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下顎頭軟骨の骨化機構に関する発生学的、免疫組織化学、超微細構造学的研究

下顎頭軟骨における軟骨内骨化の本態を解明する目的で、以下の研究を行なった。1.ラット下顎頭軟骨基質における基質線維の微細構造の観察では、線維層にはtype1 collagenの線維束が認められた。肥大細胞層では、横紋構造の不明瞭な線維束はnetwork状を示している。さらに肥大軟骨細胞周囲には主にtype 1 collagenからなるintralacunar fiberが形成されていることが、明かとなった。2.未脱灰の超薄切片による透過電顕を用いた、原子配列レベルでの結晶の超微細構造の観察において、下顎骨の線維内および線維間の結晶はハイドロキシアパタイトの結晶格子と同一の結晶格子像を示していることが観察された。3.下顎頭軟骨を抗原としたmonoclonal抗体の作製および免疫組織学的観察において、作製した下顎頭の軟骨細胞と反応するモノクロナール抗体は、グルコース糖鎖の一部を認識し、グリコーゲンの局在の検索に有効で、本抗体を用いた免疫組織化学的観察から下顎頭軟骨では、軟骨芽細胞層から肥大細胞層の軟骨細胞の細胞質に免疫陽性物質の局在が認められた。4.ラット下顎頭の発育にともなう下顎頭軟骨細胞層の構成の変化に関する観察では、離乳期(生後3週齢)で下顎骨の関節突起及び下顎頭軟骨の発育方向に変化が生じ、下顎頭軟骨の部位による軟骨細胞層の厚みや細胞の配列状態が変化し、下顎頭軟骨の機能的特徴が構造に出現し始めていた。5.下顎頭の器官培養法による下顎頭軟骨の発育に関する観察から、胎生16.5日齢の下顎頭のIMDM培地を用いた器官培養では、下顎頭軟骨は発育伸長するが、培養8日目以降未分化な細胞からの軟骨芽細胞への補給が停止が生じた結果、軟骨の分化発育が停止した。胎生17.5日齢の下顎頭の器官培養では、下顎頭軟骨の発育は認められず、軟骨組織の吸収が観察された。1.下顎頭軟骨の初期石灰化部位における結晶の超微細構造に関する観察では、種々の発育段階のラットおよびマウス下顎頭を摘出後、直ちに化学固定を行い、また一部には液体窒素を用いた急速凍結置換固定法を適用し、未脱灰のまま樹脂包埋を行い、超薄切片を作製した。その後加速電圧300KVおよび200KVの超高圧透過電子顕微鏡を用いて、下顎頭軟骨初期石灰化部位の結晶構造について、直接原子配列レベルでの観察をおこない、初期石灰化部位の結晶には多数の構造欠陥が存在することが明かとなった。2.下顎頭の軟骨細胞及び軟骨基質を抗原としたmonoclonal抗体の作製および免疫組織学的観察においては、ラット下顎頭軟骨のホモジネ-トを抗原として、、BalbCマウスを免疫し、その脾細胞とNSー1細胞とを融合させ、ハイブリド-マを作成した。その結果、下顎頭軟骨細胞と反応する単クロ-ン抗体が数種類得られた。3.連続切片の作製による下顎頭軟骨の層構造の3次元的観察では、樹脂に包埋した下顎頭の連続切片を作製して、下顎頭軟骨内骨化部位で、形態学的特徴から軟骨細胞を層状に分類した。現在下顎頭の発育にともなう、骨内骨化部位の層状構造の変化を3次元画像解析装置を用いて、復構模型を作製してところである。4.下顎頭の器官培養法による下顎頭軟骨細胞の分化発育の観察に関して、マウス胎生16.5日齢の胎仔の下顎頭を、無菌的に適出し、種々の培養条件で器官培養を行い、下顎頭軟骨の形態学的変化を観察した。

その結果、予備実験ではアスコルビン酸および牛胎仔血清を添加したイシコフのMDMを培地として用いた場合が下顎頭の発育に最適であった。1.下顎頭軟骨の初期石灰化部位における結晶の超微細構造に関する観察をおいて、種々の発育段階のラット下顎頭を摘出後、直ちに化学固定を行い、また一部には液体窒素を用いた急速凍結置換固定法を適用し、未脱灰のまま樹脂包埋を行い、超薄切片を作製した。その後、加速電圧300KVおよび200KVの超高圧透過電子顕微鏡を用いて、下顎頭軟骨初期石灰化部位に出現する結晶構造について、直接原子配列レベルでの観察を分解能をさらにあげておこなった。その結果、初期石灰化部位の結晶には構造原子の欠落や置換、さらにラセン転位などの多数の構造欠陥が存在することが明かとなった。2.下顎頭の軟骨細胞及び軟骨基質を抗原とした単クロ-ン抗体の作製および免疫組織学的観察においては、ラット下顎頭軟骨全体のホモジネ-トを抗原として、BalbCマウスを免疫し、その脾細胞とNSー1細胞とを融合させ、ハイブリド-マを作成した。その結果、分化した軟骨細胞と特異的に反応する単クロ-ン抗体が数種類得られ、その局在に関して現在免疫電顕法で観察しているところである。また、軟骨基質に対する抗体を作製するために、下顎頭軟骨基質の構成成分を分離して、in vitroおよびin vivo免疫法を用いて、抗体の作製をすすめている。3.下顎頭の器官培養法による下顎頭軟骨細胞の分化発育の観察に関して、マウス胎生16.5日齢の胎仔の下顎頭を、無菌的に適出し、アスコルビン酸および牛胎仔血清を添加したイシコフのMDMを培地として用いた場合、下顎頭軟骨の発育は進行するが、軟骨内骨化はほとんど進まないため、現在種々のホルモンや成長因子などを添加し、最適な培養条件を確立するため予備実験を繰り返している。1.下顎頭軟骨の初期石灰化部位における結晶の超微細構造に関する観察において、種々の発育段階のラツト下顎頭を摘出後、直ちに化学固定を行い、また一部には液体窒素を用いた急速凍結置換固定法を適用し未脱灰のまま樹脂包理を行い、超薄切片を作製した。その結果、初期石灰化部位の結晶には種々の溝造欠陥が在存することが明かとなった。2.下顎頭の軟骨細胞及び軟骨基質を抗原とした単クローン抗体の作製および免疫電顕的観察においては、下顎頭軟骨の軟骨細胞の細胞質と反応する単クロナール抗体を作成し、免疫電顕的に観察した結果、軟骨細胞に多量に存在するグリーコゲンを認識していることが確認出来た。また、軟骨基質に対する抗体を作製するために、下顎頭軟骨基質の構成成分を分離して、in vitroおよび睥内免疫法を用いて、抗体の作製をすすめている。3.下顎頭の器官培養法による下顎頭軟骨細胞の分化発育の観察に関して、マウス胎生16.5日齢の胎仔の下顎頭を、イシコフのMDMを培地として用いて器官培養をおこなった場合、下顎頭軟骨は分化発育し、軟骨細胞の増殖による軟骨層の肥厚が認められる結果、その大きさを増加させるが、軟骨内骨化はほとんど進行していないことが明かとなった。また、培養した下顎頭に対して、type1およびtype2collagenに対する抗体や本研給で作成した抗体を用いて免疫組織化学的観察を行なっている。
対称性の数理

可解格子模型にたいする対称性からのアプローチは本研究の中心的課題であるが、これについては従来解明されていなかった楕円的な模型について、量子群のツイストによる準ホップ代数の表現論を用いて頂点作用素の自由場表示が得られた。(白石・小竹)さらに、三角関数的な極限にあたる|q|=1の場合の差分KZ方程式について解の積分表示が得られた。(三輪・今野)長谷川はルイセナールの差分作用素を可解格子模型の連絡作用素を用いて構成できることを示した。結晶基底の理論は、可解格子模型と組合せ論をつなぐ鍵となるものであるが、これに関しては、非一様パスが、テンソル積表現の結晶基底を与えることが発見された。(三輪・尾角・国場・山田泰彦)また、パーフェクトではない結晶基底のパス理論もいくつかの興味ある例を通して構成されている。(尾角・国場)松井は、可解ではない模型について、基底状態を表すMatrix Product Stateがクンツ代数の表現と対応することを示した。トロイダル代数は、頂点作用素の対称性を統制する重要な代数であるが、三木はこの代数の構造についてその中に含まれる二つの量子群をつなぐ自己同型を構成した。場の理論の可解模型は、もう一方の中心的研究テーマであるが、河東は作用素環の手法により、2次元共形場理論のモジュラー不変量の計算法を開発した。2次元の可解模型の手法を弦理論や4次元のゲージ理論に適用することも重要である。これに関して、中津は戸田格子のタウ関数の断熱極限として、N=2超対称Yang-Mills理論の低エネルギーでのeffective actionが得られることを示した。菅野と梁は質量0のクォークを持つN=2ゲージ理論のツイストで得られる位相的ゲージ理論から、4次元多様体のDonaldson-Witten不変量の一般化を得た。加藤は曲がった時空での量子重力理論としての行列模型の満たすべき条件を解析した。3年間の研究成果として、(1)楕円的な可解格子模型に関する対称性に基づく解法が確立され、(2)混合スピン鎖を表現論的に扱うことが可能になった。さらに、(3)格子模型と組合せ論の間に新たなつながりが発見された。一方、場の理論においては、(4)幾何学的不変量の量子化についての理解が進み、(5)作用素環論と共形場理論をつなぐ代数的アプローチが開発された。国場敦夫と尾角正人は最高ウェイト表現のパス表示において有限の長さのパスが、表現論のどのような対象に対応しているか、という問題に対し、Demazure結晶との関係を明らかにすることによって興味深い結果を与えた。国場はまた、バ-テックス模型のパス空間のスペクトル分解をおこない、スピンの配置と捻れたヤング図形の間に1対1対応をつけた。これによって、スペクトルの重複度を与える指標公式を捻れたシューア関数を使って表示できた。中屋敷厚はレベル0のKnizhnik-Zamolodochikov方程式の解を与えた。これは、Smirnovによるsl_2の場合の、sl_nへの拡張である。

また、一般のレベルでの既知の結果を、レベル0に特殊化する方法を明らかにした。また、中屋敷厚と山田泰彦は、表現論の分岐指数のq類似であるKostka多項式におけるqの意味づけを、可解格子模型のvertex型模型で重要なエネルギー関数と結び付けることによって行ない、Kirillovによる予想を解決した。菅野浩明は、4次元の非線形シグマ模型の対象性としてトロイダル代数が現れることを発見した。三輪哲二は、質量0のXXZ模型の代数構造が実軸上のボゾンを用いて質量が0でないときと同様に、頂点作用素の関係式として取り扱えることを示した。また、変形されたW_n代数のscreening作用素の作る代数の構造を決定した。変形のない場合に較べ、単純ルートだけでなく、任意の正のル-ロに対して生成元となる作用素を考える必要があり、それらの間には2次の関係式が存在する。また、ABF模型に対してLukyanovとPugaiがボゾン化をしたことに基づき、境界つきの転送行列の対角比を行なった。長谷川浩司は、BelavinのR行列からできる転送行列のトレースを考えることによって、MacDonald作用素の係数を楕円関数に拡張した可換な作用素の族を構成した。梁成吉は、ヘテロチックII型弦理論の双対性に関連して脚光を浴びているE_6特異点に対応する新しいタイプのランダウギンズブルグ模型のポテンシャルを調べた。このポテンシャルは多項式の平方根を持つが、対応するトポロヂカルな場の理論、通常のE_6型の理論と等価になる。中津了勇は、D5ブレーンの基底状態を記述する6次元トポロヂカルな場の理論を構成した。D5ブレーンの退化の様子を精密に調べると、モジュライ空間のサイクルのボアンカレ双対と考えらえる物理的なオブザ-バブルが得られる。これらはD5ブレーンの束縛状態の生成演算子と同一視され、これによって5次元のブレーンの第二量子化ができた。菅野は、2次元Wess-Zumino-Novikov-Wtten理論の4次元版と考えられるケーラーWZWN模型の無限次元の対称性を調べた。群としてSL(2,R)を考えるとガウス分解することにより、カレント代数を2次元のトロイダル代数と見なすことができる。さらに、この理論のエネルギー運動量テンソルを、カレントと補助的な量を使って表示することができた。国場は、結晶基底と格子模型についての研究を進め、レベルの高い場合の局所エネルギー関数による<sι>^^^<^>_nの既約指標の分解公式を得た。この仕事は、Uglovによって<gι>^^^<^>_nに拡張され、その場合には対応するヤンギアンの表現が構成されている。白石は変形ヴィラソロ代数のGKO構成を行なった。その結果は、三輪によって中屋敷型の頂点作用素と変形ヴィラソロ代数との可換性というかたちに、利用されている。白石は神保、小竹、今野と共に、楕円的量子群の普遍R-行列の無限積表示を得た。これは、Fronsdalによって予想されていた、楕円的量子群と通常の量子群の間の関係についての決定的な結果である。中屋敷は、レベルが0のQKZ方程式の積分公式について、Tarasov-VarchenkoとSmirnovによって得られていた別々の表示を関係付けた。
パラ言語情報を含む同時音声通訳技術の研究

1-A)常時音声認識:音声、非音声音響モデルに基づく常時音声認識の検討を始めた。B)自動音声同時通訳:シフトリデュースパーザを音声認識に組み込み、逐次的に音声認識デコーダで構文解析しながら次の文構成要素を予測し、訳出、待機を行う方法の高度化について文献調査を行った。C)機械翻訳の高度化:再帰的ニューラルネットワークの一種であるLSTMによる注意形ニューラル機械翻訳(NMT)の高度化に向けて研究を進めた。D)対話制御:LSTMを用いた対話状態推定法の利用、POMDPを利用した音声翻訳の高度化に向けて検討を始めた。2パラ言語:元言語の発話から強調抽出し、アライメントを求めた後、CRFおよびLSTMニューラルネットで対象言語に強調を付与する技術の改良を進めた。3リアルタイムコミュニケーション:視線検出装置Tobi、モバイル心拍計などを用いてプロの同時通訳者の作業時、および同時通訳ユーザの聴取時の聴取負荷の観察を行うため、実験計画の検討を行った。4コーパス構築:2012年から介した基盤研究Aで収集したコーパスの整理を行い、H29年度に実施すべきコーパス収集の計画を検討した。29年度が最終年度であるため、記入しない。
中国笑話集と日本文学・日本語との関連に関する研究

本研究は、中国笑話集の翻刻・注釈を行うための基礎研究と位置づけ、研究を開始した。研究期間終了時点で、和刻本『解顔新話』『笑林広記鈔』と『新鐫笑林広記』『絶纓三笑』『訳解笑林広記』『即当笑合』との本文比較、文字の比較、原話(『新鐫笑林広記』の該当話)の邦訳を行い、浮世草子、日本笑話、川柳などへの影響を指摘した。これらの他に、本研究では中国笑話の検索システムを開発しており、現在その試作版を公開している。日本、中国の笑話研究を通して、それぞれの国の文学、国語、芸能についての理解を深め、日中両国の風土・文化の比較を行うための情報を与えることを目的とし、(1)諸本調査、(2)書誌情報の整理、(3)収集資料のデータベース化、(4)和刻本『笑府』『笑林広記』の翻刻、(5)翻字を行った文字のデータベース化の5項目について研究を行った。平成21年度については、『笑府』より先行研究が少ない『笑林広記』を中心に行うこととし、諸本調査(撮影を含む)、それに基づく書誌情報の整理を行った。未報告の刊記を持つ本の存在が確認できた一方で、既に研究報告がなされている本の中に所在不明のものがあることを確認した。そのため、追加の調査が必要であるとの認識に達し、平成22年度以降も調査を継続することにした。翻字及び異体字調査については、和刻本『笑林広記抄』『訳解笑林広記』を対象として行っており、平成22年度以降も引き続き行う。これに加え和刻本『笑林広記抄』については、所収笑話全文の注釈・口語訳を開始した。当初の研究計画では予定していなかったが、中国笑話の日本笑話への影響関係を明らかにするためには、傍訓(ルビ)についての研究も必要と考え、研究課題に加えることにした。研究遂行のため、この分野に詳しい荒尾禎秀氏が研究組織に加わった。この分野についても研究を開始した。収集した画像及び翻字を行った本文については、順次データベース化している。新たに構築を進めている新システム(試作版)を利用して、これらデータベース化した資料についての公開をWeb上で開始している。なお、この新システム構築のために山口満氏が組織に加わり、開発を担当している。日本、中国の笑話研究を通して、それぞれの国の文学、国語、芸能についての理解を深め、日中両国の風土・文化の比較を行うための情報を与えることを目的とし、以下の5項目について研究した。(1)諸本調査(2)書誌情報の整理(3)収集資料のデータベース化(4)『笑林広記鈔』の翻刻・註釈、及び『笑林広記鈔』『訳解笑林広記』の異体字調査(5)翻字を行った文字のデータベース化平成22年度については、『笑林広記鈔』『訳解笑林広記』の諸本調査(撮影を含む)、それに基づく書誌情報の整理を行った。異版はないと思われるが、複数回刊行されていると思われるため、さらなる調査が必要であるとの認識に達し、平成23年度も継続して行うことにした。翻刻及び異体字調査については、『笑林広記鈔』『訳解笑林広記』を対象として行い、『笑林広記鈔』については作業を終えた。『笑林広記鈔』については、所収笑話全文の注釈・口語訳を、ほぼ終えた。研究成果は23年度中に公開する。『解顔新話』についても、注釈・口語訳を開始した。収集した画像及び翻刻を行った本文については、順次データベース化している。平成21年度の研究成果としてシステム(試作版)を公開したが、平成22年度もシステムの改善を行い、改良版を現在公開している。日本、中国の笑話研究を通して、それぞれの国の文学、国語、芸能についての理解を深め、日中両国の風土・文化の比較を行うための情報を与えることを目的とし、次の5項目について研究した。(1)諸本調査、(2)書誌情報の整理、(3)収集資料のデータベース化、(4)『解顔新話』の翻刻・注釈・異体字調査、(5)翻字を行った文字のデータベース化。上記の研究を行うことで、平成23年度は、『解顔新話』の翻刻・注釈及び日本近世文学との影響関係についての検討、『笑林広記』と『絶纓三笑』の比較、『訳解笑林広記』の諸本調査(撮影を含む)を行った。

3年間の研究期間で、『笑林広記鈔』『解顔新話』については、『新鐫笑林広記』との本文比較、原話の邦訳の作業を終え、浮世草子、日本笑話、川柳などへの影響を指摘した。研究を通じ、漢字に付される傍訓の重要性を改めて感じた。中国笑話の日本笑話化を検討するためには、笑話に付された傍訓は文脈理解のうえで不可欠であり、今後も継続して取り組まねばならない課題であると考えた。これまで行った研究には、異体字の調査も含まれていた。近世期は、現代に通じる文字が確立する時期にあたり、文字表記が固定していく過程で出版物が果たした影響は大きいと考えたからである。今回研究対象とした『笑林広記』は、日本、中国で繰り返し刊行されている。版の違いにより文字表記が異なっていることが、本研究で行った調査で明らかになりつつある。今回の研究では十分に成果を出すことが出来なかったが、『笑林広記鈔』『解顔新話』については、『新鐫笑林広記』との比較を終えたので、報告書その他を利用して報告する。
ユビキチンリガーゼによって制御されるタンパク群の機能解析

本研究では、遺伝子改変動物(ノックアウトマウス等)を用いて、遺伝子改変によって生ずるタンパク質の変化を網羅的に検索するシステムを構築し、ユビキチンリガーゼの生理的基質の同定を試みた。まず、抗ユビキチン抗体を用いた精製法によるユビキチン化蛋白質の特異的精製を試みた。ユビキチンは細胞内で量的に多い蛋白質であり、そのほとんどが遊離の状態(基質に結合していない)で存在しているため、通常の抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うと、主に遊離ユビキチンが回収される。そこで、われわれは抗ユビキチンモノクローナル抗体であるFK2が基質と共有結合したユビキチンを選択的に認識できることに着目し、FK2-カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるユビキチン化蛋白質の濃縮を行った。一方、ユビキチンリガーゼノックアウトマウスより抽出されたタンパク質を野生型と比較するために、まず適切な組織の選択が必要であり、当該ユビキチンリガーゼの機能している臓器を推定するためにin situ hybridization法を適応、また適当な組織について適切なタンパク質の抽出法の検討を行った。そのような基礎検討をふまえ、Fbw7ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞より細胞抽出液を調製し、抗ユビキチンモノクローナル抗体であるFK2を用いたFK2-カラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行い、ユビキチン化蛋白質の濃縮を行った。時間的・空間的なタンパク質の発現量調節システムの全貌を理解することを目標に本研究を行った。基質特異的にタンパク質分解を誘導する系としてユビキチン・プロテアソーム系が重要な役割を果たしていることが知られている。この「基質特異性」を決定しているのはユビキチンリガーゼ(E3)であるが、ユビキチンリガーゼ候補分子の基質は実はほとんど不明である。そこで本研究では、遺伝子改変動物(ノックアウトマウス等)を用いて、遺伝子改変によって生ずるタンパク質の変化を網羅的に検索するシステムを構築し、ユビキチンリガーゼの生理的基質の同定を試みた。まず培養細胞抽出液中に含まれるユビキチン化タンパク質を抗ユビキチン抗体を用いて濃縮し、プロテオーム解析を行った。ユビキチン化タンパク質を500種以上決定することに成功した。つぎに、ユビキチンリガーゼノックアウトマウスより抽出されたタンパク質を野生型と比較し、ユビキチンリガーゼの基質の検索を行った。まず、当該ユビキチンリガーゼの機能している臓器を推定するためにin situ hybridization法を行った。さらに、ノックアウトマウスおよび野生型から、発現が確認された臓器のタンパク質抽出液を調製、それぞれの抽出液に異なる蛍光色素標識を行った。これらの標識タンパク質を同量混合し、発光を計測する。その際、あらかじめラベルされたタンパク質をタンパク二次元電気泳動法などで展開しておけば、量的に増加または減少したタンパク質を発光色の変化としてとらえることが可能である。この方法を用いて、ノックアウトマウスで特異的に蓄積しているタンパク質の存在を知ることに成功した。本年度は、抗ユビキチン抗体を用いた精製法によるユビキチン化蛋白質の特異的精製を試みた。野生型およびノックアウトマウスより電動実体

顕微鏡を用いて正確に臓器ごとに分離し、そのタンパク質抽出液を調製し、上記の方法で濃縮後、それぞれの抽出液に異なる蛍光色素標識を行った。これらの標識タンパク質を同量混合し、発光を計測する。その際、あらかじめラベルされたタンパク質をタンパク二次元電気泳動法などで展開しておけば、量的に増加または減少したタンパク質を発光色の変化としてとらえることが可能である。この方法を用いて、ノックアウトマウスで特異的に蓄積しているタンパク質の存在を知ることに成功した。現在、質量分析を行い、タンパク質の同定を行っている。
ＥＳ細胞未分化性維持機構の知見を利用したがん幹細胞の単離・解析

がん幹細胞を同定するには、白血病幹細胞内の不均一ながん細胞集団の中のがん幹細胞の割合を増やしてがん幹細胞の特性を知ることが1つの手段だと考えられる。そのためには細胞の不均一性は何によってどのようにもたらされるのかを知る必要がある。これまでの申請者の研究結果より、ポリコーム群遺伝子の1つであるEedによるエピジェネティックな制御によってES細胞が完全な未文化状態から不完全な未分化状態にシフトすることが示唆されており、このエピジェネティックな制御が不均一性を生み出している可能性がある。また近年、がん幹細胞とES細胞は同様なメカニズムによって制御されている可能性が示唆されているため、この現象に着目し研究を行った。Eed欠損ES細胞を用いてヒストンH3K27メチル化の有無によって、多能性に寄与する転写因子のリクルートには影響しないことが示されたため、次に多能性転写因子の転写制御機構に着目し、代表的な多能性転写因子であるOct3/4とSox2のクロマチン免疫沈降シークエンスのデータ解析の1つである転写因子のMotif解析により、Sp1がOct3/4とSox2に結合していることが示唆された。また、Sp1と進化的にも構造的にも非常によく似ているSp3が機能重複している可能性が示唆されたため、Sp1/Sp3ダブルノックアウトES細胞を作成し、機能解析を行った。それぞれの単独ノックアウトES細胞は野生型とほぼ違いが見られなかったが、Sp1/Sp3ダブルノックアウトES細胞の解析より、Oct3/4:Sox2複合体に含まれるSp1/Sp3は、特異的にKlfファミリーの発現制御に関与し、そのことでES細胞の自己複製に関与していると考えられる。またSp1/Sp3はがん幹細胞でも発現していることが想定され、さらにがん幹細胞の自己複製にも関与している可能性が示唆される。がん幹細胞においてもSp1/Sp3に着目し研究を行うことで、がん幹細胞の自己複製のメカニズムの解明に近づくと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの申請者の研究結果より、ポリコーム郡遺伝子の1つであるEedによるエピジェネティックな制御(ピストンH3K27メチル化)によってES細胞が完全な未文化状態から不完全な未分化状態にシフトすることが示唆されており、このエピジェネティックな制御が不均一性を生み出している可能性がある。ES細胞が分化する際Eedの発現は減少するが、完全には無くなることはない。Eed欠損ES細胞を分化させると、野生型を分化させたときより外胚葉、中胚葉系にはあまり分化せず、内胚葉系に分化するという異常な分化をしている傾向が見られた。逆にEedを過剰発現した状態で分化させると、すべての胚葉系の発現増加が抑えられたがH3K27meは維持されているのに関わらず完全に抑制できなかった。また、その際にアポトーシスが見られた。これらの結果より、EedによるH3K27meにはある方向の分化を抑制することができるが、それだけでは完全に分化を抑制することができず、他の転写因子の存在や他のピストン修飾の可能性があること、また、エピジェネティックな制御によって分化適応性を獲得できること、また適応できない場合は死ぬというメカニズムが働くことが示唆された。そのことで白血病幹細胞において、エピジェネティックな制御をコントロールすることで不均一性を制御できる可能性が示された。これまでの申請者の研究結果より、ポリコーム群遺伝子の1つであるEedによるエピジェネティックな制御(ヒストンH3K27メチル化)によってES細胞が完全な未文化状態から不完全な未分化状態にシフトすることが示唆されており、このエピジェネティックな制御が不均一性を生み出している可能性がある。Eed欠損ES細胞を分化させると、野生型を分化させたときより外胚葉、中胚葉系にはあまり分化せず、内胚葉系に分化するという異常な分化をしている傾向が見られ、エピジェネティクスな変化により細胞のステータスを変えることができる可能性が示唆され、エピジェネティックな制御をコントロールすることで不均一性を制御できる可能性が示された。またiPS細胞でのリプログラミング中にshRNAライブラリーを用いたゲノムワイドな遺伝子発現の抑制実験により、iPSのリプログラミング効率を変える細胞競合に関わる因子を同定した。それらの結果より、均一な細胞集団において、細胞競合によって異なる細胞集団が作られることが示唆された。

そのためには細胞の不均一性は何によってどのようにもたらされるのかを知る必要がある。これまでの申請者の研究結果より、ポリコーム群遺伝子の1つであるEedによるエピジェネティックな制御によってES細胞が完全な未文化状態から不完全な未分化状態にシフトすることが示唆されており、このエピジェネティックな制御が不均一性を生み出している可能性がある。また近年、がん幹細胞とES細胞は同様なメカニズムによって制御されている可能性が示唆されているため、この現象に着目し研究を行った。Eed欠損ES細胞を用いてヒストンH3K27メチル化の有無によって、多能性に寄与する転写因子のリクルートには影響しないことが示されたため、次に多能性転写因子の転写制御機構に着目し、代表的な多能性転写因子であるOct3/4とSox2のクロマチン免疫沈降シークエンスのデータ解析の1つである転写因子のMotif解析により、Sp1がOct3/4とSox2に結合していることが示唆された。また、Sp1と進化的にも構造的にも非常によく似ているSp3が機能重複している可能性が示唆されたため、Sp1/Sp3ダブルノックアウトES細胞を作成し、機能解析を行った。それぞれの単独ノックアウトES細胞は野生型とほぼ違いが見られなかったが、Sp1/Sp3ダブルノックアウトES細胞の解析より、Oct3/4:Sox2複合体に含まれるSp1/Sp3は、特異的にKlfファミリーの発現制御に関与し、そのことでES細胞の自己複製に関与していると考えられる。またSp1/Sp3はがん幹細胞でも発現していることが想定され、さらにがん幹細胞の自己複製にも関与している可能性が示唆される。がん幹細胞においてもSp1/Sp3に着目し研究を行うことで、がん幹細胞の自己複製のメカニズムの解明に近づくと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。エピジェネティックな制御をゲノム全体で知ることができるクロマチン免役沈降シークエンス(ChIP-Seq)の実験系の立ち上げに時間がかかっているため。新しい知見により、これまでの転写因子やエピジェネティクスに関わるような因子のみではなく、細胞競合に関わる因子が細胞集団に影響を及ぼしている可能性が示唆され、これまで以上に幅広く分野で研究を行う必要ができたため。ES細胞で得られた知見をがん幹細胞に応用して研究を行う予定であったが、ES細胞で得られる知見が十分とは言えず、さらにES細胞では研究を進めていくために重要な遺伝子ノックアウトなどの実験方法も簡単に使うことができるため、今後もES細胞を用いて研究も並行して行う予定である。
運動疾患モデルの作製とその応用

Sherringtonは、ネコの上丘ー下丘間を切断することにより四肢に筋固縮の起こることを見出した(1898)。この上丘ー下丘間切断脳固縮は、運動系の生理学的研究に利用され、また、痙性麻痺の病態モデルとして中枢性筋弛緩薬の評価に用いられてきた。我々は同モデルをラットにおいて作製してきたが、成功率の低い従来の方法の代わりに、上丘ー下丘間切断に相当する部位を高周波電流で破壊することにより、再現性よく強い除脳固縮を得る方法を開発した。本研究では、作製に成功した固縮の脳内メカニズムを探ろうとした。1.noradrenaline α_1ーアンタゴニストは脊髄クモ膜下腔内投与により固縮を抑制し、α_2ーアゴニストは第4脳室内投与により固縮を抑制した。脊髄へのα_1ーアゴニストの投与により固縮は増大した。さらに、noradrenaline神経を破壊するb-hydroxy-dopamineの2週間前の大槽内投与により、固縮は減弱し、α_1ーアンタゴニストの作用が消失した。これらの結果より、下行性noradrenaline神経の活動亢進が固縮発現に寄与していることを明らかにした。2.2-deoxyglucose法を用いて、固縮時に活動が亢進している脳部位を検索した。固縮ラットに^<14>C-deoxyglucoseを投与し、経時的に採血した後、脳切片をX線フィルム上に載せ、露光させ、オートラジオグラムを得た。オートラジオグラムを画像解析し、グルコース利用率を計算した。固縮ラットにおいては、小脳核と前庭核のグルコース利用率が著明に上昇していた。tizanidine diazepamなど脳幹に働いて固縮を抑制する薬物は、これらの核におけるグルコース利用率の上昇を抑制した。これらの結果から小脳核および前庭核の活動増加が固縮発現に関与することが明らかとなった。
炭化水素による一酸化窒素の選択還元除去触媒の設計

本研究ではこれまでの研究成果をもとにGaおよびInイオン交換ゼオライト触媒の作用機構を解明し,酸素過剰条件下で高選択的にNOをN_2へ還元除去し得る触媒として有効な活性点に対する基礎的な知見を得ることを目的として以下の点について検討を行った。これまでの研究でCH_4を還元剤に用いた場合,Gaイオン交換ゼオライトではNOと炭化水素との反応が極めて高選択的に進むことを見い出した。そこでGaおよびInイオン交換ゼオライトの高選択的挙動と反応機構について検討を行った結果,本触媒系の高選択性がGaとゼオライトの酸点の共存により発現すること及びNO_2が本反応を促進することを明らかにしており,NOの酸化によるNO_2の生成にゼオライトの酸性が関与していることを示した。さらに,これらの触媒上での還元反応はNO_2の生成が第一段階であり,生成したNO_2とCH_4がゼオライト中のGaあるいはIn上で高選択的に反応しN_2を生成することを示した。またGaやInのゼオライトへの担持方法の異なる触媒を調製し,触媒調製方法が活性および選択性へ及ぼす影響について検討するとともに,これらの触媒のキャラクタリゼーションを行った結果,本反応に有効な活性点がゼオライトにイオン交換された配意不飽和なGaおよびInであることが明らかとなった。
ディジタルアーカイブの国際コラボレーション・スキーム実証研究

歴史・文化遺産のディジタルアーカイブにおいて国際間の協力や異分野融合を効果的に行うスキームについてシルクロードを例にとり実証研究を行った。地震で破壊されたイランBam城塞の3次元CG-VR復元、シルクロード貴重書のディジタル保存、世界遺産の今昔写真や古地図の幾何補正による歴史参照、スマートフォン等を用いたシルクロード文化遺産の検索・投稿可能なWebサイトの構築を行った。国際間にまたがる異分野の専門家が実際の文化遺産を使って評価した点に意義がある。文化遺産のディジタルアーカビングの具体的な対象としてシルクロードを選び、国際コラボレーションにより本研究のアプローチの有効性を実証する構想を練った。1)文化遺産のディジタルアーカイビングが博物館、図書館、収蔵館だけでなく、考古学者、歴史学者、芸術家など様々なドメインの人が共有できるコンセプトを検討した。2)地震で破壊されたイランのBAM城塞の3次元仮想復元について、重要建築物であるGovernors Sectionの3DCG復元を進めた。きた建築物にかかわるさまざまな情報をOntologyの概念により整理し、3DCG仮想復元のデータベース化を図った。3)大英博物館のIDP(国際敦煌プロジェクト)と共でシルクロード探検家Steinの"Ancient Khotan"および"Serindia"のOCRテキストのXML化を行う共同作業を開始した。4)国際コラボレーションの一環として大英博物館IDPのOversea Project ManagerのDr.ImreGALAMBOSを招聘してMultidisciplinary Domain研究者からな4^<th>DSR WorkshopをNIIで開催した。ディジタルアーカイブの国際コラボレーションの具体的な対象として地震で破壊されたイランのBAM城塞の3次元仮想復元およびシルクロード探検家Steinの探検記を選び実証研究を進めた。1,ディジタルアーカイブのコンテンツが博物館、図書館、収蔵館だけでなく、考古学者、歴史学者、芸術家など様々なドメインの人が共有できるメタデータの概念を検討した。2,テヘラン大学より研究協力者を招聘し、地震で破壊されたイランのBAM城塞の3次元仮想復元について、重要建築物であるGovernors Section等の3DCG,QTVRモデルの構築を進めた。3,地震で破壊されたイランのBAM城塞のSatab Houseの3DCG,Governor SectionのQTVRによるWalkthroughモデルについてNHKが20数年前撮影した地震前のFilm映像と比較して、これらの類似性が高いことを検証した。4,大英博物館のIDP(国際敦煌プロジェクト)と共同でシルクロード探検家Steinの探検記のOCRテキストのXML化を行う共同作業を進めたが、OCRテキストの誤りのチェックに相当の時間が費やされた。本件については次年度に再検討する。5,国際コラボレーションの一環として大英博物館IDPのメンバー3名を招聘しMultidisciplinary Domain研究者からなるIDP-DSR Workshop(2010/7/15)をNIIで開催した。6,シルクロードの音楽について新しい関連ドメインの一つとして検討を進めた。ディジタルアーカイブの国際コラボレーションスキームの実証研究の最終年度として以下の総括をする。1,実証研究のための具体的な対象として地震で破壊されたイランのBAM城塞の3次元仮想復元を選んだことは、本テーマに関連する課題を検証するのに役立った。2,シルクロード探検家Steinの探検記のOCRテキストのXML化を行う共同作業を進めたが、誤りのチェックに相当の時間が費やされ、計画どうりに進展しなかったが、古地図補正については大きく進展した。3,地震で破壊されたイランのBAM城塞の3次元仮想復元について、日本、イラン、フランスの異なる機関がReference Modelを参照しながら協調して3DVRモデルを構築するスキームを試み、その有効性を実証した。4,本研究の発端となったディジタルシルクロードのWebサイトに新しい研究成果を取り入れて拡張し、アクセス頻度の大きいWebとなっている。5,さらに、国際コラボレーションの一環としてウズベキスタンのヒバの遺跡の古写真と現代写真を、Web上で比較し、現地のミュージアムとの協力関係を築いた。6,総合的にみると現在急速に発展しているGrid ComputingやSmartphone,Tablet端末をツールとして包含すれば更なる国際コラボレーションの進展が期待されよう。
作物全般に適用可能な分岐・矮性化・分化能を制御する転写因子の単離とその利用

平成25年度はまず、昨年度に論文発表していた植物の細胞伸長を制御するシステムTri-antagonistic bHLHsystemについて、詳細な研究を遂行した。昨年度までの成果から、Tri-antagonistic bHLHsystemにはAtIBH1、PRE、ACEという3グループに属するbHLH転写因子が関与しており、ACEは下流遺伝子の発現を直接活性化することで細胞伸長を促進すること、AtIBH1はACEに結合してそのDNA結合を阻害することで細胞伸長を抑制すること、PREはAtIBH1に結合してACEとAtIBH1の相互作用を阻害することで細胞伸長を促進することを解明していた。また、各グル一プに属する因子、合計15種を同定していた。平成25年度はACEグループの因子ACE4について、詳細な解析を行ない、ACE4が細胞伸長をポジティブに制御する転写活性化因子であることを発見した。また、ACE4の遺伝子発現が遠赤色光とマイルドな高温条件によって誘導されたことから、これらの環境要因下での細胞伸長に関与する既知の因子であるPIF4、HFR1、PAR1とACE4の関係について解析を進め、PIF4を含む複数のPIF因子がACE4の発現を促進すること、HFR1, PAR1はPIF4機能を阻害することでACE4の発現を抑制することなどを明らかにし、論文を執筆中である。一方で、細胞伸長を促進する転写アクティベーターACE1, CIB5とACE4の多重変異体を作成した。これまでの研究成果から、各々の因子は、組織、時期、一定の環境条件などに特異的に細胞伸長を制御しているものと予測されており、それぞれの機能を詳細に解析することで、特異的な組織の短縮、たとえば背は低いが葉は従来と同じサイズの植物の作成や、弱光耐性の作物の作出など、より有用性の高い技術の開発に貢献できるものと期待している。平成25年度は上記の解析に加えて、枝数・葉数の増減の制御を行う遺伝子At2g36080、および、細胞の分化全能性を制御する遺伝子WUSについても解析を進めた。さらに、AtIBH1によって改変したタバコ植物体に関する論文の投稿準備をすすめ、本法を用いたタバコ植物体の形質改変および物質生産性の評価に関する総説を発表した。(抄録なし)平成23年度は様々な有用作物全般において矮性化、枝数・葉数の増減を誘導することのできるコンストラクトの作成を目指して、研究を行った。まず、既に草丈を低くする遺伝子、HR0444の機能を解析し、効率よく矮性化を誘導する方法を探索した。そもそも、HR0444は植物細胞の伸びを抑制することがわかっていたが、解析を進めた結果、細胞伸長を直接促進する遺伝子群、THINを同定、THINが2量体を形成して細胞伸長を促進するのに対して、THINとHR0444が結合した場合にはTHINの機能が阻害され、細胞が伸びなくなることを発見した。さ、らに、HR0444とTHINの結合を邪魔する因子PREを単離、THIN,HR0444,PREという3種類のbHLH(basic helix loop helix)転写制御因子が互いに結合し、機能を阻害し合うことで植物細胞の縦の伸びを制御していることを解明した。2因子間の拮抗阻害システムは既に動植物で報告されているが、3因子による拮抗阻害は概念的に新しく、重要な発見といえる。また、単離した3種類のTHINのCRES-Tコンストラクト(転写アクティベーターの機能を優性的に抑制する手法)が強い矮性形質を誘導することに加えて、プロモーターを改変した場合には、葉、茎、さや、花柄など特異的な組織を短くできることを発見した。この成果は今後、例えば「背は低いが葉のサイズは変化しない」など、より有用性な作物の作出に役立つと期待される。一方で、枝数・葉数の増減の制御を行う遺伝子At2g36080についても解析を行い、本来のリプレッションドメインであるBRDを欠損させた遺伝子At2g36080.2に対して強力なリプレッションドメインSRDXを融合したAt2g36080.2SRDXがAt2g36080そのものよりも著しく葉の数を増加させる効果をもつこと、および、強力なアクティベーションドメィンVP16を融合したAt2g36080.2VP16は枝の数が増加させることを見いだした。この成果は、たとえば、葉野菜の葉を増やす、あるいは、切り花の枝数を増やすといった、それぞれの応用植物に適した有用形態の誘導に役立つものと思われる。平成24年度は様々な有用作物全般において効率的に矮性化、枝数・葉数の増減を誘導することのできるコンストラクトの作成を目指して、研究を行った。そもそも、HR0444は植物細胞の伸びを抑制することがわかっていたが、解析を進めた結果、細胞伸長を直接促進する遺伝子群、ACE(昨年の報告書におけるTHINと同一の遺伝子。論文発表時に改名)を同定、ACEが2量体を形成してDNAに結合し、細胞伸長の促進に関連するEXP8などの遺伝子発現を直接に活性化するのに対して、ACEとHR0444が結合した場合にはACEのDNA結合が阻害され、EXP8などの発現が抑制され、細胞が伸びなくなることを証明した。さらに、HR0444に結合する因子PREについては、HR0444と結合することでそのACEとの結合を阻害し、結果的にACEの転写活性化能を復活させることを証明した。

最終的には、ACE,HR0444,PREという3種類のbHLH (basic helix loop helix)転写制御因子が互いに結合し、機能を阻害し合うことで植物細胞の縦の伸びを制御するシステムをtriantagonistic bHLHsystemと名付け、論文発表すると同時に産業技術総合研究所からプレスリリースした。2因子間の拮抗阻害システムは既に動植物で報告されているが、3因子による拮抗阻害は概念的に新しく、重要な発見といえる。また、単離した3種類のTHINのCRES-Tコンストラクト(転写アクティベーターの機能を優性的に抑制する手法)が強い矮性形質を誘導することに加えて、プロモーターを改変した場合には、葉、茎、さや、花柄など特異的な組織を短くできることを発見した。この成果は今後、例えば「背は低いが葉のサイズは変化しない」など、より有用性な作物の作出に役立つと期待される。一方で、分岐数・葉数の制御に関与するAt2g36080については、重複遺伝子At3g11580, At2g06250との3重変異体を作成し、マイクロアレイにより遺伝子発現の変化を網羅的に解析した。その結果、3重変異体においては茎頂組織での器官形成に関わる遺伝子群の発現が低下していることが明らかとなった。平成25年度はまず、昨年度に論文発表していた植物の細胞伸長を制御するシステムTri-antagonistic bHLHsystemについて、詳細な研究を遂行した。昨年度までの成果から、Tri-antagonistic bHLHsystemにはAtIBH1、PRE、ACEという3グループに属するbHLH転写因子が関与しており、ACEは下流遺伝子の発現を直接活性化することで細胞伸長を促進すること、AtIBH1はACEに結合してそのDNA結合を阻害することで細胞伸長を抑制すること、PREはAtIBH1に結合してACEとAtIBH1の相互作用を阻害することで細胞伸長を促進することを解明していた。また、各グル一プに属する因子、合計15種を同定していた。平成25年度はACEグループの因子ACE4について、詳細な解析を行ない、ACE4が細胞伸長をポジティブに制御する転写活性化因子であることを発見した。また、ACE4の遺伝子発現が遠赤色光とマイルドな高温条件によって誘導されたことから、これらの環境要因下での細胞伸長に関与する既知の因子であるPIF4、HFR1、PAR1とACE4の関係について解析を進め、PIF4を含む複数のPIF因子がACE4の発現を促進すること、HFR1, PAR1はPIF4機能を阻害することでACE4の発現を抑制することなどを明らかにし、論文を執筆中である。一方で、細胞伸長を促進する転写アクティベーターACE1, CIB5とACE4の多重変異体を作成した。これまでの研究成果から、各々の因子は、組織、時期、一定の環境条件などに特異的に細胞伸長を制御しているものと予測されており、それぞれの機能を詳細に解析することで、特異的な組織の短縮、たとえば背は低いが葉は従来と同じサイズの植物の作成や、弱光耐性の作物の作出など、より有用性の高い技術の開発に貢献できるものと期待している。平成25年度は上記の解析に加えて、枝数・葉数の増減の制御を行う遺伝子At2g36080、および、細胞の分化全能性を制御する遺伝子WUSについても解析を進めた。
マウス肝細胞のin vitro発癌におけるDNA障害後の細胞周期制御機能の変化

正常細胞はDNA障害を受けると細胞増殖を一時的に停止させてDNA修復に必要な時間を稼ぐ能力を備えている。したがって、もし、この機能が失われると細胞は障害を持ったままDNAを複製するため、染色体異常や突然変異を生じやすくなり、細胞癌化の原因となりうる。このような遺伝子不安定性を防止する機能の一つとして、p53、p21^<Cipl(WAFl)>、cdk,Rbなどが関与するGl arrestが知られている。しかし、このようなcell cycle checkpoit能が多段階発癌の中で起こるか否か、さらにp53を含むシグナル伝達のどの異常によるのかはわかっていない。マウスの初代培養肝細胞では長期培養を続けると自然に不死化細胞が出現し、さらにこれに活性化ras遺伝子を導入すると可移植性悪性形質転換細胞が得られる。したがって、この系を用いることにより、共通にマウス肝細胞のbackgroundを持つ正常、不死化、悪性形質転換細胞についてDNA障害後のcell cycle checkpoint機能の比較が可能である。我々のこれまでの研究では正常から不死化の段階ではcell cycle checkpoint能は維持されているが、H-ras形質転換細胞では著しく低下していることが明らかになった。すなわち、正常、不死化、H-ras形質転換細胞ではいずれも正常p53遺伝子を有しており、UV照射後、核内にp53が過剰発現した。一方、正常、不死化肝細胞ではUV照射後Gl arrestに陥ったが、H-ras形質転換細胞ではp53が発現したにもかかわらずGl arrestは見られなかった。本年度は(1)発現調節が可能なvectorに活性化H-ras遺伝子を組み込み、不死化肝細胞に導入し、H-ras形質転換細胞株を作製した。これにより活性化H-rasの発現が直接的にGl arrest能の喪失に関わっているか否かの検討が可能になった。(2)マウス肝癌細胞株、H-ras導入不死化細胞株についてUV照射後の生存能を比較し、H-rasの活性化によりUV耐性になることを明らかにした。正常細胞はNA障害を受けると細胞増殖をG1期で一時的に停止させてDNA修復に必要な時間を稼ぐ能力を備えている。したがって、この機能が失われると細胞は障害を持ったままDNAを複製するため、染色体異常や突然変異が生じる。最近、このようなcell cycle checkpoint機能にはp53を含む様々の遺伝子が関わっていることが明らかになってきた。本研究では共通にマウス肝細胞のbackgroundを持つ正常、不死化、悪性形質転換の3つの階段の細胞についてDNA障害後のcell cycle checkpoint機能を比較することを目的とした。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。(1) C3Hマウス肝細胞を長期培養し、多数の不死化細胞株を作製した。また不死化細胞株に活性化H-ras遺伝子を導入して悪性形質転換細胞株を樹立した。不死化細胞では、全例がヌードマウスで造腫瘍性が見られなかったが、H-ras形質転換細胞株は全例造腫瘍性を示した。(2) UV照射後、正常、不死化細胞ではG1 arrestが見られたが、H-ras形質転換株ではarrestは見られなかった。(3) UV照射後のいずれの細胞でもp53が過剰発現し、それは蛋白の半減期の延長によるためであった。(4)染色体数については、悪性化の段階の進んだものほど染色体不安定化が進んでいた。

したがって、もし、この機能が失われると細胞は障害を持ったままDNAを複製するため、染色体異常や突然変異を生じやすくなり、細胞癌化の原因となりうる。このような遺伝子不安定性を防止する機能の一つとして、p53、p21^<Cipl(WAF1)>、cdk,Rbなどが関与するGl arrestが知られている。しかし、このようなcell cycle checkpoint能が多段階発癌の中で起こるか否か、さらにP53を含むシグナル伝達のどの異常によるのかはわかっていない。マウスの初代培養肝細胞では長期培養を続けると自然に不死化細胞が出現し、さらにこれに活性化ras遺伝子を導入すると可移植性悪性形質転換細胞が得られる。したがって、この系を用いることにより、共通にマウス肝細胞のbackgroundを持つ正常、不死化、悪性形質転換細胞についてDNA障害後のcell cycle checkpoint機能の比較が可能である。我々のこれまでの研究では正常から不死化の段階ではcell cycle checkpoint能は維持されているが、H-ras形質転換細胞では著しく低下していることが明らかになった。すなわち、正常、不死化、H-ras形質転換細胞ではいずれも正常p53遺伝子を有しており、UV照射後、核内にp53が過剰発現した。一方、正常、不死化肝細胞ではUV照射後Gl arrestに陥ったが、H-ras形質転換細胞ではp53が発現したにもかかわらずGl arrestは見られなかった。本年度は(1)発現調節が可能なvectorに活性化H-ras遺伝子を組み込み、不死化肝細胞に導入し、H-ras形質転換細胞株を作製した。これにより活性化H-rasの発現が直接的にGl arrest能の喪失に関わっているか否かの検討が可能になった。(2)マウス肝癌細胞株、H-ras導入不死化細胞株についてUV照射後の生存能を比較し、H-rasの活性化によりUV耐性になることを明らかにした。
モルテン・グロビュール構造安定化に寄与する疎水相互作用の特異性

蛋白質のフォールディング初期に蓄積するモルテン・グロビュール(MG)構造の安定化には疎水相互作用が重要であることが知られている。その相互作用の範囲や特異性を明らかにするため、ウマβラクトグロブリン(ELG)を用いて研究を行なった。1.MGの立体構造において埋没した芳香族側鎖の同定MG状態において近紫外部の円二色性(CD)スペクトルを示す残基は異方的な環境にあり、疎水性のコアに埋没していると考えられる。このような残基を同定するため5個あるTyr残基を一つずつPheに置換した変異体を作製し、そのCDスペクトルを測定した。その結果、Tyr102が埋没していることが明らかとなった。2.MGコア構造安定化に寄与する相互作用MGコア構造の安定化にCys106-Cys119のS-S結合がいかに寄与しているかを明らかにするため、S-S結合の還元に伴うヘリックス含量の変化を調べた。S-S結合の還元に伴いヘリックス含量は著しく減少し、S-S結合がヘリックスの安定化に重要であることが示された。また、コア部分の一部に相当するペプチドを合成し、ペプチドをS-S結合で連結した場合にヘリックスが誘起されるか確認した結果、ヘリックスは誘起されなかった。これらの結果を総合して考えると、1)コア領域に存在するヘリックス問には疎水相互作用が働き、ヘリックスを安定化する、2)S-S結合相互の実効濃度を高めるため、結果的にヘリックスを安定化すると結論された。ELGは酸性pHでMG状態をとる。この状態は温度を下げると鎖状で広がった分子形態を持ちながらもヘリックス含量の増加した状態(C状態)へと変化する。同じようなヘリックス含量の増加はELGが持つ2つのジスルフィド結合の1つを欠損した変異体において、低塩濃度条件で静電反発により分子を拡張することによっても観測されている。これらの現象はMG状態のコンパクトな分子形態と二次構造の少なくとも一部(βシート)は疎水相互作用によって安定化されており、分子が拡張するとともに局所的な二次構造形成傾向が優位となりヘリックス構造へと変化するものと解釈できた。そこで、この仮説を検証するために、ELGのMG状態およびC状態でヘリックスを形成している領域に相当するペプチド・フラグメントをいくつか作製し、これらフラグメントにヘリックス構造が形成されるか否かを調べた結果、ペプチドはいずれもヘリックスを形成しなかった。さらに、ELGのMG状態とC状態において二次構造の存在が示唆された領域全て(55残基)を包含するフラグメントCHIBLを大腸菌で発現させた。プロリンに置換実験の結果、CHIBLの二次構造はC状態のそれに近いものであると考えられた。先に述べた短いペプチドの結果とも併せると、CHIBLに見られるヘリックスは各ヘリックス単位内の相互作用では十分に安定化しないが、CHIBL領域の相互作用で形成されると考えられる。また、CHIBLは温度変化や塩濃度の変化によってもMG様の構造に変化しないことから、MG状態の構造はCHIBL配列以外の配列を必要とすることが明らかとなった。