hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
機能的3次元組織構築のための統合的バイオファブリケーション

前年度までの検討にて、酵素反応によるゲル化を使った3Dバイオプリンティング以外に、可視光の照射によるゲル化を使った3Dバイオプリンティングにも、血管様構造を含むものも含めて成功しており、各種機能細胞の評価からその有望性も実証することができていた。今年度は、さらに統合的な視点から3Dバイオプリンティングによる3次元組織構築に取り組むべく、将来的に汎用的に利用されるようになるプリンティングプロセスの開発に取り組んだ。具体的には、最も広く3Dバイオプリンティングにおいて使用されている、押し出し式プリンターにおいて、酵素反応を使った簡便なプリンティングを可能とする技術の確立に取り組んだ。新たに確立に成功した方法は、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを使ったゲル化において必要となる過酸化水素を、プリンティング中に連続的に反応系へ供給するために、低濃度の過酸化水素を含んだ空気中でプリンティングを行うという方法である。この方法によって、連続的に、細胞の生存に大きな影響を与えることなく、押し出し式プリンターを用いた3次元構造体の造形ができるようになった。さらに、この造形時に、生体適合性の高い各種ナノファイバーを添加しておくことで、造形精度を向上させることができた。さらに、シルクをインク成分とする3Dプリンティングにも取り組み、インクとして使用するための条件などを明らかにするとともに、良好な造形が可能な条件を見出した。共同研究者が実施した細胞側からの検討としては、3次元構造物に導入するための肝細胞をiPS細胞から効率的に分化誘導する方法の開発に取り組み、学会発表に至る結果を得ることができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、機能不全の組織や臓器を、生体外で作製した組織体を移植して治療する再生医療の実現のための技術の1つとして注目されているバイオプリンターを用いた三次元組織構築のために必要な各種技術の統合的な開発を目的として検討を行った。まず、可視光照射によりゲルを形成するとともに細胞機能を向上させるインク開発のための基礎的検討として、当該方法によりゲル化するインクの調製条件などの探索を行った。インクの主材料である高分子には、これまでに研究分担者の境が開発を行ってきた、フェノール性水酸基導入高分子を用いた。また、光増感剤としてはルテニウム(II)ポリピリジル錯体を用い、犠牲材としては過硫酸ナトリウムを使用した。光増感剤および犠牲材の濃度と細胞毒性に関して検討を行って得られた、短時間の利用であれば細胞に影響を与えない濃度にてそれらを使用し、フェノール性水酸基導入高分子水溶液のゲル化を導く条件の探索を行い、そのような条件を見出すことができた。また、押し出し式のプリンターを用いて、造形することができる条件を見出すこともできた。ただし、造形精度の点からは十分と言えるレベルにはまだ達しておらず、これはゲルの強度とゲル形成に要する時間が十分早くないためであると考えられる。これらに関してはあらためて最適化を行う必要がある。なお、前述したように、造形精度は十分でないものの、マウス線維芽細胞を用いた検討によって、細胞の生存を大きく損なうことなく造形できる可能性を見出すことができた。可視光照射によりゲルを得ることができるインク材料として有望性を見出した条件で作製したゲルを用いた肝臓由来細胞の機能を評価するには至っていないため。前年度の検討にて、これまでに開発していた酵素反応によりゲル化する複数の材料を主成分とする、可視光硬化インク材料を開発する際の設計指針を得ることができていた。本年度は、この成果にもとづいて、可視光硬化インク材料の中から、主にゼラチンとヒアルロン酸誘導体に着目し、肝臓がん細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞および、筋芽細胞を用いて、インクの組成と得られるゲルの力学的特性や分解特性、また、各細胞の増殖、遊走性を評価した。また、脂肪幹細胞に関しては、プリントされたゲル内での脂肪細胞への分化、筋芽細胞については筋細胞への分化も評価した。共焦点レーザー顕微鏡を用いた検討によって、いずれの細胞についても、生存をほとんど損なうことなくゲル内に封入できる条件を見出すことができた。また、細胞毎に、ゼラチンとヒアルロン酸誘導体のそれぞれの組成を制御することによって、ゲル内での増殖・遊走やゲルの分解性をある程度の範囲でコントロールできることが明らかになった。さらに、ハイブリッドプリンターの開発に資する技術として、マイクロ押し出し式と投映式の3Dプリンターのいずれにおいても、問題なく細胞を含んだ構造物を造形できる条件を見出すことができた。また、これらのプリンターを用いて、培養液を流通可能な管腔構造を有するゲル構造物を造形することもできた。これらの造形の点から有望性を見出すことができた条件で作製したゼラチンとヒアルロン酸の混合ゲル構造物中では、脂肪幹細胞は3週間程度、分化能を維持したまま増殖させることができ、さらに脂肪細胞への分化誘導を行うこともできることを、PCRを使った遺伝子発現解析ならびに、フローサイトメーターを使った細胞表面のタンパク質解析により確認することができた。また、筋芽細胞は、筋細胞への分化を示唆する形態変化を示すことを明らかにすることができた。当初の予定通り、インクの開発や複数のプリンタに関する検討、および幹細胞を含めた各種細胞を使用した検討が進行しているため。

今年度は、さらに統合的な視点から3Dバイオプリンティングによる3次元組織構築に取り組むべく、将来的に汎用的に利用されるようになるプリンティングプロセスの開発に取り組んだ。具体的には、最も広く3Dバイオプリンティングにおいて使用されている、押し出し式プリンターにおいて、酵素反応を使った簡便なプリンティングを可能とする技術の確立に取り組んだ。新たに確立に成功した方法は、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを使ったゲル化において必要となる過酸化水素を、プリンティング中に連続的に反応系へ供給するために、低濃度の過酸化水素を含んだ空気中でプリンティングを行うという方法である。この方法によって、連続的に、細胞の生存に大きな影響を与えることなく、押し出し式プリンターを用いた3次元構造体の造形ができるようになった。さらに、この造形時に、生体適合性の高い各種ナノファイバーを添加しておくことで、造形精度を向上させることができた。さらに、シルクをインク成分とする3Dプリンティングにも取り組み、インクとして使用するための条件などを明らかにするとともに、良好な造形が可能な条件を見出した。共同研究者が実施した細胞側からの検討としては、3次元構造物に導入するための肝細胞をiPS細胞から効率的に分化誘導する方法の開発に取り組み、学会発表に至る結果を得ることができた。ハイブリッドプリンターの開発に加え、幹細胞や肝細胞などより組織工学分野で有用と思われる細胞を用いた検討を推進する。これまでに得られた知見、成果を活かして、当初の目標を達成できるように研究を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒト脱落乳歯幹細胞(SHED)の多能性に関する研究

本研究の目的は,脱落乳歯歯髄幹細胞(SHED)の培養法を確立して,in vitroにおいて細胞への最適な分化条件を設定し,この細胞の多能性を証明すること,さらに,SHEDが特に中枢神経に特異的に分化する能力を持つという報告をうけて,移植による神経系への分化転換を動物モデルによって検討することにある。最初にSHEDを培養し,胎生マウスの脳内に移植したところ生着が確認され,その一部は視床下部視交差上核(SVN)に認められ,免疫染色の結果,アストロサイトに分化したことを示した。また,SHEDを新生マウスの脳室内に移植したところ,脳梁および海馬歯状回の顆粒層に移植細胞が認められたが,生着した細胞は少数であった。この原因は,ヒト歯髄細胞はマウスに移植後,環境因子の影響を受けた可能性が考えられた。そこで,移植細胞が海馬歯状回において生存するための環境因子の影響を調べるために咀嚼に着目し,咀嚼が海馬神経幹細胞に与える影響を明らかにした。マウスを粉末飼料投与群,抜歯後粉末飼料投与群およびコントロール群の3群に分け,海馬神経幹細胞の性質をBromodeoxyuridine(BrdU)投与により調べた。その結果,BrdU投与直後の神経幹細胞数は3群間で変わらなかったが,BrdU投与5週間後では,コントロール群に比べて,他の2群で神経幹細胞数の減少が認められた。この事は,海馬にSHEDを移植する場合,移植後の細胞が容易に生着するためには環境因子の設定が必要であり,咀嚼の条件を工夫することにより,移植細胞が容易に生着しやすい環境を設定できることが示唆された。最初に、歯髄幹細胞の動物実験モデルとして、生後4週目のGFPトランスジェニックマウスの切歯より歯髄を採取して10%FBSの入った培養液中で培養した。培養した細胞は蛍光波長下では緑色に発色した。この細胞は約1ヶ月後に、骨様の石灰化像を呈した。次に、神経細胞への分化能を検討するため、培養歯髄細胞を新生ワイルドタイプマウスの側脳室に移植した。移植後2週間後に固定を行ない、脳切片を作成した。蛍光下で移植細胞を検索すると、側脳室周辺に緑色に発色する移植細胞を認め、その中の一部は、神経様の突起を伸ばし、神経細胞に分化していることが示唆された。次に、北海道大学病院歯科診療センター外来患者の抜去乳歯より歯髄を採取し、10%FBSの入った培養液中で培養した。培養10日目に、EGFの入った神経幹細胞培養用無血清培養液で10日間培養した。細胞の一部は神経幹細胞様の球状塊を形成し、これらの一部はneuroshpere様の浮遊塊となった。この細胞を新生マウス側脳室および海馬に移植し、移植後2週間後に固定を行い移植細胞の増殖を、ヒト核抗体により、染色した。移植細胞の大部分は、免疫反応により、死滅したが、一部の細胞は側脳室近傍および海馬歯状回において染色され、生着が確認された。現在、神経細胞のマーカーを用いて、これらの細胞が神経細胞に分化しているか検討中である。一方、海馬に移植した細胞が神経幹細胞に分化し、どのような条件で増殖するかを調べるために、マウスに軟食投与および臼歯部抜歯を行なった群と通常の固形食を与えた場合の海馬歯状回の神経幹細胞の変化を比較した。軟食投与や抜歯を行なった群では、有意に神経幹細胞の生存率が減少し、咀嚼が海馬神経幹細胞に影響していることが明らかになった(論文発表済み)。

今後は、マウス歯髄細胞やヒト脱落乳歯幹細胞を海馬に移植し、咀嚼の影響でどのような分化動態を示すのか検討したい。海馬に移植したヒト脱落乳歯幹細胞(SHED)をマウス海馬に移植する際,大部分の細胞が死滅するため,これらの細胞が移植後海馬内で増殖する条件を検討した。最初に,SHEDをマウスに移植するため,異種間の拒絶反応の可能性を考慮した。そこで,これを防ぐため,移植後の新生マウスの腹腔にサイクロスポリンの投与(10mg/体重kg)を毎日行った。しかし,移植細胞の有意な成着数の増加は認められず,移植部位の環境因子(ニッチ)の改善が,SHEDの移植後の増殖に必要なことが示唆された。SHEDが海馬において,神経幹細胞あるいは神経細胞に分化転換し,どのような条件で増殖するか検討した。平成16年度の実績報告書において,咀嚼が海馬神経幹細胞の増殖に影響することを報告したが,そのメカニズムについてはよくわかっていなかった。申請者は,歯牙の喪失や軟食摂取では,口腔内の歯根膜受容器などを通して脳幹に入力していた刺激が消失し,脳幹から海馬まで情報の伝達が低下することにより,海馬の幹細胞数が減少するという仮説をたてた。そこで,生後4週のマウス臼歯の片側を抜去し,その後,通常食で数週間飼育し,bromodeoxyuridine(BrdU)を用いて,海馬歯状回における神経幹細胞の変化を測定した。その結果,BrdU投与直後では,両側の海馬歯状回で分裂した神経幹細胞数での増減はなかったが,BrdU投与5週間後において,抜歯側の反対側での海馬歯状回の幹細胞が同側に比べて有意に低下していた。以上の結果は,咀嚼を通して,口腔内の知覚情報が,脳幹を経由して海馬に到達し,神経幹細胞の維持に関与している可能性が示唆された。今後は,咀嚼の条件を変化させたり,脳幹から海馬へ達する神経系を特定し,これを刺激することでSHEDを効率的に移植する条件を検索したい。
銀河の実効的ダスト減光曲線進化の研究

当初の予定どおり、銀河の化学(ダスト)・多相星間ガス進化モデルの構築を始めた。まず、銀河におけるダストの影響を全般的に調査するために、国内の専門家を集めた「銀河のダスト」研究会を2006年11月10日・11日に主催した。24名参加という適度な規模の中、大変有意義な議論を交わすことができた。2007年3月にはこの研究会の集録を発行した。また、実効的ダスト減光曲線のモデル化も行なった。これはイタリアおよびフランスの研究協力者らとの共同研究である。星形成は分子雲などの高密度領域で起こることが知られているが、そこにはダストも豊富に存在する。したがって、誕生直後の若い星ほど大きなダスト減光を受けると予想される。このような星の年齢に依存したダスト減光を考慮し、銀河スケールの詳細な輻射輸送計算シミュレーションを行なった。結果を紫外線天文衛星GALEXによる最新の観測データと比較したところ、非常に良くデータ傾向を再現できることが分かった。この観測データは、星の年齢依存減光を考慮しない従来のモデルでは上手く説明できないことが問題であったのだが、われわれの研究によりこの問題は解決されたと考えている。この成果は2007年2月に論文として出版された。これらの研究に加えて、輻射輸送数値計算技術の開発研究も行った。光学的厚みが100万を超えるような原始惑星系円盤の温度・密度構造を精密に決定するためには、高度な輻射輸送数値計算技術が要求され、このような計算を実行可能な研究グループは世界に2,3しか無い。東京工業大学の研究協力者と共同で数値計算コード開発を行い、基本的な部分は完成した。現在コードの応用例として、原始惑星系円盤の氷の存在領域についての研究を行なっている。
ボビンレス超伝導ソレノイドと多層磁場シールドを用いた高効率ＡＤＲシステム開発

断熱消磁冷凍機(ADR)用の小型のボビンレス超伝導ソレノイド磁石の開発に成功した。極細の径0.127mmのNbTi線を用い、1N以下の張力コントロール可能な専用に開発した巻線機を用いての製作を成功させた。作成されたマグネットを液体ヘリウムの浸漬冷却によって約4.2Kの環境下で励磁試験を行った。デザインの前提としていた4A通電時中心磁場2Tの仕様を満たすことを確認した。またさらに高い6A通電で3Tを記録した。クエンチが起こる電流値まで通電していないが、NbTi線の臨界磁場、臨界電流の特性から推測される限界の90%以上の通電電流でクエンチを起こしていないということは、機械的に問題なくエポキシの選定等を含む製作方法に問題が無いことを示している。これにより、既存のADRと置き換えると、数%20%程度の冷凍能力向上が期待できる。また、一方で断熱消磁冷凍機用の磁気シールドを多層化する方法について検討を行った。原理検証を行うため、上述の超電導磁石を用いて、溶接などの複雑な方法を用いずとも多層シールドによって均一な磁気遮蔽が行えることを示した。これを元にシミュレーションによって、断熱消磁冷凍機用磁気シールドのデザインを行った。その結果、磁気シールドの多層化による効果は大変大きく、重量の半減させる技術となりうることをしめすことができた。以上の結果からADRシステムの軽量化に資するマグネットのボビンレス化及び磁気シールドの多層化という2つの技術が製作可能であり、宇宙機搭載に貢献する事を示すことが出来た。25年度が最終年度であるため、記入しない。宇宙マイクロ波背景放射観測の様に、非常に高感度な検出器を使用する場合、検出器の感度、熱雑音の低減の為、超低温環境が必要となっている。この環境において、軽量化・コンパクト化された断熱消磁冷凍機が求められる。これを解決するために、本研究のボビンレス超伝導ソレノイドの製作、多層磁場シールドの製作に挑んだ。平成24年度の実績としては、様々なエポキシ材料を比較し、ADR用の極細線を使った超伝導ソレノイド用のエポキシの選定、最適な張力の探索等を終え、マグネット製作方法の確立が行われた。塗り巻と呼ばれるエポキシを塗りながら巻く方法を採用したため、エポキシ中にボイドが出来ることなどが心配されたが、顕微鏡による断面の観察を通して、ボイドは観察されず、この製作方法の有効性が明らかとなった。また、これらの試作を繰り返す事で、より洗練されたマグネット製作用冶具の開発を行った。さらに多層磁場シールドについては、磁場解析の可能なソフトANSYSを導入し、シミュレーションによる設計・検討を繰り返した。この結果、同材料を分割して隙間を設けて3層に巻くだけで、従来の3分の1以下の軽さで同じ磁場遮蔽度が実現できる軽量化したデザインを示すなどの結果を得た。現在、数種類の磁気遮蔽材料を同時に使う形の多層化をシミュレーションによって再現するなどを行い、試作機の設計を固めつつある。これらの工夫により、さらなる軽量化が実現され上記のボビンレス化と合わせて、ADR全体として30%以上の軽量化が実現すると見込まれた。計画時に想像された以上に、エポキシの選定や超電導ソレノイドを作るための巻き線技術の収斂に時間がかかった為。研究課題として、超伝導マグネットの製作スピードがあげられる。これに対し、これまでの計画よりも小型の超伝導ソレノイド製作にシフトする事によって、実機としてのADRの冷凍能力は落ちるものの、本研究課題が目指す所のアイディアの実証に注力する事で、研究の進捗を加速する。
血栓症の分子機序に対する新規モデルの確立

本課題では、血漿成分フォンヴィルブランド因子(vWF)の挙動に着目して血栓形成機構の解明を試みた。培養細胞に効率良くvWFを一過的発現させる方法を樹立することで、細胞外へ分泌された野生型及び変異型vWF多量体の局在と生理的機能が明らかとなった。現在、vWF欠損マウスの血流中におけるvWFの挙動の解析、およびvWF分子のX線構造解析により、vWFの挙動と構造の関連性の解明に取り組んでいる。血栓症発症の分子機序を解明するため、本研究では、以下の点に注目している。vWF変異体の作成:本研で用いるvWF変異体はすべて遺伝子組換えにより作成する。ジスフィルド架橋の導入によりタンパク質の立体構造に変化を与えた変異体や、点変異により粘着性が低下した変異体を発現するような複数のコンストラクトを完成した。これらのコンストラクトは、培養細胞において変異タンパク質を発現するかを確認する。精製タンパク質アッセイ:In vitroで精製した先述のvWF変異体の機能解析を行う。ここでは、フローチャンバーシステムを用いて、変異体の血小板粘着能にや酵素による切断能などを評価する。なお、構造変化を与えたvWF変異体は、Dr. John Weisel (University of Pennsylvania, USA)の研究室にて、ずり応力に対する耐性を光ピンセットを用いて解析する。京都大学浜地格教授の研究室と共同研究により、vWFを特異的に標識するプローブ分子を開発する。リガンド指向性トシル(LDT)分子を用いることで、vWFを生体で蛍光標識することが可能になると期待される。本研究では、培養細胞や動物生体内で内因性vWFがLTD分子により標識できるか否かを検討する。他の系統マウスに比べて20倍多くvWFを発現しているCASA/RkJマウスのゲノムライブラリーを作成した。現在、複数のvWF変異タンパク質の精製と、これを用いた解析を進めている。フォンヴィルブランド因子(vWF)の標識とその解析:蛍光標識したvWF標的ペプチドを用いて、培養細胞におけるvWFの挙動の可視化を試みたが、十分なvWFの発現量が得られなかった。そこで申請者は、別の培養細胞にあらかじめヒトヒスタミン受容体(HRH1)を安定発現させて、更にvWFを一過的に発現させる方法を採用した。その結果、ヒスタミン処理により、細胞は効率良くまた十分量の野生型及び変異型vWFの産生が可能となり、細胞外へ分泌されたvWF多量体は、さや状につながる構造で細胞表面に蓄積することを確認した。申請者は12種類の変異型vWF発現系を構築しているが、それぞれについて、免疫染色によりその局在を明らかにし、流液中でのvWF多量体の構造変化や分解、そして血小板との相互作用についてその経時変化を観察することが可能となった。変異型vWFのあるものは、vWF特異的分解酵素であるADAMTS13による分解に抵抗性を持ち、流液下での血小板蓄積が増加することが明らかとなった。この実験系の開発は、vWFの血流中における挙動を可視化した点で意義があるといえる。マウスを用いた解析:分解抵抗性と血栓形成促進性をもつvWFA2変異体を発現するノックインマウスの作成を試みたが、完成には至っていない。しかし現在、vWF欠損マウスに安全性に優れるプラスミドベクターを利用して、目的の変異型vWFを遺伝子導入する方法を採用して解析を行っている。その結果、切断抵抗性を持つvWFの発現と血栓性血小板減少性紫斑病発症の関連性を明らかにできると期待される。構造醒析:野生型及び変異型vWFのX線構造解析により、vWFの挙動と構造の関連を明らかにするため、組換えVwf A2タンパク質の大量精製法を確立し、解析を進めている。
高度好熱菌ロドプシンにおける構造安定性の追求

本研究では、研究代表者らが高度好熱菌から初めて発見した、光受容体タンパク質・サーモフィリックロドプシン(TRと略)について、(1)TRの高い熱安定性を生み出す構造的要因を明らかにすること、(2)熱以外のさまざまな物理的・化学的刺激に対する構造安定性を調べることを目的として研究を行った。目的(1)について、可視吸収分光法、X線結晶構造解析法、分子動力学計算法を併用し、TRの構造は分子内部で形成される疎水性相互作用によって高く安定化されていることを明らかにした。目的(2)について、種々の化学物質による構造安定性への影響を網羅的に評価し、熱安定性との相関を明らかにした。申請者が発見した高度好熱菌由来の光受容膜タンパク質・サーモフィリックロドプシン(TR)について,高い熱安定性を生み出す構造的要因を明らかにすること,さまざまな物理的・化学的刺激に対する構造安定性を定量的に評価することを目的に,本研究を実施している。本研究で得られた知見をもとに,他の膜タンパク質への適用も可能な構造安定化法の確立や,TRの高い安定性を利用した計測や材料応用への展開を目指している。平成27年度には,TRの高い熱安定性を生み出す構造的要因の探索に取り組んだ。申請者らは,X線結晶構造解析法をもちいてTRの立体構造を明らかにした(Tsukamoto et al.(2016) J. Biol. Chem.)。得られた立体構造をもとに,類縁のロドプシン類との配列比較および分子動力学シミュレーションをおこない,TRの高い熱安定性に寄与する構造領域を推定した。推定した領域を削除した変異体タンパク質を調製し,熱安定性を評価したところ,野生型に比べて安定性が20倍以上低下することを実験で示すことができた。今後は,推定した構造領域が本当に熱安定性に寄与するのかを立証するために,他の類縁ロドプシン類にこの構造領域を挿入し,同様の熱安定性評価をおこなうことが求められる。平成27年度の研究実施計画では,TRの立体構造に基づく構造安定化部位の探索,および異種TR間での熱安定性の評価をおこない,TRの熱安定性を生み出す構造的要因を推定することができた。加えて,平成28年度の研究実施計画で予定している,さまざまな物理的・化学的刺激に対するTRの構造安定性の評価を前倒して実施することができている状況である。平成28年度には,さまざまな化学的刺激(界面活性剤、変性剤、有機溶媒)に対する、TRの構造安定性を網羅的に評価した。本研究では,界面活性剤として強力な界面活性作用をもつSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、変性剤としてレチナールの脱離を引き起こすヒドロキシルアミン、有機溶媒としてエタノールをもちいた。それぞれの化学的な刺激に対して、TRを含む5種類の微生物型ロドプシンがどれくらいの時間、活性を保っていられるかを紫外可視吸収分光法をもちいて調査した。得られた結果を定量的に解析したところ、TRはいずれの化学的刺激に対しても、他と比べて高い安定性を示すことがわかった。特に、熱に対する安定性とSDSに対する安定性の間に良い相関が見られたことから、両刺激に対する安定性は同じメカニズムで保証されていると結論した。本研究成果は、現在、欧文誌に投稿中である。さらに、TRと同等かそれ以上の熱安定性をもつロドプシンの探索を行い、TRよりも約16倍も安定な分子(Rubrobacter xylanophilusロドプシン、RxR)を発見した(Kanehara et al.(2017)Sci. Rep. 7, 44427、その他新聞報道あり)。TRとあわせて、ロドプシン分子の熱安定性獲得のメカニズムの解明および、TRやRxRをパートナー分子として利用したタンパク質安定化技術などへの応用が期待される。平成28年度の研究実施計画では,さまざまな物理的・化学的刺激に対するTRの構造安定性の評価を実施した。その結果、熱安定性と界面活性剤SDSに対する安定性に相関関係を見出した。このことから、両刺激に対するTRの安定性は、分子内部の疎水性残基が作る強固な疎水性相互作用によって実現されていると結論した。さらに、TRよりも熱安定性の高いロドプシンを発見し、その分子物性を明らかにすることができた。平成27年度の計画で予定していた、TRと他のロドプシンとのキメラタンパク質の調製にも着手した。研究の進捗状況を考慮し、平成29年度には上記の目標を発展させ、TRの分子機能の解析に焦点を置いた。TRのプロトンポンプ機能の詳細解明を目指して、数種類のアミノ酸置換体の作成した。

それらについて、紫外可視吸収分光法および時間分解吸収分光法を用いて、吸収スペクトルおよび、プロトン輸送を担う光反応中間体の形成・崩壊に対するpH依存性を細かく調査した。データ解析から、プロトン輸送に関わるアミノ酸残基の酸解離定数(pKa)を算出した。本研究を進める中で、TRのプロトン輸送機能に関する珍しい現象を発見した。その詳細を明らかにするため、さらなる分光解析を行った。また、TRの分子内部で起こる光反応中間体の生成・崩壊に伴うプロトン移動反応を、早い時間分解能で観測できる独自の手法(ITO(酸化インジウムスズ)電極法;Tamogami et al. (2009) Photochem. Photobiol. 85, 578-589)を用いて計測した。研究は現在進行中であり、今後はさらに詳細な検討および計測・解析を進める。本研究では、研究代表者らが高度好熱菌から初めて発見した、光受容体タンパク質・サーモフィリックロドプシン(TRと略)について、(1)TRの高い熱安定性を生み出す構造的要因を明らかにすること、(2)熱以外のさまざまな物理的・化学的刺激に対する構造安定性を調べることを目的として研究を行った。目的(1)について、可視吸収分光法、X線結晶構造解析法、分子動力学計算法を併用し、TRの構造は分子内部で形成される疎水性相互作用によって高く安定化されていることを明らかにした。目的(2)について、種々の化学物質による構造安定性への影響を網羅的に評価し、熱安定性との相関を明らかにした。平成27年度の研究実施計画で得られた成果をもとに,今後は推定した構造領域が本当に熱安定性に寄与するのかを立証するために,他の類縁ロドプシン類にこの構造領域を挿入し,熱安定性評価をおこなうことが求められる。平成28年度の研究実施計画では,熱以外のさまざまな物理的刺激(温度変化,光)および化学的刺激(pH,界面活性剤,変性剤,溶媒極性)に対するTRの構造安定性の評価をおこなう。平成27・28年度の研究実施計画で得られた成果をもとに、今後は熱安定性に寄与すると予想される構造領域を他のタンパク質に導入することで、熱安定性を高めることができるかどうかを検証することが求められる。加えて、熱に安定なTRが、好熱菌の中でどのように成熟していくのかを検証し、生物学的な観点でTRの安定性獲得のメカニズムについて検証したい。今後の研究にもつながっていくよう、挑戦的な内容にも取り組んでいきたい。生物物理学該当なし機器の故障等の事案が発生せず、消耗品の追加購入等の必要性が少なかったことから、次年度への繰越金が生じた。該当なし本研究の進捗状況から、今後の研究の発展を見越した挑戦的な内容を実施したい計画である。そのために使用する細胞培養器等(総額100万円未満)を購入する計画である。
ファジィクラスタリングに基づく高精度識別器

一般に高性能識別器は,調整できる自由パラメータを持っていて,識別器の汎化能力を高めている.監視カメラは防犯上の理由から多くの駐車場に設置されているが,カメラ方式の検知システムは検知精度の問題から屋外駐車場用としては実用化されていない.今回開発された新システムは平成21年に実際に導入された.また,屋外駐車場(屋上)における約2ヵ月間のテストでの検出精度は99.6%で当初の目標を大幅に上回る性能が得られた.訓練データが10倍になった時の訓練時間は,提案のFCMCでは10倍になるが,LibSVMでは約100倍になることを示した.一般に高性能識別器は,調整できる自由パラメータを持っていて,識別器の汎化能力を高めている.監視カメラは防犯上の理由から多くの駐車場に設置されているが,カメラ方式の検知システムは検知精度の問題から屋外駐車場用としては実用化されていない.今回開発された新システムは平成21年に実際に導入された.また,屋外駐車場(屋上)における約2ヵ月間のテストでの検出精度は99.6%で当初の目標を大幅に上回る性能が得られた.訓練データが10倍になった時の訓練時間は,提案のFCMCでは10倍になるが,LibSVMでは約100倍になることを示した.提案の識別器がどのようなデータにより適しているかを明らかにするために,パターン認識分野で特に最近の5年間に顕著に普及してきたサポートベクトルマシン(SVM)と呼ばれる高性能識別器との性能比較を行い同等以上の性能であることを明らかにした.また実データでの比較として,画像データ,ごみ焼却炉の計測データ,磁気核共鳴画像法(fMRI)の計測データに適用し有効性を示した.事前に分類された大量の画像を基に未知画像にタグ付けすることで自動検索ができる.その際に,画像の切り取りや色のヒストグラムなどの特徴抽出を必要とせずに分類クラスを直接識別する方法を考案した.10種のクラスに分類されたCorel画像コレクション(50万次元,1000件)を用いたベンチマークテストではテストセットに対して約80%の識別精度を達成できた.この成果はIEEEの学会WCCI'08で報告しBest Paperに選ばれた.またfMRIの計測データによる脳の課題実行時と非実行時の識別に応用した.脳の賦活を識別する問題に適用できることが確認できたが装置が大型で実用的ではない.そこで近赤外分光法による計測装置を導入して実用化可能なブレーンコミュニケーションのための識別器の開発を目指した.ヘモグロビン濃度やその濃度変化の時系列もデータ件数に比べて高次元であり,提案の識別器を有効に利用できると考えられる.しかし,期待した精度は得られなかった.現在,脳波測定を併行して用いる方法を検討している.当初の計画にはなかったが,カメラによる駐車場や駐輪場の空き状態の検出には大きな成果が得られた.識別器の訓練の高速化のためにセミハードクラスタリング法を開発した.パターン認識分野で最近顕著に普及してきた高性能識別器であるサポートベクトルマシン(SVM)との性能比較を行い同等以上の識別性能がより短い訓練時間で達成できることを明らかにした.この成果は,企業との共同研究として実施していた駐車場の車両検知システムに応用された.センサーに変えてカメラを用いる方式であり,エッジ抽出による現行方式に比べ10倍以上検出精度を改善した.新システムは平成21年10月に東京・銀座の新設地下駐車場に導入され,今年度も複数個所での導入が予定されている.特に屋外駐車場のカメラ方式車両検知システムは精度の問題から実用化されていなかったが,半年間のテスト結果から99.6%の検出精度を確認していて今後屋外用にも実用化されることになった.SVMの計算時間は訓練データ数の二乗から三乗に比例して増加するのに対して,提案識別器はデータ件数に比例して増えるだけであるので,多くの訓練データを用いる場合に特に有効である。研究成果は2010年IEEE-WCCIで発表(2件)する.また,日本知能情報ファジィ学会誌に投稿中で1件が採択決定となっている.高性能識別器として広範な応用が行われているサポートベクターマシン(SVM)は,大量データを対象とする場合の計算時間がデータ件数の2乗から3乗に比例して増大する点に着目し,提案識別器との大量データでの性能比較を実施し,提案識別器の計算が数百倍以上高速であることを示した.昨年度に大きな成果が得られた駐車場の車両検出システムは全国の駐車場に順次導入されてきている.またその画像データについても大量データでの高速な性能を明らかにした.提案識別器は,車両検出において特定の特徴抽出法を用いずに高い検出精度を達成している.これらの成果は,4編の論文として学術誌に掲載された.また,大量データでの性能比較はすでに投稿済みで,今年度の掲載が決定している.ごみ焼却炉の燃焼制御は自動化システムであるが現実にはオペレータによる頻繁な介入操作が行われており,画像データによるその自動化が求められている.試験的に集められた実データを用いて提案識別器によるプロトタイプとなるシステムを開発した.今後はこのシステムの実用化を目指す.
HMGタンパク質のDNA結合ドメイン構造と認識機構の解析

1,HMG1のDNA結合ドメインのDNA認識機構の解析HMG1タンパク質のDNA結合に主役的に働くBox Bの中で、DNAへのインターカレーションが予測される101F、102Fの結合における重要性を実験的に明らかにした。さらに分子動力学シミュレーションにより、これらの側鎖の配位と結合との関連を解析した。その結果、Box BのDNAへの結合が102F側鎖のDNAへのインターカレーションにより高められること、この側鎖の方向性を101Fが規定していることが明らかとなった。2,HMG1、2がもつDNAインテグレーションの促進機能の発見研究の過程で、HMG1、HMG2が外来遺伝子の宿主ゲノムDNAへの組込み(インテグレーション)を促進する活性を有することを初めて見い出し、促進反応について詳細な検索を行った。HMG1、2を発現するネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドをHeLa細胞に導入し、G418で選択した。G418耐性コロニー数を計測したところ、コントロールプラスミドを導入の場合と比較して約10倍に増加していた。G418耐性細胞内にインテグレートされたプラスミドのコピー数も約2倍に増加していた。さらに、HMG1、2mRNAに対するアンチセンスRNAをHeLa細胞で発現させるとコロニー数は約1/2に減少した。以上の結果より、HMG1、2が外来遺伝子の宿主ゲノムへのインテグレーションの促進反応に直接関与していることが明らかになった。3,HMGタンパク質によるDNA依存性プロテインキナーゼ活性促進機構を詳細に解析した。
惑星科学的衝撃に対する核酸・タンパク質構造の耐性

DNA試料、およびメラニン試料に対する秒速7kmまでの衝撃実験および振動実験を行った。DNAはいλDNAおよびプラスミドDNAを用い、およそ5.4-5.6×10^<-3>μg/μlの濃度で、マイナス50°Cの凍結状態および常温溶液状態において実験を行った。溶液状態のDNA試料に関しては、加速度試験装置(EMIC製F-600BM)により、10Hz-3G,100Hz-10G,40G,70G,および1kHz-30Gの基盤振動範囲で振動加速度によるDNA鎖の保存性を調べた。解析手段はDNAについては電気泳動法による鎖長分布を、またメラニンについては、主として含有されるメラニンラジカルの残存量を電子スピン共鳴法で調べた。衝撃実験に用いた2種類の試料カプセルのうち、低温脆性対策として作成した大型のものでは、秒速7km(飛翔体:0.9gポリカ弾)の場合で、DNA鎖長が48kbpから数100塩基対までに分断され、回収時に2本鎖DNAとして残存する量が50%程度となった。大型カプセル内の試料層における平均圧力は1GPa以下に減衰している可能性が考えられたため、標準的な小型のカプセルで実験を行って比較を行った。メラニン試料は小型のカプセル内に作成した1mm以下の薄い圧粉試料層をターゲットとして、常温で衝撃実験を行ったが、炭化せずメラニンをとして残存する部分は秒速7kmで50%,秒速4kmで80%となり、凍結DNA試料の場合と同様の結果を与えた。溶液状態のDNAは剪断力に弱く、破壊されることが知られているが、その程度を見積もるために、振動試験機に溶液状態のDNAとアルミナボールを混在させ、時間とともに変化するDNA鎖長を調べた。この場合、衝撃実験後のDNA試料と異なって、短時間の内に鎖長の不均一性は観測できなくなった。生命物質の宇宙起源については多くの仮説があるが、その保存性について惑星間移動に必須の衝撃効果を調べた例はない。そこで、プラズマレールガンを用いて固体凍結白油について衝撃実験をすすめるとともに、本年度は、繰り返し振動装置を用いて、溶液状態のDNA試料について高振動負荷を与える実験を行った。衝撃試験では、-30°C以下でカプセルに封入した凍結DNA試料を秒速7kmのポリカ飛翔体で衝撃させる実験を行った。結果として、10GPa程度までの衝撃で、DNA鎖がその2重鎖構造を保ったまま、数k塩基対までのさまざまな長さに分断されること、また短いDNA試料の法が破壊されにくいことが判明した。また自動振動試験装置を使用し、室温で固体粒子を含んだλ-DNA、プラスミドDNA溶液試料を30G程度までの範囲でその振動耐性を調べた。振動時間は1分間100分間として、振動後に回収した各サンプルを電気泳動法により、残留DNA濃度およびその鎖長変化を測定し、各コントロールDNA(振動時間0分のDNA)と比較した。振動によるDNAへの影響は、衝突による様々な長さに連続的に分断する結果とは異なった結果を与えた。一般にλ-DNA、プラスミドDNAにおいて、ともに粒子を混入しない状態で振動をさせた場合、それぞれの内部で切断・破壊は見られなかった。これは、媒質である緩衝溶液とその内部のDNAが同位相で振動するため、DNA自体には等しい内力として加速度が加えられたに過ぎないからである。一方固体粒子の存在下では、λ-DNAで切断・破壊が起こったが、プラスミドDNAでは大きな変化がなかった。前者では、粒子が振動装置による振動に同調しない位相遅れの振動をしたためにDNAとの衝突が繰り返され、切断・破壊が起きたと考えられる。プラスミドDNAの実験においては、DNAの形状が環状であることと、鎖長の短いことが切断・破壊を起こさせなかったことが考えられる。
微分可能多様体とその上の諸構造

1.多様体の分類に関しては、先のPrimary Manifold(ハンドル体の境界として得られる多様体)のホモトピ-分類に関する結果を応用して、2-連結8次元多様体や3-連結10次元多様体で、ホモロジ-群が自由なもののホモトピ-分類及びホモトピ-球面を法とする微分同相による分類を行うことができた。2.極小曲面については、ガウス写像の除外値の個数に関する先の結果を一般化して、R^m内の完備極小曲面に対し、非退化なガウス写像の像は(m-1)次元複素多様体のm(m+1)/2個より多くの一般の位置にある超平面を除外しないことを明らかにした。3.数理物理学に関係する方面については、一般のベクトルポテンシャルを持つ相対論的ワイル量子化ハミルトニアンに対して、加藤の不変式を確立し、その本質的自己共役性を証明した。また、Albeverio達による非線形電磁場の理論について、いくつかの良い結果が得られた。4.函数方程式に関係する方面では、1次元圧縮性粘性流体を記述する非線形偏微分方程式の解の漸近挙動を考察し、無限次元力学系におけるabsorbing setやattractorに当たるものの存在を示した。また、平均曲率方程式のDirichlet問題について、境界がLipschitz凸の場合の解の存在が明らかにされた。5.代数的方面では、代数体の円単数群について、いくつかある定義の間の関係を調べ、Sinottの定義とThaineの定義が同値であることを明らかにした。また、3次元代数多様体の極小モデルの上に現れる特異点の除去について、具体的な結果が得られた。
情報の非対称性解消による食の安全・安心確保システムの構築に関する国際比較研究

本研究は、現代フードシステムの中で肥大化し、ブラックボックス化した加工・流通・外食部門と消費者との間の食情報の非対称性を、世界各地から収集した情報の公開により解消し、食の安全・安心システムを確保するための条件解明を課題とした。本研究の成果を5点に要約する。第一は、北米牛肉産業としてアメリカと一体化しているカナダのBSE対策について、リスクマネジメント強化とコスト削減はトレードオフにあり、これらの折りあいをどの水準につけているのか、また、その背景と考え方、さらには、月齢証明とBSE検査を代替的に扱いコスト削減を図ろうとしていることを明らかにした。第二は、アジア各国のHACCP、ISOに基づく衛生管理、認証・表示制度、トレーサビリティー・システムの導入、特徴を国際会議への参加や専門家との情報交流を通して明らかにし、制度の成果を考察した。第三は、欧州における畜産副産物、食品残さ、抗生物質利用のリスクマネジメントによる規制と有効活用の妥結点とその根拠を明らかにするとともに、日本との差異を明確にした。第四は、豪州は牛肉、乳製品の輸出国かつ安全・安心システムの先進国であり、日本を主要な市場と捉えてきたが、最近は需要の拡大が急速な中国とロシア市場を重視している。生産では、相次ぐ干魃による水不足、穀物多給化傾向にある中での穀物高騰に直面し、生産量の不安定性の問題を抱え込むようになったことを明らかにした。第五は、アジアの途上国における家畜衛生の改善は、生産者の経営リスクを軽減させるだけでなく畜産物を消費者に提供する上で重用であるにもかかわらず、遅々として進んでいない。被害を最小限に抑える予防原則にしたがったリスクマネジメントの導入が必要であることを強調した。これらの成果は、学会だけではなく農業、食品関係者、消費者を対象とした会議等でも発表し、世界の安全・安心システムの情報発信に努めた。本年度はカナダにおける主要な肉牛地帯であるアルバータ州において調査を実施した上で、BSE感染牛発生にともなう日本市場損失後(調査後、日本はカナダ産牛肉輸入を解禁)の肉牛・牛肉産業の安全対策と対日輸出意向を解明した。主要な解明点は以下の通りである。1.繁殖農家では、出産期間に出生の確認をしやすい牧区に移し、一頭毎に誕生日を確認するよう努めている。2.フィードロットの素牛導入先はカナダ西部、アメリカ北西部が中心であるが、ハワイにも及び。1214ヶ月齢で導入し、37ヶ月肥育する。したがって、と畜される牛の月齢は1521ヶ月となり、日本への輸出条件の争点となった20ヶ月以下を多くの牛が満たすことになる。3.高齢牛が処理されるパッカーは特定されており、大手輸出パッカーによる30ヶ月以上の取り扱いは少ないが、処理ラインでの識別のため30ヶ月以上には青の印を付けている。SRM(特定危険部位)の除去は30ヶ月以上に義務化されているが、大手輸出パッカーでは全頭について除去している。4.BSE検査実施の意向は、アメリカ資本の企業は反対、国内資本の企業は賛成と分裂している。5.20ヶ月齢以下の分布は全体の79%であるが、75%は月齢の判断が不可能、4%が可能である。アルバータ州は月齢証明に積極的、連符政府は消極的である。6.カナダ牛肉産業には「20ヶ月齢以下は月齢証明を行うがBSE検査はなし。20ヶ月以上は月齢証明があるなしにかかわらずBSE検査をする」、または、「20ヶ月齢以下の月齢証明があるものはBSE検査なし。

20ヶ月以下の月齢証明がないものと月齢証明のあるないにかかわらず20ヶ月齢以上のすべてについてBSE検査をする」という意向がある。月齢証明とBSE検査にはコストが伴うが、それらを低く抑えつつ、将来的には20ヶ月齢以上の牛肉も輸出しようという狙いがうかがえる。本年度は、第一にAPEC加盟国のHACCP導入の現状について広範な情報収集を行った。これより各国におけるHACCP原理に基づいた食品安全制度の特徴を解明することができる。また、制度枠組みの中で行動する食品安全の監督機関、食品製造業者、食品流通業者等の取り組みを分析することより、制度の成果を評価することができる。APECはアメリカ地域、オセアニア地域、アジア地域で構成されているが、今後APEC加盟国間での食品貿易量は増大することが予想される。特に国家間で輸出入が決定される際には、経済的なコストのみならず、どの程度食品安全を確保しているかということが重要な判断基準である。得られた情報は各国の食品安全管理の状況を把握するために極めて有用である。第二はEUにおける畜産副産物の利用方法にっいて、EU委員会、畜産副産物の処理加工業者であるレンダリング業者の現地調査を踏まえて、目本との差異を明らかにした。現在日本においては牛のBSE感染の原因とされる肉骨粉等動物性タンパク質の飼料原料、肥料原料としての利用が規制されることになり、それらへの販売ができなくなったレンダリング業者は経営的に厳しい状況に置かれるとともに、社会的にも生物資源由来の循環が閉ざされた状況にある。EUではリスクに応じて畜産副産物を3つに分類し(リスクの高いものからカテゴリーI、カテゴリーII、カテゴリーIII)、カテゴリー1、カテゴリーII、カテゴリーIII材料であっても加熱・加圧等の適切な処理後にバイオエネルギー(ボイラー・バイオディーゼル燃料、バイオガスプラント材料)としての利用、また、カテゴリーII、カテゴリーIIIについては牧草地以外の家畜がアクセスずることのない土地への肥料・土壌改良材原料としての利用が、科学的評価にもとづきなされており、日本と比べて畜産副産物の利用における規制が緩和され、用途が拡大されていることを明らかにした。本年度は、中国と韓国における食品の安全、安心システムを重点的に解明することを計画し実施した。得られた主な成果は以下の通りである。中国の食品認証制度(緑色、無公害)について消費者アンケートを行なった。その結果、緑色と無公害はそれぞれ、認知率(86%、49%)、購買経験率(83%、45%)であり、2つの指標が先行研究の結果(緑色)と共通した。しかし、「理解した上での継続的購買」という新たな指標を計測したところでは、38%と24%に落ちた。認証制度の有効性を数量的に評価する際の「理解した上での継続的購買」という指標に着目し、認知率と購買経験の水準の解明のみでは、高品質財と低品質財の品質差について理解できていない消費者が含まれているため、認証による高品質財の市場化という本来の目的に沿って評価する上では、不十分であることを解明した。韓国では、韓米FTA締結下において、自由化が進展し国内農畜産業の中でも影響が大きいといわれる畜産分野において、競争力を高めるための対策(15年プロジェクト)として、外国産との差別化および流通改善のために、消費者の確実な信頼を確保することを目標とし、偽造販売の防止、危害要素の遮断、消費地流通を改善する戦略を打ち出している。
羊水過少および原因不明胎児死亡に関する病態生理の解明

過期妊娠における羊水過少は、胎児心拍の異常を来たしやすく、結果として帝王切開率の上昇や新生児合併症の増加など様々な悪影響を与える。しかしながら、過期妊娠における羊水過少のメカニズムについては不明な点が多く、本研究ではまず、動物実験モデルを用いて羊水過少に関与する因子を見いだした。Prostaglandin F2alphaノックアウトマウス(PGF2R KOマウス)および正常マウスから妊娠各時期における羊水、卵膜、胎盤、胎児および母体血を採取し蛋白およびmRNAを回収し、組織における水移送関与する因子としてアクアポリン(AQP)の発現解析を行った。AQP8蛋白の発現が過期産において有意に低下する一方、AQO1蛋白の発現についてWestern blot解析およ免疫組織染色を用いて検討したところ、羊膜基底膜におけるAQP1蛋白の発現は過期産羊膜組織において有意に増強していた。このことは、アクアポリン分子が様々な形で羊水減少機構に関与していることを示している。次に、原因不明胎児死亡の要因を解析する目的で神経組織などに広く分布し、神経保護作用を有するS100蛋白についてヒト妊娠中における経時的推移を明らかとし、さらにヒト妊娠組織において羊膜にS100B蛋白の存在をWestern blot解析、RT-PCRおよび免疫組織染色によって明らかとした。さらに妊娠高血圧症候群合併症例および子宮内胎児発育不全合併妊婦において羊水中S100B濃度が対照に比べて有意に上昇しており、その要因として羊膜におけるS100B蛋白の発現が増強していた。この結果は、胎児の子宮内環境悪化に伴う臨床指標ならびに胎児保護機構にS100B蛋白が関与していることが明らかとなり、原因不明胎児死亡の要因分析の一助となることが示された。過期妊娠における羊水過少は、胎児新生児に様々な悪影響を与えるが、羊水過少のメカニズムについては不明な点が多く、本研究では過期妊娠モデルマウスを用いて羊水過少に関与する因子を見いだすことを目的として検討を行った。Prostaglandin F2alphaノックアウトマウス(PGF2R KOマウス)および正常マウスから妊娠各時期における羊水、卵膜、胎盤、胎児および母体血を採取し蛋白およびmRNAを回収し、水移送関与する因子としてアクアポリン(AQP)に注目し、その発現解析を行った。マウスの早産期(day 14)、正期産期(day 18)、過期産期(day 20)におけるまずAQO8蛋白の発現についてWestern blot解析および免疫組織染色を用いて検討したところ、羊膜の基底膜にAQP8蛋白が認められ、その発現は過期産羊膜組織において有意に減弱していた。このことは、AQP8が過期産における羊水減少機構に関与していることを示唆している(現在論文投稿中)。さらにAQOファミリーのひとつであるAQP1蛋白についても同様に検討したところAQP1蛋白は羊膜の羊膜上皮にその局在を認め、AQP1蛋白の発現は過期産において早産期、正期産期に比べてその発現が増強していた。このことはAQP1も過期産における羊水減少に関与していることを示唆している。これらの事実はAQPが羊水過少においてその発生機構および防御機購に関与していることを示している。さらに、ヒト臨床領域における羊水過少とAQPファミリーとの関連について検討をすすめている。一方、S100蛋白は広く神経組織などに分布している蛋白であるが、この蛋白が羊水中に存在し子宮内胎児死亡と関連があることが最近報告された。本研究においても羊水量とS100蛋白との関連について検討し、妊娠中毒症合併において羊膜におけるS100蛋白の発現が増強していることが明らかとなり、病態との関連を解析中である。

過期妊娠における羊水過少は、胎児新生児に様々な悪影響を与えるが、羊水過少のメカニズムについては不明な点が多く、本研究では過期妊娠モデルマウスを用いて羊水過少に関与する因子を見いだすことを目的として検討を行った。Prostaglandin F2alphaノックアウトマウス(PGF2R KOマウス)および正常マウスから妊娠各時期における羊水、卵膜、胎盤、胎児および母体血を採取し蛋白およびmRNAを回収し、水移送関与する因子としてアクアポリン(AQP)に注目し、その発現解析を行った。昨年度の研究成果によりAQP8蛋白の発現が過期産において有意に低下していることを見いだしており、本年度は更にAQP1に関してマウスの早産期(day14)、正期産期(day18)、過期産期(day20)におけるAQO1蛋白の発現についてWestern blot解析および免疫組織染色を用いて検討し、羊膜の基底膜にAQP1蛋白が認められ、その発現は過期産羊膜組織において有意に増強していた。このことは、AQP1が過期産における羊水減少機構に関与していることを示唆している。これらの事実はAQP関連蛋白が羊水過少においてその病態の発生機構に関与していることを明らかとした。次に、原因不明胎児死亡の要因を解析する目的で神経組織などに広く分布するS100蛋白に注目して検討を進めた。ヒト妊娠組織において羊膜にS100B蛋白の存在をWestern blot解析、RT-PCRおよび免疫組織染色によって確認した。さらに妊娠高血圧症候群合併症例および子宮内胎児発育不全合併妊婦において羊水中S100B濃度が対照に比べて有意に上昇しており、その要因として羊膜におけるS100B蛋白の発現が増強していることが明らかとなった。