hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
数学の理解過程における直観と論理の相補性に関する実証的研究

本研究の目的は,メンタルモデルと反省的思考という二つの概念に着目することによって,数学の理解過程における直観と論理の相補性を実証的に解明することであった。そのために,まず,メンタルモデルと反省的思考に関する文献研究を行い,数学理解のいくつかの階層的水準を縦軸に,各水準における三つの学習段階(直観的段階,反省的段階,分析的段階)を横軸にもつ「数学理解の2軸過程モデル」を理論的に構築した。そして,「長さ」の概念について,子どもがどのようなメンタルモデルを構成しているか,子どもが各自のメンタルモデルに対していかに反省的思考を働かせ,どのようなメンタルモデルを構成するかを明らかにするために,授業観察法や質問紙法及びインタビュー法によって調査した。こうして得られたデータを,2軸過程モデルを一つの分析の枠組みとして用いて分析し,直観と論理の相補性を実証的に解明しようとした。その結果,「長さ」の概念について子どもが構成しているメンタルモデルとして,(1)両端が揃っている場合には,曲がっている方が長い,(2)2点を結ぶ最短距離は直線であるから,その直線に近いものの方が短い,(3)閉じた平面図形の辺の長さはその面積に比例する,が明らかになった。これらのメンタルモデルは数学的に誤った見越的直観につながり得るものである。しかしながら,授業での教師と子どもあるいは子どもたち同士の相互作用を通して,子どもが各自のメンタルモデルに対して反省的思考を働かせ,文字式という論理に裏づけられたかなり確固とした直観をもつことができる,ということが明らかになった。このことは,数学の理解過程において直観と論理が相補的な関係にあるとき数学的思考は生産的かつ確実に進展し得るということを,例証するものである。さらにこの結果から,「数学理解の2軸過程モデル」の妥当性がある程度,実証的に裏づけられたと言える。
フルクトース過剰摂取が次世代に及ぼす影響

妊娠ラットにフルクトースを与え、その仔を解析することで世代を超えたフルクトースの影響について解析した。母獣フルクトースラットから産まれた仔は、成長後、耐糖能異常を示すことがわかった。体重はフルクトースラットから産まれた仔の方がコントロールラットに比べ軽いことがわかった。脳はフルクトースに対して脆弱性を有するため海馬に対する影響も解析した。その結果、UCP5 mRNA量が減少していることがわかった。UCP5は海馬機能維持に重要な分子である。母獣フルクトース摂取はUCP5発現量変化を通じて、仔の海馬機能に影響を及ぼす可能性が考えられる。フルクトースは「果糖ブドウ糖溶糖」として多くの飲料の甘味料として利用され、先進国ではメタボリックシンドロームの原因として注目されている。妊婦のフルクトース過剰摂取による子への悪影響が示唆されているが、そのメカニズムは不明である。本研究はエピジェネティックな視点より、妊娠中のフルクトースの過剰摂取が仔に与える悪影響のメカニズムを解明する。今年度はフルクトース摂取した母獣から産まれた仔の表現型を主に解析した。フルクトースを摂取した母獣から生まれた仔は120日齢で耐糖能異常が観察された。それ以前(30ー90日齡)では耐糖能異常はみられなかった。また仔の体重増加についても調べたところ、フルクトース摂取した母獣から産まれた仔は、通常飼料を摂取した母獣から産まれた仔よりも70日齡以降で体重増加が遅くなることがわかった。仔を解剖し(30、60、90、120日齢)、肝臓、脂肪など様々な臓器を回収した。肝臓(仔、120日齢)を用いてマイクロアレイなどの解析をすすめている。今後は胎児の段階で過剰なフルクトースによりエピジェネティックス情報の変化が起こりその結果、疾患の素因が形成され、成人になると発症するという仮説を念頭に置き、仔のメチル化の解析を経時的に行っていく。フルクトース摂取が仔に与える影響を解析し、メタボリックシンドローム発症の分子メカニズムをエピジェネティックな視点から探ることを目標に据える。フルクトースは「果糖ブドウ糖液糖」の名で添加甘味料として多くの清涼飲料や加工食品に使用されている。過剰摂取は脂肪肝を引き起こしメタボリックシンドロームの原因の1つとして注目されているが、妊婦のフルクース過剰摂取が仔に与える影響についてはメカニズムを含めるとまだ不明な点が多い。本研究では、エピジェネティックな視点から妊娠中および授乳中の母胎のフルクトース過剰摂取が仔に与える悪影響のメカニズムを解明する。昨年度に妊娠中と授乳中にフルクトースを過剰摂取させた母胎から生まれた仔の体重減少と120日齢において耐糖能低下が起こること、更に海馬のStAR、PBR、P450(11β)、11β-HSD、17β-HSDのm-RNAレベルで変動することを確認した。当該年度ではフルクトースの影響が妊娠期と授乳期のどちらの影響によるのかを調べるために神経ステロイド代謝を担う酵素や蛋白群のm-RNAレベルで発現量を調べた、その結果StAR、P450、11β-HSD、17β-HSDは妊娠期あるいは授乳期のみでは影響しない事、PBRは授乳期のみで発現が下がることが確認された。更に現在まだ解析中であるが、妊娠期から授乳期にかけてフルクトース負荷した母胎の21日齢の仔において海馬神経新生が減少する事が確認され、同時に海馬組織中のLPOが増加していたことから、酸化ストレスが関わることが推測されたことから、海馬ミトコンドリアに局在する脱共役蛋白(UCP5)のm-RNA量を調べたところ有意に低下していることが分かり、現在神経新生に関わる部位およびUCP5のプロモータ部のメチル化解析を進めている。当初の計画ではフルクトース過剰摂取による影響を分析するにあたり、明確に対象臓器を特定していなかったが、脂肪肝を呈することから肝臓を主な対象臓器として念頭に進める計画であった。しかし研究の進行過程において脳の海馬領域において神経ステロイド代謝に関わる酵素・蛋白群に影響を及ぼすことが明らかになってきたために現在のところ脳を対象臓器として研究を推進している。母体の高脂肪食摂取など慢性的なカロリー過多や飢餓などの栄養の偏りは、次世代の生活習慣病発症のリスク因子になることが懸念されている。フルクトースは「果糖ブドウ糖液糖」の名で添加甘味料として多くの清涼飲料水や加工食品に広く利用されており、過剰摂取は摂取した個体への脂肪肝、更には非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の発症などの影響が確認されている。フルクトースに関しては、母胎の胎盤を介して脳においてもミトコンドリアのエネルギー代謝異常を誘発するなど、母体を介したフルクトースに対する脆弱性が確認されている。しかしながら、その分子メカニズムは不明であり、我々はこれらのメカニズム解明に向けて研究を行った。まず記憶中枢でありながら外的刺激に脆弱である海馬に注目した。20%フルクトース水を摂取させた母ラットより生まれた仔の海馬を解析したところ、ミトコンドリア酸素消費量の有意な低下と、過酸化脂質の有意な増加が認められた。またUncoupling protein 5 (UCP5) mRNA発現量が有意に低下し、UCP5遺伝子の転写開始点上流のDNAメチル化率が有意に高値を示した。さらに我々は細胞実験により、ラットUCP5遺伝子は転写開始点上流にプロモーターが存在しDNAメチル化によって転写制御されること、UCP5遺伝子をKnockdownすると酸化ストレスが誘発されることを確認した。

本研究において、母獣の妊娠・授乳期におけるフルクトース過剰摂取は、仔海馬において、UCP5遺伝子プロモーターのDNAメチル化を介して同遺伝子のmRNA発現量を低下させ、酸素消費量低下や酸化ストレス亢進を招くことを示唆した。妊娠ラットにフルクトースを与え、その仔を解析することで世代を超えたフルクトースの影響について解析した。母獣フルクトースラットから産まれた仔は、成長後、耐糖能異常を示すことがわかった。体重はフルクトースラットから産まれた仔の方がコントロールラットに比べ軽いことがわかった。脳はフルクトースに対して脆弱性を有するため海馬に対する影響も解析した。その結果、UCP5 mRNA量が減少していることがわかった。UCP5は海馬機能維持に重要な分子である。母獣フルクトース摂取はUCP5発現量変化を通じて、仔の海馬機能に影響を及ぼす可能性が考えられる。研究計画書通り進行している。研究の推進に当たっては主な対象臓器を脳としてそれ以外は研究計画書通りに行っていく予定である。今後は海馬の神経新生に及ぼす影響を関連する物質のプロモータ領域などのメチル化解析を進める。表現型解析のデータと比較することでエピジェネティックな変化と表現型の関連を調べる。栄養学今後も研究計画書通りに行っていく予定である。成獣ラットにフルクトースを過剰に摂取させ肝臓を解析したところ、脂肪酸の異化代謝に関わる遺伝子の発現に変化が認められた。今後はプロモーター領域などのメチル化解析を進める。表現型解析のデータと比較することで、エピジェネティックな変化と表現型の関連を調べる。必要な試薬(RNA抽出試薬、PCR用試薬)を発注していないため。必要な試薬類(total RNA抽出試薬、PCR用試薬など)や抗体を発注していないため。今後必要となるため随時購入予定である。今後必要となるので随時購入する予定である。
悪性黒色腫の免疫療法耐性細胞分画のマーカー探索、及び耐性機序の解明と克服法の開発

悪性黒色腫は、免疫療法が標準治療法の一つとして認められつつある。しかし、治療不応例も多数存在し、効く症例を見分けられるマーカー、及び治療不応の分子機序の解明と克服法の開発が課題である。本研究では、悪性黒色腫において、免疫抑制を誘導して免疫療法耐性となる細胞分画を定義できるマーカーの同定を試みた。その結果、抗腫瘍T細胞に対して耐性となる細胞集団を定義できる3つの細胞表面マーカーを同定し、さらにそのうちの一つのマーカーに関して、抗腫瘍T細胞耐性の原因となる遺伝子を一つ、マイクロアレイによる網羅的遺伝子解析で同定した。これらの分子は、治療標的や、治療マーカーとなる可能性が示唆された。悪性黒色腫は、免疫療法が奏効しやすく、最近では、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体や、養子免疫療法の開発により、長期生存が得られる標準治療法の一つとして認められつつある。しかし、治療不応例もまだ多数存在し、さらなる改善のために、効く症例を見分けられるマーカー、及び治療不応の分子機序の解明と克服法の開発が課題である。本研究では、悪性黒色腫において、がん組織の中でも、不均一(heterogeneity)に発現する細胞表面分子マーカーの中から、免疫抑制を誘導して免疫療法耐性となる細胞分画を定義できるマーカーの同定を試みた。これまでヒト悪性黒色腫組織で発現が報告されている表面抗原18種類に関して、9種類のヒト悪性黒色腫細胞株で、発現様式をFACSで解析した。その結果、5つ以上細胞株で、その発現様式に不均一性を示した表面抗原を5つ同定した。そのうちの抗原A, B, Cに関して、その陽性分画と陰性分画を各々分離し、悪性黒色腫の腫瘍抗原であるMART-1に特異的なT細胞に対する感受性を、IFN-γ放出試験で評価した。その結果、抗原A, Bに関しては、その陰性分画は、陽性分画に比べて、MART-1特異的T細胞に対して耐性であること、抗原Cに関しては、その陽性分画は、陰性分画に比べて、MART-1特異的T細胞に対して耐性であることがわかった。さらに、cancer genome atlas (TCGA)データベースにおいて、325悪性黒色腫症例で、抗原Aの発現強度を解析すると、CD8、Perforin、PD-1の発現強度と相関を認めた。以上より抗原A, B, Cの発現は、ヒト悪性黒色腫において、抗腫瘍免疫応答の誘導に関与している可能性、そのマーカーとなる可能性が示唆された。本研究の平成27年度の計画は、以下の3つであった。1悪性黒色腫で不均一(heterogeneity)に発現する表面マーカーを探索する。2悪性黒色腫において、免疫抑制能の高い細胞分画を定義できるマーカーを、1で同定された候補の中から探索する。32で同定されたマーカーの発現と臨床病理学的因子との相関を、ヒト悪性黒色腫の臨床検体を用いて解析する。これらの計画に関しての本年度の進捗具合を以下に記す、1に関しては、9種類のヒト悪性黒色腫細胞株を用いて、18種類の表面抗原の発現を解析した結果、5つ以上細胞株で、その発現様式に不均一性を示す表面抗原を5つ同定することができた。2に関しては、1で同定した5つのうち3つ(抗原A, B, C)に関して、陽性分画と陰性分画に、抗腫瘍T細胞に対する感受性を評価したところ、どの抗原に関しても、感受性の差が認めることを明らかにできた。3に関しては、抗原Aに関して、ヒト悪性黒色腫組織中の発現がT細胞関連の遺伝子の発現と相関していることを、TCGAデータベースの解析より明らかにした。2に関しては、より多くの細胞株での検証で一般性を確認する必要があり、3に関しては、我々の保有する組織でより詳細な解析が必要であるが、現時点では当初の目的に向けて、研究は順調に進捗しており、ほぼ満足できる達成度であると考えている。本研究では、悪性黒色腫において、がん組織の中でも、不均一(heterogeneity)に発現する細胞表面分子マーカーの中から、免疫抑制を誘導して免疫療法耐性となる細胞分画を定義できるマーカーの同定を試みている。昨年度までに、同定した表面抗原の候補に関して、その陽性分画と陰性分画を各々分離し、悪性黒色腫の腫瘍抗原であるMART-1に特異的なT細胞に対する感受性を、51Cr遊離アッセイを用いて評価したところ、抗原A, Bに関しては、その陰性分画は、陽性分画に比べて、MART-1特異的T細胞に対して耐性であること、抗原Cに関しては、その陽性分画は、陰性分画に比べて、MART-1特異的T細胞に対して耐性であることがわかり、前年度のIFN-γ放出試験の結果と一致した。さらに、免疫不全マウスに悪性黒色腫細胞株を移植し、MART-1特異的T細胞で治療するマウスモデルを確立し、治療群と対照群で表面抗原A,B,Cの発現を比較したところ、治療群の悪性黒色腫組織では、抗原A,Bは低発現で、抗原Cは高発現であった。この結果より、これまでのIFN-γ放出試験や51Cr遊離アッセイによって、in vitroでMART-1特異的T細胞に対して耐性であると評価された悪性黒色腫分画が、in vivoの治療モデルでも治療後により多く残存している事が分かった。以上より抗原A, B, Cの発現は、ヒト悪性黒色腫において、抗腫瘍免疫応答の誘導に関与している可能性、そのマーカーとなる可能性がin vitroおよびin vivoマウスモデルで示唆された。

本年度までの二年間で、悪性黒色腫において、免疫抑制能の高い細胞分画を定義できるマーカーとして、抗原A,B,Cを発見するに至った。その検証は、in vitro及びin vivoの実験で確かめることが出来た。次のステップの免疫抑制のメカニズム解析の為に、網羅的遺伝子発現解析を行う予定であるが、既に複数の細胞株において、抗原A,B,Cについてそれぞれ陽性分画、陰性分画に分離したサンプルを得ており、平成29年度には網羅的遺伝子発現解析がすぐに行える状況である。ヒト悪性黒色腫検体の収集も進み、一部は浸潤免疫細胞の評価が終了している。よって、抗原A,B,Cと臨床病理学的因子との相関の解析も平成29年度に行える予定である。現時点では当初の目的に向けて、研究は順調に進捗しており、ほぼ満足できる達成度であると考えている。悪性黒色腫は、免疫療法が奏効しやすく、最近では、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体や、養子免疫療法の開発により、長期生存が得られる標準治療法の一つとして認められつつある。しかし、治療不応例もまだ多数存在し、さらなる改善のために、効く症例を見分けられるマーカー、及び治療不応の分子機序の解明と克服法の開発が課題である。本研究では、悪性黒色腫において、がん組織の中でも、不均一(heterogeneity)に発現する細胞表面分子マーカーの中から、免疫抑制を誘導して免疫療法耐性となる細胞分画を定義できるマーカーの同定を試みた。ヒト悪性黒色腫組織で発現が報告されている表面抗原18種類に関して、9種類のヒト悪性黒色腫細胞株で、その発現様式をFACSで解析した結果、発現様式に不均一性を示した表面抗原を5つ同定した。そのうち、抗原A, Bに関しては、その陰性分画は、陽性分画に比べて、MART-1特異的T細胞に対して耐性であること、抗原Cに関しては、その陽性分画は、陰性分画に比べて、MART-1特異的T細胞に対して耐性であることが、in vitroおよびマウスモデルでわかった。さらに、cancer genome atlas (TCGA)データベースにおいて、悪性黒色腫症例で、抗原Aの発現強度を解析すると、CD8、Perforin、PD-1の発現強度と相関を認めた。次に、ヒト悪性黒色腫細胞株で、抗原Aに関して陽性分画と陰性分画の遺伝子発現を網羅的にマイクロアレイを用いて比較解析した結果、遺伝子Xが陰性分画に二倍以上多く発現しており、さらに、この遺伝子Xをノックアウトすると、MART-1特異的T細胞に対する感受性が増強された。以上より抗原A, B, C,遺伝子Xの発現は、ヒト悪性黒色腫において、抗腫瘍免疫応答の誘導に関与しており、治療標的や、治療マーカーとなる可能性が示唆された。悪性黒色腫は、免疫療法が標準治療法の一つとして認められつつある。しかし、治療不応例も多数存在し、効く症例を見分けられるマーカー、及び治療不応の分子機序の解明と克服法の開発が課題である。本研究では、悪性黒色腫において、免疫抑制を誘導して免疫療法耐性となる細胞分画を定義できるマーカーの同定を試みた。その結果、抗腫瘍T細胞に対して耐性となる細胞集団を定義できる3つの細胞表面マーカーを同定し、さらにそのうちの一つのマーカーに関して、抗腫瘍T細胞耐性の原因となる遺伝子を一つ、マイクロアレイによる網羅的遺伝子解析で同定した。これらの分子は、治療標的や、治療マーカーとなる可能性が示唆された。
医療保険データベースによる肝疾患の実態の把握および肝がんの新たなリスク因子の解明

近年、抗ウイルス療法の向上、肝炎対策の推進、生活習慣病の増加に伴い、肝がんの成因は大きく変化してきている。そのため、本研究では、悉皆性の高い医療保険データベースを用いて、リアルタイムに肝疾患の実態を把握し、肝がんの新たなリスク因子を解明する。市販医療保険データベース、ナショナルデータベース(レセプト情報・特定健診等情報データベース)を用いて、1)肝疾患の実態と成因の推移、2)肝がんを合併する背景肝疾患の成因の推移、3)処方等の診療行為・肝がんに関連する肝疾患以外のその他の併存症と肝癌との関連等を解析することにより、今後の生活習慣を基礎とする肝がんの成因増加への対策に資する結果を得る。
脊髄虚血後の細胞傷害機序と傷害抑制・修復機構に関する研究

一過性腰部脊髄虚血後の遅発性脊髄機能障害は胸腹部大動脈瘤手術後にもみられる現象である。したがって、遅発性脊髄機能障害の機序を解明することは、胸腹部大動脈瘤手術時の脊髄保護に新たな治療戦略を与えてくれると考えられる。われわれは家兎一過性脊髄虚血モデルを用いて、遅発性運動神経細胞傷害の機序に関して、1)アポトーシスか壊死か2)microgliaまたはmacrophageによる細胞傷害がみられるか、検討を行った。15分間の一過性脊髄虚血後、経時的に神経学的・組織学的に評価した。アポトーシスか壊死かの検討し関しては、再灌流後8時間、24時間、48時間後に神経学的、病理組織学的(H-E・Nauta・TUNEL染色)また生化学的検討(αフォドリン、カズパーゼ3、DNA電気泳動)を行った。いずれの検討でも遅発性運動神経細胞傷害の機序にアポトーシスを積極的に支持する所見はなく、緩徐な壊死であると推測された。microgliaまたはmacrophageによる運動神経細胞傷害の可能性に関する検討では、再灌流後、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、48時間で神経学的、組織学的検討(H-E、MAP2、レクチン、GFAP、RAM11染色)を行った。Microgliaは再灌流2時間後より灰白質全体に一様に活性化されていた。再灌流24時間48時間では神経障害の強い家兎ではmicrogliaの活性化が増強されたが、神経障害が弱い家兎ではむしろ活性化は低下した。Macrophageは神経障害の弱い家兎ではほとんど観察されなかったが、神経障害の強い家兎では再灌流12時間後まり認められ、48時間ではさらに多くのmacrophageが灰白質に確認された。Astrocyteも神経障害が強い家兎ではastrocyteのhypertrophyやhyperplasiaが観察された。遅発性運動神経細胞傷害においてmicrogliaやmacrophageによる運動神経細胞傷害作用を積極的に支持する所見はなく、両者はむしろ壊死組織を積極的に処理し、astrocyteはその部位にグリア瘢痕を形成して脊髄構造を支える働きをしていると考えられた。遅発性運動神経細胞傷害の機序は緩徐な壊死であると考えられ、グリア細胞の運動神経細胞傷害作用は認められず、むしろ保護的に作用していると考えられる。われわれはこれまで2025分間の脊髄虚血後の病態と治療に関する研究を行ってきた。本研究では、虚血後の神経細胞死にネクローシスの他に注目されているアポトーシスの関与を検討するため、神経・組織学的評価とアポトーシス関連蛋白、ストレス蛋白の発現を検討した。1.神経学的・病理組織学的検討方法:家兎を用い、イソフルラン麻酔・分節性脊髄発電位モニター下に腹部大動脈を遮断する一過性脊髄虚血を作成した。2025分虚血ではネクローシスが強度であったため、15分間虚血とした。

家兎を麻酔から覚醒させ、遅発性の障害発現も評価できるように虚血後7日間神経学的観察を行った。7日目の神経学的所見の評価後に、腰部脊髄の病理組織学的検討を行った。結果:7日後の神経学的所見は正常と傷害がそれぞれ約1/2を占め、運動機能障害を生じたもののうち、急性障害を生じたもの、遅発性障害を生じたものがそれぞれ1/2であった。遅発性障害家兎も虚血解除後4日目以降に神経学的障害が進行するものはなかった。2.アポトーシス関連蛋白・ストレス蛋白の発現に関する検討方法:同様の15分間の脊髄虚血モデルで、8時間後に家兎を安楽死させ、直ちに脊髄を取りだし、ウエスタンブロット法によりアポトーシス関連蛋白のうちFas、FasL、Caspase-3、Poly(ADP-ribose)polymerase、Caspase-activated deoxyribonuclease(CAD)、Bcl-2の発現を検討した。また、ストレス蛋白ではHeat shock protein 70(HSP70)の発現を検討した。結果:HSP70の発現は明らかに認められたが、検討したアポトーシス関連蛋白はいずれも発現を確認できなかった。【まとめ】これまでのところHSP70の発現は確認できたが、神経細胞死にアポトーシスの関与を示すデータは得られていない。現在、さらに虚血時間・評価時期を変えての検討を企画している。また、TUNEL法によるDNAの断片化を検討し、脊髄虚血後の神経細胞死にアポトーシスがどのように関与しているか、さらに検討を続ける予定である。本年度は家兎脊髄虚血モデルで15分間虚血・再灌流後の遅発性後肢運動機能低下の発生機序とアポトーシスおよびグリア細胞との関連を調べた。再灌流8,24,48時間後の後肢運動機能を評価し、組織を灌流固定あるいは凍結摘出した。TUNEL染色とアガロース電気泳動法によるDNA分析でアポトーシス発生を評価した。Nauta染色で軸索損傷を評価した。脊髄細胞傷害の指標にα-fodrin分解産物を免疫ブロット法で測定した。運動機能低下の重症化とα-fodrin分解産物の量が相関した。TUNEL染色では神経細胞脱落を認めた例で陽性細胞を認めたが、電気泳動ではDNA梯子状分断は認めなかった。Nauta染色で軸索傷害が明らかになった。以上から、遅発性後肢運動機能低下とアポトーシスは関連がないと考えられた。さらに、神経細胞死とグリア細胞の役割をみるため、再灌流4,12時間後の灌流固定標本を加え、グリア細胞の活動変化を調べた。組織障害の評価にHE染色を行い、免疫組織化学的に抗GFAP抗体によるアストロサイトの認識、抗RAM-11抗体によるミクログリアの認識を行った。後肢運動機能低下を認めた家兎では、再灌流後4時間で神経細胞の変性・壊死を認め、48時間後以降の標本ではこれらの変性細胞は認められなかった。再灌流後24時間から神経細胞の脱落、肥満星状膠細胞とグリア瘢痕を認めた。GFAP陽性細胞の増加は再灌流4時間以降にみられ、RAM-11陽性細胞は8時間で出現し、以後増加した。以上より、変性神経細胞は再灌流後4時間に出現し、炎症性反応としてアストロサイトが増加する一方、マクロファージ型ミクログリアにより再灌流後8時間以降48時間以内に変性細胞が脱落すると考えられた。今後、染色方法を工夫し、再灌流後12時間以前の脊髄神経細胞の変性過程におけるミクログリアの役割を検討する予定である。
生体由来スキャフォールドの可逆的改質に基づく組織構築

本研究では,生体由来材料を一時的に修飾し,その後に光照射で除去可能な分子を合成し,材料の特性を可逆的に変化させる手法の開発に取り組んだ。モデル実験として,アミノ化基板のポリエチレングリコール(PEG)の可逆的修飾による細胞付着性の制御を実施し,本戦略の妥当性を確認した。また,可逆的修飾という特徴に着目し,金ナノ粒子や基板上での生理活性アミンの活性制御や表面密度勾配の形成を行う手法を確立した。本研究では,生体由来スキャフォールドを可逆的改質する方法を開発しin vitroにおける組識構築を目指している。本年度は,モデル系としてアミノ化ガラス基板を用い,その可逆的な改質の検討を行った。まず,光分解性の2-ニトロベンジル基を介して両末端にそれぞれスクシンイミジルカルボネート基とアルキンを有する化合物(I)を合成した。アミノ化ガラス基板を, Iを含む溶液に終夜浸漬後,ポリエチレングリコールアジドを含む溶液に浸漬することでClick反応によりIを介した表面PEG化を行った。アミノ化基板のIおよびPEGによる修飾は,接触角測定,吸光度測定,原子間力顕微鏡により確認した。つづいて同基板を波長365nmの光で照射することで,ニトロベンジル基を光分解した。同様の表面分析から光分解効率を評価したところ, 89割の分解効率であることが分かった。別途作製したPEG化基板をパターン化照射した上でHeLa細胞を播種したところ,光非照射領域には細胞は接着せず,光照射領域に選択的な細胞の接着が見られた。一方,何も修飾を施していないアミノ化基板上ではHeLa細胞は顕著な細胞接着性を示した。以上の結果から,アミノ化表面を化合物IおよびPEGで修飾することで,表面を一時的に細胞非接着性にし,つづいて光照射によりPEGを切除することで,細胞接着性へと回復させることができることが分かった。このことは,細胞接着性と言う観点において,表面を可逆的に改質できたことを意味している。また,同様の化合物で表面修飾した金ナノ粒子を用いて,上記光化学反応により,アミンが再生することを細胞応答性から確認した(JACS, 131: 3811 (2009))。研究では,生体由来スキャフォールドを可逆的改質する方法を開発し,in vitroでの組織構築へと展開することを目的としている。本年度は,コラーゲンの側鎖のアミノ基を,ポリエチレングリコール(PEG)で可逆的に修飾することでコラーゲンゲル表面の細胞接着性の制御を行った。まず,昨年度開発した末端にスクシンイミジル基およびアルキニル基を有する光分解性リンカーと,PEGアジドとをClick化学により反応させ,光解離性PEGを合成した。次に,この分子をI型コラーゲンのゲルに作用させ,ゲル表面のPEG化を行った。つづいて,このゲルを波長365nmの光を照射し,ゲルに修飾したPEGを光解離させた。未処理のコラーゲンゲル,PEG化コラーゲンゲルおよびPEG化後に光照射を行ったコラーゲンゲルに対してHeLa細胞を播種し,細胞接着性を評価した。その結果,PEG化ゲルでは細胞接着が抑制され,またPEG化後に光照射を行ったゲルについては,未処理のコラーゲンとほぼ同程度の接着性を示すことを分かった。この結果は,HeLa細胞の接着性という指標においては,前記光解離性PEG化によるコラーゲンゲル表面の修飾が可逆的であることを示している。また,正立顕微鏡を用いたコラーゲンゲル表面のパターン化照射技術を確立した。現在,これら二つの技術を組み合わせ,コラーゲンゲル表面でのパターニングを進めており,これによりin vitro組織構築の道が拓かれると期待している。また,同様の化合物を用いて,光照射強度を調整することで定量的に表面改質し,表面化学勾配を形成することに成功した。
体外潅流を応用した卵巣生理の研究

卵巣では下垂体より放出されるゴナドトロピンの刺激により、卵胞発育、排卵、黄体形成と続く周期的変化がみられる。この現象には卵巣内のCAMP、ステロイド、ホルモン、プロスタグランジンのほかプラスミノ-ゲンアクチベ-タ-、コラゲネ-ス、ヒスタミンなどの様々な生化学的物質が関与することが最近明らかにされた。しかし、原子卵胞の発育開始、単一細胞の選択、卵胞や黄体の血管構築などの卵巣生理には、未解決部分が少なくない。卵巣の血流は卵胞発育、排卵、黄体形成に対応して大きく変化する。選択された単一卵胞は大量の血流を供給され、排卵時の卵巣血流はさらに増加する。卵胞、黄体のステロイド、ホルモン合成および放出にも血流が関与している。本研究では、このような卵巣血流を保った状態で卵巣生理を観察できる体外潅流法を応用し、細胞培養法を個体全部の観察では不可能な卵巣機能を解明する。とくに卵胞発育・排卵黄体形成にともなう血行動態の変化とともに、血行動態の変動による卵巣の機能・形態への影響を検討することを目的とした。研究実績1.卵巣潅流装置作製、拍動性ポンプを使用、体外排卵を観察した。2.潅流液に0.1%アルブミンを添加、コロイド浸透圧を生理的にした。3.100%酸素を使用すると、潅流液の酸素分圧は300ー350mmHgであった。4.排卵卵および顆粒膜細胞の微細構造を観察、体内排卵と比較した。5.ゴナドトロピン投与すると、6時間後より潅流圧は増加した。6.プロスタブランジン、ヒスタミン、ノルエピネフリン投与においても、卵巣潅流圧の上昇が認められた。7.血小板、PAF投与により、卵成熟を伴わない卵胞破裂がみられた。8.ゴナドトロピン投与後、卵巣は充血し、卵胞頂部の血流は低下した。この現象には卵巣内のCAMP、ステロイド、ホルモン、プロスタグランジンのほかプラスミノーゲンアクチベーター、コラゲネース、ヒスタミンなどの様々な生化学的物質が関与することが最近明らかにされた。しかし、原子卵胞の発育開始、単一卵胞の選択、卵胞や黄体の血管構築などの卵巣生理には、未解決部分が少なくない。卵巣の血流は卵胞発育、黄体形成に対応して大きく変化する。研究実績:1.卵巣潅流装置組立、新しいポンプを購入して作製した。2.潅流液のコロイド浸透圧の検討・2%アルブミンでは排卵が抑制された。3.潅流圧、潅流速度の検討。hCG投与後、徐々に潅流圧が上昇した。

4.潅流卵巣の代謝の検討。pH低下につき検討中。5.酸素化装置の検討。酸素分圧を測定中。6.手術操作の検討、カニューレ先端径を太くした。7.潅流卵巣由来排卵卵の染色体分析、材料を採取中。8.潅流卵巣由来排卵卵の体外培養。培養条件を検討中。9.潅流卵巣由来排卵卵の微細構造。細胞小器官に軽度変性を認めた。卵巣では下垂体より放出されるゴナドトロピンの刺激により、卵胞発育、排卵、黄体形成と続く周期的変化がみられる。この現象には卵巣内のcAMP、ステロイド、ホルモン、プロスタグランジンのほかプラスミノ-ゲンアクチベ-タ-、コウゲネ-ス、ヒスタミンなどの様々な生化学的物質が関与することが最近明らかにされた。しかし、原始卵胞の発育開始、単一卵胞の選択、卵胞や黄体の血管構築などの卵巣生理には、未解決部分が少なくない。卵巣の血流は卵胞発育、排卵、黄体形成に対応して大きく変化する。選択された単一卵胞は大量の血流を供給され、排卵時の卵巣血流はさらに増加する。卵胞、黄体のステロイド、ホルモン合成および放出にも血流が関与している。本研究では、このような卵巣血流を保った状態で卵巣生理を観察できる体外灌流法を応用し、細胞培養法を個体全部の観察では不可能な卵巣機能を解明する。とくに卵胞発育・排卵黄体形成にともなう血行動態の変化とともに、血行動態の変動による卵巣の機能・形態への影響を検討することを目的とした。研究実績1.卵巣灌流装置のステロイド吸着性を検討。エストロゲンに比べプロゲステロンの吸着率が高かった。2.灌流液のコロイド浸透圧をアルブミンまたは血清により増加させると、排卵率は低下した。3.灌流速度を増加させると、灌流圧は上昇するが排卵過程に対する効果は見られなかった。4.灌流卵巣の代謝の検討。灌流液のpHの低下傾向を測定した。微小管の材質について検討した。6.手術操作の検討。卵巣血管の分岐に異常を持つウサギの手術について検討した。卵巣では下垂体より放出されるゴナドトロピンの刺激により、卵胞の発育、排卵、黄体形成と続く周期的変化がみられる。この現象には、卵巣内のCAMP、プロテインカイネ-ス、ステロイド、プロスタグランジンのほか、プラスミノ-ゲナクチベ-タ-、コラゲネ-ス、ヒスタミンなどの様々な生化学物質が関与することが最近明らかにされた。しかし、原始卵胞の発育開始、単一卵胞の選択、卵胞および黄体の血流構築などの卵巣生理には不明の点が少なくない。排卵時の卵胞では卵胞壁頂部への血流が減少することが知られている。血流の減少の機序としては、動静脈間のシャント、卵胞の拡大のほかに血小板による微小血栓形成が推定されている。PAFは血小板を活性化する物質として発見されたが、排卵時の卵巣で減少し、この阻害剤が排卵を抑制するなど、排卵に関与することが示唆されている。潅流卵巣を用い、排卵時の血流変化を観察すると共に、卵巣の血流変化に関与する血小板およびPAFの直接の役割について検討した。研究実績1.ゼラチン墨汁法による卵巣血流の解析。卵巣動脈よりゼラチンを混合した墨汁を注入後、キシロ-ルで組織を透明化して排卵時の卵胞壁の血流低下を観察した。2.潅流液にヒト血小板を投与し、潅流液中の血小板数、潅流圧の変動排卵の時間経過、排卵卵の成熟を観察した。3.潅流液にPAFを投与し、1ug/mlの濃度において、未熟な卵の排卵が起こることを確認した。4.PAFによる排卵が、PAFの阻害剤により抑制されるか否かについて検討。阻害剤を投与した場合、卵胞の拡大が抑制された。5.PAF投与時の潅流卵巣の代謝について検討した。
腎糸球体上皮細胞のストレスに対する防御機構

腎糸球体上皮細胞は、細胞骨格の一種である中間径フィラメントに際立った特徴があることが分かった。一般の上皮に見られないビメンチンを多量に含み、さらに、ラットではデスミン、イヌではサイトケラチンが、これに加わっていた。比較系統学的に検討すると、両生類ではデスミン、爬虫類ではサイトケラチンまたはビメンチン、鳥類ではビメンチンが、尿細管上皮に比し特異的に多く存在していた。すなわち、糸球体上皮細胞の中間径フィラメントを多く有するという特徴は、種を超えて共通しており、糸球体上皮細胞の生存、機能の維持に重要であることが推定される。中間径フィラメントの役割を調べるため、ラットにおけるデスミンに注目し、病的条件下での変化を検討した。馬杉腎炎での抗血清の投与量に並行して、尿蛋白及びデスミンの発現量が増大することが示された。すでに報告したように、アミノヌクレオシド腎症でも、尿蛋白の一過性の増減に一致して、デスミンの増加減少が観察された。これらの所見は、糸球体上皮細胞の状態、特にストレスが負荷されるような状態に応じて、デスミンの増減が調節されていることを示唆している。ビメンチンについても、発生発達過程において糸球体上皮細胞の分化が完成した後になって、その発現量が増大してくることが示された。したがって、ビメンチンの発現も、糸球体上皮細胞の分化形質というよりは環境に依存することが考えられる。我々は、中間径フィラメントの糸球体上皮細胞における役割として以下の仮説を立てている。糸球体は、細動脈の中にある毛細血管であり、拍動している。また糸球体上皮細胞間にあるスリット膜を通じて約40μm/sの高速度でろ過液が噴き出している。このような環境下で糸球体上皮細胞は糸球体基底膜を被い、複数の毛細血管係蹄壁に突起を伸ばし、拍動及びろ過液によって生じる張力により、常に細胞体の歪みを余義なくされている。この歪みを引き起こす力は、血行動態が変化し、係蹄壁透過性が高まる病的状態ではさらに増大すると予想される。中間径フィラメントは、細胞骨格の中でも牽引力に対して最も強い耐性を示す。糸球体上皮細胞は中間径フィラメントを多く持つことでこのような歪みから細胞胞体を守っているものと考えている。糸球体上皮細胞が、ストレスに対しどのように反応するのかを理解するため、その第一段階として糸球体上皮細胞の特性を示す物質を検討した。(1)細胞間接着装置:degenerateprimerを用いたPT-PCRにより、現在までR-カドヘリン、プロカドヘリンが発現していることがわかった。特にR-カドヘリンは、未熟な糸球体上皮細胞にのみ発現が観察され、糸球体発生において糸球体上皮細胞が分離独立することに深く関わっている可能性が考えられた。細胞骨格:各細胞骨格成分、及びこれらと細胞膜裏うち蛋白を結び付けるプレクチンが、糸球体上皮細胞では核周囲に強染されるという他の細胞では見られない特異な分布を呈していることが見い出された。

また、中間径フィラメントのビメンチンは、糸球体上皮細胞に極端に多く発現しており、その発現量は、発生発達上、糸球体ろ過が増大する時期に一致して増大すること、及び比較系統学的に見て、糸球体ろ過の多い鳥類、哺乳類にのみ非常に多いことが分かってきた。新たな特異的蛋白質:糸球体の遺伝子ライブラリーとRNase protectionassayを組み合わせた方法により、糸球体に特異的に存在する物質としてオルファクトメディン関連蛋白質、チモシンb4等既知のものが9種、未だ報告のないものが2種類見つかってきている。今後は、ストレスのかかる条件下でこれらの物質がどのように変化してゆくかを探っていきたい。腎糸球体上皮細胞は、細胞骨格の一種である中間径フィラメントに際立った特徴があることが分かった。一般の上皮に見られないビメンチンを多量に含み、さらに、ラットではデスミン、イヌではサイトケラチンが、これに加わっていた。比較系統学的に検討すると、両生類ではデスミン、爬虫類ではサイトケラチンまたはビメンチン、鳥類ではビメンチンが、尿細管上皮に比し特異的に多く存在していた。すなわち、糸球体上皮細胞の中間径フィラメントを多く有するという特徴は、種を超えて共通しており、糸球体上皮細胞の生存、機能の維持に重要であることが推定される。中間径フィラメントの役割を調べるため、ラットにおけるデスミンに注目し、病的条件下での変化を検討した。馬杉腎炎での抗血清の投与量に並行して、尿蛋白及びデスミンの発現量が増大することが示された。すでに報告したように、アミノヌクレオシド腎症でも、尿蛋白の一過性の増減に一致して、デスミンの増加減少が観察された。これらの所見は、糸球体上皮細胞の状態、特にストレスが負荷されるような状態に応じて、デスミンの増減が調節されていることを示唆している。ビメンチンについても、発生発達過程において糸球体上皮細胞の分化が完成した後になって、その発現量が増大してくることが示された。したがって、ビメンチンの発現も、糸球体上皮細胞の分化形質というよりは環境に依存することが考えられる。我々は、中間径フィラメントの糸球体上皮細胞における役割として以下の仮説を立てている。糸球体は、細動脈の中にある毛細血管であり、拍動している。また糸球体上皮細胞間にあるスリット膜を通じて約40μm/sの高速度でろ過液が噴き出している。このような環境下で糸球体上皮細胞は糸球体基底膜を被い、複数の毛細血管係蹄壁に突起を伸ばし、拍動及びろ過液によって生じる張力により、常に細胞体の歪みを余儀なくされている。この歪みを引き起こす力は、血行動態が変化し、係蹄壁透過性が高まる病的状態ではさらに増大すると予想される。中間径フィラメントは、細胞骨格の中でも牽引力に対して最も強い耐性を示す。糸球体上皮細胞は中間径フィラメントを多く持つことでこのような歪みから細胞胞体を守っているものと考えている。
均衡サーチモデルに基づく雇用保護法制の再検討：解雇規制と労働生産性に関する考察

本研究では、正規・非正規それぞれの形態に対する解雇規制の変更が労働市場に及ぼす影響を、(1)団体的賃金交渉、(2)労働者及びジョブの異質性、(3)労働者の働く意欲、という要素に注目しながら分析を行った。これらの観点に基づき、従来の研究における主要な関心事であった雇用創出や失業率への影響に加え、解雇規制の変更が企業の採用基準や労働生産性、及び正規雇用者の労働意欲に与える影響も明らかにした。本研究を通じて、新規雇用の創出を促す政策であっても、正規雇用者の労働意欲を減退させたり労働生産性を低下させたりする可能性があることが示された。本研究の目的は、労働市場に存在する取引摩擦を考慮した均衡サーチ・モデルに基づき、解雇規制が企業の採用・解雇行動に及ぼす影響や労働生産性に及ぼす影響を分析することである。特に、(1)団体的賃金交渉、(2)労働者による努力水準の選択、(3)労働者及びジョブの異質性、に焦点を当てて分析している。現段階では下記の成果を挙げている。(1)に関して、正規・非正規雇用の存在および内生的雇用喪失を伴ったモデルを用い、正規雇用の賃金が団体交渉で決まる状況を想定して分析を行った。具体的には、正規・非正規の各雇用形態に課せられた解雇費用(解雇に伴う純粋な調整費用)が雇用創出および失業率に及ぼす影響や、正規雇用の賃金が個別的交渉により決定される場合との結果の相違、を明らかにした。得られた結果として、(a)正規雇用に課された解雇費用の減少は均衡失業率を低下させること、(b)賃金形態が団体交渉か個別的交渉かに応じて、解雇費用が労働市場に及ぼす影響に違いが生じること、が示された。(2)及び(3)については、現在進行中である。(2)に関して、伝統的な怠業理論とジョブの異質性を考慮したモデルを用い、制度的に支払いを義務付けられた退職金の変化が、企業の採用行動・労働者の労働意欲・労働生産性に及ぼす影響を考察している。現段階では、そうした退職金の引き上げがどのような状況で雇用創出を促し、また均衡失業率を低下させるかが特定されている。最後に(3)に関して、ジョブの生産性が異質かつ不完全な情報である状況を想定したモデルを用い、解雇に伴う調整費用の変化が企業の採用行動や労働生産性に及ぼす影響を考察している。ここでは、(1)と同様に正規・非正規雇用の存在を明示的に取り入れた状況下で、正規雇用に課された解雇費用の増加が正規雇用者の平均生産性を増大させることが示された。本研究課題の目的は、均衡サーチモデルに基づき、様々な形態の解雇規制が企業の採用・解雇行動や労働生産性に及ぼす影響を分析することである。その際、(1)団体的賃金交渉、(2)労働者及びジョブの異質性、(3)労働者による努力水準の選択に注目した。(1)平成25年度の前半は、団体的賃金交渉を伴ったモデルを用いて、正規・非正規の各形態の雇用に対する解雇規制の緩和が雇用喪失や均衡失業率に及ぼす影響を分析した。欧州諸国では依然として労働組合の影響力が強いが、その点を考慮した研究は数少ない。本研究では、解雇規制緩和の効果を団体的賃金交渉のケースと個別賃金交渉のケースとの間で比較し、生じる効果に違いが生じることを明らかにした。(2)平成25年度の後半から平成26年度の前半にかけては、真の生産性が不明な労働者をスクリーニングするために企業が非正規雇用を活用する状況に注目した。ここでは、企業が常に非正規形態での雇用を好むとする従来の想定とは異なり、自発的に正規形態で労働者を雇用するというより現実的な選択肢を考慮している。その上で、正規雇用に対する解雇規制の強化が正規・非正規の採用基準にそれぞれ異なる影響をもたらすこと、及び労働の生産性を上昇させることを示した。(3)平成26年度の後半は、非正規から正規への転換確率の変化や正規雇用に対する解雇規制が正規雇用者の努力選択に及ぼす影響を分析した。多くの実証研究において、非正規雇用から正規雇用への転換後に労働意欲が下がることが示されているが、そうした行動が起きる背景は理論的に明らかにされていない。ここでは、正規雇用への転換後に労働意欲が低下する状況を伴った均衡の存在を示し、合わせて、正規雇用への転換確率の上昇や解雇費用に占める退職金の割合の低下が、新規雇用の創出を減少させ、正規雇用者の労働意欲を引き出すことを示した。労働経済学最初に掲げた3つの研究課題((1)団体的賃金交渉、(2)労働者による努力水準の選択、(3)労働者及びジョブの異質性)ごとに、達成度を自己評価する。【研究課題(1)】既に一通りの分析を終えており、正規雇用の賃金が団体交渉により決まる状況下で解雇規制の影響を分析し、また個別的賃金交渉のケースとの間で生じる結論の相違を明らかにした。

その意味で、当初の予定に沿った形となっているが、労働生産性に関する分析及び退職金の影響を盛り込むことができなかったことは、想定外であった。【研究課題(2)】現在進行中の課題であり、労働者の怠業行動を取り入れた均衡サーチ・モデルを用いて研究している点は、当初の計画通りである。しかし、努力水準を連続変数として扱うことの困難に直面したこともあり、モデルの構造は計画した内容と若干異なる形となっている。【研究課題(3)】こちらも現在進行中の課題である。ほぼ主だった分析は終えており、労働者やジョブの異質性を考慮したモデルを用いて、解雇規制が企業の採用行動や労働生産性に与える影響を分析している点で、当初の計画通りである。【研究課題(2)】・退職金の変化が労働生産性に及ぼす影響を分析する上で、均衡を記述する式の複雑化により、明確な結果をもたらす条件を特定できないかもしれない。そのような問題に直面した場合は、生産性の分布を特定したり、他の関数の形を特定したりすることで対応を試みる。・試用期間の長さが政府により定められている状況を想定しているため、その期間の変化が労働市場に及ぼす影響も分析していく予定である。【研究課題(3)】・現状では、退職金ではなく純粋な調整費用としての解雇費用の影響に焦点を当てている。これに加え、企業の採用基準や雇用創出に与える影響が、解雇費用の種類に応じて異なるかも調べる予定である。・ここでは、非正規雇用の雇用継続期間が1期間であると仮定している。つまり企業は、各期の終わりに非正規雇用者を正規雇用に転換するか、それとも雇用契約を打ち切るかの選択を迫られることになる。この点に関して、関連研究で想定されているような非正規雇用契約の継続性を考慮することで、既に得られた結論がどのように変更されるかも調べる予定である。当初、2013年8月に行われた国際学会での報告を予定していたが、他の研究との兼ね合いで当該研究が思うように進展せず、応募を見送った。結果としてその分の旅費が浮いた形となり、書籍の購入や論文の英語校正に予算を計上したが、それでも若干の経費が余ることとなった。雇用保護及び有期雇用政策に関するEU諸国の取り組みを記した書籍等の購入か、論文の英語校正の費用に充てる予定である。
新生児仮死に伴う脳障害の発生機序 MRIによる低酸素性虚血性脳症の病態解析

昨年度の本研究においてラット新生仔低酸素性虚血性脳症モデルの脳内拡散係数の経時変化には、一過性低下群、二相性低下群、持続性低下群の3つのパターンが存在し、それぞれが病理組織学的に選択的神経細胞死および脳梗塞に対応することを明らかにした。本年度の研究では、二相性低下群における一過性拡散係数回復期が、therapeutic windowとなり得るか、すなわち組織学的な回復を意味しているか否かを明らかにすることを目的とした。生後3週齢SDラットの一側頸動脈を結紮し実験用MRI装置内に固定、8%の低酸素を30分間負荷し、低酸素負荷中の第1回拡散係数低下期、蘇生後の拡散係数回復期、48時間後の第2回拡散係数低下期にラットを灌流固定し、光学顕微鏡および電子顕微鏡によりその病理組織所見を検討した。第1回拡散係数低下期の光顕所見では、神経細胞核の淡明化、間質の粗鬆化が認められ、電顕にて前者は神経細胞核内のクロマチンの凝集、後者は神経細胞樹状突起の膨化に対応していることが判明した。拡散係数回復期の光顕所見では、神経細胞の萎縮、神経膠細胞の膨化、血管周囲の淡明化を認め、電顕にて神経細胞はdark neuron change、神経膠細胞ではperivascular astrocytic end-frrtの膨化が認められた。第1回拡散係数低下期の光顕・電顕所見では神経細胞のさらなる萎縮と神経膠細胞の著しい膨化が認められた。以上の所見から、一過性の拡散係数の回復は神経細胞の萎縮と神経細胞の膨化のバランスにより生じた見方け上の正常化である、神経細胞自体が回復したことを意味するものではないことが明らかとなった。したがってこの時期のtherapeutic windowとしての意義は少ないと考えられた。ラット新生仔低酸素性虚血性脳症モデルを確立し、またMRIよる脳虚血性病変の経時的変化の観察に成功した。すなわち生後3週齢SDラットの一側頸動脈を結紮し実験用MRI装置内に固定、8%の低酸素を負荷すると、頸動脈結紮側の拡散係数が低下することが確認された。コントロール群として頸動脈結紮単独群および低酸素負荷単独群においても同様の観察を行ったが、いずれも拡散係数の低下は認められなかった。頸動脈結紮および低酸素負荷群における拡散係数の推移には、低酸素15分負荷群では主として一過性低下パターンが認められ、拡散係数回復後は明らかな変化は認められなかった。しかしながら48時間後の病理組織学的検索では選択的神経細胞死が多数認められた。低酸素30分負荷群では低酸素負荷中に拡散係数が低下し、蘇生とともに回復、しかし24から48時間後に再び低下するという2相性低下パターンが認められた。この群においては病理組織学的に脳梗塞が認められた。低酸素60分負荷群では低酸素負荷中に拡散係数が低下し、蘇生後も回復しない、持続性低下パターンが主として認められ、全例が12時間以内に死亡した。病理組織学的には著明な脳の腫大を伴う脳梗塞が存在した。以上よりMRIによる脳内拡散係数の経時的変化を観察することにより、その病理学的予後を予測可能であることが明らかとなった。一過性拡散係数低下群における選択的神経細胞死がいつ、どの様な機序で(necrosis or apoptosis?)発生しているのかを明らかにすること、2相性低下群における拡散係数の一過性回復期がtherapeutic windowとなり得るかを明らかにすることが今後の課題となる。
脂質過酸化二次反応の制御に対するビタミンＥの作用機構

脂質過酸化二次反応におけるビタミンE(α-トコフェロール、TH)の役割を、ヘミン触媒によるリン脂質ヒドロペルオキシド(PLPC-OOH)の分解反応を用いて解析した。PLPC-OOHミセル溶液あるいはリポソームにヘミンを添加すると、PLPC-OOHは急激に分解して二次生成物であるヘキサナールが生じた。THはPLPC-OOHの分解を抑制できなかったが、ヘキサナール生成を抑制し、反応生成物としてTHキノン、二量体、THとPLPC-OOH由来のフリーラジカル種との付加体が認められた。以上の結果、THはPLPC-OOHから生じたフリーラジカルを捕捉して脂質過酸化二次反応を制御できることが明らかとなった。ビタミンE (E)の脂質過酸化二次反応における役割を明らかにするため、ヘミン触媒によるリン脂質ヒドロペルオキシドの分解に対するEの作用をミセル溶液で検討した。1-パルミトイル-2-リノレオイルホスファチジルコリン(PLPC)から調製したPLPC 13-ヒドロペルオキシド(PLPCOOH、0.5mM)とE (0.1mM)に、5mMデオキシコール酸ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.4)を加えてミセル溶液とした。調製したミセル溶液はヘミン(10μM)を添加して37°Cで反応させた。PLPCOOHの分解で生ずるアルデヒドは、ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体としてHPLC分析した。また、PLPCOOHとEとの反応生成物はHPLCで分取して構造解析した。PLPCOOHミセルにヘミンを作用させると、PLPCOOHは急激に分解して二次生成物であるヘキサナールが増加した。このミセル溶液にEを添加してもPLPCOOHの分解は抑制されなかったが、ヘキサナールの生成はほぼ完全に抑制された。このことから、EはPLPCOOHから生じたフリーラジカル種を捕捉することによってアルデヒド生成を抑制したものと推定した。そこで、E存在下でPLPCOOHミセルにヘミンを作用させ、反応生成物をHPLCで分取して構造解析した。その結果、主要反応生成物としてPLPCOOHから生じたアルコキシルラジカルに由来するepoxyPLPCラジカルとEとの付加体(E-epoxyPLPC)を得た。さらに本反応を経時的に調べると、E-epoxyPLPC以外にペルオキシルラジカルとの付加体も認められた。以上の結果より、Eは脂質過酸化二次反応において、脂質ヒドロペルオキシドのレドックス分解で生じたフリーラジカル種と付加体を形成することによって、アルデヒドの生成を抑制できることが明らかとなった。ビタミンE(α-トコフェロール、TH)は、フリーラジカル捕捉剤として脂質過酸化一次反応を停止させる。一方、一次反応で生じた脂質ヒドロペルオキシドは、遷移金属などによってレドックス分解を受けると毒性を示すアルデヒドなどの酸化二次生成物を生じる。THは脂質過酸化二次酸化反応に対して何らかの作用を示すと考えられるが、その詳細は不明である。そこで本研究は、ヘミン触媒によるリン脂質ヒドロペルオキシドの分解に対するTHの作用を生体膜モデルであるリポソームで検討し、脂質過酸化二次反応におけるTHの役割を明らかにすることを目的とした。1-パルミトイル-2-リノレオイルホスファチジルコリン(PLPC)にリポキシゲナーゼを作用させてヒドロペルオキシド(PLPC-OOH)を調製した。PLPC-OOHは1-パルミトイル-2-オレオイルPC(POPC)リポソーム膜に組み込み、ヘミン触媒により脂質過酸化二次反応を行った。その結果、ヘミンの添加によってPLPC-OOHの急激な分解とヘキサナール生成が認められた。本リポソーム膜にTHを組み込むと、PLPC-OOH分解速度はやや促進されたが、ヘキサナールの生成はTH量に比例して抑制された。さらにPOPCリポソーム膜におけるTH反応生成物を調べたところ、主要生成物はTH二量体とPLPC-OOHのレドックス分解で生じたepoxyPLPCペルオキシルラジカルとTHとの付加体(TOO-epoxyPLPC)であった。また、このリポソーム膜を界面活性剤で破壊すると、生成したTOO-epoxyPLPCは速やかに分解されてTHキノンが検出された。以上の結果より、リポソーム膜において、THは脂質ヒドロペルオキシドのレドックス分解で生じたフリーラジカル種と反応して安定な付加体を形成することで、脂質過酸化二次反応の最終産物であるアルデヒド生成を抑制できることが明らかとなった。ビタミンE(E)は、生体内抗酸化剤として脂質ペルオキシラジカルに水素を供与して脂質ヒドロペルオキシド(LOOH)とし、脂質連鎖反応を停止させる。