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高等真核生物の染色体安定化を司る新規ＲＮＡ干渉複合体ＤＲＨ－３・Ｅ１の機能研究

本研究では、研究代表者が初めて見いだした、線虫の染色体動態制御と生殖細胞形成に必須なダイサー関連ヘリカーゼDRH-3、およびDRH-3と相互作用する新規Tudorドメインタンパク質E1の分子機能解明を目指した。両遺伝子の変異体作成(計10種類)を行い、野生型と各種変異型のHisおよびGSTタグ融合タンパク質を調製し、生化学的解析を進めた。精製タンパク質を用いたプルダウン法により、野生型DRH-3とE1が結合することを初めて実証した。さらに遺伝学的解析により、DRH-3とE1が同じ経路で機能することを、細胞生物学的解析により、DRH-3とE1が細胞核内に局在する可能性をそれぞれ示した。高等真核生物におけるRNA干渉による染色体動態制御機構の解明を目指して、独自に発見した線虫ヘリカーゼ様タンパク質DRH-3、およびDRH-3と相互作用することが示唆されたE1タンパク質等に関して、本年度に実施した研究内容と結果を以下に示す。DRH-3とE1タンパク質等の生化学的解析:DRH-3タンパク質を用いてATPaseアッセイ系に関する条件検討を行った。生化学的解析および機能ドメイン解析のための5種類の変異型drh-3遺伝子(C1007A/C1010A, G802E, G840D, T834M, Ndel 370-1119)を作製した。3種類のポリヒスチジンタグ融合変異型DRH-3タンパク質(G802E, T834M, G840D)を大腸菌にて発現させてアフィニティ精製を試みたが、野生型DRH-3より可溶性画分の回収量は大きく低下した。E1タンパク質についてはGSTタグおよびポリヒスチジンタグとも融合タンパク質として精製を行い、メチル化ヒストンとの結合実験のための基礎的な条件検討を行った。また今年度新たにDRHの機能比較のため、DRH-3パラログ(DRH-1)のタンパク質発現を試みたが、発現した殆どのポリヒスチジンタグ融合DRH-1は不溶化した。DRH-3とE1との相互作用部位の解析:プルダウンアッセイによりDRH-3とE1タンパク質間の相互作用を詳細に解析するため、大腸菌発現系による欠失変異型タンパク質の調製を行った。E1タンパク質について、2種類のポリヒスチジンタグ融合Tudorドメイン欠失型タンパク質の作製、発現、精製を行ったが、不溶化のため回収困難であった。野生型タンパク質同士についてはプルダウン法で相互作用を検証している。E1遺伝子機能抑制の表現型解析:E1遺伝子機能抑制に必要なfeeding RNAi用コンストラクトを構築した。本研究では、申請者が独自に発見した高等真核生物(線虫)の染色体動態制御に関与する新規RNAi因子、DRH-3とE1の分子機能解明を目指している。昨年度より、両タンパク質の解析に重点を絞って研究を進めてきた。本年度実施した研究内容と結果を以下に示す。DRH-3等の調製と生化学的解析:生化学的解析に使用するnativeなDRH-3を調製するため、精製タンパク質からタグを除去するためのTEVプロテアーゼ切断部位を組み込んだDRH-3タンパク質発現コンストラクトを作製し、タンパク質の調製を行った。野生型DRH-3については調製できることが示されたが、昨年度、発現タンパク質の不溶化問題が判明した変異型DRH-3タンパク質については、新たにGSTタグ融合タンパク質発現コンストラクトの作製と精製の検討を進めた。これら3種類の点変異型DRH-3はRNAi機能異常を指標に単離された線虫変異体に由来しており、野生型タンパク質と比較することで、DRH-3の分子機能解明に重要と考えている。また昨年度より線虫のDicer Related Helicase (DRH)の分子機能を比較解析するため、DRH-3パラログであるDRH-1タンパク質の調製を試みているが、DRH-3とは異なり、ポリヒスチジンタグおよびGSTタグともに発現した融合DRH-1は不溶化した。E1の調製およびDRH-3との相互作用解析:相互作用解明のためのプルダウンアッセイや生化学的解析に必要な二種類(ポリヒスチジン、GST)のタグ融合野生型E1タンパク質を調製した。昨年度、不溶化で調製できかなった2種類のポリヒスチジンタグ融合Tudorドメイン欠失型タンパク質も、今年度、発現に使用する大腸菌株を変更することで精製に成功した。野生型E1とDRH-3については、プルダウンアッセイにて相互作用を確認した。変異型E1を用いて、DRH-3との相互作用、およびメチル化ヒストンとの結合におけるTudorドメインの必要性についても検討を進めた。

高等真核生物におけるRNA干渉を介した染色体動態制御機構の解明を目指して、独自に発見した線虫ヘリカーゼ様タンパク質DRH-3、およびDRH-3と相互作用することを見いだしたE1タンパク質に関して、本年度は下記の研究を実施し、結果を得た。1.DRH-3とE1タンパク質の発現・精製と生化学的性状解析:両タンパク質の大腸菌発現系を構築し、発現と精製条件の検討を行った。共にポリヒスチジンタグ融合タンパク質として発現し、アフィニティ精製することが可能であることを実証した。2.DRH-3・E1複合体と相互作用するタンパク質の探索と同定:酵母two-hybrid解析による線虫RNA干渉因子間の相互作用解析を進めた。またプルダウンアッセイに用いる(DRH-3, E1以外の)被験タンパク質を調製するために、大腸菌発現コンストラクトの作成と発現条件の検討を実施した。完全長cDNAが得られていない3遺伝子(dcr-1, rrf-3, ego-1)については、RT-PCRによる欠損cDNAの回収を進め、ego-1についてはほぼ全長のcDNAを増幅することができた。3.DRH-3とE1タンパク質の変異体作成および細胞内局在解析:DRH-3について、欠失およびアラニン置換変異型遺伝子の作成を開始し、これまでに2種類のアラニン置換変異型遺伝子を構築した。E1についても、相互作用ドメインの解析に必要な欠失遺伝子の作成を進めている。ヒト培養細胞におけるGFP融合E1タンパク質の発現を実施した結果、核付近に凝集したシグナルが観察された。DRH-3とE1タンパク質の生化学的解析についてはアッセイ系の検討をほぼ完了し、3種類の変異型DRH-3タンパク質および2種類の欠失変異型E1タンパク質の発現・精製実験を予定通り実施した。さらにDRH-3との機能比較のため、新規にDRH-3パラログ(DRH-1)についても発現・精製を行った。DRH-3とE1との相互作用部位の解析についてはプルダウンアッセイ系を確立し、野生型タンパク質同士の相互作用については検証を進めている。作製した2種類のドメイン欠失変異型E1タンパク質は不溶化のため精製が困難であったため、E1タンパク質の相互作用ドメインの解析までには至らなかった。E1機能抑制表現型の解析に必要な発現コンストラクト調製を完了した。以上のとおり、発現タンパク質の不溶化など予期せぬ問題が生じた部分はあるが、DRH-1への新たな研究展開も追加し、本年度研究計画に記載した内容についてはほぼ計画通りに実施されている。1.DRH-3とE1タンパク質の調製については、計画通り大腸菌発現系を用いた両タンパク質の発現・調製に成功した。2.変異型遺伝子の作成については、drh-3, E1遺伝子とも欠失変異遺伝子の作成が順調に進んでおり、またアラニン置換型drh-3遺伝子も2種類構築を完了している。3.タンパク質間相互作用解析についても、未解析の線虫RNA干渉関連遺伝子の酵母two-hybrid解析を進めながら、完全長cDNAクローニングを進めた(5 kbを超える3遺伝子については未達成)。4.細胞内でのGFP融合E1タンパク質の発現解析についても実施し、結果を得ている。以上、本年度研究計画に記載した内容と照らし合わせると、いずれについてもほぼ計画通りに実施されているため。
陽電荷を帯びた大環状チオエーテル遷移金属錯体

trans-M(CO)_2((syn-Me_8[16]aneS_4)(M=Mo,W)と過剰のMeOTfとの反応で3級スルホニウムイオンを含むクラウンチオエーテル錯体trans-{M(CO)_2(syn-Me_9[16]aneS_4)}OTf(1a,M=Mo;1b,M=W)を合成した。1aはX線構造解析を行い、Mo-s結合距離の比較から3級スルホニウムイオンが強いpi酸であることを確認した。一方等モルのHOTfによるプロトン化で生成する2級スルホニウムイオンはさらに強いpi酸性を示し、反応は脱カルボニルを伴って進行しtrans-{M(CO)(OTf)(syn-Me_8H[16]aneS_4)}OTf(2a,M=Mo;2b,M=W)を与える。これらモノカルボニル錯体は過剰のHOTfで中心金属がプロトン化され八配位ジヒドリド錯体{MH_2(CO)(OTf)(syn-Me_8H[16]aneS_4)}(OTf)_2(3a,M=Mo;3b,M=W)を生成する。両者の構造はx線解析により決定した。2つのヒドリドとCO配位子は環炭素に囲まれたcavityに存在し、3bでは2つのヒドリド配位子がSSC面上に配位したbicapped Oh構造をとるのに対して、3aでは一つのヒドリドはSSC面にcapし他方はC-S稜上に位置している。3級スルホニウムイオンをもつクラウンチオエーテルtrans-{M(CO)_2(syn-Me_9[16]aneS_4)}OTf(M=Mo,W)をHOTfでプロトン化すると脱カルボニルをともなってヒドリドカルボニル錯体trans-{M(CO)(syn-Me_9[16]aneS_4)}OTf(1,M=Mo;2,M=W)を生成する。ヒドリド配位子の存在はH^^1NMRおよびIRで確認した。興味あることに1のX線構造解析はヒドリドは末端ヒドリドではなく3級スルホニウムイオンの硫黄原子に架橋しMo-H-S^+3中心2電子結合を形成していることを示す(Mo-H1.48,H-S^+1.32Å)。Me_9[16]aneS_4が三座配位したfac-M(CO)_3(syn-Me_9[16]aneS_4)(M=Mo,W)をMeOTfと反応するとfac-{M(CO)_3(syn-Me_9[16]aneS_4)}OTf(3,M=Mo;4,M=W)が得られる。これら錯体のIR,H^^1NMRスペクトルは3級スルホニウムイオンが配位に関与していないことを示す。また溶液中ではMo錯体はC_1,W錯体はC_S対称をとる。
名詞句の左端部における言語事象に関する研究

名詞句の左端に関わる言語事象を研究対象として、生成文法理論を理論的枠組みとして、文と名詞句の並行性を明らかにするとともに、両者の違いに対して理論的な説明を与えた。英語を中心としながらも、比較統語論の観点からゲルマン・ロマンス諸語を広く調査し、英語名詞句の左端に関わる言語事象を浮き彫りにした。90年代における名詞句研究を最新の理論において見直したという意義を持つ。本研究は、名詞句の左端部における言語事象について、英語を主たる対象とし、ゲルマン・ロマンス諸語と比較しながら、比較統語論により研究を行うものである。名詞句の左端に関わる言語事象を詳細に調査し、EPP素性のパラメータ化、名詞句の左端部における機能範疇の種類・性質等を主な切り口としながら、文と名詞句の並行性を明らかにする事が本研究の目的である。以下、25年度の研究実績の概要について記述する。本年度は、データの収集・分析と並行して、EPP素性のパラメータ化と言語間の相違における役割、DPの左端部の機能範疇の性質と言語間の差異及び名詞句の左端部と文の左端部の共通点からのデータの検討を中心とした、24年度の作業を継続した。その一方で、研究内容を発展・補完した。25年8月にはロンドン大学に出張し、ロンドン大学中央図書館・言語学科図書館を利用し、資料収集をおこなうと共に、研究協力者であるAd Neeleman教授(ロンドン大学)と数回に亘って面会し、本研究課題について議論を重ね、助言を得た。またHans van de Koot博士(同)とも一度面会し、意見交換を行った。本研究は、名詞句の左端部における言語事象について、英語を主たる対象とし、ゲルマン・ロマンス諸語と比較しながら、比較統語論の枠組みにより研究を行うものである。名詞句の左端に関わる様々な言語事象を詳細に調査し、EPP、素性のパラメータ化、名詞句の左端部における機能範疇の種類・性質等を主たる切り口としながら、文と名詞句との並行性を理論的に明らかにする事が本研究の目的である。以下、24年度の研究実績の概要について記述する。名詞句の統語研究について、先行研究を広く収集した。所属研究機関では得られない資料については、ロンドン大学中央図書館を利用した。オリジナルな成果を挙げるために、データの収集を精力的に行った。データは先行研究からも収集し、それらのデータを分析・利用すると共に、インターネット及びコーパスを活用し、より大規模にオリジナルなデータを収集した。更に、電子メール等を活用して、対象とする言語のネイティブスピーカーへの調査を複数回に亘って行った。収集したデータ・先行研究を分析し、考察を加え、詳細に検討したが、自らのこれまでの研究成果を発展させる形で研究を進めた。受動化など、名詞句内における移動現象が手がかりとなるが、80年代・90年代の膨大な研究成果の蓄積を生かしながら研究を行った。分離CP構造を踏まえつつ、DP左端部のより精緻な構造を検討し、話題化等、文の左端部に見られる現象が名詞句内にも存在する言語とそうでない言語とを区別・説明することを試みた。研究計画を円滑に遂行するため、2012年8月に研究協力者であるAd Neeleman教授(ロンドン大学)と数回に亘って面会し、またHans van de Koot博士(同)とも一度面会した上で、意見・助言を得ながら研究を進めた。成果については、その一部を学会発表で発表すると共に、学会誌(海外)への投稿を行った。26年度は、EPP素性のパラメータ化と言語間の相違における役割、DPの左端部の機能範疇の性質と言語間の差異及び名詞句の左端部と文の左端部の共通点の3つの観点から、収集したデータ・先行研究を昨年度に引き続いて分析し、考察を加え、詳細に検討した。初年度及び2年目の計画を継続すると共に、研究内容を発展・補完した。国内の研究者との学会での交流や、海外の研究協力者とのメールを通した意見交換等を通じ、2年目に続いて、フィードバックを得ながら研究を取りまとめる作業を進めた。対象とする言語は英語を中心としながらも、比較統語論の観点からゲルマン・ロマンス諸語を広く調査し、英語名詞句の左端に関わる言語事象を浮き彫りにするという成果が得られた。本研究はミニマリズム以前の生成文法理論研究、とりわけ8090年代のGB理論時代の遺産に光を当て、ミニマリズム理論において見直すものである。最終年度である26年度においては、これらの成果を論文としてまとめ、公刊する準備を進めた。

英語学25年度の研究の進捗状況を、交付申請書に記述した「研究目的」に照らし合わせると、ほとんどの項目について、当初の計画通り進展していると言える。同時に、計画以上に進展しているとも言い難い。よって、研究目的に対する達成度を「おおむね順調に進展している」と判断した。24年度の研究の進捗状況を、交付申請書に記述した「研究目的」に照らし合わせると、ほとんどの項目について、当初の計画通り進展していると言える。今後も、平成25年度の作業を継続する一方、研究内容を発展・補完することを目指す。名詞句の統語研究及び関連する理論について、出版される研究書・論文には引き続き注意を払い、これらを収集する。データは先行研究からも収集するが、引き続きインターネット上のコーパスを利用することによって、オリジナルなデータを収集することに努める。収集したデータ・先行研究を分析し、考察を加え、詳細に検討する。平成25年度の研究結果を基に、名詞句と文がそれぞれの左端部において持つ構造において、どの程度共通性があるのかを検討する。学会・研究会等での研究発表・論文発表を通じ、研究成果を公にし、平成25年度に引き続いて、フィードバックを得ながら研究を取りまとめる。取りまとめた研究成果は、論文として国内外のジャーナル・学会誌等に投稿・公表する。平成25年度に引き続き、研究計画を円滑に遂行するため、研究協力者であるAd Neeleman教授(ロンドン大学)を初め、積極的に国内外の研究者の意見・助言を得ながら研究を進めてゆく。今後も、平成24年度の作業を継続する一方、研究内容を発展・補完することを目指す。平成24年度の研究結果を基に、名詞句と文がそれぞれの左端部において持つ構造において、どの程度共通性があるのかを検討する。学会・研究会等での研究発表・論文発表を通じ、研究成果を公にし、平成24年度に引き続いて、フィードバックを得ながら研究を取りまとめる。取りまとめた研究成果は、平成26年度中に論文として国内外のジャーナル・学会誌等に投稿・公表する。平成24年度に引き続き、研究計画を円滑に遂行するため、研究協力者であるAd Neeleman教授(ロンドン大学)を初め、積極的に国内外の研究者の意見・助言を得ながら研究を進めてゆく。海外出張の際、予想外の円高により、航空賃を始め、旅費が当初の予定を下回った事が主な要因である。25年度も海外出張を計画中であるが、今回は急速に進む円安により、旅費が嵩むのは必至の情勢であるので、その上昇分等に充当する計画である。
赤外外部反射法による長鎖n-アルカン表面近傍の分子構造と相転移挙動に関する研究

長鎖n-アルカンのような棒状分子からなるバルク表面に特徴的な相転移挙動を分子構造レベルで明らかにするため、炭素数17のn-アルカン(n-C_<17>H_<36>)の純液体の冷却に伴う赤外反射スペクトル変化を入射角、偏光を変えながら測定し、その詳細な解析を行った。その結果、分子構造に関する情報が整理され、表層での新たな相転移挙動が明らかになった。これまで報告されてきた表面固化現象やバルク固化と比較検討し、共通点と相違点を物理化学的に考察した結果をまとめ、論文として報告する準備がほぼ整った。以下に、これらの具体的な内容を列挙する。(1)炭素数17のn-アルカンの純液体の冷却に伴う赤外反射スペクトル変化を入射角1080°で、s偏光とp偏光の場合について測定した。(2)クラマース・クローニヒの変換式およびローレンツの振動子モデルを一般化された光学の式に適用し、赤外光を反射する液体試料物質(n-C_<17>H_<36>)の表面近傍の光学定数を計算した。(3)得られる光学定数のうち赤外光の吸収の強さを示す値について、温度変化をプロットした。幾つかの特定の振動数における吸収強度の変化を、比較し解析した。その結果、表面に対する分子の向きに関する情報を得た。(4)表層付近の冷却にともなう分子配向変化を、これまで報告されている現象と比較・検討し、新たな冷却にともなう分子構造変化のモデル構築を行った。(5)反射スペクトルの入射角・偏光依存性から異方性のある層の情報を分離・抽出した。その際、この層の厚さの予測と官能基ごとに配向の計算を行い、上記モデルの検証を行った。本研究では、まず、長鎖n-alkaneのひとつn-heptadecane(n-C_<17>H_<36>)液体について、28.1±0.2°Cにおける中赤外領域の光学定数をFT-IRによる赤外外部反射法で求めた。その際、角度可変の反射ユニットを用い、入射角と偏光を変えながら反射率を測定した。反射率を補正する係数を新たに設定することで複素屈折率の値が計算できた。さらに、24.7±0.2°C、23.8±0.2°Cの各温度で測定された赤外外部反射スペクトルを、三層系モデルとローレンツの振動子モデルおよびフレネルの式を用いて解析した。その結果、凝固点付近で表層に異方性のある構造を見出し、その構造の光学定数も求めた。次に、このn-C_<17>H_<36>からなる液体の凝固点(T_f:22°C)付近における表層の構造を同じ赤外外部反射法で温度を変化させながら調べた。気-液界面付近にあるn-C_<17>H_<36>分子が液体から固体に移り変わる際の構造変化の詳細を、反射スペクトルの温度依存性から調べることができた。その結果、従来報告されている表面固化のおこる温度(T_k:24°C)以外に、高温の25°Cと26°Cで不連続な変化が見出された。26°Cでまずゴーシュ形が減少しトランス形に移る。このときメチル基の対称軸は表面に対して傾く。次に25°Cで分子軸は表面に対して立つ方向で配向変化する。このとき炭素骨格からなる分子平面は表面に対して傾く。次に24°Cでは、メチル基の対称軸は表面に対して傾き、分子軸は表面に対してより立ち始める。こうした表層での分子配向変化を、24.7±0.2°C、23.8±0.2°Cの各温度における表面の異方的な構造の光学定数と併せてより詳細に解析した。
生体内のHIV-1複製を制御するエピジェネティックネットワークの解明

ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)感染症の根治に向けて、医学的・生物学的に有意義な知見を得るためには、ヒト検体や動物モデルによる解析が必要不可欠である。しかし、HIV-1はヒト特異的なウイルスであり、モデル動物を用いた解析を行うことができない。また、HIV-1感染細胞に特異的な細胞表面マーカーが発見されておらず、ヒト検体からHIV-1感染細胞のみを単離し、解析することも困難であった。そこで、本研究では、ヒト造血能を持ち、HIV-1の感染病態を再現できるヒト化マウスに、GFP遺伝子を挿入したHIV-1を感染させることで、純粋なHIV-1感染細胞を単離し、オミクス解析によりその性状を解析する。
グルタミン酸トランスポーター賦活化遺伝子の網羅的探索と神経保護メカニズムの解明

これまでに我々は、培養Muller細胞にグルタミン酸を負荷した場合の遺伝子発現の変化をマイクロアレイで網羅的に探索し、その結果として複数の遺伝子発現が上昇することを見出した。このうちインターロイキン-1b(IL-1b)およびtumor necrosis factor a(TNFa)の蛋白発現量は虚血網膜のMuller細胞において有意に上昇していた。さらにその後の細胞レベルでの検討からIL-1bおよびTNFaの両者が、GLASTおよびGLT-1によるMuller細胞へのグルタミン酸取りこみ量を増大させることを突き止めた。本年度はIL-1bおよびTNFaからグルタミン酸トランスポーターへの作用機序の検討を行った。その後GLASTおよびGLT-1欠損マウスから作製した培養Muller細胞を用いて、両者の標的となる分子と各々の貢献度を検討した。また、培養Muller細胞へIL-1bを投与するとCaspase-11,TNFaなどのmRNAが増加することを確認した。Caspase-11はCaspase-1を切断することによってIL-1bの分泌を促すことが知られていることから、IL-1bが自らの作用を増強するためのautocrine loopの存在が考えられる。またIL-1bによるTNFaの増加は、やはり更なるグルタミン酸トランスポーターの活性化に結びつく可能性があることから、IL-1b投与がMuller細胞におけるIL-1bおよびTNFaの産生・分泌に与える影響をウェスタンブロットおよび細胞外液を用いたELISA法を用いて定量化し、GLAST活性化に至るメカニズムの詳細を細胞レベルでさらに検討した。以上の結果を学術論文の原著としてまとめ、国際的に評価の高い分子生物学研究雑誌であるMolecular and Cellular Biologyに掲載された。このうちインターロイキン-1β(IL-1β)およびtumor necrosis factorα(TNFα)の蛋白発現量は虚血網膜のMuller細胞において有意に上昇していた。さらにその後の細胞レベルでの検討からIL-1βおよびTNFαの両者が、GLASTおよびGLT-1によるMuller細胞へのグルタミン酸取りこみ量を増大させることを突き止めた。本年度はIL-1βおよびTNFαからグルタミン酸トランスポーターへの作用機序の検討を行った。また、培養Muller細胞へIL-1βを投与するとCaspase-11,TNFαなどのmRNAが増加することを確認した。Caspase-11はCaspase-1を切断することによってIL-1βの分泌を促すことが知られていることから、IL-1βが自らの作用を増強するためのautocrille loopの存在が考えられる。またIL-1βによるTNFαの増加は、やはり更なるグルタミン酸トランスポーターの活性化に結びつく可能性があることから、IL-1β投与がMuller細胞におけるIL-1βおよびTNFαの産生・分泌に与える影響をウェスタンブロットおよび細胞外液を用いたEHSA法を用いて定量化し、GLAST活性化に至るメカニズムの詳細を細胞レベルでさらに検討した。
完全時系列患者データベースの構造に関する研究

平成8年度から大阪大学医学部保健学科3年次生を対象に開講される医療情報学および医療情報学演習においては、その教育目標を「社会医療情報システムおよび病院情報システムの開発を通じて、システム構築の方法を教授する。」とした。ここで、開発するシステムは、その基本となるデータベースの構造として、従来の病院情報システムと異なり、患者個人のデータを一塊としてあつかう個人データベースを採用することとし、その基本設計をおこなった。さらに、その個人データベースの応用範囲をひろげ、病院情報だけでなく、個人が生まれてから死ぬまでの健康管理をふくめた完全時系列個人データベースとし、これをパーソナル・ヘルス・データベース(PHDB)と名づけた。このデータベースの特徴は、追記のみおこなう完全時系列で、個人が受けた医療・健康管理の行為を記録するものである。このために、まず、医療・健康管理の行為となる動詞および行為を行う主体者の調査・整理からおこなった。さらに、その行為(動詞)のもつパラメータを整理した。医療行為そのものは進歩するものであり、医療言語およびその用法は追加されていくものであるが、医療言語としての文法および語用辞典の骨格ができた。次の段階として、このデータ構造と現在使用されている病院情報システムのデータ構造をリンクさせ、病院情報システムと完全時系列データの共存をはかる予定である。そのために平成8年度の医療情報学演習の課題として、垂直分散型の病院情報システムを構築するために、病院のそれぞれの部局のシステム構築を行う予定である。」とした。
構造適応型Ｄｅｅｐ　Ｌｅａｒｎｉｎｇによるビックデータ予測システムの開発

本研究では,学習中に隠れニューロン数及び隠れ層数を自動で増減する構造適応型深層学習法を開発した。平成29年度では,構造適応型深層学習法の基本的な学習アルゴリズムを構築し,具体的には,1時系列データの予測を実現するリカレント構造適応型学習方法を開発し,2深層学習に蓄積された知識をIF-THENルールとして抽出し,3ベンチマークテストや少数の実データを用いた評価を行った。平成30年度では,これまでに開発したシステムをベンチマークテストだけでなく,様々な種類のビックデータに適用し,手法の検証・改良を行った。具体的には,4単なる画像の分類だけでなく,画像の中の特定の部位の検出する物体検出アルゴリズムの開発を行った。深層学習では,R-CNN,YOLO,SSD等,畳み込みニューラルネットワークに基づく物体検出法が知られている。これらの物体検出法の考えを応用し,構造適応型学習法における新しい物体検出法を開発した。また,5開発した知識獲得手法において,深層学習における階層構造を考慮した上で知識を抽出することで,精度の改善を行った。さらに,6これらの手法を実世界に存在する様々なビックデータに適用し,手法の検証を行った。検証データとして胸部X線画像ベンチマークセットChestX-ray8(CXR8)や実際の検査機関から収集された医療検診データ等を用いた。4の物体検出手法は,CXR8に与えられている疾病(異常)箇所を既存の手法よりも高い精度で検出できた。また,医療検診データに対して5の手法を適用したところ,血液検査の異常と癌の進行に関する知識を発見できた。得られた知識の一部は,実際の診療所やクリニックのホームページ等で報告されているケースと一致するものもあった。今後は,開発した構造適応型学習法を様々な実データに適用し,実用化に関する研究を進めるとともに,性能の改善を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに学習中に隠れニューロン数及び隠れ層数を自動で増減する構造適応型深層学習法を開発した。開発した手法は画像ベンチマークテストに対し高い分類精度を示している。近年では画像分類だけでなく計測データや動画などの時系列ビッグデータの予測モデルの構築が求められている。また,高い分類精度を示す学習済みのネットワークに蓄積された重みやパラメタ等の情報から,推論や予測に用いる知識の抽出・可視化が必要である。このために,1時系列データの予測を実現するリカレント構造適応型学習方法を開発し,2深層学習に蓄積された知識をIF-THENルールとして抽出する。獲得した知識をGPUを持たない計算機においても活用することで学習後の深層学習の適用範囲を拡張し,3IoTによるビッグデータ分析として計測や医療の面での実用化を図る。1では,時系列データの予測を行うために,リカレントニューラルネットワークの考えに基づき構造適応型深層学習の改良を行った。開発した手法をいくつかの時系列のベンチマークテストに適用したところ,既存の手法に比べて高い予測精度を示した。さらに,学習係数を学習中に適応的に変更することで,予測精度の改善を行った。2では,1の手法で学習したネットワークからの知識獲得を行った。一般的に,学習済みネットワークの内部構造はブラックボックスと言われているが,ネットワークの内部構造や頻出度の高い入出力パタンを求め,推論に関するIF-THENルールを抽出した。抽出したルールを用いて推論を行ったところ,学習済みモデルを用いる場合に比べて予測精度はわずかに下がるものの,その計算時間を大幅に短縮することができ,タブレット端末等の安価なハードウェアでも動作した。さらに,実データとして別途共同研究により収集された工場計測データと医療検診データを用いて,1,2で開発した手法の検証を行い,逐次分析するための基盤を構築した。平成29年度では,1,2の基本的な学習アルゴリズムの開発・改良を行い,ベンチマークテストを用いた評価を行った。また,別途共同研究により収集されたビッグデータを用いた検証を行った。平成29年度当初の目標は,全て達成することができ,概ね計画通りに進んでいる。ベンチマークテストに対する分類精度も,既存の手法より高い値を示している。特に,1で開発した手法は,学会賞を受賞し,ジャーナル論文に採択されるなど,外部からも高い評価を受けている。3のビッグデータの分析では,クラウドサーバ上でIoT機器から逐次収集されたデータを自動で学習し,タブレット端末やPC等で表示する仕組みと,医療マルチモーダルデータを高速に学習する仕組みについて,2件の特許出願を行った(特許出願に係る費用は,本研究費ではなく,県立広島大学の費用を使用)。一方で,開発した手法を用いて実データを継続的に収集し,分析することについてはまだ実施しておらず,平成30年度において行う予定である。なお,研究計画時点では,上記2の知識獲得において,Distillation(蒸留)技術を用いて学習したネットワークの簡略化を行い,Neatと呼ばれる進化計算手法を用いて知識抽出を行うことを考えていたが,これらの手法を用いなかった。その理由として,Distillationによりネットワークを簡略化することで,獲得した知識の精度が著しく下がる場合があったからである。これに伴い,Neat手法も使用しなかった。そのため,計画を変更し,ネットワークの内部構造と入出力パタンの頻度に基づいて,IF-THENルールで表現される知識獲得を行った。開発した手法に変更はあったものの,得られた知識は安価なタブレット端末等でも高い精度で高速に動作するもので,期待していた成果が得られた。そのため,研究計画全体の遅延はないものと考えられる。

本研究では,学習中に隠れニューロン数及び隠れ層数を自動で増減する構造適応型深層学習法を開発した。平成29年度では,構造適応型深層学習法の基本的な学習アルゴリズムを構築し,具体的には,1時系列データの予測を実現するリカレント構造適応型学習方法を開発し,2深層学習に蓄積された知識をIF-THENルールとして抽出し,3ベンチマークテストや少数の実データを用いた評価を行った。平成30年度では,これまでに開発したシステムをベンチマークテストだけでなく,様々な種類のビックデータに適用し,手法の検証・改良を行った。具体的には,4単なる画像の分類だけでなく,画像の中の特定の部位の検出する物体検出アルゴリズムの開発を行った。深層学習では,R-CNN,YOLO,SSD等,畳み込みニューラルネットワークに基づく物体検出法が知られている。これらの物体検出法の考えを応用し,構造適応型学習法における新しい物体検出法を開発した。また,5開発した知識獲得手法において,深層学習における階層構造を考慮した上で知識を抽出することで,精度の改善を行った。さらに,6これらの手法を実世界に存在する様々なビックデータに適用し,手法の検証を行った。検証データとして胸部X線画像ベンチマークセットChestX-ray8(CXR8)や実際の検査機関から収集された医療検診データ等を用いた。4の物体検出手法は,CXR8に与えられている疾病(異常)箇所を既存の手法よりも高い精度で検出できた。また,医療検診データに対して5の手法を適用したところ,血液検査の異常と癌の進行に関する知識を発見できた。得られた知識の一部は,実際の診療所やクリニックのホームページ等で報告されているケースと一致するものもあった。今後は,開発した構造適応型学習法を様々な実データに適用し,実用化に関する研究を進めるとともに,性能の改善を行う。平成29年度では,基本的な学習アルゴリズムの開発・改良を行い,実データを分析するためのシステムの基盤を構築した。平成30年度では,開発したシステムをもとに,より大規模で様々な種類のビッグデータを用いた検証を行う予定である。ここでは,別途共同研究により収集された工場計測データや医療検診データを扱う予定である。各データの種類や特徴に応じて,分析手法を調整しながら,手法の改良を行う。また,1で開発した手法では,画像の分類および時系列データの予測が可能であるが,画像の中の特定の部位を検出するアルゴリズムを開発する。例えば,医療画像であれば,画像における腫瘍位置の特定である。ここでは,胸部X線画像のベンチマークCXR8を用いた評価を行うことを検討している。CXR8には,胸部X線画像に対する症状ラベルだけでなく,症状が生じている箇所の位置が記録されている。
知的営為としての(異)文化研究に関する研究

本研究は(異)文化を研究するという営為の近代性を解明することをその主要な目的としている。これを解明するためには、近代性の理解が必須である。この点に鑑み、平成15年度は、まず近代性の特徴として、直線的時間意識を手がかりに、工業化、都市化(職住分離)、個人主義のかかわりから考察し、論文発表を行った(「近代と時間:その文化性と歴史性」、Human Communication Studies,32,45-68,2004)。この時間意識と並んで近代を特徴付けるものとしての空間意識の観点とこれと密接に関わる「物事(文化を含めて)、つまり対象・客体、を正確に観察する(そして、記述する)」という研究者(観察主体)の認識形式(客観的認知)が歴史的にどのように形成されてきたのかを、とりわけ、視覚中心主義に焦点を当てて文献調査を行い、学会発表(日本コミュニケーション学会年次大会、(於)拓殖大学)を行い、それに基づいて論文発表(「近代の認識形式としての視覚優位性:視覚と空間・主体/客体・知・表象を中心として」経営と経済、84(4)、109-138、2005)を行った。視覚中心主義という近代の認識形式は遠近法の展開と密接に関わっており、遠近法を主体(観察者)と客体(観察対象)の明確な分離と構築、均質な空間認識、科学主義(客観主義)、人間中心主義と関連付け、ハイデガーの『世界像の時代』を参照しながら考察した。これらの研究に加えて、文化再生産、とりわけ、広義の教育との関連から文献考察を行い、合わせて関連学会に出席した(異文化間教育学会、日本社会学会)。特に、文化再生産における教育(学校-隠れたカリキュラム-やしつけ)の役割の観点から考察を行った。本年度は、異文化を研究するという営為と密接にかかわりのある、「物事(文化を含めて)を正確に観察する(そして、記述する)」という研究者(観察主体)の認知形式(客観的認知)が歴史的にどのように形成されてきたのかを中心に文献調査を行った。この正確に観察するという認知形式は遠近法の展開と密接に関わっており、主体(観察者)と客体(観察対象)の明確な分離、視覚の優位性、均質な空間認知、均質な時間認知、数量化などを特徴とする。こうした認知形式は近代とそれ以前の時代(そこでの認知形式は主体と客体が未分化で、両者が密接に情緒的に結びついている)を明確に分かち、近年のグローバル化に伴い、広く受容されている。とりわけ、本年度はこの近代の認知様式を視覚の優位性と直線的時間意識の観点から考察した。その成果の一つとして、近代性と直線的時間意識の関わりを論文にした(Human Communication Studies,32に掲載予定)。来年度は、このような世界認知形式と近代性についてのより全般的考察を論文にまとめ、来年度中に学会で発表し、学会誌に投稿する予定である。この文献調査に加えて、いくつかの関連する学会やシンポジウム、研究会に参加し、実際に研究者が(異)文化をどのように語り、表象するかについて観察・考察する機会を持った。特に刺激を受けたのは、異文化間教育学会特定課題研究である『異文化間教育と「日本人性」』であった。本研究の問題意識は、ある民族(文化集団)を均質な主体として、あるいは自明なものとして分析単位とする研究者の認知形式やそれを基にした研究・教育実践のあり方から生じたものであり、内なる他者の問題や米国のホワイトネス研究の成果を知ることができ、本研究に大きな示唆を与えた。来年度は、近代の認知形式とそれによって生産される知と権力の問題、さらにその再生産について、考察を進めていく予定である。
燃料電池用アニオン導電性高分子電解質膜を用いた革新的電気化学キャパシタの創製

本研究では、電気二重層キャパシタ(EDLC)に燃料電池用アニオン(OHー)導電性高分子電解質膜を応用し、その革新的全固体型EDLCの実現可能性を実証していく。本学で開発した世界トップクラスの性能を有するアニオン導電性高分子電解質膜を用いてEDLCを構築し、そのセル性能(容量、レート特性、サイクル寿命など)を評価するとともに、さらなる最適な電解質/電極界面構造や高分子構造を設計し、実証していく。また、アニオン導電性高分子電解質膜を酸化マンガン系電極と活性炭電極を組み合わせたハイブリッド(非対称)キャパシタにも応用し、新規全固体型2V超級ハイブリッドキャパシタの実現可能性も検証する。
古人骨のミトコンドリアDNA分析に基づく弥生人とその社会

北部九州の縄文から弥生への移行問題に関し、その資料欠落期における渡来系、土着系両者の人口動態を集団遺伝学的な手法を用いて分析した。その結果、北部九州では少数の渡来人が人口を急増させたとする仮説の合理性が裏付けられ、当地の考古学的な見解とも矛盾せずにこの間の推移が説明できることが明らかとなった。これによって、従来のような大量渡来を想定する必然性の無いこと、及び、弥生農耕社会への変革は、土着縄文人ではなく、やはり渡来人集団に帰すべきだとの考えが支持された。・北部九州に所在する多くの遺跡群の中で、その規模、出土遺構、遺物の内容等において吉野ケ里遺跡に匹敵するとされる福岡県筑紫野市隈・西小田遺跡の出土人骨を主な研究対象として、形態、ミトコンドリアDNA、及びそれらに考古学的な情報を加味して古人口学的な分析を実施した。形態的には従来から指摘されている「渡来系弥生人」的な特徴が非常に際だった集団であることが確認され、同時にそれらのミトコンドリアDNA配列が明らかにされた。これによって現代日本人の成立に重要な役割を果たしたとされる、いわゆる「渡来系弥生人」の形態とミトコンドリア遺伝子との関係が初めて明らかとなった。また、わが国ではほとんど類例のない古人口学的な詳細な分析が加えられ、当時の弥生人社会の平均寿命や出生・死亡状況、及び人口動態についての新知見が得られた。・福岡県筑紫野市、隈・西小田遺跡出土の弥生人骨、47個体の歯からミトコンドリアDNAを抽出し、Dループ領域の約200塩基を配列決定した。その結果、新たに12タイプの変異体が検出された。引き続き、30体余りの残りの弥生人資料についての分析を続行中である。・上記のDNA分析に供した人骨資料を中心に、計測、及び観察による形態学的なデータ採集を行った。今後も歯を含めたデータ採取作業を続行し、各個体間の形態に基づく類縁関係の分析を行う予定である。・これまでに得られたミトコンドリアDNAの分析結果に基づき、理論集団遺伝学的な方法(Kreitman & Hudson,1991)によって母集団の人口サイズの推算を行った。その結果、およそ30006000人規模の遺伝子集団が浮かび上がった。一方、甕棺墓の数に基づく隈・西小田弥生人集団の人口規模の推定を行ったところ、およそ200400人程度との結果が得られた。遺伝子分析による結果は、婚姻関係を結んだ近隣集団を含めた数と見なされるので、現在、当該地域から実際に検出されている遺跡の分布状況を検討して、当時の通婚圏の描出を試みているところである。・上記の分析に平行して、人口学的な手法による初期弥生社会の成立過程に関する論考「北部九州の縄文弥生移行期に関する人類学的考察」をまとめ、「Anthropological Science」の106巻(1998)に掲載される予定になっている。以上の分析は、いずれも従来の我が国の人類学研究においては未開拓の分野であり、引き続き来年度も、手法の改良、考案を試みながら、日本人の成立に重要な役割を果たしたとされる北部九州弥生人とその社会の考察に取り組む予定である。・昨年に引き続き、福岡県筑紫野市隈・西小田遺跡出土の弥生人骨の未分析資料36個体の歯からミトコンドリアDNAを抽出し、Dループ領域の約200塩基を配列決定した。その結果、新たに9タイプの変異体が検出された。今年度はさらに、同じ筑紫野市の近世墓から出土した江戸時代人骨(原田遺跡)51体について、同様の塩基配列決定作業を実施し、弥生人骨との比較分析に取りかかっている。現在までのところ、両時代の集団には、予想した以上の違いがあることが明らかとなっている。・上記のDNA分析に供した人骨資料、今年度は特に江戸時代人骨を中心に計測、及び観察による形態学的なデータ採集を行った。

さらに弥生人骨と江戸時代人骨の間に見られる形態変化と、上記のミトコンドリアDNA遺伝子の違いを比較して、遺伝子-形態間の変化の様相と相関を明らかにすべく、分析を始めている。・昨年度に引き続き、新たに加えられた弥生人骨のミトコンドリアDNAの分析結果に基づいて理論集団遺伝学的な方法(Kreitman & Hudson,1991)による母集団人口サイズの推算を行った。昨年度の結果と大きな隔たりは無かったが、同集団で明らかな人口増加現象をどの様に計算処理するか、その理論的な改良作業に取りかかっている。・一方、今年度は、考古学者の協力を得て、同地方、同時代の遺跡分布に関する情報をあつめ、平行して土器などに見られる地域交流の実態に関する分析を進めた。昨年の分析で明らかになったように、DNAから推測される隈・西小田弥生人集団の人口規模は、考古学情報に基づく試算よりもはるかに大きく、その差は婚姻、移住などによる当時の交流を反映したものと解釈されるので、両手法による数値の比較精度を上げていくことにより、弥生社会における通婚圏などが浮かび上がってくるものと期待される。・人口学的な手法による初期弥生社会の成立過程に関する論考「北部九州の縄文弥生移行期に関する人類学的考察」が、「Anthropological Science」106巻(1998)に掲載され、2回の考古学関係のシンポジウムで口演を求められるなど、一定の評価を得た。・昨年度までに、福岡県筑紫野市隈・西小田遺跡出土の弥生人骨のミトコンドリアDNA分析は終了しているので、今年度はその延長として、同じ筑紫野市の近世墓から出土した江戸時代人骨(原田遺跡)51体、及び、少数ながら古墳人骨6体について、弥生人と同様にDループ領域の約200塩基を配列決定した。その結果、弥生・近世両時代の集団には、当初予想していた以上の相違が明らかとなったため、それが単なる突然変異による時代変化としていいのかどうか、現在、その違いの要因を、考古、民俗資料なども参考に検討を加えているところである。また、同時に形態学上の比較結果も行い、これについては、従来から明らかになっていた程度の時代差が確認された。この、形態とDNA分析の結果を総合して、本研究のテーマの一つである両者の相関の程度を分析しているところであるが、これまで、世界的にみても、同じ地方の2000年間にわたるDNA塩基配列の変化を明らかにした研究はないため比較データが無く、また、上記のように、DNA配列の変化要因の解釈について、住人の移住、流入などによる可能性を考慮する必要がり、まだ明確な結論にいたっていない。出来るだけ早い時点で解釈をまとめ、学会誌に発表する予定である。・古人口学的な分析については、一応の結論をえたので、現在、雑誌論文としてまとめているところである。
炎症性サイトカインとmicroRNAは軟部腫瘍の診断・予後因子となりうるか？

軟部腫瘍において予後や診断に関連を示したものは血清IL-6であった.IL-17は,良性および悪性で感度よりも上昇している検体はなかった.またヘプシジンなども正常であった.IL-6は悪性軟部腫瘍で有意に上昇しており、Logistic回帰分析ではIL-6値の上昇は悪性であるOdd比が1.17(p=0.004)であり悪性の診断に有意なマーカーであった.また悪性軟部腫瘍患者59例における血清IL-6は単変量でHazard Risk(95%信頼区間)1.005 (1.002-1.008),多変量解析でもHR(95%CI)1.003 (1.000-1.006)で有意に生命予後に関連していた.炎症性サイトカイン,microRNAは癌の発生・進行に密接に関係していると考えられている.本研究の目的は,軟部腫瘍における炎症性サイトカインとmicroRNAの解析により,良悪性の診断が可能か,炎症性サイトカインの起源はどこか,これらの因子により生命予後予測が可能かどうかを明らかにすることである.具体的な研究項目は軟部腫瘍における1)患者血清中の炎症性サイトカインの測定,2)腫瘍組織における炎症性サイトカインの免疫組織学的解析,3)炎症性サイトカインと軟部腫瘍診断、予後との関連性,4)炎症性サイトカインと特異的microRNAの発現との関連性についてである。現在1)および3)を進めている。血清中のIL-6は軟部肉腫症例(n=56)にて高悪性度腫瘍であるほど有意に高値であり、IL-6とCRPの上昇は強い相関を認めた。またIL-6が高値である症例は有意に血中ヘモグロビン濃度が低値であることも判明した。好中球を遊走する働きがあるといわれているIL-17を測定したが、現時点では(n=20ほど)、明らかな血清中での濃度上昇は軟部肉腫症例では認めておらず、局所(腫瘍周囲)のみでの作用であることも予想され、今後2)である免疫組織学的解析へと進める予定である。現在集積中のIL-6やIL-17などが生命予後に影響する可能性についても、症例の経過観察期間をもう少し見届けたのちに解析予定である。現在IL-17測定の症例蓄積をしている段階であり、その後4)microRNAとの関連についても研究をすすめていく。IL-6の解析結果については本年の後半に学会で報告予定である。血清中サイトカイン濃度の測定に関して、一時濃度調整が困難であったため時間を要した。ただおおむね予定どうり研究はすすんでいると考えており、さらに研究テーマにそって実施していく。軟部肉腫症例の血清より、ELISA法を用いて各種インターロイキンなどの計測を行い、腫瘍学的背景や予後などとの関連性を解析した。当初Interleukin-17がプレ炎症性サイトカインとして注目して計測を行ったが、わずか5%以下の症例でのみ上昇を認めるだけにとどまっており、おそらく腫瘍組織周囲での局所的な反応であることが推測された。また炎症時に反応性に上昇するhepcidinにより貧血をもたらすことが知られているが、実際に計測を行うと、かなり症例でばらつきがあることがわかった。また軟部肉腫症例では明らかな貧血に陥っている症例が少なく、消化器がんなどとは異なる傾向であった。Interleukin-6が今回の研究では明らかに腫瘍学的背景および予後に関連していた。良悪性軟部腫瘍症例では明らかに軟部肉腫症例で良性軟部腫瘍よりも高値でありROC解析では6.5pg/mlが悪性と診断する閾値であった。また軟部肉腫症例のみでの解析ではInterleukin-6は組織学的悪性度やC-reactive protein(CRP)などと相関を認めており、高値の症例では明らかに低値の症例と比較して予後が不良であった。また腫瘍組織を免疫組織学的染色手法を用いて評価したが、Interleukin-6は血清所見とは明らかな相関を認めなかった。原因としては、a)局所の環境と全身性の炎症反応は少し乖離がある可能性がある(過去の論文でも述べられている)b)Interleukin-6の分子量が小さいため過小評価されている、などが考えられた。また現在今回の結果によりInterleukin-6に関連したmicroRNAであるMiR-Xと軟部腫瘍との関連性を解析中である。今後MiR-Xと血清中のInterleukin-6の関連性および良悪性の診断、軟部肉腫の予後との関連について明らかにしていく予定である。軟部腫瘍において予後や診断に関連を示したものは血清IL-6であった.IL-17は,良性および悪性で感度よりも上昇している検体はなかった.またヘプシジンなども正常であった.IL-6は悪性軟部腫瘍で有意に上昇しており、Logistic回帰分析ではIL-6値の上昇は悪性であるOdd比が1.17(p=0.004)であり悪性の診断に有意なマーカーであった.また悪性軟部腫瘍患者59例における血清IL-6は単変量でHazard Risk(95%信頼区間)1.005 (1.002-1.008),多変量解析でもHR(95%CI)1.003 (1.000-1.006)で有意に生命予後に関連していた.

現在血清hepcidinやIL-17などの測定を行っている段階でn=50を目標としている(現在n=20)。前半中には十分達成可能であり、免疫組織学的解析も同時並行で行っていく。これらの解析を行ったうえで、軟部肉腫と関連性のあるサイトカインについて、その背景で上昇しているmicroRNAを網羅的に解析していく予定である。整形外科
大腸癌患者糞便中癌関連遺伝子の検討

大腸腫瘍患者の糞便と腫瘍組織からMutant-Allele-Specific Amplification(MASA)を用いてK-ras遺伝子の点突然変異を解析した。[対象]腫瘍径10mm以上の大腸腺腫患者10例(男性8例、女性2例、平均年齢62.7歳)、大腸癌患者40例(男性22例、女性18例、平均年齢62.2歳)、正常対照者10例(男性5例、女性5例、平均年齢51歳)[方法]1)糞便からのDNAの調整:-80°Cで凍結保存した大腸癌患者の糞便50mgをSDS、proteinaseK処理後、phenol/chroloform法で抽出し、界面活性剤CTABで処理、DNAを抽出した。2)腫瘍組織からのDNAの調整;切除標本のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから病変部の10μm切片を作成し、phenol/chroloform法でDNAを抽出した。3)PCR:polymerase-chain reaction(PCR)法を用いて、K-ras codon 12におけるpoint-mutationの有無をMutant-Allele-Specific Amplification(MASA)法で確認した。まず、codon 12を中ほどにした遺伝子断片を増幅することを目的として作成したprimerを用いてPCRを行い、次にcodon 12のpoint-mutationが存在する部位にアニールする様作成したprimerを用いてPCRを行い、エチジウムブロマイドを含む3%アガロースゲルで電気泳動し、増幅された切片のbandを観察した。[成績]大腸癌患者の25%(10/40)、大腸腺腫の30%(3/10)で糞便中に変異が検出された。腫瘍組織に変異を認めた症例における糞便中変異検出率は、大腸癌で71.4%(10/14)、大腸腺腫で100%(3/3)であった。検出率を占拠部位、腫瘍径別にみると、有意差は認めないが遠位大腸の癌、小さな癌で低かった。[結語〕糞便中における癌関連遺伝子異常の解析は、大腸癌診断の一検査法となる可能性が示唆された。大腸腫瘍患者の糞便と腫瘍組織からMutant-Allele-Specific Amplification (MASA)を用いてK-ras遺伝子点突然変異を解析した。[対象]腫瘍径10mm以上の大腸腺腫患者10例(男性8例、女性2例、平均年齢62.7歳)大腸癌患者40例(男性22例、女性18例、平均年齢62.2歳)、正常対象者10例(男性5例、女性5例、平均年齢51歳)[方法]1)糞便からのDNAの調整:-80°Cで凍結保存した大腸癌患者の糞便50mgをSDS、proteinaseK処理後、phenol/chroloformで抽出し、界面活性剤CTABにて処理、DNAを抽出した。2)腫瘍組織からのDNAの調整:切除標本のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから病変部の10μm切片を作製し、phenol/chroloform法にてDNAを抽出した。3)PCR: polymerase-chain reaction (PCR)法を用いて、K-ras遺伝子codon 12におけるpoint-mutationの有無をMutant-Allele-Specific Amplification (MASA)法にて確認した。