hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
本邦におけるチームSTEPPSを参考にした施設への最適なRRS導入方法の研究

院内心停止の低下を目的とした医療機関へのRapid Response System(RRS)の導入は欧米諸国で推進され成果を挙げてきている。本邦では医療事故調査制度の整備による院内死亡症例把握の必要性や、さらには医師の働き方改革による医師のライフスタイルの変化の必要性が言われている昨今において、このRRSを機能するシステムとして導入することは、時代の変化に対応した病院体制を構築するためにも喫緊の課題である。今回、米国の医療、安全文化を向上させるために設計されたチームSTEPPSの戦略を参考にし、本邦での最適なRRSの導入方法を探索し、効果的なRRSの普及、更に院内死亡率の低下につなげることが本研究の目的である。この研究では、RRS起動数増加を目的としたRRS推進講座を企画し、計2回開催した。参加施設は、計17施設。その後のフォローアップ研修を行なった。結果は、RRS推進講座に参加した施設の方が、参加していない施設に比較して同期間の起動件数がより増加傾向にあったことは、このRRS推進講座の受講が施設のRRS起動数の増加にある一定の役割を果たしたと判断できる。さらに、参加施設のRRS起動数をもとに、RRS導入に成功する因子を検討した。RRSが実践しやすい環境を提供できた病院が、結果的にRRSの良好なアウトカムを出すことができた可能性を示していた。RRSの実践しやすい環境づくりがRRS導入の成功の一つの要因とも考えられ、これらを改善させるような施策を病院幹部に提言することが、RRSが上手く稼働できない病院への一つの解決策と考えられた。RRS推進講座を開催することで、どの段階において多くの施設ではつまずき、これらに対してはどのような対策が必要なのかを、明確にできる可能性があり、これらの研究成果をRRSの導入促進、普及につなげるための活動を継続していく必要がある。院内心停止率の低下を目的とした医療機関へのRapid Response System(RRS)の導入は欧米諸国で進められ成果を挙げてきている。しかし、本邦におけるRRSの導入が欧米諸国と同様の成果を得られるかどうかは必ずしも明らかではない。その理由の一つとして、本邦独自の医療文化は欧米諸国の手法をそのまま適応することになじまない可能性が考えられる。今回、米国の医療安全文化を向上させるために設計されたチームSTEPPSの戦略を参考にし、本邦での医療機関への最適なRRSの導入方法を探索し、本邦における効果的なRRSの普及、更に院内死亡率の低下につなけることが本研究の目的である。藤谷らのグループによって構築されたRRSオンラインレジストリで明らかになったのは、RRS導入施設において起動症例が多い施設と少ない施設に明確に分かれるという事実である。このような状況を踏まえ、RRS起動数増加を目的としたRRS推進講座を企画し、2015年10月4日と2016年1月6日の計2回開催した。参加施設は、計17施設( RRSを導入済み: 13施設、導入予定:4施設。)、受講生は85名。推進講座におけるアンケートでは、62.5%が組織自体がRRSの必要性を明確に同定している、という結果であった。今後、これらの施設のフォローアップを行うことにより、本邦でのRRS導入における医療機関の特徴を明らかにし、さらに適切なRRS導入の手法の確立を目標としている。予定では平成28年度初旬に効果測定の目的のために、フォローアップ講座を開催する予定であったが、参加施設の時期的な要素も絡み、まだ開催できていない。これからフォローアップ講座を計画し、開催する予定である。このフォローアップに参加できない施設においては、訪問、電話、スカイプなどの手段を用いてRRSの進捗状況を確認する予定である。院内心停止の低下を目的とした医療機関へのRapid Response System(RRS)の導入は欧米諸国で勧められ成果を挙げてきている。その理由の一つとして、本邦独自の医療文化は欧米諸国の手法をそのまま適応することに馴染まない可能性が考えられる。今回、米国の医療、安全文化を向上させるために設計されたチームSTEPPSの戦略を参考にし、本邦での医療機関への最適なRRSの導入方法を探索し、本邦における効果的なRRSの普及、更に院内死亡率の低下につなげることが本研究の目的である。参加施設は、計17施設(RRSを導入済:13施設、導入予定:4施設)、受講生は85名であった。その後のフォローアップ、導入計画の進捗状況の確認のためにフォローアップ研修を2016年9月17日に行なった、参加施設は12施設であった。RRS推進講座を開催することで、どの段階において多くの施設ではつまずき、これらに対してはどのような対策が必要なのかが、現在、明らかになりつつある。平成28年9月17日にRRS推進講座の効果測定のために、フォローアップ研修を開催した。参加施設は12施設であった。この講座に関する効果としては、全ての施設から概ね良好な評価を頂いている。

院内心停止の低下を目的とした医療機関へのRapid Response System(RRS)の導入は欧米諸国で勧められ成果を挙げてきている。しかし、本邦におけるRRSの導入が欧米諸国と同様の成果を得られるかどうかは必ずしも明らかではない。その理由の一つとして、本邦独自の医療文化は欧米諸国の手法をそのまま適応することに馴染まない可能性が考えられる。今回、米国の医療、安全文化を向上させるために設計されたチームSTEPPSの戦略を参考にし、本邦での医療機関への最適なRRSの導入方法を探索し、本邦における効果的なRRSの普及、更に院内死亡率の低下につなげることが本研究の目的である。藤谷らのグループによって構築されたRRSオンラインレジストリで明らかになったのは、RRS導入施設において起動症例が多い施設と少ない施設に明確に分かれるという事実である。このような状況を踏まえ、RRS起動数増加を目的としたRRS推進講座を企画し、2015年10月4日と2016年1月6日の計2回開催した。参加施設は、計17施設(RRSを導入済:13施設、導入予定:4施設)、受講生は85名であった。その後のフォローアップ、導入計画の進捗状況の確認のためにフォローアップ研修を2016年9月17日に行なった、参加施設は12施設であった。RRS推進講座を開催することで、どの段階において多くの施設ではつまずき、これらに対してはどのような対策が必要なのかが、現在、明らかになりつつある。RRS導入するためのRRS推進講座を開催した。現在、開催後のフォローアップを終了し、そのデータ解析も終了し、RRS推進講座のRRS導入における役割と重要性がが証明された。研究の中でRRS導入において大切な要素についても判明した。現在、これらの成果を論文化している段階である。院内心停止の低下を目的とした医療機関へのRapid Response System(RRS)の導入は欧米諸国で推進され成果を挙げてきている。本邦では医療事故調査制度の整備による院内死亡症例把握の必要性や、さらには医師の働き方改革による医師のライフスタイルの変化の必要性が言われている昨今において、このRRSを機能するシステムとして導入することは、時代の変化に対応した病院体制を構築するためにも喫緊の課題である。今回、米国の医療、安全文化を向上させるために設計されたチームSTEPPSの戦略を参考にし、本邦での最適なRRSの導入方法を探索し、効果的なRRSの普及、更に院内死亡率の低下につなげることが本研究の目的である。この研究では、RRS起動数増加を目的としたRRS推進講座を企画し、計2回開催した。参加施設は、計17施設。その後のフォローアップ研修を行なった。結果は、RRS推進講座に参加した施設の方が、参加していない施設に比較して同期間の起動件数がより増加傾向にあったことは、このRRS推進講座の受講が施設のRRS起動数の増加にある一定の役割を果たしたと判断できる。さらに、参加施設のRRS起動数をもとに、RRS導入に成功する因子を検討した。RRSが実践しやすい環境を提供できた病院が、結果的にRRSの良好なアウトカムを出すことができた可能性を示していた。
脊髄損傷に対する遺伝子治療を用いた新たな治療戦略

脊髄損傷モデルとして、クリップによる圧挫傷モデルと脊髄虚血モデルを確立した、それぞれのモデルにおける障害の程度をHE染色以外に、抗MAP2抗体を用いた免疫染色による灰白質の障害の程度や、抗ラットIgG抗体を用いた浮腫範囲の広がりの定量的検討を行い評価した。さらに損傷後の細胞応答反応を把握することを目的として、抗ED1抗体を用いたマクロファージの浸潤の程度を定量的に評価した。さらに二次損傷に関連する炎症性反応を定量的に評価する目的でTNFα、IL1-β、ICAM-1、COX-2に注目し、それぞれの遺伝子発現の程度をRT-PCR法を用いて定量的に評価した。次にそれらを細胞内レベルで制御することにより一次損傷に引き続き生じる二次損傷を最小限に抑えることを目的として、HVJ liposomeをベクターとし、NFκBに対し拮抗作用を有するdecoyを作成し遺伝子導入した。FITC標識NF-kB decoyを用いて、十分な導入が得られることが確認できた。NF-kB decoyの作用により脊髄虚血の範囲は縮小され、ED1陽性細胞の浸潤範囲も抑制されていた。また炎症反応に関連するTNFα、IL1-β、ICAM-1、COX-2などの遺伝子発現も有意に抑制されていた。さらにSrc kinase inhibitorであるPP1のVEGFに関連して生じる浮腫の抑制効果並びに二次損傷抑制効果を明らかにした。PP1投与群では対照群と比べて、浮腫の広がりは有意に縮小され、ED1陽性細胞の浸潤もPP1群において有意な浸潤の抑制を認めた。TNFα、IL1-β、ICAM-1、COX-2などの遺伝子発現も有意に抑制されていた。以上のデータより脊髄損傷に対す両治療法の可能性が期待される。脊髄損傷モデルを確立し、脊髄損傷後の細胞応答反応を把握すること、次にそれらを細胞内レベルで制御することにより一次損傷に引き続き生じる二次損傷を最小限に抑えることを目的とした。脊髄損傷モデルは、wistarラット(体重250g)の第10胸椎椎弓切除後に脳動脈瘤用のテンポラリークリップ(把持圧70g)を用いて3秒間圧挫して作成し、ラット胸髄一定圧挫傷モデルとした。脊髄虚血モデルは2F-Fogartyカテーテルを左頚動脈から下行大動脈内に挿入し、大動脈内で10分間インフレーションすることにより作成した。両モデルとも麻酔覚醒後、対麻痺を呈していた。傷害の程度はHE染色にて検討した。またラット抗Ig G抗体による免疫染色にて浮腫の広がり、並びに抗ED1抗体を用いてマクロファージの浸潤の程度を評価した。遺伝子導入実験としてlac Z遺伝子を発現するHSVを作成し、胸腰髄神経細胞でのlac Zの発現を検討した。HSVを用いての導入効率が上手く上がらない一方、HVJ liposomeを用いることにより高い導入効率が得られたのでHVJ lipsomeをベクターとして使用することも検討した。導入遺伝子としてNFκBに対し拮抗作用を有するdecoyを作成した。NF-kB decoyの作用により脊髄虚血の範囲は縮小される傾向が見られ、ED1陽性細胞の浸潤範囲も抑制されていた。さらにSrc kinase inhibitorであるPP1のVEGFに関連して生じる浮腫の抑制効果も検討した。PP1群では対照群と比べて、浮腫の広がりは有意に縮小され、またED1陽性細胞の浸潤も、PP1群においてより有意な浸潤の抑制を認めた。今後これらの定量的な評価が必要である。
未知の遺伝子変異を有するQT延長症候群患者への安全な治療方針決定プロトコルの開発

QT延長症候群は致死性不整脈を誘発する不整脈疾患である。13-14の型に分類されるが、90%以上がQT延長症候群13型に分類される。各々の型によって投薬や生活指導も全く異なるが、現在行われている型分類のための診断方法は遺伝子検査のみである。しかし、遺伝子の多型や遺伝滲透率の問題から、遺伝子以上が判明しても患者の症状と直接結びつくと証明されるものはごくわずかである。我々は患者さんのiPS細胞由来心筋細胞を用いて、異常が起こるイオンチャネルを簡単に調べることで型分類する診断方法を確立した。この診断方法により、より簡便に異常チャネルに基づいた診断が可能となり、正確に薬物選択や生活指導が可能となる。QT延長症候群患者におけるはチャネル遺伝子変異同定率は60-70%と言われている。しかし、報告されている遺伝子変異のなかで電気生理学的研究で明らかにQT延長症候群のPhenotypeに寄与する変異と証明されているものは多くない。よって、QT延長症候群1型、2型、3型患者から作成したiPS細胞を直接分化法で心筋細胞に分化し、その心筋細胞のPhenotypeを解析することでQT延長症候群の分類を行うことを目的とした。我々が使用するiPS細胞はQT延長症候群1型でIVS8+5G>A、QT延長症候群2型でA422T変異、QT延長症候群3型でA406K変異を有している。QT延長症候群1型はIKsチャネルのLoss of Function変異より、IKsブロッカー(Chromanol293B)投与において細胞活動電位の変化は正常iPS由来心筋細胞認めにくいと考えられる。同様にQT延長症候群2型はIKrチャネルのLoss of Function変異より、IKsブロッカー(E4031)投与において細胞活動電位の変化は正常iPS由来心筋細胞認めにくいと考えられる。QT延長症候群3型はINaチャネルのGain of Function変異より、INa増強剤(ATX-II)投与において細胞活動電位の変化は正常iPS由来心筋細胞認めにくいと考えられる。以上の理論を用いて以下の結果を得た。QT延長症候群1型iPS由来心筋細胞へのChromanol293B投与において活動電位の変化は正常iPS由来心筋細胞に比べて有意差を持ってわずかであった。次にQT延長症候群2型iPS由来心筋細胞へのE4031投与において活動電位の変化は正常iPS由来心筋細胞に比べて有意差を持ってわずかであった。現在QT延長症候群3型iPS細胞由来心筋細胞について解析中である。QT延長症候群(LQT)の1型(LQT1), 2型(LQT2), 1+2型(LQT1/2), 3型(LQT3),正常コントロール(WT)の各iPS細胞をin vitroで心筋分化させて活動電位を測定した。無投薬状態を基礎値として、C293B(IKsブロッカー)、E4031(IKrブロッカー)、ATX-II(INaアクチベーター)投与後の活動電位の変化を記録した。心筋細胞表面にイオンチャネルが正常発現していればブロッカーなどの投与により活動電位延長が認められるはずであるが、変異によってイオンチャネルの機能不全があれば同チャネルブロッカー投与によっても活動電位が延長しないことが予想され、この変化率によってLQTのタイプ分類が可能であるか、遺伝子変異とphenotypeの一致が得られるか検討した。WT iPS分化心筋はいずれの薬剤でも活動電位が延長し、イオンチャネルの正常発現が確認された。LQT1 iPS分化心筋において、C293B投与で活動電位延長はWTの約50%しか認めず、E4031やATX-II投与ではWT iPS分化心筋と同様の活動電位延長を認めた。また明らかにE4031, ATX-II投与によって不整脈の増加を認めた。LQT1/2 iPS分化心筋についてはATX-II投与では予測通り活動電位の延長を認めたが、C293B, E4031投与では活動電位延長はWT iPS分化心筋の20-30%程度しか延長しなかった。LQT2 iPS分化心筋においては、ATX-II投与においてはWT iPS分化心筋と同様の反応を示したが、C293B, E4031投与のいずれにおいても活動電位の延長はWTの10-30%程度であった。LQT3 iPS分化心筋の解析ついては心筋細胞分化効率が悪く十分なデータを得ていない。以上より、薬剤負荷によるLQTタイプ分類はある程度可能と考えられる。QT延長症候群(LQT)の遺伝子変異は必ずしもphenotypeを反映していないことと、実際QT延長症候群患者で遺伝子変異を認める患者は検査を行った中で60%程度と言われている。多くが13型に分類されるが、それぞれの型においても生活指導方法や投薬する薬の種類も異なる。よって、より正確に異常遺伝子チャネルを同定するプロトコルが必要である。その目的のために電極植込み型培養皿を使用するMEAシステムを用いたQT延長症候群の型分類を行う方法を模索している。同時に遺伝子異常が不明であっても機能不全チャネルが同定できれば患者の生活指導や適切な投薬が可能である。現在、QT延長症候群1型(LQT1)、2型(LQT2)、1+2型(LQT1/2)、3型(LQT3)と正常コントロール(WT)のiPS細胞について解析している。LQT1, LQT1/2, WT iPS細胞から分化させた心筋細胞については大方測定解析が終了している。

LQT2 iPS分化心筋については測定解析は終了しているが、一部予想と反する結果が得られており、その原因検索が必要である。またLQT3 iPS細胞から分化した心筋細胞については分化効率が低く、未だ十分な数のデータが得られていないのが現状である。心筋分化プロトコールの調整を行い、データ収集を行っていく予定である。以上より、全ての解析データが得られていないが、目標の70%程度の解析データが得られており、概ね順調に進展していると考える。LQTS患者由来iPS細胞から分化した心筋細胞を用いてin vitroでの診断系を構築ことを目的とした。LQTSの90%以上を占めるLQTS1, LQTS2, LQTS3の異常チャネルは各々IKs, IKr, INaであることに注目し、LQTS患者から樹立したiPS細胞を心筋分化させて実験を行った。例えばLoss of Functionのイオンチャネルをブロックしても活動電位変化は殆ど認めないが、正常のイオンチャネルをブロックすれば活動電位が大きく影響するとの考えから、コントロールiPS細胞由来心筋(C-iPS-CM)とLQTS iPS細胞由来心筋(LQTS-iPS-CM)に各々のチャネル阻害剤や活性化試薬を投与することで活動電位の延長率について評価を行った。活動電位の延長は、パッチクランプによる評価だけでなく、より簡便なMulti-electrode arrayシステムを使用して、心電図でのQT時間に相当するfield-potential duration(FPD)を評価した。結果、LQTS1, LQTS2に対してそれぞれクロマノール、E4031を投与し、C-iPS-CM2比べてLQT-iPS-CMで優位に活動電位延長率が低かった。また濃度を選択することで、その結果の特異度感度ともに90%以上で診断可能であった。LQT2のNaチャネルについては、現在実験中であり、阻害薬または活性化剤のいずれが診断位有用か検討中である。LQTS2 iPS細胞については遺伝子変異を修正したiPS細胞(LQT2corr-iPS-CM)を樹立し同様の実験を行った。結果、LQT2corr-iPS-CMの薬剤に対する反応はほぼC-IPS-CMと同様であった。以上より、遺伝子異常を検査するより正確でかつ薬剤選択や生活指導に直接結びつく診断方法が確立された。QT延長症候群は致死性不整脈を誘発する不整脈疾患である。13-14の型に分類されるが、90%以上がQT延長症候群13型に分類される。各々の型によって投薬や生活指導も全く異なるが、現在行われている型分類のための診断方法は遺伝子検査のみである。しかし、遺伝子の多型や遺伝滲透率の問題から、遺伝子以上が判明しても患者の症状と直接結びつくと証明されるものはごくわずかである。我々は患者さんのiPS細胞由来心筋細胞を用いて、異常が起こるイオンチャネルを簡単に調べることで型分類する診断方法を確立した。この診断方法により、より簡便に異常チャネルに基づいた診断が可能となり、正確に薬物選択や生活指導が可能となる。QT延長症候群は全体の70-80%、遺伝子変異が判明しているQT延長症候群の90%以上が1、2、3型に分類される。
ゲノム分野におけるオントロジーを基にした知識自動獲得と知識の構造化に関する研究

本研究では、ゲノム分野のように、今後、さらに知識資源が増加すると考えられる分野において、ますます問題となる知識管理に関し、XMLによる知識表現が標準となることを前提に、用語の認識と分類(ターミノロジー、及びオントロジー)を中心としたオントロジー情報の構築とオントロジー情報の管理検索の手法について研究開発を行うことを基本とする。平成16年度においては、前年度により設計された基盤システムの実装を進めると共に、研究、開発される要素技術の統合を進めることで、全体システムとして、基盤システム側と要素技術側の双方向から必要とされる機能、精度、処理効率を整理しつつ統合を行った。また、用語認識、オントロジー構築等の言語処理技術のカバレッジを広げ、頑健性を高めることで、大規模なデータを対象とする際にも十分実運用に耐えられるシステムの構築を行った。具体的には、・知識管理システムの構築と高速かつ容易な情報抽出手法の研究XMLタグを含むタグ情報等によりアノテートされた知識の効率的管理システムを実現し、研究を推進するための稼動環境の構築、および実際の運用、開発に際して、ユーザインタフェース、API等に関する研究開発を行った。さらに、管理された知識情報を効率的、かつ容易な操作で検索するための処理環境について研究を行い、実装を進め、総合的な知識の構造化システムの実現を行った。・知識の構造化とVisualizeの研究構造化された知識を如何に解りやすく表現し、Visualizeを行うかに関する研究開発を行い、知識の検索において、従来のように関連する知識のリストを表示するのみではなく、関連する知識をVisualizeすることで知識の俯瞰を可能とするインタフェースの実装を行った。以上のように、本年度においても概ね計画に基づき研究を進めることができたと思われる。今後、さらなるケーススタディ、および評価を行うことでシステム、およびモデルの有効性、頑健性を検証すると共に、実際のネットワーク上や、協力企業等での実稼動による運用を行うことで、システムの実用性を高める予定である。また同時に研究成果の発表も積極的に行う予定である。本研究の目的は、ゲノム分野やナノテクノロジー、またインターネットのように、今後、さらに知識資源が増加すると考えられる分野において、知識の量と質の問題を如何に解決するかにある。具体的には、知識が膨大であるがゆえの意図する知識の検索困難性や、(専門)用語の不統一性等を指すが、平成15年度においては、主に、これらの問題に対する基礎技術と基盤システムの設計、その実現を指向した知識獲得、知識発見等の知識抽出手法、情報抽出、及びオントロジー構築に関する基礎的研究を行う予定であった。これらの予定において、本年度は、基盤システムとして、膨大に存在する知識の管理と構造化を行うシステムの実現のためのシステム設計とプロトタイプの実装を行った。一般に、文献やデータベース等の知識ソースはそこに含まれる(専門)用語により特徴付けられる。そこで本システムでは、入力となる知識ソースからの自動(専門)用語抽出と抽出した用語の自動分類、さらに用語の分類情報に基づいた知識の類似度計算を行い、知識間の意味的な類似性を定量的に算出する。そして、ユーザより与えられたキーワードに関連する知識ソース群を、その類似性に基づいて最適配置し、視覚化を行うことで、関連する知識全体の構造を俯瞰することが可能となる。実装を行ったプロトタイプシステムに、ゲノム領域の論文アブストラクト、ナノテクに関する特許と論文、水資源に関する報告、さらには大学の授業におけるシラバス等の知識を入力し、実際に視覚化を行うことで、本システムが知識の構造化(知識の関連性の発見による新たな知の発見)に有用であることを確認した。以上のように、本年度においては概ね計画に基づき研究を進めることができたと思われる。今後、さらなるケーススタディ、および評価を行うことでシステム、およびモデルの有効性、スケーラビリティを検証すると共に、実際のネットワーク上や、協力企業等での実稼働による試験稼働を進めることで、システムの頑健性を高める予定である。

今後、さらなるケーススタディ、および評価を行うことでシステム、およびモデルの有効性、頑健性を検証すると共に、実際のネットワーク上や、協力企業等での実稼動による運用を行うことで、システムの実用性を高める予定である。また同時に研究成果の発表も積極的に行う予定である。
ウイルスの生きたまま観察も可能とする手法、及びそれを実現するためのDLC膜の開発

電子顕微鏡により含有試料を観察するためのチャンバを作製した。このチャンバに大気と含水試料をセットすることで、電子顕微鏡による含水試料の大気中観察を目指した。電子透過膜にはプラズマイオン注入法により成膜したDLC(Diamond-like Carbon)を用いた。本実験では膜厚50nm、サイズ50μm×50μmの電子透過膜を使用した。電子線が与える酵母菌へのダメージの影響については、作製したチャンバに酵母菌と培養液をセットし、加速電圧5kVの電子線を照射することで評価した。その結果、電子線を5分照射しても分裂の機能を失わない酵母菌が多数存在することが確認できた。2015年度は主にDLC膜の成膜方法の違いによる電子透過率の評価について検討した。1.電子透過膜の作製DLCの成膜方法としてRFプラズマCVD法やプラズマイオン注入成膜法を検討した結果、プラズマイオン注入成膜法により成膜時の内部応力を少なくすることが電子透過膜の作製時(エッチング時の破損防止)には極めて重要であることが分かった。2.電子透過率の評価電子透過率はモンテカルロシミュレーション及び実験により確認を行った。シミュレーションではDLCの密度、膜厚の違いによる電子透過率を算出した。例えば、膜厚を500[nm]、密度を1.57[g/cm3]とすれば、電子は加速電圧5kVで膜を透過し始め、18[kV]で99%が透過した。同じ密度で膜厚を50[nm]とすれば、電子は加速電圧2[kV]で膜を透過し始め、7[kV]で99%が透過した。また、密度を2.4[g/cm3]で膜厚を50[nm]とした場合、電子は加速電圧2[kV]で膜を透過し始め、9[kV]で99%が透過した。このように、膜厚を薄くすることは、電子透過率(最終的には検出画像の解像度)を上げるために非常に有効であるが、密度は電子透過率に大きく影響しないことが確認できた。さらには、電子のDLC透過後、DLCと観察試料の間に存在する水溶液の量の違いによる電子透過率を算出した。これによると、水溶液の量が電子透過率に及ぼす影響は非常に大きく、いかにして水溶液の量を減らすかが今後の検討事項として残された。実験ではSEMの電子銃にて電子線をDLC膜に照射し、それぞれの加速電圧における試料吸収電流の変化を計測することで、膜厚の違いによる電子透過率を求めた。当初予定していた項目はすべて行うことができた。しかし、水溶液の量が電子透過率に及ぼす影響は予想より大きく、観察試料と電子透過膜の間に存在する水溶液の量をいかにして減らすかが今後の新たな検討事項として残された。2016年度は主に1.電子透過膜(DLC)のサイズと膜厚の最適化、2.生体試料を大気圧下で観察するための試料ホルダーの試作について研究を行った。1.電子透過膜のサイズと膜厚の最適化電子透過膜のサイズ50[μm]×50[μm]、100[μm]×100[μm]、200[μm]×200[μm]において、膜厚50[nm]、100[nm]、200[nm]とした時の真空ー大気間における圧力差に対する電子透過膜の耐久性評価を行った。その結果、電子透過膜のサイズが大きいと強度を保つことができなかったが、サイズが50[μm]×50[μm]の場合においては、膜厚50[nm]においても圧力差に対しては十分な強度を持っていることが分かった。しかし、この条件において観察試料が水分を含まない金属メッシュ等の観察には成功したものの、水分を含む試料の観察については、観察中に膜が破損することが多く、生体サンプルの観察には適さないことが分かった。これは、電子線が膜に与えるダメージや電子線照射による水溶液の蒸発などが原因であると推測している。膜厚100[nm]においては、含水試料をセットした場合においても膜は破損することなく、30分の電子線連続照射にも耐えうる強度があることを確認した。2.生体試料を大気圧下で観察するための試料ホルダーの試作電子透過膜のサイズ50[μm]×50[μm]では視野の確保に乏しいため、視野の確保のため、縦横に10個×10個、計100個の電子透過膜をそれぞれ50[μm]間隔でセットする方法をとることとし、試料ホルダーを作製した。当初予定していた項目はおおむね行うことができているが、観察試料が多くの水溶液に覆われている場合には、水溶液における電子の散乱が激しく観察することが困難である。観察試料と電子透過膜の間に存在する水溶液の量をいかにして減らすかが今後の検討事項として残されている。SEMで含有試料を観察するためのチャンバを作製した。サイズは直径35mm、高さ6mmの円柱型で、電子透過膜をセットするための穴(直径3mm)を設けた。このチャンバに大気と含水試料をセットすることで、SEMによる含水試料の大気中観察を目指した。電子透過膜にはDLCを用いることを検討した。プラズマイオン注入法を用い、シリコン(Si)にDLCを成膜した後、目的領域のSiをエッチングすることで、電子透過膜を作製した。電子透過膜の強度評価のため、膜厚50nm、100nm、200nmにおいて、50×50μm、100×100μm、150×150μm、200×200μm角のサイズの電子透過膜(DLC)を作製した。

膜厚50nm、100×100μmのサイズでも、大気圧差に耐える強度であることが確認できた。しかしこのサイズで含水試料をSEMで観察すると、水分の蒸発によるチャンバ内の圧上昇により、膜が破損する可能性が高まる結果となった。Siエッチング時の歩留まり率等も合わせて考慮した結果、本研究では膜厚50nm、50μm×50μmのサイズを以降の実験で使用した。また、電子線が与える酵母菌へのダメージの影響についての評価については、大気中にセットした酵母菌が分裂する様子をSEM(5kVの加速電圧)で観察する計画であった。しかし、分裂に最適な温度管理等をSEMチャンバ内で行うことが困難であった。そのため、実験方法を1作製したチャンバに酵母菌と培養液をセットし、5kVの電子線を照射(0分、1分、3分、5分)する。2電子線を照射した酵母菌と培養液を回収し、寒天培地内で3日間25°Cの温度で培養する。3酵母菌が電子線照射により死滅、もしくは分裂の機能を失わなかった場合はコロニーを形成するため、それぞれの電子線照射時間におけるコロニー数をカウント、比較する。に変更し実験をおこなった。電子顕微鏡により含有試料を観察するためのチャンバを作製した。このチャンバに大気と含水試料をセットすることで、電子顕微鏡による含水試料の大気中観察を目指した。電子透過膜にはプラズマイオン注入法により成膜したDLC(Diamond-like Carbon)を用いた。本実験では膜厚50nm、サイズ50μm×50μmの電子透過膜を使用した。電子線が与える酵母菌へのダメージの影響については、作製したチャンバに酵母菌と培養液をセットし、加速電圧5kVの電子線を照射することで評価した。その結果、電子線を5分照射しても分裂の機能を失わない酵母菌が多数存在することが確認できた。当初の研究計画に加え、観察試料と電子透過膜の間に存在する水溶液の量の調整が必要となった。今後の具体的な研究計画は1.電子透過膜のサイズと膜厚の最適化、2.生体試料を大気圧下で観察するための試料ホルダーの試作と分解能の向上、3.生体試料に及ぼす電子線ダメージの影響である。1.ではDLCの膜厚を50[nm]とし、観察可能領域を広くするため電子透過膜のサイズを広げる工夫を行う。2.では新たな課題となった水溶液の量の調整を含め、試料ホルダーの試作を行う。3.では生体試料が死滅しないであろうと予想する加速電圧数kVによる酵母菌等の発芽観察を行う予定である。当初の研究計画に加え、観察試料と電子透過膜の間に存在する水溶液の調整が必要となった。今後の具体的な研究は、1.新たな課題となった水溶液の量の調整方法の検討2.生体試料が死滅しないであろうと予想する加速電圧数kVによる生体サンプルの観察を計画している。薄膜2015年度は2016年度に購入を計画していた電子銃システムを購入したため、計画額をオーバーして使用した。しかし、電子銃システムを予定より安価で入手することが出来たため、繰越額が発生した。電子透過膜の作製、試料ホルダ試作において当初の予定より少ない枚数、個数で実験を進めることができたため、繰越額が発生した。繰越額は電子透過膜のサイズと膜厚の最適化に関する消耗品費として使用する予定である。追加課題となった観察試料と電子透過膜の間に存在する水溶液の量の調整について、電子透過膜、試料ホルダが必要となる。これらの作製に関する消耗品費として使用する予定である。
SARSおよび動物コロナウイルスの増殖と遺伝子発現に関する研究

SARS-CoVは通常エンドゾーム経由で細胞内へ侵入することが報告されているが、我々はSARS-CoVのS蛋白の融合活性を誘導するプロテアーゼ(trypsin, elastase等)存在下では細胞膜径路で侵入することを明らかにした。更に、この径路による感染は、エンドゾーム径路感染より100-1000倍感染効率が高いことが判明した(PNAS,2005に発表)。SARSの重症肺炎の発症機序は、ウイルス感染を増強する様なプロテアーゼの存在が重要ではないかと考え、マウスに非病原性細菌感染で肺elastaseを誘導し、SARS-CoVを感染させることにより、ウイルス増殖及び肺の組織障害が高くなることを観察した。今後、更に重症肺炎に至るウイルス側及び宿主側因子の同定を進めたい。2)マウスコロナウイルス(MHV)に関する研究神経病原性の高いMHV-JHM株は受容体発現細胞に感染し、その細胞から受容体を持たない細胞に感染することが知られている。我々は、JHM株を直接受容体非発現細胞へ吸着させることにより、感染が成立することをspinoculation法(ウイルスが接種された細胞をウイルスと共に3000rpmで2時間遠心)により証明した。また、受容体非依存性感染にはJHM株のS蛋白の自然条件下で融合能が活性化されるという性質によることも明らかにされた(J.Viro1.2006発表)。SARS-CoVはエンベロープを持つRNAウイルスで、粒子表面のスパイク(S)蛋白と細胞表面のレセプターACE2が結合後、ウイルスエンベロープと細胞の膜融合により標的細胞へ侵入すると考えられている。最近Bates等は、200kDのS蛋白がトリプシンにより解裂して100kDになると膜融合が誘導されること、またSARS-CoVはエンドソームを経由して侵入すること、S蛋白の解裂活性化はエンドソーム内で起こっている可能性があることを示した。これまでエンドソーム内でのプロテアーゼによるエンベロープ蛋白の解裂活性化は知られておらず、我々はこの新しいメカニズムを解析するために、SARS-CoV感染VEROE6細胞を用いて、トリプシンおよび他のプロテアーゼに対する感受性を調べた。SARS-CoV VEROE6細胞に感染させ、S蛋白を細胞表面に発現させ、種々のプロテアーゼで細胞表面を5分間処理し、誘導される細胞融合を顕微鏡で観察した。またプロテアーゼによるS蛋白解裂は、S蛋白の1124-1140アミノ酸配列を認識する抗体を用いたウエスタンブロットで行った。trypsin、thermolysin、dispaseで処理した感染細胞では、30分から1時間後に強い細胞融合が認められ、200kDのS蛋白は100kDに解裂しており、これは抗体の認識部位から膜貫通S2サブユニットと推定された。chymotrypsin、papain、proteinase-K処理では細胞融合は弱く、S蛋白の200kD及び100kDの両バンドは消失した。collagenaseでは細胞融合は全く起こらずS蛋白の解裂も見られなかった。プロテアーゼ処理後に残存する100kDのS2の存在と膜融合活性の発現が並行することから、S蛋白の活性化には、S蛋白の解裂と、S2が分解されずに残ることが必要であると推測できる。今後、プロテアーゼがS蛋白にどのような構造変化を起こさせ、その変化が脂質二重膜にどう作用するのか、またエンドゾームの酸性条件下でも同様の変化が起るのか等を明らかにしたい。マウス肝炎ウイルス(MHV)は受容体(MHVR)を介して細胞に吸着、侵入するが、JHM株cl-2はMHVRを介して感染後、感染細胞からMHVR非発現細胞へ感染することが知られている(MHVR非依存性感染)。これは標的細胞の近傍に存在するS蛋白がMHVRに結合すること無く活性化することによると考えられる。この可能性を検証するため、spinoculation (SP)法でウイルスと細胞を隣接させることにより、MHVがMHVR非発現細胞へ感染するか否かを検討した。また、自然条件下でのS1サブユニットの遊離の検出も試みた。

本研究ではcl-2とMHVR非依存性感染活性のないsrr7を用いた。SP法は、MHVR非発現BHK細胞にウイルスを接種し、1750gで遠心後、37°Cで16時間培養した。ウイルス感染は、細胞を固定、染色後、巨細胞数を算定した。また、cl-2、srr7 S蛋白をBHK細胞で発現し、培養上清中の遊離S1蛋白をウエスタンブロット法で解析した。リアルタイムPCRによりSP法で接種したウイルスの細胞への吸着は著しく上昇し(20-150倍)、その吸着率にはcl-2、srr7間で差がないことが明らかになった。また、SP法により、cl-2のBHKへの感染は著しく促進された(約200倍)が、srr7の感染は認められなかった。一方、組換えS蛋白の解析では、受容体非依存性感染能力があるcl-2でのみS1が自然遊離し、培養上清中へ放出されることが確認された。これらの結果から、受容体非依存性感染は粒子が細胞に接着することとS1がS2から遊離することが不可欠であることが示された。以上のことから予想される受容体非依存的感染機構は、細胞表面近傍に存在するウイルス粒子のS1サブユニットが遊離することによってS2の構造変化がおこり、ウイルスと細胞の膜融合が引き起こされることによると推測された。
医療における地域災害レジリエンスマネジメントシステムの導入・推進方法に関する研究

方法開発グループは,申請者らが従来研究で開発した方法を参考に,モデル要素「f)内部監査とマネジメントレビュー」を導入する方法を考察し,導入・推進方法の原案を作成した.また,実施者に教育すべき項目を明らかにし,教育・検証グループに入力した.この方法を用いて,川口市立医療センターに適用した.適用中に,適宜推進過程の活動記録,実施者の反応,推進上のトラブル・問題点を記録し,その分析を行った.導入・推進方法を検証するために,これまでに導入・推進してきたモデル要素の中で,災害対策本部について演習を行った.演習の方法は,川口市立医療センターが行ってきた方法を原案とし,他地域の調査結果や文献を参考に改良した.演習の際に,活動内容や実施者の反応,演習結果を記録し,目標達成度等の評価を行った.概ね,導入・推進方法は妥当であることが確認できたが,いくつかの今後の課題も明確になった.教育・検証グループは,昨年度行った他地域の取り組み,過去の災害の調査とレジリエンス評価指標の洗い出しを継続して実施した.また,昨年度導入したADRMS-Hのモデル要素「d)リスクアセスメント(Risk Assessment:RA)」と「e)BCPの策定」に関する活動を継続し,評価を行った.また,方法開発グループからの入力を受けて,モデル要素「f)内部監査とマネジメントレビュー」を導入するのに必要な教育プログラムを開発した.この教育を川口市,市立医療センターと共同して対象者に実施し,理解度を測るアンケートを行うとともに,推進過程の活動記録,実施者の反応,推進上のトラブル・問題点を記録し,導入・推進の阻害要因を明らかにした.この結果をもとに,教育プログラムの改善を行った.申請時に提出した研究計画通りに進んでいる.当初の研究計画通りに進めていく.教育・検証グループは,阪神・淡路大震災,東日本大震災,熊本地震における地域の取り組み,秀逸点と問題点,演習方法について調査した.次に,レジリエンス評価指標に関しては,従来研究と文献を調査し,これをもとに評価指標を列挙した.また,最終パフォーマンス指標については,過去の震災時の記録などを参考に,時間経過とともに災害時に起き得る医療ニーズを抽出し,整理した.そして,その医療ニーズに対して,医療サービスの提供により応えることができた状態を,最終パフォーマンスの高い状態であると考え,評価項目を導出した.さらに,ADRMS-Hのモデル要素a)c)を導入するのに必要な教育プログラムについては,a)トップによる方針と目標の展開,b)ADRMS-H文書体系の整備,c)ビジネスインパクト分析(Business Impact Analysis,以下BIA)を取り上げ,教育プログラムを検討して川口市立医療センターの対象者に教育を実施し,その際の問題点を記録して改善案を作成した.合わせて,方法開発グループが,モデル要素a)c)の導入を開始したので,理解度を測るためのアンケート調査を行った.また,推進過程の活動記録,実施者の反応,推進上のトラブル・問題点を記録し,導入・推進の阻害要因を明らかにした.方法開発グループは,従来研究をもとにモデル要素a),b),c)の導入・推進方法の原案作成し,川口市立医療センターに適用した.この活動中の問題点等を記録し,上述したように,教育・検証グループにインプットした.さらに,これらの要素に関わる演習として災害対策本部演習を行い,目標達成度等について評価を行った.以上の研究結果に基づき,モデル要素a)c)の導入・推進方法の改良を行った.特に障害は発生しておらず,研究計画通りに進められている.ただし,平成28年7月に阪神・淡路大震災,東日本大震災,熊本地震の調査を行ったが,熊本地震については平成29年3月までに調査を終える予定であったが,当初想定以上に調査が必要であることが実際に現地に赴いてわかったため,同地域での調査を3ヶ月延長することとした.教育・検証グループは,まず,前年度に追加調査の必要性が明らかになった熊本地震における地域の取り組み,秀逸点と問題点について調査した.また,昨年度行った他地域の取り組み,過去の災害の調査とレジリエンス評価指標の洗い出しを継続して行った.さらに,昨年度に導入・推進を開始したADRMS-Hのモデル要素a)トップによる方針と目標の展開,b)ADRMS-H文書体系の整備,c)ビジネスインパクト分析(Business Impact Analysis,以下BIA)に関する活動を継続し,評価を行った.次に,モデル要素d)リスクアセスメント(Risk Assessment:RA)とe)BCPの策定,を導入するために必要な教育プログラムを検討し,川口市立医療センターで実施し,問題点を分析して教育プログラムの改善を行った.また,方法開発グループが,モデル要素d),e)の導入を開始したので,理解度を測るためのアンケート調査を行った.また,推進過程の活動記録,実施者の反応,推進上のトラブル・問題点を記録し,導入・推進の阻害要因を明らかにした.方法開発グループは,従来研究をもとにモデル要素d),e)の導入・推進方法の原案作成し,川口市立医療センターに適用した.この活動中の問題点等を記録し,上述したように,教育・検証グループにインプットした.さらに,これらの要素に関わる演習として災害対策本部演習,災害時調剤業務演習等の演習を行い,目標達成度等について評価を行った.以上の研究結果に基づき,モデル要素d)e)の導入・推進方法の改良を行った.申請時に提出した研究計画通りに実行できている.昨年度,追加調査が必要になったないようについても,実施することができた.方法開発グループは,申請者らが従来研究で開発した方法を参考に,モデル要素

「f)内部監査とマネジメントレビュー」を導入する方法を考察し,導入・推進方法の原案を作成した.また,実施者に教育すべき項目を明らかにし,教育・検証グループに入力した.この方法を用いて,川口市立医療センターに適用した.適用中に,適宜推進過程の活動記録,実施者の反応,推進上のトラブル・問題点を記録し,その分析を行った.導入・推進方法を検証するために,これまでに導入・推進してきたモデル要素の中で,災害対策本部について演習を行った.演習の方法は,川口市立医療センターが行ってきた方法を原案とし,他地域の調査結果や文献を参考に改良した.演習の際に,活動内容や実施者の反応,演習結果を記録し,目標達成度等の評価を行った.概ね,導入・推進方法は妥当であることが確認できたが,いくつかの今後の課題も明確になった.教育・検証グループは,昨年度行った他地域の取り組み,過去の災害の調査とレジリエンス評価指標の洗い出しを継続して実施した.また,昨年度導入したADRMS-Hのモデル要素「d)リスクアセスメント(Risk Assessment:RA)」と「e)BCPの策定」に関する活動を継続し,評価を行った.また,方法開発グループからの入力を受けて,モデル要素「f)内部監査とマネジメントレビュー」を導入するのに必要な教育プログラムを開発した.この教育を川口市,市立医療センターと共同して対象者に実施し,理解度を測るアンケートを行うとともに,推進過程の活動記録,実施者の反応,推進上のトラブル・問題点を記録し,導入・推進の阻害要因を明らかにした.この結果をもとに,教育プログラムの改善を行った.申請時に提出した研究計画通りに進んでいる.平成28年7月に阪神・淡路大震災,東日本大震災,熊本地震の調査を行ったが,熊本地震については平成29年3月までに調査を終える予定であったが,当初想定以上に調査が必要であることが実際に現地に赴いてわかったため,同地域での調査を3ヶ月延長することとした.ただし,本調査で追加調査する結果は,主に最終年度に行う導入・推進方法の普遍性を検証するためのデータとなるものであり,本研究の進捗には影響しない.したがって,当初の研究計画通りに進めていく予定である.当初の研究計画通りに進めていく.当初の研究計画通りに進めていく.
発達障害の子どもと家族を支える多職種協働モデルの創造

本研究は、児童・思春期精神科を有する病院においてアクションリサーチを行い、発達障害の子どもと家族を支える多職種協働モデルを創造することを目的とする。臨床の実践家とともに多職種協働における課題を見出し、実践や場を変革しながら協働の具体的様相や実践内容を具現化した新たなモデルを創造する。多職種が協働して課題解決に取り組む体制を構築し、協働の充実が図られることが、子どもと家族への看護と多職種協働で提供されるケアの質の向上につながる。平成30年度-令和3年度(4年間)で本研究は、1発達障害の子どもと家族にかかわる多職種協働について文献検討、2児童・思春期精神科を有する病院における多職種協働の実態調査および課題の明確化、アクション方略の洗練化、3アクションの実施・評価、4発達障害の子どもと家族を支える多職種協働モデルの創造を実施する。平成30年度は、発達障害の子どもと家族にかかわる多職種協働に関する文献検討、および次年度以降に向けた準備を以下の段階に沿って実施した。【Step1】発達障害の子どもと家族にかかわる多職種協働に関する国内外の研究を検索し、文献を収集した(平成30年5月-平成30年9月)。【Step2】文献検討により協働に関する現状と課題について分析した(平成30年10月-平成31年3月)。【Step3】次年度以降の研究実施に向けて、研究倫理審査申請の準備を行った(平成31年3月)。令和元年度は、平成30年度実績を基に文献検討の結果分析を継続し、多職種協働における現状と課題を明確化する。その結果に基づいて研究計画を修正し、アクションリサーチを実施予定である。平成30年度は当初の研究計画に沿ったスケジュールでおおむね実施できている。平成30年度の研究結果の分析は令和元年度も継続して実施する予定である。令和元年度-令和3年度は、以下の研究計画に沿って実施する。令和元年度:1発達障害の子どもと家族にかかわる多職種協働について実態調査を行う。2研究協力者とともにアクションプランを立案する。令和2年度:研究協力者とともに課題に対するアクションを実施、評価する。令和3年度:発達障害の子どもと家族を支える多職種協働モデルを創造する。研究全体の進行状況に応じて、令和元年度の研究計画2は令和2年度へ変更になる可能性を考慮して研究を進める。平成30年度は文献検討および次年度の研究実施に向けた準備に関する支出があった。継続的な文献検討の必要性があり、発表を次年度に繰り越したため、未使用額が生じた。平成30年度の未使用額は令和元年度に行う発表に関する経費に充て、令和元年度の助成金は当該年度研究計画に基づく実態調査等の経費に充てる予定である。
自己免疫疾患における病原性自己抗体の産生機序の解析

自己免疫疾患における病原性自己抗体の産生機序の解析にあたって、T細胞によるB細胞の抗体産生抑制機序の解明を行った。T細胞の活性化に伴って出現するCTLA-4分子がB細胞表面に存在するCD80/CD86分子を介して抑制シグナルを伝達するのではないかという仮説を立て、その検証を試みたが、抗体による阻害実験では確証に至らなかった。一方固相化抗CD3抗体によるT細胞依存性のB細胞活性化のシステムにおいてIgG型の自己抗体が産生されるかについて検討を行ったが、抗DNA抗体・抗Sm抗体・抗RNP抗体のいずれも検出されなかった。IgM型抗DNA抗体のIgG型へのクラススイッチの誘導も出来なかった。自己免疫疾患における病原性自己抗体の産生機序の解析にあたって、本年度はT細胞によるB細胞の抗体産生抑制機序の解明を昨年度に引き続き行った。T細胞の活性化に伴って出現するCTLA-4分子がB細胞表面に存在するCD80/CD86分子を介して抑制シグナルを伝達するのではないかという仮説を立て、その検証を試みた。その検証にあたっては固相化抗CD3抗体によるT細胞依存性のB細胞活性化のシステムを用いた。このシステムでは、T細胞は強力な抗体産生抑制作用を発揮して、その抑制能はT細胞をmitomycin C(MMC)で処理することで消失することがわかっている。このシステムにてMMC非処理のT細胞存在下抗CTLA4抗体を添加するとIgM産生が約2倍増加した。またT細胞をMMC処理するとIgMの産生は増加したが、その際にT細胞のCTLA4の発現も有意に低下していた。従って、CTLA-4分子がB細胞表面のCD80/CD86分子を介して抗体産生を抑制することが裏付けられた。ただCTLA4/Tg融合蛋白であるアバタセプトは、末梢血B細胞をStaphylococcus aureus (SA)とIL-2にて刺激した際のIgM産生をむしろ増強した。SA刺激は生理的な状態を反映していないと考えられることから、soluble CD40リガンドとIL-2+IL-10を用いたより生理的なB細胞の刺激システムを構築して再度検討してゆく予定である。IgM型の抗体については抗DNA抗体のみ検出された。次年度は抗DNA抗体について、そのIgG型へのクラススイッチがin vitroで誘導できるか検討を行ってゆく予定である。病原性自己抗体の産生機序の解析にあたって、T細胞によるB細胞の抗体産生抑制機序の解明をまず行った。T細胞の活性化に伴い出現するCTLA-4分子がB細胞表面に存在するCD80/CD86分子を介して抑制シグナルを伝達するのではないかという仮説を立て、その検証を試みた。検証にあたり固相化抗CD3抗体によるT細胞依存性のB細胞活性化のシステムを用いた。このシステムでは、T細胞は強力な抗体産生抑制作用を発揮して、その抑制能はT細胞をmitomycin C(MMC)で処理すると消失する。また、MMC比処理T細胞をMMC処理T細胞とB細胞の培養に加えた際に見られるIgM産生抑制に対して、抗CTLA4抗体は有意な影響を及ぼさなかった。今後はCTLA4欠損T細胞などを作製して、B細胞に対する作用を検証してゆく必要があると考えられた。抗DNA抗体について、そのIgG型へのクラススイッチがin vitroで誘導できるか検討を行っが、マクロファージやその産生するIアルファインターフェロンを添加してもIgGへのクラススイッチを惹起する事が出来なかった。今後更なる検討が必要である。自己免疫疾患における病原性自己抗体の産生機序の解析にあたって、本年度はTリンパ球によるBリンパ球の抗体産生抑制機序の解明を試みた。Tリンパ球の活性化に伴って出現するCTLA

-4分子がBリンパ球表面に存在するCD80/CD86分子を介して抑制シグナルを伝達するのではないかという仮説を立て、その検証を試みた。その目的のために、現在関節リウマチの治療薬として認可されているCTLA4/Tg融合蛋白であるアバタセプトの末梢血リンパ球に対する効果について検証した。その結果、アバタセプトはヒト末梢血リンパ球の増殖反応は抑制するもののIL-6、TNF-αなどはむしろ増強する傾向を示した。末梢血からBリンパ球を分離精製して、これをStaphylococcus aureus (SA)とIL-2で刺激してIgM産生を誘導し、これに対するアバタセプトの効果を検証したが、IgM産生を抑制する傾向が見られたものの有意な差はなかった。この原因の1つとして、アバタセプトの濃度が10μg/mlと低かったこと、SAによるアバタセプトの吸収などが考えられた。またIgGの測定がこの系では行いにくいという問題点も上げられた。本年度には、この点を克服するためにアバタセプトをより高濃度で使用して検討するとともに、soluble CD40リガンドとIL-2+IL-10を用いたより強力なBリンパ球の刺激システムを構築してゆく予定である。さらに、マイトマイシンCの処理によりTリンパ球の抑制活性が低下することから、マイトマイシンC処理がTリンパ球のCTLA4の発現に及ぼす影響も検討してゆく予定である。B細胞を精製して免疫グロブリン産生を誘導するシステムの構築、特に固相化抗CD3抗体によるT細胞依存性のB細胞活性化のシステムをうまく作動させることができ、T細胞による抗体産生抑制にCTLA4が関与することを証明することができた点は大きな進歩と考えられる。さらにこのシステムを用いて、健常人末梢血のB細胞のレパートリーにIgM型の抗DNA抗体産生細胞はいるものの、抗Sm抗体・抗RNP抗体産生細胞は検出できないことも明らかになった。Bリンパ球を精製して免疫グロブリン産生を誘導するシステムの構築におもいのほか時間がかかった。その一つの理由は培養液中のLーグルタミンの失活であった。さらにアバタセプトの濃度にも問題があった。CTLA4/Tg融合蛋白であるアバタセプトはStaphylococcus aureus (SA)とIL-2にて刺激した際のIgM産生をむしろ増強したが、SA刺激は生理的な状態を反映していないと考えられることから、soluble CD40リガンドとIL-2+IL-10を用いたより生理的なB細胞の刺激システムを構築して再度検討してゆく必要がある。また、自己抗体のなかではまず抗DNA抗体について、そのIgG型へのクラススイッチがin vitroで誘導できないかについて検討を行ってゆく予定である。Bリンパ球を精製して免疫グロブリン産生を誘導するシステムの構築問題点としての培養液中のLーグルタミンの失活については解決がついた。さらにアバタセプトの濃度についても検討すべき範囲を決定することができた。これまで使用してきた抗CD3抗体が枯渇したため、新たな抗CD3抗体を用いて免疫グロブリン産生システムを立ち上げてゆく必要がある。ほとんどの研究費は本年同様消耗品に充当する。ほとんどの研究費は本年度同様消耗品に充当する。