hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病性多発神経障害におけるグルコース応答性KATPチャネルの役割の解明

糖尿病性多発神経障害の病態解明を目的とした。インスリン分泌促進薬スルフォニルウレア(SU)薬の標的であるグルコース応答性KATPチャネル(KATP)がエネルギー代謝状態に応じて神経興奮性を制御するという知見に基づき、KATPの末梢神経系における生理的役割を評価した。その結果、後根神経節ニューロン培養において、SU薬及びKATP開口薬が、神経保護作用あるいは逆に神経傷害作用を発揮することを明らかにした。KATPノックアウトマウスにおいては、末梢神経系が加齢に伴い野生型マウスよりも早期に機能低下することが明らかとなった。以上より、KATPは末梢神経系の維持に重要な役割を果たすことが示唆された。本研究の目的は、治療法未確立の疾患である糖尿病性多発神経障害(DPN)の新規発症機序の解明である。インスリン分泌促進作用のあるスルフォニルウレア(SU)薬は臨床現場で汎用されているが、近年、本薬の標的であるグルコース応答性KATPチャネル(KATPC)が中枢神経系にも広く分布し、エネルギー代謝状態に応じた神経興奮性の制御、摂食行動の変化および全身の代謝状態変化に寄与することが解明されつつある。そこで本研究では、KATPCの末梢神経系における生理学的役割を評価し、KATPCに作用する臨床薬剤SU薬(KATPC opener)およびnicorandil(KATPC closer)のDPNの病態に及ぼす影響を検討することにより、DPNの新たな発症機序と治療法の確立を目指した。平成27年度の研究成果を以下に記す。(1)マウス後根神経節及び坐骨神経における各種KATPC構成タンパクが発現していることを確認した。また、streptozotocin誘発1型糖尿病モデルマウスにおけるKATPCタンパクの発現量には変化がないことを確認した。(2)マウス後根神経節ニューロン初代培養において各種SU薬が神経突起伸長を抑制し、nicorandilが伸長を促進することを示した。(3)KATPCノックアウトマウスにおいて神経伝導速度・知覚機能検査などを用い、末梢神経機能の低下を確認した。以上より、KATPCの末梢神経系における生理的役割を解明しつつある。当初計画では平成27年度において、KATPC欠損マウスにおける末梢神経系の機能および病理学的変化までを検証する予定であった。末梢神経系の機能については詳らかとなったが、病理学的変化については十分な検討が得られていない。しかしながら、その他の予定していた実験についてはおおむね予想通りの結果を得られ、順調に進展しており、総合的に判断するとおおむね順調であると考えられる。本研究は、糖尿病性多発神経障害(DPN)の新規発症機序の解明を目的とした。インスリン分泌促進作用のあるスルフォニルウレア(SU)薬の標的であるグルコース応答性KATPチャネル(KATPC)が中枢神経系にも広く分布し、エネルギー代謝状態に応じた神経興奮性の制御、摂食行動の変化および全身の代謝状態変化に寄与することにヒントを得、KATPCの末梢神経系における生理学的役割を評価した。その結果、マウス後根神経節及び坐骨神経における各種KATPC構成タンパク発現を確認した。また、streptozotocin誘発糖尿病モデルマウスおよび肥満2型糖尿病モデルdb/dbマウスにおけるKATPCタンパクの発現量を比較し、糖尿病状態でのKATPCの発現に変化を認めないことが判明した。次に、マウス後根神経節ニューロンの初代培養細胞を用いて、各種KATPC作動薬の末梢神経系細胞に及ぼす影響を評価したところ、各種のSU薬は、各々のチャネル選択性に依存して、神経保護作用あるいは逆に神経傷害作用を発揮することが明らかとなった。また、KATPCの開口薬は、神経保護作用を発揮することが示された。最後に、KATPCノックアウトマウスにおける末梢神経系の機能及び病理学的変化を評価したところ、いったん正常に発達した末梢神経系が、加齢に伴い野生型マウスよりも早期に末梢神経機能が低下することが明らかとなった。以上より、KATPCは末梢神経系の維持に重要な役割を果たすことが証明された。今後、KATPCノックアウトマウスの末梢神経系の病理学的評価と細胞生物学的評価を行い、KATPCの末梢神経系の恒常性維持に果たす役割を詳細に解明する。より頑健性の高い方法論として現在、末梢神経系特異的KATPCノックアウトマウスを作成中である。また、DPNの新規治療薬として、KATPC開口薬のDPNマウスに対する治療効果も検討する。まず、昨年度計画の残りであるKATPC欠損マウスにおける末梢神経系の病理学的変化について検証する。次に、当初研究計画に基づき、1型糖尿病モデルマウスにおけるDPNに対するKATPC作動薬による治療効果を検討する。すなわち、streptozotocin誘発糖尿病モデルマウスのDPNに対し、KATPC openerおよびcloserの影響を評価する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ナノメディスン用機能性ナノ構造体の超迅速高信頼性設計

コロイド半導体量子ドット:本研究では現在癌治療に使われている材料を改良するために、高精度第一原理計算により原子レベルでの無機/有機界面とコアの構造を調べた。a)実験から存在が明らかになっていた(CdSe)_n,n=33,34の構造とその光学スペクトルを求め、実験と良い一致をみた。b)毒性を減らすために(ZnS)_28/(CdSe)_4のコア-シェル構造を計算し、その構造が大きく変形しないことを確かめた。c)有機配位子の量子ドットへの接続は二官能性配位子TOP/TOPOを用いて量子ドットに親水性を持たせるために重要である。CdSeとCdSe/ZnSナノ粒子の安定性を調べた。これらの結果から毒性を減らしつつ、所望の性質を得ることが出来ることが示された。ポルフィリン、フタロシアニンベースの超分子:光線力学療法用光線感作物質として期待されているポルフィリン、フタロシアニンベース超分子の光学スペクトルを高精度第一原理計算により求めた。a)14種類の汎関数を用いてTDDFTを亜鉛フタロシアニンに適用し、溶媒効果も明らかにした。b)またTDDFTをポルフィリンアレイ(ポルフィリンテープ)に適用し、アレイが長くなるに従い吸収スペクトルがIRにシフトし、UVの強度が減少することが分かった。c)新しいフタロシアニン、サブフタロシアニンベースの超分子を提案し、その安定性を振動スペクトルと励起エネルギーから評価した。d)ポルフィリンベースの超分子を用い、ナノスケールの電気伝導と芳香族性の関係を明らかにした。カーボンナノチューブCNT:CNTが細胞膜を貫通する実験結果が発表されて以来、この材料をドラッグデリバリーとして使うことが提案されている。本研究では端を閉じたCNTと開いたCNTの第一原理分子動力学計算を行い、電場により細胞膜を貫通できることを確認した。本年度は以下の4点について研究を進めた。1)Cd含有量を減らし、結晶と同じ構造を持つ粒子よりも安定性を向上させ、CdSeナノ粒子の医療用効果を高めるために、(M_1X_1/M_2X_2)_n (M_1=Zn,X_1=S,Se,M_2=Cd,Pb,X_2=S,Se)のシェル-コア構造の量子ドットについて第一原理計算を行った。初期構造として我々のグループにより理論的に予言され、実験グループによって観察されたフラーレンに似た構造を持つ(CdSe)_<34>を選んだ。安定性を検討した結果、(ZnS)_<28>/(PbS)_4,以外は(M_2X_2)_6よりも(M_2X_2)_4の方が安定であることを明らかにした。2)さらに大きなサイズのクラスター形状の探索を行い、(MX)_4n_2(nは層の数)という安定な化学組成や大きさに関する「デザインルール」を見いだした。これはオクタヘドロン対称性のケージをどのように作製すればいいのかを示唆している。またこれらのケージは化学結合を切ることなくTd対称性の構造に変化させることができる。3)光線力学的治療にフタロシアニンおよびフタロシアニン基分子がよく利用されている。より効率のよい治療薬の開発のためにレーザーなど外部光の波長とこれらの分子吸収帯を一致させる努力がなされている。計算化学の分野ではより正確な吸収スペクトルの予測手法の確立が求められている。本研究ではフタロシアニン、ポルフィリンおよびそれらの誘導体の計算を進めている4)熱を与えて癌細胞を死滅させる方法(温熱療法)は新しい癌治療として期待されている。磁場中の熱の発生について第一原理計算により求める手法の開発を開始している。CdSe13,19,33,34のマジックナンバーからなるCdSe量子ドットの光学スペクトル計算を行い、実験結果と比較した。フラーレンライクな構造のスペクトルは測定されたものと良い一致を示し、計算で得られた構造が正しいことが確かめられた。次にコアとシェルから構成される新しい構造を計算により明らかにした。CdSe60,61はCdSe48のシェルとCdSe12,13のコアを持ち、大きなHOMO-LUMOギャップと接合エネルギーを示し、安定である。これは実験により1.4nmより大きな直径のフラーレンライクな構造を合成可能であることを示唆している。有機溶媒による小さなCdSeクラスターの安定性と光学スペクトルへの影響を調べるために、垂直励起エネルギーのTDDFT計算と溶媒中のCdSeクラスターのスペクトルを比較検討した。ポルフィリン、フタロシアニンとその誘導体は光線感作物質として良く知られ、現在の治療では癌の光線力学治療として使われている。光吸収剤として高い効率を実現するためにレーザー励起波長にできるだけ近いポルフィリン、フタロシアニン誘導体を見いだすことが必要である。そこで本研究では数個のポルフィリン、フタロシアニンからなる系の吸収スペクトルを計算した。モノマーがn=1-6個連なるポルフィリンアレイの孤立系(ガス相)の垂直励起エネルギーは赤外領域にシフトし、欠点である近紫外領域のピーク強度はアレイが長くなるに従い弱くなることを見出した。次にポルフィリンのメソの位置の水素をフェニル基で置き換え、モノマー、ダイマー、トライマーの吸収を調べた。同様に溶媒への溶解度を向上させるための置換基をつけても吸収スペクトルには大きな変化がなく、溶媒効果が小さいことが明らかになった。同様にフタロシアニンベースのオリゴマーについても計算を実施した。コロイド半導体量子

ドット:本研究では現在癌治療に使われている材料を改良するために、高精度第一原理計算により原子レベルでの無機/有機界面とコアの構造を調べた。a)実験から存在が明らかになっていた(CdSe)_n,n=33,34の構造とその光学スペクトルを求め、実験と良い一致をみた。b)毒性を減らすために(ZnS)_28/(CdSe)_4のコア-シェル構造を計算し、その構造が大きく変形しないことを確かめた。c)有機配位子の量子ドットへの接続は二官能性配位子TOP/TOPOを用いて量子ドットに親水性を持たせるために重要である。CdSeとCdSe/ZnSナノ粒子の安定性を調べた。これらの結果から毒性を減らしつつ、所望の性質を得ることが出来ることが示された。ポルフィリン、フタロシアニンベースの超分子:光線力学療法用光線感作物質として期待されているポルフィリン、フタロシアニンベース超分子の光学スペクトルを高精度第一原理計算により求めた。a)14種類の汎関数を用いてTDDFTを亜鉛フタロシアニンに適用し、溶媒効果も明らかにした。b)またTDDFTをポルフィリンアレイ(ポルフィリンテープ)に適用し、アレイが長くなるに従い吸収スペクトルがIRにシフトし、UVの強度が減少することが分かった。c)新しいフタロシアニン、サブフタロシアニンベースの超分子を提案し、その安定性を振動スペクトルと励起エネルギーから評価した。d)ポルフィリンベースの超分子を用い、ナノスケールの電気伝導と芳香族性の関係を明らかにした。カーボンナノチューブCNT:CNTが細胞膜を貫通する実験結果が発表されて以来、この材料をドラッグデリバリーとして使うことが提案されている。本研究では端を閉じたCNTと開いたCNTの第一原理分子動力学計算を行い、電場により細胞膜を貫通できることを確認した。
ホウ素欠乏応答の分子機構解明

ホウ素は植物の生育に不可欠の元素であり、欠乏すると組織の壊死や不稔など多様な生理障害が発生する。しかしホウ素が不足することでそれら障害が発生するメカニズムは明らかでない。そこで植物(シロイヌナズナ)のホウ素欠乏応答を詳細に解析した結果、根の先端部の急速に伸長する細胞では、ホウ素を培地から除去して1時間以内に活性酸素が蓄積し細胞死に至ることが明らかとなった。カルシウムの欠乏でも同様の応答が生じる。これらの急速な応答は細胞の成長に伴い新たに合成される細胞壁多糖ペクチンがホウ素またはカルシウムで架橋されないことで生じることが示唆され、ペクチン架橋の生理的重要性が示された。ホウ素は植物の必須元素である。ホウ素を植物の培地から除去すると直ちに種々のストレス応答が生じる。23年度までの研究で、水耕栽培シロイヌナズナをホウ素欠除培地に移すと、1時間以内に根の伸長領域に活性酸素分子種が蓄積し細胞死が発生することを示した。24年度はこの応答について更に解析を進めた結果、エチレン受容体のブロッカーである銀イオンの存在下では、ホウ素欠除に伴う活性酸素分子種の蓄積と細胞死が抑制されることを見出した。この結果は、ホウ素欠乏ストレスのシグナル伝達にエチレンが関与することを示唆する。ホウ素は細胞壁でペクチンのラムノガラクツロナンII(RG-II)領域と特異的に結合し、B-RG-II二量体を形成している。このB-RG-II二量体の形成機構や細胞壁における安定性を解析する手段として、RG-II単量体とB-RG-II二量体を区別できる抗体の作成を試みている。24年度は、23年度にファージディスプレイライブラリから選抜したファージ抗体候補の評価を行ったが、B-RG-IIに対して高い特異性を示すクローンは得られなかった。一方、本研究で確立したB-RG-II固相化法を用いる競合ELISA分析により、23年度に新たに作成したウサギ抗血清はRG-II単量体よりもB-RG-II二量体に対してより高い親和性を示すことがわかった。このことは、このウサギ抗血清中にはB-RG-II二量体を特異的に認識するイムノグロブリン画分が存在することを示す。そこで現在、B-RG-IIを固定化したカラムを用いて血清を分画することにより、B-RG-II特異抗体を取得することを試みている。植物の必須元素ホウ素(B)は、細胞壁においてペクチンのラムノガラクツロナンII領域同士をホウ酸ジエステルで架橋する役割を果している。植物の培地からBを除去すると、1時間以内にストレス応答性遺伝子の発現が誘導されるとともに、根の伸長領域において活性酸素の蓄積、細胞死が発生する。このようにBによるペクチン架橋の生理的重要性は明らかであるが、B不足によるペクチン架橋の形成不全がなぜ前述のような欠乏障害をもたらすか、その具体的な機作は未だ明らかでない。そこで本研究では水耕栽培シロイヌナズナ根におけるB欠乏初期応答の解析を行った。Bと同じくペクチンの架橋因子であるカルシウム(Ca)の欠除でも同様に迅速な根伸長領域の細胞死が生じることから、細胞死にはペクチンの架橋不全が関係していると考えられる。そこで今年度は細胞死に先立つ遺伝子発現についてもB欠除・Ca欠除に共通性が見られるか検討した。まずマイクロアレイ解析と定量RT-PCRにより、Ca欠除処理した根において1時間以内に発現誘導される遺伝子を探索し、次いでそれがB欠除でも1時間以内に誘導されるか検討した。その結果Ca欠除応答遺伝子として10個を同定し、うち3個はB欠除でも誘導されることを見出した。エチレン受容体の阻害剤である銀イオンの存在下では、これら3遺伝子のB・Ca欠除処理による発現誘導は抑制されたことから、B・Ca欠除応答のシグナル伝達にはエチレンが関与していると考えられた。また細胞壁ペクチンの架橋不全につながるB・Ca欠除応答と、細胞壁の破壊を伴う病原菌感染応答に類似性がある可能性を考え、既知の感染応答遺伝子についてBまたはCa欠除で誘導されるか検討した。しかし検討した27個の遺伝子ではいずれも有意な発現変化は認められなかったことから、B・Ca欠乏初期応答は病原菌応答とは異なる機作によることが示唆された。植物の必須元素ホウ素(B)は細胞壁でペクチンの特定の領域に結合し、多糖間を架橋してゲル化させる役割を有している。すなわちBは植物にとって細胞壁超分子構造の構築に必要な元素である。タバコ培養細胞では培地Bを除去すると数分以内に細胞膜上のカルシウムチャネルが開口し、ストレス応答が誘導される。植物細胞が外部Bの消失をこのように迅速に応答する機構は明らかでない。

そこでシロイヌナズナを用いた分子遺伝学的解析によりB欠乏の感知機構や欠乏ストレスシグナルの伝達経路を明らかにしようと考えた。まずシロイヌナズナのB欠乏応答を解析した。水耕栽培したシロイヌナズナをB欠除培地に移すと、1時間以内という短時間で根の伸長領域に活性酸素分子種(ROS)が蓄積し、細胞死が誘導された。この結果は、伸長段階の細胞は特にB欠乏感受性が高いこと、また欠乏に対する応答や障害にROSが関与することを示唆する。次に、このROSの発生源を特定するため各種変異株のB欠乏応答を解析した結果、細胞膜NADPHオキシダーゼの一種Rboh G欠損株では根伸長領域の細胞死が野生株より軽減されることを見出した。従ってB欠除に伴うROS生成の少なくとも一部は細胞膜NADPHオキシダーゼRbohGによると考えられる。またBとともにペクチンの架橋に必要とされる元素カルシウムの欠除に伴う変化を解析した結果、短時間でのROS発生・細胞死というB欠除と同様の応答が生じることが明らかとなり、B欠除応答はペクチン架橋構造の変化を介して起ることが示唆された。これらの知見は外部ミネラル濃度の変化を植物細胞が知覚するメカニズムに関して重要な知見を提供するものである。ホウ素欠乏応答機構を構成する分子の同定に関しては、エチレンの関与を明らかにすることができた。B-RG-II二量体特異抗体の作成については当初計画したファージ抗体を取得することはできていないが、代替としてウサギ抗血清の分画によって取得できる可能性を見出し、研究を推進中である。抗体が取得できれば直ちに免疫組織化学的解析が実施できるよう、タバコ培養細胞を用いた実験系の構築も完了ずみである。ホウ素欠乏応答のメカニズムについては変異株を用いた解析、カルシウム欠除応答との比較解析を通じて一定の成果を得た。ホウ素によって架橋されたペクチン・架橋されていないペクチンを区別できるファージ抗体の作成については、抗体プールから陽性クローンを選抜するための抗原の固相化法を確立する段階に時間を要し、23年度中に特異抗体を取得するとの計画どおりには進行していない。しかし確立した手法を用いて既にいくつかの候補を取得ずみであること、またファージ抗体法で目的の抗体が得られない場合に備え、ウサギ抗血清も作成したことから、全体として研究は順調に進展していると考える。ファージディスプレイ法ではB-RG-II二量体に対し十分に特異性の高い抗体を取得することができず、B-RG-II二量体の形成機構・細胞壁内での安定性に関する免疫組織化学的解析の実施に至らなかった。このため現在代替法としてウサギ抗血清の分画によるB-RG-II二量体特異抗体の取得を試みており、25年度中には抗体の取得とそれを用いた解析が実施できる見込である。引き続きホウ素欠乏応答機構の分子メカニズムについて解析を進める。さらに多くの変異株について解析することで、欠乏シグナルの伝達経路を解明する。また短時間のホウ素欠乏で損傷を受ける根の部位をより詳細に特定することで、ホウ素ペクチン複合体の生理的重要性に関する知見を得る。ホウ素ペクチン複合体特異的抗体についても作成を進める。ファージディスプレイ抗体法で得ている候補クローンの抗原結合能、特異性について評価を行う。またウサギ抗血清からも、複合体特異的成分の分画を試みる。
難治性疼痛へのインターロイキン-6の関与の検討

ラット坐骨神経を緩徐に縫合した疼痛モデル(CCI : chronic constriction injury)とcomplete Freund's adjubantを使用し神経炎症を誘発させたモデル(CFA)が神経因性疼痛を誘発することが明かにされた。これらのモデルは足底への熱輻射、冷刺激、ピンプリックテストに対し足底をなめたり逃避行動をとるなどの疼痛関連行動を起こす。これらの疼痛関連行動は免疫調整剤のサリドマイドや免疫抑制剤のサイクロスポリンSの投与によって抑制されることより炎症性の物質が神経因性疼痛に関与していることが予測される。そこで神経再生に深く関与しているインターロイキン-6(IL-6)に注目し、IL-6の抗体を前投与したところ全ての疼痛刺激に対する疼痛関連行動が抑制されることがわかった。免疫染色ではIL-6のがラット脊髄後根神経節(DRG : dorsal root gangrion)、脊髄後根および神経損傷部に神経障害直後より出現し障害後3日でピークとなり、障害後14まで継続した。これはラット疼痛関連行動の程度の経過と一致する。また、ラット坐骨神経を露出しIL-6溶液を浸したオキシセルで被覆したところCCIやCFAのように疼痛関連行動が出現した。以上のことより神経因性疼痛へのIL-6の関与が明らかになった。神経因性疼痛の治療法としてIL-6拮抗薬の神経損傷後早期に投与することが有効であると考えられる。神経因性疼痛モデルとしてラット坐骨神経を吸収性縫合糸で絞扼したものとCAF (complete Freund's adjuvant)を用いた神経炎症モデルを使用し、炎症性のサイトカインの痛覚過敏症やアロディニアなどの難治性疼痛への関与を検討した。免疫調整剤のサリドマイドや免疫抑制剤のサイクロスポリんSをラットに経口投与することによって疼痛関連行動が抑制されることが分かった。また、免疫抑制剤および免疫調整剤は神経因性疼痛モデルを作成する以前より投与するとより効果的であり神経因性疼痛に関与する炎症性の反応は神経障害直後より起こっている可能性が示唆された。以上の結果より神経因性疼痛への炎症性のサイトカインが関与していることが明らかになったが、どのサイトカインが関与しているかは明らかではない。疼痛関連行動はサリドマイドに比較してサイクロスポリンが有意に抑制する結果も得ている。サリドマイドは活性化マクロファージを抑制し炎症性サイトカインの一種であるTNF-α産生を抑制することが分かっている。サリドマイドは投与量を50mg/kgから200mg/kgに増量しても疼痛抑制効果に変化はなかった。サイクロスポリンはサリドマイドと比較してより強力により広範囲に炎症性反応を抑制する。従ってTNF-α以外のサイトカインが強く関与している可能性がある。インターロイキンー6の拮抗薬を投与したところサイクロスポリンSと同等の疼痛関連行動抑制効果が認められた。神経因性疼痛に炎症性サイトカインであるインターロイキン-6が大きく関与していることが分かった。現在は神経絞扼モデルを使用し神経のどの部分で関与しているかを免疫染色を利用することによって検討している。神経絞扼の手術後1日より脊髄神経後根神経節でインターロイキン-6が感知された。今後、時間的経過および拮抗薬を投与したモデルでの免疫染色での変化を継続し研究する予定である。前年度までにラット坐骨神経を緩徐に縫合した疼痛モデル(CCI:choronic constriction injury)とcomplete Freund's ajubantを使用し神経炎症を誘発させたモデル(CFA)が神経因性疼痛を誘発することが明かにされた。

そこで神経再生に深く関与しているインターロイキン-6(IL-6)に注目し、IL-6の抗体を前投与したところ全ての疼痛刺激に対する疼痛関連行動が抑制されることがわかった。免疫染色ではIL-6のがラット脊髄後根神経節(DRG:dorsal root gangrion)、脊髄後根および神経損傷部に神経障害直後より出現し障害後3日でピークとなり、障害後14まで継続した。これはラット疼痛関連行動の程度の経過と一致する。また、ラット坐骨神経を露出しIL-6溶液を浸したオキシセルで被覆したところCCIやCFAのように疼痛関連行動が出現した。以上のことより神経因性疼痛へのIL-6の関与が明らかになった。神経因性疼痛の治療法としてIL-6拮抗薬の神経損傷後早期に投与することが有効であると考えられる。
胃癌抗体療法におけるＡＤＣＣ活性増強の試み―Ｆｃ受容体遺伝子多型の検討も含めて―

近年、胃がんや大腸がんに対して抗癌剤のみならず抗体と呼ばれる薬が使われており、この抗体は直接がん細胞を殺すだけではなく、免疫細胞をがんのところに引き寄せてがん細胞を殺させる作用も持っている。この研究では、抗体に明らかに免疫細胞介してがん細胞を殺させる作用があることが確認された。この作用をさらに増強させるために免疫を高める薬を用いて実験してみたが、残念ながら増強効果は認められなかった。しかしこの研究で新たに、抗体が効く人と効かない人に遺伝的な違いがあることが明らかとなった。【研究の目的】抗体医薬は癌細胞に対する細胞増殖のシグナル伝達を阻害するために開発されたものであるが、その効果には、Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)も関与していることが明らかとなってきた。ADCCは癌細胞に結合した抗体がNK細胞や単球のFc受容体結合することによって惹起される免疫反応であり、今後は抗体治療においてADCC活性の増強が重要になってくる。免疫賦活剤レンチナン(LNT、β-1,3グルカン)にはADCC活性を増強する可能性があり、LNTのADCC活性増強相互作用につき検討する。ADCCは免疫細胞のFc受容体を介して惹起されるが、本研究ではFc受容体の遺伝子多型とADCC活性の関係についても明らかにする。【研究実施計画】LNTのADCC活性増強効果を検討し、Fc受容体の遺伝子多型と抗体治療の効果発現の関係を検討した。【研究実績の概要】健常ボランティアの末梢血単核球を用いてIL-2単独あるいはIL-2と固相化CD3抗体を用いてLAK細胞を誘導し、cetuximabを0.05-500μg/mlの濃度で添加しMTS assayでCetuximabのADCC活性増強効果を検討した。ADCC活性はcetuximabの濃度依存性に上昇した。一方、in vitroでのLNT添加によるADCC活性増強効果を検討したがADCC活性の増強は認められなかった。また、in vivoにおけるLNTのADCC活性増強効果を検討したが、in vivo投与においてもADCC活性の増強は認められなかった。Cetuximabで治療した60例の大腸癌患者においてFcγRの遺伝子多型を検討したが、遺伝子多型と腫瘍縮小効果に関連を認めなかった。しかしFcγRIIIaにおいて、F carrierでPFSがVVと比して有意な延長を認めた。1.健常ボランティアの末梢血単核球を用いてIL-2によりLAK細胞を誘導し、trastuzumabを10μg/mlの濃度で添加しMTS assayでtrastuzumabのADCC活性増強効果を検討した。細胞株はHER2陽性の胃癌細胞株MKN-7を用いた。MKN-7をターゲットとしてtrastuzumabの明らかなADCC活性が認められ、その活性はLAK細胞の細胞数依存性に上昇した。また、in vitroでのLNT添加によるADCC活性増強効果を検討したがADCC活性の増強は認められなかった。2.胃癌切除標本におけるHER2陽性率を免疫組織化学的検査で検討した。また、胃癌組織のホルマリン固定時間によるHER2陽性率への影響も検討した。47例の胃癌組織で検討し、HER2染色強度スコアの2+、3+を陽性とすると、陽性率は13/47=27.6%であった。ホルマリン固定時間によるHER2陽性率への影響はほとんど見られなかった。3.Cetuximabで治療した57例の大腸癌患者においてFcγRの遺伝子多型と治療効果の関係を検討した。FcγR IIa (H131R)、FcγR IIIa (V158F)ともにそれぞれの遺伝子多型と腫瘍縮小効果に関連を認めなかった。しかしFcγR IIa (H131R)とFcγR IIIa (V158F)のハプロタイプの組み合わせ(ディプロタイプ)において、HV/HVの症例はHV/nonHV、nonHV/nonHVより抗腫瘍効果が不良であった。免疫賦活剤レンチナン(LNT、β-1,3グルカン)にはADCC活性を増強する可能性があり、レンチナンのADCC活性増強相互作用につき検討する。【研究実施計画】平成23年度は基礎的検討を行う。LNTのADCC活性増強効果を検討し、Fc受容体の遺伝子多型と抗体治療の効果発現の関係を検討する。【研究実績の概要】KRASならびにBRAF

変異大腸癌細胞株に対するcetuximabの直接効果を検討したが、抗腫瘍効果は認められなかった。健常ボランティアの末梢血単核球を用いてIL-2単独あるいはIL-2と固相化CD3抗体を用いてLAK細胞を誘導し、cetuximabを0.05-500μg/mlの濃度で添加しMTS assayでCetuximabのADCC活性増強効果を検討した。ADCC活性はcetuximabの濃度依存性に上昇した。in vitroでのレンチナン添加によるADCC活性増強効果は認められなかった。cetuximabで治療した51例の大腸癌患者においてFcγR IIIa(V158F)の遺伝子多型を検討したが、CR+PR:FF/FV/VV=15/3/1例、SD+PD:FF/FV/VV=19/11/2で、遺伝子多型と効果に関連を認めなかった。in vivoにおけるLNTのADCC活性増強効果を検討した。すなわち胃癌患者にレンチナンを投与し、レンチナン開始前、1コース後(4週後)、2コース後(8週後)に末梢血を採取し、基礎的検討と同様の方法で末梢血から分離した単核球を用いてcetuximabのADCC活性を測定した。またFcγレセプターの遺伝子多型と抗体医薬の効果の関係を検討した。平成23年度の研究実施計画どおり、in vitroにおけるLNTのADCC活性増強効果を検討し、Fc受容体の遺伝子多型と抗体治療の効果発現の関係を検討できた。胃癌細胞株を用いて大腸癌細胞株と同様の検討を行う。また胃癌切除標本においてHER2の染色性の検討を行い、日本人の胃癌におけるHER2の発現状況を検討する。in vivoにおけるLNTのADCC活性増強効果を検討する。胃癌患者にレンチナンを投与し、レンチナン開始前、1コース後(4週後)、2コース後(8週後)に末梢血を採取し、基礎的検討と同様の方法で末梢血から分離した単核球を用いてcetuximabあるいはtrastuzumabのADCC活性を測定する。TargetcellはKRAS、BRAF変異大腸癌細胞株あるいはHER2高発現胃癌細胞株を用いて、cetuximabあるいはtrastuzumabを添加してMTT assayにより測定する。また、全例においてFcγIIIの遺伝子多型を解析する。次年度の研究費は、胃癌細胞株の購入、ADCC活性の測定に必要な培養液や試薬、抗体の購入、ディスポ製品の購入に使用する。また、FcγIIIの遺伝子多型の測定試薬の購入にも使用する。本年度の実験では、大腸癌細胞株を用いたADCC活性増強効果の検討を行ったため、胃癌細胞株購入予定費の41,351円が未使用額となった。この未使用額については平成25年の胃癌細胞株によるADCC活性の検討に用いる。平成23年度に購入を予定していた培養液、試薬、抗体等の購入が24年度に変更になったため、未使用額が生じた。
大腸癌進展におけるSPINK1の分子機構の解明と新規分子標的治療への応用

Serine protease inhibitor, Kazal type 1 (SPINK1)は上皮増殖因子との構造上の類似点があり、細胞増殖活性を有するユニークなトリプシンインヒビターである。まずヒト大腸癌組織の55%でSPINK1が発現していることを確認した。次に大腸癌細胞株および遺伝子改変マウスを用いて、SPINK1の過剰発現系および抑制系モデルを作製し、大腸癌の増殖を検討した。その結果、SPINK1の発現に応じて、腫瘍の増殖が有意に変化した。以上より、SPINK1は大腸癌細胞の増殖に寄与しており、大腸癌の進展に影響することが示された。1)大腸癌進展におけるSPINK1の機能を解析するために、トランスジェニックマウスを用いて研究を進めてきた。SPINK1ゲノムDNAを改変した2KbのSPINK1 minigeneを作成し、マウスにてユビキタスに発現するCAGプロモーターを結合させた、トランスジェニック(Tg)マウスを作製した。このTgマウスでのSPINK1の発現は各臓器にて若干の差が見られるが、大腸にてもその発現をまず確認した。このマウスにアゾキシメタンとデキストラン硫酸ナトリウムを併用して炎症関連大腸癌を発癌させ、発生した腫瘍個数をカウントした。SPINK1のマウスホモログであるSpink3のヘテロマウス(Spink3+/-)では1匹平均2.0±1.5個であったのに対し、Spink3+/-・SPINK1Tgマウスでは8.3±2.3個と有意に腫瘍個数が増加した(p<0.05)。腫瘍体積も同様にSPINK1Tgマウスで有意に増加した。以上よりSPINK1がヒト大腸癌の腫瘍増殖に関わる可能性が示唆された。2)大腸癌の腫瘍増殖にSPINK1が影響を及ぼすシグナルについて検討した。Spink3野生型マウスとSpink3+/-マウスに発生した大腸癌からタンパクを精製し、主要な増殖シグナルをウエスタンブロッティングにて解析した。pStat3の発現がSpink3+/-で低下している傾向にあり、Spink3の発現がJAK-STAT系シグナルを調節することにより炎症関連大腸癌の発生に寄与している可能性がある。実験マウス数を増やし、さらなる検証を進める予定である。1)まずヒト大腸癌におけるSPINK1の発現を解析するために、大腸癌切除標本を用いてSPINK1の免疫組織化学染色を行った。226症例中124例(55%)でSPINK1が発現していた。さらにSPINK1は分化型および、より進行度が高い症例で有意に高発現していた(p<0.01)。2)次に大腸癌細胞に対するSPINK1の増殖促進活性を検討するために、大腸癌細胞株にSPINK1をターゲットとしたsmall interfering RNA(siRNA)を導入し、SPINK1の発現を抑制した。また、ゲノムDNAを改変したminigeneを作製し、細胞内へ導入することでSPINK1の過剰発現系を作成した。まず4種類の大腸癌細胞株(Colo205,HCT116,HT29,SW620)の通常培養下でのSPINK1の発現をRT-PCRにて検討した。細胞によりその発現に差があり、Colo205,HT29での発現が強かった。そこでColo205にSPINK1のsiRNAを導入し、その発現を抑制させると細胞数は有意に減少し、SPINK1の過剰発現によって細胞数は有意に増加した(p<0.05)。SPINK1のマウスホモログであるSpink3のヘテロマウスにアゾキシメタンとデキストラン硫酸ナトリウムを併用して炎症関連大腸癌を発癌させたところ有意に腫瘍個数が減少することを既に昨年度報告している。以上よりin vitro, in vivoの実験系にてSPINK1/Spink3が大腸癌細胞の増殖に寄与する可能性が示唆された。3)Spink3大腸癌組織での発現解析を行うために、Spink3lacZ/+マウスを作製し、このマウスに先の方法にて大腸癌を発癌させた。癌部の上皮にβ-Galactosidase活性を強く認め、Spink3の癌部での発現を確認した。1)大腸癌切除標本を用いて、SPINK1の免疫組織化学染色を行った。55%の患者でSPINK1が発現していた。なかでもSPINK1は分化型および、より進行度の高い症例で有意に高発現していた。2)次に大腸癌進展におけるSPINK1の機能を解析するために、SPINK1ゲノムDNAを改変した2KbのSPINK1 minigeneを作成した。大腸癌細胞株にこのSPINK1 minigeneを導入し、過剰発現させるとその細胞数は有意に増加した。さらに、マウスにてユビキタスに発現するCAGプロモーターを結合させた、トランスジェニックマウスを作製し、大腸癌の腫瘍発生について検討した。マウスにアゾキシメタンとデキストラン硫酸ナトリウムを併用し、炎症関連大腸癌を発癌させたところ有意に腫瘍個数と腫瘍体積が有意に増加した。3) SPINK1をターゲットとしたsmall interfering RNA (siRNA)を大腸癌細胞株に導入し、SPINK1を抑制すると、その細胞数は有意に減少した。またSPINK1のマウスホモログであるSpink3のヘテロマウスに同様の方法で大腸癌を発癌させると、野生型と比較し有意に腫瘍個数が減少することを昨年度までに報告している。以上より、SPINK1/Spink3は大腸癌細胞の増殖に寄与しており、大腸癌の進展に影響する可能性がある。

本年度は、上記マウスを用いた実験を行い、かつ大腸癌細胞株4株(Colo205, HCT116, HT29, SW620)について新たに再現性実験を行った。最終結果を、Molecular Cancer Research誌に発表した。Serine protease inhibitor, Kazal type 1 (SPINK1)は上皮増殖因子との構造上の類似点があり、細胞増殖活性を有するユニークなトリプシンインヒビターである。まずヒト大腸癌組織の55%でSPINK1が発現していることを確認した。次に大腸癌細胞株および遺伝子改変マウスを用いて、SPINK1の過剰発現系および抑制系モデルを作製し、大腸癌の増殖を検討した。その結果、SPINK1の発現に応じて、腫瘍の増殖が有意に変化した。以上より、SPINK1は大腸癌細胞の増殖に寄与しており、大腸癌の進展に影響することが示された。遺伝子改変マウスおよび細胞株を用いた実験を通して、実験計画書の仮説通りにSPINK1の発現変化による大腸癌の腫瘍増殖の差異が確認できた点。ヒトの臨床サンプルを用いてSPINK1の発現解析が行えた点。消化器外科1)シグナル解析:前述したようにSPINK1/Spink3の発現が大腸癌の増殖に寄与していることが示唆されているため、増殖に寄与するシグナルについて解析を進める。2)SPINK1に特異的に結合するタンパクの同定を目指し、質量分析計を用いて解析を進める。トランスジェニックマウスを作製し、発癌実験を行うことができた点。実験計画書の仮説通りにSPINK1過剰発現により大腸癌の腫瘍増殖が見られた点。研究代表者の平成26年度途中での施設異動に伴い、前所属の熊本大学消化器外科や熊本大学先導機構との連携、癌研究会内でのがん研究所との連携など、研究体制の再構築が必要となりました。このため、平成26年度の研究計画に遅れが生じ、未使用額が発生した。シグナル解析:前述したようにSpink3の発現が大腸癌の増殖に寄与していることが示唆されているため、JAK-STAT系シグナルを中心として、実験マウス数を増やし、さらなる検証を進める予定である。また、大腸癌細胞株を用いて、SPINK1 siRNAによる抑制系、SPINK1 minigeneによる過剰発現系を作製し、マウス同様に増殖シグナルにSPINK1が及ぼす影響についてウエスタンブロットにて検討する。大腸癌患者の切除標本を抗SPINK1抗体を用いて免疫染色を行い、その発現について臨床病理学的因子などと併せて検討する。切除標本は300例程度を目標とし、同サンプルの癌部・非癌部での発現パターンも検討する。SPINK1に特異的に結合するタンパクの同定を目指し、質量分析計を用いて解析を進めている。現在、大腸癌切除標本からの検体採取のシステムを確立、解析を行う体制が整いつつあります。平成26年度に行う予定であった研究・解析をがん研究所と提携し平成27年度に遂行する。消耗品等、比較的安価での購入を行えたため。また、医局内保管の試薬の使用が可能であったため。今年度の結果をふまえ、動物実験や免疫染色を行うため、各種試薬や消耗品購入費に充てる予定である。
配偶子卵管内移植法の研究

1.配偶子卵管内移植法(GIFT)の適応と臨床成績:S.6063.3の期間に185例の難治性不妊患者に234回のGIFTを行い、49例の妊娠が成立した。対患者妊娠率26.5%、対GIFT妊娠率20.9%であった。主な不妊原因別の適応による妊娠率は、対GIFT妊娠率で、(1)卵管内精子輸送障害30.0%(6/20)、(2)術後卵管内性不妊(卵子pick up障害)24.1%(27/112)、(3)子宮内膜症20.0%(10/50)、(4)男性不妊12.2%(5/41)、(5)原因不明不妊9.1%(1/11)であった。2.受精能力異常を伴う男性不妊に対する臨床成績の検討:透明帯除去ハムスター卵子を用いたヒト精子貫通試験(XSPT)で精子受精能力異常(ZSPT30%以下)を伴う男性不妊の自然妊娠率は22.6%(77/340)にすぎず、体外受精治療(in vitro)では受精しなかった。GIFT(in vivo)により12.2%(対GIFT妊娠率)が妊娠し、低率ではあるが有効な治療法と考えられた。3.不妊における卵子pick up障害の頻度の検討:卵管形成術の成績は、(1)microsureryで妊娠率37.6%(S61.12までの成績、89/237)、(2)腹腔鏡下卵管形成術で妊娠率38.5%(同上、198/514)であった。卵管形成術後不妊の原因は卵子pick up障害と考えられ、これを対象にGIFTを行うと24.1%に妊娠が成立した。4.卵管内精子輸送障害に対する検討:AIH腹腔鏡による腹水中精子回収試験1124例(S58.1062.9)の分析では、207例(18.4%)に卵管内精子輸送障害が存在し、その予後は不良で明らかに難治性不妊原因と考えられた。これを対象にGIFTを行うと30.0%が妊娠した。5.まとめ:GIFTは卵管内精子輸送障害や卵子pick up障害(卵管形成術後不妊)に対して有効であった。GIFT不成功例では、不妊原因として卵管内受精障害か着床障害が考えられ、GIFT治療は診断的価値が認められた。1.総合成績:82例の難治性不妊患者に対して(S61.1S62.2)、計106回の配偶子卵管内移植(GIFT)を施行し、23例が妊娠した。卵管内に注入した成熟卵子数は平均2.5(16)であった。(1)対患者妊娠率は28.1%(23/82)、対周期妊娠率は21.8%(23/106)であった。(2)原発性不妊(28.4%)と続発性不妊(26.7%)の間には妊娠率に差はなかった。

(3)GIFT施行別による妊娠成立は、1回目で31.2%(19/61)、2回目で16.7%(3/18)、3回目で33.3%(1/3)であった。2.適応別成績:(1)卵管内精子輸送障害の妊娠率が最もよく、対患者妊娠率50%(5/10)、対周期妊娠率41.7%(5/12)であった。(2)卵管形成術後では、それぞれ41.7%(10/24)、30.3%(10/30)、(3)子宮内膜症では、17.9%(5/28)、14.7%(5/34)、(4)男性不妊では、17.7%(3/17)、12.5%(3/24)、(5)fimbriaovaricaの延長では、0%(0/3)であった。3.妊娠の予後:妊娠23例のうち17例が正常生児を出産した。流産は5例(21.7%)、双胎妊娠が4例(14.7%)に認められた。子宮外妊娠はmicrosurgery卵管形成術後の患者に1例(4.3%)発生した。4.考察:原因不明不妊の新しい治療法として開発されたGIFTは、卵管内輸送障害に対しても極めて有効であった。また卵管形成術後の卵子pick up障害の不妊患者や、精子受精能力障害を伴う男性不妊に対して有効であった。GIFTは体外受精胚移植(IVF-ET)に比べ、生理的で、かつ簡便な方法であり、社会的、心理的にもより受入れやすい治療法である。今後はさらに、GIFT無効不妊症例に対する有効な治療法の開発が必要となろう。1.配偶子卵管内移植法(GIFT)の適応と臨床成績:S6062.9の期間に177例の難治性不妊患者に221回のGIFTを行い, 44例の妊娠が成立した.対患者妊娠率24.9%,対GIFT妊娠率19.9%であった.主な不妊原因別の適応よりみた妊娠率は,対GIFT妊娠率で, (1)卵管内精子輸送障害30.0%(6/20),(2)術後卵管性不妊(卵個pick up傷害)23.6%(25/106), (3)子宮内膜症19.6%(9/46), (4)男性不妊10.3%(4/39),(5)原因不明不妊0%(0/10)であった.2.受精能力異常を伴う男性不妊に対する臨床成績の検討:透明帯除去ハムスター卵子を用いたヒト精子貫通試験(ZSPT)による精子受精能力が, ZSPT30%以下ではin vitrowでは受精が起こらないが, in rivo(GIFT)では妊娠が成立したが,その妊娠率は10.3%と低いものであった.3.不妊における卵子pick up傷害の頻度の検討:卵管形成術の成績は, microsurgeryで妊娠率35.8%(S86.6までの成績, 72/201),腹膣鏡下卵管形成術で妊娠率36.8%(S61.6までの成績, 160/435)であった.術後不妊は卵子のpickup障害と考えられ,これを対象にGIFTを行うと23.6%に妊娠が成立した.4.精子卵管内輸送障害に対する検討:AIH-腹膣鏡検査600例(S59.1S61.3)の分析では, 116例(19.3%)に卵管内精子輸送障害が存在し,その内容は73例(12.2%)が卵管内精子運動停止で, 43例(7.2%)が精子通過障害であった.その予後から不妊の難治性原因と考えられた.これを適応としてGIFTを行うと30.0%が妊娠した. 5.今年までのまとめ:GIFTは精子の卵管内輸送障害や卵管巣による卵子pick up障害(卵管形成術後)に対して有効であった. GIFT不成功例では,不妊原因として卵管内受精障害か着床障害が考えられ, GIFT治療における診断的価値が今後検討課題といえよう.1.配偶子の卵管内移植法(GIFT)の適応と臨床成績:S60S63.3の期間に、通算185例の難治性不妊患者に234回のGIFTを行い、49例の妊娠が成立した。対患者妊娠率26.5%、対GIFT妊娠率20.9%であった。主な不妊原因別の適応による妊娠率(対GIFT妊娠率)は、(1)卵管内精子輸送障害30.0%(6/20)、(2)術後卵管性不妊(卵子pick up障害)24.1%(27/112)、(3)子宮内膜症20.0%(10/50)、(4)男性不妊12.2%(5/41)、(5)原因不明不妊9.1%(1/11)であった。
絵画修復と絵画制作に使用される膠の物性に関する基礎的研究

日本画の制作や修復においては、古くから膠が顔料の固着剤として使用されてきており、特に牛皮を原材料とする三千膠が多く用いられてきた。修復の対象となる絵画は、掛け軸、屏風、板絵等様々な形態をしており、また損傷状況も様々である。そのような絵画の形態や損傷状況によって剥落止め材料に求められる性質は異なってくる。膠の種類や増粘剤の混合による物性の違いを把握し、絵画形態や損傷状態、使用状況に応じた使い分けについて言及することを目的として研究を行った。収拾した膠の水分、灰分、油脂分、不溶解分の測定および膠水溶液の粘度、融点、凝固点、pHの測定を、昨年度に引き続きJIS規格6503に定められている手法に基づいて行った。各膠に対して、膠の接着力・柔軟性の評価をするために、万能試験機(オートグラフ)を用いた圧縮強度試験、3点曲げ試験、さらに付着性(クロスカット)試験の物性試験を行い、JIS規格による膠の化学組成分析結果と物性試験結果の関連性について考察を行った。また、膠の使用感等の官能試験を行うために、紙本絵画を想定して作成したサンプルを用いて、各膠の接着力や水への再溶解性、柔軟性などについて試験を行った。今後絹本絵画や板絵等を想定した絵画サンプルを作成し、同様の試験を行う予定である。さらに、絵画書籍の修復を行っている修復工房の協力を得て修復作業の現場を拝見させていただき、膠の使用状況についての知見を得た。平成24年度は、日本国内で製造されている膠を収集するとともに、絵画書籍の修復を行っている修復工房および画家の協力を得て、絵画修復と制作の現場で使用されている膠についての情報収集を行った。膠の収集については、過去に収集した古い膠(製造業者が廃業し現在は製造されていない膠、修復技術者と画家がストックとして所有していた3050年前の膠)に加え、現在流通している膠のほとんどを入手した。一般的な牛皮由来の膠に加え、鹿皮由来の膠、海外産のウサギ膠も収集した。これらの膠は、絵画修復や制作の現場で現在用いられている又は今後の使用が検討されているものである絵画の修復および制作の現場での調査を通じて、各種膠の使用感や使用方法の詳細についての情報提供を受けた。修復技術者や画家らは、これまで使用してきた三千本膠、粒膠(共に牛皮由来)の製造元の廃業や製造縮小に伴い、新規の製造元の膠の使用テストを行っており、接着力や水への再溶解性の点で各膠の間で相違があるという話であった。また、収集した膠について、JIS規格K6503に定められている手法で化学的組成、水分、灰分、油脂分、不溶解分、の測定を行った。同様にして膠水溶液の粘度、融点、凝固点、pHの測定も行った。粘度や凝固点の値と、修復技術者と画家の感じる塗りやすさや水への再溶解性の程度の間に関連があると推測される。これらの関係性を明らかにすることで、膠の使用状況に応じたより的確な使い分けに言及することができ、絵画修復と制作の現場に役立つものと考えれられる。本年度は、膠の使用感等の官能試験を行うために紙本・絹本絵画を想定して作成した絵具塗布試料を作成し、各膠の接着力や水および有機溶剤への再溶解性、柔軟性について試験を行った。特に、タンパク質を溶解する有機溶剤であるアセトニトリルを用いて、膠を加熱せずに溶解させるための試験を行った。膠に与える水:アセトニトリルの混合比を変えることによって、膠の状態を膨潤から溶解まで調整できることがわかった。同時に、付着性試験(クロスカット法)と測色試験を行いアセトニトリルの使用による膠の接着力変化や顔料の色変化が少ないことを確認した。また、絵画書籍の修復を行っている修復工房の協力を得て修復作業の現場を拝見させていただくとともに、アセトニトリルを修復作業において使用することの可能性と有用性について協議を行った。日本国内で製造されている膠を収集するとともに、絵画書籍の修復を行っている修復工房の協力を得て、修復現場で使用されている膠についての情報収集を行った。工房では、これまで使用してきた三千本膠、粒膠(共に牛皮由来)の製造元の廃業や縮小に伴い、新規の製造元の膠の使用テストを行っており、各種膠の使用感や使用方法の詳細についての情報提供を受けた。また、収集した膠の使用感等の官能試験を行うために、紙本絵画を想定して作成したサンプルを用いて、各膠の接着力や水への再溶解性、柔軟性などについて試験を行った。アセトニトリルによる膠の再溶解は、絵画の修復作業において有効であることが確認できた。しかし、アセトニトリル処置後の試料を湿熱劣化させてから接着力試験を行ったところ、アセトニトリル処置の有無によって膠の接着力にわずかではあるが差が認められた。

より長期の劣化処置を行ったうえで接着力の変化を検証する必要があることから、当初予定していた試験を年度内に完結することができなかった。絵画修復長期劣化をさせた試料に対して、クロスカット試験およびプルオフ試験による接着力評価を行う。また、研究期間の最終年度にあたるため、これまでの研究成果のまとめを行う。平成25年度に予定していた実験作業のうち、絹本絵画や板絵等を想定した絵画サンプルの作成が行えず、膠の接着力や水への再溶解性、柔軟性などについての試験が行えなかった。その他の調査、実験作業についてはほぼ予定通り行うことができた。平成24年度に予定していた調査、実験作業をほぼすべて行うことができた。絵画修復と制作における現在の膠の使用状況について把握することができた。また、収集した膠について分析を行い、化学的組成や物性の基本的なデータを得ることができた。これまでの実験の結果から、接着力評価試験を行う前に試料を長期間劣化させる処置が必要となり、本年度予定していた試験を次年度に行うこととしたため次年度使用額が生じた。平成25年度に行うことができなかった絹本絵画や板絵の絵画サンプル作成を、修理技術者、絵画制作者の協力を得て早期に作成し、膠の接着力や水への再溶解性、柔軟性などの試験を行う。また、各試験を行ったそれぞれの絵画サンプルについて、光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡を用いて、試験箇所での膠の剥離状態、溶解状態等について表面観察、断面観察を行う。これまでに行った、化学組成試験、物性試験、絵画サンプルを用いた官能試験の結果をまとめ、絵画修復、絵画制作に膠を使用する際の使い分けの基準について考察を行う。平成25年度は、紙本、絹本、板絵などの絵具サンプルを作製し、接着力や水への再溶解性、膠が乾燥して塗膜となった後の収縮度合、柔軟性などについて試験を行う予定である。また、前年度に行った膠の使用方法等に関する調査や化学分析の結果なども合わせて検討を行う予定である。サンプルを用いた物性試験の場合、いかに実際の使用状況と整合性があるかということが重要であると考えられるため、絵具サンプル作成や試験実施に際しては、修復技術者や画家の協力を得て行う。接着力評価試験の試料作製、プルオフ試験用の機器使用料等に使用する。実験作業の遅れによって、平成25年度に予定していた絹本絵画や板絵等を想定した絵画サンプルの作成を行うことができなかった。そのため、絵画サンプル作成のための材料費や役務費用に繰り越しが生じた。平成25年度に行うことができなかった絹本絵画や板絵の絵画サンプルを、修理技術者、絵画制作者の協力を得て早期に作成し、膠の接着力や水への再溶解性、柔軟性などの試験を行う。絵具サンプル作成用の材料費として約300,000円の使用を予定している。サンプルを用いた官能試験を行うための実験消耗品として約100,000円の使用を予定している。絵画の修復作業における膠の使用事例調査のために関西方面への出張を3回程度予定している。