hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
いじめ経験が精神健康に及ぼす長期的影響の認知・脳科学的検討

本研究は、過去のいじめ被害経験が成人期にまで及ぼす長期的影響を調査研究によって明らかにすること、さらに、いじめ被害経験の有無がコミュニケーションに関わる認知・脳機能に与える影響を実験的に検討することを目的としていた。平成30年度は、1)いじめ被害経験の長期的影響の調査(いじめ被害経験者のスクリーニングを兼ねる)の対象者追加(約200名)と、3)H28年度に作成した実験課題を用いたNIRS実験の参加者追加(約20名)を行った。その結果、平成29年度までに得られた知見が追試され、それらの知見の信頼性を高めることができた。研究期間全体では大きくは3つの研究成果が得られた。1)いじめ被害経験の長期的影響については、大学入学までのいじめ被害経験が、精神健康のポジティブ・ネガティブ両面に渡って長期的な悪影響を及ぼしうること、また被害時の感情の強さの悪影響の程度に対する寄与は小さく、被害当時に本人が感じている感情的衝撃の強さに関わらず、早期の支援が必要であることが示唆された。2)いじめ被害経験者に対する調査とインタビューを通して、いじめ被害経験のトラウマの程度と外傷後成長は有意な正の相関を示し、いじめ経験者が苦悩と同時に人間的成長も経験していること、またインタビューからはそれらが対人関係の領域で顕著であることが示された。3)いじめ被害経験と関連する社交不安と脳機能の関係については、対象者の社交不安の程度によって、課題中の前頭前野の脳血流に違いがみられることが明らかとなった。この違いは、高社交不安者の不安抑制にまつわる活動の結果であると推測された。これらの結果から、いじめがもたらす脳・認知機能への長期的な影響が示されたといえる。今後はこれらの影響を考慮したアセスメントや介入方法の開発が必要である。本研究は、過去のいじめ被害経験が成人期にまで及ぼす長期的影響を調査研究によって明らかにすること、さらに、いじめ被害経験の有無がコミュニケーションに関わる認知・脳機能に与える影響を実験的に検討することを目的としている。平成28年度は、1)いじめ被害経験の長期的影響を調べ、また、いじめ被害経験を有する実験参加者をスクリーニングするための調査、2)いじめ被害経験を有する方への調査とインタビュー、および、3)いじめ被害経験を有する方を対象とした実験課題の作成を行った。1)については、約150名の大学生を対象に改訂版ライフイベント質問票(筆者ら作成)、PERMA-Profiler KIT版(筆者らが翻訳したWell-beingに関する尺度)、および、the General Health Questionnaire(GHQ)30日本語版を実施した。各尺度変数を目的変数とする重回帰分析から、先行研究と一致していじめ被害が成人期においても精神健康の悪化に大きな影響を持っていること明らかとなった。さらに対象となった学生の内、20名のいじめ被害経験を有する学生から、今後の調査、実験に協力いただける承諾をいただいた。最後に、3)については、20名の大学生を対象として、先行研究においてコミュニケーション場面での脳活動と関連することが示されている、被観察場面での語流暢課題を改良して用いてNIRSによる脳血流の測定を行った。この結果についても現在分析中である。当初、H28年度に予定していた調査の実施、実験参加者のスクリーニングを終えることができた。またH29年度以降に実施するいじめ被害経験のある方を対象とした実験課題の作成も順調に進んでいる。H29年度は当初の予定に沿って、いじめ被害経験のある方を対象に認知機能、脳機能の測定する実験を行うことが可能である。ただし、H28年度に行った調査、実験の結果の公表についてはH29年度に繰り越すこととなった。すでにH29年度9月に開催される日本心理学会へのエントリーを終了している。平成29年度は、1)いじめ被害経験の長期的影響の調査(いじめ被害経験者のスクリーニングを兼ねる)と、2)いじめ被害経験者に対する調査とインタビューの継続、3)H28年度に作成した実験課題を用いたNIRS実験を行った。1)については、H28、29年度を合わて310名を対象として調査を行った。精神健康のネガティブな側面を測定するGHQ30、および、ポジティブな側面を測定するPERMA-Profilerを従属変数、いじめ被害経験等のライフイベントを独立変数とする重回帰分析の結果、いじめ被害経験がポジティブ・ネガティブ両面に渡って長期的な悪影響を及ぼしうること、また被害時の感情の強さの悪影響の程度に対する寄与は小さく、被害当時に本人が感じている感情的衝撃の強さに関わらず、早期の支援が必要であることが示唆された。2)については、1)の対象者の内、いじめ被害経験を有する者15名を対象として、トラウマの程度を測定するIES-R、トラウマ後成長を測定するPTGI-Jを実施すると共に、インタビュー調査を行った。その結果、トラウマの程度と外傷後成長は有意な正の相関を示し、いじめ経験者が苦悩と同時に人間的成長も経験していること、またインタビューからはそれらが対人関係の領域で顕著であることが示された。3)hについては、20名の大学生を対象として、NIRSを用いた語彙流暢課題を実施した。その結果、対象者の社交不安の程度によって、課題中の前頭前野の脳血流に違いがみられることが明らかとなった。

いじめ経験の長期的影響の調査、いじめ被害経験者を対象とした調査とインタビューに関しては当初の予定通り対象者を募り、調査を実施、分析ができている。ただし、いじめ被害経験者を対象としたNIRS課題についてはまだ対象者数が十分でなく、現時点では対象者を、いじめ経験と関連が深いと考えられる社交不安の程度によって群分けし、比較する分析に留まっている。H30年度は引き続きスクリーニングを兼ねた調査を継続し、NIRS実験への参加者を増やすことで、いじめ被害経験の有無を独立変数として、脳血流の差異を検出できるような実験を行う予定である。本研究は、過去のいじめ被害経験が成人期にまで及ぼす長期的影響を調査研究によって明らかにすること、さらに、いじめ被害経験の有無がコミュニケーションに関わる認知・脳機能に与える影響を実験的に検討することを目的としていた。平成30年度は、1)いじめ被害経験の長期的影響の調査(いじめ被害経験者のスクリーニングを兼ねる)の対象者追加(約200名)と、3)H28年度に作成した実験課題を用いたNIRS実験の参加者追加(約20名)を行った。その結果、平成29年度までに得られた知見が追試され、それらの知見の信頼性を高めることができた。研究期間全体では大きくは3つの研究成果が得られた。1)いじめ被害経験の長期的影響については、大学入学までのいじめ被害経験が、精神健康のポジティブ・ネガティブ両面に渡って長期的な悪影響を及ぼしうること、また被害時の感情の強さの悪影響の程度に対する寄与は小さく、被害当時に本人が感じている感情的衝撃の強さに関わらず、早期の支援が必要であることが示唆された。2)いじめ被害経験者に対する調査とインタビューを通して、いじめ被害経験のトラウマの程度と外傷後成長は有意な正の相関を示し、いじめ経験者が苦悩と同時に人間的成長も経験していること、またインタビューからはそれらが対人関係の領域で顕著であることが示された。3)いじめ被害経験と関連する社交不安と脳機能の関係については、対象者の社交不安の程度によって、課題中の前頭前野の脳血流に違いがみられることが明らかとなった。この違いは、高社交不安者の不安抑制にまつわる活動の結果であると推測された。これらの結果から、いじめがもたらす脳・認知機能への長期的な影響が示されたといえる。今後はこれらの影響を考慮したアセスメントや介入方法の開発が必要である。H28年度に行った、いじめ被害経験のある方に対する調査とインタビューの結果の分析、また、語流暢課題を用いた被観察場面での脳血流測定の結果の分析を進め、ライフイベント調査の結果と併せて学会発表を予定している。そしてH29年度は、いじめ被害の有無による脳活動の相違を、H28年度から作成を進めている語流暢課題中のNIRS測定によって明らかにすることを主な目的とする。またライフイベント調査、いじめ経験者に対する調査とインタビューについても引き続き実施をし、調査対象者を増やす予定である。さらにH30年度には、H29年度までの実験結果を受け、表情刺激を用いた新たな実験課題の作成と実施を予定している。実験協力者を新たに募る必要もあることから、ライフイベントに関する調査も並行して行うことになる。
核内情報を制御する分子の創製と新規解析システムによる機能解析

本年度は有用な天然化合物の骨格を活かした、核内受容体の転写活性をモジュレートする新しい生理活性化合物を合成するとともに、新規なタンパク質-タンパク質相互作用をハイスループットに評価するアッセイ系の構築を達成した.すなわち大腸癌の発生に関わるWntシグナル伝達系の異常亢進を抑える有用新規化合物を探索するための、ハイスループットなアッセイ系を確立した。Wntシグナル関連タンパク質APCの変異などにより蓄積したβ-cateninは核内で転写因子TCFと結合し、標的遺伝子の転写を促進する。このβ-catenin-TCFの結合を阻害する小分子を当研究室保有の天然物ライブラリーから,見出した.具体的なアッセイはヒトβ-cateninのTCF結合領域であるアルマジロリピートを含む128683aa、分子量約67KDaのタンパク質を、GST融合タンパク質として大腸菌から発現し,96穴マイクロプレートに固定した。ヒトTCFタンパク質も同様に大腸菌より大量に発現させることに成功し、蛍光化TCFを作成し、β-catenin-TCF複合体をプレート上で形成させた。化合物を添加,インキュベートしたのち,過剰の化合物とTCFを除く事で,複合体形成を阻害しているかを,蛍光プレートリーダーで評価した.見出された阻害剤のうち数種は,細胞を用いたWntシグナルのレポータージーンアッセイによる転写活性も阻害し,Wntシグナルの阻害が,β-catenin-TCF複合体の直接的阻害であることを証明した.本年度は有用な天然化合物の骨格を活かした、核内受容体の転写活性をモジュレートする新しい生理活性化合物を合成するとともに、新規なタンパク質-タンパク質相互作用をハイスループットに評価するアッセイ系の構築を目的とした。具体的には、大腸癌の発生に関わるWntシグナル伝達系の異常亢進を抑える有用新規化合物を探索するための、ハイスループットなアッセイ系を構築した。このβ-catenin-TCFの結合を阻害する小分子を天然物資源、あるいは天然物基盤合成ライブラリーから探索する。合成ライブラリーの候補化合物としては天然物骨格のフラボノイドに着目し、新規なワンポット反応を見いだした。今後固相での合成に展開する予定である。新規アッセイ法の構築にあたり、まず必要なタンパク質の発現検討を行った。ヒトβ-cateninのTCF結合領域であるアルマジロリピートを含む128683aa、分子量約67KDaのタンパク質を、GST融合タンパク質としてコードする大腸菌発現用コンストラクトを作成した。これを用い、ヒトβ-cateninタンパク質を大腸菌より大量に発現させることに成功し、ウエスタンブロットにてアルマジロリピートに対する抗体との結合を確認した。また、ヒトTCF4のβ-catenin結合領域のタンパク質もGSTタンパク質として発現に成功した。β-catenin固定化マイクロプレート作成を行い、蛍光化TCFを作成し、β-catenin-TCF複合体を蛍光プレートリーダーにより検出することに成功した。今後、本アッセイ系を用いて、有用な化合物の探索を行う。化合物を添加,インキュベートしたのち,過剰の化合物とTCFを除く事で,複合体形成を阻害しているかを,蛍光プレートリーダーで評価した.見出された阻害剤のうち数種は,細胞を用いたWntシグナルのレポータージーンアッセイによる転写活性も阻害し,Wntシグナルの阻害が,β-catenin-TCF複合体の直接的阻害であることを証明した.
言語の生得的構造条件に関する認知脳科学的研究

本研究の目的は、構造条件c-commandに関し、日本語を獲得中の幼児を対象に、言語心理学的手法及び脳科学的手法を用いて、心理レベルと脳レベルの両面から、その脳内における所在と発達過程を明らかにすることであった。先ずは、成人を対象とした数量詞浮遊現象に基づく実験を行った。NIRSによる計測で得られたデータを解析・検討した内容を、国内外において開催された国際学会において発表した。また、移動現象を基にした成人対象の実験結果については、査読付国際学術雑誌の論文として刊行した。次に、成人対象の実験によって得られた結果を基に、幼児対象の計測に用いる実験デザインについて検討し、心理実験及びNIRSによる計測を行った。移動現象に関する成果については、国際学会において報告した。また、数量詞浮遊に基づく実験については、NIRSによる計測を行い、計測結果の解析を実施した。現代言語理論において中心的な役割を果たしている生得的な構造条件であるc-commandに関し、日本語を獲得中の幼児(2-5歳児)を対象に、言語心理学的手法(心理実験と自然発話分析)及び脳科学的手法を用いて、心理レベルと脳レベルの両面から、その脳内における所在と発達過程を明らかにすることが本研究の目的である。生得的な構造条件であるc-commandとは、抽象的な階層性を有する文構造に基づいて定義され、様々な言語の多様な文法現象に関わっている重要な性質であると考えられている。例えば、日本語に関しては、数量子浮遊((i)大学が教員を2名採用した.(ii)*大学が教員から2名寄付を受けた.)、照応詞束縛((i)太郎が自分の絵を見つけた.[太郎=自分](ii)太郎の弟が自分の絵を見つけた.[太郎≠自分])等の言語現象の説明において中心的な役割を担っている。以上の研究目的に基づき、平成20年度は、c-commandが関与する言語現象を用いた言語刺激パラダイムについて検討し、平成21年度以降に実施予定である幼児を対象とした実験の前段階として、成人を対象とした予備実験を行い、その結果について考察を加えた。具体的には、日本語の数量子浮遊現象を言語刺激文として採用することとし、言語理論及び実験を行うにあたっての実際上の問題という双方の観点から、言語刺激パラダイムの妥当性について検討した。その結果、平成20年度後半には、成人被験者を対象として、非侵襲的な機能脳画像研究手法であるNIRSを用いた調査を実施することができた。また、平成21年度早々には成果を発表できるように、実験結果について詳細な検討を行った。平成21年度の前半は、以上の研究目的に基づき、平成20年度後半に実施した成人を対象とした実験結果について考察を行った。実験には、非侵襲的な機能脳画像研究手法であるNIRSを使用し、数量詞浮遊現象に基づいた言語刺激パラダイムを用いたものであった。その研究成果は、第32回日本神経科学大会、Neurobiology of Language Conference 2009、Society for Neuroscienceにおいて発表した。平成21年度後半は、以上の学会発表に対するコメントに基づき、成人被験者を対象として、NIRSを用いた追加調査を実施し、平成22年度に論文として投稿するための準備を行った。また、平成21年後半には、幼児を対象とした予備実験も行い、平成22年度早々に幼児を対象とした本実験が行えるように、浮遊数量詞を用いた言語刺激パラダイムについて詳しい検討を行った。

現代言語理論において中心的な役割を果たしている生得的な構造条件であるc-commandに関し、日本語を獲得中の幼児を対象に、言語心理学的手法(心理実験と自然発話分析)及び脳科学的手法を用いて、心理レベルと脳レベルの両面から、その脳内における所在と発達過程を明らかにすることが本研究の目的である。生得的な構造条件であるc-commandとは、抽象的な階層性を有する文構造に基づいて定義され、様々な言語の多様な文法現象に関わっている重要な性質であると考えられている。例えば、日本語に関しては、数量子浮遊((i)大学が教員を2名採用した.(ii)*大学が教員から2名寄付を受けた.)、照応詞束縛((i)太郎が自分の絵を見つけた.[太郎=自分](ii)太郎の弟が自分の絵を見つけた.[太郎≠自分])等の言語現象の説明において中心的な役割を担っている。平成22年度は、平成21年度後半に実施した成人を対象としたNIRSによる追加計測(数量詞浮遊現象に基づいた言語刺激パラダイムを使用)のデータを含めた、成人対象の全計測データの解析結果について検討した。その検討結果については、国際学術雑誌への投稿論文として纏め、本報告書作成時点において、最終調整中である。また、幼児を対象とした心理実験及びNIRSによる計測も行った。実験により得られた計測データの解析結果を検討し、第33回日本神経科学大会、Neurobiology of Language Conference 2010、Society for Neuroscience 2010において成果報告を行った。さらに、平成22年度後半には、数量詞浮遊現象に基づく幼児対象のNIRS計測のデザインについて検討した。幼児対象を対象とした心理実験により、計測デザインの妥当性について検証した。その上で、NIRSによる計測を行い、計測結果の解析を行った。
成層圏における水蒸気収支の定量化

成層圏における熱バランスやオゾン化学に対して決定的な影響を与える水蒸気の変動について調べた.特に熱帯域に注目して,いくつかの衛星観測データと定点観測ながら精度の高い水蒸気ゾンデデータとの比較・検討をおこない,衛星観測のデータ質についての知見を得た.さらに,熱帯下部成層圏における水蒸気混合0比の過去約15年にわたる年々変動について見たところ,さまざまな変動要因は存在するものの,全体としては増加傾向を示すことがわかった.成層圏における熱バランスやオゾン化学に対して決定的な影響を与える水蒸気の変動について調べた.特に熱帯域に注目して,いくつかの衛星観測データと定点観測ながら精度の高い水蒸気ゾンデデータとの比較・検討をおこない,衛星観測のデータ質についての知見を得た.さらに,熱帯下部成層圏における水蒸気混合0比の過去約15年にわたる年々変動について見たところ,さまざまな変動要因は存在するものの,全体としては増加傾向を示すことがわかった.本研究を実施するため,大きく分けて次の3つの作業をおこなう.1:衛星観測からの大気微量成分全球データの収集とその整理,2:オゾン・水蒸気ゾンデなどのデータとの比較・検証,3:大気化学モデル結果との比較・検討.特にここでは,水蒸気を中心とした衛星からの大気微量成分データの収集と水蒸気ゾンデデータ等との比較・検討を通して,信頼すべき水蒸気気候値データを作成する必要がある.本年度はこのうち主として上記1,2の作業をおこなった.具体的には以下の通り.まず,これまでの衛星観測データに関して,提供されるデータの高度範囲,分解能,提供期間などの調査をおこなった.特に2の課題との関係で,比較的新しい期間のデータ検証を優先して,最新の観測期間(2004-)をカバーするEOS/AURA衛星搭載のMLSから得られた水蒸気データを収集した.同時に,熱帯域において近年精力的におこなわれている高精度の水蒸気ゾンデデータを整理して,衛星データとの比較をおこない,データ質の検討をおこなった.その結果,成層圏領域において両者はよい一致を示すものの,上部対流圏ではMLSがドライバイアスを持っていることがわかった.同時に,熱帯域の水蒸気ゾンデデータ観測にもとづいて下部成層圏における水蒸気混合比の過去約15年にわたる年々変動について調べた.さまざまな変動要因は存在するものの,全体としては増加傾向を示すことがわかった.いっぽう2001年頃以降,衛星から観測される熱帯下部成層圏領域の水蒸気は減少していると報告されている.断片的なゾンデ観測からはそのような減少傾向を明瞭なシグナルとしては捉えにくいが,確かにそのような傾向を見て取ることができた.今後,期間を延長してこういった減少傾向が継続しているのかどうか検証する必要がある.本研究を実施するため,主として次の3つの作業をおこなうことを計画した.1:衛星観測からの大気微量成分全球データの収集とその整理,2:オゾン・水蒸気ゾンデなどのデータとの比較・検証,3:大気化学モデル結果との比較・検討.昨年度はこのうち主として上記1,2の作業をおこなったが,本年度もこれらを継続し,さらに扱う衛星データを加えて以下のような成果を得た.なお,3の作業について,試験的にいくつかのモデルデータ結果を参照したが,本格的な解析作業にまでは至らなかった.H19年度に主として解析をおこなったEOS/AURA衛星搭載のMLSデータは,データの品質はよいが提供期間が短く,長期変化傾向を調べるには不十分である.そこで,1991-2005年の観測があるUARS衛星搭載のHALOEデータを入手し解析した.同時に,熱帯域のオゾン・水蒸気ゾンデデータを収集・整理し,熱帯対流圏界面から下部成層圏における水蒸気混合比の年々変動や関連したオゾン変動について調べた.さらに補助的に全球客観解析データも利用して,こういった変動要因となる大気波動成分についても調べた.ゾンデデータと衛星データとの比較から,ゾンデデータが衛星データでは表現できないような高度方向に薄く鋭敏な鉛直構造を示し,時間経過を保持した最大・最小値を含むゾンデ水蒸気プロファイルには明瞭な年々変動のシグナルを見て取れることが分かった.また,HALOEとゾンデデータを比較しながら熱帯下部成層圏における水蒸気の長期変動について調べたが,HALOEデータではしばしば指摘される2000年代に入っての水蒸気量の急減はゾンデデータにおいて必ずしも明瞭ではなく,ゾンデデータは長期的に見て増加傾向を示すと判断される.今後は,観測する時期や場所をうまく戦略的に選択して上で,長期間のゾンデ観測をおこなうことが,成層圏における水蒸気収支の定量化に向けた研究上必要である.
ヒト免疫担当細胞を活性化するCpG-DNA塩基配列の同定とその作用機構の解明

「目的」非メチル化CpGを含み特定の塩基配列からなるオリゴDNA(CpG DNA)は、哺乳動物にTh1優位の免疫反応を誘導する。CpG DNAの活性は動物種と塩基配列に依存して発現するため、研究ではヒトにおいて免疫刺激活性を示すCpG DNAの塩基配列を同定し、その作用機構を明らかにする。「結果」Palindrome CpG DNAにpoly-Gを結合したg10gacga(ggggggggggGACGATCGTCgggggggggg)を、ヒトPDCにIFN-α/IP10/MIP-1αを強く誘導する配列として同定した。g10gacgaの活性はCpG palindromeをなす塩基配列に依存し、活性発現にはendosomeの成熟が必要とされる。TLR9-KOマウスの脾・骨髄細胞ではg10gacgaの活性は誘導されない。g10gacga刺激PDCではp38 MAPKがリン酸化され、p38 MAPKに依存してIFN-α/IP-10/MIP-1αが誘導される。この初期の経路にIFNARのautocrine活性化は必要とされない。PDCにはIRF-3とIRF-7が構成的に発現されており、g10gacga刺激によりIRF-7の発現が増強する。それに先立ってp38 MAPK依存性にSTAT1がリン酸化され、その後STAT1、STAT2、およびIRF-9が核に移行する。PDCではNF-κB p65とp50も構成的に活性化されている。その活性はg10gacga刺激により上昇しp38 MAPK阻害剤で抑制される。NF-κBの活性化を阻止するとIRF-7/IFN-α/IP-10/MIP-1αの誘導が抑制される。反応後期ではIFNARのautocrine活性化を中心としたシグナリングが進行する。「結論」PDC活性配列であるpoly-G結合palindromeCpG DNAは、PDCに取り込まれた後endosomeの成熟とp38 MAPK活性化を介してSTAT1とNF-κBの活性化を起こし、それぞれが遺伝子プロモーターにISREサイトを有するIRF-7/IP-10とκB結合サイトを有するIRF-7/IP-10/MIP-1αの転写に独立してまたは協調して関わることにより、IFNARのautocrine活性化を必要としない機構でIFN-α/IP-10/MIP-1αが誘導されると考えられる。14年度に予定した研究と得られた知見を列記する。1.CpG DNAにより惹起されるSTAT1リン酸化がIRF-7の発現をもたらしIFN-αの産生に関わることの検証:CpG DNA刺激PDCではp38MAPK依存性のSTAT1リン酸化とIRF-7の発現が誘導される(13年度報告)。

この二つの事象とIFN-α産生の関係を明らかにするためISGF-3とIRF-7活性の測定を試みたが、十分量のPDCを得ることが困難であったため、それに変えて、遺伝子の発現にSTAT1のリン酸化やISGF-3の活性化が関わると報告されているMIP-1αやIP-10が、CpG DNA刺激で誘導されるかどうかについて検討した。その結果、いずれのケモカインもIFN-αの場合と同様autocrine IFN-αを必要としない機構で誘導され、その産生はp38MAPK阻害剤で抑制された。このことにより、CpG DNA刺激PDCにおいて認められるP38MAPK依存性のSTAT1リン酸化とIRF-7の発現は連鎖した事象であると推定された。また、CpG DNAの新たな作用として見出されたMIP-1αとIP-10の誘導はendosomal maturation阻害剤で抑制され、TLR9を介した反応であることが示された。2.CpG DNA標的蛋白の同定:CpG DNAによって最初に活性化される蛋白の同定を目指してP38MAPKとSTAT1の上流シグナルについて検討したところ、MEK3/6のリン酸化とJAK1のリン酸化が検出された。これらの活性化とTLR9の関係を検討中である。3.CpG DNA標的蛋白の発現と細胞感受性の関係:TLR9の発現が弱い細胞でもその活性化の状態やCpG DNAの配列によっては免疫活性が誘導されること見出した。このメカニズムについては(2)の研究と平行して15年度に継続して検討する。これまでの二年間に、(1)CpG DNAはPDCにSTAT1リン酸化をおこし、IRF-7の発現を亢進してIFN-αを誘導する(J Leukoc Biol 2002)、(2)IP-10やMIP-1αも、IFN-αと同様にendosomeの成熟化とp38 MAPKの活化を介して誘導され、その惹起シグナルはIFNARのautocrine活性化をバイパスすることを明らかにした。本年度は、CpG DNAがPDCにもたらす共通シグナルと、IFN-α、IP-10およびMIP-1α産生に至る個別シグナルについて検討した。その結果、(1)SR-1igand処理PDCではCpG DNA活性が抑制され、CpG DNAの細胞内取込みにSRの関与が示された。(2)PDCにはNF-κBp65とp50が構成的に活性化されており、その活性はCpG DNA刺激によりさらに上昇した。NF-κB抑制剤処理PDCでは、IRF-7、IFN-α、IP-10およびMIP-1αの誘導が損なわれ、NF-κBはCpG DNAによるIFN-α、IP-10、MIP-1αの誘導いずれにも強くかかわっていることが示された。(3)p38 MAPK阻害剤処理PDCではCpG DNAによるNF-κB活性の亢進がみられないことから、CpG DNA刺激PDCではp38 MAPKを介してNF-κB活性が亢進すると考えられた。CpG DNAはPDCにP38MAPK依存性のSTAT1リン酸化を誘導する。従って、CpG DNAはSRを介してPDCに取り込まれた後、endosomeの成熟とP38 MAPKの活性化を共通経路としてTLR9シグナルを伝達し、その下流でNF-κBとSTAT1のそれぞれが活性化されると考えられる。NF-κBは遺伝子プロモーターにκBサイトを有するIRF-7、IP-10およびMIP-1αの転写に、一方、STAT1リン酸化を介して形成されるISGF
分子生物学的手法を用いた新しい溺死診断法の開発

以上の結果から、海洋細菌の検出は溺死の簡便なスクリーニング検査として有用であることが示唆された。今後、実際の解剖事例における血液及び臓器などからの検出を行い.実用性を明らかにし論文としてまとめる予定である。本年度は特に海洋性細菌に着目し、その特異な塩基配列を指標としたPCR法の開発に取り組んだ。指標とする細菌は、世界中に広く棲息し、ヒトへの感染を認めず、日本では特に養殖魚類の病原菌として知られているListonella anguillarum及びPhotobacterium piscicidaの2つについて検討した。L.anguillarum及びP.piscicidaはこれらに感染したニジマス及びブリから単離された菌株を使用し、L.anguillarumについては2日間、P.piscicidaについては3日間平板培地にて培養した。培養後の菌体はSPS存在下でProteinase Kによる消化を行い、フェノール・クロロホルム法及びエタノール沈殿法にて染色体DNAを抽出・精製した。各細菌のプライマーの設計は微生物における系統分類の指標とされている16S rRNAの塩基配列に基づいて、それぞれ2組づつ設計した(L.anguillarum ; La1及びLa2、P.piscicida ; Pp1及びPp2)。また2組のプライマーセットのうち1組(La2及びPp2)は、Nestedプライマーとなるよう設計した。次いで、各細菌から抽出したDNAについてPCR法による標的配列の増幅を試みた。L.anguillarumについては2組のプライマーセットを使用して、La1により882bp、La2により289bpの目的断片の増幅をそれぞれ認めた。一方、P.piscicidaについてはPp1により882bp、Pp2により714bpの目的断片の増幅をそれぞれ認めた。更に、各細菌の検出限界についてはNested PCR法を利用してL.cnguillarumが100fg、P.piscicidaが1pgまで検出可能であった。また、健常者の血液から抽出したヒトDNAとの交叉性は、認められなかった。今後、実際の解剖事例における血液及び臓器などからの検出を行い、実用性を明らかにし論文としてまとめる予定である。
桁端部における耐震・免震機能部材間の連成を考慮した高架橋の耐震性評価

都市内高架桁橋の桁端部および機能部材(落橋防止装置,伸縮装置,変位制限装置,ダンパーなど)の性能の高度化や部材間の衝突や干渉を,実験および数値解析により検討した.その結果,桁端部の機能部材間の衝突や干渉が高架橋の地震時安全性に影響を及ぼすこと,および既設の都市内橋梁を含む空間的な制約を考慮すると,免震支承以外の制振機能部材を用いる高架橋の地震時安全性向上手法も有効であることを明らかにした.都市内高架桁橋の桁端部および機能部材(落橋防止装置,伸縮装置,変位制限装置,ダンパーなど)の性能の高度化や部材間の衝突や干渉を,実験および数値解析により検討した.その結果,桁端部の機能部材間の衝突や干渉が高架橋の地震時安全性に影響を及ぼすこと,および既設の都市内橋梁を含む空間的な制約を考慮すると,免震支承以外の制振機能部材を用いる高架橋の地震時安全性向上手法も有効であることを明らかにした.耐震・免震機能部材間の連成の影響を数値解析により明確にするために必要な,解析プログラムの機能向上,および模型実験の実施,に関連する以下の研究を実施した.・対象とする高架橋の選定:数値解析の実施ならびに検証のための載荷実験の実施を考慮して,実務経験者からのヒアリングと資料提供,および研究打ち合せを行い,対象とする高架橋形式を選定した.・各種機能部位の挙動を再現できる解析要素に必要となる個々の機能部材の定式化に必要となる性能検証実験を実施した.とくに,フィンガータイプの伸縮装置の模型実験を実施し,伸縮装置の定着ボルトの破断,変形,設計法の妥当性を検証した.・シリンダー系ダンパーを追加設置して耐震性向上を図る方法の有効性と適用範囲,ならびに,それを再現するための数値解析を実施する上での留意点を明らかにした.・橋脚-支承-上部構造からなる高架橋免震系の桁端部縮小模型を用いた振動台実験を実施した.また,縮小模型の動的挙動を再現できる解析モデルを用いてパラメトリックな数値解析を実施し,変位制限装置の破断特性,荷重変位関係が,耐震-免震の系の変化に及ぼす影響,および変位制限装置のノックオフ機能の必要性と有効性について明らかにした.・軸力と曲げを受ける橋脚部材のような,鋼長柱を対象とした複合非線形性骨組解析および載荷実験を実施し,鋼長柱の全体座屈評価を行った.・鋼床版構造の損傷と振動性状の相関に着目して,鋼床版形式で構成される上部構造の振動性状を検討するため,実験,解析を実施し,地震時のみならず常時の振動性状が鋼床版の損傷発生に及ぼす可能性があることを示唆した.免震橋梁の桁端部に設置される耐震・免震機能部材の振動時の挙動や数値解析への高精度なモデル化に必要な,各種機能部材の性能の定式化に必要な性能検証実験と解析プログラムの機能向上,および模型実験の実施に関連して,以下の研究を実施した.・次年度に実施する詳細な高架橋の数値シミュレーションに向けて,各種耐震・制振・免震部材の設計法と組み合わせ法・効果に関する資料を整理し,対象とする橋梁構造を再設定した.・鋼製フィンガージョイントの維持管理状態,ならびに鉛直支持,水平耐力を載荷実験結果に基づき明確にし,フィンガージョイントおよびフィンガージョイントのノックオフ化が免震橋の地震時挙動に及ぼす影響を明確にした.・鋼製べローズを用いて上部構造間を半剛結に連結する高架橋の制振設計コンセプトを提示し,および半剛結連結の効果を,鋼製ベローズの要素実験および数値シミュレーションにより明確にした.・曲げモーメントと軸力を受ける部材の中で,これまで研究例が少ない,トラス橋の弦材のような軸力が卓越して作用する部材への,軸力の繰返し作用およびそれによる部材の座屈挙動を,部材を対象とした載荷実験,および格点部による部材の変形拘束に着目したトラス橋全体を対象とした数値解析により明確にした.・鋼床版の振動特性と損傷との相関に着目して,高架橋の上部構造の地震時および常時の振動性状が損傷発生の一因である可能性を示唆した.・小型振動台実験の結果に基づく鋼製橋脚の耐震性能評価の有効性を,載荷実験および数値解析を比較し明確にした.免震橋梁の桁端部に設置される耐震・免震機能部材の振動時の挙動を,要素部材の性能検証実験や数値解析により,以下を明らかにした.各種耐震・制振・免震部材の設計法と組み合わせ法・効果に関する資料を整理し,対象とする橋梁構造を試設計し,詳細な高架橋や構造の数値シミュレーションを行い,高架橋の耐震性能向上と耐震性評価に関連する,以下の結論を得た.・鋼製フィンガージョイントに代表される高架橋桁端部に設置される機能部材の衝突や干渉,および部材の破断が高架橋の地震時挙動に及ぼす影響を明確にした。・上部構造間の半剛結連結法および半剛結連結の効果を,要素実験および数値シミュレーションにより明確にし,鋼製ベローズを用いる高架橋の制振設計コンセプトを提示した.・トラス橋の弦材のような軸力が卓越して作用する部材への,軸方向力の単調および繰返し作用およびそれによる部材の座屈挙動を,部材を対象とした載荷実験,および格点部による部材の変形拘束に着目したトラス橋全体を対象とした数値解析により明確にした.・鋼床版の振動特性と損傷との相関に着目して,高架橋の上部構造である鋼床版の地震時および常時の振動性状とその制振対策法を提案した.

・小型振動台実験の結果に基づく鋼製橋脚の耐震性能評価の有効性を,載荷実験および数値解析を比較し明確にした.・鋼材のせん断変形を利用した塑性ダンパーの機能とメカニズムを明らかにしせん断座屈拘束型ダンパーを開発した.
慢性咳嗽時の発咳亢進機序におけるC線維終末でのタキキニン遊離調節機構の関与

1)真菌抽出成分で感作した動物を用いた慢性咳嗽モデルの作成真菌から抽出したアレルゲン物質をラットに感作した後に、咳感受性および気道過敏性の亢進の有無を確認する。真菌から抽出したアレルゲン物質により感作したモルモットにおいて、クエン酸およびカプサイシンにより誘発される咳嗽数は、非感作群における誘発咳嗽数に比べ有意に増加しており、咳感受性の亢進が認められた。一方、ヒスタミンにより誘発される気道収縮反応には、感作および非感作群の間に有意な差はなく、アレルゲン感作による気道過敏性の亢進は認められなかった。また、アレルゲン感作群で認められたクエン酸誘発咳嗽数の増加は、抗ヒスタミン薬により非感作群の咳嗽数のレベルにまで抑制された。これらのことから、真菌から抽出したアレルゲン物質により感作したモルモットにおける咳感受性の亢進はヒトにおけるアトピー咳嗽における咳感受性亢進に対応するもめと考えられる2)アナナダマイドによるTRPV1受容体を刺激し介したC線維興奮と一酸化窒素の関連マウスに高濃度(3mg/ml)のアナンダマイドを3分間吸入することにより誘発された咳嗽数(約15回程度)は、TRPV1受容体の選択的拮抗薬であるガプサゼピンにより有意に拮抗された。また、低濃度(0.3mg/ml)のアナンダマイドの吸入では溶媒である10%DMSO吸入時とほぼ同程度の咳嗽数(7回程度)が誘発されたがnitricoxide(NO)の前駆物質であるL-arginineを事前吸入することにより、低濃度(0.3mg/ml)のアナンダマイドの吸入による咳嗽数は有意に増加した。L-Arginineにより増加した低濃度(0.3mg/ml)アナンダマイド誘発咳嗽数はNOの合成阻害薬であるL-NAMEにより用量依存的に抑制された。Ovalbumineにより感作およびチャレンジにより気道炎症を引き起こしたマウスのカプサイシン誘発咳嗽数は非感作・非チャレンジ群マウスに比べ増加しており、肺胞洗浄液中のNO量も有意に増加していた。これらのことから、気道炎症により増加したNOがC線維終末でのトランスポーターを介したアナンダマイドの取込みを促進し、その取込まれたアナナダマイドがTRPV1受容体を刺激し、タキキニン類の遊離を促進することで、いわゆる咳の受容器の一つであるA・線維終末受容器のrapidlyadaptingreceptorの興奮性を亢進し、咳の感受性を増大させていることが考えられる。これらのメカニズムが気道炎症を伴う慢性咳嗽の発症機序の一因となっている可能性が強く示唆される。

これらのメカニズムが気道炎症を伴う慢性咳嗽の発症機序の一因となっている可能性が強く示唆される。真菌から抽出したアレルゲン物質により感作したモルモットにおいて、クエン酸およびカプサイシンにより誘発される咳嗽数は、非感作群における誘発咳嗽数に比べ有意に増加しており、咳感受性の亢進が認められた。一方、ヒスタミンにより誘発される気道収縮反応には、感作および非感作群の間に有意な差はなく、アレルゲン感作による気道過敏性の亢進は認められなかった。また、アレルゲン感作群で認められたクエン酸誘発咳嗽数の増加は、抗ヒスタミン薬により非感作群の咳嗽数のレベルにまで抑制された。これらのことから、真菌から抽出したアレルゲン物質により感作したモルモットにおける咳感受性の亢進はヒトにおけるアトピー咳嗽における咳感受性亢進に対応するものと考えられる。Anandamaideトランスポーター阻害薬であるVDM11は、用量依存性な鎮咳作用を示した。VDM11の鎮咳作用はカンナピノイドCB1受容体拮抗薬であるSR141716Aの腹腔内あるいは吸入前処置によって拮抗された。しかし、SR141716Aの脳室内投与では、VDM11の鎮咳作用に影響を与えなかった。10%DMSO(anandamaideの溶媒)をマウスに吸入させると3分間に7.7±0.6回の咳を誘発した。低用量(0.03mg/ml)のanandamaideの吸入によって誘発される咳の数は、10%DMSOのみを吸入させた際の咳に比べ減少した。一方、anandamaideの高用量(3mg/ml)によって誘発される咳の数は、10%DMSOのそれに比べ、有意に増大していた。選択的CB1受容体拮抗薬のAM251(1.8mM)を0.03mg/mlのアナンダミドの吸入前に処置すると、咳の数は10%DMSOのみを吸入させたマウスの咳嗽数と同じレベルにまで増加した。また、3mg/mlアナンダミドの吸入により増加した咳嗽数は選択的TRPV1受容体拮抗薬である、capsasepine(0.3mM)あるいはVDM11の前処置によって有意に抑制された。これらの結果はanandamaideがC線維を介した咳感受性の調節を行っていることを示唆しており、anandamaideトランスポータがその調節に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。内因性TRPV1受容体作動薬であるアナンダマイドはC線維終末にあるアンアダマイドトランスポーターを介して取り込まれ、TRPV1受容体を刺激し、タキキニン類の遊離を促進することが示唆されている。マウスに高濃度(3mg/ml)のアナンダマイドを3分間吸入することにより誘発された咳嗽数(約15回程度)は、TRPV1受容体の選択的拮抗薬であるカプサゼピンにより有意に拮抗された。また、低濃度(0.3mg/ml)のアナンダマイドの吸入では溶媒である10%DMSO吸入時とほぼ同程度の咳嗽数(7回程度)が誘発されたがnitric oxide(NO)の前駆物質であるL-arginineを事前吸入することにより、低濃度(0.3mg/ml)のアナンダマイドの吸入による咳嗽数は有意に増加した。L-Arginineにより増加した低濃度(0.3mg/ml)アナンダマイド誘発咳嗽数はNOの合成阻害薬であるL-NAMEにより用量依存的に抑制された。Ovalbumineにより感作およびチャレンジにより気道炎症を引き起こしたマウスのカプサイシン誘発咳嗽数は非感作・非チャレンジ群マウスに比べ増加しており、肺胞洗浄液中のNO量も有意に増加していた。これまでの報告で、NOがアナンダマイドトランスポーターを活性化させることが示唆されている。
大気汚染物質がバイオエアロゾルの感染力に及ぼす影響評価と疾病予防に向けた研究

バクテリアやウイルスなどを含むバイオエアロゾルと煤の相互作用メカニズムの解明が感染症などによる健康被害を最小限に抑えるための一助になると考え本研究を推進した。対象とする環境中の汚染物質としては炭化水素の不完全燃焼から排出される黒煙(煤)を対象物質とし、オゾンをバイオエアロゾルへのストレス因子として、大気環境中での挙動を対流式反応チャンバーにてシュミレーション実験した。その結果、バイオエアロゾルが煤と混在した場合はオゾンによるストレスを軽減している傾向が見受けられた。有機物質を多く含んでいる、煤や畜舎内環境粒子がバイオエアロゾルの活性保持にどの様な影響を及ぼすか検証を行うことができた。環境中に存在する病原性微生物は、人や動物の健康に甚大な支障をきたし多大な損害をもたらすことから、これら諸問題を最小限化することは公衆衛生のみならず、社会における重要な課題である。本研究では、バクテリアやウイルスなどの微生物由来成分を含むバイオエアロゾルが浮遊粒子状物質として大気中に存在する際、大気汚染物質の存在が何らかの理由でこれら微生物の生存、保護に寄与しているという仮説のもとに、汚染物質を含むサブミクロンサイズのエアロゾルにて大気中の微生物への影響を検証することを目的としている。対象とする環境中の汚染物質は、炭化水素の不完全燃焼から排出される黒煙(煤)などである。これらがエアロゾルとして存在した状況での微生物相への影響を異なる反応チャンバーにてシミュレーション実験を行っている。また、異なる温度、湿度、紫外線照射、オゾン暴露下などの実際の大気環境中で起こりうる条件を、実験室レベルで評価し、大気汚染物質である煤などの存在がバイオエアロゾルに及ぼす影響の把握を行っている。これらの結果から疾病蔓延の予防策のための情報提供のために基礎的な知識の蓄積を行うことを大きな目的としている。初年度の主な目的は、大気汚染物質のひとつである煤が微生物の不活化にどの様な影響を及ぼすかを検証することにある。煤を使用する主な理由としては、煤は様々な過程で生成されるが、その中でも、化石燃料、バイオマス燃料などの炭化水素の不完全燃焼過程にて生成されるため、大気汚染物質として様々な場所で発生しており、重要な調査対象になるであろうと考えたからである。先行研究から、乾燥したヘドロ成分においてバクテリアの不活化を阻害する作用が見られたことから、有機物質と微生物の関係について大気中で起こりうる状況について検証を行っている。本実験では、煤を人工的に生成し、これらがバイオエアロゾルの不活化に至る割合の違いを検証している。当初の計画では、煤の修飾を受けたダストなどの導入を検討したが、修飾の手間と度合いに不均一な要素が含まれ、これらが実験に及ぼす影響を鑑み、煤を発生させ、直接暴露する方法での実験を行った。煤の生成にはヨーテボリ大学Hallquist教授らの協力を得て実験を推進した。Hallquist教授とはこれまでにも共同で研究を行ってきた経緯があり協力を得る体制は既に確立されていたことから、順調に実験が遂行した。予備実験では、ヨーテボリ大学にある流動式チャンバーを活用し、安定的に発生させた煤とバクテリアを混合し、生存率の比較を行うことができた。また、実際にウイルスを含むバイオエアロゾルを使用して細胞への感染を確認する実験を本学の萩原教授(ウイルス学)らと共同で進めている。これら感染力を検証する実験では、大気中での異なる暴露前の対流時間が感染に及ぼす影響を実験中であり、大気中(チャンバー内)に浮遊しているウイルスの感染能を評価する実験系の準備ができた。環境中に存在する病原性微生物は、人や動物の健康に甚大な支障をきたす可能性があり、個々の健康のみならず社会全体にも多大な損害をもたらす。従って、これら諸問題を最小限化することは公衆衛生のみならず、社会全体における重要課題である。本研究は、バクテリアやウイルスなどの微生物由来成分を含むバイオエアロゾルが浮遊粒子状物質として大気中に浮遊する際、大気汚染物資の存在が何らかの理由でこれら微生物の生存、保護に寄与している可能性があるのではないかという仮説の基、汚染物質を含むサブミクロンサイズのエアロゾルにて微生物の不活化への影響を検証することを目的としている。対象とする環境中の汚染物質は、黒煙(煤)などの炭化水素の不完全燃焼から排出される物質である。また、異なる温度、湿度、紫外線照射、オゾン暴露下における実際の大気環境中で起こりうる条件を、実験室レベルで評価し、大気汚染物質である煤などの存在がバイオエアロゾルに及ぼす影響の把握を行っている。また、基礎的な空気感染を定量化するために、細胞株を使用した感染実験を試験的に行っている。これら細胞株を感染性のエアロゾルに曝露することで、バイオエアロゾルがどれぐらいの感染力を持つか、定量化に向けた基本的なシステムの構築を進めている。これは、ある一定条件で培養した細胞に一定条件下で直接ウイルスを含むバイオエアロゾルに曝露し、感染したと思われる細胞への影響を指標とした定量化を行うことを目的とする。本プロジェクトは、大気汚染物質のひとつである煤がバイオエアロゾルにどの様な影響を及ぼすかを検証することにある。人工的な煤の生成については、共同研究者であるヨーテボリ大学Hallquist教授らの協力を得て実験を推進している。

煤は様々な過程で生成されるが、その中でも、化石燃料、バイオマス燃料などの炭化水素の不完全燃焼過程にて生成されるため、大気汚染物質として様々な場所で発生しており、重要な調査対象である。具体的には煤を人工的に生成し、これらがバイオエアロゾルの不活化に至る割合の違いについての検証を行っている。これには、Hallquist教授らの協力が大きくあり、煤の生成、バイオエアロゾルとの混合実験は概ね順調に遂行している。予備実験として、安定的に発生させた煤とバクテリアを混合し生存率の比較を行うことができている。しかし、これまでの検証から、結果にばらつきが見られることがあり、我々の想定する要素以外にも何らかの影響因子が存在することが想定され現在検証中である。また、実際にウイルスを含むバイオエアロゾルを使用して細胞株への感染を検証する実験を本学の萩原教授(ウイルス学)らと共同で進めている。これら感染力を検証する実験では、チャンバー(17L容器)内を大気相と想定し、これらの中に対流する時間の変化が感染による細胞の変化に及ぼす影響を検証中である。結果から、60分経過後も、チャンバー内に浮遊しているウイルスを含むバイオエアロゾルを細胞株に曝露した結果、感染が確認されていることから安定した感染の評価系の準備ができている。これまではウイルス単一の試験が主であり、ウイルスと煤などの大気汚染物質が混在する様々な成分による影響の評価までには至っていない。大気環境中には大気汚染物質やバイオエアロゾルなどの微生物を由来とする浮遊粒子状物質があり人や動物の健康に支障をきたすことが危惧されている。本研究ではバクテリアやウイルスなどの微生物由来成分を含むバイオエアロゾルが浮遊粒子状物質として大気中に浮遊する際、そこに混在する大気汚染物資がこれら微生物の生存、保護に寄与しているのではないかという仮説のもと研究を進めた。汚染物質を含むサブミクロンサイズのエアロゾルにて微生物の不活化への影響について検証を行った。具体的には、環境中の汚染物質として、炭化水素の不完全燃焼から排出される黒煙に着目した。これらが浮遊粒子状物質として大気中に混在する際のバイオエアロゾルへの影響を異なる反応チャンバーにて生存率の違いを検証する実験をスウェーデン、ヨーテボリ大学の共同研究者Hallquist教授らのチームと行った。エアロゾル化されたバクテリアと煤にオゾンを暴露した際、バクテリアのみの場合に比べてより顕著に減少する傾向が見られた。ウイルスのみを使用した実験も萩原教授らと試みたが、再現性が低く安定した結果を得ることができなかった。新規で購入した光学式パーティクルサイザー(OPS)の活用にてより高濃度のエアロゾル測定が可能となった。試験的ではあるが、最終年度の後半にて非結核性抗酸菌などのヒトにて疾病問題とされる細菌に近い種にてモデル実験を行うことができた。これまでの成果を広く報告する意味で、2017年度に酪農学園大学で「第五回:大気エアロゾル公開シンポジウムー黄砂からPM2.5までー」を開催し成果の一部を一般の方にも情報提供することができた。更に、長野県で開催された第11回バイオエアロゾルシンポジウムにても成果を発表することができた。バクテリアやウイルスなどを含む
低分子より誘導された多能性幹細胞由来骨軟骨形成細胞による骨軟骨複合体作製法の樹立

本年度は、骨芽細胞分化の効率化及び三次元講組織作成の基盤作りに関して検討してきた。前者において、1中胚葉誘導法の変更、誘導期間の最適化、2骨芽細胞誘導の最適化を行った。1に関して、Wnt作動性低分子化合物の誘導期間を0日、1日、3日、5日と設定し検討したところ、CHIRの誘導3日に中胚葉遺伝子の発現ピーク、多能性遺伝子の発現減少を認め、中胚葉誘導に最適な期間を3日とした。2に関して、骨芽細胞発生において重要なシグナルであることWnt、BMP、FGF、Hhを組み合わせた検証を行った結果、中胚葉誘導後に各種シグナルを作用させることで骨芽細胞遺伝子の発現上昇を認める結果が得られた。本内容の一部をISSCR/CiRA2016で共同演者として発表している。後者において、まず立体的な形状を付与したまま誘導可能な、多能性幹細胞の三次元培養法を確立する必要がある。そのため、マウスES細胞の三次元維持培養法を検討した。具体的には、アテロコラーゲンスポンジ中にマウスES細胞を播種し、mESCsの未分化性を維持する培養方法が、アテロコラーゲンスポンジ中においても、多能性維持に働くかを検証した。結果、多能性遺伝子発現、タンパクの発現は、三次元においても同じレベルで維持されたことが分かった。2i培養法とアテロコラーゲンスポンジの組み合わせによる三次元培養法によって、多能性幹細胞(ES細胞)の特性を変えず、基底状態で維持できるということが分かった。本研究内容の一部は、下記に示す第38回日本分子生物学会年会、第15回日本再生医療学会総会にて共同演者として発表した。さらに、この三次元維持培養法を用い、骨芽細胞分化誘導が可能か検証したところ、骨芽細胞関連遺伝子タンパクの高発現、石灰化を認めた。その一部データを、す第38回日本分子生物学会年会、第15回日本再生医療学会総会にて共同演者として発表した。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は、多能性幹細胞から骨芽細胞誘導法の確立を中心に行ってきた。骨芽細胞特異的に発現するI型コラーゲンプロモーター断片の下流にGFPを組み込んだマウスES細胞(Col1a1-GFP mESCs)を用い、誘導法の最適化を行ってきた結果、中胚葉分化を特異的に誘導するために、Wnt作動性低分子化合物(CHIR99021; CHIR)及び神経分化を抑制するためHh阻害性低分子化合物(Cyclopamine; Cyc)を用いたところ、中胚葉遺伝子であるT等は誘導開始5日で上昇し、多能性遺伝子であるNanog、神経外胚葉遺伝子であるSox1は抑えられた。中胚葉誘導後、Hh作動性化合物(SAG)及びヘリオキサンチン誘導体(TH)を用いたところ、投与14日後に、骨芽細胞関連遺伝子であるRunx2, Sp7, Col1a1, Ibspの著しい遺伝子発現がRT-qPCRにて確認された(P<0.05, vs誘導前)。これをヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)に応用した場合、骨芽細胞関連遺伝子であるRUNX2, SP7, COL1A1が上昇した(P<0.05, vs誘導前)。多能性幹細胞から骨芽細胞を誘導する報告を本年報告している(Stem Cell Reports. 2:751-60, Cell Press, 2014)。これに引き続く形で、現在、hiPSCsから骨芽細胞誘導法の改善及び、マウスES細胞を用いた骨芽細胞三次元培養条件のの最適化を行っている。

その一部データを、す第38回日本分子生物学会年会、第15回日本再生医療学会総会にて共同演者として発表した。本研究の内容の一部が、国際幹細胞学会(ISSCR)の学会誌であるStem Cell Reportsにて本年度報告されており、各種報道媒体にも取り上げられている。本年度は、1多能性幹細胞から骨芽細胞をより効率的な誘導、2誘導した骨芽細胞三次元培養法の確立を目指していた。当初、困難が予想されたものの、一定の成果を得ているため、期待通り研究が進展したと評価する。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請した研究の達成には、1hiPSCsから骨芽細胞誘導法の改善、2骨芽細胞、軟骨細胞の三次元培養法の確立、3生体における骨軟骨再生の検証が必要である。1、2の研究計画は概ね順調に遂行されており、3に関しても1、2の研究項目が達成され次第、開始する予定である。