hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レプトスピラの維持宿主動物における持続感染機構の分子基盤の解明

人獣共通感染症であるレプトスピラ症の病原体レプトスピラは,維持宿主動物と呼ばれる哺乳動物の腎臓に持続感染することができるが,持続感染に必須のレプトスピラ因子はほとんど明らかになっていない.本研究は,トランスポゾン挿入変異法によりゲノムワイドなレプトスピラランダム変異体ライブラリーを作製して維持宿主動物の感染実験を行い,腎臓に定着できない変異体を同定することにより,レプトスピラの維持宿主における持続感染機構の分子基盤を総合的に解明することを目的とする.レプトスピラ血清型Manilaeのトランスポゾン挿入株96株を個別に培養して,ラットWKAH/Hkmメス6週齢に約1×10の8乗細胞(各株1×10の6乗細胞)を腹腔内接種し,21日後に腎臓を回収し培養を行った.接種前培養(インプット)および腎臓培養(アウトプット)からDNA抽出を行い,トランスポゾン挿入近傍のDNAライブラリーを作製し,MiSeqによりDNAシーケンスを行った.その結果,インプットに対するアウトプット比が0.2%以下となったDNA配列を2つ同定することができた.この配列にトランスポゾンが挿入されている株をライブラリーからPCRによって同定し,その増殖能および血漿抵抗性を調査したが,親株と同等であった.また一括培養したトランスポゾン挿入株414株を1×10の8乗細胞接種したラットにおいて,インプットに対するアウトプット比が2%以下となったトランスポゾン挿入配列を7つ同定できた.人獣共通感染症であるレプトスピラ症の病原体レプトスピラは,維持宿主動物と呼ばれる哺乳動物の腎臓に持続感染している.持続感染の成立には,1細胞バリアを貫通して血流に侵入し,2血液の殺菌機構に抵抗して腎臓に到達し,3腎臓に定着をする必要があるが,これらの感染ステップに必須のレプトスピラ因子はほとんど明らかになっていない.本研究は,トランスポゾン挿入変異法によりゲノムワイドなレプトスピラランダム変異体ライブラリーを作製して維持宿主動物の感染実験を行い,腎臓に定着できない変異体を同定することにより,レプトスピラの維持宿主における持続感染機構の分子基盤を総合的に解明することを目的とする.既存のトランスポゾン挿入変異法の改変を行うことで,L. interrogans血清型Manilaeの形質転換効率を500倍向上させることができ,ゲノムワイドなライブラリー作製法を確立した.10の5乗8乗細胞のManilae株を維持宿主であるラット(WKAH/Hkm)に腹腔内接種し,感染21および28日後の腎臓の定着を調査した結果,10の7乗細胞以上で感染が成立することが明らかとなった.しかしながら,各細胞数・感染後日の腎臓定着の結果が一定せず,大規模な変異体スクリーニングを行うことができなかった.今後ラットの系統を変更するとともに,マウス維持感染モデルが利用できるかを調査し,Manilae株の腎臓定着モデルを確立し,変異体ライブラリーのスクリーニングを行う.ラットの感染実験の結果が安定せず大規模なスクリーニングを行うことができないため.今後動物種を変えることも検討する必要がある.人獣共通感染症であるレプトスピラ症の病原体レプトスピラは,維持宿主動物と呼ばれる哺乳動物の腎臓に持続感染することができるが,持続感染に必須のレプトスピラ因子はほとんど明らかになっていない.本研究は,トランスポゾン挿入変異法によりゲノムワイドなレプトスピラランダム変異体ライブラリーを作製して維持宿主動物の感染実験を行い,腎臓に定着できない変異体を同定することにより,レプトスピラの維持宿主における持続感染機構の分子基盤を総合的に解明することを目的とする.レプトスピラ血清型Manilae株のラットWKAH/Hkmでの腎臓定着率が安定しなかったため,他系統のラットWisterおよびマウスC57BL/6Jで感染実験を行った.その結果,Wisterにおける腎臓定着率はWKAH/Hkmと変わらず,C75BL/6Jには致死的な感染を引き起こすことが明らかとなった.そこでWKAH/Hkmメス4週齢に1匹当たりトランスポゾン挿入株96株を各約10の6乗細胞(計約10の8乗細胞)腹腔内接種し,21日後に腎臓を回収し培養を行った.接種前培養(インプット)および腎臓培養(アウトプット)からDNA抽出を行い,Nextera XTキット(イルミナ)を用いてトランスポゾン挿入近傍のDNAライブラリーを作製した.MiSeqによりライブラリーのDNAシーケンスを行った結果,インプットで検出されるがアウトプットでは検出できないDNA断片を複数同定することができた.Manilae株の持続感染モデル動物を選定すること,Nextera XTキットでのライブラリー作製の条件検討に時間がかかってしまった.人獣共通感染症であるレプトスピラ症の病原体レプトスピラは,維持宿主動物と呼ばれる哺乳動物の腎臓に持続感染することができるが,持続感染に必須のレプトスピラ因子はほとんど明らかになっていない.本研究は,トランスポゾン挿入変異法によりゲノムワイドなレプトスピラランダム変異体ライブラリーを作製して維持宿主動物の感染実験を行い,腎臓に定着できない変異体を同定することにより,レプトスピラの維持宿主における持続感染機構の分子基盤を総合的に解明することを目的とする.レプトスピラ血清型Manilaeのトランスポゾン挿入株96株を個別に培養して,ラットWKAH/Hkmメス6週齢に約1×10の8乗細胞(各株1×10の6乗細胞)を腹腔内接種し,21日後に腎臓を回収し培養を行った.接種前培養(インプット)および腎臓培養(アウトプット)からDNA抽出を行い,トランスポゾン挿入近傍のDNAライブラリーを作製し,MiSeqによりDNAシーケンスを行った.

その結果,インプットに対するアウトプット比が0.2%以下となったDNA配列を2つ同定することができた.この配列にトランスポゾンが挿入されている株をライブラリーからPCRによって同定し,その増殖能および血漿抵抗性を調査したが,親株と同等であった.また一括培養したトランスポゾン挿入株414株を1×10の8乗細胞接種したラットにおいて,インプットに対するアウトプット比が2%以下となったトランスポゾン挿入配列を7つ同定できた.Manilae株の持続感染モデルを確立するために,他のラット系統(Wistar)やマウス(BALB/c)持続感染モデルが本株で利用できるかを調査する.確立した持続感染モデルを用いて,感染21あるいは28日後の腎臓に定着できない変異体のトランスポゾン挿入位置をMiSeqにより同定する(TraDIS法).同定された変異体の,1培養細胞monolayer通過性,2血清耐性(補体耐性),3腎上皮培養細胞への接着能を確認し,感染のどのステップに欠損があるかを明らかにする.腎臓に定着できなかった変異株をライブラリーから回収し,単独で感染実験を行い腎臓定着性を再確認するとともに,1培養細胞monolayer通過性,2血清耐性(補体耐性),3腎上皮培養細胞への接着能のどのステップに欠損があるかを明らかにする.感染実験の条件検討を完了することができず大規模なスクリーニングを行うことができなかったため.また一部については,年度末納品等にかかる支払いが平成29年4月1日以降となったため,当該支出分については次年度の実支出額に計上予定.持続感染モデル動物の選定に時間がかかってしまい,スクリーニング規模が想定より小さくなってしまったため.また一部は年度末納品等にかかる支払いが平成30年4月1日以降となったため,当該支出分については次年度の実支出額に計上予定.感染実験条件を確立し早急に大規模スクリーニングを行う.また当該支出分については上記の通り.
T細胞抗原受容体CDR3解析による造血細胞移植後免疫再構築のモニタリング

CDR3スペクトラタイピングにより、レシピエントの免疫能は主としてαβ型T細胞レパートリーの回復に依存し、γδ型T細胞の再構築とはあまり相関しないことが示された。以上の結果は移植後早期におけるT細胞再生経路の主体がαβ型T細胞のperipheral expansionであることを示唆していると考えられた。造血細胞移植後の免疫能再構築に関する解析同種骨髄移植および同種末梢血幹細胞移植を受けた症例の末梢血リンパ球からRNAを抽出し、cDNA合成後Vβ鎖サブファミリーに特異的なプライマー(35種類)とCβ1に対するプライマーを用いたPCRを行い、ついで蛍光ラベルしたCβプライマー(PCR増幅に用いたプライマーより5'上流域に設定)で伸張反応を行った.得られた試料について自動DNAシークエンサー(ABI377)によりサイズ・スペクトラタイピングを行った.日和見感染症の多い骨髄移植後日数ヵ月間におけるCDR3の多様性の変化について、臨床所見と合わせ検討した.(1)骨髄移植を受けた症例において、ほぼ全例にクローナルなT細胞の増加が確認された。(2)ウイルス性間質性肺炎を合併した症例では多数のVβ鎖サブファミリーの欠落が観察された。間質性肺炎を合併しなかった症例においてはVβ鎖サブファミリーの欠落は軽度か全くみられなかった。結論:T細胞抗原受容体CDR3解析は移植後の免疫再構築のモニタリングに有用である。同種骨髄移植および同種末梢血幹細胞移植を受けた症例の末梢血リンパ球からRNAを抽出し、cDNA合成後Vβ鎖およびVδ鎖サブファミリーに特異的なプライマーとCβ1およびCδに対するプライマーを用いたPCRを行い、ついで蛍光ラベルしたCβあるいはCδプライマー(PCR増幅に用いたプライマーより5'上流域に設定)で伸張反応を行った.得られた試料について自動DNAシークエンサー(ABI 377)によりサイズ・スペクトラタイピングを行った.日和見感染症の多い骨髄移植後日数ヶ月間におけるVβ鎖およびVδ鎖のCDR3の多様性について、臨床所見と合わせ検討した.(1)ウイルス性間質性肺炎を合併した症例では多数のVβ鎖サブファミリーの欠落が観察された。(2)一方、Vδ鎖レパートリーについては日和見感染症の有無にかかわらず回復は速やかであった。結論:骨髄移植後の免疫能はT細胞抗原受容体Vβ鎖の多様性と相関があるが、Vδ鎖の多様性との間には相関はみられなかった。T細胞抗原受容体Vβ鎖CDR3解析は移植後の免疫再構築のモニタリングに有用であると考えられた。ヒト同種造血幹細胞移植後におけるT細胞再生の機序について、T細胞受容体(TCR)レパートリーの観点から解析した。移植後2ないし3ヶ月めにT細胞抗原受容体α鎖可変領域(T-cell receptor α-chain variable region,TCRAV)およびT細胞抗原受容体β鎖可変領域(T-cell receptor β-chain variable region,TCRBV)レパートリーのskewingが観察され、その程度は成人においてより顕著であった。TCRAVおよびTCRBVレパートリーのゆがみはクローナルなT細胞の増加に起因し、TCR-β鎖complementarity-determining region 3(CDR3)領域にコンセンサスシークエンスがみられる症例が存在した。CDR3スペクトラタイピングによりレシピエントの免疫能はαβ型T細胞レパートリーの回復に依存していることが示された。これらの結果は移植後早期におけるT細胞再生経路の主体は動物実験モデルでその存在が証明されているperipheral expansionであることを示唆している。
ストリゴラクトン生合成・分泌の分子機構とその調節による寄生・共生の制御

植物の根から分泌されるストリゴラクトンは、一方では、農作物に大きな被害を与える根寄生雑草種子の寄生を、他方では、有用な共生菌であるアーバスキュラー菌根菌(AM菌)の共生を誘導する。そこでストリゴラクトン生合成と分泌の分子機構を解明し、それらの調節によって寄生と共生を制御することを目的として研究を行った。その結果、(1)数種類の新規ストリゴラクトンの化学構造、(2)ストリゴラクトンの生産・分泌に対する植物栄養素の影響、(3)ストリゴラクトンの寄生雑草種子発芽およびAM菌菌糸分岐における構造活性相関、(4)根寄生雑草の宿主植物への侵入、寄生における宿主植物との相互作用を明らかにした。また、イネの地上部枝分かれ(分げつ)過剰変異体の解析から、それらがストリゴラクトンの生合成およびシグナル伝達の欠損突然変異体であり、ストリゴラクトンはカロテノイドから生合成されること、植物体内では枝分かれを抑制する植物ホルモンとして働いていることが分かった。ストリゴラクトン(SL)は、植物の二次代謝産物であり、根から根圏に分泌されて根寄生雑草種子の発芽刺激物質として、同時に、アーバスキュラー菌根菌(AM菌)の菌糸分岐誘導物質として機能する。すなわち、SLは共生・寄生の両方の宿主認識に関与している重要な根圏情報物質である。本研究の最終的な目標であるSLの生産・分泌調節による寄生・共生の制御を可能とするためには、植物界におけるSLの多様性、分布、生合成、代謝、分泌機構およびそれらに影響する要因と相互作用の全体像を明らかにする必要がある。そこで本研究では、SLの(1)単離・構造決定、(2)構造活性相関の解明、(3)宿主植物の生育条件がSL生産・分泌に及ぼす影響の解明、(4)生合成経路・分泌機構の解明を行う。タバコとアマの根滲出液から2種類の新規ストリゴラクトンを単離し、構造を決定した。また、1992年にササゲから単離され構造不明のままであったアレクトロールの構造を明らかにした。さらに、ソルガムおよびエンドウが分泌する新規ストリゴラクトンの推定構造を提出した。このように、新規ストリゴラクトンの探索と構造決定は極めて順調に進展した。なお、備品として購入したGC/MSは、構造決定と同定に有効に活用した。植物栄養条件がストリゴラクトン生産・分泌に及ぼす影響を解析した結果、根粒菌と共生するマメ科植物ではリン酸欠乏下でのみ生産・分泌が促進されたのに対して、根粒菌と共生しないイネ科植物、キク科植物では、リン酸欠乏だけではなく、窒素欠乏条件でも促進された。一方、アーバスキュラー菌根菌(AM菌)と共生しない植物では、栄養条件の影響は認められなかった。すなわち、植物の栄養獲得戦略とストリゴラクトン生産・分泌とが良く対応していることが分かった。適切な施肥および全身獲得抵抗性を誘導する薬剤の利用による根寄生雑草オロバンキの制御あるいは寄生回避を、室内および温室内実験で確認した後、オーストラリアの根寄生雑草(Orobanche ramosa)汚染地帯での小規模な圃場試験によって実証を試みた。しかし、異常気象と試験開始時期の遅れから、期待した結果は得られなかった。今後、根寄生雑草の圃場試験に充分な実績を有する海外研究者との共同研究を進める。生合成経路の解明はそれほど進展しなかったが、ストリゴラクトンはカロテノイドの酸化開裂によって生合成されるという説が有力視されている。アカクローバーおよびトウモロコシでは、カロテノイド生合成阻害剤のフルリドンを投与するとストリゴラクトン分泌量が低下した。カロテノイド酸化開裂酵素の新しい阻害剤が開発されつつあるので、次年度はそれらを使ったアプローチも試みる予定である。ソルガム、アマ、エンドウが生産・分泌する新規ストリゴラクトンの単離構造決定を行った。ソルガムが分泌するストリゴラクトンであるソルゴモールは8位のgemジメチル基の一方(β配位)が水酸化されており、さらに酸化・脱炭酸されてソルゴラクトンに変換されると考えられる。その他の新規ストリゴラクトンはすべてオロバンコールから生合成されると予想され、ストリゴラクトンの生合成経路や相互変換に関する貴重な情報が得られた。各種の植物についてそれらが生産・分泌するストリゴラクトンを分析した結果、植物は、少なくとも2種類のストリゴラクトンを分泌していることが分かった。そこで、植物栄養条件がストリゴラクトン生産・分泌に及ぼす影響を解析するに当たって、前年度までは1種類のストリゴラクトンの定量を行っていたが、本年度からは主要なストリゴラクトン2種類あるいは3種類について定量した。

その結果、全体的には、植物の栄養獲得戦略とストリゴラクトン生産・分泌が対応していたが、植物種によって、またストリゴラクトンによって植物栄養成分の影響が異なる場合もあることが明らかとなった。今後、ストリゴラクトンの生合成経路を考慮に入れて検討する必要がある。各種植物が生産・分泌する新規ストリゴラクトンの探索を継続した。その結果、エンドウからは初めてのエント体ストリゴラクトンであるファバシルアセテートを、アマからは7-オキソオロバンコールおよびそのアセテートを単離・構造決定し、ストリゴラクトンの生合成経路がその立体化学を含めて多様性に富むことが分かった。マメ科植物が生産・分泌するストリゴラクトンを精査した結果、植物間で主要なストリゴラクトンが異なることが分かった。また、アーバスキュラー菌根菌(AM菌)と共生しないホワイトルーピンもストリゴラクトンを生産していることから、ストリゴラクトンが未知の重要な機能を担っていることが示唆された。本研究に密接に関連した特筆すべき成果は、まさにその未知の機能が解明されたことである。すなわち、ストリゴラクトンは、長い間その本体が不明であった、枝分かれ抑制ホルモンであることが示された。根圏に放出されたストリゴラクトンは根寄生雑草の発芽刺激活性とAM菌の菌糸分岐誘導活性によってそれぞれ寄生と共生のシグナルとして、植物体内では枝分かれ抑制ホルモンとして機能しているのである。この発見を契機として、ストリゴラクトン研究の重要性が更に高まった。枝分かれ抑制ホルモンは、カロテノイドの2段階の酸化開裂、更にP450モノオキシゲナーゼによる酸化によって生成するとされているが、その詳細は不明である。ストリゴラクトン生合成欠損変異体が利用可能となったことから、生合成経路解明のスピードアップが期待される。新規ストリゴラクトン(SL)の探索を行った結果、キュウリ、アマから、7α-および7β-ヒドロキシオロバンコールおよびそのアセテートを単離・構造決定した。また、エンドウからはファバコールの単離に成功した。各種植物の根浸出液を精査したところ、前者は植物界に比較的広く分布していることが分かった。なお、イネ、トウモロコシなどの水耕液から新規SLが検出されており、現在構造解析を進めている。陸上植物の中で進化的にもっとも基部で分岐したコケ植物の内、蘇類のヒメツリガネゴケは、MAX1ホモログを持っていないにも関わらずSLを生産していることが明らかとなった。さらにカロテノイド酸化開裂酵素遺伝子(CCD8)破壊株もSLを生産していることから、ヒメツリガネゴケのSL合成経路は高等植物とは異なっていることが示唆された。植物の水耕液から単離されている11種のSLの根寄生植物ヤセウツボ種子に対する発芽刺激活性を調査した結果、発芽刺激活性にはSL間で100倍以上の差があること、SLの疎水性および化学的安定性が発芽刺激活性に影響することが分かった。植物は複数のSL混合物を分泌していることから、2種類のSLを混合した場合の発芽刺激活性を数種類の根寄生植物種子を用いて検定した。その結果、根寄生植物種によって個々のSLおよびその組み合わせに対する感受性が異なっており、相加的効果や拮抗的効果が認められた。
顕微レーザー誘起蛍光計測法を用いた冷却イオンのゆらぎ計測

イオントラップに閉じ込めた一成分プラズマをレーザー冷却することで、気相-液相-固相の3相のプラズマを生成できる。この系では粒子間の相関を広い範囲で制御した実験ができるため、プラズマの物性におけるクーロン相互作用の効果を詳細に研究するのに理想的な系である。粒子相関の効果は、スペクトル形状の小さな変化として現れると考えられているため、その変化を観測するには実験精度の向上が特に重要となる。本研究では、レーザー冷却により状態制御された微小な一成分プラズマの、高精度な顕微レーザー誘起蛍光(LIF)測定系を開発した。それに加え、広い温度範囲でプラズマを安定に制御して実験を行うため、レーザー冷却用および計測用光源の性能を向上させた。これら新しく開発した実験系を用いて、強結合-弱結合の中間領域の顕微レーザー誘起蛍光スペクトルの形状変化を詳細に検討し、クーロンポテンシャルの遮蔽メカニズムの変化を示唆する結果を得た。レーザー冷却によって生成した強結合プラズマは広い範囲でクーロン結合状態を制御できるため,プラズマの物性に対するクーロン相互作用の影響を詳細に研究するのに理想的な系である.しかしながら,レーザー冷却によって温度制御されたプラズマは非常に脆弱であり,実験的手法によって得られる情報は限られており,その非破壊測定法の開発が求められている.これまでの研究で,RFトラップ中のレーザー冷却プラズマのレーザー誘起蛍光(LIF)スペクトルを微弱なプローブレーザーを用いて非破壊測定することに成功している。測定したLIFスペクトルを,Voigt分布を用いてドップラー成分とローレンツ成分に分離することでイオンの熱運動と衝突に関する情報が得られるが,熱運動に関する情報はイオンの冷却に伴い観測が困難になるという問題も明らかになっている.本研究では、顕微鏡を用いたLIF計測系を開発し、観測領域を平均イオン間距離程度まで縮小することでイオン密度の統計的ゆらぎを観測することを目的としている.これにより,ドップラー成分が観測困難となる極低温プラズマの熱運動の情報が得られる.今年度は,高倍率な顕微LIF測定に必要となる薄型超高真空容器,光学高真空窓および多段型イオントラップを設計・製作した.レーザー冷却によって生成した強結合プラズマは広い範囲でクーロン結合状態を制御できるため,気相-液相-固相の3相におけるプラズマの物性を詳細に研究するのに理想的な系である.しかしながら,レーザー冷却によって温度制御されたプラズマは非常に脆弱であり,その非破壊測定法の開発が求められている.これまで我々が開発した微弱プローブ光によるプローブレーザー誘起蛍光(LIF)スペクトル測定法では,冷却イオンのスペクトルを非破壊で測定し,イオン温度と内部素過程の変化について明らかにすることが出来た.しかし,イオン温度が100ミリケルビン程度よりも低くなると,LIFスペクトルのドップラー広がりと一様広がりの大きさが同程度となるため,スペクトル形状から情報を得る手法は適さなくなる.本研究では,プラズマ中の密度ゆらぎをLIF信号の強度変調として観測し,その統計解析より相転移近傍のプラズマの熱力学的物性を明らかにすることを目的としている.この場合,LIF強度のみが必要となるため測定可能な温度範囲の制限は無く,プローブLIF法と併用することでより広いパラメータ領域での実験が可能になる.平成23年度は,イオントラップの動作テスト、閉じ込めイオンのレーザー冷却実験を開始するとともに、顕微LIF測定のための拡大光学系の設計・制作を行った.また,顕微LIF実験の予備実験としてプローブLIF法を用いた気相-液相境界領域のプラズマ計測を行った.これにより,プラズマ内部の素過程の観点から見た場合,クーロン結合係数Γが0.1程度で既に強結合の効果が現れており,気相-液相の特徴的な変化を観測するには,よりΓが小さい領域でのプラズマの制御性を確保することが必要であることが明らかとなった.イオントラップに閉じ込めた一成分プラズマをレーザー冷却することで,気相ー液相ー固相の3相のプラズマを生成できる.この系では装置に変更を加えることなく,粒子間の相関を広い範囲で制御した実験ができるため,プラズマの物性におけるクーロン相互作用の効果を詳細に研究するのに理想的な系である.しかしながら,レーザー冷却によって温度制御されたプラズマは非常に脆弱であり,その非破壊測定法の開発が求められている.

これまでに,我々は微弱プローブ光によるプローブレーザー誘起蛍光(LIF)法を開発し,非破壊計測されたLIFスペクトルからイオン温度およびイオンーイオン衝突周波数を得ている.本研究で提案している顕微LIF測定は,プローブLIF法と相補的な関係にあり,両方の測定法による計測を組み合わせることでプラズマの熱力学的物性とプラズマ内の素過程の関係を明らかにすることができる.平成24年度は,広い範囲で温度制御したプラズマを安定に生成して,これらの測定法を用いた実験を可能にするため,実験系の性能向上をはかった.イオン温度を制御するレーザー冷却用397nm第二高調波光源のフィードバック制御系を改善し,安定性および波長掃引幅を向上させた.また,これまではプローブ計測用397nm第二高調波光源の波長掃引幅の制限により,イオン温度が1K程度よりも高いプラズマの計測が出来なかったが,新たに397nmの外部共振器型半導体レーザー光源を作製して波長掃引幅を広げることで数十K以上までの計測を可能にした.顕微LIF測定系については,イメージインテンシファイア付CCDカメラを用いた2次元顕微LIF測定系を加えることで,レーザーによる励起領域を制御した計測が出来るよう改良を行った.平成23年度の交付申請書の計画通り,イオントラップの動作テスト,閉じ込めイオンのレーザー冷却実験を開始するとともに,顕微LIF測定のための拡大光学系の設計・制作を行った.24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は以下の計画で、顕微LIF測定を開始するとともに、LIF信号のゆらぎ解析手法の検討を行う。4月-8月顕微LIF系の観測領域の確認および時系列データ蓄積系の構築LIF信号をICCDカメラで観測することで観測体積の確認を行う。また、時系列データ蓄積系を構築する。9月-12月顕微LIF実験開発した顕微LIF測定系を用いて、弱結合-強結合境界領域でゆらぎ測定実験を行う。1月-3月成果の取りまとめデータの解析および成果の取りまとめを行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。
Birt-Hogg-Dube症候群原因遺伝子(BHD)の腫瘍抑制機能の解明

BHD産物(Flcn)に結合するFnip1の遺伝子に相同性を示す新たな遺伝子(FNIPL)を見出した。強制発現系を用いて調べたところ、FnipL産物もFlcnと結合することが明らかとなった。欠失変異体の解析から、結合ドメインは双方のC末端領域に見出された。さらにFnipLの共発現によりFlcnの局在が核から細胞質優位になることがわかり、その局在変化は結合に依存することが示唆された。またFnipLはFnip1と同様にAMPKによりリン酸化された。HeLa細胞において、RNAiによりFlcn、Fnip1、FnipL各々を抑制した場合、S6K1のリン酸化が低下した。これらの結果から、Flcn-Fnipl/FnipL複合体がmTOR経路を正に制御する可能性が示唆された。一方、EkerラットのTsc2欠損腎癌細胞株においてラバマイシン処理を行い、リン酸化によるFlcnのバンドシフトが抑制されることを見出した。またTsc2欠損腎癌細胞にTsc2発現系を導入した細胞においてもリン酸化の抑制が観察された。Rheb発現によるFlcnのリン酸化の亢進、Raptorの発現抑制によるリン酸化の抑制も確認され、Tsc2mTORC1のシグナル伝達経路によりFlcnのリン酸化が制御されていることが明らかとなった。また欠失変異体を用いた解析により、AMPKによるFlcnリン酸化部位が306-342番目のアミノ酸残基の領域に存在することが示唆された。これとは異なるN末端領域の主要なリン酸化セリン残基があることも質量分析により明らかとなった。以上の結果から、Flcnは複雑なリン酸化の制御を受ける蛋白であり、mTORを中心としたシグナル伝達系と相互作用し、腫瘍発生の抑制に関与していると考えられる。本年度は、Bhd発現系を導入したNihonラット由来Bhd欠損腎腫瘍細胞の表現型の変化について、さらに検討を進めた。(1)Bhd発現により、JNKの活性化が亢進していることが示唆された。(2)細胞密度が高い状態で培養を継続したところ、Bhd非発現細胞の方が細胞の多層化が顕著であった。遺伝子発現関連では、調べた限りにおいてはBhd発現によって特異的に変化している遺伝子はこれまでのところ見出していない。一方、HeLa細胞を用いてsiRNAによるBHD発現抑制を行ったところ、最も顕著な変化としてS6K1リン酸化の抑制が認められた。現在これらの表現型を生ずる分子基盤の解明を進めている。Bhdのリン酸化については質量分析と部位特異的変異の導入、リン酸化配列特異抗体により、一つのリン酸化部位を確定した。強制発現系においてはこのリン酸化によって局在に著しい変化が生ずることはなく、また最近報告されたBhd結合タンパク(Fnip1)との結合能を失うことはなかった。また、EkerラットのTsc2欠損腎癌細胞株においてラパマイシン処理を行い、リン酸化によるBhdのバンドシフトの様子が変化することを見出した。またTsc2欠損腎癌細胞にTsc2発現系を導入した細胞においてもバンドシフトの変化が観察されたことからBhdとTsc1/Tsc2の関与する経路に関連があることが示唆された。さらにリン酸化とFnip1の関連を調べる過程で、Fnip1遺伝子に相同性を示す新たな遺伝子(FnipL)を見出した。強制発現系を用いて調べたところ、FnipL産物もBhdと結合することを明らかにした。昨年度見出したBHD産物(Flcn)とFnipLの結合に関して、結合ドメインが双方のC末端領域にあることを明らかにした。さらにFnipLの共

発現によりFlcnの局在が核から細胞質優位になることがわかり、その局在変化は結合に依存することが分かった。またFnipLはFnip1と同様にAMPKによりリン酸化されていることが分かった。HeLa細胞において、RNAiによりFlcn、Fnip1、FnipL各々を抑制した場合、S6K1のリン酸化が低下することがわかった。これらの結果から、少なくとも一部の細胞においてFlcn-Fnip1/FnipL複合体がmTOR経路を正に制御する可能性が示唆された。一方、mTOR抑制機能を持つTsc2産物の発現により、Flcnのリン酸化が抑制されることが明らかとなった。Rheb発現によるFlcnのリン酸化の亢進、Raptorの発現抑制によるリン酸化の抑制も確認され、Tsc2mTORのシグナル伝達経路によりFlcnのリン酸化が制御されていることが明らかとなった。また欠失変異体を用いた解析により、AMPKによるFlcnリン酸化部位が306342番目のアミノ酸残基の領域に存在することが示唆された。これとは異なるN末端領域の主要なリン酸化セリン残基があることも質量分析により明らかとなった。以上の結果から、Flcnは複雑なリン酸化の制御を受ける蛋白であり、mTORを中心とするシグナル伝達系と相互作用し、腫瘍発生の抑制に関与していると考えられる。
DICOM3.0のファイリング機能を利用したディジタルX線画像の質的保証支援システム

ディジタル放射線画像の品質保証(QA)のための品質管理(QC)を、できるだけ少ない手間と少ない費用で行うシステムを開発した。主な開発成果は、以下のようなものであった。1.コンピューテッドラジオグラフィー(CR)による出力X線強度、半価層、管電圧の測定個人被曝測定用フィルムバッジケースに歯科口内法撮影用イメージングプレート(IP)を装填して、出力X線強度、半価層、管電圧の恒常性を検査する。測定窓のフィルタにアルミニウム、銅、錫を使用して、半価層は±0.17mmAl、出力X線強度は±5%、管電圧は±2%の誤差で測定できることが示された。2.IPの劣化を評価する方法の開発口内法撮影用IPは蛍光体層が傷付き易く、短期間で劣化するものが多い。これを簡便に試験し、管理する方法を開発した。IPを一様に曝射して読出した画像を処理して、傷を検出する画像処理手順を決めた。3.検査結果を簡便に評価して保存管理する品質保証支援情報システムの開発上記の検査結果を保存・管理するQA支援情報システムをDICOM規格に準拠して開発した。このため、QA/QCに係る事物の情報システムとしての性質を、オブジェクト指向分析によって定式化した。これに基づいて、QCオブジェクトクラスの構造(IOD)とサーバー/クライアントの機能(Service Class)を定義した。この結果、歯科放射線画像に留まらず、あらゆる画像診断のQAに応用可能な仕様となった。今後各オブジェクトの情報要素の表記法の詳細を検討すると共に、相互接続試験のための公開ソフトウエアCTNを基に、コーディングを開始する予定である。1.質的保証のためのDICOM規格に基づくIODおよびサービスクラスの定義ディジタル画像の質的保証のために必要なデータ項目を、DICOMの保存オブジェクトとして纏めるためのIODおよび、検索・転送時のサーバーとクライアントが行うべき処理(サービスクラス)を定義した。2.撮像装置の整備撮像装置として、コンピューテッドラジオグラフィ方式のDenoptix Pan scannerを購入し、処理用電算機に接続して、制御ならびに測定ソフトウエアをインストールした。3.基本特性の測定最初の目標として、X線装置の出力X線とその線質を管理する機能を開発する事とし、イメージングプレート(IP)のX線検出器としての、以下の基本特性を測定した。1)感度及び再現性:口内法撮影装置による照射で十分な信号が得られ、再現性は±3%以内であった。2)フェーディング特性:揮尽性蛍光体のIPはフェーディングがあるが、室温における信号の減衰は1時間あたり7%程度であり、照射直後に読み出し処理をすれば、十分な信頼性が有る事を確認した。3)線質依存住:フィルムバッジ(FB)ケースにIPを装填して、FBと同様の処理を行う事とした。フィルター無しでは5080kVの範囲で20%程度の依存性があった。アルミニウムフィルターによる読み値の減衰から、半価層の評価と線質依存性の補正が可能であった。以上から、IPによってX線装置の出力と線質の評価が可能であることを確認した。1.放射線画像診断の品質保証に関わるオブジェクト指向分析DICOMで扱う全てのディジタル画像の撮像過程と質的保証の手順をオブジェクト指向分析にかけ、品質管理情報特徴と流れを定式化した。これに基づき、昨年度に定義したIODを拡張して、全てのディジタル画像の品質管理に使えるIOD体系を定義した。撮影に用いるX線装置からIP、カセット、現像処理薬品に至るまで、全ての用具、材料を管理できる事、品質管理試験の作業手順の記述や、データシートまで出力する事などが大きな特徴である。2.サーバ電算機の整備品質管理情報を保存し、クライアントからの要求に応じて必要な情報を検索・転送するサーバー用の電算機を製作して、基本的なソフトウエアをインストールした。

3.CRシステムによる線量、半価層、管電圧の測定アルミニウム、銅、鉛のフィルタを有するフィルムバッジケースの中に歯科口内法撮影用イメージングプレート(IP)を装填して、40140kVの管電圧、1.03.7mmAlの総濾過のX線で照射して読み出し、そのピクセル値から、IPのレスポンスとフィルターの透過率の線質依存性を評価した。各フィルターの部分に自動的に関心領域を設定し、その中のピクセル値の平均値を読み出すソフトウエアを開発した。このピクセル値の平均値から、線量、半価層、管電圧を評価する経験式を導いた。この結果、価層は±0.17mmAl、線量は±5%、管電圧は±3.6%の誤差で測定できることが示された。1.放射線画像診断の品質保証に関わるオブジェクト定義昨年度に定義したディジタル画像の品質管理に用いるIOD体系に基づいて、IODごと、品質検査項目ごとのデータ項目と値を定めて、DICOMの規定に従ったオブジェクトを定義した。2.検査結果入力装置の開発毎日の始業点検項目を簡便に入力するための携帯端末を、市販のPDAを利用して開発した。現場で入力した結果が直ちにファイリングされるようになったため、点検の実施と記録、および評価の能率が著しく向上した。3.CRシステムによる出力X線強度、半価層、管電圧の測定昨年開発した、フィルムバッジケースに歯科口内法撮影用イメージングプレート(IP)を装填して、出力X線強度、半価層、管電圧の恒常性を検査するシステムを改良した。鉛フィルタの代わりに錫フィルタを使用したところ、半価層は±0.17mmAl、出力X線強度は±5%、管電圧は±2%の誤差で測定できることが示された。現在、これらの校正曲線を関数化して、自動的に結果をファイリングするソフトウェアを開発中である。4.IPの劣化を評価する方法の開発口内法撮影用IPは蛍光体層に傷が付き易く、短期間で劣化するものが少なくない。これを簡便に試験し、管理する方法を開発した。IPを一様に曝射して読み出した画像を処理して、欠陥箇所を検出する画像処理手順を決めた。これを自動的にスコア化して、傷の著しいIPを廃棄するように勧告するソフトウエアを開発中である。
アングロ・サクソン時代の文献に見られる「世界」観

2019年2月より研究を開始した。3月末の渡英を前に、共同研究者5名と連絡を取り合いながら、本共同研究の概要や方向性、進め方等について話し合い、2020年3月にオクスフォードでシンポジウムを開催すること、2020年7月にリーズで行われるInternational Medieval Congressにおいてセッションを行うこと、2021年3月ごろに研究成果をまとめた論文集を刊行することなど、本共同研究の大まかな流れを確認した。また、シンポジウムおよび論文集には研究代表者および共同研究者5名の他に、パネリストを複数招聘する予定であるため、具体的にどのような人選が考えられるかということについても話し合いを行った。2019年3月末には渡英し、直接共同研究者たちと話し合いを行い、上記のようなことを再び確認し、4月から本格的に研究を始めることが出来るような環境を整えることが出来た。渡英以前の打ち合わせは全て予定通りに行うことが出来、2019年3月末に予定通り渡英し、4月から本格的な研究を始めることが出来るような環境整備も出来たので、「おおむね順調に進展している」状況であるといえる。上記のように、2020年3月に本研究の成果に基づきシンポジウムを行う予定で、それに向けてこれから研究を行っていく予定である。申請書に記したように、研究代表者と共同研究者合計6名を3つのグループに分け、各グループごとにそれぞれのテーマについての研究を進めていくが、全員で定期的に会合を持ち、それぞれの進捗状況を報告したり、意見交換したりしながら進めていく予定である。これと並行して、シンポジウムの開催日や開催施設を決めたり、シンポジウムのために招聘するパネリストを選定したりといった事務的な作業も順次行う予定である。内定年度:20182019年2月より研究を開始した。
異相界面でのイオン移動と電子移動の相関性に立脚した選択的イオン分離の研究

水相/有機相あるいは水相/膜界面でのイオン移動反応は、両相間のガルバニ電位差によって支配される。本研究は、両相中にそれぞれ酸化体(あるいは還元体)および還元体(あるいは酸化体)を加え、両相間のガルバニ電位差を微妙に制御することによって、精確なイオン分離を可能にしようというものであった。以下に、研究成果の概要を記す。1.水相/有機相界面での電子移動反応の相互作用の理論的解釈.フェリシアン、フェロシアン、水酸イオンあるいはヒドロキノンなどを含む水相とフェロセン、テトラチアフルバレンあるいはテトラシアノキノジメタンなどを含む有機相との間での界面酸化還元反応(電子移動反応)を液々界面電荷移動ボルタンメトリ-によって測定し、電子移動反応を表わす理論式を導いた。また、電子移動反応は、両相中での添加分子(イオン)の標準酸化還元電位、濃度、拡散系数、活量によって表現できることを実証した。さらに、この理論式と液々界面イオン移動に関する理論式を組み合わせて、両電荷移動反応の相互作用を定量的に示し、実験結果を良く説明する理論を構築した。イオン移動と電子移動の相関性を利用すれば性質の似通ったイオンの相互分離が可能となる。上記の理論は生体膜界面での酸化還元とイオン移動反応の相互作用の解釈にも有用である。2.各種イオンの移動電位と温度、共存塩の効果.各種イオンの水相/有機相界面移動をガルバニ電位差と移動量の関数として、液々界面イオン移動ボルタンメトリ-(VICTLLI)で研究し、界面移動エネルギ-をイオン半径・電荷、溶媒物性を念頭において解釈した。界面イオン移動におよぼす温度の効果は、溶媒物性の温度変化によって説明し、水相共存塩の効果は、水の活量変化および水相中でのイオン対生成によって説明した。なお、温度や水相共存塩の効果を利用すれば、電子移動反応によってガルバニ電位差を規制した界面でのイオンの分離をより高選択的に達成できることも分かった。3.液々、液膜界面電荷移動に伴う界面電位差の振動機構の解明.液々、液膜界面をイオンが移動するとき、界面電位差の振動を伴えば、これがイオン分離に影響を与える。また、この振動現象は生体内刺激の発生と関係する。本研究では、液々界面イオン移動ボルタンメトリ-によって得られたイオン移動および界面吸着に関する知見と水相、有機(膜)相内でのイオン平衡に関する考察に基づいて、初めて同振動機構を解明しえた。本研究は、両相中にそれぞれ酸化体(あるいは還元体)および還元体(あるいは酸化体)を加え、両相間のガルバニ電位差を微妙に制御することによって、精確なイオン分離を可能にしようというものである。そのために行った平成元年度の研究は次のとおりである。

1.水相/有機相界面での電子移動の理論的解釈.フェリシアン、フェロシアン、水酸イオン、ヒドロキノンあるいはNADHなどを含む水相とフニロセン、テトラチアフルバレンあるいはテトラシアノキノジメタンなどを含む有機相との間では界面酸化還元反応が生じることを液々界面電荷移動ボルタンメトリ-によって明らかにした。また、電子移動反応は、両相中での添加分子(イオン)の標準酸化還元電位、濃度、拡散係数、活量によって表現できることを実証した。この研究によって、水相/有機相間のガルバニ差は、両相に加える酸化還元剤を選択することによっておおまかに調節でき、酸化還元剤の濃度を変えることによって詳細に調節できることが分かった。2.各種イオンの移動電位と温度、共存塩の効果.各種イオンの水相/有機相界面移動をガルバニ電位差と移動量の関数として、上記ボルタンメトリ-で研究し、界面移動エネルギ-をイオン半径・電荷、溶媒物性を念頭において解釈した。界面イオン移動におよぼす温度の効果は、溶媒物性の温度変化によって説明され、水相共存塩の効果は、水の活量変化および水相中でのイオン対生成によって説明された。3.上述の成果をもとに、電子移動反応によってガルバニ電位差を規制した界面でのイオン移動反応を調べ、各種カチオン、アニオンの高選択的分離が可能である見通しを得、現在、生体内反応との関係も考察中である。水相/有機相あるいは水相/膜界面でのイオン移動反応は、両相間のガルバニ電位差によって支配される。本研究は、両相中にそれぞれ酸化体(あるいは還元体)および還元体(あるいは酸化体)を加え、両相間のガルバニ電位差を微妙に制御することによって、精確なイオン分離を可能にしようというものである。以下、平成2年度の研究成果の概要を記す。1.水相/有機相界面での電子移動反応の相互作用の理論的解釈.平成元年度にはフェリシアン、フェロシアン、水酸イオンあるいはヒドロキノンなどを含む水相とフェロセン、テトラチアフルバレンあるいはテトラシアノキノジメタンなどを含む有機相との間での界面酸化還元反応(電子移動反応)を液々界面電荷移動ボルタンメトリ-によって測定し、電子移動反応を表わす理論式を導いた。また、電子移動反応は、両相中での添加分子(イオン)の標準酸化還元電位、濃度、拡散系数、活量によって表現できることを実証した。平成2年度には、この理論式と液々界面イオン移動に関する理論式を組み合わせて、両電荷移動反応の相互作用を定量的に示し、実験結果を良く説明する理論を構築した。イオン移動と電子移動の相関性を利用すれば性質の似通ったイオンの相互分離が可能となる。上記の理論は生体膜界面での酸化還元とイオン移動反応の相互作用の解釈にも有用である。2.液々、液膜界面電荷移動に伴う界面電位差の振動機構の解明.液々、液膜界面をイオンが移動するとき、界面電位差の振動を伴えば、これがイオン分離に影響を与える。また、この振動現象は生体内刺激の発生と関係する。本研究では、液々界面イオン移動ボルタンメトリ-及び水相、有機(膜)相内でのイオン平衡測定法を駆使することによって、初めて同振動機構を次のように解明した。液・液界面での振動は、2つのイオンi^z、j^zの交互移動に起因するが、振動を得るには、(1)両イオン移動の移動電位(ΔV)が界面の零電荷点を挟んで正負両側に分布しなければならず、(2)移動し易いイオンi^zのΔVでは吸着による攪はんを生じ、i^zが拡散律速以上の速度で移動する。
メタ記憶の観点に基づく記憶モニタリングの正確性と記憶コントロールの効果性の評価

本研究の目的は、実験室場面および日常生活場面において個人が自らの記憶能力や記憶特性、知識状態をどのようにとらえ、能動的な記憶活動の展開にいかに生かしているのかを実証的に明らかにすることである。一般大学生122名に対して個別的に、記憶実験と質問紙調査と記憶検査を実施し、記憶モニタリングの正確性と記憶コントロールの効果性に関する実験室データと日常記憶データの両方を収集した。これらのデータを総合してメタ記憶に関する理論的検討を行った。本研究は、近年、認知心理学的記憶研究において重要視されているメタ記憶に関連して、個人がどのように自らの記憶能力や記憶特性、知識状態をとらえ、能動的な記憶活動の展開に生かしているのかを実証的に明らかにすることにある。個人から記憶モニタリングの正確性と記憶コントロールの効果性に関する実験室データと日常記憶データの両方を収集し、それらに基づいて認知心理学的モデルの構築を試みるものである。平成22年度においては、当初の研究計画に沿って、具体的に次の四つの研究活動を行った。1.実験及び調査の準備:先行研究文献及び関連資料の入手、実験施設(実験室)の確保、実験装置の調達、実験用コンピュータプログラムの作成、実験データの記録様式の設定、実験参加者の確保、実験補助要員の確保、実験・調査の参加協力同意書の書式設定などを行った。2.学内倫理委員会の事前承認:所属研究機関である神戸学院大学の規程に基づいて、本研究の実験・調査の実施に関して学内の「ヒトを対象とする研究等倫理委員会」の審査を受け、承認を得た。3.予備実験及び予備調査の実施:予備段階での実験及び調査を大学生を対象に実施し、具体的な実験条件の操作や実験材料の選定、調査用紙の設計、測定指標の検討などを行った。4.既有の実験・調査データの公表(論文化):本研究の計画推進を図るために,本研究テーマに関連して過去においてすでに収集した実験調査データの整理・分析を行い、学会発表及び論文作成を行った(学会発表2件、大学紀要1編、学会誌1編(掲載内定))。本研究は、近年、認知心理学的記憶研究において重要視されているメタ記憶に関連して、個人がどのように自らの記憶能力や記億特性、知識状態をとらえ、能動的な記憶活動の展開に生かしているのかを実証的に明らかにすることにある。全体で3年の研究期間のうち2年目である平成23年度においては前年度の研究実績をもとに当初計画を拡張したうえで、具体的に次の四つの研究活動を行った。1.実験・調査・検査の準備:これまでに入手した先行研究資料、及び前年度に実施した予備実験・予備調査の結果をもとに、本研究の実験調査データ収集計画に関してかなり大幅な拡張を行った。拡張事項は主に次の3点である。(1)日常生活場面でのメタ記憶の調査について当初予定していた3種類の質問紙(EMQ,CFQ,及びMAQ)に加えて、最近日本版が開発されたMIA(成人用メタ記憶尺度)を導入する、(2)展望的記億との関連から時間的展望に関する尺度(最近日本版が開発された)を導入する。(3)記憶実験と記憶調査に加えて、標準化された個別記憶検査を実施する。こうして拡張された実験・調査・検査を行うために、実験室の再整備、調査用紙・検査用紙の設計・調達、研究データの記録様式の再設定、実験等参加協力者の確保、実験補助要員の確保などを行った。2.実験・調査・検査の実施:実験等参加協力者に対する個別的な実験・調査・検査に着手した。3.データ分析のための準備:研究データを分析するための手法や統計解析に関する資料を入手し、試験的な分析を行った。4.既有の実験・調査データの公表(論文化):本研究の計画推進を図るために,本研究テーマに関連してすでに収集した実験調査データの整理・分析を行い、学会発表及び論文執筆を行った。本研究は、近年、認知心理学的記憶研究において特に重要視されているメタ記憶に関連して、個人がどのように自らの記憶能力や記憶特性、知識状態をとらえ、能動的な記憶活動の展開にいかに生かしているのかを実験心理学的方法を用いて実証的に明らかにし、こうした記憶のモニタリングとコントロールを認知心理学的に評価しようとするものである。個人(一般成人)から記憶モニタリングの正確性と記憶コントロールの効果性に関する実験室データと日常記憶データの両方を収集することによって、今後、これまでのメタ記憶に関する実験室研究の成果と日常記憶研究の成果を包括的に議論することが可能になると考えられた。一般成人(大学生)122名が本研究に参加協力した。これらの研究参加者に対して同一の個人から記憶とメタ記憶に関する実験、メタ記憶質問紙調査、及び個別式記憶検査を実施し、記憶モニタリングの正確性と記憶コントロールの効果性に関する基準的なデータを収集した。これらの実験・調査・検査に関する個々の指標の度数分布及び指標間の関係を捉えようとした。

研究の結果、主として以下の知見が得られた。(a)記憶実験(自由再生課題)において実験参加者に直後再生の後に最終再生での再生項目数の予測を求めたところ、最終再生予測は再生試行の経過に従って過大予測から過小予測へと変化していった。(b)自由再生課題における「最終再生成績ー最終再生予測」と、メタ記憶質問紙及び時間的展望質問紙の因子ごとの平均評定値との関連性を調べると、いずれも相関関係は認められなかった。(c)自由再生課題における「最終再生成績ー最終再生予測」の値をもとに全実験参加者を記憶実験における過大予測群、適正予測群、過小予測群の3群に振り分けて、各群の記憶検査の結果を比較すると、ほとんどの指標得点において、過大予測群のほうが過小予測群よりも検査課題成績が低かった。上記「研究実績の概要」に記したように、予備実験と予備調査の結果、及び他の研究者による最近の研究結果をもとに当初の研究計画の拡張を図った。そのために、研究スケジュールの点では当初の予定よりも実験等の準備段階で若干の遅滞が生じた時期もあったが、全体の3カ年度の研究期間の2年目の研究達成度という点では当初の研究計画よりも多大な成果につながる進展がなされたと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。前述のとおり、当初の計画よりも、本研究で実施する実験・調査・検査がかなり大規模になったために、実際の研究データの収集に要する期間が長期化するとともに、実験等参加協力者への負担が大きくなった。そうした問題に対応し、本研究課題の成果を最大化するために、全体の研究期間の最終年度である平成24年度では、当初の予定であった海外での国際学会での中間的な研究成果(一部)の発表を取りやめ、それに要する時間と労力を研究データ収集にあてる。海外の学会への渡航費は、研究協力者(実験調査への参加協力者や実験調査データの整理補助者など)への謝金にあてる予定である。
免疫反応の時空間的イメージング解析

本研究の目的は、生体内における免疫反応を時空間的にイメージングすることである。一般臓器への免疫細胞の移動、あるいはそれらをコントロールするサイトカイン発現を時空間的に視覚化することは、免疫反応を理解し、制御する上で重要である。特に自己免疫疾患において、自己に対する過剰な免疫応答を制御することはその治療・予防に有用であり、自己免疫応答の視覚化はその制御方法を開発する上で意義深い。当研究室で作製されたF759マウスは、生後一年以内に自己免疫性関節炎を自然発症し、その病態がヒト関節リウマチとよく合致することが既に報告されている。このF759関節炎を自己免疫疾患のひとつのモデルとし、その発症機序について解析を行った。その結果、1、IL-17aがF759関節炎発症に重要であること、2、IL-17aによりIL-6が産生されることが発症に重要であること、また、3、試験管内で、繊維芽細胞において、IL-6/STAT3とIL-17a/NF-kBの活性化経路が相乗的にIL-6の産生を増加させること、が示された。これらからIL-17aにより、非造血系においてIL-6の増幅ループが形成されることが自己免疫発症に重要であると予想され、事実、この増幅ループの構成因子であるSTAT3を非造血系でコンディショナル・ノックアウトしたF759マウスは、関節炎発症が顕著に抑制された。さらにこのIL-6の増幅ループのモデルは、多発性硬化症モデル、EAEにおいても適合することを示した。これらから、IL-6の増幅ループは広く自己免疫疾患一般について、その発症に重要であると考えられた。現在、この非造血系におけるIL-6増幅ループが、どのように自己免疫疾患を発症させるのかを調べるため、IL-6発現細胞において蛍光を発するノックインマウスの作製によるIL-6増幅ループの可視化など、種々の方法を試みている。生体内における免疫反応の時空間的イメージングを目的に、核磁気共鳴画像法(MRI)、及び近赤外検出を用いて実験系を構築している。種々の自己免疫疾患において、どのように自己免疫応答が引き起こされるのかについては未だ不明な点が多く、自己免疫応答が可視化できれば、その機序の一端が明らかにできるものと期待される。免疫細胞の中でも、樹状細胞は抗原を提示する細胞であり、T細胞に抗原を提示し、T細胞を活性化させることが一連の免疫応答の開始に重要であると考えられている。そこで我々はまず、マウス骨髄由来の樹状細胞を試験管内で標識し、生体に移植後、検出する方法を構築した。樹状細胞に酸化鉄を内包する微小粒子、または蛍光分子標識微小粒子を貪食させると、酸化鉄、または蛍光分子を効率よく取り込ませることができた。また、この樹状細胞をマウス皮下に移植させると、帰属のリンパ節への移動、または他のリンパ節への移動がMRI、または近赤外蛍光検出、相方の方法において確認された。今後、樹状細胞の働きが必須である実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において、その発症に至るまでの樹状細胞の動き、T細胞活性化の誘導機序について検討を行う予定である。更に、免疫反応の中枢を担うT細胞にも焦点を当てている。同EAEにおいて、T細胞の移植により健常マウスに病気を移植することに成功しており、移植T細胞特異的な表面抗原に対する抗体を酸化鉄内包微小粒子に結合させ、これをマウスに静脈注射することにより、実際にEAEを誘導するこれらT細胞を可視化することも検討中である。このときフローサイトメーターにより移植T細胞が微小粒子と結合していることは既に確認している。また併せて、関節炎のモデルマウスであるF759マウスにおける自己免疫発症機序を明らかにし、可視化すべき主要な免疫反応の解析を集中して行っている。現在、この非造血系におけるIL-

6増幅ループが、どのように自己免疫疾患を発症させるのかを調べるため、IL-6発現細胞において蛍光を発するノックインマウスの作製によるIL-6増幅ループの可視化など、種々の方法を試みている。