hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高速1分子イメージングによる核膜孔局所におけるERK輸送機構の解明

細胞は外部刺激に応答するかしないかの二値的反応を示す。我々は、リン酸化ERKレベルはアナログな応答を示すが、ERK核移行においてデジタルな応答に変換される結果を得ている。ERKは必ず核膜孔を通過するため、通過の酵素反応に、上記変換の特徴が含まれると考えられる。このキネティクスを計測すべく、蛍光相関分光法を、安価な共焦点顕微鏡装置で開発した。この手法とFRAP計測を統合し、ERKの核膜孔通過の酵素反応速度定数の推定を行うことが可能となった。さらにこのキネティクスと分子機構の詳細を明らかにするため、1分子計測の実験系を全反射顕微鏡により開発し、ERKの核膜での1分子計測を実現した。一般に、細胞は、細胞外からの刺激に対して応答するかしないかという2値的な反応を示す。すなわち、細胞内シグナル伝達過程において、細胞外刺激というアナログ入力が、デジタル的な応答へと変換される。細胞内シグナル伝達のモデル系として研究が進んでいるEGFの系では、EGF濃度に対して細胞内シグナル伝達の鍵となる酵素ERKのリン酸化レベルはアナログ的に応答するのに対して、ERKの核移行レベルはヒル係数が高いことが知られており、この現象はERK基質リン酸化阻害剤や核膜孔タンパクに対するsiRNAにより抑制されたため、核膜孔タンパクやERK基質リン酸化がEGFのアナログ刺激をデジタル応答へと変換する細胞レベルでのスイッチとなっている可能性が示唆されてきた。その分子機構として、アロステリック効果による協同性など核移行過程における非線形プロセスが想定されるが、EGF刺激後には複数のシグナル伝達経路が活性化し、フィードバックが働くため、核移行の素過程の定量的速度論解析が必須となる。そこで本年度は(1)生細胞内のERK分子濃度・拡散係数の推定手法の開発と、(2)核膜孔を通過するERKの3次元1分子計測手法の開発を行った。前者の開発により既存手法に比べて安価な装置を用いて細胞内の局所的な領域における正確な分子濃度や拡散係数を広範囲で同時に推定することができるようになり、後者の開発により生細胞の核膜孔におけるERK分子の通過現象の素過程を高速にとらえることが可能になった。細胞内分子濃度・拡散係数計測にはFCSが利用されているが、高価な装置が必要となるため、汎用の共焦点顕微鏡画像の自己相関関数を計算することで、同様の情報を引き出すRICS(Raster image correlation spectroscopy)が開発されてきた。しかし、RICSは細胞や細胞内小器官の動きの影響を受けやすく、定量的な計測に適用することは困難であることが研究の過程で明らかとなった。そこで我々は、FCSおよびRICSの原理に立ち返り、共焦点顕微鏡画像の撮影条件を最適化し、RICSで培った信号処理技術を用いて自己相関関数をより正確に計算できる手法を新たに開発した。これによりin vitroでpM-uMオーダーの分子濃度が検出できるようになり、生細胞の動きの影響でよく見られる長波長のゆらぎ成分(トレンド成分)を除去した計測が可能になった。さらに全反射顕微鏡を用いて2次元の核膜上で観察されていたERKの1分子動態を核膜孔の表裏で3次元観察するため、2焦点光学系を組み合わせた。これにより核膜孔の細胞質側・核質側のERKを同時にmsオーダーでライブイメージングすることに成功し、移行の瞬間をとらえたことを示唆する結果を得た。これは細胞内のシグナル伝達過程で選択されるが、特に増殖因子EGF刺激ではその一つの候補としてERKリン酸化とその核内移行が知られている。我々はリン酸化ERKレベルはアナログな応答を示すが、ERK核移行においてデジタルな応答に変換される可能性を示唆する結果を得ている。ERKは核内に移行する際、必ず核膜孔を通過するため、核膜孔がERKを通過させる酵素反応キネティクスに、アナログをデジタルに変換する特徴が含まれると考えられる。このキネティクスを明らかにするため細胞内蛍光タンパク質濃度を絶対定量するための蛍光相互相関分光法を、安価な共焦点顕微鏡装置で実現する新規手法を開発した。この手法とFRAP計測を統合し、核膜孔の酵素反応速度定数の推定を行った。この結果、ERKの濃度に依存した通過速度定数の上昇が見られたため、通過における協同性が示唆され、この傾向はERKの特定部位の変異体により阻害され、基質リン酸化阻害剤によっても阻害されたため、ERK自身の状態と周辺環境の両方に依存したものであることが示唆されている。さらにこのキネティクスと分子機構の詳細を明らかにするため、3次元1分子計測の実験系を全反射顕微鏡により開発し、ERKの核膜での1分子計測を実現した。これを用いて滞在時間の推定や通過過程の観察を行い、核膜孔の1つ1つがERKを通過させる素過程の計測を実現した。

これまでに開発した定量化技術に加え、入出力関係を精度よくコントロールすることは複雑なシグナル伝達経路の影響をできるだけ減らし、ERKの核膜孔通過現象に的を絞った実験を行う上で重要である。すでに我々は人工タンパク質を用いてRaf-MEK-ERKのリン酸化経路のみをtamoxifenを用いて継続的に活性化させる実験系の構築に成功しており、この系をさらに発展させるため最近開発された光遺伝学的手法を用いてMEK活性を瞬時にon-off制御する系の構築を試みている。このように実験系と計測系の技術開発とその精度の改善に努めつつ、ERKの核膜孔に対するon/off rate、通過頻度、それらに対するERKの濃度依存性などのパラメータを推定し核膜孔周辺で起こるERKの物理化学的現象を定量化する。細胞生物学、生物物理学理化学研究所2016年度基礎科学・国際特別研究員の成果発表会において、本研究の一部を発表しポスター賞(生物分野)を受賞した。
炎症に伴う組織の損傷と修復 -IL-18の役割を中心にして-

炎症性サイトカインの一つであるインターロイキン-18(IL-18)は炎症の開始からその終息まで全体にわたって関与し、中心的な役割を果たしている可能性が示された。これまで我々はIL-18がIL-12と協同しガンマ型インターフェロン(IFN-γ)の産生を通じて一酸化窒素や活性酸素、TNFαなどの産生を誘導し組織障害をもたらす一方、IL-12非存在下ではT細胞やマスト細胞に作用してIL-4,IL-10,IL-13などの抗炎症性サイトカインの産生をも増強する極めてユニークなサイトカインであることを示してきた(Ann.Rev.Immunology,2001)。このようなことからIL-18は炎症において組織損傷のみならず、組織損傷を抑える役割を果たしている可能性があり本科学研究費補助金を受けた2年間にIL-18の炎症制御における役割を明らかにすることを試みた。IL-18のみをマウスに投与すると血中白血球の動態に強く影響を与える(Blood,2001,Clin.Diagn.Lab.Immunol.,2002)。その機序については解明を試みたが未だ十分には解明できていない。またIL-18をIL-12と共にマウスに投与すると腸のびらんの他に、胸腺、涙腺、だ液腺などの萎縮、損傷をひき起こしたり(J.Immunotherapy,2002),肝臓に重篤な脂肪変性をひき起こす(J.Interferon Cytokine Res.,2003)ことを認め、この二つのサイトカインが過剰の一酸化窒素を産生させ、組織の微少循環系の損傷をもたらし、多臓器の機能不全を導いたことを示した。一方IL-18欠損マウスはLPS誘導によるTNFα産生が異常に高く、ブレオマイシン肺炎、セルレイン膵炎などの病態が重篤であり、IL-18投与によって改善されることを観察し、その機序の解明を試みている(準備中)。このようにIL-18はIL-12とともに炎症における組織損傷の中的な役割を担っている一方炎症の重篤化を制御することを明らかにしたが、IL-18がIL-4,IL-10,IL-13などの抗炎症性サイトカインの産生を誘導する機序を解明することはできなかった。現在はIL-18が誘導するregulatorycellの解明に全力を挙げており、いくつかの手掛かりを得ている。炎症反応には様々なメディエーターと細胞が関与し、組織の損傷と再生、修復の過程を経て終束する。IL-18もそのような炎症性サイトカインの一つであるが、その作用はユニークで組織の破壊にも修復にも関与する可能性がある(Ann.Rev.Immunol,2001)。これまで我々はIL-12の存在下で、IL-18はTリンパ球やNK細胞による多量のIFN-γの産生を誘導し、一酸化窒素、活性化酸素を産生させ組織に傷害をもたらす可能性を示した(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, In press)。

IL-18をマウスに投与すると短時間に血中好中球の急激な減少をもたらすが、その機序としてはIL-18による一酸化窒素の産生、ICAMなどの接着因子、ケモカインの誘導などが考えられた。しかしながらIL-18を長時間投与し続けると一週間後からはneutrophilia、lymphopeniaを呈し、さらに二週間後からはeosinophiliaを呈するようになる(Blood 2001)。機序は不明であるが血中の白血球のプロフィルが変化する時にあわせて血中のサイトカインのプロフィルもIFN-γからIL-5に移行していた。IL-18の投与を止めると一週間以内にもとの状態に復する。このようにIL-18は好中球の集結や活性酸素、一酸化窒素の産生を通じて組織障害を引き起こす機序に関与していることが考えられる。しかしながら最近の研究からIL-18はIFN-gのような炎症性サイトカインのみならず、IL-4、-5、-10、-13などの抗炎症性サイトカインの産生も誘導することが明らかになった(Ann.Rev.Immunol,2001)。IL-18はプロスタグランディン(PG)の合成に関わるCox-2を誘導すること、PGE2はIL-4、-13などの抗炎症性サイトカインの誘導することなどからIL-18はPGE2産生を介してIL-12やIFN-γの産生を抑え、炎症による組織障害を抑制することが考えられる。しかしながら抗炎症性サイトカインの産生にはIFN-γの産生が必要らしく現在IL-18による抗炎症性のTh2型サイトカイン誘導の機序を解析中である。インターロイキン-18(IL-18)は炎症性サイトカインの一つでIL-12と協同してリンパ球に作用し強くガンマ型インターフェロン(IFN-γ)の産生を促す。そしてIFN-γの産生を通じて一酸化窒素や活性酸素、TNFαなどの産生を誘導する。しかし一方ではIL-18はT細胞やマスト細胞に作用してIL-4, IL-10, IL-13などの抗炎症性サイトカインの産生をも増強する極めてユニークなサイトカインである。これらの基本的で重要なIL-18の生物活性については総説としてまとめた(Ann. Rev. Immunology, 2001)にのような生物活性を持つIL-18は炎症において組織損傷のみならず、組織修復においても重要な役割を果たしている可能性がある。本科学研究費補助金を受けた2年間に炎症におけるIL-18の役割を明らかにすることを試みた。IL-18をマウスに投与すると急激な白血球減少をもたらすが投与を続けると好中球増多、リンパ球減少、好酸球増多を示し、これに伴って血中一酸化窒素代謝物、サイトカインのプロフィール、脾細胞によるサイトカイン産生などの変化が起こっていることを報告した(Blood, 2001, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2002)。このようにIL-18は血中白血球の動態に強く影響を与えることから深く炎症に係わっていることが示されたが、IL-18をIL-12と共にマウスに投与すると腸のびらんの他に、胸腺、涙腺、だ液腺などの萎縮、損傷をひき起こしたり(J. Immunotherapy, 2002)、肝臓に重篤な脂肪変性をひき起こす(J. Interferon Cytokine Res., 2003)ことを認め、この二つのサイトカインが過剰の一酸化窒素を産生させ、組織の微少循環系の損傷をもたらし、多臓器の機能不全を導いたことを示した。
食品タンパク質の味刺激能に関する研究

本研究では、甘味タンパク質の甘味発現機構解析の研究を展開し、より詳細な機構を明らかにすることを目的としている。また甘味タンパク質による味刺激の受容機構、ならびに食品タンパク質と味刺激をもつ低分子化合物との相互作用の解明も視野に入れている。これらの研究が低カロリーの甘味料の開発、タンパク質の新たな食品機能開発につながることを目指している。(1)本研究では、これまでの研究の推進を含め、以下の3点に関して研究を行った。●これまでの研究から甘味タンパク質の甘味発現においてリジン残基、アルギニン残基の役割が大きいことが明らかになっている。個々の甘味タンパク質についてこれら特定のアミノ酸残基と甘味発現機構の関係を調べた。●甘味タンパク質とりわけ卵白リゾチームの味刺激は、濃度や各種の分子修飾によって変化し、味質が変わることが明らかになっている。すなわち苦味、渋味を呈する。これらタンパク質の個々の味刺激能について、その特異性、相違点、反応機構等を解明することを目的とする。また甘味タンパク質の甘味刺激は高濃度の場合、口腔内に味が残る。いわゆる、あと味であり、甘味と苦味において顕著である。この特性を検討した。●甘味タンパク質の甘味発現機構を解析する上で、舌上の受容体機構を知ることは重要である。これまで受容機構についてはほとんど明らかになっていなかったが、最近、培養細胞系を用いて甘味タンパク質に対して感受性を有する系の報告がなされた。本研究でも培養細胞系を用いることによる受容機構の検討を進めた。(2)味は食品の特性を決める第一の因子である。甘味、苦味、酸味、塩味、旨味の5つの基本味が知られているが、このいずれについても低分子化合物を対象に多くの研究がなされてきた。これらの呈味物質の味刺激の初発段階は舌上の受容体もしくはイオンチャンネルとの相互作用から始まるとされている。高分子化合物については、構造的に舌上の受容体と相互作用することができないであろうと考えられ、味刺激を持たないと思われてきた。しかし、上記のように、特異な甘味タンパク質に限らず、タンパク質が様々な味刺激能を有する可能性が生じてきている。したがってタンパク質と味との研究に関して新たな観点の導入が必要である。また、渋味は先の基本味と異なり、三叉神経を介する反応であるとされている。これまで渋味物質の構造的な記述等がなされてきたが、その系統的な解析、機構の解明はほとんどなされていない。これを明らかにすることも本研究の特色であり、新規な点でもある。本研究により食品科学の領域における味の科学の新たな展開を試みた。この特性を検討した。リゾチームは等電点11の塩基性タンパク質であり、分子内にリジン残基6残基、アルギニン残基11残基もつ。

化学修飾法によりリジン残基の側鎖を修飾し、その等電点(pI)と、甘味閾値との関連を詳細に検討した。また、無味であるα-ラクトアルブミン、オボアルブミンの化学修飾を行いpIの異なるものを作製し、味刺激を誘発できるか検討した。方法としては、再結晶を行ったリゾチームをPLPおよび無水酢酸を用い化学修飾を行った。SP陽イオン交換カラムを用いて修飾度合いの異なるPLP化、アセチル化リゾチームを得た。pIは焦点電気泳動を用い決定した。α-ラクトアルブミン、オボアルブミンの化学修飾はグリシンメチルエステル、タウリンを用いて行い、イオン交換カラムにて精製した。pIは上記と同等の方法により決定した。pIが10.5以上である1残基、2残基修飾PLPリゾチームの甘味閾値は未修飾リゾチームとほぼ同等であったが、pIが8.7である3残基修飾PLPリゾチームの甘味閾値は減少した。アセチル化リゾチームの場合も4残基以上修飾されると甘味を消失し、6残基、5残基、4残基アセチル化されたリゾチームのpIはそれぞれ10、10.8、11.5であった。また甘味を呈したグリシンメチルエステル化したα-ラクトアルブミン、オボアルブミンのpIはともに10.5以上であった。次に、リゾチームの甘味発現に関わる部位を特定するために、リゾチーム分子表面に存在する塩基性アミノ酸であるリジン、アルギニンの変異体を作製し、甘味に与える影智を検討した。Arg45,Arg68をAlaに変異を施しても甘味閾値に影響を与えなかった。一方、Arg14,Arg21,Arg73,Lys13,Lys96,Lys97にAlaの変異を導入することにより、甘味閾値が上昇した。塩基性アミノ酸残基がリゾチームの甘味発現に深い影響を与えることが示唆された。●これまでの研究から甘味タンパク質の甘味発現においてリジン残基、アルギニン残基の役割が大きいことが明らかになっている。甘味タンパク質のソーマチン、リゾチームについて、化学修飾法、部位特異的変異法を用いてリジン残基、アルギニン残基の甘味発現に対する役割を検討した。その結果、いずれのタンパク質においても、分子表面に広い領域で甘味に関与する部位があり、その中の一部が重要な役割を担っていることが明らかとなった。部位特異的変異法には酵母Pichia pastrisを用いる発現系に導入し、官能試験に耐えうるだけの多量の変異体の発現に成功した。●甘味タンパク質とりわけ卵白リゾチームの味刺激は、濃度や各種の分子修飾によって変化し、味質が変わることが明らかになっている。すなわち苦味、渋味を呈する。また、他のタンパク質についても渋味等の昧刺激が認められる。これらについて検討を行った。●タンパク質は様々な呈味性の低分子化合物と相互作用を生じ、その味がその食品タンパク質の味として受容され、ひいては食品の味とされる場合が多い。この相互作用をタンパク質化学の手法で解析した。
聴感評価に基づく雰囲気音制作手法の開発

特にインタラクティブな映像作品制作を想定した効果的な音響デザインの指針を得るために、物理的な「正しさ」よりも聴感上の効果の面から、要素となる音を組み合わせることで狙い通りの効果をもつ雰囲気音(後景となる音)が合成できるか、また、後景となる音や前景となる音がそれぞれその時々の情動状態や他の前景情報の理解にどのような影響を与えるかを検討した。その結果、前者については要素の単なる加算を超えた何らかの直接的な音響的特徴による表現が必要なこと、後者については音がその時々の情動状態や前景となる情報に確かに影響を与え、またその与え方には一定の傾向があることが見いだされた。H24年度は、本課題の作業仮説である雰囲気音の二重符号化仮説(映像作品等で場の雰囲気をあらわす効果音(雰囲気音)は大きく後景音と前景音の2要素によって構成されているとする仮説)の検証に向けて、H23年度成果から新たに研究の必要性が浮上した後景音の情動的効果について検討し、後景音が確かに情動を方向付けることが可能なことを確認できた。方法としては、情動的反応をより直接的に喚起することが知られている嗅覚を指標として、事前に実験的に検討し分類した前景的情報としての「良いにおい」「中性的なにおい」「良くないにおい」に対して、H23年度に実際のドキュメンタリー・ニュース映像に付加されていることを見いだしたネガティブな情動を喚起する効果音と同じ種類の後景音(ドローン音)およびポジティブな情動を喚起すると考えられる音楽的な後景音が及ぼす影響をSD(Semantic Differential)法を用いて多次元的に検討した。その結果、被験者には特に音には注目させなかったにもかかわらず後景音の種類によってにおい対する評価が系統的に変化し、しかも、一般にポジティブな後景音よりネガティブな後景音の法が効果が大きいことを見いだした。この場合の音と臭いは特に物理的次元が一致するわけではないことから、情動のような高次の心理的反応によって媒介されたと考えざるを得ず、従って、後景音は確かに高次の何らかの好悪的反応を引き起こしそれが前景となる情報の判断に影響を与えることが確認できた。また、後景音の時間次元における視知覚への影響についても効果音のデザインにも資する新たな現象を見いだし欧州の学会で発表を行った。さらに、音のより無意識的な影響を検討するために情動反応のよい指標となることが知られているPGR(PsychoGalvanic Response)の測定装置を購入し、H25年度以降に向けた予備的検討を行った。平成25年度は、PGR(PsychoGalvanic Reponse)計測装置も用いて、主に後景音の情動への影響を検討し、前景音を含む雰囲気音生成のモデル化を行う予定であったが、その中で、前景音は視野内の視覚オブジェクト独立ではあり得ず後景音の影響は前景の音のみならず視覚情報にまで及ぶ可能性が明らかになってきた。そこでまず音として明確な意味を含む音声と表情を聴覚刺激と視覚刺激として用い、これらを同時に提示した場合、前景となる視覚刺激(表情)に対して音声がどのような影響を与えるかを、音声の意味と表情の種別のネガティブさポジティブさを様々に変化させながら、主に表情認知の際の反応時間と正答率を指標として検討した。その結果、まず基本的な知見として表情と音声の意味のネガティブさとポジティブさが矛盾しているときに有意に反応時間が長くなり、音は前景となる視覚刺激の意味性にも影響を与えることが明らかになった。また、被験者の性別によって音声が表情判断に及ぼす影響が異なるという新たな可能性についても明らかになった。平成23年度は計画通り、本課題の作業仮説である雰囲気音の二重符号化仮説(映像作品等で場の雰囲気をあらわす効果音(雰囲気音)は大きく後景音と前景音の2要素によって構成されているとする仮説)のうちの後景音を取り上げ、パラメータ抽出のためのドキュメンタリー等の映像作品の音の解析と、実験的な検討の両面から検討を行った。実験的な検討の方では、後景音のうち雑踏音に注目してまず雑踏の規模(群衆の人数)がどのような特徴量によって決まっているかを、要素音(足音)をミキシングで加算し聴感評価を行うことで探った。ところが、要素音を単純に加算しただけでは聴感上の規模は増大せず、背景音以外の何らかの要因の関与が示唆された。本課題では、この新たな要因として前景音との相互作用を仮定し、次年度以降に臨む。一方、音の解析では既存の映画等の資料の音声トラックの分析も行い、実験パラメータ抽出あるいは新たな仮説構築につながる知見を得ることができた。特に示唆があったのは、ドキュメンタリー映像のような一般に作為が許されないと考えられている映像にも、視聴者の情動を一定の方向に導くために後から音が付加されていることがあるという発見であった。

特に、前景音に当たる音が付加される場合は明らかな作為として社会的に問題になることに比して(例えば福島第1原発の水素爆発映像にドイツの放送局が爆発音を付加し問題になったケース)、背景音の付加は社会的にあまり問題にならず(その使用すら気づかれておらず)視聴者の情動の方向づけのためにしばしば利用されていることを見いだした(例えばナショナルジオグラフィック社の東日本大震災のドキュメンタリーの冒頭部分では視聴者の不安を喚起するような低音のドローン音が気づかれないようなレベルで付加されている)。本課題では、背景音の情動に対する機能性も新たな検討事項として次年度以降に臨む。本研究課題では、映像作品等で場の雰囲気をあらわす効果音(雰囲気音と呼ぶ)が大きく後景音と前景音の2つの要素から成り立っているのではないかという仮説(雰囲気音の二重符号化仮説)から出発して、情動的反応など一定の効果をもたらすための音と音、あるいは音とその他のモダリティの要素の統合過程について主に心理物理的手法により聴感評価を行いながら検討を行った。初年度となる平成23年度は音を単一の足音を足し合わせることで生成した雑踏の規模感を心理的に評価する実験を行い、足音を加算していっても聴感上は数人程度の規模感で頭打ちになってしまう現象を見いだした。雑踏やにぎわい等の表現において背景音そのものに加え何らかの付加的な要素との相互作用が必要なことが示唆された。また、実際の映像作品のサウンドトラックの分析も行い、ドキュメンタリーであっても一定の情動的な反応を導くために背景音が編集段階で付加されている場合があることを見いだした。そのため、2年目以降には、要素間の相互作用が情動に与える影響に着目し、まず一定の情動反応が期待できる匂いへの反応を指標として匂いに対する音の影響を検討したところ、確かに音が匂いによる情動反応を装飾することが見いだされ、また匂いの良し悪しによってその影響の非対称性があることなどが分かった。また、視覚要素との相互作用については、表情を指標として顔と声の性別の一致不一致を操作しながら、声の意味内容が表情判断に及ぼす影響を検討したところ、性別が一致しているときに声は表情判断に影響を及ぼすが人工音声の場合など条件によっては影響が見られないことなどが明らかとなった。最終年度である平成26年度には、さらに視野内に音源となる視覚オブジェクトが存在しない場合についての音の影響の検討にも着手し、本研究課題を継続的に発展させた課題(課題番号26330311)への接続を図った。知覚・認知心理学H23年度の成果となる知見から本課題の可能性を広げる新たな要因(後景音の情動的効果)を見いだしたため、当初計画からは若干内容が異なるものとなっているが、「研究実績の内容」でも述べたようにH24年度にはH23年度の知見を受けまたH25年度の方策にも繋がるような成果が得られており、最終年度であるH25年度には一定の結論も見込めることから、本課題の研究はおおむね順調に進展していると判断できる。着実に知見は積み上がっているが、今年度計画ではPGR(PsychoGalvanic Reponse)計測装置も用いて主に後景音の情動への影響を検討し前景音を含む雰囲気音生成のモデル化を行うことを目指していたのに対し検討事項を若干変更したこと、そのため外部への成果発表にまで至らなかったことなどから考慮して、(3)やや遅れていると判断した。
松果体のメラトニン生合成リズムと生体時計機能に関する分子生物学的研究

アミノ基を含む務生体内物質および薬物は、N-アセチル化されることにより生理活性を示すようになる場合と、逆に不活性化され排出される場合とがある。メラトニン生合成酵素であるセロトニンNAT(SNAT)は前者であり、肝臓などのアリルアミンNATは後者に属する。本研究ではこれら多様な機能を示すNATのcDNAと遺伝子DNAをクロ-ニングし、その構造と機能を解析するとともに、多型性の基盤をなす遺伝子変異を明らかにしようとした。2年間にわたって以下の研究成果をあげることができた。(1)ニワトリ肝臓のNATを部分精製し、これを抗原として単クロ-ン抗体を多数作成した。この抗体を用いたアフィニテイカラムによりNATを単一の蛋白にまで精製し、そのアミノ酸配列を一部決定した。(2)このアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドをプロ-ブとしてニワトリ肝臓のNATのcDNAをクロ-ニングするとともに、これを発現ベクタ-に結合したのちCHO細胞で発現させることに成功した。(3)ニワトリ肝臓のNATのcDNAをプロ-ブとして、ニワトリ松果体のcDNAライブラリ-よりNATのcDNAを2種類クロ-ニングしたが、その一つは脳に、他は腎臓に強く発現していることが判った。(4)ニワトリ肝臓のNATのcDNAをプロ-ブとしてウサギおよびヒトの肝臓のNATのcDNAをクロ-ニングした。ヒトについては多型性NATのcDNAが2種類分離できたが、これは高い活性のNATと低い活性のNATに対応するものであることが判った。(5)ヒトの遺伝子DNAのRFLP解析からNAT遺伝子型と、アセチル化反応表現型との対応関係が明らかになった。(6)ウサギのNATのcDNAを用いてウサギ遺伝子の解析を行ったところ、NAT活性が低い個体ではNAT遺伝子の一部が欠損していた。松果体はメラトニンという生理活性物質を生産・分泌することにより種々の生体リズムを制御している。メラトニンの生産は顕著な日周リズムを示し、これは生合成酵素の一つであるN-アセチル転移酵素(NAT)活性リズムによってひき起こされている。したがって、NAT活性の発現と調節の機構を明らかにすることは生体リズムの解明にとって重要な課題である。本年度は次のような研究成果をあげた。(1)ニワトリの肝臓よりアリルアミンNATを精製し、これに対する単クローン抗体を5種類作成した。この抗体を用いてイムノアフィニティカラムを作成し、これにより肝臓のNATを単一の蛋白質にまで精製し、そのアミノ酸配列を一部決定した。(2)このアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを作成し、これおプローグとしてニワトリ肝臓のcDNA-λgt10ライブラリーよりNATのcDNAをクローニングし、その全塩基配列を決定した。またこのcDNAを発現ベクターに結合したのちCHO細胞で活性を発現させることに成功した。(3)肝臓のNATのcDNAをプローグとして、ニワトリ松果体のcDNA-λgt10ライブラリーをスクリーニングし、交叉反応を示すcDNAクローンを2種分離し、その全塩基配列を決定した。またこれらcDNAを発現ベクターに結合したのちCHO細胞に導入したところ、アリルアミンNAT活性を発現することが判った。(4)上記の3種類のニワトリのNATには、システィン残基を含む13個のアルミ酸から成る共通配列がり、これがアセチルCOA結合部位と考えられた。松果体のアリルアルキルアミンNATのcDNAをクローニングするため、上記の共通配列のオリゴヌクレオチドをプローブとして松果体のcDNAライブラリーより陽性クローンを得た。昨年度我々は松果体および肝臓からアリルアミンNーアセチル転移酵素(NAT)のcDNAを合計6種類(ニワトリから3種類とヒトから3種類)クロ-ニングし、その全塩基配列を決定した。

ヒトを含む哺乳動物の肝臓のNATはアミノ基を含む薬物の主要代謝経路であり、活性が高い個体と低い個体があり遺伝的に継承されることが知られており、遺伝薬理学上注目されてきた酵素であった。我々が昨年ヒト肝臓からクロ-ニングしたcDNAには3種あり、そのうちの2種類は翻訳領域に一塩基置換がありその結果アミノ酸残基が一個異なるものであることが判った。本年度はこれら3種類のcDNAを発現ベクタ-に結合したのちCHO細胞に導入し、発現したNAT活性を調べた。その結果2種類のcDNAから発現した酵素の基質特異性は極めてよく似ており、従来から多型性NATと考えられていた酵素をコ-ドしているものと考えられた。これに対し第三のcDNAは従来から単型性NATと考えられていた酵素をコ-ドしたものであることが判った。多型性NATの2種類のcDNAのうち片方は培養細胞で極めて高い酵素活性を発現したのに対し、もう一つのcDNAは低い活性しか発現しなかった。これは後者がーアミノ酸置換により不安定な蛋白質に変異した結果であると考えられた。また、ヒトの遺伝子DNAのサザンブロット解析を行なったところ、KpnIおよびBamHIの分解により、遺伝子にRFLPが認められることが判った。また多型性NATの遺伝子には3種類存在し、そのうち一種類の遺伝子が高いNAT活性に対応するのに対し、2種の遺伝子は低いNAT活性に対応することが判った。これら3種の遺伝子の組合わせにより、rapid,intermediate,およびslow acetylator表現型が作り出されることも明らかになった。
有珠山爆発における住民活用型ハザードマップに基づく避難情報伝達に関する研究

2000年3月に噴火した北海道・有珠山は、地域に甚大な被害を与えたが、幸いにも人的な被害は発生しなかった。このことは、有珠山が定期的に噴火していること、噴火の予兆現象が観測されることなどから事前に噴火予知に関する科学的知見が研究機関(北海道大学)に蓄積され、それを研究者が地元自治体、住民に対して十分に提供していたことによるものである。しかしながら、実際には、噴火が確実視されるなかで出された避難命令、避難方法など災害時における情報をはじめ、噴火後の危険性に関する情報の伝達において、様々な混乱がみられた。そこで、有珠山周辺の伊達市、虻田町、壮瞥町の住民に対してどのように、噴火や避難に関する情報が伝達され、住民がどのように情報を活用したのかをアンケート調査および、住民の方々による座談会によって収集した。アンケート調査においては、従来の調査方法とは異なる回答者の位置情報を地理情報システム(GIS)によって解析する手法を検討した。また、地域住民の方々にお集まりいただき、座談会形式で、災害時および事前事後の経験、考え方などについて意見を聴取した。回答者の位置情報を盛り込んだ新たな調査手法により、従来のアンケート調査では得にくい地域住民の「生」の考え方を聴取することができた。さらに、災害の予測に対する科学的な知見を踏まえて地域住民の理解を容易にし、災害時に住民自らの行動を十分に事前に把握できるハザードマップ(防災地図)のあり方を整理した。本研究は2000年に噴火した有珠山周辺の住民の噴火に対する意識をアンケート調査で把握し、それを分析し地域防災計画のあり方を検討することを目的としている。今年度は虻田町を対象とした。回答が地域的に偏在しないよう自治会を活用して配布した。配布数は233通で有効回答数は149通(回収率64.8%)となった。アンケートは、1.火山防災マップ(ハザードマップ)に関する設問、2.噴火経験について、3.現在の有珠山に対する危険性の認知、4.将来の有珠山の噴火予測、5.属性、で構成されている。回答と地域特性の関連について解析するため回答者の住所をもとに住宅地図や、ハンディタイプのGPS(汎地球測位システム)を用いて回答者の位置を特定した。アンケート結果は以下のとおりである。1.多くの住民が影響を受け、家屋など被害への危険性を認知しているが、人命の危険は十分に認知していない。多くの住民は複数回の噴火を経験しているが今後も住み続ける意思がある。2.前回の噴火(1977年)のあと作成されたハザードマップは6割の住民しか認知していなかったが、危険地域や避難経路を知らせる効果はあった。3.専門家による記者会見などの報道で噴火による災害の種類や規模を認識できた。4.的確な情報提供によって住民は被害を過大に評価することはない。以上からハザードマップは噴火の危険性を住民に伝えることに一定の効果のあることが明らかになった。来年度は他の自治体に対しても同様なアンケートを実施し、地域的な意識の違いについて明らかにして地域特性を反映した防災計画のありかたについて検討をすすめていく。噴火からすでに3年以上経過(アンケート実施時点)しているため、噴火時の意識の変化などについては正確に把握できたとはいえない。そこでアンケートへの記述だけではなく対面調査(ヒアリング)などの実施も必要であることが明らかになった。
環境経営指標のマネジメントシステムへの統合に関する分析とモデル化

環境経営指標のマネジメントシステムへの統合の問題に対して,本研究課題では環境管理会計手法の多様性および共存の問題,また環境管理システムのアカウンタビリティの問題から検討を行ってきた。前者に対しては,既存のマネジメントケーパビリティと,戦略的な環境管理手法の補完性を明らかにするとともに,後者に対しては自然資本とフルコスト会計の理論的整合性のモデル化を行ってきた。「企業が環境経営指標をマネジメントコントロールシステムに関係づけるプロセスを明らかにする」という本計画での研究目的を達成するために、今年度はサンデン株式会社へのフィールド調査およびアカウンタビリティに関する分析視角についての考察を行った。前者については、MFCAの全社展開の事例について過年度からの継続調査を進め、経営者を含むマネジャー間でのアカウンタビリティ関係についてまとめている。これらの調査結果については、2015年10月にジュネーブでEnvironmental Management Accounting Networkが主催するWBCSD and EMAN joint International Sustainability Accounting Conferenceまた併せて、後者の分析視角の展開については、ネットワーク、開かれをキーワードに社会学的な知見を反映させ理論的な整理を、山形大学の尻無濱氏と神戸大学の中澤氏とともに研究会を開催するなかで実施してきた。本研究計画の環境マネジメントに応用する前に、同様にビジネスとノン・ビジネスが交差する調査領域である地域医療のマネジメントの事例に適用して、実践への適応可能性を試行している。本研究計画の目的である,企業が環境経営指標をマネジメントコントロールシステムに関係付けるプロセスの解明について,本年度までにマテリアルフローコスト会計(MFCA)を通じた資源生産性の指標の利用について,既存の環境マネジメントに関する組織能力がどのように影響するのかについて明らかにした。具体的には,マネジメントコントロールシステムの枠組みを用いて,(1)「環境マネジメントにおける指標の利用のケイパビリティ」,(2)「環境マネジメントにおけるリスクおよび理念に関するコミュニケーションのケイパビリティ」,(3)「環境マネジメントにおける非公式的なコントロールのケイパビリティ」が,企業のMFCAの採用の意思決定に与える影響を,日本企業を対象とした質問票調査を通じて分析した。構造方程式モデリングを用いた分析の結果,(1)(3)のケイパビリティがMFCAの採用の意思決定に影響することが示された。このことは,環境経営指標がマネジメントコントロールシステムの設計との関係で利用されることを示唆している。またこれらの経験的な研究の調査結果を反映して,実務家やコンサルタントの人たちとともにワーキンググループを設定し,環境経営指標としてのKey performance Indicators (KPI)の設計および実際の企業での利用可能性について調査を始めている。これにより資源生産性に特に焦点を当てたマネジメントコントロールのモデルの構築を始めている。昨年度実施したフィールド調査については,10月にジュネーブで開催されたthe first WBCSD and EMAN joint symposiumや3月にマレーシアで開催された2016 International Conference on Industrial Engineering and Operations Managementで学会発表した。また平成27年度にはドイツのドレスデン工科大学や日本の神戸大学との共同研究プロジェクトに参画し,質問票調査を実施し,環境マネジメントコントロールシステムのデザインと,MFCAの採用の意思決定の関係を分析し,2016年7月にメルボルンで開催されるAsia-Pacific Interdisciplinary Research in Accounting Conferenceでの発表を受理されている。また平成27年度ー28年度またがって実施するバランスドスコアカードのモデル設計のために,日本MFCAフォーラムでのワーキンググループの活動も実施している。研究計画の3年目の本年度は,環境アカウンタビリティの組織の内外での整合性について,明らかにする計画を立ててきた。分析の方法としては主として以下の2つのアプローチを採用した。第一に,組織の既存のマネジメントケーパビリティが環境管理会計手法の採用に与える影響について分析を行っている。従来の管理会計研究では,手法の採用や構成を説明する要因として外部のコンティンジェント要因に注目がなされてきた。しかしながらマネジメント・コントロール・システムをコントロール同士のパッケージとして捉えようとする近年のアプローチは,内部のコントロール間の補完性,代替性が与える影響が重要であることを示唆している。これに対して,本研究課題を通じて,リソース・ベースド・ビューを用いてマネジメント・システムの構成と,環境配慮型の戦略的管理会計の手法の採用との補完性を分析した。第二に,フルコスト会計と自然資本の連携可能性について理論的に考察を行った。現在,ISO14007, 14008として環境影響の貨幣評価の規格の策定が進められている。後者は経済学アプローチをベースとした,環境負荷,環境側面の経済評価方法の標準化であり,ISO14001へ経済情報を反映させるための計算技術的な規格といえる。これに対して前者の手法は,マネジメントの文脈のなかでISO14008などによって算出される環境影響の貨幣評価情報を,組織内のコスト&ベネフィット分析のなかに反映するための枠組みが検討されている。これらは従来の管理会計の文脈では,フルコスト会計として内部環境コストと外部環境コストの両方を対象としてフルコスト(=社会コスト)を計算する枠組みと近似している。また統合報告のガイドラインの発行以降,会計学領域でも注目を集めている自然資本との連携を視野に入れている。これらの関係について,本研究課題では論点および課題を検討した。

今年度予定していたフィールド調査は、上記のように実施されているとともに、これに加えて、調査先のサンデン株式会社の担当者の方も参加する産官学の共同プロジェクトである日本MFCAフォーラムのワーキンググループでのMFCA手法の導入促進のためのアクションリサーチも行っている。これにより経営者の環境マネジメントへのコミットメントを高めるとともに、エネルギーマネジメントの課題とその克服の方向性について検討を行っている。一方で、当初予定していた自然資本の指標化のマネジメントへの影響については、調査予定先との関係のなかで来年度以降の課題として調査時期を調整中となっている。また理論的考察については、アカウンタビリティの問題に対するアプローチを会計学だけでなく、政治学、心理学など学際的な展開の文脈のなかで整理している。先にあげたネットワークや開かれの視点を反映し、従来のアカウンタビリティの枠組みの拡張を試みるとともに、非評価者側の反応に対する社会心理学的分析をするための枠組みについても並行して整理する段階にある。最終年度に当たる28年度には,当初の計画通りバランスドスコアカードの枠組みを援用して,環境経営指標の利用についての理念的なモデルを提示する。そのために日本MFCAフォーラムのワーキンググループを通じて,実践家,研究者の共同研究プロジェクトを昨年度から組織し,定期的に話し合いの場を設定している。これまでの成果として,エネルギー利用においてMFCAが有効な管理指標として利用できること,それにより環境マネジメントコントロールシステムが抱える本業との乖離の問題を解消できることを明らかにした。これを敷衍し,本年度はMFCAを通じたキーパフォーマンスインディケーター(KPI)の設定の可能性について検討していく。また昨年度に実施した質問票調査の回答企業へのフォローアップでのインタビュー調査と合わせることで,環境マネジメントコントロールシステムにおけるKPIの組織での利用の側面への理解を補完することができ,多角的な理解を形成できることが期待される。
芳香族化合物の炭素-水素結合の活性化に基づく高度な増炭素反応

Innovative Advanced Protocols本研究では,遷移金属触媒を用いた芳香族炭素-水素結合切断を経る炭素-炭素結合生成を伴う反応の機構の解明と新規カップルリング反応の開発を行った。その結果、アルケニルエステルを用いたアルケニル化反応、アリール典型金属化合物とのカップリング反応、エステル基やアミド基等の極性官能基の導入反応、アセンキノン類を多置換アセン類へ短工程で変換する新手法など、既存の方法では合成が困難であった化合物を簡便に合成できる手法の開発に成功した。本研究では、芳香族炭素-水素結合を用いた高効率・高選択的な触媒反応の開発を目指した。特に、移金属錯体触媒を用いた芳香族化合物とオレフィンとの反応に関する反応機構、芳香族ケトンと有機ホウ素化合物とのカップリング反応の反応機構を解明を行った。はじめに、芳香族ケトンのオルト位選択的アルキル化反応の機構についてNMRスペクトルなどの分光学的手法を用いて検討を行った。その結果、[Ru(H)(o-C_6H_4PPh_2)(PPh_3)_2(CO)]錯体が高い触媒活性を示すことが明らかとなった。また、芳香族ケトンのオルト位炭素-水素結合がルテニウムへ酸化的付加した錯体が、触媒サイクル中に存在していることも明らかとした。[Ru(H)(o-C_6H_4PPh_2)(PPh_3)_2(CO)]錯体を用いれば、これまで130°C程度の反応温度が必要であった反応を、室温で行えることを明らかとした。また、触媒の添加量を芳香族ケトンに対して1/1000当量に低減した場合でも、定量的にカップリング生成物を与えるという、これまでにない高効率な触媒系の構築に成功した。芳香族ケトンのオルト位に炭素-水素結合と炭素-酸素結合の両方が存在する場合、室温では炭素-水素結合が選択的に切断され、80°C位で炭素-酸素結合が効率良く切断されることも明らかとした。このように、不活性炭素結合切断の選択性を温度により制御できることを初めて明らかとした。オルトフェノキシアセトフェノンと[Ru(H)(o-C_6H_4PPh_2)(PPh_3)_2(CO)]との反応をピナコロシ中で行ったところ、Ru-H種がピナコロンのカルボニル基へ付加し、Ru-OR種が生成することを見出した。また、この過程は、炭素-酸素結合切断によるRu-OR'種生成過程より速いことを実験的に明らかとした。これらの知見は、不活性炭素結合切断を利用する触媒反応の開発において有用な指針を与えるものと考えている。本研究では、配位牲の官能基を持つ芳香族化合物とアルケニルエステルとの反応により、芳香環上への位置選択的アルケニル基導入反応の開発を目指して検討を行った。この反応は有機ハロゲン化物の使用を必要としないという特長を有している。配位性の置換基としてピリジル基をもつ芳香族化合物を基質に用い、アルケニルアセテートとの反応を触媒量のRu(cod)(cot)錯体存在下、トルエン還流条件下で行った。その結果、オルト位にアルケニル基が導入された生成物が高収率で得られることがわかった。出発原料のアセテートのβ位の置換基をかさ高くすると、生成物のE/Z比の向上が見られた。β-スチリルアセテートを用いた場合には、E/Zのみがほぼ定量的に得られた。本反応では反応後に酢酸が副生するが、ほとんどの場合において塩基の使用の有無に関係無く同程度の収率で生成物が得られた。原料が酸に不安定な場合には、2,6-ルチジン共存下で反応を行うことにより収率の飛躍的な向上が見られた。本アルケニル化反応では、1,1-二置換やシクロヘキセニルアセテートなども利用することが可能である。2-(1-ピロリル)ピリジンとβ-スチリルアセテートとの反応では、ピロール環の2,5位にスチリル基が導入された生成物が得られた。この生成物では、ベンゼン環一ビニル基一ピロール環が並んだ共役構造を有している。生成物のUVスペクトルを測定したところ、原料の2-(1-ピロリル)ピリジンと比較して吸収極大が長波長側ヘシフトしていた。このことより、導入したスチリル基がピロール環と共役を形成していることが明らかとなった。このように、本研究で開発した手法を用いれば、有機ハロゲン化物を用いる従来型の合成手法とは全く異なった形式でπ共役化合物の合成が達成できることが明らかとなった。アリールピリジン類とアルケニル酢酸エステルとの反応をRu(cod)(cot)触媒を用いて行うことにより、芳香環ヘアルケニル基が選択性および収率良く導入できることを見出した。

この新規触媒反応は、環境への負荷が大きい有機ハロゲン化物や化学量論量の酸化剤、また塩基を用いる必要が無いクリーンなプロセスである。この反応の生成物は、有機合成化学分野において重要な合成中間体であるスチレン誘導体を入手容易な化合物から合成できるため、有機合成化学において有用な合成手法であるといえる。この反応は、芳香族ならびにヘテロ芳香族化合物に対して適用することが可能である。N-ピリジルピロールとスチリルアセテートとの反応では、ピロール環の2,5-位にスチリル基が導入された生成物を高収率で与えた。フェニル基以外にも、ナフチル基やインドリル基などの様々な芳香環を持つアルケニルアセテートを用いても、目的のカップリング生成物が収率良く得られた。これら生成物のUVならびに蛍光スペクトルを測定したところ、出発物質と比較して吸収極大波長が長波長側へかなりシフトしていた。これらのことから導入したアルケニル基とピロール環上のπ電子は共役していることが分かった。この反応は、芳香族化合物の炭素-水素結合の切断とアルケニルアセテートの炭素-酸素結合の切断という、困難な2つの過程を経て進行すると考えられた。反応機構に関する知見を得るために、NMR実験や重水素標識実験を行った。その結果、反応はルテニウム錯体による炭素-水素結合の切断過程を含むこと、また炭素-酸素結合切断はβ-アセトキシ脱離を経て進行することが明らかとなった。さらに、Z-体のアルケニルアセテートの反応性が、E-体と比較して極めて高く、生成物の多くがZ-体から生成するという興味ある知見も得た。炭素-炭素結合生成反応は有機合成化学において最も重要な反応の一つである。最近、炭素-炭素結合生成を直截的に達成する手法として、炭素-水素結合切断を利用する手法が注目されており、アルキル化、アルケニル化、アリール化、アシル化反応など多彩な型の反応が開発されている。本研究では、炭素一水素結合の炭素-炭素結合への変換反応として報告例が少ない極性官能基導入反応の開発に関する検討(課題1)、ならびに炭素一水素結合の直接アリール化反応を利用した多置換アントラセン類の迅速合成法の開発(課題2)について検討した。課題1では、極性の炭素官能基であるアミド基ならびにエステル基の導入を、芳香族炭素-水素結合切断を利用して触媒的に達成できる新規反応の開発を目指し検討を行った。その結果、アリールピリジン類とN,N-二置換カルバモイルクロライドとの反応を、RuCl2(PPh3)3触媒を用いてトルエン中、加熱条件下で行ったところ、ピリジン窒素に対してオルト位でアミノカルボニル化が進行した生成物が高収率得られる新触媒反応の開発に成功した。カルバモイルクロライドの代わりに、クロロギ酸エステル類を用いてアリールピリジン類との反応を行った場合には、オルト位選択的にアルコキシカルボニル基が導入された生成物を与えることを見出した。課題2では、芳香族ケトンのアリール化とそれらに関連するカップリング反応を利用して、多置換アントラセン類を迅速に合成できる手法の開発を目指して検討を行った。芳香族ケトンとしてアントラキノンを用い、芳香族ホウ素化合物とのカップリング反応を行うことにより、4箇所のオルト位炭素-水素結合ヘアリール基の導入を行った。その後、カルボニル基を還元またはアリール化することにより高度に置換したアントラセンを簡便に合成できることを見出した。本手法は、2-3工程で多様な多置換アントラセンを与える新方法論である。
日本古代葬制の考古学的研究--とくに埋葬姿勢と葬送儀礼との関わり

この成果報告書は『日本古代葬制の考古学的研究』と題するが、その内容は、埋葬姿勢に関する考古学的研究を主とするものと、古代・中世の陵墓に関する文献史料にもとづく研究の二つの柱からなる。3年間にわたる本研究は、考古学と文献史学との連携のもとに古代の葬送儀礼を多角的かつ総合的に解明しようとするものであるが、研究分担者の一人福永伸哉は、縄文時代から古墳時代にいたる埋葬姿勢に関する資料集成を全国的に実施したが、この成果報告書においては、近畿を中心にその成果をまとめた。その要点は以下のとおりである。縄文時代の埋葬が一般に屈葬を主流とすることは古くから知られているが、これに変化が起きるのは縄文晩期であり、まず腰の部分を伸ばす変化が生ずる。次いで弥生中期には下肢部をも伸展するものの比重が大きくなり、手の部分をも伸展させて完全な伸展葬となるのは古墳時代であることが判明した。この変化の背後には伸展葬が優位の大陸の葬制の影響が考えられ、日本における埋葬儀礼の変遷のみならず、渡来系集団の影響変度の識別においても、本研究の成果は重要な貢献をなす。また大石雅章は古代末期から中世にいたる葬送儀礼における仏教や僧のかかわり方を研究テ-マとして追求し、とくに天皇の葬送儀礼における仏教の役割を解明した。まず、古墳時代以来の陵墓の主流をなした墳丘墓である山陵が消滅し、これに代わって右の卒塔婆が立てられるなど仏教的要素が出現するとともに僧侶が導師や呪願をつとめ、やがて主家の御願寺などの寺院の近くで葬送が実施される。さらには寺院内に納骨される段階を迎え、12世紀初頭の院政期には遺骸そのものが法華堂に入り、寺院伽藍の一つが陵墓となるにいたる。こうして、近・現代における墳丘墓形態の陵墓の復活以前においては仏教的色彩が濃厚に認められることは注目すべきである。1.分担者の福永は弥生時代の葬制を中心に研究を進め,とくに屈葬と伸展葬について,その時期差と地域差について資料集成を行ない,西日本において弥生時代後期に転換期のあることを明らかにした.分担者の大石は中世の墓制について文献史料の分析を進める一方,静岡県一ノ谷遺跡をはじめ中世墓地遺跡の現地調査をも実施した.代表者都出は,これらの研究を総括しつつ,かつ中国や朝鮮半島など外国の葬制との比較をも進め,古墳時代の開始期に,葬制に関して中国思想の影響があることを明らかにした.2.葬制解明のための野外調査に関しては,古墳発堀計画の推進のために,本年度は古墳の分布調査と測量調査を実施して所期の目的を達成した.発堀調査については土地の所有者との交渉などに予想以上の時間がかかり,若干遅れている.しかし,その分の時間とエネルギーを墳丘測量などに重点を移したので,次年度調査との総合的見地にたてば,支障はない.3.備品の主要部分を占める図書は,古代葬制を研究する上で欠かせない基本文献のうち,代表者が所属する大阪大学に所蔵していなかったものを購入した.この文献の研究にもとづき,原始から中世にいたる,当核課題に関する研究は極めて容易になった.また,日本古代と比較するための,中国・朝鮮を中心とする諸外国の文献についても蓄積することができた結果,国際的視野にたった研究の展望がひらけつつあるのは極めて喜ばしいことである.4.以上の研究成果は,考古学と文献史学の二つの方法の共同によるところが大きいといわねばならない.この長所を次年度以降にも活用して所期の目的を達成したい.本年度の研究最も主要な内容は、日本古代葬制解明のための発掘調査であった。