hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンジオテンシン1型受容体インバースアゴニスト機構の解明

次にこれらのインバースアゴニスト作用を減弱させる変異体を組み合わせた多重変異体を作成し、インバースアゴニスト作用減弱効果への相加効果の有無を検討したところ、N111G-S109T-A163T、N111G-S109T-H256A、N111G-S109T-N295A、N111G-A163T-H256AおよびN111G-H256A-Q257Aにおいてインバースアゴニスト作用減弱効果への相加効果を認めた。これらの結果より、インバースアゴニスト作用はARBとAT_1受容体のTM3、TM4、M6およびTM7への結合により発揮されることが明らかになった。今後はこれらの変異体のARBへの親和性に及ぼす効果を競合的リガンド結合試験にて検討し、また、分子モデリングによりARBとAT_1受容体のドッキングモデルの解析を行い総合的に評価する予定である。
流体-構造連成シミュレーション解析クラスライブラリの構築

流体と構造物が相互作用する現象は流体-構造連成問題と呼ばれ、未だ現象の解明が不十分な分野であり、数値シミュレーションに対する期待が高い。本研究では、次世代流体-構造連成シミュレーション解析を目的としたC++プログラミング言語のクラスライブラリを構築した。ライブラリには最先端の数値計算手法を用いた流体解析クラス、構造解析クラス、流体-構造連成連結クラス、格子生成クラス、並列計算クラス、ビジュアリゼーション・クラス等を組み込まれ、これらを組み合わせることで現象に応じたシミュレーショ解析ソフトウェアを容易に作成することができる。構造格子型流体計算では計算精度を高めるための方法が検討され、構造計算との連成を容易にするコロケーテッド格子での安定化の手法を開発した。スタッガード格子以上の安定性とより高精度な計算を可能にし、200CPU以上での並列で爆発計算を実現した。AMRサブクラスでは3次精度を確保しつつ、ツリー型データ構造に基づく任意の細分化を可能にした。重合格子計算サブクラスを作り、風力発電の空力-風車トルクの流体-構造連成問題へ適用し、並進や回転運動を行う流体-構造連成問題には、重合格子法が非常に有効であることが明らかになった。直交格子で複雑形状の境界条件を計算できるImmersed BoundaryMethodのサブクラスを作成した。また、粉体現象で用いる要素バネに加えて間隙バネを考慮することで構造破壊計算が可能になった。フォトリアリスティックな可視化サブクラスとして、POV-Rayを用いた高品位なレイトレーシングを可能にし、気泡流の可視化、台風の可視化を行い高い評価を得た。流体-構造連成シミュレーションは流体現象と構造変形が複雑に相互作用するために多くの解析要素が含まれ、本研究では流体解析クラス、構造解析クラス、流体-構造連成連結クラス、格子生成クラス、並列計算クラス、ビジュアリゼーション・クラスを柱とする解析ライブラリの構築を目標としている。平成16年度は以下のクラスにおいて成果が得られた。流体解析クラスおよび並列計算クラス:AMRクラス:ツリー型データ構造に基づく任意の細分化か可能なAMR法を目指し、データ構造の設計、データアクセスの高速化と最適化、全ての場所・方向での3次精度補間の達成、流体計算への適用(レーリー・テーラー不安定性、衝撃波)数値計算手法:構造格子型流体計算では、計算精度を高めるための方法が検討され、さらに構造計算との連成を容易にするコロケーテッド格子を用いた計算法が検討された。従来、計算不安定のため困難とされていたが安定化の手法を開発し、スタッガード格子と比較して同程度の安定性とより高精度な計算を可能にした。コロケーテッド格子はメモリー分散型計算機での並列化も容易にするため、この安定化手法を爆発計算に導入し200CPU以上での並列計算を実現した。一方、粒子モデルをベースとした流体計算手法の開発も開始した。流体モデルは格子を形成する必要がなく、複雑形状の構造物との相互作用や自由界面の表現精度が高い。従来は計算精度が低いために適用範囲が非常に限られていたが、局所補間微分オペレータ法を導入することで計算精度が飛躍的に向上する見通しが得られ、流体クラスの粒子モデルクラスとして追加を検討中である。ビジュアリゼーション・クラス:従来のOpen GLによる可視化ではなく、フォトリアリスティックな可視化を目指してレイトレーシングによる可視化のクラスライブラリ作成を検討した。現状では高品位な画像生成が可能なPOV-Rayが存在するので、POV-Rayへのインターフェイスを強化することを検討した。構造解析クラス:個別要素法による構造破壊計算の予備計算を行った。通常の粉体現象で用いる要素バネに加えて間隙バネを考慮することで、構造計算が可能になった。さまざまな基礎的検証に加えて、コンクリートの圧縮破壊テスト、鉄心入りコンクリートの破壊問題へ適用し、有効性を確認した。

流体-構造連成シミュレーションは流体現象と構造変形が複雑に相互作用するために多くの解析要素が含まれ、本研究では流体解析クラス、構造解析クラス、流体-構造連成連結クラス、格子生成クラス、並列計算クラス、ビジュアリゼーション・クラスを柱とする解析ライブラリの構築を目標としている。平成17年度は以下のクラスにおいて成果が得られた。流体解析クラスおよび並列計算クラス:最短の隣接格子参照ステンシルで高精度計算を可能にする局所補間微分オペレータ法の開発を継続し、コロケート格子での高精度計算を可能にする安定化カップリング法を様々な流体シミュレーションに適用した。隣接格子点参照がシンプルになったため、大規模並列計算が容易になり、東京工業大学のTitech Gridシステムでほとんど並列効率が低下しないことを確認した。新しいサブ・クラスとして重合格子計算クラスを作り、風力発電の空力-風車トルクの流体-構造連成問題へ適用を試みた。風車やファンのように構造物の変形は非常に少ないが、全体として物体が並進や回転運動を行う流体-構造連成問題には、重合格子法が非常に有効であることが明らかになった。個別要素法計算クラス:3次元個別要素法のモデルを開発し、粉粒体計算を行うクラスを開発した。計算の高速化を行うための粒子マッピング化やOpenMPの導入、メモリ分散マシンでの並列化効率を上げるための動的負荷分散の手法について検討した。ビジュアリゼーション・クラス:気泡流上昇の大規模数値シミュレーションのフォトリアリスティックな可視化を行い、日経新聞・朝日新聞に掲載され、NHK教育テレビ「サイエンスZERO」でも放映された。さらに日本機械学会・計算力学部門ビジュアリゼーションコンテストで最優秀賞を受賞した。また、地球磁場変動をMHDダイナモ理論で計算した結果のレイトレーシングによる可視化や分子計算の可視化にビジュアリゼーション・クラスライブラリを適用し、有効性を確認した。流体-構造連成シミュレーションの機能単位のクラスライブラリをさらに整備し、これらを統合していくつかのアプリケーションを構築した。また、直交格子で複雑形状の境界条件を計算できるImmersed BoundaryMethodのクラスを新たに導入し、固体-液体-気体の混相流計算へ適用した。平成18年度は以下のクラスにおいて成果が得られた。重合格子計算クラス:構造物の変形が少なく、移動が激しいような流体-構造連成問題に特化したクラスであり、高レイノルズ数流れに適用可能とした。2つ以上の複数計算格子を用いて各々単独に計算するが、重合領域での境界点での補間精度が問題になり、値と微係数を用いた3次精度の補間を行うことにより系全体が高精度に計算できることが明らかになった。また、補間するタイミング、移動格子上での慣性力を正確に考慮し、非物理的な振動等を抑制することができた。Immersed Boundary Methodクラス:直交格子をベースとし、格子に対して斜め方向の境界条件を満足させるために方程式中に外力項を導入する。境界条件を満足する計算精度としてはカットセルほど高くないが、適用範囲が広い特徴がある。
北アナトリア断層帯とその周辺地域の第四紀テクトニクス

北アナトリア断層帯は(NAFZ),アナトリア(トルコ)・プレ-トユ-ラシア・プレ-トとを境する横ずれ型のプレ-ト境界である.同断層帯の西端はエ-ゲ海の背弧拡大域に連続すると従来考えられてきたが,研究代表者らが過去3回行なった野外調査の結果では,同地域のテクトニクスはかなり複雑である.本研究では,実体視可能なSPOT及びCOSMOS映像の判読と野外調査デ-タを用いてこの地域の第四紀テクトニクスの再検討を試みた.本研究で得られた主な結果は以下のとうりである:1.衛星映像の判読からは完新世の地形面上の変位地形は検出できないが,実体視することにより更新世の地形面上の変位地形は検出可能である.Mudurnu Valley以西の地域では,第四紀後期の地形面を変位させる活褶曲が識別できた.Mudurnu Valley以東では,MAFZは直線性の良いほとんど単一のトレ-スをなす.衛星映像上で検出できるトレ-スは,1967,1957,および1944年の地震断層とほぼ正確に一致する.以上の結果は,高解像度で実体視可能な衛星映像が第四紀テクトニクスの調査に極めて有効であることを示している.2.NAFZはMudurnu Valley以西ではIzmitーSapanca断層帯とIznikーMekece断層の2つに分岐する.IznikーMekece断層は直線的なほぼ単一のトレ-スからなり,局所的にかなりの縦ずれ成分を有するものの,全体としてほぼ純粋な横ずれ断層である.一方,IzmitーSapanca断層帯には多数の活褶曲が発達し短縮変形が進行していることを示す.この結果は,同地域が伸張場にあるという従来の通説とも,また微小地震の発震機構とも矛盾する.これは地表付近と微小地震発生域(<6km)とで断層のgeometryが異なることに起因すると推定される.北アナトリア断層帯は(NAFZ),アナトリア(トルコ)・プレ-トユ-ラシア・プレ-トとを境する横ずれ型のプレ-ト境界である.同断層帯の西端はエ-ゲ海の背弧拡大域に連続すると従来考えられてきたが,研究代表者らが過去3回行なった野外調査の結果では,同地域のテクトニクスはかなり複雑である.本研究では,実体視可能なSPOT及びCOSMOS映像の判読と野外調査デ-タを用いてこの地域の第四紀テクトニクスの再検討を試みた.本研究で得られた主な結果は以下のとうりである:1.衛星映像の判読からは完新世の地形面上の変位地形は検出できないが,実体視することにより更新世の地形面上の変位地形は検出可能である.Mudurnu Valley以西の地域では,第四紀後期の地形面を変位させる活褶曲が識別できた.Mudurnu Valley以東では,MAFZは直線性の良いほとんど単一のトレ-スをなす.衛星映像上で検出できるトレ-スは,1967,1957,および1944年の地震断層とほぼ正確に一致する.以上の結果は,高解像度で実体視可能な衛星映像が第四紀テクトニクスの調査に極めて有効であることを示している.2.NAFZはMudurnu Valley以西ではIzmitーSapanca断層帯とIznikーMekece断層の2つに分岐する.IznikーMekece断層は直線的なほぼ単一のトレ-スからなり,局所的にかなりの縦ずれ成分を有するものの,全体としてほぼ純粋な横ずれ断層である.一方,IzmitーSapanca断層帯には多数の活褶曲が発達し短縮変形が進行していることを示す.この結果は,同地域が伸張場にあるという従来の通説とも,また微小地震の発震機構とも矛盾する.これは地表付近と微小地震発生域(<6km)とで断層のgeometryが異なることに起因すると推定される.北アナトリア断層帯はアナトリア(トルコ)プレ-トとユ-ラシア・プレ-トとを境する横ずれ型のプレ-ト境界である。同断層帯の西端部付近には第四紀後期の短縮変形を示す多数の活褶曲が発達するが,これは北アナトリア断層の西端がエ-ゲ海の背弧拡大域に連続するという従来の通説とも,また同断層帯西端部付近で発生する微小地震メカニズムとも矛盾する。研究代表者等は,断層帯の分岐と地表と地下での断層のgeometryの違いによって上記の矛盾を説明するモデルを提出したが,このモデルからは上記の様な現象をもたらす原動力とより広域的なテクトニクスとの関係は未だ明らかになっていない。本研究では,この問題を明らかにするために,高解像度で実体視可能な衛星写真を用いて北アナトリア断層西端部とその周辺地域の活構造分布をマッピングすることを試みる。本年度は,Izmit湾からSapanca湖周辺のSPOT panchromatic映像1シ-ンを取得し解析を行なった。変位地形の判読は10万分の1に引き伸ばした印画は実体視することによって行なった。本年度のテストフィ-ルドの一部は既に現地調査を実施しているので,SPOT映像の判読によってどの程度のスケ-ルの変位地形まで検出可能かを検討した。その結果,以下の点が明らかになった:1.完新世の地形面上の変位地形は,SPOT映像からは検出できない。2.更新世の地形面上の変位地形は検出可能である。

3.広域的な活構造・組織地形のマッピングには,大縮尺空中写真よりSPOT映像の方が有効な場合がある。北アナトリア断層帯は,アナトリア(トルコ)・プレ-トとユ-ラシア・プレ-トとを境する横ずれ型のプレ-ト境界である.同断層帯の西端部付近には第四紀後期の短縮変形を示す多数の活褶曲が発達するが,これは北アナトリア断層の西端がエ-ゲ海の背弧拡大域に連続するという従来の通説とも,またこの付近で発生する微小地震のメカニズムとも矛盾する.研究代表者らは,断層帯の分岐と地表と地下での断層のgeometryの違いによって上記の矛盾を説明するモデルを提出したが,このモデルからは上記の現象をもたらす原動力とより広域的なテクトニクスとの関係はまだ明らかになっていない.本研究では,この問題を明らかにするために,高解像度で実体視可能な衛星写真の判読と過去3回の野外調査で取得したデ-タを用いて北アナトリア断層帯西部とその周辺地域の活構造の解析を試みた.本年度はMuduru ValleyからIsmetpasaまでの間の衛星映像(Zoyuzkarta社Cosmos映像)を取得し,解析を行なった.その結果,以下の点が明らかになった:1.前年度に解析を行なったMudurnu Valley以西の地域と異なり,北アナトリア断層帯は直線性の良いほとんど単一のトレ-スをなす.衛星映像上で検出できるトレ-スは,1967,1657,および1944年の地震断層とほぼ正確に一致する.2.前年度のSPOT Panchromatic映像を用いた判読結果と同様に,完新世の地形面上の変位地形は検出できないが,実体視することにより更新世の地形面上の変位地形は検出可能であった.3.断層帯に沿う幅10数kmに及ぶpressure ridge状の地形が衛星映像上で明瞭に検出された.これは大規模横ずれ断層のテクトニクスの解明する上で,重要な意義を持つと考えられる.
遠隔通信とe-learningを組み込んだスペイン語教育用教材研究

1)パソコンのテレビ電話によるコミュニケーションもますます容易に、安価でできるようになってきている。これを前提としての外国語教育のモデルとして、授業に遠隔通信をどのように組み入れれば有効かを考察するため、授業の中でスペイン国バルセロナ大学のスペイン語を母語とする学生達と、スペイン語を学ぶ日本の学生達との遠隔通信コミュニケーションを実践した。同大学イスパニア文献学科のMar Cruz Pinol博士らの全面的協力を得て半期授業の中で4回セッションを行った。準備段階としてテーマ選定、スピーチ原稿執筆、原稿の推敲、遠隔通信セッションでの発表と質疑応答、セッション後の反省というプロセスの中で、中級以上の学生にとって、外国語学習で必要な、動機付け、インプット、アウトプット、語句や表現の意識的学習、これらのすべての面において極めて有効であり、学習の自己マネジメントという面でも効果があることを観察や受講生、それに先方参加者及び見学者の記述により明らかにした。2)特定地域に偏らない標準スペイン語モデル研究の資料及び教材用として、分担者塚原と糸魚川がスペイン現地の言語資料を収集した。代表者は、スペイン語地域差、特にグアテマラの待遇形式とその用法について研究を進めた。3)異文化とジェンダーに対するステレオタイプのない教材研究として、分担者糸魚川が、今までの研究の継続として、スペイン語辞書の例文にみられる女性像・男性像の偏りを調べ、学習者に問題提起する方法などについて研究を進めた4)スペイン語e-learningは、分担者塚原が、インタラクティブなビデオ教材を試作し、スペイン国バジャドリ大学及びバジャドリ県主催第1回クリストバル・ビジャロン賞に応募した。また代表者と分担して、初級テキスト用の補足説明、動詞活用表、練習問題、朗読音声のデジタルコンテンツを作成し、ウエブサイトに公開した。スペイン語教育の効率化・達成度向上をめざし、通常授業の中に遠隔通信による母語話者とのコミュニケーション実践と予習復習用e-learningを組み入れ、そのための授業シラバスと教材、連携したe-learning教材を研究するという本研究の目的から、本年度は以下の実績を得た。1)特定地域に偏らない標準スペイン語モデル研究の資料として、また教材用として、研究分担者塚原信行と糸魚川美樹がスペイン現地の公共アナウンスの録音、生活に関する画像などの資料を収集した。研究代表者は、スペインの方言および中南米スペイン語の諸特徴について研究を進めた。2)異文化とジェンダーに対するステレオタイプのない教材研究として、分担者糸魚川が既存のスペイン語教科書にみられる女性像・男性像の偏りを調べ、教材や授業を通して性のステレオタイプを無意識に発信している可能性があることを指摘し、スペイン語における性別の表され方とそれに関連する性差別議論のような問題を授業でとりあげることも大学における外国語教育となりうることを確認した。3)スペイン国バルセロナ大学イスパニア文献学科のEmma Martinell博士およびMar Cruz Pinol博士と遠隔合同授業の進め方について、スケジュール、解決すべき問題の整理と解決手順等について研究分担者2名が打ち合わせをした。また同大学で外国語としてのスペイン語教育を学んでいる学生で本研究への協力参加者を募った。4)バルセロナ大学イスパニア文献学科研究室と愛知県立大学外国語学部の研究代表者の研究室とを結ぶインターネット回線による遠隔通信の試験を行い、音声と画像の通信品質が外国語教育に支障ないものであることが分かった。5)ユトレヒト大学(オランダ)とバルセロナ大学の間で行われている遠隔合同授業を分担者塚原がバルセロナ大学にて視察し、参加学生にインタビューを実施した。1)外国語授業に遠隔通信をどのように組み入れれば有効かを考察するため、スペイン語教科教育法の授業の中でスペイン国バルセロナ大学のスペイン語を母語とする学生達と、スペイン語を学ぶ日本の学生達との遠隔通信コミュニケーションを実践した。

スペイン国バルセロナ大学イスパニア文献学科のMar Cruz Pinol博士らの全面的協力を得て半期授業の中で4回セッションを実施し、授業運営及びコミュニケーション・テーマや課題などについて考えることができた。準備段階としてテーマ選定、スピーチ原稿執筆、原稿の推敲、遠隔通信セッションでの発表と質疑応答、セッション後の反省というプロセスの中で、中級以上の学生にとって、外国語学習で必要な、動機付け、インプット、アウトプット、語句や表現の意識的学習、これらのすべての面において極めて有効であり、学習の自己マネジメントという面でも効果があることを観察や受講生、それに先方参加者及び見学者の記述により明らかにした。2)特定地域に偏らない標準スペイン語モデル研究の資料及び教材用として、分担者塚原と糸魚川がスペイン現地の言語資料を収集した。代表者は、スペイン語地域差、特にグアテマラの待遇形式とその用法について研究を進めた。3)異文化とジェンダーに対するステレオタイプのない教材研究として、分担者糸魚川が、今までの研究の継続として、スペイン語辞書の例文にみられる女性像・男性像の偏りを調べ、学習者に問題提起する方法などについて研究を進めた4)スペイン語e-learningは、分担者塚原が、インタラクティブなビデオ教材を試作し、スペイン国バジャドリ大学及びバジャドリ県主催、第1回クリストバル・ビジャロン賞に応募した。また代表者と分担して、初級テキスト用の補足説明、動詞活用表、練習問題、朗読音声のデジタルコンテンツを作成し、ウエブサイトに公開した。
ミドリイシ属サンゴにおける環境周期適応機構の生理学的解析

沖縄のサンゴ礁を形成する造礁サンゴの一種であるウスエダミドリイシAcropora tenuisは、初夏の満月に一斉に産卵するという、季節と月相に対応した生物リズムを示す。産卵時期を決定するために、ウスエダミドリイシは外環境から季節と月相の情報を読み取っていると考えられるが、どの環境要因を指標としているのか明らかにされていない。本研究は、ウスエダミドリイシの産卵にみられる季節性と月周性影響する環境要因を特定することを目的とする飼育実験と、産卵に関連する遺伝子の探索を目的とするRNA-seqによる網羅的発現解析を行った。飼育実験は、琉球大学熱帯生物圏研究センター瀬底研究施設の屋内飼育スペースに暗室を用意し、その中に設置した生海水掛け流し水槽を用いて行った。照明にはLEDライトを用い、完全人工光下での飼育を試みた。Webカメラを用いて水槽内の様子を観察し続けた結果、2018年6月24日に産卵が確認された。このことから、ウスエダミドリイシが人工光下の月光が無い飼育でも産卵できることが明らかになった。また、同日には野外おいても産卵が観察されたことから、生海水中にサンゴの産卵の指標とする何らかの環境要因が存在する可能性が示唆された。網羅的遺伝子発現解析は、産卵前にあたる5月の満月、産卵が観察された6月の満月、産卵翌月の7月の満月に、野外にて採集したウスエダミドリイシを用いて行った。現在、次世代シークエンサーを用いて配列決定を行い、発現解析を行っている。今後、月ごとに発現異なる遺伝子の探索と、その機能について解析していく予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。造礁サンゴの一種であるウスエダミドリイシAcropora tenuisは、初夏の満月の夜に産卵する。サンゴの産卵リズムに関する研究は野外観察に基づく生態学分野の報告がほとんどで、産卵リズムが内因性の生物時計によって制御されているのか、どの環境要因を指標に産卵する時期や時刻を決定しているのかなど、産卵リズムの性質や生理学的背景に関する知見は十分に得られていない。本研究は、ウスエダミドリイシの産卵にみられる季節性と月周性影響する環境要因と、産卵リズムの生理機構について調べることを目的とする。本年度は、水温・日長を制御できるサンゴ飼育水槽のセットアップと、産卵リズムに関連する遺伝子の探索を目的としたRNA-seqによる網羅的発現解析を行った。琉球大学熱帯生物圏研究センター瀬底研究施設の屋内飼育スペースに暗室を3つ用意し、それぞれに生海水掛け流し水槽を設置した。各水槽の上流に水温調節水槽を設置することで、同じ生海水を使用しながら水温の違いを比較検証できるようにした。個室の中にLEDライトを設置し、ライトの電源をタイマー制御することで日長を調節した。また、暗室内にWebカメラを設置し、サンゴの様子を常に観察・記録できるようにした。RNA-seqには、産卵前にあたる5月の満月、産卵が観察された6月の満月、産卵翌月の7月の満月のサンプルを用いた。瀬底研究施設前にて採集したウスエダミドリイシからRNAを抽出した後、次世代シークエンサーを用いて配列決定を行った。研究計画では、ウスエダミドリイシに加えて近縁種であるコユビミドリイシAcropora digitiferaを用い、2種のサンゴを比較しながら研究を進める予定であった。しかしながら、予備実験において、コユビミドリイシがウスエダミドリイシと同程度の光強度では生育できず、2種の同時飼育が現状では困難であることが判明した。そこで、今回は飼育が比較的容易なウスエダミドリイシのみを用いて、実験を行うこととした。本年度から飼育実験を開始する予定であったが、機材の準備や設置に予想以上の期間を要してしまい、水槽のセットアップまでにとどまった。

飼育水槽を活用し、日長・水温の変化がウスエダミドリイシの生殖腺発達に与える影響や、月周性が実験室条件でも維持されるかを検証していく。RNA-seqに関して、発現解析を進めていき、サンプル間で発現が異なる遺伝子をスクリーニングし、産卵に伴って発現が変動する候補遺伝子を選定する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
糸状菌の進化の一要因としての植物/糸状菌間の遺伝情報の伝達とその機構

以下の2つの計画について研究を行った。(1)植物から菌類への遺伝子の伝達:糸状菌で選択可能なマーカー遺伝子を持つシロイヌナズナに、病原性菌および腐生菌を接種し、マーカー遺伝子が伝達された系統の選抜を試みたが、伝達は確認できなかった。そこで、モデル系として、培地中からのDNAの取り込みや、石英砂に吸着し、安定化させたDNAの取り込みについても検討を進めたが、伝達現象は確認されなかった。また、これらとは違った観点から植物/糸状菌間の遺伝子の伝達を考える系として、リンゴ斑点落葉病菌の特異的病原性決定遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、約20-kbの遺伝子中にイントロンがないことやコドンの利用頻度等からも考えて、他の生物種由来である可能性が示唆された。(2)糸状菌ゲノムへの外来DNAの組み込み機構:上記のDNAの伝達現象が起こるための、糸状菌細胞内での機構および装置として、DNAの組み込みに関与する遺伝子の同定を行った。現在までに、減数分裂時組み換えおよび組み換え修復に関与する遺伝`3つをクローニングした。そのうち、相同性の検索に関与する遺伝子を、二種の糸状菌において部位特異的に破壊し、形質転換時における細胞外DNA分子の組み込み様式を詳細に検討した。その結果、遺伝子破壊株では相同的組み込みが全くおこらず、染色体への組み込み部位数の増加も観察された。このことから、本遺伝子産物は相同的組み込みに直接関与すること、遺伝子破壊株では、非相同的組み込みを介在する別経路も同様に効率的に機能することを明らかにした。残り二つの遺伝子についても、機能解析を鋭意進めている。本課題では以下の2つの計画について研究を進めている。(1)植物から菌類への遺伝子の伝達:糸状菌で選択可能なマーカーを持つシロイヌナズナに、病原性菌として黒すす病菌を、腐生菌としてAspergillus属菌を接種し、マーカーが伝達された系統の選抜を試みている。しかし、現在まで、そのような伝達現象を確認するに至っていない。そこで、モデル系として、培地中からのDNAの取り込みについても検討を進めているが、これまで行った培養条件では伝達現象は確認されなかった。また、これとは違った観点から植物-糸状菌間の遺伝子の伝達を考える系として、リンゴ斑点落葉病菌の特異的病原性決定遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、イントロンを含まない巨大遺伝子であることが明らかになり、コドンの利用頻度等からも考えて、他の生物種由来である可能性も示唆された。(2)糸状菌ゲノムへの外来DNAの組み込み機構:上記のDNAの伝達現象が起こるための、糸状菌細胞内での機構および装置として、DNAの組み込みに関与する遺伝子の同定を進めている。現在までに、減数分裂時組み換えおよび組み換え修復に関与する遺伝子2つをクローニングした。そのうち、相同性の検索に関与する遺伝子を、二種の糸状菌において部位特異的に破壊し、形質転換時における外来遺伝子の組み込み様式を詳細に検討した。その結果、遺伝子破壊株では相同的組み込みが全くおこらず、ゲノムへの組み込み部位数の増加も観察された。このことから、本遺伝子産物は相同的組み込みに直接関与すること、および遺伝子破壊株では、非相同的組み込みを介在する別経路も同様に効率的に機能することが明らかになった。この結果をまとめた論文を本年度中に投稿予定である。(1)植物から菌類への遺伝子の伝達:糸状菌で選択可能なマーカー遺伝子を持つシロイヌナズナに、病原性菌および腐生菌を接種し、マーカー遺伝子が伝達された系統の選抜を試みている。しかし、これまで、そのような伝達現象を確認できなかった。

そこで、モデル系として、培地中からのDNAの取り込みや、砂に吸着し、安定化させたDNAの取り込みについても検討を進めたが、これまで行った実験では伝達現象は確認されなかった。また、これらとは違った観点から植物-糸状菌間の遺伝子の伝達を考える系として、リンゴ斑点落葉病菌の特異的病原性決定遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、コドンの利用頻度等からも考えて、他の生物種由来である可能性も示唆された。この内容をMolecular Plant-Microbe Interaction誌に発表した。(2)糸状菌ゲノムへの外来DNAの組み込み機構:上記のDNAの伝達現象が起こるための、糸状菌細胞内での機構および装置として、DNAの組み込みに関与する遺伝子の同定を進めている。現在までに、減数分裂時組み換えおよび組み換え修復に関与する遺伝子3つをクローニングした。そのうち、相同性の検索に関与する遺伝子を、二種の糸状菌において部位特異的に破壊し、形質転換時における外来遺伝子の組み込み様式を詳細に検討した。その結果、遺伝子破壊株では相同的組み込みが全くおこらず、ゲノムへの組み込み部位数の増加も観察された。このことから、本遺伝子産物は相同的組み込みに直接関与すること、および遺伝子破壊株では、非相同的組み込みを介在する別経路も同様に効率的に機能することが明らかになった。この結果をまとめた論文をMolecular and General Genetics誌に発表した。残り二つの遺伝子についても、機能解析を鋭意勧めている。以下の2つの計画について研究を行った。(1)植物から菌類への遺伝子の伝達:糸状菌で選択可能なマーカー遺伝子を持つシロイヌナズナに、病原性菌および腐生菌を接種し、マーカー遺伝子が伝達された系統の選抜を試みたが、伝達は確認できなかった。そこで、モデル系として、培地中からのDNAの取り込みや、石英砂に吸着し、安定化させたDNAの取り込みについても検討を進めたが、伝達現象は確認されなかった。また、これらとは違った観点から植物/糸状菌間の遺伝子の伝達を考える系として、リンゴ斑点落葉病菌の特異的病原性決定遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、約20-kbの遺伝子中にイントロンがないことやコドンの利用頻度等からも考えて、他の生物種由来である可能性が示唆された。(2)糸状菌ゲノムへの外来DNAの組み込み機構:上記のDNAの伝達現象が起こるための、糸状菌細胞内での機構および装置として、DNAの組み込みに関与する遺伝子の同定を行った。そのうち、相同性の検索に関与する遺伝子を、二種の糸状菌において部位特異的に破壊し、形質転換時における細胞外DNA分子の組み込み様式を詳細に検討した。その結果、遺伝子破壊株では相同的組み込みが全くおこらず、染色体への組み込み部位数の増加も観察された。このことから、本遺伝子産物は相同的組み込みに直接関与すること、遺伝子破壊株では、非相同的組み込みを介在する別経路も同様に効率的に機能することを明らかにした。残り二つの遺伝子についても、機能解析を鋭意進めている。
２次元ハニカム格子上のスピン系に現れる特異な磁気ダイナミクス

Li3Ni2SbO6ではTN=13.5Kで反強磁性転移を起こし、磁化曲線にはHc1=6TとHc2=16Tの2つの異常が観測されている。粉末中性子回折データの解析を継続するとともに磁化測定及び7Li核のNMRにより、磁化異常の正体や磁気構造を調べた。磁場配向試料による磁化曲線からスピンは面間方向に容易軸をもち、またHc1でスピンフロップ転移があることがわかった。中性子回折の磁気反射が(h k l) +(1/6 0 0)で指数付けできたので、a軸方向に6倍周期の磁気構造を仮定し解析を進めていたが、同時期に他グループより、(h k l) +(1/2 1/2 0)で指数付けし、ジグザク構造と呼ばれる磁気構造が提案された(A. I. Kurbakov et al.: PRB96 (2017) 024417)。この磁気構造を検証した結果、申請者らの実験結果と矛盾がないことがわかった。Na3Co2SbO6およびNa2Co2TeO6では、TN=7K及び26Kで反強磁性転移を起こし、またHc=1.3T及びHc=8.2Tでそれぞれ磁化曲線に異常が現れる。この異常のメカニズムを解明するために、磁場配向試料の作成及び、T=1.4Kで52Tまでの超強磁場下で磁化曲線を測定した。磁場配向試料の作成を試みたが、配向は起こらなかったので両物質ともに磁気異方性は小さいと考えられる。23Na-NMRのスペクトルからも磁気異方性が小さいとの結果を得た。磁化曲線からはHcで磁化が急激に増加する振舞いを示す一方、52Tでも磁化が飽和せず磁場とともに磁化が徐々に増加した。この結果は一軸異方性もつ磁性体に通常現れるメタ磁性転移では説明することができず興味深い。Hcにおいてある種のスピンフリップが生じたが、スピンフリップ後でもスピンは飽和状態になく、磁場とともにスピンの向きがさらに移り変わっていると考えられる。本研究では、(i)磁性イオンT=Ni2+,Co2+がハニカム格子を形成するスピン系A3T2A'O6 (A=Li,Na, A'=Sb,Bi)の多結晶試料を合成し、(ii)磁化率・比熱・誘電率の温度依存性や磁場依存性を調べるとともに、(iii)中性子回折実験、X線回折実験、7Li-NMRによる微視的な測定を行い、結晶構造・磁気構造や磁気ダイナミクスを調べてきた。下記に得られた主な研究成果を記述する。(1)Li3Ni2A'O6の多結晶試料を合成して、磁化率・比熱を測定した結果、TN=13.5K(A'=Sb), TN=4K(A'=Bi)で反強磁性転移を起こすことが分かった。さらにLi3Ni2SbO6の磁性を調べた結果、Hc=6T付近の磁場で磁化曲線に異常が現れることも分かった。磁場配向試料を作成し、結晶軸と磁場方向を指定して磁化曲線の振る舞いを詳しく調べ結果、Hc=6Tでの磁化曲線の異常は、H//c軸では出現するが、H//ab面では現れないことから、この異常の起源はスピンフロップ転移であることがわかった。さらにJ-PARCのiMATERIAを用いてLi3Ni2SbO6の粉末中性子回折実験を行った結果、h±δkl(δ0.165)の指数で説明可能な磁気反射を観測しincommensurateな磁気構造をもつことがわかった。(2)Li3Co2SbO6の多結晶試料を合成して、磁化率・比熱を測定した結果、TN=110Kで反強磁性相転移を起こすことがわかった。一方、LiサイトをNaに入れ替えたNa3Co2SbO6では7Kで反強磁性転移を起こすことが分かり、両者の間で磁気転移温度が2桁も異なっていた。両者のX線結晶構造解析は途中であるが、Na3Co2SbO6はCo2+イオンがハニカム格子を形成する結晶構造であるのに対し、Li3Co2SbO6はおそらくCo2+イオンが3次元的に配列したFddd構造と呼ばれる結晶構造であると考えられる。両者の結晶構造の違いがスピン間の交換相互作用の違いとなって反映され、このような磁気転移温度の大きな違いが生じたと理解できる。2015年度は磁性イオンT=Ni2+,Co2+を含むスピン系A3T2A'O6 (A=Li,Na,A'=Sb,Bi)の組み合わせの中で、Li3Ni2SbO6、Li3Ni2BiO6、Li3Co2SbO6、Na3Co2SbO6の多結晶試料を合成し、磁化率・比熱・誘電率の測定や、X線結晶構造解析、粉末中性子回折実験、7Li-NMRの測定によりこれらの物質の磁性を明らかにしたので、この物質群の基本的な磁気的振る舞いが理解できてきた。その点ではおおむね順調に進展していると考えている。一方では、Li3Ni2SbO6の粉末中性子回折実験を行いincommensurateな磁気構造をもつことがわかったものの詳細な磁気構造がまだ決定できていない。また、Li3Co2SbO6は当初期待していたハニカム構造ではなくCo2+イオンが3次元的に配列したFddd構造と呼ばれる結晶構造とわかったが、詳細な結晶構造はまだ決定できていない。

これらを早急に決定する必要があると考えている。(1) Li3Ni2SbO6はTN=13.5Kで反強磁性転移を起こすが、転移温度以下での磁気構造は分かっておらず、さらに磁化曲線にはHc1=6TとHc2=16Tの2つの特徴的な磁場で異常が観測されており、これらの異常の正体を調べた。まず磁場配向試料を作成し、磁化曲線を詳しく調べた。その結果、Hc1=6Tでの磁化曲線の異常は、H//(ハニカム面間方向)では顕著に異常が出現するが、H//(ハニカム面内方向)では異常が現れないことがわかった。一見するとスピンフロップの際の磁化曲線の振舞いと似ているが、定量的な解析によりスピンフロップでは説明できないことがわかった。ゼロ磁場下での中性子回折実験より、h±&ouml;k l (&ouml;1/6)の指数で磁気反射を観測したので磁気構造を解析しているが、6倍周期をもつシンプルなヘリカル構造やサイン波的構造では実験結果を説明できない。7Li核の核磁気共鳴(NMR)の実験結果と合わせて解析を進めている。(2) Li3Co2SbO6はTN=110Kで反強磁性転移を起こすことがわかり、LiサイトをNaサイトに全置換したNa3Co2SbO6の反強磁性転移温度TN=7Kと比べて2桁も違うので、その結晶構造や磁気構造を詳しく調べた。その結果、Li3Co2SbO6は2次元的なハニカム構造ではなく、Fddd構造と呼ばれる3次元的な結晶構造を持つことがわかった。磁場配向試料を作成し結晶軸と磁場方向を指定して磁化曲線を詳しく測定した結果、b軸方向が磁化容易軸を持つことが分かった。Li3Co2SbO6のCoは4配位であり、CoO6八面体の連なり方としては2つのcorner-shareと2つのedge-shareで結びついている。中性子回折実験を行い、磁化容易軸の情報や結晶構造の特徴を考慮した上で磁気構造解析を行った結果、磁気構造を決めることができた。本研究は、(i)磁性イオンNi2+およびCo2+スピンがハニカム格子を形成する磁性体A3T2A'O6(A=Li, Na, A'=Sb, Bi)の多結晶試料を合成し、(ii)磁化率・比熱等の温度依存性や磁場依存性の測定を行うとともに、(iii) X線回折実験・中性子回折実験・中性子非弾性散乱実験・核磁気共鳴(NMR)実験による微視的な測定を行い、ハニカム格子の構造上の特徴に起因する特異な磁気構造や磁気ダイナミクスを調べてきた。2016年度はLi3Ni2SbO6とLi3Co2SbO6の物性研究を重点的に行った。これらの試料の多結晶試料を作成し、磁場配向試料による磁化測定、磁化率・比熱測定、粉末中性子回折実験、X線結晶構造解析、7Li核のNMR等の各種の物性測定により、結晶構造の特徴や磁気的振る舞いを理解することが出来た。一方では、Li3Ni2SbO6のゼロ磁場下の磁気構造がいまだに決定できていない。また、Li3Co2SbO6は2次元的なハニカム構造ではなく、Fddd構造と呼ばれる3次元的な結晶構造を持つことがわかったが、Fddd構造をもつ磁性体の磁気的振る舞いの報告はないので、その典型例としてLi3Co2SbO6の磁性研究を展開した。Li3Ni2SbO6のNi2+スピンはTN=13.5Kで反強磁性転移を起こすが、TN以下での磁化曲線にはHc1=6TとHc2=16Tの2つの異常が観測されている。磁場配向試料を用いて磁化測定および7Li核のNMR(核磁気共鳴)により、磁化曲線に現れる異常の正体や磁気構造を調べた。磁化曲線を調べた結果、Hc1=6Tでの異常は、ハニカム面間方向と印加磁場が平行な場合では顕著に異常が出現するが、両者が垂直な場合では異常が現れないことがわかった。
高性能林業機械を使った森林伐採が土壌窒素動態および土壌微生物群集に与える影響評価

林業機械の踏み付けにより、土壌硬度が高くなるとともに土壌微生物の活性にも影響を及ぼす体積含水率が高くなる傾向がみられたが、地曳や枝条の放置などの影響はほとんどないか、小さかった。また土壌窒素動態への影響は地域によって異なった。さらに作業道の影響が見られる場合でも、10年以内でほぼ解消することが示唆された。室内培養により、強度の圧密や潅水処理により脱窒反応が起こっていると考えられる土壌窒素動態を示した。しかし、土壌微生物群集の組成は圧密による顕著な影響はみられなかった。さらに広域的な土壌を対象とした培養実験により、圧密処理に対する応答が土壌によっても大きく異なることが示唆された。本申請課題では、全国の複数の地域を対象に先進的な高性能林業機械を使った伐採法や従来の伐採法など様々な森林伐採方式が、森林生態系における土壌窒素動態や微生物群集構造にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることを目的として行う。具体的には、以下の課題について取り組んでいる。1.高性能林業機械を用いた様々な作業システムが、森林土壌に与える短期的・長期的な影響を土壌物理性・化学性・微生物群集組成などの変化に着目し明らかにする。2.高性能林業機械を用いた伐採による土壌物理性の変化を模した室内および野外培養実験により、土壌物理性・化学性・微生物群集の相互関係を明らかにする。3.地域ごとの高性能林業機械を用いた伐採影響の受け易さを評価するモデルを開発する。平成26年度は、課題1に関連して、伐採後1年2年の短期的な影響について、京都大学フィールド科学教育研究センター北海道研究林周辺の人工林および鹿児島大学高隅演習林の人工林において、伐採後の林分の土壌の物理性を測定するとともに、土壌微生物群集の構造や化学性を明らかにするために、土壌を採取した。化学性については、一部分析を完了したが、その他の項目については解析中である。課題2に関連して、培養実験の方法についての検討を行った。課題3については、北海道研究林近隣の先進林業地の見学を行った他、全国の地域ごとの作業システムについての情報収取を行った。平成27年度は、課題1に関連して、伐採後1年2年の短期的な影響について、鹿児島大学高隅演習林の人工林において、引き続き伐採後の林分の土壌の物理性を測定を行い、化学性については、分析を完了した。課題2に関連して、京都大学北海道研究林のカラマツ林において土壌を採取し、室内培養実験を行い、土壌物理性・化学性・微生物群集組成について解析を進めた。課題3については、全国の地域ごとの作業システムについての情報収取を行った。一部、野外観測が進んでいない調査地はあるが、当初予定していた野外観測、室内実験など順調に進んでおり、化学分析や微生物群集解析も進行中であるため、おおむね順調に進展していると判断する。本申請課題では、全国の複数の地域を対象に先進的な高性能林業機械を使った伐採法や従来の伐採法など様々な森林伐採方式が、森林生態系における土壌窒素動態や微生物群集構造にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることを目的として行った。具体的には、以下の課題について研究を進めた。平成28年度は、課題1に関連して、鹿児島大学高隅演習林の人工林で行った、これまでの成果をとりまとめるとともに、北海道研究林内および周辺の人工林において得られた伐採の短期影響に関するサンプルの解析を進めた。課題2に関連して、平成27年度に京都大学北海道研究林のカラマツ林において土壌を採取し詳細な室内培養実験を行った試料について、土壌物理性・化学性・微生物群集組成の解析を進め、成果の一部について学会発表を行った。また、全国の6カ所の土壌を対象に、圧密を模した室内培養実験を行い、培養前後の土壌化学性の解析を行い、圧密影響の地域性の検討を行った。課題3については、引き続き、全国の地域ごとの作業システムについての情報収取を行い、課題1,2の結果を併せ、圧密処理の影響評価を進めた。

室内培養により、強度の圧密や潅水処理により脱窒反応が起こっていると考えられる土壌窒素動態を示した。しかし、土壌微生物群集の組成は圧密による顕著な影響はみられなかった。さらに広域的な土壌を対象とした培養実験により、圧密処理に対する応答が土壌によっても大きく異なることが示唆された。作業システムの類型化については、全国の林業機械を導入した事業体の情報収取を行った。平成27年度も引き続き、情報収集を進める予定である。伐採前後の土壌調査については、概ね順調に進んだ。DNA解析と化学分析で未分析のサンプルがあるため、早急に進める必要がある。京都大学和歌山研究林での調査は、災害復旧が完了したため、平成27年度に調査を行う予定である。室内培養および野外培養については、方法論の検討を進めた。平成27年度は、室内での圧密実験を行う予定である。また野外培養についても、実験を開始する。最終年度は、これまで野外観測を行っていない京都大学和歌山研究林での観測を行うとともに、室内実験を鹿児島大学高隅演習林、京都大学和歌山研究林の土壌についても、北海道研究林同様の手法で実施する。これまで得られた試料の微生物群集解析を進めるとともに、伐採影響評価を行う手法の開発を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。森林生態学未分析のサンプルを早急に進めるほか、新たな調査地の設定および野外調査を実施する。得られたサンプルについては、随時分析を進める。培養実験については、早急に実施計画を完成させ、平成27年度中に実施する予定である。一部試料の分析に関連した経費が未使用となった。一部、野外調査や化学分析、微生物解析が予定通り進まなかったため、次年度使用額が生じた。前年度の試料の分析を行うための経費に充てる予定である。次年度は、引き続き実験などを進め、翌年度と合わせて物品費、人件費として利用する計画である。
病原真菌カンジダにおける多剤耐性機序の解明とその克服

臓器移植や各種免疫抑制療法など先進医療の発展に伴い、日和見感染症対策は重要な課題となっている。なかでも、侵襲性のカンジダ感染症は発症頻度、死亡率ともに高い。治療薬が限られているなかで、近年、多剤耐性カンジダ(Candida glabrataおよびCandida auris)の増加が重大な脅威となっている。本研究では、アゾール系薬およびキャンディン系薬への耐性を同時に獲得する分子生物学的機序を解明した後、その臨床的関連性を検証する。また、研究代表者らがこれまでに同定した新規抗真菌薬候補化合物のなかで多剤耐性株にも有効な化合物をスクリーニングし、耐性化の克服を目指した基礎研究を実施する。
TET２重感染法(TEDI)を使った大脳皮質ニューロンの軸索側枝解析

本研究課題では、順行性と逆行性のウイルスベクターを組み合わせて特定の投射ニューロンに遺伝子導入するTEDI(TET 2重感染法)の手法の確立、応用のための研究を行い、その成果として、マウスの視床、及び皮質投射ニューロンが、皮質内外で示す特徴的な軸索側枝分岐の様子を可視化し、特徴解析することに成功した。また将来的にマーモセットにおいてTEDIを適用するために、様々なAAV血清型の感染条件の違いを比較解析し、重要な知見を得た。本年度は、細胞内局在シグナルのテスト、cre-loxPシステムとの組合わせ、皮質間結合ニューロンの標識の3つの実験を計画した。このうち、細胞内局在シグナルについては、Syb2コンストラクトを作製し、in vivoにおける局在を今後テストする予定である。cre-loxPシステムについては、creが共存すると、赤色が緑色に変わるコンストラクトを作製し、in vitroでテストしたが、スイッチングがうまく起こらなかったので、今後改善する。皮質間結合ニューロンについては、運動野→対側運動野,運動野→同側感覚野、同側感覚野→運動野の3つのタイプのニューロンの標識に成功した。その結果、対側運動野に投射するニューロンのコラテラルが、同側の感覚野に投射すること、さらには両側の線条体、perirhinal cortexなど幅広い脳領域に投射することを確認できた。興味深いことに、同じニューロンから発する軸索が、対側に向かう場合は白質を通るのに対し、同側に向かう場合は、皮質第6層を通過し、白質は通らなかった。このことは、同側と対側に情報を送るメカニズムが違う可能性を示唆する。サルにおいては、同側投射でも白質を通るので、皮質間結合の役割を考える際には、種差を考慮する必要があるかもしれない。26年度の予定で計画した実験のうち、さまざまな領野の視床投射ニューロンの解析については、運動野の視床投射ニューロンの解析を行った。またマーモセットの線条体投射ニューロン及び皮質間投射ニューロンをTEDIで標識する試みを行ったが、狙った部位での2重感染は起こらなかった。今後、結合部位のマッピングの工夫が必要である。TET2重感染法(TEDI)の利用法の拡張については、TRE-トランスジーン側の改変として以下の拡張を試みた。(1)TETシステムとGCaMP6 (カルシウムセンサー)の組み合わせ。(2)TETシステムとChRの組み合わせ。(3)TETシステムとCREの組み合わせ。(4)さまざまな蛍光タンパク質のテスト。(5)プレシナプス局在シグナルのテスト。(1)については、論文投稿中。(2)(5)については、解析中である。マウスを使った視床、皮質投射ニューロンの形態解析については、バレル野と、運動野の視床投射ニューロンの比較解析、及び、運動野の視床投射ニューロンと皮質間投射ニューロンの比較解析、さらに、運動野の皮質間投射ニューロンのコラテラル解析については、結果をまとめて論文として公表した。マーモセットを使った視床、皮質投射ニューロンの形態解析については、マーモセットに対してウイルスベクター適用するためには、基盤整備が必要だと考え、注入の条件設定や、マッピングの基礎情報の収集を行った。AAVの血清型の最適化の実験に関してはデータをまとめて論文として公表した。前年度までにマウスにおけるTEDI研究を終了し、平成27年度は、霊長類への適用を目指した研究を行った。霊長類は、マウス、ラットに比べ非常に良く発達した前頭皮質を持っている。この領域に対してTEDIが適用できれば、霊長類の前頭皮質ニューロンのネットワーク解明に重要な情報が得られるものと期待できる。これまでにマーモセットに対して行った予備実験では、残念ながら2重感染がうまく成立しなかった。この最大の原因は、投射元と投射先が一致しなかったことだと考えられる。霊長類の前頭皮質は、皮質内外のさまざまな領域に投射する。そこで、まずはマーモセットにおいて、前頭皮質からの正確な投射マップを作製し、その情報に基づいた2点注入の戦略を計画する必要がある。以上の状況を踏まえて、本研究課題では、これまで培ったTETシステムや、ウイルスに関するノウハウを元に、効率的な順行性トレーサーの開発と、注入方法の改善に務めた。その結果、順行性ウイルストレーサーとしてよく使われるSynapsinI-EGFPよりも、強力にニューロン標識ができる、Clover (緑)、tdTomato(赤)、mTFP1.0(シアン)3色の標識システムを得ることができた。注入方法についても条件検討し、約1mm径で皮質カラムの方向に広がる注入方法を確立した。また通常の蛍光タンパクでは、シナプスと神経繊維の区別がつきにくいので、シナプスを効率的に可視化するVamp2-融合タンパクを発現するAAVベクターも作製し、約7倍シナプスに集積する率が高いことを確認した。現時点では、マーモセットにおけるTEDI実験には至っていないものの、複雑な前頭皮質結合ネットワークの一端が見えつつあり、今後の研究展開へつながる重要な知見を得ることができた。

また将来的にマーモセットにおいてTEDIを適用するために、様々なAAV血清型の感染条件の違いを比較解析し、重要な知見を得た。TEDIの基本論文を公表したことにより、ウイルスベクターを使った新しいトレーシング方法の開発という目的は達成することができた。一つのニューロンタイプの軸索コラテラルに注目するという手法は、神経解剖学においては、未開拓な分野である。本研究はこの分野に重要な一石を投じたものと自負している。その一方で、複雑な神経投射を解析する手法としては定量性に欠けており、今後の発展が必要だと改めて思い知らされた。また本手法を霊長類であるマーモセットに適用することは、今の時点でまだ成功していない。そのためには、正確な注入ポイントの同定や、注入方法の改善、ウイルスベクターの改良など、さまざまな基盤整備が必要だと言うことが改めて浮き彫りになった。AAVの比較解析については、今までのデータをまとめて論文として公表したが、最新の知見を踏まえてさらなる展開が必要である。神経生物学TEDIの拡張や、マーモセット脳の特徴解析などをさらに精力的に進めていかないと、マーモセット脳でのTEDIは成功しない。本提案の最終年度においては、マーモセットにおいてウイルスベクターを使った神経トレーシングを効率的におこなうことを第一目標として、さまざまな基盤整備を行う計画である。具体的にはMRIを使った正確な注入方法の検討、ウイルスベクターの改善、マッピングなどをマーモセットを対象に行う。最終的に、マウスのデータと比較できるようなベクター注入が年度内に可能になることを目指す。提案していたTEDIの拡張については、現在行っている実験の解析を進める。また、神経トレーシングの解析について、より定量的な解析の可能性を探る。25年度の3つの計画については、皮質間投射ニューロンの標識に成功し、軸索コラテラルの様子を観察することができたが、細胞内局在シグナルと、cre-loxPについては、まだ着手したのみで、今後の検討が必要である。一方、26年度計画の一部については、予備的実験を進めることができた。採択者の所属が基礎生物学研究所から理化学研究所に変わった。研究室の移転に伴い研究活動に支障が出たため、繰り越して、2015年度の研究に用いることにした。25年度内に成果の出なかった、細胞内局在シグナル、cre-loxPのシステム構築について、26年度でも継続して実験を行う。26年度の計画は、(1)さまざまな皮質領野を起点とする皮質間、及び皮質視床投射ニューロンの解析、(2)オプトジェネティクスツールの発現、(3)マーモセットにおける予備実験の3つである。これらについては、すでに前倒しで予備的検討を開始しており、特に(3)に関しては、結合部位を正確に同定する必要性がはっきりして来た。26年度は、マーモセットの前頭葉に着目し、皮質間結合や、皮質ー線条体結合をマッピングするところから初めて、マーモセットでもTEDIが行えるようにすることを目指す。また並行して、ChRやGCaMPなど、発火制御や、発火モニターができるツールと組み合わせられるウイルス感染条件の確立を目指す。