hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小規模離島における地域の風土を活かした発達障がい児療育支援体制の構築

本研究は、孤立型離島で児童発達支援事業に通う未就学児の親を対象に、特に母親が時の育てにくさを認め受け入れる過程に影響を与えた「子育てに対する思い」「子どもの特徴と成長への気づき」「他者との関りの受けとめ」を明らかにし、地域風土との関連を検討した上で、地域ごとにその特性を十分に活かした支援体制を構築することを目的としている。そのため対象地域の地理的特性や歴史、生活様式等の文化に関連する資料収集及び分析に時間を要した。しかし複数離島で同様の調査を行い、その共通点や差異を明らかにすることで離島以外の地域にも応用できると考えた。具体的には、発達支援事業に通う未就学児の親を対象にした「障害への気づき」や「受容に至るまでの育児歴の聞き取り」から、障害の受容に影響を与えた地域風土について検討した。初めに孤立型離島3島で行われる児童発達支援の現状について調査し、主たる養育者である母親及び父親の障害受容過程に関する聞き取り調査を行い、障害受容に関連する地域風土について調査した。29年度までには、研究対象地域であるX島で3事例から、離島の遠隔性・親密性・凝集性の高さ、島民が持つ発達障害の概念や児童発達支援の考え方にも影響を与えていることが明らかになった。そこで、本年度は、X島での調査結果を踏まえY島で同様の調査を実施した。また並行して、島内の医療、教育、複視、保健分野の関係者との情報交換等を継続して行った。Y島の調査結果を分析中であり、X島との相違を検討することしている。本年度は、まず、調査地域の地域特性や発達障害児(者)の状況を中心とした保健医療福祉の現状を整理した。同時に、本研究では第1段階として「風土」と「発達障害児を育てる養育者の受容や障害へのき気づき」との関係性を明らかにすることを目的としているため、「風土」に関連する文献・資料等を収集した。実際に対象地域である、種子島、屋久島、徳之島を訪れ地区踏査を行なって収集した資料・情報も含めて整理・分析した。なお、調査地域である種子島及び屋久島へは、平成28年4月に現地を再度訪問する。具体的な研究内容の説明と対象選定の方法等について確認を行うための訪問であるが、その際、文献・資料等を通して明らかになった地域特性について提示し、意見交換を行うこととしている。研究計画にも記載した通り、本研究は、地域ごとにその特性を十分に活かした支援体制を構築することを目的としている。そのため、対象地域の地理的特性や歴史、生活様式等の文化に関連する資料収拾及び分析は、「風土」を考察するうえで必要不可欠であり、今後、インタビュー結果の分析や地域の風土を活かした発達障害児療育支援体制を構築する際に非常に重要な情報にになると考えられる。また、日本において先駆的に発達障害児の地域支援に取り組んできた地域について、文献等から地域に特徴的な取り組みや成功要因、特に地域の「風土」との関係性の整理を行い、県内において発達障害児支援に長年かかわっている支援員の勉強会を通して、鹿児島県の現状について意見交換を行い、研究者自身が理解を深めた。モデル地域の現状を分析することで、地域の実情に即した支援体制が必要であることが明らかになったと言える。このことは、本研究における「地域の風土」を明らかにし、支援者が意図的にその結果を活用することの意義をがあると言える。調査準備段階の文献・資料等の整理・分析や地区踏査を踏まえた「離島の地域の風土」の分析に時間を要した。離島における地域風土を活かした発達障害児療育支援体制を構築することを目的に,平成28年度は1.孤立型離島3島で行われている児童発達支援の現状についての調査,2.主たる養育者である母親及び父親の障害受容過程に関する聞き取り調査,3.障害受容に関連する地域風土を調査した。具体的には,1.については各島において市町の保健師及び児童発達支援事業所の職員に対し研究協力依頼のための会議をもち,関係資料等の収集や研究協力者の選定を行った後,保健師及び保育士から児童発達支援の現状について聞き取り,各島における児童発達支援の概要を調査した。2,3.については,孤立型離島1島において,児童発達支援事業所に通所している未就学児の親を対象に,児の発達障害への気づきや受容の過程を明らかにし,地域風土との関係性について検討した。その結果、島の寛容な精神風土は、住民同士の密接な関わりを促し,母親の行動特性の気づきを促進すると考えられたが,逆に障害を異質なものとして捉えることが,障害の気づきを抑制する可能性が示唆された。このような風土と専門的な資源に制限がある中で、島内の専門職は親の不安感の軽減を優先した支援を実施しており,これが障害受容過程を抑制する場合があることが示された。同じ背景を持つ保護者との関わりの場を意図的に作るなど,これらの特徴を意識した関わりが必要と考えられた。本研究では,各離島の児童発達支援体制を統合して,離島における児童発達支援体制を構築することを目的としているため,今後は,他離島で同様の調査を行うこととしている。対象としていた離島をすべて訪問し,市町の保健師及び児童発達支援事業所の保育士との研究調整会議に時間を要した。本研究の目的は,本研究では児童発達支援事業に通う未就学児の親を対象にした障害への気づきや受容に至るまでの育児歴の聞き取りから,受容に影響を与えた地域風土について明らかにすることである。

そのため,孤立型離島3島で行われる児童発達支援の現状について調査し,主たる養育者である母親及び父親の障害受容過程に関する聞き取り調査を行い,障害受容に関連する地域風土について調査することとした。具体的には,平成28年度中に各島で市町の保健師及び児童発達支援事業所職員とともに研究調整会議を行った結果を整理した。また,3島のうち1島で実施した調査結果をもとに検討した「離島における発達障害児をもつ親の障害受容過程と地域風土との関連」について,研究分担者と再検討し「離島の地域風土」と母親の「子育てに対する思い」「子どもの特徴と成長への気づき」「他者との関わりの受け止め」の3点との関係性から,離島の「物理的環境」「社会文化的環境」は母親の育児経験の捉え方に大きく影響を与える事が明らかとなった。この結果は「離島における発達障害児を持つ母親の子どもの受け入れと地域風土との関連」と題し,雑誌に投稿した。また,X島での調査結果を踏まえ他離島においても同様の調査を行うため,Y島で研究調整会議を行った。H28年度中にY島Y村における母子保健事業の現状等を把握しており,それをもとに,調査が可能であるか密に協議した。次年度はY島において同様の調査を行う予定である。平成28年度までに調査が終了した孤立型離島1島の結果についてまとめ雑誌に投稿した。その他1島の対象地域において、島内関係者で研究調整会議を重ねたが調査実施には至らなかった。本研究は、孤立型離島で児童発達支援事業に通う未就学児の親を対象に、特に母親が時の育てにくさを認め受け入れる過程に影響を与えた「子育てに対する思い」「子どもの特徴と成長への気づき」「他者との関りの受けとめ」を明らかにし、地域風土との関連を検討した上で、地域ごとにその特性を十分に活かした支援体制を構築することを目的としている。そのため対象地域の地理的特性や歴史、生活様式等の文化に関連する資料収集及び分析に時間を要した。しかし複数離島で同様の調査を行い、その共通点や差異を明らかにすることで離島以外の地域にも応用できると考えた。具体的には、発達支援事業に通う未就学児の親を対象にした「障害への気づき」や「受容に至るまでの育児歴の聞き取り」から、障害の受容に影響を与えた地域風土について検討した。初めに孤立型離島3島で行われる児童発達支援の現状について調査し、主たる養育者である母親及び父親の障害受容過程に関する聞き取り調査を行い、障害受容に関連する地域風土について調査した。29年度までには、研究対象地域であるX島で3事例から、離島の遠隔性・親密性・凝集性の高さ、島民が持つ発達障害の概念や児童発達支援の考え方にも影響を与えていることが明らかになった。そこで、本年度は、X島での調査結果を踏まえY島で同様の調査を実施した。また並行して、島内の医療、教育、複視、保健分野の関係者との情報交換等を継続して行った。Y島の調査結果を分析中であり、X島との相違を検討することしている。調査準備段階を終え、種子島、屋久島、奄美大島の3島で調査を開始する。平成28年度に母親及び父親に対する調査が終わった離島においては,発達障害児の祖父母に対し同様の調査を行う。また,平成28年度に研究調整会議をもった3島については,発達障害児をもつ母親及び父親に対する調査を実施する。本年度は、予想以上に本務多忙となり調査が滞ったため、補助事業期間を延長した。今後は、研究調査会議を重ねた対象地域での調査と、平成29年度までに実施した調査結果の公表を行う。
多段階水素・電子移動状態を利用した多機能分子導体の開発

水素移動と電子移動とが結合した系を構築する目的で、EDT-TTFドナー分子へのスクアリル基の導入を試みた。しかしながら合成の段階において反応条件の選択に困難が生じており、現時点では物性評価に必要なだけの量の標的分子を得るに至っていない。一方関連物質系として、今回新たに(BEDT-TTF)_2Cl・{C_2H_4(OH)_2}_<1.5>、(BEDT-TTF)_2Br・C_3H_6(OH)_2を合成し、それぞれについて結晶構造解析および基礎的物性データの測定を行った。前者の塩では、BEDT-TTF分子は2次元的電導面をなす一方で、塩化物イオンとエチレングリコール分子とが互いに水素結合することにより梯子構造を形成している。結晶構造をもとにバンド構造を計算すると半金属的Fermi面を与えるにもかかわらず、電導度は半導体的であり、磁化率は伝導電子の局在を示唆している。また後者の塩ではドナー2分子からなるダイマーユニットが積層しており、その間に臭化物イオンとプロピレングリコール分子とからなる水素結合鎖が存在している。この物質もやはり、結晶構造からは金属的挙動が予想される一方で、物性は伝導電子が局在した半導体である。これらの系の半導体化の理由としては、後者についてはドナー分子の二量化による有効クーロン反発の増大として理解できるが、前者の物質ではドナー分子が等間隔に並んでいるためこの描像は成立せず、この系の絶縁化機構の解明が、当初の標的物質の合成条件の検討とあわせて今後の課題である。
Tリンパ球特異的な遺伝子発現を担う、PEBP2転写因子の機能

1.デフィニティブな造血の発生には、PEBP2遺伝子の機能が必須である。PEBP2αB(=AML1),PEBP2β遺伝子の各々の、遺伝子欠損マウスを作製した。両者ともにホモ個体は脳室内への出血を伴い、12.5日令で胎生致死となる。またプリミティブな赤血球は認められるが、肝におけるデフィニティブな造血像は殆ど認められない。PEBP2転写因子はα・βサブユニットのヘテロダイマーとして存在する。各々のサブユニットの遺伝子破壊が類似の表現型を示すことは、デフィニティブな造血を担う転写因子機能にとって、各サブユニットが必須かつ等価であることを示唆するものである。2. T細胞ハイブリドーマのアポトーシスの系において、PEBP2αB/AML1遺伝子の発現は特徴ある変動を示す。転写因子をコードするPEBP2αB/AML1遺伝子の、Tリンパ球刺激時における変動を、ノーザン解析により調べ以下の結果を得た。(1)脾細胞のConA刺激により、PEBP2αB/AML1転写産物の量が上昇する。この現象は、c-myb転写産物の上昇よりも早期にみられること、蛋白合成阻害剤の存在下でもみられること、ConA刺激後に細胞をG1期に同調させた後にIL2刺激をした場合にはみられないことから、PEBP2αB/AML転写産物の増加はTCR刺激のシグナルによるものと示唆された。(2)CTLL2細胞を同調させた後に、IL2刺激により細胞をG1→S期に移行させた場合には、PEBP2αB/AML1転写産物の量は変わらない。(3)ELA細胞を抗CD3抗体処理してIL2産生を誘導した場合にもPEBP2αB/AML1転写産物は変わらない。(4)DO11.10細胞を抗CD3抗体処理してアポトーシスを誘導した場合にのみ、(1)で観察されたのと同様に、PEBP2αB/AML1転写産物量の増加が観察された。そしてこの増加は、Fas・Fasリガンド転写産物量の増加とほぼ同様の時間経過をもってみられた。以上によりT細胞ハイブリドーマのアポトーシス誘導系において特異的に、TCRシグナルにより、PEBP2αB/AML1転写産物量が増加することが明らかとなった。今後は本所見と、Fas・Fasリガンド遺伝子発現の誘導及びアポトーシスとの機能的関連を解析していきたい。我々はこれまでに、DNA結合能を有するαサブニユニット、及びαとヘテロダイマーを形成しそのDNA結合能を促進するβサブユニットの、2つのサブユニットから成る新しい転写因子PEBP2について、それらをコードするマウス遺伝子を単離し、その構造・機能を解析してきた。

一方ヒト急性骨髄性白血病や慢性骨髄性白血病の急性転化でみられる、t(8;21)(q22;q22)や、t(3;21)(q26;q22)の相互転座点には、キメラ遺伝子AML1/MTG8(大木操ら)或いはAML1/EVI1(平井久丸ら)が形成されるが、我々の単離したPEBP2αB遺伝子はAML1遺伝子のマウス・ホモログである。本研究では、PEBP2dB/AML1遺伝子の機能を破壊した、ターゲティング・マウスの表現型を解析することにより、血球幹細胞の増殖・分化におけるPEBP2転写因子の機能を明らかにすることを目的として行われた。PEBP2αB(-/-)マウスは、胎生12日頃に主に脳内出血により死亡する。またyolk sac由来の胎児型赤血球は認められるのに対し、肝造血は全く認められず、definitive hematopoiesisにおけるPEBP2αB/AML1遺伝子の重要性が判明した。〈2〉Tリンパ球の増殖とPEBP2αB遺伝子の発現マウス脾細胞をConA存在下で培養すると、約24hr後に^3H-TdRの酸不溶性分画への取り込みでみた、DNA合成が開始する。休止期にある脾Tリンパ球でもPEBP2αB転写産物は認められるが、ConA刺激によりその量が著明に増大する。またこの増大は、DNA合成開始/cmyb転写産物量の増大に先行して認められる。さらに蛋白合成阻害剤であるシクロヘキシミドをConAと共存させても、PEBP2αB転写産物の増大が認められた。従ってT細胞受容体(TCR)からのシグナルがPEBP2αB遺伝子の発現誘導を惹起するものと推測された。1.デフィニティブな造血の発生には、PEBP2遺伝子の機能が必須である。PEBP2αB(=AML1), PEBP2β遺伝子の各々の、遺伝子欠損マウスを作製した。両者ともにホモ個体は脳室内への出血を伴い、12.5日令で胎生致死となる。またプリミティブな赤血球は認められるが、肝におけるデフィニティブな造血は殆ど認められない。PEBP2転写因子はα・-βサブユニットのヘテメダイマーとして存在する。各々のサブユニットの遺伝子破壊が類似の表現型を示すことは、デフィニティブな造血を担う転写因子機能にとって、各サブユニットが必須かつ等価であることを示唆するものである。2.T細胞ハイブリドーマのアポトーシスの系において、PEBP2αB/AML1遺伝子の発現は特徴ある変動を示す。転写因子をコードするPEBP2αB/AML1遺伝子の、Tリンパ球刺激時における変動を、ノーザン解析により調べ以下の結果を得た。(1)脾細胞のConA刺激により、PEBP2αB/AML1転写産物の量が上昇する。この現象は、c-myb転写産物の上昇よりも早期にみられること,蛋白合成阻害剤の存在下でもみられること、ConA刺激後に細胞をG1期に同調させた後にIL2刺激をした場合にはみられないことから、PEBP2αB/AML転写産物の増加はTCR刺激のシグナルによるものと示唆された。(2)CLT2細胞を同調させた後に、IL2刺激により細胞をG1→S期に移行させた場合には、PEBP2αB/AML1転写産物の量は変わらない。(3)EL4細胞を抗CD3抗体処理してIL2産生を誘導した場合にも、PEBP2αB/AML1転写産物は変わらない。(4)DO11.10細胞を抗CD3抗体処理してアポトーシスを誘導した場合にのみ、(1)で観察されたのと同様に、PEBP2αB/AML1転写産物の増加が観察された。そしてこの増加は、Fas・Fasリガンド転写産物量の増加とほぼ同様の時間経過をもってみられた。
アルドラーゼ欠損症の遺伝生化学的研究

アルドラーゼ欠損でおこる先天性疾患、アルドラーゼA型欠損症、B型欠損症の原因を明らかにすべく、本年度は正常ヒトB型ゲノム遺伝子の構造解析と、ヒトA型アルドラーゼ欠損症の解析を行なった。先ずB型ゲノム遺伝子を解析するために、すでに得ているB型cDNAをプローブに用いて、R.Lawnらにより作成されたヒトDNAライブラリーをスクリーニングし、7個のクローンを得た。得られたクローンの制限酵素地図作成、B型cDNAとのサザーン・ハイブリダイゼーションによりこれらのクローンはcDNAの5′端から3′端までカバーシ、イントロンーエクリン構造をもつ遺伝子であることが推定された。そこで5′隣接領域1,000ベース、3′隣接領域200ベースを含む、遺伝子の全エクソン部分とそれに接するイントロンの一部の塩基配列を決定した。その結果遺伝子は全長15キロベースにおよび、9つのエクソンからなっていることがわかった。ついで転写開始点をSlマッピングにより決定したところ、3ヶ所存在することがわかった。次にA型欠損症の解析であるが、三輪らの報告した溶血性貧血を伴った赤血球アルドラーゼ欠損症の解析を行なった。赤血球ではA型が発現していることがわかっているので、先ず患者リンパ球の形質転換を行い、遺伝子の供給を容易にすべく株化を試みた。株化したリンパ球から粗抽出液を調製し、セルロースアセテート膜による電気泳動を行なったところ、正常と較べて明らかに活性は低く、しかも抽出液の熱処理により活性はほとんど検出できなくなることがわかった。これらは患者赤血球でみられた結果と一致した。一方RNAを抽出しノーザンブロッティングを行い、A型mRNAはコントロールと較べて、サイズは同じであるが含有量がヤヤ少い結果が得られた。今後cDNAクローニングも含めて、変異部位を同定する予定である。
Aktのレドックス制御を介した心筋保護メカニズムの分子生物学的解析

Aktは酸化ストレスにより一過性にリン酸化されると同時に、活性部位近傍に存在する還元型のcysteine297とcysteine311は酸化されS-S結合を形成する。変異解析の結果よりAkt分子はcysteine297およびcysteine311のいずれもが還元型として存在している状態でのみ、酸化ストレスに反応してリン酸化され、活性化されることを明らかにした。今年度は、主にH9c2心筋芽細胞を用いて、変異解析を用いたAktのシステインSH基の酸化還元状態とリン酸化制御についての解析を行なった。まず、既に作成済みであったAktの297番目および311番目のシステインをセリンに置換したAkt mutant発現ベクター(cAkt-C297S,cAkt-C311S, cAkt-C297, 311S)を実験に使えるように大量に精製した。C297およびC311はAktのリン酸化部位に近接しており、Aktタンパクに複数存在するシステインのなかでも特に重要であると考えられることから、この部位を中心に解析を進めるためである。次に精製した変異発現ベクターをH9c2心筋芽細胞に一過性に発現させた。遺伝子導入にはLipofectAMINE PLUSを用いる予定であったが、時間短縮や遺伝子導入効率の改善が見込めることからLipofectAMINE 2000へ変更した。この試薬を用いた際の最適な条件を見出すために時間を要した。あらかじめ変異Aktを一過性発現させたH9c2心筋芽細胞を準備し、遺伝子導入48時間後に過酸化水素の投与を行なった。過酸化水素投与によるAktリン酸化の誘導は、これまでの研究結果から100μMで行なった。長時間の刺激では細胞障害の程度が強すぎるため、刺激時間は30分とした。免疫沈降法により回収した変異Aktを用いて、Western blot法により変異Aktのリン酸化の状態について検討した。まずは、cAkt-C297,311Sの酸化ストレス下でのリン酸化状態の解析を中心に行っており、今後cAkt-C297SやcAkt-C311Sについても同様の解析を行なう。内因性心筋保護機構として重要な役割を持つAktのkinase活性制御機構に関して、Akt分子の活性部位近傍に存在するCys297およびCys311に着目し、これらのシステインSH基の酸化還元状態によるAkt kinase活性の制御機構について解析した。wild type Aktに加え、Cys297およびCys311をセリンに置換した各種mutant Akt発現ベクター(cAkt-C297S, cAlkt-C311S, cAkt-C297, 311S)をそれぞれH9c2心筋芽細胞に導入し、wild type AktおよびmutantAktを細胞内に一過性に発現させた。遺伝子導入48時間後に100μMの過酸化水素による刺激を行った。免疫沈降法により回収した検体を用いて、Western blot法により一過性発現させたAktのリン酸化の状態について解析した。wild type Aktは内因性Aktと同様に過酸化水素による刺激に反応してリン酸化されたが、変異Aktはいずれもリン酸化を生じなかった。次にAktによりリン酸化されることが知られているGSK3α/βを基質として用い、過酸化水素による刺激後のwild type Aktおよびmutant Aktのkinase活性を調べた。その結果はAktのリン酸化状態と一致しており、過酸化水素投与後にwild type Aktのkinase活性は増加していたが、mutant Aktでは変化を認めなかった。以上の結果より、心筋保護機構に重要な役割を示すAktのkinase活性制御機構にAkt分子のCys297とCys311の酸化還元状態が重要な役割を持つことが示唆された。
新規リン酸化酵素阻害剤によるスプライシング制御とエイズウイルスの複製阻害

ウイルスは、宿主のスプライシングによって多様なパーツを作り出し、その集合体であるウイルスの複製を可能としている。例えばHIVは、約1万塩基にしか満たない配列をゲノムとするにすぎないが、宿主の選択的スプライシング機構を利用する事によって巧みに自己複製を可能としている。そこで、ウイルス複製を制御する宿主のRNA結合蛋白質に焦点をあてて解析してきた。特にスプライシング反応を活性化する因子として知られるSR蛋白質が、一連の反応においてリン酸化、脱リン酸化反応の制御下にあることから、さらにSR蛋白質キナーゼについても解析し、本研究においては、最終的にそのキナーゼ阻害剤を創製するに至ったので概要を報告したい(現在投稿中)。(1)SR蛋白質とSR蛋白質リン酸化酵素のウイルス複製における機能解析複数存在するSR蛋白質のリン酸化酵素は、in vitroの解析から、複数存在するSR蛋白質をそれぞれ特異にリン酸化しており、その異なるリン酸化状態がターゲットの細胞内での機能(細胞内局在およびスプライシング活性等)を変えるとされてきた。ウイルス複製に関与するSR蛋白質および上流キナーゼを検索したところ、特にSRp75とSRPK1あるいはSRPK2が、HIVウイルス産生を増大させることを見いだした。一方で、Clkはそのような著しい効果は認めなかった。(2)SRPK特異的な阻害剤のスクリーニングHIVの複製にSRPK-SRp75経路が関与する結果を得たため、我々はSRPKの特異的阻害剤をケミカルライブラリーからスクリーニングした。その結果、SRPKを特異的に阻害する低分子化合物SRPIN340を見つけ、これらがATP結合部位に作用する阻害様式を示す事を明らかにした。また、このシード化合物をもとにした構造類似体を岐阜大学との共同研究によって合成し、阻害活性の検討を終え、構造活性相関を示す実験データを得る事が出来た。(3)抗ウイルス作用の検討我々が得たSRPIN340を用いて、T細胞由来のMT4細胞株を宿主としたHIV感染をモデルとした、抗ウイルスアッセイを行った。その結果、SRPIN340は量依存的にHIV産生を阻害できた。この抗ウイルス効果は、CMVおよびSindvisウイルス、SARSにも、その効果を認めている。SRPIN340は、動物を用いた毒性試験によっても、顕著な毒性を認めないことも明らかにした。SR蛋白質のリン酸化酵素は複数種類が同定されているが、SRPK発現細胞ではSR蛋白質のリン酸化が維持され、ウイルス複製を促進することを見出した。本年度は、ウイルス複製を抑制する目的で、SRPKの特異的阻害剤をスクリーニングしたところ、SRPKについて特異的阻害剤となるシード化合物を同定するに至った。このシード化合物の酵素特異性を検討する目的で、約120種類のキナーゼに対するキナーゼスクリーニングを行った。その結果、このシード化合物がSRPKにきわめて高い特異性を示す事を明らかにした。この阻害剤を用いて、MT4細胞をホストとしてHIVに対する抗ウイルスアッセイを行ったところ、抗ウイルス効果を示した。またSARS、CMVに対しても抗ウイルス効果を示した。このシード化合物については、既にラット単回毒性試験を行い、毒性が無いことが明らかとなった(国際特許出願済)。ところで、SR蛋白質のリン酸化酵素は、SRPK以外にも存在しており、CLKについて既に我々は特異的阻害剤(TG-003)を見出している。TG-003を用いた抗ウイルスアッセイを行ったが、HIVに対する抗ウイルス効果は認められなかったことから、SRPKの作用が大切であると考えるに至った。そこでSRPKの基質としてどのSR蛋白質がウイルス複製に必要であるか検討した。その結果SRp75の強制発現によってウイルス産生が増大することをはじめて見出しただけでなく、SRPKとSRp75の共発現で、さらなるウイルス産生を誘導する結果を得た。こうした分子メカニズムの解明によって、実際にSRPK特異的阻害剤が抗ウイルス剤として有用であると考えられた(投稿準備中)。そこでシード化合物から複数の周辺化合物を合成し、これらのSRPK阻害活性について、構造活性相関を明らかにしつつある。次年度は、SRPKやSRp75が持つウイルス複製に対する分子メカニズムを明らかにするだけでなく、より特異性や細胞透過性、細胞毒性などを改良した周辺化合物の探索してゆきたい。(2)SRPK

特異的な阻害剤のスクリーニングHIVの複製にSRPK-SRp75経路が関与する結果を得たため、我々はSRPKの特異的阻害剤をケミカルライブラリーからスクリーニングした。その結果、SRPKを特異的に阻害する低分子化合物SRPIN340を見つけ、これらがATP結合部位に作用する阻害様式を示す事を明らかにした。また、このシード化合物をもとにした構造類似体を岐阜大学との共同研究によって合成し、阻害活性の検討を終え、構造活性相関を示す実験データを得る事が出来た。(3)抗ウイルス作用の検討我々が得たSRPIN340を用いて、T細胞由来のMT4細胞株を宿主としたHIV感染をモデルとした、抗ウイルスアッセイを行った。その結果、SRPIN340は量依存的にHIV産生を阻害できた。この抗ウイルス効果は、CMVおよびSindvisウイルス、SARSにも、その効果を認めている。SRPIN340は、動物を用いた毒性試験によっても、顕著な毒性を認めないことも明らかにした。
ニュージーランドにおける環境保全とそれに配慮したサステイナブルな観光に関する研究

ニュージーランドでの環境保全と持続可能な観光にかんし、南部のセントラルオタゴ地域のワインと自然環境、北部のオークランド地域の自然と観光を中心に現地調査をした。さらに背景にある自然や文化とのかかわりから、環境保全と持続可能性の方向性を明らかにした。近年の地球温暖化、グローバル化、少子高齢化などの影響を受けて、ニュージーランドでは伝統的な農業生産は大きく減少した。しかし環境保全や持続可能を重視し、高付加価値の生産を中心に、地域構造が大きく変容している。自然環境の似た日本でも、同様の対策による環境保全と持続可能の可能性が考えられる。平成27年度は研究の開始年にあたり、ニュージーランドでの現地調査に向けての準備として、2回の研究打合せ会議を行った。27年12月に現地調査を実施し、車で北島のオークランドをスタートし、ウェリントンを経て南島に渡り、西海岸、また南端のインヴァーカーギルを経て、クライストチャーチまで、北島・南島の大半を巡って調査を行った。帰国後に、現地調査のまとめの打ち合わせ会議を行った。現地調査は、ワインの大生産地である、北島のホークスベイや、南島のマールボロー、セントラルオタゴ地方などを含んでいる。また火山であるトンガリロ山や、氷食地形のミルフォードサウンドなどの地や、主要都市である北島のオークランドと南島のクライストチャーチなどでも行った。さらにニュージーランドの南北の広範な地域を巡ることにより、同国の自然、産業などの総合的な調査を行った。現地調査のほかに、ニュージーランドの自然的基盤や観光資源に関して、多方面より資料の収集を行い、種々の気象データ、地形データ、観光データなどを得た。とくにニュージーランドの経済や産業などについてStatistics New Zealandから、気象についてNIWA:National Institute of Water and Atmospheric Research Ltdから、ワイン生産についてOfficial New Zealand Wine Websiteから、地形についてLINZ:Land Information New Zealandから、観光に関してBooking Comなどより、多くのデータを収集した。上記の現地調査、また収集したデータより、データベースを作成し、さらに地理情報システムを用いて分析を行った。それらの分析の成果は初年度の研究成果としてまとめ、27年3月に早稲田大学で開催された日本地理学会において、ワイナリーと環境保全、地形と可能資源、観光と宿泊施設、の3方面から発表した。本テーマについての共同研究、現地調査は27年度が初であったが、準備段階から進行は順調であり、現地調査も計画通りに実施された。ニュージーランドの国土は南北に長く、公共交通機関が少ないため、移動にはすべてレンタカーを使用したが、それにより全国土の連続した地域において、調査を遂行することができた。その成果として、とくに以下などがあげられる。近年ワイン生産が急速に拡大しているマールボロー地方をはじめ、北島のホークスベイ、世界最南端のワイン産地であるセントラルオタゴなど、主要なワイン生産地を巡ることができた。それぞれに多数分布しているワイナリーでは、ブドウ栽培、ワイン醸造に加えて、テイスティング、レストラン、ツアー、ステイ、ウェディング、ガーデン、ギャラリーなどが用意され、観光の多様な需要に対応するようすがみられた。北島および南島では、特色のある地形を背景とした大観光地が存在している。北島のタウポ火山帯のカルデラと火砕流台地は、特色のある噴火や災害などが関心を集めているが、それらと人々とのかかわりなども観光資源として価値があり、このことは地形的に類似した南九州でも同様であると考えられた。ニュージーランドの宿泊施設はホテル、アパート、ホステル、モーテル、B&B、ホームステイ、別荘・ヴィラなどに分けられている。この中でとくにモーテルは、公共交通機関が少なく自動車交通を中心とする旅行形態に対応しており、大規模ではなく家族経営に適し、そのため地域の小規模観光産業として地域経済に貢献している。これらのほかにもニュージーランドにおける多様な観光資源、とくに南島西岸での氷河・氷食地形などや、地方に展開するトレイルなど、その自然を背景にした観光地が多数存在した。また欧州人の入植以降の、開拓の歴史的遺産にも触れることができた。これらは国土の大半の地域を車により踏破したことの成果ということができる。平成28年度は、3年間の研究期間の2年目にあたる。初年度におけるニュージーランド全域でのジェネラルサーヴェイで得られた調査資料について、分析を継続した。その成果は後述の研究発表にあるような、自然環境、農業生産、観光業などに関連した2篇の雑誌論文としてまとめられた。さらに2年目の現地調査に向けて、研究打合せ会議を行った。初年度の調査では、ニュージーランドの国土は近年大きく変化しており、伝統的な羊毛業などは減少する一方で、果樹やワインなどの生産は急速に増加しているようすがみられた。また観光には、その地域の自然環境を生かし、また小規模ではあるがきわめて多様な形態がみられた。これらの特色に関して、近年の変貌がとくに明瞭な地域を中心として、現地調査を実施することとした。さらに、調査方法やスケジュールについて、具体的な計画を策定した。その上で平成28年度には、ニュージーランドの主要研究対象地域において、本調査を行った。すなわち南島南部の高緯度にあり、冷涼な気候であるセントラルオタゴ地域において、気象観測を含めて自然環境に関する現地調査を行った。ならびにこの地域で行われるブドウ栽培に関連して、ワイナリーでの多様な観光の業態を調査した。また北島南部内陸のトンガリロ火山とタウポ湖周辺地域において、火山噴出物、地形と観光に関する調査を行った。現地では、こうした調査に加えてニュージーランドの自然環境や観光などに関して、文献や資料などを収集した。またネットを通じてニュージーランドの各種データを収集し、今後の分析の準備を進めた。研究は順調に進展しているが、それには以下のような具体的成果が得られたことにもあらわれている。

初年度の調査からは、ニュージーランドでは、広大な農牧地での機械化された農業形態は減少する一方、やや小規模ではあるが自然環境に合わせた多様できめ細かい形態が、新たに各地に出現しているようすがみられた。こうした特色は後述のように、「ニュージーランドにおけるブドウ栽培と環境保全」および「ニュージーランドの宿泊業」の2論文にまとめられた。続いて2年目の研究として、現地で多くの実態調査が進んでいることがあげられる。南島南部の調査では、高緯度のセントラルオタゴ地域において、ブドウ栽培やワイン生産、ワイナリー経営・観光を成立させる要件となる気候環境について、観測を実施できた。同地域は南島北部にあるマールボロ地域のような、大規模なワイン生産地域と異なり、とくに温度条件の厳しい地域であるが、地域内にも大きな気候の差異がある。この地域を中心にして得られたデータの解析からは、微妙な気候環境の違いを活用して、ブドウ栽培に取り組み、多様なワインツーリズムを展開して、サステイナブルな地域となっている実態を捉えることができた。さらに北島南部においても、集中的な調査を行った。活火山であるトンガリロ山のあるトンガリロ国立公園の周辺地域では、活火山周辺の特色でもある地熱を活用して、発電が行われ、また温泉や健康・保養施設などが開発されており、自然環境を利用した観光が展開されている実態を調査できた。平成29年度は3年の研究期間の最終年度にあたる。研究代表者と分担者の計3名による研究打ち合わせを、鹿児島、富山、岡山において行い、研究の総括を進めた。すなわち平成27年度、平成28年度に実施したニュージーランドでの調査記録や収集資料にもとづいて分析を進め、成果のまとめを行った。この得られた研究成果は日本地理学会において発表し、また研究成果報告書にまとめた。この報告書は研究成果を広く社会に還元するために、大学、図書館、関連研究機関、研究者宛に送付した。この3年間の研究成果の概要をまとめると以下のようである。まず、持続可能な開発と生活の重要性を改めて確認した。この研究を進めるための対象地域であるニュージーランドについて、国土の自然や社会・文化などの特色と変遷を明らかにした。さらにニュージーランドにおけるブドウ栽培の南限として、セントラルオタゴ地域のワインと自然環境についての調査と分析結果をまとめた。またニュージーランドのブドウ栽培の北限として、オークランド地域の自然と観光について、調査と分析結果をまとめた。
サイレントクロマチン構築のダイナミクス

近年、セントロメア周縁部で見られるヘテロクロマチンがRNAi(RNA interference)関連因子群によって確立、維持される事が明らかとなった。具体的には、ヘテロクロマチン領域よりnon-coding RNAの転写が起き、RNA依存的RNAポリメラーゼによって生産されるdsRNAを基質としてDicer RNaseIIIがsiRNA(short interfering RNA)を生産し、そのsiRNAの一方の鎖を保持するRITS(RNA-induced transcriptional silencing)複合体がsiRNAの相同領域にリクルートされ、ヘテロクロマチンが確立・維持されると考えられている。我々はRNAポリメラーゼII(RNAPII)がこのnon-coding RNAの転写をおこなうことを明らかにすると共に、分裂酵母のセントロメア周縁部ヘテロクロマチンが崩壊する新規変異としてRNAPIIの二番目に大きなサブユニットをコードする遺伝子rpb2の新規変異(rpb2-m203)を単離した。興味深い事に、rpb2-m203変異はnon-coding RNAの転写レベルに影響を与えずにsiRNA生産プロセスに欠陥を示す変異であった。また、rpb2-m203変異によってRNA依存的RNAポリメラーゼやRITS複合体のヘテロクロマチン局在が損なわれていた。これらの結果は、ヘテロクロマチン中のnon-coding RNAの転写とその後のsiRNAプロセシングの過程がRNAPIIによって共役される可能性を強く示唆している。さらに、野生型株とrpb2-m203株からRNAPIIを精製しRNAPIIサブユニット構成、結合因子を比較したところ、サブユニット構成には大きな違いはないが、rpb-m203に特異的に結合、あるいは結合しなくなる因子が存在することがわかり、その同定を試みている。分裂酵母のヘテロクロマチン形成に関し以下の結果を得た。1)ヘテロクロマチンの構築においてヒストンH3の9番目のリジン(H3K9)のメチル化が重要で、これをヘテロクロマチン蛋白質Swi6が認識結合しサイレントクロマチンを形成する。このH3K9のメチル化に際して、H3K14の脱アセチル化が重要であると考えられていた。しかし我々の解析の結果、H3K9のメチル化にはH3K14の脱アセチル化を不要であり、逆にSwi6がH3K9のメチル化を認識結合した後に脱アセチル化酵素Clr3をヘテロクロマチンにリクルートしH3K14の脱アセチル化がおこり、これによりサイレントな状態が作り出されることが明らかになった。これはいまだ不明であったサイレントクロマチン形成におけるメチル化と脱アセチル化の関係の一部を明らかにするものである。2)セントロメアヘテロクロマチン形成においてRNAiマシナリー及びセントロメア領域由来のsiRNAが重要であることが報告されている。我々はセントロメアヘテロクロマチン特異的に欠損を示す変異株を単離した。この変異株ではセントロメアヘテロクロマチンの崩壊と共にsiRNAが生成されていない。この変異株はRNAポリメラーゼIIに変異を持つことが明らかになった。種々の解析からヘテロクロマチンの崩壊がRNAポリメラーゼの変異による二次的な効果によるものではないことが示唆された。これはRNAポリメラーゼがsiRNAの生成に関わることを示しており、興味深い。近年、セントロメア周縁部で見られるヘテロクロマチンがRNAi (RNA interference)関連因子群によって確立、維持される事が明らかとなった。具体的には、ヘテロクロマチン領域よりnon-coding RNAの転写が起き、RNA依存的RNAポリメラーゼによって生産されるdsRNAを基質としてDicer RNaseIIIがsiRNA (short interfering RNA)を生産し、そのsiRNAの一方の鎖を保持するRITS (RNA-induced transcriptional silencing)複合体がsiRNAの相同領域にリクルートされ、ヘテロクロマチンが確立・維持されると考えられている。

我々はRNAポリメラーゼII (RNAPII)がこのnon-coding RNAの転写をおこなうことを明らかにすると共に、分裂酵母のセントロメア周縁部ヘテロクロマチンが崩壊する新規変異としてRNAPIIの二番目に大きなサブユニットをコードする遺伝子rpb2の新規変異(rpb2-m203)を単離した。興味深い事に、rpb2-m203変異はnon-coding RNAの転写レベルに影響を与えずにsiRNA生産プロセスに欠陥を示す変異であった。また、rpb2-m203変異によってRNA依存的RNAポリメラーゼやRITS複合体のヘテロクロマチン局在が損なわれていた。これらの結果は、ヘテロクロマチン中のnon-coding RNAの転写とその後のsiRNAプロセシングの過程がRNAPIIによって共役される可能性を強く示唆している。さらに、野生型株とrpb2-m203株からRNAPIIを精製しRNAPIIサブユニット構成、結合因子を比較したところ、サブユニット構成には大きな違いはないが、rpb-m203に特異的に結合、あるいは結合しなくなる因子が存在することがわかり、その同定を試みている。
加齢による機能低下がもたらす在宅高齢者の調理上の不便さと栄養摂取状況との関連

本研究の目的は、在宅高齢者の調理上の不便さとそれへの対処行動(以下、調理行動)を見出すこと、調理行動と栄養摂取状況との関連性を明らかにすること、の2点である。これにより、在宅高齢者の機能低下に配慮した調理方法や、彼らが陥りやすい栄養問題を回避するための食べ方や食材の選び方など、具体的な食生活提案を目指す。初年度は、高齢者へのインタビュー、及びそれをもとにアンケートを作成する予定であった。しかし、インタビューへの協力者が少ない上、僅かな協力者は活動度が高く、調理上の不便さが抽出できなかった。そこで、方針を切り替え、文献をもとにアンケートを作成し、協力者を募った。アンケートの内容は、文献から抽出した不便さと高齢者の食生活評価ツールとして普及している「食品摂取の多様性評価(10食品群チェック表)」の2つである。現在、88名分がアンケートに回答、回収済みである。第一段階として、対象者へのインタビューから在宅高齢者の調理上の不便さを抽出する予定であった。しかし、対象として適切な被験者の確保が困難な現状である。(インタビューに応じる在宅高齢者が少ない上、インタビューに応じてくださる高齢者は、活動度が高く、何ら不便さを感じていない。)更に、食事調査ツールとして予定していたBDHQは、本研究の対象者(虚弱高齢者)には回答困難であることが判明した。実施中のアンケート調査は、2019年度中に150名を目指す。また、インタビューについては、比較的元気な高齢者の協力が得られそうであるため、不便さだけでなく、食材や総菜、外食、調理機器等についてのニーズの聞きとりを行うことを考えている。更に、不便さを感じないほど元気な秘訣を抽出したいと考えている。現在までの進捗状況で記した通り、研究全体がやや遅れている。また、BDHQの使用を取りやめたことにより、その分の費用が不要になった。2019年度、文献検索用、及び質的解析用のソフトウエア購入を予定している。
Ｉｎ－Ｃｅｌｌ　ＮＭＲ法を用いたＶＲＫ１キナーゼタンパク質の動的構造の解明

本研究では,細胞内における特定のタンパク質のふるまいを,核磁気共鳴(NMR)法とフッ素(19F)標識法を組み合わせて選択的に観測するための技術を開発した.またこの技術を用いて生体内で重要な役割を果たしているタンパク質の細胞内におけるNMR信号の観測に成功した.これは,これまで試験管内で解析されてきたタンパク質の構造変化を,実際に機能している生きた細胞内環境下で解明するために必要な重要な技術である.本研究では,細胞内におけるタンパク質の動的構造を,In-Cell NMR法と19F-NMR法を組み合わせて観測する技術を確立し,これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの機能メカニズムを,in vivoの環境下で解明することを目的とする.本研究の平成25年度における研究成果は以下の通りである.1:平成24年度に引き続いて,In-Cell NMR法における感度の問題を克服するために,様々なアミノ酸標識技術の検討を行った.その結果,高感度19F標識アミノ酸であるトリフルオロメチオニンを,無細胞タンパク質合成系を用いて様々なタンパク質に効率よく導入する技術の開発に成功した.さらに,この19F標識タンパク質を培養細胞に導入して,19F-NMR法で高感度に観測する方法を開発した.現在,より効率的な19F標識タンパク質の導入及び測定条件を検討するため,様々なトリフルオロメチオニン標識タンパク質を合成して細胞内に導入し,NMRスペクトルを測定している.また,トリフルオロメチオニン以外の19F標識アミノ酸や各種安定同位体標識アミノ酸についても,引き続き合成条件を検討している.以上の成果は,本研究の目的である,生きた細胞内におけるVRK1タンパク質の動的構造を解析する為に必要不可欠な技術であり,本研究の目標達成に向けて大きく前進した.本研究では,細胞内における特定のタンパク質のふるまいを,核磁気共鳴(NMR)法とフッ素(19F)標識法を組み合わせて選択的に観測するための技術を開発した.またこの技術を用いて生体内で重要な役割を果たしているタンパク質の細胞内におけるNMR信号の観測に成功した.これは,これまで試験管内で解析されてきたタンパク質の構造変化を,実際に機能している生きた細胞内環境下で解明するために必要な重要な技術である.本研究では,細胞内におけるタンパク質の動的構造を,In-Cell NMR法と19F-NMR法を組み合わせて観測する技術を確立し,これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの機能メカニズムを,in vivoの環境下で解明することを目的とする.本研究の平成24年度における研究成果は以下の通りである.1:In-Cell NMR法に必要な,培養細胞へのタンパク質の導入法を確立するため,これまで報告されている様々な細胞導入法を検討した.具体的には,各種の膜透過性ペプチドや膜傷害毒素等の導入法を用いて,HeLa細胞や293F細胞などの培養細胞に対し標識タンパク質の導入を試みた.結果,複数の方法で細胞内に高濃度にタンパク質を導入することに成功した.現在最適な導入条件を検討するため,安定同位体標識したタンパク質を導入してNMRスペクトルを測定している.2:In-Cell NMR法に適した安定同位体標識技術を開発するため,様々な19F標識アミノ酸の検討を行った.結果,19F標識メチル基を持つアミノ酸が最適であると判断し,高感度に測定可能なトリフルオロメチル化アミノ酸を開発した.現在無細胞タンパク質合成系を用いて19F標識タンパク質の発現を検討中である.また平成24年度末に導入された19F核を高感度に測定できるクライオプローブの調整を行い,本研究の目的に必要な,各種19F観測法の開発を行った.以上の成果は,本研究の目的である,生きた細胞内におけるVRK1タンパク質の動的構造を解析する為に必要不可欠な技術であり,本研究の目標達成に向けて大きく前進した.本研究では,細胞内におけるタンパク質の動的構造を,In-Cell NMR法と19F-NMR法を組み合わせて観測する技術を確立し,これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの機能メカニズムを,in vivoの環境下で解明することを目的とする.本研究の平成26年度における研究成果は以下の通りである.1:平成25年度に引き続いて、In-Cell NMR法における感度の問題を克服するために様々なアミノ酸標識技術、特に高感度19F標識アミノ酸であるトリフルオロメチオニンによるタンパク質標識技術の応用について研究を行った。その結果、目標であるVRK1キナーゼタンパク質のトリフルオロメチオニン標識に成功した。さらに、19F標識VRK1タンパク質の大量合成・精製に成功し、超高感度19F-NMRスペクトルの測定にも成功した。2:次に、得られたトリフルオロメチオニン標識VRK1キナーゼタンパク質を培養細胞に導入する実験を行った。その結果、少量ながら細胞内に標識タンパク質を導入することに成功し、生きた細胞内におけるトリフルオロメチオニン標識VRK1キナーゼタンパク質のNMRスペクトルの測定を行った。現在導入量を増やすため条件検討を行っており、測定感度の向上を進めている。以上が平成26年度の成果である。本研究期間全体を通じて、細胞内への安定同位体標識タンパク質の導入方法の開発から、高感度19F標識アミノ酸の開発、さらには19F標識アミノ酸によるタンパク質標識技術と大量合成技術の開発に成功し、実際に19F標識VRK1キナーゼタンパク質のNMRスペクトルの測定を行った。以上の成果は、生きた細胞内におけるタンパク質の動的構造の解明に大きく貢献するものである。

NMR法を用いた生体高分子の構造機能解析本研究では,細胞内におけるタンパク質の動的構造を,In-Cell NMR法と19F-NMR法を組み合わせて観測する技術を確立し,これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの機能メカニズムを,in vivoの環境下で解明することを目的とする.平成25年度は,予定通りIn-Cell NMR法に適したトリフルオロメチオニン標識タンパク質を細胞内に導入し,細胞内環境下におけるタンパク質の19F-NMR測定法を確立した.ただ,細胞内への標識タンパク質の導入方法の最適化に手間取り,最終的な目標であるVKR1タンパク質の機能メカニズムの解析までは至らなかった.本研究では,細胞内におけるタンパク質の動的構造を,In-Cell NMR法と19F-NMR法を組み合わせて観測する技術を確立し,これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの機能メカニズムを,in vivoの環境下で解明することを目的とする.平成24年度ではそのために必要な細胞導入法の検討および各種安定同位体標識技術の検討を行う計画であったが,いずれの分野でも一定の成果を上げることができた.これまでにIn-Cell NMR法に最適な19F標識タンパク質の作成に成功し,これら標識タンパク質の細胞内への導入方法を最適化したので,今後は当初の計画通り,標識したVRK1タンパク質を細胞内に導入し,細胞内におけるVKR1の機能メカニズムについてNMRを用いて明らかにする予定である.また,トリフルオロメチオニン以外の各種標識技術の開発も進めており,これらの技術を用いて標識したVRK1を同様に細胞内に導入してNMRで解析することで,細胞内環境下でのVRK1の構造機能変化をリアルタイムで観測する技術を確立する.当初の計画通り,今後は標識したVRK1タンパク質を細胞内に導入し,細胞内におけるVKR1の機能メカニズムについてNMRを用いて明らかにする予定である.当初の計画では平成2425年度の2年間で,細胞内におけるタンパク質の動的構造を,In-Cell NMR法と19F-NMR法を組み合わせて観測する技術を確立し,これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの機能メカニズムを,in vivoの環境下で解明することを目標とした.これまでに,In-Cell NMR法に最適なトリフルオロメチオニン標識タンパク質の合成法を確立し,実際に細胞内に導入して細胞内における標識タンパク質のNMR測定に成功した.しかし,標識タンパク質の細胞内への導入方法の最適化に時間がかかり,当初の目標であるVRK1タンパク質の細胞内における動的構造の解明は遅れている.