hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニューロン-グリア-血管連関に基づく多発性硬化症の多変量PET解析基盤構築研究

本研究は、原因不明の難病である多発性硬化症(MS)の病態を多角的に解析するためのPET解析基盤を構築することを目的とした。脳内乳酸および脳内炎症を解析するためのL-[3-11C]lactate、18F-PBR111の合成法を確立し、小動物を用いたPET解析を可能とした。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスの脳エネルギー代謝解析のため、マウスに適用可能な15Oガス自発吸入による脳酸素代謝評価法を開発した。さらに、EAEマウスを用いたPET/MRI解析を行いMS白質病変を高感度に検出可能な18F-PQ6を見い出した。本研究の目的は、原因不明の難病である多発性硬化症(Multiple Sclerosis; MS)を対象に、重要な脳エネルギー基質であるグルコース・酸素・乳酸・酢酸のPET代謝解析を行うことにより、ニューロン-グリア-血管連関の四次元変化をエネルギー代謝を基軸として定量的に捉え、MS病態理解のためのPET解析基盤を構築することにある。また、保有する脳疾患プローブライブラリのインビボスクリーニングによりMS標的PETプローブを効率的に開発し、これらを併せることで、MS発症分子メカニズムの解明のみならず、MSの早期診断・予後予測・治療効果予測法の開発など新たなMS臨床診断法の開発に貢献する。本年度は、以下の検討を行った。(1)MSモデル動物の作製:本研究課題開始後の調査によりMSモデル動物としての有効性が知られている実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)動物としてマウスを用いたものが入手可能であることが判明した。そこで以降の検討においてはMSモデル動物としてEAEマウスを用いることとした。(2)マウス脳酸素代謝評価法の構築:これまでにマウスを用いた脳酸素代謝評価法は報告されていない。そこで本研究ではマウスに適用可能で、非侵襲的かつ同一個体での長期追跡を可能とする脳酸素代謝評価法の開発を行った。すなわち、15O標識ガスと空気および酸素ガスとの混合ガスをマウスに自発吸入させながら同時にPET撮像できる15O-PETシステムを構築し、完全非侵襲的なマウス脳酸素代謝評価法の開発に成功した。(3)各種PETプローブの合成法検討:L-3-11C-lactateは酵素法により、18F-PBR111は自動合成装置内のHPLC精製ユニットの後に固相抽出ユニットを導入することにより、高い放射化学的純度で合成可能な手法を構築した。本研究課題を推進するためのEAEモデル動物入手経路が確立でき、今後のPET実験を行うための各種プローブの合成法やマウスでの脳酸素代謝評価法を確立できた。今後これらを組み合わせることにより、本研究課題の目標を達成できるものと期待できる。以上より、本研究課題はおおむね順調に進展している。本研究の目的は、原因不明の難病である多発性硬化症(MS)を対象に、グルコース・酸素・乳酸・酢酸のPET代謝解析を行うことにより、MS病態理解のためのPET解析基盤を構築することにある。(1)マウス脳酸素代謝評価法の開発:昨年度に構築した15O標識ガス自発吸入PETを可能とする15O-PETシステムについて、脳循環代謝障害モデルマウスを用いてその有効性を調べた。すなわち、両側総頸動脈狭窄マウスを用いて術後経時的に本システムを用いたPETを施行し、術後28日までの脳循環代謝パラメータの変化を調べた。その結果、術後早期の脳血流量低下と酸素摂取率上昇、および、術後後期にかけての緩やかな酸素代謝率低下を認めた。以上より、本システムを用いた15O-PETはマウスにも適用可能であることが示された。(2)L-3-11C-lactateを用いたPET法の開発:昨年度合成法を開発したL-3-11C-lactateについてインビボPET解析検討を行った。ラットへのL-3-11C-lactate尾静脈内投与後の血中化学形変化をHPLC法を用いて調べた。また、食餌や薬剤負荷により種々の生理状態としたラットを用い尾静脈内投与後の頭部PET撮像を行った。その結果、L-3-11C-lactateは速やかに代謝され投与10分後の血中未変化体は10%程度であることが示された。またL-3-11C-lactate PETの結果から、絶食条件下において乳酸が脳エネルギー基質となる可能性が示された。本年度は、本研究課題で対象とするエネルギー基質のうち酸素・乳酸を標的としたPET解析基盤を構築できた。今後さらに、脳内炎症イメージングプローブ・新規MS標的PETプローブを用いた研究を組み合わせて推進することにより、本研究課題の目標を達成できるものと期待できる。本研究では、原因不明の難病である多発性硬化症(MS)を対象に、MS病態理解のためのPET解析基盤を構築する。

また、MS標的PETプローブを効率的に開発し、これらを併せることで、MS発症分子メカニズムの解明のみならず、MSの早期診断・予後予測・治療効果予測法の開発など新たなMS臨床診断法の開発に貢献する。本年度は、以下の検討を行った。(1)MS標的PETプローブの開発:MSは脳、脊髄の白質が硬く瘢痕化する病理的特徴を有している。そこで保有する脳疾患プローブライブラリの中から脳内正常白質への高い集積性を有する18F-PQ6に着目し、これを用いたMS病態のPET/MRI解析を試みた。MS動物には実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスを採用し、7T MRIによる磁化移動率(MTR)撮像および18F-PQ6を用いたmicroPET撮像を連続的に施行した。PET画像とMRI画像の位置合わせを行った後、MRI画像にて関心領域を設定し、延髄、脊髄領域のMTR値と放射能集積(SUV)を調べた。その結果、EAEマウスは対照マウスに比べ同等のMTR値を示した一方で有意なSUVの低下を認めた。以上より18F-PQ6は高感度なMS白質病変プローブとなり得る可能性が示された。(2)L-3-11C-lactateを用いたPET法の開発:昨年度から継続してL-3-11C-lactateを用いたインビボPET実験を行った。その結果、L-3-11C-lactateは速やかに代謝され投与10分後の血中未変化体は10%程度であり、さらに、主要代謝物は糖新生により生成したと考えられる11C-glucoseであることが明らかとなった。L-3-11C-lactate投与早期のPETデータを用いて血液画分を考慮したコンパートメント解析を実施したところ、絶食条件下において乳酸が脳に積極的に取り込まれる可能性が示された。本研究は、原因不明の難病である多発性硬化症(MS)の病態を多角的に解析するためのPET解析基盤を構築することを目的とした。脳内乳酸および脳内炎症を解析するためのL-[3-11C]lactate、18F-PBR111の合成法を確立し、小動物を用いたPET解析を可能とした。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスの脳エネルギー代謝解析のため、マウスに適用可能な15Oガス自発吸入による脳酸素代謝評価法を開発した。さらに、EAEマウスを用いたPET/MRI解析を行いMS白質病変を高感度に検出可能な18F-PQ6を見い出した。H28年度は18F-PBR111を用いたPETによるマウス脳内炎症の解析法構築とEAEマウスへの適用、および、新たなMS標的PETプローブの開発研究を重点的に行う。H29年度は18F-PBR111を用いたPETによるマウス脳内炎症の解析法構築、および、新たなMS標的PETプローブの開発研究を重点的に行う。放射性薬品化学・分子イメージング学H28年度はH27年度に構築したマウス吸入PETシステムをそのまま用いることが出来たこと、合成用試薬に関してH27年度に購入したものがそのまま使用できたことから、H28年度に予定した消耗品費を大きく節減することが出来たためである。H29年度は新たなMS標的PETプローブ開発研究を重点的に行うことから、そのために必要な合成用試薬および放射性同位元素の購入に充てる。
細胞質型チロシンホスファターゼShp2が発する新規細胞内シグナルの同定と解析

本研究では、細胞増殖因子の受容体および細胞外マトリックスの受容体として働くインテグリンの細胞内シグナル伝達経路におけるShp2等のチロシンホスファターゼの役割を明らかにすることを目標にしている。今回、四回膜貫通型蛋白質テトラスパニンファミリーに属するCD151に着目した。テトラスパニンはインテグリンを始めとし増殖因子受容体など様々な膜蛋白質と結合することが知られている。その中でCD151はラミニン受容体であるインテグリンα3β1と非常に強く結合しその機能を制御することが報告されてきている。しかしながら、どの様な分子機構によりその制御機能を発揮しているかは不明であった。私は本年度の研究により、CD151をRNAi法によりノックダウンするとインテグリンα3β1の活性化によりもたらされるFAK,paxillin,p130Cas,Srcのチロシンリン酸化が低下することを見出した。またその結果、ラミニン基質への接着強度が低下することがわかった。この時、細胞質型チロシンホスファターゼShp2が関与している可能性を考え解析を行った結果、Shp2と共免疫沈降してくる約95kDa蛋白質のチロシンリン酸化がCD151をノックダウンすることにより顕著に低下することを見出した。現在、この蛋白質の同定を試みている。また、Shp2以外にもインテグリン細胞内シグナルに関与することが知られているチロシンホスファターゼPTP1BやPTPαについても解析を行おうとしている。CD151は、これらチロシンホスファターゼの活性・機能調節を行うことによりインテグリンによるチロシンリン酸化シグナルを制御している可能性が考えられる。本研究では、細胞増殖因子および細胞外マトリックスのレセプターとして働くインテグリンの細胞内シグナル伝達経路における細胞質型チロシンホスファターゼShp2の役割を明らかにすることを目標にしている。繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の細胞内シグナルに着目し、Shp2が結合するドッキング蛋白質であるFRS2αおよびGab1の働きについて解析を行った。方法としては、FRS2αあるいはGab1を発現しない変異マウスより調製した胎児繊維芽細胞にFRS2αあるいはGab1の野生型あるいは変異型蛋白質を発現させることにより行った。その結果、FGFRの細胞内シグナル伝達経路において、FRS2αおよび,Gab1がPI3-Kの活性化に必須であることを見いだした。このとき、FGFRに結合したFRS2αがGrb2を介してGab1に結合することがこの機能を発揮する上で重要な役割を果たしていることを明らかとした。また、Shp2はこのFGFR-FRS2α-Grb2-Gab1複合体に結合することにより、MAPKの活性化制御に寄与していることを見出した。インテグリン細胞内シグナルにおけるShp2の機能解析を行うために、ヒト肺腺癌由来の上皮系細胞株A549にShp2を過剰発現させた細胞株を複数個樹立した。この細胞を用いて、基底膜の主要成分であるラミニンにより活性化される細胞内シグナルの解析を行った。その結果、Shp2を過剰発現させた細胞において、p130^<Cas>のチロシンリン酸化が顕著に持続することを見出した。ただし、従来報告されているMAPKの活性化の亢進は観察されなかった。今後、siRNA法によりShp2の発現を抑えた細胞を用いての解析も進める予定である。本研究では、細胞増殖因子の受容体および細胞外マトリックスの受容体として働くインテグリンの細胞内シグナル伝達経路における細胞質型チロシンホスファターゼShp2の役割を明らかにすることを目標にしている。今回、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の細胞内シグナルに着目し、Shp2が結合するドッキング蛋白質であるFRS2α(FGF receptor substrate α)を介した負の制御機構の解析を行った。FRS2αはそれに結合するShp2を介してMAPK(mitogen-activated protein kinase)を活性化することが知られている。活性化を受けたMAPKはFRS2αのトレオニン残基をリン酸化することによりFRS2αのチロシンリン酸化を抑制する。その結果、MAPKはShp2のFRS2αへの結合量を低下させ、FRS2αによる細胞内シグナルを減弱させる。今回の研究により、MAPKはFRS2αに直接強く結合することによりFRS2αをリン酸化することを見出した。この結合は、MAPK上の「Docking Groove」とFRS2α上の「f-X-f」モチーフ間で起こっていた。さらに、MAPKが結合することが出来ないFRS2α変異体を用いた実験において、そのFRS2αに結合しているGab1やSosがMAPKによるリン酸化を受けないことを見出した。MAPKによるGab1やSosのリン酸化も細胞内シグナルの負の制御に関わっている。この結果は、FRS2αがMAPKの足場として働くことによりFGFR細胞内シグナルの負の制御に関与していることを示している。

その中でCD151はラミニン受容体であるインテグリンα3β1と非常に強く結合しその機能を制御することが報告されてきている。しかしながら、どの様な分子機構によりその制御機能を発揮しているかは不明であった。私は本年度の研究により、CD151をRNAi法によりノックダウンするとインテグリンα3β1の活性化によりもたらされるFAK,paxillin,p130Cas,Srcのチロシンリン酸化が低下することを見出した。またその結果、ラミニン基質への接着強度が低下することがわかった。この時、細胞質型チロシンホスファターゼShp2が関与している可能性を考え解析を行った結果、Shp2と共免疫沈降してくる約95kDa蛋白質のチロシンリン酸化がCD151をノックダウンすることにより顕著に低下することを見出した。現在、この蛋白質の同定を試みている。また、Shp2以外にもインテグリン細胞内シグナルに関与することが知られているチロシンホスファターゼPTP1BやPTPαについても解析を行おうとしている。CD151は、これらチロシンホスファターゼの活性・機能調節を行うことによりインテグリンによるチロシンリン酸化シグナルを制御している可能性が考えられる。
光電子融合型疑似ランダム系列発生技術と計測応用に関する研究

光信号をなるべく光領域でデジタル処理できれば、従来のアナログ処理技術では難しかった、高速・低消費電力で光ランダムパルス系列信号発生を実現可能である。このランダムパルスは自然界にはない規則性を持つので、光計測の高感度化、光通信の評価用パルス光源の実現に寄与可能である。本研究では、光と電子技術の両者の利点を生かすことによって、100 Mbit/s40 Gbit/sの動作速度を持ち、光計測・光通信両者に対応可能な光信号のデジタル処理技術を確立した。主目標の1つであった光計測の高感度化は未達成であるが、当初予定していなかった、光通信の符号を別の形態に簡便に変換できる回路を実現することができた。光計測、光通信の両方にとって有用な、任意速度、小型・簡便構成などの特徴を持つ「光・電子融合型疑似ランダム系列発生回路」の実現に向け、必須構成要素である光排他的論理和(Exclusive Or: XOR)回路の検討を行った。2種類の構成[(a)バランス受光器+強度変調器、(b)マッハツェンダ型干渉計+受光器+強度変調器]に関して、シミュレーションおよび基礎実験によって、基本特性、機能拡張性の評価、比較を行った結果、以下の知見が明らかになった。1.(a)、(b)両構成とも、動作帯域は必要性能(数100 MHz40 GHz)をカバー可能である。2.光波の干渉を利用する(b)の構成では、通常の1入力受光器、低駆動電圧の電界吸収型半導体強度変調器を使用できるため、消費電力面では(a)の構成より優位である。しかし、疑似ランダム系列発生回路構成時の動作安定化のためには、2入力光波間の位相を波長の1/100オーダで安定化させる必要がある。光・電子融合集積技術が未成熟なため、現状、疑似ランダム系列発生回路中の光遅延線はバルクあるいは光ファイバ光学系で構成する必要がある。従って、2.の位相安定化の要求条件から、今回は(a)の構成を用いて光XOR回路実現のための実験検討を行った。その結果、100 Mbit/s(光計測用)、1040 Gbit/s(光通信用)の両ビットレート帯で動作する光XOR回路を実現することに成功した。その結果、今後、疑似ランダム系列発生回路を実現し、光計測へ応用展開する上で有用な多くの知見を得ることができた。様々な信号速度で動作し、簡便構成、小型、低消費電力の光排他的論理和回路とその応用である光疑似ランダム系列発生回路は、光計測、光通信の両方にとって重要である。光・電子融合技術を駆使してその実現に向けての検討を進めてきた。平成25年度に実現した「バランス受光器+強度変調器」構成の光排他的論理和回路をベースとし、平成26年度は、(1)数100 Mb/sの光疑似ランダム系列発生回路を実現することを目標とした。また、(2)上記発生回路を光伝送路の評価等に用いられる時間領域光リフレクトメトリ用の相関処理信号源として適用することによって、測定信号のS/N比を向上し、測定レンジを数10 km程度拡大することを目指した。実験を中心とした検討の結果、現在に至るまで、(1)のランダム系列発生回路を実現できていない状況にある。これは、信号周回による雑音の蓄積効果が予想以上に大きく、増幅部の利得飽和、フィルタ挿入によっても解決されていないためである。(1)のランダム系列発生回路は、反射型光計測技術用の簡便・低コスト化光源として有用であるため、平成27年度以降も、適宜所属機関等の研究費を活用して検討を継続する予定である。上記フォーマット変換回路と、光排他的論理和回路の40 Gb/s動作との2編に関して、英文論文誌に投稿中であるが、採否未定である。光エレクトロニクス光・電子融合型疑似ランダム系列発生回路の実現に必須な光XOR回路に関して、シミュレーションおよび基礎実験による検討を行い、その結果を基に、当初の予定通り、光XOR回路を実現することができたため。これまでに得た知見、課題を基に、バルクあるいは光ファイバ遅延線構成の2値疑似ランダム系列発生回路実現のための実験検討を開始する。遅延線長は数10 cmオーダとなるため、主に光計測用途の数100 Mb/s数Gb/sオーダの信号発生を目指す。信号周回による雑音蓄積が問題となり得るが、その場合、利得飽和、フィルタ挿入等の手法を用いて解決を試みる。他要因が問題となる場合には、構成の見直しを行う。また、上記の疑似ランダム系列発生回路を、光ファイバ伝送路評価などに使用可能な時間領域光リフレクトメトリ(OTDR: Optical Time Domain Reflectometry)の信号源として適用する実験を行う。

通常のOTDRに対して、受信信号のS/N比を数dB程度向上し、測定距離を数10 km程度拡大することを目指す。目標特性の実現が難しい場合には、測定信号の品質特性(強度揺らぎ、ジッタ、S/N比)の向上のため、回路の動作パラメータの見直しを行う。研究遂行に必要なRF増幅器の納品が当初の予定より遅れ、平成25年度の物品費の実支出額に含まれていないため。RF増幅器は納品済のため、平成26年度の早期に実支出額に計上される予定である。平成26年度分として請求した助成金は、当初の予定通りの項目で計画的に使用する予定である。
癌の浸潤・転移に関わるLutheran/B-CAMの研究

Lutheran/B-CAMは、卵巣癌で発現が上昇する抗原として発見された経緯を持つイムノグロブリンスーパーファミリーのひとつである。最近、研究代表者はLutheran/B-CAMがラミニンα5鎖と特異的に結合することを報告した(J.Biol.Chem.(2002)277,44864-44869)。ラミニンα5鎖はγ1鎖とβ1またはβ2鎖の三量体を形成し、ラミニン-10/11(α5,γ1,β1/2)として生体の殆どの基底膜に分布する。このことから癌細胞が基底膜に浸潤する際に、Lutheran/B-CAMとラミニンα5鎖の相互作用が関与している可能性が高い。しかしながら、Lutheran/B-CAMの発現や機能はほとんど明らかになっていない。本年度の研究では、癌細胞株におけるLutheran/B-CAMの発現やラミニンα5鎖上における細胞接着への関与を解析し、さらに卵巣癌以外のヒト癌組織における発現を検討した。その結果、癌細胞株における発現では転移性の弱いまたは高分化の細胞ほどLutheran/B-CAMの強い発現が観察された。また、ラミニンα5鎖における細胞接着では、発現の強い細胞は紡錘状の形態を示し、弱い細胞はフラットな形態を示した。細胞接着実験では、独自に作製した組み換えラミニン40(ラミニンα5鎖を含む)を使用し、あわせてLutheran/B-CAMの結合部位の同定も行った。さらにヒト肝細胞癌組織における免疫染色により、正常の肝細胞では見られないLutheran/B-CAMが、高分化型よりも低分化型の肝細胞癌で強く発現するのを見出した。以上、Lutheran/B-CAMが癌細胞の接着とその形態を制御する分子であることが示唆され、さらにLutheran/B-CAMが肝細胞癌の分化度を診断する有効なマーカーとなる可能性が示された。
視覚的ストレスの測定とその尺度化に関する心理物理学的研究

従来の視覚的ストレス研究では,被験者は光過敏性てんかん(photosensitive epilepsy)患者や片頭痛患者が主であった。そこで,本研究計画では,一般の健常者における視覚的ストレス(visual stress:広義の視覚刺激による不快感全般)の問題を取り上げ,一般健常者を被験者として心理物理学的実験を行った。本研究では,各刺激による視覚的ストレスの効果は,マグニチュード推定法(method of magnitude estimation)を用いて測定した。本研究で検討を加えた主な問題は,(1)幾何学的パターンの物理特性(チェック・パターンの縦/横比,ストライプ・パターンの空間周波数,パターンの大きさなど)と視覚的ストレスの効果;(2)ストライプ・パターンの色彩が視覚的ストレスに及ぼす効果;(3)ポケモン事件の視覚的ストレスに関する認知的要因:の三点である。それぞれの結果の概要は,以下の通りである。(1)生理的指標(脳波)による光過敏性てんかん患者での結果とは異なり,健常者では細かいチェック・パターンによる視覚的ストレスの効果が大きかった。(2)ストライプ・パターンのコントラストが一定の場合には,黄色のストライプ・パターンによる視覚的ストレスの効果が最も大きかった。(3)同一の視覚刺激を観察した場合でも,その観察者の心理的・認知的要因によって視覚的ストレスの効果は変化する。
新規チオレドキシン関連分子TMXによるレドックス制御機構の解析

・TMXと相互作用する分子の同定:tag配列を付加したTMXの発現ベクターを作製し、細胞への導入および薬剤による選択後、TMXを安定に発現する細胞株を樹立した。同時にインサートをもたないコントロールベクターを導入した細胞株も作製した。こうして得られた細胞から細胞抽出液を調製し、tagに対する抗体を用いて免疫沈降を行った。回収された免疫沈降物について、ウエスタンブロッティングおよびプロテーオーム解析により、構成成分の同定を行ったところ、小胞体の分子シャペロンとTMXの相互作用を示唆するデータを得た。・TMXノックアウトマウスの作製:遺伝子ターゲティングベクターをES細胞に導入し、相同組換えの起こったES細胞クローンのスクリーニングを行った。PCRにより同定されたESクローンについて、サザンブロットハイブリダイゼーションによる確認を行い、最終的に組換え体を単離した。得られた組換え体をマウス胚にインジェクションし、キメラマウスを作製した。・RNAiによるTMX遺伝子ノックダウン:ヒト培養細胞における遺伝子発現抑制を目的として、TMXのsiRNA発現ベクターを作製した。RNAiベクターを細胞に導入し、薬剤による選択後、耐性クローンを単離した。ウエスタンブロッティングにより、TMXの発現抑制効果の確認を行い、複数のTMXの遺伝子ノックダウン細胞を取得した。1.in vitro転写/翻訳系を用いて、TMXのN末端領域がシグナルペプチドとして認識・切断されるかどうか検討した。イヌ脾臓由来ミクロソームメンブレン(CMM)を反応液に加えることにより、シグナルペプチドの切断や膜通過、糖鎖結合などのプロセシングを再現できる。CMM非存在下では、TMXはシグナルペプチドのついた前駆体型として合成された。CMMを添加することにより、分子量の小さい成熟型も同時に検出されたことから、TMXのN末端領域はシグナルペプチドとして機能し膜透過後に切断されることが示唆された。2.TMXの膜への結合様式を調べるため、アルカリ溶液、および界面活性剤を用いて膜からの抽出を試みた。アルカリ処理により膜は断片化し、表在性膜タンパク質や内腔のタンパク質は可溶化されるのに対し、内在性膜タンパク質は抽出されない。小胞体内腔に存在するPDIが、アルカリ処理によって可溶化されたのに対し、TMXは膜から抽出されず不溶性の沈澱として回収された。界面活性剤の存在下では可溶化され上清に回収されたことから、TMXは内在性膜タンパク質であり、膜貫通ドメインと予想される疎水性領域を介して膜に強く結合していると考えられた。3.TMXの膜上でのトポロジーを、プロテアーゼによるタンパク質の切断パターンから決定した。プロテアーゼ処理により、膜の外側に露出した部分は切断されるが、内腔側の部分は保護されるので、分子量の小さくなったペプチド断片が検出される。293細胞より調製した膜画分をトリプシン処理後TMXのN末端領域に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。トリプシン処理により約20kDaのバンドが新たに検出された。この保護された領域は、抗体が認識可能なTMXのN末端側に相当すると考えられ、TMXはチオレドキシンドメインを含むN末端側が小胞体の内腔に存在し、C末端側が細胞質側に向く、いわゆるI型膜タンパク質であると予想された。
メラノプシンが非視覚応答を担う分子機構の解明

哺乳類の目の数%の網膜神経節細胞には青色光感受性の光受容タンパク質メラノプシンが発現しており、概日時計の位相調節や瞳孔の開閉などの非視覚応答を制御する。メラノプシンは桿体・錐体の光受容体とは異なり、無脊椎動物オプシンに類似していると考えられている。網膜の視覚応答・非視覚応答を理解するために、本研究ではランダムミュータジェネシスおよび特定の領域を狙うメラノプシン変異体作製を同時並行させた。哺乳類培養細胞にメラノプシン変異体を発現させ、青色光照射によるカルシウム濃度の変化、つまりメラノプシン光応答をin vitroで測定し、数種類の光応答変異体を単離した。哺乳類の網膜では桿体・錐体に加え、数パーセントの網膜神経節細胞が第三の光受容細胞として機能する。この細胞には青色光感受性の光受容タンパク質であるメラノプシンが発現しており、メラノプシン発現網膜神経節細胞と呼ばれる。メラノプシン発現網膜神経節細胞は自身で光を感じると共に桿体・錐体からの投射も受け、概日時計の位相調節や瞳孔の開閉などの非視覚応答を制御する。メラノプシン発現網膜神経節細胞内で光情報がいかに制御されているのかを解明することは、桿体・錐体とメラノプシン発現網膜神経節細胞の光応答の違いの理解へとつながる可能性がある。本研究ではメラノプシンおよびメラノプシン発現網膜神経節細胞の性質を明らかにするため、メラノプシンの変異体作製を行った。ランダムミュータジェネシスおよび特定の領域を狙う変異体作製を同時並行させ、数十種類の変異体を作製した。それらを哺乳類培養細胞に発現させ、メラノプシンの光応答に与える影響を調べた。哺乳類培養細胞を暗黒条件下で維持し、さまざまなメラノプシン変異体を細胞にトランスフェクションした後に青色光を照射し、カルシウム濃度の変化を測定した。その結果、数種類の光応答変異体を単離することに成功した。得られた変異体を組換えアデノ随伴ウィルスベクター用いてメラノプシンノックアウトマウスに発現させて瞳孔収縮などの非視覚応答を測定し、生体レベルで変異の効果と意義を評価することが本課題の最終目標である。そのための眼内注入の手法の確立にも着手し、実際に可能にすることができた。哺乳類の目において、1ー2%の網膜神経節細胞に青色光感受性の光受容タンパク質であるメラノプシンが発現しており、メラノプシン発現網膜神経節細胞と呼ばれる。つまり、哺乳類の網膜においては桿体・錐体に加え、メラノプシン発現網膜神経節細胞が第三の光受容細胞として機能する。メラノプシンは桿体・錐体の光受容体とは異なり、無脊椎動物のオプシンに類似すると考えられている。視覚応答・非視覚応答を理解するために、メラノプシン発現網膜神経節細胞内で光情報がいかに制御されているのかを解明したい。本研究ではメラノプシンの性質を明らかにするためランダムミュータジェネシスおよび特定の領域を狙った変異体の作製を同時並行させた。哺乳類の培養細胞を暗黒条件下で維持し、メラノプシン変異体を細胞に発現させ、青色光の照射によるカルシウム濃度の変化、つまりメラノプシンの光応答をin vitroで測定した。数種類の光応答変異体を単離することに成功し、得られた変異体を組換えアデノ随伴ウィルスベクター用いてマウスの網膜神経節細胞に発現させて非視覚応答を測定し、in vivoで変異部位の意義を評価した。当初の計画ではメラノプシンの様々な変異体の作製を進める予定であり、実際にそれを遂行して細胞に発現させることで機能を評価し、in vivo実験に持ち込む候補分子を得ることが出来た。また、マウスの網膜神経節細胞への導入方法を確立することができた。このように研究は計画通り順調に進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学今後は選定した候補分子をマウス個体において評価する。そのための行動・生体レベルでの評価系の構築に取り掛かる。明暗環境をコントロールできるマウス飼育環境のセットアップ、瞳孔収縮測定の構築、そのための暗室などを整えたい。
ミクロからマクロまでのスケールを統一的に扱える「界面」現象理論と解析手法の構築

前年度に引き続き、ミクロからマクロまでのスケールを統一的に議論する解析手法を構築するため、マクロスケールの現象を表現でき、ミクロスケールに拡張できるモデルを開発した。前年度に開発した解析手法は以下の通りである。1.高精度に気液界面を追跡する混相流解析手法(連続体近似による方法)、2.ミクロスケールを表現するための物質輸送に対する粒子挙動解析手法(離散的な方法)、3.連続体的な手法と離散的な手法を連成する方法3で示した計算手法の構築には前年度に成功していたが、その離散的な方法と連続体近似による手法を連成した計算手法の検証、離散的な方法での相互作用の影響を取り入れられていなかった。さらに、新規計算手法を用いた場合に、実際の現象がどの位微小スケールで変化するかの計算も行えていなかった。そこで、今年度は以下の方法でこれらの問題に取り組んだ。1.連続体と離散的な手法を連成した場合の方法に対しての検証、2.離散的な手法へ相互作用の影響を取り入れるように計算プログラムを変更、3.実際に分子動力学法と連続体力学手法の方法、新規数値モデルを用いた場合の3パターンで比較し、新規モデルでの物理現象の確認これらを行い、新規開発した計算手法の健全性、モデルが表現できる物理現象の限界を探った。実際に、新規開発した計算手法では連続体近似による手法と、分子動力学方による手法の間の計算結果となることが判った。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究目的はマクロスケールからメゾスケールまでのスケールにおいて、「界面」現象であるマランゴニ対流とメゾスケールで顕著となる現象の大きさを定量評価し、一般化することである。本年度はこれを達成するために、以下の研究を行った。ミクロからマクロまでのスケールを統一的に扱える数値シミュレーションモデルの大枠を構築した。初めに、ミクロスケールで見られる分子による熱揺動の影響をマクロな混相流の数値流体シミュレーションモデルに加え、混相流の数値シミュレーションモデルの開発を行った。この際に、混相流モデルとして既存のマクロスケールで用いられているVolume of Fluid法をベースに混相流モデルを構築した。Volume of Fluid法を用いる場合には高精度化のため、Level Set法と組み合わせたCLSVOF法の数値シミュレーションコードを開発した。さらに、微小スケールにおける物質輸送のために離散的にLangevin方程式と連成し、ミクロスケールでの離散的な手法とマクロスケールでの連続的な手法の連成を行い、メゾスケールにおける数値シミュレーションまでを解析できるように大枠を作成した。さらに、このシミュレーション手法を用いて数値シミュレーションを行い、実際にマクロスケールでの現象を計算できるかどうかを確認した。この計算でマクロスケールでの現象を正確に計算することができた。数値シミュレーションモデルの作成に関しては順調に開発を行うことができた。初年度にマクロスケールでのモデルを基にミクロモデルを加えるという方法で本研究に取り組み、マクロスケールでの現象を包含しながらミクロスケールの影響を取り込める大枠の方法論を確立した。故に、これからミクロモデルを追加していくための基盤ができているため、容易にミクロモデルを導入することができる。これは、今後研究を進める上でも非常に重要であり、順調に進展していると考えられる。さらに、この結果を国際学会で発表した結果、selected paperにも選ばれ、注目を浴びた。現在までの進捗状況で説明したように、これまでに全体の枠組みとしての数値解析手法の構築を終えた。マクロスケールでの現象との比較・検証も終えたため、今後はミクロモデルの導入と検証を行う必要がある。そこで、今後は微小スケールでの数値モデルの構築に取り組む。具体的には、微小スケールでのモデルを導入するために連成した離散的な手法に、分子間の力を加えることで、実際にミクロスケールでの現象を取り込んでいく。
マウス蝸牛における周波数弁別機構の分子生物学的解析

蝸牛における周波数弁別機構を解明するために、蝸牛の基底回転および頂回転よりラセン神経節細胞とコルチ器のmRNAを抽出し、周波数特異的な回転別の蝸牛cDNA・cRNAを作成し、さらに最新の研究手技であるDMマイクロアレイ法を導入することで、基底回転、頂回転のラセン神経節細胞・コルチ器に特異的に発現する分子の同定を行った。頂回転側で基底回転側より3倍以上の発現増加が見られたのは、解析を行った19801遺伝子中184遺伝子で、逆に、基底回転側で3倍以上の発現増加が見られたのは、19801遺伝子中181遺伝子であった。NAマイクロアレイ法により頂回転側と基底回転側で発現量に3倍以上の差が見られたイオン・蛋白輸送に関与する遺伝子中、real-time PCR法による遺伝子発現量の解析でも同程度の差が確認された遺伝子はSlc4a1、Gabt1、Ntsr2、Tac1等で、これらは蝸牛内での周波数弁別に密接に関与する分子であることが推察された。さらに、周波数弁別機構の一つである蝸牛遠心系の神経伝達物質であるGABAとAchの受容体に絞ってマイクロアレイの結果を解析すると、Ach受容体は回転軸間において有意な差が見られなかったが、GABA受容体に関しては、頂回転と基底回転で発現に差が見られた。すなわち、サブユニットθ、δ、ρに関しては回転軸における差は認められなかったが、サブユニットβに関してはβ1とβ2が基底回転側で多く発現し、サブユニットγに関してはγ1とγ2が基底回転側で発現上昇し、γ3に関しては差がなかった。また、α6サブユニットに関しては頂回転に発現しておらず、基底回転のみに発現していた。有毛細胞に発現しているそれぞれ異なったサブユニットで構成されるGABA_A受容体により、物理的な振動により起こる有毛細胞の膜電位上昇に修飾がなされ、これが周波数弁別能の形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。1)マウス蝸牛の摘出6週齢の雄マウスを断頭し、側頭骨を取り出し、RNA-later(Ambion社、RNA Stabilization Solution)を含む35mmデッシュの中においた。蝸牛骨壁と残存する結合組織を除去して、蝸牛軸およびコルチ器を摘出した。頂回転部分と基底回転部分の2つに分割し、それぞれをRNA-laterが1mlが満たされたプレートに移した。なお、氷上にて全ての操作を行った。Qiagen社のRNasy spin columsを使って、Total RNAを精製した。RNAの質および量を最大限に抽出するために、2mlのエッペンドルフチューブに600μlのRLT BufferとともにRNA-later中に保存した組織を移し、ポリトロン・ホモジナイザーで組織が粉砕されるまでホモジナイズした。その後は、キットの手順どうりに精製した。3)蝸牛回転別に抽出したTotal RNAの量と質の評価吸光度や変性ゲルによるRNAの電気泳動法により確認するには、濃度440μg/μlのRNA量が必要になる。2個の蝸牛から摘出されるTotal RNA量は1μg以下と報告されていて非常に収量が少ないため、今回は5ngのRNA量でも正確に量と質を判断できるAgilent 2100 bioanalyzerを用いて、RNA 6000 Nano Assey法により評価を行った。

その結果、頂回転側からは濃度67.41ng/μlで総量50μl、基底回転側からは濃度117.33ng/μlで総量50μlがそれぞれ抽出できた。Total RNA量としては、頂回転=3.37μg、基底回転=5.87μ9のRNAが抽出可能であった。抽出したtotal RNAのエレクトロフェノグラムより、18Sと28SのリボゾームRNAを反映する2点のピークが確認されており、非常に良質のRNAが抽出可能であった。今後、このRNAを用いて、蝸牛の周波数選択性に関連する分子をDNAマイクロアレイにより解析する予定である。蝸牛における周波数弁別機構を解明するために、蝸牛の基底回転および頂回転よりラセン神経節細胞とコルチ器のmRNAを抽出し、周波数特異的な回転別の蝸牛cDNA・cRNAを作成し、さらに最新の研究手技であるDNAマイクロアレイ法を導入することで、基底回転、頂回転のラセン神経節細胞・コルチ器に特異的に発現する分子の同定を行った。頂回転側で基底回転側より3倍以上の発現増加が見られたのは、解析を行った19801遺伝子中184遺伝子で、逆に、基底回転側で3倍以上の発現増加が見られたのは、19801遺伝子中181遺伝子であった。頂回転側に特異的に発現する遺伝子ではtransportに関わる遺伝子が18%を占め、カリウムイオン輸送に関与するKCNJ5、KCNJ9、カルシウムイオン輸送に関与するTRPC6などの遺伝子が確認された。基底回転側でも、同様に、イオン・蛋白輸送に関与する遺伝子が約30%を占め、カリウムイオン輸送に関与するKCNQ5、アミノ酸輸送に関与するSlc7a10、Slc6a5、クロライドイオン輸送の役割を有するGABAレセプターのサブユニットであるGABRB1、GABRB2、GABRG2、Gabt1などの遺伝子が確認された。DNAマイクロアレイ法により頂回転側と基底回転側で発現量に3倍以上の差が見られたイオン・蛋白輸送に関与する遺伝子中、real-time PCR法による遺伝子発現量の解析でも同程度の差が確認された遺伝子はGabt1、Tac1等で、これらは蝸牛内での周波数弁別に密接に関与する分子であることが強く推察された。
生殖細胞の成立と減数分裂移行の分子メカニズム

平成7年度より科学研究費補助金重点領域研究「生殖細胞の成立と減数分裂移行の分子メカニズム」が発足する。有性生殖は多くの高等生物で種の保存に不可欠な過程であり、また生命の多彩な進化の基盤をなしているが、有性生殖過程で中心的な役割を担う生殖細胞の挙動を裏づける分子機構はこれまでほとんど未解明である。近時の細胞周期研究の急激な展開と遺伝子解析技術の進歩により、有性生殖機構の中でも「生殖細胞の成立の分子機構」と「減数分裂の特性とその制御」の2課題の解明が射程に入り、分子レベルでの解析を特段に進め得る好機が到来したと判断される。そのような基盤の上に新領域は発足する。本総合研究は、この重点領域研究の円滑な発足を助けるために、関係する研究者の間で必要とされる調査、調整、準備を行った。具体的には、重点領域研究の計画研究班に参加する予定の班員の従来の研究経過と、予想される今後の研究の発展方向を発表する全体会議(平成6年9月、千里ライフサイエンスセンター)を開催し、総括班員に予定する班員の参加も得て、活発な討議を行った。計画研究班班長である山本と長濱は幾度となく意見交換して、重点領域研究運営の基本方針案を定めた。また、総括班員の主たるもので構成する幹事会においても議論を重ね、重点領域研究発足後の役割分担などについて青写真を作成した。さらには、研究の遂行上お互いの情報交換が望ましい重点領域研究「細胞周期」および「細胞核の機能構造」と協議し、合同公開シンポジウム開催の方向で意見の一致を見ている。
細分化格子法とVOF法を用いた相変化を伴う熱流動解析法の開発

細分化格子法とVOF法を用いた相変化を伴う熱流動解析法の開発として,平成18年度は,次の数値解析および測定実験を行い,次の結果を得た.(1)スタッガード格子を用いた細分化方法による流動解析界面を数値的に表すのにVOF (Volume of Fluid)法を用いた場合,検査体積表面に速度を設定するスタッガード格子を用いなければならない.細分化格子法では,細分化のたびに周囲の格子番号を再認識させる必要があり,さらにスタッガード格子では,圧力位置と速度位置が異なるためにその作業はかなり複雑なものとなる.そこで,前年度,細分化格子の周囲部にダミーの格子を配置するスタッガード格子専用の細分化方法を提案した.そこで,本年度は,ダミー格子を配置する細分化格子法のプログラムを作成し,直交座標系で円柱周りを細分化した計算格子で流れ場を解析したところ,細分化格子を適用することにより計算精度を向上できることが確認できた.動く界面の近傍を自動で細分化するプログラムの開発まで行うことができなかったが,細分化格子法を気泡などの界面に適用することにより計算精度が向上することが分かった.(2)気泡成長実験による気泡形状の測定製作した気泡成長観察実験装置で,底部のノズルから空気を一定流量で流入して成長する気泡の様子を高速度ビデオにより撮影した.そして撮影した画像より気泡形状を測定した.空気の流入速度が遅い場合は,昨年度提案した気泡界面における釣り合いの式より求めたラプラス方程式を用いて算出する気泡形状に近かった.しかし,流入速度が速い場合は,気泡形状は縦長に変形していた.提案した格子細分化法による流動解析プログラムが完成した時に,計算精度を確認できる気泡形状を実験により得ることができた.細分化格子法とVOF法を用いた相変化を伴う熱流動解析法の開発として,平成17年度は,格子の細分化方法の開発と計算精度の確認で必要となる気泡成長観察実験装置の作成および静止気泡形状の推定法の開発を行い,次の結果を得た.(1)スタッガード格子を用いたときの細分化方法の開発表面を数値的に表すのにVOF(Volume of Fluid)法を用いた場合,検査体積表面に速度を設定するスタッガード格子を用いなければならない.細分化格子法では,細分化のたびに周囲の格子番号を再認識させる必要があり,さらにスタッガード格子では,圧力位置と速度位置が異なるためにその作業はかなり複雑なものとなる.そこで,細分化格子の周囲部にダミーの格子を配置するスタッガード格子用の細分化方法を提案し,プログラムを作成した.その結果,計算メモリーは若干多くなったが,周囲の格子番号を認識させる作業ルーチンが単純であるため,計算時間は減少した.現在,流動用プログラムによる動作および計算精度を確認している.(2)気泡成長観察実験装置の作成開発した解析法の計算精度を確認するために必要となる気泡成長現象を観察する実験装置を作成した.そして,底部のノズルから空気を一定流量で流入して成長する気泡の様子を高速度ビデオにより撮影できることを確認した.(3)静止気泡形状の推定法の開発毛細管上昇法などを用いて表面張力や界面張力を測定し,気泡界面における釣り合いの式より求めたラプラス方程式より,不溶性混合液の界面に捕獲された気泡形状を推定した.この推定法では,界面が交わる点において3つの表面張力(界面張力)のベクトルが釣り合うと仮定した.その推定法より求めた気泡形状を実験装置で観察された気泡形状と比較したところ,位置誤差で2%以下であり,高精度で気泡形状を推定できることが分かった.細分化格子法とVOF法を用いた相変化を伴う熱流動解析法の開発として,平成18年度は,次の数値解析および測定実験を行い,次の結果を得た.(1)スタッガード格子を用いた細分化方法による流動解析界面を数値的に表すのにVOF (Volume of Fluid)法を用いた場合,検査体積表面に速度を設定するスタッガード格子を用いなければならない.細分化格子法では,細分化のたびに周囲の格子番号を再認識させる必要があり,さらにスタッガード格子では,圧力位置と速度位置が異なるためにその作業はかなり複雑なものとなる.そこで,前年度,細分化格子の周囲部にダミーの格子を配置するスタッガード格子専用の細分化方法を提案した.そこで,本年度は,ダミー格子を配置する細分化格子法のプログラムを作成し,直交座標系で円柱周りを細分化した計算格子で流れ場を解析したところ,細分化格子を適用することにより計算精度を向上できることが確認できた.動く界面の近傍を自動で細分化するプログラムの開発まで行うことができなかったが,細分化格子法を気泡などの界面に適用することにより計算精度が向上することが分かった.(2)気泡成長実験による気泡形状の測定製作した気泡成長観察実験装置で,底部のノズルから空気を一定流量で流入して成長する気泡の様子を高速度ビデオにより撮影した.そして撮影した画像より気泡形状を測定した.空気の流入速度が遅い場合は,昨年度提案した気泡界面における釣り合いの式より求めたラプラス方程式を用いて算出する気泡形状に近かった.しかし,流入速度が速い場合は,気泡形状は縦長に変形していた.提案した格子細分化法による流動解析プログラムが完成した時に,計算精度を確認できる気泡形状を実験により得ることができた.
乳癌患者に特有な腸管細菌叢の分子疫学的解明

本研究は、乳癌と腸管細菌叢との関係を解明するため、分子生物学的手法を用いて初発乳癌患者と対照となる健常者の腸管細菌叢を網羅的に解析し、乳癌患者に特有な腸管細菌叢パターンを解明する事を目的とした。乳癌患者における登録および検体収集が予定通りに進まず、菌叢パターンの多様性自体が現段階では明らかにならなかった。交付された研究費は患者の便収集、菌叢遺伝子解析の解析等に使用する消耗品の購入にあてた。今後も本研究を継続する予定であり、新たに登録される患者検体の解析に使用する。本研究では、乳癌発がんと腸管細菌叢との関係を解明するため、分子生物学的手法を用いて初発乳癌患者と同年代の健常者の腸管細菌叢を網羅的に解析し、乳癌患者に特有な腸管細菌叢パターンを解明することを目的としている。さらに、腸管細菌叢パターンと乳癌の各病理組織型、ホルモンレセプターやHER2遺伝子発現の有無、患者の食習慣との関係の探索を行う。具体的な方法として対象乳癌患者並びに同年代の健常者女性からi)便を採取後、核酸を抽出し、16S rRNAをPCR法で増幅後に大腸菌への形質転換を行ってサブクローニングし、ライブラリ-の作成を進めている。その後、形質転換された大腸菌を無作為に選択し、塩基配列を決定し、既知の16s rRNA遺伝子とデータベースから相同性検索を行い、腸管細菌叢の構成を決定することを試みている。これまでのところ、健常人の検体を中心に初年度より塩基配列を決定するサンプル数を増やして解析しているが、特有の菌種が検出されることが多く、菌叢パターンの多様性については明らかになっていない。そのため、同一個人の菌叢内での多用性自体が現段階では明らかになっていない。一方で、本研究の主たる対象となる乳癌患者における検体収集が進んでおらず、現段階では健常者と乳癌の比較検討を行えるまでには至っていない。そのため、当初の研究計画を1年延長して本年度、乳癌患者における検体収集の促進を図り、健常者菌叢との比較検討を行う予定である。本研究では、乳癌発がんと腸管細菌叢との関係を解明するため、分子生物学的手法を用いて初発乳癌と同年代の健常者の腸管細菌叢を網羅的に解析し、乳癌患者に特有な腸管細菌叢パターンを解明する事を主たる目的とした。さらに、腸管細菌叢パターンと乳癌の各病理組織型、ホルモンレセプターやHER2遺伝子発現の有無、患者の食習慣との探索を行うことを目的とした。具体的な方法として対象乳癌患者並びに同年代の健常者女性からi)便を採取後、核酸を抽出し、16S rRNAをPCR法で増幅後に大腸菌への形質転換を行ってサブクローニングし、ライブラリーの作成を試みた。その後、形質転換された大腸菌を無作為に選択し、塩基配列を決定し、既知の16S rRNA遺伝子とデータベースから相同性検索を行い、腸管細菌叢の構成を解析した。健常人の検体を中心とした解析では、特定の菌種が検出されることが多く、菌叢パターンの多様性については明らかにすることはできなかった。そのため、同一個人の菌叢内での多様性自体が現段階では明らかになっていない。一方で、本研究の主たる対象となる乳癌患者における便検体の収集が得られず、研究期間内に健常者と乳癌の比較検討を行えるまでには至らなかった。交付された研究費は患者の便収集、菌叢遺伝子解析、病理標本の解析等に使用する消耗品の購入に当てた。今後、申請研究期間終了後も本研究を継続する予定であり、新たに登録される患者検体の解析に使用する。本研究では、乳癌発がんと腸管細菌叢との関係を解明するため、分子生物学的手法を用いて3050歳代の初発乳癌患者と同年代の健常者の腸管細菌叢を網羅的に解析し、乳癌患者に特有な腸管細菌叢パターンを解明する事を目的としている。具体的な方法として対象乳癌患者並びに同年代の健常者女性からi)便を採取後、核酸を抽出し、16S rRNAをPCR法で増幅後に大腸菌への形質転換を行ってサブクローニングし、ライブラリーを作成している。その後、形質転換された大腸菌を無作為に選択し、塩基配列を決定し、既知の菌16S rRNA遺伝子とデータベースから相同性検索を行い、腸管細菌叢の構成を決定する事を試みている。

初年度は実験系の確立のために主として健常者女性の便検体中の菌叢を対象として、16S rRNAクローンライブラリーの構築と塩基配列の決定を行っている。これまでのところ、各人から検出される菌種は特定菌種が検出されるものがほとんどで、菌叢の多様性については明らかになっていない。この理由については、1)塩基配列の決定を行なったサブクローン化検体数が充分でなく、菌叢構成内の全体像を明らかにしきれていない可能性、2)健常者の菌叢そのものが元々多様性に乏しい、の両者の可能性考えられる。次年度は解析を乳癌患者にも拡大して健常者菌叢との比較検討を行う予定である。現段階ではコントロールとしての健常者における便菌叢の多様性が明らかになっていない。この理由として、1)塩基配列の決定を行う検体数が現在行っているレベルでは菌叢構成内の一部しか反映ない、2)健常者の菌叢そのものが元々多様性に乏しい、3)検体ライブラリー作成上の技術的な問題、の何れかが疑われ、検討を進めている。一方で、乳癌患者における検体の収集が進んでいない。そのため、本研究の本来の目的である乳癌患者と健常者の比較にまで至っていない。乳癌患者における登録および検体収集が予定通りに進んでいない。事由の一つとして対象年齢を3050歳代の比較的若年者に限定している事が考えられる。関係者に改めて研究協力を呼びかけ乳癌患者の便等検体収集促進を図る。健常者の菌叢の多様性については、異なる被験対象の検体についても再確認する。I)今後研究登録対象年齢層を50歳代以上にも拡大する事を考慮して検体の収集を促進する。II)健常者および乳癌患者における多様性の有無を確認するため塩基配列の決定を行なうサブクローン化検体数を増やす。III)乳癌生検標本は病理組織型診断並びに病理組織中のホルモンレセプター/HER2発現を解析する。IV)既知の乳癌のリスク因子として知られる項目(近親者における乳癌の家族歴、食事の嗜好[推定平均摂取カロリー、動物性脂肪の摂取量を含む]、初潮年齢、閉経年齢、出産回数、初産年齢、肥満度、など)を含むアンケート調査を乳癌患者に実施する。以上の結果を基に、「健常者と比較して乳癌患者に特有の腸管細菌叢の構成パターン」、「腸管細菌叢の構成パターンと各乳癌病理組織やホルモンレセプター/HER2発現との関連」、「食習慣の内容や既知の乳癌のリスク因子と腸管細菌叢の構成パターン」につき解析する。本研究の主たるターゲットである乳癌患者における検体の収集が進んでいないため次年度へ800,000円を繰り越した。次年度は乳癌患者における検体の収集を進め、主として同患者群における便検体中の菌叢の解析を進める。繰り越しとなる研究費は主として試薬やキット等の消耗品を中心に使用する見込みである。I)増幅PCR断片のクローニング並びにシークエンスに必要な薬品代、培地などその他の薬品代(病理検査関連消耗品を含む)II)生検組織の病理組織診断、ホルモンレセプター/HER2発現の解析III)アンケートの通信費等に使用予定である。
悪性神経膠腫に対する高圧酸素療法併用放射線治療:第I,II相試験

平成12年度からの2年間の研究期間にプロトコールに従って高圧酸素療法併用放射線治療を施行した悪性神経膠腫は21例であり、今回の検討では第II相試験としてこの治療の安全性、効果について検討を行った。Glioblastomaが15例、grade IIIのgliomaが6例であり、KPSは50-100%、年齢は25-71歳であった。6例は完全切除術が施行され、残りの15例は不完全切除術が施行された。放射線治療は週5回法で1回2 Gyとし、それぞれの治療は高圧酸素療法直後(15分以内)に施行された。全症例において予定線量60Gyの放射線治療を化学療法と同時に併用することができた。効果判定が可能である15例において、3例はCR、8例はPR、4例はSDであり、PDの症例は認められなかった。全症例の1、2年生存率はそれぞれ82%,67%であった。Grade III-IVの血液毒性は48%において認められたが、一時的であり白血球減少による発熱や出血は認められなかった。またその他の重篤な副作用も認められなかった。以上の結果より高圧酸素療法併用放射線治療は安全に施行でき効果的であることがわかった。この治療法は有望であり、今後のさらなる検討が必要であると考えられる。なお、この研究は国際学会雑誌に報告された(Radiother Oncol, in press)。放射線治療は週5回法で1回2Gyとし、それぞれの治療は高圧酸素療法直後(15分以内)に施行された。GradeIII-IVの血液毒性は48%において認められたが、一時的であり白血球減少による発熱や出血は認められなかった。