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クルーズトリパノソーマのTrypomastigoteの機能の多様性と表面構造変化

1.クルーズトリパノーマのTrypomastigoteの病原力を決定づけるのは宿主細胞への浸入の速さにあるのではなく,その後の細胞内での原虫の形態変化から増殖に至る過程にある.この現象を追うのにL細胞のような株化細胞は不適当である.同一株由来の病原力の異るTrypomastigoteを単離し,マウスマクロファージ,マウス新生児由来の線維芽細胞に対する感染実験の結果,細胞浸入能には両者に大きな差を認めなかったが,浸入後強毒株はすぐ形態変化,分裂を開始するのに比し,弱毒株では分裂開始までに48時間以上を要する.2.Trypomastigoteの細胞表面には30を越す数多くの抗原性蛋白が存在し,それらのいずれもが特に抗原として優勢でなく,細胞表面全体に密に存在することもない.しかも全体としての抗原性は弱く,とくに血流型は弱い.このことは感染治療または免疫マウスより得た抗血清を用いて,生原虫に対する凝集反応を行うと凝集価を認めないこと,間接蛍光抗体法では,蛍光陽性原虫が血流型では40倍,細胞培養由来のものでは320倍希釈まで凝集を示すことから予想された.事実原虫表面に吸着させて得た表面抗原に対する抗血清を用いたイミュノブロッティングは30余りの抗原を示した.3.Trypomastigoteの表面成分には脂質様成分が認められ,これは強毒原虫に特異的に多い.生きた原虫をトリプシン処理することにより虫体より分離される成分をSDS-PAGEにて比較した.ゲルのトリクロル酢酸(10%)固定にて白色沈澱として37kDaから50kDaにいたる未確定物質が認められ,これは強毒原虫に著名に多い.アセトンによる前処理がこれを消滅させることより脂質様成分と考えている.1.クルーズトリパノーマのTrypomastigoteの病原力を決定づけるのは宿主細胞への浸入の速さにあるのではなく,その後の細胞内での原虫の形態変化から増殖に至る過程にある.この現象を追うのにL細胞のような株化細胞は不適当である.同一株由来の病原力の異るTrypomastigoteを単離し,マウスマクロファージ,マウス新生児由来の線維芽細胞に対する感染実験の結果,細胞浸入能には両者に大きな差を認めなかったが,浸入後強毒株はすぐ形態変化,分裂を開始するのに比し,弱毒株では分裂開始までに48時間以上を要する.2.Trypomastigoteの細胞表面には30を越す数多くの抗原性蛋白が存在し,それらのいずれもが特に抗原として優勢でなく,細胞表面全体に密に存在することもない.しかも全体としての抗原性は弱く,とくに血流型は弱い.このことは感染治療または免疫マウスより得た抗血清を用いて,生原虫に対する凝集反応を行うと凝集価を認めないこと,間接蛍光抗体法では,蛍光陽性原虫が血流型では40倍,細胞培養由来のものでは320倍希釈まで凝集を示すことから予想された.事実原虫表面に吸着させて得た表面抗原に対する抗血清を用いたイミュノブロッティングは30余りの抗原を示した.3.Trypomastigoteの表面成分には脂質様成分が認められ,これは強毒原虫に特異的に多い.生きた原虫をトリプシン処理することにより虫体より分離される成分をSDS-PAGEにて比較した.ゲルのトリクロル酢酸(10%)固定にて白色沈澱として37kDaから50kDaにいたる未確定物質が認められ,これは強毒原虫に著名に多い.アセトンによる前処理がこれを消滅させることより脂質様成分と考えている.1)認められるだけでも30を越す多数の蛋白抗原を細胞表面に露呈している。しかも特に有勢な抗原をもつわけではなく、これらの数多くの抗原が個々の原虫に異った量的パターンで出現するらしい。従って免疫動物の抗血清はいろいろなパターンで反応しているのが、生原虫を用いた間接螢光抗体法で認められ、過免疫マウス中でも血流中に原虫が生存できる機構の一つは、この表面構成抗原の多さと、その量的な多様性にあると考えられる。2)病原力の差と表面構成分の差は、原虫をそのままで用いたSDS-PAGE,イミュノブロッティングでは識別できない。しかし生原虫をトリプシン処理した上清の濃縮液を用いると識別が可能になる。これはSDS-PAGE,イミュノブロッティンの両者に認められる。3)SDS-PAGEにて強毒原虫のトリプシン処理上清は弱毒のものに比し多量の糖が含まれていることが明らかになってきている。従って病原力を決定するのは単なる2-3の蛋白成分の差でなく、グリコシレーションの量的な差にあるのではないかという感触を得ている。4)キネトプラスト領域にはフィブロネクチンと特異的に結合する部位が認められるが、これは病原力には関係しない。他の発育ステージにもこれは認められるが、これらのステージのものが宿主細胞への親和性をもたないことから、一般に考えられているように宿主細胞の認識部位ではないと考えている。
超音波を用いた衝撃吸収装置の開発

自動車に広く使用されている高張力鋼板(ハイテン)や今後の自動車素材として注目されている炭素繊維強化プラスチック(CFRP)などに超音波振動を印加したときの変形特性や衝撃力特性などについて検討した。高張力鋼板・CFRPいずれの場合においても、超音波振動によって変形抵抗が低減し、衝撃力が軽減する効果が確認できた。またスプリングバック量が低減することも示した。幅10 mm、長さ200 mm、厚さ2.3 mmの高張力鋼板(WEL-TEN590RE)の場合、超音波の印加によって衝撃力およびスプリングバック量はそれぞれ最大で35%および43%低減した。自動車などはクラッシャブルゾーンが潰れることなどによって衝撃を吸収するが、歩行者を巻き込む事故など十分に衝撃を吸収できないケースは多い。また、衝突物や衝撃の大きさはそれぞれの事故によって異なるが、従来の技術では瞬時にその衝撃吸収性能を調整することはできない。そこで、超音波を用いて瞬時に衝撃吸収性能を調整できる衝撃吸収装置を考案した。これまでの研究ではアルミニウム合金(JIS A6063)に超音波を印加したときの変形特性や衝撃吸収特性について検討してきた。本研究では、自動車に広く使用されている高張力鋼板(ハイテン)や今後の自動車素材として注目されている炭素繊維強化プラスチック(carbon-fiber-reinforced plastic, CFRP)などに超音波を印加し、衝撃吸収性能を確認する。平成25年度に実施した主な研究内容を以下に示す。(1)ホーンの材質を変形しやすかったアルミニウム合金(JIS A2017)からクロムモリブデン鋼(SCM440)に変更し、かつ、試料が変形中でも振動を伝えやすくするように、先端はアール形状にした。ホーン変更後の振動特性を測定した結果、ほぼ設計どおりの共振周波数・振動分布になった。(2)高張力鋼板(WEL-TEN590RE)でも超音波による衝撃軽減効果があることを確かめた。超音波を印加することによって高張力鋼板の変形抵抗は低減し、スプリングバック量および衝撃力がそれぞれ最大で43%および35%低減した。そこで、衝撃を受けた瞬間に車両を構成する金属などに超音波を印加することで、変形抵抗を低下させ、衝撃吸収度を向上させる方法を考案した。これまでの研究ではアルミニウム合金(JIS A6063)に超音波を印加したときの変形特性や衝撃軽減特性について検討してきた。本研究では、自動車に広く使用されている高張力鋼板(ハイテン)や今後の自動車素材として注目されている炭素繊維強化プラスチック(CFRP)などに超音波を印加し、落錘衝撃試験を行うことでどの程度の衝撃が吸収できるか確認する。平成26年度に実施した主な研究内容を以下に示す。(1)CFRPや熱可塑性樹脂の場合でも超音波による衝撃軽減効果があることを確かめた。厚さ4 mm、幅20 mm、長さ200 mmのCFRPを用いて実験した結果、超音波を印加することによってCFRPの変形抵抗は最大で11%低減し、衝撃力は最大で93%低減した。また、超音波振動子に印加する電圧を増加させると衝撃力が減少することを確認した.(2)自動車等に設置するには超音波振動子の小型が必須である。そこで、全長435 mm、重さ4.54 kgであった超音波振動子を全長195 mm重さ0.92 kgまで小型化し、振動特性・衝撃軽減特性等を測定した。衝撃力ー変形特性を測定した結果、超音波振動によって変形量は最大で36%増加した。また、超音波振動子の駆動電圧を増加させると、スプリングバック量が伴って減少することを確認した。超音波振動によってスプリングバック量は最大で25%減少した。衝撃軽減特性を測定した結果、超音波振動によって衝撃力は最大で18%減少した。自動車などはクラッシャブルゾーンが潰れることなどによって衝撃を吸収するが、十分に衝撃を吸収できないケースは多い。本研究では、自動車に広く使用されている高張力鋼板(ハイテン)や今後の自動車素材として注目されている炭素繊維強化プラスチック(CFRP)の他、熱溶融型接着剤などに超音波振動を印加し、変形特性や衝撃力特性などについて検討した。高張力鋼板・CFRP・熱溶融型接着剤のいずれの場合においても、超音波振動によって変形抵抗が低減し、衝撃力が軽減する効果が確認できた。自動車等に設置するには装置の小型化が必要であるため、全長が435 mmあった超音波振動子を全長195 mmの超音波振動子に変更した実験も行い、同様の効果を確認した。最終年度には幅20 mm、長さ200 mm、厚さ3 mmの熱可塑性CFRPに超音波振動を印加したときの効果を確かめた。CFRPに超音波振動を印加することによって変形抵抗が低減し,衝撃力も低減することを確かめた。

駆動電圧を増加させるほど超音波振動の効果は顕著になり、衝撃力は最大で89%低減した。また,超音波振動子の応答特性についても検討した。小型の振動子の方が短い時間で応答した。駆動電圧の増加に伴い,応答時間が短くなることも確かめた。さらに、超音波振動子を3本接続した高張力鋼板の構造体を製作し、超音波を印加したときに変形量が大きくなることなども確かめた。自動車に広く使用されている高張力鋼板(ハイテン)や今後の自動車素材として注目されている炭素繊維強化プラスチック(CFRP)などに超音波振動を印加したときの変形特性や衝撃力特性などについて検討した。高張力鋼板・CFRPいずれの場合においても、超音波振動によって変形抵抗が低減し、衝撃力が軽減する効果が確認できた。またスプリングバック量が低減することも示した。幅10 mm、長さ200 mm、厚さ2.3 mmの高張力鋼板(WEL-TEN590RE)の場合、超音波の印加によって衝撃力およびスプリングバック量はそれぞれ最大で35%および43%低減した。当初の予定通り、素材が変形中でも振動を伝えやすくするために、超音波振動子の先端をアール形状にした。また、耐圧縮荷重の大きな衝撃用ロードセルを購入して、衝撃力を直接測定できるようにした。現在までの研究では、高張力鋼板およびCFRPに超音波を印加して落錘衝撃試験を行い、どちらの素材でも変形抵抗と衝撃力が低減することを確認している。また、自動車のシャシを模した構造体用の超音波振動子としては、これまで実験で使用してきた超音波振動子(直径54 mm、全長435 mm)は大きすぎるため、小型化した超音波振動子(直径40 mm、全長195 mm)を製作し、小型化しても変形抵抗と衝撃力が低減することを確認している。自動車のシャシを模した構造体の設計もできている。超音波振動による熱可塑性樹脂の溶融現象を利用した衝撃軽減装置も製作し、変形抵抗と衝撃力が低減することを確認している。衝突をセンサで感知した後に、超音波を印加する回路の製作・衝撃吸収装置の応答速度を確認はまだ行っていない。工学CFRPでも超音波の印加によって変形抵抗と衝撃力が低減することはすでに確認しているが、データ数が少ないため、更に実験を進め、効果の大きい条件を探す。また、自動車のシャシを模した構造体(材質:高張力鋼板)を製作し、落錘衝撃試験を行って超音波を用いた衝撃軽減装置の効果を確かめる。自動車のシャシを模した構造体には直径40 mmの超音波振動子を3本ボルトで結合する。落錘衝撃試験では、衝撃力・変形挙動などを測定する。それぞれの実験において超音波の効果が弱い場合は、超音波振動子の各部や変形試料の接触部にラップ加工を施す。力率補正・マッチング・入力波形の変更など電気的な対処についても検討する。衝突をセンサで感知した後に、超音波を印加する制御回路を製作し、衝撃吸収装置の応答速度を確かめる。制御用マイコンにはArduinoを用いる。ホーンの素材および先端形状を変え、超音波振動子の最適化を図った。新しく試作した超音波振動子の振動特性を測定した結果、ほぼ設計通りの特性が得られた。大きさの異なる2種類の超音波振動子を試作する計画であるが、現段階で試作できているのは直径56 mmのボルト締めランジュバン型振動子(BLT)を用いた超音波振動子のみである。
含フッ素ポリマーでできた水溶性超微粒子の合成

ペンタフルオロスチレン(PFS)とp-(1-メチルシラシクロブチル)スチレン(SBS)の9/1混合物をモノマーとしてニトロキシ制御ラジカル重合を行い、さらに、ネオペンチルスチレンスルホン酸(SSPen)を重合させることで、架橋可能なジブロックコポリマー(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSPen_<44>を合成した。各セグメントの重合度はポリスチレン換算のGPC測定により、PFSとSBSの組成比は^1H-NMR測定により決定した。このポリマーは、アセトニトリル中で(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>セグメントをコアとするミセルを形成した。このミセル溶液に白金系触媒を作用させたところ、ミセルコア内でSBSの開環重合が進行し、架橋ミセルCCL(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSPen_<44>が得られた。ここにヨウ化トリメチルシリルを作用させ、塩酸で処理し水酸化ナトリウム水溶液で中和することでスルホン酸エステルを加水分解してSSPenセグメントをスチレンスルホン酸ナトリウム(SSNa)セグメントに変換し加水分解架橋ミセルCCL-(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSNa_<44>を得た。スルホン酸エステルの加水分解の進行はIRにより確認した。加水分解架橋ミセルは、水に対して可溶であった。ブロックコポリマーミセル、架橋ミセル、加水分解架橋ミセルの粒径を動的光散乱により評価したところ、それぞれ、116nm、122nm、164nmと求まった。さらに、CCL-(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSNa_<44>の水溶液をガラス基板上で乾燥させて原子間力顕微鏡により観察したところ、直径150nm程度の球状粒子が多数確認できた。以上のように、本研究により含フッ素ポリマーでできた水溶性超微粒子を合成する手法を確立することができた。モノマー単位中にフッ素原子を3個、5個、7個持つビニルエーテル系ポリマー(polyTFEOVE,polyPFPOVE,polyHFBOVE)が疎水性セグメントで、ヒドロキシエチルビニルエーテルのポリマー(polyHOVE)が親水性セグメントとなった水溶性の含フッ素両親媒性ブロックコポリマーをリビングカチオン重合法とそれに続く官能基変換により、各セグメント長をそろえて(疎水性セグメントの重合度が約20、親水性セグメントの重合度が約80)精密合成し、その性質を詳細に検討した。その結果、以下の新しい性質を見い出した。表面張力測定により、含フッ素ブロックコポリマーが水面上で高い界面活性を示し、フッ素原子数が多くなるにつれてその界面活性が高くなり、polyHOVE-b-polyHFBOVEに至っては、水溶液の表面張力を28mN/mまでに低下させることが明らかになった。また、X線小角散乱および中性子小角散乱測定により、これらのブロックコポリマーが水中で多分子会合し、フッ素セグメントをコア、親水性セグメントをシェルとしたコア-シェルミセル状の粒子を形成することが明かとなった。このミセル粒子は、球状-棒状の共存状態で、コア断面の半径は、5nm程度、シェルの断面の半径は10nm程度であると見積もられた.また、フッ素原子数が増えるにつれて、ミセルの断面の大きさは変化しないが棒状ミセルの割合が増加することがわかった。さらに、紫外-可視吸光分析により、このミセルがフッ素系の疎水性化合物を選択的に可溶化する「親フッ素性」を示し、その性質がフッ素原子数が増加するにつれて顕著になることが明かとなった。これらの実験結果は、高分子界面科学の発展に寄与するとともに、工業的応用性、実用性が極めて高く意義深いものである。メタクリル酸ノナフルオロヘキシル(NFHMA)とメタクリル酸t-ブチル(tBMA)をリビングアニオン重合によりブロック共重合し、polyNFHMA-b-polytBMAを調製した後、poly tBMAセグメントのt-ブチル基の加水分解と中和を行いメタクリル酸ナトリウムセグメントに変換することで、含フッ素両親媒性ブロックコポリマーpolyNFMA-b-polyMANaを合成した。また、同一化学構造でフッ素原子を持たないメタクリル酸ヘキシル(HMA)を用いて、同様の手法により、同じ重合度と重合度比をもつフッ素不含両親媒性ブロックコポリマーpolyHMA-b-polyMANaを合成した。含フッ素ブロックコポリマーは、水中で会合してフッ素セグメントをコアとしたミセル微粒子を形成した。この含フッ素ブロックコポリマーミセル微粒子とフッ素不含ブロックコポリマーが形成するミセル微粒子に関して、大きさならびに形状を、動的光散乱(DLS)、X線小角散乱(SAXS)、中性子小角散乱(SANS)測定およびそのデータの解析を行い調査した。その結果、形状は、いずれのミセルもほぼ球状であったが、大きさに関しては、含フッ素ミセルの方が、フッ素不含ミセルよりも明らかに大きな微粒子を形成していることがわかった。これは、含フッ素ミセルの方が、ミセルのコア/シェル間の界面張力がより大きく、ミセル会合数がより大きくなるためと結論付けられた。また、これらのミセル溶液にフッ素系および非フッ素系の疎水性色素を添加し、可溶化実験を行った。

その結果、含フッ素ミセルは、フッ素系の疎水性色素を選択的に取り込む親フッ素性を示すことがわかった。このように、含フッ素ブロックコポリマーのミセル形成により、水中に溶解したフッ素微粒子を生成させることに成功し、そのフッ素微粒子の特性を明らかにすることができた。ペンタフルオロスチレン(PFS)とp-(1-メチルシラシクロブチル)スチレン(SBS)の9/1混合物をモノマーとしてニトロキシ制御ラジカル重合を行い、さらに、ネオペンチルスチレンスルホン酸(SSPen)を重合させることで、架橋可能なジブロックコポリマー(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSPen_<44>を合成した。各セグメントの重合度はポリスチレン換算のGPC測定により、PFSとSBSの組成比は^1H-NMR測定により決定した。このポリマーは、アセトニトリル中で(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>セグメントをコアとするミセルを形成した。このミセル溶液に白金系触媒を作用させたところ、ミセルコア内でSBSの開環重合が進行し、架橋ミセルCCL(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSPen_<44>が得られた。ここにヨウ化トリメチルシリルを作用させ、塩酸で処理し水酸化ナトリウム水溶液で中和することでスルホン酸エステルを加水分解してSSPenセグメントをスチレンスルホン酸ナトリウム(SSNa)セグメントに変換し加水分解架橋ミセルCCL-(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSNa_<44>を得た。スルホン酸エステルの加水分解の進行はIRにより確認した。加水分解架橋ミセルは、水に対して可溶であった。ブロックコポリマーミセル、架橋ミセル、加水分解架橋ミセルの粒径を動的光散乱により評価したところ、それぞれ、116nm、122nm、164nmと求まった。さらに、CCL-(PFS_<0.9>-co-SBS_<0.1>)_<123>-b-SSNa_<44>の水溶液をガラス基板上で乾燥させて原子間力顕微鏡により観察したところ、直径150nm程度の球状粒子が多数確認できた。以上のように、本研究により含フッ素ポリマーでできた水溶性超微粒子を合成する手法を確立することができた。
建築物屋上,屋根面を利用した冷気生成による夏季夜間の市街地冷却効果に関する研究

本研究では,研究代表者の竹林が所属する神戸大学大学院自然科学研究棟3号館屋上のヒートアイランド対策屋根実験施設(以降クールルーフ実験施設と呼ぶ)における実験,実測と並行して,この領域で先駆的に研究を実施しているアメリカのローレンスバークレー国立研究所などの研究機関と連携し,研究交流を行いながら研究を進めた.神戸大学のクールルーフ実験施設では,数種類の高反射塗料と芝生,土面,太陽光発電パネルの詳細な比較実測を2004年の夏から秋にかけて実施した.高反射塗料とは可視域の反射特性は従来の塗料と同じで近赤外域の反射率を大きく設定した塗料であり,見た目には従来の塗料と変わりないがトータルの反射率は大きくなるという特徴を持つ.実測の内容はヒートアイランド対策屋根材料における表面熱収支に注目したもので,長短波放射収支計により各表面での短波長放射と長波長放射の上向き,下向き成分を測定し,各表面でのアルベド(日射反射率)を算出した.各ユニットに施工段階で埋め込んだ温度計,熱流計により,表面熱流を算出した.芝生,土面においては土壌中の含水率の測定を行い,水分の移動についても考察して蒸発量の算定を行った.最終的に,各測定対象面において熱収支の残差からヒートアイランドの原因となる大気負荷量(顕熱輸送量)が算出され,対策屋根のヒートアイランド緩和効果の相対的な評価が可能となった.これらの結果は,2004年8月に学芸出版社より出版された「ヒートアイランドの対策と技術」(森山正和編)の中に収録した.また,2004年3月末にローレンスバークレー国立研究所のアクバリ博士,ポメランツ博士に来日いただき研究討議を行った.2004年12月に神戸大学で開催した第17回CUTE(都市熱環境会議)において,竹林が「屋上緑化及び高反射性塗料の熱・水分収支に関する研究」というタイトルで研究成果を報告するとともに,関連分野の研究者にも研究発表をして頂き,研究討議を行った.建物屋上,屋根面における熱収支,放射収支の定量的な評価を行った.神戸大学大学院自然科学総合研究棟3号館の屋上に設置されている屋上被覆実験スラブにおいて,現実に考えられるヒートアイランド対策として屋上緑化,高反射率塗料を施工し,表面熱収支の相互比較実験を行った.特に日射反射率,放射率といった放射収支の特性に注目し詳細な解析を行った.具体的には,放射収支計により上下方向の短波,長波放射量を測定した.更に実験施設の施工段階において埋め込んでいた熱流板のデータを利用し各表面での熱収支を考察し,熱収支の残差より顕熱フラックスを算定した.これらの測定により,各種表面における日射反射率,放射率などの基本的なデータベースが整理された.上記の詳細測定は夏季に集中して実施したが,様々な被覆技術が年間を通して外部環境及び室内環境に及ぼす影響についても把握する必要があるため,年間を通した連続測定を継続し,夏季以外の季節にどのような影響が生じるかという点についても検討を行っている.また,屋上面から発生する顕熱フラックスが,周辺市街地および都市のヒートアイランド現象に対してどのような影響を及ぼすかという点に注目し,定量的な解析を行った.建物の屋上や壁面,道路面から発生する顕熱フラックスと空調機の室外機や自動車などから人工的に排出される人工排熱をそれぞれ算定し,地表面の熱収支モデルと大気の熱拡散モデルを達成させた計算に入力し,それぞれの成分が周囲の気温と都市のヒートアイランド現象に影響する様子を数値シミュレーションにより検討した.本研究では,研究代表者の竹林が所属する神戸大学大学院自然科学研究棟3号館屋上のヒートアイランド対策屋根実験施設(以降クールルーフ実験施設と呼ぶ)における実験,実測と並行して,この領域で先駆的に研究を実施しているアメリカのローレンスバークレー国立研究所などの研究機関と連携し,研究交流を行いながら研究を進めた.神戸大学のクールルーフ実験施設では,数種類の高反射塗料と芝生,土面,太陽光発電パネルの詳細な比較実測を2004年の夏から秋にかけて実施した.高反射塗料とは可視域の反射特性は従来の塗料と同じで近赤外域の反射率を大きく設定した塗料であり,見た目には従来の塗料と変わりないがトータルの反射率は大きくなるという特徴を持つ.実測の内容はヒートアイランド対策屋根材料における表面熱収支に注目したもので,長短波放射収支計により各表面での短波長放射と長波長放射の上向き,下向き成分を測定し,各表面でのアルベド(日射反射率)を算出した.各ユニットに施工段階で埋め込んだ温度計,熱流計により,表面熱流を算出した.芝生,土面においては土壌中の含水率の測定を行い,水分の移動についても考察して蒸発量の算定を行った.最終的に,各測定対象面において熱収支の残差からヒートアイランドの原因となる大気負荷量(顕熱輸送量)が算出され,対策屋根のヒートアイランド緩和効果の相対的な評価が可能となった.これらの結果は,2004年8月に学芸出版社より出版された「ヒートアイランドの対策と技術」(森山正和編)の中に収録した.また,2004年3月末にローレンスバークレー国立研究所のアクバリ博士,ポメランツ博士に来日いただき研究討議を行った.2004年12月に神戸大学で開催した第17回CUTE(都市熱環境会議)において,竹林が「屋上緑化及び高反射性塗料の熱・水分収支に関する研究」というタイトルで研究成果を報告するとともに,関連分野の研究者にも研究発表をして頂き,研究討議を行った.
成長期における骨発育に影響する要因の検討-超音波法による小児骨量評価-

骨粗鬆症の予防対策は,近年は成長期の骨量に着目し最大骨量(peak bone mass)を介入により高めていく,より積極的な方法に焦点が移りつつある。そこで成長期の骨量評価は重要になってくるのだが,現時点において本邦では基礎的な検討が十分為されておらず,その理由の一つに,小児骨量の評価方法が確立されていないことが挙げられる。小児骨量の測定には,簡易かつ被曝等のない非侵襲性の方法が望ましく,成人の踵骨で既に実用化されている超音波法が候補として適していると考えられる。しかし小児の踵骨は発達が未熟であり,成人の方法をそのままでは利用できないため,超音波法による小児骨量の評価方法の早急な確立が待たれていた。そこで,平成9年度,超音波法による成長期の小児骨量評価法を確立し,暫定的に年齢階級毎の小児骨量(平均値,標準偏差)を明らかにした。平成10年度においては,これをさらに発展させ,断面研究により小児骨量の関連要因を検討した。ロジスティックモデルを用いた多変量解析では,普通骨量群に対する低骨量群の関連要因としてBMI(OR 0.87,95%CI 0.78-0.97),屋外での遊び(OR 0.52,95%CI 0.31-0.85),スポーツ活動(OR 0.58,95%CI 0.35-0.97)が有意にモデルに取り込まれた。一方,普通骨量群に対する高骨量群の関連要因としてBMI(OR l.15,95%CI 1.07-1.25)が有意にモデルに取り込まれた。今回の断面調査により,学童期の骨量と体格・屋外遊び・スポーツ活動が関連することが示された。今後,骨発育の関連要因の検討を通して,骨粗鬆症の予防に繋がる成長期の積極的な保健指導(栄養指導,運動指導等)が可能となることが期待される。近年,骨粗鬆症の予防対策は,成長期の骨量に着目し最大骨量(peak bone mass)を介入により高めていく,より積極的な方法に焦点が移りつつある。従って,成長期の骨量評価は重要であるが,本邦では基礎的な検討が未だ十分に為されていない。既に実用化されている踵骨乾式超音波法(AOS100,アロカ社)は測定時間が短く,X線被曝のない非侵襲性であり,小児の骨量を疫学的に評価するのに適していると考えられる。しかし本測定法は,元来成人用として開発されたものであり,成人と比べ踵骨が未発達な小児に応用するためには,小児用のアダプターを新たに開発する必要がある。平成9年度は,SXA画像(UXA300,アロカ社)の解析により小児用アダプター(足の大きさ18-22cm)を新しく開発し,超音波法による成長期の小児骨量評価法を確立することができた。小児用アダプターの設計値は足底側距離27.8cm,アキレス腱側距離23.6cmが妥当と考えられた。他方,足の大きさ22cm以上の小児には成人用アダプター(22-25cm)の応用が可能と考えられた。小児用アダプターを用いたAOS100の測定精度は日内変動CV=0.27-7.07%,日差変動CV=1.33-8.77%であった。また小児用アダプターを用いたAOS100とUXA300の各指標との間には相関係数0.49-0.66の有意な(p<0.01)相関関係を認めた。平成10年度は年齢階級毎の小児骨量(平均値,標準偏差)を明らかにし,さらに断面研究により小児骨量の関連要因を検討していく予定である。現在公立・私立の複数のフィールドで調査を既に開始している。また,この年代の骨の発育速度は大きく,短期間でも骨量の増分を評価できる可能性があるため,縦断研究による成長期の骨量増加の関連要因についても検討を試みる予定である。

一方,普通骨量群に対する高骨量群の関連要因としてBMI(OR l.15,95%CI 1.07-1.25)が有意にモデルに取り込まれた。今回の断面調査により,学童期の骨量と体格・屋外遊び・スポーツ活動が関連することが示された。今後,骨発育の関連要因の検討を通して,骨粗鬆症の予防に繋がる成長期の積極的な保健指導(栄養指導,運動指導等)が可能となることが期待される。
中国の熱帯林における土壌動物相の研究

陸上の生態系の平衡を維持するうえに,土壌動物は菌類・原生生物とともに植物の生存の基盤をなす重要な共生者である。したがって土壌動物についての基礎情報の整備は,農業・林業はもちろん,地球・人類の生存・存続に直接かかわる要請であり,環境問題の解明に必須の情報である。自然の荒廃がいちじるしいアジアのなかでも,とくに中国では過去の経緯から自然林が重大な危機に瀕している。本研究は平成元三年の国際学術研究"中国の亜熱帯林における土壌動物相の研究(課題番号01041032)"のおとを継承するもので,主たる調査地を浙江省から雲南省に移したが,研究内容は一連共通の目的のもとにすすめられた。われわれの日中共同研究がきわめて円滑に進行したのは,野外調査の企画・推進・実行,えられた学術資料の取扱い,研究成果の発表方法などについて,前回の学術調査発足時の平成元年四月に日中で十分に討議しそれぞれの項目について円満なる合意をえて成立した協定を日中相方が遵守してきたからである。平成四年四月,本研究の実施に先立ち,謝栄棟氏ほか四氏によって西双版納昆明,大理,景束,麗江などでの予備調査がおこなわれ,九月には尹文英氏と今立が昆明,西双版納などを歴訪して,平成四年・五年の調査地と日程の大綱をさだめた。日中の研究者が雲南省に入ったのは平成四年一〇月,翌一一月へかけて西双版納熱帯植物園とその周辺の熱帯(雨)林と,昆明郊外の西山周辺の常緑広葉樹林などの一〇地点で、ツルブレン法・拾取り法・直接法などを併用して土壌動物の調査をおこなって,大量の標本・資料をうることができた。平成五年一月,採集資料の系統分類学上の位置の研究のため,粛寧年氏が東京農業大学の渡辺泰明氏の研究室に,七月には張はん雲氏が東京医科歯科大学を訪れ,加納六郎氏や今立等と研究をふかめ,またこれからの調査研究計画についての検討をおこなった。平成五年八九月の野外調査は雲南省賓川老太山,大理点蒼山系玉竹峯,中和寺,寂照庵周辺などの常緑広葉樹林(照葉樹林)と,前年と同じ西双版納熱帯植物園周辺の熱帯(雨)林などの合計一六地点で,ツルブレン法・拾取り法・直接法などを併用して,土壌動物相を調査し,悪天候に悩まされたにもかかわらず,おおくの興味ある標本・資料をうることができた。平成五年一一一二月,謝栄棟氏,張駿氏(研究協力者)は無髄昆虫類の分類学的研究のため訪日して,東京医科歯科大学・茨城大学理学部などで研究をすすめた。尹文英氏と二人の中国人研究者は,平成六年一〇月に昭和大学でひらかれたこの共同研究の総括集会に,日本側の全研究者とともに参加された。それまでの各研究者の成果はめざましいものがあり,多数の新種,中国新記緑種がえられ,中国における土壌動物相の基礎情報が飛躍的に増大したことがあきらかとなった。たとえばササラダニ類にあっては,中国からの既知種116種から271種に増加し,うち16種は新種であった。またカマアシムシ類では,雲南省からの既知30種が53種にふえ,うち14種が新種であった。注目すべき発見としては,鞘廻類の12新種のうち,チビゴミムシ類の新種はこの原列のヒマラヤから日本列島にひろがる種属のなかの統計進化上の原型ともみなうべきものが,大理点蒼山系でえられ,新属Junnamotrechusが創設されたとがあげられる。平成六年一二月,石井清氏と伊藤良作氏は中国側研究者とともに,この共同研究をつうじてえられた重要標本・記録・資料類を整理し,中国科学院上海昆虫研究所の収集学術資料のなかに加えた。またこの一連の研究によって,中国で最初の土壌動物等の大著"中国亜熱帯土壌動物(尹文英編)"が刊行され,中国における土壌動物学研究に強力なる基盤がつくられた。この大著(618頁)の過半は本研究に参加した研究者の執筆にかかる。以上の結果から,将来のこの共同研究がめざましく卓越した成果をもたらすであろうことは疑のないところである。

平成四年四月,本研究の実施に先立ち,謝栄棟氏ほか四氏によって西双版納昆明,大理,景束,麗江などでの予備調査がおこなわれ,九月には尹文英氏と今立が昆明,西双版納などを歴訪して,平成四年・五年の調査地と日程の大綱をさだめた。日中の研究者が雲南省に入ったのは平成四年一〇月,翌一一月へかけて西双版納熱帯植物園とその周辺の熱帯(雨)林と,昆明郊外の西山周辺の常緑広葉樹林などの一〇地点で、ツルブレン法・拾取り法・直接法などを併用して土壌動物の調査をおこなって,大量の標本・資料をうることができた。平成五年一月,採集資料の系統分類学上の位置の研究のため,粛寧年氏が東京農業大学の渡辺泰明氏の研究室に,七月には張はん雲氏が東京医科歯科大学を訪れ,加納六郎氏や今立等と研究をふかめ,またこれからの調査研究計画についての検討をおこなった。平成五年八九月の野外調査は雲南省賓川老太山,大理点蒼山系玉竹峯,中和寺,寂照庵周辺などの常緑広葉樹林(照葉樹林)と,前年と同じ西双版納熱帯植物園周辺の熱帯(雨)林などの合計一六地点で,ツルブレン法・拾取り法・直接法などを併用して,土壌動物相を調査し,悪天候に悩まされたにもかかわらず,おおくの興味ある標本・資料をうることができた。平成五年一一一二月,謝栄棟氏,張駿氏(研究協力者)は無髄昆虫類の分類学的研究のため訪日して,東京医科歯科大学・茨城大学理学部などで研究をすすめた。尹文英氏と二人の中国人研究者は,平成六年一〇月に昭和大学でひらかれたこの共同研究の総括集会に,日本側の全研究者とともに参加された。それまでの各研究者の成果はめざましいものがあり,多数の新種,中国新記緑種がえられ,中国における土壌動物相の基礎情報が飛躍的に増大したことがあきらかとなった。たとえばササラダニ類にあっては,中国からの既知種116種から271種に増加し,うち16種は新種であった。またカマアシムシ類では,雲南省からの既知30種が53種にふえ,うち14種が新種であった。注目すべき発見としては,鞘廻類の12新種のうち,チビゴミムシ類の新種はこの原列のヒマラヤから日本列島にひろがる種属のなかの統計進化上の原型ともみなうべきものが,大理点蒼山系でえられ,新属Junnamotrechusが創設されたとがあげられる。平成六年一二月,石井清氏と伊藤良作氏は中国側研究者とともに,この共同研究をつうじてえられた重要標本・記録・資料類を整理し,中国科学院上海昆虫研究所の収集学術資料のなかに加えた。またこの一連の研究によって,中国で最初の土壌動物等の大著"中国亜熱帯土壌動物(尹文英編)"が刊行され,中国における土壌動物学研究に強力なる基盤がつくられた。この大著(618頁)の過半は本研究に参加した研究者の執筆にかかる。以上の結果から,将来のこの共同研究がめざましく卓越した成果をもたらすであろうことは疑のないところである。陸上の生態系の平衡の維持に土壌動物は重要な役割を担う共生者である。土壌動物相についての情報の整備は、農業や林業をふくめた陸上生態学の研究にとって基礎資料として欠かすことのできないものである。現在、アジア各地では急速に自然が荒廃しており、特に中国の熱帯森林は危機に頻している。本研究は平成元年三年に日中共同ですすめた国際学術研究“中国の亜熱帯森林における土壌動物相の研究(課題番号01091032)"のあとをうけるもので、昨春提出した実績報告にみられるように、おおくの研究報告が刊行されているが、ことに平成二年五月に北京の科学出版から刊行された中国亜熱帯土壌動物研究(尹文英編著、617頁)は、中国語で書かれた最初の土壌動物学の成書であり、単に中国での土壌動物学の発展のみならず、将来の国際共同研究の発展にも影響するところきわめておおきい。
偏光ナノフィッシングによるナノレオロジー異方性分析

本研究は、ナノ領域における高分子や蛋白質分子の粘弾性や流動性を評価するナノレオロジー原子間力顕微計測において、力情報だけでなく、偏光情報を同時に獲得することで、高分子やタンパク質分子の光学異方性応答に基づく分子動態の同時観測を可能にするナノレオロジー異方性分析手法の開発を目的とする。具体的には、原子間力顕微鏡カンチレバーチップ上の試料に、光学異方性の測定可能な複屈折近接場光学顕微鏡プローブの先端を接して、光学プローブをカンチレバーから徐々に引き離しながら、複屈折変化を計測することで、光学プローブ先端に付着する試料の光学異方性と粘弾性を同時計測する。そこで、基礎実験として液晶分子内における複屈折応答を実験的に調べた。具体的には、複屈折近接場光学顕微鏡の光ファイバープローブを1μm以下の膜厚の液晶薄膜内に挿入して厚さ方向のプローブの位置に対する複屈折応答を測定した。その結果、ポリイミド基板のラビング方向に応じてその応答が異なること、プローブの振動方向に応じて液晶分子が配向されることが明らかになった。これまでポリイミド界面上における液晶分子の配向挙動について明らかにされておらず、本結果は液晶高分子マテリアルの界面における挙動解析に革新的な解析手法を提供できるポテンシャルを有していると考えられる。今後、配向膜の種類に対する応答、IPS配向における印加電圧に対する液晶分子回転特性の解析、および膜厚方向の液晶分子配向状態の数値解析手法の開発が課題である。
C型肝炎ウイルスによる宿主RNA干渉経路の抑制を介した新たな肝発癌機構の解析

抗発癌作用を有する肝臓特異的なmicroRNA(miRNA)であるmiR-122に注目し、C型肝炎ウイルス(HCV)関連肝発癌機序の解明を目指した。HCV感染細胞ではmiR-122をはじめとする広範囲なmiRNAの機能不全が惹起されていた。その原因として、HCV構造タンパク質がmiRNAの機能発現に関与するmiRNA-induced silencing complex(miRISC)を標的とし、その機能を障害する可能性が示唆された。本研究で示されたHCVによるmiR-122機能抑制機構の詳細は、肝発癌機序の新規知見として期待される。直接作用型抗ウイルス薬の登場によりC型慢性肝炎の治療成績は劇的に向上したが、C型肝炎ウイルス(HCV)持続感染者の肝発癌は依然として高率で、治療成績も十分とはいえない。有効な治療法の開発のためにはHCV肝発癌機構のより詳細な理解が必要である。申請者は、以前、肝臓特異的なマイクロRNAであるマイクロRNA-122(miR-122)の生理機能がHCV感染により抑制されることを見出した。miR-122は抗発癌作用を有することから、miR-122機能抑制機構の解明はHCV肝発癌機序の理解に大きく貢献することが期待される。平成27年度は主に以下の3項目につき解析を行った。1) HCV感染細胞におけるmiR-122標的遺伝子の発現解析:マイクロアレイ解析でmiR-122の標的遺伝子発現が感染細胞において有意に増加していることを見出し、定量RT-PCR法でも確認した。また、miR-122の過剰発現もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた拮抗処理により、miR-122の標的遺伝子発現がそれぞれ減少、増加することを確認し、miR-122標的遺伝子の発現上昇がHCV感染によるmiR-122の機能不全を介して起きていることを明らかにした。2) miR-122機能を抑制する責任HCVタンパク質の同定:miR-122標的遺伝子発現を全長HCVゲノム複製細胞とHCVサブゲノミックレプリコン細胞間で比較し、ウイルス構造タンパク質がmiR-122機能不全に関与していることを明らかにした。3) miR-122の機能抑制に関与するHCV標的宿主細胞性因子の同定:Loss-of-function及びGain-of-function法を用いて、Argonauteタンパク質がmiR-122機能不全に関与するHCV標的宿主細胞性因子であることを同定した。研究はおおむね順調に進展しているが、miR-122機能を抑制する責任HCVタンパク質の同定に関しては、責任タンパク質領域をさらに絞り込む必要があり次年度以降の課題である。申請者は、以前、肝臓特異的なmicroRNAであるmicroRNA-122(miR-122)の生理機能がHCV感染により抑制されることを見出した。平成28年度の研究実績概要を以下に記す。1) miR-122の機能抑制に関与する責任HCV領域・宿主細胞性因子間相互作用の解析:miR-122の標的遺伝子発現を全長HCVゲノム複製細胞とHCVサブゲノミックレプリコン細胞間で比較し、ウイルス構造タンパク質がmiR-122の機能不全に関与することを明らかにした。また、構造タンパク質領域の変異体を用いて、miRNA機能不全に関与する責任HCV領域を同定した。免疫蛍光染色法により、HCV構造タンパク質がmiRNA-induced silencing complex(miRISC)の構成タンパク質と細胞内で共局在することを明らかにした。さらに、全長HCVゲノム複製細胞では、サブゲノミックレプリコン細胞に比べて細胞内のprocessing body数が減少していることを見出した。2) miR-122機能制御肝細胞の性状解析:合成miR-122の肝癌細胞株への導入により細胞増殖能が低下することを見出した。miR-122阻害剤(アンチセンスオリゴヌクレオチド)の導入は細胞増殖能に有意な影響を与えなかった。研究はおおむね順調に進展しているが、miR-122機能制御肝細胞の性状解析に関しては、細胞の遊走・浸潤能、細胞周期、抗癌剤に対する感受性の評価が十分でなく、次年度以降の課題である。平成29年度の研究実績概要を以下に記す。

1)miR-122の機能抑制に関与する責任HCV領域の同定:miR-122の標的遺伝子発現を全長HCVゲノム複製細胞とHCVサブゲノミックレプリコン細胞間で比較し、ウイルス構造タンパク質がmiR-122の機能不全に関与することを明らかにした。さらに、構造タンパク質領域の変異体を用いて、miRNA機能不全に関与する責任HCV領域を同定した。2)miR-122の機能抑制に関与するHCV標的宿主細胞性因子の同定:HCVが標的とするmiRNA経路の詳細を明らかにするために、miRNAの成熟化に関与する宿主細胞性因子のノックダウン及び過剰発現実験を行なった。その結果、HCV構造タンパク質がAGOタンパク質を中心としたmiRNA-induced silencing complexを標的とし、その機能を障害することで、miR-122をはじめとする広範囲なmiRNA機能不全を惹起する可能性が示唆された。3)miR-122の機能障害がHCV増殖に及ぼす影響の解析:HCV感染後のmiR-122機能障害により抑制解除され、発現が亢進するmiR-122の標的宿主因子を同定した。同定宿主因子のノックダウンはHCVの増殖を抑制した。抗発癌作用を有する肝臓特異的なmicroRNA(miRNA)であるmiR-122に注目し、C型肝炎ウイルス(HCV)関連肝発癌機序の解明を目指した。HCV感染細胞ではmiR-122をはじめとする広範囲なmiRNAの機能不全が惹起されていた。その原因として、HCV構造タンパク質がmiRNAの機能発現に関与するmiRNA-induced silencing complex(miRISC)を標的とし、その機能を障害する可能性が示唆された。本研究で示されたHCVによるmiR-122機能抑制機構の詳細は、肝発癌機序の新規知見として期待される。HCVによるmiR-122機能抑制機構の解析をさらに進めて行くとともに、miR-122の機能抑制が肝細胞の性状に及ぼす影響を詳細に解析する。また、in vivoの系での検証のためにヒト肝細胞キメラマウスを用いた検討も予定している。HCVによるmiR-122機能抑制機構の解析をさらに進めて行くとともに、miR-122の機能制御が肝細胞の性状に及ぼす影響をさらに詳細に解析する。In vivoの系での検証のために、ヒト肝細胞キメラマウスを用いた検討も計画している。消化器内科学、肝臓病学、ウイルス学研究がおおむね順調に進行し、予定していた研究物品の購入を必要最小限にすることが可能であったため。平成28年度は国際学会に2回参加したが、何れも日本と韓国での開催学会であり、旅費を必要最小限にすることが可能であったため。平成28年度は、miR-122機能を増強もしくは抑制した細胞株の樹立を考えており、関連する研究物品の購入に使用する予定である。平成29年度は、ヒト肝細胞キメラマウスを用いた実験を計画しており、次年度使用額は、マウスや関連する研究物品の購入に使用する予定である。
再生軟骨組織発達における輸送現象と物理刺激応答のモデリング

再生軟骨組織発達における輸送現象の可視化および定量化を行った.細胞が試験片に存在することにより,物質輸送が促進されることが観察された.これは,細胞代謝活動により拡散輸送が増大したためであると考える。細胞代謝の結果,負の電荷を有するケラタン硫酸等の細胞外マトリックスを構成する高分子の産出が拡散輸送を制限することがわかった.また,圧縮により発生する移流現象が拡散現象へ及ぼす影響を明らかにした.再生軟骨組織発達における輸送現象の可視化および定量化を行った.細胞が試験片に存在することにより,物質輸送が促進されることが観察された.これは,細胞代謝活動により拡散輸送が増大したためであると考える。細胞代謝の結果,負の電荷を有するケラタン硫酸等の細胞外マトリックスを構成する高分子の産出が拡散輸送を制限することがわかった.また,圧縮により発生する移流現象が拡散現象へ及ぼす影響を明らかにした.再生軟骨組織発達における輸送現象の可視化および定量化を行い,得られた実験データを基礎として物理刺激応答のモデリングを行うことを,本課題の目的としている.本年度は(1)「組織培養の基本プロトコルの作成」,(2)「輸送現象観測システムの構築」,(3)「流体チャンパ開発」を行った.牛足関節軟骨より単離した軟骨細胞を,担体である高分子アガロースゲル中に播種し,一定期間培養することにより再生軟骨組織を作るプロトコルを作成した.得られた再生軟骨組織内部の輸送現象を観察するために,輸送現象観測システムを構築した.輸送現象観測システムを構築するにあたって,視野内蛍光画像強度の均一性が重要となるが,主に収差が原因となり画像中心部と辺縁部で画像強度に有意な差が生じてしまうことを防ぐために画像取得方法を開発し,同時に画像処理プロセスを構築した.これにより,得られた画像強度より輸送現象を十分な精度で定量化することが可能となった.輸送現象としては,拡散と移流の二つに焦点をあてて研究を進めているが,本年度は特に拡散輸送現象を観察するための流体チャンバを開発し,拡散輸送現象の可視化を行った.拡散輸送現象の可視化は,得られた画像強度を数値化し,強度分布の時間変化と拡散方程式の解とを用いることにより,誤差関数にフィッティングすることにより拡散係数を求めることにより,数値化を行った.得られた拡散係数を,FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)により得られた結果と比較することにより,妥当な大きさであることを確認した.培養条件および用いるアガロースゲルの種類によって,組織発達の程度に大きな差異が生じることを観察した.この発達の程度と拡散輸送現象とは強い相関があることを観察し,輸送現象が組織発達に大きな役割を果たしていることを示した.再生軟骨組織発達における輸送現象の可視化および定量化を行い,得られた実験データを基礎として物理刺激応答のモデリングを行うことを,本課題の目的としている.本年度は(1)「拡散輸送と組織発達の評価」, (2)「組織内移流輸送現象可視化システム開発」を行った.前年度作成した,再生軟骨組織培養プロトコルを用いて,組織発達により拡散輸送現象がどのように変化するかについて検討した.担体アガロースには, 1%type VII, 4%type VII, 4%type IXの3種類を用い,拡散種としては蛍光デキストラン(分子量3kD, 10kD, 70kD)を用いた.特に10kDのものは電気的に中性のもの(10k)と負に帯電しているもの(10k-)とを用いた.1%type VIIを担体アガロースに用いた結果より, Control(細胞を播種しない)試験片と再生委軟骨試験片との, 28日間までの培養においては,細胞が試験片に存在することにより,物質輸送が促進されることが,全ての種類の拡散種において観察された.これは,細胞代謝活動により拡散輸送が増大したためであると考える.また,特に1%type VIIを担体アガロースに用いた場合には, 10kと10k-の拡散輸送実験結果には顕著な差異が観察され,培養期間を増大させるにつれて, 10kの拡散輸送に比較して10k-の拡散輸送の増大が観察されなかった.これは,細胞代謝の結果,負の電荷を有するケラタン硫酸等の細胞外マトリックスを構成する高分子の産出の結果であると考える.次に,移流輸送現象を可視化するために,高精度位置制御圧縮試験機を用いて再生軟骨組織の変形をそれに伴う輸送現象の観察を顕微鏡上で観察するための可視化システムを構築した.輝度総量評価法を開発することにより,拡散輸送現象と移流輸送現象とを区別して考察することが可能となった。

再生軟骨組織発達における輸送現象の可視化および定量化を行い,得られた実験データを基礎として物理刺激応答のモデリングを行うことを,本課題の目的としている.今年度は,移流は圧縮と除荷による水のPumping Mechanismによる流れに着目し,再生軟骨担体ゲル内での移流・拡散現象を,蛍光試薬と共焦点レーザー顕微鏡を用いて可視化し,定量評価を行った.前年度作成した,再生軟骨組織培養プロトコルを用いて,再生軟骨担体ゲルとして4%Agarose(TypeVII)を用いた.トレーサーとして蛍光Dextranは3kDa(-)を用い,浸漬した試験片に圧縮荷重を加えて,試験片端面から外部に蛍光Dextranが流れる様子を観察した.Pumping Mechanismを定量的に評価するために,(1)見かけの拡散係数と(2)輝度総量を用いたふたつの評価方法を開発した.(1)は試験片内での拡散方程式とPBS領域での拡散方程式を連立することで試験片内の拡散方程式の解として求め,Fittingを用いて取得画像から得られた輝度分布より見かけの拡散係数を算出した.(2)は得られた輝度分布データを用い,試験片内部を積分区間として積分することで,ある所定の時刻の輝度総量を求めた.求めた輝度総量を0sでの輝度総量から引くことにより流出量の時間変化を算出した.自然拡散実験,移流拡散実験ともに時間経過に従い見かけの拡散係数が減少に傾向にあり,低速圧縮時より高速圧縮時の方が見かけの拡散係数は大きいことを確認した.また,試験片への流出と流入の時間変化の傾向は同等であり,時間経過とともに,自然拡散による流出量が移流拡散による流出量を上回り,圧縮により,試験片外部により多くの蛍光Dextranを流出させることができること示し,圧縮により発生する移流現象が拡散現象へ及ぼす影響を明らかにした.
マイクロアレイ法による遺伝性対側性色素異常症の発症機序に関わる遺伝子の解明

遺伝性対側性色素異常症の原因遺伝子候補領域はこれまでに連鎖解析法によりを数cMの距離にまで絞り込まれていたが、近傍の組み換え情報を得られるマーカーの数が不足していたため、原因遺伝子特定するまでに至らなかった。このためマイクロアレイによる遺伝子プロファイリングを用いていわば、別方向からの原因遺伝子の推定を行おうとしていた。しかし、本研究期間中にゲノムプロジェクトにより95%のドラフト配列が明らかにされ、また詳細な物理地図も作製された。公開された物理地図やドラフト配列から、有用なDNAマーカーが得られ、マイクロアレイによる発現解析よりも直接的に原因遺伝子を特定することができるようになったため、DNAマーカーと物理地図を用いての原因遺伝子座位の詳細な解析をまず行い、原因遺伝子を特定した後にマイクロアレイによる発現解析を行うことにした。遺伝性対側性色素異常症の家系構成員3家系83人のうち、これまでの連鎖解析とハプロタイプ解析から候補領域を狭めるのに有効な組み換え情報が得られると考えられる17人を対象に、データベースから得られた配列に基づいてマーカーを作製し、疾患とマーカーとの組み換えの有無を調べた。その結果、数cMの候補領域は物理的距離にして約12Mbに及ぶ事がわかった。その後さらにデータベースの配列から作製したマーカーおよび、患者家系の候補領域の遺伝子において自ら発見したSNPを用いてハプロタイプ解析を行ったところ、候補領域を約3Mbに絞り込むことができた。現在、候補領域で疾患と関連のありそうな遺伝子の変異を解析中である。遺伝性対側性色素異常症(Dyschromatosis Symmetrica Hereditaria;以下DSHと略す)の症状の重さは、季節の影響をうける事が報告されている。遺伝疾患の原因を解明する際には、環境の影響をできるだけ受けないか、又は条件を均一にすることが必要であるため、本研究で用いる色素斑、脱色素斑は、季節変動の影響を受けにくい部位を用いたいと考えた。しかし、どの場所がどの程度季節変動するか調べた報告は未だ無いため、まずDSHの色素斑、脱色素斑の季節変動を画像解析法により定量する事とした。患者皮膚の撮影は平成11年の3月と9月に行った。撮影後に定量的な解析を行うため、撮影フィルムにはスライド用のポジフィルムを用い、遮光カーテンを用いて自然光を遮断し、カメラのフラッシュのみで撮影を行った。ついでフィルムをスキャナーを用いて画像ファイルとしてコンピュータに取り込み、コンピュータプログラムのphotoshopを用いて画像ファイルの色素補正及びグレイスケールへの変化を行った。最後にNIH Imageを用い、色素斑、脱色素斑の面積及び濃度の定量を行った。その結果冬期に比べ夏季では色素斑部の面積が拡大し、脱色素斑部の面積は減少した。また正常部位の色素濃度は夏季に有為に増加した。以上から、今までに報告されたDSHの夏季における増悪は、脱色素斑部と正常部位のコントラストが強まると同時に、色素斑部の面積が拡大することが原因であったと思われる。季節変化に伴い色素斑、脱色素斑の面積が変化することから、患者に苦痛を与える皮膚採集はこの点に注意して慎重に行いたい。また冬季撮影において、皮膚の乾燥による乱反射が撮影後の正確な定量を妨げている事から、患者に事前にハンドクリーム等を塗ってもらい、皮膚の乾燥を防ぎより正確な解析を行いたい。なおこの結果は、第17回国際色素細胞学会で発表された。