hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
閉ダイバータ模擬実験におけるデタッチメント・フロントの自励振動に関する研究

当研究所TPD-IIで発見されたデタッチメント・フロントの自励振動[A.Matsubara et al., J.Plasma Fusion Res.78,(2002)196]のさらなる理解のために,プラギング効果に密接に関わる密度と温度の沿磁力線分布を計測することを目的とした。これまでの実験より,この振動は緩和(弛緩)振動の一種であり,振動の振幅および周期は,プラギング効果と密接に関係することが定性的に分かってきた。また数値計算により,振動の発生はオリフィスにおけるプラズマ圧とその沿磁力線勾配とに強く依存することが予想されるようになった。これらのことを定量的に明らかにしていくためには,プラギング効果に密接に関わるプラズマ圧(プラズマ密度×電子温度)の沿磁力線分布の計測が必要となる。本課題では,プラズマ圧の沿磁力線分布を計測し,振動の振輻および周期,そして振動発生に及ぼすプラギング効果を定量的に明らかにすることを目的としている。申請した設備,すなわち「多点集光分光システム」により,いろいろな沿磁力線位置におけるプラズマからの発光を一度に可視分光器に導き,振動に伴うデタッチメント・フロントの位置同定を行ったり,局所熱平衡を仮定したボルツマン法やまたトムソン散乱法を用いて電子温度の沿磁力線分布測定を行ったりする。初年度は本システムの立上げ準備を行った。本システムは,磁力線に沿ったいろいろな位置に集光系を配置し,それぞれで受光された光をいくつもの光ファイバにて一台の既存分光器に伝送し分光するものである。分光器の入射側において,一本一本のファイバを入射スリットに沿わせるように並べる。こうすることで,出射側には沿磁力線位置に対応するスペクトルパターンが縦に積まれたような像として現れる。この像を既存の高速CCDカメラで連続撮影し,スペクトル解析を行う。測定波長領域を紫外まで広げて測定することや,軸方向位置に関して空間分解能をさらに向上させるため,また半径方向分布の計測に対しても,高い空間分解を持つものが必要であった。このため紫外域でも強度減衰の少ない光ファイバを,また空間分解能を上げるために紫外域に対応した集光部(カメラレンズ)を購入した。最終年度では,立ち上げた分光システムを用いて実際に往復運動するプラズマの発光分光を行うことに成功した。当研究所TPD-IIで発見されたデタッチメント・フロントの自励振動[A.Matsubara et al.,J.Plasma Fusion Res.78,(2002)196]のさらなる理解のために,プラギング効果に密接に関わる密度と温度の沿磁力線分布を計測することを目的とした。本課題では,プラズマ圧の沿磁力線分布を計測し,振動の振幅および周期,そして振動発生に及ぼすプラギング効果を定量的に明らかにすることを目的としている。測定波長領域を紫外まで広げて測定することや,軸方向位置に関して空間分解能をさらに向上させるため,また半径方向分布の計測に対しても,高い空間分解を持つものが必要である。

本課題では,プラズマ圧の沿磁力線分布を計測し,振動の振輻および周期,そして振動発生に及ぼすプラギング効果を定量的に明らかにすることを目的としている。申請した設備,すなわち「多点集光分光システム」により,いろいろな沿磁力線位置におけるプラズマからの発光を一度に可視分光器に導き,振動に伴うデタッチメント・フロントの位置同定を行ったり,局所熱平衡を仮定したボルツマン法やまたトムソン散乱法を用いて電子温度の沿磁力線分布測定を行ったりする。初年度は本システムの立上げ準備を行った。本システムは,磁力線に沿ったいろいろな位置に集光系を配置し,それぞれで受光された光をいくつもの光ファイバにて一台の既存分光器に伝送し分光するものである。分光器の入射側において,一本一本のファイバを入射スリットに沿わせるように並べる。こうすることで,出射側には沿磁力線位置に対応するスペクトルパターンが縦に積まれたような像として現れる。この像を既存の高速CCDカメラで連続撮影し,スペクトル解析を行う。測定波長領域を紫外まで広げて測定することや,軸方向位置に関して空間分解能をさらに向上させるため,また半径方向分布の計測に対しても,高い空間分解を持つものが必要であった。このため紫外域でも強度減衰の少ない光ファイバを,また空間分解能を上げるために紫外域に対応した集光部(カメラレンズ)を購入した。最終年度では,立ち上げた分光システムを用いて実際に往復運動するプラズマの発光分光を行うことに成功した。
発達段階を踏まえたコーチ教育プログラムの開発

スポーツ競技では満足の行く結果を出すために、一般的には、選手の育成に重点が置かれ、日々、選手の精神面、体力面、技術面の訓練がなされている。しかし、それと同様に重要であるコーチの育成については検討が不十分であり、国によっては殆ど議論がなされていない。選手が結果を出すための知識をコーチはどこで得ているのか。大学、協会、OCなど、どの組織がコーチ養成の責任を持つべきであろうか。本研究ではスポーツ競技のコーチが今まで受けた教育に関して調査を行い、コーチ育成のための生涯教育の可能性を検討した。6種目のスポーツ競技に関して、ブラジルの23名のコーチを対象に個々にインタビューを行った。その結果、ほとんどのコーチは競技経験かおり、体育かスポーツ科学の資格を持っているが、選手の育成に何らかの不安があり、自らの足りない知識を補って指導力を伸ばしたいと考えていることが分かった。ところが、自らの足りない部分を認識しているコーチの場合でも、自己研鑽のための時間がとれない。また、指導の現場でも、その必要性が認識されていない。仮に今の状況が改善し、指導の現場でコーチのコーチング技術向上の必要性が認識され、支援を受けられることになったとしても、体系的な研修制度が存在しないため、コーチング技術・知識をどこで補えば良いのかコーチには分からない。選手が好結果を出すには、試合で起きる偶然や選手の潜在能力などの運にのみ任せるのではなく、コーチのおかれた状況もシステマティックに改善していく必要がある。改善方法の一つとして、コーチング技術を高めるためのコーチの養成システムの構築が必要であると考える。体操競技にかかわらず、思春期の選手に対するコーチの対応は選手の競技継続に大きな影響を及ぼす。そこで、ブラジルにおいて思春期の男女の選手を指導している体操競技のコーチを対象に、コーチがどのように選手を動機づけているのかをインタビューを通して調査した。対象となったコーチは、46名であり、コーチとしての経験年数は11.16±2.26年であった。結果は、選手達が競技を断念する要因として以下の諸点が指摘されていた。(1)加齢に伴う選手の興味、関心の多様化への対応。(2)練習の激しさ、圧力、ストレスに対する対応。(3)他の影響。(4)思春期への対応。(5)スポーツに向いていないとの意識への対応。また、コーチたちは、これらの要因に対して次のように対応していた。(1)コミュニケーション。(2)励まし。(3)サポータ;(4)イベントの設定。思春期の選手のドロップアウトの原因は、国によってほとんど変わらないと考えられる。それだけにコーチは自分の行動、方法などを、注意または反省するべきである。総じて言えば、コーチは選手の期待や競技に取り組む目的などをもっとよく知るべきである。また、それを可能にするには選手とお互い理解しあうことが必要であり、コミュニケーションを数多く営むことが必要である。また、個々の選手の事情に即した対応が必要である。なお、これらのデータに続き、コーチが親の対応をどのように認識しているのかについても検討を進めた。また、大学内でコーチ教育プログラム並びにその効果研究の進め方に関する情報を収集するために、オーストラリア・クーインスランド大学を訪問するとともに、オーストラリアスポーツ委員会が開催する会議に出席し、質的研究方法、コーチ育成、スポーツ教育、コーチング過程、コーチの成績評価案等に関連する資料を収集した。研究段階:トップレベルの選手に関わるコーチの指導方法を向上させることを目的とし、6種目の競技に関して、ブラジルで活躍する23名の熟練コーチを対象に、9月-10月にインタビューを行った。優れたコーチになるためには何が望ましく、何が必要とされているかを(1)知識、(2)技術、(3)態度、(4)行動、(5)資質等、教育的観点からの聞き取り調査を行った。インラビュー結果は現在プロコトル化を進めている。それを質的手法に基づいて分析を進め、公表する予定である。発表内容:思春期の選手に対するコーチの対応が選手の競技の継続に与える影響」という内容の発表を行った。ブラジルにおいて、思春期の男女の選手を指導する体操競技のコーチは、現在46名である。コーチとしての経験年数は11.16±2.26年であった。「親の支援」と「試合の位置づけ」という2項目について発表を行った。多くのコーチ親の支援は非常に重要だと考え、親の支援がなければ選手の上達に支障をきたすと考えている。他方、親が結果、成功、評価に厳しく、選手の成績を大いに期待する場合、選手は精神的な負担を感じると思われている。多くのコーチが選手に対する試合の役割について成長と発達、そして動機付けにも深く関わっていると考えている。ただし結果を出すことのみを要求するのでなく、選手たちに試合を楽しませ、人間関係・自己啓発等に良い影響がらうように試合を取り入れていくのがコーチの役割であると考えている。

本研究ではスポーツ競技のコーチが今まで受けた教育に関して調査を行い、コーチ育成のための生涯教育の可能性を検討した。6種目のスポーツ競技に関して、ブラジルの23名のコーチを対象に個々にインタビューを行った。その結果、ほとんどのコーチは競技経験かおり、体育かスポーツ科学の資格を持っているが、選手の育成に何らかの不安があり、自らの足りない知識を補って指導力を伸ばしたいと考えていることが分かった。ところが、自らの足りない部分を認識しているコーチの場合でも、自己研鑽のための時間がとれない。また、指導の現場でも、その必要性が認識されていない。仮に今の状況が改善し、指導の現場でコーチのコーチング技術向上の必要性が認識され、支援を受けられることになったとしても、体系的な研修制度が存在しないため、コーチング技術・知識をどこで補えば良いのかコーチには分からない。選手が好結果を出すには、試合で起きる偶然や選手の潜在能力などの運にのみ任せるのではなく、コーチのおかれた状況もシステマティックに改善していく必要がある。改善方法の一つとして、コーチング技術を高めるためのコーチの養成システムの構築が必要であると考える。
資本蓄積と健康蓄積

本研究では,資産蓄積と健康蓄積の実態について日本の個票データを用いた計量分析を行い,主に次の4つ結果を得た.予備的な行動は個人の時間やリスクに関する選好により左右されると同時に,この行動が健康状態を変える,中の下階級の家計では母親が市場労働を行うと調理といった健康促進行動が阻害されやすい,親が失業すると生まれてくる子どもの健康状態が阻害される,貧しい家計ほど健康状態が悪いという関係は相関関係ではなく因果関係として存在する.本研究では,資産蓄積と健康蓄積の実態について,日本の個票データを用いた計量分析を行い,以下の3点を明らかにする.(1)何が予備的貯蓄と予備的な時間投資の同時決定に影響するか.(2)予備的な行動は資産と健康の蓄積結果を変えるか.(3)資産と健康の格差に関係はあるのか.本研究では,資産蓄積と健康蓄積の実態について日本の個票データを用いた計量分析を行い,主に次の4つ結果を得た.予備的な行動は個人の時間やリスクに関する選好により左右されると同時に,この行動が健康状態を変える,中の下階級の家計では母親が市場労働を行うと調理といった健康促進行動が阻害されやすい,親が失業すると生まれてくる子どもの健康状態が阻害される,貧しい家計ほど健康状態が悪いという関係は相関関係ではなく因果関係として存在する.まず,資産(豊かさ)と健康状態について,各国で行われてきた研究をサーベイした.サーベイは豊かさと健康状態に関係があるか,何が健康状態を高めているかの2点に絞り行った.そして,サーベイ結果を参考に,日本に関するマイクロデータを用いて以下の点について計量分析を行った.一点目として,予備的な行動により健康状態は高まるかについて,研究者自身が2006年に行った『家計のリスクに関する調査』を用いて分析した.分析により,禁煙や良い食事といった生活習慣や睡眠時間の確保が,将来の健康状態を良くすることが示された.分析にはMulti-Variate Probitモデルを用いており,健康状態が高まりやすい人ほど予備的行動を取りやすいという逆の因果関係による内生性の問題を取り除いている.操作変数として,個人のリスク回避度や時間選好率などの個人属性を用いることで,それらが予備的行動のとりやすさに影響することも確認された.現在,論文を執筆中であり,来年度には学会で報告する予定である.二点目として,豊かさと健康状態の関係について, (財)家計経済研究所による『消費生活に関するパネル調査』(1993-2006年)を用いて分析した.分析により,豊かな家計ほどその後の健康状態が良いことが示された.個人の健康状態は良いか悪いかという2値の回答であり,前年度までに健康だった者は翌年も健康であるといった持続性があるため, Autocorrelationを考慮したDynamic (Panel) Probit Modelを用いた.データとして捉えにくいような個人に特有の性質が健康状態に重要な影響を与える可能性は,固定効果を捉えることで取り除いた.分析にはMaximum Simulated Likelihood Estimationを用いた.現在,論文を執筆中であり,来年度の学会で報告する予定である.1.課題1について:過去2年間で得られた分析結果の公表と刊行平成20年度に,予備的な行動が健康状態に与える影響について「家計のリスクに関する調査」を用いた分析を行っていた.分析の結果,禁煙や睡眠を十分にとるといった予備的な行動が健康状態を高めることが分かった.この分析結果を論文としてまとめ,査読付雑誌に投稿した(現在,査読結果を待っている).2.課題3について:過去1年間に得られた分析結果の公表平成20年度に,(財)家計経済研究所の「消費生活に関するパネル調査」を用いて,豊かさと健康状態の関係を分析をした。そこでは,豊かであるほど健康状態が良いという結果が得られていた.この結果を論文としてまとめた(現在修正している).3.新たな課題について:過去2年間で行った分析の中で必要性が生じた新たな分析の遂行健康格差は親から子どもへ世代を通じて継承または拡大されていく可能性がある.たとえば,親の労働状況や所得格差が生まれてくる子どもの生まれた時点での健康状態の格差をもたらす可能性がある.とくに,世帯主が失業状態であることや家計所得が低いことが,生まれてくる子どもの健康状態を悪化させ,そのような子どもの成長後(就業期)の生産性を低下させる可能性が指摘されている.この点に関する海外での先行研究を広く展望し,サーベイ論文として公刊した.また,日本の県別データを用いて,親の労働環境や貧困が新生児の健康状態を悪化させるかどうかを分析した.分析結果については,学会等で報告の後,学術雑誌に公刊した.本研究の目的は,日本における経済格差と健康格差について,両者の関係やそれぞれの格差をもたらす因果関係を,個票データを用いた分析により明らかにすることにある.今年度はまず,資産格差が健康格差を生み出すかについて,前年度からの分析を継続して行った.前年度は,健康状態について良いか悪いかの2値変数を作り,1時点前の健康状態の影響を含み,誤差項に系列相関を考慮するモデルのプログラムを作成し,豊かであるほど健康状態がよいという結果を得ていた.しかしながら,頑健性を確かめる中で複数の問題を発見した,とくに,パネルデータの脱落問題や,健康を2値変数として捉えることの問題が大きかった.現在,健康をより細かく分けた離散変数について,先決変数と系列相関を考慮した分析を行っている("Health and Wealth Accumulation in Japan"として執筆中.来年12月発表予定).

つぎに,資産階級によって健康を作り出すための行動(具体的には調理という家計生産)に差が存在するかについて分析した.分析には,各家計の毎日の支出項目が詳細に分かるデータを用いることで,家計が食材と時間を投入することで健康によい食事を行っているかに注目した.購入品から家計生産を計測することにより,ほとんどの先行研究で家事労働時間を用いるために生じる測定誤差バイアスの問題が小さくなるという利点もあった.分析の結果,貧しいほど健康に悪い食事を行うという諸外国で見られる関係は日本では必ずしも確認されないことが分かった("Do working mothersreducetheir home production?"として執筆中.6月発表予定).なお,前年度までに分析を完了していた「予防状態と健康状態」については,査読審査をうけ改訂稿を提出したのち採択された(2010年10月掲載済み).本研究の目的は,資産蓄積と健康蓄積の実態について,日本の個票データを用いた計量分析を行い,1.何が予備的貯蓄と予備的な時間投資の同時決定を規定するのか,2.予備的な行動は資産と健康の蓄積結果を変えるのか,3.資産と健康の格差に関係はあるのか,の3点を明らかにすることにあった.前年度までに1,2は終えているため,平成23年度は3について分析を行った.まず,資産階級によって健康を作り出すための行動(具体的には調理という家計生産活動)に差が存在するかについて分析した.分析には,家計毎に毎日の食料品支出が分かるデータを用いて,家計が投入する食材と時間を計測した.分析の結果,生活水準の低い家計ほど家計内で生産される財よりも,健康に良くないと考えられる食料品を市場から購入しやすい,とくに母親がパートタイマーで働いている場合その傾向が見られることが明らかになった.本論文は,9月に『経済研究』に発表し,それを発展させたものを国内外の学会や研究会で発表した.また,豊かな者ほど健康であるのか,資産格差が健康格差をもたらしているのかについて,日本の個人パネルデータに基づき分析した.分析は,健康状態について4段階(悪い,普通,良い,大変良い)で回答された変数を過去5年間の平均資産を含む様々な属性に回帰した.説明変数の一つに前年の健康状態(先決変数)を入れることで,個人の観察されない属性により,資産から健康への因果関係が見えなくなる脱落変数の問題を小さくし,同時に,誤差項の系列相関を考慮したモデルを構築した.分析の結果,豊かな者ほど健康であるという真の因果関係が存在することが明らかになった.また,この因果関係を説明する背景の一つに,豊かな者ほど医療サービスを受けやすいことが示された.この論文は研究会で発表した.
生体に安全で環境にクリーンな低温プラズマ滅菌法の開発

生体に安全な物質を用いて,プラズマ本来の効果による低温滅菌法の開発を目指して研究を遂行した.その結果,窒素,酸素,水,またこれらを混合して生成されたプラズマは,いずれも,ガス流量,ガス圧が適正であれば,滅菌効果やエンドトキシン不活化効果が高くなった.しかし,滅菌効果と素材の適合性が共に最上位である処理条件はみいだせなかった.器材の温度を最優先させるならば,水プラズマが有利であり,試料の変色や真空排気系の結露などの課題が解決されるならば,低温滅菌法の実用化が達成できると思われた.生体に安全な物質を用いて,プラズマ本来の効果による低温滅菌法の開発を目指して研究を遂行した.その結果,窒素,酸素,水,またこれらを混合して生成されたプラズマは,いずれも,ガス流量,ガス圧が適正であれば,滅菌効果やエンドトキシン不活化効果が高くなった.しかし,滅菌効果と素材の適合性が共に最上位である処理条件はみいだせなかった.器材の温度を最優先させるならば,水プラズマが有利であり,試料の変色や真空排気系の結露などの課題が解決されるならば,低温滅菌法の実用化が達成できると思われた.加熱因子でなくプラズマ本来の効果で,しかもできるだけ低温で,生体に安全で環境にクリーンなプラズマ滅菌法の確立を目的として以下の項目を検討した。1.試料台の温度計測:現有プラズマ装置(ワイエイシイ,PACK3,13.56MHz)において,試料台(ステンレス製)の温度変化を熱電対にて計測した。熱電対はプラズマからの電気的な影響を避けるため、測定部を含め全て絶縁体で覆い、回路にはローパスフィルタを設けた。1)石英棚の各段に試料を配置し温度分布を調べた。その結果,予想外にチャンバーの中心が最も低かった。放熱による損失が高い手前の側ほど低温で,外周部ほど高温になる傾向があり,また,上下方向よりヒーターが設置してある横方向での温度が高かった。2)試料台をチャンバーの中心に設置して,装置起動後の温度変化を計測した。その結果,温度が完全に安定するまでに30分要した。2.滅菌効果:試料台に3種の芽胞B.stearothemopyus, B.atrophylus (旧称,B.subtilis), B.pumilusを10^4,10^5,10^6個づつ塗布して,酸素,水を含んだ酸素,空気それぞれにてプラズマ処理(150W;10分;10Pa,25Pa,50Pa)を行い,滅菌効果を検討した.水を含んだ酸素は,H_2O気化供給装置を用いて装置に供給した。その結果:1)酸素が最も滅菌効果が高かった。水を含んだ酸素では,水の比率が小さいほど滅菌効果が高かった。2)ガス圧は低い方が,滅菌効果が高かった。3)3種の芽胞ではB.pumilusに対して滅菌効果が高かった。4)OラジカルやOHラジカルは,現有分光測定器では検出限界以下であった。次年度は,電子顕微鏡観察によりプラズマ処理条件と芽胞の形態変化を調べると共に,高感度の微弱光領域の分光が可能な計測器を導入して,発光スペクトルと滅菌効果との関係を明らかにする。【目的】過酸化水素などの有害物質を用いず,生体に安全な酸素や水をプラズマ化して環境にクリーンな低温滅菌法を開発することである。【方法】10^6個の芽胞(B. Stearothermopylus, B. atrophylus, B. pumilus)を塗布した試料を,プラズマ装置(Pack3,ワイエイシイ)を用いて,出力150W,60°Cにて10分処理した.処理ガスの種類(N_2,O_2,O_2+H_2O),ガス圧(13,48,100Pa),電極(対向,同軸)をパラメータとして,試料の発光スペクトル(C7460,浜松ホトニクス)をピンポイントで測定するとともに,培養法による滅菌効果の検討と試料表面の損傷状態の観察(マイクロスコープ:VC7700R,オムロン)を行った.【成果】1)N_2プラズマでは,真空紫外域をはじめ,発光強度の高いスペクトルが多数検出された.しかし,10^6個の芽胞は3種類とも10分では滅菌できなかった。2)O_2プラズマでは,ガス圧の低い方が活性種の発光強度が高く滅菌効果も高く,対向電極を用いて,13Paで10分処理すると10^6個B. Stea試料はすべて陰性培養を示した。3)"O_2+H_2O"プラズマでは,308nm(OH),656nm(H),777nm(O),845nm(O)に発光強度の高いスペクトルが検出され,バブリング法で水を供給(自然気化量)した場合は滅菌効果が高かったが,加熱気化式水供給装置(SLM:堀場エステック)で水を供給(O_2:44 sccm,H_2O:6 sccm)した場合は滅菌効果が低かった.水供給装置では,各スペクトルの発光強度に変動がみられ,このH_2Oの状態の不安定が滅菌効果に影響を与えている可能性が示唆された。4)同軸電極は,対向電極に比較して,各活性種の発光強度が相対的に低く,滅菌効果が低かったが,試料表面の損傷は小さかった。同軸電極はイオンがトラップされるため,試料へのダメージが少ないものと推察される。

次年度は,試料損傷が小さかった同軸電極について,電極の形状や表面加工に改良を加え,滅菌効果を増大できる方法を検討していく予定である。【目的】プラズマ処理によるエンドトキシンの不活化効果について検討した.また,プラズマ活性種の滅菌機序や滅菌効果を推察する一助として,プラズマ処理後の芽胞形態を検討した.プラズマ処理は工業用プラズマアッシング装置(PACKIII,ワイエイシイ)を用い,同軸電極,出力150W,チャンバー温度60°Cを基本条件とし,キャリアガス(O_2、N_2、O_2+H_2O, H_2O),ガス圧(9100Pa)をパラメータとして, 10分間処理した.【方法】1.表面改質したガラス製バイアルに, LPS(55000 EU, E coli 055 : B5,和光純薬)を10μl滴下し, 37°Cで60分乾燥したものを試料(550EU/バイアル)とした.プラズマ処理後,試料に1mLの注射用水(日本薬局方,大塚製薬)を加え2分間ボルテックスミキサーで撹拌し、リムルスESIIシングルテスト(和光純薬工業)とトキシノメーターET-5000(和光純薬工業)による比濁時間分析法によって残留エンドトキシンを測定した。2. 3種の芽胞(B. Stearthermo pylus, B. Megaterium, B. Cereus)を,表面改質したスライドグラスあるいはステンレス板に5μl滴下し乾燥した後,プラズマ処理して,位相差顕微鏡(オリンパス, BX51)とマイクロスコープ(VC7700R,オムロン)を用いて観察した。【結果】1.残留エンドトキシン量は, 0_2ガス,ガス圧18Paの処理条件で最小値を示し,処理前より4桁減少した. N_2、O_2+H_2O, H_2Oプラズマでも3桁の減少がみられ,プラズマ処理はエンドトキシンの実用的な不活化法になり得ると推察された. 2. N_2プラズマ処理では、一部の芽胞で断裂した像が認められ, O_2や"O_2+H_2O"プラズマ処理では,芽胞の縮小化と細胞の断片が認められ,ガス種により滅菌機序が異なることが明らかとなった.
葉緑体で発生する活性酸素シグナルの調節機構

ROSを介した主なシグナル伝達は、センサー分子のシステイン残基がH2O2と反応してスルフェン酸を形成し、スルフェン酸が修飾を受けることでシグナルが誘導される。スルフェン酸と反応してシグナル伝達を阻害するYAP1を葉緑体に発現させたところ、INF1誘導による細胞死が抑制された。ベンサミアナタバコにPTIとETIをそれぞれ誘導し、クロロフィル蛍光とガス交換速度の測定により光合成活性測定を行った。ETIを誘導するRpi-blb2/AVRblb2は、PSIに連動するCO2固定活性を顕著に抑制した。一方で、PTIを誘導するflg22はCO2固定に影響を与えなかった。さらに、PTIとETIは共にPSII活性に影響を与えなかった。以上の結果から、ETIにおけるCO2固定阻害に起因した過剰なNADPHが、葉緑体でのROS生成に寄与しているものと考えられた。以上より、葉緑体のROSシグナルは、細胞死を誘導する因子に関連した複雑なネットワークを形成しているものと思われた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新たに発見された遺伝性白内障マウスに関する研究:新しい疾患モデル動物の開発

本研究ではddY系マウスに新たに発見された遺伝性白内障の特性を明らかにし、新しい疾患モデル動物として確立することを目的とした。はじめに、遺伝様式を調べた。白内障の肉眼的発症時期は68週齢、発症率は100%、常染色体劣性遺伝であった。組織学的変化は生後3週齢より観察され、FGFとTGF-βの発現増加が白内障の発症に関与することがわかった。次に、水晶体蛋白の発現の変化を調べるため、発症個体ならびに正常個体の水晶体蛋白の泳動を行った。発症個体で減少していた28kDa付近の蛋白のアミノ酸配列を調べたところ、β-crystallin B1であった。行動解析では、オープンフィールドテスト初日における発症個体の移動区画数および立ち上がり数に有意な増加が見られた以外著しい差は認められなかった。続いて原因遺伝子の存在する染色体を明らかにするため、日本産野生マウス(MSM/Ms)との戻し交配世代の発症個体ついて連鎖解析を行った。第2染色体上のマイクロサテライトマーカーD2Jpk4が白内障原因遺伝子と強く連鎖していることが明らかになった。さらに、原因遺伝子の第2染色体上での位置を明らかにするために、戻し交配世代の発症個体332例の連鎖解析より、原因遺伝子はD2Mit515及びD2Mit467Mrrfの1.21cMの領域に位置していることがわかった。この領域に存在する4932702F08Rik及びNADH dehydrogenase 1αsubcomplex,8遺伝子のmRNAの発現の差をPCR-RFLP法によって調べたが、ddY系白内障マウスとddY系正常マウスで差は認められなかった。白内障原因遺伝子の存在する領域はヒト第9染色体上q33.2の領域に相当し、原因遺伝子の解明によりヒトでの相同遺伝子を特定することができると考えられ、ヒトの皮質型白内障モデルとして役立つことが示唆された。本研究はddY系マウスに新たに発見された遺伝性白内障の特性を明らかにし、新しい疾患モデル動物として確立することを目的としている。本年度はddY系遺伝性白内障マウスに関して、以下の成績を得た。1.本白内障マウスの肉眼的発症時期は68週齢で、発症率は100%、遺伝様式は常染色体劣性遺伝であった。2.組織学的に4週齢より水晶体線維の膨化が観察され、36週齢において水晶体上皮細胞のFGF-1、FGF-2およびTGF-βの発現が増加し、FGFとTGF-βの発現増加が白内障の発症に関与することがわかった。3.原因遺伝子の存在する染色体を明らかにするため、日本産野生マウス(MSM/Ms)との戻し交配世代{ddY系白内障マウス×(ddY系白内障マウス×MSM系マウス)}の発症個体ついて連鎖解析を行った。60例全ての個体で第2染色体上のマイクロサテライトマーカーD2Jpk4が白内障ホモを示し、第2染色体上に原因遺伝子が存在することが明らかになった。4.さらに、原因遺伝子の位置を明らかにするために、戻し交配世代の発症個体332例について連鎖解析を行った。原因遺伝子はD2Mit515およびD2Mit467D2Mit320及びD2Mit368の3.91cMの領域に位置していた。5.白内障発症による水晶体蛋白の発現の変化を調べるため、発症個体ならびに正常個体の水晶体から抽出した蛋白の泳動を行った。

発症個体で減少していた28kDa付近の蛋白のアミノ酸配列を調べたところ、β-crystallin B1であった。以上のことから、遺伝性白内障マウスにおける遺伝様式、形態学的特性、原因遺伝子の染色体上での詳細な位置が明らかになった。今後は、本白内障マウスの行動学的特性を明らかにするとともに、原因遺伝子の同定、候補遺伝子の検出ならびにヒトにおける相同遺伝子を明らかにするための実験を計画している。本研究はddY系マウスに新たに発見された遺伝性白内障の特性を明らかにし、新しい疾患モデル動物として確立することを目的としている。本年度はddY系遺伝性白内障マウスに関して、以下の成績を得た。1.走査型電子顕微鏡観察によって3週齢より水晶体皮質領域における線維の膨化が観察された。2.八方向放射状迷路、モーリス水迷路による学習記憶検査並びにオープンフィールド、ロータロッドによる行動解析では白内障発症マウスと非発症マウスの間に著明な差は認められなかった。3.原因遺伝子の詳細な位置を明らかにするため、日本産野生マウス(MSM/Ms)との戻し交配世代{ddY系白内障マウス×(ddY系白内障マウス×MSM系マウス)}の発症個体332例について連鎖解析を行った。その結果、本白内障原因遺伝子はD2Mit515及びD2Mit467Mrrfの1.21cMの領域に位置していることがわかった。4.この領域に存在する既知の遺伝子は7つあり、4932702F08Rik及びNADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex,8遺伝子のmRNAの発現の差をPCR-RFLP法によって調べたが、ddY系白内障マウスとddY系正常マウスで差は認められなかった。5.白内障原因遺伝子の存在する領域はヒト第9染色体上q33.2の領域に相当し、原因遺伝子の解明によりヒトでの相同遺伝子を特定することができると考えられた。以上のことから、遺伝性白内障マウスにおける白内障は皮質型白内障に分類され、原因遺伝子の染色体上での詳細な位置が明らかになった。また、原因遺伝子の存在する領域がヒトでも保存されており、ヒトの皮質型白内障モデルとして役立つことが示唆された。
低蛋白食マウスを用いた腸管出血性大腸菌に対するワクチン開発の基礎研究

ベロ毒素(Stx)産生腸管出血性大腸菌感染に合併する脳症の発症機序を、低蛋白飼育マウス及びヒト血管皮内細胞(HUVEC)培養系で解析し以下の結果を得た。1)感染後2日後から血中にはTNF-αの上昇を認め、34日後にピークに達した。IL-10は感染3日後から徐々に上昇し、56日目にピークに達した。血中ベロ毒素は、感染35日目に検出し得た。脳抽出液中には感染3日後からTNF-αが検出され、6日後には2倍に増加していた。また、感染6日目にはIL-10も検出し得た。2)脳の中性糖脂質中にはStx受容体(Gb3)が存在し、精製Stx2が結合し得ることを認めた。3)感染後5日目以降神経症状を呈したマウスにおいてのみ、感染10日目の脳切片中にアポト-シス細胞が著しく増加していた。4)TNF-α共存下でのみHUVE細胞内へのStx2取り込み、及び分解が亢進することを蛍光色素ラベルStx2を用いた解析から明らかになった。5)TNF-αとStx2の同時添加でHUVEの細胞傷害が著しく亢進し、この傷害は主としてアポトーシスによることが、TUNEL法及び抽出DNAの電気泳動解析から判明した。一方IL-10はこのTNF-αとStx2によるアポトーシスの誘導を抑制し得た。6)TNF-α前処理(6時間)後にStx2を添加した時には、同時添加と同ラベルにHUVEの細胞傷害は顕著であったが、Stx2前処理後にTNF-αを添加しても有意な細胞傷害は認めれらなかった。以上の結果から、感染後血中TNF-αが早期に上昇することから、TNF-αとベロ毒素の共存による血管内皮傷害により、ベロ毒素が中枢系へ移行し得ると考えられた。また、脳内にはベロ毒素の機能的受容体が存在したことから、ベロ毒素によつ直接的神経細胞の傷害が生じるもの推察された。さらに、血中及び脳内で検出されたIL-10はベロ毒素が関与するアポトーシスに対して抑制的に作用することも認められた。低蛋白食飼育で作製したC57BL/6低栄養マウス(protein-calorie malnutrition;PCM)はべ口毒素大腸菌O157に高感受性を示す。本研究ではPCMマウスの易感染性についての基礎的解析、及び病状進行におけるサイトカインの役割について検討を加えた。PCMマウスでは、腸粘膜上皮の発育不良とIgA産生細胞数も正常マウスに比して有意に少なく、非特異的バリアーの低下がPCMマウスのべ口毒素産生性大腸菌O157高感受性の主因であると思われた。コレラ毒素投与によりIgA産生細胞数が増加することで、PCMマウスの感受性が低下したことから、低栄養小児の多い開発途上国であってもコレラ浸淫地域ではE.colj 0157:H7感染発症者が少ないもの考えられた。

PCMマウスにおいて、べ口毒素産生性大腸菌O157感染後急激に産生増強されるTNF-αは、べ口毒素の標的細胞の細胞質内でのcompartmentalizationを亢進させ、アポトーシスを促進することが認められた。また、感染後5日目以降有意に血中上昇するIL-10は抗アポトーシス因子としての役割を担っている可能性がin vitroの解析結果から示唆された。低蛋白状態は正常蛋白食個体に比して極めて微量の内毒素や臓器蛋白によってIL-1、1L-6、TNF-α等の炎症性サイトカインが産生されることが、ヒトのKwashiorkorの解析で明らかにされている。このことから、PCMマウスにおけるこれら炎症性サイトカインの上昇は、感染後血中に吸収された微量の内毒素及びStxによる単球/マクロファージへの刺激が原因となっていると推察された。PCMマウスのべ口毒素産生性大腸菌O157に対する高感受性解析結果から、近年の小児食生活に見られる偏食や高齢者における栄養低下はべ口毒素産生性大腸菌O157に対する感受性亢進の要因になると考えられた。ベロ毒素(Stx)産生腸管出血性大腸菌感染に合併する脳症の発症機序を、低蛋白飼育マウス及びヒト血管内皮細胞(HUVEC)培養系で解析し以下の結果を得た。1)感染後2日目から血中にはTNF-αの上昇を認め、34日後にピークに達した。IL-10は感染3日後から徐々に上昇し、56日目にピークに達した。血中ベロ毒素は、感染35日目に検出し得た。脳抽出液中には感染3日後からTNF-αが検出され、6日後には2倍に増加していた。また、感染6日目にはIL-10も検出し得た。2)脳の中性糖脂質中にはStx受容体(Gb3)が存在し、精製Stxが結合し得ることを認めた。3)感染後5日目以降神経症状を呈したマウスにおいてのみ、感染10日目の脳切片中にアポトーシス細胞が著しく増加していた。4)TNF-α共存下でのみHUVEC細胞内へのStx2取り込み、及び分解が亢進することを蛍光色素ラベルStx2を用いた解析から明らかになった。5)TNF-αとStx2の同時添加でHUVECの細胞傷害が著しく亢進し、この傷害は主としてアポトーシスによることが、TUNEL法及び抽出DNAの電気泳動解析から判明した。一方IL-10はこのTNF-αとStx2によるアポトーシスの誘導を抑制し得た。6)TNF-α前処理(6時間)後にStx2を添加した時には、同時添加と同レベルにHUVECの細胞傷害は顕著であったが、Stx2前処理後にTNF-αを添加しても有意な細胞傷害は認められなかった。以上の結果から、感染後血中TNF-αが早期に上昇することから、TNF-αとベロ毒素の共存による血管内皮傷害により、ベロ毒素が中枢系へ移行し得ると考えられた。また、脳内にはベロ毒素の機能的受容体が存在したことから、ベロ毒素による直接的神経細胞の傷害が生じるもの推察された。さらに、血中及び脳内で検出されたIL-10はベロ毒素が関与するアポトーシスに対して抑制的に作用することも認められた。
細胞質分裂の調節における低分子量GTPaseとそのエフェクターの役割

細胞質分裂の際にミッドボディーやミッドボディー周辺に集積する低分子量GTPaseのARF6とRabll、およびそれらのエフェクターであるArfophlin/FIPとMKLP1に関して、GFPやmCherryのような蛍光タンパク質との融合タンパク質を細胞内で発現させて、タイムラプス顕微鏡法によって細胞内局在の経時変化を観察することに成功した。その結果、RabllとArfophilin/FIPは、分裂しつつある細胞の紡錘体極中心体付近からミッドボディー近傍へとリサイクリングエンドソームを運搬してくるのに対して、ARF6とMKLP1は細胞質分裂の後期にミッドボディーに局在し、おそらくはArfbphlin/FIPからリサイクリングエンドソームを受け取ることによって、1個の細胞が二つの娘細胞へと切断される過程を調節することを明らかにした。また、ドミナントネガティブ変異体を細胞に導入する実験や、RNA干渉法を用いたノックダウン実験によって、RabllがArfophlin/FIPの分裂間期でのリサイクリングエンドソームへの局在を決定するだけでなく、細胞質分裂の際におけるArfophlin/FIPのミッドボディーへの輸送にも関与することを示した。同様の実験によって、MKLP1がARF6のミッドンボディーへの局在を決定することを明らかにした。さらには、共同研究によって、ARF6とMKLP1の複合体に関しては、X線結晶構造の解明に成功した。今後は、これらの構造データに基づいてさまざまな変異体タンパク質を作製し、構造と機能の相関に関する研究を展開する予定である。ARF6とArfbphlin/FIPに関しても、複合体の作製には成功しており、その結晶の作製が進行中である。細胞質分裂を調節する低分子量GTPaseとそのエフェクターに関して次のことを明らかにした。1.ドミナントネガティブ変異体やsiRNA、ノックアウト細胞を用いた実験により、次の(A)と(B)を明らかにした。(A)RabllとARF6の共通のエフェクターであるRab11-FIP3とRab11-FIP4のリサイクリングエンドソームやミッドボディーへの局在は、いずれもRab11によって決定されることを示した。(B)ARF6はミッドボディーに局在して、細胞質分裂の調節に関与すること。2. GFPタグまたはmCherryタグを施したタンパク質を安定に発現するHeLa細胞株を樹立し、タイムラプス解析により次の(C)(E)を明らかにした。(C)RabllとRabll-FIP3/Rabll-FIP4は、細胞分裂の間期にはリサイクリングエンドソームに局在するが、細胞分裂の前期から後期にかけては紡錘体極の中心体近傍に存在するが、終期になると中央部紡錘体の付け根部分にも存在するようになり、細胞質分裂時には中央部紡錘体の中心部分(ミッドボディー)に局在するようになること。(D)ARF6のエフェクターであるMKLPIは分裂前までは核に存在するが、細胞質分裂時にはミッドボディーに局在するようになり、分裂が終わると2つの娘細胞のどちらかに保持されたままになること。(E)ARF6は、細胞質分裂開始時に収縮環に現れ、GTPとの結合に依存してミッドボディーに局在するようになること。
フッ素ＭＲＩマルチカラーイメージングを目指した新規機能性イオン液体ナノ粒子の創製

フッ素MRIのマルチカラーイメージングを目指し、フッ素を有するイオン液体(IL)を用いたイオン液体ナノ粒子(ILNP)の調製とマウスにおける体内動態の評価、およびフッ素MRIプローブの合成をおこなった。その結果、エマルション様のILNPが調製でき、その体内動態においては腎臓に蓄積することが示された。また、癌細胞に高発現しているγ-グルタミルトランスフェラーゼの基質であるグルタチオンを用いて新規にフッ素MRIプローブを合成することができた。本申請課題は、従来のMRIを用いた「癌の画像診断」の問題点(感度が低い、造影剤の特異性が低い、コントラストが低い)を解決するために、機能性イオン液体ナノ粒子とマルチカラーイメージング対応フッ素MRIプローブを新規に開発し、次世代フッ素MRIによる癌のマルチカラーイメージングを達成するための基盤となる研究を行なうことを目的としている。本研究の目的を達成するにあたり、ナノ粒子を形成するためのイオン液体の特性と血中投与後を想定したイオン液体ナノ粒子(ILNP)の安定性を評価することは極めて重要である。初年度は、この2点に重点を置き、これらについて分光学的手法(NMR法や動的光散乱法)を用いて検討した。種々のイオン液体について、分散媒に水、界面活性剤としてSpan80とTween20を用いて乳化し、ILNPを形成するかを調べたところ、メトキシエチルメチルピロリジウムカチオンとビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミドアニオンからなるMEMPTFSIにおいて均一な懸濁液が得られた。この懸濁液をH-NMRやF-NMR、H-H NOESYを用いて詳細に検討した結果、ILNPの形成が確認され、ILNPはイオン液体を分散質とする水中イオン液体(IL-in-water)型エマルション構造を有することが明らかとなった。ILNPの粒子径およびゼータ電位はそれぞれ、100-300 nmと-30 mVであり、室温保存で約1ヶ月は安定であった。次に、体内投与後を想定し、生理食塩水中でのILNPの粒子径変化を測定した。ILNPの粒子径は、生理食塩水中で24時間、調製時とほぼ変わらず一定であった。次年度は、生体投与可能なILNPを創製し、このILNPのマウスにおける血中滞留性および臓器移行性についてF-NMRを用いて明らかにしていく予定である。平成27年度に、マウスにおけるイオン液体ナノ粒子(ILNP)の血中滞留性および臓器移行性といった基礎的な体内動態パラメータについてF-NMRを用いて得る予定であったがまだ得られていない。その理由として、生体投与可能なILNPがまだ完成していないからであった。すなわち、H-NMRやF-NMRを用いてILNP懸濁液を測定したところ、ILNPの形成とともに、一部のイオン液体が分散媒の水中に溶解して、アニオンとカチオンが遊離して存在していることが確認された。遊離のアニオンとカチオンは生体内において毒性を有する可能性があるため、現在、ゲルろ過や透析等の手段により、ILNPを安定な状態に保ちつつ、遊離のアニオンとカチオンを懸濁液より取り除く条件を検討中である。本申請課題は、機能性イオン液体ナノ粒子とマルチカラーイメージング対応フッ素MRIプローブを新規に開発し、次世代フッ素MRIによる癌のマルチカラーイメージングを達成するための基盤となる研究を行なうことを目的としている。初年度において、イオン液体として、メトキシエチルメチルピロリジウムカチオンとビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミドアニオンからなるMEMPTFSIを分散質とした、イオン液体ナノ粒子(ILNP)を調製することができた。今年度は、1)生体投与可能なILNPの調製、2)pHに応じて粒子のゼータ電位を負から正へ反転させるためのノルハルマンの検討、3)癌細胞において特異的にF-NMRシグナルの化学シフトを変化させるF-グルタチオンプローブ(F-Glu)の合成、の3点に重点を置き、実験を行なった。1)について、生体適合性の高いホスファチジルコリンを界面活性剤として用いてILNPが形成されるかについて、前年度と同様、NMRを用いて調べた。その結果、粒子径が180 nm程度のILNPを調製することに成功した。2)について、粒子調製の補助的界面活性剤として用いているパルミチン酸にノルハルマンを結合させ、血液中(pH 7.4)および癌組織中(pH 6.5)を想定した緩衝液中でノルハルマン結合粒子のゼータ電位を測定した。その結果、pH 7.4においては、粒子のゼータ電位は約-30 mVであったが、pH 6.5においては、約0 mVであり、粒子のゼータ電位の上昇が確認できた。3)について、グルタチオンにフッ素含有化合物を付加し、F-Gluを合成した。F-Gluをγ-グルタミルトランスフェラーゼ(γ-GT)存在下でF-NMRスペクトルを測定した。その結果、γ-GT存在下でのF-GluのF-NMRシグナルは、F-Gluのそれよりも高磁場側にシフトすることが分かった。平成28年度に、マウスにおけるイオン液体ナノ粒子(ILNP)の基礎的な体内動態パラメータについてF-NMRを用いて得る予定であったがまだ得られていない。その理由として、界面活性剤を生体適合性の高いホスファチジルコリンに変更したILNPを調製するのに時間を要したからであった。また、ホスファチジルコリンのILNPについて、生理食塩水中で安定性を評価したところ、ILNPが崩壊し、遊離のアニオンとカチオンが大幅に増加して水中に存在していることがわかった。

したがって、現時点において生体中で安定に存在するILNPを調製するには残念ながら至っていない。現在、生体中でも安定なILNPの調製を検討中である。一方、F-グルタチオンプローブ(F-Glu)の実験においてはおおむね順調に進めている。しかし、F-Glu合成後の精製が不十分であり、不純物がわずかに含まれている。現在、精製の諸条件を検討中である。本申請課題は、機能性イオン液体ナノ粒子とマルチカラーイメージング対応フッ素MRIプローブを新規に開発し、次世代フッ素MRIによる癌のマルチカラーイメージングを達成するための基盤となる研究をおこなうことを目的としている。初年度において、イオン液体として、メトキシエチルメチルピロリジウム(MEMP)カチオンとビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド(TFSI)アニオンからなるMEMPTFSIを分散質とした、イオン液体ナノ粒子(ILNP)を調製することができた。次年度は、癌細胞特異的なフッ素MRIプローブとして、グルタチオンを母体とするプローブの開発に成功した。そこで、最終年度は、マウスにおけるILNPの血中滞留性および臓器移行性に関するデータを得ることを目標とした。まず、マウス血液にILNPを添加したin vitro実験においては、TFSIアニオン由来のF-NMRシグナルのブロードニングが観測された。次に、マウスを用いたin vivo実験をおこなった。すなわち、ILNPをマウスの尾静脈から投与し、採取した血液および肝臓や腎臓をホモジネートした懸濁液について、F-NMRを用いて測定した。その結果、TFSIアニオン由来のF-NMRシグナルは血液および肝臓の懸濁液中よりも腎臓の懸濁液中で顕著に大きかった。in vitroおよびin vivoの両実験結果から、ILNPは生体内投与後、速やかに肝臓で分解され、TFSIアニオンとMEMPカチオンに解離するため、疎水性の高いTFSIアニオンの一部は血液の血球中に存在するが、TFSIアニオンの大部分は腎臓に蓄積し腎排泄されていくことが示唆された。フッ素MRIのマルチカラーイメージングを目指し、フッ素を有するイオン液体(IL)を用いたイオン液体ナノ粒子(ILNP)の調製とマウスにおける体内動態の評価、およびフッ素MRIプローブの合成をおこなった。その結果、エマルション様のILNPが調製でき、その体内動態においては腎臓に蓄積することが示された。また、癌細胞に高発現しているγ-グルタミルトランスフェラーゼの基質であるグルタチオンを用いて新規にフッ素MRIプローブを合成することができた。生体投与可能なイオン液体ナノ粒子(ILNP)を早急に完成させる予定である。また、F-MRIマルチカラーイメージングのFシグナル源となるフッ素化合物を付加したグルタチオンを母核とするF-MRIプローブを新規に合成し、ILNPへの溶解性を確認する。また、癌細胞で高発現している酵素であるグルタミルトランスフェラーゼをF-MRIプローブに作用させ、F-MRIプローブの切断前後で、F-MRIプローブの化学シフトが変化するかをF-NMRを用いて調べる。
トランスポゾンを用いた順遺伝学および逆遺伝学的手法に基づくホヤ遺伝子機能の解明

脊索動物カタユウレイボヤにおいて、遺伝子機能解析の基盤構築と遺伝子機能の解明を目指した。高効率の変異体作製方法を確立し、Hox1を中心とする遺伝子の新規機能を解明した。また母性効果遺伝子の新しい抑制法を開発した。組織特異的なマーカーとなる系統を整備し、それを利用して遺伝子機能や神経系のリモデリングの機構を解明した。細胞分裂の周期の可視化技術を導入し、細胞分裂と形態形成運動の調和メカニズムを明らかにした。Sleeping Beautyトランスポゾンによるカタユウレイボヤの新しい遺伝子組換え法を確立した。本研究では、遺伝学的手法が導入された原始脊索動物カタユウレイボヤにおいて、トランスポゾンを用いた技術により突然変異体を単離する基盤を形成することを目的としている。本年度はエンハンサートラップと遺伝子ターゲッティングに着目して研究を進めているため、これら2つの項目に分けて報告する。1.ホヤのエンハンサートラップについての基礎的情報を集める必要性から、トラップ系統から50種類のトランスポゾン挿入箇所を同定した。その結果、エンハンサートラップ系統の持つトランスポゾン挿入のおよそ半数が遺伝子のごく近傍、または遺伝子内に挿入を持つこと、約10%の挿入はエクソンに挿入されており遺伝子を破壊している可能性が非常に高いことが判明した。また決定された挿入箇所の中には、Hox1の上流およそ300bpの領域への挿入が含まれていたが、このようにプロモーター内部に挿入を持つ系統についても遺伝子を破壊する可能性が十分考えられた。実際にこの挿入を持つ系統はHox1のプロモーターを破壊した変異体であることを突き止めた。これらの一連の研究から、エンハンサートラップ系統を元にした突然変異体単離が十分機能することが判明した。2.遺伝子ターゲッティング法について、ターゲッティングに必要なI-SceI及びCre-loxPがホヤで機能することを突き止め、ターゲッティングベクターを持つ系統、Cre-loxP系統、I-SceI系統の作製を開始した。カタユウレイボヤの卵でMinosトランスポゾンの転移酵素を発現させる系統を作製し、それを利用してゲノム中のMinos単一挿入を転移させる新たな系を構築した。それを利用してMinosがゲノム中をランダムに移動することが明らかとなった。このことからMinosが大規模挿入変異体作製に適していることを突き止めた。また本手法で作製される系統のおよそ15%がエクソンに挿入されており、それらの系統は変異体の有用なリソースになることを突き止めた。前年度の本研究からHox1遺伝子の変異体が単離された。Hox遺伝子は発生や進化を研究する上で欠かせない重要な遺伝子であり、その機能を得られた変異体から明らかにすることを進めた。結果、Hox1遺伝子が表皮でレチノイン酸により誘導され、出水口原器の形成に働いていることを突き止めた。逆遺伝学的手法として、遺伝子ターゲッティング法の導入を目指している。I-SceI系統、Cre-loxP系統、ターゲッティングベクター系統が作製されたため、現在これらの系統の掛け合わせを進めている。またカタユウレイボヤにおいて母性因子を介したGFP遺伝子のサイレンシングが生じることを明らかにしてきた。本年度はその現象を応用し、母性で発現する遺伝子を特異的にノックダウンする新技術を開発した。遺伝学的手法が導入された原始脊索動物カタユウレイボヤにおいて、トランスポゾンを用いた技術により突然変異体を単離する基盤を形成することを目的としている。高効率に変異体を作製できるトランスポゾンベクターの構築は遺伝子機能の解明において必須である。今年度の研究においてUAS-Gal4システムを応用した新しいエンハンサートラップベクターが、従来のベクターよりも高効率に遺伝子内に挿入されることを突き止めた。具体的には、このベクターのおよそ80%が遺伝子近傍に挿入された(従来のベクターは約60%)。つまり新しいベクターにより構築された挿入系統は変異体のよいソースとなる。実際にこのベクターにより作製された系統から変異体をスクリーニソグし、新奇核内受容体と脱リン酸化酵素をコードする遺伝子が破壊されたと推定される変異体を単離した。カタユウレイボヤでは、Minosが形質転換に利用できる唯一のトランスポゾンであった。Minosに加えてもう一つのトランスポゾンの利用がホヤの遺伝学の発展に効果的である。本年度の研究において、Sleeing Beauty(SB)トランスポゾンの活性型フォームがカタユウレイボヤにおいてMinosと同程度の効率で形質転換を引き起こすことを突き止めた。このトランスポゾンの転移酵素を生殖細胞で発現させた系統も作製済みであり、今後その系統を用いて変異体作製ベクターとしての利用を目指したい。組織分化や細胞動態を可視化することは変異体の表現型の観察に重要である。

本研究にて幼生の中枢神経系をKaede蛍光タンパク質で可視化した系統を作製した。その系統を使いホヤホヤ成体の中枢神経系が形成されるメカニズムや遺伝子Ptf1a,Hox10の機能を解明した。また細胞周期可視化プローブをホヤに導入し、初期胚の表皮細胞で観察される特徴的な細胞周期変動が神経系の形成に必須であることを突き止めた。