hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PP1を介したRaf-1シグナルのロバストネス制御の動作原理とその生物学的意義

本研究の目的は、申請者が発見した新しい細胞内シグナル伝達タンパク質の生理的な機能を解明し、得られた知見に基づき細胞機能を正常化できるかを検証することである。これまでに行った予備実験結果から細胞の生死を調節しているRaf-1キナーゼが関与していることが明らかになっている。本研究では、培養細胞を用いて細胞の生死を指標にしながら細胞内のRaf-1活性を測定するとともに、Raf-1活性に異常を持つ細胞系を用いてこの経路を正常化する方法を探る。
確率密度分布図を用いたヒト胎児心拍数制御系の発達過程の解明に関する研究

一連の瞬時心拍数並びは「数列」であるとの概念から、数列の有する「順列」と「組み合せ」の双方の特性を記述するために、筆者らは、行に心拍数絶対値を、列に次の一拍への変化分を、行列の要素に確率を配する心拍数確率密度分布図を考案した。本記述法は、心拍数の全変動が1となるように基準化されているが故に、諸種の状態間での等価な比較が可能であり、心拍数変動の相互の差異を定量的に評価できる普遍性を有している。1)妊娠23-40週の正常胎児743例の心拍数群を用いて、基準となるべき妊娠2週数ごとの心拍数確率密度分布図を作製し、正常胎児における心拍数変動の妊娠の進行にともなう特徴を解析した。その結果当該妊娠期間における心拍数確率密度分布図は、妊娠23-24週から妊娠29-30週、妊娠31-32週から妊娠33-34週、妊娠35-36週以降の互いに異なる3つの心拍数変動の分布パターンを示すことが分かった。2)本法を用いて、ヒト胎児の状態を評価するために数理的に保証される必要最小限の心拍数は、妊娠の時期(妊娠23-40週)にかかわりなく、9,000-10,000拍とほぼ一定であった。また、この臨界値における心拍数群の全変動は、67-75%が一拍毎の変動(Beat-to-beat variability)、25-33%が数拍にまたがる変動(Long term variability)から成ることが明らかとなった。3)本法を用いた無脳症胎児における心拍数変動と正常胎児のそれとの数理的な解析から、ヒト胎児における心拍数変動を司る中枢神経系の機能的な発達過程には、妊娠27-28週と妊娠29-30週との間に生物学的に有意な変極の時期が存在し、妊娠28週未満では延髄が、妊娠30週以降では延髄を含めたそれより頭側の中枢神経系が胎児心拍数の制御に関与していることが分かった一連の瞬時心拍数並びは「数列」であるとの概念から、数列の有する「順列」と「組み合せ」の双方の特性を記述するために、筆者らは、行に心拍数絶対値を、列に次の一拍への変化分を、行列の要素に確率を配する心拍数確率密度分布図を考案した。3)本法を用いた無脳症胎児における心拍数変動と正常胎児のそれとの数理的な解析から、ヒト胎児における心拍数変動を司る中枢神経系の機能的な発達過程には、妊娠27-28週と妊娠29-30週との間に生物学的に有意な変極の時期が存在し、妊娠28週未満では延髄が、妊娠30週以降では延髄を含めたそれより頭側の中枢神経系が胎児心拍数の制御に関与していることが分かった従来の胎児心拍数陣痛図にかわる、胎児心拍数の定量的記述法として、心拍数絶対値とそれの次の一拍への変化分を同時に表現する胎児心拍数確率密度図を開発し、これを用いて妊娠の進行に伴うヒト胎児心拍数変動を記述することを研究の目的とした。対象には、妊娠23週から妊娠40週までの正常ヒト胎児743例を用いた。胎児より得られる90-120分の心拍数情報を、パルス・ドプラ探触子を装着した心拍数陣痛計(TOITU,MT-333)を介して瞬時心拍数に変換した後、on-lineで逐次マイクロコンピュータに記録した。ついで、連続する2妊娠週数毎にデータセットを作製し、心拍数絶対値(FHR)とそれの次の一拍への変化分(DFHR)を1bpm単位として行と列に配し、対応する要素に累積度数を有するMatrixを求めた。さらに、これらのMatrixを全変動が1となるように基準化した後、等高線表示による心拍数変動の確率密度分布図を作製した。ここで、連続する2つの妊娠期間における確率密度分布図を用意し、片方からいま一方を引算して求められる確率密度分布図(差分確率密度図)を求め、両者の間の不一致率を算出した。これら差分確率密度図および不一致率から、当該妊娠期間における胎児心拍数変動の推移を記述した。

それによると、妊娠29/30週と妊娠31/32週の間、および妊娠33/34週と妊娠35/36週の間に心拍数変動の変曲点が認められることが明らかとなり、生物学的に特性の異なる3つの心拍数制御機構の存在が示された。1.妊娠25-32週の無脳児12例(無脳児群)と正常胎児165例(対照群)を対象に、確率密度図を用いて、無脳児における心拍数変動の妊娠の進行に伴う特徴と心拍数制御系の発達過程との関連について検討した。無脳児群ならびに対照群の各々の胎児から求めた確率密度図と対応する妊娠週数の基準確率密度図の差分から不一致率を求め、無脳児群の各々の症例の不一致率と対照群のそれとの相違を解析した。その結果、妊娠25-26週から27-28週では、頚髄まで有する4例では不一致率が対照群より有意に高値を示したが、延髄まで存在する4例は対照群と有意な差を認めなかった。妊娠29-30週から31-32週では、延髄まで存在する4例においても、不一致率は対照群より有意に高値を示した。以上より、胎児の心拍数制御には妊娠27-28週と妊娠29-30週の間に変極点が存在し、それより早い妊娠の期間では延髄が、またそれ以降の期間においては延髄を含め上位の中枢が関与していることが分かった。2.妊娠23-40週の正常胎児743例を対象に、胎児健常性の評価に必要な最少心拍数を明らかにすることを試みた。心拍数データを2妊娠週数毎に9つに分割した後、各データセットから一様乱数を用いて50個、100個、〓と漸次増加させて心拍数値を無作為抽出し、各抽出数における確率密度図を作製した。各妊娠期間毎に、作製した確率密度図と対応する妊娠週数の基準確率密度図の相違を不一致率を用いて算出した。その結果、全ての妊娠期間において、抽出数が増加するにつれて不一致率は低下するものの、9,000-10,000拍を変極点として、それ以上増加しても、不一致率は25-33%とほぼ一定であった。以上より、妊娠23-40週において、妊娠週数とは関係なく、胎児を評価するのに必要な最少の心拍数は9,000-10,000拍であること、一群の心拍数変動には生物学的に異なる2つの要素が存在し、その割合は25-33%がlong-term variability、67-75%がbeat-to-beat variabilityであることが分かった。1.ヒト胎児の状態を心拍数変動によって評価する際に、必要最少限の心拍数は妊娠の進行に伴って変化するか否かを目的に、心拍数確率密度分布図を用いて解析した。妊娠の時期(妊娠23-40週)に拘りなく、数理的に保証される最少心拍数は9,000-10,000拍とほぼ一定の値であった。この臨界値における心拍数群の全変動は、67-75%が一拍毎の変動(Beat-to-beat variability)、25-33%が数拍に跨る変動(long-term variability)から成ることが証明された。2.対称性検出による輪郭線から三次元形状を構築する筆者らが開発した方法を用いて、超音波断層法で得られる二次元長軸断面像から胎児胃の三次元形状を求めた。本法の応用によって、妊娠20-27週の期間、ヒト胎児胃は紡錘形であるが、妊娠27週以降大弯小弯および噴門部幽門部が明瞭になること、また妊娠37週以降に認められる胎児胃の大きさの減少は同時期の羊水量の減少と関連していることが明らかとなった。3.諸種の胎児異常376例(妊娠21-42週)を対象に、超音波電子スキャンによって観察される胎児膀胱貯留尿量の経時的な変化の解析から、尿産生能の障害を招来する胎児疾患は腎尿路系の先天性形態異常の一群、双胎間輸血症候群非免疫性胎児水腫、子宮内発育遅延、上部消化管閉鎖であること、胎児尿産生能の異常は形態と機能との双方の発達過程における関連の下、個々の疾患に固有の妊娠の時期に異常を発現することが明らかとなった。4.妊娠週数毎の妊婦好中球の活性酸素産生能の観察から、走化性ペプチド刺激による活性
弾性表面波の波動特性を用いた粉体の精密輸送制御

近年,創薬や電子分野において,マイクロ粉体の輸送等の高精度な物理的操作に期待が高まっているが,従来技術では不可能であった。そこで,弾性表面波(SAW)デバイスに注目し,SAWによる高精度な粉体輸送の可能性について調べた。その結果,SAWを発生させる櫛歯電極(IDT)への駆動周波数を変えることで,粉体の輸送方向を制御できることが明らかになった。また,大きなピッチサイズを有するIDTほど,粉体の輸送効率が高くなることがわかった。更に,SAW伝搬面に薄膜パターンを形成することで,粉体の輸送速度が制御できることもわかった。こられの知見を基に,世界に類を見ない高精度の粉体供給機を製作することに成功した。弾性表面波(SAW)アクチュエーターから発生されるレイリー波の振幅は数十から数百nmであり、通常の測定方法では観測することができない。そこで、今年(平成25年)度はホログラフォック干渉系を用いた光学的手法により、SAWの伝播領域や方向、その振幅等を観測できるシステムの構築を行った。その結果、現時点においてSAWによって変形された弾性体(基板)表面からの一次回折光が得られるところまで達成することできたので、次年度以降もシステム構築を続けて行く予定である。上記のように光学手法を用いたSAW観測システムが未完のため、無水タングステン酸の粉末(平均粒子径: 22.3μm,標準偏差: 15μm)を篩で均一に基板表面に散布してSAWの伝播領域を確認した。その結果、アクチュエーターから発生させたSAWだけではなくグレーティングや微細溝によって反射されるSAWにおいても伝播領域を確認することができた。弾性表面波(SAW)アクチュエーターから発生されるレイリー波の伝播領域や振幅を観測するため、ホログラフィック干渉系を用いた観測システムの構築を行ったが、レーザーパワー等が不足し、期待通りのホログラムが得られなかった。そこで、昨年度に引き続き、微小粉体をマーカーとしてSAWの伝搬領域の観測を行った。ちなみに、この微粉マーカーによる測定においては、SAWの振幅は微粉マーカーの移動速度と関係がある。具体的に今年度は、粉体の輸送経路を工夫した新規の高精度SAWフィーダーのSAWの伝搬領域を調べた。このSAWフィーダーは1つ櫛歯電極IDT(ピッチ400μm,幅5mm,対数20)と2つの三角形状の誘導パターン(傾斜角5度,長さ35mm,端部の壁間距離300μm)で構成されてる。これらは1μm厚のAl膜製で、LiNbO3(128度y回転x伝播)基板上に一回の露光プロセスで同時に製作した。このSAWフィーダー上に微粉マーカー(無水化タングステン)を均一に振り掛け、SAW伝搬経路の確認を行った。その結果、誘導パターン上では微粉マーカーの移動は観測できず、IDTから発生したSAWが誘導パターンにより伝搬経路が狭まることがわかった。このことから、薄膜パターンによりSAW伝搬路を制御できることが明らかになった。今後、薄膜上におけるSAWの波動特性を系統的に調べる。そして、得られた一連の結果から粉体輸送モデルを検討し、シミュレーション解析を行って実測値と比較する。近年,創薬や電子産業分野において,微小粉体の輸送や分級等の物理的操作に期待が高まっている。しかしながら,固体でありながら液体や気体のように流動することが可能な粉体の正確な操作は難しく,現場においては長年の経験則に基づき物理的操作を行っている。特に,粒子径が数十um以下の粉体を数百ugから数mgオーダーで乾式輸送することは汎用のコンベアやブロワーを単純に小型化しただけでは不可能である。そこで,構造が簡単で小型化が容易な弾性表面波(Surface Acoustic Wave: SAW)デバイスに注目した。SAWアクチュエータの研究に関しては,液体に関する報告が殆どで固体に関する報告は非常に少ない。SAWによる液体と粉体を含む固体の輸送においては,それら輸送方向が逆になるという興味深い特徴がある。このため,従来の共振周波数でSAWアクチュエータを駆動する方式では粉体がSAW上流側へ輸送され,開口部から粉体を落とすような供給機は原理的に製作することができなかった。そこで本研究では,共振周波数以外でSAWアクチュエータを駆動する新規方式を提案し,本方式によりSAW下流方向へ粉体が輸送できることを実証した。その輸送速度はSAWを発生させる櫛歯電極のピッチサイズを大きくするほど速くなることがわかった。更に,SAWの伝搬路に金属膜パターンを設けることで,パターン上の粉体は輸送されにくくなり,抑制効果があることもわかった。これらの結果を基に,金属膜パターンを誘導壁の代用としたSAW粉体供給機を設計・製作を行った。そして,実験より,本SAW粉体供給機を用いることで,粉体量を精度良く任意の位置に落下させることが可能となることがわかった。以上,SAWの波動特性の検討はまだまだ足りていないが,本研究の本来の目標であった粉体輸送の高精度化については十分な成果を実験により得られたと自負している。

その結果,SAWを発生させる櫛歯電極(IDT)への駆動周波数を変えることで,粉体の輸送方向を制御できることが明らかになった。また,大きなピッチサイズを有するIDTほど,粉体の輸送効率が高くなることがわかった。更に,SAW伝搬面に薄膜パターンを形成することで,粉体の輸送速度が制御できることもわかった。こられの知見を基に,世界に類を見ない高精度の粉体供給機を製作することに成功した。ホログラフィック干渉系による光学的手法を用いたSAW観測システムの完成を目指して、昨年度から構築作業を行っているが諸問題により未だ思うような成果が得られていない。そこで、正確なSAWの振幅はわからないが、伝搬領域が明らかにわかる微粉マーカーによるSAWの観測に本格的に切り替え、SAWの波動特性の把握を行っている。電気・電子工学SAWの正確な伝搬領域と強度を知るため、レーザドップラー等の他の光学的観測についても検討する。更に、薄膜上でのSAWの波動特性について詳しく調べるため、薄膜材料や粉体の種類をパラメーターにし系統的に調査する。そして、得られたデータより薄膜上での粉体輸送モデルを検討し、粒子法と有限要素法等のシミュレーション解析を行い、実測値と比較する。今年(平成25年)度は、ホログラフィック干渉系を用いた光学的手法を用いたSAW観測システムが未完のため、粉体を篩で均一に基板表面に散布することでSAWを観測する方法を採用した。このため、SAWの伝播領域について把握することが可能となったが、その振幅等についてはわかっていない。支払い処理が4月に間に合わなかったため次年(平成26年)度においては、ホログラフィック干渉系を用いたSAW観測システムが完成できるかの有無を早期に見定める。もし、無理な場合には、速やかにレーザドップラー方式の検討に入り、早期、非接触式のSAW観測システムの完成を目指す。同時に、予定していた各種波動によるSAWによる粉体駆動の観測を行う。具体的には、SAWの集中に伴い粉体の集積が可能であるかを確認する。そして、SAWの干渉を利用し、干渉縞つまり基板面の局所部位でSAWの強弱の分布ができるので、それを利用して粉体の停止位置制御が可能であるか等についても調べる。これら実験結果より、各種SAWによる粉体の操作内容について吟味する。更に、上記実験で得られた各種データより粉体輸送モデルを確立し、計算シュミレーションが可能かの検討も行う。次年度、早々に処理する予定未購入の消耗品があったため消耗品を購入する予定
免疫不応答を誘導する新機能タンパク質に関する研究

経口的に摂取した抗原に対して免疫系が不応答化する経口免疫寛容では、末梢のT細胞が不応答化しているが、その不応答化したT細胞の性質を決定するような因子は不明である。そこで本研究では、免疫不応答化したCD4陽性T細胞をプロテオーム解析することにより、その細胞の特性を明らかにしようと試み、これまでに、経口免疫寛容状態のCD4 T細胞は非アポトーシス状態を保ったままcaspase-3の活性を上昇させ、TCRシグナル複合体を含む様々なタンパク質を切断し、不応答状態を維持していることを明らかにした。これまでに,内在性のcaspase-3抑制分子であるXIAPの発現上昇が、経口免疫寛容状態のCD4 T細胞を非アポトーシス状態に保つ一因であることを明らかにしたが、加えてbcl-xLのタンパク質量も増加していることを明らかにし、caspaseによるアポトーシスを阻害していることが示唆された。また、caspase-3の上流分子として、Fasレセプターのシグナル伝達分子であるcaspase-8およびミトコンドリアからのアポトーシスシグナル伝達分子であるcaspase-9の活性化をウェスタンプロットを用いて検討したところ、caspase-9のプロセッシングのみが確認された。また、in vitro培養においてFas抗体によるアポトーシス誘導を対照T細胞、経口免疫寛容T細胞で行ったところ、差が認められなかったことから、経口免疫寛容T細胞では抗アポトーシス因子の発現上昇が、caspase-3の活性化にも関わらず、Fas刺激に対する感受性を高めていないことが示唆される。以上より、経口免疫寛容状態のT細胞では、ミトコンドリアにかかるストレスによってcaspaseが活性化されているが、bcl-xLやXIAPといった抗アポトーシス分子の発現を増加させることによってアポトーシスを阻害していることが示唆された。経口的に摂取した抗原に対して免疫系が不応答化する経口免疫寛容では、末梢のT細胞が不応答化しているが、その誘導・維持の機構は不明であり、本研究ではプロテオーム解析を用いて検討した。卵白オバルブミン特異的T細胞レセプター(TCR)トランスジェニックマウスに、卵白食を4週間摂取させT細胞に経口免疫寛容を誘導した。コントロールとして卵白を含まない食餌を摂取させ、各群のマウスから脾臓CD4陽性T細胞を純化・精製し、その発現タンパク質を2次元電気泳動で展開した。そして経口免疫寛容状態のCD4陽性T細胞で発現量の変化するタンパク質を42個検出し、35個をペプチドマスフィンガープリント法により同定した。発現量の増加した分子の一つはシステインプロテアーゼであるcaspase-3であり、さらにcaspase-3の標的分子が3つ切断されていることが示された。Caspase-3はアポトーシスの主要分子だが、経口免疫寛容状態のCD4陽性T細胞は非アポトーシス状態であり、さらにcaspase-3抑制分子であるXIAPの発現を上昇させていることを示した。またTCRシグナル複合体を形成するGADSが、経口免疫寛容状態のCD4陽性T細胞でcaspase-3により切断されていた。そこでGADSを中心とするTCRシグナル複合体を分離し、TCRシグナル分子のリン酸化・会合量を検討したところ、経口免疫寛容状態のCD4陽性T細胞で顕著に減弱していることが示され、caspase-3がGADSを中心としたTCRシグナル複合体の形成を妨げ、シグナルを阻害していることが示唆された。以上より、経口免疫寛容状態のCD4陽性T細胞は非アポトーシス状態を保ったままcaspase-3の活性を上昇させ、TCRシグナル複合体を含む様々なタンパク質を切断することで、「免疫寛容」という特別な不応答状態を維持していることが示唆された。
癌の代謝とエピゲノム異常をつなぐDNA脱メチル化酵素TETの神経膠腫における役割

がんの代謝という側面とエピゲノム異常という側面の両者を橋渡す位置に存在するTET (ten-eleven translocation)という分子に注目した。まず膠芽腫細胞株のTET1,2,3の遺伝子発現を評価した。膠芽腫細胞株の種類およびTETのサブタイプによっても発現量が異なっていることが分かった。膠芽腫細胞株(U87MG, T98G, U251MG, U373MG)のTET1, 2, 3それぞれのmRNA発現レベルをリアルタイムq-PCRで定量した。TET1とTET3については、細胞株間で発現量に差があり、最も発現が高い細胞株と低い細胞株を同定した。TET2は細胞株間で差異はなかった。1%O2低酸素状態で24時間、48時間、72時間で培養し、同様にmRNA発現レベルを定量評価した。TET2とTET3は低酸素刺激で発現が変化する傾向があったが、正常酸素濃度条件下と比べて有意差はつかなかった。神経膠腫の患者から採取した腫瘍切片を対象としTET1の細胞内局在について、蛍光免疫染色により評価した。核もしくは細胞質の局在によってIDH変異との相関について検討した。IDH変異のある症例では核に集積する傾向が顕著であり、またIDH変異のない症例ではnuclear typeは少なく、cytoplasmic typeが多い傾向にあった。これまでの報告で、IDH変異は2HGを介して、TET familyタンパクの酵素活性を阻害し、5-hydroxymethylcytosine(5hmC)の減少をもたらし、メチル化を調整していると考えられている。一方で、IDH変異のないgliomaでも5hmCの減少は観察されている。したがって、TET1タンパクの核からの排除がIDH変異のないgliomaにおける5hmCの減少に関与している可能性があった。TETは血液系腫瘍で発見されTET1, 2, 3があることが知られている。TET1, 2, 3のうち、どれが癌化に関与しているかは、それぞれの癌腫により異なる。低酸素条件下でTETの発現が低下するという報告もあるが、今回我々が行った実験では、有意な変化は指摘できなかった。しかし、がんの微小環境のひとつとして低酸素状態を検討する際、単に低酸素状態に暴露した場合と、低酸素と正常酸素状態に交互に暴露した場合、がん細胞は異なる変化を来すこともほかの癌腫では報告されている。我々は、さまざまな低酸素条件をあたえ、さらに検討していく。IDH1変異型幹細胞株と、低酸素条件下に培養された膠芽腫細胞株と腫瘍幹細胞株のTET活性、蛋白発現を評価し、TETの発現が低下し機能が抑制された細胞株(低発現株X)を決定する。これらの細胞株にTET遺伝子を導入、強制発現させ、この遺伝子がtumor suppressor geneであることを証明する。さらに、TET遺伝子によりメチル化制御を受けている遺伝子群を同定する。悪性神経膠腫の発生機序に、TETがどのように関与しているか、さらにTETによってエピゲノム調節を受けている遺伝子についても検索する。治療抵抗性を示す原因として考えられている腫瘍幹細胞(glioma stem cells)、さらにはがん微小環境としての低酸素環境でのTETの変化に、着目し研究を進め、代謝異常とエピゲノム異常のつながりを明らかにする。・正常酸素条件下および低酸素条件下における膠芽腫細胞株のTET1, 2,3 mRNA発現の定量膠芽腫細胞株(U87MG, T98G, U251MG, U373MG)のTET1, 2, 3それぞれのmRNA発現レベルをリアルタイムq-PCRで定量した。・マウス正常大脳、ヒト臨床摘出標本におけるTET蛋白発現解析マウス正常大脳およびこれまでのヒト臨床摘出標本に対し、抗TET1抗体およびIDH1R132抗体を用いて免疫染色を行った。TET1蛋白は細胞質に局在する標本と核内に局在する標本のふたつに分かれた。標本より蛋白を抽出しウエスタンブロッティングで蛋白発現を評価した。・MGMT遺伝子のメチル化は膠芽腫の治療反応性を規定していることが知られているため、膠芽腫細胞株におけるMGMTメチル化をパイロシークエンス法にて定量化した。TETの発現との相関性を調べた。膠芽腫細胞株および手術摘出標本から樹立した腫瘍幹細胞株に対しTET1,2,3の遺伝子発現を評価した。細胞株の種類およびTETのサブタイプによっても発現量が異なっていることが分かった。

低酸素条件下でTETの発現が低下するという報告もあるが、今回我々が行った実験では、有意な変化は指摘できなかった。またTETの発現とIDH1変異の間には有意な相関はなかった。しかし、TET1蛋白発現に注目してみると、核内に発現している摘出標本もあれば、細胞質に発言しているものもあった。TET1蛋白の局在はIDH1遺伝子変異との間に相関関係があることが分かった。これまでの報告で、IDH変異は2HGを介して、TET familyタンパクの酵素活性を阻害し、5-hydroxymethylcytosine(5hmC)の減少をもたらし、メチル化を調整していると考えられている。一方で、IDH変異のないgliomaでも5hmCの減少は観察されている。したがって、TET1タンパクの核からの排除が、IDH変異のないgliomaにおける5hmCの減少に関与している可能性がある。悪性神経膠腫の発生機序に、TETがどのように関与しているか、さらにTETによってエピゲノム調節を受けている遺伝子についても検索する。治療抵抗性を示す原因として考えられている腫瘍幹細胞(glioma stem cells)、さらにはがん微小環境としての低酸素環境でのTETの変化に、着目し研究を進め、代謝異常とエピゲノム異常のつながりを明らかにする。膠芽腫細胞株(U87MG, T98G, U251MG, U373MG)および腫瘍幹細胞株(MGG4, MGG8, MGG23, MGG31, MGG119, MGG152)を対象とした。IDH1遺伝子の変異の有無をパイロシークエンス法で評価した。4種の膠芽腫細胞株はすべてIDH1遺伝子の変異はなく、腫瘍幹細胞株のうち、MGG119とMGG152がIDH1遺伝子変異を有していた。正常酸素条件下で培養し、TET1, 2, 3のmRNA発現をqRT-PCRで測定した。TET1とTET3の発現量は細胞株によって異なり、逆相関を示していた。1%O2低酸素状態で24時間、48時間、72時間で培養し、同様にmRNA発現レベルを定量評価した。TET2とTET3は低酸素刺激で発現が抑制された。しかし正常酸素濃度条件下と比べて有意差はなかった。また、TETの発現量は、IDH1遺伝子の変異との関連はなかった。TET酵素活性を測定した。またTETが酵素活性を及ぼすとき基質となる5-mCと代謝物である5-hmCをELISAで測定した。mRNAの発現量はTETの酵素活性とは相関しなかった。マウス正常大脳およびこれまでのヒト臨床摘出標本に対し、抗TET1抗体およびIDH1R132抗体を用いて免疫染色を行った。標本によって、核内に発現しているもの、細胞質に発現しているもの、両者に発現しているものとさまざまであった。TET1蛋白の局在について検討するため、蛍光免疫染色を行った。IDH1変異のある標本ではTET1蛋白は核に発現していることがほとんどであり、IDH1変異のない標本は細胞質には発現していることが分かった。
臨床的教育社会学アプローチによる学級経営ナラティヴ分析法の開発

本研究は、学級経営ナラティヴ分析法を開発し、小学校のフィールドワークを通して、学級経営におけるナラティヴの役割と意義を明らかにする。わかりやすくいえば、学級経営実践を向上するための研究手法の開発であり、小学校の学級を対象に質的調査を行い、「朝の会」「学級活動」等の時間を中心に映像記録し、教師と児童生徒による学級づくりの諸相を、「言葉」「ストーリー」「出来事」に注目して明らかにする。それ以外の時間に起こったエピソードや教師の学級経営観等については、インタビューで記録する。なお、日本の学級経営の特色を明らかにする上で、学級経営意識に関する日台比較補完調査を実施し、総合的な分析を行う。
ヒトの関節炎と睡眠障害の研究

関節リウマチrheumatoidarthritis (RA)患者の日常生活動作において、リウマチ気質と呼ばれる一面が、炎症性サイトカインとくに増殖性転写因子c-Fos及びIL-1βの過剰によって一方で関節破壊が促進される(JCI 99:1210, 1997)と同時に、c-Fos亢進が直接細胞周期蛋白Wee1を増加させてRAに特徴的な“腫瘍様"滑膜増殖を来し(EMBO J 20:4618, 2001;Nature Biotechnol 26:817, 2008)、さらにWee1増加が“時計遺伝子を狂わせることによって関節炎を悪化させて(J Immunol 184:1560, 2010)睡眠障害を惹起し、こうした結果、睡眠障害と同時に関節炎がさらに悪化する可能性についてこれを是とし、私達は予備的研究から、リウマチ気質が独立症候でなく病態(c-Fos過剰)の結果である可能性を指摘した。私達の睡眠研究442例(actigraphy, somnography)において相当の睡眠障害を認めている。本研究は従って、RAに対して1生物学的製剤等の治療的介入を行ってその睡眠障害への効果を調べ炎症が睡眠に及ぼす影響を検証する一方、2夜のホルモンであるメラトニン投与の疾患活動性への効果を調べて睡眠が炎症に及ぼす影響を検証することを目指している。この研究により、ヒトの疾患とくに炎症と睡眠の関係を明らかにし、睡眠の改善を治療に役立てたいと考える。そして、ヒトにおいて実際、炎症が睡眠にまた睡眠が炎症に及ぼす影響についてRAすなわち関節の炎症(関節炎)で検証することを企図している。この目標を達成するために本研究は、臨床的に、1生物学的製剤等の治療の前後を通じて、患者の疾患活動性の変化と共に治療の睡眠障害への効果を検証して、炎症が睡眠に及ぼす影響について治療的介入の視点から解明している。また反対に、2夜のホルモンであるメラトニンの臨床的投与の睡眠および疾患活動性への効果を正常の睡眠への導入という視点から解明しつつある。研究1すなわち生物学的製剤の治療介入前後を通じて、患者の疾患活動性の変化および睡眠障害への効果にかかる検証については、現在、150例の調査が終了した。研究2すなわち夜のホルモンであるメラトニン作動薬ラメルテオインによる概日リズム是正効果の研究:睡眠障害の改善が患者の日常生活動作及び疾患活動性に及ぼす治療効果の検証の課題については、現在は、前回の3例に加え7例計10例の患者さんに検証を済ませた。関節リウマチrheumatoidarthritis (RA)患者は古来、性格が固く、リウマチ気質と呼ばれたが、これまでの研究は炎症性サイトカイン過剰の重要性を指摘し、とくに私達は増殖性転写因子c-Fos及びIL-1&#61538;の過剰が関節破壊に重要で、c-Fos亢進は直接細胞周期蛋白Wee1を増加させてRAに特徴的な“腫瘍様"滑膜増殖を来し、独自に開発したc-Fosの拮抗的阻害薬が関節破壊を完全に阻止し、そしてWee1増加が“時計遺伝子"に働いて関節炎を悪化させることから、リウマチ気質が独立症候でなく病態(c-Fos過剰)の結果である可能性を指摘してきた。本研究では、RAの疾患活動性と睡眠の質の関係について、RA 284例でみたPittsburghスコアはglobal score 6.42±2.76と正常域5を超えて有意に睡眠障害があると判断された。アクチグラフィーでは%sleep 89.1±10.5, total wake after sleep 49.5±45.2 min, average wake after sleep onset 9.9±23.3timesと健常対照者に比し睡眠障害が示唆され、これら指標は血中CRP値と腫脹関節数と相関を示した(p<0.02)。生物学的製剤治療RA 517例(トシリズマブ175例、アバタセプト98例、インフリキシマブ144例)においてこれら睡眠の質障害が有意に改善された。研究1は目標を達成しこれを超えて継続している。研究2はほぼ目標に近くなり現在継続している。内科学、膠原病学研究2の組み入れを追加し、研究12総合して結果解析に移る。研究1すなわち生物学的製剤等の治療の前後を通じて、患者の疾患活動性の変化と共に治療の睡眠障害への効果を検証して、炎症が睡眠に及ぼす影響について治療的介入の視点からの研究については現在、倫理委員会をへて、約100例の調査が終了している。研究2すなわち夜のホルモンであるメラトニン作動薬の臨床的投与の睡眠および疾患活動性への効果を正常の睡眠への導入という視点からの研究については、「関節リウマチ患者の睡眠障害に対するメラトニン受容体作動薬(ラメルテオン)による概日リズム是正効果の研究:睡眠障害の改善が患者の日常生活動作及び疾患活動性に及ぼす治療効果の検証」という課題名で九州大学臨床研究倫理審査委員会に6月提出し、訂正をうけ、計2回修正審査をへて平成25年12月4日に臨床試験が承認されたので、その後現在まで3例において、メラトニン作動薬ラメルテオン投与を行い、投与前後で睡眠および関節炎の各指標について検討を行っている。当初数十例でどの期間において効果が検証されるかを調べ、その後当該投与期間を確定して用いることによってさらに多くの患者さんにご協力いただく予定である。平成27年度に使用見込みがあるため。研究1は資料の検証を行う。研究2は第一にラメルテオンの最適な投与期間を定める。

それを受けて、対照比較試験を実施するが、その際には再度九州大学臨床研究倫理審査委員会にプロトコールを提出して承認後を得てから実施する。最終年度であるため学会発表および臨床試薬の購入等を予定している。少額のため次年度と合算して使用する。
ドウモイ酸による養殖フグ寄生虫の駆除

Pseudocaligus fugu (カリグス)が寄生した養殖トラフグにつき、ドウモイ酸(DA)、ホルマリン、またはマリンサワー各250ppm添加海水、もしくは同100ppm添加淡水を用い、前者では5分間、後者では20分間の薬浴試験を行ったところ、フグ体表からのカリグスの離脱率(R)は、海水薬浴でそれぞれ80.0、6.7、46.7%、淡水薬浴で100、70.8、66.7%と、いずれの場合もDAの効果が最も高かった。さらに、DA10および50ppm添加淡水では1020分間の薬浴で90%以上、5ppmでも20分間で71%のカリグスが離脱した。一方、カイニン酸(KA)14128ppm添加淡水を用い、同様に520分間の薬浴試験を行ったところ、Rは、濃度64ppm以上、かつ15分間以上の薬浴で100%に達した。次に、Heterobothrium tetrodonis (ヘテロボツリウム)が寄生した養殖トラフグから、仔虫6個体を寄生部位(鰓)ごと摘出し、2個体をDA無添加海水、4個体をDA 100ppm添加海水に浸漬したところ、前者では2個体とも4時間以上鰓に留まって生存したのに対し、後者では30分以内に全個体が鰓から離脱し、4時間以内にすべて死亡した。他方、DA 100ppm添加淡水で20分間薬浴したフグにつき、血液検査を行ったところ、ヘモグロビン、ヘマトクリツト値および赤血球数はいずれも対照魚と大差なく正常値であった。さらに、同フグ、ならびにKA 64ppm添加淡水で20分間薬浴したフグにつき、各組織のDAないしKA含量をHPLCもしくはLC/MS分析により測定したところ、いずれも2μg/g未満で、薬剤残留は認められなかった。以上、本研究により、DAおよびKAは養殖フグ寄生虫、カリグスまたはヘテロボツリウムの駆除に極めて効果的で、かつ安全な薬剤であることが示された。鹿児島県産の紅藻ハナヤナギから抽出したドウモイ酸(DA)を用い、トラフグ養殖で問題となる寄生虫のうち、本年度はえら虫Heterobothrium tetrodonis(以下へテロ)およびはだ虫Pseudocaligsu fugu(以下カリグス)を対象として、薬浴による駆除効果を調べた。まず、ヘテロの仔虫6個体を寄生部位(鰓)ごと摘出し、2個体をDA無添加海水、4個体をDA100ppm添加海水に浸漬したところ、前者では2個体とも4時間以上鰓に留まって生存したのに対し、後者では30分以内に全個体が鰓から離脱し、4時間以内にすべて死亡した。次に、カリグスが寄生した養殖トラフグにつき、DA、ホルマリン、およびマリンサワー各250ppm添加海水を用い、5分間の薬浴試験を行ったところ、フグ体表からのカリグスの離脱率Rはそれぞれ80.0、6.7、46.7%で、DAの効果が最も高かった。一方、25100%淡水添加海水浴を20分間行ってみると、100%淡水のRが56.5%と他(6.37.7%)を凌駕した。そこで、各薬剤を100ppmの濃度で淡水に添加し、20分間の薬浴を行ったところ、DA、ホルマリン、マリンサワーのRはそれぞれ100、70.8、66.7%で、再びDAの優位性が確認された。

さらに、DA10および50ppm添加淡水では1020分間の薬浴で90%以上、5ppmでも20分間で71%のカリグスが離脱した。他方、DA100ppm添加淡水で20分間薬浴したフグにつき、血液検査を行ったところ、Hb、Htおよび赤血球数はいずれも対照魚と大差なく正常値であった。さらに、各組織のDA含量を測定したところ、いずれも2μg/g未満で、薬浴後のDA残留は認められなかった。以上、DAは養殖フグ寄生虫、ヘテロおよびカリグスの駆除に極めて効果的で、かつ安全な薬剤であることが示された。本年度は主に、紅藻マクリから得られ、化学構造や生物活性がドウモイ酸(DA)と非常によく似た駆虫成分カイニン酸(KA)につき、養殖トラフグ寄生虫の一つであるはだ虫Pseudocaligsu fugu(以下カリグス)に対する駆除効果を検討した。これに先立ち、まず、LC/MSによるDAとKAの微量分析法の確立を試みた。ZSpray^<TM>MS検出器(ZMD)を搭載したalliance LC/MSシステム(Waters)を用い、Puresil C18カラム(Waters、4.6×250mm)と1%酢酸-8%アセトニトリルの組み合わせでLCを行った後、スプリッタを介して溶出液の約20%をMSのイオン源に導入し、ESI法(ポジティブモード)によりイオン化したところ、DAとKAは、選択イオンそれぞれm/z 312および214をモニターすることにより、非常に感度よく検出・定量できた。次に、カリグスが寄生した養殖トラフグにつき、14128ppm KA、100ppmホルマリン、もしくは100ppmマリンサワー添加淡水を用い、520分間の薬浴試験を行ったところ、フグ体表からのカリグスの離脱率Rは、ホルマリンおよびマリンサワーの場合、100ppm、20分間の薬浴でも70%程度であったのに対し、KAでは濃度64ppm以上、かつ15分間以上の薬浴で100%に達した。他方、64ppm、20分間のKA薬浴に付したフグにつき、各組織のKA含量をLC/MS法により測定したところ、いずれも2μg/g未満で、KA残留は認められなかった。以上、KAはカリグスの駆除に極めて効果的で、かつ安全な薬剤であることが示された。KAの駆虫効果は、DAよりは若干低かったが、DAの原料となるハナヤナギに比べてマクリの資源量は多く、大量の薬剤をより容易に調製することが可能と考えられる。
地方分権時代における地域福祉活動の効果の測定と方法論の確立に関する学際的研究

地域福祉活動への参加、また地域福祉計画づくりに住民参加の手法を用いることは、住民本人や地域社会にどのような影響を与えるのだろうか。研究調査の結果、地域福祉活動や計画づくりへの参加は、住民の問題意識を高め、日常生活での困りごとを解決する力を身につける等、一定の効果が生まれることが明らかとなった。しかしその一方、地域福祉活動を持続させ、地域単位での問題解決システムをつくる上では、地域ガバナンスの必要性が明らかとなった。平成18年度の本研究グループによる研究実績は、以下の通りである。(1)月例研究会5月22日(年間計画、予算執行計画の確認)、6月20日(岸和田市内のアンケート調査の結果報告)、7月24日(松江市の取り組みに関する事前勉強会)、9月19日(松江市調査のまとめ、および茅野市調査の報告)、11月13日(韓国の地域福祉の動向)、12月15日(来年度の研究の方向性についての検討)、1月15日(第2回岸和田アンケート調査の質問項目検討)の計7回の研究会を大阪大学および同志社大学等で実施した。(2)松江市の地域福祉活動に関するヒアリング調査(第1回) 8月24日8月27日松江市社会福祉協議会および松江市内の公民館でヒアリング調査を実施し、地域福祉計画策定の過程を確認した。さらに来年度に実施する調査の検討を行なった。また第12回地域福祉実践研究セミナー(松江市で開催)に参加し、松江市における地域福祉実践の情報収集を行なった。(3)松江市の地域福祉活動に関するヒアリング調査(第2回) 3月1日3日松江市社会福祉協議会、松江市忌部公民館、松江市朝酌公民館を訪問し、松江市の地域福祉実践における公民館の役割についてヒアリング調査を実施した。松江市の公民館は教育コミュニティと福祉コミュニティの両方のガバナンス機能を備えていることは先行研究でも明らかであるが、館長の選出方法、財源の運用、事業運営の方法には自律したシステムがみられ、一種の社会教育と地域福祉を担う一種の自治体の役割を果たしていることが明らかになった。この成果を踏まえて、来年度もヒアリング調査を継続し、アンケート調査も実施する計画である。(4)岸和田市アンケート調査2月16日3月17日岸和田市における地域福祉実践に関するアンケート調査は、本研究プロジェクトの事前調査として実施してきたが、今回は地域福祉計画策定後に、計画策定プロセスに参加した住民にどのような変化がみられたかを評価することを目的に二度目のアンケート調査を実施中である。(分析は来年度に実施。)今年度の研究成果の一部については、日本地域福祉学会第21回大会(山口県立大学)において、口頭発表を行なう予定である。平成19年度の本研究グループによる研究実績は、以下の通りである。(1)定期研究会の実施6月8日(研究の進捗状況と19年度の研究計画の確認)、9月25日(スウェーデン現地調査の総括)、11月13日(岸和田アンケート調査(2回目分)の結果報告と分析)の計3回の研究会を大阪大学等で実施した。(2)日本地域福祉学会第21回大会での研究発表6月910日に開催された日本地域福祉学会第21回大会(山口県立大学)で、研究分担者の加川が「地域福祉研究実践における住民自治の推進と地域の福祉システム形成に関する研究」、金田が「地域福祉活動への参加を通じた主体形成の重要性に関する研究」と題して、本研究による研究成果の一部について、口頭発表を行った。(3)アンケート調査の実施と集計作業2007年23月に岸和田市で実施したアンケート調査の集計作業を実施した(89月)。また12月1月にかけて、松江市社会福祉協議会の協力を得て、松江市の地域福祉活動に関するアンケート調査を実施した。集計作業は来年度の早い時期に行う予定にしている。(4)スウェーデンにおける地域福祉活動についての現地調査の実施8月24日9月3日にわたり、スウェーデン・ヴェクショー市を中心に、地域福祉活動に関するヒアリング調査と資料収集を行った。ヴェクショー市内のアラビュー地区のまちづくりセンターと住民参加の手法、ストックホルム市のボランティア活動推進センターの機能と役割についてなど、貴重な調査結果を得ることができた。(5)松江市の地域福祉活動におけるヒアリング調査の実施3月1819日にかけて、松江市社会福祉協議会、松江市忌部公民館、松江市城北公民館を訪問し、松江市の地域福祉実践における公民館と地区社協の役割についてヒアリング調査を実施した。平成20年度(最終年度)の本研究の実績は以下の通りである。(1)2年間の本研究についての補足調査斉藤(研究代表者)は、2008年7月、島根県松江市内3箇所の公民館において、利用者を対象としたヒアリング調査を補足調査として実施した。(2)関連学会での研究成果発表

日本地域福祉学会第21回研究大会(2008年6月14-15日、同志社大学)において、金田(分担研究者)が「地域福祉(活動)計画策定を通した住民の地域に対する意識の醸成-地区別住民懇談会参加者の調査から-」、加川(分担研究者)が「地域包括ケアシステム形成におけるコミュニティソーシャルワークのあり方に関する研究」をテーマに研究成果の一部を発表し、各研究テーマの議論を深めた。また斉藤は、日本社会教育学会第32回関西研究集会において、「地域福祉と納税者としての学習機会」というテーマで研究成果の一部を発表し、地域福祉と社会教育の連携の可能性についての議論を深めた。(3)研究成果についての執筆活動本研究の研究成果については、本研究の終了後に、成果をまとめて出版する計画をたてている。今年度は本研究の最終年度となっているため、出版物の土台となる研究成果報告書を2009年3月末までに完成させる予定である。さらに社会福祉士養成課程の改正に伴って出版される書籍『新・社会福祉士養成講座/第9巻/地域福祉の理論と方法』の要所を、本研究参加者は編集者あるいは執筆分担者として、一定の役割を担っており、ここでも本研究の実績が活かされている。また今後は各研究者が、学会での口頭発表をもとに論文を執筆し、学会誌など研究誌に投稿していく予定である。
Mechanisms of anhydrobiosis-associated gene regulation in the cells and tissues of chironomid Polypedilum vanderplanki.

本研究は、複数のオミクス技術の組み合わせにより、ネムリユスリカの極限的な乾燥耐性の組織特異的な遺伝子機構を解明することを目的とした。その結果、ARIdと呼ばれる乾燥耐性関連遺伝子が集積したゲノム領域に多数のnoncoding RNA (ncRNA)が存在する事を見いだした。しかも、そのncRNAは、その近傍に存在する乾燥耐性関連遺伝子との発現相関があったことから、エンハンサーRNAである可能性がある。また、CAGE解析とRNAi実験により、熱ショック転写因子(HSF1)が、乾燥耐性特異的な転写活性化を通じて、重要な乾燥耐性機能発現調節因子であることを実証した。29年度が最終年度であるため、記入しない。
サルの実験的半側顔面痙攣モデル作製の試みと顔面痙攣の発現機構に関する生理学的検討

ヒトの三叉神経痛及び半側顔面痙攣の治療法は神経血管減圧術にて確立されたが、その発現機構を解明すべく我々は現在臨床的に神経血管減圧術中のroot exit zoneにおける異常活動電位のmonitoringを行い、術中に顔面筋電図と同期する活動電位を既に記録している。この異常活動電位の起源を求めるには臨床的には困難なため、ヒトの顔面神経への血管圧迫の機序に相当すると考えられるモデルを実験的にサルに作製する試みを昭和63年度より行ってきた。ケタラ-ル麻酔下に脳定位固定装置にサル(4-5kg)を固定し、局所麻酔下に一側後頭下開頭を行い手術用顕微鏡下に今年度購入した自在鈎に脳篦を用いて小脳を内上方へretract小脳橋角部を露出した。脳幹の橋より出た顔面神経は錐体骨底面と殆ど間隙を有さず神経の走行に直交する形で神経と骨底面との間にsilicon tube(長さ7mm,径1mm:1例)、輪ゴム(動:1例)及びGORE-TEX Surgical Membrance(上記のsizeに作製:1例)を各々挿入し、錐体骨にBiobond or Alon Alphaにて固定した。小脳及び脳幹の拍動により顔面神経が、挿入されたtubeと共に拍動する様子が観察された。半覚醒状態でサルの瞬目に一致する顔面表面筋電図を、更に顔面神経のroot exit zoneを刺激して筋電図の反応波を今年度教室に購入されたNeuropak IVにて記録した。創部を閉頭した後、ビデオカメラにてサルの顔面の状態を記録した。1例に操作した同側の顔面神経麻痺を軽度認めた。経時的に顔面の様子を観察したが、6ケ月及び7ケ月目で2匹が死亡し(頭蓋内病変なし)、残る1匹も4ケ月目を経過しているが、顔面痙攣の発現はいずれも認めていない。2匹の死亡例を剖検し脳幹部、顔面神経の出口を連続切片にて(Nissl染色)組織学的に検討したが、顔面神経核及び顔面神経の変性は認めなかった。死亡例の死因が頭蓋内によるものでなかった事より、今後術後の管理を厳重にし更に長期的な観察を行えるようにし、剖検時のtubeと神経との位置関係にずれを生じたものが1例あったことより局所の問題点を解決していくことが肝要と思われた。この異常活動電位の起源を求めるには臨床的には困難なため、ヒトの顔面神経への血管圧迫の機序に相当すると考えられるモデルを実験的にサルに作製することを試みた。

ケタラール麻酔下に脳定位固定装置にサル(4-5kg)を固定し、居所麻酔下に一側後頭下開頭を行い今回購入した手術用顕微鏡下に脳箆を用いて小脳を内上方へretractし今回の補助により購入した血管ゾンデ、マイクロ手術剪刀及びマイクロピンセットを用いて小脳橋角部を露出した。脳幹の橋より出た顔面神経は錐体骨底面と殆ど間隙を有さないが、骨底面には神経の走行に沿って溝がありnerve fookを用いてこれを神経損傷を来さぬ程度に上方へ持ち上げ、この溝に直行し橋渡しする形で神経と骨の間にsilicon tube(径1mm)を挿入し断端を錐体骨にBiobondにて固定した。小脳及び脳幹の拍動により顔面神経が、挿入されたsilicon tubeと共に拍動する様子が観察された。半覚醒状態でサルの瞬目に一致する顔面表面筋電図を既に購入されているVC-10 slave monitorにて記録し、更に臨床的に実験に使用しているものと同じ双極電極にて顔面神経の脳幹からの出口より活動電位を同時記録してcontrolとした。創部を閉頭した後、ビデオカメラにてサルの顔面の状態を記録した。同様な手技を2匹のサルに施行し現在4ヶ月及び2ヶ月経過しているが、手術操作による顔面神経麻痺等の神経脱落徴候あるいは感染などの合併症は認められていない。また、これらサルの顔面の状態を表面筋電図及びビデオカメラにて経時的に記録しているが未だ顔面痙攣の発現は認められていない。今後更に経時的観察を行っていく。ヒトの三叉神経痛及び半側顔面痙攣の治療法は神経血管減圧術にて確立されたが、その発現機構を解明すべく我々は現在臨床的に神経血管減圧術中のroot exit zoneにおける異常活動電位のmonitoringを行い、術中に顔面筋電図と同期する活動電位を既に記録している。この異常活動電位の起源を求めるには臨床的には困難なため、ヒトの顔面神経への血管圧迫の機序に相当すると考えられるモデルを実験的にサルに作製する試みを昭和63年度より行ってきた。ケタラ-ル麻酔下に脳定位固定装置にサル(4-5kg)を固定し、局所麻酔下に一側後頭下開頭を行い手術用顕微鏡下に今年度購入した自在鈎に脳箆を用いて小脳を内上方へretractし小脳橋角部を露出した。脳幹の橋より出た顔面神経は錐体骨底面と殆ど間隙を有さず神経の走行に直交する形で神経と骨底面との間にasilicon tube(長さ7mm、径一mm:一例)、輪ゴム(同:1例)及びGORE-TEX Surgical Membrane(上記のsizeに作製:1例)を各々挿入し錐体骨にBioboldor Alon Alphaにて固定した。小脳及び脳幹の拍動により顔面神経が、挿入されたTUBEと共に拍動する様子が観察された。半覚醒状態でサルの瞬目に一致する顔面表面筋電図を更に顔面神経のroot exit zoneを刺激して筋電図の反応波を今年度教室に購入されたNeuropak IVにて記録した。1例に操作した同側の顔面神経麻痺を軽度認めた。経時的に顔面の様子を観察したが、6ケ月及び7ケ月目で2匹が死亡し(頭蓋内病変なし)、残る1匹も4ケ月目を経過しているが、頑迷痙攣の発現はいずれも認めていない。2匹の死亡例を剖検し脳幹部、顔面神経の出口を連続切片にて(Nissl染色)組織額的に検討したが、顔面神経核及び顔面神経の変性は認めなかった。死亡例の死因が頭蓋内によるものでなかった事より、今後術後の管理を厳重にし更に長期的な観察を行えるようにし、剖検見時のtubeと神経との位置関係にずれを生じたものが1例あったことより局所の問題点を解決していくことが肝要と思われた。