hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノ随伴ウイルスを利用した疲労調節因子を中心とする疲労分子機構の解明

疲労調節因子が疲労負荷時において動物の疲労行動を本当に制御しているのかを決定し、疲労行動、代謝異常、および組織炎症との関係性を明確にすることを目指した。また、疲労負荷が生体組織(肝組織)の微細構造形態に与える影響を最新型の走査型電子顕微鏡技術により網羅的に調べ、組織オミックス解析「マイクロモルフォミクス」の構築を実現した。慢性疲労症候群(CFS)は、原因不明の強い全身疲労倦怠感などが長期間に渡り継続する原因不明の病態である。CFS患者と同様な代謝病態を示す疲労モデル動物を利用した病態解析により、疲労時にはエネルギー産生の低下に加え、疲労調節因子が、疲労時に特異的な代謝回路や組織の炎症反応を制御していることが予測された。当研究では、疲労調節因子が、CFS疾患に類似な、動物の疲労行動を本当に制御しているのかを決定するために、以下の研究を実施する。まず、疲労調節因子の遺伝子を各臓器に恒常発現させたモデル動物を作製し、疲労行動、代謝異常、および組織炎症との関係性を明確にする。次に、疲労調節因子、および代謝病態の機能制御が、疲労病態の改善や予防に資するかを解明する。上記の研究を展開することにより、疲労調節因子が疲労病態を生み出す責任分子であることを証明でき、CFS疾患のような疲労病態の改善や予防への一助となるものと考えられる。当年度では、疲労調節因子の遺伝子断片を含むAAVベクターのプラスミドを設計し、DNAクローニングなどによって目的のAAVベクターを得た。AAVベクターは、大腸菌Stbl3を用い、種々の条件(大腸菌培養条件、およびプラスミド抽出条件等)を検討することによって、大量産生、および高純度精製に成功した。今回、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するAAV(AAV-GFP)をポジティブコントロールとして、動物へのAAVの感染実験を行ない、肝臓での高効率での感染を確認した。当研究では、ベクターの免疫原生が低く、動物個体への遺伝子導入に適している理由から、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを利用した遺伝子導入実験を試みた。疲労調節因子の遺伝子断片を含むAAVベクターのプラスミドを設計し、DNAクローニングなどによって目的のAAVベクターを得た。AAVベクターは、大腸菌Stbl3を用い、種々の大腸菌培養条件、およびプラスミド抽出条件等を検討することによって、AAVベクターの大量産生、および高純度精製に成功した。すでに、複数回の動物実験に十分量のAAVベクターの取得にも成功している。今回、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するAAV(AAV-GFP)をポジティブコントロールとして、動物へのAAVの感染実験を行なった。AAVベクターを、ヘルパーベクターなどとともにヒト胎児腎細胞HEK293にトランスフェクションし、約3日間細胞培養を行い、ウイルス精製などのプロセスを経て、目的とするAAV-GFPを取得した。AAV-GFPを動物の尾静脈より投与し、各臓器への感染性を調べた。その結果、投与後1ヶ月の肝臓において、強いGFP蛍光が観察され、マウス1個体あたり1千億ウイルスの投与濃度で、50%前後の肝細胞への感染が確認された。本研究では、疲労調節因子が、原因不明の強い全身疲労倦怠感など長期間に渡り継続する慢性疲労症候群に類似な、動物の疲労行動を制御しているのかを決定することを目指した。今年度は、疲労調節因子遺伝子の1つであるHIF-1αを対象に、その遺伝子断片を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターのプラスミドを設計し、DNAクローニングなどによって目的のAAVベクターを得た。そのAAVベクターを用いて各臓器に恒常的に遺伝子発現させたモデル動物の作製を検討しており、さらに、疲労行動、代謝異常、および組織炎症との関係性を明確にする実験も行っており、それらとの関係性も分かりつつある。また、本研究の派生的なテーマとして、疲労調節因子の活性化などを惹起する、疲労負荷による組織微細形態に与える影響を調査するために、疲労負荷動物の肝組織において、その微細構造の変化を最新型の走査型電子顕微鏡技術により網羅的に調べる試みも実施した。この取り組みでは、「組織微細構造情報の総体(モルフォーム)」を通して、疲労病態を網羅的に理解することを目指した。また、このような網羅的な組織科学的手法によって画像ビッグデータを取得する方法論は、生命科学分野において「モルフォミクス(Morphomics)」と言われ、新たなオミックス研究領域の1つとなりつつある。今回、得られた組織微細構造の画像ビッグデータを詳細に解析することで、ミトコンドリアの変形などを含む、疲労時特有の様々な形態学的な変化が確認された。さらに、微細構造画像データに対して、実験条件や表現型データなどを記述することが可能なオントロジー(共通語彙)を提案し、モルフォミクス解析によって得られた画像データを公開・共有・検索するプラットホームの構築が達成されつつある。現在、疲労調節因子の遺伝子を発現するAAVを使用して、動物への感染実験を実施し、各種代謝物の測定、遺伝子発現解析、動物行動解析による疲労度評価などを行なう予定である。

AAV感染後に、疲労行動、および疲労代謝現象が観察された場合には、各種阻害剤(バルプロ酸など)を使用して転写シグナル系、あるいは代謝経路の阻害実験を行い、疲労調節因子と疲労行動との関係性を探る研究を進める。疲労科学
ペリーのアメリカにおける視覚的身体とジェンダー

アメリカで1840年から43年にかけて作られたダゲレオタイプ・イメージは、技術的に発展途上であったにもかかわらず、その後のイメージにはない存在感を被写体に感じる.これは、ダゲレオタイプがヴァーチャル・テクノロジーであり、取られる人物が自分を投げかける意識を持っていたからである.1850年代以降、ダゲレオタイプは写真ビジネスとして拡大し、その中で被写体の役割が消失し、ジェンダーを付与されるようになった.アメリカで1840年から43年にかけて作られたダゲレオタイプ・イメージは、技術的に発展途上であったにもかかわらず、その後のイメージにはない存在感を被写体に感じる.これは、ダゲレオタイプがヴァーチャル・テクノロジーであり、取られる人物が自分を投げかける意識を持っていたからである.1850年代以降、ダゲレオタイプは写真ビジネスとして拡大し、その中で被写体の役割が消失し、ジェンダーを付与されるようになった.研究目的:ペリーの日本来航の前後(18401860年)における文化が、イラストや写真において、どのように表象されているか、また発刊年、雑誌の種類、題材(被写体)によって、いかなる差異が現れているかについて、全体を把握する。また、日本人や文化についても、取り上げられ方や表現を見る。研究方法:(1)絵についてはHarper's New Monthly Magazine vol.124全巻について、イラストを中心として、記事内容も含め考察を行なった。ロチェスター大学図書館において調査を行い、1850年代前後の雑誌文献について研究した。これらにあわせ、女性向け雑誌も調査し、比較を行なった。(2)写真については、ジョージ・イーストマン・ハウス国際写真博物館およびボストン・アセーニアムで調査し、ダゲレオタイプを中心として検証した。また、発明当時の写真撮影について技術的側面も学んだ。研究成果:雑誌におけるイラスト数の割合が、年を追うごとに高くなっていることが分かった。女性向け雑誌および、同じ雑誌の中でも女性をターゲットとした項目のイラストは、一般向け(男性向け)のものと身体の表象に差が見られることが明らかになった。題材によっても描き分けられている。日本人については、ペリー前後で多くの雑誌で取り上げられており、スケッチの他、写真から絵を起こしていることも分かった。写真技術については、1840-60年代で、質の良い写真を撮影と、それを残すことが、具体的にいかに困難であるかを認識した。また、写真の比較により、被写体とともに時間や時代が空気として写し込まれている表現と、その技術的可能性を理解した。19年度は,アメリカにおける身体表象とジェンダー研究として,アメリカン・ガールプレイスの人形ビジネスについて研究をまとめ,成果として論文を発表することかできた。女児と母親および人形について,人種・ジェンダー・階級の搾取と言う視点から論じることができた。日本でアメリカン・ガール・プレイス茎について取りよばた研究は初あてであろうと思われ,またアメリカでも研究が広がっていないが,人形がアメリカ社会に影響を及ぼしている現象となっていることから,意義がある成果であると思う。人形に関する歴史的研究を進る過程で,19世紀アメリカにおいて子供を扱った写真や絵画,母親と子供を描いたもの,子供を人形と一緒に描いたものが見られることも確認できた。19世紀の身体表象については,Godey's Lady's Book,Graham's Magazine,Harper's Monthly Magazine,Phrenological Journalなどで描かれている,人物の表情,仕草,役割について比較検証した。多くの雑誌では,収録されている物語や逸話とともに。女性と愛を結びつけるように描いていた.1850年代の写真と雑誌におけるイラストの比較では,写真との役割の違いを確認した。写真は媒体としては発展段階なため,稀に優れた撮影者以外は,表情を描く(写す)ことが困難である。Southworth and Hawesなど,表現力豊かな写真制作者の作品には,絵画的表現や,写真の商用としての発展を見ることができた。本研究において、1840年代と50年代のイメージの比較を行い以下が明らかとなった。1840年代から50年代のアメリカにおいては、テレグラフ、蒸気機関車、ファクシミリなど、人をある場所から別の場所へと移送する、時空間の制限を越えるテクノロジーが次々と展開した。人々は「同時に」偏在する経験を開始する。ダゲレオタイプは、こうした"virtual technology"のひとつとして考えることができる。ダゲレオタイプを、" virtual presence"として感じ取っていた人々が、撮影の際「今ここにいる私」の存在をカメラに投射することを自らの役割とできた1840年代のダゲレオタイプの特徴が分かった。したがって、40年代の写真にはジェンダー表象は顕著な形では見られない。ダゲレオタイプの発展は、技術や機材の質の向上を支えるものだったが、ダゲレオタイプという事象を、気楽なものへと変えていった。この過程で、人物は「被写体」の位置へと押しやられていく。つまり「撮影される対象」に落ち着いて、ダゲレオタイピストの指示にしたがって、ポーズや姿勢、視線を「作る」ようになる。同時に、人々は写真を撮られることにも、見ることにも慣れ、" virtual presence"であるという感覚は薄まり、撮影時に自分の" presence"を投射するという意識もなくなっていった。50年代にSouthworth and Hawesのようなその表現力や芸術性において評価されているダゲレオタイピストが登場するが、退屈な被写体の表情を克服するため、洗練された技術で被写体に表情をつけることに成功したためだと理解できた。

この50年代の技術的、商業的発展の中で、写真表現の中でも徐々にジェンダーに従った身体の描き分けがなされるようになることが分かった。上記成果については平成21年度日本写真芸術学会にて発表を予定、のち論文としてまとめる。
尿路病原性大腸菌の産生するUSPの作用解析と粘膜ワクチンの開発

臨床材料から分離される大腸菌については、多くの研究者によってその病原因子の分布が調査されてきた。しかし、複雑性尿路感染症や無症候性細菌尿から分離される大腸菌における病原因子の分布に関する報告はほとんどない。単純性及び複雑性尿路感染症、或は症候性及び無症候性尿路感染症から分離された大腸菌に質的違いがあるか否かを明らかにするために、単純性膀胱炎(UC)、複雑性膀胱炎(CC)、複雑性無症候性細菌尿(CASB)の症例から分離された大腸菌の、系統分類、O血清型別、および18種類の病原因子の分布を調べた。調査には、2000年から2005年に札幌医大病院と京都専売病院で分離された大腸菌283株(UC:153、CC:56、CASB:74)を用いた。系統分類学的には、全ての症例でB2が優勢であった。pap、iha、omp TおよびPAIはCCやCASBに比較してUCにおいて高い頻度で存在していたが、残りの14病原因子はどの症例においても差は見られなかった。O血清型別においても、症例間に違いは見られなかった。複雑性あるいは無症候性尿路感染症に比べて、単純性あるいは症候性尿路感染症の方がより多くの病原因子を必要とするように思われるが、調査した3種類の症例(単純性膀胱炎、複雑性膀胱炎、複雑性無症候性細菌尿)から分離された大腸菌の系統分類、O血清型および病原因子の分布には際立った相違は見られなかった。症候性尿路感染症の発症には、細菌が発現する病原因子の作用より患者の健康状態が深く関わっていると考えられる。系統分類学的な解析によりUSPとこれに続くORFUからなる尿路病原性大腸菌(UPEC)に特異な病原遺伝子群(PAI)を4つのsubtypeに分類できることが分かった。単純性尿路感染症(194膀胱炎症例、76腎孟腎炎症例、107前立腺炎症例)から分離した427株のUPECと健常者由来の大腸菌を系統分類学的に分類し、PAI型別、尿路病原因子及び血清型における相関を調べたところ、系統分類でB2に分類されusp遺伝子をもつ株は、膀胱炎、腎孟腎炎並びに前立腺炎患者由来株で等しくdominantであった。更に、各PAI型別は尿路病原性因子及び特定の血清型と高い相関が見られた。(Kanamaru S, Kurazono H.et al.,Int.J.Urol.13:754-760,2006)。単純性急性尿路感染症(194膀胱炎症例、76腎孟腎炎症例、107前立腺炎症例)から分離されたUPECのバイオフィルム形成能をクリスタルバイオレット結合試験で検討した。前立腺炎由来株は腎孟腎炎並びに膀胱炎由来菌株に比較して、著しいバイオフィルム形成能を示した。同様に、前立腺炎由来株の多くが属する血清型04と022の菌株も、他の血清型の菌株に比較して、著しいバイオフィルム形成能を示した。この結果より、細菌性急性前立腺炎とバイオフィルム形成能には高い相関がある事が示唆された(Kanamaru S.,Kurazono H.et al.,Int.J.Antimicrob.Agent 28:Suppl 1:S21-S25、2006)。単純性膀胱炎、複雑性膀胱炎、および無症候性細菌尿の患者から分離した大腸菌の遺伝学的並びに血清学的性状を比較検討した。全ての分離菌は病原グループB2に属していた。

調査した18種類の病原因子のうち14種類は全ての症例で共通であったが、pap、iha、ompおよびPAI遺伝子は複雑性膀胱炎や無症候性細菌尿より単純性膀胱炎でより高い頻度で観察された(Takahashi A et al.,J.Clin.Microbbiol.44:4589-4592,2006)。臨床材料から分離される大腸菌については、多くの研究者によってその病原因子の分布が調査されてきた。しかし、複雑性尿路感染症や無症候性細菌尿から分離される大腸菌における病原因子の分布に関する報告はほとんどない。単純性及び複雑性尿路感染症、或は症候性及び無症候性尿路感染症から分離された大腸菌に質的違いがあるか否かを明らかにするために、単純性膀胱炎(UC)、複雑性膀胱炎(CC)、複雑性無症候性細菌尿(CASB)の症例から分離された大腸菌の、系統分類、O血清型別、および18種類の病原因子の分布を調べた。調査には、2000年から2005年に札幌医大病院と京都専売病院で分離された大腸菌283株(UC:153、CC:56、CASB:74)を用いた。系統分類学的には、全ての症例でB2が優勢であった。pap、iha、ompTおよびPAIはCCやCASBに比較してUCにおいて高い頻度で存在していたが、残りの14病原因子はどの症例においても差は見られなかった。O血清型別においても、症例間に違いは見られなかった。複雑性あるいは無症候性尿路感染症に比べて、単純性あるいは症候性尿路感染症の方がより多くの病原因子を必要とするように思われるが、調査した3種類の症例(単純性膀胱炎、複雑性膀胱炎、複雑性無症候性細菌尿)から分離された大腸菌の系統分類、O血清型および病原因子の分布には際立った相違は見られなかった。症候性尿路感染症の発症には、細菌が発現する病原因子の作用より患者の健康状態が深く関わっていると考えられる。
インターネット上の情報流通に対する「間接規制」に関する総合的研究

本研究の目的は、インターネット上の情報流通に対する「間接規制」(技術的手段等の各種の事実上の規制手段を介して行われる間接的な法規制)のあり方を比較法的に検討すると同時に、かかる規制が有する問題を実定法学のみならず法哲学や法と経済学などの学際的な観点を踏まえ考察することにより、インターネット上の情報流通の「間接規制」が有する法的問題とそれに対する規律のあり方を明らかにすることである。本年度は主に、間接規制の概念および構造に関する基礎理論的研究と表現の自由に対する間接規制のあり方に関する比較法的研究を行った。間接規制の概念および構造に関する基礎理論的研究については、近年の米国における学際的な規制理論を検討することにより、今日の情報社会における法的規制とアーキテクチャ等の非法的規制の関係を整理した上で、間接規制の概念と基本的な構造を明らかにした。以上の研究を踏まえ、論文を執筆し公表した。表現の自由に対する間接規制のあり方に関する比較法的研究については、インターネット上の表現の自由への間接規制に対する規律のあり方を考察するための手がかりとして、今日のインターネット上の間接的な表現規制と1950-60年代の米国における間接的な表現規制の背景・構造・制約効果を比較検討することにより、今日のインターネット上の表現の自由に対する技術的手段を利用した間接規制について、過剰遮断や透明性に関する問題などに対処するための新たな枠組みが求められることを明らかにした。本年度の研究により、今日の情報社会において「間接規制」という新たな規制手法の基本的な概念と構造を明らかにすると同時に、「間接規制」を表現の自由との関係で規律していくための法的枠組みのあり方について一定の示唆を得ることができたと考えている。本研究の目的は、インターネット上の情報流通に対する「間接規制」(技術的コントロール等の各種の事実上の規制手段を介して行われる間接的な法規制)のあり方を比較法的に検討すると同時に、かかる規制が有する問題を法哲学や法と経済学などの学際的な観点から考察することにより、インターネット上の情報流通の「間接規制」が有する法的問題とそれに対する統制のあり方を明らかにすることである。本年度は、主に技術的手段を用いた著作物の保護および有害情報の規制を題材にして研究を行った。技術的手段を用いた著作物の保護については、デジタル・ミレニアム著作権法の技術的手段回避規制に関する米国の裁判例・学説等を検討することにより、著作物の技術的保護のための法的規制の構造を明らかにすると同時に、この種の規制が表現の自由との関係で有している問題を多角的な観点から検討した。以上の研究を踏まえ、雑誌論文を執筆した。技術的手段を用いた有害情報の「間接規制」については、「青少年インターネット環境整備法」を中心とするわが国におけるインターネット上の有害情報規制のあり方を検討することにより、多くの私的主体が関与するわが国のインターネット上の有害情報規制の構造を明らかにすると同時に、有害情報の「間接規制」が表現の自由との関係で有する問題について考察した。以上の研究を踏まえ、国際シンポジウムにおいて報告を行った。本年度の研究により、今日の情報社会において「間接規制」という新たな規制手法が表現の自由との関係で有する問題の一端を明らかにすると同時に、国家の間接的な統治手法から個人の権利・自由を保障するための法的枠組みのあり方を考察するための手がかりを得ることができた。
修飾ヒストンの完全化学合成と非対称修飾ヌクレオソームの構築

これまでにトリメチル化リシンをはじめとした修飾アミノ酸残基を含むヒストンH3,H4の化学合成に成功している.また,チイランリンカーを利用したユビキチン化イソペプチドアナログの合成も行っている.本研究においては,引き続きトリメチル化およびユビキチン化ヒストンH3の化学合成を進めている.これまでにイソペプチドアナログ構造によるユビキチン化ヒストンH3部分ペプチドによって,DNAメチル化酵素Dnmt1の活性が向上することを報告している.その構造の検証のため,今年度はまず,天然型イソペプチド構造を有するユビキチン化ヒストンH3の合成を行った.その結果,天然型イソペプチド構造によるユビキチン化ヒストンH3部分ペプチドは,そのアナログと比べて,修飾部位による活性化の傾向は同じであることが分かった.しかし,天然型イソペプチド構造のほうがその活性化の割合が小さい傾向があった.そのため特定の機能の解明には天然型構造が重要であり,これを受けて,天然型イソペプチド構造を有するユビキチン化全長ヒストンH3の全合成を行った.本合成においてはCPEライゲーション法を用いた.また一方で,O-GlcNAc化ヒストンH2Aの合成を行った.100残基を超えるヒストンなどのタンパク質の合成の多くの場合,3つ以上の合成ブロックを用いて複数回のライゲーションを繰り返すことによって,全長配列のタンパク質を合成する.一般的にはライゲーション反応および末端の脱保護反応ごとにHPLCによる精製を行う.そのために精製時間が必要であり,また,回収率の低下が問題となる.本合成においては,アリールチオエステル,CPE,およびNAC法を用いて,4つのペプチドセグメントをワンポットで縮合した.複雑なタンパク質の調製は合成化学に要求されるテーマの1つである.4種類のヒストンタンパク質が2分子ずつからなる8量体にDNAが巻き付くことでヌクレオソームが形成される.このヒストンは複数の部位に多様な翻訳後修飾を受け,この化学修飾はエピジェネティックな遺伝情報の発現制御に関与している.この機能の詳細な解明のためには部位特異的に化学修飾したヒストンおよびヌクレオソームの調製が必要である.本研究では,独自に開発したCPEライゲーション法を基盤として,種々の修飾を有するヒストンを完全合成し,これらの翻訳後修飾の機能やクロマチンの構造に与える影響の解明に寄与することを目的としている.以前のトリメチル化リシンあるいはユビキチン化アナログヒストンの合成に加えて,本年度は天然型ユビキチン化およびO-GlcNAc化ヒストンの合成に成功した.また,ユビキチン化ヒストンでは,そのアナログでも機能を模倣することは可能であると思われるが,詳細なメカニズムの解明には天然型構造が重要であることが明らかとなったことは重要な知見である.以上の結果から,おおむね順調に進呈していると考えている.4種類のヒストン2分子ずつからなる8量体にDNAが巻き付くことでヌクレオソームが形成される.このヒストンは複数の部位に多様な翻訳後修飾を受け,この化学修飾はエピジェネティックな遺伝情報の発現制御に関与している.この機能の詳細な解明のためには部位特異的に化学修飾したヒストンおよびヌクレオソームの調製が必要である.本研究では,独自に開発したCPEライゲーション法を基盤として,複雑な修飾を有するヒストンを完全化学合成し,これらの翻訳後修飾の機能やクロマチンの構造に与える影響の解明に寄与することを目的としている.昨年度までに,トリメチル化,ユビキチン化ヒストンH3およびO-GlcNAc化ヒストンH2Aの合成を行ってきた.このうち,ユビキチン化ヒストンH3では,天然型イソペプチド構造とアナログ構造ではその効果に差異が見られ,その結合様式が重要であることが明らかとなった.その効果の差異を詳細に調べることは1つのテーマとなる.また,O-GlcNAc化修飾について,その機能は不明であり,その解明が必要である.一方で,ヒストンの完全化学合成を効率よく進行するためには,簡便で効率的な合成法が必須である.修飾ヒストンの調製を進めつつ,ライゲーション法の効率化を行う.100残基を超えるヒストンなどのタンパク質の合成の多くの場合,3つ以上の合成ブロックを用いて複数回のライゲーションを繰り返すことによって,全長配列のタンパク質を合成するが,一般的にはライゲーション反応および末端の脱保護反応ごとにHPLCによる精製を行う.そのために精製時間が必要であり,また,回収率の低下が問題となる.現在,固相上でペプチドセグメントの連続的なライゲーションによる固相ライゲーション法の検討を進めていて.これによって精製ステップを減らし,合成効率を向上させる.これまでにトリメチル化リシンをはじめとした修飾アミノ酸残基を含むヒストンH3,H4の化学合成に成功している.また,チイランリンカーを利用したユビキチン化イソペプチドアナログの合成も行っている.本研究においては,引き続きトリメチル化およびユビキチン化ヒストンH3の化学合成を進めている.これまでにイソペプチドアナログ構造によるユビキチン化ヒストンH3部分ペプチドによって,DNAメチル化酵素Dnmt1の活性が向上することを報告している.その構造の検証のため,今年度はまず,天然型イソペプチド構造を有するユビキチン化ヒストンH3の合成を行った.その結果,天然型イソペプチド構造によるユビキチン化ヒストンH3部分ペプチドは,そのアナログと比べて,修飾部位による活性化の傾向は同じであることが分かった.しかし,天然型イソペプチド構造のほうがその活性化の割合が小さい傾向があった.

そのため特定の機能の解明には天然型構造が重要であり,これを受けて,天然型イソペプチド構造を有するユビキチン化全長ヒストンH3の全合成を行った.本合成においてはCPEライゲーション法を用いた.また一方で,O-GlcNAc化ヒストンH2Aの合成を行った.100残基を超えるヒストンなどのタンパク質の合成の多くの場合,3つ以上の合成ブロックを用いて複数回のライゲーションを繰り返すことによって,全長配列のタンパク質を合成する.一般的にはライゲーション反応および末端の脱保護反応ごとにHPLCによる精製を行う.そのために精製時間が必要であり,また,回収率の低下が問題となる.本合成においては,アリールチオエステル,CPE,およびNAC法を用いて,4つのペプチドセグメントをワンポットで縮合した.複雑なタンパク質の調製は合成化学に要求されるテーマの1つである.4種類のヒストンタンパク質が2分子ずつからなる8量体にDNAが巻き付くことでヌクレオソームが形成される.このヒストンは複数の部位に多様な翻訳後修飾を受け,この化学修飾はエピジェネティックな遺伝情報の発現制御に関与している.この機能の詳細な解明のためには部位特異的に化学修飾したヒストンおよびヌクレオソームの調製が必要である.本研究では,独自に開発したCPEライゲーション法を基盤として,種々の修飾を有するヒストンを完全合成し,これらの翻訳後修飾の機能やクロマチンの構造に与える影響の解明に寄与することを目的としている.以前のトリメチル化リシンあるいはユビキチン化アナログヒストンの合成に加えて,本年度は天然型ユビキチン化およびO-GlcNAc化ヒストンの合成に成功した.また,ユビキチン化ヒストンでは,そのアナログでも機能を模倣することは可能であると思われるが,詳細なメカニズムの解明には天然型構造が重要であることが明らかとなったことは重要な知見である.以上の結果から,おおむね順調に進呈していると考えている.4種類のヒストン2分子ずつからなる8量体にDNAが巻き付くことでヌクレオソームが形成される.このヒストンは複数の部位に多様な翻訳後修飾を受け,この化学修飾はエピジェネティックな遺伝情報の発現制御に関与している.この機能の詳細な解明のためには部位特異的に化学修飾したヒストンおよびヌクレオソームの調製が必要である.本研究では,独自に開発したCPEライゲーション法を基盤として,複雑な修飾を有するヒストンを完全化学合成し,これらの翻訳後修飾の機能やクロマチンの構造に与える影響の解明に寄与することを目的としている.昨年度までに,トリメチル化,ユビキチン化ヒストンH3およびO-GlcNAc化ヒストンH2Aの合成を行ってきた.このうち,ユビキチン化ヒストンH3では,天然型イソペプチド構造とアナログ構造ではその効果に差異が見られ,その結合様式が重要であることが明らかとなった.その効果の差異を詳細に調べることは1つのテーマとなる.また,O-GlcNAc化修飾について,その機能は不明であり,その解明が必要である.
シュライナーの作品における土地風景の表象と南アフリカ人としての意識形成との関連

博士論文の序章、一章にあたる部分はほぼ完成しつつある。一章では最近になって発見されたSchreinerの短編“My First Adventure at the Cape"(1882)と彼女の初期の作品Undine(1929)(死後出版)を扱い、当時の英国植民者を政治的にも物理的にも疎外するアフリカの環境や政治的状況や、英国の風景を故郷とする英文学の伝統が南アフリカ生まれの彼女がアフリカを故郷として表象する事を阻む中で、彼女が「植民地生まれの白人」という意識から「南アフリカ人」という意識に近づくまでの葛藤を考察した。その際、科学研究費申請時にはまだその存在を知らなかった“My First Adventure at the Cape"が論文の流れを大きく変えることになった。この作品においては、Schreinerは、英国から来た男性植民者がアフリカについての矛盾に満ちた帝国主義的テキストを生産するメカニズムを冒険小説のパロディを通して暴いている。このように、アフリカを[他者]として表象する英国から来た男性植民者のテキストへの鋭い批判精神を持ちながら,それに代わる言説をSchreinerはなかなか生み出せない。その葛藤が如実に現れているのが、Undineである。この作品においで、彼女は南アフリカの風景を表象するのに英国の景色との「違い」を強調し、また、当時まだ行ったこともない英国を途中から物語の舞台に選んでいる。そこには、自分の生まれ育ったアフリカを小説の正統的な舞台として認められないほどに植民地化された意識が見られる。以前はこの作品においてこの内なる植民地化と疎外感(また、それが批評家の大体の見方でもあった)のみに注目していた。しかし研究を進めるにつれ、Undineの後半部分では、男性植民者中心のテキストを覆すような南アフリカの描写も見られることか判明し、それによって、この作品が、彼女のより南アフリカの大地に根ざした次作に通じる萌芽的な作品であることも明らかにされた。
前庭器感覚上皮の障害性について(組織培養法による薬剤性内耳破壊術の基礎的研究)

実験動物には、実験的内リンパ水腫を作成するのに最も確実なモルモットを用いた。ネンブタール腹腔内投与による全身麻酔下に、経後頭蓋窩硬膜外法により、手術用顕微鏡下に一側耳の内リンパ嚢を機械的に破壊し、内リンパ水腫を作成した。内リンパ水腫作成後、2ヵ月の時点でネンブタール腹腔内投与による全身麻酔下に断頭し、直ちに両側耳の前庭器を実体顕微鏡下に摘出した。摘出した内耳前庭器は、耳毒性薬剤としてアミノ配糖体系抗生物質である硫酸ストレプトマイシンを10mg/ml含有する、あるいは含有しない培養液中で5日間器官培養した。培養後、前庭器を固定処理し、内リンパ水腫耳と正常耳との超微細形態の相違を透過型電子顕微鏡で観察し、比較検討した。前庭器のうち、球形嚢斑は球状窩から剥離摘出する必要があり、培養開始前の操作の影響が強く出た。また、半規管(外側)膨大部陵は培養5日目には、いずれの条件下でも感覚細胞の感覚毛がほぼ完全に脱落した。このため、今回は、実験的内リンパ水腫内耳前庭器の耳毒性薬剤に対する受傷性を、主として卵形嚢斑において検討した。耳毒性薬剤を負荷していない培養条件下に置ける培養5日目では、卵形嚢斑の有毛細胞の脱落変性が内リンパ水腫耳、正常耳(対照)ともにある程度観察されたが、両耳間で、その程度に差は認められなかった。一方、硫酸ストレプトマイシン10mg/mlを添加した培養液による5日間の培養では内リンパ水腫耳、正常耳(対照)ともに強い有毛細胞の変性所見が観察され、特に内リンパ水腫耳にその傾向が強かった。これらのことより、内リンパ水腫耳では耳毒性薬剤の影響が強くでることが考えられる。薬剤の濃度の調節、内リンパ水腫作成期間の調整を行って、さらに詳しい検討をする必要があると思われる。
液体断熱膨張分子線法による水溶液及び混合溶媒中での分子の会合構造発生の起源

本研究補助金によって購入した高質量用リニアライザ-の使用によって、質量数800から1600における極めて高分解能を有する質量スペクトルの測定が可能になり、液体断熱膨張分子線法による溶液中での会合構造の研究に大きな進歩が見られた。特に、これまで困難であった違濃度の複数の溶質を含む系の研究が可能なったことにより次のような結果が得られた。1.水溶液中で分子が会合しそれが長時間安定に存在するには、互いに類似の疎水性部分を有し、その接触面積が広く、且つ、その一端のみが強い水素結合で固定される必要がある。2.この水素結合は、溶質を包む水分子のネットワ-ク生成の起点となるもので、溶質分子が途中に親水基を有するとそこでこのネットワ-クが壊され会合体は不安定になる。3.即ち、会合体が安定に存在するのは、これを取り巻く水分子の強固なネットワ-クの発生による「かご効果」による会合体の保護機構が存在するためである。4.このかご効果は、疎水性相互作用の本質ともかかわっている。5.従って、水の中で溶質分子の会合体が安定に存在するためには、充分な量の水分子が存在し会合体を取り囲んで安定化させる必要があるが、水分子が不足すると会合構造は破壊され相分離が起こる。以上の結果と関連するが、極めて興味深い事実として、水溶液中ではカルボン酸の2量体よりもアルコ-ルとカルボン酸の混合会合体の方がより安定であることがわかり、本手法が分子を識別した会合体の構造研究に対して大きな進歩をもたらすことが明らかとなった。
新しい戦略による抗がん剤創薬ターゲットの探索

がん細胞の抗がん剤感受性/耐性を規定する、もしくは感受性予測マーカーとなる遺伝子をゲノムワイドに検索・同定する目的で、我々は、多数のヒトがん細胞株をモデルに研究をすすめている。これまでに、39種類のヒトがん細胞株(JFCR39)についておよそ100種類の抗がん剤に対する感受性を測定し、またDNAチップによって各細胞株の遺伝子発現プロフィールを測定した。そして、これらの解析結果を統合してJFCR39における抗がん剤感受性・遺伝子発現統合データベース(DB)を作成し、このDBを利用して統計学的に抗がん剤有効性と関連が認められる遺伝子をリストアップした。昨年度までに、リストアップした遺伝子の中から抗がん剤感受性へ機能的な関与をもつものとして、SFN遺伝子を同定した。この遺伝子は、RNA干渉法で発現ノックダウンさせることにより、トポテカンの感受性を上昇させ、アポトーシスを起こしやすくした。また、SFN遺伝子を過剰発現させると、トポテカン感受性が低下した。このことからSFN遺伝子は、トポテカン抵抗性を規定する遺伝子であると考えられた。また、その他の遺伝子についても感受性への関与を検討している。一方、およそ5万種類のヒト遺伝子を標的としたshRNA発現レンチウイルスライブラリーを利用した抗がん剤有効性責任遺伝子を同定する試みを進めている。これらの方法論を組み合わせた効率的な抗がん剤感受性/耐性規定遺伝子のスクリーニングと、同定した遺伝子の中から抗がん剤の創薬ターゲットとしてふさわしい遺伝子の選定が今後の課題である。1 JFCR-39における相関分析により抽出された抗がん剤有効性責任遺伝子候補の機能解析39種のヒトがん細胞株からなるがん細胞パネル(JFCR-39)において統計学的に抗がん剤有効性と関連が認められ、発現ノックダウンにより抗がん剤有効性への関与が実験的に証明された遺伝子(抗がん剤有効性責任遺伝子候補)について、抗がん剤の作用メカニズムへの機能的な関与の有無があるか解析を進めた。そのうち、DNAトポイソメラーゼ(トポ)I阻害剤が効きにくい細胞株ほど発現量が高い遺伝子Aの発現をノックダウンするとトポI阻害剤が効きやすくなることを見出した。本遺伝子はこれまでに、トポI阻害剤の感受性への関与は報告されていなかったので、その分子機構を明らかにするためにフローサイトメトリー解析を行った。その結果、発現ノックダウンによりトポI阻害剤の誘導するG2/M期の細胞周期停止が解除され、アポトーシスが亢進した。このことから、この遺伝子はトポI阻害剤曝露後のG2/M期の細胞周期停止に重要な役割を果たしていることが示唆された。2ヒト遺伝子を標的とするshRNA発現レンチウイルスライブラリーを用いた抗がん剤有効性責任遺伝子の検索およそ5万種類のヒト遺伝子を標的としたshRNA発現レンチウイルスライブラリーを利用して、抗がん剤有効性責任遺伝子を同定することを目的に研究を進めている。まず、JFCR-39細胞株それぞれについて、GFP発現レンチウイルスベクターを用いてウイルス感染実験を行い、至適条件を検討した。その結果、30種類以上の細胞株に90%以上の高効率で導入することが可能になった。また、shRNA発現レンチウイルスライブラリーを用いた予備検討を進めた。
多系統萎縮症における脳内αーシヌクレイン凝集体の画像化とその臨床応用

多系統萎縮症(MSA)の病理学的特徴はグリア細胞質内封入体(GCI)であり、その主たる構成成分はα-シヌクレイン(αS)蛋白凝集体である。今回、我々はMSA同一患者において[11C]BF-227 PETを繰り返し施行し、生体脳内αS蛋白凝集体の経時的変化について検討した結果、[11C]BF-227 PETによってMSAの生体脳内αS蛋白凝集体の蓄積量を経時的に測定できることを確認しえた。MSAにおいて[11C]BF-227 PETが病期進行や治療効果の判定としてのサロゲートマーカーに応用できる可能性が示唆された。本研究の目的は、α-シヌクレイン蛋白の異常蓄積を来す多系統萎縮症などのパーキンソン症候群やパーキンソン病において、[11C]BF-227 PETによる非侵襲的な生体脳内のα-シヌクレイン蛋白凝集体の蓄積量測定が早期診断、病期指標、治療効果判定に応用できるかどうかを検討することである。平成24年度は平成23年度計画(対象患者のピックアップ、脳MRI及び[11C]BF-227 PET検査)を継続するとともに、PETデータを収集し、種々の画像解析ソフトを用いて統計解析を行い、対象患者の一部では、縦断的研究のため約1年の間隔をおいて再度上記のPET検査を施行することであった。当初、本学で[11C]BF-227 PET検査を予定していたが、東日本大震災により本学のサイクロトロンが破損したため本研究の遅延が生じていた。漸く、平成24年10月からPET検査が再開となった。現在までに種々の条件を満たした多系統萎縮症患者2名と代謝解析が必要でないパーキンソン病患者13名(新規8名、継続5名)の計15名に施行することができた。eZISというソフトを用いたpreliminaryの解析では、多系統萎縮症において大脳白質や基底核でα-シヌクレイン蛋白蓄積の増加を認めた。パーキンソン病では、最初ほとんどα-シヌクレイン蛋白蓄積がみられずその後も変化がないグループと辺縁系から全体にα-シヌクレイン蛋白蓄積が拡大していくグループがあることが判明した。すでに20名以上の多系統萎縮症ならびにパーキンソン病患者が[11C]BF-227 PET検査にエントリーしており、順次PET検査を施行し、今後eZIS以外の種々の画像解析ソフトを用いて解析を行う予定である。多系統萎縮症などのパーキンソン症候群は一次的にα-シヌクレイン蛋白の異常蓄積を来す疾患である。我々は、今まで不可能だった多系統萎縮症患者の生体脳内におけるα-シヌクレイン蛋白凝集体の可視化を[11C]BF-227 PETを用いて世界で初めて可能にした。本研究の目的は、α-シヌクレイン蛋白の異常蓄積を来す多系統萎縮症などのパーキンソン症候群において、[11C]BF-227 PETによる非侵襲的な生体脳内のα-シヌクレイン蛋白凝集体の蓄積量測定が病期指標や治療効果判定などに応用できるかどうかを検討することである。平成25年度は平成24年度計画(対象患者のピックアップ、脳MRI及び[11C]BF-227 PET検査)を継続するとともに、PETデータを収集し、種々の画像解析ソフトを用いて統計解析を行うことであった。対象患者のピックアップや各種評価、脳MRI施行までは順調に遂行できた。しかしながら、平成24年10月になって漸く本学のサイクロトロンが復旧しPET検査が再開となったため、[11C]BF-227 PET検査に遅延が生じ、PETデータ収集に時間を要してしまった。平成26年度は、収集することができた多系統萎縮症などのパーキンソン症候群患者のPETデータを基に、種々の画像解析ソフトを用いて統計解析を行う予定である。なかでも、繰り返し[11C]BF-227 PET検査を施行できた多系統萎縮症患者において、病変の分布の拡がりなどを詳細に検討する予定である。本研究の目的は、一次的にα-シヌクレイン蛋白の異常蓄積を来す多系統萎縮症などのパーキンソン症候群において、[11C]BF-227 PETによる非侵襲的な生体脳内のα-シヌクレイン蛋白凝集体の蓄積量測定が早期診断、病期指標、治療効果判定に応用できるかどうかを検討することである。平成23年度は対象患者のピックアップ、脳MRI及び[11C]BF-227 PET検査を中心に行うことであった。厚生労働省による診断基準に従い10名の患者を多系統萎縮症と診断した。簡易認知機能検査(MMSE)、重症度評価(UMSARS)、脳MRI検査(SPGR,T2WI,FLAIR)の各種評価を行った。

いずれの多系統萎縮症患者においても、MMSEが30点満点で27点以上であり認知症がなく、脳MRI検査で形態学的に明らかな異常を認めないことを確認した。この10名の患者全員が[11C]BF-227 PET検査にエントリー可能であり、いつでも[11C]BF-227 PET検査ができる状態に整備した。当初、本学で[11C]BF-227 PET検査を予定していたが、東日本大震災により本学のサイクロトロンが破損したため平成23年度においてPET検査が施行できなかった。今後、サイクロトロンの復旧がさらに遅れるようなことがあれば他施設での検査も検討している。多系統萎縮症(MSA)の病理学的特徴はグリア細胞質内封入体(GCI)であり、その主たる構成成分はα-シヌクレイン(αS)蛋白凝集体である。我々はMSAの生体脳内におけるαS蛋白凝集体の可視化を[11C]BF-227 PETを用いて世界で初めて可能にしてきた。しかしながら、生体脳内αS蛋白凝集体の経時的変化については、可視化・画像化ができておらず、その病態は不明のままである。平成26年度は4人のMSA同一患者において[11C]BF-227 PETを繰り返し施行し得られたPETデータを基に、生体脳内αS蛋白凝集体の経時的変化について画像解析ソフト(e-ZISソフト)を用いて統計解析を行った。4人のMSA-C患者はいずれも正常健常者群と比較して、レンズ核、大脳白質、前頭葉から頭頂葉かけての大脳皮質で[11C]BF-227の集積亢進を認めた。いずれの症例においても、病期の進行とともにこれらの領域の[11C]BF-227集積は増加・拡大していった。[11C]BF-227集積亢進を示したこれらの領域はMSAの病理でGCIが多い分布と一致しており、経時的変化も推定されているGCI蓄積変化と酷似していた。このように[11C]BF-227 PETによってMSAの生体脳内αS蛋白凝集体の蓄積量を経時的に測定できることが確認できた。MSAにおいて[11C]BF-227 PETが病期進行や治療効果の判定としてのサロゲートマーカーに応用できる可能性が示唆された。神経内科対象患者である多系統萎縮症ならびにパーキンソン病患者のピックアップ、各種評価、脳MRI検査施行まで本研究は順調に遂行できている。しかしながら、東日本大震災によるサイクロトロンの破損のため[11C]BF-227 PET検査に遅延が生じている。そのため、平成24年度にPETデータを収集し種々の画像解析ソフトを用いて統計解析を行う予定であったが、計画に遅れが生じている。対象患者である多系統萎縮症のピックアップ、各種評価、脳MRI検査施行まで順調に遂行できていたが、平成24年10月になって漸く本学のサイクロトロンが復旧しPET検査が再開となったため[11C]BF-227 PET検査に遅延が生じてしまった。しかしながら、平成25年度までにデータ解析を行うことができるまでの症例を蓄積することができた。そのため、平成26年度に画像解析ソフトを用いて統計解析を行う。対象患者である多系統萎縮症患者のピックアップ、各種評価、脳MRI検査施行まで本研究は順調に遂行できている。しかしながら、東日本大震災によるサイクロトロンの破損のため[11C]BF-227 PET検査が施行できていない。
アイソレーターを使用しないSCIDブタ長期管理技術の開発

近年、マウスと比べてよりヒトに近い特徴を持つ、「ブタ」の免疫不全モデルが強く求められている。これまでに申請者らは、重症複合免疫不全症(SCID)ブタを作出し、さらにSCIDブタの無菌管理技術を確立することで、その長期フォローアップを可能にした。一方、アイソレーターを使用する無菌飼育下では、大掛かりな外科的処置を施すことができない。そこで本研究では、「無菌アイソレーターを使用しないSCIDブタの長期管理技術」を開発する。本研究内容が達成されれば、大規模手術を伴う試験にもSCIDブタを利用できるようになり、SCIDブタが新たな前臨床モデルとして、幅広い研究分野の発展に貢献すると考えられる。
心房細動の発症・維持に関与する新しいイオンメカニズムの解明

TRPチャネルの研究により、心筋細胞におけるCa2+シグナルの分子候補が明らかとなってきている。心臓のTRPチャネルは、膜電位や非収縮性のコンパートメントへのCa 2+流入などに密接に関与している。この研究ではTRPチャネルの心房細動における役割について注目した。(a)TRPC1、TRPC3、TRPC6の活性化は、心肥大に関与し、心房負荷となり不整脈発症に関与する。また(b)TRPM4,7,TRPC3,6が不整脈の器質としての心房リモデリングやmechanical strechに関与すると考えられる。以上よりTRPチャネルは、ヒト心疾患の治療における新規薬理学的標的となり得る可能性がある。1心房細動の電気生理学的成因としては(1)発症因子(2)維持機構の2つの要素にわけて考えることができる。(1)発症因子としては、肺静脈心筋細胞を起源とする期外収縮が注目されている。その細胞内メカニズムの一つとして肺静脈心筋細胞内リアノジン受容体の機能異常の報告があるが、高血圧性心疾患による拡張障害などがある際には、左房、肺静脈の圧負荷が肺静脈心筋細胞の伸展刺激活性化イオンチャネルを開口し、細胞内へのCa流入によるCa過負荷を引き起こす。その結果として一過性内向き電流の活性化、Triggered activityによる異常興奮が発生し肺静脈内のリエントリーを形成し心房細動発症へとつながる機序が想定されている。我々は、「左房負荷がかかる病態では、TRPチャネルタンパクから構成されるSACやNSC(Ca)の活性化が起こり、それが心房細動の発症要因となる」という仮説をたてた。我々は、SACの分子候補として心肥大の際に発現しているTRPC1の関与,および心房圧上昇にTRPC6,心肥大におけるCa過負荷にTRPM4が関与する可能性を報告した。また最近心肥大モデル心房筋でのTRPM4発現亢進を報告されたが、これは私達の仮説を支持するものである。圧負荷がかかる状態では、心筋細胞の肥大が引き起こされ、TRPC1の発現亢進が認められる。したがって拡張期有意にCa流入が引き起こされることとなり、結果的に細胞内はCa over loadとなる。引き続きTRPM4の発現亢進が起こるため、不整脈の発症要因となりうることを報告した。心房細動の電気生理学的成因としては発症因子と維持機構の2つの要素があると考えることができる。発症因子としては、肺静脈心筋細胞を起源とする期外収縮が注目されている。そこで、我々は不整脈に関わるCa activated NSCCsとしてのTRPチャネルに焦点をあてた。左房負荷がかかる病態では、TRPチャネルタンパクから構成されるSACやNSC(Ca)の活性化が起こり、それが心房細動の発症要因となると考え、我々は、SACの分子候補として心肥大の際に発現しているTRPC1の関与,および心房圧上昇にTRPC6,心肥大におけるCa過負荷にTRPM4が関与する可能性を報告した。さらに、心臓ではTRPM4は心室筋よりも心房筋に多く発現しており、またこの発現パターンは心肥大によって変化すると考えられる。従って、TRPM4は心肥大における心房由来の不整脈の原因となる可能性がある。また、圧負荷がかかる状態では、心筋細胞の肥大が引き起こされ、TRPC1の発現亢進が認められる。今後は引き続き、TRPchannelと不整脈の関わりについて検討し不整脈治療や心臓病治療の新たなターゲットとしての可能性について検討していく。

その結果として一過性内向き電流の活性化、Triggered activityによる異常興奮が発生し肺静脈内のリエントリーを形成し心房細動発症へとつながる機序が想定されている。我々は、「左房負荷がかかる病態では、TRPチャネルタンパクから構成されるSACやNSC(Ca)の活性化が起こり、それが心房細動の発症要因となる」という仮説をたてた。我々は、SACの分子候補として心肥大の際に発現しているTRPC1の関与,および心房圧上昇にTRPC6,心肥大におけるCa過負荷にTRPM4が関与する可能性を報告した。また最近心肥大モデル心房筋でのTRPM4発現亢進を報告されたが、これは私達の仮説を支持するものである。圧負荷がかかる状態では、心筋細胞の肥大が引き起こされ、TRPC1の発現亢進が認められる。したがって拡張期有意にCa流入が引き起こされることとなり、結果的に細胞内はCa over loadとなる。引き続きTRPM4の発現亢進が起こるため、不整脈の発症要因となりうることを報告した。家兎の肺静脈あるいは肺静脈開口部周囲心房筋におけるTRPチャネルの発現状況を検討するための肺静脈心房筋のみ採取や、家兎摘出心にランゲンドルフ下で任意の心房内圧負荷をかけながら心房高頻度ペーシングをする方法で心房細動を誘発を安定して行うことに技術的修練を要すること家兎の肺静脈あるいは肺静脈開口部周囲心房筋におけるTRPチャネルの発現状況を検討するための肺静脈心房筋のみ採取や、家兎摘出心にランゲンドルフ下で任意の心房内圧負荷をかけながら心房高頻度ペーシングをする方法で心房細動を誘発を安定して行うことに技術的修練を要すること。心房細動発症に関する研究;肺静脈心筋細胞におけるTRPチャネルの役割を引き続き検討する。(1)家兎の肺静脈あるいは肺静脈開口部周囲心房筋におけるTRPチャネルの発現状況を調べ、SACの候補分子を絞り込む。また、発現が増加していたTRPチャネルの抗体を使って免疫組織学染色し、肺静脈内での局在を確かめる。(2)家兎摘出心にランゲンドルフ下で任意の心房内圧負荷をかけながら心房高頻度ペーシングをする方法で心房細動を誘発、同モデルを用いて、TRPチャネルのブロッカーや特異抗体の心房細動抑制効果を検討する。(3)SAC電流の解析ー家兎摘出肺静脈を酵素処理し、肺静脈心筋細胞を単離し、同細胞にパッチクランプを適用し、メカニカルストレス(低浸透圧刺激)によるSAC電流やcurrent clamp法での遅延後脱分極を記録する。それに対し上記(2)で用いたTRPチャネルのブロッカーやTRPC1, TRPC6抗体の抑制効果を検討する。(4)triggered activityの原因となるNSC(Ca)のチャネル分子がTRPM4から構成されていることを証明するため、単離肺静脈心筋細胞にパッチクランプを行い、電流特性を評価する(TRPM4は細胞内Ca増加で活性化されるが、Caにたいする透過性はないという特性がある)。また、single channel recordingを行い、TRPM4特有のチャネルコンダクタンスが記録できるか検証する。上記、研究の進行の遅れがあるが、引き続き、各検討を進めていく。
雑音を用いた金属-GaAs界面近傍の欠陥の測定

本研究では、金属-GaAs界面近傍の欠陥を感度良く測定するために、先ず直径0.3μmのショットキ・ダイオードの製作プロセスの改善を行い、次に、深い準位をもつ金を不純物としてGaAs表面に拡散させたダイオードの雑音の測定を試みた。1従来用いていた電子ビームレジストは、耐ドライエッチ性が十分でないだけでなく、材料にフッ素を含んでいるため、試料表面にポリマーが堆積しやすく、ドライエッチング後のプロセスの不安定性の原因となっていた。このポリマーは、ドライエッチング、表面クリーニング、エピ層陽極酸化-エッチング、ショットキ電極メッキ等の工程で影響を与え、均一性の良いダイオード製作の妨げになっていた。そのため、ダイオードの雑音特性を測定する際、データーの再現性を得ることが困難であった。2今回新たにノボラック系の電子ビームレジストの供給(試作品)を受け、耐ドライエッチ性が飛躍的に向上していること、ポリマーの堆積も少なくポリマーが酸素プラズマやオゾン等を使用せずともほぼ除去できること、が明らかになり、均一性の良いダイオードを製作できるようになった。3雑音と金属-GaAs界面近傍の欠陥との関係を定量的に明らかにするため、不純物として金をGaAs表面に拡散させたダイオードを製作した。先ず、温度500度C、1時間の条件で拡散させた場合についてダイオードの雑音特性を測定したが、現在のところ、拡散した金による明らかな雑音特性の変化は観測されていない。今後、拡散の条件を変えたり、不純物としてインジュームを用いた場合について、雑音特性の変化を求め、雑音と欠陥の関係を定量的に明らかにする予定である。
c-fos遺伝子の発現と歯周病の病態の関わりに関する基礎的研究

我々はc-fos遺伝子発現と歯周病の病態との関係を明確にすることを目的として実験を行い、以下に示す結果を得た。(1)炎症歯肉組織中におけるc-fos遺伝子発現の確認:5人の増殖性歯肉炎患者および5人の重度歯周炎患者から歯肉を採取し、通法に従い切片を作製後in situ hybridization法によりc-fos遺伝子の発現を確認することを試みたが、いずれの歯肉標本においても、c-fos遺伝子の発現は確認できなかった。現在、歯周病の急性炎症罹患部歯肉組織中のc-fos遺伝子発現の確認を行っている。(3)HGF_Sのc-fos遺伝子およびprocollagenase(proC)遺伝子発現におよぼすrhIL-1βの影響:無血清培地で培養しているHGF_Sを0.25ng/mlのrhIL-1βで刺激すると、短時間でc-fos m-RNAおよびproC m-RNAの発現が認められた。c-fos m-RNAの発現量はrhIL-1βで刺激後1時間で最大となり、6時間後まで認められた。proC m-RNAの発現はそれよりも遅く、刺激開始2時間後から認められ、その発現量は24時間後まで経時的に増加した。また10μg/mlのcycloheximideの添加によりproC m-RNAの発現は抑制されたのに対し、c-fos m-RNAの発現は逆に促進された。このことは、rhIL-1β刺激によるc-fos遺伝子の転写誘導はタンパク合成を介していないことを示している。以上の結果から、rhIL-1β刺激によるc-fos遺伝子の発現は、その後のporC遺伝子の発現誘導に関与している可能性が明らかとなった。現在、HGF_Sへのc-fos遺伝子の導入を試みている。