hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵母で解き明かすミトコンドリア膜の透過性遷移の分子メカニズム

ミトコンドリアの透過性遷移はアポトーシス誘導のトリガーとなる現象である。本研究は透過性遷移を制御する遺伝子を同定することを目的として、遺伝子改変酵母のミトコンドリアを用いた解析を行った。その結果、これまでに透過性遷移を制御すると目されてきた複数の遺伝子は、いずれも透過性遷移の誘導に中心的な役割を果たしていないことを明らかにした。これは透過性遷移を制御する未知の遺伝子の存在を示唆するものである。本研究は遺伝子壊変酵母のミトコンドリアを用いて、アポトーシス実行のトリガーとなるマシナリーである「ミトコンドリア膜の透過性遷移」の分子機構を解明することを目的とする。初年度は透過性遷移に関与する遺伝子を同定することを目指し、これまでに哺乳類において透過性遷移に関与している可能性が報告されている様々な遺伝子の欠損酵母を作製した。Adenine nucleotide translocaseの3つのアイソフォーム(AAC1、AAC2、AAC3)、porinの2つのアイソフォーム(POR1、POR2)、Hexokinaseの2つのアイソフォーム(HXK1、HXK2)、Cyclophilin D(CPR3)、phosphate carrier (PIC)の合計9種類の遺伝子について遺伝子欠損酵母を作製した。作製した各々の遺伝子欠損酵母からミトコンドリアを単離し、透過性遷移の誘導刺激であるCa^<2+>を添加したところ、いずれの変異株のミトコンドリアにおいても野生株のミトコンドリアと同様に透過性遷移が誘起された。このことから、今回欠損させた遺伝子は、いずれもそれ単独では透過性遷移に影響を及ぼさないことが判明した。しかしながら、adenine nucleotidetranslocase、porin、hexokinaseについては、それぞれアイソフォームが複数存在していることから、単一のアイソフォームだけ欠損させても透過性遷移への影響が顕著に観察されない可能性が考えられた。そこで現在、AAC1,2,3欠損酵母、POR1,2欠損酵母、HXK1,2欠損酵母をそれぞれ作製し、これらの変異株から単離したミトコンドリアを用いて透過性遷移への影響を解析している。これに加えて平成23年度は、今回調べた遺伝子以外の様々な遺伝子についても変異株を作製し、透過性遷移の制御への関係性を調べることを計画している。本研究は様々な遺伝子壊変酵母のミトコンドリアを用いて、アポトーシス実行のトリガーとなるマシナリーである「ミトコンドリア膜の透過性遷移」を制御する遺伝子を同定することを目的とする。前年度はこれまで透過性遷移の制御に関与していることが報告されているAdeninenucleotide translocaseの3つのアイソフォーム(AAC1、AAC2、AAC3)、porinの2つのアイソフォーム(POR1、POR2)、hexokinaseの2つのアイソフォーム(HK1、HK2)についてそれぞれ遺伝子破壊酵母株を構築し透過性遷移に及ぼす影響を調べたが、どの遺伝子を破壊した場合についても透過性遷移への影響は認められなかった。しかし、この実験では単一のアイソフォームのみを欠損させていたため、透過性遷移に及ぼす影響が不十分であった可能性が考えられた。そこで本年度は、アイソフォームを全て欠損させた多重遺伝子破壊株(AAC1,2,3破壊株、POR1,2破壊株、HK1,2破壊株)を構築し、これらの変異株から単離したミトコンドリアを用いて透過性遷移の誘起に及ぼす影響を解析した。その結果、いずれの変異株のミトコンドリアでも透過性遷移は野生型と同等に誘起されたことから、これまで透過性遷移の制御に関与していると考えられてきたAAC、POR、HKはいずれもその制御に中心的な役割を果たしていないことが明確に示された。我々はさらに複数の遺伝子について同様の解析を行ったが、いずれの遺伝子も透過性遷移との強い関連を示すには至らなかった。これまで、特にAACとPORについては、透過性遷移への関与が世界的に広く信じられ、今では多くの参考書にこれに関する記載がまことしやかになされている状況にある。従って、AACとPORが実際には透過性遷移に関与していないことを示した本研究のインパクトは大きい。また同時に、本研究の結果から、透過性遷移の制御にクリティカルに関与する未知の遺伝子が存在することが強く示唆される。今後、透過性遷移に関与する遺伝子の候補を新たにスクリーニングし直すことが必要である。
ビタミンDの生体内活性化におけるメガリン機能の解析

主に腎臓の近位尿細管細胞刷子縁に発現しているエンドサイトーシス受容体であるメガリンは、糸球体で濾過された様々な低分子量蛋白質を細胞内に取り込む。そこで我々は、メガリンの機能を撹乱するためにメガリンとそのリガンドとの結合を競合阻害するreceptor associated protein(RAP)をリコンビナント蛋白質として大腸菌のシステムにより発現、精製した。このリコンビナント蛋白質をマウスに投与したところ、血中25位水酸化ビタミンD(25OHD)値の低下が認められた。さらに、腎尿細管におけるナトリウム-リン酸共輸送担体の発現低下に伴い尿中リン値の上昇が認められた。そこで我々はRAPを高発現するtransgenic miceを作出した。N末端の分泌シグナルとC末端の小胞体保持シグナルを除き、新たにN末端にlgK chainの分泌シグナルを付加した分泌型RAPを発現するtransgeneを組み込んだマウスを作出した。マウスの末梢血中に存在する分泌型RAPをELISA法にて測定し、吸光度値が正常マウスより1.3倍以上高値のtransgenic個体を解析対象とした。10週令の野生型と変異型マウスを比べると、体重、血中25OHD値、血中Ca値,血中Pi値に有意な差異は認められなかった。しかし16週令のマウスでは、血中副甲状腺ホルモン(PTH)値において、野生型に比べ、変異型マウスの方が高値であった。メガリンはPTHも細胞内に取り込むことが報告されており、変異型マウスにおいて、尿中へPTHが漏出した結果、フィードバック機構によって血中PTHが高くなったと推察される。このメカニズムについて更なる検討が必要と思われる。megalinは、腎近位尿細管刷子縁に発現するendocytic receptorであり、糸球体で濾過された低分子量タンパク質を細胞内に取り込む。今回in vitroでmegalinの機能を競合阻害するタンパク質、Receptor associated protein(RAP)のリコンビナント蛋白をマウスに投与することにより、megalin機能についての検討を行った。小胞体保持シグナルを除いて可溶型としたRAPをマウスに投与したところ、投与後の尿で低分子タンパク尿が認められた。またRAP投与後の尿中へのDBPの漏出の増加をwestern blotにて確認した。これらは、生存したmegalin欠損マウスでの報告と同様であり、今回行ったこの系でもmegalinの機能を一時的に低下させることが確認できた。さらに、RAP投与後、尿中Pi排泄が有意に増加しており、血清中の250HDは、有意に低下していた。Megalinは腎近位尿細管刷子縁に発現するendocytic receptorであり、糸球体で濾過された低分子量蛋白質や化合物を細胞内へ取り込む。本研究では、megalinのリガンドの一つであるreceptor associated protein (RAP)のリコンビナント蛋白をマウスに投与する事により、megalin機能について検討を行った。マウス腹腔内に可溶型RAPのヒスチジンタグ融合蛋白(His-RAP)を単回投与したところ、投与一時間後に近位尿細管上皮細胞でHis-RAPの取り込みが確認され、さらに抗megalin抗体を用いた免疫組織化学では、細胞内にdot状の染色を認めた。また、同じく腎近位尿細管刷子縁に発現しているNa-Pico-transporter (NPT)の挙動をみたところ、RAP投与後2時間では細胞質内に染色を認めた。連続投与後の尿では、低分子量蛋白尿が認められ、ビタミンD結合蛋白質(DBP)、β2-microglobulinの漏出の増加が認められた。また、尿中Pi排泄が有意に増加しており、また血清25OHD値は有意に低下していた。しかし、血清PTH値は、RAP投与前後で有意な違いを認めなかった。これらのことから、RAP投与によるmegalin機能の一時的な撹乱は、megalinのligandであるDBPの再吸収を障害させ、さらに間接的にNPTのendocytosisを亢進させることにより、尿中Pi排泄を増加させたと考えられた。

メガリンはPTHも細胞内に取り込むことが報告されており、変異型マウスにおいて、尿中へPTHが漏出した結果、フィードバック機構によって血中PTHが高くなったと推察される。このメカニズムについて更なる検討が必要と思われる。
Zellweger症候群の病因究明に関する研究

Zellweger症候群の病因究明を目指して協同研究を進め以上の成果を得た。(2)ペルオキシゾームβ酸化系酵素は全て活性の著明存低下が見出された。(4)膜蛋白はpulse cfaseやcell Oahelling法で合成されていることが分った。しかし症例によっては70KDaの膜蛋白の異常が認められた。(5)1例ではあるが7番染色体長腕近位部の微小欠失が認められた。(6)全例、ミトコンドリヤのβ酸化系は正常であった。(7)CHO変異細胞がZellveger症候群と同一の生化学的異常を示すことが見出され、この細胞をモデルとして研究を進めた結果、入れ物としてのペルオキシゾームは存在せず、合成されたペルオキシゾーム酵素系が細胞質で速やかに分解され、膜蛋白はゴーストとして細胞質に残存することが示された。(8)免疫組織化学的研究の結果、Zellweger症候群の細胞ではペルオキシゾームが存在せず細胞質に金粒子がのっていることからやはり局在化できない蛋白質が細胞質に残っていることが証明された。以上3年間の研究で多くの新知見が得られたが本症のprimary lesionは尚明らかでない。さらに蛋白の輸送因子や膜蛋白の解析を進めることにより、細胞内小器官欠損という特異存疾患の全容が分り、ひいては細胞内小器官の成立という生命の大命題が解明されるであろう。Zellweger症候群は、細胞内小器官であるペルオキシソーム構造の欠損症である。ペルオキシソームに局在する極長長鎖脂肪酸代謝に障害がある事から、ペルオキシソーム特有のβ-酸化系酵素(acyl-CoA oxidase,bifunctional protein,3-ketoacyl-CoA thiolase)と不飽和脂肪酸代謝に関与する2,4-dienoyl CoA reductaseについて検討した。いずれの酵素も活性をほとんど認めず、Western blot法を用いて各酵素蛋白が検出できなかった。ただし3-Ketoacyl-CoA thiolaseはその前駆体と思われる酵素蛋白が検出された。そこで肝からmRNAを抽出し、無細胞蛋白合成系で翻訳を行なわせると、各酵素蛋白は合成される事がわかった。また免疫組織化学的分析によりペルオキシソーム構造が存在しない患者肝細胞の細胞質に酵素蛋白を検出できる事から、合成された酵素蛋白がペルオキシソームに局在できず、細胞質にとどまり蛋白分解酵素で分解される事が推定された。そこで、ペルオキシソーム形成自体の異常が本疾患の病因と考えられ、ペルオキシソーム膜タンパク質について解析を行なった。膜蛋白として分子量70KDa(MP-70KDa),26KDa(MP-26KDa)と22KDa(MP-22KDa)の3種類のポリクローナル抗体をウサギで作製しWestern blotに用いた。常法に従い膜画分を調整し、検討すると患者肝ではMP-70KDa,MP-22KDaが検出されなかった。MP-26KDaは微量であったが、感度を増す事によりやはり検出されない事がわかった。今後、患者皮膚線維芽細胞とオランダより供与された患者皮膚線維芽細胞を用いて、膜蛋白合成能の有無について検討し、ペルオキシソーム形成とZellweger症候群の病因について検討を加えていきたい。あわせて、生出前診断についてもその方法を検討するつもりである。Zellweger症候群は,細胞内小器官であるベルキシゾームの欠損に基づき,重篤な中枢神経症状,特異な顔貌,肝障害等を呈する遺伝病であり,その病因は未だ不明である.本研究ではペルオキシゾームに局在する極長鎖脂肪酸代謝に障害があることから,ペルオキシゾーム特有のβ酸化系酵素(acylーCoAo瑳idase,bifunctional protein,3ーketoacylーCo A thiolase)と不欠和脂肪酸代謝に関与する2,4ーdienoyl Co A reductaseについて檢索した結果,本症々例の肝ではいずれの酸素も活性を檢出し得なかった.さらにWestern blot法を用いて三等酵素蛋白を調べたがいずれも檢出し得なかった.

対照としてミトコンドリヤ局在性脂肪酸化系の9種の酵素を調べた所,患者肝でこれらの酵素の活性,蛋白量に異常は見出されなかった.そこでペルオキシゾーム形成自体が本症の病因と考えられ,ペルオキシゾーム膜蛋白の解析を行なった結果,分子量70kDaと22kDaの著明な減少が見出された.次に患者由来の培養線維茅細胞を用いて〔^<35>S〕ーメチオニンを用いて2時間パルスラベルし,6時間,24時間チェイスしたところ,患者細胞では両膜蛋白は合成されており一次的な合成障害は認められなかった.そこで膜ポリペプチドの構造異常の可能性が推測される.このことを解析するためラット肝cDNAライブラリーより70kDaポリペプチドのcDNAのクローニングを行ないその構造を決定した.今後このcDNAを用いて本症患者のペリオキシゾーム膜蛋白の分析を進め,本症の一次的病因を究明する.多田らはcell labellingからZellweger症候群患者由来の線維芽細胞に於て70KOaの膜蛋白の合成が障害されている症例を見出したが、オランダから供与されたZellvegor症候群の線維芽細胞では70KDaの膜蛋白の異常は認められなかった。さらにLeber症の4例を分析し、ペルオキシゾームβ酸化系やペルオキシゾーム膜蛋白や極長鎖脂肪酸(VLCFA)について異質な疾病の集合体であることが示された。次にペルオキシゾーム膜蛋白の70kDaについてCDNAのクローニングを行った。その結果、(1)アミノ末端側にペルオキシゾーム膜を貫通する計6つの部位が想定された。(2)カルボキシル末端側に種々の膜局在物質輸送系構成成分のATP結合部位と相同性の高い部位が2ヵ所認められた。折居らも新しいペルオキシゾーム病の発見に力を入れ、Zellweger-like症候群とペルオキシゾーム3-Ketoacyl-Co A thiolase欠損症を見出した。3-Ketoacyl-Co A thiolaseはWestern,blotで酵素蛋白が存在するにも拘わらず活性がないというもので酵素の成熟異常などが考えられた。さらに1例のみではあるが、末梢血リンパ球の染色体分析で7番染色体長腕近位部の微小欠失が見出された(46XX,del(ク)(q1/,2/q,11,23)。また横田らは免疫電顕を用いて、セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素の抗体を用い、Zellweger症候群患者の肝に於てペルオキシゾームが存在しないので細胞質に金粉子が残存することを示した。橋本らは、CHO変異細胞がZellweger症候群と同一の生化学的異常、すなわち、入れ物としてのペルオキシゾームが存在せずペルオキシゾーム酵素系が細胞質で分解され、膜蛋白はコーストとして細胞質に残存することを示した。
短期型留学プログラムにおける修了研究の教育的意義と有効性

本研究では、日本語・日本文化研修生(以下、日研生)に対する全国アンケート調査、聞き取り調査、及び4大学の日研生に対する3回に亘る日本語技能習得渡測定テスト、並びに日研生担当教員に対する聞き取り調査を実施することを通して1年未満の短期型留学プログラムにおける修了研究の意義と役割について検討した。その結果修了研究は修了要件としての役割を果たしつつ、研究スキル・学術日本語の技能習得の方法、日本に対する理解を深める方法として機能していること、更には、少人数の日研生を受け入れる大学において日研生専用のカリキュラムの部分として個人ニーズを充足する方法としての機能を果たしていることが明らかになった。本年度は以下の三つの方法で研究を進めた。1)全国アンケート調査:7月10月までの期間中に対象学生である日研生の在籍のあった47大学を対象に全国アンケート調査を実施した。130名の回答者から得られたデータを分析し、その結果の一部を学会にて発表した。修了研究の遂行過程で何が困難となるのか、現在の教育システムのどの要素がその克服過程において有効に機能しているのか、修了研究遂行による日本語技能習得効果及び研究能力獲得効果を中心に分析を進めた。2)修了研究による日本語習得効果を測定する合同日本語テストの実施及び研究会の開催:アンケート調査では把握しきれない日本語の語彙、文体、アカデミック・スキルの習得効果を可能な限り具体的に測定する目的で、東京外国語大学、千葉大学及び金沢大学の協力を得て、研究グループを立ち上げ、京都大学を含む4大学に在籍している73名の日研生を対象に合同日本語テストを実施した。技能測定を目的としたこのテストを同一対象者に対して段階別に3回行うものとし、開始時及び1学期終了時という2段階においてテストを実施した。その結果を採点し、データベース化を図った。3)聞き取り調査:本年度は4校を訪問し、担当教員5名及び修了時日研生5名を対象に聞き取り調査を行った。本調査から得られたデータを上述の日本語技能習得効果並びに研究能力獲得効果の分析に生かした。合同テストを通して日研生の実際の技能習得過程の詳細な分析に着手したという点において前進できたが、技能習得と修了研究との具体的な因果関係の解明は容易ではないということが課題として残る。修了研究遂行過程で日研生が困難と感じる点やそれらを克服する上で有効な方法などは実際の日研生教育に応用可能なデータであり、次年度においてより詳細な分析を試みたい。その上で、技能測定テスト結果と照らし合わせながら、総合的分析を進めていきたいと思う。本研究の重要な目的の一つが、日本語能力育成における修了研究の有効性を検証することである。とりわけ、日本語のアカデミック・スキル養成のツールとして修了研究がどのように活用可能か、その際の課題は何か、昨年度に引き続き検証を続けた。その方法として、東京外国語大学、千葉大学及び金沢大学の教員・日研生の協力の下、本学を含めた4大学の合計73名の日研生に対する日本語学習効果を測定するテストの第二弾及び第三弾を実施した。渡日直後の日研生に対する開始時テストは昨年度実施したが、本年度は一学期終了時テスト並びに修了時テストを実施の上、その比較検討を行った。実施したテストを研究資料として、学術語彙の獲得、接続詞・コロケーション等の表現の獲得、研究論文特有な文法の獲得、アカデミック・リーディング、アカデミック・ライティング能力の習得、誤用の傾向、費用の傾向等について分析している。テストは質問形式及び難易度を統一した形で作成した。各学生の3回分のテスト成績を比較することで、習得度合や習得の課題を検討するためである。しかし、大きな問題が浮上した。第二弾のテストである一学期終了時テストの平均的成績が他の二回と比すると、有意に低い。その理由は、難易度の統一が充分図れなかったためか、学生自身の一年間の学習への取り組み方によるものか、それらの相互作用に由来するのか、客観的解明は困難である。上記の課題に対する十分な検討が必要になったことと第一に本テストは元々の計画に含まれたものではなく、研究の遂行上の必要性に応じて実施したものであるため、研究期間を一年間延長した。現在、協力いただいた3大学の教員及びテストの採点を担当した京都大学の非常勤講師の協力も得ながら、多角的な分析を進めている。更に、昨年度実施の全国アンケート調査、現在まで実施してきた全国日研生並びに担当教員への聞き取り調査の分析も進めている。本年度は以下に記す五つの方法を用いつつ、全国における修了研究・課題の実施状況及びその意義や課題の把握を試みた。1.コースガイド分析:文部科学省により刊行されている『日本語・日本文化研修留学生コースガイド』を研究資料としながら、修了研究の実施有無を基準に、全受け入れ大学のカリキュラムを比較検討した。修了研究の実施率、カリキュラムにおけるその位置付け、修了認定の方法並びに能力育成の方法としてのその役割を分析し、論文発表を行った。

2.修了時日研生に対するパイロット調査:平成24年度において実施予定の全国アンケート調査に先だって、2校の修了時日研生を対象にパイロット調査を実施した。パイロット調査から研究遂行の困難点やその過程などが明らかになった。同調査結果の一部をまとめて以下の項目4.の報告書に掲載した。3.修了時日研生及び担当教員に対する聞き取り調査:詳細な分析データを得るため、11大学を訪問し、日研生32名及び担当教員12名に対する聞き取り調査を実施した。日研生に対する調査を通して、研究テーマ選定に至る過程及びその動機、修了研究の遂行過程と日研生としてのその他の学習との関わり、研究遂行上の困難点などを把握することができた。また、担当教員に対する聞き取り調査では、各大学の教育方針・方法・目的・育成しようとしている学生像や修了研究の指導法などが把握できた。4.数名の担当教員を交えた研究会の実施:7大学の日研生担当教員を招聘し、修了研究指導の意義と課題の事例研究会を実施した。参加校の発表を通して、受け入れ日研生数の相違によるカリキュラム編成の違いやカリキュラムにおける修了研究の位置付け・役割の相違、指導法の相違などを把握することが出来た。その上、教育法としての修了研究の意義や指導上の課題に関する議論・検討の有意義な機会となった。事例報告の概要を掲載した報告書を刊行した。本研究は概していえば、1)コースガイド分析、2)修了時日研生に対する全国アンケート調査、3)修了時日研生及び担当教員に対する聞き取り調査、4)三段階から成る日研生に対する4大学合同日本語アカデミックスキル習得測定テストから構成されている。1)のコースガイド分析では日研生を受け入れている大学の71.43%において何らかの研究課題が設定されていること、そのうち62.50%が修了要件となっていること、課題研究を取り入れたカリキュラムでは、その課題を遂行する上で必要とされるアカデミック・スキル及び研究スキル養成を目的とした授業科目が平均的に4.13科目開講され、カリキュラムの重要な一部となっていることが明らかになった(2011年現在)。2)及び3)を通して、83.08%の日研生は1年間の研修の一環として研究論文作成が必要であると認識し、その上、他の短期型プロングラムとの区別化の最大の要素として捉えていることが分かった。更に、修了研究の遂行を通して日本語での研究方法・論文の書き方の習得はもとより、日本社会・日本語学等の特定分野の理解の深化、分析・考察・体系化といった研究能力の習得、文章表現能力・長文作成能力・プレゼンテーション能力といった日本語能力の習得ができたことも窺われた。日本というフィールドを生かすことにより、研究資料に直接アクセスでき、その上、方言の多様性といった研究対象の詳細な把握・新たな発見が可能になり、日本人と直接触れ合い親交を深めつつ、日本の思想・文化に対する理解を深めることができたことも示された。
スピン状態と結合した格子揺らぎ

酸化物中八面体位置を占めるCo^<3+>(3d)^6の中間スピン状態(S=1,以後IS)は、低スピン(S=0,以後LS)、及び高スピン状態(S=2,以後HS)に比べてエネルギーが高く、通常実現することはないと考えられていたが、近年、LaCoO_3では100K近傍から半導体-金属転移の起こる500Kまでの広い温度範囲でIS状態が主たるスピン状態であるという提案がなされている。本研究では、(1)LS-ISスピン転移の動的性質とIS電子状態の軌道状態を明らかにし、(2)LaCoO_3中でIS状態が安定化される原因を探るために、(A)単一ドメインのLaCoO_3単結晶を用いて超音波測定を行い、(B)La_<1-x>Ca_xCoO_3の電子物性を調べた。(A)では、赤外線集中加熱炉で育成した擬立方晶のLaCoO_3単結晶(4つの菱面晶結晶ドメインからなる)の[111]軸方向に圧力を加えて、1500°Cから1300°Cまでstress annealingを行い、単一ドメインの単結晶を得ることに成功した。その試料で菱面晶系[111]軸方向の10MHz縦波超音波測定を行い、100K転移に伴う格子のソフト化を観測した。多ドメイン試料の擬立方晶[111]軸方向の実験結果に比べて、ソフト化の程度が大きく、スピン転移に伴う弾性以上が実際に菱面晶の対称性を持つことがわかった。(B)では、Ca置換により、電気伝導が増大し、低温で強磁性が出現する(低濃度の場合はスピングラス)というSr置換と類似の物性を示すことが判明した。La^<3+>サイトへの2価イオン導入すると、格子体積には関係なくholeの導入によりIS状態が安定すること、Ca^<2+>導入の場合、Sr^<2+>の場合に比べてholeのmobilityが小さいこと、さらに両置換とも、臨界量以上の置換でFermi準位に状態密度の発生することが明らかになった。
ヒトBリンパ腫のspontaneous apoptosisの分子機序の解明

研究代表者はspontaneous apoptosisを起こす特異なヒトバーキット型リンパ腫細胞株HBL-9を樹立した。このspontaneous apoptosisの分子機序を解明するために、主として分子生物学的手法を用いて検討してきた。HBL-9細胞のspontaneousapoptosisはcaspase活性測定、Western blot法およびNorthern blot(ribonuclease protection assay)法等の検討結果からcaspase2、3、7、8の複数のcaspaseが関与してることが明らかにされた。このspontaneous apoptosisはcaspase2、3、7、8に特異的な阻害剤で抑制されなかったが、Z-Asp-CH2-DCBやZ-VAD-FMKのcaspase阻害剤で抑制された。このことはこれらcaspaseの上流に位置するcaspaseの存在が示唆された。HBL-9細胞では、Western blot法でBax、Badの蛋白発現はみられたが、Bcl-2、Bcl-XLの蛋白の発現はみられなかった。Northern blot法ではbcl-XL、bid、bad、baxのmRNAの発現がみられた。Bax、Badの発現はみられたが、caspase9の発現がないことから、Bcl-2ファミリー分子・caspase9によるapoptosis発現機構はないと考えられた。HBL-9細胞におけるNF-kBの活性をelectrophoretic mobility assay(EMSA)で検討したが、NF-kBの活性はみられなかった。このことはHodgkin病のReed-Sternberg(RS)細胞と異なって、NF-kB活性に基づくBcl-XL分子誘導によるapoptosis抑制機構はないと考えられた。NF-kBの不活性にTRAF分子が関与しているかどうかを、Western blot法およびNorthern blot法で検討した。TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4のmRNAの発現はみられたが、蛋白の発現はTRAF2とTRAF3のみにみられた。現在のところHBL-9細胞におけるNF-kB不活性化とTRAF分子の関連は不明である。HBL-9細胞のspontaneousapoptosisはcaspase活性測定、Western blot法およびNorthern blot (ribonuclease protection assay)法等の検討結果からcaspase 2、3、7、8の複数のcaspaseが関与してることが明らかにされた。このspontaneous apoptosisはcaspase 2、3、7、8に特異的な阻害剤で抑制されなかったが、Z-Asp-CH2-DCBやZ-VAD-FMKのcaspase阻害剤で抑制された。HBL-9細胞では、Western blot法でBax、Bad、Bidの蛋白発現はみられたが、Bcl-2、Bcl-XLの蛋白発現はみられなかった。Bax、Badの発現はみられたが、caspase 9の発現がないことから、ミトコンンドリアを介したBcl-2ファミリー分子・caspase 9によるapoptosis発現機構はないと考えられた。HBL-9細胞におけるNF-kBの活性をelectrophoretic mobility assay (EMSA)で検討したが、NF-kBの活性はみられなかった。このことはHodgkin病のReed-Sternberg (RS)細胞と異なって、NF-kB活性に基づくapoptosis抑制機構はないと考えられた。

TRAF 1、TRAF 2、TRAF 3、TRAF 4のmRNAの発現はみられたが、蛋白の発現はTRAF 2とTRAF 3のみにみられた。現在のところHBL-9細胞におけるNF-kB不活性化とTRAF分子の関連は不明である。本研究からの(1)HBL-9細胞のspontaneousapoptosisにはcaspase2、3、7、8等の複数のcaspaseが関与し、さらにそれら上流に位置するcaspaseの存在が示唆された。(2)Bcl-2、Bcl-XL蛋白の欠如、NF-kBの不活性等apoptosis抑制機構の障害がみられた。(3)caspase 9の発現がみれれないことから、ミトコンドリアを介したcaspase 9活性化によるapoptosisはないと考えられた。
ヒト腎癌細胞のiPS化における細胞記憶に着目した新規治療標的分子の探索

26年度では、ヒト腎癌由来iPS細胞を新規に10-20クローン樹立し、初期化をマイクロアレイにより評価した。初期化が確認されたクローンに対して、iPS化前後でDNAメチル化の差異を解析し、ヒトES細胞データとの比較により、万能性を規定する遺伝子群と癌を規定する遺伝子群を決定した。に誘導した癌幹細胞をSCIDマウスへ移植し、増殖能を指標として癌幹細胞と確認された腫瘍を切り出し、癌腫であることを組織学的に確認した。26年度に得られた癌を規定する遺伝子群とメチル化プロファイルを比較し、ヒト腎癌における細胞記憶を規定する遺伝子群を同定した。以上より、4つの新規治療標的遺伝子が同定された。申請者らは文部科学省再生医療の実現化プロジェクト(東大iPS拠点事業)において、種々のヒト細胞からiPS細胞を樹立し、包括的な解析を行ってきた。最近正常細胞から樹立したiPS細胞には、樹立前の細胞記憶が残され、分化誘導能の違いが報告されているが、申請者らは同プロジェクトにおいて、ヒト腎臓細胞ガン株OS-RC2から樹立したiPS細胞にはガン細胞特異的細胞記憶が残され、一定の培養環境下で、再度ガン化する事を突き止めた。iPS細胞に残された細胞記憶とは、細胞の本質を規定する遺伝子と言え、ガンiPS細胞における細胞記憶を司る遺伝子こそ、最も有望なガン治療標的分子と考えられる。本研究においては、ヒト腎癌細胞のiPS化前後のメチル化プロファイル変化から、ヒト腎癌iPS細胞における細胞記憶を担う遺伝子群を同定し、ヒト腎癌に対する新規治療標的分子を絞り込む。ヒトiPS細胞の樹立により、再生医療の臨床応用に期待が集まっているが、iPS技術は再生医療のみならず、多方面への応用が可能である。ヒトiPS細胞にはヒトES細胞とは異なり、樹立の基となる細胞記憶が残されており、例えば血液から樹立したiPS細胞は血液系統へ分化しやすく、細胞記憶のメカニズムとしてDNAメチル化の関与が報告されている。我々は文部科学省再生医療の実現化プロジェクト(東大iPS拠点事業)において、iPS細胞における細胞記憶のメカニズムを解明すべく、様々なヒト細胞からiPS細胞を樹立し、iPS化前後における包括的DNAメチル化解析を行って来た。本研究においては、ヒト腎癌細胞のiPS化前後のメチル化プロファイル変化から細胞記憶を担う遺伝子群を同定し、ヒト腎癌に対する新規治療標的分子を絞り込む事を目的とする。平成27年度では癌幹細胞誘導前後でのDNAメチル化プロファイル解析を行った。新たに腎癌から樹立したiPS細胞においても、OSRC2-iPSと同様の手法を用い、癌幹細胞(Cancer Stem Cell)へと誘導し、SCIDマウスへの移植で癌幹細胞への誘導を確認後、メチル化プロファイルを解析した。以下具体的な方法を記載する。1、2012年に発売された、exosome精製キット(Total Exosome Isolation: Invitrogen)を用い、癌細胞培養上清からexosomeを精製し、精製したexosone処理により、癌由来iPS細胞を癌幹細胞へと誘導する。2、誘導した癌幹細胞をSCIDマウスへ移植し、腫瘍を組織的に検証し、癌種のみDNAを抽出する3、癌幹細胞による腫瘍と確認されたDNAをInfinium解析を行い、26年の結果と比較して、Core, High, Lowに分類される標的遺伝子郡を絞り込む。本年度は専門技術員の採用により、癌細胞のiPS化と機能解析が順調に進んだ。本研究では、ヒト腎癌由来iPS細胞における細胞記憶を担う遺伝子群を同定し、ヒト腎癌治療に有効な、新規治療標的分子を絞り込む。27年度以後では、26年度で樹立したヒト腎癌由来iPS細胞を癌細胞培養上清から精製したexosome処理し、癌幹細胞へ分化誘導した。次に誘導した癌幹細胞をSCIDマウスへ移植し、増殖能を指標として癌幹細胞と確認された腫瘍を切り出し、奇形腫ではなく、癌腫であることを組織学的に確認した。組織学的に癌と確認された腫瘍からDNAを抽出し、26年度に得られた癌を規定する遺伝子群とメチル化プロファイルを比較し、ヒト腎癌における細胞記憶を規定する遺伝子群を同定する。最後に、同定された遺伝子のsiRNA処置や強制発現による、癌に対する作用を検証した。Infinium解析で得られた遺伝子を特異的かつ強制的にOFFあるいはONとすることにより、腎癌細胞の増殖抑制作用、細胞死に対する効果を検証した。1、10種類の腎癌細胞において、強制的ONとすべき遺伝子に関しては、iPS樹立時と同様にPlatE法を用い、レトロウイルスにより強制発現させる。強制的にOFFとすべき遺伝子については、siRNAを用いて遺伝子発現を抑制した。2、1の処置後、細胞増殖、細胞死を評価し、特定した遺伝子群が新たな治療標的となりうるか検証した。以上の検討により、4つの治療標的候補遺伝子が得られた。

初期化が確認されたクローンに対して、iPS化前後でDNAメチル化の差異を解析し、ヒトES細胞データとの比較により、万能性を規定する遺伝子群と癌を規定する遺伝子群を決定した。に誘導した癌幹細胞をSCIDマウスへ移植し、増殖能を指標として癌幹細胞と確認された腫瘍を切り出し、癌腫であることを組織学的に確認した。26年度に得られた癌を規定する遺伝子群とメチル化プロファイルを比較し、ヒト腎癌における細胞記憶を規定する遺伝子群を同定した。以上より、4つの新規治療標的遺伝子が同定された。ヒト腎癌由来iPS細胞の細胞記憶を担う遺伝子群を同定し、新規治療標的分子を絞り込む。ヒト腎癌由来iPS細胞を10-20クローン樹立し、初期化をマイクロアレイにより評価した。初期化されたクローンに対して、iPS化前後でDNAメチル化の差異を解析し、ヒトES細胞データとの比較により、万能性を規定する遺伝子群と癌を規定する遺伝子群を決定した。27年度では、26年度で樹立したヒト腎癌由来iPS細胞を癌細胞培養上清から精製したexosome処理し、癌幹細胞へ分化誘導した。次に誘導した癌幹細胞をSCIDマウスへ移植し、増殖能を指標として癌幹細胞と確認された腫瘍を切り出し、癌腫であることを組織学的に確認した。癌と確認された腫瘍からDNAを抽出し、癌を規定する遺伝子群とメチル化プロファイルを比較し、ヒト腎癌における細胞記憶を規定する遺伝子群を同定した。28年度では、同定された遺伝子のsiRNA処置や強制発現による、癌に対する作用を検証する。再生医療ヒト腎癌由来iPS細胞の包括的遺伝子発現解析を進めて行くが、未分化マーカーの発現確認のみでは初期化評価は不十分であり、包括的遺伝子発現により評価を行う。申請者はiPS拠点事業において、ヒトES細胞(KhES-1,2,3)および京大山中研究室で樹立されたiPS(201B7)が非常に近いマイクロアレイプロファイルを示す事を確認しており、新規に樹立したiPS細胞とこれらの遺伝子発現を比較することにより、初期化を検証する。マイクロアレイ解析は連携研究者小川との共同研究により実施する。iPS細胞の樹立が順調であった為、消耗品購入が予想よりも少なかった為。次年度にはiPS細胞の解析を予定しており、人件費が増大すると思われ、未使用分を充当する。
ビスジアゾ化合物の光分解過程、および発生する活性中間体の構造と反応性に関する研究

特異な光化学反応性を示すことが期待されるα,α'ービスジアゾケトンの分解過程を一般的に理解するために、今年度は過去に報告例のない二種の新しいビスジアゾケトンを合成し、室温溶液中および極低温マトリックス中の反応性を詳細に検討した。七員環骨格に組み込まれたビスジアゾケトンである5,7ービスジアゾジベンゾシクロヘプタジェンー6ーオンは相当するケトンに対する,アルミナに吸着させたフッ化カリウム存在下トシルアジドによるジアゾ移動反応により合成できた。その溶液中の反応性は、従来知られているビスジアゾケトンの反応性とは全く異なり,Wolff転位後生成するジアゾケテン中間体の由来する生成物が得られた。また二個のジアゾ基が非等価な構造を持つ2,4ージスジアゾテトラヒドロナフタレンー1,3ージオンを同様の手法を用いて合成し、ジアゾ基の分解選択性を検討した。含水ベンゼン中で光照射すると二個のジアゾ基が分解した後Wolff転位を経て水とベンゼンが一分子ずつ反応した構造を持つ2ーイソダノン誘導体が25%程度の収率で得られた。生成物の構造から生成機構を推定した結果この化合物は、異なる環境にある2個のジアゾ基のうち縮環した芳香環に近接したジアゾ基が先に分解して生成したものと結論した。極低温マトリックス中では、前者のビスジアゾケトンからは溶液中の反応で想定した反応中間体がさらに光分解を受けて生成したシクロプロペノン誘導体が直接観測された。また後者のビスジアゾケトンについて非等価なジアゾ基の分解過程の直接観測を試みたが、生成するケテンの吸収との重複によりジアゾ基の分解選択性に対する明確な結論を出すことはできなかった。以上の様に、新しい構造を持つ二種類のビスジアゾケトンの反応性を検討することにより、光分解過程に及ぼす骨格の影響が明らかになり、非等価なジアゾ基の分解選択性に関しても興味深い知見を得ることができた。
若年成人女性における起立耐性能への下肢筋力・身体活動度及び性周期の影響

若年女性32人を対象に、臥位から60度立位に受動的に体位を変換させ、10分間静止立位を保持させた時の起立耐性能と大腿最大筋力、最大酸素摂取量及び体格との関係を検討した。胸部血液量の指標である胸部インピーダンスの変化によって、立位時の胸部血液量の減少が著しかった群(減少群)17人・胸部血液量が姿勢変換直後に一旦は減少するが1分以降には回復傾向にあった群(回復群)10人と胸部血液量の変化が軽度だった(軽度群)5人の3群に被験者を分けて解析した。大腿筋力の大きい者の殆どは回復群に分類され、体格と大腿筋力において回復群は他群に比べて大きい傾向にあった。臥位時の血圧には3群間で有意差はなかった。減少群と軽度群では体位変換1分以降の血圧は臥位時より高くなった。しかし、回復群の立位時の血圧は臥位時より低下し、臥位時に対する立位時の%最低血圧、%平均血圧は他群に比べて有意に小さかった。また、大腿筋力は、立位時の%最低血圧、%平均血圧の変化度と負相関があり、最大筋力の大きい者では臥位時より血圧が低下する傾向にあった。以上の結果から、回復群の立位時の血圧変化は、体位変換後1分以内に起きる胸部血液量の変化に依存することが示唆された。すなわち、筋力が大きいと立位時に起こる抗重力筋の収縮によって姿勢変換直後の心臓への静脈還流が増加するが、このことが心肺系受容体を介する血圧調節に影響して、静止立位時の血圧下降の原因になると考えられた。一方、最大酸素摂取量は立位時の血圧変化と関連は認められなかった。若年女性15人を対象に、10分間の起立負荷(傾斜60度)を行い、起立耐性能と大腿筋力、体格との関係を検討した。起立耐性能は負荷前(臥位)からの胸部インピーダンス・血圧・心拍数の変化より評価した。起立負荷時の胸部血液量の指標である胸部インピーダンスと血圧の変化によって、胸部血液量の減少が著しく、且つ血圧が増加した群(血圧上昇群と略す)5人、胸部血液量の減少が著しく、且つ血圧の減少が著明だった群(血圧下降群と略す)3人と胸部血液量の変化が軽度だった(軽度群と略す)7人の3群に分けて解析した。血圧上昇群では起立直後から血圧は平均で約2mmHg上昇し、ほぼそのままの値で10分まで推移した。血圧下降群では起立直後から2分後に約6mmHg下降したが、5分後には回復した。軽度群では起立直後に約2mmHg下降したが、2分後には回復した。3群間で体格(身長・体重・BMI)には差がなかった。大腿四頭筋の最大筋力は軽度群が他の2群に比べて有意に小さかった。筋持久力は血圧下降群が優れている傾向があった。臥位時の循環特性では心拍数、最高血圧、最低血圧、平均血圧には3群間で差がなかった。起立負荷時の心拍数は3群共に、負荷直後から2分まで増加し、以後10分まで増加したままで推移した。増加度は血圧下降群、血圧上昇群、軽度群の順であった。また起立負荷によってR-R間隔のスペクトル解析によるLF/HF比は上昇したが、3群間で差はなかった。以上の結果から、起立負荷による胸部から下肢への血液移動は大腿最大筋力に関連することが示唆された。しかし、起立負荷時の血圧調節には、筋力のみでなく筋線維タイプが関連している可能性が示された。

若年女性32人を対象に、臥位から立位に受動的に姿勢変換させ、10分間静止立位を保持させた時の起立耐性能と大腿最大筋力、最大酸素摂取量及び体格との関係を検討した。起立耐性能は血圧・心拍数の臥位時に対する立位時の%変化によって評価した。起立性低血圧は起立時の上半身から下半身への血液移動によって惹起される。そこで、胸部血液量の指標である胸部インピーダンスの変化によって、立位時の胸部血液量の減少が著しかった群(減少群)17人、胸部血液量が姿勢変換直後に一旦は減少するが1分以降には回復傾向にあった群(回復群)10人と胸部血液量の変化が軽度だった(軽度群)5人の3群に被験者を分けて解析した。体格と大腿筋力において回復群は他群に比べて大きい傾向にあった。臥位時の血圧には3群間で有意差はなかった。立位時では、回復群の最低血圧は他群に比べて変化度が有意に小さく臥位時より低下した。平均血圧も同様な傾向があった。一方、大腿筋力は、立位時の最低血圧、平均血圧の変化度と負相関があり、最大筋力の大きい者では臥位時より血圧が低下する傾向にあった。最大酸素摂取量は立位時の血圧変化と関連はなかった。以上の結果から、10分間の起立負荷時の血圧変化は、姿勢変換後1分以内に起きる胸部血液量の変化に依存することが示唆された。大腿筋力の大きい者の殆どは回復群に分類され、姿勢変換直後の胸部への血液還流に筋力が大きいことが有利に働くことが示唆された。しかし、静止立位を保持した場合には、このことが低圧受容体を介する血圧調節に影響して、静止立位時の血圧下降の原因になると考えられた。今後、筋力の影響が強い能動的、且つ短時間の姿勢変換における血圧調節と大腿筋力の関係を検討する予定である。また、大腿筋力が小さい者の中にも大きい者と同様の変化を起こす者がいたので、姿勢変換時の胸部血液量変化に影響する要因を更に追求する必要がある。
キリスト教民主主義と西ヨーロッパ政党制

平成17年度は3回の共同研究会を実施できた。すなわち、平成17年6月26日(名古屋大)、11月26日(北海学園大)、平成18年3月10日(東京大)の3回である。これらの共同研究会で各自が平素取り組んでいる研究成果を報告し、熱のこもった議論を展開した。個人別に見て行くと、土倉莞爾は論文「ベルギー・キリスト教民主主義試論」(『関西大学法学論集』55巻3号)において、キリスト教民主主義のベルギー的形態について考察を進めた。また、共訳作品として、翻訳「講演:パスカル・ペリノー『2004年EU議会選挙におけるヨーロッパ懐疑主義の伸張について』」(共訳大久保朝憲・友谷知己)(『関西大学法学論集』55巻1号)と翻訳「エマヌエル・ヘラールスティヴァン・ファン・ヘッケ『ヨーロッパのキリスト教民主主義-冷戦終了以降の下降と上昇-』」(共訳古田雅雄)(『関西大学法学論集』55巻3号)を刊行した。共同研究会では「ベルギー・キリスト教民主主義試論」を報告した。田口晃は、「スイス・キリスト教民主主義の衰退」と「書評:村松恵二『カトリック政治思想とファシズム』(創文社、2006年)」をさきの共同研究会で報告した。野田昌吾は「「危機・選択・変化」の政治学-『危機・選択・変化』再訪-」(『法学雑誌』52巻1号)「グローバル化のなかのヨーロッパ協調政治」(高橋進他編『ヨーロッパ・デモクラシーの新世紀』、早稲田大学出版部、所収)を刊行した。共同研究会では「2005年ドイツ連邦議会選挙について」を報告した。各自、それぞれの研究は多様性をはらみながらも、キリスト教民主主義と西ヨーロッパ政党制を軸として、研究の深化が見られる。平成16年度は3回の共同研究会を実施できた。すなわち、6月5日(東大)、10月3日(北大)、平成17年1月29日(千葉大)の3回である。これらの研究会で各自が平素取り組んでいる研究成果を報告して熱のこもった討議を展開した。それに加えて、2004年度日本政治学会(札幌大学)の分科会D「宗教と政治-キリスト教の場合」(10月2日)において、研究代表者土倉莞爾が司会して、研究分担者田口晃が「キリスト教民主主義の『誕生』-キリスト教社会党からオーストリア国民党へ-」、研究分担者野田昌吾が「困難のなかの『相対的成功』-ドイツ・キリスト教民主同盟(CDU)-」の報告をした。土倉莞爾は、「2001-2002年フランス市長選挙・大統領選挙・総選挙」『関西大学法学論集』(第54巻3号)において、フランスにおけるキリスト教民主主義の今日的形態であるUDFの分析を行った。また、「書評:中山洋平著『戦後フランス政治の実験』(東京大学出版会)」

『関西大学法学論集』(第54巻4号)において、第二次世界大戦後のMRPについて、中山洋平のMRP論に対比して、現時点のMRP研究に論及した。田口晃は、ジャック・ル・リデー著『中欧論-帝国からEUへ』(白水社)の翻訳と解説において、ドイツを中心とする中央ヨーロッパのキリスト教民主主義について歴史的考察を深めた。野田昌吾は、「混迷からの脱出は見えてきたか?-2002年ドイツ総選挙とキリスト教民主・社会同盟(CDU/CSU)-」『法学雑誌』(第51巻1号)において、2002年ドイツ総選挙の時点でのCDU/CSUの分析・考察を深めた。また、「(書評)F・ベッシュ『アデナウアーCDU』」『法学雑誌』(第51巻1号)でCDUの全体像を把握する考究を進めた。なお、平成16年8月、当初、研究分担者であった東京大学大学院法学政治学研究科中山洋平助教授が在外研究に出発したため、中山洋平助教授を研究分担者から外したことをお断りする。平成17年度は3回の共同研究会を実施できた。すなわち、平成17年6月26日(名古屋大)、11月26日(北海学園大)、平成18年3月10日(東京大)の3回である。これらの共同研究会で各自が平素取り組んでいる研究成果を報告し、熱のこもった議論を展開した。個人別に見て行くと、土倉莞爾は論文「ベルギー・キリスト教民主主義試論」(『関西大学法学論集』55巻3号)において、キリスト教民主主義のベルギー的形態について考察を進めた。また、共訳作品として、翻訳「講演:パスカル・ペリノー『2004年EU議会選挙におけるヨーロッパ懐疑主義の伸張について』」(共訳大久保朝憲・友谷知己)(『関西大学法学論集』55巻1号)と翻訳「エマヌエル・ヘラールスティヴァン・ファン・ヘッケ『ヨーロッパのキリスト教民主主義-冷戦終了以降の下降と上昇-』」(共訳古田雅雄)(『関西大学法学論集』55巻3号)を刊行した。共同研究会では「ベルギー・キリスト教民主主義試論」を報告した。田口晃は、「スイス・キリスト教民主主義の衰退」と「書評:村松恵二『カトリック政治思想とファシズム』(創文社、2006年)」をさきの共同研究会で報告した。野田昌吾は「「危機・選択・変化」の政治学-『危機・選択・変化』再訪-」(『法学雑誌』52巻1号)「グローバル化のなかのヨーロッパ協調政治」(高橋進他編『ヨーロッパ・デモクラシーの新世紀』、早稲田大学出版部、所収)を刊行した。共同研究会では「2005年ドイツ連邦議会選挙について」を報告した。各自、それぞれの研究は多様性をはらみながらも、キリスト教民主主義と西ヨーロッパ政党制を軸として、研究の深化が見られると言えよう。
大腸癌における抗癌剤耐性に関与する薬剤トランスポーターの役割の解明

SLCファミリーは細胞膜に存在するトランスポーターであり、近年癌などの悪性腫瘍においてその悪性化に関与する働きがあることが注目されている。細胞膜に存在するもう一つのトランスポーターであるABCファミリーは研究がすすんでおり、とくにMDR1遺伝子は種々の癌で発現が亢進しており、抗癌剤耐性に関与することが知られている。そのため本研究では、SLCファミリー特に、SLC37A1の抗癌剤の耐性をもたらす機序の解明と癌における発現を検討し、さらに、耐性克服をふまえた治療標的としての有用性についても検討する。具体的には1大腸癌切除検体でのSLC37A1の発現を確認し、臨床病理学的因子との関連解析をおこなうなかでバイオマーカーとしての有用性を検討する。2大腸癌細胞株を用いてSLC37A1の機能解析、特に細胞増殖や浸潤能といった癌の発生・進展に関与する機能の検討を行う。3薬剤耐性を乗り越える治療標的としての可能性を探求する。SLC37A1発現を大腸癌切除検体にて検討し、非癌部に比べて癌部で発現が上昇していることを見いだし、大腸癌での発現亢進例は予後が不良であることを見いだした。SLC37A1の大腸癌における発現をmRNAと蛋白の両面からより大規模症例を用いて検討する。大腸癌切除検体からmRNAを抽出し、リアルタイムPCR法にて発現を検討する。FFPE切片を用いた免疫染色にて蛋白発現を検討し、リンパ侵襲・脈管侵襲・遠隔転移といった臨床病理学的因子との相関を検討する。また、予後との相関も検討する。また、SLC37A1の大腸癌での機能は不明なため、大腸癌細胞株を用いての機能解析実験をおこなう。細胞株にてSLC37A1の強制発現ないし抑制をおこない、SLC37A1の発現変動によりもたらされる細胞増殖能や浸潤能の変化、細胞形態の変化をMTTアッセイやコロニーフォーメーションアッセイ等をもちいて観察し、SLC37A1の癌細胞に対する影響を検討する。さらに、SLC37A1が直接関与する因子の同定をもたらす多層的解析の準備を進める。SLC37A1を強制発現ないし抑制した細胞株を用いてマイクロアレイ等による遺伝子発現解析、マイクロRNA解析、メチル化解析等をおこなう。これにより、SLC37A1発現変動に伴う分子生物学的変動を全体的にとらえることができ、その意義を明らかにすることができる。mRNAはエンリッチメント解析(DAVIDやGSEA解析)を用いる予定であるが、アレイ実験同様に外部委託するなど資源と時間の有効活用を心がけることとする。主に手術検体組織と臨床病理学的因子の収集をおこなったために、使用額が少なかった。当初の予定通り物品費の多くはmRNA、免疫染色用の備品の購入に用いられる予定である。また、情報収集や解析結果を学会発表する費用や論文として公表する費用に充てられる。
コルソン系合金の疲労試験におけるき裂発生と進展挙動

Cu-Ni-Si合金(コルソン系合金)はNi_2Siの分散による析出硬化型合金でありBe銅には及ばないものの,安価で強度と伝導率の組み合わせ特性が良好であることから,現在も開発が活発に進められている.機械電気電子部品の設計において,材料の強度特性を把握することは重要であるため, Cu-Ni-Si合金においても組織や引張特性に関する報告は多い.しかしながら,疲労特性に関する報告は殆ど無く,それらに関して調査することは有益であると考えられる.疲労強度の評価や耐疲労特性の向上のためには,き裂の発生箇所と発生機構,およびき裂進展機構を明らかにする必要があるが,この種の研究はあまりなされておらず不明な点が多い.本研究では, Cu-Ni-Si合金の高サイクル疲労試験を行い,き裂の発生と進展挙動に注目してCu-Ni-Si合金の疲労強度特性を調査することを目的としている.実験は,既存の小野式回転曲げ疲労試験機を使用して実施した.試験片は丸棒試験片を使用し,試験片表面の疲労被害の観察とき裂長さの測定は,所定の繰り返し数ごとに採取したレプリカに真空中で金を蒸着させたものを,金属顕微鏡を用いて測定した.その結果, Cu-Ni-Si合金のN=10^7に対する疲労強度は,純銅と比較して約2倍に増大していることがわかった.レプリカ法により,き裂の発生位置は粒界部から発生しており,隣接する結晶粒界に沿って進展している状況が確認できた.粒界をSEMで観察したところ,結晶粒界に析出物の存在しない領域が存在することですべり抵抗が低下することや,数十nm程度のSi_2Niが析出していることでひずみが集中することが,き裂発生に影響を及ぼすことなど幾つかの疲労特性について明らかになった.Cu-Ni-Si合金(コルソン系合金)はNi_2Siの分散による析出硬化型合金でありBe銅には及ばないものの,安価で強度と伝導率の組み合わせ特性が良好であることから,現在も開発が活発に進められている.機械電気電子部品の設計において,材料の強度特性を把握することは重要であるため, Cu-Ni-Si合金においても組織や引張特性に関する報告は多い.しかしながら,疲労特性に関する報告は殆ど無く,それらに関して調査することは有益であると考えられる.疲労強度の評価や耐疲労特性の向上のためには,き裂の発生箇所と発生機構,およびき裂進展機構を明らかにする必要があるが,この種の研究はあまりなされておらず不明な点が多い.本研究では, Cu-Ni-Si合金の高サイクル疲労試験を行い,き裂の発生と進展挙動に注目してCu-Ni-Si合金の疲労強度特性を調査することを目的としている.実験は,既存の小野式回転曲げ疲労試験機を使用して実施した.試験片は丸棒試験片を使用し,試験片表面の疲労被害の観察とき裂長さの測定は,所定の繰り返し数ごとに採取したレプリカに真空中で金を蒸着させたものを,金属顕微鏡を用いて測定した.その結果, Cu-Ni-Si合金のN=10^7に対する疲労強度は,純銅と比較して約2倍に増大していることがわかった.レプリカ法により,き裂の発生位置は粒界部から発生しており,隣接する結晶粒界に沿って進展している状況が確認できた.粒界をSEMで観察したところ,結晶粒界に析出物の存在しない領域が存在することですべり抵抗が低下することや,数十nm程度のSi_2Niが析出していることでひずみが集中することが,き裂発生に影響を及ぼすことなど幾つかの疲労特性について明らかになった.