hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属延性破壊の中性子による内部構造計測に基づく高精度せん断加工解析システムの構築

本研究では、実際に単軸引張試験にて延性破壊が発生した時点との対比により限界ダメージ値を同定する手法、及び亀裂発生を表現する弾塑性FEMに関するアルゴリズム等の最適化を図り、実際にプレス金型によるせん断加工実験結果との対比等をもとに、亀裂発生箇所及び進展方向等せん断変形過程時の材料挙動が予測できることを確認した。また、金属材料(SS400)が変形する際の材料内部構造変化を中性子回折により延性破壊に至るまで連続的に観察し、材料の局所くびれ変形過程による板幅減少、板厚減少後の破断に至る過程を(110)結晶粒群の体積分率の変化として中性子線回析により捉えることができることを明らかにした。平成26年度の研究実施内容として計画していた弾塑性FEM解析によるせん断加工の解析精度向上に関して、実際のプレス金型における複雑な加工条件下での成形解析に対しても計算が途中で止まることなく成形条件最適化のために有用な解が得られることを確認した。また、中性子源を利用して金属材料歪情報の取得に向けた予備実験として、金属材料変形による集合組織の変化を捉えることができたことから、おおむね順調に進展していると判断している。塑性加工今年度の研究成果を基盤として、実際の金属材料破断に至るまでの変形過程に関する計測方法の高度化によるせん断加工の弾塑性FEM解析精度向上を図るために、材料試験片に対して引張変形を与えると同時に中性子を照射して延性破壊する部位の歪変化等微視的観察をもとに延性破壊発生(限界ダメージ値)を同定する。さらに、材料せん断変形に対して材料試験等による成形実験計測対解析結果との精度比較検証をもとに高精度せん断加工解析システムを構築する。平成25年度の研究実施内容として計画していたFEM解析に適した延性破壊条件式を明らかにすることに関して、延性破壊条件式により延性破壊とする閾値(限界ダメージ値)の同定方法を構築し、その限界ダメージ値を使用したFEM解析にて実際のせん断加工実験結果との精度比較検証ができたことから、おおむね順調に進展していると判断できる。せん断加工解析のために必要とされるプログラムモジュール開発に関するコーディング及び解析作業等を行なう補助研究員確保のための人件費及び物品購入予定額と実績額に若干の差異が発生した。弾塑性FEMに関しては、今年度の研究成果を基盤として、現状の亀裂発生の表現方法に関する解析精度上の問題を解消するために、新たなアルゴリズムを検討する。また、中性子による計測技術に関しては、パルス中性子イメージングの実現に向けた装置開発を継続するとともに、塑性変形を与えた被測定物を準備して材料結晶歪等塑性変形の解析に重要な情報の計測を試みる。今年度は、人件費・物品費及び旅費に関する昨年度実績をもとに使用計画を検討し、随時予定額対実績額の推移把握を行なう。せん断加工解析のために必要とされるプログラムモジュール開発に関するコーディング及び解析作業等に対して、本事業開始時より補助研究員を予定していたが、当初の予定通りに補助研究員を確保できなかったために、使用額に差異が発生した。今年度は、昨年度からの継続にて補助研究員を年度当初より確保し、翌年度分の人件費と合わせて使用する計画とする。
岩石のメカノルミネッセンスの機序解明と地震予知への展開

種々の岩石による摺動試験および引張り破断試験における岩石のメカノルミネッセンスを評価した。その結果,石英含有率が大なる岩石ほど発光強度が大であることや窒素ガス雰囲気において窒素のsecondpositivebandの遷移に相当する波長370nmにおいてピークが認められた。したがって,岩石のメカノルミネッセンスには,岩石に加わる応力が岩石中の圧電物質である石英に影響して雰囲気ガスがプラズマ化することが発光の主因の一つと考えられる。1.比較的石英の含有量が多い登米産粘板岩とインド産石英を供試岩石として,雰囲気ガスを,空気,酸素,窒素,アルゴンに変えて岩石のメカノルミネッセンスを評価した。試験した4種類の雰囲気ガスでは,登米産粘板岩とインド産石英のいずれの場合も窒素の場合の発光強度が最も大きかった。また,窒素ガス雰囲気中のすべり摩擦によるメカノルミネッセンスを分光分析した結果,波長370nmにおいて発光強度のピークが認められ,これは窒素のSecond positive bandの遷移に相当することから,窒素雰囲気ガスがプラズマ化していることを示しており,岩石のメカノルミネッセンスには雰囲気ガスのプラズマ化が発光の主因の一つになっている可能性があることを明らかにした。2.別府産角閃石安山岩,兵庫県産玄武岩,高山産斑レイ岩,塩山産花崗閃緑岩,幌満産かんらん岩,ペルー産黄鉄鉱,インド産石英,竹野産流理構造流紋岩,白浜産砂岩,白河産溶解凝灰岩の10種類の岩石を用い,供試岩石に三点曲げにより引張り応力を付与して,メカノルミネッセンスを評価し,引張りによる破壊でもメカノルミネッセンスが生じることを明らかにした。3.岩石の引張り破壊での負荷荷重を計測しながらメカノルミネッセンスを評価した結果,引張り強度が大なるほど発光強度が大になることが判明した。特に,別府産角閃石安山岩,兵庫県産玄武岩,高山産斑レイ岩,塩山産花崗閃緑岩,幌満産かんらん岩,ペルー産黄鉄鉱,インド産石英,竹野産流理構造流紋岩の場合には,発光強度が,石英含有量と引張り強度の積に比例することが明らかになった。この結果より,岩石のメカノルミネッセンスには,岩石の破壊時に加わる応力が岩石中の圧電物質である石英に影響を与え,それにより発光を生じている可能性があることを明らかにした。1.極微弱光分光分析装置内で,別府産角閃石安山岩,兵庫県産玄武岩,高山産斑レイ岩,塩山産花崗閃緑岩,幌満産かんらん岩,竹野産流理構造流紋岩,白浜産砂岩,登米産粘板岩,白河産溶解凝灰岩を供試岩石として,断層の運動であるアスペリティ摩擦を模したすべり摩擦試験を行い,岩石からのメカノルミネッセンスを確認するとともに,発光量を定量的に評価した。また,花崗閃緑岩,角閃石安山岩,溶解凝灰岩,砂岩,流理構造流紋岩については,電子増倍機能付冷却CCDカメラにより,岩石の摺動時のメカノルミネッセンスの観測に成功し,発光領域を特定した。2. X線回折を用いて石英の(1 0 0)面からの回折強度を測定して,石英の含有量と発光強度の関係を調べた結果,花崗閃緑岩,砂岩,粘板岩,流理構造流紋岩は石英が多く発光強度が大であり,斑レイ岩,溶解凝灰岩は石英が少なく発光強度が小であることを明らかにした。3.雰囲気ガスに,窒素,酸素,アルゴンを用いて,それぞれすべり摩擦試験を行った結果,窒素およびアルゴン中でもメカノルミネッセンスが確認された。また粘板岩と石英を供試材料として,雰囲気ガスに窒素,酸素,アルゴンを用いた場合,雰囲気ガスにより発光強度に差異が認められた。4.負荷荷重を変えてすべり摩擦試験を行った結果,負荷荷重が大なるほど発光強度が増大することを明らかにした。また,動摩擦係数を計測して,発光強度と動摩擦係数の関係を評価した結果,動摩擦係数と発光強度には明確な相関関係がないことを明らかにした。第1年度に予定していた岩石のメカノルミネッセンスの検証,岩石のメカノルミネッセンスの発光領域の検出などの研究項目を予定通りに実施することができ,第2年度に予定していた岩石のメカノルミネッセンスにおける雰囲気ガスの影響も明らかにすることができた。1.極微弱光分析装置内に,岩石の周囲のガス置換が可能な試験部を設置して,酸素,窒素,アルゴンガスなどの雰囲気ガスを用いて岩石のすべり摩擦試験を行って,岩石のメカノルミネッセンスの分光分析を行い,発光機構を解明する。2.岩石の破壊時に生じる電磁ノイズの検出を試行して,電磁ノイズとメカノルミネッセンスとの相関関係を明らかにする。また破壊モードが異なる負荷試験を行い,その際に生じる電磁ノイズを検出して,破壊モードと電磁ノイズの関係を明らかにする。

3.大震災後に,断層に引張り応力が作用しているとの報告を受けて,引張り応力負荷での岩石の破壊を模した岩石破壊試験機を試作し,引張りによる破壊時のメカノルミネッセンスを極微弱光分光分析装置で評価する。以上の項目を実施して,実験室レベルでの岩石のメカノルミネッセンスの発生機構を解明し,地震光との相関関係を明らかにする。次年度使用額として3,487円が生じているが,既に3月に納品が完了しており,4月に支払いが確定しているものである。
歯科用合金における腐食挙動のコンピュータシミュレーション

本研究では、歯科用貴金属合金の基礎となるCu-Au、Cu-Pd、Ag-Au、Ag-Pd二元系、Cu-Au-Pd、Au-Ag-Cu三元系合金の腐食挙動(定電位分極および動的分極挙動)を再現するためのシミュレーションモデルを構築した。アノード溶解反応によって、合金の構成原子は合金表面からイオンとなって溶出する。その際の溶出の容易さを示すパラメーターとして溶出確立pを定義うる。溶出シミュレーションは、溶液に接する合金表面の個々の原子を所定の溶出確立で合金から離脱させて行う。溶出確立の値は、成分元素の標準電極電位、純金属の動的分極曲線、溶出する原子と隣接する原子との原子間相互作用の強さを考慮して定めた。さらに、動的分極挙動のシミュレーションでは非貴金属元素の選択的溶出後に合金表面に残留した貴金属元素の表面再配列によるアイランド形成過程を考慮した。Cu-Au-Pd三元系合金においては、原子間相互作用を考慮したシミュレーションモデルによって定電位分極挙動を定性的に再現できた。Cu-Au、Cu-Pd、Ag-Au、Ag-Pd二元系合金においては、原子間相互作用、貴金属元素の表面再配列によるアイランド形成を考慮したシミュレーションモデルによって動的分極曲線を定性的に再現できた。Au-Ag-Cu三元系合金においては、時効処理によって二相状態となった合金の動的分極曲線を、各単相合金の動的分極曲線のシミュレーション結果をそれらの相の体積分率を考慮して重ね合わせることによって再現できた。今回の結果は歯科用貴金属合金の腐食挙動の解明や予測に対して、コンピュータシミュレーションが有効な手段となることを示した。
航空管制における協同と責任の法社会学－ビデオ・エスノグラフィーによる質的研究

本研究は、社会学のエスノメソドロジーと会話分析に依拠したビデオエスのグラフィーの手法によって、法的責任と協同とが伴う制度的相互行為を研究するものである。そこには様々な法制度的な場面における相互行為が含まれるが、航空管制の現場における管制官の相互行為も規範的な制約の中で協同的で複雑な相互行為が営まれる場面であり、その研究対象の一つである。本研究の焦点は、こうした法的・規範的な協同や責任が問題となる制度的場面において、どのように相互行為のメカニズムが協同的に規範的な場面を組み立てているか、そのメカニズムを詳細に分析して法制度の特徴を相互行為論的に描き出そうとするものである。本研究は,ビデオエスノグラフィーの手法,つまり,社会学上のエスノメソドロジーおよび会話分析、また、ワークプレース研究などの最新の研究方法論と研究視点を活用して、航空管制場面における複雑なコミュニケーションとそこにかかわる規範的諸活動の実態を、相互行為論的法社会学の観点から、分析するものである。当該年度は,昨年度とともに、航空管制官教育課程におけるビデオデータ・インタビューデータの収集を施するとともに、各研究者がそれらのデータの分析を行い、研究会を開催して、各自の分析を共有するとともに、学会などで報告を行った。本研究における研究方法論(ビデオエスノグラフィー)をさらに洗練発展させるために,航空管制以外の社会規範の実現がかかわるデータ(法的相互行為など)についての学会発表と論文執筆刊行も行った.詳細は以下の通りである。(1)データの収集。昨年度からの継続として,研究対象の航空管制場面におけるコミュニケーションは高度に専門的かつ複雑であることから、航空管制官の養成教育課程における、シミュレーション場面の撮影を許可されて、ビデオを6台利用して、管制官、副官、パイロット、管制官教師、の間の言語的・非言語的なコミュニケーションを撮影するとともに、管制官のレーダー画面をハイビジョン撮影して、人々の活動とレーダー画面とを、合成した映像を作成し、参与者の諸活動ととテクノロジー操作との相互作用を分析するためのデータセットを複数作成した。また、このデータを閲覧しつつ管制教員に場面を解説してもらう、セッションを複数回開催した。(2)分析と研究会。これらのデータセットを各分担者が分析を進めるとともに、研究会を開催した。研究方法論の開発と共有のために,法的相互行為についての研究を進めることを通じて,分析方法論の発展と,他の制度的行為との比較研究の可能性を追求した.法社会学上のエスノメソドロジーおよび会話分析、さらにワークプレース研究、ビデオ・エスノグラフィーなどの最新の研究方法論と研究視点を活用して、法的・社会的規範との関係において、航空管制場面における複雑なコミュニケーションとそこにかかわる規範的諸活動の実態を、相互行為論的法社会学の観点から分析した。研究対象の航空管制場面におけるコミュニケーションは高度に専門的かつ複雑であるから、航空管制官の養成教育課程における、シミュレーション場面をビデオを6台利用して、管制官、副官、パイロット、管制官教師、の間の言語的・非言語的なコミュニケーションを撮影するとともに、管制官のレーダー画面をハイビジョン撮影して、人々の活動とレーダー画面とを合成した映像を作成し、参与者の諸活動ととテクノロジー操作との相互作用を分析した。さらに、こうした研究方法論の洗練のために、管制以外の制度的場面、特に法的場面(法律相談、反対訊問、法科大学院の臨床教育など)における相互作用を同様の方法論により分析した。このようにして、法社会学の観点から、法的・規範的相互行為としての航空管制のコミュニケーションにおける権利と責任(管制官と副官との言語的・非言語的コミュニケーション、管制官の言語的コミュニケーションとレーダー操作、管制官とパイロットおよび管制官・パイロット・副官との3次元的なコミュニケーションの態様・共同的活動)などの態様について検討した結果、コミュニケーション的な諸規範が、その制度的場面において参加者たちによって確立・変容・利用されるやり方についての知見を得られた。本研究は、社会学上のエスノメソドロジーおよび会話分析、また、ワークプレース研究、ビデオ・エスノグラフィーなどの最新の研究方法論と研究視点を活用して、航空管制場面における複雑なコミュニケーションとそこにかかわる規範的諸活動の実態を、相互行為論的法社会学の観点から、分析するものである。当該年度は、航空管制官教育課程におけるビデオデータ・インタビューデータの収集を実施するとともに、各研究者がそれらのデータの分析を行うとともに、研究会を開催して、各自の分析を共有するとともに、研究報告を行った。詳細は以下の通りである。(1)データの収集。研究対象の航空管制場面におけるコミュニケーションは高度に専門的かつ複雑であることから、航空管制官の養成教育課程における、シミュレーション場面の撮影を許可されて、ビデオを6台利用して、管制官、副官、パイロット、管制官教師、の間の言語的・非言語的なコミュニケーションを撮影するとともに、管制官のレーダー画面をハイビジョン撮影して、人々の活動とレーダー画面とを、合成した映像を作成し、参与者の諸活動ととテクノロジー操作との相互作用を分析するためのデータセットを複数作成した。

また、このデータを閲覧しつつ管制教員に場面を解説してもらう、セッションを複数回開催した。(2)分析と研究会。これらのデータセットを各分担者が分析を進めるとともに、研究会を開催した。そこでは、今後の調査・研究の方向性について、データセットの分析方向、方法、論点、について、関連研究の動向紹介、研究方法論の開発と共有などについて、議論を行った。研究がやや遅れている理由は以下のとおりである。(1)航空管制現場の担当者や上司の移動によって,さらなる調査許諾のための交渉に時間がかかった.また,管制さらなるデータを収集するための、日程調整が、データ提供先との都合などによって、若干の研究上の遅れが生じた.(2)各担当者の他の業務などによって、各担当者が一堂に会する研究会が予定した回数実施することに困難が生じることが多い。今後は、データ提供先との調整方法について、改善の努力をするとともに、遠隔ビデオ電話などによる共同研究会などの可能性も検討することによって、研究の若干の遅れを取り戻すことが出来ると考える.研究がやや遅れている理由は以下のとおりである。(1)さらなるデータを収集するための、日程調整が、データ提供先との都合などによって、遅れている。(2)各担当者の他の業務などによって、各担当者が一堂に会する研究会が予定した回数実施することに困難が生じることが多い。今後は、データ提供先との調整方法について、改善の努力をするとともに、共同研究会を開催し、困難な場合には、遠隔ビデオ電話などによる共同研究会などの可能性も検討することによって、研究の若干の遅れを取り戻す所存である。現在、若干研究・調査上の遅れがあることから、これを回復するとともに、研究目的に沿った行動な研究を進展させる。また,並行して,当該研究で必要な,ビデオエスノグラフィーの分析方法論をさらに進展させるために,管制以外の法的・規範的現象がかかわる相互行為,コミュニケーションの現場で収集したデータも分析して,航空管制調査分析との比較分析も視野に入れる.具体的には、これまで行ってきている,法的相互行為についてのデータ分析と,航空管制の教育場面の理解に基づいて、分析枠組みと重要なトピックの候補を確定して行く。現在までの調査分析で見出されている重要なトピックは、管制官の権利と責任、管制官と副官との言語的・非言語的コミュニケーション、管制官の言語的コミュニケーションとレーダー操作、管制官とパイロットおよび管制官・パイロット・副官との3次元的なコミュニケーションの態様・共同的活動、などである。こうした諸論点について、エスノメソドロジーやワークプレース研究における諸研究の知見を利用しつつ、世界的にもまれな、航空管制官の規範的な諸活動の実態を、詳細な質的分析に基づいて解明する糸口を探りたい。
遺伝子発現制御における転写因子GATA1ネットワークの解明

本年度の研究によって、以下の諸点を明らかにした。1.ノックダウン法を用いたpbrの機能解析:ゼブラフィッシュ初期胚へアンチセンスモルフォリノオリゴを注入し、pbrのノックダウン胚(pbrモルファント)の表現型を解析した結果、低色素性の血球産生による貧血が観察された。pbrモルファントにおいて、ヘモグロビン合成に関わる遺伝子群b-globin、alas-e、aladの発現をin situ hybridization法を用いて解析した結果、野生型との間に有意な差は観察されなかった。2.GATA1の新規標的遺伝子pbrの発現部位の同定:ゼブラフィッシュのgata1変異胚と野生胚を用いたサブトラクション法によりGATA1の標的遺伝子を探索した結果、pbrを単離した。同定されたGATA1の新規標的遺伝子pbrの発現をin situ hybridization法を用いて解析した。盤割期、胞胚期では、細胞全体に発現していた。原腸胚期、尾芽期では低下し、体節期では造血部位および前腎管で発現が観察された。この造血部位での発現は、gata1変異胚で大きく低下したが、前腎管での発現に変化は見られないことが明らかとなった。3.GATA1と相互作用する因子の単離:GATA1と協調的に機能する転写因子を明らかにするために、生化学的手法を用いた相互作用因子の精製・同定を行った。予備的実験として、転写因子Nrf2にFLAG及びHis標識を行った組み換えタンパクを作製し、HeLa細胞の核抽出液を用いて、Nrf2の相互作用因子の精製を行った。その結果、約80kDa及び400kDaの相互作用因子の精製・同定に成功した。1.内在性gata1を再現して発光するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統(Tgと略)の初期胚で、GATA1を過剰発現すると異所性のGFP発現誘導が観察される。このGFP発現誘導を指標として、GATA1の機能ドメイン解析を行ったところ、6ヶ所のリジン残基をアラニンへ置換したGATA1(KA6と略)の過剰発現では顕著に発現誘導が低下することが明らかとなった。2.KA6の6ヶ所のリジン残基のアセチル化の影響を見るために、ヒトp300精製タンパクを用いてアセチル化実験を行った。アセチル化は野生型GATA1(WTと略)とKA6共に起こり、両者の間でアセチル化の程度に有意な差は見られなかった。しかしながら、免疫沈降実験によって、GATA1-GATA1相互作用の検討を行ったところ、KA6の相互作用能はWTに比べて大きく低下することが明らかとなった。3.内因性の組織におけるWTとKA6の機能の差異を検討するために、ゼブラフィッシュgata1変異体の機能回復実験を試みた。gata1遺伝子の制御領域によるWTの過剰発現の結果、gata1の下流遺伝子klfdあるいはurodの発現は回復した。一方、KA6の過剰発現では、WTのような発現回復は見られなかった。4.gata1遺伝子の制御領域上のGATA1の標的配列を明らかにするために、様々な欠失及び点変異構築を用いて解析を行った。その結果、GATA1の過剰発現で観察されるGFP発現誘導には、翻訳開始点約6kb上流に存在する2つ並んだGATA配列の両方が重要であった。さらに、電気移動度遅延法でGATA1のDNA結合能を解析したところ、多量体化したGATA1は単独のGATA配列よりも2つ並んだGATA配列により結合しやすいことが明らかとなった。1.GATA1の二量体形成とp300の相互作用の関係を検討するために、GATA1の6ヶ所のリジン残基をアラニンへ置換したGATA1(KA6と略)とp300の間の相互作用を解析した。その結果、KA6変異は、野生型に比べてp300との結合を低下させた。続いて、リジン残基の置換を前半部の2ヶ所と後半部の4ヶ所に分けたKA2およびKA4変異体を作製し、相互作用の詳細な解析を行った。GATA1の二量体形成は、KA6に比べて、KA2およびKA4の場合に部分的に低下した。これに対して、p300との相互作用は、KA6と同様に大きく低下することが明かとなった。2.GATA1によるgata1自身の活性化におけるKA2およびKA4の効果を検討するため、内在性gata1を再現して発光するトランスジェニックゼブラフィツシュ系統の初期胚に変異GATA1の過剰発現を行った。GFP発現誘導は、野生型に比べて部分的に低下することが明らかとなった。3.gata1変異胚と野生胚を用いたサブトラクション法により同定されたGATA1の新規標的遺伝子pbrの発現をin situ hybridization法を用いて解析した。

pbrモルファントにおいて、ヘモグロビン合成に関わる遺伝子群b-globin、alas-e、aladの発現をin situ hybridization法を用いて解析した結果、野生型との間に有意な差は観察されなかった。2.GATA1の新規標的遺伝子pbrの発現部位の同定:ゼブラフィッシュのgata1変異胚と野生胚を用いたサブトラクション法によりGATA1の標的遺伝子を探索した結果、pbrを単離した。同定されたGATA1の新規標的遺伝子pbrの発現をin situ hybridization法を用いて解析した。盤割期、胞胚期では、細胞全体に発現していた。原腸胚期、尾芽期では低下し、体節期では造血部位および前腎管で発現が観察された。この造血部位での発現は、gata1変異胚で大きく低下したが、前腎管での発現に変化は見られないことが明らかとなった。3.GATA1と相互作用する因子の単離:GATA1と協調的に機能する転写因子を明らかにするために、生化学的手法を用いた相互作用因子の精製・同定を行った。予備的実験として、転写因子Nrf2にFLAG及びHis標識を行った組み換えタンパクを作製し、HeLa細胞の核抽出液を用いて、Nrf2の相互作用因子の精製を行った。その結果、約80kDa及び400kDaの相互作用因子の精製・同定に成功した。
日本列島東北沖深海帯の腹足類に関する分類学的研究

様々な調査航海によって、日本列島東北沖日本海溝の深海域(水深2007500 m)から採集された腹足類標本を分類学的に検討した結果、既存研究のある水深2000 m以浅の漸深海帯から185種、それよりも深い水深帯(深海帯超深海帯)からは173種を認めた。それらの詳細な垂直分布や地理的分布の解析により、幅広い深海域での腹足類の分布様態を明らかにした。広い垂直分布を示す種の多くは深度毎に様々な表現型を示し、それらの詳しい分類学的関係については今後の分子系統的解析が必要となる。また、未記載種と考えられる種が、水深2000 m以深では7割近くを占め、これらの新種記載も今後の課題として残された。本研究の目的は、これまでの調査などによって国立科学博物館に蓄積されている標本と新規採集標本に基づき、本州北東沖の日本海溝を中心とした深海性(漸深海帯から深海帯)腹足類の分類学的研究を行い、最終的に成果を新種の記載を含むモノグラフとして纏めるとともに生物地理的な考察を行うことである。2年目となる24年度では、引き続き蓄積されている標本の検討を進めると同時に、2011年と2012年にJAMSTECによって実施された、「しんかい6500」による三陸沖潜航調査航海で採集された追加標本も検討標本に加えた。また、それらと並行してロシアの博物館や研究所に保存されている標本の調査を行った。まず既存標本の検討では、蓄積標本を精査して種レベルで分別する作業を進めた。具体的には、貝殻の形態に基づいて同定と写真の撮影を行っているが、既に論文として発表している1500m以浅の標本についても、再検討を行っている。特にTrochidaeニシキウズガイ科の一部では、東京大学大気海洋研究所のとの共同研究で分子系統解析に基づく同定の見直しも行っている。海外の博物館の標本調査では、今年度は特に日本海溝周辺の標本が多く蓄積されているロシアの幾つかの博物館と研究所において、標本の調査を行った。すなわち、モスクワのロシア科学アカデミー海洋学研究所ではビーチャジ号によって採集された多くの未同定標本を調べ、幾つかの新たな未記載種を見出した。モスクワ大学動物学博物館ではビーチャジ号採集標本に基づいて日本海溝から新種として記載された多くのタクサのタイプ標本を調べることができ、幾つかの同定の誤りを正し、新たな知見を得ることができた。さらに、サンクト・ペテルブルクのロシア科学アカデミー動物学研究所では、北太平洋と極海から得られた膨大な標本を調べることで、既知の名義タクサとの詳しい比較を行った。3年目となる25年度では、引き続き、蓄積されている標本の検討を進めると同時に、前年度に引き続いてロシアの研究所に保存されている標本の調査を行い、またイギリス自然史博物館に保管されている深海調査船で日本周辺から採集されたタイプ標本などの検討を行った。まず既存標本の検討では、標本を形態学的に精査して種レベルで分別する作業を進めた。種レベルの同定においては、主に貝殻の形態に重点を置き、写真の撮影などを行った。また、Trochidaeニシキウズガイ科の一部(ハズレシタダミ類)では、東京大学大気海洋研究所のとの共同研究で分子系統解析に基づく同定の見直しも行った。海外の博物館の標本調査では、昨年度の調査で日本海溝とその周辺海域の標本が特に多く蓄積されていることが分かったモスクワのロシア科学アカデミー海洋学研究所において追加調査を行い、さらに多くの未同定標本を見出した。ロンドンの自然史博物館では、黎明期に日本周辺の深海域からChallenger号やSylvia号などによって採集され、新種として記載されたタクサのタイプ標本も詳しく検討した。特にSylvia号の標本については、これまでほとんど再検討しておられず、多くの再発見があった。これら海外博物館における標本調査では、フォーカスを変えた多数の画像を撮影し、研究室で深度合成して実際の所蔵標本との比較検討を行った。

最初の年度では、既に蓄積されている標本の検討を進めると同時に、JAMSTECが実施した「しんかい6500」による三陸沖潜航調査航海に参加して、新規標本の採集に努めた。また、それらと並行して海外の博物館に保存されているタイプ標本などの調査を行った。まず既存標本の検討では、蓄積標本を精査して種レベルで分別する作業を進めた。現時点では貝殻の形態に基づいて分類順に整理と写真の撮影を行っているが、既に論文として発表している1500m以浅の標本についても、改めて検討することで、同定を見直したり、また仮に同一種としてまとめていたものを複数の種の複合と認めた例もある。「しんかい6500」の潜航調査では、東北太平洋沖地震の震源地周辺の水深32005500mの海底から新規に44ロットの腹足類標本を得ることができた。これらの多くはこれまでの蓄積標本に含まれない、化学合成群集の構成種であることから、研究対象種の幅を広げることができた。また、得られた標本は99%エタノールで固定・保存することで、形態分類のみならず今後の遺伝子解析に用いることも可能となった。海外の博物館の標本調査では、サンクト・ペテルブルクのロシア科学アカデミー動物学研究所と、ワシントンDCの国立自然史博物館にそれぞれ23週間滞在して非常に大きな成果を上げることができた。多数のタイプ標本を検討することにより、従来同定不詳であった種を確定できただけでなく、それぞれの博物館に保管されている周辺海域の一般標本を調べることで、分類学的な問題が解決された例も多い。本研究の目的は、これまでの調査などによって国立科学博物館に蓄積されている標本と、新規採集標本に基づき、本州東北沖の日本海溝を中心とした深海性(漸深海帯から深海帯の)腹足類の分類学的研究を行い、最終的に成果を新種の記載を含むモノグラフとして纏めるとともに、生物地理的な考察を行うことである。最終年度の26年度では、これまでの4年間に実施してきた分類学的検討の成果を取り纏め、成果を公表することを中心的な課題とした。具体的には、初年度から基本的に分類順に下位のものから進めてきた分類学的検討について、クダマキガイ上科から後鰓類の最後まで進め、全体の種を確定した。その結果、当初の対象とした水深1500mよりも深い水深から得られた種は合計で178種に整理された。このうち、水深1500m付近から出現したものは、Hasegawa (2009)が取り纏めた漸深海帯上部との近似性が高く、種レベルで重複する例が多かったため、漸深海帯下部に当る水深2000mよりも深い水深から出現した160種について、より詳しい研究を行った。その成果について、リソツボ科は周辺海域のものとともに取り纏めて、モノグラフとして出版した。また、エゾボラ属についても現在論文作成の段階にある。それら成果の一部は、ロシアで開催された北西太平洋の軟体動物に関する国際学会において発表し、関連する研究者と情報交換を行った。また、国際会議の会場となったロシア科学アカデミー海洋生物学研究所に保管されている標本についても追加調査を行った。4年の研究期間中に、当初目的とした日本海溝の腹足類相全般のモノグラフの作成は完了することが出来なかったが、幾つかのグループで新種記載を伴う論文を作成準備中である他、すべての種の写真を含めたチェックリストは近年中に出版する予定である。系統分類本研究は4年の計画で、最終的に成果をモノグラフとしてまとめることを目指している。
血管石灰化の進展におけるWntシグナル経路の役割に関する研究

動脈硬化・血管石灰化の発症・進展におけるWntシグナル経路の役割について検討した。Wntシグナル経路が動脈硬化・血管石灰化病変部で活性化されると共に血管平滑筋細胞の骨芽細胞への形質転換に関与していることが明らかにされた。また、炎症刺激が血管壁におけるWntシグナル経路の活性化に重要な役割を果している可能性が示唆された。さらに、細胞老化が動脈硬化・血管石灰化病変の成り立ちに関与している可能性も示された。ヒト血管平滑筋細胞(HVSMC)におけるWntおよびその受容体遺伝子の発現をRT-PCRにより検討したところ、ヒト冠動脈およびヒト臍帯動脈由来の血管平滑筋細胞においてWnt5a,Wnt5b,LRP5の発現が確認された。HVSMCにおけるアルカリホスファターゼ(ALP)の発現および石灰化に対するWnt3aの作用を検討したところ、Wnt3aの単独添加ではALP活性に影響を及ぼさなかったが、活性型ビタミンDとの同時添加では、活性型ビタミンD単独に比し有意にALP活性を上昇させた。また、同時添加でin vitroでの石灰化がvon Kossa染色で確認された。さらに、HVSMCにおけるWntシグナルをTCF/LEFの転写活性で検討したところ、Wnt3aの添加によりTCF/LEFの転写活性はコントロールに比し有意に上昇したが、活性化型ビタミンDとの同時添加では転写活性に対する増強効果は認められなかった。apoEノックアウトマウスの動脈硬化および血管石灰化病変におけるSAβ-galの発現を検討した。プラーク内にSAβ-gal陽性の細胞が認められた。SAβ-gal陽性領域とALP活性陽性領域とが一部一致することから、SAβ-gal陽性細胞が同時にALPを発現する可能性が示唆された。TOPGALマウスの大動脈から血管平滑筋細胞(MASMC)を初代培養した。得られたMASMCを用いて種々の炎症刺激によりWntシグナル経路が活性化されるかどうかについてx-gal染色により検討した。Lipopolysaccharide (LPS) 1μg/mlの添加によりMASMCにx-gal陽性細胞がコントロールに比して有意に増加した。また、LPS添加によりMASMCにおけるアルカリホスファターゼ(ALP)活性が有意に増加した。したがって、LPSはマウス血管平滑筋細胞においてWntシグナルを活性化することによりALPの発現を誘導する可能性が示唆された。このLPSによるALPの誘導はTOPGALマウス由来の平滑筋細胞以外にapoEノックアウト由来の血管平滑筋細胞においても確認された。apoEノックアウト(apoEKO)マウスとTOPGALマウスとを交配することによりapoEKO-TOPGALマウスを作製した。apoEKO-TOPGALマウスは、apoEKOマウスおよびTOPGALマウスと比べて成長にとくに問題はみられていない。現在、apoEKO-TOPGALマウスは18週齢まで達している。35週齢以降で動脈硬化にともなう石灰化病変部でのWntシグナルの活性化について検討する予定である。apoEノックアウトマウスおよびTOPGALマウス大動脈由来の血管平滑筋細胞を用いてLPSによるALPの発現誘導およびその機序について検討した。LPS 1 μg/mlの添加によりapoEKOマウスのVSMCにおけるALP遺伝子の発現が有意に増加した。また、同様の処理によりALP活性の上昇が酵素化学的に証明された。TOPGALマウス由来のVSMCにおいても同様にALP活性の上昇が酵素化学的に確認するとともにLPSの添加によりbeta-galactosidase活性の発現誘導がx-Gal染色により明らかにされた。このことから、LPSによるALPの発現誘導にWntシグナルが関与している可能性が示唆された。22週齢のapoEKOマウスにLPS 50 μgを週1回間歇投与し、10週後にプラーク石灰化に対する作用を検討したところ、LPSによるプラーク石灰化促進作用は認められなかった。また、40週齢以上のapoE-TOPGALマウスの大動脈プラーク病変におけるWntシグナルの活性化をx-gal染色により検討したところ、x-gal染色陽性細胞が動脈硬化性プラーク内に認められ、石灰化病変部ではその周囲にx-gal陽性細胞が確認された。したがって、血管石灰化の発症・進展にWntシグナル経路が関与している可能性が示唆された。
介護保険施設における入所条件についての現状把握とその倫理的枠組みの検討

平成13年度に行なった入所条件要綱の調査のうち、入所評価基準で特徴的だった項目をもとに、質問紙(平成15年度に調査した入所基準および入所評価基準((1)入所希望者の心身の状況、(2)家族・介護者の介護力、(3)在宅生活の可能性、(4)住環境の状況)の作成を行なった。この調査の目的は、老人保健施設ならびに介護老人福祉施設において、どのような実態があるのか明らかにすることである。平成17年度は、質問紙の内容の検討の後、調査を行なった。平成13年度は、文献検索ならびに入所条件要項の収集を行った。文献検索は、医学中央雑誌19972002年の5年間のデータを対象とし、キーワードは「介護保険」「施設」「入所条件」の3つを用いて検索した。その結果、キーワード「介護保険」は3773件、「施設」は3763件、「入所条件」は0件であった。文献検索でヒットした全ての文献を閲覧したところ、本研究と同じ主旨の文献は見当たらなかった。続いて、入所条件の収集については、施設レベルでの収集を試みた。しかし、厚生労働省から出された法令通知(平成14年8月7日老けい発第0807001号:指定介護老人福祉施設の入所に関する指針について)によって、都道府県または市町村において入所指針についての再検討が行われることになった。そのため、従来の入所条件要項の入手が困難となったため、入所指針の公開を待ち、それから入所条件指針あるいは要項を入手することとした。その結果、平成13年12月においては、全国(都道府県もしくは市町村)のうち17ヵ所の地域が入所に関する指針を作成していた。改正内容は、厚生労働省の指針に準じている地域が多く、特に地域性を考慮し独自性を発揮している指針は見受けられなかった。また、そのうち公にWebによる情報開示をしている地域は8ヵ所であった。その他、入所についての優先順位を客観的に判断する手段としては、入所優先度を点数化するスケールを作成している地域があり、実際にそのスケール使用している地域もあった。今後、各地域で作成された指針の共通・非共通性の有無、施設レベルにおける指針の取り扱い、ならびに入所優先度スケールの検討についての調査を行っていく予定である。平成14年度は、平成13年度に収集した入所条件要項を用い各都道府県でまとめられた入所指針についての内容(手続き・評価基準)を検討した。データ収集は、各都道府県ならびに市町村のホームページにアクセスし、Web公開されている入所基準を入手した。結果および考察としては次の通りである。47都道府県のうち、入所指針を公表している地域は、29ヵ所(61.7%)であった。入所の手続きについては、入所順位の名簿作成、名簿の更新(平均月1回)などを行う旨の記述がされている地域が多かった。このように名簿作成の更新がなされることによって、古い情報の停滞を防ぐことができることについては、評価できると考えられるが、入所希望者やその家族にとっては自分が今何番目であるのかという現在の順番について、どのように情報を得ることができるのかということが関心事項ではないだろうか。次に、人所評価基準について詳しくみてみると、(1)人所希望者の心身の状況、(2)家族・介護者の介護力、(3)在宅生活の可能性、(4)住環境の状況、の大きく4項目にまとめられて提示されていた。(1)の入所希望者の心身の状況の中には、要介護度の中に含まれない痴呆の有無、ならびに痴呆の程度について含まれており、今まで入所において考慮しづらかった面を含められていることが特徴的であると思われる。そして、この入所基準を点数化し、チェックシート方式で客観的に評価できるツールを使用している地域もある。以上のように何をどのように判断しているかについては、検討されているように捉えることはできるが、入所評価についての結果の公表をどのように行っているかについての明記をしている地域は見当たらない。このことから、今後入所評価されたことについてのアウトプット情報をどのように利用者に伝えていくかが課題になり、この点をクリアしていくことが公平性・透明性に一歩近づくことなり、利用者が安心し納得したサービスの提供へとつながると考えられる。平成16年度は、平成15年度に調査した入所基準および入所評価基準((1)入所希望者の心身の状況、(2)家族・介護者の介護力、(3)在宅生活の可能性、(4)住環境の状況)について、老人保健施設ならびに介護老人福祉施設において、どのような実態があるのかを把握するための質問紙を作成する。4月から7月にかけて質問紙の内容を検討したが、まだ完成には至っていない。
魚が自由に通過できる水車(水力発電用)の開発研究

魚と水力発電用水車の関係は我が国においてはあまり関心がなく、これまでほとんど研究されていない。河川にダムを建設し、既存の水車発電装置を設置すると河川は寸断され、河川魚の生息条件が著しく破壊されることは既に知られている。ダムが低い場合にはしばしば魚道が作られるが、通常建設費がかかるので設置しない。また、魚道を通過する流量は発電に利用できない。しかだって、もし魚が運転中の水車内に自由に通過することができれば河川に棲む魚族の生態系を破壊することなく、河川のいたるところに低落差の水車を設置することができる。現在の高性能反動型水車ランナーはキャビテーション寸前の高負圧下で運転され、ランナー内流速も速い。負圧は魚の内蔵破裂を引き起こし、高速では魚がさかのぼれない。このような条件を考慮して、著者らの研究目的は、落差が12mで、ランナー内流速が遅く、負圧にならない水車ランナーを開発することである。上記の目的に沿って次のような研究を行った。1.水車ランナーを通過する魚の挙動をビデオカメラおよび写真撮影により観察した。(1)、上流から下流へ移動する場合、(2)、下流から上流へさかのぼる場合。2.水車ランナーを通過する魚にランナーが与える損傷、その他生物学的打撃を検討した。3.水車ケーシングの圧力分布を測定し、水車内圧力分布と魚生存の関係を検討した。4.水車ランナー入口および出口直後の速度分布を測定し、魚が水車ランナーを下流から上流へさかのぼりうる流速の条件を明らかにした。5.魚と水車の関係を研究する研究用水車設備を開発した。もし,魚が運転中の水車内を自由に通過することができれば,河川に棲む魚族の生態系を破壊することなく,河川のいたるところに低落差の水車を設置することができる.このような水車を開発すべく,本年度は次のような研究を行った.1低落差及び低回転数のランナーを実際に設計製作した. (写真1参照)この羽根車と従来用いられている軸流羽根車(写真2参照)を用いて,ランナー内を魚や物体が流れる状態を観察した.a本年度の研究によって,ライナー形状が写真1のようなスクリュータイプであれば回転数が低く物体も羽根先端に衝突せずスムーズに流れることが明らかになった.このスクリュータイプの羽根車は低速回転で効率がよい.b写真2に示す従来タイプの軸流ランナーでは,回転数が速く,写真のごとく,羽根の先端で通過物体がたたかれることが明らかになった.このタイプのランナーは,回転速度を遅くすると,効率が著しく低くなり実用的でない.2図1に示すような低落差用水車を設計製作した.落差30cmから60cmの超低落差で十分発電することが明らかになった.しかし,まだまだ効率が低く改良せねばならぬ点が沢山指摘されている.3魚への損傷と水車ランナーの関係が相当明らかになってきた.魚と水力発電用水車の関係は我が国においてはあまり関心がなく、これまでほとんど研究されていない。したがって、もし魚が運転中の水車内を自由に通過することができれば河川に棲む魚族の生態系を破壊することなく、河川のいたるところに低落差の水車を設置することができる。現在の高性能反動形水車ランナーはキャビテーション寸前の高負圧下で運転され、ランナー内流速も速い。

このような条件を考慮して、著者らの研究目的は、落差が12mで、ランナー内流速が遅く、負圧にならない水車ランナーを開発することである。上記の目的に沿って次のような研究を行った。1.水車ランナーを通過する魚の挙動をビデオカメラおよび写真撮影により観察した。(1)、上流から下流へ移動する場合、(2)、下流から上流へさかのぼる場合。2.水車ランナーを通過する魚にランナーが与える損傷、その他生物学的打撃を検討した。3.水車ケーシングの圧力分布を測定し、水車内圧力分布と魚生存の関係を検討した。4.水車ランナー入口および出口直後の速度分布を測定し、魚が水車ランナーを下流から上流へさかのぼりうる流速の条件を明らかにした。5.魚と水車の関係を研究する研究用水車設備を開発した。
マングローブスズの概潮汐リズムを生み出す遺伝子・神経領域の解明

マングローブスズ成虫の歩行活動には、潮汐周期に応じて活動期と休息期を生み出す概潮汐リズムと、日周期に応じて活動量を増減させる概日リズムがみられる。これまでの研究で、本種の概潮汐リズムは概日時計とは異なる分子・神経機構から成る概潮汐時計によって生み出されることが明らかにされてきた。まず、概潮汐リズムに重要な神経領域を探るため、脳の微小破壊手術を行い、概潮汐リズムへの影響を調べた。その結果、脳間部もしくはその周辺の領域を除去した場合、概潮汐リズムを示す個体の割合が減少するという結果が得られた。この結果は脳間部周辺に概潮汐リズムを生み出すしくみが存在することを示唆しており、昆虫において初めて概潮汐リズムに重要な神経領域が示された。次に、概潮汐時計が存在する神経領域の特定を目的とし、神経組織の培養条件下での電気活動記録を試みた。その結果、マングローブスズから脳と胸部神経節を含む神経組織とそれらに酸素を送る気管を傷つけずに取り出す解剖手順を確立し、培養用チャンバーの作成と電気活動記録装置の立上まで成し遂げた。しかし、最適な培養条件を設定できず、電気活動の記録にまでは至らなかった。培養条件の改善が今後の課題である。さらに、概潮汐リズムに関連する遺伝子を探索するため、RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析を行い、概潮汐周期で変動する遺伝子を探索した。その結果、日周期のみを与えた実験室条件では、昆虫で知られている代表的な概日時計遺伝子の多くが日周期で変動すること、発現量が概潮汐周期で変動するコンティグが少数であることが明らかになった。次の段階として、潮汐周期で発現が変動する遺伝子の機能を推定するための解析が必要である。本研究により、概潮汐リズムに関与する可能性のある神経領域と遺伝子がそれぞれ示された。これらは、概潮汐リズム生理機構の解明へ向けた足掛かりとなる成果である。26年度が最終年度であるため、記入しない。マングローブスズApteronemobiusasahinaiは、マングローブ林に生息する小形のコオロギで、その歩行活動には潮の干満に一致するおよそ12.4時間周期の明瞭な概潮汐リズムを示す。様々な生物で概日リズムの研究が進み、概日リズムを生み出す概日時計の生理機構が明らかになりつつあるのに対し、概潮汐リズムの生理機構はほとんど分かっていない。マングローブスズでは、概潮汐リズムが約12.4時間周期の生物時計によって生み出されること、概日時計遺伝子period・Ciockの発現抑制や概日時計を司る神経領域である視葉の除去を行った場合でも概潮汐リズムが維持されることが明らかになっている。このことから、マングローブスズの概潮汐リズムは概日時計とは異なる生理機構の概潮汐時計によって生み出されると考えられるが、その実体については未だ不明である。本年度は、概潮汐リズムの形成にかかわる遺伝子・神経領域を明らかにすることを目的とし、period・Clock以外の概日時計遺伝子の発現抑制や脳の微小破壊の概潮汐リズムへの影響を観察した。概日時計遺伝子のクローニングを行った結果、timelessとcryptochrome2の部分配列が得られた。RNA干渉法を用いてこれらの遺伝子の発現抑制を行った結果、発現抑制後も概潮汐リズムが維持された。このことから、timelessとcrypotochrome2は本種の概潮汐リズムに重要ではないと考えられる。ヨーロッパイエコオロギAcheta domesticaにおいて概日時計の存在が示されている、脳間部と呼ばれる脳領域の神経分泌細胞を除去し、歩行活動リズムへの影響を観察した。その結果、概潮汐リズムを示す個体の割合が減少する傾向が見られた。活動記録後、脳間部の神経内分泌細胞と概潮汐リズムの関連性を調べるために、脳間部を除去した個体の脳をパラアルデヒドフクシン染色し、神経分泌細胞の有無を観察した。その結果、神経内分泌細胞の有無と概潮汐リズムの有無に関連性はみられなかった。このことから、脳間部の神経内分泌細胞以外に概潮汐リズムの維持に重要な神経領域が存在すると考えられる。

さらに、概潮汐リズムに関連する遺伝子を探索するため、RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析を行い、概潮汐周期で変動する遺伝子を探索した。その結果、日周期のみを与えた実験室条件では、昆虫で知られている代表的な概日時計遺伝子の多くが日周期で変動すること、発現量が概潮汐周期で変動するコンティグが少数であることが明らかになった。次の段階として、潮汐周期で発現が変動する遺伝子の機能を推定するための解析が必要である。本研究により、概潮汐リズムに関与する可能性のある神経領域と遺伝子がそれぞれ示された。これらは、概潮汐リズム生理機構の解明へ向けた足掛かりとなる成果である。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画では昨年度中に、神経の電気活動記録の手法を確立する予定であったが、まだ確立には至っていない。しかしながら、その他の計画は順調に遂行できており、おおむね順調に進展していると評価できる。脳間部が概潮汐リズムにおいて重要である可能性が示されたため、当初の計画通り、電気生理学的手法を用いて脳間部の時計機能の有無を検証する。そのために、神経の電気活動記録の手法を確立する。脳葉から食道下神経節へ伸びる神経束(下行性神経束)を含む神経領域の電気活動から概潮汐リズムが検出できるようになった後、脳間部を除去した場合の電気活動を記録する事で、脳間部の時計機能の有無について検証する。
糸状菌生合成電子環化酵素の機能と構造解析

二次代謝産物生合成における電子環状化・付加反応を触媒する酵素の機能解析と構造解析を目的として、本年度はポリケタイド合成酵素ShmAおよびShmAが生産するpreshimalactoneの酸化酵素ShmBについて酵母での異種発現系の構築を中心に研究を進めた。糸状菌E. variecolorの遺伝子であるshmAはイントロンを持つことから、shimalactoneを生産する麹菌のshmA、shmB共発現形質転換体より、shmAのmRNAを調製し、イントロンが1ヶ所であることを確認した。同様にshmB cDNAも取得し、これらを酵母発現ベクターに導入した。まず、PKS発現用宿主Sc BJ5464-npgAでのshmA発現を試みたが、preshimalactoneの生産は認められなかった。その原因として、A. nidulans由来のnpgAがShmAを認識しない可能性を考え、ShmAが発現しているA. oryzaeよりそのphosphopantetheine転移酵素遺伝子を検索し、npgAと45%相同性を示すapt遺伝子を見出した。次いで、Sc BJ5464株でshmAとaptを共発現させて、5'-UTR配列、プロモーターなど種々の検討してpreshimalactoneの生産を検討したが、確認するには至らなかった。一方、preshimalactone oxideが酸性条件下にエポキサイドが開環すると考え、この中間体から非酵素的にshimalactoneが生成するかどうかについて、東京大学薬学系研究科の内山教授との共同研究を行い、計算化学的に進行可能であることを明らかにした。また、ShmBおよびソラナピロン合成酵素Sol5のタバコ培養細胞での発現についても検討し、遺伝子導入株を取得と発現の確認を進めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。二次代謝産物生合成における電子環化・付加反応を触媒する酵素の機能解析と構造解析を目的として、本年度は特にshimalactone生合成の鍵反応であるpreshimalactoneの酸化酵素と考えられるShmBの異種発現について重点的に検討した。ShmBは、N末側にFAD結合部位を有し、C末には膜貫通領域の存在が予測された。そこで、大腸菌に至適化した全長shmB cDNAを合成し、N末His-tag、C末His-tag、および膜貫通部欠失体としてE. coli BL21(DE3)などで発現させた。全長ShmBでは可溶性と不溶性がほぼ等量であったが、可溶性発現を期待した膜貫通領域欠失体はほとんどが不溶性であった。また、フラビンのコバレントな結合のため、メタノール資化酵母Pichia pastorisや分裂酵母Schizosaccharomyces pombeなどの真核生物を宿主としたShmBの菌体内発現、菌体外発現系やAspergillus oryzaeでのShmB発現を行い、酵素液を調製して、preshimalactoneの変換反応を検討した。上記の発現系より調製したShmB酵素液を用いて、酵素活性の検出について検討した。基質であるpreshimalactone自身が不安定であるため、中性条件下でincubationを行い、反応液をHPLCで分析した。残念ながら、ShmBを発現させた大腸菌可溶性画分、P. pastris、S. pombeの粗酵素液、A. oryzae/shmBの粗酵素液、ミクロソーム画分などについて検討したが、preshimalactoneの減少は認められるものの、コントロール反応でもpreshimalactoneは減少し、かつそのバラツキが大きいため、ShmBの活性を確認することはできなかった。また、減少に伴う新たなピークの出現も認められなかった。shimalactone生合成遺伝子のうち、ポリケタイド合成酵素遺伝子shmAとFAD依存型モノオキシゲナーゼ遺伝子shmBのみをAspergillus oryzaeで異種発現させることにより8π-6π閉環反応が進行した最終産物であるshimalactoneが生成することから、本生合成反応においてはShmBの触媒する反応とその生成物の同定が8π-6π電子環化反応を含む生合成機構解明の鍵となると考え、ShmBのin vitroで酵素機能解析を目的として、ShmBの異種発現と酵素活性の検出に重点をおいて研究を進めた。その結果は、活性型としてShmBの発現に成功したとはいえない状況に止まっており、また、その酵素活性の検出方法についてもHPLCを用いて種々検討したものの、ShmBの基質と考えられるpreshimalactone自体が不安定な化合物であることから活性検出系を確立するには至っていないのが現状である。また、ShmBの発現系構築と解析を重点的に行ったため、ソラノピロン合成酵素Sol5の構造解析、phomopsidin生合成のDiels-Alderaseの検索についてはほとんど進展させられなかった。