hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト歯髄幹細胞を用いた新規三次元骨再生医療戦略

【目的】研究代表者らがこれまでに見出してきた骨形成シグナルに関する基礎的知見と骨形成低分子化合物群に関する知識を集約させ、さらに発展・融合させることで、我々の日常診療において遭遇する抜去歯からのヒト歯髄幹細胞をソースとした高効率な骨芽細胞への分化誘導を行い、採取が容易である自家細胞を用いた新たな三次元骨再生医療戦略へとつなげることを本研究の目的とした。【方法・結果】前年度までに導き出したヒト歯髄幹細胞の高効率・安定的な骨分化法の開発をより効率よく行えるように検討を行った。また、ヒト歯髄幹細胞と骨髄間葉系幹細胞、BMP2(増殖因子)と低分子化合物であるヘリオキサンチン誘導体(TH)での骨分化誘導能の比較検討を行った。その結果、骨髄間葉系幹細胞と比較し、ヒト歯髄幹細胞の方が高い増殖能および骨分化導能を有することが明らかとなった。また、BMP2添加群と比較してTH添加群のヒト歯髄幹細胞の方がRunx2, Alp, Colla1, Osteocalcinの発現が有意に上昇することを確認した。in vivo実験においては、前年度までに免疫不全マウスの頭頂骨臨界骨欠損マウスにヒト歯髄幹細胞シート移植し、マイクロCT,骨濃度、密度、およびHE染色、Masson Trichrome染色より、TH添加群で有意な骨形成能を確認できた。本年度の予定であった免疫不全ラット骨欠損モデルにおける検討までには至らなかった。【考察】本研究の目的であった、ヒト歯髄幹細胞の高効率な骨芽細胞誘導法(低分子化合物TH添加方法)を開発でき、in vivo実験により骨再生能を確認できた。【目的】応募者らがこれまでに見出してきた骨形成シグナルに関する基礎的知見と骨形成低分子化合物群に関する知識を集約させ、さらに発展・融合させることで、我々の日常診療において遭遇する抜去歯からのヒト歯髄幹細胞をソースとした高効率な骨芽細胞への分化誘導を行い、採取が容易である自家細胞を用いた新たな三次元骨再生医療戦略へとつなげることが本研究の目的である。ヒト歯髄幹細胞の高効率な骨芽細胞への誘導法の開発とその分子メカニズムの探求、生体内への応用のための適切な担体の選択と検証までを包括的に行うことで、安全かつ効率的なヒト歯髄幹細胞による歯槽骨を含む骨再生医療のための基礎技術を開発したいと考えている。【方法・結果】1.ヒト歯髄由来幹細胞の高効率的・安定的な骨分化法の開発:骨髄間葉系幹細胞にて骨芽細胞へと分化誘導が報告されている低分子化合物、ヘリオキサンチン誘導体(TH))を使用することにより高効率かつ、安価で安全性の高いヒト歯髄幹細胞の骨芽細胞分化誘導法が確立できると仮定して、THによる誘導期間・濃度(10-810-5M)を含めて検討し、歯髄幹細胞における骨芽細胞誘導条件の最適化を検討した。その結果、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、リアルタイムPCRにより、至適濃度は、10-6Mであることが分かった。さらに、TH添加によりALP,ColI、Osteocalcinなどの骨芽細胞マーカーの発現の有意な上昇を認めた。2.ヒト歯髄幹細胞由来骨芽細胞の三次元培養法の確立1で得られたヒト歯髄幹細胞由来骨芽細胞を三次元培養へと導き、移植片の作製を開始した。三次元培養には、シート培養を用いた。シート培養には温度応答性培養皿(Up Cell&reg;)を用いてヒト歯髄由来骨芽細胞シートを作成した。今後は、さらなる検討を行ってより安定した三次元骨再生法の開発を目指す。これまでに報告があるヒト歯髄幹細胞からの骨芽細胞誘導法よりもヘリオキサンチン誘導体(TH))を使用することにより高効率かつ、安価で安全性の高いヒト歯髄幹細胞の骨芽細胞分化誘導法が確立できた。研究立案当初は、テトラポット型α-TCP微小人工骨を用いて三次元培養を行うこととしていたが、シート状培養を積層させ三次元培養を行うことに成功した。よって、計画通りに研究が遂行できている。【方法・結果】初年度に引き続き、1.ヒト歯髄幹細胞の高効率・安定的な骨分化法の開発を行った。低分子化合物であるヘリオキサンチン誘導体(TH)を使用することにより高効率な骨分化誘導法を確立した。至適濃度は、10-6Mであり、qPCRによりTH添加群においてRunx2, Alp, Colla1, Osteocalcinの発現が有意に上昇することを確認した。2.ヒト歯髄幹細胞由来骨芽細胞の三次元培養法の確立を温度応答性培養皿を用いてシート状培養を行った。3.積層したヒト歯髄幹細胞由来骨芽細胞シートを免疫不全マウスの頭頂骨臨界骨欠損マウスを作成し移植実験を行った。マイクロCT,骨濃度、密度、およびHE染色、Masson Trichrome染色より、TH添加群で有意な骨形成を認め、その概要を国際英文誌(Stem Cell Res Ther, 2018)に報告した。

計画当初はテトラポット型α-TCP微小人工骨を用いて三次元培養を行う予定だったが、低分子化合物(TH)を用いることで高効率な骨芽細胞誘導法を確立し、シート培養を積層することで三次元培養に成功した。また、免疫不全マウスの頭頂骨臨界骨欠損マウスへの移植実験を行いTH添加群で有意な骨形成能が確認できたため、計画以上に進んでいる。【目的】研究代表者らがこれまでに見出してきた骨形成シグナルに関する基礎的知見と骨形成低分子化合物群に関する知識を集約させ、さらに発展・融合させることで、我々の日常診療において遭遇する抜去歯からのヒト歯髄幹細胞をソースとした高効率な骨芽細胞への分化誘導を行い、採取が容易である自家細胞を用いた新たな三次元骨再生医療戦略へとつなげることを本研究の目的とした。【方法・結果】前年度までに導き出したヒト歯髄幹細胞の高効率・安定的な骨分化法の開発をより効率よく行えるように検討を行った。また、ヒト歯髄幹細胞と骨髄間葉系幹細胞、BMP2(増殖因子)と低分子化合物であるヘリオキサンチン誘導体(TH)での骨分化誘導能の比較検討を行った。その結果、骨髄間葉系幹細胞と比較し、ヒト歯髄幹細胞の方が高い増殖能および骨分化導能を有することが明らかとなった。また、BMP2添加群と比較してTH添加群のヒト歯髄幹細胞の方がRunx2, Alp, Colla1, Osteocalcinの発現が有意に上昇することを確認した。in vivo実験においては、前年度までに免疫不全マウスの頭頂骨臨界骨欠損マウスにヒト歯髄幹細胞シート移植し、マイクロCT,骨濃度、密度、およびHE染色、Masson Trichrome染色より、TH添加群で有意な骨形成能を確認できた。本年度の予定であった免疫不全ラット骨欠損モデルにおける検討までには至らなかった。【考察】本研究の目的であった、ヒト歯髄幹細胞の高効率な骨芽細胞誘導法(低分子化合物TH添加方法)を開発でき、in vivo実験により骨再生能を確認できた。今後は、ヒト歯髄幹細胞由来骨芽細胞シートを積層し、下記研究を行う予定である。1免疫不全マウスの頭頂骨臨界骨欠損モデルを用いた移植実験および骨分化誘導の確認、評価免疫不全マウスを用いて、マウス頭頂骨臨界骨欠損モデルを作製する。このモデルは、単純な骨欠損形態での骨再生の評価に利用され、骨再生能の基礎的な評価にも適している。応募者らは、先行研究に基づき、直径4mmの全層欠損がマウス頭頂骨における臨界骨欠損となりうることをすでに確認し報告している(FASEB J, 2007, Mol Ther, 2007)。このモデルを用いて歯髄由来骨芽細胞とテトラポット型α-TCP型微小人工骨との三次元骨移植片の骨再生誘導に関する基礎的な知見を得る。移植後、4、6、8週の時点でマイクロCTによる3次元的な画像評価を行う。さらに、組織切片を作製し、HE染色、各種骨基質タンパク質(I型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシンなど)に対する免疫染色、in situ hybridizationによる骨芽細胞分化に重要な転写遺伝子(Runx2, osterixなど)の発現解析も行い骨再生を評価する。今後は、これまでの手法を生かして、免疫不全ラットへの応用を目指し、in vivoでの評価を中心に行っていく。一時期、細胞のコンタミネーションが続き、一度細胞をリセットしたため、実験ができない時があった。そのため、研究費の使用が減ったため。
視床下部ペプチドー扁桃体モノアミン神経性協調動態からみた習慣飲酒形成の機序解明

ドパミン-セロトニン放出とグレリン神経系の相互関係について習慣飲酒モデル動物を用いて検討した。習慣モデルマウスは1、3月齢マウスにおいてアルコール投与により血中グレリン濃度は有意に増加した。習慣飲酒モデルマウスの視床下部外側野GHSR mRNA発現は対照群に比較して有意に増加した。習慣飲酒形成マウスの視床下部外側野GHSRタンパク量はGHSR mRNA発現量同様に増加した。習慣群はアルコール投与により視床下部外側野DA及び5HT放出が有意に増加した。習慣飲酒モデルマウスは視床下部外側野GHSR抗体陽性細胞の増加が認められ,偏桃体中心GHSR抗体陽性細胞の増加も認められた。グレリンは、GHS-R (growth hormone secretagogue receptor :成長ホルモン分泌促進因子受容体)のリガンドとして発見された。グレリンシグナルは、血液脳関門通過弓状核系と迷走神経求心路孤束核延髄系がある。前者は視床下部外側野、後者は尾側延髄腹外側を介してPeriaqueductal gray (PAG)に連絡している。我々は既にアルコール依存形成機序形成に縫線核を含む腹側被蓋野ー側坐核脳報償系、特に側坐核5-HT_<2c>受容体亢進が大きく関与していることを発表した(基盤B 17390203)。平成24年度において習慣飲酒モデル動物におけるアルコール摂取後のin vivo視床下部グレリン放出とモノアミン放出変動の相互関係を神経薬理学的に検討した。実験I : 1,3,10月齢雄マウスにアルコール3g/kg i.p.投与した。対照群の血中グレリンは加齢とともに減少した。1,3月齢アルコール投与群のグレリンは対照群に比較して有意に減少した。実験II : 1,3,10月齢で約20日間アルコール蒸気吸入装置内飼育し、その後自発アルコール摂取量増加を確認した個体を習慣飲酒モデル動物とした。1,3月齢の習慣飲酒モデルマウスのグレリンはアルコール投与後有意に増加した。実験III:正常飼育マウスにペプチド回収プローブガイドカニューレを視床下部に挿入固定し、アルコール投与によるin vivo(無拘束無麻酔)視床下部グレリン放出をpush-pull法により測定した。アルコール投与後4時間視床下部グレリン放出増加が認められた。実験IV :アルコール吸引1日マウスは、アルコール投与80分後にドパミン放出の増加を認めた。視床下部セロトニン放出に有意な変化は認められなかった。一方習慣飲酒モデル動物は、in vivo視床下部ドパミン及びセロトニン放出増加がアルコール投与早期から認められ、各神経性賦活が示唆された。実験V :習慣飲酒モデル動物のGHS-RlAmRNA発現増加が著名に認められた。習慣飲酒形成においてPAGを介した脳報償系セロトニン神経系賦活を伴う視床下部ドパミン放出亢進とグレリンシグナル感受性増加を示す神経協調が認められた。アルコール依存症改善へのグレリン受容体アンタゴニストの臨床応用が示唆された。グレリンは、オーファンGPCRの1つであるGHS-R(growth hormone secretagogue receptor:成長ホルモン分泌促進因子受容体)のリガンドとして発見された。実験I:マウス(C57BL/6J)を用いて,アルコール吸入曝露1日(習慣飲酒未形成モデル)と20日間アルコール吸入曝露(習慣飲酒形成モデル:自発アルコール嗜好性上昇確認)を作成した。マウスの視床下部にガイドカニューレ(PEG-6)を固定し、その後術後回復良好個体にプローブ(PEP-6)を挿入した。In vivo push-pull法(AtmosLM、エイコム)により0.15% BSAを灌流(1μL/mL)し、3時間後アルコール2 g/kg i.p.投与した。アルコール投与前後の視床下部灌流液中活性グレリンをELISAキットにより測定した。実験II:I同様の方法でモデル動物を作成し、アルコール投与(2 g/kg i.p.)による視床下部ドパミンとセロトニン放出をBMD法により検討した。実験I:両群のマウスにおいて、アルコール投与後4時間視床下部外側野グレリン放出増加が認められた。実験II:アルコール吸入1日のマウス(習慣飲酒未形成モデル)は、アルコール投与80分後にドパミンのみ放出増加を認めた。一方習慣飲酒モデルは、in vivo視床下部外側野ドパミン及びセロトニン放出増加がアルコール投与直後から認められ、各神経性賦活が示唆された。習慣飲酒形成において、PAGを介した脳報償系セロトニン神経賦活を伴う視床下部ドパミン放出亢進とグレリンシグナル活性を示す神経協調が認められた。アルコール依存形成機序にグレリン受容体とセロトニン神経の相関が強く示唆された。習慣飲酒モデルマウス(C57BL/6J系)における視床下部外側野および扁桃体GHS-R1A受容体免疫組織化学的検討を行った。習慣飲酒未形成(1 day)群と習慣飲酒形成(20 days)群を作成し、リン酸バッファーパラホルムアルデヒド灌流固定後、脳を摘出した。各脳をクリオスタットを用いて16μに薄切し、リン酸バッファー内に浸漬させスライドグラス上に移した。一部の薄切脳片試料をAChE(アセチルコリンエステラーゼ染色を行い目的脳部位視床下部外側野及び扁桃体部位を細胞組織学的に同定した。

GHS-R1A抗体を用いた免疫組織化学的検討の結果、アルコールナイーブ群及び習慣飲酒未形成(1 day)におけるLH GHS-R1A陽性細胞発現に差は認められなかった。一方習慣飲酒形成(20 days)群モデルマウスのLH及び扁桃体中心核(cAMY)部位のGHS-R1A陽性細胞が有意に増加していることを認めた。習慣飲酒形成時におけるグレリン神経受容体発現増加が認められた。アルコール投与によりLHグレリン神経系賦活作用が認められた。習慣飲酒モデルマウス視床下部外側野のグレリン受容体(GHS-R1A)の変化:習慣飲酒未形成マウスと比較して、習慣飲酒形成(20 days)モデルマウスのLH GHS-R1A mRNA発現は有意に増加した。同時にWestern BlottingによりLH GHS-R1A受容体タンパク量の増加を確認した。習慣飲酒モデルマウス視床下部外側野におけるドパミン、セロトニン放出変化:アルコール2g/kg腹腔投与により習慣飲酒未形成(1 day)マウスにおけるLH DA放出は増加した。一方習慣飲酒形成モデル(20 days)マウスのLH DA及び5-HT放出は有意に増加した。習慣飲酒形成にLH 5-HT神経系活性の関与が認められた。まとめ:習慣飲酒形成において視床下部外側野のグレリン神経系とセロトニン神経系の活性が認められた。習慣飲酒形成に脳報償系を構成する扁桃体と視床下部外側野の神経協調が示唆された。1視床下部外側野における成長ホルモン分泌促進因子受容体(GHSR)mRNA発現変化:習慣飲酒モデルマウスの視床下部外側野GHSR mRNA発現は対照群に比較して有意に増加した。非習慣飲酒モデルマウスには変化は認められなかった。2習慣飲酒モデルマウスにおけるGHSRタンパク量変化:対照群に比較してアルコール蒸気吸入習慣飲酒形成マウスの視床下部外側野GHSRタンパク量はGHSR mRNA発現量同様に増加した。3アルコール・ナイーブC57BL/6Jマウスの視床下部外側野DA, 5-HT放出変化:視床下部外側野のアルコール灌流刺激においてDA放出は増加した。5-HT放出の変化は認められなかった。視床下部外側野DA神経系のアルコール感受性が認められた。4非習慣飲酒モデルマウスにおけるアルコール投与による視床下部外側野DA, 5-HT放出変化:アルコール投与80120分後DA放出増加が認められた。一方5-HT放出変化は認められなかった。5習慣飲酒モデルマウスにおけるアルコール投与による視床下部外側野DA, 5-HT放出変化:アルコール投与により視床下部外側野DA放出は長期的に有意に増加した。また同時に5-HT放出の有意な増加を示した。5-HT放出は習慣飲酒形成機序における特異性であることを認めた。6モデルにおける視床下部GHSR受容体免疫組織化学的検討:習慣飲酒モデルマウスは、非習慣飲酒モデルマウスに比較して視床下部外側野GHSR抗体陽性細胞の増加が認められた。7モデルにおける偏桃体GHSR受容体免疫組織化学的
銀河系外活動天体の宇宙論的役割の研究

本研究課題の目的は、活動銀河核(AGN)・ガンマ線バースト(GRB)・高速電波バースト(FRB)などの銀河系外活動天体の宇宙論的役割について、多角的な研究を推進することである。平成30年度の主な成果は以下の通りである。1. IceCube天文台によって検出された高エネルギーニュートリノIC-170922Aの対応天体として、明るいブレーザー(ジェットを伴う活動銀河核の一種)TXS 0506+056が発見された(IceCube, Fermi-LAT, MAGIC Collaboration et al)。これを受け、このブレーザーのマルチメッセンジャー観測(多波長電磁波およびニュートリノの観測)の整合的な解釈として、ジェットの空間構造を考慮した理論モデルを構築した(Ansoldi, Bernardini, Bhattacharya, Inoue et al.)。2.上記観測の解釈として、いくつか別の可能性も検討し、ガンマ線においてハドロン放射が卓越するモデル(Cerruti, Zech, Inoue et al.)や、外部種光子による逆コンプトン放射モデル(Righi, Tavecchio & Inoue)なども提唱した。3.中性子星連星合体GW170817の重力波・電磁波による発見を受け、中性子星合体におけるr過程重元素合成の検証方法として、X線高分散分光観測の可能性を提唱した(論文準備中)。4.高エネルギーガンマ線観測を推進するMAGIC Collaborationにおいて、突発天体サイエンスグループのリーダーとして、上記以外にもGRB、FRB、AGNなどの観測および理論解釈を進め、最新の成果を国際会議などで発表した(各論文準備中)。交付申請時の研究実施計画では、1) AGNウィンド・フィードバックに伴う非熱的放射、および2) FRBの電波分散を用いた宇宙再電離の探査法、が二つの大きな課題であった。1)に関しては、最初の論文を完成し、引き続き他の側面の研究も継続中である。2)については論文の完成が遅れている一方、平成30年度中には、当初予想していなかった大きな観測的進展として、MAGIC望遠鏡によるGRBからのTeVガンマ線の発見があった。この進展を受けて新たな研究を開始したため、すでに進行中であったFRBの研究がやや遅れることとなった。まず、遅れている、FRBを用いた宇宙再電離探査に関する論文や、中性子星連星合体におけるr過程元素合成のX線による診断法の論文を完成させる。さらに、平成30年度中に開始した、GRBのTeVガンマ線放射の研究を進展させ、論文を完成させる。その後、当初の平成30年度以降の研究計画にあった、AGNウィンドにおける超高エネルギー宇宙線加速や、非熱的放射を通じた銀河フィードバック機構の探査などの課題に取り組む。平成29年度の主な成果は以下の通りである。1. AGNウィンドと母銀河の星間ガスが相互作用する際、強い衝撃波の生成と、高エネルギー粒子加速・非熱的放射が予想される。我々は、衝撃波の二温度性やガス冷却の効果まで考慮した新たなモデルを構築し、起源が未解明のガンマ線背景放射およびニュートリノ背景放射へのAGNのウィンドの寄与を詳細に調べた。その結果、一部のエネルギー帯では卓越した寄与が可能であることがわかった(Liu, Murase, Inoue et al. 2018)。2.天の川銀河系では、現在でも階層的構造形成に伴う物質降着がある程度継続していると考えられ、それはhigh velocity cloudと銀河面との衝突現象として現れるはずである。その際起きる宇宙線加速と非熱的放射を評価し、未同定GeV-TeVガンマ線源のうち、少なくとも一部の天体の性質をうまく説明できることがわかった(Inoue et al. 2017)。3.近年発見されたFRBは、宇宙再電離を探る新たな手法として有望である。我々は、将来的なFRBの電波分散効果の観測を通じて、水素・ヘリウム双方の再電離履歴を探れる可能性を検討し、ある条件では、最近話題となっている低光度クエーサーの寄与と進化について、新たな示唆が得られることを示した(Inoue et al.,論文準備中)。4.高エネルギーガンマ線観測を推進するMAGIC Collaborationにおいて、突発天体サイエンスグループのリーダーとして、GRB、FRB、AGNなどの観測および理論解釈を進め、最新の成果を国際会議などで発表した(各論文準備中)。交付申請時の研究実施計画では、1) AGNウィンド・フィードバックに伴う非熱的放射、および2) FRBの電波分散を用いた宇宙再電離の探査法、が二つの大きな目的であった。2)については、論文の完成が遅れているが、研究計画全体としては、おおむね順調に進展しているといえる。一方で、平成29年度中には、当初予想していなかった大きな観測的進展が二つあった。中性子星連星合体GW170817の重力波・電磁波による発見、および高エネルギーニュートリノIC-170922Aの対応天体としてのブレーザー(活動銀河核の一種)TXS 0506+056の発見である。これらの進展を受け、それぞれに関して新たな研究を開始したため、すでに進行中であった2)の研究がやや遅れることとなった。

本研究課題の目的は、活動銀河核(AGN)・ガンマ線バースト(GRB)・高速電波バースト(FRB)などの銀河系外活動天体の宇宙論的役割について、多角的な研究を推進することである。平成30年度の主な成果は以下の通りである。1. IceCube天文台によって検出された高エネルギーニュートリノIC-170922Aの対応天体として、明るいブレーザー(ジェットを伴う活動銀河核の一種)TXS 0506+056が発見された(IceCube, Fermi-LAT, MAGIC Collaboration et al)。これを受け、このブレーザーのマルチメッセンジャー観測(多波長電磁波およびニュートリノの観測)の整合的な解釈として、ジェットの空間構造を考慮した理論モデルを構築した(Ansoldi, Bernardini, Bhattacharya, Inoue et al.)。2.上記観測の解釈として、いくつか別の可能性も検討し、ガンマ線においてハドロン放射が卓越するモデル(Cerruti, Zech, Inoue et al.)や、外部種光子による逆コンプトン放射モデル(Righi, Tavecchio & Inoue)なども提唱した。3.中性子星連星合体GW170817の重力波・電磁波による発見を受け、中性子星合体におけるr過程重元素合成の検証方法として、X線高分散分光観測の可能性を提唱した(論文準備中)。4.高エネルギーガンマ線観測を推進するMAGIC Collaborationにおいて、突発天体サイエンスグループのリーダーとして、上記以外にもGRB、FRB、AGNなどの観測および理論解釈を進め、最新の成果を国際会議などで発表した(各論文準備中)。交付申請時の研究実施計画では、1) AGNウィンド・フィードバックに伴う非熱的放射、および2) FRBの電波分散を用いた宇宙再電離の探査法、が二つの大きな課題であった。1)に関しては、最初の論文を完成し、引き続き他の側面の研究も継続中である。2)については論文の完成が遅れている一方、平成30年度中には、当初予想していなかった大きな観測的進展として、MAGIC望遠鏡によるGRBからのTeVガンマ線の発見があった。この進展を受けて新たな研究を開始したため、すでに進行中であったFRBの研究がやや遅れることとなった。まず、遅れているFRBを用いた宇宙再電離探査に関する論文を完成させる。さらに、平成29年度中に開始した二つの新たな課題、1)中性子星連星合体におけるr過程元素合成のX線による診断法、および2)ブレーザー天体における超高エネルギー宇宙線加速とニュートリノ放射について、研究を進展させ、論文を完成させる。その後、当初の平成30年度以降の研究計画にあった、AGNウィンドにおける超高エネルギー宇宙線加速や、非熱的放射を通じた銀河フィードバック機構の探査などの課題に取り組む。まず、遅れている、FRBを用いた宇宙再電離探査に関する論文や、中性子星連星合体におけるr過程元素合成のX線による診断法の論文を完成させる。さらに、平成30年度中に開始した、GRBのTeVガンマ線放射の研究を進展させ、論文を完成させる。
ソリトン方程式の内部対称性とその応用

Adler-van Moerbekeと共同で、行列積分と組合わせ論の種々の問題を考察した。その中である種のvicious walkの数を数える公式を得た。Schottky問題に対する、Krichever理論に基づき、しかしアーベル多様体上での複素解析を使わない初等的なアプローチで、KP方程式系に属する有限個の微分方程式による特徴付けの詳細を得た。Soliton理論との関係で最近注目されているrandom permutation, random word等の問題については、行列積分との関連についてOkounkov等の仕事があり、また直線(ZまたはN)上のvicious (non-intersecting) random walkとの関係についてForrester等により研究されているが、比較的新しい研究の方向であるので、既知のアプローチとは別の、よりsoliton理論の視点に近いアプローチが可能であろうと期待し、Mark Adler, P. van Moerbekeと共同で、その方向で研究を行い、またより広いクラスの組み合わせ論的問題の、soliton理論との関係を明らかにすることを試みた。このような観点からsoliton方程式と組合わせ論の関連について考察したが、特にvicious random walkと行列積分の関連を考察するため、直線上のいくつかのvicious random walkに対して組み合わせ論的考察を行い、Forrester等の結果と一部重複する部分的な結果を得た。これまでのこの分野での研究と同じく、基本的な道具としてRobinson-Shenstead-Knuth対応等を用いているが、Stanley等によるCauchyの公式の一般化や母関数のより巧妙な利用などの組み合わせ論的手法を取り入れ、概念的な流れをより明らかにすることを目指した。Solitgn理論との関係で注目されているrandom permutation, random word等の問題については,行列積分との関連についてOkounkov等の仕事があり,また直線(ZまたはN)上のvicious (non intersecting) random walkとの関係についてForrester等により研究されている.われわれはMark Adler, P. van Moerbekeと共同で,よりsoliton理論の視点に近いアプロチを求めて研究し,またより広いクラスの組み合わせ論的問題の,soliton理論との関係を明らかにすることを試みた.特にvicious random walkと行列積分の関連を考察するため,直線上のいくつかのvicious random walkに対して,組み合わせ論的考察を行い,Forrester等の結果と一部重複する結果を得た.またshifted Schur measureに関するTracy-Widomのstrict partitionsに対するCauchy-Binet型公式の左辺に現れる量が,A. OrlovによるBKP方程式系の超幾何型の有理解の特別の場合として表されることに注目した.ここでTracy-Widomの注目する極限定理を得るためには,分割に現れる数【less than or equal】hとして,hを離散変数とする何らかの可積分格子と関連づけることが望まれる.BKP方程式系を自然に含む格子が存在しないこともあって,この点についてはまだ分かっていないが,有理解であることから代数幾何的なアプローチも視野にいれて研究の方向を探っている段階である.基本的な道具としてRobinson-Shenstead-Knuth対応とその一般化を用いているが,Stanley等によるCauchyの公式の一般化や母関数のより巧妙な利用などの組み合わせ論的手法を取り入れ,概念的な流れをより明らかにすることを目指した.
ヘパラン硫酸6O-硫酸基転移酵素によるアルツハイマー病進行仮説の検証

アミロイド前駆体タンパク質からアミロイドβペプチドを切り出し、アルツハイマー病の進行に関与するとされる酵素であるβセクレターゼの活性が阻害された場合、ヘパラン硫酸6O-硫酸基転移酵素は小胞体に蓄積した。このとき、ヘパラン硫酸6O-硫酸基転移酵素とアミロイド前駆体タンパク質は共局在し、両者の相互作用が免疫沈降法により確認された。よってアミロイド前駆体タンパク質がヘパラン硫酸6O-硫酸基転移酵素の局在を調節する因子である可能性が示された。ヘパラン硫酸はウロン酸とグルコサミン残基の繰り返し構造を持ち、様々な硫酸化の修飾を受ける。ヘパラン硫酸硫酸基はヘパラン硫酸が機能を発揮する上で中心的な役割を担っており、硫酸化反応を制御することは、ヘパラン硫酸の生理活性を制御する重要なステップであると考えられる。グルコサミン残基の6位に硫酸基を転移する酵素(HS6ST)はゴルジ体ではたらく酵素であるにもかかわらず、培養上清や血清中に活性が見いだされ、細胞外への分泌が硫酸基のレベルを制御している可能性が考えられた。そこで我々はHS6STの細胞外分泌を制御するメカニズムについて研究を着手した。興味深いことにHS6STの3つのアイソフォームの中で、HS6ST3のみがβセクレターゼの阻害剤で細胞を処理することにより細胞外への分泌が抑制された。また、HS6ST3を発現させた細胞をβセクレターゼの阻害剤で処理するとヘパラン硫酸の6位の硫酸基が増加した。界面活性剤Triton X-114を用いた層分離アッセイ法によりHS6ST3は膜に結合しない可溶性のタンパク質として細胞内で存在することが確認されたことから、HS6ST3は分泌初期の段階で膜貫通領域を失い、βセクレターゼ活性に依存した機構により細胞外に分泌されると考えられる。HS6ST3の分泌に関わる因子を同定するために、HS6ST3-GFPを細胞に発現させ、抗GFP抗体で免疫沈降した後、相互作用するタンパク質を銀染色→ペプチドマスフィンガープリント法により同定した。現在候補タンパク質がいくつか同定されており、これらのタンパク質にタグを付けて細胞内に発現させ、HS6ST3と相互作用するか否かを調べている段階である。平成19年度において申請者はβセクレターゼ活性が阻害されたときのHS6ST3蓄積部位について検討した。HS6ST3-GFPは定常状態ではゴルジ体のマーカータンパク質であるGM130とco-localizeするが、βセクレターゼインヒビターZ-VLL-CHOで6時間細胞を処理した後では細胞内に広範囲に広がった局在を示す。このときゴルジ体マーカーGM130、小胞体マーカーPDI、エンドソームマーカーであるEEA1との局在を比較したところ、小胞体マーカーのPDIと良くco-localizeしていた。また、HS6ST3-GFPのゴルジ体への移行が起こっているかどうかについて調べるために35Sメチオニンを用いたPulse-chaseの実験を行ったところ、Z-VLL-CHOを添加しないコントロールでは60分経過するとEndoH resistantのバンドが現れるが、Z-VLL-CHO添加した場合はEndoH sensitiveのままであった。このことからもβセクレターゼの活性を阻害することによりHS6ST3-GFPが小胞体に留まっていると考えられる。また、βセクレターゼの基質の一つであるアミロイド前駆体タンパク質(APP)がHS6ST3-GFPの細胞内局在に影響を与える因子として働くかについて検討した。その結果、HS6ST3-GFPとAPPは局在の一致が観察された。しかしながら、抗GFP抗体で免疫沈降を行い、抗APP抗体でウエスタンブロッティングを行ってもAPPのバンドは検出されず、両者が相互作用しているという証拠を得ることができなかった平成19年度に引き続き、平成20年度において申請者はHS6ST3-GFPとアミロイドβ前駆体タンパク質APPが相互作用している可能性についてさらに検討を進めた。複数の条件でHS6ST3・GFPを強制発現させた細胞株において抗GFP抗体で免疫沈降を行い、抗APP抗体でウエスタンブロッティングを行ったところ、一つの条件下で両者の相互作用を観察することができた。このことからAPPがHS6ST3-GFPの細胞内局在を調節する因子として機能している可能性が考えられた。この可能性について検証するためにKDEL配列をC末端に融合させた小胞体局在型のHS6ST3-GFP(KDEL)の発現ベクターを作製した。この発現ベクターをCHO細胞に強制発現させ、APPの細胞内局在がHS6ST3とともに小胞体に移行するか否かを検討したが、APPはHS6ST-GFP(KDEL)と共発現させてもゴルジ体に局在していた。APPの他にHS6ST3-GFPと相互作用する因子を同定するためにHS6ST3-GFP発現細胞株の細胞抽出液を抗GFP抗体で免疫沈降し、共に溶出してきたタンパク質についてペプチドマス・フィンガープリント法により同定を試みた。

その結果、ミオシンやアクチンの重合を形成するタンパク質など、細胞内輸送に関わると考えられるタンパク質が複数同定された。これらのタンパク質がHS6ST3-GFPの細胞内局在に果たす役割については今後詳細に検討する必要があると考えられる。
開鼻声値から算出される鼻咽腔閉鎖圧を用いた鼻咽腔機能評価法の開発と基準値の設定

嚥下障害,構音障害のリハビリテーションにおいて,鼻咽腔閉鎖機能の評価は重要である。その評価方法として,従来は構音検査,鼻咽腔内視鏡検査,ビデオX線造影(VF)などが利用されてきた。しかし,構音検査,画像検査は評価者の聴覚的,視覚的判定に依存し,客観的とは言い難い。これらの欠点を補うものとして開鼻声値測定による評価に着目し,研究してきた。一方,鼻咽腔閉鎖の動態を観察する方法として,鼻咽腔内視鏡は視覚的に捉えやすいが,定量化が困難である。そこで数値に表現できる評価法として鼻咽腔閉鎖圧に着目した。NSと鼻咽腔閉鎖圧(以下,VPと記す)の相関が見出せれば,これまで定量化できなかった鼻咽腔動態を,NSを用いて表現できると考えた。本研究は,構音障害,嚥下障害の原因となる鼻咽腔閉鎖不全を簡便かつ客観的に評価できるようにすることを目標に,健常者の鼻咽腔閉鎖機能を開鼻声値(nasalance score,NS)および鼻咽腔閉鎖圧(velopharyngeal pressure,VP)を計測してNSとVPの相関性を捉え,評価基準値を設定することを目指すものである。NSとVPの相関性を利用し,患者のNS測定によりVPが換算できるようになることで,鼻咽腔閉鎖不全による構音障害の評価のみならず,嚥下障害で問題となるVPの評価も同時に行うことができると考えている。方法は,NS測定においては,ナゾメーターのマイクを装着し,サンプル音・文章を発話してもらい,その際のNSを測定する。VP測定においては,鼻腔に表面麻酔を噴霧し,センサーカテーテルを挿入し,圧測定できることを確認した後,サンプル音・文章発話時と水3ml嚥下時のVPを測定する。NSとVPのデータから,双方の相関性の有無を統計学的手法を用いて分析する。相関が明らかになれば,NSからVPが予測できると考える。本研究には,開鼻声値を計測するナゾメーターと,鼻咽腔閉鎖圧を計測するセンサーカテーテルとその計測装置が必要である。ナゾメーターは既存のものを使用する準備が整っているが,鼻咽腔閉鎖圧を計測するセンサーを含めた計測装置は,初年度の予算では購入が困難であったため,次年度の予算と合わせて購入することとした。センサーカテーテルとその計測装置を購入されれば研究は進められる。鼻咽腔閉鎖圧を計測するセンサーを含めた計測装置を購入することで研究計画が進められると考えている。また,被験者として参加する健常者を募り,十分説明の上,協力してもらう予定である。開鼻声値測定は非侵襲で計測手技も容易であるが,鼻咽腔閉鎖圧測定は鼻腔からセンサーカテーテルを挿入する操作があり,まったく侵襲性がないとは断言し難い。センサーカテーテル挿入による嘔気や,カテーテルと鼻腔粘膜との接触による鼻出血の可能性などに留意する必要がある。そのため,被験者には十分な説明を行い,有害事象が起こったときの対処法を準備する必要があるとともに,被験者の選定には出血傾向のある患者や鼻疾患の患者の除外を行う必要があり,その点についても注意する。

センサーカテーテルとその計測装置を購入されれば研究は進められる。鼻咽腔閉鎖圧を計測するセンサーを含めた計測装置を購入することで研究計画が進められると考えている。また,被験者として参加する健常者を募り,十分説明の上,協力してもらう予定である。開鼻声値測定は非侵襲で計測手技も容易であるが,鼻咽腔閉鎖圧測定は鼻腔からセンサーカテーテルを挿入する操作があり,まったく侵襲性がないとは断言し難い。センサーカテーテル挿入による嘔気や,カテーテルと鼻腔粘膜との接触による鼻出血の可能性などに留意する必要がある。そのため,被験者には十分な説明を行い,有害事象が起こったときの対処法を準備する必要があるとともに,被験者の選定には出血傾向のある患者や鼻疾患の患者の除外を行う必要があり,その点についても注意する。本研究には,開鼻声値を計測するナゾメーターと,鼻咽腔閉鎖圧を計測するセンサーカテーテルとその計測装置が必要である。ナゾメーターは既存のものを使用する準備が整っているが,鼻咽腔閉鎖圧を計測するセンサーを含めた計測装置は,初年度の予算では購入が困難であった。そこで29年度の予算を繰り越し,30年度の予算と合わせて購入することを計画した。
モデル超微粒子としてのイオン性コロイド系クラスター

本研究では、少数(数100個以下)のイオン性コロイド粒子を含む分散液を容積10-100μm^3程度の微小空間中に拘束し、かつ粒子を静電相互作用により結晶状に規則正しく配列させた系の物性を検討した。ここで一個の粒子を一原子と見なすと、このコロイド粒子の微小な結晶(以下クラスターと呼ぶ)は、全体として、一個の超微粒子のモデル系と考えられ、少数多体系に特有の興味ある性質を示すことが期待される。次の手法により目的とする実験系が構築できた。まず、リン脂質を用いたジャイアントリポソームをイオン性高分子ラテックス(粒子直径600nm)分散液中で形成させ、粒子をリポソーム内部に取り込む。この分散液をアガロースゲルで固定した後、界面活性剤でリポソームを除去する。最後にイオン交換樹脂を共存した水中に保って十分脱塩する。位相差および共焦点レーザースキャン顕微鏡観察の結果、粒子は凝集することなくBrown運動を示し、安定にゲル中の空孔に拘束されていることが示された。次に、バルクのコロイド結晶と、拘束したクラスターを顕微鏡により観察した。拘束したコロイド粒子系では、バルクでは結晶化する条件においても結晶が生じないことが確認された。この実験結果が、超微粒子に見られる融点降下に対応するかどうかを判断するためには、結晶化の相図のクラスターサイズ依存性のより系統的な検討が必要であり、より大きなサイズにおいては結晶が形成されることを確認することが望ましい。しかし、本方法ではさらに大きなリポソームを再現性よく得ることができず、これに替わって、より小粒径の粒子を用い、相対的にクラスタ-サイズを増加させる手法を検討している。しかし拘束により結晶化が生じにくくなったことは明らかであり、本クラスターはバルクの結晶には見られない特異な性質を持つものと考えられる。申請の研究計画に従って本年度は実験系の構築を目指し、目的としていた系、すなわちゲルマトリクス中に調整した微小空間に、数100-数1000個のイオン性コロイド粒子を含む分散液を拘束した系を得ることに成功した。構築にあたっては、試行錯誤ののち、次の方法が有効であることを見出した。まず、イオン性コロイド粒子である高分子ラテックス(粒径:600nm)分散液中、リン脂質を用いて直径数10μmのリポソーム(中空ベシクル)を調製することにより、リポソーム内部に数100-数1000個のラテックス粒子を含む分散液を拘束した。次に、このリポソームの分散液をアガロースゲルにより固定し、ゲルマトリクス中にリポソームを固定化した。さらに、得られたゲル試料を界面活性剤溶液に浸し、リポソームを除去することにより、目的の系を得た。得られた試料中のコロイド粒子の運動および空間配置を、位相差顕微鏡および共焦点レーザースキャン顕微鏡により調査した。空孔内部のラテックス粒子は自由粒子と同様のBrown運動を示し、ゲルに固定されているのではなく、ゲル中の微小空間に拘束されていることが確認できた。また、用いたラテックス分散液の結晶化を顕微鏡法により調査し、バルクの分散液については、添加塩濃度および粒子濃度を変数とした、固-液相転移の相図を得た。現在、拘束した微小分散液の結晶化条件を調査している。次年度は、結晶化条件の拘束空間サイズによる変化を調査する。本研究では、少数(100個以下)のイオン性コロイド粒子を含む分散液を、容積10-10μm^3程度の微小空間に拘束した系を構築し、その物性を調査した。

ハイドロゲル中に空孔を作り、その内部に分散液を拘束することとした。ゲル網目を通して低分子が容易に透過することから、所定の外部溶液に浸せきすることで、内部環境を制御できる。試行錯誤ののち、次の手法で目的の実験系の構築できることが明らかになった。まず、直径数10μmのジャイアントリポソームを、イオン性コロイドであるラテックス分散液の中で調製した。すなわち、ホスファチジルコリンのキャストフィルム上にラテックス分散液を加え、静置することによりラテックス粒子を内包するリポソームを得た。次に、このリポソームを含む分散液を、多糖類であるアガロースの水溶液と混和し、これを冷却することにより当該リポソームをゲル中に固定した。次に界面活性剤溶液にゲルを浸せきし、リポソーム膜を除去し、目的とする系を得た。顕微鏡観察の結果、得られたゲル中の空孔中で、ラテックス粒子は激しいBrown運動を示し、ゲル中の空孔に、実際に粒子が分散状態で拘束されていることが明らかになった。引き続き、拘束分散液の相挙動を調査した。イオン性コロイド系は粒子間性静電相互作用の増加により、粒子が規則正しく配列したコロイド結晶を形成することが知られている。今回、粒子濃度を変数として、光学顕微鏡観察によりバルクにおける相図をまず決定したところ、粒子濃度1.5%以上でコロイド結晶が観察された。これに対して、拘束された分散液では、2.5%の濃度条件においても、結晶化は観察されなかった。これは、拘束により結晶化が妨げられたことを意味する。金属超微粒子は、小数の原子から構成されるために、サイズ効果が生じ、その融点が著しく降下する。今回本コロイド系で明らかになった挙動は、超微粒子系と同様、小数多体系特有のサイズ効果が観察された可能性があるものと考えられ、引き続き詳細に検討の予定である。前年度までに、目的としていた実験系、すなわちゲルマトリクス中で調製した微小空間に、リポソームを用いて数100-数1000個のコロイド粒子を含む分散液を拘束した系を得た。また、イオン性コロイドである高分子ラテックス(粒子直径600mm)を用いて、バルク(非拘束)状態での結晶化の相図を得た。本年度は、当該ラテックス粒子を拘束した状態で、微分干渉顕微鏡観察、共焦点レーザースキャン顕微鏡観察により、結晶化の相図を決定した。バルクの相図に比べ結晶化が妨げられており、拘束の効果が顕著に観察された。ひきつづき、微小な結晶に対する分光測定を試みるために、光学顕微鏡とマルチチャンネル分光光度計を組み合わせ、顕微分光測定装置を組み上げた。バルクのコロイド結晶については良好な測定精度を確認したが、拘束系の分光学的な検討には到っていな。この点に関しては、今後引き続き検討を加える予定である。さらに、拘束空間サイズによる相図の変化を検討するため、種々のリポソーム濃度条件下において拘束を試みたが、本方法では数100ミクロン以上のサイズの空間は形成できなかった。より大きいサイズの空間を得るために、機械的に空孔を作成する手法、鋳型を用いて多孔性のゲルを構築する方法などを試みている。今後、種々のサイズの空孔中で結晶化の相図を決定し、結晶化のサイズ依存性に関する知見から、拘束の寄与にてついて、さらに詳細を明らかにしたいと考えている。なお、上記研究成果の一部は、日本学士院紀要にて報告した。
プロスタグランジンＤ２のシグナル伝達機構の解明と新規受容体の検索

プロスタグランジンD2(PGD2)はアレルギー炎症の形成に重要な役割を担っている。PGD2の作用は細胞表面受容体であるCRTH2/DP1、もしくは核内受容体を介していることが知られていたが、これまでの検討から未知の細胞表面受容体の存在が示唆された。われわれはPGD2がケモカイン受容体CCR3の発現を抑制し、これが通常リガンド刺激で認められるinternalizationによるものであることを見いだした。そこでPGD2がCCR3を介して機能している可能性を、トランスフェクション細胞を用いた受容体結合試験やカルシウムシグナルによる検討を行ったが、いずれにおいても否定的な結果が得られた。昨年までの検討から、CCR3とCRTH2を細胞膜に発現しているヒト好酸球において、PGD2はCCR3の迅速なinternalizationを誘導することを見いだした。さらにヒト末梢血レベルでCCR3とCRTH2の発現をアレルギー患者や健常人で検討したところ、細胞の表面発現は正の相関関係にあることが明らかになった。CCR3はG蛋白共役型受容体(GPCR)であり、リガンドによりinternalizationが起こることが知られていることから、PGD2の未知の受容体候補としてCCR3を考え、薬理学的な検討を行った。この結果、PGD2はCRTH2を介してCCR3のinternalizationを惹起することがわかった(日本アレルギー学会学術集会で発表)。この結果は、PGD2はCCR3のリガンドとして機能しないことを示唆するものであったが、臨床的にも興味深い知見が得られた。本年度は、気道上皮細胞株であるNCI-H292細胞を用いてCRTH2とCCR3のsiRNAによるノックダウンを試みた。細胞培養後にsiRNAを加えるプロトコルと、細胞培養開始と同時にsiRNAを加えるプロトコルを比較し、結果はqRT-PCRにて検討した。しかしながら、いずれの方法においてもCRTH2のノックダウンにより細胞死が認められ、適正な条件の設定を行う必要がある。一方、種々の化合物によってヒト好酸球のGPCRの発現変化を検討していたところ、レチノイドがCCR3の発現を増強することを見いだし、そのメカニズムと機能的な役割について明らかにした(Allergy, in press)。また、これまで報告のないGPCRがヒト好酸球に発現することを確認し細胞機能への影響についても検討を行った。プロスタグランジンD2の受容体として、これまでDP1、CRTH2(DP2)、PPARγが確認されている。プロスタグランジンD2がそれぞれの受容体を介して異なる機能やシグナルを有しているか検討するために、今年度は細胞株を用いてそれぞれの遺伝子をノックダウンするための条件設定を試みた。siRNAトランスフェクション法を用いて、気道上皮細胞株NCI-H292の細胞数、siRNA導入量、培養時間などを細かく設定して至適条件を探索した。ノックダウンの評価は、定量RT-PCR法で行った。その結果、ノックダウンはいずれの条件下でもほとんど認められず、今回用いた細胞株ではsiRNAトランスフェクションが困難であった。DP1受容体について発現は認められなかった。今後、他の気道上皮細胞株でも再検討する予定である。これまでの検討から、主要なCRTH2の発現細胞である好酸球において、PGD2によりケモカイン受容体CCR3の細胞表面発現がinternalizationのメカニズムにより抑制されることを見いだしている。本年度は並行してCCR3を介した好酸球の機能制御についても検討を行った。この結果、アディポサイトカインの一つであるアディポネクチンがCCR3の機能を抑制すること、アディポネクチンの受容体がヒト好酸球にも発現していることを新たに見いだした。また、エストロゲンの膜受容体であるGPERへのリガンド刺激が、CCR3を介した遊走にプライミング効果を有していることを見いだした。これらの結果は国内外の学会で発表し、国際誌に論文として報告した。当初の計画のもと、気道上皮細胞でのCRTH2の機能解析と未知の受容体の検索を行っているが、現在ノックダウン細胞を作成中である。一方、血中における主要なCRTH2の発現細胞として好酸球がある。種々の刺激によってヒト好酸球のケモカイン受容体であるCCR3の発現変化を検討していたところ、興味深いことにPGD2はCCR3の迅速なinternalizationを誘導することを見いだした。CCR3はG蛋白共役型受容体であり、リガンドによりinternalizationが起こることがよく知られている。そこでPGD2の未知の受容体候補としてCCR3を考え、CCR3のトランスフェクション細胞(K562)を用いて、PGD2がCCR3を介して機能するか、細胞内Caインジケータであるfra-2を用いて検討を行った。この結果、PGD2によるCa流入は認めなかった。また、PGD2の前処理後にCCR3のリガンド(eotaxin-1)刺激を行ったが、Ca流入の抑制は認められなかった。

さらにbinding assayにより、PGD2はeotaxin-1のCCR3への結合をほとんど阻害しないことが確認された。これらの結果から、PGD2はCCR3のリガンドとして機能しないことが示唆された。しかしながら、PGD2によりケモカイン受容体の細胞表面発現が抑制されることは、好酸球の局所への遊走調節機能を明らかにする上で重要な知見と考えられるPGD2は、その親和性は弱いながらもPGE受容体(EP)、PGF受容体(FP)、トロンボキサン受容体(TP)、核内受容体であるPPARγに対して結合することが知られているが、ここまでの検討から関与は否定的であった。さらに受容体のinternalizationを足がかりにGPCRの関与について検討したが、その内容は前述したとおりである。さらに各種シグナルのinhibitorを用いたPGD2による機能経路の検討を行ったが、MAPKやGi蛋白の関与が示唆される結果であり、細胞膜受容体、GPCRを中心に検討を行っている。平成24年度はデータ蓄積の過程から重要な知見が得られたため、並行して好酸球のGPCRについての検討を行った。好酸球の選択的遊走に最も重要なケモカイン受容体CCR3の発現誘導因子としてレチノイドを見いだしたことは、アレルギー免疫反応のメカニズムや今後の治療応用を考える上で非常に重要である。また、GPR120やGPR30を介した細胞機能制御といった新たな知見が得られ、平成25年度以降の計画を立てる上で有益な情報となった。平成23年度は、主にPGD2のCRTH2とDP以外の受容体への関与について検討した。特にCCR3への関与について検討したが、その内容は前述したとおりである。PGD2は、その親和性は弱いながらもPGE受容体(EP)、PGF受容体(FP)、トロンボキサン受容体(TP)に結合することが知られているが、それらのagonistやantagonistを用いてサイトカイン産生(IL-8, GM-CSF)に対する影響を検討した。結果として、それらの関与は否定的であった。また、PGD2は核内受容体であるPPARγに対しても弱い親和性を有する。さらに、PGD2は時間依存的に代謝されるが、その最終代謝産物である15d-PGJ2はPPARγのnatural ligandとして知られている。そこで、PPARγのagonistやantagonistを用いてサイトカイン産生に対する影響を同様に検討したが、その関与は否定的であった。各種シグナルのinhibitorを用いて気道上皮細胞におけるPGD2によるIL-8, GM-CSF産生経路の検討も行ったが、ERKおよびp38MAPKの関与が示唆された。また、Gi蛋白の関与も疑われる結果となった。このように平成23年度は基礎的データの蓄積のために時間および経費を費やしたため、当初の予定より進行が遅れる形となった。しかし、(1)ターゲットなりうるシグナル経路が明らかになったこと、(2)CRTH