hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニホンザルにおける腸内細菌叢の形成過程および伝播メカニズム

腸内細菌叢の形成過程および伝播メカニズムを解明するため、異なる条件下の霊長類を対象にメタゲノム解析を実施した。季節によって食性が大きく変動する野生ニホンザルを対象に採食内容と腸内細菌叢の関連性を検証したところ、昆虫食中心の時期であっても、ベジタリアンにみられるような腸内細菌タイプになることがわかった。母子間の類似性および母子分離による影響を検証するために予定していた飼育ニホンザルでの実験は、新生児からの糞サンプリングが非常に困難であったため、動物園で飼育される別の霊長類種の母子での実験に切り替え、現在データ解析を進めているところである。本申請研究は、ニホンザルの腸内細菌叢における形成過程および伝播メカニズムの解明を目的とする。異なる条件下のニホンザル母子を対象に、腸内細菌叢における菌種組成の解析および細菌の系統分類をおこなう。具体的な目標は、(1)母子間の類似性:垂直伝播メカニズムの解明、(2)母子分離によってもたらされる影響の評価、(3)採食内容と腸内細菌叢における関連性の検証である。(1)および(2)については、生まれたばかりのアカンボウとその母親(4個体ずつ)の糞中の腸内細菌叢を解析し、母子間の類似度から垂直伝播の影響を評価する計画であった。しかし、実験中にアカンボウが3個体死亡してしまったため、次年度も継続してサンプリングを実施する運びとなった。また、アカンボウからのサンプリングが予想以上に困難であったことから、次年度は対象種を広げることを検討している。(3)についてはおおむね順調であり、飼育ニホンザルだけでなく、多様な食性をもつ野生ニホンザルも対象とし、食性がもたらす腸内細菌叢への影響について解析に取り組んでいる。メタゲノム解析については、慶應義塾大学先端生命科学研究所の福田真嗣准教授のもとで、次世代シーケンサー(ロシュ社: GS Junior)を用いた腸内細菌叢解析の技術を学んだ。現在は、ランニングコストの低いMiseq(イルミナ社)に切り替え、解析を進めている。本申請研究は、異なる条件下のニホンザルを対象に、腸内細菌叢の形成過程および伝播メカニズムの解明を目的とするものであった。具体的な研究目的は、(1)母子間の類似性の解明、(2)母子分離によってもたらされる影響の評価、(3)採食内容と腸内細菌における関連性の検証の3点であった。今年度は、次世代シークエンサーを用いたメタゲノム解析の実験系を確立に取り組み、リード・クオリティ値ともに非常に良好なデータを得られるようになった。(1)については、所属機関で個別飼育するニホンザル母子を対象とした実験を予定していた。しかし、当初から懸念していた以上に、母親に抱かれたまま排泄する新生児からの糞サンプリングが困難であったことに加え、実験個体が死亡するという想定外の出来事が起こったため、必要なサンプル数を採取することができなかった。そこで、動物園で飼育されるドゥクラングールの母子での実験に切り替えた。途中から新生児が人工哺育になったことから、(2)についても検証できると考える。母子からのサンプリングはすでに終了しており、現在はデータ解析を進めているところである。(3)については、屋久島の野生ニホンザルを対象とし、12か月に渡る詳細な採食データをもとに、採食内容が腸内細菌叢にもたらす影響を検証するなど、当初の予定以上の成果を収めることができた。この結果は、国内外の学会でも発表し、現在は論文を執筆中である。以上のことから、総合的には本年度の研究はおおむね順調に進展したといえる。採食生態学次年度も継続して糞サンプリングを実施することになった。当初から、必要数のサンプルが集められなかった場合には、サンプリングを継続することになっていたため、計画自体に大きな変更はない。しかし、母親に抱かれたまま排泄するアカンボウからの糞サンプリングは予想していた以上に困難であることから、ニホンザルに加えて、ハンドリングの容易であるコモンマーモセットでの実験も検討している。メタゲノム解析については、京都大学・早川卓志氏の協力のもと、大変順調に進捗している。予備実験を実施したところ、質的にも量的にも十分なデータを得ることができた。研究成果は、日本生態学会第61回全国大会などで発表済みである。また、解析系をGS JuniorからMiseqに移行したことで、かかる費用を大幅に下げることに成功した。平成26年度は、実験個体数を増やして糞サンプリングを実施する。それでも必要なサンプル数を確保できなかった可能性を想定し、ハンドリングの容易な霊長類(コモンマーモセット)での実験も並行して進める。対象種が変更になった場合でも、ヒト以外の霊長類種を対象に、ヒトの腸内細菌叢研究にも貢献できるようなモデルの提示するという当初の目的は達成できると考える。当初の予定よりも実験の進捗状況がやや遅れていることもあり、使用期限の短い試薬(次世代シーケンサー用)の購入を次年度に延期した。次世代シーケンサー解析のための試薬購入に用いる。
脳卒中急性期患者に対する口腔の衛生・機能維持を目的とした口腔ケアプログラムの開発

脳卒中急性期患者に対して、口腔の衛生・機能維持を目的とした口腔ケアプログラムを実施した.脳卒中急性期患者の口腔内状況をOAGにより評価したが、14日間を経時的にみると口腔内状況に有意な差は認めなかった。また、口腔内環境を口腔粘膜の水分量にて評価したところ、14日間を経時的にみると6日目、7日目あたりに水分量が増えていることが明らかになった。さらに、脳卒中患者の急性期群と亜急性期群の口腔内状況を3期に区分しOAGにより評価したが、脳卒中の発症病日による口腔内状況に有意な差は認めなかった。本研究の目的は、脳卒中急性期患者に対する口腔の衛生・機能維持を意図とした口腔ケアプログラムを開発することである。内容としては、脳卒中急性期患者の口腔環境および咀嚼・嚥下・発音・呼吸などの口腔アセスメントを実施し、口腔衛生・機能維持を目的とした口腔ケアに関するニーズ調査を計画した。実施にあたり研究対象者のさらなる確保のため、新たな協力病院を開拓した。研究対象者が脳卒中患者であり、患者の安全および安楽を最優先し、人権およびプライバシーの保護について慎重に検討を重ねた。倫理審査委員会では、患者への説明依頼書・同意書などの内容や評価項目についての指導を受け、念入りに検討を重ねた。そのため、協力病院の倫理審査委員会にて承認を得るに時間を要した。さらに、口腔ケアや摂食・嚥下に関する専門家に指導をおよびスーパーバイズを受け、かつ協力病院の医師・歯科医師・看護師・言語療法士など多職種により、口腔アセスメント方法について吟味した。加えて、研究の事前準備として評価する看護師への勉強会・実技演習を実施し、口腔アセスメント方法を統一できるよう体制を強化した。現在、データ収集の段階である。研究対象者からは経口摂取の開始後に、次のような感想を得ている。内容としては、「食べられなかった間は、生きたここちがしなかった。」「水を飲んだ時、生き返ったと思った。」「食べられることは嬉しい。」などである。引き続きデータを収集し、脳卒中急性期患者の口腔内の特徴を明らかにし、口腔ケアに関するニーズを把握し、分析を進めることとする。この結果により、脳卒中急性期患者の口腔衛生と口腔機能の特徴が明らかとなり、脳卒中急性期患者に適した口腔ケアプログラムの開発につながると考える。本研究の目的は、脳卒中急性期患者に対する口腔の衛生・機能維持を目的とした口腔ケアプログラムを開発することである。1).脳卒中急性期患者の口腔環境および咀嚼・嚥下・発音・呼吸などの口腔アセスメント・口腔衛生・機能維持を目的とした口腔ケアに関するニーズ調査実施にあたり評価項目として予定していた嚥下造影検査は、協力病院の倫理審査委員会にて承認が得られず項目から除外せざる得ない状況となり研究計画の変更が必要となった。新たな評価項目の検討および情報収集に時間をかけ取り組んだ。評価項目には、細菌カウンタ(パナソニックヘルスケア株式会社)を用い口腔細菌数の測定を追加した。所属機関・協力病院の倫理審査員会にて、再度承認を得た。前年度からの調査と同様に、患者の安全・安楽を最優先としており、治療による侵襲が低い内科的治療を受ける患者に限定し協力を依頼している。そのため、研究協力者が少ないが5名の患者のデータ収集を終え、分析中である。2).脳卒中急性期患者に対する口腔の衛生・機能維持を目的とした口腔ケアプログラムの考案1).を進めると同時に、これまでの調査結果をもとに脳卒中急性期患者の口腔ケアプログラムの開発に関する課題について、脳外科医・歯科医師・歯科衛生士・言語聴覚士・看護師・口腔ケアや摂食・嚥下に関する専門家による指導およびスーパーバイズを受け検討を重ねた。口腔ケアプログラムには口腔ケア方法の統一が必要であり、1).の調査時に実施する口腔ケアの方法について、「患者の口腔衛生に関して効果を実感している」と看護師への聞き取りから確認した。今後は、1).の評価項目と重ねて検証する。平成23年度は、脳卒中急性期患者の口腔環境および咀嚼・嚥下・発音・呼吸などの口腔アセスメントを実施し、口腔衛生・機能維持を目的とした口腔ケアに関するニーズ調査を計画した。現在は、データ取集の段階である。研究対象が脳卒中患者であり、所属機関の倫理審査委員会での承認を得るに時間を要した。倫理審査委員会では、患者が亜急性期の状態であることの危険性や患者の意思疎通が困難な場合の代諾に関する手順など、倫理的配慮について慎重に検討を重ね承認を得た。さらに、治療による侵襲が低い内科的治療を受ける患者に協力を得るよう配慮した。データ収集段階ではあるが、口腔環境の要因となる口腔水分量から、口腔内が乾燥をしている患者と通常の値を示している患者に分化する傾向がみられ、データ収集と共に分析をしている。計画の実施には、患者の安全および安楽を最優先し、人権およびプライバシーについては最善の注意と関心を払い進めている。また、口腔ケアや摂食・嚥下に関する専門家による指導およびスーパーバイズを受けながら計画が遂行できるよう努めている。平成26年度は、前年度からの「脳卒中急性期患者の口腔環境および咀嚼・嚥下・発音・呼吸などの口腔アセスメント・口腔衛生・機能維持を目的とした口腔ケアに関するニーズ調査」を実施した。

計14名の患者からデータを収集し、終了した。以後、産前産後の休暇および育児休業(平成26年7月4日平成28年3月31日)による中断のため、具体的な研究成果は得られなかった。前年度より、産前産後の休暇および育児休業(平成26年7月4日平成28年3月31日)による中断のため、具体的な研究成果は得られなかった。産前産後の休暇および育児休業(平成26年7月4日平成28年3月31日)による中断のため。本研究の目的は、脳卒中急性期患者に対する口腔の衛生・機能維持を目的とした口腔ケアプログラムを開発することである。平成28年度は、これまでに実施した本プログラムを分析した。脳卒中急性期患者14名(年齢中央値±四分位偏差:81.5±14.5歳,病日中央値±四分位偏差:15.5±9.0日,歯数中央値±四分位偏差:7.5±23.3本,ALB中央値±四分位偏差:3.4±0.7g/dl)において、脳卒中の発症病日により急性期群6名・亜急性期群8名に分類した。OAGスコア点(平均点±標準偏差)は、14日間を前期・中期・後期の3期に区分した。急性期群は前期(16.6±2.7)点、中期(15.6±1.9)点、後期(15.8±2.0)点、亜急性期群は前期OAG(15.8±4.4)点、中期(15.8±2.3)点、後期(15.6±3.9)点であった。急性期群と亜急性期群およびOAG3期において統計的に分析した。結果、急性期群・亜急性期群のOAG3期における変化に差はなかった(F(1,12)=.657 p=.433)。質的帰納的に分析した結果、介入により改善した患者8名、変化が認められなかった患者3名、悪化した患者3名であった。介入時の非経口摂取患者は10名であり、介入中に経口摂取を開始した患者は4名であった。介入により口腔機能を改善する要因につながったと思われる。さらに、患者からは「してもらったほうがいい」「喉のとおりがよくなる」などの肯定的な意見が聞かれた。一方、悪化した患者はALB2.7g/dl、非経口摂取状態であり歯科治療にて抜歯をしていたことなどが口腔内環境の改善に至らなかった要因と考えられた。以上のことから、本プログラムにて脳卒中急性期患者の口腔の衛生・機能を維持したことは一定の効果があると確認された。今後、有用性について検討することが課題である。脳卒中急性期患者に対して、口腔の衛生・機能維持を目的とした口腔ケアプログラムを実施した.脳卒中急性期患者の口腔内状況をOAGにより評価したが、14日間を経時的にみると口腔内状況に有意な差は認めなかった。また、口腔内環境を口腔粘膜の水分量にて評価したところ、14日間を経時的にみると6日目、7日目あたりに水分量が増えていることが明らかになった。さらに、脳卒中患者の急性期群と亜急性期群の口腔内状況を3期に区分しOAGにより評価したが、脳卒中の発症病日による口腔内状況に有意な差は認めなかった。これまでに得たデータの分析。得られた結果から脳卒中急性期患者に対する口腔の衛生・機能維持を目的とした口腔ケアプログラムを開発する。臨床看護学
細胞間情報伝達物質を吸着除去するバイオフィルム予防ゲル材料の開発

グラム陰性細菌の細胞間情報伝達機構クオーラムセンシングではアシル化ホモセリンラクトンが情報伝達シグナルとして生産される。菌体増殖に伴い周囲のシグナル濃度が上昇すると、本機構の支配下にある遺伝子の転写が活性化される。バイオフィルム形成も本機構により制御されているとの報告がある。本研究ではバイオフィルム形成を未然に防ぐ新しい高分子ゲル材料を設計した。ホモセリンラクトン類と包接複合体を形成可能なシクロデキストリン類を、ヒドロキシプロピルセルロースなどを化学架橋し形成させたヒドロゲルに固定化した。培養液中にこのシートを浸漬することでシグナル分子を吸着除去可能となる。人為的にシグナル濃度を低く抑制することで特定遺伝子の転写をブロックする。ホモセリンラクトンをシグナルとして生産している感染性細菌の例としてセラチア菌、緑膿菌を選択しそれぞれのクオーラムセンシング制御に及ぼすシクロデキストリンの効果を調べた。例えばセラチア菌のクオーラムセンシング機構により生産が制御されている抗菌剤プロディジオシンの生産量は、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン固定化ゲルシートを培養液中に浸漬しておくだけで約10分の1程度まで抑制可能である。緑膿菌のクオーラムセンシング制御にも本研究で開発したシクロデキストリン固定化ゲルシートは有効に作用し、本機構により活性化されるlasB遺伝子の転写活性を制御し関連するタンパク質生産量を抑制することを実験的に示した。また、培養液を連続的に通液するフローセルを用いて本研究で扱った緑膿菌PAO1(QF50-lasB)株がバイオフィルムを形成することを確認した。これらの結果は本研究で提案する原理に基づきバイオフィルム形成を制御できる可能性を示唆している。細胞間情報伝達シグナル分子と包接体を形成可能な高分子ヒドロゲルシートを用いてクオーラムセンシング機構を制御可能である。本研究ではグラム陰性細菌が生産する細胞間情報伝達物質をトラップする高分子ゲルシートの合成に成功した。グラム陰性細菌の細胞間情報伝達機構クオーラムセンシングでは、アシル化ホモセリンラクトンが菌種によらずシグナル物質として生産される。クオーラムセンシング機構により細菌は、宿主への感染、病原性因子の発現、バイオフィルム形成など多様な機能を制御していることが報告されているため、クオーラムセンシングの人為的な制御技術は重要である。そこで本研究では、クオーラムセンシングのシグナル物質と高い親和性を持つゲルシートを用いたシグナル物質濃度の制御技術を検討した。本研究では、このゲルシートを液体培地に共存させながらグラム陰性細菌の1種であるセラチア菌を培養すると、アシル化ホモセリンラクトン支配下にある色素プロディジオシン生産が大幅に抑制されることを実証した。この抑制効果はゲルシートの化学構造に依存し、条件を選ぶことで通常の10分の1程度までプロディジオシン生産量を抑制可能であった。これらの実験結果は、細菌のクオーラムセンシングのシグナル物質が有効にゲルシートにトラップされていることを示唆している。合成に成功したのは、異なるサイズの疎水性空孔を有するシクロデキストリンを固定化したセルロースエーテルゲルシートである。環状オリゴ糖であるα-シクロデキストリン及びβ-シクロデキストリン誘導体は、ホモセリンラクトン類のアシル鎖と包接複合体を形成可能である。培地中にシクロデキストリンを溶解させて細菌を培養すれば、細菌が生産したシグナル物質をシクロデキストリン分子が捕捉し、系中のシグナル物質濃度を低く抑制可能であった。シクロデキストリンを高分子ゲルシートに固定化した場合でも、未固定の場合と同様のクオーラムセンシング機構の阻害効果を確認できた。

グラム陰性細菌の細胞間情報伝達機構クオーラムセンシングでは、アシル化ホモセリンラクトンが菌種によらずシグナル物質として生産され、シグナル物質濃度の上昇を契機に宿主への感染、病原性因子の発現、バイオフィルム形成など多様な機能が制御されることが知られる。クオーラムセンシング支配下にある遺伝子の転写プロセスを細胞外部からリモートコントロールする新システムを本研究では提案した。クオーラムセンシングのシグナル物質アシル化ホモセリンラクトンと包接複合体を形成可能なシクロデキストリンを人工レセプターとしてヒドロゲルシートに固定化し、このシートを培養液に浸漬するだけで細胞外部から遺伝子転写プロセスを制御することに成功した。このゲルシートを液体培地に共存させながらグラム陰性細菌の一種であるセラチア菌を培養すると、アシル化ホモセリンラクトン支配下にある色素プロディジオシン生産が大幅に抑制されることを実証した。この抑制効果はゲルシートの化学構造に依存し、条件を選ぶことで通常の10分の1程度までプロディジオシン生産量を抑制可能であった。これらの実験結果は、細菌のクオーラムセンシングのシグナル物質が有効にゲルシートにトラップされていることを示唆している。更にアシル化ホモセリンラクトンをシグナルとするクオーラムセンシング機構を有することが知られている緑膿菌にも、セラチア菌と同様に今回合成したヒドロゲルシートが有効に働くことを実証した。緑膿菌培養液を連続的に流すバイオフィルム形成実験などから、クオーラムセンシング機構をより効果的に制御するヒドロゲルの構造を検討した。
癌間質由来KGFを標的とした再燃前立腺癌の新規治療戦略

本研究により、前立腺間質PrSCではTGFβシグナルの活性化に伴う筋線維芽細胞様の分化誘導が、間質由来KGF mRNAの産生を低下させることが判明した。よって、再燃前立腺癌の増殖過程では、癌細胞を取り巻く間質細胞の種類が重要であると考えられた。本年度は、申請者が常用してきた癌間質モデルurogenital sinus mesenchyme (UGM)の代替細胞として、市販の正常ヒト前立腺ストローマ細胞PrSC(Lonza社)が腫瘍形成を促進させるか否かを検討した。さらに、PrSC由来KGF/FGF-7の産生が阻害される条件、もしくは阻害する化合物の探索を行った。【検討2】次に、in vivo腫瘍形成試験において、PrSCはアンドロゲン感受性ヒト前立腺癌由来培養細胞LNCaPとその亜株E9(アンドロゲン低感受性)、AIDL(アンドロゲン不応性)の腫瘍形成を有意に促進することを確認した。よって、ラット胎児から採取していた癌間質モデルUGMの代替細胞として、市販の培養細胞PrSCが使用可能と判断した。【検討3】PrSCを性ステロイドホルモン(DHT, E_2)、サイトカイン(TGFβ, SHH)、アドレナリン受容体アゴニスト(PE)で処理したところ、TGFβ処理群でのみKGF/FGF-7mRNAの有意な発現減少を確認した。TGFβは線維芽細胞に筋様の細胞分化を誘導することが知られたサイトカインである。よって、前立腺癌周囲に線維芽細胞や筋線維芽細胞が多いかどうかが、癌の増殖過程にKGF/FGF-7が強く関与するか否かが決まると考えられた。本年度は、癌間質モデルurogenital sinus mesenchyme (UGM)の代替細胞である市販の正常ヒト前立腺ストローマ細胞PrSC(Lonza社)について、本邦で臨床使用されている前立腺肥大症治療薬(α_1受容体遮断薬)の影響を検討した。【検討1】代表的なα_1受容体遮断薬のうち、NaftopidilはPrSCの細胞増殖を強く抑制したが、TamsulosinおよびSilodosinによる増殖抑制作用は認めちれなかった。【検討2】α_1受容体遮断薬は、PrSCにおけるKGF/FGF-7およびIGF-I mRNA曲産生に影響しなかった。【検討3】α_1受容体遮断薬によりPrSC由来IL-6のタンパク質量が有意に減少した。【検討4】ヒト前立腺癌細胞E9+PrSCのin vivo腫瘍形成は、Naftopidilにより有意に抑制されたが、TamsulosinおよびSilodosinによる腫瘍形成の抑制作用は認められなかった。以上から、α_1受容体遮断薬はPrSCにおけるKGF/FGF-7産生に影響しないものの、PrSCの細胞増殖およびIL-6産生を強く抑制しその結果、in vivo腫瘍形成の抑制に関与しているものと考えられた。
有機金属錯体の磁性と導電体の異常伝導に及ぼす水素のトンネル現象

本研究は、(1)BEDT-TTF分子を伝導層とする有機導電体の超伝導性と磁性に関する物性測定、(2)擬1次元有機金属錯体の構造と物性、とりわけ磁性に関する測定、および(3)金属水素化合物の物性測定が目的である。BEDT-TTF化合物はこの分子が層状に並んだ、ほぼ理想的な2次元的金属伝導系であるのに対して、擬1次元有機金属錯体は文字通り1次元的である。この系には白金系のような典型的な1次元金属相もあるが、本研究に取り上げた陰イオン架橋金属錯体は室温以下の範囲では、Ni-Br系等を除くと大部分が金属イ才ンの2種類の価数が規則正しく並ぶ、いわゆるCDW状態にある。今期、(1)の研究として、α-(BEDT-TTF)_2NH_4Hg(SCN)_4及びその重水素置換体を作成して、強磁場中の帯磁率測定とNMR測定を行い、50K付近の帯磁率の異常が磁気構造の変化を伴う相転移であることを見いだした。また、超伝導性有機導電体k-(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2の冷中性子散乱実験をJRR3M-AGNESを用いて1.5Kから300Kの温度範囲で実施した。この測定は以前にKEK-LAMD,LAM40を用いて行ったことがあるものだが、改めてAGNESで再測定した。その結果、超伝導転移温度近傍で、超伝導ギャップ2Δ(T=0)≒2.8meV直上と直下のエネルギー領域のフォノンの状態密度にフォノン-電子相互作用による一連の変化が見いだされた。(2)の研究としてNi^<2+>が3個の窒素イオンを介して擬1次元的に結合した新しい化合物のNDMAZ単結晶を育成して結晶構造解析、帯磁率測定及び、冷中性子散乱測定を行い、隣接するNi^<2+>イオン同士の交換積分Jとハルデンギャップの測定を行った。その結果、この物質のハルデンギャップは1.75meVであり、擬1次元系の類縁物質であるNENPのギャップよりも多少高いが、Jとの比ではNENPと誤差の範囲以内で一致している事が分かった。(3)の研究として、L1_2型規則相のYPd_3H_xを取り上げ、水素の侵入位置を、粉末中性子回析測定と、熱中性子分光測定によって研究した。分光測定から、55meV付近に水素の局在振動ピークを見いだしている。結晶構造を分析したところ、水素は2個のYと4個のPdが配位した八面体格子間位置にあることを見いだした。
オルガネラ標的創薬を指向したミトコンドリアカルシウム取込みの制御機構の解明

本研究では、細胞死のキーマシナリーであるミトコンドリアの透過性遷移のON/OFF制御の分子基盤構築に向け、その起点となるミトコンドリアのカルシウムユニポーターがカルシウムイオンを取り込む分子機構を解明することにより、虚血再灌流障害・筋ジストロフィー症・アルツハイマー病などの細胞死疾患の革新的な治療薬を創製することを目的とする。これまでに、酵母のミトコンドリアを使って、カルシウムユニポーターの2つのコアサブユニットであるMCUとEMREの機能を高感度に解析するための実験系の構築に成功している。本年度は、ミトコンドリア膜にカルシウムイオンを透過する小孔を構成するサブユニットであるMCUに焦点を当て、MCUがカルシウムイオンを膜透過させる分子機構を明らかにすることを目的として研究を行った。マウスMCUに関する様々な欠損体や点変異体を構築し、これらの変異がミトコンドリアのカルシウム取込み活性に及ぼす影響を調べた。その結果、カルシウム取込み機能を欠失させる機能性モチーフ、さらにそのモチーフ内の機能に重要なアミノ酸残基を特定することができた。ここで特定されたアミノ酸残基は、これまでに報告されていたMCUの機能に重要とされていたアミノ酸残基とは全く異なるものであった。さらに、分子シミュレーションを用いた立体構造モデルによる解析から、新たに明らかになった機能に重要なアミノ酸残基について、これらのアミノ酸残基がMCUのカルシウム取込み機能に果たす役割を考察することができた。ここまでにミトコンドリアのカルシウムユニポーター複合体を構成するサブユニットの中で、MCUとEMREがコアアブユニットであることを明らかにした。さらに、これら2つのサブユニットについて、酵母を利用して、その詳しい構造活性相関解析を行える実験系の構築に成功している。本年度は、ここまでの研究成果を基盤とする変異体を用いた構造機能相関解析から、さらにMCUがカルシウム取り込みを行うメカニズムに関する新たな知見を得ることができ、ミトコンドリアカルシウム取り込みの分子機構の理解に向け、一歩前進することができた。従って、計画に掲げたとおり、カルシウムユニポーターのサブユニットについて、酵母発現系を利用した機能解析を着実に進めることができていると言える。1平成30年度の研究により、MCUのカルシウム取り込みに極めて重要な機能性モチーフを明らかにすることができた。ここで明らかにしたMCUの機能性モチーフはMCUのカルシウム取り込み活性を人工的に調節し細胞死のON/OFFを制御する化合物をデザインする糸口となる可能性がある。このため、平成31年度はこの機能性モチーフに関するさらなる詳細な構造機能解析を行うとともに、この機能性モチーフに結合し機能を制御しうる化合物の創製を試みる。2現在発見されているサブユニット以外にも機能制御に関わる未知のサブユニットが存在する可能性があるため、プロテオミクス解析を初めとする種々のスクリーニングを駆使して、未知にサブユニットの探索とその機能解析を行う。本研究では、細胞死のキーマシナリーであるミトコンドリアの透過性遷移のON/OFF制御の分子基盤構築に向け、その起点となるミトコンドリアのカルシウムユニポーターがCa2+を取り込む分子機構を解明することを目的とする。過去に、ミトコンドリアへのCa2+取り込みに関わる7つのタンパク質が報告されている。これまでに我々は元々Ca2+取り込み機能の欠損したミトコンドリアを持つ酵母に、哺乳類のカルシウムユニポーターのサブユニットを発現させ、MCUとEMREという2つのサブユニットがミトコンドリアCa2+取り込み機能のコアサブユニットであることが明らかにした。初年度は、MCUとEMREによるCa2+取り込みを他のサブユニットが調節する機構を調べた。この解析に向け、3つ以上の遺伝子を酵母に共発現させる必要がある。そこでまず、マウスのMCUとEMREを酵母ゲノムの適切な遺伝子座にノックインした変異株を構築した。このMCU,EMRE安定発現酵母株のミトコンドリアはCa2+を取り込むことが確認された。次に、このMCU,EMRE安定発現酵母に、マウスの他の5つのサブユニットをそれぞれ一過性発現させた。その結果、いずれのサブユニットも酵母に良好に発現させることができ、またミトコンドリアに局在することが確認された。続いて、これらの変異株からミトコンドリアを単離し、MCU,EMRE依存的なCa2+取り込みに及ぼす影響を解析した。その結果、MICU1またはMICU3を発現させた場合において、Ca2+取り込み機能が亢進することが示唆された。一方、他のサブユニットについてはCa2+取り込みに変化は認められなかった。このことから、MICU1とMICU3はMCU,EMRE依存的なミトコンドリアCa取り込み機能を亢進させる機能があることが示唆された。この解析に向け、3つ以上の遺伝子を酵母に共発現させる必要があったので、まず、マウスのMCUとEMREを酵母ゲノムにノックインするために適切な遺伝子座を検討し、両遺伝子を安定的に発現させられる変異株を構築した。次に、このMCU,EMRE安定発現酵母に、マウスの他のサブユニット(MICU1、MICU2、MICU3、MCUR1、slc25a23)をそれぞれ一過性発現させ、この変異株から単離したミトコンドリアを使って、MCU,EMRE依存的なCa2+取り込みに及ぼす影響を解析した。このことから、MICU1とMICU3がMCU,EMRE依存的なミトコンドリアCa取り込み機能を亢進させる機能を有することが示唆された。

以上のように、初年度の計画に掲げたとおり、カルシウムユニポーターの既知のサブユニットに機能について、酵母発現系を利用した解析系の構築に成功し、その解析系を使って2つのサブユニットの調節機能に関する知見を得ることができた。本研究では、細胞死のキーマシナリーであるミトコンドリアの透過性遷移のON/OFF制御の分子基盤構築に向け、その起点となるミトコンドリアのカルシウムユニポーターがカルシウムイオンを取り込む分子機構を解明することにより、虚血再灌流障害・筋ジストロフィー症・アルツハイマー病などの細胞死疾患の革新的な治療薬を創製することを目的とする。これまでに、酵母のミトコンドリアを使って、カルシウムユニポーターの2つのコアサブユニットであるMCUとEMREの機能を高感度に解析するための実験系の構築に成功している。本年度は、ミトコンドリア膜にカルシウムイオンを透過する小孔を構成するサブユニットであるMCUに焦点を当て、MCUがカルシウムイオンを膜透過させる分子機構を明らかにすることを目的として研究を行った。マウスMCUに関する様々な欠損体や点変異体を構築し、これらの変異がミトコンドリアのカルシウム取込み活性に及ぼす影響を調べた。その結果、カルシウム取込み機能を欠失させる機能性モチーフ、さらにそのモチーフ内の機能に重要なアミノ酸残基を特定することができた。ここで特定されたアミノ酸残基は、これまでに報告されていたMCUの機能に重要とされていたアミノ酸残基とは全く異なるものであった。さらに、分子シミュレーションを用いた立体構造モデルによる解析から、新たに明らかになった機能に重要なアミノ酸残基について、これらのアミノ酸残基がMCUのカルシウム取込み機能に果たす役割を考察することができた。ここまでにミトコンドリアのカルシウムユニポーター複合体を構成するサブユニットの中で、MCUとEMREがコアアブユニットであることを明らかにした。さらに、これら2つのサブユニットについて、酵母を利用して、その詳しい構造活性相関解析を行える実験系の構築に成功している。本年度は、ここまでの研究成果を基盤とする変異体を用いた構造機能相関解析から、さらにMCUがカルシウム取り込みを行うメカニズムに関する新たな知見を得ることができ、ミトコンドリアカルシウム取り込みの分子機構の理解に向け、一歩前進することができた。従って、計画に掲げたとおり、カルシウムユニポーターのサブユニットについて、酵母発現系を利用した機能解析を着実に進めることができていると言える。今年度は以下の2点を目標として研究を推進する。1平成29年度は、MCU,EMRE依存的なミトコンドリアCa2+取り込み機能をMICU1とMICU3という既知のサブユニットのうちの2つが亢進することが確認された。平成30年度は、この知見についてより詳細に調べるため、MICU1とMICU3の取り込み亢進機能に関して、様々な欠損変異体や点変異体を構築し、これらを使った構造機能相関解析を行うことによって、機能に重要なタンパク質領域やアミノ酸を明らかにすることをめざす。
高速AFMによるゲノム編集ツールCRISPR-Casの分子作動機構の網羅的解析

本研究は、様々なゲノム編集ツール, Casタンパク質に高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を適用し、Casタンパク質が機能する姿を1分子イメージングすることで、その分子作動メカニズムを統一的に理解することが目的である。我々は最近、Casタンパク質の中で最も研究の進んでいるCRISPR-Cas9に高速AFMを適用し、Cas9が標的DNAを探索・結合・切断する一連の過程を1分子動画撮影することに成功した。この研究成果を基盤とし、様々な種に由来する多様なCasタンパク質、および、その巨大複合体に対し高速AFMを適用し、DNA切断ドメインの揺らぎ・構造変化・物性を網羅的に解析する。初年度は、研究の効率化を目的に、高速AFMを新たに設置した。既存の高速AFMと比べ、マイクロメーターヘッドの操作性、スキャナーの安定性を改善した。この高速AFMを用い、Staphylococcus aureusに由来するSaCas9、および、Cas12aに対して高速AFM観察を行った。Cas12aはCas9と異なりTTTN配列を認識し、また、切断されたDNAは5'突出末端となるため、ゲノム編集において、遺伝子を挿入する際に有利であると考えられている。さらに、Cas12aにおいては、Acidaminococcus sp.由来のAsCas12aとLachnospiraceae bacterium由来のLbCas12aを観察対象とし、Cas12aにおける共通の分子作動機構の解明を試みた。しかしながら、SpCas9で得られた高速AFM観察条件をそのまま各タンパク質の高速AFM観察に転用したが、DNA切断の過程を直接観察するには至らなかった。これらの結果は、各タンパク質において、最適な高速AFM観察条件が異なることを意味しており、次年度からはAFM基板の検討、観察バッファーの検討を行う予定である。SaCas9とAsCas12a, LbCas12aに対する高速AFM観察より、Casタンパク質単体では、安定な立体構造を形成せず、フレキシブルな動態をとることが分かった。さらに、Casタンパク質内部にRNAが結合すると、全てのCasタンパク質において、安定な立体構造を形成することが分かった。この結果は、RNAを介するCasタンパク質の立体構造には、RNAが重要であることを意味し、共通の分子作動機構と考えられる。次に、SaCas9のRNA-DNA三者複合体では、DNA切断ドメインがAFM基板側へ強く結合し、DNAを切断する瞬間を捉えるには至らなかった。その一方で、チューブ内において、DNA切断反応を開始させ、DNA切断後にもなお、DNAに結合しているかどうかを調べたところ、SpCas9はDNA切断後もDNAと強く結合するが、SaCas9の場合は、DNA切断後には、DNAから解離することが分かった。この結果は、SaCas9はSpCas9に比べ小型である点、タンパク質内部において、DNAと結合するサイトが少ないためだと考えられる。このDNA切断後に解離しやすいという点は、ゲノム編集において、新たな遺伝子を挿入する点で有利となる。次に、AsCas12aにおけるRNA-DNA三者複合体では、標的配列DNAへの結合には、Mgイオンが必要であることが分かった。さらに、DNAに結合した際に、DNA切断ドメインがAFM基板側を向き、その動きが制限される様子が観察された。また、DNA切断反応後にはDNAへ結合したままの分子が多くみられ、タンパク質内部のDNA結合サイトの数がDNAとの結合を反映することが分かった。Cas12aにおける結果はSpCas9と同様であり、共通の分子機構と考えられる。次年度は、1年目に設置した高速AFMと既存の高速AFMの2台をフルに稼働し、SaCas9およびAsCas12aのDNA切断における構造変化の直接観察を試みる。1年目の結果を受けて、高速AFM基板の検討を行う。これまでは、DNAを固定するため、アミノシランを用いてマイカ基板表面を正電荷に修飾していたが、AFM基板がフラットであること、DNA切断ドメインが基板へ強く吸着することを考慮して、異なる手法でマイカ表面の修飾を試みる。これまでに、脂質二重膜を高速AFM基板に適用した実績があり、正電荷を含む脂質二重膜上に、DNAが吸着できることは分かっている。そこで、さらに詳細に脂質二重膜の組成を検討すること、および、高分子化合物をAFM基板に用いることで、DNAは基板に結合するが、Casタンパク質は吸着しない基板条件を探る。また、DNAへ巻き付いたCasタンパク質のDNA切断ドメインがAFM基板上でも自由に動けるようにするため、完全にフラットはAFM基板ではなく、数ナノメートルの隙間をもつAFM基板の開発にも取り組む。さらに、Cas12aタンパク質のDNA切断ドメインが基板へ吸着しないよう、システイン残基を導入し、マイカ上にタマビジンの2次元結晶を作り、ビオチン-アビジン結合による固定化も試みる。この場合、動くべきDNA切断ドメインはAFMの基板へは向かないため、その動きを阻害することはないと考えられる。こられのAFM基板の工夫をSaCas9にも適用し、DNA切断の瞬間を捉える。さらに、Cascade-Cas3とよばれる新たなCasタンパク質の試料調製を開始し、高速AFM観察が可能なほど純度の高い試料かの検討にも着手する。

この研究成果を基盤とし、様々な種に由来する多様なCasタンパク質、および、その巨大複合体に対し高速AFMを適用し、DNA切断ドメインの揺らぎ・構造変化・物性を網羅的に解析する。初年度は、研究の効率化を目的に、高速AFMを新たに設置した。既存の高速AFMと比べ、マイクロメーターヘッドの操作性、スキャナーの安定性を改善した。この高速AFMを用い、Staphylococcus aureusに由来するSaCas9、および、Cas12aに対して高速AFM観察を行った。Cas12aはCas9と異なりTTTN配列を認識し、また、切断されたDNAは5'突出末端となるため、ゲノム編集において、遺伝子を挿入する際に有利であると考えられている。さらに、Cas12aにおいては、Acidaminococcus sp.由来のAsCas12aとLachnospiraceae bacterium由来のLbCas12aを観察対象とし、Cas12aにおける共通の分子作動機構の解明を試みた。しかしながら、SpCas9で得られた高速AFM観察条件をそのまま各タンパク質の高速AFM観察に転用したが、DNA切断の過程を直接観察するには至らなかった。これらの結果は、各タンパク質において、最適な高速AFM観察条件が異なることを意味しており、次年度からはAFM基板の検討、観察バッファーの検討を行う予定である。SaCas9とAsCas12a, LbCas12aに対する高速AFM観察より、Casタンパク質単体では、安定な立体構造を形成せず、フレキシブルな動態をとることが分かった。さらに、Casタンパク質内部にRNAが結合すると、全てのCasタンパク質において、安定な立体構造を形成することが分かった。この結果は、RNAを介するCasタンパク質の立体構造には、RNAが重要であることを意味し、共通の分子作動機構と考えられる。次に、SaCas9のRNA-DNA三者複合体では、DNA切断ドメインがAFM基板側へ強く結合し、DNAを切断する瞬間を捉えるには至らなかった。その一方で、チューブ内において、DNA切断反応を開始させ、DNA切断後にもなお、DNAに結合しているかどうかを調べたところ、SpCas9はDNA切断後もDNAと強く結合するが、SaCas9の場合は、DNA切断後には、DNAから解離することが分かった。この結果は、SaCas9はSpCas9に比べ小型である点、タンパク質内部において、DNAと結合するサイトが少ないためだと考えられる。このDNA切断後に解離しやすいという点は、ゲノム編集において、新たな遺伝子を挿入する点で有利となる。次に、AsCas12aにおけるRNA-DNA三者複合体では、標的配列DNAへの結合には、Mgイオンが必要であることが分かった。さらに、DNAに結合した際に、DNA切断ドメインがAFM基板側を向き、その動きが制限される様子が観察された。
溶液の非平衡過程の分子論的アプローチ・ミクロ集合体のゆらぎ

本研究班は「ゆらぎ」という観点から、液体あるいは溶液中の分子やイオンの動的挙動を明かにし、化学反応を溶媒分子の関与する種々の非平衡過程との関係で捉え、明らかにするのが目的である。高感度ラマン分光器にファブリーペロー干渉計(バーレー社、RC-43)をタンデム方式に配置した高分解能ラマン散乱装置によりベンゼンの全対称伸縮振動のラマンの線幅の測定が0.01cm^<-1>の高い精度で可能となった。野村は、溶液中の化学反応の速度理論に於けるKramersの遷移状態理論の検証を行なうために、ヘキサンやフタル酸ジイソブチルを溶媒としてジブロモプロパン溶液の100MHzから8GHzにおける超音波緩和スペクトルの解析より回転異性化反応の反応速度と粘度との関係を実験的に明らかにした。特に低粘度領域でKramersの理論からのずれを見いだし液体の局所構造との関連を指摘した。さらに混合ミセル溶液中のミセルとモノマーの交換反応のミセル組成依存性を明らかにした。また混合溶液の振動緩和過程をラマン散乱法と超音波緩和法を用い混合溶液中の振動緩和過程は、基本的には気体の衝突過程を考慮したSSH理論で説明できることも明らかにした。森田は、慣性項を考慮した拡散律速反応を理論的に明らかにした。さらに一般化ランジェヴァン方程式においてブラウン粒子の位置の相関関数が時間発展に従い減衰しないことや位置と速度の相関関数の定常状態における問題点を指摘した。冨永は、イオン性ポルフィリンの蛍光消光反応速度の過渡効果を解析し、有効反応距離と拡散係数を求めミクロな領域での拡散過程とバルクでの拡散過程のイオン強度依存性を明らかにした。イオン性ミセルのトレーサー拡散係数を測定し、CMCにおけるストークス半径を求めた。
貧困問題に対する諸専門領域の相互作用と社会的レジリエンス創発に関する社会学的研究

貧困問題に対する諸専門領域の相互作用を分析し、社会生態学的に考察した結果、1ネットワーク系(当事者近接・ボランティア志向)、2草の根連帯経済系(当事者近接・事業志向)、3グリーン/アース系(当事者遠隔・ボランティア志向)、4ソーシャル系(当事者遠隔・事業志向)の創発が明らかになった。社会生態学および個人的/社会的レジリエンス評価という観点で見れば、貧困問題の解決、あるいは各活動が明示的に掲げる理念を超えて、それぞれ異なる位相でのレジリエンス向上に資している。前年に引き続いて、現在の日本社会において喫緊の課題となっているいくつかの社会病理現象のなかでも、貧困問題を中心にして、そこから専門家/非専門家たちによる社会的反作用の諸力により個人的および社会的レジリエンスを生む様相について理論的・学説的かつ実証的に考察をおこなった。とくに当該年度は、前年度までに調査を進めた日本全国における貧困対抗活動を、近畿圏の活動と比較し、支援団体に協力しながら調査を進めるという形をとった。研究内容および調査分析結果の一部を一般市民、および各メディア関係者を前にして発表する機会もあった。研究成果としては、大きく分けて、欧州の研究者を対象にした発表と、アジア諸国の研究者を対象にした発表に分けられる。欧州の研究者を対象にした発表としては、チェコ国のプラハに本部を構えるThe International Institute of Social and Economic Sciences(IISES)学会の大会(プラハ開催)にて、日本の貧困に対抗する活動がボランティアベースかビジネスベースかによって、社会的レジリエンス評価が変わってくるという趣旨の報告をおこなった。欧州の研究者と交流し、日本社会の病理現象と社会活動について意見交換をする機会を得た。また、今年度より、当学会の学会誌IJoSS編集顧問委員(Editorial Advisory Board)を務めている。アジア諸国の研究者を対象とした発表としては、2014年に、初めて日本で開催されるInternational Sociological Association(ISA)学会大会の前哨戦である「ISA横浜大会プレイベントII国際ミニコンファレンス「アジアの社会学者との対話」」で、日本側からの若手代表として、日本社会における貧困対抗活動の生態系にかんする報告をおこなった。本研究で必要となる理論的視座(シカゴ学派総合的社会認識)の整備とともに、専門領域ごとの「理論運動」(disciplinary movement)とその持続可能性を明らかにすることを目指した。シカゴ学派の文献の検討に加えて、日本国内において、「反貧困」「派遣村」活動のみならず、さまざまな貧困問題と対峙する団体や活動を対象にし、総合的社会認識の方法論における質的方法を中心にして、種々の観点から調査した。比較検討のため、米国におけるコミュニティの組織化にかかわる団体からの聞きとりもおこなった。その結果、主に明らかになったのは次のとおりである。第1に、本研究の方法論・理論的視座としての、シカゴ学派の貧困観の様相である。わけても、<初期シカゴ学派の社会学者は、グローバル化の原初形態の流動的な社会状況における経済的・関係的貧困について、「組織化」の展望を持ちながら、生態学的・総合的に描き出すことを目指した>ことを明らかにし、現代日本における貧困対抗活動研究の一つの方向性を示した。第2に、日本国内において貧困問題に対抗する活動系は、理念型として、1「ネットワーク」系、2「草の根」・連帯経済系、3「グリーン」系、4「ソーシャル」系に、分類可能であることを指摘した。この分類は、「活動のスタンスにかかわる凝離と協同」、「活動の持続可能性と自己の位置づけ・理論運動の過程」「社会的反作用の展開過程という学説史的意義」といった示唆を有している。平成25年度に引き続いて平成26年度においても、現在の日本社会における社会病理現象のなかでも貧困問題を中心として、専門家/非専門家たちによる社会的反作用の諸力によって生み出される個人的および社会的レジリエンスを生む様相について、理論的・学説史的・実証的な考察を進めた。そのなかで、平成25年度における国際会議(学会報告)、および一般向けの報告などのなかで出てきた論点・問題点などを踏まえ、かつ、諸活動とレジリエンス創発の背景にある「近代化と現代化」の作用についての考察を行いながら、貧困対抗活動の各系統の性質の整理を行うことを試みた。貧困対抗活動における1ネットワーク系(当事者近接・ボランティア志向)に関しては、個人的/社会的レジリエンスの創出について、例えば、「相談者の生活の組織化」や「人々の社会意識の変容」が挙げられる。2草の根連帯経済系(当事者近接・事業志向)に関しては、個人的/社会的レジリエンスの創出について、例えば、「当事者活動家の文化的生活の組織化」や「草の根からの持続的な活動システム構築提示」が挙げられる。3グリーン/アース系(当事者遠隔・ボランティア志向)に関しては、個人的/社会的レジリエンスの創出について、例えば、「人材育成」や「海外の貧困派生問題の議題設定機能(アジェンダセッティング)」が挙げられる。4ソーシャル系(当事者遠隔・事業志向)に関しては、個人的/社会的レジリエンスの創出について、例えば、「自己実現」や「新しい社会システム構築提示」が挙げられる。現在の国内の多様な貧困対抗活動について、個人的および社会的レジリエンス、すなわち、個人の生活や社会の仕組みを柔軟に再組織化していく力という観点から社会生態学的に評価し、それぞれの活動の顕在的/潜在的社会的意義を明らかにすることを試みた。方法としては、これまで報告者が行ってきたフィールドワーク、文献、インタビュー調査などから構成した貧困対抗活動の生態系の枠組みを活用した。

その枠組みとは、1ネットワーク系(当事者近接・ボランティア志向)、2草の根連帯経済系(当事者近接・事業志向)、3グリーン/アース系(当事者遠隔・ボランティア志向)、4ソーシャル系(当事者遠隔・事業志向)、である。これらの各系統に関して収集した各種データを活用して、シカゴ学派社会学由来の社会生態学などの観点から評価し、個人的レジリエンスおよび社会的レジリエンスへの示唆を探った。各系統が生み出している個人的レジリエンスの特徴的な例としては、相談者の生活の組織化、当事者活動家の文化的生活の組織化、人材育成、関係者の自己実現、が挙げられる。社会的レジリエンスの特徴的な例としては、自己責任論に関する人々の社会意識の変容、草の根からの持続的な活動システム構築の方法の提示、海外の貧困派生問題の議題設定機能、特有の文化的要素を組み入れた新しい社会システム構築の方法の提示、が挙げられる。現在の国内の貧困対抗活動は、一枚岩で捉えられるものではない。そればかりでなく、本研究における各系統は、社会生態学および個人的/社会的レジリエンス評価という観点で見れば、貧困問題の解決、あるいは各活動が明示的に掲げる理念を超えて、それぞれ異なる位相でのレジリエンス向上に資しており、従来の多くの社会諸科学や社会福祉学などの研究者らが想定するものとは異なる形で、新たな福祉社会を構築する可能性を秘めている。貧困問題に対する諸専門領域の相互作用を分析し、社会生態学的に考察した結果、1ネットワーク系(当事者近接・ボランティア志向)、2草の根連帯経済系(当事者近接・事業志向)、3グリーン/アース系(当事者遠隔・ボランティア志向)、4ソーシャル系(当事者遠隔・事業志向)の創発が明らかになった。社会生態学および個人的/社会的レジリエンス評価という観点で見れば、貧困問題の解決、あるいは各活動が明示的に掲げる理念を超えて、それぞれ異なる位相でのレジリエンス向上に資している。本研究で得た実証的データは、文献・映像などのドキュメント資料での裏付け(triangulation)を進めることが求められると考えられるためである。社会学これまでに収集したデータを参照しながら、補足的な調査を行いつつ、理論化を進める。1ネットワーク系(当事者近接・ボランティア志向),2草の根連帯経済系(当事者近接・事業志向),3グリーン/アース系(当事者遠隔・ボランティア志向),4ソーシャル系(当事者遠隔・事業志向)の各系統が、個人の生活や社会の仕組みを柔軟に再組織化していく力について、社会生態学的に評価することを試みる。そこから、それぞれの活動の顕在的/潜在的社会的意義を明らかにする。本研究から得た貧困対抗活動の生態系分類である1「ネットワーク」系、2「草の根」・連帯経済系、3「グリーン/アース」系、4「ソーシャル」系のインプリケーションについて、国内外(日本、アジア諸国、欧州)の研究者を前にして発表する段階にまで到達しているため。
分泌性因子がもたらすミトコンドリア機能変化と放射線抵抗性獲得機構の解明

放射線照射時に生じる分泌性液性因子がミトコンドリアへ及ぼす作用に着眼し検討した。その結果、4Gyの放射線照射されたCHO細胞において、照射24時間後の培養上清を回収し、非照射CHO細胞へ処理したところ、ミトコンドリア膜膜透過性が亢進し、膜電位が低下することがわかった。さらに活性酸素の増加、HPRT遺伝子の突然変異が増加することが分かった。一連の反応は、アスコルビン酸処理により抑制した。このような作用によるミトコンドリアへの影響は、がん細胞U251細胞において、放射線抵抗性を獲得することにつなっがっており、放射線抵抗性獲得機構として分泌性因子を介した代謝経路の変化が関連する可能性が示唆される。放射線誘発分泌性因子がミトコンドリアの機能を変化させる機構の解明を目指し研究を行った。CHO細胞に4Gyを照射し、24時間後の培地を回収したものをコンディションメディウムとし、別に用意した細胞へそれを処理した。処理1時間後、ミトコンドリアの膜電位が低下することが分かった。同処理により、ミトコンドリア膜透過性の亢進が見られたことから、ミトコンドリアのマトリックスと膜間スペースのプロトン勾配が保てなくなることが原因である可能性が示唆された。次にミトコンドリア内スーパーオキシドの生成量を調べたところ、同処理により、増えることが分かった。さらに、同処理により突然変異頻度が高くなること、この突然変異誘導はSOD2の過剰発現やアスコルビン酸処理により軽減することから、ミトコンドリア内スーパーオキシドの誘導により核DNAへの損傷が誘導される機構が存在することが明らかとなった。次にヒト癌細胞における放射線照射後の分泌性因子が放射線抵抗性を獲得するか否かを調べた。グリオーマ細胞U251に4Gyを照射し、72時間後または96時間後の培地を回収したものをコンディションメディウムとし、別に用意した細胞へそれを処理した。その結果、96時間後に回収したコンディションメディウムでは、対照コンディションメディウムに比べて、細胞増殖が有意に亢進することが分かった、さらに、同処理細胞に対して8Gy照射した際、細胞生存率が有意に高くなることが分かった。このことは、96時間かけて分泌された複合因子群が放射線抵抗性に関わる制御機構を活性化する可能性を示唆している。一方、ヒト乳がん細胞株MCF7では上記のU251でみられた放射線抵抗性獲得はみられず、細胞ごとの特性が関わることが考えられる。本年度の研究において、放射線照射による生成される「分泌性因子」が、細胞集団としての生存シグナルを活性化するか否かについての検討が行われた。細胞はHeLa細胞を用いて解析が行われた。研究の仮説として、「放射線照射細胞から分泌される因子は、ミトコンドリアの機能変化を介して、細胞集団の生存シグナルに影響を及ぼすのではないか」ということを考えた。はじめに、これを検証するための実験系確立を行った。その結果、4 Gyのガンマ線照射を行い、3日後に照射細胞の培養上清を回収し、別に用意したHeLa細胞へ処理した結果、対照群(非照射細胞の培養上清を処理)に比べ、ミトコンドリア由来のスーパーオキシドラジカルが増加することが分かった。このことから、この手法は仮説の検証に有効な手法であると考えた。次に、本手法で分泌性因子の生存シグナルへの影響を調べたところ、コロニー形成率の増加が有意に認められ、生存シグナルの活性化が引き起こされている可能性が示唆された。以前に実施したCHO細胞を用いた解析から、ミトコンドリア由来のスーパーオキシドラジカルの増加はミトコンドリア機能と関連することから、照射細胞由来の分泌性因子は、ミトコンドリア機能変化を介し、生存シグナルの活性化につながる可能性が示唆された。次に、生存シグナルとして知られているAPMKの活性化を調べた。同様の手法で分泌性因子の影響を調べたところ、放射線照射細胞由来の培養上清において、対照群よりわずかにAMPKのThr172のリン酸化が亢進していることがわかった。AMPKの活性化は細胞種によって違うということが先行論文の報告から示唆されるので、数種類の正常細胞とがん細胞株を用いて、同様の解析を拡大しているところである。ミトコンドリアの機能変化をとらえる実験手法が十分に確立できていることが分かった。今年度の実験で用いたHeLa細胞でもミトコンドリアのスーパーオキシドラジカルが放射線照射により生じる分泌性因子の作用で増えるという現象をとらえている。このことから、HeLa細胞により今年度確立した手法は今後の実験計画を遂行するうえでも問題ないと考えている。しかし、DNA二重鎖切断の修復効率の解析については、まだ予備検討の段階であるので、全体としてはおおむね順調に進展していると言える。交付申請書に書いた内容のとおり、研究をすすめる。24年度に新たな発見としてAMPK

シグナルの活性化が見いだされたので、このシグナルとの関連性も加えて解析していきたい。140円の旅費が繰り越されているが、予定通りに研究費を使用する。