hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IgG4関連肺疾患の病変形成に関与するTh2サイトカイン阻害の影響

IgG4関連疾患は、血清IgG4高値、病変組織へのIgG4陽性細胞浸潤および線維化を特徴とする新規の全身性疾患である。その病態としてはTh2優位のサイトカイン産生と共に、IL-10、TGF-β等のサイトカイン産生を認めることが判明している。現在このLAT Y136F変異マウスがTh2優位の免疫反応を有するIgG4関連肺疾患と類似の病態を形成することから本疾患のモデル動物であることが判明している。本研究の目的は、Th2サイトカインである、IL-4、IL-5、IL-13をターゲットとし、抗IL-4抗体IL-5抗体、抗IL-13抗体をLATY136F変異マウスに投与することにより、Th1/Th2バランスの病態形成への影響を見ることにより、本疾患の発生機序の解明を行うことを目的として行った。LAT Y136F変異マウスを用いて、肺病変におけるサイトカイン、ケモカインの発現について分子生物学的手法を用いて検討することに関しては前年度までに終了している。次に、LAT Y136F変異マウスに抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-13抗体をそれぞれ単独または組み合わせで投与することにより同様にサイトカイン、ケモカインの発現がどのように変化するかを分子生物学的手法、ならびに病理学的手法を用いて検討するために、マウスに対する抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-13抗体の購入または作成を行った上で研究を行うことが必要であった。さらに既存治療薬とされているステロイドと上記抗体との組み合わせの投与も行い、それらによる治療効果の検討も同様に行う予定であった。研究代表者の所属が福井大学に変更となったが、マウスを金沢大学から福井大学へ移動する手続きを、元々本マウスを使用していた、フランスのMalissen教授の施設においてMTAを取るのに難航している。現在、MTAの書類をフランスに送り受理されたら移動手続きに入れるものと思われる。LAT Y136F変異マウスが福井大学に来た時点で研究再開となるため、遅れてはいるものの、当初の予定通り肺病変におけるサイトカイン、ケモカインの発現について分子生物学的手法を用いて検討する。次に、LAT Y136F変異マウスに抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-13抗体をそれぞれ単独または組み合わせで投与することにより同様にサイトカイン、ケモカインの発現がどのように変化するかを分子生物学的手法、ならびに病理学的手法を用いて検討する。最後に既存治療薬とされているステロイドと上記抗体との組み合わせの投与も行い、それらによる治療効果の検討も同様に行い、より効果を示す新規治療の開発を行う。IgG4関連疾患が多彩な病態を形成する要因は依然として不明であり、また臨床的にもステロイド漸減に伴う再発など治療に難渋する症例が多いため、本疾患の病態解明と治療法の確立は急務である。現在、IgG4関連疾患の病態として何らかの抗原刺激による宿主のTh2反応と、その抗炎症性制御が働いた結果によりIgG4産生と線維化病変が生じる、という仮説を立てている。これまでに我々はLAT Y136F変異マウスがヒトのIgG4関連肺疾患のモデルマウスとなることを確認した。LAT Y136F変異マウスでは、血清IgG1および病変局所でのIgG1陽性細胞浸潤を認める。また、少なくとも4週齢より病変が形成され、経時的にAchcroft scoreが増加することを確認した。また気管支肺胞洗浄液のIL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、Eotaxin、Rantesのmultiplex cytokine assayによる評価、ならびにTGF-β1のELISAによる評価ではLAT Y136F変異マウスにおいてTh2サイトカインが有意に増加しており、Th1サイトカインは有意に減少し、さらに線維化のサイトカインであるTGF-β1が有意に増加していることを確認した。今回、LAT Y136F変異マウスを用いて、再度4週、6週、10週、20週の肺を用いてIgG1ならびにIgGの免疫染色を試み、各組織のIgG1/IgG比の算出を行なった。また、今後の測定用に検体の保存を行なった。LAT Y136F変異マウスの繁殖が遅れており、目的の4週、6週、10週、20週のマウスの検体を集めるのに非常に時間を要したことが原因である。さらに、IgG1、IgG4の免疫染色に関してよりよい染色を行うように検討をしており、予定外に時間がかかってしまったために薬剤の投与が遅れている。ただし、手技に関しては安定したので、今後は薬剤投与を踏まえて測定を行なっていく予定である。これまでに、IgG4関連疾患の病態として何らかの抗原刺激による宿主のTh2反応と、その抗炎症性制御が働いた結果によりIgG4産生と線維化病変が生じる、という仮説を立てている。LAT Y136F変異マウスでは血清IgG1および病変局所でのIgG1陽性細胞を認める。また少なくとも4週齢より病変が形成され、経時的にAchcroft scoreが増加することを確認した。

また気管支肺胞洗浄液のIL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、Eotaxin、Rantesのmultiplex cytokine assayによる評価、ならびにTGF-β1のELISAによる評価ではLAT Y136F変異マウスにおいてTh2サイトカインが有意に増加しており、Th1サイトカインは有意に減少し、さらに線維化のサイトカインであるTGF-β1が有意に増加していることを確認した。さらにLATY136F変異マウスの4、6、10、20週の肺を用いてIgG1ならびにIgGの免疫染色を試み、各組織のIgG1/IgG比の算出をおこなった。また、今回は投与する抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-13抗体の薬剤の選定を行ったが、マウスに投与できる抗体の入手困難であり、自分で作成することも念頭においているが薬剤の選定に難航している。さらに所属の変更に伴い、マウスの新所属先への移動にも時間を要している。投与する抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-13抗体の薬剤の選定を行ったが、マウスに投与できる抗体の入手困難であり、自分で作成することも念頭においているが薬剤の選定に難航している。さらに平成29年度に所属研究機関が変更になり、マウスの現所属先への移動にも時間を要している。IgG4関連疾患は、血清IgG4高値、病変組織へのIgG4陽性細胞浸潤および線維化を特徴とする新規の全身性疾患である。その病態としてはTh2優位のサイトカイン産生と共に、IL-10、TGF-β等のサイトカイン産生を認めることが判明している。現在このLAT Y136F変異マウスがTh2優位の免疫反応を有するIgG4関連肺疾患と類似の病態を形成することから本疾患のモデル動物であることが判明している。本研究の目的は、Th2サイトカインである、IL-4、IL-5、IL-13をターゲットとし、抗IL-4抗体IL-5抗体、抗IL-13抗体をLATY136F変異マウスに投与することにより、Th1/Th2バランスの病態形成への影響を見ることにより、本疾患の発生機序の解明を行うことを目的として行った。LAT Y136F変異マウスを用いて、肺病変におけるサイトカイン、ケモカインの発現について分子生物学的手法を用いて検討することに関しては前年度までに終了している。次に、LAT Y136F変異マウスに抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-13抗体をそれぞれ単独または組み合わせで投与することにより同様にサイトカイン、ケモカインの発現がどのように変化するかを分子生物学的手法、ならびに病理学的手法を用いて検討するために、マウスに対する抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-13抗体の購入または作成を行った上で研究を行うことが必要であった。さらに既存治療薬とされているステロイドと上記抗体との組み合わせの投与も行い、それらによる治療効果の検討も同様に行う予定であった。研究代表者の所属が福井大学に変更となったが、マウスを金沢大学から福井大学へ移動する手続きを、元々本マウスを使用していた、フランスのMalissen教授の施設においてMTAを取るのに難航している。現在、MTAの書類をフランスに送り受理されたら移動手続きに入れるものと思われる。LAT Y136F変異マウスを用いて、肺病変におけるサイトカイン、ケモカインの発現について分子生物学的手法を用いて検討する。
培養胚性未分化細胞を用いる内在遺伝子機能欠損マウスの作成

マウス4日胚より培養される未分化細胞(ES細胞)を用いる変異マウス作成法は、受精卵へのDNA注入によるトランスジェニックマウス作成法に比し、相同的組換えによる内在遺伝子不活化等に多くの利点がある。しかしES細胞由来の子孫マウズが得られる頻度の著しく低いことがこの系の最大の課題で、我々の検討によればこれは染色体構成の不安定さによると考えられた。そこでLIFの添加、16日胚由来細胞をフィ-ダ-細胞として用いることなどが、ES細胞の安定な培養に効果があるか否かをまず検討し、長期間これらの条件下でES細胞を二倍体に維持できることを確認した。またB6マウス由来の4日胚を宿主胚としてこの様に培養されたES細胞は効率良くキメラマウスを形成し、更には高頻度で子孫マウスを生じることを確認した。子孫マウスが高頻度で得られるようになったので、次にこのような培養条件を用いて相同的組換えによるfyn遺伝子への変異の導入を試みた。マウスc-fyn遺伝子の第2及び第3エクソンを含むゲノミックDNAを単離し、第2エクソンに発現調節単位を欠くNeo(ポリAシグナル付き)遺伝子を、また3'末端にポリAシグナルを欠くジフテリア毒素遺伝子(発現調節単位付き)をネガティブ選別用に付加したDNAを,エレクトロポレ-ション法によりES細胞に導入、G418耐性コロニ-についてザン法により相同的組換え体を同定した。現在これらのES細胞についてキメラマウス作成を検討している。
DNAメチル化によって発現制御され胃がんの発生・進展に寄与する遺伝子の単離

DNAメチル化によって発現が制御されヒトがんの生物学的特性の決定に寄与する遺伝子の単離を試みるため、DNAメチル化阻害剤である5-azacytidine処理により増殖が抑制された培養胃がん細胞株においてdifferential display法を施行した。5-azacytidine処理によりWip1,TROP2,B4-2,BRCA-2 region transcription unit CG005,cofilin,ROCK,CD44ならびにinterferon-inducible protein 6-16 mRNA発現の経時的な変化を認め、5-azacytidine処理によって発現の変化する未知遺伝子も単離し得た。これらの遺伝子のmRNA発現を臨床手術材料においても検討したところ、非がん粘膜に比し胃がんにおいてWip1,B4-2ならびにcofilinの、非がん粘膜に比し大腸がんにおいてWip1,B4-2,BRCA-2 region transcription unit CG005,cofilinならびにROCKの、非がん肝組織に比し肝細胞がんにおいてTROP2,B4-2ならびにBRCA-2 region transcription unit CG005のmRNA発現の有意な低下を認め、大腸がんにおいてTROP2発現は有意に亢進していた。Wip1ならびにBRCA-2 region transcription unit CG005の発現低下は肝細胞がんの分化度と有意に相関し、門脈侵襲を伴う肝細胞がんにおいて特に発現が低下していた。TROP2発現は正常肝組織に比し前がん状態にある慢性傷害肝において有意に亢進し、肝細胞がんの悪性進展に伴って逆に低下していた。B4-2の発現は特にB型肝炎ウイルス感染に伴って低下していた。これらの知見は、DNAメチル化がこれらのがん関連遺伝子の発現を直接または間接に制御してヒトの多段階発がんに寄与する可能性を示している。ヒトがんにおけるDNAメチル化異常は、遺伝子発現異常や染色体構造変化を惹起することが知られている。メチル化亢進によって不活化されると予測されるがん抑制遺伝子HIC-1(hypermethylated in cancer)は、D17S5 locusに位置する。本研究では胃がん発生におけるDNAメチル化異常の意義の解明を試みた。胃がん症例手術材料凍結標本より病理組織学的検討の後にDNAを抽出し、メチル化の影響を受ける制限酵素Not Iによるサザン法を行い、非胃がん症例と比較してCpGメチル化の状態を評価した。同1ocusにおけるヘテロ接合性喪失(LOH)も併せて検討した。非胃がん症例の組織学的に著変のない胃粘膜には、D17S5 locusにおけるメチル化亢進を認めなかった。胃がん症例においては、組織学的に著変のない胃粘膜(15%)、慢性胃炎を呈する胃粘膜(13%)、腸上皮化生巣(25%)にメチル化亢進を認めた。非胃がん症例においても、腸上皮化生巣にはメチル化亢進がみられた。胃がんの45%にメチル化亢進がみられたが、高分化・中分化・低分化腺がんにおける亢進の頻度はそれぞれ0・25・56%であった。がん部においてメチル化亢進が認められなかった症例・認められた症例のそれぞれ21%・47%において、同locusのLOHがみられた。D17S5 locusのDNAメチル化亢進は腸上皮化生を含む前がん状態において既に検出され、LOHの誘因のひとつとなりあるいはHIC-1遺伝子発現低下などを介して、胃がんの発生に寄与する可能性があると考えられた。胃がん発生におけるDNAメチル化の寄与の可能性が示されたので、現在、脱メチル化剤処理した胃がん細胞を用いたdifferential display法により、胃がんの発生・進展に寄与する遺伝子の単離の試みを継続している。
高温超伝導体におけるアンダーソン局在

高温超伝導体が発見されて以来、我々は良質な単結晶と強磁場のドッキングという方向より高温超伝導を調べてきた。高温超伝導体はT_cが高く、その上部臨界磁場H_<c2>も非常に高い。我々は高温超伝導体の良質な単結晶を用いて強磁場を用いて超伝導を壊して常伝導状態を調べている。その中で、電子系高温超伝導体Nd_<1-x>Ce_XCuO_yの強磁場磁気抗抵の測定を行い、強磁場によって超伝導が壊されることにより現われた常伝導状態での抗抵値が低温になるほど大きくなることを見つけ、常伝導状態の電気抗抵は約420Kの温度範囲でlnTの温度依存性を示す事がわかった。近藤効果を起こしていると考えると、Tkは510Kとなり、20Tの磁場では近藤効果を壊れていることになりおかしく、強磁場中でも観測されている2次元弱局在による電気伝導のlnT依存性であると考えられる。データ解析により、2次元伝導の幅もc軸方向の格子定数の半分になり自然に理解出来る。したがって、超伝導を起こすサンプルにおいて、その電気抗抵は2次元的であると結論づけられる。次にNd_<2-X>Ce_XCuO_4以外の高温超伝導体でも、2次元系での弱局在領域の電気伝導のlnT依存性があるのかどうかが焦点となる。しかし、我々が以前に測ってサンプルは残留抗抵が小さすぎてlnTが観測出来ない。そこで残留抗抵のコントロールについて検討し可能性を探った。その結果、酸素濃度をコントロールすることでサンプルの超伝導状態を壊することなく、残留抵抗をある程度コントロールすることに成功した。このサンプルを用いて、現在強磁場中での磁気抵抗の測定を行っているところであり、来年度にはその結果を報告する予定である。
植物アルファ様プラス鎖RNAウイルスの膜結合前複製複合体前駆体の解析

植物プラス鎖RNAウイルスであるタバコモザイクウイルス(TMV)は、ゲノム上に130Kおよびそのリードスルー産物である180K複製タンパク質をコードする。130K,180Kタンパク質は翻訳と共役してゲノムRNAと結合し、pre-membrane-targeting complex(PMTC)と呼ばれる複合体を形成し、さらにこれが生体膜に結合して複製複合体を形成する。複製複合体が生体膜上に形成されることは、動植物を宿主とするプラス鎖RNAウイルスに共通した事象であるが、その形成過程は不明のままである。そこで本研究では、TMVのPMTCに着目して複製複合体形成機構を解析した。本年度は、生体膜を除去した脱液胞化タバコプロトプラスト抽出液でTMV RNAを翻訳したあとゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、PMTCを精製する方法を確立し、PMTCの性状を調べた。その結果、PMTCに含まれるTMV RNAは翻訳を受けない状態にあること、そして、複製タンパク質は,ヌクレアーゼでRNAを分解してもなお、ネイティブPAGE上で1MDa以上の大きさを示す複合体を形成していることが明らかになった。また、PMTCには特異的な宿主因子が含まれることを期待して探索を行ったが、精製PMTC画分に含まれる宿主タンパク質のパターンに、翻訳反応(複製タンパク質の合成)を行わなかった対照サンプルと差がなく、宿主因子の発見には至らなかった。植物プラス鎖RNAウイルスであるトマトモザイクウイルス(ToMV)は、130Kおよびそのリードスルー産物である180K複製タンパク質をコードする。ToMV130Kタンパク質は翻訳と共役してゲノムRNAと結合し、core pre-membrane-targeting complex(core PMTC)と呼ばれる複合体を形成し、さらにこれに180Kタンパク質が結合してから、生体膜に結合して複製複合体を形成すると考えられている。以前の研究でcore PMTCを精製し、共精製される宿主タンパク質を同定したが、これらはウイルス増殖には直接は関係のないタンパク質であると考えられた。このような結果となった原因としては、重要な宿主因子と複製タンパク質との結合が弱く、精製の過程で大部分が脱落してしまった前能性、ToMV RNA結合性タンパク質の量が多く、複製タンパク質に結合した重要な宿主因子が埋もれてしまった可能性等が考えられた。これらの問題点を克服するために、複製タンパク質にタグを付したToMV RNA誘導体を、超遠心で生体膜を除去した脱液胞化プロトプラスト抽出液中で翻訳してcore PMTCあるいはPMTCを形成させたあと、再切断可能なクロスリンカーDTSSPで複合体を架橋してからRNAと解離させた上でタグを用いて複製タンパク質を精製することを計画した。予備実験を進めるうちに、複製タンパク質が二量体を形成していること、core PMTCを構成する複製タンパク質のC末端に付したアフィニティー精製用タグはDTSSPで架橋すると抗体で認識されなくなる(遊離の複製タンパク質はDTSSP処理してもタグ精製が可能であるにもかかわらず)ことを示唆する実験結果を得た。
第3世代多機能型チオウレア触媒の開発と不斉触媒反応への応用

1、海洋天然物ナカドマリンAの全合成アミノチオウレア触媒を用いたα,β-不飽和イミドへのマロノニトリルの不斉マイケル反応をナカドマリンA合成において必要な3-フリル基を持った基質に適用した。しかし、その際十分な反応性で反応が進行しなかったため改めて本反応の基質検討を行ったところ、2-位にフッ素置換基を有するベンズアミドから得られる基質を用いた場合本反応が良好に進行することを新たに見出だした。また同時に若干ではあるがエナンチオ選択性の向上がみられ95%eeとこれまでで最も高い立体選択性で望みのマイケル付加体を得ることができた。その後、ここで得られた光学活性マイケル付加体を利用してナカドマリンAの中心骨格の一つであるピペリジン構造への誘導化を検討した。種々の検討の結果、同じマイケル付加体から3種類の合成ルートを経由して、酸化度の異なる3種類のピペリジン誘導体へと導くことに成功した。2、新規不斉チオウレア触媒の開発γ-ヒドロキシエノンに対する有機ホウ酸求核種の不斉付加反応を用いて新規なチオウレア触媒の開発を試みた。分子内に水酸基を有する様々なチオウレア触媒を検討したところ、芳香族水酸基を有するチオウレア触媒が反応を良好に触媒することが分かった。検討の結果、trans-シクロヘキサンジアミンとサリチルアルデヒドから導かれたイミノフェノール構造を持ったチオウレア触媒を新たに開発し、本触媒を用いることで最高99%収率、95%eeと満足のいく値で本反応が進行することを見出した。また、本反応で得られた光学活性マイケル付加体の分子内の水酸基を利用することでシクロプロパン化合物やビシクロ[3,1,0]骨格を有する化合物へと導くことにも成功した。以上の結果は、環境に配慮した新しい有機合成プロセスの開発において重要な知見を与えたものと思われる。
網膜色素変性の病態を反映するバイオマーカーの探索

実験テーマ1「プロテオミクスを用いた網膜色素変性(RP)患者の硝子体内に存在するバイオマーカーの探索」については、黄斑上膜を合併したRP患者6例と特発性網膜上膜患者3例を対象として、手術時に採取した硝子体の解析を実施し、ターゲット・タンパク群として14個のタンパク・スポットを選定できた。その後の解析により、RPの病期の進行に伴い濃度が上昇するタンパク、ならびに濃度が低下するタンパクをそれぞれ複数個同定できたので、2017年度の臨床眼科学会で「網膜色素変性患者の硝子体タンパクのプロテオミクス解析」という演題名で成果を報告した。研究期間を延長して更なる患者サンプルの解析を実施し、新たに複数のターゲット・タンパクを同定できた。現在、最終的な解析を実施中である。実験テーマ2「プロテオミクスを用いたRP疾患モデル動物の網膜内に存在するバイオマーカーの探索」については、研究期間中に十分な動物実験ができず、特記する成果が得られなかった。実験テーマ3「RP患者の前房水中に存在するバイオマーカーの探索と視機能の相関」については、抗酸化酵素であるSOD3の活性がコントロール患者に比較して、RP患者の前房水中で有意に低下していることが明らかとなったが、RP患者における視機能との有意な関連が認められなかった。研究期間を延長してサンプルを追加収集したが、最終的に有意な関連までは確認できなかった。現在、血清中の抗酸化酵素と視機能の関連も追加で検証中であり、視機能と有意な関連を示すバイオマーカーの候補が同定できている。本年度は、実験テーマ1「プロテオミクスを用いたRP患者の硝子体内に存在するバイオマーカーの探索」と実験テーマ3「RP患者の前房水中に存在するバイオマーカーの探索と視機能の相関」について主に研究を実施した。テーマ1については、黄斑上膜を合併したRP患者6例と特発性網膜上膜患者3例を対象として、手術時に採取した硝子体の解析を実施した。2次元電気泳動後のSDS-PAGEゲル上のタンパク・スポットを銀染色で可視化し、ゲル分析ソフトウェア(PD-Quest)で解析した。各サンプル間で発現変動の認められるスポットをゲルから抽出し、液相クロマトグラフィー連結型質量分析(LC-MSMS)を用いて、そのタンパク名を同定した。ターゲット・タンパク群として14個のタンパク・スポットを選定できている。現在更なる解析を実施中で、2017年度の臨床眼科学会で成果を報告する予定となっている。テーマ3については、酸化ストレスに関連するある因子の活性がコントロール患者に比較して、RP患者の前房水中で有意に低下していることが明らかとなった。現在更なる解析を実施中である。テーマ1と3については順調に進んでおり、これまで報告されていない新たな知見が得られている。本年度は、実験テーマ1「プロテオミクスを用いたRP患者の硝子体内に存在するバイオマーカーの探索」と実験テーマ3「RP患者の前房水中に存在するバイオマーカーの探索と視機能の相関」について、昨年度に引き続いて研究を実施した。テーマ1については、黄斑上膜を合併したRP患者6例と特発性網膜上膜患者3例を対象として、手術時に採取した硝子体の解析を実施し、ターゲット・タンパク群として14個のタンパク・スポットを選定できた。更なる解析により、RPの病期の進行に伴い濃度が上昇するタンパク、ならびに濃度が低下するタンパクをそれぞれ複数個同定できたので、本年度の臨床眼科学会で「網膜色素変性患者の硝子体タンパクのプロテオミクス解析」という演題名で成果を報告した。更なる患者サンプルの解析が必要と判断されたため、他施設からサンプル提供を受けられる体制を整備した。既に複数の追加サンプルが入手できており、研究期間を延長して解析を進めることとした。テーマ3については、抗酸化酵素であるSOD3の活性がコントロール患者に比較して、RP患者の前房水中で有意に低下していることが明らかとなったが、RP患者における視機能との有意な関連が認められなかった。その原因として、前房水のサンプル数が十分でないと判断されたため、研究期間を延長してサンプルを追加で収集することとした。また、テーマ2については、動物実験を実施するスペースの確保できたが、テーマ1での研究を優先するため、本年度は実施しなかった。テーマ1と3について、RP患者から手術の際に採取する眼内液(前房水、硝子体液)のため、サンプル数に限りがあり、当初予定していたサンプル数の確保が十分でないため、進捗は遅れている。しかしながら、今後に期待できる成果は確実に得られており、研究そのものは確実に前進している。実験テーマ3

「RP患者の前房水中に存在するバイオマーカーの探索と視機能の相関」については、抗酸化酵素であるSOD3の活性がコントロール患者に比較して、RP患者の前房水中で有意に低下していることが明らかとなったが、RP患者における視機能との有意な関連が認められなかった。研究期間を延長してサンプルを追加収集したが、最終的に有意な関連までは確認できなかった。現在、血清中の抗酸化酵素と視機能の関連も追加で検証中であり、視機能と有意な関連を示すバイオマーカーの候補が同定できている。テーマ1と3については順調に進んでいるが、更なる検討を追加する予定である。また、平成29年度は、テーマ2の疾患モデル動物を用いた検討についても並行して実験を進めていく。研究期間を延長すること、他施設から患者サンプルを入手する体制を整えることにより、サンプル確保に努める。テーマ1と3については、更なる検討を追加する予定である。一方、テーマ2の疾患モデル動物を用いた検討については、動物実験を実施するスペースの確保できたが、テーマ1、3での研究を優先するため一旦保留とすることとした。当初の計画では、平成28年度前半より疾患モデル動物を用いた実験(実験テーマ2)を開始する予定であったが、動物実験を実施するスペースの確保が十分でなく、年度末の実験スタートとなった。そのため、動物実験で使用する予定の研究費が一部未使用となり、平成29年度に持ち越した。(理由)当初の計画では、平成28年度前半より疾患モデル動物を用いた実験(実験テーマ2)を開始する予定であったが、動物実験を実施するスペースの確保が十分でなく、平成28年度末の実験スタートとなった。さらに、テーマ1ならびに3の研究を優先するため、テーマ2の実験を一旦保留としたため、使用予定であった研究費を来年度まで繰り越した。(使用計画)来年度(平成30年度)まで研究期間を延長し、繰り越した研究費はテーマ1ならびに3における患者サンプルの解析に使用する。各テーマについて、当初の実験計画通りに進めていく。
非可逆圧縮ガスモデルによる数値ペネトレータ学の構築

ペネトレータは高速で地表に衝突貫入し、地下の内部構造を知る槍型プローブであり、月・惑星・小天体や、地球上の到達困難な危険地帯の探査において活躍が期待される。本研究では、地中を進むペネトレータ周りの砂の流れを、一旦圧縮されると元に戻らない流体としてモデル化し、シミュレーションする手法を開発する。実験との比較で結果の妥当性を実証し、数値ペネトレータ学として月惑星探査工学や地球惑星科学の分野に提供する。
原子スケールで平坦なシリコン表面上のAlの初期成長過程のX線光電子分光法による解明

本研究の目的は、原子レベルで平坦な水素終端シリコン表面上の金属の初期成長過程を明らかにし、これにより将来の極微細寸法を有するデバイス作製技術の基礎を築くことにある。デバイス作製上重要なことのひとつが配線のコンタクト抵抗を小さくすることでる。そのための方法の一つとして、Al/シリサイド/Si構造がある。そこで、本研究では、まず水素終端Si面のシリサイド形成過程を調べた。40%弗化アンモニウム溶液処理で作製した原子スケールで平坦な水素終端Si(111)面上に基板温度300°Cでコバルトを約2分子層蒸着し、アニール温度400°C、500°C、600°Cにおけるシリサイド形成過程をX線光電子分光法(スエ-デン製ESCA300)を用いて検討した。その結果、次に知見が得られた。1)300°C、400°C、500°C、600°Cとアニール温度が高くなると、シリサイドからの信号のほかに酸化したシリコンからの信号が増加する。また、600°Cアニール後の試料を角度分解X線光電子分光法で測定した結果は、酸化したシリコンがシリサイドの表面付近に存在することを示している。このことから、600°Cにおいて基板のシリコンがコバルトシリサイド層を通り表面へ拡散していることが導かれる。また、シリコンの分子線エピタキシ-装置の設計と製作を行った。今後、高品質なAl/シリサイド/Si構造の作製のために、この装置を用いて清浄なシリコン表面を作製し、シリサイド形成過程における極微細構造の変化、Alの吸着サイト・物理吸着サイトと金属薄膜の成長に伴う極微細構造の変化を検討する予定である。
肺癌に関わるｍｉＲＮＡクラスターの標的遺伝子群の同定と肺癌発症機構の解析

悪性の肺癌細胞で高発現しているmiR-17-92クラスターは、癌悪性化の原因解明の鍵となると考えられているが、その標的遺伝子についてはあまり報告されていない。我々は、そのクラスターの中でもmiR-19aに焦点を当て、miRNAの標的遺伝子予測ソフトを使用して標的遺伝子候補を抽出し、ルシフェラーゼアッセイ、pull-downアッセイ、ウエスタンブロット法によって標的遺伝子としての可能性を評価した。その結果、4つの遺伝子をmiR-19aの標的遺伝子として同定することができた。さらに、これらの遺伝子は肺癌細胞の生存率、コロニー形成能、遊走能、浸潤能を抑制することを確認した。肺癌では、microRNA(miRNA)のクラスターmiR-17-92の過剰発現が発癌に関わることが報告されているが、その標的遺伝子群に対する相互作用はほとんど解明されていない。申請者らは、これまでmiRNAの標的遺伝子の新規同定技術の開発を行っており、このmiRNAの標的遺伝子の同定技術を用いて、肺癌に関わるmiRNAの標的遺伝子群の同定を進めている。miRNAの標的遺伝子mRNAを回収するIVPD法の最適条件を検討し、miR-19aに対する標的候補遺伝子mRNAを回収した。回収されたRNAよりcDNAを作成し、PCRにより標的候補遺伝子を選出し増幅した。miR-19aが細胞内で確かに標的遺伝子を制御していることを明らかにするために当該標的候補遺伝子のmiR-19a結合配列を持つLuciferaseレポータープラスミドを作成しLuciferaseアッセイを行い、miR-19aにより発現抑制を受ける遺伝子を絞り込んだ。さらに、miR-17-92クラスターが高発現している肺がん細胞株にanti-miRNA Locked Nucleic Acid(LNA)を導入してmiR-19aをノックダウンさせて蛋白発現解析を行ない、コントロールLNA導入細胞に比して蛋白量が上昇するものを標的遺伝子として絞り込んだ。選出された標的遺伝子を細胞内で高発現させるためのcDNA発現ベクターを作成した。肺癌ではmicroRNA(miRNA)のクラスターmiR-17-92の過剰発現が発癌に関わることが報告されているが、それと高い相同性を持つクラスターmiR-106a-363、miR-106b-25との相互調節機構、特に、その標的遺伝子群に対する相互作用はほとんど解明されていない。申請者らは、これまでmiRNAの標的遺伝子の新規同定技術の開発を行っており、このmiRNAの標的遺伝子の同定技術を用いて、肺癌に関わるmiR-17-92の標的遺伝子群の同定を進めている。miR-17-92クラスターが高発現している肺癌細胞株にmiR-19a、20a、92-1に対するanti-miRNA Locked Nucleic Acid (LNA)をそれぞれ導入した後に、2次元電気泳動と質量分析型を用いて、コントロールに比し発現上昇を示す蛋白の検出を行った。これらの蛋白をコードするmRNAの3'非翻訳領域に、対応するmiRNAのシード領域を持つ遺伝子を見いだした。一方、HEK293細胞から細胞抽出液を作成し、ビオチン修飾miR-19aと結合反応させ、miRNA-mRNA複合体をアビジンビーズで回収後、cDNAを作成した。miRNA標的遺伝子検索プログラムソフトで選択される遺伝子群のうち癌化に関わる遺伝子に絞りPCR用のプライマーを作成した。このプライマーで上記のcDNAを増幅することで、miR-19aに結合していたmRNAを見いだした。得られた遺伝子のmiRNA結合配列を挿入したルシフェラーゼプラスミドを作成した。anti-miR-19a (LNA)の存在下、非存在下でルシフェラーゼアッセイを行うことにより細胞内でmiRNAが作用するmiRNA結合配列を同定した。また、申請者らは、miRNAの標的遺伝子mRNAを回収する技術を開発したが、その最適条件を決定するために条件検討を進めている。肺癌細胞13株を用いて、miR-19aの発現量を検討した。その中で、最もmiR-19a高発現肺癌細胞と低発現肺癌細胞株を選んで、miR-19a mimic RNAおよびアンチセンスmiR-19a LNA(Locked Nucleic Acid)を導入し、確かにmiR-19aが細胞増殖の促進に関わる事、miR-19a量の変動に伴い新規標的遺伝子の蛋白質が変動する事を確認した。昨年度までに絞り込んだmiR-19aの新規標的遺伝子4種のcDNA発現ベクターを作成し、miR-19a高発現肺癌細胞と低発現肺癌細胞株にTransient Transfectionにより遺伝子導入を行った。そのTransientな遺伝子導入細胞を用いて、細胞増殖能、コロニー形成能に及ぼすmiR-19aの標的遺伝子の効果・影響を検討した。その結果、新規標的遺伝子の導入はコロニー形成を抑制する事が明らかになった。しかし、細胞の遺伝子導入効率が非常に悪くTransient Transfection系では評価が難しいので、G418選択することにより、安定したcDNA発現ベクター導入株を単離し、遺伝子導入株を確立した。

前年度までに我々の解析で明らかになったmiR-19aの新規標的遺伝子4種(FOXP1, TP53INP1, TNFAIP3, TUSC2)について、cDNA発現ベクターを作成し、miR-19a高発現肺癌細胞と低発現肺癌細胞株に遺伝子導入し安定発現株を作製した。樹立したそれぞれの株を用いて、増殖能、遊走能、浸潤能について確認したところ、4遺伝子とも肺癌細胞の増殖、遊走の抑制を示した。浸潤については、TNFAIP3, TUSC2は浸潤抑制能を示したが、FOXP1, TP53INP1は細胞により異なる結果を示した。以上の結果をまとめると、我々が同定したmiR-19aの新規標的遺伝子であるFOXP1、TP53INP1、TNFAIP3、TUSC2は、癌細胞において遺伝子ごとに浸潤抑制能に違いはあるものの、4遺伝子とも増殖抑制能と遊走抑制能を示した。よって、miR-19aが異常な高発現をすることにより、FOXP1、TP53INP1、TNFAIP3、TUSC2の蛋白発現が抑制され、癌の悪性化が進行すると考えられた。本研究のデータに関しては、論文作成と投稿を行ない、PLOS ONEに出版された。悪性の肺癌細胞で高発現しているmiR-17-92クラスターは、癌悪性化の原因解明の鍵となると考えられているが、その標的遺伝子についてはあまり報告されていない。我々は、そのクラスターの中でもmiR-19aに焦点を当て、miRNAの標的遺伝子予測ソフトを使用して標的遺伝子候補を抽出し、ルシフェラーゼアッセイ、pull-downアッセイ、ウエスタンブロット法によって標的遺伝子としての可能性を評価した。その結果、4つの遺伝子をmiR-19aの標的遺伝子として同定することができた。さらに、これらの遺伝子は肺癌細胞の生存率、コロニー形成能、遊走能、浸潤能を抑制することを確認した。新規に見出したmiR-19aの標的遺伝子のcDNAをTransientに細胞に導入し細胞のコロニー形成能を検討したところ、標的候補遺伝子を導入すると癌細胞のコロニー形成が阻害される事が確認されたが、遺伝子導入効率が悪かった。そこでG418選択することにより安定したcDNA発現ベクター導入株を単離し解析することにしたが、確実に遺伝子が入った細胞を樹立するのに時間がかかり、細胞株を用いた解析が遅れてしまった。分子腫瘍学樹立したmiR-19a標的遺伝子cDNA発現ベクター導入肺癌細胞株を用いて、細胞増殖能やコロニー形成能、遊走能、浸潤能に及ぼす標的遺伝子4種の効果を解析し、論文作成と投稿を行なう。ある種のmiRNAは癌の発症に関わっていることはわかっているが、そのmiRNAがどのmRNAに結合して作用しているか標的遺伝子に関する報告は少ない。miRNAの標的遺伝子の探索研究が進まない理由は、miRNAとmRNAの結合様式が100%マッチで結合するのではなく、miRNA結合配列の中でもシード領域(完全にマッチする約8塩基)を中心として数塩基のミスマッチを含む形で結合するため、真の標的遺伝子が見いだせないからである。本研究では、その標的遺伝子を実験系で同定しようとするものである。
Si-H結合活性化を経る高反応性ケイ素化学種を配位子とする金属錯体の合成と反応性

1.シリレン錯体の合成、構造と反応性に関する研究ジヒドロシランおよびトリヒドロシラン類のSi-H結合活性化によって、様々な塩基で安定化されたヒドリド(シリレン)タングステン錯体を合成し、以下の研究を行った。(1)cis-Cp^*(CO)_2(H)W=SiHPh・Py(Cp^*=η^5-C_5Me_5)とフェニルシランの反応において、シリル(シリレン)錯体trans-Cp^*(CO)_2(PhH_2Si)W=SiHPh・Pyが生成することを見出し、その反応機構を解明した。(2)cis-Cp^*(CO)_2(H)W=SiPhR・L(R=Ph,H;L=Py,THF)とアニオン性求核剤の反応を検討し、アニオン性ヒドリド(シリル)錯体M^+[Cp^*(CO)_2(H)WSiPhRR']^-を得た。さらに、そのプロトン化によって種々のジヒドリド(シリル)錯体Cp^*(CO)_2(H)_2WSiPhRR'を合成し、これらの錯体の結晶構造と溶液中での異性化および動的過程を明らかにした。(3)ヒドリド(ジクロロシリレン)錯体cis-Cp^*(CO)_2(H)W=SiCl_2・Pyを合成し、ケイ素とヒドリド配位子の間に配位子間超原子価相互作用が存在することを見出した。2.η^3-シラアリルおよびη^3-シラプロパルギル錯体の合成と反応性に関する研究アルケニルヒドロシランのSi-H結合活性化によって、新規η^3-シラアリル錯体Cp^*(CO)_2W(η^3-Me_2SiCR^1CR^2R^3)(R^1-R^3=H,Me)を合成し、求核剤との反応を中心に研究した。メタノールとの反応では(メトキシシリルアルケン)ヒドリド錯体Cp^*(CO)_2(H)W(η^2-MeOMe_2SiCR^1=CR^2R^3)が生成し、その挿入および異性化過程の詳細を明らかにした。η^3-シラプロパルギル錯体の合成を目的として検討したアルキニルヒドロシランのSi-H結合活性化反応において、アルキニル基がタングステンとケイ素に架橋配位した特異な構造を有する錯体Cp^*(CO)_2W(μ-η^1:η^2-C≡C^/Bu)(SiPh_2)を単離し、極性試剤に対する興味深い反応性を明らかにした。(1)シリレン錯体の合成、構造と反応性に関する研究塩基安定化型シリレン

錯体cis-Cp^*(CO)_2HW=SiHPh・Py(Py=ピリジン)はPhsiH_3と反応して、trans-Cp^*(CO)_2(PhH_2Si)W=SiHPh・Pyを生成する。この反応は、シリレン錯体とヒドロシランの反応でシリル(シリレン)錯体が生成した初めての例であり、反応機構の解明は、シリレン錯体の反応性を理解する上で極めて重要である。反応の鍵中間体と推定されるヒドリドビス(シリル)錯体Cp^*(CO)_2HW(SiH_2Ph)_2(1)の合成単離に成功し、その反応性について詳細に研究した。ヒドリド配位子の重水素ラベル実験、温度可変低温NMRによる反応追跡、観測された中間体の別途合成による同定等によって、上記反応が錯体1を経る機構で進行することを立証した。また、ジハロシリレン錯体の初めての例であるcis-Cp^*(CO)_2HW=SiCl_2・Pyを合成し、そのX線結晶構造解析によって、ケイ素とヒドリド配位子の間に、最近興味を集めている配位子間超原子価相互作用が存在することを明らかにした。(2)η^3-シラアリル錯体およびη^3-シラプロパルギル錯体の合成と反応性に関する研究η^3-シラアリル錯体Cp^*(CO)_2W(η^3-Me_2SiCRCR'R")(R-R"=H, Me)を合成し、アルコールおよび塩化水素との反応を中心に研究した。メタノールとの反応で生成するヒドリドアルケン錯体C"*(CO)_2HW【η^2-Me_2(MeO)SiCR=CR'R"]の熱力学的安定性およびW-Hへのアルケン配位子の挿入とアルケン配位子の異性化過程が、シラアリル配位子の立体的因子によって支配されていることを明らかにした。また、η^3-シラプロパルギル錯体については、安定な錯体を合成単離するには至らなかったが、その二量体が得られた。二量体の反応性について研究すると共に、単量体の単離を目指し、さらに種々の誘導体の合成を検討している。(1)シリレン錯体の合成と反応性に関する研究塩基安定化型シリレン錯体Cp^*(CO)_2(H)W=SiPhR・THF(R=Ph,H)と求核試剤PhLi、LiAlH_4反応を検討し、アニオン性ヒドリド(シリル)錯体Li[Cp^*(CO)_2(H)WSiPhR_2](R_2=Ph_2,H_2,HPh)を得た。これらの錯体をプロトン化するとCp^*(CO)_2(H)_2WSiPhR_2が生成した。これらのジヒドリド(シリル)錯体は、固体状態では歪んだ擬八面体構造あるいは擬三角プリズム構造をとっているが、溶液中では両構造異性体の平衡混合物となる。各異性体のヒドリド交換や擬三角プリズム異性体のヒドリド-シリルサイト交換等の動的過程の詳細についても明らかにした。(2)η^3-シラアリル錯体およびη^3-シラプロパルギル錯体の合成と反応性に関する研究シラアリル錯体Cp^*(CO)_2W(η^3-Me_2SiCR^1CR^2R^3)(R^1-R^3=H,Me)とMeLi、NaOMeの反応を行い、アニオン性アルケン錯体M[Cp^*(CO)_2W(η^2-R^4Me_2SiCR^1=CR^2R^3)](M=Na,Li;R^4=Me,OMe)を合成した。これらの錯体を低温でプロトン化し、反応を温度可変NMRで追跡することにより、ヒドリドアルケン錯体Cp^*(CO)_2(H)W(η^2-R^4Me_2SiCR^1=CR^2R^3)におけるアルケン挿入と異性化過程について研究した。前年度行ったシラアリル錯体とアルコールとの反応の結果とあわせることによって、このタイプのヒドリドアルケン錯体における上記過程の詳細を明らかにした。
ソフィス・リー没後百年記念国際研究集会の企画調査

1999年はSophus Lie(1842-1899)の没後100年の記念すべき年にあたる。数年前より、国際ソフイス・リー研究所長のKomrakovと本研究代表者が中心となり、99年に“100 Years after Sophus Lie"(SL100)と題してヨーロッパと日本において一連の国際研究集会を開催する企画を進めてきた。このSL100準備のため、1998年9月7日-9月17日、ロシアのカザンにおいて研究会“Towards 100 years after SophusLie"を開いた。日本からは、森本、大森、佐藤ら11名が、ロシアからは、Komrakov,Onishchik,Graev,ら20余名が参加し、25をこえる講演発表を基調にし、活発な討論を展開した。これらの成果は報告論文集としてカザン大学のLobachevskii Journal of Mathematicsに近く発表される。また99年のSL100について協議した結果、国際研究集会は一本化して日本で開催することに決めた。帰国後、日本でのSL100開催の準備のため、森本と志磨裕彦が代表となり、「ソフイス・リー没後百年に向けて」と題して、11月4日-6日、山口大学において幾何学研究会を開いた。カザン研究会の参加者をはじめ、幾何学、表現論関係の専門家30名余りが参加し、研究交流を行うと同時にSL100について協議し、国際研究集会“Lie groups,Geometric structures,and Dirfferential equations-100years after Sophus Lie"を1999年12月13日-12月17日、数理解析研究所に於いて開催することに決定した。
非症候群性遺伝性難聴の分子生物学的および電気生理学的手法による難聴発症機構の解明

本研究では、遺伝性難聴における遺伝子異常を分子生物学的手法により同定し、蝸電図を用いた電気生理学的手法によりその蝸牛病態の検討を行った。遺伝性難聴においては、既知の難聴遺伝子のスクリーニングを行った。すなわち、昨年度からのGJB2遺伝子、ミトコンドリアDNA3243点変異、1555点変異の遺伝子解析を進めると同時に、EYA1遺伝子、SLC26A4遺伝子についても検討した。方法として、各遺伝子をコードする塩基配列をPCR法により増幅し、アガロースゲル電気泳動による分離し、直接シーケンス法により変異の有無を確認した。難聴家系125家系(142例)を対象としたGJB2遺伝子(コネキシン26遺伝子)解析では、14家系(11%)30例において235delC、G45E、Y136X、V37I、T123Nの変異が認められた。ミトコンドリアDNA1555点変異は、110家系中7家系(6.4%)、アミノ配糖体系薬剤の投与例6家系中2例(33%)に認められた。また、A1555G変異例では、蝸電図を含めた機能検査により聴覚障害部位は蝸牛であり、明らかな前庭障害は来たさないことを示した。3243点変異は検索した31例中4例に認められた。一方、BO症候群2例中1例にこれまで報告されていないEYA1遺伝子変異(S189G)を同定し、前庭水管拡大を伴う難聴家系2例中1例に変異(His723Arg)を認めた。さらに電気生理学的手法による蝸牛病態の解明として、エアバッグにより生じた音響外傷例を報告し、蝸電図を含めた機能検査から蝸牛障害による感音難聴であることを示した。本研究では、非症候群性遺伝性難聴における遺伝子異常を分子生物学的手法により同定し、蝸電図を用いた電気生理学的手法により蝸牛病態の検討を行った。非症候群性遺伝性難聴においては、約70の原因遺伝子座と20以上の原因遺伝子が同定されてきている。本年度における分子生物学的検討として、既知の難聴遺伝子のスクリーニングを行った。すなわち、GJB2遺伝子、ミトコンドリアDNA3243点変異、1555点変異の遺伝子解析を行った。GJB2遺伝子(コネキシン26遺伝子)は、最も頻度の高い難聴遺伝子とされている。難聴家系58家系(62例)を対象としたGJB2遺伝子解析では、6家系(10.3%)9例において235de1C、G45E、Y136X、T123Nの変異が認められた。この中で、T123Nは常染色体優性遺伝形式の難聴家系に認められ、DFNA3を引き起こす変異である可能性が考えられた。ミトコンドリアDNA変異では、3243点変異と1555点変異を検索した。3243点変異は検索した16例中3例に、1555点変異は67例中3例に変異が認められた。後者は、アミノ配糖体系薬剤の投与で高度の難聴をきたすものであり、難聴の予防的治療の観点からも有用であった。さらに、ミトコンドリア遺伝子変異による症候群性難聴症例における蝸電図、耳音響放射、ABRなどの聴覚機能検査結果から、本遺伝子による聴覚障害部位は内耳および聴神経であることを同定した。
補助人工心臓システムの携帯性と抗血栓性向上及び完全体内埋め込み化の早期実現研究

空気駆動方式補助人工心臓用小型駆動装置の開発を行った。電気油圧式アクチュエータを使用して血液ポンプ駆動用の空気圧を作り出す機構により、小型化(35×30×45cm)、軽量化(13kg)、低消費電力化(45W)、低騒音化(39d8)、バッテリーによる2時間駆動、自動運転モード、流量監視機構を実現した。東洋紡VAD血液ポンプを用いた模擬循環回路試験で7L/minの拍出性能、15000時間以上の駆動耐久性を認し、6頭の山羊による左心補助で3ヶ月以上の駆動実績を示した。電気油圧駆動方式体内埋め込み型補助人工心臓(EHVAD)システムの開発を行った。重量は1160gで、模擬循環回路試験で最大流量8.8L/min、最大効率14.2%を確認し、3頭の仔牛(体重:6167[kg])による左心補助で1頭は90日以上の生存を得た。推定補助流量は4L/minであった。体内電池、経皮エネルギー伝送システム(TETS)、経皮光情報伝送システム(TOTS)の開発を行った。慢性動物実験によりTETSによるエネルギー供給と1日1回約40分の電池駆動、駆動パラメータの送受信が可能であることを確認した。血液ポンプ一体型の駆動圧センサ、ダイアフラム位置を直接計測する超音波センサから血液ポンプの駆動状態監視システムの開発を行った。本システムによりポンプ駆出不良の認識、さらに生体需要に応える駆動制御方法として完全充満完全駆出制御を実現した。患者のCT画像から3次元胸腔構造をコンピュータ上に構築し、人工臓器パーツを合成表示することで、解剖学的適合性に優れた人工臓器の形状やサイズの検討を行うシミュレータの開発を行った。新規開発のヘパリン化材料による抗血栓性処理方法の開発、新規材料による皮膚貫通装置の開発もあわせて行った。皮膚貫通装置については山羊を用いた慢性動物実験において1年間の消毒なしでの管理実績を得た。1.空気駆動型補助人工心臓用小型駆動装置の開発従来の駆動装置の大型、重量化、高電力、高ノイズの原因であったエアーコンプレッサを排除し、電気油圧駆動式アクチュエータを用いて駆動用空気圧を発生させる構造により大きさ35x27x17cm、重量約13kgの小型駆動装置を開発した。従来駆動装置が数100Wの電力を要したのに対し、本駆動装置は数10Wで駆動でき、内臓バッテリとAC電源双方からの電力供給も容易である。騒音レベルは、約39dBで、合衆国Environmental Protection Agencyにおける基準(病院内環境<45dB)を下回っており、極めて静かな環境を供給しうることが確認された。また流量測定機能を備えて駆動状態を常に監視し異常を警報する安全機構を備えた。さらに装置表面のウレタン化、車輪軸の軟質化により、転倒衝撃、路面衝撃対策を施した。ベンチテストにおいて15,000時間以上の動作確認を行い、モック回路試験で空気駆動式人工心臓血液ポンプを駆動し定格流量7L/min以上の拍出量を得た。今後、更に改良を行い、より小型・軽量で携帯が可能な外部駆動装置への展開を図る予定である。2.電気駆動方式体内埋め込み型の補助人工心臓の開発電気駆動方式体内埋め込み型補助人工心臓システム(EHVAD)の試作を行った。血液ポンプおよびアクチュエータはEHTAHの開発技術を利用し、コンプライアンスチャンバは新たに設計、製作を行った。

患者使用における座位での体内位置を考慮し、頭尾方向サイズが最小となる扁平形状ケーシングを作製した。各パーツをパッケージングし、大きさは縦110mm×横156mm×厚み56mmまで小型化できた。模擬回路(前負荷10mHg、後負荷100mmHg)を用いたin vitro試験では、9L/minの最大拍出量および13%の最大効率が得られた。1.空気駆動型補助人工心臓用小型駆動装置の開発従来の駆動装置の大型、重量化、高電力、高ノイズの原因であったエアーコンプレッサを排除し、電気油圧駆動式アクチュエータを用いて駆動用空気圧を発生させる構造により大きさ35x27x17cm、重量約13kgの小型駆動装置を開発した。駆動空気圧などの情報を利用し、血液ポンプの駆動状態を制御して拍出量を確保する自動駆動モードの開発を行い、その基礎検討と評価を行った。また成ヤギを用いた左心補助の慢性動物実験にて、本駆動装置により東洋紡社製VAD血液ポンプを駆動し73日間と87日間の安定した駆動を行うことが可能であった。2.電気駆動方式体内埋め込み型の補助人工心臓の開発電気駆動方式体内埋め込み型補助人工心臓システム(EHVAD)の試作を行った。血液ポンプおよびアクチュエータはEHTAHの開発技術を利用し、患者への体内埋め込み考慮した扁平形状ケーシングとなるよう楕円形とU字形のコンプライアンスチャンバのモデルを製作し評価を行った。楕円形オイルチャンバーモデルの大きさは縦110mm×横160mm×厚み55mm、容積610mL、重量950gとなり、U字形チャンバーモデルの大きさは縦110mm×横160mmと厚み58mm、容積540mL、重量940gとなった。模擬回路(前負荷10mHg、後負荷100mmHg)を用いたin vitro試験では、楕円形オイルチャンバーモデルで、9.4L/minの最大抽出量および16.4%の最大効率が得られ、U字形チャンバーモデルでは、7.6L/minの最大拍出量および12.6%の最大効率が得られた。電気油圧駆動方式体内埋め込み型補助人工心臓(EHVAD)システムの試作を行い、慢性動物実験によるin vivo評価を行った。動物実験用EHVADシステムは血液室と油室からなるダイアフラム型血液ポンプ、空気室と油室からなるコンプライアンスチャンバ、血液ポンプとコンプライアンスチャンバへ交互にシリコンオイルを送る油圧アクチュエータから構成され、一番大きな箇所でのサイズは130mm×165mm×65mm、容積は660mL、重量は1160gとなった。体重6167kgの3頭の仔牛の左胸壁皮下へ本ユニットを埋め込み、コンプライアンスチャンバ空気室内のエアーを体外へ逃すためのエアーホースとドライブラインが皮膚を貫通し、体外の駆動装置と接続された。一頭において12日間の生存記録を得て、他の一頭は現在実験継続中である。実験期間中、動物の血行動態は良好に保たれ、バイパス流量は4L台、消費電力は78W程度で維持された。アクチュエータ部分の発熱も40°C近傍で維持された。また新規開発のヘパリン化材料による抗血栓性処理方法の開発、新規材料による皮膚貫通装置の開発もあわせて行った。皮膚貫通装置については山羊を用いた慢性動物実験において1年間の消毒なしでの管理実績を得た。