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自然免疫システムによる骨代謝調節機構の解明

自然免疫システムを司るToll-like receptors (TLRs)の活性化は炎症性骨破壊を誘発することが知られている。我々は、合成二本鎖RNAでありTLR3のリガンドとして知られるPoly(I:C)が、骨粗鬆症モデルマウスの骨密度を高める作用を持つことを発見した。詳細な解析の結果、Poly(I:C)は破骨細胞の前駆細胞におけるインターフェロン-βの産生とSTAT-1依存的な細胞内シグナルの活性化を介して破骨細胞分化を抑制することが明らかとなった。すなわち、Poly(I:C)とTLR3は、炎症性骨破壊治療のための新たな戦略において、重要な構成要素となりうることが示唆された。自然免疫システムは微生物感染に対する防御機構であり、Toll-likereceptors(TLRs)とよばれる一群の受容体が微生物の構成成分を認識し、免疫応答を惹起する役割を担っている。このシステムは微生物感染を原因とする歯周病に伴う骨破壊にも深く関与することが示唆されているが、約10種類存在するTLRsがそれぞれどのような機能をもつかは不明である。本研究では、TLRsを中心とした自然免疫システムが骨代謝において担う役割について明らかにするため、生体・細胞・分子レベルでそれぞれのTLRsの機能解析をおこない、その結果に基づいて炎症性骨破壊の原因究明や、その治療方法の開発および骨再生への応用を検討する。2011年度は、TLR3のリガンドであるPoly(I:C)が骨代謝に与える影響と、その分子メカニズムについて検討した。Poly(I:C)を骨粗鬆症モデルマウスに投与したところ、破骨細胞が減少し、骨密度が有意に上昇した。Poly(I:C)は破骨前駆細胞に破骨細胞の分化抑制因子であるインターフェロンβの産生を促した。この因子がインターフェロン受容体とその下流にあるSTAT1という転写因子を介して破骨細胞分化を抑制していることが明らかとなった。これらの結果は、骨粗鬆症の新しい治療方法として自然免疫システムが有用であることを示唆する。本研究ではToll-like receptors (TLRs)とよばれる一群の受容体が骨代謝および骨病態においてどのような役割を担うのか、生体・細胞・分子レベルで解析し、得られた結果に立脚した骨疾患治療および骨再生方法の開発を目的とする。平成24年度までにTLR3が強力な破骨細胞分化抑制作用を発揮し、骨形成を誘導作用を持つことを明らかにした。平成25年度は、その作用機序を解明することに成功した。すなわち、TLR3のシグナルは細胞内シグナル伝達因子であるSTAT1を介して破骨細胞分化抑制因子であるIFN-β産生を誘導し、骨吸収を抑制することで骨量を増加させるというものである。さらに、平成25年度はボウタイモデル動物を用いてTLR4の機能について解析した。骨形成誘導因子であるBMP-2を用いた骨再生医療を想定し、細菌感染が骨形成誘導に及す影響について解析した。菌体成分LPS(TLR4のリガンド)とBMP-2を同時にマウスに投与したところ、BMP-2による骨形成誘導が強力に抑制された。その作用機序について解析した結果、LPSがIL-1βを介して骨形成を抑制していることが判明した。以上の結果は、本研究の目的である自然免疫システムと骨代謝調節機構の関係を生体、細胞および分子レベルで解明し、病態との関係についても新しい知見を得ることができたことを意味し、計画当初の期待される成果を得ることができたと言える。Toll-like receptors (TLRs)は生体内に侵入してきた細菌やウイルスなどの構成成分を認識し、免疫応答を惹起する微生物センサーである。すでに9種類以上のTLRs(マウス:TLR19、ヒト:TLR110)が同定されており、それぞれ特有のリガンドをもつ。細菌の構成成分の1つであるLipopolysaccharide (LPS)はTLR4のリガンドであり、歯周病における炎症とそれに伴う骨破壊を誘発するが、他のTLRsと骨代謝との関係については不明な点が多い。本研究では、ウイルスの二本鎖RNAや人工的に合成した二本鎖RNAであるPoly(I:C)[ポリイノシン・ポリシチジン]を認識するTLR3が、骨代謝に及ぼす影響とその作用メカニズムについて解析した。Poly(I:C)またはLPSをマウスの頭蓋骨上部に注射し、5日後にμCTを用いて解析したところ、LPSは骨破壊を誘発したのに対し、Poly(I:C)は骨破壊を誘発しなかった。次に卵巣摘出を施した骨粗鬆症モデルマウスにPoly(I:C)を尾静脈経由で3日毎に4週間投与し、脛骨の骨量を計測した。その結果、Poly(I:C)

投与群の骨量は、対照群(リン酸緩衝液投与)の1.6倍に増加していた。この作用は正常なマウスを用いた時も同様に認められた。Poly(I:C)を投与したマウスの脛骨切片を解析したところ、破骨細胞の数が対照群の半分に減少しており、Poly(I:C)が生体内で破骨細胞分化を抑制したことが判明した。その抑制メカニズムを解明するため、破骨細胞の分化誘導培養系にPoly(I:C)を添加したところ、濃度依存的な分化抑制作用が認められた。予定通り、TLR3がもつ骨密度上昇作用の分子メカニズムの解明に成功したから。25年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度の目標は、自然免疫シグナルがどのようなメカニズムで骨量を増加させるか、そのメカニズムを解明することであった。解析の結果、TLR3リガンドであるPoly(I:C)が破骨細胞の分化を抑制することによって、骨量が増加することが、細胞および分子レベルで明らかとなった。このことから、H24年度はおおむね順調に進展したといえる。TLR3が癌の骨転移に対して抑制作用を示すか否か検討するとともに、TLR8が破骨細胞分化に与える作用を解析する。1)骨粗鬆症モデル:マウスの卵巣を摘出し骨粗鬆症を誘発する。同時に各種TLRリガンドを投与して骨粗鬆症に与える影響を解析する。2)癌の骨転移モデル:骨転移能をもつマウスB16F10メラノーマ細胞株またはヒト口腔扁平上皮癌細胞株BHYをマウスの左心室に注入し骨転移を誘導する。3)炎症性骨破壊モデル:マウスの頭蓋骨の骨膜付近に各TLRリガンドを注入し、炎症性骨破壊を誘発させ、骨に与える影響を組織学的に解析する。4)関節リウマチモデル:II型コラーゲン抗体とLPSをマウスに投与し、関節リウマチを発症させ、病態を解析する。4)細胞レベルのメカニズム解析:上記骨疾患モデルマウスの組織切片を作製し、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、免疫細胞の変化を解析する。それぞれの病態を反映した細胞培養系を用いて、TLRがこれらの細胞の分化、機能、生存に与える影響を解析する。5)分子レベルのメカニズム解析:上記骨疾患モデルの罹患部よりRNAを抽出し、DNAマイクロアレイやプロテインチップを用いてTLRリガンド投与前と後の病態における遺伝子発現レベルの変化を網羅的に解析する。これらの解析結果に基づいて、IRFsなどTLRシグナルに関与する転写因子の役割をRNAiやエピジェネティクス解析を用いて解明する。さらに、TLR3などの遺伝子欠損マウスや、可溶型TLRトランスジェニックマウスを用いて、骨疾患の発症機序を解明する。6)Poly(I:C)の作用:TLR3リガンドPoly(I:C)や、他のTLRリガンドが上記の骨疾患治療に効果があるか否か、各病態モデルマウスに投与して影響を解析する。
家庭用燃料電池のための高密度排熱貯蔵・高効率熱利用システムの開発に関する研究

本研究は、家庭用燃料電池からの排熱を高密度に貯蔵し、かつ高効率に熱利用するシステムを提案し、実証試験によりその導入可能性を明らかにすることを目的として行われた。研究成果の概要は以下のとおりである。第一に、有望な潜熱蓄熱材(以下PCMとする)として、硝酸マグネシウム6水和物と塩化マグネシウム6水和物の混合物の適用を検討した。その結果、工業用製品レベルでも熱特性と耐久性に関して、実用上の問題がないことを明らかにした。また、腐食実験により、タンクや熱交換器にはSUS316または,アルミニウムの使用が適することがわかった。第二に、高性能太陽熱集熱器と潜熱・顕熱蓄熱を有する給湯システムの開発を行った。まず、真空管型集熱器と潜熱・顕熱蓄熱システムを有する太陽熱給湯システムを実証規模で構築した。数値解析では、札幌における全蓄熱槽容量に対するPCM容量の最適割合範囲は約0.3-0.4であり、PCMの融点は60°C前後が有効であると予測された。このことは、全蓄熱容量325LでPCM容量割合0.24の蓄熱槽を有する実証実験システムの妥当性を裏付けるものであった。国内の代表各都市に同システムを適用した場合の年間エネルギー削減効果について検討した結果、北海道・東北においては必要給湯負荷の約60%、東北以南の都市においては約70%を集熱システムに依存できるという結果が得られた。第三には、マイクロカプセルスラリーPCM(以下MCS-PCMと表記)の温熱蓄熱システムヘの応用について検討した。MCS-PCM使用時には、固液層に関わらず自然対流が常に生じるため、長方形型のフィンを用いる場合に放熱速度は大きくなった。次に、実規模蓄熱槽を用いてMCS-PCMの蓄放熱実験を行った。連続熱回収運転における熱回収量は、75°C蓄熱状態から冷水流量7L/minで回収した場合、水の15%増となった。また、総括伝熱係数の小さいMCS-PCMは、間欠回収運転を行うことでさらに熱回収量を増加でき、実用時に有利な結果が得られた。本研究は、硝酸マグネシウム6水和物と塩化マグネシウム6水和物の混合物を用いて、家庭用燃料電池や都市廃熱、さらには自然エネルギーを高密度に貯蔵して、高効率に熱利用するシステムの開発を行うことを目的としている。本年度はまず第1に従来試薬ベースで行っていた蓄熱材の各種試験を工業品ベースで行い、10wt%,20wt%,30wt%,40wt%の4種類の混合物について熱利用の評価に欠かせない温度とエンタルビーの関係を小型熱応答試験装置により求めた.同時に、混合物の密度、粘性係数などの基礎物性値の測定を行った。一方、実使用評価には欠かせない1000回までの繰り返しに対する耐久性試験を行い、相変化温度、相変化熱から判断して、問題がないことを明らかにした。さらに、100°C、30日間の腐食性の試験を行い、SUS316、アルミニウムに対して腐食性がほとんど無いことを明らかにした。また、高密度排熱貯蔵・高効率熱利用システムについては、蓄熱・熱回収に関する基礎実験を行い、そのときの熱移動係数を明らかにすると共に、本混合物を用いた蓄熱・熱回収に関する数値シミュレーションプログラムを開発して、実測で得られた熱移動係数を用いて都市排熱利用地域熱熱供給施設に本蓄熱材を適用した場合の負荷平準化効果および省エネルギー性について検討を行った。

一方、潜熱・顕熱ハイブリッド蓄熱システムを提案し、これを高性能真空管式太陽熱集熱器と組み合わせた場合の民生用給湯システムの開発を行った。まずシステム解析数値シミュレーターを構築し、適用地域によって異なる最適容量・相変化温度を検討した。次に、札幌に適した蓄熱温度・蓄熱容量に従い、実システムを北海道大学工学部環境工学科屋上に設置し、2003年2月より実測を始めた。本研究では、家庭用燃料電池からの排熱を高密度かつ高効率に貯蔵する方法として、その温度レベルである60-80°Cに相変化温度帯を持つ潜熱蓄熱を採用してきた。本年度は、潜熱蓄熱材(以下PCMとする)として、これまでに検討を行ってきた硝酸マグネシウム6水和物と塩化マグネシウム6水和物の混合物(無機水和物PCMとする)に加え、新たに、凝固時にも液状であり流動性を維持するマイクロカプセルスラリーPCM(MCS-PCM)を採用して、検討を行った。まず、MCS-PCMの熱特性を測定した結果、主たる相変化温度は54.3-57.9°Cであり、40-60°Cにおける比エンタルピー差は水の約1.9倍程度であった。次に、内径0.98m、高さ1.1mの蓄熱槽内に4種類の熱交換器(長方形フィン、円形フィン34枚、円形フィン17枚、単管)を設置して、熱交換特性を比較した。自然対流が常に生じるMCS-PCMを用いた場合には、自然対流の効果を多く得られる長方形フィン型の熱交換器が優位であった。他方、無機水和物PCMでは、凝固時の熱抵抗を均一に小さくできる円形フィン34枚型が有用であることが示された。さらに、MCS-PCMを500Lの実大蓄熱槽内に適用し、蓄放熱実験を行った。MCS-PCMを用いた場合、熱回収実験において、連続回収運転における熱回収量は水に比べ15%増加した。さらにMCS-PCMでは間欠回収運転を行うことにより、熱回収量を増加させることができ、実際の使用時に有用な結果が得られた。一方、昨年度構築した高性能真空管式太陽熱集熱器を用いた太陽熱利用給湯システムへの適用を想定した、システム解析数値シミュレーションを行った。MCS-PCMを蓄熱材として利用する場合には、水蓄熱と比較して年間で560MJの補助熱源エネルギー消費量を削減できることがわかった。また、MCS-PCMの利用可能エンタルピーを4倍とした場合には、同消費量の削減量は1423MJとなることが示された。
電気二重層コンデンサの充電方式の研究

一般的に耐電圧の低い電気二重層コンデンサ(EDLC)を直列接続し電圧を高くして利用する場合、EDLCを直列接続したまま充電すると高い電圧の充電器が必要になるとともに複数のEDLCの電圧アンバランスが生じる。そこで、充電時には並列接続、放電時には直列接続に変更できるダイオード16個とリレー7個を用いた簡単な回路を提案し実験にて効果を確認した。定格233F、15VのEDLC8個用い、直流モータを負荷として、負荷条件を変えて実験した結果、80W負荷で1900秒間放電可能で、充放電における電圧アンバランスは概ね±1%以内に抑制でき、充放電のエネルギー効率としては7080%という良好な結果が得られた。前年度に製作した装置に個別コンデンサの電圧計測回路、コンデンサの初期強制放電回路、充放電モード切替用のリレー回路およびシーケンス回路を新たに製作追加した。これまでは個別コンデンサの電圧はメモリハイコーダによる計測のみで確認していたが専用のディジタルメータを8個接続して常時目視観測可能にした。また充電開始の際に個別のコンデンサの残留電荷を放電させるために従来は個別に手動で抵抗に電荷を放電させていたのを止め一括で放電できる回路を製作した。さらに充放電モードを信号レベルで切替を可能にするためのリレーとシーケンス回路を製作した。以上の回路を追加して実験の効率化を図ったうえで次の実験を行った。負荷直流モータの定格は、出力2.2kW、直流100V、29A、回転数1500rpmである。このモータに直流発電機が軸直結されており、発電機出力には電球負荷(60W×複数個)が接続される。1)並列充電モードにおいて直流電源を用いて17A定電流充電を行い、約1200秒で8個の電気二重層コンデンサの充電電圧が10.8Vに均等に充電でき、電圧のばらつきも0.5%以内であることを確認した。2)充電終了後コンデンサを直列に接続切替を行い電圧は86Vとなった。3)コンデンサに直流モータを接続し始動抵抗器を利用して始動した。このとき回転数は定格1500rpmで電球負荷は開放し無負荷とした。4)始動後、電球負荷19個、1140W、を400秒かけて順次投入した。最大電流は10Aに達し、その後、モータは120秒間にわたり回転を継続して停止した。放電期間中もコンデンサ電圧のばらつきは1%以下と良好であった。また、充電時の電源供給エネルギーは174000ジュール、発電機端での放出エネルギーは125000ジュールであった。以上をまとめると充電モードは1200秒、接続切替は瞬時、負荷駆動モードは520秒となる。前年度までに製作した装置を用いて、充電オン、オフ、直列接続オン、放電オンというリレーシーケンスに設定して実験を行った。負荷装置としては直流電動機(75W)と軸直結した直流発電機を用い、発電機には20W電球負荷を4個用いた。負荷は個々にオンオフが可能であるので、電動機の負荷としては080W(最大過負荷107%)の間で特性を計測することができる。各負荷状態において、EDLCが完全に放電し切るまでの時間とEDLCに充電したエネルギーと放電したエネルギーから充放電効率を計測・計算した。電球4個では1,900秒、80.1%、3個では2,500秒、74.4%、2個では2,800秒、85.3%、1個では3,600秒、0個では7,300秒、81.3%となった。充放電効率の平均は78.7%となった。次に損失の内訳について計測・計算した。損失としては充電回路に用いるダイオード回路、放電回路に用いるリレー回路およびコンデンサの内部抵抗による損失である。まず、充電回路にはダイオードを合計16個使用しておりこれらの合計は充電エネルギーの約5.6%であった。さらに切替回路の損失を評価した。機械式のリレーを用いており、定常オン抵抗は1個当り最大で0.1Ωである。8個のEDLC間を接続する7個のリレーと電動機に接続するリレー2個の計9個のリレーを流れる電流の実測値から算出した結果。充電したエネルギーの約0.2%がリレー損失になった。また放電時にEDLCの内部で消費されるエネルギーは21.1%となった。次に負荷変化時の特性について検討した。電球の個数を04個まで1個ずつ増減しさせたところ、1個の電球について電流が0.5A変化、EDLCの電圧は8直列のEDLCの端子電圧86V付近において0.1V変化した。さらに、4個の電球を同時にオンオフする実験を行い、電流が2A増減し、電圧は0.4V変化した。

電気二重層コンデンサを8個並列接続したまま低電圧で充電し、充電完了後に直列に接続を切り替え、8倍の電圧に充電された電気二重層コンデンサによる負荷への放電へ移行する。この回路をダイオード16個、スイッチ7個という簡素な部品で構成し、装置を製作して実験により動作モードごとに問題がないか検証した。今年度の目的である抵抗負荷での充放電回路の基本動作検証について達成できた。なおスイッチには当初、半導体リレーを使用することとしていたが放電時に電圧が零迄放電できず、45V程度残ることが判明し、充電エネルギーの有効利用という観点からは問題なので、機械式リレーを使用することにした。その結果、ほぼ零の0.4V程度まで放電でき動作上も問題がないことを確認した。具体的な結果を以下に述べる。1)並列充電モードにおいて、12Vの直流電源を用いて8個の電気二重層コンデンサの充電電圧が0.5%以内のばらつきで等しくなることを確認した。同様に交流電源(5V)を用いて充電を行い同様に0.5%以内のばらつきで均等な充電ができていることを確認した。充電終了後、各コンデンサの電圧がダイオードにより放電が阻止されて電圧がダイオード2個分の順方向電圧降下分だけ低い10.9Vに維持できていることを確認した。2)スイッチをオンし、コンデンサの端子間を相互に接続して8個のコンデンサを直列に接続して、合計電圧10.9Vの約8倍である87Vになることを確認した。3)抵抗負荷を接続し過電圧が発生せずに負荷を通してコンデンサの蓄積電荷が放電できることを確認した。全コンデンサが放電しきるまで放電を行い、放電後の残電圧としては8個で0.45V程度になった。4)一連の動作モードに必要な時間を計測した結果、並列充電時間1200秒、接続切替はほぼ瞬時、抵抗負荷放電時間600秒となった。本年度の目的であるモータ負荷での基本動作の確認に関する成果は、以下の理由から十分に得られたと考える。1)実規模のモータについて実際に1140W、10Aという実負荷をとって定格回転数である1500rpmまで駆動できた。2)放電時の8個の電気二重層コンデンサの充電電圧のばらつきも1%以内という値は非常に小さな値である。3)充放電の効率はエネルギー比から71%となり、この値はモータや発電機両者の効率(9095%程度)を含んでいるので、コンデンサのみの効率としては7888%という高い値が得られたことになる。4)前年度は配線切替によりモードを変更していたがシーケンス回路の導入により、信号の切替のみで動作モードの変更ができるようになった。5)各動作モードでの所要時間を把握できた。なお、今年度は負荷を無負荷から増やしていく方向の試験であったが、負荷を減らしていく動作モード(回生モード)での詳細な検証が残されている。以下の理由から均等な充電と高い電圧からの放電ならびに簡易な回路での実現という目的に関する本年度分の成果は十分に得られたと考える。1)並列充電において、8個の電気二重層コンデンサの充電電圧のばらつきが0.5%以内という値は非常に小さな値である。電源電圧12Vに対して充電電圧が10.9Vはダイオード2個分の順方向電圧降下分にほぼ等しい値である。使用したコンデンサの定格電圧が15Vで余裕を考慮して12Vに設定したが、ばらつきが小さいことと併せて考えると充電電圧をさらに1V程度は高くできると考えられる。2)スイッチをオンし8個のコンデンサを直列にして合計電圧が10.9Vの約8倍である87Vになったのは計画通りである。
ERMタンパク質に注目した、細胞膜上におけるトランスポーターの制御機構の解明

Genipinはラットにおいては胆管側膜におけるmultidrug resistance-associated protein(MRP2)の発現量を上昇させ利胆作用を示すが、その作用は私が計画していたin vivo(マウス)及びin vitro系では異なる薬理作用を有したことから、解析を断念した。また、尿酸及びグリシルサルコシンの体内動態はradixin KOマウスにおいて野生型に比べ有意な変化が確認されなかった。私は、近年特に関心が高まっているoseltamivir及びその活性型分子であるRo64-0802の中枢移行性並びに中枢薬理について焦点を当てた。私は、血液脳関門、血液脳脊髄液関門、腎臓近位尿細管上皮細胞において互いに異なる膜上に発現しているorganic anion transporter(OAT)3及びMRP4がRo64-0802を基質にすることを明らかとした。さらに、それぞれのトランスポーターの遺伝子欠損マウスを用いて、Ro64-0802がOat3、MRP4によるベクトル輸送によって中枢及び末梢組織から効率的に体外に排泄されていることを明らかとした。両トランスポーターには、遺伝子変異に伴う機能低下が複数報告されている。実際に私は、OAT3の単位タンパクあたりの機能が約90%低下する遺伝子変異、I175V及びA38Vを見出した。こうしたoseltamivir及びRo64-0802の体内動態制御因子の遺伝子変異による機能変化を考慮し、モンテカルロシミュレーションにより両化合物の脳内暴露の個人間変動を予測した。特にRo64-0802の脳内暴露は、5万人に数人規模の極めて少数の服用者集団において平均値より10倍程度上昇することを明らかとした。私の予測法は個人間のばらつきを考慮に入れたリスク評価法であり極めて新しく、示唆に富んだものであると考える。
多成分蛍光標識ペプチドライブラリーを用いた薬剤検索システムの構築

がん細胞だけに特異的に結合するペプチドの探索は、世界の研究者が試みているがいまだに成功していない。その大きな原因は、生体中から離れた条件で探索が行われていることにある。本研究では、特定のがん細胞にだけ結合するペプチドを生体中に近い条件で探索する新手法を構築する。すなわち、多数の異なる蛍光基で標識されたペプチドライブラリーを作製し、その溶液を細胞と接触させて、細胞に結合あるいは導入されたペプチドをその蛍光スペクトルから同定する。これを繰り返すことによって、もっとも強く細胞に結合するペプチドを見出す。実際に、乳がん細胞に結合する8量体ペプチドを見出すことに成功した。20は、以下の研究を行ない、多成分蛍光標識法を確立させた。(1)多成分蛍光標識に用いる蛍光性アミノ酸の探索(2)蛍光性アミノ酸自体が細胞に認識されないようにするステルス標識法の確立(3)11種類の蛍光性アミノ酸を用いたA431細胞結合性ペプチドの探索(4)A431細胞結合ペプチドの細胞結合の共焦点蛍光顕微鏡による観察(1)30種類以上の蛍光性非天然アミノ酸を合成し、蛍光強度が強くまた他の蛍光性アミノ酸とのスペクトルの重なりが少ないものを選択した。さらに蛍光基自体がA431細胞に非特異的に結合するものを排除した。その結果.20年6月の時点で11種類の蛍光性アミノ酸が使用できることが明らかになった。また20年2月の時点では15種類のアミノ酸が使用可能になった。(2)蛍光性アミノ酸(Fl)はそれ自体が細胞結合性を持つことが予想される。細胞表面が負に荷電していることを考え、蛍光基周辺に負電荷をもつグルタミン酸(Glu)を配置したペプチドを作成した。具体的にはAc-Glu-Glu-Fl-Glu-Glu一配列とすることにより、上記11種類あるいは15種類については細胞結合性がなくなった。(3)11種類の蛍光性アミノ酸で8個のアミノ酸からなるペプチドライブラリーを標識し、A431細胞に結合する配列を探索した。スクリーニングのサイクルを経るごとに細胞に結合するペプチドの絶対量が増加してくることから、この方法が期待通りに働いていることが示唆された。スクリーニングの結果、数種類のA431細胞結合配列が見出された。(4)見出された配列を持つペプチドを培養A431細胞と接触させ、共焦点顕微鏡で観察したところ、期待通り蛍光基が細胞の表面に結合していることが観察された。以上の結果から、20年度の研究において多成分蛍光標識法の原理が確立できた。20年度の研究で多成分蛍光標識法がほぼ確立できた。さらに実際にA431細胞に結合するペプチドの探索を行った。その結果いくつかのペプチドが細胞に結合することが確認できた。しかしそれらのペプチドは他のがん細胞や正常細胞にも強く結合することがわかった。そこで21年度では、特定のがん細胞には強く結合し、他の(がん)細胞には結合しないペプチドのスクリーニングを行った。ペプチドライブラリーとしては、8量体ペプチドのN末端から4番目と5番目のアミノ酸をそれぞれ(I, v, f, m, a, t, s, w, y, p, h, n, d,r)の14種類の内の1種類に固定した、14x14種類のものを用いた。その結果、特定のペプチド群が細胞に強く結合することが見出された。つまり細胞のペプチド識別能力は高いことが明らかになった。しかし、ある細胞に結合するペプチド群は、多くの場合他の細胞にもよく結合することがわかった。つまりペプチドの細胞識別能力は高くないことがわかった。ただし、いくつかのペプチドについては、かなりの細胞識別力があることがわかった。またこれらの結果は共焦点顕微鏡観察においても確認された。これらの結果を踏まえ、22年度では細胞識別力のあるペプチドを基にしてスクリーニングを進め、目的である特定のがん細胞だけに結合するペプチドを見出す予定である。昨年度までに,他成分解析に利用できる種々の蛍光性アミノ酸を見出していた。本年度はそれらをペプチドライブラリーに導入し、蛋白質に結合するペプチドや、特定のがん細胞に結合するペプチドを見出す研究を行った。この時、がん細胞に強く結合するペプチドを見出すのではなく、特定のがん細胞にだけ結合するペプチドの探索に重点を置いた。これは昨年度までの結果で、がん細胞に結合するペプチドは比較的容易に見出すことができるが、細胞特異的に結合するペプチドの探索は困難であることがわかったからである。また、本年度ではペプチドスクリーニング条件をより生体条件に近い37°Cで行うことにした。昨年度まで行っていた4°Cではペプチドは細胞表面に集積していたが、37°Cではエンドサイトーシスによりペプチドは細胞内に入ることが予想される。この条件で探索を行った結果、オクタペプチドの内中央の6個のアミノ酸までを最適化することに成功した。

このペプチドはヒト乳がん由来のがん細胞であるMCF7に強く結合するが、その他のがん由来細胞であるA431やPC3にはその1/3程度以下しか結合しないことがわかった。また共焦点顕微鏡観察の結果、それらのペプチドはがん細胞の内部にエンドサイトーシスによって導入されていることが明かになった。このように3年間の研究により、他成分蛍光法により今までになかった特異性と親和力をもつペプチドが見出された。今後はこれらのペプチドをより実用的なものにするため,マウスインビボ実験に進める必要がある。
量子ビームの相補利用でみる多様な秩序変数による量子臨界現象

量子臨界現象を引き起こす秩序変数の担い手である,磁性・格子・価数,及びその結合に着目し,各々の秩序波数や微視的な電子状態について調べている.今年度はカイラル磁性体であるEuPtSiの有限磁場下の転移温度近傍において,f電子系で初となる磁気スキルミオン格子の実現が高い注目を集めており,その検証に重点をおいて研究を行った.EuPtSiについて,中性子と放射光X線を相補的に用いた単結晶散乱実験から,ゼロ磁場でカイラリティをもつヘリカル磁気構造をとること,磁場の印加に伴い,triple-q構造に起因した特徴的な六角形の散乱パターンへと変化し,磁気スキルミオン相が出現していることを決定した.これらの振る舞いは,典型物質であるMnSiと酷似しているが,周期が1/10と短い上に,印加磁場方向に対し強い異方性を有するなど,新たな特徴も見出した.格子系として研究している(Sr,Ca)3Rh4Sn13については,低温放射光単結晶回折実験を実施し,量子臨界点近傍の濃度において,構造相転移の秩序波数が変化することを見出した.これは今までに予想されていなかった新たな振る舞いであり,現在詳細な追加実験を進めている。また格子系のもう一つLu(Pd,Pt)2Inについては,主に放射光X線非弾性散乱から、当該化合物の2次構造相転移がソフトフォノンによって引き起こされる点を明らかにし、(Sr,Ca)3Rh4Sn13と類似性など、系統的な理解に向けた着実な進展が得られた.現在,成果をまとめている.以上,様々な秩序変数を対象とした物質系について,順調に成果が得られている.国内の研究炉の再稼働が遅れているため、主に環境整備や実験の実施について若干の遅れがある.一方で,実施した実験については,それぞれ重要な成果が得られており,全体的な進捗に大きな問題はない.本年度得られた成果を発展させ,各秩序変数に対応した量子臨界現象の理解に迫る.カイラル磁性体のEuPtSiの磁気スキルミオンについては,印加磁場異方性など,これまでの物質系にはない特徴をまとめる.また格子系の(Sr,Ca)3Rh4Sn13については,今回発見した量子臨界点近傍の新たな構造相転移について研究を進める.普遍的な理解を目的として,さらなる物質系にも同様の研究を発展させることを計画している.中途採択で半年の研究期間となった初年度は,量子臨界現象を引き起こす秩序変数を担う,磁性・格子・価数,及びその結合の各々に着目し,秩序波数や微視的な電子状態について調べた.磁性に関しては,YbRh2Si2の量子臨界点に隣接している磁気相について,Co置換系試料を対象とした中性子散乱実験を行い,新たな秩序波数を明らかにすることに成功した.格子に絡む(Sr,Ca)3T4Sn13(T:Rh, Ir)については,秩序波数やソフトモードの濃度依存性を放射光X線非弾性散乱を中心に調べ,量子臨界点に向けた変化を捉えることに成功した.磁性と価数が結合したEu系については,基準となるEu3価のJ多重項励起構造の決定を試み,EuPd3を対象とした中性子非弾性散乱実験から,3価金属における多重項励起の観測に成功し,価数揺動状態の解明の鍵となる重要な知見を得るという成果に繋がった.また磁性と格子が動的に結合するRAl2(R:希土類)について,中性子・放射光を相補的に用いた非弾性散乱実験により,両者の結合状態形成の理解に向けたデータを得ることが出来た.以上,初年度には,様々な秩序変数を対象とした物質系について,主に秩序波数などの基礎的データが得られた点で,重要な成果が得られた.採択が年度半ばになったことにより,主に環境整備や実験の実施について若干の遅れがある.一方で,実施した実験については,それぞれ重要な成果が得られており,全体的な進捗に大きな問題はない.量子臨界現象を引き起こす秩序変数の担い手として考えられる,磁性・格子・価数,及びその結合に着目し,各々の秩序波数や微視的な電子状態について調べてきた.今年度は,格子系として(Sr,Ca)3Rh4Sn13について着目し,秩序波数やソフトモードの濃度依存性を放射光X線非弾性散乱を中心に調べ,ソフトフォノンによりT*の構造相転移が引き起こされること、またソフト化の濃度依存性が量子臨界点に向けてT*0へと向かう振る舞いを捉えることに成功した.現在、成果をまとめて投稿中である。また格子系では新たな系としてLu(Pd,Pt)2Inについて実験に着手した。主に放射光X線非弾性散乱から、当該化合物の2次構造相転移がソフトフォノンによって引き起こされる点を明らかにし、(Sr,Ca)3Rh4Sn13との類似性等、系統的な理解に向けた着実な進展が得られた。磁性と価数が結合したEu系については,価数揺動系の中でもEu3価に比較的近いEuPd2Si2について中性子非弾性散乱実験から,多重項励起の観測に成功し,価数と多重項励起の間の相関が得られるという成果に繋がった.

また同じEu系では,カイラル結晶構造を反映した特異な磁気秩序が期待されるEuPtSiについて中性子・放射光を相補的に用いた回折実験により,両者の強い結合状態を示す磁気構造の決定に成功した.以上,初年度に引き続き,様々な秩序変数を対象とした物質系について,主に秩序波数の量子臨界点に向けた系統的な変化について重要な成果が得られた.国内の研究炉の再稼働が遅れたため、主に環境整備や実験の実施について若干の遅れがある.一方で,実施した実験については,それぞれ重要な成果が得られており,全体的な進捗に大きな問題はない.量子臨界現象を引き起こす秩序変数の担い手である,磁性・格子・価数,及びその結合に着目し,各々の秩序波数や微視的な電子状態について調べている.今年度はカイラル磁性体であるEuPtSiの有限磁場下の転移温度近傍において,f電子系で初となる磁気スキルミオン格子の実現が高い注目を集めており,その検証に重点をおいて研究を行った.EuPtSiについて,中性子と放射光X線を相補的に用いた単結晶散乱実験から,ゼロ磁場でカイラリティをもつヘリカル磁気構造をとること,磁場の印加に伴い,triple-q構造に起因した特徴的な六角形の散乱パターンへと変化し,磁気スキルミオン相が出現していることを決定した.これらの振る舞いは,典型物質であるMnSiと酷似しているが,周期が1/10と短い上に,印加磁場方向に対し強い異方性を有するなど,新たな特徴も見出した.格子系として研究している(Sr,Ca)3Rh4Sn13については,低温放射光単結晶回折実験を実施し,量子臨界点近傍の濃度において,構造相転移の秩序波数が変化することを見出した.これは今までに予想されていなかった新たな振る舞いであり,現在詳細な追加実験を進めている。また格子系のもう一つLu(Pd,Pt)2Inについては,主に放射光X線非弾性散乱から、当該化合物の2次構造相転移がソフトフォノンによって引き起こされる点を明らかにし、(Sr,Ca)3Rh4Sn13と類似性など、系統的な理解に向けた着実な進展が得られた.現在,成果をまとめている.以上,様々な秩序変数を対象とした物質系について,順調に成果が得られている.国内の研究炉の再稼働が遅れているため、主に環境整備や実験の実施について若干の遅れがある.一方で,実施した実験については,それぞれ重要な成果が得られており,全体的な進捗に大きな問題はない.本年度得られた成果を発展させ,各秩序変数に対応した量子臨界現象の理解に迫る.またより普遍的な理解を目的として,他の物質系にも同様の研究を発展させることを計画している本年度得られた成果を発展させ,各秩序変数に対応した量子臨界現象の理解に迫る.またより普遍的な理解を目的として,さらなる物質系にも同様の研究を発展させることを計画している本年度得られた成果を発展させ,各秩序変数に対応した量子臨界現象の理解に迫る.カイラル磁性体のEuPtSiの磁気スキルミオンについては,印加磁場異方性など,これまでの物質系にはない特徴をまとめる.また格子系の(Sr,Ca)3Rh4Sn13については,今回発見した量子臨界点近傍の新たな構造相転移について研究を進める.普遍的な理解を目的として,さらなる物質系にも同様の研究を発展させることを計画している.採択時期が半年ずれたため,主たる支出が執行出来ず,次年度にずれ込んだ.次年度において,遅れた分の環境整備及び実験による旅費支出を計画的に執行する計画である.(理由)本課題の採択時期のずれ及び主たる研究施設であるJRR-3の再稼働の遅れにより当初計画に対して予算の執行が計画どおりに行えてない部分があるため、次年度使用額が生じることとなった。(使用計画)H30年度においてはJRR-3の再稼働の遅れを加味した執行計画に見直しを図り、研究環境の整備や国内外代替実験施設での実験実施に係る費用として使用する予定である。
後発酵茶に存在する微生物の特徴とその応用食品学的研究

後発酵茶の起源は、ミヤン、ラペソーなどに通じるものと考えられるが、その経路なども仏教伝来と比較考察しても不明のまま残されている。また、これらの後発酵茶はいずれも発展途上国に産するため、それらの疫学的、科学的研究は手つかずになっているが、その利用形態等を明らかにすることが必要であると考えられる。特に類似の茶が日本のみならず東南アジアにも存社し、一方ではそれを飲用の形で利用し、他方ではそれを食用としてることは、その文化的関係も含めて実態解明は重要なことであると考える。後発酵茶はいずれも微生物が深く関わっており、その風味も酸臭を有するのが共通点でもあるとこから本研究においては、これら一連の後発酵茶の風味成分と微生物フローラをし、微生物の化学分類手法を応用して、そこから類似性と相違点を比較しながら後発酵および茶のルーツを明らかにする。さらに、これら茶類の化学成分を詳細に分析・比較し、特徴を明らかとした。東南アジア諸国に存在する微生物発酵茶と類似の碁石茶、阿波番茶は、日本の経済、社会の変化に伴い、急速に消滅の一途をたどっている。これら一連の後発酵茶が健康上に優れていることは、その歴史の証明しているところであり、各地域の予備的調査においても明らかとなっている。本研究では日本に存在するこれらの試料を用いて、その遺伝子型・風味成分等を総合的に比較分析することを行い、更に分離した微生物を用いてモデル的に後発酵茶を製造したその結果、風味も既存のものと同様のものを製造することができ、そのために必要な細菌はLactobacillus類であることもわかった。後発酵茶の起源は、ミヤン、ラペソ-などに通じるものと考えられるが、その経路なども仏教伝来と比較考察しても不明のまま残されている。特に類似の茶が日本のみならず東南アジアにも存在し、一方ではそれを飲用の形で利用し、他方ではそれを食用としていることは、その文化的関係も含めて実態解明は重要なことであると考える。後発酵茶はいずれも微生物が深く関わっており、その風味も酸臭を有するのが共通点でもあるところから、本研究においては、これら一連の後発酵茶の風味成分と微生物フローラを分析し、微生物の化学分類手法を応用して、そこから類似性と相違点を比較しながら後発酵茶および茶のルーツを明らかにする。さらに、これら茶類の化学成分を詳細に分析・比較し、その特徴を明らかにすると共に後発酵茶の製法および風味改善とその実用上の可能性を検討する。本研究では日本に存在するこれらの試料を用いて、その遺伝子型・風味成分等を総合的に比較分析することを行っており、更に分離した微生物を用いてモデル的に後発酵茶を製造し、その結果を実際の製造に応用を試みた。今までの本研究の結果では茶を飲むだけでなく、食べることによってもより健康的な生活を営むための基礎的資料を提供しつつある。

特に類似の茶が日本のみならず東南アジアにも存在し、一方ではそれを飲用の形で利用し、他方ではそれを食用としていることは、その文化的関係も含めて実態解明は重要なことであると考える。後発酵茶はいずれも微生物が深く関わっており、その風味も酸臭を有するのが共通点でもあるところから、本研究においては、これら一連の後発酵茶の風味成分と微生物フローラを分析し、微生物の化学分類手法を応用して、そこから類似性と相違点を比較しながら後発酵茶および茶のルーツを明らかにする。さらに、これら茶類の化学成分を詳細に分析・比較し、その特徴を明らかとした。東南アジア諸国に存在する微生物発酵茶と類似の碁石茶、阿波番茶は、日本の経済、社会の変化に伴い、急速に消滅の一途をたどっている。これら一連の後発酵茶が健康上に優れていることは、その歴史の証明しているところであり、各地域の予備的調査においても明らかとなっている。本研究では日本に存在するこれらの試料を用いて、その遺伝子型・風味成分等を総合的に比較分析することを行い、更に分離した微生物を用いてモデル的に後発酵茶を製造した。その結果、風味も既存のものと同様のものを製造することができ、そのために必要な細菌はLactobacillus類であることもわかった。
3次元微小力測定装置による細胞変形力の研究

細胞は運動するときに仮足と呼ばれる構造を進行方向に突き出す。この仮足内部にはアクチンフィラメントからなるゲルがつまっており支持体の役割を果たしている。仮足伸展の機構として、原形質内にあるアクチンモノマーが重合してゲルとなること(ゾル-ゲル変換)によって原形質膜が押し出される、というものが考えられており、それに沿った状況証拠が種々提出されている。にもかかわらず、その分子機構にはなお不明の点が多い。その理由の一つとして仮足それ自身の力学的性質に不明な点が多いことが挙げられる。そこで本研究では運動中の仮足部分の力学的性質をエバネッセント光をイメージング用光源とし、かつ光ピンセットを細胞顕微操作の道具として組み込んだ新しいタイプの顕微鏡を用いて解明することを目指した。光ピンセットの基礎技術は細胞運動に関わるアクチン・αアクチニン間の結合力と寿命測定の成功により確立した。一方イメージング用光源としてのエバネッセント光の利用は、蛍光ラベルしたアクチン・モノマーの重合過程の観察に成功したことにより確立した。本研究に用いる光ピンセット装置は製作段階にある。光学顕微鏡が本来持つ落射蛍光、位相差等のイメージング機能と光ピンセット操作機能とを両立させるため、顕微鏡のイメージング系再設計および光ピンセットの光学系のパラメータ決定など、長期にわたる準備作業が必要であった。実験に用いる細胞はCHOと呼ばれる種類のもので、大きさ約30μmである。ガラス上を動き回るとき厚さ約0.5μmの仮足を伸展する。この伸展に伴う「押し出す力」を測定する予定である。更にアクチンフィラメント形成を阻害するサイトカラシンという薬物を投与したときその力がどう変わるかを調べるための準備を進めつつある。
小児病態における細胞内脂質輸送の研究

細胞内脂質スフィンゴミエリン/コレステロール輸送に関わる2因子、1)酸性スフィンゴミエリナーゼ(Acid sphingomyelinase ; ASM)、2)NPC1/NPC2蛋白、に関して小児病態の研究を行った。小児疾患として新生児虚血性低酸素性脳障害、未熟児慢性肺障害、遺伝性脂質輸送障害を対象として、ラットモデルと培養細胞を使用して研究を行った。新生児虚血性低酸素性脳障害においてASM活性化が病態に関与していることを示した。未熟児慢性肺障害に関わる肺胞マクロファージのLPSによる活性化にASM活性化が関与していることを示した。LDLコレステロール由来コレステロール輸送に関して、NPC1機能低下状態でASM活性量がコレステロール輸送量調節に関与することを示した。すなわち、ASM活性の活性化効果のある酪酸を用いた実験で、ASM活性を酪酸で上昇させNPC1機能低下状態でライソゾーム/後期エンドゾームに蓄積したコレステロールを減少させることに成功した。今後、細胞内脂質輸送調節機序として研究を進めて行きたい。近年、細胞内脂質輸送に関わる機能蛋白が同定されてきているが、その多くは遺伝性小児疾患の病因として解明された。その機能分析により治療への展開が期待される。また細胞内脂質はシグナル伝達に関わり種々の小児病態と関わる。特に、コレステロールとスフィンゴミエリンは主に形質膜に細胞膜の骨格として存在するが、シグナル伝達に関わる多くのデータが示されている。我々の研究の目的は細胞内コレステロール輸送調節蛋白NPC1異常症(ニーマンピック病C型)、スフィンゴミエリン水解酵素ASM異常症(ニーマンピック病A/B型)の脂質蓄積を可視化し、その病因蛋白の調節薬剤が蓄積軽減を引き起こすか否かを実験的に示す。次に、母ラットにエンドトキシン(LPS)を投与し生まれた新生児ラット肺は先天的な炎症を有しており新生児肺疾患モデルであるが、この病態肺に関してコレステロール、スフィンゴミエリンのシグナル伝達に関して調べ、調節による新生児肺疾患の新たな治療法の可能性を探った。今年度は以下の成果が得られた。1)培養皮膚線維芽細胞を用いて脂質の細胞内局在を観察するコレステロール染色(フィリピン染色)、及び、スフィンゴミエリン染色(ライセニン+ライセニン抗体)を確立し、細胞内脂質の可視化を可能にした。2)1)を用いて細胞内脂質蓄積の見られるニーマンピック病細胞に関して種々の脂質輸送調節薬剤を用いて蓄積脂質軽減作用に関して検討した。先天的に炎症肺をもつ新生児ラットを確立した。このモデルを使用して脂質輸送関連蛋白(特にASM)と肺炎症の関係の検討を開始している。1)新生児虚血性低酸素性脳障害のラットモデルを作成した。ストレス刺激誘導シグナリングに関与するスフィンゴミエリン分解酵素である酸性スフィンゴミエリナーゼ(Acid sphingomyelinase : ASM)活性化と脳組織障害の有意な関係を、酵素活性測定及び免疫沈降法を用いた方法で示した。引き続きASM抑止剤を用いた脳障害予防に関する研究に移行している。2)未熟児慢性肺障害のラットモデルの作成を、妊娠ラット母体にLPSを投与することで、生まれてくる新生児ラット肺が障害を形成することで試みたが、組織学的検討や酵素学的な検討から成功に至らなかった。そのためラットの樹立された培養肺胞マクロファージを用いた方法に切り替えた。培養肺胞マクロファージにLPSおよび患者由来の気管吸引液等を加えて、ストレス刺激誘導シグナリングに関与するスフィンゴミエリン分解酵素のである酸性スフィンゴミエリナーゼ(Acid sphingomyelinase : ASM)活性化惹起等に関して検討を行っている。3)ストレス刺激誘導シグナリングに関与するスフィンゴミエリン分解酵素のである酸性スフィンゴミエリナーゼ(Acid sphingomyelinase : ASM)活性刺激剤の酪酸(butyrate)を用いて、細胞内コレステロール輸送等に関して、その輸送促進効果等に関して検討している。生体反応における脂質メディエーターの役割が注目されている。小児病態(虚血低酸素、炎症、脂質輸送)における細胞内脂質スフィンゴミエリン/コレステロール輸送代謝に関わる2つの因子、1)酸性スフィンゴミエリナーゼ(Acidsphingomyelinase=ASM)、2)NPC1/NPC2蛋白、の研究を行った。新生児虚血性低酸素性脳障害ラットモデルの障害組織に対する解析では、組織障害部位でのASM活性化が確認されASMの病態への関与が示された。虚血性低酸素性脳障害への治療薬を試み組織

障害の程度の軽減が観察され、ASM活性化の程度も相関し、ASM活性化の調節が組織障害のコントローに繋がる可能性を示し、今後の課題となった。未熟児慢性肺障害のラットモデルを妊娠ラットに対してLPS腹腔内投与を行い作成しようと試みたが成功に至らなかった。そのため肺胞マクロファージとして確立した培養細胞を用いた解析に変更した。すなわち肺胞マクロファージにLPS刺激を加えた場合のASM酵素の活性化の関係を詳細に調べた。その結果、LPS刺激に対するASM活性化の関与が示され、未熟児肺障害における肺胞マクロファージ由来のASMの病態への関与が示唆された。最近、ASM活性抑制剤の開発が行われ、種々の薬剤が知られるようになってきたが、それらの薬剤を用いた小児病態の研究が今後の課題である。LDLコレステロール由来コレステロール輸送に関して、NPC1機能低下状態でASM活性量がコレステロール輸送量調節に関与することを示した。すなわち、ASM活性の活性化効果のある酪酸を用いた実験で、ASM活性を酪酸で上昇させNPCI機能低下状態でライソゾーム/後期エンドゾームに蓄積したコレステロールを減少させることに成功した。今後、細胞内脂質輸送調節機序として研究を進めて行きたい。
上頸神経節に投射するγアミノ酪酸陽性線維の由来

18年度に我々は上頚神経節に投射するGABA含有線維が脊髄交感神経節前ニューロンに由来することを示した。この際、我々はGABA含有線維がC5前根のような交感神経節前線維を含まない神経にも存在することを観察した。そこで、19年度はこの線維の由来について調査を行った。GABA産生線維(GABA合成酵素のGAD67陽性線維)はC5からT5までの前根、腕神経叢などに観察された。また上腕、前腕の筋の筋紡錘錘内筋に絡み付いていた。これらのGABA含有線維はコリン作動性のマーカーも同時に発現した。腕神経叢の切断後、筋紡錘のGAD67陽性は完全に消失した。上腕三頭筋に逆行性トレーサーのfluorogoldを注入後、脊髄切片に対してGAD67 mRNAに対するin situ hybridizationとflurogoldに対する免疫組織化学を同時に行ったところ、逆行性標識された中型ニューロンの一部がGAD67 mRNAを発現することが明らかになった。これらのことは上腕に投射する頚髄のγ運動ニューロンの一部がGABAを含有することを示している。これらのニューロンはGABAのシナプス小胞放出のマーカーであるVGATを発現しなかった。また、上腕三頭筋においてGABAAおよびB受容体mRNAは検出されなかった。このためGABA含有γ運動ニューロンの機能は目下不明であり、さらなる研究が必要である。今年度の研究によって、1.上頚神経節や星状神経節において、GABA、GAD65、GAD67免疫陽性神経終末様構造が観察された。GABA陽性SIF様細胞が観察されたのに対し、GAD65やGAD67陽性の細胞体は観察されなかった。2.上頚神経節、星状神経節、後根神経節ではGAD65やGAD67のmRNAは検出できなかった。脊髄ではGAD65やGAD67 mRNA発現細胞が大量に観察され、その一部は側角に分布していた。また、前根ではGABAやGAD67免疫陽性線維が観察されたのに対し、後根や、後根神経節ではそれらの免疫反応性は検出されなかった。3.ほぼすべての上頚神経節や星状神経節のGAD67免疫反応性終末は同時にVAchT免疫反応性を示した。順行性にGFP標識された脊髄由来線維の終末の一部がGAD67免疫反応性を示した。4.逆行性に標識された節前ニューロンの一部でGAD67 mRNAが検出された。このGAD67発現節前ニューロンの多くは側角の吻側部で観察された。5.C8からT4の前根を切断することによって、上頚神経節や星状神経節のGABA及びGAD67陽性線維がほぼ完全に消失した。また、この切断によって、GABA陽性SIF様細胞も消失した。以上の結果から、上頚神経節に投射するGABA作働性線維は、ほぼすべて脊髄交感神経節前ニューロンに由来することが示された。上頚神経節GABA作働性線維は同時にアセチルコリン作働性でもあり、速い時定数で作用する興奮性と抑制性の伝達物質が一つの終末に共存していることになる。また、側角吻側部は独特の神経回路を構成するらしいことが示唆されており、多くのGABA作働性節前ニューロンがこの部位に集まっていることは興味深い。GABAの上頚神経節での作用として、長期増強の抑制や樹状突起の形成の促進などが報告されているが、共放出を念頭に置いた研究が今後必要になってくるであろう。