hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極限的環境に生育する珪藻種の形態・分子および物質レベルにおける分類学的研究

主に強酸性水域に生育するPinnularia acidojaponicaを19地点から採取し、分子配列に基づく同一種性を解析した。いずれの個体群もわずかに異なる形態を示すものであった。個体群間に認められた塩基置換の総数はSSU rDNA,rbcL, ITSともに07程度のものは、形態計測値に基づく主成分分析のクラスターと一致するものであった。しかし、置換数がより多いものは異なるクラスターとなった。また、P. acidojaponicaの被殻よりsilaffin様物質の抽出をおこなうことができた。北海道2カ所、東北地方3カ所、関東地方6カ所、中部地方3カ所、九州地方3カ所の強酸性温泉を主とする水域からPinnulariaを採集し単離培養し計21クローンを得た。解析の結果,これらの個体群は,P.acidojaponica, P.valdetolerans,およびP.sp.の3つのクレードに分けられた。この系統関係は,形態的特徴および生育地の別により支持されるものであった。これらのDNA塩基配列を18SrDNA、rbclおよびITS領域において調べ、クローン間の類似性を比較した。最初に登別温泉から採集したP.acidojaponica3クローン間でDNA塩基配列間の相違を調べたところ、調査したどの領域においても相違は全く見られなかった。次に他所産のクローン問で比較をおこなった結果、P.acidojaponicaと同定される14個体群は単系統群の中で緊密な系統関係にあることが示された。これらの個体群間で見られるわずかな形態的差異は,地理的隔離により生じた多様性の表れと考えられた。P.negoroiおよびP.paralange-bertalotiiは,恐山の強酸性水域から報告された種である。これら両種と同地から単離した、P.acidojaponicaの塩基配列を比較した結果,3つのDNA領域で最大1塩基の違いしか見られなかった。また,SEM観察から,前2種が、P.acidojaponicaに特有のshort segmental bandを持つことも明らかになった。さらに、各地点から得た個体群で200以上の殻を用い、数量的形質による分析のための計測を開始した。大涌谷産の、P.acidojaponicaを大量培養し、殻中に含有される物質の抽出を試みた。本種は粘質多糖を細胞外に分泌するため、電気泳動の結果があまり芳しくなかったが、方法の改善により明瞭なバンドを得る見通しが立った。北海道(カムイワッカ湯、川湯温泉)、東北(蒸ノ湯、泥湯、蔵土御釜)、九州(塚原温泉、別府温泉)など強酸性温泉から珪藻試料を採集し単離培養を行った。これらの18SrDNA、rbcL、ITS1、ITS2の塩基配列を解析し、系統解析を行った。また、morphometricな方法にて、各地点から100個体群を計測し主成分分析をおこない、それぞれの個体群の形態的特徴の把握、および空間座標における分布を解析をした。また、米国よりPinnularia acidojaponica類似種のタイプ標本を取り寄せ、合わせて形態解析を行った。平成18年度に実施した研究結果と合わせると、Pinnularia acicojaponicaは18SrDNAを例にとれば、殻個体群間で最大で08塩基の差異が認められた。一方、同じ極限的環境であってもP. valdetoleransや九州の硫黄谷温泉から得た個体群とは17塩基以上の差異が認められた。これらの個体群の形態的差異はわずかなものであり、その相違を客観的に示すことは従来の方法では困難であったが、主成分分析を行うことで、P. acidojaponicaは個体群間でギャップを伴うクラスターが認められないことが明らかとなった。これに対し、硫黄谷温泉や米国から得た個体群とはクラスター間に明瞭なギャップが認められた。人為的に容易に生殖を行わせることが困難な珪藻種において、個体群間における分子レベルの相違と形態クラスターとの関係をある程度把握できたことは意義があり、本結果は今後の珪藻の分布と種分化の研究において重要性をもつものと思われる。また、大涌谷産の個体群を用いて大量培養系を確立し、被殻内から物質を抽出することができた。精製には問題点がなお含まれるものの、Melosiraとは異なり、silaffin様タンパク質のバンドを認めることができた。(1)東北地方(福島県、宮城県、秋田県内の温泉)、中部地方(長野県内および富山県内の鉱泉および温泉)、九州(雲仙、別府)などの強酸性温泉および、それらに由来する河川から珪藻の採集をおこない単離培養を行った。(2)この試料を用い、光学顕微鏡により殻の形態変異を観察し、昨年度までに得た結果と合わせ主成分分析等の多変量解析により各個体群間を形態的特徴でクラスター化した。その結果、硫黄谷温泉、蒸の湯、アイオワ産の個体群は、他の個体群とはギャップをもって離れるクラスターを形成することがわかった。

(3)これらの個体群には他の産地から得られた通常のPinnularia acidojaponicaに見られる特徴的な形質であるshort segmental bandsが存在しないことが明らかとなった。(4) SSU rDNA、ITS1ITS2領域、rbcLの塩基配列をダイレクトシーケンシングにより解析したところ、硫黄谷産の個体群は他の産地のPinnularia acidojaponicaおよびP. valdetoleransと比べ、明らかに相違する塩基は入れる箇所が多いことがわかった。さらに、恐山産の形態的にP. acidojaponicaとは明らかに異なるP. negoroiiおよびP. paralange-bertalotiiの塩基配列は、P. acidojaponicaと全く同一あるいは、1塩基のみ相違していることが明らかになった。(5) P. acidojaponicaのタイプロカリティである大涌谷産acidojaponicaの大量培養に成功し、被殻からシラフィン様物質を中秋津することができた。また、この抽出物により珪酸の沈殿実験に成功した。
乳腺幹細胞への高効率なダイレクトリプログラミング因子の同定

レポーターマウスの乳腺上皮細胞(MEC)の不死化に成功しスクリーニングが効率化した。当初期待していた115個の遺伝子には活性がなく、より大きな遺伝子セットを評価する必要があった。そこでアノテーションされていないnon-coding RNAなどを含む遺伝子セットを大量に評価可能な実験系としてトランスポゾンを用いた遺伝子発現・同定技術を考案した。開発したベクターをレポーター細胞に導入し、4つの陽性クローンを得ることに成功した。その内1クローンから候補遺伝子が同定され、さらに解析を進めているところである。また、トラップ法の技術を応用し、幹細胞化遺伝子の機能評価のための各種技術を構築した。a)我々の開発した乳腺幹細胞の維持培養法を用いて、幹細胞をレポートすることのできるマウスの乳腺上皮細胞(MEC)の各分画を培養したところ、乳腺幹細胞と思われるEGFP(+)の細胞が検出される頻度が、分画細胞の混合の違いによって差がみられた。この発見から、乳腺上皮組織のある種の細胞が、別の細胞が自然に脱分化へ向かう能力を抑制するとの仮説を立てることができ、前者細胞の脱分化抑制因子の存在の可能性を世界で初めて検証するlineage tracing法を用いたin vivo解析に着手するきっかけが得られた。このような因子が同定できればその機能を阻害することで高効率な脱分化が可能となることが期待される。b)既に精製済みの脱分化誘導候補遺伝子の発現ベクターを遺伝子1個ずつ上記レポーターマウスから回収したMECに導入し、乳腺幹細胞の維持培養を行って約2週間の観察を行ったところ、僅かではあるがレポーターであるEGFPの発現の差が認められる遺伝子を2個同定することができた。この細胞は培養ウェル上の1%未満なため、FACSなどの分離は収率上困難であった。一方、ウェル上の全ての細胞をcleared fat-padへ移植しても、乳腺の再構築能が著しく向上することはなかった。a)の知見から推測すると幹細胞以外の細胞が脱分化に抑制的に働いてしまったことも十分考えられるが、再現性を含めてさらに検証の必要がある。c)幹細胞レポーター細胞のEGFP(-)とEGFP(+)のRNAを回収し、NGS解析を行うことでEGFP(+)に特異的に高発現する遺伝子の候補を新たに数個同定した。これらが幹細胞性を正に付与、または幹細胞状態を維持させる活性を有する可能性が考えられた。レポーター細胞を用いて強制発現による活性の確認を行うためにcDNAをクローニングできたものに対して発現ベクターの作製を行った。レポーターマウスの繁殖性の問題によってドナーマウスから細胞を一度に大量に回収することが難しい上、特殊な培養法での検討となるため、113遺伝子の解析を再現性も含め1つ1つ行うのにそれだけで時間を要した。また、iPS化を行って判明したEGFPの発現レベルから比較すると極めて高い活性のあるものが存在せず、僅かなEGFPの発現を示すものを顕微鏡観察下で培養ウェル上をくまなく探す必要があったため、これに多大な時間を要した。また、in vivoの解析は乳腺の再構築能が判別できるまで、2ヶ月を要し、機能性を判断する乳汁産生機能を調べるまでにさらに少なくとも1ヶ月を要する。a)スクリーニングに用いるレポーターマウスの乳腺上皮細胞(MEC)を不死化することに成功し、毎回primary培養することなく大量のドナー細胞を用意することができるようになり、スクリーニング作業が高効率に行えるようになった。b)文献情報や各種データベースから任意に選別された脱分化誘導候補遺伝子115個から弱くレポーター発現を呈した2遺伝子は、その後のin vitroおよびin vivoの解析・検証から脱分化活性を有していないと判断された。また、前年度、幹細胞性レポーター細胞のレポーター蛋白質であるEGFPの陽性細胞と陰性細胞のRNAを回収し、NGS解析を行うことでEGFP陽性細胞に特異的に高発現すると思われる遺伝子候補を同定した。これが幹細胞性を正に付与、または幹細胞状態を維持させる活性を有する可能性が十分考えられたが、強制発現による幹細胞化活性が少なくともレポーター細胞で観察されなかった。c)まだ試験的な段階であるが、ゲノム上の遺伝子をランダムにトラップさせてdoxycycline(dox)依存的に強制発現させる手法を開発した。このベクター系をレポーター細胞に導入して一方の幹細胞性レポーターであるpuromycin耐性によって選択を行ったところ、耐性を示し、かつもう一方のレポーターであるEGFPもdox依存的に陽性な独立クローンを4クローン得ることができた。このうち、dox非依存的なもう1クローンはレポーターをトラップしたものであった。これらの結果から今回開発した遺伝子トラップ技術はゲノム上の広い範囲の極めて多くの遺伝子から興味のある対象の遺伝子を簡便にスクリーニング可能であると考えられ、本脱分化因子のスクリーニングにおいても今後非常に有効なツールになると考えられる。MECを不死化できたことでこれまで著しい手間で律速であったMECの準備を短縮することができた。また、脱分化因子の同定には至っていないものの、遺伝子トラップ技術を開発することによってこれまでと比べ推定約2000倍の規模でしかも導入毎に異なるレパートリーのスクリーニングを行うことができるようになった。この技術を用いて目標(脱分化因子の同定)の達成を加速度的に遂行できるものと考えられる。さらには遺伝子が同定できていないものの、このトラップ技術を用いて実際レポーター細胞が陽性となるクローンが4つ得られている。これらから昨年度の3.やや遅れている、よりも、高く評価した。

当初期待していた115個の遺伝子には活性がなく、より大きな遺伝子セットを評価する必要があった。そこでアノテーションされていないnon-coding RNAなどを含む遺伝子セットを大量に評価可能な実験系としてトランスポゾンを用いた遺伝子発現・同定技術を考案した。開発したベクターをレポーター細胞に導入し、4つの陽性クローンを得ることに成功した。その内1クローンから候補遺伝子が同定され、さらに解析を進めているところである。また、トラップ法の技術を応用し、幹細胞化遺伝子の機能評価のための各種技術を構築した。スクリーニングに用いるレポーターマウスの乳腺上皮細胞(MEC)を不死化させたことでprimary細胞の回収作業を経ずに大量のレポーター細胞を用意することができるようになった。これによりスクリーニング作業が高効率化した。しかしながら、当初期待していた文献情報や各種データベースから選別された脱分化誘導候補遺伝子115個は脱分化能力の活性が無いことが明らかとなった。そこで、non-coding RNAのような遺伝子を含むより大きな遺伝子セットを評価の対象にすることのできるトラップ法によるスクリーニングを考案した。これはトランスポゾンのもつ任意のDNA断片をゲノムにランダムに挿入するという性質を利用したもので、in silico解析からは認証されない遺伝子を含む遺伝子セットを、ライブラリーの作製を経ず、毎回異なるレパートリーで大量に発現させ評価できる点で極めて有用であると考えられた。開発したベクターをレポーター細胞に導入してスクリーニングを行ったところ、陽性クローンが4つ得られた。さらに1クローンから候補遺伝子を同定することに成功した。この遺伝子は幹細胞化の報告が無く、さらに解析を進めている。また、幹細胞化遺伝子スクリーニングに用いるベクターの開発の他にも以下のようなトランスポゾンベクター系を構築した1プロモータートラップ法によるレポーター細胞作製技術、2転写因子によって誘導される遺伝子の同定技術、3幹細胞など遺伝子導入が困難な細胞に対する過剰発現技術、4蛍光蛋白質融合による局在マーカーの同定技術、5蛍光蛋白質再構成法による結合因子探索技術、6マウスでの遺伝子導入乳腺の再構築技術、である。これらの技術開発によって、ダイレクトリプログラミング因子候補遺伝子のin vitro/in vivo機能解析を優位に進めることが可能となった。弱くではあるが活性の同定された2遺伝子についてはさらに再現性を含め、乳腺再構築能を付与できるかどうかをin vivoで検証する。また、高い活性を与える因子(遺伝子)が未だに見つかってないが、現在考えられる仮説として、a)複数の遺伝子が必要である可能性、b)抑制因子が阻害している可能性、c)現在の遺伝子ライブラリの中には因子が含まれていない可能性、などが考えられる。それらに対し、a)組み合わせによる共導入を行う。
潜在看護職者の在宅ワークと連携する遠隔健康相談システムの開発と検証

高精度TV会議システムを活用し、大震災で被災した宮古、気仙沼、大船渡、石巻を含む全国9か所の調剤薬局に送信機器を、大学に受信機器を設置し、実務経験10年以上の看護職者を相談員として遠隔健康相談を行った。相談の内容は血圧、体重コントロールや食事、育児、皮膚のトラブルおよび糖尿病の自己管理など多様であった。遠隔健康相談員の確保は容易でなかった。健康相談では個人情報保護が重要となるため、新たなクラウドを活用し、他者がアクセスできない状況で、潜在看護職者の協力を得て、在宅での受信時にiPadを活用し、問診、視診が実施可能か検証を行った。iPadは健康相談には十分活用可能であることが明らかとなった。大学の研究室に設置した高精度TV会議装置を使用した遠隔健康相談を継続的に展開するとともに、潜在看護職者の在宅ワークを可能とするシステム開発を行った。在宅ワークにおける時間管理および各種機器の取り扱いとトラブル時の対応などの課題が明らかとなった。また、画像の鮮度に応じた相談の限界も明らかとなった。在宅ワークの試行の結果、通常の相談内容には十分対応できるため、今後は潜在看護職者の人材確保をさらに進め、在宅ワークを中心とした遠隔相談システムの開発を検証する予定である。さらに、大学の相談室との連携方法について、機器の管理と相談担当者の労務管理などの課題が明らかとなった。相談内容の分析の結果、年代や性別、相談内容等は多様であり、相談担当者には幅広い知識と様々な相談内容に対応できる経験およびわかりやすい回答を提供できる能力が求められていた。相談希望者は調剤薬局に設置されたブースから相談を発信するため、薬剤に関連した質問も多くみられ、薬剤師との連携の必要性が明らかとなった。相談希望者からは受診時に処方された薬剤に関する質問もみられるため、看護職者が対応可能な服薬中の日常生活上の留意点の検討、および薬剤師へ照会すべき内容について更なる検証が必要である。現状分析の結果、潜在看護職者である相談担当者の受診勧奨に特に問題はみられなかったが、薬剤に関する相談マニュアルおよびプロトコール開発の必要性が明らかとなった。大学の研究室に設置した高精度TV会議装置を用い遠隔健康相談を継続的に展開するとともに、iPadを使用した潜在看護職者の在宅ワークを可能とするシステム開発と検証を行った。相談者および相談に対応する看護職者双方がiPadを使用した場合の、各種機器の取り扱いとトラブル時の対応などの課題が明らかとなった。看護職者は在宅ワークの利点を、特に通勤時間が不要であること、および私的な時間をより効果的に活用できることをあげ、不都合さは機器トラブル時の対応と答えた。相談者がiPadを使用した場合、音声は平均4秒程度のタイムラグが、さらに画像のタイムラグは最大60秒以上であった。また、画像解像度も通信状況の不安定さにより、相談員が視診を行うには困難な状況も時折見られ、高齢の相談者からは画像は不要であるとの意見もあった。高齢の相談者はタッチパネルの操作は比較的容易に対応可能であったが、上肢の関節痛などがある場合、小さな画面操作には対応できない場合もあった。また、家族がスマートフォンを使用している場合と未使用の場合では、iPadを使用する際の困難さにおいて相違がみられた。看護職者はiPad操作は容易に習得でき、通信障害発生時以外は、設定型機器と同様に相談業務を実施できた。遠隔健康相談時は、安定した通信状況の確保が重要であるを再確認した。なお、薬剤に関する相談に関し、看護職者と薬剤師が有効に連携し効果的に対応するには、3者が意見交換できるディスプレイの大きさが必要であり、日常的な連携体制を構築する必要性が明らかとなった。大学の研究室に設置した高精度TV会議装置を用い、全国9か所のドラックストアの相談室と接続し、遠隔健康相談を継続的に展開するとともに、iPadを使用した潜在看護職者の在宅ワークによる遠隔健康相談を実施した。在宅で相談を受信する看護職者は機器トラブル時の対応の困難さ以外は、通勤時間が不要な在宅ワークの利便性は高いと再評価した。遠隔健康相談における育児に関連する相談内容の分析を行った。主な相談内容は、アトピーやアレルギーなどの皮膚トラブルが36%、おやつの与え方などの栄養が20%、下痢8%、嘔吐8%、虫歯などの歯科領域が4%、および言語の発達などであった。視診で乳幼児や小児の皮膚の状態や表情を判断できること、さらに、相談を担当した看護職者が母親や養育者の表情を観察しながら育児不安や困難感の軽減につながったか、を判断できることなどが、本システムの利点として確認できた。大学に設置した機器に比較し、在宅ワークで使用したiPadは画面が小さいため、健康や疾病等に関連するインターネット情報を相談者と共有することができず、相談者の健康情報リテラシーの向上に寄与することは難しいと考えられた。

また、在宅ワークでは電波環境の影響と思われる画像の乱れが時折みられ、相談の遂行に支障がでることもあったため、電波環境の安定性の維持が課題である。さらに、相談を担当する潜在看護職者をリクルートしたが、安定的に人材を確保することは容易ではなく、在宅ワークの維持および推進にはインターネット環境の整備と人材の登録等のシステムの構築が必要と考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。看護管理学26年度が最終年度であるため、記入しない。遠隔健康相談システムと在宅ワークシステムの接続に関し時間を要したため、在宅ワークの試行段階が当初の計画より延長した。接続に関する諸問題は順次解決しているため、今後は順調に進展する予定である。遠隔健康相談件数が予定より少なく、薬剤師との連携事例も含め実績数を増やす必要がある。施設配置型の遠隔健康相談システムから在宅ワークを中心とした遠隔健康相談システムの開発を進める。在宅ワークを行う潜在看護職者の人員確保と、相談件数の多い薬剤に関し、薬剤師との連携に関する課題をより探求する。施設設置型の遠隔健康相談機器を使用した場合とiPadを使用した場合の相談への対応において、利便さと不便さを相談員から聞き取り調査を行う。潜在看護職者が在宅ワークを遂行するための看護管理上の課題を明確にし、在宅ワークによる遠隔健康相談件数を増加させるための方策の検証を行う。高精度TV会議システムを設置している北海道大学の研究室が建物改修工事のため、一時的に遠隔相談が不可能となったため。現在は当該研究室の改修工事が終了したため、計画通りデータ収集は実行可能である。
腫瘍血管内皮細胞の幹細胞性と薬剤耐性獲得機構との関わりの解明

1)薬剤抵抗性と幹細胞性の関連解析:がん幹細胞は薬剤抵抗性をもつことはよく知られている.腫瘍血管内皮細胞には幹細胞性(CD90, Sca-1などの幹細胞マーカーの発現)や薬剤抵抗関連遺伝子,MDR1の発現が高いことがわかった.また,腫瘍培養上清により正常血管内皮においてこのトランスポーター遺伝子MDR1の発現が上昇したことから,腫瘍血管内皮細胞の薬剤抵抗性と幹細胞性との関わりについてCD90, Sca-1, CD133,MDR1発現と薬剤感受性の違いとの関係をreal time PCR,MTS assay,フローサイトメトリーによるSP分画解析などにより解析した.さらにALDHが高い腫瘍血管内皮細胞の存在をみいだし,それらが薬剤耐性をもっていることを明らかにした.また,幹細胞性をもつ腫瘍血管内皮細胞においてある細胞成長因子のシグナル経路が亢進していることなどを現在解析中である.2)培養上清中サイトカインの解析:腫瘍培養上清により正常血管内皮における腫瘍血管内皮マーカーの発現亢進や薬剤耐性に影響を及ぼすサイトカインの解析をおこなった.悪性度の異なるがん細胞の培養上清による処理後,細胞の抗がん剤や血管新生阻害剤への感受性の変化を増殖能,遊走能への影響を通して比較検討した.培養上清中のVEGFが血管内皮の薬剤耐性を亢進させることをみいだした.血管内皮においてこの受容体の阻害を行うことで薬剤耐性を回避できることを確認した.その他の培養上清中のサイトカインもいくつか見出され,現在解析中である.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。腫瘍培養上清による血管内皮の薬剤耐性獲得のメカニズムとしてmiRNAが含まれるmicrovesicleやエクソゾーム自体が血管内皮に取り込まれた後の性質の変化を解析した.microvesicleが取り込まれる際にエンドサイトーシスの機序で取り込まれることが見出され,その際に血管内皮細胞におけるAktのリン酸化がおこることがわかった.また,癌腫によりこれらのmicrovesicleの分泌量が異なることがわかり,転移能が高い腫瘍では転移能の低い腫瘍よりも多くのmicrovesicleを分泌していることがわかった.がん微小環境内での血管内皮細胞の薬剤耐性獲得機構にこのようなmicrovesicleが関与する可能性も示唆された.さらに,薬剤耐性獲得後の血管内皮のmRNAやmiRNA発現量の変化を解析した.腫瘍細胞との共培養によってもこの遺伝子発現変化がおこるかどうかについて解析を行った.腫瘍細胞からの液性因子によって血管内皮細胞の幹細胞マーカー耐性関連遺伝子,薬剤耐性関連分子の発現亢進,薬剤耐性の獲得が見出された.次にこのような細胞に対して各種血管内皮標的薬剤(低用量抗がん剤)によって1ヶ月ほどした.薬剤耐性関連分子を阻害できる薬剤をすることで,これまでの抗がん剤に対する耐性が回避できた.なお,薬剤耐性の獲得に関連する分子として腫瘍細胞由来の液性因子以外に,腫瘍細胞由来miRNAの関与を示唆する結果も得られ、その阻害を行うことにより血管内皮細胞の耐性が回避できるかどうかについても現在行っている.1)薬剤抵抗性と幹細胞性の関連解析:がん幹細胞は薬剤抵抗性をもつことはよく知られている.腫瘍血管内皮細胞には幹細胞性(CD90, Sca-1などの幹細胞マーカーの発現)や薬剤抵抗関連遺伝子,MDR1の発現が高いことがわかった.また,腫瘍培養上清により正常血管内皮においてこのトランスポーター遺伝子MDR1の発現が上昇したことから,腫瘍血管内皮細胞の薬剤抵抗性と幹細胞性との関わりについてCD90, Sca-1, CD133,MDR1発現と薬剤感受性の違いとの関係をreal time PCR,MTS assay,フローサイトメトリーによるSP分画解析などにより解析した.さらにALDHが高い腫瘍血管内皮細胞の存在をみいだし,それらが薬剤耐性をもっていることを明らかにした.また,幹細胞性をもつ腫瘍血管内皮細胞においてある細胞成長因子のシグナル経路が亢進していることなどを現在解析中である.2)培養上清中サイトカインの解析:腫瘍培養上清により正常血管内皮における腫瘍血管内皮マーカーの発現亢進や薬剤耐性に影響を及ぼすサイトカインの解析をおこなった.悪性度の異なるがん細胞の培養上清による処理後,細胞の抗がん剤や血管新生阻害剤への感受性の変化を増殖能,遊走能への影響を通して比較検討した.培養上清中のVEGFが血管内皮の薬剤耐性を亢進させることをみいだした.血管内皮においてこの受容体の阻害を行うことで薬剤耐性を回避できることを確認した.その他の培養上清中のサイトカインもいくつか見出され,現在解析中である.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
環境保全と技術および産業構造の変化に関する計量的研究-環境分析用産業連関表をもちいて-

これまで環境分析用産業連関表に基づく分析は、経済を約400の詳細な部門に分割してきめこまかく行ってきているが、それらはあくまでも日本全国1年間の平均値についての結果であった。そこで今年度は研究内容をより拡張して、月別、地域別のさらにきめの細かい分析を目指した。たとえば月別の分析としては、家計の消費活動と環境負荷との関係を分析するための「環境家計簿」を家計調査年報の集計値に基づいて月別に計算することを試みた。その結果、暖房用燃料消費の多くなる冬季に家計消費が誘発するCO_2排出が大きいのは予想された結果であったが、夏季にも光熱費は極端に少なくなるにもかかわらず、誘発CO_2排出が決して小さくないことがわかった。これは夏季にはレジャー、交通、外食など消費が増えるため、それによるCO_2誘発が光熱費の減少分を相殺してしまうためである。また地域別分析については、工業統計表の情報を補完的に用いることを計画し、今年度は工業統計の4桁産業別都道府県別の詳しいデータについて、事業所分布や生産性格差などの基礎情報の整理を行った。その結果、同じ日本であっても、製造業の生産性やエネルギー投入比率などが地域によって大きく異なることがわかった。さらに、今年度は中国の産業構造と環境問題の分析についても視野を拡張した。とりわけ古い重化学工業地帯の集中する遼寧省と内陸の経済発展の遅れた四川省をとりあげて、まず「国家統計年鑑」等の公表ベースの統計に基づいて、それら地域の経済と環境状況を分析した。その結果、軽工業や一般家庭における燃焼装置が意外に多くのSO_x汚染を引き起こしていることがわかった。そこでそれらの汚染を軽減するための、有効な解決のシナリオはどのようなものかを探るために、現地当局への調査、日本国内の関連機関へのヒアリング等に着手した。その結果、中国においては効果は90%あるが費用がかかるというような対策よりも、効果は60%だが安価で実現させやすい方法を見つけていかなければならないことがわかった。
低酸素誘導性転写因子HIF‐1活性化機構の解明

1)各種がん細胞において増殖因子依存性のS6K、mTORのリン酸化はmTOR阻害薬ラパマイシンによって抑制された。HIF-1αの翻訳・タンパクレベルはS6K、mTORのリン酸化と並行していた。なお、他の翻訳制御因子のタンパク量ならびにリン酸化状態には優位な変化は見られなかった。なお、ポリゾーム解析法によって、かかるHIF-1α合成の亢進がmRNAからの翻訳のレベルで制御されていることを確認した。HIF-1αのタンパクレベルの安定化に際し、その合成と分解抑制の両者がいずれも重要であることが明らかになった。2)各種がん細胞のS6K,およびS6のmRNAの発現をRNAiを用いて減弱させる系を確立し、HIF-1αタンパクの発現、VEGF、アドレノメデュリン、phophoglyrerokinase、glucose transporterなど、HIF-1の標的遺伝子の発現がS6K,およびS6によって規定されてることを示した。また、S6K1遺伝子破壊マウスにおいてはかかる経路を介したHIF-1αの発現制御とその標的遺伝子発現調節は観察されなかった。3)低酸素状態において、各種がん細胞内ATP濃度、培地中の乳酸濃度はHIF-1αの発現レベルに一意して変化した。なお、無酸素状態では増殖因子依存性のHIF-1α合成亢進はみられなかった。その理由として、AMPKの活性亢進が考えられた。また、培地中のアミノ酸濃度や組成はHIF-1αの合成に大きく影響を与えることが判明した。
アポトーシス関連因子の制御による虚血性網膜障害の治療モデルの開発

一過性眼圧負荷による虚血性網膜障害におけるアポトーシスとBaxの関与を検討した。Sprague-Dawleyラットの眼内圧を130mmHgに上げて45分間負荷した後、6、24、48、96、および168時間後のTUNEL陽性(DNA断片化)細胞を計測すると、虚血後6時間後から網膜神経節細胞層(GCL)および網膜内顆粒層(INL)に認められるようになり、虚血後24時間で最大、虚血後48時間から96時間後に急速に減少した。逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法からbax mRNAは虚血後6時間から急速に増加し24時間後に最大となり、その後徐々に減少し168時間後に虚血前の基準量レベルになった。一方、bcl-2 mRNAは虚血後168時間までの観察期間において有為の変動はなかった。虚血24時間後の網膜においてGCLおよびINLでbaxが誘導されることを免疫組織学的に確認した。baxのアンチセンスのオリゴデオキシヌクレオチッドを硝子体内に注入し24時間後に網膜に45分間の虚血負荷し24時間後に摘出し、虚血によって誘導されるbaxの抑制を確認するとともにTUNEL陽性細胞が3nmol10nmolで用量依存性に減少しアポトーシスが抑制された。これより虚血負荷によってbax遺伝子の発現が増加し、GCLおよびINLにおいてアポトーシスを駆動し虚血性細胞死に関与していることがわかった。一方、アポトーシス抑制遺伝子bcl-2の虚血性網膜神経細胞死に対する働きをみる目的で、網膜に一過性虚血を加えた後に生じる組織学的障害をbcl-2を過剰発現させたトランスジェニックマウス(NSE73a/ab)とその野生型同胞マウス(C57BL/6)で比較検討した。まずに正常組織構造を比較したところ、bcl-2トランスジェニックマウスのGCLの細胞数は野生型同胞マウスの約60%多かった。トランスジェニックマウスの内網状層(IPL)の厚みは43.8±6.7μm、野生型の33.7±1.8μmと比較し有為に肥厚していた。これよりbcl-2の過剰発現によって正常発育過程におけるアポトーシスが抑制されるため、内層のニューロン数が多くなったものと考えられた。続いて実験動物の眼内圧を130mmHgに45分間維持して網膜に虚血を負荷し、再灌流後7日目に網膜を取り出し、GCLの細胞数、およびIPL、INL、外顆粒層(ONL)の厚みを計測した。個体差を考慮して虚血を負荷した網膜の各実測値は、虚血を負荷していない反対側眼のそれを基準にした%コントロール値にして比較検討した。虚血負荷によって野生型マウスではGCL数が64.6±7.5%コントロールに減少したが、トランスジェニックマウスでは81.9%±5.6%コントロールに保持され、IPLおよびINLの厚みも野生型では42.3±0.6および71.2±0.8%コントロールにそれぞれ減少したが、トランスジェニックマウスでは82.4±19.6および95.3±11.3%コントロールにそれぞれ保持された。虚血負荷後ONLの厚みは野生型は109.3±5.8、トランスジェニックは99.9±9.7%コントロールと両者に有意差はなかった。従って、bcl-2が過剰に発現した網膜ニューロンは虚血による細胞死を100%抑制することはできないものの、野生型の虚血による細胞減少数と比較して、有為に虚血に対して抵抗性を持つことわかった。以上の結果より、アポトーシス抑制遺伝子bcl-2を過剰発現させると虚血による網膜内層ニューロンの細胞死を減少させる効果をもつことがわかった。また、平行して行っている正常ラットを用いたin vitro実験系において虚血性網膜障害の中心的機構がNMDA受容体を介して発現するグルタミン酸誘発網膜神経細胞死で一酸化窒素の発生に基づくことを証明し学会誌に報告した。また、培養細胞を用いた内在性保護因子の研究からビタミンB12から供給されたS-アデノシルメチオニンが網膜の神経細胞の細胞膜の安定化によって一酸化窒素による毒性に対して拮抗して保護作用を示すことを報告した。FK506を用いた実験より、中枢神経系や網膜に豊富に存在するカルシニューリンを抑制することにより一酸化窒素合成酵素を阻害すると興奮性毒に対し網膜神経細胞を保護することがわかった。

baxのアンチセンスのオリゴデオキシヌクレオチッドを硝子体内に注入し24時間後に網膜に45分間の虚血負荷し24時間後に摘出し、虚血によって誘導されるbaxの抑制を確認するとともにTUNEL陽性細胞が3nmol10nmolで用量依存性に減少しアポトーシスが抑制された。これより虚血負荷によってbax遺伝子の発現が増加し、GCLおよびINLにおいてアポトーシスを駆動し虚血性細胞死に関与していることがわかった。一方、アポトーシス抑制遺伝子bcl-2の虚血性網膜神経細胞死に対する働きをみる目的で、網膜に一過性虚血を加えた後に生じる組織学的障害をbcl-2を過剰発現させたトランスジェニックマウス(NSE73a/ab)とその野生型同胞マウス(C57BL/6)で比較検討した。まずに正常組織構造を比較したところ、bcl-2トランスジェニックマウスのGCLの細胞数は野生型同胞マウスの約60%多かった。トランスジェニックマウスの内網状層(IPL)の厚みは43.8±6.7μm、野生型の33.7±1.8μmと比較し有為に肥厚していた。これよりbcl-2の過剰発現によって正常発育過程におけるアポトーシスが抑制されるため、内層のニューロン数が多くなったものと考えられた。続いて実験動物の眼内圧を130mmHgに45分間維持して網膜に虚血を負荷し、再灌流後7日目に網膜を取り出し、GCLの細胞数、およびIPL、INL、外顆粒層(ONL)の厚みを計測した。個体差を考慮して虚血を負荷した網膜の各実測値は、虚血を負荷していない反対側眼のそれを基準にした%コントロール値にして比較検討した。虚血負荷によって野生型マウスではGCL数が64.6±7.5%コントロールに減少したが、トランスジェニックマウスでは81.9%±5.6%コントロールに保持され、IPLおよびINLの厚みも野生型では42.3±0.6および71.2±0.8%コントロールにそれぞれ減少したが、トランスジェニックマウスでは82.4±19.6および95.3±11.3%コントロールにそれぞれ保持された。虚血負荷後ONLの厚みは野生型は109.3±5.8、トランスジェニックは99.9±9.7%コントロールと両者に有意差はなかった。従って、bcl-2が過剰に発現した網膜ニューロンは虚血による細胞死を100%抑制することはできないものの、野生型の虚血による細胞減少数と比較して、有為に虚血に対して抵抗性を持つことわかった。以上の結果より、アポトーシス抑制遺伝子bcl-2を過剰発現させると虚血による網膜内層ニューロンの細胞死を減少させる効果をもつことがわかった。また、平行して行っている正常ラットを用いたin vitro実験系において虚血性網膜障害の中心的機構がNMDA受容体を介して発現するグルタミン酸誘発網膜神経細胞死で一酸化窒素の発生に基づくことを証明し学会誌に報告した。また、培養細胞を用いた内在性保護因子の研究からビタミンB12から供給されたS-アデノシルメチオニンが網膜の神経細胞の細胞膜の安定化によって一酸化窒素による毒性に対して拮抗して保護作用を示すことを報告した。FK506を用いた実験より、中枢神経系や網膜に豊富に存在するカルシニューリンを抑制することにより一酸化窒素合成酵素を阻害すると興奮性毒に対し網膜神経細胞を保護することがわかった。正常マウスにおいては、高眼圧によって網膜に虚血を負荷すると網膜の内層が選択的に障害されるが、bcl過剰発現マウスにおいては一過性眼圧負荷によって誘発される網膜障害が生じないことがわかった。そこで、さらに成熟ラットを用いた一過性眼圧負荷による虚血性網膜障害におけるアポトーシスとBaxの関与を検討した。
CD204(スカペンジャー受容体)の病理診断への応用と新規Mφ抗体の開発

スカベンジャー受容体ファミリー分子は、パターン認識受容体として幅広いリガンド結合性を示し、自然免疫や生体防御におけるマクロファージ(Mφ)機能に重要な役割を担っている。なかでもCD204(クラスA-スカベンジャー受容体I,II型)およびCD163(ヘモグロビンスカベンジャー受容体)はMφに特異的に発現し、病理組織診断におけるMφマーカーとして有用と考えられる。私どもが独自に作成した抗CD204抗体および抗CD163抗体はパラフィン切片に利用可能で、これらの抗体を用いて肉芽腫性疾患を免疫組織化学的に検討すると、肉芽腫周囲への浸潤Mφは何れの抗体にも強陽性所見を示したが、類上皮細胞や多核巨細胞は陰性もしくは弱陽性であった。破骨細胞や骨巨細胞腫に出現する多核巨細胞も陰性であり、CD204およびCD163は特定のMφ亜群に発現された。単球由来Mφを用いた検討では、CD204とCD163はIFN-γによって活性化される古典的活性化Mφよりも、IL-4やIL-10によって活性化されるオルタナティブ活性化Mφに強く発現誘導がおこり、後者のマーカーとして有用と考えられた。CD204陽性マクロファージの機能を明らかにするために、CD204欠損マウスを用いて心筋梗塞モデルおよび高濃度酸素暴露肺傷害モデルを作成すると、いずれも欠損マウスではTNF-αの産生やMMPの活性化が亢進し、前者では心破裂による死亡が有意に増加し、後者では肺傷害が増悪した。このことから、CD204陽性Mφは過度の炎症性サイトカインの産生を抑制し、炎症の制御に関与することが明らかとなった。これらの結果からCD204およびCD163はオルタナティブ活性化Mφの優れたマーカーと考えられ、今後、ヒト病的組織におけるオルタナティブ活性化Mφの出現と病変との関わりを解析する上で有用な指標となるものと考えられた。独自に作成したCD204(クラスAマクロファージ(Mφ)スカベンジャー受容体)に対する特異抗体を用いて、病理検体の検討を行った。抗原賦活にはクエン酸緩衝液を用いた加熱処理が有効であった。CD204は種々の炎症性疾患における炎症巣への浸潤Mφに陽性であり、CD204はMφにおける外来異物認識に重要な役割を果たすものと考えられた。従来から知られている脂質代謝における機能のみならず、パターン認識受容体のひとつとして、自然免疫においても重要な役割を果たすものと思われる。肉芽腫性疾患では、肉芽腫周囲への浸潤Mφが陽性であったが、類上皮細胞や多核巨細胞は陰性であった。破骨細胞や骨巨細胞腫に出現する多核巨細胞も陰性であり、特定のMφ亜群に発現される可能性が示唆された。単球由来Mφを用いた検討を行うと、CD204はIFN-γによって活性化される通常の活性化Mφとは異なり、特異な活性化を受けたMφ亜群(alternatively activated Mφ)に強く誘導されることがわかった。樹状細胞との関連では、組織学的にランゲルハンス細胞やinterdigitating cellは陰性であったが、培養単球をGM-CSFおよびIL-4の共存下で樹状細胞への分化を誘導すると、未熟樹状細胞で発現誘導がみられ、成熟化に伴って発現が低下した。このことは、未熟樹状細胞における抗原取り込みにCD204が関与する可能性を示唆する。

CD204の解析に加えて、Mφを特異的に認識する新規抗体を開発中であり、そのいくつかはCD163を認識することが、認識抗原の質量分析によって明らかとなった。今後、CD204,CD163陽性Mφの病態との関連を明らかにするとともに、新規Mφ抗原の解析をすすめたい。スカベンジャー受容体ファミリー分子は、マクロファージ(Mφ)を主体として発現が認められ、脂質代謝におけるMφへの変性脂質取り込みに重要な役割を果たす。しかし、多くのスカベンジャー受容体ファミリー分子は脂質代謝以外にも、自然免疫や生体防御におけるMφ機能に重要な役割を担っている。昨年度は、クラスA-スカベンジャー受容体(CD204)に対する特異抗体を用いて、CD204が種々の炎症性疾患における炎症巣への浸潤Mφに陽性であり、肉芽腫構成細胞である類上皮細胞や多核巨細胞よりも肉芽腫周囲への浸潤Mφに陽性となることを示した。本年度は、私どもが既に報告した抗Mφ抗体であるAM-3Kおよび新規作成の抗Mφ抗体KD163について、質量分析法を用いて認識抗原の解析を行い、両者ともCD163(ヘモグロビン・スカベンジャー受容体)を認識することを明らかにした。これらの抗体を用いた免疫組織化学的検討では、CD204と同様に炎症巣への浸潤Mφに陽性に陽性で、一方、肉芽腫性疾患では肉芽腫周囲への浸潤Mφに強い発現がみられるものの、類上皮細胞や多核巨細胞は弱陽性で、CD204と類似した発現様式を示すことがわかった。CD163はCD204と同様に特異な活性化を受けたMφ亜群(alternatively activated Mφ)に強く誘導されることが知られており、この両者に対する抗体はこのようなMφ亜群の認識に有用であると考えられた。一方、樹状細胞での発現に関しては、CD163はCD204とは異なり未熟樹状細胞ならびに成熟樹状細胞のいずれにも陰性であった。今後、CD204ならびにCD163陽性Mφの病態との関連を明らかにするとともに、Mφの分化や活性化、さらにMφのサブポプレーションの解析に、これらの抗体を有効に利用する予定である。スカベンジャー受容体ファミリー分子は、マクロファージ(Mφ)を主体として発現が認められ、Mφによる変性脂質取り込みに重要な役割を果たす。他方、多くのスカベンジャー受容体ファミリー分子は、パターン認識受容体として幅広いリガンド結合性を示し、自然免疫や生体防御におけるMφ機能に重要な役割を担っている。本年度の検討では、私どもが既に報告した抗Mφ抗体であるAM-3Kおよび新規作成の抗Mφ抗体KD163について、質量分析法を用いて認識抗原の解析を行い、両者ともCD163(ヘモグロビン・スカベンジャー受容体)を認識することを示すとともに、CD163は抗炎症性Mφ亜群に強く発現誘導が起こることを明らかにした。またヒト組織の検索で、CD163は炎症巣への浸潤Mφに陽性で、一方、肉芽腫性疾患では肉芽腫周囲への浸潤Mφに強い発現がみられるものの、類上皮細胞や多核巨細胞は弱陽性であることがわかった。さらに卵巣癌や脳腫瘍の検討から、腫瘍内浸潤Mφの多くはCD163に陽性で、悪性度に比例してCD163陽性Mφの密度が増加し、腫瘍促進性に作用している可能性が示唆された。次にCD204(SR-AI,II)と組織修復の関連を検討するため、CD204欠損マウスを用いて、心筋梗塞後の心筋リモデリングにおけるCD204陽性Mφの機能を解析したところ、欠損マウスでは、梗塞後の心破裂が有意に増加し、CD204陽性Mφがサイトカイン分泌とMMP産生制御を通して、梗塞後の組織修復に深く関わることを明らかにした。
Ctf18-RFCローダー複合体とDNAポリメラーゼの分子間相互作用

複製クランプPCNAのローダー複合体の1つヒトCtf18-RFCと複製DNAポリメラーゼ、polε間にある2種類の相互作用を詳細に解析し、polεがローダーとしての機能構造を基にしてCtf18-RFCと基盤となる相互作用を持ち、さらに染色体接着因子Dcc1-Ctf8を介して安定な結合が形成されることを明らかにした。さらにこの2種類の相互作用はpolεの触媒サブユニットのDNAポリメラーゼドメインを標的としており、そのDNA合成活性を制御する機能があることを明らかにした。複製クランプPCNAの第2のローダーで、染色体接着に必要とされるCtf18-RFC複合体が、DNAポリメラーゼと相互作用する分子機構の詳細を解明し、多様な反応に関与するDNAポリメラーゼが協調的に使い分けられる機構を明らかにすることを目的として研究を行い、以下の結果を得た。1.染色体接着ローダーCtf18複合体とDNAポリメラーゼεの直接の相互作用の詳細を解析し、結合にはCtf18,Dcc1,Ctf8の染色体接着特異的サブユニットからなる複合体が関与することを明らかにした。さらにこの結合に必要な複合体形成に関与するCtf18の最小領域がC末端28残基であることを見出した。2.DNAポリメラーゼε側のCtf18-RFCとの結合に必要なサブユニットを解析し、触媒サブユニットp261で十分であること、さらにこのサブユニットのポリメラーゼドメインの一部が結合に関与していることを明らかにした。これらのことより、Ctf18-RFCの結合によりDNAポリメラーゼεの触媒活性が制御される可能性が示された。3.ヒト細胞でローダー複合体RFCおよびRad17と相互作用する因子を網羅的解析し、Ctf18結合因子として見出したRPA、MCMヘリカーゼ、DNAポリメラーゼεがこれらとも相互作用を持つ事を明らかにした。このことからローダーが中心となって複製フォーク構成因子の機能的連係を行っている機構が示唆された。4.ヒト細胞でMCM複合体と特異的に相互作用する因子を網羅的に解析したところ、ローダー複合体構成サブユニットが見だされた。この知見は前項の結果をヘリカーゼ側から支持するとともに、ヘリカーゼとローダー間の相互作用の機能的重要性を強く示唆する。1. polεとCtf18-RFC間の安定な結合に必要なpolεp260の領域を解析し、N末端側メインが関与することを示した。また、Ctf18-RFCのサブ複合体、18-1-8が結合に必要であることを明らかにした。さらに両者の結合でpolεのDNA合成活性が抑制されることを見出した。これはローダーが複製ポリメラーゼの活性制御することを示した新しい知見である。2. Ctf18サブユニットのpolεとの安定な結合に必要な機能領域を限定しC末側23アミノ酸で十分であることを明らかにした。同時にこの領域が染色体接着因子Dcc1,Ctf8との複合体形成に必要な領域であることも示した。これらの構造の理解は、この3者の複合体形成で、次のパートナー結合構造が形成されるという新たな機能モチーフの解明に結びつくことが期待できる。3. MCMとローダーの相互作用を解析し、MCMの構成の違いで結合するローダーの特異性が変化することを明らかにした。これはMCMの複合体状態変化により複製フォークの分子集合が制御されることを示唆する。4.複製ローダーであるRFCとMCMのDNA結合様式を解析し、これらが協同的にDNAと結合することを明らかにした。この結果は、複製フォークの集合に両者の相互作用が協同して安定な複製フォーク複合体形成を行う機構の存在を示唆している。ヒト細胞の複製クランプPCNAの第2のローダーで、染色体接着に必要とされるCtf18-RFC複合体が、複製DNAポリメラーゼPolεと特異的に相互作用する分子機構の詳細を解析し、以下の結果を得た。1.Ctf18-RFCとPolε間の安定な結合はCtf18のC末側23アミノ酸に結合した染色体接着因子Dcc1,Ctf8によってもたらされる。またCtf18と結合したRFC2-5サブユニットは独立してPolεと弱い結合を行う。これらPolεと複合体を形成する2つの機能領域は明確にCtf18上で区別でき、この2種類の結合が機能的に独立していることを明らかにした。2.Ctf18-RFCのサブ複合体でPolεと安定な結合をするCtf18-Dcc1-Ctf8と弱い結合をするCtf18-RFC(5)を再構築してPolεとの結合領域を解析し、いずれもPolεp261の触媒活性を持つN末半分と結合することを明らかにした。

3.このPo1εp261 N末半分の領域に対する2種類の結合性と連係して、Ctf18-RFCのサブ複合体がPolεと弱い結合をする際には、そのDNA合成活性が促進され、安定な結合をする際には阻害されることを明らかにした。したがってPolεにCtf18-RFCが異なったモードで結合することで、複製の進行が制御される可能性が示唆された。4.ヒト細胞抽出液をglycerol密度勾配遠心で分画し、抽出液中のCtf8、Dcc1を含むCtf18-RFC複合体のほとんどがPolεと安定な結合していることを明らかにした。したがって細胞内ではCtf18-RFCがPolεに抑制的に働くことが染色体接着と複製の連動に重要であることが示された。
免疫抑制性C型レクチン受容体による抗真菌免疫誘導機構の解明

C型レクチン受容体(CLR)は、活性化型CLRと抑制型CLRが知られており、自己・非自己由来のリガンド認識を通じて、生体恒常性の維持や免疫活性化・制御に深く関与している。本研究では抑制型CLRに焦点を当て、真菌感染応答における役割を明らかにした。抑制型CLRは、Candia菌種などを認識し、糖鎖成分を認識することが明らかになった。またこれら真菌を感染させた際、抑制型CLRはマクロファージおよび好中球からのサイトカイン産生に関与することが明らかになった。当該年度は、抑制型C型レクチン受容体(CLR)によるカンジダ分子認識機構の解明を目的に、CLR強発現レポーター細胞を構築後、10種類の真菌ライブラリー(Candida albicans、Aspergillus neoformans、Cryptococcus neoformansなど)と共培養し、親和性をフローサイトメトリーで測定した。コントロールベクター発現細胞と比較し、抑制型CLR強発現レポーター細胞による指標は同様傾向を示し、感知能に差は認められなかった。そこで、可溶型CLR(CLR-Fc)を調製し、真菌との結合をフローサイトメトリーを用いて測定した。一部のCLR-Fcは、真菌との相互作用を示した。また、蛍光顕微鏡による解析の結果、蛍光標識化CLR-Fcは真菌の細胞表層を染色することがわかった。しかしながら、これらの結合はEDTAキレーティング処理によっても維持されていることから、カルシウム非依存的に結合することがわかった。また、消化酵素(タンパク質分解酵素、糖質分解酵素など)処理により、CLR-Fcの結合は消失することがわかった。このことから、一部の抑制型CLRは真菌細胞表層上のタンパク質あるいは多糖を認識することが示唆された。また、当該年度においてマクロファージおよび好中球による貪食機能、サイトカイン産生能、NET能を評価した。マクロファージは骨髄細胞からM-CSFにより誘導し、好中球は骨髄より単離、調製した。これらミエロイド細胞と結合が認められた真菌を共培養し、傷害活性機能を調べた。一部のCLR欠損マウス由来ミエロイド細胞は、野生型マウス由来ミエロイド細胞に比べ、それら細胞傷害機能に異常があることが認められた。当該年度に予定していた計画通りほぼ進めることができた。一部の実験仮説・作業仮説と異なったため、当初の予定に加え、検証実験を実施した。レポーター細胞を用いたアッセイ系により、真菌細胞との相互作用の解析およびリガンド構造の推定を試みたが、アッセイ系がうまく動かなかった。このため可溶性CLRを用いた生化学的実験に変更し、おおむね実験結果を得た。また、ROS産生機構を明らかにする予定であったが、蛍光染色法によるROS測定が動かなかったため、次年度の課題とする。代替手段として、ルミノール発色法によるROS産生により評価する。リガンド構造の推定については、CLR強発現レポーター細胞を用いた細胞ベースのアッセイ系から可溶型CLRを用いた生化学的な実験系に変更し、CLRリガンドの探索を進める。ROS産生の評価については、東京理科大学との共同研究により進めていく予定である。一方、平成29年度に予定していた一部の実験をすでに始めており、遅滞なく進めていく予定である。糖鎖生物学