hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウスリンパ浮腫モデルに対する培養リンパ管内皮細胞移植の有用性に関する研究

リンパ浮腫治療の基礎研究として、培養リンパ管内皮細胞移植によるリンパ管再生を目指した。マウス後肢基部で軟部組織を切断し膝窩リンパ節を郭清することでリンパ浮腫モデルを作成した。2週間程度浮腫は持続したが、4週間後にはほとんど消退した。マウス胸管からリンパ管内皮細胞の初代培養を行った。免疫染色により、リンパ管内皮細胞であることを確認したが、数継代で増殖しなくなった。ゲル上でリンパ管内皮細胞を培養し管腔形成能を評価したが、VEGF-Cによる管腔形成促進効果は認めなかった。コラーゲンスポンジで3次元培養したリンパ管内皮細胞をマウス皮下に移植し、組織学的に評価したが、リンパ管の管腔様構造は認めなかった。浮腫が長期に持続するリンパ浮腫モデルの作製に難渋し、時間を要している。リンパ管内皮細胞の三次元培養については、胸管より採取した細胞の増殖能が弱く、購入したリンパ管内皮細胞で三次元培養が行えるようになるまでに時間を要した。形成外科浜松医科大学のリンパ浮腫モデルが再現性について、検討を進め、再現性があればマウスにも応用していく。リンパ管内皮細胞の三次元培養では、機械刺激や増殖因子等によりさらなる管腔形成を目指し条件検討を行っていく。また、移植した培養リンパ管内皮細胞を識別できるように、リンパ管内皮細胞にGFP遺伝子の導入を進めていく。当初、マウスでのリンパ浮腫モデルを作成する予定であったが、ラットでの長期間持続するリンパ浮腫モデル作成に難渋しており、マウスでのモデル作成に至っていない。また、マウスからのリンパ管内皮細胞初代培養を行ったが、ラットのリンパ管内皮細胞に比べ非常に増殖能に乏しく、3次元培養を行うのが困難であったため。予定よりも試薬の使用量が少なかったため。引き続き、安定したラットリンパ浮腫モデルの作成プロトコルの作成を目指し、作成できればそれをマウスで行う。ただ困難なようなら、マウスでも2週間程度持続するモデルは作成できているので、それを用いて実験を進める。細胞培養に関しても、一旦市販のマウスリンパ管内皮細胞を用いてコラーゲンサンドイッチ培養を行い、リンパ浮腫モデルマウスに移植し、浮腫の改善度の評価、インドシアニングリーンによるリンパ管造影検査によるリンパ管再生の評価を行う方針である。実験動物の購入と、リンパ管内皮細胞の三次元培養に使用する成長因子等の購入に使用する。マウスリンパ管内皮細胞の増殖が想定よりも悪かったため、当初行う予定であったコラーゲンサンドイッチ培養下の、成長因子添加による管腔形成能の評価を行うことができなかったため。次年度では、bFGFやPDGFなどの成長因子を購入し、コラーゲンサンドイッチ培養における管腔形成の実験を行う予定である。
母乳細胞のアポトーシスの解明

母乳にはマクロファージ、リンパ球、形質細胞、導管上皮細胞などの細胞成分があり、乳児への感染防御の働きが示唆されている。近年、遺伝子に支配された細胞死であるアポトーシスが注目されており、母乳細胞成分においても、発現の可能性が考えられる。母乳細胞成分においてアポトーシスが起こっていれば、その活性化機構、発現機構、制御機構の解明は、細胞成分の乳幼児への有用性を検証する一助になると思われる。そこで、母乳から細胞を抽出し、TUNEL法とアガロース電気泳動法によりDNAの特異的な断片化を検出し、アポトーシスの有無を調べた。TUNEL法ではアポトーシスを起こしている細胞が観察でき、また、アガロース電気泳動法においてもラダーが認められた。以上から、母乳の細胞はアポトーシスを起こしていると考えられた。母乳細胞の抽出が不安定なため抽出法を検討し、アポトーシスを起こしている細胞を特定している。以上から、母乳の細胞がアポトーシスを起こしていると考えられた。母乳細胞は、不安定なため、細胞の抽出について調べている。
高等植物におけるペルオキシソーム形成を支える分子ネットワークの解明

本年度は、既に解析を進めているapm1/drp3a、apm3/pmp38変異体、およびペルオキシソーム膜局在型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(pAPX)、同じくペルオキシソーム膜に局在する22kDa(PMP22)タンパク質を用いて、ペルオキシソーム膜タンパク質の欠損によるペルオキシソーム形成機構について検討を行った。PMP38、pAPX、PMP22はペルオキシソーム膜の主要な構成タンパク質である。PMP38が欠損したapm3変異体ではペルオキシソームが巨大化し数が減少することを既に見いだしている。この表現型がapm3/pmp38変異に特異的なものなのか、それとも主要な膜成分の減少により引き起こされたものなのか検討するため、pAPXおよびPMP22遺伝子にT-DNAが挿入されたシロイヌナズナの種子をABRCより取りよせ、それら遺伝子破壊株においてペルオキシソームをGFPで可視化させた。その結果、両遺伝子破壊株におけるペルオキシソームは大きさ、数ともに野生型と同じであることが明らかとなり、ペルオキシソームの巨大化はapm3/pmp38変異体に特異的であることが明らかとなった。apm1/drp3a変異によりペルオキシソームの数は減少するもののapm3/pmp38変異体とは異なり巨大化せず長い形態をとる。そこでペルオキシソームの巨大化と伸長の関係を明らかにするためにapm1apm3二重変異体を作出し、ペルオキシソームの表現型を観察した。その結果、二重変異体のペルオキシソームは巨大化するものが優先的に存在することが明らかとなりペルオキシソームが分裂する際にはまずある程度大きくなり、その後、分裂している可能性があることが示唆された。本年度は、昨年度までに原因遺伝子を同定したペルオキシソームが巨大化するapm3変異体の解析を中心に実験を進めた。APM3遺伝子はペルオキシソーム膜タンパク質であるPMP38をコードしている。既に、PMP38特異抗体を用いたウエスタンブロットの結果から、野生型では38kDのポリペプチドが検出されるのに対し、apm3変異体では検出できないことを明らかにしている。今回、apm3のアリル取得のためデータベース上でタグラインの探索を行い、GABI-KatよりGABI_047D01とGABI_830A06の2種類のラインを入手した。この2種類のラインより調製した総タンパク質を用いてPMP38タンパク質の検出を行ったところ、apm3と同様、全く検出されず、また、apm3との掛け合わせにより、この2種類のタグラインがapm3のアリルであることが明らかとなった。APM3プロモーター下にGUS遺伝子をつなげた融合遺伝子をもつ形質転換植物の作製が終了したため、種々の組織、成長段階におけるGUS染色を行うことにより、APM3遺伝子の発現パターンの解析を行った。APM3遺伝子は、これまでにapm3変異体で観察してきた根、葉、茎のみならず、根端、葉柄、雄蕊、雌蕊、葉原基、排水組織、鞘など様々な組織で発現していること、また葉や根においても、特に維管束で強く発現していることが明らかとなった。このGUS染色が強く観察される組織におけるGFPの蛍光パターンを野生型とapm3変異体で比較してみると、apm3変異体では巨大化したペルオキシソームが観察され、鞘では直径が20μmに及ぶものが存在した。今後は、PMP38の機能解析とペルオキシソームの分裂が抑制されたapm1変異体との二重変異体の解析を進めていく予定である。
陰関数曲面カーネルに基づくCADシステムに関する研究

設計・製造分野でのCAD/CAM/CAE統合システムのすべての内部データ表現形式を,陰関数曲面により置き換えられることを目指し,本研究課題では,陰関数曲面をベースとしたCAD/CAM/CAE統合システムのための一歩として,扱う対象を曲面のソリッドモデルに限定し,陰関数曲面を設計・製造分野におけるCADシステムの基幹構造(カーネル)とするための研究開発を行うこと目的として下記の6つを行った.(1)陰関数曲面によるモデリングカーネルの整備モデリングカーネルとして幾何処理や入出力処理等の基本ライブラリ(関数群)化を行った.その成果として三角形メッシュの変形でよく使われているスムーズなラプラシアン(Laplacian)変形をSLIM曲面に適用し,その都度サポートの中心点同士の互いの包含関係でその場限りの連結グラフを作成し,これによりダイナミックなボリューム変形が細部の形状を保持したまま,リアルタイムに可能になった.(2)三角形メッシュおよび曲面からの陰関数曲面への変換手法に関する研究・開発三角形メッシュや自由曲面から陰関数曲面への変換手法を開発する.三角形メッシュもしくは自由曲面から陰関数曲面への距離にもとづく評価関数を定義し,この距離を最小にするような処理を,陰関数曲面の構築アルゴリズムの中へ組み込むことで対処した.(3)CADシステムのための操作・機能の開発従来のCADシステムのもつ機能の一部である,連続性やハイライト線等の映り込みなどの検査や平面,円筒,球などの標準形状からの偏差の検査等の各機能を開発した.また,陰関数曲面高速に直接表示できるような手法としてGPUを用いたレンダリング手法を開発した(第13回画像電子学会最優秀論文賞受賞)(4)CADシステムによる製品形状の試作シミュレーションと評価製品形状の試作シミュレーションとその評価として際に設計製造に携わっている技術者からの評価をあおぐ作業として,とくに計算流体力学シミュレーションへの連動を試みた.設計・製造分野でのCAD/CAM/CAE統合システムのすべての内部データ表現形式を,陰関数曲面により置き換えられることを目指し,本研究課題では,陰関数曲面をベースとしたCAD/CAM/CAE統合システムのための一歩として,扱う対象を曲面のソリッドモデルに限定し,陰関数曲面を設計・製造分野におけるCADシステムの基幹構造(カーネル)とするための研究開発を行うこと目的として下記の6つを行った.(1)陰関数曲面によるモデリングカーネルの整備モデリングカーネルとして幾何処理や入出力処理等の基本ライブラリ(関数群)化を行った.その成果として三角形メッシュの変形でよく使われているスムーズなラプラシアン(Laplacian)変形をSLIM曲面に適用し,その都度サポートの中心点同士の互いの包含関係でその場限りの連結グラフを作成し,これによりダイナミックなボリューム変形が細部の形状を保持したまま,リアルタイムに可能になった.(2)三角形メッシュおよび曲面からの陰関数曲面への変換手法に関する研究・開発三角形メッシュや自由曲面から陰関数曲面への変換手法を開発する.三角形メッシュもしくは自由曲面から陰関数曲面への距離にもとづく評価関数を定義し,この距離を最小にするような処理を,陰関数曲面の構築アルゴリズムの中へ組み込むことで対処した.(3)CADシステムのための操作・機能の開発従来のCADシステムのもつ機能の一部である,連続性やハイライト線等の映り込みなどの検査や平面,円筒,球などの標準形状からの偏差の検査等の各機能を開発した.また,陰関数曲面高速に直接表示できるような手法としてGPUを用いたレンダリング手法を開発した(第13回画像電子学会最優秀論文賞受賞)(4)CADシステムによる製品形状の試作シミュレーションと評価製品形状の試作シミュレーションとその評価として際に設計製造に携わっている技術者からの評価をあおぐ作業として,とくに計算流体力学シミュレーションへの連動を試みた.陰関数曲面をベースとしたCAD/CAM/CAE統合システムのための一歩として,扱う対象を曲面のソリッドモデルに限定し,陰関数曲面を設計・製造分野におけるCADシステムの基幹構造(カーネル)とするための研究開発を行うこと目的としている.平成18年度は,以下の三つの開発を行った.1.陰関数曲面によるモデリングカーネルの整備モデリングカーネルとして幾何処理や入出力処理等の基本ライブラリ(関数群)化を行った.その成果として三角形メッシュの変形でよく使われているスムーズなラプラシアン(Laplacian)変形をSLIM曲面に適用し,その都度サポートの中心点同士の互いの包含関係でその場限りの連結グラフを作成し,これによりダイナミックなボリューム変形が細部の形状を保持したまま,リアルタイムに可能になった(研究発表の3つ目と5つ目).2.データフォーマットの制定と圧縮データ表現の検討独自にフォーマットを作成し,複数のプリミティブが木構造に基づく階層的表現を活かし,かつ,応用としての計算流体シミュレーションに用いるために大容量のデータにも対応できるような効率的なフォーマットの表現のためのデータ表現について検討した.3.三角形メッシュおよび曲面からの陰関数曲面への変換手法に関する研究・開発三角形メッシュや自由曲面から陰関数曲面への変換手法を開発する.三角形メッシュもしくは自由曲面から陰関数曲面への距離にもとづく評価関数を定義し,この距離を最小にするような処理を,陰関数曲面の構築アルゴリズムの中へ組み込むことで対処した.2.と3.の成果として,入力としての点群や三角形メッシュに対して,近似精度を制御しながら陰関数(SLIM)曲面近似を行う手法を開発した(研究発表2つ目).

さらにそれらをハードウェアを用いて高速に表示する手法も開発した(研究発表の1つ目と4つ目).設計・製造分野でのCAD/CAM/CAE統合システムのすべての内部データ表現形式を,陰関数曲面により置き換えられることを目指し,本研究課題では,陰関数曲面をベースとしたCAD/CAM/CAE統合システムのための一歩として,扱う対象を曲面のソリッドモデルに限定し,陰関数曲面を設計・製造分野におけるCADシステムの基幹構造(カーネル)とするための研究開発を行うこと目的として,平成19年度は下記の3つを行った.(1)CADシステムのための操作・機能の開発従来のCADシステムのもつ機能の一部である,連続性やハイライト線等の映り込みなどの検査や平面,円筒,球などの標準形状からの偏差の検査等の各機能を開発した.また,陰関数曲面高速に直接表示できるような手法としてGPUを用いたレンダリング手法を開発した(雑誌論文での発表)(2)陰関数曲面からの各工程へのデータ出力方法の開発CADシステムからCAMやCAEへ受け渡すことのできる出力方法の開発を行った.特に要望の多い解像度の異なるポリゴンを出力できるように拡張した.(3)CADシステムによる製品形状の試作シミュレーションと評価製品形状の試作シミュレーションとその評価として際に設計製造に携わっている技術者や,ソフトウェアの開発者からの評価をあおぐ作業として,とくに計算流体力学シミュレーションへの連動を試みた(国際学会での発表).
長波長光による生体深部タンパク質光制御法の開発

本研究は、長波長の光を利用して生きた細胞中の標的タンパク質を操作する方法を確立する。そのために、長波長光照射により蛍光分子から発生する近接場光の利用、もしくは長波長光応答タンパク質を利用する。長波長光応答タンパク質を利用した方法では、タンパク質機能を光制御する方法を検討した。イオンポンプのうち580 nm前後の照射光によりイオン流入の程度が変化することが知られているタンパク質を選択し、照射光の波長と実際の細胞活動の変化の関係性を、化学発光タンパク質センサーを利用することで確認した。結果、光照射に対して鋭敏に反応する細胞活動が確認され、光応答タンパク質による長波長光での光制御の応用性を見出した。細胞中の任意のタンパク質の挙動を人為的に操作する手法のひとつ「光制御法」では,生体組織透過性の高い長波長の光による制御方法が不足している.本研究では,光制御原理の中心である光応答タンパク質の多くが青色光(短波長)制御であるという問題を克服するため,次の2つの原理, 1.長波長の光照射による蛍光分子からの青色近接場光の発生及び光応答タンパク質の活性化, 2.長派長光応答タンパク質の利用による光制御,のいずれかを達成することで,長波長光でも制御できる方法の確立を目的とする.同原理を実際の細胞内タンパク質の挙動と組み合わせることで,炎症反応や神経細胞伸長などの細胞活動を任意のタイミングで長波長光制御する.生物個体深部などに適用出来る実用性の高い手法を確立する.本年度は,光制御方法として計画していた1. 2.のそれぞれの方法を試行した. 1.では,長波長の励起光によって発生する近接場光に関してその基本的なデータも含めて絶対的に知見が少ないことから,蛍光分子および蛍光タンパク質それぞれに対して,長波長の励起光を照射した際の近接場光発生の条件および環境による効率の違いを調査した.本年度は近接場光の発生を具体的に検証することはできず次年度に方法を模索する.2.では,長派長光応答タンパク質の利用を試み,細胞膜タンパク質に光応答タンパク質を融合させる形で細胞内に発現させて,細胞膜上のタンパク質の多量化を光誘導した.結果,細胞シグナルが増加していることを確認し,長派長光による光制御を実現した.本年度は光制御方法として計画していた1.長波長の光照射による蛍光分子からの青色近接場光の発生及び光応答タンパク質の活性化, 2.長派長光応答タンパク質の利用による光制御,のそれぞれを試行し,その効果,現実性を検討した.1.の長派長光による近接場光の発生が実際に起きるか検証するため,緑色蛍光タンパク質を複数連結した融合タンパク質を発現するプラスミドを作製し,培養細胞へ導入した,蛍光タンパク質の発現を確認したのち,赤色光LEDを細胞懸濁液に照射して緑色蛍光が発生するか確認した.しかし蛍光は検出されず,現時点の系では近接場光の発生は誘導できない,もしくは発生しても近傍の蛍光タンパク質が最適な距離に位置しておらず励起されていないことが推測される.したがい,今年度計画していた近接場光の発生による可視蛍光の発生は達成できていない.2.の長派長光応答タンパク質の利用では,赤色光で反応するPhytochrome系のタンパク質を選択し,実際のタンパク質光制御に応用するタンパク質発現プラスミドを作製した.細胞膜タンパク質に光応答タンパク質を融合させる形で細胞内に発現させて,細胞膜上のタンパク質の多量化を光誘導した.実際に多量化による細胞シグナルが増加していることを下流のタンパク質のリン酸化を検出することで確認した.したがい,長派長光による光制御が実行できた.細胞中の任意のタンパク質の挙動を人為的に操作する手法のひとつ「光制御法」では,生体組織透過性の高い長波長の光による制御方法が不足している.本研究では,光制御原理の中心である光応答タンパク質の多くが青色光(短波長)制御であるという問題を克服するため,次の2つの原理, 1.長波長の光照射による蛍光分子からの青色近接場光の発生及び光応答タンパク質の活性化, 2.長派長光応答タンパク質の利用による光制御,のいずれかを達成することで,長波長光でも制御できる方法の確立を目的とする.本年度は1,2それぞれの原理の実現性を検証するとともに,いずれの原理が目的達成に適しているか選択し今後の開発展開の方向性を具体化した. 1.では,緑色蛍光タンパク質を溶液中で高濃度に存在させた状態で600 nm以上の長波長光を照射して,蛍光性を有するか検証した.結果,微弱ではあるものの励起光よりも短い波長の放出蛍光が検出された.さらに励起光の照射条件,検出光の波長特性などを詳細に分析することで,より効果的な蛍光発生を実現出来ることが期待された.2.では,長波長光応答タンパク質を利用した方法を再検討して,タンパク質機能を光制御する方法を検討した.細胞膜イオンポンプのうち580 nm前後の照射光によりイオン流入の程度が変化することが知られているタンパク質を選択し,照射光の波長と実際の細胞活動の変化の関係性を,化学発光タンパク質センサーを利用することで確認した.結果,光照射に対して鋭敏に反応する細胞活動が確認され,光応答タンパク質による長波長光での光制御の応用性を見出した.本研究は、長波長の光を利用して生きた細胞中の標的タンパク質を操作する方法を確立する。

イオンポンプのうち580 nm前後の照射光によりイオン流入の程度が変化することが知られているタンパク質を選択し、照射光の波長と実際の細胞活動の変化の関係性を、化学発光タンパク質センサーを利用することで確認した。結果、光照射に対して鋭敏に反応する細胞活動が確認され、光応答タンパク質による長波長光での光制御の応用性を見出した。今後は以下の2つを目標として研究開発を進める.1.長波長の光照射による蛍光分子からの青色近接場光の発生及び光応答タンパク質の活性化,では,蛍光タンパク質での近接場光の発生が確認できなかった.そこで,近接場光で近隣の分子を励起できることが証明されている有機蛍光色素を用いて検証する.具体的には,まず緑色蛍光色素が高濃度に存在する溶液を準備して,赤色光レーザーなどで照射することで,緑色蛍光が発生することを確認する.その際に蛍光の発生する条件を様々な照射方法から具体化する.続いて,青色光応答タンパク質にSNAPタグを繋げ,蛍光色素を付加できる形にする.細胞中に発現させたのち蛍光色素を添加して近接場光が蛍光タンパク質に照射される状態を作る.実際に赤色レーザーを照射して緑色蛍光が発生するか検討する.2.長派長光応答タンパク質の利用による光制御,では前年度に成功している光制御によるタンパク質多量化のシステム開発を続ける.細胞膜タンパク質操作の1例として,G-protein coupled receptor (GPCR)タンパク質をターゲットとする. GPCRは多岐にわたる疾患の薬剤ターゲットとして注目されており,そのホモダイマー化によって下流へのシグナルが制御されることが知られている. GPCRに光応答タンパク質および蛍光分子を繋げることで, GPCRホモダイマー化を長波長光照射によって引き起こす系を開発する.分子生物学近接場光による蛍光タンパク質の励起,もしくは光応答タンパク質の光刺激を実行するため,今年度は近接場光が予想通り発生するか,発生した場合にはどのような条件が必要か,を検討した.その結果,緑色蛍光タンパク質を複数連結した融合タンパク質では近接場光の発生が確認できず,近接場光を前提とした各種の検討実験を進めることができなかった.そのため,本年度に使用する予定であった検出試薬,観察備品等の購入を次年度に行うこととした.達成することができなかった近接場光の発生を実現するため,本年度は検証していない有機蛍光色素を購入し,近接場光で近隣の色素分子を励起できるか検証する.具体的には,緑色蛍光色素を購入し高濃度な溶液を準備して,赤色光を照射することで緑色蛍光が発生することを確認する.その際に蛍光の発生する条件を様々な照射方法から具体化する.実験に付随して光源,フィルター等を購入する.続いて,青色光応答タンパク質にSNAPタグを繋げ,蛍光色素を付加する.細胞内で発現させたのち蛍光色素を添加して,実際に赤色光を照射して緑色蛍光が発生するか検討する.青色光応答タンパク質,SNAPタグなどの遺伝子材料の合成費用,最終的な検出に必要な備品を購入する.
肺炎球菌とグリコサミノグリカンの相互作用が炎症応答と感染成立に果たす役割の解析

肺炎球菌は、肺炎や中耳炎の主たる起炎菌であり、口腔・咽頭・上気道などから分離される。全身に伝播した場合、髄膜炎や敗血症などの致死性が高い疾患を引き起こす。肺炎球菌はきわめて重要な病原性の細菌であるが、菌体外分子の機能、宿主細胞との相互作用など、不明な点が残っている。昨年度の研究実績に示すように、申請者らは肺炎球菌性髄膜炎の発症に寄与する分子として形質転換誘導因子Ccs4(competence induced protein)を同定した。肺炎球菌Ccs4はグリコサミノグリカン(GAG)へ結合する以外の方法で、肺炎球菌の脳微小血管内皮細胞への付着および侵入を促進することにより、髄膜炎発症に寄与する可能性を示した。肺炎球菌は、髄膜炎だけでなく、市中肺炎の主な原因であることが知られている。したがって、今年度は、肺胞上皮細胞への付着侵入試験、マウス肺炎モデルを用いて、肺炎球菌Ccs4が病原性に果たす役割について解析を進めた。肺炎球菌TIGR4株の野生株、ccs4遺伝子欠失株、Ccs4相補株を用いて、ヒト肺胞上皮細胞に対する付着・侵入試験を行ったところ、各株とも同程度の付着・侵入率が示された。また、マウス肺炎モデルでは、感染後のマウス生存率および感染24時間後の肺胞洗浄液における細菌数に有意差は見られなかった。さらに、マウス髄膜炎モデルにおいて、実際に肺炎球菌Ccs4が血液脳関門の突破に寄与するかを免疫蛍光染色で評価した。感染24時間後の脳組織では、ccs4遺伝子欠失株と比較して、野生株およびCcs4相補株において、脳微小血管内皮細胞への付着および血液脳関門の突破がより多く確認された。以上から、肺炎球菌のCcs4は脳微小血管内皮細胞特異的に付着および侵入を促進することにより、髄膜炎発症に寄与する病原因子である可能性が示された。肺炎球菌性髄膜炎の発症に寄与する分子としてCcs4を同定し、機能解析をまとめた論文が、Virulence誌に受理されている。肺炎球菌のグリコサミノグリカン(GAG)結合タンパク質の探索を進める。ヘパリンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、肺炎球菌グリコサミノグリカン(GAG)結合タンパク質の選出を行う。その後、肺炎球菌GAG結合タンパク質の遺伝子欠失株、組換え体を作製し、ヒト脳血管内皮細胞や肺胞上皮細胞を使用した付着・侵入・トランスロケーション試験、マウス感染モデルに供試することで、多角的に機能解析を行う。肺炎球菌は髄膜炎や敗血症などの致死性が高い疾患を引き起こす。真核細胞表面の大半のタンパク質は、短い糖鎖が結合した糖タンパク質の形で存在し、細胞の最表層は糖衣で覆われている。しかし、糖鎖と肺炎球菌の相互作用には不明な部分が多い。グリコサミノグリカン(GAG)は細胞外マトリックスの主要な構成成分で、コアタンパク質に結合し細胞表層に局在している。そこで、申請者らは「肺炎球菌GAG結合タンパク質は肺炎球菌性髄膜炎の発症過程において、脳血管内皮細胞のバリア通過に関与する」という作業仮説を立て検討を行なった。ヒト脳微小血管内皮細胞表面の糖鎖を分解酵素(heparinase)で処理すると、肺炎球菌の野生株において、細胞への侵入率が低下することを見出した。次に、肺炎球菌TIGR4株の全アミノ酸配列と髄膜炎菌のNeisserial Heparin Binding Antigen (NHBA)の相同性検索から、TIGR4株の形質転換誘導性タンパクCcs4がヘパリン結合性に重要であるアミノ酸配列を持つことが示された。そこで、ヒト脳微小血管内皮細胞へ野生株とccs4遺伝子欠失株を感染させたところ、野生株と比較してccs4遺伝子欠失株で付着率・侵入率が低下した。しかし、野生株における細胞への付着率・侵入率は、細胞のheparinase処理または肺炎球菌のheparin処理を行っても、ccs4遺伝子欠失株の付着率・侵入率より有意に高かった。また、マウス髄膜炎モデルにおいて、血中での野生株とccs4欠失変異株の生存菌数に差は認められなかったが、脳内の菌数はccs4の欠失により有意に減少することが示された。以上の結果から、Ccs4は糖鎖へ結合する以外の方法で肺炎球菌の脳微小血管内皮細胞への付着および侵入を促進することにより、髄膜炎発症に関与する可能性が示された。肺炎球菌性髄膜炎の発症に寄与する分子としてcompetence induced protein Ccs4を同定しできたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。

肺炎球菌は、髄膜炎だけでなく、市中肺炎の主な原因であることが知られている。したがって、今年度は、肺胞上皮細胞への付着侵入試験、マウス肺炎モデルを用いて、肺炎球菌Ccs4が病原性に果たす役割について解析を進めた。肺炎球菌TIGR4株の野生株、ccs4遺伝子欠失株、Ccs4相補株を用いて、ヒト肺胞上皮細胞に対する付着・侵入試験を行ったところ、各株とも同程度の付着・侵入率が示された。また、マウス肺炎モデルでは、感染後のマウス生存率および感染24時間後の肺胞洗浄液における細菌数に有意差は見られなかった。さらに、マウス髄膜炎モデルにおいて、実際に肺炎球菌Ccs4が血液脳関門の突破に寄与するかを免疫蛍光染色で評価した。感染24時間後の脳組織では、ccs4遺伝子欠失株と比較して、野生株およびCcs4相補株において、脳微小血管内皮細胞への付着および血液脳関門の突破がより多く確認された。以上から、肺炎球菌のCcs4は脳微小血管内皮細胞特異的に付着および侵入を促進することにより、髄膜炎発症に寄与する病原因子である可能性が示された。肺炎球菌性髄膜炎の発症に寄与する分子としてCcs4を同定し、機能解析をまとめた論文が、Virulence誌に受理されている。in silico解析、ならびにヘパリンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、肺炎球菌グリコサミノグリカン(GAG)結合タンパク質の選出を進める。同定した候補分子組換え体を作製し、ヘパラン硫酸への結合能力を確認する。その後、同定した肺炎球菌GAG結合タンパク質の遺伝子欠失株、組換え体を作製し、ヒト脳血管内皮細胞を使用した付着・侵入・トランスロケーション試験、マウス髄膜炎モデルに供試することで、多角的に検討する。さらに、肺炎球菌感染時に脳血管内皮細胞自身から分泌されるケモカインを測定する。GAG結合性が報告されているケモカインについて、それらの組換え体を作製する。GAGとケモカイン組換え体の結合を、肺炎球菌GAG結合タンパク質が阻害するかを確認する。マウス髄膜炎モデルでの組織像と免疫蛍光染色から、肺炎球菌GAG結合タンパク質の炎症拡大への関与を検討する。また、病原性に関与している肺炎球菌GAG結合タンパク質について、組換え体をワクチン候補としてマウスに免疫し、そのマウスにおいて髄膜炎モデルでの致死率・組織像の変化を観察する。肺炎球菌のグリコサミノグリカン(GAG)結合タンパク質の探索を進める。ヘパリンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、肺炎球菌グリコサミノグリカン(GAG)結合タンパク質の選出を行う。その後、肺炎球菌GAG結合タンパク質の遺伝子欠失株、組換え体を作製し、ヒト脳血管内皮細胞や肺胞上皮細胞を使用した付着・侵入・トランスロケーション試験、マウス感染モデルに供試することで、多角的に機能解析を行う。Ccs4と相互作用する宿主分子がグリコサミノグリカン(GAG)ではなかったため、解析方針を修正した。最終年度に肺炎球菌グリコサミノグリカン(GAG)結合タンパク質の選出を進めるための予算を確保したため、次年度使用額が生じた。
実験的嚢胞腎ラットの嚢胞形成におけるアンギオテンシンIIの関与について

本研究の目的は、我々が従来より用いているDiphenylthiazole(DPT)誘発性の実験的嚢胞腎ラットにおいて、嚢胞形成の病態へのレニン・アンギオテンシン系の関与を検討することにある。殊にアンギオテンシンII(A-II)が増殖因子として働くことに注目し、アンギオテンシン変換酵素阻害剤を同時投与した際の嚢胞形成の変化やA-IIレセプターの組織内発現を明らかにすることが最終目標である。本年度は、その前段階の実験として、SHRおよびWKYラットにDPTを投与した時の嚢胞形成の相違(平成4年度に報告)に、他の要因が関与しているか否かを検討した。まず、10-14週齢のSHRおよびWKYラットに100mg/100gBW/dayのDPTを、胃ゾンデにより投与し、嚢胞腎モデルを作製し、両者の嚢胞形成の強さ比較した。この結果、DPT投与4週目で、WKYではSHR較べ著しい嚢胞形成がみられた。DPT代謝の相違がこれに関与している可能性を考慮し、両者のDPT血中濃度をHPLC法により測定し比較したが、DPT血中濃度は両群間に有意差はなかった(2週目でWKY:8170±2650,SHR:7048±1231ng/ml)。更に、両ラットの腎循環動態の違いが嚢胞形成に与える影響をみるため、大動脈にクランプをかけ、腎動脈灌流圧を変化させたときの左腎動脈血流量を電磁流量計により測定し、腎動脈自動調節能を評価した。この結果、WKYでは、定常血圧域における腎血流の自動調節が不完全であることが示され、嚢胞形成の一因と考えられた。以上の結果を踏まえ、両ラットモデルの病態におけるA-IIの役割について現在研究を始めている。予備実験においてWKYでは、A-IIレセプターの組織内発現が強く、A-IIの病態への関与が示唆されており、今後は更に、captoprilの投与による嚢胞発生の変化などをみる予定である。
Grothendieckの変動的ホッジ予想への新アプローチ

ホッジ予想はクレイ研究所が提出したミレニアム問題のひとつである.変動的ホッジ予想は,ホッジ予想よりは弱い予想であるが,アーベル多様体にたいしては同値である.最近の進展により問題は,形式的スキームの代数的K群にたいする代数化の問題に帰着される.これはGrothendieckの偉業である形式的存在定理を大きく一般化する難題でこれまで一般的アプローチは知られていなかった.本研究はこれにたいし,全く新しい一般的アプローチを提出する.具体的にはリジッド解析空間のK理論を新たに構築しリジッド解析的手法を問題に適用する.すでに基礎理論であるリジッド解析空間のK理論の構築がほぼ完成している.これを簡単に説明する.与えられたリジッド解析空間にたいしスペクトラルのpro-systemが定まる.これを解析的K群と呼ぶ.リジッド解析空間が形式的スキームに付随する解析空間である場合には、その形式的スキームの代数的K群のスペクトラルのpro-systemから解析的なK群のスペクトラルのpro-systemへ自然な写像が構成され、さらにそのファイバーが形式的スキームの下部空間である代数的スキームのK群のスペクトラルと同値であることが示されるのである.この構成により、形式的スキームの代数的K群にたいする代数化の問題が解析的K群の代数化の問題に帰着されるころになり、変動的ホッジ予想にたいするリジッド解析的なアプローチが可能になるのである.今後はこの新たな解析的K理論を変動的ホッジ予想以外の様々な重要問題に応用することも目標にしている.すでに基礎理論であるリジッド解析空間のK理論の構築がほぼ完成している.対象とするリジッド解析空間が代数多様体に付随した解析空間である場合に、リジッド解析空間のK理論から代数多様体にたいするコホモロジー的不変量へのチャーン類写像を構成することにより解析的K理論の研究を行う.具体的には基礎体がp-進体の場合に、リジッド解析空間のK理論から代数多様体のサントミックコホモロジーへのチャーン類写像を構成する.これにより目標である形式的スキームの代数的K群にたいする代数化の問題が、p-進体上の代数多様体にたいするBloch-Kato予想と関係づけることを目標とする.標数0の体k上の一変数級数環R=k[[t]]とその商体K=k((t))を考える.XはS=Spec(R)上の射影的で滑らかなスキーム,YをXの特殊ファイバーとし,制限写像i:K_0(X)→K_0(Y)を考える.ここで一般にスキームZにたいし, K_0(Z)はZ上のベクトル束の同型類全体がなす亜群(算法は直和)のGroup completionを表す(ZのGrothendieck群と呼ばれる).Grothendieckの変動的ホッジ予想とは,K_0(Y)の元αをK_0(X)に持ち上げるための必要十分条件を,αのホッヂ理論的条件によって与えるものである.名高いホッジ予想は変動的ホッジ予想を導く.アーベル多様体にたいして両者は同値である.本研究目的は変動的ホッジ予想に対する全く新しい一般的アプローチを提出することである.写像i: K_0 (X)→K_0 (Y)がK_0 (X)→K^cont_0(X) →K_0 (Y)と分解し, α∈K_0 (Y)の持ち上げのプロセスを2段階に分けることができる.最初の持ち上げの問題を無限小変形持ち上げとよび,次の段階の持ち上げを代数化とよぶ.MorrowとBloch-Esnault-Kerzは,前者をほぼ一般的な状況で解決することに成功した.残された代数化の問題は,Grothendieckの偉業である形式的存在定理をはるかに一般化する難題でこれまで一般的アプローチは全く知られていなかった.これにたいする新しいふたつのアプローチとして、リジッド解析空間のK理論の構築およびモチーフ理論の一般化を遂行する。代数的K理論は,代数多様体あるいはスキームZにたいし高次代数的K群K_j(Z) (jは整数)なる基本的不変量を与える.j=0の場合はK_j(Z)は前述のGrothendieck群に等しい.当該研究では,リジッド解析空間に対する代数的K群の類似物を構成し,これにより上述の代数化の問題にリジッド解析幾何の手法が適用可能となる理論的枠組みの構築を行った.これを説明するために,Rを完備離付値環,Kをその商体とする.上で考察したR=k[[t]]とK=k((t))はこの例である.XをS=Spec(R)上の有限型スキームとし,X_nをXの特殊ファイバーのn-th thickeningとする.高次K群の逆系K^cont_j(X):={K_j(X_n)}_(n>0)をリジッド解析幾何を用いて解析する新理論を構成した。さらに次の成果が得られている.一般にリジッド解析空間Mに対しその解析的K群K_j^an (M) (jは整数)が(pro-abel群として)定義されて,Mが前述のスキームXのformal completionに(Raynaudの意味で)付随する対応リジッド解析空間のときK_j^an(M)とK_j^cont (X)が(ほぼ)同型である.

さらに自然な射K_0(X)→K_0^an(M)は同型である.ホッジ予想はクレイ研究所が提出したミレニアム問題のひとつである.変動的ホッジ予想は,ホッジ予想よりは弱い予想であるが,アーベル多様体にたいしては同値である.最近の進展により問題は,形式的スキームの代数的K群にたいする代数化の問題に帰着される.これはGrothendieckの偉業である形式的存在定理を大きく一般化する難題でこれまで一般的アプローチは知られていなかった.本研究はこれにたいし,全く新しい一般的アプローチを提出する.具体的にはリジッド解析空間のK理論を新たに構築しリジッド解析的手法を問題に適用する.すでに基礎理論であるリジッド解析空間のK理論の構築がほぼ完成している.これを簡単に説明する.与えられたリジッド解析空間にたいしスペクトラルのpro-systemが定まる.これを解析的K群と呼ぶ.リジッド解析空間が形式的スキームに付随する解析空間である場合には、その形式的スキームの代数的K群のスペクトラルのpro-systemから解析的なK群のスペクトラルのpro-systemへ自然な写像が構成され、さらにそのファイバーが形式的スキームの下部空間である代数的スキームのK群のスペクトラルと同値であることが示されるのである.この構成により、形式的スキームの代数的K群にたいする代数化の問題が解析的K群の代数化の問題に帰着されるころになり、変動的ホッジ予想にたいするリジッド解析的なアプローチが可能になるのである.今後はこの新たな解析的K理論を変動的ホッジ予想以外の様々な重要問題に応用することも目標にしている.すでに基礎理論であるリジッド解析空間のK理論の構築がほぼ完成している.代数化の問題への別のアプローチとして、モチーフ理論の一般化を行うことを計画している。モチーフ理論とは,1970年代にGrothendieckがその構想を打ち出して以来,哲学的指導原理として多くの優れた研究を導いてきた(例えばDeligneのWeil予想の解決や混合Hodge構造の理論もそのうちである).Beilinsonは,Grothendieckのモチーフ哲学をより正確に予想として定式化した.VoevodskyはBeilinson予想の部分的解決に成功した.少なくとも正則なスキームにたいしては,期待された性質を持つモチーフ理論が構成できることを示したのである.この業績により彼にフィールズ賞が与えられたことからもモチーフ理論がいかに重要視されてきたかがわかる.しかし,変動的ホッジ予想への応用に必要なのは必ずしも正則とも(それどころか被約とも)限らないスキームXにたいするモチーフ理論の構成が求められる.研究計画は,Voevodskyのモチーフ理論をより広範な枠組みへと拡張し,Voevodskyの理論では不可能だった新たな応用をもたらすことである.具体的にはVoevodskyのモチーフ理論の基盤であるホモトピー不変性層の理論を相互層の理論に拡張し,これを用いてVoevodskyのモチーフの圏を拡張する相互モチーフの圏の構成を行う.対象とするリジッド解析空間が代数多様体に付随した解析空間である場合に、リジッド解析空間のK理論から代数多様体にたいするコホモロジー的不変量へのチャーン類写像を構成することにより解析的K理論の研究を行う.具体的には基礎体がp-進体の場合に、リジッド解析空間のK理論から代数多様体のサントミックコホモロジーへのチャーン類写像を構成する.これにより目標である形式的スキームの代数的K群にたいする代数化の問題が、p-進体上の代数多様体にたいするBloch-Kato予想と関係づけることを目標とする.
皮膚疾患克服のための「超個体」理解に基づいた皮膚微生物-宿主免疫解析法の確立

常在細菌叢解析は腸管や皮膚などで広く行われ、疾患への寄与が次々と明らかになりつつある。微生物-免疫応答の解析では、細菌叢のみの解析では、対微生物免疫応答の一面しか見られていない可能性がある。しかしながら、微生物全体を対象とした微生物免疫応答解析モデルはない。これまで、先行する研究において病原細菌S. aureusや病原真菌C. albicansにおける、経表皮的マウス感染症モデルを樹立し、反応を明らかにしてきた。この系を発展、細菌・真菌・などを含め“超個体"の理解に基づく解析を行い、皮膚微生物-宿主免疫解析法の確立を目指す。これまでに、皮膚におけるS. aureus及びC. albicans感染免疫応答性IL-17産生性細胞の解析を行い、経表皮モデルにおけるS.aureusのIL-17産生細胞が、皮膚gdT細胞と、ILC3であることを同定し、その誘導に、菌由来PSMaがケラチノサイトのIL-1, IL-36の細胞死を介した分泌が必要であることを突き止めた。これまでにこれらの研究実績を論文として報告した。本研究では、真菌として当初、C.albicansの免疫反応を検討することを目的としていたが、研究期間中に論文が多く報告されたため、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎などの皮膚炎に関与する、Malasezziaの皮膚における、皮膚炎惹起メカニズムの解明に着手した。Malasezziaのin vivoの検討の系は存在していないが、申請者らは、マウスにおけるMalasezziaの皮膚炎モデルを新規に確立し、ケラチノサイトのMyD88シグナルを介して皮膚炎惹起が誘導されていることを見出した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。常在細菌叢解析は腸管や皮膚などで、近年広く行われ、疾患への寄与が次々と明らかになりつつある。一方、近年、バクテリオファージウイルスによる細菌叢の“群集改造理論"の概念提唱や、真菌叢解析の報告などが報告されるようになった。このような観点から皮膚における、微生物-免疫応答の解析において、細菌叢のみの解析では、対微生物免疫応答の一面しか見られていない可能性がある。しかしながら、依然、共生微生物全体を対象とした微生物免疫応答解析モデルは確立していない。これまで申請者らは、先行する研究において皮膚病原細菌S. aureusや皮膚病原真菌C. albicansにおける、他に類のない経表皮的マウス感染症モデルを樹立し、免疫反応を明らかにしてきた。この系を発展させ、細菌・真菌・ファージを含めた“超個体(Superorganism)"の統合的理解基づく解析を行うことで、より本質的な恒常性の理解よる皮膚微生物-宿主免疫解析法の確立を目指す。これまでに、我々の経表皮黄色ブドウ球菌感染モデルにおけるIL-17の産生細胞が、ILC3とgdT細胞であることを確認した。また、IL-1ファミリーの下流アダプターであるMyD88の角化細胞特異的ノックアウトマウスで表現系が得られたので、IL-36、IL-1に焦点を当て、ノックアウトマウスや抗サイトカイン抗体を用いた実験を行い、表現系を得ることに成功した。マウス表皮角化細胞に黄色ブドウ球菌培養上清で刺激を加えることで、これらのサイトカインが誘導されることを確認している。当初、29年度以降に予定していた、IL-17サイトカインをを皮膚で誘導するのに必要な黄色ブドウ球菌由来病原因子を同定するという部分に優先的に着手し業績をまとめることを優先した。そのため、皮膚細菌叢解析と病原微生物相互作用を詳細に解析するという当初の計画に遅れが生じている。全体の計画としては順調に推移していると考えられるが小項目の前後が生じているため、やや遅れていると評価した。これまでに、皮膚におけるS. aureus及びC. albicans感染免疫応答性IL-17産生性細胞の解析を行い、我々の経表皮艦船モデルにおけるS.aureusのIL-17産生細胞が、皮膚gdT細胞と、ILC3であることを同定た。これらのIL-17産生には、その誘導に、S. aureus由来PSMaが表皮ケラチノサイトのIL-1, IL-36サイトカインの細胞死を介した分泌が必要であることを突き止めた。また、ヒト初代培養角化細胞を用いた実験で、マウスのモデルだけでなく、ヒトでもこの現象が保存されている可能性を明らかにした。これまでに、これらの研究実績を論文として報告した。IL-

17産生に必要な皮膚の細胞を同定し、さらに菌側の病原因子の同定をし、論文としてこれまでに報告できている点は計画以上に進展したと考えている。一方、真菌叢解析などの菌叢と宿主という点からはこれまでに、データが得られれていないので若干の遅れがある。以上から概ね順調と評価した。常在細菌叢解析は腸管や皮膚などで広く行われ、疾患への寄与が次々と明らかになりつつある。微生物-免疫応答の解析では、細菌叢のみの解析では、対微生物免疫応答の一面しか見られていない可能性がある。しかしながら、微生物全体を対象とした微生物免疫応答解析モデルはない。これまで、先行する研究において病原細菌S. aureusや病原真菌C. albicansにおける、経表皮的マウス感染症モデルを樹立し、反応を明らかにしてきた。この系を発展、細菌・真菌・などを含め“超個体"の理解に基づく解析を行い、皮膚微生物-宿主免疫解析法の確立を目指す。これまでに、皮膚におけるS. aureus及びC. albicans感染免疫応答性IL-17産生性細胞の解析を行い、経表皮モデルにおけるS.aureusのIL-17産生細胞が、皮膚gdT細胞と、ILC3であることを同定し、その誘導に、菌由来PSMaがケラチノサイトのIL-1, IL-36の細胞死を介した分泌が必要であることを突き止めた。これまでにこれらの研究実績を論文として報告した。本研究では、真菌として当初、C.albicansの免疫反応を検討することを目的としていたが、研究期間中に論文が多く報告されたため、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎などの皮膚炎に関与する、Malasezziaの皮膚における、皮膚炎惹起メカニズムの解明に着手した。Malasezziaのin vivoの検討の系は存在していないが、申請者らは、マウスにおけるMalasezziaの皮膚炎モデルを新規に確立し、ケラチノサイトのMyD88シグナルを介して皮膚炎惹起が誘導されていることを見出した。黄色ブドウ球菌病原因子同定という部分を優先的に行っているため、そちらの計画の進捗状況を鑑みながら、今後、細菌囃解析と、黄色ブドウ球菌、カンジダなどの皮膚病原微生物の相互作用を解析し、宿主免疫系を統合的に解析する。引き続き、皮膚細菌叢と病原因子、宿主免疫系の相互作用を解析していく予定である。計画以上に進展した側面があるが、一方で、菌叢と宿主という観点は現時点までにデータが得られていないので、今後、菌叢解析と宿主免疫系を重点的に解析する予定である。また、真菌叢という部分ではヒト皮膚常在真菌叢はカンジダよりもマラセチアの占める割合が多い点にも着目し実験系の再検討を行っていきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
空気シャワー中ミューオン数観測のための僻地大型水槽実験の実証実験

チベット空気シャワーアレイ観測宇宙線がハドロン起源かガンマ線起源かを弁別可能な装置として水チェレンコフ光観測型大型ミューオン検出器を考案。現地(標高4300m、チベット高原)にて作成可能かどうかの実証実験を行った。具体的には土洩2.2m、水深1.4m、面積50m^2の壁厚0.35mのコンクリート製駆体を床壁白にし、20インチ光電子増倍管(PMT)を天井に取り付けたプロトタイプ検出器を設計・制作した。装置は無事完成。最も心配であった駆体強度は仕様通り出来、水漏れに関しては貯水後3ケ月間水位変動無しであり、価格、品質とも想定内で問題無く作成できた。PMT取り付けも無事終わり、ミューオン信号の検出にも成功した。ノイズも想定以下であることがわかった。成果は国際会議・物理学会にて発表した。その他本研究でわかった点は以下の通り。施工:施工可能業者有。自前での施工管理が何より重要。設計図・施工図は中国の設計院で作成。工期は3ケ月半(2007年9月1日着工)。予算:本実験では防水水槽約3.5万円/m^2と予想。躯体強度:コンクリート強度30N(試験結果と一致)、鉄筋規格HRB335とした。防水:水性エポキシ系防水材とセメント系防水材+タイベックシートでテスト。後者が価格(約2倍)・光量(約30%)・施工面で優れていた。共に漏水無し。後者はpH値が9.0を指したが問題は無い。水:テスト水槽より150mの距離の井戸より最大0.5m^3/分で給水。水質検査結果からは神岡地下水同等で良質。水温は+5度で安定(2007年12月から現在まで)。長期透明化のためには殺菌か浄水が必要。地盤:深さ10mまで砕石・礫層。想定長期(短期)地耐力200(400)[kN]。地下水位低く漏水の危険小。無事建設完了しミューオン信号を確認。チベット空気シャワーアレイ観測宇宙線がハドロン起源かガンマ線起源かを弁別可能な水チェレンコフ光観測型ミューオン検出器の現地作成実証実験を行う。そのため土洩2.2m、水深1.4m、面積50m^2、床壁白塗装、20インチ光電子増倍管(PMT)を天井に取り付けたプロトタイプ検出器を、シミュレーション・現行アレイとの関係・躯体強度・価格等を考慮し設計・決定。国際会議・物理学会にて発表。決定事項、わかったこと、不明な点を以下に述べる。1.施工業者:本テスト実験はダム施工実績を持つ四川省の会社のラサ支店を予定。2.設計図、工期:設計図完成、中国では施工図は設計院が作成。工期3ヶ月半。3.予算:床面積120m^2(検出器2台分)で1000万円。本実験では躯体(塗装込)3.5万円/m^2を予想。4.躯体強度:コンクリート24N、鉄筋規格HRB335。躯体強度計算結果OK。5.防水方法:水性エポキシ系防水材とセメント系防水材+タイペックシートでテスト。6.水の染出し・染込み:pH値に注意が必要。7.床壁の反射率:カメラテストでは上記防水材は要求反射率>70%を満たす。8.水の確保:テスト水槽より150mの距離の井戸から200m^3/日で給水可能。9.水質、浄水:井戸水水質テストでは神岡地下水同等で良質であることを確認。長期透明度。10.給水・排水システム:本実験時にテスト水槽内に貯水層と浄水器を設置したシステムで進行中。11.地盤:深さ10mまで砕石・礫層。長期地耐力200[kN]、短期地耐力400[kN]が想定される。12.水温:土中深さ2mで年間を通して8±5度。13.PMTの取り付け方法:神岡実験を参考に、ネオプレンゴムとスチン板で天井にボルトで固定。14.蓋とケーブルの引き回し:テスト実験ではマンホールを使用。以上。装置は無事完成。

躯体強度:コンクリート強度30N(試験結果と一致)、鉄筋規格HRB335とした。防水:水性エポキシ系防水材とセメント系防水材+タイベックシートでテスト。後者が価格(約2倍)・光量(約30%)・施工面で優れていた。共に漏水無し。後者はpH値が9.0を指したが問題は無い。水:テスト水槽より150mの距離の井戸より最大0.5m^3/分で給水。水質検査結果からは神岡地下水同等で良質。水温は+5度で安定(2007年12月から現在まで)。長期透明化のためには殺菌か浄水が必要。地盤:深さ10mまで砕石・礫層。想定長期(短期)地耐力200(400)[kN]。地下水位低く漏水の危険小。無事建設完了しミューオン信号を確認。