hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中枢脱髄疾患の発症機序におけるガングリオシドの果たす役割の解明

われわれはGuillain-Barre症候群などの免疫性神経疾患における抗ガングリオシド抗体の解析をしてきたが、最近二種類のガングリオシドの混合抗原(複合体)に対して強く反応する抗体を見出した。二種類のガングリオシドの糖鎖が相互作用して新たなエピトープを形成すると考えられる。とくにGD1aとGD1bあるいはGD1bとGT1bの複合体に対して特異性をもつ抗体は、人工呼吸器を必要とするなどの重症GBSにみられることが多い。またフィッシャー症候群では抗GQ1b抗体の上昇が知られるが、複合体との反応をしらべることにより、GQ1b特異的、GQ1b/GM1特異的、GQ1b/GD1a特異的の三種類が存在することがわかった。ガングリオシド複合体を認識することが、神経障害の病態にどのような意義をもつのか今後の検討が必要である。一方、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の病態とガングリオシドの関わりを解明するために、複合型ガングリオシドを欠くGM2/GD2合成酵素遺伝子ノックアウトマウス(C57BL/6マウスをバックグラウンドとする)をmyelin-oligodendrocyte glycoprotein(MOG)で感作してEAEを作成した。野生型にもノックアウトマウスにもEAEの発症をみたが、ノックアウトマウスでは発症が平均で5日遅延し、有意差がみとめられた。受け身移入実験では、野生型とノックアウトマウス由来のMOG特異的T細胞を、別の野生型に移入しても差異はなかったが、野生型由来の同細胞を、野生型とノックアウトマウスに移入すると、ノックアウトマウスでEAE発症が遅延した。以上から、複合型ガングリオシドを欠くことは、T細胞の活性化には影響しないが、EAEの発症を遅延させることがわかった。すなわち、活性化Tリンパ球の血液脳関門透過性やミエリンへの接着などに影響を及ぼしている可能性が考えられ、その詳細な機序を今後解明する必要がある。ガングリオシドに対する免疫反応に基づく神経障害について検討した。われわれはこれまでにGuillain-Barre症候群などの免疫性神経疾患における抗ガングリオシド抗体の解析をしてきたが、その際に精製されたガングリオシド分子を抗原として用いていた。しかし今回の検討により、GBS血中には単独のガングリオシド分子には反応しないかごく弱い反応しか示さないが、二種類のガングリオシドの混合抗原に対しては強く反応する抗体があることがわかった。GM1とGD1aの組み合わせに対して反応する例が多いが、GD1aとGD1bあるいはGD1bとGT1bの組み合わせに対して特異性をもつ抗体を有する例は、人工呼吸器を必要とするなどの重症GBSであることが多く、そのような抗体は重症化のマーカーとなることがわかった。ガングリオシドは細胞膜のラフトにおいて複数の分子がクラスターを形成していることが知られており、今後複数のガングリオシドの複合体に特異性をもつ抗体の病因的意義を詳細に検討する必要がある。一方、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の病態とガングリオシドの関わりを解明するために、複合型ガングリオシドを欠くGM2/GD2合成酵素遺伝子ノックアウトマウス(C57BL/6マウスをバックグラウンドとする)をmyelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG)で感作してEAEの作成を試み、野生型マウスと比較した。MOGの接種により、野生型にもノックアウトマウスにもEAEの発症をみたが、ノックアウトマウスでは発症が遅延する傾向が認められた。複合型ガングリオシドを欠くことがリンパ球機能に影響を与えるのか、あるいは神経組織におけるガングリオシドの存在が神経障害発症メカニズムに何らかの影響を与えるのか、などについて詳細な検討をすすめているところである。

以上から、複合型ガングリオシドを欠くことは、T細胞の活性化には影響しないが、EAEの発症を遅延させることがわかった。すなわち、活性化Tリンパ球の血液脳関門透過性やミエリンへの接着などに影響を及ぼしている可能性が考えられ、その詳細な機序を今後解明する必要がある。
薬剤塗布機能を有する環境低負荷型雑草防除システムの開発

本研究の目的は、新たな雑草防除の手法の確立するために、実用的な薬剤塗布機能付き雑草防除システムを開発することにある。雑草防除システムは,「薬剤塗布機能付き刈払い機」と「草刈りの最適農作業計画支援システム」の二つで構成される。「薬剤塗布機能付き刈払い機」は,薬剤(農薬)散布を主体とした化学的防除と,雑草を機械的に切断する物理的防除の長所を組み合わせたもので,草刈によって切断された雑草の茎に,成長を抑制するだけの薬剤を同時に塗布するものである。一方で,「草刈りの最適農作業計画支援システム」は,雑草の繁茂量を種別に測定することによって,草刈の効果的な時期を,薬剤濃度と共に決定するものである。昨年度は、微少量を連続的に吐出する方法の検討を行った結果、回転により生じる遠心力を利用し、放射状に放出される薬剤を抵抗の大きさで調整する方法とした。その結果、フェルトを圧縮し,透過量を抑えることで,単位面積当たりの雑草の茎断面占有面積に塗布するだけの必要除草剤量を吐出可能であることが確認されが、高回転中の刈り払い機の刈り刃部における薬剤の飛散をどう抑えるかについては多くの課題が残された。したがって、本年度は、回転中の刈り刃部への薬剤を吐出する方法を変更し、刈り終えた雑草へのワイパー方式による薬剤塗布に重点を置いて研究を行った。一方で、雑草防除システムのための刈払い時期と雑草生長のシミュレーションモデルの構築を試みた。モデルにおいては、雑草の草丈の最大高さ、雑草の刈払い高さ、および雑草の生長曲線はロジスティック方程式で表現できると仮定した。さらに、刈り払い時期を入力パラメータとし雑草量の評価を雑草の草丈と時間関数との積分で表すモデルを立案した。本年度はシミュレーションプログラムの開発を行い、実際の雑草の生長とモデルの検証を行った。薬剤塗布機能を有した雑草刈り払い機の開発、および農作業のシステム化を行い、除草剤使用量を抑えることが可能な刈払機の開発を目的とした研究を行った。これまでに得られた知見は以下の通りである。抑制効果除草剤塗布による抑制可能希釈濃度を明らかにするために、予備実験としての除草剤塗布実験を、宇都宮大学峰圃場周囲で実施した。実験では、圃場で大豆(豆科),ソバ(タデ科),ソルゴー(イネ科)を各1列,株間15cmで栽培した。ラウンドアップの希釈濃度を100、200、300、400、500倍に設定し(通常は100倍程度)、対照区として切断のみの各草種合計21通りでその後の成長を観察した。その結果、ソバ,ソルゴーに対しては200300倍希釈付近に目標とする最適濃度が確認された。さらに、雑草の断面積から、一様散布と雑草断面に付着させた場合には1/40程度まで除草剤の量を減少できることが明らかとなった。薬剤塗布機能の開発微少量を連続的に吐出する方法の検討を行った結果、回転により生じる遠心力を利用し、放射状に放出される薬剤を抵抗の大きさで調整する方法とした。その結果、フェルトを圧縮し,透過量を抑えることで,単位面積当たりの雑草の茎断面占有面積に塗布するだけの必要除草剤量を吐出可能であることが確認された。しかし、高回転中の刈り払い機の刈り刃部における薬剤の飛散をどう抑えるかについては現在検討中である。農作業システムの開発雑草防除システムのための刈払い時期と雑草生長のシミュレーションモデルの構築を試みた。現在シミュレーションプログラムを開発中である。

さらに、刈り払い時期を入力パラメータとし雑草量の評価を雑草の草丈と時間関数との積分で表すモデルを立案した。本年度はシミュレーションプログラムの開発を行い、実際の雑草の生長とモデルの検証を行った。
エンドヌクレアーゼの標的DNA認識に関する構造生物学的解析と基質特異性改変

大腸菌H709c株由来の制限酵素EcoO109Iについて、大過剰量の酵素を添加して反応を行った結果、通常とは異なる配列を認識する、いわゆるスター活性を示すことを初めて明らかにした。スター活性の誘導条件を検討した結果、2.5mM Mgイオン、50%グリセロール、25%DMSO存在下で野生型酵素のスター活性が著しく上昇することを明らかにした。しかし、立体構造情報を基に認識特異性の変化を期待して作成したK74R変異酵素は、これらの条件下でもスター活性をほとんど示さなかった。野生型酵素と変異酵素のスター活性認識配列を網羅的に解析した結果、K74R変異酵素は野生型酵素よりも認識特異性が厳密であることを明らかにした。また、K74R変異酵素-DNA複合体の結晶を得ることができた。一方、大腸菌TH38株由来の制限酵素EcoT38IについてもEcoO109Iと同様にスター活性を示すことを明らかにした。EcoT38Iの通常の切断活性は、MgまたはMnイオン存在下で検出できたが、Ca存在下ではDNAに結合するにも関らず切断活性は検出できなかった。しかし、CaはMgによる切断活性を抑制する一方、Mnによる切断活性を促進する効果を示した。スター活性に対してCaは抑制効果を示した。以上の結果について構造生物学的アプローチを行うため、結晶化条件の検討を行った結果、タンパク質単独とタンパク質-DNA複合体の結晶が得られ、それぞれ2.1Åと3.3Åの分解能でX線回折データを取得することができた。大腸菌TH38株の生産するII型制限酵素EcoT38Iの結晶化条件を検討するため、大量発現系の構築を構築して精製法の検討を行った。すでに解析した制限修飾系遺伝子配列をもとに、PCRを用いてEcoT38Iメチラーゼ遺伝子を増幅してpACYC184ベクターに挿入した。次にPCRで増幅した制限酵素遺伝子をpUC118のlacプロモーターの下流に挿入したpUCR38とpET3aベクターのT7プロモーターの下流に挿入したpET3R38の2種類の高発現ベクターを調製した。宿主大腸菌としてUT481株、HB101株、JM109株、DH5α株、XL1-Blue株、TH38株、DE3(BL21)株を用いてメチラーゼと制限酵素の共発現系を構築して制限酵素の生産量の比較を行った結果、DE3(BL21)株にメチラーゼ発現プラスミドとpEr3R38を共存させてIPTGを添加して培養を行った時に最も高い生産が認められた。菌体破砕液からDEAE-Sepharose、P-cellulose、HiTrap Heparinのカラムを用いてほぼ均一な酵素標品が得られた。大腸菌TH38株の制限修飾系遺伝子発現制御タンパク質C.EcoT38IのDNA結合タンパク質としての作用メカニズムを解析するため、大量発現系を構築して均一な標品を調製した。ゲルシフト法を用いてDNA結合特異性を解析した結果、メチラーゼとC.EcoT38I自身の遺伝子間に存在する新奇な2回回転対称配列を認識して結合することによりDNA鎖を約60°湾曲させることを明らかにした。DNA存在下と非存在下で結晶化条件を検討した結果、いずれも容易に結晶が得られた。転写産物の解析を行った結果、C.EcoT38Iはメチラーゼ遺伝子の転写抑制因子として作用するのみならず、C.EcoT38I遺伝子の転写活性化因子としても作用する多機能転写因子であることを明らかにした。大腸菌TH38株由来の制限酵素EcoT38Iについて、昨年度構築した大量発現系から均一な標品が得られたので、市販の結晶化試薬を用いて結晶化条件の検討を行った。

約150種類の試薬を用いて、ハンギングドロップ法により5°Cと20°C、基質DNA存在下と非存在下で結晶化を試みた結果、数種類の結晶が得られた。SPring-8 BL41XUビームラインを用いてデータ収集を試みたが、回折データは得られなかった。大量発現にあたり、組換え体大腸菌を植え継ぐことによって、酵素の発現量が著しく低下することを明らかにした。均一に精製した酵素標品を用いて酵素学的諸性質を解析した結果、本酵素はMnイオン存在下でもMgイオン存在下の約30%の活性を示し、Coイオン存在下でもわずかな活性を示すことを明らかにした。一方、すでに立体構造を明らかにしている大腸菌H709c株由来の制限酵素EcoO109Iについて、認識配列の改変を目指してK74とK173の部位特異的変異酵素を構築して解析を行った。K173R変異酵素は触媒活性を消失したが、予想に反してK74R変異酵素の比活性は野生型の約10倍まで上昇した。4種類の配列に対する切断活性のプリファレンスを比較した結果、野生型ではほとんど差がなかったのに対し、K74R変異酵素では2-3倍の差が認められた。さらに、反応液に非イオン性界面活性剤Triton X-100を添加することで、反応速度が約100倍上昇することを見出した。大腸菌H709c株由来の制限酵素Eco0109Iについて、大過剰量の酵素を添加して反応を行った結果、通常とは異なる配列を認識する、いわゆるスター活性を示すことを初めて明らかにした。スター活性の誘導条件を検討した結果、2.5mM Mgイオン、50%グリセロール、25%DMSO存在下で野生型酵素のスター活性が著しく上昇することを明らかにした。立体構造情報を基に認識特異性が変化することを期待して作成したK74R変異酵素は、これらの条件下でもスター活性をほとんど示さなかった。野生型酵素と変異酵素のスター活性認識配列を網羅的に解析した結果、K74R変異酵素は野生型酵素よりも認識特異性が厳密であることを明らかにした。また、K74R変異酵素-DNA複合体の結晶を取得することができた。一方、大腸菌TH38株由来の制限酵素EcoT38IについてもEco0109Iと同様にスター活性を示すことを明らかにした。EcoT38Iの通常の切断活性は、MgまたはMnイオン存在下で検出できたが、Ca存在下ではDNAに結合するにも関らず切断活性は検出できなかった。しかし、CaはMgによる切断活性を抑制する一方、Mnによる切断活性を促進する効果を示した。スター活性に対してCaは抑制効果を示した。以上の結果について構造生物学的アプローチを行うため、結晶化条件の検討を行った結果、タンパク質単独とタンパク質-DNA複合体の結晶が得られ、それぞれ2.1Åと3.3Åの分解能でX線回折データを取得することができた。
最適汎化ニューラルネットワークの構成法に関する研究

本研究では,まず多層ニューラルネットワークの学習問題が,数学的には関数近似の問題と等価であることに着目し,学習と汎化の問題と逆問題として定式化した.そして,多層ニューラルネットワークが,与えられた訓練データに対して最適汎化能力をもつために,中間層の素子数,中間層の入出力関数,および各重み係数の値が満たすべき必要十分条件を求め,最適汎化能力をもつニューラルネットワークの構成法を与えた.この構成法によると,同じ汎化能力をもつニューラルネットワークを構成する方法が,一般には無限に存在することがわかる.この無限の自由度の中から,現実の場面で現れる誤差等に対して最も頑健になるような構成法を求めた.具体的には,ニューラルネットワークの結合荷重に現える比例性誤差,断線故障,およびr-縮退故障の汎化能力に及ぼす影響が最小になるような結合荷重の決定法を与えた.更に,上記3種類の問題に対して,結合荷重だけでなく,中間素子の入出力関数も変化させた場合の最適な結合荷重と入出力関数を求めた.また,追加学習(incremental learning)の理論を構築した.これは,ある訓練データに対して最適汎化ニューラルネットワークが既に得られているとき,新しく追加された訓練データを併せた全訓練データに対して最適なニューラルネットワークを,これまでの結果と新しい訓練データだけから構成する理論であり,将来,訓練データを能動的に選んでいく能動学習(active learning)の研究へとつながるものである.更に、上述の学習と汎化の理論の立場から,誤差逆伝搬学習における過学習の問題に対しても一つの解決を与えた.即ち,2種類の評価基準の間の許容性の概念を導入し,もって過学習を抑制するための訓練データの設計法を与えた.本研究では,まず多層ニューラルネットワークの学習問題が,数学的には関数近似の問題と等価であることに着目し,学習と汎化の問題と逆問題として定式化した.そして,多層ニューラルネットワークが,与えられた訓練データに対して最適汎化能力をもつために,中間層の素子数,中間層の入出力関数,および各重み係数の値が満たすべき必要十分条件を求め,最適汎化能力をもつニューラルネットワークの構成法を与えた.この構成法によると,同じ汎化能力をもつニューラルネットワークを構成する方法が,一般には無限に存在することがわかる.この無限の自由度の中から,現実の場面で現れる誤差等に対して最も頑健になるような構成法を求めた.具体的には,ニューラルネットワークの結合荷重に現える比例性誤差,断線故障,およびr-縮退故障の汎化能力に及ぼす影響が最小になるような結合荷重の決定法を与えた.更に,上記3種類の問題に対して,結合荷重だけでなく,中間素子の入出力関数も変化させた場合の最適な結合荷重と入出力関数を求めた.また,追加学習(incremental learning)の理論を構築した.これは,ある訓練データに対して最適汎化ニューラルネットワークが既に得られているとき,新しく追加された訓練データを併せた全訓練データに対して最適なニューラルネットワークを,これまでの結果と新しい訓練データだけから構成する理論であり,将来,訓練データを能動的に選んでいく能動学習(active learning)の研究へとつながるものである.更に、上述の学習と汎化の理論の立場から,誤差逆伝搬学習における過学習の問題に対しても一つの解決を与えた.即ち,2種類の評価基準の間の許容性の概念を導入し,もって過学習を抑制するための訓練データの設計法を与えた.学習と汎化は、現在の情報工学、情報科学を進歩させていく上で欠くことのできない研究課題である。本研究の目的は、汎化能力が保証され、同時に工学的に優れた特性を持つニューラルネットワークの構成方法を与えることである。このような研究に関し、本年度は次のような成果を得た。学習を逆問題として定式化することにより、層状神経回路網の学習特性を解析し、層状神経回路網による写像を要素として持つ関数空間の構造を解明した。一般標本化定理の考え方を適用することにより、学習を訓練データに対する応答から未知データに対する応答を求める補間操作として定式化できることを示した。最適汎化能力を実現する上でニューラルネットワークが満たさなければいけない条件を、ニューラルネットワークが含まれるべき関数空間の形態と関連づけて明らかにした。さらに、ニューラルネットワークの信号に重畳される雑音の影響の最小化,ニューラルネットワークの結線の一つが断線した場合の影響の最小化,ニューロン間の結合係数の分散の最小化など,最適汎化能力を持ったニューラルネットワークを実現する際に生じる工学的要請に対応した設計理論を構築した。こうして、最適汎化能力を持ったニューラルネットワークの理論とそれを構成するための設計理論の両方を構成することができた。さらに、計算機実験によって、工学的要請に対応した最適汎化能力を持つニューラルネットワークを実際に構成し、本研究で提案した設計理論の有効性を確認した。本研究の最終年度にあたる平成7年度は,次の二つの大きな成果を得ることができた.まず,最適汎化ニューラルネットワークを構成する際に,ニューラルネットワークの結合加重に現れる比例性誤差および単一断線故障の汎化能力に及ぼす影響が最小になるような結合加重の決定法を前年度に求めていたが,これを次の三つの方向に拡張した.この理論を単一断線故障から複数断線故障に拡張し,単一断線故障で得られていた最適結合加重がそのまま複数断線故障に対しても最適であることを明らかにした.新しくγ-縮退故障に対しても同様の最適結合加重の設計法を与え,比例性誤差,複数断線故障,γ-縮退故障の全てに対して同時に最適になる条件も求めた.

上記3種類の問題に対して,最適な結合加重だけでなく,中間素子の最適な入出力関数も求めた.従来,この入出力関数として経験的にシグモイド関数等が使われていたが,本成果により,最適な関数形を決定できるようになったのである.第二の大きな成果は,追加学習(incremental learning)の理論を構築したことである.これは,ある訓練データに対して最適汎化ニューラルネットワークが既に得られているとき,新しく追加された訓練データを併せた全訓練データに対して最適なニューラルネットワークを,これまでの結果と新しい訓練データだけから構成する理論であり,従来,訓練データを能動的に選んでいく能動学習(active learning)の研究へとつながるものである.
新規アデノ随伴ウィルスベクターを応用した神経変性疾患の病態解析

神経細胞またはグリア細胞特異的に遺伝子を導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用して神経変性疾患における病態を解析し新たな治療法を開発することを目標に研究を実施した。脳内の神経細胞特異的にアミロイド前駆体蛋白質を発現させてアルツハイマー病のモデルマウスを作製した。特定の変異型TDP-43を脳内で発現させたマウスでは行動異常が認められた。神経細胞またはグリア細胞特異的に遺伝子を導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用して,アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患における病態を解析し,新たな治療法を開発することを目標として研究を行った.パーキンソン病患者の黒質に認められるLewy小体の構成成分であり家族性パーキンソン病の原因遺伝子の一つでもあるα-synuclein,あるいは,アルツハイマー病患者の脳内に老人斑として蓄積するβamyloidによる細胞変性の機序を,これらの蛋白質を長期間継続して過剰発現させることが可能なAAVベクターを使用した実験系で解析した.初代培養細胞・ES細胞を使用したin vitroの実験に加えて,マウス・ラット・カニクイサルにおける病態モデルの作製を試みた.平成19年度は,神経細胞,astroglia,oligodendrocyteの各細胞特異的プロモーターによりα-synucleinあるいはアミロイド前駆体蛋白(APP)を発現するAAVベクターを作製した.現在,マウスの脳内にこれらのベクターを注入し,細胞毒性の発現の有無を解析している.神経細胞またはグリア細胞特異的に遺伝子を導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用して,パーキンソン病,アルツハイマー病,筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患における病態を解析し,新たな治療法を開発することを目標に研究を実施した。パーキンソン病患者の黒質に認められるLewy小体の構成成分であり家族性パーキンソン病の原因遺伝子の一つでもあるα-synuclein,アルツハイマー病患者の脳内に老人斑として蓄積するβamyloid,さらに前頭側頭葉型痴呆(FTLD-U)およびALSで見られる神経細胞内凝集体の構成成分として同定されたTDP-43などの蛋白質を発現するAAVベクターを作製した。マウスの胚性幹細胞(ES細胞)から分化誘導した神経細胞にアミロイド前駆体蛋白質(APP)を発現するAAVベクターを感染させる実験では,神経細胞死を誘導するアミロイド凝集体が検出された。α-synucleinを発現するAAVベクターをマウスの黒質に注入する実験では,黒質緻密部のドパミン神経細胞の減少が観察された。さらに,特定の変異型TDP-43を脳内に注入したマウスでは行動異常が認められた。作製した病態モデルについて,生化学的および免疫組織化学的解析を行い,これらの蛋白質による神経細胞変性の誘導しやすさは特定部位のリン酸化の程度よりも形態変化が重要である可能性を示唆する結果を得ている.
急性肺傷害に対するRNA干渉(RNAi)を応用した分子生物学的治療法の開発

RNA干渉による急性肺傷害に対する治療戦略の実験的検討を目的に、ヒト2型肺胞上皮細胞由来であるA549細胞を用いて実験を行なった。初年度から最終年度にわたりA549にヒトIL-8遺伝子に対する合成siRNA(small interference RNA)を高率に形質導入できる方法を検討した。21塩基からなるIL-8のsiRNA(ロダミン標識)を非ウィルスベクターであるHVJenvelope vectorを用いてトランスフェクションを試みたが導入効率はきわめて不良で、それに対する改善策としてsiRNAの濃度を上げたりトランスフェクション時間を十分にとりトランスフェクションを行なったが、最終的に導入効率は悪く今までの実験結果を改善するには至らなかった。A549培養細胞の密度をいろいろ設定して導入も施行したが導入効率はきわめて低いものであった。また導入効率を高めるためにリン酸カルシウム法DEAEデキストラン法、リポフェクション法およびトランスフェクションプレートやトランスフェクタムの使用による各方法を試みたがすべて確実な形質導入は得られなかった。ゆえに本システムを以後の急性肺傷害にむけた実験に供することは不可能であった。効率よい形質導入にむけてマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、FuGENE 6 transfection reagent法も試す必要があるものとおもわれた。RNA干渉(RNAi)による急性肺傷害(ARDS)に対する治療戦略の実験的検討を目的に、初年度はヒトA549細胞(2型肺胞上皮細胞)にIL-8(ヒト)遺伝子に対する合成siRNA(small interference RNA)を高率に形質導入できるかどうかを検討した。21塩基から成るIL-8のsiRNA(ロダミン標識)をマイクロインジェクション法を用いてトランスフェクションを試みたが導入効率は著しく低く以後の実験に供することができなかった。そこで、HVJ envelope vector(非ウィルス性ベクター)を用いてトランスフェクションを行なったが、現段階ではこれも導入効率は不良で、かなりのばらつきがありトランスフェクションの方法を改善する必要があるものと考えられた。また、エンドトキシン刺激によってRNAi効果を検討したが、IL-8タンパクの産生は全く抑えられていなかった。この原因として導入効率の問題か、またはsiRNAの配列が悪いのかを決定することはできなかった。ラットの肺胞上皮細胞についてはGRO/CINC-1(ラット)のsiRNAを合成し、A549と同様にマイクロインジェクション法とHVJ envelope vector法を用いてトランスフェクションを試みたが、導入効率は低くLPS/TNF-alpha刺激によるGRO/CINC-1の分泌は抑制されておらず、このシステムを以後の実験に供することはできなかった。RNA干渉(RNAi)による急性肺傷害(ARDS)に対する治療戦略の実験的検討を目的に、初年度と同様にA549細胞(ヒト2型肺胞上皮細胞由来)にIL-8(ヒト)遺伝子に対する合成siRNA(small interference RNA)を高率に形質導入できるかどうかを検討した。21塩基から成るIL-8のsiRNA(ロダミン標識)を非ウィルス性ベクターであるHVJenvelope vectorを用いてさまざまなトランスフェクション条件のもとでトランスフェクションを試みたが、今年度も導入効率及び細胞生存率が非常に悪く前年度の結果を改善できなかった。ゆえに本システムを以後の実験に供することはできなかった。今後の実験における改良点とすればsiRNAの改善、siRNAの至適濃度の決定、トランスフェクションの時間、培養細胞の健康状態や培養密度、またリバーストランスフェクション法を導入することなどがあげられる。また導入効率を高めるために非イオン性水和微粒子の併用およびワンステップから成るトランスフェクションプレートの使用、トランスフェクタムの使用などを考慮する必要があると思われる。さらにリン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、FuGENE 6 Transfection Reagentを用いた方法を試みる必要がある。最終年度もA549にヒトIL-8遺伝子に対する合成siRNA(small interference RNA)を高率に形質導入できる方法を検討した。

初年度および次年度の実験結果の反省のもとに21塩基からなるIL-8のsiRNA(ロダミン標識)を非ウィルスベクターであるHVJenvelope vectorを用いてトランスフェクションを試みた。今年度の工夫としてはsiRNAの濃度を上げたりトランスフェクション時間を長くしてトランスフェクションを行なったが、最終年度も導入効率は悪く今までの実験結果を改善するには至らなかった。A549培養細胞の密度をいろいろ設定して導入も施行したが導入効率はきわめて低いものであった。また導入効率を高めるためにリン酸カルシウム法DEAEデキストラン法、リポフェクション法およびトランスフェクションプレートやトランスフェクタムの使用による各方法を試みたがすべて確実な形質導入は得られなかった。ゆえに本システムを以後の急性肺傷害にむけた実験に供することは不可能であった。効率よい形質導入にむけてマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、FuGENE 6 transfection reagent法も試す必要があるものとおもわれた。
「レスター・B・ピアソンの国連外交に関する考察(1945〜1957年):国連平和維持活動形成過程におけるカナダの役割」

(1).本研究は、1948年から57年までカナダのサンローラン自由党政権下で外相を務めたレスター・B・ピアソンの展開した団連外交に焦点を当て、国連平和維持活動形成過程においてミドルパワー・カナダが果たした役割を実証的に考察することを目的としている。その際、特に1949年のNATOの創設において果たした役割、50年の朝鮮戦争の際に展開した危機外交、そして56年のスエズ危機の際の国連緊急軍創設のために発揮したイニシアチブなどのケースを一次資料を中心に関連付け、a).戦後、カナダが一貫して展開してきた国連中心主義外交の起源は何か、b).当時のカナダの国内的・国際的諸情報に鑑み、ピアソン外相が展開した国連外交の理念と実践はいかなるものであったか、c).ピアソンの国連外交が今日持つ学問的・政策的意義は何か、という3つの問題に取り組んでいる。なお、この研究の成果の一部は、「レスター・B・ピアソンの多国間外交の理論と実践(194857年):カナダにおける研究動向の調査と将来の研究課題に関する若干の提言」(函館大谷女子短期大学紀要19号)という論文ですでに発表している。(2).今回の助成期間内に、たまたまカナダの大学に客員研究員として赴任する機会を得た。そのため、本研究との関連で、日本では入手不可能な多くの資料にアクセスできたことや、様々な研究者と議論を深めることができたのは非常に幸いであった。(3).今後の研究課題としては、今回取り上げたピアソンの外相時代の国連外交と後の彼の首相時代(196368年)の対国連政策とを比較検討することにより、国際情勢の変化、カナダ国民の世論の動向、カナダの抱える国内問題の位相などの観点からピアソンの国連外交の連続姓と非連続姓とを考察したいと考えている。
人間言語における倫理形式の派生アルゴリズムの解明およびその多角的検証

英語のthat節に代表される補文は、基底生成された位置では、CPと分析されている。しかし、補文は文主語構文及び、トピック構文で移動した場合、補文が残した痕跡はDPの特性を示すという一般化が指摘されていた。この補文の統語範疇のミスマッチに対しては、音形を持たないDP作用詞の移動が上述の構文には関与しており、補文は表層位置に基底生成されるという分析が提案されていた。本研究では、文主語構文及び、トピック構文で観察されるreconstruction効果を、作用詞の移動を用いた分析に対する反例として提示した。文主語構文及び、トピック構文で観察されるreconstruction効果は、これらの構文で、補文が実際に移動していることを示している。本研究は、補文が移動した場合には必ず音形を持たない決定詞を伴わなければならないと提案した。また、補文が移動しない場合には、決定詞が認可されないとも提案した。これにより、移動した補文と移動しない補文との間の統語範疇のミスマッチを導き出すことが可能となる。補文が移動した場合にのみ音形を持たない決定詞が存在しなければならないという構造的必要性は、コピー理論においてコピーを解釈するためのメカニズムの特性から導き出すことができると提案した。上述のように、文主語構文及び、トピック構文ではreconstruction効果が観察されるが、これらの構文では、anti-reconstruction効果も観察される。この事実は、Takahashi(2006)、Takahashi and Hulsey(to appear)で提案されているWholesale Late Mergerを採用することで説明することができると主張した。1,非循環的併合についての研究本研究は、私の博士論文で提案した非循環的併合が限定詞の限定節に適用可能であるという理論を、新しい言語データを基にさらに発展させたものである。限定詞の限定節に対する非循環的併合は、A移動では比較的自由に適用可能であることが束縛原理に関する事実から知られている。一方、A'移動ではこの操作が、非常に限られた状況でしか適用できないと考えられる。このA移動とA'移動の非循環的併合の適用可能性についての非対称性を、限定節の格の特性の観点から説明を行った。この分析により、現在まで分析が存在しなかった言語事実に対し説明をあたえることが可能となり、さらに新しい言語事実の発見にも至った。本研究の帰結として、人間言語の論理形式に課せられている制約の一つを解明するに至った。2,時を表わす副詞節の統語構造および意味解釈についての研究本研究は、時制情報が論理形式にどのように構造表示されているのかを解明することを主要な目的としている。具体的な研究成果としては、before、afterなどの時を表わす副詞節内に存在する非顕在的な演算子の移動が、副詞節が修飾する主節にも存在していることを削除現象のデータを基に提案した。また、時を表わす副詞節において観察される、意味解釈の曖昧性と削除の認可条件との相互作用を利用し、変項束縛関係が時を表わす副詞節の補文内に存在し、削除の認可に影響を及ぼすことを示した。さらに、時を表わす副詞節における先行詞を含む削除に対して、補文に非循環的併合を適用するという分析を提案した。この分析により、時を表わす副詞節における先行詞を含む削除において、束縛原理Cの違反が回避されるという事実を説明することが可能となった。1,削除文における態の相違についての研究動詞句削除文において、動詞の態の相違が可能であることが観察されている。本研究では、この種の相違が、常に可能であるわけではないという事実を指摘し、この種の相違は、動詞句削除の認可条件が、削除された動詞句と先行詞の動詞句との一致によって満たされた時のみ可能であるという一般化を提案した。この一般化は、二つの文法特性により説明することができる。第一に、動詞句の態は、動詞句削除により削除される構成素を直接的に支配する機能範疇により決定される。第二に、統語構造の一致が削除の認可条件である。動詞句削除は、削除された動詞句とその先行詞の統語的一致で認可できない場合、削除された動詞句より大きな構成素が潜在的に認可条件を満たす可能性がある構成素となる。しかし態の相違が存在する場合、そのような構成素が認可条件を満たすことはありえない。よって、上記の一般化が成立するのである。2,比較構文についての研究本研究は、英語、日本語、及びヒンディー・ウルドゥー語を中心とした言語事実の検証により、句を用いた比較構文の統語構造を解明することを目的とする。この構文における量化詞の作用域の事実に基づくと、英語では基底構造に潜在的な節構造が存在すると考えられる。一方で、日本語、及びヒンディー・ウルドゥー語では、量化詞の作用域の特性が英語と異なり、基底構造に潜在的な節構造は存在せず、表層構造と同じく句構造しか存在しないと考えられる。本研究では、この言語間の相違は、比較対象を表わす語の語彙特性に起因していると提案した。具体的には、日本語、及びヒンディー・ウルドゥー語の比較対象を表わす語は、後置詞として使用することができるが、英語の比較対象を表わす語は、前置詞として使用することができない。この違いが文法のほかの性質と相互作用し、上記の言語間の相違が発生すると考えている。

2,比較構文についての研究本研究は、英語、日本語、及びヒンディー・ウルドゥー語を中心とした言語事実の検証により、句を用いた比較構文の統語構造を解明することを目的とする。この構文における量化詞の作用域の事実に基づくと、英語では基底構造に潜在的な節構造が存在すると考えられる。一方で、日本語、及びヒンディー・ウルドゥー語では、量化詞の作用域の特性が英語と異なり、基底構造に潜在的な節構造は存在せず、表層構造と同じく句構造しか存在しないと考えられる。本研究では、この言語間の相違は、比較対象を表わす語の語彙特性に起因していると提案した。具体的には、日本語、及びヒンディー・ウルドゥー語の比較対象を表わす語は、後置詞として使用することができるが、英語の比較対象を表わす語は、前置詞として使用することができない。この違いが文法のほかの性質と相互作用し、上記の言語間の相違が発生すると考えている。英語のthat節に代表される補文は、基底生成された位置では、CPと分析されている。しかし、補文は文主語構文及び、トピック構文で移動した場合、補文が残した痕跡はDPの特性を示すという一般化が指摘されていた。この補文の統語範疇のミスマッチに対しては、音形を持たないDP作用詞の移動が上述の構文には関与しており、補文は表層位置に基底生成されるという分析が提案されていた。本研究では、文主語構文及び、トピック構文で観察されるreconstruction効果を、作用詞の移動を用いた分析に対する反例として提示した。文主語構文及び、トピック構文で観察されるreconstruction効果は、これらの構文で、補文が実際に移動していることを示している。本研究は、補文が移動した場合には必ず音形を持たない決定詞を伴わなければならないと提案した。また、補文が移動しない場合には、決定詞が認可されないとも提案した。これにより、移動した補文と移動しない補文との間の統語範疇のミスマッチを導き出すことが可能となる。補文が移動した場合にのみ音形を持たない決定詞が存在しなければならないという構造的必要性は、コピー理論においてコピーを解釈するためのメカニズムの特性から導き出すことができると提案した。上述のように、文主語構文及び、トピック構文ではreconstruction効果が観察されるが、これらの構文では、anti-reconstruction効果も観察される。この事実は、Takahashi(2006)、Takahashi and Hulsey(to appear)で提案されているWholesale Late Mergerを採用することで説明することができると主張した。
外分泌における水電解質輸送と開口分泌の協調機構

本研究は、大量の水分泌と開口分泌を観察できる唾液腺に対象を限定、分泌顆粒が細胞膜に融合し開口放出を起こすプロセスについて分子生理的、形態学的に水輸送・開口分泌両システム間の協調機構を検討した。A.分泌経過チームは、耳下腺/顎下腺を漿液/漿粘液分泌のモデルとして血管潅流・単離細胞標本を作製、carbachol/isoproterenolによりmuscarinic/β-adrenergic受容体を刺激し、水電解質分泌・アミラーゼ/ムチン分泌を測定、水分泌は直接的には細胞内Ca信号による制御、開口分泌はCaとcyclicAMP両者による制御を受けることが示された。muscarinic受容体低レベル刺激による水分泌と酸素消費増加はβ-adrenergic受容体刺激によりupregulateされ、このupregulationは細胞エネルギー供給系の能力/過剰な細胞内Caにより制限されることが示唆された。一方、耳下腺/顎下腺ともに酸素消費増加は主として水分泌と対応し、開口分泌増加には代謝エネルギー消費の増加はわずかであることが示された。B.形態チームは、レーザー・走査電子顕微鏡を用い、耳下腺の血管潅流標本の分泌経過に沿って水経路とアミラーゼ開口分泌の微小形態の変化を観察した。その結果、細胞間隙の開閉が分泌刺激による起こること、分泌初期には細胞経由の水分泌が傍細胞経由より優位であること、carbachol刺激では細胞間分泌細管ICの初期一過性拡大が観察された。Isoproterenol刺激により、細胞間分泌細管ICに一次、二次の開口分泌像が観察された。いずれの刺激でもmicrovilliは消失し、IC周辺のrERの拡張mitochondoria電子密度増加も同時に観測された。前者は細胞内Ca代謝と後者はエネルギー代謝増加と関連づけられた。C.開口放出関連蛋白チームは、免疫組織化学法により耳下腺ではVAMP2が分泌顆粒膜に,syntaxin4とSNAP23が管腔膜に発現するが、舌下腺ではsyntazxin1Aが腺房細胞に局在することを見い出し、粘液分泌と漿液分泌で開口分泌の分子機序が異なる可能性が示された。D.分泌物質の運動性グループは、標識デキストランの腺房上皮通過を測定し、ラット顎下腺ではmuscarinic受容体刺激により直径5Åの傍細胞分泌経路が開通すると推定した。また羊口腔腺の潅流実験を行い、水分泌の陰イオン依存性について、詳細な測定を行なった。以上、細胞内信号の組み合わせにより開口分泌と水輸送が協調して活性化される機構が明らかになった。本研究は、大量の水分泌と開口分泌を観察できる唾液腺に対象を限定、小胞輸送により運ばれた分泌顆粒が細胞膜に融合し開口放出を起こすプロセスについて共同研究者の各実験サイトで分子生理的、形態学的に水電解質輸送と開口分泌を計測、水輸送・開口分泌両システム間の協調機構を検討することを目的とする。平成10年度、A.分泌経過

チーム:酵素開口分泌(漿液分泌)のモデルとして、耳下腺の血管潅流・単離細胞標本を作製し、カルバコール(ムスカリニック刺激)イソプロテレノール(βアドレナジック刺激)について水電解質分泌・アミラーゼ分泌・酸素消費の時間経過を測定、水分泌と開口分泌が、前者は主として細胞内Ca信号によりコントロールされ、後者はCaとcyclic AMP両者の組み合わせで制御を受けることが明らかになった。B.形態チームは、レーザー・走査電子顕微鏡を用い、Aのプロトコルで、耳下腺の血管潅流・単離細胞標本の「分泌顆粒、小胞輸送、膜融合、開口放出、膜の回収」の時間経過に沿って水経路の形態の時間的変化とアミラーゼ開口分泌の微小形態の変化を観察した。その結果カルバコール刺激では大きな形態変化は無く、細胞間小管の拡大がみられるのみであった、一方開口分泌像はカルバコールとイドプロテレノール両者の刺激で多く観察され、貯蔵された分泌顆粒もその数を減少させた。C.開口放出関連蛋白チームは、耳下腺分泌顆粒膜の安定化を検討した。また、ターゲットの細胞膜における局在を、形態グループと協力して実施するために、新しいSEM法の開発に着手した。D.分泌物質の運動性グループは、本年は、水分泌経路のサイズの測定のため研究協力者ヒル博士(ケンブリッジ大と共同実験を行い標識デキストランの腺房上皮通過を測定した。本年度、アミラーゼ分泌増加と対応した酸素消費増加分を蛋白分泌に必要なエネルギー要求として測定できた。本研究は、大量の水分泌と蛋白質の開口分泌を観察できる唾液腺に対象を限定、小胞輸送により運ばれた分泌顆粒が細胞膜に融合し開口放出を起こすプロセスについて共同研究者の各実験サイトで分子生理的、形態学的に水電解質輸送と開口分泌を計測、水輸送・開口分泌両システム間の協調機構を検討することを目的とする。平成11年度、A.分泌経過チーム:酵素開口分泌のうち粘液分泌のモデルとして、顎下腺の血管潅流・単離細胞標本を作製し、カルバコール(ムスカリン性受容体刺激)イソプロテレノール(βアドレナジック刺激)について水分泌・ムチン分泌・酸素消費の時間経過を測定。耳下腺と比較し、βアドレナリン性受容体刺激で開口分泌が相当量増加するにも関わらず、水分泌と酸素消費が有意に増加しないことを見出した。一方前年度耳下腺で観測されたわずかな酸素消費増加は、11年度明らかになった刺激後期でのわずかな水分泌と対応する可能性が高くなり、分泌刺激による開口分泌増加には殆どエネルギー消費の増加がみられない可能性が高くなった。B.形態チームは、細胞内マセレーション法を導入し、レーザー:走査電子顕微鏡を用い、耳下腺の血管潅流・単離細胞標本の時間経過の観察を継続した。共焦点レーザー顕微鏡による観察で細胞間隙の開閉が分泌刺激による起こることを観測した。分泌細管にロードした色素が分泌初期に薄まることから、この時細胞内よりの水分泌が傍細胞経由より優位であることが示された。このことは、10年度に見出したカルバコール刺激による細胞間小管の拡大と対応させると、細胞間隙経路の機能的開門は、経細胞経路からの水分泌より遅れることを示唆した。C.開口放出関連蛋白チームは、分泌関連蛋白の局在の検討を開始した。
超対称ゲージ理論の可解性における量子代数の役割

Ding-Iohara-Miki代数と呼ばれる量子トロイダル代数を用いて、refined topological vertexのpreferred directionを変更しても理論が不変であることを示した。refined topological vertexは2007年に提唱された、5次元N=1超対称ゲージ理論の分配関数の非摂動項を計算するためのツールで、trivalentなグラフに対応している。この3つ足の中で、一方向だけ他の足と違った方向があり、この方向をpreferred directionと呼ぶ。理論自体はtrivalentなグラフのうちどれをpreferred directionに選ぶかに依存しないにも関わらず、preferred directionを取り替えると分配関数の関数形が劇的に変わって見える、という問題があった。異なって見える二つの分配関数が実際は一致しているということの数学的な証明は限られた例では幾何学的になされていた。我々は今回この問題を量子代数を用いて純粋に代数的に証明を与えた。その際に、generalized Macdonald関数と呼ばれる関数の具体形を与えるアルゴリズムを提唱した。この関数は存在と一意性は以前より証明されていたが、その具体形を与える公式を与えたのは本研究が初めてである。また、それを用いて楕円マクドナルド多項式への拡張手段も考察をはじめた。上で述べた通り、Ding-Iohara-Miki代数と呼ばれる量子トロイダル代数を用いて、refined topological vertexのpreferred directionを変更しても理論が不変であることを示した。この結果は本年度の計画には全く書いていなかったことではあるが、非常に超弦理論では重要な結果であるので当初の計画以上に進展していると言える。本年度の研究目的に記述した未達成の内容については、来年度の計画にも一部反映させている。まずはマクドナルド多項式の楕円変形をこれまで位相的頂点の知識を用いて構成する。まずそうした手法で構成された楕円マクドナルド多項式の候補がその他の楕円マクドナルド多項式の候補と一致しているかをチェックする必要がある。また、マクドナルド多項式は非常に良い性質を持っているが、こういった性質が楕円版でも成立するかは詳しく調べる必要がある。また、通常のマクドナルド多項式が量子トロイダル代数で支配されているのに対して、楕円マクドナルド多項式を支配する代数というのはよく知られていない。よって、そういう対称性をもつ代数を構成することが大目的である。また、こういった楕円マクドナルド多項式の知識はゲージ理論におけるSuperconformal Indexと呼ばれる指数に対して非常に強い予想を与える。この指数は通常3つのパラメータを持つが、この完全形はまだ予想もされていない。そのパラメータのうち一つを0にとる極限ではこの形は予想されており、マクドナルド多項式を用いて表されている。これ楕円マクドナルド多項式に置き換えることで、Superconformal Indexの完全形がわかるのではないかと予想する。この予想を確かめることも目標とする。それとは別の課題として、一昨年度に量子トロイダル代数を用いて構成したD型の箙ゲージ理論に関係したマクドナルド多項式を実際に構成する。D型のマクドナルド多項式にはD型のW代数が作用していると予想されているが、それをトロイダル代数の言葉でかけるかどうかはよくわかっていない。これを解明することも目標の一つである。D型マクドナルド多項式の一般系は知られていないが、この研究を通じてこの一般系を求めることができる可能性がある。2017年度は論文を3本執筆した。それぞれに関して大まかな説明をすると、最初2本はDing-Iohara-Miki代数と呼ばれる代数を用いて、5次元の超対称ゲージ理論の解析を行った。特に1本目では、この代数に関係する可積分性を考察するために、R行列という無限の大きさの行列を部分的に計算した。またそのR行列のパラメータを特殊な値にとることでこのR行列に関係した可積分系がCalogero-Sutherland模型というよく知られた模型に帰着することを見た。また2本目の論文では、D型の箙ゲージ理論と呼ばれるゲージ理論を解析した。そのために上で述べた代数において、ある種の境界作用素を導入する必要があることに気づき、実際に構成した。この境界作用素をもちいることで、D型箙ゲージ理論の分配関数が、その代数の表現論から計算できることを発見した。3本目の論文に関しては、少し異なったテーマについて研究した。とくに共形場理論においてConformal Defectと呼ばれる欠陥がある状況で、場の演算子の期待値がどのように振る舞うか、ということを調べた。Embedding Formalismという形式を用いて計算することで、対称性のみからその期待値を決定した。また、AdS/CFT対応において、一次元高い空間での場をその境界に住む共形場理論の場から構成できる、という知られている事実が、Radon変換という数学の特殊な応用として理解できることをより厳密に定式化した。また以上の内容に関して、日本大学、東京工業大学でセミナーを行った。

上で述べたD型箙ゲージ理論のインスタントン分配関数のDing-Iohara-Miki代数の表現論からの導出に関しては、共著者である韓国KIAS所属のBourgine氏、および申請者の受け入れ教官である松尾准教授と春に日本で集中して議論ができたことが大きい。Bourgine氏は当初、申請者が考えていたD型箙ゲージ理論の構成法に置ける問題点を指摘し、それによってより良い方法を発見することができた。また、Conformal Defectについての論文では、共著者である西岡氏が、既存の文献の不十分な点を逐一指摘してくださったことが大きかったと思われる。またこれはまだ論文になっていない仕事であるが、上で述べたDing-Iohara-Miki代数に関連したソリトン系がどうなっているかということを現在研究しており、そちらでも十分な進展があった。大きい理由としては、夏に参加したサマースクール及び研究会にて、研究分野が非常に近い人たちと議論できたことが挙げられる。特に、フランスIPhTのPasquier教授、東京大学数理科学研究科の白石教授らの有益なアドバイスにより、自分の研究の課題が明確に認識できたことが大きい。Ding-Iohara-Miki代数と呼ばれる量子トロイダル代数を用いて、refined topological vertexのpreferred directionを変更しても理論が不変であることを示した。refined topological vertexは2007年に提唱された、5次元N=1超対称ゲージ理論の分配関数の非摂動項を計算するためのツールで、trivalentなグラフに対応している。この3つ足の中で、一方向だけ他の足と違った方向があり、この方向をpreferred directionと呼ぶ。理論自体はtrivalentなグラフのうちどれをpreferred directionに選ぶかに依存しないにも関わらず、preferred directionを取り替えると分配関数の関数形が劇的に変わって見える、という問題があった。異なって見える二つの分配関数が実際は一致しているということの数学的な証明は限られた例では幾何学的になされていた。我々は今回この問題を量子代数を用いて純粋に代数的に証明を与えた。その際に、generalized Macdonald関数と呼ばれる関数の具体形を与えるアルゴリズムを提唱した。この関数は存在と一意性は以前より証明されていたが、その具体形を与える公式を与えたのは本研究が初めてである。また、それを用いて楕円マクドナルド多項式への拡張手段も考察をはじめた。