hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深海・地殻環境中に高頻度出現する新奇・未培養真菌群の実態とその生態学的意義の解明

メタン冷湧水域と鯨骨域の底泥からは非常に高頻度で真菌が分離されたのに対し、深度1万メートル近い海溝域の底泥からは低頻度でのみ真菌が分離されたが新種の割合が多かった。海溝域から分離された株については高圧培養を行い、その耐圧性を現在調査中である。海底に人為的に沈められた木片からはこれまでに世界で1例しか報告がなく、深海性真菌の可能性が高い菌が子実体を木片に形成した形で採集された。子実体を形成した形での深海からの真菌の分離は非常に珍しく、今後の深海性真菌の研究に非常に重要なサンプルの取得となった。本研究で特に注目している未培養真菌群Deep-Sea Fungi-Group1 (DSF1)に関しては、当初の計画通りに特異的プライマーの構築、マイクロマニュピュレーターによるsingle cell PCRやsingle cell培養が進んでいる。DSF1は調査が終わっているすべてのサイト(鯨骨域は現在調査中)からDNA、RNAレベルの両方で検出され、深海環境に広く生息している真菌である事を改めて確認した。今年度の研究成果により、これまでその多くが謎に包まれていた深海環境中の真菌の多様性や生態についてその一端が見えて来た。今後これらの調査がさらに進めば、深海環境における真菌類の実態解明や生態学的意義の解明へと繋がる。予定していたサンプリングが順調に進み、培養や環境PCR法による深海における真菌多様性が海溝や鯨骨化学合成環境などで進んでいる。研究目的である“これまでに報告されていない新奇真菌類の発見"を順調に達成できていると考える。これまで深海環境からのみ分離されている「深海性真菌」である可能性の高い菌のEST解析にも成功し、順調に深海真菌の生態についての解明が進みつつある。今年度は予定通りにサンプリングが進み、さらに研究協力者の協力により当初の予定にはなかった人為的に沈めた木片からの深海性真菌の取得にも成功した。取得したサンプルからはこれまでに培養できていなかった新規性の高い真菌類や、『深海性』である可能性のある非常に珍しい菌を分離できており、研究目的である"これまでに報告されていない新奇真菌類の発見"を順調に達成できていると考える。本研究で特に注目している未培養グループDSF1に関しては、当初の計画通りに特異的プライマーの構築を行い、取得サンプル中におけるDSF1の出現傾向の調査がDNAレベルとRNAレベルの両方で進んでいる。以上の事から本研究は、概ね順調に進展していると考える。来年度はEST解析により得られた遺伝子配列情報の詳細解析を行い、深海における真菌類の代謝系の解明等を行う。また、来年度初めには相模湾初島沖航海が予定されており、FISH用のサンプリングを行う予定である。今後は、引き続きサンプリングした泥、海水、木片から分離した新規性の高い真菌類の同定や性状解析を進めると共に、環境PCR法によって真菌多様性解析を行う。これらの結果を元に深海環境における真菌の地理学的分布や出現傾向を考察し、まだ培養できていない新規性の高い系統群についてはマイクロマニピュレーターによるsingle cell PCRやsingle cell培養、FISH等により実態解明を行う。また、来年度はこれまでに分離された新規性の高い菌の中でも、人為的に海底に沈められた木片から採取された『深海性』である可能性の高い菌に特に注目し、この菌のExpressed Sequence Tag (EST)解析を行う。
活性化組織好酸球に発現するCD69の機能的役割の解明

好酸球は、気管支喘息やアレルギー性鼻炎などのアレルギー性疾患において炎症局所に集積・活性化し、組織傷害性タンパク質や種々のサイトカインやケモカインを産生したりすることで、その病態形成に重要な役割を果たしている。好酸球性副鼻腔炎では、局所に浸潤した好酸球が病態形成に深く関与していると考えられている。組織に浸潤した好酸球は活性化し、CD69分子を発現しているがその詳細なシグナル伝達や機能的役割については、まったく解明されていない。この疑問を解明する事で、好酸球性副鼻炎を制御する新たな治療戦略の開発につながると期待される。
毒ヘビ血清新規蛋白質SSPの蛇毒成分に対する分子認識機構の解明

蛇毒中には多彩な薬理作用を示すものが多数含まれる。一方、毒ヘビ自身の血液中には、これらの毒酵素成分に対する内在性阻害物質が含まれている。本研究では、ハブ血清中の蛋白質、ハブ毒蛋白質を精製し、血清蛋白質が、毒中の神経毒や出血毒に対して阻害することを明らかにした。また、ハブ血清蛋白質の一つは、ハブ毒中の細胞死を誘導する蛋白質を等量で阻害することが分かった。本研究では、血清蛋白質がどの領域で毒蛋白質を認識しているのかに関する知見も得た。本研究では、毒ヘビ血清新規蛋白質SSPsのCa^<2+>チャンネル結合性神経毒Triflinとアポトーシス誘導蛋白質Hv1に対する生理的阻害能、相互作用部位を調べ、SSPの分子認識機構を変異体を用いた生化学的な手法で明らかにすることを目的としている。平成20年度の研究成果1:ハブ血清低分子タンパク質(SSPs)の精製とSSP組換え蛋白質の調製実験実施計画に記載した3段階クロマトの精製法により、ハブ血清6.0mlからSSP-1,SSP-2をそれぞれ7.5mg,6.9mg得た。また、BL21(pLys)宿主細胞を用いてSSPを発現誘導し、封入体として得られたSSPは、希釈法を用いたリフォールディングにより巻き戻しを行った(巻き戻し効率25%)。今後の相互作用解析に十分な量を得た。2:アポトーシス誘導蛋白質(Hv1)の精製ゲルろ過クロマト(sephacryl S-300HR)、陽イオン交換クロマト(SP-sepharose)、ゲルろ過クロマト(Superdex 75)の3段階クロマトを用いてハブ粗毒300mgから高純度のHv1は、約2mg得た。精製したHv1は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞に対して濃度依存的に細胞毒性を示すことが確認された(IC_<50>=0.3μg/ml)。今回精製したHv1は、今後のSSP結合実験やHv1の細胞毒性に対するSSPの影響を調べる実験に用いる。3:SSP-2によるTriflinの相互作用領域の同定SSP-2のアミノ基,Trp残基,His残基を化学修飾し、Triflinとの結合活性をTSKgel G3000SWカラムを用いるゲルろ過HLPCで評価した。その結果、アミノ基を修飾したSSP-2はTriflinと結合しなかった。また、SSP-2とTriflinと結合しないSSP群とのアミノ酸配列を比較すると、SSP-2のαアミノ基またはN端ドメイン領域が結合に関与する可能性がある。本研究では、毒ヘビ血清新規蛋白質SSPsのCa^<2+>チャンネル結合性神経毒Triflinとアポトーシス誘導蛋白質Hv1に対する生理的阻害能、相互作用部位を調べることを目的としている。研究成果Triflinの相互作用ドメインの同定大腸菌発現系を用いてTriflinの発現系構築を試みた。Triflinは封入体として得られたため、リフォールディング条件を確立し、培地1L当たり、約1mgのTriflinを得ることに成功した。また、SSP-2との結合にはTriflinのN末端ドメインが必要であることが分かった。SSPsとHv1の相互作用解析SSP-1の結合分子として見つかったHv1が他のSSPs(SSP-2,SSP-3,SSP-4,SSP-5)のに対しても結合するのかをBIAcore3000を用いて調べた。その結果、SSP-4も結合することが分かった。Hv1の機能解析とHv1活性に対するSSPの影響
潰瘍発現性薬物によりFosを発現する神経細胞の分離・培養とそのCRH分泌特性

[1]シンコフェン刺激によるニューロンのFosの発現生後一週令のラットに5%のシンコフェン溶液を腹腔内投与(300mg/kg)した。この刺激により脳内にFos発現が見られることを免疫組織化学的手法を用いて確かめた(第72回日本生理学会にて発表)。[2]蛍光ラベルしたcDNAの細胞導入によるFos発現細胞の同定同様の刺激の後、無菌的に脳を摘出、トリプシン/ディスパーゼを用いSinglecellsuspensionを作製した。c-fos mRNAに相補的かつ特異的なDNA鎖にAcridine orangeを結合させることで蛍光標識したプローブをエレクトロポレーションによって、脳細胞のsuspensionに導入した。c-fosが発現している細胞に導入されてc-fos mRNAとハイブリダイズしたプローブは緑色の蛍光を発し、c-fosの発現のない細胞に導入されたプローブは一本鎖のままなので赤色の蛍光を発した.この発する蛍光の相違を利用することにより、c-fos mRNAの発現している細胞と、発現していない細胞を区別することが可能とであることが示された(第72回日本生理学会にて発表、日本生理学誌に掲載)。
新規アポトーシス制御因子GRIM-19の発現制御機構の解析

(1)口腔扁平上皮癌細胞株におけるGRIM-19のタンパク質発現をウエスタンブロット法にて検討した結果,IFN-ssおよびRAの共刺激によりCa9-22細胞ではGRIM-19の発現が誘導されたが,HSC-2細胞ではその発現誘導は認められなかった.(2) GRIM-19のmRNAをリアルタイムPCRにて検討した結果,どちらの細胞においても構成的なGRIM-19のmRNA発現が認められた.しかしこの構成的なmRNA発現はIFN-ss,RAの共刺激により,いずれの細胞においても発現増強は認められなかった.(3)一方,IFN-β誘導性遺伝子であるCXCL11,TRAILの発現はいずれの細胞株でも認められたことから,IFN-ssのシグナル伝達経路の異常でないことが示唆された.これらの結果から,口腔扁平上皮癌細胞においてGRIM-19の発現制御が遺伝子の転写レベルでなく,翻訳レベル,あるいは翻訳後レベルで制御されている可能性が示唆された.(1)口腔扁平上皮癌細胞株におけるGRIM-19のタンパク質発現をウエスタンブロット法にて検討した結果,IFN-ssおよびRAの共刺激によりCa9-22細胞ではGRIM-19の発現が誘導されたが,HSC-2細胞ではその発現誘導は認められなかった.(2) GRIM-19のmRNAをリアルタイムPCRにて検討した結果,どちらの細胞においても構成的なGRIM-19のmRNA発現が認められた.しかしこの構成的なmRNA発現はIFN-ss,RAの共刺激により,いずれの細胞においても発現増強は認められなかった.(3)一方,IFN-β誘導性遺伝子であるCXCL11,TRAILの発現はいずれの細胞株でも認められたことから,IFN-ssのシグナル伝達経路の異常でないことが示唆された.これらの結果から,口腔扁平上皮癌細胞においてGRIM-19の発現制御が遺伝子の転写レベルでなく,翻訳レベル,あるいは翻訳後レベルで制御されている可能性が示唆された.口腔扁平上皮癌細胞におけるGRIM-19の発現を検討するため、HSC2,Ca9-22細胞にIFNBおよびRAを添加し,12時間および24時間後,total cell lysateを調製しWesわern blotを行った.HSC-2細胞ではIFN6およびRAによる共刺激でGRIM-19の発現は誘導されなかった.一方,Ca9-22細胞ではIFN6,RAによる共刺激でGRIM-19の発現が誘導された.また同じ条件下におけるmRNA発現をリアルタイムPCR法により検討したところ,Western blot法と同様にCa9-22細胞ではIFNB,RAによる共刺激でGRIM-19の発現が有意に誘導されたが、その他の細胞株での有意な発現誘導は認められなかった.またTypeIIインターフェロンであるIFNYによるGRIM-19の発現誘導は,いずれの口腔扁平上皮癌細胞株でも認められなかった.GRMI-19の構成的な発現が認められないHSC-2細胞に,GRIM-19を強制発現させ,STAT3の発現やSTA3依存性遺伝子発現に及ぼす影響を検討するため,レンチウイルス発現ベクターを作製した.ウイルスベクター構築には,Gateway(R)システムを用い,GRIM-19cDNAをdestination vectorにクローニンぎした後,ウイルスパッケージングミックスとともに293FT細胞に遺伝子導入し,組み換えレンチウイルスを得た.また,コントロールとしてGFP発現組み換えレンチウイルスも作製した.レンチウィルスベクターによりHSC-2細胞にGRIM-19を強制発現したところ,STAT3の発現に抑制傾向が認められた.口腔扁平上皮癌細胞株においてSTAT3の発現について検討したところ,HSC-4,Ca9-22細胞ではHSC-2,HSC-3細胞に比べて発現量は低かった.リン酸化STAT3はすべての口腔扁平上皮癌細胞株においてその発現が認められた.このSTAT3のリン酸化(Tyr705)はIFNy処理により変化は認められなかった.これまで研究代表者らは口腔扁平上皮癌細胞株におけるGRIM-19遺伝子の発現制御機構ならびにGRIM-19遺伝子の不活性化のメカニズムの解析を行ってきた。その結果、Ca9-22細胞ではIFNβ,RAによる共刺激でタンパク質レベルでのGRIM-19の発現が誘導された。一方、HSC-2細胞ではIFNβおよびRAの共刺激でGRIM-19の発現は認められず、遺伝子発現の不活性化が示唆された。そこでIFNβおよびRA刺激によるGRIM-19のmRNA発現に違いが認められるのか、リアルタイムPCRにて検討行った。その結果、予想に反してCa9-22細胞においてもIFNβ,RAによる共刺激12時間、24時間での有意なGRIM-19のmRNAの発現誘導は認められなかった。これらの口腔癌細胞株におけるGRIM-19遺伝子発現の非誘導性がIFNβに対する不応答性に起因しているのか、他のIFNβ誘導性遺伝子であるCXCL11、TRAILについて検討した。その結果、いずれの細胞においても有意なmRNA発現誘導が認められたことから、IFNβのシグナル伝達経路の異常によるものではないことが示唆された。Ca9-22細胞ではIFNβ,RAによりGRIM-19のタンパク質レベルでの発現誘導が認められることからGRIM-19の誘導には転写後の調節機構が関与している可能性が示唆された。これまでに、以下の知見が得られた。

1口腔扁平上皮癌細胞におけるGRIM-19のタンパク質レベルを検討した結果、HSC-2細胞ではIFNβおよびRAによる共刺激でGRIM-19の発現は誘導されなかったが,Ca9-22細胞ではGRIM-19の発現が誘導された。2GRIM-19のmRNA発現をリアルタイムPCRにて検討した結果、どちらの細胞においても構成的なGRIM-19の発現は認められたが、IFNβ,RAによる共刺激による発現誘導は認められなかった。3IFNβ誘導性遺伝子であるCXCL11、TRAILの発現は認められたことから、IFNβのシグナル伝達経路に異常は認められなかった。これらの結果は、GRIM-19の発現制御が遺伝子の転写レベルでなく、タンパク質レベルで制御されている可能性を示唆している。そこで、口腔扁平上皮癌細胞におけるIFNβとRA刺激によるGRIM-19のタンパク質レベルでの発現制御機構を明らかにするため、特にタンパク質の合成系、分解系に焦点を置き、現在プロテアソーム阻害剤であるLactacystinおよびユビキチン活性化酵素(E1)阻害薬(UBEI-41)を用いてGRIM-19の発現に及ぼす影響について検討を行っている。GRIM-19遺伝子の発現誘導が転写レベルでの制御機構によるものであるとの仮説で本研究課題を遂行していたが、遺伝子発現解析等から転写レベルではなく、転写後の制御による可能性が出てきたため当初予定していた解析が行えなかったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの解析結果から口腔癌細胞におけるGRIM-19の発現が、転写レベルではなく転写後の制御機構による可能性が出てきた。この後の本研究課題の推進方策として、このIFNβ,RAによるGRIM-19のmRNAの非誘導性が口腔癌細胞など悪性腫瘍に認められる特徴なのか明らかにするため、正常ヒト口腔粘膜上皮細胞におけるGRIM-19の遺伝子発現について検討を行う。またCa9-22細胞で認められるGRIM-19のタンパク質レベルでの発現誘導がどのようなメカニズムにより制御されているのか、転写後の制御機構についても検討を行う予定である。
脂肪乳剤を用いた全身麻酔からの覚醒促進および認知機能回復促進

脂肪乳剤は脂溶性薬剤を取り込み、体内分布を変える効果を持つ。そのためブピバカインのような脂溶性の局所麻酔薬による心・中枢神経毒性の治療に有効である。同様の効果により、揮発性麻酔薬セボフルランによる全身麻酔からの覚醒を促進する可能性がある。全身麻酔からの覚醒過程に生じるせん妄および認知機能障害は、術後管理に悪影響を与えるだけでなく予後にも影響する可能性があるため、発症の予防が大切である。しかし現時点では確立した予防・治療法はない。体内に残存する全身麻酔薬の効果を速やかに拮抗することにより覚醒がより速やかになれば、せん妄や認知機能障害を減らすことができると考えられる。脂肪乳剤によるリピッドレスキューの効果は、全身麻酔薬からの覚醒促進をもたらす可能性が期待される。本研究の目標は、ラットを用いて脂肪乳剤のセボフルラン全身麻酔薬からの覚醒および認知機能回復促進効果を調べること、さらに細胞・受容体レベルでその機序を調べることである。これまでの段階で、脂肪乳剤がセボフルラン全身麻酔からの覚醒を促進することを、行動実験および脳波記録において確認した。次の段階では、脂肪乳剤による認知機能の回復促進効果を調べ、さらに細胞・受容体レベルで機序を調べる計画である。認知機能を行動実験から評価し、セボフルランによる影響とそれに対する脂肪乳剤の作用を調べる。パッチクランプ法を用いて、全身麻酔薬に感受性の高い神経細胞のチャネル・受容体の活動を記録し、セボフルランによる作用に対する脂肪乳剤の効果を検討する。稼働手術室増加に伴う診療業務の増加、各種学内・院内職務の増加、院外での社会的な任務などの影響により、研究に割り当てられる時間が大幅に減少した。大学院生も手術件数増加の影響を受け多忙となり研究協力が得られにくい状況であった。そのような制約が生じたため、今年度の研究が遅れる結果となった。新年度では、診療部門内での調整を行い、研究時間および人員を確保できる見通しである。今後、認知機能を評価する機器を導入し、セボフルラン全身麻酔からの認知機能回復に対する脂肪乳剤の効果を調べる。神経細胞のチャネル・受容体レベルで、セボフルランの作用に対する脂肪乳剤の効果を検討する。学内の研究技術職員に神経細胞培養について支援を依頼する予定である。本研究の目標は、ラットを用いて脂肪乳剤の全身麻酔薬からの覚醒促進効果および認知機能回復効果を調べ、さらにその機序を受容体レベルで明らかにすることである。全身麻酔からの覚醒過程におけるせん妄や興奮などの認知機能障害は、術後管理に悪影響を与えるだけでなく予後にも影響する可能性がある。そのため発症を防ぐことが大切であるが、現時点では確立した予防・治療法はない。残存する全身麻酔薬による作用が最も重要な原因の1つであるため、覚醒をより速やかにすることが有効な治療になると考えられる。全身麻酔薬は比較的に脂溶性が高いことから、局所麻酔薬中毒の有効な治療法である脂肪乳剤に全身麻酔からの覚醒、認知機能の回復を速める効果が予想されたため、覚醒過程での認知機能障害への対処法として脂肪乳剤の有効性を検討することが本研究の目的である。まずは脂肪乳剤投与による揮発性麻酔薬セボフルラン全身麻酔からの覚醒促進効果を検討した。セボフルラン2%で全身麻酔したラットを、セボフルランの吸入をやめて脂肪乳剤または生理食塩水を投与すると、脂肪乳剤を投与した場合の方が正向反射回復までの時間が短くなった。正向反射の消失するセボフルラン濃度を調べ、その濃度による全身麻酔中に脂肪乳剤または生理食塩水を投与すると、脂肪乳剤を投与した方が正向反射の回復するラットの数が多かった。そして脳波記録では、セボフルラン2%による全身麻酔中に脂肪乳剤を投与すると、デルタ波の減少を認めた。このように脂肪乳剤がセボフルランによる全身麻酔からの覚醒促進効果を持つことがわかった。これまでにラットの行動実験および脳波解析から、脂肪乳剤はセボフルラン全身麻酔からの覚醒促進効果を持つことがわかった。これらの脂肪乳剤の効果について濃度(投与量)依存性そして効果発現時間および効果持続時間を引き続き検討するという段階である。脂肪乳剤にセボフルラン麻酔からの覚醒促進効果があることが分かったため、機序を調べる予備実験を開始した。本研究では、全身麻酔からの認知機能回復における脂肪乳剤の有効性について検討することを計画しており、そのため平成28年度にオペラント行動を評価するオペラント学習実験装置を購入・設置し、実験準備を進める予定であった。現在までの研究の進捗状況に少し遅れが生じており、平成28年度中の導入に至らなかった。さらにオペラント行動評価の研究には予想以上の人的支援と研究時間を必要することが分かったので、それらの調整が可能かも含めて研究計画・方法について検討していているため、認知機能を調べる研究の開始が遅れた。

全身麻酔薬は比較的に脂溶性が高いことから、局所麻酔薬中毒の有効な治療法である脂肪乳剤に全身麻酔からの覚醒、認知機能の回復を速める効果が予想されたため、覚醒過程での認知機能障害への対処法として脂肪乳剤の有効性を検討することが本研究の目的である。平成28年度は、行動実験および脳波記録から、脂肪乳剤投与がセボフルランによる全身麻酔からの覚醒促進効果を持つことがわかった。平成29年度は、脂肪乳剤の全身麻酔からの覚醒促進について、まずは、その機序に関する予備実験を行った。Neuroblastoma-glioma hybrid cell line (NG108-15)を用いて、パッチクランプ法により全身麻酔薬に感受性の高いGABAA受容体、神経ニコチン性アセチルコリン受容体の電流測定を試みた。しかしNG108-15ではいずれの電流も非常に小さく、全身麻酔薬および脂肪乳剤の影響を評価することが困難であった。認知機能回復効果の実験については、オペラント行動評価が予想以上の人的支援と研究時間を必要することから、計画の再検討を行った。さらに認知機能回復と脳波記録は別に行う予定としていたが、情報統合・連絡性などの詳細な脳波活動を認知機能と同時に評価することが有益な情報になると考え、次年度に向けて、使用する機器および実験計画について再検討した。脂肪乳剤によるボフルラン全身麻酔からの覚醒促進効果について、次の段階として、細胞・受容体レベルでの機序、認知機能回復効果について研究を進める予定としていた。平成29年度は、まず機序の予備実験として、Neuroblastoma-glioma hybrid cell line (NG108-15)を用いて、パッチクランプ法による受容体電流記録を行った。しかし予想に反して、記録されるGABAA受容体電流も神経ニコチン受容体電流が微小であったため、脂肪乳剤の影響を評価することができなかった。この実験に予定以上の時間を費やした。また全身麻酔からの認知機能回復における脂肪乳剤の有効性については、予想以上に人的支援と研究時間を必要とするオペラント行動評価の研究を実験環境を調整することで進められるか、より簡便な代替の実験方法(Y字迷路試験もしくは新規物体認識テストなど)に変更して進めるか、再検討を行った。さらに脳波解析に関しては、情報統合・連絡性などの中枢神経機能に関する活動の評価がより有益な情報になると考えられたので、使用する機器および実験計画について入念に再検討した。そのため研究の進捗が遅れる結果となった。脂肪乳剤は脂溶性薬剤を取り込み、体内分布を変える効果を持つ。そのためブピバカインのような脂溶性の局所麻酔薬による心・中枢神経毒性の治療に有効である。同様の効果により、揮発性麻酔薬セボフルランによる全身麻酔からの覚醒を促進する可能性がある。全身麻酔からの覚醒過程に生じるせん妄および認知機能障害は、術後管理に悪影響を与えるだけでなく予後にも影響する可能性があるため、発症の予防が大切である。しかし現時点では確立した予防・治療法はない。体内に残存する全身麻酔薬の効果を速やかに拮抗することにより覚醒がより速やかになれば、せん妄や認知機能障害を減らすことができると考えられる。脂肪乳剤によるリピッドレスキューの効果は、全身麻酔薬からの覚醒促進をもたらす可能性が期待される。
代謝調節ホルモン・レプチンと顔面口腔領域における胎児発育との連関に関する研究

本研究と関連したこれまでの研究業績より、レプチンが味覚器にも作用していることが明らかになり、口腔内器官もまたレプチンの作用部位であることが分かった。今回の実験結果では胎児マウス下顎骨におけるレプチン受容体の発現を確認することができなかった。レプチン受容体の発現が認められないとすると、顎骨へのレプチンの直接作用の可能性は低い。しかし、中枢を介した顔面口腔領域の発達への関与が可能性として考えられるため、その点については今後の検討課題である。脂肪細胞由来のホルモンであるレプチンは、摂食抑制やエネルギー代謝亢進に関与する生理活性物質として広く知られている。一方、胎児期においてもレプチンは、胎盤から産生されていることや胎児組織器官にもレプチン受容体が発現していることから、胎児発育への関与が示唆されている。しかしながら、胎児におけるレプチンの機能については不明な点が多く、特に顔面口腔領域においては未だ解析がなされていない。我々の研究機関ではこれまでにマウス・ヒトの成体におけるレプチンの機能解析を進め、口腔領域においてもレプチン受容体が発現しており摂食に関与する機能を持つことを明らかにした。本研究では、胎児期の顔面口腔領域におけるレプチンの機能解析を行い、胎児発育への関与について検索し解明することを目的とした。胎児正常マウスを用いて、血中レプチン濃度を測定し成体との比較を行うためサンプル収集を継続している。成体との比較に加えて、胎児マウスにおける血中レプチン濃度の日内変化を検索したいところであるが、一個体の胎児マウスから得られる血液量に限界がある。また、胎児正常マウスの組織切片を用いて顔面口腔領域におけるレプチン受容体(Ob-R, Ob-Rb) mRNAおよびタンパク質の発現解析を進めており、データ取得を継続している。まだ、サンプル数が少なく、新しい知見につながる結果の発見には至っていない。一方、胎児期においてもレプチンは、胎盤から産生されていることや胎児組織器官にもレプチン受容体が発現していることから、胎児発育への関与が示唆されている.しかしながら、胎児におけるレプチンの機能については不明な点が多く、特に顔面口腔領域においては未だ解析がなされていない。胎児正常マウスを用いて、血中レプチン濃度を測定し成体との比較を行うためサンプル収集した。成体マウスは2.53.5ng/mlの範囲で変動したのに対し、胎児マウスにおける血中レプチン濃度は約1.0ng/mlであった。また、胎児正常マウスの組織切片を用いて顔面口腔領域におけるレプチン受容体(Ob-R,Ob-Rb)mRNAおよびタンパク質の発現解析を進めており、昨年からのデータ取得を継続している。レプチン受容体の発現が認められないとすると、顎骨へのレプチンの直接作用の可能性は低く、従来の報告にあるようにレプチンが制御する骨吸収機序は中枢の受容体にレプチンが作用し交感神経系を介すると考えられる。
オゾン水洗浄を利用した下水直接ナノ膜ろ過技術の開発

生物処理等の前処理を省いた下水の直接膜ろ過の課題は、ろ過水の水質悪化と膜汚染(膜ファウリング)である。本研究では、微量化学物質を含む有機物除去性能、耐薬品性、寿命の面で優れたセラミック製ナノ膜を用いて下水直接膜ろ過を行い、処理水質の評価を行うと共にオゾン水洗浄の膜ファウリング抑制効果を明らかにした。今年度はまず室内実験試験にてろ過運転条件とオゾン水洗浄条件の最適化を重点的に行った。セラミック製ナノろ過膜を使った場合の処理水質に関しては、分画分子量200 Daltonのナノ膜を用いた場合は実験に使用した微量物質のほとんどに対して高い除去率を示した一方で、分画分子量450 Daltonのナノ膜を用いた場合は用いた微量物質の大きさに関わらず非常に低い除去率を示した。これにより、ナノ膜における分画分子量は微量物質除去に対して非常に重要な検討項目であることが分かった。下水の再利用に使用する膜分離プロセスにおいて重要な課題の一つである膜ファウリングに対しては、下水二次処理水を供給水として使用したために低流束で運転を行った場合でも非常に速い速度で膜ファウリングが進んだ。ただし、洗浄力の高いオゾン水洗浄を用いて膜ファウリングの進行を大幅に低減することができた。これにより、高頻度の薬品洗浄を必要としないナノ膜ろ過運転を可能にする洗浄技術としてオゾン水洗浄が有効であることを示した。27年度が最終年度であるため、記入しない。
幼児・児童の日本語と英語の音韻識別能力の比較と英語の読み能力の発達に関する研究

英語圏、また日本においても子どものphonological awareness(音韻認識能力)とreading developmentには強い関係があると報告されている。しかしながら音韻認識能力自体についての研究は少なく、第二君語における同様の研究はさらに少ない。音韻認識能力の言語転移問題については、研究もやっと始まったばかりである。本研究は4つの調査を通して第二言語(英語)における音韻認識能力の実体を探った。最初の研究では、仮説「第一言語における音韻識別能力が第二言語の音韻識別能力の発達に影響を及ぼし、それに知能も関連している」を検証するため2つの調査が行なわれた。実験1では日本語と英語の音韻認識能力の転移について幼稚園児,および小学校1年生222名を対象に、英語と日本語の音韻に関するテストを実施した。また、実験2はその参加者中115名の知能を測定し、言葉の音韻認識能力と知能との関係も探った。structural equation modelingの使用を試みた結果、日本語から英語への音韻認識能力の転移、さらに日本語の音韻認識能力に対して知能が関与していることが示唆された。次の研究では、さらに英語の音韻認識能力を細かく分析するため、中学1年生94名と小学6年生131名の計225名に最初の音の聞き分けと最後の音の聞き分けテストを実施した。この調査から音節内部構造を分節する際、日本人の学習者も個別の音素を聞き分ける前になんらかの音を認識する単位をもっていることが明らかになった。英語の母語話者はonset-rime単位で音節を分節するが、「日本人学習者は音節の内部構造をonset-rimeに分節するのではなく、モーラ単位で分節するのではないか」という仮説を検証し、その妥当性が明らかになった。さらに第二言語での音韻認識が読み能力に影響していることも示唆された。研究目的-今年度は日本語と英語の音韻認識能力の関連性について重点的に研究した。仮説は「第一言語(日本語)における音韻識別能力が第二言語(英語)の音韻識別能力の発達に影響を及ぼし、この2つの力にはpositive transferが存在する」である。研究方法-幼稚園年長児、および小学校1年生を対象に、6月から7月にかけて次の4種類のテストを実施した。テストは英語の音に関する知識(Alliteration Test, Rhyme Test, Phoneme Blending Test)、日本語の音に関する知識(最初のMoraテスト、最後のMoraテスト,Moraカウントテスト)、知能(幼児用ウェスウラー知能テストWPPSIの一部)、記億力(視覚記憶、聴覚記憶、数記億)を測るものである。この年齢に被験者を絞ったのはまだ公的に文字指導を受けておらず、かつそれぞれのテストを理解し答えることができる年齢だからである。英語、日本語テストを63名、および知能テストを25名が受けた。研究結果-日本語と英語の音韻識別能力に何らかの関係があるのかを調べるため、日本語の音韻識別能力が英語の音韻識別能力に対して影響を及ぼすというモデルを構築し、参加者の数がまだ少ないのだが、structural equation modelingの使用を試みた。その結果、このモデルは自由度8でx^2係数が5.65、Bentler-Bonett Normed Index. 96,およびComparative Fit Index 1.0でありplausible modelということができた。日本語音韻識別能力から英語識別能力への標準偏回帰係数は37であった。研究発表-以上の結果を平成14年12月16日より21日までシンガポールで行われた世界応用言語学会(AILA)において発表した。研究目的-今年度は昨年度研究した日本語と英語の音韻認識能力の関連性についての研究に加え、年齢の高い子どもを対象に英語の音韻識別能力と英語の読み能力の関連性について研究した。

昨年度の研究から「第一言語(日本語)における音韻識別能力が第二言語(英語)の音韻識別能力の発達に影響を及ぼしている」ことが判明したので、今年度はその追従研究とともにReading能力に関しては、「英語の音韻識別能力と英語のReading能力に関連性がある」という仮説を検証した。研究方法-音韻識別能力に関する日本語と英語のテストは前年度の研究と同じ手順で行なった。英語の音韻識別能力と英語のReading能力に関する研究では、小学校6年生とPhonicsが導入されている中学校1年生(222名)を対象に行なった。研究参加者は研究代表者が製作した音韻能力を測る2種類のテストとReading能力を測る3種類のテストを受けた。研究発表-以上の結果を平成15年10月23日に行なわれたWales大学Bangor校の心理学研究室でのlecture seriesにおいてguest speakerとして発表した。
in vivo部位特異的光架橋法を用いたミトコンドリア膜透過装置の解析

私は、in vivo部位特異的光架橋法を用いて、ミトコンドリア外膜膜透過装置のTOM40複合体のサブユニットで、受容体など多様な機能をもつ、Tom22の相互作用解析を行っている。in vivo部位特異的光架橋法とは、解析対象のタンパク質にBPAという光架橋側鎖をもつ非天然アミノ酸を部位特異的に導入し、UV照射により架橋を行う方法で、アミノ酸残基レベルの空間分解能で相互作用解析が行える手法である。Tom22について,サイトゾルドメインとTOM40複合体のもうひとつの受容体サブユニットTom20との相互作用,膜間部ドメインと内膜膜透過装置TIM23複合体の受容体サブユニットTim50との相互作用について,基質プレ配列または基質前駆体の存在下と非存在下,in vivoおよびin organelloで部位特異的光架橋を用いて解析し,Tom22の機能時の動的なタンパク質間相互作用変化を解明した。得られた結果は,in vivo部位特異的光架橋法が細胞内における膜タンパク質複合体の機能と関連した相互作用及びその変化を十分な空間分解能で明らかにできる強力な手法であることを示すものであり,PANS誌に論文発表した。さらに酵母細胞内で過剰発現したTom22がTOM40複合体に組み込まれる前に一過的に相互作用する因子として,サイトゾルのシャペロンに加えてミトコンドリア外膜タンパク質ポリン(Por1)を見出した。野生株、Por1破壊株、Por2破壊株におけるTom22の安定性をシクロヘキシミドチェイス実験により検討した。その結果、Por1破壊株ではTom22の安定性にわずかに影響が見られた。以上の結果から、Por1はTOM40複合体に含まれなかったTom22と一時的に相互作用し、分解から保護していることが示唆されたミトコンドリアタンパク質の膜透過機構の解明に向けて大きく分けて、以下の二つの事を明らかにした。ミトコンドリア外膜受容体のTom70は、これまでプレ配列を持たない前駆体タンパク質を認識する受容体と考えられていたが、当研究室での網羅的な解析から、Tom70の基質としてプレ配列を持つ前駆体タンパク質が5種(pAco1p、pAtp1p、pCit1p、pDld2p、pIdh1p)同定された。PURESYSTEMを用いてこれら5種類のタンパク質を合成する際に、Tom70を共存させないと、合成されたほとんどのタンパク質が不溶性となるが、精製Tom70を共存させると、可溶性になることを見出した。すなわち、Tom70はシャペロン様の機能をもつことが示された。したがって、Tom70は、プレ配列を持つ前駆体タンパク質の膜透過反応時に成熟体部分を保護する事で、膜透過反応をスムーズに行えるように助ける働きがある事が示唆された。以上の結果は、THE JORNAL OF BIOROGICAL CHEMISTRYに掲載された。外膜受容体のTom22においてin vivo部位特異的光架橋法を用いた相互作用解析により、Tom22のサイトゾルドメインの酸性アミノ酸に富む領域、および膜間部ドメインが、前駆体タンパク質と直接相互作用する事を明らかにした。さらに詳細な解析から、基質がTom22の膜間部ドメインから内膜膜透過装置TIM23複合体の受容体サブユニットTim50に受け渡される仕組みについても,知見を得た。また、酵母細胞内で過剰発現したTom22がTOM40複合体に組み込まれる前に一過的に相互作用する因子が,サイトゾルのシャペロンであることを証明した。ミトコンドリア外膜膜透過装置構成因子Tom22についてin vivo部位特異的光架橋法を用いて、相互作用解析を行っている。これまで、Tom22の分子全体について、既知のTOM40複合体構成因子との相互作用部位の解析は完了している。本年度は、Tom20と相互作用する、サイトゾルドメインに着目し、前駆体タンパク質の過剰発現や、単離ミトコンドリアに対し精製したプレ配列を加えることにより、Tom20との相互作用の変化を検出することで、Tom22とTom20の基質認識機構について解析した。その結果、Tom22は前駆体タンパク質を認識している時、その酸性アミノ酸領域がTom20と離れ、その部位にプレ配列が結合することでTom20とともに、前駆体タンパク質を挟んで認識するこが分かった。これまで、Tom22を過剰発現した場合にのみ見られる架橋産物について未同定であった。この未同定の架橋産物を同定するため、大量発現系を確立し、架橋産物を大量に調整した。その後、その架橋産物をLC-MS/MSにより解析し、未同定の架橋産物がporinのひとつである、Por1であることを突き止めた。porinは、外膜に存在するβバレル型膜タンパク質で、低分子化合物の外膜透過(能動輸送)に関与しているタンパク質で、出芽酵母では、Por1とPor2の2つのisoformを持つことが知られている。しかし、これまでTom22とPor1が相互作用するという報告はない。Por1遺伝子を破壊した酵母株では、ミトコンドリア外膜に存在しているTom22の量が顕著に減少していることから、Por1はどうやらTom22がミトコンドリア外膜に過剰に存在している時に、保護する機能があることが示唆された。in vivo部位

特異的光架橋法とは、解析対象のタンパク質にBPAという光架橋側鎖をもつ非天然アミノ酸を部位特異的に導入し、UV照射により架橋を行う方法で、アミノ酸残基レベルの空間分解能で相互作用解析が行える手法である。Tom22について,サイトゾルドメインとTOM40複合体のもうひとつの受容体サブユニットTom20との相互作用,膜間部ドメインと内膜膜透過装置TIM23複合体の受容体サブユニットTim50との相互作用について,基質プレ配列または基質前駆体の存在下と非存在下,in vivoおよびin organelloで部位特異的光架橋を用いて解析し,Tom22の機能時の動的なタンパク質間相互作用変化を解明した。得られた結果は,in vivo部位特異的光架橋法が細胞内における膜タンパク質複合体の機能と関連した相互作用及びその変化を十分な空間分解能で明らかにできる強力な手法であることを示すものであり,PANS誌に論文発表した。さらに酵母細胞内で過剰発現したTom22がTOM40複合体に組み込まれる前に一過的に相互作用する因子として,サイトゾルのシャペロンに加えてミトコンドリア外膜タンパク質ポリン(Por1)を見出した。野生株、Por1破壊株、Por2破壊株におけるTom22の安定性をシクロヘキシミドチェイス実験により検討した。その結果、Por1破壊株ではTom22の安定性にわずかに影響が見られた。以上の結果から、Por1はTOM40複合体に含まれなかったTom22と一時的に相互作用し、分解から保護していることが示唆された
悪性グリオーマの浸潤能評価in vivoモデルの確立とその治療研究への応用

9週齢雄ヌードラットF344/Njcl-rnuの右基底核に、fast blueで蛍光標識をしたヒトグリオーマ株細胞U87MG 5X10^5個を定位的に移植した。一群には5日及び10日目に移植部位にhepatocytic growthfactor(HGF)を定位的に注入し、他群はコントロールとした。移植23週間後に摘出した脳を固定し10μmの凍結切片としてHE染色した後、蛍光顕微鏡下で標識細胞を観察し、両群を比較した。その結果、これまでの我々の実験で比較的限局性に発育すると考えられたU87MGが、HGFの存在下で周囲脳に浸潤する形で増殖しており、HGFがグリオーマ細胞の浸潤に強く関与していることが示唆された。しかし、浸潤能を評価するための定量化には切片作成の工夫などがさらに必要と思われた。1998年5月より2001年10月までの間に画像上多発性(多中心)の膠芽腫を4例経験した。この4例と同時期の孤発性膠芽腫5例に対して、免疫組織学的にMIB-1 sataining index(MIB-1SI), P53, GFAP, fibronectinの染色を行い、生存期間とともに比較検討を行った。その結果、MIB-1SI, P53, GFAP, fibronectinそれぞれに高低あるいは強弱を認めたが、GFAPの発現が多発例で低い傾向はあるものの、孤発例と多発例との間に今回検討したマーカーには有意な差は認められなかった(表1)。したがって、ヒトグリオーマにおける浸潤能にはこれらとは異なる因子が関与していると考えられ、浸潤能評価のためには、今後、MMP-2,VEGFなどさらに多くのマーカーについて検討を加える必要があると考えられた。当初予定していたGFP発現plasmid(pCMS-EGFP:Clontech社)のtransfectionに時間を要しており、我々はこれ迄に開発したヌードラット脳に蛍光染色をしたヒトグリオーマ株細胞の移植モデルを作成し、主にHGFの腫瘍細胞浸潤に及ぼす影響について検討した。9週齢雄ヌードラットF344/Njcl-rnuの右基底核に、fast blueで蛍光標準したヒトグリオーマ株細胞U251MGおよびU87MG5×10^5個を定的的に移植して腫瘍移植部位にミニ浸透圧ポンプを留置しヒトHGFを持続的に投与又は定位的に腫瘍移植部位にHCGを2回分割注入するモデルを作成した。3週間後に摘出した脳を固定し10μmの凍結切片とした後、蛍光顕微鏡下で標識細胞を観察した。U251MGはコントロール群において周囲脳に浸潤して増大し、腫瘍の範囲を同定することが困難な所見を呈しており、HGFの評価が困難であった。U87MGは腫瘍が比較的限局して腫瘍塊を形成していることが観察されたが、HGF投与群では中心部に壊死を伴い周囲に腫瘍細胞が分散する形状を示した。この結果HGFがU87MGにおいては腫瘍細胞の周囲脳への浸潤に強く関与していることが示唆された。今後は当初の予定通りGFP発現plasmid transfectionグリオーマ細胞を用いた移植脳腫瘍モデルを作成し、グリオーマの浸潤に対するHGFの作用およびその他のサイトカインの関与についても明らかにしたい。予定していたGFP発現plasmid(pCMS-EGFP : Clontech社)のtransfectionに関し、組み換えDNA実験の申請後承認審査に長時間を要し、14年末に決定がなされたため今年度内のGFP発現plasmidのtransfection実験遂行が困難となった。

このため我々はこの間に臨床材料を用い画像上のグリオーマ浸潤と、各種のバイオマーカーの発現との相関を比較検討し、グリオーマの浸潤能の評価を試みた。glioblastomaあるいはanaplastic astrocytomaの中で、診断時の画像上多発性腫瘍の所見を示した4例のパラフィン包埋切片および画像上弧発性腫瘍の所見を示した10例のパラフィン包埋切片を対象に、GFAP、MIB-1、P53、ファイブロネクチン、ラミニンの免疫染色を行ってそれぞれの発現の程度を評価し、多発性腫瘍すなわち臨床上浸潤速度が早いと考えられる腫瘍群と弧発性の腫瘍群との間での発現の差を検討した。GFAP、P53等では発現程度の数量化を現在構築中であり、したがってこれらについては統計処理は今後の課題であるが、これまでの観察ではMIB-1陽性細胞数の全細胞数に対する割合、すなわち増殖能を示すMIB-1 staininng index(SI)が多発腫瘍で高い傾向を示すことが示された。すなわち、浸潤能は増殖能を反映していることを示唆する結果であったが、症例数が少ないために有意差が出ない可能性があり、特に多発性腫瘍症例を渉猟して症例数を加え、その他のマーカーの発現の統計処理と合わせて検討したい。
歯周病原細菌P.gingivalisの細胞内侵入による炎症性サイトカン誘導作用

成人性歯周疾患は、Porphyromonas gingivalis(P.gingivalis)の感染により発症する難治性の慢性感染症である。最近の研究は、本菌が上皮細胞内に侵入すること、さらに、骨組織に達する深い組織への侵入が認められる。しかし、本菌細胞内侵入による病態の成立や進行機構を検討した報告は少ない。そこで、口腔上皮細胞KB細胞を用い、P.gingivalisの細胞内侵入が、骨吸収活性を有した炎症性サイトカインIL-6を誘導するか否か検討した。本菌を細胞に作用させるとIL-6が強く誘導された。また、本菌のKB細胞への付着と細胞内侵入は、それぞれ、41kDa線毛と67kDa線毛に司られていることを、それぞれの特異的抗血清を用いて示した。本誘導性IL-6の発現は、抗41kDa線毛抗血清で抑制された。また、その発現は、その線毛前処理で、抑制された。一方、本菌LPSは、その発現を誘導できなかった。また、抗67kDa線毛抗血清で、本菌の細胞内侵入を抑制すると、IL-6の発現は、著明に抑制された。また、本菌の細胞内侵入阻害剤MDC、ouabain、colchicine、nocodazoleは、本菌誘導性IL-6を、著明に抑制した。これらの結果から、P.gingivalisの細胞内侵入が、KB細胞のIL-6を強く誘導することが明らかとなった。さらに、その情報伝達機構について検討したところ、本菌の誘導作用は、MAP kinaseの一つであるp38の阻害剤SB202190により著明に抑制された。他のMAP kinase阻害剤PB98059とSP600125はその様な阻害作用を示さなかった。また、NFκ-Bの関与も、ほとんど無いことを確認した。このことから、P.gingivalisの細胞内侵入誘導性IL-6の情報伝達機構には、p38が関与していることが示された。また、P.gingivalisが、骨芽細胞のODF/RANKLを誘導することも確認している。成人性歯周疾患は、Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)の感染により発症する難治性の慢性感染症である。最近の研究は、本菌が上皮細胞内に侵入することを報告している。また、実際に、本疾患患者の歯肉組織で、上皮細胞内への本菌の侵入と、骨組織に達する深い組織への侵入が認められ、細胞内侵入が病原性と関連することが示されている。また、近年の研究から、P. gingivalisの骨吸収活性を有した炎症性サイトカイン(IL-1、TNF-α、並びに、IL-6)誘導作用が、病原性因子・機構として病態の成立・進行に関与すると考えられている。従い、本菌の細胞内侵入に伴うサイトカイン誘導能について検討することは、意義あることと考えられる。そこで、本菌の細胞内侵入による炎症性・骨吸収性サイトカイン誘導作用を口腔上皮細胞を用いて検討している。その結果、本菌の細胞内侵入が上皮細胞のIL-6を誘導することを示唆する結果を得たので、引き続き、実験を行っている。

成人性歯周疾患は、Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis)の感染により発症する難治性の慢性感染症である。最近の研究は、本菌が上皮細胞内に侵入すること、さらに、骨組織に達する深い組織への侵入が認められる。しかし、本菌細胞内侵入による病態の成立や進行機構を検討した報告は少ない。また、近年の研究から、骨吸収活性を有した炎症性サイトカイン(IL-1、TNF-α、並びに、IL-6の誘導作用が、成人性歯周疾患の病態の成立・進行に関与すると考えられている。従い、P.gingivalisの細胞内侵入に伴うサイトカイン誘導能について検討することは、意義あることと考えられる。そこで、本菌の細胞内侵入によるそのサイトカイン誘導作用を、口腔上皮細胞KB細胞を用いて検討した。その結果、本菌の細胞内侵入が上皮細胞のIL-6を誘導した。また、この誘導作用は、MAP kinaseの一つであるp38の阻害剤SB202190により著明に抑制された。他のMAP kinase阻害剤PB98059とSP600125はその様な阻害作用を示さなかった。また、NFκ-Bの関与も、ほとんど無いことを確認している。また、一方、上皮細胞以外の細胞へのP.gingivalis細胞内侵入能を検討したところ、骨芽細胞にも、本菌が、侵入することを見いだした。また、本菌による細胞内侵入は、骨芽細胞の増殖を抑制した。また、ODF/RANKLの発現を誘導することも確認した。
消化管粘膜上皮再生修復に関与する生理活性物質の病態生理機構の解明 (特にHepatocyte Growth Factor(HGF)及びTrefoil Peptides(TP)について)

我々はこれまで、肝細胞増殖因子(HGF)を特異的に活性化させるセリンプロテアーゼであるHGF Activator (HGFA)、及びその活性調節因子であるHGFactivator inhibitor type-1 (HAI-1)及びtype-2(HAI-2)が、消化管潰瘍性病変の回復期において高発現されることを報告してきた。本研究では、HGFAおよびHAI-1ノックアウトマウスを作製し、その解析をおこなった。ノックアウトマウスは遺伝子の一部ををネオマイシン耐性遺伝子におきかえることで不活化したターゲットベクターを、常法どおり遺伝子導入し、交配させることによって作製した。HGFノックアウトマウスは肝臓及び胎盤の形成不全により胎生致死であるが、HGFAノックアウトマウスは正常に生まれ、正常に生殖能も持っていた。HGFの活性化能はノックアウトマウス血清中には認められないので、HGFAの機能は完全に欠損していた。実験的にデキストラン硫酸を経口投与して作製した大腸炎では、コントロールマウスは投与中止後3日目には一部うっ血や浮腫が認められるもののほぼ粘膜上皮の再生が完了しているのに対し、ノックアウトマウスでは、投与中止後もまだ炎症が引き続いており、粘膜上皮の再生が遅延する傾向にあることが判明した。このことより、正常な成長時のHGFの活性化にはHGFAは関与していないか、あるいは他の酵素で代償されている可能性が考えらるが、炎症や組織障害後の消化管粘膜上皮再生にはHGFAによる局所でのHGFの活性化が大変重要で大きな役割を果たしていることが示唆され、難治性消化管潰瘍性病変の治療にHGFAが活用できる可能性が考えられた。一方、HAI-1ノックアウトマウスはヘテロマウスの交配によっても生まれてこないので胎生致死である可能性が考えられ、この遺伝子はマウスの発生、発育に必須であることが判明した。我々はこれまで、肝細胞増殖因子(HGF)を特異的に活性化させるセリンプロテアーゼであるHGF Activator (HGFA)、及びその活性調節因子であるHGFactivator inhibitor type-1(HAI-1)及びtype-2(HAI-2)が、消化管潰瘍性病変の回復期において高発現されることを報告してきた。さらに、マウスHGFA, HAI-1, HAI-2遺伝子をクローニングし、現在これらの遺伝子を欠損したマウスを、熊本大学の山田源教授らのグループと共同で作成している。本研究では酢酸経直腸投与及びDextran Sodium Salfate(DSS)経口投与などによる消化管潰瘍モデルにおいて、これらの遺伝子欠損マウス及びコントロールの正常マウスを用いて、消化管粘膜上皮再生修復時に高発現するこれらHGF関連蛋白の発現動態を検討することを目的としている。本年度はまず作成したHGFA knockout miceの解析を中心に行った。HGF knockout miceは肝臓及び胎盤の形成不全によりembryonal lethalだと報告されているが、HGFA knockout miceは正常に生まれ、正常に生殖能も持っていた。すなわち正常な成長時のHGFの活性化にはHGFAは関与していないか、あるいは他の酵素で代償されている可能性が考えられた。しかし、実験的に肛門から5%酢酸を注入して作成した大腸酢酸潰瘍では、コントロールマウスは3日後には一部うっ血や浮腫が認められるもののほぼ粘膜上皮の再生が完了しているのに対し、ノックアウトマウスでは、まだ炎症が引き続いており、粘膜上皮の再生が遅延する傾向にあることが判明した。このことは、炎症や組織障害後の粘膜上皮再生にはHGFAによる局所でのHGFの活性化が大変重要であることを示唆している。

現在さらに実験数を増やしてこのことを確認するとともに、他の方法での潰瘍モデルでも同様の現象が観察されるかどうか検討している。またHAI-1及びHAI-2のノックアウトマウスの表現形解析も並行して進めている。我々はこれまで、肝細胞増殖因子(HGF)を特異的に活性化させるセリンプロテアーゼであるHGF Activator(HGFA)、及びその活性調節因子であるHGFactivator inhibitor type-1(HAI-1)及びtype-2(HAI-2)が、消化管潰瘍性病変の回復期において高発現されることを報告してきた。今年度は、HGFAおよびHAI-1ノックアウトマウスを作製し、その解析をおこなった。ノックアウトマウスは遺伝子の一部ををネオマイシン耐性遺伝子におきかえることで不活化したターゲットベクターを、常法どおり遺伝子導入し、交配させることによってH作製した。HGFノックアウトマウスは肝臓及び胎盤の形成不全により胎生致死であるが、HGFAノックアウトマウスは正常に生まれ、正常に生殖能も持っていた。HGFの活性化能はノックアウトマウス血清中には認められないので、HGFAの機能は完全に欠損していた。実験的にデキストラン硫酸を経口投与して作製した大腸炎では、コントロールマウスは投与中止後3日目には一部うっ血や浮腫が認められるもののほぼ粘膜上皮の再生が完了しているのに対し、ノックアウトマウスでは、投与中止後もまだ炎症が引き続いており、粘膜上皮の再生が遅延する傾向にあることが判明した。このことより、正常な成長時のHGFの活性化にはHGFAは関与していないか、あるいは他の酵素で代償されている可能性が考えらるが、炎症や組織障害後の消化管粘膜上皮再生にはHGFAによる局所でのHGFの活性化が大変重要で大きな役割を果たしていることが示唆され、難治性消化管潰瘍性病変の治療にHGFAが活用できる可能性が考えられた。一方、HAI-1ノックアウトマウスはヘテロマウスの交配によっても生まれてこないので胎生致死である可能性が考えられ、現在その原因を究明中である。