hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
センサーを用いた細胞膜と薬物の相互作用研究の新展開

イオンセンサーや酸素電極などの電気化学センサーを利用して、カチオン性ポルフィリンやキサンテン系色素がいかに細胞膜を光不活性化するかを解明した。また、カリウムイオンセンサーを利用した細胞膜の透過性変化の測定を通じて、溶血活性の低い膜作用性抗菌ペプチドの創製、マストパランなどのヒスタミン遊離物質の細菌、赤血球及び肥満細胞に対する膜透過性増大作用の比較研究及びグラム陰性菌の外膜透過性を亢進させる物質の探索などを進めた。本研究は、細胞膜を標的とする薬物の作用機構の解析にセンサー法を応用し、センサー法を生物科学領域への新しい研究手法として確立していくことを目的としている。本年度得られた研究成果は以下の通りである。1.色素による細菌の光不活性化機構を解明するために、細菌細胞質膜に対する色素の作用をセンサーを用いて系統的に検討した。本年度は、特に、カチオン性ポルフィリンの作用機構を、酸素電極、カリウムセンサーと膜電位測定用(テトラフェニルホスホニウム)センサーを用いて検討した。その結果、カチオン性ポルフィリンによる光不活性化は、呼吸阻害による膜電位低下が引き金になることを明らかにした。2.カリウムセンサーを用いて、塩基性両親媒性物質の細菌膜、赤血球膜および肥満細胞膜に対する膜透過性増大作用を系統的に検討した。その結果、ヒスタミン遊離活性が強く、黄色ブドウ球菌に対して強い膜透過性増大作用をもち、酸性リン脂質との相互作用が強い塩基性両親媒性物質は、ラット腹腔肥満細胞からヒスタミン分泌後に、すぐに肥満細胞形質膜の透過性を増大させることを見出した。ヒスタミン分泌後にはホスファチジルセリンが細胞膜表面に出現することはよく知られており、今回の結果は酸性リン脂質と強い相互作用を示す両親媒性物質は細菌膜のみならず肥満細胞形質膜の透過性も増大できることを示した。また、これらの物質は、赤血球膜の透過性変化(溶血)を引き起こす濃度で、赤血球の形態をエキノサイト(外方突出)型に変形させた。したがって、今回検討した塩基性両親媒性物質は、細胞膜外層に優先的に蓄積することにより膜構造を不安定化させ、膜透過性変化を引き起こすものと考えられた。3.その他、酸素電極を用いたスーパーオキシドアニオン(O_2^-)の新規定量法を開発した。1.色素による細胞膜の光不活性化機構を解明するために、ポルフィリン及びキサンテン系色素を用いて細菌および赤血球膜に対する作用を詳細に検討した。センサーとして、カリウムセンサー、酸素電極、テトラフェニルホスホニウムセンサーを用い、膜透過性亢進、呼吸阻害、膜電位消失などの早い過程で引き起こされる細胞膜機能の低下をリアルタイムで追跡した。その結果、キサンテン系色素による光不活性化は、一部の色素では呼吸阻害がみられだものの、主に膜透過性亢進による膜電位低下が引き金になることを明らかにした。この作用は、呼吸阻害による膜電位低下が引き金になったカチオン性ポルフィリン色素とは大きく異なった。作用の違いは、細胞質膜中での色素の存在位置に起因する可能性が大きいことが、赤血球の形態変化の観察から示唆された。2.抗生物質グラミシジンSは細菌膜の透過性を増大し、強力な抗菌作用を示すものの、赤血球膜にも作用して溶血活性を示すため、溶血活性の低いグラミシジンSアナログの創製を目指して研究を進めた。合成したアナログの細菌に対する膜透過性亢進作用は、細胞質からのカリウムイオンの流出をカリウムセンサーを用いて評価し、溶血作用と比較した。その結果、グラミシジンSのβ-ターン部位のフェニルアラニン残基を、側鎖にピリジル基をもつ親水性非天然アミノ酸に置換したペプチドが溶血活性を抑え、細菌膜の透過性を選択的に増大させることを見出した。3.グラム陰性菌の外膜透過性を亢進させる物質を探索することを目的として、カリウムセンサーと細胞質膜の透過性を選択的に増大させるカリウムイオノフォアとを組み合わせた評価法の開発を進めた。1.これまで進めてきた「カリウムセンサーを用いた大腸菌外膜の透過性測定方法」を確立するために、アッセイ条件を詳細に検討した。本法の測定原理は、外膜透過性が増大すると、細胞質膜の透過性変化を引き起こす薬物(チロシジンAなど)が細胞質膜に到達できるようになり、細胞質からカリウムイオンを流出させることを利用している。カリウム流出量をカリウムセンサーで測定することにより、短時間で簡便に薬物の外膜透過性増大能を評価できる。既存の医薬品の外膜透過性亢進能を詳細に検討した結果、ジミナゼンやペンタミジンなどの抗原虫薬には外膜透過性を増大させる作用があり、その濃度依存性を明確に提示することができた。

2.光照射したプロトポルフィリンが赤血球を溶血させることが古くから知られていることから、構造類似の一連のポルフィリン(プロトポルフィリン、メソポルフィリン、デューテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン)の赤血球及び細菌に対する作用を比較検討した。赤血球は溶血、細菌(黄色ブドウ球菌)は細胞質からのカリウムイオンの流出を指標にして作用の強さを比較すると、両者ともにメソポルフィリン≒デューテロポルフィリン>プロトポルフィリン>ヘマトポルフィリンの順に増大した。一方、膜への侵入能力の指標の一つとなるオクタノールー水間の分配係数は、メソポルフィリン≒プロトポルフィリン>デューテロポルフィリン>ヘマトポルフィリンの順であり、分配係数がある程度の大きさであれば、膜透過性変化を引き起こすことが示されたものの、微妙に順番が異なっていた。これらのポルフィリンは水溶液中で凝集することが知られており、現在、さらに詳細な検討を進めている。当初の研究計画通り実験が進み、研究成果が原著として2報発表できたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。カチオン性ポルフィリンとキサンテン系色素の間で作用の違いが見られたことから、今後さらに色素の種類を変えて検討し、色素間の違いがなぜ起こるのかを解明する。
溶接接合部の超高速引張り時の破断挙動と変形能力に関する基礎的研究

本研究の目的は、鋼構造溶接部の動的外力下で破壊性状と引張り強さ・変形能力の支配因子の検討を行い、歪み速度が溶接部の破断性状と引張り強さ・変形能力に与える影響を明らかにする事である。本研究では、溶接によって靭性が変化した供試体を安価に安定して製作する方法として再現熱サイクル試験機による熱加工に注目し、引張り試験片の中央部に再現熱サイクル試験機で溶接熱影響部を再現した後に高速引張試験に供した。鋼種の違いによる歪み速度の影響の違いを把握するため、SN400,SN490と組成の大きく異なる2種類のHT780の4種の鋼材を対象とした。まず、それぞれの鋼材の熱加工サイクルとシャルピー吸収エネルギーの関係を把握するための実験を行った。その後に、歪み速度と応力集中の有無をパラメータとした超高速引張り実験を行った。さらに、ひずみ時効を受けた鋼材の溶接部についても同様の実験を行った。得られた主な結論は以下の通りである。・シャルピー吸収エネルギーが小さい場合、歪み速度が大きくなると脆性破面率が増加する。・延性破断した場合の引張強さは、溶接熱影響やひずみ時効を受けている鋼材であっても、ひずみ速度が増加するにつれて上昇する。また、この強度の上昇割合の支配因子は静的引張強さであった。ただし、脆性破断した場合の引張強さは、ひずみ速度が増加しても静的引張強度と同程度のままである。・応力集中がない場合、ひずみ速度の増加により変形能力が若干低下する。応力集中がある場合、溶接熱影響部やひずみ時効部の変形能力は、シャルピー吸収エネルギーの大きな鋼材ではひずみ速度が増加するにつれて上昇する。しかし、シャルピー吸収エネルギーの小さな鋼材では変形能力が大きく低下する。このように、応力集中がある場合、高歪み速度下での溶接部の変形能力の支配因子はシャルピー吸収エネルギーであった。本研究の目的は、鋼構造溶接部の動的外力下で破壊性状と変形能力の支配因子の検討を行い、溶接接合部の靭性および試験温度が、歪み速度と破断性状・変形能力の関係に与える影響を明らかにする事である。これにより、動的外力の影響を考慮した溶接構造物の安全性評価の基礎的資料が得られるだけではなく、動的外力を受ける溶接接合部が脆性的な破壊をおこさないための必要シャルピー吸収エネルギー値が提案できる。本年度は、靭性の異なる供試体を実際の溶接で製作することが非常に高価・困難であることが判明したため、靭性の異なる供試体を安価に安定して製作する方法として再現熱サイクル試験機による熱加工に注目した。再現熱サイクル試験機で引張り試験片を熱加工するため、特殊な形状の試験片と熱加工ジグを考案し、靭性の均一な引張り試験片を製作することができること明らかにした。また、SN400,SN490,HT780材の熱加工サイクルとシャルピー吸収エネルギーの関係を把握するための実験を行った。これらの検討によりパラメトリックな実験が可能となったため、SN400について本実験供試体を20体製作し、再現熱サイクル試験で靭性を変化させた後、靭性・歪み速度・応力集中の有無をパラメータとした超高速引張り実験を行った。実験には、"超高速衝撃構造性能評価システム-超高速引張りユニット-"および100kHzのデータ収集能力のある超高速デジタルメモリレコーダを用いた。この実験により、供試体の靱性と応力集中の有無が、歪み速度と破断性状・変形能力の関係に与える影響を明らかにした。

今後SN490,HT780材についても同様の実験・検討を行う。本研究の目的は、鋼構造溶接部の動的外力下で破壊性状と引張り強さ・変形能力の支配因子の検討を行い、歪み速度が溶接部の破断性状と引張り強さ・変形能力に与える影響を明らかにする事である。これにより、動的外力の影響を考慮した溶接構造物の安全性評価の基礎的資料が得られる。本年度は、昨年度同様、溶接によって靭性が変化した供試体を安価に安定して製作する方法として再現熱サイクル試験機による熱加工に注目し、引張り試験片の中央部に再現熱サイクル試験機で溶接熱影響部を再現した後に高速引張試験に供した。本年度は、昨年度実験を行ったSN400との比較を行い、鋼種の違いによる歪み速度の影響の違いを把握するため、SN490と組成の大きく異なる2種類のHT780を対象とした。まず、それぞれの鋼材の熱加工サイクルとシャルピー吸収エネルギーの関係を把握するための実験を行った。その後に、歪み速度と応力集中の有無をパラメータとした超高速引張り実験を行った。得られた主な結論は以下の通りである。(1)シャルピー吸収エネルギーが小さい場合、歪み速度が大きくなると脆性破面率が増加する。(2)延性破断した場合の引張強さは、溶接熱影響受けている鋼材であっても、ひずみ速度が増加するにつれて上昇する。また、この強度の上昇割合の支配因子は静的引張強さであった。ただし、脆性破断した場合の引張強さは、ひずみ速度が増加しても静的引張強度と同程度のままである。(3)応力集中がない場合、ひずみ速度の増加により変形能力が若干低下する。応力集中がある場合、溶接熱影響部の変形能力は、シャルピー吸収エネルギーの大きな鋼材ではひずみ速度が増加するにつれて上昇する。しかし、シャルピー吸収エネルギーの小さな鋼材では変形能力が大きく低下する。このように、応力集中がある場合、高歪み速度下での溶接部の変形能力の支配因子はシャルピー吸収エネルギーであった。
模擬市場実験と人工市場研究の融合による金融市場安定化のための制度的考察

本研究の最終的な目標は,金融市場でしばしば見られる大きな価格変動の将来予測および価格安定化のための手法の開発と,それを実現する制度設計・政策提言を行うことにある.本年度の研究では,上記の最終目標に向けて必要となると考えられる,市場参加者個々人の意思決定方略や心理バイアスの解明と,それがマクロな市場価格形成に与える影響を明らかにするための人工市場モデルの拡張を行った.具体的には,まず,実際の経済取引場面に酷似した模擬市場での実験を通して,現実のプロの市場参加者が共通に示す心理バイアスを明らかにした.Java言語を用いて独自に開発した仮想市場実験システムVDSを通して,金融の実務経験が5年以上のエキスパートと経済学部生・大学院生であるノービスに,外国為替取引を行わせ,そこでの投資行動を特にリスク管理と利益の確定という意思決定の側面から分析した.その結果,エキスパートの市場参加者は,プロスペクト理論で示される投資家の非合理的行動を部分的に回避していることがわかった.プロスペクト理論では,処置効果もサンクコスト効果も投資家に一般的にかかるバイアスとされているが,真のエキスパートは少なくともサンクコスト効果を回避していることが明らかになった.また,現実のプロの市場参加者にインタビューを行い,彼らの意思決定方略の一部(市場のコンセンサスへの注目)を抽出した.それを人工市場モデルに実装し,そのモデルでのシミュレーションを通して,市場のコンセンサスへの注目という意思決定方略が金融市場の価格形成に与える影響について分析を行い,市場のコンセンサスの形成過程や価格形成における意味を明確にした.具体的には,(1)実際に取引を行う投資家エージェントが価格決定要因の全てを入手できないことが新古典派経済学における情報の不安定性をもたらしていること,(2)そのため,投資家エージェントは全ての情報を処理できる情報提供者エージェントの予測に大部分は依存することになり,これにより情報の不均衡・非対称性が発生していること,(3)一方でこの非対称性を克服するための「アナリストランキング」が自然発生しており,これが意見の集約に大きな役割を果たしていること,が明らかになった.今後は,模擬市場実験で明らかにされた心理バイアスを,構築した人工市場モデルの各エージェントの意思決定の部分に実装し,そのシミュレーションに基づいて,金融市場の安定化のための制度設計・政策提言を行う予定である.本研究の最終的な目標は,金融市場でしばしば見られる大きな価格変動の将来予測および価格安定化のための手法の開発と,それを実現する制度設計・政策提言を行うことにある.本年度の研究では,上記の最終目標に向けて必要となると考えられる,市場参加者個々人の意思決定方略や心理バイアスの解明と,それがマクロな市場価格形成に与える影響を明らかにするための人工市場モデルの拡張を行った.具体的には,まず,実際の経済取引場面に酷似した模擬市場での実験を通して,現実のプロの市場参加者が共通に示す心理バイアスを明らかにした.Java言語を用いて独自に開発した仮想市場実験システムVDSを通して,金融の実務経験が5年以上のエキスパートと経済学部生・大学院生であるノービスに,外国為替取引を行わせ,そこでの投資行動を特にリスク管理と利益の確定という意思決定の側面から分析した.その結果,エキスパートの市場参加者は,プロスペクト理論で示される投資家の非合理的行動を部分的に回避していることがわかった.プロスペクト理論では,処置効果もサンクコスト効果も投資家に一般的にかかるバイアスとされているが,真のエキスパートは少なくともサンクコスト効果を回避していることが明らかになった.また,現実のプロの市場参加者にインタビューを行い,彼らの意思決定方略の一部(市場のコンセンサスへの注目)を抽出した.それを人工市場モデルに実装し,そのモデルでのシミュレーションを通して,市場のコンセンサスへの注目という意思決定方略が金融市場の価格形成に与える影響について分析を行い,市場のコンセンサスの形成過程や価格形成における意味を明確にした.具体的には,(1)実際に取引を行う投資家エージェントが価格決定要因の全てを入手できないことが新古典派経済学における情報の不安定性をもたらしていること,(2)そのため,投資家エージェントは全ての情報を処理できる情報提供者エージェントの予測に大部分は依存することになり,これにより情報の不均衡・非対称性が発生していること,(3)一方でこの非対称性を克服するための「アナリストランキング」が自然発生しており,これが意見の集約に大きな役割を果たしていること,が明らかになった.今後は,模擬市場実験で明らかにされた心理バイアスを,構築した人工市場モデルの各エージェントの意思決定の部分に実装し,そのシミュレーションに基づいて,金融市場の安定化のための制度設計・政策提言を行う予定である.
A・グラムシ『獄中ノート』の全体的論理構造の基礎研究

研究成果として次の諸点が明らかになった。1.『ノート』全容を故竹村英輔氏は、一般的理論問題の考察と歴史具体的な個別諸事象の考察との「二重構造」として捉えたが、これを歴史研究と理論研究との二重構造として捉えなおし、前者に属する(1)イタリア知識人史、(2)アメリカニズムとフォード主義と、後者に属する(3)哲学、(4)政治学の諸主題を『ノート』の4大主要テーマとして把握することができる。2.この4大主要テーマをも貫く『ノート』全体の統一的テーマは、新しい歴史主体の形成にあり、この主体として想定されているのは、「階級」(社会集団)と「人間」(個人)であり、「階級」は、(1)自己主体化の媒介としての自己の「知識人」層を自ら創造して自己包括的な複合的社会集団をなし、さらに(2)自己を主導者として包括する諸階級の「社会的ブロック」を構成して歴史の主導者となる。そして「人間」は、自己の個人性を中核にして自己が活動的諸関係をとり結ぶ他者および自然からなる自己包括的複合体をなして具体的な人間となる、と各々弁証法的に概念把握されている。3.『ノート』全体において決定的な意義を有するのは上記(3)の「哲学」(実践の哲学)であり、この「哲学」は、「階級」および「人間」の自己主体化の哲学として、それ自体が、自己を自己に包括し、諸科学を包含した複合的体系としての広義「実践の哲学」となる。4.前記(1)や(2)の歴史研究は、哲学研究の一側面として探究された歴史方法論と結びついている。その方法論は、(1)「哲学」を前提として含み、(2)その哲学を実際の歴史の研究における「方法論的規準」に翻訳・変換した「実際的諸基準」、(3)個別諸事象捕捉の方法としての「文献学」、の3次元から構成される。「実際的諸基準の体系的展覧」が「歴史叙述の理論」をなすとすれば、「諸基準」と「個別諸観察」の総体からなる前記(4)「政治学」は、そこから分化したものである研究成果として次の諸点が明らかになった。「実際的諸基準の体系的展覧」が「歴史叙述の理論」をなすとすれば、「諸基準」と「個別諸観察」の総体からなる前記(4)「政治学」は、そこから分化したものである「研究課題」である「A・グラムシ『獄中ノート』の全体的論理構造の基礎研究」に接近するため、今年度は、『獄中ノート』における「将来社会像」の論理を探り、次に、彼の概念構成の弁証法的な性格を検証した。そこから以下の重要な成果が得られた。1.将来社会像の包括的研究を通じて、(1)近代の完成によるその超克という彼の発想法を明確にしえるとともに、(2)将来社会像の諸側面として、(1)必然性-自由の弁証法、(2)統一体的人間性への到達、(3)経済的基礎、(4)文化的側面、(5)政治(国家)の止揚、という5つの側面の存在を明らかにし、その総体的連関の解明にまで進みえた。2.グラムシにおける弁証法的な概念構成として、その自己包括的概念構成の存在を、「実践の哲学」概念、「人間」概念、さらに「国家」概念について検証した。3.この作業から「国家」概念については、思わぬ成果として、一般的な「国家と個人(自由)」の問題に対するグラムシ独自の解答がそこに潜められていることが突き止められる結果となり、彼の「政治社会-市民社会」論を、まさにこの問題視角から究明するという新しい探求課題が浮上した。

したがって、次の課題は、この探求課題に着手し、グラムシ国家論の新たな総合的解明に向かうことである。1.前年度の研究から浮上した、グラムシの「政治社会-市民社会」論の自己包括的概念構造を解明するという新たな課題がひとまず果たされ、あらなめてグラムシ『獄中ノート』における「哲学」「人間」「国家」の諸概念の弁証法的構造を組織立てて論述することができた。2.その上で、「人間」論については、これまでに発表してきた解読を前提にしつつ、新たに「人間的本性」概念と「ヒューマニティ」概念の区別と関連を明確化し、さらに「社会的諸関係の総体」である「人間的本性」の内的諸矛盾、および、諸個人間の性格的矛盾という「矛盾」の観点を導入して『ノート』の再読に取り組んだ結果、グラムシの人間論をより統合的かつ正確に捉えなおすことができた。3.加えて、今年度の最大の成果は、『獄中ノート』におけるグラムシ自身の「研究プラン」(Q1プラン、Q8プラン)の推移と、これに関連する獄中書簡との分析を、『ノート』の実際の執筆過程に照らしながら進める作業を通して、『ノート』全体の主題構成を探り、そこから「4大主要テーマ」(イタリア知識人史、アメリカニズムとフォード主義、哲学、政治学)を分析仮説として析出することができたことである。そして同時に、そこから、先行研究としての竹村英輔、松田博両氏の『ノート』把握に関する見地を批判的に検討し、それらを乗り越える方向、課題を提示した。これにより、『ノート』全容解明への新たな橋頭堡を築きえた。1.グラムシの階級概念を検討した結果、この概念が典型的に「自己包括的」な論理構造を有していることが判明すると同時に、「ヘゲモニー」と「歴史的ブロック」という歴史の運動把握にとってのグラムシの重要概念が、その階級概念の論理構造内に位置づけられることが明らかとなった。それによって、元来自己包括的な概念構造は自己主体化の論理であることに鑑み、グラムシにおいてこの論理構造をとる概念は、基本的に、「人間(個人)」、「階級(社会集団)」および、この2つの主体の理論的表現としてある「実践の哲学」の3概念であるという結論に達し、研究期間の初年度以来探究してきた自己包括型概念の所在探索をひとまず完了しえた。2.前年度に解明した『獄中ノート』の4大主要テーマを踏まえて、歴史的経験的分析の方法論(歴史方法論)を探究した結果、それがα一般的方法論としての「哲学」、βこの哲学を「歴史と政治の研究と解釈」のための方法論的諸規準に翻訳・変換した「実際的諸基準」、γ「文献学」、の3次元構造をなしていることが明らかになった。そして、そこから『獄中ノート』の体系構造全体の輪郭が浮上した。その輪郭とは、(1)「哲学」、(2)その変換形態としての「実際的諸基準」を含む上記3次元方法論、(3)それによる多様な個別諸事象の経験的諸分析(イタリア知識人史、アメリカニズムとフォード主義、等)、(4)同時に、この経験的分析のなかで定立された各種の多様な「実際的諸基準の体系的展覧」としての分析枠組的社会理論の構成(歴史-階級-知識人の理論、国家の理論、等)、として展開する体系構造をなしているということである。3.以上のことから、本研究は、課題名に照らしてほぼ満足のいく成果を収めえたものと考えている。
ヒト乳頭腫ウイルスシグナル伝達に着目した喉頭乳頭腫に対する新規治療の開発

ヒトパピローマウイルス(HPV)が関連する難治性の疾患である喉頭乳頭腫の研究モデルを作成するため、培養細胞の樹立を試みた。乳頭腫組織から腫瘍細胞の生着を認めたが、継代することは困難であった。一方、新たな治療の探索のため、腫瘍細胞における免疫染色で、腫瘍のfibrovascular coreにある血管の周囲に血管新生因子である血管内皮増殖因子(VEGF)の発現を確認した。VEGFは血管構造が明らかとなる以前のfibrovascular core様構造箇所に発現していることも確認され、抗VEGF療法の可能性がうかがわれた。喉頭乳頭腫の培養細胞モデルの作成のため、以下の3条件を設定して、手術により採取し細切した組織を培養シャーレに接着させた。(1)培養シャーレに細切組織を直接置き、培養液で被覆した。(2)培養シャーレに細切組織を直接置き、コラーゲンゲルで覆った後に、培養液で被覆した。(3)細切組織を培養シャーレにおいてコラーゲンゲル内に包埋し、培養液で被覆した。(1)および(3)では乳頭腫細胞の増殖を認めなかったが、(2)では細切組織の周囲に上皮細胞の増殖を認め、乳頭腫細胞と考えられた。したがって、喉頭乳頭腫組織からの初代培養では、(2)の方法が最適と考えられた。続いて、(2)においてコラゲナーゼにより被覆したコラーゲンを分解した後、トリプシンを用いて増殖した細胞をはがし、新たにシャーレに培養を開始したが、この時点で増殖が確認できていない。摘出した腫瘍組織11標本における研究も平行して開始した。免疫染色は未施行だがヘマトキシリン・エオジン染色により、腫瘍のコアに毛細血管が進展していることを確認した。喉頭乳頭腫の培養細胞モデルの作成のため、前年度実績に基づき、手術により採取し細切した組織を培養シャーレに直接置き、コラーゲンゲルで被覆する方法を採用し継続した。細切組織の周囲に上皮細胞の増殖を認め、乳頭腫細胞と考えられた。コラゲナーゼにより被覆したコラーゲンを分解した後、トリプシンを用いて増殖した細胞をはがし、新たにシャーレに培養を開始した。乳頭腫と思われる細胞の増殖を認めたため、さらにトリプシンではがした後に、研究目的であるEGFRシグナル系の活性化やシクロオキシゲネース-2(COX-2)の発現を検証、さらにはCOX-2阻害薬の効果を検証するため、分注して増殖を試みた。しかし、それ以降の増殖は確認できず、研究は停滞している状態である。並行して、摘出した腫瘍組織11標本において免疫染色も開始した。ヘマトキシリン・エオジン染色では、腫瘍のコアに毛細血管が発達していることを確認した。血管新生因子である血管内皮増殖因子(VEGF)は、全例において、コアの毛細血管の周囲に発現を認めた。コア様の組織構築を示すが毛細血管の管腔を明らかに確認し得ない箇所においても、VEGFの発現を認めた。これは、毛細血管構築に先立ってVEGFが発現することを示唆し、乳頭腫組織における血管新生を示しているものと思われた。また、VEGFの発現に一致するようにCOX-2の発現も認めた。一方、血管新生作用の知られている誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現はVEGFに比べると弱いものの観察された。培養細胞モデルの作成を目標としているが、達成できていない。そのため、EGFRシグナル系の活性化の検証ができていない。組織をコラーゲンゲル下に埋める方法により、細胞の増殖は確認し、二代目への継代は可能であったが、実験を実施するために三代目として分注しての増殖を試みるが不可であった。並行して施行した、摘出した腫瘍組織における免疫染色による研究は、想定どおりの進捗であり、おおむね予想した結果を確認することができている。喉頭乳頭腫の培養細胞モデルの作成のため、前年度と同様に、手術により採取し細切した組織を培養シャーレに直接置きコラーゲンゲルで被覆する方法を採用し、継続した。前年度との違いとして培養液に市販のケラチノサイト細胞培養システムを使用することとした。倒立顕微鏡での観察では、細切組織の周囲に上皮細胞の増殖を認め、乳頭腫細胞と考えられた。乳頭腫と思われる細胞の増殖を認めたため、さらにトリプシンではがした後に、研究目的である様々なHPVシグナル伝達経路の評価のため、分注して増殖を試みたが、以降の増殖は確認されなかった。また、研究代表者の所属機関変更のため、新たに倫理委員会への承認を得る手続きにも時間を要し、当初予定の進捗が得られなかった。一方、並行して、摘出した腫瘍組織における免疫染色も継続した。こう投入投手の組織学的特徴は、ヘマトキシリン・エオジン染色で観察される腫瘍のコアにある毛細血管である。血管新生因子である血管内皮増殖因子(VEGF)は、コアの毛細血管の周囲に発現を認め、血管新生に関与していることがうかがわれた。付随研究として、喉頭乳頭腫に対する新規治療開発の一助となるよう、うがい液からのHPV DNA検出を試みた。喉頭乳頭腫7例から咽頭うがい液と口蓋扁桃擦過検体を採取したところ、咽頭うがい液では5例においてHPV DNAを検出したが、口蓋扁桃擦過検体には検出しえなかった。

ヒトパピローマウイルス(HPV)が関連する難治性の疾患である喉頭乳頭腫の研究モデルを作成するため、培養細胞の樹立を試みた。乳頭腫組織から腫瘍細胞の生着を認めたが、継代することは困難であった。一方、新たな治療の探索のため、腫瘍細胞における免疫染色で、腫瘍のfibrovascular coreにある血管の周囲に血管新生因子である血管内皮増殖因子(VEGF)の発現を確認した。VEGFは血管構造が明らかとなる以前のfibrovascular core様構造箇所に発現していることも確認され、抗VEGF療法の可能性がうかがわれた。培養細胞モデルの作成を予定したが、達成できていない。そのため、EGFRシグナル系の活性化の検証ができていない。当初は、コラーゲンゲル内に組織を包埋していたが、細胞の増殖は得られなかった。このモデルの作成のノウハウを獲得するため、平成26年10月に米国ニューヨーク州にあるFeinstein Institute for Medical ResearchのDr. Steinbergのラボを訪問し、その手法ならびに試薬の調整等の視察を行った。獲得した方法はコラーゲンゲル下に組織を埋めるものであり、これにより細胞の増殖は確認できた。しかし、二代目への継代後の増殖が得られず、研究が進んでいない状態である。培養細胞モデルの作成が遅れているため、当初平成27年度以降に予定していた、摘出した腫瘍組織における研究も平行して施行すべく開始した。11標本の免疫染色用切片を準備した。培養細胞モデルの作成のため、前年度に視察したFeinstein Institute for Medical ResearchのDr. Steinbergのラボとの連携を密にし、引き続き培養細胞モデル確立に従事する。その上で、当初予定の、(1)EGFRシグナル系の活性化をウェスタンブロットによる検証、(2)EGFR抗体処理による増殖ならびにシグナル伝達系因子の変化の検討を、可能な限り行う。さらに、(3)血管内皮細胞との共培養による血管新生の有無の観察、ならびに(4)そのメカニズムの一つとしてVEGFの発現を検討するとともに抗VEGF抗体で細胞を処理し血管新生の抑制の有無を観察することも可能な限り行う。あわせて、摘出した腫瘍組織を用いた免疫染色を、さらにEGFRシグナル伝達系に着目して進めていく。耳鼻咽喉科学Feinstein Institute for Medical ResearchのDr. Steinbergのラボと連携を密にし、喉頭乳頭腫培養細胞モデルの確率を急ぐ。その上で、当初の予定どおり、(1)EGFRシグナル系の活性化をウェスタンブロットにより検証し、(2)EGFR抗体処理による増殖ならびにシグナル伝達系印紙の変化の検討を行う。さらに、(3)血管内皮細胞との共培養による血管新生の有無を観察する。(4)そのメカニズムの一つとしてVEGFの発現を検討するとともにVEGF抗体で細胞を処理し血管新生の抑制の有無を観察する。(5)摘出した腫瘍組織を用いた免疫染色をEGFRシグナル系および血管新生因子に着目して進めていく。当初予定額に加え平成27年度分の一部を前倒しで使用した。そのため、次年度使用額として残余することとなった。前倒しした平成27年度分の残余額であるため、当初予定した平成27年度の研究に使用する。
日韓中の恊働による相互理解のための国際理解教育カリキュラム・教材の開発

日韓中の相互理解を深めるための教材を3ヶ国で協力して開発するために「食」「人間関係」「人の移動」の3つの大単元を設定した。各単元で開発した教材を3ヶ国での実験授業を通して改善し、学習者の発達段階に応じ単元カリキュラムとして構成した。研究の目的は、日韓中の相互理解を深めるための教材を共同で開発することである。そのために、3か国の研究者および学校教員による研究グループをテーマごとに編成し、教材開発を行ってきた。具体的には、6月に第1回3か国全体会議(京都)を開催して研究方針・計画を確認し、直後のグループ会議で各単元の教材開発の枠組みについて協議した。その後、各グループごとに調査や教材研究を進め、各地での国内グループ会議を経て、11月に韓国で第2回全体会議(韓国)を開催した。各グループとも22年6月の日本国際理解教育学会研究大会で発表するための準備を重ね、2月末の代表者会議(札幌)で今年度の総括を行った。教材は大きく3つの単元から構成される。A「食文化」単元では「ラーメン」グループと「米」グループに分かれ、それぞれラーメン/米を通じてのつながり、および3か国におけるラーメン/米をめぐる違いをとりあげている。B「人間関係」単元の「つきあい方」グループでは家族・教師・友人とのつきあい方の違いと共通点を、「言語・言語活動」グループでは言語の意味や使い方の違いと共通点をとりあげている。C「人の移動」単元の「旅行」グループでは3が国の文化・歴史・今日的課題などを、「移民」グループでは3か国の移民の現状・背景・移民をとりまく諸問題をとりあげて、教材の開発に取り組んだ。本研究の意義は、日韓中3か国の恊働によって共通の教材および発達段階に対応したカリキュラムを開発することにある。開発された教材を3か国の小・中・高校で実践し、その結果を持ち寄ってさらに検討し、改善を図るという点においてもきわめて画期的であり、我が国の国際理解教育史上はじめての試みである。2010年度は、1年目の研究成果を日本国際理解教育学会で発表するとともに、各グループで開発した教材を3か国で実験授業にかけ、改善を行った。具体的には以下の通りである。A「食文化」単元では、「麺」グループが3か国におけるラーメンをめぐる食文化やラーメンを通じた3か国のつながりを内容とする教材を開発して、日本,韓国、中国で実験授業を行い、改善を図った。「米」グループは、「米」をめぐるグロバリゼーションとローカリゼーションをとりあげた教材を開発し、日本,韓国で実験授業を行い,改善を図った。B「人間関係」単元の「付き合い方」グループは、家族・教師・友人とのつきあい方の違いと共通点を内容とする教材を開発し、日本,韓国で実験授業を行い,改善を図った。「言語・言語活動」グループは、「あいさつ言葉」「お礼のことば」「若者ことは」をとりあげた教材を開発し、国内で実験授業を行い、改善を図った。C「人の移動」単元の「移民」グループはハワイ移民、ブラジル移民をテーマにした読み物教材を開発して日本と韓国で実験授業を行い、改善を図った。「留学生」グループは、留学生にとつての異文化理解や直面している諸問題を取りあげた教材を使って日本と中国で実験授業を行い、改善を図った。「旅行」グループは、3か国の文化・歴史・つながりなどを理解するための双六教材を開発して日本と韓国で実験授業を行い、改善を図った。相互理解のための教材を日韓中3か国の協働により開発し、3か国語に翻訳して、それぞれの国の学校で実験授業を行い、その結果を討議するプロセスで、3か国の研究者/学校教員の間の相互理解が深まりつつある。同時に、各国の児童/生徒の実情や国際理解教育の現状についても、次第に明らかになってきた。こうして得られた知見を生かしながら、今後、3か国で広く活用されうる教材の開発をめざしている。本研究の目的は、日韓中の相互理解を深めるための教材・カリキュラムを共同で開発することである。そのために、「食」「人間関係」「人の移動」の3つの大きな単元(テーマ)を設定し、3か国の研究者および学校教員による研究グループをテーマごとに編成した。「食」単元では、「ラーメン」グループは、3か国におけるラーメンをめぐる食文化やラーメンを通じた3か国のつながりを内容とする教材を開発した。「米」グループは、「米」をめぐるグローバリゼーションとローカリゼーションをとりあげた教材および単元カリキュラムを開発した。「人間関係」単元の「生活文化」グループは、家族・教師・友人とのつきあい方の違いと共通点を内容とする教材を、「ことばと生活文化」グループは、「あいさつ言葉」「お礼のことば」「若者ことば」をとりあげた教材を開発した。「人の移動」単元の「移民」グループは、ハワイ移民、ブラジル移民をテーマにした読み物教材を開発し、「留学生」グループは、留学生にとっての異文化理解や直面している諸問題を取りあげた教材を開発した。また、「旅行」グループは、3か国の文化・歴史・つながりなどを理解するためのすごろく教材を開発した。

いずれも、日本・韓国・中国で実験授業を実施し、それらの結果を検討した上で、教材の改善を図るとともに、学習者の発達段階に応じて各大単元のカリキュラムを構成した。本研究の意義は、第一に、3か国共通のテーマを扱うことにより、日韓中3か国の文化の違いだけではなく、文化の共通性および相互の繋がりをも学ぶことができる点にある。第二に、教材・カリキュラム開発のプロセスにおいて、3年間にわたって研究会を重ねることにより、日韓中3か国の研究者および教員が相互理解を深めることができ、そのことは教材にも反映されている。日韓中3カ国語に翻訳された本教材は、今後3ヶ国で活用される予定である。
『漢書』『晋書』『隋書』刑法志を基軸とする刑罰制度変遷史の基礎的研究

本来の計画では、25年度は中国(北京・上海)と台湾(台北)に一ヶ月ほど滞在し、宋元版および明清版の中国正史の刑法志について、数種を校合しながら、文字の校訂を含めた内容の比較作業を行なう予定であった。しかし24年度に引き続き25年度にも入院・手術という憂き目にあってしまったので、体調上の問題から中国・台湾への遠征を控えることにして、もっぱら日本国内の宋元版・明清版資料の調査に従事し、それらを用いてすでに影印書籍として出版されている版本との比較校合・文字の校訂とその内容の検討に集中することにした。また文字の校訂作業を終えてから行なう計画であった、歴代正史の刑法志の性格と傾向の検討作業に先に手をつけて、とくに『晋書』および『隋書』刑法志の内容を精読し、その作業を通じて、刑法志という形態で記される歴代王朝の法制の概要記述に見られる傾向と問題点の分析を行ない、ある程度の学説的な目処を立てた。この成果は、26年度に学術雑誌上で報告・発表する予定である。またこの歴代刑法志の研究から派生して、中国古代法制史を題材とした一般向けの概説書の執筆・出版の計画を進めており、堅実な出版社の編集担当者との会合・打合せを頻繁に持つことができた。その出版社は京都に本社を置くため、あわせて京都に所在する明清版の中国正史の調査や京都の博物館・美術館の古籍をひろく見聞するという体験ができた。版本の文字の校訂作業には、書誌学・美術史的な広い知識と美術が必要とされるので、その知識を深める目的で、中国の古籍に限らず、日本の古籍も実地に見て眼識を高めるように勤めた。なお最終年度に入って、ようやく体調が落ち着いてきたことから、今年度の夏期休暇に北京・台北に滞在して資料調査を行なう予定であるが、本来の計画ほどの長期間の滞在は無理なため、期間を短くして、資料の要所に限定した調査を行なう予定である。前年度の入院・手術以来、国内における大学の講義や出張、および全国に所在する漢籍資料の調査においては、何ら問題なく通常通りの活動ができるまで、体調は回復しているが、この研究のメインになる、中国・台湾に所在する漢籍資料を調査するため長期滞在してじっくりと文字・内容の比較校合を行なうことはまだ困難がともなっている。内臓の消化器系の手術を二度行なったため、とくに中国の食事情にともなう食事の安全性の問題から、食中毒の可能性や添加物の蓄積などに、現在の私の身体が耐えられるかどうか、心許ないからである。今年度は、最新の注意を払って渡航して調査に手をつけるが、当初の計画ほどの本格的な徹底調査を行なうことは少々無理があると思われる。そこで現在は国内に所在する漢籍の調査に従事しているが、この国内資料の調査は順調に進んでいるため、本年度を通じて、国内資料を利用した研究には確固とした成果を挙げられるものと思われる。また国内資料の調査に当たって、図書館・博物館・美術館・資料館などのように、一般に資することを目的とした閲覧のシステムが確立している機関のばあいは、閲覧申請から閲覧まで、時間も手間をそれほどかからない。しかしただその資料を所有しているだけで、とくに一般への閲覧を考えていない機関のばあいは、その閲覧までの手続きに予想外の時間と手間がかかる。紹介者を捜さなければならないこともある。この問題から、本年度中の閲覧調査が不可能なばあいが生じるかも知れない。書誌学または歴史学の大家の紹介状を手に入れるのが一番望ましいが、私の交遊範囲ではなんとも心許ない。本研究は、『漢書』『晋書』『隋書』の刑法志をメインの資料として選択しているが、海外資料との比較校合の作業を除けば、『漢書』についてはほぼその目的を達している。残るは『宋版通典』との比較のみである。そこで本年度は『晋書』『隋書』に集中して、まずその内容の正確な読解と問題点の発見を行なったうえで、国内資料を中心として、文字の比較校合作業を行なうことにする。コンピューターに複写をすべて読み込むか、あるいはネット上に散在する海外の漢籍の複写の情報を利用して、すべてパソコンに入れたうえで、それを漢籍所有機関に持ち込む方法もないわけではないが、紙質の比較や紙の汚れ・虫食い迹なども検討の材料として重要なため、画像資料で比較することはできるだけ避けたい。迂遠な方法であり、昨今のトレンドから外れていて、しかも海外の研究機関や一部の国内機関は画像の利用のみを提供するものの、版本そのものの閲覧許可をしぶる傾向がある。しかし何とか実物を実見するようにしたい。また最終年度であるため、少なくとも夏期休暇終了後には、まとまった成果を学術雑誌に投稿し、さらにそれを最終研究成果報告書に盛り込めるようにしたい。平成24・25年度の二度の手術・入院により、中国・台湾における長期の資料調査ができなかったことから、本研究費の半分を占める旅費の大部分を使用しないまま、最終年度に至ってしまったことが理由として挙げられる。本年度はようやく体調・体力も回復の兆しをみせ、長期は難しいが短期であるなら、中国・台湾での資料調査が可能であることから、年度のできるだけ早い時期に両国へ渡航し、まずは該当資料の実見と調査を行なう。その調査をもとに、できれば二度渡航して調査を行ないたい。それで残る旅費分の全額使用が可能になると思う。また現地で資料の複写をできるだけ購入して、日本国内でも検討作業が可能なようにする。

その購入費にも旅費分を当てるつもりである。本来の計画では、25年度は中国(北京・上海)と台湾(台北)に一ヶ月ほど滞在し、宋元版および明清版の中国正史の刑法志について、数種を校合しながら、文字の校訂を含めた内容の比較作業を行なう予定であった。しかし24年度に引き続き25年度にも入院・手術という憂き目にあってしまったので、体調上の問題から中国・台湾への遠征を控えることにして、もっぱら日本国内の宋元版・明清版資料の調査に従事し、それらを用いてすでに影印書籍として出版されている版本との比較校合・文字の校訂とその内容の検討に集中することにした。また文字の校訂作業を終えてから行なう計画であった、歴代正史の刑法志の性格と傾向の検討作業に先に手をつけて、とくに『晋書』および『隋書』刑法志の内容を精読し、その作業を通じて、刑法志という形態で記される歴代王朝の法制の概要記述に見られる傾向と問題点の分析を行ない、ある程度の学説的な目処を立てた。この成果は、26年度に学術雑誌上で報告・発表する予定である。またこの歴代刑法志の研究から派生して、中国古代法制史を題材とした一般向けの概説書の執筆・出版の計画を進めており、堅実な出版社の編集担当者との会合・打合せを頻繁に持つことができた。その出版社は京都に本社を置くため、あわせて京都に所在する明清版の中国正史の調査や京都の博物館・美術館の古籍をひろく見聞するという体験ができた。版本の文字の校訂作業には、書誌学・美術史的な広い知識と美術が必要とされるので、その知識を深める目的で、中国の古籍に限らず、日本の古籍も実地に見て眼識を高めるように勤めた。なお最終年度に入って、ようやく体調が落ち着いてきたことから、今年度の夏期休暇に北京・台北に滞在して資料調査を行なう予定であるが、本来の計画ほどの長期間の滞在は無理なため、期間を短くして、資料の要所に限定した調査を行なう予定である。本研究は、国内および中国・台湾の漢籍収蔵機関から、中国歴代王朝の正史の「刑法志」とその抄本の版本を実見し、刑罰制度に関する記述を収集して、そこに現れた記述の異同に注目し、比較検討を行なうことを主たる方法とするものである。初年度にあたる平成24年度は、夏期・春期の休暇を利用し、台湾中央研究院および故宮博物院で集中的に『漢書』『晋書』『隋書』の刑法志の調査を進める予定であった。ところがこの年の春、代表者(石岡)が入院して手術を受けるという事態が発生し、消化器系の疾病を患ったことから、退院後に食事療法のリハビリが必要となり、当分、国外に長期間滞在することが不可能となった。このため台湾における調査を延期し、国内の学術機関の収蔵する漢籍を主たる対象として調査を行なうことにしたものの、病後の回復期間にあることから、国内の版本の調査も、結局、次年度・次々年度に集中して行なうことにせざるを得なくなってしまった。そのため、初年度に渡航費・交通費と滞在費の多くを使用すべく申請してあったが、それらは次年度に繰り越しせざるを得なくなった。本来は漢籍の版本の比較研究を通じて、歴代正史「刑法志」の中から問題点を発見する手法を目指していたが、24年度は上記の理由により、所有する書籍および図書館の所有する文献を対象として、すでに問題点が発見されている「刑法志」上の刑罰制度の矛盾点・疑問点を整理する作業に専念し、資料の収集に努めた。
免疫アジュバントによるTh1活性化と抗腫瘍免疫増強

本研究は「細胞性免疫応答やTh1免疫応答を強く惹起するアジュバント活性を示すペプチドを結核菌の分泌タンパク質より探索し、それを用いてがん免疫を増強し、腫瘍排除や腫瘍転移を阻止する有効な免疫法を開発すること」を目的とした。まず結核菌が分泌するAg85BのTh1エピトープであるPeptide-25による抗腫瘍免疫増強機構を解析した。その結果、(1)Peptide-25自身は直接抗原提示細胞を活性化できないが、Peptide-25特異的CD4^+ T細胞存在下に抗原提示細胞をTh1反応誘導型へと活性化できること、(2)この抗原提示細胞の活性化によって腫瘍特異的CTLの増殖とクローン出現頻度が上昇すること、(3)この腫瘍特異的CTLの活性化増強によって抗腫瘍免疫反応が増強し、腫瘍細胞の生体内での生着を拒絶できることが示された。そこで、Peptide-25を特異的に認識するTCRを発現しているトランスジェニックマウス(P25 TCR-Tg)を作出しPeptide-25によるTh1分化誘導機構をさらに検討した。その結果、(4)P25TCR-TgナイーブCD4^+ T細胞はTCRからのシグナルのみで、副刺激分子、サイトカイン非依存的にTh1特異的転写因子7-betの発現が上昇すること、一方でTh2特異的転写因子GATA-3の発現を低下させ、結果としてTh1細胞へと分化できることが示された。以上のことから、Peptide-25はPeptide-25特異的CD4^+T細胞に対し強力なTh1応答を惹起し、その結果抗原提示細胞を含めた反応環境をTh1型へと誘導し、共存する他の抗原に対する特異的免疫応答をも選択的にTh1型へと誘導する活性、Th1応答誘導型ヘルパーペプチドの効果を有していることが示唆された。それを利用することにより腫瘍特異的CTLの活性を増強できることが明らかとなった。結核菌体成分がTh1細胞によって調節される細胞性免疫応答を強力に惹起することは良く知られている。本研究ではヒト型結核菌の分泌するタンパクを用いTh1免疫応答を有効に惹起することによって、がん免疫の増強並びにがんを免疫学的に排除するシステムを確立することを目的としているこれまでに結核菌が分泌するα抗原及びそのC末端側の15merペプチド(Peptide-25:FQDAYNAAGGHNAVF)がI-A^b拘束性のTh1応答を惹起できること、そのTh1細胞の大半がVβ11陽性T細胞であることを明らかにしてきた。本年度は、α抗原及びPeptide-25による選択的なTh1誘導機構を明らかにすること、Peptide-25のI-A分子との結合部位のアミノ酸残基を置換することにより、I-A^dやI-A^kマウスにTh1応答を惹起できる変異Peptide-25を開発することを研究目的とし、解析を進めた結果、下記のような知見を得た。(2)BP1以外のVβ11陽性T細胞クローン5種のTCRα鎖は、すべてVα5であったが、CDR3領域には多様性が見られた。以上のことから、Peptide-25はI-A^b拘束性にVα5-Vβ11という特定のTCRを発現したT細胞を選択的にTh1細胞へと分化誘導することが示され、現在このTCRトランスジェニックマウスの作成を進めている。

また、変異Peptide-25を用いて、本来Th2応答が優位なことで知られているBALB/cマウスに対してもTh1応答を惹起できることが明らかとなり、結核菌由来Peptideが複数のI-Aハプロタイプを示すマウスにTh1応答を惹起しうることが示された。Peptide-25を用いたTh1応答による細胞障害性T細胞の生成に関する増強効果について検討している。がん細胞を標的としたT細胞依存性の免疫応答において、細胞傷害性T細胞(CTL)とともにTヘルパー(Th)細胞の重要性が認識されている。Th細胞の中で細胞性免疫応答に関与するエフクター細胞を活性化する、Th1細胞が重要である。Th1は至適な抗原刺激によりIFNγやTNF-βを産生しCTLの生成やその活性化を促進するのみならず、NK細胞やマクロファージなども活性化し宿主の抗腫瘍性を高める。しかしながら、Th1を有効に活性化できる抗原系やアジュバントは分かっていない。本研究は、細胞性免疫応答を強く惹起し有効なアジュバント活性を示す、結核菌の菌体成分や結核菌の分泌するタンパク質を用いてTh1免疫応答を有効に惹起できるシステムを確立すること、Th1細胞誘導の細胞性ならびに分子機構を明らかにすること、免疫アジュバントを用いてがん免疫の増強ならびにがん細胞を免疫学的に排除する有効な方法を開発すること、などを研究目的としている。本年度の研究により以下の成果が得られた。(1)結核菌由来ペプチド-25はC57BL/6(B6)に免疫原性を示し、Th1生成を選択的に惹起する。ペプチド-25をCpG DNAとともにリン酸緩衝液に混合してB6マウスに免疫し、リンパ節細胞をペプチド-25で再刺激した。ペプチド-25による単独免疫よりも有意なTCRVβ11細胞の生成とIFNγ産生が見られた。(2)15アミノ酸残基からなるペプチド-25のアミノ酸を変異させたペプチドを各種合成し、BALB/cやC3H/Heマウスに有効なTh1ペプチド-25を開発した。(3)卵白アルブミン(OVA)とペプチド-25を用いてB/6マウスを免疫しCTLの生成を調べた。ペプチド-25の免疫によりOVA特異的なCD8+CTL生成が著明に増強された。この結果から、ペプチド-25が抗原特異的なCTLの生成を増強できるアジュバント活性を示すことが分かる。(4)ペプチド-25に特異的な株化Th1細胞よりTCRVα5,TRVβ11遺伝子をそれぞれクローニングし、発現べクターに組み込みTCRを発現していない株化T細胞に遺伝子導入した。その細胞をペプチド-25とB6マウスの抗原提示細胞存在下に刺激するとIFNγを産生した。この産生にCD4は必須でなかったが、CD4の発現によりIFNγの産生はさらに高まった。(5)発現ベクターに組み込んだTCRVα5とTCRVβ11遺伝子をB6マウスの受精卵に注入し、それぞれの遺伝子をT細胞上に発現する複数のTCRトランスジェニックマウスを作製した。現在、T細胞のペプチド-25に対する応答性、Th1細胞の優位な分化の有無、TCRVα5を規定した場合の各種TCRVβの使用頻度やTCRVβ11を規定した場合のTCRVβの使用頻度に関し検討し始めている。本研究は、結核菌α抗原由来Peptide-25の選択的Th1細胞活性化誘導による抗腫瘍免疫反応の増強機構を明らかにすることを研究目的としている。平成14年度迄の研究成果に基づき、本年度はPeptide-25
酵母オリゴヌクレオチド形質転換法による修飾ヌクレオチドの突然変異誘導特異性の解析

以下の項目の研究を行い、以下の結果を得た。1.オリゴヌクレオチド形質転換法を用いたDNA損傷の変異誘導特性の解析(1)脱塩基部位APエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子APN2及びAPN1APN2欠損株を新たに作成し、天然型脱塩基部位(0)およびテトラヒドロフラン型脱塩基部位(F)の変異誘導特性の解析を行った。その結果、Fは二種類のAPエンドヌクレアーゼの内、APN1産物によって除かれることが明らかとなった。またそのスペクトラムはOに対してシトシンをFに対してアデニンを最も良く取り込むというAPN1欠損株の結果と類似していた。APN1APN2二重欠損株ではそれぞれの遺伝子を欠損した株のスペクトラムとは異なっており、これらの遺伝子が損傷乗り越え修復に影響を及ぼすことが明らかとなった。Fの5'側の塩基を変えたオリゴヌクレオチドを4種類作成し変異スペクトラムを解析した。いずれの場合もアデニンとシトシンが良く取り込まれたが、その割合は5'側の塩基の種類によって差が見られた。(2)(6-4)光産物紫外線によって生成されるDNA損傷である(6-4)光産物についても変異誘導特性を解析した。この損傷の乗り越えにはRev1タンパク質及びRad30タンパク質が関与していること、3'Tの変異原性が高いことなどを明らかにした。これらは酵母の他の系を用いた結果を支持する結果であり、我々の系がかさの大きい損傷の変異誘導特性の解析にも応用できることを明らかにした。2.オリゴヌクレオチド形質転換法のメカニズムの解明オリゴヌクレオチドが染色体DNAに導入される過程に於いて、塩基のミスペアが形成される。そこで、ミスマッチ修復系の影響を調べるためにPMS1欠損株を作成し、野生株との形質転換効率の比較を行ったところ、2-4倍の効率の上昇が見られた。酵母オリゴヌクレオチド形質転換法を用いて,異常塩基特に脱塩基部位の変異誘導特性について解析を行った.1.酵母変異株の作成遺伝子破壊法を利用して,ウラシルDNAグリコシラーゼ欠損株(ung1),損傷乗り越え修復に関与している遺伝子であるRad30欠損株(rad30),Rev1欠損株(rev1),更にAPエンドヌクレアーゼとRev1の二重欠損株(apn1 rev1)を作成した.2.脱塩基部位の変異誘導特性の解析デオキシウリジン(dU),天然型脱塩基部位(O),あるいはテトラヒドロフラン型脱塩基部位(F)を含むオリゴヌクレオチドを野生株(B7528)あるいは上記の欠損株に導入し,形質転換効率の比較及び変異スペクトラムの解析を行った.異常塩基を含むオリゴヌクレオチドの形質転換効率がコントロールのものに比べ10分の1以下であり,導入したオリゴヌクレオチドのほとんどが酵母内で分解あるいは修復系で除去されている可能性が示された.dUの変異スペクトラムがOのスペクトラムに類似していること,ung1株ではdUオリゴヌクレオチドの形質転換効率がコントロールの効率と同程度であったことより,酵母内でdUが除かれそのほとんどが天然型脱塩基部位に変換されていることが示唆された.rev1あるいはrad30の形質転換効率から,脱塩基部位のバイパスにRev1の寄与が大きい一方rad30の寄与は低いことが示唆された.Oの相手にはシトシンが最も良く,次にアデニンが取り込まれた.Fではアデニンが最も良く取り込まれ,OとFとでは変異誘導特性が異なることが明かとなった.またスペクトラムの違いはrad30,apn1rev1でも見られたことから,Fに対するアデニンの取り込みへのRad30やRev1以外の因子の関与が示唆された.また,rev1を用いた一連の解析結果はLawrenceらの報告を支持するものであった.以下の項目の研究を行い、以下の結果を得た。

そこで、ミスマッチ修復系の影響を調べるためにPMS1欠損株を作成し、野生株との形質転換効率の比較を行ったところ、2-4倍の効率の上昇が見られた。