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定置型燃料電池システム用水素化ホウ素ナトリウムを燃料とする水素生成装置の開発

3 kWの定置用燃料電池に、水素化ホウ素ナトリウムの加水分解反応により水素を供給する生成装置を開発し、水素生成装置のモデルを導出し、そのモデルを使用して水素圧制御器を設計し、有効性を実機により確認した。また、粉体水素化ホウ素ナトリウムの水溶液を作るための燃料フィードユニット、複数の低電圧大電流入力昇圧電力変換回路、を提案し、シミュレーションや実験により評価を行った。また、それらを組み合わせた検証実験も行った。本年度実施した項目と得られた成果を以下に示す。1.定置型(ユニットハウス用)水素生成システムの開発水素リアクターについては、触媒担持方法を新たに考案するなどの設計を見直した関係で、次年度早々に発注することとした。また、燃料フィードユニットについては、3Dプリンターを使用してカートリッジを試作した。さらに、燃料電池で発電時に生じる水を回収し、水素生成に再利用することで、提案システムは小型化ができるが、この部分については、連携研究者(片山昇助教)の協力のもと、燃料電池システムを構築し、低出力域での試験を行った。定格域については、次項の電力変換システムとの組み合わせで今後検証する予定である。その他、始動時などに水素生成量を急速に増加させるための水素生成促進剤として希塩酸について検討し、実験によりその有効性を検証した。この成果については、3月に開催された平成26年電気学会全国大会で報告するとともに、5月に開催されるEVTeC and APE Japan 2014にて発表することが決定している。2.ユニットハウス用電力変換システムの設計・製作1の燃料電池は入手の容易さ、価格面を考慮した結果、低出力電圧・大出力電流形となったため、昇圧部の電力変換回路に対する要求仕様が高くなった。この燃料電池システムの出力容量に合わせて、幾つかの回路を検討し、設計製作した。一部の結果については、12月に開催された電気学会半導体電力変換/自動車/家電・民生合同研究会にて発表を行った。3.定置型システムの実証試験による基本性能の確認については、2で製作した電力変換回路の電圧サージの問題から、出力が上げることができていないため、燃料電池を接続した実験が行えていない。このため、サージ対策を施すとともに、別の変換回路についても検討・設計・製作し、次年度に実証試験を実施する予定である。1.定置型システムの実証試験提案システムの実証用燃料電池の定格出力電圧は18Vであり、一般家庭用の商用出力を得るためには、この電圧を810倍昇圧する必要がある。このための電力変換回路として、結合インダクタを用いたコンバータをインターリーブ化したDC-DCコンバータ(提案回路1)と多相絶縁型SEPICコンバータ(提案回路2)の実験を行った。その結果、提案回路1、2共に所望の昇圧比が得られることが示された。また、提案回路2を燃料電池に接続することで、燃料電池の定格まで実験を行うことができた。これらの結果は、8月に開催された電気学会産業応用部門大会(2件)、10月に米国で開催された国際会議(1件)、2月に開催された電気学会研究会(2件)で発表した。なお、その内の1件で、発表した学生がYPC優秀発表賞とIEEE IAS Japan chapter 2014YoungEngineer Competition Awardを受賞した。2.燃料カートリッジ及び燃料フィードユニットの改良提案システムでは、粉体燃料を水と混合し反応器へ送ることで水素を生成する。従来のシステム(燃料フィードユニット)では、粉体燃料をタンクから送る際に、10gずつ計量し、それを混合タンクに送る方式を採用していた。二軸型テーブルフィーダー方式を採用することで、排出量を制御可能な試作機を、今年度の研究で開発した。この試作機を用いた実験結果については、3月に開催された電気学会全国大会で発表した。その他、水素生成促進剤の水素生成速度の向上効果について検証し、その結果を5月に横浜で開催された国際会議で発表した。高昇圧比を有する電力変換回路をこれまでに複数提案しているが,その中の一つは,スイッチ及びダイオードでのサージ電圧が問題になっていた。そこで,その回路をベースに新たに2つの回路を提案し,昇圧比や動作波形の比較をシミュレーション・実験で行った。また,もう一つの回路である六相SEPICコンバータについては,負荷の要求する電力の変化に伴い,燃料電池の出力電圧(コンバータの入力電圧)が変わっても,コンバータの出力電圧を一定に制御できる電圧フィードバック法を適用し実験により有効性を示している。これらの結果は,国際会議(1件),国内学会(1件)で発表した。そのほか新たに多段のインターリーブ方式整流回路について検討を行った。触媒の固定方法が従来と異なる新しい水素リアクタを製作し検証したが,従来のリアクタに比べ,水素生成能力が劣る(反応率が低い)などの問題があることが明らかになった。また,提案水素生成器の始動時間を,前年度までに開発した燃料フィードユニットを用いることで,従来のバッチ処理的な供給方法に比べ67%短縮できた。そのほか定置用燃料電池スタックの発電時の水生成量を測定したが,期待した水量(50%以上)が得られていない。そのため復水器の強化が必要であることが明らかになった。これらの結果の一部は,国内学会(2件)で発表した。

水素生成システムのモデル化の有効性検証を行った結果,導出モデルを用いて水素圧力を制御することで,従来のオンオフ制御に比べて,水素圧力の変動が抑制できることが明らかになった。これらの結果は,国際会議(1件),国内学会(2件)で発表した。低温時などに水素生成反応を加速するために添加する,水素生成促進剤について,クエン酸の添加が必要な温度条件の導出や,副生成物回収後の処理が簡単になるホウ酸を利用した場合の水素生成速度等の検証を行った。これらの結果は,国際会議(2件)で発表した。3 kWの定置用燃料電池に、水素化ホウ素ナトリウムの加水分解反応により水素を供給する生成装置を開発し、水素生成装置のモデルを導出し、そのモデルを使用して水素圧制御器を設計し、有効性を実機により確認した。また、粉体水素化ホウ素ナトリウムの水溶液を作るための燃料フィードユニット、複数の低電圧大電流入力昇圧電力変換回路、を提案し、シミュレーションや実験により評価を行った。また、それらを組み合わせた検証実験も行った。交付申請時に記載した今年度の研究実施計画では、1.定置型システムの実証試験、2.燃料カートリッジ及び燃料フィードユニットの改良を実施することにしていた。研究実績の概要に示した通り、今年度はこの2点について主に研究を実施し、国内及び国際学会で発表を行った。その内、平成26年電気学会産業応用部門大会ヤングエンジニアポスターコンペティション優秀発表賞及びIEEE Industry Applications Society Japan Chapter 2014 Young Engineer Competition Awardを大学院生が受賞するなどしている。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。パワーエレクトロニクス水素エネルギー社会に対する期待がより高まっている中、本研究で用いている粉体燃料を用いた燃料電池電気自動車について、昨年10月にはテレビ番組で取り上げられるなど、本研究に対する期待も高まっている。今年度実験を行った結果、提案回路の効率が若干低い点もあり、この改善を行う。また、燃料電池で発生した水の量が現段階では予想より少ないため、より多くの水を回収し利用するシステムの構築を行う予定である。さらに、燃料カートリッジ、及びリアクタの改良についても予算の範囲内で引き続き行う予定である。研究実績の概要で述べたとおり、入手の容易さ、価格面を考慮した結果、入手した燃料電池は低出力電圧・大出力電流形となった。このため昇圧回路では10倍の昇圧比が必要になった。このことを考慮して、電力変換回路を設計・試作したが、大きな電圧サージが半導体デバイスに印加されてしまうため、高負荷(定格負荷)領域での実験が行えていない。現在、配線長やスナバ回路等を見直すことで、この対策を行っている。また、別の昇圧回路についても、試作を進めている。一部遅れている部分もあるが想定の範囲内であり、提案回路については低出力領域で所望の結果が得られ学会発表も行っており、国際会議にもアブストラクトを投稿中である。
腸炎ビブリオのIII型分泌装置およびそのエフェクターの発現制御についての解析

本研究では、腸炎ビブリオに新たに見出された2セットのIII型分泌装置(TTSS1とTTSS2)およびそれらの分泌蛋白(エフェクター)の発現条件とその発現制御機構について研究を行った。本研究により得られた研究成果は以下である。TTSS1、TTSS2それぞれの装置遺伝子およびエフェクター遺伝子のさまざまなin vitro条件における発現を検討した。その結果、TTSS1は培養の早期(log期)から発現がみられるのに対し、TTSS2は比較的後期から定常期により強い発現がみられた。またTTSS1、TTSS2ともに、腸炎ビブリオの増殖至適条件である塩濃度3%ではなく、1%以下の時により強い発現が見られた。また30°C以上の温度でともに発現が上昇した。これらの結果は、両TTSSの発現至適条件を示唆するものである。TTSS1、TTSS2ともにゲノム上でそれらの遺伝子の近傍に、それぞれの発現制御をしていると考えられる遺伝子が見いだされた。その詳細について解析した結果、TTSS2に関しては、上流下流の関係にある2つの制御蛋白がTTSSを含むpathogenicity island(Vp-PAI)の領域全体の遺伝子を正に発現制御していることが明らかになった。また今回見いだされた制御遺伝子が制御する遺伝子を同定するためマイクロアレイを用いて解析を行ったところ、その発現制御はVp-PAI領域内の遺伝子群に特異的であることが示された。以上のように、本研究により腸炎ビブリオに新規に見出された2セットのIII型分泌装置およびそれらのエフェクターの発現条件と発現制御機構の概要を明らかにすることができた。この成果は腸炎ビブリオの病原性を理解する上で重要な知見であるとともに、病原因子であるTTSSの発現抑制による感染制御にもつながる結果である。本研究では、腸炎ビブリオに新たに見出された2つのIII型分泌装置(TTSS1およびTTSS2)およびそれらの分泌蛋白(エフェクター)の発現条件を明らかにするとともに、その発現制御機構を解明することを目的とし研究を行っている。本年度得られた成績を挙げる。この結果はTTSS1がquorum sensingにより負に制御されるというこれまでの報告に一致する。ただし培地の種類により各TTSSの発現は大きく異なることから、栄養成分や微量分子が発現に大きな影響を与えることが考えられ、今後の検討に注意が必要である。今後はこれら新規に見いだされた遺伝子の役割について詳細に解析していくとともに、上に述べたin vitro条件における発現との関係を解析して行く予定である。また、今回見いだされた制御遺伝子が制御するTTSS関連以外の遺伝子を同定するため、マイクロアレイを用いた腸炎ビブリオ全遺伝子の発現プロファイルの解析も行っていく。TTSS1、TTSS

2ともにゲノム上でそれらの遺伝子の近傍に、それぞれの発現制御をしていると考えられる遺伝子が見いだされた。その詳細について解析した結果、TTSS2に関しては、上流下流の関係にある2つの制御蛋白がTTSS2を含むpathogenicity island (Vp-PAI)の領域全体の遺伝子を正に発現制御していることが明らかになった。また、今回見いだされた制御遺伝子が制御する遺伝子を同定するためマイクロアレイを用いた腸炎ビブリオ全遺伝子の発現プロファイルの解析を行ったところ、その発現制御はVp-PAI領域内の遺伝子群に特異的であることが示された。さらに、この発現制御遺伝子の過剰発現系を用い、TTSS2のトランスロコンおよび新規なエフェクターを同定することができた。この成果は腸炎ビブリオの病原性を理解する上で需要な知見であるとともに、病原因子であるTTSS2の発現抑制による感染制御にもつながる結果である。今後はこれら新規に見いだされた制御遺伝子の発現制御機序について分子レベルで詳細に解析していくとともに、in vitro条件における発現との関係を解析して行く予定である。
酵素のキラル分子認識機構の熱力学的解析

Burkholderia cepacia由来リパーゼの3-phenylbutyric acidに対する光学選択性を熱力学的、構造学的に解析を行った。光学選択性の改変された4重変異体4種類の大量生産系構築を行った。1リットルの培養液当たり233mg以上の組換えリパーゼの発現が確認された。精製酵素を用いて結晶化実験を行い、20-30%のイソプロパノールを共沈剤として用いた条件で針状結晶がえられ、X線回折データの取得を行った。また、キラルカラムを用いて、ラセミックな基質に対する選択的分解を観察する手法を開発した。Burkholderia cepacia由来リパーゼの3-Phenylbutyric acidに対する光学選択性を熱力学的、構造学的に解析するために、まず、野生型のBurkholderia cepacia由来リパーゼおよび、光学選択性の改変された4重変異体4種類の大量生産系構築を行った。リパーゼ欠損変異Burkholderia cepaciaを用いた分泌発現系を構築し、オレイン酸を発現誘導体として分泌発現を行い、1リットルの培養液当たり233mg以上の組換えリパーゼの発現が確認された。本培養液中に含まれるタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性カラムクロマトグラフイーに供して精製した。pnitrophenyl butyrateの分解活性で精製酵素の直鎖状エステルに対する酵素活性を評価し、変異導入によって比活性が時下していない事を確かめた。また、本リパーゼの光学選択性を評価するための基質として3-Phenylbutyric acidのエステルを合成し、キラルカラムクロマトグラフィーによる分離条件、及び各3-Phenylbutyric acidエナンチオマーの溶出時間を決定した。ラセミックな基質を精製したそれぞれの酵素で反応し、その分解産物中に含まれる光学異性体をキラルカラムにより定量し、光学選択性を評価する方法を確立した。得られたX線回折データを解析したが、十分な回折点の強度が得られず構造決定にはいたらなかった。良質な結晶が得られない理由として培地成分中の低分子化合物の混入が考えられたので、分子量の差を利用した分離法で高純度精製を行うことに成功した。Burkholderia cepacia由来リパーゼの光学選択性を解析するために、本酵素の基質である3-phenylbutyric acid p-nitrophenyl esterのR体、S体、およびラセミ体をそれぞれ合成した。キラルカラムによるR体およびS体の3-phenylbutyric acid分離条件を決定し、リパーゼ反応産物の分析を行った。p-nitrophenyl butyrateの分解活性で精製酵素の本基質に対する酵素活性を評価し、野生型及び変異型で酵素活性に大きな差が無いことを確かめた。また、変異酵素においてS選択的であった光学選択性がR選択的に変化していることがわかった。昨年度、結晶構造の得られなかった野生型のBurkholderia cepacia由来リパーゼおよび、光学選択性の改変された4重変異体4種類について、発現時の分解を抑制して精製したところ、結晶化に適した高純度精製表品を得ることに成功した。本酵素を用いて結晶化実験を行ったところ、20-30%のイソプロパノールを共沈剤として用いた条件で良質な結晶がえられ、X線回折データの取得を行った。得られたX線回折データの分子置換法による解析を行った。構造データをもとにしたモデルを作成し、変異体と野生型で基質結合部位を比較したところ、基質のフェニル基が結合すると思われる位置にあるフェニルアラニン側鎖の除去と、基質のメチル基が結合する部分の疎水性アミノ酸側鎖の体積が基質の光学選択性に影響していることが示唆され、機能改変に向けたタンパク質工学的改変の方針を示すことができた。
室町時代の居士仏教に関する基礎的考察

本研究は、宗教実践者(在俗信徒)としての公家・武家勢力に着目し、世俗社会にとっての宗教、宗教にとっての世俗社会の歴史的評価を試みる。最終年度は、補助的な資料調査・分析を行いつつ、論文執筆や報告に努めた。在俗者の受戒について、重受の場合には、古来、賛否両論があったが、この議論は室町期にも影響を残している。滅罪の効能が期待された十重戒には、国王・大臣が職に就いた際に受戒するべきとする『梵網経』の規定がある。そうした主張は、15世紀の仏教界にもみられ、室町殿や天皇の受戒をも意義づけた。そのため、在俗信徒である彼らが受戒する際には、剃髪ではなく、有髪であることに政治的・宗教的意味があった。一方、在俗者の剃髪に対して、仏教界には抵抗感があったが、法体俗人の衣服規定が定められるなど、およそ16世紀をピークとして、その後、ゆるやかに減退する社会現象であると推測される。在俗者の視角から、転換期・移行期とされる近世初頭までのアウトラインを素描することができた。拙稿1「宗教勢力としての中世禅林」では、禅、天台、律、法華、浄土真宗などを視野に入れ、中世後期の宗教勢力の総体に迫った。宗教勢力を社会集団とみる際、彼らが宗派としての結束性だけでなく、地縁・職能などの社会的属性をもって他集団と結びつく分散性に着目。僧侶から居士号や法衣を授与され、道場主も務めたような、俗人の主体性や宗教的地位の向上が、中世仏教の社会定着の基軸になったと展望した。拙稿2「法名・道号・房号」では、鎌倉仏教から戦国武将にいたる、歴史人物の名前の表記法・呼称法が、不統一である点を指摘した。口頭報告では、南北朝期の京都における宗教勢力の情勢に関して報告した。室町期を対象とする本研究の時間軸を広げる意味をもつ。また、中世仏教の僧坊における飲酒・酒宴の特質に関する報告は、仏教堕落論を批判的に検討する本研究にとって、副産物といえる。28年度が最終年度であるため、記入しない。研究初年度の今年度は、(1)関連資料の収集・整理などの基礎的作業、(2)学会・シンポジウムでの研究報告4本を行った。(1)受入機関である東京大学史料編纂所を中心に、関係諸機関や寺院に出張して史料調査を実施した。調査対象は、15世紀を中心に、出家剃髪の俗人あるいは有髪受衣の俗人である。室町殿のほとんどは、剃髪せず受衣(袈裟の拝受)と安名(道号法諱の命名)を五山僧から受けたが、在家の受衣安名儀礼は室町殿以外にも確認でき、「有髪の僧」と称される武家や公家が散見される。また、義満の受戒時とみられる延暦寺戒壇院の図を確認することができた。一方、在家のまま剃髪・受衣する社会慣習に対する顕密仏教側の批判も発見した。在俗居士の社会的地位や増加現象、中世後期の社会と宗教を総評するうえでも見逃せない、貴重な視点を獲得している。(2)研究報告の場にも恵まれた。(a)本研究の骨子に関わって、室町時代研究と宗教史研究の可能性をめぐり、課題の所在や視座・方法論について論じた。今後の著書出版にも直接反映する成果である。(b)15世紀前半、華厳・唯識など顕密仏教の教学が南都律僧を介して京都・五山にもたらされ、その知識が室町殿の道号や儒仏一致に影響したことを解明した。(c)国際シンポジウムでは、室町・戦国期に興行された天神法楽連歌のあり方、正月奉納などの事実を明らかにし、その社会的・宗教的背景を論じた。この他、フランス国立極東学院(EFEO)で一休宗純の研究が行われ、議論を共有している。本研究は、公家・武家勢力の宗教実践者(在俗信徒)としての側面を重視し、その歴史的評価を試みる。今年度も東京大学史料編纂所や関係諸機関で資料調査・分析を進めた。俗人の宗教実践や出家の当否に関する中世仏教の考え方は一様ではなく、顕密系よりも新仏教系の方がやや寛容にみえるが、慎重に検証する余地がある。また俗人の道服着用については、15世紀と16世紀で若干の変化がみられる。在俗信徒の存在形態をしるうえで興味深い現象である。これらの成果の一部は以下のとおり。(a)東京国立博物館その他が所蔵する連歌師肖柏(牡丹花)画像賛の比較分析・読解を進めた。同画像の隠者風の衣装は「居士形」を具体的に示す一例であり、肖柏が出家と「還俗」を経て「肖柏居士」と称される経緯、「居士」の存在形態を考察した(報告「遁世芸能者の居士肖像ー連歌師肖柏と中世宗教」)。(b)14世紀の未刊禅語録や関連史料を用いて、当時の仏教者の熊野参詣やその交通路を明らかにし、熊野別当家・海賊勢力と仏教の展開を関連づけて論じた(報告「鎌倉末期の熊野参詣と禅律僧」)。(c)フランス国立極東学院(EFEO)東京支部主催シンポジウムで報告した。

時代の大転換期とされる室町時代像と、戦後歴史学や評論家によって造形された一休像をめぐる時代背景を探ると同時に、当時の仏教界における民衆救済や飲酒女色の問題に対する新しい捉え方を提起し、英雄史観を排した客観的な宗教社会史の必要性を主張した。同シンポは約150名の参加者を得て活気ある討論会となった。本報告は拙稿「一休が生きた時代」の延長線上にある成果といえる(報告「一休宗純論と室町時代像」)。この過程で知見を深めた内容は、別稿「宗教勢力としての中世禅林」に発表予定である。検出数は膨大であるものの資料調査は進んでおり、新史料など今後につながる嬉しい発見もあった。またフランス国立極東学院などの企画を通して、室町仏教を論じる上でも無視できない一休宗純について考えを深める機会を得たことは僥倖であった。本研究は、宗教実践者(在俗信徒)としての公家・武家勢力に着目し、世俗社会にとっての宗教、宗教にとっての世俗社会の歴史的評価を試みる。最終年度は、補助的な資料調査・分析を行いつつ、論文執筆や報告に努めた。在俗者の受戒について、重受の場合には、古来、賛否両論があったが、この議論は室町期にも影響を残している。滅罪の効能が期待された十重戒には、国王・大臣が職に就いた際に受戒するべきとする『梵網経』の規定がある。そうした主張は、15世紀の仏教界にもみられ、室町殿や天皇の受戒をも意義づけた。そのため、在俗信徒である彼らが受戒する際には、剃髪ではなく、有髪であることに政治的・宗教的意味があった。一方、在俗者の剃髪に対して、仏教界には抵抗感があったが、法体俗人の衣服規定が定められるなど、およそ16世紀をピークとして、その後、ゆるやかに減退する社会現象であると推測される。在俗者の視角から、転換期・移行期とされる近世初頭までのアウトラインを素描することができた。拙稿1「宗教勢力としての中世禅林」では、禅、天台、律、法華、浄土真宗などを視野に入れ、中世後期の宗教勢力の総体に迫った。宗教勢力を社会集団とみる際、彼らが宗派としての結束性だけでなく、地縁・職能などの社会的属性をもって他集団と結びつく分散性に着目。僧侶から居士号や法衣を授与され、道場主も務めたような、俗人の主体性や宗教的地位の向上が、中世仏教の社会定着の基軸になったと展望した。拙稿2「法名・道号・房号」では、鎌倉仏教から戦国武将にいたる、歴史人物の名前の表記法・呼称法が、不統一である点を指摘した。口頭報告では、南北朝期の京都における宗教勢力の情勢に関して報告した。室町期を対象とする本研究の時間軸を広げる意味をもつ。また、中世仏教の僧坊における飲酒・酒宴の特質に関する報告は、仏教堕落論を批判的に検討する本研究にとって、副産物といえる。研究活動の中心を史料収集・整理に置いたことで、今後研究をすすめるうえでの基礎を固めている。研究報告の場にも恵まれ、当初の研究対象に加えて、南都仏教や連句文芸にも議論を展開することができた。従来取り組んできた研究も含めて総括する議論もおこなっており、研究成果をまとめる計画は順調に進んでいる。前年度も成果公表の機会は多かったが、資料調査から情報整理・執筆作業に比重を移す。資料調査も受入機関外を含めて必要な範囲で補足的に継続する。28年度が最終年度であるため、記入しない。前年度に行った研究報告の論文化・投稿、著書出版計画を進める。同時に資料収集・整理作業は継続し、とくに世俗社会・権力側の分析を深めていく。また引き続き学会報告にも取り組む(上半期に1件の学術大会報告にエントリー済である)。
分析化学的手法を用いた遺跡朱の産地同定方法の開発

古代中国の辰砂産地である陳西省と雲南省を訪問し、辰砂鉱石を得てこれを分析した。その結果、弥生時代後期の日本海沿岸の遺跡朱は従来考えていた中国貴州省産辰砂ではなく、陳西省産辰砂の可能性が大であることが判明した。さらに、遺跡および辰砂鉱石の鉛同位体分析方法を開発した。朱(硫化水銀)はその生成時に他の金属を巻き込むことは少なく、陳西省産辰砂に含まれる鉛量も微量であった。しかし、陳西省産、貴州省産、丹生鉱山産、大和水銀鉱山産鉛同位体に明らかな違いが認められた。さらに、遺跡出土朱の鉛同位体分析も可能であったが一緒に出土した青銅器由来と考えられる鉛同位体値が観察された。遺跡より朱をサンプリングするときはコンタミがない状態でサンプリングしなければならないが、作業現場で実際にサンプリングをおこなうものにその心構えがないことが多く、難しい問題である。以上より、本研究成果として中国陳西省産辰砂が弥生後期に日本海沿岸にもたらされた可能性がイオウ同位体比分析の結果から推察された。また、鉛同位体分析も測定できるシステムを構築したが、イオウ同位体比分析に比べて細心な注意が遺跡朱のサンプリングに必要である。弥生時代後期から古墳時代に祭礼儀式として遺跡内部の遺体の装飾や壁に彩色する目的で赤色顔料の朱(別名辰砂、硫化水銀)が用いられた。この朱の産地同定が可能になればちょうど古代大和王朝誕生前後の時期と重なることから、大和王朝の影響下にあるか、あるいは中国から直接影響を受けているかが判明すると考え、朱の産地同定を試みた。朱に含まれるイオウの同位体を調べると中国大陸産と日本産で明らかな違いがあった。しかし、中国大陸には4つの大きな辰砂鉱脈が存在することが分かっているので、その中でも古代中国で稼動していたと思われる3つの鉱脈の内、陝西省と雲南省を訪問し、古代日本へもたらされた可能性について調査した。他の1鉱脈は貴州省であり、以前に調査している。その結果、陝西省旬阻県には古の坑道跡が残っており、近くで今も豊富な埋蔵量を誇り稼動している辰砂鉱山を訪ねることができた。そこでは地下坑道から朱鉱石の採取も許され、帰国後にイオウ同位体分析を行った結果、北九州から山陰一帯の有力者遺跡で使用された朱と類似の値を示した。当地は古代都の長安より徒歩1週間の距離にあり、当時の皇族が納めていた重要な拠点であった。一方、当時の属国であり辰砂鉱山の存在が知られていた雲南省鉱石は、帰国後のイオウ同位体分析結果から、古代日本で使用した可能性が低いと判断した。次に弥生後期の北九州で日本産辰砂鉱石が使用された可能性を調べるため、長崎県の旧鉱山である波佐見鉱山と江戸時代に開発された同県相浦鉱山を巡検した。両鉱山の場所は今回はじめて特定できたが、採取した鉱石のイオウ同位体分析結果から当地の辰砂鉱石が北九州地域の遺跡で用いられた可能性は低いと判断した。イオウ同位体分析は朱の産地推定の強力な武器であるが、確実性を高めるため地域によって異なる値を示す鉛同位体分析も試みている。20年度は、19年度に採取した中国陜西省の辰砂鉱山鉱石の分析と、弥生時代後期と古墳時代黎明期の遺跡出土朱の分析を行った。陜西省鉱山は秦時代にさかのぼる可能性が高い地域に存在する鉱山であり、そのイオウ同位体比は貴州省のものと異なり、弥生後期日本海側遺跡出土朱の値とほぼ重なる値を示した。従来、貴州省産と考えられていた朱も陜西省産の可能性が高くなった。惜しむらくは、20年度に四川省辰砂鉱山の訪問を企画していたが、地震の震源地近くであったため中止せざるを得なかった。一方、イオウ同位体比と2次元マップを作成する計画は、鉛同位体比分析が順調に進み、朱においても混在している微量鉛から鉛同位体比分析を行うことが可能であり、産地が判明している日本産辰砂鉱石と中国産辰砂鉱石から明らかな違いを観察することが出来た。

この結果から、いくつかの遺跡出土朱からも中国産と日本産の区別が可能と思われるデータを得ており、イオウ同位体比分析と鉛同位体比分析の2次元マップの作成が近い将来可能である。このことにより、ますます信頼性の高い遺跡出土朱の産地推定が行えると確信している。本研究成果はいくつかの論文と学会発表で公表しているが、今後研究計画に記載したように文化財研究者へ広く情報提供していく予定である。
精神障碍者の地域定着のための対話技法の開発：精神医療倫理の基礎研究として

現在、精神障碍者の地域定着・就労支援が課題とされている。本研究の目的は、精神障碍者の地域定着・就労支援事業において予想される問題を解決し、協力関係を構築・強化するための対話技法を構築することである。具体的には、紛争解決のための対話技法としてのコンフリクト・レゾリューション理論と、精神障碍者との対話技法であるオープン・ダイアローグを組み合わせた対話技法を開発することである。
肝内胆管癌におけるマイクロRNAの役割解明とバイオマーカー開発のための分子基盤

胆管上皮細胞特異的miRNAの標的となるmRNAの同定と機能解析を行いました。胆管上皮細胞特異的miRNAの標的mRNAが受容体チロシンキナーゼ関連分子である成長因子受容体結合蛋白質が標的分子であることを明らかにしました。肝内胆管癌細胞では、胆管上皮細胞特異的miRNAの発現が抑制されることで成長因子受容体結合蛋白質の発現抑制が解除され、その発現が上昇し、成長因子からチロシンキナーゼ型受容体を介した下流のシグナル伝達が増強された結果、肝内胆管癌の細胞運動能が向上する新知見を見出しました。本研究は、新たに見出した胆管上皮特異的microRNA(miRNA)の転写後翻訳調節が肝胆道系疾患(肝内胆管癌、閉塞性黄疸等)関連シグナル伝達経路にどのように関わるのか、機能解析を目指すとともに、miRNAの切り口から肝内胆管系疾患の分子病態の解明と診断のための新規バイオマーカー開発のための基盤研究を目的に研究を行った。1)胆管上皮細胞特異的miRNAの標的mRNAの検証:胆管上皮細胞特異的miRNAの標的mRNAの3'-非翻訳領域をルシフェラーゼ遺伝子のコード領域の下流に挿入したレポータープラスミドを構築し、当該miRNAとともにCOS-7等に導入・培養後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼアッセイにより、受容体チロシンキナーゼ(RTK)関連分子が標的であることを明らかにした。2)miRNA機能解析:培養肝内胆管癌細胞株に、特異的miRNAを過剰発現させ、RTK→Ras/Raf/MAPKカスカスケードのシグナル分子を、real-time PCRにてmRNAレベルにおける発現変動を解析した。3)閉塞性黄疸に特徴的なmiRNAプロファイル解析:閉塞性黄疸は、さまざまな肝臓疾患において起こる病態であり、マウス閉塞性黄疸モデル(BDLモデル)を用いてmiRNAの発現プロファイル解析を行った。マウス肝臓組織のsmall RNAライブラリーから、総数17,565個のクローンのシークエンス解析に成功した。プロファイル解析から特徴的なmiRNA、13個を見出した。また、胆管上皮細胞特異的miRNAのうち、シークエンス解析においてBDLモデルにのみ発現を認めたmiRNAに関してreal-time PCR法を用いた定量的検証を行ったところ、miR-199aはBDLモデルの肝臓で有意に発現上昇していた。閉塞性黄疸に特徴的なmiRNAをはじめて明らかにすることができた。我々が新たに見出した胆管上皮特異的microRNA(miRNA)の転写後翻訳調節が肝胆道系疾患(肝内胆管癌、閉塞性黄疸等)関連シグナル伝達経路にどのように関わるのか、機能解析を目指すとともに、miRNAの切り口から肝内胆管系疾患の分子病態の解明と診断のための新規バイオマーカー開発のための基盤研究を目的に研究を行った。1)胆管上皮細胞特異的miRNAの標的mRNAの検証:胆管上皮細胞特異的miRNAの標的mRNAの3'-非翻訳領域、さらには3'-非翻訳領域中に存在する標的配列を改変した変異を含むレポータープラスミドを構築し、当該miRNAとともにCOS-7等に導入・培養後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼアッセイにより、受容体チロシンキナーゼ関連分子である成長因子受容体結合蛋白質が標的分子であることを証明した。2)miRNA機能解析:胆管上皮細胞特異的miRNAは正常胆管上皮細胞では特異的に発現しているが、肝内胆管癌細胞株(HuCCT1)では発現していない。そこで、HuCCT1細胞に特異的miRNAを過剰発現させ、運動能、増殖能、アポトーシスの解析を行った。トランズウェルを用いた運動能の解析を開始した。過剰発現後にウェル下面に移動した細胞数をカウントすると、胆管上皮細胞特異的miRNAを過剰発現させたHuCCT1細胞では移動した細胞が有意に減少すること見出した。このことは、肝内胆管癌細胞では胆管上皮細胞特異的miRNAの発現が抑制されることで成長因子受容体結合蛋白質の発現抑制が解除され、その発現が上昇し、成長因子からチロシンキナーゼ型受容体を介した下流のシグナル伝達が増強された結果、肝内胆管癌の細胞運動能が向上することが示唆された。現在、詳細な機能解析を継続している。我々が新たに見出した胆管上皮特異的microRNA(miRNA)の転写後翻訳調節が肝胆道系疾患(肝内胆管癌、閉塞性黄疽等)関連シグナル伝達経路にどのように関わるのか、機能解析を目指すとともに、肝内胆管系疾患の分子病態の解明と診断のための新規バイオマーカー開発のための基盤研究を行った。1)miRNA機能解析

:HuCCT1細胞に特異的miRNAを過剰発現させ、増殖能、移動・浸潤能の解析を行った。miRNA過剰発現HuCCT1細胞に上皮成長因子を添加し、上皮成長因子受容体(チロシンキナーゼ関連型受容体)を活性化(リン酸化)させたが、増殖の抑制は認められなかった。しかし、移動・浸潤能は有意に抑制されることを見出した。さらに、上皮成長因子受容体から癌細胞の浸潤抑制へリンクするシグナルカスケードを解明するため、マイクロアレイによる網羅的解析とバイオインフォマティクス解析を進めた。2)miRNA発現のエピジェネティック解析:miRNA発現抑制の制御機構の一端を明らかにするために、DNAメチル化解析を行った。バイサルファイト処理シークエンシング法により、胆管上皮細胞特異的miRNAの上流域に存在するCpGアイランドのメチル化解析を行った。正常胆管上皮細胞と比較してHuCCT1細胞では強くメチル化されていた。HuCCT1細胞にDNAメチル化阻害剤とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を細胞に添加することで、胆管上皮細胞特異的miRNAの発現が検出されるようになった。HuCCT1細胞では、胆管上皮細胞特異的miRNAの発現がエピジェネティックな制御により抑制されていることが明らかとなった。3)miRNAの胆管癌バイオマーカー開発:病理標本の発現解析を進めるとともに、胆汁に含まれるmiRNA解析を行い、胆汁中のmiRNA、特にmiR-9が胆管癌のバイオマーカーとして有用であることを見出した。
二重過程理論とARSを活用する農薬のリスクコミュニケーション技法の開発

本研究は、一つの化学物質が農薬取締法に基づく登録を受けて上市に至る過程や上市後に行われる食品や環境への残留量調査を、それらに携わる人々の仕事のイメージが浮かぶような「一連のストーリー」にして示すスライド教材を作成し、ARS(Audience Response System)も活用しつつ行うリスクコミュニケーション技法の開発を目指すものである。一方、本研究を開始した時期から国会において「農薬取締法の一部を改正する法律」の審議が始まり、その後公布された。よって、その具体的な内容をスライド教材に反映させる必要が生じたため、関連する学会やシンポジウムに参加して情報収集を行った。そして、改正内容の一部を盛り込んだスライド教材を作成し、担当科目にて講義を行った。さらに平成29年度から試行していた「ARSを活用するケースメソッド」を充実させ、同科目にて実施した。そして、ARSを用いたアンケート結果や感想文の内容からその有効性を検証した。また、具体的な農薬に対する興味を喚起することを目的に、ICTを活用して自主的な学習を行うための手順を示した資料を作成して3つの科目の受講生に配布した。さらに、それらについて日本農薬学会第44回大会にて2件の一般講演を行うと共に展示ブースを設けて公表したところ、約130名に関係資料を配布することができ、その一部には開発したスライド教材を提示して意見等を聴取した。一方、本研究を開始した時期から第196回国会(平成30年通常国会)において「農薬取締法の一部を改正する法律」の審議が始まり、その後成立して平成30年6月15日に公布された。そして、改正内容の一部を盛り込んだスライド教材を作成し、担当科目である「農薬環境科学」(平成30年度の受講生:5266名/回)にて講義を行った。また、具体的な農薬に対する興味を喚起することを目的に、ICTを活用して自主的な学習を行うための手順を示した資料を作成して平成30年度後期の3つの科目の受講生(61,36および87名)に配布した。さらに、それらについて日本農薬学会第44回大会にて2件の一般講演を行うと共に展示ブースを設けて公表したところ、約450名の参加者のうち約130名に関係資料を配布することができ、その一部には開発したスライド教材を提示して意見等を聴取した。今回の農薬取締法の改正項目の一部は、平成32年4月1日に施行されるが、その具体的な内容は今後決定されるため、引き続き情報収集を行って、スライド教材に反映させる。そして、それを用いて講義を行った上で、ARSを用いたアンケート結果や感想文の内容からその有効性を検証しつつ、さらに洗練させていく。また、ケースメソッドに関して、討議への参加やARSによる回答をしない学生への対応策、また、ICTを活用する自主的な学習の実施者率の向上策を検討する。その上で、二重過程理論等を参考にそれらの学習効果等を分析しながら継続・改善し、「感情に動機づけられ,かつ科学的論拠に基づく合理的な理解や判断を促すような授業方法」および「様々な立場を理解し,かつ対話や共考を通じて多様な情報や見方を共有する姿勢を養うような授業方法」の開発を進める予定である。さらに、開発したリスクコミュニケーション技法の適用対象を学生以外にも広げていく。特に、小学校、中学校および高等学校の教諭など、次世代の育成に携わる社会人も対象として実施、検証していく予定である。

さらに、それらについて日本農薬学会第44回大会にて2件の一般講演を行うと共に展示ブースを設けて公表したところ、約130名に関係資料を配布することができ、その一部には開発したスライド教材を提示して意見等を聴取した。本研究は、一つの化学物質が農薬取締法に基づく登録を受けて上市に至る過程や上市後に行われる食品や環境への残留量調査を、それらに携わる人々の仕事のイメージが浮かぶような「一連のストーリー」にして示すスライド教材を作成し、ARS(Audience Response System)も活用しつつ行うリスクコミュニケーション技法の開発を目指すものである。一方、本研究を開始した時期から第196回国会(平成30年通常国会)において「農薬取締法の一部を改正する法律」の審議が始まり、その後成立して平成30年6月15日に公布された。よって、その具体的な内容をスライド教材に反映させる必要が生じたため、関連する学会やシンポジウムに参加して情報収集を行った。そして、改正内容の一部を盛り込んだスライド教材を作成し、担当科目である「農薬環境科学」(平成30年度の受講生:5266名/回)にて講義を行った。さらに平成29年度から試行していた「ARSを活用するケースメソッド」を充実させ、同科目にて実施した。そして、ARSを用いたアンケート結果や感想文の内容からその有効性を検証した。また、具体的な農薬に対する興味を喚起することを目的に、ICTを活用して自主的な学習を行うための手順を示した資料を作成して平成30年度後期の3つの科目の受講生(61,36および87名)に配布した。さらに、それらについて日本農薬学会第44回大会にて2件の一般講演を行うと共に展示ブースを設けて公表したところ、約450名の参加者のうち約130名に関係資料を配布することができ、その一部には開発したスライド教材を提示して意見等を聴取した。今回の農薬取締法の改正項目の一部は、平成32年4月1日に施行されるが、その具体的な内容は今後決定されるため、引き続き情報収集を行って、スライド教材に反映させる。そして、それを用いて講義を行った上で、ARSを用いたアンケート結果や感想文の内容からその有効性を検証しつつ、さらに洗練させていく。また、ケースメソッドに関して、討議への参加やARSによる回答をしない学生への対応策、また、ICTを活用する自主的な学習の実施者率の向上策を検討する。その上で、二重過程理論等を参考にそれらの学習効果等を分析しながら継続・改善し、「感情に動機づけられ,かつ科学的論拠に基づく合理的な理解や判断を促すような授業方法」および「様々な立場を理解し,かつ対話や共考を通じて多様な情報や見方を共有する姿勢を養うような授業方法」の開発を進める予定である。さらに、開発したリスクコミュニケーション技法の適用対象を学生以外にも広げていく。特に、小学校、中学校および高等学校の教諭など、次世代の育成に携わる社会人も対象として実施、検証していく予定である。
頭頚部悪性腫瘍に対するハイパーサーミア併用放射線治療とγ型インターフェロンの効果

我々は頭頸部悪性腫瘍患者について術前治療として放射線照射と化学療法を行い、術後治療として再発防止の目的でα型interferon(IFN)とimmunopotention(OK-423)を併用して来た。α型IFNとの併用によってOK-432で誘導されるγ型IFN産生が増強されること、更に、この治療方法を行った症例の長期的臨床経過観察の結果、この治療を行わなかった症例に比べて再発例は減少することを報告した(Arch Oto-rhinolaryngol 243:281287,1986)。この治療方法は末梢血中のNK活性を上昇させ、IL-2-R陽性細胞が出現し、白血球の減少を防止する(Recent advances in chemotherapy,University of Tokyo Press P12561257,1985,Immunopharmacological aspects of OK-432 in humans Excepta Medica P161173,1986)。これらのことが再発防止に有効であろうと考えられる。これらの治療法を再発防止だけでなく、積極的に癌の治療法に用いるため、術後再発した頭頸部癌重症例や、始めから遠隔臓器に転移した症例に、局所ではhyperthermia併用放射線照射を行い、全身的には化学療法とα型IFNとOK-432の投与を行う。放射線照射や化学療法による白血球減少と免疫機能低下をα型IFNとOK-432の併用によって防ぐことを目的にしている。その基礎的研究として上顎癌から樹立した培養癌細胞を用いてhyperthermia(42゚Cあるいは43゚C1hrの熱処理)と放射線照射の併用の効果について調べ、放射線照射によってS期が延長し、分裂が抑制された細胞が熱処理によって死滅されることを報告した(Progress in hyperthermic oncology,Shinohara shupan P7273,1986)更に、放射性耐性細胞(上記の上顎癌由来癌細胞に何度も放射線照射を行って10Gy照射で死滅しない細胞株を作った)に対してもhyperthamiaの効果は同じであることを報告した(第3回日本ハイパーサーミア学会,大阪1986.11月)。臨床的には頸部リンパ節転移病巣に対してhyperthermiaと放射線照射の併用を行い、腫瘍の大きさが5cm以上の症例では、放射線単独照射より有効であることを報告した(第8回日本頭頸部腫瘍学会,九州1984・6月)。
冗長マクロマイクロ型マニピュレータの運動制御

組立作業などにおいては、マニピュレータ(ロボットアーム)の位置決め精度より小さなすきましかない部品の挿入などが要求されるため、マニピュレータの手先に作用する外力に応じて手先変位が生じること(順応動作)が重要となる。しかしながら通常のマニピュレータは、動作範囲は大きいものの、慣性の大きさのためにこの順応動作には適さない。本研究においては、通常のマニピュレータをマクロマニピュレータとして扱い、その先端に慣性が小さく順応動作に適するマイクロマニピュレータを装着した冗長マクロマイクロ型マニピュレータを議論の対象とした。そしてマクロ部の動作範囲の大きさと、マイクロ部の順応動作の実現性の両者を活かした運動制御法を確立することを目的とし、運動制御法の開発と制御法に適したマイクロ部の試作を行った。運動制御法の開発はインピーダンス制御法に着目して行った。インピーダンス制御法とは、手先に望みの機械インピーダンスが実現されるような関節駆動力を算出することにより、手先外力が作用する際の手先変位の生じやすさを制御する方法である。通常のインピーダンス制御は、手先部だけに対して望みの機械インピーダンスを指定するが、開発した制御法においては、冗長マクロマイクロ型マニピュレータの手先部の他にマクロ部先端に対して望みの機械インピーダンスの指定を行なえばよいことがわかり、以下の特性を実現することが可能となった。1)マイクロ部の小さな慣性が有効に作用し、過大な駆動トルクを必要とすることなく手先の順応動作が実現できる。2)マイクロ部から伝わる力によりマクロ部が指定された動作を行い、マイクロ部の動作範囲の狭さが補償される。また、マイクロ部の試作においては以下の2点を考慮した。1)対象としたマクロ部の動作帯域が12Hz、実現しようとする動作帯域が510Hzであること。2)マクロ部とマイクロ部が直列構造であり、制御法が手先外力の作用する状況を対象としたものであることを考慮し、マクロ部と同程度の手先力である10Nが発生できるものであること。これらのことより、マイクロ部の試作においては実現可能な手先力と手先加速度に着目した。動作試験により、所望のマイクロ部が開発できたことが確認できた。
動物細胞の増殖特性に及ぼす培養液流れの影響解析

動物細胞培養過程で遭遇するダイナミックプロセスは、培養面への接着プロセス、培養面での増殖プロセス、培養面からの剥離プロセス、と考えられる。培養面での接着プロセスでは、培養初期段階における動物細胞の培養面への効率的接着方法を、培養面での増殖プロセスでは、動物細胞が培養面で増殖しうる剪断応力値を、培養面からの剥離プロセスでは、増殖した動物細胞が剥離してしまう剪断応力値を、それぞれ実験的に明らかにして、動物細胞用バイオリアクターの設計指針となりうる基礎データを収集することが本研究課題の目的である。1回転粘度計(現有備品)を改造することによって培養器内のどの細胞にも同一の剪断応力が負荷されるシャーレ型動物細胞培養装置を製作した。2剪断応力無負荷状態での細胞接着時間を顕微鏡下撮影カメラシステム(申請備品)によって測定し数十分のオーダーであることを明らかにした。3培養開始時に動物細胞の培養器への接着時間を確保せずとも細胞付着が可能であることを明らかにした。4接着した細胞のその後の増殖動態を顕微鏡画像処理システム(申請備品)に記録して、増殖速度が単位面積当たりの細胞密度に依存することを見出した。5細胞は数Pa程度で培養面から剥離することを明らかにした。6増殖も剥離もせず細胞数が一定に保たれる適度な剪断応力値の存在を新たに見出した。7細胞活性を維持したまま動物細胞をバイオリアクター内に高密度培養できる形式を提案した。平成13年度は、動物細胞への剪断応力負荷装置を製作すると共に接着プロセス解析を行った。1シャーレ型培養器内で動物細胞を培養しながら細胞に一定の剪断応力を負荷する装置を製作した。この装置は回転粘度計(現有備品)を改造することによって製作した。改造の主要点は動物細胞培養のための37°Cの温度制御と雑菌汚染対策用としてのクリーンブースを設置したことである。2電極反応を利用して培養器壁面剪断応力を測定したところ、培養器内剪断応力の半径方向分布は認められず、培養器内のどの細胞にも同一の剪断応力が負荷されていることを確認できた。3培養器へ細胞を播種し、剪断応力無負荷状態での細胞接着時間を顕微鏡下撮影カメラシステム(申請備品)によって測定した。ピペッティングによっても細胞が剥がれない時を接着時間としたが、数十分のオーダーであった。4接着細胞数の剪断応力依存性を実験的に求めたところ、一般的には剪断応力値の増大に伴って接着細胞数は減少したが、低剪断応力負荷では接着細胞数の変化しない領域の存在を確認できた。5培養開始時に動物細胞の培養器への接着時間を確保せずとも細胞付着が可能であることを明らかにした。平成14年度は、前年度作製した剪断応力負荷装置を使用して明らかになった接着プロセス後の増殖プロセスと剥離プロセスをそれぞれ解析して研究の総括を行った。1接着した細胞のその後の増殖動態を顕微鏡画像処理システム(申請備品)に記録し、細胞の増殖形態と増殖速度を測定した。増殖速度は、単位面積当たりの細胞密度に依存し、密度の高い方が増殖は良好であった。

これは、周囲の細胞に依る協力現象と捉えられる。2細胞が培養面から剥離する剪断応力値を明らかにした。数Pa程度で細胞は剥離した。3剪断応力負荷装置により、細胞の増殖中に剪断応力を負荷して、増殖速度の剪断応力依存性を実験的に明らかにした。剪断応力が大きすぎると細胞は剥離するが、増殖も剥離もせず細胞数が一定に保たれる適度な剪断応力値の存在を新たに見出した。4 2年間で得たデータを整理して、細胞の活性を維持したまま動物細胞をバイオリアクター内に高密度培養できる形式を提案した。
新しい網羅的遺伝子解析を用いた食道癌化学放射線療法耐性遺伝子の解明

食道癌細胞にトランスポゾンを導入することで、抗癌剤耐性遺伝子を増幅もしくは、減弱させ、抗癌剤暴露環境下で培養し、作成した抗癌剤耐性株のDNA解析を行うことで、耐性遺伝子を特定することが可能となる。食道癌細胞株TE4,5,9,15について、Transposon tagged cellを樹立した。樹立したtransposon tagged cellを用いて、各種薬剤を添加もしくは放射線照射を施行し、TE4,15についてシスプラチン耐性株および放射線耐性株を獲得した。シスプラチン耐性遺伝子は37種類、放射線耐性遺伝子は10遺伝子を同定され、このスクリーニングシステムが有用なことが証明された。ヒトゲノム上に存在する全ての遺伝子をスクリーニング可能であるトランスポゾンを用いて、食道癌に対するシスプラチン、5-FU、放射線耐性遺伝子の新しい網羅的解析に関する研究において、以下のような研究を施行した。1.食道癌細胞においてTransposon tagged cellの樹立した。各種細胞へトランスポゾンを用いて、CMVプロモーターとピューロマイシン耐性遺伝子を導入し、ピューロマイシンによるselectionを行い、細胞一つ一つにおいてCMVプロモーターがゲノム上のランダムな位置に挿入された細胞プールである、Transposon tagged cellの樹立した。食道癌細胞株TE4,5,9,15について、Transposon tagged cellの樹立に成功した。2.食道癌細胞株でのシスプラチン耐性株の獲得野生型細胞株が全滅する薬剤濃度を決定した後、樹立したtransposon tagged cellを用いて、その濃度の薬剤を添加すると、CMVプロモーターにより薬剤耐性に関与する遺伝子を過剰発現した細胞はsingle cellとして生き残り、3週間程度培養することでコロニーを形成した。TE4,15についてシスプラチン耐性株を獲得した。3.シスプラチン耐性遺伝子の同定。耐性を獲得したコロニーをピックアップし、それぞれのコロニーからGenomic DNAを抽出し。PCRを施行し、Sequenceにより増幅したDNAの塩基配列を同定、BLASTを用いて遺伝子を同定した。37の候補遺伝子を同定した。食道癌細胞にトランスポゾンを導入することで、抗癌剤耐性遺伝子を増幅させ、抗癌剤暴露環境下で培養し作成した抗癌剤耐性株のDNA解析を行うことで、耐性遺伝子を特定することが可能となる。このシステムを用いて、食道癌細胞株TE4,5,9,15について樹立したtransposon tagged cellを用いて各種抗癌剤に曝露させ、STE4,15についてシスプラチン耐性株を獲得し、TE4について5-FU,ドセタキセル耐性株を獲得した。耐性コロニーを単離培養した後DNAを抽出し、トランスポゾンにより挿入された箇所を制限酵素処理にて切り出し、Splinkerette PCRにてDNAを増幅させ、プラスミドベクターを用いて大腸菌内でさらに増幅させた。続いて、増幅したDNAの塩基配列を同定し、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)を用いて遺伝子を同定した。複数の耐性コロニーから同様にDNAを抽出して発現遺伝子を解析する。複数の耐性コロニーで共通して発現している遺伝子であれば、投与薬剤に対する耐性遺伝子である可能性が高いと考えられる。シスプラチン耐性遺伝の候補としてJAK2(janus kinase2),SSRP(signal sequence receptor, gamma),MDRP(multi drug resistant protein)をはじめとした遺伝子を確認した。このJAK2遺伝子に着目し、シスプラチン耐性遺伝子としての検証した。シスプラチン耐性株においてPCRを行い、耐性株でNDA量の低下を認めた。さらにshRNAによるJAK2遺伝子サイレンシング細胞株の樹立に関する検証を行っており、これによりJAK2遺伝子のkock down株でもシスプラチン耐性が確認された。放射線耐性遺伝子は10遺伝子を同定した。放射線耐性遺伝子株の1つMT-CO1低発現株の発現低下はReal-time quantitative PCRで確認し、放射線耐性を確認した。放射線耐性遺伝子のMT-COX1はアポトーシスを誘導すると報告されている。放射線照射後のcaspase-3活性はMT-CO1低発現株で有意に低値であり、MT-CO1低発現株はアポトーシスが阻害されていることにより、放射線耐性を獲得していた。このスjavascript:onTransientSave();クリーニングシステムが実際に機能していることが証明され、シスプラチン、放射線耐性の候補遺伝子が同定された。本システムはトランスポゾンを使用した抗癌剤耐性遺伝子を網羅的に解析するシステムであるが、いくつかの候補遺伝子が発見された。実際にその遺伝子の導入によって抗癌剤耐性を獲得したことから、本システムがスクリーニングシステムとして正常に機能していることが証明された。一般消化器外科今後はin vivoの研究を進めていく。