hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
殺虫剤の尿中代謝物プロファイリングによる体内負荷量の定量と健康影響のリスク評価

1遺伝子多型と4種類の尿中代謝物、血中及び尿中の8-ヒドロキシデオキシグアノシンの関係の解析が進行中である。動物モデルによる実験としては、9週齢のWistar系雄ラット40匹を1週間馴化した後に4群にわけ、ジクロルボス0,5,10mg/kg、ダイアジノン3mg/kgを週6日9週間経口投与した。最終投与終了後、24時間尿を採取した後に麻酔下に大動脈採血をおこない、血球及び血清コリンエステラーゼ活性、生殖器を含む臓器重量、精子原液調整後の時間経過ごと(0,15,30,60分後)の精子運動性を測定した。現在、精子運動に関与するアデノシン3リン酸(ATP)の測定法を検討中であり、尿中ジアルキル酸とともに平成18年度にかけて測定・解析していく予定である。本研究の目的は、複数の殺虫剤による混合曝露を受けた場合のリスク評価を念頭に、殺虫剤に曝露するヒト職域集団およびモデル動物で、神経系、生殖器系に関して尿中代謝物量と健康影響の量反応関係を明らかにすることである。平成18年度は、前年度に続き衛生害虫防除作業者を対象に8月(散布業務の繁忙期、n=66)、2月(閑散期,n=39)に健康調査を実施した。曝露評価として、血中コリンエステラーゼ活性とともに、作業翌日の早朝尿を用いて、有機リン代謝物であるジメチルリン酸(DMP)、ジメチルチオリン酸、ジエチルリン酸、ジエチルチオリン酸と、ピレスロイド系殺虫剤の代謝物である3-フェノキシ安息香酸(3-PBA)を測定した。DMP及び総ジアルキルリン酸(DAP)濃度は夏期に散布者で非散布者に比べ高く、尿中の8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OHdG)濃度は夏期冬期共に散布者で有意に高かった。3-PBAに関しては冬にのみ有意差をみとめた。8-OHdG濃度と尿中DHP, DAP濃度は有意に相関した。有機リン殺虫剤の代謝酵素であるパラオキソナーゼ1(PON1)遺伝子多型に関して、Q/Q、Q/R、R/Rの各多型頻度は17,39,44%であり、PON1多型と白血球及び尿中8-OHdG濃度との関連は認められなかったが、尿中DAP濃度については夏期にQアレルが減少するにつれて有意に減少した。動物モデルによる実験としては、9週齢のWistar系雄ラット40匹を4群にわけ、ジクロルボス0,5,10mg/kg、ダイアジノン3mg/kgを週6日9週間経口投与した。尿中DAP濃度、血球及び血清コリンエステラーゼ活性、生殖器を含む臓器重量、精子運動性を測定した。ダイアジノン群で精子運動性が有意に低下し、60分後の精子アデノシン3リン酸(ATP)/アデノシン2リン酸比がジクロルボス10mg/kg投与群で有意に低下した。本研究の目的は、複数の殺虫剤による混合曝露を受けた場合のリスク評価を念頭に、殺虫剤に曝露するヒト職域集団およびモデル動物で、尿中代謝物量と健康影響の量反応関係を明らかにすることである。以下に平成19年度に行った検討結果を抜粋する。フェニトロチオンの代謝物3-メチル-4-ニトロフェノール(MNP)の抱合能の種差をみる目的で、ウズラ、ラット、マウスの肝ミクロソーム分画中のUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)、細胞質分画中の硫酸転移酵素(SULT)の活性を測定した。UGTに関して酵素活性はウズラが最小、マウスが最大であった。一方SULTに関しては、UGTに比べ活性はかなり低く、有意な種差は認められなかった。また、糖尿病(DM)患者では有機リン系殺虫剤の代謝と毒性がどのように変わるか明らかにする目的で、DMモデル動物での毒性実験を行った。9週齢のWistar系雄ラットを2群にわけ片方の群にストレプトゾトシン45mg/kgを投与し、1型DMのモデル(DM群)とした。DM群及びストレプトゾトシン非投与対照群にダイアジノン0,6.5mg/kg,65mg/kgを1回腹腔内投与した。
サブミリ波ジャイロトロン出力のプラズマ計測への応用のためのモード変換と高効率伝送

福井大学では,超高周波・中出力・周波数可変ジャイロトロンの開発を行っており,サイクロトロン基本波動作と二次高調波動作を併用したジャイロトロン(Gyrotron FU Series)により,周波数890GHzまで周波数可変で出力100W-1kWを達成している。本研究では、福井大学で開発したサブミリ波ジャイロトロン(Gyrotron FU IV)を大型核融合装置内に自然励起される密度揺動の散乱計測等の光源として応用するために、出力の伝送システムの開発研究を行う。(1)周波数156GHz(TE_<12>モード)から812GHz(TE_<19>モード)にいたる広い範囲の帯域で共通のモード変換用アンテナ、得られたガウシアンモードを回転楕円面金属ミラーによって伝送するシステム、偏向面を任意に設定してプラズマに入射するためにgrooveを有する一対の金属ミラーからなる偏向器を、設計し製作した。これらを組み合わせて,伝送システム全体を構成し,Gyrotron FU IVの出力を用いて性能テストを行った。偏向器は周波数によって異なるので,これを除くシステムのテストを,ジャイロトロンの各発振モード(TE_<0n>、及びTE_<1n>モード)について行い,プラズマ中の測定点に対応する位置でのモードパターンと伝送効率を求めた。(2)次に,偏向器を伝送システム中に挿入して,ジャイロトロン出力を用いたシステム全体の性能テストを行った。偏向器を構成する対向する一対の金属面上のgrooveの方向の相対角度を変化させて,偏向面の方向が任意に設定できることを確かめた。(3)設計値と性能テストの結果を比較検討して,システム全体の評価を行い,核融合装置に実際に設置して,サブミリ波散乱計測を行うことを計画した。このために,Gyrotron FU IV,本研究で構築した高効率伝送システムにサブミリ波デテクションシステムを付加して,散乱計測システムを構成する。福井大学で開発したサブミリ波ジャイロトロン(Gyrotron FUIV)の出力伝送システムの開発研究を行った。(1)Gyrotron FUIVの円筒空洞共振器は直径23.23mmであり,各々の共振モードで発振した出力はこれにテ-パ-管で接続された円形導波管(直径28mm)によって出力窓まで伝送される。従って,すべてのTE_<0n>モードとTE_<1n>モードに対して,導波管内での伝播角は度となる。出力窓にステップカット導波管を接続して,伝播角に等しい角度で放射した電磁はビームを楕円筒面と方物筒面よりなるアンテナによって,ガウシアンモードに変換する。周波数156GHz(TE_<12>モード)から812GHz(TE_<19>モード)にいたる広い範囲の帯域で共通のモード変換用アンテナを設計し製作した。(2)アンテナによって変換して得られたガウシアンモードを回転楕円面金属ミラーによって,伝送するシステムの設計を行い,これに基づいて製作をする。最終的にプラズマ中の測定点でビームウェストが直径15mmになるように設計を行った。(これにより,空間分解能15mmの計測が可能となる。)(3)ガウシアンビームの偏向面を任意に設定してプラズマに入射するためにgrooveを有する一対の金属ミラーによって偏向器を構成し,伝送システムの中に挿入する。その設計パラメーターは周波数によって異なるため,各モード(TE_<0n>,TE_<1n>モード)に対してgrooveのパラメーターを定め,複数個の偏向器を製作した。(4)誘電体を内壁にコーティングした導波管によって,HE_<11>モードを高効率,高純度モードで伝送するためのシステムの設計を行った。

福井大学では,超高周波・中出力・周波数可変ジャイロトロンの開発を行っており,現在までにサイクロトロン基本波動作と二次高調波動作を併用したサブミリ波ジャイロトロン(Gyrotron FU IV)を完成し,周波数880GHzまでに周波数可変で出力100W-1kWを達成している。このジャイロトロンは,大型核融合装置内に自然励起される密度揺動の散乱計測等に格好の光源である。これを有効に活用するためには,ジャイロトロンの円形導波管モードをガウシアンモードに変換して,低損失で長距離を伝送し,高周波電場の偏波面を任意の方向に設定して,プラズマ中に入射するためのシステムの構築が必要である。(1)前年度に設計製作したコンポーネントを組み合わせて,伝送システム全体を構成し,サブミリ波ジャイロトロン(Gyrotron FU IV)の出力を用いて性能テストを行った。偏向器は周波数によって異なるので,これを除くシステムのテストを,ジャイロトロンの各発振モード(TE0n及びTE1nモード)について行い,プラズマ中の測定点に対応する位置でのモードパターンと伝送効率を求めた。(2)次に,偏向器を伝送システム中に挿入して,ジャイロトロン出力を用いたシステム全体の性能テストを行った。偏向器を構成する対向する一対の金属面上のgrooveの方向の相対角度を変化させて,偏向面の方向が任意に設定できることを確かめた。(3)設計値と性能テストの結果を比較検討して,システム全体の評価を行い,核融合装置に実際に設置して,サブミリ波散乱計測を行うことを計画した。このために,サブミリ波ジャイロトロン(Gyrotron FU IV),本研究で構築した高効率伝送システムにサブミリ波デテクションシステムを付加して,散乱計測システムを構成する。
脳脊髄液中リポ蛋白とβ-アミロイドの相互作用におけるアポJの存在意義の解明

脳脊髄液中のアポE及びアポJ含有リポ蛋白をヘパリンセファロースカラムで分離する方法を構築し、さらに回収したリポ蛋白の構成成分であるアポリポ蛋白、コレステロール、リン脂質、シアル酸(SA)の高感度定量法をそれぞれ構築した。髄液と血清が同時に提出された患者14名の検体を匿名化して使用した。血清及び髄液中のアポE及びアポJ含有リポ蛋白は超遠心分離後のリポ蛋白画分をアフィニティーカラムに注入し分取した。アポE含有リポ蛋白粒子の性状解析としてSA、総コレステロール、リン脂質の各濃度、透過型電子顕微鏡によるリポ蛋白粒子の観察を行った。結果1.血清中のSA濃度は髄液中のSA濃度よりも高値であったが、髄液と血清それぞれの総蛋白濃度でSA濃度を補正すると、髄液中の補正SA濃度は血清中よりも高値であった。2.若年者グループ(5.4±2.3才)と高齢者グループ(72.0±3.2才)の髄液中の補正SA濃度は高齢者グループで低値となる傾向が認められた。3.アポE含有リポ蛋白中のSA/アポE濃度比(SA/アポE)と総脂質濃度は逆相関を示した。SA/アポEが高く総脂質濃度が低いアポE含有リポ蛋白の粒子サイズ(17.5±0.2nm)とSA/アポEが低く総脂質濃度が高いアポE含有リポ蛋白の粒子サイズ(12.0±0.1nm)間には明らかな有意差が認められた。中枢神経組織のSAは主として蛋白質に結合した状態で存在しており、そのSA濃度は加齢によって減少する傾向が認められ、結合蛋白質の生物学的機能に影響を与えていると考えられた。SAに富むアポEは脂質量の少ない未成熟なリポ蛋白に含まれており、SAの少ないアポEは脂質量が多いリポ蛋白に存在していたことから、アポE含有リポ蛋白中のSAは、中枢神経組織のリポ蛋白の粒子形成およびコレステロールの排泄機構をはじめとする脂質輸送の制御に関係していることが示唆された。髄液アポEのSA含有量は中枢神経組織における脂質代謝と密接に関わりながら、老人斑の形成にも関与していることが示唆された。今後これらのリポ蛋白とβ-アミロイドとの相互作用解析が課題である。
ＲｅｃＱヘリカーゼによるテロメア維持機構の構造研究

WRNタンパク質とBLMタンパク質は,RecQファミリーに属するDNAヘリカーゼで,ヒトのゲノムDNAを変異損傷から守る重要な役割を担っている。本研究では,BLMのヘリカーゼ活性に必須なBLM RQC(RecQ C-terminal)ドメインの構造研究に取り組んだ。その結果,X線結晶解析法により,同ドメインの立体構造を初めて決定することに成功した。RecQヘリカーゼが,巻き戻しの困難なDNA構造を解きほぐす仕組みについて,新しい知見を得ることができた。ウェルナー症候群とブルーム症候群は,常染色体劣性のまれな遺伝病である。発症の原因はそれぞれ,WRNヘリカーゼ(Werner syndrome protein)とBLMヘリカーゼ(Bloom syndrome protein)に変異が起こり,機能欠損してしまうことが原因である。WRNとBLMは,DNA巻き戻しのさいモーターとして働くATPaseドメインに加えて,C末に特徴的に保存されたRQC (RecQ C-terminal)ドメインとHRDCドメイン(helicase-and-ribonuclease D-C-terminal)を有している。今年度は,これらドメインを含むWRNヘリカーゼとBLMヘリカーゼの新たなタンパク質発現コンストラクトの作成を,重点的に進めた。タンパク質のN末側には,精製を効率的に進めるためのアフィニティータグglutathione-S-transferase (GST)を融合させた。タンパク質発現条件と精製条件を詳細に検討した結果,いくつかのタンパク質試料を大腸菌によって大量発現させ,高純度に精製することができた。精製のためのクロマトグラフィーには,GST融合タンパク質用アフィニティーカラム,イオン交換カラム,およびゲルろ過カラムを利用した。タンパク質やDNA試料の濃度調製には,分光光度計による吸光度測定の方法を用いた。これらの研究成果の一部は,アメリカで開催された国際学会で発表した。ウェルナー症候群の原因タンパク質WRN(Werner syndrome protein)とブルーム症候群の原因タンパク質BLM(Bloom syndrome protein)は,RecQファミリーに属するDNAヘリカーゼで,C末に特徴的に保存されたRQC(RecQ C-terminal)ドメインとHRDC(helicase-and-ribonuclease D-C-terminal)ドメインを有している。本年度は,BLMタンパク質RQCドメインのX線結晶構造解析を進めた。この結果,同ドメインにリン酸イオンが結合した状態のタンパク質立体構造を,分解能2.7オングストロームで決定することに成功した。これは,BLMヘリカーゼのDNA作用部位の立体構造を,世界で初めて明らかにした研究成果である。BLM RQCドメインは,結晶中で二量体を形成していた。溶液中でのBLM RQCドメインの挙動を調べるために,ゲルろ過クロマトグラフィー法,超遠心分析法,CDスペクトル測定法による分子形状の解析実験を行った。その結果,同ドメインは溶液中で,単量体として存在していることが明らかとなった。さらに,RQCドメインに結合しているリン酸イオンの位置を利用して,BLMヘリカーゼがDNAに作用している状態の立体構造モデルを,コンピュータを使って作成した。この複合体モデルを使って,RecQファミリーヘリカーゼが,テロメア領域などのDNAを巻き戻す仕組みに関して,新しい機構を提唱することができた。両患者の細胞には,テロメアの急速な短縮など,ゲノムDNAの不安定化が顕著に認められる。本研究では,WRN,BLM両タンパク質とDNAの複合体立体構造を決定し,テロメアDNA巻き戻しの仕組みを明らかにすることを目指す。今年度はまず,結晶化に用いるタンパク質ドメインを,大腸菌によって大量発現させ,クロマトグラフィーを用いて高純度に精製する作業を行った。同時にテロメア配列の一本鎖DNAを受託合成し,アニーリングによって結晶化用DNA試料を調製した。様々な組成のバッファー(緩衝液)を用いて,X線結晶構造解析に必要な結晶化条件の検索を行った。複合体の結晶はまだ得られていないものの,結晶化に有利に働くと考えられる条件の選定を進めることができた。また,2010年に研究代業者らがX線構造決定に成功した,三量体Gタンパク質と阻害剤YM-254890の複合体構造(Nishimura, A.*, Kitano, K.*, et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.;*Equallycontributed.)を用いた,新たな計算解析の研究も行った。WEB上のデータベースや,専用ソフトウェアを用いて阻害剤作用機構を調べた結果,YM-254890がくさびのようにタンパク質のドメイン間に挟まって,三量体Gタンパク質の運動を阻害するという,阻害剤作用の新しい仕組みを提唱することができた。この研究成果は,国内のふたつの研究会で発表した。

計画していた作業のうち,目的タンパク質の大腸菌を用いた大量発現,クロマトグラフィーによる高純度精製,そしてアニーリングによる結晶化用DNA試料の調製は,おおむね順調に進んでいる。ただし,WRNヘリカーゼやBLMヘリカーゼとDNAの複合体結晶は得られていない。ただし,複合体の結晶はまだ得られていない。長さや配列を変化させたDNA試料の調製と,新しい発現コンストラクトを用いたタンパク質試料の精製をおこなって,引き続き,結晶化条件の探索を進める。結晶が得られれば,兵庫県播磨市の大型放射光施設スプリング-8,または茨城県つくば市の高エネルギー加速器研究機構(KEK)に出張して,高輝度X線を利用したX線回折データ測定を行う予定である。引き続き,タンパク質試料の調製作業を行う。同時に,配列や長さを多様に変化させたDNAオリゴを合成することによって,より系統的な結晶化条件の探索を試みる。結晶が得られれば,ただちに,兵庫県の大型放射光施設スプリング-8,または高エネルギー加速器研究機構(KEK)に出張して,高輝度X線を利用したX線回折実験を行う予定である。未使用額が生じた要因は,結晶化実験の進捗状況に合わせて,予算執行計画を変更したことに伴うものである。今後,未使用額の研究費は,結晶化用および相互作用分析用のDNAオリゴの受託合成費,タンパク質の変異体作成・精製・結晶化実験・X線結晶解析に必要な消耗品の購入,スプリング-8または高エネルギー加速器研究機構(KEK)への国内旅費,学会で研究成果を発表するための国内および海外旅費,などに使用する予定である。未使用額が生じた要因は,結晶化実験の進捗状況に合わせ,予算執行計画を変更したことに伴うものである。今後,未使用額を含めた研究費は,タンパク質試料の調製に必要な生化学試薬や消耗品の購入,多種類のDNAオリゴの受託合成費,X線解析の作業に用いる消耗品の購入,スプリング-8または高エネルギー加速器研究機構(KEK)への国内旅費とビームライン使用料,国際学会で研究成果を発表するための海外旅費,などに使用する予定である。
精製オピオイド結合物質(受容体)のリポソーム膜への再構成とその性格付け

現在全く不明の,オピオイド受容体系でのトランスメンブレンコントロールの解明を目指し,エンケファリン類と親和性基とするアフィニティクロマトグラフィー法を用いて,オピオイドー結合物質(受容体)を精製し,更に精製受容体を抑制性GTP結合タンパク質(Gi)と共にリポソーム膜に再構成し,そのアゴニスト結合能について検討を加え,以下の結果を得た.1.アフィニティHPLCを用いた受容体の精製(Peptide Chemistry):Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leuを受容体に対する親和性基としたアフィニティHPLC用ゲルを開発した.このゲルを用いて,ラット脳より界面活性剤にて可溶化した受容体粗分画からオピオイド結合能を有する部分精製標品を得た.電気泳動的による分析では,数本のバンドが観測されたため,更に本標品をサイズ排除HPLCにて精製し,電気泳動的に単一な,分子量62,000のバンドを得た.2.精製受容体のリポソーム膜への再構成(生化学;投稿準備中):精製受容体を精製Giの存在下,または非存在下にリポソーム膜に再構成し, S-アゴニストとして知られる^3H-DADLEをラジオリガンドとして用いたラジオレセプターアッセイにより,リガンド結合能を測定した.その結果,精製受容体をGiの存在下でリポソーム膜に再構成した場合には,高親和性と低親和性の二相性の応答が見られたが, Gi非存在下では低親和性の応答のみが観測された.更に, Giと連関した受容体系で一般に見られるように, Gi共存下での再構成系において観測される高親和性の成分が,グアニンヌクレオチド類の添加によって低親和性へ移行することも確認された.本実験の結果より,我々の用いた精製標品が単なるオピオイド結合物質ではなく,オピオイド受容体そのものであり,しかも得られた受容体は, S-タイプであることが明らかとなった.また細胞膜中と同様に, S-タイプのオピオイド受容体がGiと連関し得ることを精製受容体を用いて初めて示した.現在全く不明の,オピオイド受容体系でのトランスメンブレンコントロールの解明を目指し,エンケファリン類と親和性基とするアフィニティクロマトグラフィー法を用いて,オピオイドー結合物質(受容体)を精製し,更に精製受容体を抑制性GTP結合タンパク質(Gi)と共にリポソーム膜に再構成し,そのアゴニスト結合能について検討を加え,以下の結果を得た.1.アフィニティHPLCを用いた受容体の精製(Peptide Chemistry):Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leuを受容体に対する親和性基としたアフィニティHPLC用ゲルを開発した.このゲルを用いて,ラット脳より界面活性剤にて可溶化した受容体粗分画からオピオイド結合能を有する部分精製標品を得た.電気泳動的による分析では,数本のバンドが観測されたため,更に本標品をサイズ排除HPLCにて精製し,電気泳動的に単一な,分子量62,000のバンドを得た.2.精製受容体のリポソーム膜への再構成(生化学;投稿準備中):精製受容体を精製Giの存在下,または非存在下にリポソーム膜に再構成し, S-アゴニストとして知られる^3H-DADLEをラジオリガンドとして用いたラジオレセプターアッセイにより,リガンド結合能を測定した.その結果,精製受容体をGiの存在下でリポソーム膜に再構成した場合には,高親和性と低親和性の二相性の応答が見られたが, Gi非存在下では低親和性の応答のみが観測された.更に, Giと連関した受容体系で一般に見られるように, Gi共存下での再構成系において観測される高親和性の成分が,グアニンヌクレオチド類の添加によって低親和性へ移行することも確認された.本実験の結果より,我々の用いた精製標品が単なるオピオイド結合物質ではなく,オピオイド受容体そのものであり,しかも得られた受容体は, S-タイプであることが明らかとなった.また細胞膜中と同様に, S-タイプのオピオイド受容体がGiと連関し得ることを精製受容体を用いて初めて示した.
フラボノイド輸送系の包括的解明と有用物質生産への応用

植物は20万種以上にも上る多様な二次代謝産物を生産するが、その中でもフラボノイドは7,000種以上の大きなグループであり、医薬品原料や機能性食品等として私たちの生活に重要な化合物も多く含まれる。しかし、これらの植物由来の有用物質は、含有量が少ない、希少植物由来である、精製が困難である等の理由により、安定供給には大きな障害がある。本研究では植物におけるフラボノイドの細胞外やプラスチドへの輸送体を明らかにすることにより、形質転換体を用いた有用フラボノイド安定生産系の構築を目指した。植物は多様なフラボノイドを生合成する。フラボノイドはヒトの健康維持に重要であるのみならず、植物において病原菌からの防御や根粒菌との共生に機能する。フラボノイドの生合成や生理機能の発現には、細胞内外の適切な場所への輸送が重要であるが、その輸送メカニズムはほとんど未解明である。本研究では、ダイズのフラボノイド輸送系をモデルとして、フラボノイド輸送の包括的解明を目的とする。本年度は生化学的輸送解析からダイズの主要イソフラボンアグリコンであるゲニステインを輸送することが示唆されたABC輸送体のフルサイズGサブファミリーに着目した。ダイズゲノム中に見いだされた40分子種について、病原菌(Phytophthora sojae、Pseudomonas syringae、Xanthomonas campestris)感染条件、根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)感染、ホルモン処理、窒素欠乏条件において、RT-PCR及びリアルタイムPCRにより詳細な発現解析を行った。その結果、ダイズファイトアレキシンであるグリセオリン誘導と同調的に発現する遺伝子やイソフラボン分泌の上昇する窒素欠乏条件で誘導される遺伝子が見出された。これらについて全長cDNAのクローニングと発現ベクター構築を行った。プラスチドへの輸送体を見出すため、プラスチドに局在するフラボノイドのプレニル化酵素遺伝子と同調的に発現する輸送体遺伝子をスクリーニングし、候補遺伝子を見出した。さらに、輸送体の生化学的解析系の条件検討を行うとともに、トマトの形質転換体の解析を進めた。本年度は病原菌、根粒菌、メチルジャスモン酸処理、窒素欠乏条件での発現変動が顕著なABCGサブファミリー7種類の輸送体に着目し、タバコBY-2細胞、形質転換タバコを作出して、ベシクル輸送解析を進めた。現在のところ目的の遺伝子は得られていないが、効率的なベクター構築系を導入しスクリーニングを進ている。フラボノイド分泌の生長過程、栄養条件での変動を明らかにし論文発表を行った。さらに、RNA-seq解析を行い細胞膜型、プラスチド型輸送体の発現変動を包括的に解析した。またトマトや微生物での有用フラボノイド生産に向けて新たな遺伝子を単離した。研究計画に従って輸送体のスクリーニングと解析を進めている。候補遺伝子を効率的に解析する系を確立したことと、RNA-seqによる網羅的解析によりプラスチド型輸送体候補遺伝子を見出しているが、輸送活性が生化学的には証明されていないため、この部分は計画よりも遅れているが、分泌解析や有用遺伝子の単離等での進展が大きいため、全体としては概ね順調と考えている。植物は20万種以上にも上る多様な二次代謝産物を生産するが、その中でもフラボノイドは7,000種以上の大きなグループであり、医薬品原料や機能性食品等としてヒトの健康維持に役立つ有用な化合物も多く含まれる。しかし、植物由来の有用物質は、含有量が少ない、希少植物由来である、精製が困難である等の理由により、安定供給には大きな障害がある。そのため、代謝工学により形質転換生物を用いた安定生産が試みられてきたが、実用化された例はほとんどない。イソフラボンは健康維持に重要な物質であるが、ダイズ植物において、抗菌性イソフラボンのグリセオリンは病原菌の感染を防御するファイトアレキシンとして機能し、ゲニステインやダイゼインは根から分泌され根粒菌へのシグナルとして機能する。フラボノイドの生合成や生理機能の発現には、細胞内・細胞外の適切な場所への輸送が重要であるが、植物におけるフラボノイド輸送は液胞への蓄積に関与する輸送体以外明らかになっていない。本研究ではフラボノイド分泌型輸送体及びプラスチド型輸送体の単離と機能解析を目的とし、これらを利用した効率的な有用物質生産系の構築を目指した。今年度はダイズのRNA-seq解析により候補遺伝子を絞り込み、全長遺伝子の単離とこれを発現する形質転換タバコの作出を行った。また、プラスチド型輸送系のモデル基質としてアデニン及びホモゲンチジン酸を用い、プラスチドへのエネルギー依存的な輸送系を明らかにした。さらに有用物質生産に資するフラボノイドプレニル基転移酵素遺伝子を新たに同定した。

本研究では植物におけるフラボノイドの細胞外やプラスチドへの輸送体を明らかにすることにより、形質転換体を用いた有用フラボノイド安定生産系の構築を目指した。初年度に計画していた遺伝子の探索とベクター構築を進めた。生化学的輸送実験ではNicotiana benthamianaの系で、ベシクルが形成されないという問題があったため、計画よりも遅れている部分はあるが、BY-2培養細胞を用いた解析系を確立したため、全体としては概ね順調に進展していると考えている。「フラボノイド輸送系の包括的解明と有用物質生産への応用」を目標に研究を進める。計画より遅れている輸送体スクリーニングを重点的に行うとともに、有用物質生産を目指して新たに単離した遺伝子の解析や生産系の確立を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。応用生物化学研究計画に従って、フラボノイド輸送体の包括的理解と有用物質生産への応用を目標に研究を進める。平成27年度は特に異種発現系でのABCG輸送体の機能解析を重点的に行い、基質特異性や種々の輸送特性の解析を行う。また、新たな形質転換体の作出と解析を進め、代謝輸送工学的研究を推進する。実験に使用する消耗品が予定よりも少なかったため残額が生じた。計画に沿って消耗品購入のため使用する。
N-アミジノ含窒素環状骨格を基盤としたBACE1阻害剤の開発研究

申請者は、新たに考案したN-アミジノ含窒素環状骨格を基盤とした新規低分子βセクレターゼ(BACE1)阻害剤の開発研究を行った。アミジノピロリジンとアミジノピペリジンの2種類の骨格について、それぞれいくつかの誘導体の合成に成功し、得られた誘導体のBACE1阻害活性を評価した結果、(a)置換基がかさ高いこと、(b)置換基の相対立体配置がtransであること、が活性発現に有効であることを示唆する知見を得ることができた。申請者は、アルツハイマー病根本治療薬の開発を最終目標として、新規低分子βセクレターゼ(BACE1)阻害剤の開発に着手した。本年度は、研究実施計画に基づき(1)アミジノピロリジン型BACE1阻害剤の開発研究と、(2)アミジノピペリジン型BACE1阻害剤の開発研究を行った。(1)アミジノピロリジン型BACE1阻害剤の開発では、ヒドロキシプロリンを出発原料として、(a)カルボン酸へのアミンの縮合によるR1基の導入、(b)光延反応を用いた水酸基へのR2基の導入、(c)環上窒素原子へのアミジノ基の導入、の3段階の工程によりR1、R2が異なるいくつかの誘導体を合成した。また、出発原料のD-ヒドロキシプロリンへの変更や、光延反応による水酸基の立体反転を行うことで、立体配置の異なるジアステレオマー/エナンチオマーの合成も行った。続いて、得られた誘導体のBACE1阻害活性を評価したところ、R1、R2にかさ高い置換基を導入した誘導体が弱いながらもBACE1阻害活性を示すことを見出した。(2)アミジノピペリジン型BACE1阻害剤の開発では、アラニンを出発原料として誘導した環化前駆体に対して、所属研究室で開発したPd触媒を用いたジアステレオ選択的環化反応を用いて2,6-cis-二置換ピペリジン骨格の構築を行い、環上窒素原子へのアミジノ基の導入、及び側鎖への置換基の導入を行うことで各種誘導体を合成した。また、合成法を変更することで2,6-trans-二置換ピペリジン骨格の構築にも成功している。これまでに得られた誘導体では十分なBACE1阻害能を有する化合物は見出せなかったが、各誘導体間で活性の値に差が生じていることから、適切な置換基を選択することができればアミジノピペリジン骨格も有用な母骨格になりうると考えている。「研究目的」に記載した、(1)「アミジノピロリジン型BACE1阻害剤の開発」については、本年度の研究において弱いながらもBACE1阻害活性を示すアミジノピロリジン骨格を有する誘導体を見出すことに成功した。また、多少制限はあるものの当初予定していた合成法を応用することで、ジアステレオマー/エナンチオマーも含めた各種誘導体の合成が可能であることを見出しているため、更なる構造最適化研究もスムーズに遂行できるものと考えている。研究目的(2)「アミジノピペリジン型BACE1阻害剤の開発」に関しては、本年度の検討では十分な活性を有する化合物を見出すことは出来なかったが、置換基の構造により誘導体間で活性の差があることを明らかにしており、アミジノピペリジン骨格の新規母骨格としての可能性を示すことができた。また、立体の異なる誘導体の合成法を確立することができたことから、今後はより多様な誘導体合成が可能になるため、更なる高活性化合物の探索を効率的に遂行することができると考えている。以上の点から、本年度の研究はおおむね順調に進行したと判断した。本年度は、昨年度から引き続き(1)アミジノピロリジン型BACE1阻害剤の開発研究と、(2)アミジノピペリジン型BACE1阻害剤の開発研究を行った。(1)アミジノピロリジン型BACE1阻害剤の開発では、昨年度の検討から、(a) R1、R2がtrans-配置であること、(b) R1、R2がかさ高いこと、が活性発現に重要であることが示唆されたことから、これらの知見に基づき更なる構造活性相関研究を行った。具体的には、R1 = 2-ビフェニル、3-ビフェニル、1-ナフチル、3-ブロモフェニル、R2 = 2-ナフチルメチル、3-ビフェニルメチルに関して、これらを組み合わせた誘導体を、昨年度確立した合成法を利用して合成した。現在、得られた誘導体のBACE1阻害活性評価を進めている段階であり、活性評価の結果に基づき、更なる構造最適化を行う予定である。(2)アミジノピペリジン型BACE1阻害剤の開発では、昨年度の検討において、ピロリジン型と同様にかさ高い置換基が活性発現に有効であることが示唆されていたが、得られた誘導体では十分なBACE1阻害能を有する化合物は見出せていなかった。本年度は、2つの置換基がtrans-配置の構造に合成目標を変更し、昨年度確立した2,6-trans-二置換ピペリジン骨格の構築法を利用することでいくつかの誘導体の合成を行った。現在、得られた誘導体のBACE1阻害活性評価を進めている段階であり、並行してより簡便に合成可能な2,6-cis-二置換ピペリジン骨格合成を応用した誘導体合成法の検討を行っている。

アミジノピロリジンとアミジノピペリジンの2種類の骨格について、それぞれいくつかの誘導体の合成に成功し、得られた誘導体のBACE1阻害活性を評価した結果、(a)置換基がかさ高いこと、(b)置換基の相対立体配置がtransであること、が活性発現に有効であることを示唆する知見を得ることができた。(1)アミジノピロリジン型BACE1阻害剤の開発研究では、かさ高い疎水性置換基を中心にR1、R2に種々置換基を導入した誘導体を合成し、高活性化合物の探索を進める。また、これと並行して立体の異なる誘導体も合成し、活性評価を行うことで、活性立体配置の同定を行う。100 μM以下のIC50値を示す化合物については、BACE1との共結晶を作成し、X線結晶構造解析を行うことで結合構造を同定する。得られたデータを基に新たな分子設計を行うことで、研究の効率化を図る。(2)アミジノピペリジン型BACE1阻害剤の開発研究では、(1)の結果を参考にしてかさ高い疎水性置換基を中心に誘導体合成を進め、高活性化合物の探索を行う。ドッキングシミュレーションを用いた結合予測では、cisよりもtrans配置の2,6-二置換ピペリジン骨格のほうがBACE1のポケットに対してよりよい結合を示すことから、2,6-trans-二置換ピペリジン骨格を主軸に誘導体合成を行うことを計画している。(3)アミジノアザデカリン型BACE1阻害剤の開発研究では、(1)、(2)で得られる置換基構造や距離情報を基にドッキングシミュレーションを組み合わせることで、より効率的な分子設計を行い、新規骨格を有するBACE1阻害剤の開発に取り組む。本項目では、置換基の検討箇所をR1基のみに限定しているため、比較的短い期間で誘導体合成を行うことが可能であると考えている。創薬科学本年度の研究では、(1)「アミジノピロリジン型BACE1阻害剤の開発」及び、(2)「アミジノピペリジン型BACE1阻害剤の開発」の両者において、各種誘導体の合成法の確立を主軸に研究を遂行し、当初予定していたほどの大規模な活性評価試験を行わなかったため、それらに関する支出が抑えられた結果、次年度使用額が生じた。本年度の研究により確立した合成法を用いて、各種誘導体の合成を行い大規模な活性評価試験を行う。次年度使用額は、当初の予定通りこれら活性評価試験に関する費用として使用する。翌年度分として請求した助成金は、得られた高活性誘導体の構造解析及び、(3)「アミジノアザデカリン型BACE1阻害剤の開発」のための費用として使用する。
相分離RNPナノ構造体の構築・設計原理の解明

細胞に多数存在する長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)の中で一群のものは、相分離構造体構築のための骨格として機能する。このようなlncRNAは生理的に非常に重要な機能を持つ例が多く報告されている。しかし、このような構造体の性状がどのようにlncRNAによって規定されているかは明らかではない。そこで、その性状決定機構ならびにその設計原理を明らかにすることで、RNAによる相分離構造体形成の根幹をなす分子原理を解き明かす。
モアノミン作動性神経間クロストークの機能・形態構築と異種受容体発現メカニズム

モノアミン作動性神経は放散的シナプス構造を呈し、異種受容体(ヘテロレセプター)を介する、相互の調節機構の在在が知られている。これら放散的モノアミン作動性神経系はどのような順序で相互シナプスを形成していくのか、またそれらシナプスははどのような機能を有しているのか明らかにすることを目的とした。ノルアドレナリン(NA)受容体によるセロトニン(5-HT)遊離調節機構が存在する海馬において、α2受容体の受容体蛋白のmRNAは5-HTの最大の神経核である背側縫線核にその発現が認められ、5-HT作動性神経終末にα受容体が発現することを遺伝子レベルで明らかにした。また、背側縫線核から5-HT作動性神経が投射する皮質前頭前野において、DA遊離に5-HT6受容体および5-HT1B受容体を介する調節システムが存在することを明らかにした。すなわち、内因性5-HTを皮質前頭前野において再取り込み阻害薬fluoxetineで増加させると、細胞外液中のDA濃度が上昇した。そしてこの上昇は5-HT6受容体mRNAのアンチセンスを投与したラットで一部減弱し、さらに5-HT1B受容体拮抗薬で完全に抑制された。以上のことは、海馬では5-HT作動性神経に後からNA作動性神経がシナプスを形成していくこと、また、皮質前頭前野ではDA作動性神経に5-HT作動性神経がシナプスを形成していくことを示すものである。系統発生学的事実より、5-HT作動性神経の伝達物質遊離調節機構として、DAおよびNA作動性神経がどのような順序でシナプスを形成していくのか、また神経はどのようにして、何を目標として到達すべき神経へと向かうのか。本研究では5-HT、DA、NA三者間の胎生期を含めた発生・発達過程におけるシナプス形成順序を捉えることを目的とした。平成9年度には5-HT異種受容体(ヘテロレセプター)蛋白の発現機構を薬理学的、分子生物学的アプローチにより明らかにすることを主眼においた。NA受容体による5-HT遊離調節機構が存在する海馬において、α_2受容体の受容体蛋白のmRNAは5-HTの最大の神経核である背側縫線核にその発現が認められた。これは5-HT作動性神経終末にα受容体が発現することを遺伝子レベルで明らかにしたものである。したがって、機能的にその存在が示唆されていた5-HT作動性神経終末のα受容体を介する5-HT遊離調節機構の存在を裏付けるものである。おそらく、α受容体蛋白遺伝子はNAという神経伝達物質を獲得した後に5-HT作動性神経が獲得したと思われ、この問題については次年度は明らかにされることが期待される。セロトニン(5-HT)などのモノアミン作動性神経は放散的、かつ広館囲に分布しており、異種受容体(ヘテロレセプター)を介する、相互の調節機構の在在が知られている。モノアミン作動性神経のなかで、5-HT作動性神経が系統発生学的に最も古く、原生動物からその存在が確認されている。したがって、この5-HT作動性神経系に異種のモノアミンを伝達物質とする調節系が進化の過程で参入したとすると、5-HT神経終末部に新たなシナプスを形成するとする仮説が成り立つ。では、このようなモノアミン作動性神経間の形態形成ならびに機能構築はいつどのようにしてなされるのだろうがか。系統発生学的事実より、5-HT作動性神経の伝達物質遊離調節機構として、ドパミン(DA)およびノルアドレナリン(NA)作動性神経がどのような順序でシナプスを形成していくのか、また神経はどのようにな機能をゆうしているのか明らかにすることを目的とした。NA受容体による5-HT遊離調節機構が存在する海馬において、α2受容体の受容体蛋白のmRNAは5-HTの最大の神経核である背側縫線核にその発現が認められた。

したがって、機能的にその存在が示唆されていた5-HT作動性神経終末のα受容体を介する5-HT遊離調節機構の存在を裏付けるものである。おそらく、α受容体蛋白遺伝子はNAという神経伝達物質を獲得した後に5-HT作動性神経を獲得したと考えられた。また、皮質前頭前野におけるDA遊離調節機構に5-HT6受容体および5-HT1B受容体を介するシステムが存在することを明らかにした。
チタニアコーティングによる各種チタン合金の高生体活性化とそのメカニズムの解明

先行研究の成果から,基材としてTi-29Nb-13Ta-4.6Zr(TNTZ)を使用する場合,必ずしもチタニアコーティングによって骨伝導性が向上するわけではないこと,ならびに純Tiの場合と同様にTNTZ基材表面の親水性が骨伝導性に影響する可能性が示唆された.そこで,TNTZに対して,純Tiの親水化処理として極めて有効であった水熱処理を施し,その効果を検討するとともに,Nb,Ta,ZrなどのTi以外のバルブ金属に対しても水熱処理を施し,動物内埋植試験の結果と合わせることで,異なる金属材料表面における親水性と骨伝導性との関係について検討した.TNTZにおいては,陽極酸化処理の有無にかかわらず,水熱処理(453Kの蒸留水中に試料を180min.浸漬)を施すことで,大気中で1d保持した後の水滴接触角が15deg.以下まで大きく低下し,さらに試料を成膜直後にリン酸緩衝生理食塩水(PBS(-)中に保存することで,水滴接触角が5deg.以下の超親水性表面を形成することが可能であった.また,Nb,Ta,Zrの単体金属においても,同条件の水熱処理ならびにPBS(-)中保存によって,水滴接触角が5deg.以下の超親水性表面の形成が可能であり,金属種の違いによる親水性の違いは認められなかった.以上のことから,これらのバルブ金属およびその合金に対しては,水熱処理による表面親水化が可能であることが見出された.超親水化させたTNTZ,Nb,Ta,Zrを動物内埋植試験に供した場合,いずれもきわめて高い骨伝導性を示したことから,Tiだけでなく,TNTZ,Nb,Ta,Zrなどのバルブ金属で構成された材料においても,高い親水性を付与することで,骨伝導性を大きく向上させることが可能なことが示された.本年度は,陽極酸化によってβ型Ti合金のTi-29Nb-13Ta-4.6Zr(TNTZ)およびTi-13Cr-1Fe-3Al(TCFA)の骨伝導性を向上させることを念頭に,まず骨伝導性の向上に有効な平滑表面を維持しつつ,アナターゼ(anatase)皮膜を成膜する条件を検討した.TCFAでは平滑なanatase皮膜を成膜することができなかったが,TNTZでは,0.1M H_2SO_4水溶液中で,印加電圧が150Vの時に表面の平滑なanatase皮膜を成膜することができた.しかし,その骨伝導性は高くなく,同様のanatase皮膜をTi表面に成膜した場合とは異なる傾向を示した.その原因を調べるために,皮膜の親水性を評価したところ,水滴接触角は60(deg.)程度を示し,Ti表面に作製したanatase皮膜の骨伝導性に関する先行研究で示された,骨の生成しにくい表面における水滴接触角と一致することが分かった.そこでNb,Ta,Zrの単体金属,ならびに各合金元素とTiとの2成分系合金を用いて,TNTZ表面に成膜したanatase皮膜の親水性におよぼす合金成分の影響を検討したところ,TNTZ合金中に多く含まれるNbの酸化物が,TNTZの陽極酸化皮膜の親水性を低下させることが示唆された.以上を総括すると,平滑表面を有する場合,合金においても親水性が骨伝導性に強く影響することが明らかとなり,今後は親水性を軸とした表面設計を検討する必要性が示唆された.また,表面平滑化とは逆行するものの,純Tiにおいて骨伝導性の向上に効果のあることが確認された高濃度(>3M)H_3PO_4水溶液中でのスパーク陽極酸化をTNTZ,TCFAにも試みた.いずれの合金においても,多量のPO^<3->_4を含有するanatase皮膜が生成し,TCFAの骨伝導性はTiと同様に大きく向上するものの,TNTZの骨伝導性はわずかに向上するのみであった.このとき,TNTZ表面には合金成分が存在し,TCFA表面には合金成分はほとんど存在しないことまで分かっているが,その影響については現在研究を進めている段階である.先行研究の成果から,基材としてTi-29Nb-13Ta-4.6Zr(TNTZ)を使用する場合,必ずしもチタニアコーティングによって骨伝導性が向上するわけではないこと,ならびに純Tiの場合と同様にTNTZ基材表面の親水性が骨伝導性に影響する可能性が示唆された.そこで,TNTZに対して,純Tiの親水化処理として極めて有効であった水熱処理を施し,その効果を検討するとともに,Nb,Ta,ZrなどのTi以外のバルブ金属に対しても水熱処理を施し,動物内埋植試験の結果と合わせることで,異なる金属材料表面における親水性と骨伝導性との関係について検討した.TNTZにおいては,陽極酸化処理の有無にかかわらず,水熱処理(453Kの蒸留水中に試料を180min.浸漬)を施すことで,大気中で1d保持した後の水滴接触角が15deg.以下まで大きく低下し,さらに試料を成膜直後にリン酸緩衝生理食塩水(PBS(-)中に保存することで,水滴接触角が5deg.以下の超親水性表面を形成することが可能であった.また,Nb,Ta,Zrの単体金属においても,同条件の水熱処理ならびにPBS(-)

中保存によって,水滴接触角が5deg.以下の超親水性表面の形成が可能であり,金属種の違いによる親水性の違いは認められなかった.以上のことから,これらのバルブ金属およびその合金に対しては,水熱処理による表面親水化が可能であることが見出された.超親水化させたTNTZ,Nb,Ta,Zrを動物内埋植試験に供した場合,いずれもきわめて高い骨伝導性を示したことから,Tiだけでなく,TNTZ,Nb,Ta,Zrなどのバルブ金属で構成された材料においても,高い親水性を付与することで,骨伝導性を大きく向上させることが可能なことが示された.これまでは材料が骨伝導性を発現するメカニズムが明らかではなく,どのような表面が骨伝導性を示すかが不明確であったが,表面粗さや親水性が骨伝導性に強く影響することが明らかとなり,今後の表面設計の指針が見出せたため.●これまでとは異なる試みとして,陽極酸化以外の方法で,TNTZおよびTCFA合金表面を親水化するための表面処理法を検討する.具体的には,水熱処理,プラズマ照射,紫外線照射を用いた親水化を検討している.●本年度に引き続き,TCFA合金の最適な陽極酸化処理法を検討する.特に,TNTZ合金とは異なり,酸化条件によって皮膜表面における膜組成が大きく変化することから,合金成分量の少ない表面を有する酸化皮膜の創製を試みる.
オゾン水による湖沼アオコ無農薬防除システムの試作研究

アオコ現象は夏季において、日照量の増加、水温の上昇、湖沼水の富栄養化などの条件が整うことで植物プランクトン(特にラン藻類)が大繁殖し、湖面に集積することで起こる。農業排水は富栄養化の原因の一つといわれている。アオコ現象の被害としては、水質汚濁・悪臭・浄水施設の機能障害などがあげられる。現在のアオコ駆除の手法としては、集積した細胞を物理的に除去する方法と細胞の生育を妨げる方法があるが、さらに効率的な手法の開発が望まれている。本研究では、酸化力の強い気体であるオゾンにより細胞を破壊することで、盛夏での細胞数を抑制する手法を提案し、その実用性を見るものである。オゾン通気殺藻処理実験における細胞数の変動では、反応時定数が0.110.14となり、それぞれが同様の反応であることが分かった。このため、細胞が低濃度で存在する状況でも、オゾン施用により細胞数を減少させることが可能であり、アオコの早期防除を行うことができると考えられる。次に、画像中心の縦・横100ピクセル四方の選択範囲内のRGB成分を256段階の輝度に分割してヒストグラム化し、色の評価に用いた。画像の色情報を用いて細胞数・殺藻数を簡便に評価する手法の開発をおこなった。輝度60110の成分が細胞の存在により増大することが分かった。殺藻処理時のblue成分および細胞数の経時変化をFig.5に示す。双方のデータが同様の変化を見せているため、画像のblue成分により細胞数を評価することが可能であると考えられる。夏季の湖沼においてラン藻類が大繁殖し、水面を青く染めるアオコ現象の発生が全国的に広くみられる。本年度はオゾンによるアオコ駆除特性を定量的に評価するための実験を行った。ラン藻類として、Micrasterias crux-melitensis Ralfsの純粋株を、塩類を加えたMA倍地上で、25°C、2000lxの条件において培養した細胞を用いた。オゾン発生器からのオゾン・酸素混合気体を、1リットルビーカー内の試料溶液に通気し、10分間隔で400μlをサンプリングし、位相差顕微鏡でノイバウエル血球計算盤を用いて、1×10^<-4>ml中の細胞数をカウントした。測定の結果、アオコ状態(1.0×10^7cells/ml程度)にある試料溶液でも、オゾン量が300mg/l以上のオゾン・酸素混合気体を約2時間通気することで完全に駆除できることが分かった。また、低濃度のオゾン・酸素混合気体でも細胞数を減少させることができるため、本来の目的である早期防除的施用に十分に対応できることが分かった。

オゾン発生器からのオゾン・酸素混合気体を、1リットルビーカー内の試料溶液に通気し、10分間隔で400μlをサンプリングし、位相差顕微鏡でノイバウエル血球計算盤を用いて、1×10-4ml中の細胞数をカウントした。16試験区(1試験区あたりの平均細胞数が5個以下の場合には64試験区)でのデータを平均し、その試料溶液の細胞数とした。スチレンボードにより周囲を覆った暗条件のもとで、インバータ-タイプの蛍光灯を光源として透過光を観測した。20分ごとに試料溶液をビデオカメラにより撮影し、ビデオカメラからのNTSC画像をPIASでRGBに分解する。次に、画像中心の縦・横100ピクセル四方の選択範囲内のRGB成分を256段階の輝度に分割してヒストグラム化し、色の評価に用いた。画像の色情報を用いて細胞数・殺藻数を簡便に評価する手法の開発をおこなった。アオコ現象は夏季において、日照量の増加、水温の上昇、湖沼水の富栄養化などの条件が整うことで植物プランクトン(特にラン藻類)が大繁殖し、湖面に集積することで起こる。農業排水は富栄養化の原因の一つといわれている。アオコ現象の被害としては、水質汚濁・悪臭・浄水施設の機能障害などがあげられる。現在のアオコ駆除の手法としては、集積した細胞を物理的に除去する方法と細胞の生育を妨げる方法があるが、さらに効率的な手法の開発が望まれている。本研究では、酸化力の強い気体であるオゾンにより細胞を破壊することで、盛夏での細胞数を抑制する手法を提案し、その実用性を見るものである。オゾン通気殺藻処理実験における細胞数の変動では、反応時定数が0.110.14となり、それぞれが同様の反応であることが分かった。このため、細胞が低濃度で存在する状況でも、オゾン施用により細胞数を減少させることが可能であり、アオコの早期防除を行うことができると考えられる。輝度60110の成分が細胞の存在により増大することが分かった。殺藻処理時のblue成分および細胞数の経時変化をFig.5に示す。双方のデータが同様の変化を見せているため、画像のblue成分により細胞数を評価することが可能であると考えられる。