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Fc受容体との相互作用に着目したTNF阻害抗体医薬の生物学的特性に関する研究

臨床応用されている各種TNF阻害薬の生物活性の差異を明らかにすることを目的に、抗TNF抗体医薬品(インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ)及びTNF受容体-Fc融合タンパク質医薬品(エタネルセプト)について、1)血中半減期制御に関わる受容体FcRnとの結合親和性、2)TNFとの複合体形成能及び複合体のFcγR活性化能を解析した。その結果、1)Fc融合タンパク質のFcRn結合親和性が抗体と比較して低いこと、2)TNFとの複合体形成能が3種類の抗体で異なり、形成される複合体サイズがFcγR活性能に影響することが明らかになった。Fc受容体との相互作用に関するこれらの違いが、ヒトでの血中半減期や、免疫エフェクター細胞の活性化を介したインフュージョン反応あるいは抗薬物抗体の発現頻度等に影響している可能性が考えられる。【目的】現在までに我が国では、関節リウマチ等を対象として3種類のTNF阻害薬(Infliximab,Adalimuma,Etanercept)が承認されており、これらの医薬品の使い分けが臨床現場での新たな課題となっている。本研究では、これらTNF阻害薬のPK/PDを考える上で重要な情報となるFc受容体との相互作用特性に着目し、その差異を明らかにすることを目的とした。【方法】TNF阻害薬とFc受容体(FcRnおよびFcγRI)との結合親和性を表面プラズモン共鳴法により解析した。【結果と考察】TNF受容体と抗体Fcドメインの融合タンパク質医薬品であるEtanerceptと、抗体医薬品であるInfliximab,AdalimumabはいずれもIgG1由来のFcドメインを有しており、Fcドメインの一次構造はアロタイプの相違による2アミノ酸を除いて共通である。しかし、EtanerceptではFcRnとの結合親和性が低いことが明らかとなり、FcRn結合部位(CH2-CH3間付近)の高次構造がFc融合タンパク質と抗体医薬品で異なっている可能性が考えられた。一方、FcγRIとの結合親和性は3種のTNF阻害薬間でほぼ差がなく、FcγRI結合部位(ヒンジ領域付近)の高次構造は類似していると考えられた。また、TNF阻害薬に結合標的であるTNFαを添加した場合に、特に抗体医薬品においてFcRnとの結合センサーグラムの形状が大きく変化した。これらの結果から、1)TNF阻害薬のFcドメインとFcRnとの結合親和性にFcドメイン以外の構造が影響を与えていること、2)TNFαとの結合に依存してTNF阻害薬のFcRnとの結合特性が変化し、体内動態が変化する可能性があることが示唆された。【目的】現在までに関節リウマチ等を対象として世界では5種類、我が国ではこのうち3種類のTNF阻害薬が承認されており、これらの医薬品の使い分けが臨床現場での新たな課題となっている。本研究では、これらTNF阻害薬のPK/PDを考える上で重要な情報となるFc受容体との相互作用特性に着目し、その差異を明らかにすることを目的とする。【方法】TNF阻害薬とFc受容体との結合親和性を表面プラズモン共鳴法により解析した。【結果と考察】昨年度までに、抗TNFα抗体(Infliximab, Adalimumab)とTNF受容体Fcドメイン融合タンパク質医薬品(Etanercept)では、抗体の体内動態制御に関わるFc受容体(FcRn)との結合親和性が異なり、FcRnとの結合親和性の違いがヒトでの血中半減期の相違に関連していることを明らかにした。この知見に基づき、FcRnとの結合親和性を規定する構造特性を明らかにするため、Infliximab, AdalimumabおよびEtanerceptをパパイン消化することによりFc領域を分離し、FcRn結合親和性を測定した。その結果、パパイン消化前には抗体医薬品と比較して低かったEtanerceptのFcRn結合親和性が、パパイン消化後は抗体医薬品に匹敵する程度に上昇することが分かった。したがって、これら医薬品のFcRn結合親和性の差異は、アロタイプの違いに起因するFc部分のアミノ酸配列やFc部分に結合している糖鎖構造の相違によるものではなく、Fabあるいは受容体部分の構造の影響により生じるFc領域の高次構造の違いにより生じていることが示された。本成果は、ヒトIgG1のFc領域を持つ既承認TNF阻害薬の血中半減期の相違を規定する構造特性に関する初めての知見である。【目的】現在までに関節リウマチ等を対象として日米欧で5種類のTNF阻害抗体医薬品が承認されており、その使い分けが臨床現場での新たな課題となっている。

本研究では、課題解決に向けた薬学的見地からのアプローチの一つとして、これらTNF阻害薬のPK/PDを考える上で重要なFc受容体との相互作用特性に着目した解析を行っている。本年度は、臨床応用されている抗TNFα抗体医薬品と可溶性TNFαとの複合体形成に着目し、抗原-抗体複合体形成能の差異がFcγR活性化に及ぼす影響について検討を行った。【方法】抗TNFα抗体Infliximab(IFX)、Adalimumab(ADM)、Golimumab(GOL)とTNFαを混合して抗原-抗体複合体を形成させ、動的光散乱法により複合体の推定分子量を算出した。また同様の複合体をFcγR発現細胞に添加し、FcγRへの結合能およびIL-2の分泌を指標とした免疫エフェクター細胞活性化能を測定した。【結果および考察】3つの抗TNFα抗体は共存するTNFα量の増加に伴って分子量100万以上の巨大な複合体を形成し、その複合体形成能はIFX>GOL>ADMであった。一方、細胞表面に発現するFcγRへの結合はTNFα量に依存して3つの抗体で一様に増加し、差は認められなかった。しかしながら同条件において、抗原-抗体複合体によるFcγR発現細胞の活性化能はIFX>GOL>ADMの順で強く、複合体形成能と相関を示した。これらの実験結果は、抗TNFα抗体の抗原-抗体複合体の形成様式が、FcγRを介した免疫エフェクター細胞の活性化能に関与する可能性を示唆している。FcγRの活性化は、抗体医薬品の血中からの消失やインフュージョン反応の発生と関連している可能性があることから、抗原との複合体形成様式が各抗TNFα抗体医薬品を特徴づける重要な指標の一つであると考えられた。
一分子解析による食品成分間相互作用が吸収に及ぼす影響の解明

腸管で発現するペプチドトランスポータPepT1と基質ペプチドの相互作用を検出する実験系の構築に必要な要素技術の最適化を行った。原子間力顕微鏡の相互作用力測定モードを活用するため、測定基板上の脂質二重膜に再構成したPepT1と、基質であるオリゴペプチドで修飾したカンチレバーを作製して一分子解析系に適用した。一方、暗視野顕微鏡を用いることで腸管モデル細胞であるCaco-2細胞と金粒子の1粒子レベルでの相互作用解析が可能であり、粒子表面を基質ペプチドで修飾することにより生きた細胞レベルでPepT1との相互作用解析ができる可能性が示唆された。原子間力顕微鏡(AFM)の相互作用力測定モードを活用し、PepT1の分子認識機構を解明することを目的とする。具体的には、AFM測定基板上の脂質二重膜に再構成したPepT1と、基質であるオリゴペプチドで修飾したカンチレバーを作製して一分子解析系を構築するとともに、PepT1-基質間に作用する相互作用を検出する。平成22年度は、目的タンパク質の発現、精製条件の検討を行うと共に、リポソームへの再構成を試みた。まず、ヒトPepT1遺伝子のクローニング、及び発現ベクターの作製を行い、免疫染色法により培養細胞による膜画分への発現を確認した。フラスコに付着した細胞を2mMEDTAを含むHBS(Hepes Buffered Saline)緩衝液で洗浄後、同緩衝液で回収した。細胞破砕した試料のうち、膜画分を遠心操作により取得した。この膜画分を500mM NaCl 1%CHAPSを含むHBS緩衝液で可溶化し、引き続き超遠心分離によって上清画分を回収した。PepT1はヒスチジンタグ(His-tag)融合タンパク質として発現されるため、ニッケルアガロースとともに懸濁・洗浄を行った後、イミダゾールで溶出することにより精製PepT1を得た。次に、精製したPepT1をリポソームに再構成するため、CHAPSを透析により除去しつつ単層リポソームでPepT1を安定化させる必要があった。HBS緩衝液を透析外液として用いて、終夜室温で透析を行った。予備的検討の結果、透析法によりPepT1がリポソーム膜内へ再構成される可能性を示唆するデータを得た。今後、再構成効率の向上を目指して諸条件の最適化を行う予定である。PepT1の発現、精製及びリン脂質への再構成まで実験スキームを構築した。mata、原子間力顕微鏡の相互作用力測定モードによって基質とPepT1の間の相互作用を測定するため、カンチレバーを基質の1つであるトリペプチドCys-Gly-Alaで修飾した。そのために市販のクロスリンキング剤を用いて、カンチレバーに導入したマレイミド基とシステイン残基のチオール基間で結合した。PepT1で再構成したリン脂質、あるいはリン脂質のみの試料を作製し、基質で修飾したカンチレバーと修飾しないカンチレバーを用いて相互作用力の測定を行った。その結果、PepT1で再構成したリン脂質と基質で修飾したカンチレバーの組合せで測定した時に他の組合せの場合に比べて相互作用力が大きく測定される傾向が認められたものの、有意差として明確にはならなかった。再構成PepT1の密度は1マイクロメートル四方当たり20分子程度であり、再構成密度を向上させることが解決策の一つになると考えられる。一方、試験管内腸管モデルであるCaco-2細胞単層シートを安定的に作製する方法を見出し、暗視野顕微鏡による観察方法について条件を最適化した。暗視野顕微鏡は観察視野が原子間力顕微鏡よりも広いにも関わらず、観察対象によっては非染色での解析が可能であることが知られている。そこで、Caco-2培養上面に金コロイドを添加したところ、細胞と粒子の相互作用が1粒子レベル観察できることを見出した。粒径が等しく表面電荷が異なる金コロイドでは細胞に対する吸着挙動が大きく異なったため、表面電荷の改変によって腸管吸収効率を制御できる可能性が示唆された。24年度はこの観察系も併用して解析を進める。Caco-2細胞と金粒子の相互作用解析を暗視野顕微鏡で解析した。粒径の異なる粒子に対して観察したところ、正の表面電荷を持ちかつ粒径が小さい粒子ほど細胞に吸着しやすいことを明らかにした。次に、機能性成分のキャリアーとして期待されるリポソームと細胞との相互作用を暗視野顕微鏡で観察できるかを検討した。まず、孔径50, 100, 200 nmのメンブレンフィルターにて調製した単層ベシクルを観察したところ、いずれも白色の粒子として確認できた。これらをシート状に培養した細胞に添加したところ、細胞と単層ベシクルからの散乱光の色調が類似しリポソームの位置を確認するには至らなかった。

そこで、赤色の色調を持つ金粒子をマーカーとしてリポソームに内包して細胞との相互作用を可視化することを試みた。金内包リポソームはリン脂質懸濁液に金ナノ粒子を添加してからメンブレンフィルターに通すことにより調製した。その後、塩濃度を高めて遊離のリポソームあるいはリポソームの外表面に付着した金粒子を沈殿させた後、上清をゲル濾過カラムに通して均一な金粒子内包リポソームを得た。単一粒子の散乱スペクトルを測定したところ、金の内包化により散乱強度が約2倍に上昇し、スペクトルのピーク波長が長波長側にシフトした。またこれにより細胞培養液中に浮遊するリポソームの位置が単粒子レベルで確認できるに至ったが、卵フォスファチジルコリンでは相互作用は見られず、粒子表面の物性が細胞との相互作用に影響すると思われる。一方、局在マーカーとしての金粒子が適用できることが判明したため、オリゴペプチドの細胞表面での相互作用の可視化を目指して金粒子の表面にジスルフィド結合を介してPepT1の基質を結合させる条件を最適化し、このペプチド修飾金粒子を用いて細胞表面あるいは再構成膜上のPepT1との相互作用の可視化条件の検討を開始した。リン脂質へのPepT1の再構成測定系の調製方法に目途がついた。再構成密度の向上のための条件は探索中であるが、一方で試験管内腸管モデルであるCaco-2細胞を用いた暗視野顕微鏡による相互作用測定の可能性を見出した。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに構築した原子間力顕微鏡による測定法あるいは新たに見出した暗視野顕微鏡による相互作用測定を適用する。PepT1再構成系では引き続き再構成密度の向上を図る。一方、暗視野顕微鏡では金粒子等への基質ペプチドの修飾により、非染色にて相互作用を可視化する。上記解析法により消化後に小腸に滞留すると考えられる糖やアミノ酸について、試験系で用いる緩衝液中の含量を系統的に変化させて、相互作用に及ぼす影響を解析する。
RNAスプライシングを介した神経分化制御機構の解析

神経発生過程では複数の因子がalternative splicingを受けており、RNA修飾が神経分化に深く関わる事が示唆されるがその分子メカニズムは不明である。そこで(1)神経幹細胞に発現するSplicing調節因子PTBのコンディショナルKOマウスを作製して解析を行った。Nestin-Creマウスとの交配により作製したPTB欠損脳では、未分化細胞(Radial glia)が脳室帯表層において形成する接着構造が消失しており、PTBが神経幹細胞の細胞間接着および細胞極性を制御して未分化維持に働くことが明らかとなった。また生後では重篤な水頭症を引き起こすことを見出した。次に(2) alternative splicingにより制御されるナンセンス変異依存RNA分解機構(NMD:Nonsense mediated mRNA decay)が神経分化にどのような影響を及ぼしているのかを明らかとするため、NMD構成因子UPF1のコンディショナルKOマウスを作製した。神経特異的UPF1欠損により、脳の低形成や神経幹細胞に由来するNeurosphere形成能の低下が観察され、UPF1が胎生期の神経分化に必須である事が明らかとなった。神経発生過程では複数の因子がalternative splicingを受けており、このようなRNA修飾は神経分化に深く関わる事が示唆されているが、その分子メカニズムは不明な点が多い。これまでに神経幹細胞に発現するSplicing調節因子PTBのコンディショナルKOマウスを作製し、PTBの欠損が生後での重篤な水頭症を引き起こすことを見出した。未分化細胞(Radial glia)が脳室帯表層にて形成する接着構造の維持にPTBは働いており、神経幹細胞集団の細胞間接着および細胞極性を制御して未分化維持に働くことが明らかとなった。本研究ではこのようなalternative splicingにより制御されるナンセンス変異依存RNA分解機構(NMD)に注目し、NMDが神経分化にどのような影響を及ぼしているのか、NMD依存的に抑制される標的RNAの解明を目的に、NMD構成因子UPF1コンディショナルKOマウスを作製した。Nestin-Creマウスとの交配による神経特異的UPF1欠損は、脳の低形成を引き起こしin vitroにおいても神経幹細胞に由来するSphere形成能の著しい低下が認められた。また早期に大脳皮質特異的にCreを発現するEmx1-Creマウスとの交配による神経特異的UPF1欠損脳では胎生期17日での大脳皮質領域がほぼ消失しておりUPF1が胎生期初期の神経分化に働く事が明らかとなった。現在、UPF1欠損マウスより得られる脳サンプルを用いてマイクロアレイ法による標的mRNAの網羅的な探索を行っている。今後これらの研究によりRNA結合蛋白質によるalternative splicing制御と神経分化との相関について新たな知見が得られる事が期待される。中枢神経系を構成する様々な細胞(ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト)は、増殖能及び多分化能を有する神経幹細胞より生み出される。そのため神経幹細胞からの分化メカニズムの解明は生物学的研究意義に加え神経疾患に対する再生医療という観点からも重要な課題である。近年、転写因子群による神経分化制御機構に加え、alternative splicingによるRNA修飾が細胞分化制御に関わる事が示唆されている。しかしRNA修飾機構に関する研究は未だ立ち後れているのが現状であり、その機構解明が望まれる。そこでalternative splicingにより制御されるナンセンス変異依存mRNA分解機構(NMD)に注目し、NMDによる発現調節は神経分化にどのような影響を及ぼしているのか?またその過程でNMD依存的に抑制される標的RNAの解明を目的に研究を行った。昨年度には樹立した相同組換え体ES細胞(BL/6)を用いてNMDの構成因子UPF1のコンディショナルKOマウスの作製を行った。また発生過程でのRNA splicing制御に関わる知見が非常に乏しい現状から、神経分化依存的alternative splicing switchの生体内での可視化を試みた。神経分化に伴いsplicing isoformが変化する遺伝子に注目し、各isoform特異的に蛍光蛋白質を発現するPTBレポーターベクターを構築した。本年においてUPF1 KOマウスの解析、および本レポーターを用いたKnock-inマウスの作製を行い、胎生期の中枢神経系(大脳皮質)に見られるダイナミックなsplicing patternの変化を可視化する事を計画している。

今後、これらの研究によりRNA結合蛋白質によるalternative splicing制御と神経分化との相関について新たな知見が得られる事が期待される。当初の計画以上に順調に研究は進展していたが、平成24年1月1日より大分大学のテニュアトラック教員として採用され、現在は新たな環境にて研究を進めている。異動に伴い一時的に研究を遂行出来ない期間があり、昨年度で計画していた「マイクロアレイ解析によるNMD標的mRNAの同定」はH24年度以降で計画している。これまでに「UPF1コンディショナルノックアウトマウスの作製」、「生体内でのPTBによるalternative splicing制御の可視化及びその解析」といった計画を完了しており、本年度以降で神経系特異的なCreマウスとの交配によりNMDが神経発生にどのように関わっているかを遺伝子改変マウスを用いて明らかとしてゆく予定である。現在は大分大学での研究体制の確立を目指し、胚操作を含めた発生工学手法や遺伝子改変マウスの作出法の環境作りにも取り組んでいる。昨年度で作製したUPF1コンディショナルノックアウトマウス、PTBレポーターノックインマウスを用いてRNA editingと神経分化との相関性に関する解析を引き続き行う。得られた結果を取りまとめその成果は学術論文や国内外の学会発表を通じて発信する。またマイクロアレイ法により標的RNAの網羅的解析を進め、同定された候補遺伝子の機能解析を行う。現在考えられているNMDのモデルでは、まずsplicingに伴ってExon-Exonの境界に蛋白質複合体(EJC:Exon junction complex)が結合し、次にEJCを介してNMD関連因子(UPF1,SMG-1等)がmRNA上へと集結する。その後の翻訳段階でリボソームがナンセンス変異で停止するとEJC-NMD関連因子により変異mRNAが選択的に分解される事が知られる。神経発生過程で発現しているsplicing調節因子によってsplicingを受ける標的mRNAの同定及びその機能解析を進める事で、これまであまり知られていなかったNMD依存的な発現制御機構や、それに伴う分化調節機構の解明に繋がる事が期待される。In vitroにおいてUPF1欠損細胞を用いてマイクロアレイ解析を行う。得られた候補因子の神経細胞への導入実験を行ない増殖能や分化能に関して検証する。細胞培養する際にはシャーレなどのプラスチック消耗品や培地血清類の消費が予想され、細胞を分化誘導させる際にはbFGF,wntなどの高価な液性因子が必要となる。In vivoでの解析として作製したUPF1 cKOマウスEmbryo及び子宮内電気穿孔法によりトランスジーンを導入したEmbryoの脳組織を免疫組織染色法により解析する。特にニューロンの分化度やサブタイプを各種抗体により検討する。
C型肝炎ウイルスの母子感染成立に寄与する因子の同定

1.研究目的C型肝炎ウイルス(HCV)陽性母体から出生した児の血清を、われわれが樹立したHCV組み換えウイルス感染実験系に作用させて、その反応性を検討する。.感染性への影響がみられた血清の臨床プロファイルを解析し、母子感染成立に関与する因子の解明とともに、予後因子の検討を行い、HCV陽性母体から出生した児の長期管理指針作成の科学的根拠としたい。2.研究実施経過(1)HCV母子感染症例の血清HCV陽性母より出生した児の血清を自施設および他施設より提供して頂いた。(2)HCV感染実験HCV陽性母体より出生した31症例の血清に関いて、HCV組み換えウイルス感染実験系での反応性を検討した。11症例の検体では感染増強効果が認められた。特に、母子感染症例では4/5(80%)の症例において、感染増強効果がみられた。これは、母子感染が成立しなかった症例群と比較し、統計学的に有意に高率であった(p<0.05)。(3)感染増強に関与する因子の探索Mannan-binding lectinは自然免疫において重要な役割を果たしている。特に病原微生物の糖タンパクと結合することで抗病原活性を有することから、高度に糖修飾されている外被タンパクをもつHCVに関しても感染防御に関与する可能性が考えられる。今回の感染実験に用いた血清中のmannan-binding lectin濃度について検討したところ、有意差は認められなかったが感染増強効果がみられた群のサンプルにおいて低値を示す傾向がみられた。以上の結果よりHCVの母子感染成立に関して、HCV感染を助長する何らかの血清因子が関与している可能性が示唆された。,Mannan-binding lectinなどの糖タンパクについて、さらに検討を進めいていき、HCV母子感染メカニズムの解明につなげていく。感染性への影響がみられた血清中サイトカインの測定、および臨床プロファイルを解析し、母子感染成立に関与する因子の解明とともに、予後因子の検討を行い、HCV陽性母体から出生した児の長期管理指針作成の科学的根拠としたい。2.研究実施経過(1).HCV母子感染症例の血清保存:HCV母子感染症例、および母体HCV抗体陽性例に関して、経時的に児の血清を収集、凍結保存をしている。(2).抗HCV抗体の解析:血清中の抗体成分とHCVの各タンパクとの結合性に関して、フローサイトメトリー法を用いて検討したところ、有意な結果は得られなかった。現在、ウエスタンブロット法にて検討中である。(3).HCV感染実験:HCV組み換えウイルス感染実験系での反応性を検討したところ、HCV母子感染症例(急性肝炎発症例)一例で感染増強効果が認められた。また、少数例ではあるが母体HCV抗体陽性症例において感染増強効果が認められた。感染増強効果に関しては、移行抗体、あるいは何らかの血清因子の作用と考えられ、現在、解析中である。(4).血清中の各サイトカイン濃度の測定:血清中の各サイトカイン濃度を測定し臨床プロファイル、感染実験系の結果と合わせて解析していく予定である。これまでの研究結果を第108回日本小児科学会学術集会、および第32回日本小児栄養消化器肝臓学会、第53回日本ウイルス学会で発表した。HCV母子感染症例は極めてまれであることから、学会発表と同時に検体提供の呼びかけを行い、他施設からの検体提供を受けている。今後、多数例の検討を行い、感染増強メカニズムの解析、母子感染成立因子・予後因子の解明につなげていく。
脳梗塞に対する新規治療標的分子としてのプログラニュリンの検討

急性局所虚血に対し,成長因子プログラニュリン(PGRN)は,PGRNノックアウトマウスを用いた実験で,TDP43の細胞質への異常局在を抑制すること,ミクログリアにおけるIL-10を介した抗炎症作用,そしてVEGF抑制を介した血管保護作用を含む,さまざまなメカニズムにて脳保護効果を有することを明らかにした.さらにラット自家血血栓を用いた脳塞栓モデルにおいて,組織プラスミノゲン・アクチベーターとPGRNの併用は,脳梗塞サイズ,浮腫サイズ,出血量を有意に抑制した.PGRNは神経細胞保護,血管保護,抗炎症効果を併せ持つ,これまでにない脳保護薬になる可能性が示唆された.まずKOマウスのWillis動脈輪の奇形の有無について確認を行ったが,野生型と比較して明らかな違いは認められなかった.このため一過性虚血実験を施行した.虚血24時間後では両群間の脳梗塞サイズに有意差は認められなかった(P = 0.12).しかし,虚血24時間後の脳浮腫サイズに関してはKOマウスが有意に大きいことが分かった(P = 0.048).さらに虚血24時間後の運動スケールについてもKOマウスで有意に不良であった(P = 0.02).虚血72時間後では脳浮腫,およぶ運動スケールの有意差は認められなかった(それぞれP = 0.95,0.75).2初代培養細胞における低酸素.低グルコース負荷(OGD)の検討野生型マウス由来の初代培養細胞(神経細胞・ミクログリア)に対しOGD負荷を行ったところ,神経細胞・ミクログリアともOGD後にPGRNの発現の増加が認められた.また神経細胞ではTDP43蛋白の細胞内局在が,核から細胞質への変化が見られた.ミクログリアでのサイトカインのRT-PCRによる評価では,PGRN KOマウス由来のミクログリアにおいて,炎症抑制性サイトカインであるIL-10の発現が低下していることがわかった.1組み換えPGRNの脳虚血に対する効果の検討ラット自家血血栓塞栓モデルを用いて,PGRNのt-PAとの併用効果について検討を行った.このモデルは血栓溶解薬t-PAで再灌流を行い,ヒトの脳梗塞に類似した治療可能時間を有するモデルである.治療可能時間を超えた虚血4時間の時点で,t-PAと組み換えPGRN蛋白を同時に投与すると,コントロール蛋白を同時投与した場合と比較し,虚血24時間後の脳浮腫や脳出血合併症は有意に減少し(P < 0.05およびP < 0.01),さらに梗塞サイズも縮小した(P < 0.01).さらに,機能予後も有意に改善した(P < 0.01).以上より,t-PAとPGRNの併用療法は,脳梗塞に対する脳保護療法の有望な候補となる可能性が示唆された.2神経保護作用のメカニズムに関する検討PGRNによる神経細胞保護効果は,TDP-43のloss of functionの防止に基づくという仮説を立て,検証を行った.ラット血栓塞栓モデルにて,虚血4時間後に,tPAとPGRNないし対照(IgG)の静注を行い,虚血24時間後,免疫ブロットにて活性型caspase-3,TDP-43(全長型,C末断片)の発現を比較した.またPGRN KOマウスと野生型マウスにおいて,一過性脳虚血24時間後のTDP-43の細胞内局在を免疫染色にて比較した.この結果,血栓塞栓モデルの対照群では,活性型caspase-3増加,全長型TDP-43の減少と25 kDa C末断片の増加を認めたが,PGRN投与群ではこれらの変化が抑制された.またPGRN KOマウスでは,野生型と比較して,虚血後のTDP-43の細胞質への異常局在を認める神経細胞の頻度が多かった(P < 0.01).計画以上に研究は進展し,すでに特許出願を行った.さらにこのまま計画に従って検討を進め,産学連携に繋げたい.プログラニュリン(PGRN)が脳梗塞に対する新機能保護薬になる可能性を考え,(a)PGRNノックアウトマウスの局所脳虚血モデル(in vivo),およびその初代培養細胞(神経細胞,血管内皮細胞,ミクログリア)の脱酸素・脱グルコース(OGD)モデル(in vitro)を用いて,PGRNが神経細胞生存,血液脳関門機能,炎症制御に果たす役割や機序を明らかにすること,(b)上記のin vivoおよびin vitroモデルにおいて,組み換えPGRNの投与が局所脳虚血やOGD負荷に対して保護的に作用するか,神経細胞・血液脳関門の保護,炎症制御の観点から明らかにすること,(c)PGRNの病態への関与を検証する橋渡し研究として,ヒト脳梗塞患者のtPA療法前後の血液を試料としたPGRNと炎症性サイトカイン定量を行い,臨床試験の実現へつなげることを目的とした検討を行った.この結果,(a)PGRNノックアウトマウスに対する一過性局所脳虚血を負荷したところ,脳梗塞サイズのおよび脳浮腫サイズが野生型と比較して有意に大きいこと,(b)PGRNノックアウトマウス由来の初代培養ミクログリアに対してOGD負荷を行い,IL-10のmRNAの低酸素・低糖刺激後の発現が,野生型と比較して有意に低下し,PGRNがIL-10を介した抗炎症作用を有すること(c)ラット脳塞栓モデルにおいてtPAと組み換えマウスPGRNの経静脈的に投与は,脳梗塞・脳浮腫サイズ,脳出血量,および機能・生命予後のすべての項目を,tPAと偽薬の併用と比較して有意に改善することを示した.

これまでの予備実験の結果と合わせ,PGRNはTDP43を介した神経保護作用,VEGF抑制を介した血管保護作用,IL-10を介した抗炎症作用を併せ持つ,これまでにない脳保護薬になる可能性が示唆された.急性局所虚血に対し,成長因子プログラニュリン(PGRN)は,PGRNノックアウトマウスを用いた実験で,TDP43の細胞質への異常局在を抑制すること,ミクログリアにおけるIL-10を介した抗炎症作用,そしてVEGF抑制を介した血管保護作用を含む,さまざまなメカニズムにて脳保護効果を有することを明らかにした.さらにラット自家血血栓を用いた脳塞栓モデルにおいて,組織プラスミノゲン・アクチベーターとPGRNの併用は,脳梗塞サイズ,浮腫サイズ,出血量を有意に抑制した.PGRNは神経細胞保護,血管保護,抗炎症効果を併せ持つ,これまでにない脳保護薬になる可能性が示唆された.計画以上に研究は進展し,すでに特許出願や論文発表を行った.さらにこのまま計画に従って検討を進め,創薬の実現に繋げたい.脳虚血患者血清におけるPGRN濃度をELISAにより定量し,種々の臨床評価項目との相関を調べる.神経内科組み換えPGRNを使用して,その効果について検討を進める.また脳虚血患者血清におけるPGRN濃度をELISAにより定量し,種々の臨床評価項目との相関を調べるが,すでに倫理委員会での承認も受け,検討を開始している.本年度の途中に,本創薬シーズに対する評価が高まり,産学連携が実現し,これに伴う外部資金の獲得ができた.つまり物品費を外部資金から使用することができたため,当初予定していた物品費を使用しなかったため次年度使用額が生じた.次年度に行う脳虚血患者血清によるPGRN濃度測定用ELISAキットの購入に費用を回す必要があったため.外部資金は翌年度途中に終わるため,次年度使用額は物品費や海外発表のための旅費として使用する予定である.PGRN濃度測定用ELISAキット,および組み換えPGRNの購入に使用する.
質の高い終末期へのデス・エデュケーションのプログラム開発と効果に関する実験的研究

本研究の目的は1デス・エデュケーション(以下,DEと称す)の実施は,死の不安を軽減し,望む終末期療養の実現や,より質の高い終末期ケアの提供につながるとの仮説を検証することにある.加えて2対象の特性や目的に応じたDEのプログラムを開発し,その効果と影響を検証することを目的にしている.そして,3質の高い終末期療養推進のため,看護教育や啓発活動に活用できる知見を得ることを本研究の目的としている.平成29年度の一般市民や医療者への調査結果から,一般市民や医療者ともに必要とされているDE内容はアドバンス・ケア・プランニング(ACP)に関する事であることが明らかになった.平成29年度実施状況報告書「今後の研究の推進方策」で記したように,平成28年度の実験結果から当初の研究計画書で平成30年度に実施予定であった実験2は実施せずに,ACPに関連するDEパンフレットを作成し,介入によりその有効性を検証する計画に修正した.修正計画通り,平成30年度ではACPに関するDE学習教材としてパンフレットを作成し,看護系大学生やそれ以外の大学生,一般市民,医療者にそれを用い,学習の効果をアンケート調査から検討した.またDEやACP学習効果を判定するのに,河野(2005)の死観尺度を基にACP尺度を開発した.DE学習パンフレット用いた学習の結果,家族や近しい人と看取りや終末期の希望に関する話し合いについては,講義前では74.8%の人が希望を伝えていないと回答していたが,講義後99.1%の人が講義を聞いて話し合う必要性が理解できたと回答し,87.6%の人が今後,話し合うと回答した.また一般市民や看護系大学生ともにACP尺度得点を分析した結果,講義後の死から「逃避」は中位点を下回り,ACP「実施認識」は中位点を大きく上回ったことからDEとしてACPの学習効果があり,パンフレットの有効性が示された.計画書や研究目的の通りに実験・調査を実施・終了でき,貴重なデータを得ることができたため,研究は順調に進展していると思われる.とりわけ研究当初に計画していた通りに,生理学的指標を用いて実験的に恐怖管理理論の視点からの仮説の検証を試みたのは本邦初であり,学術的に価値が高いデータが得られ,現在専門学術雑誌への投稿準備中である.そして河野(2005)が開発した自己と大切な他者の死観尺度の再検査信頼性を検証し,新性格特性との関連から併存的妥当性の検証も行えた.また,対象の特性や目的に応じたデス・エデュケーション(以下、DEと称す)のプログラムを開発するために,市民講座受講者や学会参加者・医療者に対する質問紙調査を実施した.その結果,求めれれるDEプログラムとして,アドバンス・ケア・プランニング(ACP)との関連が示された.研究目的通りに,平成30年度ではACPに関連させたDE教材を開発し,大学生や看護系大学生,一般市民や医療者にそのDE教材を用いた介入を行い,DEとACPの有効性に関する調査を実施し,DEの有効性を検証できた.また,前年度の実験や調査結果からDEの効果を検証するのにDAS(死の不安)や死観尺度は指標として有効ではないことが示され,DEの効果を検証するため,河野(2005)の死観尺度を基にしたACP尺度を新たに開発し,尺度の信頼性と妥当性の確認を行うことができた.本研究で開発した紙面ベースのパンフレットを用いた講義を行うことで,看護系大学生や医療者また一般市民といった所属に関係なくACPの理解度は高まり,デス・エデュケーションの効果はあった事が示された.しかしパンフレット教材を用いたレクチャーであれば,講師の説明が必要となり,講師の説明により有効性は変化すると予測される.個人や組織が講師がいなくても,いつでも必要な時に使用でるようなDEやACPに関する視聴覚教材開発の必要性があると思われた.従って,研究最終年度ではこれまでの研究結果を統合させ,残りの経費を使用してACPに関するDEのDVD教材を開発すること目指す.そして作成したDVDは科研費成果物として広く希望者に配布し,利用できるようにする予定である.本研究の目的は1デス・エデュケーションの実施は,死の不安を軽減し,望む終末期療養の実現や,より質の高い終末期ケアの提供につながるとの仮説を検証することにある.加えて2対象の特性や目的に応じたDEのプログラムを開発し,その効果と影響を実験的に検証するとともに,縦断的調査から有効性を検証することを目的にしている.そして,3質の高い終末期療養推進のため,看護教育や啓発活動に活用できる知見を得ることを本研究の目的としている.初年度は目的1に関して研究計画書に記載した通り,デス・エデュケーションの効果と方法の妥当性や指標の信頼性を確認するための実験を実施した.看護学生9名と看護系以外の大学生11名の合計20名に対し,1「自己の死に関こと」,2「大切な他者の死に関すること」,3「死のない世界に関すること」,統制課題として4「大人のぬりえ」の4課題の実験を実施した.実験手順としては,問診を含む調査票への記入を行った後,唾液アミラーゼ活性値や心拍変動などの生理学的指標を測定し,課題を実施した(所要時間30分).課題を実施した後,再び生理学的指標を測定し,問診を含む調査票へ回答し,気分の変調等を確認した上で終了とした.全実験時間は1回概ね60分90分であった.

本研究で実施する課題は教育的内容のものであり,被験者に与える負の影響は少ないと思われるが,死の不安を煽ってしまう危険性が無いわけではないため被験者への倫理的配慮の面からも,影響に関しては生理学的指標も測定したが,全ての被験者が実験後のデータはストレス無しの範囲内であり,問診でも不調を訴える被験者はいなかった.また目的2に関連して,H29年度実施予定の市民講座受講者や学会参加者に対してデス・エデュケーションに関する質問紙踏査を実施した.実験データと質問紙調査データを現在分析しており,H29年度に学科発表等を行う準備をすすめている.計画通りに実験を実施・終了でき,貴重なデータを得ることができた.研究当初に計画していた通りに,恐怖管理理論の視点からの仮説の検証を試みた.そして河野(2005)が開発した自己と大切な他者の死観尺度の再検査信頼性を検証し,新性格特性との関連から併存的妥当性の検証も行えた.また,対象の特性や目的に応じたデス・エデュケーションのプログラムを開発するために,H29年度実施予定であった市民講座受講者や学会参加者に対する質問紙調査をH28年度中に実施できたことは計画以上に進呈したと評価できる.アンケート調査の結果から河野(2005)の自己と大切な他者の死観尺度に探索的因子分析を実施した結果,自己と大切な他者の死観尺度の因子構造は全く同じであり,先行研究と類似した因子構造が得られたことから,自己と大切な他者の死観尺度は対象が異なっても安定した因子構造が得られることが明らかになり,河野(2005)の自己と大切な他者の死観尺度は死への態度を測定するのに有効であることが検証された.しかし、H28年度に実施した実験データを分析すると,本研究の根幹となる仮説に反して,自己の死について考えるデス・エデュケーションを実施することで死の不安や自己の死の恐怖が高まることが明らかとなった.自己の死の恐怖の高まりは課題実施直後の一時的でなものではあるが,死の不安に関しては平均41日後でも持続していることが明らかとなった.但し,死の不安や恐怖といった死への態度変化に関しては無自覚であり,対象に何らかの負の影響を与えるものではなかった.本研究の目的は1デス・エデュケーション(以下,DEと称す)の実施は,死の不安を軽減し,望む終末期療養の実現や,より質の高い終末期ケアの提供につながるとの仮説を検証することにある.加えて2対象の特性や目的に応じたDEのプログラムを開発し,その効果と影響を実験的に検証するとともに,縦断的調査から有効性を検証することを目的にしている.そして,3質の高い終末期療養推進のため,看護教育や啓発活動に活用できる知見を得ることを本研究の目的としている.H29年度は,研究目的1を達成するためにH28年度に実施した実験研究結果を分析し,4つの学会にその成果を発表した.なお本研究で実施する実験内容は教育的内容のものであり,被験者に与える負の影響は少ないと思われるが,死の不安を煽ってしまう危険性が無いわけではないため被験者への倫理的配慮の面からも,影響に関しては生理学的指標も測定した.その結果,全ての被験者が実験後のデータではストレス無しの範囲内であり,問診でも不調を訴える被験者はいなかった.但し,結果からDEの実施により,死の不安の指標として用いたDASは,予想に反して高まるものの,自覚レベルで死の不安を高めるものではなく,望む看取りを実現するためにDEは有効であることが示された.
3DCG所作データベースに基づく能の「型付」資料未記述部分の解明

能の舞の基本となる所作単元をモーションキャプチャによって記録し、3DCG化して所作単元データベースを構築した。さらに、このデータベースから所作単元を型付資料に記述される順に引用して繋げば自動的に舞が復元できるようなシステムを試作し、これらを利用して、省略の多い古型付の解読・復元を試みた。また、システム試作の過程で、型付に記されていない、能の所作を支える暗黙のルールのいくつかを明らかにし得た。(1)所作単元の選定とモーシヨンデータの収録:約150種の所作単元と、連続した仕舞7種(老松キリ・熊野クセ・船弁慶クセ・高砂キリ・鶴亀キリ・羽衣キリ・山姥キリ)及び中ノ舞を観世流能楽師の馬野正基氏に舞って頂き、3次元モーションデータとして収録した。老松キリと熊野クセは、簡単な3DCGで再現できるようにしてある。またこれらの舞に出てくる約100の所作単元を個別に収録した。(2)モーションデータの解析:収録したデータからどんな場合でもその所作を演ずるときには必ず在るコアの部分を取り出す作業をおこない、抽出した所作単元コア部分の3DCGを個別に作成して、データベースとして蓄積した。本年度は特に基本的な50種のコア部分を抜き出す処理を終え物理的指標を添えて示すことが可能になっており、また、簡単な3DCGを制作済みである。(3)3D-CGの制作:基本的な舞である「老松」「熊野」の型付資料に基づいて、上記の所作単元コア部のモーションデータを時系列的に配置し、モーションの合成や補間を行うことにより、3D-CG映像を作成した。さらに、これらの合成された舞を、能役者が演ずる一連の舞と比較したところ、舞台上の位置と方向にずれが生じるものの、合成された舞が舞全体の動きをほぼ正確に再現できることを確認した。(4)能の舞自動合成ビューアの試作:上記映像は、3D-CGツールを用いて作成したが、型付資料から所作単元を配置することにより、誰でもが舞を3次元的に復元できる「能の舞自動合成ビューア」のプロトタイプを、外部委託業者との共同開発により作成した。(5)成果の発表:上記(1)(4)の研究成果は「人体と身体性」についてのシンポジウムでの口頭発表、能の型付記述ルールに関する論文、能の所作復元ツール試作版として、発表した。1能の基本的な舞を網羅できる40橦類ほどの所作単元3Dモーションデータを能役者の舞から作成し、それらを解析して、一連の舞の中に組み込まれても必ず演じられるコア部分を抽出した。また、従来データの見直しも行い、所作単元のより正確なコアデータを作成した。これにより、合成可能な舞の種類が増加し、自然な舞の合成が可能になった。2市販の3Dアニメーションツール(MotionBuilder)を用い、1で作成した所作単元のコアデータを連続的に配置していくつかの舞の合成を行い、一連の舞全体の動作と比較を行った。これにより、能舞台上での演者の位置と向きのずれを補正するには、軸足を中心とした回転角度の調整や、重心の軌跡の修正が必要となることを見出した。3 1で作成したコアデータを、型付資料に従って配置することにより、初心者でも簡単に舞を合成し、3DCGアニメーションとして確認できる舞の自動合成ビューアを委託業務により試作した。2で明らかとなった動作の補正機能をすべて実装しておらず、まだ十分にスムーズで自然な舞が合成できる段階ではないが、特別な知識を必要とせず、型付資料のみから舞の全体を様々な視点から確認できる有用なツールに仕上がっているので、近日中に、所作学研究会のWebサイトにて公開する予定である。4以上のような成果と進捗状況を、所作学研究会において、毎月1回程度報告し、成果の検証を行った。これらの成果は、近日中に、文系的な側面と理系的な側面の2つの観点から整理し、それぞれの分野に適した学会で発表する予定である。1所作単元データベースの充実:VICONによる所作単元の撮影を続けた。前年度までの合成ツール試作の段階で明らかになった問題点を踏まえて撮影をし直したものも多い。舞台上での歩行動作の収録、比較のための舞全体の収録等もおこなった。撮影データのファイルには所作単元名に加え、腕が上がっているか下りているか、扇を閉じているか開いているか等の情報も付してリスト化した。2市販のアニメーション合成ソフトを利用して、型付の記載順に所作単元をつないで能の舞を合成しようとした場合、どのような問題が起き、それを解決するためにどのような補正が必要かを明らかにし、その成果を情報処理学会人文科学とコンピュータ研究会で発表するとともに(2011年7月)、論文として活字化した。3江戸時代初期の古型付を解読し、そこに記された所作単元を上記のルールに合わせて合成して、能<桜川>の古い仕舞を復元した。

古型付の復元に舞の合成システムを利用する方法や、所作単元から舞を合成する際の問題解決の過程で明らかになった能の所作の特徴について、能楽学会世阿弥忌セミナーで発表するとともに(2011年8月)、論文として活字化した。4能舞台の上を大きく移動する所作についても、従来は「右へ廻る」「左へ廻る」「角へ行く」等の所作単元として考えられているが、それを歩行動作として捉え直し、舞の合成の際に利用できるか否か、検討を始めた(本研究課題終了後も別の研究課題として継続)。5以上の成果を公開するためのウェブサイトを作成し、順次、成果を発表している。
ジストロフィン遺伝子からの新規転写産物のクローニング

ジストロフィン遺伝子はヒト最大の遺伝子で、3000kbにもおよび、その全遺伝子構造は未だ解明されていない。現在までに多くの研究がなされ、ジストロフィン遺伝子に8種類のプロモーター領域が存在し、各々のプロモーターからジストロフィンのアイソフォームが産生されることが明らかにされている。私たちは、ジストロフィン遺伝子に関する研究を精力的に行ってき、ジストロフィンの新しいアイソフォームが発現していることを示唆する結果を得た。本研究は、この新しいジストロフィンのアイソフォームをクローニングし、その機能を明らかにするものである。ここでは、私たちが既に明らかにしたこのアイソフォームの1部の塩基配列を基点として、cDNAの5′あるいは3′方向へと順次その配列を明らかにするものである。これには、5′RACEあるいは3′RACEを用い、既知配列にデザインしたプライマーを用いてPCR増幅し、増幅断片を得た。そして、この増幅断片の塩基配列を自動塩基配列決定装置を用いて解析した。さらに、ここで明らかにした配列にプライマーをデザインし、同じ操作を繰り返した。その結果、現在までに、ほぼ3′端の塩基配列を明らかにすることに成功した。現在、5′端領域の全塩基配列を明らかにしつつある。今後この研究を推進し、この新しいアイソフォームの塩基配列を明らかにするものである。そして、明らかにした塩基配列の1部の塩基配列からプローブを合成し、これを用いてノーザンプロットを行い、この新しいアイソフォームの組織分布を解析する予定である。
規則波中の船の推進性能算定法に関する研究

平成8年度から平成10年度までの研究成果の概要は以下の通りである。1.規則波中の抵抗増加と運動計算法の改良を行った。2.九大水槽において、貨物船型とタンカー船型のプロペラ面における伴流分布を3本のプロペラ式流速計(直径3mm)を用いて計測し、短波長域でも波があると伴流速度大きくなることを把えることが出来た。3.同じ模型船を用いて、規則波中での抵抗試験と自航試験を行った。長さ2.5mという小型模型を用いても、荷重度変更試験を行って、十分意味のあるデータがとれた。4.短波長規則波中での船の推進性能を算定するプログラムを作成して、形状が異る3隻の数式船型(長さ150m)に対する計算を実施した。この結果は、定性的に前記自航試験結果を説明するものであった。5. CFD計算によって、規則波の中での船体まわりの流れをシミュレートできるプログラムを開発した。6.静水面より上方の船体形状まで考慮できる、波の中の船体抵抗増加を計算できる。7.波浪中で、船首フレアに働く抵抗を計測した。本年度の研究実績は次の通りである1.まず九大水槽の造波装置の性能を調査し、波高波長比を一定にして、再現性をチェックした。その結果、古いモーターと伝達機構を使っているため、十分な再現性が得られていないことが判明した。次年度に改良を行いたい。2.新たに購入した規則波中抵抗計測装置を用いて、タンカー船型の向波中での運動と船体抵抗を計測して、抵抗増加量を求めて、今まで得られた結果に近いことを確かめた。3.規則波中の船の推進性能を求めるための定式化を行った。4.規則波中の船の運動と抵抗増加を求める定式化とプログラムの作成を行い、数式船型と貨物船型の場合に計算を行い、実験値と比較した。本年度の研究実績は次の通りである。1.平成8年度の九州大学での規則波中の実験において、造波装置の不備が明らかになった。そのため、造波駆動装置を取り替えて、再度2隻の模型船(貨物船型とタンカー船型)の規則波(短波長向波)における、船体抵抗とプロペラ面の伴流計測を行った。その結果、造波装置から30m程度までは安定した規則波(波長0.5m1.75m)が得られるようになった。抵坑増加量は、波長が小さい範囲ではバラつきがあるが、他水槽で得られた値より大き目の値が得られた。また、プロペラ面の平均伴流率については、波長が長くなるにつれて、小さくなる結果がえられた。この結果も船舶技術研究所が得られた傾向と一致した。2.規則波中におけるタンカー船型の船体抵抗増加を理論計算によって算定し、実験値と比較検討した。計算値は、船首部で反射した波による抵抗増加を精度良く予測できることが分った。3.大型模型船を用いて、規則波の自航試験を行うと共に、5孔管によるプロペラ面の伴流分布を計測し、さらに船尾付近の圧力分布を計測した。伴流率については、規則波中では減少し、圧力分布は平水中と略同じであった。4.動揺する船のまわりの流れのCFDシミュレーションを行った。5.非定常プロペラ性能を解析する簡便なパネル法を開発した。6.矩波長規則波中の船の推進性能を解明する定式化を完成させ、数式船型に対する数値計算を実行した。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。1.九大水槽において、貨物船型とタンカー船型のプロペラ面における伴流分布を3本のプロペラ式流速計(直径3mm)を用いて計測し、短波長域でも波があると伴流速度大きくなることを把えることが出来た。2.同じ模型船を用いて、規則波中での抵抗試験と自航試験を行った。3.短波長規則波中での船の推進性能を算定するプログラムを作成して、形状が異る3隻の数式船型(長さ150m)に対する計算を実施した。4. CFD計算によって、規則波の中での船体まわりの流れをシミュレートできるプログラムを開発した。
膝関節アライメントを変えることで生じた力学的負荷の変化が関節軟骨に与える影響

多くの高齢者が罹患している変形性膝関節症の原因や治療を理解するうえで、膝関節のアライメントが変わることによって生じた力学的負荷の変化が関節軟骨にどのような変化を与えるかを知ることは重要である。本研究では関節外で膝関節のアライメントを変えて変形性膝関節症を生じる動物モデルの作成は不成功に終わった。しかし変形性膝関節症自然発症マウスでは、脛骨の捻じれによる膝関節のアライメントの変化が、変形性関節症発症の原因の1つであることが示された。1.脛骨外反骨切りモデルの評価(1)モデルの作成方法日本白色家兎の雄3.0kgを使用し、両側の脛骨外反骨切りモデルを作成した。脛骨内側を関節面から約2cm縦切開、レントゲン透視下で骨切り部を確認後切骨し、ポリェチレンで作成した20度のウエッジを骨切り部に挿入した。1.0mmの軟鋼線で作成したステイプル2本で固定し各層縫合し手術を終了した。術後ケージ内で自由に荷重させた。(2)変形性関節症発症の評価術後4、8、12週で屠殺し、両側脛骨を採取した。肉眼所見、軟エックス線所見、HE染色による組織学的評価を行ったが、各週で変形性膝関節症は発症していなかった。2.脛骨外反骨切り術+内側側副靭帯剥離モデルの評価本研究の目的は、従来の関節内操作を行うことによって変形性関節症を生じさせるのではなく、関節に直接手術操作を加えることなく変形性関節症を生じさせることである。実験1においてアライメントの変化だけでは変形性膝関節症が発症しなかったことから、外反骨切り術に関節外での内側側副靭帯剥離を加え、膝関節の不安定性を生じさせた。(1)モデルの作成方法実験1の(1)と同様の方法で外反骨切り術を行い、ステイプル固定後脛骨顆部から内側側副靭帯を剥離した。以上の結果から、関節外のアライメントの変化と動揺性ではケージの中で飼育されている家兎に変形性関節症は生じないことが示された。今後は運動負荷を加えるか、あるいは他の関節で関節外のアライメントを変化させ、変形性関節症が発症しうるかどうか検討する必要がある。本研究の目的1.従来の動物モデルのように関節内操作を行うことによって変形性関節症を生じさせるのではなく、関節内に直接手術操作を加えることなく、関節外のアライメントを変えることで変形性関節症を生じさせる動物モデルを開発することである。2.そのモデルを用いて、どの段階でアライメントを戻せば変形性変化が可逆的であるかを評価する。前年度の実験と結果1.外反骨切りモデル:日本白色家兎の雄3.0kgを使用し、脛骨内側を関節面から約2cm縦切開、レントゲン透視下で骨切り部を確認後切骨し、ポリエチレンで作成した20度のウエッジを骨切り部に挿入した。2.外反骨切り+内側側副靭帯剥離モデル:1のモデルの内側側副靭帯を脛骨付着部で剥離し、外反動揺性を追加した。いずれのモデルでも、組織学的評価によって変形性変化は認められなかった。本年度の実験と結果前年度のモデルで変形性変化がおこらない理由の1つとして、日本白色家兎は股関節屈曲・外転・外旋位、膝関節屈曲位でいるため、膝外反位では膝関節外側への負荷の増加は少ない可能性が考えられた。そのため1.の実験において、脛骨外側から骨切りを行う内反骨切りモデルを作成した。術後4、8、12週で屠殺し、両側脛骨を採取した。X線の詳細な評価では、骨切り角度が経時的に減少しており、挿入したポリエチレンの軽度逸脱が認められ、open wedge osteotomyでアライメントを長期に矯正することは困難であることが示された。来年度の実験正確な角度のClosed osteotomyを日本白色家兎で行うことは困難と考えられるため、domeosteotomyによってアライメントを矯正する。平成13年国民生活基礎調査によると、本邦の要介護の原因の中で関節疾患は11%を占めている。そのなかで変形性膝関節症は最も頻度が高く、加齢に伴い罹患率が増加することが示されている。

わが国の高齢化は急速に進んでおり、変形性膝関節症患者が増加することは明らかである。そのためこの疾患の病態を理解し、適切な保存的あるいは手術的治療を行うことは、本疾患により要介護となる患者を救済していくために必要不可欠である。この変形性膝関節症の原因や治療を理解するうえで、膝関節の軸が変わることによって生じた力学的負荷の変化が関節軟骨にどのような変化を与えるかを知ることは重要である。本研究では(1)日本白色家兎を用いて、関節内に侵襲を加えずに関節外のアライメントを変化させることで関節軟骨の変形性変化を生じる動物モデルを確立こと、(2)変形性膝関節症自然発症マウスが変形性膝関節症を発症する原因が膝関飾外のアライメントの変化であることを示し、今後このマウスを使用して変形性膝関節症の病態や治療に関する研究を行うための基礎データを蓄積すること、を目的とした。(1)に関しては、骨切りによってアライメントを変化させて変形性膝関節症を発症させることは困難であった。今後骨切り後に運動負荷を加えることによって変形性関節症を発症させうるか検討する必要がある。(2)に関しては、組織学的には10週齢、20週齢から膝蓋大腿関節の関節軟骨の異常所見が個体差、左右差なく認められた。また組織学的に膝蓋大腿関節の変形性変化が再現性よく発症する原因を骨形態学的に評価したところ、脛骨の内捻がその原因の1つであると考えられた。今後はこの変形性膝関節症自然発症マウスを用いて、変形性関節症の進行予防のための保存療法である運動療法やヒアルロン酸の関節内投与の影響を評価していく予定である。