hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞老化におけるアポトーシス抵抗性の分子基盤の解明とその阻害方法の探索

細胞老化特異的にアポトーシスを誘導できる低分子化合物を探索した結果、ある特定の分子に対する阻害剤が複数ヒットした。そこで、様々な方法で細胞老化を誘導したヒト線維芽細胞においてこれら阻害剤に共通の標的分子(ヒストン修飾酵素)をRNA干渉法を用いてノックダウンしたところ、効率よくアポトーシスを誘導できることが確認された。更に網膜色素上皮細胞など、線維芽細胞以外の細胞においても同様の結果が得られたため、このヒストン修飾酵素が細胞老化に共通してアポトーシス抵抗性を示す原因分子の一つである可能性が強く示唆された。細胞老化を起こした老化細胞がアポトーシス抵抗性を示す分子メカニズムの解明とその阻害方法の開発を目指して研究を行い、以下の研究結果を得た。(1)複数の異なる培養細胞を用いた実験により細胞老化の誘導により共通して発現レベルが上昇する遺伝子群を絞り込んだ。これらの遺伝子群について、老化細胞が蓄積する個体老化の過程でも発現レベルが増加するかについてマウスの組織を用いて検討した結果、個体老化においても発現レベルが上昇する遺伝子が複数存在することが分かった。これらの遺伝子群のうち、アポトーシスに関与している遺伝子を探索するために老化細胞において、それらの遺伝子の発現をsiRNAによりブロックした場合、又は、過剰発現させた場合にアポトーシスを起こすものを探索した。その結果、老化細胞で過剰発現しており、siRNAでノックダウンすることで老化細胞にアポトーシスを誘導する遺伝子を複数単離することに成功した。更にそれら遺伝子の発現を様々ながん細胞で比較検討し、発がんに関与している可能性がある遺伝子であるかどうかについて検討を試みた。(2)単離した遺伝子の機能をそれらがコードするタンパク質の既知または推定される機能を基にインシリコでパスウェイ解析を行い、遺伝子機能を阻害する可能性がある阻害剤の探索を試みた。また、同時に公的バンクより入手した化合物ライブラリーを用いたスクリーニングシステムを構築するために標的遺伝子を過剰発現させることでアポトーシスに対して抵抗性を示すようになる細胞株の樹立を試み、目的とする細胞株を樹立することに成功した。細胞老化を起こした老化細胞がアポトーシス抵抗性を示す分子メカニズムの解明とその阻害方法の開発を目指して研究を行ない、以下の研究成果を得た。(1)公的または商業的細胞バンクから多種類のヒトの正常細胞株(皮膚繊維芽細胞、胎児肺由来繊維芽細胞、網膜上皮細胞、表皮角化細胞、肝星細胞など)を入手し、それらの細胞に継代培養の繰り返し、DNAダメージ誘発剤、活性化型Rasの発現など、発癌の危険性があるストレス(発癌ストレス)を与えて細胞老化を誘導した場合に共通して発現レベルが変化する遺伝子群をDNAマイクロアレイを用いた解析により探索した。その結果、細胞周期制御因子、DNA修復酵素、細胞骨格構成因子、炎症性サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、細胞外マトリックス分解酵素などすでに細胞老化との関連が知られていた遺伝子以外にアポトーシスの制御に係る可能性がある遺伝子群を複数同定した。(2)培養細胞で得られた上記遺伝子群の発現変化が生体内でも本当に起こっているかどうかについて検討するために、発光シグナルを利用して細胞老化マーカーであるp16遺伝子やp21遺伝子の発現をリアルタイムにインビボイメージングできるマウスを用いて解析を試みた。その結果、加齢やDNAダメージ誘発剤の投与、活性化型Rasの発現等、細胞老化の誘導が予想される処置のみならず、肥満などのストレスを与えた場合においても、培養条件下で認められた細胞老化関連遺伝子の発現変化が確認された。更に興味深いことに、そのうちの一部の遺伝子の発現変化については、肥満に伴う肝癌との関連が指摘されている、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の患者から摘出した肝星細胞においても確認された。これらの結果は培養細胞を用いて得られた細胞老化に伴うアポトーシス関連遺伝子の発現変化の少なくとも一部は生体内でも起こりうる現象であることを強く示唆している。細胞老化を起こした細胞(老化細胞)がアポトーシス抵抗性を示す分子メカニズムの解明とその阻害方法の開発を目指した研究を行い、以下の研究結果を得た。(1)前年度までに単離した老化細胞において発現レベルが上昇し、ノックダウンすることで老化細胞にアポトーシスを誘導できる遺伝子について更に詳細な解析を行った結果、これらの遺伝子をノックダウンすると正常細胞もアポトーシスを起こしやすくなるため、創薬の分子標的には適さないことが分かった。(2)線維芽細胞を用いて活性化型Rasにより細胞老化を誘導させる前後でアポトーシス誘導能に大きな変化が見られる低分子化合物を化合物ライブラリーを用いてスクリーニングした。その結果、ある特定のヒストン修飾に関わる酵素に対する阻害剤がヒットした。更にスクリーニングを続けた結果、同じ酵素に対する別の阻害剤がヒットしたため、これら阻害剤の共通の標的分子を(ヒストン修飾酵素)を活性化型Rasにより細胞老化を誘導した線維芽細胞においてノックダウンしたところ、効率よくアポトーシスを誘導できることが確認された。また、活性化型Ras以外にも放射線、DNA損傷性薬剤、または分裂寿命により細胞老化を誘導した場合にも同様の結果が得られた。

更に線維芽細胞以外にも網膜色素上皮細胞においても同様の結果が得られたため、このヒストン修飾酵素が細胞老化に共通してアポトーシス抵抗性を示す原因分子の一つと考えられた(3)上記ヒストン修飾酵素を阻害することで発現レベルが変化する遺伝子群をRNAシークエンス法により同定することに成功した。今後、これらの遺伝子産物を標的とすることでより特異性が高いアポトーシス誘導法の開発に繋がる可能性が期待される。分子腫瘍学化合物ライブラリーを用いたスクリーニングシステムの構築を完了するのに予想以上に時間がかかってしまい、スクリーニングを開始した時期が遅れ実験を完了するのが次年度になったため。当初目標としていた様々な老化細胞で共通して発現レベルが変化する遺伝子群の同定に成功した。また、それら遺伝子群のうち少なくとも幾つかは実験動物(マウス)やヒトの臨床サンプルを用いた解析によって、生体内で起こる細胞老化の場合にも発現レベルが変化することが確認された。このため、当初の計画通り研究が進行していると判断される。樹立した細胞株を用いて化合物ライブラリーをスクリーニングすると同時に、既に培養細胞において効果があることを確認しているsiRNAによるアポトーシス誘導効果をマウスモデルを用いて評価する。(1)老化細胞を除去するための分子標的の同定H24年度の研究で絞り込んだ遺伝子群の発現パターンを基にイン・シリコでパスウェイ解析を行い、アポトーシス抵抗性に関与する可能性がある遺伝子の絞り込みを行う。更に、それら遺伝子をRNA干渉法(RNAi)によるノックダウン、もしくは過剰発現することで老化細胞がアポトーシスを起こしやすくなるかどうか調べ、老化細胞のアポトーシス抵抗性を規定する分子基盤を明らかにすると同時に老化細胞を除去するための分子標的の絞り込みを試みる。(2)老化細胞を除去する薬剤の探索上記(1)の解析で絞り込んだ分子標的に対する阻害剤を共同研究として利用可能な化合物ライブラリー又は公的な化合物ライブラリーを用いてスクリーニングを試みる。また、もしもこの方法がうまくいかない場合に備えて、効率よくノックダウン出来るsiRNAオリゴの合成も行い、動物実験でその効果を検討する。化合物ライブラリーを用いたスクリーニングシステムの構築を完了するのに予想以上に時間がかかってしまい、スクリーニングを開始した時期が遅れ実験を完了するのが次年度になったため。(1)物品費(生化学・分子細胞生物学研究用試薬代(80万円)、培養容器等プラスチック器具類代(20万円)、実験動物購入・維持費(20万円))として総額120万円を使用予定。(2)旅費に10万円を使用予定。(3)その他(論文掲載料(30万円)、物品輸送費(10万円))として40万円を使用予定である。
発達性協調運動障害の身体性・模倣能力の定量化とバーチャルリアリティ訓練の効果

4-15歳の定型発達児132名を対象に,感覚情報と運動情報を時間的に統合する機能(感覚-運動時間的統合機能)の発達変化について調査した。その結果,年齢と手先の器用さは,それぞれ独立して,定型発達児の感覚-運動時間的統合機能の予測因子であることが明らかとなった。この研究は,定型発達児の手先の器用さと感覚-運動時間的統合機能との重要な関係性を明らかにした最初の研究である。定型発達の大学生30名を対象に,閾値下振動触覚刺激装置を使用して,確率共鳴(Stochastic resonance: SR)現象を付与した際の感覚-運動時間的統合機能と感覚-運動時間的統合が困難な条件下での手運動機能に与える影響を調べた。SR付与条件はブロックデザインとし,15名にはSRあり-なし-あり-なしの順に実施し,性別と年齢を揃えた残り15名にはSRなし-あり-なし-ありの順に実施した。感覚-運動時間的統合機能の測定と感覚-運動時間的統合が困難な条件下での手運動課題には,映像遅延装置を用いた。その結果,SRを付与することにより,感覚-運動時間的統合機能が即時的に向上することを明らかにし,発達性協調運動障害(Developmental Coordination Disorder: DCD)で困難となっている感覚-運動時間的統合を改善する可能性を示唆した。DCD児一例に対するSRを用いた介入が,感覚-運動時間的統合機能,視覚依存傾向,手先の器用さに与える効果をシングルケーススタディで検証した。その結果,SRを付与することで,感覚-運動時間的統合機能が向上し,視覚依存傾向が減少し,手先の器用さが有意に改善することを明らかにした。【具体的内容】子ども(4-15歳)の手の運動機能と視覚-運動時間的統合機能との関連性を調査した.結果,年齢の増加に伴い視覚-運動時間的統合機能は向上し,発達変化することが示された.同時に手先が器用になるほど,視覚-運動時間的統合機能は向上することが明らかになった.【意義】発達性協調運動障害(DCD)のような手の運動機能が低下している子どもでは,視覚-運動時間的統合機能が低下している可能性が示唆された.【重要性】子どもの手の運動機能と視覚-運動時間的統合機能との関連性を明らかにした初めての研究である.【具体的内容】DCDの可能性が高い子どもたち(probableDCD群)とその可能性が低い子どもたち(Typical Development群)との間で,視覚-運動時間的統合機能,自動模倣機能,自閉症スペクトラム(ASD)傾向,注意欠如多動性(ADHD)傾向,抑うつ傾向の比較,関連性を調査した.結果,pDCD群は,TD群より,視覚-運動時間的統合機能,自動模倣機能が低下しており,ASD傾向,ADHD傾向,抑うつ傾向が高いことが判明した.また運動機能と視覚-運動時間的統合機能,ASD傾向,ADHD傾向の間には,有意な相関関係が認められた.さらに視覚-運動時間的統合機能は,子どもの手の運動の不器用さを予測する最大の因子であることが判明した.【意義】この研究から,視覚-運動時間的統合機能や自動模倣機能を高めるニューロリハビリテーション介入が,子どもの手の運動の不器用さの改善に繋がる可能性が示唆された.【重要性】手の不器用さを持つ子どもたちに視覚-運動時間的統合機能,自動模倣機能が低下していることを明らかにした初めての研究であり,DCDに頻繁に併存するASD,ADHD傾向よりも視覚-運動時間的統合機能が子どもたちの手の運動の不器用さを予測する因子として抽出されたことは重要な発見である.平成28年度には,発達性協調運動障害(DCD)と内部モデルの一機能を反映する視覚-運動時間的統合機能,ミラーニューロンシステムの働きを反映する自動模倣機能,そして自閉症スペクトラム傾向,注意欠如多動性傾向,抑うつ症状との関連性を明らかにする計画であったが,その計画はほぼ達成した.対象児リクルートメントおよびデータ計測は,多くの協力機関と密な連絡を取り合い順調に実施できた.測定機器の運用,得られたデータの解析,検討も順調に実施できた.定型発達の大学生30名を対象に,経頭蓋直流電気刺激を使用して,自閉症スペクトラム障害(ASD)で困難となる模倣抑制機能,視点取得機能に関わる脳領域の調査を実施した。その結果,下前頭回領域と側頭-頭頂接合部領域は,模倣抑制および視点取得の両方に重要な働きを有していることを明らかにした。4-15歳の子どもたち132名を対象に,視覚情報と運動情報を時間的に統合する機能(視覚-運動時間的統合機能)の発達変化について調査した。その結果,年齢と運動機能は,それぞれ独立して,子どもたちの視覚-運動時間的統合機能の予測因子であることが明らかとなった。この結果は,子どもたちの運動機能(微細運動機能)と視覚-運動時間的統合機能との重要な関係性を明らかにした最初の研究である。4-15歳の発達性協調運動障害(運動の不器用さ)リスクを有する子ども(pDCD児,29名)と年齢と性別を揃えた定型発達を有する子ども(TD児,運動の不器用さを持たない子ども,42名)を対象に,視覚-運動時間的統合機能および自動模倣機能の比較,およびASD,注意欠陥多動性障害(ADHD),抑うつ症状などの特性傾向の調査を実施した。その結果,pDCD児は,TD児と比較して,視覚-運動時間的統合機能および自動模倣機能が有意に低下していた。

さらに,pDCD児は,TD児と比較して,ASD傾向・ADHD傾向・抑うつ傾向が有意に高値であった。そして,子どもたちが有する視覚-運動時間的統合機能は,pDCD(運動の不器用さ)の有意な予測因子であることが判明した。この結果は,視覚-運動時間的統合機能や自動模倣機能を改善するハビリテーション介入が,運動の不器用さの改善に効果的である可能性を示唆した。当初の計画では,平成28年度に,発達性協調運動障害(運動の不器用さ,DCD)と自閉症スペクトラム障害(ASD),注意欠陥多動性障害(ADHD),抑うつ症状との関連性を明らかにすること,DCDと視覚-運動時間的統合機能,自動模倣機能との関連性を明らかにすることとしていた。これらについては,明らかにすることができ,論文による公表も実施できている。平成29年度には,DCD児に対するバーチャルリアリティ訓練の効果検証を目標とした。しかしながら,バーチャルリアリティの子どもへの適用は,斜視に繋がるかもしれないとの研究結果があったため,実施を見合わせたため,「やや遅れている」と判断した。4-15歳の定型発達児132名を対象に,感覚情報と運動情報を時間的に統合する機能(感覚-運動時間的統合機能)の発達変化について調査した。その結果,年齢と手先の器用さは,それぞれ独立して,定型発達児の感覚-運動時間的統合機能の予測因子であることが明らかとなった。この研究は,定型発達児の手先の器用さと感覚-運動時間的統合機能との重要な関係性を明らかにした最初の研究である。定型発達の大学生30名を対象に,閾値下振動触覚刺激装置を使用して,確率共鳴(Stochastic resonance: SR)現象を付与した際の感覚-運動時間的統合機能と感覚-運動時間的統合が困難な条件下での手運動機能に与える影響を調べた。SR付与条件はブロックデザインとし,15名にはSRあり-なし-あり-なしの順に実施し,性別と年齢を揃えた残り15名にはSRなし-あり-なし-ありの順に実施した。感覚-運動時間的統合機能の測定と感覚-運動時間的統合が困難な条件下での手運動課題には,映像遅延装置を用いた。その結果,SRを付与することにより,感覚-運動時間的統合機能が即時的に向上することを明らかにし,発達性協調運動障害(Developmental Coordination Disorder: DCD)で困難となっている感覚-運動時間的統合を改善する可能性を示唆した。DCD児一例に対するSRを用いた介入が,感覚-運動時間的統合機能,視覚依存傾向,手先の器用さに与える効果をシングルケーススタディで検証した。その結果,SRを付与することで,感覚-運動時間的統合機能が向上し,視覚依存傾向が減少し,手先の器用さが有意に改善することを明らかにした。当初の研究計画書通りに平成29年度には,バーチャルリアリティトレーニング介入による効果検証を実施する.平成28年度に多くの協力機関と良好な関係を築けており,対象児リクルートメントなどに問題はない状況である.また平成28年度に得られた研究データの公表(学会発表,論文投稿)は引き続き継続し,平成29年度に得られる予定の研究データも速やかに解析,検討し,公表していく予定である.当初,DCD児に,視覚-運動統合障害があれば,その視覚-運動統合を促進する方法として,バーチャルリアリティトレーニングの有効性を考えた。
多台参照追従モデルを用いた安全な隊列交通シミュレーションに関する研究

本研究では,複数の他車両からの情報(速度,車間距離等)に基づいて速度制御を行う多台参照追従モデルを用いた隊列走行する車両の速度制御に関する研究を行い,以下の成果を得た.第1に,速度制御規則のパラメータを安定性解析とシミュレーションから設計し,それをLEGOマインドストームNXTで制作した走行車両型ロボットによる隊列走行実験に適用した.第2に,交通量を最大化する道路交通ネットワークの最適設計問題について定式化を示した.第3に,以上の成果を,4編の査読付き学術雑誌論文,27編程度の国際会議論文や国内講演会論文として公開した.本年度の研究成果は以下の3つからなる.第1は隊列走行実験のためのビークルロボットの速度制御アルゴリズムの設計であり,第2はその速度制御アルゴリズムを実際の隊列走行実験へ適用することである.第3は隊列走行の実用的な応用対象としての交通ネットワークの最適化アルゴリズムについての研究である.第1の制御アルゴリズムの設計研究においては,4台のビークルロボットからなら隊列走行実験のために2種類の速度制御アルゴリズムを設計した.第1は,前方車両群との速度差に応じて自車両の加速度を制御するモデルである.第2は,第1のモデルにおいて前方車両群との速度差を差分近似で車間距離差に置き換えたモデルである.それぞれについて,パラメータ設計を行った.第2の制御アルゴリズムの走行実験への適用研究においては,4台のビークルロボットからなる隊列走行実験を行った.2つの速度制御モデルにおいて前方車両群に対する感度を最大化すると,先頭車両と直前方車両の情報だけを参照すれば良いので,そのことをもとにビークルロボット間で通信しながら速度制御するようにして実験を行い,シミュレーションと実験が定性的には一致することを確認したが,定量的な議論が今後の課題として残った.第3の交通ネットワークの最適化アルゴリズムについての研究では,交通量を最大化するように道路リンクを選択するように問題を定式化した.このアルゴリズムを簡単な解析例に適用し,最適な交通ネットワークが交通密度(単位道路長あたりの車両台数)に依存するとともに,交通密度が最大値よりも少ない状態においては,道路リンクを利用しない方が最大交通量を大きくできることを確認した.平成24年度は次の3点を遂行する計画であった.第1は隊列走行車両のために多台参照追従モデルによる速度制御アルゴリズムを研究すること,第2はLEGOマインドストームによる隊列走行実験を行うこと,第3は情報収集と成果公表のために国際会議と国内講演会に参加することである.第1の隊列走行車両の速度制御アルゴリズムの研究についての実績は以下のようである.複数の前方車両との速度差に応じて自車両の加速度を制御するアルゴリズム(アルゴリズム1),アルゴリズム1において,直前方車両については速度差の代わりに車間距離差を用いるアルゴリズム(アルゴリズム2)の2種類のアルゴリズムについて研究した. 4台の車両からなる隊列走行において安定性解析とシミュレーションから検討を進めた結果,隊列の先頭車両と直前方車両の2台を参照する場合に隊列走行が安定することを確認した.第2のLEGOマインドストームによる隊列走行実験の研究についての実績は以下のようである.LEGOマインドストームNXTを購入し,ビークル(走行車両型)ロボットを製作した.車両番号を先頭から車両1,車両2,車両3,車両4とすると,各車両は以下のようにプログラムされている.車両1は,一定速度で走行するが,前方に障害物があれば停止する.その他車両は,直前方車両との車間距離差に応じて自車両の速度を制御する.同一車間距離に配置された4台のビークルロボットにより隊列走行実験を行い,プログラム通りに動作することを確認した.実施できたことをまとめると以下のようになる.第1は,これまでに設計していた直進する隊列走行実験に用いる速度制御アルゴリズムを用いてレゴマインドストームNXTによる走行実験を行うとともに、その成果をコンピュータシミュレーションと比較したことである.両者は定性的に一致し,定量的にもある程度良い一致を示した.第2は,交差点で交叉する車両間の安全な走行シミュレーションのための速度制御モデルを開発したことである.同じ車線において自車両の直前方を走行する車両と,直行する他の車線を走行していて,交差点で近接する可能性のある車両の速度に対して自車両の速度を更新するモデルを開発し,コンピュータシミュレーションでモデルの妥当性を確認した.第3は,交通ネットワークの最適化アルゴリズムの改良を行ったことである.問題が大規模な場合においても大域的最適解を探索できるように,解探索のアルゴリズムとして遺伝的アルゴリズムを用いるようにした.平成27年度の成果についてまとめると以下のようになる.第1は,交差点で交差する2台の車両からなる2つの隊列について,隊列を構成する4台の車両の速度制御モデルを設計し,数値シミュレーションとLEGO Mindstorm NXTによる走行実験に適用したことである.第2は,交通ネットワークの最適化アルゴリズムについて改良を行い,避難経路の最適化問題に適用したことである.第3に,査読付き論文心への投稿,国際会議や国内講演会へ参加して成果を公表したことである.第1については,交差点で交差する2台の車両からなる2つの隊列について,前年度までに制御アルゴリズムについて設計を進めていたが,車両を質点として扱っていたたので,衝突が起こる可能性があった.この問題を解決するために,車両の大きさを考慮してアルゴリズムを設計し直した.それを用いてLEGO Mindstorm NXTによる走行実験を行い,結果をシミュレーション結果と比較した.

第2については,交通ネットワークの最適化問題を解くためのアルゴリズムとして勾配法に替わって遺伝的アルゴリズムを適用するように改良を行い,仮想的な道路ネットワークの最適化だけでなく,避難経路の最適化問題にも適用した.第3については,査読付き学術雑誌へ論文を投稿したことと,国際会議CsC2014,日本機械学会年次大会,日本計算工学会講演会へ参加して成果発表を行った.本研究では,複数の他車両からの情報(速度,車間距離等)に基づいて速度制御を行う多台参照追従モデルを用いた隊列走行する車両の速度制御に関する研究を行い,以下の成果を得た.第1に,速度制御規則のパラメータを安定性解析とシミュレーションから設計し,それをLEGOマインドストームNXTで制作した走行車両型ロボットによる隊列走行実験に適用した.第2に,交通量を最大化する道路交通ネットワークの最適設計問題について定式化を示した.第3に,以上の成果を,4編の査読付き学術雑誌論文,27編程度の国際会議論文や国内講演会論文として公開した.すでに述べたように以下の点は実施できた.第1は,これまでに設計していた直進する隊列走行実験に用いる速度制御アルゴリズムを用いてレゴマインドストームNXTによる走行実験を行うとともに、その成果をコンピュータシミュレーションと比較すること.第2は,交差点で交叉する車両の交差走行のための速度制御モデルを開発すること.第3は,交通ネットワークの最適化アルゴリズムの改良すること.一方で,以下の点は計画よりも遅れている.第1は,交差点を交通する車両の速度制御モデルの研究において,レゴマインドストームNXTによる走行実験と数値シミュレーションの比較が遅れている.走行実験は実施可能であるが,そのデータを数値シミュレーションと比較し,モデルの妥当性を確認することができていない.そのためもあって,研究成果を論文として投稿する作業を含めて,計画が全体として遅れている.これらのことから,以上のような判断となった.工学(機械)今年度は以下の点について研究を進めていく.第1は,交差点で交差する車両の速度制御モデルにおいて,実験結果と数値シミュレーション結果を比較することである.このために,レゴマインドストームNXTによる走行実験を行い,その結果を計算機シミュレーションと比較する.第2は,左折する車両のシミュレーションと交差点で交差する車両の交通シミュレーションについて研究発表を行うとともに,それ以前の成果とも併せて論文投稿することである.第3は,以上の成果を研究成果報告書にまとめる.以下の点はおおむね順調に進展している.第1は.隊列走行実験に用いるビークルロボットの速度制御アルゴリズムの研究である.最初の予定である前方車両との速度差に応じて自車両の加速を制御するモデルと,それにおいて前方車両群との速度差を差分近似で車間距離差に置き換えたモデルの設計は終了し,この計算機シミュレーション結果も妥当なものであった.第2は,これらの速度制御モデルをビークルロボットの隊列走行実験に適用できたことである.
腫瘍内プロテアーゼ活性をイメージングするオーバーハウザーＭＲＩ造影剤の開発

オーバーハウザーMRI(OMRI)はニトロキシラジカルといった常磁性分子の電子スピンとプロトンの核スピンとのオーバーハウザー効果で増強するイメージング技術である。本研究ではデンドリティックポリリジンを、腫瘍で高発現しているプロテアーゼの基質ペプチドを介して安定ニトロキシルラジカル誘導体(TEEPO)で修飾した。この造影剤をプロテアーゼ処理した結果、ペプチドが切断され、ニトロキシルラジカルの運動性が増し、OMRIシグナルに変化が認められた。このように、OMRIを使った腫瘍の機能性イメージングの基礎を構築することができた。オーバーハウザー効果MRI(OMRI)は電子スピンからプロトンへのエネルギー遷移により核磁気共鳴信号を数十数百倍にも増強する新しい画像診断法である。23年度は腫瘍に集積する性質を持つ枝分かれ状高分子(デンドリマー)にOMRIの造影剤となるニトロキシラジカル基を、ペプチド(腫瘍特異的に発現しているプロテアーゼの基質となる)を介して修飾した分子を構築した。これにプロテアーゼを作用させるとニトロキシラジカル基の電子スピン共鳴(ESR)スペクトルが大きく変化し、OMRIにおいて、腫瘍を選択的に造影できることを示した。本年度はまずそのニトロキシラジカル基について、従来利用していたテトラメチルを有するニトロキシラジカル(TEMPO)基を、より生体内で安定に存在するテトラエチル基を有するニトロキシラジカル(TEMPO)基に変えることを試みた。テトラエチル体はラジカル部分が周囲のエチル基によって遮蔽されているため、還元剤や酸化剤から守られており、血中においても数時間の半減期をもつ誘導体である。まず、この誘導体の化学合成からはじめ、それをデンドリマー分子に修飾した。その結果、血中においても明確なESRスペクトルを長時間維持することがわかった。さらに、プロテアーゼの基質となるペプチドを介して、このテトラエチル体の修飾にも成功したが、得られる化合物の量が極めて少なく、実際のプロテアーゼ処理後のESRスペクトル変化の解析には至らなかった。目的化合物の収量が少なかった理由として、その合成戦略に問題があることがわかり、改善が必要である。23年度から24年度まで、腫瘍に集積する性質を持つ枝分かれ状高分子(デンドリマー)にOMRIの造影剤となるニトロキシラジカル基を修飾し、これが腫瘍に集積することを明らかにした。また、腫瘍特異的に発現しているプロテアーゼの基質となるペプチドを組み合わせて、腫瘍のみでOMRIシグナルが増強するシステムを構築した。しかし、ニトロキシラジカル基がマウス血中において速やかに還元され、造影能が速やかに(半減期約15分)失われることが明らかになった。そこで、従来利用していたテトラメチルを有するニトロキシラジカル(TEMPO)基を、還元耐性をもつテトラエチル基を有するニトロキシラジカル(TEEPO)基に変更した。その結果、血中において1時間以上の耐性が認められ、また、腫瘍内での造影能も観察された。また、プロテアーゼに応答する分子の大量合成にも成功し、プロテアーゼ活性に応答したOMRIシグナルの変化も観察できた。この技術は腫瘍を選択的に造影する技術の基盤となるものであり、さらに分子構造を最適化することにより、OMRIでの腫瘍の診断あるいは治療後の予後の追跡に有効な造影剤となることが期待される。本研究では腫瘍に集積する性質を持つポリマーにOMRIの造影剤となるニトロキシラジカル基を修飾し、腫瘍内のプロテアーゼ活性をリアルタイムにイメージングするシステムを構築する。この技術は、腫瘍内の1種類のプロテアーゼの活性量を知るだけではなく、複数のプロテアーゼ活性を同時に検出することも可能にする。さらに、従来の蛍光イメージングとは異なり、MRIを基盤とするこのイメージング技術は体内深部の診断も可能にし、次世代の機能イメージング技術と発展すると期待される。23年度は枝分かれ状高分子(デンドリマー)の末端にOMRIの造影剤となるニトロキシラジカル(PROXYL)基をペプチド鎖を介して修飾した。このペプチドは腫瘍選択的に発現しているウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベーター(uPAプロテアーゼ)の基質配列をもつ。これにモデルプロテアーゼとしてトリプシンを作用させると、PROXYL基がデンドリマーから遊離し、運動性が向上し、ESRスペクトルの顕著な変化が観察された。しかし、uPAプロテアーゼを作用させた場合、ESRスペクトルは変化せず、uPAプロテアーゼの活性不足や基質配列の問題等が考えられた。

ESRスペクトルがプロテアーゼの作用により大きく変化したという事実は、この現象がOMRI造影に反映し、腫瘍部位でシグナルが現れることを示しており、本研究課題の第一歩を踏み出すことができたと考えている。これまで、プロテアーゼを作用させた際の大きなESRスペクトルの変化を観察し、また、安定性の高いニトロキシラジカル誘導体の有効性を明らかにした。これら両者を併せ持つ化合物の設計にも目処がついてきた。一方で、研究代表者は平成24年12月に熊本大学へ異動となった。その前後で研究の進捗が止まり、全体的に研究の進行は遅れてしまったが、25年度に挽回したい。プロテアーゼの作用によってESRシグナルが大きく変化するという原理的な部分は23年度に確認でき、それをどう改善すれば、当初の計画を達成できるかについて、示すことができたことから、おおむね順調に進展していると判断した。安定性の高いニトロキシラジカル誘導体と基質ペプチドを修飾したデンドリマー分子を合成し、プロテアーゼに対する応答性や、さらに、動物実験においてその有効性を評価する。そして、本研究提案の最終目的であるOMRI造影剤を提案したい。平成23年度の結果より、目的を達成するための問題点を明確にすることができた。これを分子設計に反映させ、目的プロテアーゼであるウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベーター(uPAプロテアーゼ)に応答して明瞭なシグナルを与える分子の設計を引き続き行う。また、In vivoにおいてこのシステムが機能するかを評価する。uPAプロテアーゼを発現している腫瘍細胞をマウスに移植し、担がんマウスを作製する。それに対して本ペプチドを介してニトロキシラジカル基を修飾したデンドリマー分子を投与し、ESR共鳴ラジオ波有り無しにおけるMRI画像を取得し、オーバーハウザーMRIを取得する。また、コントロール配列をもつペプチドと比較することによって、腫瘍内プロテアーゼに存在するプロテアーゼに応答していることも確認する。その他にも14Nと15Nをもつニトロキシラジカルを組み合わせた2種類のプロテアーゼ活性の同時イメージングや、細胞内に積極的に取り込ませるような表面修飾をデンドリマー分子に施し、細胞内プロテアーゼのイメージングについても検討したい。前述した実験に合成用試薬、分析試薬、動物実験に関する消耗品を物品費として使用し、また、実験補助者に対する謝金、また、研究成果発表のための出張旅費に利用する予定である。次年度は前述したように、オーバーハウザー効果MRIの造影剤設計と合成が中心となる。したがって、合成用試薬や分析用試薬の消耗品が必要となる。動物実験においては、使用する実験動物(マウス)に加え、移植する腫瘍細胞の培養に培地やそれを取り扱うプラスチック器具類が必要で、これら消耗品を購入する。また、この研究を遂行する上で、MRIといった物理的計測技術を専門とする研究者との研究打合せに必要な旅費が必要となる。また、得られた成果を報告し、他研究者との情報交換を行うための旅費も必要である。同時に、成果報告の際の投稿料等のその他費用が必要である。
DNA二重鎖構造巻き戻し機能を持つDNA切断化合物の合成

本年度は、DNA二重鎖の高次構造を変化させる側鎖を有するDNA切断化合物として、アミノアルキルフェナジンN-オキシド1と、昨年度、新規に合成したl,6-ジヒドロキシフェナジンN-オキシドのアミノアルキル誘導体2について、DNAに対する相互作用と切断活性について明らかにした。DNAに対する相互作用は、化合物1、-2の酸化還元電位をウシ胸腺DNA存在下で測定することにより解析した。その結果、2の還元ピークの電流値はDNA濃度の増加と共に大きく減少した(27μA→7μA)。また、電位のシフト(-0.42V→-0.46V)も観測された。この結果は、2はDNAと強い親和性を示し、フェナジン骨格がDNAの塩基間にインターカレートしている可能性を示唆している。一方、1は同様の条件下では電流値は僅かに低下したが電位の変化は見られず、DNAとの親和生が弱いことが明らかとなった。次にDNA切断実験をpBR322DNAを用いて還元剤存在下で行なった。その結果、両化合物のDNA切断反応は、好気的条件下、及び嫌気的条件下で進行し、好気的条件下では酸素分子を還元活性化して、一方、嫌気的条件下では分子内N-オキシドの酸素原子を利用して酸素ラジカルを発生し、DNA鎖を切断していることが示された。また、2のDNA切断活性は1と較べて非常に強く、この活性の強さは、DNAに対する強力な親和性に由来していることが考えられた。以上、1のDNAに対する親和性を増加させる目的で新規に合成した、l,6-ジヒドロキシフェナジンN-オキシドのアミノアルキル誘導体2が、好気的及び嫌気的条件下で強力なDNA切断活性を示したことは、本化合物が、固形腫瘍に対して有効な抗癌剤としてのリード化合物として有効であることが明らかとなった。本年度は、DNA二重鎖の高次構造を変化させる側鎖を有するDNA切断化合物として、フェナジンN-オキシド誘導体の分子設計と合成を行なった。S.M.HechtらはアミノアルキルフェナジンN-オキシドが還元剤存在下、活性酸素を発生してDNAを切断することを報告している。しかし、この化合物は構造中N-オキシドがマイナスに荷電している為、マイナス荷電を示すDNAに対しては電気的な反発が生じて親和力が弱い。本研究では、N-オキシドのペリ位に水酸基を導入した1,6-ジヒドロキシフェナジンN-オキシドのアミノアリキル誘導体を新規に合成した。本化合物はN-オキシドが水酸基と水素結合する為、無置換のフェナジンと較べてDNAに対する親和力が増加する。また、水酸基導入によって還元され易くなると、活性酸素生成能が増加してより強力にDNAを切断することが考えられる。本化合物は、Whol-Aue反応によりジヒドロキシフェナジン骨格を合成後、アルキル基を導入して1,6-ジヒドロキシフェナジンアミノアルキル誘導体へと変換し、さらにN-オキシドに酸化して合成した。まず、2-アミノ-5-メチルアニソールと2-ニトロアニソールをWhol-Aue反応により縮合させて1,6-ジメトキシ-3-メチルフェナジンを合成した。3位のメチル基は、NBSを用いてブロム化後、1,3-プロパンジオールを導入した。側鎖末端の水酸基は、Mitunobu反応によりフタルイミドに変換した後、ヨウ化リチウム及びメチルアミンによって脱保護し、1,6-ジヒドロキシフェナジンアミノアルキル誘導体へと導いた。本化合物はさらにアミノ基を保護した後、mCPBAを用いてN-オキシド体へと酸化し、トリフルオロ酢酸によって脱保護して、目的化合物、1,6-ジヒドロキシフェナジンN-オキシドのアミノアルキル誘導体を合成した。水酸基を有していないアミノアルキルフェナジンN-オキシドはHechtらの方法に従って合成した。これらの化合物については、現在DNAに対する相互作用と切断活性について解析中である。

以上、1のDNAに対する親和性を増加させる目的で新規に合成した、l,6-ジヒドロキシフェナジンN-オキシドのアミノアルキル誘導体2が、好気的及び嫌気的条件下で強力なDNA切断活性を示したことは、本化合物が、固形腫瘍に対して有効な抗癌剤としてのリード化合物として有効であることが明らかとなった。
西洋と極東における法観念の比較研究

この研究の目的は、日本法を西洋法とは異質なものとする通説の基礎すなわち西洋法治主義対極東徳治主義という対立図式を再検討することにあった。終始この目的に基本的変更はなかったが、研究遂行の過程において微妙な軌道修正や強調の転換を加えなければならなかった。第1の転換は、極東徳治主義の実態の解明に重点を移したことである。中国の古代思想における儒家と法家との対立にもかかわらず、それは排他的なものではなく、法と道徳の未分化が認められること、内法外儒的官吏が意外に多いこと、そして同様の現象は律令時代のわが国においても認められること等が明かとなった。その原因を探究する過程で、わが国における法学教育事始めを検討する必要が生じた。これが第2の転換であった。わが国でも中国でも大学が早くから法学教育を放棄して、遂に官吏養成の機関になりえなかったことこそ、最も重大な意味をもつものと判明した。実際わが国の場合には、律令国家の崩壊と共に数世紀に及ぶ法学教育の大空白期を惹起し、東西法文化を分かつ決定的原因になったと考えられているからである。このことと関連して、西洋的な大学制度が実質的な社会に移入される場合に起こりうる諸問題を検討した。そのために帝政ロシア最初の大学として創設されたモスクワ大学を素材にしたが、これによって古代近代のわが国における大学制度の移入に際して起こった状況に酷似する驚くべき諸事実を発見した。継受法の定着と運用の要員を養成すべき法学教育の前には、種々の障害が横たわっているという事実もまた予想以上の驚きであった。おらそく法や裁判制度と文明の関係は創造以上に複雑かつ多様であると考えられる。この関係の究明をも求めて、目下一方では方法論にまで遡り(マクロの比較)、他方では裁判制度、訴訟と調停の制度的発展と利用度、法源とその適用等の諸問題に随時立ち入ることによって、この研究の早期完成を目指している。1.研究目的について:極東における法文化や法生活の基調がいわゆる徳治主義であるとする通説は,西洋の学説史や思想史の手法をそのまま踏襲したことの結果生み出された誤解であり,中国思想の古典を精読すれば,儒家と法家との排他的対立などということはなく,いわゆる内儒外法とか内法外儒の語にみられるように,両者は混在していたことが判明した.その結果,秦漢以来編纂され続けてきた多数の法典にも,西洋的な法とはかなり異なる内容-「道徳的なもの」の混入を免れなかったようであり,法と道徳の未文化こそ東西法文化を分かつ岐路となったこと,そしてそれを促したのは,極東において法学教育が独立せず,法律家の養成がなされなかったこと,そしてその反面中国における科挙のような独特な官吏登用試験があったからではないかとの仮説を立てうるまでになった(実績報告第2, 3, 4論文).この関係では,中国と日本における教育史に研究の視野を拡げたことは有益であった.しかし東洋徳治主義の通説は否定されても,東洋社会において法に課せられる役割が西洋の場合といかに相違しているかを確かめるためには,法の形式に留まらず,法の内容や裁判制度及びその運用にまで立ち入った研究を施さなければならない.その他法の存在様式を規定する諸要素の検討を必要としよう(方法については第6論文).これらは,次年度の課題となる.

2.研究計画と方法について,当初の計画はほぼ順調に遂行できたが,昨年7月に発注した洋書の納入状況がはなはだ悪く, 11月中旬にはかなりの部分の法観念に関する検討は,大幅に立ち遅れている.それを補うために,東北,京都および特に大阪の諸大学に出張し,調査と資料収集に努めた.他方,都内諸大学から文献を集め,精力的にそれらを複写して研究の促進を図ったがその利用は次年度に回さざるを得ない.今年度の研究の重点は、東洋における徳治主義の実態を法治思想との特殊東洋的な絡み合いにおいて解明することにおかれていたが、儒家と法家の立場のみを思想史的に取り扱うのでは不十分なので、一層具体的に、わが国古代における律令の継受、その運用の要員、その養成を検討することから開始することにした。特に徳治を旨とする者を循吏とし法治主義に立つ者を酷吏とする呼称からすれば、法の没落と儒教の支配は容易に推定される。しかしこれでは中国にも日本にも内法外儒的官吏が多く存在した事実を説明し難いので、むしろ律令制以来の法学教育のあり方にまで遡って説明する必要があり、今年度は多くの時間をこれに費やせざるを得なかった。その結果として、律令制の下でわが国の大学教育は、西洋の大学に先んじて整備されながら、蔭位制や官職と学問の世襲制により官吏養成の機関たる役割を喪失したこと、明経道と同様暗記事心に行われた明法道は令義解の編纂以来創造性を失ったこと、そして詩歌文章をこととする文章道が大学教育の主流になり、遂に法学教育は西洋の近代的法学教育を取り入れるまでの大空白期を迎えてしまったこと等が明かにされた。それどころか同時に儒教教育も大学では放棄され、結局儒法ともに文章経国に奉仕する教養的手段と化し、極東における法と法学の発展を著しく阻害したことが判明した。たまたまロシヤ最初の大学であるモスクワ大学草創期を検討し、わが国の大学創設の場合と酷似する大きな障害を発見したことは収獲であった。これは文明と法を主題とする比較の方法論にも反省を迫るからである。こうして現在は、これまでに得られた知見を基礎にして、最後に残された問題すなわち西洋法継受後のわが裁判所の構成やその担い手、法源とその解釈適用等いわゆる法様式形成要素と目される諸制度な諸問題、とりわけ訴訟と調停の制度的発展と利用度などを鋭意検討し、まとめの段階に入っている。
ソルボサーマル反応による自動車排ガス浄化向けレアメタルフリー助触媒の創製

平成25年には、ソルボサーマル反応による触媒材料組成と形態を制御し、助触媒の酸素吸蔵能に及ぼす最適な化学組成と形態を明らかにするため、資源的に豊富でSn2+-Sn4+の価数変化が可能なSnO2に着目し、第一原理計算よりSnO2にアルカリ土類金属イオンをドープすることで、酸素脱離エネルギーが減少し、OSC性能向上に寄与する可能性が示された。平成26には、ソルボサーマルを用い、合成したアルカリ土類金属ドープ酸化スズは、市販の酸化スズに比べ、焼成後も高い比表面積が維持され、高いOSCを示した。以上の研究結果に関して、国際学会8回、国内学会9回を発表し、学術論文4報を国際論文誌に掲載された。レアメタルは自動車の排ガス浄化用触媒や固体高分子形燃料電池の電極触媒をはじめ、さまざまな触媒に使用されている。今後、排ガス規制が厳しくなることや高効率エネルギー変換デバイスの開発が求められることは必至であり、レアメタル需要の増大が見込まれるが、レアメタルは高価であり、また、資源が極端に偏在することから供給リスクが懸念されている。CeとZrはレアメタルであるため、その使用量の削減あるいは代替材料の開発は急務である。レアメタルフリー新規助触媒の酸素吸蔵能(OSC)と自動車用の排ガス浄化触媒併せて利用することで排ガス浄化性能がより向上し、更に自動車に使用されている貴金属の使用量を大幅に低減することができる。平成25年度には、ソルボサーマル反応による触媒材料組成と形態を制御し、助触媒の酸素吸蔵能に及ぼす最適な化学組成と形態を明らかにするため、資源的に豊富でSn2+-Sn4+の価数変化が可能なSnO2に着目し、第一原理計算よりSnO2にアルカリ土類金属イオンをドープすることで、酸素脱離エネルギーが減少し、OSC性能向上に寄与する可能性が示された。ソルボサーマル法を用い、合成したアルカリ土類金属ドープ酸化スズは中空状ナノ粒子であり、市販の酸化スズに比べ、規則的な形態を持ち、焼成後も高い比表面積が維持され、高いOSCを示し、特に、SnO2にSr2+及びBa 2+などのイオンをドープした中空状ナノ粒子M-SnO2(M=Sr、Ba)が、優れた耐熱性を示すと共に、OSCが標準助触媒より90倍も向上し、排ガス浄化用助触媒中にレアメタルであるCeとZrの使用量削減・代替が可能であることを見出した。以上の研究結果に関して、国際学会6回、国内学会6回を発表し、学術論文2報を国際論文誌に掲載された。レアメタルは、自動車の排ガス浄化用触媒や固体高分子形燃料電池の電極触媒をはじめ、さまざまな触媒に使用されている。今後、排ガス規制が厳しくなることや、高効率エネルギー変換デバイスの開発が求められることは必至であり、レアメタル需要の増大が見込まれるが、レアメタルは高価であり、また、資源が極端に偏在することから供給リスクが懸念されている。レアメタルフリー新規助触媒の酸素吸蔵能(OSC)と自動車用の排ガス浄化貴金属触媒を併せて利用することで、排ガス浄化性能を向上させ、自動車排ガス浄化触媒に使用される貴金属の使用量を大幅に低減することが期待できる。平成26年度には、ソルボサーマル反応による触媒材料組成と形態を制御し、助触媒の酸素吸蔵能に及ぼす最適な化学組成と形態を明らかにするため、資源的に豊富でSn2+-Sn4+の価数変化が可能なSnO2に着目し、第一原理計算よりSnO2にアルカリ土類金属イオンをドープすることで、酸素脱離エネルギーが減少し、OSC性能向上に寄与する可能性を示した。また、ソルボサーマル法を用い、合成したアルカリ土類金属ドープ酸化スズは、市販の酸化スズに比べ、焼成後も高い比表面積が維持され、高いOSCを示し、特に、SnO2にSr2+及びBa2+などをドープした中空状ナノ粒子が、優れた耐熱性を示すと共に、OSCが標準助触媒より90倍も向上し、排ガス浄化用助触媒中にレアメタルであるCeとZrの使用量削減・代替が可能であることを見出した。以上の研究結果に関して、国際学会2回、国内学会2回を発表し、学術論文1報が国際論文誌に掲載された。環境無機材料化学本研究では、ソルボサーマル反応による自動車排ガス浄化向けレアメタルフリー助触媒の創製を目指す。具体的に、平成25年度の研究の目標として、ソルボサーマル反応による化学組成と形態制御を行い、Ca、Baなどのイオンをドープした酸化スズ系などレアメタルフリー助触媒の最適な化学組成と形態を明らかにする。

その研究目標を実現するため、まず理論計算を行い、この結果から、Ca、Baだけではなく、アルカリ土類金属イオン全般は酸化スズにドープすることによって酸素吸蔵能(OSC)向上に寄与する可能性が示された。更に、ソルボサーマルプロセスを用い、合成した金属イオンドープSnO2は高いOSCを有することが実証された。特に、SnO2にSr2+及びBa 2+などをドープした中空状ナノ粒子M-SnO2(M=Sr、Ba)が、優れた耐熱性を示すと共に、OSCが標準助触媒より90倍も向上し、排ガス浄化用助触媒中のレアメタルCeとZrの使用量削減・代替が可能であることを見出した。さらに、多数の国際学会と国内学会に参加し、研究成果を発表すると共に、学術論文が掲載された。以上の通り、平成25年度の研究の目標に達成したと思われる。平成25年度の研究成果を踏まえ、酸化スズ系より、もっと資源的に豊富で、かつ安価な酸化マンガン系や鉄系レアメタルフリー新規ナノ助触媒(OSC材料)の開発を目指す。さらに、新規助触媒の酸素吸蔵の原理を理論的に解明し、自動車三元触媒機能性評価を行い、三元触媒活性を最大限に発揮できるOSC材料とγ-酸化アルミニウムおよび貴金属との複合方法を見出す。例えば、ソルボサーマル法、含浸法などの手法を検討する。また、OSC材料とγ-酸化アルミニウムおよび貴金属間の挙動を検討する。OSC材料とγ-酸化アルミニウムおよび貴金属の複合状態を解明し、触媒活性と複合体の微細構造との相関を検討する。最後に、研究成果を総括し、自動車排ガス浄化向けレアメタルフリー助触媒の作製手法を確立し、国内及び国際学会における研究成果を発表し、学術論文を公表する。25年度に、アルカリ土類金属イオンドープ酸化スズ新規触媒OSC速度の解析を行い、その結果を日本セラミックス協会秋季シンポジウムにおいて発表する予定であったが、OSC速度の解析が完了しなかったため、計画を変更し、アルカリ土類金属イオンドープ酸化スズのX線の解析を行うことに留まったため、未使用額が生じた。次年度では、アルカリ土類金属イオンドープ酸化スズ新規触媒のOSC速度解析と日本セラミックス協会秋季シンポジウムでの発表を行う予定であり、未使用額をその経費に充てることに計画した。
マラリア原虫sera遺伝子ファミリーの系統進化発生の解明と免疫抗原としての作用

霊長類マラリア原虫10種についてsera遺伝子の配列を決定しファミリー構造の解析とsera遺伝子の系統解析および、発現解析を行った。seraは、シゾントが壊裂して原虫感染赤血球からメロゾイトが放出されるプロセスで機能するシステインプロテアーゼである。seraのホモログは全てのマラリア原虫に保存的に存在し、互いに相同性の高い遺伝子がタンデムに並ぶ遺伝子ファミリーを形成していた。遺伝子ファミリーを形成しているマラリア原虫の抗原分子は抗原変異を示す場合が多いが、seraは抗原変異を示さず抗原多型も少ないため有力なワクチン候補抗原であるが、遺伝子ファミリーを形成している理由は解明されていなかった。今回の研究から、seraはマラリア原虫の進化の過程において、重複や欠損をを繰り返していることが明らかになり、げっ歯類マラリア原虫では、sera遺伝子のレパートリーが5つであるのに対して、ヒトを宿主とする三日熱マラリア原虫とサルを宿主とするその近縁種では、遺伝子重複、欠損、フラグメント化、偽遺伝子化が高頻度に生じた結果、SERA遺伝子数が6から12と種間で大きく異なることが解析された。また、遺伝子数の変化はプロテアーゼドメインの活性中心がシステインからセリンに置換されているSERA遺伝子のグループの中で生じていることが系統樹推定から解析された。sera遺伝子の発現解析からは、シゾントの壊裂に関わるseraが、げっ歯類マラリア原虫と霊長類マラリア原虫では異なるグループに属するものであることが観察され、シゾントの壊裂という原虫の増殖に必須なプロセスにおいて、霊長類マラリア原虫とげっ歯類マラリア原虫ではその分子機序が異なっていることが示唆された。マラリア原虫の進化の過程において、sera遺伝子が重複により遺伝子レパートリーを変化させていったのは、多様に変化した宿主赤血球に適応するためであった可能性が高いと考えられた霊長類マラリア原虫10種についてsera遺伝子の配列を決定しファミリー構造の解析とsera遺伝子の系統解析および、発現解析を行った。マラリア原虫の進化の過程において、sera遺伝子が重複により遺伝子レパートリーを変化させていったのは、多様に変化した宿主赤血球に適応するためであった可能性が高いと考えられた当該研究課題について、本年度は2種のヒトマラリア原虫種P. malariae, P. ovale8種のサルマラリア原虫種について、sera遺伝子ファミリーを構成する遺伝子の同定と配列決定を行った。マラリア原虫のsera遺伝子は2つのhypothetical proteinn遺伝子(hpl, hp2)の間にsera遺伝子がタンデムに存在するファミリー構造であること、sera遺伝子は4つのグループに分類出来ることがゲノムプロジェクトが行われている8種のマラリア原虫種から明らかにされている[Arisue, et. al. J. Mol. Evol.(2007)65:82-91]。今回解析を行ったマラリア原虫種も同様のファミリー構造をしており、各1個のGroup I, II, III sera遺伝子がhp2遺伝子の上流に並び、Group III sera遺伝子とhplの間に複数個(38個)のGroup IV SERA遺伝子が存在していた。Groupl, II, III sera遺伝子配列を用いてマラリア原虫種間の系統関係を解析したところ、ヒト三日熱マラリア原虫P. vivaxとサルマラリア原虫が単系統であること、ヒトマラリア原虫P. malariaeおよびP. ovaleの分岐位置が、げっ歯類マラリア原虫からなる単系統群とP. vivaxを含むサルマラリア原虫の単系統群の間であることが示唆された。P. vivaxを含むサルマラリア原虫間の系統関係についてはP. gonderiの分岐が最も早いことやP. knowlesi, P. coatoneyi, P. fragileの近縁性、P. inuiとP. hylobatiの近縁性、P. fieldi, P. simiovaleの近縁性が支持された。

また、P. vivaxとP. cynomolgiの近縁性は系統樹解析からは支持されなかったが、sera遺伝子のレパートリーが同一でありことから、両者の遺伝的な距離は近いと考えられた。現在はGroup IV sera遺伝子の配列も含めてsera遺伝子間の進化学的な関係を解析すると共に、P. synomolgi, P. coatoneyi, P. knowlesiの3種について、sera遺伝子の転写解析を進めている。当該研究課題について、本年度は昨年度に引き続き霊長類マラリア原虫10種についてsera遺伝子の配列を決定しファミリー構造の解析とsera遺伝子の系統解析および、発現解析を行った。seraは、シゾントが壊裂して原虫感染赤血球からメロゾイトが放出されるプロセスで機能するシステインプロテアーゼである。seraのホモログは全てのマラリア原虫に保存的に存在し、互いに相同性の高い遺伝子がタンデムに並ぶ遺伝子ファミリーを形成している。遺伝子ファミリーを形成しているマラリア原虫の抗原分子は抗原変異を示す場合が多いが、seraは抗原変異を示さず抗原多型も少ないため有力なワクチン候補抗原であるが、遺伝子ファミリーを形成している理由は解明されていなかった。seraはマラリア原虫の進化の過程において、重複や欠損をを繰り返しており、げっ歯類マラリア原虫では、sera遺伝子のレパートリーが5つであるのに対して、三日熱マラリア原虫とその近縁種では、遺伝子重複、欠損、フラグメント化、偽遺伝子化が高頻度に生じた結果、SERA遺伝子数が6から12と種問で大きく異なっていた。また、その変化はプロテアーゼドメインの活性中心がシステインからセリンに置換されているSERA遺伝子のグループの中で生じていることが系統樹推定から解析された。sera遺伝子の発現解析からは、シゾントの壊裂に関わるseraが、げっ歯類マラリア原虫と霊長類マラリア原虫では異なるグループに属するものであることが観察され、シゾントの壊裂という原虫の増殖に必須なプロセスにおいて、霊長類マラリア原虫とげっ歯類マラリア原虫ではその分子機序が異なっていることが示唆された。マラリア原虫の進化の過程において、sera遺伝子が重複により遺伝子レパートリーを変化させていったのは、多様に変化した宿主赤血球に適応するためであった可能性が高いと考えられた。