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社会学年報学派の宗教研究に関する体系的研究

デュルケームを中心とした社会学年報学派の宗教研究における全体的かつ通時的な方向性を、とりわけモースやユベールの「供犠の本質と機能に関する試論」執筆に関わる共同作業の内実の検討を通じて解明した。また、そのような社会学年報学派の宗教研究の集大成たるデュルケームの『宗教生活の基本形態』を細密に読解し、その翻訳作業を進めた。これに付随して、社会学年報学派の宗教研究、とりわけ『宗教生活』の、日本における受容過程を描き出した。本研究は、デュルケーム、ユベール、モースらの共同作業に基づく社会学年報学派の宗教研究の全体像を明らかにし、その宗教学史的意義を再検討することを目的としている。この目的達成のために、(2)ユベールとモースの共同作業によって刊行された著作、とりわけ「供犠の本質と機能に関する試論」(1899年、以後「供犠論」と略記)ならびに「呪術の一般理論素描」(1904年、以後「呪術論」と略記)を、関連する他の論文・書評等も視野に収めつつ、精細に検討し、その生成過程を具体的に解明する。(3)併せて当時の宗教学史的な時代背景や影響関係、さらには社会的・文化的コンテクストも考慮に入れながら、社会学年報学派の宗教研究における共同作業の内実を解明し、その全体像を提示する。フランス社会学年報学派による宗教研究のあり方を体系的に解明し、宗教学の視点からその意義を再検討することを目的とする本研究において、本年度は、ユベール・モース「供犠の本質と機能に関する試論」(以下、「供犠論」と略記)の生成過程を、とくにデュルケームによる関与を中心に検討した。その作業の一貫として、9月には4日間にわたってIMEC所蔵のFonds Maussに収められているゲラ刷りや草稿などの一次資料を調査した。この調査結果もふまえつつ、「供犠論」のテクストの精査、並びにモースとユベール宛てのデュルケームの書簡の分析に基づいて検討を進めた。この結果、1)ユベールとモースの処女作とされるこの論文が、デュルケームも含めた三者の緊密な共同作業の上に成立していること、2)この共同作業のなかから宗教現象の体系的かつ共時的把握という、社会学年報学派の宗教研究の基本的な方向性が確立されたこと、3)この過程のなかでデュルケームに萌した、儀礼による社会活性化の機能という新たな視点が、「供犠論」の結論部分に直接取り入れられていること、が明らかとなった。要するに「供犠論」は、社会学年報学派としての宗教研究の出発点であると同時に、発生論的観点に依拠していたデュルケームの従来の宗教研究からの転換点をなすものでもあった。このように、「供犠論」の生成をめぐって、ユベール、モースとデュルケーム三者による共同作業の内実を具体的に検討する研究は、内外に例を見ない独創的なものといえる。この成果の一端は、「ユベール・モース「供犠の本質と機能に関する試論」の生成--社会学年報学派の宗教学思想I--」として発表している。共同作業に基づく社会学年報学派の宗教研究の全体像を明らかにし、その宗教学史的意義の再検討を目的とする本研究において、本年度は昨年度に引き続き、ユベール・モース「供犠の本質と機能に関する試論」(以下、「供犠論」と略記する)の生成過程を考察すると共に、イギリス社会人類学との交流を検討した。その作業の一貫として、8月下旬の1週間、IMEC所蔵のFonds Maussの調査に赴き、「供犠論」の草稿、膨大なモース宛の書簡の目録、フレーザーからモースに宛てられた20通の書簡、さらにはIMEC所蔵のFonds Halbwachsの目録を、それぞれ精査した。とりわけフレーザーの書簡の文面からは、モースとの真情あふれる交流が窺われ、従来、どちらかといえば、宗教研究の基本的な視角をめぐって対立関係にあったとみなされてきた、社会学年報学派とイギリス社会人類学派との問の意外な親近性が新たに浮かび上がってきた。この調査結果もふまえ、ユベール、モース、デュルケーム三者の共同作業に基づく「供犠論」の生成過程に関して、前年度の検討結果をさらに展開させて、その一端を「デュルケームとモースの「隠された共同作業」-「供犠論」の生成」と題して日本宗教学会第65回学術大会にて発表した。さらに、当時のトーテミズムをめぐる状況に関しても、予備的作業としてデュルケームからレヴィ・ストロースに至る研究動向の変遷の概要を検討した。その成果の一端は、『宗教学事典』(丸善、印刷中)の「トーテミズム」「原始心性」の項目において、発表する予定である。共同作業に基づく社会学年報学派の宗教研究の全体像を明らかにし、その宗教学史的意義の再検討を目的とする本研究において、本年度は、これまでの研究成果を踏まえつつ、インド学者

シルヴァン=レヴィとの関連で、ユベール・モース「供犠の本質と機能に関する試論」(以下、「供犠論」)の生成過程を考察した。その作業の一貫として、9月初旬の1週間、IMEC所蔵のFonds Maussの調査に赴き、シルヴァン=レヴィがモースに宛てた書簡、並びにユベールのモース宛書簡の精査を試みた。終生モースと密接な関係にあった両者のうち、シルヴァン=レヴィは「供犠論」の執筆時期にはアジア旅行に出かけていて、この間、直接的な助言等は見られなかったこと、一方のユベールとは頻繁に手紙のやり取りをしていて、「供犠論」の細部に至るまで、緊密な共同作業に基づいていたことが明らかになった。その共同作業の錯綜したプロセスについては目下解明中である。他方、当時の社会学年報学派による宗教研究の背景を探る作業も継続中であり、とくに学派のトーテミズム理解の変遷過程の解明、ならびに学派に近かった哲学者、レヴィ・ブリュルの「原始心性」説の位置づけを試みた。その成果の一端は、『宗教学事典』(丸善)における「原始心性」、「トーテミズム」の項目で、簡単に述べている。また、社会学年報学派の仕事が、日本の宗教研究に与えた影響の探査を開始した。具体的には『宗教生活の基本形態』の訳者である古野清人、パリに長期間留学してモースに直接師事した松平斉光や山田吉彦らの、とりわけ戦中から戦後間もなくにかけての著作の読解を通じて、彼らの宗教研究の視角を分析・検討した。共同作業に基づく社会学年報学派の宗教研究の全体像を明らかにし、その宗教学史的意義の再検討を目的とする本研究において、本年度は、これまでの研究成果をふまえ、ユベール・モース「供犠の本質と機能に関する試論」の生成過程の解明に努めた。その作業の一環として、10月初旬の4日間、IMEC所蔵のFonds Maussの調査に赴き、この論文をめぐるユベールとモースのやり取りに関して、膨大な量にのぼる両者間の書簡の一部を再び精査した。併せて姉崎正治、松本信廣や東洋文庫等からのモース宛書簡を精査し、これをふまえて社会学年報学派による宗教研究が日本の宗教学に与えた影響関係を考察した。その成果の一端はJapan's reception of Les forms elementaires delavie religiouseとして発表した。本論文は、国際的に権威ある宗教学の専門誌Religion42-1の『宗教生活の基本形態』出版100周年特集号に、乞われて寄稿したものであり、社会学年報学派による宗教研究の集大成たる『宗教生活の基本形態』が日本に受容される過程を、赤松智城や古野清人らによる同書の紹介・解釈を中心に辿ったオリジナリティの高い論考である。これは、社会学年報学派による宗教研究の宗教学史的意義の再検討の一環をなしている。他方、当時の社会的・思想的コンテクストを明らかにする作業も継続しており、本年度は、その成果の一端として伊達聖伸著『ライシテ、道徳、宗教学-もうひとつの19世紀フランス宗教史』の書評を発表した。本書は19世紀のフランスにおける宗教学の生成を、ライシテの道徳との動態的な関係性のなかで圧倒的なスケールで描き出した力作であり、その骨格と問題点とを宗教学の視点から批評した。ここまでの研究によって蓄積された成果をもとに、デュルケームの『宗教生活の基本形態(Les forms elementaires de la vie religiouse)』(1912)そのものの精査にも着手した。社会学年報学派による宗教研究に共通する枠組み、ならびにその共時的・動態的な視点が、本書のなかでどのように定式されたかの検討を進めている。
AEを用いた方向制御層状組織を有するTiAiの破壊に関する研究

軽量耐熱材料として期待されている(gamma+alpha_2)二相層状TiAiの破壊挙動について、FZ法にて層状組織を方向制御したTiA1-PST結晶を用いることにより、微細組織、結晶方位異方性に注目した系統的な研究を行った。PST結晶における層間隔、ドメイン径といった微細組織はA1濃度を変化させることで制御可能である。したがって、本研究では、Ti-49.1at%A1、Ti-50.8at%A1合金を用いることで、層間隔をそれぞれ0.75mum、1.13mum、gammaドメイン径をそれぞれ23mum、64mumに制御したTiA1-PST結晶を作製した。さらに、層界面とノッチとの方位関係が異なる3タイプの試験片についてCT試験を行った。その結果、PST結晶の破壊挙動は主亀裂の伝播方向と層界面とのなす角度関係に強く依存し、特に層界面に対し平行方向に主亀裂が進展する場合(Type A)、層界面を横切る場合(Type B)に比べ、5倍も高い靱性値(K_Q)を示した。このことは層界面における主亀裂のブランチングならびにリフレクションが主亀裂伝播の障害となるためであり、層状組織の方向制御による強靱化の可能性を示唆している。また、低靱性を示すTypeAにおいては、破壊試験後の詳細な組織観察ならびにSEM-ECP法により、主亀裂の伝播は主にalpha_2相の(0001)上でのへき開により進行することが明らかとなった。さらに、微細組織が破壊挙動におよぼす効果は顕著であり、TypeAでは、alpha_2相間隔の微細化が、Type Bでは、層間隔の微細化が強靱化にとって極めて有効であった。このことは、AE波測定の結果とあわせて、微細組織ならびにその異方性が、主亀裂の発生、伝播そして破壊に至るまでの過程に対し密接な相関関係によって作用していることを示唆している。したがって、破壊靱性向上のためには微細組織の制御ならびにalpha_2相における変形モードの改善といった立場からの合金設計が不可欠である。
癌特異的かつ全身的な効果を併せ持つ癌ウイルス療法の新戦略

現在世界中において、生きたウイルスを利用して癌を治療する癌ウイルス療法に関する臨床試験が積極的に行われている。これは、ウイルスが本来持っている癌細胞に感染後、癌組織内で増殖しながら死滅させるという性質を利用する方法である。本研究では、ワクシニアウイルスを遺伝子組換え技術によって改良を加え、腫瘍のみを標的破壊するspecific(癌組織に特異的)な効果と、1)ウイルスの形態形成と感染の制御に基づくウイルス腫瘍集積性の向上、2)ウイルスと生体免疫反応の制御に基づく抗腫瘍免疫の誘導・増強により、転移した癌も標的破壊できるようにsystemic(全身的)な効果を併せ持たせる新戦略を確立した。癌は日本における死亡原因でもっとも多い病気であり、特に現行の治療法に対して極めて高い抵抗性を示し、容易に他臓器に転移する難治性進行癌に対する新規治療法の確立が望まれている。癌ウイルス療法は、ウイルスを癌細胞に感染させ増殖溶解させることで、直接癌細胞を破壊する癌治療法である。これまでの研究において、癌細胞特異的に増殖し破壊する遺伝子組換えワクシニアウイルスMDRVVの開発に成功した。そこで本研究の目的は、このspecific(癌組織に特異的)な効果に加え、1)ウイルスの形態形成と感染の制御に基づくウイルス腫瘍集積性の向上、2)ウイルスと生体免疫反応の制御に基づく抗腫瘍免疫の誘導・増強により、転移した癌も標的破壊できるようにsystemic(全身的)な効果を併せ持たせることである。目的1)に関しては、昨年度、ウイルス膜蛋白を改良した形態形成制御型MDRVV由来のEEV(細胞外性被覆ウイルス)は、改良しないMDRVV由来のEEVよりも優位に中和を逃れていることがin vitroの解析結果より示された。そこで本年度は、ヒト卵巣癌細胞を用いて腹膜播種モデルマウスを構築し、ウサギ抗ワクシニア血清の投与により擬似的な免疫保持状態となることを確認した。このマウスモデルを用いて、ウイルス膜蛋白の改良より、腫瘍細胞におけるEEVの産出性と免疫回避能を増加させ、転移した腫瘍への集積性と抗腫瘍効果を向上させるかどうかを検証中である。目的2)に関しては、マウス大腸癌細胞株MC38を同系C57BL/6マウスの両側の皮下に移植した担癌モデルマウスにおいて、生理食塩水、MDRVV、又は26年度で作製した各免疫制御型MDRVVを右側の腫瘍にのみ投与した結果、インターロイキン12を発現するように組込んだMDRVV-IL12は、投与した腫瘍だけではなく投与しない腫瘍の増殖も、最も有意に抑制することを見出した。目的1)に関しては、ウイルスのEEV産生の増加とEEV免疫回避能を同時に評価するためのマウスモデルを構築し、ウイルス膜蛋白の改良より、腫瘍細胞におけるEEVの産出性と免疫回避能を増加させ、転移した腫瘍への集積性と抗腫瘍効果を向上できるか否かを評価している。本年度の計画はマウスモデルを用いた評価を終了させる目標であったが、補助事業の目的をより精緻に達成するため、本補助事業の研究期間内で新たなマウスモデルを構築した。それゆえ、本年度内に完了までには至らなかったので、次年度に継続して実施する。目的2)に関しては、各免疫制御型MDRVVの中で最も抗癌効果を発揮するMDRVV-IL12を決定したので、順調に進展していると評価する。そこで本研究の目的は、このspecific(癌特異的)な効果に加え、1)ウイルスの形態形成と感染の制御に基づくウイルス腫瘍集積性の向上、2)ウイルスと生体免疫反応の制御に基づく抗腫瘍免疫の誘導・増強により、転移した癌も標的破壊できるようにsystemic(全身的)な効果を併せ持たせることである。最終年度である本年度は、ヒト卵巣癌細胞の腹膜播種モデルマウスにおいて、ウサギ抗ワクシニア血清の投与により擬似的な免疫保持状態を作出した。本モデルにおいて、MDRVVのウイルス膜蛋白を部分的に欠失させたMDRVV/ΔSCRは、腫瘍細胞におけるEEV(細胞外性被覆ウイルス)の産出性を増加させるとともに、そのEEVの元来有している中和抗体からの免疫回避能力を向上させることで腫瘍集積性を向上させ、その結果、抗がん効果を増強させることに成功した。

加えてマウス大腸癌細胞株MC38を同系C57BL/6マウスの皮下に移植した担癌モデルマウスにおいて、そのMDRVV/ΔSCRの抗癌効果は、NK細胞を活性化する・Tリンパ球に作用しTh1タイプの免疫反応を誘導し腫瘍に対する細胞性免疫を増強するIL-12を発現するように組込むことで、さらに増強することを実証した。以上より、specific(癌特異的)な効果とsystemic(全身的)な効果を併せ持つ癌ウイルス療法の新戦略を確立した。癌は日本における死亡原因でもっとも多い病気であり、特に現行の治療法に対して極めて高い抵抗性を示し、容易に他臓器に転移する難治性進行癌に対する新規治療法の確立が望まれている。癌ウイルス療法は、ウイルスを癌細胞に感染させ増殖溶解させることで、直接癌細胞を破壊する癌治療法である。これまでの研究において、癌細胞特異的に増殖し破壊する遺伝子組換えワクシニアウイルスMDVVの開発に成功した。そこで本研究の目的は、このspecific(癌組織に特異的)な効果に加え、1)ウイルスの形態形成と感染の制御に基づくウイルス腫瘍集積性の向上、2)ウイルスと生体免疫反応の制御に基づく抗腫瘍免疫の誘導・増強により、転移した癌も標的破壊できるようにsystemic(全身的)な効果を併せ持たせることである。本年度は、目的1)に関して、ウイルス膜蛋白を改良した組換えウイルスを作製した。MDVVをコントロールとし、この形態形成制御型MDVVを様々なヒト正常細胞、ヒト腫瘍細胞に感染させ、その後のウイルス増殖能、及びIMVとEEV産出性から形態形成能を解析した。その結果、特に卵巣癌では7種類の中で5つの細胞株において、両者のウイルスでIMVの産出に差がないにもかかわらず、血中を介して全身に伝播できる性質を持つEEVの産出は、MDVVと比べ形態形成制御型MDVVにおいて著明な上昇が確認された。さらに、ワクシニアウイルスで免疫したウサギより調製した血清を用いて、形態形成制御型MDVVの免疫回避能を評価した結果、MDVVのEEVと比較して、形態形成制御型MDVVのEEVでは中和反応回避能が高いことも確認した。一方、目的2)に関して、マウスIL-12分子、マウスLIGHT分子、マウスPD-1細胞外領域とイムノグロブリンFc領域の融合蛋白(PD-1-Fc)をコードする遺伝子を発現するようMDVVゲノムに挿入した免疫制御型ウイルスを作製した。目的1)に関しては、ウイルスの形態形成の制御により、EEV産出能と免疫回避能を向上できるかどうかを検討する計画であり、その研究目的は達成した。目的2)に関しては、各免疫制御遺伝子を発現する組換えウイルスの作製は完了したが、これらの遺伝子をコンビネーションで発現する組換えウイルスの作製は進行中である。本年度は、これらの組換えウイルスを作製する計画であり、おおむね完了しつつあるので、順調に進展していると評価する。目的1)に関しては、ヒト卵巣癌細胞を用いて腹膜播種モデルマウスを用いた抗腫瘍効果(腫瘍発育抑制効果と生存期間延長効果)、及び安全性の評価を完了させる。又、事前にワクシニアウイルスによって免疫したC57BL/6マウスに、マウス卵巣癌細胞を移植した同種同系移植モデルを構築し、免疫存在下でのEEV遠隔感染能を同様の手法によって比較検証する。目的2)に関しては、形態形成制御と免疫制御を併せ持つ次世代型MDRVVによる抗癌効果(腫瘍への集積性および抗腫瘍免疫)の増強を、形態形成制御型MDRVV、又は免疫制御型MDRVVと比較検証する。腫瘍治療
樹状細胞のパターン認識受容体に及ぼす放射線の影響と機構解明

樹状細胞は自然免疫と獲得免疫を繋ぐ最も強力な抗原提示細胞で、免疫システムにおいて重要な役割を担っている。本研究では、この樹状細胞の分化誘導における放射線の影響をパターン認識受容体の応答性に着目し検討を行った。ヒト単球にX線を照射し、既報のサイトカインの組み合わせにより樹状細胞へ分化誘導を行った後、細菌の細胞壁構成成分であるリポ多糖および炎症性サイトカインで刺激し、細胞表面発現抗原および機能解析を行った。その結果、X線照射単球由来樹状細胞は非照射対照群と比べて、リポ多糖刺激後におけるT細胞を刺激する分子の発現やサイトカイン産生などが著しく低下していた。一方で、炎症性サイトカイン刺激後ではこれら低下は観察されなかったことから、放射線に曝露された前駆細胞由来樹状細胞は炎症性サイトカインに対する応答性は比較的維持しているものの、病原菌に対する応答性が著しく低下することが示唆された。リポ多糖はパターン認識受容体であるToll様受容体4によって認識されるが、X線照射単球由来樹状細胞のToll様受容体4の発現は非照射群と同程度であったことから、放射線によってリポ多糖認識後のシグナル伝達経路が影響を受けている可能性が示唆された。樹状細胞は免疫応答において重要な細胞で、がん治療後の良好な予後のための免疫力強化という点でも重要な役割を担っている。しかしながら、樹状細胞およびその前駆細胞に対する放射線の影響についての詳細は不明である。さらに、病原体に普遍的に存在する分子パターンを認識するパターン認識受容体に及ぼす放射線の影響評価はほとんどなされていない。そこで本研究では、まず2011年度に樹状細胞の前駆細胞であるヒト単球から樹状細胞への分化誘導における放射線の影響を検討した。ヒト単球にX線を照射し、照射約1日後に既報のサイトカインの組み合わせにより樹状細胞へ分化誘導を行った後、細菌細胞壁構成成分であるリポ多糖および炎症性サイトカインで刺激し、細胞表面発現抗原解析や各種機能解析を行った。その結果、X線照射単球由来樹状細胞は非照射対照群と比べて、リポ多糖刺激後におけるT細胞を刺激する分子の発現やサイトカイン産生などが著しく低下した。一方で、炎症性サイトカイン刺激後ではこれら低下は観察されなかったことから、放射線に曝露された前駆細胞由来樹状細胞は炎症性サイトカインに対する応答性は比較的維持しているものの、病原菌に対する応答性が著しく低下することが示された。また、その原因として細胞内のレドックス制御の応答性変化の可能性を示唆した。2012年度は放射線曝露後のリポ多糖に対する応答性低下を詳細に検討するため、リポ多糖の受容体で代表的なパターン認識受容体であるToll様受容体に及ぼす放射線の影響を評価した。その結果、ヒト単球のToll様受容体発現は放射線照射によって顕著に減少した一方で、同一単球から誘導した樹状細胞では放射線による発現影響は認められなかった。以上のことから、放射線がToll様受容体に及ぼす影響は、単球の分化段階により異なり、未分化細胞においてその影響が強いことが明らかとなった。樹状細胞は免疫応答において重要な細胞で、がん治療における寛解後の良好な予後のための免疫力強化という点でも重要な役割を担っている。放射線治療は有効ながん治療法の一つであるが、治療過程における樹状細胞およびその前駆細胞に対する放射線の影響についての詳細は不明である。さらに、単球や樹状細胞が病原体に普遍的に存在する分子パターンを認識するパターン認識受容体に及ぼす放射線の影響評価はほとんどなされていない。そこで本研究課題は、樹状細胞の前駆細胞であるヒト単球から樹状細胞への分化誘導における放射線の影響を明らかにするとともに、免疫細胞におけるパターン認識受容体に対する放射線の影響を検討する。本年度は、ヒト樹状細胞の分化誘導における放射線の影響解析を中心に行った。実験は、献血バフィーコートから分離したヒト単球にX線を照射し、照射約1日後に既報のサイトカインの組み合わせにより樹状細胞へ分化誘導を行った後、細菌細胞壁構成成分であるリポ多糖および炎症性サイトカインで刺激し、表面発現抗原および機能解析を行った。

一方で、炎症性サイトカイン刺激後ではこれら低下は観察されなかったことから、放射線に曝露された前駆細胞由来樹状細胞は炎症性サイトカインに対する応答性は比較的維持しているものの、病原菌に対する応答性が著しく低下することが示唆された。また、代表的なパターン認識受容体であるToll様受容体に及ぼす放射線の影響を、単球系細胞株THP1細胞を用いて評価したところ、Toll様受容体発現に及ぼす放射線の影響は免疫細胞の分化段階により異なることが明らかとなった。次年度は、パターン認識受容体に及ぼす放射線の影響をより詳細に解析する予定である。当初の予定と順番を変更し、本年度はヒト樹状細胞の分化誘導における放射線の影響解析を中心に行ったが、研究は順調に進展している。また、パターン認識受容体に対する放射線の影響解析も既に本年度から解析を始めており、引き続きより詳細な解析を次年度に行う。当初は本年度にパターン認識受容体に対する放射線の影響解析を中心に行う予定であったが、ヒト樹状細胞の分化誘導における放射線の影響解析が順調に進展したため予定を変更しその解析を中心に行った。従って、当初の計画を変更し、次年度にパターン認識受容体に対する放射線の影響解析をより詳細に行う。その他の研究計画については申請書の研究経過の通りに遂行する。当初は本年度にパターン認識受容体に対する放射線の影響解析を中心に行う予定であったが、予定を変更し、ヒト樹状細胞の分化誘導における放射線の影響解析を中心に行った。そのため、本年度の支出が予定より少なくなった。次年度にパターン認識受容体に対する放射線の影響解析を詳細に行うため、繰り越した分の助成金をその実験に使用する。また、東日本大震災の影響により中止になった学会があるため、本年度に予定していた研究成果発表のための旅費を次年度に使用する。その他の研究費の使用計画については申請書の通りに遂行する。
低温全収集分光装置を用いた酸化物薄膜の表面電子構造評価

本研究では、酸化物薄膜の表面、異種界面でのフェルミ準位近傍の電子状態を、独自に開発した全収集分光法により調べた。通常の光電子分光法では感度が低いこと(信号カウント数で34桁のダイナミックレンジ)、超伝導状態を評価できるためのエネルギー分解能を有していないこと(通常50meV、かなりの工夫をして30meV)が障害となり、詳細なデータが得られていない。我々は、通常の光電子分光とは全く逆の発想に基づく全収集分光を用いた光電子分光装置を自作した。通常法での欠点は全て、電子のエネルギー分析器を使用することから発生する。新手法では電子のエネルギー分析を行わず、その替わりに、励起光源のエネルギーをスキャンすることで電子状態の分光を行う。そのため、ダイナミックレンジは7桁に向上し、エネルギー分解能を約10meVまで向上した。本年度は、薄膜サンプルを清浄な雰囲気を保ったまま輸送できるトランスファーシステムを自作した。Bi系単結晶試料において、超伝導ギャップの観測に成功した。YBCO薄膜についても、成膜チャンバーから清浄雰囲気で搬送した試料について、フェルミ準位端の電子占有状態の温度変化を詳細に調べた。c-軸方向では半導体的な性質を持つのに対して、ab-面内では金属的な振る舞いが観測され、この材料の異方性を電子状態から明らかにした。
カテキン類による増殖因子受容体の分解促進機構の解明

血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)は頭頸部癌を含む様々な腫瘍にて高度に発現し,治療における分子標的としての有用性が検討されている.緑茶成分に含まれるカテキン類の中でエピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)は癌や心血管疾患や神経変性疾患などに対する有用性が基礎・臨床研究により報告されている.今回我々はPDGFR蛋白質レベルでの影響について検討を行い次のことが明らかとなった.(1)様々なカテキン類においてEGCGのみが添加2時間後よりPDGFR-βの蛋白質レベルでの減少を引き起こした.(2)PDGFR-β蛋白質レベルでの減少が蛋白質の分解の促進か合成の低下であるのかを確認するため,蛋白合成阻害剤CHXを添加し調べた結果,合成系が止められても6時間ではPDGFR-βは大きく減少しないこと,またEGCGとの併用で減少の促進作用があることから,分解を促進していると考えられた.(3)PDGFR-β分解はまずプロテアソームにて行われた後とライソソームで行われるが,プロテアソームおよびライソソームの阻害剤を添加にてPDGFR-βの分解は減少した.(4)PDGFR-β分解はまず細胞膜上てPDGFR-βがユビキチン化を受けた後にプロテアソームに移動し分解されるが,免疫沈降法にて調べた結果,EGCG処理はPDGFR-βのポリユビキチン化を促進することが明らかとなった.またプロテアソームの阻害剤にて分解を抑制するとさらにユビキチン化の増強を認めた.(5)PDGFRにはαとβのアイソフォームがあるがβだけではなくαもEGCGに添加による減少を認めた.以上によりEGCGはPDGFRを蛋白質レベルにて減少させこれは生理的蛋白質分解機構であるユビキチン-プロテアソーム分解経路の活性化によることが示唆された.今後頭頸部扁平上皮癌の腫瘍細胞での有効性を評価していく予定である.血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)は頭頸部癌を含む様々な腫瘍にて高度に発現し,治療における分子標的としての有用性が検討されている.緑茶成分に含まれるカテキン類の中でエピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)は癌や心血管疾患や神経変性疾患などに対する有用性が基礎・臨床研究により報告されている.今回我々はPDGFR蛋白質レベルでの影響について検討を行い次のことが明らかとなった.(1)様々なカテキン類においてEGCGのみが添加2時間後よりPDGFR-βの蛋白質レベルでの減少を引き起こした.(2)PDGFR-β蛋白質レベルでの減少が蛋白質の分解の促進か合成の低下であるのかを確認するため,蛋白合成阻害剤CHXを添加し調べた結果,合成系が止められても6時間ではPDGFR-βは大きく減少しないこと,またEGCGとの併用で減少の促進作用があることから,分解を促進していると考えられた.(3)PDGFR-β分解はまずプロテアソームにて行われた後とライソソームで行われるが,プロテアソームおよびライソソームの阻害剤を添加にてPDGFR-βの分解は減少した.(4)PDGFR-β分解はまず細胞膜上てPDGFR-βがユビキチン化を受けた後にプロテアソームに移動し分解されるが,免疫沈降法にて調べた結果,EGCG処理はPDGFR-βのポリユビキチン化を促進することが明らかとなった.またプロテアソームの阻害剤にて分解を抑制するとさらにユビキチン化の増強を認めた.(5)PDGFRにはαとβのアイソフォームがあるがβだけではなくαもEGCGに添加による減少を認めた.以上によりEGCGはPDGFRを蛋白質レベルにて減少させこれは生理的蛋白質分解機構であるユビキチン-プロテアソーム分解経路の活性化によることが示唆された.今後頭頸部扁平上皮癌の腫瘍細胞での有効性を評価していく予定である.
衝撃波を用いた非観血的な僧帽弁交連切開術の開発に関する研究

非観血的に僧帽弁の狭窄病変が交連切開できればその臨床的意義は大きい。そこで,泌尿器科領域で最近多用されている体外衝撃波砕石術(ESWL)による交連切開の可能性につき検討した。1.まず,開心術で僧帽弁置換術時に摘出した石灰化病的僧帽弁を用いて以下の実験を行った。種々の程度の石灰化を呈する摘出僧帽弁を水槽内に固定し,衝撃波源としてピエゾ素子を用いた衝撃波装置を用いて,駆動電圧,照射rateを変化させながら摘出僧帽弁に衝撃波を照射し,僧帽弁への影響を調べた。2. 1.の結果,一部の高度な石灰化を示す病的狭窄で石灰化の一部にキレツが認められたが,他の多くの狭窄弁には肉眼的に有意な変化はみられなかった。またキレツが認められた狭窄弁でもキレツの方向は交連部とは一致せず,多彩であった。以上から,先ず初期の実験段階において,ESWLによる石灰化狭窄弁の交連切開には大きな問題のあることが明らかにされた。最近の研究では,音響インピーダンスの異なる臓器表面での衝撃波反射の影響で,その組織に損傷の生じることが確かめられている。その影響は当然心臓にも認められ,最近心筋梗塞の危険のある場合,あるいは心筋梗塞発生後短期間の場合にはESWLは禁忌とされつつある。更に,近年衝撃波が肺に昭射されると肺出血を生じる可能性も指摘されている。従って,実際の臨床で石灰化狭窄僧帽弁に衝撃波を集束させるには胸骨左様からのapproach以外にはないことになる。しかし,この方法では衝撃波の照射が丁度僧帽弁と平行になる為,その効果は極めて小さいと予想される。以上から,ESWLを用いた石灰化狭窄僧帽弁の交連切開には臨床的に大きな限界のあることが明らかにされた。
酸素ストレスによる臓器障害:特徴的膜脂質分解反応の解析と新規治療薬開発への模索

昨年までに、四塩化炭素で惹起したラット肝臓傷害モデルで、内在性のホスファチジルエタノールアミンの加水分解が比較的低濃度のカルシウム依存的に進むこと、この加水分解におそらく2型ホスホリパーゼA_2(PLA_2)が関わっていることを明らかにしてきた。本年度は、以下の検討を行った。(1)傷害肝臓のホモジネートから抽出した脂質画分に、2型PLA_2活性を上昇させる画分があることを見い出した。即ち、脂質画分を酵素反応液に添加して2型PLA_2のin vitroでの酵素活性に対する影響を調ベたところ、添加する脂質の量に依存して活性が約3倍まで上昇した。障害肝由来の脂質を添加した場合に観察されるPLA_2活性化反応では、酵素活性に必要なカルシウムイオン濃度の要求性が正常肝臓由来の脂質の場合に比ベて低下した。(2)傷害肝蔵由来の全脂質をシリカカラムで分画したところ、PLA_2活性を上昇させる作用を持つ画分がホスファチジルエタノールアミン近傍に見いだされた。正常肝臓由来の脂質を分画しても活性化作用は観察されなかった。傷害肝臓と正常肝臓との間で、脂質の分画パターンに大きな違いはみられず、傷害肝臓に含まれる比較的微量な脂質性分子が2型PLA_2の酵素活性を上昇させていると結論した。(3)我々は、2型PLA_2が肥満細胞の脱顆粒反応にも関わっていることを示唆しているが、活性化肥満細胞由来の脂質画分にも2型酵素を活性化させる因子が存在することがわかった。以上から、酵素ストレスにカップルした組織損傷の進行あるいは肥満細胞脱顆粒反応において2型PLA_2の酵素活性を促進させる脂質が生成し、活性調節すると結論した。(1)心筋虚血にともなって、異常な脂質代謝が進行することが古くから知られている。我々は、ラットの冠状動脈前下行支を結紮して誘導した虚血心筋部位のホモジェネ-トを、試験管内で37度でインキュベ-トすると、内在性のホスファチジルエタノ-ルアミンが特異的に加水分解されることを見いだした。正常心筋のホモジェネ-トでは、この反応は全く観察されなかった。生じるリゾPEの脂肪酸組成を調べることによって、本反応がホスホリパ-ゼA2の活性化によることを明らかにした。しかし、放射標識した基質を用いて、ホモジェネ-ト中の酵素活性を測定した場合には、有為な変動は観察されなかった。この内在性の基質のみを加水分解する活性は、比較的低濃度のカルシウムイオンを必要とすることがわかった。ホスホリパ-ゼA2の回定をすべく、各種阻害剤の効果を調べた。その結果、14kDaグル-プII型酵素の特異的抗体及び阻害剤が非常に効率よく本反応を阻害することがわかった。(2)四塩化炭素をラットに投与して誘導した肝障害モデルでも、同様の内在性ホスファチジルエタノルアミンの加水分解が亢進していた。この反応も、14kDaグル-プII型ホスホリパ-ゼA2特異的な阻害剤で抑制された。処理した肝臓からは対照に比べて、多量のホスホリパ-ゼA2が1MKClで可溶化されてきた。さらに、処理肝臓から抽出したリン脂質画分には、ホスホリパ-ゼA2活性を促進する因子が含まれていることが示唆された。(3)ラット14kDaグル-プII型ホスホリパ-ゼA2は、従来から知られている膵臓由来酵素と異なり、臨界ミセル濃度以下の濃度で存在する基質をも効率よく加水分解することを見いだした。さらに、非代謝性の基質アナログを共存させると、著しく活性化され、2分子構造を形成することがわかった。この特徴的活性化反応を、酸素ストレスにカップルしたリン脂質代謝と関連すべく解析している。

昨年の本研究で、酸素ストレスで誘発された障害臓器中では、哺乳動物14kDaグル-プII型ホスホリパ-ゼA2が活性化されていることを見いだした。II型酵素は炎症部位侵出液、血小板や肥満細胞の刺激上清から精製されてきた。本年度は14II型酵素の活性制御について以下の解析を行った。1)14kDaII型酵素の活性機構:精製ラットII型酵素が放射標識した大腸菌由来のホスファチジルエタノ-ルアミンを加水分解する反応に、基質アナログであるテトラデシルホスホコリンを添加したところ、添加量依存的に酵素活性が上昇した。アナログ添加の反応のカルシウム依存性は無添加に比べて低かった。膵臓由来の消化酵素である哺乳動物14kDaI型ホスホリパ-ゼA2を用いた解析では、同様な反応は観察されなかった。2)障害臓器のII型酵素活性化脂質:ラットに四塩化炭素で誘導した障害肝臓から脂質画分を抽出したところ、基質アナログの場合と同様なII型酵素活性化能が観察された。I型酵素には無効であった。シリカゲルカラムで分画したところ酵素活性促進脂質はホスファチジルエタノ-ルし近縁の画分に溶出した。臓器障害にともなう脂質過酸化反応の一環として、II型酵素活性化脂質が生産されたと予想している。3)血小板放出性II型酵素の生理的な意義:血小板活性化反応の進展にともなって形質膜一部がベシクルとして放出される。II型酵素特異的な阻害剤存在化に血小板を活性化すると、生じるベシクルの量が減少した。また、血小板から放出されたII型酵素がベシクルの膜脂質を著しく効率よく加水分解した。阻害剤存在下あるいは非存在下で生成したベシクルを用いて、血液凝固反応を進展させたところ、前者は後者に比ベ凝固促進活性が著しく強かった。この結果は、炎症進展部位でII型ホスホリパ-ゼA2が血液凝固反応の調節因子の一つとして機能することを示唆している。昨年までに、四塩化炭素で惹起したラット肝臓傷害モデルで、内在性のホスファチジルエタノールアミンの加水分解が比較的低濃度のカルシウム依存的に進むこと、この加水分解におそらくII型ホスホリパーゼA_2(PLA_2)が関わっていることを明らかにしてきた。本年度は、以下の検討を行った。(1)傷害肝臓のホモジネートから抽出した脂質画分に、II型PLA_2活性を上昇させる画分があることを見い出した。即ち、脂質画分を酵素反応液に添加してII型PLA_2のin vitroでの酵素活性に対する影響を調べたところ、添加する脂質の量に依存して活性が約3倍まで上昇した。障害肝由来の脂質を添加した場合に観察されるPLA_2活性化反応では、酵素活性に必要なカルシウムイオン濃度の要求性が正常肝臓由来の脂質の場合に比べて低下した。(2)傷害肝臓由来の全脂質をシリカカラムで分画したところ、PLA_2活性を上昇させる作用を持つ画分がホスファチジルエタノールアミン近傍に見いだされた。正常肝臓由来の脂質を分画しても活性化作用は観察されなかった。傷害肝臓と正常肝臓との間で脂質の分画パターンに大きな違いはみられず、傷害肝臓に含まれる比較的微量な脂質性分子がII型PLA_2の酵素活性を上昇させていると結論した。(3)我々は、II型PLA_2が肥満細胞の脱顆粒反応にも関わっていることを示唆しているが、活性化肥満細胞由来の脂質画分にもII型酵素を活性化させる因子が存在することがわかった。
内耳諸細胞の細胞内Ca^<2+>およびCl^-動態に関する研究

研究代表者らは従来、蝸牛内・外有毛細胞および前庭器有毛細胞を用い、高カリウム刺激などの条件下で細胞内遊離Ca^<2+>濃度(〔Ca^<2+>〕i)を測定し、音および平衡刺激・受容・伝導機構を明らかにしてきた。本研究では、対象細胞にラセン神経節細胞を加え、また細胞内遊離Cl^-濃度(〔Cl^-〕i)も測定することにより、以下の3点について重点的に研究された。1)蝸牛内・外有毛細胞および前庭器有毛細胞の〔Ca^<2+>〕iに及ぼす遠心性神経伝達物質の影響を観察した。その結果、AchやATPがこれらの3種類の細胞に対する、またGABAが前庭器有毛細胞に対する遠心性神経伝達物質であろうことが判明した。しかし、CGRPやEnkは神経修飾物質であろうことが推測された。2)蝸牛外有毛細胞に一定の交流刺激を加えると、刺激後30秒後に細胞は強く収縮し、その体積を減じ、3060秒間にこれが持続し、その後再び元の状態に戻ることが観察された。また、この細胞の収縮時に一致した〔Cl^-〕iの減少を認めた。このことから伸縮および体積の増減は水の細胞内外への出入によるものと考えられた。3)単離したラセン神経節細胞を用い、Glutamateによる〔Ca^<2+>〕iの変化を観察した。その結果Glutamate刺激でラセン神経細胞の〔Ca^<2+>〕iは著明に上昇した。このことは聴覚系の求心性神経伝達物質としてGlutamateが有力な候補であることを強く示唆した。1)モルモットの前庭器有毛細胞(VHC)を機械的および酵素的処理により単離し、遠心性神経伝達物質の同細胞内遊離Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)に及ぼす影響をFura-2を用いた画像解析により観察した。1mMAChを投与すると[Ca^<2+>]iは緩徐な上昇を示し、10μM ATPでは[Ca^<2+>]iは急激に上昇した。またGABAもATPと同様の急激な上昇を示し、したがってACh,ATP,GABAはモルモットのVHCにおいて遠心性の神経伝達物質と考えられた。一方CGRPやEnKを投与したところVHCの[Ca^<2+>]iには変化を認めず、したがってこれらは遠心性神経伝達物質ではなく一種の修飾物質でないかと考えられた。2)モルモットの蝸牛内有毛細胞(IHC)を単離し、遠心性神経伝達物質の同細胞[Ca^<2+>]iに及ぼす影響を観察した。結果はVHCにおいて観察されたものとほぼ同様であり、ACh,ATPは伝達物質,CGRP,EnKは修飾物質と思われた。ただATPによって生じる[Ca^<2+>]iの上昇は、AChの同時投与によって抑制されることがわかり、AChとATPはお互に拮抗作用を持つことが推測された。3)単離されたIHCを電気刺激したところ、IHCが収縮することを初めて明らかにした。細胞内遊離Cl^-濃度([Cl^-]i)をMQAEを用いた画像解析により観察したところ、IHCの収縮と同時に[Cl^-]iは著明に減少することが判明した。この結果より収縮に併って細胞内の水分が細胞外へ流出したと考えられた。サイトカラシンB投与下では収縮は生じなかったことから、このIHCの収縮にはアクチン・ミオシン系が関与していると思われた。1.蝸牛内有毛細胞(IHC)の遠心性抑制性機構を解明するため、種々の遠心性の神経伝達物質と考えられる物質を単離したIHCに投与し、その際の細胞内遊離カルシウムイオン濃度([CA^<2+>]_1)を測定した。

その結果Ach,ATPそれぞれの投与でIHCの[Ca^<2+>]_1は上昇し、両者ともIHCの遠心性神経伝達物質と考えられた。ただATPで上昇するIHCの[Ca^<2+>]_1は、Achの同時投与で抑制された。このことはAchがATPにより惹起されるCa^<2+>の細胞内流入機構に拮抗的に働いたものと思われた。一方CGRP,enkephalinの投与ではいずれも[Ca^<2+>]_1の上昇を認めず、これらは修飾物質にすぎないと考えられた。2.蝸牛ラセン神経節細胞を単離することに成功し、これを用いて:(1)高K^+液下における同細胞の[Ca^<2+>]_1上昇から、同細胞が電位依存性カルシウムチャンネルを持つことを証明した。(2)また蝸牛の音刺激伝達機構に於ける求心性の神経伝達物質を知るために、gultamateを同細胞に投与したところ、その[Ca^<2+>]_1は上昇した。このことはglutamateが求心性神経伝達物質であることを強く示唆した。
過熱水蒸気を用いたスプレーブレンド法による金属微粒子の合成

金属ナノ微粒子の新規液相連続合成法を提案する。エアーアシスト型スプレーノズルから金属塩溶液と還元剤溶液の二液の同時噴霧による分散・混合、および加熱に過熱水蒸気を用いたシステムの開発を試みる。銅及びニッケルナノ粒子をターゲットに、金属塩、分散安定剤、還元剤及び溶媒の種類や濃度などの調製条件および過熱水蒸気の流量と温度、圧力などの操作条件が生成ナノ粒子の形状やサイズに及ぼす影響を明らかにする。銅ナノ粒子およびニッケルナノ粒子の合成系を選び、反応系と温度場や速度場などの操作条件が生成ナノ粒子の性状や収量等に及ぼす影響について検討する。
多胎児を出産した母親の出産体験の価値づけと母親意識の形成・変容に関する研究

本研究は、多胎を出産した母親の出産体験の価値づけと母親意識の形成・変容の実態を明らかにし、育児ノイローゼ、乳幼児虐待を予防するための援助モデルを作成することを目的としている。調査1では、経膣分娩をした産後114日目の母親1130名(双胎20名)を対象に出産体験の価値づけと母親意識の関係について「出産体験の自己評価尺度」と「母親意識尺度」、「産後うつ尺度」から構成される質問紙調査を行った。調査期間は12年4月8月であった。その結果、出産体験の価値づけが低い場合には産褥早期の母親意識も消極的であることがわかった。調査2では、多胎を出産した母親18名(双胎14名、品胎4名)を対象に半構成的面接法により多胎を出産した母親の出産体験の自己評価と産褥早期の母親意識の関係を検討した。面接対象者の分娩様式は、経膣分娩3名、帝王切開15名であった。調査期間は、平成11年1月9月。面接内容はカセットテープレコーダーに録音し、その逐語録について内容分析を行った。その結果、出産体験の価値づけに影響を及ぼす要因として、妊娠期の健康管理、分娩方針に関するインフォームドコンセント、出産に対する満足感、新生児の健康状態、出産直後の児への接触、分娩時・分娩直後の産科医療スタッフの関わり、分娩時の夫のサポートがあげられた。また、出産体験の自己評価が否定的な場合は母親意識はが低く育児も消極的になる傾向があることがわかった。多胎児の母親の場合、異常分娩になるケースが多いため母親が出産体験を肯定的に価値づけられるような関わりが必要であるといえる。そこで、平成10年度11年度にかけて、多胎と診断されてから出産・早期産褥期にいたるまでの母親意識の形成・変容を追跡し、母親としての自覚を促進・阻害する因子を明らかにすること。また、多胎を出産した母親が出産体験をどう価値づけるかによって子どもに対する共感性に違いがあるかについて検討することを目的に、妊娠中期から産後1年間にかけて縦断的な半構成的面接調査を始めた。平成10年度は延20回の面接調査が行われた。調査の対象者は、G大学病院産科外来通院中で、多胎と診断されている妊婦12名(双胎妊婦10名、品胎妊婦2名)。不妊治療による多胎10名(品胎妊婦2名を含む)、自然多胎妊婦2名である。対象者の選定には、以下3つの条件を設けた。(1)調査に同意が得られる、(2)妊娠期から産後1年までの継続的な面接調査に協力が得られる、(3)面接内容をカセットテープレコーダーに録音すること、また、個人が特定されない方法で研究論文に掲載されることに協力が得られる。面接依頼時の対象者の妊娠週数は14週36週であった。今年度は12名の対象者に面接調査が実施され逐語録が作成された。妊娠中期の面接は6名に実施され、胎動を自覚しているかによって母親意識に違いがあることが示唆された。妊娠後期の面接は5名に実施され、切迫早産、TTTSなどのリスクがあって入院している場合、母親意識は児の成長に向けられていることがわかった。早産を含め、5名が分娩を終了し、その内4名が帝王切開であった。1名は、双胎のうち1児が死産であった。産褥早期の面接の結果、出産体験の価値づけができている場合は、母親意識の形成が促進されることが示唆された。

本研究は、多胎を出産した母親の出産体験の価値づけと母親意識の形成・変容の実態を明らかにし、育児ノイローゼ、乳幼児虐待を予防するための援助モデルを作成することを目的としている。そこで、平成11年度は、多胎児の母親への援助のあり方を検討するための資料を得る目的で、半構成的面接法により、多胎児を出産した母親の妊婦期から産後3ヶ月までの母親意識の形成・変容を縦断的に追跡した。調査の対象者は、G大学病院産科外来通院中で、多胎と診断されている妊婦18名(双胎妊婦14名、品胎妊婦4名)。初産婦14名、経産婦4名であった。ただし、研究参加の手続き中,または,研究参加同意後面接実施前に出産になってしまった3名は調査対象から除外した。今年度は15名の対象者に面接調査が実施され逐語録が作成された。面接によって得られた母親意識の内容は妊婦期は「母親としての自覚」と胎児への共感性」について、出産後34日後は出産体験の自己評価について、産後1ヶ月、34ヶ月、61年後に「母親としての自覚」と「胎児の共感性」について内容分析が行われた。多胎妊婦の母親意識は胎動を自覚するまでは超音波によって形成され、胎動自覚後は、子供たちの発育・健康状態に強い影響を受ける。分娩の日処がつくと具体的に多胎児の育児をイメージすることが多くなることがわかった。また、出産体験自己評価については、出産した子どもに異常がある場合は否定的に評価され、そのことは、「子どもへの共感性」に影響を及ぼす傾向が見られた。産後、「母親としての自覚」は親としての責任として表現されており、34ヶ月ごろから双子、三つ子の育児に工夫が見れるようになることが分かった。そこで、平成12年度は、多胎児の母親への援助のあり方を検討する目的で質問紙調査(調査1)と面接調査(調査2)を実施した。調査1では、経膣分娩をした産後114日目の母親1100名(双胎20名)を対象に出産体験の価値づけと母親意識の関係について「出産体験の自己評価尺度」と「母親意識尺度」、「産後うつ尺度」から構成される質問紙調査を行った。調査期間は12年4月8月であった。その結果、出産体験の価値づけが低い場合には産褥早期の母親意識も消極的であることがわかった。調査2では、多胎を出産した母親18名(双胎14名、品胎4名)を対象に半構成的面接法により多胎を出産した母親の出産体験の自己評価と産褥早期の母親意識の関係を検討した。面接対象者の分娩様式は、経膣分娩3名、帝王切開15名であった。調査期間は、平成11年1月9月。面接内容はカセットテープレコーダーに録音し、その逐語録について内容分析を行った。その結果、出産体験の価値づけに影響を及ぼす要因として、妊娠期の健康管理、分娩方針に関するインフォームドコンセント、出産に対する満足感、新生児の健康状態、出産直後の児への接触、分娩時・分娩直後の産科医療スタッフの関わり、分娩時の夫のサポートがあげられた。また、出産体験の自己評価が否定的な場合は母親意識はが低く育児も消極的になる傾向があることがわかった。多胎児の母親の場合、異常分娩になるケースが多いため母親が出産体験を肯定的に価値づけられるような関わりが必要であるといえる。
魚類病原体ゲノム情報を利用した網羅的エピトープマッピング

魚類においても病原体の排除には特異抗体が重要である。また、抗体が認識するタンパク質やポリペプチドは成分ワクチンとして利用できる可能性がある。本課題では、血清中の抗体が認識する抗原の網羅的な同定に資する技術の開発を目的として研究を行った。魚類病原体のマダイイリドウイルス(red sea bream iridovirus : RSIV)または冷水病原因菌Flavobacterium psychrophilumのゲノム全体を網羅したファージディスプレイライブラリーを作製し、それぞれの病原体で免疫した試験魚の血中抗体と反応するファージを親和性選択により濃縮した。次いで、濃縮したファージの塩基配列を次世代シーケンサーで決定し、その配列情報(リード)を各々の病原体のゲノム配列にマッピングした。これと同じ操作を健康魚の血中抗体でも行った。免疫した魚と健康魚の間でマッピングされたリード数を比較し、免疫した魚においてリードが多くマッピングされた遺伝子を抗原をコードした遺伝子と推定した。RSIVで免疫したブリ血清を用いた試験では、マッピングされたリード数が健康魚よりも2倍以上多くなった遺伝子が30種類程度見つかった。その中にはウイルス粒子を構成するタンパク質をコードした遺伝子が複数含まれていた。冷水病原因菌で免疫したアユの血清では、健康魚血清と比較してマッピングされたリード数が10倍以上多くなった遺伝子が700種類程度見つかった。その中には外膜タンパク質等の菌体表面に存在すると考えられる分子をコードした遺伝子が含まれていた。本研究で見つけた遺伝子は、感染防御に有効な成分だけを濃縮した成分ワクチンの開発のみならず、病原体のキャリアとなる感染耐過魚を高感度に検出するための手法の開発にも応用可能だと考えられる。病原体の感染によって誘導された抗体が認識する成分(エピトープ)を同定できれば、組換え技術を利用した成分ワクチンの開発を効率化することができる。本研究では、効率的かつ網羅的なエピトープ同定技術の開発を目指している。具体的には、断片化した病原体ゲノムDNAをランダムに挿入したファージディスプレイライブラリーを構築する。次いで、感染耐過魚などの抗体が結合するファージクローンをライブラリー中から選抜し、挿入されている病原体由来DNA断片の塩基配列を決定する。決定した配列を、病原体のゲノム配列情報と照合し、エピトープをコードした領域を決定する(エピトープマッピング)。平成28年度は、エピトープマッピングのための材料を準備するために以下の3つの実験を行った。実験1マダイイリドウイルスの培養上清からDNAを抽出しPCRを利用してゲノム全体を増幅した。冷水病菌は培養した菌体からゲノムDNAを抽出した。それぞれの病原体から調製したゲノムDNAを1001500bpになるよう超音波を利用して断片化した。このゲノムDNA断片の両末端に制限酵素認識サイトを含んだアダプターを付加し、T7ファージベクター(T7 select 10-3b DNA;ノバジェン社)に任意に挿入し、ファージディスプレイライブラリーを作製した。実験2マダイおよびアユの血清中からイムノグロブリンM (IgM)を精製し、これに対するモノクローナル抗体を常法で作製した。モノクローナル抗体は試験魚の血中抗体価を測定するために使用する。実験3それぞれの病原体でマダイまたはアユを攻撃したのち、感染耐過した複数の個体から血清を採取した。ここまでの研究成果を、平成29年9月にインドネシアで開催される10th Symposium on Diseases in Asian Aquaculture (DAA10)にて発表する予定である。実験1では、マダイイリドウイルスの培養上清からDNAを抽出しPCRを利用してゲノム全体を増幅した。また、培養した冷水病菌からゲノムDNAを抽出した。それぞれの病原体から調製したDNAを超音波を利用して断片化し、制限酵素のBamH I認識サイトを付加したアダプターをDNA断片の量末端に付加した。BamH Iで消化したT7ファージベクター(T7 select 10-3b DNA;ノバジェン社)にアダプターを付加したDNA断片を挿入し、ファージディスプレイライブラリーを構築した。作製したライブラリーのサイズは、マダイイリドウイルスに対するライブラリーで3.2百万クローン、冷水病菌に対するライブラリーで6.9百万クローンだった。実験2では、マダイおよびアユのIgMに対するモノクローナル抗体を準備することができた。さらに、ペルオキシダーゼで標識するためにプロテインAビーズを利用して濃縮と精製を行った。実験3マダイイリドウイルスでマダイを攻撃し、生残した個体から血清のサンプリングを行った。一方、冷水病については、ホルマリンで不活化した原因菌を4週間間隔でアユに2回接種したのち血清を採取した。次年度は、血清中の抗体と反応するファージクローンの選抜を行う計画であるが、そのために必要な材料を今年度中にすべて準備することができたため、おおおむね順調に進展していると判断した。病原体の感染に耐過した魚の抗体が認識する成分(エピトープ)を同定できれば、組換え技術を利用した成分ワクチンの開発を効率化することができる。本研究では、効率的かつ網羅的なエピトープ同定技術の開発を目指す。具体的には、魚類病原体のゲノムDNA断片を無作為に挿入したファージディスプレイライブラリーを構築する。次いで、感染耐過魚などの抗体が結合するファージクローンを選抜し、挿入されている病原体由来DNA断片の塩基配列を決定する。決定した配列を病原体のゲノム配列情報に照合し、エピトープを推定する。