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金属間相互作用解明のための合理的多核金属錯体の設計

前年に引き続いて、ルテニウム錯体cis-[Ru(bpy)_2Cl_2]を多核錯体の素単位に用い、アミノエタンチオレート(aet)をもつNi錯体[Ni(aet)_2]との反応により、新規錯体合成に成功した。また、その諸性質を前年度に合成した3種の錯体と比較した。1)cis-[Ru(bpy)_2Cl_2]の塩化物イオンをAg^+で引き抜いた後、[Ni(aet)_2]とモル比Ru:Ni=1:2の比で反応をおこなった。すると、Ru部位に[Ni(aet)_2]がキレート配位したRu-S-Ni-Sの4員環をもつ環状型錯体[Ru(bpy)_2{Ni(aet)_2}]^<2+>(1)が生成することをX線結晶構造解析および^1H,^<13>C NMRにより特定した。このことにより、[Ni(aet)_2]を加える比を変えるだけで、1とRu-S-Ni-S-Ru-S-Ni-S八員環をもつ[{Ru(bpy)_2}_2{Ni(aet)_2}_2]^<4+>(2,前年度合成)を選択的につくり分けることができることを明らかとした。2)錯体1、2の溶液中での安定性を^1H NMRで検討した。その結果、1、2ともにアセトン中では、数日間はその構造を安定に保っているが、アセトニトリル溶液中では、構造変換が起こることが判った。錯体2は、その構造変換の過程で一部が錯体1に変換することも見出した。前年度合成したRu-S-Pd-S-Pd-S六員環をもつ[Ru(bpy)_2{Pd_2(aet)_3}Cl]^<2+>(3)についてもアセトニトリル溶液中で安定性を調べた。3は、80°Cまで溶液の温度を上げても、錯体の分解が認められず、高い安定性をもつことが判明した。ルテニウム錯体cis-[Ru(bpy)_2Cl_2]を多核錯体構築の素単位に用い、アミノエタンチオレート(aet)をもつNiもしくはPd錯体[M(aet)_2](M=Ni^<II>,Pd^<II>)との反応により2種類の金属イオンから成る環状型混合金属多核錯体の構築に成功した。1)cis-[Ru(bpy)_2Cl_2]の塩化物イオンをAg^+で引き抜いた後、[Ni(aet)_2]とモル比1 : 1で反応をおこなった。この反応では、ルテニウム部位に[Ni(aet)_2]のチオレートが結合し、[Ni(aet)_2]が2つのcis-Ru(bpy)_2部位を架橋したRu-S-Niから成る八員環をもつRu_2Ni_2四核錯体[{Ru(bpy)_2}_2{Ni(aet)_2}_2]^<2+>(1)が生成することをX線結晶構造解析および^1HNMRスペクトルにより特定した。
若年婦人子宮頸癌発症要因としての喫煙に関する調査研究

喫煙は子宮頸癌発症に影響を及ぼすと考えられ、さらにGSTM1 nullの個体においてその影響が強いものと思われた。さらに、喫煙との因果関係は不明であるものの、メチル化を介しての癌抑制遺伝子(DAPK,FHIT)の発現低下が癌化メカニズムの一因と考えられた。1.子宮頸癌の発症に及ぼす喫煙の影響を確認するため、疾患群(子宮頸癌患者)ならびに対照群(子宮頸部細胞診に異常が見られない健常者)での喫煙率を調査したところ、喫煙率は疾患群で41%、対照群で18%と、有意に疾患群での喫煙率が高率であった。2.ヒトパピローマウイルスの感染については、疾患群で96%、対照群で10%ともちろん疾患群で有意に高い感染率であったが、喫煙とヒトパピローマウイルス型分類については現時点で明らかな関連性は見られていない。3. PCR法(TaqMan法)によるCYP1A1, CYP2E1, CYP2A6, NQO1, NAT2, mEH, MPO, GSTT1, GSTM1といった9つの毒物代謝酵素の遺伝子多型判定を行ったところ、GSTM1 null型(解毒活性を持たない)の頻度が、疾患群で62%、対照群で47%と疾患群で有意に高率であった。他の遺伝子多型については両群間で差を認めていない。4.癌抑制遺伝子のエピジェネティックな変化として、メチル化による機能抑制を介した癌化メカニズムが報告されている。喫煙によりメチル化が促進されるとの報告もあり、p16、MGMT、DAPK、FHITといった4つの癌抑制遺伝子のメチル化状態をメチル化特異的PCRにて検討したが、現在のところ疾患群と対照群におけるメチル化の頻度には差を認めていない。現時点で、喫煙は子宮頸癌発症に対する影響があると考えられ、さらにGSTM1 nullの個体においてその影響が強いものと思われるが、そのメカニズムについてはさらなる検討を要する。1.疾患群(子宮頸癌患者)ならびに対照群(子宮頸部細胞診が正常な健常者)での喫煙率を調査したところ、喫煙率は疾患群で41%、対照群で18%と、有意に疾患群での喫煙率が高率であった。2.ヒトパピローマウイルスの感染については、疾患群で96%、対照群で10%と疾患群で有意に高率であったが、喫煙とヒトパピローマウイルス型分類について明らかな関連性は見いだせなかった。3.PCR法(TaqMan法)によるCYP1A1,CYP2E1,CYP2A6,NQO1,NAT2,mEH,MPO,GSTT1,GSTM1,9つの毒物代謝酵素の遺伝子多型判定を行ったところ、GSTM1 null型(解毒活性を持たない)の頻度が疾患群で62%、対照群で47%と疾患群で有意に高率であり、他の遺伝子多型については両群間で差を認めなかった。4.癌抑制遺伝子のエピジェネティックな変化として、喫煙によるメチル化からの機能抑制を介した癌化メカニズムが報告されている。p16、MGMT、DAPK、FHIT,4つの癌抑制遺伝子のメチル化状態をメチル化特異的PCRにて検討したところ、DAPK、FHITにおいて疾患群で有意にメチル化の頻度が高かった。また、DAPKについてはリアルタイムPCRにおいてメチル化群のmRNA発現レベルが非メチル化群に比し有意に低下していた。しかし、喫煙とメチル化との有意な関連は見いだせなかった。さらに、喫煙との因果関係は不明であるものの、メチル化を介しての癌抑制遺伝子の発現低下が癌化メカニズムの一因と考えられた。
新しい脊髄由来疼痛制御物質スパイノルフィンの生体における役割

脊髄に高濃度存在していたenkephalin分解酵素阻害物質・スパイノルフィン(以後spinorphin LVVYPWT)はブラドジニン(BK)を用いた薬理試験において、生理的な低濃度で鎮痛活性を有することが分かった。その効果は百日咳毒素処理に非感受性で、モルヒネ等のオピオイドと異なり、G蛋白を介さない新たな情報伝達機構に関与している可能性を報告してきた。更に、本物質はenkephalin代謝酵素を発現する好中球の機能(遊走・脱顆粒等)をそれぞれ阻害し、カラゲニンで惹起したマウス急性炎症モデル系での、好中球集積を有意に抑制することも明らかにした。この好中球機能の抑制効果は、spinorphinが刺激剤(FMLP)の細胞表層レセプターへの結合阻害に由来していると考えられた。一方、spinorphinを介した新しい疼痛制御メカニズムを解明するために、enkephalin代謝酵素DPPIIIに着目した。15年前enkephalin代謝酵素のインヒビターが、副作用がない鎮痛薬として脚光を浴びていた。エンケファリナーゼインヒビター・チオルファン等が数多く合成され、薬理試験を経て、一流雑誌等に数多く報告されてきた。当時、私達はDPPIII活性等のenkephalin代謝酵素を抑制する物質がヒト脳脊髄液中に存在することを突き止めた(1989年臨床薬理理財団・1988年内藤財団シンポジュウム)。そこで、生体におけるインヒビターを探索し、ウシ脊髄に高濃度存在していたspinorphinを、7段階カラム操作で単離精製することに成功した。近年spinorphinアナログのtynorphinが特異的DPPIIIインヒビターであることも明らかにした。更に、tynorphinは、spinorphinと同じ程度の強い鎮痛活性を有することも分ってきた。このような背景より、spinorphinが生体の複雑な慢性疼痛の制御機構にどのように関与しているのかを研究している。その結果、炎症の要として作用している好中球表層に、DPPIII活性が高濃度存在していることを明らかにした。本年度、慢性疼痛のリウマチ関節液中で、RAにおいてOAと比較して6倍前後の異常な高直を有することが分かってきた。spinorphinは、モルヒネと同等の強い鎮痛効果も確認され、それ自体にも好中球に対する脱顆粒抑制等による抗炎症作用が有る。更にspinorphinは、海馬スライス標本を用い、高頻度の刺激条件下で、シナプス電位の長期増強を、単独で抑制した。この活性は、NMDA受容体拮抗薬により抑制される特色のある化合物で有ることが分かってきた。
おとり型核酸医薬(デコイ)を用いた滲出性中耳炎に対する遺伝子治療の検討

本研究において、まず滲出性中耳炎、慢性副鼻腔炎におけるNF-κBの役割を検討した。アデノイド線維芽細胞から発現するIL-8は、TNF-αにより、発現が増強する。また滲出性中耳炎患者の上咽頭のIL-8発現は滲出性中耳炎患者の鼓膜コンプライアンスと相関を示し、滲出性中耳炎の病態の一因として、IL-8が関与している可能性が示唆された。慢性副鼻腔炎患者における鼻茸線維芽細胞から産生されるVCAM-1はTNF-α、IL-4刺激にてその発現を増強する。アデノイド線維芽細胞におけるIL-8の発現、鼻茸線維芽細胞におけるVCAM-1の発現はいずれも転写因子であるNF-κBを介して発現されることが確認された。NF-κBはこれらの病態に対しての治療戦略となることが期待され、NF-κBを特異的に抑制するために、転写因子にたいするDecoy oligoを用いての研究を進めた。Decoy oligoを細胞内に導入し、NF-κB特異的な抑制を検討するために、患者から採取したアデノイド線維芽細胞をもちいて導入実験を行ったが、安定した導入効率を得ることが出来なかった。導入の効率化をはかり、liposome法、センダイウイルスベクター法を用いて、検討を行ったが、何れの方法にても再現性のあるデータを得るにはいたらなかった。滲出性中耳炎動物モデルをマウスにて作成したが、滲出性中耳炎モデルとしての確立にはいたらなかった。本研究は、NF-κB decoy oligoを用いての滲出性中耳炎、慢性副鼻腔炎への治療応用を目的としたものであったが、培養細胞レベルにてのdecoy oligoの作用の確認と動物モデル作成へむけての今後のさらなる研究が必要である。しかしながら、滲出性中耳炎、慢性副鼻腔炎におけるNF-κBの役割を解明できたことは、NF-κBがこれらの疾患の治療戦略として重要であることを示唆しており、Decoy oligoによる治療法確立にむけさらなる研究が必要であると考えられる。NF-κBデコイの細胞への取り込みを確認するため蛍光ラベルしたNF-κBデコイを作製した。蛍光ラベルしたNF-κBデコイを種々の濃度にてリポソーム法にてヒト鼻茸由来培養線維芽細胞へ投与し、蛍光顕微鏡にて経時的に観察し細胞へのデコイの取り込みを検討した。2.ヒト鼻茸由来培養線維芽細胞におけるNF-κBデコイの作用3.マウス滲出性中耳炎モデルの作製マウスにおける実験的滲出性中耳炎モデル作製のため、マウスの中耳腔にインフルエンザ菌由来のエンドトキシンを注入し、中耳貯留液の出現の有無およびその期間を調べるとともに、中耳腔粘膜を採取して組織学的変化を観察した。さらに、中耳粘膜からtotal RNAを抽出し、エンドトキシン投与後のムチン遺伝子発現の変化について検討した。以上本年度においては、in vitroでのNF-κBデコイの細胞への取り込みおよびデコイの作用について検討を行い、デコイによるNF-κB活性の抑制についての基礎的研究を行うとともにマウスにおける実験的滲出性中耳炎モデルの確立を図った。今後はマウス実験的滲出性中耳炎モデルに対し、NF-κBデコイを投与しその影響について検討する予定である。

IL-8をはじめとする炎症性サイトカインはエンドトキシンなど微生物由来の抗原刺激により中耳粘膜や貯留液中の細胞から産生され、滲出性中耳炎の発症および遷延化に重要な役割を果たしているが、これらの発現は主にNF-κBを介してなされている。NF-κBデコイの滲出性中耳炎に対する有用性を検討するために、培養線維芽細胞における炎症性サイトカイン発現に対する影響を検討した。ヒト鼻茸由来培養線維芽細胞ヘリポソーム法にてNF-κBデコイを投与した後、インフルエンザ菌由来のエンドトキシンあるいはIL-1βにて刺激した後、炎症性サイトカインであるIL-8の発現をELISA法やRT-PCR法にて測定し、NF-κBデコイのIL-8発現に対する影響を検討した。同様の方法でNF-κBデコイをヒト鼻茸由来培養線維芽細胞にリポソーム法にて投与し、エンドトキシンやIL-1βにて刺激した後、核蛋白を抽出、Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)法にてNF-κB活性を測定し、NF-κBデコイによるNF-κB抑制の程度を検討した。2マウス滲出性中耳炎モデルの作製マウスにおける実験的滲出性中耳炎モデル作製のためマウスの中耳腔にインフルエンザ菌由来のエンドトキシンを注入し、中耳貯留液の出現の有無やその性状を調べるとともに中耳腔粘膜を採取して組織学的変化を検討した。NF-κBデコイをセンダイウイルスベクターをもちいて、アデノイド線維芽細胞に導入した。センダイウイルスを用いたNF-κBデコイの導入では、高効率に短時間でアデノイド線維芽細胞に導入できることがわかった。導入効率は蛍光ラベルしたNF-κBデコイを導入し、FACSをもちいて測定した。同時にVIA-Probeを用いて、センダイウイルスベクターによる細胞障害性についても検討を行った。NF-κBデコイを導入した細胞を、レーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞の形態上、どの部位に導入されているかを検討した。NF-κBは、活性化前は細胞質に存在し、活性化により核内に進入することがわかっている。NF-κBデコイはその多くが細胞質に導入されており、活性化したNF-κBを細胞質にて阻害することが推測された。NF-κBデコイが導入された培養アデノイド線維芽細胞をもちいて、LPS刺激に対するIL-8産生について検討した。本年度は、これまでの研究にてNF-κBデコイの作用が確認できなかったことを受けて、in vitroの系に立ち返りNF-κBデコイの導入効率を確認し、NF-κBデコイの作用を評価することを行った。センダイウイルスベクターを用いることより、NF-κBデコイの導入効率を上げることに成功した。NF-κBデコイの導入効率化により、NF-κB活性化の抑制を確認し、そのメカニズムを検討した。当初の予定であったin vivoでのNF-κBデコイの作用検討まではいたらなかった。今後は、センダイウイルスベクターをin vivoに応用することにより、in vivoでのNF-κBデコイの作用を検討する予定である。
ラットリングフォノンと超伝導

ナノ構造物質が有する内部空間に閉じ込められる元素の異常非調和振動と関係したラットリングフォノンが、電子格子相互作用を介して物質の電子状態に与える影響を超伝導の観点を中心にして研究した。その結果、e-ph相互作用は籠骨格構造の局所的変形を伴う状態密度の減少という場合と、ナノ構造を構成する原子の再構成の結果として非調和ポテンシャルを形成することが判明した。骨格の歪を抑える事のできる物質系では、ラットリングフォノンは、電子格子相互作用が大きくなる可能性を有している。本研究では、クラスタの内部空間に閉じ込められた原子の特異なフォノンがe-ph相互作用により、電子相転移ならびに超伝導に関与する可能性を探求し、新しい物性科学への道を拓くことを目的とする。物性研究の中で興味ある現象として、電子とフォノンの相互作用(e-ph相互作用)が関係した多くの現象がある。この相互作用は、金属-絶縁体転移や超伝導などを発現させる重要な相互作用として知られている。従来この現象に関係するフォノンとしては、結晶の格子振動に関係する格子フォノンがその主な研究対象とされてきた。しかし、最近の研究で多面体クラスタを基本構造とする結晶では、結晶全体に関係する格子フォノンではなくクラスタ内に閉じ込められた原子運動と関係する非調和フォノンが重要な働きをする可能性が指摘され、近年ラットリングフォノンという名称で認識されている。本研究は、正12面体を基本とする多面体クラスタから構築される結晶を用いてラットリングフォノンが関与するe-ph相互作用と電子相転移および超伝導転移との関係を探求する事を研究する。Ba_<24>Ge_<100>とBa_<24>Si_<100>物質は結晶学的に同等な物質であるが、その電子物性は大きく異なる事を見出した。Ba_<24>Ge_<100>とBa_<24>Si_<100>は両方とも超伝導を示すが、圧力に対する臨界温度の依存性が反対の傾向を示す。また、精密X線回折にもとづき、MEM/Rietveld解析をおこなったところ、Ba_<24>Si_<100>におけるBaの電密度分布は等方的であるのに対して、Ba_<24>Ge_<100>は低温で異方性を示すことが明らかになった。この実験事実は、Baのラットリングフォノンが超伝導発現機構に関係している可能性を示唆するものである。そこで、Ba_<24>Ge_<100>とBa_<24>Si_<100>の2つの物質の高圧力下でのBaラットリングフォノンモードを、精密X線構造解析法を用いて検討し、2つの物質の詳細な物性パラメータを圧力の関数として決定した。残念ながら、新しいフォノンモードであるラットリングフォノンと超伝導機構が本当に関係しているかどうかの正確な判断ができる十分な分解能で議論することができなかった。一方、ラットリングフォノンの観測には、固体比熱を正確に測定する事が重要な鍵を握る。そこで、^3He極低温用温度制御システム、比熱測定システム、熱起電能測定システム、熱伝導測定システムにより、ラットリングフォノンの状態を種々の物性の温度変化の観点から詳細に研究した。その結果、熱電係数であるゼーベック係数においても、Baの異常熱振動に依存すると考えられる温度変化を観測することができた。今後はさらに、厳密な比熱解析、ホール測定、ラマン測定など、物性変数を精密に決定するための重要ないくつかの基本的な測定をする必要がある。広い空間の閉じ込められた原子の異常振動が関係した分散の小さいフォノン(ラットリングフォノンと称されている)は、音響フォノンと反交差をして、散乱により熱伝導を著しく阻害することが、スクッテルダイトやクラスレート物質で報告されている。また最近、このような広い空間を有する幾つかの物質群で、原子の異常熱振動と関係していると考えられる超電導などの電子物性が、特殊な幾何構造を有するパイロクロアや開放骨格系のクラスレートで報告されている。本研究では、多彩な幾何構造を有するクラスレートを対象として、結晶中の内部空間に閉じ込められた原子の異常振動と構造・物性の相関を探究するために、I内部空間の大きさが一定の場合の内包原子の大きさの影響および、II内包原子の大きさが一定の場合の骨格構造原子を変えることによる内部空間の大きさの影響の二つの観点に中心をおいて、M_8Ga_<16>Ge_<30>(M=Sr,Ba,Eu)およびBa_<24>IV_<100>(IV=Si,Ge)の物質群の構造と物性を詳細に検討した。M_8Ga_<16>Ge_<30>(M=Sr,Ba,Eu)クラスレート物質系では、内殻準位に対して軟X線光電子分光手段を用いた研究から、骨格構造に関して従来とは異なる重要な知見を得ることできた。

一方、開放骨格を有するクラスレート物質Ba_<24>IV_<100>(IV=Si,Ge)では、従来報告されているGe超伝導体に対して、新しい同構造のSi超伝導体の存在を見出し、同一の内包原子の運動に異なる大きさの内部空間が与える影響の観点から研究を進めた。その結果、内包Ba原子の運動が電子物性に大きな影響を与える状況を二つの物質の比較から明白にすることができた。空間自由度の大きな内部空間に閉じ込められた原子の異常振動が関係した物性を比熱の観点から研究した。対象物質として、結晶学的には同構造であるが、物性が大きく異なる多面体クラスタ物質として、Ba_<24>Si_<100>ならびにBa_<24>Ge_<100>の物質を対象とした。本物質系は、Ba_<24>Ge_<100>が200K付近で構造転移をともない低温で超電導状態になるのに対して、Ba_<24>Si_<100>は低温まで構造転移が明確に観測されないまま超電導状態になることを特徴とする物質である。しかしBa_<24>Si_<100>の比熱を慎重に測定すると、比熱の時間依存性が存在することを見出した。そこで、本現象が本質的なものであるかどうかを確かめることを目的として、別の構造を有する一連のシリコン多面体物質に関して、詳細な比熱を測定した。新しく取り扱った物質は、Ba8Si46を基本とした物質においてBaの一部をSrで置換したBa_2Sr_6Si_<46>物質である。Srは、Baよりもそのイオン半径が小さいので、多面体クラスタ固体の骨格が同じ場合には、内部空間の実効的な自由度を変化させることが可能である。その結果、Ba24Si100で観測された比熱の時間依存性の現象は、本物質系全般に観測される普遍的な現象であることを確認することができた。非熱の時間依存性は、多面体内部空間の作るポテンシャルと関係する現象であることから、超伝導臨界温度との相関が注目される状況である。空間自由度の大きな内部空間に閉じ込められた原子の異常振動フォノンが超伝導とどのように関係するかに関して、結晶学的に等構造であるBa_<24>Si_<100>ならびにBa_<24>Ge_<100>の物質を比較して研究した。二つの物質は物性が大きく異なる多面体幾何物質として重要であり、Ba_<24>Ge_<100>は、内包空間が大きくBaは非調和な振動をする事が知られている。一方Ba_<24>Si_<100>はSi原子が作る籠構造の内部空間がGe原子が作る籠構造よりも小さいための、内部に閉じ込められたBaは比較的調和振動的なフォノンを有する事が分かっている。この二つの物質を軟X線光電子分光を適用してフェルミ準位の状態密度の相対値を求め、SQUIDを用いたパウリ磁化率と比較する事により、フェルミ準位の状態密度の絶対値を算出した。その結果は、第1原理バンド計算で求められた値と良い一致を示した。一方、フォノンが有する特性デバイ温度は、比熱測定の結果をアインシュタインモードとデバインモードの組み合わせ関数を用いて解析することにより実験的に求めた。この得られた実験結果をマクミラン方程式の物理変数と用いて、超伝導臨界温度T_cの観点から超伝導機構を解析したところ、Ba_<24>Si_<100>ならびにBa_<24>Ge_<100>で同程度の電子格子結合定数が見積もられた。この事は、内包原子の異常振動が創出する非調和フォノンは」、この系においては超伝導として強く影響を及ぼさない事を示唆する。
試験管内ES細胞分化誘導系を用いた膵幹細胞の解析

(計画)申請者らは、これまでにES細胞から内胚葉への分化誘導法を開発してきた。ES細胞から分化した膵幹細胞を蛍光蛋白の発現で可視化し、分化誘導する時の細胞の挙動を容易に追跡できるようにした。本プロジェクトでは、ES細胞から膵への細胞系譜の決定、膵幹細胞の性質を理解することを目指し、研究を進めた。その結果、以下の点を明らかにした。1、マウスES細胞から膵幹細胞の誘導に関わるシグナルの同定前年度では、ES細胞から膵臓に至るまでの分化誘導の過程を、ES細胞から中内胚葉、中内胚葉から内胚葉、内胚葉から膵前駆細胞へと3段階に分けて、それぞれの段階において分化誘導に関わる成長増殖分子及びその作用機序を明らかにした(Shirakiら論文投稿中)。すなわち、アクチビンと塩基性FGFがそれぞれの分化段階において正の制御因子として作用していること、さらにこの2つのシグナルは相乗的に作用する効果があることを明らかにした。2、ES細胞由来の膵幹細胞の解析時期特異的に成長増殖因子などを添加することで、ES細胞を消化管前駆細胞、膵臓前駆細胞のような特定の細胞系譜へ選択的に分化させることも可能になり、ES細胞由来の分化細胞をセルソーターを用いて純化し、その遺伝子発現プロファイルについて解析を行った。3、ES細胞由来の膵幹細胞の生体内分化能の解析-動物への移植による分化能の解析上記のES細胞由来の膵幹細胞の分化能について、生体内に移植し、生体内での生存、増殖、分化が可能かどうか、などの生体内における膵幹細胞の挙動、性質の変化について検討する。SCIDマウスの腎臓皮膜下に移植した場合、上記のPdx1陽性膵臓幹細胞からインスリン発現細胞への分化が観察された。したがって、ES細胞由来の膵臓幹細胞はインスリン発現細胞への分化能を有することが分った。我々は、ES細胞から膵幹細胞を分化誘導するためには正常発生と同様な過程を経ることが重要であると考え、膵幹細胞マーカーであるpdx1の発現を指標にしている。そのためには、分化誘導に必要なシグナル源の探索から始めた。様々な検討の結果、膵臓原基の代替となる誘導活性の高い培養細胞株を支持細胞として用いる方法を確立した。この方法では、外胚葉および中胚葉の細胞は分化誘導されずに、内胚葉の細胞が特異的に効率よく誘導されている。更にpdx-1/GFPマウスからES細胞を樹立し、上記の分化誘導法と組み合わせることにより、各種因子が膵前駆細胞への分化に与える影響について経時的かつ簡便に観察することが可能となった。上述の分化誘導法により、始めて大量にPdx1/GFP陽性細胞をES細胞から得ることが可能になった。セルソーターを用いて、GFP陽性細胞の蛍光強度に基づき純化することができ、ES細胞由来の膵前駆細胞の遺伝子発現網羅的解析を行なった。これは国内外でも初めての成功例である(吉田ら、論文準備中)。得られたpdx-1/GFP陽性細胞で発現する遺伝子について、既に報告されているマウス胎生7.5日目の内胚葉層及び胎生9.5日目の膵前駆細胞の遺伝子発現プロファイル(Gu et al.2004)と比較した。今回得られた、ES細胞由来の膵前駆細胞の遺伝子プロファイルは、マウス胎生7.5日目の内胚葉の遺伝子プロファイルとよく似ているものであり、ES細胞から膵への分化誘導は正常胚発生を再現していることが強く示唆された。ES細胞由来の分化細胞と初期胚発生の正常細胞とで共通して発現している遺伝子には、消化器以外の体性幹細胞でも共通して発現している遺伝子が含まれている(吉田ら論文準備中)。したがって、ES細胞由来のPdx1陽性細胞は、幹細胞の性質を一部持つと予想される。SCID

マウスの腎臓皮膜下に移植した場合、上記のPdx1陽性膵臓幹細胞からインスリン発現細胞への分化が観察された。したがって、ES細胞由来の膵臓幹細胞はインスリン発現細胞への分化能を有することが分った。
先進諸国の現代的政治変容をめぐる理論と現実との交錯

本研究課題の達成のため、アメリカ合衆国とドイツ連邦共和国とに、それぞれ3回にわたり現地に赴きながら、先進諸国政治の比較政治学的研究のための研究会議出席や、ヒアリング調査・資料収集等を行った。それらの作業に加え、日本での図書購入や資料収集、研究会開催などの作業も行った上での、本研究の成果の概要は以下の通りである。第1に、比較政治理論研究に関して言えば、アメリカ出張の機会を利用し、この領域における最先端の理論状況についての知見を深め、またデューク大学のキッチェルト教授をはじめとする第一線の研究者との討論も行った。その成果はまず、民主化理論における最新の理論状況をとりまとめた上で、アジア諸国攻治の比較へのそれらの適用可能性を探った論文「比較政治学の新たな可能性-アジア諸国の政治をいかに比較するか-」として公表された。この分野ではさらに、「法整備支援の比較政治学的考察をめざして-E・オストロームの支援論を手がかりに-」と題する論文も公刊した。次に、本研究のテーマである「理論と実践との交錯」という観点から「実践的政治学の構築」をめざした論稿「法科大学院の政治学には何が必要か」も公刊した。また、2003年秋には韓国で行われた国際会議に招待され、「比較の中の日本政治と韓国」と題する報告を行った。また2004年秋にはウズベキスタンで開催された、民主化に関する国際会議にも招待され、そこで「民主主義の指標論」に関する英文報告を行った。この報告ペーパーは、報告後『名古屋大学法政論集』で公刊された。第2に、先進諸国政治の現状分析に関しては、この間注目を集めたドイツにおける政権交代に焦点を当てた。1998年選挙で政権を奪取したドイツ社会民主党と緑の党は、経済状況の不調による失業率上昇もありながら、旧東ドイツ地域での洪水事件やイラク攻撃という偶発的な出来事に助けられ、今回の選挙でかろうじて政権を維持した。この経過について、「比較の中の現代ドイツ政治序論-2002年9月に実施されたドイツ連邦議会選挙を手がかりとして-」と題する研究論文を公刊した。現在それに引き続く論文執筆を行っているところである。なお、これらの作業の副次的成果として、この2年間に日本で開催された2回の国際研究会議でも、報告する機会を得た。本研究の第1の目的は、ドイツ政治を中心とした、先進諸国政治の現状分析である。そのために、設備備品費を利用しながら、先進諸国政治研究の文献を年度初めから系統的に収集してきた。さらに2004年1月にはドイツを訪問し、ハイデルベルク大学現代政治研究所のメルケル教授・シュミット教授らへのインタビューを通じて、現代ドイツ政治研究の状況に関する調査を行った。この時に合わせて、フランクフルト市にある社会民主党事務所と、ヴィースバーデン市にある緑の党の事務所を訪問し、資料収集と聞き取り調査をも実施した。これらの成果は、「シリーズ比較の中の現代ドイツ政治」と題する論文で公表する予定であり、2004年3月には、同シリーズの第2論文「比較の中の現代ドイツ政治序論」が『名古屋大学法政論集』に掲載された。本研究の第2の目的は、比較政治理論の検討であり、このテーマに関しても、設備備品費を活用しながら文献収集を行っている。

また、本研究代表者が「研究分担者」を務めている他の科学研究費を利用して、平成15年4月と8月にアメリカ合衆国を訪問し、比較政治理論に関する国際研究会議に出席して、知見を広めるとともに各国研究者との議論も行った。この成果の一部は、「拒否権プレーヤー」研究として進められた。その後平成16年3月には、イタリアにおける比較政治研究の中心である2つの機関-ミラノ大学とヨーロッパ大学機構-の政治学研究者を訪問し、聞き取り調査を行った。これらの作業を踏まえ、本研究における新たな目的として、比較政治理論による「比較民主化過程研究」をめざすこととなった。そのために平成15年11月に韓国を訪問し、韓国の政治学研究者との議論も行った。新たな政治学理論を追求するこれらの研究の一部は、「法科大学院の政治学には何が必要か」(東大出版会『UP』2003年12月号掲載)にまとめられた。本研究課題の達成のため、アメリカ合衆国とドイツ連邦共和国とに、それぞれ3回にわたり赴きながら、先進諸国政治の比較政治学的研究のための研究会議出席や、ヒアリング調査・資料収集等を行った。それらの作業に加え、日本での図書購入や資料収集、研究会開催などの作業も行った上での、本研究の成果の概要は以下の通りである。第1に、比較政治理論研究に関して言えば、アメリカ出張の機会を利用し、この領域における最先端の理論状況についての知見を深め、デューク大学のキッチェルト教授らとの討論も行った。その成果はまず、民主化理論における最新の理論状況を取りまとめた上で、アジア諸国政治の比較へのそれらの適用可能性を探った論文「比較政治学の新たな可能性-アジア諸国の政治をいかに比較するか-」として公表された。この分野では更に、「法整備支援の比較政治学的考察をめざして」と題する論文も公刊した。次に、本研究のテーマでもある「理論と実践との交錯」という観点から「実践的政治学の構築」をめざした論考「法科大学院の政治学には何が必要か」も公刊した。また、2003年秋には韓国で行われた国際会議に招待され、「比較の中の日本政治と韓国」と題する報告を行った。また2004年秋にはウズベキスタンで開催された、民主化に関する国際会議にも招待され、そこで「民主化の指標論」に関する英文報告も行った。このペーパーは、名古屋大学『法政論集』で公刊された。第2に、先進諸国政治の現状分析に関しては、ドイツにおける政権交代に焦点を当て、「比較の中の現代ドイツ政治序論」と題する研究論文を公刊した。現在それに引き続く論文執筆を行っているところである。なお、これらの作業の副次的成果として、この2年間に日本で開催された2回の国際会議で英語発表を行う機会を得た。
水産無脊椎動物における外骨格の幾何学的構造を考慮した成長モデルの新展開

無脊椎動物の体の構造を考慮に入れて開発された既存の成長モデル(成長曲線)について、さらに固有の生活史をモデルに反映させる場合の、新しい展開の可能性を考察した。体構造の幾何学的な扱いやすさから二枚貝を研究材料とした。水産業では、特に生息場の水温をはじめ環境要因やストレスと成長速度の結びつきについての関心が高く、この視点に立ったモデル拡張も試みた。候補となった多くのモデルの微分方程式は解析的に扱えず、カーブフィット以外の、数値解法にもとづく用途についても検討が必要である。二枚貝の生息条件と水産上の利用形態に注目し、アカガイ、ホタテ、シジミ、3種についてモデル構築の基礎情報を得るため、研究機関でヒアリング調査を行った。それぞれ、南方の天然資源、北方の増養殖対象資源、中間的な天然資源と位置づけた。既存の改良型成長モデルに優先的にモデルを付加する必要がある構造として、生殖腺重量の季節変動が3種に共通して挙げられた。研究機関で閲覧した生データから判断して、季節変動は周期関数で単純に描ける場合とそうでない場合があり、さらに年と成長段階による違いが混在している。ホタテにおいては成長速度が速く、硬組織の面拡張期と肥厚期が交互にある。波浪や個体の取扱いの方法によって生じるストレスが原因で、成長速度が鈍化する現象もみられる。このような要素を取り込んだモデル化は非常に困難と思われた。モデル開発・検証の実測データ収集は全般的に困難であった。増養殖対象種では、漁業経営の安定を計るため、病害のリスクを受ける前の出荷が主体で、飼育個体はますます小型化している。ホタテの生涯成長を追跡できるデータは現在ほとんど得られない。アカガイについては若齢個体のデータを入手したが成長が遅い種であり個体群の生涯を通じたモデル検証にふさわしいデータではなかった。研究機関としては、カーブフィットや成長解析のためのモデルよりも、成長予測を主体とするツールが期待されていた。以上のような調査結果から、生殖腺重量の周期変動がみかけ上、相対的に小さく、生涯を通じた測定データが得られるような種を選定し、モデル検証用データを得る必要がある。モデル開発の方向としては、速度の周期変動よりも環境やストレスによる硬組織の幾何学的多様性に注目すべきである。Ohnishi・Akamine標準型モデル(以下OAモデル)の検証に用いる情報として、ホッキガイ放流稚貝の成長を追跡記録した個体別データ(年齢・殻長)を、福島県水産試験場栽培漁業部の協力により入手した。また体部位の幾何学的成長を精査する資料として、殻長と殻重量の個体別測定記録を東北大学より借用できた。OAに加えてVBGF、Logistic、Gompertz各モデルを、年齢・殻長値に当てはめた結果、情報量規準にもとづきOAモデルの適性が確認できた。ここでのソフトウェア構築にはMS-ExcelソルバとMatlabを用いた。さらにOAモデルの発展形の理論的考察を行った。硬組織の成長に多様性を与えるため、繁殖・ストレス・季節性による成長変動を導入した。“繁殖"と“季節性"については、a(体成長)b(生殖腺成長)c(殻成長)の間のエネルギ配分を幾何的構造に沿って定式化した。a-b間の周期的配分がcに及ぶモデルを構築した。この時点でモデルは解析的に扱えず、成長方程式は数値解法に基づくものとなった。生息環境下における貝個体のストレスと成長の関わりについては、ストレスに曝露されている時間の長さが変数になる。そこで、体表面積の変化速度に乗じる係数が時間の関数となる表現を用いた。これにより、年齢(加齢)に伴って、殻形成分泌の生理機能が時間変化する仕組みを導入できる。この場合のモデルは変数分離型にならず、また一般的なdL/dt型で解くことはできず、逆数のdt/dL型にした場合に、線形微分方程式となった。解法については前者と同様に、数値解法に基づく必要があった。
質量分析法を用いた睡眠呼吸障害における脂質代謝異常のメカニズムの検討

睡眠呼吸障害は、心筋梗塞、心不全や脳卒中など様々な心血管疾患の危険因子であることはよく知られている。研究代表者はこれまで、睡眠呼吸障害による血中の一酸化窒素や心血管機能への影響について研究してきた。睡眠呼吸障害の第一治療選択である持続気道陽圧療法によりこれらの心血管疾患の発症リスクが抑制されることも報告されている。この発症抑制のメカニズムには持続気道陽圧療法による血圧低下効果のみならず、中性脂肪やコレステロールの低下作用による影響も報告されている。したがって、睡眠呼吸障害患者において、将来的な心血管疾患の発症や疾患増悪を予防するためには、十分な治療により患者の脂質代謝異常をコントロールすることが重要である。しかしながら、睡眠呼吸障害における脂質代謝異常となるメカニズムについては十分に検討されていない。近年、質量分析計により包括的な脂質メタボローム解析が可能となり、ヒトにおいてもその代謝メカニズムを検討することができるようになった。本研究では、脂質質量分析法を用いて、1睡眠呼吸障害患者を対象に、健常人との比較および重症度別の比較により、睡眠呼吸障害の脂質代謝異常への影響、2炎症に関わるとされている脂肪酸領域を対象に睡眠呼吸障害の炎症へのかかわり方について検討する。前年度に引き続き検体収集および睡眠ポリグラフ検査を継続した。収集した血液は遠心分離後、血漿部分を-80°Cで保管し、解析を順次行っている。また、同時に健常人の検体を収集し、睡眠に関連した情報も蓄積した。これらの対象で、睡眠時間と血中の脂質メタボロームとの関連を検討し、いくつかの脂質分子種において睡眠時間と関連することを確認した。研究代表者の異動と研究環境のセッティングおよび病気等の理由により当初計画よりやや遅れている。昨年度までに、検体収集および質量分析のための研究環境セッティングを終えられた。本年度は、検体収集を再開し、解析に必要な検体数を集める。さらに、検体収集と質量分析を同時に進め、睡眠呼吸障害と関連する脂質分子種の検討をする。睡眠呼吸障害患者における脂質代謝異常は、メタ解析により、すべての脂質成分の異常:総コレステロール、LDLコレステロールおよび中性脂肪の上昇、HDLコレステロールの低下などが認められることが明らかとなっている。睡眠中の無呼吸低呼吸による慢性的な間歇的低酸素血症は、stearoyl-coenzyme A desaturase-1や活性酸素種を産生させたり、脂質の過酸化や交感神経活動の活性化を引き起こすことにより、脂質代謝異常に関係している可能性が示されている。しかし、睡眠呼吸障害がどのように脂質代謝を変化させるのかは十分に明らかにされてはいない。質量分析計により包括的な脂質メタボローム解析が可能となり、ヒトにおいてもその代謝メカニズムを検討することができるようになった。本研究では、睡眠呼吸障害による脂質代謝異常への影響を検討するために、質量分析法を用いて中性脂肪領域およびリン脂質領域をターゲットに、睡眠呼吸障害患者と健常成人との比較および重症度での比較することにより、脂質代謝異常の包括的解析を行う。また、脂質成分中でも炎症に関連しているといわれる脂肪酸をターゲットに、他の炎症性マーカーと比較することにより、睡眠呼吸障害がどのように炎症に関与しているかを明らかにする。本年度は、睡眠呼吸障害患者への研究説明と検体および検査結果の収集をおこなった。睡眠ポリグラフ検査を行い睡眠呼吸障害と診断され、研究に同意した患者から、血液検体を取得した。遠心分離後、血漿部分を-80°Cで冷凍保存した。現在、症例を20例集積し、次年度以降も症例の収集および対照群への研究説明と検体収集を行う予定である。患者群の検体集めは順調に進んでおり、次年度から解析を始める予定である。この発症抑制のメカニズには持続気道陽圧療法による血圧低下効果のみならず、中性脂肪やコレステロールの低下作用による影響も報告されている。本研究では、脂脂質質量分析法を用いて、1睡眠呼吸障害患者を対象に、健常人との比較および重症度別の比較により、睡眠呼吸障害の脂質代謝異常への影響、2炎症に関わるとされている脂肪酸領域を対象に睡眠呼吸障害の炎症へのかかわり方について検討する。これらの対象で、睡眠時間と血中の脂質メタボロームとの関連を検討した。検体収集は順調に進んでいる。一部の検体の測定を行い、データを得ている。睡眠呼吸障害の第一治療選択である持続

気道陽圧療法によりこれらの心血管疾患の発症リスクが抑制されることも報告されている。この発症抑制のメカニズムには持続気道陽圧療法による血圧低下効果のみならず、中性脂肪やコレステロールの低下作用による影響も報告されている。したがって、睡眠呼吸障害患者において、将来的な心血管疾患の発症や疾患増悪を予防するためには、十分な治療により患者の脂質代謝異常をコントロールすることが重要である。しかしながら、睡眠呼吸障害における脂質代謝異常となるメカニズムについては十分に検討されていない。近年、質量分析計により包括的な脂質メタボローム解析が可能となり、ヒトにおいてもその代謝メカニズムを検討することができるようになった。本研究では、脂質質量分析法を用いて、1睡眠呼吸障害患者を対象に、健常人との比較および重症度別の比較により、睡眠呼吸障害の脂質代謝異常への影響、2炎症に関わるとされている脂肪酸領域を対象に睡眠呼吸障害の炎症へのかかわり方について検討する。前年度に引き続き検体収集および睡眠ポリグラフ検査を継続した。収集した血液は遠心分離後、血漿部分を-80°Cで保管し、解析を順次行っている。また、同時に健常人の検体を収集し、睡眠に関連した情報も蓄積した。これらの対象で、睡眠時間と血中の脂質メタボロームとの関連を検討し、いくつかの脂質分子種において睡眠時間と関連することを確認した。研究代表者の異動と研究環境のセッティングおよび病気等の理由により当初計画よりやや遅れている。本年度に収集した検体を用いて、血液中の脂質質量分析を行っていく。また、対照群となる方を対象に、研究説明・同意書取得、検体採取を行っていく予定である。検体の収集を継続し、血液中の脂質質量分析を行っていく。昨年度までに、検体収集および質量分析のための研究環境セッティングを終えられた。本年度は、検体収集を再開し、解析に必要な検体数を集める。さらに、検体収集と質量分析を同時に進め、睡眠呼吸障害と関連する脂質分子種の検討をする。本年度は患者群の検体採取のみを行い人件費・謝金を使用しなかったため、差額が生じた。2017年度は患者検体の収集に注力したため、測定の費用および謝金等の支払いが必要なくなり、次年度使用額が生じた。2018年度は、これまでに収集した検体の測定を進めていくため、これらの消耗品や機器使用料に充てていく。2018年度は患者検体、コントロール検体収集のための体制づくりのため、検体収集が思うように進まず、研究費使用が少なくなった。2019年度は、これまでに収集した検体の測定を進めていくため、これらの消耗品や機器使用料に充てていく。次年度以降で、対照群の検体採取等で使用していく。
核内オーファン受容体RORのリガンド探索

ROR(Retioid related Orphan Receptor)はDNA結合領域がRARと類似性をもつレチノイド関連核内受容体である。RORのリガンドは未知であり、構成的な転写活性化能をもつとされ、脳の発達や免疫系などに関与していると示唆されている。このRORの内因性もしくは合成リガンドを探索する目的で、まずRORリガンドの活性の評価系としセ、転写活性化能を検討するためのレポーターアッセイ系について高い再現性を示す条件を種々検討した。その過程で、内因性リガンド候補として松果体ホルモンであるメラトニンおよびレチノイン酸を想定し、その誘導体を合成して、活性を検討したが、9-cisレチノイン酸がわずかにROR転写活性に影響を与えた以外は不活性であった。また、既にリガンド探索用にコンピュータ上で構築したRORのリガンド結合領域の3次元構造のより確からしいモデリングを行い、その受容体構造に対して、市販品データベース中の化合物群とのドッキングを行った。その結果、適度な長さの脂肪酸誘導体にROR結合親和性を有する可能性を示した。その後、RORのリガンド結合領域の結晶解析が報告されたが、その受容体にはステアリン酸がリガンド結合空間におさまっており、本研究者らの構築したモデルが信頼しうるものであることがわかった。このモデルを用いることにより、RORアゴニストもしくはアンタゴニストの論理的探索が可能である。レチノイド関連核内受容体RORはリガンド未知のオーファン受容体である。RORについては、リガンドの活性を評価する適切な評価系がないので、その特異的リガンドを探索するにあたり、まず、転写活性化能を検討するためのレポーターアッセイ系を構築した。Giguere博士より供与されたROR発現用プラスミドとコンセンサスなRORE(ROR応答部位)下流にルシフェラーゼ遺伝子をつなげたレポータープラスミド(RORE)-3TKLUCを用いて、COS-1細胞への一過性遺伝子導入を行った。この系において、RORは構成的にレポーター遺伝子の発現誘導を引き起こした。この結果はGiguereらの報告と一致する。RORのリガンド候補化合物としてCarlbergらによって報告されているメラトニンの効果を、このレポーターアッセイ系で検討したが、構成的発現に対する影響は見られなかった。また、RORのリガンド結合領域がレチノイド受容体RARと最も相同性が高いことから、レチノイン酸及びその天然、合成誘導体を用いて、ROR転写活性化に対する効果を検討したが、いずれも不活性であった。RORの特異的リガンドを計算化学的に探索する目的で、RORのリガンド結合領域の3次元構造モデリングを行った。RARとのアミノ酸配列のアラインメントを行い、その結果と、結晶構造が報告されているRARγの立体構造を鋳型としてRORの立体構造を構築した。しかしながら、アミノ酸測鎖の自由度が大きいことなどに由来する複数のモデルが提唱され、現在、他の核内受容体を鋳型とするなど、より信頼性の高いモデリングの検討を行っている。
単子葉花き園芸植物の花被形成を司る分子機構の解明

まず、改変ABCモデルにおけるクラスB変異体であると期待できるチューリップの品種群の解析により、2つのクラスB DEF-like遺伝子の発現量低下が花被片の緑色化に関与していることが示唆された。また、ABCDEモデルにおいて花弁形成に関与するとされている遺伝子に着目し、野生種(Alstroemeria ligtu)においてRT-PCR法などによる発現場所を特定およびシロイヌナズナへの形質転換の結果から、クラスA,クラスE遺伝子はアルストロメリアではモデルとは異なる発現パターンを示すこと、AGL6-like遺伝子は花被形成と何らかの関わりがある可能性と、クラスAとクラスC遺伝子の拮抗関係に作用している可能性が示唆された。そして、花序分裂組織から花芽分裂組織への切り替えの部分に異常がある変異体品種における遺伝子の発現解析により、変異体品種では調査した7遺伝子のうち3遺伝子で変異体での発現量減少が確認された。その中でも、AlsLFYは変異のカギとなる花序形成開始期から発現量が減少しており、変異の原因遺伝子の候補として有力視できそうである。<まとめ>単子葉植物における花芽および花弁状花被形成に関する考察二層の花弁状花被を持つ単子葉植物に関して、近年様々な植物種においてクラスB遺伝子の発現解析がなされ、改変ABCモデルを支持する結果が示されてきたが、本研究では更に変異体の研究を行うことで、クラスB遺伝子と二層の花弁状花被形成の関連性を強く示すことが出来た。一方でクラスA,E,AGL6-like遺伝子等の調査により他の遺伝子に関しては単純に改変ABCモデルだけで説明することが困難であることを浮き彫りにした。今後、更に詳細な調査や、他の植物種を使った調査により、より高次のモデルを構築することが望まれる。
木材腐朽菌の繁殖分散戦略と昆虫との関係

木材腐朽菌の、倒木上の発生に、昆虫がどの程度寄与しているのかを調べるため、ミズナラ、イタヤカエデの2樹種、3直径階からなる60本の昆虫排除処理を施した倒木と同数の対照木において、発生する木材腐朽菌の種を比較した。実験は、北大付属苫小牧研究林で行い、平坦な林床に10m間隔で、それぞれの倒木を設置した。6月から9月まで、木材腐朽菌調査を月二回、訪木材昆虫調査を月に一回行った。その結果、一部未同定種を含む、約29種の木材腐朽菌の発生が確認された。これら29種の木材腐朽菌の材ごとの発生種数について、材の樹種、処理、大きさの3つをファクターとする、3元分散分析を行った結果、全ての主要因と、樹種×大きさ、そして3次の交互作用項の効果が有意となり、材上の木材腐朽菌種数に、昆虫が寄与している可能性が示唆され、その効果が樹種、材の大きさで異なることが分かった。また、10以上の材からの発生の見られた木材腐朽菌種6種を用いて、それぞれの種の、材上での在不在を目的変量、材の樹種、処理、大きさの3変数を説明変量とする多重ロジスティック回帰を行った結果、ある木材腐朽菌種において、処理の効果が有意に正の効果を持っていることが分かった。以上のことより、木材腐朽菌の発生において、昆虫が寄与していることが示唆され、どのような種において昆虫が重要かを特定することが出来た。今後は調査により採集された未同定の木材腐朽菌種の同定を行うことで、より正確な結果を求めるとともに、各設置木材から採集された昆虫の同定を進めることで、具体的に,どの昆虫が,どの菌種と関係を持っているのかを明らかにする必要がある.木材腐朽菌の、倒木上の発生に、昆虫がどの程度寄与しているのかを調べるため、ミズナラ、イタヤカエデの2樹種、3直径階からなる60本の昆虫排除処理を施した倒木と同数の対照木において、発生する木材腐朽菌の種を比較した。今後は調査を継続することで、さらに腐朽段階が進んだ時点での昆虫の効果を明らかにする必要がある。今後は調査により採集された未同定の木材腐朽菌種の同定を行うことで、より正確な結果を求めるとともに、各設置木材から採集された昆虫の同定を進めることで、具体的に,どの昆虫が,どの菌種と関係を持っているのかを明らかにする必要がある.

木材腐朽菌の、倒木上の発生に、昆虫がどの程度寄与しているのかを調べるため、ミズナラ、イタヤカエデの2樹種、3直径階からなる60本の昆虫排除処理を施した倒木と同数の対照木において、発生する木材腐朽菌の種を比較した。実験は、北大付属苫小牧研究林で行い、平坦な林床に10m間隔で、それぞれの倒木を設置した。6月から9月まで、木材腐朽菌調査を月二回、訪木材昆虫調査を月に一回行った。その結果、一部未同定種を含む、約29種の木材腐朽菌の発生が確認された。これら29種の木材腐朽菌の材ごとの発生種数について、材の樹種、処理、大きさの3つをファクターとする、3元分散分析を行った結果、全ての主要因と、樹種×大きさ、そして3次の交互作用項の効果が有意となり、材上の木材腐朽菌種数に、昆虫が寄与している可能性が示唆され、その効果が樹種、材の大きさで異なることが分かった。また、10以上の材からの発生の見られた木材腐朽菌種6種を用いて、それぞれの種の、材上での在不在を目的変量、材の樹種、処理、大きさの3変数を説明変量とする多重ロジスティック回帰を行った結果、ある木材腐朽菌種において、処理の効果が有意に正の効果を持っていることが分かった。以上のことより、木材腐朽菌の発生において、昆虫が寄与していることが示唆され、どのような種において昆虫が重要かを特定することが出来た。今後は調査により採集された未同定の木材腐朽菌種の同定を行うことで、より正確な結果を求めるとともに、各設置木材から採集された昆虫の同定を進めることで、具体的に,どの昆虫が,どの菌種と関係を持っているのかを明らかにする必要がある.
材質認識と物体認識を融合した画像認識の新展開

これまで行ってきた研究内容は大きく分けて3つある。1つめは、機械学習器の確信度判定である。正しく確信度を判定できれば、確信度が低い場合に別の特徴抽出や機械学習の手法を導入ことによって判定結果を正しいものに上書きできる。2つめは、進化計算を用いたCNNの構造・パラメータ自動最適化の研究である。CNNの構造・パラメータを進化計算による探索によって最適化した。3つめは文脈に基づく物体検出・認識性能の向上である。画像中に共起している他の物体の情報や、物体の出現位置や大きさを考慮して確信度を再計算する手法を提案した。本研究の目的は、これまで独立に行われてきた「材質認識」と「物体認識(形状認識)」を融合して処理し、互いのデータを補助的に用いることでそれぞれのタスクの認識率を向上させること、さらに材質・形状を手がかりとしたさらに細かな画像分類を可能とすることであった。しかし、深層学習などあたらしい手法の登場により両者の垣根がなくなり同等の問題として扱われるようになってきた。そのため、下記のように研究の力点を変え、材質認識、物体認識両方に一般的に利用可能な手法について研究を進めた。正しく確信度を判定できれば、確信度が低い場合に別の特徴抽出や機械学習の手法を導入ことによって判定結果を正しいものに上書きできる可能性がある。この確信度判定について、解析的な手法と機械学習を用いる手法を提案した。CNNに代表される深層学習は、研究者が手作業で特徴量抽出アルゴリズムを決定する必要がない画期的な手法とされているが、構造・パラメータについては研究者がやはり手作業で決定する必要がある。これらの最適化は探索空間が広く手作業による最適化は非常に困難であるため、進化計算による自動最適化について研究している。本年度は特に粒子群最適化法による最適化の検討を行った。3つめは事例に基づく局所特徴量の高速化である。物体・材質認識においては画像の小さな領域から局所特徴量を抽出する作業に多くの時間を割いている。そこで、過去の処理結果を事例としてデータベースに格納し、データベースを参照することにより局所特徴量算出の計算をしなくとも特徴量が得られる手法を研究した。これらの最適化は探索空間が広く手作業による最適化は非常に困難であるため、進化計算による自動最適化について研究た。本年度は特に粒子群最適化法による最適化を行い、具体的な性能向上を確認すると共に画像認識のスマートフォンアプリを公開した。研究内容について申請時の研究計画からの修正はあるものの、逆により汎用性の高い複数の課題について研究を行うことができ、予想以上の成果をあげている1つめの機械学習器の確信度判定については、論文誌に再録されたほかその拡張方式を国際会議に投稿中である。これまでのところ、SVMが出力する分離超平面からの符号付き距離やConvolutional Neural Network (CNN)などで用いられるsoft-max法が出力する確率値などに対して解析的な手法と機械学習による手法の2つを提案し、研究代表者がこれまで研究してきた差分法にくらべて大きな精度向上が実現できた。また、CNNで確信度が低い場合にAdaboostと組み合わせることで画像認識精度を向上できることを実験的に示した。2つめのCNNの構造・パラメータ自動最適化については、大規模な実験によりその有効性を確認した。進化計算は多くのシードを用いて繰り返して最適化を行うため計算時間が膨大になる問題があるが、小規模な学習ででも大規模な学習とほぼ同等の性能が得られる方式を開発した。これは、進化計算を行う場合、最終的な精度がわからなくとも個体同士の優劣差が明らかになればよい、という知見に基づく。数種類の標準画像データセットを用いて認識実験を行ったところ、いずれの場合においても数%の精度向上を確認した。3つめの文脈に基づく物体検出・認識性能の向上については、どのような物体検出手法に対しても適用可能な後処理として、画像の文脈情報を用いた出力の高精度化を行っている。