hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国典籍日本古写本研究の精密化と国際的情報発信

科研費交付決定の後、7月28日科研メンバー全員で第一回打ち合わせを開催(於京都大学)し、今後の具体的な研究計画について協議をおこなった。8月23日、科研メンバー4名が関西大学に赴き第二回打ち合わせを行い、主に古写本データベースのブラッシュアップについて検討した。また同大学図書館内藤文庫に保存される古写本写真について調査を行い、これらの写真が影印書作成前段階の資料であり、その幾つかは影印本に見られる破損が少ない貴重なものであることを確認した。2月21日東京国立博物館において第三回打ち合わせを行い、東京及び近郊地域の図書館博物館の古写本所蔵に関する情報交換を行った。3月6・7日大東急記念文庫において所蔵古写本13点を調査した。ただ希望した所蔵資料の幾つかは、記念文庫の展示会準備のため調査できなかった。以上は科研メンバーが共同して行った調査活動である。この他、メンバー個別に、国会図書館、中国の大連市図書館、北京の中国国家図書館などに赴き、古写本及び関連資料の調査を行った。研究成果については、データベースの拡充のための資料収集と、ブラッシュアップが、メンバー共同の成果である。メンバーはそれぞれ、国内外の学術誌への投稿や国際学会での発表を行った。また現在中国でも日本に伝わる中国古典籍に対する関心が高まっており、研究もすすめられている。そのうち天津師範大学を中心とする関連プロジェクトとの情報交換、研究協力についても協議をおこなった。計画初年度であった2018年は、今後の活動の基礎となる調査方針、所蔵調査機関についての情報交換を行った。7月の第一回打ち合わせ会議の結果、調査対象となる公設私設機関を選択した。本計画では調査の重点を国会図書館所蔵古写本とするが、所蔵点数が多い為、資料のまず資料の洗い出しを行うこととし、現在作成中である。また私立・寺社所蔵の古写本について調査を行っている。このうち大東急記念文庫の調査を行い、あわせて他の機関についても閲覧の可否について科研分担者、科研協力研究者とともに、交渉を行っており、幾つか施設については調査許可を得ることができた。これについては、科研メンバー全員或いは個別に、順次校務の合間に調査に赴く予定となっている。第一回合同調査として、関西大学に赴き、内藤文庫の古写本等の写真資料を閲覧した。その結果、これらの写真は古写本資料として高い価値を有するものであることが確認できたので、本科研の当初の計画には無かったが、追加の課題として継続して調査を行うこととなった。本調査は関西大学に所属する科研メンバーを中心に、その他の写真資料の発見、及び、既調査写真について、何時どのような目的で、誰によって撮影されたのか、その影印や復刻の有無などについて、メンバー全員で検討を行っている。この他、科研メンバーはそれぞれの専門との関係の強い分野の古写本について調査を行っている。また、国内、中国などで開催された国際学会に参加し、成果を発表している。本科研の大きな目的の一つである古写本の調査は、所蔵の多い国会図書館を中心とする。これまでの調査の経験から、調査にかなりの時間がかかることが予想されるため、調査候補となる古写本のリストを作成し、閲覧の優先順位を決定し、調査の効率化を図ることとした。当初の数回は科研メンバー全員で調査を行うが、その後はメンバーそれぞれの専門や関心に従って、個別に調査を行う。これは科研メンバーそれぞれ校務が多忙であり、全員が揃って調査に赴く時間を見つけることが困難であるからである。私立図書館・美術館や寺社所蔵古写本については、公設機関に比べると所蔵情報や閲覧方法がそれぞれ異なるため、閲覧の許可が得られた機関から順に、調査に赴き、必要に応じて追加の調査を行う。これも所蔵機関の許可が優先されるため、科研メンバーが個別或いは数名で赴くことになる。本科研のメンバーは、積極的に中国・台湾などの国際学会に参加している。その機会に国内外の研究者より、本科研の課題と同じような関心を持っている研究者の存在や、国外で本科研と関連する研究課題が計画されているといった情報を得ることがあった。例えば天津師範大学の王曉平教授らが中国で行っている研究項目は、本科研課題とも重なるところがあり、シンポジウムなどの方法で知見の共有の可能性を検討している。これを含め国外研究者との連携の可能性を探ってゆく方針である。なお、古写本データベースについては、逐次資料情報の追加とブラッシュアップを行う。

研究成果については、データベースの拡充のための資料収集と、ブラッシュアップが、メンバー共同の成果である。メンバーはそれぞれ、国内外の学術誌への投稿や国際学会での発表を行った。また現在中国でも日本に伝わる中国古典籍に対する関心が高まっており、研究もすすめられている。そのうち天津師範大学を中心とする関連プロジェクトとの情報交換、研究協力についても協議をおこなった。計画初年度であった2018年は、今後の活動の基礎となる調査方針、所蔵調査機関についての情報交換を行った。7月の第一回打ち合わせ会議の結果、調査対象となる公設私設機関を選択した。本計画では調査の重点を国会図書館所蔵古写本とするが、所蔵点数が多い為、資料のまず資料の洗い出しを行うこととし、現在作成中である。また私立・寺社所蔵の古写本について調査を行っている。このうち大東急記念文庫の調査を行い、あわせて他の機関についても閲覧の可否について科研分担者、科研協力研究者とともに、交渉を行っており、幾つか施設については調査許可を得ることができた。これについては、科研メンバー全員或いは個別に、順次校務の合間に調査に赴く予定となっている。第一回合同調査として、関西大学に赴き、内藤文庫の古写本等の写真資料を閲覧した。その結果、これらの写真は古写本資料として高い価値を有するものであることが確認できたので、本科研の当初の計画には無かったが、追加の課題として継続して調査を行うこととなった。本調査は関西大学に所属する科研メンバーを中心に、その他の写真資料の発見、及び、既調査写真について、何時どのような目的で、誰によって撮影されたのか、その影印や復刻の有無などについて、メンバー全員で検討を行っている。この他、科研メンバーはそれぞれの専門との関係の強い分野の古写本について調査を行っている。また、国内、中国などで開催された国際学会に参加し、成果を発表している。本科研の大きな目的の一つである古写本の調査は、所蔵の多い国会図書館を中心とする。これまでの調査の経験から、調査にかなりの時間がかかることが予想されるため、調査候補となる古写本のリストを作成し、閲覧の優先順位を決定し、調査の効率化を図ることとした。当初の数回は科研メンバー全員で調査を行うが、その後はメンバーそれぞれの専門や関心に従って、個別に調査を行う。これは科研メンバーそれぞれ校務が多忙であり、全員が揃って調査に赴く時間を見つけることが困難であるからである。私立図書館・美術館や寺社所蔵古写本については、公設機関に比べると所蔵情報や閲覧方法がそれぞれ異なるため、閲覧の許可が得られた機関から順に、調査に赴き、必要に応じて追加の調査を行う。これも所蔵機関の許可が優先されるため、科研メンバーが個別或いは数名で赴くことになる。本科研のメンバーは、積極的に中国・台湾などの国際学会に参加している。その機会に国内外の研究者より、本科研の課題と同じような関心を持っている研究者の存在や、国外で本科研と関連する研究課題が計画されているといった情報を得ることがあった。
in viyoにおけるペプチジルアルギニンデイミナーゼの活性化とその波及効果

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)は、Ca^<2+>存在下でタンパク質のアルギニン残基を脱イミノ化する酵素であるが、その生理的意義はまだ明らかでない。本研究では、PADがいずれ死に至る細胞で活性化され、周囲の細胞にも波及効果を及ぼしうるという作業仮説を下に、以下のような検討を行なった。1.灌流ラット脳におけるPADの活性化:ラットを麻酔下で保温したフルオゾール(高酸素溶解能を有する過フルオロ化合物の乳濁液)で全身灌流後、大脳中の脱イミノ化タンパク質の出現をウエスタンブロット法、及び免疫細胞化学的方法で調べた。高酸素・有グルコース条件で灌流するとほとんど脱イミノ化タンパク質の出現が認められなかったが、低酸素・無グルコース条件では灌流時間経過に従って多数の脱イミノ化タンパク質のバンドが出現した。組織切片上でも、アストログリア(PAD局在)のほか、扁桃核の神経細胞に脱イミノ化タンパク質陽性を示すものが認められた。以上の結果から、低酸素・無グルコース負荷下ではアストログリア中のPADが活性化され、生じた脱イミノ化タンパク質が一部の神経細胞にも出現することが分かった。皮膚とその付属器官に存在する脱イミノ化タンパク質の性質と局在:ラット足裏皮膚か凍結法で剥離した角層外層のタンパク質をウエスタン法で調べたところ、55K77Kに部分的にケラチンと対応する複数の脱イミノ化タンパク質が検出された。これらのバンドは体毛の密生したラット成体の皮膚には認められなかったが、幼若ラットや成体でも除毛一週間後の皮膚には65Kのバンドが認められた。脱イミノ化タンパク質は角層に局在がみられ、体毛で保護されていない皮膚で、表皮細胞の角化に伴って活性化されたPADの働きで出現することが示唆された。二次元ウエスタンブロット法による脱イミノ化タンパク質の動態解析を進めている。
中国の近代化過程における美と美育に果たしたメディアの位置づけに関する実証的研究

本研究の目的は美による国民形成と道徳再建の可能性を、美を重んじる中国教育史を踏まえて改めて追究するところにある。中国は清末以後の近代化に伴い、美および美育による国民道徳向上の思想とその実践があった。本研究は、20世紀初頭に「美育救国」を提出した元北京大学総長蔡元培の理論と実践にあてて、美の理念とその教育のあり方をいかに社会全体に浸透させたのかを明らかにした。一方、「美育救国」という方針の下で、当時多くの留学生が芸術を学ぶために日本にやってきた。日本で学んだ留学生たちの実態、そして彼らが帰国後の教育活動を通して、中国近代芸術教育の構築に貢献した留学生たちの姿を浮き彫りにすることができた。中国社会の急速な近代化によって、国民の心を豊かにする役割をもつ道徳の問題が浮上してきている。これまで行われてきた道徳教育はもはやグローパル社会に対応できなくなっている。こうした状況下で、道徳の再建が喫緊の重要課題として新たに注目されるようになった。中国は清末以後の近代化に伴い、美および美育におる国民教育を形成する思想とその実践があった。美を重んじる中国史を踏まえて、本研究の目的は美による国民形成と道徳再建の可能性を改めて追究するところにある。美は抽象的な概念であり、ある種の主観性をもって語られ定義され、判断されることが多いため、美の語り方/伝え方こそが、美の本質を示すことになる。ここで美を語る/伝える手段とされるメディアの問題が現れる。美はそれを語る/伝えるメディアに依存し、また、メディアはその美の語り方/伝え方を規定する。この意味では美を醸し出すメディアこそが、実は美を作り出し、さらには国家と国民を作り出す大きな原動力を持っている。ここにメディアの視点から思想史や教育史の研究にとって不可避とする理由がある。メディアという視点から近代中国の美と美育の実態を解明するため、初年度では、20世紀初頭において、初めて「美育をもって国を救う」という教育方針を打ち出した民国初代教育総長・北京大学総長蔡元培の言説とその実践を取り上げ、彼の説いた美の理念がいかに当時の社会に浸透していたのかを資料に基づいて実証的研究を行った。先行研究に依拠しながら膨大な資料を整理することを通して、美育推進の輪郭をある程度把握することができた。要するに、校内新聞紙や教育雑誌、芸術活動の開催などメディアを活用し、知識人によるトップダウン式の推進であった。メディアと取り入れたことで、美育をよりダイナミック的に捉えることができた。この点において大きな意義と重要性があると認識している。中国社会の著しい近代化の発展に伴って、国民の心を豊かにする役割をもつ道徳の問題が浮上してきた。これまで行われてきた道徳教育はもはやグローバル社会に対応できなくなっている。そうした道徳の再建が緊急な重要問題として新たに注目されるようになった。清末以後の近代化過程において、中国は美および美育による国民教育を推進する思想と実践を展開していった。美を重んじる中国史を踏まえて、本研究の目的は美による国民形成と道徳再建の可能性を改めて追及するところにある。美は抽象的な概念であり、ある種の主観性をもって語られ定義され、判断されることが多い。ゆえに、美の語り方/伝え方が美の本質を示す重要なものになる。この意味では美を醸し出すメディアこそが、実は美を創り出し、さらには国家と国民を創り出す大きな原動力である。ここにメディアの視点から思想史および教育史の研究にとって不可欠とする理由がある。メディアという視点から近代中国の美と美育の実態を明らかにするため、二年目では、「美育で国を救う」という教育方針を打ち出した北京大学総長蔡元培の言説を取り上げ、彼の美育思想が実践においてどのような形で展開されていたのか、そして、美を語る/伝えるメディア(ここでは主に新聞を指す)の役割は何であったのかを一次資料に基づいて検証した。北京大学総長に務めた10年間、蔡元培は『北京大学日刊』という新聞誌を利用し、美に関する多くの言説を掲載することによって、人々の美に対する関心を喚起し、美に対する理解を促した。また、画法研究会、音楽研究会を立ち上げ、実践の活動を通じて、大学そして社会全体へと発信し、感性的に美を愛好する人々の心を育成することに尽力したのである。本研究期間は3年間を予定している。初年度では、資料の収集・整理・分類および翻訳といった基礎作業を行った。2年目では、それらの調査データをもとに、日本・中国・ヨーロッパでの研究発表を行った。学会発表は以下のようなものである。2.『北京日刊』を中心に美育を推進してきた蔡元培の実践を明らかにした。「近代中国における美育運動の展開に関する実証的研究ー1910年代から1920年代までの蔡元培の教育実践を中心にー」、楊奕、日本教育学会第74回大会(於お茶の水女子大学)3.東京美術学校で学んだ留学生のデータをもとに、留学生の基本情報を紹介した。「東京美術学校における中国人芸術留学生」、楊奕、第五回世界華人美術大会(中国上海華東師範大学)本研究の目的は、美による国民形成と道徳再建の可能性を、その両者の関係性をめぐる歴史的変遷に遡って改めて追究するところにある。

中国社会の急速な経済発展によって、国民生活がこの20年間著しく向上を遂げ、豊かになった。しかし、その一方で、道徳低下の問題も指摘されるようになった。これまで行われてきた道徳教育は社会の様々な問題に対応できなくなったという反省から、国民の心を豊かにする役割をもつ道徳教育はどうあるべきかという問題が、重要課題として再び社会に注目されるようになった。中国は清末以後の近代化に伴い、美および美育による国民道徳向上の思想とその実践があった。美を強調する知識人の努力があったからこそ、西洋と異なる中国ならではの近代化が実現できたと思われる。その意味で、今日行き詰まっている道徳教育の状況を打開するための一つの試みとして、美を重んじる中国近代知識人の言説と活動を研究することは現実味を帯びるものであり、大きな意味があるように思われる。美を重んじる中国教育史をめぐって、20年代初頭、中国国内では、北京大学元総長蔡元培を中心に美育が進められてきた。本研究では、彼の理論と実践にあてて、美の理念とその教育のあり方をいかに社会全体に浸透させたのかを明らかにした。一方、同じ20年代初頭、西洋美術や音楽を学ぶために、多くの留学生が日本にやってきた。芸術に対する彼らの理念と活動は、後の中国近代芸術教育の構築に大きく貢献した。日本で学んだ留学生たちの実態、そして彼らが帰国後の活動などを、当時在籍していた日本の大学の資料、帰国後の中国での執筆活動と教育実践、また、彼らの家族へのインタビューなどの調査を通して、芸術によって中国近代化を進めていく留学生の特質を明らかにした。その資料を最終年度にまとめ、留日芸術学生の資料集として、2018年に中国で出版する予定である。本研究の目的は美による国民形成と道徳再建の可能性を、美を重んじる中国教育史を踏まえて改めて追究するところにある。本研究は、20世紀初頭に「美育救国」を提出した元北京大学総長蔡元培の理論と実践にあてて、美の理念とその教育のあり方をいかに社会全体に浸透させたのかを明らかにした。一方、「美育救国」という方針の下で、当時多くの留学生が芸術を学ぶために日本にやってきた。日本で学んだ留学生たちの実態、そして彼らが帰国後の教育活動を通して、中国近代芸術教育の構築に貢献した留学生たちの姿を浮き彫りにすることができた。本研究期間は3年間を予定している。初年度では、「美」の言説の誕生とその発信者としての位置づけを中心に(1910年代から1930年代まで)、「美育救国」の教育方針を提出した北京大学元総長蔡元培の言説と実践にあてて、美の理念とその教育のあり方をいかに社会全体に浸透させたのかを明らかにした。一年目では、主に資料の収集・整理・分類と翻訳といった基礎作業を行った。現在まですでに以下の作業を完成した。1、『蔡元培全集』、『蔡元培美育論集』、『学風』、または、当時影響力のある教育雑誌(例えば、『教育世界』)における蔡の言説を収集・整理した。美の言説が生まれるまでの経緯を探った。2、当時、重要な校内新聞紙である『北京大学日刊』(北京大学出版)を利用し、中には、主に美と美育に関するエッセー、論説、美術展示会・音楽会の情報、演目などを表にまとめた。
ミトコンドリア透過性遷移孔を制御する蛋白キナーゼ系の解析

ミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)の構成蛋白とキナーゼの関連を解析し、1)PTP開口閾値がシクロフィリンD(CypD)と無機リン輸送担体(PiC)の結合に規定され、2)細胞質から水ミトコンドリアに移行したGSK-3betaは呼吸鎖複合体IIIと結合し活性酸素産生の亢進によりmPTPを開口させること、3)細胞内シグナルによるGSK-3beta不活化がCypD-PiC相互作用を抑制し、mPTP開口の抑制ばかりでなくmPTP再閉鎖を促進すること、4)GSK-3betaのミトコンドリアへ移行にはVDAC2との結合が重要であることを明らかにした。本年度はミトコンドリア透過性遷移孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)の制御をその再閉鎖機構に焦点を当てて解析した。心筋細胞株であるH9c2細胞において、antimycin A (AA)の一過性処置による酸化ストレスで誘導されるmPTPの開口再閉鎖の過程をTMREを用いたミトコンドリア膜電位、ミトコンドリアに取り込ませたcalceinを指標に測定した。AAによるmPTPの開口には、mPTPの構成蛋白ならびに制御蛋白の発現レベルの変化は伴っていなかったが、GSK-3betaとミトコンドリアcomplex IIIとの結合が亢進していた。ミトコンドリアATP感受性Kチャネル(mKatp channel)の活性化はGSK-3beta-Ser9のリン酸化、GSK-3beta-complex III結合の抑制、活性酸素産制の抑制ならびにmPTPの再閉鎖の促進をもたらした。こうしたmKatp channel活性化の効果はsiRNAを用いたGSK-3betaノックダウンによって再現された。また、AAの処置後に、活性酸素消去薬(MPG, N-acetylcysteine)を用いることによってもmPTPの再閉鎖が有意に促進された。いずれの処置によるmPTPの再閉鎖促進においても、AA処置後のH9c2細胞の壊死が抑制された。以上の結果から、開口したmPTPの再閉鎖を阻害する要因として持続的な活性酸素が重要であり、その産生にはGSK-3beta-complex III結合が関与し、GSK-3betaのSer9リン酸化は活性酸素産生の抑制を介してmPTPの再閉鎖を促進し細胞を壊死から保護することが示唆された。本年度ではさらに、GSK-3betaの細胞質からミトコンドリアへの移行の機序を、2次元電気泳動、MALDI-TOF/MS、変異GSK-3betaの作成によって解析した。その結果、GSK-3betaとvoltage dependent anion channel-2 (VDAC2)との蛋白蛋白結合、GSK-3betaのキナーゼ活性、GSK-3betaのN末端側15個のアミノ酸で構成されるドメインが、活性酸素による刺激によって誘導されるGSK-3betaのミトコンドリアへの移行とmPTPの開口に重要であること、一方活性酸素自身はGSK-3beta活性は直接的には亢進させないことを明らかにした。この成績と既報のものを含めたこれまでの実験成績を総括することにより、「活性酸素によってGSK-3betaのN末端ドメインを介してGSK-3betaとVDAC2の結合が起こり、その結果ミトコンドリアへの蛋白輸送担体であるTOM20との親和性が上昇してGSK-3betaがミトコンドリア内の膜間スペース(mitochondrial intermembrane space)に移行し、そこでミトコンドリア内膜上のcomplex IIIと結合することによってミトコンドリア内での活性酸素産生を亢進させ、mPTP開口とその維持がもたらされる」といった新たな仮説を示すことができた。今後、この仮説のさらなる検証を進める予定である。ミトコンドリア透過性遷移孔の主要構成タンパクであるミトコンドリア無機リン酸輸送体(inorganic phosphate carrier, PiC)に対する抗体を作製し、虚血再灌流障害におけるPiCと他のmPTP構成タンパクとの機能関連を解析した。その結果、in vivoの実験では、PiCとミトコンドリアマトリックスタンパクであるcyclophilin D (CypD)との結合が、mPTPの開口閾値と強い逆相関関係があること、adenine nucleotide translocase (ANT)とPiCとの結合は虚血再灌流障害の影響を受けないことが示され、CypD-PiC相互作用がmPTP制御に重要であることが明らかとなった。細胞保護シグナルであるPI3K-Akt-GSK-3beta経路の活性化によりCypD-PiC相互作用が減弱しmPTP開口が抑制させることが示された。また糖尿病状態は、ミトコンドリアにおけるunfolded protein responseの亢進を介してPI3K-Akt-GSK-3betaシグナルによるCypD-PiC抑制を阻害することが示唆された。

H9c2細胞を用いてmPTP開口をミトコンドリア膜電位の消失を指標に解析したin vitroの実験では、細胞を一過性に活性酸素に暴露することによりmPTPは開口するがその後に再閉鎖すること、ミトコンドリアATP感受性Kチャネルの活性化によりもたらされる細胞保護はmPTPの再閉鎖の促進による可能性が示唆された。mPTPの開口・再閉鎖に関する蛋白キナーゼとmPTPの構成・制御蛋白との関連の主なものとの関連について基本的な成績を得ることができた。またミトコンドリアのunfolded protein responseについても糖尿病心筋の解析がほぼ終了しており最終的な解析を行っている段階である(来年度には研究実績として報告が可能である)。ミトコンドリア無機リン酸輸送体(inorganic phosphate carrier, PiC)に対する抗体の作製と、抗体の特異性、免疫沈降、免疫組織法への応用の可能性について行った予備実験に日数を要したため、研究計画の遂行はやや遅れた。mPTPの開口を制御する蛋白キナーゼ系のうちGSK-3betaの重要性を確認し、またその役割がミトコンドリアcomplex IIIとの相互作用を介した活性酸素産生促進であるとの成績を得た。今後は、GSK-3betaが細胞質からミトコンドリアへ移行する分子機構とGSK-3betaのリン酸化に関与する蛋白キナーゼのミトコンドリア分布の解明に重点を置き、プロテオミクスの手法を駆使して研究を推進する。ミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)の構造タンパクのうちPiCに対する抗体は購入可能なものがないため、研究室で独自に作製したが、その結果、ウェスタンブロットのみならず免疫沈降、免疫組織法にも使用可能な抗体であることが確認できた。この抗体と現在現有の抗体を用いることでmPTPの構造タンパクの相互作用はほぼ網羅的に解析可能である。またプロテオーム解析の方法論として2次元電気泳動と質量解析の応用プロトコールを確立すべく準備を進めている。mPTPの開口閾値をこれまで主に単離ミトコンドリアのカルシウム保持能を指標に解析してきたが、今後は、2種類のミトコンドリア膜電位プローブをを用いて単離心筋細胞におけるmPTPの開口と再閉鎖をモニターすることによって、mPTP閉鎖に関与する分子を解析する。年度末に購入したPower Lab8/35の購入費が当初の見積り額よりも少額であったこと、また作製を依頼している抗VDAC2抗体の完成が遅れ、そのための費用を年度内に支出できなかったことが、残額が生じた理由である。抗体作製費用ならびに実験試薬の購入のための費用として使用する予定である。平成23年度はPiCに対する抗体は購入可能なものがなかったため、我々の研究室で独自に抗体を作製し、その特異性ならびに各種実験における有用性の検討に多くの時間を要した。その結果当初年度内に予定した実験プロトコールを全ては終了することができず、平成23年度に使用予定であった研究費の全て使用するには至らなかった。
自己免疫膵炎の免疫病態と線維化における自然免疫の関与に関する研究

本研究ではIgG4関連疾患の胆膵病変である自己免疫性膵炎(AIP)とIgG4-関連硬化性胆管炎を中心に、自然免疫系異常と線維化を解析するために、患者病変部に浸潤する自然免疫系細胞の解析を行った。文書にて同意の得られたAIP症例25例を対象とし、アルコール性慢性膵炎20例、特発性慢性膵炎20例、健常人20名の患者末梢血を採取し、自然免疫系細胞について、主に活性化好塩基球、自然リンパ球(innate lymphoid cells)、Mucosal-associated invariant T cell (MAIT細胞)、樹状細胞、単球、M2マクロファージをサイトカインプロファイルとともにフローサイトメトリーを用いて解析した。その結果、切除標本の病変局所ではTLR-7陽性のM2マクロファージと好塩基球が優位に浸潤しており、線維化、Th2免疫反応に関与している可能性が示された。末梢血のフローサイトメトリー解析ではILT-2+/ILT-3+Mo、MAIT細胞(CD3+CD8+TCRVα7.2+CD161+IL18R+IL12R+)や自然リンパ球ICL-1, 2, 3細胞(leanage-CD125+CRTH2+)の優位な増加を認めた。さらにM2マクロファージの上流に位置するとされる好塩基球が存在し、TLR2もしくはTLR4シグナルを介して反応していることが明らかになった。また、Tregの関与する抗原特異的胸腺摘出自己免疫性膵炎マウス、自然免疫系の関与する自己免疫性膵炎マウス、疾患関連抗原特異的IgE-CAIマウスの作成を行い、疾患に類似の炎症所見を膵、胆管、唾液腺などにみとめ、末梢血、病理学的な検討を行っている。本研究ではIgG4関連疾患の胆膵病変である自己免疫性膵炎(AIP)とIgG4-関連硬化性胆管炎を中心に、自然免疫系異常と線維化を解析するために、患者病変部に浸潤する自然免疫系細胞の解析を目的に、現在、本症患者末梢血における自然免疫系細胞について、主に活性化好塩基球、自然リンパ球(innate lymphoid cells)、Mucosal-associated invariant T cell (MAIT細胞)、樹状細胞、単球、M2マクロファージをサイトカインプロファイルとともにフローサイトメトリーを用いて解析している。特に従来組織中には浸潤しないとされていた好塩基球の膵組織への浸潤を確認している。さらにアレルギーモデルマウス(TNP-IgEマウス)を用いた動物モデルを作成中であり、患者末梢血と組織のデータを基に好塩基球やM2マクロファージを中心とした自然免疫系細胞の動態について免疫染色法、フローサイトメトリーを用いて検討しており、おおむね順調に進展している。アレルギーモデルマウス(TNP-IgEマウス)を用いた動物モデルの作成を完成させ、好塩基球とその後のマクロファージの活性化による慢性アレルギー反応が病初期の病態形成に重要であること、また線維化については、切除標本と動物モデルにおいて線維化に関与する線維芽細胞、膵星細胞を細胞のsmad2/3リン酸化抗体を用いて免疫組織化学法により検討する予定である。検討しえた切除例ではsmad2/3Lのリン酸化が亢進していることが確認できており、さらに検討症例を増やし検討する予定である。今後は、さらに症例を集積し、臨床例とマウスモデルの解析を通してIgG4関連疾患における自然免疫反応の役割を解明する予定である。またmad2/3リン酸化を介するTGFβシグナル伝達系と繊維化の解析から繊維化の機序についても検討を開始しており、線維化における意義を明らかにする方針である。文書にて同意の得られたAIP症例20例を対象とし、アルコール性慢性膵炎20例、特発性慢性膵炎20例、健常人20名の患者末梢血を採取し、自然免疫系細胞について、主に活性化好塩基球、自然リンパ球(innate lymphoid cells)、Mucosal-associated invariant T cell (MAIT細胞)、樹状細胞、単球、M2マクロファージをサイトカインプロファイルとともにフローサイトメトリーを用いて解析した。

本研究ではIgG4関連疾患の胆膵病変である自己免疫性膵炎(AIP)とIgG4-関連硬化性胆管炎を中心に、自然免疫系異常と線維化を解析するために、患者病変部に浸潤する自然免疫系細胞の解析を目的に、現在、本症患者末梢血における自然免疫系細胞について、主に活性化好塩基球、自然リンパ球(innate lymphoid cells)、Mucosal-associated invariant T cell (MAIT細胞)、樹状細胞、単球、M2マクロファージをサイトカインプロファイルとともにフローサイトメトリーを用いて解析中であること、また、現在アレルギーモデルマウス(TNP-IgEマウス)を用いた動物モデルを作成中であり、研究全体としてはおおむね順調に進展している。本研究ではIgG4関連疾患の胆膵病変である自己免疫性膵炎(AIP)とIgG4-関連硬化性胆管炎を中心に、自然免疫系異常と線維化を解析するために、患者病変部に浸潤する自然免疫系細胞の解析を行った。文書にて同意の得られたAIP症例25例を対象とし、アルコール性慢性膵炎20例、特発性慢性膵炎20例、健常人20名の患者末梢血を採取し、自然免疫系細胞について、主に活性化好塩基球、自然リンパ球(innate lymphoid cells)、Mucosal-associated invariant T cell (MAIT細胞)、樹状細胞、単球、M2マクロファージをサイトカインプロファイルとともにフローサイトメトリーを用いて解析した。その結果、切除標本の病変局所ではTLR-7陽性のM2マクロファージと好塩基球が優位に浸潤しており、線維化、Th2免疫反応に関与している可能性が示された。末梢血のフローサイトメトリー解析ではILT-2+/ILT-3+Mo、MAIT細胞(CD3+CD8+TCRVα7.2+CD161+IL18R+IL12R+)や自然リンパ球ICL-1, 2, 3細胞(leanage-CD125+CRTH2+)の優位な増加を認めた。さらにM2マクロファージの上流に位置するとされる好塩基球が存在し、TLR2もしくはTLR4シグナルを介して反応していることが明らかになった。また、Tregの関与する抗原特異的胸腺摘出自己免疫性膵炎マウス、自然免疫系の関与する自己免疫性膵炎マウス、疾患関連抗原特異的IgE-CAIマウスの作成を行い、疾患に類似の炎症所見を膵、胆管、唾液腺などにみとめ、末梢血、病理学的な検討を行っている。本研究ではIgG4関連疾患の胆膵病変である自己免疫性膵炎(AIP)とIgG4-関連硬化性胆管炎を中心に、自然免疫系異常と線維化を解析するために、患者病変部に浸潤する自然免疫系細胞の解析を目的に、現在、本症患者末梢血における自然免疫系細胞について、主に活性化好塩基球、自然リンパ球(innate lymphoid cells)、Mucosal-associated invariant T cell (MAIT細胞)、樹状細胞、単球、M2マクロファージをサイトカインプロファイルとともにフローサイトメトリーを用いて解析している。特に従来組織中には浸潤しないとされていた好塩基球の膵組織への浸潤を確認している。
微小磁場環境下における細胞酸化ストレス抑制と細胞骨格縮小のメカニズム解明

昨年度の研究で、微弱磁場環境下に置かれた株化マクロファージRAW264におけるミトコンドリア膜電位が通常の地磁気環境下に置かれた場合に比べて低下することを明らかにした。地磁気環境下でミトコンドリア膜電位はミトコンドリア内膜を挟んだプロトン濃度差により生じるが、濃度差形成に伴う副産物として、酸化ストレス源であるスーパーオキシドアニオン(O2-)がミトコンドリア内に生成する。マクロファージは通常の培養条件下では地磁気環境中にあるが、その際にも一定レベルのO2-が生じている。このことから、微弱磁場に曝露されたマクロファージ中ではミトコンドリア膜電位形成の副産物であるO2-の産生も低下することが予想される。そこで地磁気環境と微弱磁場環境におけるマクロファージのO2-産生を比較した。地磁気環境と微弱磁場環境を実現するため、細胞培養用の炭酸ガスインキュベーターを磁場シールドケースに収めた。この状態ではインキュベーター内部の磁場は数マイクロテスラまで低下する。インキュベーター内には2台のメリットコイルを設置し、一方のコイルを形成する2本の電線に同方向にDC電流を流し、鉛直下向きに直流磁場を発生させ地磁気の代わりとした。もう一方のコイル(微弱磁場用)には2本の電線に逆向きに同じ大きさのDC電流を流して磁場をキャンセルさせ、ジュール熱だけが磁場発生用コイルと等しくなるようにした。この状態でコイル内にマクロファージを培養したシャーレを置き、24時間、摂氏37度で培養した。その後マクロファージ中のO2-を指示薬ニトロTBを用いて測定した。3回の独立な実験を行った結果、地磁気環境に置かれた細胞と微弱磁場環境に置かれた細胞の間でO2-産生量に差はなかった。従って最初に予想した、微弱磁場中でマクロファージのO2-産生が低下するという予想は支持されなかった。研究実績概要に述べたように、我々が昨年度得た結果から導いた作業仮説「微弱磁場環境下においてマクロファージのミトコンドリアO2-産生は低下する」に基づいて、一細胞あたりのO2-(O2-指示薬発色量を発色にかかわる全細胞数で除した値)を見積もった。しかし上述のように、微弱磁場中でO2-産生低下は見られなかった。従って、予想された低下が測定データのばらつきに隠蔽されてしまったという可能性が完全には否定できていない。すなわち一細胞あたりのO2-産生量を求めるためには上述のようにO2-の指示薬発色量と測定されている全細胞数が必要である。データの相対変動係数(測定の標準偏差を平均値で除した量)を、発色量の測定値から得られるものと細胞数測定値から得られるものの間で比較すると前者が大きい、つまりよりばらついている。このばらつきが一細胞あたりのO2-産生量のばらつきとなって現れ、予想された差が隠蔽されてしまった可能性が完全には否定されていない。細胞を用いた実験ではデータのばらつきが大きくなる傾向があり、本研究でも当初からそれを予想して独立な実験を繰り返し、また実験手順を一つ一つ見直して誤差の原因を除去する努力を行った。これらが研究進捗が当初予定より遅れる原因となった。しかし、ミトコンドリアで産生されたO2-がそののち代謝されることによる減少などに起因するばらつきは考慮しておらず、解決すべき課題として浮かび上がってきている。今後は作業仮説の当否を確定するため、O2-産生量を測定する際の測定値のばらつきを小さくすることに注力する。すなわち、(1)O2-産生測定の指示薬をMitoSoxRed(ミトコンドリア内に取り込まれてO2-と反応して蛍光性となる性質を持つ)に切り替える。そのメリットはO2-が発生する場所で測定するということであり、産生されたO2-が細胞内で代謝にされて消失してしまう前に捕まえるということである;代謝による消失も確率的に起こると考えられ、測定という点から見れば誤差の原因となるのでこの点の改善が見込める。(2)細胞数についても細胞核を染色する蛍光色素HOECHST33258を用いた測定を行って見積もる。この方法では測定対象となる細胞数は、直接計数法(一定体積内の細胞数をカウンターで計数する)が対象とする細胞数(オーダー100)よりもはるかに多数(オーダー10000)であるため誤差は10分の一程度となることが期待される。これらを組み合わせてO2-産生に対する微弱磁場影響の有無を再検討し、作業仮説の評価確定を目指す。地磁気(GMF)が減弱して生じる磁場を微小磁場(Hypo-Magnetic Field;HMF)と呼ぶ。減弱の原因としては建造物の鉄筋による磁場吸収がある。HMFが細胞生理に影響することを示す研究はここ10年くらいで徐々に増加しており、またHMF中ではすべての磁気モーメントの歳差運動が抑制されるため、生体中の化学反応ネットワークに対してHMFは広く影響するという理論的研究の結果も示されている。私はこれまでに強度0.5ミリテスラの50ヘルツ磁場がDNA鎖切断確率を上昇させること、熱ショック蛋白質やスーパーオキシドアニオン産生を増加させること、ミトコンドリア膜電位を低下させることなどを示してきた。しかし実験は、50ヘルツ磁場に加えて50マイクロテスラGMFが背景磁場として存在する条件で行わざるを得ず、50ヘルツ磁場を(ヒトへの影響が現れるとされている)

1マイクロテスラ程度まで弱める実験はできなかった。私は、HMFが細胞生理学的な影響を与えるという先行研究の結果に着目し、もし研究室においてHMFが実現できれば、1マイクロテスラ程度まで弱めた50ヘルツ磁場の細胞生理学的指標への影響を解明できるのではないかと考えた。そこでまず、実験室におけるHMF条件を確立し、次にHMF中で免疫細胞であるマクロファージを対象として微弱磁場が与える影響を検討する実験を計画した。以前使用していた細胞培養用のCO2恒温器をミューメタルで作った磁場シールドケースに格納し、その内部でメリットコイルを用いてGMFと同程度の強さの磁場を発生させ、マクロファージを培養した。GMF状態の細胞とHMF状態(2マイクロテスラ)の細胞に対する比較測定を行った。実験の結果これまでに、HMF中ではGMF中に比べて、総細胞数が有意に減少し、またミトコンドリア膜電位が有意に低下することを見出している。当初計画では29年度中に(1)実験装置立ち上げ(2)HMF中での細胞骨格と細胞接着の評価(3)HMF中での細胞増殖評価を行うこととなっていた。これらのうち(1)については達成している。(2)については、測定、解析の容易さならびにデータ取得に際して以前の経験が生かせるかどうかを総合的に考慮した結果、計画を変更して当初平成30年度以降に行う予定だったミトコンドリアに対するHMF影響の評価を先行させることとした。その場合に用いる評価の指標としてはミトコンドリア膜電位並びにミトコンドリアにおけるスーパーオキシドアニオン産生があり、当初計画ではミトコンドリアにおけるスーパーオキシドアニオン産生測定を先行させる予定だった。しかし、上述のように、以前の研究で実績のあったミトコンドリア膜電位測定を測定する方が予備実験を兼ねることもできると考え、これを先に行うこととした。その結果ミトコンドリア膜電位がHMF条件下で減少することが認められたため、さらにミトコンドリアにおけるスーパーオキシドアニオン産生に対するHMF影響も引き続き測定することにしている。細胞に対する磁場影響は一般に弱いため、実験は独立に3回ずつ行うなど、結果を確実にしつつ進まねばならない。またスーパーオキシドアニオンが細胞骨格制御にかかわっていることは先行研究で示されているため先にスーパーオキシドアニオンに対するHMF評価を行って結果を確立することは研究を進めるうえで望ましいと思われる。従って計画の進捗はやや遅れているものの、方針を変更したことには意味があったと考えている。(3)については細胞数測定を行った結果HMF中で減少することまで示した。ただし細胞数減少だけでは増殖が抑制された結果なのか、接着の減弱によるはがれの結果なのかは判断できないので目標の途中までの達成ということになる。昨年度の研究で、微弱磁場環境下に置かれた株化マクロファージRAW264におけるミトコンドリア膜電位が通常の地磁気環境下に置かれた場合に比べて低下することを明らかにした。地磁気環境下でミトコンドリア膜電位はミトコンドリア内膜を挟んだプロトン濃度差により生じるが、濃度差形成に伴う副産物として、酸化ストレス源であるスーパーオキシドアニオン(O2-)がミトコンドリア内に生成する。マクロファージは通常の培養条件下では地磁気環境中にあるが、その際にも一定レベルのO2-が生じている。
ナノ・マイクロ立体加工技術の開発と次世代マイクロアクチュエータへの展開

本研究は,リソグラフィ,金型作製,成形を一連とするLIGAプロセスを基盤としたマイクロ・ナノ立体加工技術の開発と,次世代マイクロアクチュエータへの展開を行うものである.従来のリソグラフィ技術では加工深さ方向に垂直となる2.5次元的な構造体しか得られていなかった.しかし,このトータルLIGAプロセスによる加工技術は,機械加工等では達成できない微細領域の加工を可能とする手法であり,超微細立体加工技術のブレイクスルーを生み出す要素技術である.これまでに,3次元X線リソグラフィ技術,平坦性が良く応力の小さなマイクロ金型,ロールホットエンボス技術による微細パターンの量産化技術の開発を進め,精密で高精度な成形品を量産できる技術開発を進めてきた.さらに,X線リソグラフィにおける露光ステージを多軸化することで円筒形状表面に3次元構造を加工する技術を開発し,微細細線となるマイクロコイルの作製へ展開してきた.構造の複雑さ故に小型化に伴い得られる出力が低下する問題を有するマイクロコイルであるが,微細高アスペクト比の細線構造としたマイクロコイルを利用することを提案し,電磁型マイクロアクチュエータのブレイクスルーを目指して研究に取り組んだ.その結果,X線リソグラフィ技術により微細細線の深溝加工を行い,銅めっきにてコイルラインを形成して,コイルを完成させることが出来た.作製したコイルラインのアスペクト比を向上させるとマイクロコイルの性能は飛躍的に向上することも実証した.今後は更なるプロセス技術開発を進めることでマイクロアクチュエータの新たな展開を行う.本研究は,リソグラフィ,金型作製,成形を一連とするLIGAプロセスを基盤としたマイクロ・ナノ立体加工技術の開発と,次世代マイクロアクチュエータへの展開を行うものである.従来のリソグラフィ技術では加工深さ方向に垂直となる2.5次元的な構造体しか得られていなかった.しかし,このトータルLIGAプロセスによる加工技術は,機械加工等では達成できない微細領域の加工を可能とする手法であり,超微細立体加工技術のブレイクスルーを生み出す要素技術である.これまでに,3次元X線リソグラフィ技術,平坦性が良く応力の小さなマイクロ金型,ロールホットエンボス技術による微細パターンの量産化技術の開発を進め,精密で高精度な成形品を量産できる技術開発を進めてきた.さらに,X線リソグラフィにおける露光ステージを多軸化することで円筒形状表面に3次元構造を加工する技術を開発し,微細細線となるマイクロコイルの作製へ展開してきた.構造の複雑さ故に小型化に伴い得られる出力が低下する問題を有するマイクロコイルであるが,微細高アスペクト比の細線構造としたマイクロコイルを利用することを提案し,電磁型マイクロアクチュエータのブレイクスルーを目指して研究に取り組んだ.その結果,X線リソグラフィ技術により微細細線の深溝加工を行い,銅めっきにてコイルラインを形成して,コイルを完成させることが出来た.作製したコイルラインのアスペクト比を向上させるとマイクロコイルの性能は飛躍的に向上することも実証した.今後は更なるプロセス技術開発を進めることでマイクロアクチュエータの新たな展開を行う.本研究では、兵庫県立大学高度産業科学技術研究所がすでに確立している3DLIGAプロセスとメタライズ技術をマイクロアクチュエータの作製に応用すべく、作製プロセス上の問題点を洗い出し、更なる高精度化を図った。マイクロアクチュエータへの適用を見据えて現在の研究開発動向を調査した。その結果、電磁型マイクロアクチュエータの開発を目指す事とした。立体マイクロコイル作製のために開発した3DLIGAプロセスを工程毎に問題提起を行い、条件の最適化、プロセスの再構築を行った。(1)立体形状を持つ母材を塗布するディップング装置を新規に設計し、チャッキング部分の作製に取り掛かった。(2)3DX線リソグラフィでは、X線マスクのアライメント機能を飛躍的に充実させ、ラインアンドスペースパターン転写による議事螺旋構造体の作製から、ドットラインパターンの転写による新生螺旋構造体の作製を目指す。本年度はこの中核技術となるX線マスクのアライメント機能を新規開発中である。(3)ナノ単位で工作機械を制御しうる超精密加工機の新たな用途の確立と可能性を模索すべく、超精密5軸加工機を用いた切削加工技術を応用した立体コイルマスターを試作中である。(4)電鋳による微細構造金型を作製するにあたり、有限要素方による電流密度分布解析を行い、陰極電柱密度分布の均一化を図った。実際の実験結果との相関が取れ、電流密度分布の均一化が図れることがわかり、また、電析膜の平面度も向上できた。本研究では,本学高度産業科学技術研究所がすでに確立している三次元LIGAプロセスとメタライズ技術をマイクロアクチュエータの作製に応用すべく研究を進めている.前年度の研究開発動向調査の結果を受け,マイクロアクチュエータの駆動方法に電磁型を採用して,キーデバイスとなる円筒マイクロコイル作製のプロセス開発を行った.三次元X線リソグラフィ技術を駆使して立体円筒形状に疑似螺旋構造体を作製することによりコイルを作製した.X線リソグラフィにおけるアライメント機構を飛躍的に向上させることで,立体形状にも10μmラインアンドスペースの微細な細線を形成することが出来,アスペクト比が約5となるコイルラインの作製に成功した.

電流路となる疑似螺旋構造体の高アスペクト比加工が実現すると,同一サイズにおいて電磁型アクチュエータの出力を飛躍的に大きくすることが可能となる.現在作製した疑似螺旋構造体にコイルラインとなる銅をめっきするプロセスを開発中であり,円筒コイルの完成となる.一方で作製した電磁型アクチュエータを評価する装置を開発した.電磁型アクチュエータのコイル部分を交換するだけで測定が可能であり,様々なアスペクト比を有するコイルラインに対応させた.これにより,実際に高アスペクト比加工の優位性を検証できるようにした.アクチュエータの作製プロセスにおける条件の最適化を行いながら,マイクロ・ナノ立体加工トータルプロセスの観点から,プロセスフローの完成を目指す.本研究では,微細な三次元LIGAプロセス,メタライズ技術による精密金型の作製,精密成形までのトータルプロセスの技術開発を進め,これまで実現し得なかった微細形状を有するマイクロアクチュエータヘ展開するものである.立体形状の精密加工には,構造体表面に均一にレジスト材を塗布することが重要である.そこで,ディッピング法を改良し,円筒形状表面に約50μmの均一膜厚を塗布することに成功した.レジスト膜厚を厚くすることが可能となり,螺旋構造となる微細線幅10μmのコイルラインを形成したときに,アスペクト比を5以上にて作製することができた.これにより,微細でかつ高アスペクト比を有する円筒形状コイルラインが作製できるようになった.次に,この微細線幅に銅をめっきにて埋める技術開発を進めた.線幅10μmという狭所にめっきを施す技術は難しい.しかし,本研究ではめっき液をマイクロメートルオーグーの狭所に循環させる工夫を加えることで狭所めっきを実現可能な技術を開発した.狭所めっきができるようになったので,コイルラインからあふれた銅めっき過剰の凸部の除去を行えばコイルラインが完成し,コイルおよびアクチュエータとして評価可能となる.高アスペクト比であれば同一サイズにおいて電磁型アクチュエータの出力は飛躍的に増大することがこれまでの研究で明らかとなっており,本研究で提案している高アスペクト比加工マイクロコイルの優位性の検証を急ぐ.アクチュエータの作製プロセスにおける条件の最適化を進めながら,マイクロ・ナノ立体加工におけるトータルプロセスの観点から,ブレークスルーを生み出す製造技術,およびアクチュエータの作製を目指す.本研究では,微細な三次元X線リングラフィ技術,メタライズ技術による精密金型の作製,精密成形までのトータルLIGAプロセスの技術開発を進め,これまで実現し得なかった微細形状を有するマイクロコイルを作製し,マイクロアクチュエータへ展開するものである.円筒形状表面のような三次元形状に対してX線リングラフィを可能とし,微細線幅を有する螺旋構造を作製する技術を確立した.作製したレジスト微細線幅間に銅をめっきにて形成する技術開発を進め,マイクロコイルの導電路となる銅をめっきにて作製できるようになった.30μmの微細線幅に対してアスペクト比は2を超える銅をめっきにて形成することができた.さらに,本年度はコイルラインからあふれた銅めっき過剰の凸部の均一エッチング技術を新たに開発し,本研究で提案するマイクロコイルを完成させることに成功した.一方で,電磁型アクチュエータの吸引力評価装置を作製し,シミュレーションと作製したマイクロコイルの実測評価を行った.
がん発症においてNK細胞の免疫監視機構は重要な役割を果たすのか?

NK細胞は抗原の感作なしに腫瘍細胞やウイルス感染細胞を殺傷することのできるリンパ球集団で、免疫監視機能に重要な役割を果たしていると考えられている。私たちはresidentNK活性を欠損するNK変異マウスを用いて、種々の免疫不全マウスとがん高発系マウスを交配することによって、がん発症におけるNK細胞の関与を解析するモデルマウス系の樹立を試みた。その過程で、マウスNK細胞上に未知のNKレセプターが存在する可能性を示唆する結果を得、新規NKレセプターの検索を開始した。近年NK細胞の標的認識に関わる分子群の同定が進んでいるが、その詳細はまだ明らかではない。本研究では、NK細胞の標的認識に関与するレセプター群の同定を目的として研究を行った結果、マウスCD94に対する新規モノクローナル抗体の樹立および新規Ly-49遺伝子のクローニングに成功した。(1)マウスCD94の発現と機能解析:NKおよびNKT細胞に特異的に反応し、NK細胞の細胞傷害活性を修飾する抗体Yuri3を樹立し、性状解析を行った。その結果、Yuri3抗体がマウスCD94を認識することが明らかになった。CD94は、NK、NKT細胞および一部のCD8陽性T細胞に発現し、成熟NK細胞はCD94強陽性細胞とCD94弱陽性細胞の2集団に分類された。Yuri3抗体存在下では、syngeneicおよびallogeneic由来の標的細胞いずれに対してもNK細胞の細胞傷害活性を増強した。このことから、複合体を形成するNKG2の種類によって、CD94は活性化シグナルと抑制性シグナルのいずれもが伝達される可能性が示唆され、現在シグナル伝達経路の解析も進めている。(2)新規Ly-49の遺伝子クローニングとその性状解析:Ly-49ファミリーに属する新規メンバーを同定し、Ly-49Qと命名した。Ly-49Qは細胞内領域にITIMモチーフを有することから、抑制性レセプターとして機能することが示唆された。半定量的PCR解析の結果、Ly-49QのmRNAは出生までに次第に減少し、成熟NK細胞においてはその発現量は極めて少なくなる。これは、生後に発現が始まる既知のLy-49分子とは異なるユニークな動態である。このことから、Ly-49Qは胎児肝臓内でのNK細胞の分化あるいは妊娠期間中の母子相互作用に何らかの役割を果たしている可能性が考えられる。現在その機能解析のために、特異的モノクローナル抗体の作成、認識分子の同定を進めている。
細胞質ダイニンのアイドリング複合体の構造解析と活性化メカニズムの解明

我々は細胞質ダイニンの制御機構の解明に取り組んできた。細胞質ダイニンは微小管上を双方向に走るがプラス端に向って走るメカニズムは不明であった。我々は滑脳症の原因遺伝子・LIS1が細胞質ダイニンを微小管上に固定し、微小管-LIS-細胞質ダイニンの複合体を形成し、キネシン依存的に運搬することを明らかにした。さらにアスペルギルスにおけるNud遺伝子群のNudCがキネシンのアダプタータンパク質として機能していることを明らかにした。このことからLIS1が変異を起こすと細胞質ダイニンの順行性の運搬が障害され、細胞内における細胞質ダイニンの局在が中心体に偏った分布を示し、細胞の末梢部分で枯渇することが分かった。このことがLIS1の変異に伴う神経細胞の遊走異常、また細胞分裂における紡錘体形成や染色体分配の異常につながることが分かってきた。また、NudCの変異は細胞質ダイニンの順行性の運搬のみならず、他のオルガネラの運搬も障害されることから、NudCはキネシンの一般的なアダプタータンパク質として機能していることが示唆された。さらに、細胞質ダイニンはLIS1により微小管上にアイドリング状態になるが、低分子量G蛋白質のRabファミリーのタンパク質によって活性化されることが示唆された。さらに電子顕微鏡を用いた構造解析から、LIS1は細胞質ダイニンの頭部に結合し、ダイニン分子のスライドを制限することで細胞質ダイニンの微小管上の移動を制限することを証明した。細胞質ダイニンの微小管上におけるLIS1との複合体の構造を明らかにし、さらに低分子量G蛋白質のRabファミリーによる細胞質ダイニンの活性化の証明に成功した。細胞質ダイニンの不活化のメカニズムさらには低分子量G蛋白質の活性化・不活化に制御する分子機構の解明に取り組む。我々は滑脳症の原因遺伝子・LIS1が細胞質ダイニンを微小管上に固定し、微小管-LIS1-細胞質ダイニンの複合体を形成し、キネシン依存的に運搬することを明らかにした。