hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ドパミンと神経毒6-ヒドロキシドパミンによる神経細胞障害の分子機構の差異の検討

ドパミン(DA),L-DOPA,神経毒6-ヒドロキシドパミン(6-OHDA)(以下総称としてDA系化合物)による神経細胞傷害の分子機構違いを明らかにすることによってParkinson病における緩徐進行性の神経変性の抑制への手がかりを得ることを目的として研究を行い,以下の結果を得た.1.鉄と過酸化水素によるDNA損傷はDAやL-DOPAによって著しく促進した.亜鉛単独ではDNA損傷を惹起しないが,6-OHDAが共存するとDNA損傷を惹起した.アルミニウムによるDNA損傷はDA系化合物によって阻止されるので,他の遷移金属と機序が異なっている.2.鉄による水酸化ラジカル(HO・)生成は,DAとL-DOPAで影響されないが,6-OHDAで著明に増加した.一方,銅による著明なHO・生成はDA系化合物によって抑制された.3.鉄による脂質過酸化をDAは軽度抑制したが,L-DOPA,6-OHDAは影響しなかった.一方,銅にDA,L-DOPAあるいは6-OHDAを加えた場合には,脂質過酸化は著明に抑制された.4. DA系培養神経細胞(B65)には遷移金属,ことに銅が顕著な毒性を示した.また,DA系化合物も濃度依存的に細胞生存率が減少させたが,特に6-OHDAの毒性が高かった.5. B65細胞において,遷移金属,6-OHDAはスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性を強く上昇させたが,L-DOPAによるSOD活性の上昇は緩やかだった.一方,グルタチオン(GSH)活性は鉄,銅添加でやや減少したが,DA系化合物(特にDA,6-OHDA)で増加した.以上のように,DA,L-DOPA,6-OHDAは微量遷移金属,生体内での過酸化水素発生量,酸化還元状態との相互反応によってそれぞれ固有の機序によって細胞傷害性を示すことを実験的に明らかにした.これらの知見はParkinson病の神経保護療法の開発に貢献する成果だと考えられる.ドパミン(DA),L-DOPA,神経毒6-ヒドロキシドパミン(6-OHDA)(以下総称としてDA系化合物)による神経細胞傷害の分子機構違いを明らかにすることによってParkinson病における緩徐進行性の神経変性の抑制への手がかりを得ることを目的として研究を行い,以下の結果を得た.1.鉄と過酸化水素によるDNA損傷はDAやL-DOPAによって著しく促進した.亜鉛単独ではDNA損傷を惹起しないが,6-OHDAが共存するとDNA損傷を惹起した.アルミニウムによるDNA損傷はDA系化合物によって阻止されるので,他の遷移金属と機序が異なっている.2.鉄による水酸化ラジカル(HO・)生成は,DAとL-DOPAで影響されないが,6-OHDAで著明に増加した.一方,銅による著明なHO・生成はDA系化合物によって抑制された.3.鉄による脂質過酸化をDAは軽度抑制したが,L-DOPA,6-OHDAは影響しなかった.一方,銅にDA,L-DOPAあるいは6-OHDAを加えた場合には,脂質過酸化は著明に抑制された.4. DA系培養神経細胞(B65)には遷移金属,ことに銅が顕著な毒性を示した.また,DA系化合物も濃度依存的に細胞生存率が減少させたが,特に6-OHDAの毒性が高かった.5. B65細胞において,遷移金属,6-OHDAはスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性を強く上昇させたが,L-DOPAによるSOD活性の上昇は緩やかだった.一方,グルタチオン(GSH)活性は鉄,銅添加でやや減少したが,DA系化合物(特にDA,6-OHDA)で増加した.以上のように,DA,L-DOPA,6-OHDAは微量遷移金属,生体内での過酸化水素発生量,酸化還元状態との相互反応によってそれぞれ固有の機序によって細胞傷害性を示すことを実験的に明らかにした.これらの知見はParkinson病の神経保護療法の開発に貢献する成果だと考えられる.ドパミン(DA),L-DOPA,6-hydroxydipamine(6-OHDA)などのDA系薬剤と金属イオンとによるフリーラジカル傷害の解析から,Parkinson病などの緩徐進行性神経変性の機序の解明を目的とする.1.DAやL-DOPAと鉄イオン,過酸化水素の3者を反応させると,反応開始直後から強い濃緑色の発色がみられ,一方,6-OHDAの場合には自己酸化による淡い黄褐色の発色がみられた.2.DAとL-DOPAはFe(II)によるDNA損傷をin vitroで著しく促進させた.また,高濃度のCu(II)とDA系薬剤の共存はDNA損傷を惹起した.また,Zn(II)と過酸化水素のみではDNA損傷を惹起しないが,6-OHDAが存在するとDNA損傷を惹起した.Al(III)はそれ自身でDNA損傷を惹起した.3.Fe(II)と過酸化水素によるFenton反応では大量の水酸化ラジカル(HO・)が発生した.Zn(II)の場合に6-OHDAが共存したときのみにFe(II)場合に匹敵するHO・の発生がみられ,上述のDNA損傷がHO・によるものと考えられた.

一方,Cu(II),Al(III)によっても著しいDNA損傷が発生するが,それに対応するHO・の発生はみられず,Fe(II)とは異なった機序でDNA損傷をもたらすものと考えられた.4.NOラジカル消去活性を定量できる新規測定法を確立し,DA agonistがNOラジカルを消去し,この作用がDA agonistの神経保護作用の一端である可能性を明らかにした.今回新たに開発したNOラジカル消去活性の定量法はNOラジカル消去能をもつ薬剤のスクリーニングに有用だと考えられる.5.培養神経細胞およびグリア細胞で,6-OHDAあるいは過酸化水素の添加後の細胞生存率は,ともに薬剤の濃度および処置時間依存的に低下した.しかし,グリア細胞は神経細胞に比べて両者に対する抵抗性が高く,特に過酸化水素に対しては高濃度においてもかなりの生存率が認められた.1.マウス脳ホモジネートの自動酸化:遷移金属の存在は脳ホモジネートの自動酸化による脂質過酸化を促進した.DAと6-OHDAは単独ではこの自動酸化に影響を持たないが,遷移金属による脂質過酸化をDAと6-OHDAは濃度依存的に抑制した.この抑制はDAと6-OHDAが遷移金属と配位したためと考えららた.2.細胞死に伴う転写因子活性の変化と神経栄養因子の防御効果:初代培養神経細胞とグリア細胞は6-OHDAとH_2O_2によって濃度依存的に細胞生存率が減少したが,グリア細胞の方がより抵抗性であった.転写因子DNA結合活性(TRE結合,CRE結合)は神経細胞では細胞数の減少に平行して減少したが,グリア細胞では細胞数が減少したにも拘わらず亢進した.神経栄養因子brain-derivedneurotrophic factor(BDNF)は6-OHDAとH_2O_2によって低下する培養神経細胞の転写因子活性を高め,逆に,グリア細胞では6-OHDAとH_2O_2によって亢進する転写因子活性を低下させた.これらの成績から,酸化的ストレスの転写因子に及ぼす効果は神経細胞とグリア細胞とでは異なっていることを明らかにした.4.次年度に酸化的ストレスによるDAセレプターの微細損傷を検討する予定であるが,そのためのPCR-SSCP法の確立の準備は順調に進行している.1.遷移金属による水酸化ラジカル(HO・)生成に対するドパミン(DA),6-ハイドロキシドパミン(6-OHDA)の影響:Fe(II),Fe(III)単独,あるいはFe(II),Fe(III)とH2O2によるHO・生成に対して,DAおよびL-DOPA添加は影響ないか軽度促進させたが,6-OHDA添加はHO・生成を著明に増加させた.6-OHDAはスーパーオキサイド(O2^-)を生成することから,Fenton様反応がより促進されHO・生成が高まると考えられる.これに対してCu(II)の場合,Cu(II)単独あるいはCu(II)とH2O2により著明なHO・生成がみられたが,DA,L-DOPA添加において著明な,6-OHDAにおいて軽度のHO・生成の抑制が認められた.これはCu(II)がこれらのDA系化合物と配位したためと考えられる.6-OHDAはHO・生成を促進することから,配位に基づく抑制効果が相殺され軽度にとどまったと推測される.2. DA系培養神経細胞(B65)のスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD),グルタチオン(GSH)活性に対する遷移金属,DA,6-OHDA,H2O2の影響:Cu(II),6-OHDA,H2O2の添加によりB65細胞の生存率が濃度依存的に減少することを昨年報告したが,本年はその場合のSOD,GSH活性の変化を検討した.
一部のシアノバクテリアにおける澱粉性貯蔵多糖の生産メカニズム

光合成微生物シアノバクテリアの一部の種が、グリコーゲンではなく植物の澱粉に類似した貯蔵多糖を生産する仕組みを解明するため、本研究を行った。二種の澱粉生産株についてゲノム配列を決定し、澱粉性多糖生産能は、複数(2-3個)の枝作り酵素アイソザイムの協調的発現と強く相関することを見出した。グリコーゲン生産性シアノバクテリア株における、澱粉代謝関連異種遺伝子の発現系を構築した。無機栄養欠乏時に澱粉性多糖生産を促進する条件を見出した。また、組換え型枝作り酵素の特性解析を行い、1型、2型酵素は短い糖鎖を転移し、一方、3型は活性が低く短い糖鎖とともに長い糖鎖をも転移し得ることを見出した。シアノバクテリアの多くは貯蔵多糖としてグリコーゲンを蓄積する。ところがごく一部の種では、植物の澱粉成分であるアミロペクチンと類似した不溶性の分岐多糖を生産することが明らかになった。各種シアノバクテリアのゲノム配列を比較すると、グリコーゲン産生型のシアノバクテリアには枝作り酵素(α-1,6-結合形成酵素)が唯一つしか存在しないのに対し、これまでに見出されたアミロペクチン産生株にはいずれも酵素遺伝子が3種存在することが分かった。近年、アミロペクチン産生株と近縁のシアノテーセ(Cyanothece)5種のゲノム配列が報告され、そのうち4種については枝作り酵素を2つ持つことが明らかとなった。そこでこれらPCC 7424、PCC 7822、PCC 8801、PCC 8802について、貯蔵多糖の分子形態を解析した。貯蔵多糖の鎖長分布パターンから、PCC 7424、PCC 7822株はグリコーゲン、PCC 8801、PCC 8802株はアミロペクチン型の多糖を生産することが見出された。PCC 7424の精製貯蔵多糖は、分子サイズがウサギ肝臓由来のグリコーゲンと同等であった。PCC 8802の貯蔵多糖は、アミロペクチンと同等でグリコーゲンよりも大きな分子サイズであり、グリコーゲンにはない糊化特性、A形の結晶性など特異な性質が見られた。活性染色法により、PCC 7424では2者の枝作り酵素のうち一方(1型)のみが高レベルで発現していること、PCC 8802では2者の酵素が同等なレベルで発現していることが明らかとなった。従ってアミロペクチン型多糖の生産には、複数の枝作り酵素が適正なバランスで発現していることが必要であると考えられた。本研究では、一部のシアノバクテリア(Cyanothece、Cyanobacterium属の一部の種)が澱粉性貯蔵多糖を生産する事実に着目し、近縁種が生産するグリコーゲンではなく、植物の澱粉に酷似した高分子が如何にして生成するか、その機構解明を目指している。平成26年度は、次に示す3点について新知見が得られた。これまでに見出された澱粉生産性シアノバクテリアは、複数の枝作り酵素遺伝子を保持している。このことを指標として、ゲノムデータベースを検索し、新規澱粉生産種候補としてCyanobacterium aponinum PCC 10605株を見出した。同株を系統保存施設Pasteur Culture Collectionから入手し、貯蔵多糖の鎖長分布が澱粉性の特徴を示すことを実証した。同株は染色体、およびプラスミド上に窒素固定遺伝子群を保持していないことから、非窒素固定性、澱粉生産種の初の例となった。イネBEIおよびBEIIb遺伝子を導入したシアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942形質転換株を作製し、共発現の効果を検証した。各遺伝子を単独で導入した株と比較して、二重形質転換株では貯蔵多糖中の長鎖成分の比率が増大した。導入した遺伝子に関して、今後はプロモータを増強するなど、発現レベルの向上を目指すことを計画している。一部のシアノバクテリアは、グリコーゲンではなく、澱粉性の貯蔵多糖を生産する.その原因遺伝子として同定された、Cyanobacterium sp. CLg1株由来GlgX2遺伝子を、前年度にSynechocystis sp. PCC 6803株(グリコーゲン生産株)に導入した。この形質転換株における貯蔵多糖構造を解析した結果、ピーク鎖長はDP = 6に認められ、親株(野生株)と同様のグリコーゲンであった。すなわち、この事例においては、単一の酵素遺伝子を発現させたのみでは、貯蔵多糖構造の変換は達成できないことが示された。澱粉生産性シアノバクテリアとして窒素固定能を持つCyanothece sp. 8802、および窒素固定能を持たない株として前年度、本研究により新規に見出されたCyanobacterium sp. 10605について、栄養欠乏条件下(窒素、鉄、二酸化炭素)で培養を行い、多糖蓄積量の消長を調べた。窒素、鉄欠乏条件では一過的な澱粉蓄積の促進、二酸化炭素欠乏条件では澱粉合成の停止と蓄積量の漸減が認められ、これら現象は窒素固定能の有無に拠らないことが見出された。シアノバクテリアにおける澱粉合成系の再構築を目指し、イネ由来澱粉合成酵素(SSI)、枝作り酵素(BEI)遺伝子をシアノバクテリアSynechococcus sp. PCC 7942株(対応する内在遺伝子を欠損した変異株)に導入した。

SSI、BEI遺伝子の共存下、SSIの発現が認められず、一方BEIの発現が(BEIを単独で導入した場合と比較して)促進される現象が認められた。今後、遺伝子の導入法(プラスミドあるいは染色体への挿入)を変更することにより、両遺伝子の発現レベルの向上を試みる計画である。光合成微生物シアノバクテリアの一部の種が、グリコーゲンではなく植物の澱粉に類似した貯蔵多糖を生産する仕組みを解明するため、本研究を行った。二種の澱粉生産株についてゲノム配列を決定し、澱粉性多糖生産能は、複数(2-3個)の枝作り酵素アイソザイムの協調的発現と強く相関することを見出した。グリコーゲン生産性シアノバクテリア株における、澱粉代謝関連異種遺伝子の発現系を構築した。無機栄養欠乏時に澱粉性多糖生産を促進する条件を見出した。また、組換え型枝作り酵素の特性解析を行い、1型、2型酵素は短い糖鎖を転移し、一方、3型は活性が低く短い糖鎖とともに長い糖鎖をも転移し得ることを見出した。本研究においては、原核光合成生物であるシアノバクテリアの一部の種が、グリコーゲンではなく、澱粉様多糖を生産する能力に着目し、その要因(機構)解明を目指している。平成26年度には、澱粉性多糖を生産するシアノバクテリアとして、新たにCyanobacterium sp. PCC 10605株を同定した。ゲノム情報に基づいて予測を行い、これを生化学的に実証できたことから、澱粉生産性シアノバクテリアの系統内分布と多様性に関する知見が深化したと言える。遺伝学的手法により、Cyanobacterium sp. CLg1株において澱粉生産を担う遺伝子glgX2を同定したので(共同研究)、平成26年度は本遺伝子をモデルシアノバクテリア株(Synechocystis sp. PCC 6803)に導入して形質転換株を作製した。すなわち、異種シアノバクテリア由来、澱粉代謝酵素の解析基盤が構築できたと考えられる。また、イネ由来澱粉合成代謝遺伝子のシアノバクテリアにおける機能発現系も着々とできあがりつつあり、今後、植物とシアノバクテリアにおける多糖生産機構を比較解析していく上での環境整備が進行している。以上のことから、研究目的にかなった成果が順調に得られていると考えられる。植物生理学シアノバクテリアにおける澱粉様多糖合成機構の解明、および異種生物由来遺伝子の発現による多糖構造の改変を目指して、以下の項目の解析を行う。イネ由来澱粉代謝酵素の共発現系構築の一環として、澱粉合成酵素(SS I)および枝作り酵素(BE)遺伝子をSynechococcus elongatus PCC 7942株に導入する。これまで試験管内で認められた両酵素の相互作用をシアノバクテリア生体内で再現する試みを通じて、多糖構造改変技術の基盤を構築する。これまでの研究(共同研究)を通じてCyanobacterium sp. CLg1株の枝切り酵素遺伝子glgX2が澱粉性貯蔵多糖の生産に重要な役割を果たしていることを明らかにした。同酵素の遺伝子を染色体上に挿入した、Synechocystis sp. PCC 6803形質転換株が、平成26年度に構築できたため、同株の生育特性、多糖代謝特性、貯蔵多糖構造を解析する。一部のシアノバクテリアは、アミロペクチンに類似した貯蔵多糖生産能力を持つ点で極めて特異である。本研究では多糖代謝酵素の中でも特に枝作り酵素遺伝子の数に着目し、貯蔵多糖の分子形態との間に相関性が認められるか検証を行った。
食品卸等によるスーパー配送業務の一括受託と青果物流通への影響に関する研究

1中国寿光市場の分析本年度は昨年度からの継続課題として、中国寿光市場の分析を行い、論文化した。2ポーランド・ヴィエルコポルスカ市場の調査研究同じく昨年度からの継続課題とし紙ヴィエルコポルスカ市場の調査研究を行った。昨年度との調査内容の齟齬があり、論文取りまとめには至らなかったが、西欧外資系量販店への販売対応は、交渉力の限界から利益の確保しにくい状況にあることが明らかになった。3国内大手量販店の調達・販売戦略に関する調査研究残留農薬事件、無登録農薬事件等を経て、日本の大手量販店各社が、どのような仕入れ・販売戦略を再構築しつつあるのかについて、調査研究を実施した。まもなく原稿作成、投稿の予定である。4中国の対日輸出向け野菜加工企業に関する分析残留農薬事件以降、中国産加工野菜に対する信頼性が大きく揺らぐ中で、当地の加工企業がどのような対応を採っているのかについて、調査研究を実施した。今後継続的に調査研究を展開していくつもりである。本年度は特に海外調査を中心に展開した。具体的には中国の代表的な産地市場である山東省寿光市場について、他の科研費調査を合わせて計3回の調査を実施し、中国における青果物流通の近年の変化について分析を進めた。その結果、次の諸点が明らかになった。すなわち、(1)中国国内において青果物の広域流通が大きく進展していること、(2)その中で寿光市場も地場産野菜のみを扱う純粋な産地市場から、全国の産地から集荷し再び全国へと再転送する集散市場へとその性格を変化させていること、(3)地場野菜の集荷については、かつて寿光市場の「衛星市場」と呼ばれた郷鎮営の市場群が産地市場として大きく成長し、寿光市場に代わって中心的な役割を果たすようになってきたこと、(4)寿光市場のこうした機能変化のなかで、同市場内で移出商の依頼を受けて出荷者との取引を仲介していた取引代理人も、地場産野菜を求めて郷鎮営の諸市場に活動領域を広げつつあること、等である。また、ポーランドにおける卸売市場の研究を行い、量販店が西欧から進出して零細な小売店が打撃を受ける中、ロジスティクス部を設置し、生産者への技術指導などを実施しながら量販店への配送を円滑化し、取扱高を維持、拡大している事例(ヴィエルコポルスカ市場、ポズナン市)を分析した。
アミノ酸-mTOR経路構成因子の同定と解析

前年度に引き続き、TORC1活性制御に関わる新規分子の同定に向けて、TPCKの標的分子として得られたDLATの解析をおこなった。DLATの過剰発現やノックダウンにより、TPCKによるmTORC1阻害能が変化するかを、S6Kリン酸化や4EBP1のリン酸化について調べたが、ほとんど影響を示さなかった。また、DLATの発現量自体もTORC1活性にほとんど影響を示さなかった。このことは、DLAT以外の分子をTPCKが標的にしてmTORC1活性に影響を及ぼす可能性を示唆するが、DLAT以外の候補分子は現在のところ不明である。前年度までに行った酵母での遺伝学的スクリーニングから得られた分子Pbp1について、TORC1活性制御への関連を調べた。Pbp1の過剰発現は、様々な栄養源に対して一般にTORC1活性抑制能を示すことがわかった。Pbp1過剰発現はTORC1の複合体形成に影響を与えなかったため、TORC1活性自体あるいは細胞内の局在に影響を与えている可能性か考えられた。Pbp1過剰発現時のTORC1の細胞内局在を観察したところ、興味深いことにPbp1過剰発現により細胞質foci形成していた。Pbp1はグルコース飢餓などのストレス下でmRNAの翻訳の停止に依存して形成されるfoci(stress granule)の構成成分の1つと考えられているが、TORC1はPbp1 fociと共局在していた。このことは、Pbp1過剰発現によるfoci形成がTORC1活性化阻害に寄与することを示唆する。さらに、生理的な条件下でのPbp1とTORC1との共局在を調べると、グルコース飢餓に伴いTORC1の一部分がstress granuleと共局在した。また、グルコース飢餓時のStress granule形成が妨げられるpub1破壊株でのTORC1活性化への影響を調べると、グルコース刺激後のTORC1の活性化が早く起こっていた。これらのことから、グルコース飢餓下でTORC1がstress granulesヘリクルートされることにより、グルコース刺激後のTORC1活性化を一時的に遅らせていると考えられた。このような一時的な抑制は細胞のストレス応答にとってなんらかの意義があると推測しており、今後TORC1活性制御における新たな視点をもたらす可能性がある。1.mTOR活性化阻害作用を有する試薬TPCKを用いた構成因子の同定TPCKが既知mTOR経路上のどの辺りに作用しているかを調べるために、mTOR活性化因子Rheb過剰発現および酸化剤PAO(Phenylarsine Oxide)用いた解析を行った。これらはいずれもアミノ酸量とは無関係にmTORC1活性を上昇させることが知られているが、TPCKはこれらによるmTORC1活性化を阻害したことから、TPCKの作用点はmTORC1であると考えられた。次に蛍光標識されたTPCKを用いて、mTORC1に含まれる構成因子のうちのいずれかにTPCKが結合するかについて検討した結果、候補としてmTORの可能性が考えられた。TPCKとmTORとの共有結合の可能性を、質量分析によりさらに検討しmTOR内の2ヵ所にTPCKが結合している可能性が得られた。2.酵母での活性亢進型TORを利用した遺伝学的スクリーニングによる活性制御因子の同定酵母TORC1の不活性因子の同定を目指して、遺伝学的スクリーニングを行った。約30万クローンのスクリーニングから、生育を回復させた候補として4つのcDNAクローンを得た。最近報告されたTORC1基質であるSch9に対するリン酸化抗体を作製し、TORC1不活性化状態であるRapamycin添加や窒素源飢餓に伴い、Sch9が速やかに脱リン酸化されることを見いだした。これは今後、酵母でTORC1活性を知る上で有益なツールとなる。スクリーニングで得られたcDNAクローンのうち1つがその過剰発現時にSch9のリン酸化低下をもたらした。この遺伝子産物は機能未知であり、ほ乳類には保存されていない。しかしながら、この機能未知遺伝子産物がどのようにして酵母TORC1経路を負に制御しているか興味深いため、今後、酵母においてさらに解析を進めていく予定である。前年度に同定したmTORのTPCK修飾候補部位について解析を進めた。同定されたアミノ酸残基をそれぞれAlaあるいはPheに置換したmTOR変異体を作製し、これらを導入した細胞でS6キナーゼのリン酸化がTPCK耐性を示すかを検討した。しかしながら、これらの変異体においてもTPCK耐性を示さなかった。そこで、mTORC1免疫沈降物にTPCK化されている分子が含まれているかを検討するために、抗TPCK抗体を作製し調べたところ、約70kDaの分子がTPCK化されていることがわかった。質量分析計を用いてこの分子を同定したところ、pyruvate dehydrogenase complex E2component(PDC-E2)であった。PDC-E2はピルビン酸からアセチルCoAを作る解糖系の酵素のサブユニットの1つである。代謝系酵素とmTORC1との間の直接の結合はmTORC1が栄養源シグナル伝達を担う中枢の分子であることからも興味深い。酵母TORC1の負の制御因子の同定を目指して、新たな遺伝学的スクリーニングを行った。酵母ゲノムライブラリーの導入により、遺伝子産物の過剰発現時に生育を回復させるクローンの取得を行った。得られた9つの遺伝子産物過剰発現時のTORC1活性への影響を調べたところ、そのうちの1つPBP1を過剰発現した場合に窒素源刺激後のTORC1活性化が有意に低下していた。しかし、グルコースによるTORC1活性化は抑制しなかった。

これらのことから、Pbp1過剰発現によるTORC1活性化阻害は窒素源の感知からTORC1活性化に至る過程に特異的であることが考えられた。Pbp1の哺乳類ホモログであるataxin-2過剰発現においてもアミノ酸刺激によるmTORC1活性低下がみられており、この阻害作用は保存されており、これらの分子のTORC1経路への重要性が示唆される。前年度に引き続き、TORC1活性制御に関わる新規分子の同定に向けて、TPCKの標的分子として得られたDLATの解析をおこなった。DLATの過剰発現やノックダウンにより、TPCKによるmTORC1阻害能が変化するかを、S6Kリン酸化や4EBP1のリン酸化について調べたが、ほとんど影響を示さなかった。また、DLATの発現量自体もTORC1活性にほとんど影響を示さなかった。このことは、DLAT以外の分子をTPCKが標的にしてmTORC1活性に影響を及ぼす可能性を示唆するが、DLAT以外の候補分子は現在のところ不明である。前年度までに行った酵母での遺伝学的スクリーニングから得られた分子Pbp1について、TORC1活性制御への関連を調べた。Pbp1の過剰発現は、様々な栄養源に対して一般にTORC1活性抑制能を示すことがわかった。Pbp1過剰発現はTORC1の複合体形成に影響を与えなかったため、TORC1活性自体あるいは細胞内の局在に影響を与えている可能性か考えられた。Pbp1過剰発現時のTORC1の細胞内局在を観察したところ、興味深いことにPbp1過剰発現により細胞質foci形成していた。Pbp1はグルコース飢餓などのストレス下でmRNAの翻訳の停止に依存して形成されるfoci(stress granule)の構成成分の1つと考えられているが、TORC1はPbp1 fociと共局在していた。このことは、Pbp1過剰発現によるfoci形成がTORC1活性化阻害に寄与することを示唆する。さらに、生理的な条件下でのPbp1とTORC1との共局在を調べると、グルコース飢餓に伴いTORC1の一部分がstress granuleと共局在した。また、グルコース飢餓時のStress granule形成が妨げられるpub1破壊株でのTORC1活性化への影響を調べると、グルコース刺激後のTORC1の活性化が早く起こっていた。これらのことから、グルコース飢餓下でTORC1がstress granulesヘリクルートされることにより、グルコース刺激後のTORC1活性化を一時的に遅らせていると考えられた。このような一時的な抑制は細胞のストレス応答にとってなんらかの意義があると推測しており、今後TORC1活性制御における新たな視点をもたらす可能性がある。
クロロフィル,ヘムをモデルとする非対称分子骨格を有するフタロシアニン類縁体の合成

1.難溶性フタロシアニンの合成原料である1,2ージシアノベンゼン(1)と、可溶性テトラピラジノポルフィラジン(2)の合成原料である5,6ージトリデシルー2,3ージシアノピラジン(3)を同時に用い、エタノ-ル中、DBUの存在下で還流した。原料(3)と(1)のモル比を変化させたところ、1:4.7のときに、ピラジン環を1個含む非対称フタロシアニン類縁体(4)が最大収率12%で得られた。また、原料(3)のアルキル基をウンデシル基とすると、(4)の固族体(5)が9%の収率で得られた。2.上記2種の反応においては、ピラジン環を2個以上含むフタロシアニン類縁体の生成はほとんど認められなかった。これは、原料(1)に比較して、(3)の反応性が低いと考えると解釈できる。分子軌道法計質による電子密度の考察もこの考え方を支持した。3.原料(3)のかわりに、2,3ーボルナノ〔2,3ーb〕ピラジンジカルボニトリル(6)を用い、(6)と(1)のモル比1:19で反応させると、ピラジン環を2個含むフタロシアニン類縁体(7)が収率3%で得られた。4.可溶性フタロシアニン(8)の合成原料である4,5ージヘプチルー1,2ージシアノベンゼン(9)と,難溶性テトラピラジノポルフィラジンの合成原料である2,3ージシアノピラジン(10)をモル比1:79で反応させると、ピラジン環を3個含む非対称フタロシアニン類縁体(11)が低収率ながら得られた。5.合成した新規フタロシアニン類縁体(4),(5),(7),(11)の諸物性を比較した。なかでも、非対称体(4),(5)は、対称型類縁体(2),(8)のと比較して、きわめて高い溶解度を示すという特徴があり、クロロフィルやヘムの機能との関連が示唆された。
eラーニングに適した思考を促す学習指導モデルの開発とその実践適用

eラーニングの学習形態が求める考え方が身についていない学生は,eラーニングコースをドロップアウトする傾向が高い.本研究課題ではeラーニングで成果を挙げている優良な学習者の受講中の思考行為を分析することで,eラーニングに適した思考を促す学習行為指導モデルの開発を目的とする.eラーニングに適した思考を促す学習行為指導モデルは,優良な学習者が学習内容の理解を深めるための典型的な振舞いを体現させる教示ルールである.それをeラーニングが不得意な学習者に適用することで,eラーニングへの満足度とドロップアウト率の低下が期待される.eラーニングの学習形態が求める考え方が身についていない学生は,eラーニングコースをドロップアウトする傾向が高い.本研究課題ではeラーニングで成果を挙げている優良な学習者の受講中の思考行為を分析することで,eラーニングに適した思考を促す学習行為指導モデルの開発を目的とする.eラーニングに適した思考を促す学習行為指導モデルは,優良な学習者が学習内容の理解を深めるための典型的な振舞いを体現させる教示ルールである.それをeラーニングが不得意な学習者に適用することで,eラーニングへの満足度とドロップアウト率の低下が期待される.
ハミルトン・ヤコビ・ベルマン方程式に対する漸近問題の確率論的研究

本年度は,時間発展を持つ1階および2階のハミルトン・ヤコビ・ベルマン(HJB)方程式に対する解の長時間挙動を研究した.1階のハミルトン・ヤコビ方程式に関しては,石井仁司氏(早稲田大学)との共同研究において,方程式の解が漸近解と呼ばれる一種の定常状態へ収束するための十分条件を,ハミルトニアンが凸かつ強圧的な場合について考察した.具体的には,ハミルトニアンの凸性に基づく解の変分公式,ないしは最適制御問題を用いた解釈を積極的に用いることにより,解の長時間挙動に関する詳細な情報を,背後にある力学系的な性質を見ることで解析した.これにより,既存の結果のほぼすべてが我々の結果の特別な例として捉えられるだけでなく,従来扱うことの出来なかったいくつかのケースについても,新しい結果を得ることができた.一方,2階のHJB方程式に対する漸近問題については,1階の方程式と類似の性質を持つ反面,方程式の性質としては異なるところも多い.従って,既存の結果をもとに,1階の方程式で行った議論がどこまで通用するのかを検討した.その際,この分野の専門家であるAcademia SinicaのS.J.Sheu教授を訪問し,1階の方程式との関連性に関して有益な議論することができた.これにより,2階のHJB方程式に関する研究を発展させていくための一定の方向性を得ることができた.これらの成果は,下記の雑誌論文において公表され,国内外のセミナー・研究集会においても口頭発表された(研究発表欄参照).本年度は,時聞発展を持つ1階のハミルトン・ヤコビ方程式に対する解の長時間挙動を研究した.特に,石井仁司教授(早稲田大学)との共同研究において,ハミルトニアンが概周期性などの弱い周期性を持つ場合も込めた漸近問題についていくつかの結果を得た.周期性よりも弱い「半周期性」を持つ場合は,昨年度以前の同教授との共同研究により既に調べられていたが,「概周期性」はこれよりも弱い概念である.この問題に対するアプローチとして,解に対する最適制御問題(あるいは変分問題)による表現公式を採用した.この変分公式を用いることで,考えているハミルトン・ヤコビ方程式の解の長時間挙動,特に解が定常状態へ収束するメカニズムを,対応する最適制御問題の性質から明らかにすることができた.その結果,周期性よりも弱い「概周期的」なハミルトニアンを持つハミルトン・ヤコビ方程式の解の長時間挙動も考察の対象とすることができるようになった.これは,ハミルトニアンにランダムネスを含む揚合の解の長時間挙動を調べるための足掛かりとして期待できる結果である.また,ハミルトニアンに周期性が全くない場合でも,ハミルトニアンおよび初期関数がある特別な形状を持つ場合には解が定常状態へ収束することを証明した.さらに,空間次元が1次元の場合には,一般次元の場合より弱い仮定の下で強い結果が得られることを示した.以上の結果を総合して,既存ないし最新の結果をある程度統一的な枠組みでとらえることができた.本年度得られた結果は,国内外のセミナーおよび研究集会において報告された.また,国内外の研究者を訪問あるいは招へいし,上記の問題に関連するいくつかの話題についても議論した.本年度は,時間発展を持つ1階および2階のハミルトン・ヤコビ・ベルマン(HJB)方程式に対する解の長時間挙動を研究した.1階のハミルトン・ヤコビ方程式に関しては,石井仁司氏(早稲田大学)との共同研究において,方程式の解が漸近解と呼ばれる一種の定常状態へ収束するための十分条件を,ハミルトニアンが凸かつ強圧的な場合について考察した.具体的には,ハミルトニアンの凸性に基づく解の変分公式,ないしは最適制御問題を用いた解釈を積極的に用いることにより,解の長時間挙動に関する詳細な情報を,背後にある力学系的な性質を見ることで解析した.これにより,既存の結果のほぼすべてが我々の結果の特別な例として捉えられるだけでなく,従来扱うことの出来なかったいくつかのケースについても,新しい結果を得ることができた.一方,2階のHJB方程式に対する漸近問題については,1階の方程式と類似の性質を持つ反面,方程式の性質としては異なるところも多い.従って,既存の結果をもとに,1階の方程式で行った議論がどこまで通用するのかを検討した.その際,この分野の専門家であるAcademia SinicaのS.J.Sheu教授を訪問し,1階の方程式との関連性に関して有益な議論することができた.これにより,2階のHJB方程式に関する研究を発展させていくための一定の方向性を得ることができた.これらの成果は,下記の雑誌論文において公表され,国内外のセミナー・研究集会においても口頭発表された(研究発表欄参照).
染色体倍加に伴う慢性的な中心体異常の発生原理と細胞不均一性への寄与

過剰数の中心体は腫瘍形成を引き起こす主要な細胞異常であるが、余剰中心体がどのような仕組みで発生し、病態にどう寄与するかは不明である。本研究では、申請者が最近発見した「染色体倍加に伴う慢性的中心体増大および複製亢進現象」の発生原理を解明し、それが腫瘍形成で果たす病理的寄与を理解することを目的とする。細胞イメージングと網羅的遺伝子探索を組み合わせたアプローチで染色体倍加により中心体複製亢進が惹起される分子経路を明らかにし、慢性的中心体異常が細胞不均一性に及ぼす長期的影響を検証する。これにより、一細胞内で起こる中心体制御異常現象と、組織レベルで生じる細胞不均一性の間の因果関係と作用原理を解明する。
機能性膜タンパク質搭載細胞外ベシクルの設計とＤＤＳ応用

あらゆる細胞は、脂質膜で囲まれたナノサイズの小胞を細胞外へ分泌している。これらは細胞外ベシクル(EV)と総称され、細胞間の情報・物質輸送の役割を担っていることが近年明らかとなった。EVは高い物質輸送能および生体適合性を有するためドラッグデリバリーシステム(DDS)における薬剤運搬キャリアとしての応用が期待されているが、標的指向性の制御や内部への薬剤導入など様々な問題点が残されているのが現状である。そこで本研究では、EV膜上へ膜タンパク質を提示することによる機能化を図り、核酸医薬品などのバイオ医薬品を運搬する新規DDSキャリアの開発を行っている。
脳磁図(MEG)による自閉スペクトラム症の反復常同性とその制御機構の解明

画像刺激提示ソフト「Presentation」を用い、被検者に選好刺激(被検者の好むものの画像)および非選好刺激(被検者の興味のない画像)さらにコントロールとしてのベースライン刺激(何か分からないぼやけた画像)を各20スライド提示し、これらをそれぞれ3ブロック、合計9ブロックの刺激を与える。PresentationからMEG装置へのトリガーアウトプットを出し、選好刺激提示時、非選好刺激提示時、ベースライン刺激提示時の脳磁場の反応をそれぞれ加算平均できるような反復常同性課題プログラムを作成した。さらにそれを画像解析ソフトSPM12を用いて、MRI撮像による位置情報との照合からMNE標準脳上に逆再構成し、経時的に表示できる環境を整えた。現在予備実験として、身内の被検者3名に測定を行っており、解析可能なデータが収集できることを確認している。また、視線キュー(画面に提示されたヒトの顔の視線が動き、左右いずれかの方向を挿す、社会的な意味付けを持つ刺激となる)による方向指示と、矢印キュー(単なる矢印が左右いずれかの方向を挿す、社会的な意味付けを持たない刺激)による方向指示とに対して、指示に従って左右いずれかのターゲットを見たときの脳磁場の反応を測定できるように、赤外線視線追従装置EyeLinkとPresentationとMEG装置を連動させた視線認知課題プログラムを作成した。現在予備実験として身内の被検者2名に測定を行っており、解析可能なデータが収集できることを確認している。今後、これらの課題を用いて被検者(患者群と定型発達群)のMEG測定を行っていく。当初の計画にあった反復常同性課題に加え、視線認知課題プログラムも作成して測定を行える状況を整備したため、実際の被検者の測定が遅れている。残りの1年で被検者への測定およびデータの解析、知見の発表等を行う。また実験系の確立のための予備実験を西新潟中央病院のMEGを用いて行い、MEG測定室の中で使用可能な刺激(映像)提示装置の設置(MEGは生体内神経活動の非常に微弱な電流を感知するために測定室に磁性体を持ち込むことができない)および刺激提示プログラムの開発(Neurobehavioral Systems社のPresentationを使用)、刺激提示時の視線の測定系の設置(同じく非磁性体である必要がありSRResearch社のEyeLinkを使用)、これら実験装置の連動の確認などを行った。これらにより、刺激提示中に被検者の視線をトレースしながらMEGを測定することができるようになり、今後、被検者および健常対照群の測定に進むことができる段階となった。実験系の確立のために時間を要しており、被検者の測定にまだ至っていない。次年度に予定されていた被検者測定数を増やし、対応する。実験系の確立のために時間を要し、被検者の測定を開始出来ていないため、謝金およびMEG・MRI測定費用分が残っている。次年度の被検者測定数を増やして対応する。当初計画されていた反復常同性課題プログラムに加え、視線認知課題プログラムも同時並行して作成したため、被検者の測定が遅れ、被検者測定時にかかる予算の使用が遅れている。次年度に被検者の行い、これを解消する。
成体由来幹細胞の移植による脊髄再生のメカニズム－形態学的究明と新たな動向の推進－

ラットの脊髄に挫滅損傷を与え、損傷後1、2、4週後の3群に分けて、培養骨髄間質細胞の移植を開始した。移植は毎週1回、3週行った。1回目の移植から4週後に固定し、歩行の回復と組織修復を調べた。歩行は、BBBスコアで3群いずれも対照群と有意の差があった。また、3群とも無数の再生神経がアストロサイトの存在しない損傷部位に伸びていた。再生軸索はシュワン細胞に囲まれていた。骨髄単核細胞は骨髄液から分離、培養を経ないで脊髄損傷のラットの髄液に注入した。有意な歩行の回復、組織の修復が見られた。培養脈絡叢上皮細胞は、脊髄損傷部位に直接移植した。細胞は宿主組織に生着し、再生軸索が移植細胞に沿って伸びていた。1細胞移植亜急性(損傷後1-2週)と慢性期(損傷後4週)の脊髄損傷ラットに対して、自家骨髄間質細胞を第4脳室経由で移植した。細胞移植後4週まで観察した。亜急性期および慢性期の何れの場合も効果はあることを確認した。移植群では、歩行運動はBBBスコアで10-12ポイントまで回復したが、対照群では0-6の範囲に留まった。再生軸索の伸長が明らかで、損傷部を頭尾方向に伸びて橋渡ししていた。これらの軸索はシュワン細胞に囲まれており、その周囲は、コラーゲン線維を含む結合組織マトリックスであった。この領域にはアストロサイトは入っていなかった。2骨髄間質細胞の分泌する有効性分の同定骨髄間質細胞の培養上清を、ゲル〓過にかけて、さらに種々のカラムを使って分離した。得られた分画を、生後1日ラット脳から分離した培養海馬ニューロンに加えて、海馬ニューロンの生存と突起伸長作用をアッセイしている。これまでの実験で、有効分画はかなり限局されつつある。特定な因子の同定に向けて実験中である。3リハビリテーションの効果リハビリテーションの効果は、上と同じように脊髄を損傷させたラットに、トレッドミルによる歩行訓練を行わせる方法で調べている。これまで、3回のシリーズの実験を行った。1回の実験でラットを約20匹使用した。トレッドミル訓練によって、対照群との間に、回復の程度およびその早さに差を見いだしている。ただ、脊髄損傷したラットが飼育中に死にやすいことから、統計に必要なラットの匹数を得るのに時間がかかっている。(1)骨髄間質細胞を脊髄損傷後、1,2週(亜急性期)及び4週(慢性期)のラットに毎週1回、3週間脳室経由で投与した。投与骨髄間質細胞は1ー2週間で宿主脊髄から消失したが、歩行回復効果は明らかであった。骨髄間質細胞が液性因子を出して効果を発揮していること、慢性期でも有効であることを示した。この成果はPlosONEに発表した。また培養過程を経ない骨髄間質細胞の髄液経由移植の効果を調べた。(2)骨髄間質細胞の分泌する有効因子の同定を進め、分子量の範囲、分子の特性などを解明してきた。まだ最終的な同定には至っていないが精力的に進めている。(3)脈絡叢上皮細胞は培養して脊髄損傷部に移植し、生存することを確認した。1細胞移植:骨髄間質細胞の髄液内投与を、脊髄損傷1週後、2週後(両者とも亜急性損傷)、4週後(慢性損傷)から開始し、3回(毎週1回)まで注入して、脊髄損傷の治療効果を調べている。その結果、亜急性損傷、慢性損傷のいずれにおいても、移植群ではBBBスコアが10ー12ポイントに回復したが、対照群では0ー6の範囲に留まった。脊髄損傷部における再生軸索の伸張、組織的な修復、グリア細胞の増殖・遊走などについて調べた。これらを論文に纏めて投稿中である。論文は、現在、細かい点について改訂を要求されている。再投稿の準備をしている。2骨髄間質細胞の分泌する有効成分の同定:骨髄間細胞の培養上清の中に含まれる(骨髄間質細胞から分泌される)因子で、ニューロンの生存と突起伸張を促進させる分子の探索を続けている。培養液を種々のカラムにかけて分離し、それぞれの分画について、生後1日のラット海馬から培養したニューロンをアッセイ系に用いて、その効果を調べている。分子量のレベル、分子の成分などについてかなり限局されてきた。本年度中には同定されるものと期待している。3リハビリテーションの効果:脊髄損傷のラットに対して、トレッドミルによる訓練を施してその効果を調べた。後肢の足底を接地させる歩行訓練が脊髄損傷の治療には有効であることが分かった。

論文を投稿して、現在改訂中である。4有効成分のin vivoにおける判定:骨髄間質細胞の培養液、またはその分画成分を、血液経由あるいは髄液経由で注入して、ラットにおける脊髄損傷の治療効果を調べている。今のところ、血液経由では効果はないが、髄液経由では効果があるという結果を得ている。将来、分離した有効因子の効果を同じ方法で調べ、判定を行う。1亜急性および慢性期の脊髄損傷に対する骨髄間質細胞の移植効果が確かめられ、論文として投稿中である。2骨髄間質細胞培養上清の有効成分の分離は、精力的に行っているが、カラムへの吸着性が低く、手間取っている。3脊髄損傷ラットに対するリハビリテーションの効果の検定はかなり進んだが、ラットが死にやすく、まだ十分なラットの匹数が得られていない。また、BBB以外に有効な歩行の判定方法を模索している。25年度が最終年度であるため、記入しない。1亜急性、慢性期の脊髄損傷に対する骨髄間質細胞の移植の効果は明らかになり、長い時間がかかったが、論文が近いうちに発表されることを期待している。2骨髄間質細胞から分泌される有効因子の分離は、古典的な方法しかなく、手間取っている。毎週アッセイをして、ようやくマススペクトロメトリーで検索できる迄になっている。本年度中には同定されることを期待している。3リハビリテーションの効果については、次の段階として、細胞移植したラットに対する効果を調べるべきである。現在、その実験について計画中である。4骨髄間質細胞培養上清から近い将来分離される有効因子を髄液中に注入して、その有効性を確かめる。1骨髄間質細胞の培養上清内に含まれる有効成分の同定は、かなり難しい行程を経なければならないと感じられる。さらにいろいろなカラムを使って分離を試みる。2ラットの生存を高めるために、抗生物質を手術後3日間、1日3回投与する。損傷の方法や程度を調節して、歩行の回復程度が少なく、しかも生存しやすい脊髄損傷の方法を考える。1骨髄間質細胞は、移植された後、生着はしないが効果がある。これは骨髄間質細胞からの液性因子が脊髄損傷部を直接的に、また中枢神経系の特別な部位を間接的に刺激して、そこから出る有効因子によって2次的に脊髄損傷の修復が促進されるのではないかと考えられる。この仮説の下に、脳の特定部位について検索を進める。2骨髄間質細胞と違って、神経系の細胞ならば、移植後に脊髄に生着する可能性がある。そのような神経系細胞と骨髄間質細胞との共移植によって、移植細胞の機能を高められるかどうかを検討する。
ガラスの結晶化を利用した超リチウムイオン伝導性固体電解質の創製と応用

本研究では、70Li_2S・30P_2S_5(mol%)組成をベースとする硫化物系固体電解質の導電率向上に向けて、主に導入する第三成分がガラスセラミックスの母構造にどのような影響を及ぼすかについて検討した。第三成分としては、様々な硫化物を選択した。その結果、硫化物の中でもP_2S_3は少量置換することによって導電率が向上し、得られたガラスセラミックスが室温で5.4×10^<-3>Scm^<-1>の非常に高い室温導電率を示した。ガラスおよびガラスセラミックスの局所構造解析の結果、P_2S_3を置換することによって硫黄欠損を有するLi_7P_3S_<11-z>結晶が析出し、これが高い導電率を示すことが今回のガラスセラミックスの導電率向上につながったと結論づけた。この固体電解質を用いて全固体リチウム二次電池を構築したところ、作動が困難である100°C、10mAcm^<-2>という高温、高電流密度下で電池は良好に作動し、700サイクルの間容量が劣化しないという結果を出した。このように、第三成分を導入することによって、電気的、電気化学的に優れた新規な固体電解質材料の開発に成功した。
ω3脂肪酸の機能性発現に関わる代謝経路についての網羅的解析

エイコタペンタエン酸(EPA)などのω3脂肪酸は、酵素的に代謝されることにより抗炎症効果を発揮する。申請者らのグループではこれまでに、EPAのω3位がエポキシ化された17,18-epoxyeicosatetraenoic acid(17,18-EpETE)およびその二次代謝物を外因的に投与する事により炎症反応が抑制される事を見出している。しかし、これらの代謝物の生成に関わる酵素が明らかになっていなかったため、内因性に産生されるエポキシ化脂肪酸代謝物の生理学的役割は不明であった。そこで本研究ではまず、EPA由来の機能性代謝物17,18-EpETEの生成に関わる酵素を網羅的に同定するために、ゲノムワイドな脂肪酸代謝酵素cDNAライブラリーを用いたin vitroスクリーニングを行った。その結果、110種類の脂肪酸代謝酵素ライブラリーのうち、5種類のシトクロムP450(Cyp)が17,18-EpETEを産生する事を見出した。次に、Cyp欠損マウスを用いた解析を行い、EPAの機能性発現に関わる本代謝経路の寄与についてin vivoでの解析を行った。その結果、Cyp欠損マウスでは野生型に比べ、組織内17,18-EpETE産生の減少が認められた。さらに、Cyp欠損マウスでは時間の経過とともに、皮膚組織における局所的な異常所見(表皮肥厚・炎症性細胞浸潤)や、リンパ節肥大が認められた。Cyp欠損マウスでは乾癬病態マーカーの上昇・IL-23/IL-17 axisの活性化が認められたことから、このマウスでは乾癬様皮膚炎が自然発症することが示唆された。即ち、生体内においてもCypがω3脂肪酸の代謝に寄与しており、そこから生成する機能性代謝物が組織恒常性の維持に関与していることが考えられる。今後、Cyp欠損マウスで認められる表現型とω3脂肪酸代謝系との関係を分子レベルで明らかにしていきたい。エイコサペンタエン酸(EPA)などのω3脂肪酸は、酵素的に機能性代謝物に変換され、抗炎症効果を発揮する。申請者らはこれまでに、ω3位のエポキシ化代謝がこの機能性発現に重要であることを明らかにしてきたが、その生体内における産生経路はわかっていなかった。そこで本研究では、脂肪酸代謝酵素であるシトクロムP450(CYP)ファミリーに着目し、この代謝経路に関わる分子種を同定するとともに、その遺伝子欠損マウスを解析することで、その生理的意義を明らかにすることを目的とした。本年度は下記に示す成果を得た。EPA由来の機能性代謝物であるエポキシ化EPA(17,18-EpETE)の産生経路を明らかにするために、マウス(全102種類)およびヒト(全57種類)のCYP遺伝子ライブラリーを完成した。さらに、このCYP遺伝子ライブラリーを培養細胞に過剰発現し、EPA処理後の培養液に含まれる代謝物のメタボローム解析を行い、EPAから17,18-EpETEを産生するCYP分子種を包括的に同定した。現在、同定したCYP遺伝子の欠損マウスの導入・作製を進めている。また、導入が完了したCYP遺伝子欠損マウスについて生体内での機能解析を行ったところ、野生型マウスに比べ、臓器内での17,18-EpETE産生の減少が認められた。さらに興味深いことに、このCYP欠損マウスでは時間の経過とともに、皮膚組織において局所的な異常所見(表皮肥厚・炎症性細胞浸潤)や、所属リンパ節の肥大が認められた。このことから、生体内においてこのCYPがω3脂肪酸の代謝に寄与しており、そこから生成する機能性代謝物が組織恒常性の維持に関与していることが示唆された。今後、このCYP欠損マウスで認められる表現型とω3脂肪酸代謝系との関係を分子レベルで明らかにしていくとともに、導入・作製中のCYP欠損マウスについても解析を進める予定である。当初の予定どおり、CYP遺伝子ライブラリーの作製と、EPAから17,18-EpETEを産生するCYPの網羅的同定を完了することができた。同定したCYP遺伝子の欠損マウスの作製・導入についても、順調に進めることができている。準備が整い次第、機能解析に進みたいと考えている。

さらに、Cyp欠損マウスでは時間の経過とともに、皮膚組織における局所的な異常所見(表皮肥厚・炎症性細胞浸潤)や、リンパ節肥大が認められた。Cyp欠損マウスでは乾癬病態マーカーの上昇・IL-23/IL-17 axisの活性化が認められたことから、このマウスでは乾癬様皮膚炎が自然発症することが示唆された。即ち、生体内においてもCypがω3脂肪酸の代謝に寄与しており、そこから生成する機能性代謝物が組織恒常性の維持に関与していることが考えられる。今後、Cyp欠損マウスで認められる表現型とω3脂肪酸代謝系との関係を分子レベルで明らかにしていきたい。現在解析中のCYP欠損マウスに関しては、皮膚組織やリンパ節異常の表現型とω3脂肪酸代謝系との関係を分子レベルで明らかにしていきたい。まずは、このCYPの特異的抗体を作製し、組織免疫染色フローサイトメトリーにより発現細胞の特定を行う予定である。すでに候補となる抗体が数種類得られているので、現在バリデーションを進めている。発現細胞を同定したのちに、Cre/loxPシステムによるコンディショナル欠損マウスの作製を行う(既にfloxマウスの準備は完了している)。コンディショナル欠損マウスを用いた解析を行うことにより、この表現系において重要な役割を果たしている細胞を明らかにし、生体恒常性維持における17,18-EpETEの役割を詳細に検討したいと考えている。一方、現在導入・作成中のCYP遺伝子欠損マウスについても上記と同様に、まず生体内でEPAのエポキシ化(17,18-EpETE産生)を触媒するか否かを調べ、野生型マウスとの差が認められた臓器について、定常状態や病態モデルでの表現系解析を行いたいと考えている。