hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨格筋不死化細胞に由来する筋知覚神経軸索伸長因子の解析とクローニング

本研究の目的は、障害を受けた末梢神経,特に筋収縮情報を中枢へ伝達する筋知覚神経の再生をめざして,ラット筋芽細胞由来の知覚神経軸索伸長因子を生化学的に同定し、クローニングすることである。そこで平成16年度は平成15年度の成果を踏まえ以下の研究を行った.ラット筋芽細胞株L6より,すでに平成15年度に確立した方法で伸長活性を有するL6培養上清(L6CM)を調製し,生化学的方法により濃縮を行い,MS/MS解析を行った.その結果Pigent epithelium-derived factor(PEDF)という黒色色素細胞に由来する成長因子が複数のバンドで検出された.そこで,本年度はPEDFをラットL6細胞よりRT-PCRによりクローニングし,大腸菌発現ベクターpGEX6Pベクターにサブクローニングし,大腸菌においてepitope-tagging融合蛋白質として発現させ調製した.しかし,これらの蛋白質にはニワトリ胚由来後根神経節細胞器官培養系における軸索伸長評価系においてL6CMに認められるような顕著な活性は認められなかったが,シュワン細胞の遊走性を活性化することが明らかになった.したがって,PEDFはL6CMにおける筋知覚神経の神経軸索伸長活性の本体ではないと予想された.そこで,さらに他のバンドに由来する分子を検討したところ,Insulin like Growth Factor I Binding Protein 6(IGFBP6)が見出された.IGFそのものはMS/MS解析では範囲外のバンドであったが,IGF-Iが本体である可能性が示唆されたので,IGFの効果を検証したところ,L6CMと同等の活性があることが明らかになった.IGF-Iの筋知覚神経軸索の伸長活性の分子機序については未だ不明の部分が多いが,今後,IGF-I/IGFBP6複合体の筋知覚神経の軸索伸長における作用機序,またin vivo除神経モデル動物における神経軸索再生時の作用機序についてさらなる研究が必要である.本研究の目的は、障害を受けた末梢神経,特に筋収縮情報を中枢へ伝達する筋知覚神経の再生をめざして,ラット筋芽細胞由来の知覚神経軸索伸長因子を生化学的に同定し、クローニングすることである。そこで平成15年度は以下の研究を行った.L6細胞をgrowth media (DMEM/10%FBS)でCO_2インキュベータ中で培養し、100%cf.に達した時点でinduction media (DMEM/0.5%FBS)に培地交換した。6日間培養した後、培養上清を採取した(以下、この細胞上清をL6CMと呼ぶ)。ヘパリンカラムにL6CM中の活性因子を結合させ、グラディエント溶出法によって分画を行った結果,500mM NaCl溶出フラクションに神経軸索伸長活性が認められた.凍結乾燥により濃縮を行ったあと,通常の方法によりSDS-PAGEを行い分離した.サイプロルビー染色を行い,ゲルから直接バンドを切り出し,抽出したタンパク質をプロテアーゼ処理によって断片化してMS/MS解析を行った.活性のある500mMNaCl分画中に含まれる270KDa,68KDa,46KDa,40KDa,36KDa,35KDa,32KDa,30KDa,25KDa,15KDaの10種類のバンドのMS/MS解析の結果,Pigent epithelium-derived factor (PEDF)という黒色色素細胞に由来する成長因子が複数のバンドで検出された.おそらくタンパク質のデグラデーションによるものと思われる.ウシ由来でなくラット由来のPEDFが検出されたことで,このタンパク質がL6細胞により分泌されていることが予想された.そこで,L6細胞が本当にPEDFを発現しているかRT-PCRを行ったところ,実際にPEDFを発現していることが確認された.すでにPEDFのクローニングは終了し,次年度に向けて現在大腸菌でリコンビナントを作成中である.本研究の目的は、障害を受けた末梢神経,特に筋収縮情報を中枢へ伝達する筋知覚神経の再生をめざして,ラット筋芽細胞由来の知覚神経軸索伸長因子を生化学的に同定し、クローニングすることである。そこで平成16年度は平成15年度の成果を踏まえ以下の研究を行った.ラット筋芽細胞株L6より,すでに平成15年度に確立した方法で伸長活性を有するL6培養上清(L6CM)を調製し,生化学的方法により濃縮を行い,MS/MS解析を行った.その結果Pigent epithelium-derived factor(PEDF)という黒色色素細胞に由来する成長因子が複数のバンドで検出された.そこで,本年度はPEDFをラットL6細胞よりRT-PCRによりクローニングし,大腸菌発現ベクターpGEX6Pベクターにサブクローニングし,大腸菌においてepitope-tagging融合蛋白質として発現させ調製した.しかし,これらの蛋白質にはニワトリ胚由来後根神経節細胞器官培養系における軸索伸長評価系においてL6CMに認められるような顕著な活性は認められなかったが,シュワン細胞の遊走性を活性化することが明らかになった.したがって,PEDFはL6CMにおける筋知覚神経の神経軸索伸長活性の本体ではないと予想された.そこで,さらに他のバンドに由来する分子を検討したところ,Insulin like Growth Factor I Binding Protein 6(IGFBP6)が見出された.IGFそのものはMS/MS解析では範囲外のバンドであったが,IGF-Iが本体である可能性が示唆されたので,IGFの効果を検証したところ,L6CMと同等の活性があることが明らかになった.IGF-

Iの筋知覚神経軸索の伸長活性の分子機序については未だ不明の部分が多いが,今後,IGF-I/IGFBP6複合体の筋知覚神経の軸索伸長における作用機序,またin vivo除神経モデル動物における神経軸索再生時の作用機序についてさらなる研究が必要である.
多能性幹細胞塊から細胞の種類と配置を制御して多種細胞集合体へ分化させる方法の確立

細胞に光を当ててタンパク質の生産を開始させたり停止させたりするオリジナルの技術を使って、細胞集団のレーザーで狙った1個の細胞だけを神経細胞に変化させることに成功しました。この手法を発展させ組織の三次元培養と併用すればiPS細胞などの多能性幹細胞の塊から細胞の種類と位置を人工的に操作し組織を作り上げることができると期待されます。本課題では、申請者が開発した“翻訳の可逆的光制御法"を使い、Hes-1の発現量および発現周期を多能性幹細胞塊の細胞個々で独立に操作し、細胞の種類および配置を制御して分化させる方法を確立することが目的である。本年度は、可視光領域の光で異性化する新規光応答性capの開発、RNase耐性を持つHes-1mRNAの作製およびHes-1をノックアウトしたマウスES細胞の作製を行なう計画であった。当初はこれまでの光応答性capの分子骨格を改良していく方針であり、実際に複数の新しい光応答性capを合成したが、cis体の熱的安定性の低さからこのアプローチでは可視光で異性化する光応答性capの実現は困難であると結論した。そこで、新たな分子骨格をもつ全く新しい光応答性capを開発することにした。研究開始から半年で合成経路を確立するすることに成功し、プロトタイプを合成した。プロトタイプの光応答性capは370nmと405nmの光で可逆的に異性化したが、mRNAからタンパク質への翻訳を制御するにはいたらなかった。Hes-1mRNAにRNase耐性を持たせるため、β-グロビンの3'非翻訳領域の反復配列をHes-1mRNAの3'非翻訳領域に挿入しることを試みた。DNAリガーゼを使い10回の反復をもたせることまでできたが、それを増幅するステップがうまくいかず2回の反復配列をもつmRNAまでしか作製することができなかった。2回の反復配列を挿入することで通常の倍程度までmRNAの寿命を延ばすことに成功した。タンパク質発現の可逆的光操作法を使い多能性幹細胞の集合体において狙った細胞だけで分化誘導タンパク質を発現させ、目的の細胞へ分化させる方法を確立することが目的であった。タンパク質発現の可逆的光操作法とは、申請者が独自に開発したmRNAからタンパク質への翻訳を光で可逆的にスイッチングできる新しい光遺伝学の技術である。H-rasタンパク質の強制発現により神経様細胞へと分化するPC12細胞を使い本技術の有用性を検討した。培養中のPC12細胞全てに光で翻訳をスイッチングできるmRNAをインジェクションした後、405nmのレーザーを1つの細胞にだけ照射し局所的にH-rasタンパク質を強制発現させた結果、その細胞だけが突起を伸ばし始め最終的には神経様細胞へと分化した。別の波長の光を照射し分化途中でH-rasタンパク質の発現を止めると伸びた突起が収縮し元のPC12細胞へ戻る現象がみられた。これは本技術の優位点であり、分化途中であっても分化誘導タンパク質の発現を止めれば分化をリセットさせられることを意味する。世界中の幹細胞研究者が多能性幹細胞を目的の細胞へ分化させる分化誘導因子の探索をおこなっている。今後、多くの分化誘導因子が発見されることが期待でき、本技術をその分化誘導因子の発現制御に用いれば多能性幹細胞の集合体から位置と細胞の種類を人工的に操作して立体的な組織を作る再生医療へ応用できると考えられる。ケミカルバイオロジー本年度の達成目標は可視光領域の光で異性化する新規光応答性capの開発、RNase耐性を持つHes-1mRNAの作製およびHes-1をノックアウトしたマウスES細胞の作製を行なうことであった。可視光領域の光で異性化する新規光応答性capの開発、RNase耐性を持つHes-1mRNAの作製が予想以上に時間を要しHes-1をノックアウトしたマウスES細胞を作製するにまでいたらなかった。今後は目標を達するまで引き続き可視光で異性化する新規光応答性capの開発およびRNase耐性を持つHes-1mRNAの作製をおこなう。本年度開発した新規光応答性capのプロトタイプをmRNAからタンパク質への翻訳を制御できるように改良を重ねる。また、β-グロビンの3'非翻訳領域の反復配列を2回以上もつmRNAを作製し、さらなる寿命の引き延ばしを行なう。その2つの短期目標に到達した後にHes-1をノックアウトしたマウスES細胞の作製および26年度の計画を実行する。前年度に納品されたステン皿小ねじ、サンデーPET、サンボンベ、カッター、アクリサンデー接着剤、アクリ透明三角棒、ニチペットEXII 1001000μL、ニチペットEXII 20ー200μL、ニチペットEXII 2ー20μL、ニチペットEXII 0510μ、ニチペットEXII 0.12μL、寒天100g、超精密ピンセットNo5ーDUMOSTAR、ガラス管Gー1 500入、プラスチックピンセットNo233先平細の支払いが4月になったため。次年度に繰り越された物品費は4月の支払いで全て消費される。次年度は当初の計画通りに予算を使用する。
呈色型機能性ホスト分子の開発と水中における分子認識への展開

当研究室で開発された機能性フェノールフタレインを用い、『直接的ポリアミン検出による簡便なガン診断検査薬の開発』に向けた応用研究に取り組んだ。ポリアミンとはアミノ基を2つ以上持つ炭化水素化合物を包括的に指し、生体内ポリアミンとしてスペルミジン、スペルミン、プトレッシン、カダベリンが知られている。スペルミジン及びスペルミンはいずれもガン細胞において濃度が上昇しているため、腫瘍マーカーとして利用されている。しかし、実際に臨床で用いられている測定法は操作が煩雑である、誘導体化が必要であるという欠点があり、直接的かつ簡便なポリアミン検出試薬の開発が望まれている。このような状況の中、当研究室ではフェノールフタレインを基本骨格とし、認識部位にクラウンエーテルを組み込んだ呈色型ホスト分子が開発されている。今回、本ホスト分子がスペルミジン及びスペルミンを含むアミン類をゲスト分子として呈色を示すことを見出した。ポリアミンをゲスト分子として用い呈色識別した例は本研究以外に報告がなく本ホスト分子の有用性が大いに期待できたが、診断検査薬として応用化を図るには大幅な感度向上が要求された。そこで、高感度な呈色を示すホスト分子の探索研究に取り組んだ結果、イソベンゾフラノン環上にジメチルアミノ基を持つホスト分子の創製に至った。これは、従来の類縁体に比してポリアミンに対する呈色感度が劇的に向上していた。次いで、本ホスト分子を用いポリアミン4種と生理活性アミン4種を合わせ、メタノール中でスクリーニングした結果、本研究の標的であるスペルミジン及びスペルミンのみが強く呈色することが判った。本研究により、簡便なガンの診断検査薬を開発するための端緒となる重要な知見を得た。当研究室で開発された機能性フェノールフタレインを用いて、(1)アルカリ金属との温度変化に伴う呈色挙動、及び(2)β-aminoalcoholの不斉呈色識別、の2テーマについて機能の評価・検討を行った。(1)フェノールフタレイン型ホストに関してこれまで想定していた目に見える呈色錯体以外に、相反する挙動を示す目に見えない錯体が存在する可能性がある事は判っていた。ナトリウムとカリウムに対しては温度可変IR測定を行い2種類の錯体が存在している事を確認した。リチウムに対しては錯体の結晶化に成功し、IR測定により「無色錯体」の存在が示唆された。この無色錯体の存在が機能性フェノールフタレインにユニークかつ複雑な性質を付与しているといえる。一方、Mole ratio plotにより、アルカリ金属に対する呈色錯体は1:2の化学量論である事が示唆された。またUV及びNMR測定、マイクロカロリメトリーによる会合定数、熱力学パラメータの決定を試みたが残念ながら解析不可能であった。(2)フェノールフタレイン型ホストが呈色識別可能なゲスト分子はこれまでジアミン構造が必須であったが、高濃度ではモノアミンでも強く呈色し得る事を見出した。そこで、フェニル基を導入した光学活性ホストを合成し機能を精査した結果、アミノ酸を還元して得られるβ-aminoalcoholに対しては低温において高い不斉認識能を有している事が判り、R/S指示薬としての応用も期待できる。さらに極めて興味深い事に、温度変化に伴う呈色挙動を検討した結果、R体とS体で温度に依存して呈色が逆転するという類を見ない現象を見出した。一方、Job's plot測定により呈色錯体に関しては1:3である事が示唆されたものの、1:2の化学量論である無色錯体が少なからず存在し会合定数等の解析は不可能であった。当研究室で呈色型機能性分子として開発されたフェノールフタレイン誘導体を用いて、主に2つのテーマについて研究を進めた。(1)アルカリ金属に対する温度依存性の呈色挙動の解析と評価(2)水溶性ホスト分子の合成と完全水中での分子認識挙動(1)Na^+及びK^+は生体内において重要な役割を担うイオンであり、分子認識化学的なアプローチによる特異的検出は重要な課題の1つである。フェノールフタレイン誘導体とアルカリ金属との温度変化に伴う呈色挙動は、Na^+とK^+で正反対になり鮮明なコントラストを描くことを既に報告している。網羅的な解析を行った結果、ホストはK^+に対して1:2の無色錯体を形成していること、ならびに会合定数を算出することができ、これまで不可能であった錯体の定量的な評価が可能になった。さらにこの応用として、すべてのアルカリ金属のうちK^+を加えた時にのみ退色するという、カリウム特異的な呈色識別も達成した。(2)既に当研究室ではプロトン性溶媒中における水素結合駆動型の呈色型分子認識にいくつか成功しているが、それらはすべてメタノール中での評価にとどまっていた。生体内分子の定量等を考慮すれば、水中での水素結合の分子認識というより高次の機能を持つ呈色型分子の開発が望まれていた。ところが、これまでのフェノールフタレイン誘導体は水にはほとんど溶解しないため、水溶性を付与した第二世代の機能性フェノールフタレインを新たに設計・合成した。十分な水溶性を獲得したホスト分子を用い完全水中生理的pHにおいて、ジアミン分子の長さの違いを呈色の強弱として表現することに成功した。

スペルミジン及びスペルミンはいずれもガン細胞において濃度が上昇しているため、腫瘍マーカーとして利用されている。しかし、実際に臨床で用いられている測定法は操作が煩雑である、誘導体化が必要であるという欠点があり、直接的かつ簡便なポリアミン検出試薬の開発が望まれている。このような状況の中、当研究室ではフェノールフタレインを基本骨格とし、認識部位にクラウンエーテルを組み込んだ呈色型ホスト分子が開発されている。今回、本ホスト分子がスペルミジン及びスペルミンを含むアミン類をゲスト分子として呈色を示すことを見出した。ポリアミンをゲスト分子として用い呈色識別した例は本研究以外に報告がなく本ホスト分子の有用性が大いに期待できたが、診断検査薬として応用化を図るには大幅な感度向上が要求された。そこで、高感度な呈色を示すホスト分子の探索研究に取り組んだ結果、イソベンゾフラノン環上にジメチルアミノ基を持つホスト分子の創製に至った。これは、従来の類縁体に比してポリアミンに対する呈色感度が劇的に向上していた。次いで、本ホスト分子を用いポリアミン4種と生理活性アミン4種を合わせ、メタノール中でスクリーニングした結果、本研究の標的であるスペルミジン及びスペルミンのみが強く呈色することが判った。本研究により、簡便なガンの診断検査薬を開発するための端緒となる重要な知見を得た。
遺伝性出血性末梢血管拡張症(オスラー病)に関する遺伝子疫学的研究

遺伝性出血性末梢血管拡張症(オスラー病:hereditary hemorrhagic telangiectasia ; HHT)は,1)遺伝的発生,2)皮膚・粘膜,内臓の多発性末梢血管拡張,3)各部位からの反復する出血を3主徴とする疾患である.本症は,末梢血管拡張,その部位からの出血が種々の臓器に出現する多臓器疾患であるために臨床症状が極めて多岐にわたり,患者は内科のみならず,外科,耳鼻咽喉科,皮膚科,歯科など極めて多くの科を初診する.さらに,合併する脳動静脈奇形あるいは,肺動静脈奇形の破綻により致死的となることも希ではない.本研究は,日本におけるHHTの発生頻度・罹病率について遺伝疫学的に検討を行い,本疾患による合併症の予防,治療を呼吸リハビリテーション(リハビリ)という観点から考案し,さらに将来的には遺伝子治療の足がかりを探ろうとするものである.日本におけるオスラー病の遺伝子異常は下記のごとくであった.HHTに合併した肺動静脈奇形に対する呼吸リハビリは,そのプログラムがないことより実際には行われていない現況にある.また,肺動静脈奇形に対して肺動脈塞栓術が施行された後の呼吸リハビリ・プログラムも示されていない.佐竹は,高齢COPD患者に対する運動療法プログラムを考案した(佐竹他,COPD FRONTIER, 2006).上述の55歳男性HHT症例に対して佐竹の呼吸リハビリ・プログラムを施行したところ非常に有用で患者は通常の日常生活に復帰した.この呼吸リハビリ・プログラムはHHTに合併した肺動静脈奇形に対して応用可能であると考えられた.遺伝性出血性末梢血管拡張症(オスラー病:hereditaryhemorrhagic telangiectasia ; HHT)は,1)遺伝的発生,2)皮膚・粘膜,内臓の多発性末梢血管拡張,3)各部位からの反復する出血を3主徴とする疾患である.本症は,末梢血管拡張,その部位からの出血が種々の臓器に出現する多臓器疾患であるために臨床症状が極めて多岐にわたり,患者は内科のみならず,外科,耳鼻咽喉科,皮膚科,歯科など極めて多くの科を初診する.さらに,合併する脳動静脈奇形あるいは,肺動静脈奇形の破綻により致死的となることも希ではない.本研究は,日本におけるHHTの発生頻度・罹病率について遺伝疫学的に検討を行い,本疾患による合併症の予防,治療を呼吸リハビリテーション(リハビリ)という観点から考案し,さらに将来的には遺伝子治療の足がかりを探ろうとするものである.日本におけるオスラー病の遺伝子異常は下記のごとくであった.HHTに合併した肺動静脈奇形に対する呼吸リハビリは,そのプログラムがないことより実際には行われていない現況にある.また,肺動静脈奇形に対して肺動脈塞栓術が施行された後の呼吸リハビリ・プログラムも示されていない.佐竹は,高齢COPD患者に対する運動療法プログラムを考案した(佐竹他,COPD FRONTIER, 2006).上述の55歳男性HHT症例に対して佐竹の呼吸リハビリ・プログラムを施行したところ非常に有用で患者は通常の日常生活に復帰した.この呼吸リハビリ・プログラムはHHTに合併した肺動静脈奇形に対して応用可能であると考えられた.遺伝性出血性末梢血管拡張症(オスラー病:hereditaryhemorrhagic telangiectasia ; HHT)は,1)遺伝的発生,2)皮膚、粘膜,内臓の多発性末梢血管拡張,3)各部位からの反復する出血を3主徴とする疾患である.本症は,末梢血管拡張あるいはその部位からの出血が種々の臓器に出現する,いわゆる多臓器疾患であるために臨床症状が極めて多岐にわたり,患者は内科のみならず,外科,耳鼻咽喉科,皮膚科,歯科など極めて多くの科を初診する,さらに,合併する脳動静脈奇形あるいは,肺動静脈奇形により時に致死的となることも希ではない.本研究は,日本におけるHHTの発生頻度、罹病率について遺伝疫学的に検討を行い,本疾患による合併症の予防,治療を呼吸リハビリテーションという観点から考案し,さらに将来的には遺伝子治療の足がかりを探ろうとするものである.今年度は,HHTの患者の発見に尽くした.その結果,多発性肝膿瘍,脳膿瘍で発症した肺動静脈奇形を合併する男性症例を発見した(小熊,石田).本例では,妹および妹の子二人にも臨床的に鼻出血と末梢血管拡張がみられHHTと診断した.本例においては,同意を得たのち倫理規定に従い,家系図を作成し,遺伝子の連鎖解析を行いそののち遺伝子異常のみられる染色体領域を決定し,候補遺伝子の配列の決定を行う.肺動静脈奇形に合併したHHTに対する呼吸リハビリテーションは,そのプログラムがないことより実際には行われていない現況にある,また,肺動静脈奇形に対して肺動脈塞栓術が施行された後の呼吸リハビリテーション・プログラムも示されていない.佐竹は,こうしたHHTの高齢患者の評価方法として有用な歩行試験の有用性を確認し発表した.本法は,本症の呼吸リハビリテーション・プログラムに応用可能であることから,平成17年度は,実際にHHT患者において施行を予定している.遺伝性出血性末梢血管拡張症(オスラー病:hereditary hemorrhagic telangiectasia; HHT)は、1)遺伝的発生、2)皮膚・粘膜、内臓の多発性末梢血管拡張、3)各部位からの反復する出血を3主徴とする疾患である。本症は末梢血管拡張、その部位からの出血が種々の臓器に出現する多臓器疾患であるために臨床症状が極めて多岐にわたり、患者は内科のみならず、外科、耳鼻咽喉科、皮膚科、歯科など極めて多くの科を初診する。

さらに、合併する脳動静脈奇形あるいは、肺動静脈奇形の破綻により致死的となることも稀ではない。本研究は、日本におけるHHTの発生頻度・罹病率について遺伝疫学的に検討を行い、本疾患による合併症の予防、治療を呼吸リハビリテーション(リハビリ)という観点から考察し、さらに将来的には遺伝子治療の足がかりを探ろうとするものである。HHT症例として、多発性肝膿瘍、脳膿瘍で発症した肺動静脈奇形を合併する55歳男性症例を発見した。また、64歳男性、67歳女性でそれぞれ別の家系に所属するHHT症例も発見した。さらに28歳男性でHHTに肺動静脈奇形および脳動静脈奇形を合併した致死症例について報告した(塩谷他、日本胸部臨床、2005)。HHTに合併した肺動静脈奇形に対する呼吸リハビリは、そのプログラムがないことより実際には行われていない現況にある。また、肺動静脈奇形に対して肺動脈塞栓術が施行された後の呼吸リハビリ・プログラムも示されていない。佐竹は、高齢COPD患者に対する運動療法プログラムを考案した(佐竹他、COPD FRONTIER,2006)。上述の55歳男性HHT症例に対して佐竹の呼吸リハビリ・プログラムを施行したところ非常に有用で患者は通常の日常生活に復帰した。この呼吸リハビリ・プログラムはHHTに合併した肺動静脈奇形に対して応用可能であると考えられた。
教師の共同体と関係性レジリエンス：解決困難な問題への共同体的対処

本研究は教員の関係性レジリエンスを高めることを目的に,精神医学の手法である「当事者研究」を英語科教員へ適用するものである。初年度(2019年度)は文献調査を中心に関係性レジリエンスと当事者研究を理論的に結びつけ,続く年度のために理論的基盤の整理を行う。20年度には文献調査と半構造化面接を用いて「英語科教員のための当事者研究」のモデルを作成し,21年度は作成したモデルの実践・改良を行う。最終年度にはそれまでの総括を行い,国際学会で研究発表を行う。
ゲノム安定性維持機構に関連する遺伝子の分離と機能解析

本研究課題は、哺乳類培養細胞の温度感受性変異株を用いて、染色体安定性維持機構に関連する遺伝子を分離し、その機能を明らかにすることを目的とする。温度感受性変異株tsTM3に関して、ユビキチン活性化酵素Uba1遺伝子上に変異を同定した。また、制限温度下のtsTM3株では核内のUba1が著しく減少し、ユビキチン化活性が低下するとともに、複製のライセンシング因子の分解に異常が起こることを見出した。これは核内のUba1の減少と反比例しており、ユビキチン活性化酵素Uba1の温度感受性変異が複製反応に影響を与える有力なメカニズムとして発表した。研究対象である温度感受性変異株は、制限温度(39°C)において染色体不安定性やDNA合成活性の低下などの表現型を示す。本研究では、解析が進んでいない変異株に関して原因遺伝子の分離と機能の解明を行う。また、対象とする温度感受性変異株には、DNA合成活性の低下やS期での細胞周期の異常などの表現型を示すものも少なくない。そこで、変異株中の複製反応を評価できる実験系を確立し、複製反応と染色体不安定性との関連を明らかにする。平成24年度は、以下の項目に関して研究を行った。1.温度感受性変異株の原因遺伝子の探索と機能解析ハムスターCHO-K1細胞由来の温度感受性変異株を研究対象として、断片化したヒトゲノムDNAの導入による相補実験を終了した。最終的に3株の変異株から制限温度下で生育可能となった形質変換株が得られた。分離した形質変換細胞よりゲノムDNAを調製し、ヒト特異的なAlu配列を利用したPCRと塩基配列の解析を行ったが、相補に寄与した遺伝子の特定に至っていない。なおtsTM3株に関しては、原因遺伝子として同定したユビキチン活性化酵素について、野生型遺伝子の導入による相補実験やウェスタンブロッティングによる機能の解析を行い、その成果を学会にて発表した。2.DNA複製反応の解析系の確立核酸前駆体アナログを用いたDNA複製反応の解析を行い、伸長反応を評価する実験系としてCldUとIdUによる標識からDNAファイバーを解析する方法を構築した。また、DNA合成活性の低下の表現型を示すtsTM18株に関して、DNA複製を解析する候補とした2ヶ所の遺伝子座について、これまでのスプライシングの異常に関する成果と合わせて原著論文として発表した。研究対象とする温度感受性変異株には、DNA合成活性の低下やS期での細胞周期の異常などの表現型を示すものも少なくない。平成25年度は、以下の項目に関して研究を行った。1.温度感受性変異株の原因遺伝子の探索と機能解析平成24年度に分離した制限温度下で生育可能となった形質変換株を対象として、ヒト特異的なAlu配列を利用したPCRと塩基配列の解析を行った。また、サザンハイブリダイゼーションによりヒトゲノム断片の探索も行った。これらの解析から、形質変換株は自然発生型の形質復元株であること、親細胞である温度感受性変異株はヒトゲノム断片の導入の際に高頻度に形質が復帰することが明らかになった。一方、計画以上の成果が得られているtsTM3株に関しては、レポーターシステムを利用して核内のユビキチン化を詳細に解析した。また、ウェスタンブロッティングにより核内のユビキチン活性化酵素が著しく減少することを見出した。2.DNA複製反応の解析系の確立非許容温度下で複製反応に異常を示すtsTM3株などの変異株を対象に、CldUとIdUによる標識とDNAファイバーの解析により伸長反応を評価した。また制限温度下のtsTM3株では、核内のユビキチン化活性の低下に伴って、複製のライセンシング因子の分解に異常が起こることを見出した。これは核内のユビキチン活性化酵素の減少と反比例しており、ユビキチン活性化酵素の温度感受性変異が複製反応に影響を与える有力なメカニズムと考えている。これらの成果を国内外の学会にて発表するとともに、原著論文として取りまとめて投稿し受理された。

また、対象とする温度感受性変異株には、DNA合成活性の低下やS期での細胞周期の異常などの表現型を示すものも少なくない。そこで、変異株中の複製反応を評価できる実験系を確立し、複製反応と染色体不安定性との関連を明らかにする。平成23年度は、以下の項目に関して研究を行った。1.ヒトDNAによる温度感受性の相補と形質変換株の分離ハムスターCHO-K1細胞由来の温度感受性変異株に断片化したヒトDNAを導入し、遺伝学的相補により制限温度で生育可能となった形質変換株の分離を行った。10株の候補変異株中8株に関して相補実験が終了し、3株の変異株から形質変換株が得られた。分離した形質変換細胞よりゲノムDNAを調製し、ヒト特異的なAlu配列を利用したPCRにより相補に関連したヒトDNA断片の特定を行っている。なおtsTM3株に関しては、野生型遺伝子の導入による相補実験と塩基配列の解析による変異の同定により、その原因遺伝子がユビキチン活性化酵素E1であることを確認し、学会にて発表した。2.DNA複製反応の解析系の確立DNA合成活性の低下などの表現型を示す温度感受性変異株に関して、EdUにより新生DNA鎖を標識する実験系を構築した。また、制限温度下でDNA合成に異常を示すtsTM18株において、スプライシングに異常を生ずる遺伝子座を新たに2ヶ所同定し、DNA複製を解析する遺伝子座の候補とした。本成果をこれまでの成果と合わせて学会にて発表した。本研究課題は、哺乳類培養細胞の温度感受性変異株を用いて、染色体安定性維持機構に関連する遺伝子を分離し、その機能を明らかにすることを目的とする。研究対象とする温度感受性変異株には、DNA合成活性の低下やS期での細胞周期の異常などの表現型を示すものも少なくない。平成26年度は、温度感受性変異株tsTM3について、Uba1の温度感受性変異と複製反応に関する研究成果を学会発表するとともに原著論文として発表した。また研究期間全体の成果として、染色体安定性維持機構に関連する遺伝子の探索と機能解析に関して、tsTM3株の原因遺伝子がユビキチン活性化酵素Uba1であることを同定した。さらに制限温度下のtsTM3株では、核内のユビキチン化活性の低下に伴って複製関連分子の分解に異常が起こることを見出した。これは核内のUba1の減少と反比例しており、Uba1の温度感受性変異が複製反応に影響を与える有力なメカニズムとして提案した。これらの成果を国内外の学会にて発表するとともに、原著論文として発表した(Sugaya et al. PLoS ONE, 2014)。また、DNA複製反応の解析系の確立に関しては、各種の核酸前駆体アナログを用いたDNA複製反応の評価を行った。この成果の一部をUba1の温度感受性変異と複製反応の研究成果と合わせて学会発表するとともに、原著論文として発表した(Sugaya et al. FEBS Open Bio, 2015)。
河川生態系の維持機構とダム下流域で生じる劣化機構：フィードバックループに着目して

ダム下流域で生じる付着藻類の過剰な成長と藻類食者の消失といった、自然河川とは異なる生態系が生じるプロセスを解明するために、野外・室内実験を行った。実験の結果、ダムに起因する濁水の発生や流砂の減少などは、複合的な影響を付着藻類に及ぼし、場合によっては付着藻類の過剰な成長を引き起こすことが明らかとなった。また、水生昆虫などの藻類食者の減少は、ダムによる流砂の欠乏が影響するプロセスと、餌資源である付着藻類の変化が影響するプロセスが存在する可能性が示唆され、水生昆虫の消失もまた付着藻類の過剰な成長をもたらす一因であるといった、両者の密接な関係性が示された。本年度は、前年度からの継続も含めて、下記の2つの研究課題について実施した。1、河川において発生する洪水と掃流砂の流出が、水生昆虫などの底生動物に付着藻類(餌資源)を介してどのような影響を及ぼすのかについて検証を行った。河床にタイルを設置することで付着藻類の定着を促した後、流速を2段階に操作した実験水路内に設置した(0.5 m/s、4.0 m/s)。その際、掃流砂の有無についても操作を行った。各流水条件に曝した付着藻類を2種類の水生昆虫に与えたところ、高流速で掃流砂が存在する付着藻類は現存量が低いものの生産性が高いために、水生昆虫の餌資源として十分に機能することが明らかとなった。一方、低流速で掃流砂が存在しない場合でも水生昆虫は餌資源として利用していたが、付着藻類が糸状藻類へと変化する場合もあり、餌としては不適な状態へと変化することもあった。2、水産重要種であるアユを対象に、河床に存在する砂の消失がどのよう影響を及ぼすのかについて検証を行った。実験河川において長さ10mの実験区を設置し、アユの有無と河床の砂の有無を操作した。砂が欠乏することで、付着藻類に含まれる無機物含有量は多くなる傾向にあったが、アユはその多寡に関わらず摂食を行っていることが明らかとなった。ただし、無機物を多く含む付着藻類のみを餌として利用していたアユについては、肥満度が低下している個体も存在した。河川において貯水ダムが建設されることで河床を流れる掃流砂は欠乏しやすくなるが、洪水撹乱が発生する際に流量の増加だけでなく、掃流砂が流れることで、付着藻類を剥離する効果は大きくなるものと考えられ、付着藻類の剥離・更新が進むことで藻類食者にとって質の良い餌資源が提供される可能性が示された。本年度は、下記の3つの研究課題について実施した。1.シルトの堆積が付着藻類の生産性に及ぼす影響:野外の河川でタイルに定着させた付着藻類を、濁水(SS濃度, 1000 mg/Lもしくは10,000 mg/L)に曝し、得られた付着藻類の生産速度を測定した。その結果、無機物の堆積が多くなるほど、生産性が低下することが明らかとなり、このことから無機物の堆積は、付着藻類の更新を妨げる可能性が示された。2.シルトの堆積が藻類食者の摂食量に及ぼす影響:1と同様にタイルに定着した付着藻類を濁水に曝し、無機物が堆積した付着藻類を2種類の藻類食者(コヤマトビケラ属の1種とエルモンヒラタカゲロウ)と一緒にメソコスムに投入した。その結果、コヤマトビケラ属の1種はシルトが堆積していたとしても、付着藻類を摂食しており、その量に変化はなかった。一方、エルモンヒラタカゲロウは付着藻類にシルトが堆積していることで、摂食量がわずかに減少していた。そして、藻類食者による違いは、口器の違いに起因していると考えられ、生態的特性に応じて付着藻類からの影響の受け方が異なることが明らかとなった。3.藻類食者による摂食が付着藻類の遷移過程に及ぼす影響:2と同様の実験条件を設定し、藻類食者(コヤマトビケラ属の1種とエルモンヒラタカゲロウ)の有無による付着藻類の遷移過程の違いを調査した。その結果、藻類食者による摂食がないことで、付着藻類は大きく成長し、遷移が著しく進行することが明らかとなった。一方、藻類食者が存在することで、付着藻類の遷移が妨げられ、常に遷移初期種が維持されることが明らかとなった。以上の成果から、藻類食者と掃流砂が存在することで、付着藻類は餌資源としては好ましくない過剰な成長はせず、常に餌として利用される状態が保たれることが示された。流砂の減少が付着藻類と魚類(アユ)の相互作用に及ぼす影響について、室内およびおよび野外実験にて検証を行った。

野外実験については、出水の影響で実験を最後まで継続することが困難であったが、室内実験により補完データを取ることで、流砂ー付着藻類ー魚類の相互関係に関する知見を得ることが出来た。室内実験の結果、流砂の増加は付着藻類の現存量を低下させる一方で、生産性を高めることが示された。また、流砂と同様にアユによる摂食も付着藻類の現存量を低下させるが、生産性を高める傾向にあった。ただし、流砂による付着藻類の磨耗と、アユによる摂食とでは、付着藻類の群集構造に及ぼす影響は異なる可能性が示唆された。そして、野外実験の結果、流砂の欠乏は付着藻類が多いにも関わらず、アユの肥満度の低下をもたらすことが明らかとなった。これは、付着藻類の餌資源としての質が低下したためと考えられた。ただし、肥満度の低下については、アユのサイズによってバラツキが大きく、個体のコンディションによって影響が異なる可能性が示唆される。また、過剰な砂を人為的に河川へ供給することで礫が埋没し、付着藻類の生育面積の減少によるアユへの影響が危惧されているが、このような礫の埋没はアユの生育にわずかではあるが負の影響を及ぼしていた。以上の結果から、流砂の欠乏は付着藻類の餌資源としての質の低下を介して、過剰な流砂の存在は付着藻類の生育面積の減少による量の低下を介して、アユに負の影響を及ぼす可能性が示唆された。河川生態学当初の予定では、平成25年度に研究計画の仮説2(藻類は不安定化しても、洪水によって安定化する)について検証を進める予定であったが、洪水を発生させる計画については気象条件(河川の流量減少)の問題から、一部を見送ることとなった。ただし、平成24年度に平成26年度に行う予定の実験を既に進めていることから、全体としての研究計画については順調に進められており、仮説2の検証についても平成26年度に行う予定である。当初の予定では、平成24年度に研究計画の仮説1(フィードバックループにより、付着藻類は安定する)と仮説3の一部(掃流砂の欠乏は付着藻類の不安定化をもたらす)について検証する予定であったが、使用できる実験システムを拡張できたことから、H26年度に実施する予定であった仮説3の残り(掃流砂の欠乏により不可逆状態に至り、元に戻らない)についても検証することができた。さらにサンプルを増やして検討することで、より頑健な成果を得る必要があるものの、仮説通りの成果を得られる目途が立った。平成26年度は、当初の計画通り仮説4(濁水は付着藻類の不安定化を促進し、不可逆性を強める)についての検証を進める。平成24年度と25年度に行った実験により、既に実験を行うためのシステムについては構築されている。気象条件が整えば、流量の操作を行うことも可能であり、平成25年度に実施する予定だった研究課題についても進められるものと考えられる。H25年度は、当初の計画通り仮説2(藻類は不安定化しても洪水によって安定化する)について検証を行う。この仮説を検証するために、野外の実験河川(幅2m、長さ600m)を用いるが、野外であり規模も大きくなることから、H24年度に実施した室内実験よりも、処理区に工夫を施す必要がある。そのため、準備期間に多くの時間を要するが、H24年度に得られた成果を鑑みると、当初、予定していた実験期間よりも短い日数で検証することが可能であると考えられる。そのため、全体としての研究期間は当初の予定通りになると考えられる。海外誌への論文の掲載料として約6万円を予定していたが、査読とその修正に時間がかかってしまい、該当年度内での支払がなくなったため、次年度使用額が生じた。該当論文については、すでに提出済みのため、平成26年度内に掲載料として約6万円使用する予定である。
昼間側磁気圏界面磁気再結合過程に伴なう電離圏擾乱の南北非対称性に関する研究

これまでの磁気流体計算機実験において、昼間側磁気圏界面における磁気再結合過程(磁気リコネクション)は、惑星間空間磁場の方向によって、さまざまな南北半球非対称性を作り出すと予想されてきた。しかし、磁気圏界面における人工衛星観測によって、その兆候を捕らえることは、単点観測という観測上の制限によってなされてこなかった。本研究では、開いた磁力線と閉じた磁力線の境界(open-closed field line boundary : OCFLB)を電離圏において見積もり、その南北半球での差異を明らかにすることを試みた。実際には、SuperDARNレーダーのデータのスペクトル幅と呼ばれるパラメータを用いて、OCFLBの同定をおこなった。まず始めに、統計的な手法を用いて、OCFLBの位置の南北比較を行ったが、そこでは有為な南北半球差異は認められなかった。これは、さまざまな惑星間空間の磁力線のトポロジーによって誘起されると考えられる南北差は、統計手法では抽出できないということを意味している。その結果を受けて、事例解析を通しOCFLBの南北差を明らかにすることを試みた。その結果、やはり昼間側磁気圏界面における磁気再結合過程が作り出す南北差は、電離圏レベルでは同定されず、OCFLBは、両半球で非常に調和的な変動をしていることがわかった。これは過去の計算機実験などが理想的な状況しか扱ってこなかったということを示唆している。しかし、これは事前に予想していなかったことであるが、夜側磁気圏における磁気再結合過程が引き起こしたと考えられる南北差を見出すことができた。この結果は、これまでの研究では示されたことのないものである。以上の結果は、磁気圏界面における磁気再結合過程が作り出す磁力線トポロジーの南北非対称性が、磁気流体計算機実験などで再現できるような単純なものではなく、夜側磁気圏における磁気再結合まで含めた系で議論する必要のある物理現象であることを示している。
Rho-ROCKによる着床現象の制御機構の解明

1)インフォームドコンセントを取得後、正常月経周期を持つ子宮筋腫の手術時に増殖期および分泌期子宮内膜を採取し、人工妊娠中絶時に妊娠初期脱落膜を採取し実験材料とした。2)SatyaswaroopおよびBravermanらの方法にて妊娠初期脱落膜の培養細胞を作製した。3)増殖期と分泌期の子宮内膜および、妊娠初期脱落膜を抗Rho抗体を用いて免疫組織染色した結果、増殖期と分泌期の子宮内膜ではRhoの発現が腺上皮にみられ、脱落膜ではその発現が間質に移行した。4)増殖期と分泌期の子宮内膜および、妊娠初期脱落膜を抗Rho抗体を用いてwestern blott解析した結果、増殖期と分泌期の子宮内膜および、妊娠初期脱落膜に約21kDaのRhoに相当するbandの発現をみた。また、その発現量は変化しなかった。5)7週令のCD-1雌マウスをPMSG-hCGにて過排卵誘起し、同系雄マウスと交配し、hCG投与後96h後に子宮内初期胚(桑実胚および初期胞胚)を回収し、脱落膜間質細胞と共培養した。C3をBASAに添加し、Rhoの着床現象における役割を検討した結果、C3酵素の添加はマウス胞胚のhatchingおよびattachmentに影響を与えなかったが、マウス初期胚の伸展した面積(μm2)を濃度依存性に抑制した(非添加群:124,C3 1ng/ml:89.9,C3 10ng/ml:74.5,C3 100ng/ml:67)。これらのデーターより、子宮内膜におけるRhoは、性周期により発現が移行し、初期胚の浸潤に関与している可能性が示唆された。1)SatyaswaroopおよびBravermanらの方法に従ってインフォームドコンセントを取得後、人工妊娠中絶時に妊娠初期脱落膜を採取し実験材料とした。3)妊娠初期脱落膜の培養細胞を抗Rho抗体を用いて免疫蛍光染色した結果、細胞質にRhoの発現がみられた。4)妊娠初期脱落膜の培養細胞を、Rhoの選択的阻害剤であるボツリヌス菌菌体外酵素C3添加とともに培養し、固定後FITC-Phalloidinにてアクチンフィラメントを染色した結果、C3酵素により、アクチンフィラメントの構造が破壊された。これらのデーターより、子宮内膜におけるRhoは初期胚の浸潤に関与している可能性が示唆された。
ラット実験腫瘍の染色体遺伝子背景についての研究

前田,高橋,杉山は,DMBA,TMBA誘発ラット白血病の遺伝子異常を解明する作業を開始した.まず前田が確立したDMBA誘発白血病のK1D,K2D,K3D,D5A1などの細胞株で,Nrasの61コドンの変異を一致して認めた.また,高橋はmRNAの発現を,杉山は造血を阻止した多血症ラットにエリトロポイエチン(EP)を投与して骨髄のmRNA発現を解析した.これには未知遺伝子のmRNA解析法(Liang・Pardee,1992)を用いた.全mRNAのcDNAについて,3'端のpolyAと5'側に10マー程度のオリゴヌクレオタイドをプライマーとしてPCRで増幅したのち解析した.EP刺激下に発現する骨髄,増殖刺激下の肝,腎細胞のmRNAとも対比して各白血病細胞の遺伝子発現の特徴を解明することに成功し,現在K1DにおけるRB類似遺伝子ほか,幾つかの遺伝子を釣り上げている.樋野は遺伝性腎癌の系を確立して10q12,5q31-33に抑制遺伝子の存在することを示しクローニング中である.志佐はPNUリンパ腫の病型決定に関与する遺伝子の存在を解明し,その染色体部位を決定した.吉田は,LEC肝癌の遺伝子は1,10染色体に存在することを示した.芹川は,体細胞交雑,in situ分子雑種,ms解析,PCR法を組み合わせてラットの遺伝子マップ法の基礎を確立した.豊富な発癌系にもかかわらず,ラットの遺伝子解明が遅れていて困難を感ずるが,他方,新知見を解析できる利点があり,豊富な研究方法を駆使して,急速に遅れを取り戻せると考えられる.平成5年10月21日に,杉山,樋野,吉田が世話人として開催したラット発癌系に関する日本癌学会シンポジウムには280人以上が参加するなどラット発癌系での遺伝子解析の関心は高い,マウスと異なり発癌系は豊富で未知の世界が多く,ヒトでは出来ない研究がラットで新鮮な立場で実施されると思われる.前田,高橋,杉山は,DMBA,TMBA誘発ラット白血病の遺伝子異常を解明する作業を開始した.まず前田が確立したDMBA誘発白血病のK1D,K2D,K3D,D5A1などの細胞株で,Nrasの61コドンの変異を一致して認めた.また,高橋はmRNAの発現を,杉山は造血を阻止した多血症ラットにエリトロポイエチン(EP)を投与して骨髄のmRNA発現を解析した.これには未知遺伝子のmRNA解析法(Liang・Pardee,1992)を用いた.全mRNAのcDNAについて,3'端のpolyAと5'側に10マー程度のオリゴヌクレオタイドをプライマーとしてPCRで増幅したのち解析した.EP刺激下に発現する骨髄,増殖刺激下の肝,腎細胞のmRNAとも対比して各白血病細胞の遺伝子発現の特徴を解明することに成功し,現在K1DにおけるRB類似遺伝子ほか,幾つかの遺伝子を釣り上げている.樋野は遺伝性腎癌の系を確立して10q12,5q31-33に抑制遺伝子の存在することを示しクローニング中である.志佐はPNUリンパ腫の病型決定に関与する遺伝子の存在を解明し,その染色体部位を決定した.吉田は,LEC肝癌の遺伝子は1,10染色体に存在することを示した.芹川は,体細胞交雑,in situ分子雑種,ms解析,PCR法を組み合わせてラットの遺伝子マップ法の基礎を確立した.豊富な発癌系にもかかわらず,ラットの遺伝子解明が遅れていて困難を感ずるが,他方,新知見を解析できる利点があり,豊富な研究方法を駆使して,急速に遅れを取り戻せると考えられる.平成5年10月21日に,杉山,樋野,吉田が世話人として開催したラット発癌系に関する日本癌学会シンポジウムには280人以上が参加するなどラット発癌系での遺伝子解析の関心は高い,マウスと異なり発癌系は豊富で未知の世界が多く,ヒトでは出来ない研究がラットで新鮮な立場で実施されると思われる.
炎症性腎疾患における腎外・細胞内からの好中球制御

近年,好中球の活性化におけるPI3Kβ(Kulkami, et al: Sci Signaling 2011),Btk (Volmering, et al: Immunity 2016), Abl (Nishi et al: J Clin Invest 2017)等の関与が明らかになり炎症性疾患に対する分子標的薬の利用が進む中で,炎症性腎疾患における骨髄球の作用に着目し骨髄球活性化に関与するリン酸化酵素の発見を目指した.とくにRNA結合ドメインとリン酸化酵素活性ドメインの両方を持つ一部のリン酸化酵素がマウス骨髄好中球やヒト培養好中球に発現すること,ウイルスに感染された単球・マクロファージなどの抗原提示細胞で活性化されるのみならず,白血球遊走化因子の刺激によって自己リン酸化されることを明らかにした.さらに,リン酸化酵素が好中球の血管内皮接着や血管外遊走に対して促進的に作用することを見出した.一方,腎臓の炎症における好中球の挙動には血行動態,ホルモン,液性因子,神経活性など種々の刺激・制御系が影響を与えると考えられる.国内外の施設のご協力を得て共同研究を推進しながら,上記を媒介する分子のリガンド・受容体それぞれの欠損マウス及び野生型マウスに好中球が主体となる腎炎モデルを導入し,好中球の血管内接着,血管外浸潤や腎障害の評価項目となるアルブミン尿や病理組織像を観察している.また,上記制御系の影響は全身に及ぶことから,腎臓以外にも有意な炎症性変化をきたしうる組織・臓器に応じた評価項目を設定して表現型のアセスメントを行っている.細胞内シグナルの影響については阻害作用をもつ低分子化合物およびshRNAウイルスベクターを用いた培養細胞実験や動物実験によって,とくにRNA依存性リン酸化酵素の好中球における発現や細胞活性化における機能の解析を進めた.これらの実験成果の一部は学会・研究会発表を重ねて,関係研究者からのさらなる情報を収集して研究を展開している.一方,腎臓外からのシグナルが好中球に与える影響についても,複数の腎炎モデルを導入しながら組織障害を評価しており,これにこれまでの培養細胞実験の結果を加えて投稿準備を進めている.引き続き,当初の計画していた方向で研究を推進していく.細胞内シグナルの影響については好中球におけるRNA依存性リン酸化酵素の上流・下流のシグナル解析と,遊走を促進する際に介在する細胞骨格分子への影響を解析する.また,好中球を主体とする炎症モデルでの低分子化合物の薬理作用も評価する.一方,腎臓外からのシグナルが好中球に与える影響については,複数の腎炎モデルを導入しながら組織障害を評価しており,これにこれまでの培養細胞実験の結果を加えて投稿準備を進めている.近年,好中球の活性化におけるPI3Kβ(Kulkami, et al: Sci Signaling 2011),Btk (Volmering, et al: Immunity 2016), Abl (Nishi et al: J Clin Invest 2017)等の関与が明らかになり炎症性疾患に対する分子標的薬の利用が進む中で,炎症性腎疾患における骨髄球の作用に着目し骨髄球活性化に関与するリン酸化酵素の発見を目指した.とくにRNA結合ドメインとリン酸化酵素活性ドメインの両方を持つ一部のリン酸化酵素がマウス骨髄好中球やヒト培養好中球に発現すること,ウイルスに感染された単球・マクロファージなどの抗原提示細胞で活性化されるのみならず,白血球遊走化因子の刺激によって自己リン酸化されることを明らかにした.さらに,リン酸化酵素が好中球の血管内皮接着や血管外遊走に対して促進的に作用することを見出した.一方,腎臓の炎症における好中球の挙動には血行動態,ホルモン,液性因子,神経活性など種々の刺激・制御系が影響を与えると考えられる.国内外の施設のご協力を得て共同研究を推進しながら,上記を媒介する分子のリガンド・受容体それぞれの欠損マウス及び野生型マウスに好中球が主体となる腎炎モデルを導入し,好中球の血管内接着,血管外浸潤や腎障害の評価項目となるアルブミン尿や病理組織像を観察している.また,上記制御系の影響は全身に及ぶことから,腎臓以外にも有意な炎症性変化をきたしうる組織・臓器に応じた評価項目を設定して表現型のアセスメントを行っている.細胞内シグナルの影響については阻害作用をもつ低分子化合物およびshRNAウイルスベクターを用いた培養細胞実験や動物実験によって,とくにRNA依存性リン酸化酵素の好中球における発現や細胞活性化における機能の解析を進めた.これらの実験成果の一部は学会・研究会発表を重ねて,関係研究者からのさらなる情報を収集して研究を展開している.一方,腎臓外からのシグナルが好中球に与える影響についても,複数の腎炎モデルを導入しながら組織障害を評価しており,これにこれまでの培養細胞実験の結果を加えて投稿準備を進めている.引き続き,当初の計画していた方向で研究を推進していく.細胞内シグナルの影響については好中球におけるRNA依存性リン酸化酵素の上流・下流のシグナル解析と,遊走を促進する際に介在する細胞骨格分子への影響を解析する.また,好中球を主体とする炎症モデルでの低分子化合物の薬理作用も評価する.一方,腎臓外からのシグナルが好中球に与える影響については,複数の腎炎モデルを導入しながら組織障害を評価しており,これにこれまでの培養細胞実験の結果を加えて投稿準備を進めている.