hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒメバチ亜科Ｐｌａｔｙｌａｂｉｎｉ族における多様性と宿主転換の解明

本年度は、昨年度までに収集したサンプルに基づき、分類学的再検討、系統解析、寄主特定を進めた。さらに、台湾の国立自然科学博物館と行政院農業委員会農業試験所、および韓国の嶺南大学校の所蔵標本調査を行った。これらはそれぞれの国内における最大の寄生蜂コレクションであり、日本の周辺の寄生蜂相を考える上で重要なコレクションだった。これらの結果から、まず各属の分類学的再検討の論文化を行った。本年度内にはDentilabus属の再検討が出版され、日本及び韓国から2新種、D. nigripodusとD. iyoensisが記載された。また、日本産Platylabini族に含まれる全属の検索表を作成し、そのリストとともに国際膜翅目学会(9th International Congress of Hymenopterists)で発表した。また、この国際学会の参加報告を昆虫学会大会にて発表した。Platylabus属のうち、P. uranius種群に含まれる日本産種については、平成30年度北海道応用動物・昆虫研究会にて分類学的再検討の結果を発表した。さらに、台湾での調査結果では、日本から1種、極東ロシアから1種の2種のみが知られるHeinrinchiellus属について、全く未知の4種が台湾に分布しており、日本にもさらに2種、インド1種、ラオス1種、インドネシア1種の11種が確認された。系統解析からは、Platylabus属が側系統群である可能性が示唆された。また、Heinrichiellus属は他の属と大きく異なる可能性が示唆されているが、他の族を含むヒメバチ亜科全体の系統関係を明らかにする必要があるといえる。寄主特定について、ヒメバチ成虫を用いた分子手法では結果を出すことができていない。今後全く別の手法を開発する必要があると考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、当研究課題に必要なサンプル収集を目的として、日本国内のほかアメリカ合衆国においても許可を得てフィールドワークを行った。また、国内研究期間の標本調査に加えて、本年度は韓国の国立生物資源研究所を訪問し、標本調査を行った。国内の研究者・協力者との標本交換によっても、研究対象であるPlatylabini族のサンプルを効率的に収集できた。これらのサンプルをもとに、第一段階として、日本産Platylabini族の分類体系の整理を行った。結果として、属の定義の検討が必要なPlatylabus属を除き19属45種が認識された。これらのうち、13属は日本未記録属、2属は未記載属であると考えている。現在までに記録されている日本産Platylabini族また、Platylabus属に含まれると考えられる種は20種以上が分布していることが明らかになった。さらに、韓国での調査では、韓国から記録のないPlatylabini族のいくつかの属の標本を発見した。その中には日本との共通種も見られたが、同属でも日本産種とは明らかに異なるものが分布しているようであった。本年度の調査を通して、分子系統関係推定に必要な新鮮なサンプルも集まったため、分子系統推定の準備も進めている。また、協力者により、宿主から羽脱したサンプルを得ることも出来た。これらの研究の一部はアメリカでの国際昆虫学会議で発表し、論文投稿の準備を進めている。本年度の調査を通じて、日本産のPlatylabini族の多様性を把握し、分類体系の整理を進めることができた。この結果から、次年度の海外標本調査での調査方針を決定できたため、効率的に調査し記載を進めることができる。また次年度の分子解析のための標本も集まってきたため、早い段階で解析を始められると考えている。これらのことから、当初の予定どおり概ね順調に進展していると判断した。本年度は、昨年度収集したサンプルを基に分類学的再検討と分子系統解析の準備を進めた。また、国内研究機関の標本調査により、Platylabini族の未記載属の1つについて宿主を特定することができた。この未記載属は形態形質により、Platylabus属に近縁であることがわかっている。また、その宿主はカギバガ科に含まれる種であった。Platylabus属の一部にもカギバガ科を宿主として利用するものが知られており、それらの種との系統関係を明らかにする必要がある。この未記載属の宿主は葉を綴り合せてシェルターを形成することが明らかになった。寄生者の雌はシェルターに侵入して産卵すると考えられ、他の分類群で隠蔽的な宿主に対する適応と考えられている形態形質がこの未記載属においても複数見出された。Platylabini族が含まれるヒメバチ亜科においては、その種数の多さに反して宿主に対する形態的な適応が明らかになっているものはほとんどいない。今回の未記載属に関する発見については、国際食虫性昆虫学会議で発表した。Platylabus属の1種について、日本から記録された標本が所在不明であったが、標本調査の過程で見出すことができた。その結果、日本産種の別の種と同物異名関係であることが判明した。また、未記載属を含む日本産Platylabini族の全属について、先行研究における属の定義を再検討した。この過程でPlatylabini族の共有派生形質を新たに見出し、それが宿主に寄生するステージと関連していることを考察した。この結果について日本昆虫学会で発表した。本年度の研究を通じて、日本産Platylabini族の属の定義を再検討し、未記載属の分類学的な位置も把握することができた。

また、属レベルで宿主が判明していなかった種の宿主が解明されるなど、重要な進捗が見られた。しかし、種レベルの記載で必要な比較標本の一部について、海外研究機関の調査を行う予定であったが、先方との予定が合わず延期となってしまった。これにより、記載論文の執筆が遅れており、全体としてやや遅れていると判断した。本年度は、昨年度までに収集したサンプルに基づき、分類学的再検討、系統解析、寄主特定を進めた。さらに、台湾の国立自然科学博物館と行政院農業委員会農業試験所、および韓国の嶺南大学校の所蔵標本調査を行った。これらはそれぞれの国内における最大の寄生蜂コレクションであり、日本の周辺の寄生蜂相を考える上で重要なコレクションだった。これらの結果から、まず各属の分類学的再検討の論文化を行った。本年度内にはDentilabus属の再検討が出版され、日本及び韓国から2新種、D. nigripodusとD. iyoensisが記載された。また、日本産Platylabini族に含まれる全属の検索表を作成し、そのリストとともに国際膜翅目学会(9th International Congress of Hymenopterists)で発表した。また、この国際学会の参加報告を昆虫学会大会にて発表した。Platylabus属のうち、P. uranius種群に含まれる日本産種については、平成30年度北海道応用動物・昆虫研究会にて分類学的再検討の結果を発表した。さらに、台湾での調査結果では、日本から1種、極東ロシアから1種の2種のみが知られるHeinrinchiellus属について、全く未知の4種が台湾に分布しており、日本にもさらに2種、インド1種、ラオス1種、インドネシア1種の11種が確認された。系統解析からは、Platylabus属が側系統群である可能性が示唆された。また、Heinrichiellus属は他の属と大きく異なる可能性が示唆されているが、他の族を含むヒメバチ亜科全体の系統関係を明らかにする必要があるといえる。寄主特定について、ヒメバチ成虫を用いた分子手法では結果を出すことができていない。今後全く別の手法を開発する必要があると考えている。これまでに得られているサンプルを基に、記載を進める。そのため、ドイツのミュンヘン動物学収集博物館のコレクションとの比較を計画している。ヨーロッパから記載された種の一部は記載の質が不十分な物があり、実物と比較する必要のある種が複数あるためである。また、宿主の特定のためのサンプリングと分子系統推定を並行して行う予定である。次年度はPlatylabini族の系統関係推定と分類学的再検討を完成させ、宿主利用の転換について解析を進める。また、今年度行くことのできなかったドイツでの標本調査を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
担子菌リグニン分解酵素のラジカル形成能を利用する木質系新素材の生産技術開発

木粉の処理に用いうる酵素を生産する担子菌の選抜を試みた。先ず、スギ木粉に生育する担子菌のスクリーニングを行い、ウスバタケ(Coliolus consors)、ハタケチャダイゴケ(Cyatus stercoreus)などの菌株が選抜された。また、4-クロロレゾルシノールの分解を指標として担子菌を検索した結果、ヒラタケ(Pleurotus ostreatus)、ウスバタケなどを選抜した。特に、ウスバタケは高いラッカーゼ生産能を示した。本酵素を精製し2つの主要なアイソザイムが生産されることを認めた。得られたLac標品の作用により2,6-ジメトキシフェノール(DMP)が重合し、種々の溶媒に不溶性のポリマーが得られたが、オリゴマーにとどまっていた。次いで、本酵素標品および市販のLacを用いてアルカリリグニンおよびリグノスルホン酸の再重合を試みた。特にアルカリリグニンからはさらに重合度の増加した画分が得られた。この反応においてはDMPなどが反応のメディエーターとして作用し反応を促進することを見出した。さらに、スギ辺材をリファイナー処理した調製した繊維を部分精製した市販ラッカーゼで処理し、反応後手漉きにより作成したシートを熱圧処理した。得られたシートは非処理繊維からのシートに比べて引張り強度が増加すること、また、ラッカーゼメディエーター(ABTSおよびHOBt)により強度の向上が認められた。一方、ラマン分光分析の結果はラジカル形成によると考えられるシグナルの生成を示した。また、ESR解析によってもラジカルの生成が認められた。このように、Lacの処理により木粉中に存在するリグニン間の結合が形成され、ラジカル重合により引張り強度が向上することが示され、新しい木質系素材の生産に利用され得ることが示唆された。まず、スギ木粉に生育する担子菌のスクリーニングを行い、Coriolus consors(ニクウスバタケ)などの菌株が選抜された。また、ラジカル重合反応に用いる酵素の生産源として、4-クロロレゾルシノール酸化活性を指標として担子菌を検索した結果、Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)、C.consorsなどを選抜した。特にC.consorsは高いLac活性を示したため、本菌株を主要な酵素生産源として選定した。また、P.ostreatusは高いMnP活性を示し、培養条件により酸化活性の異なる2つのMnPアイソザイムを生産すること、また、木粉の処理にはMnP2アイソザイムが有効であると考え、本菌が酵素源としても有用であることを認めた。次いで、本菌の液体培養液からラッカーゼを分離し、Superdex75PGカラムクロマトグラフィーで単一のピークを与えるまでに生成した。本酵素標品を用いた反応により、2,6-ジメトキシフェノール(DMP)が重合し、ジクロロメタンに不溶性のポリマーを得た。このポリマーを溶解し、木粉と混合することにより、新しい素材の調製を試みた。また、得られたLac標品を用いて、アルカリリグニンおよびリグノスルホン酸の高分子化を試みた結果、両リグニンに対する高い酸化能が認められ、アルカリリグニンからはラジカル酸化重合体と考えられる沈殿物が得られた。また、この反応においてDMPがメディエーターとして作用することが示された。これにより、リグニン分子におけるラジカルの形成が示唆された。一方、スギ樹皮のスラリーにデンプンを添加し、漉きあげて160°Cに保持することによりファイバーボードを調製した。このプロセスを酵素処理ファイバーボード生産の基本条件として設定した。

まず、スギ木粉に生育する担子菌のスクリーニングを行い、Coriolus consors(ニクウスバタケ)などの菌株が選抜された。また、ラジカル重合反応に用いる酵素の生産減とした、4-クロロレゾルシノール酸化活性を指標として担子菌を検索した結果、Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)、C.consorsなどを選抜した。特に、C.Consorsは高いラッカーゼ(Lac)活性を示した。本酵素を精製し2つの主要なアイソザイムが生産されることを認めた。次いで、得られたLac標品により2,6-ジメトキシフェノール(DMP)が重合し、ジクロロメタンに不溶性のポリマーが得られた。また、Lac標品を用いてアルカリリグニンおよびリグノスルホン酸に作用させたところ両リグニンに対する酸化能が認められ、特に前者からはラジカル酸化重合体と考えられる沈殿物が得られた。この反応においてはDMPがメディエーターとして作用してラジカル重合反応を促進することが推測された。さらに、スギ辺材をリファイナー処理して調製した機械パルプを、Sepharoseにて精製した市販ラッカーゼを添加して反応を行い、反応終了後、手すき器で作製したシートを熱圧処理した。得られたシートから試験片(15mm x 120mm)を調製し、引張強さを測定したところ引張り強度の向上がみられた。また、反応時にラッカーゼメディエーター(ABTS、HOBt)を添加することにより、更なる引張り強度の向上が認められた。このように、酵素処理により繊維間の結合が増強されることが明らかにされた。
MRI拡散画像による末梢神経の機能評価法確立のための基礎的研究

パルス磁場勾配NMR法を用いると生体組織中の水分子の自己拡散係数を非破壊的に測定することが可能である。この方法の1つの大きな特徴は、任意の方向への拡散係数を選択的に測定可能なことである。本研究では、MRI拡散画像による末梢神経障害の新しい評価法を確立するための基礎データを得るために、正常な成熟家兎の坐骨神経内の水分子の拡散係数をパルス磁場勾配NMR法により測定した。さらに、神経の走行方向に対して、平行、垂直方向の拡散係数を比較してその異方性について検討を加えた。末梢神経には3成分の拡散係数が存在し、早い拡散を示す分画から順に軸索内、細胞外間質、そしてミエリン細胞内の水の拡散係数であると同定した。軸索内の水の神経長軸方向への拡散係数は、これに垂直な方向への拡散係数の約2-3倍であり有意に異方性が存在した。末梢神経は構造上、最も強い方向性を持つ組織の一つである。今までに、末梢神経では水分子の拡散係数に異方性が存在することが明らかになった。この現象は神経組織の機能上きわめて重要であると考える。現在、ワーラー変性を生じた末梢神経における拡散係数を測定中であり、拡散係数の異方性が消失することが明らかになりつつある。
実験的片側精索捻転症における対側精巣障害の精細胞核DNA分布から見た定量的研究

Lewisラットを対象とした片側精巣捻転症ラットの成長後の雌ラットとの交配実験、精巣DNA量解析結果から、5週齢ラットでは片側の精巣捻転症による対側精巣の造精機能障害と妊孕性低下が確認された。さらに、5週齢Lewis雄性ラットを5群に分け、1群はコントロール群で、他の4群は、左精索捻転(1080度時計方向回転させ、精巣白膜を陰嚢皮下組織に6-0絹糸にて固定)作製後、4時間、8時間、12時間、24時間後に精索捻転を解除し、陰嚢内に固定、5週間後(雄性ラットは10週齢)に10週齢の雌性ラットと交配させ、胎児数、妊娠率を測定した。交配後、雄性ラットの精巣を摘出、Flow cytometryによる精細胞DNA量分布にもとづいたHaploid cell比率の測定、精細管直径、精巣上体重量を測定した。さらに採血、deep freezeし、下垂体-精巣系の内分泌学的動態を測定した。その結果、片側精巣回転症による精巣虚血が4時間、8時間となるにつれて成長後の雌ラットとの交配後の胎児数、妊娠率が低下の傾向を示し、さらに12時間を越すと、成長後の妊孕が有意に低下することが示され、さらに、精細胞DNA量の定量的解析ならびに下垂体-精巣系の内分泌動態の解析の結果、精細胞DNA量から測定した精細胞の成熟度も8時間以上の精巣虚血では、成長後に対側精巣の機能障害をきたすことが実証された。また、血清LH,FSH,テストステロンの測定の結果、これらの内分泌動態には異常を来さないことが実証された。以上の結果から、幼少時の精巣捻転症において、8時間以上の期間経過した捻転側精巣を整復、固定した場合、成長後に対側精巣の造精機能障害や不妊症をおこしうる事が確認され、臨床上、本症の治療において念頭におくべきことと考えられた。5週齢Lewis雄性ラットを5群に分け、1群はコントロール群で、他の4群は、精索捻転(1080度時計方向回転させ、精巣白膜を陰嚢皮下組織に6-0絹糸にて固定)作製後、4時間、8時間、12時間、24時間後に精索捻転を解除し、陰嚢内に固定した。術後、5週間目(雄性ラットは10週齢)に10週齢の雌性ラットと交配させ、胎児数、妊娠率を測定した。交配後、雄性ラットの精巣を摘出、Flow cytometryによる精細胞DNA量分布にもとづいたHaploid cell比率の測定を、これまでの筆者らの方法により(Andrologia,22:137-143,1990)施行した。また、精細管直径、精巣上体重量を測定した。ラット屠殺時に心臓穿刺により採血、deep freezeし、下垂体-精巣系の内分泌学的動態を測定した。その結果、片側精巣回転症による精巣虚血が4時間、8時間となるにつれて成長後の雌ラットとの交配後の胎児数、妊娠率が低下の傾向を示し、さらに12時間を越すと、成長後の妊孕性が有意に低下することが示され、現在、精細胞DNA量の定量的解析ならびに下垂体-精巣系の内分泌動態の解析が進行中である。

さらに、5週齢Lewis雄性ラットを5群に分け、1群はコントロール群で、他の4群は、左精索捻転(1080度時計方向回転させ、精巣白膜を陰嚢皮下組織に6-0絹糸にて固定)作製後、4時間、8時間、12時間、24時間後に精索捻転を解除し、陰嚢内に固定、5週間後(雄性ラットは10週齢)に10週齢の雌性ラットと交配させ、胎児数、妊娠率を測定した。交配後、雄性ラットの精巣を摘出、Flow cytometryによる精細胞DNA量分布にもとづいたHaploid cell比率の測定、精細管直径、精巣上体重量を測定した。さらに採血、deep freezeし、下垂体-精巣系の内分泌学的動態を測定した。その結果、片側精巣回転症による精巣虚血が4時間、8時間となるにつれて成長後の雌ラットとの交配後の胎児数、妊娠率が低下の傾向を示し、さらに12時間を越すと、成長後の妊孕性が有意に低下することが示され、さらに、精細胞DNA量の定量的解析ならびに下垂体-精巣系の内分泌動態の解析の結果、精細胞DNA量から測定した精細胞の成熟度も8時間以上の精巣虚血では、成長後に対側精巣の機能障害をきたすことが実証された。また、血清LH,FSH,テストステロンの測定の結果、これらの内分泌動態には異常を来さないことが実証された。
1930年代における困難児・障害児保育問題と保育科学の成立に関わる諸学の動向

本研究は、戦前の保育問題研究会が提起した「保育科学」の動向に着目し、障害乳幼児や発達困難幼児の「保育時代」の誕生というライフコースの変動に対して、関連諸学が保育科学として領域横断的に統合化される過程の解明を目的とした。21年度は、1930年代における障害乳幼児・発達困難児問題の顕在化を当事者のライフコースにおける「保育時代」の誕生の意味を社会史的視点から検討した。22年度は、保育科学の成立に向けた諸学の動向と統合化の過程を検討した。本年度は、1930年代における障害乳幼児・発達困難児問題の顕在化を当事者(子ども・家族)のライフコースにおける「保育時代」の誕生と仮定し、その意味を社会史的視点から検討した。具体的には、愛育研究所「異常児保育室」の実践を通して、障害児保育実践の成立過程とその意味を「異常児」とその家族、保育実践を支えた保姆の双方の視点から検討した。とりわけ、保育に携わった保姆・小溝キツの実践と思索を彼女の保育記録の読み解きを通じて明らかにし、戦時下における障害児保育実践の誕生の意味を考察するために、(1)小溝の発達観と保育観、(2)家族による「異常児」の子育てをめぐる心性、(3)時局と保育実践の間に立つ保姆としての自己意識や「異常児保育」の心性、という3つの分析視点を設定した。本研究にあたり、日本子ども家庭総合研究所図書室において、小溝キツに関する史料調査を実施した。愛育研究所の「異常児保育」は、従来看過されてきた「幼児時代の異常児」を包摂する新たな実践として立ち上がってきたのであり、それは障害児保育実践の誕生を意味した。異常児保育は人的資源論や優生問題として言説化され、「幼児時代の異常児」の早期介入、統制として構想されていたが、実践の具体相には戦争というイデオロギーやファクターに回収されない「保育実践」の世界が認められた。「異常児」を「いかに生かすか」という「異常児保育」は、小溝に保姆として「いかに生きるか」という問いと矜持を鋭く内面化させるものであり、国家目標や時局認識も、矛盾なく子どもの発達を追求する保育として実践化されていた。上記の研究成果は、幼児教育史学会第5回大会(2009年12月5日、法政大学)において「障害児保育実践の誕生-「異常児保育」と保姆・小溝キツ-」の題目で口頭発表し、同学会誌(幼児教育史研究)に投稿中である。本年度は、保育科学の成立に向けた諸学の動向と統合化の過程を検討した。とくに、保育科学と関連諸学における発達論の形成過程に着目し、城戸幡太郎学派の研究動向を検討した。具体的には、(1)波多野完治の自我研究と社会性研究、(2)山下俊郎の乳児研究と基本的生活習慣の研究、(3)正木正の性格心理学研究を分析して、発達における障害の認識とその発達的助成の方法論がどのように構築されたのかを検討し、保育科学の中心課題として「発達と障害」の理論が据えられていたことを考察した。史料としては、保育問題研究会『保育問題研究』、教育科学研究会『教育』、児童学研究会『教材と児童学研究』等の機関誌における論稿を中心に検討した。上記の作業を通して、諸学が既存の対象論・方法論に自己限定することなく統合され、保育科学として成立してくるプロセスを考察した。上記の研究成果の一部は、「戦時下における小溝キツと「異常児保育」-保育記録にみる障害児保育実践の誕生-」幼児教育史学会『幼児教育史研究』第5号(2010年12月刊行)として論文化し、「恩賜財団愛育会と戦時下の障害児保育問題」とのタイトルで比較教育社会史研究会2010年度秋季大会(2010年10月)において報告した。
電気インピーダンス測定によるナノ界面空間の静的・動的構造の解明

電気インピーダンス計測によりナノ流路内のイオン分布と輸送現象を評価した。その結果,流れがある場合,流れが無い状態に対して電気二重層の厚さが薄くなるという結果を得ることが出来た。さらに,電気二重層がオーバーラップする程に細いナノ流路内では,表面電荷を打ち消すカウンターイオンでナノ流路内が占められていると考えられ,Grahameの式で見積もった表面電荷量をDebye-Huckel-Onsager式にフィードバックして抵抗値に換算したところ,ナノ流路表面の表面電荷に制限された抵抗値が得られ,低濃度側における電気二重層のオーバーラップ状態の抵抗値と非常に良く一致することを明らかとした。本年度は,まず測定デバイスを作製し,電気インピーダンスによる直接測定からナノ流路内のイオン分布と輸送現象を評価した。デバイスは,当初計画の通り,4大学コンソーシアム(東大,東工大,早稲田大,慶応大)で共同運用しているMEMS加工装置群を利用して作製した。電気インピーダンス測定に関しては,研究が予定よりも大幅に進み,H26年度とH27年度に実施予定であった,様々なイオン種を用いた測定と,「流れがある」状態での測定にも踏み込み,約2年の研究前倒しで予想以上に順調に進んでいる。具体的には,過去の研究例が多く,参照データが豊富なKCl溶液をサンプル溶液として用い,KCl濃度を1nM1Mの範囲で変化させつつ,電極ギャップ(流路幅)がそれぞれ数10nm1μmのナノ流路で電気インピーダンスを測定した(測定周波数はDC10MHz)。さらに,同様の実験を流れがある状態でも実施し,流れの有無がナノ流路内のイオン分布に与える影響も調べた。その結果,静的な状態におけるイオン濃度が電気二重層の厚さに与える影響を明らかとした上で,かつ,流れがあると連続的にキャリアイオンが供給されるため,長期連続的な測定が可能となること,及び「流れが無い」状態に対して電気二重層の厚さが薄くなるという結果を得ることが出来た。再現性・定量性の面で確認が必要であるのでH26年度も追試を行うが,基本的にはH25年度だけでなく,H26年度に実施予定していた実験まで達成した。一方,H27年度に実施予定であった,イオン半径や水和半径の影響に関しては,KCl,NaCl,LiCl,MgCl2,AlCl3などのイオン半径や水和半径,および価数の異なる様々なイオンを網羅的に測定し,水和半径や価数が電気二重層の厚みに与える影響,およびナノ流路内の導電率や誘電率に与える影響を網羅的に評価し,その基礎現象を明らかとした。イオンの影響を一気に明らかとするため,価数やイオン半径が異なる様々なイオンを網羅的に評価してナノ流路内のイオン分布構造の解明に取り組んだ。KCl, NaCl, LiCl, MgCl2, AlCl3をサンプルに用い,アニオンはCl-で共通とした状態におけるカチオンの価数およびイオン/水和半径の違いが,イオンの移動度と結果として得られる電流値に対してどのように相関するかを調べた。その結果,10-5M付近の濃度を境にして,高濃度側と低濃度側で異なるトレンドを示すことが明らかとなった。10-5M以上の高濃度側における溶液抵抗の実測値は,抵抗値の高い順にLiCl> NaCl> MgCl2 > KCl > AlCl3の順番であった。これはDebye-Huckel-Onsager式により求めた理論値と良い一致を示すことを明らかとした。さらに電気二重層がオーバーラップする程に細いナノ流路内では,流路表面からの強い静電的拘束や壁面に衝突するなどにより拡散が制限されるため,バルクに比べて高い粘度を示すことが予想される。本測定における低濃度側がこの条件に当たり,例えば,519nm幅の流路に対し77nm幅の流路では,K+の粘度は約2.5倍,Al+に関しては約3倍の粘度を示した。すなわち,低濃度側の抵抗値は,ナノ界面空間特有の粘度変化によるものであることが明らかとなった。さらに低濃度側では内部空間が電気二重層で占められるので,程度の差こそあれ表面電荷を打ち消すカウンターイオン(この場合はカチオン)でナノ流路内が占められていると考えられ,Grahameの式で見積もった表面電荷量をDebye-Huckel-Onsager式にフィードバックして抵抗値に換算したところ,ナノ流路表面の表面電荷に制限された抵抗値が得られ,低濃度側における電気二重層のオーバーラップ状態の抵抗値と非常に良く一致することを明らかとした。以上,静電力だけでなく流体の流れ場の影響まで含めたイオン分布構造まで踏み込んで明らかとすることに成功した。ナノメートルサイズの断面を持つナノ流路を合目的に利用した,生体分子の電気的1分子測定デバイスの開発にあたっては,流路幅が壁面付近の固液界面に形成される電気二重層幅と同じオーダーであるため,場合によっては内部空間の全てが電気二重層に埋もれてしまう特殊な空間となる。そこで,これまではナノ流路における電気測定の高感度化・高精度化を目指し,こうしたナノ空間の構造の研究を進めてきた。今年度は,これまでに明らかとしたナノ流路内のイオン分布を元に解析モデルを構築し,ナノ流路内における生体分子の電気的1分子測定に挑戦した。具体的には,これまでの成果を反映したナノ流路内の電気等価回路モデルを構築し,これを元にDNA1分子の電気インピーダンス測定と構築したモデルによるデータ解析を行った。

その結果,長さ5kbpのDNAまでに関しては,1分子(モル濃度で約420fM)で計測できることを世界で初めて実証にすることに成功した。当初計画全体の目標であった,ナノ流路内のイオン分布の構造に関して明らかとしただけで無く,そこで得られた知見を元にナノ流路内の電気的等価回路をモデリングし,実際に生体分子(DNA)の1分子計測で得られた電気インピーダンスデータを,上記の等価回路で分析することで,DNA1分子の電気インピーダンスシグナルの取得に成功した。液中の電気インピーダンス計測としては世界最高感度を実証することに成功したため。ナノメートルサイズの断面を持つナノ流路では,流路幅が壁面付近の固液界面に形成される電気二重層幅と同じオーダーとなる場合があり,場合によっては内部空間の全てが電気二重層に埋もれてしまう特殊な空間となるため,イオン分布や移動度はバルクと異なる事が予想される。ナノ流路における電気測定の高感度化・高精度化にあたっては,こうしたナノ空間の構造の理解が重要となる。そこで本研究では,電気インピーダンス測定によりナノ流路内の物理構造を直接測定し,バルクとの違いを明らかとする。さらに,ナノ流路の内部空間を電気等価回路でモデリングする解析手法を確立し,実験と解析手法の両面から,ナノ流路内における電気的1分子測定の高感度化と高精度化にアプローチした。まず測定デバイスを作製し,電気インピーダンスによる直接測定からナノ流路内のイオン分布と輸送現象を評価した。具体的には,過去の研究例が多く,参照データが豊富なKCl溶液をサンプル溶液として用い,KCl濃度を1nM1Mの範囲で変化させつつ,電極ギャップ(流路幅)がそれぞれ数10nm1μmのナノ流路で電気インピーダンスを測定した。さらに,同様の実験を流れがある状態でも実施し,流れの有無がナノ流路内のイオン分布に与える影響も調べた。その結果,静的な状態におけるイオン濃度が電気二重層の厚さに与える影響を明らかとした上で,かつ,流れがあると連続的にキャリアイオンが供給されるため,長期連続的な測定が可能となること,及び「流れが無い」状態に対して電気二重層の厚さが薄くなるという結果を得ることが出来た。さらに,KCl,NaCl,LiCl,MgCl2,AlCl3などの水和半径や価数の異なる様々なイオンを網羅的に測定し,水和半径や価数が電気二重層の厚みに与える影響,およびナノ流路内の導電率や誘電率に与える影響を網羅的に評価し,その基礎現象を明らかとした。電気インピーダンス計測によりナノ流路内のイオン分布と輸送現象を評価した。その結果,流れがある場合,流れが無い状態に対して電気二重層の厚さが薄くなるという結果を得ることが出来た。さらに,電気二重層がオーバーラップする程に細いナノ流路内では,表面電荷を打ち消すカウンターイオンでナノ流路内が占められていると考えられ,Grahameの式で見積もった表面電荷量をDebye-Huckel-Onsager式にフィードバックして抵抗値に換算したところ,ナノ流路表面の表面電荷に制限された抵抗値が得られ,低濃度側における電気二重層のオーバーラップ状態の抵抗値と非常に良く一致することを明らかとした。本年度は,ナノ流路内のイオン分布が流れの有無によってどのように変化するかの測定を目指していた。それに対し今年度は,単に流れの有無だけでなく,溶質として溶けているイオン半径や価数の異なる様々なイオンに対する網羅的な測定から,ナノ流路内のイオン分布の静的,および動的構造を一気に明らかとした。
バキュロウイルスによる共有結合型フラビン酵素のアポタンパク質の産生とその再構成

高等真核生物における共有結合型フラビンの形成メカニズムを解明するため,ラットのグロノラクトン酸化酵素(GLO)のアポタンパク質をバキュロウイルスを用いて作るための細胞培養系の確立を試みた。まず,ラットGLOのcDNAをカイコ多核体病ウイルスへ組み込んで組換え体ウイルスを作製し,これをカイコ培養細胞BMN4へ感染させてGLOを発現させた。発現の確認は酵素活性の測定とウエスタンブロット法で行った。GLOを発現した細胞の抽出液は,ラット肝臓のミクロゾーム画分と同程度の比活性を示し、GLOの高レベルの発現を実現できた。また,FADが酵素タンパク質に共有結合していることを,SDS-ゲル電気泳動後にフラビンの蛍光を発するバンドを検出することによって証明した。次に,リボフラビン欠乏条件下で組換え体ウイルスを細胞に感染させると,発現されたGLOタンパク質の大部分がアポ型であることを,細胞抽出液へのFADの添加によって酵素活性が著明に増加することにより確認した。FADの添加によって得られた活性は,通常の培養条件で発現したGLOと等しかった。しかし,FADのアポタンパク質への共有結合は起きていなかったので,活性発現には共有結合は必要でないことが分かった。さらに,FADが結合すると予想されるヒスチジン残基を部位特異的突然変異によってセリン,システインないしチロシンに変えた変異型GLOをバキュロウイルスを用いて発現させると,細胞抽出液のGLO活性は正常のGLOを発現させたものに比べ低いが,これにFADを添加すると活性が回復した。この事実から,アミノ酸の置換によって共有結合が起きないために変異型GLOはアポタンパ質として生成されるものと考えられる。
診断群分類包括評価データの人工知能解析を基盤とする新規の集中治療管理戦略

私は東北大学病院集中治療室における統合ビックデータの構築のため、東北大学病院に分散している非構造化データを一元化し、解析可能な構造化データへの変換し、集中治療室入室患者の重症度とコストの関係を分析し、患者の重症度変化に応じた、最適な医療資源の分配と最大の診療効果を上げる治療を導き出すアルゴリズムを開発することを計画した。この統合ビッグデータを構築するため、パネルデータベース用サーバーの設置し、周術期部門システムベンダーの協力の下、患者重症度スコア等のデータクリーニングを行ったうえで、過去5年分の東北大学集中治療室入室患者の集中治療部門システムデータ、生体情報ベットサイドモニターデータを転送した。また、病院診療録データ、DPC/PDPSデータについても大学病院医事課の協力のもと材料費、労務費、経費データを取得し、データを転送、統合した。この統合ビッグデータを用いて当院集中治療室における原価計算を行った。この計算によると、2017年単月において、費用を除いた材料費と労務費の合計が75,710,585円とすでに収入の74,748,228を上回っており、費用を加味すると大幅な赤字であることが判明した。この結果の一部は第46回日本集中治療医学会学術集会にて報告した。また、重症度とコスト予測の関連において、看護必要度に重症度スコアであるSOFAスコアを加えると、コスト予測精度が上がる傾向があることが分かった。この統合データベースは今後も運用可能であるため、さらに深層学習による1日ごとの重症度、医療コスト、診療報酬額の解析を継続する。私は平成29年度は東北大学集中治療室における統合ビックデータの構築のため、東北大学病院に分散している各データを一元化し、解析可能な構造化データへの変換することを計画した。この中で、現在パネルデータベース用サーバの設置を完了し、過去5年分の東北大学集中治療室入室患者の集中治療部門システムデータ、生体情報ベットサイドモニターデータを転送中である。また、病院診療録データ、DPC/PDPSデータ,レセプトデータについては、現在大学関係各所へデータ出力の依頼を行い、データ出力の調整中である。上記の過去の東北大学集中治療部におけるデータセットはノイズが大きいため、データクリーニングを行なっている。また、本研究で重要となる臨床的な重症度を、周術期部門システムベンダーの協力の下、集中治療部門システムのスコアリング項目に患者重症度のスコアリングシステムを内蔵し、患者重症度スコアであるAPACHE2とSOFAを前向き及び後向に入力中である。本研究の終盤に、比較検討に使用する予定である、集中治療室入室患者のナショナルデータとなり得る日本集中治療医学会のレジストリデータベースである日本ICU患者データベース(JIPAD)に登録を完了し、JIPAD用サーバーの設置し患者登録を開始した.当初の予定よりもやや遅れてはいるが、しっかりデータクリーニングを行った上で構造化データを構築し分析を行う事が、本研究では重要になるため、データベース構築に時間をかけている。東北大学ICUにおける統合ビックデータの構築を構造化データへの変換のためデータサーバーを設置したが,その選定,納品が遅れたことでデータの流し込みのタイミングが遅れている.また、1次データのクリーニングに時間を要している。深層学習による重症度,医療コスト,診療報酬額の解析を平成29年度中に開始予定であったが,現在そのもととなるパネルデータを作成中である.データベース構築終了後,すぐに分析を開始する予定である.分析が開始できれば,外部機関と協働し,ヒューリスティック探索とアルゴリズム解析へ移行することが可能となり,現在進めている日本集中治療患者データベースとの比較を合わせて行っていく.理由計画がやや遅れており、軽度予算執行が遅れているため。使用計画次年度の分析に適切に使用する。
インド中世の宮殿建築の寸法計画に関する史的研究

本研究課題の最終年度である今年度も、過去2年同様、インドの中世ヒンドゥー宮殿の現地調査を実施した。(平成16年8月22日から9月22日)今回は西インド・ラージャスターン州に位置するチットールガル市の城塞に遺された3つの宮殿、ラナ・クンバ宮殿、カンワル・パーダ宮殿、パッタズ宮殿について、その遺構を管理するインド考古局ジャイプール支局から調査許可を得て、スケッチ作成、実測および写真撮影を行ったた。その他、西インドに遺された宮殿建築、特にジョドプールの宮殿およびグジャラート・カッチ地方中心都市ブジの宮殿の実地調査および写真撮影を行った。その現地調査の成果として以下の2点が挙げられる。(1)ラナ・クンバ宮殿の主要部分についての実測を行い、インド考古局による修復中の箇所を除き、詳細の平面構成をスケッチし、それらの寸法を把握した。また寸法を把握する過程において、平面計画上の軸線が複数あることがはっきりした。装飾様式の変化などを含め、さらに詳細の検討を要するが、この大きな宮殿の歴史的な変遷を考える基本的なデータとなる。(2)カンワル・パーダ宮殿およびパッタズ宮殿については、最少単位の宮殿構成の寸法把握を行った。特に後者の宮殿については周辺の付属施設を含めた敷地全体の構成や基本的な寸法を押さえることができた。この内容は既往の文献では全く扱われておらず、貴重なデータと考えている。以上、今年度の調査で得られたデータは前年度までの調査対象のデータとあわせて比較・考察することでより総合的な結論を導きだせると考えており、日本建築学会計画系論文集および建築史学にまとめた報告をすると共に、検討結果を論文としてまとめていく予定である。本研究の3年計画の初年度である平成14年度は、インドのヒンドゥー宮殿建築の実測をはじめとした実地調査を行い,寸法を把握するためのデータ収集および整理と実測図面の作成を行うことが主な作業であった。実測については,時間的および予算的制約もあり,数多く対象にすることは実際上不可能であるため、この年度はマッディヤ・プラデーシュ州グワーリオールのキルッティ・マンディール(15c.半ば)及びマン・マンディール及びグジャリ・マハール(ともに15c.後半)をとりあげ,実測調査及び寸法体系に関する研究を推進するための様々なデータを収集し、検討を行った。特に、平成14年10月13日27日にかけて行ったインドでの現地調査においては、これらの建築遺構の管理を行うインド考古調査局ボーパール支局およびグワーリオールのジワジ大学、そしてマッディヤ・プラデーシュ州考古局の配慮を得、(1)その地の代表的宮殿であるマン・マンディールについての寸法把握のための実測調査を実施し、(2)グジャリ・マハールについては現況調査と寸法把握手法の検討および写真データ収集、そして(3)キルッテイ・マンディールに関しては2年前に行った調査の補足調査を行った。さらに、先に述べた国および州政府の機関と現地大学の研究者とは本研究に関する次年度以降の研究調査に関しての調整も行った。そして今年度の現地調査の結果に関する報告を日本建築学会2002年度関東支部研究発表会(2003年3月68日実施)にて行った。本研究の3年計画の2年目にあたる平成15年度は、前年度に引き続き、インドの中世ヒンドゥー宮殿の現地調査を実施した(平成15年12月20日平成16年1月10日)。現地調査にあたっては、グワーリオール市のジワジ大学シャルマ氏の配慮のもと、マッディヤ・プラデーシュ州政府考古局および博物館からグジャリ・マハル及びジャハンギール・マハルの調査許可及び実施にあたっての配慮を得た。その現地調査の成果として、次の3点が挙げられる。(1)15世紀後半に建設されたとされるグジャリ・マハール(現州政府考古博物館)については、前年度は予備調査を行うにとどまったが、今年度はその基準階平面の実測を実施し、壁・柱の配置に関わる寸法を把握するとともに、現在までになされてきた改造部分の把握を中心に、建設当初の状況を詳細に把握した。(2)オルッチャにある17世紀に建設されたジャハーンギール・マハールの平面構成(プランおよび用途)の調査および基準寸法の計測、構造体や壁画等の遺構残存状況の把握を野帳作成し、写真撮影を行った。(3)インドの文化遺産保護のNPO組織であるIndian National Trust for Art and Cultural Heritage (INTACH)を訪問し、当組織によるオルッチャの建築遺産(町並みを含む)全般について行われた過去の調査成果に関する資料、およびジャハーンギール・マハールに関わる調査資の写しを参考質料として入手した。また、平成16年度調査(ラージャスターン州チットールガルにあるラナ・クンバ・パレス)実施に向けて、ジワジ大学でのアドバイスを受け、かつ遺構管理をしているインド考古局の研究者との調整も今年度調査時にあわせて行った。

その他、西インドに遺された宮殿建築、特にジョドプールの宮殿およびグジャラート・カッチ地方中心都市ブジの宮殿の実地調査および写真撮影を行った。その現地調査の成果として以下の2点が挙げられる。(1)ラナ・クンバ宮殿の主要部分についての実測を行い、インド考古局による修復中の箇所を除き、詳細の平面構成をスケッチし、それらの寸法を把握した。また寸法を把握する過程において、平面計画上の軸線が複数あることがはっきりした。装飾様式の変化などを含め、さらに詳細の検討を要するが、この大きな宮殿の歴史的な変遷を考える基本的なデータとなる。(2)カンワル・パーダ宮殿およびパッタズ宮殿については、最少単位の宮殿構成の寸法把握を行った。特に後者の宮殿については周辺の付属施設を含めた敷地全体の構成や基本的な寸法を押さえることができた。この内容は既往の文献では全く扱われておらず、貴重なデータと考えている。以上、今年度の調査で得られたデータは前年度までの調査対象のデータとあわせて比較・考察することでより総合的な結論を導きだせると考えており、日本建築学会計画系論文集および建築史学にまとめた報告をすると共に、検討結果を論文としてまとめていく予定である。
パイプライン化された依存性グラフからの高速非同期式プロセッサの生成

本研究では、パイプライン動作を表現した依存性グラフ(プロセッサ内で実行される部分処理(基本操作)間の実行順序や条件分岐などを記述した有向グラフ)から、効率的に動作する2相非同期式回路を生成する手段を得ることを目的とし、その基本アルゴリズムを開発した。まず、バイプライン動作を表す依存性グラフを、より効率的に作成するため、以前に開発した依存性グラフのパイプライン化アルゴリズムを抜本的に改良した。次に、以上の研究成果を用いてより一般的な依存性グラフを用いて試験した結果、前年度に開発したアルゴリズムでは、一定の条件を満たしたクラスの依存性グラフにしか適用できないことが判明した。そのため、やはり、条件分岐を含まない場合に限定し、アルゴリズムを改良した。改良したアルゴリズムでは、バイプライン動作を表現した依存性グラフが、動作ステージ間でループ構造を構成する点に着目し、これらのループ構造ごとに、ループの最初に実行される基本操作と最後に実行される基本操作の相を反転させるように、グラフを構成し直す。これによって、並列に動作すべき基本操作対において、稼動相どうしが並列に動作できる2相依存性グラフが生成できるようになった。本アルゴリズムが、上記前提のもとで正当であることについても、ループ構造ごとの繰り返し適用である点に着目し、そのループ構造の複雑度に関する帰納法を適用することで証明可能となった。本方法では、条件分岐を含まない場合に関しては、その目的を達成したが、条件分岐を含む場合のアルゴリズムは未完成である。この点は、条件分岐を含む依存性グラフの構造を、上述のように一般的な構成要素に分解することによって可能となると考えられる。本研究では、パイプライン動作を表現した依存性グラフ(プロセッサ内で実行される部分処理(基本操作)間の実行順序や条件分岐などを記述した有向グラフ)から、効率的に動作する2相非同期式回路を生成する手段を得ることを目的とし、本年度は、その原理と条件分岐を含まない場合の基本アルゴリズムを開発した。本方式では、まず、依存性グラフを次のように標準化する。(1)並列動作の開始を極力早く、待合せを極力遅く実行するようにグラフを変形する。(2)パイプライン動作をしない基本操作間に通常方向の枝が省略されている場合、これを付加する。次に、どの時点で次の回の処理を開始できるかを表す逆方向の枝を2分し、対応する通常方向の枝に対して交叉するように接続する。このようなグラフにおいて、1と0のサイクルによる動作を対応づけると、この基本操作の対は、1と0のサイクルが反転して実行されるようになる。この結果、パイプラインによって並列に動作すべき基本操作の対は、同サイクル内で並列に実行される。これによって、最初の依存性グラフで表現されていたパイプライン動作をそのまま保持しつつ、グラフと回路の動作が1対1に対応するようなグラフ(2相依存性グラフ)が生成できる。最後に、この2相依存性グラフを、従来とほぼ同じように回路にマッピングすることにより、もとの依存性グラフで表現されているとおりにパイプライン動作する2相非同期式回路が得られる。本方法では、現在のところ以下のような点が未解決である。(1)条件分岐を含む場合に対応できない。(2)依存性グラフを標準化する際、冗長な枝が付加されるので、生成される回路が大きくなるおそれがある。これらの点は、次年度に解決すべき課題である。
ヒストンアセチル化酵素による関節リウマチ滑膜細胞の日内リズム調節機構の解明

これまでの研究で、関節リウマチ(RA)滑膜細胞において、炎症性サイトカインTNF-αによる時計遺伝子Bmal1発現のかく乱機構に、ヒストンアセチル化酵素p300/CBPが関与していることを明らかにした。平成30年度の実績として、RNA干渉実験から、1Bmal1は細胞周期調節因子サイクリンE1のactivatorとして機能することを明らかにした、2しかしBmal1遺伝子を発現抑制しただけでは、TNF誘導性のサイクリンE1遺伝子発現増加をキャンセルすることはできなかった。3実際、Bmal1を抑制した細胞では、TNFαによる細胞増殖へは影響しなかった。上記1-3により、TNFαによる細胞増殖誘導はBmal1を介さず、別の経路で起こっている、あるいはBmal1遺伝子単独を発現抑制するだけでは不十分な可能性が考えられた。一方、Bmal1と同様にROREを有する、あるいは有する可能性が示唆される分子で、かつRAの病態形成に深く関わる分子として、細胞遊走に関与するケモカインCCL2、サイトカインIL6、軟骨破壊に関与するMMP3にも着目した。これらの分子においても、4Bmal1と同様にp300/CBPをsiRNAや阻害剤を用いて抑制すると、TNFαによる発現誘導が抑制されていた。5特にCCL2については、RORα阻害剤とReverbα誘導剤の共投与によっても、TNFαによる誘導を抑制することができた。6さらに、p300/CBP阻害剤で前処理後にTNFα刺激した上清(この上清は上記ケモカインが抑制されている)は、DMSOで前処理後にTNFα刺激した上清(対照群)と比較して、RA滑膜細胞の遊走を誘導することができなかった。7また、生物学的製剤投与前後の時計遺伝子発現を比較した結果、一部の時計遺伝子群は疾患活動性と相関していた。前年度までの結果により、TNF-αが時計遺伝子を撹乱する機構を初代培養系滑膜細胞において明らかにすることができた。今年度は当初予定していた、CBP/p300結合DNA量に及ぼす影響の検討(ゲルシフトアッセイ)、TNF-αによるRORα, Reverb αプロモーター領域のヒストンアセチル化に及ぼす影響の検討(クロマチン免疫沈降法)、TNF-αによるRORα/ Reverb α遺伝子プロモーター活性に及ぼす影響の検討(ルシフェラーゼアッセイ)について実験系の確立に時間がかかり実現できていない。一方でBmal1を標的にして、滑膜細胞の増殖機構を抑制できるか検討したが、予想に反してBmal1単独ではTNFαによる細胞増殖誘導を抑制できなかった。一方、Bmal1と同様にROREを有するケモカインCCL2等は、これまでBmal1に行ってきた結果と同様の現象が見られた。このCCL2等による遊走作用は、ヒストンアセチル化酵素p300/CBPの阻害によって抑制できることが確認できた。したがって、Bmal1を介したRA滑膜細胞の増殖機構については研究途上のところがあるが、その一方で遊走や軟骨破壊に対してはヒストンアセチル化酵素からROREを介した調節機構が明らかになりつつあり、新たな研究の進展がみられている。加えて、当初平成31年度に予定していた生物学的製剤の投与前後の時計遺伝子の変化も解析が進んでいる。これらの結果の一部は学会発表や論文として成果報告することができており、総じて考えると概ね順調に進展していると思われる。12018年度に実験系を確立できなかった検討を実施する。2ヒストンアセチル化酵素阻害剤C646を用いた実験により、TNFα誘導性CCL2を抑制することができたため、今後はC646がCCL2の機能、すなわち細胞遊走能や増殖に与える影響を検討する。3生物学的製剤の投与前後による時計遺伝子群の発現解析は順調に進んでおり、これらに加えてヒストンアセチル化酵素の発現解析を行う。4in vivo実験として、関節炎モデルマウスを作成し、C646の治療効果を検討する。これまでの研究で、関節リウマチ(RA)滑膜細胞において、炎症性サイトカインTNF-αによる時計遺伝子Bmal1発現量の増加は、転写活性因子RORαの増加と転写抑制因子Reverbαの減少によって起こることを明らかにしている。またこのRORα増加はカルシウムシグナルを介する経路を通り、Reverbαの減少はカルシウムシグナルを介さない経路を通ってBmal1の増加をもたらすことことも見出している。平成29年度の実績として、1TNF-α刺激によりRA滑膜細胞内のp300 mRNA発現量はわずかに増加した一方、p300と協調して作用するCREB-binding protein(Cbp)発現量には変化がなかった。2また、カルシウムキレート剤であるBAPTA-AMを用いて、細胞内カルシウムイオンの流入を阻害した場合、TNF-α刺激によってp300、CbpともにmRNA発現量が有意に低下した。この結果はBmal1を調節する転写抑制因子Reverbαの結果と同様のものであった。このことは細胞内カルシウムイオン濃度によってp300やCbpのmRNA発現量が調節されていることを示すものである。3次に、RNA干渉によってp300とCbp発現量を共に抑制したRA滑膜細胞を作製し、TNF-α刺激をおこなった。その結果、TNF-α誘導性のBmal1増加が抑制された。またこの時の転写抑制因子Reverbαの減少と転写活性因子RORαの増加も抑制されていた。4さらに、p300/CBP阻害剤であるC646を前処理した場合においても、3の結果と同様の現象が確認された。すなわち、TNF-αによるBmal

1遺伝子の撹乱機構にヒストンアセチル化酵素が関与していることを、RNA干渉や阻害剤を用いた実験系から示すことができたと考える。TNF-α刺激による時計遺伝子Bmal1発現増加がどのようにして起こるかという課題に取り組み、そこにはカルシウムシグナルを介した経路と介さない経路が存在すること、またいずれの場合においてもBmal1を増加させるように転写因子が作用していることが明らかになった。また、これらの機構にはヒストンアセチル化酵素が関与していた。当初予想された結果とはやや異なる結果が得られたが、その本質は変わらず、TNF-αが時計遺伝子を撹乱する機構を初代培養系滑膜細胞において明らかにすることができた。したがって当該年度は順調に計画を達成できていると考える。これまでの研究で、関節リウマチ(RA)滑膜細胞において、炎症性サイトカインTNF-αによる時計遺伝子Bmal1発現のかく乱機構に、ヒストンアセチル化酵素p300/CBPが関与していることを明らかにした。平成30年度の実績として、RNA干渉実験から、1Bmal1は細胞周期調節因子サイクリンE1のactivatorとして機能することを明らかにした、2しかしBmal1遺伝子を発現抑制しただけでは、TNF誘導性のサイクリンE1遺伝子発現増加をキャンセルすることはできなかった。3実際、Bmal1を抑制した細胞では、TNFαによる細胞増殖へは影響しなかった。上記1-3により、TNFαによる細胞増殖誘導はBmal1を介さず、別の経路で起こっている、あるいはBmal1遺伝子単独を発現抑制するだけでは不十分な可能性が考えられた。一方、Bmal1と同様にROREを有する、あるいは有する可能性が示唆される分子で、かつRAの病態形成に深く関わる分子として、細胞遊走に関与するケモカインCCL2、サイトカインIL6、軟骨破壊に関与するMMP3にも着目した。これらの分子においても、4Bmal1と同様にp300/CBPをsiRNAや阻害剤を用いて抑制すると、TNFαによる発現誘導が抑制されていた。5特にCCL2については、RORα阻害剤とReverbα誘導剤の共投与によっても、TNFαによる誘導を抑制することができた。6さらに、p300/CBP阻害剤で前処理後にTNFα刺激した上清(この上清は上記ケモカインが抑制されている)は、DMSOで前処理後にTNFα刺激した上清(対照群)と比較して、RA滑膜細胞の遊走を誘導することができなかった。7また、生物学的製剤投与前後の時計遺伝子発現を比較した結果、一部の時計遺伝子群は疾患活動性と相関していた。前年度までの結果により、TNF-αが時計遺伝子を撹乱する機構を初代培養系滑膜細胞において明らかにすることができた。今年度は当初予定していた、CBP/p300結合DNA量に及ぼす影響の検討(ゲルシフトアッセイ)、TNF-αによるRORα, Reverb αプロモーター領域のヒストンアセチル化に及ぼす影響の検討(クロマチン免疫沈降法)、TNF-αによるRORα/ Reverb α遺伝子プロモーター活性に及ぼす影響の検討(ルシフェラーゼアッセイ)について実験系の確立に時間がかかり実現できていない。