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リアルタイム生細胞発光モニタリングを用いた体内時計作動薬のテイラーメイド探索

概日リズム睡眠障害は近年社会問題になっています.この研究ではES細胞を用いて,概日リズム睡眠障害を世界で初めて試験管内で再現することに成功しました.また,昼夜逆転発症の分子メカニズムの一端の解明にもつなげることができました.さらに,本実験系は組織分化やヒトiPS細胞への応用も可能なことから,個々人にあった睡眠障害治療薬を探すのに有用と考えられます.また,薬剤探索では,臨床研究で時間調節作用が予想された4種類の漢方薬から, 2つの化学物質を発見することができました.これらの薬剤の効能の個人差の評価には,先述のiPS細胞を用いた分化誘導系が有効と考えられます.体内時計作動薬のテイラーメイド探索のための基盤技術として,まずはリアルタイム生細胞発光モニタリングを用いた概日リズム睡眠障害のin vitroモデル系の構築を目指し,家族性睡眠相前進症候群(FASPS)の試験管内モデル化を試みた.FASPSは,時計遺伝子Per2の点突然変異によって起こることが示されている.さまざまなグループが試験管内モデル化を試みてきたが,概日時計の周期短縮を試験管内で再現できた報告は存在しなかった.モデル化が困難な理由としては,発現量の至適範囲が狭いことがかんがえられた.この困難を克服し, FASPSの試験管内モデル化を達成するため,わたしたちは次のような戦略をとった.まずPer2の無いES細胞を用意する.そして, Rosa26にPer2遺伝子とLuciferase遺伝子をゲノム編集により1コピーだけ正確にノックインする. ES細胞は時計を持っていないが,分化誘導することで概日振動が出現することが知られているため,培養細胞レベルでFASPSの周期短縮を検出できると考えられた.これに必要な要素技術として, 1)周期長を精密に検出できるES分化誘導系と, 2) Rosa26に1コピーだけ正確に導入できるようなPer2ノックアウトレスキュー系を開発し, FASPSのin vitro model化を試みた.最終的に, WTとFASPSの各々2クローンのES細胞を分化誘導すると, FASPSでの周期短縮が確認された.また,この概日リズム睡眠障害試験管内モデル系には汎用性があり,さまざまな変異体の表現型を測定することができ,昼夜逆転の発症機序の一端の解明にも寄与することができた.また,漢方薬のスクリーニングにおいては,概日リズム変容作用のある物質を,生薬の分画レベルまで同定することに成功した.多能性幹細胞を用いた概日リズム睡眠障害の試験管内モデル系の構築に成功し,ヒトiPS細胞への応用が見えてきているため.近年社会問題となっている概日リズム睡眠障害は体内時計の周期長の個人差が原因の一つとなっている.例えば,家族性睡眠相前進症候群(FASPS)では,体内時計の周期が短くなることで極端な朝型になるが,本疾患の体内時計の周期短縮を<I>in vitro</I>で再現に成功した報告は存在しなかった.本研究では,まずマウスES細胞のゲノム改変と分化誘導,そしてリアルタイム生細胞発光モニタリングを用いた実験系の開発に成功し, FASPSの周期短縮を世界で初めて細胞レベルで再現する事に成功した.また,本実験系は汎用性が高いことが示され,昼夜逆転発症の分子メカニズムの一端の解明にもつなげることができた(Tamiya Sci Rep2016, Nature Japanおすすめのコンテンツ, ISSCR (国際幹細胞学会)Merit Award, Travel Award,日本時間生物学会優秀ポスター賞).さらに,本実験系は組織分化やヒトiPS細胞への応用も可能なことから,体内時計作動薬・睡眠障害治療薬のテイラーメイド探索への応用が期待される.また,薬剤探索では,代表者らが行った臨床ビッグデータ研究(Tamiya, PLoS ONE 2015)で時間調節作用が予想された4種類の漢方薬につき,ヒト培養細胞を用いて釣藤散に時計作用があることを同定した.さらに構成9方剤の中から時計作用のある方剤を同定した.また,薬学部との共同研究において,方剤の酢酸エチル分画に作用成分があることを同定し,さらにクロマトグラフィーを用いたActivity guided separationを繰り返し行うことで, 2種類のセスキテルペンを同定した.これらの薬剤の効能の個人差の評価には,先述のiPS細胞を用いた分化誘導系が有効と考えられる.以上のようにリアルタイム生細胞発光モニタリングを用いた体内時計作動薬のテイラーメイド探索の基盤技術の開発と,その候補薬の同定に成功した.概日リズム睡眠障害は近年社会問題になっています.この研究ではES細胞を用いて,概日リズム睡眠障害を世界で初めて試験管内で再現することに成功しました.また,昼夜逆転発症の分子メカニズムの一端の解明にもつなげることができました.さらに,本実験系は組織分化やヒトiPS細胞への応用も可能なことから,個々人にあった睡眠障害治療薬を探すのに有用と考えられます.また,薬剤探索では,臨床研究で時間調節作用が予想された4種類の漢方薬から, 2つの化学物質を発見することができました.これらの薬剤の効能の個人差の評価には,先述のiPS細胞を用いた分化誘導系が有効と考えられます.当初の予定では単核球に対するリポフェクションによる非侵襲的な概日リズム障害のモデル化をめざしていたが,効率が低く,波形も綺麗なものが得られにくいことが分かってきたため,エレクトロポレーションを用いた系を検討している.また,現在多能性幹細胞を用いたin vitroモデル系の構築に成功している.

この実験系は,ヒトiPS細胞への応用も可能なため,今後は多能性幹細胞を用いたモデル系の構築し,テイラーメイド探索へ向けた基盤技術の確立を目指していく方針である.治療薬の探索については,医療ビッグデータ解析から概日時計調節作用が示唆された方剤に対してスクリーニングをおこない,生薬の分画レベルまで同定をおこなっている.今後は成分単位で同定していく方針である.老年医学
本格的再生医療への応用を目指した自発的還流機能を有する3次元マクロ組織の作製

本研究では、灌流可能な3次元マクロ組織の作製を目指して研究を行った。まずはマイクロ流体デバイスを用い、細胞からひも状の組織(細胞ファイバ)を構築した。様々な細胞から細胞ファイバを作製し、直径500ミクロンのアルギン酸ハイドロゲルファイバの周りに細胞ファイバを多層に巻き付けることで、高速に階層化組織を構築可能であった。組織構築後、支持体であるアルギン酸ファイバを酵素で分解したところ、内腔を有する管腔組織を構築でき、ペリスタポンプで培養液を灌流可能であった。肝がん細胞と線維芽細胞を階層化した組織構造では肝がん細胞単独から作製した構造体に比べてアルブミン生産能が有意に上昇していることが確認された。本研究ではマイクロ流体デバイスを利用した灌流可能な組織の作製を試みる。本年度はひも状に加工した細胞集塊を、後から分解可能な犠牲層担体に巻き付けることで管状組織の作製を試みた。細胞から組織を構築する際に、足場材料に細胞を播種して組織構造を作製するトップダウン型の組織工学が多く研究されている。足場材料を用いる方法は非常に簡便ではあるが、内部にまで均一に細胞を播種することが困難であり、また一様に播種するため、異なる細胞の階層化も難しい。一方で、スフェロイドなどの微小な細胞集塊を作製し、それらを集積化することで組織構築を試みるボトムアップ型の組織工学が近年注目を集めている。そこで、本研究ではマイクロ流体デバイスを利用し、ひも状に加工した細胞集塊を用いて組織作製を試みた。二軸同時軸のマイクロ流体デバイスで、外側にアルギン酸ナトリウム溶液、内側に細胞外マトリクス(ECM)に懸濁させた細胞を流し、塩化カルシウムでゲル化させることで中軸部分にECMと細胞を内包したゲル状の構造体(細胞ファイバ)を得た。細胞密度100000000cells/mLで作製した細胞ファイバを培養すると2-3日程度で内部細胞が増殖し充填されるのを確認した。十分に充填され、細胞同士の接着が形成された頃に、酵素を用いて外殻のアルギン酸を分解したところ、細胞塊がひも状形態を維持していることが確認された。この露出されたファイバ状の細胞塊を、同じマイクロ流体デバイスで作製したアルギン酸のみからなるゲルファイバにピンセットを用いて巻き付けたところ、細胞ファイバ同士が接着して、巻き付けた形を維持したままの構造体を作製することが可能であった。24時間ほど培養すると細胞同士が接着し、らせん状に巻かれていた構造の境界線がわからなくなるほど一体化することが確認された。これらの結果より、本手法によって簡便に高細胞密度な管腔状の構造を作製することに成功した。本研究ではマイクロ流体デバイスを利用した階層化組織の高速作製を目指し、細胞をひも状に加工した細胞ファイバを犠牲層担体となる分解性ハイドロゲルに巻き付けることで管腔の階層化組織構造の作製を行った。マイクロ流体デバイスを連結することで、異なる溶液を混じり合うことなく連続的に流すことができる。この性質を利用してシェルに酵素分解可能なアルギン酸ゲルを配置し、コアに細胞をコラーゲンなどのゲルに包埋した状態でひも状(細胞ファイバ)に加工した。細胞ファイバは高密度(100000000 cells/mL)で細胞を内包可能であり、培養初期から生体細胞密度に近い状態での組織作製が可能であった。2日培養後、線維芽細胞や間葉系幹細胞は細胞同士の結合が形成され、シェルを除去した後も、細胞ファイバはひも状形態を保っており、ハンドリング可能であった。また、ヒト肝がん由来細胞(HepG2)の場合、単独ではコア除去後にばらけてしまったが、間葉系幹細胞を混ぜて培養することで、ひも状形態を保ったままで回収可能であった。この細胞ファイバを犠牲層担体であるアルギン酸ゲルファイバに巻き付けることで管腔状組織の構築を行った。1層巻き付けた後に他の細胞ファイバを巻き付けることで、階層化組織の構造体を作製可能であった。そこで、HepG2ファイバを1層巻き付けた組織とHepG2ファイバを巻き付けた組織の外側にマウス線維芽細胞ファイバを巻き付けた階層化組織を作製し、アルブミン合成能を比較したところ、階層化組織の方が有意に高いアルブミン合成能を示した。また、階層化した後にアルギン酸ゲルを除去することによって、内部に還流可能な管腔組織を作製した。自発的な灌流機構を付与するには至らなかったが、ペリスタポンプで還流を行うことが可能であった。これらの結果により、本手法によって簡便に高細胞密度の組織を作製し、還流培養を行うことに成功した。管腔状組織作製のために、細胞ファイバと犠牲層

担体を用いているが、どちらも同じマイクロ流体デバイスで作製することが可能であり、すでに安定してファイバを作製する技術が確立していたため、巻き付ける工程の試行錯誤に十分な時間を費やすことが可能であった。また、一度に多くの量を作製することが可能なため、様々な細胞で同様に管腔状組織の作製が可能であることを確認できた。組織工学、再生医療、バイオマテリアル今回、犠牲層担体に細胞ファイバを巻き付けることで管腔状組織構造体を作製することに成功した。しかし、構造体作製後に犠牲層を分解除去すると、構造体がつぶれてしまうなどの問題が発生した。そこで、今後は構造体がより安定な状態になるまで培養が可能なように、犠牲層担体を中空状構造とし、犠牲層を分解しなくても培養液を灌流可能な構造を作製することを試みる。また、異なる細胞ファイバを用いて階層化された組織構造体の作製を目指す。本年度に参加した国際学会の一つが国内で行われたものであり、旅費にさほど費用が必要とされなかったため。次年度は材料の改良などを行う予定であり、試薬等の消耗品へあてる。またマイクロ流体デバイスの作製に必要な装置の購入および、ヒト不死化血管内皮細胞の購入などを予定しているため、その購入費へ使用する。
特殊関数の幾何学的研究

多変数超幾何関数・微分方程式系に関する公式を構成した。(1)積分表示に関する局所系係数(コ)ホモロジー群に定義される交点形式を利用して、モノドロミー表現やパッフ形式を表現空間の基底の取り方に依存しない形で与えた。(2)代数多様体の周期積分とみなせるような特殊なパラメーターを有する超幾何関数に対して、保型形式と超幾何級数との恒等式を与えた。(3)多種の多項間平均たちの反復により定まる極限を多変数超幾何関数により表示した。R.Vidunusにより発見された超幾何関数の関数等式を利用して、新しい平均反復を定め量の極限をGaussの超幾何級数を用いて表示した。この表示には複素平面に作用する三角群(3,3,3)が深く関係しており、平均反復の極限公式と1の三乗根ωを周期とする楕円曲線の加法との関係解明により、さらなる研究発展の可能性をもつものである。約120年前にG.Lauricellaにより定義されたm変数rank 2^mの超幾何微分方程式系EAに対して、Singular locusを決定し、モノドロミー群の生成系を与えた。解の積分表示から定まるねじれホモロジー群の交点形式と、Singular locusへ変数が近づく際に退化するねじれサイクルの決定により生成系が定まるというモノドロミー交点数原理を発見している。その結果として表現空間の次元が2^mと大きくなるものに対しても、交点形式に関する鏡映としてモノドロミー行列を具体的に表示することが可能となった。また一般のパラメーターに対しては、EAのモノドロミー群が鏡映群になることが自動的に証明されている。ここで得られた定理や原理を用いれば、超幾何微分方程式系EBのモノドロミー群の生成系が得られ、他のEuler型積分表示をもつ超幾何方程式系のモノドロミー群の計算が交点形式の計算に帰着されることになる。したがってこの結果は単にEAのモノドロミー群を決定しただけでなく、汎用性のある重要な結果であると確信する。Euler型の積分表示を有する超幾何関数に関して、ねじれホモロジー群とねじれコホモロジー群が定義され、これらの群の間にある自然なペアリングとしてその積分表示は翻訳される。一方でこれらの群には交点形式と呼ばれるペアリングが存在する。研究代表者は、超幾何微分方程式系のモノドロミー表現に対して、異なる固有空間がねじれホモロジー群上にある交点形式について直交することを発見した。この事実によりLauricellaにより定義された多変数超幾何微分方程式系F_Dのモノドロミー表現の生成系を解空間の基底の取り方に依存しない形で与えた。そしてある基低を指定した場合のモノドロミー行列を複素鏡映のルートベクトルによって与えた。基底を定めずにモノドロミー表現が与えられたことは初めてであり、基底を指定した場合には交点行列を計算することでその基底に関するモノドロミー行列が得られる仕組みが出来たことは大変重要なことである。また、超幾何微分方程式系を同値なパッフ形式に変形することは、ねじれコホモロジー群をファイバーとするベクトルバンドルの接続形式を求めることであることは知られていた。研究代表者は、ねじれコホモロジー群上にある交点形式を用いて、ベクトルバンドルのフレームの取り方に依存しない形で接続形式を与える原理を発見した。その応用として超幾何微分方程式系F_AとF_Dに対して、対応するベクトルバンドルの接続形式を与え、フレームを指定することでパッフ形式の具体形をねじれコホモロジー群上の交点形式を用いて与えた。与えられたフレームに対して、交点行列を計算することでパッフ形式が得られる仕組みは、他の超幾何微分方程式系への応用が期待される。AppellやLauricellaにより拡張された多変数の超幾何微分方程式系には、解の積分表示があることが知られている。その積分表示に対して、ねじれホモロジー群とコホモロジー群が定義される。また、ねじれ(コ)ホモロジー群は、それぞれの双対空間となるねじれ(コ)ホモロジー群が存在していて、双対性を定める交点形式が存在している。研究代表者は、多変数超幾何微分方程式系をねじれ(コ)ホモロジー群の交点形式を用いて研究した。まず、解の線積分表示のあるAppell F_1やLauricellaのF_Dに対して、モノドロミー群の生成系を交点形式を用いて基底の取り方によらない表現で与えた。その結果を利用して、解空間の基底を与えた場合の行列の導出法や具体的な行列表示も与えた。また、この微分方程式系のパッフ形式については、ベクトル値未知関数の設定のやり方によらない表現をねじれコホモロジー群の交点形式を用いて与えた。そして、未知関数を具体的に設定をした場合の接続行列を与えた。これらの結果をまとめた論文はKyushu Journal of Mathematicsに掲載予定となっている。解の積分表示に2次式が現れる2変数超幾何微分方程式系F_4に対して、ねじれ(コ)ホモロジー群の基底を与えて、それらの基底に対する交点行列たちを具体的に求めた。

Appellが与えた4つの級数解に対応するねじれサイクルを具体的に構成し、ねじれ(コ)ホモロジー群間にあるペアリングたちの整合性から導かれるねじれ周期関係式を具体的に与えた。また、モノドロミー群の生成系を交点形式を用いて解空間の基底の取り方によらない表現で与え、表現が有効となるパラメーターについての条件を緩和した。これらの結果をまとめた論文は、現在投稿中となっている。多変数超幾何微分方程式系のうちF_AとF_Dと呼ばれるものに関しては、モノドロミー群やPfaffianの構造を交点形式を用いて解明している。F_Cと呼ばれるものに関しては、2変数に関しては同様に構造の解明がなされている。また、2変数超幾何関数で成立する変数変換公式を発見し、不完全楕円積分の高速数値計算アルゴリズムへの応用も得ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。超幾何微分方程式系F_Cに関しては、一般変数の場合への拡張を目指す。多変数超幾何関数の変数変換公式の導出やその公式の解析数論への応用をはかる。
途上国における医療制度・政策に関する実証分析

本研究課題は、発展途上国における医療サービスについて、主にその質的側面に注目し、医療制度・政策や、人々の需要行動、健康状態などとの関連を実証的に明らかにすることを目的とする。発展途上国における医療施設へのアクセスの改善が、必ずしも健康状態の改善にはつながっていないことが指摘されており、医療サービスの質的側面の政策的重要性は極めて高いものである。本年度は、(1)診療費減額政策が医療サービス供給に与える影響に関する実証分析を進めるとともに、(2)医療サービスの品質が需要行動・健康状態に与える影響に関する文献調査を行った。(1)については、修士課程から継続して取り組んでいる研究であり、ケニアで実施された診療費減額政策が、診療時間や診療内容、診療所の設備などの医療サービス供給に与えた影響を、マイクロデータを用いて分析するものである。分析の結果、主に人員配置に関連する医療サービスの品質が低下していたことが明らかになった。こうした発展途上国における診療費減額政策の多くは、主に貧困層の医療サービスへのアクセス向上を意図して実施されるが、同時に供給される医療サービスの品質に与える影響を考慮することの重要性を示す定量的なエビデンスを提供した点に本研究の意義がある。(2)については、発展途上国における医療サービスの品質が人々の医療施設の選択行動、そしてその結果としての健康状態に与える影響に関する既存文献をまとめ、人々の学習を考慮した動学的な分析への拡張を検討した。本研究課題は廃止となったため、記入しない。
肝移植後のT細胞数の激減に伴う免疫機能の低下及び拒絶反応の適確な診断とその対策

本研究の主目的は肝移植後の免疫能の機能低下に伴う感染症及び拒絶反応の適確な診断と、その対策を確立することであり、それに加えて免疫寛容の機構に関するものである。分担者の小澤が生体肝移植を世界に先駆けて完成し、田中が引き継ぎ、世界最多の1100症例数に達し、研究面では佐藤が免疫細胞学的見地から主導的な役割を担ってきた。現今、移植患者に免疫抑制剤などを含めて術後管理において画一的な治療が施行されている。しかし、移植患者の免疫機能は千差万別であり、移植後の予後向上のためには個々の患者の背景や術前状態に応じた、いわゆるテーラーメイドの免疫療法が不可欠である。その確立のためには術前の免疫機能を包括的に分析・評価し、それに応じて患者を正確に階層化する有効な分析が必須である。本研究の重要な成果は、患者個人個人の状態に応じたテーラーメイド方式による対策が可能になったことである。移植患者の免疫能はT細胞のCD8^+T細胞のCD45isoform profilesに強く依存していることを明らかにし、さらにhierarchical clustering手法を用いて、術前の状態で移植患者を5階層化に分類しうることが、世界で始めて可能になった。この中で5群、即ちCD8^+ effector T cells(cytotoxic activityが最も高い)を多く持つ患者では感染症が70%に発症し、その死亡率は30%に達する。この群は成人症例の29.1%に存在し、術前、術後において、その時点でのCD8^+T細胞の機能を考慮して、免疫抑制剤の適量などを判断し、感染症対策をすることが必要である。生体肝移植では、細胞性免疫で主要な役割を演じるT細胞の細胞数が術後に激減し、移植抗原に対して無反応(アナジー)性になっている時期があり、これが重篤な感染症を含めて、種々の合併症を発生する要因となっている。本年度は22名の患者(3名は死亡)で、移植直後の拒絶を引き起こしている時期から、T細胞数が正常範囲に回復するまで、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞の動態とBCL-2 mRNAの発現量をしらべた。その結果、移植後、T細胞数は全患者で減少し、12時間以内にT細胞のBCL-2 mRNA量が増加していた。その後のT細胞数回復はBcl-2 mRNA量の減少と逆相関していた(r=-0.77)。T細胞数の回復過程の解析から、患者は10日以内に細胞数が正常にもどるグループ(I群:7名)と、正常に戻るのにさらに長期間が必要なグループ(II群:12名)の2群に別れた。フローサイトメトリーによる解析で、I群ではT細胞数の増加は主に胸腺で新生したT細胞によるものであった。一方、II群での、遅延した細胞数増加は主に末梢のT細胞が増殖することによるものであった。術後に患者のT細胞数が正常に戻るまで、感染を防がなければならない。今回の実験で、T細胞のBcl-2 mRNAの量を測定することが免疫寛容の遷移を知る上でよい指標になることが判明した(論文投稿中)。同時に、移植患者の1114検体(約100症例)を採取し、移植後のT細胞の変化をCD45,CD69,CD27,CD28,INF-γ,TNF-α等のマーカーの発現の違いから調べている。現在、ほぼデータをとり終えて、解析を始めている。移植を受ける患者が、術前に移植後どのようなタイプの免疫応答を示すか予測することが可能であることを示す結果が得られている。京都大学では既に1000例を超える症例数を経験している。しかしながらその成績は、移植後5年生存率が小児症例で83%、成人症例で69%とまだ満足できるものではなく、成績向上のために術後管理のさらなる改善が望まれる。

なかでも術後の免疫抑制療法は、個々の症例の免疫機能により免疫抑制過剰となり重篤な感染症を併発したり、逆に免疫抑制が不十分なために拒絶反応が発生しグラフトロスにつながることもある。現在までに200症例の約1500の検体について測定した結果、移植直後のT細胞は3分の1に激減し、それに伴う免疫能の低下はしばしば重篤な感染症を引き起こす。移植による死亡例の3割は術前にすでに末梢血Tリンパ球のCD8+細胞内のeffector cellが著しく増加していた症例であった。この事実をもとに現在prospectiveの研究-テーラーメイド療法-に入っている。Bcl-2タンパクはアポトーシスや種々の障害因子による細胞死に対して防御的に作用するミトコンドリア・タンパク質である。検討を行なった121名(13名は死亡)の移植患者は術後のT細胞数の回復過程から3群(I,II及びIII)に分けられた。それぞれの群でPCRによりbcl-2発現量を計測し、フローサイトメトリーでT細胞のプロフィールの変化を検討した。いずれの群においてもT細胞数とbcl-2値の間には、統計的に有意な逆相関が認められた。このことから、患者のT細胞のbcl-2発現レベルを計測するによってT細胞数の回復過程、したがって患者の感染症に対するリスクの程度、を予測できることが示唆された。これらにより、本研究の目的でもあるテーラーメイドの免疫抑制療法の確立が実現可能になると考えられる。
看護職のプロフェッショナリズム育成プログラムの開発に向けて

看護職のプロフェッショナリズムを効果的に育成するためのプログラム開発を目的とし、病院に勤務する看護職を対象に2段階の調査を実施する計画である。第1段階は個々の看護職のプロフェッショナリズムがチームダイナミクスを経て、組織や患者に及ぼす影響を検証する。第2段階では看護職の具体的な経験からプロフェッショナリズムの成長プロセスを探索する。2018年度は調査に向けての準備を行い、以下の成果を得た。(1)調査票の作成_看護職がプロフェッショナリズムを備えることで患者、組織、他職種に及ぼす影響を文献レビューや臨床で働く看護職・他職種から情報収集して調査項目を検討した。(2)調査協力施設の選定・調整_チームダイナミクスを考慮するため、第1段階の調査は病棟単位でおこなう。病棟に所属する看護職と他職種、その病棟の患者を対象に、分析時にはデータが連結できるように調査する必要がある。調査協力を説明・依頼し、協力が得られる施設と調査時期・内容などの調整をおこなった。(3)第2段階の調査に向けての対象者選定_国内の学会学術集会に参加し、プロフェッショナリズムを備えていると考えられる看護職の情報収集をおこなった。(4)新たな知見の情報収集_看護管理学分野係わる国内の学会学術集会に参加。(5)解析方法の検討_収集したデータを解析するときに使用すると考えられる統計解析手法について、必要な知識の修得して理解を深めた。本研究は2017年度から3年計画で行う研究である。現在第1段階の調査票の内容と調査時期を調査協力施設と最終確認をしている。研究機関の倫理審査委員会の承認を得た後、病院での調査を実施する。また現時点で調査協力の内諾が得られている施設では、対象者の数が十分ではないため、新たな施設も選定・依頼している。第2段階の調査については、第1段階の調査結果の概要を確認した後、対象者を選定しインタビューガイドを完成させて実施する。2019年_研究者の所属機関の倫理審査を受け、第1段階の調査を実施する。協力の得られた施設の管理者などからの機縁法で新たな調査協力施設を増やす。データ収集ができ次第すみやかに解析を実施、結果の公表をする。公表の場で、研究者・臨床看護師と情報収集や交流をおこないインタビュー調査の対象者を選定する。2020年_第2段階のインタビュー調査を実施する。社会が看護職に求める役割に応えるために、看護職は専門職として発展しなければならない。本研究は看護職のプロフェッショナリズムを効果的に育成するためのプログラム開発を目指すことを目的とし、病院に勤務する看護職を対象に二段階の調査を実施する。具体的には第一段階として個々の看護職のプロフェッショナリズムがチームダイナミクスを経て、組織や患者に及ぼす影響を検証する。第二段階では看護職の具体的な経験から探索することでプロフェッショナリズムの成長プロセスを明確化する。平成29年度は第一段階の調査に向けて準備を行い、以下の成果を得た。(1)本研究における最重要キーワードである「プロフェッショナリズム」の文献検討を行い、研究計画の信頼性と妥当性を高めた。個々の看護職がプロフェッショナリズムを備えることにより、質の高い看護が看護の対象者へ提供されているかに関して未だ検討されていないことが明らかなった。さらに看護職のプロフェッショナリズムの評価をする場合、ケアの対象となる患者だけでなく他の医療職からの評価を受けることが重要であるとがわかった。これらのことを踏まえ、調査の対象者に他の医療職を含めることを検討することとした。(2)看護管理学分野係わる国内の学会学術集会に参加し、看護職のプロフェッショナリズム、専門職性の新たな知見を得た。プロフェッショナリズムに関心をもつ他の研究者との交流を深め、調査に向けての助言を得た。(3)収集したデータの統計解析に必要な知識を修得した。本研究は平成29年度から3年計画で行う研究である。現在作成中の調査票が完成次第、病院での調査を実施する。調査施設とコンタクトをとり、対象者に負担がかからない時期を調整して実施する予定である。また、対象者の負担とならない程度に調査票の項目の洗練させている。

(3)第2段階の調査に向けての対象者選定_国内の学会学術集会に参加し、プロフェッショナリズムを備えていると考えられる看護職の情報収集をおこなった。(4)新たな知見の情報収集_看護管理学分野係わる国内の学会学術集会に参加。(5)解析方法の検討_収集したデータを解析するときに使用すると考えられる統計解析手法について、必要な知識の修得して理解を深めた。本研究は2017年度から3年計画で行う研究である。現在第1段階の調査票の内容と調査時期を調査協力施設と最終確認をしている。研究機関の倫理審査委員会の承認を得た後、病院での調査を実施する。また現時点で調査協力の内諾が得られている施設では、対象者の数が十分ではないため、新たな施設も選定・依頼している。第2段階の調査については、第1段階の調査結果の概要を確認した後、対象者を選定しインタビューガイドを完成させて実施する。平成30年9月までに調査票の作成し、研究者の所属機関の倫理審査を受ける。平成30年10月12月に質問紙調査を行い、データ収集ができ次第すみやかに解析を実施する。平成31年1月3月は質問紙調査の結果を公表しつつ、次のインタビュー調査の準備をすすめる。2019年_研究者の所属機関の倫理審査を受け、第1段階の調査を実施する。協力の得られた施設の管理者などからの機縁法で新たな調査協力施設を増やす。データ収集ができ次第すみやかに解析を実施、結果の公表をする。公表の場で、研究者・臨床看護師と情報収集や交流をおこないインタビュー調査の対象者を選定する。2020年_第2段階のインタビュー調査を実施する。平成29年度内に実施する予定であった質問紙調査が、年度内に実施できなかった。このため、質問紙調査費用として計画していた質問紙印刷代、郵便通信費、調査の準備に関連した人件費を使用しなかった。平成30年度に質問紙調査を実施する計画であるため、その時に使用事項、使用額は変更せずに使用する計画である。調査票作成の遅れ、調査協力施設との調整から2018年度内に計画していた第1段階の質問紙調査は2019年度に実施することとなった。質問紙調査にかかる費用、その公表のための費用は次年度に繰り越して使用する。
動作シナジーの組織化に関する神経行動科学的研究

一般に、ロコモーション(移動運動)や咀嚼などを含むリズミカルな動作は、人間を含めた動物に共通した基本な運動であり、スポーツにおいてもきわめて重要な意味をもつ。これらの動作には数多くの筋の協調的な働き(シナジー)が不可欠であることから、ロシアの生理学者ニコライ・ベルンシュタインは、これらの動作をコントロールするレベルを「シナジーのレベル」と名づけた。複雑系やカオス研究とともに近年ますます発展してきた非線形力学は、複雑な時系列を解析する方法論を確立し、このシナジーを定量的に評価しうる可能性をもたらしつつある。そこで本研究では、動作の協調性(シナジー)を、非線形力学系アプローチを用いて定量的に評価し、さらに協調性に関わる脳活動の特性を明らかにすることを目的とした。その結果、本研究において、1)シナジーの定量化に非線形力学系アプローチを用いた再帰定量化解析が有効であること、2)シナジーを必要とする動作の時空間的安定化に聴覚情報が有益な役割を果たすこと、3)シナジーを必要とする動作の学習過程を非線形微分方程式によるシミュレーションモデルによって再現可能であること、4)シナジーを必要とする動作の遂行過程には環境および脳活動の冗長性を利用した多重安定性が存在すること、5)動作レベル、筋活動レベル、および脳活動レベルの冗長性を用いた多重安定性は、適応的変動という概念によって包括的に捉えられることが明らかになった。これらの知見は、多関節協調のスキルを必要とするスポーツ動作のみならず、音楽演奏スキルの獲得や、スキルの再学習ともいえるリハビリテーションにおいても今後役立つであろうと考えられる。本年度は、動作シナジーの組織化に関する理論的研究および実験的研究を進めた。理論的研究に関しては、2005年7月に行われたInternational Conference of Perception and Actionに参加し、コネチカット大学教授Michael T.Turvey教授と非線形力学系の理論を用いたシナジー研究に関する情報交換を行った。その後、環境からの情報がリズミカルな体肢の運動を安定させる仕組みをHakenら(1985)の力学系モデルを拡張することによって説明することに成功し、その内容を日本体育学会第56回大会にて発表した。また、リズミカルな体肢の運動の安定性に対して、体肢機能の左右差がどのように影響しうるのか、非線形微分方程式モデルを用いたシミュレーションにより検討中した。さらに、動作シナジーの組織化を含む巧みな動作制御の背景にある脳活動に関する知見を著書(「運動と高次神経機能」の第6章第3節)および総説(体育の科学第56巻1号)としてまとめ、さらにトレーニングに関する示唆を発表(体育の科学第55巻6号)した。実験的研究に関しては、行動レベルおよび脳活動レベルでの動作シナジーの組織化に関する検討を行った。はじめに、行動レベルでは、リズミカルな体肢の運動を行う際、両側肢の動作が同位相ではなく逆位相で比較的安定し、体肢動作の左右差が大きい場合には位相がドリフトするという興味深い現象を発見した。この知見に関して、次年度以降理論的な背景を検討し、体肢協調動作の安定性を規定する要因について更に明らかにしていく予定である。次に、脳活動レベルでは、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて環境情報に対する協調動作を実現するための脳活動について実験を進めている。データの解析等は次年度以降に行う予定である。本年度は引き続き,動作シナジーの組織化に関する理論的研究および実験的研究を進めた。はじめに,複雑な筋活動の協調を必要とするリズミカルな動作の安定性が環境情報によって変化することを明かにし,非線形微分方程式モデルを用いてその妥当性を検証した。また,その内容をJournal of Experimental Psychology : Human Perception and Performance誌に発表した。次に,リズミカルな体肢の運動の安定性に対する体肢機能の左右差の影響について,非線形微分方程式モデルを作成し,シミュレーションおよび実験によってその妥当性を検討した。その結果,動作の熟達化にとって体肢の左右差が重要な制御変数となることが明かになった。

本内容に関しては,平成19年7月に開催される国際学会14th International Conference on Perception and Actionにて発表予定である。動作シナジーに関わる脳活動については、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて環境情報に対する協調動作を実現するための脳活動について実験を行い,データ解析を進めている。詳細な結果については,次年度に報告する予定である。さらに、研究代表者である工藤は動作シナジーの組織化に関する知見を著書(麓信義編「運動行動の学習と制御」,第4章「学習された運動行動の制御」)として発表し,加えて日本スポーツ心理学会第33回大会におけるラウンドテーブルディスカッション「スポーツ心理学における数理モデル」の世話役および司会を担当して運動制御における力学系モデルの可能性について議論した。また,同ラウンドテーブルディスカッションでは,研究分担者である宮崎が話題提供者として発表を行なった。本年度は、環境情報に対する協調動作を実現するための脳活動に関する検討を行った。実験では24名の参加者が刺激提示装置によって提示される2種類の視覚情報に対してタイミング反応を行うよう教示された。その際の脳活動を機能的磁気共鳴画像装置によって記録し、解析した結果、連続的に提示される視覚情報に対する反応では、間歇的に提示される情報に対する反応に比べて、高次視覚野における活動が増大し、補足運動野および運動前野の活動が減少することが明らかになった。これらの結果は、協調動作の組織化において注目する環境情報の相違により異なる脳部位を用いた情報処理が遂行される可能性を示唆しており、運動の熟練および未熟練の相違を脳活動レベルで定量化できる可能性を示すものである。なお、本研究結果は、第30回日本神経科学大会において発表された。また、昨年度、リズミカルな動作の組織化に関する非線形微分方程式モデルによって、動作の熟達化にとって体肢の左右差が重要な制御変数となることを明らかにしたが、本年はシミュレーションモデルによって推定された左右の機能差と実際の機能差との間に高い相関が認められることを明らかにした。本結果は、本研究で新たに作成された体肢協調動作の力学系モデルの妾当性を更に支持するものである。なお、本内容は、第14回知覚と行為の国際会議において発表され、Lawrence Erlbaum社より出版されたStudies in perception & action IXに掲載された。更に、本研究による一連の研究内容は総説として「体育の科学」誌に掲載され、原著論文として人工知能学会誌に受理された。
心血管系を支配する交感神経の抑制性シナプス後電位の性質と役割の解明

ラット交感神経節前線維(SPN)パッチクランプ法を用いてα2受容体を介した間接作用(postsynaptic)について調べた。Norepinephline (NE)はSPNsを脱分極しその後回復させた。NEによって興奮性シナプス後電位(EPSP)優位のSPNではEPSPの頻度が増加、抑制性シナプス後電位(IPSP)優位のSPNではIPSPのvoltageが増大し、Dexamedetomidineは抑制した。firingの多いSPNの一部では、NEによってfiringが消失した。SPNはα2受容体を介したpostsynapticな作用とα2受容体を介さない抑制作用があった。平成25年度は交感神経節前線維(SPN)のα2受容体を介した抑制作用を調べるために新生児ラット摘出標本でのパッチクランプ法を用いてSPNのNorepinephline(NE)とDexamedetomidine(Dxm) (yohinmineよりα受容体親和性が強い)に対する反応を調べた。以前、我々は、SPNにはsilent neuronとfiring neuronの2種類が存在し、それぞれの電気生理学的な特徴を報告しているが、本研究ではsilent neuron(n=2), firing neuron (n=16)のそれぞれのSPNにおいて、control recordingで自発的に興奮性シナプス後電位(EPSP)を優位に呈するSPN(EPSP-SPN)と抑制性シナプス後電位(IPSP)を優位に呈するSPN(IPSP-SPN)の2種類があることを発見した。NE投与によって、どちらのタイプのSPNも有意に脱分極し、EPSPもIPSPも共に増加、また、NEのwash outで脱分極は回復した。一方で、SPNのfiring neuronの中にはNAによって有意に過分極するものも少数だが認め、NEのwash outで過分極は回復した(n=3/18)。我々は、これらのNEに対するSPNの反応の違いは、それぞれのSPNのα受容体のタイプ別の分布や感受性によって異なると仮定した。そこで、yohimbineよりα2受容体への親和性が高いDxmを用いてα2受容体を介するSPNの反応を調べた。DxmはNAによって脱分極するSPNではEPSP-SPNであってもIPSP-SPNであってもEPSPやIPSPを抑制、また膜電位は有意に変化させなかった。NAによって脱分極するSPNではDxmによっても脱分極しなかった。以上よりSPNのNAとDxmに対する反応は、α1受容体優位なSPNとα2受容体優位なSPNでは異なり、α1受容体優位なSPNではNAによって脱分極しEPSPやIPSPが増加、Dxmによって抑制され、α2受容体優位なSPNではNAによっても抑制、Dxmによっても同様に抑制する可能性が考えられた。平成25-26年度は交感神経節前線維(SPN)のα2受容体を介した抑制作用を調べるために新生児ラット摘出標本でのパッチクランプ法を用いてSPNのNorepinephline(NE)とDexamedetomidine(Dxm) (yohinmineよりα受容体親和性が強い)に対する反応を調べた。以前、我々は、SPNにはsilent neuronとfiring neuronの2種類が存在し、それぞれの電気生理学的な特徴を報告しているが、本研究ではcontrol recordingで自発的に興奮性シナプス後電位(EPSP)を優位に呈するSPN(EPSP-SPN)と抑制性シナプス後電位(IPSP)を優位に呈するSPN(IPSP-SPN)の2種類で分類した。NE投与によって、どちらのタイプのSPNも有意に脱分極し、EPSPもIPSPも共に増加した。一方で、SPNのfiring neuronの中にはNAによって有意に過分極するものも少数だが認め、NEのwash outで過分極は回復した。我々は、これらのNEに対するSPNの反応の違いは、それぞれのSPNのα受容体のタイプ別の分布や感受性によって異なると推測した。そこで、α2受容体への親和性が高いDxmを用いてα2受容体を介するSPNの反応を調べた。DxmはNAによって脱分極するSPNではEPSP-SPNであってもIPSP-SPNであってもEPSPやIPSPを優位に抑制(消失させ得るほど)、また膜電位は有意に変化させなかった。以上よりSPNのNAとDxmに対する反応は、α1受容体優位なSPNとα2受容体優位なSPNでは異なり、α1受容体優位なSPNではNAによって脱分極しEPSPやIPSPが増加、Dxmによって抑制され、α2受容体優位なSPNではNAによっても抑制、Dxmによっても同様に抑制されると考えられた。上位中枢と連続性を保ったSPNのNAとDxmに対する反応についての実験を施行中である。各薬剤に対する反応は過大になるかもしれない。以前、我々は、SPNにはsilent neuronとfiring neuronの2種類が存在し、それぞれの電気生理学的な特徴を報告しているが、本研究では交感神経の抑制作用を調べるために、シナプス後電位に注目した。SPNにはcontrol recordingで自発的に興奮性シナプス後電位(EPSP)を優位に呈するSPN(EPSP-SPN)と抑制性シナプス後電位(IPSP)を優位に呈するSPN(IPSP-SPN)の2種類が認められた。

NE投与によって、どちらのタイプのSPNも有意に脱分極し、EPSPもIPSPも共に増加した。一方で、SPNのfiring neuronの中にはNAによって有意に活動電位やシナプス後電位が抑制されるものもある一定の割合(20%程度)で認められ、NEに対するSPNの作用は多様性が認められた。我々は、これらのNEに対するSPNの反応の違いは、それぞれのSPNのα受容体のタイプ別の分布や感受性によって異なると推測し、α2受容体への親和性が高いDxmを用いてSPNの反応を調べた。しかし、このNAによる抑制作用はDxmで変化が認められなかった。よって、以前、Nishiらが報告(Nishi S. et al. Organization of the autonomic nervous system 1987)にあるように、SPNの興奮作用はα1受容体、抑制作用はα2受容体を介したものというより、両者は異なる機序による作用である可能性も考えられた。しかし、Nishiらの報告と我々の実験方法は異なるものであり、ひとつのSPNの多様性を考えると、さらに大きな交感神経ネットワークでの実験が必要と考えられた。研究実施計画書にあるように、平成25-26年度においてはSPNそのものの電気生理学的性質、薬剤に対する反応を調べた。心血管系を支配するSPNが電気生理学的に自発的に活動電位を発火するfiringneuronと自発的に発火しないsilent neuronの2種類がるが(Minoura et al.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2009)、それぞれにEPSPを優位に受けるものとIPSPを優位に受けるものの2種類があることがわかった(第78回, 79回日本循環器学会総会で発表済, 2014日本高血圧学会で発表済)。さらに、薬剤に対する反応では、ノルエピネフリン(NE)による反応は上述のように多様性があり、ひとつのSPNにおける電気生理学的性質も異なり、さらに薬剤の反応も異なるため、平成27年度も引き続きSPNにおける実験を続行したため若干計画に比べて実験に時間がかかっており、研究計画書よりやや遅れていると考えられる。平成28年度は交感神経節前線維(SPN)でのα2受容体を介した間接作用(postsynaptic)をより明確にするために、パッチクランプによる実験数を増やして、Norepinephline(NE)とDexamedetomidine(Dxm)への興奮性シナプス後電位(EPSP)と抑制性シナプス後電位(IPSP)の反応をまとめた。SPNにはEPSPを優位に呈するタイプ(EPSP-SPN)とIPSPを優位に呈するタイプ(IPSP-SPN)があり、NEで両者有意に脱分極しNEのwash outで脱分極は回復した(平成25-27年度にも報告済)。EPSP-SPNsではNEによってEPSPの頻度が有意に増加し、IPSP-SPNsではIPSPのvoltageが有意に増大した。Dxmによってこれら両者のNEに対する反応は有意に消失した。
日本的予算管理システムの特質に関する実証研究-国際比較研究の観点から-

本研究では、日本的予算管理システムと欧米の予算管理システムとの比較の観点からフィールド調査を行い、その結果を踏まえ、日本企業の予算管理システムに見られるいくつかの特質を明らかにした。本研究は、日本的予算管理システムの特質を明らかにすることを狙いとしている。そのためのベースとして、平成20年度は、日本と欧米の文献に見られる予算研究ならびにその周辺研究をレビューし、今後の研究課題を提示することができた。膨大な文献レビューから、日本と欧米の研究の間に、メインとなるトピックスや研究へのアプローチの仕方にかなりの隔たりがあることが確認された。とりわけ、欧米の研究で持続的に研究が続けられているRAPM (Reliance on Accounting Performance Measures)研究に該当するものは、日本では皆無であった。こうした文献レビューの結果は、両者の間に予算管理システムの設計あるいは運用方法に何らかの相違があることを示唆するものであり、日本的予算管理システムに内在する特質を解明することが研究上大きな意義を持つことを物語っている。一方、文献レビューの結果を踏まえて行われたヒアリング調査からは、日本企業の予算管理実務について、その全体像と運用プロセスに関する多くの知識を得ることができた。欧米を中心に、Beyond Budgetingに代表されるような予算に対する批判的な見方が存在するにも関わらず、日本企業では相変わらず予算は必要不可欠なものとして認識されており、若干の予算の弊害は運用の仕方を工夫することによって十分回避できるものと認識されている。これらの知識は、今後予定されている別のヒアリング調査においてさらに補完されることになろう。また、平成20年度に行った文献レビューやヒアリング調査等により、次年度以降の質問票調査のための基礎資料が提供されたといえる。日本的予算管理システムの特質を明らかにすることを目的に、3つのサブトピックスを中心とした研究が行われた。まず、日本企業への成果主義の導入が予算管理システムに及ぼす影響に注目し、RAPM(Reliance on Accounting Performance Measures)研究からのアプローチを試みた。次に、制度的な側面が予算管理に与える影響を把握することを目的に、企業が公表する決算短信に含まれる経営者予測に注目し、経営者予測が予算目標あるいは予算管理に及ぼす影響について検討を行った。さらに、日本的予算管理は、ハード面のシステムそのものよりも運用の仕方にこそ特徴があることを明らかにしようとした。その際、組織成員間の相互作用は重要な切口の一つとなっている。これら3つのサブトピックスについては、今年度も引き続き追加的な研究が行われることになっている。研究の進め方としては、ヒアリング調査をメインにし、企業実務のありのままの姿を浮き彫りにしようと心掛けた。同時に、予算管理ベンチマーキング研究会を立ち上げ、実務家から直接同社の中期経営計画ならびに予算管理システムについて話を聞く場を設けた。一連のヒアリング調査と予算管理ベンチマーキング研究会の開催により、日本企業の予算管理実務について多くの知識を得ることができた。欧米を中心に、Beyond Budgetingに代表されるような予算に対する批判的な見方が存在するにも関わらず、日本企業では相変わらず予算は必要不可欠なものとして認識されている。もっとも、日本企業の予算管理にまったく問題点がないわけではない。ヒアリング調査からもその問題点は指摘されているが、予算管理システムの運用の仕方を工夫することによってそれらは十分回避できるものと認識されている。今後予定されている別のヒアリング調査、ベンチマーキング研究会、質問票調査などによって、これまでの研究成果はさらに補完されることになる。前年度に引き続き、日本的予算管理システムの特質を明らかにすることを目的に、日本企業への成果主義の導入が予算管理システムに及ぼす影響を検討した。また、制度的要因が予算管理システムに与える影響を分析すべく、決算短信に含まれる経営者予測にも注目した。一方、日本的予算管理はハード面のシステムそのものよりも、そのシステムの運用の仕方に特徴があることについても検証を試みた。具体的な研究の進め方としては、複数の代表的な企業へのヒアリング調査をメインにしながら、予算管理ベンチマーキング研究会の開催により、実務家から直接各社の中期経営計画や予算管理システムについて報告してもらい、実務家との質疑応答を通じて多くの知識と示唆を得ることができた。これまでの研究活動から、日本企業における予算管理は、中期経営計画を実現するためのアクションプランとして機能していること、従来から言われてきたとおり、予算実績が直接的に報酬決定に結びつく傾向は弱いこと、アクションコントロールやプロセスコントロールによる期中統制が重視されていること、などの特徴が明らかになった。また、脱予算経営(BB)の主張とは異なり、日本企業において予算管理はかなり有効に機能している側面もうかがえた。以上を踏まえ、予算管理システムについても、欧米モデルとは異なる日本独自のモデルの存在が示唆された。その結果、これまでほとんど注目されてこなかった日本的予算管理論を体系化していくことが理論的にも実務的にも非常に重要であることが認識された。
口腔咽頭におけるヘルペス属ウイルス検出法の確立とその臨床応用の検討

はじめに,ウイルス検出のための検体として採取時の侵襲が少なく繰り返し採取可能である咽頭うがい液に注目し,うがい液から簡便かつ確実にDNAを抽出する方法を検討した。その結果,血液用50mlDNA抽出キットの用いることで,超遠心とエタ沈による手作業と比してDNA収量を減少させることなくのDNA抽出時間を大幅に短縮することが可能となった。次いで,うがい液に含まれる体細胞とEBウイルス(EBV)コピー数を定量的に検出するために,体細胞数1個あたり2コピー存在するbcl-2と,EBVのWとBNRF-1領域のシークエンスを利用したプライマーとプローブを作成し,Taqman PCRによるReal-Time PCRの系を整えた。bcl-2,EBV W, EBV BNRF-1のプライマーからPCRとTAクローニングよりプラスミドを作成し,この希釈系をReal-Time PCRのstandardに用いることで精度の高い定量測定系を確立した。健常ボランティア33名,口蓋扁桃摘出症例47例を対象に経時的に計582のうがい液を採取し,年齢,扁桃疾患の等の臨床データ別に解析した。今回の検討では,臨床データや血中ウイルスとうがい液中のEBV量との有意な相関はみられなかった。咽頭うがい液を用いた臨床応用として,性感染症の代表的な病原体である淋菌およびクラミジアの口腔咽頭からの検出について530症例を対象に検討した。うがい液と従来からおこなわれている咽頭スワブを同一例から同時に採取し,2つの核酸増幅法を用いて検出した。いずれの検査においてもうがい液が咽頭スワブより陽性検出数が上回っていた。以上,口腔咽頭からの微生物検出用の検体としてうがい液が有用であることが示された。また,うがいの仕方,摂食前後で収集されるDNA量にばらつきがみられ,経時的に測定する場合はうがい液採取条件が今後の検討課題と考えられた。これまでに、ウイルス性急性扁桃炎または急性咽喉頭炎が疑われた患者および、唾液腺疾患で手術を受けた症例の計52症例から得られた検体と、健常者20名の唾液を検体としてウイルス分子生物学的検索手段の検証を行った。凍結保存およびホルマリン固定した検体組織と末梢血単核球からはDNAを抽出し、PCR法にてEBウイルス(EBV)・ヒトヘルペスウイルス6および7(HHV-6,7)の検索を行った。ホルマリン固定標本からは病理組織学的変化を観察し、免疫組織化学にて単純ヘルペスウイルス(HSV)および水痘帯状庖疹ウイルス(VZV)抗原の検出を試みた。またEBV感染症の疑われた症例にはin situ hybridizationを行い炎症局所からのEBV検出を試みた。健常者の唾液からは、DNA抽出処理し同様にPCR法にてEBV、HHV-6、HHV-7の検索を行った。対象症例中、臨床所見、病理組織診断および血清抗体などの従来の臨床検査にてウイルス感染症と診断できたのは、それぞれHSV3症例、VZV1症例、EBV15症例であった。一方、今回検証した検体組織と末梢血単核球からのPCR、免疫組織化学検査およびin situ hybridizationによってHSVを5症例、EBVを12症例、HHV-6を5症例から検出した。今回の検討でHHV-7およびVZVを検出した症例と、2種類以上のウイルスを検出した症例はなかった。局所の組織の分子生物学的検索は、HSVおよびHHV-6においては従来の診断手段に比べ感受性が高いが、EBVにおいてはむしろ低医結果であった。