hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
皮膚疾患におけるリン脂質動態の解析

本研究において乾癬様皮膚炎症時のマウス表皮ではイノシトールリン脂質であるホスファチジルイノシトール(3,4,5)-三リン酸(PI(3,4,5)P3)やその下流シグナルに変化が見られることが明らかになった。さらに、イノシトールリン脂質分解酵素ホスホリパーゼC (PLC)delta1の減少時に見られる皮膚炎症の発症や重症化に関与する細胞内シグナル伝達経路を明らかにした。以上の結果より、PI(3,4,5)P3やPLCdelta1下流シグナルと乾癬様皮膚炎症との関連が示唆された。皮膚疾患とリン脂質動態の関連を解明するために、ヒト三次元培養皮膚疾患モデルや皮膚疾患モデルマウスを作製し、皮膚疾患発症時のリン脂質やその代謝産物の変化を明らかにすることを目的として研究を行った。当該年度の計画としてマウス皮膚疾患モデルを作製し、病態発現によりイノシトールリン脂質が変化するかを検討することを予定していた。解析の結果、イミキモドによりマウスに乾癬様皮膚炎を誘導した際の表皮角化細胞でPI (3, 4, 5)P3下流シグナルが活性化されること、また肥満時に見られる乾癬の悪化にはPI (3, 4, 5)P3下流シグナルの過剰活性化が関与する可能性が示唆された。また、当該年度の計画としてGFP融合各種イノシトールリン脂質結合ドメイン(脂質可視化プローブ)を導入した細胞を用いて作製したヒト三次元培養表皮モデルにサイトカイン処理等により皮膚疾患様状態を誘導し、脂質の局在がどのように変化するかを検討することも予定していたため、ヒト表皮角化細胞株HaCaT細胞を用いた3次元培養表皮モデルにて各種イノシトールリン脂質結合ドメインを用いて脂質の局在や量の解析を試みた。PI(4, 5)P2結合ドメインを用いた可視化の結果、シグナルが細胞膜に一様に検出された。またPI(3, 4, 5)P3結合ドメインを用いた際も細胞膜にシグナルが検出されたが、3次元培養表皮下層に比べ上層のより分化が進んだ細胞で強いシグナルが見られた。以上のように当該年度の研究により3次元培養表皮モデル中にてPI (4, 5)P2やPI (3, 4, 5)P3の可視化が可能になった。皮膚疾患とリン脂質動態の変化との関連を解明するために、各種皮膚炎様の異常を示すマウスである表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮を用いてイノシトールリン脂質動態の変化について検討を行なった。その結果、前年度に解析を行なったイミキモド誘導性乾癬モデルマウスの表皮で見られたのと同様に、表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの皮膚炎部の表皮においてもホスファチジルイノシトール3, 4, 5-三リン酸の下流シグナルが過剰活性化していることが明らかになった。さらに、皮膚炎発症前の表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮におけるイノシトールリン脂質の量についても質量分析により解析を行なったところ、予想外なことに皮膚炎発症前の表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮では正常マウスの表皮と比較しホスファチジルイノシトール3, 4, 5-三リン酸の量が顕著に減少していることが明らかになった。また、この際に表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮ではホスファチジルイノシトール3, 4, 5-三リン酸の下流シグナルの活性低下も確認された。さらに、皮膚炎発症前の表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮においてホスファチジルイノシトール3, 4, 5-三リン酸以外のイノシトールリン脂質や他のリン脂質の量についても検討を行なったが大きな変動が見られる脂質はなかった。このことから、皮膚炎発症前の表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮ではホスファチジルイノシトール3, 4, 5-三リン酸の量が特異的に変化していることが明らかになった。当初計画では当該年度の研究において皮膚疾患モデルマウスの皮膚より脂質を抽出し、質量分析法により各イノシトールリン脂質の量を調べ、正常状態との比較を行うことを計画していた。実際に、当該年度の研究において各種皮膚炎様の異常を示すマウスである表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮に存在するイノシトールリン脂質の量を質量分析により調べ、正常状態と比較しホスファチジルイノシトール3, 4, 5 -三リン酸が顕著に減少していることを見出すことができた。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。本研究ではヒト三次元培養皮膚モデルおよびマウス皮膚を用いて皮膚疾患の発症や悪化とリン脂質動態の関連を解明することを目的とした。炎症性皮膚疾患の一つである乾癬のモデルマウスの皮膚を解析したところ、PIP3の下流シグナルが過剰活性化していることが判明した。また、肥満時に見られる乾癬の症状悪化にもPIP3の下流シグナルの過剰活性化が関与している可能性を見出した。

さらにリン脂質代謝酵素であるホスホリパーゼC delta1を欠損したマウスは乾癬に一部類似した皮膚炎を示したため、ホスホリパーゼC delta1を欠損したマウスの皮膚においてもPIP3の下流シグナルについて検討したところ、乾癬のモデルマウスと同様にPIP3の下流シグナルが過剰活性化されていることが明らかになった。次に、ホスホリパーゼC delta1の減少時に細胞内情報伝達経路にどのような変化が見られるかについて解析を行ったところp38 MAPKの過剰活性化が誘導されることが明らかになった。また、ホスホリパーゼC delta1を減少させたヒト三次元培養皮膚モデルおよびホスホリパーゼC delta1を欠損したマウスの皮膚をp38 MAPKの阻害剤で処理することにより皮膚バリア機能を増強できることを明らかにした。さらに乾癬のモデルマウスの皮膚をp38 MAPKの阻害剤で処理することにより皮膚炎症の程度を軽減することにも成功した。本研究結果により代謝酵素の異常によるリン脂質動態の変化が炎症性皮膚疾患の発症や悪化に関与することが強く示唆された。本研究において乾癬様皮膚炎症時のマウス表皮ではイノシトールリン脂質であるホスファチジルイノシトール(3,4,5)-三リン酸(PI(3,4,5)P3)やその下流シグナルに変化が見られることが明らかになった。さらに、イノシトールリン脂質分解酵素ホスホリパーゼC (PLC)delta1の減少時に見られる皮膚炎症の発症や重症化に関与する細胞内シグナル伝達経路を明らかにした。以上の結果より、PI(3,4,5)P3やPLCdelta1下流シグナルと乾癬様皮膚炎症との関連が示唆された。当該年度の研究では、マウス皮膚疾患モデルのうち乾癬モデルにおいて表皮角化細胞でPI (3, 4, 5)P3下流シグナルが活性化していることを見出した。また、脂質可視化プローブを用いてヒト三次元培養皮膚モデル中でPI(4, 5)P2やPI (3, 4, 5)P3といったイノシトールリン脂質を可視化することにも成功した。ヒト三次元培養皮膚モデルを用いて炎症性サイトカイン処理等により皮膚疾患モデルを作製しイノシトールリン脂質の可視化を行う事や、マウス皮膚疾患モデルのうちアトピー性皮膚炎モデルにおけるイノシトールリン脂質の解析が終了していないものの、肥満による乾癬様皮膚炎悪化にPI (3, 4, 5)P3下流シグナルの過剰活性化が関与することを見出し、論文発表を行う事ができたことなどを総合的に考えるとおおむね順調に進展していると考えられる。皮膚炎発症前の表皮角化細胞特異的ホスホリパーゼC-delta1欠損マウスの表皮においてホスファチジルイノシトール3, 4, 5 -三リン酸が顕著に減少していることを見出すことができたため、今後は、薬剤誘導性のマウス皮膚炎モデルにおいても、皮膚炎発症直前の段階で同様なホスファチジルイノシトール3, 4, 5 -三リン酸の減少が見られるかどうかを検討する。また、表皮におけるホスファチジルイノシトール3, 4, 5 -三リン酸の減少に関与するイノシトールリン脂質代謝酵素の探索、特定を試み、特定できた酵素についてはsiRNAの導入や活性化剤、阻害剤によりホスファチジルイノシトール3, 4, 5 -三リン酸の量を正常化することを試み、皮膚炎の発症や重症度が抑制されるかを検討する。
ポリフェノール含有食品の血糖値上昇抑制効果の指標となるスコア作成に関する研究

生活習慣病は今日、緊急に克服すべき社会的な課題である。糖尿病は代表的な生活習慣病の一つであるが、この疾患にはI型とII型の2種離知られており、このうち、II型は糖尿病患者の95%以上を占めている。現在、2つの方法がこの病気の治療及び予防が行われている。治療の目標は血糖値の調節におかれているが、有効に利用されている薬剤治療は副作用があるため、血糖値調節に役立つ食品における機能性成分に注目されている。これらの成分としては、小麦アルブミン、グアバ茶ポリフェノール、難消化性ポリデキストロースなどが知られている。私たちは、これら以外の機能性成分につき検討を行ってきたが、パキスタンの自生植物Nerium indicumの葉に血糖値調節に効果を示す成分を見出し、これをクロロゲン酸であることを明らかにした。更に、これまでの既知のポリフェノールについて検討した結果、カテキン類ならびにクエルセチンに同様な効果があることを明らかにした。私たちは、血糖値調節の観点から、食品に含まれる成分により、それらの食品を摂取することにより、血糖値調節にどの程度効果を有するかをあらわす指標を作成することを計画しているが、このためには、食品における有効成分を究明しておく必要があると考えて、食品におけるポリフェノールの血糖値調節機能を有する成分の検索を引き続き詳細に検討を行った。その結果、総社市の特産品である白サツマイモであるきびみどり葉にクロロゲン酸の誘導体が大量に存在し、しかもそれらの化合物は血糖値調節に裕子であることを明らかにした。この化合物を単離・同定した結果、キナ酸と2分子のコーヒー酸とエステル結合した3種類のクロロゲン酸の誘導体であることを明らかにした。以上の諸結果は、各食品による血糖値調節の指標を作成するに当たり、その基盤を与えるものである。パキスタン自生植物Nerium indicumが血糖値上昇抑制効果を示すことはよく知られているが、私たちは、その有効成分の一つが、クロロゲン酸およびその異性体であることを明らかにし、これらの化合物が、ラットにおいても血糖値上昇を抑制することを確認した。この血糖値上昇抑制はマルトースやスクロースの二糖類を加水分解する酵素であるα-グルコシダーゼを阻害することによることが示された。すなわち、これらの化合物は強力なα-グルコシダーゼ阻害剤として働くことを意味している。クロロゲン酸は代表的なポリフェノール化合物である。そこで、既知のポリフェノール化合物について、詳細に検討した結果、クロロゲン酸と同様に血糖値上昇抑制効果を示す化合物としては、クエルセチン、カテキン類が強い活性を有することが明らかになった。カテキン類について、更に詳細に検討した結果、カテキン類のうち、エピカテキン、カテキン、ガロカテキンの間ではそれほど違いが認められなかったが、ガレートエステル型はその効果は一桁強いことが明らかになった。このことは、カテキンを大量に含むものとして、お茶があるが、お茶の品種により、血糖値上昇抑制効果は大きく異なることを示すものである。現在、お茶の品種について、この点から詳細に検討しているところである。また、上述したように、血糖値上昇にクロロゲン酸が効果を示すということで、クロロゲン酸を多く含むものとして、ウコギとコーヒがあるが、ウコギの場合、そのクロロゲン酸の効果は認められなかった。しかし、コーヒについては、効果があることが認められた。この事実は、コーヒは血糖値調節に有効な食材であることを示すものである。これと関係して、現在、クロロゲン酸を大量に含む植物を検索しているが、この過程で、興味ある結果を得ている。すなわち、総社市で栽培されている白いもの葉には、クロロゲン酸ならびにその誘導体が大量に含まれていることが示された。

その誘導体の化学構造は未だ決定していないが、幾つかの根拠から、キナ酸にコーヒさんが2個ないし3個結合したものと考えられる。しかも、これらはクロロゲン酸より活性が強いものと思われる。このことが確立されるならば、この植物の葉は血糖値調節に有効であることを意味するものである。今後この点も含めて検討する予定である。本研究は、食品におけるポリフェノール化合物のうち、血糖値調節用に役立つ機能性を有する化合物を特定してその活用を行う基盤づくりを行うものである。本年度、食品におけるポリフェノール化合物を検索する課程で、総社市における特産品、白サツマイモであるきびみどりの葉に多くのポリフェノール化合物の存在を認めた。このうち、α-グルコシダーゼ阻害活性を指標にして検索を行った結果、クロロゲン酸の他、興味ある3つの化合物の存在を見出した。これらの未同定化合物を明らかにするために、きびみどりの乾燥葉からポリフェノール類を70%エタノールで抽出し、濃縮後、0.1%トリフルオロ酢酸で平衡化したODSカラムを備えたHPLCにて0-80%アセトニトリルにて溶出し、目的とする化合物を精製した。得られた化合物のUVスペクトル、加水分解による構成成分分析、MS分析により、それぞれクロロゲン酸(3-0-caffeoylquinic acid)、3,4-0-dicaffeoylquinic acid、3,5-0-dicaffeoylquinic acid、4,5-0-dicaffeoylquinic acidであると同定した。これらの化合物はいずれもα-グルコシダーゼを特異的に阻害することが示された。また、HPLCを用いて、きびみどりの乾燥葉におけるクロロゲン酸及びその誘導体の含量について分析した結果、クロロゲン酸が乾燥葉gあたり20mg、上記3つの誘導体を併せて16mg、これらを合算して36mg存在することが示された。この結果は、きびみどりの乾燥葉を活用すれば、血糖値調節に役立つ食品の開発に有効であることを示唆している。
新規なタンパク質-DNA間相互作用検出法の開発とその転写因子機能解析への応用

新規のタンパク質-DNA間相互作用の高感度検出系を構築することを目的として、タンパク質に対する抗体にプローブDNAを結合すると同時に、標的DNAにもプローブDNAを結合させたものを用いて、タンパク質-DNA間相互作用をリアルタイムPCR法により検出することを試みた。その結果、既知の結合強度に応じたタンパク質-DNA間相互作用を検出することはできたが、その感度は期待よりはるかに低く、実用的な使用には更なる手法の改善が必要と思われた。新規のタンパク質ーDNA間の相互作用検出系を構築することが本研究の目的である。ここでは、既存のタンパク質ータンパク質相互作用を検出するPLA法を改変した系を検討した。すなわち、トマトのMADSボックス転写因子RINと既知の標的配列との相互作用を検出するために、転写因子タンパク質に対する抗体にプローブ用DNAを結合したものと、標的配列にもプローブ用DNAを結合し、両者のプローブ用DNAが近接して存在した場合、リンカーDNAを介したライゲーション反応によりプローブDNAが結合し、それぞれのプローブDNAに相補なプライマーでリアルタイムPCRを行うことにより、結合を検出する。昨年度までに相互作用が検出できなかった原因として、それぞれのプローブが一分子の複合体に対して一カ所ずつしか認識部位がないためだと予想した。そこで、RINタンパク質にGFPタンパク質を融合したキメラタンパク質を用意し、GFPタンパク質全体に対するポリクローナル抗体をプローブとして使用することにした。キメラタンパク質がDNA結合性を有することはゲルシフトアッセイにより確認した。キメラタンパク質を無細胞系で合成し、標的DNAと結合反応させ、本系での検出を試みた。ゲルシフトアッセイにおいて標的DNAとして、強く結合が認められるもの、弱く結合するもの、結合が認められないものを比較した。その結果、リアルタイムPCRにより、既知の結合強度の順にプローブDNA間の結合反応が生じた割合が高く検出されたが、その差は期待ほどには大きくなかった。プローブ濃度、タンパク質量、反応バッファー等の種々の実験パラメーターの調節を行ったが、本研究期間内に統計的な有意差を示す差を検出するには至らず、ゲルシフトアッセイよりも検出感度的に劣っていると判断せざるを得ない結果となった。本研究では新規のDNAータンパク質間相互作用を定量的に検出する手法の確立を目標として、今年度はトマトのMADSボックス転写因子RINとTDR4の複合体に対し、結合することが確認されているDNA配列との結合の検出を試みた。まず、RIN及びTDR4に対する抗体にビオチンラベルを行い、ストレプトアビジンラベルされたPLA法キット付属のオリゴDNAと混合することにより、DNAと抗体が結合したプローブを作成した。このプローブを用い、細胞抽出液をサンプルとしてRINとTDR4の複合体をリアルタイムPCRにより検出したところ、タンパク質濃度依存的に増幅産物が得られることから、2種のプローブ合成に成功したと考えられた。次に、結合するDNA配列について、ビオチン化オリゴDNAをプライマーに結合配列をPCRで増幅し、ストレプトアビジンラベルされたPLA法用のオリゴDNAでラベル反応を施した。このDNAを、網状赤血球細胞由来、または小麦胚芽系の無細胞タンパク質合成系で合成したRINとTDR4と混合して、定量PCRにより結合の程度の検出を行ったが、今のところ対照区と有意な差が検出できない状態である。検出ができない要因として、網状赤血球細胞由来のタンパク質合成系では反応液に強い赤色色素があるため、リアルタイムPCRの蛍光検出阻害の可能性、それを回避するために小麦胚芽系を使用したが、この反応系では複合体形成阻害が見られており、またタンパク質合成量を適切に制御できていないことも検出の妨げになっている可能性が考えられた。現在、これらの原因を回避する方法を見出したので、再度、タンパク質合成系の条件設定を行って、DNAータンパク質の相互作用検出を試みる予定である。本年度の研究は当初計画に基づき、転写因子RIN及びTDR4の抗体のビオチンラベル、さらにPLA法用のオリゴDNAの結合、さらに汎用性のあるサンプルDNAの調製法の確立には成功したが、研究の最大の目的である、DNAータンパク質相互作用の検出には今のところ至っていない。そのため、予定からやや遅れているという評価となった。種々の試行錯誤の結果、原因の一つとして、無細胞タンパク質合成系の適性が、複合体形成、リアルタイムPCRによる検出に適していないことが原因であることが分かってきた。また、供試するタンパク質およびDNAの濃度についても重要な配慮が必要であることが分かってきた。これらの問題点を回避すべく、無細胞タンパク質合成系の変更、合成タンパク質の活性化法、タンパク質、DNAの適性濃度調製法等、様々な観点から実験系を根本的に見直している段階であり、個々の問題点の解決法が徐々にできてきた。したがって、予定より遅くなっているが、次年度に手法開発が大いに期待できると考える。またこれらの過程で見出された知見は、本研究だけでなく、今後、無細胞タンパク質合成系を利用した実験に幅広く応用できることが期待できるものであり、種々の検証を加えて手法の開発と言うことでも成果の発表につなげたい。次年度は本年度達成できなかったDNAータンパク質の相互作用の検出法を確立するために、以下の検討を行う。無細胞タンパク質合成系について、定量PCRの検出に網状赤血球

由来の合成系が不適であることが分かったので、次年度は小麦胚芽系のタンパク質合成系を用いて検出を行う。小麦胚芽の系は、網状赤血球由来の系で問題になっていた色素の影響が見られないため、検出阻害が見られレないことが期待される。さらに、この合成系ではタンパク質合成量は多いものの、合成タンパク質の複合体形成活性が低いことが示唆されるデータが得られており、その回避策も見出していることから、次年度はこの回避策の有効性を確認しながら系の構築を行う。以上のタンパク質合成系の改良を行い、PLA法に用いる一本鎖DNAラベルしたRIN及びTDR4の標的DNA、あるいは一本鎖DNAをラベルした非標的DNAを合成タンパク質と混合する。RIN及びTDR4の複合体と標的DNAが結合すれば、一本鎖オリゴ同士を結合させるコネクターDNAを介して一本鎖DNAが結合する。この結合DNAを定量PCRで検出し、その結合の強弱を定量的に解析する。また、本定量系が確立すれば、RINが発現している生細胞におけるゲノムDNAとRINの結合を検出する実験系の確立を行う。RINが発現している果実細胞からクロマチンを抽出し、制限酵素処理によりゲノムDNAを切断し、一本鎖DNAでラベルしたRIN抗体を処理し、適切なコネクターDNAを介してDNAの結合を行う。RINが結合していることが同定されている遺伝子領域についてPCR法により、結合の検出を行う。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画どおり、物品費・旅費・賃金に使用する。なお、次年度使用額168,085円は、研究進行が予定を下回り、研究補助者を雇用するレベルまで研究の推進が至らなかったため発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせ、研究の遅れを取り戻すべく、早期の研究系の確立と研究補助者の雇用による研究推進加速のために使用する。
濃縮海洋深層水による微細藻デュナリエラの培養と藻体の機能性解明

H20年度は、(1)膜蒸留法による濃縮高塩分化海洋深層水の製造とデュナリエラの培養への応用、(2)蒸発濃縮海洋深層水を用いたデュナリエラの培養技術の確立、(3)デュナリエラのピロリ菌増殖抑制効果の解明、の研究を実施した。各項目の研究結果は下記の通りである。(1)新たに提案した膜蒸留装置により、濃縮海洋深層水(塩分濃度5.2%)から濃縮高塩分化海洋深暦水(塩分濃度12.3%)を製造することが可能であった。また、濃縮高塩分化海洋深層水に窒素とリンのみを添加することでデュナリエラの培養に利用可能であることが判明した。(2)工業的蒸発濃縮により製造した硬度20,000mg/L(塩分濃度16%)の蒸発濃縮海洋深層水を用いた際に、最も良好なデュナリエラの増殖が認められることを明らかとした。また、この蒸発濃縮海洋深層水に栄養塩として窒素のみを添加することで十分なデュナリエラの増殖が認められることが判明した。以上の結果より、外部からのNaC1の添加を必要としないデュナリエラの培養系を確立することができた。これにより培養コストを大幅に削減可能であることから、本知見は日本国内におけるデュナリエラの産業的培養の実現に寄与できるものと考えられた。(3)デュナリエラMeOH抽出液のピロリ菌増殖抑制効果について調べたところ、機能性物質として知られ、かつデュナリエラ中に豊富に含まれるβ-カロテンは抑制効果を示さず、β-カロテン以外の複数の物質が抑制効果に関与していることが判明した。これまで、デュナリエラ中におけるβ-カロテン以外の機能性物質の存在は明らかとなっていないことから、本研究の成果は、デュナリエラへの新たな価値の付与に貢献できるものと考えられた。本研究では、円筒型フォトバイオリオアクター(高さ2m、直径15cm)を微細藻Dunaliella salina(D.salina)の培養に適用するとともに、D.salinaの増殖に影響を与える環境因子の特定を試みた。培養液は、RO膜で約5%に濃縮した海洋深層水にNaClと栄養塩を添加したものを用いた。NaCl濃度は11.9%とした。D.salinaを異なる環境条件下(温度、照度、培養容器)にて培養し、細胞数、およびβ-カロテン含量を経時的に測定した。2007年5月-6月にリアクターによるD.salinaの培養を行ったところ、培養25日目の細胞数は3.1×10^5 cells/mLと過去に得られた細胞数と比較して低かった。培養期間中のリアクター内の平均水温は36°Cであったことから、この高温条件がD.salinaの増殖に影響を及ぼした可能性が高いと考えられた。そこで、フラスコ内においてD.salinaの増殖に対する培養温度(15°C、20°C、25°C、30°C、35°C)の影響を調べたところ、最も低温の15°Cにおいて最大の細胞数(15.0×10^5cells/mL)が認められた。その一方で、リアクターの平均水温に最も近い35°Cにおける培養では、5.1×10^5cells/mLの細胞数しか得られなかった。また、β-カロテン含量も15°Cで最も高い値(14.6μg/mL)が認められた。次に、フラスコ内においてD.salinaの増殖に対する培養照度(15,400Lux、19,300Lux)の影響を調べたところ、細胞数、およびβ-カロテン含量に差違は認められなかった。以上の結果から、照度と比較して温度がより重要な環境要因であり、低温環境におけるリアクターでの培養がD.salinaの生産性向上につながると考えられた。

これまで、デュナリエラ中におけるβ-カロテン以外の機能性物質の存在は明らかとなっていないことから、本研究の成果は、デュナリエラへの新たな価値の付与に貢献できるものと考えられた。
光電子収量分光法を応用した、励起準位エネルギーの大気下計測手法の開発

本研究では、励起準位を簡易に計測する手法として、時間分解二光子光電子収量分光法(2P-PYS)を提案した。2P-PYSは高額な分析機器を使わずに、単純な電流計測で材料の励起一重項状態や三重項状態のエネルギー絶対値を決定を可能とする。2P-PYS用の超低ノイズ電流計測装置と時間遅延光学システムを構築して、2P-PYSの原理検証実験を行った。フェムトアンペアオーダーのノイズ性能によって、有機半導体ペンタセン薄膜の三重項励起状態からの二光子吸収に由来する光電子放出を確認した。さらに2P-PYSに必要な光電効果の閾値エネルギー分光によるエネルギー絶対値の決定への課題を抽出した。本年度は研究課題のスタートとして、大気中または実デバイス環境下で試料からの光電子放出量がフェムトアンペアからの精度で計測可能な超低ノイズ小型真空測定室、光源として150ピコ秒のパルス幅を持つNd:YAGパルスレーザの第3高調波、二光子を時間的に分割するための光学遅延システム、さらに光電子放出量の計測プログラムの開発をそれぞれ推し進めた。それらを構築して光学定盤上に組み込むことで、遅延時間を最大2ナノ秒まで変調可能な二光子光電子放出計測システムのプロトタイプを完成させた。これを用いて、典型的なp型材料として知られるペンタセン(C22H14)薄膜を試料として、ビームスプリッタを用いて二つに分離した3.49 eVのパルス光を異なる遅延時間で試料に照射し、ペンタセン薄膜中の励起状態からの光電子放出の観測に挑戦した。その結果、二つのパルス光の時間的な重なりに依存して光電子放出が二乗で増大すること、さらにその重なりから時間的に離れた条件において励起三重項準位から一光子吸収に由来する光電子放出を示唆する結果を得られた。この結果は、本測定が原理的に試料の励起一重項状態と三重項状態を分離してそれぞれの光電子放出閾値エネルギーを見積もることができることを期待されるものである。以上の成果を査読付き国際誌で報告[T. hosokai, et al., Appl. Phys. Exp. 10, 022401 (2017).]するとともに、国内外の学会において公表を進めた。同時並行で、自然科学研究機構の計算科学研究センターの計算課題に申請し、次年度で計測の対照とする熱活性型遅延蛍光分子の励起準位の計算も行った。予定していた計測装置のプロトタイプの構築を終了し、また実験試料を用いた本手法を適用することで提案する実験手法の原理の確立を進めるとともに、論文化も行った。また、次年度に向けての試料の励起準位の計算もおおむね終了している。最終年度となる本年度は、昨年度に報告した二光子光電子収量法の原理を実証するべく、短レーザパルスの白色光による二光子光電子閾値分光を検討を行った。白色光の生成はパルスレーザの非線形効果を用いて検討した。始めに昨年度の原理実証に用いた150ピコ秒のパルス幅を持つNd:YAGパルスレーザの第2高調波をガラス基板に集光して白色光の生成を試みた。しかし、ガラス基板が焼け付くほど集光しても白色光の生成は明確に確認できず、本パルスレーザの使用を断念した。そこで、100フェムト秒のパルス幅を持つTi:Sapphireフェムト秒レーザを用いた実験にシフトした。フェムト秒のレーザ光をサファイア基板上に集光することで白色光の作製に成功した。これをバンドパスフィルターを用いて試料である有機半導体ペンタセン(C22H14)薄膜の吸収波長にあわせ、低真空化での二光子光電子放出の遅延時間依存性の実験を行った。時間原点がゼロの二つのパルスを合わせることで、瞬間的な電流値の増加を確認した。ただし、以降遅延ステージを用いてゼロ以上の遅延時間を検討したところ、電流値は観測されず、またその後に同照射スポットにおいて再現実験を行ったが電流値増加の再現は得られなかった。未照射のスポットでも試行しところ、同様な結果が得られた。その後、試料をチャンバーから取りだして確認したところ、基板に用いた試料に変色の後が見られた。この箇所はフェムト秒のレーザ照射によって試料または基板自体に変性が起こったことが原因と考えられる。フェムト秒のパルスレーザは短パルスのエネルギーが強すぎるため、多重光電子放出が起こりペンタセン薄膜試料が分解したことが予想できる。つまり、提案した原理を最終的に実証するには、フェムト秒パルスを強力に減光するか、またピコ秒レーザによる白色光を用いるなど、光強度を考慮した検討が必要であることが判明した。

研究課題の最終となる次年度は、提案実験手法の骨子となる二光子光電子収量スペクトルの計測システムの立ち上げを行う。まずは、光源として用いているパルスレーザを透明光学素子に集光して、自己位相変調による連続光の発生に挑戦する。発生した連続光を光学フィルターまたは分光器によって分光し、光エネルギーの関数として励起状態にある実験試料からの光電子収量スペクトルを測定することが本装置の目指すところである。もし、サブナノ秒パルスレーザの連続光が発生しない場合は、フェムト秒の超短レーザの連続光を用いる。後者に関しては、光強度が強いために試料ダメージが予想されるが、これは減光フィルターを工夫して用いることで対策する。装置完成を確認後は、様々な熱活性型遅延蛍光分子薄膜に当手法を適用して、励起一重項や三重項準位からの光電子放出閾値を見積もることで、それぞれの準位のエネルギー絶対値を決定する。それらのエネルギー差が一重項や三重項状態の光化学反応の性質と効率を定める。得られたエネルギー差を昨年度から進めている分子軌道計算の値と比較することで、熱活性型遅延蛍光や励起子フィッション、アップコンバージョン過程において励起準位と化学反応の過程のエネルギー絶対値を主軸として既存のメカニズム考察の詳細に踏み込む。有機半導体物性当該年度は計画に基づいて目的装置のプロトタイプを作製するために経費を使用したが、物品発注の一般競争入札の結果、見積もり金額より低下で購入できたため余剰金が発生した。平成29年度は集光パルスレーザを用いるために、光学素子の焼き付きが起こる。初年度の余剰金は、この焼き付きによって発生する光学素子の交換代として使用することを予定している。
放課後児童クラブにおける生活の場としての空間構成と音環境に関する研究

児童が生活する部屋について、内装仕上げに吸音材を使用していない場合、残響時間が0.6秒を超え、会話の明瞭性や喧噪感が懸念される。また、落ち着いた環境が必要な行為には、休息、食事、昼寝、食後のからだ休め、帰りの会(話を聞く)、個別指導(話す・聞く)、着替え等がある。児童の生活に安定や落ち着きをもたらすために、おやつの時間や帰りの会では、小規模集団による保育が行われる。読書や工作等の行為についても専用の小空間が形成されている。以上より、室内音環境の整備と落ち着ける空間の確保に向けて、生活行為と音環境整備の双方から考案した小空間を用いた改善策を示した。放課後児童クラブ(いわゆる学童保育所)は、学校とは異なり多様な生活行為が行われることや近年の入所児童数の増加等により、会話に支障が出る、児童が大声になる等の問題が顕在化し、音環境整備や落ち着ける空間の確保が必要となっている。本研究は、留守家庭児童の第二の「生活の場」である放課後児童クラブを、落ち着いて生活できるような場所とするために、音環境の観点から、その生活環境を向上させることを目的としている。平成25年度は、以下の2つの研究を実施した。1.家庭の生活に準じた毎日の「生活の場」である放課後児童クラブに求められる環境や施設・設備を明らかにするために、福岡県春日市および福岡市の放課後児童クラブ13ヶ所を対象に、生活行動と空間の使い方の観察・記録調査、指導員対象ヒアリング調査を実施し、遊びや学習以外に児童が行う生活行為や休息、くつろぎ、静養など特に落ち着きが求められる行為、生活の場としてふさわしい児童の集団規模、多様な行為の混在を避けるための空間の使い方、児童の休養や落ち着きを確保するために指導員が行っている配慮等を把握した。2.障碍児が放課後生活を過ごす場所の必要性が高まっていることから、福岡市の特別支援学校の児童・生徒が放課後を過ごす施設4ヶ所を対象に、指導員対象ヒアリング調査および家具配置の記録等を行った。特に発達障碍児は、目、耳等からの外部情報のコントロールが苦手なケースがあることで知覚への配慮が必要であるため、施設内における空間の使い方、および子どもの嫌いな音や嫌いな音への対応等、音環境の現状を把握した。平成26年度は、以下の研究を実施した。1.平成25年度に実施できなかった学校休業日の一日保育の日の行動観察調査、発生音の観察・記録を実施した。特に、放課後児童クラブで行われる多様な行為のなかから、生活の場として環境整備が求められる行為として、おやつを取り上げ、おやつの提供に関する環境整備について調査を行った。2.開設場所や建物構造が異なる放課後児童クラブを対象に、児童が生活する部屋の騒音レベルの連続測定と残響時間の測定を行った。クラブの音環境改善や、新築・改築時に有用となる建築音響性能に関する基礎データを収集した。平成25年度、26年度の調査研究では、以下の3点を明らかにした。1)児童が生活する部屋の騒音レベルは80dBを超える時間帯があり、ワンルームタイプのクラブの部屋は残響時間が0.6秒を超え、会話の明瞭性や喧噪感が懸念される。2)落ち着いた環境が必要な行為として、休息、昼寝や食後のからだ休め、パニックを起こした児童を落ち着かせる、食事(喧騒感の回避)、帰りの会(話を聞く)、個別指導(話す・聞く)、着替え等がある。3)児童の生活に安定や落ち着きをもたらすことを意図して、おやつの時間や帰りの会では、児童の集団ー担当指導員ー活動空間を一致させた小規模集団による保育が行われ、また、読書や工作等の行為について専用の小空間が形成されている。最終年度の平成27年度は、1)3)の成果をもとに、室内音環境の整備と落ち着ける空間の確保に向けて、生活行為と音環境整備の双方から考案した小空間(児童の使いやすさを考慮した面積で、吸音材を貼った棚やカーペットで形成された小空間)を用いた改善策を考案した。クラブの活動室に見立てた教室に小空間を設置し、残響時間を測定した結果、吸音性のある材料を多く用いた小空間の形成や、吸音性能のあるカーテンの使用により、室の残響時間を減らすことができた。今後は、改善案を既存のクラブに設置し、音環境の改善効果と児童の生活行動への影響を明らかにする。

また、落ち着いた環境が必要な行為には、休息、食事、昼寝、食後のからだ休め、帰りの会(話を聞く)、個別指導(話す・聞く)、着替え等がある。児童の生活に安定や落ち着きをもたらすために、おやつの時間や帰りの会では、小規模集団による保育が行われる。読書や工作等の行為についても専用の小空間が形成されている。以上より、室内音環境の整備と落ち着ける空間の確保に向けて、生活行為と音環境整備の双方から考案した小空間を用いた改善策を示した。平成26年度実施予定の、活動室と静養スペースにおける騒音レベルの連続測定と残響時間の測定は実施済みである。具体的には以下の通りである。静養スペースの音環境の実態調査と静養のための空間整備に関する提案については、静養スペースとして使われる部屋において、騒音レベルの連続測定を行った。また、独立した静養スペースがあるクラブは少ないことから、静養スペースとして使われる部屋と活動室において、同時刻の騒音レベルの連続測定を実施した。これにより2つの空間の音の影響が明らかとなったため、これを室間音圧レベル差に代わる測定とした。さらに、独立した静養スペースがないクラブにおける、吸音パネルや吸音パーティション等を用いた静養空間の提案に関する予備実験を実施した。パーティション等を用いた静養空間の遮音効果の測定およびインタビュー調査による改善効果の検討は平成26年度に実施できなかったが、遮音効果よりも発達障害児にとって問題となりやすい声の聞きとりやすさに重点を置くため残響時間の測定とし、平成27年に実施する予定である。住居学児童や指導員の生活行動などを考慮した上で、壁面の吸音パネル設置や吸音パーティション等を用いた改善手法を提案し、残響時間の測定およびインタビュー調査において、改善効果を考察する。これまでの分析結果をまとめ、最終報告書を作成する。研究成果を学会等で発表する。平成25年度実施予定の現地調査および先進事例・特色のある事例の視察はほぼ実施済みである。平成25年度に実施できなかった調査項目(学校夏季休業中の一日保育の日の行動観察調査、発生音の観察・記録)もあるが、障碍児が放課後を過ごす施設を調査対象に加えるなど調査事例数を増やし、研究を充実させることができているため、全体としてはおおむね順調であると言える。次年度使用額は少額であり、当該年度の助成金はほぼ使用したと言える。本研究は、放課後児童クラブを児童が落ちついて生活できるような場所にするために音環境の観点から生活環境を向上させることを目的としており、研究の背景には、音情報のコントロールが苦手とされる障碍児の利用の増加もある。放課後に障碍児を受け入れる施設については,平成24年には放課後等デイサービスが創設されるなど、施設の形態も多様化してきた。このため、平成25年度の調査では、放課後児童クラブに加え、特別支援学校敷地内の専用建物で放課後の支援事業を行っている施設においても、生活環境の現状や苦手な音の対策などを把握することを目的に、指導員対象のヒアリング調査を行っている。平成26年度の音環境の調査は、放課後児童クラブを中心に、児童が放課後を過ごす施設について、残響時間などの建築音響性能の調査を行い、放課後児童クラブの生活の場づくりに有益な基礎的資料を示す予定である。次年度使用額は少額であるため、研究に必要な消耗品等の購入に合算して使用する予定である。
エクソソームによる情報伝達により制御される子宮内膜症発症機構の解明

本研究では細胞間情報伝達手段の1つとして注目されるエクソソームに着目し、子宮内膜症の成因を解明し、新規治療の開発に繋げることを目的とする。昨年度までに不死化子宮内膜細胞よりエクソソームを抽出し、抽出したエクソソームを用いて不死化子宮内膜細胞への添加実験を行ない、エクソソーム添加によりHPMC(腹膜中皮細胞)の細胞間隙が拡大することが確認された。しかしながら、子宮内膜間質細胞の浸潤能については変化がみとめられなかった。本年度は子宮内膜間質細胞ではなく、腹腔内マクロファージに対するエクソソームの機能を検討をおこなった。腹腔内マクロファージは手術時に採取した腹腔内洗浄液よりマクロファージを回収する予定であったが、腹腔内洗浄液からは十分な細胞数は得られなかったため、末梢血単核球を用いることとした。先行論文と比較して、かなり少量の細胞しか得られない原因として手術対象のほとんどが薬物療法をうけているためではないかと考えられた。子宮内膜間質細胞と正常ドナーの末梢血単核球を共培養し、LDH assayにより細胞死を検討すると子宮内膜症症例から採取した子宮内膜間質細胞では非子宮内膜症症例に比べて細胞死が減少する。この作用がエクソソームによるものであるとすると不死化子宮内膜間質細胞から採取したエクソソームを非子宮内膜間質細胞と末梢血単核球との共培養に添加することにより細胞死は増加すると考え検討を行なった。しかしながら有意差は認められなかった。これらの結果が不死化子宮内膜間質細胞を用いたことによるのか、エクソソームとはことなる経路が作用していることによるのかを検討するために、不死化子宮内膜間質細胞から採取したエクソソームと子宮内膜症症例の正所性子宮内膜から採取したエクソソームの類似性を検討中である。子宮内膜症の克服は女性のQOL改善に貢献するのみならず、労働損失・医療費軽減、少子化対策とも直結する重要な命題である。また生殖期女性の約10 %に存在するcommon diseaseであるにもかかわらず、その発症機序については諸説あり、いまだ定見を得ない。本研究では、細胞間情報伝達手段の1つとして注目されるエクソソームに着目し、子宮内膜症の成因を解明し、新規治療の開発に繋げることを目的とする。エクソソームは様々な細胞から分泌され、体液中を循環して離れた細胞間の情報伝達を行い、抗原提示、アポトーシス、血管新生、炎症などへの関与が指摘されており、子宮内膜症においても子宮内膜細胞と腹腔内微小環境を形成する周辺細胞がエクソソームを介して情報を伝達し、子宮内膜細胞が腹膜へと生着する環境を整えているのではないか考えられる。本年度は内膜症症例と非内膜症症例の正所性子宮内膜からのエクソソームの抽出を試みた。手術時に採取した子宮内膜症症例とその他の良性疾患症例の子宮内膜より子宮内膜間質細胞を初代培養し、細胞上清から超遠心法を用いて子宮内膜間質細胞からエクソソームであると思われる小胞を回収した。回収した小胞がエクソソームであるかどうかはCD63及びCD81抗体を用いた免疫染色を行い電子顕微鏡で観察した。子宮内膜間質細胞からのエクソソームの回収プロトコールは確立できたが、子宮内膜間質細胞から得られるエクソソームの量は細胞への添加実験で用いるには不十分であったため、同様のプロトコールを用いて不死化子宮内膜間質細胞よりエクソソームを回収することとした。本年度は手術にて摘出した子宮内膜組織より子宮内膜間質細胞を初代培養し、初代培養細胞からエクソソームを回収するプロトコールを確立した。すでに卵巣癌細胞細胞にて確立している超遠心を用いた方法にてエクソソームを回収下が、卵巣癌細胞に比べ回収できるエクソソームの量が少なかったこと、培養細胞数を増やしてエクソソームの回収量を増加させようと試みたが、初代培養細胞を大量に安定的に培養することは困難であった。そこで当初の計画でも予定していたようにhTERTを導入された不死化子宮内膜間質細胞の提供を受け、不死化細胞を用いての検討とすることとした。昨年度までに子宮内膜症間質細胞からエクソソームを抽出するプロトロルを作成した。しかしながら、回収できるエクソソームの量は細胞への添加実験で用いるには不十分であったため、同様のプロトコールを用いて不死化子宮内膜細胞よりエクソソームを抽出した。抽出したエクソソームを用いて、不死化子宮内膜症細胞由来のエクソソーム添加によりHPMC (腹膜中皮細胞)および子宮内膜間質細胞に生じる変化を以下の手法により検討した。エクソソーム添加によるHPMCの形態変化:初代培養したHPMCを用いて、HPMCに生じる細胞間隙を蛍光色素を用いて蛍光顕微鏡下に観察したところ、エクソソーム添加によりHPMCの細胞間隙が拡大することが確認された。In vitro invasion assay:マトリゲルコートを行ったboyden chamberの上層で内膜症細胞を培養してエクソソームを添加、下層に内膜症の浸潤促進因子であるTNFαをchemoattractantとして添加した条件下で一定時間後にboyden chamber下面に移動した内膜症細胞数を測定した。

結果、子宮内膜間質細胞は浸潤能力が弱く、エクソソーム添加の有無により浸潤能に有意差は認められなかった。これらの結果の解釈および今後検討予定のエクソソーム機能解析において、子宮内膜症間質細胞由来エクソソームと不死化子宮内膜症細胞由来エクソソームの類似性を証明するために、iTRAQ法により蛋白質の網羅的解析を行い比較することとしている。初年度、子宮内膜間質細胞の初代培養からのエクソソーム抽出量が当初予想よりも少なく、不死化細胞を使用することとした。しかしながら、不死化細胞株由来のエクソソームと初代培養由来のエクソソームの内胞する情報伝達物資の類似性を証明する必要が生じたため、非内膜症症例の正常子宮内膜と内膜症症例の子宮内膜、不死化子宮内膜症細胞のエクソソームを比較するためにiTRAQ法を行うも、初代培養系は採取検体により差異が大きく、解析に用いるサンプル調整に時間を要している。本研究では細胞間情報伝達手段の1つとして注目されるエクソソームに着目し、子宮内膜症の成因を解明し、新規治療の開発に繋げることを目的とする。昨年度までに不死化子宮内膜細胞よりエクソソームを抽出し、抽出したエクソソームを用いて不死化子宮内膜細胞への添加実験を行ない、エクソソーム添加によりHPMC(腹膜中皮細胞)の細胞間隙が拡大することが確認された。しかしながら、子宮内膜間質細胞の浸潤能については変化がみとめられなかった。本年度は子宮内膜間質細胞ではなく、腹腔内マクロファージに対するエクソソームの機能を検討をおこなった。腹腔内マクロファージは手術時に採取した腹腔内洗浄液よりマクロファージを回収する予定であったが、腹腔内洗浄液からは十分な細胞数は得られなかったため、末梢血単核球を用いることとした。先行論文と比較して、かなり少量の細胞しか得られない原因として手術対象のほとんどが薬物療法をうけているためではないかと考えられた。子宮内膜間質細胞と正常ドナーの末梢血単核球を共培養し、LDH assayにより細胞死を検討すると子宮内膜症症例から採取した子宮内膜間質細胞では非子宮内膜症症例に比べて細胞死が減少する。この作用がエクソソームによるものであるとすると不死化子宮内膜間質細胞から採取したエクソソームを非子宮内膜間質細胞と末梢血単核球との共培養に添加することにより細胞死は増加すると考え検討を行なった。しかしながら有意差は認められなかった。これらの結果が不死化子宮内膜間質細胞を用いたことによるのか、エクソソームとはことなる経路が作用していることによるのかを検討するために、不死化子宮内膜間質細胞から採取したエクソソームと子宮内膜症症例の正所性子宮内膜から採取したエクソソームの類似性を検討中である。不死化子宮内膜間質細胞は安定的に培養可能であるため、それを用いてエクソソームを回収し、回収したエクソソームを用いて腹膜中皮細胞及び腹腔内マクロファージに添加し、形態、貪食能、接着能及び浸潤能にどのような変化が生じるかを検討する。不死化細胞を用いることにしたために、エクソソーム機能解析に先んじて、エクソソーム内の情報伝達物質の同定を行うことした。よって、エクソソーム添加による機能解析と平行して、iTRAQ法で同定された蛋白から子宮内膜症病変形成あるいは子宮内膜症のがん化のバイオマーカーとなる物質の検索も進めていく。
法定地上権制度に関する立法論的検討

本研究は、法定地上権制度(民法388条)の改廃を検討することをその目的としている。昨年度は、主として、資料収集と検討を行い、その成果を「法定地上権制度に関する立法論的検討(一)(二・完)」(琉大法学72号109頁133頁、琉大法学73号145頁165頁)に公表した。今年度は、主として、右の研究成果の成果報告に努めた。まず、2005年9月24日(土)に、日本土地法学会中国支部研究会において、「法定地上権制度に関する立法論的検討」というテーマで報告を行った。右の報告においては、(1)立法過程の議論、(2)法定地上権の成否に関する判例の問題点、(3)法定地上権の改廃に関する学説の提案、(4)過去の民法、借地借家法及び建物区分所有等に関する法律の制定時、改正時に主張された法定地上権制度の改廃に関する提案、を手がかりに、従来の法定地上権制度の改廃に関する提案の利点、問題点を整理し、さらに、法定地上権制度の改廃を行う際の検討課題に言及した。右の報告の趣旨は、法定地上権制度の改廃については、例えば、改正については、法定地上権から法定賃借権への変更、あるいは、重要判例の明文化、という方法があり、廃止については、民法370条の改正や、自己借地権制度の導入、という方法があるのであるが、どの選択肢も一長一短であり、法定地上権制度の代替手段として強く期待されている自己借地権制度についても、右の制度の単独導入のみでは、法定地上権制度の代替制度としての役割を完全に果たすことができず、また、この制度自体にも、自己借地権の設定なくして、土地建物の分離が生じた場合をどのように対処するか、など、未解決の問題が多いため、仮に、法定地上権制度の代替手段として、この制度を導入するのであれば、今後、十分に検討を行わなければならない、というものである。なお、2005年11月12日(土)には、沖縄法政学会において、個別報告を行った。報告のテーマ、内容は、上記の研究会と同様である。もっとも、右の報告においては、時間の関係上、特に、上記の(3)、(4)を中心に取り上げて、法定地上権制度のあり方について言及した。右学会の個別報告の内容は、「沖縄法政学会会報No.18」に掲載予定である。本年度は、本テーマを検討するための資料収集、分析等を行い、その成果を、「法定地上権制度に関する立法論的検討(一)(二)」という表題で、琉大法学72巻109頁以下、琉大法学73巻145頁以下に発表した。右論文は、法定地上権制度の抱える問題点を明らかにした上で、従来提唱されてきた法定地上権制度の改廃に関する提案を検討する、という内容である。論文の主要部分は、(1)民法起草時における法定地上権制度についての理解、(2)法定地上権の成否に関する判例理論の問題点、(3)学説における法定地上権制度の評価及び改正提案、(4)各種立法時における法定地上権制度の理解、(4)検討、である。本論文の検討を通じて、法定地上権制度の抱える問題点としては、敷地利用権の内容が「地上権」であること、法定地上権の成否、さらには、成立する場合の法定地上権の内容が競売時に不明確なこと、関係者の意図を柔軟に敷地利用権の内容に反映させることができないこと、等が挙げられていることが分かった。これに対して、従来、法定地上権制度の改廃案として代表的なものとしては、自己借地権制度の導入、及び、370条を改正して、土地抵当権の効力を建物に及ぼす構成が挙げられる。しかし、これらの提案は、各々克服するべき課題を有している。例えば、前者の自己借地権制度については、濫用の危険性や、強制競売や公売の場合の対応、後者については、土地のみに抵当権を設定する必要性を完全に捨てきることができるか、という問題がある。それは、言い換えれば、両者とも、法定地上権制度と比較して、敷地利用権確保の守備範囲の狭さを表している。したがって、法定地上権制度を廃止して、これらの制度を導入するのであれば、この問題を克服することが不可欠である。本研究の結果、右のような結論に至った。

右の報告の趣旨は、法定地上権制度の改廃については、例えば、改正については、法定地上権から法定賃借権への変更、あるいは、重要判例の明文化、という方法があり、廃止については、民法370条の改正や、自己借地権制度の導入、という方法があるのであるが、どの選択肢も一長一短であり、法定地上権制度の代替手段として強く期待されている自己借地権制度についても、右の制度の単独導入のみでは、法定地上権制度の代替制度としての役割を完全に果たすことができず、また、この制度自体にも、自己借地権の設定なくして、土地建物の分離が生じた場合をどのように対処するか、など、未解決の問題が多いため、仮に、法定地上権制度の代替手段として、この制度を導入するのであれば、今後、十分に検討を行わなければならない、というものである。なお、2005年11月12日(土)には、沖縄法政学会において、個別報告を行った。報告のテーマ、内容は、上記の研究会と同様である。もっとも、右の報告においては、時間の関係上、特に、上記の(3)、(4)を中心に取り上げて、法定地上権制度のあり方について言及した。右学会の個別報告の内容は、「沖縄法政学会会報No.18」に掲載予定である。
次世代シーケンサーを用いた脂腺癌の遺伝子解析と発症メカニズムの解明

本研究は、1次世代シーケンサーを用いた脂腺癌の網羅的遺伝子解析、2臨床病型との照合、人種差の原因解明、3発癌、増殖及び転移に関わる細胞内伝達機構を明らかにし、予後推測および内科的治療法につなげることが目的である。今年度は、次世代シーケンサーを用いて遺伝し解析できる段階に検体を抽出する作業を主に行ってきた。当科における脂腺癌症例は2007年から2017年までの11年間で56例、そのうち腫瘍および周囲の正常組織を含めた凍結保存検体があるのは24例である。これらの検体については、正常組織を含む腫瘍組織検体であるため、顕微鏡下に正常組織と腫瘍組織の鑑別および抽出作業を行った。組織の挫滅等により正常組織と腫瘍組織の分離が不可能な症例もあったが、数検体について試験的にDNA,RNAの抽出処理を行ったところ、DNA、RNAともに解析可能な品質条件は満たしており、次世代シーケンサーによる解析の準備は着実に進行している。また、今年度の新たな脂腺癌症例で遊離瞼板移植を施行した症例については、健側の瞼板を得ることができるため、その余剰検体(健常側の瞼板)を保存している。正常組織である健側の瞼板を解析することで、完全にコンタミネーションのない正常組織と腫瘍組織の解析および比較を行うことができる。これらの検体もすでに5例以上得ることができており、次世代シーケンサーによる解析前の状況として順調に検体採取、分離、DNAおよびRNA抽出ができたと考えている。今年度は、次世代シーケンサーを用いて遺伝し解析できる段階に検体を抽出する作業、具体的には顕微鏡下に正常組織と腫瘍組織の鑑別および抽出作業を行ったが、組織の挫滅等により正常組織と腫瘍組織の分離が不可能な検体もあった。同一検体からの組織抽出は精度が非常に重要であるが、正常組織として抽出した組織にわずかでも腫瘍細胞がコンタミネーションしていれば、全く正しい結果が得られないこととなる。しかし、新たな脂腺癌症例の健側の同部位の瞼板から得られた正常組織は、全くコンタミネーションがないため、それらの検体からの遺伝子解析の結果が、最も信頼度が高いと期待できる。当初の予定よりも総数が少なくなる可能性はあるが、当科のように脂腺癌症例の紹介数が多い施設では、全体の研究期間中に十分な症例数を得られる可能性も高く、今後に期待できる。総じて、今年度はDNA,RNAの抽出と、完全にコンタミネーションのない新たな検体の採取が可能であっとことから、進捗は順調であったといえる。。今後は次世代シーケンサーを用いて遺伝子解析に取りかかる。DNAに対しては全エクソーム解析、RNAに対しては全トランスクリプトソーム解析を施行する予定である。同一症例の腫瘍部分の遺伝情報と正常部分の遺伝情報が得られ、その比較により、腫瘍部分に特異的な遺伝子変異の検索が可能となるが、新たな正常瞼板を得られた症例については、より信頼度の高い遺伝子解析が可能と考える。同一検体からの正常組織と腫瘍組織の分離は、全例で確実に行えたわけではない上、健側の同部位の瞼板組織が得られた症例もでてきたことから、まずは健側の同部位の瞼板組織と患側の腫瘍組織との遺伝子解析、比較を行う方針とした。次世代シーケンサーによる解析後は、それぞれの症例の臨床病型との照合を行う。臨床病型の違い、再発の有無、遠隔転移の有無によって分類し、それぞれの群で遺伝子変異に違いがあるかを検討し、臨床動態の違いに関与している遺伝子変異を明らかにする。