hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境浄化および物質生産を目的とした微生物酵素の水生植物における発現と応用

環境水の浄化に用いる水生植物体として、多様な環境下で生育が可能であり水中の各種有機、無機成分を効率的に吸収する能力を有するクレソンを選抜した。詳細な条件検討の結果、無菌クレソンの継代培養系を確立し、多芽体、不定根、カルスを形成し増殖させる条件および倍数体の作出条件を見出した。クレソン外植体に対し、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法にて遺伝子導入を行い、組換え植物体を作出し、安定的に増殖することを確認した。組織培養により得られたクレソン多芽体を用いて、環境水の浄化実験をフィールドにて行った。・水生植物の組織培養系と分子育種技術の確立多様な環境下で生育が可能であり、水中の各種有機、無機成分を効率的に吸収する水生植物としてクレソンを選抜した。無菌クレソンの継代培養系を確立し、無菌的に各種植物ホルモンが添加された様々な植物組織培養培地にて、組織培養を試みた。クレソンは2,4-DやNAAなどのオーキシンを微量に加えた培地でm1/2MS培地で前培養し、その後オーキシン添加の培地に移植すると不定根を形成した。一方、TDZやBAなどのサイトカイニンを加えた培地に移植すると不定芽へと分化した。オーキシン、サイトカイニン両方を加えた培地で培養することで、安定的にカルスを形成し細胞を増殖させることが出来、懸濁培養細胞系を確立できた。これらの結果をもとに、アグロバクテリウム法およびパーティクルガン法を用いて、クレソンに外来遺伝子の導入を試みた。さらに、形質転換効率の向上や遺伝子組換え体の選出などを検討した。・水生植物における窒素、芳香族化合物の代謝解析目的とする環境汚染物質の代謝経路において強化されるべき酵素群を選抜するため、クレソンにおける各種代謝物(糖、アミノ酸、芳香族化合物)の解析を行った。・水生植物の組織立養系と分子育種技術の確立[加藤、荻田]前年度確立されたクレソンの組織培養系を用い、各種外来遺伝子の導入を行った。カルスや茎などのクレソン外植体に対し、GFPやGUSなどのレポーター蛋白を発現するように構築したプラスミドを用い、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法にて遺伝子導入を行い、組換え植物体を創生した。得られた組換え植物を蛍光顕微鏡等により観察し、安定的に導入遺伝子が機能していることを確認した【Journal of Plant Research, 112, 455-463(2009)】。・硝化細菌の共存による窒素代謝強化[加藤、川上]水生植物の根圏に共存させるべき硝化細菌のスクリーニングを行った。スクリーニングは、特に植物の水耕栽培に適した弱酸性の条件下にて、土壌、湖沼水、腐葉土などを用い、アンモニウムイオンを含む弱酸性培地を用いて、硝化細菌を集積培養にて濃縮・単離した。硝化細菌は培養が長時間かかり、かつ、単離が困難であり、現在スクリーニングを継続中である。・水生植物の組織培養系と分子育種技術の確立[加藤、荻田]分子育種法によらずに高機能化した水生植物の作出の例としてクレソン倍数体に着目し、その作出、生長能及び浄化能力の解析を行った。クレソン種子のコルヒチン処理により、野生種の4倍体に対して染色体の倍加した8倍体を得ることが出来、さらに未処理の種子の中から突然変異を起こした6倍体を見いだした。フローサイトメトリーを用いた各変異体の倍数性解析法を確立するとともに、倍数変異体の安定維持にも成功した。各倍数変異体を用いて、窒素及びリン酸の代謝能について検討を行った。・フィールド実験における環境水の浄化実験[加藤、川上]高岡市役所の協力を得て、高岡古城公園に簡易浄化装置を作成・設置し、組織培養したクレソン多芽体に濠水をゆっくり流下させることで濠水の浄化を試みた。予備的試験では水温の低下により植物体の浄化能が著しく低下していたため期待していたほどの浄化は認められなかったが、予備的試験で得られた問題点等をもとにして改善を加え、本試験では良好な浄化データを得ることが出来た。・根圏微生物を共存させた植物の生長能力および物質代謝能の解析[加藤、荻田]クレソンに加えて、モデル植物として知見の多いイネ及びムギを用い、根圏微生物の共存下による水耕栽培実験を行い、根圏微生物非共存下と比較した植物体の生長能力および物質代謝能を解析した。
睡眠時無呼吸症候群における遺伝的素因、炎症・間歇的低酸素と心血管系合併症

肥満と内臓脂肪は、閉塞型睡眠時無呼吸低呼吸症候群(OSAHS)発症の危険因子であり、OSAHSの一部は低換気を呈している。脂肪組織由来のレプチンは肥満の程度(BMI)の増加に伴い増える。実験的には、レプチンは内臓脂肪を選択的に減少させ、また呼吸刺激作用がある。内臓脂肪・皮下脂肪の分布が低換気と関係するのか、レプチンはOSAHSの一部に見られる低換気の病態に関与しうるのかどうかを検討した。106名の炭酸ガス分圧が正常の群と、79名の高炭酸ガス血症を呈した群において、内臓脂肪(VFA)・皮下脂肪(SFA)をCTスキャンで評価し、血中のレプチンを測定した。全体として、レプチンは、BMI(r=0.56)、VFA(r=0.24)、SFA(r=0.47)と相関が見られたが、PaO_2、睡眠中の平均SpO_2との相関はなかった。BMI、%VC、FEV_<1.0>%、AHI、睡眠中の平均SpO_2、VFA、SFAは両群間において有意差は見られなかった。血中のレプチンは、高炭酸ガス血症群において高値を呈していた。ロジスティック解析において、血中のレプチンは、唯一、高炭酸ガス血症の存在の予測因子であった(b=0.21,P<0.01)。内臓脂肪・皮下脂肪の分布は低換気の病態とは直接の関係はないが、レプチンの存在は、高炭酸ガス血症群における低換気の病態と関係している可能性が示唆された。閉塞型睡眠時無呼吸低呼吸症候群(OSAHS)の病態的特徴は、繰り返す低酸素血症である。肥満と内臓脂肪(VFA)は、OSAHS発症の危険因子である。また実験的には、間歇的低酸素はレプチン産生を刺激する。肥満のない(BMI【less than or equal】27) OSAHS症例において、睡眠中の低酸素血症は血中のレプチンレベルに影響するのか、内臓脂肪・皮下脂肪の分布は血中のレプチンレベルに影響するのかどうかを検討した。全体として、レプチンは、BMI (r=0.30)、VFA (r=0.44)、SFA (r=0.28)、AHI (r=0.48)、睡眠中の平均SpO_2値(r=0.59)、睡眠中の最低SpO_2値(r=0.37)と相関が見られた。重回帰分析の結果、睡眠中の平均SpO_2値(P<0.01)、睡眠中の最低SpO_2値(P=0.03)は、血中レプチンの説明要因であったが、AHI、BMI、VFA、SFAは説明要因とはなり得なかった。肥満のないOSAHS患者においては、脂肪分布は血中レプチン値の上昇に関与しうるが、睡眠時の低酸素血症は血中レプチンの規定要因としてより重要であることが示唆された。

全体として、レプチンは、BMI(r=0.56)、VFA(r=0.24)、SFA(r=0.47)と相関が見られたが、PaO_2、睡眠中の平均SpO_2との相関はなかった。BMI、%VC、FEV_<1.0>%、AHI、睡眠中の平均SpO_2、VFA、SFAは両群間において有意差は見られなかった。血中のレプチンは、高炭酸ガス血症群において高値を呈していた。ロジスティック解析において、血中のレプチンは、唯一、高炭酸ガス血症の存在の予測因子であった(b=0.21,P<0.01)。内臓脂肪・皮下脂肪の分布は低換気の病態とは直接の関係はないが、レプチンの存在は、高炭酸ガス血症群における低換気の病態と関係している可能性が示唆された。
溶液混合を引き金としたマイクロ秒分解一分子蛍光観察実験の確立

生体分子の運動性を分子動力学計算により再現し、機能を理解することは、低コストの薬剤開発などにも繋がる重要課題である。そのために、実験データを基に計算データを検証する必要がある。代表者はライン共焦点顕微鏡という新技術を開発し、連続的な一分子蛍光観察の時間分解能を短縮し、計算データとの比較に十分な時間精度を達成した。しかし、生体分子の大規模な構造変化は稀にしか起こらないために、実験データと計算結果の比較は未だに難しい。本研究では、溶液の高速混合装置を改善してライン共焦点顕微鏡に組み合わせることで、稀にしか起こらない生体分子の構造変化を多数観察することを可能にする。ユビキチンのフォールディング過程を対象として、実験データを分子動力学計算の結果と比較することで、揺らぎながら構造を形成し機能を果たす生体分子の実体を理解することを目指す。2018年度は、時間分解能の高い一分子蛍光分光法であるライン型共焦点顕微鏡の新しい改良として,ハイブリッド光検出器を用いて10マイクロ秒の時間分解能で5ms以上の時間にわたって,一分子が発する蛍光を観察する装置を完成した.特に,短時間内に大量に放出される光子を数え落としなく計数するための手法を最適化した.これは一分子蛍光観察の方法として,世界的に我々だけが達成した最短の時間分解能である.2018年度はさらに、一分子蛍光測定に用いる対物レンズを水浸レンズとし、流路表面に吸着した試料に由来するアーテファクトを取り除くことに成功した。また、ポリアラニンを蛍光色素で二重ラベル化し,ポリアラニン配列のヘリックス形成に応じて蛍光移動効率が変化すること,さらに、色素間距離がマイクロ秒以内の時間領域で変動を示すことを確認した。また,ポリプロリン配列のシストランス異性化反応について,一分子蛍光分光法を用いることで追跡可能であることを示した.本研究ではライン共焦点顕微鏡と溶液混合装置を組み合わせることで、タンパク質のフォールディング過程における速度論的な構造変化を一分子レベルで計測することを目的とした。しかし、2018年当初の研究の過程で、この実験を困難にしている原因として、これまで使用していた対物レンズの選択が最適ではなく、フローセル表面に吸着した試料を主に観測していたことに気づいた。この問題に対処するため、対物レンズを水浸レンズに交換するとともに、水浸レンズに最適化した光学系の再設計を行なった。その結果として、フローセル表面と相互作用することで一分子蛍光信号が変形していた問題を解決することができた。上記の問題は研究を計画していた当初は予想していなかったため、実際に一分子測定装置と溶液混合装置を組み合わせた観測をスタートすることが遅れた。しかし、水浸レンズを用いない場合による溶液混合実験には成功しており、大きな研究の遅れではなく、おおむね順調に研究が進んでいると言える。2019年度は、第一に、昨年度開発した水浸レンズを用いた一分子観察装置を用いて、できるだけ多くのタンパク質試料の蛍光観測を実施する。さらに、光学系に合わせた溶液混合セルを作成し、溶液混合に同期した一分子観察を実施する。観測する対象として、ポリアラニンのヘリックスコイル転移とそのダイナミクスの解明、天然変性状態にあるタンパク質断片であるPNtの水溶液中における構造の不均一性、液液相転移を示すLAF-1の単分子状態における構造特性、さらに、γサブユニットが回転運動を示すF1-ATPaseのαとβサブユニットの構造変化ダイナミクスについて、それぞれに大学院生を割り当てて取り組む。2019年度は第二に、水浸レンズに合わせた溶液混合装置を開発する。昨年度において、流体力学的絞り込み効果を用いて、試料流から変性剤を500マイクロ秒以内に拡散させることに成功した。さらに、この装置を使ってF1-ATPaseの運動の観察にも成功した。しかし、昨年度の研究の過程で、この装置は水浸レンズを基に構築した光学系には直接は応用できないことが判明した。したがって、混合流路の深さを10倍以上に広げ、同時に試料の逆流を防ぐための流体抵抗を十分に確保した流路を設計する。設計には流体力学計算を用いる。作成した流路を用いることで、タンパク質のフォールディングダイナミクスの計測を実施する。2018年度は、時間分解能の高い一分子蛍光分光法であるライン型共焦点顕微鏡の新しい改良として,ハイブリッド光検出器を用いて10マイクロ秒の時間分解能で5ms以上の時間にわたって,一分子が発する蛍光を観察する装置を完成した.特に,短時間内に大量に放出される光子を数え落としなく計数するための手法を最適化した.

これは一分子蛍光観察の方法として,世界的に我々だけが達成した最短の時間分解能である.2018年度はさらに、一分子蛍光測定に用いる対物レンズを水浸レンズとし、流路表面に吸着した試料に由来するアーテファクトを取り除くことに成功した。また、ポリアラニンを蛍光色素で二重ラベル化し,ポリアラニン配列のヘリックス形成に応じて蛍光移動効率が変化すること,さらに、色素間距離がマイクロ秒以内の時間領域で変動を示すことを確認した。また,ポリプロリン配列のシストランス異性化反応について,一分子蛍光分光法を用いることで追跡可能であることを示した.本研究ではライン共焦点顕微鏡と溶液混合装置を組み合わせることで、タンパク質のフォールディング過程における速度論的な構造変化を一分子レベルで計測することを目的とした。しかし、2018年当初の研究の過程で、この実験を困難にしている原因として、これまで使用していた対物レンズの選択が最適ではなく、フローセル表面に吸着した試料を主に観測していたことに気づいた。この問題に対処するため、対物レンズを水浸レンズに交換するとともに、水浸レンズに最適化した光学系の再設計を行なった。その結果として、フローセル表面と相互作用することで一分子蛍光信号が変形していた問題を解決することができた。上記の問題は研究を計画していた当初は予想していなかったため、実際に一分子測定装置と溶液混合装置を組み合わせた観測をスタートすることが遅れた。しかし、水浸レンズを用いない場合による溶液混合実験には成功しており、大きな研究の遅れではなく、おおむね順調に研究が進んでいると言える。2019年度は、第一に、昨年度開発した水浸レンズを用いた一分子観察装置を用いて、できるだけ多くのタンパク質試料の蛍光観測を実施する。さらに、光学系に合わせた溶液混合セルを作成し、溶液混合に同期した一分子観察を実施する。観測する対象として、ポリアラニンのヘリックスコイル転移とそのダイナミクスの解明、天然変性状態にあるタンパク質断片であるPNtの水溶液中における構造の不均一性、液液相転移を示すLAF-1の単分子状態における構造特性、さらに、γサブユニットが回転運動を示すF1-ATPaseのαとβサブユニットの構造変化ダイナミクスについて、それぞれに大学院生を割り当てて取り組む。2019年度は第二に、水浸レンズに合わせた溶液混合装置を開発する。昨年度において、流体力学的絞り込み効果を用いて、試料流から変性剤を500マイクロ秒以内に拡散させることに成功した。さらに、この装置を使ってF1-ATPaseの運動の観察にも成功した。しかし、昨年度の研究の過程で、この装置は水浸レンズを基に構築した光学系には直接は応用できないことが判明した。したがって、混合流路の深さを10倍以上に広げ、同時に試料の逆流を防ぐための流体抵抗を十分に確保した流路を設計する。設計には流体力学計算を用いる。作成した流路を用いることで、タンパク質のフォールディングダイナミクスの計測を実施する。
赤痢アメーバ“シスト形成”の分子機構の解明

赤痢アメーバは、ヒトの大腸に感染しアメーバ赤痢を引き起こす病原虫である。感染は、アメーバ赤痢罹患者の糞便中のシストに汚染された食物や水の摂取によって引き起こされ、発展途上国では、年間10万人の死者が報告されている。臨床薬が限られており病原性の解明、新規薬剤開発が危急の課題である。赤痢アメーバの生活環はシスト期と栄養体期、2つの時期で構成されているが、感染はシストの経口摂取によるため、シスト形成は、寄生原虫の寄生性・病原性に関わる重要な生物機構である。近年我々はこのシスト形成に原虫自身が産生するコレステロール硫酸が必須であることを報告した。本研究課題では、シスト形成の新規な解析法としてフローサイトメトリー法の導入を試みた。従来の方法は、形成されたシストの数を顕微鏡下で計測する方法であり、得られる情報が限られていた。栄養体の膜構造をEvans blueで、そしてシスト壁の主成分であるキチンをCalcofluorで蛍光染色することで、栄養体とシストをそれぞれ、(Evans blue+calcofluor-)、(Evans blueーCalcofluor+)という細胞集団として明確に区別して検出することに成功した。本方法は大量のサンプルに対して、形成されたシスト数を迅速・再現性良く定量処理できるため、シスト形成を阻害する化合物のスクリーニングが可能となった。トライアルとして400化合物のスクリーニングを行った結果、シスト形成を顕著に阻害する化合物を17個得ることができた。寄生虫疾患は、発展途上国を中心に、地球規模で甚大な被害をもたらしている脅威の感染症である。未だに有効な治療法が確立していない疾患が多く存在しているのが現状である。寄生虫疾患の病原体、つまり寄生虫の多くで、ミトコンドリアが退化していることが知られている。退化したミトコンドリアは、ミトコンドリア関連オルガネラ(MRO)と総称され、その特殊性・重要性が徐々に解明されてきている。我々はこれまでに、赤痢アメーバの退化したミトコンドリア"マイトソーム“が産生するコレステロール硫酸(CS)が、シスト形成制御に必須な分子であることを明らかにした。シスト形成は次の宿主への唯一の伝播経路であり、その阻害は感染拡大を阻止することが出来るため着目されてきたが、分子機構は不明な点が多く、特に制御機構については未だに解明されていない。本研究では赤痢アメーバのシスト形成制御の分子機構をCSを鍵分子として解析を行い、その全容を明らかにすることを試みている。最初にCSの機能を解明するために、シスト形成において、CSがどの時期に必須であるかを解析した。通常の培養条件において、シストの形成には72時間を要する。72時間を6時間ごとに区切り、CSの有無で形成されるシスト数の比較を行った。結果、CSはシスト形成誘導後、6ー30時間、つまりシスト形成の初期に作用することが明らかになった。次にCSによるシスト形成の促進を阻害する化合物の探索に必須な、形成されるシスト数の測定を短時間で行う方法論の検討を行った。これまでに、新規方法論の開発に繋がる結果が蓄積されてきており、さらにこの方法を用いた阻害剤の探索に着手している。CSの機能がどの時期で必須であるかを解明し、誘導後初期に作用することを明らかにした。これによりCSの機能解明を初期に限って解析することができている。また、形成されるシスト数の測定を短時間で行う方法論の検討を行い有用な方法を得ることができた。これまで形成されたシストの数は界面活性剤の処理を行ってから染色、顕微鏡で観察して計測する必要があり、長時間かかるだけでなく、サンプルの数を増やすことができない、計測するヒトによって誤差が生じるなどの多くの問題があったが、これをすべて解消できると期待される。流シグナルを解析する。関わる分子群を同定し赤痢アメーバシスト形成制御の分子機構を明らかにする。

また、初年度に開発した、形成されるシスト数の測定を短時間で行う方法論を用いて、CSによるシスト形成誘導促進を阻害する化合物を探索する、またCS分子の合成に関わる酵素や分解に関わる酵素の阻害剤を探索する。予定していた物品の購入が次年度になったこと、参加予定の学会が次年度開催になったことにより次年度使用額が生じた。培養器具などの購入、および学会参加のための旅費として使用を予定している。
一般化されたセルマ-群の研究

Kを代数体,Gkをその絶対ガロア群,MをGk-加群とするとき一般化されたセルマ-群とはガロアコホモロジーH^q(K、M)のfinite part H^g_f(K、M)のことである。このような群の正しい定義を与えるためには局所体Kvに対する局所条件H^g_f(Kv.M)を与えなければならない。このような局所条件はp進Hodge理論を用いて定義されるのであるが、有限ガロア加群Mに対してこのようなことを考えて行くと、DeRhaw cohomologyとetale cohowologyのintegral structureのずれを調べることになった。結論としてこのような局所条件は目的に応じてさまざまなとり方ができることがわかった。このような理論を使って加藤和也氏辻雄氏との共同研究により保型形式の岩澤理論に多くの結果が得られた。すなわちこのような観点からの保型形式のp進L関数の新しい構成方法,Mazur Tate Teitelbaum Fontaineによるexceptional zeroが起こるときのL-invariantについての公式の証明等である。
初期バロック音楽の実践的歌唱法の開発

本研究は、17世紀前半の初期バロック音楽の適切な歌唱法を、理論と実践の両面から具体的に解明したものである。理論面においては、ボヴィチェッリ、カッチーニ、プレトーリウスの理論的著述からの考察をもとに、声楽家のための手引書「初期バロック音楽の実践的歌唱法」を作成し、これを踏まえた演奏を通して、歴史的に的確な歌唱法を提示した。今回の成果により,演奏面では,この時代の声楽作品の適切な歌唱に対する指針を,具体的なレパートリーとともに示すことが可能となり,音楽史研究の面では,歌唱技術という点から,より歴史的な現実感を伴ったアプローチが可能となった。本研究の目的は,17世紀前半の初期バロック音楽の適切な歌唱法を,実践と理論の両面から具体的に解明することである。平成23年度は,初期バロックの歌唱法を探る上で,特に重要な歴史的資料である,G.B.ボヴィチェッリ「Regole passaggi di musica」(1594),G.カッチーニ「Le nuove musiche」(1602),「Nuove musiche enuova maniera di scriverle」(1614),M.プレトーリウス「Instructio pro Symphoniacis」(『Syntagma Musicum』III-3-9,1618・19),の4冊の歌唱理論書の読解を中心に研究を進めた。特に,カッチーニの「Lenuove musiche」「Nuove musiche e nuovamaniera di scriverle」と,プレトーリウスの「Instructio pro Symphoniacis」を,歌唱技術の面から具体的に解明し,(1)アフェットの概念,(2)単・複の声の長い回転,(3)スプレッツァトゥーラ,(4)イントナツィオーネ,(5)エスクラマツィオーネ,(6)トリッロとグルッポ,について,当時の歌唱法を明らかにしたが,すべての技法は,言葉のアフェットを表親するために考案されたものであることが判明した。以上を踏まえた上で,声楽初心者に対して必ず課題とされる,G.カッチーニ《アマリッリ》を例に,当時の様々な技法を用いて,適切な歌唱法を提案した。また,原典にもとづくことによって,パリゾッティ版,ペートン版,イェペセン版,ヒッチコック版からは見えてこなかった,新たな歌唱法の視点も指摘することができた。G.カッチーニ,M.プレトーリウスの歌唱理論書から導き出された注意点や歌唱法は,古楽器と演奏する際はもちろん,現在,多くの人が愛用するパリゾッティ版を用いる際にも有益であり,これまでとは違った生命感の溢れる演奏が可能になると確信した。本研究の目的は,17世紀前半の初期バロック音楽の適切な歌唱法を,理論と実践の両面から具体的に解明することである。今年度は,研究の最終年度にあたる。これまで,理論面においては,ボヴィチェッリの「マドリガーレとモテットの即興装飾法」,カッチーニの「新しい音楽作品」とその続刊,プレトーリウスの『音楽大全』第3巻所収の「音楽家に対する指導」の理論的著述を中心に,歌唱技法の面から具体的に解明してきた。また,実践面では,イタリア・バロックの声楽曲を中心に,広く楽譜を収集し,各々の曲にふさわしい歌唱法について検討を重ねた。平成24年度は,これまでの成果をもとに,レクチャー・コンサートを開催するとともに,声楽家のための手引書「初期バロック音楽の実践的歌唱法」を作成し,各研究機関を中心に,成果の還元を行った。手引書の内容は,第1部:カッチーニとプレトーリウス,1)翻訳:プレトーリウス「音楽家に対する指導」,2)カッチーニとプレトーリウスにおける歌唱法,3)歌唱法の具体的指針ー《アマリッリ》を例にー,第2部:ボヴィチェッリ,1)翻訳:ボヴィチェッリ『マドリガーレとモテットの即興装飾法』,2)ボヴィチェッリにおける歌唱法,である。本書において,3人の著述の中心をなす10種類の装飾音について考察した結果,それらは言葉のアッフェットを表現するためのものであったとの結論を得た。その成果は,これを踏まえて臨んだレクチャー・コンサートに結実し,言葉を際立たせることに成功した。本研究の意義は,理論的な考察の実践による検証という手続きを一貫して用い,それを踏まえた演奏を通じて,歴史的に的確な歌唱法を追求した点にある。この研究により,古楽演奏家たちのみならず,イタリア歌曲を学ぶ声楽の初心者に対しても,初期バロック音楽の適切な歌唱法に対する指針と,新たな視点からの演奏を提案することができた。平成23年度の研究実施計画においては,歌唱理論書の読解,前年度に収集した手稿譜の読解と歌唱技術の分析,現代譜の作成,コンサート会場の手配と演奏者の確定を掲げた。G.B.ボヴィチェッリの読解に時間を要し,手稿譜の読解と歌唱技術の分析が多少遅れたものの,次年度のレクチャー・コンサートで取り上げる曲目も決定し,おおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は,研究の最終年度にあたる。

理論書から導き出した歌唱法を,レクチャー・コンサートにおいて,研究代表者本人が実演を通じて具体的に示す計画であるが,オリジナル楽器の演奏者3名は,東京在住であるため,演奏研究に支障をきたす。よって研究代表者が,短期集中的に東京へ足を運び,研究を遂行する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
脳磁図とfMRIを用いたヒト痛覚認知機能の研究

痛覚には有髄のA-delta線維に加えて無髄のC線維が関連することが知られており、前者は鋭い痛み(first painあるいはsharp pain)、後者は鈍い痛み(second painあるいはburning Pain)に関与するとされている。しかし、これまでC線維を選択的に刺激する事は非常に困難であり、そのため研究はほとんどなされてこなかった。C線維末梢受容体のPolymodal or mechano-heat responsive C線維の興奮閾値温度はA-delta線維のものよりも低い。C線維のもう1つの特徴として、末梢皮膚での受容体密度がA-delta線維よりもはるかに高いことがあげられる。このような特徴を応用すればC線維を単独に刺激してsecond painに関与する脳反応を記録することは可能であるはずである。私達は、低出力のCO2レーザー光線を、直径0.4mmの極めて小さい穴をぎっしりとあけた薄いプレートに照射して極めて狭い範囲に照射することにより、C線維を選択的に刺激する方法を開発した。既に数編の英文原著論文を発表してきたが、今年度に得られた新しい知見としては、私達が用いている刺激を用いて直接末梢神経からmicroneurographyを記録し、伝導速度が約1m/秒であり、間違いなくC線維を上行していることを確認した事があげられる。また、脳に到達した信号が、刺激対側の第1次感覚野から第2次感覚野、島に到達し、脳梁を介して対側半球の第2次感覚野と島を活性化し(初期反応)、さらに両側半球の帯状回と扁桃体に情報伝達されること(2次反応)を確認した。また、これらの反応のうち、痛み以外のものに注意を向ける時あるいは睡眠中には2次反応の活動が著明に低下し、両側半球の帯状回と扁桃体が痛覚認知の情動的側面に大きな役割を果たしている事を明らかにした(現在、最終改訂論文を投稿中)。Second painに関するこのような注意や覚醒度の研究は、内臓痛やガン痛の治療に有用であると思われる。
「チャイナ・トレード・ショック」とアメリカ製造業:労働・中間層対策・通商・地域

本研究課題は、米トランプ政権誕生の中長期的背景と直接的要因を、経済学(製造業分析、労働市場分析、財政政策分析、通商政策分析)、地理学(空間的視点・地域経済論視点)の視野を総合・融合しつつ、ポスト工業社会への移行、グローバル化の製造業労働者への影響、地域ごとのその影響の相違、トランプ政権にいたる米連邦政府の政策の影響に着目し、明らかにすることを掲げている。2018年度は、1)トランプ現象の経済的背景をなす、全米、ラストベルトの製造業と製造業労働者のおかれた境遇と動態を分析した。「ラストベルト」諸州は、衰退してきたとはいえ、依然として「製造業地域」という性格を強く残していること、直近ではやや回復しつつあるものの、製造業労働者は減少し、待遇が悪化してきたこと、再就職環境も厳しかったこと、リベラル地域と比較した場合、ラストベルトの労働市場はシビアな状況にあり、労働組合も苦境にあったこと、これらが「トランプ現象」をもたらした経済的背景をなすこと、2)内政(財政政策)としては、オバマ政権と比較したトランプ政権の財政政策展開は、実はミドルクラス対策の後退と把握できること、3)外政(通商政策)としては、国際政治経済学視点からのトランプ政権通商政策の特質の分析、通商政策とも連動するトランプ政権の国家安全保障戦略の検証の結果、リベラルな国際秩序が米国を中心とした「有志連合」に改変されつつある、と把握できることを明らかにした。研究成果リストにあるとおり、当初予定の「基礎研究、データ・資料の検討」という計画を上回り、3年間の研究計画の6070パーセントに相当すると考えられる研究成果(アウトプット)をすでに得ることが出来た。2019年度(2年目)は、一部予定を、代表者の校務多忙化に伴い、3年目に実施することを想定しているが、かわりに上記の通り、初年度に作業をかなり前倒しして進めた。「研究実績の概要」に記載通り、当初計画(1年目は基礎研究に相当する、研究レビュー、統計処理、資料読解、共同研究におけるシナジー効果の工夫等)を超えて、2年目に想定していた研究および研究成果公表まで、行うことが出来たため。研究計画1年目(2018年度)「どの製造業・どの製造工程」が再編され「どの製造業労働者階層」に最も負の影響が及んだのか」に、2年目に想定していた計画(問題が集中した地域(ラストベルト等)の労働市場と地域経済はどのように再編されたのか)の大半を遂行した。そのため研究計画2年目(2019年度)は、米国現地調査および研究成果のアウトプットに主眼を置くこととしたい。研究計画通り、シンクタンク、NPO等、政策立案に関わる利害関係団体などを念頭に、米国現地調査を遂行する。現時点で想定しているのは、製造業業界団体関連の研究所、政策立案に深く関わる米国のシンクタンク(超党派系シンクタンクを中心に予定)、通商政策に関わる業界団体等の利害関係団体、可能であればトランプ現象の背景をなす労働組合や関連するNPO等へのヒアリング等、などである。また、2年目に予定していた「製造業・産業衰退と労働者の苦境(失業、転職、賃金低下等)にともなう、地域経済に及んだ負のスパイラル」についても、すでに収集済みの地域経済統計、地域社会統計、米国連邦政府、州政府、議会資料、報告書、研究のレビュー等に基づき、研究に着手するほか、労働組合の動向、財政政策の最新の展開と過去との比較によるその意義の研究、通商政策の展開のフォロー等を続ける。研究代表者は、6月に米国研究の全国学会で発表する(ラストベルトの産業構造動態と製造業労働者-トランプ現象の経済的背景・8州の事例分析から-)ほか、研究分担者とともに、国際経済学系の全国学会で、ミニシンポジウムを開催する。2年目に予定していた国際シンポジウムについては、研究代表者の校務多忙化に伴い、3年目に延期する方向で調整している。3年目は研究計画に相当程度の余裕があるためでもある。

2019年度(2年目)は、一部予定を、代表者の校務多忙化に伴い、3年目に実施することを想定しているが、かわりに上記の通り、初年度に作業をかなり前倒しして進めた。「研究実績の概要」に記載通り、当初計画(1年目は基礎研究に相当する、研究レビュー、統計処理、資料読解、共同研究におけるシナジー効果の工夫等)を超えて、2年目に想定していた研究および研究成果公表まで、行うことが出来たため。研究計画1年目(2018年度)「どの製造業・どの製造工程」が再編され「どの製造業労働者階層」に最も負の影響が及んだのか」に、2年目に想定していた計画(問題が集中した地域(ラストベルト等)の労働市場と地域経済はどのように再編されたのか)の大半を遂行した。そのため研究計画2年目(2019年度)は、米国現地調査および研究成果のアウトプットに主眼を置くこととしたい。研究計画通り、シンクタンク、NPO等、政策立案に関わる利害関係団体などを念頭に、米国現地調査を遂行する。現時点で想定しているのは、製造業業界団体関連の研究所、政策立案に深く関わる米国のシンクタンク(超党派系シンクタンクを中心に予定)、通商政策に関わる業界団体等の利害関係団体、可能であればトランプ現象の背景をなす労働組合や関連するNPO等へのヒアリング等、などである。また、2年目に予定していた「製造業・産業衰退と労働者の苦境(失業、転職、賃金低下等)にともなう、地域経済に及んだ負のスパイラル」についても、すでに収集済みの地域経済統計、地域社会統計、米国連邦政府、州政府、議会資料、報告書、研究のレビュー等に基づき、研究に着手するほか、労働組合の動向、財政政策の最新の展開と過去との比較によるその意義の研究、通商政策の展開のフォロー等を続ける。研究代表者は、6月に米国研究の全国学会で発表する(ラストベルトの産業構造動態と製造業労働者-トランプ現象の経済的背景・8州の事例分析から-)ほか、研究分担者とともに、国際経済学系の全国学会で、ミニシンポジウムを開催する。2年目に予定していた国際シンポジウムについては、研究代表者の校務多忙化に伴い、3年目に延期する方向で調整している。3年目は研究計画に相当程度の余裕があるためでもある。2018年度の残額(繰越し)は主として一部研究分担者の物品費(書籍代)、研究代表者の国内旅費、全員の消耗品費等で生じたが、物品費は必要な図書の出版が2019年にずれ込んだこと等により、2019年度に購入予定である。国内旅費は2月実施の研究会のための旅費の支出が、会計処理上、2019年度に行われるためであり、すでに2019年度の支出が決定している。消耗品費は消耗品費枠で購入予定だった2018年度購入予定の図書が廃刊になったため等であり、2019年度に代替図書を購入すること、必要な消耗品を購入することで執行予定である。
絶滅危惧種の野生復帰事業にかかる野生生物保全教育の意義と課題の析出

本研究では、コウノトリやツシマヤマネコを対象とした調査を行ない、野生生物保全教育の課題の析出を行なった。野生生物保全教育においては、小学校等で一定時間学びの時間を設けることは重要であるが、その際には、副読本教材の作成・活用や、対象生物のことだけを知る・学ぶのではなく、環境教育・ESDとしての深化が必要であるし、地域住民と対象生物とのかかわりを学ぶという意味では地域学習としての深化も必要といえる。今年度は、コウノトリの野生復帰事業に焦点を主にあて、野生生物保全教育に向けてまずは住民意識を把握することを行った。豊岡市では、最初の放鳥から10年目を迎える節目であり、多くのコウノトリが野外で定着し、特に農作物の付加価値としての役割を地域の中で果たしている。研究では野生復帰事業に関わる行政・保護団体・市民を対象にした聞き取り調査およびアンケート調査を実施した。聞き取り調査では、例えば、コウノトリをシンボルにした農産物などの販売は好調であり、今年度イタリアで開催されたミラノ万博では日本館の展示のシンボルにコウノトリが選ばれ、本格的な海外輸出の契機となった。しかし、このような取り組みが豊岡市内でPRされるよりも豊岡市外でPRされることが多く、市民の中で、「コウノトリとの共生」が生活の中で実感される機会が薄らいでいる、という課題も把握できた。アンケート調査では、2015年11月に豊岡市民1000人を対象とした調査を実施した。多くの回答者はコウノトリおよび野生復帰事業に肯定的であり、コウノトリを「地域のシンボル」とする捉え方がより確かなものとなっていた。そして、コウノトリの野生復帰事業は、兵庫県豊岡市だけではなく、千葉県野田市や福井県越前市においても飼育コウノトリを譲り受ける形で野生復帰を目指した取り組みが進められ、野田市では2015年7月、越前市では2015年10月にそれぞれコウノトリの放鳥が実施された。そのため豊岡市だけではなく、越前市で聞き取り調査やアンケート調査を実施した。また野田市でのアンケート調査には協力を行った。これら野田市や越前市ではコウノトリを「自然環境の象徴」とする捉え方が多く、「地域のシンボル」とする豊岡市とは異なる傾向を有していることを把握することができた。今年度はコウノトリの野生復帰事業に焦点をあて、最初の放鳥実施から10年目を迎える兵庫県豊岡市、また新たに放鳥を実施した千葉県野田市や福井県越前市を事例として調査研究を行なった。兵庫県豊岡市や福井県越前市では市民を対象にアンケート調査を実施し、それぞれのコウノトリおよび野生復帰に対する住民意識の特徴を明らかにすることができた。コウノトリの野生復帰事業に主に焦点をあて、「コウノトリとの共生」に向けた意識啓発をどのように行っていけばよいのかについて、その現状把握・分析を行った。事業が実施されている兵庫県豊岡市については、平成29年度からの実施に向けた、小学3年生から中学3年生までを対象にした「ふるさと教育」についてその策定過程を担当者から聞き取り調査を実施できた。「ふるさと教育」では、小学3年生・5年生では、コウノトリについて知り、コウノトリと共に生きることについて学ぶことが想定されていた。これまで、コウノトリの環境教育については、生息エリアに近い学校や担当教員が熱心である学校という偏りが見られたが、「ふるさと教育」では市内の全ての小学校・中学校が対象であり、こどもへの意識啓発については重要な役割を担うことになる。また、コウノトリは水田を餌場環境とするので、農業者への意識啓発も必要となる。昨年度に実施した市民アンケートを農業従事別に分析し、2006年・2011年に実施したアンケート結果とも比較したところ、非農業従事者と同様にコウノトリおよび事業を肯定的に捉えていることが確認できた。さらに、以前は野生復帰事業の評価について「どちらともいえない」と判断を留保する傾向があったがそれが昨年度のアンケートでは見られなかった。農作物の付加価値にもなる「コウノトリ育む農法」といったこの10年間の取り組みが農業者の意識をより肯定的なものに変化させたことが伺えた。さらに、今年度はこれまで各地で実施されてきた野生復帰事業について事例横断的な比較も実施した。豊岡市や佐渡市では他の事例と比較して「地域のシンボル」とする認識が確立されていることが伺えたが、経年変化としては協力意思は低下している傾向が見られ、野生復帰事業に関する意識啓発を考える上での課題を把握することができた。平成29年度から兵庫県豊岡市で実施される「ふるさと教育」について、その策定過程を担当職員(教育委員会、コウノトリ共生課)から聞き取り調査をすることができ、意識啓発・環境教育を考える上での重要なテーマを得ることができた。また、各地で実施されている野生復帰事業について、これまで実施してきたアンケート調査を横断的に比較することにより、事例の特徴や課題を明確にすることができた。野生生物保全の中でも、本研究ではコウノトリの野生復帰事業とツシマヤマネコの保護活動に焦点をあて、調査研究を実施した。コウノトリの野生復帰事業では、2017年4月から兵庫県豊岡市の全ての小学校で実施されている「ふるさと教育」に着目し、その中でコウノトリ学習がどのように展開されているのかを、こども(本研究では小学校5年生に着目)・担当教員それぞれに着目して、把握した。学習内容は、コウノトリに関する調べ学習が中心であり、その結果をポスターにまとめたり、保護者向けに発表したり、またカルタを制作する小学校もあった。

これまでコウノトリ学習の指導経験のない教員が多い中で、まずはコウノトリについて知る、調べることが学習の中心にあり、その際に重要な情報源となったのが副読本であることがわかった。この副読本は「ふるさと教育」実施にあたり豊岡市が作成したものであり、コウノトリについても写真やグラフが多用され、こどもたちにもわかりやすいと評価され、教員からも使いやすいと評価されていた。したがって、野生生物保全教育においては、副読本のような補助教材の存在が非常に重要であることがわかった。ツシマヤマネコの保護活動では、特に減少の原因と危惧されている交通事故対策に焦点をあて、環境省対馬野生生物保護センターの協力の下、レンタカー店を中心に交通事故の注意喚起や事故の際の連絡方法を記したチラシの配布を行った。また、ボランティアとして大学生も同行させ、標識の清掃や管理作業も体験した。当該活動により、学生がツシマヤマネコについて知識・関心を深める機会になったことが明らかになった。また同時に、自分の意見を他者に説明する意欲の向上など、コンピテンシーの獲得も期待されることがわかった。以上のことから、野生生物保全教育には補助教材の活用が重要であり、また同時にコンピテンシーの獲得にも寄与することがわかった。本研究では、コウノトリやツシマヤマネコを対象とした調査を行ない、野生生物保全教育の課題の析出を行なった。野生生物保全教育においては、小学校等で一定時間学びの時間を設けることは重要であるが、その際には、副読本教材の作成・活用や、対象生物のことだけを知る・学ぶのではなく、環境教育・ESDとしての深化が必要であるし、地域住民と対象生物とのかかわりを学ぶという意味では地域学習としての深化も必要といえる。今後は、明らかになった住民意識をもとに、どのような普及啓発を実施していけばよいのか、という問題意識をもとに取り組んでいくこととする。具体的には、学校での教育活動の中で、野生復帰がどのような位置づけとなっているのかを明らかにしていく予定である。また、大人を対象にした環境教育活動において、野生復帰がどのような役割を担っていくのかについても明らかにしていきたい。また事例間比較として、豊岡市、野田市、越前市の比較はもちろんであるが、トキの野生復帰事例(新潟県佐渡市)やツシマヤマネコの野生復帰計画(長崎県対馬市)など他事例との比較も行っていく。兵庫県豊岡市については、平成29年度から実施される「ふるさと教育」の進展状況を把握することにしたい。また、こどもだけではなく、大人への意識啓発として新たなアクターを考察することにも取り組んでいきたい。さらに、他事例でも、野生生物との共生をテーマにした環境教育の実践事例がないか、情報を収集し、現状を把握することに行いたい。これらのことをふまえ、野生生物保全教育の構築に向けた考察を行っていきたい。野生生物保護論資料購入が進まなかったため、次年度への繰越となった。国外への調査が実施できなかったため、次年度への繰越となった。平成28年度中に繰越部分は完了する予定である。平成29年度には国外調査を実施する予定である。
低酸素環境下における血管系の神経情報変換・伝達機構

牛副腎髄質より、酵素的方法(collagenase及びDNase)を用いて副腎髄質細胞を調整した後、Percoll濃度勾配遠心及びdifferential platingを用いて単離クロマフィン細胞を作成した。3-7日間CO_2インキュベ-タ-にて培養した後、クロマフィン細胞を対照(21%酸素/79%窒素で平衡化)または低酸素栄養液(100%窒素で平衡化)中にて高K^+で刺激すると、遊離されるカテコ-ルアミン量は低酸素により約50%に低下した。この結果は血管条片からの電気刺激による〔^3H〕ノルアドレナリン遊離が低酸素により抑制されることとよく一致することから、培養副腎クロマフィン細胞が血管支配交感神経のモデルとなることが確認できた。ノルアドレナリン遊離は、細胞内自由Ca^<2+>濃度(〔Ca^<2+>〕i)に依存すると考えられている。低酸素によるカテコ-ルアミン遊離抑制のメカニズムを明らかにするために、カルシウム指示薬であるFura-IIを用いて、高K^+刺激により誘発される〔Ca^<2+>〕iの増加に対する低酸素の影響を検討した。高K^+刺激により誘発される〔Ca^<2+>〕iの増加は低酸素により約50%に減少した。さらに、この〔Ca^<2+>〕iの増加の抑制機構を明らかにするために、電位依存性Ca^<2+>チャンネル機能の生化学的指標である細胞内への^<45>Ca^<2+>取り込みを検討したところ、高K^+刺激により誘発される^<45>Ca^<2+>の取り込み増加が低酸素により抑制された。以上の結果から、高K^+刺激により誘発されるカテコ-ルアミン遊離の低酸素による抑制は、電位依存性Ca^<2+>チャンネル機能抑制に起因する〔Ca^<2+>〕i増加の抑制によることが明らかとなった。
湖沼水質改善過程で動物プランクトン食性魚の捕食率低下に果たす水生植物の役割の評価

本研究では、動物プランクトン食魚としてわが国に多いモツゴPseudorabora parvaを、動物プランクトンとしてミジンコDaphnia pulexを用いて、実験により動物プランクトン食魚の動物プランクトンの捕食特性を調べている。具体的には、餌の密度および魚の空腹度がP.parvaのD.pulexの捕食特性に与える影響を解明した点、障害物の存在が捕食特性に与える影響の解明した点の二つの点について特に取り上げている。これらについて、主に、以下のような点を明らかにしている。まず、最初の点については、絶食させたP.parvaを入れた水槽に、餌である所定の密度のD.pulexを導入、補充し、ビデオ等を用いて、捕食速度、平均遊泳速度等を求めている。遊泳速度、捕食速度は餌の密度と共に減少、また空腹が満たされるにつれて減少している。また、様々な条件での結果も餌間を魚が移動する速度にほぼ反比例することが示されて、捕食速度を、餌密度、空腹度の関数として与えている。次に、水生植物のような障害物が散在する場でP.parvaのD.pulexの捕食に及ぼす影響を調べている。障害物としては木綿糸を用い、様々な障害物密度、餌密度について調べている。捕食速度、遊泳速度は障害物の密度、餌密度、空腹度に対しMonod関数もしくは指数関数的に減少することが示されている。特に、捕食速度は障害物の間隔が体長と同程度になると急激に減少することが示されており、この間隔が尾ヒレの1回のビートで泳ぐ距離に相当し、この間隔より小さくなると障害物に衝突しやすくなるため捕食速度が減少するとしている。これより、植生や人工物によって動物プランクトンの捕食を減少させるには対象とする魚の体長程度の密度が必要であることを結論している。以上、得られた結果は、動物プランクトン食魚と動物プランクトンの関係の解明に貢献するだけでなく、動物プランクトンの生存量を増やすために用いられる施設の設計に対して極めて重要な情報を与えている。まず、実際の湖沼において観測を行って現状の把握を行った。対象とした湖沼は、湖内に動物プランクトンの捕食者からの避難場所となりうる植生群落等の存在する湖沼を選択し、避難場所内外の動物プランクトンおよび捕食者である動物プランクトン食性魚の分布の状況から間接的に両者の関係の把握を行った。また、植物プランクトンの分布から動物プランクトンの濾過摂食の量の差の見積もりを行い、また、動物プランクトンの分布の状況を重点的に調べた。その結果、特に大型の動物プランクトンについて、水生植物群落の内外で捕食される割合に大きな差が生じており、捕食率に差があることが認められる結果を得、さらにこの差が植物プランクトンの量に大きく影響することが明らかとなった。次に、動物プランクトン食性魚の動物プランクトンの摂食モデルを作成した。ここでは、まず、障害物のない比較的理想的な条件下での探索率、攻撃の成功率等の理論的な解析を行い、これまで行われた実験結果を精度よく予測することを可能にした。さらに、当初、11年度に予定していた、水生植物を模擬した障害物存在下での捕食魚による動物プランクトンの捕食率の変化を調べる実験について、その基礎的な実験を行った。実験では、糸を張って障害物として、Pseudorabora parva(モツゴ)によるDaphnia pulexの捕食実験を行った。

その結果、捕食率は、空腹度、Daphnia pulexの密度の他に、障書物の密度に大きく依存していることが明らかとなった。本研究では、動物プランクトン食魚としてわが国に多いモツゴPseudorasbora parvaを、動物プランクトンとしてミジンコDaphnia pulexを用いて、実験により動物プランクトン食魚の動物プランクトンの補食特性を調べている。具体的には、餌の密度および魚の空腹度がP.parvaのD.pulexの補食特性に与える影響を解明した点、障害物の存在が補食特性に与える影響の解明した点の二つの点について特に取り上げている。これらについて、主に、以下のような点を明らかにしている。まず、最初の点については、絶食させたP.Parvaを入れた水槽に、餌である所定の密度のD.Pulexを導入、補充し、ビデオ等を用いて、補食速度、平均遊泳速度等を求めている。遊泳速度、補食速度は餌の密度と共に減少、また空腹が満たされるにつれて減少している。また、様々な条件での結果も餌間を魚が移動する速度にほぼ反比例することが示されて、補食速度を、餌密度、空腹度の関数として与えている。次に、水生植物のような障害物が散在する場でP.ParvaのD.Pulexの補食に及ぼす影響を調べている。障害物としては木綿糸を用い、様々な障害物密度、餌密度について調べている。補食速度、遊泳速度は障害物の密度、餌密度、空腹度に対しMonod関数もしくは指数関数的に減少することが示されている。特に、補食速度は障害物の間隔が体長と同程度になると急激に減少することが示されており、この間隔が尾ヒレの1回のビードで泳ぐ距離に相当し、この間隔より小さくなると障害物に衝突しやすくなるため補食速度が減少するとしている。これより、植生や人工物によって動物プランクトンの補食を減少させるには対象とする魚の体長程度の密度が必要であることを結論している。以上、得られた結果は、動物プランクトン食魚と動物プランクトンの関係の解明に貢献するだけでなく、動物プランクトンの生存量を増やすために用いられる施設の設計に対して極めて重要な情報を与えている。
肺癌における分子標的抗腫瘍薬チロシンキナーゼ抑制剤の耐性獲得機序多様性の解明

分子標的抗腫瘍薬TKI(tyrosine kinase inhibitor)はEGFR変異陽性肺癌に有効であるが、奏効例の殆どは最終的に薬剤耐性を獲得する。本研究では、一部のTKI治療後腫瘍は主に野生型EGFRを持つ腫瘍細胞からなり、変異型腫瘍細胞が消失或いは極端に減少し、その治療前腫瘍に野生型腫瘍細胞が混在していることを明らかにした。また、TKI未治療の外科切除肺癌を用いた分析でも、多くのEGFR変異陽性症例に野生型EGFRを持つ腫瘍細胞が混在していた。そこで、EGFRの二次性T790M変異やMet遺伝子の増幅の他、変異陽性症例に元々存在していた野生型EGFRを持つTKI耐性クローンの選択的な生き残りも肺癌のTKI耐性獲得に寄与すると考えられた。134症例の外科切除肺癌を無作為に抽出し、チロシンキナーゼ抑制剤(TKI)抗腫瘍薬の効果を規定するEGFR遺伝子変異のhot spotであるexon19の欠損とexon 21のL858Rの点変異を、通常PCRとdirect sequencing法を用いて検索した。各変異陽性例より、laser microdissectionにて微量の腫瘍細胞を8カ所から別々に採取し、nested PCRによるDNA増幅後direct sequencingを行った。その結果は以下の通りである。(1) 33症例(24.7%)が上記EGFR変異を有しており、その31症例(93.9%)は腺癌であった。(3) Microdissectionに基づいた微量腫瘍細胞の変異分析では、11症例(73.3%)のexon 19欠損腫瘍と15症例(83.3%)のexon 21 L858R点変異腫瘍から、野生型のEGFRを持つ腫瘍細胞も検出された。以上より、EGFR変異を有する肺癌の殆どは腺癌であり、その多く(全体の約78.8%)に野生型EGFRを持つ腫瘍細胞も混在していることを明らかにした。従って、多くの肺癌のEGFR遺伝子変異にはヘテロジェネイティ性があり、それはTKI抗腫瘍薬の治療効果に影響するとともに、野生型EGFRを持つTKI耐性クローンの選択的な生き残りが腫瘍の薬剤耐性能の獲得にも関与する可能性が高いと考えられる。1.平成21年度の研究結果と併せて、134症例の外科切除肺癌より、35(26.1%)症例にEGFR変異が確認され、そのうちexon 19欠損例は17例、exon 21点変異例は18例であった。変異例のうち32症例(exon 19→15例,exon 21→17例)からlaser microdissectionにて微量腫瘍細胞(cell cluster)を採取し、nested PCRによるDNA増幅後に遺伝子変異を分析した。Exon 19欠損例からは97個(平均6.47個/例)のcell clusterを分析し、そのうち25個は野生型、72個は変異型、15例のうち11症例は野生型と変異型の何れのcell clusterも有していた。Exon 21点変異例から採取した119個(平均7.0個/例)のcell clusterを分析した結果は野生型44個、変異型75個であり、17例のうち14症例は野生型と変異型両方のcell clusterを有していた。纏めると、25/32(78.1%)症例のEGFR変異にはヘテロジェネイティ性があることが明かとなった。また、EGFR変異と腫瘍細胞の亜型や増殖パターンとの関係を統計解析したところ、篩状配列をとる腺管構造を形成する比較的分化度の低い腫瘍にはEGFR変異頻度が高い傾向が見られた。2.TKI耐性を獲得した7症例の48病変より、4症例の13病変にEGFR exon 20のT790M変異が検出された。また、FISH法にて、1症例の3病変にMET増幅も検出された。以上より、肺癌のTKI耐性獲得には、EGFR変異のヘテロジェネイティ性をはじめ、EGFRの二次性変異やMET増幅などの複数の因子が関与していると考えられる。1.活性化EGFR変異陽性かつTKI耐性を獲得した症例の分析(1)平成23年度、活性化EGFR変異陽性かつTKI耐性を獲得した新たな1症例を収集した。TKI投与前生検材料からlaser microdissectionにて採取した腫瘍細胞の微小clusterを分析したところ、野生型EGFRを持つ腫瘍細胞も検出された。(2)剖検で得られた3カ所のTKI治療後再発・転移性腫瘍を分析したところ、1病変からEGFRの二次性T790M変異が確認された。(3)FISH法による検索で、3カ所のTKI治療後再発・転移性腫瘍は何れにもMet増幅を認めなかった。2。