hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト心筋の収縮応答性の計測による心臓収縮を引起こす電気的興奮伝導の非侵襲的可視化

心臓の収縮は,電気的興奮が洞房結節で発し,心臓全体の心筋に伝導して始まる。もし,これら心筋興奮の伝導経路と電気的刺激到来後の心筋収縮の伝搬速度を非侵襲的に可視化できれば,心不全や心筋梗塞など重篤な心疾患において心臓壁の心筋細胞各々の画期的診断が可能となる。本研究では,1心臓壁内での電気的興奮の伝導経路,2電気的興奮に伴う心筋の応答性・伝搬速度に関する断層像,を可視化する全く新しい超音波計測法を開発し,心筋特性の診断法の確立を目指す。
ソヴィエト期ロシアにおける統治構造の形成-ボリシェヴィキの政治文化に着目して

最終年度である本年度は、本申請研究全体の成果として、革命期ロシアに成立した体制の特質を、「労働を通じたネイション・ビルディング」という観点から解明することに成功した。具体的には、革命期に展開された一連の集団労働を、「ソヴィエト共和国」という政治共同体の構成員を創出する行為として捉えた。そのような行為は、ネイション・ビルディングの側面をもつと同時に、「国家が所有する労働力」という人間観にも支えられていた。結果として、ソ連期ロシアにおけるネイション・ビルディングは、国家への依存度が非常に高い「公民」を生み出すこととなったのである。本申請研究の成果として得られた以上の認識は、ソ連期ロシア史が世界史の中でもつ普遍性と特殊性の両方を、「労働を通じたネイション・ビルディング」という独自の観点から明らかにするものである。またこの認識は、現代ロシアの状況を考える上でも、大きな意義をもつと考えられる。上述の成果は、本年度においては、次頁記入の論文4本、および学会報告2本、1)「革命期ロシアにおける労働、コミューン、ネイション」、ロシア史研究会年次大会(成蹊大学)、2005年10月23日、2)「農村統治とロシア都市:県・市合同、1918-1921」(露語)、国際研究会議「20世紀ロシア農民史研究」(東京大学経済学部)、2005年11月13日、により部分的に公表された。さらに昨年度(2005年3月)提出の博士論文「革命期ロシアにおける国家運営と民衆統合--モスクワ市から見る」の審査を東京大学大学院人文社会系研究科(西洋史)にて行ない、合格した。これにより2005年10月、博士号(文学),を授与された。この博士論文は本申請研究の成果を総合したものであり、現在出版を目指して加筆修正を行なっている。提出した研究予定に基づき、内戦期ロシアにおけるボリシェヴィキ政権の諸政策について、行政機構の組織化を中心にして分析を進めた。並行して、首都モスクワ市における党組織と行政機構の動向についても分析を進めた。その成果として論文「内戦期のモスクワにおける党と行政」を執筆した。これは『スラヴ研究』(北海道大学スラブ研究センター)2004年4月、51号に掲載される予定である。ヴェ・ペ・ブルダコーフ(所属:ロシア科学アカデミー・ロシア史研究所)と共同で、ロシア史研究会2002年度大会についての学会報告「日本のスラヴ研究者の年次大会」(露文)を『祖国史』(モスクワ)、2003年8月、4号に発表した。翻訳は、J.バーバー「ソヴィエト研究の意義と将来」を『思想』、2003年8月、第952号に、ヴェ・ペ・ブルダコーフ「20世紀初頭のロシア帝国に関する現代の論争」を『ロシア史研究』、2003年10月、第73号にそれぞれ発表した。2003年7月に北海道大学スラブ研究センターに滞在し、同センターの夏期シンポジウムに出席するとともに史料収集に従事した。9月から10月にかけてモスクワに滞在し、史料収集に従事するとともに、現地の研究者との意見交換を行なった。10月のロシア史研究会年次大会の共通セッション「ロシア史における国家イデオロギー」においてコメンテーターをつとめた。研究予定に基づき、内戦期ロシアにおけるボリシェヴィキ政権の諸政策について、労働動員を中心に分析を進めた。その成果として、博士論文「革命期ロシアにおける国家運営と民衆統合-モスクワ市から見る」を作成し、東京大学大学院人文社会系研究科に提出した(現在審査中)。論文「内戦期のモスクワにおける党と行政」を『スラヴ研究』(北海道大学スラブ研究センター)2004年4月、51号、1-25頁、に発表した(査読あり)。史料紹介「内戦期モスクワのアルヒーフ史料-革命家と官僚制」を『歴史と地理』(山川出版社)、2004年11月、第580号、26-32頁、に発表した。2004年7月、第7回北海道大学-ソウル大学ジョイント・シンポジウム(於北海道大学)で、ソウル大学のKim Namsub氏の報告に対するコメンテーター(英語)を務めた。

さらに昨年度(2005年3月)提出の博士論文「革命期ロシアにおける国家運営と民衆統合--モスクワ市から見る」の審査を東京大学大学院人文社会系研究科(西洋史)にて行ない、合格した。これにより2005年10月、博士号(文学),を授与された。この博士論文は本申請研究の成果を総合したものであり、現在出版を目指して加筆修正を行なっている。
NKT細胞受容体Vα14Jα18遺伝子再構成に関わるクロマチンダイナミクス

NKT細胞は、均一なVα14Jα18受容体を発現し、CD1d分子上に提示された糖脂質抗原を認識する特殊なリンパ球である。今回、この特徴的なT細胞受容体の遺伝子再構成における分子機構を明らかにすべく、Vα14プロモーターに結合する転写因子の観点からの解析を加えた。DNA配列解析・プロモーター配列を用いたDNAプルダウン・未熟NKT細胞のRNA-seq解析などにより、23種類の候補遺伝子を選定し、うち18遺伝子のノックアウトマウスの作成によりその機能を確認した。その結果、2系統のマウスにおいて、顕著なNKT細胞の減少が確認され、NKT細胞分化に重要な遺伝子であることが強く示唆された。本研究では、NKT細胞特異的遺伝子再構成に際するクロマチン構造変化を捉え、その制御因子の同定の試みを通して、NKT細胞系列決定機構の一端を明らかにすることを目的とする。1.細胞分化に伴うVα14Jα18受容体遺伝子領域クロマチン構造の時間的変動NKT細胞の核移植によって作成したNKTクローンマウスよりES細胞を作成し、NKT-ES細胞として使用した。OP9-DL1システムにてNKT-ES細胞からNKT細胞への分化誘導を行い、その分化過程におけるVα14領域のクロマチン構造変化の指標としてヒストン修飾をChIP-qPCR法にて確認した。その結果、初期状態ではヘテロクロマチン状態にあることが確認され、T細胞受容体α鎖の発現に伴いユークロマチン状態への変化が確認された。また、PcG複合体の主要構成因子の一つである分子AがNKT細胞の分化に必須であることが確認され、Vα14領域への分子Aの集積も確認されたことから、PcG複合体がNKT細胞分化に重要である可能性が示唆された。2.Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子の同定NKT細胞において、Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子を同定するために、Vα14遺伝子配列を利用したDNAプルダウンアッセイを実施し、複数の結合タンパク質を同定した。また、Vα14プロモーター部位に特異的に結合配列が存在する転写因子群の存在も確認した。現在これらの候補制御因子について、CRISPR/Cas9をを利用しノックアウトマウスを作成中である。27年度研究計画に記載した「細胞分化に伴うVα14Jα18受容体遺伝子領域クロマチン構造の時間的変動」については順調に解析が進んでいる。クローンマウス由来LSK細胞よりiLS細胞を作成し使用する予定であった。iLSの誘導には成功したが、T細胞受容体遺伝子の再構成に起因すると考えられる分化促進が認められ、iLS細胞の特徴である未分化性の維持が困難であったため、使用を断念した。しかしながら、クローンマウスより樹立したES細胞を用いて本課題の進捗を得た。また、28年度以降の計画として記載した「Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子の同定」について、一部同定が完了したため、上記区分を選択した。本研究では、NKT細胞特異的遺伝子再構成に際するクロマチン変化を捉え、その制御因子の同定の試みを通して、NKT細胞系列決定機構の一端を明らかにすることを目的とする。1.細胞分化に伴うVα14Jα18受容体遺伝子領域クロマチン構造の時間的変: NKTクローンマウスより作成したNKT-ES細胞を用い、ESからNKT細胞への分化過程におけるVα14領域のクロマチン構造変化を、ヒストン修飾を指標としてChIP-qPCR法にて確認した。2. Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子の同定: NKT細胞において、Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子を同定するために、Vα14遺伝子配列を利用したDNAプルダウンアッセイを実施し、複数の結合タンパク質を同定した。また、プロモーター部位のDNA配列解析の結果、Vα14プロモーター部に特異的に結合配列が存在する転写因子群の存在も確認した。NKT-ES細胞を利用し、TCR Cα下流に蛍光レポーターを挿入したマウスを作成した。本マウスにおいてはNKT細胞受容体α鎖の発現をモニターでき、胸腺におけるNKT細胞受容体α鎖発現直後の細胞(NKT前駆細胞)を検出することが可能となる。NKT前駆細胞を分取し、発現遺伝子をRNA-seq法にて確認した。その結果、NKT前駆細胞特異的に発現する遺伝子群の存在を確認した。3.同定された候補因子のNKT細胞受容体Vα14Jα18遺伝子再構成への関与:同定された制御因子候補についてCRISPR/Cas9を用いて10系統の遺伝子欠損マウスを作成した(現在13系統を追加で作成中)。遺伝子欠損マウスの解析を進め、2系統においてNKT細胞の著減を確認した。また、1系統においてサイトカイン産生の減少を確認した。現在これらの減少が遺伝子再構成への関与によるものか否かを確認中である。27年度研究計画に記載した「細胞分化に伴うVα14Jα18受容体遺伝子領域クロマチン構造の時間的変動」については解析を終了している。28年度以降の計画として記載した「Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子の同定」については、複数の観点からの検討により、候補因子の同定をほぼ終了した。

同定した候補因子についての遺伝子ノックアウトマウスの作成も順調に進み、「Vα14/Jα18遺伝子領域への集積因子について、遺伝子再構成への関与を検証」の項に関する結果も収集中であり、一部ポジティブな結果を得ている。以上の進捗状況により、上記区分を選択した。本研究では、NKT細胞特異的遺伝子再構成に際するクロマチン変化を捉え、その制御因子の同定の試みを通して、NKT細胞系列決定機構の一端を明らかにすることを目的とする。1.細胞分化に伴うVα14Jα18受容体遺伝子領域クロマチン構造の時間的変: NKTクローンマウスより作成したNKT-ES細胞を用い、ESからNKT細胞への分化過程におけるVα14領域のクロマチン構造変化を、ヒストン修飾を指標としてChIP-qPCR法にて確認した。2. Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子の同定: NKT細胞において、Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子を同定するために、Vα14遺伝子配列を利用したDNAプルダウンアッセイを実施し、複数の結合タンパク質を同定した。また、プロモーター部位のDNA配列解析の結果、Vα14プロモーター部に特異的に結合配列が存在する転写因子群の存在も確認した。これらの因子について定量PCR解析を実施した結果、NKT細胞特異的に発現する因子ではないことが確認された。3.同定された候補因子のNKT細胞受容体Vα14Jα18遺伝子再構成への関与:同定された制御因子候補についてCRISPR/Cas9を用いて23系統の遺伝子欠損マウスの作製を試み、18遺伝子の欠損マウスを作成した。遺伝子欠損マウスの解析を進め、2系統においてNKT細胞の著減を確認した。NKT細胞が完全に欠損するわけではなかったため、遺伝子再構成時のVα14遺伝子の選択に影響する可能性を考慮しDegital Genomic PCRにて選択Vα遺伝子のレパトア解析を実施したところ、偏りは認められなかった。NKT細胞の減少が認められたマウスのうち1系統では、NKT1の著減が確認されたことから、NKT細胞のサブセット誘導において重要な因子である可能性が考えられた。NKT細胞は、均一なVα14Jα18受容体を発現し、CD1d分子上に提示された糖脂質抗原を認識する特殊なリンパ球である。今回、この特徴的なT細胞受容体の遺伝子再構成における分子機構を明らかにすべく、Vα14プロモーターに結合する転写因子の観点からの解析を加えた。DNA配列解析・プロモーター配列を用いたDNAプルダウン・未熟NKT細胞のRNA-seq解析などにより、23種類の候補遺伝子を選定し、うち18遺伝子のノックアウトマウスの作成によりその機能を確認した。その結果、2系統のマウスにおいて、顕著なNKT細胞の減少が確認され、NKT細胞分化に重要な遺伝子であることが強く示唆された。同定した制御因子に対し、CRISPR/Cas9技術を用いてノックアウトマウスを作成し、Vα14Jα18遺伝子再構成、およびNKT細胞分化への関与を確認する。NKTクローンマウス由来iLSの使用を断念したが、NKTクローンマウス由来NKT-ES細胞を用いてのNKT細胞分化誘導を可能としたため、これを用いてCRISPR/Cas9による遺伝子編集を実施する。遺伝子ノックアウトNKT-ESを作成すし、各遺伝子のNKT細胞分化への関与を確認する。
分子系統に基づくスゲ属植物の生物地理学的研究

スゲ属植物は日本の顕花植物の中で最も属内の種数が多く、200種以上が報告されている。染色体は分散型動原体を持ち、2n=12から2n=132までの連続した種内異数性が見られる。本研究に用いたヒメスゲには、2n=18,20,24,26の種内異数体が見られ、北海道から分布が南に移行するにしたがい染色体数が増加する傾向があり、葉緑体遺伝子でハプロタイプIとハプロタイプIIの2型に分けられることが明らかになった。また、アキイトスゲやオオムギスゲは、過去、朝鮮半島から九州北部、瀬戸内地域に広く分布していたが、その後の気候変動により島嶼部や沿岸地域に隔離され、遺存的に生き残ったことが明らかになった。本年度は、染色体の分析と核および葉緑体DNAの解析が行なわれていないスゲ属植物を、日本各地から研究分担者の協力を得て採集した。本年度明らかにした20分類群の染色体および核リボソーム遺伝子ITS、ETS 1f領域の解析結果と、今まで我々が明らかにしているデータを統合して、スゲ属植物の染色体の分化を考察した。染色体数が少ない分類群で、節の分類体系と相関が見られたのは8節であり、その他の分類群はほとんどが2n=60以上であった。分子系統樹から、スゲ属植物は染色体の異数性と倍数性の両方を伴って、染色体数が増加する方向に分化したことが推定された。また、種内異数性と地理的分布を明らかにするために、連続した種内異数性が見られるヒメスゲを、日本各地の54場所から採集した。本年度は、染色体の観察と、25場所については葉緑体遺伝子trnT-L-F,rpL16,rpS16領域を解析した。その結果、北海道から関東地方東部までは、2n=18が分布し、関東地方から中国地方までは2n=20、四国地方と九州地方には2n=24、2n=26は福岡県の英彦山付近で見られた。分布が北から南に移行するに従い染色体数が異数的に増加していた。また、葉緑体遺伝子の解析から、9種類のハプロタイプに分けられた。これらのハプロタイプは、北海道と本州に分布する2n=18,20でハプロタイプIと、四国と九州に分布する2n=24,26のハプロタイプIIにわけられ、染色体数と相関が見られた。これらの結果から、スゲ属植物は異数性と遺伝的分化を伴って分布域を拡大し、進化したことが推定された。本年度は、種内異数性と地理的分布を明らかにするため、ヒメスゲとアキイトスゲの系統地理学的解析を行った。ヒメスゲは、昨年までに2n=18,20,24,26の種内異数体が北海道から分布が南に移行するにしたがい染色体数が増加する傾向があり、葉緑体遺伝子でハプロタイプIとハプロタイプIIの2型に分けられることが明らかになっている。染色体数2n=18と20は本州のみで報告されていたが、広島県の深入山で2n=24の九州地方と同一の染色体数が観察された。また、四国地方には2n=24のみが報告されていたが、2n=20の異数体を高知県白髪山と徳島県次郎笈で確認した。葉緑体遺伝子の解析から、北方由来であるヒメスゲは中国地方から九州地方と四国地方から九州地方の2つのルートで分布を拡大したことが明らかになった。アキイトスゲは、九州地方の対馬、佐賀県に分布し、瀬戸内島嶼部に隔離分布することが知られている。韓国の木浦でも採集されている。本年度は、九州と瀬戸内沿岸地域の12場所で採集したアキイトスゲの葉緑体遺伝子6領域(trnT-LIGS、trnLintron、trnL-FIGS、rpL16intron、rpS16intron、atpB-rbcL)ハプロタイプの解析を行なった。その結果、5種類のハプロタイプが認められることが分かった。これらのハプロタイプの分布には明瞭な地理的隔離が見られた。また、瀬戸内に分布していたハプロタイプのうち、2種類は1塩基の変異しか認められず、特に近縁であった。これらのことから、アキイトスゲは、更新世後期の最終間期に朝鮮半島から対馬、佐賀県島嶼部、瀬戸内にまで分布を広げていたが、その後の気候変動によって、島嶼部や沿岸部に隔離され、遺存的に生き残ったと考えられる。

以上のように、ヒメスゲとアキイトスゲの染色体やハプロタイプの解析結果から、スゲ属植物は気候の変動による分布域の変化と、遺伝的な変異との間に密接な関連が見られることが明らかになった。本年度は、連続した種内異数性が見られるヒメスゲの染色体の分析と葉緑体遺伝子の解析を行った。葉緑体遺伝子はtrnT-L-F、rpL16、rpS16の3領域を解析した。また、オクノカンスゲ亜節とホンモンジスゲ類に属する35分類群の核リボソーム遺伝子ITSとETS-1f領域を解析し、分子系統と染色体の変異との相関関係を調べた。ヒメスゲは西日本に隔離分布することが明にされており、ハプロタイプの解析から、四国地方から豊後水道を経て九州の鹿児島県に分布するタイプと、広島県西端から関門海峡を経て九州の中央山地に分布する2種類のタイプがあることが明らかになった。特に前者のタイプは、四国地方から宮崎県、鹿児島県の東部までの襲速紀区系の植物分布と一致した。また、染色体数は、2n=20から2n=24へ異数的に増加したことが明らかになった。スゲ属植物の分子系統に関する先行研究から、ヌカスゲ節は大きく3つのクレードに分けられることが明らかになっている。その3クレードの一つは、オクノカンスゲ亜節とホンモンジスゲ亜節であった。オクノカンスゲ亜節に属する分類群の染色体数は2n=3044に変異し、染色体も大型であった。一方、ホンモンジスゲ亜節に属する分類群の染色体数は2n=5680が観察され、染色体の大きさは、オクノカンスゲ亜節のものの半分以下であった。ヌカスゲ節の分子系統樹から、オクノカンスゲ亜節とホンモンジスゲ亜節は、それぞれ別のサブクレードに分かれ、染色体数や核型と一致していることが明らかになった。スゲ属植物の染色体は、異数的に染色体が増加するだけでなく、倍数性による染色体の増加と、それに伴う染色体の小型化による分化もあることが明らかになった。本年度は、中部地方より採集したヒメスゲの染色体と葉緑体遺伝子の解析を行った。長野県茅野市豊平美濃戸阿弥陀岳より採集したヒメスゲの集団に、2n=20の個体と2n=22の個体が観察された。昨年度まで、北海道から九州地方まで日本各地のヒメスゲの種内異数体を解析し、2n=18, 20, 24, 26の4種類が存在することを明らかにしてきた。しかし、本年度初めて長野県で2n=22の種内異数性が見つかった。2n=20の個体は標高2400m以下に、2n=22の個体は、標高2400mから2750mの高山帯の尾根に分布していた。本研究により、ヒメスゲには2n=18から26までの連続した異数体が存在することが明らかになった。葉緑体遺伝子の解析より、日本に分布するヒメスゲは次の2つのタイプにわかれた。(1)ハプロタイプI:染色体数は2n=18と2n=20で、紀伊半島以東に分布する.(2)ハプロタイプII:染色体数は2n=24と2n=26で、中国、四国、九州地方に分布する.栃木県と群馬県に広く分布し、西日本に隔離分布するクロヒナスゲの葉緑体遺伝子と核遺伝子の比較も行った。その結果、栃木県、群馬県、岐阜県、三重県および愛媛県の集団の葉緑体遺伝子と核遺伝子は完全に一致したが、鹿児島県の高隈山の集団のみ核遺伝子で11サイト、葉緑体遺伝子で4サイトの塩基置換が見られた。このことから、日本の最も南西に分布する高隈山の集団は遺伝的分化が進んでいることが明らかになった。平成24年度は、韓国で採集したアキイトスゲとオオムギスゲの葉緑体遺伝子を用いてハプロタイプの解析を行った。ヌカスゲ節のアキイトスゲは中国地方の瀬戸内沿岸地域や島嶼部に隔離分布する種であり、長崎県の対馬および佐賀県にも隔離分布することが明らかにされている。韓国に関しては京都大学の標本庫に木浦より採集されたものが1点のみ保管されているのみで、アキイトスゲの韓国での分布は不明であった。また、オオムギスゲは岡山県、広島県および香川県の小豆島に分布し、韓国にも生育するとされている。
酸化ストレスで誘導される植物由来遺伝子の過酸化脂質消去機能の解明

シロイヌナズナ染色体DNAからクローニングした過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子プロモーター領域をβ-グルコニダーゼ遺伝子上流に連結した。本融合遺伝子をパーティクルガンによりエンドウ根に照射して25°C一昼夜MS培地で培養した結果、β-グルコニダーゼ活性を示す青色スポットを認めたことから、本遺伝子断片はプロモーター機能を持つことが明らかとなった。次に、50mM,100mMNaClを含むMS培地で培養してところ、β-グルコニダーゼ活性に差を認めることができず、過酸化リン脂質グルタチオセペルオキシダーゼ様遺伝子プロモーター領域は塩ストレスにより転写活性の誘導が起こらないことが示唆された。過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子のORF領域を大腸菌発現ベクターpET15bに挿入したプラスミドで形質転換した大腸菌クローンを作出した。クローン無細胞抽出液について過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ活性を測定した結果、tert-butyl hydroperoxide, cumene hydroperoxide, hydrogen peroxideの還元活性を認めることができなかった。次に大腸菌クローンをNaCl含有LB培地で生育させた結果、3%,NaCl含有LB培地では、クローンの生育は1%NaCl含有LB培地の場合とほぼ同じであったが、コントロールの生育は1%NaCl含有LB培地の時よりも悪くなった。5%NaCl含有LB培地では、コントロールはわずかしか生育できず10時間後には凝集したが、クローンは生育することができ、14時間後は1%NaCl含有LB培地時の約45%の生育度を示した。7%NaCl含有LB培地では、コントロールは生育することができなかったが、クローンはわずかながら生育することができ、4時間後は1%NaCl含有LB培地時の約23%の生育度を示した。以上の結果、植物由来過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子は酸化ストレスを引き起こす塩ストレスに対して抵抗性を付与することが明らかとなり、植物における酸化ストレス/塩ストレス抵抗性に関与するシステムの構成要因であることが示唆された。【過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子のプロモーター領域のクローニング】シロイヌナズナ染色体DNAを抽出し、各制限酵素Dral、EcoRV、Pvull、Scal、Stulで切断しアダプターを連結したDNAライブラリーを作製した。過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様cDNAの開始コドン領域に相補的な塩基配列をもつプライマーとアダプターに相当する塩基配列をもつプライマーを用いてPCRを行ったところ、Dralで切断したDNAライブラリーで約800bp長のDNAフラグメントが増幅した。本DNAフラグメントをクローン化し塩基配列を決定した。開始コドンから153bp上流にTATAボックスと一致する塩基配列TATATAAが、177bp上流にCAATボックスと一致する塩基配列CAATが認められ、転写開始は132bp上流のAであることを推定した。一方、植物遺伝子の制御因子であるABA-responsive element配列ACGTGが302bp上流と325bp上流、cis-acting factorのas-1配列TGACGが361bp上流に認められた。この結果、クローン化した過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子のうち、少なくとも開始コドンから361bp上流の領域がプロモーターとして必要であることを推定した。

【過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質の精製】過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子のORF領域をPCRで増幅し、大腸菌発現ベクターpET15bのNdel/BamHIに導入した。その結果、ORFの上流にHis-Tag遺伝子が融合したプラスミドpARAGPX-EX1を構築した。pARAGPX-EX1を導入した大腸菌をIPTGで発現誘導して集菌し、超音波破砕法で無細胞抽出液を調製した。無細胞抽出液をNi-NTAアフィニティーカラムに供し、吸着タンパク質をイミダゾールで溶出した。その結果、40mM1Mイミダゾール画分に分子量約22,000のHis-Tag融合過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質が溶出され、SDS-PAGEでほぼ単一のタンパク質バンドになった。【過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子のプロモーター領域のトランジェントアッセィ】シロイヌナズナ染色体DNAからクローニングした過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子プロモーター領域を含むと推定した約800bp長のDNAをプロモーター検索ベクターpBI121へ導入してβ-グルコニダーゼ遺伝子上流に連結した。本プラスミドを金粒子に吸着させてパーティクルガンによりエンドウ根に照射して25°C一昼夜MS培地で培養した結果、β-グルコニダーゼ活性を示す青色スポットを認めたことから、本遺伝子断片はプロモーター機能を持つことが明らかとなった。次に、50mM,100mM NaC1を含むMS培地で培養してところ、β-グルコニダーゼ活性に差を認めることができず、過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子プロモーター領域は塩ストレスにより転写活性の誘導が起こらないことが示唆された。【過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質の活性】大腸菌で発現させ精製した過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様タンパク質の過酸化水素、過酸化フォスファチジルコリン、過酸化リノール酸、クメンヒドロキシペルオキシドに対する還元活性を測定した結果、全ての過酸化物に対する酵素活性を認めることが出来なかった。以上の結果から、植物由来過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子は哺乳類のものとは機能が異なることが示唆された。来年度は、植物由来過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子の酸化ストレス(特に塩ストレス)耐性獲得に寄与する機能について検討する。過酸化リン脂質グルタチオンペルオキシダーゼ様遺伝子のORF領域をPCRで増幅し、大腸菌発現ベクターpET15bのNdeI/BamHIに挿入してプラスミドpBarGPX-EX1を構築した。
市場導入と民主化のシークエンシング-旧ソ連と中国の比較

1993年春には研究の方向付けをするために「市場経済導入のための基本問題」を執筆した。これは東京大学の紀要に掲載した。同年68月には米国ワシントンに滞在し、援助問題シンクタンクである海外開発研究所(ODC)で市場移行戦略について意見交換するとともに内部セミナーで研究発表した。このペーパーは筑波大学新国際システム特別プロジェクトの研究論文として出版される予定である。またワシントン滞在中に世界銀行の「東アジアの奇跡」プロジェクト担当者とも意見交換した。同7月後半には海外経済協力基金(OECF)のキルギス共和国派遣ミッションに参加し、マクロ経済調査を担当しながらインタビュー・資料収集その他を通じて市場導入問題を現地で考察した。この成果の一部は『経済セミナー』に掲載した。同10月末には前述世界銀行プロジェクトの国際会議がホノルルで開催され、戦後の日本経済発展に関するペーパーを発表した。これはコンファレンス・ボリュームとして世銀を通じて出版される予定である。秋以降は以上の研究を総括する書物を執筆する作業を行っている。これは『市場移行の政治経済学』と題し、筑波大学社会科学系助教授辻中豊氏(政治学)との共著として有斐閣から1994年中に刊行される予定である。私の担当部分は3月中に脱稿すると思われる。この書物は市場導入を学際的にアプローチすることをめざした本年度の研究の最終成果となる。(なお研究発表論文・図書は、予定については現時点で書名が確定しているもののみを示した。)1993年春には研究の方向付けをするために「市場経済導入のための基本問題」を執筆した。)
心身障害児をきょうだいにもつ中高生の障害の受けとめ方、ストレス状況と親子関係

本研究の目的は、心身障害児をきょうだいに持つ健常児に関して(1)発達過程での同胞の障害の受け止め方・位置づけ、(2)同胞が障害を持っていることによるストレス、(3)親子関係の特徴、(4)同胞の障害属性との関係を明らかにすることである。母親・きょうだい各々20名への面接調査と質問紙調査を実施した。質問紙調査は、400部の質問紙を配布し、きょうだい用270部、母親用284部の回答を得た。心身障害者の平均年齢は16.2歳で、障害属性別には知的障害児・者54.5%、肢体不自由児・者45.5%だった。きょうだいの平均年齢は17.8歳であった。きょうだいの障害の受け止め方は、45歳から気づき始め、母親の受容過程に比べると自然と受け止める傾向にあった(平成9年度報告書参照)。また、将来つきたい仕事は肢体不自由児のきょうだいで47.4%、精神発達遅滞児のきょうだいで32.2%が同胞と関係していると回答した。きょうだいのストレス兆候は、夜尿が長く続いた14.1%、爪噛み10.5%、不登校5.4%、円形脱毛2.9%などであった。母親はその要因として、幼少期にスキンシップが不足したことや障害児を優先させてしまったことなどをあげた。同胞のことで嫌だったこととして、肢体不自由児のきょうだいでは、留守番・外出制限、精神発達遅滞児のきょうだいでは、留守番・物を壊されること・友達の前で恥ずかしい経験をしたこと等であった。親子関係の特徴としては、対象が質問紙への調査に協力できるようなきょうだいだったこともあり、「長期的には、障害児の存在により家族の絆を強めた。」とする回答が多く、母親に対して78%、父親に対して68%のきょうだいが肯定的な評価をした。しかしながら、72.7%の母親が、障害児のことで手一杯で十分に手が掛けれない時期があったと回答し、きょうだい育児との両立に対する配慮の必要性を示唆した結果であった。本研究は、心身障害児をきょうだいに持つ健常児に関して次の点を明らかにすることを目的とする。(1)発達過程の中での同胞の障害の受け止め方・位置づけ、(2)同胞が障害を持つことでのストレス、(3)親子関係の特徴及び(1)、(2)との関係、(4)同胞の障害属性(種類・程度)と(1)(3)の関係。今年度は、質問紙作成のための予備調査として、心身障害児・者の母親・きょうだい各々20名(兄姉11名、弟妹9名)に面接調査、親子関係診断テストを実施した。母親面接では、障害児の生育歴に沿って、その時々のきょうだいの様子、きょうだい関係、きょうだいへの配慮、家族の協力度、障害児の将来への思いなどを尋ねた。きょうだい面接では、同胞との思い出など話しやすい内容から入り、いつ障害に気づき、現在どのように理解しているか、同胞が障害を持つことでのプラス面・マイナス面について尋ねた。肢体不自由児のきょうだいでは、車椅子に乗っている同胞を見て『何か乗ってる』、精神発達遅滞児のきょうだいでは、同胞の行動が友達のきょうだいとは違うと気づき始めたのが45歳で、小学校高学年から必要な時には友達に説明できるようになり、中学高校生で自分の中で位置づけれるようになったとする回答が多かった。協力を得られたきょうだいは、時に友達から心ないことを言われたりしながらも、親よりも同胞の障害をスムーズに受け止めていた。自分自身の将来について考える時期に同胞の将来について不安を抱いたり、強い責任感を感じてもいた。きょうだいの協力が得れず母親面接のみのケースの中には、ストレスによる身体症状を持ち、かなり深刻なケースもあった。現在、面接テープの掘り起こし作業が終了し、母親用質問紙(同胞の障害属性・親子関係・きょうだいのストレス等を含む)、きょうだい用質問紙(障害の受け止め方・親子関係等を含む)ともにほぼ仕上がっている状況である。

同胞のことで嫌だったこととして、肢体不自由児のきょうだいでは、留守番・外出制限、精神発達遅滞児のきょうだいでは、留守番・物を壊されること・友達の前で恥ずかしい経験をしたこと等であった。親子関係の特徴としては、対象が質問紙への調査に協力できるようなきょうだいだったこともあり、「長期的には、障害児の存在により家族の絆を強めた。」とする回答が多く、母親に対して78%、父親に対して68%のきょうだいが肯定的な評価をした。しかしながら、72.7%の母親が、障害児のことで手一杯で十分に手が掛けれない時期があったと回答し、きょうだい育児との両立に対する配慮の必要性を示唆した結果であった。
アゾベンゼン修飾による光応答性メゾ多孔体の構築とその応用

シリカメゾ多孔体の持つ規則性ナノ細孔内に、アゾベンゼン(Az)分子を放射状に配置すれば、細孔径が光照射により可変化できる。これまで、この細孔径変化に伴って細孔内に導入した蛍光性分子(テトラフェニルポルフィリンなど)の物性が変化するかどうかを検討したが、いかなる条件でも変化を見出していない。そこで細孔内分子に対し光異性化により何らかの摂動を与える別の試みとして、分子サイズが光により可変となる化合物の利用を考えた。具体的にはポルフィリン(Por)環にAz基が直結した化合物であるテトラキス[x-(フェニルアゾ)フェニル]ポルフィリン(x=2または4、それぞれ2-AzP、4-AzPとする)。これらの化合物は溶液中で異性化が全く進行しないことが知られるが、この試みの中で4-AzPは規則性細孔内に担持されると異性化が進行し、2-AzPは溶液と同様に進行しないことを見出した。この担持されたAzPのUV-VISスペクトルにおけるAz基の吸収波長やPor環のソーレー帯の半値幅と担体の細孔径との関係を詳細に調べたところ、4-AzPではAz基ーシリカ表面間の多点的接触が可能であること、Az基とPor環の電子的相互作用が抑えられていることが分かった。一方、2-AzPにはそのような効果は確認されなかった。これによりAz4Pでは励起したAz基からPor環へのエネルギー移動が抑制され、異性化が可能であることが分かった。両者の物性の違いは、2-AzPが球状、4-AzPが平板状分子であるという形状の違いによるものと推察されるシリカメゾ多孔体の持つ規則性ナノ細孔内に、アゾベンゼン(Az)分子を放射状に配置すれば、光異性化に伴い細孔径が可逆的に変化する新規ナノ空間が構築できると考え、研究を行っている。申請時において、(1)シリカメゾ多孔体MCM-41(M41)にp-トリエトキシシリルアゾベンゼンを反応させてAz修飾M41(Az-M41)を調製したこと、(2)Az基は可逆的に異性化すること、(3)これに伴い細孔サイズが変化することを明らかにしていた。本年度は、(1)細孔径の変化幅を大きくするために光異性化効率の確認とのその向上について検討し、(2)細孔内に導入された分子の蛍光挙動が細孔径変化に伴ってどのように変化するかについて検討した。以下、説明する。(1)Az-M41の光異性化効率の測定およびその向上:UV照射して光異性化させたAz-M41を暗所下でフッ酸処理し、有機溶媒で抽出を行うと、シス体のAz成分を取り出すことができた。これを利用して吸光度測定により異性化効率を求めた。Az修飾量が約1.5mmol/g-M41(約0.9group/nm^2)以下であれば異性化効率はほぼ一定であり40-60%程度であった。また、異性化効率にはM41調製時の焼成温度も影響し、540°C程度が最大となった。以上のことから細孔径の変化幅を大きくするためのAz-M41の最適調製条件をほぼ明らかにした。(2)Az-M41細孔内に導入された有機分子の蛍光挙動:Az-M41中にメゾスケールの分子サイズを有するmeso-テトラフェニルポルフィリン(TPP)を導入して、光異性化前後で蛍光スペクトルが変化するかどうかを調べたところ、可逆的な蛍光波長のシフト(7nm)を観測した。Az修飾したアモルファスシリカの場合には変化はなかった。このことから、メゾ細孔内のTPPが異性化により立体的な摂動を受けていることを明らかとした。シリカメゾ多孔体の持つ規則性ナノ細孔内に、アゾベンゼン(Az)分子を放射状に配置すれば、光異性化に伴って細孔径が可変化できると考え研究を行っている。前年度まで、MCM-41(M41)にp-トリエトキシシリルアゾベンゼンを反応させて調製したAz修飾M41(Az-M41)の細孔径が可逆的に変化すること、その変化幅を最も引き出しうるAz基表面密度(0.9個/nm^2)が存在することを明らかとしていた。本年度はまず、細孔径変化に伴って細孔内分子の物性がどのように変化するかを検討した。Az-M41中にテトラフェニルポルフィリンなどの数種の蛍光性分子を導入し、異性化前後で蛍光ならびに吸収スペクトルが変化するかどうかを調べたが、いずれも変化を見出すことはできなかった。これは、Az基が細孔表面に対して直立した状態で固定されていないためと考えられる。そこで、細孔内分子に対し光異性化により何らかの摂動を与える別の試みとして、分子サイズが光により可変となる化合物の利用を考えた。具体的にはポルフィリン(Por)環にAz基を4つ直結した化合物(テトラキス[4-(フェニルアゾ)フェニル]ポルフィリン、Az4P)を用いた。しかし、Az4Pは溶液中で異性化が全く進行しないことが知られる。この試みの検討中に、この化合物がシリカメゾ細孔内に担持されると異性化が進行するようになることを見出した。

異性化率と細孔径の関係を検討したところ、細孔径が分子に近いときに異性化率が高くなり、またフェニル基で被覆したメゾ細孔内に導入するとさらに異性化率が増した。これはAz基が細孔表面と多点接触することで、その自由回転が抑えられるのに伴い、励起したAz基からPor環へのエネルギー移動が抑制されるためと考えられる。シリカメゾ多孔体の持つ規則性ナノ細孔内に、アゾベンゼン(Az)分子を放射状に配置すれば、細孔径が光照射により可変化できる。これまで、この細孔径変化に伴って細孔内に導入した蛍光性分子(テトラフェニルポルフィリンなど)の物性が変化するかどうかを検討したが、いかなる条件でも変化を見出していない。そこで細孔内分子に対し光異性化により何らかの摂動を与える別の試みとして、分子サイズが光により可変となる化合物の利用を考えた。具体的にはポルフィリン(Por)環にAz基が直結した化合物であるテトラキス[x-(フェニルアゾ)フェニル]ポルフィリン(x=2または4、それぞれ2-AzP、4-AzPとする)。これらの化合物は溶液中で異性化が全く進行しないことが知られるが、この試みの中で4-AzPは規則性細孔内に担持されると異性化が進行し、2-AzPは溶液と同様に進行しないことを見出した。この担持されたAzPのUV-VISスペクトルにおけるAz基の吸収波長やPor環のソーレー帯の半値幅と担体の細孔径との関係を詳細に調べたところ、4-AzPではAz基ーシリカ表面間の多点的接触が可能であること、Az基とPor環の電子的相互作用が抑えられていることが分かった。一方、2-AzPにはそのような効果は確認されなかった。これによりAz4Pでは励起したAz基からPor環へのエネルギー移動が抑制され、異性化が可能であることが分かった。両者の物性の違いは、2-AzPが球状、4-AzPが平板状分子であるという形状の違いによるものと推察される
数値数式融合計算システムの開発

本研究では、1)国産数式処理システムGALの実用化、2)GALへの数値数式融合計算機能の付加、3)近似代数の算法開発、4)近似代数の応用の開拓、の4点を目標とした。1)に関しては、研究用としては使えるまでに整備したが、一般ユーザに供するにはまだ多くの機能が不足している。2)に関しては、NSL(Nara Standard-Lisp)の機能強化で対処した。すなわち、NSLにDynamic Loading機能を付加してLispとCとの混合計算を可能とし、またグラフィック表示も行えるようにした。3)に関しては、「多変数代数方程式のべき級数解法」や、それを利用した「代数関数の解析接続とリーマン面の決定法」など、いくつかの重要な算法を開発できた。4)に関しても、「近似GCDの有理関数近似への応用」や、それを利用した「データの平滑化算法」など、重要な応用を見い出すことができた。開発された算法はいずれも、従来の正確な算法よりもはるかに柔軟で、従来の算法の難点を克服して広い適用範囲をもち、近似代数の有用性を明白に示している。一方、本研究の過程で、近似代数を本格的に実現するには現在のシステムでは不十分なことも判明した。すなわち、近似代数では誤差項の処理、特に桁落ちによる精度低下が問題となる。本研究で得られた知見をまとめると以下のようになろう。1.近似代数は、算法レベルで数値計算と数式処理を融合させうるもので、数式処理に革新的進歩をもたらす可能性を十分に秘めている。2.しかし、近似代数の算法開発は多年を要する課題で、今後、精力的に取り組む必要がある。特に、近似代数の数学的理論の建設が当面の急務である。3.また、近似代数を実現するシステムについても、計算の過程で桁落ちをモニタできる機能をもった浮動小数演算体系を開発する必要がある。1.数式処理システムGALを高エネルギ-物理学研究所に移植し,研究道具用に提供した。そして,ガンマ行列の跡計算に対し,新しい算法を考案し,GAL上にインプリメントして,同研究所に提供した(佐々木・鈴木)。さらに,GALをワ-クステ-ション上で稼動させ,奈良女子大,愛媛大,豊橋技科大に移植した(鈴木・佐々木他)。2.悪条件である数値積分に対し,被積分関数を有理式近似し,数値数式の融合算法で計算することにより,誤差を小さく計算する方法を考案し,インプリメントして有用性を実証した(野田)。3.特異点を有するようなサンプルデ-タに有理式をあてはめた場合,選んだ次数が大きすぎて,局所的におかしな振舞いが生じることが多い。この場合,分子分母を近似GCDで簡約すると,サンプルデ-タが非常にうまく有理式で近似できることを発見した(野田)。4.PC-PRS GCD算法(べき級数を利用した多変数多項式のGCDの効率的算法)において,主項が精度落ちする場合を解析し,あらゆる場合に通用できる効率的算法を開発した(鈴木・佐々木)。5.多変数多項式の近似因数分解に関して,算法の完全性を「数係数が十分な精度で計算されるならば」との条件下で証明した(佐々木)。6.近似Grobner基底に関して,浮動小数係数の場合,従来の計算法をそのまま適用したのでは精底が低下し,うまく計算できないことが分った。現在,近似Grobnerとはそもそも何であるか,との深い考察から出発し,新しい計算法を解析・検討中である(森継・佐々木)。

以上のように,算法面では多くの成果が得られたが,システム開発が遅れているので,次年度はシステム開発に力を注ぐ予定である。1)数式処理システムGAL上で数値計算を行なうことを目的に、奈良女子大で開発したLispシステムにC言語プログラムのダイナミックロード機能を付加した(加古)。これにより、GAL上で代数計算と数値計算の混合計算が可能になる。2)数式処理システムGALのマニュアル(移植用、パッケージプログラミング用、システムプログラミング用の3種)を著した(佐々木、鈴木、加古)。3)数値数式融合計によるデータ平滑化のための新しい方法を考案した。これは前年度の近似GCD算法を用いた有理式近似法をさらに進めたものである。さらに、コーシーの主値積分に対し、数値数式融合計算による新しい算法を考案した(野田)。数値数式融合計算は種々の形で現実問題に使えることが実例で示された。4)多変数代数方程式の根を(分数)ベき級数で表す問題に対し、一般化ヘンゼル構成を拡張して、全根を同時に計算する方法を考案した(佐々木、加古)。この方法は、この種の問題に対する斬新な算法であるばかりでなく、数値計算の有名な方法に対応するものであると言う点からも、注目される。5)近似グレブナー基底をsyzygyにより定義し、その計算法を与えた(佐々木、森継)。近似グレブナー基底の理論ができたことにより、連立代数方程式を近似代数の観点から解くことが今後の課題となろう。6)零因子を有する剰余環上の多項式因数分解の研究(北本、佐々木)。この問題に対し、代数的数体上の因数分解算法と中国剰余定理を組み合わせて、部分的な解法を与えたが、よりよい算法を目指して研究中である。最終年度である平成5年度は、近似代数を発展させるべく、以下のように研究を遂行した。1.ワークステーション上でANSシステムのコンパイラと実行系を開発した(鈴木)。2.従来、ヘンゼル構成法は1次と2次の収束をする方法しか知られていなかったのに対し、1次因子に対するヘンゼル法を記号的ニュートン法と比較して、任意次数で収束する方法を見い出した(北本)。3.前年度に考案したPuiseux級数展開の算法を利用し、与えられた多項式P(x,y)=0の根として定まる代数関数y=f(x)のリーマン面を、実際的に効率よく決定する数値数式融合算法を考案した。この方法は解析接続の実際的方法でもある(椎原〔院生〕、佐々木)。4.上記のPuiseux級数展開算法の誤差解析を行なった。その結果、分岐点の近傍では算法は極めて安定であることが証明できた。しかしながら、級数根が有限の傾きで交差する点ではすさまじい桁落ちが発生することが判明し、その現象を理論的に解明した(北本、加古、佐々木)。5.前年度にその有用性を示した、近似GCDに基づく有理関数近似をデータの平滑化に応用した。有理関数近似では、指定した許容誤差から大きくずれたデータ点がはじき飛ばされて、元々欲しかった曲線を当てはめるという、実に興味深い結果が得られた(甲斐〔院生〕、野田)。6.数係数に誤差を含む近似多項式は、悪条件の場合には極めて病的な振舞いをする。このような場合を詳しく解析し、商と剰余の不定性をcancel数なるもので定量化し、さらに、商と剰余を可能なかぎり高い精度で計算する算法を考案した(佐々木)。
触覚パターン時空間認知の神経回路機構の光遺伝学的研究

W-TChR2V4ラットを用い、複数ウィスカに時空間パターン光遺伝学刺激を与えつつ、大脳皮質バレル野浅層のニューロン活動を電気生理学的に計測するシステムを構築した。その結果、地理的対応プロジェクションとゾーンプロジェクションが並列的に存在していることが示唆された。ウィスカ光遺伝学刺激によるW-TChR2V4ラット行動の条件付けの反応時間を高い精度で定量するシステムを構築し、早期視覚剥奪群において、知覚閾値が有意に低下していることが示唆された。マウスS1第5層の入出力を解析するオールオプティカルシステムを構築し、相互抑制の結果、光入力部位の近傍にカラム様構造が創発することを見出した。W-TChR2V4ラットのウィスカ毛根の光刺激により、触覚の時間・空間的なパターン(optogenetic tactile pattern, OTP)を作り出し、OTPが大脳皮質において、どのように情報処理されるかを研究する。平成25年度の研究では、この目的を達成するために、OTP装置を作製し、最適化した。すなわち、光源には、青色のpower LED (460-490 nm)を用い、コントロールとして赤色LED (620-645 nm)を用いた。PC上のプログラムで光源オン・オフパターンを作成し、16チャネルD/Aコンバーターを介して出力した(うち2チャンネルを同期トリガーに用いる)。14個それぞれのチャネルのアウトプットをブースター回路により電流増幅し、光源を駆動した。したがって,14個の光源が任意の独立した時系列パターンでオン・オフする。それぞれの光源からの光をプラスチックファイバー(φ, 0.75 mm)に導入した。W-TChR2V4ラットの片側のウィスカを剃り、それぞれのウィスカの付け根をファイバーに結合させた。また、これを用いたOpto-fMRI計測システムを最適化した。その結果、OTPに対応したBOLD信号の時空間パターンを得ることに成功した。また、皮質ニューロンマルチユニット計測および局所フィールド電位記録において、OTPに対応した皮質ニューロン活動の計測に成功した。具体的には、光刺激に同期したニューロンのバースト活動(LEB)に引き続き、10-20Hzの頻度で繰り返すバースト(PAB)が誘発された。LEB, PABは、OTPの時空間パターンに依存していた。これらの成果は、論文として報告した(Hojoh et al., 2014)。ウィスカ床光刺激に対する応答を、反対側大脳皮質バレル野において計測したところ、青色光照射に同期したユニット活動(MUA)の上昇および局所フィールド電位(LFP)の変動を計測した。バレル野MUAは、反対側のウィスカ床の青色光照射に同期したバースト活動(Light-evoked burst, LEB)、LEBに引き続いた活動休止期、10-20Hzの頻度で繰り返すアフターバーストから構成されていた。また、LFPについては、光照射に同期したネガティブ応答とこれに引き続くスピンドル振動(10-20 Hz)が認められた。このような状態遷移応答は、ウィスカ光刺激の時間・空間的パターンに依存しており、知覚パターンの脳内表現の一種であると考えられる。このような実験系は、世界的に類例がなく、それぞれのウィスカを独立にパターン刺激する道が開かれた。これは、感覚生理学の分野において、時空間パターンの脳内表現の解明に至るマイルストーンである。さらに、PC上のプログラムで光源オン・オフパターンを作成し、16チャネルD/Aコンバーターを介して出力し、14個それぞれのチャネルのアウトプットをブースター回路により電流増幅し(うち2チャンネルを同期トリガーに用いる)、光源を駆動するOTP装置を開発した。すなわち,14個の光源が任意の独立した時系列パターンでオン・オフする。また、これを用いたOptofMRI計測システムを最適化した。昨年度の研究を発展させ、PC上のプログラムで光源オン・オフパターンを作成し、16チャネルブースター回路により電流増幅し、光源を駆動するOTPシステムを最適化した。すなわち,16個の光源が任意の独立した時系列パターンでオン・オフする。ウィスカ毛根周囲の機械受容ニューロン軸索端にチャネルロドプシン2(ChR2)を発現するトランスジェニックラット(W-TChR2V4)の片側のウィスカを剃り、それぞれのウィスカの付け根をファイバーに結合させた。大脳皮質バレル野からユニット記録しながら、それぞれのウィスカ毛根に光を順次照射したところ、それぞれのユニットは、特徴的な応答パターンで複数のウィスカに応答した。すなわち、バレル野のニューロンには、複数のウィスカの組合せに応答するものがあることが示唆された。ラットの触覚パターン認識の神経回路機構を研究する目的で、W-TChR2V4ラットのウィスカ光刺激と報酬を関連付ける条件付け実験システムを構築し、ウィスカ光刺激直後5秒以内にリッキングすると報酬を得るGoタスクと、5秒間リッキングを抑制すると報酬を得るNo-goタスクを課した。ラットは、いずれのタスクもすみやかに学習した。また、OTPシステムを用いたOptofMRI計測システムを覚醒ラットに最適化した。その結果、ウィスカ光刺激に対応したBOLD信号を得ることに成功した。

本研究課題の遂行において、基盤となる実験システムを最適化し、予備データを得ることに成功した。本研究においては、ラットのウィスカに与えた時空間パターンの脳内表現を解明することを目的としているので、固有のパターンに応答するユニットの記録から、バレル野において、単純なパターンの識別がなされていることが示唆される。ウィスカ光刺激と報酬を関連付ける条件付け実験については、例数を増やすことにより、確実性を高められた。また、Ca2+イメージングについては、マイクロプリズムと2光子顕微鏡を用いた層横断的イメージングの最適化に成功した。昨年度の研究を発展させ、ウィスカ毛根周囲の機械受容ニューロン軸索端にチャネルロドプシン2(ChR2)を発現するトランスジェニックラット(W-TChR2V4)のそれぞれのウィスカ毛根と青色LED光源をファイバーに結合させた。大脳皮質バレル野からユニット記録しながら、それぞれのウィスカ毛根に光を順次照射したところ、それぞれのユニットは、特徴的な応答パターンで複数のウィスカに応答した。すなわち、バレル野のニューロンには、複数のウィスカの組合せに応答するものがあることが示唆された(Liu et al.,第39回日本神経科学大会, 2016;劉越人ら,先端モデル動物支援プラットフォーム平成28年度成果発表会, 2017)。ラットの触覚パターン認識の神経回路機構を研究する目的で、W-TChR2V4ラットのウィスカ光刺激と報酬を関連付ける条件付け実験システムを構築し、ウィスカ光刺激直後5秒以内にリッキングすると報酬を得るGoタスクと、5秒間リッキングを抑制すると報酬を得るNo-goタスクを課した。ラットは、Go, No-goのパラダイムシフトをすみやかに学習した(Abe & Yawo,第39回日本神経科学大会, 2016)。微小プリズムを用いた2光子in vivoカルシウムイメージングを光操作技術と組み合わせ、大脳皮質横断的にパターン照射するシステムを最適化した。ウイルスベクターを用いて、マウス大脳皮質一次知覚野第V層ニューロンにチャネルロドプシンとカルシウムセンサーR-CaMP2を発現させ、時空間パターン光刺激することにより、第V層における入出力特性を解析した(Koizumi et al.,第39回日本神経科学大会, 2016他)。これにより、5層メゾスコピック回路における入出力の機能構築を解明した。ラットウィスカ毛根の光刺激の時空間パターンと大脳皮質一次知覚野のユニット計測研究に関しては、基盤となる実験システムの最適化をほぼ終了し、膨大なデータが蓄積されつつある。また、これらのデータから、パターン情報処理に関する機能構築が解明されつつあり、期間内に当初の目的を達成することが見込まれる。バレル野において、単純なパターンの識別がなされていることが示唆される。