hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
流体及び電磁流体力学に現れる境界値問題の数学的構造の解明

今後,この知見を基に,外部領域上のHodge分解定理の提出とその外部領域上のNavier-Stokes方程式への応用等の研究に行っていく予定である.これらの研究は,小園英雄氏(早大),清水扇丈氏(京大),Matthias Hieber氏,Anton Seyfert氏(Darmstadt工科大学)との共同研究による.2.昨年度得たMHD方程式の非斉次境界条件下での定常解の存在と安定性に関する結果において,透磁率は零と出来ることを確認した.しかし,粘性係数あるいは磁気抵抗係数を零にした場合における明確な結果を得ることは出来なかった.3.流体力学における特異摂動極限問題に関する奈良女子大学PDEセミナーを平成30年2月7日に行い,新たな知見を得た.流体及び電磁流体力学に現れる幾つかの境界値問題を対象に,次の3点の数学的連関を明らかにすることを目指して研究を進めた:(i)方程式の非線型構造,(ii)境界条件の設定,(iii)領域の幾何構造.具体的な研究成果は以下の通りである.(1)非斉次境界条件下の定常MHD方程式の境界値問題に対して,その弱解の存在と安定性を示した.(2)3次元外部領域上のr乗可積分な調和ベクトル場全体のなす空間の,領域位相不変量による特徴づけを与えた.この結果は,外部領域上のHodge分解定理を構築する際の基礎となると考える.引き続き定常MHD方程式の境界値問題の考察を進めるが、本年度のSecchi教授との議論により「自由境界問題」の重要性を再認識したので、トカマクをモデルとしたMHD方程式に対する自由境界問題の研究も行っていく。MHD方程式の定常解の存在と安定性に関する結果を、至急論文としてまとめ公表する.また、考察が遅れている物理パラメータが一部退化している場合の定常MHD方程式の解の存在に関する考察を進める.その為に、昨年度殆ど参加することが出来なかった国内や海外の研究集会に積極的に参加し、最新の研究成果の把握に努める.また、国内及び海外の研究者との共同研究を推進する.非線型解析学当初、Paolo Secchi教授の他にもう1名の研究者を海外から招聘する予定だったが、日程調整がつかず本年度の執行ができなかった為。学内委員等の職務遂行の為、当初予定していた国内・海外出張が殆ど出来なかったこと、および招聘する予定だった講師の方との日程調整が出来ずにセミナー・研究集会が開催できなかったことが主な理由である.平成28年度中には、上記の海外研究者を招聘できるように調整していく。本年度は、昨年度は断らざるを得なかった講演依頼を積極的に引き受け、海外や国内の研究集会に参加する予定である.また、海外の若手研究者の本学への招聘も計画している.
良食味米飯を得るための米の収穫適期に関する研究

良食味の米飯を得るための米の収穫適期を明らかにする目的で,米飯の"甘味"と"うま味"の観点から,従来提唱されてる収穫適期(出穂日から約40日後)よりも収穫時期を10日間早めた早刈り米(供試米,島根県産コシヒカリ)の米飯特性(官能特性,テクスチャー特性,呈味成分含量)を,いわゆる適期に収穫した米の米飯と比較することにより,米の早刈りが米飯の食味に与える影響について検討を行った.はじめに官能検査を実施したところ,早刈り米の米飯は,いわゆる適期に収穫した米の米飯よりも,甘味,うま味および総合評価において,特に高い評価を受けた.早刈り米で米飯の甘味が増加したのは,浸漬および炊飯過程において,米の内在性糖質分解酵素の作用によってでんぷんからグルコースやマルトースのほかに,マルトトリオース,マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖類が多量に生成されたためであることが明らかとなった.また,早刈り米の米飯でうま味が増加したのは,早刈り米の米飯には,いわゆる適期に収穫した米の米飯よりも,うま味物質の主体と考えられているL-グルタミン酸が,多く含まれるためであることも明らかとなった.これらの実験結果を総合して,従来提唱されている収穫適期(出穂日から約40日後)よりも10日間程度米を早く収穫することにより,米飯に甘味とうま味が増して,食味が向上すると結論した.従来,米の収種時期は,主として外観の観点から決定されてきた.しかしながら,遅刈り米は収量が増しても食味が劣るなど,米の収穫時期が米飯の品質に種々の影響をあたえていることも示唆されていた.そこで,本研究では,いわゆる収穫適期(出穂後約40日)に収穫した米と,適期よりも10日間早く収穫した米(早刈り米)について,それらの米飯特性を官能評価および器機分析などから総合的に解析することにより,食味の優れた米飯を得るための米の収穫時期について検討を行うことを目的とした.いわゆる収穫適期より10日間収穫を早めた早刈り米の米飯は,適期に収穫した米の米飯よりも軟らかくて粘りがあり,米飯のテクスチャー特性が良好であった.また,早刈り米の米飯は,浸漬または炊飯過程で内在性糖質分解酵素(α-アミラーゼなど)の作用により,でんぷんからグルコース,マルトースおよびマルトトリオースを主体とするマルトオリゴ糖類が生成されるため,いわゆる適期に収穫した米の米飯よりも甘味が増して,食味が向上した.さらに,早刈り米米飯には,米飯の旨味成分の本体であるL-グルタミン酸も多く含まれていた.一方,早刈り米米飯では,前述のオリゴ糖類の増加により,保存中の米飯の糊化度およびテクスチャーの低下が遅延し,保存性が向上した.これらの結果を総合して,呈味性が高い良食味米飯を得るための収穫適期は,いわゆる収穫適期よりも10日間程度早い時期であることが明らかとなった.良食味の米飯を得るための米の収穫適期を明らかにする目的で,米飯の"甘味"と"うま味"の観点から,従来提唱されてる収穫適期(出穂日から約40日後)よりも収穫時期を10日間早めた早刈り米(供試米,島根県産コシヒカリ)の米飯特性(官能特性,テクスチャー特性,呈味成分含量)を,いわゆる適期に収穫した米の米飯と比較することにより,米の早刈りが米飯の食味に与える影響について検討を行った.はじめに官能検査を実施したところ,早刈り米の米飯は,いわゆる適期に収穫した米の米飯よりも,甘味,うま味および総合評価において,特に高い評価を受けた.早刈り米で米飯の甘味が増加したのは,浸漬および炊飯過程において,米の内在性糖質分解酵素の作用によってでんぷんからグルコースやマルトースのほかに,マルトトリオース,マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖類が多量に生成されたためであることが明らかとなった.また,早刈り米の米飯でうま味が増加したのは,早刈り米の米飯には,いわゆる適期に収穫した米の米飯よりも,うま味物質の主体と考えられているL-グルタミン酸が,多く含まれるためであることも明らかとなった.これらの実験結果を総合して,従来提唱されている収穫適期(出穂日から約40日後)よりも10日間程度米を早く収穫することにより,米飯に甘味とうま味が増して,食味が向上すると結論した.前年度の研究において,いわゆる収穫適期に収穫した米よりも,10日前早刈りした米の方が米飯食味が優れていることを明らかにした.本年度は,早刈りから遅刈りまで収穫時期を変えた2品種の米について,米飯食味の変化を明らかにするとともに,その変動要因について解明することを目的としてた.供試米には,広島県立大学の実験圃場で栽培されたコシヒカリと中生新千本を用いた.出穂後2849日間に3日間隔で収穫した8種類の供試米について,玄米の千粒重,白度,未熟粒,死米,着色粒,胴割粒および剛度,精白米の色,タンパク質量,タンパク質組成,アミロース量およびα-アミラーゼ活性を測定した.精白米を1.5倍加水で炊飯した米飯について,テクスチャー,糊化度および粘り物質と飯粒中の遊離糖量と遊離アミノ酸量を測定した.

その結果,コシヒカリでは,対照米(出穂後40日目に収穫)よりも6日および9日前早刈り米で米飯の粘りが増すとともに,粘り物質中にマルトオリゴ糖を含む遊離糖量が増加し,食味の向上が認められた.一方,遅刈り米は,対照米よりも粘り物質中の遊離糖量が減少し,食味の低下が認められた.これらの変動要因のひとつとして,α-アミラーゼ活性に影響をあたえるタンパク質の溶解性の差が示唆された.中生新千本の場合も、コシヒカリと概ね同様の結果となり、早刈り米で米飯中に遊離糖量の増加が確認された.以上の結果を総合して,米を収穫適期よりも10日間程度早く収穫することにより,米飯の食味を向上できることが明らかとなった.
手腕系振動症候群におけるストレス感受性の亢進とその成因に関する研究

本研究は手腕振動症候群患者におけるストレス感受性の亢進をもたらす要因と機序、その評価方法を明らかにすることを目的とした。冷水負荷試験に与える季節、食事要因に関する基礎的検討を行った。夏季は手指皮膚温が有意に高く、冬季は食後が有意に高い皮膚温を示した。冷水浸漬中、夏季ではLF/HFが食後で空腹時よりも高く、冬季ではLF、HFが高い傾向であった。一側手冷水浸漬試験における10°C10分法と15°C3分法を、手腕振動症候群患者と健常被験者で比較検討した。現在、夏季における手指皮膚温のデータのみが集計されている。10°C10分法では有意差が見られたのに対し、15°C3分法では有意差が認められなかった。手腕振動症候群患者と健常被験者を対象に、情動ストレス負荷による心拍変動、血漿中PF4、β-TG、cAMPの変化を検討した。心電図R-R間隔変動は負荷後にレイノー症状を有しない患者で有意に低い値を示し、レイノー症状を有する患者では負荷前の血漿中PF4が有意に高い値を示した。同様に、情動ストレス負荷試験における心拍変動、尿中カテコールアミンの変化を検討した。自発呼吸時と深呼吸負荷時とも、LF成分とLF/HF成分が手腕振動障害患者で有意に高いこと、尿中ノルエピネフリンおよびエピネフリンが特にレイノー症状を有する患者で情動ストレス負荷後に有意に高値を示すことが認められた。今回の研究から手腕振動障害患者では寒冷ストレス負荷のみならず情動ストレス負荷に対してもストレス感受性の亢進がみられることが確認された。本研究で検討された評価手法は増加するストレス関連疾患の予防研究に応用することができる。1実験系の整備:寒冷ストレス負荷、振動ストレス負荷、騒音ストレス負荷、心理的ストレス負荷のための実験系を整備した。2健常者を対象とした寒冷ストレス負荷基礎実験:健康な男性6名を対象に、冷水負荷試験中の自律神経機能変動の基礎実験を夏季および冬季に実施した。その結果、食事摂取は特異動的作用(SDA)と交感神経系緊張の亢進により、その自律神経影響が相殺されること、夏季と冬季では特に末梢循環機能に対する交感神経系影響が大きく異なることを明らかにした。3健常者および手腕系振動症候群患者を対象とした基礎実験:手腕系振動症候群患者20名および年齢をマッチさせた健康な男性被験者10名を対象に、情動ストレス負荷中の自律神経機能の変化を分析した。その結果、手腕系振動症候群患者では、情動ストレス負荷に対する自律神経系および副腎髄質系反応が亢進していることを確認した。4以上により、ストレス負荷反応に対する影響因子を基礎的に検討するとともに、手腕系振動症候群におけるストレス負荷に対する全身調節系反応測定の方法論を確立した。本研究は手腕振動症候群患者におけるストレス感受性の亢進をもたらす要因と機序、その評価方法を明らかにすることを目的としている。冷水負荷試験に与える季節、食事要因に関する基礎的検討結果の解析を行った。夏季は手指皮膚温が有意に高く、冬季は食後が有意に高い皮膚温を示したことは昨年度報告したが、心電図R-R間隔変動のFFT解析を行い、冷水浸漬中、夏季ではLF/HFが食後で空腹時よりも高く、冬季ではLF、HFが高い傾向である成績を得た。

手腕振動症候群患者と健常被験者を対象として、情動ストレス負荷による心拍変動、血漿中PF4、β-TG、cAMPの変化を検討した。心電図R-R間隔変動は負荷後にレイノー症状を有しない患者で有意に低い値を示し、レイノー症状を有する患者では負荷前の血漿中PF4が有意に高い値を示した。今回の研究から手腕振動障害患者では寒冷ストレス負荷のみならず情動ストレス負荷に対してもストレス感受性の亢進がみられることが確認された。
新生仔ラット脳内のエストロゲン受容体の一過性出現の解析

われわれは、新生仔ラットの顔面神経核および天脳皮質聴覚野にα型エストロゲン受容体(ER)が一過性に出現する現象を発見したが、この現象の持つ生物学的な意味付けについては殆ど解析が進んでいない。今回われわれは、胎生16日令から生後11日令の顔面神経核についてアポトーシスの出現をTUNEL法によって検索したが、陽性シグナルは殆ど検出できなかった。したがって、ERが一過性に出現するニューロンは早期に死滅する細胞ではないことが示唆された。ERニューロンの発生日令を検討する目的で、BrdU投与を行ったところ、妊娠11および12日令についてのみERとBrdUのシグナルの共存が見られた。したがって顔面神経核の運動ニューロンはおおよそ11-12日令に分裂・発生し、これらの内のいくつかにERが発現するものと考えられた。ER陽性ニューロンは生後14日令以降に殆ど検出されないことから、未熟な運動ニューロンにのみERが発現し、これらの運動ニューロンが成熟するとERが消滅するというわれわれの仮説が支持された。一方、大脳皮質聴覚野に見られるER陽性ニューロンと各種の神経ペプチドとの共存を検索したが、NPY、galanin、substance P、CCK8、VIPについてはERとの共存が見られなかった。これらのペプチドの多くはERが検出される第V層に線維の走行が見られたことから、間接的な影響がある可能性は否定できない。海馬におけるERの一過性出現が報告されているが、われわれの観察では十分な証拠は得られなかった。一方、電子顕微鏡観察により、海馬錐体ニューロンの細胞質内にもER陽性シグナルが検出されることから、細胞核外でのERを経由したエストロゲンの作用の可能性もある。エストロゲンが脳の分化に関与していることは知られている。エストロゲンの作用は転写調節因子であるエストロゲン受容体(ER)を介しているものと考えられている。また、脳内に発現したERはその場所で長期間にわたって観察されることが知られていた。ところが、林らは、大脳皮質聴覚野と顔面神経核内側亜核とに、α型ERが一過性に発現する事実を見いだした。このERは、大脳皮質においては出生後5日令頃に出現するが、顔面神経核ではすでに胎仔期から検出される。いずれの領域においても、ERシグナルは約10日令で消失を始め、,生後2週令では殆ど検出されない。顔面神経核についてはER含有細胞がコリンアセチルトランスフェラーゼと共存することから、コリン作動性の運動ニューロンであることを確認した。また、これらのニューロンの出現を日令を追って計測したところ、ER含有ニューロンは非含有ニューロンに比べて小型であった。この観察は、未熟な運動ニューロンのみにERシグナルが検出されることを示唆していた。この領域の運動ニューロンは後部耳介筋に投射することから、標的組織に投射をしていない未熟なニューロンにのみERが発現するという仮説を立てた。一方、大脳皮質聴覚野のER含有細胞は、グリア細胞のマーカーであるGFAPとは共存しないこと、第5層に局在する錐体細胞であること、細胞内カルシウム代謝に関与するタンパクであるカルレチニンとの高率の共存が見られたことから、同様にニューロンであると想定したが、この領域の錐体ニューロンが投射している領域に蛍光物質などの逆行性標識物質を与えても細胞体に取り込まれることが証明されなかった。これらのことから、大脳皮質に一過性に発現するER含有ニューロンの生理学的な意味は現時点では不明である。われわれは、新生仔ラットの顔面神経核および大脳皮質聴覚野にα型エストロゲン受容体(ER)が一過性に出現する現象を発見したが、この現象の持つ生物学的な意味付けについては殆ど解析が進んでいない。

今回われわれは、胎生16日令から生後11日令の顔面神経核についてアポトーシスの出現をTUNEL法によって検索したが、陽性シグナルは殆ど検出できなかった。したがって、ERが一過性に出現するニューロンは早期に死滅する細胞ではないことが示唆された。ERニューロンの発生日令を検討する目的で、BrdU投与を行ったところ、妊娠11および12日令についてのみERとBrdUのシグナルの共存が見られた。したがって顔面神経核の運動ニューロンはおおよそ11-12日令に分裂・発生すし、これらの内のいくつかにERが発現するものと考えられた。ER陽性ニューロンは生後14日令以降は殆ど検出されないことから、未熟な運動ニューロンにのみERが発現し、これらの運動ニューロンが成熟するとERが消滅するというわれわれの仮説が支持された。一方、大脳皮質聴覚野に見られるER陽性ニューロンと各種の神経ペプチドとの共存を検索したが、NPY、galanin、substance P、CCK8、VIPについてはERとの共存が見られなかった。これらのペプチドの多くはERが検出される第V層に線維の走行が見られたことから、間接的な影響がある可能性は否定できない。海馬におけるERの一過性出現が報告されているが、われわれの観察では十分な証拠は得られなかった。一方、電子顕微鏡観察により、海馬錐体ニューロンの細胞質内にもER陽性シグナルが検出されることから、細胞核外でのERを経由したエストロゲンの作用の可能性もある。
無機イオン結晶空間内の単分子ポリマーによる指向性イオン輸送

ポリオキソメタレート(POM)は表面電荷密度の低いアニオンでありカチオンの伝導を効率良くアシストできる.POMとアルカリ金属イオンを構成ブロックとする無機イオン結晶のチャネル内に酸性あるいは塩基性官能基を有するポリマーを単分子として導入し,組成ー構造ー機能の相関を明確にしたうえで,ポリマーのコンフォメーション/セグメント運動を活用したプロトン伝導を実現する.研究成果は,スーパーサイエンスハイスクール,化学グランプリ,国際化学オリンピック,大学前期教養課程・全学ゼミ,の活動を通じて社会に還元する.ポリオキソメタレート(POM)は表面電荷密度の低いアニオンでありカチオンの伝導を効率良くアシストできる.POMとアルカリ金属イオンを構成ブロックとする無機イオン結晶のチャネル内に酸性あるいは塩基性官能基を有するポリマーを単分子として導入し,組成ー構造ー機能の相関を明確にしたうえで,ポリマーのコンフォメーション/セグメント運動を活用したプロトン伝導を実現する.研究成果は,スーパーサイエンスハイスクール,化学グランプリ,国際化学オリンピック,大学前期教養課程・全学ゼミ,の活動を通じて社会に還元する.
両親媒性物質による細菌機械受容チャネルMscLの活性化機構の解明

大腸菌にはMscSとMscLと呼ばれる機械受容(MS:mechanosensitive)チャネルが発現している。低張刺激に晒されて菌体が膨張すると閾値の低いMscSから順に開口して水やイオンなどを放出することで細胞の破裂死を防いでいる。しかし、MSチャネルの機械刺激に対する活性化機構についての詳細は謎である。本研究の目的は、機械刺激およびMSチャネルのactivator(活性化剤)であるクロルプロマジン(CPZ)に対し、どのようにMscLが活性化されるのか、その分子機構を解明することである。平成29年度は、電気生理学的手法であるパッチクランプ法を用いて、CPZの投与による野生型MscLの機械刺激および両親媒性物質に対するMscLの活性化機構の解明に向けた基礎的研究を行った。その結果、MscLはCPZの作用により、時間依存性、濃度依存性および圧力依存性を示した。今後は、突然変異型MscLの作成、細胞膜発現の確認およびin vivoでの機械刺激感受性の評価を行う予定である。
代謝酵素の基質認識機構解明および医薬候補化合物の代謝予測システムへの応用

医薬品の薬物代謝に関与する酵素系は主にcytochrome P450 (CYP)スーパーファミリーであり,数種の重要なヒトCYP代謝酵素が存在する.本研究では,ヒトの主要なCYPによる多様な構造の化合物の代謝物をin silico予測できるシステムを構築することを目的とした.結果として,ドッキングシミュレーションより代謝物の構造が,水素原子の引き抜きエネルギー計算より生成する代謝物の生成比順序が予測され,代謝物予測システム構築が可能となった.医薬品の薬物代謝に関与する酵素系は主にcytochrome P450 (CYP)スーパーファミリーであり,数種の重要なヒトCYP代謝酵素が存在する.本研究では,ヒトの主要なCYPによる多様な構造の化合物の代謝物をin silico予測できるシステムを構築することを目的とした.結果として,ドッキングシミュレーションより代謝物の構造が,水素原子の引き抜きエネルギー計算より生成する代謝物の生成比順序が予測され,代謝物予測システム構築が可能となった.多くの医薬品は経口投与により腸管から吸収され、ヒト体内に取り込まれた後、肝臓などに存在する代謝酵素により代謝されて体外へ排出される。薬物代謝に関与する酵素系は、主にcytochrome P450(CYP)スーパーファミリーであり、数種の重要なCYP代謝酵素が存在する。これらのさまざまな代謝酵素が化合物のどのような構造的特徴を認識して代謝反応を引き起こすかを知ることは、創薬科学においてきわめて重要である。本年度は、まず、主要代謝酵素であるCYP3A4および遺伝子多型で日本人に欠損の多いCYP2C19を取り上げ、農薬の一つTebufenozideをモデル化合物として、その代謝物の同定を行った。その結果、ヒトCYP3A4では、それぞれB環エチル基1位(M1)、A環メチル基、tert-ブチル基が水酸化された3種の代謝物が得られた。一方、CYP2C19の場合、M1を含むB環エチル基のみが変化した3種の代謝物が得られた。また、両酵素の主要代謝物であるM1が不斉炭素を持つことから、各CYPにより生成したM1の立体異性体比に基づき、その立体選択性について検討した。M1のRS比率は、それぞれ、CYP3A4の場合R:S=333:67、CYP2C19の場合R:S=2:98であった。異性体比から、CYP2C19はCYP3A4より立体選択的にTebufenozideのB環エチル基1位を代謝することがわかった。各代謝物生成の反応速度定数も求めた。M1の立体異性体比の決定に時間がかかったため、他の化合物についてのスクリーニングは次年度の実施となったが、代謝物のin silico予測を先に行い、ドッキングシミュレーションとTebufenozideにおける水素原子引き抜きのエネルギー計算に基づき、各CYPによるTebufenozide酸化部位の予測が可能となったため、代謝予測システム構築の基盤が築かれた。多くの医薬品は経口投与により腸管から吸収され、ヒト体内に取り込まれた後、肝臓などに存在する代謝酵素により代謝されて体外へ排出される。薬物代謝に関与する酵素系は、主にcytochrome P450 (CYP)スーパーファミリーであり、数種の重要なCYP代謝酵素が存在する。本年度は、農薬の一つであるTebufenozideの類縁体について、CYP3A4による代謝反応を行い、LC/MS,LC/MS/MSを用いて代謝物構造の同定を行った。LC/MSのみでは、同定は困難であったが、LC/MS/MSによりほぼ代謝物の構造を同定することができた。ただし、疎水性の高い類縁体については、代謝反応の際にアセトニトリルに化合物を溶解するが、溶解性において問題が生じ、代謝物同定に必要な濃度の溶液を調製するのに困難が生じた。そのため、詳細な実験方法について検討を行った。その結果、代謝反応を効率よく行う系を確立することができた。昨年度、代謝物のin silico予測のための方法論として、ドッキングシミュレーションおよび化合物の各位置における水素原子引き抜きのエネルギー計算を行ったが、その条件について、さらに詳細に検討した。ドッキングソフトウェアとしては、GOLDおよびFREDが使用可能であるが、FREDの方が実験結果をより良く再現することがわかった。また、エネルギー計算では、まず、分子軌道法MNDO/AM1その後、密度汎関数法(DFT法)のB3LYPを用いて、基底関数6-31G*で水素原子の引き抜きエネルギーを計算した。これらの手法により、各CYPによるTebufenozide類縁体酸化部位の予測が可能となったため、代謝予測システム構築の基盤が築かれた。多くの医薬品は経口投与により腸管から吸収され,ヒト体内に取り込まれた後,肝臓などに存在する代謝酵素により代謝されて体外へ排出される.薬物代謝に関与する酵素系は主にcytochrome P450 (CYP)スーパーファミリーであり,数種の重要なCYP代謝酵素が存在する.

これらのさまざまな代謝酵素が化合物のどのような構造的特徴を認識して代謝反応を引き起こすかを知ることは,創薬科学においてきわめて重要である.本年度は,農薬の一つであるTebufenozideとその類縁体,および他の化合物について,ヒトのもつ主要な6種のCYP分子種のうち,3A4以外の5種, 2C19, 2C9, 1A2, 2D6, 2E1による代謝反応を行い,LC/MS, LC/MS/MSを用いて代謝物構造の同定を行った.その結果,例えばTebufenozideは2E1以外のCYPにより代謝され,それぞれの代謝物には類似点と相違点が見出された.他の化合物も同様であった.代謝物のin silico予測のため,FREDソフトウェアを用いたドッキングシミュレーション,および密度汎関数法(DFT法)のB3LYPと基底関数6-31G*を用いた,化合物の各位置における水素原子引き抜きのエネルギー計算を行った.その結果,ドッキングシミュレーションより代謝物の構造が、水素原子の引き抜きエネルギー計算より生成する代謝物の生成比順序の予測される可能性が示された.また,これまでに蓄積されている医薬の代謝データベースに基づき,多様な構造を持つ化合物の予測結果について検証した.こうして,「多対多」の「代謝酵素-基質」の組合せをドッキングとエネルギー計算の手法を用いて解析し,より予測能にすぐれて精度よく代謝予測できるシステムの構築が可能となった.一般に農薬は疎水性の高い化合物が多いため、代謝反応の際に溶解性において問題が生じ、代謝物同定に必要な濃度の溶液を調製するのに困難が生じた。しかし、本年度、詳細な実験方法につして検討を行い、代謝反応を効率よく行う系を確立したため、今後の研究進展には何の問題もない。24年度が最終年度であるため、記入しない。できる限り、多様な構造の農薬関連化合物についてスクリーニング、代謝物の同定を行い、データを得る。各種データベースで医薬に対して得られている代謝物データも補完的に利用するが、本研究の最大の特徴は実際に実験データを得て、それを代謝物予測システムの構築に利用する点であり、データの質と量が重要である。これまでの我々の研究において得られたin silico予測手法が妥当であるかどうかの検討を行い、ケミカル・ゲノミクスの手法を応用して代謝物予測システムの構築を目指す。
エタノールに対する応答過程および醸造過程における酵母細胞内ｍＲＮＡ動態の解析

種々の醸造関連ストレス条件下で、不要不急のmRNAの翻訳が抑制されて細胞質中のP-bodyやstress granule (SG)に隔離されることを明らかにした。また、ストレスへの対処に必要とされるmRNAの優先的・効率的な翻訳にP-bodyやSGが大きく寄与することを見出した。さらに、エタノールストレス条件下でも優先的に翻訳されるmRNAを同定し、その遺伝子の発現制御機構を解析した。清酒醸造やワインのマロラクティック発酵、バイオエタノール発酵工程の乳酸菌汚染などとも深く関連する乳酸ストレスが翻訳抑制とP-bodyの形成を速やかかつ可逆的に誘導する一方で、SGの形成は誘導しないことを見出した。廃木材や稲藁などの木質バイオマスを原料として製造される第二世代バイオエタノールは、食糧資源と競合しないことや未利用資源活用の観点から今後の需要と製造規模の拡大が期待されている再生可能エネルギーである。セルロース・ヘミセルロース・リグニンを主成分とする木質バイオマスを酵母によるアルコール発酵に用いるためには、酸や加圧熱水による糖化前処理を通常おこなうが、この際に糖だけでなく、フルフラールやHMF、バニリンなどの発酵阻害物質が副産物として生じてしまう。これらの発酵阻害物質は酵母の生育や発酵能を著しく抑制するため、技術面およびコスト面で大きな障壁となっているが、酵母細胞に及ぼす影響や作用機構は十分に解明されていない。そこで、バイオエタノール製造技術を改良する上で有用な新規知見を収集するために、これらの発酵阻害剤が酵母のmRNA fluxや翻訳活性に及ぼす影響について検討した。非翻訳状態のmRNAによって形成されるP-bodyやストレス顆粒(SG)などの細胞質mRNP granuleの形成は、それぞれの構成因子のGFP fusion発現系を構築して蛍光顕微鏡解析をおこなった。また、酵母の翻訳活性はポリソーム解析によって検討した。解析の結果、木質バイオマスに由来する発酵阻害物質は酵母の翻訳活性の低下を引き起こし、mRNP granuleの形成を誘導することを見出した。また、その効果は濃度依存的かつ可逆的であった。さらに、各々単独ではSGの形成や翻訳抑制をほとんど誘導しない低濃度であっても、複数の阻害物質や低濃度エタノールストレスと組み合わせることによって、深刻な翻訳抑制が誘導されることを明らかにした。発酵阻害物質の影響がmRNP granuleの形成に反映されることから、P-bodyやSGのGFPマーカーが発酵状況の管理指標として活用できるのではないかと考えられた。エタノールをはじめとする種々の醸造関連ストレス条件下で、不要不急のmRNAの翻訳が抑制されて細胞質中のP-bodyやstress granule (SG)などに隔離されることを明らかにした。清酒醸造やワインのマロラクティック発酵、バイオエタノールの発酵工程における乳酸菌汚染などとも深く関連する乳酸ストレスが翻訳抑制とP-bodyの形成を速やかかつ可逆的に誘導する一方で、SGの形成は誘導しないことを見出した。他の代表的な有機酸である酢酸やプロピオン酸では同様の現象は誘導されなかった。また、乳酸耐性獲得の上で重要な遺伝子を複数同定した。木質草本系バイオマスの糖化前処理によって生じる発酵阻害物質バニリン、フルフラール、5-ヒドロキシメチルフルフラールなどがbulkの翻訳抑制やmRNP granuleの形成誘導、酸化的ストレス、ミトコンドリアの断片化を誘導することを見出した。また、共同研究を通じてバニリンの細胞内作用点を検討した。高濃度エタノールストレス存在下でも翻訳が抑制されず優先的に翻訳されているmRNAを、ポリソーム解析やマイクロアレイ解析などを通じて探索し、ストレス下でも優先的に転写・翻訳されている遺伝子をqRT-PCRやWesternblt解析により複数同定することに成功した。酒類醸造やバイオエタノール製造において重要な出芽酵母はエタノールストレスに対して高い耐性を持つ。これまで、転写段階を中心に耐性獲得機構の解明に向けた取り組みが多数おこなわれてきたが、詳しいメカニズムや実際の醸造過程における酵母の生理は十分に解明されていない。そこで本研究では、これまでにない視点から、酵母のエタノール応答機構や耐性獲得機構の解明に取り組んだ。mRNAの選択的核外輸送や細胞質構造体におけるmRNAの隔離・分解・翻訳制御といった転写以降のステップに焦点を当てて解析をおこない、従来の転写段階中心の解析からは見えてこなかったエタノール応答機構の本質に迫ることを目的とした。本年度は、備品として購入したピストングラジェントフラクショネーターを活用して、ポリソーム解析をおこなった。酵母細胞をエタノールストレスをはじめとする各種ストレスで処理後、細胞破砕液を調整し、各種条件下における翻訳活性を観察することや、リボソーム因子の分画調整条件を確立した。また、醸造発酵と深く関連する種々の条件下におけるP-

bodyやstress granuleの形成を新たに見出すとともに速度論的解析をおこない、構成因子の違いや翻訳抑制との相関性などについて新たな知見を得た。さらに、stress granuleの分解に関与する因子の探索をおこない、複数の候補因子を同定した。解析は実験室酵母のみならず、清酒酵母やワイン酵母についてもおこない、比較検討した。研究内容については学会での発表および論文投稿をおこなった。酒類醸造やバイオエタノール製造において重要な出芽酵母はエタノールストレスなどに対して高い耐性を持つ。これまで、転写段階を中心に耐性獲得機構の解明に向けた取り組みが多数おこなわれてきたが、詳しいメカニズムや実際の醸造過程における酵母の生理は十分に解明されていない。そこで本研究では、これまでにない視点から、酵母のエタノール応答機構や耐性獲得機構の解明に取り組んできた。mRNAの選択的核外輸送や細胞質構造体におけるmRNAの隔離・分解・翻訳制御といった転写以降のステップに焦点を当てて解析をおこない、従来の転写段階中心の解析からは見えてこなかったエタノール応答機構の本質に迫ることを目的として掲げた。本研究では、エタノールストレス条件下の細胞質内でmRNAの隔離や分解、翻訳制御において重要な役割を担うProcessing body (P-body)とストレス顆粒(Stress Granule, SG)に着目し、これらの構造体に運び込まれるmRNA種の解析を通じて、エタノールに対する応答機構・耐性獲得機構に関する新たな知見の収集に取り組んだ。これまでに、エタノールストレス条件下でこれらの構造体に隔離されるmRNA種の回収方法の確立に成功した。現在、各mRNAの同定と、ストレスからの回復や耐性獲得段階で必要とされる遺伝子なのか否かを検討中である。また、エタノールストレス以外で、アルコール発酵と深く関わるバニリンをはじめとする発酵阻害剤の影響についても新しい知見を報告した。ピストングラジェントフラクショネーターの導入によってポリソーム解析が実施できるようになり、これまで困難だった解析を実施することによって様々な新たな知見を得た。エタノールストレス条件下でP-bodyまたはStress granuleに隔離されるmRNAの同定とそのキャラクタライゼーションを進める。一方で、エタノールストレス条件下でも優先的に翻訳されるポリソーム画分にとどまるmRNAについても同様に同定する。同定したmRNAについて、エタノールストレス条件下における転写と核外輸送状況を解析する。ストレス処理開始後の初期段階あるいは順応後の段階で、これらの遺伝子の転写が活性化され優先的にmRNAが核外輸送されているのか?ノーザンブロット解析およびFISH解析により明らかにする。
副腎チトクロームP⊂⊃∈ーテDNAによる先天性副腎過形成のDNA診断法の開発

先天性副腎過形成21OHlase欠損症例におけるP450c21のDNA leaclの異常を既に報告したが、実際その発現における異常の存在の有無については未だ報告を見ていない。そこで21OH lase異常の先天性副腎過形成及び機能性副腎癌の副腎組織においてP450c21のDNAと同時にmRNAの異常について検索した。副腎腺腫を発生した21OH lase欠損症単純男性型37才女性の手術摘出副腎腺腫組織のP450c21遺伝子及びそのmRNAを解析した。培養副腎腺腫細胞のステロイド合成はACTH添加により17OHprogesteroneはcortisol,11deoxycortisolに比べ著明な反応増加を示し、21OHlase障害の存在が確認された。副腎腺腫組織DNAは、TagI切断で正常ヒト白血球と同様にSouthern blot法で6.2,3.7,3.2,2.5kbのバンドを認め、異常バンドを認めなかった。次に副腎腺腫組織及びその周囲副腎組織のmRNAはNorthern blot法で共に2.1Kbの部位にバンドを認め、mRNAの大きさには正常副腎組織と比べ差異を認めなかった。副腎腺腫は21OHlase障害を有するがDNAは勿論、mRNAにおいても異常を認めず、P450c21の遺伝子のpoint matationが示唆された。次に機能性副腎癌2例即ち副腎性器症侯群を示す3才女性とCushing症候群を示す6才女性の手術時摘出副腎癌組織よりDNA及びRNAを抽出した。Southern blot法でTagI切断により副腎癌では正常副腎と同様に6.2Kb,3.7Kb,3.2Kb,2.5Kbにバンドを認め、EcoRi切断にてCushing症候群を呈した症例では18Kb,15kb,13Kb,10.5Kb,9.5Kb,9Kb以外に16Kbのバンドを認めた。一方Northern blot法では副腎癌では正常組織と同様に2.1Kbのバンドを認めたが、Cushing症候群を呈した症例ではその他に1.6Kbのバンドを認めた。即ちヒト副腎癌においてP450c21のDNAに異常が存在し、明らかにその発現型であるmRNAにも異常の大きさのmRNAが存在する事を証明した。
ナノファイバーから構成される芳香族ポリアミド多孔質体の構造および機能制御

室温下沈澱重合法により、フッ素含有芳香族ポリアミドからナノファイバー(ファイバー径:約50nm)が密に絡み合った多孔質体が得られた。これらは優れた耐薬品性および耐熱性(熱分解温度:約500°C)を示す一方、高温域では相転移が生じ分子構造や特性が変化した。また、ファイバーは、反応初期に形成された粒子が自己組織化により形成されたものであることが明らかとなった。これらの成果は、新たな材料開発や材料特性の制御に活用できるものと考えられる。沈澱重合法により、トリフルオロメチル基を有する芳香族ポリアミドナノファイバー(ファイバー径:50100nm)が密に絡み合った多孔質体を作製することができた。また、この反応系では重合時のモノマー濃度や溶媒組成によって、モルフォロジーが大きく変化することが昨年度の研究により明らかとなった。そこで本年度においては、ファイバー形成において最適な反応系およびそれ以外の反応系とも比較しながら、様々な分析手法を用いて、その形成過程や形成後の時間変化に伴う構造および特性変化を検討した。その結果、モノマー溶液混合後、最初に粒子が多数形成され、その後自己組織化によりファイバー状に変化することが分かった。また、このようなモルフォロジー変化を伴う形成過程においても、重合は進行していた。そして、一定時間後にファイバー径などが揃った多孔質体が得られた。またこのようなファイバー形成には、反応過程における物理ゲルの形成も密接に関係していることが分かった。さらに反応時間を長くすると、そのモルフォロジーは乱れるが、分子間の水素結合および結晶化度は増加する傾向が見られた。このようなことから、反応時間によってもモルフォロジーや特性をある程度制御できることが明らかとなり、材料設計などにも活用できるものと考えられる。また、これら多孔質体の特性および構造は、熱処理によっても顕著に変化することが分かった。一方、得られた生成物(多孔質体)は、用いる最終分散溶媒によって、加工のしやすさや比表面積が変化することが分かった。昨年度の研究においては、様々な分析手法を用い総合的に検討することで、トリフルオロメチル基を有する芳香族ポリアミドナノファイバー構造体の形成メカニズムや形成後の時間変化に伴う構造および特性変化を明らかにすることができた。これらの結果を踏まえ、本年度は最適化した反応条件でナノファイバー構造体を作製し、様々な温度における熱処理効果や温度変化に伴う構造変化について検討を行った。その結果、得られた構造体は見かけ上融点を示さず、炭化後もファイバーの形状を保持していることが明らかとなった。また、温度上昇、特に高温域で、分子構造や結晶化度の顕著な変化が見られたことから、転移が生じているものと考えられる。この転移により、材料の力学的強度の大きな減少が予想されることから、転移挙動および温度の解明はナノファイバー構造体の応用および実用化において非常に重要な知見となる。また、温度変化に伴う構造変化の詳細を明らかにすることで、構造と熱特性に関する詳細な相関も把握でき、今後の材料設計に活用できるものと考えられる。さらに、本年度はナノファイバー構造体の機能化を目指し、共重合化などによる官能基の導入も試みた。昨年度に解明したナノファイバーの形成メカニズムも踏まえながら反応条件の検討を行うことで、高機能化ファイバーの形成ファクターも一部明らかにすることができた。今後はこれらの結果も活用することで、高機能かつ新規なファイバー構造体の開発が期待できる。近年、ナノレベルで構造が制御された高分子多孔質体は、新たな機能性材料の1つとして注目されている。このような多孔質体においては、高分子自体が本来有する特性以外に、これらから形成されるナノレベルの孔なども重要な材料特性の1つとなっている。そこで本研究では、沈澱重合法により、モノマーからワンステップでポリマー多孔質体を作製した。得られた多孔質体は芳香族ポリアミドのナノファイバー(ファイバー径:50100nm)が密接に絡み合った構造体である。その特性においては、約500°Cの熱分解温度を示すとともに、一部の溶媒(硫酸やN-メチルピロリドンなど)にしか溶けないなど、優れた耐熱性および耐薬品性を示した。また、これらのファイバー径やモルフォロジーは、用いた反応溶媒組成やモノマー濃度によって大きく変化するほか、精製段階で用いる溶媒や乾燥条件によってもその比表面積などが変化することが分かった。一方、本反応はモノマーから重合が進むにつれてゲル状態を形成することなどからも、ナノファイバーおよび多孔質体の形成においては分子間相互作用や分子と溶媒との親和性が大きく関与しているものと考えられる。これらの反応および形成メカニズムについては、次年度以降、様々な手法を用いることにより分子レベルからの解明に取り組む。なお、本調製手法は、ナノ・サブミクロンサイズの微粒子の作製にも応用できることから、これらの形成メカニズムなどとも比較しながら、研究を進めていく予定である。申請時の2年目計画としては、1.多孔質体の形成機構の解明、2.加工方法の検討について主に研究を進めることとしていた。

特に1の項目においては、反応系が当初予測していたものより複雑であったことから、様々な分析手法を組み合わせる必要があり、その解析は困難であった。しかしながら、今年度末には、分子レベルからの情報も含めた形成機構の全体像を把握することができた。これらのさらなる詳細な解析については次年度も引き続き取り組んでいきたいと考えている。当初の初年度計画としては、(1)多孔質体の作製および(2)モルフォロジー制御について主に研究を進めることとしていた。これらについては、研究実績の概要でも記入したように、生成物と作製条件についてある程度の系統だったデータを得ることが出来た。今年度は、本研究期間の最終年度(研究期間:3年)となることから、1.多孔質体の構造および特性の相関関係の解明、2.ファイバーへの機能付与および改質について主に研究を進めていく予定である。1の項目については、熱処理に伴う構造および特性変化をより詳細に検討するとともに、多孔質体作製時の反応条件(撹拌方法および反応時間)による構造および特性への影響なども検討する。そしてこれまでの研究結果も踏まえ、より包括的かつ系統的な解明に取り組む。2の項目については、ファイバーと他の化合物による複合化や複数のモノマーを用いる共重合化などにより機能付与や改質を行う。生成物および反応メカニズムに関する分子レベルからの構造解明などについては、これまでの研究過程より、当初想定していた以上に複雑なファクターがからみ合っており、その解明が困難であることが明らかとなってきた。このようなことから、次年度以降は様々な手法を用いながら、生成物のみならず、反応過程や乾燥過程などにおける構造変化などについても追跡して行く予定である。次年度使用額(140円)については、金額が少額であったため、物品費・旅費等で使用することが出来なかった。このようなことから、残額は次年度に繰り越して使用するが、使用計画については当初の申請どおりである。次年度に繰り越して使用する予定の研究費はない。当初の申請どおり、試薬、実験用器具、分析用消耗品、成果発表代、旅費等で使用予定である。
大腿切断者を含む制約のないヒトの運動解析および歩行訓練技術の開発

義足を装着した大腿切断者を含めたヒトの歩行運動解析を,平地,斜面,階段などの日常生活動作を反映した多種多様な路面環境に適応可能な形で実施し,運動学・動力学的視点からの現象解明に基づき,下肢の各関節に生じる負荷状態,角度変化,消費エネルギに加えて,関節間協調動作の寄与度を表す特異値分解に基づく定量的な歩行評価指標を定義し,健常者と大腿義足装着者の相互比較を用いた外部制約を受けない汎用性を持つ歩行運動解析技術を開発した.続いて,大腿切断者を始めとするヒトの足に対して左右個別に並進外乱を付加し,各評価指標値との相互関係を考察することにより,歩行障害者に用いる客観的な指標を持つ歩行訓練技術を開発した.義足を装着した大腿切断者を含めたヒトの歩行運動解析を,平地,斜面,階段などの日常生活動作を反映した多種多様な路面環境に適応可能な形で実施し,運動学・動力学的視点からの現象解明に基づき,下肢の各関節に生じる負荷状態,角度変化,消費エネルギに加えて,関節間協調動作の寄与度を表す特異値分解に基づく定量的な歩行評価指標を定義し,健常者と大腿義足装着者の相互比較を用いた外部制約を受けない汎用性を持つ歩行運動解析技術を開発した.続いて,大腿切断者を始めとするヒトの足に対して左右個別に並進外乱を付加し,各評価指標値との相互関係を考察することにより,歩行障害者に用いる客観的な指標を持つ歩行訓練技術を開発した.最初に,筋骨格モデルを適用したシミュレーションソフトウェアSIMMによって,平地歩行中に既存の設置型床反力計および3次元動作解析装置を用いた場合における大腿義足装着者の関節間力,関節モーメントを理論解析の結果として数値計算により求めた.次に,移動式床反力計および姿勢センサ,義足内蔵型6軸力覚センサを併用して実験室外の環境下で生じる下肢の運動状態を計測し,その際に生じた床反力,足底圧中心点,関節角度,関節間力,関節モーメント,関節パワーなどとの相関性を調べ,計測データを実験結果として健常者と大腿義足装着者,健足側と義足側の相互比較をおこなった.ここで,各歩行解析システムは被験者に適用,装着するものとし,歩行計測実験においては日常生活動作を反映した屋外の平地,斜面および階段の昇降を路面環境として使用した.さらに,歩行計測実験において得られた各種物理量に関するデータ解析をおこない,姿勢センサの装着位置に対応した下肢に生じる床反力,関節角度,関節モーメントに加えて,一歩行周期での各関節の仕事率である関節パワーを積分した消費エネルギを求め,ヒトの歩行に関する特徴量として抽出し,定量的な歩行評価指標を定義した.加えて,歩行の制御メカニズムを具体的に解明する上で重要となる各関節間の協調動作における時空間パターンを調べるため,これまでに触れてきた生体医工学的・運動学的物理量の時系列データを立脚期,遊脚期,両脚支持期などに分類して行列にまとめ特異値分解を施し,得られた特異値を関節間の寄与度とみなし,各被験者・各歩行条件に関して整理することによって,無拘束状態におけるヒトの各身体部位で最も相関が高い動作パターンを抽出し評価した.これらを包含した提案手法を,大腿切断者を含む制約のない汎用性を持つヒトの歩行運動解析技術として開発し,被験者や歩行周期における統計処理も考慮した上で,有効性を検証した.今までに提案した,一歩行周期での各関節の仕事率である関節パワーを積分した消費エネルギを算出する手法やヒトの歩行などの制御メカニズムを具体的に解明する上で重要となる各身体部位で最も相関が高い関節間協調動作の時空間パターンを抽出する手法に基づく歩行評価指標の有用性を確認するため,設置型床反力計を内蔵し被験者の歩容,歩行速度に準じて左右の足に個別のベルト速度,進行方向による並進外乱を与えて制御することが可能なスプリットベルト式の3次元トレッドミルを計測装置として適用し,健常者および大腿義足装着者を被験者とする片足もしくは両足に適宜変更してベルト速度を付加する歩行計測実験をおこない,これまでのウェアラブルな歩行解析システムも併用した場合の各出力を相互比較するとともに,定義した評価指標値を算出し,それらの特徴を把握した.筋骨格モデルシミュレーションソフトウェアSIMMによって,歩行中に既存の設置型床反力計および3次元動作解析装置を用いた場合における大腿義足装着者の関節間力,関節モーメントを理論解析の結果として数値計算により求めたが,階段歩行については実験を実施していない.次に,移動式床反力計および姿勢センサ,義足内蔵型6軸力覚センサを併用して実験室外の環境下で生じる下肢の運動状態を計測し,その際に生じた床反力,足底圧中心点,関節角度,関節間力,関節モーメント,関節パワーなどとの相関性を調べ,計測データを実験結果として健常者と大腿義足装着者,健足側と義足側の相互比較をおこなった.

しかし,上肢や筋電については評価できておらず,義足側の関節モーメントなども正確に算出できていないことから,これらを今後の達成目標とする.さらに,歩行計測実験において得られた各種物理量に関するデータ解析をおこない,姿勢センサの装着位置に対応した下肢に生じる床反力,関節角度,関節モーメントに加えて,一歩行周期での各関節の仕事率である関節パワーを積分した消費エネルギを求め,ヒトの歩行に関する特徴量として抽出し,定量的な歩行評価指標を定義した.加えて,歩行の制御メカニズムを具体的に解明する上で重要となる各関節間の協調動作における時空間パターンを調べるため,これまでに触れてきた生体医工学的・運動学的物理量の時系列データを立脚期,遊脚期,両脚支持期などに分類して行列にまとめ特異値分解を施し,得られた特異値を関節間の寄与度とみなし,各被験者・各歩行条件に関して整理することによって,無拘束状態におけるヒトの各身体部位で最も相関が高い動作パターンを抽出し評価した.これらを包含した提案手法を,大腿切断者を含む制約のない汎用性を持つヒトの歩行運動解析技術として開発し有効性を検証したが,3次元トレッドミルを適用した実験は未実施のままである.25年度が最終年度であるため、記入しない。提案手法に基づく歩行評価指標の有用性を実際的な歩行訓練における観点から理解,確認するため,床反力計となる多軸力覚センサを床面内に埋設した被験者の歩容,歩行速度に対応して左右の足それぞれを個別のベルト速度,進行方向による並進外乱を与えて制御することが可能なスプリットベルト式の3次元トレッドミルを計測装置として適用し,健常者および大腿義足装着者を被験者とする片足もしくは両足に適宜変更してベルト速度を付加する歩行計測実験をおこない,健常者は移動式床反力計および姿勢センサを用いた歩行解析システム,大腿義足装着者については6軸力覚センサ内蔵型義足歩行訓練装置を併用した場合の各出力を相互比較するとともに,受動的な歩行の変化を観察しデータを取得し,定義した評価指標値を算出する.続いて,計測データを解析した上でベルト速度と各歩行評価指標との相互関係を調べ,被験者の身体特性に準じた最適な外部入力の大きさを判断し,どの評価指標値がより大きく改善されているか,一歩行周期中において規則性を持つ変化が顕著に現れており歩行訓練に有用であるかどうかを,ばらつきなどの統計的な観点からも検証する.具体的には,ベルト速度や進行方向との詳細な関連性を位置づけるため,応答曲面法,満足度関数を用いた多目的最適化手法によって各評価指標が歩行パラメータに依存することを示し,最適解として健常者および大腿義足装着者への外乱を同定した上で,歩行訓練に対する有効性を検証する.最終的には,最適な評価指標を決定した後,大腿義足装着者を始めとする歩行障害者に対して提案手法を用いた実験結果に基づく歩行訓練をおこない,運動学習効果が評価指標値に十分な形で反映されていることを確認した上で,これらを歩行障害者に用いる客観的指標を持つ歩行訓練技術の開発としてまとめ,有効性を検証する.また,上肢や筋電,義足側の関節モーメントについても評価する.25年度が最終年度であるため、記入しない。
各型コラーゲンCDNAを用いた各種皮膚疾患におけるコラーゲン産生細胞の態度

平成3年度には各型コラーゲンすなわちtypeI,IV,V,ラミニン及びコラーゲンの架橋酵素であるリジルオキシダーゼについて各々のCDNAを大量に得るための作業を中心に実験をつづけた。つづいてinvitroのコラーゲン産生遺伝子発現をみるために培養系を使用し以下の結果を得た。基底膜の主要講成成分であるIV型コラーゲンの表皮角化細胞における遺伝子の発現をinvitroで検索した。正常ヒト角化細胞(NHEK)をヒト下垂体抽出物添加MCDB培地にて培養し,confluent及びsubconfluentの状態でRNAを採取しNorthen blottingを行った。subcofluentの状態では2.1kbのサイズのバンドを著明にみとめるが,confluentの状態では抑制されてほとんど発現しなかった。以上のことからIV型コラーゲンは正常ヒト表皮角化細胞において遺伝子レベルで発現しており,confluentの状態では何らかの理由でその発現が抑制されることが明かとなった。次にラットを用いてinviroの病的状態におけるコラーゲンとその関連物質の発現をみる実験に入った。まずコラーゲン発現に重要な役割を果たすリジルオキシダーゼについて創傷治癒モデルにおける遺伝子発現について検討した。真皮全層レベルでの開放創を作製し受傷後1,4,7日迄の治癒過程において皮膚を採取しRNAを抽出しNorthern blotting及びin situ hybridizationを行い次の結果を得た。リジルオキシダーゼmRNAの発現量は受傷後4日目でピークとなり7日目ではコントロールレベルに復帰した。in situ hydridizationでは肉芽組織周辺のfibroblastと思われる細胞に一致して陽性所見がみとめられた。これらの結果を参照しつつ現在,各型コラーゲンmRNAの発現について検討中であり、リジルオキシダーゼの発現時機との関連においてどの型のコラーゲンがみられてくるのかなど詳細なコラーゲン代謝の追究を進める予定である。まず,各型コラ-ゲンのc-DNAを入手精製する必要があったため,当院第2内科石村氏よりコラ-ゲンのtype I,III,IV,V及びラミニンについてのc-DNAをプラスミドDNAの形で供与して頂き,これをもとに,c-DNAの大量調製を試みた。塩化カルシウム法を用いてコンピテント細胞の作成を行い,ディ-プサソ-ザ-ル保存した。これより,アルカリ法を用いてプラスミドDNAの大量調製を試み各成分についての充分量のc-DNAを得るに至ったが,ここまでの手技,方法について種々の困難な状態があったため,随分の日数を費したため,今年度中に皮膚疾患に適用するのをあきらめ,培養ヒト表皮細胞について応用することとした。現在,培養ヒト表皮細胞を用いて,これを対数増殖期及び増殖停止期の2群に分けて培養し,IV型ユラ-ゲン,ラミニンについての遣伝子発現を,ノ-ザンブロット,ドットブロット法を用いて検討中である。これらの発現は,表皮細胞などの接着,細胞ネットワ-クなどについての基礎的デ-タを与えてくれるものと考えられる。これらのデ-タをもとにして,以降,病的状態を検討する予定である。昨年度にひきつづき細胞培養系における遺伝子発現を検索する作業を続けるとともに病的状態ではラットを用いた創傷治癒のモデル実験においてコラーゲン産生の細胞レベルでの状態を遺伝子レベルにおいて検討することとした。創傷治癒モデルにおいては各型コラーゲンの形成に深く関与する酵素であり、コラーゲン分子、エラスチン分子の架橋形成初期に働くリジル-オキシダーゼの遺伝子発現を優先して検索し、コラーゲン遺伝子発現との関わり合いを次の段階で検索していくこととした。