hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分岐型ジシアリル糖鎖抗原による腎癌悪性化メカニズムの解明

腎癌細胞株に発現している糖脂質糖鎖の解析により、Disialyl糖鎖の発現パターンの変化が腎癌での悪性化や転移性に関連していることが推測されている。本研究では、Disialyl Lc4(DSLc4)の末端にGalNAcがβ1-4結合したDisialyl糖鎖(GalNAc-DSLc4)の合成機構と機能の解析を行ってきた。GalNAc-DSLc4の合成に関わる糖転移酵素遺伝子β4GalNAc-T2を、GalNAc-DSLc4糖鎖抗原をほとんど発現していない腎癌細胞株に遺伝子導入し、糖鎖リモデリングの結果惹起される表現型の変異を解析した結果、樹立したGalNAc-DSLc4安定発現株の増殖能および浸潤能が、コントロール細胞株よりも亢進していることを明らかにした。また、リアルタイム細胞形態計測システム(RT-CES)を用いて、細胞外基質をコーティングした表面に対する細胞の接着形態を調べたところ、GalNAc-DSLc4安定発現株がラミニンコーティングプレートに特異的に接着することを見出した。これらの表現型は、いずれもAktのリン酸化レベルがコントロール細胞株よりも高いことが関与しており、PI3K阻害剤であるLY294002を添加することで、その浸潤能やラミニンへの接着能は抑制された。GalNAc-DSLc4安定発現株のさまざまな悪性形質はPI3K-Aktシグナル経路が活性化されていることに起因することが考えられた。腎癌細胞株細胞表面に発現している糖鎖抗原の解析結果から、約70%の腎癌細胞株において、Lacto系列糖脂質糖鎖Disialyl Lc4(DSLc4)の末端にGalNAcがbeta1-4結合したDisialyl糖鎖(GalNAc-DSLc4)が発現していることを確認した。そこでDisialyl糖鎖の発現パターンの変化が腎癌での悪性化や転移性に関連していると推測し、GalNAc-DSLc4の合成機構と機能の解析を行ってきた。これまでに、GalNAc-DSLc4の合成に関わる糖転移酵素遺伝子beta4GalNAc-T2を、腎癌細胞株に遺伝子導入し、糖鎖リモデリングの結果惹起される表現型の変異を解析した結果、樹立したGalNAc-DSLc4安定発現株の増殖能および浸潤能が、コントロール細胞株よりも亢進していることを明らかにした。また、リアルタイム細胞形態計測システムを用いて、細胞外基質をコーティングした表面に対する細胞の接着形態を調べたところ、GalNAc-DSLc4安定発現株がラミニンコーティングプレートに特異的に接着することを見出した。これらの表現型は、いずれもFCS存在下において顕著に見られたため、FCS添加時の細胞内シグナル分子の変化と悪性化に関与する分子の同定を行なった。その結果、安定発現株細胞内におけるAktシグナルのリン酸化レベルはコントロール細胞株よりも高く、PI3K阻害剤(LY294002)を添加することで、その浸潤能やラミニンへの接着能は抑制されることから、安定発現株のさまざまな悪性形質はPI3K-Aktシグナル経路が活性化されていることに起因すると考えられた。これまでに得られた知見から、細胞膜表面のGalNAc-DSLc抗原が、チロシンリン酸化受容体の細胞膜上での局在や二量体化などに深く関与し、PI3K-Aktシグナル経路を活性化させる可能性が示唆された。これまでに、GalNAc-DSLc4の合成に関わる糖転移酵素遺伝子B4GalNAc-T2を、GalNAc-DSLc4糖鎖抗原をほとんど発現していない腎癌細胞株に遺伝子導入し、糖鎖リモデリングの結果惹起される表現型の変異について解析したところ、表現型の一つとして、GalNAc-DSLc4安定発現株はラミニン処理プレートに特異的に接着することが明らかになった。そこでラミニンとの結合に関わる接着分子インテグリンの細胞表面における局在を調べた。

ショ糖密度勾配法により細胞膜成分を分画したところ、安定発現株ではインテグリンbeta1がシグナル分子の集合するラフトドメインにも一部存在しており、ラミニン表面に対して強く接着するメカニズムに関与している可能性が示唆された。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、インテグリンbeta1はラフトマーカーであるcaveolin-1分子とよく似た局在を示し、ラミニン未処理プレート表面に対する接着面には両分子の共局在が確認できたが、細胞間の接着面にはcaveolin-1分子は強く局在するがインテグリンbeta1分子は局在していなかった。一方、腎癌の悪性化にはガングリオシド特異的に働くシアリダーゼ(NEU3)の異常高発現が関与することが近年になって報告されたため、本研究のB4GalNAc-T2遺伝子強制発現株についても、NEU3のmRNA発現量をreal-time RT-PCRにより確認し、NEU3の異常発現の有無を調べた。しかし、GalNAc-DSLc4安定発現株の増殖・浸潤能の亢進やラミニン表面への接着性と、Neu3のmRNA発現量には相関性は全く認められなかったため、安定発現株で惹起されたさまざまな特性はNeu3を介さない他の経路により引き起こされている可能性が考えられた。GalNAc-DSLc4糖鎖の発現量が、インテグリンbeta1分子の細胞膜上での局在にどのように関与しているのかを明らかにすることは、GalNAc-DSLc4発現細胞株の高転移性を解明する上で重要と考え、共焦点レーザー顕微鏡下での細胞接着時の各分子局在について経時的に観察しようと試みているが、ガラス表面のラミニン修飾が効果的に出来ていない可能性が高く、ラミニン修飾ガラスプレパラート上へのGalNAc-DSLc4発現細胞株の接着過程が、培養ディッシュへの接着時のように再現出来ていないと思われる。この条件検討のために、時間がかかっている。また、GalNAc-DSLc4抗原を提示する糖脂質もしくはタンパク質を同定することで悪性形質の発現に直接関与していると思われる会合分子を見出すことが可能となると考えているが、RM2抗体を用いた免疫共沈降の条件検討において時間がかかっている。糖脂質以外にGalNAc-DSLc4抗原を提示しているキャリアータンパク質の存在の有無を明らかにする。そのために、免疫沈降とMS解析により同定を試みる。また、GalNAc-DSLc4抗原と会合するリガンド分子を見つけ出すことで、悪性化に関与する分子群の同定を試みる。さらに、B4GalNAc-T2糖転移酵素には二つのisoformが存在しているので、それぞれの糖転移酵素の発現と悪性化との関連性について明らかにしていく。ラミニンコーティング表面に接着する際の接着分子の挙動および局在、それに伴うシグナル分子の動きを把握することで、転移メカニズムについて明らかにし、転移を抑制できるような治療法開発の手掛かりにしたい。GalNAc-DSLc4抗原を提示する糖脂質もしくはタンパク質の同定、もしくは悪性形質の発現に直接関与していると思われる会合分子を見い出せたら、質量分析を用いたタンパク質同定を行なう予定である。LC-MS/MSやMALDI-TOF MSによるタンパク同定を受託サービスにて行ないたいと考えている。(定価350,000円)また、GalNAc-DSLc4抗原がタンパク質に提示されていた場合、その糖鎖構造の詳細な解析を行なう必要があるので、受託サービスを利用したいと考えている。(定価200,000500,000円)
歯科治療ストレスモニターシステムの開発-非線形解析によるストレス評価システム-

平成7年度に作成した歯科臨床用非線形解析システムの信頼性を向上させ,さらに非線形カオス解析の高速化とシステムのGUI(グラフィカルインターフェース)の改良を行った.改良したシステムは,臨床モニター機器から得られたアナログデータを,MPU(Intel社Pentium)搭載コンピュータのISAバスに装着したデータ分解能12bitのアナログ・デジタル変換ボード(Keithley社DAS-1800ST)を用いてリアルタイムにデジタルデータに変換し,さらに本年度開発した非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)による高速非線形カオス解析を可能とした.非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)は,平成7年度に開発した非線形カオス解析プログラム(Ver.1.0)と同様にVisual C++とVisual Basicでプログラミングし,Microsoft社Windows3.1上で動作可能とした.非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)は,測定サンプリングレートならびに測定チャンネル数の最適化により,非線形カオス解析プログラム(Ver.1.0)に比べて約1.5-2倍の解析速度の高速化を達成した.また,GUI(グラフィカルインターフェース)についても改良を行い,マウスを主体とした簡易な操作により解析が可能で,また解析結果の視認性,認識性についても改良を行った.以上により,当該年度に開発した歯科臨床用非線形解析システムは,臨床モニター機器から得られた時系列データの,Takensの時間遅れ埋込み定理によるアトラクター再構築,Kolomogorov-Sinaiエントロピー,自己相関量,以上3測定項目についてについてリアルタイム解析を可能とした.平成7年度に作成した歯科臨床用非線形解析システムの信頼性を向上させ,さらに非線形カオス解析の高速化とシステムのGUI(グラフィカルインターフェース)の改良を行った.改良したシステムは,臨床モニター機器から得られたアナログデータを,MPU(Intel社Pentium)搭載コンピュータのISAバスに装着したデータ分解能12bitのアナログ・デジタル変換ボード(Keithley社DAS-1800ST)を用いてリアルタイムにデジタルデータに変換し,さらに本年度開発した非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)による高速非線形カオス解析を可能とした.非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)は,平成7年度に開発した非線形カオス解析プログラム(Ver.1.0)と同様にVisual C++とVisual Basicでプログラミングし,Microsoft社Windows3.1上で動作可能とした.非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)は,測定サンプリングレートならびに測定チャンネル数の最適化により,非線形カオス解析プログラム(Ver.1.0)に比べて約1.5-2倍の解析速度の高速化を達成した.また,GUI(グラフィカルインターフェース)についても改良を行い,マウスを主体とした簡易な操作により解析が可能で,また解析結果の視認性,認識性についても改良を行った.以上により,当該年度に開発した歯科臨床用非線形解析システムは,臨床モニター機器から得られた時系列データの,Takensの時間遅れ埋込み定理によるアトラクター再構築,Kolomogorov-Sinaiエントロピー,自己相関量,以上3測定項目についてについてリアルタイム解析を可能とした.研究計画に従い当初,指尖容積脈派,指尖血流量,心電図波形,トノメトリ法による非観血的連続動脈圧などの非侵襲モニターから得られた生体情報の時系列データを,高速に非線形解析カオス理論で解析するシステム(高速非線形解析システム)を作成した.このシステムはデジタル変換した時系列データの非線形カオス解析が高速に可能で,従来我々が行っていたワークステーションによる非線形解析の約10倍の計算速度の向上を達成した.次に,これらの非侵襲モニターから得られたアナログデータを,on lineでデジタルデータに変換し,このデジタルデータをreal timeで解析する歯科臨床用非線形解析システムを開発した.歯科臨床用非線形解析システムで使用するカオス解析プログラムは,VisualC++とVisualBasicでプログラミングし,マイクロソフト社Windows3.1上で動作可能なプログラムとした.この歯科臨床用非線形解析システムでは,時間遅れ埋め込み定理によるアトラクター再構築,KSエントロピー,自己相関量についてreal time解析を可能とした.歯科臨床用非線形解析システムの信頼性と再現性が,従来のワークステーションによる非線形解析,そして高速非線形解析システムと比べて同等であることを検証した後,健康成人ボランティアの協力を得て,各種のストレスパラダイムをボランティアに負荷した際の,指尖容積脈派,指尖血流量,トノメトリ法による悲観血的連続動脈圧の時系列データのカオス特性の変化を検討した.負荷するストレスパラダイムは,精神的因子の大きいパラダイムとして暗算計算ストレス,歯科治療を想定したパラダイムとして下顎歯槽粘膜への生理的食塩水投与を行った.その結果,指尖容積脈波の,時間遅れ埋め込み定理によるアトラクター再構築,KSエントロピー,自己相関量が,ストレス負荷に対して比較的再現性良く反応する事を観察した.当該年度は,平成7年度に作成した歯科臨床用非線形解析システムの信頼性を向上させ,さらに非線形カオス解析の高速化とシステムのGUI(グラフィカルインターフェース)の改良を行った.改良したシステムは,臨床モニター機器から得られたアナログデータを,MPU(Intel社Pentium)搭載コンピュータのISAバスに装着したデータ解能12bitのアナログ・デジタル変換ボード(Keithley社DAS-1800ST)を用いてリアルタイムにデジタルデータに変換し,さらに本年度開発した非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)による高速非線形カオス解析を可能とした.非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)は,平成7年度に開発した非線形カオス解析プログラム(Ver.1.0)と同様にVisualC++とVisual Basicでプログラミングし,Microsoft社Windows3.1上で動作可能とした.非線形カオス解析プログラム(Ver.2.0)は,測定サンプリングレートならびに測定チャンネル数の最適化により,非線形カオス解析プログラム(Ver.1.0)に比べて約1.5-2倍の解析速度の高速化を達成した.

また,GUI(グラフィカルインターフェース)についても改良を行い,マウスを主体とした簡易な操作により解析が可能で,また解析結果の視認性,認識性についても改良を行った.以上により,当該年度に開発した歯科臨床用非線形解析システムは,臨床モニター機器から得られた時系列データの,Takensの時間遅れ埋込み定理によるアトラクター再構築,Kolomogorov-Sinaiエントロピー,自己相関量,以上3測定項目についてについてリアルタイム解析を可能とした.
高線量率小線源治療における接続健全性判定システムの開発

高線量率小線源治療は手作業の工程が多いため,ヒューマンエラーによる事故が発生しやすい.特に,治療装置とアプリケータを接続する際には注意が必要である.本研究では,接続間違いを検知するためのシステムを作成した.このシステムは,リング型の磁石,ホール素子とソフトウェアから構成される.磁石から発生する磁界は,チェックケーブルの走行によって乱れるため,その磁界の変化をホール素子で検知する.チェックケーブル位置の同定精度はホール素子との距離に依存し,距離が離れる程低下した.小線源治療の安全性を向上させるための装置を考案した.このシステムは,治療装置とアプリケータの接続間違いを感知出来る可能性がある.高線量率小線源治療では、複数のアプリケータを病巣部に挿入し、治療装置とアプリケータを移送チューブで接続して線源を送り出す。移送チューブ接続作業では、治療計画装置で割り振った番号通りに繋がなければならないが、機械的なチェック機構が備わっていないため、ボタンの掛け違いのような接続ミスによる事故を招き易い。本研究課題では、治療装置とアプリケータの接続健全性判定システムの開発を目的としている。これが達成できれば、高線量率小線源治療の安全性と効率が飛躍的に増し、より質の高い医療を提供することができる。今年度は、このシステムの基盤となる検出器の作成に注力した。この検出器は、リング型磁石とホール素子を組み合わせ、模擬線源に見立てた磁性体の走行位置を同定する。また、検出器からの信号を受信するためのソフトウェアも完成させた。現在は、検出精度を向上させるために改良を重ねている。リング型磁石の中心部における検出精度は、磁気ノイズや磁力低下による影響のため、低下傾向にある。本研究の目的は、高線量率小線源治療におけるアプリケータと移送チューブの接続間違いを防止し、放射線治療の安全性を向上させることである。接続間違いを感知する方法として、チェックケーブルの走行位置を磁場の乱れから推測する方法を採用した。チェックケーブルの役割は、治療用の線源を使用する直前の線源進路の確認である。磁場発生装置としてリング型のフェライト磁石を使用し、磁力検出器としてホール素子(AT1324LUA-T)を用いた。チェックケーブルには、磁性体のステンレスを用いた。チェックケーブルがフェライト磁石の中を走行する際に、フェライト磁石から発生している磁力線が乱れる。その乱れは、チェックケーブルの走行位置によって規則性があるため、ホール素子で磁場強度を測定する事により、チェックケーブルの位置を推測出来る。装置は、株式会社千代田テクノルと共同開発した。本年度は、チェックケーブルの走行位置推測の分解能向上、装置の小型化に取り組んだ。分解能は、ホール素子とチェックケーブル間の距離に依存し、距離が離れるほど分解能は低下した。その分解能を向上させるため、ホール素子の数を4個から6個に増設した。また、装置を小型にするために、使用するリング磁石の磁力強度を上げた。ソフトウェアもノイズ除去が出来るように改良した。さらには、無線装置を取り付け、各ホール素子からの信号をワイヤレスでPersonal Computerに受信出来るようにした。この装置は、非接触型のため患者負担が少なく、簡便に測定が可能であるため、アプリケータと移送チューブの接続間違いを検知するシステムとして有効であると考える。高線量率小線源治療は手作業の工程が多いため,ヒューマンエラーによる事故が発生しやすい.特に,治療装置とアプリケータを接続する際には注意が必要である.本研究では,接続間違いを検知するためのシステムを作成した.このシステムは,リング型の磁石,ホール素子とソフトウェアから構成される.磁石から発生する磁界は,チェックケーブルの走行によって乱れるため,その磁界の変化をホール素子で検知する.チェックケーブル位置の同定精度はホール素子との距離に依存し,距離が離れる程低下した.小線源治療の安全性を向上させるための装置を考案した.このシステムは,治療装置とアプリケータの接続間違いを感知出来る可能性がある.当初のスケジュール通りに進んでいる。医学物理学・放射線技術学位置検出精度を向上させる。磁石とホール素子の組み合わせから、最適なものを探す。システム開発に必要な経費が、当初の見積もり以上に必要になりそうなため、学会参加を取りやめて、旅費を節約したため。磁石とホール素子の購入に充てる予定である。
ES細胞由来神経幹細胞より作製する神経系細胞への温熱刺激効果の検討

温熱刺激は,細胞の増殖・生存に影響を及ぼすことが知られているが,神経系組織・機能再生のための移植細胞と期待される神経系細胞のもとになる神経幹細胞の増殖および神経系細胞への分化に対する温熱刺激効果については十分に検討されていない。我々は先行研究(Omori H, et al., Neurosci Res, 2014)で,マウスES細胞より神経幹細胞を作製した神経幹細胞の培養0日目に20分1回の温熱刺激を加え,その細胞を増殖培養すると,高温刺激を加えた細胞で細胞死と増殖抑制を引き起こし,非温熱刺激群と比較して細胞数が減少することを報告した。本研究では,移植細胞としての適した細胞作製のために,ES細胞より作製した神経幹細胞の増殖期および分化期における有用な温熱刺激条件の検討をする。初年度は,増殖期の神経幹細胞の増殖および生存への温熱刺激効果を先行研究よりさらに検討するため,増殖培養中の神経幹細胞の異なる時期で温熱刺激を加えて,温熱刺激効果の培養期間による違いについて検討した。マウスES細胞より神経幹細胞を作製し,増殖培養中の神経幹細胞に対して恒温槽を用いて温浴で温熱刺激を加えた。刺激時間20分間,非温熱刺激群,温熱刺激群(42°C以上)の条件で,温熱刺激時期を変えて温熱刺激を加えた。温熱刺激後,位相差顕微鏡を用いて単位面積当たりの残存細胞数を計測した結果,非温熱刺激群対する温熱刺激群の残存細胞数の割合(%)は,43°C以上の温度条件で時期によって差異が認められた。これにより,増殖期の神経幹細胞では,時期による温熱刺激に対する応答に違いがあることが示唆された。現在は,時期による温熱刺激応答の差異について解析を進めている。先行研究でマウスES細胞から神経幹細胞を作製・培養する方法,恒温槽を使用した細胞に対する温熱刺激方法,増殖の変化を評価する細胞数の計測方法,細胞死,細胞増殖抑制の評価方法など,検討に必要な実験方法が確立されており,温熱刺激条件変更のみで実験可能となっていた。1.増殖している神経幹細胞の時期による残存細胞数の差異を引き起こす要因,特に,細胞死,細胞増殖抑制について,タンパク質分析,遺伝子発現解析で検証する。2.各培養時期における神経幹細胞の増殖・生存に効果を示す温熱条件を熱ショックタンパク質の発現変化等を指標にして検討する。マウスES細胞由来神経幹細胞の作製および温熱刺激実験のための機器,試薬購入でおおむね使用した。次年度も引き続き,細胞培養,タンパク質分析,遺伝子発現解析実験の機器・試薬購入に使用する。
微生物機能の多面的活用による新規機能性脂質の創製

乳酸菌は機能性が注目されている共役リノール酸をつくる。ここでは、リノール酸から共役リノール酸への変換に関わる一連の酵素系を解明し、乳酸菌による共役リノール酸生産を確立した。さらに、油糧微生物の遺伝子操作や変異処理により、機能性が高い高度不飽和脂肪酸やステロール類の発酵生産技術を確立した。これら機能性脂質は、医薬・健康食品としての利用が多いに期待されるものである。本年度は、共役リノール酸と高度不飽和脂肪酸(PUFA)生産の効率化をめざした研究を行った。1.共役リノール酸生産の効率化をめざし、乳酸菌における共役脂肪酸生産酵素系の解析を行った。Lactobacillusplantarum AKU1009aはリノール酸を水和し、10-hydroxy-12-octadecenoic acid(HY)を生成した後、HYを脱水異性化することで共役リノール酸を生成する。L.plantarum AKU1009aより得たcell-free extractを超遠心し、膜画分と可溶性画分とに分画した結果、一連の変換反応に必要な蛋白質が両画分に分散していることを明らかにした。さらに、これらの蛋白質の精製を試みた結果、膜画分に一つ、可溶性画分に二つ、本反応に関与する蛋白質が存在することを明らかにした。2.アラキドン酸(AA)の工業生産糸状菌であるMortierella alpina 1S-4の分子育種によりPUFAの組成を大きく変えることに成功した。具体的には、RNAi法により、M.alpina 1S-4の脂肪酸鎖長延長酵素(MAELO)遺伝子の発現抑制を行ったところ、炭素鎖長22以上の飽和脂肪酸が検出されなかったことから、本酵素遺伝子は主に超長鎖飽和脂肪酸の生合成に関与していることが示唆された。グルコースを炭素源とした培地で培養すると、MAELO-RNAi形質転換株では超長鎖飽和脂肪酸が培養14日目でも検出されないことから、MAELO遺伝子発現抑制により超長鎖脂肪酸を含まないAA生産を示すことができた。また、AAをエイコサペンタエン酸(EPA)に変換するω3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を本菌株で過剰発現させ、EPAの生産量を4倍増加させることに成功した。このようにある特定の遺伝子の過剰発現により、PUFAの生産性を向上できることを示した。さらに、アグロバクテリウムを用いた形質転換系を開発した。胞子8x10^8個から約700株の形質転換体を得ることに成功した。またそのうち16株中15株においてゲノム上に1コピーの挿入が確認でき、継体培養を繰り返しても安定してその形質が保持されることが明らかになった。よりマイルドな条件での形質転換が可能となり、宿主に応じた形質転換法の選択が可能となった。(2)ステロール生産性Mortierella属糸状菌の形質転換系の構築とステロール高生産変異株の探索を行った。Mortierella alpina FA113株は天然では希少なデスモステロールを多く蓄積することを見出している。デスモステロール高生産を目指し、パーティクルガン法を用いてウラシル要求性を指標とした形質転換系を構築した。さらに、ニトロソグアニジンによる変異処理により、本菌からステロール高生産株を2株単離することができた。ひとつは、総ステロール量が親株の1.5倍向上した変異株であり、もう一方は総ステロールに占めるデスモステロールの割合が70%以上に達する変異株であった。1.これまでに、微細藻Prototheca sp.がn-アルカンをサブターミナル酸化経路によって代謝することを明らかにした。本年度は、微生物スクリーニングの結果、放線菌Streptomyces californicusやS.griseusがn-アルカンのサブターミナル酸化経路を有することを見いだした。n-ヘキサデカンを基質とした場合4位が、n-テトラデカンを基質とした場合2位が酸化された生成物が主に蓄積される。基質の鎖長によって酸化位置が異なることを初めて明らかにした。また、n-アルカン由来の生成物を同定したところ、n-アルカンはケトン誘導体、アルコール誘導体へと酸化された後、Baeyer-Villiger反応によりエステル誘導体となり、その後、加水分解され対応する1級アルコールと脂肪酸へ分解されると推測された。2.乳酸菌が触媒するリノール酸の共役リノール酸への異性化反応が、Δ9位の二重結合の水和による10-hydroxy-脂肪酸の生成と、脱水を伴う二重結合の転移という複数のステップから成り立つこと、膜画分に存在するCLA-HYと可溶性画分に存在するCLA-DH,CLA-DCの3つのタンパク質が関与することを明らかにしていた。本年度はLactobacillus plantarum AKU 1009aにおける本異性化反応の初発反応を触媒するリノール酸水和酵素CLA-HY、ならびに、二重結合転移に関与するshort-chaindehydrogenase相同蛋白質CLA-DHの機能解明を行った。

その結果、CLA-HYがFADを補酵素としリノール酸、オレイン酸、α-リノレン酸、γ-リノレン酸などを対応する10-hydroxy-脂肪酸へと変換すること、CLA-DHがNAD+存在下にて10-hydroxy-脂肪酸を対応する10-keto-脂肪酸へと変換することを明らかにした。これらの知見は、嫌気性微生物における不飽和脂肪酸異性化過程の詳細を酵素反応レベルで初めて解明した先駆的な成果である。
現代日本の思春期における定型化された自己解釈に関する実証的研究

現代日本における思春期・青年期の若者たちは、些細な欲求不満場面で容易に「ムカつき、キレる」傾向をもつ、ということがしばしば指摘される。本研究は、自己の感情の未分化で定型的な解釈が、若者たちのそうした傾向をもたらす一要因となっている、との仮説を実証的に検討しようとしたものである。1)予備的インタビュー研究により、一つの社会的場面から相互に矛盾する複数の感情が同時に生起する可能性については、小学校中学年の頃から理解できるようになることが確認された。したがってある場面での自己の感情を未分化に捉える傾向は、中学生以降の段階では発達問題ではなく個人差の問題であることが示唆された。2)だがその個人差は、発達的に形成されたものである可能性が高い。その先行要因を探る目的で、5種類の項目群から構成される質問紙を作成した。それらは、a)友人との社会的関係を自らコントロールする可能性についての自己効力感、b)欲求不満場面と怒りや攻撃的反応とを短絡的に結びつける傾向(攻撃性)、c)怒りや落ち込みなど、自分のなかの否定的感情に対する対処方略、d)幼少時から現在に至る父親との関係、e)幼少時から現在に至る母親との関係、を測定する項目群である。3)この質問紙により、中学生、高校生、および少年鑑別所収容少年を対象とする調査を実施した。鑑別所収容少年は欲求不満場面における攻撃性の処理に偏りのあるグループと想定される。3グループ別に因子分析を行ったところ、攻撃性や自己効力感等において、鑑別所群は中学・高校生の標準群に比べて相対的に未分化な因子構造を示した。4)標準群(中高生)と鑑別所群とでそれぞれ共分散構造分析を行い、両群の間に顕在・潜在諸変数間のパス構造の違いが見られるか否かを検討した。本年度の研究実施計画に従い、思春期前後の子どもたちの感情分化に関する尺度構成のための予備調査を進めてきた。1.自己解釈のために利用可能な認知カテゴリーの多様性を検討する目的で、Hartleyの20答法(TST)により日米の高校生の自己記述を比較したところ、日本の高校生よりもアメリカの高校生のほうが記述数が多く、内容面でも性格や態度など内的特性に関する記述が多いことが知られた。現在、顕著な差異を示すカテゴリーの有無、および自己認知の構造的な差異の有無について分析中である。また年齢的変化に関しても新たなサンプルを加えて検討することを予定している。(研究実施計画(1)に対応)2.感情解釈を含めて自己・他者理解に用いられる認知的スキーマの基本構造を明らかにするために、Selmanの対人視点取得(interpersonal perspective taking)発達理論に基づき小中学生のインタビュー・データを分析中である。小学校年齢の子どもたちは2値的判断(正-誤、好-悪、等)の認知構造をもち、対象の矛盾しあう感情価を統合することに構造的な困難さを有するとの予備的知見をえている。(研究実施計画(2)、(3)に対応)3.対象やできごとへの自己の反応の多義性(ambiguity)の認知と精神的健康度(GoldbergのGHQ)との関係を検討する目的で、日米の大学生のデータに基づき、同一事態に対する「現実の自己(actual-self)」、「あるべき自己(should-self)」、および「ありうる自己(can-self)」の反応を比較した。その結果、日米に共通の傾向として、3者間の高い一貫性は必ずしも精神的健康と結びつかず、また非一貫性にはポジティブとネガティブの両パターンが存在することが知られた。健康度と関連の深い指標項目を分析中である。(研究実施計画(4)に対応)

本年度の研究実施計画にもとづき、思春期前後の児童・青年を対象とした感情分化尺度の構成のために、前年度からの予備調査を継続・発展させつつ尺度項目の収集と整理を進めてきた。1.予備調査では、子どもの年齢による感情認知スキーマの構造的特質を明らかにする目的で、前年度に引き続き、対人視点取得(social perspective taking)に関するSelman課題によるインタビュー調査を行った。昨年度の調査では、小学校から中学校段階の子どもの認知様式として、人は同一状況に対して対立的な複数感情を抱きうることを理解するが、その両価的感情の統合の可能性については理解をもたないことが知られた。今年度の調査では、中学校から高校にかけての年齢段階において、人が自分のなかの対立的な視点を、より上位の視点(メタ視点)に立って相互に交流させ統合する可能性が理解されるようになること、これによって同一状況のみならず同一対象に対する両価的感情が自覚可能となることが知られた。またそれと並行して、個人間の対立についても積極的に対話や妥協といった視点の相互調整の可能性を探る姿勢が現れてくることが知られた。これらの発達的変化は、本研究の主題である定型的・短絡的な感情解釈の反応傾向に対して抑制的に作用することが予想される。2.定型的・短絡的な感情解釈の傾向に関して、上記予備調査で知られた発達差の次元と区別される個人差の諸次元を明らかにするための尺度構成の作業を続けてきた。予備的な分析により、発達的には同レベルのコンピテンスのもとでも感情解釈のパフォーマンスには大きな個人差がありうること、その個人差には発達的変化を通して解消に向かうものと持続するものとがあることが明らかになりつつある。(研究実施計画の(1)に対応)3.感情分化尺度が未完成のため、実態調査は実施できなかった。(研究実施計画の(2)、(3)に対応)1.前年度までの予備的調査を今年度も継続し、高校・大学生における複合感情や両価感情の理解をインタビュー調査で検討した。前年度までの結果も総合すると、中学生段階では特定状況での複合感情は理解されるが、それが特別な感情状態とみなされるのに対して、高校高学年から大学生になると、複合感情が通常であって、単一的な感情がむしろ例外的とみなされるようになることが知られた。自己解釈の複雑性を高めることが予想される複合感情の理解は中学校段階でひとまず達成されることが確認されたため、定型的自己解釈をテーマとする本研究では当初の予定通り中学校前後の年齢域に焦点をあてることとした。2.定型的自己解釈の尺度については、言語的にいくつかの社会的場面とそれへの非定型的反応を与えて(例:約束を破られて笑っている)、その考えうる理由を複数挙げさせる半投映法的課題を作成した。定型的な自己解釈傾向をもつ被験者は、反応の質、量ともに低得点となることが予想される。3.定型的自己解釈と「ムカつきキレる」反応との関係を探るために、攻撃性尺度に関する先行研究にもとづき、その複数の次元をカバーする質問項目を整理した。また親子関係が定型的自己解釈の背景要因となる可能性を検討するために、やはり先行研究にもとづき父親、母親別に過去と現在の親子関係の複数の次元をカバーする質問項目を整理した。こうして収集した質問項目について大学生を対象に予備的調査を行い、項目ごとの反応分布と項目間相関を分析して質問項目の絞り込みを行った。
神経回路網形成期における脊髄ニューロン群の自発性発射活動の機構

申請者は、これまでラット胎児の脊髄摘出標本を用いたin vitroの実験系にて胎生14.5日から17.5日にかけて腰髄前根に数秒間にわたる自発性発射活動が観察されることを見出し、その発現機構について電気理学的、薬理学的手法を用いて調べ、この時期に見られる脊髄運動ニューロン群の周期的な発射活動は、グリシン及びGABAA受容体を介した興奮性シナプス入力により引き起こされていることを明らかにした。本研究では、この運動ニューロン群の周期的な自発性発射活動を誘発する機構を単一ニューロンレベルで解析するために胎生15.5-16.5日の脊髄摘出標本を用いてブラインド・パッチクランプ法により脊髄腹側ニューロンのホールセル記録を行った。その結果、記録した細胞の大部分に腰髄前根の自発発射活動に同期した膜電位変化が観察された。この膜電位変化はテトロドトキシン、及びストリキニ-ネの潅流投与により完全に阻害されたことから、主にグリシン受容体を介したシナプス伝達によっていることが示唆された。次にこの膜電位変化のイオンメカニズムを調べるためにパッチピペット内溶液のCI^-イオン濃度を変化させ、この自発発射活動と同期したシナプス電位やシナプス電流の大きさとの関係を調べた。その結果、胎生15.5日の標本においては5mMのCI^-イオンから成るピペット内溶液の場合にはシナプス電位による活動電位は25%の細胞でのみ観察されたが、50-60mMの高濃度のCI^-を用いた場合には全例で活動電位が出現した。また、CI^-の高濃度溶液でホールセル記録したニューロンでは低濃度溶液で記録したニューロンと比較して2倍以上の大きさの内向き電流が観察された。このことから、CI^-イオンがこの発射活動を引き起こす上で重要な役割を担っていることが示唆された。
ホローファイバーバイオリアクターによるLAK細胞の培養

骨肉腫肺転移症例に対し、rIL-2とLAK細胞による養子免疫療法を行うことを目的として実験を行った。臨床的に効果を得るには少なくとも10^9コ以上のリンパ球が必要とされており、患者に負担をかけない20ml程度の血液から得られる少量のリンパ球から大量のリンパ球を得るために、ホローファイバーバイオリアクターを用いる方法を行った。培養液は2%ヒトAB血清添加AOM-V溶液を用い、rIL-2は383JRU/ml、amti-CD3抗体は25mgをPBS10mlで溶解し、150cm^2フラスコを同相化して用いた。細胞濃度は0.5×10^6/mlとした。フラスコでの培養開始後、ほぼ一週間でホローファイバーバイオリアクターに移行した。培養液は3日ごとに交換し、その都度IL-2を添加した。ホローファイバーバイオリアクターはCellmax 100(Cpllce Advanced Bioreactors Inc. Md)カートリッジはBitypeを使用した。これ全体をCo_2インキュベータ-内に入れ、培養した。リンパ球はExtrm fibre spaceにIL-2とともに培種し、循環側の培養液は5分間隔で流れる方向を転換し、Relative Flowは10%とした。ホローファイバーにリンパ球を移してから、1週目、2週目におけるリンパ球数、リンパ球表面マーカー、NK活性、LAK活性を測定した。結果、同相化したフラスコにより、12×10^7コのリンパ球から約1週間で46×10^8コのリンパ球を得る方法は確立された。しかし、リンパ球をホローファイバーに移してからはリンパ球を増殖させることはできなかった。リンパ球の表面マーカーではLem 4a陽性細胞(CD3)が、1、2週目とも9899%、Leu 2a陽性細胞(CD8)は1週目55%、2週目74%、Leu 3a陽性細胞(CD4)は1週目48%、2週目25%であり、経過とともにCo4/8比は小さくなった。細胞障害活性は1、2週目ともNK活性、LAK活性は数%と低値であった。臨床応用できる量のリンパ球は得られなかった。骨肉腫肺転移症例の治療の一手段となすべく、LAK細胞の大量培養を目的として実験を行っている。末梢血20ccから採取できる10^610^7個程度のリンパ球をホローファイバーに直接移して培養しても、2週間で10倍程度にしかならず、増殖力が弱く、培養液IL-2が無駄使いになる。そこで、まず従来の培養フラスコによる培養で、培養初期にIL-2とともにOKT3(抗CD3抗体)を添加する方法を行った。培養液は34日間に1度交換、IL-2をその都度、添加する。これにより約200倍のリンパ球を得ることが可能であることがわかった。しかし、これは細胞をsubcaltureしながら行った理論上の数字であり、得られる細胞全体を培養したものではない。この培養条件を維持したまま、細胞の増殖力を変化させないで、いかにホローファイバーに移行するかが今後の課題である。

ホローファイバーのバイオリアクター・カートリッジ1本で10^<10>個の細胞を維持できると言われており、10^610^7個程度の小数の細胞ではホローファイバーを使用する意味はなく、10^9個程度のリンパ球数になってからホローファイバーに移行するのが妥当だと思われる。培養液はAIM-Vが至適であり、血清は添加した方がよいが、しなくても細胞増殖には、それ程影響はない。細胞増殖が悪ければ、培養一週間目頃に、もう一度OKT-3により細胞を刺激することも考えている。骨肉腫肺転移症例で、多発性肺転移があり、腫瘍倍加時間の早いものに対しては手術適応はなく、化学療法が聞かなくなると手の施しようがない。このような症例への適応を目的としてLAK細胞の培養を行ってきた。ホローファイバーを用いて、血液20ml程度から採れる10^7個程度のリンパ球を培養しても細胞培養はよくなかった。これは、細胞増殖にはある一定以上の細胞密度が必要と考えられるためであった。そこで、培養初期には、容量の小さなフラスコを用い、さらにanti-CD3抗体を用いて、リンパ球に抗原刺激と同様の条件を与え、培養を行った。現在、一週間の培養で10^7個の細胞から4×10^8個6×10^8個程度の細胞は確実に得られることは判明した。今後、これらをホローファイバーにうつし、至適な培養条件の確立を達成するべき実験中である。骨肉腫肺転移例のLAK細胞による治療を目的として、ホローファイバーバイオリアクターを利用して、大量のリンパ球を得る実験を行った。昨年までに、anti-CD3抗体でリンパ球を刺激すれば、一週間の培養で、12×10^7個の細胞から46×10^8個の細胞が得られることが確実となったので、培養1週目に、ホローファイバーバイオリアクターに移し、さらに細胞を増殖させる実験を行った。またホローファイバーに移してから1週目、2週目におけるリンパ球の表面マーカー、NK活性、LAK活性を測定した。ホローファイバー中ではリンパ球を増殖させることはできなかった。リンパ球の表面マーカーではLeu4(CD3)陽性細胞が、1、2週目とも9899%、Leu2a(CD8)陽性細胞は1週目、55%、2週目74%、Leu3a(CD4)陽性細胞は1週目48%、2週目25%であり、経過とともにCD4/8比は小さくなった。細胞障害活性は1、2週目ともNK活性、LA活性は数%と低値であった。臨床応用には致らなかった。
分散型ロボット要素群による知的物体操作の研究

近年,ロボットに対し様々な環境下での作業が求められており,作業環境によっては器用な人間の指に代わって単純な機能を持つ複数のロボットによる操作が有効になる場合がある.本研究では,単純な機構を持ったロボット群で物体を安定把持・操作を行うことを目的として,分散型ロボット要素群を製作した.このような物体把持・操作の応用例としてはマイクロマシンを想定している.一つ一つのロボット要素をマニピュレーションエレメント(ME)と呼ぶことにする.製作したMEは,DCサーボモータにより直進運動する指(プッシュロッド)と,ばね特性を持つ受動関節からなる.指先にかかる力は,サーボモータに与えている電流値から計算する.また,受動関節の回転角はポテンショメータで検出する.複数のMEを用いて一つの対象物を安定把持・操作する制御法を構築した.制御法を構築するに当たり,MEと対象物間の力学的解析,幾何学的解析を行い,安定把持の条件を求めた.対象物を操作するのに一つ一つMEが実現すべき力を求める問題を力分配問題という.今回この分配問題を,拘束条件付きの最適化問題として解く方法と一般化逆行列を用いて解く方法の二つの方法で解いた.製作した四つのMEを用いて,対象物の安定把持・製作実験を行った.実験では実時間制御を行うことを考慮し,力分配問題を一般化逆行列を解く方法を採用した.対象物の並進移動,及び回転移動の実験を行い,良好な結果を得た.今回の研究により,分散型ロボット要素群による知的物体操作の基礎を確立した.近年,ロボットに対し様々な環境下での作業が求められており,作業環境によっては器用な人間の指に代わって単純な機能を持つ複数のロボットによる操作が有効になる場合がある.本研究では,単純な機構を持ったロボット群で物体を安定把持・操作を行うことを目的として,分散型ロボット要素群を製作した.このような物体把持・操作の応用例としてはマイクロマシンを想定している.一つ一つのロボット要素をマニピュレーションエレメント(ME)と呼ぶことにする.製作したMEは,DCサーボモータにより直進運動する指(プッシュロッド)と,ばね特性を持つ受動関節からなる.指先にかかる力は,サーボモータに与えている電流値から計算する.また,受動関節の回転角はポテンショメータで検出する.複数のMEを用いて一つの対象物を安定把持・操作する制御法を構築した.制御法を構築するに当たり,MEと対象物間の力学的解析,幾何学的解析を行い,安定把持の条件を求めた.対象物を操作するのに一つ一つMEが実現すべき力を求める問題を力分配問題という.今回この分配問題を,拘束条件付きの最適化問題として解く方法と一般化逆行列を用いて解く方法の二つの方法で解いた.製作した四つのMEを用いて,対象物の安定把持・製作実験を行った.実験では実時間制御を行うことを考慮し,力分配問題を一般化逆行列を解く方法を採用した.対象物の並進移動,及び回転移動の実験を行い,良好な結果を得た.今回の研究により,分散型ロボット要素群による知的物体操作の基礎を確立した.
農耕地を起源とするダイオキシン類の拡散に関する研究

ダイオキシン類は、今日知られている環境汚染物質の中でも特筆すべき強毒性化合物と云え、我が国の場合、嘗て散布された農薬中に不純物として含まれていたダイオキシン類による欧米に見られない特異的な農耕地土壌汚染が顕著である。従って我が国独自の視点に立脚した研究を展開する必要がある。そこで本研究課題では、農耕地からのダイオキシン類の流出とその環境中での存在及び挙動について検討した。農耕地土壌から農薬CNP中に不純物として含まれていた1,3,6,8-TCDD,1,3,7,9-TCDDが比較的高い濃度で検出された。水田土壌と河川底質中のPCDD/DFsは上流から下流域までほとんど同じ組成を示し、河川底質中のダイオキシン類の多くは農耕地からの流出によるものであることが示唆された。さらに水田から河川に流出する土壌粒子のうち、粒子径5μm以下の粒子にダイオキシン類は吸着・付着した状態で存在することを明らかにした。農作物への移行性について検討した結果、特に比較的高い濃度のダイオキシン類として1,3,6,8-TCDD及び1,3,7,9-TCDDが検出され、農耕地土壌から作物に移行することが示唆された。作物の中で果菜類であるきゅうりが高い傾向を呈した。淡水魚類にも1,3,6,8-TCDD,1,3,7,9-TCDDの高い濃度の蓄積が見られた。陸域生態系の高次生物として位置づけられる野生鳥類について、森林棲息性の猛禽類体内より高濃度が検出された。猛禽類のダイオキシン類摂取経路について、大気経由で森林樹木葉に吸着し、食物連鎖を通して植物食性の小動物に移行し、高次捕食者である猛禽類体内へ濃縮されたことが推定された。日本人のヒト血液に関する検討の結果、PCDDs,PCDFs及びCo-PCBsが7.4-23,000pg/g脂肪重、検出された。TEQ値では、7.0-46pgTEQ/g脂肪重であった。ヒト血液中の異性体は濃度が高い順に、1,2,3,7,8-PCDD次に2,3,4,7,8-PCDFであり、農薬中に不純物として含まれ農耕地土壌汚染を引き起こしている化合物はヒトでは代謝分解することが示唆された。統計分析の結果、魚を多食するヒトの血中ダイオキシン類濃度は比較的高い傾向を示し、さらに年齢との相関も見られ、ヒト体内における残留蓄積性を示した。ダイオキシン類は、従来の環境汚染物質とは異なり非意図的に人間活動で生成する化学物質として特徴付けられ、汚染の現状とその推移について社会的関心が高い。特に、我が国は農薬の不純物として含まれていたダイオキシン類の農薬散布にともなう農耕地土壌汚染が顕著で、欧米に見られない特異的な汚染を惹き起こしていると云える。

従って欧米における研究例を参考にわが国の汚染を考究することは困難で、わが国独自の調査・研究を展開する必要がある。そこで本研究課題では、農耕地における汚染の現状、農耕地から河川への流出機構、河川から海に至る汚染の拡大とそのメカニズムおよび水圏における魚介類への濃縮機構など、多面的にわが国におけるダイオキシン類の環境動態及びヒトを含む生物蓄積の特性を検討するものである。今年度は農耕地を中心に各種の土壌におけるダイオキシン類濃度とその給源、さらに農耕地を集水域とする陸水に生息する魚類の汚染実態とその給源について検討した。その結果、水田土壌中のダイオキシン類は農薬由来の1,3,6,8-TCDD,1,3,7,9-TCDDおよびOCDDが高濃度を呈する特徴的な残留組成を示し農薬散布の影響を呈した。さらに陸水に生息するオオクチバスなどの淡水魚中にもそれらの特徴的な組成が見られ農薬由来のダイオキシン類による汚染影響が示唆された。次に陸域から海域への拡散を解明するために瀬戸内海沿岸域の海水及び貝類試料についても検討した結果、燃焼生成ダイオキシン類とともに農薬由来のダイオキシン類汚染が海域まで拡大し、沿岸域に生息する貝類に取り込まれていることが明らかとなった。同一海域の海水中濃度と貝類中濃度を用いて生物濃縮係数を算出したところ、PCDDsは約7609,200、PCDFsは約66012,500、コプラナーPCBsは約11,000270,000であり、濃縮性はコプラナーPCBsが比較的大きく、次いでPCDDs及びPCDFsであった。ダイオキシン類(PCDD/DFs及びコプラナーPCBs)は、今日知られている化学物質の中でも毒性が強く、しかも環境中で安定で生態系を通じ高次生物に濃縮され、その汚染実態とゆくえについて社会的関心が高い。ダイオキシン類は人間活動によって非意図的に生成することが明らかにされており、特にわが国の場合、農薬中に不純物として含まれていたダイオキシン類の農薬散布に伴う農耕地汚染が顕著で欧米に見られない特異的な汚染状況を呈しており、わが国独自の視点に立脚した研究を展開する必要がある。本年度は、陸域生態系の高次生物である野生鳥類を対象に汚染実態の把握と蓄積の特徴について検討した。その結果、森林棲の猛禽類より高濃度検出され、大気経由で植物葉に吸着など森林生態系に取り込まれたダイオキシン類が食物連鎖を通して小動物に移行し最終的に高次捕食者に生物濃縮されるという汚染経路が考えられた。PCDD/DFs同族体及び異性体組成は種特異的で、棲息環境や食性などの生態学的要因によって異なった。ダイオキシン類のうちコプラナーPCBsの濃度レベルは、肉食性>魚食性>雑食性の順であった。特に、残留性を有し然も毒性の強い化合物が生態系の高次生物種へと次第に濃縮される傾向が明らかとなった。ダイオキシン類のうちTEQに寄与するPCDD/Fsは陸域環境からの供給が大きく、一方コプラナーPCBsは水圏生態系からの供給か大きいことが推定された。得られたデータをクラスター分析によって解析した結果、PCDD/Fs残留組成とそのTEQ寄与は、鳥種の生態学的特性と密接に関係していることが示唆された。わが国の陸棲野生鳥類のダイオキシン類汚染濃度は、これまで報告されている欧米を中心とする諸外国のデータとほぼ同程度であった。しかしながら、わが国の肉食性の鳥種では比較的高い濃度傾向を示した。このことは、汚染ルートに関して依然として不明な点があることを意味しており、今後さらに検討が望まれる。ダイオキシン類(PCDD/DFs及びコプラナーPCBs)は、これまで幾つかの事例で明らかなように具体的にヒトに対し健康被害を及ぼしたという観点から今日知られている環境汚染物質の中でも特筆すべき強毒性化学物質と言える。
植物低抗性遺伝子の発現制御

植物の病害低抗性の中でもファイトアレキシン合成経路の鍵酵素として特に重要な役割を担うフェニルアラニンアンモニアリア-ゼ(PAL)をコ-ドする遺伝子とカルコン合成酵素(CHS)をコ-ドする遺伝子について構造解析を行うとともに、各々の遺伝子にレポ-タ-遺伝子を融合させたキメラ遺伝子を作成し、植物細胞に導入した後、植物病原菌由来のエリシタ-を処理してレポ-タ-遺伝子発現に対する影響を解析した。更にGUSをレポ-タ-遺伝子としたキメラ遺伝子をタバコあるいはエンドウ細胞に導入したトランスジェニック植物体における遺伝子発現様式を調べた。1.PAL遺伝子に関する研究PAL遺伝子のプロモ-タ-配列にレポ-タ-遺伝子として発光遺伝子(Lux)、βーグルクロニダ-ゼ(GUS)遺伝子、クロラムフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ(CAT)遺伝子を融合したキメラ遺伝子の作成を行った。このうちpBI101をベ-スとしたPALーGUSのキメラ遺伝子はタバコ及びエンドウにバイナリ-ベクタ-法を用いて導入し、形質転換されたトランスジェニックタバコ及びトランスジェニックエンドウカルスを得たが、一部のトランスジェニック植物体でエンドウ褐紋病菌由来エリシタ-や病原菌接種によってGUS活性の増高が見られた。現在顕著なGUS活性を示した個体におけるキメラ遺伝子の染色体DNAへの挿入部位を調べている。一方、カリフォルニア大学デ-ヴィス校においてデュポン社製パ-ティクルガンを用い、各種のキメラ遺伝子を導入し、トランジェットなLux、あるいはGUSの発現を組織レベルで観察したところ、コントロ-ル実験での35SCaMVプロモ-タ-を有するキメラ遺伝子では顕著な活性が一部の細胞で見られたが、PALプロモ-タ-を連絡したキメラ遺伝子の導入ではエリシタ-処理によっても顕著な発現が観察されなかった。また、CAT遺伝子をレポ-タ-遺伝子とした系においては、キメラ遺伝子を主にエンドウの培養細胞由来のプロトプラストにエレクトロポレ-ション法を用いて導入し、トランジェントなCATの発現を測定することによってgPALー1遺伝子の転写調節に必要なシスエレメントの検索を行った。その結果、-340から-140までの上流領域にエリシタ-によって転写誘導を受け、エリシタ-による低抗性の誘導を阻害するオルトバナジン酸(原形質膜ATPア-ゼの阻害剤)により抑制されるエンドウgPALー1遺伝子の発現調節領域が存在することが明らかとなった。2.CHS遺伝子に関する解析エンドウのCHS遺伝子についてはエリシタ-処理を施したcDNAライブラリ-から、多数のcDNAのクロ-ニングを行い構造の解析によって3種の主要な2種のCHS遺伝子がゲノム上にタンデムに並んで存在していることを明かにし、上述のCAT遺伝子を用いたトランジェントアッセイによってこの2つのCHS遺伝子(PsCHS1,PsCHS2)はエリシタ-の処理を施さなくてもCATの活性を増高させるシスエレメントを各々の上流(PsCHS1:-1493+80;PsCHS2:-1889+83)にもつことが明らかにされた。3.植物病原菌が生産するシグナル物質の単離調製法と情報伝達機構の解析手法の研究調査平成3年12月にカリフォルニア大学カド教授を招へいし、岡山大学において長年進められてきた植物病原菌が生産するシグナル物質に関する研究を中心に調査を行った。カド教授は植物病原糸状菌の生産するエリシタ-・サプレッサ-の単離調製を行った。更にエリシタ-・サプレッサ-による植物細胞の初期情報伝達系に対する影響を解析するために岡山大学で研究されているATPア-ゼを始めとする種々の情報伝達系に関与する酵素活性の測定法や解析法について視察並びに討議を行った。また、CAT遺伝子をレポ-タ-

遺伝子とした系においては、キメラ遺伝子を主にエンドウの培養細胞由来のプロトプラストにエレクトロポレ-ション法を用いて導入し、トランジェントなCATの発現を測定することによってgPALー1遺伝子の転写調節に必要なシスエレメントの検索を行った。その結果、-340から-140までの上流領域にエリシタ-によって転写誘導を受け、エリシタ-による低抗性の誘導を阻害するオルトバナジン酸(原形質膜ATPア-ゼの阻害剤)により抑制されるエンドウgPALー1遺伝子の発現調節領域が存在することが明らかとなった。2.CHS遺伝子に関する解析エンドウのCHS遺伝子についてはエリシタ-処理を施したcDNAライブラリ-から、多数のcDNAのクロ-ニングを行い構造の解析によって3種の主要な2種のCHS遺伝子がゲノム上にタンデムに並んで存在していることを明かにし、上述のCAT遺伝子を用いたトランジェントアッセイによってこの2つのCHS遺伝子(PsCHS1,PsCHS2)はエリシタ-の処理を施さなくてもCATの活性を増高させるシスエレメントを各々の上流(PsCHS1:-1493+80;PsCHS2:-1889+83)にもつことが明らかにされた。3.植物病原菌が生産するシグナル物質の単離調製法と情報伝達機構の解析手法の研究調査平成3年12月にカリフォルニア大学カド教授を招へいし、岡山大学において長年進められてきた植物病原菌が生産するシグナル物質に関する研究を中心に調査を行った。カド教授は植物病原糸状菌の生産するエリシタ-・サプレッサ-の単離調製を行った。更にエリシタ-・サプレッサ-による植物細胞の初期情報伝達系に対する影響を解析するために岡山大学で研究されているATPア-ゼを始めとする種々の情報伝達系に関与する酵素活性の測定法や解析法について視察並びに討議を行った。