hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
B細胞表層での分子認識制御によるユニバーサルナノワクチンの創製

本研究の目的は、インフルエンザウイルスの抗原タンパク質を、配向を制御して金ナノ粒子に固定化し、誘導される抗体と抗原の配向性の関連明らかにすることである。今年度は、インフルエンザウイルスの抗原タンパク質であるヘマグルチニンタンパク質(HA)の配向制御固定化のための方法を大きく改善させた。昨年度まではアルキル鎖とHA認識ペプチドとの複合体を合成、次にそれらで金ナノ粒子を修飾し、HAを配向固定化する方法を進めてきた。しかしながら金ナノ粒子の修飾過程で粒子の分散性が大きく減少するため、HAの結合実験まで定量的に進まなかった。そこでアルキル鎖を介すのではなく、自己組織化能を有することが知られているペプチドの先端にHA認識ペプチドを持たせた新たなペプチドを金ナノ粒子に直接固定化した。この場合、アルキル鎖とペプチドを連結させる化学反応のステップが不要なだけでなく、金ナノ粒子修飾後の粒子分散性も向上した。認識ペプチドを固定化した金ナノ粒子は流体力学径が増加した。緩衝溶液中でHAを添加、さらに金ナノ粒子を遠心分離により沈殿後、上澄みのHA量が減少していることからHAがナノ粒子に結合していることがわかった。しかしHA固定量および、HA結合選択性を十分に向上させる条件を詰めるには至っておらず、バイオアッセイまでには課題が残った。一方、2018年度はインフルエンザウイルスのワクチンとして金ナノ粒子を用いる際の粒子形状やサイズに関する成果を学術論文として発表することができた。具体的には、ナノロッドにアジュバント核酸を固定化することでインフルエンザ経鼻ワクチンの効果を向上できることを発表できた。この成果は、インフルエンザウイルスのワクチンとして金ナノ粒子を応用するためにはどのような形状・大きさが適しているのかをあらかじめ知るための重要な知見となった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。金ナノ粒子を使ってワクチン研究を進めるにあたり、どのような粒子サイズや形状がワクチン活性のために優れているのかを理解しておく必要がある。細胞への取り込み能は活性向上のための一つの要因となり得る。そこで今まで定量的な報告例が無かった三角形プレート金ナノ粒子に着目した。三角形プレート金ナノ粒子の細胞取り込み量を球状ナノ粒子と比較した。粒子表層はどちらもカルボン酸で被覆し、シンプルな系で形状効果を比較した。球状粒子の場合はサイズが大きくなると取り込みが減少したが、三角形プレートの場合はむしろ一辺の長さが長くなるほど細胞取り込み量が大きくなることがわかった。この粒子の細胞取り込みの形状効果を2016年にアメリカ化学会のLangmuir誌にて発表した。次に抗原であるヘマグルチニンタンパク質(HA)を球と三角形プレートの金ナノ粒子に固定化した。抗原を固定化したこれらの金ナノ粒子をマウスに投与し、抗体産生量を調べた。具体的には、粒子表面にカルボン酸を有するキレート分子であるNTAリガンドを提示し、ニッケルイオンを介してヒスチジンタグによりHAを固定化した。球と三角形プレートのサイズは平均66nm(直径)と72nm(一辺)とした。これらのサイズを選ぶと粒子の粒子表面積は同程度となる。HAの投与量は同量となるように、マウスに皮下あるいは経鼻で接種した。皮下接種において、平均値では球状粒子のほうが高い抗体(IgG)産生を誘起していた。経鼻接種においても、球状粒子はIgA抗体を有意に産生していた。これらの実験より、HAを固定化した金ナノ粒子をワクチンとする場合、今回試したサイズでは球が優れていることがわかった。インフルエンザウイルスに対するナノ粒子ワクチンの効果を調べるための最初のステップである、粒子の形状などの効果を明らかに出来た。金ナノ粒子上で、抗原タンパク質(ヘマグルチニンタンパク質HA)の固定化方向を制御するための化学手法を探った。ウイルス様の順方向固定化のためにHis-Tagを使った。今回、水溶性のオリゴエチレングリコールを介して、His-Tag固定化するためのリガンド分子を新たに化学合成した。一方、ウイルスとは逆方向の固定化のためにHA結合性能のペプチドを利用した。HA結合性ペプチド末端にアルキンを導入し、アジド基を粒子表面に提示してクリック反応にて固定化する手法を試した。しかしこの反応では銅イオンを使うため反応時に粒子が凝集してしまう問題が生じた。そこで銅イオンを使わずにクリック反応するため、環状のアルキン誘導体をペプチドに導入した。これにより水分散性の改良を試みている。また、ワクチンでは、抗原だけでなくアジュバント分子(免疫賦活剤)の選択も活性の鍵となる。我々は、経鼻インフルエンザワクチンにおいてアジュバント分子(低分子量合成RNA)をナノロッドと複合体化することで活性を上げることができることを見いだしてきた。しかし皮下接種における粒子形状・サイズの効果は不明だった。今回抗原HA投与量は、皮下接種を基準として100ngと高い量として皮下と経鼻を比較した。皮下接種ではサイズ・形状に関係なく、アジュバント分子単独よりも複合体のワクチン活性が上がった。一方、経鼻接種では抗原の投与量が高いため、アジュバント分子単独でも効果が見られ、複合体化することの効果が隠れてしまった。しかし、比較的大きな40nm球形粒子を使うとむしろ活性が低い傾向が見られた。球形粒子をHAで被覆すると経鼻ワクチンとして効果的である前年度の結果と対照的である。このアジュバント分子と抗原によって選択すべき粒子が異なるという知見は今後、メカニズム解明などに重要な知見となりえる。

ナノ粒子の分散性を保つための試行錯誤に時間を使ってしまった。抗原タンパク質固定化の方向性の効果についてのワクチン活性はまだ明らかにできていない。本研究の目的は、インフルエンザウイルスの抗原タンパク質を、配向を制御して金ナノ粒子に固定化し、誘導される抗体と抗原の配向性の関連明らかにすることである。今年度は、インフルエンザウイルスの抗原タンパク質であるヘマグルチニンタンパク質(HA)の配向制御固定化のための方法を大きく改善させた。昨年度まではアルキル鎖とHA認識ペプチドとの複合体を合成、次にそれらで金ナノ粒子を修飾し、HAを配向固定化する方法を進めてきた。しかしながら金ナノ粒子の修飾過程で粒子の分散性が大きく減少するため、HAの結合実験まで定量的に進まなかった。そこでアルキル鎖を介すのではなく、自己組織化能を有することが知られているペプチドの先端にHA認識ペプチドを持たせた新たなペプチドを金ナノ粒子に直接固定化した。この場合、アルキル鎖とペプチドを連結させる化学反応のステップが不要なだけでなく、金ナノ粒子修飾後の粒子分散性も向上した。認識ペプチドを固定化した金ナノ粒子は流体力学径が増加した。緩衝溶液中でHAを添加、さらに金ナノ粒子を遠心分離により沈殿後、上澄みのHA量が減少していることからHAがナノ粒子に結合していることがわかった。しかしHA固定量および、HA結合選択性を十分に向上させる条件を詰めるには至っておらず、バイオアッセイまでには課題が残った。一方、2018年度はインフルエンザウイルスのワクチンとして金ナノ粒子を用いる際の粒子形状やサイズに関する成果を学術論文として発表することができた。具体的には、ナノロッドにアジュバント核酸を固定化することでインフルエンザ経鼻ワクチンの効果を向上できることを発表できた。この成果は、インフルエンザウイルスのワクチンとして金ナノ粒子を応用するためにはどのような形状・大きさが適しているのかをあらかじめ知るための重要な知見となった。抗原タンパク質との複合体化においては今後、球に絞り研究を進める。水溶液中での粒子の分散性をより高めるためにリガンド分子の化学改良も行っていく予定である。作製した金ナノ粒子のサンプルの化学的特性を十分に明らかにした上で、予定通り生物実験(ワクチンアッセイ)に進めていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
形質転換型ラン藻における二酸化炭素固定の環境適応機構

微細藻類やシアノバクテリアのカーボニックアンヒドラーゼ(CA)活性は、培養時のCO_2濃度を15%(高CO_2細胞)から通常の空気レベル(低CO_2細胞)に低下させると増大する。SynechococcusPCC7942株では、CA遺伝子を破壊すると高CO_2濃度要求性を示すことが明らかになっている。同株では、CAのmRNA、活性レベルとも極めて低いが、その生理的意義を解析する目的で、バクテリアのtacプロモーターの挿入によるCA発現量の増大を試みた。CA遺伝子開始コドンの上流147bpを欠失させ、ここにtacプロモーターとカナマイシン耐性遺伝子を連結したカセット、あるいはカナマイシン耐性遺伝子のみを挿入した形質転換株を構築し、それぞれΔSP::KT1、ΔSP::K2と命名した。細胞破砕液のCA活性は、^<13>C^<18>O_2を基質したときの同位体交換反応の速度から算定した。野生株のCA活性は、高CO_2細胞(66U/mg Chl)に比べ低CO_2細胞(110)で高く、生育時のCO_2濃度による活性の変化が確認された。ΔSP::K2株では、CO_2条件にかかわらず活性は極めて低く(7-8U/mg Chl)、CA遺伝子上流領域は発現に必須であることがわかった。ΔSP::KT1株における活性は、高CO_2細胞で43、低CO_2細胞で114U/mg Chlであった。すなわち、CAはtacプロモーターに依存して発現したが、野生株と比較して発現量を顕著に増大させる効果は認められなかった。しかし、遺伝子の上流領域を除去したにもかかわらず、生育時のCO_2濃度による変化が認められたことから、CA活性調節機構については以下の可能性が考えられる。1)転写制御を担う配列が、遺伝子のコード領域内あるいは下流域に存在する。2)活性調節は、酵素生合成の転写後の段階においておこる。3)tacプロモーターを含むDNA断片にCO_2濃度変化に応答する配列が存在する。
去勢抵抗性前立腺癌における機能性RNA分子経路の解明と革新的治療法の開発

microRNAではguide鎖が遺伝子発現を制御し、相補的な配列であるpassenger鎖は関与しないとされていた。昨年度までに実施した次世代シークエンサーを用いた解析により、passenger鎖であるmiR-145-3pが去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)において発現が低下しており、癌抑制型microRNAとして機能していることを示した。本年度はこれらをさらに進めることにより、以下に示すような成果を得た。Passenger鎖であるmiR-99a-3pを発現させると、前立腺癌細胞の増殖能、遊走能、浸潤能が有意に抑制された。またmiR-99a-3pが標的とする分子としてNon-SMC condensin I complex subunit G (NCAPG)を同定した。NCAPGはmiR-99a-3pによって直接制御されており、CRPCの診断や治療標的に応用可能である事を明らかにした。これらの成果をCancer Medに発表した。miR-455-5p(passenger鎖)ならびにmiR-455-3p(guide鎖)では、The Cancer Genome Atlasデーターベースを利用して、標的とする遺伝子の一つとしてPIR (pirin)を同定した。PIRはホルモン感受性前立腺癌(HSPC)ならびにCRPCの分子マーカーや治療標的になる可能性を示した。これらの成果をMol Oncolとして発表した。CRPCにおいて、miR-199a/b-3pによって制御される癌遺伝子としてnon-SMC condensin I complex subunit Hをコードする遺伝子を同定した。The Cancer Genome Atlasデーターベースを解析することにより、non-SMC condensin I complex subunit Hの高発現は不良な無疾患生存率と有意に関連していることを示した。これらの成果をInt J Urolに発表した。前立腺癌の臨床症例についてもデータをまとめ英文誌に論文発表した。その他の泌尿器癌においてもmicroRNAに関する解析を行い英文誌に論文発表した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。前立腺癌組織を用いたマイクロRNA発現プロファイルにおいて発現抑制されているmiR-452を同定し機能解析を行った。アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞に核酸導入した結果、癌細胞の遊走・浸潤を顕著に抑制する事を見出した。この事から、miR-452は癌抑制機能を有する事が判明した。また、臨床検体の解析でmiR-452の発現抑制が去勢抵抗性となるまでの期間を予測する因子となることを示した。miR-452の標的分子としてWWP1遺伝子を同定した。この標的分子は癌細胞の浸潤・遊走を促進する癌遺伝子機能を有しており、臨床検体において発現が更新していることを示した。これらの結果について、Br J Cancerに論文発表した。新規に作成した去勢抵抗性前立腺癌組織を用いたマイクロRNA発現プロファイルを解析し、発現抑制を認めたmiR-320aについて機能解析を行った。その結果、癌細胞の浸潤を抑制する癌抑制型マイクロRNAである事を示した。miR-320aが制御する分子として、LAMP1遺伝子を同定し、この分子が前立腺癌組織において過剰に発現していることを明らかにし、Int J Oncolに論文発表した。前立腺癌組織において著明に発現抑制されている6つのマイクロRNA(miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-29b, miR-29c and miR-218)についてさらに解析した。これらが共通して制御し前立腺癌の転移を促進する35の候補遺伝子を同定した。この中でLOXL2遺伝子が前立腺癌で過剰発現している事や、発現を抑制することにより前立腺癌細胞の浸潤・遊走を抑制することを明らかにした。マイクロRNAのネットワークの解明につながるものとしてJ Hum Genetに論文発表した。その他の泌尿器癌においてもマイクロRNAに関する解析を行い英文誌に論文発表した。研究実績の概要にも示したとおり、前立腺癌組織や去勢抵抗性前立腺癌組織において発現が低下しているマイクロRNAの中から、miR-452、miR-320aを癌抑制型マイクロRNAとして同定した。さらに、それぞれのマイクロRNAが標的とするWWP1遺伝子ならびにLAMP1遺伝子を同定し、癌遺伝子機能を有する事を証明した。これらの新知見を、それぞれBr J CancerならびにInt J Oncolに論文発表することができた。また、6つのマイクロRNA(miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-29b, miR-29c and miR-218)が共通して制御するLOXL2遺伝子について解析し、マイクロRNAのネットワークを解明するための新知見として、その成果をJ Hum Genetに論文発表した。その他の泌尿器癌においてもマイクロRNAに関する解析を行い英文誌に論文発表することにより、マイクロRNAによる癌制御の解明に向けて、研究を進めることができた。研究期間の1年目でこれらの成果を達成していることから、本研究課題はおおむね順調に進展していると自己評価した。次世代シークエンサーを用いた解析を行い、passenger鎖であるmiR-145-3pが去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)において発現が低下していることを初めて示した。miR-145-3pが標的とする4つの遺伝子を同定し、予後予測マーカーとしての可能性を明らかにした。これらの成果をBr J Cancerに発表した。ホルモン感受性前立腺癌(HSPC)

ならびにCRPCにおけるmiR-150-5p(guide鎖)とmiR-150-3p(passenger鎖)について解析し、いずれもヒト前立腺癌細胞株の遊走能や浸潤能を抑制することを示した。標的遺伝子としてSPOCK1を同定し、microRNAネットワークに着目した新規治療開発の可能性について明らかにした。これらの成果をInt J Oncolに発表した。前立腺癌においてmiR-205-5pが制御する37個の候補遺伝子を同定した。The Cancer Genome Atlas databaseを用いて解析し、37個のうち7個の遺伝子(HMGB3, SPARC, MKI67, CENPF, CDK1, RHOU, POLR2D)について、発現亢進が疾患特異的生存率の低下に関連していることを明らかにした。HMGB3遺伝子についてさらに解析を進め、HSPCならびにCRPCにおいて発現が低下していることを明らかとした。新たな治療標的を同定するための手法を確立するとともに、これらの成果をJ Hum Genetに発表した。前立腺癌の臨床症例についてもデータをまとめ英文誌に論文発表した。その他の泌尿器癌においてもmicroRNAに関する解析を行い英文誌に論文発表した。研究実績の概要にも示したとおり、microRNAではguide鎖が遺伝子発現を制御し、相補的な配列であるpassenger鎖は関与しないとされていた。次世代シークエンサーを用いた解析を行い、passenger鎖であるmiR-145-3pが去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)において発現が低下していることを初めて示した。これにより、研究が大きく展開し、前立腺癌におけるmicroRNAによる遺伝子発現の制御に関する機序の解明に向けて大きく進展することができた。以降、guide鎖のみでなくpassenger鎖についても解析を進めた。研究実績の概要にも示したとおり、passenger鎖であるmiR-150-3pからは標的遺伝子としてSPOCK1を同定した。また、網羅的遺伝子解析やin silico解析、The Cancer Genome Atlas databaseを用いた解析により、効率よく候補遺伝子を絞り込む手法を確立した。miR-205-5pからは7個の候補遺伝子まで絞り込むことができ、臨床検体における発現解析と一致した結果が得られることも示すことができた。また、その他の泌尿器癌においても同様の手法を用いて解析を行い、候補遺伝子を同定することが可能であることを示すことができた。これらの成果も英文誌に発表し、microRNAによる癌制御の解明に向けて、研究を進めることができた。
難溶性薬物のキャリアーを目指した大環状ヘリ-クス蛋白質の創製

難溶性の薬物を可溶化し、生体内のターゲットサイトに効果的に輸送する事は、新薬開発上の大きな課題である。この目的のために、シクロデキストリン、リポソーム、合成高分子などさまざまな素材のドラッグキャリアーとして応用を試みられてきているが、キャリアー自体の包接能、ターゲットサイトでの薬物の放出、キャリアーの安定性や毒性など、種々の解決されねばならない問題が残っている。本研究では、立体的にデザインした合成ペプチドを新しいタイプのドラッグキャリアーとして応用するための基礎として、まず、キャリアー分子の構築法の開発を行った。20残基程度の長さからなる4本の両親媒性ヘリックスをFmoc型固相合成法で調製し、これを脱保護精製した後、これらを4本のジスルフィド結合によって選択的に架橋することにより、90残基程度の残基からなる大環状ヘリックス蛋白質を容易に構築しうることを見出した。また、この人工蛋白質が水中で安定なヘリックス構造を取りうることも確認した。さらに、選択的チオエーテル形成により熱や変性剤に大して非常に安定な大環状ヘリックス蛋白質を構築する方法も別途に考案した。これらの分子は中心部に疎水面を持ち、分子中のすべてのヘリックスの両端がリンカーで連結されているために、安定に疎水性の薬物を抱合できると期待できる。これらの蛋白質の薬物取り込み能および、膜との相互作用による薬物放出に関しては蛍光などを用いる分光学的方法などを用いて、現在、検討中である。
薬剤排出蛋白阻害剤スクリーニング系の開発

本研究では、臨床的に重要な黄色ブドウ球菌の多剤排出蛋白NorAおよび緑膿菌のMexAB両多剤排出蛋白に加えて、大腸菌のTet(B)に対する阻害剤を耐性度に対する相乗効果でスクリーニングする系を確立し、山之内製薬株式会社の協力を得て、10万検体以上の化合物をチェックした。まず、NorA,MexABをそれぞれ黄色ブドウ球菌と緑膿菌で発現するプラスミドを構築し、それぞれの内在性遺伝子欠損株に導入発現させる。対照として、宿主菌を用意し、排出されることによって耐性化するキノロン剤、β-ラクタム剤に対する抗菌力を、各種の化合物を加えた培地で測定した。その結果、いくつかの阻害剤が得られたが、阻害剤の検出頻度は同様のスクリーニングに比べて異様に低いものであった。このことは、細菌の多剤排出蛋白の特異的阻害剤がきわめてまれであることを示している。すなわち、耐性因子としての多剤排出蛋白の克服が容易でないことが改めて証明された結果になってしまった。本研究と並行して、我々とは別の、米国のベンチャービジネス企業が同様の方法を用いてやはり6万検体以上のスクリーニングを行い、やはりめぼしい阻害剤が得られないと言う結果になっている。彼らはなお研究を継続している。我々も、本研究終了後もスクリーニングは継続する予定である。上に述べた研究とは別に、黄色ブドウ球菌のテトラサイクリン排出蛋白Tet(K)の阻害剤をロッシュの自家化合物の中からスクリーニングしたところ、特異的阻害剤としてインダン誘導体が得られた。これについても引き続きその性質を検討している。以上のような現状に鑑み、異物排出蛋白阻害剤の開発にはドラッグデザインの手法が必要になるものと判断し、基質認識部位の立体構造決定にも取り組んだ。蛋白工学的手法によって立体構造を推定し、コンピューター計算で最適構造を求めるという手法で立体構造モデルを提出することができた。今後はこのモデルの検証と、これに基づく阻害剤の理論的設計を行いたい。7年度においては、まずTetとNorAを大腸菌において発現し、活性を解析する系の開発を目指した。なぜなら、当初の計画では、これらの排出系の性質を厳密に比較できるように、同一宿主での発現による解析を目指したからである。このうち、Tet Kについては大腸菌で構成的に良く発現する系が構築でき、輸送活性を詳細に解析することができた。この結果は報告した。NorAについても、大腸菌での発現系が構築でき、薬剤耐性をもたらすことが示された。ところが、反転膜を作成し輸送活性を反転膜での薬剤取込みとして測定することには成功しなかった。輸送活性がテトラサイクリン排出蛋白の場合よりはるかに低いことに主因があるものと考えられる。そこで、輸送活性については生菌体への薬剤蓄積量の低下を指標とすることにした。これには、排出蛋白発現株と発現しない感受性株に大きな差が認められる。ところで、反転膜を調整せず、生菌体で測定するのならば、スクリーニング系としては、臨床的に分離される状態に近いS.aureusでNorAおよびTet Kの活性を測定した方が良いと考えられる。そこで、これらの排出系の性質の基礎的な比較ならびに変異体構築などは大腸菌での発現系を用い、阻害剤のスクリーニングにはS.aureusでの発現系を用いることとした。緑膿菌のmexA/B系については引続きクローニングを試みるとともに、京都薬大の後藤博士よりプラスミドの提供を受けることとした。S.aureusのNorA産生株、P.aeruginosaのMexA/B

高度発現株をそれぞれ確立し、非産生株とのセットでキノロン剤およびβ-ラクタム剤に対する耐性をMICを指標として測定する系を確立した。この系を用いて、山之内製薬との共同で、阻害剤候補化合物のスクリーニングを行った。約6万種類の化合物をチェックしたが、1個だけヒットする化合物が得られた。この確率は、通常の酵素阻害剤のスクリーニングに比べると異常に低い確率である。細菌の多剤排出蛋白は非常に阻害されにくい蛋白であり、その克服が大変難しいことを示唆している。今後、さらに多数の化合物を検索すると共に、このヒット化合物の阻害機構について検討していきたい。本研究では、臨床的に重要な黄色ブドウ球菌の多剤排出蛋白NorAおよび緑膿菌のMexAB両多剤排出蛋白に加えて、大腸菌のTet(B)に対する阻害剤を耐性度に対する相乗効果でスクリーニングする系を確立し、山之内製薬株式会社の協力を得て、10万検体以上の化合物をチェックした。まず、NorA,MexABをそれぞれ黄色ブドウ球菌と緑膿菌で発現するプラスミドを構築し、それぞれの内在性遺伝子欠損株に導入発現させる。対照として、宿主菌を用意し、排出されることによって耐性化するキノロン剤、β-ラクタム剤に対する抗菌力を、各種の化合物を加えた培地で測定した。その結果、いくつかの阻害剤が得られたが、阻害剤の検出頻度は同様のスクリーニングに比べて異様に低いものであった。このことは、細菌の多剤排出蛋白の特異的阻害剤がきわめてまれであることを示している。すなわち、耐性因子としての多剤排出蛋白の克服が容易でないことが改めて証明された結果になってしまった。本研究と並行して、我々とは別の、米国のベンチャービジネス企業が同様の方法を用いてやはり6万検体以上のスクリーニングを行い、やはりめぼしい阻害剤が得られないと言う結果になっている。彼らはなお研究を継続している。我々も、本研究終了後もスクリーニングは継続する予定である。上に述べた研究とは別に、黄色ブドウ球菌のテトラサイクリン排出蛋白Tet(K)の阻害剤をロッシュの自家化合物の中からスクリーニングしたところ、特異的阻害剤としてインダン誘導体が得られた。これについても引き続きその性質を検討している。以上のような現状に鑑み、異物排出蛋白阻害剤の開発にはドラッグデザインの手法が必要になるものと判断し、基質認識部位の立体構造決定にも取り組んだ。蛋白工学的手法によって立体構造を推定し、コンピューター計算で最適構造を求めるという手法で立体構造モデルを提出することができた。今後はこのモデルの検証と、これに基づく阻害剤の理論的設計を行いたい。
ｉＰＳ細胞をより安全に臨床応用するための感染制御方法の検討

口腔領域の再生医療成功の鍵の1つは、口腔細菌やバイオフィルムの制御である。すなわち感染制御する一方で、軟組織への影響を考慮し、さらに分化を妨げない歯科技術が必要である。機能水の1種である次亜塩素酸電解水は、強い殺菌性を示す一方で、食塩水を原料とする電解水であることから安全性が期待されている。本研究において、抗菌試験及び細胞毒性試験を行い、1)短時間で殺菌効果を発揮、2)バイオフィルム浸透殺菌効果を有するおよび3)硬軟組織への影響が僅かである次亜塩素酸電解水を選択し、口腔領域における再生医療への応用についてその可能性を検討した。口腔領域は、多くの細菌種が存在しているため、常に感染のリスクが懸念される。そのため口腔領域の再生医療成功の鍵は、細菌やバイオフィルムの制御であるとされる。すなわち細菌やバイオフィルムを制御する一方で、軟組織への影響を考慮し、さらに分化を妨げない歯科技術が必要である。バイオフィルム制御に関して、抗菌剤や消毒剤などの化学療法剤が主流であるが、我々はこれまでに機能水のバイオフィルム制御作用の可能性を見出した。機能水は、一般的に分解性が高く、残留性が殆ど無いため安全性が示唆されている。そのため再生医療への応用にも期待でき、本研究課題においてその可能性を検証している。25年度は、機能水の細胞毒性を検証した。機能水として次亜塩素酸電解水及び対照群として3%過酸化水素水を準備し、KB細胞に作用させた。尚、次亜塩素酸電解水は、24年度で使用した無隔膜電解槽で電解した次亜塩素酸電解水に加えて、3室ダブルイン型電解槽で電解した次亜塩素酸電解水を用いた。作用後は、酵素活性試験及びLIVE/DEAD Viability Kitを用いた蛍光顕微鏡による生死判定試験を行った。酵素活性試験の結果、2種類の次亜塩素酸電解水の吸光度は、3%過酸化水素水と比較して高かった。また生死判定試験の結果に関しても、2種類の次亜塩素酸電解水群の死細胞の割合は、3%過酸化水素水と比較して著しく少なかった。2種類の次亜塩素酸電解水間で比較した場合、有効塩素濃度が一致しているにも関わらず、3室ダブルイン型電解槽で電解した次亜塩素酸電解水の細胞毒性は低かった。2種間で原材料及び製造方法などが異なるため、生成された次亜塩素酸電解水のpH、有効塩素の成分比率、食塩など不純物の割合或いは有効塩素の安定性などに差が生じたためと考えられた。今後は、口腔領域の再生医療に使用するために、さらなる検証が必要であると思われる。24年度は、機能水の細胞毒性を検証した。機能水として次亜塩素酸電解水及び対照群として3%過酸化水素水を準備し、ヒト口腔由来細胞KB細胞に作用させた。尚、次亜塩素酸電解水は市販品を希釈して用いた。酵素活性試験の結果、次亜塩素酸電解水群の吸光度は、対照群と比較して2から3倍程度高かった。また生死判定試験の結果、対照群は、作用直後では50%以上の死細胞が認められ、3、5及び7日後では、その割合が増加した。一方、次亜塩素酸電解水群の死細胞の割合は、対照群と比較して少なかった。したがって、本実験において、次亜塩素酸電解水は、臨床応用されている3%過酸化水素水ほどの細胞傷害性を示さなかったが、有効塩素の低濃度化も含め、今後さらなる検証を行う予定である。またこれらと並行して、iPS細胞に関しては、現在DsRed iPS細胞を作製中である。口腔領域の再生医療に関わる様々な細胞で十分検討した上で、機能水のiPS細胞或いはiPS細胞から骨組織への分化能に及ぼす影響に関して、調べることが次の課題である。

機能水の1種である次亜塩素酸電解水は、強い殺菌性を示す一方で、食塩水を原料とする電解水であることから安全性が期待されている。したがって、次亜塩素酸電解水は、再生医療への応用にも期待できるため、本研究課題においてその可能性を検証した。24および25年度の2年間の実験で、口腔内で使用するにあたり1)短時間で殺菌効果を発揮、2)バイオフィルム浸透殺菌効果を有するおよび3)硬軟組織への影響が僅かである次亜塩素酸電解水を選択した。26年度は、2年間で得た結果をもとに3室ダブルイン型電解槽で生成した次亜塩素酸電解水を選択し、細胞毒性試験を行った。対照群として3%過酸化水素水を用いた。これらの供試溶液をKB細胞に作用した後、LIVE/DEAD Viability Kitを用いた蛍光顕微鏡による生死判定試験を行った。蛍光顕微鏡観察した結果、3%過酸化水素水における死細胞の多くは、次亜塩素酸電解水と比較して扁平形態が失われ、培養プレートから剥離していることを確認した。そこで細胞接着分子へ及ぼす影響に差が生じていることが考えられるため、細胞接着分子の1つであるE-カドヘリンの抗体を用いて免疫組織化学的染色を行った。その結果、E-カドヘリンの発現は、3室ダブルイン型電解槽で生成した群では発現が多く見られたが、3%過酸化水素水群では僅かであった。以上より、3室ダブルイン型電解槽で生成した次亜塩素酸電解水のKB細胞におけるE-カドヘリンへの損傷の程度は、臨床で用いる3%過酸化水素水と比較して小さいことがわかった。社会歯学現在までに、次亜塩素酸電解水のKB細胞に及ぼす影響に関して検証を行った。この研究により、細胞培養系及び機能水の細胞毒性試験系の確立を達成することができ、様々な機能水を検証することができた。さらに、本研究で得られた成果は、長野県松本市で行われた第62回口腔衛生学会・総会及び秋田で行われた第139回日本歯科保存学会2013年度秋季学術大会にて発表するに至った。機能水の歯科応用に期待が寄せられている一方で、他の抗菌剤や消毒剤などの化学療法剤と比較して、科学的検証を行った報告が少ないため、本研究は高い評価を得ることができ、達成度としてはおおむね順調に進展していると思われる。現在までに、機能水の1種である次亜塩素酸電解水のヒト口腔由来細胞KB細胞に及ぼす影響に関して検証を行った。この研究により、細胞培養系及び機能水の細胞毒性試験系の確立を達成することができた。さらに、本研究で得られた成果は、長野県松本市で行われた第62回口腔衛生学会・総会にて発表するに至った。今後は、有効塩素の低濃度化も含めたさらなる機能水の検証を行い、再生医療に応用するための最適な条件或いは作用方法を模索していきたい。また、iPS細胞に関しては、DsRed iPS細胞の作製を、現在樹立中である。口腔領域の再生医療に関わる様々な細胞で十分に検討した上で、順次実験を開始していきたい。
多文化共生地域福祉論の構築

日系ブラジル人は、「家族戦略」によって、ブラジルと日本の両国にまたがった生活を送っていた。その生活は不安定であることが明らかであった。二国間にまたがる家族を支援する新しい方法が求められている。もっとも重要なのは移民自身の当事者組織による支援であった。移民が受け入れられる多文化地域福祉を構築する必要がある。本研究は移民の生活実態を把握し、その生活を支援する方法、さらに多文化共生コミュニティの形成方法を明らかにすることであった。そこで今年度は、昨年度に引き続きブラジル調査をサンパウロ、リオデジャネイロで行った。まずは日本から帰国した日系ブラジル人の生活史と生活実態調査を行ない移住の際の「家族戦略」の実態を明らかにした。そのうえで日系人の生活支援団体であるサンパウロ日伯支援協会のソーシャルワーカーに日系人の現状と課題をヒアリングし、高齢化が進む中で、増加しつつある高齢者支援の取り組みについて詳細にヒアリングを行った。また日伯支援協会が運営する老人ホームの見学とその実態把握の調査も実施した。公的な制度が不十分ななか財政的に厳しい実態とケアの質の確保が課題であった。さらに日本から帰国した日系人の相談機関であるNIATREの相談員に最近の相談内容の傾向等を伺った。ブラジルの雇用環境は高学歴や専門的な技術がある人にとっては改善されているが、工場なども少なく低学歴層には依然厳しい就職環境であり、日系企業も進出しつつあるとはいえ、そこで求められるのはポルトガル語、日本語、英語ができる人材であり、日本からの帰国者にはハードルが高いということであった。また日本へのデカセギ支援機関であるCIATEにも調査に行った。そこでは、デカセギ希望者は以前ほどではないが、依然存在しており、その人たちには明確な目標をもって日本に行くこと、日本の雇用環境や日本語教育の学習支援を行っているとのことであった。なおリオデジャネイロの日系人組織はサンパウロと比較すると相当開かれ、ブラジルの人々との関係がより強く感じられた。日系人が集住ではなく分散していることにもよると思われる。多文化コミュニティの形成過程にあると感じられた。「多文化共生地域福祉論」という福祉国家の枠組みを超えた地域福祉の理論を構築することを目的に国境を越えて移住する人たちに焦点をあてて調査研究を行ってきた。中でも80年代後半から急増した日系ブラジル人の実態を明らかにするために2011年、2012年にはブラジルでの日系人の実態調査を行ってきたが、その結果を踏まえ、さらに日系人の歴史のあるハワイの日系人についてその実態と課題を調査してきた。ハワイでは日系2世、3世の方の移住の経緯と現状をインタビュー調査によって明らかにしてきた。ハワイの日系人の歴史のなかでは第二次世界大戦の真珠湾攻撃当時の日系人のおかれた状況の厳しさを改めて実感させられた。国境を越えた生活を維持するためにはいかに平和が重要であるかを再確認させられた。また初期の移住はブラジルの日系人と同様に苛酷な農園労働であった。ハワイの日系人コミュニティの現状もインタビュー調査等によって行ったが、ブラジル以上に日系人コミュニティは崩壊しつつあることが明らかであった。とはいえ日系人の文化センターの運営などによって日本とのつながりや日系人としてのアイデンティティの保持を図る努力が行われていた。ハワイの日系人はアメリカとの関連も強く、移住は二国間というよりは複数国にまたがるまさにグローバルな視点での移住支援方法・システムの構築が必要不可欠である。移民社会であるハワイでは多文化ソーシャルワークが重視されていた。以上の内容を踏まえて多文化地域福祉論を考察しつつある。2011年度は初年度であり、研究仮説のキーワードである「トランスナショナルな移住」に関する文献の収集と「家族戦略」についての先行研究のレビューを行い、理論研究を進め、仮説に基づく調査項目を作成した。またブラジル調査のためにブラジルの地域研究やブラジルの社会保障、福祉に関する文献、さらにブラジルの移民史について文献研究を行った。予定していた調査については、日本の日系ブラジル人集住地域の一つである美濃加茂市を中心にブラジル友の会と共同で岐阜県外国人生活実態調査を実施した。事例調査については、統計調査の結果を踏まえ、2008年以降失業等大きな影響を受けた日系ブラジル人に対し、その生活史を含む生活実態調査を行った。また、次年度以降のブラジル調査の予備調査として、ブラジルのサンパウロにある日系ブラジル人集住地域に行った。そこでは、ブラジルでの移民支援組織であるブラジル日本文化協会、サンパウロ日伯援護協会へのヒアリングと日本からの帰国者への事例調査を行った。なかでもブラジル日本文化協会、サンパウロ日伯援護協会と日系ブラジル都道府県人会連合会とで設立したCIATE(国外就労者情報援護センター)とNIATRE(帰国者支援センター)の支援内容について調査を行った。ブラジルでの調査によって、ブラジルにおける日系移民社会の実態とともにそこにおける日本にデカセギに出た人々の位置づけ、さらに日本から帰国した日系ブラジル人の生活実態やその支援の概要について明らかにできた。本研究は、グローバル化のもと国境を越えて移動する移民に焦点をあて、移民の生活実態とその支援方法を明らかにすることを目的として行ってきた。中でも1980年代後半から急増した日系ブラジル人の生活課題とその解決方法を明らかにするために日本で生活する日系ブラジル人とブラジルに帰国した日系ブラジル人の生活実態を明らかにしてきた。

日系ブラジル人はブラジル帰国後もその生活は不安定で、ブラジル社会に再適応するのが困難な実態が明らかであった。そして日本に定住する日系ブラジル人もその生活は不安定であり、なかでも移民2世の問題や老後の問題などは深刻な課題となりつつある。移民の生活を安定化させるためには「家族戦略」は一定程度有効であるといえる。しかし、それだけでは乗り越えられない就労支援や子育て・教育を含む生活支援はブラジルでも日本でもNPOなどによって行われていた。ブラジルでは日系移民社会が日本から帰国した日系ブラジル人の支援を行っていたが、政府の支援も行われていた。その一方日本における日系社会の力は脆弱であり、当事者組織が支援を担うまでには発展していない。日本では総合的な移民政策が不十分ななか外国人集住都市や日本語ボランティアなどのNPOが支援活動を行っているが、その活動は地域差が大きい。したがって、日本における移民支援を行うためには、移民の当事者組織をエンパワーするための多文化地域福祉政策や多文化ソーシャルワークの実践が求められる。地域福祉当初予定していたブラジル調査は2年間継続して行ったことにより、支援機関との関係も構築でき、日系ブラジル人の生活実態と支援内容の把握を行うことが順調にできた。日本から帰国した日系ブラジル人については家族関係も把握することができ、トランスナショナルな移住の家族戦略の内容を明らかにすることができた。移民は仮説のとおり家族が生活をより豊かにしていくために戦略的に行動していることは明らかであった。また移民支援に関しては、当事者である移民の相互扶助的な支援が重要であり、ブラジルのサンパウロでは移民の集住地域を拠点としながら子育て、子どもの教育、障害児の療育、高齢者支援など体系的に取り組まれてきていることが理解できた。とはいえ、トランスナショナルな移住はブラジルと日本との連携がもっと必要であり、お互いの社会保障や社会福祉サービス等の知識・情報が共有できるようなシステムの構築が重要な課題である。日系ブラジル人の移住は「家族戦略」によって家族の生活を維持するために国境を越えて移動する生活をしている。そのような流動的な移民の生活を支援することが求められるという仮説のもとにブラジルとハワイでの移民の実態調査を行ってきた。中でもブラジルでは、多くの日系人が「家族戦略」によって移住を行っており、まさにトランスナショナルな移住が展開されていた。しかしその生活は不安定であり、家族内では解決できない多くの深刻な課題があることを明らかにできた。なかでも移住第二世代である子どもの問題と移民の高齢化の問題である。それらの問題をいかに解決していくかは調査データをさらに分析して明らかにしていきたい。またブラジルでは、日系人への支援が日系人当事者組織によって多様に展開されていた。
世界遺産条約「文化的景観」とその導入による我が国の歴史的庭園の保存施策研究

○世界遺産条約に「文化的景観」概念が提起、導入される経緯およびその活用のされ方を考察。当該概念は、条約の規定に関する矛盾から導入されたものであり、遺産登録における地域間格差に関して大いに活用されている。○今後の施策検討のための基礎的研究に位置づけたイタリアの事例研究の成果は以下の3点から成る。1)保護法制と保護動向を法定財物件数の推移と社会事象から考察した。同国の歴史的庭園は1939年制定の文化財の保護法と自然美の保護法の2法によって法廷材とされ、我が国の場合と大きく異なる点は、この2法が都市計画法の上位にあることである。歴史的庭園の保護は、(1)今世紀初頭の自然美保護思潮の影響下に具体化し、(2)保護法制の整備には、50年代後半からの市民運動や都市計画の拡充に明らかな相関がみられた。(3)70年代からは環境財という概念が導入されたことに強い影響を受け、(4)80年代、フィレンツェ憲章の草案を契機として、歴史的庭園の定義づけや具体的な保護・修復の手法等へと議論が深化。2)法定財の目録づくりに関する「指針」を施策展開への第一段階と捉え、その策定背景と内容を検証。その結果歴史的庭園は、環境の総和と認識されていると理解され、その思想にはフィレンツェ憲章の存在と、1970年代以降の文化財行政の意識改革とも言える「文化財は環境財である」という概念が色濃く反映されている。3)歴史的庭園の本質的な保存・継承は、都市計画にその保護施策を如何に位置づけるかにかかっていると考え、ローマの近代都市計画における都市緑地システムと歴史的庭園の消失・荒廃の事例を検証した。○我が国のケーススタディとして、東京に現存する江戸期の武家屋敷の庭園遺構を調査。確認した55件の庭園遺構を、(1)当時の所有者(藩名)、(2)現況、(3)所在地、(4)残存状況、(5)立地、(6)文化財指定の有無の6項目に整理、さらに、(7)ランドスケープ遺産としての価値付けを行なった。平成10年度の計画(1)(2)(3)に・ついて:現在までの調査研究の結果、「文化的景観」概念の導入は「世界遺産条約」以百の国際間及び欧州間の取り決めにおいて、大きくは以下2系統より求められた課題に対する成果であるどの阪説を立てるに至っている。i)「ラムサール条約」等にみられる、国家単位を超えた環境保全に対する連携的取り組みの拡大。)宗教・慣習等の無形な文化に対する評価の必要性が増し、それらを育む風上全体を「景観」として捉えて保護の対象とする取り組みの発生,計画(4)について:我が国の歴史的庭園の保存実態調査を行っている。江戸期の地誌・切絵図等の文献及び江戸期以降の地図情報と文献調査によって、東京都区部に40箇所の旧大名庭園(部分)を抽出、所有形態の差異等によって類型し、残存状況の調査から保護制度の評価手法を検討中である。計画(5)について:文献調査により、イタリアの歴史的庭園は1939年制定の文化財の保護法と自然美の保護法の2法によって法定財とされ、我が国の場合と大きく異なる点として、これらの保護法は概念的位置付けが都市計画法の上位にあり、よって運用次第で広域的な建築行為や開発行為の規制を可能としていることを明らかにした。

法定財物件数の推移(1902'91年)を併せて考察した結果、イタリアの歴史的庭園の保護は、i)今世紀初頭の自然美保護思潮の影響下に具体化、ii)'70年代からは環境財という概念が導入され強く影響を受けており、iii)'80年代より具体的な保存・修復の手法等に関する論議が深まる。これはICOMOS-ILFAのフィレンツェ憲章の制定が起因していることを明らかにした。また、イタリアの歴史的庭園に関する保護法制の進展には、'50年代後半からの市民運動や、都市計画の拡充に重要な相関関係があることも指摘し論考した。「文化的景観」概念の導入は、宗教・慣習等の無形な文化に対する評価の必要性が増加したことを主たる要因とし、それら無形な文化を育む風土全体を「文化的景観」と位置づけて保護対象としていこうとしている、と整理できた。諸文献のレビューから、「文化的景観」という概念を考慮した結果をふまえたうえで本研究では、既に世界遺産条約の対象となっている庭園に関して、そのカテゴリー分類の見直し等、「文化的景観」として再評価すべきであるとの論考の展開を試みた。イタリアを事例とした研究においては、イタリアの歴史的庭園の保護動向を、世界遺産条約との相関で捉えるために、フィレンツェ憲章の草案である(1)IFLA会長案、(2)イタリア・ノストラ案、さらに同憲章の制定以前に急拠制定されたイタリア独自の憲章の3本を比較分析した。その結果、イタリアにおいては、歴史的庭園をより明確に自然環境や国土計画と関連させて保護することの重要性が打ち出されており、また、フィレンツェ憲章において、修復に関する厳格な定義づけが実現したことは、イタリア・ノストラをはじめとするイタリアの研究者たちの保護思潮に負うところが大であると判断された。
介護保険施設でのケアの質を高めるチーム・コミュニケーションと組織公正感

チームの自律性に関しては、介護施設のワークチームは現場の業務に関してはかなりの裁量権が与えられていたが、組織運営にかかわる意思決定に関してはほとんど与えられていないことやワーカーQWLに対してリーダーシップが重要であることがわかった。。また、従来型構造チームの場合は、自律性の程度が直接ワーカーのQWL (i.e.,コミットメント・OCB)に関係しているが、組織公正感を得るとより大きくなることがわかった。一方、ユニット型チームの場合は、チームに自律性を与えることでVoice(意見表明の機会)および組織公正感が促進しなければ、ワーカーのQWLは向上しないことがわかった。。本年度は,文献調査を行うとともに,5つの介護保険施設を訪問し,インタビュー調査を行った。また,生活介護研究所長代表の坂本宗久氏にインタビューを行った。介護保険施設でのインタビューは,施設長と生活相談員・施設介護支援専門員および介護職員2人4人に行った。前者への主たる質問は,ユニット・ケア導入の動機・目的,あるいは,従来型にこだわる理由,チームのありかたについて,チームへの権限委譲の程度,意思決定のルートおよびフォーマルコミュニケーションのルート,組織構造,人事制度,ケアの質の関する現状認識,メンバーの組織行動・態度(職務満足,動機づけなど)の問題,チームワークの効果と問題などについてであった。後者への主たる質問は,チーム内のコミュニケーションで困難なこと,うまくいっていること,リーダーの役割と機能,自由裁量(自律性)の程度,職務満足,動機づけなどの問題,チームワークの効果と問題,コミュニケーション・情報伝達の過不足の問題,不公正や不公平だとう思いがあるとすればどんなことか,ユニットケア導入前後の仕事への取り組みやケアの質の変化,バーンアウト状況などである。坂本氏からは,ユニットケアにおける問題点や利点を詳細に伺い,チームの自律性とリーダーの役割の重要性を再確認できた。これらのインタビュー調査を通して,ユニットケアと従来型の利点と欠点,リーダーシップの機能(ファシリテーションスキルなど),チーム内のメンバー関係(協力,サポート,信頼など),組織公正(対人・情報公正とvoice)とそれによる公正感認知,そして,評価のあり方がケアの質に関係があるという理論モデル(仮説)を演繹できた。それに基づき,質問票を作成し,2年目の量的調査の準備を行った。本研究チームは、介護保険施設における介護職員の労働生活の質(Quality of Working Life=QWL)向上がケアの質を高めるだろうと考え、彼らのQWLに影響を与える要因を探った。その要因とは介護職員のチームの機能とそれを機能させるチーム・コミュニケーションである。そして、組織やチームに対して知覚するチームメンバーの公正感である。組織公正感は、組織コミュニケーションにも関連する概念であると同時に組織メンバーのQWLに影響を与える要因でもある。このプロジェクトで、われわれはインタビュー調査と質問票調査の両方を行った。1年目は、文献調査とともに、A県4施設のほかに、県外1施設で、インタビュー調査を行った。このインタビュー調査で多くの有益な情報を得ることができた。そのデータを分析し、2年目の質問票調査でどのようなことを質問すればいいのかが明確になった。質問票調査は、A県にフィールドを絞り、質問票をA県老人福祉施設協議会に所属している全100施設に、生活相談員・施設介護支援専門員用(1部ずつ)と介護職員用(10部ずつ)を配布した。生活相談員・施設介護支援専門員用質問票に関しては、61名から回答を得た(回収率61%)。また、介護職員からは、538名から回答があった(回収率53.8%)。多くの発見があったが、一部のみ提示する。チームの自律性に関しては、介護施設のワークチームは現場の業務に関してはかなりの裁量権が与えられていたが、組織運営にかかわる意思決定に関してはほとんど与えられていないことやワーカーのQWLにリーダーシップが重要であることがわかった。また、従来型構造チームの場合は、自律性の程度が直接ワーカーのQWL(i.e.,コミットメント・OCB)に関係しているが、組織公正感を得ると自律性の影響がより強くなることがわかった。
神経芽細胞腫のアポトーシス誘導に重要なカスパーゼ8のメチル化のアレイと解析

本年度はカスパーゼ8のメチル化解析の実験を行う上で、昨年度までの研究を更に進め以下のとおり実施した。(1)これまで当科にて保存したDNA検体に加え、購入したMagtration System 6GCを用い当科に保存してある神経芽細胞腫組織からDNAを抽出した。(4)PCR産物を精製し準備調整したPrimerを用いてPCRをかけ増幅した。(5)現有するシークエンサーを用いてDNAシークエンスを解析した。オリゴアレイでの腫瘍組織のメチル化判定結果と300箇所中262箇所で同一判定を得た。(6)判定の異なるサンプルに対し、TAクローニングを行い、得られたクローンに対しオリゴアレイ、シークエンス解析を行った。各クローンのメチル化にばらつきが見られた。(7)サンプルのうち一部でcDNAを作成し、TaqMan PCR法を用い、カスパーゼ8の発現状態を解析し、オリゴアレイ結果を検証した。Stage別での比較ではstage1とstage4について発現量に有意差が見られた。神経芽細胞腫のカスパーゼ8のメチル化に注目し本腫瘍の退縮・分化の機序を解明し予後良好な腫瘍(favorable type)と予後不良の腫瘍(unfavorable type)との鑑別診断に資することを主目的とした。実験には当科に保存されている神経芽細胞腫の凍結標本を用いた。購入したQiagen BioRobot EZ1 type HS DNA抽出装置を用いてDNA抽出し、bisulfate処理を行った。bisulfate処理GenomeをPCRにかけ増幅し試作したメチル化特異的DNAアレイにハイブリダイズさせ、メチル化の有無を判定した。標本は腫瘍組織および対照として末梢血リンパ球各43検体を用い、アレイの判定結果をstage別に検討を行った。試作したアレイはカスパーゼ8の今回標的とした6箇所について個別にメチル化を判別可能なように作成した。試作したアレイの判定結果の検証としてbisulfate処理Genomeのシークエンスを調べることで、簡易アレイの結果との相同性を検証した。アレイ判定結果は現在までstage1は13例中腫瘍のメチル化17箇所、末梢血リンパ球のメチル化0箇所、stage2は4例中腫瘍メチル化7箇所、末梢血リンパ球2箇所、stage3は9例中腫瘍メチル化17箇所、末梢血リンパ球0箇所、stage4は腫瘍11例中メチル化31箇所、末梢血リンパ球0箇所、stage4sは6例中腫瘍メチル化6箇所、末梢血リンパ球1箇所であった。stage4群において高頻度のメチル化が見られた。H17年度は引き続きアレイによるメチル化判定を行うとともに、bisulfate処理Genomeのクローニングを行い、メチル化部位の解析、シークエンスを行う。Stage別での比較では発現量と有意差は見られなかった。