hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有効性と経済性から観た大学病院における職場環境アレルゲン削減への取り組みの評価

これにより、ラテックスアレルギーに起因する有害事象(アナフィラキシーショックおよび接触性皮膚炎)の発生は理論的にはゼロになった。一方、それ以前に院内で発生したアナフィラキシーショック事例について、電子カルテ上の病名登録およびアクシデントレポートシステムより抽出する作業を行った。その結果、電子カルテ上で診療情報の検索が可能であった2012年以降に、院内で明らかなラテックスアレルギーの新規事例は0件であった。以上より、本研究において、当初予定していたラテックスアレルギーに対する認識調査や非ラテックス製グラブとの比較検討は実施でき、さらに、職場環境での医療材料の非ラテックス化を促進することが出来た点で臨床的意義を認めるが、もう一つの課題であった非ラテックス化による有害事象発生の抑制効果が購入費用上昇分を凌駕するか否かについては、変更前にも有害事象が発生していなかったため、比較検討することが出来なかった。電子カルテ導入以前に患者データについては、検索機能がないため検討に必要なデータ抽出が出来なかったことも背景にあると考える。当院医療者を対象に院内e-learningシステムを利用して「ラテックスアレルギー」に対する認知度およびサージカルグラブを含む医療材料の非ラテックス化に対するアンケート調査を実施した。その結果、知っているが正しく説明ができない者が56%であった。ラテックスアレルギーを有する患者と接したことがある者は25%あり、医療材料の非ラテックス化に対しては、56%が賛成であった。この結果を踏まえて、研究期間を1年延長し、平成28年度には手術室内で非ラテックス製サージカルグラブを全て非ラテックス製に変更したが、その前後でのラテックスアレルギー発症事例数検討が出来ないまま研究期間を終了した。今回の調査目的で予備検証の上採用した非ラテックス性サージカルグラブがメーカーによる一方的な仕様変更(従来品よりも薄くなったため、指先部の知覚性は向上したが、耐久性や機器・組織の把持力が低下したとの指摘が一部の医療スタッフから出ており、メーカーを含めて対応を検討中である。平成28年度には、サージカルグラブ以外での職場環境からのアレルゲン削減の手段として、あらたに尿道留置カテーテルの非ラテックス化を実施する予定であり、これに関しても、医療従事者と患者へのアンケート調査を実施し、アレルギーなどの有害事象発生頻度とその治療に要した費用も算定して、サージカルグラブのデータとまとめる形で、その有効性と経済性について検証する予定である。医療安全学医療従事者でのラテックスアレルギーおよび接触性皮膚炎有病率の変化を検証し、その治療に有した医療費や業務制限による損失による経済的損失を算出し、サージカルグラブの購入費用増加との比較を行う。職員側の調査、検証が予定通り進行しているが、電子カルテから過去のラテックスアレルギー事例の発祥件数や重症度および原因物質に関する調査はまだ出来ていない。
カイラルフェルミオンを用いた素粒子標準模型とそれを越える物理の解析

素粒子物理学の現時点での集大成である素粒子標準模型中のキャビボ-小林-益川(CKM)理論の精密検証に導く、格子QCD数値計算の新技術の試験開発を行った。その結果、標準模型の基本定数である、sクォーク質量、udクォーク平均質量の主たる系統誤差を5分の1に縮小し、π、K中間子崩壊定数、中性K中間子混合パラメタの高精度計算が実現され、B中間子崩壊定数、中性B中間子混合パラメタの高精度計算、標準模型を超える物理法則の探索に重要な陽子崩壊行列要素計算に応用された。本研究では、素粒子標準模型の基本パラメターであるキャビボ-小林-益川(CKM)行列とクォーク質量の精密決定を念頭に、現在広く用いられている格子QCD計算の解析手法の大幅な改良を目指す。そこから得られる計算結果と、実験からのデータを突き合わせることにより、標準模型の精密検証を行う。また、大統一理論における陽子寿命の予言、ダークマターの検出効率の見積りなどに応用し、標準模型を超えた物理法則を探索する。今年度は、この改良に必要な新技術の試行と、既に確立している技術の大規模数値計算への応用を手がけた。新技術A)非例外条件(non-exceptional condition)を用いた非摂動くりこみでは、クォーク質量くりこみ定数の大幅な精度向上を実現した。この手法はCKM行列の精密決定に重要なK^0-K^0^^^-遷移行列要素のくりこみにも応用された。D)演算子の改良は、やはりCKM行列の精密決定に重要なB^0-B^0^^^-遷移行列要素の静的近似を用いた計算に適用され、フレーバーSU(3)対称性の破れ指数のカイラルフェルミオンによる第一原理計算の最初の結果をもたらした。今後の質量、各行列要素の複数格子間隔にわたる大規模計算との融合により、u、d、sクォークの質量と、CKM行列要素の精密決定に期待が持たれる。B)重率変換法(reweighting)は、sクォーク質量の微調整への応用に成功し、すべての物理量の系統誤差縮小に貢献している。この手法による、ダークマター検出効率に関わる、陽子中のストレンジ物質存在率の計算が進行中である。今年度は、昨年度実用に目処が立った新技術A)非例外条件を用いた非摂動くりこみとB)異質量重率変換法を用い、u、d、sクオーク質量の高精度計算を2つの異なる格子間隔で行った上、連続極限を取ることに成功した。これは、ユニタリーな格子理論を用いた3フレーバーQCDの初めての結果となる。K^0-K^0混合行列要素計算においても、A),B)による、精度向上に成功した。2つの異なる格子間隔を用いた計算が進行中である。B^0-B^0混合行列要素計算では、B)、D)演算子改良の上、より大きな体積、より現実のu, dクォーク質量に近い数値計算を、改良されたクォーク波動関数を用いることによって行い、大幅な精度向上につなげることに成功した。今後、2つ目の格子間隔の計算を加え、連続極限を取ることにより、CKM行列の精密決定に供する結果を得る目処が立った。陽子崩壊行列要素は、A)、B)を用いた計算に着手した。次年度での完了を目指している。今年度は、昨年度までに確立した新技術、A)非例外条件を用いた非摂動くりこみとB)異質量重率変換法を用い、中性K中間子の混合行列要素の計算を2つの異なる格子間隔で行った上、連続極限の後に高精度な結果を得る事に成功した。これは、昨年度のクォーク質量、π、K中間子の崩壊定数と共に、ユニタリーな格子理論を用いた3フレーバーQCDにおける世界初の結果となる。中性B中間子の混合行列計算においては、新技術B)とD)演算子改良、とともに、より大きな体積、より現実のu, dクォーク質量に近い数値計算を、改良されたクォーク波動関数を用いて、2つの格子間隔で実行することにより連続極限の結果を導く事を目指して、現在計算が進行中である。

震災の影響で遅れたが、24年度の前期にまとめられる予定である。この研究の過程で、新技術C)フェルミオンモード分解と低モードの厳密な取扱いの新しい構成法が確立されつつあり、今後の更なる高精度化に期待が持てる。陽子寿命の予言に必要な陽子崩壊行列要素は、新技術A)を用いた計算が完了し、論文投稿準備中である。
細胞傷害性T細胞（CTL）の機能維持と遊走活性に対する石綿曝露影響の解析

石綿曝露による悪性中皮腫の発症を抑制する為の生体防御機構の一つとして、ナイーブCD8+T細胞が細胞傷害性T細胞(CTL)に分化し、分化後CTLが機能を持続して、適切に腫瘍部位へ遊走し、腫瘍細胞を攻撃・殺傷することが重要である。本研究では、石綿添加培地中で混合リンパ球培養法を用いてCTL分化誘導を行ったところアロ刺激によるCD8+T細胞中のCXCR3+細胞比率の増加が部分的に抑制された。一方で、ヒトCD8+T細胞株を用いて、石綿長期曝露亜株を作成したところ、granzyme B+、perforin+、及びIFN-gamma+細胞比率への5μg/mlの石綿曝露影響はなかった。石綿曝露は悪性中皮腫や肺癌を引き起こす。石綿の発癌作用はよく知られているが、癌疾患の抑制に働く抗腫瘍免疫機能への石綿曝露影響は不明な部分が多い。抗腫瘍免疫において細胞傷害性T細胞(CTL)は特異的に腫瘍細胞を攻撃する。申請者はこれまでに、石綿曝露がヒトCTLの分化を抑制することを見出した。腫瘍細胞が効果的に排除されるためには、「CTLが分化すること」だけでなく、「分化後のCTL亜集団(Effector,TEM,TEMRA,TCM)が機能を持続させること」、「CTLの遊走(腫瘍部位への遊走とリンパ節への停留)が適切であること」が重要である。CTL亜集団は、ケモカイン受容体とCD45RAの発現動態により分類できる。そこで、本研究の目的は分化後CTLを4亜集団に分類・単離したのち、各CTL亜集団の機能維持と遊走活性に対する石綿曝露影響を調べることである。平成25年度は、研究実施計画のうち、「分化後エフェクターCTLの分類・単離方法の確立」に取り組んだ。調製した末梢血単核球(PBMC)を放射線照射処理アロPBMCと1週間混合培養し、アロ標的特異的CTL分化誘導を行い、分化誘導7日目のPBMCを回収し、CD8+T細胞を磁気ビーズで回収し、回収したCD8+T細胞をCXCR3に対する蛍光標識抗体で染色し、Effector(CXCR3+)CTLの細胞集団をフローサイトメトリー(FCM)で単離する実験系を確立することができた。この手法によって、Effector CTLを単離することができ、Effector CTLの機能維持と遊走活性に対する石綿曝露影響を調べることができる。平成26年度は、研究実施計画のうち、「3種類の分化後メモリーCTL亜集団(TCM, TEM, TEMRA)の分類・単離方法の確立」に取り組んだ。調整した末梢血単核球(PBMC)を放射線照射アロPBMCと1週間混合培養し、アロ標的特異的CTL分化誘導を行い、分化誘導7日目のPBMCを回収した。回収した細胞をCD8、CD45RA、及びCCR7に対する各種蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて3種類のメモリーCTL亜集団への分類を試みた。分類手法を確立するためには、フローサイトメトリーの測定条件などの改良が必要であることがわかった。或いは、磁気ビーズを用いて、PBMCからCD8+T細胞を予め単離した後にCD45RAとCCR7に対する蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリー解析を行う必要性も考えられる。平成27年度は、ヒトCD8+T細胞株を用いて、1カ月の石綿曝露亜株を作成し、長期石綿曝露によるメモリーCTL亜集団の機能影響について調べた。CD8+T細胞株をCD45RA、及びCCR7に対する各種蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いてCTL亜集団の分類を試みたところ、TCM及びTEM集団に分類できることがわかった。

5 μg/mlの石綿添加培地中で1カ月間培養維持しヒトCD8+T細胞株、EBT-8の石綿曝露亜株を作成したところ、石綿曝露亜株のgranzyme B+、perforin+、及びIFN-gamma+細胞比率は、5μg/mlの石綿曝露影響を示さなかった。今後は、より高濃度の石綿曝露亜株の作成・解析が必要である。石綿曝露による悪性中皮腫の発症を抑制する為の生体防御機構の一つとして、ナイーブCD8+T細胞が細胞傷害性T細胞(CTL)に分化し、分化後CTLが機能を持続して、適切に腫瘍部位へ遊走し、腫瘍細胞を攻撃・殺傷することが重要である。本研究では、石綿添加培地中で混合リンパ球培養法を用いてCTL分化誘導を行ったところアロ刺激によるCD8+T細胞中のCXCR3+細胞比率の増加が部分的に抑制された。一方で、ヒトCD8+T細胞株を用いて、石綿長期曝露亜株を作成したところ、granzyme B+、perforin+、及びIFN-gamma+細胞比率への5μg/mlの石綿曝露影響はなかった。平成26年度は、メモリーCTL亜集団の分類・単離方法の確立に向けて研究を進められていることや、本研究に関する研究成果を纏めた論文が国際誌に受理された一方で、育休取得の為に研究を一時中断したことから現在までの達成度がやや遅れている。衛生学・免疫学次年度は、3種類の分化後メモリーCTL亜集団(TCM, TEM, TEMRA)の分類・単離方法を改良し、分化後Effector CTLとあわせて、3種類の分化後メモリーCTL亜集団の機能維持と遊走活性への石綿曝露影響を調べる予定である。平成25年度は「分化後エフェクターCTLの分類・単離方法の確立」に取り組み、得られた研究成果について、平成25年8月3日に開催された第4回川崎医科大学学術集会において、演題名「ケモカインレセプターに注目したエフェクター/メモリーCTL機能に関する石綿関連分子指標の探索」で、ポスター発表を行った。以上の理由から、本研究課題の研究目的はおおむね順調に進展していると思われる。育休取得の為、研究を一時中断したことにより、研究試薬などの消耗品の研究費の支出が少なかったことや、予定していた各種国内・国際学会出張を行わなかったので、次年度使用額が生じた。今後は、3種類の分化後メモリーCTL亜集団(TCM, TEM, TEMRA)の分類・単離方法の確立も行い、分化後Effector CTLとあわせて、3種類の分化後メモリーCTL亜集団の機能維持と遊走活性への石綿曝露影響を調べる予定である。上記理由により、科学研究費助成事業の期間延長を申請し承認されたので、次年度使用額が生じた研究費については、細胞培養を中心に、細胞培養液、牛胎仔血清、培養プレート、及び蛍光標識抗体などの研究試薬等の研究経費として使用する計画を立てている。また、研究成果は、国内・国際学会などでの報告に加えて、論文に纏めて海外雑誌に投稿・誌上発表するため、出張費、論文校閲費、及び論文印刷費が必要である。平成25年度の実施計画を予定していた実験のうち、3種類のメモリーCTLの分類・単離方法の確立が、進んではいるものの未完成であることから、研究試薬などの消耗品の研究費の支出が少なかったことや、予定していた各種国内・国際学会出張を行わなかったので、年度使用額が生じた。
休止期における抜毛による成長期誘導機序の解明

生後7から8週令のマウス背部の毛嚢は休止期にある。この時期に抜毛を行い新たな毛周期を誘導すると、自然の毛周期よりも良く同調した毛周期を得ることができるため、毛の実験で広く用いられている。しかし、何故、抜毛により非常に良く同調した毛周期が得られるかは不明であった。今回、抜毛を行い経時的に皮膚を採取し検討した。その結果、組織学的に抜毛後、毛嚢下部に穴が生じた。その穴には立毛筋が付着しており毛嚢の幹細胞が存在するとされる位置に一致していた。抜毛後、42時間には穴は消失し、毛嚢は増殖し始め、同時に表皮も肥厚し始めた。抜毛後12時間から36時間にかけて、この穴の内側の細胞はアポトーシスに陥ったことをTUNEL法、電顕、DNA電気泳動にて確認できた。また、電顕では穴の中と外に多数の細胞の残骸もみられ、抜毛という機械的損傷により壊死も同時に生じていることが確認された。したがって、抜毛により自然の毛周期よりも良く同調した毛周期が生じる機序として、抜毛によりわずかに異なる大きさの毛嚢が、同時にアポトーシスに陥り何らかの因子が働き一斉に成長期に入ることが大きな要因と考えられた。抜毛後12時間から36時間まで生じた穴の内側を構成する細胞はBrdU陽性であった。アポトーシスに陥った細胞と同じ細胞がBrdU陽性であり、この事実は他の組織、特に性ホルモンと関係する組織で報告されているように、アポトーシスに陥る細胞がBrdU陽性であり、その機序として提唱してあるように、アポトーシスとBrdU陽性になる場合の初期の経路が共通であることが考えられた。このように抜毛後にはアポトーシスと細胞増殖が、他の組織と同様に、同時に起きていることが毛嚢でも確かめられた。生後6-8週令の背部皮膚がピンク色である、すなわち、毛嚢が休止期にある雌のC57BL/6マウスを用いた。シンクロナイズした毛周期を作製するため背部を全身麻酔下に除毛した。抜毛後、15,30分、1,2,4,6,12,24,30,36,42,48,54,60,66,72時間に背部の一定部位より皮膚を採取した。組織学的に抜毛後15分に毛嚢下部に空洞が生じた。この空洞は辺縁の細胞が平行に並び36時間まで認められた。42時間からはhair germが増大していった。この空洞辺縁の平行に並んだ細胞はTUNEL染色にて陽性で、アポトーシスに陥ったものと考えられた。抜毛12時間後の皮膚から抽出したDNAは電気泳動でDNA ladderを示し、アポトーシスが生じた事の確認がなされた。また、BrdU染色ではこの平行に並んだ細胞が抜毛後12時間で陽性であり、これらの細胞はS期に入ったものと考えられた。これらの事から抜毛により生じた空洞の辺縁の細胞は、その機械的刺激により傷つき生体にとっては不必要な細胞となったため、アポトーシスに陥り除去されるものと考えられた。しかし、アポトーシスに陥る細胞がBrdUにも陽性であり、アポトーシスに陥っている細胞がDNA合成を行っているとの結果である。この事は矛盾であるが、一方、生体では他の細胞でも同一の所見が知られている。すなわち、アポトーシスとDNA合成の最初のステップは同一の経路を通るというものである。したがって、毛嚢組織でも抜毛によりそのステップを通る細胞が出現したものと考える。以上より抜毛により毛嚢下部の毛幹があった部分に空洞が生じ、それらの細胞はアポトーシスに陥り除去され、全ての毛嚢が一旦同じステージとなり、何らかの誘導で一斉に毛嚢が増大し、よく同一した毛周期が得られるものと考えられた。

アポトーシスに陥った細胞と同じ細胞がBrdU陽性であり、この事実は他の組織、特に性ホルモンと関係する組織で報告されているように、アポトーシスに陥る細胞がBrdU陽性であり、その機序として提唱してあるように、アポトーシスとBrdU陽性になる場合の初期の経路が共通であることが考えられた。このように抜毛後にはアポトーシスと細胞増殖が、他の組織と同様に、同時に起きていることが毛嚢でも確かめられた。
低金属量環境下での原始惑星系円盤光蒸発と星・原始惑星系円盤・惑星形成の理論的研究

本年度始め、原始惑星系円盤における紫外線光蒸発の金属量依存性についての研究成果をまとめた論文がAstrophyiscal Journalにて出版された。本研究では世界初の自己無撞着輻射流体シミュレーションを遂行することで、原始惑星系円盤の光蒸発による質量損失率を様々な金属量において導き、紫外線光蒸発率の金属量依存性を明らかにした。光蒸発率の金属量依存性が観測される原始惑星系円盤寿命の金属量依存性に説明を与えられることを初めて示した。本研究の続編として、X線も加熱源として考慮した原始惑星系円盤光蒸発の金属量依存性についての研究も本年度前期に行った。研究成果を論文にまとめ9月にAstrophysical Journalにてその論文が出版された。本研究の結果、これまで光蒸発を駆動するために重要だと思われていたX線は大きな光蒸発率を生まないことが明らかとなった。また、X線は紫外線による加熱を増幅させる役割を持ち、それにより光蒸発率がX線がない場合に比べ増加することも直接示した。X線により増幅された紫外線光蒸発はX線がない場合のものと比べ、より観測的な円盤寿命の金属量依存性と整合する光蒸発率の金属量依存性を与えるということが明らかとなった。また、本年度は多様な環境下における大質量星近傍の分子雲コアの光蒸発に関しての研究も遂行した。本研究の結果、初期宇宙などの極端に金属量の低い環境下では、近傍大質量星からの強い紫外線輻射により星周囲の分子雲が破壊・消散することが明らかとなった。消散時間は星形成時間よりも十分に短いため、この効果により極低金属量環境では星形成が強く抑制され得ることを示した。また、比較的高金属量では分子雲が圧縮を受け長時間生き残るという大質量星駆動星形成と整合する結果を得た。研究成果を論文にまとめ、2018年度末現在Astrophysical Journalに投稿中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。原始惑星系円盤は惑星系が形成される現場であるため、その物理・化学的な性質を明らかにすることは惑星形成を明らかにする上で重要である。その中でも本研究では、円盤が形成されて消失するまでの時間である円盤寿命が金属量に依ってどのような振る舞いを示すのかを研究している。円盤寿命は惑星形成時間を制限するため、これを明らかにすることは理論的・観測的な観点から重要である。また、その金属量依存性を明らかにすることは、惑星形成が起こりうる環境や時代について示唆を与えることができると考えられる。今年度は、自ら開発した輻射流体コードを用いて、超紫外線・遠紫外線照射による円盤ガスの光蒸発をシミュレーションし、光蒸発率の金属量依存性を明らかにした。超紫外線による加熱は金属量依存性を示さないが、遠紫外線による加熱は、高金属量になるほど加熱源が多く存在するという性質と円盤ガスの高密度領域まで浸透しにくくなるという性質の二つを持つことが示された。この二つの性質のうち、前者は金属量が上がるほど光蒸発率を増大させる傾向を持ち、後者は光蒸発率を減少させる傾向を持つ。その帰結として、シミュレーションから得た光蒸発率は0.5太陽金属量程度でピークを持ち、それよりも高金属量側および低金属量側の両領域で減少することが明らかとなった。この光蒸発率の結果から、原始惑星系円盤寿命は低金属量および高金属量で長く、0.5太陽金属量程度で最も短くなることが示唆される。本研究成果は、三件の国内学会・研究会、一件の国際学会にて発表をした。また、本研究成果を学術誌に投稿するため、論文にまとめた。本研究では、輻射輸送・化学反応を取り入れて流体シミュレーションをするため、計算コストが高い。したがって、シミュレーションを実行すると、当初の見積もりよりも数倍計算時間が長くなるという事態がしばしば起こり、実際に本研究でもそれが起こった。計算時間を可能な限り節約するために、コードを調整するなどして対策を行ったが、コードを調整する度にテストが必要となるため、当初の予定にはなかった時間を多く消費することとなった。このように不測な事態が起こりはしたものの、計画に沿って原始惑星系円盤光蒸発のシミュレーションを行い、光蒸発・円盤寿命の金属量依存性を得た。また、自己重力モジュールの実装も海外共同研究者のR.Kuiper氏との共同研究の下、概ね完了している。さらに、次の研究へのステップとしてX線による光蒸発を研究する必要があると考えられたため、当初の予定に加えてさらに追加でX線加熱を計算するモジュールを開発してそれをコードに実装した。以上のように、当初の予定より多くの時間消費が必要であったが、研究計画に沿った研究の進捗が認められる。原始惑星系円盤は惑星誕生の現場であるため、その物理学的・化学的な構造を明らかにすることは惑星形成過程を明らかにする上で重要である。中でも、原始惑星系円盤が形成されてから消失するまでの時間「寿命」は惑星形成時間を制限する重要な量である。近年の観測により、原始惑星系円盤寿命が金属量に依存する傾向にあることが明らかになってきた。円盤寿命の金属量依存性は他銀河や初期宇宙など、より一般的な環境下の惑星形成を明らかにする上で重要な指標となる。今年度は昨年度に引き続き、原始惑星系円盤寿命の金属量依存性を明らかにすることを目的として、数値シミュレーションを用いた「原始惑星系円盤光蒸発の金属量依存性」の研究を遂行した。

年度の前期は紫外線による光蒸発率の金属量依存性を、後期は紫外線およびX線による光蒸発率の金属量依存性をそれぞれ輻射流体シミュレーションにより導いた。結果として、円盤寿命の金属量依存性は光蒸発率の金属量依存性により整合的に説明できることを示した。また、極低金属量環境では原始惑星系円盤寿命が太陽金属量環境よりも長くなることが本研究結果から示された。紫外線による光蒸発率の金属量依存性の研究については、昨年度より論文作成に取り組んでおり、今年度の6月に論文を投稿した。投稿と時期を同じくして、X線および紫外線による光蒸発の金属量依存性の研究も開始し、今年度11月より成果を論文にまとめはじめ、現在も原稿を改訂中である。今年度は積極的に研究成果を発表することにも努め、2件の国際学会、5件の国内学会、4件の学外セミナー(うち2件は海外)、1件の学内セミナーにて発表を行った。今年度6月に、昨年度から執筆に取り組み続けていた「紫外線による原始惑星系円盤光蒸発の金属量依存性」の論文を投稿した。査読過程において、付加的な数値シミュレーションを実行することを余儀なくされた。付加的といっても、投稿論文の初版を作成する上で必要となった計算例の数倍計算例を増やすことが必要となった。本研究の輻射流体シミュレーションは、輻射輸送のみならず化学反応計算も取り入れており、計算コストが高く、一例の計算を終えるまでにクラスター計算機を用いて一ヶ月程度の時間を要する。上の付加的な数値計算を全て完了させるのに数ヶ月かかり、結局、再投稿は12月、再々投稿は2月、論文受理は3月となった。計算資源には限りがあるため、上の付加的な計算を行う間は、当初予定していた次の研究に関わる数値シミュレーションを本格的には開始することができなかった。そのため、本年度は当初の予定より進捗がやや遅れた。しかし、長い計算時間を要するシミュレーションが完了するまでの時間を利用し次の課題に必要となる数値計算コードを開発するなど、時間を効率的に活用した結果、概ねの研究進捗は認められる。本年度始め、原始惑星系円盤における紫外線光蒸発の金属量依存性についての研究成果をまとめた論文がAstrophyiscal Journalにて出版された。本研究では世界初の自己無撞着輻射流体シミュレーションを遂行することで、原始惑星系円盤の光蒸発による質量損失率を様々な金属量において導き、紫外線光蒸発率の金属量依存性を明らかにした。光蒸発率の金属量依存性が観測される原始惑星系円盤寿命の金属量依存性に説明を与えられることを初めて示した。本研究の続編として、X線も加熱源として考慮した原始惑星系円盤光蒸発の金属量依存性についての研究も本年度前期に行った。研究成果を論文にまとめ9月にAstrophysical Journalにてその論文が出版された。本研究の結果、これまで光蒸発を駆動するために重要だと思われていたX線は大きな光蒸発率を生まないことが明らかとなった。また、X線は紫外線による加熱を増幅させる役割を持ち、それにより光蒸発率がX線がない場合に比べ増加することも直接示した。X線により増幅された紫外線光蒸発はX線がない場合のものと比べ、より観測的な円盤寿命の金属量依存性と整合する光蒸発率の金属量依存性を与えるということが明らかとなった。
アミノ酸異性化酵素由来合成DNAを用いる食品生菌数の迅速測定法に関する研究

食品の一般細菌検査をアラニンラセマーゼの遺伝子を指標として、迅速かつ特異的に行うことを目的とし、本酵素遺伝子の活性中心Lys残基、およびHis168残基を含む高井保存領域に対応する数種のオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)により、本酵素遺伝子断片を特異的に増幅する条件を検討した。プライマーのミックス度が高いもの、及び、イノシンの含有量が多いプライマーでは、アラニンラセマーゼ遺伝子断片の増幅は見られなかったが、既知アラニンラセマーゼ遺伝子のコドン利用頻度を考慮して設計したプライマーの使用やアニーリング温度等の検討から、特異的に約400bpのDNAが増幅される条件を確立した。得られたPCR産物のDNAシーケンシングを行ない、その塩基配列からPCR産物が確かにアラニンラセマーゼ遺伝子断片であることを確認した。確立したPCRの条件に従い、各種低温菌、常温菌、好熱菌由来の染色体DNAを鋳型としたPCRを行なったところ、同様のサイズのDNAが増幅され、本PCR法は、各種細菌の検出に有用であることが明かとなった。また、実際に、食品に、細菌を加えて、本PCR法による検出を試みたところ、牛乳やミネラルウォーター中の細菌1細胞が検出可能であった。種々の細菌間で高い相同性を示すアラニンラセマーゼの活性中心領域に対応する種々のDNAを合成し(17-23塩基対)、5'末端をビオチンで標識した。これらのDNAプローブを用いて、ドットブロット法によりハイブリダイゼーションの条件検討、および、ビオチン検出システムとしてのストレプトアビジン-アルカリホスファターゼの反応条件を調べた。ハイブリダイゼーションに影響を与える最も重要な条件、温度、プローブ濃度、反応時間では、25°C、10pmol/ml、16時間が最もハイブリダイゼーションに適していた。合成DNAプローブとしては、イノシン含有DNAよりミックスプローブの方が特異性の点で優れていた。代表的細菌の染色体DNAをもちいたDNAハイブリダイゼーションでは、Bacillus subtilis,Pseudomonas fluorescens,Escherichia coli由来DNAのいずれもが合成DNAプローブと反応し、細菌種にかかわらず1種類のアラニンラセマーゼ遺伝子断片を用いて、異なる細菌DNAを同様に検出できる可能性が高まった。また、食品の全処理条件では、フェノール抽出、RNase処理が好ましいと考えられたが、より簡便なアルカリSDS法や煮沸法のみで調製した試料を用いて検討が必要と考えられる。食品の一般細菌検査をアラニンラセマーゼの遺伝子を指標として、迅速かつ特異的に行うことを目的とし、昨年度の研究成果を踏まえて、本酵素遺伝子の活性中心Lys残基、およびHis168残基を含む高い保存領域に対応する数種のオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)により、本酵素遺伝子断片を特異的に増幅する条件を検討した。確立したPCRの条件に従い、各種低温菌、常温菌、好熱菌由来の染色体DNAを鋳型としたPCRを行なったところ、同様のサイズのDNAが増幅され、本PCR法は、各種細菌の検出に有用であることが明らかとなった。
磁気分離システムを利用した末梢血検体の細胞診による癌存在診断法と転移予測法の確立

末梢血検体を使用し、採血のみによる癌の存在診断と転移能の評価を可能とすることを目的として研究を進めた。昨年度は、正常者20名、大腸癌患者(転移なし)20名、大腸癌患者(転移あり)20名、の末梢血を使用し、癌の存在診断法を確立し、転移関連因子6因子の発現性の評価を終了した時点での報告となった。前回までに、癌細胞の存在診断に関しては、従来多くの文献で評価されてきた抗サイトケラチン抗体と今回我々が新たに上皮細胞の同定手段として用いたヒト上皮関連抗原による血中の上皮細胞に対する同定率と特異性の評価し、抗サイトケラチン抗体が上皮細胞以外の血球細胞(好酸球、マクロファージ)に非特異的に結合し上皮細胞として同定される可能性があることと、ヒト上皮関連抗体が特異的に上皮細胞のみを同定可能であることが確認できた。また、FISHを使用して、第7染色体、第17染色体、第18染色体のαサテライトマーカーを使用して、肝転移症例3例、非肝転移症例3例の系6例に関して、癌細胞の診断を染色体レベルで証明する事ができた。大腸癌の進達度と末梢血中の癌細胞の検出率の検討では、sm以下の早期癌では癌細胞の同定率は15%にとどまったがpm以上の進達度を示した症例においては90%診断が可能であることが確認された。また、転移能の評価に関しては、蛍光抗体二重染色法を用いて解析を進めたが、好酸球や腫瘍細胞自体が発するの自家蛍光の問題が容易に解決されなかったが、好酸球と腫瘍の自家蛍光の波長サイズを正確に同定することによって、蛍光色素としてAMCA、TexasRedを使用し、デジタル画像解析装置(Meridian In Sight IQ)を併用することによって、自家蛍光を完全に除去しての観察が可能になった。転移関連因子としては、E-cadherin,α-catenin,β-catenin,sLex,sLea,VEGF,PD-ECGF,の評価に加えて今回は、MMP-2,MMP-9,MMP-7,TIMP-1,TIMP-2,MT-1MMP,MT2-MMP,CD44-v6,CD44-v10,P53,nm23,KAI-1,DCC,cMET receptorについて評価を終了した。以上18因子におけるSPSS Exact Testを使用してのPiason x 2検定にてP<0.05を認めた因子は、E-cadherin,α-catenin,MMP-2,MMP-7 TIMP-2,MT2-MMP,CD44-v6,KAI-1,cMET receptorの9因子であった。以上2年間の研究によって、磁気細胞分離システムとデジタル画像解析装置を併用して、末梢血中の癌細胞の同定及び、その血中癌細胞における転移関連因子の発現性を評価できることが証明できたと考えている。現在までに、正常者20名、大腸癌患者(転移なし)20名、大腸癌患者(転移あり)20名、の末梢血を使用し、磁気細胞分離システムを使用して癌の存在診断と転移関連因子6因子の発現性の評価を終了した。癌細胞の存在診断に関しては、従来多くの文献で評価されてきた抗サイトケラチン抗体と今回我々が新たに上皮細胞の同定手段として用いたヒト上皮関連抗原による血中の上皮細胞に対する同定率と特異性の評価し、抗サイトケラチン抗体が上皮細胞以外の血球細胞(好酸球、マクロファージ)に非特異的に結合し上皮細胞として同定される可能性があることと、ヒト上皮関連抗体が特異的に上皮細胞のみを同定可能であることが確認できた。現時点における評価では、大腸癌における磁気細胞分離システムによる癌の存在診断は、病理所見にてsm以下の早期癌では癌細胞の同定率は15%にとどまったがpm以上の進達度を示した症例においては100%診断が可能であることが確認された。また、転移能の評価に関しては、蛍光抗体二重染色法を用いて、転移関連因子として、E-cadherin.α-catenin.β-catenin.sLex.VEGF.PD-ECGFについて評価し、E-cadherin.VEGF.に関してx2検定にてP<0.05にて転移群と非転移群にて優位差が認められた。以上の結果は、癌の存在診断については第57回日本癌学会にて報告した。また、転移能の評価については、第99回外科学会総会にて報告予定である(ワークショップ採用済み)これからの1年で、癌細胞の存在診断に関して、抗体を使用した方法のみでなくFISHを用いた染色体診断を行う予定である。転移関連因子の評価では更にMMP-2.MMP-9.TIMP-1.TIMP-2.MT-1MMP.MT2-MMP.CD44-v6.CD44-v10.P53.nm23.KAi-1.DCC.について評価予定である。

前回までに、癌細胞の存在診断に関しては、従来多くの文献で評価されてきた抗サイトケラチン抗体と今回我々が新たに上皮細胞の同定手段として用いたヒト上皮関連抗原による血中の上皮細胞に対する同定率と特異性の評価し、抗サイトケラチン抗体が上皮細胞以外の血球細胞(好酸球、マクロファージ)に非特異的に結合し上皮細胞として同定される可能性があることと、ヒト上皮関連抗体が特異的に上皮細胞のみを同定可能であることが確認できた。また、FISHを使用して、第7染色体、第17染色体、第18染色体のαサテライトマーカーを使用して、肝転移症例3例、非肝転移症例3例の系6例に関して、癌細胞の診断を染色体レベルで証明する事ができた。大腸癌の進達度と末梢血中の癌細胞の検出率の検討では、sm以下の早期癌では癌細胞の同定率は15%にとどまったがpm以上の進達度を示した症例においては90%診断が可能であることが確認された。また、転移能の評価に関しては、蛍光抗体二重染色法を用いて解析を進めたが、好酸球や腫瘍細胞自体が発するの自家蛍光の問題が容易に解決されなかったが、好酸球と腫瘍の自家蛍光の波長サイズを正確に同定することによって、蛍光色素としてAMCA、TexasRedを使用し、デジタル画像解析装置(Meridian In Sight IQ)を併用することによって、自家蛍光を完全に除去しての観察が可能になった。転移関連因子としては、E-cadherin,α-catenin,β-catenin,sLex,sLea,VEGF,PD-ECGF,の評価に加えて今回は、MMP-2,MMP-9,MMP-7,TIMP-1,TIMP-2,MT-1MMP,MT2-MMP,CD44-v6,CD44-v10,P53,nm23,KAI-1,DCC,cMET receptorについて評価を終了した。以上18因子におけるSPSS Exact Testを使用してのPiason x 2検定にてP<0.05を認めた因子は、E-cadherin,α-catenin,MMP-2,MMP-7 TIMP-2,MT2-MMP,CD44-v6,KAI-1,cMET receptorの9因子であった。以上2年間の研究によって、磁気細胞分離システムとデジタル画像解析装置を併用して、末梢血中の癌細胞の同定及び、その血中癌細胞における転移関連因子の発現性を評価できることが証明できたと考えている。
金属反応剤を用いる芳香複素環化合物の固相合成

医薬品の母核として重要な芳香複素環化合物の一つであるインドール誘導体のトレースレスリンカーを用いる固相合成を検討した.特に閉環反応を中心に検討を行い,以前に液相反応で開発した縮合複素環合成の手法の適用を試みた.次に,キノリン誘導体の合成を固相Heck反応を利用して検討し,光照射下による新しいシクロリリース法の開発を行った.また,より有効にライブラリーを構築するための様々な置換基の導入についても検討を加えた.複素環化合物への有効な置換基の導入法としてメタル化反応を用いる方法があリ,種々の化学選択的なメタル化反応を固相反応へ活用し新たな固相における炭素-炭素結合生成反応を検討した.最近溶液反応で注目されている亜鉛あるいは銅アート錯体を用いるハロゲン-メタル交換反応とメタルアミド試薬を用いる脱プロトン化反応である.前者については,ハロヘテロ環化合物のジンケートを用いるメタル化および親電子剤との反応を検討し良好な結果が得られた.また,メタルアミドを用いるメタル化反応については,インドール誘導体をはじめとする様々なヘテロ環化合物についてについてメタル化反応および親電子剤との反応を種々試みた.ハロゲン-メタル交換反応については,溶液反応とほぼ同等の結果が得られ,固相反応においても円滑に反応が進行した.固相における脱プロトン化反応については,さらに反応試薬,反応条件の検討が必要と考えられたので,まず新しい脱プロトン化剤として亜鉛アミドアート錯体を用いる選択的な芳香環の水素-亜鉛交換反応の開発を行った.この亜鉛アミド試薬を用いてさらに固相脱プロトン化反応の検討を行った.現時点ではまだ反応条件の最適化には至っていないが,利用展開の可能性を見いだすことができた.この応用として,固相メタル化反応を用いるカンプトテシンなどの生理活性複素環化合物の合成についても検討した.医薬品の母核として重要な芳香複素環化合物の一つであるインドール誘導体のトレースレスリンカーを用いる固相合成を検討した.特に閉環反応を中心に検討を行い,以前に液相反応で開発した縮合複素環合成の手法の適用を試みた.次に,キノリン誘導体の合成を固相Heck反応を利用して検討し,光照射下による新しいシクロリリース法の開発を行った.また,より有効にライブラリーを構築するための様々な置換基の導入についても検討を加えた.複素環化合物への有効な置換基の導入法としてメタル化反応を用いる方法があリ,種々の化学選択的なメタル化反応を固相反応へ活用し新たな固相における炭素-炭素結合生成反応を検討した.最近溶液反応で注目されている亜鉛あるいは銅アート錯体を用いるハロゲン-メタル交換反応とメタルアミド試薬を用いる脱プロトン化反応である.前者については,ハロヘテロ環化合物のジンケートを用いるメタル化および親電子剤との反応を検討し良好な結果が得られた.また,メタルアミドを用いるメタル化反応については,インドール誘導体をはじめとする様々なヘテロ環化合物についてについてメタル化反応および親電子剤との反応を種々試みた.ハロゲン-メタル交換反応については,溶液反応とほぼ同等の結果が得られ,固相反応においても円滑に反応が進行した.固相における脱プロトン化反応については,さらに反応試薬,反応条件の検討が必要と考えられたので,まず新しい脱プロトン化剤として亜鉛アミドアート錯体を用いる選択的な芳香環の水素-亜鉛交換反応の開発を行った.この亜鉛アミド試薬を用いてさらに固相脱プロトン化反応の検討を行った.現時点ではまだ反応条件の最適化には至っていないが,利用展開の可能性を見いだすことができた.この応用として,固相メタル化反応を用いるカンプトテシンなどの生理活性複素環化合物の合成についても検討した.医薬品の母核として重要な芳香複素環化合物の一つであるインドール誘導体のトレースレスリンカーを用いる固相合成を検討した.特に閉環反応を中心に検討を行い,申請者が以前に液相反応で開発した縮合複素環合成の手法の適用を試みた.まず,固相担体上のエチニルカルバニラート誘導体の合成をパラジウム触媒下での末端アセチレン類との縮合反応により行い,次いで閉環反応を塩基性条件下で試み,固相におけるインドール閉環反応に成功した.次に,キノリン誘導体の合成を固相Heck反応を利用して検討し,光照射下による新しいシクロリリース法の開発を行った.これらの反応を検討する際に反応のモニター法(FT-IR,^<13>C-NMRなど)についても検討し.また,より有効にライブラリーを構築するための様々な置換基の導入についても検討を加えた.他の縮合複素環化合物の固相合成についても同様に,閉環反応を中心にまたトレースレスなリンカーを用いて検討した.次に,複素環化合物への有効な置換基の導入法としてメタル化反応を用いる方法を試みた.申請者は最近,化学選択的なメタル化反応としてアート錯体を用いるハロゲン-メタル交換反応とマグネシウムアミドを用いる脱プロトン化反応の開発を行っており,これらの反応の固相合成への応用を検討した.まず,固相担体に固定したベンゼン環上において,アート錯体を用いるハロゲン-亜鉛交換反応を行い好結果を得た.今後芳香複素環についてこの固相メタル化反応を検討する.複素環化合物への有効な置換基の導入法としてメタル化反応を用いる方法があり,今回種々の化学選択的なメタル化反応を固相反応へ活用し新たな固相における炭素ー炭素結合生成反応を検討した.最近溶液反応で注目されている亜鉛あるいは銅アート錯体を用いるハロゲンーメタル交換反応とメタルアミド試薬を用いる脱プロトン化反応である.

前者については,ハロヘテロ環化合物のジンケートを用いるメタル化および親電子剤との反応を検討し良好な結果が得られた.また,メタルアミドを用いるメタル化反応については,インドール誘導体をはじめとする様々なヘテロ環化合物についてについてメタル化反応および親電子剤との反応を種々試みた.ハロゲンーメタル交換反応については,溶液反応とほぼ同等の結果が得られ,固相反応においても円滑に反応が進行した.固相における脱プロトン化反応については,さらに反応試薬,反応条件の検討が必要と考えられたので,まず新しい脱プロトン化剤として亜鉛アミドアート錯体を用いる選択的な芳香環の水素ー亜鉛交換反応の開発を行った.この亜鉛アミド試薬を用いてさらに固相脱プロトン化反応の検討を行った.現時点ではまだ反応条件の最適化には至っていないが,利用展開の可能性を見いだすことができた.この応用として,固相メタル化反応を用いるカンプトテシンなどの生理活性複素環化合物の合成についても検討した.
平滑筋の各種リン酸化酵素による制御機構

平滑筋の収縮は、細胞内Ca濃度の増加に基づくミオシン軽鎖のリン酸化によって制御されていると考えられてきたが、近年、生化学的研究により、ミオシン側ではなくアクチン側の制御機構が存在する可能性が指摘されている。しかし、生理的条件下でこの様な機構が機能しているかどうかの検討はほとんどなされていない。本研究では血管および気管平滑筋において、生筋におけるfuraー2を用いた細胞内Ca動態、ミオシンのリン酸化、およびスキンドファイバ-における収縮反応を解析する事により、以下の点を明らかにした。I.血管平滑筋および気管平滑筋の収縮機構には、1)細胞内Ca濃度の増加に依存したミオシン軽鎖のリン酸化による制御機構2)ミオシン軽鎖のリン酸化のCaに対する感受性を増加させる機構3)Caに依存するミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない収縮機構の3つが存在する。II.上記のミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない収縮(3)はアクチンとミオシンの相互作用による。III.上記のミオシン軽鎖のリン酸化のCaに対する感受性を増加させる機構には、ミオシン側からの制御機構ではなく、何等かのアクチン側からの制御機構による可能性が考えらた。それらの作用が、Cキナ-ゼを活性化するホルボ-ルエステルによっても認められることから、その機構にCキナ-ゼが関与する可能性が考えられたが、その詳細はさらに検討を要する。平滑筋の受容体の刺激によりイノシト-ルリン脂質代謝回転が活性化され、細胞内のCaが増加すると、Caーカルモジュリンーミオシン軽鎖キナ-ゼ系によりミオシンがリン酸化を受け、これがアクチンと相互作用を生じて収縮を発生する。Ca濃度が減少するとホスファタ-ゼの働きでミオシンは脱リン酸化され、筋は弛緩すると考えられている。我々は細胞内遊離Caと収縮張力の同時測定から、受容体刺激時において、収縮蛋白系のCa^<2+>感受性が増強される可能性と、Caに依存しない収縮が存在する可能性を示唆した。本年度の研究では以下の点を明らかにした。1ミオシンのリン酸化量の測定結果から、受容体作動薬の存在下ではより多くのミオシンがリン酸化されることを見出した。このことは、受容体刺激はCaの増加によるミオシン軽鎖キナ-ゼの活性化の他に、何等かの機構を介してミオシン軽鎖キナ-ゼをさらに活性化するか、あるいはホスファタ-ゼを抑制し、その結果ミオシンのリン酸化量をさらに増加させ、これがCa感受性の増加のひとつの機序であることが示唆された。2受容体刺激による収縮は、Caチャンルブロッカ-を用いて細胞内Caを静止レベルまで減少させても、なお一部残存する。このときにミオシンのリン酸化量は静止値まで戻っていることが見出された。このことは、平滑筋の収縮にミオシンのリン酸化とは無関係な部分があることを示す。3 Cキナ-ゼの活性化をおこすホルボ-ルエステルは受容体刺激と類似の作用を持つことが見出された。このことは、上記1および2の作用に、Cキナ-ゼによる蛋白質のリン酸化が関与することを示す。平滑筋の収縮は細胞内遊離([Ca^<2+>]_i)の増加に基づくミオシン軽鎖のリン酸化によって制御されていると考えられてきた。しかし、近年受容体作動薬による収縮が高濃度K^+収縮に比べてそのCa^<2+>感受性が高いことが明らかにされたが、その詳細は明らかにされていない。本研究では血管および気管平滑筋において、furaー2を用いた[Ca^<2+>]_i動態、ミオシンのリン酸化、スクンドファイバ-による収縮蛋白系等について詳細に検討し、それらの収縮機構について以下の点を明らかにした。血管平滑筋および気管平滑筋の収縮機構は、1)[Ca^<2+>]_iの増加に依存したいわゆるミオシン軽鎖のリン酸化による制御機構に加えて、2)ミオシン軽鎖のリン酸化のCa^<2+>に対する感受性を増加させる機構と、3)ミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない収縮機構が存在することが示唆された。また、血管平滑筋におけるミオシン軽鎖のリン酸化のCa^

<2+>感受性増加機構は、受容体作動薬によって異なること、3)のミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない収縮がアクチンとミオシンの相互作用によることを明らかにした。ホルボ-ルエステルや受容体作動薬による3)のミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない収縮は、α毒素処理スキンドファイバ-におけるCa^<2+>を含まない弛緩液中では認められないことから、この機構にも静止レベル以下のCa^<2+>によって制御されているものと考えられる。3)の機構としてはミオシン側からの制御機構ではなく、何等かのアクチン側からの制御機構による可能性が考えらるがその点についてはさらの検討しなくてはならない。受容体作動薬による2)および3)の機構は、Cキナ-ゼを活性化するホルボ-ルエステルによっても認められることからその機構にCキナ-ゼが関与する可能性が考えられたが、血管平滑筋においてホルボ-ルエステルを用いてCキナ-ゼをあらかじめダウンレギュレ-ションさせホルボ-ルエステルによるミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない収縮が生じない標本においても、受容体作動薬によるミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない収縮は生じることから、2)および特に3)の機構にCキナ-ゼが関与するか杏かについては今後さらに検討しなくてはならない。
小分子化合物によるマイクロRNA生成効率の調節

本研究では,「pre-miRNA(miRNA前駆体)の切断反応を小分子化合物により調節する」ことを目指した.pre-miRNAの末端ループ配列をランダム化した末端ループ変異体ライブラリーから,当研究室で新規に合成されたナフチジリン誘導体RNDに結合する末端ループ配列をセレクション法により選別した.得られた末端ループ配列を導入したヘアピン型RNAは,RNDの結合によりその切断反応が顕著に阻害されることが分かった.また,ゲルシフトアッセイにより,RNDによる切断阻害効果は,RNDが変異体の末端ループに結合してループ間相互作用を誘起し,変異体ダイマーを形成することによることが分かった.本研究の目的は,「Dicerによるpre-miRNAの切断効率を,小分子化合物で調節する」ことである。本研究では,RNA中の特定の配列に結合する化合物を用いて,Dicerによる切断に最適な2次構造をpre-miRNAに誘起する。これにより,pre-miRNAの切断効率を調節し,miRNAの生成量を化合物によってコントロールすることを目指す。この目的を達成するために,平成25年度は以下の2つの項目に分けて研究を進めることとした。2. (Z)-NCTSの存在下におけるDicer反応の解析:項目1と並行して行った。pre-miR-29aのDicerによる切断反応は,ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。切断産物の配列等の詳細な解析にはノーザンブロット法が適していると考えられるが,多くの変異体を基質とした反応を解析するにあたっては,スループット性が低いと考えられたため,今回は行わなかった。(Z)-NCTSの他に,(Z)-NCTSの部分構造を有するNCDという化合物を用いて同様の実験を行ったところ,UGG5を基質として用いた場合には切断パターンの変化が見られるが,UGG5-longでは大きな変化が見られない,という(Z)-NCTSと同様の結果が得られた。本研究の目的は,「Dicerによるpre-miRNAの切断効率を,小分子化合物で調節する」ことである。平成25年度において,当初使用予定であった(Z)-NCTSおよびNCDに細胞毒性があることが分かり,使用を断念した。そこで,当研究室で新規に合成されたRNDを標的とし,RNDに結合するRNA配列をin vitroセレクション法により探索し,得られた配列を本研究に利用することにした。平成26年度は以下の3つの項目に分けて研究を進めることとした。1.得られた末端ループ変異体の発現ベクターを作製し,細胞内での有用性の確認:in vitroセレクションで得られた末端ループ変異体配列を導入した発現プラスミドを作製し,細胞内で変異体を発現させた。RNDの有無でmiRNAの生成量が変化するかをレポーターアッセイによって確認した。2.得られた末端ループの配列を基に,RND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA発現プラスミドライブラリーを作製:先に得られた末端ループ配列を他のpre-miRNAに導入した場合に,RND依存的なプロセシング効率の変化が見られるかどうかを検討した。3.細胞内でのRND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA末端ループ配列をcell-basedセレクションにより選別:RNDの結合でDicerによる切断効率が変化する末端ループ配列を,cell-basedセレクションにより得る。前年度までに,末端ループ部分の塩基配列をランダム化したヘアピン型RNAライブラリーから,当研究室で新規に合成されたRNDに結合する末端ループ配列をin vitroセレクション法により得た。得られた末端ループ配列を導入したヘアピン型RNA(末端ループ変異体)のDicerによる切断反応をRNDで制御することを試みた。平成27年度は以下の2つの項目に分けて研究を進めた。1.得られた末端ループ変異体の発現ベクターを作製し,細胞内での有用性の確認:前年度に行ったレポーターアッセイの結果から,細胞内では末端ループ変異体のDicerによる切断反応に対するRNDの効果が見られないことが分かった。この原因を調べるために,RNDの添加に伴う,末端ループ変異体のDicerによる切断産物量の変化をリアルタイムqPCRで定量した。2.得られた末端ループの配列を基に,RND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA発現プラスミドライブラリーを作製:前年度に行ったin vitroのDicer切断反応の結果から,ループ部分をセレクションで得られたループ変異体の配列に置換することで,RND依存的な切断反応のコントロールができることが示唆された。しかしながら,項目1で示したように,レポーターアッセイでは細胞内でRNDの効果が確認できなかった。RNDが細胞内に効果的に取り込まれていない,RNDと末端ループ変異体との結合が効果的に起こっていないなどの理由が考えられたので,RNDと末端ループ変異体との結合を表面プラズモン共鳴解析(SPR),ゲルシフトアッセイ等の手法を用いて詳細に解析した。