hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄幹細胞を用いた蝸牛細胞の再生の検討

加齢とともに急速な感音難聴と蝸牛組織の萎縮を伴う難聴モデルマウス2種(MRL/1pとSAMP1)を用いて、蝸牛細胞維持・再生機能と骨髄免疫系機能との関連性を検討した。対比する正常マウスとして、BALB/cやC57BL/6、また、C57BL/6に緑色蛍光を発する蛋白(green fluorescence protein;GFP)のDNAが導入されたトランスジェニックマウスであるGFPを用いた。骨髄移植法として、一般的な経静脈的骨髄細胞接種を行ったが、骨髄内骨髄移植法が移植後の免疫機能を移植前の機能と同程度にまで回復させうることを明らかにできたので、この方法も用いた。1.いずれの難聴モデルマウスにおいても、難聴や蝸牛細胞萎縮の原因は蝸牛側にあるのではなく、骨髄(幹)細胞から分化した免疫担当細胞側にあると考えられた。すなわち、これらのマウスに正常マウスの骨髄を移植すると、本来発症すべき難聴とこれに伴う血管条萎縮(MRL/1pr)、あるいは螺旋神経節萎縮(SAMP1)は、予防・治療された。また、正常マウスにこれらのマウスの骨髄(幹)細胞を移植すると、正常マウスに同様の難聴と蝸牛病変が生じた。したがって、骨髄移植が難聴の治療として有効であると考えられる。2.難聴モデルにおける蝸牛細胞萎縮の発現消失機序を検討したところ、移植された骨髄幹細胞が蝸牛局所に至ってこの部の再生を司るのでなく、骨髄幹細胞から分化した免疫担当細胞の分泌した液性因子が、内耳血液関門を通して蝸牛細胞の維持に関与することが明らかとなった。加齢に伴いTh cell機能障害が認められ、さらに、難聴モデルマウスの免疫力を低下させると、難聴の進行する現象が認められた。以上より、全身免疫機構、特にTh cellが液性因子を介して蝸牛機構に作用していることが明らかとなった。液性因子の同定やこの因子の投与、Th cell機能の活性化が、蝸牛細胞維持、聴覚維持に有効であり、難聴の予防法・治療法に結びつくものと考えられる。1.螺旋神経節細胞の早期萎縮により早期老人性難聴が生じるSAMP1マウスに対し、蝸牛障害発症前にGFPマウスからの骨髄を移植した。GFPマウスとは、C57BL/6マウスにGFP (green fluorescence protein)遺伝子を導入され、骨髄細胞を含む自己の細胞すべてが蛍光を発するトランスジェニックマウスである。結果を見ると、骨髄移植後5ヶ月で無処置SAMP1マウスに比し、難聴の進行が有意に予防できた。今後、側頭骨の病理組織学的、免疫組織化学的検討を行い、移植された細胞が蝸牛に到達し局所で生存し、蝸牛細胞に変化して蝸牛を再生するか、もしくは免疫担当細胞に分化してこの部の蝸牛細胞の維持・再生に関与するかにつき検討する。2.過大音響負荷で聴覚正常マウスに中等度以上の感音難聴を発生させる方法を確立した。また、このマウスにGFPマウスからの骨髄を移植した。音響負荷翌日に放射線照射と骨髄移植が行われた群では、ストレスが短期間に集中するためかマウスがすべて死亡した。音響負荷2週後に照射と移植がされたマウスではすべて生存したが、移植3ヵ月後のABRで聴力の改善は明確でなかった。

今後、前項と同様の局所観察を行うとともに、音響負荷後のいつ骨髄移植を行えば聴力改善に有効かを検討する。3.SAMP1マウスを2群に分け、免疫機能の疲弊・低下するとされるコンベンショナル(感染に無防備)な環境と、そうでないSPF (specific pathogen-free)の環境とで飼育した。すると、前群のマウスでは後群に比し免疫力の低下と難聴の進行が著明であった。したがって、SAMP1マウスの示す早期老人性難聴の発生・進行機構には、蝸牛に対する全身免疫機構、とくに骨髄・免疫担当細胞の作用が大きいと考えられ、これらの細胞が、SAMP1マウスで特異的に損傷される螺旋神経節細胞の維持や再生に関与していることが考えられた。骨髄幹細胞を含む骨髄細胞の移植(骨髄移植)を用いて、以下のことを行った。1.螺旋神経節細胞の早期萎縮により早期老人性難聴が生じるSAMP1マウスをホストとして用いた。このマウスの蝸牛障害発症前において、放射線照射により免疫担当細胞を除去したのち骨髄移植を行った。この際、骨髄ドナーには老人性難聴の発症の遅いマウスを用いた。骨髄移植効果を検討したところ、移植されたドナー細胞は、ホスト内でホストの免疫担当細胞と置き換わり、かつ難聴発症は予防されることが明らかとなった。したがって、骨髄細胞が早期老人性難聴発症を阻止すると考えられ、早期老人性難聴の原因は蝸牛側にあるのでなく骨髄(幹)細胞側に存在し、これが蝸牛における機能維持に働くことが明らかになった。2.蝸牛障害マウスを作製し、障害部位の再生を検討する目的で、聴力正常マウス(BALB/c)にシスプラチン(CDDP)を投与し、螺旋神経節細胞を傷害させ難聴を発症させる方法を確立した。今後この蝸牛障害マウスを用い、シスプラチン投与前後に骨髄移植を行ってドナー骨髄細胞による螺旋神経再生と難聴の予防・治療効果を観察する。3.自己免疫性感音難聴のモデルマウスであるMRL/1prマウスにおいて、この骨髄を聴力正常マウスに移植すると、MRL/1prマウスと同様の蝸牛病変および難聴が生じることを明らかにした。この難聴マウスでは血管条の細胞萎縮が生じる。したがって、細胞萎縮の原因が蝸牛側にあるのではなく骨髄側にあることが示唆された。今後、聴力正常ドナーからの骨髄を用いた骨髄移植により、蝸牛萎縮の修復や再生による難聴の治療の可能があると考えられた。1.螺旋神経節細胞の早期萎縮により早期老人性難聴が生じるSAMP1マウスにおいて、このマウスの骨髄を正常マウスに移植するとこの正常マウスに早期老人性難聴が起こり、正常マウスの骨髄をこのマウスに移植すると難聴が起こらないことを証明した。蝸牛局所を見ると、ドナーの抗原を表出する細胞は認められず、したがって、(1)この難聴の原因は蝸牛細胞にあるのではなく骨髄・免疫担当細胞側にあると考えられた。(2)難聴発症機序として、ドナー細胞(骨髄(幹)細胞)が蝸牛に直接到達して螺旋神経節細胞のアポトーシスや維持・再生に関わるのではなく、ドナーの骨髄幹細胞から再構築された全身免疫機構の液性因子が内耳血液関門を通して蝸牛に関与することが示唆された(Inaba, Iwai, etal.International Conference Series,2件投稿中,2件発表予定(世界耳鼻咽喉科Rome,2005))。2.自己免疫性感音
磁気対相関関数を用いた局所磁気構造解析法の開発

本研究課題で開発を行っている磁気対相関関数(磁気PDF)を用いた局所磁気構造解析手法を、短距離磁気秩序をもつ物質に実際に適用してその短距離磁気配列を調べている。最終年度では反強磁性磁気転移温度以下の中間温度域において反強磁性長距離秩序によるブラッグ散乱と短距離磁気秩序による磁気散漫散乱が同時に観測されている金属磁性体を取り上げた。最低温では反強磁性長距離磁気構造で説明できる磁気PDFが得られたが、転移温度直上ではそれとはパターンの異なる磁気PDFが観測された。さらに転移温度直下の中間温度域においてはそれら2種類のパターンが足しあわされたような磁気PDFが得られた。この結果は転移温度以上では反強磁性長距離秩序とは異なる磁気配列をもつ短距離磁気秩序が存在していること、中間温度域では反強磁性長距離秩序およびそれとは異なる磁気配列をもつ短距離磁気秩序が共存していることを示唆するものである。研究期間全体を通じて実施した研究によって、様々な磁気配列に対して磁気PDFをシミュレートする方程式の定式化を行い、さらに中性子散乱データからの磁気PDFの定量的な導出方法を決定した。単純な磁気構造を持つ磁性体を標準試料として磁気PDFのシミュレーションおよび実験的導出を行い、上記方程式および磁気PDF導出方法の妥当性を確認した。またスピングラス物質や最終年度で取り上げた金属磁性体のような短距離磁気秩序をもつ磁性体に対してこの手法を適用することによって、それらの系に存在する短距離磁気配列の特徴的なふるまいを観測できている。これらの研究によって磁気PDFを用いた局所磁気構造解析手法がほぼ確立され、短距離磁気秩序をもつ磁性体の短距離磁気配列を調べることが可能になったと考えている。磁気対相関関数(磁気PDF)を用いた局所磁気構造解析を可能にするために、(1)様々な磁気配列に対して磁気PDFをシミュレートする方程式の定式化を行い、さらに(2)中性子磁気散乱強度からの磁気PDFの定量的な導出方法を決定した。さらに標準試料を用いた中性子散乱データから(2)の方法で導出した磁気PDFが(1)の方程式で計算されるものと定量的にほぼ一致することを示した。磁気配列に対する磁気PDFのシミュレーション式はコロンビア大グループによって既に提案されていた。しかしそのシミュレーション式は数密度に比例し距離rに対して線形の負のベースライン項を含んでおらず、さらに局在スピン系だけを想定したものであった。そこで我々はこれらの問題を解決するシミュレーション式を提案した。また磁気PDFを中性子磁気散乱強度データから定量的に導出するために、各種補正を施して強度の絶対値化および規格化を行い構造関数S(Q)を導出し、さらにS(Q)をフーリエ変換して磁気PDFを導出する方法を定式化し、さらに実験データから磁気PDFを導出するマクロを作成した。さらに単純な磁気構造をもつ強磁性体MnSbおよび反強磁性体MnF2を標準試料として中性子散乱実験を行い、上記の方法で中性子散乱強度データから磁気PDFを導出した。得られた磁気PDFはそれぞれの磁気構造から上で述べた式を用いてシミュレートされる磁気PDFと定量的にほぼ一致することがわかり、上記の磁気PDFのシミュレーション式および磁気PDFの定量的な導出方法の妥当性を確認することができた。上で述べたように磁気配列から磁気PDFをシミュレートする方程式、および中性子磁気散乱強度からの磁気PDFの定量的な導出方法を決定することができ、さらに標準試料を用いたパルス中性子散乱実験によりそれらが妥当であることを確認することができた。これらによってパルス中性子散乱データを用いた磁気PDF解析の一連の流れをおおむね確立することができたと考えている。磁気対相関関数(磁気PDF)を用いた局所構造解析の適用例としてスピングラスを示すMn0.5Fe0.5TiO3の局所磁気構造を調べた。その結果スピングラス状態において短距離磁気相関しかもたないこと、2つの異なる磁気構造が競合していることを反映した磁気PDFが得られた。磁気PDF解析が特に短距離磁気相関しかもたない磁性体の磁気構造を調べる上で有効であることを示す目的で、約20 K以下でスピングラスを示すイルメナイト化合物Mn1-xFexTiO3をその適用例として取りあげた。先行研究からは、この系はx=0(MnTiO3)およびx=1(FeTiO3)では反強磁性長距離秩序を示しそれぞれ異なる磁気構造をもつが、x=0.5付近では2つの磁気構造の競合により長距離秩序をもつことができず、スピングラスを示すと考えられている。Mn0.5Fe0.5TiO3の粉末試料を固相反応を用いて合成し、J-PARCに設置されている高強度全散乱装置NOVAにおいて中性子回折実験を行った。得られた中性子回折強度から磁気散乱成分を抽出し磁気PDFを導出した。スピングラス状態における磁気PDFをみると、磁気対相関ピークの強度が距離とともに急激に減少しており、このことはスピングラス状態においては短距離の磁気相関しかもたないをあらわしている。また得られた磁気PDFはMnTiO3およびFeTiO3の磁気構造から期待される磁気PDFの線形結合でよく再現できることがわかり、先行研究で指摘されている2つの磁気構造の競合と一致する結果が得られた。平成28年度に磁気PDF解析手法の一連の流れをほぼ確立することができている。さらに平成29年度はこの手法をスピングラス物質Mn0.5Fe0.5TiO3に適用することによって、スピングラス状態における短距離磁気相関を観測し、さらに局所磁気構造を調べて2つの磁気構造が競合していることを確認することができた。これによってこの手法が短距離磁気相関しかもたない磁性体の局所磁気構造を調べる上で有効であることを確認できたと考えている。

本研究課題で開発を行っている磁気対相関関数(磁気PDF)を用いた局所磁気構造解析手法を、短距離磁気秩序をもつ物質に実際に適用してその短距離磁気配列を調べている。最終年度では反強磁性磁気転移温度以下の中間温度域において反強磁性長距離秩序によるブラッグ散乱と短距離磁気秩序による磁気散漫散乱が同時に観測されている金属磁性体を取り上げた。最低温では反強磁性長距離磁気構造で説明できる磁気PDFが得られたが、転移温度直上ではそれとはパターンの異なる磁気PDFが観測された。さらに転移温度直下の中間温度域においてはそれら2種類のパターンが足しあわされたような磁気PDFが得られた。この結果は転移温度以上では反強磁性長距離秩序とは異なる磁気配列をもつ短距離磁気秩序が存在していること、中間温度域では反強磁性長距離秩序およびそれとは異なる磁気配列をもつ短距離磁気秩序が共存していることを示唆するものである。研究期間全体を通じて実施した研究によって、様々な磁気配列に対して磁気PDFをシミュレートする方程式の定式化を行い、さらに中性子散乱データからの磁気PDFの定量的な導出方法を決定した。単純な磁気構造を持つ磁性体を標準試料として磁気PDFのシミュレーションおよび実験的導出を行い、上記方程式および磁気PDF導出方法の妥当性を確認した。またスピングラス物質や最終年度で取り上げた金属磁性体のような短距離磁気秩序をもつ磁性体に対してこの手法を適用することによって、それらの系に存在する短距離磁気配列の特徴的なふるまいを観測できている。これらの研究によって磁気PDFを用いた局所磁気構造解析手法がほぼ確立され、短距離磁気秩序をもつ磁性体の短距離磁気配列を調べることが可能になったと考えている。上記のようにパルス中性子を用いた磁気PDF解析の一連の流れはほぼできたので、今後はこの磁気PDF解析法が威力を発揮すると期待される磁気配列が短距離秩序しかもたない物質系の磁気構造解析に適用し、この解析手法の有効性を確認する。まずは異なる磁気配列の競合によって長距離秩序を持つことができずスピングラス状態が実現していると考えられる混晶イルメナイト化合物や関連物質をとりあげ、磁気PDF解析を用いてその短距離磁気配列を調べる。またこれらの系の研究を通じて磁気PDF解析手法の確立を進めていく。さらに磁気PDF解析法を用いて短距離磁気相関をもつ磁性体の局所磁気構造解析を行っていく。今年度は低温で反強磁性長距離秩序によるブラッグ散乱と大きな散漫散乱が同時に観測されている金属磁性体を取り上げ、粉末試料についてJ-PARCに設置されている高強度全散乱装置NOVAを用いて中性子回折実験を行う。得られた回折強度データから磁気PDFを導出して局所磁気構造を調べることにより、反強磁性長距離秩序と短距離秩序が共存する理由を明らかにする。このような研究例を増やしていくことにより、磁気PDFを用いた局所磁気構造解析の有効性をアピールしていく。
超分子リビング重合に基づく革新的超分子ポリマーの開発とその応用

超分子ポリマーの精密重合ならびに、高靱性・自己修復能を有したエラストマー開発を行った。コランニュレンというお椀状π共役分子に導入したアミド基が形成する分子内水素結合と、それを利用したコランニュレンの光学分割に関して研究を行った。通常π共役分子に対称にアミド基を導入すると、分子間で水素結合を形成し、超分子ポリマーが形成される。コランニュレンのお椀構を利用することで、適切な条件下では分子内水素結合を速度論的に優先できることを実証し、非極性溶媒中でも単量体として単離できることがわかった。また側鎖に不斉点を導入することで、コランニュレンのキラリティーを偏らせられることを見いだした。さらにコランニュレンをモノマーとして、新たに開発した開始剤を組み合わせることで、連鎖重合型超分子重合を実現した。また不斉炭素を導入した開始剤を用いることで、得られるポリマー内でコランニュレンのキラリティーを100%選択できることを示し、立体選択的超分子重合を実現させた。加えて、水素結合型超分子ポリマーを利用し、高靭性と自己修復能を両立したエラストマーを開発した。強度の異なる二種類の水素結合を共存させることで、弱い方の水素結合が犠牲結合として働き、高靱性を実現できることがわかった。絶縁性の高いポリジメチルシロキサンをベースに設計することで、フレキシブルエレクトロニクスへ応用が期待できる。結論として、分子設計戦略を工夫することで超分子重合・超分子ポリマーの可能性を拡張させることに成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。コラニュレンからなるお椀状分子を用いることで、側鎖のアミド基に速度論的に分子内水素結合を形成させ、自発的な超分子重合を抑制することに成功した。そこに、適切にデザインした開始剤を加える事で、世界ではじめて超分子連鎖重合の実現に成功した。加えて、この超分子重合を工夫することで、開始剤の不斉情報をモノマーに転写することに成功した。さらに超分子ポリマーの特性をいかし、この不斉情報をより多くのモノマーに転写し、言い換えれば不斉情報を増幅する系の開発に取り組んだ。当初計画していた以上の研究成果を出し、研究成果がハイインパクトジャーナルに受理された。毎日真摯に研究に取り組み、現在複数の論文への投稿を準備している。また研究室のミーティングでは積極的に発言をし、リーダーシップをしっかりと示している。後輩の学生の面倒もよくみ、まさにお手本のような学生であるという評価を担当教員の方からいただいている。この研究は偶発的に発見した結果ではなく、いかに合理的にデザインするかに主眼が置かれ、その結果得られた分子であるため。

絶縁性の高いポリジメチルシロキサンをベースに設計することで、フレキシブルエレクトロニクスへ応用が期待できる。結論として、分子設計戦略を工夫することで超分子重合・超分子ポリマーの可能性を拡張させることに成功した。現在、1つ当たりの開始剤の情報が1017のモノマーの不斉情報に増幅される系の開発に成功している。この系をさらに発展させ、近いうちに論文に投稿する準備を進めている。得られた分子設計指針は他の材料設計にも貢献が期待され、今後の材料科学の発展に大きく寄与することが見込まれるため。29年度が最終年度であるため、記入しない。
高配位有機テルル化合物の構造と反応特性

1、ビス(2,2′-ビフェニリレン)ジクロロパーテルランの合成とその構造ビス(2,2′-ビフェニリレン)テルラン(1)とスルフリルクロリドとを低温下、THF中にて反応させたところ、黄色の結晶としてビス(2,2′-ビフェニリレン)ジクロロパーテルラン(2)を51%の収率で得ることに成功した。この化合物は各種NMR、質量および元素分析により同定することができた。結晶構造について詳細に検討するためX線結晶構造解析を行ったところ、テルル原子に対して、6配位、八面体型となっており、塩素原子の配置はトランス体のものは得られず、シス体のみであることが明らかとなった。またこの化合物はΛ,Δ-体の2種類の異性体の存在が考えられるが、結晶のパッキング等からこの化合物はラセミ体であることもわかった。2、ビス(2,2′-ビフェニリレン)テルランオキシドダイマーの合成とその構造テルラン1を低温下、CH_2Cl_2中にてオゾンと反応させたところ、無色の結晶としてビス(2,2′-ビフェニリレン)テルランの酸化体(3)を得ることに成功した。得られた化合物について各種NMRの測定を行ったところ化合物2と非常によく似たパターンのシグナルが得られたことから、この化合物は2量体として存在しており、それぞれ中心原子のテルルは6配位型の配置をとっていることが予想された。またFABMSにより2量体分の分子の質量ピークの検出にも成功した。そこでこの化合物についても詳細な構造を調べるためX線結晶構造解析を行った。その結果、予想どうり酸素で架橋されたテルランオキシド2量体であることが明らかとなった。それぞれのテルル原子は6配位、8面体構造を有し、4つのビフェニリレン基はパーテルラン2と非常によく似た配置をとっていた。また化合物3はΔΔ、ΛΛ、ΔΛの3つの異性体を取り得るが、NMR、X線構造解析から、ΔΔまたはΛΛの構造のみが得られることが明らかとなった。
有機薄膜トランジスタを用いた非標識バイオイメージング技術の開発

バイオイメージング技術は、細胞や生体分子の機能を明らかにするのに必須の基盤技術である。生体物質は可視光に対して透明なため、蛍光標識を行ったうえで蛍光顕微鏡を用いて観察するのが最も一般的であるが、標識による生体物質の機能損失やスループット低下が大きな問題となっている。本提案では、有機薄膜トランジスタを用いた新原理の非標識バイオイメージング技術の実証研究に取り組む。
歯髄・歯根膜細胞における炎症性サイトカイトン発現に対する転写因子NF-kBの動態

歯髄・歯根膜細胞における炎症性サイトカイン発現に対する転写因子MF-kBの動態を調べるために,以下の実験を行なった。1.ヒト歯髄および歯根膜細胞の培養矯正学的理由で抜歯した小臼歯より無菌的に歯髄および歯根膜を摘出し,組織片を10%α-MEM倍地にて増殖させる.実験には継代数510代までを用いる.コンフルエントに達した細胞を,P.intermediaのLPSや各種インヒビターを含む倍地に交換して培養し,以下の実験を行なう.2.ゲルシフト法による転写因子NF-kB活性化の測定培養細胞の核蛋白をDignamらの方法で抽出し,ゲルシフト法によりNF-kBの活性化を調べる。以上の実験から,次のような結果が得られた.根尖性歯周炎の病態の修飾には多くのサイトカインが関与していると考えられているが、抗生剤のうちのエリスロマイシンが炎症性サイトカインの発現を調節しうる可能性が示唆された.今後,抗生剤によるサイトカイン発現調節メカニズムについてさらに検討を加えていきたいと考えている。
老化における神経組織の細胞接着蛋白の機能解析

神経組織には特徴的な細胞接着蛋白質群が存在し、それらは神経系の組織構築における諸過程に重要な役割を果すとともに老化、再生にも関与する可能性が示されている。本研究では細胞接着蛋白質L1とその関連蛋白群の構造と機能の解析を行ない、老化におけるこれらの分子群の量的、構造的、機能的変化を検討し、機能回復に関する病態生理学的研究を行なうことを目的とする。平成4年度における成果は次のようである。1.ラットL1cDNAを培養細胞へ導入し、発現する系を確立し、細胞膜表面に発現したL1の機能解析を行なった。L1発現細胞は非発現細胞に比較して、有意の細胞接着性を示し、細胞塊を形成し、その接着様式は同種細胞同士のホモフィリックなものであった。L1発現細胞は神経細胞と強い接着作用を示し、神経細胞の突起伸展を強く促進し、成長円錐の発達を促し、神経細胞の遊離移動を促進した。2.老化のモデルとして約19カ月長期培養したアストロサイトについて、約1カ月短期培養したものと比較検討した。ラット胎生20日目の大脳皮質より分離し長期培養した細胞はグリア線維性酸性蛋白質抗体等との反応性より、アストロサイトの特徴を保持していることが確認された。この長期培養細胞は正常アストロサイトと比較してNCAMの発現の著明な減少およびラミニンの発現の明瞭な増大が見出され、神経細胞と共培養した場合、アストロサイトと神経細胞との相互接着の明瞭な減少が観察された。老化したアストロサイトではNCAMの発現量が減少し、神経細胞との接着性も減少し、アストロサイトと神経細胞間の相互接着が変化する可能性が示唆された。
ヒトおよびブタ顎関節におけるプロテオグリカンの生化学的分析

顎関節諸組織の主要構成非コラーゲン性糖タンパクであるプロテオグリカンをブタ関節円板、円板後部組織、下顎頭線維層および腱組織を用いて生化学的(タンパクレベル)に比較した。まず各組織を部分精製し、プロテオグリカンのコアタンパクを消化後セルロースアセテート膜電気泳動を行い、糖鎖であるグリコサミノグリカンについて検索した。次にグリコサミノグリカンを消化後コアタンパクについてウエスタンブロット法で検索した。その結果各組織はアグリカン、デコリン、ビグリカンと類似したプロテオグリカンを含んでいた。次にヒトの顎関節開放手術により摘出された関節円板およびブタ下顎頭線維層よりTotal RNAを抽出し、逆転写酵素を使用してcDNAを作製した。そして前年度の研究でその存在が推測されたアグリカン、デコリン、ビグリカンのプライマーを作製した。その各プライマーとcDNAを利用して、RT-PCR法を行った。出来上がったPCR産物を4.5%ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色した。またブタのPCR産物に関してはダイレクトシークエンス法にてその塩基配列を検索し、以前報告されている各プロテオグリカンの塩基配列とのホモロジーを比較した。その結果ブタ下顎頭線維層のPCR産物は以前報告されたプロテオグリカンの塩基配列と高いホモロジーを示した。このことより今回検索したヒト、ブタのPCR産物はプロテオグリカンであるアグリカン、デコリン、ビグリカンであると考えられた。また、ヒト顎関節関節円板はアグリカン、デコリン、ビグリカンのmRNAを全て発現しており、ブタ顎関節下顎頭線維層もまたプロテオグリカンであるアグリカン、デコリン、ビグリカンのmRNAを全て発現していた。顎関節各組織の主要構成非コラーゲン性タンパクであるプロテオグリカンをブタ関節円板、円板後部組織、下顎頭線維層および腱組織を用いて生化学的に比較検討した。プロテオグリカンは各組織より4Mグアニジンを用いて抽出し、イオン交換クロマトグラフィーにて部分精製した。部分精製したプロテオグリカンはプロナーゼEを用いてコアタンパクを消化し、グリコサミノグリカンをセルロースアセテート膜電気泳動を用いて検索した。次に、コンドロイチナーゼABCあるいはAC IIを用いてグリコサミノグリカンを消化し、残ったコアタンパクをウエスタンブロット法によって検索した。以下にその結果を示す。1.関節円板にふくまれるグリコサミノグリカンは、デルマタン硫酸が主成分で91.4%、コンドロイチン硫酸が5.8%、ヒアルロン酸が2.8%であった。円板後部組織に含まれるグリコサミノグリカンもデルマタン硫酸が主成分で89.5%、コンドロイチン硫酸が10.5%であった。下顎線維層ではヒアルロン酸が主成分で61.6%、デルマタン硫酸が32.6%、コンドロイチン硫酸が5.8%であった。またデルマタン硫酸/コンドロイチン硫酸値の比較では関節円板では15.7、円板後部組織は8.5と関節円板の半分の値で、腱組織(9.3)とほぼ同じであった。下顎頭線維層では5.6とさらに小さい値を示した。またプロテオグリカンは関節円板、円板後部組織および下顎頭線維層ともに高分子型プロテオグリカンと2種類の低分子型プロテオグリカンを認めた。2.モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法より、高分子型プロテオグリカンはアグリカンと類似していた。また低分子型プロテオグリカンはデコリン、およびビグリカンと類似するものであった。顎関節諸組織の主要構成非コラーゲン性糖タンパクであるプロテオグリカンの遺伝子発現(mRAN)について比較検討した。

ヒトの顎関節開放手術により摘出された検体(関節円板)およびその咀嚼様式がヒトと類似しているブタ顎関節組織(下顎頭線維層)よりTotal RNAを抽出し、逆転写酵素を使用してcDNAを作製した。次に前年度の研究(ブタ顎関節関節円板、円板後部組織、下顎頭線維層よりタンパクを精製し、生化学的研究を行った)でその存在が推測されたプロテオグリカンであるアグリカン、デコリン、ビグリカンのプライマーを作製した。そして各プライマーとcDNAを利用して、RT-PCR法を行った。出来上がったPCR産物を4.5%ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色した。またブタのPCR産物に関してはダイレクトシークエンス法にてその塩基配列を検索し、以前報告されている各プロテオグリカンの塩基配列とのホモロジーを比較した。以下にその結果を示す。1.ブタ下顎頭線維層のPCR産物は以前報告されたプロテオグリカンの塩基配列と高いホモロジーを示した。このことより今回検索したヒト、ブタのPCR産物はプロテオグリカンであるアグリカン、デコリン、ビグリカンであると考えられた。2.ヒト顎関節関節円板はプロテオグリカンであるアグリカン、デコリン、ビグリカンのmRNAを全て発現しており、特にデコリン、ビグリカンのmRNAが強く発現していた。このことよりヒト関節円板は腱組織に類似した組織であることが推測された。3.ブタ顎関節下顎頭線維層もまたプロテオグリカンであるアグリカン、デコリン、ビグリカンのmRNAを全て発現していた。しかしこの組織はアグリカンを強く発現しており、軟骨組織に近い組織であることが推測された。
動的ならせん構造を有する新規誘導適合型不斉触媒及び機能性分子の開発

1.BiBINOLを用いた新規誘導適合型不斉触媒の開発に関して,BiBINOL誘導体を各種合成して不斉反応の検討を行った.その結果,カルシウムイソプロポキシドと(R,R)-BiBINOLの錯体が,カルコン誘導体とニトロメタン及びマロン酸ジエステルの不斉マイケル付加反応を効果的に触媒することを見出し,最高で99%収率,>99%eeを達成した.また,3位の炭素上に求核性を有するピリジン置換基を導入したBiBINOL誘導体をメチルビニルケトンと芳香族アルデヒドとの不斉Baylis-Hillman反応に適用したところ,現在までに72%収率,60%eeで生成物を得ることに成功している.2.BINOLオリゴマーの動的らせん構造を利用した機能性分子の開発に関して,主に以下の2点に関して研究を行った.(1)センシングの検出に有効なフルオロフォアであるピレン基をBINOLオリゴマーの3位に導入した誘導体を単量体から四量体まで各種合成し,それらのスペクトル解析を行った.特に,ピレニルメチル基を導入したBINOL三量体においてピレン基同士の特徴的な分子内エキシマー発光が強く観測され,それは半経験的分子軌道法計算による予想構造とも一致した.(2)BINOL三量体の単結晶は極めて興味深い構造を有しているが,その構造が空気中で不安定なため各種分析が極めて困難であった.そこで,CH-πやπ-π相互作用による安定化が期待される誘導体として,6位の炭素上にフェニル基を有するBINOL三量体の合成を行った.既知の方法を改良することでBINOLから6段階,通し収率41%で合成を達成し,現在再結晶条件を検討中である.光学活性なビナフトールをその3位で直接連結させたオリゴマーについて、18量体の各種スペクトル測定を行った。UV/visスペクトルでは各オリゴマーのモル吸光係数とオリゴマーの量数との関係をプロットしたところ5量体以降で明確な変化が見られ、またCDスペクトルでも5量体以降で260nm付近に分裂型のコットン効果が新たに観測された。定性的ではあるが、これらの実験結果はビナフトールオリゴマーが少なくとも5量体以上においてらせん状の構造をとっていることを示唆するものである。また上記の動的構造に関する知見に加えて、X線単結晶構造解析を用いることによりビナフトール3量体の静的な構造に関する知見を得ることにも成功した。3量体の単結晶はジクロロメタン/ペンタン混合溶媒より得られ、再結晶溶媒に水を用いていないにも関わらず、非対称単位は2分子のビナフトール3量体と複数の水分子によって構成されていた。ビナフトール3量体は分子内の2つの動的不斉軸がS配置に固定されヒドロキシル基が内側を向いた半円型の構造となっており、これが交互に重なる形で自己組織化されることにより全体としてキラルなチューブ状構造を形成することが分かった。そして、チューブの親水性内孔には水分子が枝分かれの無い一本鎖として包摂され、それらはすべて右巻きのらせん構造をとっていた。このような水分子の配列は生体内でのプロトン移動のモデルとなり得るため極めて重要であるが、本結晶は空気中で即座に風解してしまうという問題があったため、より安定な結晶を得るためにビナフトール3量体の各種誘導体の合成を行い、それらの結晶化を現在検討中である。またビナフトール2量体を用いて、動的不斉軸を有する新規なブレンステッド酸-ルイス塩基二機能性不斉触媒を開発中である。1.BiBINOLを用いた新規誘導適合型不斉触媒の開発に関して,BiBINOL誘導体を各種合成して不斉反応の検討を行った.その結果,カルシウムイソプロポキシドと(R,R)-BiBINOLの錯体が,カルコン誘導体とニトロメタン及びマロン酸ジエステルの不斉マイケル付加反応を効果的に触媒することを見出し,最高で99%収率,>99%eeを達成した.また,3位の炭素上に求核性を有するピリジン置換基を導入したBiBINOL誘導体をメチルビニルケトンと芳香族アルデヒドとの不斉Baylis-Hillman反応に適用したところ,現在までに72%収率,60%eeで生成物を得ることに成功している.2.BINOLオリゴマーの動的らせん構造を利用した機能性分子の開発に関して,主に以下の2点に関して研究を行った.(1)センシングの検出に有効なフルオロフォアであるピレン基をBINOLオリゴマーの3位に導入した誘導体を単量体から四量体まで各種合成し,それらのスペクトル解析を行った.特に,ピレニルメチル基を導入したBINOL三量体においてピレン基同士の特徴的な分子内エキシマー発光が強く観測され,それは半経験的分子軌道法計算による予想構造とも一致した.(2)BINOL三量体の単結晶は極めて興味深い構造を有しているが,その構造が空気中で不安定なため各種分析が極めて困難であった.そこで,CH-πやπ-π相互作用による安定化が期待される誘導体として,6位の炭素上にフェニル基を有するBINOL三量体の合成を行った.既知の方法を改良することでBINOLから6段階,通し収率41%で合成を達成し,現在再結晶条件を検討中である.
放射線Saturated Repairモデルのレポーター遺伝子を用いた実験的検証

本研究の一連の実験により、相同組換え修復が低線量の一定範囲でしか働かず、中高線量では修復能がsaturate(飽和)することが確認できた。一方、非相同末端再結合は放射線量に依らずにほぼ一定の修復能を維持しているので、両修復が機能する低線量では放射線抵抗性、いわゆる擬似しきい値、が存在することになる。このように本研究は、D. LeaやK. H. Chadwick & H. P. Leenhoutsが提唱した物理的損傷ではなく、生物学的な修復能に基づいて、"生存曲線の肩“を説明することに成功した。低線量と中・高線量照射で放射線応答機構が同じかどうかは明らかでない。細胞致死を指標にした低線量域でみられる放射線抵抗性(擬似しきい値、いわゆる細胞生存曲線の肩)を説明するために、物理学的損傷に基づいた標的説やαβモデルが考案された。これに対して、低線量と中・高線量照射でのDNA修復能力の違いにより説明する生物学的なSaturated Repairモデルは1962年に提唱されたが、当時DNA修復能力を実測出来る方法が無かったために長年顧みられることはなかった。このため本研究では、最新のレポーター遺伝子技術を用いて、低線量と中・高線量照射時の細胞内の相同組み換え修復および非相同末端再結合能を定量的に測定した。この結果、相同組換えと非相同末端再結合では被ばくした放射線量依存性が大きく異なることが判明した。つまり、非相同末端再結合では放射線量に依存して活性化するのに対して、相同組換えではその活性がsaturateして中高線量では機能しない可能性が示された。この結果、抗体を用いたい免疫染色や蛋白の酵素活性測定でも観察された。今後は両修復機構で挙動が異なる原因について解析して、我々の観察結果をさらに確認する予定である。本研究は、最新のレポーター遺伝子技術を用いて、低線量と中・高線量照射時の細胞内の相同組み換え修復および非相同末端再結合能を定量することを目的とする。非相同末端再結合能は誤りの多い修復系として知られているので、本研究結果は細胞生存曲線のモデル化に加えて、低線量域での放射線リスク評価の研究にも資すると期待される。レポーター遺伝子を用いて解析した結果、非相同末端再結合能は放射線量によらずほぼ一定したが、相同組換え能は放射線量とともに減少した。減少の程度は、低線量域でみられる放射線抵抗性の放射線量と一致したので、この放射線抵抗性は非相同末端再結合能と相同組換えのいずれも働くことにより放射線抵抗性であることが明らかになった。続いて、高線量域で相同組換えが低下する原因について解析した。非相同末端再結合の鍵タンパクをノックダウンすると相同組換えが回復することから、原因の1つは非相同末端再結合が相同組換えを抑制していることが明らかになった。現在、その抑制機構について解析を進めている。相同組換えと非相同末端再結合では被ばくした放射線量依存性が大きく異なることを日本放射線影響学会鹿児島大会(斎藤裕一朗、他、2014年10月1日)で発表した。また、その原因となる機構について30th RBC-NIRS International Symposium(Y. Saito, et al., 2015年2月20日)において発表して、出席した外国人研究者に大きなインパクトを与えて有益な助言が得られた。今後は、これらの助言を取り入れることにより、予定通りに研究計画を遂行出来ると確信している。放射線生物学今年度半ば迄には今までの研究成果を学術誌に投稿、その後は必要な追加実験も行って今年度中に確実に終了する。本研究は2年計画であり、当初計画に沿って実験を進めた。しかも、実験の一部に関して放射線生物研究センター側からの支援もあって、経費の一部を節約できた。次年度使用額が多くなったので、実験回数を増やすことによりSaturated repair model検証の精度をさらに上げる予定である。
朝鮮半島、京畿地塊を構成する原生代基盤とペルムー三畳紀衝上体の地質学

朝鮮半島中部の京畿地塊基盤岩は約18. 6億年前のグラニュライト相ユニットとペルム.三畳紀の角閃岩相ユニットから構成される。境界には大規模なマイロナイトが発達し、マイロナイト自体が2. 47-2. 40億年に変成している。角閃岩相ユニットは蘇魯造山時に揚子江地塊から離れて中朝地塊のグラニュライト相ユニットに衝上した高温異地性岩体であり,その熱でマイロナイトや近傍のグラニュライト相ユニットが接触変成した。朝鮮半島中部、京畿地塊の華川地域、春川-束草地域、瑞山-公州地域の地質調査を実施して、グラニュライト相変成岩の地形学的上位に、厚さ200500mのマイロナイト帯を挟んで、角閃岩相変成岩が重なること、両岩石の剪断センスはtop-to-the-NEであることを明らかにした。更に、岩石学とCHIME年代測定・年代マッピングにより、(1)グラニュライトは原生代(約18.5億年)の累進及び後退変成作用を記録し、角閃岩相変成岩はペルム-三畳紀(約2.4億年)の年代を記録していること、(2)マイロナイト帯から2-3kmまでのグラニュライトに菫青石がMg-ザクロ石を置換するペルム-三畳紀の重複変成があること、(3)マイロナイトがペルム-三畳紀の角閃岩相変成を被っていること、(4)角閃岩相変成岩の原岩は原生代後期(800Ma)以降に堆積したものであること、を明らかにした。華川地域の京畿地塊について、グラニュライトと角閃岩相変成岩は大規模な衝上断層で接する別個の地質体であり、マイロナイト帯近傍のグラニュライトに残るペルム-三畳紀重複変成は衝上した角閃岩相地質体の接触変成作用と解釈して報告した。春川地域の角閃岩はE・タイプMORBの化学組成を有し、ザクロ石角閃岩は同じ露頭から採取した非ザクロ石岩よりSrに乏しい。この鉱物共生と化学組成を解析して、角閃岩が累進的に緑色片岩相と角閃岩相の変成を受け、エクロジャイト相の変成度には達していないことを明らかにした。グラニュライト基盤が分布する京畿地塊ではE-タイプMORBの火成活動を考えにくいので、春川地域の角閃岩と随伴する堆積岩源変成岩を衝上体と解釈した。ポーランドTrebic Plutonおよび中国九華山花崗岩のジルコンをCHIME法と同位体法で比較分析して、Pbの少ないジルコンのCHIME年代測定の高精度化も実現した。朝鮮半島中部に分布する京畿地塊の地質調査を実施し、グラニュライト相変成岩の地形学的上位に、厚さ200500mのマイロナイト帯を挟んで角閃岩相変成岩が重なること、両岩石の剪断センスはtop-to-the-NEであることを明らかにした。洪城地域の白銅ザクロ石グラニュライトは、飛鳳エクロジャイトと共に、ペルム-三畳紀の大陸衝突に伴う超高圧変成作用を受けたと推定されてきた。しかし、白銅グラニュライトのザクロ石、ジルコン、アラナイト間のYの分配とCHIME年代を解析した結果、高Caザクロ石の成長した高圧累進変成作用が約430Ma、高Caザクロ石が分解した後退変成作用が236Maであることが明らかになった。この形成史は、ペルム-三畳紀の累進変成で生じた飛鳳エクロジャイトと異なる。従って、両者を一連の変成岩と考えて中国山東半島の蘇魯衝突帯に対比することには無理があることが判明した。そこで、原生代のグラニュライトユニットとペルム-三畳紀の片麻岩ユニットの関係を京畿地塊北東部の春川-束草地域地域で検討した。両者の境界は、幅数100m以上に渡ってマイロナイト化し、マイロナイト自体が変成を被っている。マイロナイト帯から離れた地域のグラニュライトは約1.87Ga前の変成作用のみを記録し復変成作用の痕跡を示さない。他方、マイロナイト帯に近いグラニュライトのザクロ石は、塑性変形の後の低圧変成作用で董青石に置換されている。ザクロ石中のモナザイト(1.87Ga)と董青石中のモナザィト(1.87Gaのコアと240Maのリム)の年代が異なることから、(1)片麻岩ユニットはグラニュライトユニットに衝上したペルム-三畳紀変成岩からなる高温のallochthonであり、(2)その熱でマイロナイト帯やその近傍のグラニュライトユニットが接触変成した、と解釈した。

大韓民国の華川-草束地域と洪域-公州地域の京畿地塊から採取した変成岩のCHIME年代測定と岩石学的・地球化学的解析および剪断センスの解析を実施し、京畿地塊全体にわたって原生代初期のグラニュライト相地質体(中朝地塊)の上にペルムー三畳紀の角閃岩相地質体が西南方向から北東方向に衝上していることを確認した。また、衝上帯のグラニュライト起源マイロナイトでは,衝上運動の後でMg-ザクロ石のポーフィロクラストの周辺が童青石で置換される変成作用を受けていること、ザクロ石中のモナザイトは18.5億年の一様な年代を示すのに対して菫青石中の粒子は18.5億年のコアと240-250Maの高Yリムの累帯構造を示すことが元素・年代マッピングにより明らかになった。これらのデータを総合して、(1)京畿地塊のペルムー三畳紀地質体は揚子江地塊起源であり、(2)中朝-揚子江地塊の衝突に伴う高温変成作用の直後に、トランスフォーム断層を越えて東方の中朝地塊に衝上し、(3)グラニュライト相基盤岩に接触変成をもたらしたと結論し、オーストラリア、パースで開催された国際学会で報告(招待講演)した。ペルムー三畳紀地質体の分布を明らかにするために、朝鮮半島南部に分布する嶺南地塊の地質調査と変成岩のCHIME年代測定を実施した。これにより、嶺南地塊の基盤岩はグラニュライト相と角閃岩相の変成岩で構成されていること、両者の境界は漸移的でマイロナイト帯が存在しないこと、CHIMEモナザイト年代は18.5億年でペルムー三畳紀の重複変成を受けていないことが明らかになり、嶺南地塊は中朝地塊の一部であることが判明した。これは山東半島の中朝-揚子江衝突帯が朝鮮半島まで延長していないとする本研究の結論と整合する。さらに、ザクロ石-モナザイトのY分配に関する比較研究とザクロ石の結晶化学的研究も実施した。
マラリア感染予防、伝播防止を目的とした微生物培養液からのpfFabI阻害剤の探索

Enoyl-acyl carrier protein reductase (pfFabI)はマラリア発症前段階の肝臓細胞内で原虫が分裂増殖する際に必須の脂肪酸合成酵素の一つであり、本酵素阻害によりマラリア予防、伝播阻止が期待される。微生物代謝産物の探索から、pfFabI阻害物質を14化合物見出した。特に放線菌K12-0828の培養液から得られたcomplestatin類が最も強い阻害活性を示し、加えて肝臓ステージマラリア原虫に対しても同等の効果を示すことが明らかとなった。本研究により見出された化合物のpfFabI阻害活性、肝臓ステージマラリア原虫に対する効果は新たな知見であった。見出された化合物のpfFabI阻害活性は新知見であり、特にcomplestatinはFabI阻害活性自体が初の知見であった。In vitro培養マラリア原虫に対しては12.5 μg/mlで阻害活性を示すものは無かった。これらの成果について論文投稿準備中である。本年度は前年度取得した化合物の中で最も強い活性を示したcomplestatinおよびその位置異性体であるchloropeptin Iに着目しpfFabI阻害活性を精査した。また、化合物ライブラリーおよび微生物培養液のスクリーニングを継続しpfFabI阻害活性物質を見出した。1 Complestatin生産菌を新たに培養し、complestatin、chloropeptin Iを精製、単離した。pfFabI阻害活性はそれぞれ3.61,4.36 microMであった。これら2化合物はin vitro肝臓ステージのマラリア原虫に対しpfFabI阻害活性と同等の活性を示すことが確認され、新たな知見となった。2糸状菌代謝産物のintegracide A,放線菌代謝産物のmadurahydroxylactoneにIC50でそれぞれ25.6, 35.3 microMのpfFabI阻害活性が見出され、新たな知見となった。4、その他としてType IIの脂肪酸合成系を有する病原原虫(Leishmania Trypanosomaなど)に対するcomplestatine, chloropeptin Iの評価を行なっている。ポジティブコントロールのtricrosanはLeishmania原虫に対しIC50 12.3 microMであった。新たな知見は多々得られたがpfFabI阻害新規物質の取得には至っていないため。本年度は取得した化合物についてpfFabI阻害活性および一部の化合物についてtypeII型の脂肪酸合成系を有するリーシュマニア原虫に対する作用の検討を行った。また、抗生物質ライブラリーと微生物培養液のスクリーニングも継続して行い、新たにpfFabI阻害活性を示す状菌代謝産物のxanthofulvin、cinatrin D, Eが見出された。新規pfFabI阻害活性物質と予測される化合物を含む放線菌培養液も見出され検討を継続中。研究期間中に、抗生物質ライブラリーおよび5991サンプルの微生物培養液から14化合物のpfFabI阻害活性が見出され新たな知見となった。また、新規pfFabI阻害活性物質と予測される化合物を含む放線菌培養液1サンプルが見出されている。抗生物質ライブラリーより見出された7化合物のpfFabI阻害活性はIC50値7.9-118.8 microMであった。培養液より単離された6化合物のpfFabI阻害活性はIC50値でそれぞれ4.8-66.4 microMを示した。最も強いpfFabI阻害活性を示したcomplestatin及びchloropeptin I(放線菌K12-0823より単離、IC50値それぞれ4.8, 5.8 microM)について、抗マラリア、抗リーシュマニア活性を精査したが、いずれも>12.5 microMであった。さらに公益社団法人グローバルヘルス技術振興基金(GHIT)のコラボレーションセンターの協力を得て、in vitro肝臓ステージマラリア原虫に対する阻害活を確認したところ、それぞれIC50で4.1および4.5μMの阻害活性が認められた。酵素阻害活性のみならず、肝臓ステージに対する抗原虫阻害活性も認められたことは新たな知見となった。微生物培養液からpfFabI阻害活性を指標として活性物質が取得された例は報告されていなかったが、本研究ではこれを遂行し、活性物質の取得に至った。特にcomplestatinの様にpfFabIのみならず、FabI阻害活性自体が初の知見となる成果が得られた。当初の目標であった少なくとも活性物質5化合物以上の取得を目指す点においても、5化合物を単離、取得し、目標をクリアしているが、さらに新規化合物の取得も期待している。得られた活性物質はその酵素阻害とは別にin vitro赤血球ステージの培養マラリア原虫に対する効果を併せ持たなかったが、逆に酵素特異的であることが示唆された。pfFabI阻害新規物質の取得には至っていないため、これを目指しスクリーニングを継続する。TypeIIの脂肪酸合成系を持つ病原原虫に対する評価も継続して行う。

引き続き連携研究者である北里大学獣医学部筏井宏実准教授によるマラリア感染防御活性評価系の構築および有望化合物の評価を目指す。寄生虫学生化学マラリア原虫媒介蚊から得られるスポロゾイトをマウスへ接種する感染系を用いてpfFabI阻害物質のマラリア感染防御活性評価系を構築し、最も強い阻害活性を示したcomplestatineについて評価を行う(連携研究者北里大学獣医学部筏井宏実准教授の協力を得る)。評価系の作成は既に検討しており、条件の最適化を行う。あわせて評価化合物の大量取得を目指す。Type II脂肪酸合成系を有する他の病原体に対する創薬展開も期待し、抗菌、および抗トリパノソーマ原虫活性評価を進める。新規物質獲得を目指し、スクリーニングを継続する。消耗品の購入費用が前年よりも控えられたこと、出張などの旅費の計上が無かったこと、謝金の派生が少なかったことにより次年度使用額が生じた。人権費、謝金分として88,000円が残高となった。物品費としてはマイナス1,150円であり、トータルで86,850円が生じた。謝金が派生するボランティアの数が未確定かつ年ごとに変動があるために差額が生じた。新規活性物質の取得およびその他の病原原虫に対する活性評価を含む生物活性評価全般を加速させるために必要な物品の購入に使用する。学会発表を積極的に行い、研究成果を公表すると同時に情報収集を行う。同様に謝金として使用するとともに、今後生じる剰余分は物品費などに計上する。
歯肉溝滲出液中の潜血を探知する歯周病迅速診断キット開発と応用

歯肉溝滲出液(GCF)中の潜血(ヘモグロビン)の探知可能な歯周病迅速診断システム開発のため、本学附属病院で歯肉の健常者、歯周病患者の協力を得て、次の事を行った。1)歯周組織の状態とヘモグロビン量との関連の検索、2)GCF中の潜血を探知する迅速診断キットの開発、3)その迅速診断キットの歯周病初期段階の診断への有用性検証と臨床応用のための指針作成。具体的には医科の定期健康診断などで便潜血検査に用いられているイムノクロマトグラフィー法を応用したヘモグロビン検出キットを、GCF中の微細な炎症の存在を示す潜血探知に応用できるように改良し、使い勝手などを検討し、歯周病迅速診断システムの開発に成功した。方法被験者:定期的にSPTを受診している非喫煙者。検索部位:歯冠修復のない上下顎前歯部。臨床パラメータ:plaque index (PlI),gingival index (GI),clinical attachment level (CAL),PPD,BOP,GCF量。GCF採取:対象部位に簡易防湿にてペリオペーパー(OraFlow)を挿入し採取。Hb検出法(潜血反応の探知):ヒトモノクローナル抗体を用いてヘモグロビンを探知するIC(イムノクロマト)法(ワカモト製薬)およびルミノール法。統計解析:各臨床パラメータに対するそれぞれIC法とルミノール法との相関は,Spearman's correlationで解析。倫理的配慮:本研究は日本歯科大学生命歯学部倫理委員会承認のもと遂行(承認番号:2111)。結果PPD4mm以下BOP(-)群とPPD5mm以上BOP(+)群において,IC法とルミノール法とは両群において有意な相関を認めた。GI:0群とGI:1&2群において,IC法とルミノール法とは前者において相関は認められなかったが,後者では有意な相関を認めた。59歳以下と60歳以上において,IC法とルミノール法とは前者において相関は認められなかったが,後者では有意な相関を認めた。以上の結果から,既存の歯周病進行度の臨床的分類がHb量と相関することが確認され,特に迅速にHb量が測定できるIC法の測定は,有効な診断ツールであることが確認された。本邦での成人の歯周病有病率は未だに高く,これは歯周病の検査・診断・治療技術が不十分であることを示唆して歯肉溝滲出液(以下GCF)は各歯の部位別病態を反映する多彩な情報を含み,簡便かつ無痛的に採取可能な優れた検査試料であることが知られている。我々はチェアサイドで迅速にGCF中のヒトHemoglobin(Hb)を検出し,歯肉の微細な炎症反応を探知可能な迅速診断キットを開発中であり、これまでの研究期間でその具備条件を有する試作品が完成したので、対外診断薬としての可能性について検討した。結果および考察:従来の歯周病の臨床パラメーターであるBOP(+)を示した部位は試作キットでもHb(+)を示し、さらにBOP(-)でプロービングでは炎症の兆候が探知できなかったにも係わらずHb(+)を示した部位についても検索したところ、Hb(+)部位ではGCF量,生化学マーカーのALPとAST活性,さらに蛋白質量などがHb(-)部位と比べて高値で、統計学的に有意であった。これらのことからHb検査はBOP等で探知できる部位の病変の探知に加え,BOPでも探知できない,炎症が潜在的に存在する組織破壊をも探知することが可能で,新たな歯周病検査の可能性を有していることが示された。研究の順調な進展の理由として,歯周病の迅速診断検査キットとしての具備条件を満足させる試作キットが予定通り作成できたことが大きく,研究実績の概要でも記載した通り,現在対外診断薬としての臨床でのトライアルを開始している。採取サンプル数も増加しており,本年度の半ばで試料収集も完了する予定であり,その後さらなるデータ数を使用した統計解析,得られた結果の学会発表,論文作成の準備も合わせて開始している。歯周病は口腔内だけでなく、全身疾患に繋がる問題である。しかし未だに日本国民の成人の80%以上が罹患し、歯の最大の喪失原因であることからも、現在の歯周病検査と診断、それを治療に繋げる技術が充分ではないことは明白である。その原因には、歯周病発症の早期探知ができていないこと、治療計画立案が画一的検査結果に基づき行われていることが考えられる。そこで本研究では、3年の研究期間において、新たな歯周組織検査の開発として、歯の部位ごとの微細な歯周組織の病態変化が把握可能で、客観的検査結果が得られる歯肉溝滲出液(以下GCF)に焦点を当て、GCF中成分変化の探知、とくに炎症の存在を反映する潜血の証拠であるヘモグロビン探知を応用した歯周病の迅速診断キットを開発した。そしてそれを歯周病の早期発見、早期治療へと臨床応用する方法について考察を行った。このキットの概要は、GCFの溶解液にヒトヘモグロビンモノクロナール抗体を塗布した細長い濾紙を浸漬後、展開したGCF中に一定量のヘモグロビンが存在すると赤色にバンド状に発色(陽性)、存在しないと無色のまま(陰性)となる発色の有無を利用して、その部位に炎症があるか否かを評価するものである。