hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯の発生・分化におけるIKK-γによる転写制御ネットワークの解析

歯の発生は、さまざまな遺伝子の発現やサイトカインなどの増強因子の作用によって調整され、複雑なシグナルネットワークが歯の分化と形成には重要な役割を果たしていることが明らかになっている。しかし、歯の発生における全てのメカニズムの詳細が明らかになっている訳ではない。本研究は、IKK-γが歯の形成のメカニズムにどのように関与しているのかを明らかにするために、以下の実験を行った。1.歯胚初期におけるIKK-γのmRNA発現の確認マウスの顎骨から各ステージの歯胚および歯胚を含む周囲の組織を摘出、IKK-γに対するin situハイブリダイゼーションを行い、各歯胚ステージでのIKK-γの発現時期・部位の検索を行った。その結果、IKK-γは、歯胚初期において歯胚上皮に強く発現していることが確認された。2.マウス歯胚領域におけるIKK-γのsiRNAによる機能障害実験マウスの顎骨から各ステージの歯胚および歯胚を含む周囲の組織を摘出し、器官培養を行った。器官培養の過程で、IKK-γのセンスRNAに対するsiRNAを注入し、歯胚の形成における形態学的な変化について検討した。その結果、siRNA作用させた群では、歯胚の成長のみならず、下顎骨の成長も抑制された。3.転写因子の検索以上の結果から、IKK-γが歯および下顎骨の形成のメカニズムに深く関与していることが示唆された。歯の発生・分化のメカニズムを明らかにするうえで、IKK-γは極めて重要な役割を果している考えられた。歯の発生と組織分化は、最新の分子生物学的手法によって、さまざまなサイトカインや形態形成遺伝子のシグナルネットワークが重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。しかし、その全てのメカニズムの詳細が明らかになっている訳ではない。初年度の研究では、IKK-γが歯の形成のメカニズムにどのように関与しているのかを明らかにするため、歯の発生および分化期におけるIKK-γの発現について以下の実験を行った。1.in situハイブリダイゼーションによるIKK-γのmRNA発現の確認マウスの顎骨から各ステージの歯胚および歯胚を含む周囲の組織を摘出、標本切片を製作した。IKK-γに対するin situハイブリダイゼーションを行い、各歯胚ステージでのIKK-γの発現時期・部位の検索を行った。2.マウス歯胚領域におけるIKK-γのsiRNAによる機能障害同様に、マウスの顎骨から各ステージの歯胚を含む組織を摘出し、器官培養を行い、IKK-γのセンスRNAに対するsiRNAを注入し、歯胚の形成における形態学的変化について検討した。また、RT-PCRでmRNAレベルにおける発現を検討した。その結果、siRNA導入による明らかな形態変化は確認されなかった。RT-PCRにおいてIKK-γの発現に差は確認されなかったことから、単に初代培養細胞におけるsiRNAのノックダウン効率が低いためか、siRNAの導入方法および設計について検討を行っている最中である。しかし、in situハイブリダイゼーションの結果からも、IKK-γが歯の形成のメカニズムに関与しているのは明らかであり、歯の発生・分化のメカニズムを明らかにする上で、IKK-γの発現解明は極めて重要と考えている。歯の発生と組織分化は、さまざまなサイトカインや形態形成遺伝子発現など複雑なシグナルネットワークが存在していることが明らかになっている。本研究では、IKK-γが歯の形成のメカニズムにどのように関与しているのかを明らかにするために、実験を行い以下の結果を得た。IKK-γは、歯胚初期において歯胚上皮に強く発現しており、IKK-γのsiRNAによる機能障害によって歯胚の成長のみならず下顎骨の成長も抑制された。IKK-γは、歯胚誘導初期の反応遺伝子であることを示した。

このことからIKK-γが転写抑制因子として下流の様々な遺伝子を制御し歯の発生に重要な働きをしていることが示唆された。実際、siRNAによりIKK-γの発現を抑制することで、歯胚の発生の抑制のみならず、顎骨の発育も抑制されることは新しい発見である。色素失調症の臨床所見においても顎骨の劣成長がみられることは本実験結果を裏付けるものであった。以上の結果から、骨の成長にはIKK-γの発現が必須であるか、もしくは顎骨内に歯胚の存在がすることが正常な顎骨の成長には必要であるのか、二つの可能性が示唆され、今後詳細な検討が必要と思われた。また、転写調節領域を含む遺伝子断片のクローニングを行い、クローニングした上流配列にプロモーター活性を示す部位が存在するか検証したところ、転写因子NF-kBの発現が増強していることが確認された。NF-kBは、細胞死抑制に関与する遺伝子群や、炎症性サイトカイン遺伝子群の転写を誘導する主要な制御因子である。今後、NF-kBの活性化のシグナル伝達についても詳細に検討する必要性があることが示唆された。
巨大地震に先行する地震群の活動と広域地殻応力場の変化

研究目的:大地震や火山噴火にはその震源域や火山周辺においてしばしば先行する地震群の活動がその直前だけでなくかなり以前から出現し、大地震の震源域や噴火に関わる領域よりも広い地域にわたる地殻応力場の変動と密接に関わっている。これらの地震群の発生メカニズムを解析し、地殻内の応力状態を推定する方法を確立する。研究成果:1989年6月30日伊豆半島東方沖に発生した群発地震は7月13日には遂に伊東沖の海底噴火に発展した。この一連の現象を研究対象とするとともに、各地に発生した地震群の特性を調査研究した。更に、研究成果を持ち寄り研究討論会(元年11月17日19日於静岡県地震防災センター)を開き全員で研究発表を行った。この成果は「群発地震と広域応力場(続)」として月刊地球に掲載予定である。(伊豆半島東方沖群発地震関係)7月より臨時観測を実施し、本研究班からは3班が出動し、長期の地震活動の変化、海底噴火後の地震活動域の特徴及び微動の消長にそれぞれ焦点をしぼって研究を行った。更に1978年以来しばしばこの付近に発生した約20回の群発地震活動と異常隆起との関係を調べ、群発地震による破壊の進行やマグマ溜の合体は非可逆現象で一方的に変化するとのモデルで一連の群発地震活動と地殻の異常隆起の現象を統一的に解釈することができた。(地震群の特性と地殻応力場との相関)1)地震の発生と潮汐力による地殻歪との関係。2)フィリッピン海プート内に発生する地震群と上部地殻内に発生する地震群との相関。3)群発地震の震源域の拡大及び成長。4)北海道に発生した地震群の特徴から、応力場に変化が生じると地震の発生回数だけでなく、地震の発生様式にも変化がみられる。5)南極昭和基地付近の微小地震は数年から10年の間隔で間欠的に発生していて、〓床後退に伴う地殻の隆起による歪の蓄積で発生する。等の研究成果である。等の研究成果である。
生殖統御機構としての脳

本研究の目的は、生殖機能を合目的的に統合・調節する最終経路である下垂体前・後葉ホルモンの拍動的(pulse)分泌発現の機序ー発生源(pulse generator,PG)の本態とその脳内における局在を明らかにすることにある。昨年度に行った輪出入神経切断手術や、胎子脳移植の実験から、黄体形成ホルモンの拍動的放出を駆動する機構がラットでは視床下部内側基底部(MBH)に存在することが推測された。本年度は、体外に取り出したMBHを含む視床下部小片をin vitroで内頸動脈より灌流し、下垂体柄に放出されるLH放出ホルモン(LHRH)を測定し、PGのMBH内の局在を確めた。このようにして灌流された視床下部小片から、LHRHはパルス状に分泌されるのが観察された。このパルスの振幅は、発情前期、発情期において発情周期より大きい傾向が認められた。PGの局在に関し、多ニュ-ロン発火活動(MVA)をシバヤギで長期にわたり記録した。その結果弓状核においてLHパルスに先行してMVAの増加が観察された。これはPGがMBHに存在するというラットの結果とよく一致する。正中隆起に軸索を送るLHRH細胞を逆行性に同定し、その単一ニュ-ロン活動を長期にわたって記録しようと試みたが、十分な成果は得られなかった。下垂体神経葉に軸索を送る視索上核と室傍核のオキシトシン(OT)神経は、乳頭に対する連続的吸乳刺激にも拘らず間欠的に同期した活動電位の発射増加(burst)をおこす。このため、OTはパルス状に分泌される。視床下部内側核とその外側周辺に、OT細胞と同期してburst状に発火する神経細胞の存在を見出した。この細胞は視索上核へ軸索を送っているが、神経葉へは軸索を延ばしていない。それ故、この細胞は、乳頭からの刺激を、間欠的なburst状の信号に変換するものであり、OTのパルス状分泌を促すPGであると考えられる。この神経細胞の性質を分析することにより、LHRHのPGの解明に役立つものと思われる。本研究の目的は,生殖腺機能を合目的的に統合・調節する最終経路である下垂体前・後葉ホルモンの拍動的分泌(パルス)発現の機序ー発生源(PG)の本態とその脳内における局在を明らかにすることにある。本年度は,PGの局在に焦点をあてin vivo,in vitroの実験を行った。視床下部内側基底部(MBH)に前方より入力する神経線維を弓状核前部で切断したラットではLHパルスは消失した。このような動物のLHパルスは,胎子脳MBHを第3脳室内へ移植することによって回復した。胎子大脳皮質の移植はパルス回復効果を持たない。この結果は、MBH内にLH放出を刺激する視床下部性LH放出ホルモン(LHRH)のパルス状放出を駆動する機構が存在することを強く示唆する。移植した胎子脳が,ホストである成熟動物の脳と連絡する機序を形態学的に調べた。その結果,神経成長因子(NGF)が密接に関係していることが明らかになった。すなわち,胎子視床下部は宿主側に存在する微量のNGFにより自らの受容体をupーregulationにより作りながら神経線維のネットワ-クを構築して行くものと考えられる。

また,シバヤギにおいて多ニュ-ロン発火活動(MUA)を長期にわたって記録する技術を開発し,電極の先端が弓状核にある時にのみLHパルスに同調するMUAの増加を観察した。この結果は前述のラットで得られた結果と一致する。一方,視床下部ー下垂体潅流系を用いたin vitroの実験では,in vivoの結果とは異なり視索前野にPGが存在する可能性が示された。オキシトシン(OT)分泌を行うニュ-ロンもパルス状の発火活動を示す。この発火活動と同期して発火するニュ-ロンがBMHに存在することが明らかにされた。このニュ-ロンは,オキシトシンニュ-ロンの細胞体の一部が存在する視索上核に直接線維を送っていることも示された。このニュ-ロンがOT分泌のPGであるか否か,LHRH分泌のPGであるか否かは分後の問題である。本研究の目的は、生殖機能を合目的に統合・調節する最終経路である下垂体前・後葉ホルモンの拍動的(pulse)分泌発現の機序ー発生源(pulse generator,PG)の本態とその脳内における局在を明らかにすることにある。昨年度に行った輪出入神経切断手術や、胎子脳移植の実験から、黄体形成ホルモンの拍動的放出を駆動する機構がラットでは視床下部内側基底部(MBH)に存在することが推測された。本年度は、体外に取り出したMBHを含む視床下部小片をin vitroで内頸動脈より灌流し、下垂体柄に放出されるLH放出ホルモン(LHRH)を測定し、PGのMBH内の局在を確めた。このようにして灌流された視床下部小片から、LHRHはパルス状に分泌されるのが観察された。このパルスの振幅は、発情前期、発情期において発情周期より大きい傾向が認められた。PGの局在に関し、多ニュ-ロン発火活動(MVA)をシバヤギで長期にわたり記録した。その結果弓状核においてLHパルスに先行してMVAの増加が観察された。これはPGがMBHに存在するというラットの結果とよく一致する。正中隆起に軸索を送るLHRH細胞を逆行性に同定し、その単一ニュ-ロン活動を長期にわたって記録しようと試みたが、十分な成果は得られなかった。下垂体神経葉に軸索を送る視索上核と室傍核のオキシトシン(OT)神経は、乳頭に対する連続的吸乳刺激にも拘らず間欠的に同期した活動電位の発射増加(burst)をおこす。このため、OTはパルス状に分泌される。視床下部内側核とその外側周辺に、OT細胞と同期してburst状に発火する神経細胞の存在を見出した。この細胞は視索上核へ軸索を送っているが、神経葉へは軸索を延ばしていない。それ故、この細胞は、乳頭からの刺激を、間欠的なburs状の信号に変換するものであり、OTのパルス状分泌を促すPGであると考えられる。この神経細胞の性質を分析することにより、LHRHのPGの解明に約立つものと思われる。
ポリグリシン化による微小管の機能制御

細胞骨格は細胞の形態、極性形成に重要である。本研究では微小管ポリグリシン化による微小管多様性の形成(1)、FilGAPによるアクチン細胞骨格の時空間制御機構の解析を行った(2)。(1)グリシン化酵素TTLL8のノックアウトマウスの精巣、鞭毛ではチュブリンのポリグリシン化が低下し、グルタミン酸化が増加していた。この結果からポリグリシン化とグルタミン酸化の拮抗的な制御が微小管の多様性を生み出していると考えられた。(2)クラスリンによるFilGAPの活性抑制がアクチン細胞骨格再編成を時空間的に制御する可能性が示唆された。ポリグリシン化はタンパク質の特定のグルタミン酸残基に一つあるいは複数のグリシンを直鎖状に付加するユニークな翻訳後修飾である。繊毛、鞭毛の微小管は高度にグリシン化されているが、その詳細な役割は分かっていない。これまでポリグリシン化の責任酵素は分かっていなかったが、最近Tubulin tyrosine ligase like protein 3,8,10がグリシン化酵素であることが同定された。ポリグリシン化が微小管の多様性創出の分子基盤であることを示すために、グリシン化酵素であるTTLL8欠損マウスを作成した。TTLL8欠損マウスは正常に発生し、生殖機能などにも異常は見られなかった。TTLL8欠損マウスにおけるタンパク質のポリグリシン化を調べたところ、精巣においてポリグリシン化が大きく減少していた。また精子においてもポリグリシン化が減少していた。一方、TTLL8欠損マウスにおいてポリグルタミン酸化が上昇していたことから、ポリグリシン化はポリグルタミン酸化と拮抗する反応であることが示唆された。今後、ポリグリシン化の状態により微小管に結合するタンパク質が変化するか、精子鞭毛軸糸の構造、精子鞭毛の運動にどのような影響を与えるか調べていく予定である。これまでポリグリシン化の責任酵素は分かっていなかったが、最近Tubulin tyrosine ligase like protein 3, 8, 10がグリシン化酵素であることが同定された。ポリグリシン化が微小管の多様性創出の分子基盤であることを示すことが本研究の目的である。22年度の研究においてグリシン化酵素の一つであるTTLL8欠損マウスの作製に成功し、繊毛における微小管のポリグリシン化を低下させることに成功した。TTLL8欠損マウスは正常に発生し、正常に繁殖可能であった。TTLL8欠損マウスにおけるタンパク質のポリグリシン化を調べたところ、精巣において様々なタンパク質のポリグリシン化が大きく減少していた。またTTLL8欠損マウスのオスから単離した精子においてαチュブリンのポリグリシン化が減少しているが、βチュブリンのポリグリシン化は変化していなかったことから、TTLL8はαチュブリン及びチュブリン以外のグリシン化を生体内で制御していることが明らかとなった。さらにTTLL8欠損マウスの精巣、精子でポリグルタミン酸化が上昇していたことから、ポリグリシン化はポリグルタミン酸化と拮抗する反応であることも示唆された。23年度の研究では、精子の構造を光学顕微鏡、軸糸の構造を電子顕微鏡で観察を行なった。精子の構造と軸糸の微細構造は野生型マウスと大きな違いは観察されなかった。ここまでの結果を第63回日本細胞生物学会において報告した。また、精巣、精子、気管上皮、繊毛を持つ組織でのTTLL8の発現と局在を調べるためにウェスタンブロット、免疫染色に使用可能なTTLL8抗体を作成に成功した。前年度から北里大学への移籍に伴いアクチン細胞骨格による細胞の極性形成制御機構の研究を開始している。前年度、細胞の形態形成や運動に重要な因子であるRac特異的GAP因子FilGAPにリン酸化依存的に結合するタンパク質を単離することに成功したことを報告した。今年度の研究でFilGAPBPがFilGAPのRacGAP活性を抑制することを明らかにした。GSTプルダウンアッセイによってFilGAPがFilGAPBPに直接結合することを明らかにした。組み替えタンパク質を用いた結合部位のマッピングにより詳細な結合に必要な領域を同定することにも成功した。また、in vitroにおいてFilGAPBPは野生型および非リン酸化型FilGAPのRacGAP活性を阻害するが、擬似リン酸化型FilGAPは阻害しないことを明らかにした。

さらに細胞内においてFilGAPBPの発現抑制によってFilGAPのRacGAP活性が増加しコラーゲンコートしたカバーガラス上での細胞伸展を抑制したことから、FilGAPBPは細胞内においてもFilGAPのRacGAP活性を抑制することが示唆された。非リン酸化型FilGAPはwoundhealing assayにおける細胞運動を低下させたが、FilGAPBPの発現抑制によって細胞運動の低下が回復した。FilGAPBPの発現抑制はFilGAPの活性化を介してコラーゲンゲル上で培養した乳がん細胞の形態を細長い間葉型から丸いアメーバ型へと変換を促進することが分かった。以上の結果からFilGAPBPは脱リン酸化型FilGAPに結合しFilGAPのRacGAP活性を抑制することにより細胞の形態、運動を制御する因子であることが明らかになった。これらの結果は平成26年度日本細胞生物学会で報告する予定である。複雑な生物の個体が形成される機構の解明は現代の生物学の根底的な問題である。細胞生物学的には、細胞という単位に着目してほぼ対称な卵から複雑な細胞の形態が生み出される機構の解明として捉えなおすことが一般的である。細胞の形態形成には細胞骨格が重要である。本研究の目的はポリグリシン化とよばれる機能未知のユニークな翻訳後修飾による微小管機能制御機構を明らかにすることである。前年度作製したグリシン化酵素TTLL8に体する抗体を用いたウェスタンブロットによる解析によりグリシン化チュブリンが多く局在する精巣の精子鞭毛分画にTTLL8が局在することを明らかにした。しかし、様々な条件検討を行ったが免疫染色で内在性のTTLL8を染色することは難しかった。ここまでの研究成果は第64回日本細胞生物学会合同大会において発表を行った。今年度6月から現在の所属である北里大学への移籍に伴い、実験動物や実験設備の変更にともない当初の研究計画の変更を余儀なくされた。現在の所属先ではアクチン細胞骨格による細胞の極性形成制御機構の研究を開始した。低分子量GTPase RhoAとRac1は細胞内にそれぞれ異なる形態のアクチン繊維を形成することで細胞内に極性を形成する。FilGAPはRhoAの下流でリン酸化され活性化するRac1の不活性化因子であり、RhoAとRac1の活性のバランスを調整することで細胞極性を形成する。FilGAPにリン酸化依存的に結合するタンパク質を探索し候補タンパク質を単離することに成功した。同定したFilGAP結合タンパク質(FilGAPBP)の発現を抑制すると運動する細胞の極性が頑強になり、一方FilGAPの発現を抑制すると細胞の極性が失われることから、FilGAPBPはFilGAPと相互作用することで細胞内極性を制御する因子であることが示唆された。当初計画していたグリシン化酵素のノックダウン実験は、グリシン化酵素欠損マウスが完成した為に中止した。今年度達成目標に掲げた軸糸の構造の解析は完了し、繊毛/鞭毛の高速ビデオカメラによる運動解析は現在準備を進めているところである。グリシン化酵素の細胞内局在、組織分布を調べる為の抗TTLL8抗体の作製も完了しているため、おおむね順調に研究は進展していると評価した。25年度が最終年度であるため、記入しない。
唾液中８－ヒドロキシグアニンの酸化ストレスバイオマーカーとしての有用性評価

唾液中8-ヒドロキシグアニン(8-OHGua)のヒトを対象とした酸化ストレスバイオマーカーとしての有用性の検証を目的として、研究協力者(渡邉晋太郎)が産業医として勤務する企業(研究協力承諾書を取得済み)において、5月から8月にかけて実施された職場健診に合わせて、唾液、尿のサンプリングならびにアンケート用紙を用いた生活習慣調査を実施した。合計704名から本研究への参加同意が得られ、採取した尿、唾液サンプル、アンケート調査結果を、ID番号を付して整理し、産業医科大学職業性腫瘍学研究室に送付して、今後の解析に向けて保管した。HPLC-ECD(電気化学検出器)法による唾液中の8-OHGua、尿中の8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OHdG)の測定を行い、得られたサンプルの約半数について測定を終了した。また、生活習慣アンケート結果の集計を行った。今回収集したサンプルの全ての測定・解析を終えるのは次年度になる予定であるが、現段階に於いて、尿中8-OHdG値に対して、喫煙習慣が正の相関、BMIが負の相関を示すなど、生活習慣と酸化ストレスマーカーに関連が見られており、今後の結果に興味が持たれる。本研究に関連した成果について学会発表を行った。研究実績の概要で示したとおり、平成30年度に計画した研究内容は、概ね計画通り行うことができた。特に、本研究テーマの中心である人を対象とした唾液中の8-OHGuaの酸化ストレスバイオマーカーとしての有用性評価に向けて、唾液、尿の採取と生活習慣アンケート調査を予定通り行う事ができ、今後の分析、評価につなげることが可能となった。さらに、唾液中8-OHGua、尿中の8-OHdGの分析が順調に進んでおり、平成30年度中に約半数のサンプルの分析を終えることができた。これまでに得た酸化ストレスバイオマーカーの測定結果と生活習慣アンケート調査から、生活習慣と生体内酸化ストレスの関係が一部明らかとなった。本研究と関連してこれまでに得られた酸化ストレスバイオマーカーに関する知見を学会発表した。現在、論文投稿準備を行っている。また、測定を終えた酸化ストレスマーカーの値について、研究協力者の産業医を通じて希望する被験者に通知した。同時に、酸化ストレスマーカーの結果の解説を加えたことで、生活習慣の改善効果に期待が持たれる。一方で、人を対象とした研究にかける時間と労力が多くなったため、平成30年度に予定した動物実験が十分に進められなかったが、唾液中8-OHGuaの生成メカニズムを考える上で動物を用いた基礎的な検討が必要と考えられることから、今後引き続いて検討したい。1.これまで継続して行ってきたマウス・ラットを用いた運動負荷試験に加えて精神ストレス負荷試験を行い、唾液中の8-OHGuaレベルを測定して、酸化ストレスバイオマーカーとしての有用性を検証する。ヒトを対象とした研究への応用を目的として、運動に加えて精神的ストレスによる酸化ストレスバイオマーカーの変動についての基礎的な知見を得たい。2.研究協力者(渡邉晋太郎)が産業医として勤務する企業(研究協力承諾書を取得済み)において採取した唾液ならびに尿について、酸化ストレスマーカーである尿中8-OHdGならびに唾液中8-OHGuaのHPLC-ECDによる分析を継続して実施する。合わせて、生体試料の採取時に実施した生活習慣調査を目的としたアンケート調査の結果を集計する。3.上記で得た唾液中の8-OHGua、尿中の8-OHdGの測定値およびアンケートの集計結果を基に、生活習慣と酸化ストレスマーカーの関係について解析を行う。有意義な結果が得られた場合には、順次、学会発表や論文発表を行う。4.解析結果を希望した被験者に通知し、生活習慣の見直しと改善を提案する。同時に、労働環境との関連についても調査を行い、必要が認められた場合には、研究協力者の産業医を通じて職場環境の改善を提案する。5.本研究では、生活習慣や体調の変化、経年変化などによる影響を明らかにするため、同一の集団において、再度、尿中8-OHdG、唾液中8-OHGua、生活習慣・労働状況に関するアンケート調査結果を得ることを目的としており、2回目の調査を開始する。平成29年度は、唾液中8-ヒドロキシグアニン(8-OHGua)の酸化ストレスバイオマーカーとしての有用性を評価するための分析方法の検討ならびに動物を用いた基礎的な研究を行うと共に、少人数のヒトでの分析を実施した。唾液中8-OHGuaをHPLC-ECD法によって精度良く効率的に分析する方法と、タンパク分解酵素を用いる唾液の前処理方法を確立し、学会および論文にて発表した。これにより、平成30年度から実施予定のヒトの集団での調査に於いて、多数の検体を測定する事が可能となった。動物を用いた実験では、マウスにX線照射や運動負荷などの酸化ストレスを与え、8-OHGuaの変動を測定したが、control群と比べて有意な変化は見られなかった。その理由として、唾液採取時に用いる麻酔の影響が考えられることから、実験条件を見直して検討を続けたい。さらに、約10名のヒトを対象に、経時的に唾液を採取して8-OHGuaレベルを測定した。その結果、喫煙者で高い傾向を認めた。また、唾液中の8-OHGuaの値には日内変動があることが分かり、早朝に高い傾向があることが明らかとなった。よって、唾液採取は午前10時以降が適当と考えられる。これまでに、魚などに8-OHGuaが多く含まれていることを見出していることから、食事の影響を検討した。

現時点までの結果では、8-OHGuaを含む食品を多く摂取しても、唾液中レベルに顕著な影響を与えなかった。唾液中8-OHGuaは、食事の影響を受けにくいと考えられるが、より確かな結論を得るために、今後ヒト集団での調査を行う場合に、食事内容についても同時に調査したい。さらに、平成30年度から研究協力事業所で行う調査について、具体的な実施方法を検討し、事業所に説明を行って了承を得た。研究実績の概要で示したとおり、平成29年度に計画した研究内容は、概ね計画通り行うことができた。特に、本研究テーマの中心である唾液中の8-OHGuaの正確で効率的な測定方法を確立できたことは、今後予定されているヒト集団での調査に於いて意義が大きいと考える。さらに、唾液中8-OHGuaの日内変動パターンや食事の影響などの結果が得られたことで、平成30年度に計画している研究協力企業での検体のサンプリングについて、具体的な実施方法を検討する上で有益な情報となった。これまで得られた結果を、研究参加者への生活習慣アンケート調査に反映することで、より確かな結果が得られるものと期待する。一方で、動物実験については、予想した通りの結果が得られなかったが、実験方法を改善することでより価値のある結果が得られるものと考えられる。動物実験は、唾液中8-OHGuaの生成メカニズムを考える上で欠かせないと考えられ、今後引き続いて検討したい。唾液中8-ヒドロキシグアニン(8-OHGua)のヒトを対象とした酸化ストレスバイオマーカーとしての有用性の検証を目的として、研究協力者(渡邉晋太郎)が産業医として勤務する企業(研究協力承諾書を取得済み)において、5月から8月にかけて実施された職場健診に合わせて、唾液、尿のサンプリングならびにアンケート用紙を用いた生活習慣調査を実施した。合計704名から本研究への参加同意が得られ、採取した尿、唾液サンプル、アンケート調査結果を、ID番号を付して整理し、産業医科大学職業性腫瘍学研究室に送付して、今後の解析に向けて保管した。HPLC-ECD(電気化学検出器)法による唾液中の8-OHGua、尿中の8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OHdG)の測定を行い、得られたサンプルの約半数について測定を終了した。また、生活習慣アンケート結果の集計を行った。今回収集したサンプルの全ての測定・解析を終えるのは次年度になる予定であるが、現段階に於いて、尿中8-OHdG値に対して、喫煙習慣が正の相関、BMIが負の相関を示すなど、生活習慣と酸化ストレスマーカーに関連が見られており、今後の結果に興味が持たれる。本研究に関連した成果について学会発表を行った。研究実績の概要で示したとおり、平成30年度に計画した研究内容は、概ね計画通り行うことができた。特に、本研究テーマの中心である人を対象とした唾液中の8-OHGuaの酸化ストレスバイオマーカーとしての有用性評価に向けて、唾液、尿の採取と生活習慣アンケート調査を予定通り行う事ができ、今後の分析、評価につなげることが可能となった。さらに、唾液中8-OHGua、尿中の8-OHdGの分析が順調に進んでおり、平成30年度中に約半数のサンプルの分析を終えることができた。
超高感度固体高分解能遷移金属核NMR検出器の開発

^<109>Ag核観測可能な検出器の製作を行なった。特に、プローブ及びパワーアンプについて以下の点に注目して試作した。(1)方向性結合器(デュプレクサ-)の周波数広帯或問題の解決に向け、低周波数でも広域帯で観測が行なえるようにしたものを組み込んだ。(2)サンプル量を多くして感度をあげることを行なった。本計画では従来の5mmFを7mmFにしてサンプル量を2倍にできるプローブを製作した。(3)二重共鳴系のチューニング問題の解決をした。そのため低周波観測核と高周波照射核(^1H)のチューニング、マッチングがプローブコイル一つでとれる回路を検出器に導入した。(4)高速回転によるCP法の低効率化を防止するため新しいCPパルス(shaped pulse)を分光器のプログラムに組み込んだ。特に^<109>Ag核については、(1)標準試料(AF, AgCl, AgBr, AgI, Ag_2(CH_3COO)_2, Ag_2SO_4など)を用いて極めて信号対雑音比の高い吸収線を得ることができた。(2)これらについてCP-MAS法の最適条件(コンタクトタイム、パルス繰り返し時間等)を調べ、以後の通常測定用の観測パラメータセットを決定してコンピュータに組み込むことができた。このようにしてこの検出器とNMRのマッチングをスムーズにし、通常測定が問題なくできる^<109>Ag核検出器を得た。さらに^<109>Ag核固体高分解能NMR観測におけるソフトの開発をおこなった。特に、水素を近接して持つ有機金属錯体を多数合成し、CP-MAS法の最適条件(コンタクトタイム、パルス繰り返し時間等)を調べつつスペクトルを測定して化学シフトを決定した。そしてこれまでになかった化学シフト範囲表の作製を行い、本NMR法を通常測定手段にまで高めることができた。なお、本研究成果により得られた検出器は日本電子株式会社より製作され1台が国内の研究機関に納入され、稼働をはじめた。本年度は^<109>Ag核について観測可能な検出器の製作を行なった。特に、プローブおよびパワーアンプについて以下の点に注目して試作した。(1)方向性結合器(デュプレクサー)の周波数広帯域問題の解決に向け、低周波数でも広域帯で観測が行なえるようにしたものを組み込んだ。特に^<109>Ag核については、(1)標準試料(AF,AgCl,AgBr,AgI,Ag_2(CH_3COO)_2,Ag_2SO_4など)を用いて極めて信号対雑音比の高い吸収線を得ることができた。このようにしてこの検出器とNMR本体のマッチングをスムーズにし、通常測定が問題なくできる^<109>Ag核検出器を得た。

標準試料となる金属錯体に関する研究をも推し進め、その過程で全く新しい固体構造を持つフェナジン銀錯体の合成に成功した。本年度は前年度の成果を受けて^<109>Ag化核固体高分解能NMR観測におけるソフトの開発をおこなった。特に、(1)標準試料(AF,AgCl,AgBr,AgI,Ag_2(CH_3COO)_2,Ag_2SO_4など)を用いて測定条件の設定、化学シフトの標準値の決定をおこない、前年度得られたハード上の成果に加えて単一パルス法での通常測定用の観測パラメータセットを決定してコンピュータに組み込むことができた。(2)次に水素を近接して持つ有機金属錯体を多数合成し、CP-MAS法の最適条件(コンタクトタイム、パルス繰返し時間等)を調べつつスペクトルを測定して化学シフトを決定した。これより以後の通常測定用の観測パラメータセットを決定してコンピュータに組み込むことができた。このようにしてこの検出器とNMR本体のマッチングを前年度以上にスムーズにし、通常測定が問題なくできる^<109>Ag核検出器を得た。そしてこれまでになかった化学シフト範囲表の作製を行い、本NMR法を通常測定手段にまで高めることができた。なお、本研究成果により得られた検出器は日本電子株式会社より製作され1台が国内の研究機関に納入され、稼働をはじめた。
発癌における炎症性微小環境を調節する新規ケモカイン受容体バリアントの解析

内膜症部分、境界部分、癌部におけるCXCR3-Bに対応するCXCL4は段階的に悪性部で減少し、その発現がマクロファージであることを突き止めた.マクロファージはEAOCでCD163 (+) CXCL4 (-)であった.更にIFN-g高発現EAOC症例においてsuppressor of cytokine signaling (SOCS)が減弱していることを発見した.これまでの研究から, IFN-γとCXCR3は炎症疾患である子宮内膜症のみならず卵巣癌でも発現が亢進していることを示したが、まずヒト内膜症とEAOCにおいて3種類のCXCR3バリアントが存在することをシークエンス解析から証明した。次にそれらの発現を比較したところ, CXCR3-BがEAOCでは抑制されていることがわかった.CXCR3-Bに対応するリガンドを検討したところ、CXCL4がEAOCでは抑制されていた.病変部におけるCXCL4抑制の原因となっているマクロファージの特徴を免疫染色で検討した.内膜症ではCD68 (+) CXCL4 (+)マクロファージが主体であるのに対しEAOCではCD163 (+) CXCL4 (-)マクロファージが主体であった.さらにQ-PCRと免疫染色から、IFN-γ高発現EAOC症例においてsuppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1)が減弱していることを発見した.病変部におけるマクロファージの特徴を検討したところ、内膜症ではCD68 (+) CXCL4 (+)マクロファージが主体であるのに対しEAOCではCD163 (+) CXCL4 (-)マクロファージが主体であった.さらにIFN-γ高発現EAOC症例においてsuppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1)が減弱していることを発見した. Western blotでは有意な差が認められた.組織学的に検討したところ、SOCS1発現の主体は浸潤マクロファージであり、内膜症では発現が認められるのにEAOCでは発現が明らかに低下していた.以上の結果から, IFN-γ高発現下で発癌するEAOCに動員されるCD68 (+)マクロファージは,従来のM1/M2に規定されるものではなくCD163 (+) CXCL4 (-) SOCS1(-)という特徴的なマーカーを有するものであることが判った.これらの分子の発癌への役割や診断応用が今後の研究課題となる.内膜症部分、境界部分、癌部におけるCXCR3-Bに対応するCXCL4は段階的に悪性部で減少し、その発現がマクロファージであることを突き止めた.マクロファージはEAOCでCD163 (+) CXCL4 (-)であった.更にIFN-g高発現EAOC症例においてsuppressor of cytokine signaling (SOCS)が減弱していることを発見した.子宮内膜症合併卵巣癌(endometriosis-associated ovarian cancer; EAOC)をモデルに,発癌段階のIFN-γ誘導性ケモカイン受容体CXCR3のバリアントに着目し、CXCR3応答軸破綻が引き起こす病態を解明してきた.これまでの研究から, CXCR3は炎症疾患である子宮内膜症のみならず卵巣癌でも発現が亢進していることを示したが、癌におけるCXCR3上昇の意義は不明であった。今回の研究において、まずヒト内膜症とEAOCにおいて3種類のCXCR3バリアントが存在することをシークエンス解析から証明した。次にそれらの発現を比較したところ, CXCR3-Aは両者ともに高値であるが、CXCR3-BがEAOCでは抑制され、CXCR3-altがEAOCで亢進していることがわかった(Furuya M, et al. Gynecol Oncol 2011).またCXCR3-Bに対応するリガンドを検討したところ、CXCL4がEAOCでは抑制されていた。この状態がEAOC発癌段階に有意な相関を示すかどうかを解明するため、単嚢胞中に発癌するEAOCを用いて内膜症部分、境界部分、癌部におけるCXCL4を検討した。その結果、CXCL4は段階的に悪性部分で減少し、その発現細胞がマクロファージであることを突き止めた(Furuya M, et al.Cancer Biol Ther, in press).癌部の浸潤マクロファージの特徴の一つとして,過去に様々な悪性疾患で報告されているCD163 (+)が重要であることが組織学的に確認された一方,まだ関連のよくわからないSOCS1も関与している可能性が出てきた。このため、マクロファージの機能がM1からM2にシフトする過程が病変部で限局性に起こっているのか、循環末梢血中でも捉えることができるかどうかを明らかにする必要が出てきた。またIFN-γ高発現状況下でSOCS1の発現を負に調節する機構があると予想され、その分子を同定する必要がある。CXCR3バリアントの導入株を卵巣癌で作成した。しかしCXCR3-Bを導入すると細胞増殖が止まることから樹立を断念した。CXCR3-Aは樹立できたが細胞増殖がまだ弱いため、純化に時間がかかっている。多数例でSOCS1の発現を定量的に解析し、統計学的にSOCS1が癌で有意に発現低下していることを証明する(western blot, Q-PCR)。SOCS1の発現低下に関与する分子同定を行う。いくつかのmiRNAを候補分子として検討している。末梢血中のマクロファージの多染色により、CD14(+)monocyteにCXCL

4, SOCS1などの発現が認められるデータをもとに、病変部の単核球を分離し、短期培養によってその発現分子の特徴を明らかにする。CXCR3バリアント導入株をもちいて卵巣癌細胞自身に発現するCXCR3バリアントの意義を解明する。CXCL4発現細胞がマクロファージであることが分かったので、EAOC発癌におけるM1/M2マクロファージの関与を病理学的に解明する。該当なし細胞培養と細胞機能解析に要する試薬M1/M2マクロファージ解析に必要な抗体(CD163, CD204など)の購入と二次元蛋白質解析に要する試薬
Gefarnateの結膜におけるムチン分泌促進作用のドライアイモデルでの評価

ムチン産生促進作用のあるgefarnate(geranyl farnesyl acetate)は、粘膜上皮の杯細胞からのムチン産生を促進することから、胃では防御因子増強型潰瘍治療薬として既に市販されている。杯細胞は眼の結膜上皮にも同様に多数存在しており、昨年までに、家兎の涙腺除去モデルに下眼瞼結膜のアルカリ外傷を作成しての、gefarnate点眼による創傷治癒効果を判定を行ったところ、3週目で基剤点眼群に比べて有意な改善を認めた。本年度は、まず別のドライアイモデルとしてのコンタクトレンズ装用モデル(CLモデル)を完成させるべく、基礎的な研究を行った。ニュージーランド白色家兎の両眼の瞬膜を実験開始1週間前までにあらかじめ切除し,感染症などの合併症を発症しなかった動物のみを用いた.瞬膜切除は、家兎に塩酸ケタミン及びキシラジン塩酸塩混合液を筋肉内投与しての全身麻酔下で行った.片眼にSCLを装用し、脱落防止のために瞼々縫合を置き、反対眼は正常対照とした。SCL連続装用眼では装用1ヶ月目に点状表層角膜症、および涙液分泌量減少を認めたが、やはりレンズ脱落やレンズの汚れが目立つ例があったこと、および角膜潰瘍を生じる例もあったことから、長期装用によるドライアイ発症モデルとしては適さないと思われたことから、このモデルを用いてのgefarnateの効果判定は困難と判断した。結局、昨年得られた涙腺除去モデルの結果と正常眼での創傷治癒効果とを比較すべく、眼異常の無い家兎6匹を用い、0.5%NaOH溶液によるアルカリ外傷後のgefarnate効果判定を行った。ゲファルナート投与眼では基剤投与眼に比べて、生体染色スコアが受傷後23週目で改善を認めた。これをドライアイモデルでの結果と比較したところ、gefarnateによる効果は正常眼での方が強いと考えられた。胃粘膜保護剤gefarnate(geranyl farnesyl acetate)は、胃粘膜上皮の杯細胞からのムチン産生作用により防御因子増強型潰瘍治療薬として既に市販されている。杯細胞は眼の結膜上皮にも多数存在しているが、眼での結膜上皮修復能やムチン産生能の機序解明は行われていなかった。本研究では、gefarnateの結膜杯細胞におけるムチン分泌促進の作用機序を解明する事を目的としているが、まずは数種類のドライアイモデル動物が安定して作成できるか否かの判定を行った。ドライアイモデルの候補には、1.副交感神経除神経モデル、2.涙腺除去モデル、3.コンタクトレンズ(CL)モデルの3モデルとした。いずれも片眼のみ実験的に使用し、もう片眼は正常対照として使用した。1の副交感神経除神経モデルは、涙腺を支配する大錐体神経を脳から出た直後で切断するため、顕微鏡下での難手術となり、脳挫傷や感染症などの合併症で安定した供給が難しく、今回は保留とした。2の涙腺除去モデルは、涙液量が思っていたほど減少しなかったが、角膜上皮障害を出現し、ドライアイを来たすと判断されたため採用した。3のCLモデルは、レンズの眼からの脱落が相次ぎ、既製品を使用しての実験が困難と思われたため、CLメーカーに家兎用CLの製作を依頼している。上記の涙腺除去モデルを用いて、下眼瞼結膜のアルカリ外傷を作成しgefarnateによる創傷治癒効果を細隙灯顕微鏡的観察、結膜インプレッションサイトロジーにて判定を行ったところ、3週目で基剤点眼群に比べて有意な改善を認めた。このことから、gefarnate点眼はドライアイモデル家兎においてもアルカリ外傷後の結膜杯細胞増殖促進効果があると考えられ、新たな眼表面保護剤として臨床応用できる可能性が示唆された。
Epstein-Barrウイルスの複製に伴う宿主細胞応答の解析

RPAは3つのサブユニット(RPA1,RPA2,RPA3)から成る蛋白質複合体で、一本鎖DNAに結合する。DNA複製において各段階でRPAは重要な働きを持つ。さらにDNA組み換え修復、遺伝子発現等のDNAを器質とするさまざまな反応に関与する多機能因子であることが知られている。RPA複合体の一つRPA2サブユニットは特に細胞周期信仰やDNA損傷存在かにおいてリン酸化修飾を受けることが知られ、細胞周期制御、DNA損傷応答との関連が報告されている。EBVウイルス複製感染を誘導した細胞では経時的にRPA2のリン酸化修飾が増加し、またRPA2自身およびリン酸化修飾RPA2のDNA結合画分への移行が観察された。さらにリン酸化RPA2はEBウイルス複製領域中に共局在することが免疫染色による観察により明らかとなった。またこのときRPA2と同様にDNA組み換え修復に昨日する因子(Rad51,Rad52,Mre11,Nbs1)もEBウイルス複製領域中での共局在が観察された。免疫沈降実験により、リン酸化RPA2、Mre11,Rad52はEBウイルスDNA複製に関与するウイルス因子BMRF1と共沈してくることがわかり、さらにDNA組み換え修飾に関与する因子群はEBウイルスゲノムを免疫沈降により共沈させることが明らかとなった。またこうしたDNA組み換え修復に関連するタンパク質がEBウイルス複製領域内に観察されるたことは、そこにDNA損傷(DNA二重鎖切断部位)が存在することが強く示唆された。そこでTUNELアッセイを行いDNA二重鎖切断部位の有無を検証したところ、新規DNA合成領域に確かにDNA損傷部位を認めた。またsiRNAを用いてRad51とRPAをdeletionさせるとEBVゲノム合成能に著しい低下がみられた。以上のことから、EBウイルスDNA複製進行中、宿主DNA祖み換え修復関連タンパク質はウイルス複製装置と共に挙動し、そこでウイルスゲノム合成のいずれかのステップに関連してることが示唆された。Epstein-Barr(EB)ウイルスが潜伏感染するがん細胞でウイルス産生感染へ移行すると、RB蛋白質は高リン酸化状態になりCyclinA(E)/CDK2の活性が維持され宿主DNA合成を伴わないS期様細胞環境となる。RPA(ヒト一本鎖DNA結合蛋白質)は3つのサブユニット(RPA1,RPA2,RPA3)からなる蛋白質複合体で、一本鎖DNAに結合する。複製では、その開始から伸長反応まで各段階で重要な働きを持つ。さらに、遺伝的組み換え、修復、遺伝子発現等、DNAを基質とするさまざまな反応に関与する多機能因子である。RPA2は特に細胞周期進行やDNA損傷存在化においてリン酸化されることがしられ、細胞周期制御、DNA損傷応答との関連が報告されている。ウイルス産生感染を誘導した細胞ではRPAのDNA結合画分への移行が観察され、ウイルス複製領域内にRPA複合体が局在していた。RPAはDNA損傷に応じてリン酸化されることが知られるが、ウイルス産生感染時においてもRPA2のリン酸化が起きていた。TUNEL染色像の解析やRPAリン酸化蛋白質によるEBウイルス産生感染誘導細胞核内染色により、ウイルス複製領域内にはリン酸化型RPA2を引き寄せる二本鎖DNA断端を多く含んでいることがわかった。また、同領域内にはMre11、NBS1,Rad51などのDNA修復(DNA相同組み換え)に機能する蛋白質の集積が認められ、EBウイルス複製領域ないにおいて宿主DNA修復機構によるDNA鎖切断の修復が行われていることが示唆された。RPA(ヒト一本鎖DNA結合タンパク質)は3つのサブユニット(RPA1,RPA2,RPA3)から成るたんぱく質複合体で、一本鎖DNAに結合する。DNA複製においてその開始からDNA鎖慎重反応まで各段階でRPAは重要な働きを持つ。またこのときRPA2と同様にDNA組み換え修復に昨日する因子(Rad51,Rad52,Mre11,Nbs1)もEbウイルス複製領域中での共局在が観察された。免疫沈降実験により、リン酸化RPA2、Mre11,Rad52はEbウイルスDNA複製に関与するウイルス因子BMRF1と共沈してくることがわかり、さらにDNA組み換え修飾に関与する因子群はEBウイルスゲノムを免疫沈降により共沈させることが明らかとなった。そこでTUNELアッセイを行いEBウイルス複製領域中にDNA二重鎖切断部位の有無を検証したところ、新規DNA合成領域に確かにDNA損傷部位を認めた。以上のことから、EBウイルスDNA複製進行中、宿主DNA組み換え修復関連タンパク質はウイルス複製装置と共に挙動し、そこで何らかの機能に関連していることが示唆された。

さらにDNA組み換え修復、遺伝子発現等のDNAを器質とするさまざまな反応に関与する多機能因子であることが知られている。RPA複合体の一つRPA2サブユニットは特に細胞周期信仰やDNA損傷存在かにおいてリン酸化修飾を受けることが知られ、細胞周期制御、DNA損傷応答との関連が報告されている。EBVウイルス複製感染を誘導した細胞では経時的にRPA2のリン酸化修飾が増加し、またRPA2自身およびリン酸化修飾RPA2のDNA結合画分への移行が観察された。さらにリン酸化RPA2はEBウイルス複製領域中に共局在することが免疫染色による観察により明らかとなった。またこのときRPA2と同様にDNA組み換え修復に昨日する因子(Rad51,Rad52,Mre11,Nbs1)もEBウイルス複製領域中での共局在が観察された。免疫沈降実験により、リン酸化RPA2、Mre11,Rad52はEBウイルスDNA複製に関与するウイルス因子BMRF1と共沈してくることがわかり、さらにDNA組み換え修飾に関与する因子群はEBウイルスゲノムを免疫沈降により共沈させることが明らかとなった。またこうしたDNA組み換え修復に関連するタンパク質がEBウイルス複製領域内に観察されるたことは、そこにDNA損傷(DNA二重鎖切断部位)が存在することが強く示唆された。そこでTUNELアッセイを行いDNA二重鎖切断部位の有無を検証したところ、新規DNA合成領域に確かにDNA損傷部位を認めた。またsiRNAを用いてRad51とRPAをdeletionさせるとEBVゲノム合成能に著しい低下がみられた。以上のことから、EBウイルスDNA複製進行中、宿主DNA祖み換え修復関連タンパク質はウイルス複製装置と共に挙動し、そこでウイルスゲノム合成のいずれかのステップに関連してることが示唆された。
エピプラキンのin vivo複合体の同定とその機能

エピプラキンは、自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原として同定された表皮細胞内分子である。創傷治癒2日目において、エピプラキン存在下で、核周囲にケラチンが凝集し、2日目以降に核と細胞膜の間に線維として再構築され、同時に表皮細胞が肥大化した。エピプラキンノックアウト表皮細胞では、細いケラチン線維が、細胞膜と平行に走行して観察され、表皮細胞の肥大化が生じなかった。このことからエピプラキンは、ケラチン線維を束ねて細胞強度を与える役割を果たしていることが推定された。エピプラキンは、自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原として同定された表皮細胞内分子であり、その一次構造ならびに遺伝子構造は既に明らかになった。さらにスロットプロット・アッセイを用いたin vitro相互作用の実験からエピプラキンは、ケラチン、ビメンチンとの相互作用することが明らかになった(J Dermatol 2006)。本研究では、実際に中間径フィラメントとエピプラキンとが結合しているか否かと、中間径フィラメント以外の分子との結合の有無とを調べ、その機能を明らかにしたい。エピプラキンと中間径フィラメントとの細胞内での動態を調べるために、まず創傷治癒過程におけるマウス表皮において、共焦点レーザー顕微鏡観察、ついで免疫電子顕微鏡観察を行なった。創傷治癒過程では、4-6日目に創端の増殖表皮細胞の基底細胞層から上方に強い発現が見られたが、8日目に減弱し、10日では正常に復した。創は6-8日で治癒したが、創面を伸長する表皮先端には発現が見られなかった。免疫電子顕微鏡観察では、創傷部の増殖表皮細胞において、4-6日目にケラチン6、10の混合した太い線維の周囲にエピプラキンが見られた。このケラチン線維は2日目では、塊状として見られ、2日目以降にエピプラキン存在下で線錐に再構築されるものと推定された。しかしエピプラキンノックアウト表皮細胞では、ケラチン線維は太くなく、また綱胞膜と平行に走行する線維として観察された。このことからエピプラキンの機能は、ケラチン線雑を束ねて強度を与える役割を果たしていると考えられた。ファーウエスタンブロット法によるエピプラキン結合蛋白質の探索は、実施しえなかったので、平成20年度に計画している。さらにスロットプロット・アッセイを用いたin vitro相互作用の実験からエピプラキンは、ケラチン、ビメンチンとの相互作用することが明らかになった(J Dermatol2006)。本研究では、実際に中間径フィラメントとエピプラキンとが結合しているか否かと、中間径フィラメント以外の分子との結合の有無とを調べ、その機能を明らかにすることを目標とした。このケラチン線維は2日目では、核周囲に凝集し、2日目以降にエピプラキン存在下で核と細胞膜の間に、線維として再構築され、これとともに表皮細胞が肥大化した。しかしエピプラキンノックアウト表皮細胞では、細いケラチン線維が、細胞膜と平行に走行する線維として観察され、表皮細胞の肥大化が生じなかった。これらのことからエピプラキンの機能は、ケラチン線維を束ねて強度を与える役割を果たすことが示唆された。
ブレーン世界描像に基づく超対称大統一理論

平成13,14,15年度の三年間にわたる本研究の研究成果は次の通りである。I.ブレーン世界シナリオの研究:我々の4次元世界が実は、より高次元時空中での3-braneであるというブレーン世界シナリオを研究すべく、一番簡単な5次元時空を考え、余分な1次元がオービフォルドS^1/Z_2にコンパクト化した場合の、超共形テンソル計算則(superconformal tensor calculus)を与えた。特に、境界4次元面上の物質場とバルク超重力場物質場との超共形対称な結合のさせ方を一般的に明らかにした。また別の論文では、5次元のテンソル超多重項に対し、ゲージ多重項と非ゲージ多重項の2種類があることを初めて明らかにし、そのoff-shell超共形テンソル計算則を全面的に与えた。さらに、Bergshoeff-Kallosh-Van Proeyenの「特異時空上の超対称性」の理論を完全にoff-shellで定式化した。これにより、Randall-Sundrumのブレーン世界シナリオの場合に要求される境界面上のtensionの大きさとバルクの宇宙項の大きさの間の特殊な関係式が、超対称性の要請から自然に出てくること、またこれとは異なるBagger達の定式化では、その関係式が超対称性から要求されずファインチューニングになることも明らかにした。II.超対称E6統一模型におけるHiggs場とquark/leptonの質量・混合:いわゆるtriplet-doublet splittingの問題に対して、通常のHiggs doubletだけがPseudo-南部-Goldstone粒子であるため軽くなるのだというアイデアを、E6にもとづく大統一理論の枠内で考察した。その結果、E6大統一理論の場合には、Higgs doublet以外に必ず他の軽いPseudo-南部-Goldstone多重項が現れること、また、それがゲージ結合定数の統一を破らないためには、SU(5)の10+10^*表現になるのが唯一の可能性であり、現在の陽子崩壊の実験的boundとぎりぎり矛盾しないこと、を明らかにした。一方、1)クォーク・レプトンの質量行列が、異常U(1)電荷により冪の与えられる因子化されたFrogatt-Nielsen形をとること、および2)このU(1)電荷がSU(5)GUTの構造を持つこと、の二つの仮定をすれば、先ず、up型、down型クォークの質量データが必然的にニュートリノの大きな2-3世代間混合を意味することを示した。さらに太陽と大気ニュートリノの二乗質量差の比のデータをインプットすれば、1-2世代間混合もまた必ず大きくなるということ、すなわちbi-large混合を導くことを示した。同時に、これがE6にもとづく超対称大統一模型を支持しているという議論を与えた。今年度の研究実績は次の通りである。