hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの意思決定におけるモノアミンの役割の強化学習モデルを用いた解明

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
判決からみた麻酔関連領域患者への説明義務内容の検討

麻酔関連領域での判例で、2004年までの判例を含め法律雑誌などに掲載された判決を中心に、説明義務違反に関連したものを検討した。説明義務違反は脊髄くも膜下麻酔で認められていて、説明義務反が理由で医療側が敗訴となる事例が近年増加していた。説明に関しては、患者の個々の事情を考慮して個別的に説明を行うことなどが認容されていた。説明義務に関する法的解釈としては、従来からの合理的医師基準説が採用されていたが、近年具体的患者基準説が新たに採用されていた。より患者本位に立った説明内容に移行すべきと考えられた。この把握を踏まえ、説明すべき事項や範囲を含め麻酔法の種類別の説明文書を作成した。なるべくわかりやすい文章を主とし、インフォームド・コンセントを得る方針で作成した。麻酔の合併症の記載では、その発生頻度とより危険性が高いものへの言及を試みた。しかし、その根拠となる論文が少なく、具体的数値の記載ができない場合があった。国外の説明文書の検討では、具体的患者基準説に基づく説明と考えられた。フランスやドイツでの麻酔説明文書の検討では、総ページは2から6ページで滋賀医大の同文書とほぼ同じで簡潔な点は似ていた。相違点としては、麻酔の不確実性一百%の安全はありえないとより強調されていた。合併症の頻度に関しては、数値ではなく言葉で説明されていた。わが国の判例でも、その合併症のリスクをどの程度、どの範囲まで説明べきかに関してはまだ確立していないので、個々の症例によりその説明内容は異なると考えられた。今後は、同様な説明を行ってもその理解度は異なるので、いかに理解されているかを確認する方法なりの検討が重要になると考えられ、それらを反映した麻酔の同意書のあり方を検討すべきと考えられた。麻酔関連領域での判例で、1997年までに法律雑誌に掲載された判決を検討した。その内、全身麻酔症例、脊髄くも膜下麻酔症例で、説明義務違反に関連したものを検討した。説明義務違反は脊髄くも膜下症例で認められていた。2003年までの過去5年間の検討では、最高裁判所の判決が収集された。この検討では、周術期に関しては、患者側の充分な納得と、その説明内容を記録に残すことが重要と思われた。これらの把握をふまえ、説明すべき事項や範囲を含め、麻酔の説明文書の具体的文書を作成した。脊髄くも膜下麻酔と硬膜外麻酔の文書を作成した。その作成に関しては、なるべくわかりやすい文章で記載した。また、これらの麻酔に伴う合併症の記載では、発生頻度とより危険性が高いものへの言及を試みた。しかし、その発生頻度に関しては、その基礎となる根拠となる論文が少なく、より具体的数値が記載でないものがあった。研究分担者は、これらの説明文書を麻酔関連領域ばかりでなく、臨床各科の同意・説明文書の編集に携わり、法的要件を満たす方針で臨んだ。また、研究協力者は、全身麻酔、硬膜外ブロックの説明文書の作成を試み、編集補助も行った。医療に伴う合併症などのリスクをどの範囲やどの程度にするか、その発生頻度を明確な基準で示すことは、現在、判例的には確立していないので、個々の症例によってその説明は異なると考えられる。また、同様に説明を行っても、患者の理解度は異なるので、患者サイドで如何に理解されているかを確認することも需要である。実際には、説明を行っても同意に至るまでの充分な時間、判断するまでの充分な時間があることも重要である。麻酔科関連領域での判例で、2004年の判例を一部含め、引き続き説明義務違反に関連したものを収集し検討した。

その他に、地方裁判所の医療集中部における報告文献からの症例も収集し検討した。これらの検討では、説明されていない医療行為は改めて説明すること、説明の内容としては一般的な治療ばかりではなく、ある程度有効な治療があれば説明すること、その説明も一般的な説明のみではなく、患者の個々の事情を考慮し個別的な説明をすることなどが認容されていた。これらの結果、説明義務に関する法的解釈としては、従来からの合理的医師基準説が多くの判例では採用されていると考えられていたが、最近の判例では、具体的患者基準説が新たに採用されていると推察された。また、近年、説明義務違反が理由で医療側が敗訴となる例が増加していた。医療側としては、この説明に関してはより患者本位に立った説明内容に移行すべきと思われた。次に国外での麻酔科領域での説文書等の収集を始めた。まず、病院として、患者の同意を取得する際の基本的な医師用ガイドラインの作成文を収集した。19ページに及ぶもので、倫理的な内容を含むものであった。医師の研修用として充分利用できる内容であった。麻酔用説明書としては、1つの外国大学病院の説明書は全体として2ページでより簡潔されたものであった。その内容としては、麻酔の合併症としてより頻度の少ない合併症も記述されていた。また、どんな有能な麻酔科医が科学的根拠に基づいて麻酔を行っても100%の安全はあり得ないと強調されていた。麻酔の不確実性を強調していた。これは別の国外の病院の麻酔科用説明書でも言及されていた。麻酔科関連領域での医事紛争した症例で,引き続き説明義務違反に関連すると考えられた症例を収集し検討した。全身麻酔症例での腹臥位で生じた顔面皮膚損傷に関してクレームがあり医事紛争化した。しかし,説得により納得された。この皮膚損傷に関しては術前の麻酔説明に記載がなかった。この症例を麻酔の説明から検討すると,説明するのがのぞましい内容として,(1)生命に危険を及ぼす可能性のあるもの(2)不可逆的な損傷(3)発生頻度が高いもの(4)美容に関するものが想定される。この症例はこの美容に関するものと考えられ,今までの判例よりの解釈では,具体的患者基準説に合致し今後問題にすべきと考えられた。次に国外の市販の麻酔の説明書を入手した。その内容を滋賀医科大学の麻酔の説明書と比較検討した。医学用語を麻酔専門語と一般的用語の併記で説明している。医学的解剖の図が挿入されている。100%の安全はありえないと太い文字で記載されている。歯列の記載がある。合併症の頻度に関しては,数字ではなく,言葉で説明。さらに同意書に関しては,患者との対話,質問を記載する欄が設定されている。以上が主な相違点であった。日本での判例からの検討では,根底には合理的医師基準説があり,その上に具体的患者基準説が加味されたと考えられた。内容は約6ページで簡潔にしようとしていると思われた。今後は,より専門性の高い病院,大学などでの麻酔の説明書のあり方の国内外での比較検討,その内容として,どんな要因がその説明内容を変更させるのか,検討すべきと思われた。
生体吸収性微粒子を利用するがん免疫療法

複合用高分子として、種々の分子量をもつポリ乳酸,ポリグリコール酸,および種々の共重合体組成をもつそれらの共重合体を合成した。免疫賦活剤としてムラミルジペプチドの脂溶性誘導体を用いた。これらの複合用高分子を用いて免疫賦活剤-高分子複合微粒子を調整し、高分子複合微粒子からの免疫賦活剤の徐放挙動を調べた。徐放期間は、複合用高分子の分子量および共重合体組成を変えることでコントロール可能であった。種々の高分子複合微粒子は、疎水性表面のため、マクロファージ(Mφ)に容易に貪食された。そして、貪食された微粒子は、Mφ内において消化分解されていくことも電子顕微鏡観察により確かめた。これら高分子複合微粒子によるMφのin vitro抗腫瘍活性化を調べた。Mφは、マウス腹腔より採取した。その結果、免疫賦活剤を微粒子に包含することで免疫賦活剤単独に比較して、数千分の一という少ない量で、しかも短時間でMφを活性化でき、その抗腫瘍活性を長期間維持させることができた。また、その活性持続期間は、用いた複合用高分子の分子量および共重合体組成により変化し、免疫賦活剤の徐放期間との間によい一致が認められた。これは、Mφに貪食された微粒子が分解され、それにともない免疫賦活剤がMφ内部で徐放されたためであると考えられる。また、ゼラチンで微粒子をコーティングすることにより、Mφによる微粒子の貪食は促進され、それにともないMφの抗腫瘍活性も増強した。移植腹水癌をもつマウスを用いて免疫賦活剤-高分子複合微粒子の腹腔内投与による治療効果を検討した。その結果、対照群(PBS投与と空の微粒子投与)では30日までにすべてのマウスが死亡したが、微粒子投与群では、移植120日後においても60%のマウスが生存しており、in vivoにおける免疫賦活剤-高分子複合微粒子の有効性を確認した。
HIV-1複製制御に向けたスプライス暗号の解読

HIV-1 Vifは、宿主細胞に存在する強力なウイルス抑制因子APOEC3Gと拮抗し、その発現量や機能はウイルス複製能を規定する主な要因の1つである。Vifの発現量調節機構には未解明な点が多く、この機構の解明は新たな複製制御手法の確立に役立つと期待される。申請者は、HIV-1ゲノムのスプライシングアクセプター(SA)1とドナー(SD)2の周辺領域において、自然に存在する種々の同義1塩基置換(nSNV)がVif発現量を増減させることを見出し、その領域をSA1D2proxと名付けた。Vif超低発現変異体NL-tacがAPOBEC3G高発現下でどのように適応するかを細胞内馴化実験により検討したところ、vifコード領域に1塩基置換(AdM1)を獲得することでVif発現量を増加させることが分かった。昨年度は、Vif発現量調節機構を調べるため、人工的な配列ではなく親株NL4-3本来の配列を持つミニゲノムを構築した。このミニゲノムを用いた実験で、プロウイルスクローンで得られたVif発現量変動の結果を反映することを確認した。今年度は、AdM1によるNL-tacのVif発現量増加に関して解析した。まず、ミニゲノムを用いてスプライシングパターンの変化を調べた。Vif mRNA産生にはSD1とSA1のみでスプライシングが起こることが必須条件となる。NL-tac-miniでは、NL4-3-miniと比較してSD1/SA1でのスプライシング産物が著減し、逆にSD1/SA2産物が増加した。NL-tac-miniへのAdM1の導入は、NL-tac-miniと比べSD1/SA1産物を増加させるとともに、既報のSD2b(本来のSD2とは異なるスプライシングサイト)由来の産物を増加させた。AdM1の導入によりスプライシング効率や部位が変化することで、NL-tacのVif発現量が増加することが示唆された。昨年度より、ミニゲノムを用いたVif発現量調節機構の解析を進めている。上述の通り、NL-tac-miniへのAdM1導入(tac+AdM1)によるVif発現量の増加においては、スプライシングパターンの変化が見られた。このようなパターンの変化はSA1D2prox内のnsSNVによっても認められた。これらの結果は、Vif発現量の変動が、スプライシングの変化と、続いて起こるmRNA産生量の変動により起こることを示唆した。スプライシングには多数の宿主因子とこれらの標的となる塩基配列が関与する。そこで、ミニゲノムの一定領域の配列(Vif発現量を変動させる1塩基置換を含む)を鋳型としてRNAを合成し、HeLa細胞の核タンパク質を用いてプルダウンアッセイを実施した。NL4-3-mini、NL-tac-miniとtac+AdM1由来の各RNAについて、プルダウン後のタンパク質を電気泳動により比較した。サンプル間で明瞭な違いが観察されなかったため、当研究室で保有するスプライシング関連因子の抗体を用いて検出を試みた。その結果、ある種のスプライシング因子群が、NL4-3-miniやtac+AdM1由来のRNAに比べてNL-tac-mini由来のRNAに、より多く結合していることが分かった。これは、NL-tacでは、検出されたスプライシング因子群が結合することにより、SA1でのスプライシングが抑制され、その結果、Vif発現量が減少しているのではないかと考えられた。Vif発現量調節機構に関してRNAプルダウンアッセイの条件等を検討する必要があるが、スプライシング因子群の結合については、さらに詳細に解析中であり、研究は概ね順調に進捗していると判断している。上述のNL-tacだけでなく、他のVif低発現変異体やVif過剰発現変異体を用いて細胞での馴化実験を行い、幾つかのVif発現量を変動させる適応変異の情報を得ている。これらの変異情報を基に、Vif発現量調節に関与する部位・領域ならびにその塩基配列を明らかにしていく。本研究課題の遂行により、HIV-1ゲノムにおいて、Vif発現調節に関与する領域は当初想定していたよりも広範囲に渡ることが分かってきた。HIV-1のサブタイプではVifの抗APOBEC3G活性が異なることが知られている。異なるサブタイプのSA1D2proxおよびvif配列を利用し、SA1D2proxとvifのサブタイプ間の組み合わせ、あるいは、サブタイプ間のキメラvifをコードする複数のプロウイルスクローンを作製した。これらのプロウイルスクローンの中には、親株NL4-3と比較してVif発現量が大きく変動するものが認められた。このことは、SA1D2proxだけでなく、vifコード領域の塩基配列もVif発現量の決定に関与することを示す。一方、ミニゲノムを用いた解析等から、Vif発現量が増加する、つまり、SA1でスプライシングされた産物が増える時には、SA2でのスプライシング産物が減少することが分かった。SA1とSA2でのスプライシングは逆相関することを意味する。SA2は、vifコード領域内に存在し、vpr mRNA産生に重要なスプライシングサイトである。従って、Vpr発現量調節に関与する塩基配列は、Vif発現量調節にも関与すると予測される。前述の結果と併せて、vifおよびvprコード領域の塩基配列においても、Vif発現量調節に寄与する配列を探索中である。以上の実験により、Vif発現量を変動させるHIV-1ゲノムの塩基配列、および、その調節機構について包括的に理解することを目指す。

HIV-1の遺伝子発現は厳密に制御された過程であり、ウイルス複製に強く影響を及ぼす。申請者はこれまでに、HIV-1のスプライシングアクセプター1(SA1)およびドナー2(SD2)の周辺領域(SA1D2proxと名付けた)において認められる「自然に存在する1塩基置換(nsSNP)」により、vif mRNA/タンパク質発現量が変動することを見出した。また、Vif発現量とVpr発現量とが逆相関することも明らかにした。本年度は、SA1D2prox内nsSNPによるVif/Vpr発現量変動のメカニズムを解析することを目的とした。HIV-1ゲノム上には、少なくとも4つのSD、7つのSAが存在する。Vif/Vpr発現量変動のメカニズムを解析しやすくするため、ミニゲノムの作製に取り組んだ。以前、Vif発現用ミニゲノム(LTR-gag/pol-vif-RRE)を作製したが、ウイルスクローンを用いて明らかにしたSA1D2prox内nsSNPによるVif発現量変動を反映しなかった。そこで、今回は、3種類のミニゲノムを作製しこれまでに得られた結果を反映するか否か検証した。3種類のミニゲノムとも共通してSD1、SA1D2proxと全長vif配列を含むが、vifの下流にルシフェラーゼ遺伝子、短いvpr配列あるいは全長vpr配列を持つ点で異なる。後者の全長vpr配列を持つミニゲノムからのVif発現は検出できなかった。一方、前者2種類のミニゲノムではこれまでに得られたSA1D2prox内nsSNPによるVif発現量変動が観察されたが、その全体的な発現量はミニゲノムの種類により異なり、vif下流にルシフェラーゼ遺伝子を持つミニゲノムで最も効率良くVifが発現した。これらの結果から、vif-mRNA産生レベルがvif上流のSA1D2prox配列のみならず、vif下流の配列にも制御されていることが示唆された。当初の本年度の実験計画では、ミニゲノムを作製後、SA1D2prox内nsSNPによるVif発現量変動に関与する宿主因子の同定を進めることにしていた。しかし、ミニゲノムの種類(配列)により全体的なVif発現量が変化してくることから、ミニゲノム作製を慎重に進めた。このことは、上述の通り、SA1D2proxやvif配列以外の配列、特にvpr配列が全体的なvif発現量を負に制御することを示唆しており、興味深い結果が得られたと考えている。加えて、現在、ミニゲノムを用いてSD1/SA1/SD2/SA2のスプライシング効率の変化等を解析している。これまでにVif発現量を低下、増加あるいは過剰発現させるSA1D2prox内nsSNPを同定していたため、これらのnsSNPがミニゲノムでのスプライシング効率に及ぼす影響を解析した。その結果、SA1D2prox内で異なるnsSNPであっても、Vif発現量の変動(低下、増加、過剰発現)に応じて一定のスプライシングパターンが認められ、Vif発現量の変動が主にnsSNPによるスプライシング効率変化に依存していることが示唆された。
高エネルギー粒子線と星間物質類似の炭素質物質との相互作用の研究

本研究は筑波大学加速器センターのビームライン上に新たに設置した「試料照射用温度圧力環境可変チェンバー」を用いて、プロトン線照射実験を行った。照射試料としてPAH物質などの星間dust類似の炭素質固体物質を用いる予定であったが、最初の実験試料としては、より単純な炭素のみよりなる各種の物質であるグラファイト、石炭、人工及び天然産ダイヤモンドなどの各種炭素材料から行った。照射実験は、梯子状試料ホルダー上の各種試料について色々のエネルギーと電流密度のプロトンビームを用いて行った。その実験においてダイヤモンド試料でルミネッセンス発光が観察された。ダイヤモンドのイオンルミネッセンスについてはほとんど報告がないが、ルミネッセンスのスペクトル変化は試料物質内の欠陥の発生と変化の検出に敏感であろうとの判断で、研究の一部として[プロトン照射によるダイヤモンドのイオンルミネッセンスの研究]を行った。ダイヤモンドのカソードルミネッセンスは確立した研究手法であるので、イオンルミネッセンスと対比させながら、試料を窒素温度近くまで冷却させて照射効果を研究した。その結果、当初のスペクトル自体はカソードルミネッセンスと同じであっが、長時間照射後には新たなスペクトルの生成など、これまで報告のなかった天然ダイヤモンドと人工単結晶ダイヤモンドのイオンルミネッセンスを初めて観測することに成功した。この手法はPIXEとの併用により、物質内に存在する不純物欠陥の構成元素とその形態を同時観察できる極めて有効な分析方法である。照射後のグラファイト試料は、FTIR及びラマン散乱、ESCA等の光学的手法で観察を行った。その結果照射によりグラファイト構造が不定形炭素へ変化をしたり、それとは逆に不定形炭素がグラファイト構造に変わる現象が観察された。しかしながらグラファイト構造や不定形炭素からダイヤモンド構造への変化は今のところ確認されていない。これは結晶の変化が数オングストロームの範囲内でのみ発生している可能性がある。cosmic rayとの相互反応より生成されたと考えられる隕石中のダイヤモンドはオングストロームサイズである。光学的手法によりダイヤモンドが確認されないことから、本実験により生成されるダイヤモンドも隕石中に含まれるダイヤモンド同様オングストロームサイズと考えられる。最近放射線照射による炭素質物質内でのミクロ・ダイヤモンドの生成が話題に上っていることから、本研究でも、照射後の炭素物質を過塩素酸により蒸発させ、その残差物質について観察を行いつつある。照射後の試料の形態・粒子径の変化のTEM・SEM観察も同様に行いつつある。残念ながら、照射試料についての観察が、その途上にあるため現在は報告できる内容が未だ乏しい。ビームの電流密度が不足である事も考えられ、照射実験を継続すると共に、試料としてPAH状物質も加えて行う予定である。本年度は、イオン線ライン上に設置する「試料照射用温度圧力環境可変チェンバー」の設計製作(末野、栗田)を行った。

設計に先立ち,加速器センター研究者の全面的協力を得ながら,照射実験に使用するタンデム型加速器により,既設の一般照射用チェンバーを利用してイオン線の安定性とビーム内でのイオン線強度分布や,チェンバー内の真空度,炭素質物質試料にイオン線を照射した場合に試料から発生するガスの有無とその真空度に対する影響などを綿密にテストした。その結果,イオン線不安定性,照射中の試料観察装置の不備,試料の温度上昇によるガスの発生と真空度の低下などの困難があることが判った。それらの状況を把握した後,チェンバーの設計を行ったが,試料は梯子状の試料ホルダーに数個を取り付けて,その試料ホルダーがチェンバーの金属蓋上に設置した3軸モーター可動装置で前後,左右,上下にリモートコントロール出来るように設計製作した。この設計では,駆動装置がチェンバー外部にあるため,真空に対して影響せず,またチェンバー内部には空間的余裕が出来るため,温度上昇装置も取り付けられる。炭素質物質試料についての本格的な照射実験は行えなかったが,タンデム型加速機内での荷電変換に使用するブ-スターフィルター炭素膜のX線回折(中井)やTEM(末野,中井)による研究などを行った。その結果の結論はまだ出ていないが,照射後の炭素膜は,非常に割れやすく,炭素組織に照射による変化が生じたことは明らかである。今年度は,本格的に照射実験を遂行する時間がなかったが,来年度における実験準備は整った。来年度はPAH物質などの星間dust類似の炭素質固体物質試料の照射実験を主に行う。照射後の試料は,その赤外吸収スペクトル変化を参照しつつ,FTIR[既設],Raman散乱[既設]などの分光学的手法、電磁気的手法などによる測定を行なう。本年度は、初年度に筑波大学加速器センター)のビームライン上に設置した「試料照射用温度圧力環境可変チェンバー」を用いて、プロトン線照射実験を行った。当初は試料として星間物質とcosmic rayとの相互反応を研究する目的でPAH物質などの星間dust類似の炭素質固体物質を用いる予定であったが、最初の実験試料としてより単純な炭素のみよりなる各種の物質であるグラファイト、石炭、人工及び天然産ダイヤモンドなどの各種炭素材料から行うこととした。照射実験は、梯子状試料ホルダーに取り付けた各種試料について色々のエネルギーと電流密度のプロトンビームを用いて行った。その実験において最も純粋な試料であるダイヤモンドでルミネッセンス発光が観察された。ダイヤモンドのイオンルミネッセンスについてはほとんど報告がないが、照射によるルミネッセンスのスペクトル変化は試料物質内の欠陥の発生と変化の検出に敏感であろうとの判断で、本年度の研究の一部として[プロトン照射によるダイヤモンドのイオンルミネッセンスの研究]を行った。ダイヤモンドのカソードルミネッセンスは確立した研究手法であるので、イオンルミネッセンスと対比させながら、試料を窒素温度近くまで冷却させて照射効果を研究した。
外国貿易商社を媒介とする技術=生産の受容過程、その歴史的経験-イリス商会の代理店機能の変遷と国産化-

イリス商会に関する研究は、(1)幕末・明治初期の紀州・和歌山藩との関わり、(2)陸海軍工廠の生産との関連、(3)第一次世界大戦後のボッシュ社(電装品メーカー)代理店としての役割、に関する資料収集とその分析について行なわれた。(1)については、軍制改革のお雇外国人たるプロシャ軍人ケッペルが、イリス商会(クニフラル商会)の売込におおきな役割を果たしたこと、(2)については、貿易商社高田商会と競合しつつ、イリス商会がクルップ社製品を売込み、陸海軍工廠における生産の不可欠な要素となったこと、(3)については、戦前日本において、ドイツ・ボッシュ社製品の国産化が実現できなかったこともあって、イリス商会ボッシュ部を設立して、電装品の販売と修繕も担当することで、イリス商会が販路を確保したこと、などが明らかとなった。イリス商会は、ドイツの重工業製品、クルップ社製品、そしてボッシュ社製品の売込みを通じて、日本重工業の展開にかかわったのであるがその史実を明らかにするための資料収集は、まだ不充分であり、特に、重工業セクターの中心であった陸海軍工廠における在来兵器生産から、航空機などの生産、技術開発への「転換」に関するデータの欠落は今後の課題とせざるを得ないものとなっている。つまり、イリス商会、財団法人三井文庫、および防衛庁防衛研究所図書館に所蔵されている資料については一応、収集し得たと考えられるが資料上のつながりは充分とは言えず、更に補完データの収集によって体系化することが必要となっている。したがって、イリス商会の代理店機能を日本における重工業の展開と関係づけて、その意義を問う(日本への技術移転の媒介)という課題に関するトータルな把握は今後の課題となっている。
「土壌-樹木」系における水の動態と樹種別の乾燥抵抗特性に関する研究

樹木の健全性の維持の最も重要な要因として、土壌の水分環境が挙げられる。今までの水分生理の研究は蒸散や吸水といった面を植物体のみで扱われ、「土壌水-樹木」という系では捉えていない。そこで、本研究では、「土壌-林木」という系としての水の動態から樹種別の乾燥抵抗性を探りだし、あわせて養分の動態にも検討をくわえた。1.主な公園樹木であるカツラ、メタセコイヤ、ケヤキ、シラカシの壮齢木を用い、木部圧ポテンシャル(XPP)の季節的変化を調査した。晴れと曇りでは、樹冠上部および下部での水ストレスは大きく異なった。常緑広葉樹は、冬季でも昼間と夜では0.51MPaの違いがみられた。また冬季でもクチクラ蒸散がなされ、昼間でも-1.0-2.0MPaの値を示した。常緑広葉樹は雨量の多い年と少ない年で、夜間の水ストレスの回復はわるかった。昼間の蒸散に対する抵抗は、ケヤキやシラカシよりもカツラ、メタセコイヤで小さいと推定された。2.ケヤキおよびミズナラのポットを用い、乾燥前歴が水ストレスに及ぼす影響について調査した。その結果、短期間でも強度の乾燥の前歴によって、水ストレスに対する耐性が得られると推察された。3.開葉後の枝からの樹液の採取法を検討した。その結果、夜間の樹液の採取は、降雨後で容易であるが、晴天が続くと吸引圧を高める必要がある。夏の日中での着生枝吸引法による採取は難しく、分析に必要な樹液の採取には切り枝吸引法でよい。樹木の個体別あるいは樹種別の栄養生理的特性、森林地での酸性雨の樹木の衰退に及ぼす情報や地位の良否などに対して、樹液のイオン分析の情報がどの程度有効かは、さらに検討する必要がある。1.主な公園樹木の壮齢木(カツラ、ケヤキ,メタセコイヤ、シラカシ)の木部圧ポテンシャルの季節変化を調査した。カツラ、ケヤキ、メタセコイヤは日中の木部圧ポテンシャルの値に大きな違いはなく、日中の水ストレスの度合は同程度であると推察された。一方、夜間の木部圧ポテンシャルでは、年によって大きく異なった。このことは、成長期(5月は7月)の初めに厳しい水分条件にあうと、盛夏での水ストレスに対する耐性(夜間での水ストレスの回復)の増加がおきる。ポットを用て、乾燥前歴が潅水停止後の水ストレスに及ぼす影響を調査した結果、ケヤキでは短期間の乾燥前歴でも、その後の乾燥に対して葉乾重当りの蒸乾重当りの蒸散量を少なくし、木部圧ポテンシャルを低くすることによって、耐乾燥性を増加させた。街路樹、公園の樹木、半乾燥地の緑化を考える場合、過多な水分供給はひかえ、ある程度の水分ストレスを保つような土壌水分環境しておくことが重要である。2.木部樹液の無機元素濃度を調査するため、着生枝吸引法と切り枝吸引法にる樹液採取を検討した。夜間の樹液の採取は、降雨後では着生枝吸引圧法で採水できるが、夏の日中での採水は難しく、切り枝吸引法で吸引を高める必要がある。春先の開葉前では、樹液のイオン濃度は著しくたかまり、侵透的水吸収がなされている。本年度の調査では、土壌の交換性、土壌溶液、葉中、樹液それぞれのイオン濃度比に同じ傾向はみられなかった。切り枝吸引法による、ミズキ、ホヤノキ、イタヤカエデ、ウリハダカエデの日中の樹液の季節変化を調査した。

樹種間に大きな違いがみられたのは、Mg濃度でホオノキの2ppmから、ミズキの29ppmと15倍の違いがあった。ミズキのK、Mg、SO_4ーSの濃度は他の樹種より高く、ホオノキはK、Ca、Clで最も低かった。この様に、樹種によって樹液濃度が異なっていることがわかった。また、季節的な変動には樹種間の違いは明かでなかった。1.主な公園樹木の壮齢木(カツラ、ケヤキ、メタセコイヤ、シラカシ)の木部圧ポテンシャルの季節変化を調査した。カツラ、ケヤキ、メタセコイヤは日中の木部圧ポテンシャルの値に大きな違いはなく、日中の水ストレスの度合は同程度であると推察された。一方、夜間の木部圧ポテンシャルでは、年によって大きく異なった。このことは、成期期(5月は7月)の初めに厳しい水分条件にあうと、盛夏での水ストレスに対する耐性(夜間での水ストレスの回復)の増加がおきる。ポットを用て、乾燥前歴が潅水停止後の水ストレスに及ぼす影響を調査した結果、ケヤキでは短期間の乾燥前歴でも、その後の乾燥に対して葉乾重当りの蒸散澄を少なくし、木部圧ポテンシャルを低くすることによって、耐乾燥性を増加させた。街路樹、公園の樹木、半乾燥地の緑化を考える場合、過多な水分供給はひかえ、ある程度の水分ストレスを保つような土壌水分環境しておくことが重要である。2.木部樹液の無機元素濃度を調査するため、着生枝吸引法と切り枝吸引法にる樹液彩取を検討した。夜間の樹液の採取は、降雨後では着生枝吸引圧法で採水できるが、夏の日中での採水は難しく、切り枝吸引法で吸引を高める必要がある。春先の開葉前では、樹液のイオン濃度は著しくたかまり、浸透的水吸収がなされている。本年度の調査では、土壌の交換性、土壌溶液、葉中、樹液それぞれのイオン濃度比に同じ傾向はみられなかった。切り枝吸引法による、ミズキ、ホオノキ、イタヤカエデ、ウリハダカエデの日中の樹液の季節変化を調査した。ミズキのK、Mg、SO_4-Sの濃度は他の樹種よりも高く、ホオノキはK、Ca、Mg、Clで最も低かった。1.5年生のカツラ、ケヤキ、シオジ、ミズナラの4樹種を用い、短期間の強い乾燥前歴が、樹木の木部圧ポテンシャル(XPP)と蒸散にどのような影響を与えるか、また樹種によってその影響は異なるのかを調査した。15日間程度で耐乾性を高める前歴の与え方としては、カツラで土壌含水比の40%、シオジで50%処理が有効であると推定された。ケヤキは強い乾燥前歴を持ったことで耐乾性を獲得したが、土壌含水比の50%処理と40%処理では違いが見られなかった。ミズナラは乾燥処理による耐乾性の獲得は明かでなかった。乾燥抵抗の強いミズナラがより大きな乾燥抵抗を獲得するには、より強い乾燥前歴が必要である。2.都市で主な造園樹木の1本当りの蒸散量の推定法について検討した。高木としてケヤキ、スダジイ、クスノキを,中低木としてヤブツバキ、サザンカ、カナメモチ、ツツジを、地被類として芝、ヘデラを用いた。蒸散量の推定法として、光量子、飽差および蒸散環境変数を用いた。1本の蒸散量を推定するには、蒸散環境変数が最も良いと結論された。裸地の光量子と飽差を測定し、蒸散環境変数を求め、蒸散環境変数の部位別減衰率を用い、回帰式から部位別蒸散量を推定する。その推定値に部位別葉量比を乗じることによって、1本当りの蒸散量を求める。この解析方法は他の方法に比較して、精度の高い推定値を得ることが出来る。
タバコ培養細胞の代謝工学

植物培養細胞の中で増殖が極めて速く、生理学的研究の進んでいるタバコ培養細胞(Nicotiana tabacum L.cv.BY2)に有用物質生産経路の遺伝子群を植物の高発現プロモーター、制御シス配列の支配下で導入し効率的に物質生産を行わせる代謝工学の確立を目的とした。現在植物で汎用されているCaMV35Sプロモーターより活性の高いプロモーター、発現誘導可能なプロモーターを検索し、特性を明確にすることを目標に置いた。増殖が速いタバコ培養細胞の対数増殖期でmRNA含量が高く、ゲノム上のコピー数が少ない遺伝子はプロモーター活性が高い、との想定で検索した結果、機能は未知であるがBY2細胞でCaMV35Sの6倍の活性を持つプロモーターを得た。一方、実用植物細胞培養では高細胞濃度や固定化細胞が考えられ、そこでは細胞増殖はほぼ停止している。この時期に作動するプロモーターも利用価値が高いと考え、BY2から候補遺伝子を3種類得た。その内ペクチンエステラーゼ遺伝子のプロモーターはGUSレポーターで検定した結果、確かに培養6-7日目の増殖がほぼ停止した時期にCaMV35Sの約10倍のプロモーター活性を示した。その発現誘導因子の同定が重要であるが、これは極めて有望なプロモーターである。シロイヌナズナの熱ショック遺伝子、HSP18.2のプロモーター/GUS融合遺伝子を持つBY2細胞では培養温度を27°Cから37°Cにシフトすると2時間後にGUS活性は1000倍に増大した。これは熱誘導は転写レベルで起こっていた。最適誘導温度は37°Cであった。植物細胞でこのように顕著な誘導がかかる系は貴重である。なお、高温で植物細胞を長時間培養するのは不適で転写因子の一過的発現に利用することが有効であろう。1)タバコ細胞の高発現プロモーターの検索対数増殖期にmRNA濃度が高く、ゲノム上のコピー数が少ない遺伝子はプロモーター活性が高いと考え、候補となるcDNAクローンを3個得た。塩基配列から、F1-ATPaseδサブユニット、翻訳伸長因子1-a、および未知の遺伝子であった。一方、物質生産は細胞の高密度培養が実用的である。この観点から増殖停止期に高発現させるプロモーターも有効であると判断され、対数増殖期と増殖停止期のmRNAに由来するcDNAのdifferential screeningを行い、停止期に高発現している遺伝子のcDNAクローンを3個得た。これらはエクステンシン、アルコールデヒドロゲナーゼ、ペクチンエステラーゼ遺伝子であった。各cDNAの5′末端領域をプローブにゲノムの5′上流断片をクローニングした。次年度には各断片のプロモーター活性を評価する。2)熱ショックプロモーターの解析シロイヌナズナの熱ショック遺伝子、HSP18.2のプロモーターはタバコの培養温度を28°Cから37°Cへのシフトで転写量が1000倍上昇し、温度制御による遺伝子発現に有効であった。今年度は本プロモーターの熱ショック要素に結合する転写因子の単離を行った。タバコ細胞より2種の転写因子のcDNAを得た。詳細な培養制御には今後転写因子の特性の解明が重要である。3)テアニン合成酵素の精製タバコ培養細胞で茶の有効成分、テアニンの生産を目的とし、茶培養細胞からまずテアニン合成酵素の精製を行っている。まだHPLCによる活性測定条件、酵素の安定化条件を把握した段階であるが、早急に精製、アミノ配列決定を完成させ、cDNAクローニングに入る予定である。

増殖が極めて速いタバコ培養細胞(Nicotiana tabacumL.cv.BY2)に有用物質生産経路の遺伝子群を高発現プロモーター、制御シス配列等の支配下で導入し、効率的生産を行うための植物の代謝工学の確立を目的とし、今年度は以下の研究を行った。1)タバコ細胞の高発現プロモーターの解析タバコ細胞の対数増殖期に高発現している遺伝子のcDNA cloneを3種類得たが、clone27(機能未知)と29(F1-ATPase δsubunit)のプロモーター断片をGUSレポーター遺伝子に連結しタバコ培養細胞ゲノムに組み込みプロモーター活性を評価した。29はCaMV35Sプロモーターの6倍の活性を示したが、形質転換タバコ個体の葉部では活性はかなり低かった。したがって増殖の盛んな細胞で強い転写活性を持つことが推定された。一方、clone38(elongation factor 1-α)のプロモーターはまだ得ていないが、cDNAをプローブとするノザン解析で培養細胞、タバコ植物体の各器官で強いシグナルを与え、高活性かつ構成的プロモーター支配下にあることを示唆する。2)熱ショックプロモーターの発現解析シロイヌナズナの熱ショック遺伝子、HSP18.2のプロモーターはGUSをレポーターとしたタバコ培養細胞で培養温度の28°Cから37°Cへのシフトにより転写量が1000倍上昇した。これはシロイヌナズナ由来の熱ショック応答シス配列に結合する転写因子がタバコ細胞に存在することを意味し、転写因子のcDNAを2種類得た。推定アミノ酸配列には転写因子に保存されているDNA結合ドメイン、核移行シグナル配列が見出された。実際GFPとの融合タンパク質は核に移行した。大腸菌で発現させた転写因子はin vitro実験でシス配列に結合し、今後熱ショックによる転写因子の合成、構造変化を解析する系が出来たことになる。植物培養細胞の中で増殖が極めて速く、生理学的研究の進んでいるタバコ培養細胞(Nicotiana tabacum L.cv.BY2)に有用物質生産経路の遺伝子群を植物の高発現プロモーター、制御シス配列の支配下で導入し効率的に物質生産を行わせる代謝工学の確立を目的とした。昨年度までにBY2の対数増殖期に高発現している遺伝子のcDNAを3種類、その2つはプロモーター断片を得た。今年度はクローン27遺伝子(機能未知)のプロモーター、990bp断片をGUSレポーター遺伝子に連結し、BY2染色体に導入した。独立に得た3クローンはいずれもCaMV35Sの6倍のGUS活性を示した。各クローンのGUSのコピー数は1-2で、クローン27のプロモーターは少なくともBY2細胞で有望な強力プロモーターであると結論した。増殖停止期に高発現する遺伝子を3種得たが、ペクチンエステラーゼ遺伝子のプロモーター/GUSをやはりBY2に導入した。培養6-7日目の増殖停止期に入ると著しくGUS活性が増大し、CaMV35Sの場合の約10倍になった。実用化に有望なプロモーターである。昨年度までにシロイヌナズナの熱ショック遺伝子、HSP18.2のプロモーター/GUS融合遺伝子を持つBY2では培養温度を27°Cから37°Cにシフトすると2時間後にGUS活性が1000倍に増大することを示した。この融合遺伝子はHSP18.2のATGから翻訳され、GUSタンパク質のN末端に17アミノ酸付加された融合タンパク質として回収される。
CAPD患者の腹膜機能不全に対する血管・リンパ管新生を中心とした病態解明と対策

本病態における、血管・リンパ管新生、線維化につき検討した。腹膜線維化においてTGF-βの下流に位置するCTGFが、病態を反映する腹膜機能のバイオマーカーになる可能性を明らかにした。一方、腹膜機能低下と伴にVEGF-C産生・リンパ管新生が亢進することを明らかにし、中皮細胞がVEGF-Cの重要な産生源で、TGF-βによって誘導されることを見出した。TGF-βがCTGF, VEGF-Cを誘導するpathwayを抑制することによって線維化・腹膜透過性をコントロールできる可能性を示した。ヒト腎疾患におけるリンパ管新生の意義に関して新たな知見を得、発表した(Kidney Int. 2009, in press)。間質の慢性炎症、線維化が間質のリンパ管新生の大きい誘因となり、炎症細胞・尿細管上皮細胞から発現されるVEGF-Cが直接リンパ管新生を誘導することを証明した。新生リンパ管によって、炎症細胞や、巣状硬化に伴う癒着部位から間質への尿のmisdirected filtrationをdrainageしていることが推察され、今後リンパ管新生促進が腎障害を軽減する可能性も示唆することができた。リンパ管新生の慢性腎疾患における意義を検討した報告は世界で始めてであり重要な結果であると考える。現在、ラットの慢性腎障害モデルにおける検討を進めておりさらに病態生理、その意義を追求し、治療への結びつきについて検討している。ヒト腎疾患におけるリンパ管新生の意義に関する研究も進めている。ヒト腹膜機能不全(除水不全)においてD2-40陽性リンパ管、LYVE-1陽性リンパ管新生が進んでいることを免疫組織染色で認め、real-time免疫染色およびPCRでVEGF-C蛋白、mRNAの上昇を確認した。さらにヒト腹膜透析排液においてもVEGF-Cを検出し腹膜透過性と良好な相関も確認した。さらにヒト腹膜中皮細胞からVEGF-C mRNA,蛋白発現を確認してきている。腹膜へのリンパ管新生は、リンパ管の構造からも透析液の吸収から除水不全へと結びつくことが考えられ、この病態生理を明らかにし、さらに動物モデルで抑制実験を行い治療ターゲットになることを今後証明していく計画である。腎疾患におけるリンパ管新生の意義に関して新たな知見を得、発表した(Kidney Int.2009)。ヒト腎生検組織の検討から間質の慢性炎症、線維化が間質のリンパ管新生の大きい誘因となり、VEGF-Cが直接リンパ管新生を誘導することを証明した。これをもとに、ラットUUOモデルを用いて、線維化にともないTGF-bが近位尿細管、集合管、マフロファージからVEGF-Cを誘導しリンパ管新生をきたすことを示し、さらに新生リンパ管は、腎盂・間質の浮腫・尿をドレナージする役割を果たしていることを明らかにした。本研究は2010年米国腎臓学会発表予定であり、現在投稿中である。腹膜におけるリンパ管新生の意義に関する研究も進めている。さらにヒト腹膜透析排液においてもVEGF-C、s-VEGFR3を検出し腹膜透過性と良好な相関も確認した。さらにヒト腹膜中皮細胞からVEGF-C mRNA,蛋白発現を確認し腹膜透過性と良好な相関も確認した。また、もうひとつのリンパ管新生の成長因子であるVEGF-Dも同様な所見を確認し現在検討している。線維化と腹膜透過性の検討からは、線維化の重要な成長因子であるCTGFと腹膜透過性について検討を進め、腹膜組織・PD排液・腹膜中皮細胞それぞれでCTGFの発現との関連性が認められた。またPD排液中のCTGF濃度は腹膜透過性と強い相関を示し、線維化と腹膜透過性についてのバイオマーカーとなりうると考え発表した(Am J Physiol Renal Physiol 2010)。さらに、Tissue-type plasminogen activatorが、腹膜透析腹膜の線維化・障害と強い関連があることを示し報告した(Am J Physiol Renal Physiol 2009)。1. VEGF-Cとリンパ管新生、腹膜透過性亢進(2011米国腎臓学会で発表、投稿予定)(1)ヒト腹膜組織における検討。腹膜組織中のVEGF-C mRNAは、腹膜機能低下群で有意な増加を認め、腹膜の厚さとも相関を示した。(2)免疫染色で、VEGF-C蛋白の発現を腹膜中皮細胞および炎症細胞に認めた。特に腹膜機能不全群では発現上昇を確認した。(3)PD排液における検討。

PD排液中VEGF-CとD/P CrとR=0.662(p<0.001)と良好な相関を得た。(4)排液中腹膜中皮細胞培養において、TGF-β刺激で12時間をピークとして3-3.5倍のVEGF-C mRNA、蛋白の上昇を確認し、TGF-βI受容体拮抗薬(LY364947)で抑制がかかることも確認した。そして、そのVEGF-C mRNA増幅率は、D/PCrと相関することが明らかとなった。(5)動物モデルにおける検討。クロルヘキシジンモデル(CGH)を隔日に投与し腹膜線維症モデルを作成。TGF-βI受容体拮抗薬を連日投与した。Type III collagen低下とともに、VEGF-C,リンパ管新生の抑制を確認した。以上より、腹膜線維化にともないTGF-β-VEGF-C pathwayでリンパ管新生が誘導され、治療ターゲットとなりうる点を確認した。慢性好酸球性腹膜炎を経験し、腹膜組織採取する機会をえた。組織では、好酸球の組織内浸潤のみならず、免疫組織学的検討によって肥満細胞を多数確認し、化学遊走物質による腹膜透過性亢進と推察された。TGF-βが腹膜血管・リンパ管新生に関与することを確認した。
メカニカルスナッバンの耐震性能に関する研究

原子力発電所における配管系の耐震用指示装置として、ボールねじ、はずみ車、回転伝達球、ディスクブレーキからなるメカニカルスナッバ(以後メカスナと呼ぶ)が用いられている。このメカスナは荷重と振動数の両方に対して複雑な非線形特性を有するため、その特性を解析的に求めることは困難であった。本研究は、地震時における配管系の安全性を工場させる観点から、メカスナの性格な抵抗力特性とこれを配管系に取り付けたときの正確な耐震効果を計算によって求め、実験結果と比較検討し、さらに本研究者らが提案してきた新しいタイプのメカニカル防振器の耐震効果と比較検討しようとするものである。2年間にわたる研究の主な成果は以下の通りである。(1)回転伝達球が置かれている溝の形状が球面の場合と円錐面の場合についてメカスナの運動方程式を導き、メカスナの緒元をいろいろと変えて変位と抵抗力のリサージュ波形を計算した。その結果、リサージュ波形に影響を及ぼすパラメータを見出すことができた。また、試作した振動台を用いて行った実験結果は計算結果と良く一致し、解析の正しさが確かめられた。(2)単純支持はりの中点にメカスナを取り付けて強制振動実験を行い、実験結果を計算結果と比較した。その結果、メカスナの拘束効果と解析の正しさが確認された。(3)メカスナで支持された配管の地震応答解析を行った結果、配管を拘束するまでにはいたらなかった。この原因として、圧縮側の熱交換、再生器の流動損失並び効果をあまり低下させることなくメカスナに加わる力を滴下させるようなメカスナの緒元を求めることができた。(4)新しいタイプのメカスナ防振器として、ボールねじ、遠心力ブレーキ、回転自由な円筒からなる防振器およびボールねじ、はずみ車、調速機からなる防振器を提案し、それらの防振、耐震効果を理論的並びに実験的に検討した。メカニカルスナッバは原子力発電所における配管系の耐震用支持装置として使用されており,ボールねじ,はずみ車およびディスクブレーキから成っている.このメカニカルスナッバの抵抗力特性は荷重と振動数の両方に対して非線形であるため,その特性を解析的に求めることは困難であった.本研究は,地震時における配管系の安全性を向上させる観点から,メカニカルスナッバの正確な抵抗力特性とこれを配管系に取り付けたときの正確な耐震効果を計算によって求める方法を確立し,さらに本研究者らが提案してきたボールねじを用いた新しいタイプのメカニカル防振器の耐震効果と比較検討しようとするものである.本年度の主な成果は以下の通りである.(1)メカニカルスナッバの正確な運動方程式を導き,これを連続系シミュレーション言語によりプログラムして変位と抵抗力のリサージュ波形を計算した.計算結果は文献に示されている実験結果のリサージュ波形とよく一致し,運動方程式およびプログラムの正しさが確認された.(2)メカニカルスナッバを単純支持はりの中点に取り付け,中点に加振力を与えてスナッバの制振効果を実験的に確かめた.また,はりをn個の質点系に置き換えて上記の実験に対応する運動方程式を導き,連続系シミュレーション言語を用いてディジタルシミュレーションを行った.シミュレーション結果は実験結果とほぼ一致し,シミュレーションの正しさが検証された.(3)新しいタイプのメカニカル防振器として,ボールねじ,遠心力ブレーキおよび回転自由な円筒から成る防振器を試作し,そのリサージュ波形と単純支持はりに対する制振効果を実験とディジタルシミュレーションにより確かめた.また,この防振器で支持されたはりの地震応答解析を行った.(4) 3.75KWのインバータ・モータ駆動による,リサージュ波形測定用の水平振動台を設計・製作した.原子力発電所における配管系の耐震用指示装置として、ボールねじ、はずみ車、回転伝達球、ディスクブレーキからなるメカニカルスナッバ(以後メカスナと呼ぶ)が用いられている。

(4)新しいタイプのメカスナ防振器として、ボールねじ、遠心力ブレーキ、回転自由な円筒からなる防振器およびボールねじ、はずみ車、調速機からなる防振器を提案し、それらの防振、耐震効果を理論的並びに実験的に検討した。原子力発電所における配管系の耐震用支持装置として、メカニカルスナッバ(以後、略してメカスナと呼ぶ)が一般的に使用されている。このメカスナは振動数と荷重の両方に対して複雑な非線形特性を有するため、これを配管系に取り付けたときの正確な地震応答解析を行うことはむずかしく、従来はメカスナを等価な質量-ばね-減衰系に置き換えて解析が行われていた。本研究は、地震時における配管系の安全性向上の観点から、メカスナの正確な抵抗力特性を解析し、このメカスナで支持された配管の地震応答解析を行って、配管とメカスナの安全性を確かめることを目的としている。メカスナはボールねじ、はずみ車、回転伝達球、ディスクブレーキおよびブレーキシューからなっており、回転伝達球ははずみ車とディスクブレーキの両方に作られた4個の球面状溝または円錐形状溝の中に置かれている。配管が熱膨張によってゆっくりと変形するときは、はずみ車とディスクブレーキが一体となって回転するため、極めて小さな抵抗力で追従するが、地震時にははずみ車とディスクブレーキの間に回転角のずれが生じ、ディスクブレーキがブレーキシューに押しつけられて大きな抵抗力が生ずる。本年度は、溝の形が円錐形の場合について、Hertzの接触論を用いて回転伝達球がディスクブレーキに及ぼす力およびブレーキシューによる制動トルクの式を誘導し、ディジタルシミュレーションを行って変位と抵抗力とのリサージュ波形を正確に求めた。また、このメカスナを配管に取り付けたときの地震応答解析を行い、はりの変位とメカスナに加わる力を正確に求めた。その結果、はりの変形とメカスナの強度の両方の観点から望ましいメカスナの設計条件を導くことができた。また、前年度に試作した水平振動台を用いて市販のメカスナのリサージュ波形を測定し、解析結果と比較してその正しさを検証した。
生体反応を利用した抗体の細胞内導入法の開発

パーフォリン(孔形成タンパク質)およびグランザイムB(セリンプロテアーゼ)を動物細胞に添加することによって、グランザイムBが細胞外からサイトソルへ移行し、プログラム細胞死を誘導することが報告されている。本研究では、FRET(fluorescent resonance electron transfer)法を用いて、グランザイムBの細胞外からサイトソルヘの移行を検出できる実験系の構築を目的とした。FRET法に用いる蛍光タンパク質として、シアン蛍光タンパク質(AmCyan)および赤色蛍光タンパク質(DsRed-Monomer)を選択した。転写因子であるFosファミリーやJunファミリーは、分子内にbZIP(basic-region leucinezipper)モチーフを有し、ヘテロ二量体を形成することができる。FosファミリーおよびJunファミリーからマウスc-Fosおよびマウスc-Junを選び、bZIPモチーフ(35アミノ酸残基)をPCRで増幅し、DsRed-MonomerのN末側にクローニングした。さらに、AmCyanのN末側にc-Fosおよびc-JunのbZIPモチーフを挿入した発現ベクターを構築した。グランザイムBは、サイトソルへ移行するとプログラム細胞死を誘導するため、プロテアーゼ活性中心のセリン残基をアラニン残基に置換(Ser195→Ala195)した不活性型グランザイムBを作製した。また、野生型および不活性型グランザィムBから、シグナル配列およびジペプチド配列を除去した欠失変異体をそれぞれ作製した。さらに、野生型グランザイムB、不活性型グランザイムB、並びに野生型と不活性型グランザイムBの欠失変異体(シグナル配列とジペプチド配列を除去)をc-Fos-DsRed-Monomerおよびc-Jun-DsRed-MonomerのN末側に挿入した発現ベクターを構築した。本研究では、細胞傷害性T細胞やナチュラルキラー細胞の細胞傷害機構を工学的に応用し、生細胞に抗体を効率的に導入する技術を確立することを目的とした。その第一段階として、実験材料となるパーフォリンとグランザイムB遺伝子の取得を行った。PCR3ベクター(Invitrogen,CMVプロモーター)を基本骨格として、マルチクローニングサイトの下流に、FLAGタグ(DYKDDDDK)を挿入し、C末端側にFLAGタグを付加することのできる動物細胞用発現ベクターを作製した。ヒトナチュラルキラー細胞株YTより、トータルRNAを精製した後、オリゴdTをプライマーとして、逆転写酵素反応を行い、一本鎖cDNAを合成した。パーフォリンおよびグランザイムBの塩基配列情報から、N末端およびC末端にそれぞれEcoRI、Xholの制限酵素配列を付加したプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて、YT細胞より作製した一本鎖cDNAを鋳型としてPCRを行った結果、パーフォリンおよびグランザイムB遺伝子に相当すると考えられるDNAフラグメントを得た。これらのDNAフラグメントをEcoRIとXhoIで切断し、上記のC末端FLAG発現ベクターのEcoRI-XhoIサイトにクローニングした。DNAシークエンシングによって塩基配列を決定し、変異のないヒトパーフォリンおよびヒトグランザイムBの遺伝子であることを確認した。さらに、ヒト胎児性腎細胞HEK293細胞にパーフォリン遺伝子およびグランザイムB遺伝子を一過的に発現させ、細胞ライゼートを調製した。SDS-PAGEでタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜へ転写後、抗FLAG抗体でウェスタンブロッティングを行った。パーフォリンおよびグランザイムBを発現させた細胞では、それぞれ60-70kD付近と30-35kD付近にポジティブなバンドが観察された。
ミセル溶液系における金属クラスター生成過程の解明

1.界面活性分子デシルトリメチルアンモニウムブロミド(C_<10>TAB)の^<13>CNMR測定を行い、臨界ミセル濃度(CMC)以下では縮退しているピークが、CMC以上では、完全に分離して現われることを見いだした。これは、CMC以上で界面活性分子が直線状にのびきった構造をとっていることを示している。さらに、C_<12>TABに保護された白金クラスター分散液では、C_<12>TABのアルキル鎖の中心部分で白金クラスターによるシフトが観察された。また、ポリエチレングリコールモノウラレートに保護された白金クラスターではアルキル鎖の炭素のシグナルが消失した。これらは、アルキル鎖部分が白金クラスター粒子表面に強く吸着していることを示唆している。2.キャピラリー法で白金クラスターを包埋したミセルの拡散速度と、ピレンをトレーサーとするトレーサー拡散速度とを求め比較した。これらの拡散速度から求めたストークス半径を、電子顕微鏡観察から求めた白金クラスターの半径と比較すると、C_<16>TABおよびC_<14>TAB系では計算値と実測値はほぼ一致するが、C_<10>TABおよびC_<12>TAB系では、白金クラスター包埋ミセルの実測値の方が計算値よりも小さいことが明らかとなった。この事実は、先にNMR測から示唆された界面活性分子吸着型のクラスター安定化機構を支持するものである。3.水容性高分子または界面活性分子存在下、2種の貴金属イオンを一緒に還元すると二元金属クラスター分散液ができる。金クラスター分散液が可視吸収スペクトルに特徴的なプラズマ吸収を有することに着目して、金-白金クラスターの還元調製時のスペクトルの変化を測定して、二元金属クラスターの生成過程を検討した。その結果、金-白金二元金属クラスターの生成過程において、金クラスターがまず生成し、その後に金クラスターの周囲に白金原子が付着して、金-白金二元金属クラスターが構築される機構が明らかとなった。