hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高速大規模な画像情報の取得を特徴としたゲノムプロフィリングシステムの開発と応用

本研究は、「ハードウエアの開発」、「ソフトウエアの開発」、「ハードとソフトの融合」に分けて進めている。・ハードウエアの開発:本項目では、細菌・細胞の培養、DNA抽出、DNA増幅をMMVマイクロアレイで行い、その後、サンプルをゲルに移してTGGEを行う一連の操作を自動化し、手作業が基本的に不要なシステム「MMV-TGGEシステム」の開発を目的としている。2018年度は、5サンプルを同時に泳動できるTGGEシステムを設計した。現在、(株)ピーエムティーに試作を依頼する方向で進めている。・ソフトウエアの開発:本項目では、TGGEの泳動パターンを追跡し、変曲点を求める手法を開発することを目的としている。2018年度は、ある点における濃度値とその点が右方向に関して上下どの向きに進行しているかを判定し、順次一つの連続した線として保持し、線幅の情報を確定させることをめざした。そのために、各軌跡に対して、シグモイド関数のパラメータを変更しつつ、フィッティングに関する評価関数の値を求め、評価関数の幅により、軌跡を推定する処理を組み込むことに取り組んだ。・ハードとソフトの融合:本項目では、各種用途に対してそれぞれ複数の測定項目を設定し、対応するプライマーを設計し、配列解析も同時に行い、TGGEの泳動パターンと関連づけ、「革新GPデータベース」を構築することを目的としている。2018年度は、等温DNA増幅法であるRPA(Recombinase Polymerase Amplification)法の基本性能を確認した。また、RPA法を構成する3種類の酵素であるリコンビナーゼ(recA)、1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)、DNAポリメラーゼについて大腸菌で組換え酵素を発現させた。・ハードウエアの開発(主担当:ビヤニ):今回設計した5サンプルを同時に泳動できるシステムでは、温度勾配を横軸方向に1回だけである。MMVマイクロアレイでのPCRについては、温度変化が速やかに伝わるよう、MMVマイクロアレイのサーマルサイクラーへの設置方法について種々の検討を行った。・ソフトウエアの開発(主担当:吉高):1ピクセルよりは大きな斑点状の領域(人の判断としては点状に見えるもの)が複数ピクセルから構成されるため、アルゴリズム的にはピクセルを複数回にわたって追跡してしまっていることについて、線長に関する制約を導入することで、これらの線領域をすべて削除することで対応した。また、京都大学でTGGEを行い、目視で変曲点を求める作業を行っている担当者と議論し、多くのTGGEパターンを入手した。・ハードとソフトの融合(主担当:保川):嘔吐型セレウス菌の毒素であるセレウリドを合成する酵素の遺伝子であるcesDをモデルとしてRPA法の性能を検討した。感度はPCRとほぼ同等であった。反応温度は34°C46°Cの範囲であり、増幅に要する時間は5分間であったことから、PCRに対する優位性が確認された。・ハードウエアの開発:1024ウエルのMMVチップからのサンプルをハンドリングできる100ウエルのMMVチップ(ウエルのサイズは縦横1.6 mm、深さ1 mm)を設計する。MMVチップの作製には3Dプリンター(Ultimaker 3, Netherlands)を用いる。まず、0.4 mmあるいは0.25 mmのノズルを用いて、縦横0.5 mm、深さ1 mmのウエルをプリントする。チップが十分平らであるか、でこぼこがないかについて、注意を払う。3Dプリントの各種パラメーター(Layer height, Infill, Top/bottom thickness, Line width, Infillspeed, Wall line count, Wall speed, Top/bottom speed, Travel speed, Print acceleration, Travel acceleration, Printing temperature, Retraction distance)を最適化する。マイクロTGGEについては、まず、従来の装置を用いて、2サンプルを泳動する。今後、そのためのチップを作製する。・ソフトウエアの開発:一つ一つの軌跡に対して、シグモイド関数のパラメーターを変更しつつ、フィッティングに関する評価関数の値を求め、その値により軌跡を推定する処理を組み込む。基本的なアイデアは、ハフ変換で使用する関数をシグモイド関数としたものである。・ハードとソフトの融合:2018年度はTwist社から販売されているキットを用いてRPAの評価を行った。今後は、自家製造した酵素を用いてRPAを実現させ、各種評価を行う。また、「革新GPデータベース」の構築に向けて、配列既知の複数のPCR増幅断片に対してTGGEを行い、配列の違いが変曲点に与える影響について解析する。

・ハードとソフトの融合:本項目では、各種用途に対してそれぞれ複数の測定項目を設定し、対応するプライマーを設計し、配列解析も同時に行い、TGGEの泳動パターンと関連づけ、「革新GPデータベース」を構築することを目的としている。2018年度は、等温DNA増幅法であるRPA(Recombinase Polymerase Amplification)法の基本性能を確認した。また、RPA法を構成する3種類の酵素であるリコンビナーゼ(recA)、1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)、DNAポリメラーゼについて大腸菌で組換え酵素を発現させた。・ハードウエアの開発(主担当:ビヤニ):今回設計した5サンプルを同時に泳動できるシステムでは、温度勾配を横軸方向に1回だけである。MMVマイクロアレイでのPCRについては、温度変化が速やかに伝わるよう、MMVマイクロアレイのサーマルサイクラーへの設置方法について種々の検討を行った。・ソフトウエアの開発(主担当:吉高):1ピクセルよりは大きな斑点状の領域(人の判断としては点状に見えるもの)が複数ピクセルから構成されるため、アルゴリズム的にはピクセルを複数回にわたって追跡してしまっていることについて、線長に関する制約を導入することで、これらの線領域をすべて削除することで対応した。また、京都大学でTGGEを行い、目視で変曲点を求める作業を行っている担当者と議論し、多くのTGGEパターンを入手した。・ハードとソフトの融合(主担当:保川):嘔吐型セレウス菌の毒素であるセレウリドを合成する酵素の遺伝子であるcesDをモデルとしてRPA法の性能を検討した。感度はPCRとほぼ同等であった。反応温度は34°C46°Cの範囲であり、増幅に要する時間は5分間であったことから、PCRに対する優位性が確認された。・ハードウエアの開発:1024ウエルのMMVチップからのサンプルをハンドリングできる100ウエルのMMVチップ(ウエルのサイズは縦横1.6 mm、深さ1 mm)を設計する。MMVチップの作製には3Dプリンター(Ultimaker 3, Netherlands)を用いる。まず、0.4 mmあるいは0.25 mmのノズルを用いて、縦横0.5 mm、深さ1 mmのウエルをプリントする。チップが十分平らであるか、でこぼこがないかについて、注意を払う。3Dプリントの各種パラメーター(Layer height, Infill, Top/bottom thickness, Line width, Infill
二次元結晶のクリスタルエンジニアリング

本研究の目的は、三次元結晶に比べて制御の次元が少ない二次元結晶系である合成脂質の作る膜構造に着目し、分子の化学構造と膜構造との相関性を明らかにし、この系における構造形成因子を解明することである。我々はすでに、疎水部にアゾベンゼン発色団を持つ一本鎖型合成脂質CnAzoCmN^+Br^-について、その化学構造と膜構造の間の関係を単結晶X線構造解析の結果を基にして詳細に検討してきた。その結果、m-nz2の化合物ではH-会合形態、m=5の化合物ではJ-会合形態をとること、また加熱により後者ではJ'-会合となった後、室温では元のJ-会合に戻るが、前者ではJ'-会合の後、冷却するとJ-会合になり、加湿することでH-会合に戻る等の一連の転移現象を見つけてきた。さらに、この転移時に転移湿度、転移エンタルピー等の特性にアルキル鎖長(m,n)の奇偶に基ずく大きな差異を見つけ、この原因がH-会合形態における親水部分のわずかな構造の違いによるものであることを明らかにした。本年度においては、H-型結晶のみならずJ-型結晶においても、極めて微少ではあるが、やはりアルキル鎖長の奇偶による転移時の物性値の違いを観測し、この原因も室温におけるJ-型結晶の構造の微少な違いに基ずくことを明らかにした。また、この化合物における化学構造と膜構造の相関に関するこれまでの知見に基ずき、類似化合物を利用した機能性膜の分子設計を行なった。即ち、アゾベンゼンの代わりに電子供与基であるビフェニルを導入し、アンモニューム基の代わりに電子受容基であるビオローゲンを用いた化合物(CmBphV^<2+>)を合成した。この化合物においても、アゾ化合物の場合と同様にアルキル鎖長(m,n)により、J-会合、H-会合の制御ができ、J-会合形態をとる時だけ、ビフェニルと隣接分子のビオローゲンが近づくため、電筒移動を観測した。
ナノサイズの空孔を持つ水素結合型超分子包接体の機能性物質への応用展開

研究業績:PybenHはカルボン酸二量体を形成し、架橋配位子として機能することを見出した。芳香族化合物存在下、pybenH二量体とNi(SCN)_2を集積させたところ、二種類の包接体結晶を得ることに成功した。包接体結晶のX線結晶構造解析の結果、pybenH二量体とSCN^-は、Ni^<2+>をそれぞれ約21Åと約6Åで架橋し、二次元格子状の集積型金属錯体を形成することが明らかとなった。二次元格子内には長方形の空孔が形成され、その中にnaphthaleneやdibenz[a,h]anthracenenが包接されていた。包接体結晶は、二次元格子状の集積型金属錯体が積層することで形成されていた。空孔の大きさから、これら二種類のゲスト以外にも様々な芳香族化合物が包接されることが予想された。(Chem.Lett.2006,35,614-615に掲載)四種類のピリジンガルボン酸(isoH, acrylH, pybenH, pppeH)を用い、1と同様な方法で包接体結晶の作成四種類のピリジンガルボン酸(isoH, acrylH, pybenH, pppeH)を用い、1と同様な方法で包接体結晶の作成を行った。その結果、それぞれの二量体とNi(SCN)_2のX線結晶解析を行い、結晶構造の比較を行った。(Inorg.chem.2006,45,9233-9344に掲載)からなる包接体結晶を得ることに成功した。包接体結晶のX線結晶解析を行い、結晶構造の比較を行った。(Inorg.chem.2006,45,9233-9344に掲載)3)PybenHを用いた集積型金属錯体の包接能の解明1)の結果に基づき、pybenHを用いた集積型金属錯体の包接能を調べた。様々な芳香族化合物存在下、包接体結晶の作成を試みた。その結果、20種類以上の包接体結晶を得ることに成功した。包接体結晶のX線結晶構造解析を行い、pybenHを用いた系の包接能についてまとめた。(現在論文を執筆中である。)Isonicotinamide(isoNH_2)もカルボン酸と同様に水素結合二量体を形成することを利用し、1)と同様な方法で包接体結晶の作成を試みた。その結果、四種類の包接体結晶を得ることに成功した。包接体結晶のX線結晶構造解析を行い、結晶構造を明らかにした。(現在速報を執筆中である。)研究内容申請書に記載したイソニコチン酸誘導体を合成し、包接体結晶の作成を行った。その結果、多数の包接体結晶が得られた。単結晶X線結晶構造解析を行い、構造を明らかにしだ。イソニコチン酸からイソニコチンアミドへと構造展開を行うことで、新たな包接体を得ることに成功した。これらについても単結晶X線結晶構造解析を行い、構造を明らかにした。得られた構造データを、整理分類し、学会発表、速報及び論文の執筆・投稿を行った。研究発表下記学会にて本年度の研究に関する発表を行った。第55回錯体化学討論会新潟朱鷺メッセ「カルボン酸の二量化を利用した水素結合型超分子ホストの設計合成」「イソニコチンアミド二量体をピラーとして用いた層状ホストの設計合成と包接能」第14回有機結晶部会シンポジウム京都大学「イソニコチンアミドの二量化を利用した包接体結晶のX線結晶構造解析」2005年環太平洋国際化学会議米国ハワイ州第86回日本化学会春季年会(口頭1件)日本大学「カルボン酸水素結合と配位結合を併用した集積型配位高分子ホストの設計合成と包接能」論文本年度の研究に関する速報が一報掲載された。また、現在速報一報、論文一報を投稿中である。

その結果、それぞれの二量体とNi(SCN)_2のX線結晶解析を行い、結晶構造の比較を行った。(Inorg.chem.2006,45,9233-9344に掲載)からなる包接体結晶を得ることに成功した。包接体結晶のX線結晶解析を行い、結晶構造の比較を行った。(Inorg.chem.2006,45,9233-9344に掲載)3)PybenHを用いた集積型金属錯体の包接能の解明1)の結果に基づき、pybenHを用いた集積型金属錯体の包接能を調べた。様々な芳香族化合物存在下、包接体結晶の作成を試みた。その結果、20種類以上の包接体結晶を得ることに成功した。包接体結晶のX線結晶構造解析を行い、pybenHを用いた系の包接能についてまとめた。(現在論文を執筆中である。)Isonicotinamide(isoNH_2)もカルボン酸と同様に水素結合二量体を形成することを利用し、1)と同様な方法で包接体結晶の作成を試みた。その結果、四種類の包接体結晶を得ることに成功した。包接体結晶のX線結晶構造解析を行い、結晶構造を明らかにした。(現在速報を執筆中である。)
歯髄の治癒促進と硬組織接着性を併せ持つ革新的直接覆髄材の探索研究

歯を削る必要のある治療の際に,時として歯の神経まで至る切削が行われることがある.この時,条件が許されれば歯の神経を保存していく治療が可能になる.そのことで,歯の寿命を延ばすことができ,米国等の外国では極めて高価な神経の治療を回避することが可能となる.いまのところ,このような時に使える材料や手技に限界があり,新たな材料の出現が待たれている.本研究では,露出された歯の神経の部分を完全にシールし,傷ついた神経の治癒を助ける材料の開発を検討していくことを目的としている.歯を削る必要のある治療の際に,時として歯の神経まで至る切削が行われることがある.この時,条件が許されれば歯の神経を保存していく治療が可能になる.そのことで,歯の寿命を延ばすことができ,米国等の外国では極めて高価な神経の治療を回避することが可能となる.いまのところ,このような時に使える材料や手技に限界があり,新たな材料の出現が待たれている.本研究では,露出された歯の神経の部分を完全にシールし,傷ついた神経の治癒を助ける材料の開発を検討していくことを目的としている.
同変シンプレクティック幾何学およびトーラス同変コホモロジーの研究

本研究は以下の2つの研究課題,課題(a)シンプレクティック幾何における運動量写像の凸性定理の拡張の研究,課題(b)グラスマン多様体の変種についてのシューベルトカルキュラスの研究,から成る.まず、課題(a)については、昨年度すでに論文としてまとまった形で雑誌に投稿中であり、雑誌からの返事で要求された修正を行い、修正版を投稿中である。本年度は課題(b)の研究を精力的に行った。この研究は韓国KAISTの松村朝雄氏との共同研究である。昨年度の研究によって、重み付きグラスマンのコホモロジー環において重み付きのシューベルト類を定義し、その構造定数を計算する公式を与えた。「研究の目的」にも記したように、本年度はシューア多項式とシューベルト類の関係を重み付きグラスマンに対して一般化することを試み、論文にまとめてpreprintを発表した。シューア多項式は対称多項式の中でも特に様々な数学に現れる対象であり、特にシューベルトカルキュラスでは、グラスマン多様体のコホモロジー環の中でシューベルト類を表す多項式として理解できる。すなわち、シューア関数はシューベルト類の親玉である。この状況を重み付きグラスマンのコホモロジー環とそのシューベルト類に対して一般化するため、我々はシューア多項式の変種を導入し、それが確かに重み付きのシューベルト類を表すことを示した。これにより、重み付きグラスマンのシューベルトカルキュラスも、このシューア関数の変種どうしの掛け算を自分自身で展開するという形で調べることが出来るようになった。これにより、シューベルトカルキュラスの問題が、コホモロジーというものを離れて単純に多項式同士の計算として理解されるので、この結果は重要である。また、この変種は本質的に、factorialシューア多項式とよばれるものを変形したものの特殊化として得ることが出来るので、factorialシューア多項式の知識をフルに活用することで、重み付きグラスマンのシューベルトカルキュラスについて様々なことが明らかになってくるであろう。重み付きシューベルト類をコホモロジー環の中で表す多項式が見つかったことにより、重み付きグラスマンのシューベルトカルキュラスの理解が一段と進行した。ただ、この多項式は新しい変数を1つ含み、その幾何的な意味がまだ十分に解明されていない。現在、この変数を用いない形での定式化を調べていて、それが完成すれば満足のいく形で理解できたと言ってよい。課題(a)では、主定理に現れる写像のファイバーの一般形を知ることや、Duistermaat-Heckmanの定理との関係などが今後の問題として挙げられる。課題(b)では、上記の新しい変数を含まない形での定式化を行うことが当面の課題である。また、計算した構造定数の幾何学的な意味や、表現論的な意味を調べることも課題として残されている。重みなしのグラスマン多様体の場合は、シューベルトカルキュラスは一般線形群の表現論と密接な関わりを持っているので、この関係が重み付きグラスマンの場合にも一般化できれば非常に面白い研究となる。また、重み付きグラスマンは軌道体なので、Chen-Ruanコホモロジーの計算など、軌道体として調べるべきことは多い。また、整係数のコホモロジーに捩じれがあるかどうかも調べたい。本研究では2つの課題に取り組んでいる。まず1つめは、同変シンプレクティック幾何学における運動量写像に関わるもので、AtiyhaとGuillemin-Sternbergによる凸性定理の一般化を研究している。私は、戸田格子の超可積分系の構造をモデル化した一般化を与えていたが、これ自体は数学的な定理であって、物理的な応用がまだなされていなかった。23年度の本研究によって、この定理の物理的な応用が見つかり、実際にこの定理と超可積分系が関係していることが判明した。定理自体は数学的に述べられているが、理論物理に応用を持つことが分かったので、この成果は大きく、今後の超可積分系の研究につながっていくであろう。次に、23年度の研究として、グラスマン多様体上のシューベルトカルキュラスを重み付きグラスマンというorbifold上へ一般化することに成功した。これはKAISTの松村朝雄氏との共同研究である。通常、シューベルトカルキュラスは等質空間上で行われ、空間のsubvariety達から定まる基本類に関してその構造定数を求めるという問題である。一つの分野に限らず、様々な数学の分野からのアプローチが可能であることがその面白さの一つである。一方で、orbifold(またはstack)は特異点を持つことがあるが、モジュライ空間の理論との関係から近年急速に発展しており、現在非常に注目を集めている理論である。Orbifoldのもつ特異性は性質の良いものに限られるので、多様体上でできていたことがorbifold上でも可能であることがしばしばある。シューベルトカルキュラスをorbifold上で展開したのは我々が世界初であり、非常に大きなインパクトを持っている。orblfold上でのシューベルトカルキュラスからどのような新しく面白い数学が出てくるのかはまだこれからの仕事にかかっているが、本研究によってシューベルトカルキュラスの新しい可能性が開かれたのは間違いない。

この研究は韓国KAISTの松村朝雄氏との共同研究である。昨年度の研究によって、重み付きグラスマンのコホモロジー環において重み付きのシューベルト類を定義し、その構造定数を計算する公式を与えた。「研究の目的」にも記したように、本年度はシューア多項式とシューベルト類の関係を重み付きグラスマンに対して一般化することを試み、論文にまとめてpreprintを発表した。シューア多項式は対称多項式の中でも特に様々な数学に現れる対象であり、特にシューベルトカルキュラスでは、グラスマン多様体のコホモロジー環の中でシューベルト類を表す多項式として理解できる。すなわち、シューア関数はシューベルト類の親玉である。この状況を重み付きグラスマンのコホモロジー環とそのシューベルト類に対して一般化するため、我々はシューア多項式の変種を導入し、それが確かに重み付きのシューベルト類を表すことを示した。これにより、重み付きグラスマンのシューベルトカルキュラスも、このシューア関数の変種どうしの掛け算を自分自身で展開するという形で調べることが出来るようになった。これにより、シューベルトカルキュラスの問題が、コホモロジーというものを離れて単純に多項式同士の計算として理解されるので、この結果は重要である。また、この変種は本質的に、factorialシューア多項式とよばれるものを変形したものの特殊化として得ることが出来るので、factorialシューア多項式の知識をフルに活用することで、重み付きグラスマンのシューベルトカルキュラスについて様々なことが明らかになってくるであろう。本研究は前頁で述べた2つの課題に取り組んでいる。1つ目の課題は論文としてまとめて国際誌に投稿中であり、現在は2つ目の課題の方をメインとして取り組んでいるので、こちらはあまり大きな進展は見せていない。2つ目の課題は、期待以上の成果が出たと言ってよい。本研究で重み付きグラスマンの同変コホモロジーの構造定数を完全に決定したが、構造定数を完全に決定することは一般には非常に難しい問題であり、完全に決定できるまでにはもう少し時間がかかると予想していた。重み付きシューベルト類をコホモロジー環の中で表す多項式が見つかったことにより、重み付きグラスマンのシューベルトカルキュラスの理解が一段と進行した。ただ、この多項式は新しい変数を1つ含み、その幾何的な意味がまだ十分に解明されていない。現在、この変数を用いない形での定式化を調べていて、それが完成すれば満足のいく形で理解できたと言ってよい。今後は特に2つ目の課題の方を中心として、orbifold上のシューベルトカルキュラスを発展させていく予定である。特に、weighted flag varietyやweighted Bott towerなどの同変コホモロジーの構造定数を調べたい。問題点としては、weighted flag varietyはその定義方程式(Plucker関係式)が非常に複雑なので、この方程式の下で空間の分解をしてコホモロジーを調べることが困難かもしれないことがあげられる。
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた尿素サイクル異常症の遺伝子治療研究

ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)遺伝子を持つアデノ随伴ウイルス(AAV)のベクタープラスミドをITR-ITR間が5.35kbでTX-neo遺伝子を持つもの(以下OTC2)と4.4kbでTK-neoを持たないもの(以下OTC3)を作製した。これらのプラスミドをスクリーニングするために、リン酸カルシウム法を用いてそれぞれpackaging plasmidとともにHeLa細胞にco-transfectionし、野生型アデノウイルスを感染させて、AAVを作製した。OTC2を用いて作製したAAV(以下AAV/OTC2)は3T3細胞を用いて力価測定したところ10^4cfu/mlであった。一方、OTC3を用いて作製した,AAV(以下AAV/OTC3)をdot blot法によりparticle数を測定したところ、10^5particle/mlであった。AAV/OTC2及びAAV/OTC3をそれぞれ2mlずつ10^6個のHepG2細胞にtransductionし、OTC活性を測定したところ、前者では測定感度以下であったが、後者では1.265μmol/mg protein/hrの活性が得られた。ここでAAV/OTC3を150ml作製しセルロースカラムを用いて濃縮したものを20μl用いて10^6個のHepG2細胞にtransductionしたが0.144μmol/mg protein/hrの活性しか得られなかった。次に高力価のrAAV vectorを作製するためにOTC2とpackaging plasmidのpackagin cell lineの作製を試みている。ヒトOTC遺伝子を持つAAVのvector plasmidとしてITR-ITR間が5.35kbでTK-neo遺伝子を持つもの(以下OTC2)と、4.4kbでTK-neoを持たないもの(以下OTC3)の2つを作製した。これらのconstructionをscreeningする目的でリン酸カルシウム法を用いてそれぞれのベクターをpackaging plasmidとともにHeLa細胞にco-transfectionし、野性株アデノウイルスを感染させて、AAVを作製した。OTC2を用いて作製したAAV(以下AAV/OTC2)は3T3細胞を用いて力価測定したところ、10^4cfu/mlであった。一方、OTC3を用いて作製したAAV(以下AAV/OTC3)をdot blot法によりperticle数を測定したところ10^5perticles/mlであった。AAV/OTC2及びAAV/OTC3をそれぞれを2mlずつ10^6個のHepG2細胞にtrunsductionしOTC活性を測定したところ、前者では測定感度以下であったが、後者では1.265μmol/mg protein/hrの活性が得られた。そこで、AAV/OTC3を150ml作製し、硫酸セルロースカラムを用いて濃縮したものを20μl用い、10^6個のHepG2細胞にtransductionしたが0.144μmol/mg protein/hrの活性しか得られなかった。現在、OTC2とpackaging plasmidのpackaging cell lineを作製中であり、より高い力価のAAV/OTCを作製を目指している。アデノ随伴ウイルス(以下AAV)はヒトパルボウイルスの一種で約4.7kbの1本鎖DNAのゲノムを持ち、ウイルスの複製の調節に関わっていろり遺伝子と構造蛋白をコードしているcap遺伝子からなる。このウイルスは感染後、ヒト19番染色体S1部位に組み込まれることが分かっている。大きな特色は非分裂細胞にも感染可能で、また感染細胞のゲノムにintegrateされることである。人の先天代謝異常症に対する遺伝子治療にウイルスベクターの使用を考えるとき、アデノウイルスベクターではその効果が一過性であり、またはレトロウルスでは分裂細胞にのみ導入可能なのに対し、AAVでは非分裂性の標的細胞のゲノムに導入され、効果が長期に及ぶことが期待される。そこで、尿素サイクルの酵素の一つであるオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)とチロシン分解酵素のフマリルアセト酢酸水酸化酵素(FAH)の欠損症に対する遺伝子治療にむけてAAVベクターの作製を試みた。

組換えAAVの作製にあたり、両端のITRだけを残しrepとcapを取り除き、ヒトOTCとヒトFAHのcDNAをそれぞれ組み込んだvector plasmidを作製した。このvector plasmidを1μgと、repとcapを組み込み、両端のITRを取り除いたhelper plasmidをそれぞれ10μgずつ7×10^6のHeLa細胞にtransfectさせ、G418を用いてselectionし約10^4cfu/mlの組換えAAV/FAHベクターを産生するpackaging cell lineを作製した。現在、さらに感染効率を上げるために、硫酸アンモニウムと塩化セシウムを用いた濃縮法を試みている。高濃度のAAVウイルスを用いてさらに先天代謝異常症の遺伝子治療実験をすすめている。
生物学的な個人差から見たADHDにおける衝動性メカニズムの解明

ヒト遺伝子を対象とした実験に対する本学および本学部倫理委員会の審査は進行が遅く、スムーズな遺伝子データの取得に困難が見込まれたため、前年度に引き続き、遺伝子-行動実験の体制を整備するとともに、遺伝子データの採取を伴わない、皮膚電気活動等を利用した心理生理実験を平行して行うことを試みた。年度当初は、本研究的資金により、実験室環境の整備、予備実験の実施等のセットアップ作業を入念に行い、遺伝子-行動実験および心理生理実験に向けての準備をおこなった。本研究資金で構築した実験環境において、行動抑制課題であるGo/Stop課題およびGo/NoGo課題等を用いた行動実験を実施して、データの蓄積を行った。このデータ取得は本研究期間修了後も引き続き継続していく予定である。これら行動実験と平行して、特にADHDの衝動性に関して、ドーパミン関連とセロトニン関連の遺伝子多型を主なターゲットとして絞り込み、遺伝子解析を用いた予備的な実験にも着手した。この予備的な実験に際して、遺伝子解析を得意とする本学部教員と研究ネットワークを構築し、遺伝子解析、行動実験を効率的に進めていく研究体制を確立した。さらに実験研究以外にも、質問紙法を利用した調査研究を開始し、多角的な視点から衝動性を捉えることへ研究を拡大した。今後は、本研究資金でセットアップされた研究環境をもとに、さらに研究を進めて、関連した研究成果を、学会や論文紙面において発表していく予定である。現在の本学部の実験設備では効果的に研究を進めることに対して困難が見込まれたため、初年度は本実験に入る前の導入期間として位置づけ、次年度以降の研究をスムーズに進めていくための準備を行った。まず、本研究的資金により、実験室環境の整備、予備実験の実施等のセットアップ作業を入念に行い、次年度に行う本実験にむけての準備を整えた。行動抑制課題であるGo/Stop課題およびGo/NoGo課題等を本研究的資金により購入した実験ソフトにより作成し、実験課題の妥当性・信頼性を検討した。実験のセットアップと平行して、先行研究の入念な調査を行い、ADHDに関連する遺伝子多型を絞り込む作業を試みた(研究発表参照)。その結果、特にADHDの衝動性に関して、ドーパミン関連とセロトニン関連の遺伝子多型を主なターゲットとして解析を進めていくことを決定した。遺伝子という個人情報を扱うため、本研究で採集される遺伝子情報の厳重な管理体制を整えた。さらにすべての実験はコンピュータで制御され、課題成績の記録・管理もイントラネットワーク内でデータベース化され、情報が外部に漏洩することのないように安全に処理されるシステムを構築した。地域社会への研究成果の還元に関して、ADHD児への理解と今後の実験参加を促進する目的で、山形大学附属養護学校の研究会等で特別支援教育における本研究課題の意義などを盛り込んだ講演を行い、実験室一教育現場連携のコミュニティづくりを目指す取り組みを試みた。
持続的血液濾過透析施行下における抗菌薬シプロキサンの適正使用に関する研究

【研究の目的】ニューキノロン系抗菌剤シプロフロキサシン(CPFX)は、敗血症、外傷・熱傷等の重症あるいは難治性感染症に対し高い治療効果を示す。一方で、腎機能障害等の副作用の発現頻度も高く、特に腎機能障害患者・血液透析患者においては適宜減量するよう添付文書にも記載されている。救急領域における持続的血液濾過透析(CHDF)施行患者は重症で肝機能、腎機能の低下に伴い薬物の体内動態が通常とは大きく異なること、分子量が小さく蛋白結合率が低い(約30%)CPFXはCHDFで除去されている可能性が高いことなど、いろいろなファクターがある。しかし、CPFXのCHDF施行時の体内動態に関する臨床報告やCHDFによるCPFXの除去に関する報告がない。そこで本研究はCPFXの有効濃度を保ち、かっ体内への蓄積を避げCHDFでの除去を考慮に入れた投与量設定を行うことを最終目的とし検討を行った。【研究方法】CPFXの反復点滴投与時の最低血中濃度は0.1μg/mL程度であることから、定量下限を0.05μg/mLに設定し血液サンプルからの抽出、測定を試みた。過去の報告では固相抽出+液体クロマトグラフィー(HPLC)グラディエントシステムが主流であり、抽出操作が煩雑である。そこで本研究でより簡便な除蛋白法+HPLCで測定が可能になるよう基礎検討を行った。【研究成果】除蛋白法+HPLCでの測定方法において0.05μg/mLは測定可能となった。HPLCにて測定する検量線用既知濃度添加血漿サンプルの安定性試験も同時に行い、-20°C凍結保存下にて1ヶ月は安定性が保たれることを確認した。現在山梨大学医学部倫理委員会の承認を取得すべく申請準備を行っている段階であり、承認を取得次第、CHDF施行患者血液サンプルの測定に着手したいと考えている。
潜在癌の顕在化に関する動物モデルによる解析

伊東はDMBA前立腺癌モデルにおいてテストステロンにより浸潤性前立腺癌を高率に作成し潜在癌の顕在化の解析を行ないテストステロンの関与を確立した優れた実験系を用いて明らかにした。また肝発癌過程におけるGSTーP陽性巣の進展過程を,コンピュ-タ-による三次元画像再構築より解析し,その進展の場は肝小葉内であり,潜在癌の顕在化には既存組織との相互関係の破綻が重要な要因である事を示した。伊藤はMNUとヨ-ド欠乏症(IDD)の併用による甲状腺腫瘍実験系において,去勢雄ラットでエストロゲン投与により腺癌発現の高率化を実現し,さらにエストロゲンレセプタ-のレベルが腺腫,腺癌への悪性化に伴い上昇する事実から潜在癌の顕在化におけるレセプタ-の関与を見出した。北川(石川)はSV40ーT抗原遺伝子導入マウスでの多段階的肝発癌の進展を明らかにし,Hーrasの活性化が後期に出現する事を示し,Hーrasの活性化が潜在癌の顕在化要因として重要である事を示した。西澤は潜在癌顕在化の機構解明のモデルとしてホルモン依存性の消失に注目し,無血清培地でアンドロゲン依存性増殖を示す細胞株の増殖にはアンドロゲン誘発性増殖因子(SCGF)が関係し,アンドロゲン非依存性株の一部はSCGFをホルモンと無関係に合成するものが存在することを明らかにした。一方,エストロゲン依存性増殖を示す細胞株の一部はアラキドン酸代謝経路を介することをも見い出した。江角は大腸発がんモデルにおけるがん遺伝子の活性化を検索し,ジメチルヒドラジンで誘発したラットの大腸癌では,約70%の腫瘍で,cーHーras遺伝子の活性化が起こっている事を示した。立松はラット胃癌発癌過程におけるペプシノ-ゲン遺伝子のメチル化パタ-ンを検討し,腺腫レベルよりメチル化パタ-ンの変異が明らかに認められることと,前癌病変と考えられているペプシノ-ゲン変異幽門腺でもメチル化変異の可能性を示唆した。
地域における津波避難基礎力の評価と改善に関する研究

本研究では、津波災害の際にそれぞれの地域が有する避難トリガー(避難行動を開始するきっかけとなる事象や情報)に着目し、それらが機能する条件について理解を深めることを目的として、近年の国内外のさまざまな地域における災害事例にもとづいた分析を行った。まずは避難トリガーの分類を行い、次にそれぞれの地域において機能した避難トリガーを定量的なデータから抽出した。その結果、地域によって機能した避難トリガーは異なっており、その背景には、主としてそれぞれの地域における津波災害に関する知識や意識の違いがあることがわかった。本研究では、津波発生時の避難、特にそれぞれの地域における、避難行動を始めるきっかけと避難行動に影響を与える因子に着目し、国内外の具体的な災害事例に基づいて分析を進めている。2016年度の主な研究成果を以下に示す。まず、避難行動を始めるきっかけについて、近年海外で生じた四つの津波災害(2007年ソロモン諸島津波、2009年サモア諸島津波、2010年チリ津波、2010年インドネシア・メンタワイ諸島津波)に関する現地調査報告に基づいて分析を行った。分析と整理の結果、避難のきっかけは、地震による揺れ、他の人の行動や呼びかけ、普段とは異なる海の挙動、大きな音、津波による浸水の五つに分類できることがわかった。それぞれのきっかけが機能しない場合についても考察を行った。加えて、2016年11月に福島県沖でマグニチュード7.4の地震が発生し、青森県太平洋沿岸から伊豆諸島までの八つの津波予報区に津波警報や津波注意報が発表されたことにともない、この地震における津波避難について、その実態と課題を把握するために、宮城県塩釜市で住民への聞き取り調査を行った。調査の結果、津波注意報から津波警報へと切り替わったタイミングで住民の行動が変化していたこと、集落や職場などの小さな単位におけるローカルな情報の共有が津波避難のきっかけのひとつとなっていたことがわかった。今回のような津波を含めて、大小さまざまなレベルの津波に対する避難のあり方をそれぞれ考えていく必要があることがわかった。上記の研究成果については、国際学会や学術論文を通して発表を行った。近地津波の際には、沿岸域の人びとにはできるだけ早く避難行動を開始することが求められる。本研究では、そういった避難行動を実現するための条件について理解を深めるべく、国内外のさまざまな地域における近年の災害事例をもとに、津波災害時の避難行動について分析を進めてきた。2017年度に得られた主な研究成果を以下に示す。まず、2009年から2011年の間に発生した津波災害における避難行動の実態を現地で調査した国内外の文献を収集し、その調査結果を整理した。加えて、それらの調査結果の中のアンケート結果等の定量的なデータに着目し、避難行動に関する比較分析を行った。これらの結果、地震発生後に避難行動を開始するきっかけは地域によって異なっていたことがわかった。また、その背景には、それぞれの地域における津波災害の発生頻度の違いにともなう津波災害に関する知識や意識の違いがあることが示唆された。発生頻度が比較的高い場合は、いずれの地域においても地震による揺れをきっかけに避難を始めた人の割合が高かった。発生頻度が比較的低い場合は、津波警報システムが機能しなかった地域では大きな音や津波の視認などが、津波警報システムが機能した地域では公共機関からの津波や避難に関するメッセージが、それぞれ避難のきっかけとなっていたことが多かった。これらの結果については論文にまとめ、国際学術誌へ投稿中である。また、これらの結果を考慮した避難シミュレーションモデルについても検討を進めた。2017年度より所属研究機関を変更することにともない、当初予定していた水理実験ではなく、災害事例の調査や数値シミュレーション・避難行動シミュレーションの活用を中心として、研究を進めていく予定である。特に、それぞれの地域における海岸構造物や沿岸環境が津波に与える影響と、その影響を踏まえた避難のあり方について分析を進めていく予定である。海岸工学、自然災害所属研究機関の変更にともない、当初、次年度に実施することを想定していた水理実験に必要な機器の購入と計測技術の習得をとりやめ、計算環境の整備に充てることとしたため、次年度使用額が生じた。次年度使用額を含めて、主に計算環境の整備、消耗品の購入、学会への参加、論文投稿に伴う経費等に用いる予定である。
様々な海洋環境における海洋生態系動態メカニズムの解明

近年、気候変動による海洋生態系への影響が懸念されている。だが、その動態を広範囲かつ連続的に観測することは難しい。そこで、本研究では海洋生態系の高次捕食者である海鳥・オオミズナギドリにデータロガーを装着・回収することで、様々な海域(亜熱帯亜寒帯)において彼らの採餌行動から生物資源ホットスポットを特定し、その形成の特徴を明らかにした。また、採餌域と海洋環境の相関からハビタットモデルを構築し、今後予測される水温上昇シナリオに対する彼らの応答を明らかにした。本研究の結果から、オオミズナギドリの採餌行動を指標とすることで、日本周辺海域における海洋生態系動態のモニタリングが可能であることが示唆された。本研究課題では、日本周辺の様々な海域で繁殖する外洋性海鳥・オオミズナギドリに動物搭載型データロガーを装着・回収し、彼らの採餌域の時間的・空間的変化から海洋生態系の動態を捉える。そして、海鳥の採餌行動データを海洋環境情報と併せて解析することで、環境変動が海洋生態系に及ぼす影響の把握・理解を試みる。野外調査は岩手県三貫島、伊豆諸島御蔵島、南西諸島仲ノ神島にあるオオミズナギドリの繁殖地で実施する。平成24年度は次年度(平成25年度)の調査準備および予備実験をおこなった。そこで、平成24年度には予備実験として、三貫島と仲ノ神島で繁殖するオオミズナギドリに、GPSデータロガーのテスト装着・回収をおこなった。データロガーを用いた研究では、装着個体を再捕獲し、データロガーを回収しなければデータを得ることができない。また、データロガーは高価である。そのため、確実にデータを取得(データロガーを回収)するための調査プロトコールの確立は、本研究課題を達成する上で重要である。また、仲ノ神島では繁殖地に帰巣したオオミズナギドリを捕獲し、胃洗浄法により胃内容物を採取した。3月に国立極地研究所においてそれらの試料の分析手法を修得し、遺伝子情報から種を特定した。御蔵島の繁殖地には、オオミズナギドリのモニタリング用に人工巣箱が埋設してあり、調査ではそれらの巣箱で繁殖する鳥を用いる。人工巣箱の状態を良好に保つことにより、来年度に繁殖のために利用する鳥が多くなる。調査に用いる個体数を確保する上で、人工巣箱のメンテナンスは必須の作業である。そのため、24年度の11月に巣箱のメンテナンス作業をおこなった。また、次年度(平成25年度)の調査に向け、地元の人々との協力体制を整えた。本研究課題では、日本周辺の様々な海域で繁殖する外洋性海鳥・オオミズナギドリに動物搭載型データロガーを装着・回収し、彼らの採餌域の時間的・空間的変化から、それぞれの海域における海洋生態系のホットスポットおよび動態を捉える。平成25年度には、熱帯海域に位置する南西諸島仲ノ神島で野外調査を実施し、GPSデータロガーを用いてオオミズナギドリの採餌行動を記録した。また、夜間に繁殖地に帰巣したオオミズナギドリを捕獲し、胃洗浄法により胃内容物を採取した。その結果、本海域におけるオオミズナギドリの餌の多くはイカ類とトビウオであった。採餌域は主に台湾の東側の斜面域で、顕著な採餌域の季節的変動は見られなかった。一方、台風の接近による海況悪化のため岩手県三貫島には渡島することができず、野外調査を実施できなかった。だが、三貫島から数十キロ離れた繁殖地において、昨年度に装着したデータロガー(ジオロケータ)が回収されたため、それらに記録されたデータを解析することで三陸海域におけるオオミズナギドリの空間利用情報を得ることができた。そして、海洋環境情報からオオミズナギドリの空間利用パターンをモデル化することで、気候変動(水温上昇)による採餌域の動態を明らかにした。その結果、水温の変化に伴いオオミズナギドリの採餌域は北上および沖合に変動した。熱帯海域では海水が温められて成層化するため、表層の生産性は全体的に低い。そのため、海水の混合により局所的に生産性が高くなる斜面域などでオオミズナギドリは餌を採っており、採餌域には顕著な季節変化が見られなかったと考えられる。一方、寒流と暖流が混在する三陸沖では、水温の上昇に合わせて生物の空間分布が変動していると考えられる。平成24年度は、調査準備および予備実験を計画していた。データロガーを用いた研究の予備実験として、三貫島と仲ノ神島においてGPSデータロガーのテスト装着・回収をおこなった。そして、データを取得するための調査プロトコールを確立した。

また、仲ノ神島では、親鳥から胃内容物を採取し、遺伝子解析により餌種を特定する手法を修得した。御蔵島では、平成25年度の調査に向け、調査地のメンテナンスおよび地元の人々との協力体制を整えた。以上のような理由から、平成24年度は当初の計画通りに、おおむね順調に進展していると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の予備実験と調査準備により、野外調査の実施およびデータ解析・分析のための体制は整った。平成25年度の調査では、各繁殖地で勢力的にオオミズナギドリの行動データと餌試料を取得し、得られたデータを海洋環境情報と併せて解析する予定である。
放散虫の画像データ解析による形態変化の研究

本研究では、初期の目的を取り込んで、より大きなスケールで研究を展開するために、パーソナルコンピューター(本研究費で購入)、画像取り込み装置、画像処理ソフトウェア、学内LAN,名古屋大学大型計算機センター、光磁気ディスク電子ファイリングシステム、名古屋大学古川総合研究資料館などを有機的に結んだ放散虫画像データベース、およびその解析システムの構築を目指して研究を行った。時間不足のため、本研究の初期の目的であった化石放散虫の画像処理による系統進化という点では大きな成果をあげるにはいたらなかったが、微化石の画像処理について、次のような問題点がうきぼりになった。1.微化石は、その個体数、種数が大型化石にくらべ、非常に多いので、画像データを蓄積するのに膨大な記憶媒体が必要となる。本研究では、パーソナルコンピューターとLANで結ばれた名古屋大学大型計算機センターの共用ファイルを記憶媒体として考えていたが、画像データの処理にマッキントッシュパーソナルコンピューターを用いたため、フォーマットなどの問題があり、使いやすいシステムとはならなかった。2.画像データのうち数値化できるもの(例えば、殻の直径、スパインの直径や長さ)については、統計的処理になじみやすいが、数値化の難しい要素(例えば、殻上のポア、コスタ、リッジの形態や配列)は、数値化するよりは、コンピュータースクリーン上に同時に表示し、人間の目で比較した方が、その特徴をとらえやすい。また、本システムを使って、環太平洋造山帯(ロシア極東地域)、アルプス-ヒマラヤ造山帯(パキスタン)、および両者の接点であるインドネシア地域の放散虫生層序学的研究を行った。得られた成果は裏面の雑誌論文を参照されたい。平成3年度には,予定通り画像処理用パ-ソナルコンピュ-タ-,およびレ-ザ-プリンタ-を購入した。現在これらの設備とメインフレ-ム,SEMなどのデバイスのネットワ-クを構築中である。また,現在,デ-タ蓄積装置としてレ-ザ-ディスクなどの装置利用の可能性を,名古屋大学大型計算機センタ-の設備を利用して検討中である。また,微化石抽出用試料として西南日本内帯の美濃帯に分布する。複数の時代の違うマンガン炭酸塩ノジュ-ルを採取し,現在その処理を行っている。放散虫化石群集の時代の精度を高めるために,採取と同時に,産地付近の詳細な地質調査を行った。今後の研究予定としては,1.獲られた放散虫化石画像デ-タに様々な処理(例えば,POREの粒度分布計測,面積測定,シェ-ディング補正,エッジ強調,フィルタリング,濃度変換)を施すことにより,放散虫の形態の時代的変化を数値化し,その時代的変化を追う。3.得られた結果を理解しやすい形で表示し,他の研究結果と対比する。などがあげられる。平成4年度には,西南日本内帯の美濃帯から採取したマンガン炭酸塩ノジュール中のきわめて保存の良い放散虫化石と,平成3年度に構築した画像処理システムを用い化石放散虫の画像データの取り込み・処理・データベース作成などを行った.平成4年度の研究では,時間不足のため,本研究の主目的であった化石放散虫の画像処理による系統進化には大きな成果あげるにはいたらなかったが,微化石の画像処理について,次のような問題点がうきぼりになった。1.微化石は,その個体数,種類が大型化石にくらべ,非常に多いので,画像データを蓄積するのに膨大な記憶媒体が必要となる.本研究では,パーソナルコンピューターとLANで結ばれた名古屋大学大型計算機センターの共用ファイルを記憶媒体として考えていたが,画像データの処理にマッキントッシュパーソナルコンピューターを用いたため,フォーマットなどの問題があり,使いやすいシステムとはならなかった.

2.画像データのうち数値化できるもの(例えば,殻の直径,スパインの直径や長さ)については,統計的処理になじみやすいが,数値化の難しい要素(例えば,殻上のポア,コスタ,リッジの形態や配列)は,数値化するよりは,コンピュータースクリーン上に同時に表示し,人間の目で比較した方が,その特徴をとらえやすい.また,本システムを使って,環太平洋造山帯(ロシア極東地域),アルプスーヒマラヤ造山帯(パキスタン),および両者の接点であるインドネシア地域の放散虫生層序学的研究を行った.得られた成果は裏面の雑誌論文を参照されたい.
大気汚染による肺障害機序の解明と培養肺胞上皮細胞透過性による検査法の開発

1.肺胞【II】型上皮細胞の分離培養とその機能:1匹のラット肺より20×【10^6】の細胞が得られ、タンニン酸固定によるpurityは8590%であった。電顕,蛍光抗体法によっても細胞小器官やcytoskeleton構造もよく保持されていた。フィルター上に培養した肺胞上皮細胞をUssing chamberにセットし、電気生理学的パラメータを調べると電位差(PD)-1.0mV,抵抗(R)200Ω・【cm^2】,SCC1.8μA.【cm^(-2)】位で形態学的、薬理学的にもin vivoの肺胞上皮細胞に類似していた。2.炎症細胞の肺胞上皮細胞透過性への影響;大気汚染物質により炎症細胞が刺激されsuperoxideやproteaseが放出され肺障害が起こると考えられている。肺胞マクロファージや好中球をUssing chamberの粘膜側に入れopsonizedzymosanやTPAで刺激すると6090分後にmonolayerのR,PDが50%以下に低下し透過性が亢進した。終了後フィルターを固定し形態学的に調べると、炎症細胞が凝集しmonolayerに付着していた。3.antioxidantの予防効果;前記2に対して、antioxidant(SOD,catalase,α1-antitrypsin)を前投与すると、透過性亢進が抑制された。このことから肺胞上皮細胞透過性亢進には、一部superoxide産生,protease遊離が関与していると考えられる。4.気道粘膜上皮細胞への影響;気道はイオン輸送などにより気道粘膜液層の恒常性を維持して粘液線毛輸送などの防御機構を調節している。上記装置で粘膜上皮がPD-30mV,R200Ω・【cm^2】,SCC50μA・【cm^(-2)】の電気生理学的特性を有し、これらがNaイオンやβ-receptorに依存したイオン輸送機構であることを明らかにできた。現在、大気汚染物質自体の影響を検討するため、上記装置のフード内および炭酸ガス培養器用chamberを作製中である。今後は、微量長期曝露した動物の肺胞上皮細胞の変化、肺表面活性物質の分泌およびアポ蛋白遺伝子への影響などの研究を進める予定である。
潰瘍性大腸炎における腫瘍発生危険因子としてのエストロゲンレセプターメチル化の解析

平成17年度は,前年度の結果をもとにERのメチル化の定量性解析を行った.大腸全摘術を施行された腫瘍合併UC8症例の大腸各部位(直腸,S状結腸,下行結腸,横行結腸,上行結腸,盲腸)の非腫瘍性上皮とサーベイランスにて腫瘍非合併が確認された10症例の大腸各部位からの生検材料を用いた.OCT包埋した新鮮凍結材料からlaser capture microdissectionにて粘膜上皮のDNAを抽出し,combined bisulfite restriction analysis(COBRA)法にてERのメチル化の程度を%methylationとして算出した.計18症例の大腸各部位の非腫瘍性上皮のうち105検体が解析可能であった.腫瘍合併UCの非腫瘍性上皮における%methylationは25.4%であり,腫瘍非合併UCの4%に比較し有意に高値であった(p<0.001).また,大腸各部位における比較では,直腸から上行結腸までの広い範囲で,腫瘍合併UCの非腫瘍性上皮は腫瘍非合併UCより有意に%methylationが高かった(直腸,42.2% vs.6.9%,p<0.001;S状結腸,33.2%vs.3.8%,p<0.001;下行結腸,32.4% vs.5.4%,p<0.001;横行結腸,15.0% vs.3.6%,p<0.05;上行結腸,15.2% vs.1.7%,p<0.05;盲腸,13.6% vs.2.3%,NS).炎症の程度と%methylationには有意な相関を示さなかった.今年度の検討から,UCの非腫瘍性粘膜におけるERのmethylationの定量解析は,腫瘍発生のhigh risk群の拾い上げに有効なマーカーとなり得ると考えられ,更に腫瘍合併UCの非腫瘍性粘膜では広範囲にERのmethylationをみとめることから,例えば直腸生検材料の解析で,high risk群の拾い上げが行える可能性が示唆された.平成16年度は,大腸全摘術を施行された腫瘍合併UC13症例との大腸各部位(直腸,S状結腸,下行結腸,横行結腸,上行結腸,盲腸)の非腫瘍性上皮,およびサーベイランスのための全大腸内視鏡検査と大腸各部位からの生検材料を用いた病理組織学的検索にて腫瘍非合併が確認された17症例の生検材料を対象として,methylation specific PCR (MS-PCR)にてestrogen receptor (ER)のメチル化の頻度を検索した.腫瘍合併UC13症例にうち11例は癌を,2例はdysplasiaを合併していた.計30症例の大腸各部位の非腫瘍性上皮のうち165検体が解析可能であった.腫瘍合併UCの非腫瘍性上皮は,70検体中54検体,77.1%でメチル化陽性であった.一方,腫瘍非合併UCでは,95検体中23検体,24.2%でメチル化陽性であり,腫瘍合併UCの非腫瘍性上皮は,有意にERのメチル化が高頻度であった(P<0.001).大腸各部位でのメチル化の頻度を比較すると上行結腸を除く広範囲の大腸において,腫瘍合併UCの非腫瘍性上皮は,腫瘍非合併UCに比較し有意にERのメチル化が高頻度であった。(直腸,92.3%vs.31.2%,p<0.01; S状結腸,100%vs.31.2%,p<0.001;下行結腸,76.9%vs.25.0%,p<0.05;横行結腸,63.6%vs.31.3%,p=0.20;上行結腸,54.5%vs.13.3%,p=0.069;盲腸,66.7%vs.12.5%,P<0.05).腫瘍合併UCの非腫瘍性上皮は,広範囲にメチル化を受けており,更に前癌病変であるdysplasiaを合併した症例においても同様であったことから,ERのメチル化はUCに合併する腫瘍発生の前段階,あるいは早期の段階で起こる変化であることが予想された.平成17年度は,今回の結果をもとにメチル化の定量性解析を行う.平成17年度は,前年度の結果をもとにERのメチル化の定量性解析を行った.大腸全摘術を施行された腫瘍合併UC8症例の大腸各部位(直腸,S状結腸,下行結腸,横行結腸,上行結腸,盲腸)の非腫瘍性上皮とサーベイランスにて腫瘍非合併が確認された10症例の大腸各部位からの生検材料を用いた.OCT包埋した新鮮凍結材料からlaser capture microdissectionにて粘膜上皮のDNAを抽出し,combined bisulfite restriction analysis(COBRA)法にてERのメチル化の程度を%methylationとして算出した.計18症例の大腸各部位の非腫瘍性上皮のうち105検体が解析可能であった.腫瘍合併UCの非腫瘍性上皮における%