築した。さらにサブユニットライブラリーを組み合わせることで、簡便に触媒分子が導入された609種類のRNPリセプターを作製した。加水分解反応前後で蛍光強度が大きく変化するアデノシン誘導体(5'ーデオキシー5'ー(ウンベリフェリルブチレート)アミドアデノシン)を標的基質として用い、加水分解活性を指標にしたスクリーニングを行うことで、構築したRNPライブラリーの中から触媒活性を有するRNPを獲得することに成功した。本方法論は汎用性の高い新規酵素作製方法論になると期待できる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、基質選択性を有するRNA基質結合場と非天然の反応活性中心が協同的に働くようにRNAーペプチド複合体(RNP)を構築するという、新しい酵素作製原理の開発を目的とする。RNPの三次構造情報は限られているため、様々な三次構造を有する非天然活性中心導入RNPライブラリーを構築し、触媒活性を指標にしたスクリーニングを行うことで、目的のRNPを獲得する。RNA、ペプチドそれぞれをライブラリー化することにより、その複合体であるRNPライブラリーの多様性は容易に増大することができる。RNAライブラリーには、これまでに森井らが獲得し報告しているATP結合性RNPリセプターライブラリーのRNAライブラリーを採用した。このRNPリセプターはATPのアデニン部位を認識し結合するが、糖およびリン酸部位は結合に関与しないことがわかっている。ペプチドライブラリーには、RevペプチドのN末端に様々な構造や長さのペプチドリンカーを介して反応活性中心として、DMAP、ヒスチジンおよび亜鉛錯体をそれぞれ導入した。スクリーニングでの触媒活性評価を行うため、標的反応の簡便な評価系を構築する必要がある。そこで標的分子としてアデニン部位を有しており化学反応前後で大幅に蛍光強度が増大するアデノシン誘導体(5'ーデオキシー5'ー(ウンベリフェリルブチレート)アミドアデノシン)を設計・合成した。この基質を利用することで、反応の進行を定量的に評価することが可能となった。RNAライブラリーとペプチドライブラリーを組み合わせて、多様な三次構造をとる反応活性中心導入RNPライブラリーを構築した。合成した基質の加水分解反応を標的としてスクリーニングを行い、添加することで反応が加速されるRNPが存在していることが明らかになった。平成27年度は、当初の予定通りATP結合性RNAライブラリーの構築、およびN,Nージメチルアミノピリジン(DMAP)、亜鉛ージエチレントリアミン錯体などの触媒分子を様々なリンカーを介してN末端に修飾した非天然活性中心導入Revペプチドライブラリーの構築を行った。さらにこれらを組み合わせてRNPライブラリーを構築し、エステル加水分解反応を標的反応として加水分解活性を指標にしたスクリーニングを行う条件を確立した。当初は、加水分解生成物が特徴的なUV吸収帯をもつpーニトロフェニルエステルを含むアデノシン誘導体を標的基質として用いることで、RNPの触媒活性スクリーニングを行うことができると考えていたが、同基質はRNPや反応活性中心の非存在下であっても水中で不安定であり、比較的エステルが安定な酸性側の緩衝溶液中では反応生成物の吸光係数が大幅に低下することがわかった。そのため吸光度測定により生成物の定量を行うことができなくなり、スクリーニングに用いるのは難しかった。そこで、加水分解生成物が蛍光を発するウンベリフェリルエステルを含むアデノシン誘導体を新たに設計、合成した。この基質を用いることで酸性側の緩衝溶液中でもプレートリーダーを用いた分光学的スクリーニングが可能となった。森井らが報告したATP結合性RNP

リセプターには多様な三次構造、基質親和性をもつRNAサブユニットが存在することに着目し、ATP結合場を有するRNAライブラリーとして用いた。また、RevペプチドのN末端に加水分解触媒として機能すると期待できるジメチルアミノピリジン、ビピリジン、そしてヒスチジンを様々なペプチドリンカーを介して修飾し、構造多様性を持つ触媒分子修飾ペプチドライブラリーを構築した。さらにサブユニットライブラリーを組み合わせることで、簡便に触媒分子が導入された609種類のRNPリセプターを作製した。加水分解反応前後で蛍光強度が大きく変化するアデノシン誘導体(5'ーデオキシー5'ー(ウンベリフェリルブチレート)アミドアデノシン)を標的基質として用い、加水分解活性を指標にしたスクリーニングを行うことで、構築したRNPライブラリーの中から触媒活性を有するRNPを獲得することに成功した。本方法論は汎用性の高い新規酵素作製方法論になると期待できる。これまでに多様な構造をもつ非天然活性中心導入RNPライブラリーの構築とスクリーニング系を確立したため、エステル加水分解活性を有するRNPを効率的に選び出すことが可能になった。平成28年度には、スクリーニングにより触媒活性のあるRNPを選択する。得られたRNPをもとにして、RNAの一部にランダムな塩基配列を導入することでRNPの2次ライブラリーを構築する。2次ライブラリーのスクリーニングを行うことによって、よりエステル加水分解に適した三次構造を有するRNPを獲得できると期待している。これらによってRNPを用いた酵素作製方法論の妥当性を検証する。また、RNPリセプターをもとに段階的に酵素を作製する方法以外に、触媒活性を指標にした進化工学的手法により酵素活性を持つ分子を選択する方法も考えられる。ランダムなRNA配列を含み、ジエチレントリアミンやアザクラウンといったキレート分子をRevペプチドのN末端に導入したRNPライブラリーに対して、まずは樹脂上の基質との結合反応を行う。続いて、非結合性RNPを洗浄により除いた上で、亜鉛などの金属を添加して加水分解活性を持つ錯体をRNP上で形成させる。基質と活性中心が適切な空間配置をとるときにのみ加水分解が起こりRNPが溶出される。このサイクルを繰り返すことにより加水分解活性を持つRNP酵素を獲得する。HPLC解析および質量分析等によって触媒活性を評価し、RNPリセプターへの触媒機能付加により作製したRNPと比較する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ノトバイオート技術を用いたProbiotics評価系動物の開発

ブタフローラマウス(PFM)と投与ブタ糞便では、主要フローラ構成菌群に大きな違いはみられなかったが、菌種レベルではBacteroidaeaeとStreptococaceaeで著しい違いがみられ、その他の菌群でも構成の単純化がみられた。一方、腸内代謝産物の比較ではVFAの産生はブタとPMFで大きな差はみられなかったが、PMFではイソ体、つまりイソブチック、イソバレリックが検出されなかった。しかし腸内腐敗産物の生成では両者に大きな差がみられ、ブタではパクレゾールとスカトールが主でインドールも検出されたが、PMFでは全く検出されなかった。このうちインドール産生菌について検索したところ、ブタ糞便中では、EnterobayteriaceaeとStreptococaceaeが主に産生し、PMF腸内ではEnterobayteriaceaeとBacteroidaeaeが主な産生菌であり、PMF腸内にもインドール産生菌が最優勢に存在することが明らかになった。そこでブタならびにPMF糞便よりインドール産生菌を分離して無菌マウスにpoly-associationしたところ、わずかではあるがインドールがノトバイオート腸内で検出された。また、PMFにブタ用飼料を与えたが、腸内での腐敗産物は検出されなかった。以上の結果から、ブタ糞便菌叢の代謝活性をPMFに移植することは、VFAにおいては糞便投与のみで行なうことができるが、腐敗産物については、マウス腸内環境により菌の持つ産生能が抑制されたものと考えられる。本年度は,ブタの糞便フローラを生後10日,20日,40日,60日に検索し、このうち20日と60日の糞便を無菌マウスに投与して、投与糞便とマウス腸内に定着するフローラについて比較検討した。腸内フローラの日齢による変動は,離乳前の20日齢までは,好気性菌,特に大腸菌と腸球菌の菌数が高いが,離乳後は嫌気性菌が優勢となり安定したフローラとなった。20日齢のブタ糞便を投与された無菌マウスでは、投与後、1週目に比べて4週目でより単純化したが、優勢菌種であるBacteroidaceae,Eubacteria,Clostridiaはマウスでは優勢に定着し,予測に反してLactobacilliは投与糞便同様に10^9/gでマウス腸内に定着した。好気性菌である大腸菌,腸球菌,ブドウ球菌はほぼ投与糞便と同様の菌数となった。しかし,菌種レベルでは,ブタとマウスで違いがみられ,ブタ腸内ではきわめて少ない菌数のBacteroides fvagilis groupがマウスでは優勢菌種となり,マウスによる選択が行われたと考えられる。また,TATAC培地でも,マウスでは、ブタ糞便中と異なり,Enterococusが主となり,菌数では同じでも菌種による違いがみられた。現在,離乳直後のブタにProbioticsの1つであるBifidobacterium longumの培養液濃縮物を飼料に添加して腸内フローラならびに腸内腐敗産物を検索している。ニワトリは、成鶏の盲腸内容物をマウスに投与し,ニワトリフローラマウスを作出したところ,優勢菌種はニワトリ同様に定着し,さらに,Campylobacter jojumi排除能があることから,菌種ばかりでなく,機能面でも、ニワトリフローラをマウスに移植できたものと考えられる。本年度は,腸内代謝活性の無菌マウスへの移植という関点から,ブタフローラマウスでの盲腸内短鎖脂肪酸(VFA)と腐敗産物の生成について検討した。その結果、ブタ糞便中とほぼ同じ程度のVFAがブタフローラマウスでも検出され,生後20日齢のブタの糞便と60日齢のブタの糞便を投与されたブタフローラマウスでは20日齢のブタ糞便を投与された群でより投与糞便に近い状態であった。しかし,ブタ糞便中で少量ながら検出されたイソ体がブタフローラマウスではほとんど検出されなかった。

一方,ブタ糞便中では腸内腐敗産物であるパラクレゾール,スカトールと少量のインドールが検出され,20日齢では60日齢の約3倍量が検出された。しかし,これらを投与されたブタフローラマウスでは腐敗産物は全く検出されなかった。次に,ヒトの腸内から分離した株のNitroreductase,B-glucosidase,B-glucronidaseの活性をin vitroで測定したところ,株ごとにどの酵素が活性があるかというパターンが異なり,このうちB-glucosidase活性のみが+となった。Clostridium ramosumとB-glucronidaseが+でB-glucosidase-のC・clostridiformeをそれぞれ無菌マウスに投与して,その盲腸内での活性を比較したところ,C・ramosum投与群ではB-glucosidase活性のみが無菌マウスに比べて上昇し、C.clostridiforme投与群ではB-glucronidase活性が上昇し,B-glucosidaseは無菌マウスに比べてわずかに高い値を示すにとどまった。ヒトの糞便そのものを投与された無菌マウスではヒト糞便中に近い値の活性がヒトフローラマウスでもみられた。ブタフローラマウス(PFM)と投与ブタ糞便では、主要フローラ構成菌群に大きな違いはみられなかったが、菌種レベルではBacteroidaeaeとStreptococaceaeで著しい違いがみられ、その他の菌群でも構成の単純化がみられた。一方、腸内代謝産物の比較では、VFAの産生はブタとPMFで大きな差はみられなかったが、PMFではイソ体、つまりイソブチリック、イソバレリックが検出されなかった。しかし、腸内腐敗産物の生成では両者に大きな差がみられ、ブタではパラクレゾールとスカトールが主でインドールも検出されたが、PMFでは全く検出されなかった。このうちインドール産生菌について検索したところ、ブタ糞便中では、EnterobacteriaceaeとStreptococaceaeが主に産生し、PMF腸内ではEnterobacteriaceaeとBacteroidaceaeが主な産生菌であり、PMF腸内にもインドール産生菌が最優勢に存在することが明らかになった。そこで、ブタならびにPMF糞便よりインドール産生菌を分離して無菌マウスにpoly-associationしたところ、わずかではあるがインドールがノトバイオート腸内で検出された。また、PMFにブタ用飼料を与えたが、腸内での腐敗産物は検出されなかった。以上の結果から、ブタ糞便菌叢の代謝活性をPMFに移植することは、VFAにおいては糞便投与のみで行なうことができるが、腐敗産物については、マウス腸内環境により菌の持つ産生能が抑制されたものと考えられる。
戦前・戦後改革期日本のカリキュラム改造論に関する研究

本年度は、主に以下、二つの観点から研究を進めた。1.1920年代の日本のカリキュラム改造に関する平成13年度の研究成果を踏まえながら、1930-40年代のカリキュラム改造の試みについて、当時の実践面・理論面での嚆矢であった及川平治と津田信雄の指導下にあった仙台市教育研究所の実態を解明した。津田信雄は1920年代東京市富士見小学校で独自なカリキュラム研究実践を行っていたが、これまでのカリキュラム研究史で殆ど注目されてこなかった人物であり、本研究では彼の業績の解明も行った。これまで地方の実態に即したカリキュラム研究を行う地方公(市)設教育研究所は戦前の日本には存在していなかったという定説に対し、仙台市教育研究所は、教育行政に力を発揮した渋谷徳三郎市長の庇護の下、及川と津田を擁したことにより、カリキュラム研究に積極的に踏み込んでいたことが明らかになった。以上の結果から、本研究は戦前期日本のカリキュラム研究の水準のみならず、地方教育研究所の存在意義について新たな知見をもたらしたと言える。これらの成果は『秋田大学教育文化学部紀要』と同『教育実践研究紀要』とにまとめた。2.昨年度に引き続き、戦後秋田県のコア・カリキュラムに関する資料の収集と分析を行った。昨年度、秋田県内の戦後改革期のコア・カリキュラム資料の残存状況を調査した結果、秋田師範学校附属中学校に一定の纏まった資料があることが判明した。今年度その資料を分析した結果、当校を中心として県内の中学校が研究提携していることが明らかになり、当時の関係者の聞き取りも含め、これら提携校の資料収集も行った。教科担任制である中学校において、教科越境的なコア・カリキュラム実践を可能にしていた条件について、特に教師の戦前・戦時中の初等教育での教職経験の有無が影響しているのではないかという仮説のもと、現在も研究を継続している。本年度は、主に以下の二つの観点から研究を進めた。(1)既に研究に着手している1920-30年代日本におけるカリキュラム改造の試みについて、当時の実践面・理論面での嚆矢であった及川平治の指導下にあった明石女子師範学校附属小学校と仙台市教育研究所に関する資料収集と分析とを行った。その際、仙台市教育研究所の実態はこれまでその詳細が明らかにされてこなかったことから、本年度はその実態解明に重点を置いた。その結果、及川が研究所設立構想の段階から深く関与していたこと、そして当時日本に数多く設置されていた児童研究所とその性格を異にし、学校教育に関するあらゆる課題を網羅すべく設立された、公(市)設としては我が国初の総合的教育研究所であったことが明らかになった。現在は、こうした及川の実践とその基盤となった彼のカリキュラム理論の分析検討の成果を博士論文として執筆中である。(2)戦後秋田県のコア・カリキュラムに関する資料の保存状況を把握するとともに、一部収集を行った。その結果、秋田の過疎化に伴う学校統廃合やそれに伴う学校新築事業等の過程で戦前・戦後の多くの文書資料が紛失しており、コア・カリキュラムの資料収集は極めて困難であることが明らかになった。ただし、一部の中学校には僅かではあるが良好な状態で資料が保存されていた。学習指導の基盤が「教科」である中学校でコア・カリキュラム実践の蓄積は小学校と比較すると明らかに希有である。これまで東北地方のコア・カリキュラム実践は殆ど注目されておらず、しかも新制中学校での取り組みが研究の俎上に上ったことはない。そこで(1)の研究と平行しながら、戦前のカリキュラム改造の試みの戦後への継承の有無と、それらの戦後秋田の新制中学校のコア・カリキュラムヘの影響関係を分析中である。
ゼブラフィッシュにおける嗅覚記憶ダイナミズムの分子・細胞・神経回路メカニズム

多くの生物にとって嗅覚は、餌を探し出す、交配相手を見つける、親子を識別する、そして危険から逃避するなど、個体の生存あるいは種の保存に直結する本能的行動に不可欠な感覚である。外界に存在する多種多様な匂い分子が嗅細胞で受容され、その情報が嗅球さらには高次嗅覚中枢へと伝達・処理されて、嗅覚イメージの形成、快不快の情動創出、さらには匂い記憶の成立へと至る。本研究では嗅覚記憶の時空間的ダイナミズムの分子・細胞・回路メカニズムの全貌を明らかにすることを目的とし、遺伝学・発生工学・神経解剖学・神経活動イメージング・電気生理学・神経行動学など多様な実験手法を駆使できるゼブラフィッシュをモデル生物とした統合的解析を行った。平成29年度においては、餌報酬と関連させた嗅覚条件付け記憶を制御する神経回路メカニズムの解析を行った。まずは、ゼブラフィッシュにおいて嗅覚入力と報酬・恐怖の連合学習を制御する神経回路メカニズムの解明を目指して、嗅覚記憶行動解析システムの開発を行った。誘引も忌避も起こさないニュートラルな匂い分子の嗅覚入力と、餌の報酬とを条件付けすることによって、ゼブラフィッシュがその匂い分子を記憶して策餌行動を示すことを見出した。すなわち匂い刺激と餌報酬の連合記憶の形成・維持・想起の行動実験系をゼブラフィッシュにおいて確立することができた。また、遺伝学・神経解剖学・分子生物学などの手法を組み合わせることによって、この嗅覚記憶を司る神経回路の解析を行い、視床の特定の神経核が、餌報酬と連関させた匂い刺激によって活性化されることを見出した(投稿準備中)。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。嗅覚は、餌を探し出す、交配相手を見つける、親子を識別する、危険から逃避するなど、すべての生物にとって個体の生存や種の保存に直結する重要な化学感覚である。すなわち外界に存在する多種多様な匂い分子が嗅細胞で受容され、その情報が嗅球さらには高次嗅覚中枢へと伝達・処理されて、嗅覚イメージの形成、快不快の情動創出、さらには匂い記憶の成立へと至る。本研究では嗅覚記憶の時空間的ダイナミズムの分子・細胞・回路メカニズムの全貌を明らかにすることを目的とし、遺伝学・発生工学・神経解剖学・神経活動イメージング・電気生理学・神経行動学など多様な実験手法を駆使できるゼブラフィッシュをモデル生物とした統合的解析を行う。平成25年度においては以下の2つの項目について研究を行い、次年度につながる重要性かを得た。1.ゼブラフィッシュ嗅球から高次嗅覚中枢へと至る二次神経回路の包括的プロジェクトーム解析:遺伝学的単一ニューロン蛍光標識法と最新の画像レジストレーションシステムを組み合わせることにより、嗅球出力ニューロンの軸索投射パターンを包括的に解析した。その結果、嗅球出力ニューロンは5つの標的脳領域に異なったパターンで軸索を投射し、それぞれの領域における匂い情報の収束・処理メカニズムの相違性が明らかとなった。本研究で得られた知見は嗅覚記憶の神経メカニズム解明のための基盤データとなる。2.嗅覚インプリンティングを司る神経メカニズム解明のための行動実験システムの開発:サケの母川回帰行動を実験室内のゼブラフィッシュで再現し、遺伝学・神経解剖学・神経活動イメージング技術を組み合わせることで、嗅覚インプリンティングを司る分子・細胞・神経回路メカニズムを解明するために、平成25年度はまず嗅覚インプリンティングを評価する行動解析システム(Y迷路)の確立を行った。平成26年度においては以下の研究を行い、次年度につながる重要な成果を得た。1)嗅覚インプリンティングを司る神経回路メカニズム解明のために、サケの母川回帰行動を実験室内のゼブラフィッシュで再現するための行動解析系の改良を行った。新たなY迷路システムの導入により、上流から投与した2種類の溶液が魚が泳ぐアリーナ内で、明確に分離されて混ざり合わない状況を作り出すことに成功した。本システムの利用によって、匂い分子に対するゼブラフィッシュの誘引あるいは忌避行動を、これまで以上に客観的かつ信頼性高く評価することが可能となった。2)嗅覚インプリンティングを効率よく誘起する匂い分子の探索・同定に成功した。通常は忌避行動を惹起させることが報告されているある特定の匂い分子を発達期のゼブラフィッシュに暴露すると、それらの魚は成体になってからその匂い分子に誘引行動を示すことを見いだした。すなわち同じ感覚入力が、魚の経験によって忌避と誘引の行動変化ダイナミズムを引き起こすことに成功した。

すなわち外界に存在する多種多様な匂い分子が嗅細胞で受容され、その情報が嗅球さらには高次嗅覚中枢へと伝達・処理されて、嗅覚イメージの形成、快不快の情動創出、さらには匂い記憶の成立へとる。本研究では嗅覚記憶の時空間的ダイナミズムの分子・細胞・回路メカニズムの全貌を明らかにすることを目的とし、遺伝学・発生工学・神経解剖学・神経活動イメージング・電気生理学・神経行動学など多様な実験手法を駆使できるゼブラフィッシュをモデル生物とした統合的解析を行う。平成27年度においては以下の研究を行い、次年度につながる重要な成果を得た。1)嗅覚インプリンティングを司る神経回路メカニズム解明のために、行動解析装置(Y字型迷路)の改良を行った。新たな装置内では、匂い物質がほぼ混ざり合わずに2つの流路を形成し、ゼブラフィッシュの匂いに対するpreferenceあるいはaversionをはっきりと観察できるシステムの構築に成功した。2)嗅覚報酬記憶の新たな実験系を立ち上げた。特定の匂いを餌報酬と連合させることによって、ゼブラフィッシュはその匂いに対して明らかなpreferenceを示すようになった。本システムを用いることにより、嗅覚記憶の神経回路機構の解析が可能となる。嗅覚インプリンティングの実験システムの改良、餌報酬と連関した嗅覚記憶を引き起こすシステムの構築など、研究全般においてほぼ予定通り順調に進行している。嗅覚は、餌を探し出す、交配相手を見つける、親子を識別する、危険から逃避するなど、生物にとって個体の生存や種の保存に直結する重要な化学感覚である。すなわち外界に存在する多種多様な匂い分子が嗅細胞で受容され、その情報が嗅球さらには高次嗅覚中枢へと伝達・処理されて、嗅覚イメージの形成、快不快の情動創出、さらには匂い記憶の成立へと至る。平成28年度においては以下の研究を行い、次年度につながる重要な成果を得た。前年度に確立した嗅覚報酬記憶の実験系を用いて、特定の匂い刺激と餌報酬の連合記憶を形成させたゼブラフィッシュ(paird)と形成させていないゼブラフィッシュ(unpaird)を作成した。これらの魚に匂い刺激だけを与えた後に脳切片を作成してc-Fos in situハイブリダイゼーションを行ったところ、unpairedフィッシュと比較してpairedフィッシュにおいてc-Fos発現細胞数が有意に多い視床神経核を発見した。また哺乳類の梨状皮質に相当するゼブラフィッシュの脳領域Dpなどでは、pairedフィッシュとunpairedフィッシュでc-Fos発現細胞数に違いは観察されなかった。平成28年度は、匂い分子と餌報酬の連合記憶実験において興味深い知見が得られた。研究全般においてほぼ予定通り順調に進行している。多くの生物にとって嗅覚は、餌を探し出す、交配相手を見つける、親子を識別する、そして危険から逃避するなど、個体の生存あるいは種の保存に直結する本能的行動に不可欠な感覚である。
妊娠免疫機構を利用したヒト化マウス体液性免疫評価システムの確立

本研究では、ヒト末梢血単核球(PBMC)移植した重度免疫不全マウスであるNOGマウスにpregnancy zone protein(PZP)を妊娠時に免疫系を調節するホルモンであるプロゲステロン(PG)と投与あるいは遺伝子導入し、ヒト体液性免疫系再構築を可能とするマウスの作製を目的としている。今年度は、PZP遺伝子導入したNOGマウスをマイクロインジェクションにより作成した。また、PGをPBMC移植NOGマウスに連続投与したP4ヒト化マウスの系を確立した。PZPの過剰発現マウスでは、妊娠の成立が大変難しいことが明らかとなり、PZPが妊娠に重要な役割を果たすことが推察された。一方、PG投与NOGマウスでは、各リンパ組織中の免疫担当細胞の割合に、対照群と有意な差は検出されなかった。しかし、血漿中のIgG抗体濃度は非投与マウス群よりIgG量が増加していることが示された。一方、NOG-hIL-4-TgにPBMCを移植した後、申請者が開発中の乳癌ワクチンであるCH401MAPを免疫し,さらに、免疫賦活化のためにPD-1抗体(オプジーボ)を投与した。その結果、PD-1抗体投与によりB細胞の減少とCD8T細胞の割合の増加の傾向が観察された。現在はPZPマウスの系統を確立するとともに、double-Tgマウスを作成準備中である。さらに、PG投与ヒト化マウス、乳癌患者環境再構築マウスの条件が確立したため、この方法を元に、担癌マウスでこれら妊娠関連分子の免疫学的効果を評価する、テーラーメードなワクチンの評価系が確立できたと考えられる。事実、移植されたPBMCの反応性は個体により異なっていた。これにより、本研究目的の達成が、現実的に可能となったと考えられる。特許に抵触する可能性もあり、学会発表は最小限となっている。2018年度は、PZP遺伝子導入したNOGマウスを作成し、F1まで作成することができた。一方、PZPの過剰発現マウスでは、1腹のマウスで10匹中1匹しかPZP遺伝子を持つ子マウスがいないなど、妊娠の成立が予想以上に大変難しいことが明らかとなり、PZPが妊娠に重要な役割を果たすことが推察された。一方、PGをPBMC移植NOGマウスに連続投与したP4ヒト化マウスの系を確立した。PG投与NOGマウスでは、各リンパ組織中の免疫担当細胞の割合に、対照群と有意な差は検出されなかった。しかし、血漿中のIgG抗体濃度およびアイソタイプをLC-MSで解析したところ、むしろPG投与群では非投与マウス群よりIgG量が増加していることが示された。これらの抗体は、IgG1, IgG3およびκ・λ軽鎖を含む一方、IgG2, IgG4は観察されなかった。そこで、NOG-hIL-4-TgにPBMCを移植した後、申請者が開発中の乳癌ワクチンであるCH401MAPを免疫し,さらに、免疫賦活化のためにPD-1抗体(オプジーボ)を投与した。その結果、PD-1抗体投与によりB細胞の減少と抗体産生の低下、CD8T細胞の割合の増加の傾向が観察された。さらに、PG投与ヒト化マウス、乳癌患者環境再構築マウスの条件が確立したため、この方法を元に、担癌マウスでこれら妊娠関連分子の免疫学的効果を評価し、テーラーメードなワクチンの評価系として確立する基盤ができたと考えられ、ほぼ今年度の予定を達成している今年度は3年目のプロジェクトとして予定通り、以下の5点についての研究を推進する。1NOG-PZPマウスとNOG-hIL-4-Tgマウスを交配した、double-transgenicマウスを作成する。マウスが確立したならば、これらに健常者PBMCを移植する。確立するまでは、従来のNOG-hIL-4-Tgマウスを使用する。生着したヒト免疫細胞をフローサイトメトリーで解析し、PZP導入によりGVHDがより回避されたか否かを明らかにする。2HER2ワクチンの改良を行う。具体的には、すでに抗体ープロゲステロンコンジュゲートの作成には成功しているため、これらのコンジュゲートの形態について改良を引き続き行う。3PD-1抗体のヒト化マウスにおける作用機序を明らかにする。申請者らは、in vitroでのヒト細胞培養とヒト化マウスについて、すでにある程度の結果は得ているが、さらに詳細を明らかにするために、各リンパ球サブセットのRNA発現をRNA-Seqあるいはrealtime-PCRにより解析する。また、特異抗体産生能についてはELISAにて解析する。4NOG-PZPマウスとNOG-hIL-4-Tgマウスのdouble-transgenicマウスについて、抗体産生の亢進が観察されるか否かをCH401MAPを用いた免疫とELISAにて評価する。5NOG-PZPマウスとNOG-hIL-4-Tgマウスのdouble-transgenicマウスでヒト化担癌マウスを作成し、これらにワクチン投与をすることにより抗腫瘍効果を低下させることなく抗体産生の亢進あるいはGVHDの減弱が観察されたならば、これらにさらにPD-1抗体およびそのプロゲステロンコンジュゲートを投与し、抗腫瘍効果および抗体産生の亢進が生じるか否かを評価する。

今年度は、東海大学病院にて同意を得た初発乳がん患者43名および健常者37名の末梢血単核球(PBMC)の免疫担当細胞を、フローサイトメトリーを用いて解析した。一部のドナーPBMCはB細胞の特異的抗体産生を誘導できるNOG-hIL-4-Tgマウスに移植した。移植後、HER2部分ペプチドCH401MAPで免疫し、2週間後に追加免疫を行った後、移植4週間後の抗体産生能を解析した。その結果、乳がん患者の28.6%では健常者に比べて未成熟なB細胞の割合・細胞数が増加していた。PBMCを移植しペプチド免疫したNOG-hIL-4-Tgマウスの脾臓細胞では、乳がん患者・健常者共に非常に多くの形質細胞様B細胞が維持されていたが、オプジーボを投与するとマウス脾臓中のB細胞画分の割合・細胞数は顕著に減少する傾向が見られた。マウス血清中のペプチド特異的IgGは、健常者では53.3%(8/15名・p=0.032)で亢進したのに対して、乳がん患者では11.1%しか亢進しなかった。以上の結果より、乳がん患者の末梢血では未成熟なB細胞が増加しているが、これらの細胞はマウス体内で抗体産生能を持つB細胞には分化しない事が示唆された。また、ペプチドワクチンのアジュバントの開発を行い、BALB/cマウスにおいては、ミエロイド系の細胞の過剰な活性化は抑制するが、特異抗体産生は亢進するアジュバントの合成を行った。さらに、妊娠関連タンパク質であり免疫調節機能を持つ事が推測されるpregnancy-zone protein (PZP)の分子構造を解析し、その特徴を明らかにした上で、これらの分子を発現する重度免疫不全マウスの作製に着手した。本年度の本研究は、ほぼ予想通りの進捗を得ている。平成29年度の計画は(1)担癌ヒト化マウスの系の確立と乳癌患者では健常者と比較して免疫抑制が生じている事を明らかにし、(2)同時にヒト化マウスに適した改良型ワクチンと免疫調節分子の開発、(3)NOG-PZP-Tgの作製を開始する、というものであった。(1)については、研究代表者である亀谷は、徳田により同意のもと採取された血液よりPBMCを単離し、NOG-IL-4-Tgにこれらを移植し、ヒト化マウスを確立した。さらにこれらにHER2部分ペプチドであるCH401MAPを免疫し、特異抗体産生を誘導した。その結果、健常者と比較して乳癌患者PBMCではHER2ペプチドに対する抗体産生能の低下が生じている事を明らかにした。さらに、担癌マウスの作製に先んじて30年度以降に予定していた免疫チェックポイント抗体の投与を行い、免疫系のシフトについてフローサイトメトリーを用いて解析を開始している。(2)については、研究分担者である真鍋が、HER2ペプチドにTLRリガンドと糖鎖をベースとしたアジュバントを結合した改良型ワクチンを合成した。亀谷がこれらのワクチンをBALB/cマウスに免疫した後、フローサイトメトリー及びELISA法を用いて脾臓中のリンパ球の動態および抗体産生能を解析した。その結果、フロイントアジュバントより高い抗体産生能をもつが、炎症性のミエロイド系細胞の増殖は抑制する事が出来るアジュバントの合成に成功した。また、これらのアジュバントとCH401MAPを結合し、健常者PBMCを移植したヒト化マウスに投与すると、抗体産生が可能である事を明らかにした。
プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ阻害作用を指標とする天然薬物シーズの探索研究

プロテインチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)はインスリンシグナル伝達経路の負の制御因子であり、その阻害剤は新規糖尿病治療薬として期待される。本研究は薬用植物抽出物および天然化合物ライブラリーから新規PTP1B阻害剤を見出した。そのうち、生薬甘草由来のフラボノイドglycybenzofuranおよび生薬苦木由来のアルカロイドpicrasidine LはPTP1Bの競合型阻害剤であり、優れた酵素阻害選択性を示した。更に、glycybenzofuranとpicrasidine Lは細胞内インスリンシグナル伝達を促進する作用を示し、新しい糖尿病治療薬創製のシード化合物として期待される。本研究は新規糖尿病治療薬のシーズ化合物の発見を研究目標として、生薬および天然有機化合物ライブラリーを用いてプロテインチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)阻害活性を評価した。優れたPTP1B阻害活性示した生薬抽出物について、更にBioassay-guided fractionation法により活性成分の同定を行った。バラ科植物Sorbuspohuashanensis果実の70%エタノール抽出物より得られた7種のトリテルペン化合物は顕著なPTP1B阻害活性を示し、そのうち、pomolic acid 3-acetate、ursolic acid 3-acetate、およびbetulinic acidは最も強いPTP1B阻害活性を示した。一方、生薬甘草由来の42種のフラボノイドについてPTP1B阻害活性を評価したところ、新たに4種のプレニルフラボノイドが顕著なPTP1B阻害活性を示した。これら化合物について、更に酵素阻害速度論解析による阻害形式、PTP酵素に対する選択性およびpAKTの発現を指標とする細胞内インスリン経路に対する影響を調べた結果、甘草由来のプレニルフラボノイドglycybenzofuranがいずれの評価系においてもポジティブな結果を示し、PTP1Bを標的とする新しい抗糖尿病薬発見のシーズ化合物として期待される。プロテインチロシンホスファターゼ1B(以下、PTP1B)はインスリンシグナル伝達経路の負の制御因子であり、PTP1B阻害剤は新規糖尿病治療薬として期待されている。本研究は新規糖尿病治療薬シーズの発見を研究目標として、漢方薬、生薬および天然有機化合物ライブラリーを用いてPTP1B阻害活性を評価した。フラボノイド化合物ライブラリーから、生薬クジン由来のフラボノイド3種を新規PTP1B阻害剤として見出した。一方、beta-carbolineとcanthinone型アルカロイド化合物ライブラリーから、canthinone型アルカロイド6種を新規PTP1B阻害剤として見出した。これら活性成分のうち、生薬ニガキから単離されたpicrasidine Lは競合的にPTP1Bを阻害し、加えてPTP1Bの選択的阻害剤であることを明らかにした。さらにpicrasidine Lはヒト肝癌細胞HepG2において、インスリン刺激によるAktのリン酸化を促進し、細胞内インスリンシグナリング増強作用も認められた。Picrasidine Lは今後新たな糖尿病治療薬創製のリード化合物として期待される。一方、インスリン抵抗性2型糖尿病の治療への新たな臨床応用の可能性を巡って、147種の日本の医療用漢方製剤のPTP1B阻害活性を評価した。大黄甘草湯、麻子仁丸、桃核承気湯、桂麻各半湯そして調胃承気湯の順に濃度依存的に高いPTP1B阻害活性を示した。PLS法で得られた回帰モデルより、構成生薬の大黄がこれら漢方製剤のPTP1B阻害活性に最も高い寄与度を示した。PTP1B阻害を作用機序としたIR-T2DM治療の臨床治療薬がまだない現状から、今後のこれら漢方製剤の臨床応用の可能性が期待される。本研究は新規糖尿病治療薬のシーズ化合物の発見を研究目標として、200種の生薬ライブラリーを用いてプロテインチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)阻害活性をスクリーニングした結果、中国伝統薬用植物血満草(Sambucus adnata)のメタノール抽出物は優れたPTP1B阻害活性示した。この抽出物について、詳細な化学成分研究を行い、新規トリテルペン化合物1種を含む計13種の化合物を単離し、各種スペクトル解析により構造解析を行った。新規化合物の構造は1alpha-3beta-dihydroxy-urs-12-en-11-one-3-yl palmitatene-3-ylpalmitateと決定した。単離した化合物のうち、2種のトリテルペン化合物ursolic acidとoleanolic acid、および1種のネオリクナン化合物boehmenanは最も強いPTP1B阻害活性を示し、IC50値はそれぞれ4.1, 14.4 and 43.5 microMである。一方、酵素阻害速度論解析の結果、boehmenanはPTP1Bの競争型阻害剤である。Boehmenanはネオリクナン類PTP1B阻害剤として初めての報告例であり、今後、その誘導体の作成により新たな新規PTP1B阻害剤の創製が期待される。

本研究は新規糖尿病治療薬のシーズ化合物の発見を研究目標として、伝承医薬に用いられている薬用植物からPTP1B阻害作用を有する化合物の探索、ケミカルバイオロジーの研究手法によりこれら化合物の構造活性相関と阻害作用機序を解明を研究目的とする。24年度の研究において、新たに新規PTP1B阻害活性を有する化合物を発見したと共に、より糖尿病の病態に近い細胞実験に用いても、インスリンシグナル増強に有益な化合物の発見が出来た。1年目の研究は200種の生薬ライブラリーを用いたPTP1B阻害活性のスクリーニング、および優れたPTP1B阻害活性示した中国伝統薬用植物血満草(Sambucus adnata)のメタノール抽出物抽出物から3種のPTP1B阻害活性を有する天然化合物を発見できた。次年度は更なるPTP1B阻害活性示した薬用植物抽出物の成分研究を行う一方、今まで発見した活性成分について細胞試験においてその作用を詳しく調べる予定である。今後は2つの方向で研究を推進する予定である。1、新しいPTP1B阻害活性成分の発見を目指して、更に多くの化合物の活性評価を実施する。2、天然由来のPTP1B阻害剤であるトリテルペンおよびプレニルフラボノイドの構造活性相関を明らかにする。今後は3つの方向で研究を推進する予定である。1、新しいPTP1B阻害活性成分の発見を目指して、血満草以外のPTP1B阻害活性示した薬用植物抽出物の成分研究を行う。2、既知PTP1B阻害活性成分の化学誘導体の作成を行い、構造活性相関の解析を行う。3、細胞実験を用いて、既知PTP1B阻害活性成分のインスリンシグナル伝達経路への影響を調べる。24年度の研究はおおむね計画通り進んでいたが、学会での発表は24年度に未実施したため、当初予定していた旅費の部分が発生されなかった。24年度の研究費残額および25年度の研究費を合わせて、次の項目に使用する予定である。1)最終年度である25年度に実施する予定である天然成分の化学修飾、細胞レベルのインスリン経路に対する影響など実験に使用物品費。2)研究結果の発表に使用する予定の学会参加旅費。平成23年度は成分研究を中心に展開していた。当初1年目に想定していたPTP1B阻害活性成分の構造活性研究が行わなかったため、この分に計上した研究費は使用しなかった。これら研究は2年目から行う予定で、2年目に計画とおり使用する予定である。
ステロイド抵抗性喘息における気道上皮細胞のオートファジーの重要性

真菌の一種であるアルテルナリアは喘息の重症化と強い相関がある。細胞の自食作用(オートファジー)はその役割が恒常性の維持のみならず免疫応答にもおよぶことがわかってきた。我々は、アルテルナリア刺激で気道上皮から炎症誘導因子(IL-18)が分泌することを報告した。今回はそのIL-18が、オートファジーを介するのではないかと仮説をたてた。そして、アルテルナリアはダニ抗原と部分的に異なるサイトカインプロファイルを持つこと、ダニの主成分であるLPSはアルテルナリアと同様に気道上皮のオートファジーを引き起こすもののその反応は中途で停止してしまうことで、IL-18の分泌に至らないことを発見した。本年度においては、気道上皮由来のアラーミンの同定とオートファジーに関するアラーミンの分泌機序の解明を主に行った。本研究に先立って、気道上皮細胞が真菌の一種であるアルテルナリア(以下ALT)の刺激をうけるとアラーミンである、IL-18を分泌するとのデータを得ていた。そのデータを検証するため、A549細胞において同様の実験を行った。A549細胞においてもALT刺激によって経時的、および濃度依存的にIL-18の分泌を上昇させることができた。次に正常ヒト気道上皮細胞を培養し、ALTおよび、コナヒョウヒダニ抗原(以下DF) (ともにgreer lab, USAから購入、米国テキサス大学Sanjiv Sur研究室との共同研究)によって15分刺激した上清をbioplexを用いて測定、Ingenuity pathway analysisを用いてその相関を検討した。ALT抗原刺激群では、以前と同様にIL-18の著明な増加が認められるとともに、近年アレルギー疾患に係るIL-17及びその下流に存在する、IL-1&#61538;, IL-3, IL-9, IL-10, IL-12,IL-13, CCL2, CCL1, IL-6, CCL3, G-CSFなどの上昇を認めた。DFとALT-Eに共通するサイトカインとしては、IL-3, HGF, CXCL1, IL-13, IL-1RAなどの上昇を認めた。次に、IL-18の分泌機序に関する検討を行った。inhibitorを用いた予備実験では、従来より報告のある、NLRP3ではなくautophagyを介している可能性を示唆していた。そこで、A549細胞をALTにて刺激後、Western blottingを用いてautophagy誘導蛋白であるLC3-IIとp62を測定したところ刺激後、LC3-IIの増加とp62の減少を認めた。gfpを用いたLive cell imaging (cyto ID autophagy detection kit, enzo, NY )においてもautophagosomeの増加を認め、この結果より、ALT刺激によってautophagyが誘導され、IL-18の分泌が起こる可能性が高いことが示唆された。本年度は前年度の結果を元に、まず気道上皮からのIL-18分泌がautophagyに関わるという証明をより堅固なものとするために、異なるautophagy inhibitorであるBafilomycinを用いてIL-18の分泌を検討した。その結果、Bafilomycinを用いても同様にIL-18の分泌を抑制できることが判明した。次に気道上皮細胞からのIL-18分泌シグナルがどのようなレセプターを介して分泌されるのかを検討した。我々はinnate immune systemの引き金となる、Toll like receptor (TLR) 1-9の各々のinducerを用いて気道上皮細胞を刺激し、IL-18分泌の有無を検討した。TLR1-9のすべてのinducerを用いてもIL-18は誘導されず、気道上皮からのIL-18分泌はTLR-1-9を介さないことを証明した。更にcaspase1 inhibitorを用いて気道上皮由来のIL-18分泌を検討したところ、Caspase 1 inhibitorを用いてもALT-EによるIL-18の分泌は抑制されず、気道上皮からのIL-18分泌はCaspase非依存型であると結論づけた。次にダニ抗原とアルテルナリア抗原がIL-18の分泌において、どのような相違点をもつのかをダニの主要抗原であるLPSを用いて行った。アルテルナリア抗原においてはオートファジーを誘導する際に、オートファゴソームの形成に関わるLC3-II蛋白の上昇とオートライソゾームの形成に関わるp62の下降が認められるのに対して、LPS刺激群においては、LC3-IIの上昇は認めるもののp62の減少を認めないことが判明した。LPSにおいてはオートファジーは誘導されるものの、オートライソゾームの形成までには至らず、その結果としてIL-18の分泌がなされないのではないかと考えた。