hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ICTを活用した離島・へき地教育における教員支援にかんする研究

(1)昨年度実施した離島教員へのICTに関するニーズや実態調査を踏まえ,離島におけるICT活用のワークショップを実践した。内容は,インターネット回線に頼らないプロジェクタやデジタルビデオ・カメラの活用,情報モラル教育,遠隔教育環境下の遠隔交流学習の進め方に関するものをテーマとした。分科会方式を取り,複数のテーマを選択するようなワークショップを設計したところ,参加者からの肯定的な評価を得ることができた。(2)長崎,鹿児島,沖縄の3地区(いずれも複式学級;2小学校は3,4年生,1小学校は3年生と5年生の複式)間の遠隔共同学習の授業研究を行った。また,授業研究を通して,事前打ち合わせ,事後授業検討会(これらもテレビ会議システムを用いて行う)教員のサポートも行った。授業設計時にはメーリングリストも活用した。「総合的な学習の時間」や社会科での地域文化を共通の学習テーマとし,遠隔学習環境で相互発表活動を行う授業を設計した。その結果,発表に関する自信が出てくる,他地域の視点に気づく,他の学校との子どものつながりを実感するという視点から,本授業実践の効果を実証的に明らかにしたことで,昨年度の実践方法を検証することができた。また,離島によくある回線の状況の悪い問題に対応するためにコミュニケーションの取り方を工夫することができた。さらに,大学からの一方的な支援ではなく,対話的に現場教師が実施できるような方向に持っていくことができた。その結果,本実践終了後も教師間で独自にコミュニケーションをとることができるようになった。1公立小学校126校,に勤務する254名の教師(教諭;管理職を除く)を対象にして,コンピュータ等ICT活用の実態やテレビ会議等,ICTによる支援へのニーズに関する調査を行った。教職歴や性別による差も考慮した上で,僻地部と都市部の二群比較を行ったところ,以下の点が明らかになった。(1)一般的なパソコン利用については,二群間で差はない。(2)授業においてはへき地部の学校に所属する教員は都市部の教員に比べてパソコンをよく利用している。(3)離島・へき地部の教員のほうが,都市部の教員に比べてテレビ会議の利用に関するニーズが高く,関心も高い。(4)テレビ会議の利用は,特定教科での利用についてはニーズに差はないが,子ども同士の交流や総合的な学習の時間などでの活用ニーズが高い。また,専門機関への相談よりも,他校の教員の打ち合わせや職員研修に関してのほうに差が見られた。2長崎,鹿児島,沖縄の3地区(いずれも複式学級;小学校5,6年生)間の遠隔共同学習の授業研究を行った。「総合的な学習の時間」での食文化を共通の学習テーマとし,遠隔学習環境で相互発表活動を行う授業を設計した。その結果,発表に関する自信が出てくる,他地域の視点に気づく,他の学校との子どものつながりを実感するという視点から,本授業実践の効果を実証的に明らかにした。3コミュニケーション能力育成のカリキュラムに関する現場のニーズ調査を行い,現場教員が重視している学習項目と実際の違いについて検討した。また,コミュニケーション能力を重視した学習環境において,どのような授業構成要素を重視しているのかについて,通常の授業設計と比較した上で明らかにした。
HTLV-1ウイルスによる感染細胞内外の微小環境支配と感染細胞運命への影響

HTLV-1は感染T細胞を不死化し、約5060年後に極めて悪性度の高い末梢血T細胞腫瘍ATLを引き起こす。HTLV-1流行地域である我が国では、HTLV-1の病原性発現機構の解明が課題であるが、長く複雑な感染T細胞の腫瘍化プロセスは実験的再現が難しく、未だATL発症におけるHTLV-1の「役割」はほとんど明らかになっていない。これまでの研究から申請者は、HTLV-1のウイルス活動が、感染細胞の腫瘍化への引き金になると予想した。よって本研究では「HTLV-1が感染細胞内外の微小環境にどのような「傷」を残し、感染細胞の運命に影響するか?」という、HTLV-1ウイルスの本質に関わる「問い」に迫る。
縄文時代の地域間交流の研究－CADを用いた土器容量の比較ー

本研究は縄文時代中期(紀元前3000年から2000年)のさまざまな形の土器を分析対象とし、地域どうし交流関係を明らかにする。研究は大きくA、B、Cの3つ分け、AからCの順に行う予定である。A:文献による東日本の縄文時代中期集落遺跡から出土した土器のデータベース化、B:CADを用いた土器の容量計測、C:パプアニューギニアにおける民族学的手法を用いた、土器の交換や贈与と集団どうしの交流関係の研究本研究は縄文時代中期(紀元前3000年から2000年)のさまざまな形の土器を分析対象とし、地域どうし交流関係を明らかにする。A:文献による東日本の縄文時代中期集落遺跡から出土した土器のデータベース化、B:CADを用いた土器の容量計測、C:パプアニューギニアにおける民族学的手法を用いた、土器の交換や贈与と集団どうしの交流関係の研究
イギリスのホッケー普及過程におけるスポーツ用具業者の役割に関する研究

本研究では、スポーツ用具業者がイギリスのホッケー普及過程において果たした役割について検討を行った。スポーツ用具業者は、19世紀末のゲームの組織化を契機としてホッケー関連用具製造に参入し、大量の用具を市場に提供した。またホッケー用具の供給に注力した複数の用具業者は、プレイヤーの満足度を高める工夫を試みていた。ホッケーのゲームの多様な普及を一面で支えていたのは、彼らが供給した用具であった。本年度は、イギリスにおけるホッケーのゲームの地域的な普及と用具供給の因果関係を解明することを目的とし、スポーツ用具製造業者アルフレッド・リーダー社の関連用具の供給実態と、近隣地域へのホッケーの普及に及ぼした影響を明らかにする計画であった。ただし、調査を行ったものの十分な史料を得られなかったため、計画を以下のように変更し実施した。スポーツ用具業者がホッケーの普及過程に果たした役割を精査するためには、用具供給の実態だけではなく、彼らの用具開発の意図にも検討の対象を拡げる必要がある。以上の問題関心から、スポーツ用具業者が1914年以前に取得した特許に着目し、以下の3点から検討を行った。1)ホッケー関連特許の全容、2)用具業者のホッケー関連特許の取得状況、3)特許取得業者によるホッケー関連用具の商品化。結果、以下の成果を得た。1914年以前のスポーツ用具関連特許におけるホッケー関連特許の総数は45件であった。その数は1890年代後半以降増加し、用具別にはスティック、特にその握りに関する特許が多かった。ホッケー用具の開発と製品化に注力した用具業者は、ボールやスティックといった規格品をホッケー関連用具の市場に大量に投入しただけではなく、使い手の満足度を高める工夫を19世紀末から継続していた。こうしたスポーツ用具業者の意向は、例えば女性用のスティックにおける手の痛みの緩和が女性たちのゲームの参与を容易にすると考えられるように、ホッケーのゲーム普及に少なからず影響を及ぼしていた。以上の本年度の成果は下記に論文として掲載された。秋元忍、「1914年以前のイギリスにおけるスポーツ用具業者のホッケー関連特許」、『身体行動研究』、第2巻、2013年、pp.17-29。19世紀末以降のイギリスにおけるホッケーの普及は、統括組織の戦略の貫徹に留まらない多様な実相を伴うものであったが、同時に、スポーツ用具業者によるホッケー関連用具の大量の供給を伴っていた。これらの用具業者の史料は、彼らがプレイヤー以上に冷静な眼差しをホッケーという市場に向けていたがゆえに、これまでの研究が関心を寄せてきたゲームの実施状況とは異なる観点から、ホッケーの普及過程の特徴を浮かび上がらせる可能性がある。以上の着想に基づき、平成23年度の研究では、1914年以前のイングランドにおけるスポーツ用具業者のホッケー関連用具供給について、以下の3点から検討した。1)ホッケー関連用具供給の展開の背景。2)ホッケー関連用具市場の評価。3)ホッケー関連用具供給の実態。スポーツ用具業者は、19世紀末のゲームの組織化を契機としてホッケー関連用具製造に参入し、大量の関連用具を市場に供給した。個人の好み次第であったホッケー用具は規格品となり、製品名を伴って流通した。これらの供給を支えたのは、ゲーム実施の拡張と、業界誌に典型的に見られた有望な新市場という評価であった。用具業者は、ホッケープレイヤーの社会階層的な拡がりを認識していた。彼らが柔軟な戦略により供給した用具が、ホッケーのゲームの多様な普及を一面で支えたのである。今年度の研究成果は、スポーツ史学会第25回大会において発表され、『身体行動研究』第1号に掲載された。ホッケーのゲームの地域的な普及と用具供給の因果関係を解明するため、著名なボール製造業者であったアルフレッド・リーダー社を事例として、その内部史料の分析に基づき、以下の2点を検討する。1)ホッケー関連用具供給の実態、2)近隣地域へのホッケーの普及に及ぼした影響。交付予定研究費50万円のうち、10万円をホッケー関連書籍の入手(古書購入・複写含む)に、30万円を文献複写等の消耗品に、10万円を学会発表用旅費に使用する。
カツオを題材とした水産版食育の実践的研究　－「ぎょしょく」の体系化とツール開発－

本研究は、水産社会学や文化人類学の視点から、総合的な水産版食育に関する実証的な研究を推進するものである。日本人の魚食を支えるカツオや、ユネスコ無形文化遺産に登録された和食の出汁素材である鰹節に関わる産業と文化に焦点をあてて検討する。カツオの産業文化の歴史性と地域性に着目して学際的なアプローチを試み、水産版食育「ぎょしょく」教育の概念の明確化と学術的な展開を明らかにする。その上で、カツオの産業文化に関するコンテンツを総合的に検討して、「ぎょしょく」教育プログラムの体系化を拡充し、食育実践のツールとして教育現場へ還元することが、本研究の最終的な到達点である。本研究は次の2段階で進める。第1段階として、カツオの諸事象を産業と文化の問題として捉え、歴史的な動向と地域的な展開を念頭に置いて検討する。カツオの漁獲から販売までを「カツオ産業」、カツオの消費文化や地域文化を「カツオ文化」とそれぞれ位置付けて、それらの実態を包括的に把握した。第2段階では、第1段階の分析で得られた知見を、総合的な水産版食育「ぎょしょく」教育に展開させた。カツオの諸事象を魚触→魚色→魚職→魚飾→魚植という一連のプロセスを経て、魚食に到達するものとして検討した。本研究の第1年度(2018年度)における研究実績は次の2点であり、積極的にフィールドワークと成果公表を図った。第1に、調査研究としては、沖縄県宮古島市と本部町においてカツオ産業文化に関するフィールドワークを実施した。さらに、日本カツオ学会や日本村落研究学会、筑波大学などでカツオ産業文化や「ぎょしょく」教育に関する資料・情報収集、意見交換などを実施した。第2に、研究成果としては、3件(大学紀要1件:宮崎県日南市のカツオ産業文化、学術広報誌1件:「ぎょしょく教育」活動の実践報告、博物館紀要1件:沖縄県宮古島市のカツオ産業文化)を公表した。当初計画にしたがい、調査研究と成果公表は順調に進んでいると判断する。特に、研究の成果公表は、これまでに収集したデータも含めて整理・分析し、初年度にもかかわらず、3件に達した。他方、調査研究は沖縄県でのフィールドワークは実施できたが、鹿児島県は実施できなかった。(ただし、宮崎県の研究成果の公表は、日南市のステークホルダーの協力もあって、これまでの蓄積データをもとに公表できた。)次年度(2019年度)も、当初計画にもとづいて、九州地方・四国理法におけるフィールドワークによる資料・情報収集を強力に展開したい。また、「ぎょしょく」の視点から、沖縄県や鹿児島県におけるカツオ産業文化に関する研究の成果公表を推進したい。【理由】当初計画のうち、鹿児島県でのフィールドワークが実施できなかったことによる。【使用計画】

次年度(2019年度)に鹿児島県でのフィールドワークを実施し、次年度分(宮崎県や高知県、愛媛県)とともに効率よく実施する予定である。
インフルエンザ脳症発症におけるミトコンドリアの脂肪酸代謝障害の役割の解析

今までに、熱性痙攣やインフルエンザウイルス感染に伴って重積した痙攣や意識障害などの既往歴のある患者に対して、SNP解析を行い、特にミトコンドリアでの長鎖脂肪酸代謝に関わるCPT2遺伝子における変異が酵素活性の低下を引き起こし、ATP産生の低下、ミトコンドリアの機能障害などの細胞障害性を誘発することで、インフルエンザウイルス感染の増悪化の原因となっていることを見出してきた。そこでこのCPT2に着目し、インフルエンザ脳症の患者で実際に見つかり、酵素活性の低下が確認された遺伝子変異を細胞に導入し、変異CPT2を発現する細胞を作製し、この細胞において、血液脳関門を構成する蛋白質の発現の変化、インフルエンザウイルス感染、鎮痛解熱剤に対する細胞膜透過性の変化、インフルエンザウイルス感染におけるTNF-αなどのサイトカインに対する応答性、ミトコンドリアの機能障害を検討することによって、インフルエンザウイルス感染による脳症を発症させる機序を明らかにする目的で研究を進めている。平成19年度には、SNP解析をさらに進めた。インフルエンザ脳症患者より、ゲノムDNAを抽出し、ミトコンドリアでの脂肪酸代謝に関わるCPT2とβ-酸化に関わる3種の酵素複合体のプロモーター領域、蛋白質をコードする領域をPCRで増幅し、塩基配列を網羅的に決定し、得られた配列情報を健常者グループの配列と比較して、危険因子となりえるSNPsを検討した。その結果、今年度も、新たなCPT2のSNPsを発見し、細胞にトランスフェクトすることで、熱(41°C)に対し、不安定であることを発見した。また、CPT2遺伝子を発現しない細胞、さらに、CPT2のノックアウトマウスも作製した。このCPT2の細胞とノックアウトマウスを用いて、血液脳関門を構成する蛋白質の発現の変化、インフルエンザウイルス感染、鎮痛解熱剤に対する細胞膜透過性の変化、インフルエンザウイルス感染におけるTNF-αなどのサイトカインに対する応答性、ミトコンドリアの機能障害を検討する予定である。現在までに、熱性痙攣やインフルエンザウイルス感染に伴って重積した痙攣や意識障害などの既往歴のある患者に対して、SNPs解析を行い、特にミトコンドリアでの長鎖脂肪酸代謝に関わるCPT2遺伝子における変異が酵素活性の低下を引き起こし、ATP産生の低下、ミトコンドリアの機能障害などの細胞障害性を誘発することで、インフルエンザウイルス感染の増悪化の原因となっていることを見出してきた。そこでこのCPT2に着目し、インフルエンザ脳症の患者で実際に見っかり、酵素活性の低下が確認された遺伝子変異を細胞に導入し、変異CPT2を発現する細胞を作製し、この細胞において、血液脳関門を構成する蛋白質の発現の変化、インフルエンザウイルス感染、鎮痛解熱剤に対する細胞膜透過性の変化、インフルエンザウイルス感染におけるTNF-αなどのサイトカインに対する応答性、ミトコンドリアの機能障害、プラスミン、ミニプラスミンによる細胞障害性の変化を検討することによって、インフルエンザウイルス感染による脳症を発症させる機序を明らかにする目的で研究を進めている。平成18年度には、SNPs解析をさらに進めた。その結果、新たなCPT2のSNPを発見し、細胞にトランスフェクトすることで、熱(41°C)に対し、不安定であることを発見した。また、インフルエンザ脳症の患者で実際に見つかり、酵素活性の低下が確認されたCPT2遺伝子の変異を細胞に導入し、変異CPT2を発現する細胞を作製中である。この細胞を用いて、血液脳関門を構成する蛋白質の発現の変化、インフルエンザウイルス感染、鎮痛解熱剤に対する細胞膜透過性の変化、インフルエンザウイルス感染におけるTNF-αなどのサイトカインに対する応答性、ミトコンドリアの機能障害、プラスミン、ミニプラスミンによる細胞障害性の変化を検討するよていである。

このCPT2の細胞とノックアウトマウスを用いて、血液脳関門を構成する蛋白質の発現の変化、インフルエンザウイルス感染、鎮痛解熱剤に対する細胞膜透過性の変化、インフルエンザウイルス感染におけるTNF-αなどのサイトカインに対する応答性、ミトコンドリアの機能障害を検討する予定である。
突然変異体を用いた植物の細胞接着機構に関わる遺伝子の同定とその発現調節

半数体Nicotiana plumbaginifoliaの葉切片にT-DNAを導入することにより得られた不定芽形成能力の喪失と共に紳胞接着性の低下した変異体(nolac-H18)において、新規糖転移酵素遺伝子=NpGUT1(glucuronyltransferase 1)が同定された。NpGUT1は、ペクチン多糖にグルクロン酸を転移する新規酵素をコードするペクチン合成に関わる初めての遺伝子で、頂端分裂組織で特に発現が強かった。また、変異体のペクチンではホウ素を介した分子間架橋が形成されなかった。(PNAS,2002)1)NpGUT1::GUS形質転換タバコにおいてNpGUT1は、未熟種子胚の全体(特に幼根)、発芽直後の子葉・茎頂、芽生えの茎頂および篩部で発現を示した。そこで、DEXによりアンチセンスNpGUT1が誘導される形質転換植物を作成し、DEX存在下で種子発芽を行った。その結果、子葉展開期までは影響が出なかったのに対し、本葉が出るステージになって、葉序に異常が生じ、全体的に黄化することがわかった。この表現型は、ホウ素を全く含まない培地にて種子発芽を行った場合に類似していた。このことは、NpGUT1の発現がホウ素の受容に必須であるこをを示している。2)花においては、タペート組織、成熟花粉、花粉管の先端部、花柱の伝達組織においてNpGUT1の発現が見られた。NpGUT1の発現が強かった花柱の伝達組織は、花粉管の通り道となっており、また細胞間の接着が非常に弱い。受粉後に花粉管が伸長し胚珠を目指す際、花粉管との間での細胞接着が行われると考えられるが、その機能にNpGUT1が重要であることが予想された。そこで、未熟な雄蕊においてDEXによりNpGUT1の発現を抑制したところ、成熟した約75%の葯には正常な花粉が形成されなかった。花粉をDEX存在下において発芽させたところ、約75%が発芽せず、また発芽花粉にDEXを与えたときには、花粉管伸長が著しく阻害された。このことより、NpGUT1は花粉の形成・発芽、花粉管の伸長に重要な役割を果たしていると考えられる。また、未熟な雌蕊をDEX処理したところ、ほぼ全ての花柱において伝達組織に異常が生じ、不稔となった。半数体Nicotiana plumbaginifoliaの葉切片にアグロバクテリウムを介してT-DNAを導入し、不定芽形成能力の喪失と共に細胞接着性の低下した変異体を作出した。そのうちnolac-H18株において、変異の原因遺伝子として新規糖転移酵素遺伝子=NpGUT1(glucuronyltransferase 1)が同定された。NpGUT1は、ペクチン多糖にグルクロン酸を転移する新規酵素をコードするペクチン合成に関わる初めての遺伝子の報告となった。またNpGUT1は、頂端分裂組織で特に発現が強いことがin situ hybiridizationおよびPNpGUT1::GUS形質転換体により示された。そして、変異体のペクチンではホウ素を介した分子間架橋が形成されなかった。以上の結果は、NpGUT1が、ペクチンに対する新規のグルクロン酸転移酵素遺伝子であり、またその発現はメリステムにおける強固な細胞接着に必須である事を示している。(PNAS,2002)一方、ペクチンのアラビナン鎖の伸長が著しく抑制されていることが判明している変異体nolac-H 14(Planta,2001)において、原因遺伝子として新規膜タンパク質をコードするNOLAC-H 14が同定された。NOLAC-H 14の転写産物は、茎頂と茎に多く、NOLAC-H 14のプロモーターは、主に茎頂において働くことが示された。また、35S::NOLAC-H 14:GFPを導入したBY-2細胞の観察により、NOLAC-H14は小胞体に局在する可能性が確認された。

2)花においては、タペート組織、成熟花粉、花粉管の先端部、花柱の伝達組織においてNpGUT1の発現が見られた。NpGUT1の発現が強かった花柱の伝達組織は、花粉管の通り道となっており、また細胞間の接着が非常に弱い。受粉後に花粉管が伸長し胚珠を目指す際、花粉管との間での細胞接着が行われると考えられるが、その機能にNpGUT1が重要であることが予想された。そこで、未熟な雄蕊においてDEXによりNpGUT1の発現を抑制したところ、成熟した約75%の葯には正常な花粉が形成されなかった。花粉をDEX存在下において発芽させたところ、約75%が発芽せず、また発芽花粉にDEXを与えたときには、花粉管伸長が著しく阻害された。このことより、NpGUT1は花粉の形成・発芽、花粉管の伸長に重要な役割を果たしていると考えられる。また、未熟な雌蕊をDEX処理したところ、ほぼ全ての花柱において伝達組織に異常が生じ、不稔となった。
養護型不登校経験者の社会的自立促進要因に関する研究

本研究は養護型不登校(長期的な経済的不利に由来する学力不振を伴う不登校)を経験した子どもたちが社会的に自立していくための要因と課題を明確にしようとしたものである。そのため生活保護率が極めて高い地域で暮らす不登校児69人(うち生活保護世帯58%)のフォローアップ調査を実施した。中学卒業時点での進路は高校進学が56%、無職32%であった。学歴が確定している調査対象者の7割が中卒であった。調査時点で社会的(経済的)に自立している群と自立していない群の相違は後者が前者に比べ生活技能の困難、ソーシャルサポートネットワークからの疎外を経験している傾向が高かった。本研究は養護型不登校(経済的不利と学力低下に起因する不登校)を経験した子どもたちが社会に出て自立していくための要因を明確化することを目的としている。そのためA町(生活保護率が全国平均の10倍以上にあるフリースクール(Bスクール)の卒業生69名を対象に調査をおこないBスクール在籍時の状況とBスクール卒業後の実態を把握した。調査は(1)69名に関するBスクールでの指導記録、Bスクールのスタッフからの聞き取り(2)このうち21名は本人または保護者のインタビュー調査で構成されている。69名のBスクール在級時の経済的状況は生活保護家庭が56.5%、厳しい家計の家庭が13.0%、標準的家庭が26.1%、裕福な家庭が4.3%であった。学力は「同学年平均を上回る」が2.9%、「同学年平均と同等」が29.0%、「同学年平均を下回る」が40.6%、「同学年平均を大幅に下回る」が27.5%であった。生活保護受給家庭の子どもたちは受給していない家庭の子どもたちに比べ学力が有意に低下している傾向が確認された(P<.01).また在級児の家族構成は両親家庭が53.6%、母子家庭が36.2%、父子家庭が2.9%、祖父母養育家庭が5.8%、不明が1.4%であった。学歴に関して確定している45名を調べると中学卒業が51.1%%、高校中退が17.8%、高校卒業が26.7%、大学卒業が4.4%であった。就学中以外44名の生活・就労状況は常勤勤務が11.3%、非常勤勤務が18.2%、専業主婦が13.6%、施設入所・入院が6.8%、生活保護で生活が18.2%、生活保護以外で無職が13.6%、不明が18.2%であった。平成20年度はインタビュー結果をもとに質的分析をくわえる。本研究は養護型不登校(経済的不利と学力不振を伴う不登校)を経験している子どもたちが社会で白立していくための要因や課題を明確にすることを目的としている。そのため生活保護率が全国の10倍を超えるA町で活動を行っているフリースクール(Bスクール)の卒業生69人に対するフォローアップ調査を実施した。調査方法は(1)69名の指導記録、Bスクールスタッフへの聞き取り(2)このうち21名に対するインタビュー調査である。対象ケースの家庭は生活保護世帯58%、厳しい家計が12%、標準26%、裕福4%であった。学力は「標準を大きく下回る」が28%、「標準以下」が41%であり、生活保護世帯は有意に学力が低下するという相関性が認められた。中学卒業時点での進路は高等学校(特殊学校を含む)が51%であるが常勤就職0%、アルバイト3%、無職29%と厳しい結果になっている。進学も普通高校は3割以下である。学歴が確定している44名を調べると中卒(高校中退含む)70%が(うち生保受給率75%)、高卒25%(同55%)、大卒5%(同0%)で学歴が低いほど生活保護受給者の割合が高くなっていた。在学者、不明を除いた就労状況は無職36%、パート22%、準常勤17%、常勤11%、施設入所8%、専業主婦6%であった。Bスクール通級中に生活保護を受給していた40名のうち調査時点でも受給中の者は18名であった。このうち9名は学校に行かず定職がなかった。この9名をBスクール通級中には生活保護を受給していたが調査時点で経済的に自立していた群とインタビュー調査による質的分析によって比較した。その結果前者は後者に比べ生活技能における困難、ソーシャルサポートネットワークから疎外されている傾向があった。
遺伝暗号解読の正確性を担うtRNAウォブル位修飾ウリジン生合成機構の解明

ヒトミトコンドリアtRNAウォブル位修飾ウリジンの修飾遺伝子であるhGTPBP3とhMTO1の機能解析を行った。2遺伝子産物は共にミトコンドリア局在性を示し、細胞内で複合体を形成していた。酵母の相同遺伝子欠損株を用いた相補実験の結果から、2遺伝子はヒト-酵母の組み合わせで修飾活性を発現しないこと、またhGTPBP3のC末端が修飾の形成に必要であることが示唆された。ヒトミトコンドリア型ウォブル位修飾ウリジン(xm5U)修飾酵素であるGTPBP3とMTO1の全長遺伝子をC末タグ融合型でクローニングし、HeLa細胞に共発現させ、発現タンパクが共にミトコンドリア局在し、両タンパクが細胞内で複合体を形成することを見出した。これまでの結果からGTPBP3がC末タグにより失活することが示唆されたため、融合タグ除去型のコンストラクトを構築する必要があるが、共発現系からのタグ融合MTO1の精製により、タグ除去型GTPBP3を含む複合体の取得が期待される。HeLa細胞の一過性発現では修飾再構成に必要なタンパク量を得るには必ずしも最適でない可能性があるため、細胞株の選択といった改善の余地がある。引き続きヒト由来コンポーネントを用いた修飾再構成とヒトタンパクの機能解明を目指す。未だxm5U修飾構造が未決定のアーキアに関し、好塩性アーキアのtRNAについてその構造の特定のためtRNA単離を試みたが、従来の条件では精製効率が低く、引き続き条件検討が必要となった。一方、好塩性アーキアで真核生物の細胞質型xm5U修飾遺伝子のホモログ破壊株の作製を進め、遺伝子破壊株を得ることができた。今後はtRNAの単離達成を皮切りに、アーキアウォブル位修飾ウリジンの構造と修飾候補遺伝子との関連を明らかにすることでxm5U修飾の生合成メカニズム解明に近づく必要があるだろう。また、ヒトミトコンドリアtRNA型のxm5UがイカミトコンドリアtRNAの変則暗号系においても用いられることを見出し、xm5U構造の進化的分布と起源解明への貢献があった。ミトコンドリア/バクテリア型のウォブル位修飾ウリジンxm5Uの再構成系の構築に関し、酵母の修飾酵素であるyMSS1とyMTO1の欠損株にyMSS1とyMTO1を、またはそれらのヒトホモログであるhGTPBP3とhMTO1を各欠損株に相補し、xm5Uが再構成されるかを観察した。結果、C末タグ融合ヒトホモログ相補系ではxm5Uが酵母内で再構成されず、一方、C末タグ有り/無しでの酵母相補系ではC末タグ融合yMSS1相補時のみxm5Uが再構成されなかった。yMSS1/hGTPBP3のC末端が活性に重要な要素である可能性が示唆されると共に、培養細胞で行っていたhGTPBP3の発現系を改善すべき必要性が考えられた。酵母細胞質tRNAの修飾ウリジンncm5Uについて安定同位体標識された酢酸ナトリウム(13C2、CD3体の2種)の修飾構造への取り込みを観測したところ、アセチルCoAが基質となると考えられる修飾シチジンへの同位体元素の取り込みと比較し効率が低いことが示唆された。当初の予想では、酢酸からアセチルCoAへの1段階の転換後、それが直接の基質として利用されると見込まれていたが、この結果は酢酸・アセチルCoAから更なる代謝を経て基質が形成されることで基質中の安定同位体元素の標識が希釈されたことを示唆すると考えられた。一方、ヒトミトコンドリアtRNAのxm5UがホヤミトコンドリアtRNAの変則暗号系においても発見され、xm5U構造の進化的分布と起源を明らかにする寄与があった。これまで活性が見られなかったヒト因子によるミトコンドリア型xm5Uの再構成について、酵母を用いた結果からGTPBP3についてはコンストラクトの再検討を要すること、hMTO1については酵母の系と直交性を持つことが示唆されたことから、活性のあるヒト因子を調製するために必要なコンストラクトの改善をどのように行うべきか方針が定まったと言える。真核生物細胞質xm5Uの解析は、TRM9欠損株を用いることでmcm5Uの中間産物でもあるncm5Uを対象とした解析系を構築し検出感度の改善を図りつつ、基質決定に関しては酢酸の代謝経路において酢酸・アセチルCoAが直接の基質となる可能性が低いことを支持する結果を受け、アシルCoAの代謝経路を調べる方針に絞り込めた。また、好塩性古細菌のRNA解析系と遺伝子破壊系を導入中であり、広く生物種間に見出されるxm5Uをドメイン毎に決定する準備が整っている。ミトコンドリア型xm5Uの修飾酵素GTPBP3がC末タグにより修飾再構成活性を持たなくなる可能性が示唆された。

N末タグ付加体を考慮する場合、N末ミトコンドリア移行シグナル配列の残存が活性に影響を及ぼす可能性があるためN末を適切に除去した上でタグを付加する等、コンストラクトの工夫を要する。系の改善を行い引き続きヒト由来コンポーネントを用いた修飾の再構成とヒトタンパクの機能解明を目指す。未だ構造未同定の古細菌xm5Uに関し好塩性古細菌のtRNAのウォブル位修飾ウリジンについてその構造の特定を行い、得られた構造に基づき比較ゲノムから修飾遺伝子の絞り込みを行い、遺伝子破壊法による逆遺伝学的解析により修飾遺伝子の特定を行う。真核生物細胞質mcm5U/ncm5Uに関し、基質の絞り込みを行う。酵母において酢酸が間接的に構造中に取り込まれた結果からアセチルCoA/アシルCoAの代謝経路に関連する基質や遺伝子発現制御株を用い、ncm5U量の変動を解析する。引き続き、RNA解析対象となる生物を培養するために必要な試薬、また調製RNA解析に必要な各種試薬、安定同位体標識化合物、分析に必要な各種部品や消耗品の購入、成果発表のための旅費として使用する計画である
青年期の親子関係に関する生涯発達心理学的検討

本研究は,青年期の親子関係について,子と親の双方がらデータを収集し,双方が認識する関係について生涯発達心理学的観点から検討を行った。2回の調査を実施し,親子関係の認識,性役割観,夫婦関係の認識,well-being,人口統計学的変数などについてデータを収集し,相互作用の観点から分析した。主要な結果は以下の通りである。(1)多くの父親は,家事や仕事,子育てについて伝統的性役割観をもっていたが,多くの母親はそうではなかった。これらはある意味で隠れたカリキュラムとなり,子の性役割観や男女平等観に影響を与えた。また,初経や精通は,青年の側から親子関係,とりわけ異性の親との関係を変化させる契機になっていた。しかし,従来から言われてきたような親に対する反抗や関係性の混乱はみられなかった。(2)多くの親はこどもが十代になると,親子関係がネガティブになると考えていたが,こどもの側にはそうした考えはあまり見られなかった。(3)青年期の子どもをもつ親には,高齢になる自分の親もおり,自分の親や自分の子どもについての発達的,心理的問題を有することがあった。これらの問題を親たちに大きなストレスとなるため,メンタルヘルスの問題を引き起こすこともあった。このように,自分のこどもや自分の親に関わる出来事が,子どもとの関係に相互作用し,多様な影響を与えるものと言える。中学2年生,高校2年生,大学2年生の生徒・学生240名およびその父母480名を対象に,親子関係を中心とした人間関係や対人傾向の特徴を明らかにするために,質問紙調査を実施した1.生徒・学生の特徴(1)両親との関係認知:両親に対するイメージはおおむね肯定的で,悩み等を相談できる者も多く,自分の意志を尊重してくれる等養育態度を肯定的に認知していた。第2反抗期の様相は中・高生に見られず,また両親との同居大学生では家庭からの独立志向が見られず,全体として両親との良好な関係が見られる反面,両親から自立傾向に乏しかった。(2)友人関係:友人数や親友数は従来の調査結果と大差はないが,大学生においては友人数が多い反面,親友のいない者がおり,携帯電話のメール機能等の発達が人間関係の拡大を促進する一方で,親密な関係を形成することを阻害している可能性が推測された。(3)対人傾向:他者への共感性や向社会的行動も望ましい傾向が示されており,報道等で指摘されるような他者への無関心傾向などは見られなかった。2.父母の特徴(1)子どもとの関係認知:自分に考えを押しつけない理解ある親として養育してきたとする者が多く,母親が子どもとの密着を危惧する一方で,父親は子どもと適当な関係にあったとする傾向が見られた。また,子どもの性格・行動特徴の認知では,両親間で概ね一致していたが,同じ特性でも肯定的/否定的に見るか否かで若干の齟齬があった。(2)夫婦関係:中学生と高校生の親では自分たちの関係を夫婦関係としてよりも親関係として認知する傾向にあり,大学生の親では子どもとの密着度が強いほど親関係と認知し,子どもの独立傾向が強いほど2者関係の見直しを考えていた。前年度の調査結果に基づき、とりわけ青年期においてそれまでの比較的単一の価値観とは異なる多様な価値観を背景に親子関係を経験していると考えられる、1970年代に青年期を経過している1960年代生まれのコホートに親世代を設定し、その子との関係性について、検討した。具体的には小学校5年生から中学3年生の児童・生徒及びその保護者を対象として、兵庫県大都市部で種々のでもグラフィック条件を有する地区にある小・中学校で調査を行った。児童・生徒は授業時間を利用し回答を求め、保護者は子が持ち帰った調査票に回答の上、郵送で返送を求めた。多様な家族形態があり、当該調査によって児童,生徒へ心理的負担を生じさせないため、保護者の回答は母親、父親に限定せず、協力者の判断に委ねてところ、母親からの回答が9割は占め、父親からの回答は少なかった(父母以外の保護者からの回答もわずかにあった)。

主な結果は以下の通りであった。(1)回答者の分布にも見られるように、多くは母親が子との中心的関係となっており、父親との関係の希薄さは母親、子の双方から示された。(2)親自身の養育態度では、子の主体性を重視し、自分の価値観をあまり押しつけないとしながらも、将来については子の意向とは別に高学歴を求めた。(3)親は子と友だちのような関係を理想としていたが、とくに思春期年齢になると相互理解に不安を示した。(4)他方、小学生までは従来からの養育態度に大きな変化はないが,中学生以降では子の自由を承認する態度と,より規制を強める態度に二分された。(5)また,親子の相互作用では,親の中学生期における親との相互作用経験が,現在の子との相互作用に影響しており,伝統的な上下関係を志向する態度と平等な関係を志向する態度,とりわけ思春期発育を契機に,男らしさ/女らしさを強調する態度とジェンダーにとらわれない態度に二分される傾向があった。
Mahler関数の理論とregular列への応用

変換をZ→Z^dに関して関数方程式をみたすような関数f(z)をMahler関数といい、その値の超越性や代数的独立性が研究されてきた。しかしこれまでの代数的独立性についての研究で満足のゆく結果が得られているのは考察の対象であるMahler関数がすべて同一の変換Z→Z^dに対して関数方程式をみたす場合であった。2種の変換Z→Z^<d1>、Z→Z^<d2>に対してそれぞれ関数方程式をみたす関数を同時に考えた時多くの困難な問題が生ずる。今回の研究により、この問題に一定の解答を与えることができた。まずかなり応用範囲の広い代数的独立性についての一般的定理を得ることができ、また応用としてフィボナッチ数の逆数和の代数的独立性を証明することができた。これによりErdosやGrahamによって提出されたフィボナッチ数の逆数和についての問題はほぼ完全に解決されたといってよい。我々はまた、実代数的数の2進展開が有限オートマトンによって表現できないことを証明した。これは実代数的数の2進展開がある意味で複雑であることをあらわす。他方Nesterenkoによるmodular関数の値の代数的独立性に関する結果をフィボナッチ数の逆数和に応用し、Mahler関数の応用として得られないタイプの逆数和の超越性を証明することができた。また、テータ級数やロジャー・ラマヌジャン連分数の超越性も証明することができた。Nesterenkoにより最近証明されたモジュラ関数の代数的数における値の代数的独立性は予想外に多くの結果を導くことがわかってきた。モジュラ不変量に関するMahlerの予想はもちろんであるが,研究代表者他3名の共同研究により、テ-タ級数やロジャース・ラマタジャン連分数,フィボナッチ数の偶数巾の逆数和の超越性が証明された。またMahler関数の値の代数的独立性についての結果を使って実代数的数の2進展開がある種の有限オートマトンでは記述できないことを研究代表者他2名の共同研究により証明した。これは実代数的数の2進展開の複雑さを示すものである。また研究代表者が証明したMahler関数の値の代数的独立性に関する一般定理をフィボナッチ数の逆数和に応用し、種々の代数的独立性を導いた。代数的常微分方程式系の一形態として、Lie系がある。これはLie環を構造としてもち、解空間のLie群的特性を研究するのに便利な系である。西岡啓二によりLie系と強正規微分拡大との関連が追求され,Lie系の一般解が作る微分拡大の部分拡大で任意定数に有理的に依存するもので最大のものは同じくLie系になること、強正規拡大は特殊なLie系であること等が判明した。変換Z→Z^dに関して関数方程式をみたすような関数f(Z)をMahler関数といい、その値の超越性や代数的独立性が研究されてきた。しかしこれまでの代数的独立性についての研究で満足のゆく結果が得られているのは考察の対象であるMahler関数がすべて同一の変換Z→Zd^dに対して関数方程式をみたす場合であった。2種の変換Z→Z^<d_1>、Z→Zd2^<d_2>に対して関数方程式をみたす関数を同時に考えた時、多くの困難な問題が生ずる。これによりErdosやGrahamによって提出されたフィボナッチ数の逆数和の性質についての問題はほぼ完全に解決されたといってよい。他方Nesteronkoによるmodular関数の値の代数的独立性に関する結果をフィボナッチ数の逆数和に応用し、Mahler関数の応用としては、得られないタイプの逆数和の超越性を証明することができた。

研究成果交流の面では1998年11月9日-11日に東京で日仏会館の協力の下、日仏超越数論研究集会を開催し、フランスより4人、ドイツより1人の超越数論研究物を招き、最近の結果の報告を行った。その中でMahler関数の理論がいろいろな方向に発展している事が報告された。
抗がん薬分包時の薬剤残存による他剤への汚染実態調査及び防止策の検討

<研究目的>抗がん剤を含む細胞毒性薬剤の取り扱いの危険性に関しては、医療従事者の抗がん剤曝露を最低限に抑えるために、曝露防止に関して様々な検討がなされており、世界的にガイドラインが作成されている。本邦でも抗悪性腫瘍剤の院内取扱い指針として「抗がん剤調製マニュアル」が出され、医療従事者における抗がん剤曝露に関する注意喚起がなされている。しかし、マニュアルやガイドライン、様々な曝露防止に対する検討がなされているのは、ほぼ注射剤の抗がん剤調製に関する事であり、同様に曝露の危険性が高い散剤についての詳細な検討はない。そこで今回、同じ分包機を使用することによる他剤への汚染、また、汚染された散剤を服用することによる他の患者への影響を最小に抑えることを目的とした。<研究方法>6-メルカプトプリン製剤を自動散剤分包機で分包後、洗浄剤として重曹、酸化マグネシウム、乳糖で洗浄を行った。それぞれの洗浄散剤中に含まれる6-メルカプトプリン量を高速液体クロマトグラフ(HPLC)を用いて定量した。<研究成果>洗浄散剤中に含まれる6-メルカプトプリン量は重曹で3回目には検出限界以下、酸化マグネシウムで4回目には検出限界以下、乳糖では5回目でも6-メルカプトプリンが検出された。以上の結果より、洗浄剤として炭酸水素ナトリウムを使用し3回以上洗浄することが最も確実に抗がん剤を洗浄できる方法であることが明らかとなった。当院では、抗がん剤を分包する際は、他の散剤の分包が無い時に行っており、分包後清掃を行っている。効果的な洗浄剤の種類と使用法を明らかにできたことで清掃作業者への影響を最小に抑えることが出来ると考えられる。
経鼻呼出療法のComputer-Aided Medicationに関する研究

経鼻呼出療法はエアロゾル化したステロイド薬剤を口から一旦吸入し,その後,経鼻呼出することにより,鼻腔深部に薬剤を送達させる。難病指定を受ける好酸球性副鼻腔炎に有効であることが確認されている一方で,人為的な呼出により薬剤を輸送するため,治療効果発現に個人差が現れやすい。事実,臨床研究において治療効果発現が隠微な症例でも呼出条件を変えたところ効果が顕著になったとの報告がなされている。そこで本研究では工学的な見地から呼出条件と薬剤の輸送特性との相関を明らかにし,患者個々の最適な呼出条件を探索することを目的とした。最終年度は,前年度実施した鼻腔内非定常エアロゾル輸送解析をより詳細に実施し,呼出条件(ストークス数)と沈着特性との関係を明らかにした。乱流解析にはShear Stress Transportモデル/LESモデルを,二相流解析にはオイラー・ラグランジェ法を適用し,好酸球性副鼻腔炎患1症例ならびに鼻疾患を有さない2症例,計3症例について解析を実施した。その結果,いずれの症例においても呼出流のストークス数約10,000(エアロゾル粒径3μmとしたときの流量で表すと10L/minに相当)の条件にて,好酸球性副鼻腔炎の病巣である篩骨洞でのエアロゾルの沈着が顕著になり,また,ストークス数が100,000に近づくと篩骨洞での沈着が減少するとともに鼻咽頭での沈着が増加することが明らかになった。本結果より呼出条件には最適な領域があり,エアロゾル粒径3μmの薬剤を使用する際には呼出流量を10-30L/minにすることにより篩骨洞へのエアロゾル沈着を促進できるものと考えられる。本研究成果は経鼻呼出療法におけるComputer-Aided Medication(本研究にて確立した解析方法,評価方法を用いた患者個々の最適な呼出治療条件の探索)の臨床現場への展開を可能とするものと考えられる。経鼻呼出療法は,難病指定を受ける好酸球性副鼻腔炎の有効な治療方法として注目を集めている。本治療ではエアロゾル化したステロイド薬剤を口から一旦吸入し,その後,経鼻呼出することにより,篩骨洞副鼻腔などの鼻腔深部に薬剤を送達させる。すなわち外鼻孔から薬剤を投入するネビュライザ治療とは,薬剤の輸送経路が真逆になっている。このような人為的な呼出により薬剤を輸送するため,個人差(ある人は強く呼出し,ある人は弱く呼出するなど)が現れやすい。事実,臨床的にも治療効果が顕著に現れる症例とそうでない症例とが確認されている。そこで本研究では工学的な見地から呼出条件と薬剤の輸送特性との相関を明らかにするとともに,個々の患者に対して,より治療効果が得られるであろう呼出条件を探索することを目的としている。本年度は好酸球性副鼻腔炎の10症例に対してスパイロ計測を行い,呼出条件と治療効果発現との相関を調査した。その結果,呼出流量15L/min前後(平静時の呼出条件に相当)で治療効果が得られている症例が多いことを発見した。この知見をもとに,好酸球性副鼻腔炎エアロゾル輸送の数値流体力学解析を行った。解析モデルにはオイラー・ラグランジェ法を用い,連続相にはLESモデルを適用した。呼出流量は15L/min(平静時の呼出条件), 90L/min(高負荷時の呼出条件)の2条件を検討した。その結果,呼出流量の増加に伴い鼻咽頭領域でのエアロゾル粒子の慣性衝突が顕著となることが明らかになった。本結果は大きな呼出流量では,ターゲットとしている鼻腔深部への薬剤の送達を妨げている可能性があると考えられる。また,粒子沈着の非定常特性に着目すると,経鼻呼出開始直後に沈着量が不安定な時間帯があることが明らかになった。このような呼出流量の影響,沈着特性の非定常性が経鼻呼出療法の治療効果発現に影響を及ぼすものと考えられる。連携研究先の関西医科大学との協力体制が確立しており,症例データの収集・集積,その評価・分析を円滑に進めることができている。特に呼出条件と治療効果発現との相関を明らかにできており,本研究成果は好酸球性副鼻腔炎治療における臨床学的貢献は極めて大きいものと考える。また,数値流体力学解析においては,経鼻呼出療法の解析・評価には非定常特性を考慮する必要があることを明らかにした。既往の鼻咽頭領域の数値流体力学解析の研究ではそのほとんどが定常解析で行われている。本解析結果は,経鼻呼出療法の研究を進める上では既往の手法をそのまま用いることはできず,非定常性に着目した解析・評価を行う必要があることを示唆するものと考えられる。以上のこれまでに得られた知見を鑑み,本研究はおおむね順調に進捗しているものと考える。

そこで本研究では工学的な見地から呼出条件と薬剤の輸送特性との相関を明らかにし,患者個々の最適な呼出条件を探索することを目的とする。本年度は(1)エアロゾルの鼻腔内非定常輸送解析によるエアロゾル沈着特性の解明,(2)経鼻呼出実験によるエアロゾル呼出特性の解明,を実施した。以下にその詳細を述べる。(1)エアロゾルの鼻腔内非定常輸送解析による症例毎の沈着特性の評価を行なった。解析モデルにはLESモデルを適用,呼出条件を流量15-60L/min,粒子径3-10μmとして解析を実施した。また,解析結果はストークス数により規格化,症例差を検証した。その結果,吸入時に比べて呼出時の方が高い沈着特性を示す症例を発見した。鼻咽頭から両鼻腔にかけての形態により沈着が促進されたためであると考えられる。(2)実症例を対象とした経鼻呼出実験を実施した。これは経鼻呼出療法において,一回の吸入・呼出により,どの程度の薬液エアロゾルが鼻から呼出されるのかの経時測定することにより,経鼻呼出の非定常特性を明らかにするものである。実験では被験者に風洞内に入ってもらい,経鼻呼出されたエアロゾル粒子数を光膜式粒子計測法によりリアルタイム計測を行なった。その結果,粒子径が小さくなるにつれて,呼出特性にブロード傾向が現れた。これは吸入時に上下気道中で浮遊しているエアロゾルの数密度分布に起因するものと考えられる。連携研究先の関西医科大学との協力体制が確立しており,症例データの収集・集積,その評価・分析を円滑に進めることができている。また,今年度は新たにスペイン・バルセロナスーパーコンピュータセンターの協力を得て,大規模・高精度な経鼻呼出時のエアロゾル輸送解析を実施し,解析精度の向上を図った。また,実症例を対象とした経鼻呼出実験においては,呼出エアロゾルの経時特性を新規に明らかにした。既往の解析研究,実験研究では定常データの蓄積しか行われてきておらず,経鼻呼出流の輸送特性を解明する上で貴重なデータと考えられる。このデータをもとに次年度はエアロゾルの輸送解析を行い,症例毎の最適な経鼻呼出条件の探索を行なって行く予定である。以上のこれまでに得られた知見を鑑み,本研究はおおむね順調に進捗しているものと考える。経鼻呼出療法はエアロゾル化したステロイド薬剤を口から一旦吸入し,その後,経鼻呼出することにより,鼻腔深部に薬剤を送達させる。難病指定を受ける好酸球性副鼻腔炎に有効であることが確認されている一方で,人為的な呼出により薬剤を輸送するため,治療効果発現に個人差が現れやすい。事実,臨床研究において治療効果発現が隠微な症例でも呼出条件を変えたところ効果が顕著になったとの報告がなされている。そこで本研究では工学的な見地から呼出条件と薬剤の輸送特性との相関を明らかにし,患者個々の最適な呼出条件を探索することを目的とした。最終年度は,前年度実施した鼻腔内非定常エアロゾル輸送解析をより詳細に実施し,呼出条件(ストークス数)と沈着特性との関係を明らかにした。乱流解析にはShear Stress Transportモデル/LESモデルを,二相流解析にはオイラー・ラグランジェ法を適用し,好酸球性副鼻腔炎患1症例ならびに鼻疾患を有さない2症例,計3症例について解析を実施した。
CLC-5とKCC4による胃プロトンポンプ共役型塩素イオン分泌機構の分子生理

胃酸(塩酸: HCl)のプロトン(H^+)を輸送する蛋白質が、胃プロトンポンプ(H^+,K^+-ATPase)であることはよく知られているが、塩化物(塩素)イオン(Cl^-)を輸送する蛋白質については、これまで確定していなかった。本研究で、Cl-輸送蛋白質のKCC4とCLC-5が胃酸分泌機構に関与することを見出した。KCC4は胃酸分泌細胞のアピカル膜で、胃プロトンポンプと共に、空腹時(胃酸分泌休止時)の胃酸分泌に主として関与し、CLC-5は細管小胞膜上で、プロトンポンプと共に、摂食時(胃酸分泌刺激時)の胃酸分泌に関与することがわかり、空腹時と摂食時で異なる胃酸分泌機構が機能していることが明らかとなった。胃酸(塩酸:HCl)のH^+は胃プロトンポンプ(H^+,K^+-ATPase)により分泌されるが、塩素イオン(Cl^-)を輸送する分子実体は確定されておらず、塩酸分泌機構の全容は未解明である。本研究では、CLC-5塩素イオンチャネルおよびK^+-Cl^-共輸送体(KCC4)による胃プロトンポンプ共役型塩素イオン分泌の分子生理基盤について研究を進め、以下のような興味深い知見を得た。ブタ胃粘膜標本の分別遠心により、胃細管小胞に富む膜画分(GIベシクル;酸分泌休止状態に対応する)および分泌膜に富む膜画分(SAベシクル;酸分泌刺激状態に対応する)をそれぞれ調製した。H^+,K^+-ATPaseはSAベシクルにおいて、界面活性剤のCHAPS(0.5-1%)に不溶性の画分に局在していたが、GIベシクルにおいては、CHAPSに不溶性および可溶性の両画分に分布していた。KCC4に対する抗体を作製し、KCC4がSAベシクルにおいて高レベルで発現していることを見出した。一方、GIベシクルにおいてKCC4の発現レベルは低かった。H^+,K^+-ATPaseを安定発現させたHEK293細胞における、CLC-5 Tet-on systemを用いた免疫沈降の結果、H^+,K^+-ATPaseとCLC-5は分子会合していたが、内因性Na^+,K^+-ATPaseとCLC-5とは分子会合していないことがわかった。またCLC-5の発現により、H^+,K^+-ATPaseの酵素活性は有意に上昇したが、Na^+,K^+-ATPaseの酵素活性は全く影響を受けなかった。したがってKCC4は胃プロトンポンプと共役した二次性能動輸送体としてCl^-を分泌し、CLC-5はプロトンポンプの活性調節因子として機能している可能性が考えられた。本研究では、胃酸分泌細胞において、K^+-CI^-共輸送体(KCC4)およびCI^-/H^+対向輸送体(CLC-5)が胃プロトンポンプ(H^+,K^+-ATPase)とどのように機能共役し、胃酸分泌を調節しているのかを解明することを目的とした。ブタ胃粘膜より調製した胃細管小胞に富むベシクル(TV)および分泌膜に富むベシクル(SA)において、H^+,K^+-ATPaseはTVおよびSAの両方に高発現する一方、KCC4はSAのみに、CLC-5はTVのみに高発現していた。免疫沈降実験で、KCC4とCLC-5は、それぞれSAとTVのH^+,K^+-ATPaseと共沈した。胃腺においてKCC4とCLC-5は共に、酸分泌能の高い頚部の胃酸分泌細胞に高発現し、酸分泌能の低い底部の胃酸分泌細胞にはほとんど発現していなかった。一方H^+,K^+-ATPaseは頚部および底部の両方に高発現していた。以上の結果から、細管小胞ではCLC-5がH^+,K^+-ATPaseの活性を調節しているが、分泌膜においてはKCC4とH^+,K^+-ATPaseが、互いに活性を調節しあうことが明らかになった。本研究では、CLC-5およびKCC4による胃プロトンポンプ共役型塩素イオン分泌の分子生理基盤について、胃プロトンポンプ(H^+,K^+-ATPase)とCLC-5、KCC4の機能連関に着目し、新しい生理機能を解明することを目的とした。まず、CLC-5が高発現している胃細管小胞に富むベシクルにおいて^<36>Cl^-取り込み実験を行ったところ、ATPの存在下のみに観察されるCl^-の輸送が、H^+,K^+-ATPaseの特異的阻害薬のSCH

28080によって阻害されることを見出した。またH^+,K^+-ATPaseを安定発現させたHEK293細胞に予め^<36>Cl^-を取り込ませ、SCH28080感受性のCl^-輸送活性を測定したところ、この細胞にCLC-5を安定発現させた場合に有意に活性が上昇した。これらの結果からCLC-5がCl^-/H^+交換輸送体であり、H^+,K^+-ATPaseにカップリングした二次性能動輸送体として機能しているものと考えられた。次に、H^+,K^+-ATPase安定発現HEK293細胞に、KCC4のT-RExシステムを導入した。KCC4の発現によりH^+,K^+-ATPaseの発現量は変わらなかった。KCC4発現細胞から調製した膜標品において、H^+,K^+-ATPaseのATP加水分解活性は変化しなかった。しかし、アンモニウムパルスによる細胞内酸性化からの回復速度を、細胞内pH変化を指標に測定すると、KCC4発現細胞では、未発現細胞に比べて有意に回復速度が上昇した。上昇した回復速度はKCC阻害薬のDIOAによって未発現細胞と同レベルにまで抑制された。この結果は、KCC4の発現によりH^+,K^+-ATPaseのH^+輸送活性が有意に上昇したことを示しており、KCC4とH^+,K^+-ATPaseのイオン輸送機能が連関していることが明らかになった。