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旧ソ連・東欧の民営化政策と西側経済援助

本研究の目的はロシア・東欧における民営化政策の制度と実態を実証的に分析することによって、ミクロレベルでの体制転換の意味とそれに対する西側の経済支援の処方箋を検討するというものである。3年間を通じて次の点を明かにしている。第1に、ロシアの民営化の政策と制度を明かにし、民営化が市場と企業に及ぼす効果を分析した。この分析では東欧の民営化との比較をも行っている。民営化がインサイダー経営者を形成し、労働者への優先的な条件は有効に作動していないことを明かにしている。第2に、企業構造と行動の変化を研究した。民営化が所有権の変更に焦点をあてているが、企業構造の変化からリストラの効果を分析した。企業は市場に適合的な行動を示す同時に、市場に適合せず補助金を求める行動をとり、その行動の背景には企業内での安定的な労使関係、国家の官僚的調整の温存傾向が存することを明かにしている。企業の意思決定にかかわって、モデル化を試みた。上記の2点は移行諸国への経済支援は進化的に実施されなければならないことを提言している。第3に、企業再編の最新状況として資本市場、金融・産業グループの実証分析に着手した。この研究は世界的にまだ萌芽的でイギリスバ-ミンガム大学教授との共同研究の途上にあるが、移行諸国の経済システムの特殊性を明かにし、経済支援策を見直す素材になると考えられる。以上の分析結果はすべて内外の学会において口頭報告している。この期間中、現地企業調査をロシア、ドイツにおいて実施し、とりわけロシアでは定点観測として複数年にわたり企業経営の実態調査と現地研究者、実務家へのインタビューを行っている。最後に、これまでの研究とこの3年間の研究をとりまとめて、単著『ロシア経済・経営システム研究』の形ですべての研究を公表している。本年度はロシアを対象として、体制転換の経済政策の効用と民営化政策の実証研究を行なった。また、いずれの問題についても実証的な研究を深めるために、93年2-4月にロシアでの現地企業調査(官庁等を含む)および経済専門家との意見交流を行なった(94年3月にはドイツ、ベルリンでの現地企業調査を行なう予定である)。わが国では比較的マクロ的な視角からの研究が多いのに対して、ミクロ的な視角からの実証研究は、類似の調査が皆無なこともあり、独自性のある貴重なデータとなる。経済政策の分析により、92年からロシアで(東欧ではそれ以前から)実施されているショック療法型の市場形成政策が事実上修正されており、産業政策が重視され、国家の管理能力(統制)の拡大の傾向が明かになった。このことは、旧社会主義体制の体制転換が長期的には市場経済化するとしても、中短期的には特殊な形で、ロシアの場合には伝統的な慣行を復活させながら、移行することを意味している。また、この政策の分析では、東欧諸国との比較研究を行ない、経済の自由化の結果、政策スタンスに生じている変化の共通性と相違性を明かにした。さらに、平成4年に継続して、民営化の制度・経営主体の動向を理論的・実証的に検討した。民営化への経済支援がすでに提起されている以上、経済支援のひとつの対象として位置づけられる。所有改革は進んだが、形式的な所有権の移転にすぎず、経営者機能の改革がきわめて弱いことが明かになる。いずれのテーマについても、専門の学会(ロシア・東欧学会や国際経済学会など)および講演会で報告し、また、図書あるいは論文の形式でそれらの公表を行なっている。また、93年の激しい変化に対応して、適時に新聞等への解説も発表した。本年度は、民営化政策の実証分析のために、2度の現地調査を行った。

ひとつは、94年3月のドイツ(旧東独地域)における調査で、信託公社や民営化企業を調査し、多くの研究者との交流を図った。もうひとつは、94年9-10月のロシアにおける調査で、資産管理委員会や雇用局などの主要官庁を訪ね、経済学者との討論、円卓会議を行った。いずれの調査でも、民営化の実施機関および企業を直接に訪ねて、民営化の効果を調査している。とくに、後者の調査では西側の経済援助がロシア(とりわけ地方都市)に及ぼす経済効果について科学アカデミー、研究者と交流を行い、タタールスタン共和国大統領、各地の科学アカデミー支部において日本の経済学者との知的交流の要請を受けた。本年度の研究では、まず、民営化政策をロシア・東欧諸国において比較研究し、ロシアの民営化の独自性、ロシア市場の独自性を明らかにした。官僚的調整の作用範囲の大きさ、産業ロビ-の形成の現状、それに伴う国家の役割・経済政策の変化はその独自性を示している。ただし、体制転換リセッションにおける経済政策の目標転換においては、インフレ抑制から景気刺激への共通する傾向もまた明らかになる。また、民営化に伴う企業行動の変化を研究するために、ロシアにおける労働市場を実証研究し、企業・労働者が市場に適合する動きと集団主義的に行動する動きを明らかにした。体制転換諸国における民営化が、すぐに失業者を排出しないメカニズムが検証されている。このような研究は、民営化が経営能力の形成に直結しておらず、西側経済援助や国際的な共同研究が経営者の形成、市場慣行への適応において効果が大きいことを示している。いずれのテーマについても、専門の学会(比較経済体制学会、比較経営学会など)および講演会において報告し、また図書あるいは論文の形でそれらの成果の公表を行っている。本年度はこれまでの研究の中間的なとりまとめを次のふたつの方向にもとづいて行った。第1に、92年以来実施してきたミクロレベルでのロシアおよび東欧諸国における企業の構造、行動にかんする実証分析を総括して、企業と国家の相関関係、企業内における意思決定をめぐる労使関係を明かにした。つまり、企業の行動、経営者の動機に効率性が反映せず、リストラが進まない原因として企業内での集団主義と企業・国家間での温情主義の惰性が存することを明かにしている。この研究は95年9月からのバ-ミンガム大学ロシア東欧研究センターにおいてロシアの金融制度と企業・国家の相関の研究のテーマで共同研究し、セミナーの報告・討論を行っている。同研究は体制転換諸国への経済援助が資金や知的支援だけでは十分は効果を有せず、長期的視野から経済システムの諸制度、慣習、価値観を相互理解することが重要であることを提言している。この企業レベルにおける市場化の到達点にかんしては、本年度の国内の専門の学会(比較経済体制学会、比較経営学会)の共通論題において報告し(国外の学会においても96年6月に報告を予定)、論文の形式で公表している。第2に、これまで分析してきたソ連企業の研究と現在のロシアの体制転換過程の企業研究を結びつけ、移行経済のミクロ分析として取りまとめる作業である。ソ連邦の枠内で形成された企業が非効率性を内部化し、その溶解の過程がすでに80年代から存していたこと、体制転換はこの溶解を市場適合に直接に導かず、市場と官僚的調整の結びついた状況を生みだすことを明かにしている。
ワイドバンドギャップ半導体材料・デバイスの照射効果に関する研究

ワイドバンドギャップ半導体である炭化ケイ素(Sic)に着目し、電子線照射を用いた欠陥生成による新たな単一発光中心の探索を行った。具体的な内容を以下に示す。本研究では半絶縁性Sicに1MeVで電子線を照射することで欠陥を導入し、その後、真空中300°Cで熱処理を行うことで特定の欠陥の生成(残留)を試みた。その結果、室温においても非常に明るく発光する従来の報告に無い単一発光中心がSic中に形成されることを共焦点顕微鏡によるアンチバンチング測定により確認した。更に、この発光中心のアンチバンチング測定結果を二次の相関関数を用いて解析することで発光の減衰挙動を明らかにした。その結果、発光中心には準安定な状態があり、発光を伴わずに基底状態となる緩和課程が存在することが判明した。哩論計算を行ったところ、この現象は欠陥の特性に起因し、電子のスピン-軌道相互作用によるものと推論できた。また、この発光中心の量子発光効率は70%であることも併せて判明した(30%は非発光での緩和課程)。本研究では、この単一発光中心の構造同定に関する研究も進めた。その結果、正に帯電した炭素空孔(Vc)とSi格子位置をCが置換したCアンチサイト(Csi)の複合欠陥(CsiVc^+)が最有力候補であるという解釈が得られた。これまでの低温でのフォトルミネッセンス評価の報告では、この波長にピークを有する発光は中性のCsiVcに由来すると言われていたが、今回ab intitoと群論を用いた理論計算を行うことでCsiVc^+を提案するに至った。但し、現時点ではC_<Si>Vc^+に完全に構造決定したという訳では無く、欠陥構造の完全同定には詳細な理論的考察を含め、今後の更なる研究が必要であると考える。半導体中の欠陥中心の持つスピンを利用した量子コンピューティングの実現へ向けた、より発光特性の優れた量子ビット探索を行うための試料を作製するため、ダイヤモンド(IIa)及びn型の六方晶炭化ケイ素(4H-SiC)に、酸素及びクロムイオンを注入した。イオン注入条件の最適化を図る評価を行うため、異なる照射量、温度条件でのイオン注入を行った。酸素イオンは、室温にて120keVのエネルギーで1.5x10^<11>1.5x10^<13>/cm^2のフルエンス範囲で打ち込んだ。一方、クロムイオンに関しては、室温または1000°Cで1x10^<11>1x10^<13>/cm^2のフルエンス範囲の注入を行い、注入エネルギーに関しては、酸素イオンの侵入深さと同程度となるように300keVとした。また、欠陥生成に及ぼす結晶中の酸素の効果を調べるため、同一の試料でクロムのみの注入領域と、クロムと酸素の共注入を行った領域を形成した。イオン注入後、試料に対して真空中で10001650°Cの範囲で、30分から1時間の熱処理を行った。1650°C熱処理では、SiC表面の結晶性が劣化することが懸念されるので、熱処理に際しては、キャップ層として表面に炭素膜を施し、表面荒れの発生を防いだ。更に本研究では、効率的な欠陥形成技術の開発を狙い、4H-SiCに2MeVのエネルギーを有する電子線を照射した。照射温度は室温とし、1x10^<13>1x10^<17>/cm^2のフルエンス範囲での照射を行った。今後、作製した試料に対し、ラマン分光やフォトルミネッセンス測定を行い、結晶性を評価するとともに、共焦点顕微鏡観察等での単一フォトン測定を行う事で、量子コンピューティングに応用可能な単一欠陥の探索を行う。半導体中あ欠陥中心の持つスピンを利用した量子コンピューティングの実現へ向けた、発光特性の優れた欠陥探索及び効率的欠陥生成技術の確立のため、ダイヤモンド及びn型の六方晶炭化ケイ素(4H-SiC)に、酸素及びクロムイオン注入、または、電子線照射を行った。量子コンピューティングのための発光中心として有望視されるNV(窒素-空孔複合欠陥)センターの効率的作製技術の確立に関する研究では、大量生産を視野にナノダイヤモンド(15nm及び100nm粒径)中に含まれるNを電子線照射によってNVセンターに変換する手法を試みた。ナノダイヤモンドでは、結晶中に多量に存在するダングリングボンド等が原因で、電子常時性共鳴法(EPR)を用いて、含まれるNの濃度を定量する事は困難とされてきたが、測定条件の最適化によりPlセンター(ダイヤモンドの格子位置を置換するN)の観測に成功した。2MeV電子線を室温にて照射し、1000°Cの真空中で熱処理を行ったところ、P1センターが減少していくことが見出された。今後、減少したPlセンターがNVセンターに変換したかについて、フォトルミネッセンス等を用いて評価する予定である。イオン注入により導入した不純物、照射欠陥の挙動に関する基礎的な研究として、導入した不純物が、注入後の熱処理において結晶回復にどの様に影響を及ぼすかを検討した。シリコン及びガリウム中にヒ素(As)やリン(P)、ボロン(B)やアルミニウム(Al)を導入した際の固相エピタキシャル成長(SPE)過程を評価、した。その結果、不純物を1x10^<20>/cm^3程度の高濃度に導入した場合は、SPEの増大効果が生ずることが見出され、その効果はドナーやアクセプタ不純物導入によるフェルミ準位の変化に基づいた理論で解釈できることが判明した。

ワイドバンドギャップ半導体である炭化ケイ素(Sic)に着目し、電子線照射を用いた欠陥生成による新たな単一発光中心の探索を行った。具体的な内容を以下に示す。本研究では半絶縁性Sicに1MeVで電子線を照射することで欠陥を導入し、その後、真空中300°Cで熱処理を行うことで特定の欠陥の生成(残留)を試みた。その結果、室温においても非常に明るく発光する従来の報告に無い単一発光中心がSic中に形成されることを共焦点顕微鏡によるアンチバンチング測定により確認した。更に、この発光中心のアンチバンチング測定結果を二次の相関関数を用いて解析することで発光の減衰挙動を明らかにした。その結果、発光中心には準安定な状態があり、発光を伴わずに基底状態となる緩和課程が存在することが判明した。哩論計算を行ったところ、この現象は欠陥の特性に起因し、電子のスピン-軌道相互作用によるものと推論できた。また、この発光中心の量子発光効率は70%であることも併せて判明した(30%は非発光での緩和課程)。本研究では、この単一発光中心の構造同定に関する研究も進めた。その結果、正に帯電した炭素空孔(Vc)とSi格子位置をCが置換したCアンチサイト(Csi)の複合欠陥(CsiVc^+)が最有力候補であるという解釈が得られた。これまでの低温でのフォトルミネッセンス評価の報告では、この波長にピークを有する発光は中性のCsiVcに由来すると言われていたが、今回ab intitoと群論を用いた理論計算を行うことでCsiVc^+を提案するに至った。但し、現時点ではC_<Si>Vc^+に完全に構造決定したという訳では無く、欠陥構造の完全同定には詳細な理論的考察を含め、今後の更なる研究が必要であると考える。電子線及びイオン注入も予定通り行い、試料準備が順調に進んでいる。また、作製試料の欠陥評価もほぼ予定通り行っており、国際会議や論文発表といった一定の成果が挙げられているため。今後も引き続き、イオン注入及び電子線照射を行う。照射試料を熱処理後にフォトルミネッセンス、EPRやDLTSにより評価することで欠陥中心に関する情報を得て、量子コンピューティング応用への可能性を探求する。研究遂行では光学測定を行う必要があるが、保有していない装置での測定に関しては共同研究先等を活用することで効率的に進める。
双安定性有機材料におけるテラヘルツ超高速スイッチング

本研究では、有機双安定メモリをはじめとした、外場の刺激に敏感なソフトクリスタルを対象として、テラヘルツパルスによって超高速制御および超高速テラヘルツデバイスに関する研究を進める。有機材料と金属微粒子等を組み合わせた系において、テラヘルツ・光等の外場制御によるスイッチングを実施していく。AIDCN (2-amino-4, 5-imidazoldicarbontrile)中にアルミニウムナノクラスタを挟んだ試料において、超高速伝導制御を試みている。AIDCNと金属Al蒸着装置の改造を行い、これまで単一のターゲットを蒸着する仕様であったが、装着できるターゲット・電源等をすべて複数化することにより、同時に複数の物質を特定のスピードで蒸着することができるようになった。現在は、有機材料と金属材料を共蒸着することによって、試料作成の最適化を図っており、以前より大きな伝導変化が得られている。外部より印加する電場のみならず、磁場によって、偏光制御可能なテラヘルツ素子の開発を行った。磁性体薄膜Coに非磁性金属薄膜Ptを組み合わせ、さらには外部電場可能な液晶層を放射側に装着した。これにより外部の磁場によって、スピン流の流れを制御し、また電場により放射テラヘルツ波の位相遅延を制御することを可能にした。印加する磁場の向きや電場の大きさによって、直線偏光から円偏光に至るまで制御することが可能になった。スピン分光や偏極分子の分光など、テラヘルツ領域における偏光に基づいた精密分光の需要は高まっており、それらに適したコンパクトで強力な光源の開発に成功した。有機双安定メモリとして働く材料の探索および最適化など、順調に進んでいる。液晶をもちいたテラヘルツ偏光素子や光記録材料におけるテラヘルツ分光など、当初予定していた以上に多彩な展開が行われている。有機材料や液晶等をはじめとしたソフトクリスタルを対象に、テラヘルツや光による超高速制御を試みる。また、ソフトクリスタルをもとにテラヘルツ制御デバイスの開発を試みる。テラヘルツ分光等によるソフトクリスタルの評価や、光パルス照射により発生するテラヘルツ波発生をモニターすることで、光記録材料等の評価への応用も試みる。新たなターゲットに対するテラヘルツ照射実験やテラヘルツ分光測定などを積極的に行い、多くの成果につながるようにしたい。
人工細胞を用いた反応場サイズと内部反応の関係性の解明

細胞のサイズは内部の反応にどのような影響を与えているのだろうか?本研究では、既知分子のみを用いて、大きさの異なる微小反応場にタンパク質合成反応を内包した、「人工細胞」を再構成した。次に、これを用いて内部のタンパク質合成反応に反応場サイズが与える影響を調べた。その結果、反応場が小さいほど早く進行する反応の存在を見出し、そのメカニズムを明らかにした。反応場が小さいことが有利に働く一例を実験的に示すことに成功した。細胞のサイズは内部の反応にどのような影響を与えているのだろうか?特定のシグナルカスケードを稼働させるのに、細胞サイズが寄与していること、もしくは、細胞には生育に適したサイズが存在しうることが議論されている。一方で、細胞のサイズ変化のみが内部反応に与える影響を実験により解明する試みはほとんどない。本研究では、oil層にwater層が分散しているw/oemulsionを用い、その内部に完全再構成無細胞翻訳系(PURE system)を封入する。これにより、サイズの異なる反応場に蛋白質合成反応を内包した、既知の成分のみからなる「人工細胞」を再構成し、これを用いて内部反応に反応場サイズが与える影響を調べることを目指した。23年度はw/o emulsion内蛋白質合成系を確立した。具体的には、レポータ蛋白質であるβ-グルクロニダーゼ(GUS)とβ-ガラクトシダーゼ(GAL)を用いた合成反応の検出系を構築した。さらに、それらの反応がDNA濃度が高いところでは、emulsionの液的のサイズに依存しない条件を見いだした。これにより、サイズの異なるemulsion内でのGUS, GAL合成反応のリアルタイム検出が可能となった。24年度は、サイズの異なる区画にサイズの異なる微小反応場におけるGUSとGAL合成反応のダイナミクス解析を行った。GUS合成反応は4量体形成が反応律速になっているため、反応場サイズが小さいほど4量体の会合反応が加速され、一方で、GALではそのようなサイズ依存性は見られなかった。この結果は、GUS、GAL合成反応の速度論モデル(理論)と合致していた。このように、反応場サイズと内部反応ダイナミクスの関係性を定量的に明らかにすることに成功した。細胞はマイクロメートルスケールのサイズを有している。では、サイズは内部の反応にどのような影響を与えているのだろうか?理論研究から、特定のシグナルカスケードを稼働させるのに、細胞サイズが寄与していること、もしくは、細胞には生育に適したサイズが存在しうることが議論されている。これにより、サイズの異なる反応場に蛋白質合成反応を内包した、既知の成分のみからなる「人工細胞」を再構成し、これを用いて内部反応に反応場サイズが与える影響を調べることを目指している。本研究では、PURE systemを用いたGUS, GAL合成反応の反応場サイズ依存性を実験と理論から明らかにする。その準備段階として、bulkでのPUREsystemを用いたGUS, GAL合成反応の速度論解析を行い、その結果を論文に発表した。また、emulsion以外の小さい反応場であるマイクロチャンバー内でのGUS, GAL合成反応検出技術も開発し、これについても、その結果を論文に発表した。具体的には、界面活性剤(tween80, span80, AbilEM90)の濃度比を変化させてemulsionを調製し、サイズが異なるemulsion内でも同じようにPURE systemを用いたタンパク質合成反応が進行する条件を見いだした。レポータ蛋白質として、ホモ4量体であるβ-グルクロニダーゼ(GUS)とβ-ガラクトシダーゼ(GAL)を用いた合成反応の検出系も構築した。具体的には、それぞれの酵素の蛍光基質をPURE systemに加えることでGUS, GALの4量体が合成されると、蛍光基質が加水分解され、蛍光シグナルが生成する。また、bulkでのPURE systemを用いたGUS, GAL合成反応の速度論解析を行い、その結果を論文に発表した(Matsuura et al., JBC, 2011)。w/o

emulsion以外の細胞サイズの反応場、具体的には石英ガラスを用いたマイクロチャンバーを用いた蛋白質合成反応の検出系も構築し、これについても論文を発表した(Okano, Matsuura et al., Lab Chip, 2012)。サイズの異なる区画にサイズの異なる微小反応場におけるGUSとGAL合成反応のダイナミクス解析を行う。具体的には、異なるサイズの反応場におけるGUSとGAL合成反応ダイナミクスを顕微鏡下でリアルタイム測定する。GUS合成反応は蛍光基質の加水分解、すなわち蛍光強度の増加で検出する。平成23年度に発表した論文(Matsuura et al., JBC, 2011)から、各emulsionに1分子のDNAを封入する程度のDNA濃度では、内部のGUS, GAL合成反応はemulsionサイズに対して異なる振る舞いをすることが予想される。すなわち、GUS合成反応は4量体形成が反応律速になっているため、反応場サイズが小さいほど4量体の会合反応が加速され、蛍光強度が早く立ち上がってくる。一方で、GALではそのようなサイズ依存性は見られないと予想される。GUS、GAL合成反応の速度論モデル(理論)と実験結果の整合性を調べる。モデルと合致しない場合には、これ以外の効果(界面と内部反応の適合性、表面積・体積比など)も考慮し、反応場サイズと内部反応ダイナミクスの関係性を定量的に明らかにする。平成24年度はw/o emulsion内でのGUS, GAL合成反応の顕微鏡下における反応のリアルタイム検出を行う。そのために、23年度にリアルタイム計測に必要なソフトウエア、機器を既存の顕微鏡に設置した。平成24年度はそれに加えて、インキュベーター、高感度検出のための開光数の高いレンズを購入する予定である。また、23年度と同様にPURE systemを用いた蛋白質合成反応に必要な一般試薬を購入する。当初予定していたリアルタイムPCR器の購入をとりやめたため、23年度の研究費に未使用額が生じたが、24年度に顕微鏡の付属品を購入しリアルタイム計測の研究を実施する。
癌化シグナルを標的とした新規腎細胞癌治療法開発のための研究

肝細胞成長因子の受容体型チロシンキナーゼであるMET蛋白が腎細胞癌の発癌メカニズムの中で、増殖、生存能、上皮間葉転換、運動能、血管新生といった様々なstepにおいて重要な働きをしていること、このMET蛋白が腎細胞癌の新規治療標的となることを明らかにしました。本邦では年間1万人前後の新規腎細胞癌患者が発症すると言われています。近年の画像診断の普及に伴い、早期の段階で腎癌が発見されるようになり、根治的手術の可能な症例が増え、腎癌の治療成績は向上してきていますが、手術適応のない腎癌に対するサイトカイン療法の治療成績は充分な数字とは言えず、根治的手術が不可能な進行症例については以前と同様にその治療が困難であり、新たな治療法の開発が急務と言われています。私たちはここ数年の研究によって淡明細胞型腎癌の増殖と腫瘍形成がMET蛋白と呼ばれるチロシンキナーゼの活性に依存していることを明らかにしました。そこで、MET蛋白を足掛かりとして腎癌細胞内の癌化シグナルの詳細を明らかにし、癌化シグナルそのものを標的とする新しい腎癌治療法を開発していきたいと考えました。平成19年度の本研究の成果として、MET特異的阻害剤であるPHA-665752が濃度依存性にMET蛋白の活性を阻害することによって、MAP kinase、c-Actといった情報伝達系に関わる細胞内蛋白の活性が阻害されること、細胞接着において重要な働きをしているIntegrinの発現が抑制されること、その結果として、腎癌細胞の増殖、運動能が抑制されるとともに、アポトーシスを誘導することを明らかにしました。またSiRNAを用いてMET蛋白の発現を抑制することによっても、腎癌細胞の増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されることを明らかにしました。さらに、実際の腎細胞癌組織においてもMET蛋白の発現、活性が正常腎組織と比較して、亢進していることも明らかにしました。この知見はMET蛋白下流のシグナルが腎癌の癌化において重要な働きをしていることを示唆するものと考え、今後その詳細な解析を進めていく予定です。本邦では年間1万人前後の新規腎細胞患者が発症すると言われています。近年の画像診断の普及に伴い、早期の段階で腎癌が発見されるようになり、腎癌の治療成積は向上してきていますが、手術適応のない進行症例については以前と同様にその治療が困難であり、新たな治療法の開発が急務と言われています。そこで、平成19年度に引き続き、MET特異的阻害剤であるPHA-665752にてMETの活性を阻害するという方法と、SiRNAを用いてMET蛋白の発現を抑制するという方法を用いて淡明細胞型腎癌細胞内のMETのシグナルを阻害し、MET蛋白が腎癌の発癌メカニズムの中でどのような働きをしているのかをしらべたところ、(1)MET蛋白の活性化によって腎癌細胞の増殖が誘導されること(2)MET蛋白の発現こよってapoptosisが抑制されること(3)MET蛋白の活性化によって癌細胞の特徴でもある間葉系マーカーの発現が誘導されること(4)MET蛋白の活性化によって癌細胞が運動能を獲得すること(5)MET蛋白の活性化によって癌の進行に必要とされる血管新生を誘導するVEGFの産生が亢進することを明らかにしました。以上のように、MET蛋白は腎癌の発癌メカニズムにおける、増殖、生存能、上皮一間葉転換、運動能、血管新生といった様々なstepにおいて重要な働きをしており、新規治療標的となることを明らかにしました。今後は臨末応用に向けて本研究を継続していく予定です。
高選択性吸着剤を用いる水中の有害重金属元素のキャラクタリゼ-ション

近年,河川水・湖沼水・海水等に含まれる各種有害重金属元素の存在状態別定量に大きな関心が集まっている。これは,存在状態の物理的・化学的差異により,たとえ同一の元素であっても地球化学的挙動や水棲動植物に与える影響が大きく異なりうるからである。例えば銅の場合,水和イオンやヒドロキソ錯体が最も毒性が強く,一方,安定な錯体(フミン錯体等)を作ると毒性がかなり減少するといわれている.しかし,今日深刻な問題となってきた酸性雨などにより水のpHが低下した場合,フミン錯体は解離して有害な銅イオンを放出する恐れがある.そこで本研究では,河川水(ニュ-クリポアフィルタ-で予め濾過して懸濁粒子を除去)と合成試料のpHを塩酸,硝酸または硫酸で徐々に低下させ,フミン錯体の濃度変化を調べた.フミン錯体は,巨大網目構造の陰イオン交換体DEAEーSephadex Aー25カラムに選択的に吸着捕集し,脱着後黒鉛炉原子吸光法により定量した.脱着は超音波を照射することにより,迅速かつ定量的に行うことができた.その結果,天然・合成共にフミン錯体の解離挙動は極めてよく似ており,pH4までは酸性化の影響を敏感には受けない事がわかった.さらに水酸化インジウム共沈におけるフミン錯体の分離挙動を,水酸化鉄(III)共沈と比較しながら詳しく調べた.ケイ酸が多量に共存するとフミン酸やフルボ酸は共沈しなくなるが,錯体を生成していた重金属元素は完全に沈殿に捕集された.現在のところ,フミン錯体として共沈するのか,それとも錯体が解離して無機化学種として共沈するかは明らかではないが,共沈法はフミン錯体を含む全化学種の有力な分離濃縮法となりうることが分かった.近年,河川水・湖沼水・海水等に含まれる各種有害重金属元素の存在状態別定量に大きな関心が集まっている。例えば銅の場合,水和イオンやヒドロキソ錯体が最も毒性が強く,一方,安定な錯体(フミン錯体等)を作ると毒性がかなり減少するといわれている.しかし,今日深刻な問題となってきた酸性雨などにより水のpHが低下した場合,フミン錯体は解離して有害な銅イオンを放出する恐れがある.そこで本研究では,河川水(ニュ-クリポアフィルタ-で予め濾過して懸濁粒子を除去)と合成試料のpHを塩酸,硝酸または硫酸で徐々に低下させ,フミン錯体の濃度変化を調べた.フミン錯体は,巨大網目構造の陰イオン交換体DEAEーSephadex Aー25カラムに選択的に吸着捕集し,脱着後黒鉛炉原子吸光法により定量した.脱着は超音波を照射することにより,迅速かつ定量的に行うことができた.その結果,天然・合成共にフミン錯体の解離挙動は極めてよく似ており,pH4までは酸性化の影響を敏感には受けない事がわかった.さらに水酸化インジウム共沈におけるフミン錯体の分離挙動を,水酸化鉄(III)共沈と比較しながら詳しく調べた.ケイ酸が多量に共存するとフミン酸やフルボ酸は共沈しなくなるが,錯体を生成していた重金属元素は完全に沈殿に捕集された.現在のところ,フミン錯体として共沈するのか,それとも錯体が解離して無機化学種として共沈するかは明らかではないが,共沈法はフミン錯体を含む全化学種の有力な分離濃縮法となりうることが分かった.
幹細胞を利用した抗癌ウイルスの効率的デリバリー法の基礎開発

幹細胞技術を応用して増殖型遺伝子組換え単純ヘルペスウイルスI型(HSV-1)を用いたウイルス療法を発展させ、新たな癌治療法につなげるための基礎研究を行うことを目的とした。G47Δは腫瘍特異的なウイルス複製能に優れ且つ安全性が高い第三世代HSV-1で、平成21年度より再発膠芽腫患者を対象とした臨床研究が開始された。HSV-1に感受性の高いA/Jマウス由来の神経幹細胞や、市販のヒト間葉系幹細胞を用い、G47Δに対する感受性を調べたところ、いずれの幹細胞もG47Δの感染を受けながら、U87MGなどの腫瘍細胞株に比べると長期に渡って生存した。ヒト間葉系幹細胞を、予めG47Δに感染させたり、投与直前にG47Δと混合したりして、様々な条件でG47Δと併用して、ヌードマウスに移植したU87MGの脳腫瘍モデルや皮下腫瘍モデルで治療効果を検討したところ、G47Δ単独に比べて治療効果の増強は得られなかった。豊富なマウス神経幹細胞の供給を得て更なる検討を行うため、レンチウイルスベクターを用いて、培養したA/J由来神経幹細胞にv-mycを安定導入し、不死化したマウス神経幹細胞株を作成している。一方、手術検体から樹立したヒト膠芽腫由来がん幹細胞のG47Δに対する感受性を調査したところ、二次的sphere形成試験でMOI=0.01といった低い感染率でもほとんどsphereが形成されず、G47Δが効率的にがん幹細胞を殺すことが示された。がん幹細胞を用いたマウス脳腫瘍モデルでは、G47Δ投与が有意に生存期間を延長した。正常幹細胞とがん幹細胞では、G47Δに対する盛受性に大きな差があることが判明した。
植物細胞で機能するエフェクター様因子探索を目的とした希少さび病菌遺伝子情報の収集

本年度は当初の計画通り、比較的菌体の入手が容易で、技術的蓄積があるメダケ赤衣病菌(Stereostratum corticioides)を用いて優良解析試料DNAの取得を試みた。当初はガラスホモジナイザーを用いてDNA抽出操作を行うことを計画していたが、小容量の実験には適応不可能であることから、1.5mLマイクロチューブの中でプラスチック製のペッスルを用いて菌体(冬胞子)を破砕する方法を試行した。その結果、メダケ赤衣病菌を用いた場合はほぼ十分な磨砕効率が得られることが判明した。一方、比較のためにササ類さび病菌(Puccinia sp.)を用いた場合では、十分なDNA量が得られず、今後に課題を残した。その理由は、磨砕操作の結果生じた微少なキズを有するチューブ表面やペッスルに無視できないDNA吸着が生じている可能性が考えられた。今のところ、ガラスホモジナイザーか、モーターで駆動させたプラスチック製ペッスルを用いる方法以外にさび病菌の胞子から効率良く核酸試料を抽出可能な系は見あたらないが、この方法ではガラス面あるいはプラスチック面に対する吸着は不可避であり、微量サンプルのNGS解析を想定した場合、重要な今後の検討課題であると思われる。一方、ゲノム情報からのエフェクター候補遺伝子の探索については、既存のゲノム情報を用い、特定のアミノ酸配列をプローブとした配列探索を試み、効率改善の余地は大いにあるものの、一定のノウハウを得ることが出来た。また、アグロバクテリウム法あるいは遺伝子銃をもちいたエフェクター因子の特徴付けに関しては、96穴プレートを用いた一過性発現系に目途がつき、レポーター系を組み合わせることにより遺伝子機能解析に活用できると考えられた。ゲノム解析や、遺伝子導入法に関する進展は期待通りであったが、DNA抽出手法の問題点に行き詰まり、さらに想定外の大学業務の多忙と老母介護がかさなり、予定していた実験研究時間が十分確保出来ず、NGS解析を実施出来なかったことが理由である。当初計画していた、超微量試料からのDNA試料調製は継続して試行するが、それに拘泥せずに、得られたDNAサンプルを用いてメダケ赤衣病菌のゲノム解析をすすめる。当初計画していたNGS解析が実施出来なかったことにより、関連の経費を次年度に全て持ち越す必要が生じたことによる。
新生マウス脳幹脊髄摘出標本を用いた吸啜運動に関与するプレモーターニューロンの解析

生後一定期間の哺乳類では、吸啜運動によって母乳を摂取することで生体エネルギーの確保を行っている。吸啜運動は、口唇や口腔内粘膜への機会刺激によって誘発されるリズム運動で、このリズムの形成には脳幹内に存在する神経回路網が重要な役割を果たしていると考えられているが、その詳細については明らかにされていない。本研究では、新生マウスの脳幹-脊髄摘出標本を用いて吸啜リズムを形成する神経回路に含まれる介在ニューロンについての解析を行った。吸啜や咀嚼といった摂食運動時の顎の最も基本的な運動は、閉口筋と開口筋のリズミックな交代性収縮から成り立っている。このようなリズミックな顎運動は、脳幹内に存在する介在ニューロンからなる神経回路網により形成されると考えられているが、その詳細は明らかではない。本研究では、吸啜運動のリズムを形成する神経メカニズムを明らかにすることを目的に、新生マウス脳幹脊髄摘出標本を用いて実験を行った。実験には生後0-2日齢のICRマウスを用いた。ジエチルエーテルで深麻酔後断頭し、酸素を飽和させた氷冷人工脳脊髄液中で中脳下丘から第7頸髄までを摘出した。摘出した標本は、記録用チャンバーに移し、酸素を飽和させた室温(25-27°C)の人工脳脊髄液を灌流した。吸啜運動は口唇への触刺激によって誘発されることから、三叉神経を通る感覚神経の電気刺激を行うことにより吸啜様リズムを誘発した。片側の三叉神経感覚根に、持続時間200 μsec,10Hz,100回の電気刺激を与えたところ、刺激終了の数十秒後から、両側の三叉神経運動根にリズミックな神経発射が観察された。このリズミックな神経発射は、灌流液中にNMDA受容体の拮抗薬であるAPVを加えることにより完全に消失した。また、GABA_A受容体の拮抗薬であるSR95531の投与では、神経発射の数が188%まで増加した。一方、グリシン受容体の拮抗薬であるストリキニーネの投与は、神経発射に有意な変化を与えなかった。以上の結果から、吸啜リズムの神経回路網には、NMDA受容体を介する興奮性の入力とGABA、受容体を介する抑制性の入力が重要であることが示唆された。本研究では、吸啜運動のリズムを形成する神経メカニズムを明らかにすることを目的に、新生マウス脳幹-脊髄摘出標本を用いて実験を行った。吸啜運動は、NMDAを灌流液中に投与することによって誘発した。NMDAを投与したことにより誘発された神経活動を三叉神経運動根および舌下神経から記録した。三叉神経運動根からは、二種類のリズミックなバースト発射が記録された。一つは、低周波数のリズムであり、左右の三叉神経で同期して活動がみられた。この低周波数のリズムは、舌下神経の活動とも同期していた。もう一つは、高周波数のリズムで、左右の三叉神経の活動は、独立していた。この高周波数のリズムに対応する活動は、舌下神経には見られなかった。脳幹-脊髄摘出標本を正中部分で完全に切断し、左右片側の標本を作製した。この場合に、三叉神経運動根では、高周波数のリズムのみが記録され、低周波数のリズムは消失した。また、脳幹-脊髄摘出標本の延髄部分のみ左右に分離した標本でも、完全に左右分離した標本と同様に、高周波数のリズムのみが観察された。この際、舌下神経では、低周波数のリズムが観察されていた。延髄の尾側部分のみを左右分離した場合には、三叉神経運動根で、低周波数と高周波数の両方のリズムが観察され、左右切断していない完全な標本で見られるリズムと同じであった。これらの結果から、低周波数のNMDA誘発リズムのリズム形成回路網から、三叉神経運動ニューロンへの入力には、延髄吻側を通る交叉性の介在ニューロンが関与していることが示唆される。
骨髄間質細胞抗原BST-1(CD157)のB細胞支持機能の解析

1.BST-1の2型コラーゲン誘発関節炎(IICA)における役割:DBA/1Jに8回戻した交配した可溶性BST-1トランスジェニックマウスS15(n=6,血中可溶性BST-1濃度平均43±13μg/ml)および野生型マウス(n=8)を用い,不完全フロイントアジュバントとウシ2型コラーゲン100μgを免疫した。S15の発症およびその増加は、野生型に比べて約1週間先行したものの最終的な発症率と重症度に有意差を認めなかった。一方、DBA/1Jに5回戻し交配したBST-1欠損マウス(n=15)のIICA発症率の進展も野生型マウス(n=13)より先行する傾向が認められた(8週目で、BST-1欠損マウス100%、野生型マウス69%)が、重症度に有意差は認められなかった。IICAの病態にBST-1は重要な役割を持たないと考えられた。2.BST-1/CD38二重欠損マウスの作成:CD38とBST-1両遺伝子を欠損したES細胞クローンを選別し、キメラマウスを得た。F1世代の遺伝子解析の結果、同一アリルのBST-1とCD38の欠損とそのgerm line transmissionが確認された。現在、F1世代の交配により、BST-1とCD38遺伝子欠損のホモ接合体を作製中である。3.受容体機能:BST-1遺伝子導入プロB細胞株mBST-1BAF表面のBST-1をモノクローナル抗BST-1抗体で架橋することにより、細胞凝集が認められた。BST-1からのシグナルが細胞接着を誘導することが示された。4.BST-1リガンド:BST-1を結合するB細胞株由来のcDNAライブラリーを調整し、発現クローニング法により、2万クローンのスクリーニングを行ったが、ヒトBST-1リガンドのcDNAは得られなかった。1.可溶性BST-1トランスジェニックマウスとBST-1欠損マウスにおける2型コラ-ゲン誘発関節炎(CIA)の解析:可溶性BST-1トランスジェニックマウスに、CIAの誘発を試みたが、CIA抵抗性の系統であるC57BL/6バックグラウンドでは、発症率が低く評価が困難であった。CIA感受性の系統であるDBA/1Jバックグランドへのバッククロスは、可溶性BST-1トランスジェニックマウスで7世代、BST-1欠損マウスで4世代まで終了しており、予備実験を開始する。2. BST-1/CD38ダブルノックアウトマウスの作成:BST-1遺伝子とCD38遺伝子を欠損したES細胞のクロ-ンを樹立し、キメラマウスを作成中である。今後、gcrm line transmissionの確認および同一遺伝子座のBST-1とCD38が欠損したマウスの選別を行う。さらに、BST-1欠損マウスとCD38欠損マウスの交配によるダブルノックアウトマウス作製も行っている。3. GPI結合型分子BST-1の情報伝達機構の解明:BST-1と会合する分子を免疫沈降法で検出するために、界面活性剤や架橋剤の検討を行なっている。4. BST-1リガンド遺伝子のクロ-ニング:BST-1結合タンパクを発現するヒトBリンフォ-マ細胞株より、発現ベクタ-pEF-BOSに組み込んだcDNAライブラリ-を作製した。

293T細胞に遺伝子導入し、発現クロ-ニング法により2万クロ-ンをスクリ-ニングしたが、BST-1リガンドの遺伝子は得られでいない。さらにスクリ-ニングを継続するとともに、生化学的な解析も試みる。1.BST-1の2型コラーゲン誘発関節炎(IICA)における役割:DBA/1Jに8回戻し交配した可溶性BST-1トランスジェニックマウスS15(n=6,血中可溶性BST-1濃度平均43±13μg/ml)および野性型マウス(n=8)を用い,不完全フロイントアジュバントとウシ2型コラーゲン100μgを免疫した。S15の発症およびその増加は、野生型に比べて約1週間先行したものの最終的な発症率と重症度に有意差を認めなかった。一方、DBA/1Jに5回戻し交配したBST-1欠損マウス(n=15)のIICA発症率の進展も野性型マウス(n=13)より先行する傾向が認められた(8週目で、BST-1欠損マウス100%、野性型マウス69%)が、重症度に有意差は認められなかった。IICAの病態にBST-1は重要な役割を持たないと考えられた。2.BST-1/CD38二重欠損マウスの作製:CD38とBST-1両遺伝子を欠損したES細胞クローンを選別し、キメラマウスを得た。F1世代の遺伝子解析の結果、同一アリル座のBST-1とCD38の欠損とそのgerm line transmissionが確認された。現在、F1世代の交配により、BST-1とCD38遺伝子欠損のホモ接合体を作製中である。3.受容体機能:BST-1遺伝子導入プレB細胞株mBST-1BAF表面のBST-1をモノクローナル抗BST-1抗体で架橋することにより、細胞凝集が認められた。BST-1からのシグナルが細胞接着を誘導することが示された。4.BST-1リガンド:BST-1を結合するB細胞株由来のcDNAライブラリーを調整し、発現クローニング法により、2万クローンのスクリーニングを行ったが、ヒトBST-1リガンドのcDNAは得られなかった。
北陸の次世代省エネルギー基準住宅に適した統合型エネルギーシステムに関する研究

(平成16年度)富山・石川・福井の北陸3県に立地する次世代省エネルギー基準住宅群を対象として、これまで当研究室で継続してきた省エネナビを用いた調査を基に、暖冷房等の用途別・月別・時間帯別エネルギー消費量データを整理し、同住宅の実際のエネルギー消費水準を明示した。1.次世代省エネルギー基準適合住宅への省エネナビの設置とデータ回収2.過去の調査データ整理3.住宅のエネルギー消費に関する文献収集と整理4.住宅エネルギー供給システムに関する文献収集と整理(平成17年度)北陸の次世代省エネルギー基準以上の性能を有する住宅について、電気・ガス・石油類を熱源とする各種住宅エネルギーシステムに関するシミュレーションモデルを作成し、1)から得られる消費用途(冷房・暖房・給湯・調理・照明動力)別エネルギー需要パターンを適用して、先ず、現在普及している設備レベルで一次エネルギー消費の少ないエネルギーシステムを抽出した。1.省エネナビ設置住宅のデータ回収の継続と分析2.住宅エネルギー供給システムに関するシミュレーションモデルの作成(平成18年度)新しいエネルギーソースとして、CO2冷媒ヒートポンプ給湯システム、1kW級小型ガスエンジン及び燃料電池等の分散型エネルギー源を評価対象に加えた検討を実施した。この場合、これら分散型エネルギー源による発電電力を、普及の著しい電磁調理器に回すケースとそうでないケース(ガス調理器)を設定して解析を行うなど、住宅における設備動向ならびに居住者の高齢化を考慮したシステムシミュレーションを実施し、次世代エネルギー源の適用の有効性を評価した。1.統合型住宅エネルギーシステム評価モデルの構築と評価(平成16年度)富山・石川・福井の北陸3県に立地する次世代省エネルギー基準住宅群を対象として、これまで当研究室で継続してきた省エネナビを用いた調査を基に、暖冷房等の用途別・月別・時間帯別エネルギー消費量データを整理し、同住宅の実際のエネルギー消費水準を明示した。1.統合型住宅エネルギーシステム評価モデルの構築と評価1.次世代省エネルギー基準適合住宅への省エネナビの設置とデータ回収北陸に立地する全電化次世代省エネルギー基準住宅について、系統別に省エネナビを設置して、年間連続測定・データ記録を開始した。また、同時に各住宅の居住室と非居住室内に小型温湿度計を設置し、室間温度差・上下温度差ならびに冷暖房の稼動状況を15分間隔でモニターしている。2.過去の調査データ整理研究室で蓄積している、北陸地域の次世代省エネルギー基準住宅・省エネナビ調査データの整理を行った。1)調査対象住宅の概要、2)居住者の基本情報と季節による住まい方、3)使用電気器具の出力、4)消費用途別電力消費データについてである。次に、次年度以降に実施する住宅エネルギー供給システムの解析で必要となる、基本的解析を行った。1)単位床面積当たり総エネルギー消費原単位、2)消費用途別エネルギー消費原単位、3)暖冷房稼動日・時間と暖冷房温度・外気温度の実態、4)熱損失係数のレベルに応じた外気温(あるいは内外温度差)と暖冷房エネルギー消費量の相関分析結果、などについてである。3.住宅のエネルギー消費に関する文献収集と整理北陸地域の次世代省エネルギー基準住宅におけるエネルギー消費の位置付けを行うために、全国の住宅のエネルギー消費に関する報告・文献を、日本建築学会および空気調和・衛生工学会を中心に収集し、戸建住宅のエネルギー消費用途にまで踏み込んで解析したデータについて整理。使用したパラメータは次のとおり。1)面積規模、2)熱性能、3)立地地域、4)家族人数、5)年齢構成、6)ライフスタイル4.住宅エネルギー供給システムに関する文献収集と整理次年度に行う住宅エネルギー供給システムのシミュレーションモデルの作成に先立ち、住宅用エネルギーシステムに関する調査を開始した。主に、現行と次世代の2種類の設備システムに分類して整理作業を進めた。平成17年度の研究目標は次のとおり。北陸の次世代省エネルギー基準以上の性能を有する住宅について、電気・ガス・石油類を熱源とする各種住宅エネルギーシステムに関するシミュレーションモデルを作成し、1)から得られる消費用途(冷房・暖房・給湯・調理・照明動力)別エネルギー需要パターンを適用して、先ず、現在普及している設備レベルで一次エネルギー消費の少ないエネルギーシステムを抽出する。平成17年度に実施した内容は次の2項目である。1.省エネナビ設置住宅のデータ回収の継続と分析省エネナビ設置住宅からのデータ回収作業を継続。取得データを基に、1)系統毎の時刻別エネルギー消費パターン、2)各エネルギー消費の季節性、3)延床面積・家族構成・住まい方とエネルギー消費量との関係、などを解析し、住宅のエネルギー供給システムの適用評価に用いる用途別エネルギー消費パターンを確定した。

2.住宅エネルギー供給システムに関するシミュレーションモデルの作成暖冷房だけでなく、給湯その他の用途に使用されるものも含め、住宅全体の一次エネルギー消費量及びCO_2発生量を、年間でみて最小化出来る設備及びシステムの抽出を目的として、住宅エネルギー供給システムに関するシミュレーションモデルを作成。今年度は、現行の設備システムを主体にモデル化を行い、シミュレーションモデルの正常な入出力と動作状態を確認しつつ、現行の各種設備の組み合わせに基づく、北陸の次世代省エネルギー基準住宅に適した複数の設備システムを抽出し、提示した。本年度の研究の成果については、日本建築学会の全国大会(横浜)および北陸支部大会(福井)で研究発表を行う予定であり、現在投稿原稿を作成している。平成18年度における研究目標は、統合型住宅エネルギーシステムの評価モデルを構築し、次世代省エネルギー基準住宅に適したエネルギーシステムを抽出することにある。新しい住宅エネルギーソースとして、CO_2冷媒ヒートポンプ給湯システム、1kW級小型ガスエンジン及び燃料電池等の分散型エネルギー源を評価対象に加え、検討を実施した。この場合、これら分散型エネルギー源による発電電力を、普及の著しい電磁調理器に回すケースとそうでないケース(ガス調理器)を設定して解析を行うなど、住宅における設備動向を考慮したシステムシミュレーションを実施し、次世代エネルギー源の適用の有効性を評価している。開発したシミュレーションモデルの特長は、次の2つの新しい評価軸を持っていることである。1)燃料電池に代表されるような次世代の分散型発電エネルギー源を評価できるようにプログラム化したこと、2)調理器具を電磁調理器とするかガス器具とするかなどの需要の組み替えや、暖房熱源と給湯熱源を共通化し1台で済ませるなど、いわゆる統合型のエネルギーシステムを評価できるようにプログラム化したこと。次世代エネルギー源としては、1)1kW級燃料電池、2)1kW級小型ガスエンジン、3)3kW級太陽電池、4)CO_2冷媒ヒートポンプ給湯システム、5)高COPヒートポンプ冷暖房システム、の5種類を取り上げ、北陸の次世代省エネルギー基準以上の熱性能を有する住宅に適した統合型エネルギーシステムを提案した。なお、本年度の研究成果については、日本建築学会・環境系論文集に投稿中である。
脳領域依存的なアミロイドベータ蛋白質蓄積の分子機構解明

脳内の領域特異的なアミロイドベータ蛋白質(Ass)蓄積は当該領域の神経細胞膜を形成する脂質分子の構成に依存することが、剖検脳より調製した神経細胞膜の再構成実験により示された。一方、神経細胞膜上にあってAss重合を誘導するガングリオシドとAssとの分子レベルでの相互作用について、ガングリオシドを組み込んだ小型の人工的脂質膜での蛋白質と糖脂質の結合特異性に関する体系的なNMR計測が実施可能であることが実証された。研究成果:本研究はアルツハイマー病(AD)における中核的病理所見であるアミロイドB蛋白質(AB)の脳内における重合・蓄積の分子機構を明らかにすることを目的に、アミロイド形成の脳領域依存性に着目し、神経細胞膜誘導性AB重合の特性に焦点をあて、AD症例を含む高齢者剖検脳より調整した神経細胞膜試料を対象に、解析、検討を行うものである。初年度においては、解析対象とする脳試料を東京都健康長寿医療センター・高齢者ブレインバンクより、AB蓄積初期段階脳及びAB非蓄積脳を抽出し、それらより楔前部(AB蓄積好発部位)及び鳥距溝(AB蓄積回避部位)の切り出しを行った。次に、脳試料から細胞レベルでのAB蓄積開始部位とされる神経突起末端部の細胞膜を調整する方法を培養神経細胞及びマウス脳を対象に確立し、質量分析等による膜脂質組成解析の準備を行った。さらに、神経細胞膜脂質組成の変容のAB重合誘導効果を定量的ならびに定性的に評価することを目的に、有機溶媒による脂質可溶化、マイカ基盤上における再構成膜作製、また再構成膜上でのAB凝集のatomic force microscopyによる観察手法の構築を行った。加えて、特異な脂質組成を有する神経細胞膜上でABが構造変化を獲得し、その結果として可溶性A3の重合を促進する"種"になることを検証することを目的に、NMRによる解析を可能とする微小な人工的ディスク状脂質膜(bicell)の作製とその上でのABの膜結合と構造変化の解析実験を試行した。意義及び重要性:ABの脳内における重合開始の分子機構を明らかにすることはAD研究において、その病態解明のみならず治療薬開発の視点からも最も重要な研究課題の一つである。今年度の研究により、AB蓄積開始部位を有するヒト剖検脳及び対照脳より試料を得て、高い精度での分子レベルの脂質解析を進める準備が整った意義は大きく、二年目以降のデータの導出に期待したい。研究成果:アミロイドβ蛋白質(Aβ)の脳内における重合機構を明らかにすることを目的に、アミロイド形成の脳領域特異性に着目し、神経細胞膜依存的Aβ重合に焦点をあて、AD症例を含む高齢者剖検脳より調整した神経細胞膜試料を対象に解析を行っている。平成23年度においては、大脳皮質より分離した神経突起末端膜からラフト様のマイクロドメインを精製する手法を確立し、質量分析による脂質解析を開始した。また神経細胞膜上におけるAβの構造変化をNMRで解析するべく、GM1の含有量およびバイセルサイズの最適化を行うとともに、NNR計測の溶液条件の最適化を進めた。これにより、GM1含有バイセルが顕著にAβ凝集を誘起する条件を見出した。またバイセル上におけるAβの結合様式を原子レベルで解明するためのNMR緩和解析実験の条件を確立した。さらに、神経細胞膜上におけるAβ重合のAFMによる解析の準備として、シナプトゾームの脂質の各成分の種類を比率を定量化した結果に基づき、GM1、スフィンゴミエリン、コレステロール、リン脂質を含むモデル膜を構築した。このモデル膜に対するGM1クラスター結合性ペプチドの相互作用の解析を行った。一方、重合のAβの神経毒性発現機構の解明を目指して、GM1共存下で神経毒性を有するAβ42及びAβ40溶液の安定的な調製法を確立した。現在、Aβ溶液中の神経毒性体の特性及び検出方法について検討中である。意義及び重要性:Aβの脳内における重合開始の分子機構について、神経細胞膜の脂質構成の解析から物理化学的解析にまで踏み込んで解明を試みる研究はこれまでになされておらず、その意義は極めて大きいといえる。研究成果:本研究は、アルツハイマー病(AD)脳における中核的病理所見であるアミロイドβ蛋白質(Aβ)の凝集・蓄積の分子機構を明らかにすることを目的に、ヒト剖検脳を対象に解析を進めた。平成24年度は、剖検脳リソースの充実を図るべく、68例を高齢者ブレインバンクに登録し、全例に抗Aβ抗体免疫染色を施し、Braakステージ分類、Thal分類、apoE遺伝子多型決定等を行った。次に、脳内におけるAβ重合開始機構について、Aβと神経細胞膜との相互作用を原子間力顕微鏡にて評価することを目的に、剖検脳より調製したシナプトゾームの脂質成分を二分子膜に再構成し、原子間力顕微鏡にて膜の表面構造解析ならびに膜上でのAβの重合動態観察を行い、脳内の領域特異的なAβ蓄積と連関して再構成膜上での濃度依存的なAβ重合誘導が確認された。

さらに、神経細胞膜上にあってAβ重合を誘導する責任分子であるガングリオシドとAβとの分子レベルでの相互作用について、様々なガングリオシドを組み込んだ小型の人工的脂質膜での蛋白質と糖脂質の結合特異性に関する体系的なNMR計測が実施可能であることが実証され、両者の相互作用の初期過程を捉えることに成功した。最後に、神経細胞膜上のガングリオシドに依存して形成されるAβ重合体の神経細胞毒性の特性について、平成23年度に引き続き、Aβ(Aβ42)とガングリオシド(GM1)との反応溶液中の神経細胞毒性体の解析法を検討し、神経細胞毒性を発現する分子形態を捕捉することを目的に、本毒性体を認識する特異抗体の作製へと展開した。本研究により、AD脳におけるAβ重合開始過程における神経細胞膜、特にガングリオシドの役割が分子レベルでさらに明らかとなり、神経細胞毒性誘導分子形態の実態解明へと展開が図れたことの意義は大きい。本研究課題の中核となるヒト脳神経細胞膜脂質組成に関する質量分析については、ほぼ計画通り進行し、そのアミロイドβ蛋白質(Aβ)重合誘導性に関する原子間顕微鏡を用いた検討の準備に移行しつつある。以上より、おおむね当初の計画通りに進展していると判断される。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究期間中に本研究課題の脳領域異存的なアミロイドβ蛋白質(Aβ)の重合及び蓄積への神経細胞膜脂質組成の影響について、当初計画に従って進める。一方、平成23年度の研究で得られた神経細胞膜構成脂質依存的な非アミロイド性Aβ重合について、神経生物学的視点から、鋭意研究を進める。研究課題の推進に特に支障となる問題はない。