hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不揮発性イオン液体を推進剤としたレーザーアブレーションスラスタの研究

本研究では、推力可変式で推進剤の管理が容易な小型レーザー推進機の実験研究を実施した。推進機は液体や固体粉末にレーザーを照射する単純な構成であり、この推進機を搭載した振り子式推力スタンドを真空チャンバ内へ設置し、レーザーは真空チャンバ外から導入することで、インパルスが得られた。本推進機を宇宙機の精密姿勢制御に応用するためには、レーザー強度ならびに周波数を制御することで、広範囲かつ安定性の高い推力プロファイルを得る必要があり、今後の課題が明らかになった。繰返しパルスレーザー光をイオン液体(推進剤)に照射して推力を得る、1mNクラス小型レーザー推進機の実験実証を行う。本研究では、過去に研究されてきたレーザーアブレーションスラスタ(金属などの固体ターゲットに短時間大強度パルスレーザーを照射してジェットを生成するタイプ)の欠点である推進剤供給方式を抜本的に改善する試みとして、不揮発性のイオン液体を容器に装填した状態で暴露してレーザーを照射する、新しいタイプの推進機を目指す。もしもレーザー周波数の変化に応じて線形に変化する推力特性が得られれば、レーザー周波数を時間変化させることで高速な推力スロットリングが可能となるため、衛星の精密姿勢制御へ応用可能であろう。平成26年度は、小型レーザースラスタとレーザースラスタの推力測定に必要な推力測定スタンドの設計製作を行い、小型レーザースラスタの設計までを実施した。実験システムは、レーザー、イオン液体を装填した推進剤ターゲット(ポット)、推進剤ターゲットを搭載した振り子式推力測定スタンド、ならびに、振り子の変位を測定するレーザー変位計から構成される。ねじり振り子式推力測定スタンドは、直径60cmの真空チャンバ内に設置され、外来ノイズの影響を取り除いた精密な推力測定のため、真空チャンバを防振台の上へ設置して、真空チャンバ全体を防振したレーザースラスタ実験システムを構築した。また、コイルマグネット/静電アクチュエータによるスラストスタンド制御:微小推力測定用スタンドをフィードバック制御し、アクチュエータ制御量から推力を求めるための計測制御系を構築した。繰返しパルスレーザー光をイオン液体(推進剤)に照射して推力を得る、1mNクラス小型レーザー推進機の実証実験を行なった。本研究では、過去に研究されてきたレーザーアブレーションスラスタ(金属などの固体ターゲットに短時間大強度パルスレーザーを照射してジェットを生成するタイプ)の欠点である推進剤供給方式を抜本的に改善する試みとして、不揮発性のイオン液体を容器に充填した状態で暴露してレーザーを照射する、新しいタイプの推進機を目指している。実験システムは、レーザー、イオン液体を装填した推進剤ターゲット、推進剤ターゲットを搭載した推力測定スタンドから構成される。平成27年度は、小型レーザースラスタとレーザースラスタの推力計測に必要な推力測定スタンドを運用して、推力評価を実施した。推力特性は、レーザー周波数のみならず、レーザーパワ密度ならびに焦点距離に依存して変化することから、これら制御パラメータを適切に選択することで、可変推力のマイクロスラスタが構築可能であることが示唆された。また、推進剤ターゲット付近の計測から予想される推力発生メカニズムとしては、イオン液体へレーザーが照射された際の液体表面からの蒸発とアブレーションとの混在していると予想され、比推力を向上させるためには、液体表面からの蒸発よりも、アブレーションによるジェット生成を強調する必要があることが明らかになった。実験システムの整備が順調に進んでいるため。航空宇宙工学H26年度に構築した小型レーザースラスタ試験システムを用いて、小型レーザースラスタの推力特性の把握と、推力発生メカニズム解明へ向けた試験を実施する。H27年度の具体的な実施項目を以下にまとめる。1)推力特性の把握:ターゲット厚さ、焦点距離、レーザーパワおよび環境条件(真空度や推進剤温度)が推力に与える影響を評価する。推力特性は、レーザーパワ密度や推進剤までの焦点距離に強く依存することが予想されるため、これらの推力に与える影響について調査する。また、単位時間あたりの重量欠損も評価して、スラスタの比推力特性も調べる。2)コイルマグネット/静電アクチュエータを利用したスラストスタンドによる推力ノイズ測定:ある種のミッションでは、姿勢制御用スラスタの推力安定性が求められる。推力ノイズは、推力の時間履歴をFFT解析する事で得られるので、推力評価が順調に進むようならば測定を試みる。3)推力発生メカニズムの解明:レーザーを推進剤ターゲットに照射中に発生する原子放射を直接確認するなどの各種測定(粒子、プラズマ、温度等)を行い、これらの計測データを基に推力発生メカニズムを解明する。4)システム化検討:本提案によるレーザースラスタの実現可能性や、衛星姿勢の精密制御用スラスタとしての実現性をまとめる。スラスタの製作・試験はFY27の実施としたためスラスタの製作・試験費用として使用。
自律型無人潜水機への海中給電のための水中用無線電力伝送システムの研究

現在、AUV(Autonomous Underwater Vehicles)等の航走体が稼動している。AUVは機器に搭載しているバッテリーにより自律航行を行う。そのため稼働時間の制限があり、充電時に海上へ浮上しなければならない。そこで、海水中のAUVに非接触電力伝送による充電が考えられている。それにより、海上に浮上する必要なく海水中で充電できることや、稼働時間の延長等のメリットがある。海水中での非接触電力伝送には2つの考え方があり、海水中に直接コイルを設置する方法で実験を行った。しかし、この方法だとコイルを直接海水中に入れるため、海水の影響を直接受けてしまう。今年度は、海水による非接触電力伝送への影響を明らかにするという目的で研究を行った。まず、海水中で電力伝送実験を行った。電力伝送の実験結果より、損失解析を行った。解析結果より、近接効果の影響が考えられることがわかった。この近接効果の影響を明らかにするために近接効果の小さくなるようなコイルを作製し、インピーダンス測定を行った。作製したコイルは4つである。1つ目のコイルは導線間にピッチが無いため防水コイルを流用している。2つ目のコイルは導線間に導線1本分(1.6mm)のピッチがあり、3つ目と4つ目のコイルも同様に導線間に導線2本分、3本分とピッチを設けている。また全てのコイルのインダクタンスをピッチ0に統一している。そのため、ピッチが広がるごとに各コイルの巻数及びコイル幅は増大していく。それ以外のコイルの構成素材は統一している。これらのピッチコイルを用いて、インピーダンス測定を行った。海水中では、海水による近接効果の増加により交流抵抗が増加する。これにより、損失が増加し、電力効率が低下することが明らかとなった。この実験より、海水中でコイルの交流抵抗の測定値が増加する要因は海水による近接効果の増加であることが明らかとなった。海洋探査のための機器の開発が活発に行われている。しかし、AUV (Autonomous underwater vehicles)などの海洋探査機器は電池やケーブルによって給電されているため、稼働時間や作業範囲に制限がある。そこで、これらの機器にワイヤレス電力伝送技術を導入することで、充電の物理的な制約を取り除くことができ、さらに自由度が増すと思われる。たとえば、海面に浮上することなく水中で充電できることや、ケーブルレスによる作業範囲の拡大といった効果が得られる。しかし、空気中の無線電力伝送システムと同じシステムを水中にそのまま転用できるかどうかは明らかではない。周囲の水が電磁界の媒体となり、その影響を受ける可能性がある。平成26年度は海水中でワイヤレス電力伝送するための予備検討を行った。まずは磁界共振方式のアンテナを製作し、空気中において、ワイヤレス電力伝送にQ値が与える影響について検討した。次に耐水性のアンテナを作製し、空気中、純水中、水道水中、塩水中のアンテナの特性の比較を行った。伝送実験を行うことにより、基準となる空気中の回路特性を明らかにした。そして、アンテナの水中でのインピーダンスについて検討を行い、塩水中でのワイヤレス電力伝送実験を行なった。ワイヤレス電力伝送実験により、塩水中では電力効率は空気中よりも低下することが分かった。また、入力電圧一定の条件では、塩水中で入力電力が低下することも分かった。水中ではインピーダンスが変化すると考えられる。今後はこの結果についてさらなる検討を行なっていく。無線電力伝送用のアンテナを作製し、空気中、純水中、水道水中、塩水中のアンテナの特性の比較を行った。基本的検討を行うことができ、予定通り順調に進んでいる。海洋探査機器の中でも、AUV (Autonomous Underwater Vehicles)やROV (Remotely Operated Vehicle)は代表的である。AUVは機器内部へのバッテリの搭載によって自立して海中を航行し、ROVはケーブルで給電されている。これらの機器に無線電力伝送の技術を導入すると、電極部がコンタクトレスとなるため、充電の物理的な制約を取り除くことができる。その結果、機器の作業効率が向上する。しかし、空気中のContactless Power Transmission (CPT)システムを水中にそのまま転用できるかどうかは明らかではない。これは空気中と海水中の伝送性能の違いが明確ではないからである。これまでに塩水中CPTシステムの電力効率の悪化が報告されている。海水中で伝送する場合、周囲の海水が電磁界の媒体となり、その影響を受けるはずである。しかし現在、海水中での電力伝送の損失増加の原因は解明されていない。今年度は海水中で非接触給電を行うことを目的とし、海水中での効率低下の要因について検討した。無線電力伝送実験により、塩水中では電力効率は空気中よりも低下することが分かった。また、入力電圧一定の条件では塩水中で入力電力が低下することも分かった。すなわち、水中ではインピーダンスが変化すると考えられる。海水中では、誘電損失が増加し、それによっても伝送効率が低下する。そこで、塩水中には空気中での損失とは別の損失があると仮定し、純水の損失、塩の損失の考えを導入した。この仮定により、塩水中ではインピーダンスの変化だけで説明できない損失が存在することを示した。また、漏れキャパシタンスの概念を取り入れ、塩水中の伝送特性の悪化を考察した。塩水中での漏れキャパシタンスは大きく、無視できないことがわかった。

水中における無線電力伝送用のアンテナを製作し、空気中、純水中、水道水中、塩水中における損失解析を実験により行なっている。また本システムにおける制御用のデータ伝送に関しては、無線電力伝送で送信される電力を干渉波としてその特性を評価している。現在、AUV(Autonomous Underwater Vehicles)等の航走体が稼動している。AUVは機器に搭載しているバッテリーにより自律航行を行う。そのため稼働時間の制限があり、充電時に海上へ浮上しなければならない。そこで、海水中のAUVに非接触電力伝送による充電が考えられている。それにより、海上に浮上する必要なく海水中で充電できることや、稼働時間の延長等のメリットがある。海水中での非接触電力伝送には2つの考え方があり、海水中に直接コイルを設置する方法で実験を行った。しかし、この方法だとコイルを直接海水中に入れるため、海水の影響を直接受けてしまう。今年度は、海水による非接触電力伝送への影響を明らかにするという目的で研究を行った。まず、海水中で電力伝送実験を行った。電力伝送の実験結果より、損失解析を行った。解析結果より、近接効果の影響が考えられることがわかった。この近接効果の影響を明らかにするために近接効果の小さくなるようなコイルを作製し、インピーダンス測定を行った。作製したコイルは4つである。1つ目のコイルは導線間にピッチが無いため防水コイルを流用している。2つ目のコイルは導線間に導線1本分(1.6mm)のピッチがあり、3つ目と4つ目のコイルも同様に導線間に導線2本分、3本分とピッチを設けている。また全てのコイルのインダクタンスをピッチ0に統一している。そのため、ピッチが広がるごとに各コイルの巻数及びコイル幅は増大していく。それ以外のコイルの構成素材は統一している。これらのピッチコイルを用いて、インピーダンス測定を行った。海水中では、海水による近接効果の増加により交流抵抗が増加する。これにより、損失が増加し、電力効率が低下することが明らかとなった。この実験より、海水中でコイルの交流抵抗の測定値が増加する要因は海水による近接効果の増加であることが明らかとなった。これまでは海水中でワイヤレス電力伝送を行うことを目的とし、空気中を基準として、塩水が無線電力伝送システムの電力に与える影響を検討した。ワイヤレス電力伝送実験により、塩水中では電力効率は空気中よりも低下することが分かった。今後は、送信アンテナへの入力電圧を一定にした無線電力伝送実験が必要である。また、漏れキャパシタンスを通して、海水中に漏れ出たエネルギーの有無を考察し、海水中と空気中の伝送特性のちがいが明らかにしていく。これまでに塩水中での効率低下の要因について検討してきた。塩水中でのアンテナの交流抵抗は空気中よりも増加した。
分子多様性レチノイン酸合成酵素類の特性並びに生理的役割

レチノイン酸は、形態形成、細胞分化誘導、神経系形成並びに肢芽形成等リポアクチベターとして必須の化学物質です。このレチノイン酸を生合成する酵素系を我々は研究してきました。これまでの研究で、レチノイン酸合成酵素には、ミクロソーム局在のシトクロムP-4501A1(CYP1A1)モノオキシゲナーゼ系、細胞質にレチナール酸化酵素及びNADP^+-依存性脱水素酵素の3種類が少なくとも存在します。平成10年度は、これらの全塩基配列を決定しました。これにより、全アミノ酸残基の配列も決定しました。その結果、レチナール酸化酵素(EC1,2,3,11)とアルデヒド酸化酵素(EC1,2,3,1)は同一の酵素であることを証明しました。ウサギ肝臓のレチナール酸化酵素とマウス肝臓のレチナール酸化酵素のアミノ酸配列の相同性についても検討しました。その結果、相同性は高く、82%でした。レチナール酸化酵素は、分子量30万で、2量体の分子構造を持ち、MoとFeをキレートしたFADを補酵素とするフラビン酵素です。このような高分子で、しかも2種類の金属を持つ酵素の大腸菌中での発現はこれまでありませんでしたが、我々は、ウサギのレチナール酸化酵素を大腸菌で発現することに成功しました。レチノイン酸生合成酵素の1つであるNADP^+-依存性レチナール脱水素酵素の塩基配列も決定し、この大腸菌での発現並びに酵素活性や酵素化学的性質を検討中です。各種レチノイン酸合成酵素の動物の発達段階での発現状態についても検討中です。レチノイン酸合成酵素は多様性で、少なくとも3種類の酵素がレチナ-ルをレチノイン酸に酸化していることが我々の研究で分かった。酵素の局在もミクロソームと細胞質に局在している。ミクロソームに局在しているレチノイン酸合成酵素は、シトクロムP-450依存性モノオキシゲナーゼ系で、レチノイン酸のカルボキシル基の酸素が分子状酸素の添加で合成されている。一方、細胞質中でレチノイン酸を合成する酵素は、FADを補酵素とするフラビン酵素で、モリブデンと鉄の2種類の金属をキレートしている。この場合のレチノイン酸合成は、酸化酵素反応でH_2Oの酸素がレチノイン酸のカルボキシル基に添加され、レチノイン酸が生合成される。他の1つはNAD^+依存性のアルデヒド脱水素酵素によるレチナ-ルからのレチノイン酸の合成である。アルデヒド脱水素酵素には7種類のアイソザイム存在するが、レチナ-ル関与しているのはヒトではII型とかIII型とか去う報告もあるが、一般のアルコール(エタノール)代謝に関与するものと同じかどうか、レチノイン酸生合成を行うレチナ-ル特異的酵素の存在に関して、今後検討をする必要がある。特に、どんな化学構造のアルデヒドに作用するのか検討をする必要がある。レチナ-ルに基質特異性が強いアルデヒド脱水素酵素について組織内分布や成長過程における活性等を検討する必要がある。

ウサギ肝臓のレチナール酸化酵素とマウス肝臓のレチナール酸化酵素のアミノ酸配列の相同性についても検討しました。その結果、相同性は高く、82%でした。レチナール酸化酵素は、分子量30万で、2量体の分子構造を持ち、MoとFeをキレートしたFADを補酵素とするフラビン酵素です。このような高分子で、しかも2種類の金属を持つ酵素の大腸菌中での発現はこれまでありませんでしたが、我々は、ウサギのレチナール酸化酵素を大腸菌で発現することに成功しました。レチノイン酸生合成酵素の1つであるNADP^+-依存性レチナール脱水素酵素の塩基配列も決定し、この大腸菌での発現並びに酵素活性や酵素化学的性質を検討中です。各種レチノイン酸合成酵素の動物の発達段階での発現状態についても検討中です。
実践的教育を目的とした非接触形状欠陥検査実験教材の開発

1.研究概要本研究は生産現場を意識した画像検査ラインの一部を模擬的に再現し,欠陥検査をテーマとした画像処理を学習するための実践的な実験教材を開発し授業への応用について検討した.2.実験教材の構成と機能装置は,画像収録,ワーク(試料)搬送,検査用照明,良否判定表示で構成したものを制作した.ワークは20個程度用意し,模擬的な欠陥として,傷,欠け,打痕の3種類を自作した.欠陥検査プログラミング言語は,日本ナショナルインスツルメンツ社のLabVIEW及びそのアドインソフトウェアを用い,検討のためデモンストレーションプログラムを製作した.プログラムは, (1)ベルトコンベヤ上を移動するワークの位置検出, (2)ワーク画像の欠陥顕在化, (3)良否判定と表示,で構成される.動作テストでは移動するワークについてリアルタイムに処理が可能であり,欠陥検出時にPC画面上及び装置上の赤いLED表示で作業者に警告できることを確認した.3.研究成果従来の画像処理プログラミング演習は,一定条件における画像を使用していた.これに対して本実験教材は,ワークの移動速度設定,照明角度などの動的な条件も考慮が可能である.例えば,照明角の条件を変えると欠陥検出率に影響があり,今回の実験教材は最適照明条件を探す必要がある.しかし一定条件の画像のみを用いた演習では,現場での最適条件を検討することができない.このように本実験教材は実験・演習時における最適条件や実験仕様等を付加することで考察範囲を広げ,従来の演習を改善した.今後は,開発したデモンストレーションプログラムを基本として短い授業時間内でも消化できるよう整備する必要がある.さらに本実験教材で使用する画像処理手法の解説や照明条件の変更設定についても検討し,将来的にあらたな学習課題として提案していきたいと考えている.1.研究概要本研究は生産現場を意識した画像検査ラインの一部を模擬的に再現し,欠陥検査をテーマとした画像処理を学習するための実践的な実験教材を開発し授業への応用について検討した.2.実験教材の構成と機能装置は,画像収録,ワーク(試料)搬送,検査用照明,良否判定表示で構成したものを制作した.ワークは20個程度用意し,模擬的な欠陥として,傷,欠け,打痕の3種類を自作した.欠陥検査プログラミング言語は,日本ナショナルインスツルメンツ社のLabVIEW及びそのアドインソフトウェアを用い,検討のためデモンストレーションプログラムを製作した.プログラムは, (1)ベルトコンベヤ上を移動するワークの位置検出, (2)ワーク画像の欠陥顕在化, (3)良否判定と表示,で構成される.動作テストでは移動するワークについてリアルタイムに処理が可能であり,欠陥検出時にPC画面上及び装置上の赤いLED表示で作業者に警告できることを確認した.3.研究成果従来の画像処理プログラミング演習は,一定条件における画像を使用していた.これに対して本実験教材は,ワークの移動速度設定,照明角度などの動的な条件も考慮が可能である.例えば,照明角の条件を変えると欠陥検出率に影響があり,今回の実験教材は最適照明条件を探す必要がある.しかし一定条件の画像のみを用いた演習では,現場での最適条件を検討することができない.このように本実験教材は実験・演習時における最適条件や実験仕様等を付加することで考察範囲を広げ,従来の演習を改善した.今後は,開発したデモンストレーションプログラムを基本として短い授業時間内でも消化できるよう整備する必要がある.さらに本実験教材で使用する画像処理手法の解説や照明条件の変更設定についても検討し,将来的にあらたな学習課題として提案していきたいと考えている.
広域DEM画像判読による「アジアの詳細デジタル活断層図」作成と地震予測精度の改善

2018年度は5カ年計画の初年度にあたり、本格的な調査研究に備え下記の事項を実施した。1)活断層判読に必要なアジア全域の広域DEM(ALOS 30およびSRTM1など)をインターネット経由でダウンロードした。また、3D画像ソフトを用いてこれらのDEMからアナグリフ画像を作成した。研究代表者を中心に行ったこの作業には数ヶ月以上の時間を費やし、研究分担者および研究協力者に配布した。2)次いで研究集会を開催し、判読基準および作業手順の検討を研究分担者と研究協力者とともに行い、これを決定した。当初は、活断層判読およびマッピングの方法としてGISソフトにオープンソースの地図上に情報とアナグリフ画像を読み込み作業することを考えた。しかし、GISソフトに不慣れな者が少なくなかったために、より直感的で効率的な手法としてGoogle Earth上にアナグリフ画像を読み込みマッピングする方法を採用することとした。その際、アナグリフ画像を画像処理ソフトMap Tiler Pro (Klokan Technologies)を使って、kmlファイルに変換してGoogle Earthに重ねる画像処理作業を研究分担者が中心となって実施した。3)さらに、広域的な活断層の判読作業に先立ち、研究代表者と研究分担者がサンプル地域としてヒマラヤ南麓地域を選び活断層判読と結果のクロスチェックを行い、判読基準の統一と判読精度の同質化をはかった。また、研究分担者や研究協力者の既存研究地域や関心の有無をもとに、判読作業とクロスチェック作業の分担地域を決め、予察的判読作業に着手した。4)活断層の新たな分布が確認されたモンゴルの一部地域について、CORONA衛星画像を用いて詳細な活断層図を試作した。5)本研究で用いた広域活断層の判読手法や予察的判読で新たに得られた成果については、その都度、学会発表を行った。研究の基本的な材料となるALOS 30 DEMの準備、それを用いたアナグリフ画像の作成と配布が順調に進んでいるため。また、効率的な活断層判読とマッピング手法を考案し、一部の地域において試作図の作成を行ったことも初年度の研究計画として、順調な進捗状況と判断できるため。研究分担者および研究協力者に、それぞれの担当地域に対し、本格的に活断層判読を着実に実施するよう要請するとともに、研究集会などを通して意見交換を図り、統一基準のもとに活断層図の作成を進める。また、アジア地域において活断層調査を行っている主要研究者との連携も深めて行く予定である。
超音波スペクトロスコピーによる生体組織診断の基礎研究

本研究では、超音波スペクトロスコピーの手法により「生体を構成する組織や物質の粘弾性的性質を超音波特性の周波数依存性から解析し、生体組織や物質の構造や性質を明らかにする学問」の開拓を目指して生体組織診断法に関する基礎研究を行った。これまでの技術的な背景をもとに、生体超音波計測技術者と超音波医学者との共同研究を実現することによって、問題点の整理を行い、研究組織を発足させ、研究分担課題の整理を行った。具体的な研究成果を以下に示す。1.研究組織の編成研究内容を大きく4つに分け、総括班を加えて5つの班からなる組織を編成した。総括班:本研究の全体の総括と研究分担者間の研究の調製第1班:新素材・バイオ物質の超音波物性に関する研究・調査第2班:超音波顕微鏡による生体組織診断法の調査第3班:心筋及び動脈の硬化度の定量計測に関する研究・調査第4班:硬組織の弾性的性質の定量計測に関する研究・調査2.研究状況の調査各班の研究内容に関連した研究についての研究状況の調査を行った。3.「超音波スペクトロスコピーによる生体組織診断に関する研究会」の開催1996年10月及び1997年2月に、仙台においてこの表題の研究会を開催した。4.科学研究補助金「重点領域研究」の申請に関する打ち合わせ総括班のメンバーにより本研究を重点領域研究の研究領域へと発展させるための組織作り、研究分野の整理と班編成、研究規模、具体的な到達目標、将来の展望などの詳細について打ち合わせを行った。その結果、「重点領域研究」を効果的に進めるためには更なる詳細な研究調査を実施して、平成11年度の重点領域申請を目指すこととした。
富栄養化した湖沼に発生するアオコ毒素(ミクロシスチン)検出用キットの開発

世界的規模で富栄養化した湖沼が増加しており、それらの湖沼ではアオコとよばれる藍藻類の異常発生が観察され、これらアオコの多くから肝毒素ミクロシスチンが検出された。このミクロシスチンのヒトの健康への影響・被害が懸念されることから、本研究ではミクロシスチン検出法の開発を行った。1.抗体による検出法の開発ミクロシスチンはハプテンであることから、ミクロシスチンLRにキャリアーを化学的に結合し抗原を調製した。これら抗原をマウスに投与し、モノクロナール抗体産生細胞を分離した。これら細胞より調製したモノクロナール抗体は精製ミクロシスチンと反応し、抗体による検出法を開発した。2.イエバエによるバイオアッセイ法の開発精製ミクロシスチンおよびアオコ抽出液を用いて、経口法による殺虫試験法を開発した。経口法によるイエバエに対するミクロシスチンLRのLD_<50>は約0.4μg/cm^2-口紙であり、ハエを用いた毒性試験はマウスを用いた場合に比べ毒素量が少なくてすみ、有効な方法であることが示された。3.ミクロシスチン合成遺伝子による毒性検出法の開発ミクロシスチン生産菌であるM.aeruignosa K-139株ミクロシスチン合成遺伝子オペロン(約45kb)をクローン化し、塩基配列を決定した。この遺伝子より作製したプローブを用いたサザン解析および特徴的な領域のPCR増幅法による毒性アオコ検出法の開発および生産株の遺伝子発現制御系を明らかにした。1.モノクロナール抗体の調製ミクロシスチンはハプテンであることから、ミクロシスチンLRにBSAあるいはポリリジンを化学的に結合し抗原を調製した。これら抗原をマウスに投与し、定法に従い数個のモノクロナール抗体産生細胞を分離した。これら細胞より調製したモノクロナール抗体は精製ミクロシスチンと反応した。来年度はこれら抗体を用いて、試料調製法および測定法の検討を行う。2.イエバエによるバイオアッセイ法の検討精製ミクロシスチンおよびアオコ抽出液を用いて、経口法および経皮法による殺虫試験を試みた。経口法では致死が観察されたが、経皮法では致死は観察されず、毒素は経口的に摂取させることが必要であった。経口法によるイエバエに対するミクロシスチンLRのLD_<50>は約0.4μg/cm^2-ロ紙であり、ハエを用いた毒性試験はマウスを用いた場合に比べ毒素量が少なくてすみ、有効な方法であることが示された。来年度は本検出法の感度および精度の検定をショウジョウバエを用いたアッセイ法の検討を行う。3.遺伝子マーカーによる毒性検出方法の検討アオコ毒素検出への遺伝子工学的手法の応用について検討した。毒素生産菌でありM.aeruignosaに繰り返し配列が認められたことから、その繰り返し配列をプローブとしたゲノミックサザン解析による毒性株の同定を試みた。しかし、毒性株に共通するシグナルパターンは見出されなかった。そこでアオコ毒素遺伝子のクローニングを試み、合成遺伝子の一部と思われる断片のクローン化に成功した。来年度は毒素遺伝子を用いたPCR法による毒素検出法について検討する。1.毒素遺伝子のクローニング2種のミクロシスチン(7-desmethylmicrocystin-LR、3,7-didesmethylmicrocystin-LR)を生産するMicrocystis aeruginosa K-139株よりペプチド合成酵素遺伝子をクローン化した。そのひとつは5つのアミノ酸活性化ドメインを含む約19kbの遺伝子で、3つの翻訳単位から構成されている。本遺伝子は1つのD型アミノ酸、1つのメチル化アミノ酸および3つのL型アミノ酸活性化ドメインを有していた。またこの遺伝子から作製したプライマーを用いて毒性株ゲノムDNAを鋳型にPCR増幅を試みたところ、90%以上の相同性を持った遺伝子がいずれの毒性株からも検出された。更にこの遺伝子を破壊したところ、2種のミクロシスチンを生産するK-139株のミクロシスチン生産能は消失した。このことは本遺伝子がミクロシスチン合成酵素遺伝子であることを示している。

ミクロシスチンは7つのアミノ酸から構成されることから、残りの2つのアミノ酸を活性化するための遺伝子のクローン化をすすめている。このクローン化の過程で毒素と異なるペプチド合成酵素遺伝子がクローン化された。現在これらの知見をもとに、毒性株検出のための遺伝子プローブを開発中である。2.抗体によるアッセイ法の開発数種のモノクローナル抗体を取得し、様々の毒素試料を調製し、検出感度を検討した。しかし分離した抗体の毒素との反応性あるいは感度が必ずしも良いとはいえないことから、更に感度の良いモノクローナル抗体の作製を試みている。昨年度ミクロシスチン毒素はリボゾーム非依存的に、multienzyme complexにより合成される事を明らかにし、毒素遺伝子のクローン化に成功した。本年度はミクロシスチン合成遺伝子を特異的に検出するためのPCR法およびプローブ法をキット化するため、全遺伝子のクローン化を行った。これまでに約45kbをシークエンスした結果、ミクロシスチン合成遺伝子群を構成する6個のオープンリーディングフレーム(ORF)を見出し、さらに少なくとも1つ以上のORFの存在が予想された。遺伝子構成は同方向に転写される3つのORFは5つのアミノ酸活性化ドメインを有する。プライマー伸長法によりこの遺伝子は3つの転写開始点を有し、光応答性に発現することが示された。さらに逆方向に転写される3つのORFが見出された。最初のORFはポリケチド合成遺伝子、2番目はポリケチド合成遺伝子とペプチド合成酵素遺伝子モチーフを有するORF、3番目のORFはラセマーゼ遺伝子であった。この様な特徴的な遺伝子構成はミクロシスチンで初めて見出された。このポリケチド遺伝子がミクロシスチン合成遺伝子であることは遺伝子破壊実験により確かめられた。本遺伝子の特徴的な塩基配列領域のPCR増幅および各ORF由来のDNA断片によるハイブリ実験を行った結果、ミクロシスチン生産株間ではPCR増幅した塩基配列の保存性は95%以上であり、また全てのORF由来の断片がゲノムDNAにハイブリダイズした。さらにミクロシスチン非生産株は二つのグループに分けられた。一つのグループはミクロシスチン合成遺伝子オペロンを全くもたない。もう一つのグループはPCR増幅及びハイブリダイズ実験からミクロシスチン合成遺伝子を有するグループである。本結果から富栄養化した湖沼に発生する僅かなアオコからも遺伝子的にミクロシスチン生産を予測することが可能である事が示された。
日本における屋外体感温熱指標の検証と分布図の開発

本研究では都市域における体感温熱環境の面的な評価を目的として、河川沿いや街路樹下を含めた街区において夏季に気象観測を行った。その結果は以下のようになる。(1)都市域内外における暑熱環境の地域差を検討した結果、不快指数などある種の体感温熱指標は、日中でも中心と郊外とで差が見られず、一様な分布を示した。また夜間から明け方にかけての一部の時間帯では、郊外の方が都心より高い値であった。(2)街路樹や河川の傍の日なたでは、午前中や夜間では不快指数などでみると高い値がみられ必ずしも暑熱回避に有効とはいえないことが考察された。一部の時間帯では高層ビル傍での計算値より高い値がみらみられた。(3) (1)、(2)の要因として、それらの環境下では、相対的に気温が低くても湿度が高いため、計算上は都心のビル街と近い値が算出されるためであると考えられる。(4)ビルの日かげでは河川沿いと近い値がみられ、建物による日射遮蔽の影響が考察された。しかし夕方から夜にかけて比較的高い値が見られ、建物からの排熱や交通量の影響と推察された。近年都市空間では、高温化により快適性が損なわれ、熱中症患者も増加している。この対策として屋上緑化など技術だけでなく、予防や適応の策が考えられる。都市の熱環境改善を施策とするには、気候環境の面的な研究成果(地図)が重要である。ドイツの諸都市では、その研究成果を都市計画や大気汚染対策に活用するために、クリマアトラスという環境主題図の作成が行われている。その一つとして体感温熱環境の分布図が有効だと考えられる。そこで本研究ではその開発を目的として、埼玉県熊谷市などで都市域における気象観測を埼玉県熊谷市にて行った。調査方法は気温、湿度、放射、風向・風速等の気象要素の定点観測、および徒歩による移動観測である。主に日中の気温が高い時間帯で実施した。その結果から各気象要素の分布図を作成した。この成果にもとづき、体感温熱環境の評価と分布図の作成を試みた。しかし、夏季に台風や雨天など悪天候が続き気象観測を予定通りに実施できなかったため、本研究で必要とされる晴天日における気象観測データを十分に取得できず、屋外における体感温熱指標については評価が不十分であるそのため数値シミュレーションなどの解析により補完方法を検討中である。近年都市空間では、高温化により快適性が損なわれ、熱中症発生や熱帯夜の増加が顕在化している。この対策(暑熱環境への防御や適応)は喫緊の課題といえる。また都市の熱環境改善を施策とするには、気候環境の面的な研究成果(地図)が重要である。ドイツの諸都市では、気候環境の評価を都市計画や大気汚染対策に活用するために、クリマアトラスという環境主題図の作成が行われている。そこで本研究では熱環境に配慮したまちづくりを目ざし、都市域における体感的な気候環境評価を目的として、典型的な夏季の晴天日において、埼玉県熊谷市などで周辺の建物や土地利用が異なる条件下で気象観測を行った。調査項目は気温、湿度、放射、風向・風速等の気象要素で定点観測、および徒歩、自動車を用いた移動観測により計測された。この成果にもとづき、屋外における体感温熱指標については、異なる街区における体感温熱環境の評価を行なった。その街路樹下の日陰で最も体感温度が低い値であった。一方、河川付近の街区では、低層の建物が多いため、比較的オープンスペースとなっており、高い値であった。また高層建築物の日陰でも総体的に低い値がみられ、その要因として建物による日射遮蔽の影響等が推察された。
拡大教科書選定のための評価システムの開発 --発達段階を考慮した生態学的アプローチ--

拡大教科書を選定するための評価方法は確立されておらず、適切な教科書の選択がなされていない。そこで、拡大教科書を利用する際の諸条件が読書の効率に及ぼす影響を明らかにした上で、拡大教科書選定支援のための検査バッテリーを試作した。また、試作した検査バッテリーの有効性を検討するために、試用調査を実施した。さらに、本検査バッテリーを非専門家が簡便に利用できるようにするためのマニュアルを作成し、拡大教科書を利用している弱視児童生徒の担任教員に配布した。本研究の目的は、視覚に障害のある児童生徒に適した拡大教科書を選定するための検査バッテリーと普及・啓発を促進するための教材と研修プログラムを開発することである。児童生徒の視機能や他の障害の有無だけでなく、学習環境、発達段階、補助具等の操作能力等を評価するための検査バッテリー、拡大教科書の選定支援をするためのエキスパートシステム、特別支援学校等に本システムを普及させるための教材・研修プログラムを開発し、必要な児童生徒に適切な拡大教科書が無駄なく、安定して給与されることを目指している。本年度は、まず、様々な学校現場での教科書の活用場面に関して調査を実施した。弱視児童生徒が在籍している盲学校、弱視特別支援学級、弱視通級指導教室において、拡大教科書がどのように活用されているかを郵送方式のアンケート及び訪問によるヒアリングで調査した。盲学校高等部の調査では約7割の生徒が拡大教科書を利用していることがわかった。また、通常学級調査には636名、弱視特別支援学級調査には138名、弱視通級指導教室には97名の弱視児童生徒が拡大教科書を利用していることがわかった。次に、どのような拡大教科書がどのような方法で作成されているかを教科書発行者とボランティアを対象に調査した。教科書発行者では18、22、26ポイントのレイアウト変更方式(小中学校)と14ポイント程度の単純拡大方式(高等学校)を、ボランティアは個別対応のプライベートサービス方式を中心に作成していることがわかった。また、フォントにはゴシック体を使っているケースが多いことがわかった。現在、拡大教科書を選定するための科学的評価法は確立されていないため、給与された拡大教科書が有効に活用されていなかったり、必要な教科書を入手することができなかったりしている可能性が高いが、その実態は明らかにされていない。そこで、著者らは、昨年度、拡大教科書を必要としている児童生徒が多いと考えられる視覚障害特別支援学校や弱視特別支援学級の教員を対象に、拡大教科書の選定に関する実態調査を行った。本年度は、拡大教科書の普及・啓発において重要な役割を果たしていると考えられる教科書センター884箇所を対象に選定支援の実態を調査した(有効回答数426件[48.2%])。その結果、拡大教科書の選定支援はほとんど行われていないことがわかった。しかし、評価キットがあれば、利用したいというセンターが8割を越えていたため、200箇所に試作した評価キットを送付し、試用していただいた。その結果、83.4%のセンターから「有効だと思う」という回答が得られた。次に、文字サイズや照明等の視環境を変化させたときに、弱視児童生徒が教科書との視距離等をどのように変化させるかを非拘束の条件で評価するために、3次元磁気センサーを用いた評価ソフトウェアを試作した。また、文字を用いて有効視野を測定するために開発した文字処理有効視野評価システムが、最新のPCでも動作するように、改良を行った。さらに、現在、読書評価に最も利用されているMNREAD-Jや小学生用に改良されたMNREAD-FUEに用いられている文章の難易度が均一であるかどうかを検討する実験を実施した。加えて、評価システムに最新のタブレット型携帯端末が利用できるかどうかを検討するために、研究協力校の視覚障害特別支援学校でiPad2を学習へ導入する試みを行った。本研究の達成目標は、視覚に障害のある児童生徒に適した拡大教科書を選定するための検査バッテリーと普及・啓発を促進するための教材と研修プログラムを開発することであった。最終年度である本年度は、拡大教科書を選定するための検査バッテリー「拡大教科書選定支援キット」の試作し、関係団体(80団体)で試用実験を実施した。また、研究協力機関(19機関)に依頼し、本キットをノービス(初学者)が利用する際の問題点等について事例収集を行った。事例研究の結果に基づき、通常学級の教員が簡便に利用できる「簡易版拡大教科書選定支援キット」を試作した。そして、その有効性を確認するために、全国の盲学校(70校)と都道府県教育委員会(52)の122機関に配布した結果、68機関から有効回答(55.7%)があり、60機関(88.2%)から役立つという回答を得た。また、本キットの活用に関して希望のあった学校等に訪問し、OJTを行った。3年間の研究成果を普及・啓発するために、「簡易版拡大教科書選定支援キット」を拡大

教科書を利用している小中学生の担当教員1,194人(通常学級570人、弱視学級187人、弱視学級以外の特別支援学級205人、盲学校212人、その他20人)に配布すると同時にホームページでも公開した(http://web.econ.keio.ac.jp/staff/nakanoy/research/largeprint/03_kaken/2012/index.html)。また、3年間に実施した3回の公開シンポジウム、3回の学会シンポジウム、10種類の調査研究、12種類の実験研究、弱視児童生徒の障害特性と読書行動の関係を検討するために開発した4つのアプリケーションソフトウェア、調査の過程で収集した2種類の各種情報もホームページで公開した。本研究では、拡大教科書の選定を支援するための生態学的妥当性の高い評価システムを開発することを目的にしている。これまで、拡大教科書の選定実態の調査に基づき、評価システムのパーツとして、評価キット、自由視条件での視距離評価ソフトウェア、文字処理有効視野評価システムの改良、読書評価ツールの検討等が試作できている。眼球運動を評価するためのシステムは、ハードウェアの制約により、中心暗点のある弱視生徒や極めて視力が低い場合等には適応できないことが明らかになったため、来年度の検討課題とせざるを得なくなったが、その代わりに、タブレット型携帯端末が評価に利用できる可能性を検討することができた。したがって、本研究は、おおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。上述した通り、本研究は、おおむね当初の予定通り進展している。当初予定していながら、実現できていない眼球運動を評価するためのシステムを構築するために、来年度、大学で新しい眼球運動測定装置を購入する予定である。来年度は、今年度、試作したパーツを組み合わせ、学習環境、発達段階、補助具等の操作能力等を評価するための検査バッテリー、拡大教科書の選定支援をするためのエキスパートシステム、特別支援学校等に本システムを普及させるための教材・研修プログラムを開発する計画である。
進化古生物学及び環境マーカーとしての実験動物-海生介形虫飼育技術の開発-

海生介形虫類を常に実験動物として供給できるよう,2つのシステムを立ち上げた。すなわち自然状態に近い環境をつくって複数種を同時に飼育するシステム(Mother Cultureシステム)と特定種をインキュペーター内で単離飼育するシステム(Mono Cutureシステム)である。Mother Cultureシステムでは,岩礁地における環境を再現し,微空間における介形虫類のmicrohabitatについて観察することができた。その結果,これまで「岩礁地に生育する石灰藻を住処とする」と一括されてきた介形虫類の中には種ごとに細かく棲み分けていることが明らかになった。すなわち,葉上に棲むもの,仮根部分の堆積物表面に生息するもの,さらに堆積物中に潜って生息するものの3パターンが認められた。但し,このシステムでは,個体数が減少する傾向が見られ,常に野外の生育地から個体を加入させる必要がある。これは,生育する海藻が減少していくことと関連がありそうである。本システムで個体数の経時的減少を防ぐには,海藻が常に繁茂できるよう,紫外線や循環する海水量を豊富にする必要があると思われる。Mono Cultureシステムでは,Xestoleberls hanaiiの背甲として実験が進められた決果,Sr/Caはほとんど水温に依存しないのに対し,Mg/Caは水温に依存的で,特に個体発生の段階を経て観察した結果,Mgは,背甲の有機物中に含まれ,背甲生成の重要な元素であることが確かめられた。このシステムでは,飼育している水を取り替える際,水だけでなく容器ごと交換することによって,バクテリアの繁殖が抑えられること,また餌は少量のデトリタスで,ほとんどの介形虫を維持できることがわかった。介形虫の複数種を含む飼育システム(Mother Cultuerシステム)と、単独の特定種を隔離飼育システム(Mono Cultuerシステム)に関して以下のことを行った。通常のガラス水槽(20×33×23cm)を用い、貝形虫が棲息する浅海砂泥底の環境を再現した。飼育水槽の水温に関しては、飼育水槽ごと一回り大きな別の水槽に入れ二重水槽形式にして、2水槽間の水を低温循環水槽とつないで循環させ、その水温をコントロールすることによって設定・管理した。また、水質は底面濾過と外部浄化システムによって管理された。その結果、複数種の介形虫の継続飼育(6ヶ月以上)に成功した。さらに同装置を用いて、これまで飼育が非常に困難であるとされた遊泳性介形虫Vargula hilgendorfiiの継続飼育にも成功した。現在、岩礁域の環境を再現するシステムを製作中である。インキュベーター内で、特定種の隔離飼育を行い、それらの継続飼育に成功した。当初に計画した自動で海水の循環・浄化を行う装置はまだ完成していないが、継続して製作を行っている。また、特定種(Xestoleberis hanaii)の飼育個体を用いて、各種環境条件における形態学的・化学的な反応に関するデータが出始めた。特に、石灰質の背甲に取り込まれる微量元素(Mg、Sr)に関しては水温との明らかな相関が捉えられた。海生介形虫類の複数種を含む飼育システム(Mother Cultureシステム)と,単独の特定種を隔離飼育するシステム(Mono Cultureシステム)に関して,昨年度行った実験を改良し,今年度は以下のような実験を行った。通常のガラス水槽(20x33x23cm)中で,介形虫が棲息する浅海砂泥底の環境を再現し,飼育実験を行った。水温は一回り大きな別の水槽に飼育水槽を入れ,二重水槽形式とし,二水槽間の水を低温循環水槽とつないで水温をコントロールした。また,水質は底面濾過と外部浄化システムによって管理された。その結果,複数種の介形虫の継続飼育(6ヶ月以上)に成功した。

さらに同装置を用いて,これまで飼育が非常に困難であるとされた遊泳性介形虫Vargula hilgendorfiiの継続飼育にも成功した。現在,岩礁域の環境を再現するシステムを製作,実験中である。インキュベーター内で,特定種の隔離飼育を行い,それらの継続飼育を行っている。当初計画した自動海水循環・浄化装置についてはまだ完成していないが,継続して作業・実験を進めている。また,特定種(Xestoleberis hanaii,Robustaulira spp.など)の飼育個体を用いて,各種環境条件における形態学的・化学的な反応に関するデータが出始めた。特に,石灰質の背甲に取り込まれる微量元素(Mg,Sr)に関しては,水温(15°,18°,21°,24°,28°Cの5段階)と塩濃度(34‰)において,幼体から成体に至る各ステージの殻の元素の取り込みについて調べられた。海生介形虫類を常に実験動物として供給できるよう、2つのシステムを立ち上げた。自然状態に近い環境をつくって複数種を同時に飼育するシステム(Mother Cultureシステム)と特定種をインキュベーター内で単離飼育するシステムを立ち上げた。Mother Cultureシステムでは、岩礁地における環境を再現し、微空間における介形虫類のmicrohabitatについて観察することができた。その結果、これまで「岩礁地に生育する石灰藻を住処とする」と一括されてきた介形虫類にも、微小空間を利用して種ごとに細かく棲み分けていることが明らかになった。すなわち、葉上に棲むもの、仮根部分の堆積物表面に生息するもの、さらに堆積物中に潜って生息するものの3パターンが認められた。但し、このシステムでは、経時的にどの分類群でも個体数が減少する傾向が見られ、常に野外の生育地から個体を加入させる必要がある。これは、生育する海藻が減少していくことと関連がありそうである。筑波大学下田臨海実験センターの屋外には、1ユニットが3m×4mの3連水槽が置かれているが、ここでは岩礁地と同じように、年間を通して海藻が繁茂し、季節的な個体数の増減が確認できた。本システムで個体数の経時的減少を防ぐには、海藻が常に繁茂できるよう、紫外線や循環する海水量を豊富にする必要があると思われる。Mono Cultureシステムでは、Xestoleberis hanaiiの背甲を素材として実験が進められた結果、Sr/Caはほとんど水温に依存しないのに対し、Mg/Caは水温に依存的で、特に個体発生の段階を経て観察した結果、Mgは、背甲の有機物中に含まれ、背甲生成の重要な元素であることが確かめられた。このシステムでは、飼育している水を取り替える際、水だけでなく容器ごと交換することによって、バクテリアの繁殖が抑えられること、また餌は少量のデトリタスで、ほとんどの介形虫を維持できることがわかった。
細胞内薬物濃度解析に基づく腎癌に対する分子標的薬の効果及び副作用の予測法の確立

【背景】転移性腎細胞癌に対する第一選択薬であるスニチニブは、用量制限毒性となる重篤な有害事象の発現頻度が高く、投与量の減量もしくは治療の中断に至る症例が多く存在する。一般には血中薬物濃度解析に基づく投与量設計が副作用を回避し、十分な臨床効果を得るために有用な手法であるとされているが、スニチニブにおいてはその血中濃度が甲状腺機能低下症の発現率のみと相関し、発現頻度の高い副作用である血小板減少症や手足症候群とは相関しないことが報告されている。さらに、日本人と欧米人に同量のスニチニブを投与した際の血中薬物濃度は両者で同程度であるが、奏功率および重篤な有害事象の発現率は共に日本人で高値となっている。このことから、スニチニブの作用発現部位である細胞内濃度が日本人で高く、そのため日本人において効果・副作用ともに強く現れている可能性があると考えられる。しかし、細胞内薬物濃度に影響するトランスポーターの遺伝子多型とスニチニブの効果もしくは副作用発現との関係について複数の研究結果が報告されているものの、それらの関係は未だ十分に解明されていない。これは、スニチニブおよびその活性代謝物の細胞内濃度には非常に多くの因子が複雑に関与しており、トランスポーターの遺伝子型のみでは細胞内薬物動態を十分に評価しきれていないことが、大きな要因の一つと考えられる。【目的】スニチニブの細胞内濃度を解析し、スニチニブの副作用や効果に対する細胞内薬物濃度の影響を直接的に評価するとともに、細胞内濃度に影響を与える因子の検討を併せて行うことで、細胞内濃度に基づいた効果および副作用の予測法を確立する。【方法】1血液中および細胞内薬物濃度度測定のために、LC-MSによる高感度測定法を確立する。2スニチニブ内服患者から血液検体を採取し、血清および細胞内濃度の指標として用いられる細胞のうち、一般臨床にて採取可能な末梢血単核球(PBMC)中のスニチニブおよびその活性代謝物濃度を測定し、臨床効果や副作用発現状況等との関係性および個人差を評価する。3スニチニブの細胞内濃度に関する変動要因を詳細に検討するため、健常人由来PBMCやヒト腎癌由来細胞株を用いたスニチニブの曝露実験を行い、腎癌細胞中薬物濃度推移とPBMC中薬物濃度推移の解離について検討し、その要因を評価する。【成果】血液中および細胞内薬物濃度度測定のためのLC-MSによる高感度測定法を確立させた。患者検体の測定の実施に向けて、本学臨床試験倫理審査委員会の承認を受けるための申請準備を行っている。今後、測定結果解析が終了し次第、論文もしくは学会発表にて研究成果を公表する。
神経筋接合部を標的にした末梢神経再生

Thy1-YFP Tgマウス腓骨神経切断モデルで運動神経の再生過程を可視化した。神経切断後の前脛骨筋内では数日内にYFP陽性神経線維が消失し、2週以降にシュワン細胞が消失した。一方、神経筋接合部(NMJ)は、切断6週目でも残存していた。よって神経切断から再建までの期間を4週(4週群)と6週(6週群)に設定し、経時的に10週間観察した。その結果、4週群のほうが、運動機能の回復が良好であった。組織学的解析では、4週群のほうが6週群よりも約3倍のNMJが観察できた。本研究成果から神経切断4週と6週間でNMJ変性に関連した分子機序の違いが推察され、同分子の解明によって神経再生の促進が見込まれた。本研究計画では、末梢神経損傷モデルを使用し、神経筋接合部(NMJ)の変性保護に注目し、神経損傷における神経再生ならびに拘縮予防の新規治療法の開発を目指すものである。今年度は、腓骨神経切断モデルの作製と切断後の前脛骨筋内NMJの評価および運動機能の変化を解析した。野生型マウスを用いて腓骨神経を露出させ分岐部で切断するモデルである。神経切断後は、前脛骨筋萎縮が経時的に進行していく。切断後、1週、2週、3週と経時的に運動機能を解析し、前脛骨筋を組織学的に評価した。運動機能テストには、ポータブルビデオで撮影した足底の荷重面、足趾の開きを計測してperoneal functional index (PFI)を算出した。さらに両足圧力差痛覚測定機器を用いて切断側の荷重を測定した。その結果、PFIは切断後低下したままで運動機能の回復はなかった。一方、後肢荷重は切断後2週で低下し、3週で回復傾向にあった。神経線維(NF)とNMJをラベルするボツリヌス毒素(BTX)を用いた免疫組織学解析では、切断2週でBTX陽性数が一時的に増加していた。NFとBTX共陽性のNMJ数は、切断1週、2週で共陽性が観察されなかったのに対し、3週時のNMJでは一部観察された。また、ミエリンを形成するシュワン細胞のマーカーであるS100で免疫染色すると切断1、2週では染色性の低下が見られたが、3週ではやや増加していた。このことから切断3週後に観察された部分的な後肢荷重が、痛みの軽減効果だけでなく前脛骨筋の神経筋接合部での神経再支配が原因である可能性が示唆された。今後は、損傷3週以降のマウスを用いてNMJの再神経支配に注目して同様に解析を進め、分子生物学的に萎縮筋に発現する神経栄養因子やサイトカインの定量を行っていく予定である。昨年度の結果から組織学的に神経線維(NF)の変性が腓骨神経切断1週間で出現することと3週経過してもNMJをラベルするボツリヌス毒素(BTX)陽性数が維持されていたことが明らかとなった。今年度は、昨年同様に腓骨神経切断モデルの作製と切断後の前脛骨筋(TA)内NMJの評価および運動機能の変化を超短期(損傷1日、3日)と長期(28日、42日)に観察して解析した。昨年同様、シュワン細胞のマーカーであるS100でも免疫染色を行い、BTX陽性と近接するNFおよびS100陽性数を定量した。BTX陽性数は、正常側と損傷側で比較すると損傷42日目まで陽性数が維持されていた。一方、NF数は、損傷1日目から減少し、3日以降、陽性数の観察はできなかった。しかし42日目ではわずかに陽性線維がBTX陽性部近傍で確認できたことから切断断端からの再生が得られたものと推測された。S100は、損傷1週で観察されたものの2週以降はBTXと近接する部位が観察されなくなり比較的早期に陽性細胞が消失していくことが明らかとなった。NFの変性に注目してThy1-YFPトランスジェニックマウスを利用した。同マウス腓骨神経切断直後に各断端を1針で縫合する神経再建モデルを作製した。縫合3日後のTAを観察するとYFP陽性線維が観察されNMJと近接する線維も確認できた。可及的であっても神経断端同志の接合が神経変性を予防するために必要であることを示唆する所見であった。一方、神経筋接合部は神経切断後も長期に残存しており神経損傷後慢性期であっても神経再建による軸索再生で運動機能の獲得が見込まれた。今年度、腓骨神経切断後の神経線維とシュワン細胞、神経筋接合部の変性経過を経時的に明らかにすることができた。また、数個の個体であるがYFPマウスを用いた神経再建実験が実施でき、神経変性が早期に出現することと神経断端の接着が重要であることが組織学的に明らかとなった。また、腓骨神経切断から6週が経過しても標的筋の神経筋接合部が残存していたことから、筋萎縮が強くても神経再建方法を工夫すれば運動機能獲得が得られる可能性が明らかとなった。よって当初の計画通り損傷慢性期において切断端に他のマウスから採取した遊離腓骨神経を用いて架橋縫合を行う。