hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ガンジスカワイルカの生態解明のための高精度長期音響観測システムの開発と展開・運用

研究最終年度である平成26年度においては、平成25年度までの6シーズンにわたり実施した定点での長期音響観測により取得し専用サーバーに集積したイルカデータを基に、統合的データ解析を実施、イルカのエコーロケーションクリックのICI(Inter-click Interval:クリックの発振間隔)を主要パラメタとする解析を行い、大人のガンジスカワイルカの単独移動時には、ICIは比較的長いが(30msec60msec程度:つまり22m45m先を音響的に見ている)、生後6ヶ月までの子供のイルカがいるグループの移動時には、相互に短いICIから構成されるクリックトレイン(Buzzと呼ばれる)を頻繁に発振している(10msec以下)ことを突き止めた。他の歯クジラ類の観測からBuzzは捕食およびコミュニケーションに用いられると推定されており、Buzzは何らかのコミュニケーションツールとして用いられている可能性がある。この事から、一頭のイルカが発している短いICIの連続するクリックを自動検出できるアルゴリズムを開発、膨大なデータから子供のイルカを含むイルカグループの抽出を容易に行うことができるようになった。また、今後は、目視情報なしで、グループ内に子供のイルカがいるかどうかを推定することが可能である。次ぎに移動型観測用アレイシステムについては、25年度の洪水後の緊急センサスでの運用成果を基にフィードバックを行い、ハンドリングが容易でロバスト性の高いコンパクトなものへと改良を行い、環境ノイズの多いボルネオ島・マハカム河のカワゴンドウの曳航によるセンサスで機能検証試験を行い、フィルタリングによるイルカの軌跡の自動検出という課題残したが、目視と合致する頭数のイルカの軌跡検出に検出した。今後は、定点観測システムと移動観測システムを組み合わせた高精度な広域イルカ音響観測システムによる多様な流域での観測を提案していく。26年度が最終年度であるため、記入しない。音響工学26年度が最終年度であるため、記入しない。リアルタイムデータ転送システムを利用したデータベースを構築しより、イルカデータ、環境データ、録音システムログデータを1時間毎にアップロード、さらにフィルタリング機能、ICIやCF解析機能を付加することで、現在進行形のデータの高精度解析することが可能となった。また、音響カメラの導入により観測場所の環境のみならず生態系を理解することが可能となり、総合的システムの構築が期待される。定点観測ステーション近傍を行き来するガンジスカワイルカの移動あるいは滞留中のICI(Inter-Click Interval)の変化のトレンドに着目することで、子供のイルカを含むグループのイルカのクリックトレインのICIの値は、移動中でも12msec以下のものを多く含むことが新たに判明してきた。短いICIのクリックトレインはバズーと呼ばれ、捕食やコミュニケーションに用いると報告されている。長期観測で取得した膨大なデータを解析することで、ガンジスカワイルカの社会行動について解明するため、取得した音響データから1頭のイルカのバズーを自動検出できるソフトを開発し検討を進めている。
自然の分析美学-自然・環境・アルス

本研究は「自然」「環境」「風景」といった基本概念を分析哲学の方法を用いて精査した上で、これらの基本概念を自然美、風景、廃墟、人造自然、われわれの内なる自然をテーマとするアブジェクト・アート、環境アート(エコ・アート)といった具体的な美的現象や美的経験、また現代アートの記述・分析に適用することで、近代美学や現代の環境美学がまだ十分に解明するにはいたらない上記の問題群を解明することをめざした。その成果は、平成23年11月に出版された単著『プラスチックの木でなにが悪いのか-環境美学入門』(勁草書房)のかたちで公開された。本研究は、芸術を中心に構築されてきた近代以降の美学・芸術哲学においてはともすれば無視されてきた自然、風景、環境における美的現象や美的経験を、広い意味での人間の「アルス(術)」との関わりを軸に新たに主題的にとりあげ記述・分析しようとするものである。このテーマは70年代以降欧米の環境美学、環境保護論、環境倫理で論じられつつあるものの、日本の美学研究においてはまだ目だった研究はほとんどないのが実情である。また欧米における研究でも、そこで前提されている「自然」「風景」「環境」といったコンセプト自体が混乱しているために、十分な成果を上げているとはいいがたい。本研究はその新たなコンセプトを提示し、これらに関わる美的現象や美的経験を記述・分析するために近代美学を脱構築することに挑戦するものである。本研究は、まず上記の基本概念を分析哲学の方法を用いて精査した上で、これらの基本概念を自然美、風景、廃墟、人造自然、われわれの内なる自然をテーマとするアブジェクト・アート、環境アート(エコ・アート)といった具体的な美的現象や美的経験、また現代アートの記述・分析に適用することで、近代美学や現代の環境美学がまだ十分に解明するにはいたらない上記の問題群を解明することをめざした。これによってえられた具体的な研究成果の相当部分は、平成23年11月に出版された単著『プラスチックの木でなにが悪いのか-環境美学入門』(勁草書房)および平成24年3月の編著『日常性の環境美学』(勁草書房)のかたちで公開され、前者の本についてはたとえば日本経済新聞紙上での書評(平成24年2月11日)で極めて高く評価された。
椎間板ヘルニア退縮における血行新生の過程の解明と生理的椎間板ヘルニア溶解術の開発

椎間板ヘルニアは整形外科領域で最も多く見られる疾患の1つであるが、椎間板ヘルニアには経時的にヘルニア塊が減少する自然退縮機序が存在することがわかっている。また、ヘルニア急性期を再現したモデルで、浸潤マクロファージと椎間板細胞の相互作用により、炎症性サイトカインであるTNF-αが血管新生因子であるVEGFや、タンパク分解酵素であるMMP-3およびMMP-7を強誘導することが明らかとなり、これらがヘルニア塊の分解やマクロファージの椎間板浸潤に機能していることが判明した。本研究では炎症性サイトカインや血管新生因子、各種タンパク分解酵素の経時的な発現を検討することにより、椎間板ヘルニアの退縮過程ではどのようなカスケードが構成されているのかを考察した。急性期椎間板ヘルニアのin vitroモデルを用い、活性型マクロファージと椎間板組織の共培養、およびそれぞれの単培養を行った。TNF-α、VEGF、MMP-3、MMP-7、plasminのマクロファージおよび椎間板組織での各mRNAの発現と、培養液からのタンパクレベルでの各分子の発現を、それぞれ経時的に検討した。共培養の環境により、マクロファージから最初にTNF-αの発現が増強され、続いてVEGF、Plasmin、MMP-3の発現が確認された。また、同じモデルを用い、培養液中にTNF-α中和抗体を加えたところ、plasminタンパクの発現が阻害された。今回の結果と既知知見を考察すると、椎間板ヘルニアの生理的な自然退縮カスケードが次のように想定される。まず、活性型マクロファージがTNF-αを強発現する→TNF-αがVEGF、MMP-7、MMP-3を誘導する→VEGFがplasminogen activatorを活性化してPlasminを誘導する→plasminがMMPsを活性化する→MMPsがmatrixを分解する、という過程である。炎症性サイトカインであるTNF-αはヘルニア退縮過程において炎症のイニシエーターとして働き、血管新生と各種酵素の発現を行うkey moleculeであるといえる。このカスケードを詳細に検討することは、今後の臨床応用に非常に有用であろうと考えられた。成人の正常椎間板組織は無血管野である。一方、腰椎推問板ヘルニアの検体には血管新生と炎症性細胞の浸潤を認めることが多い。腰椎椎間板ヘルニア保存治療例を対象に造影MRI検査を行うと、脱出型椎間板へルニアには多く造影効果を認め、また造影されたヘルニア塊は多くの場合自然退縮することがわかった。今回、椎間板ヘルニアにおける血管新生や炎症性細胞の組織浸潤のメカニズムについて、血管新生促進因子であるVEGFに着目して検討した。これまで我々は椎間板ヘルニアの急性期炎症を反映するモデルとして椎間板組織とマクロファージを共培養するシステムを開発し、軟骨の構成成分を強力に分解する能力をもつMLP-3やMMP-7、炎症性サイトカインであるTNF-αが強発現をすることを確認しているが、今回はマウス軟骨細胞であるATDC-5とマウスマクロファージ細胞であるWEHI-3Bを用い、それぞれの細胞培養液にマウスリコンピナントTNF-α、VEGF、抗TNF-α中和抗体を加えて培養を行った場合の変化を経時的に調べた。

ATDC-5を培養後2日目に採取したRT-PCRでは、MMP-3、MMP-7、VEGFの発現が見られた。マウスリコンピナントTNF-αを加えた場合、培養後2日目、4日目でMM-3の発現が増強され、6日目には低下していた。VEGFの発現も培養4日目で増強された。VEGFを加えた場合、培養後2日日MMP-3、MMP-の発現が増強されたが4日目には元に戻っていた。VEGFにより活性化されMMPsを活性化するといわれているurokinase-type Plasminogenactivater(u-PA)は2、4、6日目共に何も加えない場合と変化なく発現していた。一方、WEHI-3BではMMP-7、VEGFが強く発現していた。マウスリコンビナントTNF-αを加えた場合、培養後2日目でVEGFの発現が抑制され、抗TNF-α中和抗体を加えた場合、培養後2日目からMMP-7の発現が抑制された。u-PAの発現は認めなかった。以上より、TNF-α、VEGF、MMP-3、MMP-7の相互間で、軟骨細胞側、マクロファージ側でそれぞれ制御のカスケードがあると思われるが、他の分子の動き、あるいは反応早期の動きをさらに詳しく調べる必要がある。椎間板ヘルニアの退縮過程で血管新生を分子により制御可能となれば、促進因子を増強することにより生理的にヘルニア治遼が行える可能性がでてくると考えている。椎間板ヘルニアには経時的にヘルニア塊が減少する自然退縮機序が存在する。また、ヘルニア急性期を再現したモデルで、浸潤マクロファージと椎間板細胞の相互作用により、炎症性サイトカインであるINF-αが血管新生因子であるVEGFや、タンパク分解酵素であるMMP-3およびMMP-7を強誘導することが明らかとなり、これらがヘルニア塊の分解やマクロファージの椎間板浸潤に機能していることが判明した。本研究では炎症性サイトカインや血管新生因子、各種タンパク分解酵素の経時的な発現を検討することにより、椎間板ヘルニアの退縮過程ではどのようなカスケードが構成されているのかを考察した。急性期椎間板へルニアのin vitroモデルを用い、活性型マクロファージと椎間板組織の共培養、およびそれぞれの単培養を行った。TNF-α、VEGF、MMP-3、MMP-7、plasminのマクロファージおよび椎間板組織での各mRNAの発現と、培養液からのタンパクレベルでの各分子の発現を、それぞれ経時的に検討した。共培養の環境により、マクロファージから最初にTNF-αの発現が増強され、続いてVEGF、plasmin、C、MMP-3の発現が確認された。また、同じモデルを用い、培養液中にTNF-α中和抗体を加えたところ、plasminタンパクの発現が阻害された。これらの結果と既知知見を者察すると、次のようなカスケードが想定される。まず、活性型マクロファージがTNF-αを強発現する→TNF-αがVEGF、MMP-7、MMP-3を誘導する→VEGFがplasminogen activatorを活性化してplasminを誘導する→plasminがMMPsを活性化する→MMPsがmatrixを分解する、という過程である。炎症性サイトカインであるTNF-
生体内で軸索末端に投与された神経栄養因子に反応する神経細胞体の同定法開発

神経栄養因子の神経細胞死抑制効果は知られているが、生体内ではこの因子を受け取る場所と核のある細胞体が極めて離れている為、従来の方法では標的組織に投与した神経栄養因子に応答する神経細胞体を特定し、細胞内でどの様な変化が起こるのかを検討することは不可能であった。本研究は新生ラット足底に神経栄養因子を投与し、そこに投射するであろう神経細胞体で幾つかのマーカーとなりうるタンパク発現を経時的に観察することにより、神経栄養因子に反応する神経細胞の同定法の確立を試みた。1.H15年度よりGDNF・NGF・BDNFなどについて検討し、各々段階的な量を新生ラット足底に投与した後、経時的に試料作成し検討した結果、過去の論文から応答する可能性が示唆されるニューロンにおいて特有のパターンを以てc-Fosタンパク質の発現が上昇することを観察した。一方CREBやSTAT3リン酸化など複数のマーカーを検討したが、正常状態で一定の発現がありc-Fosのような明瞭な結果は得られなかった。2.本方法で応答する神経細胞が投与部位を支配するものか否かを、化学標識した神経栄養因子の逆行輸送により検討した。軸索末端からDigoxigenin標識の因子が取り込まれる事は電子顕微鏡的に確認できたが、検出の技術的問題と予想するが、c-Fos陽性の細胞体でそれを検出することはできなかった。しかし神経切断や軸索輸送ブロック実験によりc-Fos発現誘導に軸索輸送が不可欠であること、また解剖学的に応答した神経細胞の位置と投与部位が一致する為、応答する神経細胞が投与部位を支配していると考えられる。3.神経栄養細胞に応答した神経細胞とその細胞の神経栄養因子受容体発現に相関が認められた。以上の結果からc-Fosをマーカーとした本方法は、生体に投与した神経栄養因子に反応する神経細胞体を組織学的に効率的に検出する方法となると考えている。神経栄養因子の活性評価は主にin vitro系で行われている。本研究は生体内で外因性に投与した神経栄養因子に対して応答する神経細胞を同定する簡便な方法を確立する事を目的とし、ラット足底へ神経栄養因子を投与後、脊髄前角・後根神経節(DRG)細胞等、投与部を支配する神経細胞がc-Fosなどのタンパクの発現誘導を起こすか杏かを詳細に検討するものである。今年度は、当初計画に従い神経栄養因子としてNGFおよびGDNFについて検討を行った。新生ラット足底にNGF(5200ng)を投与した場合、投与後10時間後に第4第5腰椎レベルの少数のDRG細胞がc-Fos陽性像を示す事を確認した。しかし、脊髄前角運動神経細胞には何の変化も見いだされず、投与量による変化も見られなかった。一方、GDNFを投与群では、DRGではNFG同様第4第5腰椎レベルの少数の神経細胞がc-Fos陽性を示したが、脊髄においてはNGFと異なり多数の前角運動神経細胞にc-Fos陽性像が観察された。また、投与量510ngでは、およそ支配領域に一致する投与側のDRG・脊髄前角細胞が陽性を示したが、50ng以上の投与では対象側を含め観察した殆どの脊髄前角細胞が陽性を示した。この反応は投与後12時間で最大になった.また、投与前に坐骨神経を切断する実験モデルでは低容量投与時の反応は抑制したが、高容量投与時の反応は影響されなかった。これは、低容量の場合、GDNFの効果が神経性に軸索を逆行輸送されニューロンのc-Fos発現に影響を与えたものであると考えられ、一方高容量の場合は血行性に働いた可能性を示唆している。即ち、GDNFの場合は至適投与量10ng、足底投与後1014時間後という条件において、投与部位支配領域に相当する脊髄前角細胞等のc-Fos発現が本研究の目的を達成する指標となりうることを明らかにしたと考えている。

3.神経栄養細胞に応答した神経細胞とその細胞の神経栄養因子受容体発現に相関が認められた。以上の結果からc-Fosをマーカーとした本方法は、生体に投与した神経栄養因子に反応する神経細胞体を組織学的に効率的に検出する方法となると考えている。
リボソームにおけるK63ユビキチン化と新規ユビキチン鎖形成促進機構の解析

分裂酵母を材料にリボソームにおけるK63ユビキチン鎖と機能制御、ならびにRNAによる新規K63ポリユビキチン鎖形成促進メカニズムについて解析した。in vitroにおいてUbc13/Mms2依存的K63ユビキチン鎖形成反応は、あるbuffer条件下で核酸によって強く促進されることを発見した。核酸の配列依存性や鎖長等を検討した結果、核酸の長さが促進に重要であること、配列依存性はみられないことが明らかになった。さらに、Ubc13/Mms2ヘテロダイマーが直接核酸に結合することが反応促進に必須であることが明らかになった。分裂酵母リボソームも含め、核酸によるユビキチン鎖形成促進メカニズムに着目した。K63鎖ポリユビキチン化による細胞内機能制御、ならびにポリユビキチン鎖形成促進メカニズムに着目し研究を進めている。分裂酵母を用いた解析から、リボソーム結合タンパク質Cpc2の免疫沈降複合体中にはリボソーム小サブユニットとともに未知のユビキチン化タンパク質が存在していることをこれまでに見出している。Cpc2がUbc13/Mms2と2-hybridで相互作用することから、リボソームによる翻訳機構の制御にK63ユビキチン化が関わる可能性がある。そこで、Cpc2複合体中にK63ユビキチン鎖が含まれているかどうかを、K63ユビキチン鎖特異的抗体を用いて検討した。しかしユビキチン化タンパク質量が微量なこともあり、現在までに明確な結果は得られていない。そこでCpc2複合体の精製をスケールアップし、得られた複合体をウェスタンブロットならびに質量分析で解析する準備を進めている。これによりK63鎖の存在だけでなく、複合体中のタンパク質を網羅的に解析することが可能になると期待される。Mms2破壊株やUbc13破壊株を用いた解析も進めている。またin vitroのUbc13/Mms2依存的K63ユビキチン鎖形成反応が、あるbuffer条件下においてRNAやDNAによって強く促進されることをこれまでに見出している。この促進メカニズムを明らかにするために、核酸の長さや配列依存性などを検討した。その結果、核酸の長さが促進に影響すること、配列依存性はみられないことが明らかになった。次に、Uba1、Mms2、Ubc13、UbのDNA結合能を解析した。その結果、Ubc13/Mms2ヘテロダイマーにした場合にバンドがシフトしたことから、Ubc13/Mms2が直接核酸に結合することが反応促進に重要であると考えられた。現在は構造データを参考に、核酸との結合に重要な残基の探索を進めている。これからの解析がさらに進むことによって、将来的には核酸によるK63ユビキチン鎖形成促進の生物学的意義にまで理解が進むことを期待している。in vitroのUb化アッセイに関して予定していた実験はほぼ完了し、核酸による促進についてUbc13/Mms2の核酸結合が重要であることを明らかにできた。この知見はこれまでに報告例もなく、新しい発見であり、インパクトも大きい。さらにvivoでの意義が明らかにできれば、この分野のさらなる発展が期待できる。今後の展開が大いに期待される。一方で、リボソームにおけるK63ユビキチン化の解析があまり進んでおらず、これが今後の課題となっている。日々解析方法や試薬などの技術進化が進んでおり、積極的に情報を取り入れるように心掛けている。その中でも期待されるのは質量分析法である。複合体精製プロトコールは確立できたので、こちらも順調に遂行できると考えている。これまでの解析に引き続いて、K63ユビキチン鎖の形成についてはUbc13/Mms2依存的なin vitroでの解析が順調に進んでいる。昨年度の解析では、核酸がこの反応を促進する条件等を明らかにした。詳細な核酸結合実験の結果、E2酵素であるUbc13/Mms2複合体が直接核酸に結合することが反応促進に重要であることが示唆された。そこで平成28年度では、Ubc13/Mms2と核酸の結合に着目して解析を行なった。まず、構造データを参考に、核酸との結合に重要な部位の探索を進めた。ドッキング予測プログラムであるZDOCKを用いてUbc13/Mms2複合体と各種核酸(dsRNA, dsDNA, ssDNA)の結合を予測した結果、いずれの核酸もUbc13とMms2のヘテロダイマーを形成するジョイント部分近傍へのドッキングが予測された。これまでのin vitroの解析結果からは、核酸によるK63ユビキチン鎖の形成促進はUbc13やMms2単体では見られていないことから、Ubc13とMms2のヘテロダイマー構造と核酸結合能が深く関わっていることが示唆された。ZDOCKプログラムはタンパク質表面形状の相補性や静電ポテンシャルなどを考慮した予測結果を示すことから、核酸との結合に重要と思われる数か所のアミノ酸残基を予測し変異体スクリーニングを進めている。核酸結合に重要なアミノ酸残基を同定することで、in vivoにおける核酸依存的なK63ユビキチン鎖形成の意義についての理解につながると期待している。

核酸の配列依存性や鎖長等を検討した結果、核酸の長さが促進に重要であること、配列依存性はみられないことが明らかになった。さらに、Ubc13/Mms2ヘテロダイマーが直接核酸に結合することが反応促進に必須であることが明らかになった。分裂酵母リボソームも含め、核酸によるユビキチン鎖形成促進メカニズムに着目した。設備環境面では分裂酵母をラージスケールで高効率に破砕することが可能になった。複合体を用いた解析を積極的に進めていきたい。また、分裂酵母で見られた本結果について、ヒトや出芽酵母のin vitroユビキチン化系を用いた解析で普遍性を検討したい。DNA組換え・修復
RANKL/Fasを介した関節リウマチにおける骨軟骨破壊機構の解明

本研究の目的はRANKLシグナルとFasシグナルのクロストークの解明から、破骨細胞の活性化・維持機構を明らかにするとともに、関節リウマチ(RA)病変へのRANKL/Fasシグナルクロストークが及ぼす影響の解明と新たなRA診断・治療法を開発することである。RA自然発症モデルマウスであるFas遺伝子欠損MRL/lprマウスを用いてその破骨細胞の機能解析を行い、同マウスでの破骨細胞の機能亢進が、骨および軟骨破壊を伴うRA病態で重要な役割を果たしていること、RANKL/Fasシグナルクロストークが破骨細胞の分化および活性化、S1Pを介した破骨細胞前駆細胞の遊走能機能を制御している可能性が示唆された。本年度はまず、RANKL(Receptor activator of NF-kB Ligand)シグナルおよびアポトーシスに関わるFasシグナルを介した骨および軟骨破壊機構を解明するために自己免疫性関節リウマチ自然発症モデルマウスであるFas欠損MRL/lprマウスの破骨細胞の分化および機能について詳細に解析を実施した。Macrophage-colony stimulatingfactor (M-CSF)およびRANKL添加下にて培養した骨髄由来の破骨細胞はMRL/lprマウスにおいて対照マウスと比較して著しく増加し、骨片上での骨吸収能の亢進やアクチンリングの増大も認めた。マイクロCT解析にてMRL/lprマウスの大腿骨では対照マウスに比べて骨密度の低下を認め骨粗鬆症様および関節表面の骨吸収の所見がみられた。さらに破骨細胞の分化や機能に関わる遺伝子群の発現(nuclear factor of activated T cells c1; NFATc1、TRAP、Cathepsin K、c-Fos、NF-kB1サブユニットp50, p65)はMRL/lprマウスにおいて著しく亢進していた。以上のことより、MRL/lprマウス破骨細胞の機能亢進が骨および軟骨破壊を伴う自己免疫性関節リウマチ病態において重要な役割を果たしていること、破骨細胞におけるRANKL/Fasシステムが破骨細胞の分化および骨吸収機能に関与している可能性が示唆された。現在、破骨細胞遊走に関わるケモカインおよびその受容体の動態を検討中である。本年度はまず、平成25年度に得られた結果を基にして、関節リウマチや変形性顎関節症などといった病的状況下における脂質メディエーターを介した血球系由来の破骨細胞、間葉系由来の軟骨細胞の細胞遊走能に関する解析を実施した。関節リウマチなどの自己免疫疾患などの炎症状態では血液中の脂質メディエーターの一つであるS1P(sphingosine-1-phosphate)濃度が上昇することが報告されている。そこでMRL/lprマウス由来破骨前駆細胞のS1P遺伝子発現量を対照群と比較したところ有意に上昇を認め、前駆細胞の遊走能が亢進していることが判明した。破骨細胞ではS1PレセプターであるS1PR1, S1PR2を介して遊走能が制御されていることが最近報告されていることからMRL/lprマウス由来破骨前駆細胞におけるS1PR1, S1PR2発現量を解析したところmRNAレベルでの強い発現がみられた。破骨前駆細胞を培養し、M-CSF, RANKL存在下にて4日間培養後、トランスウェルメンブレン上で12時間培養した。メンブレンの外のメディウム中にS1Pを添加しておくことで、S1Pに対する遊走細胞がメンブレンを通過し、96ウェルプレート上に移動する。その遊走細胞数を蛍光プレートリーダーにより測定した。対照マウス由来破骨前駆細胞と比較して、すべてのS1P濃度においてMRL/lprマウス由来OC前駆細胞の遊走能が高いことが示された。本年度は、平成26年度に得られた結果を基にして、変形性顎関節症などの病態における脂質メディエーターを介した血球系由来の破骨細胞、間葉系由来の軟骨細胞の細胞遊走能に関する解析を実施した。Smad3 KOマウス下顎頭をマイクロCTにて撮影し、形態学的解析を行ったところ下顎頭形態の粗造化がみられ、骨密度が有意に低下していた。さらに、サフラニンO染色、トルイジンブルー染色にてSmad3 KOマウス下顎頭では野生型マウスに比較して経時的な軟骨領域の減少が認められ、Mankinスコアにおいても軟骨破壊の重篤度が増していた。また、免疫染色を行うことで軟骨形成マーカーは減少し、軟骨分解マーカーやアポトーシス分子の増加が認められたことからもSmad3は変形性顎関節症を呈することがあきらかとなった。ATDC5細胞においてはSmad3遺伝子発現抑制により、TGF-β1刺激による細胞遊走能亢進効果が低下した。Smad3 KOマウスの下顎頭において、S1P3発現の著しい低下が認められた。それをもとに、野生型の下顎頭由来軟骨細胞においてS1P3遺伝子発現抑制を行ったところ、TGF-β1刺激によるRac1、RhoA、Cdc42活性化が低下し、細胞遊走能も抑制された。これらの検討より、Smad3/S1P3シグナル経路が健常な顎関節の恒常性維持ばかりでなく、変形性顎関節症の病態形成においても重要な役割を果たしていることが示唆された。RA自然発症モデルマウスであるFas遺伝子欠損

MRL/lprマウスを用いてその破骨細胞の機能解析を行い、同マウスでの破骨細胞の機能亢進が、骨および軟骨破壊を伴うRA病態で重要な役割を果たしていること、RANKL/Fasシグナルクロストークが破骨細胞の分化および活性化、S1Pを介した破骨細胞前駆細胞の遊走能機能を制御している可能性が示唆された。関節リウマチや変形性関節症における骨破壊のメカニズムを解析することを当該年度の目標としており、S1PおよびS1Pレセプター発現調節を中心とした破骨細胞や軟骨細胞の遊走能による病態関与を明らかにした点で、大筋の目標は達成できたと考えているが、さらに詳細な検討を必要とする。さらに、研究成果発表および論文掲載の準備を進めている段階であることから、概ね順調に進展していると考えられるが、さらに詳細な検討を必要とする。27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学今後は平成26年度に得られたin vitroを中心とした結果を基にして、インビボイメージングを用いた標識破骨前駆細胞の各臓器への集積状況の観察を実施する。Ex vivoにて標識し移入した破骨前駆細胞がRA疾患モデルマウスレシピエントにおいて骨髄、脾臓やリンパ節など免疫系臓器を中心とした各臓器への遊走能および集積状況を観察するために、インビボイメージングにてXenoLight DiR(シアン系近赤外線蛍光色素)で標識した破骨前駆細胞の動態および集積状況を移入直後から経時的に観察しRA病態との関連性を探る。関節リウマチ自然発症MRL/lprマウスの破骨細胞の分化および機能について詳細に解析することを当該年度の目標としており、マイクロCT解析にてMRL/lprマウスの大腿骨では対照マウスに比べて骨密度の低下を認め骨粗鬆症様の所見がみられ、また破骨細胞の関与を明らかにした点でほぼ計画通りの進捗状況であり、来年度の計画もすでに道筋をたてている。今後はMRL/lprマウス由来破骨細胞のin vivo系での影響を詳細に検討するため、破骨細胞前駆細胞を膝関節に移入し、末梢免疫細胞や関節リウマチ病態への影響を遊走に関わるケモカインを中心に解析する予定である。以上の内容の実験を遂行する上ではハード面、ソフト面ともに問題はない。昨年度研究発表を予定していた学会を一部取りやめた為、繰越金が生じた。昨年度研究発表を予定していた学会を一部取りやめた為、繰越金が生じたが今年度の学会参加および資料収集のために使用する予定である。
相補性下群色素性乾皮症の紫外線誘発突然変異感受性の解析

色素性乾皮症(XP)には除去修復欠損型としてA群からG群まで7つの遺伝的相補性群がある。欧米に比し、日本ではA群とF群の患者が多い。A群と異なってF群では精神神経症状を伴わず,皮膚症状は軽く皮膚がん発症も中年以降で遅い、紫外線DNA損傷に対する修復能欠損の程度はA群XP細胞が最も強く,F群細胞では正常人細胞に比べ極めて緩徐ながら,ある程度の修復効率を示す.従って紫外線が誘発する致死損傷と発がん性突然変異誘起損傷の関係をより深く理解するために,A群XP患者,F群XP患者,正常人,の三者に由来する細胞の比較が役立つものと考えられる。特に緩徐修復が突然変異誘起損傷の固定にどのように影響するかが重要である。そこで申請者等が樹立したF群XPリンパ芽球様細胞におけるUV誘発変異頻度を調べ,これまでに観察しているA群XP,C群XP,正常人由来細胞の実験結果と比較して量的,質的差異を究明することを目指した.その結果,(1)相補性F群色素性乾皮症(XP)患者由来リンパ芽球様細胞は遠紫外線の細胞致死作用に高感受性であったが,その程度はA群細胞よりも軽く,ほぼC群細胞に近かった.(2)6チオ・グアニン抵抗性を指標とする遠紫外線誘発突然変異に対して,F群XP細胞は高感受性で,A群細胞には及ばないが,C群細胞よりも線量あたりの誘発変異頻度は高かった.(3)正常人細胞,A群XP細胞,F群XP細胞各の紫外線誘発6チオ・グアニン抵抗性変異体クローンを増殖せしめ,HPRT遺伝子cDNAを合成,PCRによる増幅の後,直接DNAシーケンシングを行って変異塩基配列の同定を開始している.色素性乾皮症(XP)には除去修復欠損型としてA群からG群まで7つの遺伝的相補性群がある。そこで申請者等が樹立したF群XPリンパ芽球様細胞におけるUV誘発変異頻度を調べ,これまでに観察しているA群XP,C群XP,正常人由来細胞の実験結果と比較して量的,質的差異を究明することを目指した.その結果,(1)相補性F群色素性乾皮症(XP)患者由来リンパ芽球様細胞は遠紫外線の細胞致死作用に高感受性であったが,その程度はA群細胞よりも軽く,ほぼC群細胞に近かった.(2)6チオ・グアニン抵抗性を指標とする遠紫外線誘発突然変異に対して,F群XP細胞は高感受性で,A群細胞には及ばないが,C群細胞よりも線量あたりの誘発変異頻度は高かった.(3)正常人細胞,A群XP細胞,F群XP細胞各の紫外線誘発6チオ・グアニン抵抗性変異体クローンを増殖せしめ,HPRT遺伝子cDNAを合成,PCRによる増幅の後,直接DNAシーケンシングを行って変異塩基配列の同定を開始している.
翻訳後修飾によるヘムオキシゲナーゼの機能調節とその破綻による疾患発症との関係

ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、生体内でヘムを分解して代謝的にCOを発生する酵素として知られているが、過剰のCO生成は生体毒となるため、HO活性は厳密に制御されていると考えられる。本課題においては、その活性制御の鍵となる翻訳後修飾を探ることを目的としている。これまでHOは、ミクロソーム酵素として知られていたが、前年までも研究結果において、各種刺激によって、ミトコンドリア、核、カベオラなど、種々の細胞内小器官に局在することが明らかになった。今年度は、特に核に移行したHOの翻訳後修飾に着目して研究を進めた。A549細胞、およびNIH3T3細胞をHypoxiaで刺激した後、免疫沈降法によってHO-1を単離し、Peptide-Mass-Fingerprinting法によるMS解析を行った。その結果、核に局在するHO-1は膜結合部分が完全に排除されていることが確認された。MS/MS解析によって詳細な配列解析を行った結果、Ser275とPhe276のアミノ酸間で切断されていることが明らかになった。そこで、この部分の点変異体(S275A, F276L)を作成した。この変異体をA549細胞にトランスフェクトし、Hypoxiaで刺激した後、HO-1の局在を調べた結果、核内への局在は観測されなかった。また、昨年度同定した核内局在HOのアセチル化部位であるLys243とLys256の変異体(K243A, K256A)を作成し、その性質を調べた結果、野生型よりも細胞内寿命が長くなることが確認された。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、生体内で代謝的にCOを生成する唯一の酵素であり、内因性のCOの大部分は、HO反応によって生成される。一方で過剰のCO生成は生体毒となるため、COの発生源であるHOの活性は厳密に制御されていると考えられるが、その詳細は明らかではない。一方、HOはこれまで小胞体膜結合型酵素として知られていたが、我々のこれまでの研究では、カベオラや核内にも存在することが明らかになり、その細胞内寿命は各局在によって異なることが考えられた。今回、HO1とHO2およびその膜貫通領域を排除した可溶型酵素のcDNAをpcDNA31にサブクローニングし、A549, NIH3T3, PC3, HEK293T, renal cellにトランスフェクトし、各種誘導剤を用いて、その細胞局在について検討した。その結果、Rat renal cellをCo-PPXで刺激した場合にはミトコンドリアに、A549、PC3をheminで刺激した場合には、それぞれミトコンドリア、細胞質、核に局在することが明らかになった。また、NIH3T3をhypoxiaで刺激すると核に優先的に局在することを明らかにした。さらに、マウス腹膜マクロファージをLPSで刺激すると、HOはカベオラに優先的に局在することを明らかにした。一方、前年度までに我々は、HOが高度にユビキチン化されることを明らかにしていた。そこで今回、HCT116をプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブで処理すると、HO1のLys39, Lys69, Lys86, Lys148, Lys153, Lys243がユビキチン化されることを質量分析によるペプチドマッピングによって同定した。当初、翻訳後修飾の有無に着目して検討する予定だったが、これまでの実験によって、HOは小胞体だけではなく、ミトコンドリア、核、カベオラなど様々な細胞小器官に局在することが明らかになり、その局在のメカニズムが翻訳後修飾によるものかどうかを検討することにした。一方で、前年度までに、HOがユビキチン化されていることを証明していたため、並行してそのユビキチン化部位の決定を行った結果、いくつかのリジン残基の修飾を同定することができた。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、生体内で代謝的にCOを発生する酵素として知られているが、過剰のCO生成は生体毒となるため、HO活性は厳密に制御されていると考えられる。これまでHOは、ミクロソーム酵素として知られていたが、前年までも研究結果において、各種刺激(Hemin, Hypoxia, LPS)によって、ミトコンドリア、核、カベオラなど、種々の細胞内小器官に局在することが明らかになった。今年度は、核に移行したHOの翻訳後修飾に着目して研究を進めた。核に移行するタンパク質の多くは、リジン残基がアセチル化されることが知られている。そこで、NIH3T3をHypoxiaで刺激した後、免疫沈降法によってHO-1を単離し、Peptide-Mass-Fingerprinting法を行った。その結果、Lys243とLys256がアセチル化されていることが明らかになった。さらに、核に局在するHO-1は膜結合部分が排除されていることも確認された。HEK293細胞にHO-1とp300, CREB-biding protein(CBP)をトランスフェクトし、HO-1特異的抗体で免疫沈降すると、p300, CREB-biding protein(CBP)が共沈してくることを明らかにした。逆にP300, p300, CREB-biding protein(CBP)の特異的抗体で免疫沈降すると、HO-1が共沈してくることも併せて確認された。

Lys243は、前年までの研究結果において、ユビキチン化される残基でもあり、この残基を変異させたHO-1を作成し、その機能について検討中である。当初、翻訳後修飾の有無に着目して検討する予定だったが、前年度の結果によって、HOは各種刺激に応答して、核やカベオラなど、各種細胞小器官に広く局在することが明らかになった。今年度は、その局在移行に関わる翻訳後修飾の1つとして、核内タンパク質のアセチル化に着目して研究を進めた。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、生体内でヘムを分解して代謝的にCOを発生する酵素として知られているが、過剰のCO生成は生体毒となるため、HO活性は厳密に制御されていると考えられる。本課題においては、その活性制御の鍵となる翻訳後修飾を探ることを目的としている。これまでHOは、ミクロソーム酵素として知られていたが、前年までも研究結果において、各種刺激によって、ミトコンドリア、核、カベオラなど、種々の細胞内小器官に局在することが明らかになった。今年度は、特に核に移行したHOの翻訳後修飾に着目して研究を進めた。A549細胞、およびNIH3T3細胞をHypoxiaで刺激した後、免疫沈降法によってHO-1を単離し、Peptide-Mass-Fingerprinting法によるMS解析を行った。その結果、核に局在するHO-1は膜結合部分が完全に排除されていることが確認された。MS/MS解析によって詳細な配列解析を行った結果、Ser275とPhe276のアミノ酸間で切断されていることが明らかになった。そこで、この部分の点変異体(S275A, F276L)を作成した。この変異体をA549細胞にトランスフェクトし、Hypoxiaで刺激した後、HO-1の局在を調べた結果、核内への局在は観測されなかった。また、昨年度同定した核内局在HOのアセチル化部位であるLys243とLys256の変異体(K243A, K256A)を作成し、その性質を調べた結果、野生型よりも細胞内寿命が長くなることが確認された。HOが様々な誘導剤、刺激剤、細胞種によって局在が変化することが明らかになったため、その局在の変化にも翻訳後修飾が関係している可能性がある。そこで、HO寿命に係るユビキチン分解の解明と並行して、各種局在型HOの翻訳後修飾の有無についても検討を行っていく予定である。HOが様々な刺激によって、局在が変化することが明らかになったため、その局在移行に関与する翻訳後修飾を明らかにしていく予定である。さらに、その翻訳後修飾がHOの機能ならびに、生理機能にどのように関係しているのかについて検討を行う予定である。年度末に発注した合成オリゴおよび海外発注品のELISAキットの納品が次年度になったため。当初予定していた研究計画から若干の修正を行ったため、使用予定だった抗体量および質量分析用の試薬量に変更が生じたため上記の合成オリゴおよび海外発注品のELISAキットの納品はすでに完了している。
一細胞α線照射ライブイメージングによる体内局所被ばく影響評価

本研究は、生体内局所における内部被ばく影響を細胞スケールで解明し、とくに未知のことが多いバイスタンダー効果の組織・臓器特異性について、その解析系を確立し、ミクロレベルでの実態を明らかにすることを目指している。高LET放射線による生体分子損傷情報が細胞内あるいは細胞間を伝播する過程をミクロスケールでライブイメージングできるよう、一細胞防照射システムをこの解析用に改良することから研究に着手した。本年度はまず、細胞照射用線源である、Po-210の精製分離作業を行った。その後、細胞照射用の微小線源(直径25μメートル)を作成し、固形放射線検出樹脂CR-39等を用いた細胞照射範囲の測定を行った。その結果、極めて純度の高い微小なPo-210アルファ線源であることを確認、線源から放出されるアルファ線のエネルギーは5.3MeVであり、アルファ線以外の放射線はほぼ検出されないことを確認した(アルファ線放出比99.999%)。線源の強度(放射能)については数Bq数十Bqのものを作成した。すなわち、一個の細胞に照射するために必須の微小な点線源の準備が整ったことを確認した。ただし、この線源由来のアルファ線がが実際に細胞のヒットした際のイオン数とエネルギーについては、その測定系の目途は今年度中にはたたなかった。今後の継続課題である。ライブイメージングに適したバイスタンダー効果マーカーの探索については、アポトーシスやDNA二本鎖切断修復に関連する因子を対象に選定を行った。マーカー探索については引き続き令和元年度も継続する。さらに、今年度は三次元照射に必要となるマニピュレータの増設を予定どおり行った。また、ガラスキャピラリーを工作するためのプーラーも導入した。プーラーの操作には習熟が必要であることが判明したため、当初の研究計画よりも早めに導入し、機器の操作習熟訓練等を開始した。1一細胞を標的としたα線照射を行うための微小線源の作成、ならびにその性能確認については予定通りである。2ライブイメージングに適したバイスタンダー効果マーカーの探索については、当初の計画通りのタイムスケジュールで進んでいる。3細胞にヒットするイオン数およびエネルギー評価を行うための解析系については、いくつかの手法を試行したものの、完成の道筋がたっていない。やや遅れてが出ている。4当初計画では平成32年度(令和2年度)以降に予定していた三次元照射の検討について、予定を早めて一部の機器を導入し三次元照射系の開発の準備を開始した。上記14の項目を総合して自己点検を行った結果、おおむね順調に進展していると評価できるとした。今後は、当初の計画通りにライブイメージングに適したバイスタンダー効果マーカーの絞り込みを行う、これについては既にいくつかの候補となる因子があるため、これを順に検証していくことになる。細胞にヒットするイオン数およびエネルギー評価を行うための解析系については、全く新しい手法を考案するか、イオン数及びエネルギーを直接的に計測するのではなく、間接的に計測する方法に切り替える方法を検討する。三次元照射系についても、専用キャピラリーの作成や照射方法の検討等を進めながら、ドロップ型の三次元臓器・組織照射の実現を目指す。

4当初計画では平成32年度(令和2年度)以降に予定していた三次元照射の検討について、予定を早めて一部の機器を導入し三次元照射系の開発の準備を開始した。上記14の項目を総合して自己点検を行った結果、おおむね順調に進展していると評価できるとした。今後は、当初の計画通りにライブイメージングに適したバイスタンダー効果マーカーの絞り込みを行う、これについては既にいくつかの候補となる因子があるため、これを順に検証していくことになる。細胞にヒットするイオン数およびエネルギー評価を行うための解析系については、全く新しい手法を考案するか、イオン数及びエネルギーを直接的に計測するのではなく、間接的に計測する方法に切り替える方法を検討する。三次元照射系についても、専用キャピラリーの作成や照射方法の検討等を進めながら、ドロップ型の三次元臓器・組織照射の実現を目指す。平成32年度に購入予定であったプーラー(プーラ・ナリシゲ社)を、予定を早めて購入したため、次年度使用額が生じた。これについては、消耗品等の購入に充てる予定である。
国際組織の活生化と停滞のメカニズム 加盟国による役割・機能付与に注目して

三年目の本年は、研究成果をまとめることに力を注いだ。(1)国際組織を活用することが米国の軍事行動を長期化させることを発見したという論文、(2)米国の国際組織活用の傾向が経済情勢と分割政府(divided government)によって左右されるという議論を展開する論文を作成した。当初から予定していたように、英語で論文を執筆し、現在、投稿中である。本については既に年度の初めにJournal of Politicsに対して投稿を行ったが、三人のレフェリーのうち、一人が即掲載可、一人が条件付で掲載可、一人が掲載不可の裁定を下し、最終的には不採用になった。問題は理論部分が弱いこととされ、その点について継続的に修正を施した。また、二本目の論文を執筆した。年度の後半は二つの論文について校正を繰り返した。現在、Journal of Peace ResearchおよびJournal of Conflict Resolutionに対して投稿を行っている。本年度中に成果を掲載できなかったことは残念であるが、早期に上記で挙げたような北米の学術雑誌に掲載される論文を仕上げたいと考えている。なお、このプロジェクトで作成したデータセットは論文を学術雑誌上に発表した段階でホームページを通じて公表する方針である。また、2004年4月にシカゴで開かれるMid-west PoliticalScience Associationの年次大会で成果報告を行う予定である(Duration of the US Use of Force and Institutional Effects of Multilateral Military Actions)。二年目の本年は、国際組織の活性化を決定付ける条件の分析を進めた。主に、「国際組織が法的な意味で役割を強化される」、または「加盟国の自由な行動を制約する」という二つの側面において国際組織の制度化が進む条件を見出した。具体的には、アメリカ合衆国のラテンアメリカにおける二つの軍事行動(キューバ危機とドミニカ介入)を分析し、そこにおける「正当化の戦略」の違い(積極的な正当化・消極的な正当化)に応じて、国際組織が先にあげた二つの意味で制度化されるか否かを検証した(業績1「国際制度と集団的正当化米国の軍事行動における制度選択の分析」『国際政治』)。結果、積極的な正当化を行った場合に限って国際組織の制度化が進むという暫定的な結論を得た。なお、このための資料調査としてテキサス州のジョンソン大統領図書館での一次史料の収集を行った。このほか、前年度に重点的に研究を行った統計分析(Why does the United States Differentiates Its Approaches to Military Action?)に関して、英語での学会報告を行い、学術論文での発表を試みた。二つの学会報告(2002年10月中旬、米国リッチモンドで開催されたISA-South/ISSS/ISAC会議および、2003年2月末、米国ポートランドで開催されたISA-Annual会議)を行うことができたが、学術論文としての発表に関してはアメリカのある学会誌について掲載不決定となった。次年度は再度英文での成果発表を目指して努力する予定である。
パーキンサス属原虫の天然海域のアサリへの影響評価とアサリ資源回復のための特性解明

アサリに寄生するパーキンサス属原虫の攻撃試験によって、この原虫はアサリに致死的で、致死的な感染強度は106cells/g軟体部重量であることが示された。アサリ資源が大きく減少した有明海の定点で3年間調査した結果、この海域では感染率は100%に対し、最大感染強度が致死的感染強度と同じくらいに達するとアサリ生息密度が減少した。これらより、本原虫はアサリ資源の減耗要因になっていることが強く示唆された。パーキンサス属原虫が天然海域のアサリ資源に与える影響、ならびにパーキンサス属原虫寄生強度と環境の影響を明らかにすることを目的として、以下の4点について研究を実施した。(1)アサリに寄生するパーキンサス2種のリアルタイルPCRによる定量法の開発:Perkinsus olseniとP.honshuensi2種の増幅のために設計したプライマーの特異性ならびにアサリからのDNA抽出法を検討した。その結果、アサリ組織にパーキンサスそれぞれの種の培養栄養体を添加したものを標準試料とし、アサリからChelex樹脂をもちいて抽出したDNAをテンプレートとして、それぞれの種に対する定量法を開発することができた。(2)定点調査によるアサリのパーキンサス感染状況の把握:アサリ資源の減耗が顕著な有明海の一地点に定点を置き、アサリ生息数のつぼ狩り調査とパーキンサスの感染状況を調査した。その結果、パーキンサス寄生強度は106細胞/g軟体部湿重量に達し、夏季にアサリの著しい減耗が起きることが明らかとなった。(3)各地域のアサリにおけるパーキンサス感染状況調査:浜名湖、有明海、東京湾、三河湾などの様々な環境に生育するアサリにおけるパーキンサス原虫の寄生状況を種別に調べたところ、P.honshuensisの感染強度は検出限界以下であり、パーキンサスの感染強度は比較的塩分の低い海域では感染強度が低い傾向があった。(4)パーキンサス培養株からの遊走子作出法の開発:Perkinsus broth mediumで培養した栄養体をAFTM培地で培養した後、再びPerkinsus broth mediumに戻すという手法で遊走子を作出することができた。ただし、遊走子遊出率はP.olseniでは30-40%に達するのに対し、P.honshuensisでは5%以下と低く、今後さらに改良する必要がある。(1)攻撃試験の効率化を目的として、Perkinsusolseni遊走子の作出方法の最適化を図った。その結果、培養した栄養体を注射したアサリの外套膜と鯛からトリプシン処理によって前遊走子を集める手法を開発した。(2)P.olseniのアサリへの病害性を、異なるサイズのアサリ稚貝(殻長3-4mm)と幼貝(殻長10mm前後)を用いて、かつ水温を変えて調べた。その結果、どの条件でも感染によってアサリが死亡するが、病害性は高温ほど強く、また、小型の個体ほど高いということが分かった。また、アサリが死亡する感染強度は野生アサリにおいて最も高い感染強度とほぼ同等であったことから、パーキンサス原虫の感染は野生アサリの重要な減耗要因になっていると推察された.(3)22年度と同様に、アサリ資源の減耗が顕著な有明海の一地点にでアサリ生息数のつぼ狩り調査とパーキンサスの感染状況を調査した。その結果、パーキンサス寄生強度は106細胞/g軟体部湿重量に達し、新規加入群では夏季にアサリの著しい減耗が起きること、前年加入群では4月頃から減耗が始まり夏季まで継続することが明らかになった。(2)の結果と合わせ、パーキンサス原虫の感染は野生アサリの重要な減耗要因になっていると結論することができた。(4)未感染アサリの放流試験:、(3)の定点調査時に未感染アサリをかごに入れて放流し、一ヵ月後に回収して、寄生強度を調査した。その結果は、アサリへのパーキンサス原虫の侵入は厳冬期の除いてほぼ通年生じていることが明らかになった。(5)異なる環境における感染状況調査:比較的狭い海域で塩分濃度が異なり、かつ天然アサリ幼貝が広く分布している浜名湖において各地点における天然アサリにおける感染強度をRFTM培地でしらべた。その結果、浜名湖内でも場所によって感染強度が大きく異なることが分かった。しかし、それぞれの地点の塩分濃度の変化が不明で、詳細な解析ができなかった。1.パーキンサス属原虫2種のうち、アサリの死亡要因となっていると考えられるPerkinsus olseniについて塩分濃度15-30の間で攻撃試験をした。その結果、アサリが通常生息している環境では、塩分濃度はパーキンサスの体内増殖に影響しないことが実験的に明らかとなった。2.18°Cから30°Cの間で、幼貝(殻長5mm前後)成貝(殻長20mm前後)に対してP. olseniによる攻撃試験を行った結果、水温が高いほど高い致死性が観察された。

また、幼貝では体内の栄養体が急速に増殖するのに対し、成貝では栄養体の増殖は遅く、死亡も遅延した。水温サイズによらず、栄養体密度がおおよそ平均10E6細胞/g重量でアサリの死亡が始まった。3.アサリ資源の減少が著しい有明海定点において寄生状況とアサリの減耗状況の調査を継続した。これまで同様、おおよそ106E細胞/g重量が寄生強度の最大値であり、アサリの月齢が進むにつれ寄生強度の低い個体が減少した。また、寄生強度が高水温時に10E6細胞/g重量に達する時期に、アサリ個体群の減耗が著しくなった。また、感染実験によって10E6細胞/g重量程度に人工的に感染させたアサリを干潟上に1か月間設置する実験を3回おこなったところ、人工的に感染させたアサリは有意に高い死亡率をしめした。23の結果から、パーキンサス原虫が野生所歌でもアサリの死亡を引き起こしていることがあきらかとなった。4資源状態が良好な2海域でのパーキンサスの寄生状況を調査した。いずれの海域でも3の有明定点と比較して寄生強度が極めて低かった。これらの海域では塩分濃度が低いことのパーキンサス感染の低さにつながっていると考えていたが、1の結果を考え合わせると、塩分濃度がパーキンサスの感染を抑制しているとは言えず、今後他の要因の関与についても検討していく必要がある。攻撃試験とフィールド調査により、パーキンサス原虫がアサリの重要な減耗要因になっていることを示すことができた。また、P.honshuensisはP.olseniに比べて著しく感染強度が低く、減耗要因としてはほぼ無視できることから、今後の減耗要因の研究はP.olseniに集中できることもわかり、今後の研究の労力の軽減にもつながった。24年度が最終年度であるため、記入しない。パーキンサス原虫がアサリの重要な減耗要因になっていることを示すことができた。今後は、アサリ増殖場の改良を目的としてパーキンサス原虫が感染しにくあるいは感染しても影響が少ない環境要因を明らかにすることが重要である。これまでの調査では、塩分濃度が重要なファクターになっていることが推察されることから、塩分濃度が増殖に及ぼす影響を攻撃試験とフィールド調査で明らかにしていく。