hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
伝統食品の現代化が期せずして招いた食中毒リスクの原因究明

近年の健康志向の影響から伝統的な塩蔵食品の低塩分化がすすみ、その種の食品の細菌及び食中毒菌汚染のリスクが懸念されている。そこで市販の各種の塩蔵食品の食中毒リスクを明らかにすることにした。まず、それら食品の一般細菌数を調べたところ、高塩分の製品よりも低塩分のものの方が10倍程度高かった。また両製品において、食中毒菌の汚染は確認されなかった。さらにそれら食品中での食中毒菌の消長を調べたところ、両種の食品で菌の接種後すぐに死滅した。これらのことから、現在市販されている様々な種類の塩蔵食品は安全性が高いことが明らかとなった。本研究では、わが国に数多く伝わる伝統食品、そのなかでも特に塩蔵食品について、近年の消費者の食嗜好をふまえたその食品の特性と製造および保管の過程での安全性について、細菌学的な視点から明らかにすることを目的としている。元来、塩蔵食品は大量の塩を用いて製造されてきたが、近年の健康志向の高まりからその食品では減塩化がすすんでいる。食品の減塩化は生活習慣病の予防の面では極めて効果的であるが、一方で食品の保存性の面からみればマイナス面が多い。なかでも細菌汚染による食品の腐敗や食中毒菌による健康被害の発生は深刻な問題となっている。本年度は、塩蔵食品の中でも水産物を使用した水産加工食品について広く市場調査を行い、現在製造されているそれら食品の特性について調査を実施した。またそれら食品の取扱および流通における食品管理の段階での食品衛生の現状についても調査を実施した。日本各地から数多くの塩蔵食品が集まる東京都中央卸売市場にて、現在市販されている水産加工の塩蔵食品について調べたところ、これまではイカ塩辛を代表とする塩辛製品が大部分を占めていたが、近年では同じ塩辛でも様々な水産物を使用した製品が数多く製造および販売されていた。またそれら食品では、塩の使用量が伝統的な製法の塩蔵食品とは異なり、かなり少ない量の塩で作られていた(食品の塩分濃度が5%以下)。そのことによってそれら食品の保存性が低下することから、それら塩蔵食品の保存環境は要冷蔵が求められており、伝統的な製法で製造された塩蔵食品の室温保存とは明確に異なっていた。さらにそれら食品の理化学的特性を調べたところ、塩分濃度が5%以下と低く、水分活性が0.88以上と高いことが分かった。それら食品において塩分濃度が低く、また水分活性が高いということは細菌汚染のリスクが高くなるということであり、極めてリスクの高い食品であること考えられた。本研究では、わが国に数多く伝わる伝統食品、特に塩蔵食品に着目して、近年の消費者の食嗜好をふまえたその食品の特性と製造及び保管の過程での安全性について、細菌学的な視点から明らかにすることを目的とした。元来、塩蔵食品は大量の塩を用いて製造されてきたが、近年では減塩化が進んでいる。食品の減塩化は生活習慣病の予防には効果的であるが、一方で、食品の保存性の低下を招くことから、食品の腐敗や食中毒などのリスクが上昇すると考えられる。故に、低塩分化した伝統食品の細菌性食中毒のリスクについて検討することとした。伝統食品の代表格である塩蔵食品の中でも、特に水産加工食品の塩辛類について市場調査を行い、現在市販されているそれら食品の特性について調査を行った。近年では製品の多様化が進み、様々な魚介類を使用し、また様々な調味料を添加した製品が製造されていた。元々、伝統的な塩辛では高濃度の食塩を加えていることから常温で長期間の保存が可能であり、それによって醸成された食品であったが、近年の製品の大部分は低塩分であることから、食品中での細菌の制御が不十分になり、醸成が十分に行われない和え物風の食品になっている。そのことから、食品中で不足する旨みを補う目的で様々な調味料が添加されていた。細菌学的な解析において、低塩分の各種の塩辛では食中毒菌の汚染は確認できなかったが、一般細菌数において比較的高い菌数が確認され、さらに常温保存が続いた状態ではそれが100倍以上に増加しており、細菌汚染リスクの高い製品であることがわかった。一方で、高塩分の各種の製品でも食中毒菌の汚染は確認されず、また一般細菌数は低塩分の製品よりも10倍程度低かった。さらにその製品を常温に保管した場合でも、一般細菌数の上昇は確認されなかった。これらのことから、近年の市販塩蔵食品は製造及び管理において、特に注意する必要があると考えられた。本研究では、近年の消費者の健康意識の向上を背景とした食嗜好の変化がもたらす新たな健康リスクに着目している。イカ塩辛を代表とした塩辛類は最も人気のある塩蔵食品であるが、近年になって様々な塩辛製品が開発され、製造販売されている。

そこでそれら食品について市場調査を実施し、様々な魚介類を使用した製品が市場で人気を博していることが確認できた。さらにそれら食品の理化学的な特性を調べて特徴を明らかにすることができた。食品微生物学これまでに実施した結果から、新たに様々な塩辛製品が製造されていることが分かった。それらの食品では塩分濃度が低く、水分活性が高いという特徴を示し、一往に同じ特性であった。またそれら食品の微生物汚染及びそれら食品中での微生物の挙動に関する知見は限定的である。これまでの伝統的な塩蔵食品とは異なるそれら食品について、今後は食中毒リスクを明らかにするために細菌学的な研究を展開する。所属研究機関の異動による研究環境の変化から若干の研究計画の変更があった。本年度においては、地域の伝統食品の市場調査及び取扱の衛生環境の視察を重点的に実施した。また入手した塩蔵食品の市販品についての特性を調べることはできたが、細菌汚染の実験が十分に実施できなかった。次年度以降も継続して市場調査および入手した食品の理化学的な特性を調べる。さらに、本年度に実施が不十分であった市販塩蔵食品の細菌汚染リスクについて、食品の安全性の重要な指標となる細菌汚染の実態を明らかにし、それら食品における微生物制御法の確立へと繋げることを計画している。
中枢神経系における内因性ジギタリスを介した高血圧発症メカニズムの解明

内因性ジギタリス(EDLF)が末梢組織だけでなく中枢神経系にも存在することが報告されている.特にウアバインは視床下部に存在し,脳内のレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系(RAAS)がその分泌の調節に関与することが報告されている.今回,視床下部不死化細胞を用いて,ウアバインとは異なるブファジエノライドの属すると思われる候補物質の分泌を認めた.さらにブファジエノライドに属するマリノブファゲニンとその関連物質であるマリノブフォトキシンの副腎からの分泌にアンジオテンシンが関与していることを明らかにした.中枢での新規のEDLFの存在の可能性と内因性ジギタリスの中枢、末梢組織の分泌においてRASSが重要な役割をはたしていることを明らかにした.内因性ジギタリス(EDLF)が末梢組織だけでなく中枢神経系にも存在することが報告されている.特にウアバインは視床下部に存在し,脳内のレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系(RAAS)がその分泌の調節に関与することが報告されている.今回,視床下部不死化細胞を用いて,ウアバインとは異なるブファジエノライドの属すると思われる候補物質の分泌を認めた.さらにブファジエノライドに属するマリノブファゲニンとその関連物質であるマリノブフォトキシンの副腎からの分泌にアンジオテンシンが関与していることを明らかにした.中枢での新規のEDLFの存在の可能性と内因性ジギタリスの中枢、末梢組織の分泌においてRASSが重要な役割をはたしていることを明らかにした.中枢神経系に内因性ジギタリス(EDLF)特にcardenolide属するにouabain (OUA)が視床下部に存在することを免疫組織染色を用いて我々は以前に報告している.その生理作用はLeenenらのグループが中枢でのOUA分泌が交感神経の亢進を介して血圧上昇することを報告しており,その調節に脳内のレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系が深く関与することが報告されているが,その詳細はまだ十分解明されていない.その原因として,視床下部の確立された培養細胞がすくなくOUAの視床下部での産生・分泌メカニズムが解明されていない.我々は,市販されているマウス視床下部不死化細胞株(N1細胞)からELISAと高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を組み合わせてOUA分泌を確認した.さらにその分泌がアルドステロンで増加し,その分泌をミネラロコルチコイド受容体(MR)阻害剤であるエプレレノンで抑制したことを確認し報告した.今回の我々の発見は,いまだ十分解明されていない視床下部からのOUAの分泌・産生メカニズムの解明のための重要なツールとなると思われる.内因性ジギタリス様物質(EDLF)がナトリウムポンプ活性を抑制することでカルシウムイオン濃度を上昇させ血管平滑筋を収縮させ,脳内では交感神経活性を亢進させることで血圧を上昇させると考えられている.EDLFは主に副腎で分泌されているが,規床下部,下垂体にも存在し,末梢ではマリノブファゲニン(MBG)やその関連物質であるマリノブフォトキシン(MBT)が,中枢ではウアバイン(OUA)が主に作用していると考えられている.中枢でのOUAの存在や分泌調節因子の検討はラットを中心とするモデル動物で解明されてきているが,外因性の要素を取り除いた培養細胞系での報告はない.さらに中枢におけるMBGの検討は少なく,視床下部不死化細胞株を用いEDLFの候補物質であるマリノブファゲニン(MBG)が視床下部に存在の検討とOUAの視床下部での分泌調節因子の検討および副腎でのEDLFの分泌調節との関連を明らかにすることを本研究は目的とした.視床下部不死化細胞株からMBG様免疫活性物質の分泌をELISA用いて確認した.さらにその中心物質の検討を液体クロマトグクフィー(HPLC),質量分析(LC/MS)を用いて検討を行っているが,MBG,MBT,OUAと異なる物質の存住が碓認された.中枢でのOUAの分泌因子として視床下部不死化細胞株を用いた検討でもレニン・アルドステロン・アンジオテンシン系が関与することを示唆するデータが得られた.これらに基礎的データをもとにさらに副腎でのMBG様免疫活性物質の分泌にもアンジオテンシンが関与することを確認しており,今後中枢、末梢両組織を用いEDLFの産生・分泌機構の解明を行う予定である.
高磁場MR装置を用いた炭素同位体測定による新たな臨床評価指標の確立

本研究課題では,炭素同位体を用いたMR診断における新たな臨床評価指標の確立を目指した.基礎的な検討として,600MHz NMR装置および超変極装置を用いることにより,がん細胞における炭素化合物の代謝を測定した.また,臨床応用への一歩として臨床用3T MR装置で使用できる炭素,水素用の表面コイルの作成と評価を行った.新たな臨床指標の確立には至らなかったが,炭素化合物の特性および臨床機における炭素測定の特性を解析することができた.本研究課題では,炭素同位体を用いたMR診断における新たな臨床評価指標の確立を目指した.基礎的な検討として,600MHz NMR装置および超変極装置を用いることにより,がん細胞における炭素化合物の代謝を測定した.また,臨床応用への一歩として臨床用3T MR装置で使用できる炭素,水素用の表面コイルの作成と評価を行った.新たな臨床指標の確立には至らなかったが,炭素化合物の特性および臨床機における炭素測定の特性を解析することができた.本年度は実験装置使用期限の関係もあり,当初の予定を変更して過偏極した炭素化合物の特性とがん細胞に投与した際の代謝物変化について検討した.過偏極にはHypersense(Oxford)を用い,NMR測定装置にはDRX600(Bruker)を用いた.使用したがん細胞は,C3Hマウス由来のFM3Amammary carcinomaである.がん細胞はRPMI1640培地を用いて48時間培養したが,その際にグルコースのない培地も作成してその有無による代謝の違いを比較した.また,培養時に抗がん剤である5FUを投与したものと,対照群としてUracilを投与したものも作成・測定し,その変化を観察した.種々の炭素化合物のT1値を測定した結果,以下のようになった.1-13C-Pyruvate=51.5±0.8sec,1-13C-Glycine=42.9±0.5sec,1-13C-Acetate=51.5±1.3sec,1-13C-Glutamate=17.6±0.1sec,1-13C-Glucose<2sec.特にグルコースはTI値が非常に短く,過偏極の対象にはなりにくいことが示されるとともに,1-13C-PyruvateやAcetateが良い対象になることが示唆された.1-13C-Pyruvateを培養細胞に投与した結果,Pyruvateの投与と共にLactateの代謝が観察された.これらの運度定数をDayら(Nature medicine,2007)の理論式を元に算出すると,5FU投与群とUracil投与群でほとんど差がないこと,およびグルコースなしでの培養の場合はグルコース有りに比してLactateの速度定数が非常に長いことが示された.これらは,炭素化合物を用いた代謝状態の可視化の可能性を示唆するものであると考えられた.本年度は,13C高感度測定法開発の一環として,臨床用3T MRで使用可能な1H-13C表面コイルの製作を行った.従来使用していたコイルは,深部まで十分な感度を維持することが困難であった.そこで,本コイルでは1Hおよび13C用のそれぞれのエレメント径を大きくすることにより,より深部における感度向上を図った.また,1H用エレメントを8の字型に配置することにより,1Hと13Cの磁気的結合を物理形状で切断することとした.結果としてデカップラー使用時の性能向上が可能であった.製作に必要なケース用材質選定のために,樹脂材料やスポンジ材料等で評価実験を行った.その結果,樹脂材料では13C測定においていくつかのピーク信号が見られ,アーチファクトとなることがわかった.そこで,13C測定において不要信号を出さない材質としてスポンジ材料を選定しコイルケースを作製する結論となった.また,これに防水処理のためのディッピング塗装を行う必要があるため,強度・加工の容易さも含めて勘案して一つの材料を選択し,コイルを作製した.本コイルの完成により,従前よりより深い位置まで感度域を持ち,かつ高感度な13C測定が可能となった.また,RF負荷時のコイル温度上昇試験も行ったが,エレメントや給電点での温度上昇なども見られず,一般的な使用においては十分に安全性が担保されることが示された.本成果により,臨床評価指標の確立に向けた基盤が整備された.本年度は,1)臨床用3TMR装置を用いた13C測定の最適化,および2)新たな代謝評価のための新規13C標識化合物の検討を行った.本学設置の臨床用3TMR装置で使用可能な13C-1Hコイルは,前年度作成したものを用いた.測定対象は13C標識化合物の水溶液あるいはサラダ油のファントムとした.本コイルを用いる際の最適送信・受信ゲインの探索および領域選択法(コイル感度域による選択およびISIS法)の比較を行った.その結果,最適ゲイン設定法を構築するとともに,ISIS法では感度が低く3Tの臨床用装置での領域選択は非常に困難であることがわかった.そこで,今後の測定はコイル感度域を全て用いた測定を行うべきであり,最初のポジショニングおよびコイルの設定が非常に重要であることが示唆された.また,プロトンデカップリング手法についても評価したが,臨床用装置では十分なパワーを入れることができずに測定値が安定せず,被験者の安全性も十分に確保できない状況のために定量評価を行うには不十分であるとの結論に達した.

新たな代謝評価を行うために,GMPグレードの1-13C-L-Phenylalanineを入手し,そのスペクトルを観測した.フェニルアラニンは神経伝達物質としての役割を持つ必須アミノ酸に一つであり,これから生成されるノルエピネフリンとドーパミンによって刺激を伝達する.蒸留水に溶解した0.2Mのファントムを作成し,臨床用装置で測定したところ174.24ppmの単一スペクトルが観測でき,測定できることが確認でした.生体での検討はできなかったが,新たな代謝評価指標の一つになり得る可能性が示唆された
日本語音声の自然性を決定づける音響特徴の解明

非日本語母語話者が発声した日本語音声の自然性に関わる音響特徴を明らかにすることを目的とし,日本語,中国語,韓国語,タイ語,ベトナム語,フランス語母語話者が発声した日本語音声を,日本語母語話者に呈示し,発声の正誤判定および自然性の5段階評価を行わせた。発声が正しいと判断された音声について,相対時間長,相対強度,相対基本周波数,相対VOA(Voice Onset Asynchrony)を求め,重回帰分析を行ったところ,母語による相異はあるものの,母音の時間長およびF0パタン,発話リズムが非日本語母語話者の発声した日本語音声の自然性に関与していることが示唆された。日本語として自然に聞こえる音声の音響特徴量を,音響解析および知覚実験の手法を用いて解明することを目的とし,平成26年度は以下の2点において研究を進めた。1.日本語母語話者・非日本語母語話者の日本語音声の音響特徴の解析音声の自然性に関わる音響特徴を特定するため,自然性の高い日本語母語話者の音声と自然性の低い非日本語母語話者の音声を解析し,両者の音響特徴の差を明らかにした。申請者らが分担者として参画し,構築した日本語音声コーパスから日本語母語話者10名と非日本語母語話者40名(韓国語・タイ語・ベトナム語・中国語母語話者各10名)が発話した2モーラ長および3モーラ長の単語音声を抽出し,両者の音響特徴を解析・比較した。音響的特徴として母音の相対時間長,相対強度,相対対数基本周波数を取り上げた。解析の結果,母語によって日本語母語話者と差のある音響特徴が異なり,母語によっては二つ以上の音響特徴において差があった。また,母音の位置によって日本語母語話者と差のある音響特徴が異なることが明らかになった。得られた結果を日本音響学会等にて発表した。2.日本語音声の自然性の知覚実験:評定法による予備実験音声の自然性の許容範囲を大まかに特定するため,評定法による音声知覚実験を行った。愛知淑徳大学聴覚情報実験室にて実施し,日本語母語話者の評価データを得た。今後は,引き続き音声知覚実験の予備実験を行い,大まかな自然性の許容範囲を推定する。その結果に基づき,自然性の許容範囲をより詳細に特定するため,一対比較法を用いた本実験を行う予定である。日本語として自然に聞こえる音声の音響特徴を,音響解析および知覚実験の手法を用いて定量的に解明することを目的とし,平成27年度は下記の2点において研究を進めた。1.フランス語・英語母語話者の日本語音声の音響的特徴の解析:前年度に解析・実験を行ったアジアの諸言語母語話者計40名のデータに,フランス語・英語母語話者各10名の日本語音声データを追加し,前年度と同じ手法で音響解析を行った。フランス語・英語母語話者の日本語音声は特に相対周波数および相対強度において,日本語母語話者とも韓国語・中国語・ベトナム語・タイ語母語話者とも異なるパタンを示すことが明らかになった。研究結果をInternational Congress of Phonetic Sciences(ICPhS2015), International conference on Second-Language Speech (New Sounds),日本音響学会聴覚研究会で発表した。2.日本語音声の自然性の知覚実験:日本語母語話者を対象に,非母語話者音声の自然性の評価実験を行った。非日本語母語話者の発声した音声を,日本語母語話者32名の実験参加者にヘッドホンでランダム順に呈示し,日本語としての自然性を「とても自然」から「とても不自然」の5段階で評定させた。この評定値が4以上の刺激を「日本語として自然である」とみなし,その音響特徴の値を境界値として,自然性の大まかな許容範囲を求めた。韓国語母語話者が発話した音声の自然性に関する結果を,日本音響学会,ECP2015にて発表した。今後は,得られた自然性の許容範囲をより詳細に特定するため,音響特徴を変化させた刺激連続体を用いて知覚実験を行う。フランス語・英語音声データの追加に伴う,データの再解析等に時間を要したため,平成27年度後半平成28年度前半に予定していた一対比較法による知覚実験の着手が遅れた。一対比較法による日本語音声の自然性の知覚実験は平成28年度前半に実施する。以上のことから,本研究は当初の計画からやや遅れているといえる日本語音声の自然性を規定する要因を音響解析および知覚実験の手法を用いて定量的に解明する目的で,平成28年度は次の3点において研究を進め成果を得た。1.音響特徴の追加・検討:リズムによる自然性への影響をより詳細に見るため,隣り合う母音間の開始時点の差(Voice Onset Asynchrony,VOA)を新たに解析対象として追加し,自然性への影響を検討した。2.自然性の評価:フランス語,韓国語,中国語,タイ語,ベトナム語,日本語を母語とする話者各10名が発声した日本語音声について,日本語母語話者22名が1発声の正誤判断と2音声の自然性の5段階評定をした。発声が「正しい」と判断された場合の音声の評定平均値を「自然性評定値」とし,自然性判定のため指標の一つとして用いた。3.重回帰分析による自然性を規定する要因の解明:キャリア文を含む全ての母音において,時間長,強度,基本周波数(F0),およびVOAを計測し,それぞれ全体に対する相対値を求めて音響特徴量とした。自然性評定値が平均以上であった日本語

母語話者の音声の母音毎に各音響特徴量の平均を求め,これを基準とする非日本語母語話者の各音響特徴量のRMSE(Root Mean Squared Error)を音声毎に求めた。これら4種の音響特徴量(相対時間長距離,相対強度距離,相対F0距離,相対VOA距離)を独立変数とし,自然性評定値を従属変数として強制投入法による重回帰分析を行った。以上の結果から,日本語音声の自然性を規定する音響特徴として相対時間長,相対F0,相対VOAが有効であることが明らかになった。言語別にみると,フランス語話者,韓国語話者,タイ語話者ではF0パタン,中国語話者は発話のリズムや母音の長さ,ベトナム語話者は母音の長さがそれぞれ日本語音声の自然性低下の要因になっていることが示唆された。非日本語母語話者が発声した日本語音声の自然性に関わる音響特徴を明らかにすることを目的とし,日本語,中国語,韓国語,タイ語,ベトナム語,フランス語母語話者が発声した日本語音声を,日本語母語話者に呈示し,発声の正誤判定および自然性の5段階評価を行わせた。発声が正しいと判断された音声について,相対時間長,相対強度,相対基本周波数,相対VOA(Voice Onset Asynchrony)を求め,重回帰分析を行ったところ,母語による相異はあるものの,母音の時間長およびF0パタン,発話リズムが非日本語母語話者の発声した日本語音声の自然性に関与していることが示唆された。平成26年度の研究実施計画で挙げた2項目すべてについて着手し,研究成果を学会等で報告した。また,交付申請書の「研究の目的」で挙げた4項目のうち,すでに3項目に着手しており,平成27年度中に研究成果を学会等で報告する予定である。以上のことから,本研究は当初の計画通り,おおむね順調に進展しているといえる。研究計画書に従い,平成28年度は下記を実施する。1.日本語音声の自然性の知覚実験(一対比較法による実験):評定実験により推定された大まかな自然性の許容範囲を,より詳細に特定することを目的とし,一対比較法を用いた知覚実験を行う。2.日本語音声の自然性を規定する要因と許容範囲の総合的理解および自然性の定量的予測モデルの構築:知覚実験で得られたデータから,自然性に対する各音響特徴の影響の強さを特定し,音響特徴間の相互作用を解明する。その結果を踏まえながら,日本語音声の自然性を規定する要因と許容範囲の総合的理解を目指す。研究結果を国内外の学会で発表し,そのフィードバックをもとに,論文を学術雑誌へ投稿する。音声科学研究計画調書に従い,平成27年度は下記を実施する。1.日本語音声の自然性の知覚実験:評定法による予備実験前年度に引き続き予備実験を実施する。2.日本語音声の自然性の知覚実験:一対比較法による本実験予備実験で推定された大まかな自然性の許容範囲を,より詳細に特定することを目的とし,一対比較法を用いた本実験を行う。先に推定した許容範囲の重心を求め,その重心から許容範囲外の領域まで,予備実験よりも細かなステップで各音響特徴を変化させた刺激連続体を,音響特徴の多次元空間内に放射状に配置する。日本語母語話者に刺激連続体上の刺激対をランダム順にヘッドホンで提示し,日本語としてより自然に聞こえる刺激を二肢強制選択させる。その二肢強制選択のデータから,反応率が50%となる音響特徴の値をロジスティック回帰分析によって解析的に求め,自然性の詳細な許容範囲とする。
歴史における周縁と共生-疫病・触穢思想・女人結界・除災儀礼-

本研究は、日本の歴史のなかで女性の周縁化(地位の劣化)が進行していく過程を、女性の身体に対する認識の歴史的変化に着目しつつ、医学・衛生・宗教・地域・出産/月経という主として五つの側面から検討を加えた。伝統的医学と近代医学それぞれの女性身体観、近代衛生政策における女性役割の位置づけ、仏教と神道の女性認識の変遷、血穢などに対する地域社会の対応の形成等について明らかにしえた。(1)男女の生理的・身体的差異、特に女性の出産や月経に伴なう身体性が穢と意識されて女性の地位の周縁化にどのような影響を与えたかを明らかにする。具体的には感染症や出産、尼、遊女、祭礼などを取り上げて、広く事例を分析する。(2)上記の意識がその後も女人結界や女人禁制に帰結していった歴史的実態を明らかにする。本年度は3回の研究会と4回の現地調査を実施するとともに、伝統習俗に関するアンケート調査を実施した。また科研活動を班員全員で共有するため、ニューズレターを発行した。・第1回研究会・調査(2008,6/7-8);脇田晴子氏「古代中世の触稼と女人禁制」、武藤康弘氏「奈良の伝統的祭礼と女性」の研究報告を行う。調査は奈良県大峰山の女人結界門を中心に、山岳修験と女人禁制の関係について考察を深めた。・第2回研究会・現地調査(2008,10/25-27);東京で鈴木正崇氏「熊野信仰と湯立て神楽」、野村伸一氏「広大論-東アジアの儺者たち」、梅澤ふみ子氏「江戸時代における富士山の女人禁制と富士講」の研究報告を行う。調査は富士講関係の史跡について、山梨県富士吉田市内を中心に行う。山岳信仰と女人禁制との関係の考察を深めた。・第3回研究会・現地調査(2008,12/20-23);研究会報告は栗山茂久氏「西洋医学再考-汚れ意識のゆくえ」、調査は沖縄の葬送儀礼・巫女を中心に行った。死穢や女性の穢れに対する意識の、西洋と日本、また同じ日本でも沖縄と本土との相違について考察を深めた。・第4回現地調査(2009,2/10-12);鹿児島県南さつま市の疱瘡踊を中心に調査した。女性が除災儀礼の主役として活躍する背景について今後考察するための好例となった。・アンケート調査は、現在の祭礼や生老病死にかかわる儀礼の中に、穢意識や女性排除がどのような形で残存しているのかを調査した。有効回答数73通。すでに実体験としてこれらの儀礼を経験している人は少ない。しかし今後の調査地選定の参考としていく。東北・北陸地域の、感染症・死穢・女性の稼にまつわる習俗の現地調査を3回に分けて行った。また出産・感染症・死・神道と穢をテーマに4回研究会を行った。研究成果の共有のため、ニューズレターを5回発行。[現地調査]第1回(5/3-5)は青森県恐山菩提寺とむつ市内を、近世・近代民衆の死生観変容について考察するために梅澤富美子氏の案内で調査。第2回(10/23-25)は仙台市歴史民俗資料館学芸員佐藤雅也氏の案内で、同資料館にて病気平癒等の絵馬を調査するとともに、生出森八幡神社神楽・早池峰岳神楽・雄勝法印神楽上演を見学。下倉集落で中世以来続く結城大本家の神棚や同族団墓地を調査。第3回(12/26-27)は石川県立歴史博物館(金沢市)見学と、森まゆみ氏の案内で七尾市内の女人禁制だった酒蔵調査、および一本杉商店街にて女性と伝統産業との関わりに関する聞取り調査。[研究会]第1回(6/20-21、大谷婦人会館・キャンパスプラザ京都);加藤美恵子「中世の出産と授乳」、梶谷真司「妊娠・出産・育児における病災論」、脇田修「差別と稼」、久保田優「医学的および社会的観点からみた感染症」、松岡悦子「出産習俗にみる文化」。第2回(7/18-19、キャンパスプラザ京都);中川学「近世の触穢観念と天皇」、酒井シヅ「庖瘡に対する忌避行動から見えるもの」、菅谷文則「唐墓に描かれた男と女」、三枝暁子「近世における北野社門前」、青木純一「予防対策にみる結核へのまなざし」。第3回(10/17-18、キャンパスプラザ京都・メルパルク京都);濱千代早由美「伊勢とケガレ」、瀧澤利行「衛生思想の中の女性」、小林丈広「弓矢町の近世・近代」、福田真人「憧憬と差別と近代日本における結核イメージ史の試み」、鈴木則子「江戸時代の感染症」。第4回(12/19、メルパルク京都);谷口美樹「院政期の服薬と身体」、鈴木則子「江戸時代の女性美と身体管理」、成田龍一「衛生思想の変化のなかの女性と女性観・再論」。

本年度は6回の研究会と3回の現地調査を行い、それらの成果を共有するためにニューズレターを4回発行した。[研究会]病および女性と穢れの関係について、感染症史・仏教史・美術史・民俗学の領域から検討を行った。内訳は以下の通り。第1回(5月22・23日、於東京ガーデンパレス):日本近代・近世の結核史研究報告計4本。第2回(6月27日、於メルパルク京都);女性の穢れと女性表象、胞衣に関する研究報告計3本。第3回(7月24日、於メルパルク京都)中世仏教・近世温泉・近代民俗と穢れに関する研究報告計3本。第4回(10月24日、於東京ガーデンパレス)結核に関する資料紹介及び近代結核史に関する研究報告計2本。第5回(12月18日、於メルパルク京都)身体障害および感染症史に関する研究報告計3本。第6回(1月22日、於奈良女子大学)服飾史・伝染病史に関する研究報告計2本。[現地調査]本年度は山陽・東海・山陰地域に於いて、宗教の中の穢れ意識、感染症に対する差別、近世女性労働の位相などに関わる史跡・施設の見学と、医学史関係資料収集を行った。内訳は以下の通り。第1回(7月810日)岡山調査;吉備津神社・吉備津彦神社・邑久光明園・長島愛生園・津山洋学資料館。第2回(10月10・11日)岐阜調査;内藤記念くすり博物館・鵜飼・明治村他。第3回(11月2830日)島根調査;出雲大社・島根県立古代出雲歴史博物館・石見銀山・沖泊他。1,現地調査;北海道で、前近代のアイヌ・倭人社会における女性の地位、および近代以降の漁業における女性労働の位相の変化について、現地の資料館や史跡を調査した。この調査によって、北海道・東北・東海・近畿・山陰・山陽・九州・沖縄の、信仰や習俗的伝統を残す代表的地域の調査を完了した。2,研究会;各研究分担者・連携研究者全員が、これまでの研究成果を個別報告し、全体討論をすることを通じて考察を深めた。またゲストスピーカーを招いての研究会では、近代天皇制と穢れ、現代の感染症差別の問題について議論した。3,ニューズレターの発行;現地調査報告と研究会報告彙報を掲載した第14号・第15号を発行した。4,研究成果論集の作成;研究成果を総括するとともに、広く他の研究者と成果を共有するための方法として、硬究成果論集を作成し、関連領域の研究者・諸機関に配布した。収録内容は、前半が「感染症へのまなざし」「衛生と近代社会」「女性と宗教」「地域と宗教」「女性と身体」の5部構成で計16本の個別論考、後半は「科研ニューズレター」11号15号。5,研究ショートムービーの作成;より一般の人びとに研究成果を発信する試みとして、研究協力者栗山茂久のもとで、研究内容を視覚化した一人あたり数分間のショートムービーを作成した。ただし、画像資料の著作権の問題があるため、インターネット上で一般公開するには至らず、CDに焼きつけて関連研究者に配布するという形をとった。
振動下での細胞培養実験に基づく細胞の動的力学モデルの構築

本研究では,微小振幅の振動場において軟骨細胞の培養実験を行い,その結果をもとに細胞の力学モデルを構築することを目的としている.細胞は一般に数十ミクロン程度の大きさで機械構造物と比較して極めて微小であるが,内部には多様な機能を有する多くの器官を含んでおり,それらが生存を目的として相互に作用する大規模なシステムとして捉えることができる.本研究ではその考え方を基本として,細胞の動的な力学モデルを求めることで,従来は生化学的な特性に偏りがちであったこの分野の研究に新たな視点を与えることを目指している.平成17年度には,昨年度に引き続きセルサイクルが確立されているHeLa細胞株,およびマウスの骨由来細胞株MC3T3-E1を対象として,振動場下での細胞培養実験を実施し,振動振幅一定の条件で周波数を変化させて実験を行った。振動は細胞の大きさ程度の振幅を基準に電磁加振器により正弦波を与えた.新たに蛍光顕微鏡を購入し,細胞内部の細胞骨格の形成状況を把握し,さらに細胞の弾性係数を求めて粘弾性特性を有する簡易モデルの提案を行った。本研究では,微小振幅の振動場において軟骨細胞の培養実験を行い,その結果をもとに軟骨細胞の力学モデルを構築することを目的としている.細胞は一般に数十ミクロン程度の大きさで機械構造物と比較して極めて微小であるが,内部には多様な機能を有する多くの器官を含んでおり,それらが生存を目的として相互に作用する大規模なシステムとして捉えることができる.本研究ではその考え方を基本として,細胞の動的な力学モデルを求めることで,従来は生化学的な特性に偏りがちであったこの分野の研究に新たな視点を与えることを目指している.平成16年度には,セルサイクルが確立されているHeLa細胞株,およびMC3T3-E1というマウスの骨由来細胞株を対象として,振動場下での細胞培養実験を実施し,振動振幅一定の条件で周波数を変化させて実験を行い,その範囲内で最も影響のある周波数帯は約100ヘルツであることを特定した.振動は細胞の大きさ程度の振幅を基準に電磁加振器により正弦波を与えた.現在100ヘルツのもつ意味について機械力学的考察を加えている.さらに,既存の生物顕微鏡設置可能なマイクロマニピュレーターを購入し,細胞壁の静的および動的特性に関する検討を行った.本研究では,微小振幅の振動場において軟骨細胞の培養実験を行い,その結果をもとに細胞の力学モデルを構築することを目的としている.細胞は一般に数十ミクロン程度の大きさで機械構造物と比較して極めて微小であるが,内部には多様な機能を有する多くの器官を含んでおり,それらが生存を目的として相互に作用する大規模なシステムとして捉えることができる.本研究ではその考え方を基本として,細胞の動的な力学モデルを求めることで,従来は生化学的な特性に偏りがちであったこの分野の研究に新たな視点を与えることを目指している.平成17年度には,昨年度に引き続きセルサイクルが確立されているHeLa細胞株,およびマウスの骨由来細胞株MC3T3-E1を対象として,振動場下での細胞培養実験を実施し,振動振幅一定の条件で周波数を変化させて実験を行った。
機振法の研究

機振法が第二次大戦後のわが国自動車部品工業に及ぼした影響についてとりまとめた.この作業を通じて,なお一層追究さるべき作業仮説として確立したのは以下の3点である.(1)機振法に盛られた産業政策の思想の渕源は,遅くとも商工省による産業合理化運動(昭和4年)にまで溯る.それ以前にも,例えば規格化は大正10年の工業品規格統一調査会(JIS)に始まっていた.個別産業振興のため特別法を策定したのは昭和10年代の業種法に始まる.第2次大戦後には,工業標準化法(昭和26年),企業合理化促進法(同27年)等に盛られた産業合理化の思想と政策とが機振法の下地となった.(ただし,独禁法が存在する点で戦前と質的に異なる面もある. )なお,機振法が法律中に基本計画と実施計画とを盛りこんだ機動的形態を具えているのは,石炭合理化法のスタイルを踏襲したものといえよう.(2)機振法は,企業群一般(例えばいわゆる「中小企業」)一般を対象とせず,自発的に申請した企業の中から一定の資格要件を満たしたものだけを選択的に支援した点で,通常の産業法スタイル(例えば,中小企業近代化促進法)とは大いに異なる.(3)機振法制定・運営の評価にあたっては,通産省特有の組織と意思形成メカニズムとを注目せねばならない.産業を律するタテ糸と機能目的を律するヨコ糸とが組み合わされた通産省の「マトリックス的構造」が,機振法のような総合的性格を持つ法律を効果的に策定・運営し得た根本的理由の一つだったと思われる.さらに,このマトリックス構造と機動的に連携して情報収拾と政策執行のための有効なテコの役割を果たしたのが,業界団体であった.あえて言えば,業界団体が弱体の場合には産業政策は有効に機能し得なかったとすら判断される.機振法が第二次大戦後のわが国自動車部品工業に及ぼした影響についてとりまとめた.この作業を通じて,なお一層追究さるべき作業仮説として確立したのは以下の3点である.(1)機振法に盛られた産業政策の思想の渕源は,遅くとも商工省による産業合理化運動(昭和4年)にまで溯る.それ以前にも,例えば規格化は大正10年の工業品規格統一調査会(JIS)に始まっていた.個別産業振興のため特別法を策定したのは昭和10年代の業種法に始まる.第2次大戦後には,工業標準化法(昭和26年),企業合理化促進法(同27年)等に盛られた産業合理化の思想と政策とが機振法の下地となった.(ただし,独禁法が存在する点で戦前と質的に異なる面もある. )なお,機振法が法律中に基本計画と実施計画とを盛りこんだ機動的形態を具えているのは,石炭合理化法のスタイルを踏襲したものといえよう.(2)機振法は,企業群一般(例えばいわゆる「中小企業」)一般を対象とせず,自発的に申請した企業の中から一定の資格要件を満たしたものだけを選択的に支援した点で,通常の産業法スタイル(例えば,中小企業近代化促進法)とは大いに異なる.(3)機振法制定・運営の評価にあたっては,通産省特有の組織と意思形成メカニズムとを注目せねばならない.産業を律するタテ糸と機能目的を律するヨコ糸とが組み合わされた通産省の「マトリックス的構造」が,機振法のような総合的性格を持つ法律を効果的に策定・運営し得た根本的理由の一つだったと思われる.さらに,このマトリックス構造と機動的に連携して情報収拾と政策執行のための有効なテコの役割を果たしたのが,業界団体であった.あえて言えば,業界団体が弱体の場合には産業政策は有効に機能し得なかったとすら判断される.1.5人の専門家に直接面接して機振法制定当時の事情や運営の実態等を聴取した結果、同法制定とその運営は、通産省と業界諸団体の緊密な協力の下に行われたことが明かになった。機振法の中心、生産設備の新規投資や刷新に対する(日本開発銀行と中小企業金融公庫による)資金の低利融資であるが、実際には市中銀行の協調融資が追加されるため、金額的にもかなり重要な効果を持ち得たものといってよい。通産省等の専門家から技術上の注意が与えられたり、具体的な機種の推薦が行われた場合もあった。2.機振法の国会審議の状況につき、文書調査の報告を受けた。国会審議はごく簡単で、同法の成立(ならびに2回の延長の承認)にかくべつの困難はなかった。むしろ興味深いのは、当時、機振法の効力について制定者自身すら大きな期待は持たなかったことである。3.機振法融資を受けた数社の事例研究を実施した。その結果によれば、機振法の効果は、その付加効果まで含めればすこぶる重要だった。ただ、ミクロ的な効果とマクロ的な効果とは自ずから別個であるから、これらの事例研究の成果をそのまますぐに一般化することは控えなくてはならない。4.第2年度に検討さるべき仮説(例)として次の2点を考慮中である。(1)機振法の機能とそれにもとづく通産省の産業政策の有効性とは、業界団体(例えば日本自動車部品工業会)の機動性と有効性にかかわる。ゆえに、業界団体の機能が劣る場合には産業政策の有効性もまた失われる。

(2)一般に、産業政策のない状態では「市場」が(人為的な介入なしに)機能したと想定しがちだが、これは必ずしも正しくない。機振法が成立したことによって、市場(とりわけ資本市場)の機能が強化された(あるいは可能となった)側面がある。そのかぎりにおいて、産業政策には市場競争創設的効果があった。
花粉の表層構造エキシンおよびポレンコートの形成機構と受粉過程における機能の解析

エキシンは花粉の表層にある硬くて化学的にも安定な構造で、花粉を保護する働きがある。エキシンの立体構造が壊れるシロイヌナズナの突然変異体kaonashiを多数見出し、そのうち12個の遺伝子を同定して、エキシンの形成にはキシランなどの多糖が必要であることを明らかにした。一方、ポレンコートはエキシンを覆う粘着物質である。ポレンコートの主要タンパク質であるEXLとGRPがいずれも花粉の稔性に重要な役割を持つことを示した。さらに、柱頭に接着した花粉のポレンコートの挙動をライブイメージングで観察することに成功した。花粉の表面はエキシンと呼ばれる硬い殻で覆われている。エキシンの構造は極めて多彩であるが、植物種ごとに固有である。このことは、エキシンの構造の構築が遺伝子の制御下で行われていることを意味する。では、どのような遺伝子が働いているのだろうか。シロイヌナズナの花粉は網目状のエキシンを持つ。この網目構造が正常に形成されない突然変異体kaonashiを多数同定し、その原因遺伝子の同定と遺伝子産物の機能解析を進めた。本年度はkaonashi4 (kns4)のおよびkns6を中心に研究を進めた。これらの原因遺伝子を同定した結果、いずれも細胞壁多糖の生合成に関わる糖転移酵素をコードする遺伝子であった。kns4については花粉形成の初期にアラビノガラクタンタンパク質(AGP)の蓄積量が著しく減少していたことから、KNS4はAGPの生合成酵素であると推定された。同時に、AGPがエキシン形成に重要な役割を持っていることが明らかになった。エキシンの網目の内部には、ポレンコートと呼ばれる粘着性の物質が詰まっている。ポレンコートは送粉者への接着、乾燥からの保護、柱頭が同種花粉として認識するための識別分子の保持、柱頭上での吸水の促進など幅広い機能を持つと考えられている。本年度はこの形成機構について解析を進めた。ポレンコートの原料は花粉を取り囲むタペート細胞で生合成され、タペート細胞内にはこれらの物質を一時的に蓄積する特殊なオルガネラ、タペートソームおよびエライオプラストが発達する。シロイヌナズナとセイヨウナタネ用い、両オルガネラの形成過程をGFPを用いた方法でライブイメージングすることに成功した。ポレンコート形成時にはタペート細胞がプロトプラスト化し、葯室内に潜り込んでいく様子も観察された。さらに、シロイヌナズナのポレンコートの主要タンパク質であるEXLがタペート細胞内に蓄積する様子も明らかになった。シロイヌナズナの花粉の表面は網目構造のエキシンで覆われている。その網目が野生型よりも細かくなる突然変異体kaonashi6(kns6)について、原因遺伝子の同定を試みた。高速シーケンサによるリシーケンスで見出された候補遺伝子について、遺伝子導入による表現型の相補の確認や、T-DNAによる遺伝子破壊株の表現型解析(kns6と同じ表現型を示すことの確認)を行い、それが真の原因遺伝子であることを確認した。原因遺伝子KNS6は糖転移酵素をコードすると推定される遺伝子であった。GUSレポーター遺伝子を用いた解析から、KNS6は花粉四分子期から二細胞期まで比較的長時間に渡り、タペート細胞で発現していることがわかった。KNS6は細胞外の多糖性マトリクスの形成に寄与することが期待されたため、多糖を認識する特異抗体を用いて発達初期の花粉の免疫染色実験を行った。その結果、野生型ではエキシンの形成に先行して多糖による柱状の構造が等幅・等間隔に構築される様子が観察できた。一方、kns6突然変異体ではその構造が細く密になり配置も乱れていた。この結果より、エキシンの形状を決める際には多糖性マトリクスが重要な働きをしていることが明らかになった。kns6と同様の表現型を示すkns3突然変異体についても免疫染色実験を行い、やはり多糖性マトリクスの構造が異常になっていることを確認した。エキシンが薄くなるkns4についても解析を進め、原因遺伝子KNS4がコードする酵素の活性を生化学的に証明することに成功した。花粉表層のエキシン層が押しつぶされたような形状になるシロイヌナズナの突然変異体kaonashi20(kns20)について重点的に解析を行った。ファインマッピングおよび高速シーケンサを用いたリシーケンスによりkns20の原因遺伝子を同定した。複数のアリルが同じ表現型を示すことも確認した。原因遺伝子がコードしていたのは、おそらく何らかの多糖の生合成に必要であると推定される酵素であった。GUSレポーター遺伝子を用いた解析から、KNS20遺伝子は四分子期前後のタペート細胞で発現していると推定された。

アニリンブルー染色したサンプルの共焦点レーザー顕微鏡観察、および透過型電子顕微鏡による観察から、kns20の花粉四分子は野生型よりもカロース壁が薄く、さらにプライムエキシン層(四分子内の小胞子とカロース壁の空間で、エキシンが発達する場所)にも異常が認められた。KNS20はおそらくカロース壁やプライムエキシン層の形成に必要なのだろう。このほかのkns突然変異体についても高速シーケンサを用いた原因遺伝子の同定を進め、kns3、kns19、kns23、およびkns27の原因遺伝子を決定した。このうちkns19はハウスキーピング遺伝子の弱い変異アリルであると推定された。またkns27はkns20のアリルであることがわかり、kns20の原因遺伝子の同定に貢献した。kns3とkns23の原因遺伝子はまだ機能がわからない遺伝子であった。高速シーケンサを用いた遺伝子同定法のノウハウが蓄積し、比較的短時間で遺伝子同定が行えるようになった。1.エキシン形成におけるアラビノガラクタンの機能エキシンが異常に薄くなるkns4突然変異体とその原因遺伝子KNS4について解析を進めた。まずKNS4がアラビノガラクタン生合成酵素であることを実験的に確認した。次に、葯におけるアラビノガラクタンの分布を特異抗体を用いて調べた。その結果、プライムエキシン層(小胞子の表層に形成されるマトリクス層でその中でエキシンが発達する)に多く含まれていることがわかった。このことはkns4のプライムエキシン層が野生型よりも著しく薄いことをよく説明する。さらにkns4のプライムエキシン層ではペクチンも減少していた。KNS4はタペート細胞で発現していた。以上より、タペート細胞で作られたアラビノガラクタンが小胞子の表面に運ばれ、ペクチンとともに十分な厚さのプライムエキシン層を形成することが、正常なエキシンの形成に必要であると結論した。2.高速シーケンサを用いたkns突然変異体の原因遺伝子の同定。ガンマ線や速中性子線を変異原として用いた場合は主に欠失が生じると言われている。遺伝子を破壊する程度が塩基置換よりも大きいため表現型の明瞭な変異アリルの取得が期待できる反面、高速シーケンサを用いたリシーケンスで欠失を検出するのは容易でないため、実施例は少なかった。そこで、今年度はガンマ線および速中性子線で誘導された4個のkns突然変異体についてリシーケンスを行い、原因遺伝子の同定を試みるとともに、欠失を検出するプログラムの開発に資するデータを取得することにした。ラフマッピングであらかじめ推定されていた付近の塩基配列を精査した結果、全ての変異体で欠失が検出され、欠失の長さは4 bp、86 bp、10 kb、および16 kbであった。候補遺伝子について遺伝子破壊株を取り寄せて表現型を観察し、最終的に4個全ての原因遺伝子を同定することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子遺伝学26年度が最終年度であるため、記入しない。エキシン形成に異常を示すkaonashi突然変異体の原因遺伝子の同定が順調に進んでおり、また、ポレンコートの形成機構の解析も進んでいる。初年度としては十分な成果である。kns4、kns6、kns20を中心に解析が進んでおり、原因遺伝子が同定できたことにとどまらず、エキシンの形成がどのようなしくみで進行するかが明らかになりつつある。
網羅的解析手法およびゲノム編集技術による銅苔の重金属耐性・蓄積機構の分子基盤解明

環境負荷の少ない植物を用いた重金属浄化や回収技術の技術発展のためには、ハイパーアキュムレーター種の有する重金属耐性・蓄積機構の解明とその利用が鍵となる。本研究では、銅耐性・蓄積能を有するホンモンジゴケに着目し、トランスクリプトーム情報の収集およびゲノム編集などの実験技術を適用することで、未知である本種の高い銅耐性・蓄積能の背景にある分子機構の解明を目指した。その結果、銅輸送体であるScHMA5を介した細胞内から外への銅の排出機構が、ホンモンジゴケの有する高い銅耐性能に必須であることが明らかになった。当該年度の研究計画に即し、銅耐性・蓄積能を有する銅苔であるホンモンジゴケへのゲノム編集技術CRISPR/Cas9システムの導入を試みた。まず、ホンモンジゴケのU6SnRNAプロモーター配列を用いたガイドRNA発現用ベクターおよび構成発現プロモーターによるCas9発現ベクターを作出した。葉緑体の分裂に関与するFtsZ2遺伝子をターゲットとして、プロトプラストへの一過的発現と再生および薬剤耐性選抜を行うという方法により、表現型(葉緑体の形態)に影響が生じた株を、5割以上の効率で得ることができた。さらに、単離した表現型の変化した株では、ゲノムDNA上におけるターゲット配列近傍にランダムな欠損および挿入変異が起こっていることも確かめた。また、確立した手法では、2種のガイドRNAを用いた数kbpの欠損導入や、他のセン類であるヒメツリガネゴケにおいても適用可能であることも確認している。ホンモンジゴケ原糸体におけるRNAシークエンスについては、まず本種の生育に悪影響が出ないレベルの銅添加(0.8 mM)培養条件で実施したが、銅の存在により顕著に発現誘導される重金属耐性・蓄積に関連する遺伝子を見出すことはできなかった。一方で、構成的に高発現している転写産物群の中に重金属結合能が推定されるタンパク質をコードするものが見出せている。現在は、上記のゲノム編集技術を用いた候補遺伝子の変異導入株の作出および表現系の解析を進めている。初年度の主要な達成目標であるホンモンジゴケへのゲノム編集技術の導入に成功したことから、計画は順調に進んでいると考えられる。また、確立した手法は、目レベルで系統の異なるセン類(ヒメツリガネゴケ)においても適用可能であることも確認済みである。従って本手法はセン類において広く適用できる可能性が高く、例えば非モデルコケ植物種を材料に用いた植物の環境ストレス耐性や進化に関する研究の発展にも貢献できると考えられる。1.前年度から継続して、ホンモンジゴケおよびヒメツリガネゴケへのゲノム編集技術の導入(CRISPR/Cas9システム由来RNA-guided endonucleasesを用いたゲノムDNA上標的配列への変異導入)に関するデータ取得を進めた。さらに、それらの結果を纏め、学術論文として発表した。加えて、実験系の利便性の向上を図るために、ガイドRNAとCas9発現ベクターを一本化したゲノム編集用オールインワンベクターの作出も実施した。2.導入したゲノム編集技術を用いて、ホンモンジゴケの銅耐性機構に関与しうる候補遺伝子の一つである銅輸送体Heavy Metal ATPase 5ホモログ遺伝子(ScHMA5)の変異体株を取得した。それらの解析を進めた結果、野生型のホンモンジゴケと比較して、ScHMA5変異体株では銅耐性能が顕著に低下していることが明らかになった。また、銅含有量を調べた結果、高濃度の銅添加条件において、変異体株では、野生株よりも銅が蓄積されることが明らかになった。これらの結果から、銅輸送体遺伝子を介した細胞外への銅輸送機構が、ホンモンジゴケの高い銅耐性能に貢献していることが新たに示唆された。3.以前に実施した条件より、高濃度の銅処理条件(2 mM硫酸銅添加培地)において24時間処理したホンモンジゴケ原糸体培養株、および寺院の銅葺き屋根下のホンモンジゴケ生育地より採取した茎葉体を対象にRNAシークエンスを行った。ホンモンジゴケおよびヒメツリガネゴケへのゲノム編集技術導入についての結果を、学術論文として発表できた。また、ゲノム編集技術を用いることで、一端ではあるが、ホンモンジゴケの高い銅耐性能に関わる分子機構を明らかにしつつある。従って、研究の進捗は、おおむね順調に進展している状況であると考えられる。1.前年度までに確立および誌面発表した蘚類におけるCRISPR/Cas9システムを用いた標的遺伝子への変異導入法について、より詳細な実験手順を国際的なプロトコル誌に発表した。2.前年度までに見出したホンモンジゴケの銅耐性能に貢献する銅排出型輸送体ScHMA5の機能解析を進めた。ScHMA5の細胞内局在を調べるため、蛍光タンパク質を融合したScHMA5 (Citrine-ScHMA5)を、ScHMA5プロモータ下で安定的に発現するホンモンジゴケ形質転換体を作出し、観察を行った。その結果、ScHMA5は小胞体に局在している可能性が見出された。また、銅添加処理による細胞内局在の影響を調べたが、顕著な変化は観察されなかった。3.上記のScHMA5の細胞内局在の真偽を検証するため、蛍光タンパク質融合ScHMA5発現ベクターを用いたschma5変異体株の相補試験を実施した。

その結果、Citrine-ScHMA5の蛍光シグナルが小胞体に観察される相補株において、schma5変異体で引き起こされた銅耐性能の低下、並びに銅蓄積の上昇が回復することが確認された。従って、小胞体膜に局在するScHMA5が、細胞内から細胞外への銅の排出に関与し、本機構がホンモンジゴケの高い銅耐性能に重要な役割を果たしていることが新たに明らかになった。本研究の遂行により、ホンモンジゴケを研究するための基盤技術の開発と共に、未知であった本種の高い銅耐性能の背景にある分子機構の一端に切り込むことが出来たと考えられる。環境負荷の少ない植物を用いた重金属浄化や回収技術の技術発展のためには、ハイパーアキュムレーター種の有する重金属耐性・蓄積機構の解明とその利用が鍵となる。本研究では、銅耐性・蓄積能を有するホンモンジゴケに着目し、トランスクリプトーム情報の収集およびゲノム編集などの実験技術を適用することで、未知である本種の高い銅耐性・蓄積能の背景にある分子機構の解明を目指した。その結果、銅輸送体であるScHMA5を介した細胞内から外への銅の排出機構が、ホンモンジゴケの有する高い銅耐性能に必須であることが明らかになった。基本的には当初の計画通りに、研究を推進する予定であるが、可能であれば、より高濃度の銅添加処理時におけるトランスクリプトーム解析の実施を予定している。ゲノム編集技術に関しては、確立した手法におけるオフターゲット効果の度合いを確認し、大きな問題があるようであれば、その低減のための各手法の導入も試みる予定である。これまでに見出している候補遺伝子の機能解析を進め、学術論文として投稿する。さらに、今年度に追加で実施したホンモンジゴケのRNAシークエンスの結果が良好であれば、銅耐性および蓄積への関与が想定される候補遺伝子の探索を進める定である。植物細胞分子生物学試薬消耗品類購入費には足りない程度のごく少額の残金が生じた。今年度の納品が間に合わないものがあったため次年度使用額が生じた。当該年度に生じたごく少額の残金は、翌年度の試薬消耗品類の購入に企てる。当該年度に生じた残金は、翌年度の試薬、消耗品類の購入に企てる。