hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中次視覚機能の定式化と新しい機能的解釈による視覚計算理論

図地分離にかかわる新たな視覚計算理論を構築し,Neural Networks誌の論文としてまとめた.具体的には輪郭所有権問題(BO問題)と物体重なり順序計算問題は,電磁気学のE=∇φ(Eは輪郭所有権方向,φは重なり順序を示す量)として定式化できることを見出し,これらを解く神経回路網モデルを演繹的に導出した.これまでにもBO問題を解く神経回路網モデルが提案されてきたが,いずれのモデルも本研究で導出したモデルに包含されることが分かった.同時に,電気生理学実験結果と本モデルとの整合性を評価し,定性的に無矛盾であることを示した.また,画像の動きを符号化するMT細胞モデルの妥当性を評価するために,新たな研究手段を提案した.具体的には錯視の予測と錯視画像の生成である.錯視画像は通常,研究者がこれまでの知見を基にして作成されることが多い.一方,MT細胞モデルはヒトの視覚をシミュレーションすることから,モデル出力を観察することで画像が錯視画像か否かを予測することができるはずである.そこで約1600万種の入力画像に対するモデル予測(シミュレーション)を実行し,モデル予測はヒトの知覚特性と高い相関を示すことが分かった.これらの研究成果をNeuralComputing and Applications誌の論文としてまとめた.立体・奥行知覚に関する数理モデル研究も行った.奥行き変化は両眼視差量で計算され得るが,白紙などにみられる均一領域内では視差量を原理的に計算できない.一方,ヒト視覚系では均一領域内では平坦な面を知覚することが知られている.そこでヒト視覚系の特性を説明しうる立体奥行き知覚を,平坦性を示すガウス曲率の最小化問題として定式化した.以上,主に3種の研究をおこなったが,いずれも微分量に基づく動画像符号化と最適化問題によって視覚中低次機能を記述できることを示している.中低次の視覚機能の一つとして図地分離に関わる計算理論を構築し,数値シミュレーションによりその妥当性を評価した.具体的にはborder ownership選択性を示すV2細胞(以下BO細胞)の反応と図地分離結果はそれぞれ,電磁気学で用いられる形式:電場と電位の関係として表現できることを見出した.すなわち,BO細胞の出力を電場E,図地分離結果を電位φとし,E=∇φとして両者の関係を表現できることを見出した.本式の左辺と右辺が等しくなるためには,ベクトル場であるEの回転がゼロでなければならない(保存場)ことをもちいて,BO細胞の挙動と図地分離結果を示す神経回路網モデルを導出した.このモデルの特徴は,調整すべきフリーパラメータが1つだけであることである.これまでにもいくつかBO細胞の数理モデルが提案されてきたが,例えばLiのBOモデルでは数十種のフリーパラメータをad hocに決める必要があった.また,数値シミュレーションにより電気生理実験結果を再現できることも明らかにした.さらにMT細胞(外界像の動きを計算していると考えられている細胞)の性質を表す新しい計算原理も導いた.これまではSimoncelliとHeegerによるMT細胞モデルがいわゆるデファクトスタンダードであった(以降SHモデル).本研究では,画像工学アルゴリズムの一つであるLucas-Kanade法をノイズに強いアルゴリズムに改良したアルゴリズムを構築し,これが結果的にMT細胞の性質を示すことを明らかにした.本研究によってMT細胞の新しい計算論的解釈が可能となった.さらにこの新解釈に基づいて心理物理実験を計画し,新アルゴリズムの妥当性を評価した.これらの成果は現在2つの論文として投稿中である.その他に計算理論構築のための基礎データとして立体視と視聴覚情報統合に関する研究を行い成果を発表した.予定していた計算理論の構築は予定通りおこなわれ,また数値シミュレーションによる評価もおおむね期待通りの結果となった.これらの研究成果を現在2つの投稿論文として投稿中(査読中)である.また,本研究で得られた成果の一つとして,新たな錯視パターンを作成することに成功した.錯視に関しても関連研究として成果を発表し,錯視・錯聴コンテストで入賞を果たしている.図地分離にかかわる視覚計算理論(昨年度の研究成果)の妥当性を評価し,論文としてまとめた.具体的には輪郭所有権問題(BO問題)と物体重なり順序計算問題は,電磁気学のE=∇φ(Eは輪郭所有権方向,φは重なり順序を示す量)として定式化できることを見出し,これらを解く神経回路網モデルを演繹的に導出した.本年度は昨年度の研究成果をさらに発展させ,多解像度解析の導入や既存研究との比較に力点を置いた.これまでにもBO問題を解く神経回路網モデルが提案されてきたが,いずれのモデルも本研究で導出したモデルに包含されることが分かった.すなわち,これまで異なるモデルとして扱われてきた既存モデルは,本モデルによって統一的に記述できることが示された.同時に,電気生理学実験結果と本モデルとの整合性を評価し,定性的に無矛盾であることを示した.これらの研究成果は,Neural Networks誌に投稿,受理,掲載されている.また,画像の動きを符号化するMT細胞モデルの妥当性を評価するために,新たな研究手段を提案した.具体的には錯視の予測と錯視画像の生成である.錯視画像は通常,研究者がこれまでの知見を基にして作成されることが多い.一方,MT細胞モデルはヒトの視覚をシミュレーションすることから,モデル出力を観察することで画像が錯視画像か否かを予測することができるはずである.そこで本年度は約1600万種の入力画像に対するモデル予測(シミュレーション)を実行し,ヒトの知覚と整合するか否かを評価した.モデル予測と心理実験結果は高い相関を示すことが分かった.

これらの研究成果は,Neural Computing and Applications誌に投稿,受理,掲載されている.その他,両眼立体視にかかわる視覚計算理論とその評価を行い,Neural Networks誌に投稿し,受理,掲載されている.神経生理学的観点,ならびに心理学的観点から提案モデルの評価を行い,いずれも期待していた結果が得られた.また,学術論文として3件が受理・掲載されたため,この点においても順調に進展していると判断した.図地分離にかかわる新たな視覚計算理論を構築し,Neural Networks誌の論文としてまとめた.具体的には輪郭所有権問題(BO問題)と物体重なり順序計算問題は,電磁気学のE=∇φ(Eは輪郭所有権方向,φは重なり順序を示す量)として定式化できることを見出し,これらを解く神経回路網モデルを演繹的に導出した.これまでにもBO問題を解く神経回路網モデルが提案されてきたが,いずれのモデルも本研究で導出したモデルに包含されることが分かった.同時に,電気生理学実験結果と本モデルとの整合性を評価し,定性的に無矛盾であることを示した.また,画像の動きを符号化するMT細胞モデルの妥当性を評価するために,新たな研究手段を提案した.具体的には錯視の予測と錯視画像の生成である.錯視画像は通常,研究者がこれまでの知見を基にして作成されることが多い.一方,MT細胞モデルはヒトの視覚をシミュレーションすることから,モデル出力を観察することで画像が錯視画像か否かを予測することができるはずである.そこで約1600万種の入力画像に対するモデル予測(シミュレーション)を実行し,モデル予測はヒトの知覚特性と高い相関を示すことが分かった.これらの研究成果をNeuralComputing and Applications誌の論文としてまとめた.立体・奥行知覚に関する数理モデル研究も行った.奥行き変化は両眼視差量で計算され得るが,白紙などにみられる均一領域内では視差量を原理的に計算できない.一方,ヒト視覚系では均一領域内では平坦な面を知覚することが知られている.そこでヒト視覚系の特性を説明しうる立体奥行き知覚を,平坦性を示すガウス曲率の最小化問題として定式化した.以上,主に3種の研究をおこなったが,いずれも微分量に基づく動画像符号化と最適化問題によって視覚中低次機能を記述できることを示している.まずは,V2野(BO細胞)と図地分離結果(V4野を想定)の相互作用を考慮した計算理論へと発展させていきたい.現在はV2野→V4野へのfeed-forward信号だけであるが,V4→V2野へのfeed-back信号を理論的に導入することで,主観的輪郭が知覚される計算論的理由づけができるのではないかと期待している.またMT細胞モデルについても,定量的な評価を十二分に行っていく予定である.大別すると3種の視覚計算理論とその数理モデルを構築した.具体的には(1)輪郭所有権問題と重なり順序知覚,(2)物体の動きを計算する
牛ウイルス性下痢ウイルスの牛群汚染様式に関する疫学的・免疫学的解明

牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)による牛群汚染様式を解明するため、バルク乳検査によって陽性となった農家と陰性であった農家を無作為に抽出して比較解析した。農家の立地と発生状況に統計学的な因果関係が見出されたが、ウイルス遺伝学的には関連性が見出されなかった。発生農家の飼養牛の免疫学的解析において、BVDVは卵胞液に局在する傾向が強いこと、子宮内感染を容易にする免疫学的バイアスをBVDVが誘導している可能性が高いことが疑われた。本研究課題における研究目的は、以下のとおりである。(1)牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)が牛群に侵入して持続感染(PI)牛が発生するのを阻止するため、牛群への侵入経路を疫学的に解析して、防疫対策に役立てる(2)PI発生機序を解明するために、BVDVの牛体内での免疫回避機序を遺伝子レベルで解明し、宿主側要因を検討して感染防止に利用する(3)BVDV急性感染時の個体レベルでの免疫応答能に及ぼす影響を分析し、生産獣医療における群レベルでの感染症対策に応用する。本年度はまず、北海道内の酪農専業地域(オホーツク、釧路、根室)、乳肉農家混在地域(石狩、胆振、十勝)の酪農家を対象として、BVDV浸潤状況をバルク乳検査によって調査し、汚染牛群と清浄牛群の選別を実施した。バルク乳検査で陽性となった農家を対象に、子牛、育成牛、未経産牛などの非泌乳牛を含む全頭検査を、血清を用いたRT-PCR法によって実施した。ワクチン接種状況、飼養牛導入の有無、公共牧野使用歴および放牧時期、飼養形態および規模、飼料自給率、などの情報を畜主、農家担当獣医師、あるいは農協から得て、ウイルス侵入門戸の推定を試みるとともに、摘発農家の地理的位置関係を解析した。発生農家の立地に統計学的に因果関係が認められたが、分離ウイルスの遺伝子の比較では有意な関係が認められなかった。また、すべての地域に共通する危険因子として、導入牛が抽出された。摘発されたPI牛体内におけるBVDVの分布状況、特に卵胞液および卵巣におけるウイルス量とサイトカイン発現量の解析によって、PI発生機序に関連が深いと考えられる因子の抽出を試みるべく、材料を蓄積中である。また、妊娠牛の急性感染時におけるサイトカインプロファイルから、PI発生機序の解明が可能であるか否かの検討を始めた。まず、感染拡大阻止のための牛群へのPI侵入経路特定を試みた。これまで実施してきている地域単位でのバルク乳検査を、1年ごとから6ヶ月ごとに短縮したところ、より効率的な清浄化対策となることが示されたが、地域によって汚染状況がさまざまであり、侵入経路の特定は可能であったが、特異的な侵入経路の確定には至っていない。これは、清浄化達成後の監視によって可能になるのではないかと考えられ、今後も継続していく予定である。次に、上記の対策において摘発されたPI牛を用いて、牛生殖器内でのウイルスの動向、特に卵胞液におけるウイルス量の定量とその感染性について検討した。明確な関連性は見いだせておらず、今後継続して解析する予定である。さらに、PI牛が摘発された牛群の免疫状態を評価するため、同居牛についてサイトカインプロファイルを分析した。本分析においては、さまざまな感染性因子の影響を受けることが予想され、宿主-特異的病原因子の直接的な関連性を明確にすることは困難であったが、PI牛発生機序に関与する因子に焦点を絞り解析を進めているところである。本研究課題における研究目的は、(1)牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)が牛群に侵入して持続感染(PI)牛が発生するのを阻止するため、牛群への侵入経路を疫学的に解析して、防疫対策に役立てる(2) PI発生機序を解明するために、BVDVの牛体内での免疫回避機序を遺伝子レベルで解明し、宿主側要因を検討して感染防止に利用する(3)BVDV急性感染時の個体レベルでの免疫応答能に及ぼす影響を分析し、生産獣医療における群レベルでの感染症対策に応用する。バルク乳検査を継続して、清浄化状態を監視した。さらに、公共牧野への入牧牛検査にPI牛摘発検査を導入し、育成牛での感染状況を監視した。ワクチンだけによる防疫対策を実施して入牧時に検査を実施していなかった牧野では、高率にPI牛の潜伏が確認された。

これによって、牧野で授精して下牧する牛が、PI胎子としてBVDV感染を農場間で広げる危険性が明らかとなった。さらに、PI牛が摘発された牛群の免疫状態を評価するため、同居牛についてサイトカインプロファイルを分析した。子宮内感染の多い牛群では、PI成立に密接に関与していると疑われているケモカイン受容体CXCR-4の発現量が低下しており、さらに免疫系がTh2優位な状態(IL-10分泌過剰)にシフトしていた。このシフトは、BVDVワクチン未接種牛群では認められなかった。すなわち、IL-10の分泌が過剰な状態でCXCR-4の発現量が低下する状態、あるいはCXCR-4の発現量が低下している時期にIL-10の分泌が過剰になる状態の、いずれかが誘発されるとPI牛産生(BVDVの子宮内感染)が容易になると考えられた。正確な流行状況を把握せずに斉一的にワクチン接種することは、この状態を招きやすい。本症対策においては、感染状況把握のための検査を励行して、適切な防疫対策を実施することの重要性が示された。本研究課題における研究目的は、以下のとおりである。(1)牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)が牛群に侵入して持続感染(PI)牛が発生するのを阻止するため、牛群への侵入経路を疫学的に解析して、防疫対策に役立てる(2) PI発生機序を解明するために、BVDVの牛体内での免疫回避機序を遺伝子レベルで解明し、宿主側要因を検討して感染防止に利用する(3)BVDV急性感染時の個体レベルでの免疫応答能に及ぼす影響を分析し、生産獣医療における群レベルでの感染症対策に応用する。前年度から引き続き、感染拡大阻止のための牛群へのPI侵入経路特定を試みた。これまで実施してきている地域単位でのバルク乳検査を、1年ごとから6ヶ月ごとに短縮したところ、より効率的な清浄化対策となることが示されたが、地域によって汚染状況がさまざまであり、侵入経路の特定は可能であったが、特異的な侵入経路の確定には至っていない。これは、清浄化達成後の監視によって可能になるのではないかと考えられ、今後も継続していく予定である。次に、上記の対策において摘発されたPI牛およびこれまでに保存されていたPI牛材料を用いて、牛生殖器内でのウイルスの動向、特に卵胞液におけるウイルス量の定量とその感染性について検討した。PI牛体内では、血清や末梢血白血球中のウイルス量よりも卵胞液中のウイルス量が多いことが判明した。本分析においては、さまざまな感染性因子の影響を受けることが予想され、宿主-特異的病原因子の直接的な関連性を明確にすることは困難であったが、PI牛発生機序に関与する因子に焦点を絞り解析を進めているところである。科学的測定データの明示に基づく研究目標の到達はまだなされていないが、徐々に到達目標に近づいていると考えられるから。25年度が最終年度であるため、記入しない。科学的測定データの明示に基づく研究目標に到達しつつあるが、まだ完全には到達目標に達していないと考えられるから。本研究課題は、乳肉生産現場(生産者、役場、農協)とその生産動物の健康管理に携わる臨床獣医師との連携を保ちつつ計画されている。研究者としての追究心のみから研究を進めていくことは、双方にとって有益ではないとの予想が立てられる。
ATL細胞のグルココルチコイドおよびレチノイン酸受容体の解析

成人T細胞白血病(ATL)細胞はT細胞由来である。T細胞はグルココルチコイド(GC)を始めとする様々な因子により増殖、分化の制御を受ける。GCは細胞内部に存在する受容体蛋白(GR)に結合した後に転写調節因子として働き、特異的なDNA塩基配列(Hormone Responsive Element,HRE)を認識することが明らかになった。ビタミンA誘導体のレチノイン酸(RA)もステロイド受容体スーパーファミリーの受容体(RAR)と複合体を形成し、目的遺伝子の発現を調節することによって細胞の分化増殖の調節に関与している。本研究では慢性型及び急性型ATL細胞の増殖に対するGC及びRAの効果を検討し、その作用機序に関し考察を加えた。ATL患者末梢血単核球から分離したリンパ球から羊赤血球処理にてT細胞を分離し、更にCD4抗体結合ビーズにてCD4抗原陽性細胞のみを純化した。検索には慢性型ATL3例と急性型ATL3例を使用した。RA,GCの効果は^3H-チミジンの取り込みで測定した。ATL細胞の増殖に深く関与している細胞表面のインターロイキン受容体α鎖(IL-2Rα)の発現量の変化はフローサイトメトリーにて測定した。またGR,RAR遺伝子発現はノーザンブロッティング法及びRT-PCRを用いて検索した。増殖反応の結果からはRAは急性型ATL細胞の増殖を抑制したが、慢性型ATL細胞の増殖は抑制しなかった。またGCはいずれの型でも細胞の増殖を抑制した。また、IL-2Rαの発現はGCでは抑制されたがRAでは変化がなかった。しかしながらRARα遺伝子発現は急性型、慢性型で差がなかった。これらのことより、RAの慢性型及び急性型ATL細胞の増殖に対する抑制効果の違いはRA-RAR複合体の作用する遺伝子の違いによると思われ、その目的遺伝子の解析が必要であることが明らかにされた。本研究の遂行過程で付随的にATL細胞にはCD4もCD8も持たない亜型が存在することを明らかにした。本亜型に於てもCD3-T細胞抗原受容体が刺激されており、その刺激が増殖に大事と思われる。
エナメル芽細胞の分化におけるshh遺伝子の役割

アミロライド感受性上皮ナトリウムチャンネルはα、β、γの3つのサブユニットからなるアピカルメンブレンタンパクで、セルボリュームやメカノトランスダクションに関与していることが知られている。これらのサブユニットは腎臓の集合管や、大腸上皮に均等に共発現している。そこで、我々は、ラット切歯の3つのステージ毎の、歯性上皮での発現をmRNAレベルで検索した。RT-PCRによる分析では、前期成熟期、後期成熟期、基質分泌期のエナメル器、に3つのサブユニットの発現がみられた。さらに、インサイチューハイブリダイセイションと免疫組織学的検索により、ラット切歯エナメル芽細胞層に特異的な発現がみられた。熱ショックタンパクはストレス状態のみならず生理的状態においても、シャペロンとして発現している。Hsp90は正常状態において多くのトランスデゥーサーや、細胞周期、発生調節因子の経路において作用すると考えられている。我々は、ラット切歯を免疫組織学的手法により、Hsp90が歯性上皮に広く発現し、また、中間層細胞に強く発現していることを示した。さらに、新しく形成された象牙質上のセメント芽細胞にも、発現がみられた。ソニックヘッジホッグは哺乳類ヘッジホッグファミリーの1つで、胎生発生や、器官発生に重要な役割をしている。Shhは、その拡散する範囲内に存在する細胞の行動や運命に影響を与える。そこで、我々は、ラット切歯におけるShhタンパクの局在を免疫組織学的に検索した。強いShh免疫陽性反応が重層化した中間層細胞と、そのすぐ下層の内エナメル上皮に観察された。またその免疫陽性反応は、エナメル芽細胞が分化するにつれて減弱した。さらに、Shh免疫反応は、内エナメル上皮下層から間葉に向かって段階的に局在していた。1.マウス切歯歯胚の培養条件の確立。生後13日齢のマウスから切歯歯胚を摘出し100μg/mlアスコルビン酸、100単位/mlペニシリンストレプトマイシン含有DMEM培地中で、ミリポアーフィルター上で切歯歯胚を培養した、本培養条件下で、最大10日間の器官培養を行った。本培養条件下での組織像を観察すると、中間層は3、4層の扁平な上皮層を示し、また、エナメル芽細胞には極性がみられその分化には大きな異常は観察されなかった。また、エナメルタンパクの分泌もみられた。これらのことより、本培養条件下で、エナメル芽細胞と中間叢細胞の分化は正常に分化することを示すものであり、本実験遂行上の基本的な培養条件を確立した。3.標的遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス配列の決定。アンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインし培地中に加え、標的遺伝子が培養組織中で転写障害が起こっているか確認中である。4.本実験に関連して、切歯歯胚中間層に発現するこれまでに報告されていないタンパク質について、免疫組織化学的に検索中である。本研究により、切歯歯胚中間層に発現するタンパク質について若干の所見を得ている。熱

ショックタンパクはストレス状態のみならず生理的状態においても、シャペロンとして発現している。Hsp90は正常状態において多くのトランスデゥーサーや、細胞周期、発生調節因子の経路において作用すると考えられている。我々は、ラット切歯を免疫組織学的手法により、Hsp90が歯性上皮に広く発現し、また、中間層細胞に強く発現していることを示した。さらに、新しく形成された象牙質上のセメント芽細胞にも、発現がみられた。ソニックヘッジホッグは哺乳類ヘッジホッグファミリーの1つで、胎生発生や、器官発生に重要な役割をしている。Shhは、その拡散する範囲内に存在する細胞の行動や運命に影響を与える。そこで、我々は、ラット切歯におけるShhタンパクの局在を免疫組織学的に検索した。強いShh免疫陽性反応が重層化した中間層細胞と、そのすぐ下層の内エナメル上皮に観察された。またその免疫陽性反応は、エナメル芽細胞が分化するにつれて減弱した。さらに、Shh免疫反応は、内エナメル上皮下層から間葉に向かって段階的に局在していた。
モリブデンシリサイドの合成とそれを用いた熱電変換素子の開発

2珪化モリブデン(MoSi2)にゼーベック係数の向上を目的として珪素(Si)を添加し、rfマグネトロンスパッタ法によりMoSiX (2.00≦X≦2.60)の成膜を行った。結晶構造解析、ホール効果測定装置の製作、導電率およびホール係数の温度依存性の測定、ゼーベック係数の測定、微細構造の観察を行い、以下のことを明らかにした。X≦2.30で過剰なSiは結晶中に固容している。サファイア基板のc面に対して(110)面のエピタキシャル膜が成膜された。ゼーベック係数はX増加すると増加した。伝導種の同定、伝導機構の提案を行った。メカニカルアロイングによる剪断摩擦により準安定β相が合成の可能性が示唆された。今までに報告されていない新たな組成Mo2Si5と考えられる新規モリブデンシリサイド組成が約900°C以下で存在することを示唆する結果が研究代表者らにより得られた。この新規組成の特徴は、α型MoSi2がp型伝導を示すのに対し、β型はn型伝導を示すことである。したがって、新規組成の創成という面での価値と、p型とn型のモリブデンシリサイドが得られるので、これらを用いた熱電変換素子の開発が可能になる。現時点で以下のことが明らかとなった。(1)β型MoSi2は単一の伝導路を電子が格子振動等の散乱課程を経て伝導する。そのとき電子の有効質量は負であり、伝導型はp型である。Xが増加すると、Mo格子の間で過剰なSiは平均構造をとり、配置の無秩序性が増加する。そのとき、フェルミ面近くの電子は、局在準位間をホッピング伝導する。X≧2.5以上で新規安定構造に変化した後も、単一の伝導路を電子は局在準位間のホッピング伝導支配的になる。そのとき電子の有効質量は正であり、伝導型はn型である。この内容を元に学術雑誌に投稿するための論文の作成を行った。(投稿予定)(2)サーマルプローブ方により簡易的にα型,β型,β型と未知相との混合物についてゼーベック係数の測定を行った,その結果,ホール係数の測定結果と合わせるとα型は電子と正孔の2種のキャリアが,β型はほぼ正孔のみ,未知相は電子と正孔の2種のキャリアが存在することが分かった。以上の結果より、β型において大きな値のゼーベック係数が期待される。(3)当該助成金により購入した遊星ボールミル装置よよび既存の低速装置により試験的に鉄シリサイドの合成を行い,シリサイドが一部合成されることが分かった。(4)抵抗率の温度依存性の測定範囲を高温側に現行よりさらに約200°C拡張できる装置の作製を行った。モリブデンシリサイドをフラックス法により直接合成する試験を現時点は完了していない。理由としてナトリウムをフラックスとしてモリブデンとシリコンを析出させて合成するのであるが,ナトリウムは空気中では取り扱うことは不可能であり,グローブボックスを使用する必要がある。現時点でグローブボックスを現有しているが,その使用方法について熟練をしていないために,慎重を期すためにその取扱方法について訓練をしている段階である。遊星ボールミルによる合成に関しては,鉄シリサイドについて出発原料の粒度分布,合成雰囲気,遊星運動の条件等を検討し,合成に必要な条件をほぼ明らかにしている。鉄シリサイドを用いた理由は,過去に他の研究者による報告例があるからであ。28年度は実際にモリブデンシリサイドの合成を行う予定である。300°Cまでホール係数および抵抗率が測定可能な装置を作製し評価した。これにより20-573Kの温度範囲でのホール係数および抵抗率の測定が可能になった。この装置を用いてβ型MoSi2、新規組成MoSi2、β型を100-1050°Cで熱処理した試料についてホール係数を測定した。その結果以下の伝導モデルの妥当性がより明確となった。β型MoSi2は単一の伝導路を電子が格子振動等の散乱課程を経て伝導する。そのとき、フェルミ面近くの電子は局在準位間をホッピング伝導する。X≧2.5以上で新規安定構造に変化した後も単一の伝導路を電子は局在準位間のホッピング伝導支配的になる。β型MoSi2を高真空下において1000°C程度で熱処理を行うことによりα型にした後、ホール係数の温度特性を測定した結果、キャリアの伝導路が2種存在することがわかり、抵抗率の温度特性と合わせて解析することにより、それぞれの伝導課程に関するホール係数の温度特性を分離することに成功した。それぞれのホール係数はβ型の場合と類似の温度依存性を示す。サーマルプローブ方により簡易的にα型,β型,β型と未知相との混合物についてゼーベック係数の測定を行った、その結果、ホール係数の測定結果と合わせるとα型は電子と正孔の2種のキャリアが、β型はほぼ正孔のみ、未知相は電子と正孔の2種のキャリアが存在することが分かった。以上の結果よりβ型において大きな値のゼーベック係数が期待される。抵抗率とホール係数の温度素特性より得られた知見をまとめて国際学術誌に(Material Chemistry and Physics)投稿した。

モリブデンとケイ素のあるいは2珪化モリブデンとケイ素の混合粉末を用いてメカニカルミリング(アロイング)法により新規組成と考えられるMo2Si2.5の合成を行う前段階として合成例が報告されている鉄とケイ素の合金の作製を試みた。その結果、硬度の大きいケイ素のミリングによる破談が生じる場合には鉄とケイ素のほぼすべてが反応することがわかった。しかしこの条件を見いだすために多くの時間を費やした。そのため28年度に予定していていたモリブデンとケイ素の合成を前述のミリングの条件を基に平成29年度に行うことにした。そのために研究に遅れが生じた。またフラックス法による新規組成の合成には平成28年度内には成功していない。現在発熱体として利用されている2珪化モリブデン(MoSi2)に熱電変換素子としての高いゼーベック係数を付与するため珪素(Si)を添加し、高周波マグネトロンスパッタ法によりサファイア基板のc面上に複合薄膜(MoSiX、2.00≦X≦2.60)の成膜・評価を行った。その結果以下の事柄が分かった。薄膜の結晶構造はβ型6方晶(2.00≦X<2.4875)、未知相あるいは未知相と6方晶の混晶(2.4875≦X≦2.60)が出現する。薄膜を1000°C以上で高真空中で加熱するとα型正方晶に相転移する。抵抗率の温度係数は、フォノンによる散乱過程ではGruneisen-Bloch理論で説明され、ホッピング伝導過程はMottのvariable range hopping理論で説明できる。β型薄膜のゼーベック係数は未知相と比較して高く約50μV/°C程度でXが増加すると増加し、X=2の場合より最大約1.5大きくなった。ゼーベック係数とホール係数(装置を製作)よりα型は電子と正孔の2種のキャリアが、β型はほぼ正孔のみ、未知相は電子と正孔の2種のキャリアが存在する。X線極点図測定より基板のc面はβ型6方晶薄膜のc面と格子が極めて高いに関わらず(110)面が基板のc面より約07°ずれて配向し、他に大きな回折ピークがないことより、(110)面はエピタキシャルに近い成長をしている。これよりβ型の抵抗率に関する伝導種の伝導路はほぼ(110)面である。またSiを過剰に添加しても膜の配向性はほとんど変化しない。透過型電子顕微鏡(TEM)観察および電子線回折により膜中および膜と基板の界面において微細構造(microstructure)は形成されておらず、過剰なSiは結晶中に固容している。ボールミルメカニカルアロイングによる準安定なβ型を合成するには粒子を破断するのではなく剪断摩擦が必要である。2珪化モリブデン(MoSi2)にゼーベック係数の向上を目的として珪素(Si)を添加し、rfマグネトロンスパッタ法によりMoSiX (2.00≦X≦2.60)の成膜を行った。結晶構造解析、ホール効果測定装置の製作、導電率およびホール係数の温度依存性の測定、ゼーベック係数の測定、微細構造の観察を行い、以下のことを明らかにした。X≦2.30で過剰なSiは結晶中に固容している。サファイア基板のc面に対して(110)面のエピタキシャル膜が成膜された。ゼーベック係数はX増加すると増加した。伝導種の同定、伝導機構の提案を行った。メカニカルアロイングによる剪断摩擦により準安定β相が合成の可能性が示唆された。
蠕虫感染防御におけるIgE産生量規定遺伝子の関与

本研究は蠕虫感染宿主に特徴的なIgE産生亢進の生体防御における役割を明らかにすることを目的とした。とくにマウスにおけるIgE産生の強弱を決定するIgE産生量規定遺伝子に注目し、これと蠕虫感染防御能との関係を解析した。この遺伝子は刺激抗原に関係なくIgE産生のみを特異的に制御し、ヒトのアトピー遺伝子に対応するものである。実験は、まず蠕虫感染防御のIgE依存症について行われた。IgE依存症は、IgE産生量規定遺伝子によって区別されるIgE高応答性と低応答性マウスとその各々のIgE欠損マウスとで各種蠕虫感染に対する防御能を比較することで判定した。感染防御のIgE依存性はマレー糸状虫、Heligmosomoidesではみられなかったが、小形条虫および旋毛虫に対して認められた。旋毛虫感染では感染防御のIgE依存性が、IgE高応答性マウスの場合に限ってみられた。またマウスに旋毛虫抗原と結合能をもたないIgEを多量にくり返し移入し、抗旋毛虫IgE抗体のIgE受容体への結合を阻害した場合の旋毛虫感染防御能を検討したところ、IgE受容体への結合阻害による感染防御能の抑制は、IgE高応答性マウスにみられ、低応答性にはみられなかった。次にIgE産生量規定遺伝子とIgE依存性感染防御の関係をさらに明らかにするため、高および低応答性マウスの交配によりNS世代を得て、旋毛虫の感染を行った。旋毛虫感染N2世代マウスのIgE産生は高低半数ずつにわかれ従来知られる単一遺伝子の支配が確認された。このIgE産生量規定遺伝子によるN2世代マウスの高および低応答性の発現は、旋毛虫感染防御の強さと逆相関していた。この知見は、IgE産生量規定遺伝子がIgE依存性感染防御遺伝子として働いていることを示唆している。換言すればIgEの機能が本来蠕虫感染防御に向けられていることが想定される。本研究は蠕虫感染におけるIgEの産生とその遺伝的制御が感染防御に与える影響について検討するものである。遺伝的制御とはIgE産生のみを特異的に制御するIgE産生量規定遺伝子によって規定されるIgEの高および低応答をさす。感染防御のIgE依存性は、IgE産生の低および高応答性マウスとそのIgE欠損マウスに感染を行い、回収虫体数の比較によって決定した。その結果、小形条虫成虫の腸管からの排虫にIgEの関与が、IgE低応答性マウスにおいて認められた。Heligmosomoides感染では,1次および2次感染後の腸管からの成虫の排虫にIgEが関与しないことが、IgEの低および高応答性マウスで判明した。旋毛虫感染では回収筋肉内幼虫数でみた感染防御のIgE依存性は、マウスのIgE応答性が高い場合にのみみられ、応答性が低い場合には認められなかった。そこでIgE産生量規定遺伝子とIgE依存性感染防御との関係をさらに明らかにすべく、高および低応答性マウスの交配によりN2世代を得た。N2マウスの欠く個体のIgE応答は、旋毛虫感染後の総IgE値・抗旋毛虫IgE抗体量、抗原接種によるIgE抗体産生量について相関し、高および低応答性マウスに区別できた。またN2マウスにおけるIgE高応答性と低応答性の個体数の比率は1:1となり、従来知られる単一遺伝子の支配が確認できた。

最も重要な知見は、IgE応答性と感染虫体数の間に逆相関を認めたことである。すなわちIgE高応答性マウスは低応答性マウスに比し感染虫体数が少なく感染防御能が優れていた。これはIgE産生量規定遺伝子がIgE依存性感染防御遺伝子として機能していることを示唆している。本研究は、蠕虫感染によって誘導されるIgEの感染防御における役割を免疫遺伝学的方法で解析するものである。IgEの産生に関しては他の免疫応答とは独立した遺伝支配がある。マウスではIgE産生量規定遺伝子によってIgE産生能の強弱が決まり、IgE高応答性と低応答性に区別される。昨年までの研究で、IgE単独欠損マウスを用いた実験から、IgE依存性の感染防御はIgE高応答性マウスにのみ認められることが判明した。この点を旋毛虫感染防御についてさらに確認する実験を行った。マウスに旋毛虫抗原と結合能をもたないIgEを多量にくり返し移入し、抗旋毛虫IgE抗体のIgE受容体への結合を阻害した場合の旋毛虫感染防御能を検討した。IgE受容体への結合阻害による感染防御能の抑制は、IgE高応答性マウスにみられ、低応答性にはみられなかった。この結果は、IgE応答性と感染防御の支持するに加え、IgE抗体による防御の発現がIgE受容体をもつ細胞を介することを示唆している。また昨年度に行った交配実験は、さらに個体数を増やし追試をくり返した。すなわち、高応答性と低応答性マウスの交配でN2世代のマウスを得て旋毛虫感染させた。N2世代の各マウスは総IgE値および抗旋毛虫IgE抗体価によって高低に区別でき、個体数比は1:1になりIgE応答性の単一遺伝子支配が確認できた。さらに高応答性マウスでは低応答性マウスに比し防御能が強く示され、IgE産生量規定遺伝子がIgE依存性の感染防御遺伝子であることが示唆された。次にN2世代の旋毛虫感染マウスよりDNAを抽出し、マイクロサテライトマーカーを用いてIgE応答性との連鎖解析を行いIgE産生量規定遺伝子座の決定を試みているが、現在まで遺伝子座の確定に至っていない。
レーザー加工による極細繊維とメビオールジェルを用いた人工的生体血管の作成

本研究の目的は、臨床で使用可能な小口径の人工血管を開発するための基礎的データを得ることにある。大伏在静脈の平滑筋細胞はメビオールジェル内で3次元培養可能であった。しかし、細胞培養後、メビオールジェル内から細胞層のみの立体構造(重層構造)を保ちながら、細胞層を得ることは困難であった。その理由としてジェル内での培養細胞の密度が低いためであると考え、細胞密度を上げることを目指した。培養条件の変更、増殖因子、細胞外基質を使用したが、一定以上の密度が得られなかった。メビオールジェルを利用して細胞層のみの重層化構造を得るにはさらなる条件の検討が必要であると考えられた。高齢者人口の増加と糖尿病患者の増加により、本邦における最近の血管疾患患者の疾患構造が変化しつつある。すなわち、閉塞性動脈性硬化症に患者が増加するのみならず、細動脈にまで広がる瀰漫性病変が頻繁に見られるようになってきた。したがって閉塞性動脈硬化症による慢性動脈閉塞により発症した重症虚血肢患者では、細動脈への血行再建手術の可否がその患者のQOLを決める重要な要素となっている。しかしこのような手術においては、満足できる開存率を有する人工血管がないため、自家静脈をグラフト材料として用いることが第1選択となっているのが現状である。また下肢の血行再建では再手術が必要となる場合も多く、すでに自家静脈を使用しているためにグラフト材料の選択に難渋することもしばしばである。したがって、閉塞性動脈硬化症患者が増えれば増えるほど自家静脈に匹敵する成績を有する人工血管のグラフト材料の必要性は高まり、その開発が急務であると考えられるが、現在臨床的に使用可能な小動脈用のバイパスグラフト材料は存在しない。したがって本研究の目的は、臨床で使用可能な小口径の人工血管を開発するための基礎的データを得ることにある。平成21年度は、バイパス手術で得られたヒト大伏在静脈を用い、静脈から平滑筋細胞を採取し初代培養を施行した。続いてIn vitroで3次元構造を構成させるための培養条件、細胞移植方法の検討を行うため、まず低温保存(4°C)したメールジェル(液状化)に、平滑筋細胞と、ウシ胎児血清あわせ、インキュベーター内に静置、ゲル化させ培養を行いメビオールジェル内で3次元培養が可能なことを確認した。今後はメビオールジェル内での細胞密度を上昇させるために、使用する増殖因子、細胞の数などの検討を行って行きたい。閉塞性動脈硬化症による慢性動脈閉塞により発症した重症虚血肢患者では、細動脈への血行再建手術の可否がその患者のQOLを決める重要な要素となっている。しかしこのような手術においては、満足できる開存率を有する小口径の人工血管がない状況である。具体的には、シート状に作成された極細繊維にメビオールジェルを浸透させ平滑筋細胞をその中で3次元培養を行い極細繊維シートを自己組織細胞で覆うことを目標とした。昨年まで、メビオールジェル内での3次元培養を試みてきた。メビオールジェルの低温では液状、高温で固体状という性質を利用し、ジェルを低温とし粘性を下げて平滑筋細胞を混和させ3次元培養の条件を検討してきた。大伏在静脈の平滑筋細胞は3次元培養可能であった。しかし、細胞培養後、ジェルの温度を下げ、細胞層のみを取り出そうとすると細胞層がくずれてしまい、立体構造(重層構造)を得ることができなかった。そのため、培養条件(細胞数、FBS濃度)、増殖因子(PDGF,EGF等)を検討してきた。23年度から細胞の種類を増やし大伏在静脈の平滑筋細胞だけでなく、冠動脈、大動脈の平滑筋細胞を使用し同様の実験を試みることを考えている。しかし、このような手術においては、満足できる開存率を有する小口径の人工血管がない状況である。これまで、メビオールジェル内での3次元培養を試みてきた。メビオールジェルは低温の状態では液状、高温で固体状という性質を利用し、ジェルを低温とし粘性を下げて平滑筋細胞を混和させ3次元培養の条件を検討してきた。大伏在静脈の平滑筋細胞はジェル内での3次元培養可能であった。昨年まで、細胞培養後、メビオールジェル内から細胞層のみの立体構造(重層構造)維持し、細胞層を得ることを行ったが困難であった。

そのため、本年度は培養条件(細胞数、FBS濃度)の変更、増殖因子(PDGF)、細胞外基質(コラーゲン、フィブロネクチン)を使用しジェル内での細胞密度を高めることをめざしたが、一定以上の密度が得られず重層化した細胞層としては得られなかった。次に大伏在静脈の平滑筋細胞だけでなく、ヒト正常大動脈の平滑筋細胞を使用し同様の実験を行った。大伏在静脈の平滑筋細胞と同様、一定の密度まで培養可能であった。しかし、高密度の状態までは不可能であった。メビオールジェルを利用して細胞層のみの重層化構造を得るにはさらなる条件の検討が必要であると考えられた。
Ｅ型肝炎ウイルスにおいて宿主細胞への侵入に関わる部分配列の合成的研究

E型肝炎は、発展途上国において汚染された飲料水などが原因で発症するウイルス感染症と考えられてきた。しかし近年、先進国でも土着のE型肝炎ウイルスがあり、ブタ・イノシシなどを宿主とする人獣共通感染症であることが報告された。我が国でもブタやイノシシに広く蔓延しており、2010年の調査によって人口の5%(500万人)が感染既往者であると推定されたこと、患者報告が年々増加していることから注目を集めている。本申請では、これまでに行ってきた、合成ペプチドを用いたマラリアワクチン・検査キット・感染メカニズムに関する研究成果を生かして、E型肝炎ウイルスに応用し、化学的な視点から研究を実施する。
ナノ粒子の再分散/肺送達に適した吸入粉末製剤化及び体内動態/安全性の包括的評価

今年度には、ナノ粒子の表面修飾による再分散性の向上を試みるとともに、ナノ粒子を含有した噴霧急速凍結乾燥(SFD)微粒子を培養細胞に曝露した際のナノ粒子の膜透過性・細胞毒性、またナノ粒子分散液をマウスに肺内投与した際の肺内動態について評価を行った。ナノ粒子の再分散に適した表面修飾剤を探索したところ、特にポリエチレングリコール(PEG)誘導体が有用であることを見出した。これまでに良好な再分散性が得られた数種のナノ粒子含有SFD微粒子を用いて加湿前後の結晶性とナノ粒子の再分散性を評価・比較した結果、加湿後にSFD微粒子の賦形剤成分が非晶質から結晶質へと転移するとともにナノ粒子の再分散性を消失したことから、ナノ粒子の再分散性の獲得において賦形剤の非晶質状態が重要である可能性が窺えた。ナノ粒子の膜透過性に及ぼす曝露状態の影響(粉末微粒子と分散液の違い)について検証したところ、PEG修飾ナノ粒子では粉末微粒子として曝露した方が顕著に高い膜透過性を示したのに対し、未修飾ナノ粒子ではこのような違いは認められなかった。PEG修飾ナノ粒子は未修飾ナノ粒子よりも高い細胞毒性を示したが、PEG誘導体の脂溶性部分の化学構造を変えることで、ナノ粒子の良好な再分散性を維持しつつ細胞毒性を軽減できることを見出した。肺内動態の評価において、肺内に到達したナノ粒子は気道上皮細胞上から速やかに肺組織へと移行した後に、肺組織内で長時間に渡り滞留し、全身循環への移行はほとんど認められなかった。ナノ粒子の粒子径が増大するにつれて肺胞マクロファージへの移行性が高まる傾向が見られたが、上記の動態特性については、ナノ粒子の粒子径およびカルボキシル基・アミノ基の化学修飾による明確な違いが認められなかった。一方、PEG修飾ナノ粒子については、気道上皮細胞上から肺組織への移行が遅延する傾向を示した。今年度には当初の研究実施計画どおり、『ナノ粒子のin vitro細胞内取り込み・細胞毒性(マイクロプレート)』『ナノ粒子のin vitro膜透過性・細胞毒性(細胞単培養系、トランスウェル)』『ナノ粒子のin vivo肺内動態・肺障害性』の計3項目に着手し、それぞれ未だ完結できていないものの部分的に成果を残すことができた。但し、細胞培養ならびに評価系の確立が計画していた様には順調にいかず、培養細胞を用いた研究を十分に進めることができなかった。また、当初の計画以上の成果として、PEG誘導体によるナノ粒子の表面修飾の有用性を明らかにするとともに、SFD微粒子の賦形剤成分の結晶性とナノ粒子の再分散性との関係性を新たに見出すことができた。以上の点から判断した。上記の進捗状況の項で記載の内容のうち、未だ着手できていないものを優先して研究を進めていく。具体的には、『ナノ粒子のin vitro細胞内取り込み・細胞毒性(マイクロプレート)』において細胞内取り込み評価、『ナノ粒子のin vitro膜透過性・細胞毒性(細胞単培養系、トランスウェル)』においてナノ粒子間(未修飾・カルボキシル基修飾・アミノ基修飾・PEG修飾)の比較、『ナノ粒子のin vivo肺内動態・肺障害性』において粉末微粒子と分散液の比較をそれぞれ行う。その後、当初の研究実施計画どおり、『ナノ粒子のin vitro膜透過性・細胞毒性(細胞共培養系、トランスウェル)』の評価を行う予定である。今年度には、ナノ粒子の再分散性と肺送達性の双方に優れた吸入粉末剤の開発に向けて、ナノ粒子の物性・賦形剤の種類・製造法が異なる種々の粉末微粒子を製造し、水中で溶解後に再分散したナノ粒子の粒子径測定および粉体物性評価の結果に基づいて処方・製造条件の適合範囲について検証した。賦形剤の種類について、評価した中でトレハロース(Tre)が最もナノ粒子の再分散に適しており、肺送達性および耐吸湿性の向上が期待できるロイシン(Leu)で50 wt%まで置換しても、ナノ粒子の高い再分散性を維持できることを見出した。ナノ粒子の物性について、表面修飾した官能基として『カルボキシル基修飾>アミノ基修飾>未修飾』の順でナノ粒子の再分散性が高い結果が得られ、表面電荷と再構築性の間に相関関係が認められたのに対し、粒子径による再分散性への明確な影響は認められなかった。製造法について、噴霧乾燥法よりも噴霧急速凍結乾燥(SFD)法の方がナノ粒子の再分散に適した粉末微粒子を得られることが示唆された。以上の結果を基に、カルボキシル基修飾ナノ粒子の含量およびTreとLeuの混合比を変えて製造したSFD微粒子について、粉体物性評価を進めた。製造した粉末微粒子は、すべて直径が約5-10 μmでSFD法特有の中空多孔性に富む球状構造であり、非晶質化していることを確認した。これらのSFD微粒子の吸湿性について、保存時の一般的な温湿度環境では吸湿し難い一方、肺内の高温・高湿度環境では吸湿して肺内沈着性が高まる可能性を有していた。吸入特性について、Leuの混合比が増加するにつれて、SFD微粒子の肺治療域到達性ならびに肺深部送達性の両方が向上する傾向が認められた。一方、ナノ粒子の含量が増加するにつれて、SFD微粒子の肺深部送達性は低下するものの、肺治療域到達性については維持される傾向にあった。

今年度には当初の研究実施計画どおり、『ナノ粒子含有粉末微粒子の調製』『ナノ粒子含有粉末微粒子の粒子形状・粒子径』『再構築したナノ粒子の物性』『ナノ粒子含有粉末微粒子の吸入特性』の計4項目に着手し、ナノ粒子の再分散性と肺送達性の双方に優れた吸入粉末剤の開発に適した処方・製造条件の適合範囲を明らかにした。また、当初の計画以上の成果として、ナノ粒子含有粉末微粒子の結晶性ならびに吸湿性について評価し、粉体物性をより明確にすることができた。今年度には、ナノ粒子の表面修飾による再分散性の向上を試みるとともに、ナノ粒子を含有した噴霧急速凍結乾燥(SFD)微粒子を培養細胞に曝露した際のナノ粒子の膜透過性・細胞毒性、またナノ粒子分散液をマウスに肺内投与した際の肺内動態について評価を行った。ナノ粒子の再分散に適した表面修飾剤を探索したところ、特にポリエチレングリコール(PEG)誘導体が有用であることを見出した。これまでに良好な再分散性が得られた数種のナノ粒子含有SFD微粒子を用いて加湿前後の結晶性とナノ粒子の再分散性を評価・比較した結果、加湿後にSFD微粒子の賦形剤成分が非晶質から結晶質へと転移するとともにナノ粒子の再分散性を消失したことから、ナノ粒子の再分散性の獲得において賦形剤の非晶質状態が重要である可能性が窺えた。ナノ粒子の膜透過性に及ぼす曝露状態の影響(粉末微粒子と分散液の違い)について検証したところ、PEG修飾ナノ粒子では粉末微粒子として曝露した方が顕著に高い膜透過性を示したのに対し、未修飾ナノ粒子ではこのような違いは認められなかった。PEG修飾ナノ粒子は未修飾ナノ粒子よりも高い細胞毒性を示したが、PEG誘導体の脂溶性部分の化学構造を変えることで、ナノ粒子の良好な再分散性を維持しつつ細胞毒性を軽減できることを見出した。肺内動態の評価において、肺内に到達したナノ粒子は気道上皮細胞上から速やかに肺組織へと移行した後に、肺組織内で長時間に渡り滞留し、全身循環への移行はほとんど認められなかった。ナノ粒子の粒子径が増大するにつれて肺胞マクロファージへの移行性が高まる傾向が見られたが、上記の動態特性については、ナノ粒子の粒子径およびカルボキシル基・アミノ基の化学修飾による明確な違いが認められなかった。一方、PEG修飾ナノ粒子については、気道上皮細胞上から肺組織への移行が遅延する傾向を示した。今年度には当初の研究実施計画どおり、『ナノ粒子のin vitro細胞内取り込み・細胞毒性(マイクロプレート)』『ナノ粒子のin vitro膜透過性・細胞毒性(細胞単培養系、トランスウェル)』『ナノ粒子のin vivo肺内動態・肺障害性』の計3項目に着手し、それぞれ未だ完結できていないものの部分的に成果を残すことができた。但し、細胞培養ならびに評価系の確立が計画していた様には順調にいかず、培養細胞を用いた研究を十分に進めることができなかった。また、当初の計画以上の成果として、PEG誘導体によるナノ粒子の表面修飾の有用性を明らかにするとともに、SFD微粒子の賦形剤成分の結晶性とナノ粒子の再分散性との関係性を新たに見出すことができた。以上の点から判断した。当初の研究実施計画どおり、来年度には『ナノ粒子のin vitro細胞内取り込み・細胞毒性(マイクロプレート)』『ナノ粒子のin vitro膜透過性・細胞毒性(細胞単培養系、トランスウェル)』の計2項目、再来年度には『ナノ粒子のin vitro膜透過性・細胞毒性(細胞共培養系、トランスウェル)』『ナノ粒子のin vivo肺内動態・肺障害性』の計2項目について検討していく予定である。また、ナノ粒子の再分散性のさらなる向上を目的として、ナノ粒子の表面コーティングによる効果についても検証していきたいと考えている。
ぶどう膜炎の疾患特異的iPS研究

ベーチェット病や原田病ぶどう膜炎の標的網膜細胞の検索、標的抗原の検索、治療法スクリーニングを行うために、初年度(2018-2019)に、標的細胞としてヒトiPS細胞由来RPE細胞およびガングリオン細胞樹立を行った。iPS-RPE細胞の品質規格試験、RPE特異的遺伝子発現(RPE65など: RT-PCR)、RPE純度試験(Bestrophinなど:免疫染色)、増殖因子分泌試験(VEGF/PEDF: ELISA)、視細胞外節の貪食試験(蛍光顕微鏡)では問題はなく、RPEが樹立できた。HLA-DR4陽性の原田病ぶどう膜炎患者(1名)、HLA-DR4陽性の健常人(1名)およびHLA-DR4陰性の健常人(1名)から樹立して、来年度のassay用に複数のiPS細胞由来RPE細胞を用意、保存した。また、ヒトiPS細胞由来3D retina(視細胞や神経網膜を含む)を分化・誘導した。品質規格試験、視細胞特異的遺伝子発現(RT-PCR)、ガングリオン細胞特異的遺伝子発現(RT-PCR)、視細胞およびガングリオン細胞純度試験(免疫染色)では問題はなく網膜の樹立できた。ガングリオン細胞の単離はImmunopaning法もしくはMACSで行い、最終的にSMI、Brn-3bの染色で純度を確認した。ガングリオン細胞は、HLA-B51陽性のベーチェット病ぶどう膜炎患者(1名)、HLA-B51陽性の健常人(1名)およびHLA-B51陰性の健常人(1名)から樹立して来年度のassay用に大量に保存した。次年度(2019-2020)は、ベーチェット病ぶどう膜炎は3D retinaやガングリオン細胞を用いたin vitro病態モデル、原田病ぶどう膜炎はメラノサイトとRPE細胞を用いたin vitro病態モデル作成を遂行する予定である。初年度(2018-2019)に、ヒトiPS細胞由来RPE細胞およびヒトiPS細胞由来ガングリオン細胞樹立を行った。これらは当初の予定通りであり、それ以上、それ以下でもない。ヒトiPS細胞由来RPE細胞は当研究室で多数の実績があり、予定通りその樹立を問題なく行えた。一方、ヒトiPS細胞由来ガングリオン細胞は3D retina分化誘導に時間がかかるため1年間かけて3ラインを作成する事が出来た。次年度(2019-2020)は、ベーチェット病は3D retinaやガングリオン細胞を用いたin vitro病態モデル、原田病はメラノサイトとRPE細胞を用いたin vitro病態モデル作成を遂行する予定である。現時点ではヒトiPS細胞由来のメラノサイトの樹立に成功していない。もし出来ない場合は同じ色素がありメラノサイト抗原を発現しているRPE細胞のみで行う予定である。患者さまのリクルート(検体採取)は、年間かなりの数のベーチェット病ぶどう膜炎や原田病ぶどう膜炎患者が来院されるので問題ないと思われる。

現時点ではヒトiPS細胞由来のメラノサイトの樹立に成功していない。もし出来ない場合は同じ色素がありメラノサイト抗原を発現しているRPE細胞のみで行う予定である。患者さまのリクルート(検体採取)は、年間かなりの数のベーチェット病ぶどう膜炎や原田病ぶどう膜炎患者が来院されるので問題ないと思われる。