hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非喫煙者肺癌モデルを用いた有効な分子標的薬剤の選択と作用機序の解明

上皮成長因子受容体(EGFR)チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)耐性肺癌細胞株およびマウスモデルを用いて各種分子標的薬剤(mTOR阻害剤、JAK2/STAT3阻害剤、EGFRと血管新生の両阻害剤)の有効性を示した。また、第2世代EGFR-TKIであるアファチニブは、EGFR遺伝子改変マウスにおいてゲフィチニブよりも生存期間を延長した。T790Mを有する肺癌に対してもアファチニブと血管新生阻害剤の併用が有効性が示唆された。さらには、SRCを介したERKへのバイパスシグナルを有する新規EGFR-TKI耐性機序を発見し、その耐性株ではSRC阻害薬の併用によりゲフィチニブ感受性が回復することを証明した。非喫煙者肺腺癌の50-60%に上皮性成長因子受容体(epidermal growth factor receptor: EGFR)遺伝子変異が認められ、それらに対するゲフィチニブなどのEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)の有用性が示されてきた。しかしながら、約1年で耐性となり肺癌の増悪が生じるため、私たちは新たな治療法の開発を前臨床試験として行っている。まずは、次世代EGFR-TKIであるアファチニブが、EGFRエクソン19欠失遺伝子改変マウスにおいてゲフィチニブよりも有用であった。また、EGFR-TKI耐性機構の約60%を占める二次変異であるT790Mを有する肺癌に対して、血管新生阻害剤であるベバシズマブとの併用がゼノグラフトモデルにおいて有効であった。次に、STAT3はJAKファミリーキナーゼを介して活性化されるが、EGFR遺伝子変異を有する肺癌細胞株においてJAK1/2阻害剤であるAZD1480は、in vitroでゲフィチニブ感受性および耐性細胞株に同等の効果を示した。ゼノグラフトモデルにおいてもAZD1480は単剤で血管新生を抑制し腫瘍縮小効果を呈し、EGFR遺伝子改変マウスの生存期間も延長した。さらには、これまで報告されてきたEGFR-TKI耐性機序とは異なるSRCを介するERKへのバイパスシグナルを有するゲフィチニブ耐性細胞株(PC9-GR)を樹立した。SRC阻害薬としてのダサチニブとゲフィチニブを併用すると、感受性が回復することをin vitroおよびin vivoで示すことができた。非喫煙者肺腺癌の50-60%に上皮性成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異が認められる。これらの遺伝子は発癌と進展に関与しており、それらに対するEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)の臨床的有用性が示されてきた。しかしながら奏効期間は平均約1年で耐性となるため、新たな治療法の開発が望まれている。この耐性を打破するために本研究を考案した。肺癌細胞株におけるエベロリムスの抗腫瘍効果はPC-9およびRPC-9で同等であった。エベロリムスは、EGFR遺伝子改変マウスの肺腫瘍数を有意に抑制し、かつ生存期間を延長させた。PC-9/ER3ではJAK2の活性化が認められ、その阻害剤であるJSI-124とEGFR-TKIの併用によりPC-9/ER3のJAK2並びにAKTの活性化が抑制され、EGFR-TKIに対する感受性が回復した。また、PC-9/ER3のマウス移植モデルにおいても、JSI-124とEGFR-TKIの併用により腫瘍縮小効果も示された。一方、バンデタニブはH1650の移植モデルにおいて、そのEGFR-TKI耐性を克服であった。以上より、EGFR-TKI耐性肺癌細胞株とマウスモデルにおいて、in vitroおよびin vivoでのmTOR阻害剤、JAK2/STAT3阻害剤および血管新生阻害剤の有効性が示唆された。上皮成長因子受容体(EGFR)シグナルの下流にあるmTORは蛋白合成,細胞増殖,代謝などの制御に重要な役割を果たしており,悪性腫瘍においてはEGFR-mTOR伝達経路に異常をきたしていることが多い。エベロリムスはmTOR阻害剤であり,いくつかの癌腫においてその抗腫瘍効果が明らかにされている。肺癌細胞株とEGFR遺伝子改変マウスを用いてエベロリムスの抗腫瘍効果を検討した。エベロリムスに対する肺非小細胞癌細胞株の感受性は,A549,H3255,PC-9,RPC-9のいずれもIC50は約0.01μMと、エベロリムスがEGFR遺伝子変異の有無に関わらず有効であることが示唆された。遺伝子改変マウスに5週齢から20週齢まで,エベロリムスあるいは偽薬を10 mg/kg/日(1回/日,5回/週)投与し,エベロリムスの抗腫瘍効果を検証した。

左肺表面の長径1 mm以上の腫瘍個数(±SD)はエベロリムス投与群と偽薬群でそれぞれ1.9 ±0.9 (n = 14)と9.4 ±3.2 (n = 13)であり,差が認められた(p<0.001)。エベロリムス投与群ではリン酸化S6が抑制されていたが,リン酸化mTORとリン酸化4E-BPは偽薬群と同程度の発現であった。5週齢のマウスを2群に分け,10 mg/kg/日(1回/日,5回/週)のエベロリムスおよび偽薬を投与し続けた。エベロリムス投与群と偽薬群での生存期間中央値はそれぞれ58.0週と31.2週で差が認められた(p<0.001)。エベロリムスはin vitroではアポトーシスとオートファジーを誘導していた。しかしながら,EGFR遺伝子改変マウスにおいてはアポトーシスおよびオートファジーは確認されず,血管新生が抑制されていた。以上より、エベロリムスは腫瘍の血管新生を抑制することにより,活性型EGFR遺伝子変異を有する肺癌への有効性が示唆された。肺癌実験は計画どおりに順調に進み、論文発表も行った。実験は計画どおり順調に進み、論文発表も行った。残りの一年では、mTOR阻害剤を投与されたマウス腫瘍組織の解析を中心に行う。また、それぞれのEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の耐性機序に対応して、最も効果のある新規のmTOR阻害剤、血管新生阻害剤、JAK/STAT3阻害剤の使用方法を検討する。mTOR阻害剤、JAK2/STAT3阻害剤および血管新生阻害剤が、なぜEGFR-TKI耐性の克服に有用であるかをin vitro、in vivoで証明し、耐性機序に合わせた薬剤投与が可能となるような基礎実験を、計画書に合わせて行っていきたい。動物実験のマウスの購入が遅れたため。動物実験とそれに関連した試薬等の物品費に使用する。動物実験のマウスの購入が一部遅れて次年度使用額が生じた。平成25年度請求額と合わせて、試薬等実験用物品費中心、学会出張旅費・参加費、論文掲載・英文校正料として使用予定。
リン原子修飾RNA核酸医薬の革新的不斉合成法

近年、遺伝子の発現を選択的に制御可能なsiRNAやmicroRNAを医薬として用いるための研究が盛んに行われている。これらのRNA分子を医薬として実用化するためには、生体内における安定性の向上が必須である。本研究では、優れた安定性と薬理活性が期待される、リン原子の絶対立体配置が厳密に制御されたリン原子修飾RNA類縁体の新規合成法を開発し、オリゴマーの合成を達成した。本年度は、2'-0-メチルリボヌクレオシド誘導体を用いて、新規オキサザホスホリジンモノマーおよびリン原子の立体が制御されたホスホロチオエート2量体の合成検討を行った(オキサザホスホリジン法)。ホスホロチオエート結合を有する2'-0-メチルRNA類縁体は、siRNAやmicroRNAなどの核酸医薬として極めて有望視されている化合物の一つである。まず、不斉補助基となる光学活性アミノアルコールを合成し、高い光学純度で目的物を得ることができた。つぎに、光学活性アミノアルコールと三塩化リンを反応させ、オキサザホスホリジンモノマーを合成するためのホスフィチル化剤の合成を行い、収率良く目的物を得た。リボヌクレオシド誘導体として、2'-0-メチルウリジンを用い、光学活性オキサザホスホリジンモノマーの合成を検討した。従来法で問題となっていた縮合反応効率の向上を目指すため、本研究ではより酸性度の高い活性化剤を縮合反応に用いる。そのため、縮合反応時に5'-水酸基の保護基の脱離を防ぐため、従来汎用されるDMTr基よりも安定なMMTr基を用いることとした。5'-位がMMTr基で保護された2'-0-メチルウリジン誘導体をホスフィチル化剤と反応させて、高い光学純度で目的とする新規オキサザホスホリジンモノマーを合成することに成功した。光学活性モノマーと遊離の5'-水酸基を有する2'-0-メチルウリジンを固相担体上で酸性度の高い活性化剤、ジメチルシアノメチルアンンモニウムトリフラートの存在下で縮合させ、酸処理することにより、不斉補助基の除去を行った。得られたH-ホスホネート中間体を硫化し、固相担体から切り出し、得られたホスホロチオエート結合を有する2量体を逆相HPLCにより分析した。98%の縮合効率、99%以上の立体選択性で目的とする立体化学的に純粋な2'-0-メチルホスホロチオエートウリジル酸2量体を得ることができた。これらの結果は、オリゴマー合成にも十分適用可能な値であり、本年度の目標を達成することができた。平成22年度の研究において、次世代核酸医薬として有望な、含ホウ素核酸類縁体(ボラノホスフェートRNA)の立体選択的固相合成法の開発を重点的に行った。2'-OMe修飾を有するリボヌクレオシド誘導体に関して、リン原子の立体が制御されたモノマーユニットの合成法を確立し、高収率で高純度の目的物を合成する手法を確立した。合成したモノマーを用い、固相担体上で2量体を合成することにより、縮合反応、ボラノ化反応、脱保護反応条件の最適化を行った。縮合反応における活性化剤として、従来法で用いられるものよりも活性の高い化合物を見出し、迅速かつ高立体選択的に縮合反応を行うこと層できた。この活性化剤は、酸性度が高く、縮合反応中に、核酸合成で従来用いられる5'-水酸基の保護基であるDMTr基の脱離が懸念されるため、酸性条件下より安定なMMTr基へと保護基を変更した。また、従来のホスファイト中間体をボラノ化する反応条件では、核酸塩基が還元される副反応が進行するが、反応溶媒、試薬等の条件を詳細に検討したところ、副反応がほとんど起こらない反応条件を見出した。これらの新規反応条件を用いて、リン原子の立体が制御された2'-OMeウリジル酸ボラノホスフェート2量体の合成に成功した。さらに、長鎖オリゴマーの固相合成を試みたところ、目的とするリン原子の立体が制御された2'-OMeウリジル酸ボラノホスフェート10量体の合成に成功した。以上、本研究の成果は、siRNAやアプタマー等の化学修飾型核酸医薬の研究分野に大きく貢献することが期待できる。平成23年度の研究において、次世代核酸医薬として有望な、2'-O-Me-ボラノホスフェートRNAの立体選択的合成をおこない、その性質を明らかにした。ボラノホスフェート型核酸類縁体は、その脂溶性の高さから細胞膜透過性に優れ、ヌクレアーゼ耐性も高いことから核酸医薬として有利な性質を有する。一方、2'-O-Me修飾を有するリボヌクレオシド誘導体は高い二本鎖形成能と免疫誘導抑制効果から、糖部修飾核酸医薬として有用である。本研究では、2'-O-Me修飾を有するボラノホスフェートRNAの合成を検討した。

前年度までの検討で確立した、固相法によるオリゴマーの鎖長延長反応条件を適用し、リン原子の立体が制御された2'-O-Meウリジル酸ボラノホスフェート10量体を合成した。次に、相補的なアデニル酸10量体と形成する二重鎖の熱力学的安定性を温度可変UV測定により評価した。生理的条件下(100mM NaCl)では、Sp絶対立体配置を有する2'-O-Me-ボラノホスフェートRNAのTm値は天然型よりも23.3。C上昇し,顕著な二本鎖の安定化が見られた。一方、Rp絶対立体配置を有するオリゴマーは二本鎖を形成しなかった。これまでに知られている最も二本鎖形成能が高いリン原子修飾RNA類縁体は、Rp絶対立体配置を有する2'-O-Me-ホスホロチオエートRNAであるが、天然型と比較したTm値の上昇は11.4°Cであり、これと比較しても2'-O-Me-ボラノホスフェートRNAは二本鎖形成能が極めて高いといえる。以上、本研究の成果は、siRNAやアプタマー等の化学修飾型核酸医薬の研究分野に大きく貢献することが期待できる。
日常生活中エネルギー消費量の携帯型計測器の開発・評価

高精度携帯型エネルギー消費測定器を開発することを目的として、椅座位での上肢作業時および農作業時の消費エネルギーと心拍数、身体部位の加速度、三角筋中部線維部の表面電極筋電電図位との関連を検討した。運動中のエネルギー消費量はテレメーター式呼吸代謝測定装置および携帯型呼気分析装置で測定した酸素消費量から算出した。心拍数はホルター型心電計、筋電図はホルター型筋電計を使用し記録分析した。また、身体部位の加速度は、腰部に垂直方向、上腕部に直行する3軸方向の加速度計をそれぞれ装着し測定した。加速度データは、テレメーターで送受信後データーレコーダに記録し、A/D変換後パーソナルコンピュータで分析した。椅座位での上肢作業時のデータ解析結果からは、筋電図電位を用いて酸素消費量を推定した場合に、心拍数あるいは上腕部加速度計を用いた推定よりも高精度の推定が可能であった。また、農作業時のエネルギー消費量の推定実験に於いては、作業形態などにより推定精度のばらつきがあることが示唆されたが、腰部加速度と三角筋中部線維部の表面電極筋電図電位、さらには年齢、性、BMIを独立変数とした重回帰式により高精度で推定できることが明らかとなった。これらの結果より、高精度携帯型エネルギー消費量測定器の原理としては、腰部加速度と三角筋中部線維部の表面電極筋電図電位の測定を行い、年齢、性、BMIを変数に加えた重回帰式で推定することが妥当との結論を得た。今後の課題としては、機器の小型軽量化、製作費用の低減化、簡便な筋電図電極の貼付方法の開発などがあるが、解決可能な課題であり、できる限り早期に実用化を図る予定である。加速度系を利用した高精度携帯型エネルギー消費測定器開発の基礎資料を得ることを目的として、健康な若年男女を対象として、歩行、走行、球技実施時の消費エネルギーと身体部位の加速度との関連を検討した。運動中のエネルギー消費量はテレメーター式呼吸代謝測定装置による酸素消費量から算出した。身体部位の加速度は、腰部に垂直方向、上腕部に直行する3軸方向の加速度計をそれぞれ装着し測定した。腰部加速度データと年齢、性、BMIを独立変数として、歩行・走行時の酸素消費量を重回帰式により推定した結果では、心拍数を用いた推定よりも高精度の推定が可能であった。しかし、球技実施時の酸素消費量を、歩行・走行時のデータを基に作成した回帰式で推定した結果では、心拍数を用いた場合に比べ推定精度が低かった。特に、バレーボール実施時の誤差が大きく、腰部加速度のみでは、上肢を使用する活動時の推定精度が低下することが明らかとなった。そこで、上腕部に装着した3軸加速度計のデータを加え、同様の推定作業を行ったところ、腰部加速度のみの場合に比べ、推定精度は上昇したが心拍数を用いた推定と比較すると十分な精度は得られなかった。これは、推定式の基となった歩行・走行時の腰部加速度と上腕部下速度の相関が高すぎるため、推定式の精度が低下したものと考えられる。現在、推定式作成に使用するデータの追加、上腕部加速度の評価方法の再検討、他身体部位における加速度測定の必要性などについて検討を進めている。高精度携帯型エネルギー消費測定器を開発することを目的として、椅座位での上肢作業時および農作業時の消費エネルギーと心拍数、身体部位の加速度、三角筋中部線維部の表面電極筋電図電位との関連を検討した。

また、身体部位の加速度は、腰部に垂直方向、上腕部に直行する3軸方向の加速度計をそれぞれ装着し測定した。加速度データは、テレメーターで送受信後データーレコーダに記録し、A/D変換後パーソナルコンピュータで分析した。椅座位での上肢作業時のデータ解析結果からは、筋電図電位を用いて酸素消費量を推定した場合に、心拍数あるいは上腕部加速度計を用いた推定よりも高精度の推定が可能であった。また、農作業時のエネルギー消費量の推定実験に於いては、作業形態などにより推定制度のばらつきがあることが示唆されたが、腰部加速度と三角筋中部線維部の表面電極筋電図電位、さらには年齢、性、BMIを独立変数とした重回帰式により高精度で推定できることが明らかとなった。これらの結果より、高精度携帯型エネルギー消費量測定器の原理としては、腰部加速度と三角筋中部線維部の表面電極筋電図電位の測定を行い、年齢、性、BMIを変数に加えた重回帰式で推定することが妥当との結論を得た。今後の課題としては、機器の小型軽量化、製作費用の低減化、簡便な筋電図電極の貼付方法の開発などがあるが、解決可能な課題であり、できる限り早期に実用化を図り予定である。
要素間のモーメント伝達を考慮したDEMによる粒状体の変形機構の研究

多くの粒状体に置いて粒子同士の接触形状は面積の無視できない面であるが、現在の数値実験に置いては面積を持たない点と仮定している。従来の接触を点として扱う個別要素法による要素試験ではピーク応力比は実験より低く、粒子形状の効果を取入れても説明がつかなかった。ここで、粒子が面である場合には力だけでなくモーメントも伝達される。材質が柔らかい場合には接触面積は大きくなり、難い場合でも表面の凹凸が激しければモーメントが伝達されうると思われる。今年度は粒子間でのモーメント伝達の効果を把握する研究を行った。まず従来の個別要素法での要素間力の扱いに加えて要素間モーメントの伝達を要素間に回転バネを想定することで表現した。次に要素間の接線方向相対変異をころがり成分と滑り成分に分離し、ころがりにより接点でのモーメントが発生すると考えプログラムを作成した。数値実験として光弾性材料にパラメータを合わせた2軸圧縮数値試験を行い、実験結果との比較を行った。従来のモーメントの発生が無い場合、粒子の回転を完全に拘束する場合、モーメント伝達を考慮する場合の3通りを想定したところ、せん断帯の形状、柱構造の持続性、せん断帯付近での柱の屈曲の形状、応力、ひずみ関係、せん断帯内での粒子回転の方向性など、いままで再現できなかった特性が、モーメント伝達を考慮したモデルにより再現される結果が得られた。以上より、粒状体の強度特性・変形特性に置いて粒子接点でのモーメントの伝達すなわち偶応力が重要な役割を担っている可能性を指摘する事が出来る。なお、計算には購入したパーソナルコンピュータを用いた。
中枢神経障害に対する幹細胞治療とロボットを使用したリハビリテーションの併用効果

本研究では,脊髄損傷モデル動物に対し間葉系幹細胞を移植することで運動機能回復に寄与するか否か検討した.細胞移植を行うことで移植を行わない群と比較して運動機能が改善することが分かった.移植後の脊髄組織では,炎症に関連する遺伝子発現が減少しており,運動機能改善に影響を与えた要因のひとつと考える.さらに,免荷型歩行補助装置を用いた介入を行ったところ,荷重下では自発運動がみられない時期においても,免荷をすることで自発運動を観察できたが,長期的な自発運動の持続には至らず,移植との併用効果については今後の課題となった.本研究のテーマである脊髄損傷モデルラットに対する間葉系幹細胞を用いた細胞治療とロボットを使ったリハビリテーションの併用効果の検証に向け、本年度は、移植に用いる間葉系幹細胞の特性評価およびラット脊髄損傷モデルの作製方法ならびに間葉系幹細胞単独の移植効果について検討を行った。移植に用いる細胞の特性評価について、骨髄組織からの樹立方法を確立し、樹立した間葉系幹細胞は増殖能および骨細胞、脂肪細胞、神経細胞へ分化可能な多分化能を有することが確認された。脊髄損傷モデルの作製方法に関しても検討を行い、本研究の治療アウトカムとして検討している運動機能障害の重症度において再現性高く作製することが可能となった。間葉系幹細胞単独の移植効果について、脊髄損傷モデルを用いた動物実験の結果、損傷後に治療介入を行わない群と比較して間葉系幹細胞を移植することで、運動機能が改善する結果が得られた。さらに、脊髄損傷モデル動物用のリハビリテーションロボットの開発についても検討を進め、脊髄損傷によって運動麻痺が生じた後肢それぞれに対し運動制御が行えるトレッドミル装置の運動原理研究およびロボットの設計が完了している。本研究成果の一部は、再生医療関連(第15回日本再生医療学会総会)の国内学会で発表した。移植に用いる細胞の特性評価や動物実験に関して実験を進め、その一部を学会で発表することができた。本研究では、脊髄損傷モデルラットに対して間葉系幹細胞を用いた細胞治療を行い、その効果を検証した。また、間葉系幹細胞を使用した細胞治療の効果をより高めるために細胞移植後のリハビリテーション治療に着目した。脊髄損傷では、損傷部以遠の重篤な運動・感覚障害を呈し適切な歩行刺激の入力が困難であるため、適切な歩行刺激の入力を実現するために免荷型歩行補助装置を使用した。脊髄損傷モデルの作成には、weight drop methodを使用することで再現性のあるモデル作成が可能であった。脊髄損傷モデルラットに対する間葉系幹細胞の移植効果として、細胞移植を行うことで細胞移植を行わない群と比較して運動機能が改善する結果が得られた。また、損傷後の脊髄組織において、組織の炎症に関連する遺伝子発現が細胞移植によって抑制されることが明らかとなった。損傷組織への移植細胞の生着はきわめて少なく、移植細胞から放出される栄養因子が炎症反応を抑制したことが回復の作用機序として考えられた。また、免荷型歩行補助装置を用いた細胞移植後のリハビリテーションについて検討を行った。その結果、荷重下では自発運動がみられない時期においても、免荷環境下では一部自発運動を観察できたが、長期的な使用効果や細胞治療との併用効果については十分な検討が行えなかった。本研究成果の一部は再生医療関連の国内学会(第16回日本再生医療学会総会)で発表した。本研究では,脊髄損傷モデル動物に対し間葉系幹細胞を移植することで運動機能回復に寄与するか否か検討した.細胞移植を行うことで移植を行わない群と比較して運動機能が改善することが分かった.移植後の脊髄組織では,炎症に関連する遺伝子発現が減少しており,運動機能改善に影響を与えた要因のひとつと考える.さらに,免荷型歩行補助装置を用いた介入を行ったところ,荷重下では自発運動がみられない時期においても,免荷をすることで自発運動を観察できたが,長期的な自発運動の持続には至らず,移植との併用効果については今後の課題となった.今後は、本年度の研究成果を活かし、細胞移植とロボットを使用したリハビリテーションの併用効果について研究を進める予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。リハビリテーション28年度が最終年度であるため、記入しない。
発達障害における自閉性の段階づけ(ratmg)評価の研究

本研究の目的は自閉症の程度の段階付け評価を行うことである.1.自閉性障害のチェックリストの作成自閉症の診断基準であるDSM-III-Rに具体的な症状を多数設定したチェックリストを作成した.2.対象は82名で,年齢は1歳10ヵ月から18歳4ヵ月までで(平均5歳7ヵ月),男児65名,女児17名である.3.結果1)精神発達の評価精神発達は正常9名,境界9名,精神遅滞64名である.2)チェックリストでの陽性カテゴリー数で自閉性を段階付けすると,なし境界4名,軽度12名,中等度24名,高度42名であつた.診察ならびにチェックリストによる自閉性障害の程度はよく相関していた(p=0.0079,x^2の検定).3)チェックリストによる方法に比較して,診察による自閉性の診断では,精神遅滞が中-重度では自閉性の程度をより重度に判断していた(P=0.0039,x^2検定).4)自閉性障害の程度と精神遅滞ならびに運動障害の合併の有無について検討した.運動障害については脳性麻痺はみられず,全て歩行など粗大運動の軽微な障害のみであった.精神遅滞ならびに運動障害の有無については自閉性障害の程度と関係がなかった.4.結論本研究で作成したチェックリストにより自閉性に種々の段階があることが指摘された.診察による自閉性の程度とよく相関していたことから本チェックリストの妥当性が確認できた.診察による自閉性の診断では,精神遅滞が中-重度では自閉性の程度をより重度に診断していたので,チェックリストによる方が客観性があるといえる.自閉性の程度により,精神遅滞,運動発達障害の比率には変化がみられなかった.このことから自閉性障害(広汎性発達障害)と特定不能の広汎性発達障害には本質的な相違はなく,自閉性の程度には移行があると考えられた.当初の予測が確認されたといえる.本研究の目的は自閉症の程度の段階付け評価を行うことである.1.自閉性障害のチェックリストの作成自閉症の診断基準であるDSM-III-Rに具体的な症状を多数設定したチェックリストを作成した.2.対象は82名で,年齢は1歳10ヵ月から18歳4ヵ月までで(平均5歳7ヵ月),男児65名,女児17名である.3.結果1)精神発達の評価精神発達は正常9名,境界9名,精神遅滞64名である.2)チェックリストでの陽性カテゴリー数で自閉性を段階付けすると,なし境界4名,軽度12名,中等度24名,高度42名であつた.診察ならびにチェックリストによる自閉性障害の程度はよく相関していた(p=0.0079,x^2の検定).3)チェックリストによる方法に比較して,診察による自閉性の診断では,精神遅滞が中-重度では自閉性の程度をより重度に判断していた(P=0.0039,x^2検定).4)自閉性障害の程度と精神遅滞ならびに運動障害の合併の有無について検討した.運動障害については脳性麻痺はみられず,全て歩行など粗大運動の軽微な障害のみであった.精神遅滞ならびに運動障害の有無については自閉性障害の程度と関係がなかった.4.結論本研究で作成したチェックリストにより自閉性に種々の段階があることが指摘された.診察による自閉性の程度とよく相関していたことから本チェックリストの妥当性が確認できた.診察による自閉性の診断では,精神遅滞が中-重度では自閉性の程度をより重度に診断していたので,チェックリストによる方が客観性があるといえる.自閉性の程度により,精神遅滞,運動発達障害の比率には変化がみられなかった.このことから自閉性障害(広汎性発達障害)と特定不能の広汎性発達障害には本質的な相違はなく,自閉性の程度には移行があると考えられた.当初の予測が確認されたといえる.Iチェックリストの作成現在自閉症の診断基準として、DSM-III-Rでは下位項目は,相互反応調節,非言語的意志伝達の障害などの抽象的な表現がされているので,「あやしても喜ばない」,「今日は等に反応しない」,「うれしくて親に見せに持ってくる」などの具体的な症状を文献や経験から多数設定(合計52症状)したチェックリストを作成した.II調査対象は心身障害児通園施設,保健所経過観察児(発達クリニック受診児),教育センター教育相談室受診児,心身障害学級児の合計120名であった。III各患児に対して,主任研究者が診察を行い,さらに自閉症のチェックリストを記載した.従来行われている診察ならびに行動観察による診断と,チェックリストによる診断を行い,比較検討した.今回はその中で各項目のデータのそろった症例(44例)について分析した.チェックリストからは,20名が自閉症(完全型)と診断された.これらについて,診察による診断では,重度は2名,中等度は8名,軽度は6名,境界は4名,正常は0名であった.すなわち,チェックリストによる診断の方が,診察,行動観察よりも自閉症の症状をより強く把握する傾向が認められた.具体的な下位項目のうち,陽性率の高いものは,「他人の事(不快)を気遣いしないでマイペースで行動する」,「孤立した遊びを好む」,「大人の役や動物を空想して演じることをしない」,「あるパターン,CMのマーク,特定の物や動きに関心がある」などであった.

今後はデータを増やして,より特異性の高い項目を選定して,各患児の自閉性の程度(rating)を明らかにしたい.1.対象は82名で,年齢は1歳10ヵ月から18歳4ヵ月までで(平均5歳7ヵ月),男児65名,女児17名である.2.結果1)精神発達指数の評価精神発達は正常9名,境界9名,精神遅滞については軽度19名,中度34名,重度21名である.2)自閉性障害チェックリストの分析方法として,陽性のカテゴリー数により03までの段階に分けた.診察ならびにチェックリストによる自閉性障害の程度はよく相関していた(p=0.0079,x^2検定).3)精神発達の程度により,診察ならびにチェックリストによる自閉性障害の程度の判定がどのように異なるかについてみた.チェックリストによる方法に比較して,診察による自閉性の診断では,精神遅滞が中-重度では自閉性の程度をより重度に判断していた(p=0.0039,x^2検定).4)自閉性障害の程度と精神遅滞ならびに運動障害の合併の有無について検討した.運動障害については脳性麻痺はみられず,全て歩行など粗大運動の軽微な障害のみであった.精神遅滞ならびに運動障害の有無については自閉性障害の程度と関係がなかった.3.結論チェックリストと診察による自閉性の程度を比較するとよく相関していたことから本チェックリストの妥当性が確認できた.診察による自閉性の診断では,精神遅滞が中-重度では自閉性の程度をより重度に診断していたので,チェックリストによる方が客観性があるといえる.自閉性の程度により,精神遅滞,運動発達障害の比率には変化がみられなかった.このことから自閉性障害(広汎性発達障害)と特定不能の広汎性発達障害には本質的な相違はなく,自閉性の程度には移行があると考えられた.当初の予測が確認されたといえる.
食品による腸内環境改善を目指した腸内共生のエピゲノム基盤の解明

腸内共生の分子機構解明を目的とし、腸内細菌によるエピジェネティックな機構を介した腸管上皮機能の調節について解析を行った。その結果、腸内細菌により腸管上皮細胞において発現が誘導されるmiRNAを介して上皮透過性が調節されること、特定部位の腸管上皮細胞に豊富に発現するmiRNAを介して菌体シグナル抑制分子の発現が調節されることが明らかとなった。これらの成果は、腸内共生系を良好な状態に維持する食品成分の評価系構築に応用可能なものである。近年、腸内細菌が宿主の健康維持に重要な役割を果たすことが急速に明らかにされてきたが、莫大な数の腸内細菌が宿主免疫系に排除されずに共生する機構については十分明らかにされていない。本研究では、まず、腸内の共生の成立に関わるモデル遺伝子として、病原菌からの防御のみならず腸内細菌叢の維持に重要な役割を果たす抗菌ペプチドα-ディフェンシン5、および菌体刺激によるシグナル伝達を抑制するTollipを取り上げ、腸管上皮細胞(IEC)における発現調節機構を解析した。α-ディフェンシン5遺伝子の5 ́領域中に転写調節配列を同定し、この配列への結合因子候補としてFBP1を同定した。また、大腸IECにおいて顕著に高いタンパク発現が認められるTollipの発現調節機構について、小腸IECにおけるmiRNAによる翻訳抑制に加えmRNAの転写後修飾が関わる可能性が示された。次に、共生の分子機構として、腸内細菌による宿主IECに対するエピジェネティックな作用を明らかにするため、DNAメチル化とmiRNA発現に着目して解析を行った。まず、腸内細菌によるIECにおけるDNAメチル化の変動を確認した。通常および無菌マウスの大腸IECからゲノムDNAを調製し、メチル化CpG結合タンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った結果、腸内細菌によりメチル化頻度が増大あるいは低下する遺伝子集団が特定された。一方、通常および無菌マウスのIECにおけるmiRNA発現をマイクロアレイにより解析した結果、腸内細菌により発現が顕著に変動するmiRNAが存在することが明らかになった。また、腸管の部位により発現が顕著に異なるmiRNAも同定された。腸内細菌により発現が増大することが確認されたmiR-21-5pについて、IEC株を用いた解析により、菌体成分により発現が誘導されること、上皮透過性の調節に関わることが示唆された。腸管には生体で最大の免疫系が存在するにもかかわらず、免疫学的に異物である莫大な数の腸内細菌が排除されてしまうことなく共生している。本研究では、腸内細菌からの刺激を常に最前線で受け取る腸管上皮細胞に着目し、共生のエピジェネティックな分子機構を解析した。昨年度から継続の解析により、腸管上皮細胞において腸内細菌によりDNAメチル化が誘導される遺伝子集団を特定した。メチル化誘導過程の腸管上皮細胞を用いたプルダウンアッセイにより、これらの遺伝子集団へのメチル化酵素のリクルート因子を同定するために、ヒト腸管上皮細胞株HCT 116を用いて脱メチル化後に再メチル化を誘導する条件を決定した。今後、この条件を用い、腸内細菌刺激の存在下および非存在下でプルダウンアッセイを行う。一方、腸管上皮細胞に発現するマイクロRNA(miRNA)のうち、腸内細菌により発現が誘導されることが明らかになったmiR-21-5pについて、発現誘導機構の解析を行った。その結果、複数の菌体成分リガンドによりMyD88依存的に発現が誘導される傾向が示された。インヒビター導入試験により昨年度このmiRNAが上皮透過性の制御に関わることを明らかにしたが、さらに、菌体刺激に対する炎症性ケモカインIL-8の産生応答への影響を調べたところ、IL-8産生応答は変化しないことが明らかになった。次に、このmiRNAのターゲットを同定するために、miR-21-5pあるいはコントロールのアンチセンスLNAインヒビターを導入した腸管上皮細胞株の細胞抽出物を2次元電気泳動に供し、発現量に顕著な差がある複数のスポットにつきMS/MS解析を行い、候補分子を同定した。腸内細菌によるDNAメチル化制御に関わる分子の同定のための条件検討を行い、条件を決定することができた。また、腸内細菌により発現が誘導されるmiRNAの標的候補分子を同定した。腸内細菌によるDNAメチル化制御に関わる分子の同定については一部来年度に継続して持ち越しとなったが、おおむね計画に沿って研究を遂行することができた。食品を消化・吸収する腸管は体内で最も多い免疫細胞と莫大な数の共生細菌を含む独特の生態系を有し、われわれの健康維持に不可欠な役割を果たす。本研究では特に、腸内細菌からの刺激を常に最前線で受け取る腸管上皮細胞に着目した。そして、腸内細菌による宿主遺伝子の発現制御という側面から、共生を基盤とする腸管特有の生態系の形成・維持の分子機構を明らかにすることを目的とした。まず、腸内の共生の成立に関わるモデル遺伝子として、病原菌からの防御のみならず腸内細菌叢の維持に重要な役割を果たす抗菌ペプチドα-ディフェンシン5、および菌体刺激によるシグナル伝達を抑制するTollipを取り上げ、腸管上皮細胞における発現調節機構を解析した。最終年度は特に、マウス盲腸内容物中にα-ディフェンシン5遺伝子の転写を活性化する、低分子量の腸内細菌由来代謝産物が存在することを見出した。また、腸内細菌が腸管上皮細胞におけるmiRNA発現を変化させることを明らかにし、腸内細菌により発現が誘導されるmiRNAとしてmiR-21-5pを同定した。

さらに、このmiRNAが腸管上皮透過性の調節に関わることを示した。最終年度において、miR-21-5pによる腸管上皮透過性の調節作用は、低分子量GTPアーゼであるARF4を介することを明らかにした。したがって、miRNAを介したエピジェネティックな機構により、腸内細菌が腸管上皮細胞の機能を調節し、腸管内生態系の制御に関わることが示された。これらの結果は、食品による腸管内生態系の制御のための新たなターゲットの確立に応用可能なものであり、腸管内生態系の恒常性の破綻に起因する様々な疾患の予防、治療につながる可能性が期待される。腸内共生の分子機構解明を目的とし、腸内細菌によるエピジェネティックな機構を介した腸管上皮機能の調節について解析を行った。その結果、腸内細菌により腸管上皮細胞において発現が誘導されるmiRNAを介して上皮透過性が調節されること、特定部位の腸管上皮細胞に豊富に発現するmiRNAを介して菌体シグナル抑制分子の発現が調節されることが明らかとなった。これらの成果は、腸内共生系を良好な状態に維持する食品成分の評価系構築に応用可能なものである。平成26年度の研究計画として、1.腸管上皮細胞における共生関連モデル遺伝子の発現制御機構の解析、2.腸内細菌により誘導される腸管上皮細胞のエピジェネティックな変化の解析という研究計画であったが、おおむね順調に達成したと考えている。1については、2つのモデル遺伝子を取り上げ、それぞれ特徴的な発現調節機構が明らかになった。2については(1)大腸上皮細胞において腸内細菌によりメチル化が変動する遺伝子の網羅的解析(2)小腸および大腸上皮細胞におけるmiRNA発現パターンに及ぼす腸内細菌の影響の2点について実施した。次世代シーケンスの委託解析が来年度に持ち越しとなった以外は、おおむね計画に沿って研究を遂行することができた。平成27年度に決定した条件を用い、メチル化誘導過程の腸管上皮細胞を用いたプルダウンアッセイにより、腸内細菌によりDNAメチル化が誘導される遺伝子集団へのメチル化酵素のリクルート因子の同定を試みる。同定された分子および平成27年度に特定された腸内細菌依存的なmiRNAのターゲット候補分子について、腸管における機能や発現パターンを解析し、共生の成立・破綻、腸内共生系の恒常性維持における役割を明らかにする。さらに、これらの分子の発現や機能が腸内細菌によりどのように制御されるか、腸内細菌のうちどの菌種が高い制御活性を有するか解析する。腸内共生系の改善効果を有する食品成分の評価系を構築するために、これらの分子のうちで機能が明確になった分子について、食品因子による腸管内生態系の制御のためのターゲットとしての有用性を評価する。農学平成26年度に腸内細菌によりDNAメチル化が増大あるいは減少する遺伝子群を同定した結果をもとに、まず、腸内細菌により特定の遺伝子集団のメチル化が調節される機構を明らかにする。このために、DNAメチル化酵素あるいは脱メチル化酵素と標的遺伝子をつなぐ分子の同定を試みる。同定された分子につき腸管における機能や発現パターンを解析し、共生の成立・破綻、腸内共生系の恒常性維持における役割を明らかにする。
葉緑体ガラクトリパーゼ遺伝子の単離と発現機構の解析

高等植物におけるガラクトリパーゼの生理的役割を明らかにするため、脂質代謝レベル、タンパク質レベル、および遺伝子レベルで研究を行い、以下の結果を得た。1.大気汚染(オゾン)傷害の過程でガラクトリパーゼによって駆動される新規脂質代謝系が、各種高等植物葉に普遍的に作動すること、この代謝系が二酸化硫黄処理、水欠乏処理、プロトプラストの単離などのストレスによっても作動することを見出し、ガラクトリパーゼが環境ストレスに共通して機能することを示した。2.インゲン(Phaseolus vulgaris L.)葉には、葉緑体膜結合型と可溶性の少なくとも2種類のガラクトリパーゼが存在する。葉緑体ガラクトリパーゼに対して作成した抗血清は、葉緑体膜から可溶化したタンパク質および葉の可溶性タンパク質に含まれるガラクトリパーゼ活性を完全に阻害したことから、両画分の酵素は免疫学的に類似していること、かつ免疫学的に識別されるガラクトリパーゼのイソ酵素が存在しないことが分かった。3.インゲン品種間で、葉緑体ガラクトリパーゼ活性に3,000倍を越える差があることを見出している。葉緑体タンパク質について、デオキシコール酸を含むNative-電気泳動およびウェスタンブロットを行ったところ、単一バンドのみが検出され、かつインゲン品種間の活性差とタンパク質量の差に相関関係が見出された。可溶性ガラクトリパーゼも、ウェスタンブロットで単一バンドを示した。4.ガラクトリパーゼタンパク質の発現量が多いインゲン品種からmRNAを単離し、cDNAライブラリーを作成して、抗血清によるガラクトリパーゼcDNAのスクリーニングを行った。いくつかの問題点を解決し、現在新たに作成したライブラリーを用いてcDNAのクローニングを急いでいる。本年度は、既に調製済みのインゲン葉ガラクトリパーゼ抗血清を用いて、ガラクトリパーゼタンパク質の免疫学的研究を行うとともに、ガラクトリパーゼによって引き起こされる葉緑体脂質の新規代謝系が、各種環境ストレスに曝した植物葉において共通して発現するかどうかを検討した。1.インゲン葉の粗酵素液を、SDS-、Native-電気泳動によって分離しウェスタンブロッティングを行ったところ、バックグランドが著しく高かったが、デオキシコール酸を含むNative-電気泳動の後ウェスタンブロッティングを行ったところ、ガラクトリパーゼタンパク質が単一バンドとして検出されることが判明した。2.インゲン葉から得た粗酵素液のガラクトリパーゼ活性は、抗血清によって完全に阻害されることが分かり、インゲン葉には、免疫学的に異なるガラクトリパーゼのイソ型酵素は存在しないことが示唆された。3.インゲン品種間で、ガラクトリパーゼ活性に3,000倍を越える差があることを見出している。上述の電気泳動法を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、活性の高低に対応してタンパク質量に著しい差が見出され、ガラクトリパーゼタンパク質の発現量がインゲン品種間で異なっていることが判明した。4.大気汚染(オゾン)障害の初期にホウレンソウ葉に見出される新規脂質代謝系は、ガラクトリパーゼの作動が引金になっていることを証明している。タバコ、ソラマメ、トマトなど9種の植物をオゾンに、ホウレンソウを二酸化硫黄に、ソラマメ葉をプロトプラストの単離に、ホウレンソウ、大麦、キュウリを水欠乏に曝したところ、全てのストレス処理でオゾンの場合と同一の代謝経路が作動することが分かった。これらの事実から、大気汚染のみならず多様な環境ストレスに共通してガラクトリパーゼが機能することが示唆された。本年度は、インゲン葉からcDNAライブラリーを作成し、抗血清を用いてガラクトリパーゼcDNAスクリーニングを行うとともに、昨年度に引き続いてガラクトリパーゼタンパク質に関する免疫学的研究を行った。

1.ガクトリパーゼタンパク質の発現量が多いインゲン(Phaseolus vulgaris L.)の幼葉からmRNAを単離し、cDNAライブラリーを作成して、抗血清によるガラクトリパーゼcDNAのスクリーニングを行った。当初の実験では、一次スクリーニングで得られた陽性クローンがすべて二次、三次で消失したため、逆転写のレベル、ライブラリーに含まれるcDNA断片の鎖長、抗血清の純度などを検討し、現在新たに作成したライブラリーを用いてスクリーニングを行っており、有望な結果が得られている。2.インゲン葉には、葉緑体膜結合型と可溶性の少なくとも2種類のガラクトリパーゼが存在する。これまで葉緑体酵素に注目して研究を進めており、抗血清もこの酵素から作成している。そこで、この抗血清を用いて可溶性ガラクトリパーゼの免疫学的性質を調べた。その結果、可溶性ガラクトリパーゼの活性は抗血清によって完全に阻害されるとともに、ウエスタンブロッテイングによって分子量54,000の位置に可溶性ガラクトリパーゼサブユニットの明確な単一バンドが確認された。従って、可溶性ガラクトリパーゼは少なくとも免疫学的には葉緑体酵素と類似していることが明らかになった。3.ガラクトリパーゼが、活性酸素などの作用で葉緑体膜に蓄積した過酸化脂質を消去できるかどうかを調べるため、過酸化ガラクト脂質を作成してガラクトリパーゼの作用を調べた。その結果、ガラクトリパーゼは未処理のガラクト脂質と同程度に過酸化ガラクト脂質を加水分解できることが分かった。
γ－ピロンのアルドール型反応を鍵反応とするオーリピロン類の構造活性相関研究

オーリピロンA,Bは海洋軟体動物タツナミガイから単離、構造決定されたポリケチド化合物である。オーリピロン類はがん細胞に対して細胞毒性を示すが、オーリピロン類は天然からは極微量しか得られず、詳細な生物活性試験は行われていなかった。申請者はこれまでに生物活性試験のための量的供給を行うべく、γ-ピロンの新規アルドール型反応を利用したオーリピロン類の全合成を達成してきた。今回、申請者はγ-ピロンのアルドール型反応の選択性を高めることを目的に、向山アルドール型反応を新たに開発し、反応の最適条件を見出した。また、その立体選択性と基質一般性に興味深い知見を得た。続いて、構造活性相関研究を行った。側鎖にベンゾイル基、4-フェニルブチリル基、ラウリル基を導入した類縁体を合成し、それぞれの細胞毒性を天然物と比較した。その結果、側鎖の構造は細胞毒性にほとんど影響を与えないことが分かった。さらに、全合成の合成ルート及び構造活性相関で得られた知見を活用して、生物活性発現機構の解明を目的とした分子プローブの開発に着手した。まず、細胞内の局在を解析するために、側鎖部に蛍光基を導入した蛍光プローブを設計し、アセチレンを導入した側鎖と蛍光基を持つアジドのHuisgen反応を鍵反応としてこれを合成した。このプローブを用いた細胞内局在解析によってオーリピロン類は細胞質に局在することが分かった。この結果を受けて、オーリピロン類の標的分子の精製および同定のために、これを担持したFG (Ferrite-Glycidyl methacrylate)ビーズを調整した。現在、これを利用したオーリピロン類の標的分子の探索を検討している。まず、細胞内の局在を解析するために、側鎖部に蛍光基を導入した蛍光プローブを設計し、アセチレンを導入した側鎖と蛍光基を持つアジドのHoisgen反応を鍵反応としてこれを合成した。現在、オーリピロン類の標的分子同定のために、オーリピロン類をリガンドとする光親和性ビオチンプローブの合成を検討している。当初の予定通り、構造活性相関研究を行ってオーリピロン類の修飾可能位置の割り当てまで完了している。オーリピロン類の構造活性相関研究においては十分な結果が得られたと判断されるため、今後はオーリピロン類の細胞毒性発現機構に関する研究へとシフトしていこうと考えている。
内皮機能障害から動脈硬化へ至る分子機構の解明

内皮細胞特異的Gab1欠損(Gab1ECKO)マウスを作製してApoE欠損(ApoEKO)マウスと交配して二重欠損(DKO;Gab1ECKO/ApoEKO)マウスを作製し、DKOマウスとApoEKOマウスの6ヵ月齢オスにAngiotensin II(AngII)を浸透圧ポンプ負荷した。DKOマウスではApoEKOマウスに比して動脈硬化と動脈瘤形成が促進され、大動脈での炎症性サイトカインの発現は有意に増加し、転写因子KLF2とKLF4の発現は有意に減少していた。内皮細胞のGab1欠損はAngII依存性の血管炎症と動脈硬化をKLF2とKLF4の発現低下と相関して促進する可能性が示唆された。H24年度はGab1を内皮細胞特異的に過剰発現するトランスジェニックマウス系を構築した。Cre-loxP系を用いて、内皮細胞特異的に(1)胎生期から、(2)任意の時期に薬剤(タモキシフェン)依存性に過剰発現誘導できるマウスを作製した。(1)の目的にはTie2ーCre-Tgマウスを、(2)の目的にはVE-Cadherin-CreERT2-Tgマウスをそれぞれ用いてloxP-Stop-loxP-Gab1-Tgマウスと交配して作成した。H23年度のGab1ECKO/ApoEKOマウスの詳細な解析から、本研究のタイトルである「内皮機能障害から動脈硬化へ至る分子機構」に内皮細胞のGab1が関与することを証明出来て、論文発表することが出来た。さらにH24年度では、内皮細胞特異的にGab1を過剰発現するトランスジェニックマウスの作製を終えることが出来て、内皮機能におけるGab1の役割をさらに解明する準備を整えることが出来た。以上より、おおむね研究は順調に進行していると考えられる。H23年度のGab1ECKO/ApoEKOマウスの詳細な解析から、本研究のタイトルである「内皮機能障害から動脈硬化へ至る分子機構」に内皮細胞のGab1が関与することを見出すことが出来て論文発表1篇出来たことことから、おおむね研究は順調に進行していると考える。Gab1内皮細胞特異的トランスジェニックマウス(Tie2CreTgマウスまたはVE-Cadherin-CreERT2マウス)で内皮特異的過剰発現をまず確認する。十分な過剰発現が見られた場合は、(1)大腿動脈結紮による下肢虚血ストレス、(2)ApoEノックアウトマウスとの交配を行ったうえで高脂肪食負荷又はアンジオテンシンII負荷をすることで動脈硬化・血管炎症のストレスをかけて、Gab1の内皮保護効果を検討する。内皮保護効果が確認された場合は、in vitroでHUVECの系に立ち返り、Fluid Shear Stressを負荷した系でのGab1の機能を検討したい。Gab1ECKO/ApoEKOマウスでのAngiotensin II(AngII)依存性動脈硬化・血管炎症の増悪にはGab1を介したFluidshear stress(FSS)依存性の血管内皮保護シグナルの伝達不全が背景にあったと推察される。そこで、今後はGab1のFSS依存性血管内皮保護シグナルにおける機能解析を一つの中心テーマとして進めたいと考えている。(1)Gab1のFSSおよびスタチンによる血管内皮保護シグナルにおける関与の検討:Gab1がFSS依存性にチロシンリン酸化されることとFSS依存性AKTおよびeNOSのリン酸化に重要であることはこれまでに既に報告されている。FSS、スタチンともにERK5活性化とそれに引き続くKLF2の遺伝子発現促進を誘導することも報告されており、そのシグナルへのGab1の関与を明らかにしたい。Gab1のFSS依存性シグナルへの関与が明らかになった場合、Gab1-ERK5を経由してERK5でリン酸化される標的分子の同定をしたい。(2)Gab1内皮細胞特異的過剰発現マウスの解析:Tie2-promoter下にGab1遺伝子を過剰発現するマウスが今後得られる予定であり、そのマウスの血管内皮機能、虚血後血管新生などを検討する予定である。実験試薬代:50万円マウス飼養・購入代:20万円旅費:10万円を予定している。実験試薬代:80万円マウス飼養・購入代:50万円旅費:20万円合計150万円を予定している。
深層学習を用いた配置配線手法の研究

本年度はCNNニューラルネットワークへ入力される論理素子の配置状況をより画像に近づける試みを行った.具体的には論理素子の配置位置を画像上の点とした他,論理素子間の接続をネットで接続される素子間をつなぐバウンディングボックスとして表現し,バウンディングボックスを枠線や色を持つ面として入力画像上に表現したものを用いた.そして,この方法をさらに進めた方法としてネット毎に用意されたチャネルをチャネル間で加算して単一のチャネルに統合することでネット数に関わらず単一チャネルの入力することを試みた.その結果,単一チャネルの入力しか持たないCNNであっても処理できる事が明らかになった.この方式の有用性を確認するため, Yann LeCunが発明したLeNet-5を模したCNNニューラルネットワークを用いて32×16のアレイを構成する再構成型デバイスMPLDにおいて2つの配置のいずれがより良い配置であるか判定するように学習させた.その結果,8種類のベンチマーク回路から200000件の配置を作成して学習させた結果,未知の回路の配置に対して90%以上の確度で2つの配置の内より良い配置を判定できるようになった.さらに,2つの配置を比較してより良い配置を判定するように学習したCNNニューラルネットワークをコスト関数として用いてSA法により配置し,配線するCADを作成したところ,実際に配置配線が可能であることが確認できた.現在のところ配置配線品質は従来のコスト関数にまだ及んでいないが,深層学習を用いて学習するCADが可能であることが示せた.今後はCAD自ら行った配置配線結果を用いてニューラルネットワークの再学習を行う枠組みを研究する他,より適切なニューラルネットワークアーキテクチャの探求,および,さらにより良い配置配線問題の定式化を追求していく予定である.改良の余地があるものの当初予定していた深層学習を用いたCADシステムの枠組みを作成することができた.しかし,配置配線問題の評価に使用するニューラルネットワークの構造が現在適切なものが選ばれていると言えず,今後さらなる研究調査が必要である.また,配置問題をニューラルネットワークでも解けるように定式化することに関しても今後とも引き続きより良い定式化を追求していく必要がある.ニューラルネットワークの計算処理,学習データ生成の高速化をFPGA実装により達成する予定であったが,FPGA用CADの能力やFPGAデバイスの能力により想定していた高速化ができなかった.しかし,代わりにGPUサーバを購入し,ニューラルネットワークの計算処理と学習データ生成の計算処理をGPUで行うことにより,研究に必要な計算性能を達成することができた.しかし,現状配置配線を行っている再構成デバイスの規模がまだ小さく,今後より大きい再構成デバイスに対応したCADシステム開発が今後の課題である.現在,ニューラルネットワークに入力配置やネット情報を加工し,ニューラルネットワークへの入力情報としている,しかし,今後より高い精度でより良い配置を選択できるようにするためには,現在のように完全に画像化した形ではなく,もっと個別のネット情報が識別できるような方法を考案する必要がある.また,現在使用しているCNNニューラルネットワークについてもYann LeCunが発明したLeNet-5を用いているが,これも段数やマスク数,プーリング層などなどまだまだ最適化を行う必要がある.今後はこれらの最適化を行った現在以上に高い精度でより良い配置を選択できるように改良していく.また,同時に現在比較的小規模な再構成デバイスを対象としたCADシステムの構築を行っているが,今後これをさらに大規模化させて行く予定である.大規模化に伴い今後増える計算処理の増加をどのように高速処理するかも今後解決して行く予定である.本年度は,配置配線問題を深層学習で処理できるように問題を定式化する研究,配置配線問題を深層学習するための学習データ自動生成方法の研究,専用計算エンジンの研究の3つを行った.配置配線問題を深層学習で処理できるように問題を定式化する研究では,アプリケーション回路のネットリストをすべての論理素子間の接続関係を表現する隣接行列を用いて定式化する方法,ネットリストのI/Oに対する各論理素子の距離で各論理素子の関係を定式化する方法,および,各論理素子の接続関係を有限長のリストで表現することで弱い接続関係を切り捨てた表現で定式化する方法の3つの考案し,それぞれの有効性を検証した.その結果,各論理素子の接続関係を有限長のリストで表現することで弱い接続関係を切り捨てた表現で定式化する方法が最も良い効果的に定式化できることが分かった[1].学習データ自動生成方法の研究では,自己組織化マップ(SOM)を用いて配置配線を行う方法,および,SA法を用いた方法を試みた.その結果,SOMを用いた方法とSA法を用いた方法ではそれぞれ性質の異なる配置配線結果が得られることが分かった.最後に,専用計算エンジンの研究では,深層学習の事前学習で持ちいる制限付きボルツマンマシンのCベース設計を用いたFPGA実装を試みた.しかし,実装を行ったFPGAボードが古い世代のFPGAボードであったので性能評価に至らなかった.[1]田中智大,谷川一哉,弘中哲夫,石黒隆“細粒度再構成可能デバイスMPLDのIOを考慮したSOMベース配置手法, "リコンフィギャラブルシステム研究会,信学技報, vol. 116, no. 210, pp.29-34, 2016年9月5日.平成28年度に予定してた3つの研究テーマである,配置配線問題を深層学習で処理できるように問題を定式化する研究,配置配線問題を深層学習するための学習データ自動生成方法の研究,専用計算エンジンの研究に予定通り取り組めた.そして,ほぼ計画通りの成果を得ているので概ね順調である.