hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子生物学的手法による高感度プランクトン検出法の開発

法医学領域で従来より行われているプランクトン証明方法に,分子生物学的手法を導入し,その方法論を確立することができた.琵琶湖に特異的に発生するプランクトンの一種である藍藻類,ピコプランクトンの純粋培養に成功した.このピコプランクトンは大きさ約1μmの藍藻類であるが,個体群の色調からブラウン株,グリーン株及びピンク株の3種類に分類され,従来,光学顕微鏡下では形態学的識別をできず,蛍光顕微鏡下で蛍光強度の差を用いて識別されていた.そこで本研究では,蛋白合成を担う重複遺伝子リボゾームDNA(以下rDNA)の16SrDNAの塩基配列を検索し,その結果,各種間における変異領域を発見した.さらに,最も高頻度に検出される珪藻類の一種であるメロシラの塩基配列を検索し,これらに特異的なプローブを作成し,PCR条件を検索した.次に決定された塩基配列を,淡水産のみならず海水産を含め,多種類のプランクトンについて,系統樹を作成し,それぞれの相同性を決定した.予備実験として湖水を用いてPCR法を行い,これらプランクトンの検出限界を決定した.そこで,ピコプランクトン及びメロシラについて,溺死以外の死体の臓器あるいは血液に既知濃度のプランクトン含有溶液を添加し,PCR条件の検索を行い,その方法論を確立した.さらに,溺死の疑われた例の臓器を用いて,PCR法によるプランクトンの証明を行い,琵琶湖での溺死例,その上・下流河川で発見された水中死体の死因及び死亡場所の決定に成功した.
翻訳後修飾の未標識ダイレクトイメージング

生物のからだを構成しているタンパク質の翻訳後修飾を標識せずに直接検出する方法の確立に挑戦した.脳などの神経系を構成するニューロンに豊富なタンパク質と翻訳後修飾を対象に,質量分析による直接検出に必要な諸条件を探索した.組織からのタンパク質抽出を経ない脳組織上での翻訳後修飾の直接検出は達成されなかったが,これまでにない簡便な方法により組織中の翻訳後修飾を直接検出する方法を確立できた.得られたの成果は,世界中で発売される英文図書に掲載された.本年度は、翻訳後修飾の未標識ダイレクトイメージングを目指し、精製チューブリン/微小管を用いた条件検討を重ねた。ポリグルタミン酸化が豊富な脳由来精製微小管を用い、ポリグルタミン酸化の未標識ダイレクト検出に必要なチューブリンの最低量を調べた。検討の結果、MALDI型質量分析計におけるレーザー照射領域あたり510フェムトモルのチューブリン分子が必要であることが分かった。これはマウス2個体の気管から精製した繊毛軸糸を1平方mmにした量に概ね等しい。実際のマウス気管サンプル上において繊毛軸糸微小管のポリグルタミン酸化を未標識ダイレクト検出する場合、レーザー照射領域内に0.20.5フェムトモル程度のチューブリンしか存在しないため、20倍程度の感度向上が必要であることも分かった。上記問題はある程度想定していたため、微小管以上に高密度で組織内に存在するタンパク質をターゲットとしたダイレクト検出を企図し、リスクヘッジおよび挑戦的萌芽的視点でポリグルタミン酸化修飾の新規ターゲットタンパク質を探索した。探索の結果、ポリグルタミン酸化チューブリンが豊富な組織で微小管以上に多量かつ高密度に存在するタンパク質Aがポリグルタミン酸化されることを示唆するデータを得ることに成功した。in silicoで酵素消化を検討した結果、微小管のポリグルタミン酸化をダイレクト検出する際に使用する酵素Asp-Nに比べ酵素活性と切断部位特異性が高いトリプシンが使用でき、且つ検出に都合が良いチューブリンよりも短いペプチド断片を生成できることが分かった。これらにくわえ、本研究が進展した際に未修飾ダイレクトイメージングを実際に適用する神経病理標本における微小管翻訳後修飾状態に関する知見を得た。本年度も前年度に引き続き、微小管ポリグルタミン酸化修飾のダイレクトイメージングに向け、測定条件の最適化に取り組んだ。修飾の検出限界となる微小管密度(単位積当たりの微小管量)を、実際の生体サンプルイメージング可能な水準まで下げることができず、微小管ポリグルタミン酸化修飾の未修飾ダイレクトイメージングは達成できなかった。しかしながら、研究期間全体を通じて実施してきた微小管ポリグルタミン酸化修飾の未精製直接検出については、方法論としてまとめ英文図書の一章に発表した。これまでにない簡便な微小管翻訳後修飾の手法を公表できた点は、挑戦的萌芽研究として非常に意義があったと思われる。また、微小管翻訳後修飾の未修飾ダイレクトイメージングを適用することを想定して解析していた神経病理標本における微小管翻訳後修飾の変化についても、ダイレクトイメージングによる解析を行わずに得られたデータをまとめ、論文化に向け原稿を執筆した。これは、本研究から副次的に生まれた成果ではあるが、医学的に非常に重要な報告になると期待している。これらに加え、前年度に探索に挑戦した微小管以上に高密度に存在するタンパク質Aのポリグルタミン酸化修飾について、ダイレクトイメージングの可能性を検証し、実際に質量分析により修飾を検出することに成功した。この成果は、新しいポリグルタミン酸化修飾ターゲットを発見した点で、今後の発展が大きく期待できる萌芽的であると考えられる。生物のからだを構成しているタンパク質の翻訳後修飾を標識せずに直接検出する方法の確立に挑戦した.脳などの神経系を構成するニューロンに豊富なタンパク質と翻訳後修飾を対象に,質量分析による直接検出に必要な諸条件を探索した.組織からのタンパク質抽出を経ない脳組織上での翻訳後修飾の直接検出は達成されなかったが,これまでにない簡便な方法により組織中の翻訳後修飾を直接検出する方法を確立できた.得られたの成果は,世界中で発売される英文図書に掲載された.微小管サンプルにおけるスライド上酵素消化後のポリグルタミン酸化修飾検出は、挑戦的萌芽研究らしく困難に遭遇し、当初計画からやや遅れが生じた。一方で、研究開始時より困難をある程度予想していたため、萌芽研究としての挑戦性を保ちながらのリスクヘッジを図ってきた。この試みが奏功し、微小管よりもダイレクト検出・イメージングに適した新規のポリグルタミン酸化修飾ターゲットタンパク質の発見につながった。細胞生物学、解剖学微小管を用いた本年度の検討で明らかとなった問題点について、チューブリンと酵素の分子数比、酵素消化時の条件(液量、温度、時間、回数)、使用マトリクスの変更など、複数の視点でパラメータを再検討し、少なくとも繊毛軸糸あるいは培養神経細胞の軸索からポリグルタミン酸化を直接検出できる条件を決める。ここをクリアした後は、実組織標本から微小管だけを残し他のタンパク質を除去するという、組織標本側の処理について検討を行う。現段階では、タキソール投与により微小管を保持しつつの、マイルドな界面活性剤や両親媒性の液体を用いた処理を想定している。一方で、未修飾ダイレクトイメージング法による翻訳後修飾の検出が本研究の目指すべき達成目標であり、当初計画した微小管翻訳後修飾の直接イメージングにとらわれる必要は必ずしもない。

本年度発見された、より強力かつ正確な酵素消化によりチューブリンよりも短いペプチド断片を生み出すことができる新規ポリグルタミン酸化標的タンパク質についても、精製サンプルや界面活性剤・両親媒性液体を用いた夾雑タンパク質・脂質を排除した培養神経細胞を用い、直接イメージング法による検出を目指す。本年度未使用の次年度使用額は10,000円弱であり所要額の1%に満たない。基金の利点を生かして年度を跨いでシームレスに研究を遂行したために発生したものである。平成27年3月から4月にかけても年度を意識せずに研究を行なったが、輸入扱い品など一部の商品で納入時期が遅れる関係上発注納品が次年度にずれ込むことになり、これにより微額の次年度使用額が発生した。次年度使用額と交付額の合計1,409,632円は,おおむね当初計画どおりに使用するが、研究をより効率的に進めるために技術補佐員の謝金として物品費の一部を流用する計画である。使用内訳は、物品費:709,632円、旅費:300,000円、人件費・謝金:300,000円、その他:100,000円となる予定である。
高度に配向制御された二次元分子集合系による励起子形成

有機分子が秩序的に集合して特異な分子配向を形成すると長距離にわたる電子エネルギーの移動が可能となり、それに基づく新たな分子材料の設計が期待される。しかし、有機分子の配向を思うように制御して品質の良い会合体を作製する技術はいまだ十分には確立されていない。我々はこれまで、二分子膜や気液界面単分子膜、LB膜などの分子集合体に着目しその二次元特性を用いた分子配向制御を行ってきた。例えば、二分子膜の荷電表面へ反対電荷を持つ色素や高分子が特異的に吸着することを見いだした。とりわけ、ジアルキルアンモニウム塩単分子膜の荷電表面にアニオン性のシアニン色素が静電吸着し、J-会合に特異的な吸収をしめす単結晶性の二次元複合体が形成されることを見いだした。そこで本研究では、鋳型となる単分子膜の分子構造と形成された色素会合体構造の相関性に基づく二次元結晶工学を確立し、二次元分子集合体を用いた分子材料の設計指針を明かにした。1.カチオン性単分子膜はアニオン性シアニン色素と気液界面にてイオン対を形成し,界面を鋳型として数十ミクロンにも及ぶサイズのそろった矩形の発光体を形成する。吸収ならびに発光スペクトルの長波長シフトから,この会合体は色素のJ会合体であることが明らかになった。2.アニオン性単分子膜とカチオン性シアニン色素の場合には吸収スペクトルの比べて著しい短波長シフトがおこり、H会合体が形成された。3.単分子膜-色素複合体LB膜で修飾したITO電極は光電気化学応答を示した。光照射によってカソード電流が生じており、アニオン色素の方がカチオン色素よりも大きな値を示すことが明らかになった。
レーザー共鳴イオン化法を用いた鉄核変換物質検出による超高感度中性子ドシメトリー

本研究は、低レベル中性子照射環境における中性子ドシメトリーを、従来の誘導放射能測定に代わり超高感度に行う方法として、レーザー共鳴イオン化法(Resonance Ionization Spectroscopy : RIS)の適用性を検討したものである。特に、原子力施設の構造材でよく使われるSUS材等の元素を対象に、質量分析計と組み合わせて、高感度性とともに、高選択性、迅速性、同重体干渉回避等のRISの特長を活かし、中性子との核反応の結果生じた微量核種又は同位体比変化の定量によって中性子線量評価を行う方式の原理実証、及び標準的な測定システムとデータ処理法の構築を目的とした基礎研究を行い、以下のような成果を得た。(1)微量核変換生成物検出用のRISシステムの試作・整備を行い、Xeガス検出実験によって、基本性能を明らかにした。(2)SUS材の高速中性子照射によって生成されるCuを中心に、構成元素のRISによる検出スキームの理論的検討を行い、その妥当性を実験的に検証した。特に、レーザーアブレーションと共鳴イオン化を同時に行う共鳴レーザーアブレーションに基づく検出法について、理論モデルを考案し、基本性能のレーザー出力や波長依存性を説明することに成功した。また、質量分析系へのイオン引き出し電極の改良により、従来の放射化測定を凌ぐ感度が得られる可能性を示した。(3)これらRIS測定から簡便に中性子線量を推定する方法として、ニューラルネットワークに基づく手法を考案した。放射化率の測定データから中性子スペクトルの推定問題で。本手法の適用性を評価したところ、従来のドシメトリー解析手法と遜色のない推定結果が得られたとともに、RIS測定データの処理に適した特長を有することを示した。ただし、今後、実用化に向けた専用システムの開発では、レーザー系の安定性の改善や試料の蒸気化プロセスの素過程の解明と精密制御等の技術課題を克服する必要がある。本研究は、低レベル中性子照射場における中性子ドシメトリーを、従来の誘導放射能測定に代わり、効率的かつ高精度に行う方法として、レーザー共鳴イオン化法(Resonance lonization Spectro-scopy:RIS)の適用を提案するものである。特に、原子力施設の構造材に豊富に含まれる鉄含有サンプルを対象とし、高感度、高選択性、迅速性、同重体干渉回避などのRISの特長を生かして、中性子との核変換反応の結果生じたFe及びMnの安定または長半減期の同位対比変化の測定をもとに、中性子ドシメトリーを行う方式の検討を行い、本手法の原理実証、基本の測定手順とデータベースの確立、及び適用限界を評価することを目的としている。今年度実施した研究概要は、下記の通りである。1.中性子とFeの核反応断面積ファイルをベースにして、代表的な鉄鋼材中のFe、Mn同位体比変化率と中性子フルエンス・エネルギースペクトルとの相関データベースを検討し、従来の放射化反応率を用いる汎用中性子ドシメトリー(中性子スペクトルアジャストメント)コードに組み込む作業を行った。2.Fe,Mn同位体比のRISスキームについて、理論計算によるサーベイを行い、Mn検出に適した実験スキームを見出した。3.RISシステムについて、過去に文献例の豊富なXeガス検出の基礎実験を行い、光学系と基本的なデータ処理系を整備するとともに、基本性能(検出効率と選択率)の確認を行った。今後、東風試料蒸気化のためのレーザーアブレーション光学系を整備し、鉄鋼材の未照射と照射試料に対して、Fe,Mnの同位体比変化をRISで検出する基礎実験に進む予定である。本研究は、低レベル中性子照射環境における中性子ドシメトリーを、従来の誘導放射能測定に代り、超高感度に行う方法として、レーザー共鳴イオン化法(Resonance Ionization Spectroscopy:RIS)の適用性を検討したものである。

特に、原子力施設の構造材に豊富に含まれる鉄等の元素を対象に、質量分析計と組み合わせて、高感度性とともに、高選択性、迅速性、同重体干渉回避等のRISの特長を生かし、中性子との核反応の結果生じたMn等の微量核種または同位体比変化の定量によって中性子線量評価を行う方式の原理実証、基本的な測定システムとデータ処理法の確立、及び実用化のための技術的課題を明らかにすることに重点が置かれた。平成7年度のXeガス検出を媒介にした基本システムの整備と性能評価、及びFe,Mn等の検出スキームの理論的検討結果をもとに、平成8年度に実施された研究概要と主な成果は下記の通りである。1.固体試料蒸気化のためのレーザーアブレーション工学系を整備し、Mn,Fe等に関してRISスキームの妥当性を実験的に確認した。特に、レーザーアブレーションと共鳴イオン化を同時に行うレーザー共鳴アブレーションに基づく検出法について、基本性能(検出効率、元素選択性等)のレーザー出力や波長依存性等を明らかにし、システムの最適調整によって、従来の放射化測定を凌ぐ感度が得られることを実証した。2.Fe等の中性子核変換による微量生成核種及び同位対比変化のRIS測定から簡便に中性子線量を推定する方法として、ニューラルネットワークをベースにした手法を考案し、従来の放射化法と遜色のない推定結果が得られることを示した。しかしながら、放射線安全に関わる実験的制約から、実際に中性子照射された試料における同位体比変化の定量精度の評価が未だ不十分であり、また、レーザー系の安定性改善や試料の蒸気化プロセスの素過程の解明が実用化にとって重要であることが分かった。
分子生物学的手法を用いた活性汚泥法微生物ポピュレーションの評価と下水処理場の機能解析

従来はBODの除去を主眼としていた下水処理であるが、今日では富栄養化対策として窒素・リンの除去が求められるようになってきている。処理に求められるレベルが高度になるにしたがい、活性汚泥中の微生物群集を的確に把握し、微生物の持つ処理性能を最大限に発揮させるための方策が求められている。本研究は、近年開発された遺伝子レベルで微生物群集を検出することができる蛍光遺伝子プローブを用い、下水処理場における微生物群集構造を明らかにすることを目的として行った。本手法は培養プロセスを経ずに活性汚泥中の微生物群集構造を直接解明することができるという特徴を持っている。本研究では、北海道3カ所、東京都5カ所、埼玉県4カ所、および沖縄県3カ所の計15カ所の下水処理場20系列を対象とし、平成9年11月、10年1月、5月、および8月の計4回活性汚泥中の微生物相を調査した。調査には次の6種の微生物群を検出するプローブを用いた。全真性細菌、プロテオバクテリアα群、β群、γ群、グラム陽性高GC群、およびサイトファガ・フラボバクテリア群。解析した結果、多くの下水処理場においてプロテオバクテリア群(α群、β群、γ群)が優占種であること、また、その中でも特にα群やβ群が大きな割合を占めることがわかった。また、本研究で検討した分類レベルでは、微生物群集構造には地域・気候による違いや処理方式による違いは明確には見いだせなかった。一方、小規模の下水処理場では今回用いた遺伝子プローブでは検出できない微生物群が多く存在することがわかった。多くの処理場で、冬から夏にかけてα群の増加と高GC群の減少が、また夏から冬はその逆の微生物相の変化が見られた。本研究では、分子生物学的手法、特に蛍光標識した遺伝子プローブにより特定の微生物を顕微鏡下で検出する方法(FISH法)を用いて日本各地の下水処理場の微生物群集の特徴をあきらかにし、さらにその機能を解析することを目的として研究を行った。まず、FISH法を下水処理場に応用するための予備的な検討として、顕微鏡下で検出した微生物群の画像解析による定量化の方法を確立し、また微生物試料を現場から研究室に運搬する際の条件について検討した。さらに、各種の遺伝子プローブをテストし、その最適使用上件を決定した。微生物試料の前処理(分散)のための条件も決定した。これらの手法が一応確立されたと判断したので、日本全国から20の活性汚泥サンプルを採取し、FISH法による微生物群集調査を行った。その結果から、各下水処理場の運転条件や処理成績と微生物群集の特徴を比較したところ、リン除去の優れている処理場では、グラム陽性高G+CDNA含有細菌群が多い傾向にあることがわかった。また、プロテオバクテリアのβサブクラスは多くの処理場に於いて多く存在し、これが活性汚泥微生物群の一つの特徴ではないかと思われた。今後、さらに季節・地域等の要因と微生物群構成の関連を見て行く必要がある。

本研究では、北海道3カ所、東京都5カ所、埼玉県4カ所、および沖縄県3カ所の計15カ所の下水処理場20系列を対象とし、平成9年11月、10年1月、5月、および8月の計4回活性汚泥中の微生物相を調査した。調査には次の6種の微生物群を検出するプローブを用いた。全真性細菌、プロテオバクテリアα群、β群、γ群、グラム陽性高GC群、およびサイトファガ・フラボバクテリア群。解析した結果、多くの下水処理場においてプロテオバクテリア群(α群、β群、γ群)が優占種であること、また、その中でも特にα群やβ群が大きな割合を占めることがわかった。また、本研究で検討した分類レベルでは、微生物群集構造には地域・気候による違いや処理方式による違いは明確には見いだせなかった。一方、小規模の下水処理場では今回用いた遺伝子プローブでは検出できない微生物群が多く存在することがわかった。多くの処理場で、冬から夏にかけてα群の増加と高GC群の減少が、また夏から冬はその逆の微生物相の変化が見られた。
尿中抗体を利用した膀胱がん早期診断マーカーの獲得と診断キット開発に向けた検討

膀胱がんは特異的な診断マーカーがなく、検診などで使用可能な診断法がないことから、診断時には進行がんであり治療が困難な場合がある。そのため、より早期に膀胱がんを検出でき、かつ簡易検査で使用可能なマーカーの獲得が期待される。本研究では膀胱がん患者で直接腫瘍に晒されている尿に着目し、尿中に含まれる抗体を一次抗体として用いて二次元免疫ブロット法を行うことで、自己抗体が認識する抗原タンパク質を検出する。検出された自己抗原群については、早期診断マーカーとしての有用性の確認を行う。有用と判断された抗原タンパク質については、膀胱がんの早期診断に役立つ尿中自己抗体を対象とした診断キットの開発を目指す。
前庭性嘔吐の中枢機序の検討

動揺病や急性内耳障害でみられる嘔吐は前庭自律神経反射の現象の一つである。前庭神経とWangらの言う延髄の嘔吐中枢との関連は明らかになっていない。前庭性嘔吐の中枢性機序を検討するため猫を使い半規管神経と延髄の嘔吐中枢を電気刺激し、それぞれの胃内圧と呼吸状態について観察した。実験は麻酔した猫の胃内圧変化、呼吸変化をそれぞれ、バルーンを使った圧測定と、胸郭の大きさから測定した。さらに、半規管神経を電気刺激し延髄における活動電位を記録した。半規管神経の刺激では、ときに胃の蠕動の抑制、胃内圧の低下が観られた。延髄の刺激では胃内圧の低下と蠕動は抑制され、ほかの部位では圧上昇と蠕動の亢進が観られた。ときに流涎、retchingが観察され、その部位において半規管刺激による活動電位が観察された。
力学的刺激によるエナメル芽細胞の分化誘導方法の開発

エナメル質は高度に石灰化した組織であり、エナメル芽細胞によって形成される。エナメル芽細胞は様々な生化学的刺激によって分化が誘導されることが報告されているが、石灰化したエナメル質を再生できるレベルにまでは分化を誘導できていない。一方、申請者らは、足場の硬さ(力学的刺激)に着目して研究を行い、生体内と同程度の硬さの足場で細胞を培養することにより、細胞内の生化学的なシグナルを増強できることを明らかにした。そこで、本研究では、歯の発生段階における象牙質およびエナメル質の硬さを正確に測定し、生体内と同程度の硬さの足場で、申請者の樹立した内エナメル上皮細胞クローンを培養することにより、成熟期エナメル芽細胞への高度な分化誘導方法を確立することを目指す。本年度は、エナメル芽細胞の全ての分化段階を観察することが可能な生後1日齢のラットの下顎切歯を用いて、発生段階における象牙質、幼若エナメル質、エナメル質の硬さを正確に測定するための最適な切片の作成方法を検討した。通常の組織切片作成のように固定や凍結を行えば、生体内での本来の硬さを維持できなくなる可能性がある。そこで、ラットから採取した下顎骨を固定も凍結も行わずにそのままの状態で切断し、下顎切歯の断面を観察することが可能な方法を見出した。今後、原子間力顕微鏡(AFM)によりエナメル芽細胞の各分化段階における象牙質、幼若エナメル質、エナメル質の硬さの測定を進める予定である。
RFIDを用いた移動動線推定による安心快適ユビキタスホーム

屋内における人の移動履歴を検出する技術とこれに必要な屋内インフラネットワークとしての無線アドホックメッシュネットワークのための通信プロトコルの研究を行った。移動履歴を検出する技術としてはUHF帯パッシブ型RFIDを用い、タグを天井に貼り付け、人が持つRFIDリーダでタグを読取り、読取りタグパターンから人の位置を検出し、移動動線を算出する方式を考案した。さらに、アドホックメッシュネットワークに適したTCPとUDPを研究した。1.RFIDタグを室内の天井に一定間隔で配置し、人がRFIDリーダを持ち、このリーダが読み取ったタグの座標から人の位置を推測する方式を提案し、タグ読み取りパターンをレイトレース電波シミュレーションで評価する方法を研究した。リーダをレイの発信点、タグを受信点とし、受信電力とタグ読み取り閾値電力の比較から読み取りパターンを求めた。さらに、読み取り実験を行い、両者の比較から、本シミュレーション方法が有効であることがわかった。この結果に基づき、人がリーダを持つ場合の人が遮蔽物になることによるタグ読み取りへの影響、部屋の材質による影響などをシミュレーションにより検討した。位置推定アルゴリズムとして読み取られたタグ間の重心を基にクラスタ化を行い、推定精度を高める方法について、本シミュレーションと実験により詳細に検討した。人が移動する場合についてもこれらの研究成果を踏まえ、実験を行い移動動線推定法を検討中である。2.無線マルチホップ通信において情報を効率的に伝達する方法を研究し、2項目の成果を得た。第1の成果はUDPをベースとして、他の通信との公平性を保ち、情報量に応じた輻輳制御が可能なプロトコルを提案し、シミュレーションで効果を確認した。第2の成果は新しいバッファ管理アルゴリズムを考案し、シミュレーションで効果を確認した。3.メッシュネットワーク等の基盤となる無線LANのアクセス制御におけるスループットの改善方式の提案と性能解析を行った。1.PFIDを用いた屋内位置計測と移動履歴追跡技術に関して、引き続いて電波シミュレーションと実験により研究を進めた。読み取られたタグ位置からリーダの位置を推測する方式であるので、タグの読み取り特性を実験で検証した。天井に50cm間隔で配置したタグ近辺の電力測定を行い、読み取られたタグ(受信タグ)と読めなかったタグ(非受信タグ)について電力特性を調べた。測定は60秒間行い、受信タグにおいても読み取られた回数は1回から50回までばらつき、各タグにおける受信電力平均値は-4.2dBmから-19.16dBmまで広がっている。さらに、読み取られた回数の少ないタグの受信電力は時間変動が大きいことが分かった。受信タグに隣接し、かつリーダに近いにも係らず読めない非受信タグを選び測定した受信電力平均値は-19.19dBmであった。さらに、実験結果を検証するためにレイトレース電波シミュレーションでタグの受信電力を求めた。実験とシミュレーションによる受信タグ、非受信タグの分布は正確には一致しないが、概略のパターンは一致する。これらの結果から、電波の反射・回折によりリーダの近い点で受信電力が低かったり、遠い点で受信電力が高く、受信タグがリーダの位置に対して同心円状になるという理想的な状態にはならない状況が解明できた。2.リーダを人が持つことにより人の影響により電波伝搬が影響を受け、タグの読み取り結果が人の居ない場合と比べて異なる。実験と電波シミュレーションを行い、これまで開発した位置推定アルゴリズムにおいて人の影響がどのようになるかを調べた。今後は人の影響を考慮した位置推定アルゴリズムの開発を行う。3.マルチホップ通信にいてジッタやパケット損失に対して品質条件の厳しいUDPトラヒックの品質向上を目指した新しいバッファ管理方法IDS(Interference Drop Schem)を提案し、各種ネットワーク条件においてUDPのジッタとパケット損失が従来の方式よりも優れていることを確かめた。本年は研究課題の最終研究目標である移動動線推定アルゴリズムについて研究を行った。基本方式はこれまでに研究を行った天井にRFIDタグを一定間隔で貼りつけ、人が持つRFIDリーダでタグを読み取り、読み取られたタグの座標値から人の位置を推定し、移動動線を算出する。読取をある時間間隔ごとに行い、計算した位置を連続的に繋ぎ合わせることにより移動動線を算出する。単純につなぎ合わせるだけでは、実際の移動動線からの乖離が大きい。そこで、これまでに構築した実験設備を用いて読取特性を評価し、精度を向上させるアルゴリズムを開発した。人が部屋の隅にいる場合は本方式の構成上誤差が大きくなる。そこで、部屋の隅に居ることを検出した場合には、推定位置を補正する方法を提案した。2番目の補正処理として前後の推定位置を用いて移動方向を推測し、移動動線推定精度を上げる方法を提案した。3番目に人の移動速度を推定し、静止していると判断した場合には動線補正する方法を提案した。実験を行い提案した移動動線推定アルゴリズムの評価を行い、これらのアルゴリズムのパラメータの設定と誤差の関係を検討した。単純に繋ぎあわせた方式と比べ、提案方式の方が実際に移動動線に近いことを確認した。提案方式では1つの部屋に複数のリーダが存在する場合が想定される。
中性子回折による水素ハイドレートの高圧結晶構造の解明と横断的科学分野への応用

水素ハイドレートは、水分子が水素結合によりフレームワーク構造を作り、その中に水素分子を内包することで形成される固体結晶である。氷惑星やその衛星中に水素ハイドレートが偏在し、水素分子のリザーバとして、天体の形成や進化に重要な影響を及ぼしている可能性がある。このことから、氷天体内部に匹敵するような高圧条件下による物性を明らかにすることは非常に重要な課題であったが、従来の研究手法では構造内の水素の情報を得ることが難しかった。本研究では、水素原子の情報を直接得ることができる、中性子回折実験の手法を採用することで、水素ハイドレートの高圧構造を詳細に決定することを目指した。高圧中性子実験にはダイヤモンドアンビルセル(DAC)と呼ばれる高圧発生装置を用いることとしたが、従来のDACでは、加圧することのできる試料体積が小さく、中性子実験では十分な強度を得ることができなかった。そこで、本研究期間内に、新たなDACの開発を行った。その結果として、従来の装置と比較し100倍程度の初期試料体積を加圧することができるようになった。このことで、水素ハイドレートの高圧中性子回折実験を行うことが可能となった。最終年度には、水素ハイドレートや氷単体を試料として、高圧下における中性子回折実験を行った。得られた中性子回折パターンを用いて構造解析を行った結果、10万気圧以下のような低圧では、氷の結晶構造について水素位置を含めた原子配置を決定することができた。一方で、DACを用いた実験では、入射中性子の一部がダイヤモンドによって吸収され、また高圧下ではその影響がより強くなることが明らかとなった。このため、高圧下の回折パターンについて構造解析を行うためには、この吸収プロファイルの補正が必要となる。補正方法の開発は現在取り組んでおり、これが解決し次第、得られた中性子パターンについて結晶構造解析を行う予定である。水素ハイドレートとは、氷と水素分子の共存状態において、低温あるいは高圧条件下で形成される固体結晶である。宇宙空間中の広い範囲で、この水素ハイドレートが偏在し、水素分子のリザーバとして、天体の形成や進化に重要な影響を及ぼしている可能性がある。しかしながら、従来の研究手法では結晶構造内での水素の情報を得ることが難しかったため、水素ハイドレートの物性研究には、詳細な構造の解明など多くの未解決問題が残されている。本研究では、水素原子を直接測定することが可能な中性子回折実験の手法を用いて、水素ハイドレートの詳細な高圧構造を決定し、ハイドレート物性を解明することを目的として研究を行っている。本年度は、高圧条件下における水素ハイドレートの中性子回折実験を行うための、高圧発生装置の開発を行った。すなわち、大強度のパルス中性子源を利用した中性子実験施設、J-PARC・物質生命科学実験施設(MLF)の、高圧中性子ビームラインPLANETにおいて使用することのできる、高圧発生装置・ダイヤモンドアンビルセル(DAC)を開発することを課題として取り組んできた。DACとは、先端を平らにした2つのダイヤモンドアンビルで、ガスケットと呼ばれる金属板を挟むことで加圧を行う装置である。本年度の装置開発により、中性子回折実験を行うために必要な新たな大容量のDACを製作した。その後、本装置を用いたDACの加圧テストを行い、35万気圧の高圧発生に成功した。さらに、J-PARCのPLANETビームラインにおいて、水を試料とした高圧中性子回折実験を行うことにも成功し、DAC中の高圧試料について、中性子回折パターンを得ることが可能となった。一方で、ダイヤモンドを通したことで中性子の入射強度のプロファイルが変化することが明らかとなり、構造解析を行うためには、プロファイルの補正方法を確立する必要があることが示された。平成28年度は、高圧発生装置・ダイヤモンドアンビルセル(DAC)を開発して本装置の高圧発生テストを行うこと、また、J-PARC・MLFの高圧中性子ビームラインPLANETにおいて中性子回折実験のテストを行うことを目標として研究を進めてきた。実際の成果として、DAC装置を用いた35万気圧の高圧発生に成功した。さらに、水を試料として中性子回折実験を行うことができた。このことから、本年度の研究計画を達成できたということができる。また本成果により、次年度以降に目標としていた水素ハイドレートの高圧中性子回折実験の実施の足掛かりを築くことができた。水素ハイドレーとは、水分子が水素結合によりフレームワーク構造を作り、その中に水素分子を内包することで形成される固体結晶である。しかしながら、従来の研究手法では結晶構造内での水素の情報を得ることが難しかったため、水素ハイドレートの詳細な構造の解明など多くの未解決問題が残されている。本研究では、水素原子を直接測定することが可能な中性子回折実験の手法を用い、水素ハイドレートの詳細な高圧構造を決定して、ハイドレート物性を解明することを目的として研究を行っている。本年度は、水素ハイドレートの高圧実験を行うために開発を行った、高圧発生装置・ダイヤモンドアンビルセル(DAC)の高度化を行うことを主な目標として研究を行った。研究の成果として、DAC装置により45万気圧の高圧発生に成功した。この圧力は本装置において想定していた最大圧力に近く、ほぼ理想通りにDACの開発が成功したことが示された。また平成28年度の研究で中性子回折実験において、中性子ビームをダイヤモンドを通して入射するとそのプロファイルが変化することが明らかとなった。

本年度はこのプロファイルの変化を避けるため、中性子ビームがダイヤモンドを通らない装置の開発を行い、その結果として解析可能な中性子回折パターンを得ることに成功した。さらに、開発を行ったDAC装置中で、水素ハイドレート試料の作成に成功し、高圧下での顕微鏡観察を行うことができた。これらの研究・開発により、水素ハイドレート試料の高圧中性子回折パターンを得ることが可能となった。平成28年度の研究において、中性子ビームをダイヤモンドアンビルセル(DAC)のアンビルに通すことで、入射ビームの強度プロファイルが変化することが明らかとなった。このため、中性子回折パターンによる構造解析を行うためには、強度プロファイルの補正方法を確立するか、あるいは入射ビームが変化しないような方法を開発することが必要となった。このことは、研究を進めていく上で新たに生じた課題であり、平成29年度にこの課題に取り組んだため、当初の予定より研究がやや遅れてしまった。一方で、本年の研究・開発によりDACによる中性子回折実験を行うための準備は整い、またDACによる水素ハイドレート試料の生成に成功した。このことから、水素ハイドレートの高圧中性子回折実験の実施の足掛かりを築くことができた。水素ハイドレートは、水分子が水素結合によりフレームワーク構造を作り、その中に水素分子を内包することで形成される固体結晶である。氷惑星やその衛星中に水素ハイドレートが偏在し、水素分子のリザーバとして、天体の形成や進化に重要な影響を及ぼしている可能性がある。このことから、氷天体内部に匹敵するような高圧条件下による物性を明らかにすることは非常に重要な課題であったが、従来の研究手法では構造内の水素の情報を得ることが難しかった。本研究では、水素原子の情報を直接得ることができる、中性子回折実験の手法を採用することで、水素ハイドレートの高圧構造を詳細に決定することを目指した。高圧中性子実験にはダイヤモンドアンビルセル(DAC)と呼ばれる高圧発生装置を用いることとしたが、従来のDACでは、加圧することのできる試料体積が小さく、中性子実験では十分な強度を得ることができなかった。そこで、本研究期間内に、新たなDACの開発を行った。その結果として、従来の装置と比較し100倍程度の初期試料体積を加圧することができるようになった。このことで、水素ハイドレートの高圧中性子回折実験を行うことが可能となった。最終年度には、水素ハイドレートや氷単体を試料として、高圧下における中性子回折実験を行った。得られた中性子回折パターンを用いて構造解析を行った結果、10万気圧以下のような低圧では、氷の結晶構造について水素位置を含めた原子配置を決定することができた。一方で、DACを用いた実験では、入射中性子の一部がダイヤモンドによって吸収され、また高圧下ではその影響がより強くなることが明らかとなった。このため、高圧下の回折パターンについて構造解析を行うためには、この吸収プロファイルの補正が必要となる。補正方法の開発は現在取り組んでおり、これが解決し次第、得られた中性子パターンについて結晶構造解析を行う予定である。
免疫調節薬IMiDsにおける作用機構の分子基盤の解明

本年度は基質S1のCRBN非結合型変異体を発現する株をいくつか樹立し、またS1をRNAiによりノックダウンを行ったさいのトランスクリプトーム解析を行った。またS1がF1, F2と融合遺伝子を作ることで白血病などの発症に関わることが判明したことから、S1-F1およびS1-F2融合遺伝子を作製し、その産物が特定のIMiDにより分解されることを明らかにした。またS1のCRBN結合領域についての変異体を用いた解析から、S1のstructural degronについての理解が深まった。IMiDs間で作用が異なってくる変異体などの単離にも成功した。加えて融合遺伝子S1-F1においても、前年度に明らかにしたS1の特定のGlycineを別のアミノ酸に置換することによって分解が抑えられることが分かった。またS1の分解はIMiDにおいては、ベンゼン環上にある特定のアミノ基が重要であることも誘導体を用いた解析から明らかとなった。非基質X1はN末においてCRBNと結合することを明らかにしたが、これまでに知られているような共通のモチーフはないことが判明した。ちなみに非基質X1は骨髄腫などにおいてはノックダウンしてもそれほど大きな作用の変化は検出できなかったが、血管内皮細胞においては、X1をノックダウンすることにより血管新生の阻害が見られた。X1はIMiDsが作用することで知られる血管形成機構に重要であることが示唆された。また前年度に引き続き、プロテオミクス解析を行い、基質候補をいくつか得ることに成功した。S1の機能解析がかなり進み、またS1分解の意義としてS1-F1融合遺伝子の発症を抑えうることが判明したことが大幅な前進である。S1のCRBN結合領域における理解も深まり、またトランスクリプトーム解析によるS1の支配する遺伝子群についても少しずつ分かってきた。ただX1における部位は、本年度でも完全には決まらなかったので来年度継続して挑戦したいと考えている。全体的には、おおむね順調であると考えている。S1-F1,F2による血液癌の発症機構を解析するために、融合遺伝子を発現する細胞株を作製する。そして増悪の過程を検証する。またS1-F1による遺伝子発現変化をIMiDsがどのように抑制するのかも検証する。X1の部位を決めて、その部分だけでも共同研究によって構造解析などを実施したいと考えている。これらの成果を合わせることによってIMiDsの作用機構のメカニスティックな基盤の解明を図る。本年度は基質S1のCRBN結合領域の決定を行った。基質S1はZinc fingerを有しており、近年の研究によりIkarosやAilos、そして新たに海外のグループが発見したZFP91のCRBN結合領域はQCXXCG(Xは任意のアミノ酸)といった特定の配列であることが判明しつつある。研究代表者はS1よりその配列を探したところCXXCGのところは同一の配列を二か所発見したことにより、それらのGlycineに変異をいれ、CRBNとの結合および薬剤による分解を解析したところ、片方のみ結合および分解が抑制されることが判明した。今後はそのglycine変異体を発現する癌細胞株を樹立し、IMiDsの作用機構においてどのような位置づけかについて解析を行う予定である。またS1が結合するのにCRBN V388が重要であることを明らかにした。V388をイソロイシンに置換するとS1との結合能が失われることを明らかにした。非基質X1については、明確なコンセンサス配列がなく特定のグリシンを見つけることに難航しているが、新たな発見としてマウスX1がマウスCRBNと結合可能であるという結果を得た。これまでのすべてのCRBN結合基質はヒトCRBNとしか結合能がなく、マウスCRBNで確認されたものはなかった。X1はマウスにおいてもCRBNとの結合がみられる因子としては、研究代表者の知識では最初のものである。次に他の非基質がみつかるかどうかについて、プロテオミクス解析を行い、CRBN結合タンパク質の探索を行ったところ、新たな非基質候補因子X2を発見した。X2は現在のところ薬剤処理で分解が確認されない。いかなる生理学的、薬剤の作用における意義があるのかについては次年度から検証する。本年度においてはS1のCRBN結合部位のglycineを発見し、またS1が結合するのにCRBNのV388が重要であることなどを明らかにし、順調にS1の研究は進んでいる。またX1についてはマウスCRBNにおいても結合するという意義深い結果を得た。ただし、X1におけるCRBN結合部位などは本年度では決定できなかったので、来年度継続して挑戦したいと考えている。研究計画における想定通り新たな非基質X2が発見できたのは大変良い成果であったと考えている。よって、おおむね順調であると考えている。

またS1の分解はIMiDにおいては、ベンゼン環上にある特定のアミノ基が重要であることも誘導体を用いた解析から明らかとなった。非基質X1はN末においてCRBNと結合することを明らかにしたが、これまでに知られているような共通のモチーフはないことが判明した。ちなみに非基質X1は骨髄腫などにおいてはノックダウンしてもそれほど大きな作用の変化は検出できなかったが、血管内皮細胞においては、X1をノックダウンすることにより血管新生の阻害が見られた。X1はIMiDsが作用することで知られる血管形成機構に重要であることが示唆された。また前年度に引き続き、プロテオミクス解析を行い、基質候補をいくつか得ることに成功した。S1の機能解析がかなり進み、またS1分解の意義としてS1-F1融合遺伝子の発症を抑えうることが判明したことが大幅な前進である。S1のCRBN結合領域における理解も深まり、またトランスクリプトーム解析によるS1の支配する遺伝子群についても少しずつ分かってきた。ただX1における部位は、本年度でも完全には決まらなかったので来年度継続して挑戦したいと考えている。全体的には、おおむね順調であると考えている。次年度は本年度に引き続き、基質S1,非基質X1、そして本年度に見いだした新たな非基質候補X2の解析を行い、また更にCRBN結合因子の探索を行うことを計画している。またトランクリプトーム解析なども行い、これらS1などが関わるシグナル伝達・遺伝子発現についても分析する。基質S1の解析についてはCRBN結合に必要なGlycineやCRBNにおけるS1結合に必要なアミノ酸を明らかにしているので、次年度はCRBN非結合型S1発現のがん細胞株を樹立することを計画している。またS1をRNAiでノックダウンした際とIMiDsを処理した際の遺伝子発現変化を比較するためにトランスクリプトーム解析を行うことを考えている。CRBN非結合型S1細胞が樹立されたならば、その細胞もトランスクリプトーム解析のコントロールとして使用する予定である。非基質X1の解析については本年度に引き続いてCRBNとの間の相互作用の様式の解析を続ける。X1の欠損変異体をいくつか作成し、領域を決定する。またIMiDs処理によるCRBN結合がX1のいかなる機能に影響を与えるのかについても生化学的に検証することを考えている。非基質候補因子X2の解析について、次年度ではX1と同様結合様式を解析し、IMiDs存在下におけるCRBN結合のX2への影響を検証することを考えている。加えてLC-MS/MSによるさらなるプロテオミクス解析を実施し、がん細胞におけるCRBNに結合する基質・非基質の単離を行っていくことを予定している。S1-F1,F2による血液癌の発症機構を解析するために、融合遺伝子を発現する細胞株を作製する。そして増悪の過程を検証する。またS1-F1による遺伝子発現変化をIMiDsがどのように抑制するのかも検証する。X1の部位を決めて、その部分だけでも共同研究によって構造解析などを実施したいと考えている。
微小強磁性トンネル接合に於けるクーロン・ブロッケイドの基礎理論

本年度の研究実績は以下の3項目に纏められる。(1)微小強磁性二重トンネル接合に対するクーロン・ブロッケイドの微視的理論を(a)非平衡グリーン関数による高次のトンネル過程の考慮(b)電磁場環境効果を各慮したアイランド電荷状態の自己無着な記述を考慮して定式化し、トンネル電流、トンネル磁気抵抗変化率に対する厳密な表式を求めた。(a)は量子ゆらぎのによるクーロン・ブロッケイドの破れを記述する上で不可欠であり、(b)は電磁場環境効果それ自体がクーロン・ブロッケイドの安定性と電荷ゆらぎに関わる重要な物理であることに加え、これがアイランドの電荷状態に影響を及ぼすからである。この理論は、任意の外部環境インピーダンス(任意のエネルギー散逸)に対するクーロン・ブロッケイドに起因する伝導特性の検討を可能とするものである。(2)この理論に基づいて、トンネル電流、トンネル磁気抵抗変化率に対する"電磁場環境効果を考慮した高次のトンネル効果"をダイアグラム的に検討した。高次のトンネル効果は、摂動の各次数で非平衡グリーン関数の非既約な自己エネルギーをもたらし、これが具体的な取り扱いを困難なものとしていることを明らかにした。(3)予備的な検討として、摂動パラメターの2次までの範囲で自己エネルギーのあるクラスを考慮してトンネル電流およびトンネル磁気抵抗変化率を数値的に計算した。結果は、電磁場環境効果の取り込みには成功しているが、量子ゆらぎの記述は未だ不十分であり、実験事実を定性的には記述するが定量的には記述できていない。従って、この系の伝導現象の物理の定量的理解のためには、未検討の白己エネルギークラスの評価、さらには非平衡グリーン関数そのものの定式化にまで踏み込んだ検討が今後の課題となる。
人工スプライシングシステムの構築と不溶性蛋白質合成への展開

既存の技術では、膜蛋白質の合成は遺伝子工学的手法、化学合成を問わず、極めて困難である。もし不溶性ということがなければ近年蛋白質合成の方法論として利用される機会が増大しているインテイン法が、膜蛋白質合成にも利用することが可能かも知れないと考えた。HIV-1のgp41由来であるN36/SC-peptideが極めて水溶性の高い、安定6量体複合体を形成するという点に着目し、このN36/SC-peptide複合体を、(1)不溶性蛋白質フラグメントの可溶性デバイスとする、(2)N36とSC-peptideに不溶性蛋白質フラグメントを結合させ、水溶液中で可溶性複合体を形成させると共に、2つのフラグメントの反応点の距離を近づける、(3)N36あるいはSC-peptide/不溶性蛋白質フラグメントの結合部位に人工スプライシングシステム(インテインシステム)を導入することにより不溶性フラグメントの縮合を達成させるとともに、不要になったN36/SC-peptide複合体は縮合したフラグメントから自動的に遊離させる、という不溶性蛋白質の新たな合成戦略を立案し研究展開を行ってきた。本年度はリポソームを利用した不溶性蛋白質の化学合成について検討を加えた。その結果、チオエステルを利用するケミカルライゲーション法を利用すれば、難溶性ペプチドフラグメントであっても、脂質二重膜中で極めて効率的に反応に、2回膜貫通型の受容体モデルへと変換できることを明らかとした。今後は、本手法の不溶性蛋白質合成への展開例を増加させ、その有用性を検証する予定である。さらに、本年度は、ペプチド鎖の更なる延長を目的とし、新規光切断型保護基の開発を行い、基礎研究レベルではあるものの、本保護基を利用することにより、従来困難であったTandem型ライゲーションが可能であることを明らかとした。膜蛋白質の調製という点に目を移した場合、現状では遺伝子工学的手法、化学合成を問わず、この不溶性蛋白質を調整することは極めて困難である。HIV-1のgp41由来であるN26/SC-peptideが極めて水溶性の高い、安定6量体複合体を形成するという点に着目し、このN36/SC-peptide複合体を、(1)不溶性蛋白質フラグメントの可溶性デバイスとする、(2)N36とSC-peptideに不溶性蛋白質フラグメントを結合させ、水溶液中で可溶性複合体を形成させると共に、2つのフラグメントの反応点の距離を辺づける、(3)N36あるいはSC-peptide/不溶性蛋白質フラグメントの結合部位に人工スプライシングシステム(インテインシステム)を導入することにより不溶性フラグメントの縮合を達成させるとともに、不要になったN36/SC-peptide複合体は縮合したフラグメントから自動的に遊離させる、という不溶性蛋白質の新たな合成戦略を立案し、極めて水溶性が高く、かつN36と非常に安定な複合体を形成するペプチドとしてSC35EK分子の開発に成功した。この分子をデバイスとしタスプライシングシステムの構築に取り組む予定である。さらに、本年度は不溶性蛋白質そめものの化学合成を念頭に脂質2分子膜中でのペプチドの縮合反応について検討を加えた。その結果、これらチオエステルを含むペプチドフラグメントは、脂質二重膜中で極めて効率的に反応に、2回膜貫通型の受容体モデルへと変換できることを明らかとした。

さらに、本年度は、ペプチド鎖の更なる延長を目的とし、新規光切断型保護基の開発を行い、基礎研究レベルではあるものの、本保護基を利用することにより、従来困難であったTandem型ライゲーションが可能であることを明らかとした。
セラミック原料粉体の粒子形態制御と焼結性

一般にセラミック原料粉体を形成し常圧で焼結する場合、粒子が微細で成形体の初期充填密度が高い程低温で緻密に焼結する。本研究では、アルミナを試料として一次粒子の形態および粒度組成の異なる粉体を作製し、得られた粉体の粒度分布の測定、電子顕微鏡による観察、格子定数の測定を行った後、焼結体を作製し嵩密度、熱膨張、電子顕微鏡により微構造を観察し粉体性状の焼結に及ぼす影響について検討した。その結果得られた粉体は粉砕機の種類により若干異なるが、乾式法に比し湿式法は微細化が進み、結晶子経は減少した。格子歪は乾式粉砕物の方が大きく、粒子形態は湿式粉砕物が角ばっているのに対し乾式では粉砕が進むにつれて丸味を帯てきた。成形体の嵩密度は乾式粉砕物が大きいが焼結体の嵩密度は同温度の場合、微細化の進んだ湿式粉砕物が大きくなる。湿式粉砕後乾式粉砕を加えると成形体の嵩密度は増大することなどを明らかにした。また平均粒径の細かい粉体と平均粒径を2-12μmの範囲で変えた粗い粉体の2種類の粉体からなる混合粉体について、その充填および焼結性に与える粗い粒子の大きさの影響を検討した。その結果、より大きな粗い粒子を含む形成体は密度が高く、大きな気孔径および広い気孔径分布である。細かい微子の体積比が小さい範囲では、焼成温度にかかわらず、粗い粒子が小さいほど混合粉体の緻密化ははやく進行した。細かい粒子の体積比が高い範囲では、粗い粒子が小さいほど、焼成温度の低い場合の混合粉体の緻密化ははやく進行したが、焼成温度が高い場合の混合粉体の緻密化ははやく進行する事などを明かにした。
多発性筋炎/皮膚筋炎関連急速進行性間質性肺炎の病態におけるIL-15の役割の解明

多発性筋炎/皮膚筋炎はしばしば間質性肺炎(ILD)を合併し、中には急速進行性間質性肺炎(RPILD)を来たし、致死的な転帰を辿ることもある。我々は血清のサイトカインを用いた検討で、血清IL-15がRPILDと非RPILDを識別する重要なサイトカインであることを同定した。そのため多発性筋炎/皮膚筋炎関連RPILDにおけるIL-15の機能解析を行なっている。血清を用いた検討では、治療前後のRPILDの血清でのIL-15値の推移を検討したところ、治療後増悪した群(n=7)では有意にIL-15値は上昇していた。このことより血清IL-15値の推移を確認することで治療反応を予測、反映することができると考えた。また気管支肺胞洗浄液中のIL-15値に関して、RPILD群(n=5)と非RPILD群(n=7)を比較したところ、RPILD群で有意に高値であった。このことより、RPILDの病態においてIL-15は肺局所においても産生が亢進していることが示唆された。RPILDで死亡した症例の肺組織において、免疫染色でIL-15を染色したところ、上皮細胞、浸潤細胞ともに発現を認めた。IL-15は浸潤細胞、上皮細胞両者より産生されている可能性が示唆された。血清、気管支肺胞洗浄液、肺組織を用いた検討においてIL-15の重要性を実証してきており、その点は概ね計画通り進められている。しかし上皮細胞のcell lineを用いた系では引き続き刺激におけるタイムコースや濃度の調整に時間を要す可能性があり、またマウスを用いた検討は未着手であるため、引き続き進展させていく必要がある。現在未着手のマウスを用いた検討を進めていく。IL-15欠損マウスと野生マウスの肺の線維化の比較、また肺組織中の上皮細胞とマクロファージにおけるIL-15を含めたサイトカインの評価を行なっていく方針である。肺胞及び気管支上皮細胞のcell line引き続き刺激におけるタイムコースや濃度の調整を行い複数検討していく方針である。これまでヒト検体を用いた検討を中心に進めており、未着手であったマウスを用いた検討を次年度において着手していくため、マウス購入・維持、抗体の購入等に物品費を当てていく。またこれまでの研究成果の発表と情報収集のために海外及び国内学会での発表回数も増やしていくため旅費にも使用していく。