hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
凍結保存材料への応用を目指した生体吸収性ナノファイバーの物性解析と生体適合性評価

本研究は,細胞凍結保存用の培養足場材料への応用を見据え,ポリ(3-(R)-ヒドロキシ酪酸-3-(R)-ヒドロキシヘキサン酸)(PHBH)ナノファイバーの高分子物性と生体適合性に関して,以下の項目の研究をすすめている。前年度までに高分子構造の解析と,生分解性に関するデータ取得をおこなった。本年度はその解析と,次のステップである凍結可能な細胞足場材料の性能評価に関する検討をおこなった。(1) PHBHナノファイバーの生分解性・生体吸収性・炎症性の評価について,前年度に引き続き,生体環境下での長期試験に相当する加速試験により分解性・炎症性について検討をおこなった。得られたデータをこれまでのWAXD,DSC,GPC測定により得られた高分子構造に関する知見と統合し,ポリマーの分解挙動に関するメカニズムを提案した。(2) PHBHナノファイバー上での細胞の接着特性の解析について免疫組織学的な検討をすすめた。これによりナノファイバーシートの前処理に応じて細胞の接着挙動が異なることを見出した。(3) PHBHナノファイバーを利用した凍結可能な細胞足場材料について,3T3細胞を用いた凍結・融解後の生存率評価の解析より,凍結保存足場材料としての性能評価をおこなった。PSナノファイバーと比較し,ポリマーのガラス転移温度が足場材料としての性能に影響している可能性を見出した。また3次元的な足場材料の設計をおこなった。当初予定していた計画の通り,研究を遂行している。細胞の凍結保存基材としての有用性を他の汎用ポリマーと比較により示した。さらに詳しく解析を進めることでPHBHナノファイバーを用いた細胞培養基材の実現も可能となると考えられる。凍結保存材料の設計に重点を置き,当初予定していた通り,高密度細胞保存技術の展開にすすめていく。また他のポリマーとの比較によりポリマー物性が細胞生存率に影響するメカニズムについても,生体と細胞の界面での接着性などに着目しながら検討をすすめる。(1) PHBHナノファイバーの結晶構造と熱的性質について,ポリ-L-乳酸(PLLA)を比較対照としてすすめ,電子顕微鏡(SEM, TEM),X線回折(WAXD),熱分析(DSC)をおこない,以降の評価に必要なPHBHナノファイバーの高分子構造・物性に関する基礎情報を得た。これによるとナノファイバーとフィルム状に成形した場合では高分子の結晶構造に顕著な差がないと考えられた。一方でPLLAは両者に大きな違いが見られ,エレクトロスピニング法がもたらす高分子構造の影響が大きいことが示された。(2) PHBHナノファイバーの生分解性・生体吸収性・炎症性について,ラットへの6ヶ月間の埋込試験を実施し,中・長期の生体中での挙動(分解性・吸収性・炎症性)を,GPC,WAXD,DSC,免疫染色により,分子量分布、結晶化度、炎症性について評価した。この結果から,生体中ではPHBHでは生体中で高分子主鎖がランダムに開裂していくという分解様式に関する知見が得られた。(3) PHBHナノファイバーを利用した凍結可能な細胞足場材料について,3T3細胞を用いた凍結・融解後の生存率評価の解析より,これまでに当研究室が検討してきたPUナノファイバーと同様に凍結保存足場材料として利用できることを見出した。その結果,PHBHの物性解析により,ナノファイバー化することで構造化が進行するとの期待とは逆の結果が得られつつある。PLLAとの比較により,この点を切り口として,さらに詳しく解析を進めることでPHBHの特徴をさらに明らかにできるのではないかと期待している。物性解析については,PLLAとの比較という点に着目してさらに詳細に解析をすすめる。

生体での分解性についてはメカニズムに関して,予定していた解析を完了した。今後は,生体と細胞の界面での接着性などを詳しく調べていく。また,凍結保存材料の検討に重点を置き,当初予定していた通り,高密度細胞保存技術の展開に進めていく。凍結保存材料の設計に重点を置き,当初予定していた通り,高密度細胞保存技術の展開にすすめていく。また他のポリマーとの比較によりポリマー物性が細胞生存率に影響するメカニズムについても,生体と細胞の界面での接着性などに着目しながら検討をすすめる。
糖転移酵素の阻害剤を指向した糖ヌクレオチド類似体の設計と合成

近年、複合糖鎖の構造やその生物学的機能が急速に解明され、生物学的現象における糖鎖の役割が注目されるようになってきた。その一方で、さらに詳細な糖鎖機能解明のツールとして、また、糖鎖の構造異常が原因となる疾病の治療薬として、これら糖鎖を生合成する酵素に対する選択的阻害剤の開発も盛んになってきた。糖鎖は、糖転移酵素による糖鎖の伸長と一旦でき上がったオリゴ糖鎖のグリコシダーゼによる加水分解から成る経路で生合成される。グリコシダーゼに対する阻害剤についてはオセタミビルのように医薬品として利用されているものまで存在する。しかし、糖転移酵素に対する阻害剤については、100種以上の糖転移酵素がクローニングされている現在でも実用的な阻害剤は開発されておらず、最近になって漸く阻害活性の強いものが開発されてきたと言える。そこで、私たちは、今回、さらに実用的な糖転移酵素に対する阻害剤の開発を目指し、糖転移酵素が糖供与体基質として利用する糖ヌクレオチド類似体の効率良い合成法を確立することを目標とし、研究を開始した。特に、糖ヌクレオチド類似体としては、nikkomycinを始めとするペプチド性糖ヌクレオチドが既に医薬品・農薬として実用化されていることから、ペプチド性糖ヌクレオチドの1つであるpolyoxin類を標的分子として選んだ。また、本研究を、特定の糖転移酵素に対して高い選択性も持つ「二基質阻害剤」への開発へと展開するために、糖転移酵素が受容体基質として利用するオリゴ糖鎖の新合成法も開発することとした。その結果、著者らが開発したL-スレオニンアルドラーゼを利用した酵素的アルドール縮合を鍵反応とし、polyoxin Cの短工程(形式)合成に成功した。さらに、著者らの研究室で開発している無臭チオールを用いて、癌転移に関与しているN-アセチルグルコサミン転移酵素の受容体三糖の合成にも成功した。近年、糖転移酵素の異常な活性発現が癌や自己免疫疾患などの疾病に関与していることが明らかにされ、糖転移酵素に対する阻害剤が新規医薬品のリード化合物として期待されている。そこで今回、著者らは、Streptmyces属の放線菌が生産する抗生物質として知られているnikkomycinがN-アセチルグルコサミン転移酵素を阻害することに注目し、nikkomycinと同様な「糖ヌクレオチドのペプチド性類似体」が糖転移酵素の優れた阻害剤となり得ると考え、UDP-GlcNAcおよびGDP-Fucのペプチド性類似体をそれぞれN-アセチルグルコサミン転移酵素およびフコース転移酵素の阻害剤として合成する計画を立てた。まず,ウラシル(U)およびグアニン(G)を塩基存在下、1,1-diethoxy-2-bromoethaneでアルキル化し,得られた生成物をそれぞれ酸加水分解し、アルデヒド体へと誘導した後、Candida humicola(AKU4586)由来のL-スレオニンアルドラーゼの触媒反応でグリシンと縮合させてウラシル(U)またはグアニン(G)をγ-位に有するβ-ヒドロキシ-α-L-アミノ酸を大量に調製した。一方,D-GlcNAcおよびL-フコースの誘導体をグリコシルドナーとしてFmoc-アスパラギン酸エステルのγ-カルボキシル基をグリコシル化し、グリコシル化アスパラギン酸を合成した。最後に得られたグリコシル化アスパラギン酸のα-カルボキシル基と上述したβ-ヒドロキシ-α-L-アミノ酸とをDCC/NMM/HOBtで縮合させ、標的分子の保護体を得ることに成功している。現在、保護基の脱保護および、標的分子の糖転移酵素に対する阻害活性の測定準備を進めている。

近年、糖転移酵素の異常な活性発現が癌や自己免疫疾患などの疾病に関与していることが明らかにされ、糖転移酵素に対する阻害剤が新規医薬品のリード化合物として期待されている。糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖供与体基質として利用し、オリゴ糖鎖に糖を転移して糖鎖を伸長する反応を触媒する。それゆえ、糖転移酵素の阻害剤開発においては、糖ヌクレオチドの類似体を合成することが必要不可欠である。一方、微生物が生産する抗生物質にもnikkomycinやpolyoxin類など糖ヌクレオチドのペプチド性類似体と呼べるものが多く存在する。そこで私たちは、今年度、thymine polyoxin C(1)の効率良い合成法を検討した。1はβ-ヒドロキシ-α-L-アミノ酸を部分構造として持っていることから、私たちが開発したL-スレオニンアルドラーゼを用いて、水溶液中、温和な条件下で合成できると予想し、合成スキームを考えた。実際には、D-リボースから3工程で調製できる(2S,3S)-2,3-O-isopropyriden-4-penten-1-alとグリシンとをL-スレオニンアルドラーゼの触媒する反応で縮合させ、得られるβ-ヒドロキシ-α-L-アミノ酸のアミノ基とカルボキシルをそれぞれCbz-基、メチル基で保護した。続いて、得られた保護アミノ酸の末端二重結合をオゾン酸化し、生成するアルデヒドをAmberlyst 15存在下にオルトギ酸メチルで処理し、1の合成前駆体であるmethyl(methyl 5-N-carboxybenzylamido-5-deoxy-2,3-isopropyliden-D-allo furanosid)urinate(2)の簡易合成に成功した。2から1への変換は既に報告されており、私達の手法は1の全合成を短工程、高収率(15工程、5%)で達成できることを示した。
割合概念の理解過程に関する発達的研究

本研究では、割合問題の難しさが、概念それ自体と子どものもつ既有知識に2つの要因から構成されているのではないかという仮定をして、実際にそうした要因が難しさに関連しているかどうかを検討した。このために、割合問題を以下の2つの要因の点から作成した。1つは、割合を求める基本となる公式から引き出される3つの形態(これは比の3用法と呼ばれている)である。つまり、第2、第2、第3用法の3種類である。もう1つは、割合問題を定義するために使用される意味の構造である本研究では、部分一全体、変化(これを増加型と減少型の2つにさらに区分する)、比較(これを増加型と減少型の2つにさらに区分する)、速度という5種類の意味構造を設定した。数学的構造から3つ、意味構造から6つの合計18タイプの問題が準備された。これらの問題を、小学5年、6年、中学1年、2年、大学生に与えて、問題の解決をおこなわせた。その結果、速度の問題は、5年生でも第1用法の正答率が51%で、残り2つのタイプも60%台の後半とかなりの成績を示した。これは、1つには彼らがすでにこれらの問題の教授を終わっていることによると考えられる。しかし、そうであれば、すでに割合を学習し終っている6年生でも、もっとも基本となる部分-全体のタイプでも同じような結果が得られるかといえば、かなり異なっていた。6年生の部分-全体のタイプに対する正答率は、第1が37%、第2が67%、だい3が42%と構造による正答率の差がみられた。さらに、意味的な構造についてみれば、6年生での第2用法では、変化の増加タイプでは43%、変化ま減少では23%、比較の増加では11%、比較の減少では53%と、意味的な構造による正答率の差も、きわめて大きなというきわめて興味ある結果が得られた。
都市プランナーの職能・専門性の変容と再構築に関する国際比較研究

本研究では、都市プランナーの職能・専門性の変容と再構築に関する国際比較研究を実施した。特に都市計画分野の多様化、都市計画教育の国際化等を背景として、職能・専門性の育成・評価システムが迫られている近年の変容、及び職能・専門性に対する社会ニーズの変容を明らかにした。更に、理論と実践の両立、分野横断的特質といった都市計画分野固有の内容のあり様など、欧米における都市プランナーの職能・専門性の再構築に関する議論を分析した。これに基づき、今後の日本における都市プランナーの新たな職能・専門性を支える社会システムのあり方とその確立方策の検討を行った。1)職能・専門性の育成・評価システムの発展経緯と近年の変容職能団体(学会}・資格制度・研修制度・大学教育プログラム認定システム等の職能・専門性の育成・評価システムの実態について、以下の内容につき主にイギリスを中心に(フランス、ドイツも含め)関係者へのインタビューと資料収集を実施した。1-1)職能団体の活動活動の歴史的展開、構成員の概要等、運営の変容(構成、運営、規範、綱領、ヴィジョン等の変化)1-2)資格制度の運用実態と変遷実態資格の根拠制度、大学等での履修必要期間、受験・申請資格、試験の内容等1-3)研修制度・人材支援プログラム1-4)大学教育プログラム認定システム大学教育プログラム認定システムの内容や方法の変遷2)都市プランナーの職能・専門性に対する社会ニーズの変容:以下の内容について、イギリスを中心に(フランス、ドイツも含めて)関係者へのインタビューと資料収集を実施した。都市計画・まちづくりの具体的な実務の現場において、都市プランナーの専門性・職能の関与の実態を調査する。調査対象として、a)総合計画、将来構想の策定、b)大規模なPPP開発における公民協議調整過程、c)デザインレビュー、d)個別の建築・開発審査等の手続き、などの典型的場面について、場面毎に意思決定プロセスに関与するプランナーやコンサルタント、法曹関係者などの専門家が果たしている専門的役割についてインタビュー調査を行った。本研究は、都市プランナーの職能・専門性の変容と再構築に関する日・英・米・独・仏の国際比較研究を実施することにより、特に1)職能・専門性の育成・評価システムの近年の変容、2)職能・専門性に対する社会ニーズの変容を明らかにし、3)欧米における都市プランナーの職能・専門性の再構築の方向性の分析を踏まえて、今後の日本における都市プランナーの新たな職能・専門性を支える社会システムのあり方とその確立方策の検討を行うことを目的とした。米国のプランナーは専門家としての資格制度、倫理規定、研修システムなどが確立している。更に、分野横断的かつ理論と実践の密接な連携が必要等の分野固有の特性について、大学教育現場で自覚されているとともに、職能団体でもプランナーに必要な資質のあり方について絶えず議論が行われていることが明らかとなった。日本では、各種の学会や専門家組織団体が存在しているものの、所属組織を超えた専門家共通の規範・価値を共有する仕組みが十分に確立していない。本研究では、都市プランナーの職能・専門性の変容と再構築に関する日・英・米・独・仏の国際比較研究を実施することにより、特に1)職能・専門性の育成・評価システムの近年の変容、2)職能・専門性に対する社会ニーズの変容を明らかにし、3)欧米における都市プランナーの職能・専門性の再構築の方向性の分析を踏まえて、今後の日本における都市プランナーの新たな職能・専門性を支える社会システムのあり方とその確立方策の検討を行うことを目的とする。平成24年度は、以下の内容について日米比較を中心に調査を行い、更にドイツについても補足調査を適宜実施した。1)職能・専門性の育成・評価システムの発展経緯と近年の変容:職能団体(学会)・資格制度・研修制度・大学教育プログラム認定システム等の職能・専門性の育成・評価システムの実態について調査を行った。1-1)職能団体(学会)の活動:活動の歴史的展開、構成員の概要等(人数の変遷等)、運営の変容(構成、運営、規範、綱領、ヴィジョン等の変化)について調査を行った。1-2)資格制度の運用実態と変遷実態:資格の根拠制度、大学等での履修必要期間、受験・申請資格、の内容等の変遷について調査を行った。1-3)研修制度・人材支援プログラム:研修制度、CPD(Continuing Professional Development)の実態について調査を実施した。1-4)大学教育プログラム認定システムの内容や方法について調査を実施した。2)都市プランナーの職能・専門性に対する社会ニーズの変容:都市計画・まちづくりの具体の実務現場において、都市プランナーの専門性・職能の関与の実態を調査する。場面毎に意思決定プロセスに関与する自治体職員やその他専門性を有するプランナー、建築家、コンサルタント、法曹関係者、開発業者、NPOなどの典型像を抽出し、それぞれの専門家の属性・職能を調査する。

調査対象国によって若干進捗のばらつきがあり、また海外での入手資料等の詳細な分析作業について時間が更に必要であるが、概ね研究目的を達成するために必要な資料・データについて入手・整理している。25年度が最終年度であるため、記入しない。次年度については、アメリカについて重点的に調査を実施するとともに、適宜イギリス、フランス、ドイヅについても現地の協力者を通じて補足資料・データ等を入手する。また日本の調査については当初の予定通り調査を進める予定である。次年度については、アメリカを中心に補足調査を実施するとともに、適宜イギリス、フランス、ドイツについても現地の協力者を通じて補足資料・データ等を入手する。
葉酸摂取量の調節による免疫機能制御方法の開発

制御性T細胞(Treg細胞)は、生体内において過剰な免疫応答を制御する機能を担う免疫担当細胞の一つである。Treg細胞膜上には4型葉酸受容体(FR4)が高発現していることが報告されているが、その生理的意義は不明である。生体が摂取した葉酸はTreg細胞上のFR4を介してTreg細胞機能に何らかの機能変化を及ぼすことが想定される。本研究は葉酸摂取量がTreg細胞の機能や分化に及ぼす影響とその分子レベルでの機序を解明することを目的としている。今年度の研究では、葉酸欠乏食、葉酸過剰食がTreg細胞機能、分化に及ぼす影響を評価した。葉酸を過剰に含有する飼料(1500mg/kg diet;通常飼料葉酸含量2 mg/kg diet)で飼育した場合にTreg細胞頻度が増加する傾向がみられた。また、これら過剰葉酸含有飼料で飼育したマウス由来の脾臓細胞をin vitroでCD3抗体およびCD28抗体で刺激した場合サイトカインIL-17産生量が低下していた。一方、FR4の発現量について葉酸摂取量は影響を及ぼさなかった。次に、健常マウス脾臓細胞懸濁液を調製し、in vitroで過剰量葉酸存在下、形質転換成長因子(TGF-b)にて誘導型Treg(iTreg)を誘導し、誘導されたTreg細胞頻度を評価したところ、葉酸の用量依存的にTreg細胞(Foxp3+)数が減少した。in vivo試験から葉酸摂取は、Treg細胞頻度を増加させ、IL-17産生を抑制することが考察される。一方in vitro試験ではTreg細胞が減少した。これらの結果は、葉酸過剰摂取は、胸腺で誘導される内在性Treg(nTreg)のFoxp3発現を亢進し、Treg細胞の免疫抑制能を亢進する一方、胸腺外で分化誘導されるinducible Treg(iTreg)細胞の分化に対しては葉酸が抑制的に作用する可能性が考えられた。葉酸摂取の変化が制御性T細胞分化に影響を及ぼす可能性を示す実験結果が得られている。In vivo試験でのinducible Treg(iTreg)細胞の分化に及ぼす影響についての検討(経口免疫寛容誘導試験)を実施中である。葉酸過剰、あるいは葉酸欠乏飼料で健常マウスを一定期間飼育した場合に、制御性T細胞の量的変化が生じることを明らかにした。2019年度は、葉酸過剰摂取に伴うTreg細胞の遺伝子発現、発現タンパク質の変化について包括的解析を実施する。発現量に差異があると判断した遺伝子、タンパク質について詳細な解析を行いそのメカニズムにせまる。
ガン発症におけるＲＵＮＸタンパク質の機能解析

RUNXファミリーはRUNTドメインを有する転写因子であり、ヒトではRUNX1、RUNX2、RUNX3から構成されている。RUNTドメインは特異的な塩基配列の認識やコファクターであるCBF betaとの結合に必須である。先行研究により、RUNXファミリーは個体の発生や細胞のガン化に関与することが示唆された。RUNX1は血液幹細胞の産生および血球系分化に働き、変異体は血液腫瘍に関与している。RUNX2は骨芽細胞の骨分化を制御しており、骨肉腫、大腸ガン、乳ガンなどで高発現している。RUNX3は胃ガンにおいて抑制的に働くという報告がある。申請者は、RUNX1の新規結合タンパク質としてAEBPを見出し、相互作用について検討してきた。本研究ではガン発症に深く関連するDNA損傷後のゲノムの恒常性の維持におけるRUNX-AEBP複合体の役割を明らかにする。申請者は、RUNX1とAEBPとの分子間結合および相互作用に関する論文の投稿準備中であり、追加実験や論文の執筆を行った。また、今年度は新たにヒトRUNX2およびRUNX3のクローニングを行って、AEBPとの分子間結合を確認すると共に、ヒトの腫瘍由来の培養細胞株を用いて過剰発現、あるいは発現抑制の実験系を立ち上げた。更に、機能解析を行ったところ興味深い相互作用が見出されたため、現在、発現量の制御や細胞増殖、細胞応答などへの影響について検討中である。申請者は、RUNX1の新規結合タンパク質としてAEBPを見出し、機能的な相互作用について検討してきた。ヒトの血球系培養細胞などを用いて、ウエスタンブロッティング、細胞免疫染色、フローサイトメトリー法により実験を行ったところ、AEBPの活性や下流遺伝子の発現制御、細胞応答などに影響があるという重要な結果を得た。また、MDS、FPD/AML、CMLなどの血液腫瘍患者において検出されたRUNX1変異体(RUNTドメイン内のミスセンス変異)とAEBPとの結合活性について検討したところ、野生型に対して有意な差が見られた。更に、これらのRUNX1変異体の過剰発現およびAEBPの発現抑制を行い、タンパク質の安定性や活性に対する相互作用について検討した。現在、論文の投稿準備中である。なお、ヒトRUNXファミリーにおいてRUNTドメインのアミノ酸配列は90%以上と高いホモロジーを示している。そこで、AEBPはヒトRUNX2およびRUNX3とも結合し、機能的相互作用を及ぼす可能性を考えた。まず、ヒトRUNX2およびRUNX3の発現ベクターを作製し、293T細胞の内在性AEBPとの結合活性について確認した。次に、ヒトの腫瘍由来の培養細胞株におけるRUNX2あるいはRUNX3タンパク質の発現についてウエスタンブロッティング法を用いて検討した。このうち、内在性RUNX2が高発現している細胞株を用いてRUNX2あるいはAEBPの発現抑制を行い、タンパク質の安定性への影響について調べた。また、RUNX2を安定的に過剰発現する細胞株を作成し、AEBPの活性および細胞応答について検討を行った。RUNX1とAEBPとの結合および相互作用に関する論文を学術雑誌に投稿し、早期の発表を目指す。また、転写因子RUNX2に注目し、新規結合タンパク質AEBPとの機能的相互作用について検討を行う。まず、内在性RUNX2を高発現しているヒトの腫瘍由来の培養細胞株を用いて、発現抑制あるいは過剰発現を行い、RUNX2およびAEBPの発現量の変化について調べる。また、マイクロアレイを用いて腫瘍化関連遺伝子の網羅的な検索を行うと共に、RUNX2によって転写活性制御を受ける既知の下流遺伝子や、骨芽細胞の骨分化への影響について検討する。更にヒトの腫瘍で検出された変異型RUNX2についてもクローニングを行って、野生型との比較を試みる予定である。また、MDS、FPD/AML、CMLなどの血液腫瘍患者において検出されたRUNX

1変異体(RUNTドメイン内のミスセンス変異)とAEBPとの結合活性について検討したところ、野生型に対して有意な差が見られた。更に、これらのRUNX1変異体の過剰発現およびAEBPの発現抑制を行い、タンパク質の安定性や活性に対する相互作用について検討した。現在、論文の投稿準備中である。なお、ヒトRUNXファミリーにおいてRUNTドメインのアミノ酸配列は90%以上と高いホモロジーを示している。そこで、AEBPはヒトRUNX2およびRUNX3とも結合し、機能的相互作用を及ぼす可能性を考えた。まず、ヒトRUNX2およびRUNX3の発現ベクターを作製し、293T細胞の内在性AEBPとの結合活性について確認した。次に、ヒトの腫瘍由来の培養細胞株におけるRUNX2あるいはRUNX3タンパク質の発現についてウエスタンブロッティング法を用いて検討した。このうち、内在性RUNX2が高発現している細胞株を用いてRUNX2あるいはAEBPの発現抑制を行い、タンパク質の安定性への影響について調べた。また、RUNX2を安定的に過剰発現する細胞株を作成し、AEBPの活性および細胞応答について検討を行った。RUNX1とAEBPとの結合および相互作用に関する論文を学術雑誌に投稿し、早期の発表を目指す。また、転写因子RUNX2に注目し、新規結合タンパク質AEBPとの機能的相互作用について検討を行う。まず、内在性RUNX2を高発現しているヒトの腫瘍由来の培養細胞株を用いて、発現抑制あるいは過剰発現を行い、RUNX2およびAEBPの発現量の変化について調べる。また、マイクロアレイを用いて腫瘍化関連遺伝子の網羅的な検索を行うと共に、RUNX2によって転写活性制御を受ける既知の下流遺伝子や、骨芽細胞の骨分化への影響について検討する。更にヒトの腫瘍で検出された変異型RUNX2についてもクローニングを行って、野生型との比較を試みる予定である。
自動車の安全性に関する総合評価技術基盤の確立に関する研究

研究代表者は自動車の1次安全の観点から、車両運動の不安定化の基本的な原因となるその非線形性に着目し、これを安定化する制御則を提案した。その効果をコンピューターシミュレーションにより確認するとともに、提案した車両運動安定化の制御則を実験車に組み込み、実験によるその効果の検証を行った。更に、車両運動を安定化するシャシー制御則の検討を行い、タイヤの横力と前後力の左右差によるヨーモーメントを用いた、横すべりとヨーレイトの協調制御により、より車両運動の安定化が可能な事をコンピュータシミュレーションで検討し、これも実験による確認を行った。また更に、外界からの道路形状や、障害物位置の情報を車両が得る事により可能となる、ドライバーが障害物を回避する時のドライバーアシスト制御の提案を行い、その効果についてシミュレーションで検討した。研究分担者前川一郎は自動車の2次安全の観点から、構造強度一般に対して衝撃力の効果は波動特性を考慮すべき事を指摘し、力性波と言う新しい概念に基づいた設計工学を構築する事は、Reverse Phase Methodによる安全設計法、動的破壊力学の問題点の解決、自動車の安全システムへの応用などを統一的に推進する基盤思想になる事を確認した。高速で走行中の自動車の安全設計には動的応力集中効果の解明が必要であるため、並列切欠きを持つ帯板の衝撃破壊強度に及ぼす切欠き間距離、衝撃速度及び試験片長さの影響を初めて明らかにし、数値解析により応力波の干渉効果を確かめた。また、き裂を持つ帯板及び円筒のアクリル試験片の衝撃引張り、曲げ及びねじり実験と数値解析により力性波の効果を指摘し、静強度と対比して衝撃強度の特性を明示した。研究分担者遠藤順一は2次安全の点で構造上有利になる正方形管のアルミニュームスペースフレームに着目し、その新しい曲げ加工法を研究した。研究代表者が中心となり自動車の1次安全の観点から、車両運動の不安定化の基本的な原因となるその非線形性に着目し、これを安定化する制御則を提案した。またその効価をコンピューターシュミレーションにより検証するとともに、実験による検証のための準備を行い一部実験的にその効果を実証した。その結果車両の構造的パラメータを考慮した上で、タイヤの横力ではなく左右タイヤの前後力差により生じるヨーモメントを用いて、従来からいわれてきた車両のヨーレイトではなく横すべり運動を制御することが効果的であることを明らかにした。研究分担者前川一郎は自動車の2次安全の観点から、部材が衝撃力を受けたときの変形挙動を実験的にはひずみ計法を用いて、理論的には動的有限要素法により解明した。構造部材として中空矩形断面のアルミはりに衝撃曲げを作用させた際の曲げ変形は、静的曲げと異なり、衝撃により生じた応力波の伝播挙動を考慮して理解されることを明らかにした。中空部材は中実部材に比べ、衝突時に断面の押しつぶれによるエネルギーの吸収が有り、2次安全の点で構造上有利となる。研究分担者遠藤順一はこの観点から正方形管のアルミニュームスペースフレームに着目し、その新しい曲げ加工法を示した。また、研究代表者及び研究分担者全員の討議を通じて、自動車の総合的で根底的な安全性の評価技術基盤を確立するためには、1次安全と2次安全の両面から同時並行的に基本的な研究を進めることが肝要であることを確認した。研究代表者は、1次安全の観点から、昨年度提案した車両運動安定化の制御則を実験車に組み込み、実験によるその効果の検証を更に進めた。また更に、車両運動を安定化するシャシー制御則の提案を行い、タイヤの横力と前後力の左右差によるヨーモーメントを用いた、横すべりとヨーレイトの協調制御により、より車両運動の安定化が可能な事を一部コンピュータシミュレーションで確認した。

また、外界からの道路形状や、障害物位置の情報を車両が得る事により可能となる、ドライバーアシスト制御やドライバーが障害物を回避する時の経路設定(パースセッティング)とその効果について検討した。研究分担者前川一郎は2次安全の観点から、小粒子が層状板に衝突して生じる損傷が応力波の干渉による影響を受ける事を明らかにし、構造強度一般に対しても衝撃力の効果は波動特性を考慮すべき事を指摘し、層状化、複合化による新材料構造開発の基礎的知見を示した。そして、亀裂材の衝撃強度評価に対して、力性波と言う新しい概念に基づいた設計工学を構築する事は、Reverse Phase Methodによる安全設計法、動的破壊力学の問題点の解決、自動車の安全システムへの応用などを統一的に推進する基盤思想になる事を再確認した。研究分担者遠藤順一は、昨年度に引き続いて、2次安全の点で構造上有利になるアルミニュームスペースフレームの加工法を研究した。本年度はとりわけOR曲げ加工に注目し、曲げによる変形をひずみ測定の結果から明らかにし、その加工法の可能性を明らかにした。このように、車両の安全に関わる基盤的研究を、車両運動、車両構造、車両生産と言うそれぞれの立場から進めた。研究代表者は、1次安全の観点から、昨年度に引き続き、車両運動を安定化するシャシー制御則の提案を行い、タイヤの横力と前後力の左右差によるヨーモーメントを用いた、横すべりとヨーレイトの協調制御により、より車両運動の安定化が可能な事をコンピュータシミュレーションで確認した上で、実験によるその効果の検証を更に進めた。また更に、外界からの道路形状や、障害物位置の情報を車両が得る事により可能となる、ドライバーが障害物を回避する時のドライバーアシスト制御の提案を行い、その効果についてシミュレーションで検討した。その結果、1周期の正弦波状の横加速度を実現するために位相を進めたヨーレイトをモデル応答とするDYCによるアシスト制御が、単なる車両の応答特性の向上制御に比べても、回避性能の向上に大きく寄与することが示された。研究分担者前川一郎は2次安全の観点から、自動車等構造物にき裂が生じた際の健全性評価の新方法として、実用材中の複数き裂や他種き裂との干渉挙動を、巨視的荷重の下でき裂先端の微視的解析により明らかにした。さらに高速自動車の走行中の安全設計には動的応力集中効果の解明が必要であるため、並列切欠きを持つ帯板の衝撃破壊強度に及ぼす切欠き間距離、衝撃速度及び試験片長さの影響を初めて明らかにし、数値解析により応力波の干渉効果を確かめた。また、き裂を持つ帯板及び円筒のアクリル試験片の衝撃引張り、曲げ及びねじり実験と数値解析により力性波の効果を指摘し、静強度と対比して衝撃強度の特性を明示した。本年度はとりわけオフセットローラーを用いたスペースフレーム曲げ加工装置の形式を改良し、さまざまの条件で実験を行うことにより、この加工法の実用化のための知見を得た。
在宅医療用可搬型Ｘ線撮影装置の実用化に向けた研究

在宅医療において、早期発見、早期治療のためのX線診断は重要であるが、従来のX線撮影装置は、ポータブル型のものでさえ大きな装置になり、家屋等での使用には困難を伴う。本研究では、X線撮影装置を大幅に小型化するため、焦電性結晶によるX線源を用いたX線撮影装置の開発を目指し、様々なパラメータに対し、このX線源の強度とエネルギーについて調べた。得られた実験結果を踏まえて、焦電性結晶を用いたプロトタイプのX線撮影装置を作製し、撮影を行った。その結果、原子番号の大きなものは描画できるが、原子番号の低いものはうまく描画できないことがわかった。在宅医療において、早期発見、早期治療のためのX線診断は欠かせない。しかし、従来のX線撮影装置は高電圧電源とX線管球が必要であり、ポータブル型のものでさえ大きくなるため、家屋等でのX線撮影は困難を伴う。一方で、高電圧電源とX線管球を使わずにX線を発生させる方法に、焦電性結晶を用いる方法がある。これを用いれば、X線撮影装置を大幅に小型化できる可能性がある。本研究では、焦電性結晶を用いてX線撮影装置を大幅に小型化することによって、AED(自動体外式除細動器)のように持ち運びが可能で、撮影場所を選ばない、在宅医療、救急医療等において撮影可能な可搬型X線撮影装置を試作し、実用化を目指す。今年度は、第二子の入院と第三子の出産でほぼ1年間休業したため、ほとんど研究は進んでいない。今年度は、基礎実験として、焦電性結晶による発生X線の広範囲な気圧依存性について調べた。既存の装置では、気圧を3 Pa程度までしか下げることができなかったが、高真空を達成できるポンプを導入し、0.8 mPa程度までの低気圧を実現したので、0.8 mPaから20 Paの気圧範囲における発生X線の特性を調べた。その結果、10 Paより高い気圧ではX線は発生せず、気圧が高い領域(3から10 Pa)では、X線の発生電圧と強度は気圧を下げるにつれて急激に増加することがわかった。X線の発生電圧は3 Pa付近で最大となり、それより低い気圧では減少し、さらに気圧が低くなると一定値に収束することがわかった。X線の強度は、3 Pa付近で最大になり、それより低い気圧では最大値で飽和することがわかった。4桁にわたる広範囲な気圧に対する発生X線の特性を調べたことにより、気圧に対するX線発生特性をほぼ網羅できた。また、X線撮影とX線スペクトル測定の両方共に可能なプロトタイプ装置を作製し、X線撮影の画像を記録する装置として、小型のフラットパネルディテクタを導入した。これらのことにより、実験効率を高めることができた。焦電性結晶表面に発生する電圧は焦電性結晶に与える温度差に比例すると考えられるため、今年度は、基礎実験として、焦電性結晶の温度差と発生電圧・発生X線強度の関係を調べた。その結果、温度差を大きくすると発生電圧は増加するが、発生電圧が70kV程度になると、発生電圧は飽和することがわかった。今回の実験の設定では、最大電圧76kV程度が限界であることがわかり、この原因として、焦電性結晶表面とターゲット金属間の距離が関係すると考えられた。次に、基礎実験の結果を踏まえて、最大のX線強度が得られる条件で撮影実験を行った。被写体としてタングステンコリメータとICを用いた。タングステンはX線の吸収が大きいので、画像上で影として映るが、ICは画像としては映らなかった。このことから、X線の強度を高くする必要があることがわかった。

これを用いれば、X線撮影装置を大幅に小型化できる可能性がある。本研究では、焦電性結晶を用いてX線撮影装置を大幅に小型化することによって、AED(自動体外式除細動器)のように持ち運びが可能で、撮影場所を選ばない、在宅医療、救急医療等において撮影可能な可搬型X線撮影装置を試作し、実用化を目指す。昨年度の撮影実験により、X線強度が低いことがわかったので、今年度はX線の強度を高めるための実験を行った。最初に、X線の強度を高くする方法として、発生電圧を高くする方法を試みた。昨年度までの実験により、発生電圧は気圧を変化させることで制御できることがわかっている。気圧が10-3 Paのとき、約70 kVの発生電圧が得られるが、気圧を1 Paにすると、約95 kVの発生電圧が得られ、発生電圧を高くすることができた。しかし、X線が発生する持続時間が短く、全体としてX線の強度を高くすることができなかった。次に、温度変化率を高くすることによりX線の発生強度を高くすることを試みた。温度変化率を高くするとX線強度が高くなることがわかった。しかし、温度変化率を高くすることには限界があり、ある値以上にすると放電が起こり、X線が発生しなくなることがわかった。現在、最大の強度が得られる温度変化率と気圧の条件を求めており、その条件で撮影実験を行う予定である。在宅医療において、早期発見、早期治療のためのX線診断は重要であるが、従来のX線撮影装置は、ポータブル型のものでさえ大きな装置になり、家屋等での使用には困難を伴う。本研究では、X線撮影装置を大幅に小型化するため、焦電性結晶によるX線源を用いたX線撮影装置の開発を目指し、様々なパラメータに対し、このX線源の強度とエネルギーについて調べた。得られた実験結果を踏まえて、焦電性結晶を用いたプロトタイプのX線撮影装置を作製し、撮影を行った。その結果、原子番号の大きなものは描画できるが、原子番号の低いものはうまく描画できないことがわかった。撮影実験によりX線強度が低いことがわかったので、今後は、X線強度を高くするための実験を行えば良いことがわかった。量子ビーム科学現在の実験のセッティングで気圧と温度変化率を変化させて、発生X線の強度が最大になる条件を探索する。その後、焦電性結晶表面ーターゲット間距離を変えて、発生電圧を上昇させ、さらにX線強度を増加させる。最大強度のX線が得られる条件で撮影実験を行って、撮影画像を得る。第二子の入院と第三子の出産でほぼ1年間休業し、ほとんど研究できなかったため。基礎実験を行うにあたって低気圧が達成可能な真空ポンプを導入したが、既存の真空槽では容量が大きいため、40 mPa程度の気圧までしか達成できなかった。発生X線の気圧依存性を明らかにするためには、1 mPa程度の気圧を達成させる必要があるため、既存の真空槽より容量の小さな真空槽を導入した。これにより、1 mPaから10 Paまでの4桁にわたる広範囲な気圧下での実験が可能となったが、真空槽交換に伴う真空部品の設計と納品に時間がかかり、基礎実験の進行が遅れた。前年度は育児休業を取得したため、補助事業期間を1年間延長した。それに伴い、延長期間における研究経費が必要となったため。今年度はほとんど研究が進まなかったため、研究期間の延長を申請している。今年度の研究計画を来年度に、来年度の研究計画を再来年度に順次ずらして実行する予定である。
柱梁を剛結合しないフレーム構造＝滑構造の実現可能性評価のための実験的研究

本研究では柱と梁を剛接合しないで摩擦接合した長方形1スパンの4層構造物模型試験体を作成し、振動台を用いて動的加振試験を実施した。実験は1層時と2層時の挙動を確認したのち、4層まで積層して実験を行った。各層には1トンの錘を載せて長周期化を図った。実験の結果、1層時には大速度地震動を与えた場合にはストッパーに衝突した。その際の摩擦係数は0.4程度と推定された。4層では兵庫県南部地震や熊本地震の地震動の60%入力を与えてもストッパーに衝突することはなかった。しかし、一回の実験で残留変形がかなり生じた。よって滑構造は特に何も装置を設置しない滑動部、ストッパ、セルフセンタリング機構で構成する必要がある。今年度は防災研究所の実大鉄骨架構を用いた摩擦式制震構造の振動実験および静的加力試験結果のシミュレーションを実施し、その特性を模擬することに注力した。その結果得られた摩擦式制震構造の特性は、改良前に比べて格段に安定的なものとなっていることがわかった。これにより摩擦式制震構造における設計原理を確立することができた。さらに得られたシミュレーションモデルを用いて、実際に柱を分離した場合の摩擦式制震構造を導入した構造物が地震時にどのように挙動するかについて、シミュレーション解析を実施した。それによって、適切な摩擦係数を付与すれば十分耐震的な摩擦式制震構造が構築可能であるとの見通しを得た。当初計画していたように、次年度実施する実験に向けて必要なモデルパラメータを整備することができたから。今年度は柱と梁を剛接合しない=摩擦接合した1スパン角の長方形4層構造物を作成し、振動台を用いて動的加振試験を実施した。実験は1層時の挙動を確認したのち、2層時でも実験して情報を収集、さらに4層まで積層して実験を行った。実験の結果、1層時には兵庫県南部地震や熊本地震の地震動の80%入力を与えた場合にはクリアランスを超えてストッパーに衝突する現象が生じた。その際の摩擦係数は0.30.4程度と推定された。4層を積層した場合には構造物が長周期化するとともに各層の変位が分散することで、兵庫県南部地震や熊本地震の地震動の60%入力を与えた場合でもストッパーに衝突することはなかった。しかし、一回の実験で残留変形が残るのでその都度センターを出す必要があった。このことは摩擦接合構造物ではやはり残留変形を実用的な範囲に留めるためにはかなり強力なセンタリング機構が必要であるということがわかった。以上の検討により、滑構造は特に何も装置を設置しない滑動部とストッパ、およびセルフセンタリング機構で構成することが適切である。次年度は実験を実施するために、試験体を設計し、必要な部材を用意して振動実験を行う。得られた結果を整理して提案する摩擦制震構造物がフィージブルであることを実証する。都市災害管理学
熱流体数値シミュレーションにおける境界条件の高精度化に関する研究

空間発達流における流体運動や熱輸送の数値シミュレーションでは流出境界条件が重要な問題である。計算機能力の制約から、有限の領域内で人口的な流出境界条件を与える必要があるが、適切な境界条件は明らかでない。本研究では、比較的精度の良い境界条件として使われるようになってきたSommerfeld放射条件と呼ばれる境界条件の高精度化に関する研究を行った。特に、Sommerfeld放射条件の対流速度の取り扱い方法が解に与える影響を数値実験より調べ、より高精度の対流速度決定方法について考察を行った。数値実験は粘性流体の一様流中を対流するHillの球形渦の三次元流れ場を対象とした。レイノルズ数は500である。この流れ場に三つの流出境界条件を適用した。それらは、対流速度に一様流速度を用いるSommerfeld放射条件、研究代表者が新たに提案した対流速度に流出境界の法線方向速度の最大値と最小値の算術平均速度を用いるSommerfeld放射条件,これまで一般的に広く使われてきた流れ方向の一階微分を零とする自由流出条件である。計算法は有限差分法で対流項には三次精度風上差分、それ以外の項は二次精度執心差分を用いた。時間積分は一次精度の半陰的splitting法を用いた。数値実験の結果から次のようなことが明らかになった。流出境界近傍の渦度場を比較した結果、渦度等高線の変形は自由流出条件が最も大きいのに対し、算術平均速度を用いるSommerfeld放射条件は渦度の空間的振動が最も小さく渦度の滑らかな流出を可能にする条件である。長領域の解を基準にした誤差ノルムは、速度・圧力とも算術平均速度を用いるSommerfeld放射条件が最も小さく、比較した三種類の流出境界条件の中で算術平均速度を用いるSommerfeld放射条件が最も精度が高い。
音響手法を用いた北海道噴火湾近海におけるソウハチの移動と分布の解明

春季の北海道南部の噴火湾近海で見られるソウハチによるスケトウダラ稚魚の捕食は、将来のスケトウダラ資源量に影響していると考えられる。そのため、ソウハチによる捕食圧の評価が可能になれば、スケトウダラ資源管理において貴重な資料となる。これを調べるためには、ソウハチ魚群が当該海域にどのように分布しているか、また、ソウハチがどのような行動パターンを持っているかを解明する必要がある。本研究では、計量魚群探知機を用いてソウハチの分布を調べると同時に、超音波発信器や標識タグを用いて個体の移動を調べ、ソウハチが索餌を行う時間や範囲を明らかにする。
メリステム機能による側生器官分化の制御機構

これまでの研究により, YABBY遺伝子ファミリーに属するTOB1が細胞非自律的にイネの小穂メリステムの維持制御に関わっていることが明らかになっている.本年度は, TOB1と近縁なTOB2とTOB3を含め,これらの3つのYABBY遺伝子の機能解明を行った.まず, in situ hybridizationで空間的発現パターンを解析したところ, TOB2とTOB3は,小穂メリステムから生じる側生器官で強く発現し,小穂メリステムでは発現していないことが示された.これは, TOB1の発現パターンとよく一致しており,これ3つの遺伝子機能が類似していることを示唆している.次に,野生型において, TOB2とTOB3のノックダウンを行ったところ,ほとんど表現型が現れなかった.一方, tob1変異体において, TOB2とTOB3をノックダウンしたところ, tob1変異を昂進することが示された.したがって,これら3つのTOB遺伝子は,冗長的にはたらき,側生器官で発現して細胞非自律的にメリステムの維持に関わっていると考えられる.本研究は,側生器官とメリステムとのコミュニケーションに,新たな局面を切り開く研究として,植物発生学の中で重要な位置を占めつつある.雄ずいの向背軸極性の確立機構を解明する目的で,低分子RNA (miRNA166やta-siARF RNAなど),各種転写因子(OsETT, OsPHB, OsPRS, OsKAN)などの発現パターンを解析した.その結果,向背軸極性の転換には,転写制御,転写後制御の両者が関わっていることが示唆された.また,外穎頂端部に生じる芒の形成機構に関しても解析を行い, DROOPINGLEAF (DL)とOsETTIN2 (OsETT2)遺伝子が重要な役割を果たしていることを明らかにした.0sETT2は芒原基で発現するのに対して, DLは芒原基直下の組織で発現しすることから,細胞非自律的に芒形成に関与すると考えられる.さらに,ジャポニカイネで芒が形成されない一つの原因は, OsETT2の芒原基での発現消失であることも示唆された.(抄録なし)イネの花や花序の発生・形態形成の機構を,メリステムの機能と関連しつつ研究を行った.1.tongari-boushi1(tob1)変異体では,小穂器官の形態異常や発育不全,シームレス穎の形成など,花や花序に多面的な異常を示す表現型が見られる.詳細な解析の結果,多面的な小穂器官の異常は小穂メリステムの機能不全と密接に関係していることが明らかとなった.遺伝子を単離した結果,TOB1は,YABBY転写因子をコードし,外穎・内頴など小穂の側生器官で発現していた.一方,メリステムでの発現は全く検出されなかった.したがって,tob1変異体のメリステムにおける異常は,TOB1が細胞非自律的に作用していることと考えられる.また,TOB1は転写の促進因子としてではなく,抑制因子として働くことが示唆された.TOB1を過剰発現させると小穂の器官数が増加し,メリステムの活性が増大することが示された.一方,TOB1に転写抑制ドメインを結合させて過剰発現させたところ,tob1変異体の表現型は示さず,単なるTOB1の過剰発現と同様の表現型を示した.したがって,TOB1は転写の促進因子としてではなく,抑制因子として働くことが示唆された.以上の結果から,TOB1遺伝子は,転写抑制に関わり,側生器官からメリステムへのシグナル伝達を通して,細胞非自律的にメリステムの制御に関わっていることが明らかとなった.2.aberrant spikelet and panicle1(asp1)変異体は,生殖成長期において花序や小穂に多面的な表現型を示したが,詳細な表現型の解析の結果,これらの異常はメリステムの転換や維持,小穂発生の遺伝的プログラムの部分的遅延あるいは昂進としてとらえることにより,統一的に解釈することが判明した,ポジショナルクローニングにより遺伝子を単離した結果,ASPI遺伝子はシロイヌナズナのTOPLESS様の転写コリプレッサーをコードしていることが示された.さらに,栄養成長期では,腋芽の伸長抑制解除や葉序の乱れなどがみられ,ASPI遺伝子の機能はオーキシン作用と密接に関連していることが判明した。これまでの研究により, YABBY遺伝子ファミリーに属するTOB1が細胞非自律的にイネの小穂メリステムの維持制御に関わっていることが明らかになっている.本年度は, TOB1と近縁なTOB2とTOB3を含め,これらの3つのYABBY遺伝子の機能解明を行った.まず, in situ hybridizationで空間的発現パターンを解析したところ, TOB2とTOB3は,小穂メリステムから生じる側生器官で強く発現し,小穂メリステムでは発現していないことが示された.これは, TOB1の発現パターンとよく一致しており,これ3つの遺伝子機能が類似していることを示唆している.次に,野生型において, TOB2とTOB3のノックダウンを行ったところ,ほとんど表現型が現れなかった.一方, tob1変異体において, TOB2とTOB3をノックダウンしたところ, tob1変異を昂進することが示された.

したがって,これら3つのTOB遺伝子は,冗長的にはたらき,側生器官で発現して細胞非自律的にメリステムの維持に関わっていると考えられる.本研究は,側生器官とメリステムとのコミュニケーションに,新たな局面を切り開く研究として,植物発生学の中で重要な位置を占めつつある.雄ずいの向背軸極性の確立機構を解明する目的で,低分子RNA (miRNA166やta-siARF RNAなど),各種転写因子(OsETT, OsPHB, OsPRS, OsKAN)などの発現パターンを解析した.その結果,向背軸極性の転換には,転写制御,転写後制御の両者が関わっていることが示唆された.また,外穎頂端部に生じる芒の形成機構に関しても解析を行い, DROOPINGLEAF (DL)とOsETTIN2 (OsETT2)遺伝子が重要な役割を果たしていることを明らかにした.0sETT2は芒原基で発現するのに対して, DLは芒原基直下の組織で発現しすることから,細胞非自律的に芒形成に関与すると考えられる.さらに,ジャポニカイネで芒が形成されない一つの原因は, OsETT2の芒原基での発現消失であることも示唆された.TOB1遺伝子とASP1遺伝子の機能欠損がどのような発生異常を引き起こすのかを明らかにするとともに,両遺伝子を単離した.さらに,分子生物学的な解析を進め,TOB1およびASP1遺伝子の発生上および分子レベルでの機能を解明した.遺伝子単離および,分子レベルでの機能解析という点は,当初の計画以上に進展している.TOB1遺伝子の機能をさらに解析するため,TOB1と類似した遺伝子(TOB2,TOB3)をも研究対象とし,その発生上における機能の解明を行う.これら遺伝子の多重変異体を作製し,これら遺伝子の機能を深く追究するとともに,機能の冗長性も調べる.さらに,TOB1が転写抑制に関わる点に着目し,TOB1と相互作用する因子を見いだし,転写抑制に関わる分子機能を明らかにする.ETTIN遺伝子に関しては,雄蕊の発生における役割をさらに明らかにするとともに,芒形成との関連も含めて解析を進める.(抄録なし)
ヒトI PS細胞を用いた骨格筋前駆細胞誘導と

新たに報告された初期化促進遺伝子の知見を取り入れ、非ウイルスベクターであるプラスミドを用いたヒトiPS細胞の効率の良い樹立方法を開発した。本方法で、ゲノム中へプラスミドが取り込まれていないiPS細胞が得られている。さらに、免疫拒絶反応に関与するHLA-A, B, C, DRがいずれもホモである歯髄細胞2株からもiPS細胞を作製し、ドーパミン神経細胞や網膜色素上皮細胞に分化することも確認した。計算上は日本人の約20%へ移植適合性がある。ヒトiPS細胞分化培養系において、PDGFRa陽性細胞を50%程度誘導できる分化誘導条件を確定した。しかしながらPCRによる遺伝子発現解析にて、PDGRa陽性細胞が全て沿軸中胚葉の前駆細胞ではないことが明らかとなり、その中でもPDGFRa陽性KDR陰性分画が、体節レベルの分化段階である沿軸中胚葉前駆細胞であることを見出した。この沿軸中胚葉前駆細胞を、筋損傷モデルのNoc/Scidマウスに移植したところ、細胞の生着は確認できたが、すべて間質に存在し骨格筋再生に寄与している細胞は同定できなかった。また試験管内での成熟した骨格筋への分化誘導も様々に試みたが、残念ながら成熟骨格筋への分化はいずれの条件でも認められなかった。以上の結果より、PDGFRaをマーカーとして用いる分化誘導系においては、マーカー上はマウスips細胞での研究と同等の前駆細胞を誘導することに成功したが、この中に骨格筋前駆細胞が存在するという確証は得られなかった。そこで他の方法を試みた。MahmoodらがヒトES細胞で報告した(J. Bone and Mineral Res. 2010)Acitivin阻害剤を使用した分化誘導法で、試験管内で骨格筋に分化しうる前駆細胞を同定した。またこの前駆細胞を筋損傷モデルのNoc/Scidマウスに移植したところ、生体内でホストの骨格筋と融合している組織像が観察され、再生に寄与していると考えられた。また奇形種の発生は認められなかった。現在は筋ジストロフィーモデルマウスへの移植を試みているが、計画書に記載した免疫トレランスの誘導方法は効果がなく、当研究所中畑研究室が作成しているNOGマウスのバックグラウンドに改変した筋ジストロフィーモデルマウスを使用させていただけるよう共同研究を提携した。昨年度より引き続き、ヒトiPS細胞からの骨格筋前駆細胞誘導研究を行った。マウスと同じくPDGFRa陽性細胞が沿軸中胚葉の前駆細胞であることを明らかにしたが、マウス細胞とは異なり、骨格筋へ分化する細胞はごく僅かであった。またこれまでヒトES細胞にて報告されているCD73にて細胞を純化する方法や、Activin阻害剤を用いる方法など、他の分化誘導法もいくつか試みたが、やはり骨格筋へ分化する細胞はごく僅かであった。そこで、ヒトiPS細胞にテトラサイクリン応答性MyoD1発現ベクターを遺伝子導入することにより、効率の良い骨格筋分化誘導法の確立を目指した。これまで、未分化ヒトiPS細胞への遺伝子導入は効率の悪いものが多く、あまり成功していなかったが、我々はpiggyBacと呼ばれるトランスポゾン・ベクターを用いることで遺伝子導入を容易にし、テトラサイクリン添加により60%以上の高い効率で、わずか2週間程度で、骨格筋前駆細胞を分化誘導する方法を開発した。誘導された骨格筋は遺伝子発現レベルにおいて、成熟骨格筋細胞と同等の発現を示し、CK-MやDystrophinといった成熟骨格筋マーカー蛋白も発現していた。さらにこの誘導骨格筋細胞は、電気刺激により収縮することも観察し、機能を持った細胞であることが明らかとなった。この誘導法の分化途中の細胞を筋ジストロフィーモデルの免疫不全マウスに移植すると、ヒト由来のDystrophinの発現を確認したことから、生体内で骨格筋再生に寄与する事が明らかとなった。またこの方法は、異なる細胞クローンにおいてもほぼ同様の高効率で誘導可能であることが分かり、再現性も極めて高いと言える。これまで、ヒトiPS細胞からこれだけの効率で、機能を持った骨格筋細胞を誘導した例はなく、今後の細胞移植治療の開発や、筋疾患モデルの研究に大いに有用である。