hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SOI構造におけるシリコン結晶薄膜中の欠陥評価

本研究では、SOI(Silicon on Insulator)構造におけるシリコン結晶薄膜の電気的評価技術を確立し,その結晶膜中の欠陥と界面準位の物性を解明することを目的としている。本年度の研究実績の概要な以下の通りである。1.SOSウエハに電流DLTS法を適用して、ブロードな信号が観測された。これらの信号は、容量DLTSでは観測できないことより、SOI構造における欠陥評価に、電流DLTS法が非常に有効であることを示した。ブロードな信号中に見いだせる2つのピークに対して、放出率の温度依存性が求められた。その傾きより、2つのピークに対応する準位は、伝導帯下0.12eVおよび0.33eVと求められた。2.SIMOX(Separation by implanted Oxygen)ウエハについても、電流DLTSを適用した。測定に用いた試料は、酸素イオンをエネルギー180KeV、注入量1.7×10^<18>cm^<-3>で注入したp型ウエハである。薄膜Siの膜厚は128nm、埋め込みSiO_2膜厚は,429nmである。120K付近に、1つのピークが観測された。その準位深さは、価電子帯上、0.15eVに位置する欠陥と同定された。以上のSOIウエハに対する電流DLTSの結果は、SOIウエハの評価技術として有効と考えられる。
亜鉛欠乏が成長ホルモンのIGF-1産生に及ぼす影響-ラット培養肝細胞での検討-

食餌性の亜鉛欠乏ラットを作成し、その成長速度とinsulin-like growthfactor-1(以下IGF-1)濃度との関連、血清亜鉛濃度とIGF-1の関連、各臓器中での亜鉛濃度の検討などをおこなった。4週令Wistar系ラット同一条件下、標準食餌にて5日間飼育した後3群に分けた(Day0とした)。すなわち、標準食餌を自由摂取させたコントロール群(以下C群)、亜鉛欠乏食餌を自由摂取させた亜鉛欠乏群(以下Z群)、標準食餌をZ群の食餌摂取量にあわせて摂取させた低栄養群(以下M群)である。Z群での体重増加は極めて不良であり、Day5の時点でC群:155.8±16.6、M群:141±9.6、Z群:105.8±4.2g(平均±SD)と他の2群に比し有為に低値であった。(P<0.001)体長もDay7でC群:17.8±0.68、M群16.6±0.59、Z群:16.0±0.44cmと有為に低値となった。(p<0.05)また、Z群の食餌摂取量はC群の約55%と低下していた。血清亜鉛濃度(μg/dl)はZ群ではDay21に感度以下(C群:84±7.9)となったが、M群においてもDay0では102±16.2、Day14では57.8±6.7と徐々に低下傾向にあった。血清IGF-1濃度(ng/dl)はC群ではDay14に690.7±174.7と最大値となるが、他の2群ではM群:336.0±116.8,Z群:209.3±125.8と共に低値であり、またZ群がM群よりも低い傾向にあった。成長期であると考えられるDay14において血清亜鉛濃度とIGF-1との間にr^2=0.463の正の相関(P<0.05)を認めた。Day21にC群とZ群について肝、腎、骨格筋、骨の亜鉛濃度を比較したが、骨のみZ群の方が有為に低値であった。以上のように、亜鉛濃度と成長、IGF-1濃度との間に密接な関係があることが明らかになった。一方、Z群では食餌摂取量も減少し低蛋白の影響も無視できない。また、肝臓中の亜鉛濃度には差が見られなかったことより、初代肝細胞培養法を用いたIGF-1mRNAの発現に亜鉛や亜鉛欠乏が及ぼす影響について検討を開始している。【方法】4週令

Wistar系ラットを5日間同一条件下で飼育し、3グループに分け(Day0)、コントロール群(C群:標準食餌を自由摂取)、低栄養群(M群:標準食を亜鉛欠乏群の食餌摂取量に合わせて摂取)、亜鉛欠乏群(Z群:亜鉛欠乏食を自由摂取)とした。体重、体長を記録すると同時にDay0、7、14、21に尾静脈より採血し、ALP(酵素法)、IGF-1(抽出法RIA)、血清亜鉛(原子吸光度法)を測定した。【結果】(数値は平均±SD)〈体重&体長増加〉Z群での体重増加は極めて不良で、Day5の時点でC群:155.8±16.6、M群:141±9.6、Z群:105.8±4.2gと他の2群に比し有意に低値であった。体長もDay7でC群:17.8±0.68、M群:16.6±0.59、Z群:16.0±0.44cmと有意に低値となった。又、亜鉛欠乏群の食餌摂取量はコントロール群の約55%と低下していた。〈血清亜鉛濃度(μg/dl)〉Z群ではDay21に感度以下(C群:84±7.9)となり、M群でもDay0で102±16.2、Day14で57.8±6.7と徐々に低下傾向にあった。〈血清ALP活性(U/I)〉Day7、14の成長期においてZ群では576.7±51.5(C群:965.7±304、M群:911.1±218.5)、464.1±24.9(C群:1092.0±343.2M群:976.0±199.8)と有意に低値であった。〈血清IGF-1濃度(ng/dl)〉C群ではDay14に690.7±174.7とピークとなり、他の2群ではM群:336.0±116.8,Z群:209.3±125.8と共に低値であったが、Z群がM群よりも低い傾向にあった。また、成長期であるDay14において血清亜鉛濃度とIGF-1との間にr_2=0.463の正の相関を認めた。【考案】IGF-1は小児期の成長ホルモンを介しての成長発達に最も重要な役割を担っている。今回の検討で、成長期における亜鉛の重要性がIGF-1関連の成長について確認された。しかし、低栄養群においても血清亜鉛の低下があり亜鉛のみの影響を検討するには低蛋白、低栄養の影響を充分考慮する必要がある。今後初代肝細胞培養系を用い、より詳細な検討を進めていくつもりである。食餌性の亜鉛欠乏ラットを作成し、その成長速度とinsulin-like growthfactor-1 (以下IGF-1)濃度との関連、血清亜鉛濃度とIGF-1の関連、各臓器中での亜鉛濃度の検討などをおこなった。4週令Wistar系ラット同一条件下、標準食餌にて5日間飼育した後3群に分けた(Day0とした)。すなわち、標準食餌を自由摂取させたコントロール群(以下C群)、亜鉛欠乏食餌を自由摂取させた亜鉛欠乏群(以下Z群)、標準食餌をZ群の食餌摂取量にあわせて摂取させた低栄養群(以下M群)である。Z群での体重増加は極めて不良であり、Day5の時点でC群:155.8±16.6、M群:141±9.6、Z群:105.8±4.2g(平均±SD)と他の2群に比し有意に低値であつた。(P<0.001)体長もDay7でC群:17.82±0.68、M群:16.6±0.59、Z群:16.0±0.44cmと有意に低値となった。(P<0.05)また、Z群の食餌摂取量はC群の約55%と低下していた。血清亜鉛濃度(μg/dl)はZ群ではDay21に感度以下(C群:84±7.9)となったが、M群においてもDay0では102±16.2、Day14では57.8±6.7と徐々に低下傾向にあった。血清IGF-1濃度(ng/dl)はC群ではDay14に690.7±174.7と最大値となるが、他の2群ではM群:336.0±116.8, Z群:209.3±125.8と共に低値であり、またZ群がM群よりも低い傾向にあった。成長期であると考えられるDay14において血清亜鉛濃度とIGF-1との間にr^2=0.463の正の相関(P<0.05)を認めた。Day21にC群とZ群とについて肝、腎、骨格筋、骨の亜鉛濃度を比較したが、骨のみZ群の方が有為に低値であった。以上のように、亜鉛濃度と成長、IGF-1濃度との間に密接な関係があることが明らかになった。一方、Z群では食餌摂取量も減少し低蛋白の影響も無視できない。
プロテオーム解析を用いたアンジオテンシンIIによる不全心形成の分子機構の解明

タンパク質発現は翻訳後修飾を受け、ゲノム解析であきらかになった遺伝子がコードする個体レベルの数よりも実際の病態でのタンパク質発現量は何倍も多くなっている。心不全の病態形成が単一の因子で形成されることはないという事実から、遺伝子探索のみでなく不全心で発現変化するタンパク質を網羅的に探索することが大変重要であると考えられる。そこで我々はその研究方法としてプロテオーム解析によるディファレンシャルディスプレーを取り入れた。頻拍誘発性心不全イヌモデルを用いて、その心筋組織でのタンパク質発現を正常心筋と比較し、発現検証、特異的発現タンパク質の同定を行った。2次元ゲル上に約500個のスポットを認め、不全心にて20タンパク質スポットが正常心と比して変化していた。特に発現増加の大きい9スポットについて2DE/MALDI-TOF MSによるプロテオームプロファイリング、質量分析データーベース解析を行った結果、alpha B crystallinやsmall heat shock protein (HSP) 27,HSP20等が不全心にて有意に増加していることを同定した。翻訳後修飾を受けてタンパク質が機能することから、small HSPの重要な修飾過程としてのリン酸化を検討したところ、不全心で増加しているalpha B crystallinやHSP27はリン酸化フォームが増加している事が明らかになった。これらのsmall HSPはリン酸化することで、単に心負荷の急性期の応答タンパクとして発現するのでなく、慢性の心不全形成過程において発現増加し、血行動態や組織学的検討から、アポートシスや心筋拡張障害の病態形成に関与していることが示唆された。心筋でのタンパク質発現は転写時あるいは翻訳後修飾(リン酸化、スプライシング)を受けることから、ゲノム解析であきらかになった遺伝子がコードする個体レベルの数よりも実際の病態でのタンパク質発現量が何倍も多くなっている。特に心不全の病態形成が単一の因子で形成されることはないという事実から、不全心での特異的発現タンパク質の同定、有意に発現変化するタンパク質を網羅的に探索することが大変重要であると考えられる。不全心にて36タンパク質スポットが正常心と比して変化していた。特に発現増加の大きい8スポットについて2DE/MALDI-TOF MSによるプロテオームプロファイリング、質量分析データーベース解析を行った結果、特に抗アポトーシス作用に関連するalpha B-crystallinやsmall heat shock protein 20等が不全心にて有意に増加していることを同定した。心不全形成過程において今まであまり関与が明らかでなかったsmall heat shock protein群が病態形成に重要な働きをしていることが示唆された。この研究成果は第68回日本循環器学術総会にて発表する。心不全の病態形成が単一の因子で形成されることはないという事実から、不全心での特異的発現タンパク質の同定、病態下で発現変化するタンパク質を網羅的に探索することが重要であると考えられる。我々はプロテオーム解析によるディファレンシャルディスプレーを取り入れ、頻拍誘発性心不全イヌモデルを用いて、心筋組織でのタンパク質発現を正常心筋と比較し、特異的発現タンパク質の同定を行った。不全心にて36タンパク質スポットが正常心と比して変化しており、特に発現増加の大きい8スポットについて2DE/MALDI-TOF MSによるプロテオームプロファイリング、質量分析データーベース解析を行った。その結果alpha B-crystallinやsmall heat shock protein (HSP)27、HSP20が不全心にて有意に増加していることを同定した。これらはsmall heat shock protein群に属し、心不全ではnative formではなくalpha B-crystallinに関して言えば、59番目のセリンのリン酸化型、HSP27では47、62番目のセリンのリン酸化型が心不全で有意に増加していた。転写後リン酸化修飾を受けることで、small HSPは抗アポトーシス作用等の心保護作用を発揮すると考えられ、心不全の病態形成に重要な働きをしていることが示唆された。この研究成果は第69回日本循環器学術総会にて発表した。
カロテノイド生合成制御機構の解明とそれを応用した新花色花きの創出

花の色は、豊富にあるように思うが、それぞれの品目についてみてみると、色の幅は限られている。新しい花色花きは、商品価値を高めるため、その創出は大きな目標となっている。鮮やかな黄色の花色発現は主にカロテノイドが、緑色はクロロフィルが担っている。カロテノイドとクロロフィルは、多くのステップを経て生合成されることがわかっているが、その制御機構はほとんど明らかになっていない。多くの植物において、早期のつぼみは黄緑色を呈しており、少量ながらクロロフィルとカロテノイドが蓄積している。花弁の成長・開花に伴って、それらは分解されて、それぞれの花弁の色へと変換される。つぼみの段階で蓄積しているカロテノイドは、鮮やかな黄花に蓄積しているようなエステル体ではなく、葉と同じ組成のカロテノイドが遊離の状態(葉タイプのカロテノイド)で葉緑体に存在している。このつぼみの黄緑色を、開花時まで延長することが出来れば、これまでにない新花色花きの創出につながると考えた。当初予定していた、カロテノイド生合成酵素遺伝子群だけでなく、カロテノイド分解関連遺伝子、クロロフィル性合成酵素遺伝子群及びクロロフィル分解関連遺伝子群について、その発現を制御する転写因子の探索を行った。最終年度では、シロイヌナズナに置いてクロロフィル代謝を制御している転写因子が、異種植物であるペチュニアにおいても機能を発揮すること、花器官においても機能することを示した。また、カロテノイド代謝関連遺伝子群の発現を制御する転写因子の同定にも成功し、その転写因子を過剰発現させることで、花弁にカロテノイドを多く蓄積することを明らかにした。本研究では、花弁にクロロフィル及びカロテノイド代謝を制御する転写因子を導入することにより、花色改変が可能であることを示した。28年度が最終年度であるため、記入しない。花の色は豊富にあるように思うが、それぞれの品目についてみると色の幅は限られている。黄色のアサガオは、「幻のアサガオ」と位置付けられ、江戸時代からその育種は試みられているが、未だに成功していない。また、シロイヌナズナのように、非常に多くの変異体が存在する植物でも、黄色の花は作出されておらず、従来の育種や単独の遺伝子の変異では、黄花の作出は難しいと考えられる。鮮やかな黄色の花色発現は、主にカロテノイドが担っており、カロテノイドは多くのステップを経て生合成されるが、その制御機構はほとんど明らかになっていない。本研究では、複数のカロテノイド生合成酵素遺伝子の発現を制御する転写因子を同定し、カロテノイド蓄積量を制御することで、高付加価値のある新花色花きを創出する。植物体に蓄積するカロテノイド量を制御する鍵酵素として報告されているphytoene synthase (PSY), phytoene desaturase (PDS), ζ-carotene desaturase (ZDS)、蓄積するカロテノイドの種類を決定するlycopene β-cyclase (LCYB), lycopene ε-cyclase (LCYE)、花弁に蓄積しているカロテノイドのほとんどはエステル体で存在しているが、そのエステル化に必要な水酸基を付加す酵素であるβ-ring hydroxylase (BCH1, BCH2)、合成されたカロテノイドを分解してcolorless compoundにするcarotenoidcleavage dioxygenase (CCD4)の8遺伝子について、ゲノム情報遺伝子について,ゲノム情報が整備されているアラビドプシスからプロモーター領域を単離し、GATEWAYシステムを利用しyeast one-hybridアッセイに用いるbaitコンストラクトを作製した。このbaitコンストラクを利用してシロイヌナズの転写因子のみで構築されたcDNAライブラリーを用いた新奇なyeast one-hybrid法による網羅的スクリーニングを行った。その結果、PSYを除く7遺伝子について、その発現制御に関わる転写因子の有力な候補をいくつか単離することに成功した。PSYについては、酵母を変えてスクリーニングを複数回行ったが、候補を得ることは出来なかった。アサガオやペチュニア、シロイヌナズナは、鮮やかな黄花が存在しない代表的な花きである。鮮やかな黄色の花色発現は、主にカロテノイドが担っている。カロテノイドは多くのステップを経て生合成されるが、その制御機構はほとんど明らかになっていない。機能性成分としても注目されているカロテノイドの生合成制御機構を明らかにし、植物体におけるカロテノイド量を制御することが出来れば、農業上重要な形質を獲得でき、応用展開が期待できる。昨年度の半年間でスクリーニングが完了した7遺伝子について、さらなる解析を進めるべく、in planta結合検定を行うためのコンストラクトを作製した。また、複数の遺伝子に共通して結合する転写因子を得ることが出来た。これは、カロテノイド量制御の鍵となる可能性があるので、変異体の種子を共同研究先から申請、入手した。今後、ホモ個体の選抜、採種を行う。また、昨年度に転写因子が得られなかった遺伝子について、様々なbaitコンストラクトを作製し、スクリーニングを行った結果、転写因子候補を得ることが出来た。今後、さらに解析を進める予定である。花のつぼみは少量ながらクロロフィルやカロテノイドを蓄積している。花弁の成長、開花に伴ってそれらは分解され、それぞれの花弁の色へと変換される。

つぼみに蓄積しているカロテノイドは葉タイプで、クロロプラストに存在している。このつぼみの黄緑色を開花時まで維持することが出来れば、これまでにない新花色花きの創出につながると考えた。そこで、今年度はクロロフィル分解関連遺伝子に着目し、11遺伝子のbaitコンストラクトを作製し、順次スクリーニングを進めている。花の色は豊富にあるように思うが、それぞれの品目についてみると色の幅は限られている。アサガオやペチュニア、シロイヌナズナは、鮮やかな黄花が存在しない代表的な花きである。鮮やかな黄色の花色発現は、主にカロテノイドが担っている。カロテノイドは、多くのステップを経て生合成されることがわかっているが、その制御機構はほとんど明らかになっていない。カロテノイドは、栄養面や機能性成分としても注目されており、その生合成制御機構を明らかにし、植物体におけるカロテノイド量を制御することが出来れば、農業上非常に重要な形質を獲得できる応用展開が期待できる。カロテノイドの生合成およびクロロフィルの分解を制御する転写因子を同定するために、カロテノイド生合成酵素遺伝子8遺伝子およびクロロフィル分解酵素遺伝子12遺伝子についてシロイヌナズナの転写因子のみで構築されたcDNAライブラリーを用いた網羅的yeast one-hybridスクリーニングを行った。これまでに、クロロフィル分解の鍵となることが報告されている4遺伝子に共通して結合する転写因子の同定に成功した。本転写因子の変異体シロイヌナズナ種子を申請、入手し、ホモ個体の選抜を行った。また、過剰発現体および機能抑制体のコンストラクトを作製し、シロイヌナズナの形質転換体を作出した。これらのシロイヌナズナ形質転換体を育成し、表現型を調査した。クロロフィル分解制御による葉の老化制御などが確認され、これらの成果を論文化の準備を行った。しかしながら、シロイヌナズナの花弁は非常に小さく、花色の変化までは確認できなかった。そこで、ペチュニアの薄黄緑色品種`カリフォルニアガール'を材料として、本転写因子の過剰発現体および機能抑制体を作出した。機能抑制体では、クロロフィルの分解が抑えられ、これまでにない花色が得られた。今後、形質転換ペチュニアの解析を進める予定である。昨年度から始めたクロロフィル分解関連遺伝子の発現を制御する転写因子を探索するためのスクリーニングで良好な結果が得られ、論文化の段階に入った。10月から半年間の産休、育休取得により、当初の予定からは変更になるが、おおむね順調に進展している。花の色は、豊富にあるように思うが、それぞれの品目についてみてみると、色の幅は限られている。新しい花色花きは、商品価値を高めるため、その創出は大きな目標となっている。鮮やかな黄色の花色発現は主にカロテノイドが、緑色はクロロフィルが担っている。カロテノイドとクロロフィルは、多くのステップを経て生合成されることがわかっているが、その制御機構はほとんど明らかになっていない。
生殖系列キメラを用いた魚類の性分化機構の解明

本研究ではゼブラフィッシュ、キンギョ、メダカをモデルとし、始原生殖細胞(PGCs)の数と性の分化の方向性を明らかとするために生殖細胞欠損個体やPGCsの数を様々に変化させた生殖系列キメラ個体を作出し、その性を調べた。生殖細胞欠損個体はそれぞれの魚種のdnd遺伝子を発現抑制することにより作出した。1.ゼブラフィッシュでは生殖細胞の欠損個体さらに数個のPGCsを移植したキメラ個体は全て雄となり、通常の数(約30個)倍の数のキメラでは雄も雌も現れた。このことから始原生殖細胞の数に依存した生殖細胞量的な性分化機構のあることが示された。2.キンギョの生殖細胞欠損個体では、組織学的解析により卵巣腔構造を持つ雌とシスト構造を持つ雄個体がほぼ一対一の割合で出現し、性分化の方向性は生殖系列の体細胞により決定されていると考えられた。このことはゼブラフィッシュとは異なり、生殖細胞の有無に関わらず体細胞依存的に性分化の方向が決定されると考えられた。3.メダカの生殖細胞欠損個体では、外部形態の性別判定では遺伝的雌の雄化が認められたが、組織学的解析では遺伝的雄と雌の間で明瞭な形態的相違は認められなかった。以上の結果、ゼブラフィッシュではPGCsの数が、キンギョでは生殖系列の体細胞が生殖腺の性分化の方向性に関与することが明らかとなった。このように生殖腺の性の分化の方向性を決定する細胞因子は魚種により異なることが示された。一般に性は遺伝的に決定されると考えられているが、魚類では遺伝的性が明瞭ではない種が多く存在し、その決定機構は明らかとされていない。近年、ゼブラフィッシュにおいて始原生殖細胞を欠いた個体が雄となることが報告された。さらに、人為的に始原生殖細胞を欠損させた個体に一つの始原生殖細胞を移植しても雄となることが確かめられている。このことにより始原生殖細胞の数が性分化に何らかの影響を及ぼしていると考えられる(始原生殖細胞量的性分化)。本研究では始原生殖細胞の数と性の分化を明らかとするために生殖系列キメラ法を用いてPGCsの数を様々に変化させた個体を作出し、その性を調べている。これまでに、数個の始原生殖細胞を移植した個体においても全ての個体が雄となることが明らかとなっている。現在、通常の倍量の始原生殖細胞を移植した生殖系列キメラを飼育中である。次に、遺伝的性が明瞭であるメダカやキンギョにおいても生殖細胞量的性分化が存在するのか、または始原生殖細胞の数に拘らず遺伝的性に従い性が決定するのかを調べることを目的として以下の研究を進めている。ゼブラフィッシュでは始原生殖細胞の移動と維持に重要であるdead end遺伝子をモルフォリノオリゴにより発現抑制することで生殖細胞欠損個体を作出できる。メダカとキンギョでも同様に、dead end遺伝子の単離を行い、この遺伝子に対するモルフォリノオリゴを作成した。始原生殖細胞欠損個体作出の為の濃度条件を確定し、それらの生殖腺の形態を組織学的に解析した。キンギョにおいては始原生殖細胞を欠損させた個体においても卵巣腔の形成されている個体が存在したことから、本種の性分化は始原生殖細胞の有無に影響を受けないものと考えられた。以上の結果、遺伝的性の明瞭な魚種においては始原生殖細胞の有無に拘らず性分化は遺伝的性に従い、ゼブラフィッシュのように遺伝的性が明瞭ではない魚種では始原生殖細胞量的性分化が存在すると考えられた。
治療の個別化を視野にいれた,卵巣腫瘍における低酸素関連因子の解析

ヒト明細胞腺癌株において, m-TORの発現はeverolimus(ラパマイシンの誘導体)によって処理を行っても,行わなくても差がないことが明らかとなった.しかしながら,リン酸化された状態であるphosphorylated-mTORは, everolimusによって著しく抑制されると判明した.また, m-TOR関連因子であるhosphorylated-4E-BP1, HIF-1α, VEGFなども発現量が抑えられた.一方で, HIF-1αの分解系に関わってユビキチン化を促すとされるVHLは, everolimus投与によって発現が増すことが証明された.これに連動して,アポトーシスのkey分子であるcleaved-caspase3も亢進する. m-TORの阻害はp-mTORの直接的な抑制のみでなく,腫瘍のアポトーシスの促進に繋がることが示唆された.動物実験での応用においては,ヒト明細胞腺癌株RMG-1を移植されたマウスにeverolimusを経口的に投与し,有意に腫瘍の縮小が得られた.このことは臨床実地への道標となった.ヒト明細胞腺癌株において, m-TORの発現はeverolimus(ラパマイシンの誘導体)によって処理を行っても,行わなくても差がないことが明らかとなった.しかしながら,リン酸化された状態であるphosphorylated-mTORは, everolimusによって著しく抑制されると判明した.また, m-TOR関連因子であるhosphorylated-4E-BP1, HIF-1α, VEGFなども発現量が抑えられた.一方で, HIF-1αの分解系に関わってユビキチン化を促すとされるVHLは, everolimus投与によって発現が増すことが証明された.これに連動して,アポトーシスのkey分子であるcleaved-caspase3も亢進する. m-TORの阻害はp-mTORの直接的な抑制のみでなく,腫瘍のアポトーシスの促進に繋がることが示唆された.動物実験での応用においては,ヒト明細胞腺癌株RMG-1を移植されたマウスにeverolimusを経口的に投与し,有意に腫瘍の縮小が得られた.このことは臨床実地への道標となった.本年度は様々な卵巣腫瘍における低酸素関連因子の発現を免疫組織化学、Western blotting、Real time RT-PCR法、DNA binding assayにより解析した。その結果、他の組織型に比して卵巣明細胞腺癌においてHIF-1αが高発現しており、とりわけ核に有意な発現を認めた。さらにHIF-1αmRNAの発現も高く、DNA binding assayの結果からも本組織型においてHIF-1の転写活性が高いことが判明した。これらの結果から、明細胞腺癌は他の組織型に比較してHIF-1αが特徴的に発現してHIF-1の転写活性も高く、HIF-1αは低酸素環境のみならず、他のシグナルの影響を受けている可能性が示唆された。また、本組織型が他の腺癌の組織型に比して予後不良であることは、HIF-1αの高発現が下流因子を効率的に発現させ薬剤抵抗性を獲得していることに関連しているものと推察された。次年度においては、近年、HIF-1αの翻訳の制御に関わるとの報告があるPI3K-Akt-mTORシグナル伝達系がHIF-1αに与える影響、さらには様々な卵巣明細胞腺癌株を用いたmTOR-HIF-1のシグナル阻害薬を用いた細胞増殖抑制への影響についても詳細に検討し、卵巣癌をターゲットとした分子標的治療薬の開発を視野に置いて解析を進めていきたいと考えている。また、in vitroでの成果が得られた場合は、速やかにin vivoによる検討を行い現行の治療薬との併用療法も検討する予定である。平成22年度においては、平成21年度に得られた『他の上皮性卵巣癌に比して明細胞腺癌でmTOR-HIF経路が有意に亢進していた』ことから、明細胞腺癌培養株を用いてmTOR阻害剤(Rapamycin,エベルリムス)による本経路の阻害がもたらす影響について様々な分子生物学的手法を用いて解析した。MTS assayおよびMIB-1 Labeling Indexによる解析から、mTOR阻害剤を培養時に添加したところ、薬剤濃度依存的に細胞増殖が有意に抑制された(p<0.0001)。さらに薬剤添加し6時間後に回収したサンプルを用いて免疫組織化学、Western blotting法、real time RT-PCR法によりmTOR-HIF関連因子のタンパクおよびmRNAの発現動態について解析を行った。その結果、上流のAkt、p-Akt、さらにmTORの発現には変化を認めないものの、p-mTOR、下流のp-4EBP-1、HIF-1α、VEGF、EPOの発現に抑制が認められた。一方で、HIF-1αの分解系に関与しているVHLは濃度依存的に発現の増加が認められた。これらのことから、mTOR阻害剤はmTOR-HIF経路の阻害に有用であり、本経路を通じた抗腫瘍薬としての効果が期待された。現在、上皮性卵巣癌を含む様々な癌においてHIF-1αの下流に位置する血管新生因子VEGF阻害剤bevacizumab(アバスチン)の臨床治験が行われているが、mTOR阻害剤はさらに上流で血管新生をコントロールするばかりでなく、他の腫瘍増殖因子の発現も抑制することから包括的な抗腫瘍薬としての可能性を秘めていることが実証された。最終年度では、腹膜癌モデルヌードマウスや皮下移植マウスを用いて、mTOR阻害剤の抗腫瘍効果を既存の抗癌剤とのcombination assayによって検証を進める。

また、mTOR-HIF関連因子のタンパクおよびmRNAの発現と予後との関連を分析し、卵巣癌治療の個別化に指針を示したい。平成23年度においては、平成2122年度に得られた『他の上皮性卵巣癌に比して明細胞腺癌でmTOR-HIF経路が有意に亢進していた』に基づき、明細胞腺癌培養株を用いてmTOR阻害剤(Rapamycin,エベルリムス)による本経路の阻害がもたらす影響について様々な分子生物学的手法を用いて解析した。かつ、明細胞腺癌でリン酸化されたmTOR(phosphorylated-mTOR)が優勢に発現していることが明らかにされ、mTOR阻害剤の臨床応用に対してp-mTORがbiomarker-治療選択のための指標-になることが推察された。ラバマイシンの抗腫瘍効果を解析するために行った動物モデル実験では、直接的な腫瘍殺効果(局所への注入)と間接的な腫瘍抑制効果(経口投与)を証明した。また、上皮性腫瘍に限らず、性索間質性腫瘍の代表である顆粒膜細胞腫でも、ラバマイシンの抗腫瘍効果が期待できることにも言及できた。具体的には主として以下のような解析を行った。明細胞腺癌培養株をヌードマウス右背部皮下および腹腔に2x10^6個を移植し、腫瘍体積が約100mm^3に到達した時点で、各群の腫瘍体積の母平均に差が生じないように各群に割り付け、EverolimusおよびEverolimusと各薬剤の組み合わせで投与を行った。投与開始より週2回の体重測定および腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(V)は、腫瘍の長径(L)、短径(W)、厚み(H)より算出し、Everolimusおよび各薬剤の投与量については他の癌種での最大投与量(MTD)と抗腫瘍効果を参考にして投与した。抗腫瘍効果の評価には各投与群において実験期間中死亡例を認めず、平均体重を20%以上低下させないMTDを規定した。MTD以下の用量について抗腫瘍効果を判定し、統計学的解析を加えた。投与試験終了後には、頭部を含む全身について解剖し、摘出組織および血清を用いて各薬剤の効果判定を病理学的、生化学的解析を行って、治療レジメンの確立に向けて指針を勘案した。
生殖技術に見る日仏の生命観のメタ倫理学的検討

2007年度は、(1)選択的中絶に見る個人的優生主義、(2)戦前期日本における母性フェミニズムと優生主義との親和性、(3)フランスにおける生殖補助医療によって出生した「子ども」の権利の確保、の3点を軸に調査を進めた。個人的優生主義は、選択的中絶を容認する根拠の一つとしての社会における障害者の受け入れの不備と偏見だけにとどまらず、「社会」の価値基準の変化をもたらしうる特定の人々の価値および規範意識をも反映する。そして、自己決定という原則のもとでの個人的優生主義の容認は、特定の社会グループの価値観に基づく、望ましくないとされる特質を持った人々へのスティグマの付与とこれに伴う社会的排除、および社会的な序列の強化にもなりうる。この点に関しては、応用倫理国際カンファレンス(北海道大学、2007年11月22-25日)において報告した。日本の戦前期フェミニズムもまた、社会改良の目的のもと、母性保護と私生児の出生防止を目的として、貧困層に対する生殖の制限を容認する傾向にあった。優生主義は、政府の優生政策のみならず、困難な状態にある人々の社会的排除の可能性を持った当時のフェミニズムに対しても理論的根拠を提供した。この点に関しては、国際臨床生命倫理学会(2007年9月14-15日開催)で報告した。ところで、フランス生殖補助医療では、匿名出産によって出生した「子ども」の「自らの出自を知る権利」がクローズアップされるにつれ、匿名性の原則についても再考を促す声が出始めている。匿名出産および生殖補助医療によって出生した「子ども」の「出自を知る権利」は、「子ども」自身の自己尊重とこれに基づく他者との関係の形成の基盤となるがゆえに確保されなければならない。これについては、「『子どもへの権利』は『子どもの権利』に優越するか-フランスにおける『自分のルーツを知る権利-』」(『医療・生命と倫理・社会』第7号)にまとめた。本年度では、中絶の合法化と選択的中絶を手がかりに、フランス生命倫理における生命観について調査を行った。調査の結果、フランス社会の場合、1.中絶は女性の身体への自由として社会的合意がほぼ成立しており、選択的中絶もまた、カップルの判断として社会的合意が得られていること、また2.フランス生命倫理における「人格」概念が身体を座とする概念であること、3.したがって人間身体は尊厳ある存在であり、この原則からヒト胚利用によるES細胞研究等が制限されること(人の生命の尊厳ではなく)、4.生殖補助医療に関しては、生殖医療全般の進歩によって胎児が将来の家族の一員として認識され、「欲しいときに一人の子どもを」という中絶合法化運動のスローガンが生殖の場面でも実現しつつあること、がわかった。この反面、障害を持った子どもの社会的受け入れは進んでいるとはいえず、ペリュシュ事件において問題となった「社会的連帯」はあいまいなままであることから、選択的中絶を是認する理由の一端になっている。以上の結果を踏まえ、2005年度日本倫理学会第56回大会(岡山大学)において「フランス生命倫理における『人格』概念」と題して報告を行った。フランス生命倫理においては「生命」概念そのものを問うよりも、人間身体そのものに対して認められる「尊厳」を人間身体尊重の原則の基盤に据えることで、生命がどの時点から発生するかという形而上学的問題には踏み込まない。このため、生殖に関わる医療技術の諸問題は、生命観そのものを問うよりも人間の身体が他の物質的存在とは異なる価値を持っのはなぜなのかという問題にも関わってくるように思われる。こうした点を踏まえ、2006年度では、「生命」概念だけでなく「身体」と「尊厳」の概念にも重点をおいて、検討を進める。今年度は、中絶をめぐる日本における言説の変遷をまとめるとともに、選択的中絶と障害者の生の権利の検討を通じて、個々人の自己決定と社会全般の価値観・規範意識の関係を考察した。今年度の調査において明らかになったのは、「尊厳」と「人権」を原則とするフランス生命倫理法およびEUにおける生命倫理指針が、中絶や臓器移植など、議論によっては異なる権利主体の間の利害対立と見なされうる個々の問題については、ある特定の条件下でのみこれらの原則を解除するという形を取ることで、「尊厳」および「人権」原則を固守する点である。これにより、医療技術の発展によって日々変動する社会の様々な要請に対処すると同時に、当該技術によって影響を受ける人間の権利の擁護を考慮することが求められると考えられる。ところで、出生前診断による選択的中絶については、その社会でどのように障害者が受け入れられているかによってスティグマが発生し、これにより選択的中絶への決断が後押しされる。胎児の異常を理由とする中絶を認めるフランスでは、障害児の数が少なく、これにより障害児教育システムの整備が遅れている。そして、障害者の社会的受け入れの現状が障害者への偏見を増幅させ、選択的中絶を許容する社会的土壌を再生産している。こうした状況は、個々の自己決定が社会的状況に大きく左右されるだけでなく、自己決定を最優先に重視する現代社会においては、その倫理的性質まで把握していないため、個々の自己決定が社会の価値規範を増幅させる働きを持つことを示している。なお、以上の研究成果については、PND研究会(「遺伝医療における心理的支援に関する研究」、玉井真理子信州大学教授代表)、および京都生命倫理研究会(「生命の尊厳をめぐるアメリカ対ヨーロッパの対立克服のための方法論的研究」盛永審一郎富山大学教授代表、との共催)においても報告した。2007年度は、(1)選択的中絶に見る個人的優生主義、(2)戦前期

日本における母性フェミニズムと優生主義との親和性、(3)フランスにおける生殖補助医療によって出生した「子ども」の権利の確保、の3点を軸に調査を進めた。個人的優生主義は、選択的中絶を容認する根拠の一つとしての社会における障害者の受け入れの不備と偏見だけにとどまらず、「社会」の価値基準の変化をもたらしうる特定の人々の価値および規範意識をも反映する。そして、自己決定という原則のもとでの個人的優生主義の容認は、特定の社会グループの価値観に基づく、望ましくないとされる特質を持った人々へのスティグマの付与とこれに伴う社会的排除、および社会的な序列の強化にもなりうる。この点に関しては、応用倫理国際カンファレンス(北海道大学、2007年11月22-25日)において報告した。日本の戦前期フェミニズムもまた、社会改良の目的のもと、母性保護と私生児の出生防止を目的として、貧困層に対する生殖の制限を容認する傾向にあった。優生主義は、政府の優生政策のみならず、困難な状態にある人々の社会的排除の可能性を持った当時のフェミニズムに対しても理論的根拠を提供した。この点に関しては、国際臨床生命倫理学会(2007年9月14-15日開催)で報告した。ところで、フランス生殖補助医療では、匿名出産によって出生した「子ども」の「自らの出自を知る権利」がクローズアップされるにつれ、匿名性の原則についても再考を促す声が出始めている。匿名出産および生殖補助医療によって出生した「子ども」の「出自を知る権利」は、「子ども」自身の自己尊重とこれに基づく他者との関係の形成の基盤となるがゆえに確保されなければならない。これについては、「『子どもへの権利』は『子どもの権利』に優越するか-フランスにおける『自分のルーツを知る権利-』」(『医療・生命と倫理・社会』第7号)にまとめた。
分子膜-低次元金属錯体から成る無機-有機超分子組織体の創成とその溶液化学

これまで固体化学の対象であったハロゲン架橋一次元白金混合原子価錯体[Pt(en)_2][PtCl_2(en)_2]と種々のアニオン性合成脂質1との複合化をはかり、ヘテロ型複合体[Pd(en)_2][PtCl_2(en)_2][1]_4,[Ni(en)_2][PtCl_2(en)_2][1]_4,[Pd(en)_2][PdCl_2(en)_2][1]_4を新たに調製した。これらはいずれもクロロホルムに分散でき、それぞれ黄色(λmax443nm)、赤色(λmax524nm)、深緑色(λmax910nm)の溶液を与えた。これらの電荷移動吸収の極大波長は、[Pt(en)_2][PtCl_2(en)_2][1]_4(λmax590nm)の場合と同様、対応する過塩素酸塩(固体)の吸収極大波長に比べて大きく長波長シフト(60305nm)しており、1の嵩高さのために金属間距離が増大したものと推測される。また電子顕微鏡観察において、いづれもナノレベルの構造体として分散していることが明らかとなった。また、[Pd(en)_2][PtCl_2(en)_2][1]_4については、20-55°Cの範囲で可逆的なサーモクロミズムが観測され、高温側でハロゲン架橋構造の解離がおこるが、低温では架橋錯体構造が再構成されることを確認した。以上の結果、脂質とのポリイオンコンプレックス化により、溶液系で自己組織性を有する一次元金属錯体を構築する方法論が確立された。さらに、[Pt(en)_2][PtCl_2(en)_2][1]_4のクロロホルム溶液を気液界面に展開し、表面積-表面圧曲線の測定ならびに界面反射スペクトルの測定を行った。分子専有面積約0.4nm^2/moleculeの凝縮膜が得られ、600nmに電荷移動吸収が観測された。すなわち、界面において一次元ハロゲン架橋白金錯体が形成できることが判った。
微生物由来新規カルボキシルプロテアーゼの構造機能解析と分子進化

原核生物由来の最初のカルボキシルプロテアーゼ(CP)であり,且つ,ペプスタチン非感受性CPであるPseudomonas sp.(PCP)とXanthomonas sp.(XCP)の酵素を始め,Bacillus coagulans J-4酵素,高温細菌由来CP,クマモリシンの合計4種類の酵素を対象に,これらCPの構造と機能を総合的に考察する。更に,CPの進化を考察すると共に,CPの全体像を探る。1.触媒残基の同定(部位特異的改変体)PCPとXCPの両酵素に保存されている8ケのAsp又はGlu残基を触媒残基の候補として,これらのAla改変体(合計16種)について検討した結果,PCPの触媒残基はAsp 170とAsp 328,XCPのそれはAsp 169とAsp 348と同定した。2.触媒残基の同定(スチレンオキシド)スチレンオキシドの^<14>C標識化合物を用いて検討し,PCPのGlu 80,XCPのGlu 75とAsp 110は基質結合部位として重要であることを明らかにした。3.触媒残基の同定(カルボジイミド)特異的阻害剤チロスタチンと^<14>C-N,N`-ジシクロヘキシル力ルボジイミドの併用によるDifferential Labelingを行い,PCPのAsp 140とGlu 222,XCPのGlu 235は触媒残基としてではなく,基質結合部位として重要であることを明らかにした。ペブスタチン非感受性で,且つ,アルコール耐性の本酵素について遺伝子のクローニングを行い,ほぼ全領域の遺伝子の取得に成功した。5.クマモリシンの高発現系の確立耐熱性酵素クマモリシンの大腸菌での高発現系の構築に成功した。新規カルボキシルプロテアーゼ(CP)のうちPseudomonas sp.CP(PCP)とXanthomonas sp.CP(XCP)に的を絞って,これら酵素の構造と機能解析を行う。1)触媒残基の同定(部位特異的改変体)機能上重要な部位は保存性が高いと仮定し,PCPとXCPの両酵素に保存されている8ケのAsp又はGlu残基を触媒残基の候補として選択した。これらのAla改変体(合計16種)を作成し,それらの自己活性化能,及び精製標品の比活性を調べた結果,PCPの触媒残基はD170とD328,XCPのそれはD169とD348と同定できた。2)触媒残基の同定(チロスタチン誘導体)特異的阻害剤チロスタチンをモデルとした親和標識化合物(約20種)やスチレンオキサイドで触媒残基の同定を試みたが,現在のところ同定には至っていない。3)触媒残基の同定(カルボジイミド)カルボキシル基の特異的修飾剤カルボジイミドによって,不活化されることが判明。そこでこの試薬とチロスタチンを併用して触媒残基の同定を検討した。即ち,(1)CPとチロスタチンの複合体をカルボジイミドで修飾,(2)透析で複合体からチロスタチンを解離,(3)この生成物を標識したカルボジイミドで再修飾,(4)標識化されたペプチドの同定。この方法は有望で,現在,(4)のステップの研究が進行中であり,4月末までには同定可能と考える。購入したHPLCは触媒残基の決定に不可欠であり,非常に有効に使用されている。原核

生物由来の最初のカルボキシルプロテアーゼ(CP)であり,且つ,ペプスタチン非感受性CPであるPseudomonas sp.(PCP)とXanthomonas sp.(XCP)の酵素を始め,Bacillus coagulans J-4酵素,高温細菌由来CP,クマモリシンの合計4種類の酵素を対象に,これらCPの構造と機能を総合的に考察する。更に,CPの進化を考察すると共に,CPの全体像を探る。1.触媒残基の同定(部位特異的改変体)PCPとXCPの両酵素に保存されている8ヶのAsp又はGlu残基を触媒残基の候補として,これらのAla改変体(合計16種)について検討した結果,PCPの触媒残基はAsp 170とAsp 328,XCPのそれはAsp 169とAsp 348と同定した。2.触媒残基の同定(スチレンオキシド)スチレンオキシドの^<14>C標識化合物を用いて検討し,PCPのGlu 80,XCPのGlu 75とAsp 110は基質結合部位として重要であることを明らかにした。3.触媒残基の同定(カルポジイミド)特異的阻害剤チロスタチンと^<14>C-N,N〓-ジシクロへキシルカルポジイミドの併用によるDifferential Labelingを行い,PCPのAsp 140とGlu 222,XCPのGlu 235は触媒残基としてではなく,基質結合部位として重要であることを明らかにした。ペプスタチン非感受性で,且つ,アルコール耐性の本酵素について遺伝子のクローニングを行い,ほぼ全領域の遺伝子の取得に成功した。5.クマモリシンの高発現系の確立耐熱性酵素クマモリシンの大腸菌での高発現系の構築に成功した。
ザンビアにおける入院時胎児モニタリング異常波形と母体リスク因子の関連の解明

ザンビアでは、CTG(分娩監視装置)のモニタリングは全例に行われていないため、入院時の胎児の健康状態の判定が十分にできていない。本研究は、同意が得られた産婦に対し、入院時にCTGを装着し胎児の健康状態の評価を行う。そして、母体リスク因子に関する情報を収集し、入院時のCTG異常波形と母体リスク因子との関連を明らかにすることを目的とする。医療資源の限られたサブサハラアフリカ地域において、搬送を受け入れる病院でハイリスク妊産婦にCTGモニタリングを実施することの意義について検討する。そして、助産師らが母体リスクに関連した胎児機能不全を早期に発見し、正常逸脱の判断能力を向上させることに貢献したい。
細胞膜における情報伝達分子筏の形成と機能:一分子観察・操作法の開発と応用

一分子観察・操作法の開発をさらに推進した。また、分子間の結合と相互作用を蛍光共鳴エネルギー移動を利用して可視化するため、蛍光寿命イメジング顕微鏡法の開発も進めた。特に膜分子の運動を1分子レベルで0.1ミリ秒の時間分解能[通常のビデオ速度の330倍]で追跡する方法を開発したことによって、研究が大きく進展した。これらの方法を用いて、細胞膜での情報伝達分子の局在化、及び、異なった情報伝達経路間のクロストークの制御機構を検討した。具体的には、まず、脂質(リン脂質、糖脂質)の運動を一分子レベルで観察した。培養繊維芽細胞(NRK)の細胞膜上でリン脂質の運動を1分子レベルで追跡した。細胞膜にフルオレセイン-PEを導入し、これを抗フルオレセイン抗体を介して金コロイドで標識し、その光学顕微鏡像を高速カメラで観察した。0.22msの時間分解能、100msの時間スケールで見ると、NRK細胞の細胞膜上では、約70%のPEがホップ拡散をしていた。即ち、暫時的に直径420nmの膜内のコンパートメントに閉じこめられ、平均160ms毎に隣接したコンパートメントに移動(ホップ)していた。残りの30%は単純ブラウン運動をしていたが、これは、1ミクロン程度の大きいドメイン中では、観察時間100msの間に境界に到達できなかったためだと考えられる。実際、1sの時間スケールで見ると、ほぼ全ての脂質分子がホップ拡散していた(時間分解能は2msにおちる)。一方、GFPを細胞間接着分子カドヘリン、及び、それに結合して細胞骨格との結合を担うカテニンに結合した分子を遺伝子操作によって作製し、細胞間接着ドメインの形成過程を追跡した。
眼炎症疾患に対する新しいドラッグデリバリーシステムの開発

実験的ぶどう膜炎(EAU)マウスおよび正常マウスに対し、糖鎖(+)リポソーム、糖鎖(-)リポソームをそれぞれ投与し各臓器へのリポソームの集積を評価した。結果として、糖鎖(+)リポソームを炎症マウスに投与した場合にのみ、眼でのリポソームの取り込みの増加を認めた。次に、炎症眼のどの部位にリポソームの集積が生じるかを組織学的に評価した。その結果、血管の最も豊富な脈絡膜毛細管板から糖鎖(+)リポソームの集積が開始され、時間とともに周囲の組織に拡散していくというリポソームの炎症部位での動態があきらかとなった。次に、E-セレクチン、P-セレクチンのEAUマウス眼における発現部位と糖鎖(+)リポソームが最初に集積した集積ラインとが一致しているかを免疫染色にて確認した。その結果、E-セレクチン、P-セレクチンともに糖鎖(+)リポソームの集積ラインに一致した部位で強く発現していることが観察できた。また、使用した抗体に対する中和ペプチドにより染色が消失したことはこの免疫染色の特異性を示すものと考えられた。最後に、糖鎖(+)リポソームの標的分子が確かにE-セレクチンとP-セレクチンであることを示すために、EAU発症マウスの尾静脈より抗マウスE-selectin抗体、抗マウスP-selectin抗体を同時投与し受容体を中和したのち、糖鎖(+)リポソームを尾静脈より投与しリガンド受容体特異的結合が阻害されるか解析した。その結果、E-セレクチンとP-セレクチンの抗体を同時にEAUマウスに投与することで糖鎖(+)リポソームの集積を阻害することができた。以上の実験結果より、シアリルルイスX糖鎖結合リポソームはE-セレクチンとP-セレクチンを標的とした標的指向性ドラッグデリバリーシステムとなりうることが示された。結果1:EAUマウスおよび正常マウスに対し、糖鎖+リポソーム、糖鎖-リポソームをそれぞれ投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価した。結果として、炎症を起こした眼でのみリポソームの取り込みの増加を認めた。糖鎖-リポソームがEAUマウスの眼で正常マウスの眼の1.5倍の取り込みを認めたのは血管内皮細胞間隙の拡大によるものと考えられる(passive transport)。一方、糖鎖+リポソームがEAUマウスの眼で正常マウスの眼の6倍の集積(すなわち糖鎖-リポソームと比較して約4倍の集積)を認めたことは炎症部位に発現したE-セレクチン、P-セレクチンを標的としたためと考えられる(active transport)。結果2:炎症臓器(眼)のどの部位にリポソームの集積が生じるかを組織学的に評価した。その結果、血管の最も豊富な脈絡膜毛細管板から糖鎖+リポソームの集積が開始され、時間とともに周囲の組織に拡散していくというリポソームの炎症部位での動態があきらかとなった。これは糖鎖+リポソームが炎症部位の血管に発現しているE-セレクチン、P-セレクチンを標的として集積し、その後、炎症により拡大した血管内皮細胞間隙を通って周囲組織に拡散していったものと考えることができる。一方、糖鎖-リポソームで明確な蛍光色素が観察できなかったのは、このリポソームの炎症部位への集積がpassive transportであるため、糖鎖+リポソームのように標的となって集積する部位がなく、個々ばらばらに組織に拡散していくためと考えられる。

実験1:E-セレクチン、P-セレクチンがEAUマウス眼において確かに発現しているのか、そしてその発現部位が糖鎖+リポソームが最初に集積した集積ラインと一致しているかを免疫染色にて確認した。その結果、E-セレクチン、P-セレクチンともに糖鎖+リポソームの集積ラインに一致した部位で強く発現していることが観察できた。また、使用した抗体に対する中和ペプチドにより染色が消失したことはこの免疫染色の特異性を示すものと考えられた。一方、正常マウスではE-セレクチン、P-セレクチンともに発現を認めなかった。EAUマウスにおけるE-セレクチン、P-セレクチンの発現部位と糖鎖+リポソームの集積部位が一致したことは、このリポソームの標的がE-セレクチン、P-セレクチンであるという理論を支持するものである。実験2:糖鎖+リポソームの標的分子が確かにE-セレクチンとP-セレクチンであることを示すために、EAU発症マウスの尾静脈より抗マウスE-selectin抗体200ug、抗マウスP-selectin抗体200ugを同時投与し受容体を中和したのち、糖鎖+リポソームを尾静脈より投与しリガンド-受容体特異的結合が阻害されるか解析した。その結果、E-セレクチンとP-セレクチンの抗体を同時にEAUマウスに投与することで糖鎖+リポソームの集積を阻害することができた。アイソタイプIgGの投与では集積を阻害することはできなかった。また、E-セレクチンとP-セレクチンのそれぞれの抗体単独投与では完全には集積を阻害することはできなかった。この結果と、実験4で示した結果を併せて考えると、糖鎖+リポソームの標的はE-セレクチンとP-セレクチンであると結論できる。以上の実験結果および今までの実験結果より、シアリルルイスX糖鎖結合リポソームはE-セレクチンとP-セレクチンを多く発現している病巣部位特異的に薬剤をデリバーできることが示された。
脳神経細胞の生存・機能維持におけるコレシストキニン-B受容体の役割

中枢神経系のコレシストキニン(CCK)は食欲、不安や自発運動などの高次機能や下垂体機能調節やモルヒネ耐性への関与、ドパミン系の神経伝達を調節することなども示唆されているがその詳細は明らかでない。私達は、遺伝子クローニングにより大脳CCK-B受容体(CCKBR)が胃ガストリン受容体と同一のG蛋白共役型受容体であり、そのリガンド依存性増殖増殖能を世界で初めて明らかにした。また、CCKBRは神経栄養因子などのチロシンキナーゼ型受容体よりの細胞内情報伝達系とクロストークし細胞骨格蛋白の制御にも関与していることも報告した。これらの細胞生物学的機能が中枢神経細胞の生理的機能にどのような意義をもつか、個体レベルで解析してゆく系を確立することを目的としてCCKBR遺伝子欠損マウスの作成した。ホモ変異マウスには発生異常や外表奇形は見られないが、高ガストリン血症や胃酸基礎分泌の低下のみならず、胃粘膜細胞の著明な発育障害が見られ、ヒスチジン脱炭酸酵素、クロモグラニンAなどの遺伝子発現の著しい抑制が確認された。すなわち、CCKBR発現細胞の個体における生理的な細胞増殖に本受容体がたいへん重要な役割を果たしていることが証明された。中枢神経系においてはCCKBRは、大脳皮質の錯体細胞に最も強く発現し、その他嗅球、梨状葉、扁桃、線状体、視床、視床下部や橋などにも領域特異的な発現が認められる。しかしこれらの領域の神経細胞の形態異常は認められず、中枢神経系においてもCCKBR欠損にともなうCCK-A受容体発現への影響は確認されず、両者の受容体発現には代償的な調節機構が存在しないことが明らかとなった。CCKBR遺伝子欠損マウスの解析は、CCK-A受容体を介さないCCKBR機能の代償機構の存在をはじめとして、本受容体の中枢神経系における生理的機能の解明に極めて有用であると期待される。