hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化器癌におけるDNAメチル化による遺伝子発現抑制のメカニズムの解析

さらに、細胞をメチル化酵素阻害剤、5-aza-dCで処理すると、ヒストンアセチル化が回復すること、ヒストン脱アセチル化阻害剤単独投与では、ヒストンアセチルは快復するが、遺伝子発現は回復しないことより、ヒストンアセチル化の変化は、DNAメチル化の状態によって制御されていると考えられた。一方、遺伝子の転写開始点から離れた部位では、ヒストンがアセチル化されていても、DNAメチル化が起こるのに対し、遺伝子の転写開始点近傍では、DNAメチル化とヒストン脱アセチル化及びヒストンメチル化は遺伝子のサイレンシングとよく相関した。DNMT1-/-DMT3B-/-細胞においては、メチル化により不活化されている遺伝子、CHFR及びTMS1が再発現しており、ヒストンメチル化の消失と、ヒストンの再アセチル化を認めた。以上の結果より、DNAメチル化はヒストン修飾を介して遺伝子発現制御を行っていると考えられた。DNA異常メチル化により様々な癌抑制遺伝子が不活化されることが明らかとなり、DNAメチル化の分子機構の解明は、発癌のメカニズムの解明だけでなく、新しい癌の診断や治療法の開発に重要と考えられる。われわれは、消化器癌におけるDNAメチル化の異常およびその分子機構について明らかにする目的で、細胞周期調節遺伝子やアポトーシス関連遺伝子の異常について解析した。M期チェックポイント遺伝子CHFRが大腸癌、胃癌、白血病などで高頻度に異常メチル化しており、遺伝子発現抑制にDNAメチル化およびヒストン脱アセチル化が重要な役割を果たしていた。CHFRが異常メチル化している腫瘍細胞は、微小管阻害剤による薬剤感受性が高く、CHFRのメチル化を指標として、抗癌剤感受性の予測が可能になると考えられた。また、WNTシグナルを負に調節する遺伝子SFRPsが大腸発癌の早期に異常メチル化により不活化されることを明らかにした。SFRPsの発現が消失している大腸癌細胞にSFRPを遺伝子導入することにより、APCやbeta cateninの変異の存在下でも、TCF活性の阻害とアポトーシスの誘導を認め、SFRPsが新しい癌治療の分子標的として重要であると考えられた。また、メチル化のスクリーニングにより、癌において異常メチル化している遺伝子断片を多数同定した。これらの遺伝子断片を分子マーカーとして、大腸癌および胃癌においてBH3 only subfamilyに属するpro-apoptotic遺伝子HRKが、がんにおいて高率にメチル化していることを明らかにした。これらの結果より、DNAメチル化の異常は抗がん剤感受性を予測する分子マーカーとして重要なだけでなく、がんの治療の新しい分子標的として重要であることが示唆された。がんの発生と進展には、ジェネティックな異常だけでなく、DNA異常メチル化などのエピジェネティックな異常が重要であることが明らかとなってきた。DNAメチル化の網羅的解析により、数百の遺伝子が異常メチル化により不活化されていることが示唆される。
抗腫瘍作用・抗ウイルス作用を持つ新規サイトカインlimitinの臨床応用

申請者らが白血病細胞株増殖を抑制することを指標にした発現クローニングで同定したLimitinは、IFN-αやIFN-βと相同性を有すること、IFN-α/β受容体と結合することより新種のI型IFNと考えられている。当該期間内に、リコンビナントLimitin蛋白や抗Limitin抗体を作製し、以下のLimitinの生理作用や蛋白発現を解析した。(1)Limitinは細胞障害性Tリンパ球キラー活性を増強させるとともに抗原提示細胞上のMHC class I抗原発現を増強させた。また、Limitinは多くの細胞株やp210bcr/ablを強制発現させた血液細胞株に対し細胞周期停止やアポトーシスを誘導した。マウス脳心筋炎ウイルス・マウス肝炎ウイルス・単純ヘルペスウイルス感染に対してLimitinはIFN-αとぼぼ同等の抑制効果(20-30pg/EU)を示した。一方、抗ウイルス活性を基準にLimitinとIFN-αの量を調整し両者の生理活性を比較すると、Bリンパ球系や巨核球系コロニー形成抑制にはIFN-αと比較して高濃度のLimitinが必要であり、IFN-αで認められた骨髄球系・赤芽球系細胞増殖抑制はLimitinでは認められなかった。LimitinはIFN-αやIFN-βと同様に免疫調節作用・抗腫瘍作用・抗ウイルス作用を示すが、IFN-αやIFN-βと比較して骨髄抑制作用が少ないという特徴を有していた。(2)免疫組織染色にてLimitin蛋白の発現を解析すると、脾臓・胸腺に存在する成熟Tリンパ球が陽性であった。また、胸腺におけるLimitin遺伝子発現は健常時から認められ、ウイルス感染による遺伝子発現増強は認められなかった。以上より、Limitinは、ウイルスの侵入に備えることや免疫状態を調節し腫瘍細胞など危険な細胞を排除することに恒常的に生体内で関与していると考えられた。また、胸腺で高いLimitin遺伝子発現が認められる事実から、ヒト胸腺由来cDNA libraryがヒト型Limitin遺伝子をスクリーニングする際の有力な候補と考えられた。(3)シグナル伝達分子Tyk2を欠損させると、LimitinとIFN-αのコロニー形成抑制作用(CFU-IL7,CFU-Meg)が消失した。LimitinやIFN-αでBリンパ球系細胞を刺激するとDaxx蛋白(増殖抑制に関与)の誘導や細胞内分布変化が認められるが、Tyk2欠損細胞ではDaxx蛋白の変化が消失していた。このように、徐々にLimitinとIFN-αによる骨髄抑制作用に関わるシグナルを明らかにしてきた。レコンビナントLimitin蛋白を作製し、Limitin蛋白の性状解析やin vitro, in vivoでの作用の解析を行った。レコンビナントLimitin蛋白作製は、Limitin遺伝子を強制発現したCHO細胞の培養上清をimmunoaffinity chromatographyとion-exchane chromatographyで精製することにより得た。Western blot解析により、Limitinの分子量が約20kDであること、Limitinが糖蛋白であること、Limitin蛋白内にS-S結合を有することを確認した。さらに、Limitinはヘパリン結合能を有し、熱や酸に安定であることを見出した。

免疫組織染色やRT-PCRで生体内におけるLimitin産生細胞について解析した。Limitinの産生細胞は、主に成熟Tリンパ球であり、特に胸腺でLimitin遺伝子発現が高いことを見出した。この結果から、ヒト胸腺由来cDNA libraryがヒト型Limitin遺伝子をスクリーニングする際の有力な候補と考えられた。新規IFN様蛋白Limitinの産生細胞特定を行なうとともに既知のIFNとの作用の相違をシグナルレベルで解析した。(1)Limitin産生細胞の同定免疫組織染色にてLimitin蛋白の発現を解析すると、脾臓(Periaortic lymphoid sheath)・胸腺(胸腺髄質)に存在する成熟Tリンパ球や肺・唾液腺の腺細胞が陽性であった。また、胸腺におけるLimitin遺伝子発現は健常時から認められ、他のIFNとは異なりウイルス感染による遺伝子発現増強は認められなかった。以上より、Limitinは、ウイルスの侵入に備えることや免疫状態を調節し腫瘍細胞など危険な細胞を排除することに対して恒常的に(健常時から)生体内で関与していると考えられた。また、胸腺で高いLimitin遺伝子発現が認められる事実から、ヒト胸腺由来cDNA libraryがヒト型Limitin遺伝子をスクリーニングする際の有力な候補と考えられた。(2)LimitinとIFN-alphaの作用の比較マウス脳心筋炎ウイルス・マウス肝炎ウイルス・単純ヘルペスウイルスの感染に対してLimitinがIFN-alphaとほぼ同等の抑制効果(TCID50:20-30pg)を示すことを明らかにした。抗ウイルス活性を基準にLimitinとIFN-alphaの量を調整し両者の生理活性を比較した結果、LimitinとIFN-alphaはp210 bcr/ablをstable transfectionした血液細胞株(FDCP-1や32D細胞株)の増殖を同程度抑制した。Bリンパ球系や巨核球系コロニー形成を抑制するためには、IFN-alphaと比較して高濃度のLimitinが必要であった。IFN-alphaで認められる骨髄球系・赤芽球系細胞増殖抑制はLimitinでは認められなかった。一方、IFN-alphaと比較して低濃度のLimitinでMHC class I発現を誘導した。このようにLimitinとIFN-alphaでは類似の生理活性を示すが、各々で特徴ある作用を示した。(3)LimitinとIFN-alphaによる骨髄抑制作用に関わるシグナルの解析Tyk2を欠損させると、LimitinとIFN-alphaのコロニー形成抑制作用(CFU-IL7,CFU-Meg)が消失した。LimitinやIFN-alphaでBリンパ球系細胞を刺激するとDaxx蛋白(増殖抑制に関与)の誘導や細胞内分布変化が認められるが、Tyk2欠損細胞ではDaxx蛋白の変化が消失していた。
終末期に近づく高齢者の生理学的バイオマーカーの確立とその応用

高齢者が、要介護状態から終末期に至る移行期は、医療およびケアの方向が転換していく重要な時期である。この時期には、病状の不可逆性が、意思決定の重要な拠り所になることが多い。しかし、臓器不全や認知症・老衰の進行した状態では、その臨床経過は多様で、予後を予測するバイオマーカーがほとんどない。我々は、高次機能や身体機能が既に大きく低下している状態では、生命に直結する原始的な機能、すなわち脳幹機能や消化管機能が臨床経過を左右すると予想している。我々は、最初に、過去の終夜睡眠ポリグラフ検査結果をもとに、非終末期の患者の安静閉眼時の呼吸リズムを定量化して評価した。呼吸リズムの定量化は、睡眠ポリグラフ装置にて入眠前の安静閉眼覚醒状態を確認し、その状態での3.5分間の呼吸リズムについて、サーミスターを用いた気流波形全体をフーリエ変換することによるエントロピーSを算出して評価した。解析途中であるが、呼吸リズムの乱れと年齢との関連はみられず、性差も確認されなかった。重症心不全、重症腎不全、高度の肥満、神経変性疾患のいずれかが存在すると呼吸リズムの乱れがみられた。そのほか、肺炎後の経口摂取再開の可否を予測する因子について探索した結果、本研究開始前に想定していたように肺炎前のADLや意識レベルが、肺炎後の経口摂取の可否に関わった。さらに、経管栄養下の患者の胃運動を腹部超音波により評価を継続し、経管栄養終了30分後の胃体部の排出能が37.5度以上の発熱日数と相関した。しかし、これらの患者は、すでに経管栄養が継続できている患者であることもあり、胃運動の超音波による評価が肺炎の発症や発熱、予後の予測に使用できるかは評価困難であった。呼吸リズムの評価については、きわめて新規性の高いマーカーであるため、当初の研究予定であった前向き研究に先立って、既に存在する終夜睡眠ポリグラフ検査結果をもとに非終末期の患者での検討を実施したため開始が遅れた。しかし、その結果、呼吸リズムに与える因子を新たに明らかにすることができ、本研究全体にとって必須のプロセスであったと考えている。関連して前向き研究全体の開始の遅れはあるが、肺炎患者の後ろ向き調査でも、これまでに注目されていない因子についての検討を加えることができ、今後の前向き研究の下地となった。予定とおり、75歳以上の肺炎患者の急性期、回復期での呼吸リズムや活動、傾眠の評価を実施する。本前向き研究のための倫理審査委員会からの承認もえている。各時点での評価結果や、急性期から回復期の改善の有無が、その後の患者の生存、ADL、摂食状況の予測に応用できるかを明らかにする。また、後ろ向き研究の意義も高く、分担研究者らと多施設の症例の臨床経過を統一して評価しなおす体制をとることができたので、今後はその解析もすすめる。

また、後ろ向き研究の意義も高く、分担研究者らと多施設の症例の臨床経過を統一して評価しなおす体制をとることができたので、今後はその解析もすすめる。呼吸リズムの評価については、きわめて新規性の高いマーカーであるため、当初の研究予定であった前向き研究に先立って、既に存在する終夜睡眠ポリグラフ検査結果をもとに非終末期の患者での検討を実施した。そのために前向き研究の開始が遅れたことにより、研究費の使用が少なくなった。前向き研究実施の準備はできており、次年度からは、今年度に予定していた使用計画と同様の物品費その他の目的のため助成金の使用を予定している。
生体リズム受光器の周波数特性に基づく新規光源・照明装置の検討

生体リズムに関わる受光器であるメラノプシンを含む網膜神経節細胞(mRGCs)の周波数変調光に対する挙動を、mRGCsを選択的に刺激する手法を用いて確認した。mRGCsは8Hz変調光に強い反応を示す一方、それより低・高周波数変調光に対する反応は小さいことを明らかにした。また青色LED光を用いて、生体リズムの指標である夜間のメラトニン分泌挙動への影響を確認した。1000Hz及び7.14Hzの青色LED周波数変調光のメラトニン分泌抑制への影響は小さいことを確認した。光はヒトの生体リズムに強く関わっており、特に夜間に浴びる光は睡眠や体温、内分泌リズムを撹乱し、人の健康に大きな影響をもたらす。しかし、現代生活には夜間の人工照明が必須であり、行動・行為上で必要とする明るさを得ることと、生体リズムへの影響を少なくすることのジレンマを抱えている。本研究は、我々が予備実験から見出した、生体リズムに関わる受光器であるメラノプシンを含む神経節細胞(以下mRGCと略す)の光刺激に対する周波数特性を更に充実させ、それを基に、上記ジレンマを解決する光源・照明装置開発への知見を得ることを目的としている。本年度は他の受光器への刺激量は一定に保ちながら、mRGCだけを選択的に刺激する多原色光源装置の改善を行った。さらにその機器を用いてmRGCへの刺激量だけを選択的に変化させた場合の網膜電図への反応、および明るさ感への影響を確認した。mRGCを選択的に刺激した場合の活動電位を網膜電図による把握から、提示刺激の周波数変調により特徴的な変化を示す可能性を確認した。また、mRGCの明るさ感への寄与の可能性が見られ、これまでの錐体・桿体に加えた明るさ感メカニズムの存在が推測された。これらの結果を踏まえ、投入エネルギーの増加を抑えながら、明るさ感の確保、生体リズムへの影響減少を考慮したmRGC周波数変調刺激制御法を考察した。光はヒトの生体リズムに強くかかわっており、特に夜間に浴びる光は睡眠や体温、内分泌リズムをかく乱し、人の健康に大きな影響をもたらす。本年度は、研究分担者である辻村が開発した多原色光源装置を用いて、輝度刺激値を一定とし、mRGCだけを選択的に刺激する条件を設定し、mRGCの光反応特性を網膜電図を用いて確認した。その結果、本研究における光刺激装置は、目的とするmRGCへの選択的刺激が十分に行えること、光刺激に対するmRGCの反応を錐体と分離して把握可能なこと、及びmRGCは光刺激on及びoff時に80msec程度の潜時を持って陽性反応を示すことを確認した。この考え方を基に明るさ(輝度)は同一とし、mRGC刺激値が異なる2つの光源・照明装置のプロトタイプを製作し、その光条件下でのメラトニンホルモン分泌への影響を確認したが、両者の差を十分に把握できるところまでには至らなかった。また、周波数変調を加えた光刺激が生体リズムに与える影響把握においても検討の余地が残った。光はヒトの生体リズムに強くかかわっており、特に夜間の浴びる光は睡眠や体温、内分泌リズムをかく乱し、人の健康に大きな影響をもたらす。しかし、現代生活には夜間の人工照明が必須であり、行動・行為上で必要な明るさを得ることと、生体リズムへの影響を少なくすることのジレンマを抱えている。本研究は、我々が予備実験から見出した、生体リズムに関わる受光器であるメラノプシンを含む網膜神経節細胞(以下mRGCと略す)の光刺激に対する周波数特性を更に充実させ、それを基に、上記ジレンマを解決する光源・照明装置開発への知見を得ることを目的としている。本年度は、mRGCの光応答性に関するこれまでの知見をもとに、青色LEDを用いて同一光刺激条件における100Hz周波数変調光と連続光を夜間に90分間浴びた場合の心理評価(眠気、感情・気分評価)および唾液中メラトニン分泌挙動への影響を比較した。その結果、心理的評価においては明確な差を見出すことはできなかったが、周波数変調条件では連続光条件に比べ、そのメラトニン抑制程度は小さい傾向が認められた。このことから、適切な周波数変調を加えることにより視覚系(明るさ感等)には変化をもたらさないが、非視覚系(生体リズム)に対しては影響の少ない夜間照明開発への可能性が示唆された。本年度の研究遂行上のポイントであった光刺激装置を用いたmRGCの特性把握については十分な成果を挙げることができた。

しかし一方で、その光刺激がもたらす生体リズム(メラトニンホルモン分泌)への影響についてはやや検討の余地が残る結果であった。24年度が最終年度であるため、記入しない。光刺激装置の改善・修正を行うとともに、実験条件(実験時刻、被験者の特性把握など)を再考し、今年度十分に行えなかった、周波数変調を加えた光刺激の生体リズムへの影響把握を継続する。
部分安全係数の合理的決定法に関する研究

1.安全性・経済性と設計の考え方について総括的な纏めを行った。2.部分安全係数法を批判する形で提案された方法について検討し、一部の指摘には評価すべき点があるものの、2次モーメント法及び部分安全係数法について認識不足があり、妥当なものでないことを具体的に指摘した。3.安全性を信頼性指標で評価する際の確率分布設定上の注意点、特に扱い易いためにしばしば用いられる正規分布及び対数正規分布を用いる場合には、結果として非現実的な議論をするおそれがあることについて指摘した。4.部分安全係数の決定に大きな影響を与えると考えられる、道路橋活荷重の改訂の設計に与える影響について具体的に検討し、このような改訂によって現状より大きな荷重の通過を許すことは適切でないことを指摘した。5.部分安全係数と密接な関係にある、社会資本施設の保守費の予測を過去のデータを用いて行い、40150年で建設費と同程度の保守費が必要であることを明らかにした。6.構造物の経済性と安全性の、比較的一般性のある、数値的評価方法を提示した。7.これまでの許容応力度設計法では安全性にかなりのばらつきがあるが、限界状態設計法ではばらつきが小さくなることが数値的に確かめられ、それを積極的に取り入れた部分安全係数の選択方法について提案した。8.個々の設計基準の作成者(コード・ライター)及び第一線の設計者が容易に利用できる、適切な部分安全係数を選択するための図を作成した。これを用いると、これまでの安全性と経済性の水準との対比ができ、部分安全係数の選択が合理的に行える。9.許容応力度設計法と限界状態設計法による、CADシステムを利用した構造物の設計製図のプログラムを開発して示した。10.具体的な設計例によって、上記の図が有効に利用できるものかどうかについて検証した。11.コンクリート構造物の耐久性設計への部分安全係数法の導入について検討して、提案した。1.部分安全係数決定の基本に関する次のような成果が得られた。(1)強度項と荷重項をそれぞれ一つの確率分布で表現する時、その確率分布とパラメータの設定には十分注意しなければならないことが分かった。特に扱い易いためにしばしば用いられる正規分布及び対数正規分布を用いる場合には、結果として非現実的な議論をするおそれがある。(2)費用と耐久性を考慮したコンクリート床版の最適かぶり厚さについて知見が得られた。(3)事故・災害の考え方について提言し、安全性・経済性と設計の絡みについても考察を加えた。(4)今後利用が予想されるエアービーム構造物の簡易数値解析手法を提案した。2.これまで許容応力度設計法で設計された、典型的な道路及び鉄道鉄筋コンクリート構造物の設計計算例について、経済性と安全性の水準の評価が一部明らかになった。3.上記の構造物を限界状態設計法で設計し、経済性と安全性の比較について数値的結果が一部得られた。4.常時と地震で断面寸法が決まる場合の許容応力度設計法と限界状態設計法による、安全性と経済性の評価方法についての検討を終え、具体的な評価を行っている。5.限界状態設計法で用いる部分安全係数の数値と、従来の許容応力度設計法での経済性と安全性の関係が一部明かになった。6.これまでの許容応力度設計法では安全性にかなりばらつきがあるが、限界状態設計法ではばらつきが小さくなることが、数値的に確かめられた。その結果を積極的に取り入れた部分安全係数の検討を行っている。

1.部分安全係数法を批判する形で提案された方法について検討し、一部の指摘には評価すべき点があるものの、2次モーメント法及び部分安全係数法について認識不足があり、妥当なものでないことを具体的に指摘した。2.部分安全係数の決定に大きな影響を与えると考えられる、道路橋活荷重の改訂の設計に与える影響について具体的に検討し、このような改訂によって現状より大きな荷重の通過を許すことは適切でないことを指摘した。3.部分安全係数と密接な関係にある、社会資本施設の保守費の予測を過去のデータを用いて行い、40150年で建設費と同程度の保守費が必要であることを明かにした。4.個々の設計基準の作成者(コード・ライター)及び第一線の設計者が容易に利用できる、適切な部分安全係数を選択するための図を作成した。これを用いると、これまでの安全性と経済性の水準との対比ができ、部分安全係数の選択が合理的に行える。また安全性を評価するための信頼性指標の計算プログラムを開発し示した。5.CADシステムを利用した構造物の、許容応力度設計法と限界状態設計法による設計製図のプログラムを示した。これは設計条件をデータとして与えることにより、自動的に設計製図が行えるものである。6.具体的な設計例によって、上記の図が有効に利用できるものかどうかについて検証した。その結果、一般論から得られたことが具体例でもほぼ成立していることが分かった。7.コンクリート構造物の耐久性設計への部分安全係数法の導入について検討して、ある思案を提案した。今後確率分布情報が得られれば、耐久性設計に役立つであろう。
PTH受容体転写促進因子の同定と口腔癌による顎骨吸収下におけるその機能解析

副甲状腺ホルモンは、カルシウム代謝、さらには骨代謝において重要な役割を担うが、その受容体(PTH1R)の発現は、骨組織においては成熟骨芽細胞や前肥大軟骨細胞のみといったように時期的にも部位的にも厳密に制御されている。骨芽細胞では、PTHやPTHrPによる破骨細胞活性化因子の発現亢進を仲介することで骨吸収を促進する。本研究では、このPTH1R遺伝子発現制御機構を解析したところ骨芽細胞におけるPTH1R遺伝子の主要なプロモーターであるU3プロモーターのコア領域は、GC配列に富むTATA-lessプロモーターで、deletion mutant解析および変異導入解析から、以前我々がPTHSRと名付けた転写開始点付近の配列中の+1/+12部分がイニシエーター(Inr)エレメントで、-128/-1領域が、MAZやSp1などが結合するアクチベーター結合領域、さらには、+51/+103領域が下流制御エレメントであるinitiator-mediated型のプロモーターであることが明かとなった。また、ゲルシフトアッセイの結果、Inrエレメントを特異的に認識するタンパク質が存在することが明かとなった。そして、PTHもしくはIGF-Iの処理によりこの結合が弱くなり、しかも転写活性が減衰することから、このタンパク質がInrに結合することが転写の活性化に必要であることが考えられた。このInr結合タンパク質に関して、ビオチン化したPTHSRと骨芽細胞の核抽出物を反応させ、アビジン-アガロースカラムで精製して結合したタンパク質をSDS-PAGEで解析したところ、112kDaと129kDa付近に2本のバンドがみられた。4-nitoroqinoline-N-oxideを用いてラットに口腔癌を発症させ、その腫瘍部分の顎骨および顎骨周囲の組織を採取して解析したところ、ほとんどの検体の顎骨周囲組織において、PTHrPの発現が正常部位に比べ著しく上昇していた。顎骨部分においては、Inr結合候補タンパク質遺伝子の発現は正常部位に比べ変化はみられなかったものの、PTH1Rの発現はダウンレギュレートされていた。しかし、RANKL、Cathep-sin Kは正常部位に比べ上昇しており、OPGの発現は抑制されていた。このため、PTHrPによるPTH1Rのダウンレギュレーションはみられるものの、RANKLの発現が上昇しOPGの発現が減少していることで、破骨細胞が活性化され、骨吸収が進行していると考えられた。カルシウム代謝、さらには骨代謝において重要な役割を担う副甲状腺ホルモン受容体(PTH1R)の発現は、骨組織においては成熟骨芽細胞や前肥大軟骨細胞のみといったように時期的にも部位的にも厳密に制御されている。本研究では、このPTH1R遺伝子上に作用してその遺伝子の発現調節に影響を与えるタンパク質のクローン化を試みたところ、以下のような結果が得られた。

(1)以前の我々の研究で、何らかのタンパク質が結合することでPTH1Rプロモーター活性に強く影響する転写開始点付近の領域であるPTHSRの存在を示したが、この領域中の3つの塩基を変異させた約4kbのコンストラクトを作製したところ、変異の無い場合に比べプロモーター活性が激減した。これより、PTHSRに結合する何らかのタンパク質は、PTH1R遺伝子発現に重要な役割をしていると考えられた。(2)ビオチン化したPTHSRと骨芽細胞の核抽出物を反応させ、アビジン-アガロースカラムで精製して結合したタンパク質をSDS-PAGEで解析したところ、112kDaと129kDa付近に2本のバンドがみられた。また、PTHSRをプローブとして、精製したタンパク質についてゲルシフトアッセイを行ったところ、未精製の核抽出物を用いた場合と同じ位置にバンドがみられた。(3)SDS-PAGEで得られたバンドをMALDI-TOF MS/PMF解析してタンパク質の同定を行ったところ、2種類のタンパク質が候補として考えられた。このうちの1つは、転写因子としての機能を有していないタンパク質なので可能性は低いと考えられた。一方は機能が解析されていない、類似タンパク質として登録されているものであった。副甲状腺ホルモンは、カルシウム代謝、さらには骨代謝において重要な役割を担うが、その受容体(PTH1R)の発現は、骨組織においては成熟骨芽細胞や前肥大軟骨細胞のみといったように時期的にも部位的にも厳密に制御されている。骨芽細胞では、PTHやPTHrPによる破骨細胞活性化因子の発現亢進を仲介することで骨吸収を促進する。本研究では、このPTH1R遺伝子発現制御機構を解析したところ、骨芽細胞におけるPTH1R遺伝子の主要なプロモーターであるU3プロモーターのコア領域は、GC配列に富むTATA-lessプロモーターで、deletion mutant解析および変異導入解析から、以前我々がPTHSRと名付けた転写開始点付近の配列中の+1/+12部分がイニシエーター(Inr)エレメントで、-128/-1領域が、MAZやSp1などが結合するアクチベーター結合領域、さらには、+50/+103領域が下流制御エレメントであるinitiator-mediated型のプロモーターであることが明かとなった。また、ゲルシフトアッセイの結果、Inrエレメントを特異的に認識するタンパク質が存在することが明かとなった。そして、PTHもしくはIGF-1の処理によりこの結合が弱くなり、しかも転写活性が減衰することから、このタンパク質がInrに結合することが転写の活性化に必要であることが考えられた。このInr結合タンパク質に関して、ビオチン化したPTHSRと骨芽細胞の核抽出物を反応させ、アビジン-アガロースカラムで精製して結合したタンパク質をSDS-PAGEで解析したところ、112kDaと129kDa付近に2本のバンドがみられた。4-nitoroqinoline-N-oxideを用いてラットに口腔癌を発症させ、その腫瘍部分の顎骨および顎骨周囲の組織を採取して解析したところ、ほとんどの検体の顎骨周囲組織において、PTHrPの発現が正常部位に比べ著しく上昇していた。顎骨部分においては、Inr結合候補タンパク質遺伝子の発現は正常部位に比べ変化はみられなかったものの、PTH1Rの発現はダウンレギュレートされていた。
神経伝達物質の遊離機構におけるプロテインキナーゼCの役割に関する研究

プロテインキナーゼC(Cキナーゼ)が中枢および末梢神経からの伝達物質遊離機構,多分開口放出の機構に関与することを見出した.ラット脳の可溶性分画から精製されたCキナーゼに対するモノクローナル抗体を作製し,この抗体を用いた免疫組織科学によるCキナーゼの脳内分布は,海馬,扁桃体,嗅球,小脳皮質等に多く,脳幹部では少なかった.標識ホルボールエステルを用いたオートラジオグラフィーでも同様に嗅球,海馬に多く,延髄,白質,橋では少なく,ホルボールエステルの結合はCキナーゼであることが明らかになった.中枢および末梢神経からのアセチルコリン,ノルアドレナリン, γアミノ酪酸のCa依存性遊離はCキナーゼを活性化するホルボールエステル(TPA)により増大した.一方, Cキナーゼ活性化によるノルアドレナリン遊離の増大がホルコスコリンによるサイクリックAMP-Aキナーゼ系の活性化により抑制されたことから, Ca依存性の神経伝達物質の遊離過程がジアシルグリセロールーCキナーゼ系とサイクリックAMP-Aキナーゼ系の相互作用により調節されている可能性が見出された.Cキナーゼは従来単一の物質と考えられていたが,近年の遺伝子クローニング法によりα, βI, βII, γと少なくとも4種のサブタイプの存在が明らかにされている. Cキナーゼの多彩な役割の中で神経伝達機構に関わるサブタイプを解明するために,各サブタイプの脳内分布を調べたところ, γタイプCキナーゼは深部小脳核に投射するプルキンエ細胞(γアミノ酪酸を伝達物質とする)の神経終末に存在し,深部小脳核スライスからのγアミノ酪酸遊離がTPAによるCキナーゼの活性化で増大することが見出され, γタイプCキナーゼがγアミノ酪酸の遊離機構に関与することが示唆された.今後,本酵素の各サブタイプの局在を電顕レベルで解析することにより, Cキナーゼの役割を明らかにすることができると考えられる.プロテインキナーゼC(Cキナーゼ)が中枢および末梢神経からの伝達物質遊離機構,多分開口放出の機構に関与することを見出した.ラット脳の可溶性分画から精製されたCキナーゼに対するモノクローナル抗体を作製し,この抗体を用いた免疫組織科学によるCキナーゼの脳内分布は,海馬,扁桃体,嗅球,小脳皮質等に多く,脳幹部では少なかった.標識ホルボールエステルを用いたオートラジオグラフィーでも同様に嗅球,海馬に多く,延髄,白質,橋では少なく,ホルボールエステルの結合はCキナーゼであることが明らかになった.中枢および末梢神経からのアセチルコリン,ノルアドレナリン, γアミノ酪酸のCa依存性遊離はCキナーゼを活性化するホルボールエステル(TPA)により増大した.一方, Cキナーゼ活性化によるノルアドレナリン遊離の増大がホルコスコリンによるサイクリックAMP-Aキナーゼ系の活性化により抑制されたことから, Ca依存性の神経伝達物質の遊離過程がジアシルグリセロールーCキナーゼ系とサイクリックAMP-Aキナーゼ系の相互作用により調節されている可能性が見出された.Cキナーゼは従来単一の物質と考えられていたが,近年の遺伝子クローニング法によりα, βI, βII, γと少なくとも4種のサブタイプの存在が明らかにされている. Cキナーゼの多彩な役割の中で神経伝達機構に関わるサブタイプを解明するために,各サブタイプの脳内分布を調べたところ, γタイプCキナーゼは深部小脳核に投射するプルキンエ細胞(γアミノ酪酸を伝達物質とする)の神経終末に存在し,深部小脳核スライスからのγアミノ酪酸遊離がTPAによるCキナーゼの活性化で増大することが見出され, γタイプCキナーゼがγアミノ酪酸の遊離機構に関与することが示唆された.今後,本酵素の各サブタイプの局在を電顕レベルで解析することにより, Cキナーゼの役割を明らかにすることができると考えられる.中枢および末梢のコリン作動性神経からのアセチルコリン遊離,アドレナリン作動性神経からのノルアドレナリン遊離が発癌物質のホルボールエステル(TPA)によって増幅されることを見出した。TPAはプロテインキナーゼCを活性化するので、神経伝達物質の遊離機構におけるプロテインキナーゼCの関与が示唆された。本年度はプロテインキナーゼCの神経系における役割を分子レベルで解析するため、ラット脳組織におけるプロテインキナーゼCの局在を本酵素に対するモノクローン抗体と標識TPAを用いて調べた。ラット脳の可溶性分画から精製されたプロテインキナーゼCに対して作製されたモノクローン抗体は脳の可溶性分画内のすべての蛋白のうち、プロテインキナーゼCとのみ反応し、他のプロテインキナーゼ(サイクリックAMP依存性,サイクリックGMP依存性プロテインキナーゼ)とは全く反応しなかったので、このモノクローン抗体はプロテインキナーゼCと特異的に反応すると考えられた。このモノクローン抗体を用いた免疫組織化学によるプロテインキナーゼCの脳内分布は、海馬,扁桃体,嗅球,小脳皮質等に多く、脳幹部では少なかった。標識TPAを用いたオートラジオグラフィーでも同様に嗅球,海馬に多く、延髄,白質,橋では少なかった。免疫組織化学でさらに詳細に調べると、プロテインキナーゼCは神経細胞に存在し、グリア細胞にはほとんど存在しないことが明らかになった。

小脳のプルキンエ細胞におけるプロテインキナーゼCの免疫反応では、シナプス前部の神経終末に強い反応がみられたことから、本酵素が神経伝達物質の遊離機構に深く関与していることが明らかになった。今後さらに、本酵素の局在を電顕レベルで解析することによってプロテインキナーゼCの情報伝達機構における役割を解明することができると考えられる。
低誘電率、低誘電正接を有する次世代感光性有機層間絶縁膜の開発

シリコン超大規模集積回路(ULSI : Ultra-Large Scale Integrated Circuits)は21世紀の高度情報化社会、ユビキタス情報社会の実現のために情報通信分野で最も重要なコア部であり、今後さらに高集積化と高速化が要求されている。この高集積化と高速化の両立には配線間を取り巻く層間絶縁膜の低誘電率(lowk)化と低誘電正接化が必須である。そこで本研究では、材料の分極率を下げ、双極子分極が起こりにくい構造を有するポリマーを設計した。繰り返しのハンダ工程に耐えうる耐熱性も重要であるが、耐熱性向上のための芳香環の導入は低誘電率化に不利に働く。しかし、ナフチル基のカップリングで生じるビナフチルはナフタレン環がほぼ直行しているため嵩高く、高分子の骨格内に分子レベルのナノ空孔を形成でき、耐熱性や剛直性も同時に実現できると考えた。そこで酸化カップリング重合により種々のポリ(ナフチレンエーテル)を合成した。得られたポリマーは自己支持性のある強靭なフィルムが作成可能であり、高耐熱性(500°C以上)、低誘電性(ε=2.7-2.75)を示した。また、ビス(トリフルオロメチル)ビフェニルを有するポリマーは剛直な主鎖構造により高周波10GHzで0.0025という低誘電正接を達成した。さらに、同様な骨格を持つポリ(ナフチレンエーテル)をマトリックスとして用いて、架橋剤及び光酸発生剤と組み合わせることによりネガ型の感光性ポリマーの開発を行った。作成した感光性ポリマーは、感度(D_<0.5>)が6.0mJ/cm^2、コントラスト(γ_<0.5>)が5.2であり、化学増幅機構による高感度なレジストシステムであった。さらに、密着露光法により20μmの解像度を有するラインアンドスペースのパターンが作成可能であった。得られた感光性ポリマーフィルムは、高い耐熱性と低誘電性を示し、次世代感光性絶縁材料としての応用が期待される。シリコン超大規模集積回路(ULSI : Ultra-Large Scale Integrated Circuits)は21世紀の高度情報化社会,ユビキタス情報社会の実現のために情報通信分野で最も重要なコア部であり,今後さらに高集積化と高速化が要求されている。この高集積化と高速化の両立には超微細加工のためのリソグラフィー技術、配線間を取り巻く層間絶縁膜の低誘電率(low k)化と低誘電正接化が必須である。そこで本研究ではこれら二つを命題として掲げた。一つ目の次世代超微細加工リソグラフィー用材料として、分子レベルで応答可能な低分子アモルファス材料に着目した。すなわち、種々のコア分子を有する低分子アモルファスを合成したところ、ヘキサキス(ヒドロキシフェニル)ベンゼンをコアとする分子が高いガラス転移温度(105°C)を示した。これをシリコン基板に塗布し、電子線照射、アルカリ現像あるいは超臨界二酸化炭素現像による検討を行ったところ微細パターンが可能であった。二つ目の低誘電・低誘電損失材料開発では、材料の分極率と密度を下げ、双極子分極が起こりにくい構造を設計した。繰り返しの半田工程に耐えるための耐熱性も重要であるが、耐熱性向上のための芳香環の導入は低誘電率化に不利に働く。しかし,ナフチル基のカップリングで生じるビナフチルはナフタリン環がほぼ直交しているのでかさ高く,高分子の骨格内に分子レベルのナノ空孔を形成ができ(molecular scale free volume),耐熱性,剛直性も同時に維持できると考えた。そこで酸化カップリング重合を用いた低誘電性ポリマーの合成に取り組み,2,2'-ビス(1-ナフチルオキシ)-1,1'-ビナフチルの酸化カップリング重合により高分子量の相当するポリ(ナフチレン-エーテル)(PNE)の合成に成功した。その物性について検討したところ,誘電率(2.5),強度(9.5GPa),耐熱性(500°C以上)など次世代低誘電層間絶縁膜に要求される基本的な物性を有していることが分かった。この高集積化と高速化の両立には超微細化工のためのリソグラフィー技術、配線間を取り巻く層間絶縁膜の低誘電率(low k)化と低誘電正接化が必須である。ヘキサキス(ヒドロキシフェニル)ベンゼンをコアとする低分子アモルファスを合成し、これをシリコン基板へ塗布したものを用いて電子線照射およびアルカリ現像液あるいは超臨界二酸化炭素現像を行ったところ、50nmまでの微細パターンを得ることに成功した。また二つ目の低誘電・低誘電損失材料では、材料の分極率を下げ、双極子分極が起こりにくい構造を設計した。繰り返しの半田工程に耐えうる耐熱性も重要であるが、耐熱性向上のための芳香環の導入は低誘電率化に不利に働く。そこで酸化カップリングによりビス(トリフルオロメチル)

ビフェニルやテトラフェニルメタンを骨格に有するビナフチレンエーテルから種々のポリ(ナフチレンエーテル>を合成した。得られたポリマーは高耐熱性(500°C以上)、低誘電率(2.7-2.75)および低誘電正接(0.0025)を示し、トルエン溶液からキャストすることにより自己支持性のある強靭なフィルムが作成可能であった。シリコン超大規模集積回路(ULSI : Ultra-Large Scale Integrated Circuits)は21世紀の高度情報化社会、ユビキタス情報社会の実現のために情報通信分野で最も重要なコア部であり、今後さらに高集積化と高速化が要求されている。この高集積化と高速化の両立には配線間を取り巻く層間絶縁膜の低誘電率(lowk)化と低誘電正接化が必須である。そこで本研究では、材料の分極率を下げ、双極子分極が起こりにくい構造を有するポリマーを設計した。繰り返しのハンダ工程に耐えうる耐熱性も重要であるが、耐熱性向上のための芳香環の導入は低誘電率化に不利に働く。しかし、ナフチル基のカップリングで生じるビナフチルはナフタレン環がほぼ直行しているため嵩高く、高分子の骨格内に分子レベルのナノ空孔を形成でき、耐熱性や剛直性も同時に実現できると考えた。そこで酸化カップリング重合により種々のポリ(ナフチレンエーテル)を合成した。得られたポリマーは自己支持性のある強靭なフィルムが作成可能であり、高耐熱性(500°C以上)、低誘電性(ε=2.7-2.75)を示した。また、ビス(トリフルオロメチル)ビフェニルを有するポリマーは剛直な主鎖構造により高周波10GHzで0.0025という低誘電正接を達成した。さらに、同様な骨格を持つポリ(ナフチレンエーテル)をマトリックスとして用いて、架橋剤及び光酸発生剤と組み合わせることによりネガ型の感光性ポリマーの開発を行った。作成した感光性ポリマーは、感度(D_<0.5>)が6.0mJ/cm^2、コントラスト(γ_<0.5>)が5.2であり、化学増幅機構による高感度なレジストシステムであった。さらに、密着露光法により20μmの解像度を有するラインアンドスペースのパターンが作成可能であった。得られた感光性ポリマーフィルムは、高い耐熱性と低誘電性を示し、次世代感光性絶縁材料としての応用が期待される。
新規Z型配位子を有する遷移金属錯体の合成と触媒的有機合成反応への応用

本研究は遷移金属錯体に対して、強いσ受容性を示すことが期待できるZ型配位子を新たにデザイン・合成し、触媒的有機合成反応への応用を目指すものである。Z型配位子錯体はL型およびX形配位子錯体とは異なり、高いLewis酸性を有することが期待されるため、その特異な触媒活性を示すことが期待される。これまでに研究計画に従い、窒素配位部位を有するZ型配位子合成の際、カルバゾール部位を導入した基質での検討を行ったものの、目的とする反応は進行しなかった。またその研究過程において、ハロゲン化トリアリールアミンおよびハロゲン化ホウ素との反応により、新規1,4-アザボリンが得られることを見出し、こちらが固体状態で特異な発光特性を示すことも併せて発見した。一方、リン配位部位を有するZ型配位子合成は順調に軸不斉モノホスフィン配位子までの合成ルートを確立することができた。このZ型配位子合成の過程で、アルコールとハロゲン化ホウ素との反応による合成を検討し、アルコールの活性化を目的として、カルボジイミドを添加したところ、目的とする反応は進行しなかったものの、アルコールの水素移動型反応が進行することを見出した。更なる検討の結果、本反応はルテニウム触媒を用いた際に定量的に進行し、官能基許容性にも優れた反応であることが分かった。本知見は採択研究課題より派生した研究であるが、これまでにカルボジイミドを水素受容体とするアルコールの水素移動型反応は報告されておらず、学術的にも興味深い知見を得ることができた。本研究により得られた知見等は、Z型配位子錯体を用いた触媒反応検討に関してもそのモデル反応として利用できるなど、本研究課題の遂行・発展に生かすことができるものと考えている。申請者は平成30年4月より首都大学東京より武蔵野大学に異動となったため、その準備や赴任した研究室で必要な実験設備を整えるために時間を要した。そのため、当初の計画通りには当該研究課題は進行しなかったものの、「研究成果の概要」でも記述したようにその研究過程でルテニウム触媒およびカルボジイミドを用いたアルコールの効率的な水素移動型反応を見出しており、またZ型配位子合成の際に得られた新規1,4-アザボリンが固体状態での特異な発光特性を示すこともわかった。これらの知見はいずれも学術的に興味深いものであり、本研究課題の今後の遂行に際し、有益な情報となることが期待できる。平成31年度以降は、平成30年度の研究課題を引き続き検討するとともに、Z型配位子合成計画の見直しも図っていく必要があると考えている。すなわち、Z型配位子の合成法としてベンザインを利用する手法やbora-Friedel-Crafts反応を利用することで合成が達成できるものと推察しており、今後検討を行っていく予定である。

すなわち、Z型配位子の合成法としてベンザインを利用する手法やbora-Friedel-Crafts反応を利用することで合成が達成できるものと推察しており、今後検討を行っていく予定である。平成30年度は研究課題遂行に必要な器具・試薬などを整備するために、受領した研究費の大半を物品費に充て、計画的に予算執行を行った。その結果残額が生じたが、平成31年度以降も継続の研究課題であり、また平成30年度の予算残額が少額であった為、次年度に繰り越すこととした。次年度の使用計画についてだが、平成30年度と同様、物品費に該当する試薬(基質や基質の合成原料となる有機化合物、触媒合成用の遷移金属錯体および塩、原料合成や反応探索時の反応、および化合物精製に用いる有機溶媒、NMR測定に用いる重溶媒)や実験器具(シュレンクやフラスコに代表される各種実験器具など)の購入に充てる予定である。
液体金属のキャビテーション現象の解明および予測

数値解析に関しては、液体金属のキャビテーション現象を解析するための圧縮性・非圧縮性流体の統一解法のコードを開発した。初年度は主にモデルの検証のため二次元解析を実施した。2年目は、水銀を用いた下記の気泡崩壊挙動観測の実験を対象とした単一気泡の成長・崩壊の解析を行い、本数値解析モデルにより気泡挙動を良好に再現できることを確認した。最終年度は、実験により流れによってキャビテーションの損傷が軽減されることがわかったため、その原因を数値解析的に究明し、流れによる気泡成長時の変形により崩壊時の衝撃が軽減されること、および流れによる壁面からの気泡離脱により崩壊時の衝撃が軽減されることがわかった。実験に関しては、液体金属の一例として水銀を対象とした実験を実施した。核破砕中性子源水銀ターゲットのパルス陽子ビーム入射時に発生する水銀中のキャビテーション気泡について、バブルダイナミックスを適用した数値解析および衝撃圧力負荷試験における高速度ビデオカメラを用いた気泡崩壊挙動観測を行った。核破砕中性子源水銀ターゲットのパルス陽子ビーム入射時に発生する水銀中のキャビテーション気泡について、固体界面に生成した気泡の崩壊挙動を超高速度ビデオカメラにより可視化した。これらの実験結果や数値解析結果により、液体金属中のキャビテーション発生機構を明らかにすると共に、キャビテーションによる固体損傷の防御方法を提案することが可能となった。そのコードに相変化を考慮したキャビテーション・モデルを導入し、従来の数値解析結果や実験データと比較を行いその妥当性を検討した。今年度は主にモデルの検証のため二次元解析を実施した。水を対象とした予備解析で、キャビテーション現象の数値解析では、状態方程式や相変化モデルの影響が大きいことがわかった。また、水銀を用いた下記の気泡崩壊挙動観測の実験を対象とした単一気泡の成長・崩壊の解析を行い、本数値解析モデルにより気泡挙動を良好に再現できることを確認した。その結果、水銀中では、圧力が負圧限界に達した後に気泡の成長が始まること、気泡の成長から崩壊までの過程は負圧保持時間と除荷時間に依存することを明らかにした。また、音響振動計測により得た気泡崩壊に励起される高調波振動と、気泡崩壊のタイミングは良い一致を示し、実機の音響振動計測により運転中のキャビテーション気泡挙動のモニタリングが可能であることを明らかにした。昨年度の実験結果より、キャビテーションによる損傷は流れの影響を受けることがわかっており、今年度はその原因解明の解析を実施した。その際、従来用いていた状態方程式では液体水銀の物性を一部表現できない状況があることがわかったため、水銀に適した新しい状態方程式の導入を図った。また、実験に関しては、液体金属の一例として水銀を対象とした実験を実施した。それによると、崩壊に伴い、マイクロジェットの吹き出しが観測され、その固体壁面への衝突速度は約200m/sに達することが推測された。また、崩壊直後に生じた衝撃波の伝播に伴い、二次キャビテーションが発生することを確認した。今後、これらの実験事実について、解析的考察を加えることで、その発生機構を明らかにすると共に、その防御策について検討を進める。昨年度の数値的に確認された、キャビテーションにおける流れの影響を評価をより系統的に実施した。流れによる損傷軽減の原因として、気泡の変形効果および気泡の剥離効果の二つが考えられるため、その二点について、様々に条件を変えた数値解析を実施し、その原因を解明した。一方で、キャビテーションにおける損傷軽減のために、水銀中にヘリウムのマイクロバブルを注入する手法が検討されている。水銀ターゲット容器内流れ場中における、マイクロバブルの挙動解析も、気泡の合体・分裂を考慮した手法により実施した。

その結果より、分裂よりも合体の効果が大きく、初期気泡径をなるべく小さくすべき可能性あることがわかった。実験では、ヘリウムバブル微小気泡を注入することにより、キャビテーション損傷を低減できること、損傷低減効果は気泡注入条件に大きく影響されることが明らかとなった。しかしながら、気泡注入条件の定量的な評価及び、その最適条件を見出す所には至っていない。今後の課題として残るが、数値解析と実験評価を両輪のごとく実施しすることが、必要不可欠であることは自明である.
周囲脂肪組織を標的とした新規血管保護療法の開発

血管のホメオスターシス維持と病変形成過程における、血管周囲脂肪組織の役割について検討した。痩せたマウスの血管外膜周囲に豊富に存在する脂肪組織の形質を、皮下脂肪、内臓脂肪と比較したところ、血管外脂肪組織は通常は皮下脂肪に近いものの、血管傷害を契機に内臓脂肪型に形質を転換することが明らかとなった。血管外膜周囲の毛細血管をMelcox樹脂を用いて走査型電子顕微鏡で観察した。外膜脂肪細胞が血管と解剖学的に近接関係にあり、外膜液性因子が粥腫に直接アクセスする経路が示された。血管外膜脂肪組織周囲と血管壁との外膜微小血管によって、物理的、機能的に相互作用していることが明らかとなった。また、痩せたマウスの血管外膜周囲脂肪組織を残した場合と、除去した場合で、血管傷害を加えて病変の形成の程度を比較検討した。外膜脂肪組織の除去により病変形成が加速された。また、その後、痩せた別のマウス由来の皮下脂肪を移植すると、病変形成は内因性の血管周囲脂肪組織がある場合と同程度まで抑制された。一方、太ったマウスの内臓脂肪を移植すると逆に病変形成は加速された。以上より、外膜周囲脂肪組織は病的血管リモデリングを抑制する作用があることがわかった。外膜周囲脂肪組織は、通常病的血管リモデリングに対して防御的に機能することが明らかとなった,また、冠動脈疾患患者では、心臓周囲脂肪組織に炎症が生じ、動脈硬化の進展と破綻に大きな役割を担っていることが明らかとなった。バイパス手術を施行する場合に、炎症に富む心臓周囲脂肪組織を取り除き、健全な皮下脂肪を移植する新規抗動脈硬化治療手術を現在ブタを用いて検討している。
フィトクロムを介する植物の光センシングと生物応答の基本原理の解析

光独立栄養生物であり固着生物を営む植物は、生育する場所の光環境を光受容体を介して正確に感知し、成長を最適化している。フィトクロムを単一分子種としてもつ苔類ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)と役割分担が進み複数の分子種をもつシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を材料にフィトクロム信号伝達原理と分子進化研究を進めた。信号伝達の研究は、フィトクロム相互作用タンパク質シロイヌナズナVOZについて研究を進めた。VOZは、ジンクフィンガータンパク質であり、フィトクロム制御の特徴のひとつである遺伝子発現変化に関与すると考えられる。相互作用は、in vitro pull downとY2Hアッセーで確認された。更に、in vivoフィトクロムとの相互作用が、Split Luciferaseアッセーでも検出された。Split LUCの系を利用して、相互作用の光質特異性を検討した。VOZはゲノムに2コピー存在し、単一変異では表現型は観察されない。二重変異体では、フィトクロムが関わる花成時期の表現型を示す。花成に重要なフロリゲンをコードするFT遺伝子の発現を調べたところ、その発現が低下すること、特に、概日リズムのピークが消失することがわかった。生体時計の下流ET遺伝子を制御CO遺伝子発現には変化が見られなかった。最近、植物の低温耐性にフィトクロムによる赤色光と遠赤色光の比率の感知が大きく関わることが示されている。そこで、voz変異体において低温応答を調べたところ、耐凍結性が向上していた。これは、VOZが光のみならず、低温のクロストークに関わる信号伝達因子であると期待された。フィトクロムは植物が持つ主要な光受容体である。フィトクロムを初発とする光シグナル伝達経路を解明するために、本研究では原始陸上植物である苔類ゼニゴケを用いた。単離されたMpPHY遺伝子は1分子種のみ存在した。大腸菌発現系よるリコンビナントMpphy(N612)は赤色光/遠赤色光可逆的な構造変換を示した。次に、フィトクロムのGAFドメイン内のTyr残基をHis残基に置換することで光可逆性を失い、常に活性型として機能するという知見に基づき、Mpphyの241番目のTyrをHisに置換したリコンビナントMpphyY241H(H612)を得た。このMpphyY241H(N612)は光可逆性を失い、蛍光タンパク質となった。ゼニゴケ野生株では光依存的に仮根形成が見られる一方で、MpphyY241H全長を発現させたMpphyY241H導入株では暗黒下でも仮根形成が観察された。またこの株では青色光応答が抑制されていた。MpphyY241H-GFPは光条件を問わず核内で顆粒状構造体を形成し、常に活性型として機能していると予測された。現在、Mpphy機能欠失変異体の作出を試みており、Mpphyが制御する光応答メカニズムの解明が期待される。
皮膚線維性腫瘍培養細胞と細胞外マトリックスの相互作用

皮膚線維性腫瘍培養細胞のcell strainが特に重要と思われる字で増殖が停止してしまったので同様の系列の実験を全身性強皮疾患者由来の培養線維芽細胞及びメラノーマ培養細胞を用いて施行した.研究期間内に強皮症患者線維芽細胞のエントセリンに対する反応性の低下、逆にマトリックス誘導細胞成長因子とに有名なTrousforaing Growth Factor Dに対する反応性の応進といった新しい知見を見いだし、論文はすでに体裁された.その他本症患者血清中の、コラーゲン関連蛋白の上昇や、細胞成長因子の増加について新たな知見を見いだした.またメラノーマ培養細胞でエントセリンのBtyfeレセプターが転移性の株では減弱していることを見いだし、掲載予定である。