hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複製後修復によるゲノム安定保持機構

細胞に紫外線が照射され、DNAに傷害物が形成されると通常のDNA複製酵素はその部位で停止してしまい、複製が阻害される。この時にRad18が活性化され、PCNAをユビキチン化することによりポリメラーゼηを損傷部位に誘導し、損傷乗り越え複製を促進させるというモデルを考案した。in vitroでは、精製したRod18-Rad6タンパクがPCNAをモノユビキチン化する系を構築し、Rad18がユビキチンライゲースであることを実証できた。また、プルダウン試験により、PCNAがモノユビキチン化されるとポリメラーゼδではなく、ポリメラーゼηに対する親和性が著明に増大することがわかった。この親和性の変化により、通常の複製酵素から損傷乗り越え複製酵素への変換が促されると考察した。in vivoでも、RAD18-KO細胞ではDNA損傷に伴うPCNAのモノユビキチン化がみられず、またポリメラーゼηの核への集積もみられなかった。このため、Rad18は細胞内でPCNAをユビキチン化することによりポリメラーゼηを損傷部位へ誘導していると考えられた。現在、PCNAがRad18によりモノユビキチン化されると、通常の複製酵素または損傷乗り越え複製酵素による複製効率、複製エラー率がどのように影響を受けるのか解析している。RAD18ノックアウトマウスが発癌するかどうかみるため、1年8カ月齢のマウスを協同研究機関へ送付し解析を行っている。電離線放射により、白血病が誘発される現在観察を続行している。免疫能をみるためマーカー蛋白をマウス個体に注射した後に、協同研究機関へマウスを送付し、免疫グロブリンの変異誘発頻度を測定し、Rad18が抗体の多様性の獲得に果たす役割についてみている。現在、複製後修復欠損マウスであるRAD18ノックアウトマウスと除去修復欠損マウスであるXPA-KOマウスをかけ合わせている。これによりRAD18-XPAダブルKOマウスを作成し、その表現型に関して解析する予定である。我々はヒトRAD18遺伝子(hRAD18)を単離し、その機能を明らかにしてきた。RAD18遺伝子の機能が不全になると、複製後修復が機能しなくなることとゲノムが不安定になることを検証するため、マウスRad18遺伝子を破壊したES細胞を調製した。この細胞は、紫外線、メチル化剤、架橋化剤などの種々のDNA損傷に対して高い感受性を示した。DNA損傷後の新規のDNA複製が抑制されていたことから、複製後修復が欠損していることがわかった。RAD18ノックアウト細胞の自然突然変異率は、野生型細胞に比べてわずかな増加し、DNA損傷誘発処理後の誘発変異は逆に抑制されていた。また、RAD18ノックアウト細胞では姉妹染色体分体間組換え(SCE)が約3倍増加していた。外来遺伝子が安定にゲノムに保持され発現する効率は約20倍増加しており、部位特異的組換え頻度は約40倍の値を示した。このため、RAD18遺伝子は、非正統的組換えを抑制することによりゲノムの安定性の維持に寄与していると結論づけた。RAD18ノックアウトマウスの作製にも成功し、表現型を解析している。抗体を用いた染色試験により、細胞がDNA損傷を受けるとRAD18蛋白は核内に均一に拡散した後にDNA損傷部位に蓄積していくことがわかった。Rad6-Rad18によるユビキチン結合制御とDNA修復および発がん抑制がどのように結びつくのか明らかにするため、Rad18によりユビキチン化を受けると思われる基質としてPCNA等に着目し、その機構と意義について研究を進めてゆく予定である。

細胞に紫外線が照射され、DNAに傷害物が形成されると通常のDNA複製酵素はその部位で停止してしまい、複製が阻害される。この時にRad18が活性化され、PCNAをユビキチン化することによりポリメラーゼηを損傷部位に誘導し、損傷乗り越え複製を促進させるというモデルを考案した。in vitroでは、精製したRad18-Rad6タンパクがPCNAをモノユビキチン化する系を構築し、Rad18がユビキチンライゲースであることを実証できた。また、プルダウン試験により、PCNAがモノユビキチン化されるとポリメラーゼδではなく、ポリメラーゼηに対する親和性が著明に増大することがわかった。この親和性の変化により、通常の複製酵素から損傷乗り越え複製酵素への変換が促されると考察した。in vivoでも、RAD18-KO細胞ではDNA損傷に伴うPCNAのモノユビキチン化がみられず、またポリメラーゼηの核への集積もみられなかった。このため、Rad18は細胞内でPCNAをユビキチン化することによりポリメラーゼηを損傷部位へ誘導していると考えられた。現在、PCNAがRad18によりモノユビキチン化されると、通常の複製酵素または損傷乗り越え複製酵素による複製効率、複製エラー率がどのように影響を受けるのか解析している。RAD18ノックアウトマウスが発癌するかどうかみるため、1年8ヵ月齢のマウスを協同研究機関へ送付し解析を行っている。電離線放射により、白血病が誘発される現在観察を続行している。免疫能をみるためマーカー蛋白をマウス個体に注射した後に、協同研究機関へマウスを送付し、免疫グロブリンの変異誘発頻度を測定し、Rad18が抗体の多様性の獲得に果たす役割についてみている。現在、複製後修復欠損マウスであるRAD18ノックアウトマウスと除去修復欠損マウスであるXPA-KOマウスをかけ合わせている。これによりRAD18-XPAダブルKOマウスを作成し、その表現型に関して解析する予定である。
ストレスが引き起こす社会行動の障害とその背景にある神経ネットワークの解明

ストレスが引き起こす社会行動の障害とその神経基盤の解明を目指し、最終年度はこれまでの研究から得られた実験結果の統合と解釈を行った。本研究では情動発現に関与するといわれている扁桃体の中でも、その出力部位である扁桃体中心核の神経活動を記録した。その結果、扁桃体中心核は不安を感じるような状況においてその神経活動が亢進していた。また、隔離飼育ストレスにより、ラットは不安に抗した積極的な行動が減弱した。また、コントロール群で観察された扁桃位中心核の神経活動の亢進が、ストレス群では減弱していた。扁桃体中心核は視床や脳幹に投射線維を送っており、恐怖や不安に伴う情動反応を制御していると考えられている。隔離飼育された動物で観察された行動変化の背景には、このような制御機能の低下があり、不安や恐怖のコントロールが困難になっているのではないかと考えた。続いて、皮質の中でも特に扁桃体と合わせて情動に関与する神経システムとしてよく議論される内側前頭前皮質の情動行動に伴う神経活動を記録した。実験の結果、内側前頭前皮質の前辺縁皮質の神経活動は、動物が恐怖や不安を感じる状況でその神経活動が亢進していた。一方、下辺縁皮質は恐怖や不安を感じる状況ではなく、恐怖記憶の消去時にその神経活動が亢進していた。また、これら二つの領域の不安関連行動に伴う活動亢進は、扁桃体と同様に、隔離飼育群で減弱していた。以上を踏まえ、本年度は、異なる観点からこれまで得られた研究結果に対する考察を深めるため、追加実験として脳の電気刺激実験に取り組んだ。追加実験により、内側前頭前皮質の各下位領域が情動行動において異なる機能を有することが明らかになった。また、内側前頭前皮質の特定の領域の活性が、社会行動を含めた情動行動の障害に対する有用な介入方法となり得ることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はストレスが導く社会行動の障害とその背景にある脳の機能変化を明らかにすることを目的として計画した。そのためにラットを用いたSocial Interaction実験を行い、ストレス負荷群と対照群において社会行動に伴うラット脳の神経活動を比較することを計画した。Social Interaction実験(以下SI実験)は同一のフィールドに入った複数のラットが互いに関わりあいながら行う社会行動を観察するものである。SI実験では複数のラットが関わるために行動が多様である。加えて社会的行動時の脳活動をリアルタイムで計測した実験はこれまでにないことから、データの解析・解釈が困難であった。そこで、解析・解釈の基準となるデータを得るため、ストレスを負荷されていない対照群の脳活動を事前に解析する必要があり、当該年度は主にコントロールデータの取得を行った。具体的な実施内容は次の通りである。1単一の個体を対象とした行動実験として、不安水準の評価に用いられる高架式十字迷路テストおよびオープンフィールドテストを行った。申請書に記載した通り、ラット扁桃体に着目し、神経活動記録用電極を挿入した。現在、情動行動に伴うラット扁桃体の神経活動を解析している。2扁桃体と密接な線維連絡を持ち、情動発現とその情動に基づく行動決定に関与していると報告されている、内側前頭前皮質に電極を挿入した。そして1と同様の行動実験を行い、ラットの行動および内側前頭前皮質の神経活動を解析した。得られた結果の一部を第37回日本神経科学大会で報告した。12の実験によって、複雑で解釈の困難な社会行動およびそれに伴う神経活動の解析・解釈の基準となるデータを得ることができた。これにより、これまで報告されたことのない、社会行動とそれに伴う神経活動を同時に観察した実験においてより適切な解析を行い、考察を進めることが可能となった。そのために同一のフィールドに入った複数のラットが互いに関わりあいながら行う社会行動を観察するSocial Interaction実験(以下SI実験)を行うこととしていた。昨年度に引き続き、現在、行動実験として、主に、高架式十字迷路とSI実験を行い、コントロール群および、ストレス群のデータを取得している。また、これまでの実験結果の支持材料として、前頭前皮質の電気刺激実験を行った。その結果、内側前頭前皮質の電気刺激によって高架式十字迷路上での積極的な探索行動が出現することがわかった。また、単一の脳領域の中でもある特定の部位で、一部の周波数のみの刺激で探索行動の誘発が可能であった。この結果は第14回コメディカル形態機能学会学術集会で報告した。ストレスが引き起こす社会行動の障害とその神経基盤の解明をめざし、当該年度は主に高架式十字迷路とSI実験を行い、コントロール群および、ストレス群のデータの取得に取り組んだ。また、当初の計画に加えて、内側前頭前皮質の電気刺激を行い、その抗不安作用を検討するために刺激実験を行った。当初の計画通り、扁桃体関連領域として内側前頭前皮質の神経活動の記録を行った。これまでえられたデータを分析した結果、マルチユニット活動をより詳細に分類し、解析する必要があると考えた。そのために新たな解析方法を導入したことから、論文発表には至っていないが、現在、これまで得られた結果をまとめている。

そして、採用第3年度には、扁桃体を中心とした情動発現とその情動に基づく行動決定に深く関わっている神経回路ネットワークについて、隔離飼育ストレスによってどのように機能が変化しているのかを考察し、論文として発表することを予定している。社会行動の障害とその神経基盤を解明するにあたり、これらの実験で得られたデータは非常に重要で意義のあるものであり、おおむね当初の研究目的に即してデータの取得を行えている。ストレスが引き起こす社会行動の障害とその神経基盤の解明を目指し、最終年度はこれまでの研究から得られた実験結果の統合と解釈を行った。本研究では情動発現に関与するといわれている扁桃体の中でも、その出力部位である扁桃体中心核の神経活動を記録した。その結果、扁桃体中心核は不安を感じるような状況においてその神経活動が亢進していた。また、隔離飼育ストレスにより、ラットは不安に抗した積極的な行動が減弱した。また、コントロール群で観察された扁桃位中心核の神経活動の亢進が、ストレス群では減弱していた。扁桃体中心核は視床や脳幹に投射線維を送っており、恐怖や不安に伴う情動反応を制御していると考えられている。隔離飼育された動物で観察された行動変化の背景には、このような制御機能の低下があり、不安や恐怖のコントロールが困難になっているのではないかと考えた。続いて、皮質の中でも特に扁桃体と合わせて情動に関与する神経システムとしてよく議論される内側前頭前皮質の情動行動に伴う神経活動を記録した。実験の結果、内側前頭前皮質の前辺縁皮質の神経活動は、動物が恐怖や不安を感じる状況でその神経活動が亢進していた。一方、下辺縁皮質は恐怖や不安を感じる状況ではなく、恐怖記憶の消去時にその神経活動が亢進していた。また、これら二つの領域の不安関連行動に伴う活動亢進は、扁桃体と同様に、隔離飼育群で減弱していた。以上を踏まえ、本年度は、異なる観点からこれまで得られた研究結果に対する考察を深めるため、追加実験として脳の電気刺激実験に取り組んだ。追加実験により、内側前頭前皮質の各下位領域が情動行動において異なる機能を有することが明らかになった。また、内側前頭前皮質の特定の領域の活性が、社会行動を含めた情動行動の障害に対する有用な介入方法となり得ることが示唆された。ストレスが引き起こす社会行動の障害とその神経基盤の解明をめざし、当該年度は主にコントロールデータの取得に取り組んだ。当初の計画に加えて発展的に追加実験を行ったが、それに伴って2年目に実施予定であった内側前頭前皮質における神経活動の解析を1年目(当該年度)に取り組むこととなった。本研究ではマルチユニット活動の記録を行い、情動行動に伴う神経活動の解析を行っているが、これまで得られたデータの解析結果から、マルチユニット活動をその波形やタイミングによって、より詳細に分類する必要があると思われた。そのため、採用第2年度から新たな解析方法を導入し、現在はその適正を検討している段階である。採用第3年度も引き続き、解析を進め、実施済みの各実験のデータをまとめたうえで発表することを予定している。
初等中等教育の現場における複数の表示装置の効果的な活用支援基盤の構築と検証

本研究では,初等中等教育の現場におけるICT活用を円滑に進めるために,大型ディスプレイなどの複数の表示装置の効果的な活用を支援するための基盤技術の開発を行い,実際の授業で活用した上での教育効果について検証を行い、有用性を明らかにすることを目的とする.平成30年度は以下に述べる研究を遂行し,所望の成果が得られている.初等中等教育のICTを活用したものづくりを行う実習において,従来の片手に持ちながら操作する表示装置の画面コンテンツを操作するためのインタフェース機器では,ものづくりの実習の内容説明時に両手で作業しながら,コンピュータの画面操作をすることは難しい.それを受けて,前年度までに設計,実装を行った片手に装着可能な画面操作用インタフェースの実装,設計を行った.今年度は複数の大型表示システムを活用した効果的な実習の取り組みとして,仮想的な大規模ディスプレイを構成するミドルウェアと画面操作用インタフェースを組み合わせた大画面コンテンツ提示環境を構築した.本環境を用いて現場の工業担当の高校教員による模擬実習を実施した結果,本環境において効果的なICTを活用した実習を実施できる可能性が高いことを示した.多くのモバイル端末に同じ映像データをリアルタイムに配信するマルチキャスト配信技術において,映像データ受信時の待機時間および再生中の途切れ時間で構成される再生待ち時間を短縮するスケジューリング技術を開発した.また,モバイルマルチキャスト配信の高性能化を図ると共に,スケジューリング技術を適用可能なモバイル端末向けの映像配信システムを開発し,有用性を評価した.本研究では,初等中等教育の現場におけるICT活用を円滑に進めるために,大型ディスプレイやタブレット端末などの複数の表示装置の効果的な活用支援基盤の構築を行い,授業で活用した上での教育効果について検証を行い,有用性を明らかにすることを目的とする.平成28年度は以下の項目に関する研究を遂行し,所望の成果が得られている.現在,初等中等教育の現場における視聴覚教材を活用した授業向けの画面操作及び入力用の様々なインタフェース機器が提案されている.しかしこれらの大半はリモコンタイプであり,手に持って操作しなければならないので,身振り手振りなどのジェスチャーをする際に支障が生じる.我々は視聴覚教材を活用して円滑な授業を実現するために必要な画面操作用インタフェースとして,片手に装着でき,軽量かつコンパクトでインタラクティブな操作が簡単で,さらに教室内を自由に歩き廻れることが可能になるといった要件を満たすインタフェースのプロトタイプの提案及び設計,実装を行った.さらに本インタフェースを用いて視聴覚教材を活用した授業を実験的に行い,授業の円滑化に関する効果について検証を行った.複数の表示装置の利用を想定したデータ配信技術について,分割放送型配信で複数の動画データを同期配信するときに発生する再生時の待ち時間を短縮するスケジューリング手法を実際のネットワーク環境で評価できる放送型配信システムTeleCaSを提案した.設計では,セグメントの配信契機を考慮した同期配信方式,および複数動画の同時再生方式の二つを実現した.これらの機能を実装し,待ち時間の短縮効果を評価した.視聴覚教材を活用して円滑な授業を実現するために必要な要件を満たした画面操作用インタフェースのプロトタイプの提案及び実装,さらに分割放送型配信で複数の動画データを同期配信するときに発生する再生時の待ち時間を短縮するスケジューリング手法の提案及び設計が当初の予定通り,実現できた点.本研究では,初等中等教育の現場におけるICT活用を円滑に進めるために,大型ディスプレイなどの複数の表示装置の効果的な活用を支援するための基盤技術の開発を行い,実際の授業で活用した上での教育効果について検証を行い、有用性を明らかにすることを目的とする.平成29年度は以下に述べる研究を遂行し,所望の成果が得られている.初等中等教育のICTを活用したものづくりを行う実習において,従来の片手に持ちながら操作する表示装置の画面コンテンツを操作するためのインタフェース機器では,ものづくりの実習の内容説明時に両手で作業しながら,コンピュータの画面操作をすることは難しい.それを受けて,前年度に設計,実装を行った片手に装着可能な画面操作用インタフェースを用いて,実習授業での検証評価を行う中で,長時間に及びものづくりを行う実習を行った際に教員の疲労感が伴う問題が生じることが明らかとなった.これらの問題を解決するために,片手に装着して長時間使用した際でも,疲労感を軽減可能な新たな画面操作用インタフェースを提案し,設計及び実装を行った.放送型配信において,実際のネットワーク環境でスケジューリング手法を評価可能な配信システムを実現した.実現方式では,データの配信契機を同期する方式,および逐次再生に対応するデータ配信方式の2種類を実装した.システムの有用性に関する評価の結果,スケジューリング手法に応じた再生待ち時間および中断受信時間の短縮効果を確認し,システムの有用性を示した.初等中等教育のICTを活用したものづくりを行う実習を円滑に実施できるために必要な要件を満たした画面操作用インタフェースの設計及び,実習を通した評価において更な改善点を見出すことでの機能面の向上に着手できた点,さらにコンテンツ配信において,実際のネットワーク環境でスケジューリング手法を評価可能な配信システムを実現できた点.本研究では,初等中等教育の現場におけるICT活用を円滑に進めるために,大型ディスプレイなどの複数の表示装置の効果的な活用を支援するための基盤技術の開発を行い,実際の授業で活用した上での教育効果について検証を行い、有用性を明らかにすることを目的とする.平成30年度は以下に述べる研究を遂行し,所望の成果が得られている.初等中等教育のICTを活用したものづくりを行う実習において,従来の片手に持ちながら操作する表示装置の画面コンテンツを操作するためのインタフェース機器では,ものづくりの実習の内容説明時に両手で作業しながら,コンピュータの画面操作をすることは難しい.それを受けて,前年度までに設計,実装を行った片手に装着可能な画面操作

用インタフェースの実装,設計を行った.今年度は複数の大型表示システムを活用した効果的な実習の取り組みとして,仮想的な大規模ディスプレイを構成するミドルウェアと画面操作用インタフェースを組み合わせた大画面コンテンツ提示環境を構築した.本環境を用いて現場の工業担当の高校教員による模擬実習を実施した結果,本環境において効果的なICTを活用した実習を実施できる可能性が高いことを示した.多くのモバイル端末に同じ映像データをリアルタイムに配信するマルチキャスト配信技術において,映像データ受信時の待機時間および再生中の途切れ時間で構成される再生待ち時間を短縮するスケジューリング技術を開発した.また,モバイルマルチキャスト配信の高性能化を図ると共に,スケジューリング技術を適用可能なモバイル端末向けの映像配信システムを開発し,有用性を評価した.画面操作インタフェースの機能向上を目指した設計,実装を継続して行い、実際の授業で活用を行うことでパフォーマンス面や授業中における生徒とのコミュニケーションや教育効果の観点からの評価分析を行い、本研究における提案手法の有効性について検証を行う.複数の表示装置の利用を想定した教材データコンテンツ配信技術の検証として,前年度から引き続き,実装を行った同期配信方式,および複数動画の同時再生方式における待ち時間の短縮効果について検証実験を行う.複数の大画面表示装置の効果的な活用を促進するために,既存研究で実装している様々な教材コンテンツを自由な位置,サイズで同時提示を可能とする機能を本実験環境を構築し,効果的な教材コンテンツ提示及び操作方法について検討を行う.画面操作インタフェースの機能向上を目指して,教育現場の教員による試用評価を行うことでさらなる知見を得ることで新たな設計,実装を継続的に行う.さらに実際のICTを活用したものづくり実習で本インタフェースを活用し,生徒とのコミュニケーションや教育効果の観点からの評価分析を行い,本研究における提案技術の有効性について検証を行う.複数の表示装置の利用を想定した教材データコンテンツの配信技術の検証として,実装を行ったシステムを用いた検証実験を行う.複数の大画面表示装置の効果的な活用手法について,様々な教材コンテンツの自由な配置,サイズによる同時提示を行える環境を構築し,効果的な教材コンテンツの提示,操作方法について検討を行う.予定していた国外開催の国際会議での発表を取りやめたため.購入予定の物品を既存の物品で代用できたことと,予定していた国内外開催の学会での発表を取りやめたため,次年度使用額が生じた.これらは次年度の国内外開催の学会に参加するための旅費,参加費,さらに研究成果の論文投稿費として使用する予定.国外開催の国際会議に参加するための旅費として使用する予定.
テロメラーゼ阻害活性を有するディクティオデンドリン類の合成研究

本研究では、海綿から単離・構造決定されたテロメラーゼ阻害活性天然物ディクティオデンドリン類の合成研究を行った。その結果、ベンザインの高い反応性を利用する多置換インドリンの新規合成法を開発し、ディクティオデンドリンBの効率的全合成に成功した。さらに、ディクティオデンドリンAの世界初の全合成も達成した。本合成経路は合成終盤にさまざまな置換基を収束的に導入できることから、ディクティオデンドリン類の誘導体合成に応用可能である。ディクティオデンドリン類は、海綿Dictyodendrilla verongiformisから単離・構造決定されたテロメラーゼ阻害活性(IC_<100>=50mM)を示す海産性の天然物である。しかしながら、これらは二つの窒素原子を含む高度に置換された芳香環を有しており、これらが非常に電子豊富であることから、古典的な手法では合成がきわめて困難である。そこで本化合物群の効率的な合成を可能にする新規方法論を開発できれば、テロメラーゼ阻害を作用機序とする新規抗がん剤の創製につながるのではないかと考えた。研究代表者はディクティオデンドリン類の極めて重要な生理活性と興味深い構造に注目し、これまでの研究過程で得られた知見をディクティオデンドリン類の効率的な合成に活かしつつ、さらに発展させることを計画した。本研究では、(1)ディクティオデンドリン類の効率的合成法の確立、(2)ディクティオデンドリン類の誘導体合成および構造活性相関の評価、(3)多置換含窒素環状化合物の一般的かつ効率的な新規合成方法論の開発を目的として合成研究を行った。平成19年度の研究成果としては、100グラムスケールにて容易に調製可能なトリハロベンゼンから3工程で得られるノシルアミドに対し、芳香族アミノ化反応が片方のブロモ基を完全に保持したまま、ほぼ定量的に進行して目的のブロモインドリンが得られた。ここから、残されたブロモ基を足がかりとして鈴木宮浦クロスカップリングを含む数段階の変換によりアジドへと誘導し、これを加熱したところ、四環性コア骨格を備えた重要中間体の合成に成功した。今後はパラヒドロキシフェニル基の導入を経て、まずは全合成の達成を目的として研究を行う。前年度に四環性コア骨格を備えた重要中間体の合成に成功したので、パラヒドロキシフェニル基の導入を経て、まずは全合成の達成を目的として研究を行った。しかし、さまざまな検討の後、五置換ベンゼン環に対するハロゲン化やリチオ化を経たヨウ素等による捕捉、さらに、様々な四環性化合物を用いてもρ-メトキシフェニル基の導入はできなかった。また、通常の遷移金属触媒を用いる直接的なρ-メトキシフェニル基の導入についてもきわめて困難であることが分かった。そこで、立体的な制約がきびしい5置換ベンゼン環への置換基導入を断念し、インドリン環の構築と同時にp-メトキシフェニル基の導入の足がかりとなるヨウ素を導入できないかと考えた。すなわち、同様のジブロモベンゼン誘導体に対して、過剰量のLiTMPを-78°Cで加えた後に昇温することでベンザインを発生させ、生成した7-リチオインドリンの塩化亜鉛によるトランスメタル化とヨウ素での捕捉により、きわめて立体的に込み入った位置にヨウ素化を行い目的とするヨードインドリンを得ることに成功した。この結果は、従来法では合成困難であった六置換ベンゼン環の一般的合成法になりうるものであり、現在、一般性に関して検討を行っている。得られたヨードインドリンに対して、順次官能基導入を行うことでディクティオデンドリンBの全合成を達成した。また、これまで合成例がなかったディクティオデンドリンAの世界初の全合成も達成し、今後この結果を論文投稿する予定である。また、本合成経路は合成終盤にさまざまな置換基を収束的に導入できることから、ディクティオデンドリン類の多様な誘導体合成に応用可能であると考えている。
対流圏光化学とオゾン収支

本年度で航空機観測用測定器の開発・整備を継続した。レーザー誘起蛍光法によるNO_2測定器の開発を行った。NO_2分子に可視のレーザー光を2波長照射し、その蛍光強度からNO_2分子濃度を求めるものである。60秒平均で20-30pptvの精度でNO_2を測定できるシステムを製作した。更にNO_2を近紫外光でNOに変換し化学蛍光法で測定する方法を継続して改良した。この測定器を実際に航空機に搭載して大気中のNO_2の測定を試みた。10秒平均で10-20pptvの精度でNO_2を測定できた。実験室で合成したNO_2と大気中に含まれるNO_2を2つの方法で測定比較した結果、両者は100pptvより高い濃度では10%以内で一致した。航空機観測を実施し、またこれまでに得られたデータを解析した。2000年11月-12月に熱帯域での大気成分の航空機観測を実施した。北部オーストラリアでの雷放電が熱帯オゾンの生成に及ぼす効果をオゾン前駆気体成分の高精度測定により調べた。また1998-1999年8-10月の航空機観測データより得られたオーストラリア上空のデータを詳細に解析し、バイオマス燃焼によるオゾンへの効果を求めた。熱帯域でのオゾン分布、収支のシミュレーションをするための3次元数値モデルの開発を継続して行なった。1998、1999年の熱帯太平洋のオゾン、窒素酸化物のシミュレーションを行った。熱帯域の境界層中でのオゾンの損失と対流活動がオゾン分布に大きな効果を持つことが判明した。本年度でまず航空機観測用測定器の開発・整備を行なった。1. NO,NO2,NOy測定器:NO,NOy化学蛍光測定器の感度を更に上げ、より低濃度NO,NOyの測定を可能にした。この結果、10秒での検出限界を2pptvまでに改善することに成功した。2. CO測定器:真空紫外共鳴蛍光法に基づく高時間分解能・高感度のCO測定器の開発を始めた。目標は1秒の時間分解能で1ppbvのCOを測定できるようにすることである。測定器の組上げを行った。1. 1997年10月-11月に行った大西洋での航空機観測の化学観測データを解析している。特に上部対流圏で航空機より排出されるNOx及び雷放電により生成されるNOxの量を中心に解析を進めた。2. 98年4月名古屋よりガルフストリーム機により日本近海上での5回のフライト行った。このアジア大陸上での大規模対流と水平輸送によるオゾン前駆気体成分の輸送効果を中心に現在解析を進めている。3. 98年9月-10月に熱帯域での大気成分の航空機観測を実施した。インドネシア、オーストラリアでのバイオマス燃焼が熱帯オゾンの生成に及ぼす効果をオゾン前駆気体成分の高精度測定により調べた。熱帯域でのオゾン分布、収支のシミュレーション熱帯域でのオゾン分布をシミュレーションするための3次元数値モデルの開発を行なった。1994の場合のバイオマス燃焼効果のシミュレーションを行った。本年度でまず航空機観測用測定器の開発・整備を行った。1.NO_2:測定器:NO_2を近紫外光でNOに変換し化学蛍光法で測定する方法を継続して開発した。サンプル大気の圧力によらず50%のNO_2をNOに変換できた。10秒平均で20-30pptvの精度でNO_2を測定できた。2.CO測定器:真空紫外共鳴蛍光法に基づく高時間分解能・高感度のCO測定器の開発を継続した。1秒の時間分解能で2ppbvのCOを測定できるようになった。

測定器の組上げを行い、航空機に搭載し、大気中のCO濃度の測定を行った。実験室と同レベルの測定精度が得られることを確認した。3.HOx測定器:レーザー誘起蛍光法によるOH測定器の開発を継続した。5×10^5cm^<-3>のOH濃度が測定できるまでに測定器の開発が進んだ。航空機観測を実施し、またこれまでに得られたデータを解析した。1.1999年8月-9月に熱帯域での大気成分の航空機観測を実施した。北部オーストラリアでのバイオマス燃焼が熱帯オゾンの生成に及ぼす効果をオゾン前駆気体成分の高精度測定により調べた。2.1999年12月-2000年3月に北極域での下部成層圏-上部対流圏の大気成分の航空機観測をNASAと共同で実施した。中緯度から高緯度での様々な大気組成を冬期から早春にかけて測定することにより、上部対流圏の大気化学過程の緯度変化、季節変化を調べるためのデータが取得された。熱帯域でのオゾン分布、収支のシミュレーション熱帯域でのオゾン分布をシミュレーションするための3次元数値モデルの開発を継続して行った。1999年の北部オーストラリアでのバイオマス燃焼のシミュレーションを行った。本年度で航空機観測用測定器の開発・整備を継続した。レーザー誘起蛍光法によるNO_2測定器の開発を行った。NO_2分子に可視のレーザー光を2波長照射し、その蛍光強度からNO_2分子濃度を求めるものである。60秒平均で20-30pptvの精度でNO_2を測定できるシステムを製作した。更にNO_2を近紫外光でNOに変換し化学蛍光法で測定する方法を継続して改良した。この測定器を実際に航空機に搭載して大気中のNO_2の測定を試みた。10秒平均で10-20pptvの精度でNO_2を測定できた。実験室で合成したNO_2と大気中に含まれるNO_2を2つの方法で測定比較した結果、両者は100pptvより高い濃度では10%以内で一致した。2000年11月-12月に熱帯域での大気成分の航空機観測を実施した。北部オーストラリアでの雷放電が熱帯オゾンの生成に及ぼす効果をオゾン前駆気体成分の高精度測定により調べた。また1998-1999年8-10月の航空機観測データより得られたオーストラリア上空のデータを詳細に解析し、バイオマス燃焼によるオゾンへの効果を求めた。熱帯域でのオゾン分布、収支のシミュレーションをするための3次元数値モデルの開発を継続して行なった。1998、1999年の熱帯太平洋のオゾン、窒素酸化物のシミュレーションを行った。熱帯域の境界層中でのオゾンの損失と対流活動がオゾン分布に大きな効果を持つことが判明した。
尋常性乾癬における細胞外ATPの機能解析

ヒト皮膚三次元モデルにおいて細胞外ATPがEGFファミリー、PTGS2等の乾癬関連遺伝子群を発現させることを明らかにした。また、EGFファミリー受容体下流のRas-ERK経路、PI3K-Akt経路の活性化を確認した。さらに、上記経路とPTGS2の発現経路の関係性について解析を行ったところPTGS2の経時的発現が認められた。本検討により、細胞外ATPが誘導するPTGS2の発現にはRas-ERK経路またはPI3K-Akt経路が関与している可能性が示唆された。細胞外ATPによりこれらの細胞内イベントが制御されているという本研究成果は、乾癬の病態形成や治療法を考える上で重要な知見であると考えられた。三次元モデルヒト表皮を用い、細胞外ATPが誘導する尋常性乾癬の発症・悪化に関与する新規バイオマーカーの探索と同定を試みた。DNA microarray法による網羅的遺伝子発現解析の結果、延べ291遺伝子の有意な発現上昇が認められた。さらに、従来のヒト表皮基底層との比較解析により、HB-EGF、AREG、cyclin A1、IL-24およびPTGS2など細胞外ATPが誘導する新規遺伝子群を明らかにした。今回新たに見出した遺伝子群は、細胞増殖、免疫応答およびアレルギーに関与する因子として知られており、特に上皮成長因子(EGF)ファミリーに属するHB-EGF、AREGは表皮ケラチノサイトのオートクライン増殖因子として機能する一方、尋常性乾癬の病変部において高発現し、病態に深く関与していることが報告されている。さらには、EGF受容体のtransactivationによるサイトカイン産生が明らかになっており、EGFファミリーの炎症性疾患への寄与が分かっている。そこで次に、三次元モデルヒト表皮においてEGFファミリーが惹起する炎症性サイトカインの発現を予測し、尋常性乾癬の憎悪因子として近年注目を集めているIL-33の誘導に着目した。qRT-PCR法を用いてHB-EGF、AREGおよびIL-33の経時的なmRNAの発現解析を行った結果、HB-EGF、AREGともにATP刺激後、経時的に同一の変動を示し、有意な発現が認められた。一方、IL-33の発現はHB-EGFおよびAREGの発現が消失した後に誘導されることが判明した。これらの結果は、EGFファミリーによるIL-33の発現誘導を引き起こす可能性を示唆するものであり、細胞外ATPが誘導するHB-EGF、AREGおよびIL-33は、尋常性乾癬の発症・悪化メカニズム解明に有用な新規バイオマーカーになり得ると考えられる。平成28年度の研究計画の中で、DNA microarray法により三次元モデルヒト表皮において細胞外ATPが発現誘導する遺伝子群の網羅的解析結果と従来の表皮基底層のみの検討で得られた結果と比較解析したところ、新規に発現する遺伝子群を見出すことに成功した。これらの中には尋常性乾癬の発症および悪化に密接に関与する遺伝子が存在し、細胞外ATPが誘導する尋常性乾癬における新規バイオマーカーの探索と同定については予定通り行うことができたと考えている。加えて、今回の検討で見出されたEGFファミリーがセカンドメッセンジャーとして炎症性サイトカインIL-33の発現を惹起する可能性を示唆する結果も得ることができた。しかしながら、年度内にこれら同定された新規バイオマーカーのタンパク質レベルでの評価解析に着手することができず、年度をまたいで着手する形となる。今後の展開として、P2受容体またはEGF受容体を介したIL-33の発現に関する細胞内シグナル伝達機構の解析を進めることで、尋常性乾癬の発症および悪化メカニズムの解明において新たな知見を得ることができると考えている。前年度までに三次元モデルヒト表皮において細胞外ATP処理により尋常性乾癬や炎症性皮膚疾患に関与することが報告されているHB-EGF、AREG、PTGS2およびIL-33等の新規遺伝子群の発現が促進されることを明らかにした。本年度は、細胞外ATP処理三次元モデルヒト表皮から細胞質および核よりタンパク質を抽出し、主にwesternblot法にて各遺伝子群のタンパク質レベルでの発現について観察した。まず、その結果、ATP処理後2時間後においてHB-EGFおよびPTGS2の発現が促進されることが明らかとなった。一方、AREG、IL-33はヒト表皮において恒常的に発現しており、mRNAの発現は上昇しているもののタンパク質レベルでの差異を確認することはできなかった。また、EGFファミリーの産生が起こっていることから、EGF受容体を介した細胞内シグナル伝達経路の解析について更に検討を行った。EGF受容体を介したシグナル伝達は、Ras-ERK経路、JAK-STAT経路およびPI3K-Akt経路を活性化することが知られている。細胞外ATP処理三次元モデルヒト表皮において、活性化されるシグナル伝達経路を確認したところ、Ras-ERK経路およびPI3K-Akt経路で時間依存的な活性化を誘導した。また、JAK-STAT経路の活性化は認められなかった。以前、ヒト表皮の基底層のみをターゲットに細胞外ATPの機能解析を行った際には主にJAK-STAT経路の活性化を認めたことから、三次元モデルヒト表皮においては異なる経路を活性化することが明らかとなった。Ras-ERK経路およびPI3K-Akt経路の活性化は、主に細胞増殖の促進や細胞保護作用を有すことから、表皮に物理的・化学的刺激が加わった際に放出される細胞外ATPは、三次元モデルヒト表皮における初期のストレス応答として作用することが示唆された。

さらに、上記経路とPTGS2の発現経路の関係性について解析を行ったところPTGS2の経時的発現が認められた。本検討により、細胞外ATPが誘導するPTGS2の発現にはRas-ERK経路またはPI3K-Akt経路が関与している可能性が示唆された。細胞外ATPによりこれらの細胞内イベントが制御されているという本研究成果は、乾癬の病態形成や治療法を考える上で重要な知見であると考えられた。これまでの検討から、三次元モデルヒト表皮において細胞外ATPが誘導する尋常性乾癬の発症・悪化に関与する新規バイオマーカーとして、EGFファミリーおよびIL-33を提唱した。また、EGFファミリーによってIL-33の発現を誘導することが示唆されたものの、現段階では飽くまで現象を捉えたに過ぎず、これらの関連性の詳細は不明である。そこで、当初は尋常性乾癬病変部のDNA microarray解析と細胞外ATPの機能評価に関して検討を進めていくことを計画していたが、尋常性乾癬の発症・悪化に密接に関与するIL-33の発現機構の解明にフォーカスした尋常性乾癬における細胞外ATPの機能解析を加速する。すなわち、P2受容体、EGF受容体およびその下流シグナル伝達経路における各種阻害剤を用い、どの分子の関与が大きいのかを検討し、尋常性乾癬の治療を指向した細胞内シグナル伝達の解明を進める。また、三次元モデルヒト表皮において細胞外ATPが誘導する新規遺伝子群と尋常性乾癬の病態に影響を与える遺伝子の検索とその意義について引き続き検討を行う。医療薬学当初計画していたよりも円滑に実験を進めることができ、研究は概ね順調に進展しているが、細胞外ATPが誘導する尋常性乾癬の新規バイオマーカーのタンパク質レベルでの発現評価についての着手が年度をまたぐ形となり、次年度使用額に計上することとなった。昨年度得られた研究成果に対して細胞内シグナル伝達機構の解明等、分子生物学的手法による実験および解析に使用するとともに、最終年度の成果創出のための英文校正ならびに論文投稿費等に次年度使用額を充てる予定である。
自動調整に適した能動共振回路の開発

本研究ではモノリシックIC化および高周波動作を目標としたアナログ信号処理回路の開発を主目的とした.まず対象とする回路を多くのアナログ信号処理回路で必要とされる能動共振回路を中心にして行うものとした.対象とする能動共振回路の応用としては帯域通過特性を実現するフィルタ回路とし,モノリシックIC化および高周波動作の可能性について検討を行った.演算増幅器の周波数特性を積極的に利用して,演算増幅器2個とキャパシタ素子1個を用いて片側接地された受動LC並列共振回路と等しい入力アドミタンスを実現できる能動共振回路について検討した.検討はアナログ回路シミュレータとしてよく知られているPSpiceを用いた計算機シミュレーションによって行った.その結果,理想的には電圧制御電圧源で表される演算増幅器を用いることによって構成される能動共振回路は,理想的な場合には実現可能であるものの,実際の演算増幅器の持つ非理想特性の影響により回路が発振してしまうこと,さらには演算増幅器の非理想特性に対する感度に高く実際の回路を構成する上で大きな問題点を持つことが確認された.そこで本研究の主目的である,モノリシックIC化および高周波動作を目標としたアナログ信号処理回路の開発について,理想的には電圧制御電流源で表されるOTA(Operational Transconductance Amplifier)を用いたアナログフィルタ回路について検討を行った.直接型構成法の一回路構成法を検討することにより,任意の伝達関数を実現することができるOTAを用いたアナログフィルタ回路の実現性を示すことができた.さらにLCシミュレーション法に基づいた一構成法を示し従来型回路よりも非常に低素子感度となる回路構成法への可能性を示すことができた.今後はモノリシックIC化および高周波動作を目標としたアナログ信号処理回路の開発について,使用する能動素子としてOTAを対象にし,任意の伝達関数を実現することができる直接型構成法の開発を進める一方,より一層低素子感度となるLCシミュレーション法に基づいた回路構成法の開発を進める予定である.本研究ではモノリシックIC化および高周波動作を目標としたアナログ信号処理回路の開発を主目的とした.まず対象とする回路を多くのアナログ信号処理回路で必要とされる能動共振回路を中心にして行うものとした.対象とする能動共振回路の応用としては帯域通過特性を実現するフィルタ回路とし,モノリシックIC化および高周波動作の可能性について検討を行った.演算増幅器の周波数特性を積極的に利用して,演算増幅器2個とキャパシタ素子1個を用いて片側接地された受動LC並列共振回路と等しい入力アドミタンスを実現できる能動共振回路について検討した.検討はアナログ回路シミュレータとしてよく知られているPSpiceを用いた計算機シミュレーションによって行った.その結果,理想的には電圧制御電圧源で表される演算増幅器を用いることによって構成される能動共振回路は,理想的な場合には実現可能であるものの,実際の演算増幅器の持つ非理想特性の影響により回路が発振してしまうこと,さらには演算増幅器の非理想特性に対する感度に高く実際の回路を構成する上で大きな問題点を持つことが確認された.そこで本研究の主目的である,モノリシックIC化および高周波動作を目標としたアナログ信号処理回路の開発について,理想的には電圧制御電流源で表されるOTA(Operational Transconductance Amplifier)を用いたアナログフィルタ回路について検討を行った.直接型構成法の一回路構成法を検討することにより,任意の伝達関数を実現することができるOTAを用いたアナログフィルタ回路の実現性を示すことができた.さらにLCシミュレーション法に基づいた一構成法を示し従来型回路よりも非常に低素子感度となる回路構成法への可能性を示すことができた.今後はモノリシックIC化および高周波動作を目標としたアナログ信号処理回路の開発について,使用する能動素子としてOTAを対象にし,任意の伝達関数を実現することができる直接型構成法の開発を進める一方,より一層低素子感度となるLCシミュレーション法に基づいた回路構成法の開発を進める予定である.
市町村における成人歯科保健対策と禁煙支援の連携推進に関する研究

成人歯科保健事業と禁煙支援との関連状況を把握のために全国の自治体への調査を行った。第1回の回収率は77.4%であった。歯周疾患に関する保健事業と禁煙支援事業が約40%で同時に、歯周疾患検診時の禁煙教育・指導・支援は約30%で実施されていたが、どの事業も大規模な自治体の実施率が高かったが、歯周疾患検診時の禁煙教育は約40%であり、自治体の類型間であまり差が見られなかった。そこで、成人歯科保健事業と禁煙支援との関連状況をより詳細に把握するため、第2回目の全国の403自治体への調査用紙を送付し、回収率は68.0%であった。歯周疾患検診は政令市などで90%以上実施しているが、実施方法は人口規模が大きい自治体ほど委託型で、小さい自治体は直接実施の傾向がみられ、成人歯科健診でも同様の傾向であった。しかし、成人歯科保健指導では、直接実施が高い値を示した。成人歯科保健事業での禁煙関連の実施状況は、市では人口規模が小さいほど低くなる傾向がみられたが、町村では規模に関わりなくあまり差がなかった。一方、禁煙関連事業での歯周疾患教育等の実施は、市では人口規模が小さくなるに従って低下する傾向であり、町村では人口が小規模で高かった。歯科保健・禁煙関連連携の事業を人口3万以下の市では1市もしていなかった。歯科保健での喫煙状況の聴取は6割以上で実施され人口規模による差異はみられなかったが、喫煙状況別の歯科保健状態結果の集計は人口規模に伴い低下していた。健康日本21の地方計画に「喫煙が歯周疾患に影響を及ぼすこと」の記載状況では、政令市で約80%と最も高く、市では概ね人口規模に従い低下していたが、町村では人口規模の小さいほど記載が多く人口1万未満で約50%であった。また、専任の歯科保健職種がいなくても実施できるように、市区町村の現場にいる保健職種向けの「歯科保健指導と禁煙支援の連携マニュアル」を作成し、試行もした。本年度の研究は以下のように実施した。1.都道府県レベルで成人歯科保健における現状値および地方目標をある程度得ていたが,喫煙に関する現状値や目標値、あわせて,政令市に対しても,同様に,成人歯科および喫煙に対する現状値および目標地の収集を行った。2.禁煙支援については,市区町村での成人歯科保健事業との禁煙支援との関連や成人歯科保健状況に関する状況を全国的に把握するために、平成14年度の老人保健事業の実施状況などの厚生労働省の公表データを基に、成人に対して歯周疾患対策の事業(検診・保健教育・健康相談)を行っている市区町村と禁煙支援を行っている市区町村を調査した。その結果、600弱の市区町村で両事業は実施されていた。この数は当初の予定より高かったので、研究順序を変更し、これらの市区町村で双方の事業を連携させた型の事業の実施状況などについてのアンケート作成し、各市区町村へ郵便による調査を行った。その結果、アンケート回収率は約60%で、3割程度が連携型の事業を実施しているようであった。現在、この調査結果を、自治体類型別を基本とし,他の要因との関連を再度分析している。この中から、次年度の先進地域としての聞き取り調査を行う予定である。3.都道府県衛生主管部局および地区歯科医師会などの支援を受けながら,市区での歯周疾患罹患状況と現在歯数状況のデータの開示・提供を依頼した。さらに,喫煙状況のデータも可能な限り収集した。

成人保健目標や喫煙に関する保健目標のデータならびに成人歯科保健事業の実施状況についての資料を収集したが、個人情報保護法の施行前であり、予定より収集にて手間がかかった。そのため、データ採取地域の偏りがあったが、総数で約1000人の現在歯の状況・歯周疾患と喫煙状況のデータが、同一の規格で採取できた。現在、これらの関連性について、性・年齢以外にも地域集団ごとの特性も考慮して検討を加えている。本年度の研究は以下のように実施した。1.市区町村での成人歯科保健事業との禁煙支援との関連に関する状況を全国的に把握するために、平成14年度の老人保健事業の実施状況などの厚生労働省の公表データを基に、成人に対して歯周疾患対策の事業を行っている市区町村でかつ禁煙支援を行っている市区町村調査を先年度から引続き実施した。アンケート回収率は77%であった。調査結果より、歯周疾患に関する保健事業と禁煙支援事業が全体では40%程度が同時に行われているのではないかと推定された。また、自治体が大規模であるほど、禁煙と歯科保健を関連させた事業を行なっている傾向がみられ、保健所設置の市区では60%を超えていた。内訳では、歯周疾患検診時の禁煙教育・指導・支援が全体で約30%であったが、大規模な自治体では50%前後であり、比較的良く行われていることが伺われた。両事業が同時になされている自治体では、喫煙状況を76.2%が聞いているが、喫煙状況の集計結果をだして把握している自治体はわずか18.8%であった。歯周疾患検診時の禁煙教育の実施率は、全体で39.9%であったが、他の問と異なり、類型間であまり差が見られなかった。2.市区町村での成人歯科保健事業と禁煙推進の連携での問題点が、1.の分析により、いくつか見えてきたので、その対応を含め、専任の歯科保健職種がいなくても実施できるように、市区町村の現場にいる保健職種向けの「歯科保健指導と禁煙支援の連携マニュアル」を作成した。さらに、喫煙状況を問診のみに頼ることなく容易に把握できるように「呼気中CO濃度」の測定を応用することも、本マニュアルに記載した。このマニュアルを、数箇所の自治体で、試験的な応用を開始している。また、これとあわせて、喫煙状況などの採取したアンケート成績を容易に集約し、その後の市区町村での健康事業に応用できるようなシステム構築をも考案し、一部の自治体で開始した。本研究は、市区町村における禁煙支援を歯科領域から推進するための施策づくりの方法を探るとともに、推進支援用のマニュアルを作成することを目的としてきた。成人歯科保健と禁煙支援事業の実施状況について、前年度までの資料を分析し、さらなる市区町村へのアンケート調査を行った。調査の結果、歯周疾患検診も含めて、規模の大きな自治体ほど成人歯科保健事業の実施率が高い状況は従来と同様であったが、実施方法では規模の大きい自治体ほど委託型が多く、小規模の自治体では直接実施している傾向がみられた。しかし、歯科保健指導の実施は、ほぼ直接実施の傾向がみられた。また、すべての成人歯科保健事業で禁煙関連の実施をしている自治体は少ない。一部の事業で実施している自治体は、市では人口の規模が小さいほど低くなる傾向がみられたが、町村では規模に関わりなくあまり差がなかった。一方、禁煙関連事業での歯周疾患関連の教育等の実施状況は、市では人口規模が小さくなるに従って低下する傾向があった。町村では人口が小規模なところほど高かった。
筋性疼痛における各種神経栄養因子の関与と筋における産生・作用機構

筋に痛みを持つ人は多いが、その神経メカニズムは良くわかっていない。そこで運動後に遅れて現れる遅発性筋痛をモデルとして、神経成長因子やグリア細胞由来神経栄養因子が筋に痛みを起こす上でどんな役割を担っているかについて調べた。これらの因子は運動後に、運動した筋の筋細胞または筋衛星細胞で産生され、筋の痛み受容器の圧迫刺激に対する反応を強めることを明らかにした。両栄養因子は協同して、筋の圧迫に対してより敏感に痛みを感じるようにする(筋機械痛覚過敏)ことも明らかにした。本研究から、筋細胞・筋衛星細胞自身が痛みを強める物質を作っていることが明らかになり、筋の痛み発生における筋の重要性を示した。本研究は遅発性筋痛や神経損傷以外の様々な筋性疼痛モデルにおいて各種神経栄養因子がどのように関与しているか調べ、その筋性疼痛に関与している範囲を明確にし、またこれら神経栄養因子の痛み受容器に対する作用機構を明らかにする。さらにはこれら因子の筋における産生に関わる因子を明らかにすることを目的とする。(1)本年は新たな筋性疼痛のモデルの1つとして大腿動脈へのFeCl_2投与による虚血モデルの作成を試みた。虚血が不十分なためとおもわれるがまだ筋機械痛覚過敏を確認できていない。(2)神経栄養因子の作用機構について、取出し長指伸筋-総腓骨神経標本からの単一神経記録により調べた。グリア由来神経栄養因子(GDNF)は、神経成長因子(NGF)とは異なりC線維ではなくA-δ線維の機械感受性を増大させた。その時間経過はGDNFによる機械痛覚過敏とよくあっていた。(3)COX-2-GDNF経路に関わるEP2のノックアウトマウスに伸張性収縮を負荷し、負荷筋におけるCOX-2、NGF、GDNFのmRNAの発現を調べたところ、GDNFのみならず、COX-2,NGFいずれの発現増大も抑えられていた。(4)また、収縮形態のなかで伸張性収縮のみが遅発性筋痛を起こす理由を探る目的で、収縮形態によるATP遊離量の違いを検討するため、取出し長指伸筋を用いてATPの測定を行うための実験装置を作成し、測定を開始した。(5)遅発性筋痛におけるNGE,GDNF,COX-2の産生細胞をin situ hybridizationにより調べ、筋細胞が産生することを突き止めた。(6)神経損傷モデル(L5脊髄神経結紮モデル)において、その求心神経の大半が切断されたL5に由来する腓腹筋内側頭でも痛覚過敏が見られることから、他分節からの求心神経の再支配が生じている可能性について、筋からのFast blueの逆行性輸送を用いて目下検討中である。昨年度の研究で、単独では筋機械痛覚過敏を引き起こさない用量のNGFとGDNFを同時に筋注すると、強くかつ2日間も持続する筋機械痛覚過敏が生じることを明らかにしている。両神経栄養因子はそれぞれ別の求心神経群に作用していると考えられているので、両者が末梢で相互作用するメカニズムについて調べた。A)後根神経節(DRG)におけるpERKの発現を指標として、低用量のNGFとGDNFをそれぞれ投与した後に機械刺激をした場合と、両者を同時に投与した場合にpERKを発現するDRG細胞の髄節分布と神経細胞の大きさ、細胞群について調べた。NGFとGDNFの混合物を投与した場合に最も多くのpERK陽性細胞が見られたが、投与群による発現髄節、細胞の大きさに差は確認できなかった。B)NGFに対する受容体TrkAを発現する求心神経とGDNFに対する受容体RET, GFRαを発現する求心神経の間に、物質を介した相互作用がある可能性について、まず神経ペプチドの介在の可能性を検討した。サブスタンスP受容体の拮抗薬L-703,606とCGRPの拮抗薬CGRP8-37の筋注はいずれもNGF+GDNFの感作作用を抑制しなかった。また、末梢NMDA受容体の関与をDL-AP5を用いて調べたが、効果は認められなかった。さらに検討を進める必要がある。次に、NGFによる侵害受容器の感作メカニズムを明らかにするため、幼弱マウスから培養したDRG細胞から、機械感受性電流をパッチクランプ法により記録し、NGF投与30分以後の細胞とNGF投与しなかった細胞とで、反応する細胞の割合、反応パターンの割合を比較した。NGFの添加によって電流応答の大きさには変化が見られなかったが、機械刺激に応答しない細胞の割合が有意に低下し、遅順応型タイプの機械応答が増加した。これらの変化がNGFによる機械感作の元にあると考えられる。筋性疼痛のメカニズムの解明をめざし。