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水俣病事件の教訓と環境法政策の基本原理

水俣病事件の実証研究から得られた主たる成果として,水俣病事件にかかわる一連の訴訟を,公共訴訟・現代型訴訟と位置づけることにより,法の失敗が引き起こされる制度的要因を解明した。この成果は,福島原発事故の損害賠償スキームにも適用することができた。理論面での基本原理にかかわる成果として, K. W.カップによる「社会的費用」の理論に依拠して,今日の地球温暖化問題にかかわる環境問題に対する基本的視座を獲得した。本年度における研究成果として,まず,台湾大学で開催された国際シンポジウム「正義理論とその実践」おける招待講演「京都学派と第2次世界大戦」を挙げることができる。本報告では,今般,環境倫理の基礎理論としても着目されている京都学派の哲学につき,倫理学の政治・社会的役割に関する問題意識の脆弱性という難点を指摘した。この基本考察により,環境倫理の基礎を解明するという思想的営みは,同時に政治・社会文脈をも考慮すべきであり,抽象理論を提唱するだけでは不完全である,という知見が得られた。つぎに,北京で開催された国際法哲学会第24回世界大会において,口頭発表「法の失敗に対する方策に関する考察-日本の公共訴訟における水俣病事件の研究」を行った。本報告の内容は,水俣病事件の法的・司法的解決の経緯のなかで,効率的紛争解決,司法審査・統制機能,損害費用の公正な配分という点で司法権の機能不全が認められ,アメリカの公共訴訟の諸制度を参考に解決すべき問題が少なくない,というものである。この口頭発表の基礎となった論文は,共著『各国憲法の統合と差異』(印刷中)に発表する論文「現代型訴訟としての水俣病事件」である。本稿では,日本の現代型訴訟とアメリカの公共訴訟の比較という観点から水俣病事件を分析し,そこで対応を迫られている問題系として,配分的正義と矯正的正義にかかわる法の根本問題を摘出した。さらに,裁判手続によっては現代型訴訟のような限界事例を必然的に適切に解決し得ないという問題につき,要件事実論を含めた裁判手続論・法的思考理論の限界がかかわる,という問題系を発展させた。これにかかる成果が,口頭発表「要件事実論と審査・起案技術」および,学術創成研究での招待講演「現代型訴訟の特質と限界-水俣病事件をてがかりに」である。両者の成果は,次年度に論文の形で発表する予定である。本年度は,昨年度より行ってきた研究の成果を,論文と口頭発表の形で公表することができた。哲学的・倫理的基礎理論から環境公害問題を解明した成果として,主に,論文「社会的費用,成長の限界,成長の権利」を取り上げることができる。この議論は,中国吉林大学の国際学会において招待講演の形で公表する機会を得て,国際的に関心を共有してもらうことができた。方法論的基礎理論から出発した成果として,主に,図書『各国憲法の差異と接点』に収録された論文「現代型訴訟としての水俣病事件」を取り上げることができる。水俣病事件の現代型事件としての特質を,アメリカの公共訴訟との対比で明らかにしつつ,各判決の分析を通して要件事実論に照らしてハード・ケースであることを同定したものである。本成果は,憲法,民事訴訟法,英米法,法理学の各学問分野に横断する学際的なアプローチとしての意義を有すると位置づけられよう。水俣病事件に関する実証研究の成果は,上記論文のほか,中国語図書において翻訳された「司法審判中公害問題的解決及其限界」がある。また,社会実践的には,新潟県立水俣病事件資料館における招待講演において,社会に対する成果発表の機会を得て,研究の意義を理解していただけるように努めた。計画最終年度である次年度に残された課題として,実証面では,水俣病事件に関する資料の整理収集が引き続き残されている。理論面では,分析手法として,システム理論,合理的選択理論,ガバナンス論など,学際的かつ多角的なアプローチが引き続き必要であると考えている。本年度は,研究計画の最終年度として,研究の成果を論文と口頭発表の形で公表した。まず,水俣病事件から導かれる教訓として,訴訟による紛争解決と,訴訟外での和解による紛争解決の相違,とりわけそれぞれの長所と短所に関して比較分析を行った。この問題系を,福島原発事故の損害賠償の問題の先例と位置つけたうえで,英語の論文として公表した(論文1)。英語の論文の基礎となった研究成果は,二回の国際学会において口頭で発表し,質疑応答を通じて考察を深め,その成果を論文の中に反映させた(学会発表1,4)。環境倫理,環境法政策をめぐる哲学的,方法論的基礎理論に関しては,国内学会,国際学会でそれぞれ発表を行った(学会発表6,5)。このほか,本研究をつうじて得られた哲学的考察の成果として,国家理性の問題をめぐって国際学会において招待講演を行った(学会発表3)本研究計画の途上で,東日本大震災が発生し,かつ研究活動自体を被災地のただなかで遂行しなければならなかったために,本年度の研究成果は少なからず東日本大震災との関連でまとめることとなった。すなわち,本研究における実証分析の成果を踏まえて,東日本大震災の問題状況に関して,日本語の論文を公表した(論文3)。

同様に,日本法システムをめぐる本研究における特徴づけを基礎に,海外における国際シンポジウムの関心と合わせる形で,東日本大震災における日本の法政策の特質と問題点について,英語にて招待講演を行った(学会発表2)。さいごに,本研究が課題の一つとしていた公害訴訟資料の整理に関して,新潟弁護士会所属,坂東克彦弁護士の所蔵する資料の整理につき,文献資料の整理をおおむね終えることができた。整理済みの資料は,新潟県立新潟水俣病資料館に順次おさめられており,現在,資料館が資料の電子化を進めているところである。
在宅生活ニーズ把握を目的とした多職種連携のための見取り図活用方法の開発

平成29年度は、在宅生活を送る高齢者の相談事例をもとに、家庭訪問から事例検討会まで一連の流れの中で、見取り図を活用しながら支援のためのアセスメントやプランニングを行う過程を収録し、教材DVDを制作した。教材DVDは、在宅生活を支援する経験の浅い実務者の研修会等で活用することを想定しており、今年度はDVD活用の解説書である「DVD活用ガイド」を作成した。教材DVDとその活用について、地域で実務者が集まる会議や研修会の機会、学会会場で開催したワークショップなどで紹介した。さらにDVDを実際に活用してみたいという協力者を募り、DVDを配布するとともにDVD視聴しての感想や活用に関するアンケートの協力も依頼した。平成30年度末の時点で、教材DVDと活用ガイドをセットにしたもの600組の配布がほぼ終了したところである。アンケートについては順次回収し、分析を進めている。今後、追加調査として、アンケート結果を補完するためのヒアリング調査の実施を予定している。教材DVD視聴に関して寄せられた意見の中に、看護や福祉を学ぶ学部生等を対象とした基礎教育の中での活用も有効ではないかというものがあった。当初は経験の浅い実務者を想定して制作した教材DVDであったが、教員が学内の講義で教材として使うほか、臨地実習の場で、指導者が家庭訪問やニーズアセスメントについてDVDを視聴しながら説明を加えて学びを深めるために使うことなどが提案された。今後、見取り図の活用やその効果について広く周知するためには、教材DVDをどのように活用していったらよいのか、さらなる検討が必要である。制作した教材DVDについては、視聴後アンケートの依頼とともに、ほぼ配布が終了したところである。DVDそのもののPRや活用の依頼は当初の予定より早いペースで進んでいる。しかしアンケートの回収と分析については、これから本格的な作業を進めていく段階である。またアンケートに加えて実施する予定のヒアリング調査は、次年度に実施する予定である。DVD視聴に関するアンケートの集計と分析を進めていく。アンケートに協力した対象者の中で、ヒアリング調査にも協力可能と返信があったものを抽出し、具体的な意見を聴取して考察を加える。制作したDVDの具体的な活用を検討することで、さらなる見取り図の普及と活用について検討していく。また、アンケートの回答にあった基礎教育の教材としてDVDを活用することの可能性や活用方法についても検討していく。在宅生活ニーズを把握するためのアセスメント・ツールとして、見取り図が備えるべき要件を整理した上で、家庭訪問、情報収集、見取り図作成、アセスメントの一連の流れを試行し、具体的な見取り図の活用方法を検討した。これらもとにシナリオを作成し(第1話:初回訪問、第2話:継続訪問)、動画をDVDに収録した。さらにシナリオの中の仮想事例を用いて、実際に多職種参加による事例検討会を開催した。事例検討会の録画も編集後にDVDに収録した(第3話:事例検討会)。最終的に第1話第3話の3部構成によるDVD「生活を俯瞰する見取り図の活用:在宅ニーズの理解のために」を完成させた。見取り図に興味のある保健医療福祉職を対象としたDVD試写会では、DVDの活用について、1在宅支援に関わる専門職等を対象に、相談の始まりから家庭訪問、事例検討会の中で、見取り図を用いた情報整理、本人や家族と課題共有や解決策の検討、事例検討会など、それぞれの場面での見取り図の活用について(どのような活用の可能性があるのか)を確認する。2新任の保健医療福祉職対象の研修等で、相談の一環として家庭訪問を行う時に、本人や家族にどのように関わっていくのかをシミュレーションするための教材として活用する。3保健医療福祉を学ぶ学生(初学者)を対象に、家庭訪問での観察ポイント、コミュニケーションスキル、事例検討会や多職種連携について教授するために、DVDの視聴と講義を組み合わせて活用するなどが提案された。初年度の目標であった教材として活用できるDVDを作成するということは達成できた。次年度以降は、この教材DVDを用いて見取り図活用効果を検証するための介入調査を実施する予定である。

制作した教材DVDについては、視聴後アンケートの依頼とともに、ほぼ配布が終了したところである。DVDそのもののPRや活用の依頼は当初の予定より早いペースで進んでいる。しかしアンケートの回収と分析については、これから本格的な作業を進めていく段階である。またアンケートに加えて実施する予定のヒアリング調査は、次年度に実施する予定である。保健医療福祉の実務者を対象とした研修会等の機会にDVDを視聴してもらい、その前後で見取り図活用に関する考え方や、実際の取り組みについて調査し、比較検討する予定である。当初は調査対象者として現場で実際に在宅療養支援を行う実務者のみを想定していたが、学生等の初学者に対しても、DVDの活用が提案された。またDVDの活用方法も、第1話第3話を通して視聴するのみではなく、講義やグループ討議を交えるなど、様々な使い方が考えられる。今後、DVDの活用効果の検証と合わせて、効果的なDVDの活用方法も併せて検討していく。DVD視聴に関するアンケートの集計と分析を進めていく。アンケートに協力した対象者の中で、ヒアリング調査にも協力可能と返信があったものを抽出し、具体的な意見を聴取して考察を加える。制作したDVDの具体的な活用を検討することで、さらなる見取り図の普及と活用について検討していく。また、アンケートの回答にあった基礎教育の教材としてDVDを活用することの可能性や活用方法についても検討していく。
分子形状共鳴状態の崩壊ダイナミックスの精密測定

低エネルギー電子衝突により発現する分子の共鳴状態は、分子のポテンシャルにより一時的に電子がトラップされる形状共鳴と一時的な電子励起を伴うFeshbach共鳴とに大別される。軟X線領域の光子衝突で観測される分子の内殻吸収スペクトルもまた、閾値の上では形状共鳴に支配される。この光子衝突に見られる形状共鳴とは光電子が分子ポテンシャルに一時的にトラップされた後に放出される現象であり、低エネルギー電子衝突に見られる形状共鳴と本質的に同じ現象である。本研究では、低エネルギー電子衝突における形状共鳴と内殻光イオン化における形状共鳴をより高分解能で系統的に研究することで、そのダイナミクスの全貌を解明することを目的とする研究を計画した。この目的を達成するために、N_2,O_2,CO, H_2O, CO_2の基本的な分子からプロセスに関連した分子までを対象として、低エネルギー電子衝突実験を上智大で遂行するとともに、放射光共同利用施設(財)高輝度光科学研究センター(SPring-8)における共同利用実験により内殻光電子分光と光電子一イオン同時計測とを遂行した。内殻イオン化状態と基底状態を比べるとクーロンポテンシャルは異なるが、価電子の電子配置は等しいことから、電子散乱と内殻光イオン化で生成する形状共鳴の対称性とエネルギー、振動励起、電子励起を共通の分子を用いて比較することで、当該研究期間に多体問題としての形状共鳴の本質を明らかにするとともに、電子と核の運動との結合による断熱近似の破れを実証することに成功した。当該研究期間において、欧文論文59編、また国際会議49件(招待講演9件、一般講演40件)として報告された。電子衝突により発現する分子の共鳴状態は分子ポテンシャルにより一時的に電子がトラップされる形状共鳴と一時的な電子励起をともなうFeshbach共鳴とに大別される。軟X線領域の光子衝突で観測される分子の内殻吸収スペクトルもまた、しきい値の上では形状共鳴に支配される。ここでいう形状共鳴は光電子が分子ポテンシャルに一時的にトラップされた後に出ていく現象であり、低エネルギー電子衝突で見られる形状共鳴と本質的に同じ現象である。本研究では、形状共鳴における角運動量移行と電子放出に伴う振動励起・電子励起の機構を解明して少数多体問題としての形状共鳴の本質を明らかにするとともに電子と核の運動との結合による断熱近似の破れを実証することを目指している。この目的を達成するために、16年度はCO,H_2CO,CO_2,N_2O、H_2Oといった基本的な分子を対象として、低エネルギー電子衝突実験を上智大学で遂行すると共に、放射光共同利用施設SPring-8における共同利用実験により内殻光電子分光と光電子イオン同時計測とをおこなった。1.低エネルギー電子衝突実験(上智大学):現有装置の改良、高分解能化、計測系の高度化を進め電子衝突実験をH_2O,c-C_4F_6といった分子で行い低エネルギーに現れる形状共鳴の観測に成功した。2.高分解能内殻光電子分光実験(SPring-8):形状共鳴エネルギー領域におけるイオン芯の振動励起の探索でCO,CO_2,N_2O分子の内殻光電子(メインライン)の角度分解分光を行い、各振動成分の部分断面積と非対称パラメーターとを光子エネルギーの関数として決定した。3.光電子-イオン同時計測装置の高分解能化(SPring-8):現有の光電子-イオン同時計測装置の電子エネルギー分解能の高精度化のため、分子線のサブミリ化とTDCの高分解能化をはかり、電子のエネルギー分析の分解能を一桁あげることを試た。これら結果を論文、国際会議等で成果を発表した。昨年度と同様に、形状共鳴状態の崩壊ダイナミックスの精密測定を進めた。電子衝突により発現する分子の共鳴状態は分子ポテンシャルにより一時的に電子がトラップされる形状共鳴と一時的な電子励起を伴うFeshbach共鳴とに大別される。

軟X線領域の光子衝突で観測される分子の内殻吸収スペクトルもまた、閾値の上では形状共鳴に支配される。この形状共鳴とは光電子が分子ポテンシャルに一時的にトラップされた後に放出される現象であり、低エネルギー電子衝突に見られる形状共鳴と本質的に同じである。本研究では、形状共鳴における角運動量移行と電子放出に伴う振動励起・電子励起の機構を解明し少数多体問題としての形状共鳴の本質を明らかにすると共に電子と核の運動との結合による断熱近似の破れを実証することを目指した。今年度はN_2,O_2,CO,H_2Oといった基本的な分子以外にCH_4,C_2H_2,C_2H_4,C_2H_6,F_2CO,C_3H_6,C_3F_6等のプロセス関連多原子分子を対象とし、低エネルギー電子衝突実験を上智大学で遂行すると共に、放射光共同利用施設SPring-8における共同利用実験により内殻光電子分光と光電子-イオン同時計測を行った。また加熱分子による内殻吸収スペクトルの観察に世界で初めて成功しPRLに発表した。1.低エネルギー電子衝突実験(上智大学):前年度改良した分光系を用い、F_2CO,C_3H_6,C_3F_6の低エネルギー電子衝突実験を行い形状共鳴の観測に成功し、また閾値近傍でのCH_4からの中性解離種CH3ラジカルの計測に成功した。2.高分解能内殻光電子分光実験(Spring-8):形状共鳴エネルギー領域におけるイオン芯の振動励起の探索のため内殻光電子分光をC_2H_2,C_2H_4,C_2H_6について行い、各振動成分の部分断面積と非対称パラメーターを決定した。今年度は加熱CO_2,N_2Oからの内殻吸収スペクトルの測定にも成功し、振動励起と共鳴性内殻励起との関係を明らかにした。17年度研究成果は欧文論文20編、また国際会議30件(招待講演5件)として報告された。昨年度と同様に、形状共鳴状態の崩壊ダイナミックスの精密測定を進めた。電子衝突により発現する分子の共鳴状態は分子ポテンシャルにより一時的に電子がトラップされる形状共鳴と一時的な電子励起を伴うFeshbach共鳴とに大別される。今年度は昨年度に引き続きN_2,O_2,CO,H_2O,CO_2といった基本的な分子に加え、CH_4,C_2H_2,F_2CO,H_2CO,C_3H_6,C_3F_6CF_3X(X=Cl,Be,I)等のプロセスに関連した多原子分子を対象とし、低エネルギー電子衝突実験を上智大学で遂行すると共に、放射光共同利用施設SPring-8における共同利用実験により内殻光電子分光実験を行ってきた。また前年度に引き続き加熱分子による内殻吸収スペクトルの測定をN_2OやCF_3Iに対して行った。
プロテオーム解析を用いた口腔癌の分子標的の探索とそのオーダーメード医療への応用

【緒言】MHC class1 chain-related molecule A(MICA)は、ナチュラルキラー(NK)細胞やT細胞などの免疫細胞の活性化受容体であるNKG2Dのリガンドであり、ストレスや感染を受けた細胞および種々の腫瘍細胞に発現が誘導されると考えられている。一方、癌細胞表面にMICA蛋白が発現しているにも関わらずNK緬胞などによって癌細胞が排除されないのは、何らかの免疫回避システムが存在すると考えられており、その一つとして可溶性MICA(sMICA)が考えられている。Transforming Growth Factor(TGF)-βは細胞性免疫抑制性に作用し、NKG2Dの発現を抑制することが報告されでいる。TGF-βシグナルの異常は癌の発生・進展に関与することが明らかになっている。【目的】本研究では、sMICA産生機構の解明およびMICA分子とOSCG患者の臨床病態との関連性を明らかにすりことを目指した。【方法】OSCC組織におけるMICA蛋白の発現を免疫組織化学的に検討するともに、OSCC患者血清中sMICAをELISA法を用いて定量し、臨床病態との関連性ついて検討した。次に、OSCC細胞株KO細胞の培養上清より、sMICAを精製し、脱糖鎖処理およびTOF-MSを用いた質量解析により切断部位の同定を行った。さらに、OSCC細胞株KO細胞を用いてMICA蛋白およびsMICAの発現におけるTGF-β_<1/2>の機能を、TGF-β_<1/2>siRNAを用いて検討した。【結果】1.免疫組織化学的検討の結果、発現様式や強度に差はあるものの全例においてMICA蛋白の発現を認め、MMPsを高発現している浸潤部では、MICAの細胞表面での発現は低下あるいは消失していた。また、進展例では、癌細胞表面でのMICA発現は低下し、間質組織での発現は低下あるいは消失していた。また,進展例では、癌細胞表面でのMICA発現は低下し、間質組織での発現が上昇していた。さらにMICAの癌細胞表面での発現と化学療法や光線力学療法などの治療効果は相関傾向を示した。血清sMICA濃度は、癌の進展、再発や転移に伴い上昇した。さらに腫瘍血管内皮および平滑筋細胞でMICA発現を示す症例では血清sMICA濃度は有意に低値を示した。2.OSCC細胞株KO細胞の培養上清よりsMICAを精製し、脱糖鎖処理および質量解析により、SMICAの分子量は約24,000であることが判明し、sMICAはMICA分子のα3ドメインの前半部分(前半部分とは?どちらからか?細胞膜側からかN-末端側からか?)で切断されている可能性が考えられた。3.無血清培養系にて、TGF-β_<1/2>によりKO細胞の細胞表面におけるMICA蛋白の発現は低下し,培養上清中へのsMICAの産生は促進された。一方、TGF-β_<1/2>siRNA導入KO細胞では,細胞表面MICA蛋白の発現は亢進し、培養上清中へのsMICAの産生は著しく抑制された。また、TGF-β_<1/2>によりMMP-2,-3,-8,-9mRNA発現およびzymographyによるMMP-2,-3,-8,-9活性の上昇を認め、MMPs特異的阻害剤により細胞表面MICA蛋白の発現は上昇し、培養上清中へのsMICAの産生は抑制されることが明らかとなった。【考察】癌細胞におけるsMICAおよびsMICAのα3ドメイン領域で切断・産生され、担癌生体の全身免疫回避に重要な働きをしているのみならず、腫瘍局所、特に浸潤部位においてNK細胞などの機能を抑制することで、浸潤・転移の獲得にも重要な役割を果たしていると考えられた。さらに、癌細胞におけるMICA発現や血清sMICA濃度は臨床病態と相関していたことから、MICAは口腔癌の新たな分子標的として有用であると考えられた。【結果】

1.免疫組織化学的検討の結果、発現様式や強度に差はあるものの全例においてMICA蛋白の発現を認め、MMPsを高発現している浸潤部では、MICAの細胞表面での発現は低下あるいは消失していた。また、進展例では、癌細胞表面でのMICA発現は低下し、間質組織での発現は低下あるいは消失していた。また,進展例では、癌細胞表面でのMICA発現は低下し、間質組織での発現が上昇していた。さらにMICAの癌細胞表面での発現と化学療法や光線力学療法などの治療効果は相関傾向を示した。血清sMICA濃度は、癌の進展、再発や転移に伴い上昇した。さらに腫瘍血管内皮および平滑筋細胞でMICA発現を示す症例では血清sMICA濃度は有意に低値を示した。2.OSCC細胞株KO細胞の培養上清よりsMICAを精製し、脱糖鎖処理および質量解析により、SMICAの分子量は約24,000であることが判明し、sMICAはMICA分子のα3ドメインの前半部分(前半部分とは?どちらからか?細胞膜側からかN-末端側からか?)で切断されている可能性が考えられた。3.無血清培養系にて、TGF-β_<1/2>によりKO細胞の細胞表面におけるMICA蛋白の発現は低下し,培養上清中へのsMICAの産生は促進された。一方、TGF-β_<1/2>siRNA導入KO細胞では,細胞表面MICA蛋白の発現は亢進し、培養上清中へのsMICAの産生は著しく抑制された。また、TGF-β_<1/2>によりMMP-2,-3,-8,-9mRNA発現およびzymographyによるMMP-2,-3,-8,-9活性の上昇を認め、MMPs特異的阻害剤により細胞表面MICA蛋白の発現は上昇し、培養上清中へのsMICAの産生は抑制されることが明らかとなった。【考察】癌細胞におけるsMICAおよびsMICAのα3ドメイン領域で切断・産生され、担癌生体の全身免疫回避に重要な働きをしているのみならず、腫瘍局所、特に浸潤部位においてNK細胞などの機能を抑制することで、浸潤・転移の獲得にも重要な役割を果たしていると考えられた。さらに、癌細胞におけるMICA発現や血清sMICA濃度は臨床病態と相関していたことから、MICAは口腔癌の新たな分子標的として有用であると考えられた。口腔癌34症例に対して,超選択的動脈注射療法を用いて,NK/LAK細胞を用いた細胞治療,CDDPを用いた化学療法,ビタミンA(ショコラA6万単位/日)の経口投与の併用を行った。その結果,臨床的治癒効果および病理組織学的治療効果(大星・下里分類)とビタミンA投与に相関関係を認めた。(P<0.05)。特に化学療法+ビタミンA+免疫療法を併用した群ではほとんどの症例で臨床的治療効果がCR(完全消失)を示し,高い治療効果があることが明らかになった。そこで,ETAN-DIGEシステムを用いた2次元電気泳動およびそれに続くMALDI-TOFMS解析法を用いたプロテオーム解析にてビタミンA処理により癌細胞表面で発現亢進する細胞膜タンパク群を分離・同定した。その結果ナチュラルキラー細胞活性化受容体として最近明らかにされた,NKG2DのリガンドであるMajor histocompatibility complex class I chain-
植物病原菌が生産するペプチド系化合物の構造多様性創出機構の解析

リボソームペプチドは、遺伝子の転写と翻訳による前駆体合成と翻訳後修飾により生合成されるペプチド系天然有機化合物の一群であり、顕著な生物活性を示す化合物が多い魅力的な化合物群である。微生物ではバクテリアで盛んに研究されているが、カビにおける例は少なく詳細な解析例はustiloxin Bのみである。本研究では、植物病原性糸状菌が生産するphomopsin A等、他の生合成経路が未解明の化合物についても、生合成遺伝子の異種発現や生合成酵素の生化学解析により明らかにする。それにより、カビが生産するリボソームペプチドの構造多様性創出機構を解明する。
高等生物由来のユビキノン合成酵素遺伝子の解明

ユビキノンは補酵素Q(CoQ)とも称される脂溶性抗酸化物質であり、生体内において電子伝達系の必須成分として重要な機能を果たしている。大腸菌、出芽酵母、分裂酵母においてコエンザイムQ(CoQ)の生合成経路の研究は進行中であるが、高等生物のCoQ生合成経路に関しては明らかにされていない部分が多い。本研究は高等生物由来のユビキノン合成に関わる遺伝子の同定を目的としている。分裂酵母のポリプレニル二リン酸合成酵素を構成するdps1とdlp1の2種類の遺伝子の配列を基に配列データベースからヒト由来の2つのクローンを得て、それぞれhDPS1とhDLP1と命名した。これらの遺伝子を両方とも大腸菌において発現させ、UQ抽出を行ったところ、UQ-10の生成が確認できた。すなわち単離した2つの遺伝子がデカプレニル2リン酸合成酵素をコードしていることを示した。また、分裂酵母のミトコンドリア移行シグナルを付加した融合蛋白質発現プラスミドを構築し、分裂酵母dps1破壊株とdlp1破壊株において発現させたところ、最少培地上での相補が見られ、ヒト由来のデカプレニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子は複合体で機能していると考えられた。同様な結果をマウス由来のmSPS1とmDLP1について得た。これらの結果よりヒト及びマウスでは2種類遺伝子が複合体を形成し、ヘテロマーの酵素がそれぞれユビキノンの合成に働いていることを見いだした。分裂酵母のCoQ生合成に関わる遺伝子のうち10種の遺伝子とその遺伝子破壊株を取得している。これらの破壊株は、CoQ生合成の不能に加え、最少培地での生育遅延、硫化水素の発生、酸化ストレス感受性といった表現型を示す。それらの表現型を利用して、ヒト及びシロイヌナズナ由来のCoQ生合成遺伝子を分裂酵母のCoQ生合成遺伝子破壊株で発現させた時、表現型が野生型へと回復すれば、その部分に関しては同様の反応が行われていることの証明になる。そこで我々は既知のCoQ生合成遺伝子配列をもとにして相同性の高いヒト及びシロイヌナズナ由来のcDNAを取得し、分裂酵母用発現ベクターを用いて分裂酵母のCoQ生合成遺伝子破壊株で発現させたところ、ヒト由来のCoQ生合成遺伝子は少なくとも8種、シロイヌナズナ由来のCoQ生合成遺伝子は少なくとも6種が相補性を示した。ユビキノン(UQ)は補酵素Q(CoQ)とも称される脂溶性抗酸化物質であり、生体内において電子伝達系の必須成分として重要な機能を果たしているのみならず、生体内で唯一合成できる脂溶性抗酸化物質である。そのため最近ではサプリメントとして広く使用されその需要は年々高まっている。これまでにユビキノンの側鎖長を決定する酵素であるポリプレニル2リン酸合成酵素について広く解析を進めてきたが、本研究では2種類のソラネシル2リン酸合成酵素を植物より同定した。既知のポリプレニル二リン酸合成酵素遺伝子配列を基にシロイヌナズナ配列データベースから2つのクローンを得て、それぞれAt-SPS1とAt-SPS2と命名した。これらの遺伝子をそれぞれ大腸菌において発現させ、UQ抽出を行ったところ、UQ-9の生成が確認できた。

すなわち単離した遺伝子がソラネシル2リン酸合成酵素をコードしていることを示した。また、分裂酵母のミトコンドリア移行シグナルを付加した融合蛋白質発現プラスミドを構築し、分裂酵母dps1破壊株とdlp1破壊株において発現させたところ、最少培地上での相補が見られ、UQ-9の生成が確認できた。これらの結果より、Arabidopsis thaliana由来のソラネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子はそれぞれ単独で機能していると考えられた。At-SPS1とAt-SPS2の細胞内局在を明らかにするため、各酵素をsGFPのN末端に連結した融合蛋白質発現プラスミドを構築し、タバコ細胞で発現させた。蛍光顕微鏡観察の結果、At-SPS1は小胞体に、At-SPS2は葉緑体に局在することがわかり、At-SPS1はユビキノン側鎖生合成に、At-SPS2はプラストキノン側鎖生合成に関与すると考えられた。これらの結果より植物では2種類の酵素がそれぞれ別のキノンの合成に働いていることを見いだした。ユビキノン(UQ)は補酵素Q(CoQ)とも称される脂溶性抗酸化物質であり、生体内において電子伝達系の必須成分として重要な機能を果たしているのみならず、生体内で唯一合成できる脂溶性抗酸化物質である。そのため最近ではサプリメントとして広く使用されその需要は年々高まっている。これまでにユビキノンの側鎖長を決定する酵素であるポリプレニル2リン酸合成酵素について広く解析を進めてきたが、本研究ではヒトとマウス由来のポリプレニル2リン酸合成酵素を同定した。分裂酵母のポリプレニル二リン酸合成酵素を構成するdps1とdlp1の2種類の遺伝子の配列を基に配列データベースからヒト由来の2つのクローンを得て、それぞれhDPS1とhDLP1と命名した。これらの遺伝子を両方とも大腸菌において発現させ、UQ抽出を行ったところ、UQ-10の生成が確認できた。すなわち単離した2つの遺伝子がデカプレニル2リン酸合成酵素をコードしていることを示した。また、分裂酵母のミトコンドリア移行シグナルを付加した融合蛋白質発現プラスミドを構築し、分裂酵母dps1破壊株とdlp1破壊株において発現させたところ、最少培地上での相補が見られ、ヒト由来のデカプレニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子は複合体で機能していると考えられた。同様な結果をマウス由来のmSPS1とmDLP1について得た。これらの結果よりヒト及びマウスでは2種類遺伝子が複合体を形成し、ヘテロマーの酵素がそれぞれユビキノンの合成に働いていることを見いだした。大腸菌、出芽酵母、分裂酵母においてコエンザイムQ(CoQ)の生合成経路の研究は進行中であるが、高等生物のCoQ生合成経路に関しては明らかにされていない部分が多い。これまでの研究により、ユビキノンの側鎖長を決定する酵素であるポリプレニル2リン酸合成酵素について広く解析を進めてヒトとマウス由来のポリプレニル2リン酸合成酵素を同定した。本研究により、分裂酵母のCoQ生合成に関わる遺伝子のうち10種の遺伝子とその遺伝子破壊株を取得している。
分裂酵母における浸透圧応答と情報伝達系の分子機構

本研究は分裂酵母のストレス応答とそれにかかわるシグナル伝達の分子機構を解明しようとするものである。本研究を進めるにあたり、我々は既に分裂酵母の浸透圧感受性変異株の取得と解析を行い、多くの遺伝子を同定した。更に分裂酵母の浸透圧ストレス応答遺伝子gpd1をクローニングし、gpd1遺伝子のプロモーター構造を明らかにし、その発言がWis1-Sty1MAPキナーゼカスケードに支配されていることを示した。またこのカスケードが多様なストレス応答に関与していることを示唆した。今回我々は(1)このカスケードの下流で働く転写因子Atf1の欠損株がカルシューム感受性を示すことを見い出した。(2)Wis1-Sty1MAPキナーゼと関連して働く転写因子群(Atf1,Atf21,Atf31)を取得、解析した。また(3)分裂酵母から新規な転写転写因子をコードする遺伝子(Prr1)をクローン化して、バクテリア型His-Aspリン酸リレーシグナル伝達ドメインを持つことなどの構造的特徴を明らかにした。(4)Prr1欠損変異株を作成し、Prr1がカタラーゼ遺伝子(Ctt1)の発現を制御するなど酸化ストレス応答に重要である事を明らかにした。この過程でストレス応答転写因子であるPrr1欠失変異株が接合・減数分裂不能の表原型を示すことを最近になって新たに見い出した。このことから、Prr1が分裂酵母における多様なストレス応答(酸化ストレスや栄養飢餓)に関わるユニークな因子であるとの着想を得た。そこで、Prr1の機能やそれに関わるシグナル伝達機構を解析することで、細胞周期・減数分裂を制御するシグナル伝達機構の解析という普遍的課題に直接かつ独自にアプローチ出来ると考えられる。また、真核生物に於けるHis-Aspリン酸リレーシグナル伝達機構に関するユニークな研究が展開できる可能性も同時に開けたと考えられ、これら二つの視点を有機的に交えた研究を、今後行う予定である。本研究は分裂酵母の浸透圧応等系をモデルとして環境応答の分子機構を解明しようとするものである。我々は既に、分裂酵母は高浸透圧条件下で、細胞内にグリセロールを蓄積して環境に適応していることを明らかにした。その機構は「?--Wis1-Sty1-Atf1-?-Gpd1」と想定されているが、その全貌はまだ明らかになっていない。特にWis1-Sty1はMAPキナーゼカスケードを形成していると思われるがまだ不明な点が多い。我々は既に一群の浸透圧感受性変異株を取得しているが、それらの解析を進める中で、今回、低分子量G蛋白質Ryh1変異が高浸透圧感受性を示すことを明らかにした。この変異株は他の変異株と異なりgpd1の転写やグリセロールの合成、蓄積に関しては正常であるものの、高温感受性、ハイグロマイシン感受性、バナジン酸感受性、胞子形成不能の表現型を示した。現在、rhy1変異株の多コピー抑制遺伝子の取得をはじめ、Rhylの機能解析を進めている。一方、原核、真核生物に普遍的な二成分(His-Asp)リン酸リレー情報ネットワークも環境応答の基盤を成すものである。今回、分裂酵母のAspリン酸受容型因子をコードする新規遺伝子(prr1)を取得した。Prr1は過酸化水素ストレスに応答して働く因子であり、prr1欠損変異株は過酸化水素などの酸化ストレスに対して超感受性となることを明らかにした。この因子が組み込まれているHis-Aspリン酸リレー情報伝達機構の実体の解明が今後の課題である。

我々はこれまでに分裂酵母の浸透圧感従受性変異株の取得と解析を行い、多くの遺伝子を同定した。更に分裂酵母の浸透圧ストレス応答遺伝子gpd1をクロ-ニングし、gpd1遺伝子のプロモーター構造を明らかにし、その発現がWis1-Sty1MAPキナーゼカスケードに支配されていることを示した。またこのカスケードが多様なストレス応答に関与していることを示唆した。今回我々は(1)このカスケードの下流で働く転写因子Atf1の欠損株がカルシューム感受性を示すことを見い出した。(2)Wis1-Sty1 MAPキナーゼと関連して働く転写因子群(Atf1,Atf21,Atf31)を取得、解析した。(3)分裂酵母から新規な転写因子をコードする遺伝子(Prr1)をクローン化して、バクテリア型His-Aspリン酸リレーシグナル伝達ドメインを持つことなどの構造的特徴を明らかにした。(4)Prr1欠損変異株を作成し、Prr1がカタラーゼ遺伝子(Ctt1)の発現を制御するなど酸化ストレス応答に重要であることを明らかにした。この過程でストレス応答転写因子であるPrr1欠失変異株が接合・減数分裂不能の表原型を示すことを最近、新たに見い出した。このことから、Prr1が分裂酵母における多様なストレス応答(酸化ストレスや栄養飢餓)に関わるユニークな因子であるとの着想を得た。そこで、Prr1の機能やそれに関わるシグナル伝達機構を解析することで、細胞周期・減数分裂を制御するシグナル伝達機構の解析という普遍的課題を直接かつ独自にアプローチ出来ると考えられる。また、真核生物に於けるHis-Aspリン酸リレーシグナル伝達機構に関するユニークな研究が展開できる可能性も同時に開けたと考えられ、これら二つの視点を有機的に交えた研究を今後行う予定である。
緑内障モデルDBA/2Jマウスに対する免疫療法による網膜神経節細胞保護

本研究では、続発緑内障モデルであるDBA/2Jマウスに対し、ミエリン塩基蛋白類似のコポリマーIを投与し、Tリンパ球を活性化させることで網膜神経節細胞死の抑制効果を検討するのが目的である。前年度にトノペンXLによる眼圧測定が不正確であったため、新たにリバウンドトノメーターを入手し、マウスの眼圧測定を行った。前年度にDBA/2JマウスにコポリマーIを注入する前段階として、ラットの眼圧上昇モデル、NMDA網膜障害ラットモデルにコポリマーIを使用した。コポリマーIを注入したあとに、レーザーにてラットの眼圧上昇モデル作成、あるいはNMDAを硝子体内に注入した網膜障害モデル作成を行い、5%Fluorogold溶液にて逆行性に網膜神経節細胞を染色し、全網膜の平坦切片を作成後、蛍光顕微鏡下に網膜神経節細胞の観察し、染色網膜神経節細胞の細胞数と細胞密度を測定し、各網膜の比較検討を行った。コポリマーIを投与した群とそうでない群で効果があるか検討したが、有意差はでなかった。DBA/2Jマウスに関しても固体により眼圧上昇の程度や時期にばらつきがあり、またマウスへの投与に関する方法も確立したものがないため、コポリマーI投与が網膜神経節細胞を保護しているという傾向があるかどうかははっきりしなかった。実際に効果があるかどうかを検討するには更なる時間と数が必要であると考えられた。本研究では、続発緑内障モデルであるDBA/2Jマウスに対し、ミエリン塩基蛋白に似たコポリマーIを投与し、Tリンパ球を活性化させることで網膜神経節細胞死の抑制効果を検討するのが目的である。本年度の研究実施計画に基づき、まず、FIuorogoldやコポリマー1など各種試薬を購入した。マウスの眼圧測定について、トノペンXLでマウスの眼圧測定可能であったという論文に基づき、当初トノペンXLを購入して測定する予定であったが、同機種でのマウスの眼圧測定を試用にて、測定が不正確な可能性があり、購入を断念した。新たに市販されたマウス用眼圧測定器を導入し、マウスの眼圧測定に関する実験を進めている途中である。DBA/2Jマウスによる実験が計画から遅れているため、マウス眼圧の測定必要とせずにコポリマーIによる網膜神経節細胞死の抑制効果について検討するため、ラットの緑内障モデルやNMDAによる網膜神経節細胞障害モデルについて網膜神経節細胞死の抑制効果があるか検討を行っている。今度の研究計画では1.生後6ヶ月以前の雌DBA/2Jマウスについて、週1回実験終了まで全マウスの眼圧を測定。2.マウスを(1)6ヶ月の時点でコポリマー1を含む溶液で免疫する群、(2)9ヶ月の時点でコポリマー1にて免疫する群、(3)コントロール群(免疫しないあるいはプラセボ投与)の3群に分ける。3.生後6ヶ月の時点で(1)群マウスに、生後9ヶ月の時点で(2)群マウスコポリマー1にて免疫。4.生後12ヶ月の時点で各群のうち半数、生後15ヶ月の時点で残りの半数のマウスについて5%Fluorogold溶液にて逆行性に網膜神経節細胞を染色。全網膜の平坦切片を作成。蛍光顕微鏡下に網膜神経節細胞の状態を観察。顕微鏡に付属のデジタルカメラにて画像を取り込み、コンピューター上で染色網膜神経節細胞の細胞数と細胞密度を測定し、各網膜の比較検討を行い、各群間で比較する。
回転可視コロイドの実現と応用

コロイド分散系とは粒径数十ナノメートルから数ミクロの微粒子を液体に分散させたものである。一つずつの粒子を光学顕微鏡で視認、動的構造変化等を直接観察することができる。しかし粒子が球体の場合は流体の流れに最も敏感な回転運動が見えない。本研究は蛍光色素プロファイルのみ非対称な球状コロイド粒子の合成と応用を目的とした。計画で提案したプラスチック素材では実現できなかったが、シラン化合物の一種を用いて表面下に局在する小さな別色・同素材の核を持つ粒子の合成に成功した。高体積分率の分散液中でも共焦点顕微鏡を用いてコロイドの回転熱運動が視認可能となり、ミクロスケールの剪断流計測への応用等も期待される。本研究の主な目的は従来回転が見えない球状のコロイド粒子(粒径0.55ミクロ)の回転運動を蛍光顕微鏡観察を用いて観察するため、形状は球体でありながらも蛍光色素の分布が非対称なコロイド粒子の合成法を確立することである。本年度最大の功績は複合的な構造をもつ粒子を合成するために必要な最も基礎的な技術、「コアシェル」粒子の合成法の実現と再現性の向上である。まず核(コア)となる粒子を合成して、その後これに違う蛍光色素の厚い膜(シェル)を付与することによって、蛍光顕微鏡で観察すると中心部分と外殻が違う色の粒子が完成する。これを再現性良く合成するには1、シェルとなる材料の添加速度と2、化学反応が起きる溶媒の体積が大きな影響を及ぼすことが判明した。精密に添加速度を変えられる液体輸送メカニズムを実現して、結晶化出来るほどに単分散な粒子の合成に成功した。計画で注目されていた二点の課題は1、コアシェルを安定的に合成できるか、そして2、コアが中心からずれた位置にある粒子が作れるかにあった。1はクリアできたが、2は未だ成功していない。シェルがコアのまわりに形成されていく際コアが中心からずれた位置に落ち着くためには1、コアと溶媒の接触の方がコアとシェルの接触より望ましい、2、シェルが形成されていく中、コア・シェルを形作る高分子が再配分できる(液滴のように)、この二つの条件が重要である。今年度は1に着目してコアとシェルの材質を系統的に変えていったが、この効果のみで対称性が崩れた構造を得ることができないことが明らかになった。次年度はコア・シェル双方の流動性を保持するため、開発した合成法の応用も新しい材質を作ったコロイドの合成も両方考え「回転可視コロイド」を実現させたい。本年度の主な課題は単分散なコアシェル粒子の合成法の確立であった。原理証明は計画段階で示したとおり存在したが、残されていた大きな課題がシェルになるモノマーの添加速度の制御である。添加速度が早すぎる場合、現存するコアに加えて二次的な核形成によりシェル材質のみの小さいコロイドが多数できてしまう。添加したモノマーが消耗されていくためコアは育たず、二次的に出来る粒子の大きさがコア・シェル粒子の粒径に近いため分離も極めて困難である。再現性良く遅い添加速度を保持するためシリンジポンプを利用してガラスシリンジからのモノマーの添加を試みた。しかしモノマー混合液の表面エネルギーがとても低いためシリンジから漏洩が多く、添加されたモノマーの量が不明確であった。そこでモノマーを封入したガラス管瓶に空圧を加えることで徐々にモノマーが押し出されていく輸送システムを実現した。すると5秒に約10mg程度の添加スピードを実現できた。更に核形成を抑制するために反応体積を大きく増やした。すると期待していた効果に加え上記で挙げた問題点2、つまり凝集体が大きく減った。コアとコアの間の距離が開いたため、隣接した状態で成長するコアが大きく減り、これにより繋がった凝集構造が出来にくくなったと考えられる。コアシェルの合成プロトコルの完成後、コアが中心からずれた「回転可視コロイド」の合成へ移った。しかし当初考えていたコア・シェルの相対的な安定性を利用したコアの移動は未だ成功していない。安定剤の分子量や割合を変えることによってコアと溶媒の相互作用を変えることはできたが、シェルの形成スピードに若干の変化が生じるのみで、コアが表面付近に移動することはなかった。複合的なコロイド構造を目指す以上、コアシェル粒子の合成プロトコルが完成したことは大切だが、未だ回転可視コロイドに至らないため、計画以上の進展は認められないと考える。通常球状の物体の回転運動を顕微鏡により観察することは困難である。回転運動を可視化するためには粒子の回転対称性を破る必要がある。本研究は直径数ミクロの微粒子(コロイド)の重心、形状等に影響を与えることなく「回転運動を捕捉可能なコロイド」の合成を目的とした。当初は高分子素材(PMMA)を使う予定であった。当研究室ではPMMAコロイドの合成に成功しており、「コアシェル」合成も手掛けていた。コアシェル合成では核(コア)となる微粒子の上に膜(シェル)を成長させることにより二重の同心球構造が得られる。各々に微量の蛍光剤を添加することにより核と膜を別々に観察することが可能である。コアが中心からずれている粒子を作成できれば回転を検出できる。しかしPMMAコアシェル粒子は合成条件によらず同心球構造を有することが明らかになった。この原因は、シェルが液体的に振舞わないことにあった。そこで申請者は液体素材であるTPMの使用に思い至った。

TPMは単分散の液滴を形成することで知られコロイド合成へも幅広く応用されている。まず蛍光コア粒子を作り、この上に同じ物質でシェルを形成させ、シェルには異なった塗料剤を付与。コアとシェルは同じ材質であるため接触角がゼロ度であり、結果コアは常にシェルの表面に接するよう自発的に形成される。イメージ通りの合成に成功した。当初、液中近接した粒子間の流体を介した動的な回転結合の研究を目的としていたが、他にも様々な応用の可能性がある。液中で流れるコロイドの並進運動は周囲の流れ速度を反映するが、速度勾配の情報を得ることは困難である。回転を可視化可能なコロイドを用いることで粒子にかかっている回転力、つまり速度勾配の測定が可能となる。これは、「世界最小のせん断力測定器」といえる。従って従来の方法では困難であった、細菌や微生物の回り等の「局所的な流れ場」の測定にも応用が可能と思われる。コロイド分散系とは粒径数十ナノメートルから数ミクロの微粒子を液体に分散させたものである。一つずつの粒子を光学顕微鏡で視認、動的構造変化等を直接観察することができる。しかし粒子が球体の場合は流体の流れに最も敏感な回転運動が見えない。本研究は蛍光色素プロファイルのみ非対称な球状コロイド粒子の合成と応用を目的とした。計画で提案したプラスチック素材では実現できなかったが、シラン化合物の一種を用いて表面下に局在する小さな別色・同素材の核を持つ粒子の合成に成功した。高体積分率の分散液中でも共焦点顕微鏡を用いてコロイドの回転熱運動が視認可能となり、ミクロスケールの剪断流計測への応用等も期待される。当初の計画ではコアとシェル双方の溶媒との相互作用の差を使い非対称な構造を作ることが計画であった。しかし本年度の実験を元に考えると、これを実現するにはもう一つの要因が必要であることが判明した。これはシェルの成長と共にに内部の高分子構造が「緩和」できることである。つまりシェルの成長が少し進んだ地点でもコアが表面へ移動して最安定状態を保つことができることである。これを実現するためには形成過程のコロイドの流動性を保持する必要がある。大きく分けて三つの解決法が考えられる。1、コロイドを形成する高分子の分子量の制御。これは連鎖移動剤という添加物の量を調節することによって可能ではあるが、基本的な粒子形成過程に多大な影響を及ぼすため、調節幅が狭い。2、合成温度を上げる。コロイドを形成するPMMAというプラスチックは比較的低い「ガラス転移温度」(柔らかくなる温度)をもつ。あまり高く設定するとシェルの成長に加え小さく不安定な高分子の凝集体が形成されてしまうため、最適な温度を探る必要がある。3、今現在PMMAという高分子によって形成される粒子を利用しているが、液滴から固体粒子へと反応中に変異する「エマルジョン高分子化」という合成手法が存在する。実験手法としてはこれまでと同じノウハウが生かされるが形成メカニズムがまったく違う。特に重要なのは形成過程でコロイドが液滴から生まれる点である。この手法を詳しく学ぶために他研究室を訪問することも検討している。コアシェル合成法が確立された今、これを最大限に生かして回転可視コロイドの実現に向けて実験を続行する計画である。
人工リンパ節技術を用いた新規アジュバントの開発と高機能型抗体の作製

人工リンパ節移植技術を簡便化するために,単に二次リンパ組織移植(SLOTs)を行ったマウスの免疫能について解析を行った。NP-OVAを抗原として免疫したマウスから採取したリンパ節をSCIDマウスに移植した後,追加免疫した後の抗体産生量を調べた。その結果,SLOTsを行ったSCIDマウス(SLOTs-SCIDマウス)の血清中に,通常の免疫操作を行ったマウスに比べ,20100倍以上高い抗体産生が認められた。この結果は,SLOTs-SCIDマウスの脾細胞を用いたELISPOTでも抗体産生細胞が100倍以上増加していることから確認された。SLOTsの際,SCIDマウスではなく,正常マウスを用いたところ,この抗体価の上昇が観察されなかったことから,SLOTsによる抗体価の上昇には,移植する宿主においてリンパ球が存在しない状態が必要であることが示唆された。次に移植を行う二次リンパ組織として体表リンパ節の代わりに肺縦隔リンパ節や鼻粘膜リンパ節といった粘膜付属リンパ節を用いたところ,IgG型抗体の代わりにIgA型抗体が大量に産生されることが明らかになった。また,H1N1不活化インフルエンザウイルスを免疫したSLOTs-SCIDマウスの血清における中和抗体価について調べたところ,高い抗体価とともにH5N1インフルエンザウイルスに対しても中和活性を示す,亜型交差性をもった抗体が産生されることが明らかになった。以上の結果から,SLOTsはこれまでの抗体産生技術を亢進させる画期的な技術となり得る可能性を秘めていることが強く示唆された。
１次リンパ組織の微小環境特異的エピジェネティック制御の解明

胸腺T細胞分化段階ごとのポリコームタンパク質複合体を精製し、サブユニット構成、PRC1相ソフォームの比率を検討したETPではPRC1.2が多く存在し、DN3ではPRC1.4が多く存在する事が分かった。その事が、それぞれ、mel-18(PCGF1.2) KOマウスとbmi1(PCGF1.4) KOマウスの表現型の出現場所が異なる事につながる事が分かった。また、組織特異的KOマウスの作成に成功した。さらに、ANRILというlncRNAとPRC2が結合する事が報告された。それと同じマウスlincRNA-AK148321を同定した。研究計画の項目は、(1)ポリコーム蛋白質複合体の精製、この中で(2)(3)は順調に研究計画が推移している。しかし(1)に関しては、当初考えていたよりもポリコーム蛋白質複合体が、よりheterogeneityに飛んでいる事が分かって来た。当初は、PRC1のアイソフォームとしてPRC1mel, PRC1bmiの単離精製を目標として研究を行っていた。しかし、その後の検討により、mel-18,やbmi-1等が属するPCGFファミリー(PCGF1からPCGF6: mel-18=PCGF2, bmi1=PCGF4)がそれぞれ異なるPRC1蛋白質複合体を構築する事、さらにPCGF2とPCGF4が共通のコアユニット(CBXs,PHCs, SCMs)を共有し、PCGF3とPCGF5が共通のコアユニット(AUTS2, FBRS, FBRSL1, CKIIs)を共有する事、PCGF1、およびPCGF6は、また全く異なるコアユニットと複合体を構築する事、などが分かって来た。さらにmel-18(PCGF2)を含む複合体PRC1においても、CBXsを含む複合体と、その代わりにRYBPを含む複合体との間に動的平行関係が存在する事が判明して来た。この様な、当初予想していた異常に複雑な蛋白質複合体のheterogeneityが明らかとなった。この様な状況下で、リンパ球分化段階ごとに、どの複合体がドミナントであるかを同定しようとしている。本研究の当初の目的は下記の3点であった。(1)ポリコーム蛋白質複合体の精製、(2)PcG遺伝子群の組織特異的KO(conditional Knock-Out)マウスの作成、(3)long non-codingRNAの検索、研究目的(1)に関しては、当初考えていたよりもポリコーム蛋白質複合体が、よりheterogeneityに飛んでいる事が分かって来た。PRC1タンパク質複合体を分類すると、PRC1.1からPRC1.6までの6種類の複合体が存在する。さらにmel-18(PCGF2)を含む複合体PRC1.2においても、CBXsを含む複合体と、その代わりにRYBPを含む複合体との間に動的平行関係が存在する事が判明して来た。その結果、未熟胸腺細胞DN1とDN3を材料とし、PRC1タンパク質複合体のheterogeneity(特にPRC1.2とPRC1.4の比較)を検討した結果、DN1ではPRC1.2が優位、DN3ではPRC1.4が優位であり、細胞分化段階ごとにPRC1.2/PRC1.4のバランスが変化する事が分かった。その事が、対応する標的遺伝子群のスペクトラムの変化に反映されると考えられた。研究目的(2)PcG遺伝子群の組織特異的KO(conditional Knock-Out)マウスは、当初の目的の、floxed-mel18,以外にfloxed-eed, floxed-ezh2,などを作成できた。現在、組織特異的Cre-TgマウスとしてLck-Cre Tg, CD4-Cre-Tg, FoxN1-Cre Tg, Mx-Cre Tgマウスとの交配を行っており、結果が出てきている。さらにERT-Creマウスも用いて解析を行っている。研究目的(3)long non-coding RNAの検索:最近、PRCタンパク質複合体にlong non-coding RNA(lncRNA)が結合し、標的遺伝子特異性に関与している事が分かってきた。その中の1例がANRILでありINK4a遺伝子座にあるanti-senseRNAである。実際にDN1やDN3分画でPRCタンパク質複合体と一緒に結合しているRNAを検索した結果ANRILのマウス版に対応するincRNAを検出できた。研究計画(H23年度)に記載した内容3項目;(1)ポリコーム蛋白質複合体の精製、(2)PcG遺伝子群の組織特異的KO(conditional Knock-Out)マウスの作成、(3)non-codingRNAの検索、この中で(2)(3)は順調に研究計画が推移している。