hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光を検出原理とした新規プロテインキナーゼ活性検出法の開発とその医薬への応用

プロテインキナーゼは、細胞内情報伝達において主要な役割を果たし、生命活動の維持や疾病の発現に関与する重要な酵素である。本研究の目的は、プロテインキナーゼの蛍光アッセイ法の開発である。既に、リン酸化セリン・トレオニンの化学反応性を利用し、オンビーズでのセリン・トレオニンキナーゼ活性の蛍光検出に成功しているが、オンビーズアッセイには欠点(分子量の大きなキナーゼに適用できない)があった。そこで、本年度は、オンビーズアッセイの欠点を克服して、より汎用性の高いアッセイ法とするため、検出原理のペプチドアレイへの適用を目指した。アレイ用の蛍光検出器に適用可能かつリン酸化検出に適した蛍光試薬の開発を進め、新規ローダミン誘導体の開発に成功した。開発した試薬を用い、セルロースメンブレン上に作製したペプチドアレイを用いてセリン・トレオニンキナーゼの活性検出を行った。プロテインキナーゼA(PKA)及びAkt-1という2種のキナーゼの活性検出に成功した。Akt-1の分子量は、オンビーズアッセイには適用できない大きさであるため、ペプチドアレイを用いることで、オンビーズアッセイの欠点を克服できたといえる。次に、PKAに対する2種の阻害剤の評価を試みた。その結果、いずれの阻害剤も妥当な阻害活性を示し、本検出法が阻害剤スクリーニングに適用しうることが明らかとなった。ガラス基板上に作製したペプチドアレイについても、リン酸化ペプチドを検出できることを確認しており、今後、キナーゼアッセイへ展開する予定である。以上のように、本年度は、これまでのオンビーズアッセイの欠点を克服し、様々なキナーゼの活性検出や阻害剤のハイスループットスクリーニングへの適用に期待できる結果を得た。
ミトコンドリアDNA多型と黒毛和種の育種選抜

黒毛和種は我国が誇る唯一の経済的・実用家畜である。その特性は、高品質の牛肉を生産することである。現在までの所、この高品質牛肉を生産する事に関わる原因遺伝子は明らかにされていないが,研究の中心は核遺伝子の検索に置かれている。我々は、もう一つの遺伝子を持つミトコンドリアに注目し,研究を行なっている。黒毛和種はミトコンドリアのD-loopの塩基配列によって、5グループに区分できる。5タイプについて,生産形質との関連を見ると,タイプ4が肉質の向上に関連する事が確かめられた。そこで,繁殖現場でのミトコンドリア・タイプの効果を見るため、1)約8000頭の雌牛よりデータを収集し、ミトコンドリアD-loopの塩基配列によって雌牛を分類した。グループ間で経済形質の差の有無を検討した。全体的に見ると環境効果に相殺されて、ミトコンドリア・タイプの効果は顕著ではなかったが、兵庫県の集団では28ヶ月齢未満の個体で,効果が認められた。D-loopは遺伝子のコード領域ではないので、タイプ4のD-loop型と関連する(ハプロタイプを形成する)突然変異が残りのミトコンドリア領域に存在する可能性がある。そこで、2)タイプ毎に2個体を選び出し、それらについてミトコンドリアの全塩基配列を決定した。その結果、14箇所の塩基置換が発見された。タイプ4に特異的な置換は16SrRNA内で見つかり、他のタイプでは発見されなかった。現在の所、この突然変異がどのような生理的作用を及ぼしているかは明らかではないが、今後検討を要する。3)黒毛和種のミトコンドリアの区分が判明したので、約1000頭の我国ホルスタイン種を分析した所、我国のホルスタイン種は西洋の同品種と異なって、在来土着牛のミトコンドリアを受継いでいる個体が半数近くに上る事が明らかとなった。以上,ミトコンドリア・ゲノムの分析を集中的に行なった結果、様々な重要な,発見が為され、今後の我国のウシ品種の育種改良を行なう上での貴重な情報が得られた。それらは近日中に論文として発表する予定である。我国の代表的な肉牛品種である黒毛和種について、そのミトコンドリアの遺伝的変異を調査した。その結果、黒毛和種はミトコンドリアのD-loopの塩基配列から2グループ、5タイプに区分されることが示された。5タイプ間で枝肉形質を比較した所、タイプ4では脂肪交雑やロース芯面積で他のタイプより優れていることが示された。本研究では、この形質による黒毛和種の育種選抜の可能性を探るため、現場の繁殖集団についてこの事実の確認を行なう作業を試みた。この作業に先立って、数千頭規模のウシのミトコンドリアDNAD-loop領域の塩基配列によるタイピングを行なうため、PCR-SSCP法の導入を行ない、その分析を可能にした。また、ミトコンドリアは母系遺伝をするので、繁殖集団をその血統によりグループ化し、雌家系の構築することによって、母系を代表する個体のDNAを調査することで、分析頭数の削減を試みた。

この方法を採用することで、宮崎県の繁殖集団では2889頭、兵庫県では4000頭、鳥取県を代表する家系は岩手県で入手したが、岩手県では1346頭の枝肉情報を用いた分析を行なった。現実の繁殖集団では予想していたような結果は得られなかった。その理由は、有意な効果の認められた集団が25ヶ月の集団であるに対して、現場の集団が平均28ヶ月を超えるものであったことが原因であると考えられた。実際の肥育牛は28ヶ月を越えていて、25ヶ月の該当牛を探すことは困難であったが、あえて、そのような牛群を兵庫県の集団から探し出し、分析を加えた。その結果、予想通り、タイフ4が脂肪交雑で他のタイプより優れている結果が得られた。今後、肉牛の肥育期間が短縮される傾向にあるので、ミトコンドリア・タイプの持つこの効果は今後の育種改良において、有用な指標のーつとなるものと考えられる。黒毛和種は我国が誇る唯一の経済的・実用家畜である。その特性は、高品質の牛肉を生産することである。現在までの所、この高品質牛肉を生産する事に関わる原因遺伝子は明らかにされていないが,研究の中心は核遺伝子の検索に置かれている。我々は、もう一つの遺伝子を持つミトコンドリアに注目し,研究を行なっている。黒毛和種はミトコンドリアのD-loopの塩基配列によって、5グループに区分できる。そのうちの1タイプは我国のウシ固有の塩基配列である。5タイプについて,生産形質との関連を見ると,タイプ4が肉質の向上に関連する事が確かめられ、特に28ヶ月齢以下の固体で,効果が認められた。D-loopは遺伝子のコード領域ではないので、タイプ4のD-loop型と関連する(ハプロタイプを形成する)突然変異が残りのミトコンドリア領域に存在する可能性がある。そこで、タイプ毎に2個体を選び出し、それらについてミトコンドリアの全塩基配列を決定した。その結果、タイプ4に特異的な変異が発見された。それは16SrRNA内での塩基置換であって、タイプ4に共通するもので、他のタイプでは発見されなかった。現在の所、この突然変異がどのような作用を有しているかは明らかではないが、ミトコンドリア蛋白質の合成に何らかの作用を及ぼしている可能性はある。この他、同義的置換が6箇所、非同義的置換が5箇所発見された。これらの塩基置換はこれまで、報告されておらず。特に非同義的置換がどのような生理的な影響を及ぼしているかは興味深い。
開眼手術後における視運動系による歩行活動の発生・成立過程に関する実験心理学的研究

本研究は、日常場面の行動を誘導・調整する視・運動系活動の形成過程について明らかにすることを最終的な目的とし、科学研究費が採択されたこの2年間は、主に9歳のときに開眼手術を受けた女性ToMについて、触覚に依拠する段階を離れて視覚を通して身体を移動(歩行)する行動の発生・成立過程を確定したいと考えた。むろんひとくちに歩行行動といっても、それはいくつかの下位機能群に支えられて初めて成立すると考えられ、本研究ではそれらを、(1)遠方視機能、(2)即時視機能、(3)移動物体視機能、(4)奥行視機能、(5)歩行認知地図作製機能の5つとし、各々の機能形成を図ると同時に、随時ToMに屋外をガイドなしで歩いてもらい、その状況を観察し状況に応じて新たに課題を組み込んでいった。2年間の一連の実験の結果、歩行行動の下位機能と想定した遠方視機能、即時視機能、移動物体視機能、奥行視機能、歩行認知地図作製機能の各々の形成をある程度図ることができ、その結果、各機能の成立メカニズムを推定することができた。同時に、それらの下位機能群がどのように組み合わされたときに日常場面の歩行行動が成立するかについてもある程度明らかになってきた。他方、ToMの屋外歩行の状況を観察すると、当初予想した5つの下位機能の他に新たな機能形成が必要であることがわかった。そのひとつが眼球運動を統制する機能形成である。この機能は、物体の認知水準に対応することが示唆された。2人の開眼受術者ToMとKaMについて歩行活動ならびにそれを支える下位機能の形成実験を行った。I.開眼受術者ToMについて(1)眼による“深みの知覚"が成立していないために、歩行の際、下がり階段の発見が困難であった。駅や公園において下り階段を発見するためにどのような手がかりを抽出するかについてデータを集積した。(2)視方向に変えて同一対象を等距離に提示すると、その対応率は方向によつて同一ではなかった。実験日による変化の様子を追跡した。(3)普段歩いている場所で視覚による遠方対象の把握が可能になると、その場所の構造把握に一定の変化が現れてくる。(4)遠方対象を捉えるときの眼球運動をEOG法によって測定した。対象の提示距離を遠方にすると不随意的な眼球運動が現れてくる。II.開眼受術者KaMについて(1)2つの対象の“遠近の知覚"は、対象の提示距離によってその知覚様相が変化する。(2)歩行の際、場所によって視覚あるいは視覚のいずれかに依拠する。9歳のときに開眼手術を受けて現在24歳になる女性(ToM)について、触覚に依拠する段階を離れて視覚を通した身体移動(歩行)行動の成立過程を明らかにしたいと考え、本年度は、(1)遠方視機能、(2)即時視機能、(3)歩行認知地図作製機能の3つの機能形成を当面の目標とした。これに加えて、(4)随時ToMに屋外をガイドなしで歩いてもらい、道路上の陰の認知及び下り階段の発見が眼で可能かどうかを主要なポイントにしてToMの歩行状況を観察した。研究成果の概要は次のとおりである。(1)遠方視機能:識別距離を拡大するためにいくつかの方策を実施した結果、事前教示と対象定位を輔ける方策が有効であることが示唆された。(2)即時視機能:対象を素早く捉えるためには眼球を統制して動かす機能を形成することが必要ではないか、という観察事実に基づいて、種々の条件の下でEOGによって眼球運動の記録を行い、その状況を分析した。一連の実験結果から対象の認知が容易になれば徐々にその眼球運動が統制されていくことが示唆された。(3)歩行認知地図作製機能:特定の場所について探索を繰り返すとその場所に関する座標軸や方位軸が形成されていき、その経過に対応して認知地図が正確になっていく。

いったんそのような座標軸や方位軸の形成の仕方を知ると、場所の探索回数が少なくともその認知地図をほぼ正確に描くことができるようになる経過がほぼ確定できた。ToMに屋外をガイドなしで歩いてもらうと、陰の認知は前年度に比較すると可能になっていった。これに対し、下り階段の発見は依然として困難であった。ただし、階段の種類によってそれを発見する手がかりを作るようになり、その探索回数が増えるに従いその手がかりは変化していくことがわかった。
マイクロバブルの非線形力学とその生体組織に及ぼす影響

1.レーザトラッピング法を用いたマイクロバブルの力学解析(1)マイクロバブルに作用する光学力を算出した.鉛直方向の光学力は110mWのレーザ出力に際して約90pNであった.(2)マイクロバブルが,レーザ捕捉されるまでの軌跡およびレーザ捕捉を逃れる際の軌跡をシミュレートした結果,実験結果と良い一致を示した.(3)固体境界近傍でマイクロバブルのレーザ捕捉を行うとともに,せん断流れ場中で,マイクロバブルがレーザ捕捉域を逃れる際の軌跡を解析した結果,せん断流れ場中でマイクロバブルの軌跡は,その初期半径に大きく依存すること等が示された.(4)マイクロバブルの安定性に及ぼす内部気体の拡散と表面張力の影響を検討した結果,超音波造影剤用のマイクロバブルの表面張力は,水-空気系の表面張力よりも約1/800に低下していること,単一ならびに合体後のマイクロバブルには,収縮するか膨張するかを決定する臨界半径が存在すること等が示された.2.境界要素法を用いた微小気泡の崩壊挙動の解析内部気体の熱移動を考慮しつつ,マイクロジェット貫通後のトロイダル気泡の力学を解析する数値計算手法を開発した.本手法を用いて,固体境界ならびに生体を模擬した弾性境界近傍での微小気泡の崩壊挙動を解析し,以下の知見を得た.(1)微小気泡の崩壊過程では,気泡内部の熱移動のために崩壊が促進され,ジェット貫通後は気泡周囲に局所的な高圧領域が形成される.(2)内部気体の熱移動を線形近似することにより導出した有効ポリトロープ指数は,定性的な気泡崩壊挙動を予測するには有効である.しかし,気泡崩壊時の最大圧力等を評価するためには,内部の熱移動を厳密に扱う必要がある.(3)弾性壁の特性により,気泡が初期位置にて崩壊する中立崩壊条件が存在する.この条件は,気泡内部の気体の熱移動を厳密に評価した場合とポリトロープ変化を仮定した場合とで異なる.1.レーザトラッピング法を用いたマイクロバブルの力学解析(1)マイクロバブルに作用する光学力を算出した.鉛直方向の光学力は110mWのレーザ出力に際して約90pNであった.(2)マイクロバブルが,レーザ捕捉されるまでの軌跡およびレーザ捕捉を逃れる際の軌跡をシミュレートした結果,実験結果と良い一致を示した.(3)固体境界近傍でマイクロバブルのレーザ捕捉を行うとともに,せん断流れ場中で,マイクロバブルがレーザ捕捉域を逃れる際の軌跡を解析した結果,せん断流れ場中でマイクロバブルの軌跡は,その初期半径に大きく依存すること等が示された.(4)マイクロバブルの安定性に及ぼす内部気体の拡散と表面張力の影響を検討した結果,超音波造影剤用のマイクロバブルの表面張力は,水-空気系の表面張力よりも約1/800に低下していること,単一ならびに合体後のマイクロバブルには,収縮するか膨張するかを決定する臨界半径が存在すること等が示された.2.境界要素法を用いた微小気泡の崩壊挙動の解析内部気体の熱移動を考慮しつつ,マイクロジェット貫通後のトロイダル気泡の力学を解析する数値計算手法を開発した.本手法を用いて,固体境界ならびに生体を模擬した弾性境界近傍での微小気泡の崩壊挙動を解析し,以下の知見を得た.(1)微小気泡の崩壊過程では,気泡内部の熱移動のために崩壊が促進され,ジェット貫通後は気泡周囲に局所的な高圧領域が形成される.(2)内部気体の熱移動を線形近似することにより導出した有効ポリトロープ指数は,定性的な気泡崩壊挙動を予測するには有効である.しかし,気泡崩壊時の最大圧力等を評価するためには,内部の熱移動を厳密に扱う必要がある.(3)弾性壁の特性により,気泡が初期位置にて崩壊する中立崩壊条件が存在する.この条件は,気泡内部の気体の熱移動を厳密に評価した場合とポリトロープ変化を仮定した場合とで異なる.上記研究課題に関する研究を以下のごとく行った.1.マイクロバブルのレーザ捕捉と散乱理論を用いた気泡サイズの測定レーザマニピュレーション法を用いて,非接触かつ3次元的にマイクロバブルの捕捉およびマニピュレーションを行い,マクロバブルに働く光学的な捕捉力を検討した.また,Mie散乱理論を用いてレーザの散乱強度と気泡径との関係を調べた.その結果,以下のような知見を得た.(1)本レーザトラッピング法における鉛直(光軸)方向の拘束力を評価したところ,正味約110mWのレーザ出力で約90pNの力が作用していることがわかった.(2)捕捉したマイクロバブルに水平方向の抗力を加え,抗力と光学力との釣り合いから水平方向のレーザ捕捉力を評価した.水平方向の捕捉力が極値をとる位置よりも下方にマイクロバブルが捕捉されている場合は,ほぼ気泡半径の二乗に比例して水平方向捕捉力は増加する.しかし,半径の増加とともに,マイクロバブルの捕捉位置が,水平方向捕捉力が極値をとる位置よりも上昇すると,逆に水平方向捕捉力は減少する.(3)マイクロバブルに作用するレーザ捕捉力は,中空円錐状のレーザのカーテンの厚みが薄いほど強くなる.(4)浮上してきた気泡が捕捉に至るまでの軌跡ならびにマイクロバブルがレーザ捕捉を逃れる際の軌跡をシミュレートした結果,実験の軌跡と良い一致を示した.

(5)気泡半径が15ミクロン以下の場合の,レーザの散乱強度と気泡半径との校正曲線を得た.2.境界要素法を用いた気泡の崩壊挙動の解析境界要素法を用いて生体等を模擬した複合境界(弾性体モデルなどで構成)と気泡との相互干渉を解析するとともに,気泡内部の熱過程が気泡の大変形に及ぼす効果を解析した.その結果,以下の知見を得た.(1)複合境界の質量,ばね係数を適切に選ぶことにより,気泡が初期位置を保ったまま崩壊(中立崩壊)する状況が実現される.(2)気泡内部に非構造格子を用いて,内部気体の熱過程を考慮しつつ,大変形する気泡の崩壊挙動に適用可能な数値計算手法を開発した.本手法には十分な計算精度があり,マイクロジェット貫通前後の気泡崩壊を扱えることが示された.I.レーザトラッピング法を用いたマイクロバブルの力学解析(1)Mie散乱理論を用いて光散乱強度とレーザ捕捉された気泡の半径との関係を調べた.捕捉されたマイクロバブル以外の気泡からの散乱光を排除するために観測倍率を上げたことが原因で,気泡半径が大きくなると,光散乱強度が飽和する傾向が見られた.そこで,より大きなマイクロバブルに対して散乱理論を適用するために,毛細管を利用して数密度を制御しながらマイクロバブルを発生させる方法を検討した.(2)血管内のせん断流れ場とマイクロバブルとの相互干渉を解析するための第段階として,固体境界近傍でマイクロバブルのレーザ捕捉を行った.固体境界(カバーガラス)下方でのレーザ捕捉力を検討した結果,鉛直および水平方向レーザ捕捉力は,カバーガラスなしで自由界面の下方で捕捉した場合とほぼ同じであることが示された.また,固体境界近傍で鉛直方向にレーザマニピュレーションを行い,壁面から約50ミクロンの位置までマイクロバブルを近づけられることを示した.(3)せん断流れ場中で,マイクロバプルがレーザ捕捉域を逃れる際の軌跡をシミュレートした.同じせん断流れ場では,気泡径が小さいほど,下方に大きくはじかれ捕捉を逃れること等が示された.II.境界要素法を用いた微小気泡の崩壊挙動の解析気泡内部に非構造格子を用いて,内部気体の熱移動を考慮しつつ,マイクロジェット貫通後のトロイダル気泡の力学を解析する数値解析手法を開発した.本手法を用いて,固体境界ならびに生体を模擬した弾性境界近傍での微小気泡の崩壊挙動を解析し,以下の知見を得た.(1)微小気泡の崩壊過程では,気泡内部の熱移動のために崩壊が促進され,ジェット貫通後は気泡周囲に局所的な高圧領域が形成される.また,気泡の膨張過程では内部に局所的な低温領域が形成される.(2)内部気体の熱移動の影響を線形近似することにより導出した有効ポリトロープ指数は,定性的な気泡崩壊挙動を予測するには有効である.しかし,気泡崩壊時の最大圧力や再膨張後のトロイダル気泡を解析するためには,内部の熱移動を厳密に評価する必要がある.I.レーザトラッピング法を用いたマイクロバブルの力学解析(1)血管内のせん断流れ場とマイクロバブルとの相互干渉を解析するために,固体境界近傍でマイクロバブルのレーザ捕捉を行うとともに,せん断流れ場中で,マイクロバブルがレーザ捕捉域を逃れる際の軌跡を理論的に解析した.その結果,せん断流れ場中でマイクロバブルの軌跡は,その初期半径に大きく依存すること等が示された.(2)直径100μm以下の微小毛細管を用いて,数密度を制御してマイクロバブルを発生させる方法を考案するとともに,微小毛細管から噴出されたマイクロバブルがレーザ捕捉される様子をシミュレートした.
ヘテロ元素含有電子求引性ユニットの開発と機能性高分子材料への応用

これまでの研究より、電子親和性の高いホウ素原子を有するボロンキノレート誘導体を共役主鎖内に含んだ高分子が、汎用性の高い電子輸送材料であるAlq3とほぼ同程度の優れた電子移動度を示すことを明らかにしている。ここで、アザボロンジピロメテンホウ素錯体(Aza-BODIPY)はボロンキノレートに比べ拡張した共役系を有していることから、既存の高分子よりもさらに優れた電子移動度の発現が期待できる。そこで本研究ではAza-BODIPYを含有した共役系高分子を合成し、その電子輸送特性を評価した。電子求引性の無機元素錯体と電子供与性のコモノマーとの交互共重合体を作成することで、分子内電荷移動(CT)に基づいた強発光・狭バンドギャップを有する高分子材料の作成を狙う。また、電荷輸送材料としての評価も行う。具体的には、ジケトネート、メタロフルオレン、ベンゾキノリン骨格を配位子として、重金属元素や電子求引性を示す3価の13族元素、高配位ケイ素を含む錯体等、特にホウ素以外のモノマーを用い、それらを含む共役系高分子の合成を目指す。電子求引・供与性モノマーによる交互共重合体は、CTに由来した高輝度発光や狭バンドギャップによる赤色・近赤外発光、ならびに高い電荷輸送性を持つ材料としてその有用性が注目されている。申請者は現在まで、無機元素含有錯体を利用することで、電子供与性モノマーの開発を目指し研究を進めてきた。その結果、可視光領域に及ぶ強い光吸収を示し、ホウ素の空のp軌道を介して共役系が主鎖に沿って拡張していることが明らかとなった。次に、高い電子輸送性と発光性を示すトリス(キノラート)アルミニウム(Alq3)の構造を基に、BPh2qというホウ素錯体を設計し、高分子を合成した。得られた物質はAlq3と同程度の電子輸送能を有しつつ、成膜性や安定性に優れていることが明らかとなった。これらの研究を進める中で、有機ホウ素化学における高分子合成論、反応論、電子構造論という学問領域を発展させることや、特にホウ素錯体が電子求引性ユニットとして働きCTによる高輝度発光や高効率で電子輸送が可能な実用的にも有用性の高い物質を生み出すことができた。本研究では、さらに高機能性材料を得るとともに、ヘテロ元素含有共役系高分子の可能性を拡げることを指向して、特にホウ素以外の元素に着目し、共役系の構築を基盤として新規物質探索を行うものである。今年度はホウ素含有高分子の開発と発光材料への応用を目指した。当研究室ではこれまでに有機ホウ素錯体の優れた発光特性と、特にケトイミンホウ素錯体を含有した共役系高分子が凝集誘起型発光を示すことを報告している。一方で、ケトイミンホウ素錯体の酸素原子を窒素原子に変えたジイミンホウ素錯体やそれを基盤とした誘導体の光学特性に関する報告は少ない。そこで、本研究ではジイミンホウ素錯体を含有した共役分子を合成し、その光学特性を紫外可視吸収スペクトル、発光スペクトルにより評価した。実験の結果、ジイミンホウ素錯体を基盤としたAIE性共役系高分子の合成に成功した。得られたジイミンホウ素錯体誘導体はジイミンホウ素錯体部位の分子運動による無放射失活が固体状態で抑制されるとこでAIEE特性が発現した。さらに、分子がねじれた骨格を有することにより、結晶状態に比べてアモルファス状態でのベンゼン環同士の強いπ-πスタッキングが生じることでCIEE特性が発現した。CIEE特性を利用することで熱や溶媒蒸気などの外部環境変化により発光特性の調節が期待できる。これらの結果を元に、刺激応答性固体発光材料の創出が可能である。以上のことから本研究テーマの目標を十二分に達成できたといえる。電子求引性の無機元素錯体と電子供与性のコモノマーとの交互共重合体を作成することで、分子内電荷移動(CT)に基づいた強発光・狭バンドギャップを有する高分子材料の作成を行った。具体的には、ジケトネート、メタロフルオレン、ベンゾキノリン骨格を配位子として、重金属元素や電子求引性を示す3価の13族元素、高配位ケイ素を含む錯体等、特にホウ素以外のモノマーを用い、それらを含む共役系高分子の合成を目指した。今年度はガリウム含有高分子の開発と発光材料への応用を目指した。一方で、ジケトン錯体の酸素原子を窒素原子に変えたジイミン錯体やそれを基盤とした誘導体の光学特性に関する報告は少ない。そこで、本研究ではジイミンガリウム錯体を含有した共役分子を合成し、その光学特性を紫外可視吸収スペクトル、発光スペクトルにより評価した。

実験の結果、ジイミン錯体を基盤としたAIE性共役系高分子の合成に成功した。得られたジイミン錯体誘導体はジイミン錯体部位の分子運動による無放射失活が固体状態で抑制されるとこでAIEE特性が発現した。さらに、分子がねじれた骨格を有することにより、結晶状態に比べてアモルファス状態でのベンゼン環同士の強いπ-πスタッキングが生じることでCIEE特性が発現した。CIEE特性を利用することで熱や溶媒蒸気などの外部環境変化により発光特性の調節が期待できる。これらの結果を元に、刺激応答性固体発光材料の創出が可能である。以上のことから本研究テーマの目標を十二分に達成できたといえる。これまでの研究より、電子親和性の高いホウ素原子を有するボロンキノレート誘導体を共役主鎖内に含んだ高分子が、汎用性の高い電子輸送材料であるAlq3とほぼ同程度の優れた電子移動度を示すことを明らかにしている。ここで、アザボロンジピロメテンホウ素錯体(Aza-BODIPY)はボロンキノレートに比べ拡張した共役系を有していることから、既存の高分子よりもさらに優れた電子移動度の発現が期待できる。そこで本研究ではAza-BODIPYを含有した共役系高分子を合成し、その電子輸送特性を評価した。ホウ素原子を含む共役系高分子はホウ素の特異な性質に起因して高い発光特性やn型半導体特性を示すことが知られており、有機電子材料への応用が期待されている。有機ホウ素錯体の一種であるボロンジケトネートは高い安定性と優れた蛍光・燐光発光特性を示し、ボロンジケトネートを共役系主鎖内に有する高分子においても優れた蛍光発光特性を示す。誘導体であるボロンケトイミネートはボロンジケトネートと同様に優れた蛍光・燐光発光特性を示すと考えられ、さらに窒素原子上の置換基を変化させることによってその電子状態を容易に調整可能であることからボロンケトイミネートを含有した共役系高分子はボロンジケトネートと同様に優れた有機発光材料として期待できる。しかしながら、ボロンケトイミネートの発光特性についての報告例は少なく、共役系高分子内に導入した例はほとんど無い。本研究ではボロンジケトネートまたはボロンケトイミネートを用いてフルオレンを主鎖内に含む共役系高分子を合成し、その蛍光・燐光発光特性を発光スペクトル測定により調べた。また、ボロンケトイミネートの窒素原子上に異なる置換基を導入し、その置換基効果によるポリボロンケトイミネートの発光特性についても検証した。得られたポリマーのフィルム状態では溶液状態に比べ発光強度が増強し、凝集誘起型発光性が確認された。さらに、黄色から青緑色発光を共重合体変化により得ることができた。以上の結果からボロンジケトネートの誘導体を共役系高分子主鎖内に含んだポリマーは特異な多種発光性を示すことが分かった。加えて、今回合成したポリマーは固体状態においても高い発光特性を有することから有用な有機発光材料としての応用が期待できる結果を得たことから、目標を十二分に達成することができたといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。高分子合成高配位ガリウム錯体を主鎖に含む高分子を作り出すことを目指す。実験手順としては、まず強固な配位結合の実現のために、ベンゾキノリン配位子を導入し安定な高配位状態の形成を目指す。高分子主鎖にはガラフルオレンやジベンゾガレピンによる共役系を構築し、ガリウム原子との相互作用の実現を図る。
OFDMベースバンド伝送方式を活用した無線ネットワークの広域化・低消費電力化

本研究では,無線センサネットワークエリアの広域化および送信機の長寿命化(低消費電力化)に主眼を置き,スペクトル拡散方式(M-ary SS方式)を活用したOFDMベースバンド伝送方式(エルミート対称符号化OFDM方式)の電力利用効率ならびに回線利用効率を明らかにすることを目的としている.2017年度は電力利用効率(ビット誤り率)に主眼を置いて検討したが,2018年度は回線利用効率(スループット)とのバランスも考慮に入れながら,マイコン開発ボードやシングルボードコンピュータを用いた実験的検討ならびにコンピュータシミュレーションを用いた検討を進めた.実験的検討に関しては,無線センサネットワークを柔軟に構築することを目的として,可視光伝送系やFMステレオ伝送系,超音波伝送系の3種類の無線伝送系を構築し,提案方式のビット誤り率特性およびスループット特性を取得した.その結果,いずれの伝送系においても提案方式の有効性が確認できた.また,モノのインターネット(Internet of Things: IoT)への提案方式の活用を目的とした検討,すなわち,廉価なマイコンへの提案方式の実装を考慮した検討も進めた.具体的には,OFDMベースバンド伝送方式として,高速フーリエ変換(FFT)に基づくOFDM方式だけでなく,Wavelet変換に基づくOFDM方式についても検討した結果,後者の方が無線信号処理の計算負荷が軽いことがわかり,スループット特性の改善につながることが確認できた.さらに,Android端末への提案方式の実装についても検討も進めた.コンピュータシミュレーションを用いた検討に関しては,ビット誤り率特性およびスループット特性の双方の改善を目的としたM-ary SS方式の多値化方法を提案するとともに,誤り訂正符号化(LDPC符号化)や多シンボル遅延検波の導入に関して検討を進めた.当初の研究実施計画のうち,2017年度と2018年度に予定していた検討項目は概ね終了し,当初予定していなかった検討(ビット誤り率に関する理論的側面からの検討)も実施した.それらの検討結果が国際学会での発表3件,国内学会での発表7件の成果につながったことから,トータルとして「おおむね順調に進展している」と自己評価した.本研究の最終年度となる2019年度は,これまでの研究で得られた提案方式の有効性を十分に発揮するような制御方法について検討し,実験的検討を進める.電力利用効率の向上効果,すなわち,従来方式と同一の受信電力で伝送品質(ビット誤り率)を改善できる効果は,送信機の送信電力を低減させて同一の伝送品質を担保できること(送信機の低消費電力化)と等価であり,送信電力を維持して同一の伝送品質を担保できる伝送距離を延ばすこと(無線ネットワークエリアの広域化)とも等価である.また,後者に関しては,広域化に代わって回線利用効率の向上につなげることも可能であることから,無線ネットワークに関する様々な環境を想定した実証実験を実施する.さらに,本研究で提案しているM-ary SS方式は電波伝搬が安定的な環境(仲上ーライスフェージング環境)で効果が発揮される方式であるのに対して,電波伝搬が劣悪な環境(レイリーフェージング環境)ではM-ary SS方式よりも繰り返し符号化方式の方が良好な特性が得られることが過去の研究から明らかになっている.実世界とサイバー空間が相互連携した社会(CPS/IoT社会)に対する期待は様々であり,必要とする無線ネットワークの形態も様々であることから,無線ネットワークエリアの広域化に関する発展的な検討として,繰り返し符号化方式の高効率化についても検討する.以上の検討で得られた知見を国内外の学会にて発表する.初年度は,無線ネットワークの広域化・長寿命化(低消費電力化)が見込めるスペクトル拡散方式(M-ary SS方式)に着目し,同方式をOFDMベースバンド伝送方式に適用したときの電力利用効率の特性について検討した.まず,M-ary SS/OFDM方式のコンピュータシミュレーションプログラムを作成した.具体的には,M-ary SS方式の送受信処理,すなわち,送信側で情報ビット列に応じたユニークな拡散符号(直交符号)を選択・送信し,受信側で全ての直交符号に対する相関処理後に最大値を検出して情報ビット列を復元する処理をOFDM変復調処理に応用して組み込んだ.また,無線回線における様々なフェージング状態を模擬できる仲上-mフェージングシミュレータを準備し,M-ary SS/OFDM方式における電力利用効率の特性を取得・解析するための計算機シミュレーションを実施できる環境を整えた.さらに,可視光伝送系だけでなく,ステレオFM伝送系や超音波伝送系を用いる実験の準備を進めた.センサネットワークを視野に入れた送受信端末として,マイコン開発ボードやシングルボードコンピュータにM-ary SS/OFDM信号処理を実装する環境を整えた.OFDMベースバンド信号処理の選択肢を増やすことを目的として,FFTではなくWavelet変換を用いた-OFDM方式(Wavelet-OFDM方式)を用いる準備も進めた.当初の計画のうち,平成29年度に実施する予定が実際には実施できなかった検討事項がある一方で,平成30年度に実施する予定の検討項目を前倒しで実施したものもある.具体的には,平成29年度に実施できなかった事項は「様々なフェージング環境を想定した計算機シミュレーションによる電力利用効率特性の取得・解析」である.一方,前倒しで実施した事項は「回線利用効率に関するコンピュータシミュレーションプログラムの作成」および「マイコン開発ボードやシングルボードコンピュータへの実装」である.上記の理由により,トータルとして「おおむね順調に進展している」と自己評価した.本研究では,無線センサネットワークエリアの広域化および送信機の長寿命化(低消費電力化)に主眼を置き,スペクトル拡散方式(M-ary SS方式)を活用したOFDMベースバンド伝送方式(エルミート対称符号化OFDM方式)の電力利用効率ならびに回線利用効率を明らかにすることを目的としている.

2017年度は電力利用効率(ビット誤り率)に主眼を置いて検討したが,2018年度は回線利用効率(スループット)とのバランスも考慮に入れながら,マイコン開発ボードやシングルボードコンピュータを用いた実験的検討ならびにコンピュータシミュレーションを用いた検討を進めた.実験的検討に関しては,無線センサネットワークを柔軟に構築することを目的として,可視光伝送系やFMステレオ伝送系,超音波伝送系の3種類の無線伝送系を構築し,提案方式のビット誤り率特性およびスループット特性を取得した.その結果,いずれの伝送系においても提案方式の有効性が確認できた.また,モノのインターネット(Internet of Things: IoT)への提案方式の活用を目的とした検討,すなわち,廉価なマイコンへの提案方式の実装を考慮した検討も進めた.具体的には,OFDMベースバンド伝送方式として,高速フーリエ変換(FFT)に基づくOFDM方式だけでなく,Wavelet変換に基づくOFDM方式についても検討した結果,後者の方が無線信号処理の計算負荷が軽いことがわかり,スループット特性の改善につながることが確認できた.さらに,Android端末への提案方式の実装についても検討も進めた.コンピュータシミュレーションを用いた検討に関しては,ビット誤り率特性およびスループット特性の双方の改善を目的としたM-ary SS方式の多値化方法を提案するとともに,誤り訂正符号化(LDPC符号化)や多シンボル遅延検波の導入に関して検討を進めた.当初の研究実施計画のうち,2017年度と2018年度に予定していた検討項目は概ね終了し,当初予定していなかった検討(ビット誤り率に関する理論的側面からの検討)も実施した.それらの検討結果が国際学会での発表3件,国内学会での発表7件の成果につながったことから,トータルとして「おおむね順調に進展している」と自己評価した.まずは当初の計画で平成29年度と平成30年度において実施予定としていた検討事項を中心に進める.具体的には,研究代表者らが過去に提案したディジタル変調の多値化方法をM-ary SS/OFDM方式に適用し,電力利用効率だけでなく回線利用効率とのバランスも考慮に入れながら,コンピュータシミュレーションを用いて伝送特性を取得・解析する.その結果を基に,提案方式全体の設計方針を決定する.次に,コンピュータシミュレーションで得られた提案方式の効果を実機を用いて実証する.実証実験の際には可視光伝送系,ステレオFM伝送系,超音波伝送系の3種類の無線回線を活用する.送受信端末として,サイバーフィジカルシステム(CPS)やモノのインターネット(IoT)を視野に入れ,なるべく低価格・小型でかつ相応の計算処理能力のあるマイコン開発ボードを選定して実装する.さらに,平成31年度で実施予定の検討事項についても前倒しでできるか検討する.
先進的放射線治療の確立に資する臨床試験放射線治療品質保証システムの開発

本研究では、臨床試験参加施設で行われた放射線治療内容を研究事務局が放射線治療計画解析ソフトを用いて評価することが可能か、技術面を含めてその実施可能性を確認した。ついで品質保証を実施するためのロジスティックスを検討し、今後益々その重要性が増す先進的放射線治療の多施設共同臨床試験を実施するために必要な放射線治療品質保証システムの運用体制を確立した。今後、国際協調も図りつつ先進的放射線治療を確立、推進するにあたり極めて重要な成果と考えられる。平成25年度の実績:臨床試験登録全例に対して放射線治療の品質保証を実施するためのロジスティックスの検討、システムの運用テストを行った。具体的には、厚生労働科学研究費補助金研究班と連携し、前立腺癌に対する強度変調放射線治療の多施設共同臨床試験に登録された症例を対象として、放射線治療内容を各参加施設の放射線治療計画装置からDICOM(Digital Imaging and COmmunications in Medicine)形式によるCT画像情報およびDICOM-RT(DICOM in RadioTherapy)形式による腫瘍、正常臓器等の輪郭情報、線量分布情報をデジタルデータとして出力し、各参加施設で個人情報を匿名化した登録症例のデータを収集し、放射線治療計画解析ソフト(VODCA-RT)を用いて評価した。2013年12月31日までに登録された84例中72例で研究事務局による評価が終了している。本研究は今後益々その重要性が増す先進的放射線治療の多施設共同臨床試験を実施するための基盤をなすものであり、国際協調も図りつつ先進的放射線治療を確立、推進するにあたり極めて重要である。臨床試験参加施設で行われた放射線治療内容を研究事務局が放射線治療計画解析ソフトを用いて評価できるか、技術面を含め実施可能性を確認した。厚生労働科学研究費補助金研究班と連携し、前立腺癌に対する強度変調放射線治療の多施設共同臨床試験の登録例において、放射線治療内容を各参加施設の放射線治療計画装置からDICOM(Digital Imaging and COmmunications in Medicine)形式によるCT画像情報およびDICOM-RT(DICOM in RadioTherapy)形式による腫瘍、正常臓器等の輪郭情報、線量分布情報を電子データとして収集し、放射線治療計画解析ソフト(VODCA-RT)により4施設5症例で正しく再現され、評価可能であることを確認した。本研究は今後益々その重要性が増す先進的放射線治療の多施設共同臨床試験を実施するための基盤であり、国際協調のもとで先進的放射線治療を確立、推進するにあたり極めて重要である。平成26年度の実績:臨床試験登録全例に対して放射線治療の品質保証を実施するためのシステム運用テストを行った。具体的には、厚生労働科学研究費補助金研究班と連携し、前立腺癌に対する強度変調放射線治療の多施設共同臨床試験に登録された症例を対象として、放射線治療内容を各参加施設の放射線治療計画装置からDICOM(Digital Imaging and COmmunications in Medicine)形式によるCT画像情報およびDICOM-RT(DICOM in RadioTherapy)形式をもちいて、腫瘍、正常臓器等の輪郭情報、線量分布情報をデジタルデータとして出力し、各参加施設で個人情報を匿名化した登録症例のデータを収集し、放射線治療計画解析ソフト(VODCA-RT)を用いて評価した。本年度までに登録78症例の評価を問題なく実施可能であった。また、ウィーンで開催された欧州放射線腫瘍学会にて本研究成果の発表を行うとともに、放射線治療品質保証国際協調グループ会議に参加し、各臨床試験・品質保証グループにおける品質保証体制に関する情報交換を行った。本研究により、今後益々その重要性が増す先進的放射線治療の多施設共同臨床試験を実施するために必要な放射線治療品質保証システムの運用体制を確立できた。放射線治療、品質保証研究計画通りに、臨床試験登録全例に対して放射線治療の品質保証を実施するためのロジスティックスの検討、システムの運用テストを行うことができた。また平成26年度には新たに肝臓癌に対する体幹部定位放射線治療の臨床試験においてシステムの運用テストを実施できる見込みとなった。連携する研究班の強度変調放射線治療の臨床試験で症例登録ペースが見込みよりもやや遅れたため、予定していた放射線治療計画装置の一部で確認作業が完了しなかったが、H25年度の前期には完了できる見込みである。その他は予定した計画通りに進んでおり、さらに別の研究班の定位放射線治療の臨床試験とも連携について合意を得た。平成26年度には強度変調放射線治療、定位放射線治療など先進放射線治療の多施設共同臨床試験と連携して放射線治療品質保証システムの運用テストを行い、恒常的な放射線治療品質保証システムの運用体制の確立を図る。また引き続き、世界の主要な放射線治療臨床試験グループにより平成23年度に設立された放射線治療品質保証の国際協調グループの会議に出席し、意見交換、情報収集を行うとともに、国際学会で本研究成果の発表を行う。平成25年度に、臨床試験登録全例に対して放射線治療の品質保証を実施するためのロジスティックスを検討する。その後、平成26年度にかけて強度変調放射線治療、定位放射線治療など先進放射線治療の多施設共同臨床試験と連携して放射線治療品質保証システムの運用テストを行い、恒常的な放射線治療品質保証システムの運用体制の確立を図る。

また平成25年度には、世界の主要な放射線治療臨床試験グループにより平成23年度に設立された放射線治療品質保証の国際協調グループの会議に出席し、意見交換、情報収集を行う。平成26年度には国際学会で本研究成果の発表を目指す。該当なし
酸化LDL受容体蛋白質LOX-1のリガンド認識機構の精密解明と診断技術への応用

酸化LDL受容体蛋白質LOX-1の基質認識機構を分子レベル・細胞レベルで解析した.LOX-1はホモ二量体で1つの受容体を構成するが,受容体1分子では十分な酸化LDL認識能をもたず酸化LDL認識には多量体形成が必要であることを明らかにした.細胞上では,膜貫通部にあるcys残基がパルミトイル化されることでリピッドラフト上に局在し集積構造を形成することを明らかにした.細胞毒性の低い鉄を使ったMRI造影技術も開発した.酸化LDLよりも強くLOX-1に結合するリポソームの調製も本研究で可能とし,このリポソームを利用する血管上のLOX-1造影法の基盤技術を確立した.酸化LDL受容体蛋白質LOX-1の基質認識機構を分子レベル・細胞レベルで解析した.LOX-1はホモ二量体で1つの受容体を構成するが,受容体1分子では十分な酸化LDL認識能をもたず酸化LDL認識には多量体形成が必要であることを明らかにした.細胞上では,膜貫通部にあるcys残基がパルミトイル化されることでリピッドラフト上に局在し集積構造を形成することを明らかにした.細胞毒性の低い鉄を使ったMRI造影技術も開発した.酸化LDLよりも強くLOX-1に結合するリポソームの調製も本研究で可能とし,このリポソームを利用する血管上のLOX-1造影法の基盤技術を確立した.本年度は,以下の研究項目を行った.1.LOX-1の大量調製技術の確立:LOX-1と酸化LDLとの相互作用解析を系統的に進めるために,LOX-1の細胞外領域のほぼ全長を含むフラグメントの大量調製法を検討した。これまで行っていた試料調製法では,不溶性顆粒として得られるLOX-1フラグメントを巻き戻して活性のあるタンパク質を得るために,refolding溶液に対して微量滴下する方法を利用していた.この方法では,精製するタンパク質量のスケールアップが困難であったため,本年度は,より簡便に大量に試料を得ることをめざして,段階的透析法を検討した.その結果,安定にホモニ量体を形成したLOX-1細胞外ドメイン蛋白質を得る条件を確立できた.2.LOX-1の細胞表層上でのクラスター形成制御機構・輸送機構の解明:LOX-1が細胞表層上でクラスターを形成することが酸化LDLの認識に必須であるとの知見を得た.また,クラスター形成にはlipid raft構造が関与していることを見出した.LOX-1受容体の細胞内輸送にはcaveolaeを利用する可能性を見出した.LOX-1の細胞内輸送の時間経過を解析した.その結果,典型的なcaveolae輸送とは異なる時間経過を示すことが取ることが見つかり,典型的なcaveolaeを用いた輸送系とは異なることを見出した.3.Fe^<3+>を利用するMRI画像法の検討:細胞毒性の少ないFe^<3+>を利用する画像法について検証した.細胞内での鉄の含量を定量的に計測する技術を確立し,LOX-1を対象とする系への適用を検討した.本年度は,以下の研究成果を得た.1. LOX-1に結合能を持つリポソームの調製:DOPGを用いてSUV(small unilamellar vesicle)を調製した.粒子サイズをLDL粒子よりもやや大きめの直径100nmのリポソームを調製することが可能となった.DOPGで表面電荷を負に帯電させているために,LOX-1に対して強い親和性を持つことが期待された.His-tagをN末端付加したLOX-1をCo2+-レジンに吸着させたプレートを準備し,酸化LDLと上記のDOPG-SUVとの間での結合競合実験を行った.その結果,DOPG-SUVは1分子あたり酸化LDLの100-1000倍の親和性を持つことか分かつた.これは,粒子サイズが大きいためにSUVの方が一度に多くのLOX-1と相互作用できるためと考えられる.さらに特異性をあげるためにApoB-100ペプチドをドープしたSUVの調製を進めている.2. LOX-1の細胞表面上でのクラスター形成機構:LOX-1がプラズマ膜上ではろlipid raft上に集積することを確認した.また,この集積過程にはLOX-1のパルミトイル化が関与すると考えたが,実験から,この可能性は否定された.LOX-1に対して高い親和性を示すApoB-100蛋白質中の酸化生成物が,両親媒性ヘリックス部のリジンがアセチル化されたものであることを実験的に明らかにした.3. MRI画像法の開発:フェリチンを用いたT2緩和時間の差に基づく画像法を確立した.また、フェリチンのアガロースゲル試料を用いてゲル中の水のT2緩和に対する鉄と、分子運動の寄与を分離する実験式を得た。これにより分子運動の制限された生体中においてもフェリチン鉄濃度を定量できる道が開けた。本年度はLOX-1の基質認識機能の精密化を進めLOX-1特異的に結合する人工リポソームの作成に成功した1.LOX-1の基質認識機構の精密解明:LOX-1が細胞上で集積構造を取る.この集積構造の酸化LDL認識おける役割を明らかにするために表面プラズモン共鳴法(SPR)を用いて,酸化LDL認識における集積構造の必要性を定量的に明らかにした.

この結果,LOX-1一分子では,細胞上で観測される結合能よりも4桁低い親和性しか持たないのに対して,streptavidinを介して人為的にLOX-1を集積化した場合には,細胞上で観測される酸化LDLに対する親和性を再現できた.この知見に基づいて,さらに金薄膜上の自己集積化単層膜を作成し,その上に配置したLOX-1受容体に対する酸化LDLの結合能測定したところ,細胞膜状でのLOX-1と同等の親和性を再現できた.また,単層膜上におけるLOX-1の量に応じて結合能が変化することも観測しており,この実験からLOX-1の集積構造が基質認識に必要であることを確認した.またこの測定系を用いて,単層膜リポソームにより酸化LDLの1000倍の結合能を持つ人工粒子の作成に成功した.2.LOX-1の集積構造形成機構と輸送機構の解明:LOX-1の膜貫領域内にあるCys36,並びにCys46がパルミトイル化されることにより効率的にラフトへ輸送されていることが明らかとなった。一方、LOX-1に取り込まれた酸化LDLが、細胞内輸送の初期過程において、ラフトを介した輸送系により取り込まれることが知られているCT-B(コレラトキシン・サブユニットB)と同一小胞内に存在することが共焦点レーザー顕微鏡でも確認された。3.MRI画像法の開発:含鉄タンパク質であるフェリチン分子を陰性造影剤として用いる場合の定量法について、フェリチンをアガロース、またはゼラチンのゲルに添加した場合の横緩和速度R2と鉄濃度[Fe]の間の実験式を1.5T,4.7T,11.7T,18.8Tの各磁場強度で求めた。この結果、R2と[Fe]の線形相関の係数は磁場に比例して増大することがわかった。上記人工LDL粒子によるMRI測定のトライアル実験を進めた.
公民権運動期以降のアフリカ系アメリカ文学における身体的経験としての痛みと親密性

本研究は、身体的経験としての痛みがどのように言語化されてきたか、という問題意識にもとづいてアフリカ系アメリカ文学の読み直しを図るものである。公民権運動時代以降に活躍している作家トニ・モリスン、ジェイムズ・ボールドウィン、マヤ・アンジェロウなどの作品における身体的な痛みの表象を、近年の脳科学や臨床医学において主張されている「記憶する身体」という視点から分析する。心と身体のつながりや記憶の身体的な側面を作家たちが正確に見抜き、表現してきたことを明らかにしつつ、トラウマティックな記憶からの癒しにおける他者との身体的接触や親密性の重要性を理論化することを目的とする。
癌の転移先臓器決定と覚醒におけるCrkおよびExosomeの機能解析

がんの転移についてはこれまで多数の研究が実施されてきたが、転移先臓器で長年潜伏していたがん細胞が何をきっかけに覚醒・再増殖するのか、また解剖学的位置関係からは説明をつけにくい臓器に転移・再発する理由はなぜか、その詳細な分子メカニズムは未だ解明されていない。申請者らはこれまで、シグナル伝達アダプター分子Crkががんの増殖・接着・浸潤・転移の全てのステップにおいて重要な役割を果たしていること、また最近、Crkががん組織の多様性形成に関与すると共に、エクソソームを介して転移の成立と促進に寄与するという新知見を見出した。これは、アダプター分子が転移先臓器の環境を整備しがん転移を成立させることを示唆する画期的なデータである。本研究では、Crkによるエクソソームの多様性形成メカニズムを明らかにし、がん転移の臓器選択性とがん細胞の覚醒との関連性を解明する。当該年度は、ヒト浸潤性膀胱癌細胞株UM-UC-3の親株およびCrkノックダウン細胞から、超遠心法によりエクソソームを分離した。エクソソームに内包されている分子を、nano-LC MS/MS(蛋白質)で解析した所、受容体型チロシンキナーゼ、細胞内チロシンキナーゼ、細胞増殖因子、細胞外マトリックス、細胞接着分子、マトリックスメタロプロテアーゼなどが内包されていることが明らかとなった。これらの結果は、Western blottingによって確認された。各エクソソームを血管内皮細胞HUVECsに投与すると、UM-UC-3由来のエクソソームはHUVECsの細胞増殖能力、およびマトゲルへの浸潤能が行進することが明らかとなった。Crkノックダウン細胞由来のエクソソームはこれらの効果は認められなかった。本研究は、当初の予定通りに遂行されている。現在まで、特別な問題点や実験の遅れは生じていない。次年度以降も研究計画に沿って研究を遂行する。(1)Crk依存的エクソソームヘテロジェナイティー形成とがん転移先臓器選択性の解析マウスxenograftを用いて、エクソソームのヘテロジェナイティーとがんの転移先臓器との親和性を解析する。癌細胞から分離したエクソソームをPKH67で蛍光ラベルし、ヌードマウスの尾静脈から接種。一日後にマウスのどの臓器に取込まれているかを蛍光顕微鏡下で観察する。さらに、エクソソームを連続投与して転移先臓器をeducate(教育)した後(1日置きに2週間、計6回投与)、tdTomato-Luc2導入野生型UM-UC-3細胞を尾静脈から接種し、一ヶ月後にIVIS spectrumを用いて転移巣の形成を観察。エクソソームのヘテロジェネイティーと転移先臓器との相関をパネル化する。一方、肺・肝・骨に転移した膀胱癌患者の血液中あるいは尿中からエクソソームを採取しマウスxenograftで得られた知見との一致性について検討する。(2)Crk依存的エクソソームヘテロジェナイティー形成とがん細胞の覚醒との関連性解析種々の癌腫由来のがん細胞に細胞周期の進行をモニタリングするFucciベクターを導入後、高濃度BrdU処理によりがん細胞に細胞老化を誘導。その後、エクソソームを処理し、どのエクソソームがどの癌腫の休眠状態のがん細胞を覚醒(再増殖)できるかをタイムラプス蛍光顕微鏡下で解析する。覚醒前後のがん細胞は、EMT、がん幹細胞、ヒストンメチル化関連分子に対する免疫染色を施行し、がん細胞の動態を解析する。これらを、野生型およびCrk knock-down細胞由来のエクソソーム間で比較し、Crkが制御するがん転移先臓器選択性とがん細胞覚醒化の全体像をパネル化する。

現在まで、特別な問題点や実験の遅れは生じていない。次年度以降も研究計画に沿って研究を遂行する。(1)Crk依存的エクソソームヘテロジェナイティー形成とがん転移先臓器選択性の解析マウスxenograftを用いて、エクソソームのヘテロジェナイティーとがんの転移先臓器との親和性を解析する。癌細胞から分離したエクソソームをPKH67で蛍光ラベルし、ヌードマウスの尾静脈から接種。一日後にマウスのどの臓器に取込まれているかを蛍光顕微鏡下で観察する。さらに、エクソソームを連続投与して転移先臓器をeducate(教育)した後(1日置きに2週間、計6回投与)、tdTomato-Luc2導入野生型UM-UC-3細胞を尾静脈から接種し、一ヶ月後にIVIS spectrumを用いて転移巣の形成を観察。エクソソームのヘテロジェネイティーと転移先臓器との相関をパネル化する。一方、肺・肝・骨に転移した膀胱癌患者の血液中あるいは尿中からエクソソームを採取しマウスxenograftで得られた知見との一致性について検討する。(2)Crk依存的エクソソームヘテロジェナイティー形成とがん細胞の覚醒との関連性解析種々の癌腫由来のがん細胞に細胞周期の進行をモニタリングするFucciベクターを導入後、高濃度BrdU処理によりがん細胞に細胞老化を誘導。その後、エクソソームを処理し、どのエクソソームがどの癌腫の休眠状態のがん細胞を覚醒(再増殖)できるかをタイムラプス蛍光顕微鏡下で解析する。覚醒前後のがん細胞は、EMT、がん幹細胞、ヒストンメチル化関連分子に対する免疫染色を施行し、がん細胞の動態を解析する。これらを、野生型およびCrk knock-down細胞由来のエクソソーム間で比較し、Crkが制御するがん転移先臓器選択性とがん細胞覚醒化の全体像をパネル化する。