hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Lnkファミリーアダプター蛋白質による増殖・分化シグナル制御の分子機構

リンパ系組織に発現するLnk及びそのファミリーアダプター蛋白質に着目し、その生理作用及び免疫系の構築および維持における役割について解析を進めた。lnk欠損マウスではB前駆細胞の過剰増殖が認められ、その一因がlnk欠損によるc-Kit増殖シグナルの亢進であることを示した。c-Kitは造血前駆細胞の主要な増殖因子受容体であるので、より未熟な造血前駆細胞でのlnk欠損の影響を検討した。lnk欠損マウスの骨髄では、造血幹細胞を含む分化抗原陰性c-Kit陽性Sca-1陽性分画が増加しており、CFU-Sを形成する多能性前駆細胞も増加していた。競合的骨髄再構築法によりlnk欠損造血幹細胞の造血能が飛躍的に亢進していることを明らかにした。c-Kit膜貫通部に欠失を持つWマウスと交配したところ、lnk欠損W/+マウスでは造血前駆細胞の増加が正常化に向かい、これにはc-Kitシグナルの増強が主因となっていると考えられた。一方、造血能の亢進はlnk損W/+マウスでも正常化せず、これにはLnk依存性c-Kit非依存性シグナルの制御破綻も関与すると考えられた。Lnkをリンパ球系細胞で過剰発現するトランスジェニックマウスではB細胞分化がproB細胞の段階で障害され、Lnkがc-Kit以外のシグナルにも抑制作用を持つことを確認した。Lnkによるc-Kit増殖シグナルの制御機構についてはマスト細胞株を用いて検討し、LnkがGab2リン酸化やそれに続くMAPK活性化を抑制し増殖シグナルを抑制することを示した。また、Lnkファミリー蛋白質群の生理作用を明らかにするため、SH2-B欠損マウス及びAPS欠損マウスを作製した。SH2-Bが生殖器官の成熟に重要な分子であること、APSがB-1細胞の増殖維持に重要な機能を持つことを明らかにした。lnk欠損マウスではB前駆細胞の過剰増殖によるB系細胞の増加が認められた。lnk欠損骨髄前駆細胞は、正常前駆細胞が反応できない低濃度のSCF(stem cell factor)にも反応し、正常より多くのかつ大きなコロニーを形成した。B細胞過剰産生の一因はlnc欠損によりc-kitを介する増殖シグナルが増強されるためであることが考えられた。SCFは造血前駆細胞の主要な増殖因子であるので、より未熟な造血前駆細胞でのlnk欠損の影響を検討した。lnk欠損マウスでは、造血幹細胞を含む分化抗原陰性c-Kit陽性Sca-1陽性分画が増加しており、骨髄移植後12日目にCFU-Sを形成する多能性前駆細胞も増加していた。競合的骨髄再構築(competitive repopulation)法により造血幹細胞の造血能を評価したところ、B細胞ばかりでなくT細胞や骨髄球系細胞の大部分もlnk欠損前駆細胞から産生され、造血幹細胞の造血能がInk欠損により飛躍的に亢進することがわかった。lnk欠損マウスをc-kit膜貫通部に欠失を持つWマウスを交配したところ、lnk欠損W/+マウスでは分化抗原陰性c-Kit陽性Sca-1陽性細胞分画が正常化に向かい、造血前駆細胞の増加はc-Kitシグナルの増強が主因と考えられた。一方造血能の亢進はlnk欠損W/+マウスでも正常化せず、Lnk依存性ではあるがc-Kitに依存しないシグナル伝達系の制御破綻も関与している可能性が示唆された。Lnkによるc-Kit増殖シグナルの制御機構について、c-KitおよびIL-3Rを発現するマスト細胞株を用いて検討した。LnKの発現量に応じてSCF依存性増殖が阻害される一方、IL-3依存性増殖は影響を受けず、Lnkの増殖抑制作用はc-Kit特異的と考えられた。c-Kit活性化に伴う細胞内蛋白質のリン酸化を検討したところ、LnkはGab2リン酸化、それに続くMRPK活性化を抑制し増殖シグナルを抑制することが考えられた。また、Lnkファミリー蛋白質群の生理作用を明らかにするため、APS欠損マウス、SH2-B欠損マウスを作製し、解析を開始した。

Lnkをリンパ球系細胞で過剰発現するトランスジェニックマウスではB細胞分化がproB細胞の段階で障害され、Lnkがc-Kit以外のシグナルにも抑制作用を持つことを確認した。Lnkによるc-Kit増殖シグナルの制御機構についてはマスト細胞株を用いて検討し、LnkがGab2リン酸化やそれに続くMAPK活性化を抑制し増殖シグナルを抑制することを示した。また、Lnkファミリー蛋白質群の生理作用を明らかにするため、SH2-B欠損マウス及びAPS欠損マウスを作製した。SH2-Bが生殖器官の成熟に重要な分子であること、APSがB-1細胞の増殖維持に重要な機能を持つことを明らかにした。リンパ系組織に発現するLnk及びそのファミリーアダプター蛋白質に着目し、その生理作用及び免疫系の構築および維持における役割について解析を進めた。lnk欠損マウスではB前駆細胞の過剰増殖が認められ、その一因がlnk欠損によるc-Kit増殖シグナルの亢進であることを示した。c-Kitは造血前駆細胞の主要な増殖因子受容体であるので、より未熟な造血前駆細胞でのlnk欠損の影響を検討した。lnk欠損マウスの骨髄では、造血幹細胞を含む分化抗原陰性c-Kit陽性Sca-1陽性分画が増加しており、CFU-Sを形成する多能性前駆細胞も増加していた。競合的骨髄再構築法によりlnk欠損造血幹細胞の造血能が飛躍的に亢進していることを明らかにした。c-Kit膜貫通部に欠失を持つWマウスと交配したところ、lnk欠損W/+マウスでは造血前駆細胞の増加が正常化に向かい、これにはc-Kitシグナルの増強が主因となっていると考えられた。一方、造血能の亢進はlnk欠損W/+マウスでも正常化せず、これにはLnk依存性c-Kit非依存性シグナルの制御破綻も関与すると考えられた。
刑務所の自己改革システム構築のための比較法的・実証的研究

これまで、刑事施設視察委員会の構成、活動範囲、報告書の作成などについて、法施行後の状況を各刑務所の活動報告書をもとに分析した。また、F刑務所の職員にアンケートを実施し、職員の意識調査を行った。さらには、研究代表者が刑事施設視察委員会委員であることを生かし、参与観察の方法で、刑務所の自己改革に向けた取り組み状況を調査した。その成果の一部は、土井政和「刑事被収容者処遇法運用上の諸問題」(『刑事政策の体系』前野育三先生古稀祝賀論文集所載、法律文化社、2008)として既に公刊した。本年度に残された課題は、比較法的研究として、イギリスの行刑制度を取り上げ、とりわけ第三者機関、NPOなどの市民団体、市民ボランティアなどの活動が、刑務所の自己改革にいかなる影響を与えているか、について研究することであった。そのため、資料収集と実地調査をかねてイギリスに調査に赴く予定であったが、研究代表者の突発的な病気入院のためこれが実現できなかった。しかし、同じく刑事施設視察委員会について比較法的研究している研究者と意見交換を行う機会をえたのは有意義であった。日本の場合、施設長の改革目的策定、実施、自己評価を前提にした外部評価(刑事視察委員会)を行うという構想は、施設長ら幹部職員の異動サイクルが極めて短く(通常1年)、施設ごとの改革目的を策定しそれに向けて努力するという体制をくむことが困難であるために、必ずしも有効なものとはいえないことが明らかになった。第一に、受刑者処遇法に基づき同法施行規則や通達類が策定され、施行されているが、そこで実務上生じている問題点について分析した。まず、日本において新設された刑事施設視察委員会に関する諸規定の分析を行った。これにより、刑事施設視察委員の性格や活動範囲、さらには、報告書公表のあり方などの問題点が明らかになった。次に、刑事施設視察委員会の構成、活動範囲、報告書の作成などについて、法施行初年度の状況を各刑務所の活動報告書をもとに分析した。また、ある刑務所の職員にアンケート調査を実施した。さらには、申請者が刑事施設視察委員会委員であることを生か1し、参与観察の方法で、刑務所の自己改革に向けた取り組み状況を調査した。その成果の一部を、土井政和「刑事被収容者処遇法運用上の諸問題」(『刑事政策の体系』前野育三先生古稀祝賀論文集所載、法律文化社、2008)として公刊した。第二に、比較法的・実証的として、本研究では、イギリスの行刑制度を取り上げ、とりわけ第三者機関、NPOなどの市民団体、市民ボランティアなどの活動が、刑務所の自己改革にいかなる影響を与えているか、について資料収集と実地調査をかねてイギリスに調査に赴く予定であったが、時間的に余裕がなく、これは次年度以降の課題となった。第一に、昨年に引き続き、日本において新設された刑事施設視察委員会に関する諸規定と運用状況について刑事視察委員会の報告書などをもとに分析を行った。これにより、刑事施設視察委員会の役割に関し、施設の協議機関あるいは諮問機関ではなく、評価機関あるいは監視機関としての性格を持たせることの意義が問われていることが明らかになった。第二に、昨年に引き続き、申請者が刑事施設視察委員会委員であることを生かし、刑務所の自己改革に向けた取り組み状況を調査した。その中で、刑事施設視察委員会が独自にその意見書を公開しつつあること、また、新聞報道などを通じて、委員会の存在が国民に知られるようになり、評価機関あるいは監視機関としての性格も表れてきていることが明らかになった。そのことにより、施設もまた、自己改革の必要性を認識しつつある。第三に、比較法的・実証的として、本年度は、ドイツを訪問し、刑事施設評議会の関係資料を収集した。とりわけ第三者機関、NPOなどの市民団体、市民ボランティアなどの活動と評議会の活動が、刑務所の自己改革にいかなる影響を与えているか、について現在検討している。また、韓国では、施設の達成目標の設定とその評価制度が機能しつつあり、刑務所の改善が進みつつあることを訪問調査によって知ることができた。
ナノファイバーのインフラマゾーム形成機構と毒性評価に関する研究

繊維状粒子状物質とエンドトキシンとの複合曝露が、インフラマゾームを介したサイトカイン産生に及ぼす影響について調べるた。まず、粒子状物質が貪食レセプターを介して、貪食作用だけでなくマクロピノサイトーシスによっても細胞内に取り込まれることを明らかにした。また、マクロファージに、繊維状二酸化チタン粒子、リポポリサッカライド、あるいは両者を添加し、同時投与で成熟IL-1betaの分泌が特異的に上昇すること、リソゾームの機能低下により、LC3-Iの脂質付加体であるLC3-II、p62/SQSTM1が上昇したことから,インフラマゾーム形成にオートファジーが関与していることを明らかにした。繊維状粒子状物質は、通常の球体形状の粒子と異なり、粒子の計測方法も確立していない。しかし、細胞や組織の粒子に対する反応性は、粒子表面の物計測量と強く関連することが予想されることから、粒子のキャラクタリゼーションと培地への分散方法、細胞への曝露方法を検討した。細胞として粒子状物質のターゲット細胞である肺胞マクロファージ、およびマクロファージの貪食レセプターであるMacrophage Receptor with Collagenous Structure (MARCO)を安定的に発現させたCHO細胞を用いた。細胞膜に発現したGFP-MARCOは、macropinocytosisにより細胞内に取込まれていることが観察されたが、この取込み作用はcytochalasin Dにより阻害された。オートリソゾーム阻害剤の添加により、LC3-IからLC3-IIへの変化(lipidation修飾)が検出されたが、この時GFP-MARCOがpunctateを形成し、またオートファゴソーム形成に必要なLC3B、あるいはオートリソゾームを構成するLAMP2とそれぞれ共局在していることが明らかとなった。このpunctateの形成は、cytochalasin Dでは阻害されなかったが、dinasoreの添加により阻害された。また、nocodazolはpunctateを凝集させたが、punctateの形成は阻害しなかった。以上のことより、環境粒子の貪食に中心的役割を担うMARCOが、エンドサイトーシスを介してオートファジー形成に関与していることが明らかとなった。粒子状物質とエンドトキシンとの複合曝露が、インフラマゾームを介したサイトカイン産生に及ぼす影響について調べることを目的とし、J774.1細胞に、繊維状二酸化チタン粒子(FTiO2)、リポポリサッカライド(LPS)、あるいは両者を添加した。培養上清を抗体アレイ法やELISA法によるサイトカインの定量に、細胞はカスパーゼ1活性やRT-PCR法によるサイトカインmRNA発現量の測定に供した。また、IL-1betaの産生に及ぼすカスパーゼ阻害剤の効果についても調べた。比較用粒子としてリン酸3カルシウム(TCP)を用いた。LPSを曝露した細胞では、IL-1betaの他G-CSF, GM-CSF, IL-6の産生が顕著に上昇したが、FTiO2との同時曝露により相乗効果がみられたのは、IL-1betaのみであった。細胞をLPSで前処理した後に-TiO2に曝露した場合には、このような相乗的効果は認められなかった。また、TCPも同様にLPSとの相乗的効果を示した。IL-1betaのmRNA発現量はLPSとF-TiO2との同時曝露により相乗的に増加したが、この効果はIL-6 mRNAについても見られた。一方、LPSやF-TiO2は細胞内カスパーゼ1の活性に影響を及ぼさなかったことから、J774.1細胞におけるLPSとF-TiO2との複合曝露によるIL-1betaの産生上昇は、LPSのプライミング効果というよりは、転写活性から成熟IL-1betaの分泌にわたる一連の効果によるものであると考えている。また、J774.1細胞のリソゾームの機能を低下させ、LC3-Iとその脂質付加体であるLC3-II,ならびにオートファジー基質であるp62/SQSTM1とそのリン酸化体の量的変化をwestern blotting法により調べたところ、炭酸アンモニウム、bafilomycin、chloroquineでリソゾーム機能を低下させた細胞においては、LC3量とともにLC3-II/LC3-I比が上昇し、さらに血清非存在下ではリン酸化p62/SQSTM1(Ser351)量も顕著に増加していることがwestern blottingの結果から明らかとなった。加熱処理によりエンドトキシンを除去した多層カーボンナノチューブ,酸化チタンウィスカーを細胞に曝露して、細胞障害性を調べた。粒子のレセプターを介した細胞内取り込みに関して、細胞骨格を形成するアクチンや中間フィラメントなどのタンパク質についても解析を行なった。

米国毒性学会において、シンポジウム(Immune Responses to Different Classes of Inhaled Particulates: Unique vs. Shared Responses and Mechanisms)を企画し、関連する研究成果である様々な粒子状物質に対する一次免疫反応や炎症過程に関する発表と総合討論を行った。環境毒性学ナノファイバーを曝露した細胞においては、粒子が細胞内に完全に取り込まれない完全貪食(Frustrated Phagocytosis)や、ファゴゾームと細胞内オルガネラであるリソゾームとの融合が完全でないためにリソゾーム膜が障害を受け、インフラマゾームが形成され様々な炎症反応が惹起されるものと推測される。このことから、GFP蛍光標識した細胞膜を持つ細胞貪食(GFP-MARCO)を用い、またリソゾーム(Lysosome-associated membrane protein 2, LAPM-2)を免疫蛍光標識して、貪食途中過程にあるナノファイバーとこれらタンパク質の局在性を蛍光顕微鏡、あるいはレーザー共焦点顕微鏡を用いて調べる。また、インフラマゾームの形成をcaspase-1の活性化を指標としてwestern blottingにより調べるほか、ELISAを用いてインフラマゾームのベンチマークである熟成型IL-1betaの産生量を調べる。さらに、陽性対照として、尿酸ナトリウム針状結晶をBIORUPTORで処理して用いる。これらのナノファイバーを細胞に曝露し、IL-1beta産生量を調べることによりインフラマゾームの活性化の程度を評価する。347円というきわめて少額であり、特に理由はない。少額であり、試薬などに有効に使用する予定である。
気管支喘息の夜間発作の心理・生理学的研究

昭和61年度に引き続き,気管支喘息の治療のために入院してきた患者の協力を得て,就寝前に装着させた長時間動態生体現象記録用データレコーダにより,睡眠中の脳和,筋電図,呼吸音,心電図などを経時的に記録し,それらを臨床経過と関連づけて解析して,現在までのところ次のような結果が得られている.1.夜間発作出現時に夢を見,それを覚醒後も記憶している症例が約4割にみられた.その夢の内容としては不愉快なもの,誰かに追われているものなどが多かった.2.そのような症例では逆護睡眠期(REM期)に喘息発作が起こっているものが少なくない. 3.そのような症例では, REN期前後での脈拍数,体表面微細振動(MV)などの変化が大きく,自律神経系の乱れの大きいことを示唆する所見がみられる. 4.そのような症例でも,心身医学的な治療によって日常生活における心理的な問題が解決され,日常行動に変化がみられたものではREM期にも喘息発作の出現をみなくなり,不愉快な夢を記憶していることもなくなっている.これらの結果は,夜間に起こる喘息発作には,日常生活における未解決の心理的な問題が夢の内容, REM期の身体的条件に影響を及ぼし,それによる身体的変化が加わって起こっているものがあることを示唆するものである.したがって,今後は日常生活のあり方,自律神経系内分泌系の日内リズム就寝時の心身の状態,睡眠中の姿勢による肺機能の変化などとREM期の身体的変化の関係をより明確にし,夜間に起こる喘息発作の発生機序を解明しさらに心身医学的な治療によって夜間に喘息発作が起こらなくなる機序を解明していくことが研究課題となる.この課題と達成には,現在用いている記録装置では不十分で,大巾な改良が必要である.気管支喘息の治療のために入院中の患者を対象として、就寝前に装着させた長時間動態生体現象記録用データレコーダにより、睡眠中の脳波、マイクロバイブレーション(MV)、心電図、呼吸パターンなどを経時的に記録してそれらを解析し、現在までに次のような結果が得られている。1.夜間の喘息発作は、逆説睡眠期(REM期)に起こる場合が多い。とくに喘息発作が出現する群では、出現しなくなっている群に比べて、REM期前後での脈拍数、呼吸パターン、MVなどにみられる変化が大きい症例が多い。2.REM期に一致して起こった喘息発作のために途中覚醒のみられた症例のうち、夢を見たことを記憶している症例では、不諭快な夢を見ていたと報告するものが多かった。3.REM期または夢と関連して喘息発作が起こっていると思われる症例には、心理・社会的な問題の末処理の症例が多かった。ただし入院して心理・社会的な問題から隔離されたことで心身両面で安定したと思われる症例では、たとえ現実には心理・社会的な問題が末処理であっても、喘息発作が起こりにくくなる場合が多いように思われた。今後の課題として、1.入院後も夜間に喘息発作が起こり続ける症例と起こらなくなる症例とで、(1)睡眠中、とくにREM期の生理学的条件にどのような違いが生じているのか、(2)それらの違いに夢が関連しており、それに日中に末解決の心理・社会的な問題が関連していると言いきれるか、(3)その日中の心理・社会的な問題が心身医学的治療によって、REM期前後の自律神経系の機能にどのような変化が起こりうるのか。そのような生理学的な変化によって、夜間の喘息発作の予防が可能となるのか、などについて2.同一症例を対象として、家庭訪問による入院前の状態からデータをとり、治療経過を通して詳細に検討を重ねて、夜間の喘息発作の出現のメカニズムを明らかにし、治療法を確立する。昭和61年度に引き続き,気管支喘息の治療のために入院してきた患者の協力を得て,就寝前に装着させた長時間動態生体現象記録用データレコーダにより,睡眠中の脳和,筋電図,呼吸音,心電図などを経時的に記録し,それらを臨床経過と関連づけて解析して,現在までのところ次のような結果が得られている.1.夜間発作出現時に夢を見,それを覚醒後も記憶している症例が約4割にみられた.その夢の内容としては不愉快なもの,誰かに追われているものなどが多かった.2.そのような症例では逆護睡眠期(REM期)に喘息発作が起こっているものが少なくない. 3.そのような症例では, REN期前後での脈拍数,体表面微細振動(MV)などの変化が大きく,自律神経系の乱れの大きいことを示唆する所見がみられる. 4.そのような症例でも,心身医学的な治療によって日常生活における心理的な問題が解決され,日常行動に変化がみられたものではREM期にも喘息発作の出現をみなくなり,不愉快な夢を記憶していることもなくなっている.これらの結果は,夜間に起こる喘息発作には,日常生活における未解決の心理的な問題が夢の内容, REM期の身体的条件に影響を及ぼし,それによる身体的変化が加わって起こっているものがあることを示唆するものである.したがって,今後は日常生活のあり方,自律神経系内分泌系の日内リズム就寝時の心身の状態,睡眠中の姿勢による肺機能の変化などとREM期の身体的変化の関係をより明確にし,夜間に起こる喘息発作の発生機序を解明しさらに心身医学的な治療によって夜間に喘息発作が起こらなくなる機序を解明していくことが研究課題となる.この課題と達成には,現在用いている記録装置では不十分で,大巾な改良が必要である.
SRM自動車のセンサレス高精度トルク制御

スイッチトリラクタンスモータ(SRM)は,レアアースを用いない高信頼・低コストモータとして,電気自動車への応用が期待される。しかし,トルクリプルによる振動・騒音・乗り心地などへの影響が懸念されるほか,回転子位置検出のためのセンサが必要なため,信頼性や低コスト性が損なわれるなどの欠点も有する。本研究では,これらの二つの欠点を解消するため,SRM自動車のセンサレス高精度トルク制御法の提案と実証を行った。近年,地球環境問題の深刻化や化石燃料枯渇への懸念から,クリーンで高効率な自動車として電気自動車の普及が求められているが,その多くは希土類等の希少資源を使用した磁石モータを用いており,資源に対する将来への不安は小さくなく,それによる高コストは電気自動車の普及を阻害する。また,磁石モータは無通電時でも磁束を生ずるその特性から,必ずしも自動車用モータとして最適とは言い難い。スイッチトリラクタンスモータ(SRモーター)は,磁石を持たず,また,構造が単純で堅牢,安価,悪環境下で運転可能,高効率などの特徴があり,電気自動車への応用が期待される。しかし,トルクリプル,回転子位置検出が必要などの欠点も有する。そこで,本研究では,これらの二つの欠点を解消すべく,SRM自動車のセンサレス高精度トルク制御の実現を目的とした。平成21年度においては,シミュレーションと小型モータを用いた実験により基本的なアルゴリズムの考案と検証を行い,以下のような成果を得た。1.計算機シミュレーションによりアルゴリズムの開発と検証を行い,提案センサレス制御法の有用性を確認した。2.小型モータを用いた実証実験を行い,提案センサレス制御手法によって,簡便なアルゴリズムでセンサレス,かつトルクリプルの小さい高精度なトルク制御が実現できることを確認した。以上により,本年度の研究目標を十分に達成したほか,来年度の研究に対する準備も進めることができと考える。スイッチトリラクタンスモータ(SRM)は,磁石を持たず,また,構造が単純で堅牢,安価,悪環境下で運転可能,高効率などの特徴があり,電気自動車への応用が期待される。平成22年度においては,前年度の研究において,小型モータを用いて明らかしたセンサレス高精度トルク制御法を,電気自動車への適用するため,シミュレーションおよび電気自動車用制御回路の開発を行い,以下のような成果を得た。1.計算機シミュレーションにより電気自動車用SRモータへの適用性を確認した.また,その場合の最適パラメータをシミュレーションにより明らかにした.2.シミュレーション結果に基づき.電気自動車用SRモータの制御回路の開発を行った.実走行試験により,その基本動作を確認した.以上により,本年度の研究目標を十分に達成した.
燃料電池のカソード過電圧低下効果が高いαフタロシアニン触媒層の構築と耐久性の向上

化学的安定で高選択的な酸素還元触媒能を有する金属フタロシアニン(MPc)が燃料電池カソード触媒として実用レベルの高活性を発現できるような電極担持法を検討した。その結果、有機系酸性溶液を用いた湿式中和法によりα結晶相として担持したFeとCoを中心金属に持つものが高い活性を示し、中心金属と電極内の分散状態によって耐久性と活性が異なることが分かった。また金属の複合化が活性向上に効果があることが分かった。本研究は、種々のαフタロシアニンを燃料電池カソード極に担時する手法の確立を行い、それによって得られたカソード極の酸素還元特性を評価し、中心金属によって異なる触媒活性の比較検討とα相のカソード電極作動時の耐久性評価を行うことを目的として行った。研究実施計画として挙げた4つの手法によるα相の形成は以下の(1)(4)の結果となった。(1)有機酸電解浴中での電気泳動析出法によってガス拡散電極上に作製したαフタロシアニンを用いた活性比較の結果は、電気泳動析出結果が中心金属に依存するものであったため中心金属の種類による活性評価とはならなかった。(2)一方、有機酸溶液を塩基性水溶液表面に展開して作製するスプレッド中和法では、塩基性溶液類によって得られる結晶相が異なり、強塩基のNaOH,KOH水溶液を用いることで、効率よくαフタロシニンが形成されることが分かった。これによって得られたαフタロシニンの分子間距離をXRDにより求め、約4Aであることを確認した。さらに、強塩基水溶液中に高表面積カーボンを分散させて得たαフタロシアニン担時カーボンを用いて作製したガス拡散電極による活性評価により、αコバルトフタロシアニンが広範囲の過電圧領域で良好な酸素還元特性を示すことを見出した。(3)また、湿式合成法を用いての温度による結晶相の分別を試みたが、α相の単分離が困難であった。(4)α相への変換を目的にしてβ相粉末に対して行ったアンモニア処理でも、αフタロシニンは得られなかった。さらに、αフタロシニンの耐久性の評価では、雰囲気によって異なる結果が得られており、評価条件等を検討中である。本研究の目的は、種々の金属フタロシアニンが高い酸素還元触媒能を発揮する結晶構造や電極内担時状態を検討し、燃料電池を実用可能とするためのカソード極を構築することである。本年度までに、酸素還元反応触媒の高活性化には酸素の反応場からの脱離速度を上昇させる必要があり、それには酸素の吸着状態がμ-peroxo構造であることが不可欠なため、その構造形成に必要なα構造のフタロシアニンを電極内に設置する手法を種々検討した。その結果、電気泳動法と中和法のいずれもそれぞれが長所、短所のある手法であることが分かった。電気泳動法は、電極表面への固着力が強いことと薄い触媒層が得られる長所と析出時の反応が金属フタロシアニンの中心金属に依存して大きく異なり、多様な金属の系統的な比較に適さないという短所があった。一方、中和法は多様な中心金属を持つフタロシアニンを同様な条件で担持できる長所を持つが、前者より固着力が小さいことと触媒層が厚くなりやすく、電極内に局在化し易いという短所があった。これらの手法を用いて、電極作製法を統一して得られた電極の酸素還元特性比較結果から鉄を中心金属に持つαフタロシアニンは電極表面上の酸素濃度が限界値を超えなければ、高活性を維持可能な優れた酸素還元触媒として利用可能なことを見出した。しかし、限界値を超えると急速に触媒活性が低下し、さらに活性の再生ができなかった。このことを改善させるために、鉄ほどの高活性は示さないが、触媒活性能の再生が容易なコバルトフタロシアニンとの複合化を検討し、さらに高活性なカソード電極が得られた。本研究では、中心金属に酸素を吸着する機能を持ち酸素分子の解離が必要な酸素還元反応に対して高選択的な触媒活性を有する金属フタロシアニン(MPc)の触媒活性を向上させる電極への担持法を開発することを目的としている。これまで、プロトン付加によってMPcが単分子分散した有機酸溶液を用いることで種々の2価の金属を中心に持つα相のMPcが得られることを確認した。このα相は二つのMPc分子が4Å間隔で積層しており、酸素分子が二つのMPcにブリッジ構造を形成して吸着することが可能であるため、一つのMPcに吸着する場合より酸素分子が解離し易く、高い酸素還元触媒活性を示すものである。本年度はプロトン付加した溶液を用いて、析出法の違いによるMPc層のキャラクタリゼーションと酸素還元触媒特性を評価した。その結果、プロトン付加したMPcを中和するために強塩基性溶液中で中和すると比較的配向性が少ないα相粉末が得られた。中心金属の種類はFe,Co,Ni,Cu,Znと多くの2価金属に応用可能であった。しかし、Mnは2価の状態が得られにくいためかα相が確認できなかった。

これらの酸素還元触媒特性を評価したところ、FeとCoが高活性を示したがFeの活性は維持が難しかった。また、同MPc溶液を電解液として電気泳動析出法によって析出させたMPc層は(002)配向性が高いものであった。しかし、中心金属に依存して析出量が大きく異なり、種々の中心金属のMPcの同条件下での触媒活性比較は困難であった。電気泳動析出法から得られたMPcの触媒活性は、析出し易さの考慮も必要ではあるが、中和の場合と同じ中心金属にCo,Fe,をもつMPcが高い触媒活性を示した。電気泳動析出法で得られたものがより中和によって得られたものより高い触媒活性を示した。これは導電材料であるカーボンとの固着が強固になっていることや、2次元的に広がった層を形成しているためと考えられる。
硫酸の酸素・硫黄質量非依存分別(MIF)に基づく、大規模火山噴火記録の検出

国内初となる硫酸塩の三酸素同位体定量法を開発し、1試料23分で分析可能な自動測定法を立ち上げた。現有する四種硫黄同位体組成分析法を微量化し、1μmol試料で酸素・硫黄の質量比依存分別を定量するシステムを立ち上げた。研究期間内には発表には至らなかったが、すでに本手法を用いてアイスコア、エアロゾル試料の分析を開始しており、今後大規模火山噴火を特定する新指標としての有用性を検討する。当該年度は研究開始から半年しかなかったが、この少ない期間で主に測定法の立ちあげを主に行った。硫酸の酸素・硫黄の質量非依存分別(Mass-independent fractionation, MIF)を用いて、火山噴火後の硫酸生成のメカニズム(酸化剤の特定、光化学反応(光解離、光励起等))を行う基盤が構築された。大規模火山噴火のシグナルには不明点が多く、アイスコア・火山灰・チャンバー実験などの模擬実験から、火山噴火によって放出される二酸化硫黄(SO2)が硫酸に生成する際にどのような同位体の変化が生じるかを考察することを目的とする。硫酸の四種硫黄同位体測定に関しては、存在度の少ない36Sを高精度・高確度に測定するため、新に購入したカラムを用いてフルオロカーボン等の不純物を取り除き、国際標準試薬であるIAEA-S1, S2, S3の測定によってd34S, D33S, D36Sがすべて他の研究室と比較可能な測定ができることを確かめた。現状では5-10マイクロモルの試料を分析で十分な精度で計測が可能となった。硫酸の三酸素同位体組成に関しては、国内初の測定法を立ちあげた。試料中の硫酸をイオンクロマトグラフを用いて他イオンから分離・回収を行い、この方法を用いて硫酸を硫酸銀として回収した。回収した溶液から硫酸銀を90度の遠心分離で固体として回収した。硫酸銀を石英カプセルに秤量し、1000度の硫酸銀粉末を熱分解することでO2を生成し、このO2の三酸素同位体組成を測定した。17Oをラベルした4試料(0‰、1.1‰、2.2‰、8.0‰)を分析した結果、その結果はワシントン大学の結果と調和的であり、結果として海外と比較可能な測定法が開発された。次年度は立ちあげた方法を環境試料に供試し、硫酸生成過程の解明を行う。当該年度は、硫酸の三酸素同位体測定法の自動測定法を自作し、その評価を行った。硫酸を他イオン(硝酸など)から分離するイオンクロマトグラフの導入部、バルブ、フラクションコレクターを自動化をを完了した。また、硫酸銀の熱分解による酸素生成、分離、導入、同位体比質量分析も自作ラインによって自動化し、20分/試料で分析できる体制を整えた。硫酸の四種硫黄同位体測定に関しては、自作のマイクロボリュームインレットを作成し、約1 umol程度の試料での分析が可能となった他、硫酸の湿式還元を多連化することで、以前よりも多数の試料が測定できるように改良した。作成した分析法を用いて、多国間(フランス・アメリカ)のキャリブレーションを行い、整合的な結果を得た。また、本年度からJSPSの二国間交流事業の支援によりLGGE/CNRS(フランス)との共同研究が開始され、大規模火山噴火後に南極に保存されたアイスコア、南極大陸で採取されたエアロゾル試料の分析、火山噴火を模擬した光化学チャンバー実験を開始するなどを包括的に研究できる体制が整った。当該年度にはいくつかの光化学チャンバーの低温実験を行い、成層圏も模擬した硫酸生成実験を行った。さらに、現時点では成果公表には至らなかっていないが、すでに南極アイスコアやエアロゾルの試料の分析がスタートしており、次年度以降に分析・解析が進む予定である。このように、研究活動のスタートアップとして一定の成果を得た。また、大規模火山噴火が存在しない時期のバックグラウンド硫酸エアロゾルの起源である硫化カルボニル(OCSもしくはCOS)の硫黄同位体測定法を開発に成功し、成果発表を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。安定同位体地球化学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究計画から半年間という短い期間で、重要なステップである硫酸の三酸素・四種硫黄同位体組成の2手法測定法の立ちあげに成功することができた。この方法は汎用性が高く、チャンバー実験・エアロゾル・火山灰などの試料に用いることが可能である。また、共同研究者との打ち合わせが進み、宝永火山噴火後の火山灰の供与が決まっている。また、日仏二国間共同研究が2014-2015年度で採択されたため、本研究の根幹である大規模火山噴火後の硫酸生成プロセスに関して、日仏共同のチャンバー実験によるMIFの変動要因を解明を行うことが可能となった。研究も今年度に立ちあげた手法が応用先の一つであり、かつ本質的である。

このように、重要なステップである測定法の立ちあげがほぼ完成し、さらに応用先である環境試料及びチャンバー実験などの準備も進んだ。このため、来年度に本研究計画の目的を達成させるための基盤構築ができたため、研究は概ね順調に進展していると考えられる。前年度までに立ちあげた方法を自動化して効率的に研究を進めるため、元素分析計を用いてオンラインかつ自動化を行う。この改良によって操作等によって生じる誤差を低減することが期待される。また、石英カプセルと試料間において酸素同位体交換が引き起こされることを発見したため、低試料のサンプルの測定において補正式を新に作ることが求められる。また、目的の一つである火山灰試料に応用するため、火山灰を塩酸処理し硫酸を硫酸バリウム態として回収する必要がある。しかし、硫酸バリウムは不溶性であるため硫酸バリウムから酸素を抽出する方法はないため、硫酸バリウムと炭酸ナトリウムの酸素同位体交換によって硫酸バリウム態から硫酸銀へ変換する方法を検討する。この方法を確かめるため、今年度作成した17Oラベルしたスタンダードを用いて、変換において同位体交換を引き起こすか検討する。[環境試料への応用]宝永火山噴火で沈着した火山灰試料や日本上空のエアロゾル試料を分析することで、硫酸生成過程の解析を進める。[チャンバー実験]成層圏に噴煙が直接到達する大規模火山噴火後には、南極などの極域の硫酸に特徴的な硫黄・酸素MIFが見られることが知られている。申請者のこれまでの研究で大まかな描像は描かれているが、より定量的にMIF情報を解析するために、チャンバー実験を用いたMIF変動要因の解明を行う。
新規ゲノム編集技術の開発と生体内遺伝子修復治療への応用

近年、ゲノムの標的遺伝子を操作する『ゲノム編集』技術が急速に進歩し、培養細胞のゲノム塩基配列を選択的に改変することが可能となった。しかし、生体内で直接ゲノム配列を改変する事は非常に困難である。申請者は最新の研究成果として、生きたマウスの脳・筋肉にて標的配列を自由に改変する世界初の革新的な技術「HITI」の開発に成功している(Suzuki et al, Nature 2016)。本研究課題では、研究代表者らが開発したゲノム編集技術「HITI」を発展させ、生体内の随意の組織・器官内で特定の細胞のゲノム情報を自由自在に改変する、次世代ゲノム編集技術の確立を目指す。更に当該技術を発展させることで、難治性遺伝病の治療を目的とした『生体内遺伝子修復治療法』の開発を目指す。特に平成29年度は、『マウス生体内の随意の組織・器官に遺伝子ノックインを行うための新ゲノム編集技術の開発』に関する研究を行なった。研究代表者らが開発した、生体内での遺伝子ノックイン効率が3%程度と低いことが生体内ゲノムの改変に対して大きな問題点であった。この問題点を解決するために、様々な方法を検討した結果、感染するAAVベクターのタイターを上げる事で、従来では3-10%であった遺伝子ノックイン効率が15-25%まで上昇し、更なる高効率化に成功し、年度目標を達成した。今後は『遺伝性疾患の原因遺伝子を疾病罹患部位特異的に修復する生体内遺伝子修復治療法の開発』に注力する。さらに安全性の検討を新たに行なうことで、安全かつ高効率な生体内遺伝子修復治療法の確立を目指す。内定年度:2015所属研究機関:ソーク生物学研究所(米国)近年、ゲノムの標的遺伝子を操作する『ゲノム編集』技術が急速に進歩し、培養細胞のゲノム塩基配列を選択的に改変することが可能となった。
日本列島の化石有孔虫フォーナの起源と古生物地理学的評価

本研究では、北西太平洋の一角を占める日本列島およびその周辺海域において、有孔虫類が古生代より現世に至るまでたどってきた変遷の様相を総合的に追及し、その進化系統を明かにし、それぞれの時代のフォーナの生物地理学的評価を行うことを目指した。2か年にわたる研究期間中に、研究集会を2回仙台において開催し、初年度には古生代-新生代の大型・小型有孔虫の各分野の専攻研究者による総合的レビューと討論、第2年度には地質時代別の研究グループによる調査検討の中間報告と討論を行った。またこの間に学会の小集会を利用し、研究連絡にも努めた。これら研究集会の発表内容は研究連絡誌「有孔虫研究」Nos.12に収録、公表した。さらに、分担者による研究結果は論集して「論集:日本列島の有孔虫」にまとめた。本研究を通じて明かになってきた有孔虫フォーナの変遷史を要約する。日本列島では最古の記録は中部シルル系まで遡れる。次のデヴオン紀の記録はなく、石炭紀-ペルム紀にフズリナ類が量産する。これらは古太平洋低緯度域に生息し、堆積して石炭岩を形成したが、その後のプレートの運動により運搬され、日本列島に付加された化石群集である。中生代の三畳紀・ジュラ紀についてはわずか記録があるものの未解明である。白亜紀には適応放散して多彩化したが、生物地理区上の位置はまだ明かでない。相当数の白亜紀の底生種が第三紀まで生き残ったが、中期始新世には後期古第三紀の北太平洋区のフォーナが入れ替わり漸新世まで存続していたが、また中新世初頭に新興のグループと交代した。初期中新世/中期中新世境界期付近を頂点に黒潮系フォーナの北進があり、続いて親潮系のフォーナの南下があって、両者のきっ抗関係が生まれ、これによりほぼ現在の日本列島周辺海域における分布パターンの骨格ができあがった。1)8月25, 26の両日にわたって, 23名の研究者の参加のもとに研究集会を仙台市において開催し,古生代より新生代にいたる有孔虫についての系統進化,古生物地理の研究および生物学的研究の現状の展望と中心的課題に関連する諸問題について,下記のような時代ないし対象にわけて,研究分担者によるレビューが行われ,それらを中心に討論を行った:古生代大型有孔虫,古生代小型有孔虫,中生代大型有孔虫,中生代小型有孔虫,古第三紀小型有孔虫,新生代小型有孔虫,第四紀小型有孔虫,新生代大型有孔虫,有孔虫の生物学2)討論の結果にもとづいて,地質時代別の研究グループを編成し,各グループごとに文献資料調査と,実際の標本による分類学上の比較検討を行った.さらに必要に応じて野外調査を実施して,化石種の産出層準や層序の検討,また新たな試料採集などを実施した.3)研究集会における発表の一部を編集して,研究連絡誌「有孔虫研究」第1号として発行した.
小胞体ストレスを介した運動神経細胞変性機構の解析

筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)は上位下位両運動神経が変性脱落する進行性の運動神経変性疾患である。中年期以降に発症し、発症から約25年で死に至る。現在根本的治療薬はない。これまで我々は、TDP-43の発現がALS患者の脊髄などにおいて上昇していることに着目し、高発現TDP-43が神経細胞に与える影響を検討してきた。その結果TDP-43は内在性の約25倍量の高発現によりBimの発現誘導およびBcl-xLの発現を低下させ、Caspase依存性神経細胞死を導くことを明らかにした。当該年度は、TDP-43誘導性神経細胞死のより詳細なメカニズムを解析し、以下のことを明らかにした。1.高発現TDP-43は小胞体ストレス誘導性細胞死メディエーターであるCHOPの発現を上昇させることにより神経細胞死を導く。2.ALS原因遺伝子であり、またその生理的機能として小胞体ストレス応答の一経路であるIRE1/XBP1経路を活性化することが知られているVAPBについて、VAPB関連ALSにTDP-43の神経毒性が関与しているか検討したところ、野生型VAPBはTDP-43による細胞死を抑制するが、変異型(P56S)はTDP-43の神経毒性を増強した。3.グリア細胞を含む非神経細胞においては、高発現TDP-43はp53依存性G2/M期停止を導く。本年度は筋萎縮性側索硬化症(以下ALS)原因遺伝子の一つであるTDP-43に着目し研究を行った。TDP-43は殆どのALSで認められるユビキチン陽性封入体の主要構成成分であり、孤発性家族性の両ALSで変異が認められていることからALS発症に密接に関与していることが示唆されている。本研究では、ALS患者においてTDP-43の発現が増加していることに着目し、TDP-43発現増加による神経毒性メカニズムについて解析した。その結果、TDP-43は内在性のわずか25倍量の発現により神経細胞死を導くことを見出した。また神経細胞死メカニズムはBimの発現誘導およびBcl-xLの発現低下によりCaspase依存性の細胞死を導くことを明らかにした。さらにALSにおいてはTDP-43が断片化し、断片化TDP-43が細胞内に蓄積・凝集していることが報告されている。我々はTDP-43の断片化メカニズム、TDP-43断片の同定およびその毒性について詳細な解析を行った。その結果、TDP-43は小胞体ストレスを含む種々のストレスによって活性化されたCaspaseにより、Asp89およびAsp169部位で切断され、ALSで認められる病理像と一致したTDP-43断片が産生されることを明らかにした。さらに重要なことに、これらの断片化TDP-43は、我々が用いたモデルにおいては神経毒性を示さず、TDP-43による神経細胞死を抑制する方向に機能することが明らかとなった。今後はALS治療薬開発を最終目標として、これらin vitroでの結果をin vivoにおいて検証すると同時に、ALSにおけるTDP-43の発現増加メカニズム、TDP-43誘導性細胞死のより詳細なメカニズムを明らかにし、TDP-43による神経細胞死を抑制できる薬剤の開発に取り組む予定である。
磁性体を装荷しない陽子シンクロトロン用高周波加速空胴

磁性体を装荷しない陽子シンクロトロン用高周波加速空胴の基本的な概念について、研究を行った。加速空胴の設計、電磁場計算、実機製作、実機の測定及びハイパワー試験を行い、本空胴によって広帯域にわたって加速電圧が発生できることを実証した。本件は、磁性体を装荷しない陽子シンクロトロン用高周波加速空胴の研究開発を目的としている。当該年度では以下の項目について、研究開発を行った。1.高周波加速空胴の設計必要とされる加速周波数帯域を確保するコイル、コンデンサー、抵抗値の計算を行い、必要な寸法から高周波加速空胴の構造体の設計を行った。最も重要な構成要素である対向ソレノイドコイルについては詳細に解析計算を行い、コイル半径、巻き数を決定することに成功じた。2.電磁場解析3.高周波加速空胴製作設計した高周波加速空胴を製作した。4.高周波加速空胴特性測定製作した高周波加速空胴の周波数特性測定を行った。必要な加速周波数帯域が確保することに成功した。ただし、基本周波数成分よりも高い周波数成分において、寄生共振があることが確認されたが、寄生共振自体の値も低い値であることが分かった。また、ピッゲアップコイルによる磁場測定を行い、当初のコンセプトである対向するコイル構造によって、加速軸方向の磁場が打ち消すごとに成功していることを確認した。5.加速電圧発生試験高周波加速空胴に、半導体増幅器で増幅した100W程度の高周波を投入し、実際に加速電圧が発生できるかどうかを高周波投入試験を行った。必要な加速周波数帯域において、加速電圧が発生できることに成功した。ただし、電磁場計算において確認されていた加速軸とは垂直方向の雷磁場についても観測され、加速軸とは垂直方向にキックされる現象を解明していくことが、今後の課題となる。当該年度では、以下の項目について研究開発を行った。1.抵抗体の製作ハイパワー試験に耐えうる抵抗体として、空胴に必要な抵抗値を持つ直接水冷方式の抵抗体の製作を行った。2.高周波加速空胴のハイパワー試験昨年度製作した高周波加速空胴に、上記で製作した水冷抵抗を装着し、1kW程度の高周波でCW運転を行った。その結果、必要な加速周波数帯域において、ハイパワーにおいても加速電圧を連続して発生できることを確認した。また、インダクタンスを構成するコイルについて温度測定を行い、自然空冷でハイパワー試験を行えるレベルであることを確認した。3.ビーム計算昨年度の研究結果より、本空胴においては加速軸と垂直方向にも電場が発生する特徴があるため、ビーム計算によりどの程度影響があるのかを見積もった。その結果、垂直方向にビーム太さを大きくする影響があることが分かり、この影響を抑えなければならないことが分かった。
ネッタイツメガエル皮膚ペプチドを用いたスキンケア素材への可能性追求

ネッタイツメガエルは、両生類ではいち早くゲノム解析が修了した事から、独自に開発した組織をそのままMALDI-MSの測定に供する分析を実施し、ゲノム解析データとマッチングした。その結果12種類の皮膚由来の分泌性ペプチドPxt-112を単離した。ペプチド合成を行いその物性を調べたところ、表面張力低下能、グラム陰性・陽性・酵母等に対する抗菌活性、赤血球に対する溶血活性、肥満細胞に対するヒスタミン遊離作用を示した。特に泡立ち活性の強いPxt-2, 5, 12とその逆配列のreverse Pxt-2, reverse Pxt-5, reverse Pxt-12について物理化学的特性を円二色性分散計(CD)で調べたところ、50% TFE中でいずれもアルファヘリックス形成を示した。Pxt-5とreverse Pxt-5は、最も強い表面張力低下能を示した。さらにPxt-2, 5, reverse Pxt-5は、高濃度ではミセル形成を示した。Reverse Pxt-5はHaCaT細胞に対し、IL-8とHMOX-1(heme oxygenase)の強い発現誘導作用と細胞毒性作用を示した。Pxt-5 (FIGALLGPLLNLLK-NH2)の、50%TFE存在下での立体構造を500MHz NMRで調べた。本ペプチドはN末から7アミノ酸程度は明確な構造を取らないランダムコイル様の構造を取るが、8番目のProからC末端まで典型的なアルファーヘリックス構造を取る事が判明した。ナノディスクは、血中の高密度リポプロテイン粒子を人工的に再構成したディスク状の形態を持つ粒子であり、通常はHDLの主要タンパク質であるApoA-Iとリン脂質から構成される。Pxt-5とそのアナログペプチド(FIQALLQWLLELLK-NH2)を合成し調べたところ、ナノディスク形成能を有することが判明した。ネッタイツメガエル皮膚から単離されたPxtペプチドの内、特に泡立ち活性の強いPxt-2, Pxt-5, Pxt-12とその逆配列のreverse Pxt-2, reverse Pxt-5, reverse Pxt-12について、性質解明を実施した。まず固相合成法を用い、6つの上記ペプチドを合成し、その純度についてHPLC及びMALDI-MSにより確認した。その後、物理化学的特性を円二色性分散計(CD)で調べたところ、50%TFE中でいずれも有意なアルファヘリックス構造形成を示した。6つのペプチドの内Pxt-5とreverse Pxt-5は、最も強い表面張力低下能を示した。さらにPxt-2, Pxt-5, reverse Pxt-5は、高濃度ではミセル形成を示し、限界ミセル濃度を求めることができた。生物化学的性質としては、Pxt-5は赤血球に対し、最も強い溶血活性を示した。また6つのペプチドの中でreverse Pxt-5は、培養皮膚細胞のHaCaT細胞に対し、炎症マーカー及びストレスマーカーであるIL-8とHMOX-1(heme oxygenase)の、最も強い発現誘導作用と細胞毒性作用を示した。一方Pxt-12とreverse Pxt-12はグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対し弱い抗菌作用、赤血球に対して弱い溶血作用、HaCaT細胞に対して弱い細胞毒性作用を示した。すべての6つのペプチドは、10-5 Mの濃度で肥満細胞に対し、20%-50%のヒスタミンの遊離活性が認められた。またreal-time PCRを用いてPxt peptidesの各種臓器での発現を調べたところ、皮膚以外にもPxt-5は精巣に、Pxt-12は筋肉にも発現していた。Pxt peptidesの物理化学的・生物化学的諸性質の解明を順調に実施できた。14アミノ酸からなるPxt-5 (FIGALLGPLLNLLK-NH2)ペプチドの、50%TFE存在下での立体構造を調べた。測定は500Mzのブルカー社製NMRで行いDQF-COSY, TOCSY, NOESY等の多次元NMRを用いて、構造解析を実施した。構造計算はCNSプログラムを利用し、シミュレーテッド・アニーリング(SA法)を用いた。得られたペプチドの構造から、本ペプチドはN末から7アミノ酸程度は明確な構造を取らないランダムコイル様の構造を取るが、8番目のプロリンからC末端まで典型的なアルファーヘリックス構造を取る事が判明した。このアルファーヘリックス構造は、ロイシンが周囲を取り囲む非常に疎水性の高いへリックスであった。TFE等の有機溶媒は、膜等の疎水環境を模倣するために良く用いられる。このことから、膜存在下では、本ペプチドのC末端のへリックスが膜に突き刺さると考えられる。あるいは水溶液中ではこのへリックスを利用したバンドル構造を形成することで、規則的な会合(凝集)を起こすと想定される。一方、脂質ナノディスクとは、主にアポリポプロテインA-I(apoA-I)と各種リン脂質から形成されるディスク状のナノ粒子であり、生体内において脂質輸送を担うHDLを再構成したものである。そこで、通常用いられるapoA-Iではなく、Pxtペプチドに注目した。特にアルファーヘリックス構造形成を行うPxt-5に注目した。その結果、臨界会合体形成濃度(CAC)以上の濃度のPxt-5とDMPCリポソームを直接混合すると、わずか2分程度で濁度が低下し、脂質を速やかに可溶化させて脂質ナノディスクを形成することが明らかになった。

Pxt peptidesの物理化学的性質の解明を、順調に実施してきている。ナノディスクは、血中の高密度リポプロテイン(HDL)粒子を人工的に再構成したディスク状の形態を持つナノ粒子であり、通常はHDLの主要タンパク質であるアポリポプロテインAーI(ApoA-I)とリン脂質から構成される。生体内におけるHDL粒子は、脂質輸送、特にコレステロールの逆輸送(RCT)において重要な役割を担っており、肝臓外組織からコレステロールを除去するように機能し、多くの細胞の構造及び機能を維持することに寄与する。実際に、HDL粒子の血清レベルが高いと、冠動脈心疾患を抑制するだけでなく、アテローム性動脈硬化症のプラークの退縮を促すとされている。このような生体内における作用を有することから、HDL粒子に結合したコレステロールは一般に「善玉コレステロール」と呼ばれている。これに対して、低密度リポプロテイン(LDL)粒子の血清レベルの上昇は、心血管リスクの増加と相関しており、LDL粒子に結合したコレステロールは「悪玉コレステロール」と呼ばれている。従って、血中のHDLを模倣したナノディスクは、高脂血症、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、アテローム性動脈硬化などの心血管疾患を含む、脂質代謝異常障害に対して有効であり、これらを治療または予防する医薬品として注目されている。ナノディスクの形成にはApoA-Iの両親媒性の部分配列が有効であることが知られているが、今回独自に発見したネッタイツメガエル皮膚由来Pxtペプチドの内、両親媒性・界面活性能を強力に有するPxt-5(FIGALLGPLLNLLK-NH2)とそのアナログペプチド(FIQALLQWLLELLK-NH2)を合成し、詳細に調べたところ、ナノディスク形成能を有することが判明した。ネッタイツメガエル皮膚由来Pxtペプチドについて、新たにナノディスクの形成機能を有するという新規性に富んだトピックス性を持つ結果が得られたので。ネッタイツメガエルは、両生類ではいち早くゲノム解析が修了した事から、独自に開発した組織をそのままMALDI-MSの測定に供する分析を実施し、ゲノム解析データとマッチングした。その結果12種類の皮膚由来の分泌性ペプチドPxt-112を単離した。ペプチド合成を行いその物性を調べたところ、表面張力低下能、グラム陰性・陽性・酵母等に対する抗菌活性、赤血球に対する溶血活性、肥満細胞に対するヒスタミン遊離作用を示した。特に泡立ち活性の強いPxt-2, 5, 12とその逆配列のreverse Pxt-2, reverse Pxt-5, reverse Pxt-12について物理化学的特性を円二色性分散計(CD)で調べたところ、50% TFE中でいずれもアルファヘリックス形成を示した。Pxt-5とreverse Pxt-5は、最も強い表面張力低下能を示した。さらにPxt-2, 5, reverse Pxt-5は、高濃度ではミセル形成を示した。Reverse Pxt-5はHaCaT細胞に対し、IL-8とHMOX-1(heme oxygenase)の強い発現誘導作用と細胞毒性作用を示した。Pxt-5 (FIGALLGPLLNLLK-NH2)の、50%TFE存在下での立体構造を500MHz NMRで調べた。