hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
階段形特性MOSFETを用いた多値フリップフロップ用Bi-cMOS TEGの製作

『音声波形のパルス化回路』を市販部品によって試作し、この装置を用いて音声の認識実験をした。その結果を踏まえて、新しい実時間音声認識システムを考案して東北大学電気通信研究所の第281回音響工学研究会で報告した。研究業績2はこのシステムで必要とされる『パルス幅弁別MOS回路』に関するものである。以上、本研究によって階段形特性MOSFETの基本的な特性の信頼性が確立し、実用化の基礎が確立された。
自転車と共生するための利用者視点にたった交通環境整備に関するデザイン提案

自転車通行空間に設置されている路面表示と任意標識に着目し、これらが抱える課題を明確化し、利用者にとってわかりやすく地域景観の構成要素となる自転車通行空間にするためには、地域独自のガイドライン整備の必要性と地域独自のガイドライン整備時に必要となる基本デザイン方針を明らかにした。Web調査、ガイドライン調査、フィールド調査から、自転車通行空間における路面表示と任意標識の課題を設置や表現方法、各地域での取組などの視点から総合的に明確化した。そして、地域独自のガイドライン整備の必要性と有用なガイドライン整備を行うために、ガイドライン上に具体的に明記すべき7つの事項をまとめた。本研究では、近年の自転車を取り巻く社会状況の変化をふまえ、自転車と歩行者、そしてその他車両とが共生できる交通環境の創造を目指すことを目的としている。研究計画としては、社会状況の変化に対応するかたちで急務に進められる自転車通行帯の整備においては既に課題が見受けられることから、事例フィールド調査や文献調査によりその課題を明確に整理し、利用者が利用しやすくわかりやすい自転車通行環境整備のあり方についてデザイン提案を行うこととしている。本年度は主に自転車通行環境の整備における先進事例調査及び自転車をとりまく社会環境に関する事例調査を実施した。事例調査は主にWebとフィールド調査で実施しており、現時点で以下の点が明らかとなった。1.通勤手段等の最も自転車利用が日常的に行われていると考えられる大都市の中心市街地においては、十分な自転車通行環境の整備が行われているとは言いがたく「自転車をとりまく社会情勢の変化に伴う対応」といった整備状況が多くあるといえた。2.地方都市においては、観光での自転車利用促進等も進められている事例が多くあり、それに伴い道路環境の整備も工夫して行われている事例がある。3.大都市圏においては、日常生活における自転車利用促進の目的から一定のエリア内(特に中心市街地)で自転車シェアサービスの導入事例が近年急速に増加しており、自転車利用の在り方の変化がみられることがわかった。4.道路環境の整備においては、自転車、歩行者、その他車両等の共生が図られるように様々な工夫を試みているものの、すべての利用者にとって有効な決定的な解決策がとられている事例はみられなかった。以上の事例調査から、自転車をとりまく利用環境の変化が急速に進んでいるため、利用環境の変化をもふまえた自転車通行帯の整備が必要であることがわかった。今後も事例調査を続けながら課題を整理し、解決すべき課題の明確化を行う。本年度は、海外事例としてヘルシンキ(フィンランド)およびストックホルム(スウェーデン)において自転車通行環境の調査を実施したほか、東京都23区内および福岡市内各所の自転車通行環境の調査を実施した。海外事例とこれまでの日本の比較的先進的な事例の調査結果を比較したり、自転車通行環境整備箇所の周辺状況等の違いによる比較分析を行うことで、詳細な考察を行った。日本の事例では、各情報提供方法について、非常に多くの工夫が行われている。一方で、調査を実施した北欧2国では、自転車通行空間を取り立てて主張するような工夫があるようには思えなかった。やはりユーザーの自転車に対する認識の変換を行うことが最重要点となると言えたが、詳細の分析により、日本の自転車通行空間の各所に設けられている情報提供方法の工夫が、全体として自転車通行空間を認識した場合には、各工夫間が干渉しあい、有効な工夫としてうけとれなくなっていることがわかった。これまでは、筆者も各情報提供の方法をどうするかに関する改善を行うことを念頭に研究を進めてきたが、各情報提供の方法や表現に配慮することに加え、全体を把握する視点が必要であることを導出できた。全体把握の視点を整備に際して取り入れるために、各周辺状況を判断し、どの箇所の情報提供の方法を工夫するか等のヒエラルキーを見極めるための方法を確立する必要がでてきた。今後は、自転車通行環境を景観としてとらえた場合の整備方針の立て方に関して言及していく。本年度は、自転車通行環境のフィールド調査を継続するとともに、各市町村から続々と発行されている自転車通行空間整備のためのガイドラインや整備方針についての資料の分析を行った。そしてこれまでに実施してきたモデル地区のWeb調査結果、各地のフィールド調査の結果、ガイドラインの調査結果を総合的に分析し、自転車通行空間整備のうえで重要な事項をまとめ、次年度開催の国際学会およびデザイン学会へ論文を投稿した。また国内学会での発表を行った。昨年度の調査から自転車通行空間におけるハード整備のみでなく、人々への自転車通行に関する啓蒙活動の不足がわかっていたことから、効果的な啓蒙活動を実施するための方法や対象選定のため予備調査として小学生らに対しての自転車通行教育状況についてヒアリングおよびWeb調査も実施した。近年、自転車通行をとりまく法改正等が度々行われてることから自転車通行環境が目まぐるしく変化し続けており、的確な研究成果を挙げるために研究期間の延長申請を行い承認を得た。本研究費採択後、自転車に関わる法律や規制の改正が数回行われており、自転車をとりまく環境が劇的に変化するとともに地域や社会の認識も大きく変化した。したがって、その変化に合わせ発信される情報の整理をその都度行った結果、研究計画変更の必要性が生じた。具体的には、当初は研究計画に無かったガイドラインの調査に時間を要したことが要因である。平成24年11月に国土交通省道路局および警察庁交通局から「安全で快適な自転車利用環境創出ガイドライン」が発行されており、平成25-27年にわたり、各地域で自転車通行環境の整備が急速に進み、このガイドラインをベースとしながら自転車通行環境に関わるハードおよびソフトに関わる各地域独自のガイドラインの制作が行われている。

各地域のガイドラインには、過去の整備での不具合改変についての言及や、地域特性をふまえた整備上の工夫等を掲載しているものが多く、自転車通行空間の路面表示や法定外標識および自転車教育に関するデザイン提案を実施予定の本研究においては、調査を省くことができない。以上のことから、研究の進行にやや遅れを要しており研究期間延長の申請を行い承認をえた。28年度は、この数年に行われた自転車に関わる法律や規制の改正に対応した各地域のガイドラインの内容整理と実際に高齢者や教育機関向けに実施されている交通安全教室についての情報を収集した。そして各地域のガイドラインの内容とこれまでに実施してきたフィールド調査の結果とを利用者への代表的な情報提供媒体である路面表示と任意標識の2軸から総合的に分析した。分析の結果、特に路面表示には、色彩のあるなしのみでなく、色彩の差異や着色方法の差異にも意味を持たせる傾向があるが、それらが各管理機関の連携のもとにはっきりとしたルールに則り広域に実施されているわけではないことから、利用者に混乱をもたらす要因になっていることを指摘した。また任意標識においては、路面表示の補完的役割を担うために設置される場合が多いものの、設置の際にはその認識が欠如し単独の標識として設置されていることが多く、利用者に情報が伝わりにくく有効な活用が行えていないことを指摘した。以上の分析結果をふまえ、各地域でガイドラインを含む自転車通行環境を整備する際の留意事項を7つにまとめ図解によりわかりやすく示した。この研究成果は、日本デザイン学会の学会誌への掲載や国際学会(KEER2016)での発表により広く公表した。また、自転車通行環境のハード整備においては本研究成果により得られた留意事項をもって整備することにより従来よりも利用者へのスムーズな情報伝達が行えるものと考えるが、情報提供の観点からはハード整備における情報提供をさらに有効に機能させるための啓蒙活動(ソフト整備)に関しても、言及したく実施した予備調査により、各交通安全教室等の現状においても工夫の余地があることを認識でき、今後の研究課題を得ることもできた。自転車通行空間に設置されている路面表示と任意標識に着目し、これらが抱える課題を明確化し、利用者にとってわかりやすく地域景観の構成要素となる自転車通行空間にするためには、地域独自のガイドライン整備の必要性と地域独自のガイドライン整備時に必要となる基本デザイン方針を明らかにした。Web調査、ガイドライン調査、フィールド調査から、自転車通行空間における路面表示と任意標識の課題を設置や表現方法、各地域での取組などの視点から総合的に明確化した。そして、地域独自のガイドライン整備の必要性と有用なガイドライン整備を行うために、ガイドライン上に具体的に明記すべき7つの事項をまとめた。調査を詳細に行ったことにより、今年度は自転車通行環境整備時の方針を決定する際のポイントを導出することができた。
多鉱岩の弾性変形におけるカルサイト応力計の開発

岩石やコンクリートといった多鉱材料に強いストレスが生じても,弾性回復した後に古応力を推定するのは不可能と考えられてきた.本研究は,応力によって内部が双晶変形するカルサイト結晶を用いて,岩石や断層の力学的理解や,コンクリート構造物の安全評価に役立てることが目的である.そのために必要な,応力計に適したカルサイト結晶の合成(特許出願済),粒状体内部の応力状態の可視化と効率的な応力推定方法(特許出願済)に成功した.岩石やコンクリートといった多鉱材料に強いストレスが生じても,弾性回復した後に古応力を推定するのは不可能と考えられてきた.本研究は,応力によって内部が双晶変形するカルサイト結晶を用いて,岩石や断層の力学的理解や,コンクリート構造物の安全評価に役立てることが目的である.そのために必要な,応力計に適したカルサイト結晶の合成(特許出願済),粒状体内部の応力状態の可視化と効率的な応力推定方法(特許出願済)に成功した.本研究は,岩石やコンクリート等の多鉱材料が受けた力の大きさを材料が弾性回復した後に読み取る方法を確立することにある.これは断層が有した過去の地震エネルギーの大きさの推定や,コンクリート構造物が受けたダメージの大きさを応力イベント後に評価することを可能とするものである.カルサイト結晶は受けた力に応じて結晶内部の双晶変形が増加することで知られている.これをマイクロ応力計とすることで断層やコンクリート建築物への応用を目指す.ただし天然のカルサイトは不純物を多く含み,かつ過去の履歴を有しているので人工のカルサイト粒子を水熱合成する.また合成カルサイトの単結晶試験およびカルサイトを含む人工岩石(コンクリート)の実証試験を行う.そして個々のカルサイト結晶と材料全体にかかる力の関係を数値モデルによってシミュレーションし,力学試験と比較する.昨年度は,応力計として実用化するための砂状サイズのカルサイト結晶の水熱合成に成功した.これまでセンチもしくはナノメートルオーダーの結晶は合成されてきたがミリメートルオーダーの結晶合成は初めての成果であり特許を申請した.この砂状カルサイトを固結させた粒状体の一軸圧縮試験を行い,載荷量に応じて双晶変形が増加することを確かめた.また双晶変形の力学挙動を確かめるために,結晶構造に基づく計算モデルの検討と大型単結晶を用いた変形試験を実施した.その結果,結晶サイズに対して変形量が小さい場合には,弾性回復に伴って双晶変形が消失する場合があり,試料サイズに対して十分に小さい結晶を用いる方がよいことがわかった.本研究の目的は,岩石やコンクリート等の多鉱材料が受けた力の大きさを材料が弾性回復した後に読み取る方法を確立することにある.これは断層が有した過去の地震エネルギーの大きさの推定や,コンクリート構造物が受けたダメージの大きさを応力イベント後に評価することを可能とするものである。カルサイト結晶は受けた力に応じて結晶内部の双晶変形が増加することで知られている.これをマイクロ応力計とすることで断層やコンクリート建築物への応用を目指す.ただし天然のカルサイトは不純物を多く含み,かつ過去の履歴を有しているので人工のカルサイト粒子を水熱合成する.また合成カルサイトの単結晶試験およびカルサイトを含む人工岩石(コンクリート)の実証試験を行う.そして個々のカルサイト結晶と材料全体にかかる力の関係を数値モデルによってシミュレーションし,力学試験と比較する.昨年度は,応力計として実用化するための砂状サイズの水熱合成カルサイト結晶(本科研特許技術により製造されたもの)を樹脂で膠結させ,模擬岩石を作り,これを一軸圧縮試験した.その結果(1)載荷に応じてカルサイト内部の平均双晶密度が上昇すること,(2)全粒子の双晶変形密度が均等に上昇するのではなく,双晶密度の高い粒子群が連なっている様子が観察された.これは粒状体シミュレーションで見られる鎖状の応力場と極似している.実際の多結晶材料の内部応力不均質性の可視化は,おそらく初めての成果である.カルサイトが受けた力によって結晶内部に双晶変形が生じる特性を用いて,岩石やコンクリートが過去に受けた力を読み取る手法を確立し,岩石力学の基礎研究や建築物の安全評価への応用に道筋を示すことが本申請研究の目的である.カルサイト結晶の双晶密度によって天然の岩石が過去に受けた力を推定する方法は,申請者らにより提案されているが(Sakaguchi et al.,2011),(1)天然結晶は初生的に双晶変形を含む,(2)粒子毎の双晶密度測定が煩雑,(3)大きな結晶でないと低応力に適用できない,という問題があった.粒状体の応力計として基礎研究および建築物に応用するためには,内部に双晶変形を含まない人工カルサイトの合成と,より簡便な応力推定方法の確立が必要であった.そこで本年は,カルサイト合成方法の効率化と,低応力状態でも簡便にかつ正確に測定できる方法を試みた.カルサイト合成実験:小型オートクレーブの実験でこれまでに明らかになった結晶合成の最適条件で,大型オートクレーブで実験した.その結果,大きな気液表面積が結晶成長を阻害することが明らかになった.応力測定法:上記の合成実験で生成されたカルサイト粒子で集合体を作成し,これを一軸圧縮試験した.その結果,載荷重に比例して双晶変形した粒子の割合が増えることを確認した.これは個々の結晶粒子の双晶密度を測定することなく,双晶変形の有無を確認するだけで古応力がわかることを意味する(特許出願準備中).

しかもこの手法なら,双晶密度の平均値に基づく従来の方法では測定が難しかった10MPa以下の古応力を精度良く測定することができる.合成カルサイトの集合体をコンクリート構造物等に設置することで,何らかの応力イベントがあった後に,双晶変形した粒子の割合を測定することから,以前に受けた載荷重を推定することができるようになるだろう.成果の一部が有名国際誌に掲載され,また昨年特許を取得した技術の学会発表(後藤田ほか,第18回ヤングセラミスト・ミーティングin中四国)が奨励賞を受賞した.24年度が最終年度であるため、記入しない。本年は総括の年であり,追試および議論・研究発表・論文執筆を実施する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
ミトコンドリアゲノム分析に基づく下位条鰭類高次系統の解明

ミトコンドリアゲノム全塩基配列分析を用いてコモロとインドネシア・シーラカンスの分岐年代を推定した.1998年にインドネシア・スラウェシ島沖で採集されたシーラカンス,Latimeria menadoensisのミトコンドリアゲノム全塩基配列を決定し,これまでの研究で蓄積してきた下位条鰭類のデータと合わせて,シーラカンス2種の分岐年代推定解析を行った.コモロとインドネシアのシーラカンスは鱗表面の色彩が異なる以外,形態的変異が見受けられないものの,本研究では少なくとも2種が3千5百万年前に分岐することが明らかになった.2種の種分化のシナリオとして,インド亜大陸が北上し、ユーラシア大陸と衝突したことで、それまでインド洋全域に生息していたとされるシーラカンスが地理的に分断されたという仮説が,スミソニアン博物館のスプリンガー博士によって提唱されている.本研究は,スプリンガー博士の仮説を支持する結果となった.本研究は,この3年間の総括ともなる結果を残すに至った.すなわち,シーラカンスだけでなく下位条鰭類の系統関係を明確にし,その時間軸設定を行うことで,最終形とも言うべき「下位条鰭類の時間軸付き系統樹」を提示した.これらの成果は脊椎動物最大の分類群である条鰭類の進化の道筋を示す極めて重要なもので,今後発展するであろう脊椎動物ゲノム進化の研究に,必要不可欠な情報をもたらす.年次計画の1年目の目標とした,38種のミトコンドリアゲノム全塩基配列の決定,論文執筆を行った.一部データがとりきれていない分類群を除いて,当初の目的であった下位条鰭類の分子系統解析の結果を論文として発表した.この論文によって系統関係が研究者によって異なっていた古代魚5系統の関係が明瞭になっただけでなく,脊椎動物最大の分類群である真骨類の単系統性が証明された.本研究で得られた系統樹は,現在ゲノム分析が急速に進められているゼブラフィッシュ,メダカ,フグ,などの系統的位置を明確にするもので,今後の比較生物学的研究に必要不可欠な知見を提出するものである.さらに現在,ミトコンドリアゲノム遺伝子配置変動に関する論文を投稿中である.本年度で得られたデータの解析は,当初の目的を上回る結果をもたらしただけでなく,挑戦可能な問題点を浮き彫りにした.それは,下位条鰭類に含まれるそれぞれの分類群内部における系統的な問題である.例えば淡水魚のみから構成されるオステオグロッサム類の大陸分布の謎,さらにはレプトケファルス幼生を唯一の根拠としてまとめられるカライワシ類の単系統性に関する問題である.これらは魚類学における最大の問題であったが,従来の形態や分子データではとうてい解析不能の難物であった.次年度からさらにミトコンドリアゲノム全塩基配列データを決定・解析することで,魚類学にとどまらず生物学全体にも大きく貢献する結果が得られると期待できる.昨年度論文として公表した下位条鰭類の分子系統解析に基づき,条鰭類内部における系統学的問題に着手した.下位真骨類の一群であるカライワシ類の系統解析を行い,論文として公表した.カライワシ類は特異な仔魚形態であるレプトケファルス幼生を根拠として1966年にGreenwoodらによってまとめられた一群であるが,その後40年間にわたってその単系統性が盲目的に信じられてきた.成魚の形態があまりにも多様であるため形態学的データに基づく解析は不可能であったのである.また,これまで分子分析に用いられてきたデータでは,1億年を超えるカライワシ類の歴史を解明するのは不可能であった.本研究ではミトコンドリアゲノム全塩基配列という従来の10倍以上のデータを用いて解析を行うことによりカライワシ類の単系統性を証明し,Greenwood et al.(1966)依頼の魚類学最大の謎を解明した.さらにカライワシ類の分子分析を行う過程で,特異な形態で知られる深海魚・フウセンウナギのミトコンドリアゲノムにおいてこれまでの常識では考えられないような遺伝子配置を発見し,論文として発表した.フウセンウナギ類は形態的にあまりにも特化しているため,一部の研究者は硬骨魚類ですらないと結論していた.本研究では,この特異な形態をしたフウセンウナギ類において,ミトコンドリアゲノムの遺伝子配置も奇妙なものであったことを報告した.さらに,これまで報告されている真骨類57種のミトコンドリアゲノムデータとあわせて詳細な系統解析を行うことによって,フウセンウナギ類が実はウナギ類の一部から派生してきたことを明らかにした.以上の成果によって最終となる次年度の課題が明確になった.これまで行ってきた魚類の分子分析は系統関係を明確にするものであった.次年度,あるいはより将来の目標として,分子系統樹に時間軸を設定することが可能になってきた.ミトコンドリアゲノム全塩基配列分析を用いてコモロとインドネシア・シーラカンスの分岐年代を推定した.1998年にインドネシア・スラウェシ島沖で採集されたシーラカンス,Latimeria menadoensisのミトコンドリアゲノム全塩基配列を決定し,これまでの研究で蓄積してきた下位条鰭類のデータと合わせて,シーラカンス2種の分岐年代推定解析を行った.コモロとインドネシアのシーラカンスは鱗表面の色彩が異なる以外,形態的変異が見受けられないものの,本研究では少なくとも2種が3千5百万年前に分岐することが明らかになった.2種の種分化のシナリオとして,インド亜大陸が北上し、ユーラシア大陸と衝突したことで、それまでインド洋全域に生息していたとされるシーラカンスが地理的に分断されたという仮説が,スミソニアン博物館のスプリンガー博士によって提唱されている.

本研究は,スプリンガー博士の仮説を支持する結果となった.本研究は,この3年間の総括ともなる結果を残すに至った.すなわち,シーラカンスだけでなく下位条鰭類の系統関係を明確にし,その時間軸設定を行うことで,最終形とも言うべき「下位条鰭類の時間軸付き系統樹」を提示した.これらの成果は脊椎動物最大の分類群である条鰭類の進化の道筋を示す極めて重要なもので,今後発展するであろう脊椎動物ゲノム進化の研究に,必要不可欠な情報をもたらす.
柱型環状分子を基にした弱刺激応答性ソフトクリスタルの創成

これまでに我々は、ピラー[5]アレーン結晶を直鎖炭化水素蒸気に晒すと、空孔内に直鎖炭化水素が取り込まれ結晶構造転移が生じ、100%の効率で直鎖炭化水素蒸気を補足することを見出した。さらにピラー[5]アレーンの分子構造にベンゾキノン骨格を導入することで、直鎖炭化水素蒸気の取り込みを電荷移動錯体由来の色変化から検知できるソフトクリスタルの合成に成功した。本研究ではピラーアレーンをベースにした新規ソフトクリスタル結晶が高分子をどのように取り込むか、また結晶に取り込まれたゲストがどのような運動性を示すかを調査した。ピラー[5]アレーン結晶内へのゲスト分子の取り込み・放出・運動性ピラー[5]アレーンの結晶構造とゲスト分子の取り込み・放出・運動性についての相関を調査した。その結果、ヘリングボーン構造を有するピラー[5]アレーン結晶よりもヘリングボーン構造を有するピラー[5]アレーン結晶の方が、低ゲスト分子圧で取り込み、安定に貯蔵できることが分かった。また、チャンネル構造を有する結晶中のゲスト分子のほうが、ヘリングボーン構造を有する結晶中のゲスト分子よりも高い運動性を有していることを見出した。ピラー[5]アレーン結晶の高分子の取り込み溶融した高分子であるポリエチレンオキシドにピラー[5]アレーン結晶を浸漬させると、ポリエチレンオキシドがピラー[5]アレーン結晶内に取り込まれ、ポリ擬ロタキサン構造を形成することが分かった。興味深いことに、ピラー[5]アレーン結晶は、様々な高分子量体のポリエチレンオキシドの中から、高分子量体のポリエチレンオキシドを選択的に取り込むことを見出した。当初は予期していなかったピラーアレーンソフトクリスタル内での炭化水素アルカンゲストの運動性を見出すことができた。またピラーアレーン結晶は分子量、高分子の末端をも見分けて選択的に取り込むことを見出した。これより本研究課題は当初の計画以上に進展しているといえる。1)キラルな炭化水素蒸気をセンシングできるピラーアレーンソフトクリスタルの開発を行う。ピラーアレーンの側鎖に不斉炭素中心を導入すると、ピラーアレーンの面性不斉が偏ることが分かっている。色変化を示すユニットを導入し、キラルな炭化水素蒸気のセンシングを試みる。2)炭化水素蒸気を明瞭な蛍光変化でセンシングできるピラーアレーンソフトクリスタルの開発を行う。電子吸引性のπ共役ユニットを直接連結することで、蛍光発光色が劇的に変化するソフトクリスタルの開発を行う。
減数分裂におけるカルシニューリンシグナル経路の役割と普遍性の解明

本研究では、減数分裂など生殖細胞ではたらく特別なプロセスの普遍性や多様性を生み出す分子機構を解明することを目的として、マウスとショウジョウバエを用いた遺伝子機能解析をおこなった。ショウジョウバエにおいて卵活性化時の減数分裂の進行に必須であることが知られているカルシニューリン(CN)とGSK-3は、マウスでは配偶子融合や多精拒否反応に関与する可能性が示唆された。また、他の多くの生物で共通してみられる、卵活性化時のCa2+濃度の上昇がショウジョウバエでも保存されていることを見出した。(A)マウス卵でのCN発現・機能解析:本研究では、動物種により多様な減数分裂システムの分子機構の普遍性を解明することを目的として、ショウジョウバエの減数分裂再開・完了に必須であるカルシニューリン(CN)の発現と機能を、マウスを用いて解析した。CN特異的阻害剤を含む培地でGV期卵を体外培養すると、卵核胞崩壊のタイミングがコントロールと比較して遅れることがわかった。一方、MII期卵を塩化ストロンチウムによって人工的に活性化させる実験では、CN阻害剤は減数分裂の進行に影響を与えなかった。しかし、野生型精子を用いて体外受精をおこなうと、CN阻害剤は卵子と精子の融合を阻害することが明らかとなった。これらの結果は、マウス卵においてもCNは発現しているが、ショウジョウバエとは異なり卵成熟や受精という局面ではたらく、という遺伝子の機能の多様化を示唆するものである。(B)ショウジョウバエでのCNシグナル伝達経路の機能と調節機構の解析:これまでの研究で、Glycogen synthase kinase (GSK)-3betaが、CNの調節因子であるSraをリン酸化することで、卵活性化におけるCN活性化に重要な役割を果たすことを示してきた。本研究では、卵形成期ではCNがSraの脱リン酸化を調節することで、GSK-3betaと拮抗する機能を持つという、より複雑なシグナル伝達のクロストークやフィードバック機構の存在を示唆するデータを得た。(A)マウス卵でのCN、GSK-3の発現・機能解析:本研究では、減数分裂など生殖細胞ではたらく特別なプロセスの普遍性や多様性を生み出す分子機構を解明することを目的とし、リン酸化反応を触媒するカルシニューリン(CN)とGSK-3に注目してきた。前年度の体外受精実験により、CN阻害剤が卵子と精子の融合をブロックすることが分かったため、その表現型の詳細な解析をおこなった。卵子と精子の接着や、CD9やIzumo1など融合に関連する分子の局在はCN阻害剤によって影響を受けないことから、卵子と精子が膜融合するための最後のステップが阻害されていることが考えられた。一方、GSK-3阻害剤は多精受精を引き起こすことが明らかとなった。そこで、融合実験や精子のみの阻害剤処理をおこない、卵子、精子への影響をそれぞれ検証した。その結果、精子の超活性化運動能や先体反応の活性化が亢進されることで多精となることを示唆する結果を得た。さらに、GSK-alphaノックアウトマウスの表現型解析により、雄不妊となること、体外受精での精子の受精率が低下することが明らかとなった。これらの結果は、GSK-3シグナル経路の正確な制御が精子機能に重要であることを示したものである。(B)CNシグナル伝達経路の機能と調節機構の解析:これまでの研究で、Ca2+依存性脱リン酸化酵素であるCNとGSK-3betaによるその制御が、ショウジョウバエの卵活性化に伴う減数分裂の再開・完了に必須であることを示した。そこで、GCaMPやGFP-aequorinを用いてCa2+イメージングをおこなったところ、排卵された成熟卵においてCa2+濃度の一過的な上昇が確認できた。これは、他の多くの生物で共通して知られる卵活性化時のCa2+の上昇がショウジョウバエでも保存されていることを示した初めての証拠である。分子発生生物学ショウジョウバエを用いた研究に関しては、当初の計画通りに進まない部分があった。しかし、マウスのプロジェクトに関しては、CNおよびGSK-3をコードする全遺伝子の発現解析と、阻害剤を用いた体外培養・受精実験を完了することができた。現在は、機能が推測される遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの解析に着手しており、全体としての達成度とはほぼ予定どおりと考えている。マウスでのCN、GSK-3の機能をより詳細にするため、Zp3-Cre系統との交配により、卵母細胞特異的な遺伝子ノックアウトをおこない、妊性、卵成熟、受精率への影響を詳しく調べていく。また、阻害剤による実験で観察された融合異常の原因を生化学、細胞生物学的手法により究明することで、ほぼ未解明である受精の分子機構を知るための手がかりを探る。

ショウジョウバエの研究に関しては、リン酸化抗体を用いた解析や結合実験などにより、Sraのリン酸化調節機構を明らかにしていくとともに、CNの基質や下流のシグナル経路の特定を目指し、生化学的、遺伝学的なアプローチを試みる。平成25年度は、主にマウスの購入費、情報収集のための国内外での学会参加費に充てた。マウスプロジェクト立ち上げと体外培養系を用いた基礎データの収集に力を入れたため、次年度での使用額が生じた。平成26年度は、薬品(抗体・遺伝子工学用試薬)や実験動物の管理・購入費、研究成果を発表するための論文投稿費や学会参加費として使用する予定である。
画像処理自動化装置による細胞電気泳動法の臨床的研究

我々が開発したコンピュータ画像処理による細胞電気泳動自動化装置により、各種疾患患者赤血球の細胞電気泳動度を検討した。また細胞性免疫のin vitro assayとして知られる細胞電気泳動試験electrophoretic mobility test(EMT)への応用を試み、膠原病および免疫異常が予想される患者リンパ球に対するPHA、ConAなどの反応性を検討した。(1)各種疾患患者赤血球の細胞電気泳動的研究:SLE、RA、PSS、PM/DMなどの膠原病患者赤血球の細胞電気泳動度を測定したところ、対照に比して有意な差はみられなかった。しかしglycerolに対する抵抗性を検討したところ、SLE患者の一部でglycerolに対する抵抗性が認められ、glycerol抵抗性を示した赤血球の細胞電気泳動度は低下した。glycerol抵抗性赤血球膜をSDS-PAGEで検討したところ、対照とは異なるパターンを示した。SLE患者赤血球のglycerol抵抗性に関する意義と細胞電気泳動的変化については継続検討中である。(2)既に我々は長年にわたり細胞電気泳動法によるEMTを行ってきたが、新しく開発に成功した自動化装置により、その成績をfollowしている。EMTの指示細胞としてのタンニン酸ヒツジ赤血球に、PHA、ConA、PWMなどで刺激した正常ヒトリンパ球の培養上清を加えると、指示細胞の電気泳動度が低下することが認められた。このうち、PHAを加えたとき低下率(泳動遅延率)がもっとも著しいことが認められた。これを各種膠原病患者について行ったが現在のところ、疾患特異的に有意の差は認められていない。しかし一部のSLE、免疫機能低下患者(抗癌剤投与悪性腫瘍)などで遅延率の異常を認めた。今後対象患者の病像、治療前後などを考慮して検討する必要があると思われた。
初期卵胞の体外発育法の確立および遺伝資源の保全を目的とした卵巣組織バンクの構築

希少な野生動物のメスの遺伝資源を保全する生殖介助技術の構築を目指し、モデルとしてイヌとネコの卵巣を用いて、原始卵胞の利用を想定した卵巣皮質の凍結保存と体外発育の研究を行った。イヌの未成熟卵子の発育能力を保存する卵巣組織の凍結保存方法を検討した結果、DMSOとPVPを組み合わせた凍結保護剤を用いたガラス化凍結法によって、イヌの卵巣組織は未熟な卵巣の生存性および発育能を維持した状態で凍結可能であることを示した。さらに凍結組織をラットへ移植することで、卵胞発育を誘導できることが示された。さらに、イヌの卵巣で有効であった凍結保存条件がネコの卵巣組織にも有効なことを確認した。ネコの卵巣組織については、体外培養研究も論文にまとめた。この研究はレチノイン酸をネコの卵巣組織培養下に添加することで、組織中の細胞外マトリクスのリモデリングを促すMMP9の発現を活性させ、未成熟卵子の発育を誘導できることを示した。さらに、国内の動物園の協力を得て、野生動物の卵巣組織の凍結保存(卵巣バンク)を進めた。これまで、合計で11動物園から32件、19種の野生動物の卵巣を受け入れた。それぞれ卵巣組織の凍結保存を行うとともに、組織解析のための組織固定、分子学的解析のためのRNA保存、タンパク質保存も実施した。すでに解析を一部で実施し、絶滅危惧種であるアムールトラ等、複数の種で正常な形態の卵胞を確認し、良好な状態で凍結保存を実施できたことを確認している。さらに、共同研究者の協力のもと、ニワトリをモデル動物とした未成熟卵子保存のための卵巣組織保存法の開発も進めている。昨年度は以上の研究成果を論文にまとめ、2報を国際科学雑誌で発表した。さらに、5つの国際学会・国際シンポジウム、5つの国内学会・国内シンポジウムで発表を行い、一般書の執筆、アウトリーチ活動により、社会に向けた情報発信も積極的に実施した。イヌの卵巣組織の凍結保存に関する研究は計画以上に進展し、未成熟卵子の凍結保存に有効な凍結手法を確立するだけではなく、移植実験によって、未成熟卵子の発育手法の開発まで進めることができた。さらに、イヌとネコで同じ凍結方法が有効だったことから、この凍結方法はイヌ科、ネコ科の野生動物を始め、多数の動物種に有効である可能性が示された。そのため、より積極的に野生動物の卵巣を動物園から受け入れることができた。特に昨年からは動物園側からより協力を得られる体制になり、卵巣組織バンクの構築を促進することができた。動物園側からの関心も高まり、昨年は動物園関係者が多数集まる学会で2件の招待講演を行った。さらに鳥類の卵巣保存に関する研究は、当初の研究計画にはなかったが、研究の発展によって実現した新たなプロジェクトである。哺乳類の卵巣組織保存の研究が順調に進展していることから、国内でより絶滅危惧種の多い鳥類の卵巣保存にも取り組むように共同研究者から助言を受けて始まったもので、すでに野生動物の鳥類への応用に向けた話し合いも始めており、研究が進展した成果とも言える。今後もモデル動物(イヌ、ネコ、ニワトリ)を用いた卵巣組織の体外培養、凍結保存の研究を進めるとともに、野生動物への応用も進めることで、幅広い動物種に応用可能な生殖介助技術の開発を目指す。特に、未成熟卵子の体外発育については、まだ二次卵胞以上への発育は見られなかったため、課題が残った。今後、3次元培養システムの導入など、体外培養条件をより検討し、より発育の進んだ卵胞の獲得を目指す。また、ニワトリの凍結後の卵巣についても解析を進め、異なる凍結条件が及ぼす未成熟卵子への影響を調べることで、鳥類の卵巣の凍結保存法の確立を目指す。野生動物への応用研究も推進する。今後、凍結後の野生動物の卵巣について、組織学的・分子生物学的な解析を進め、必要に応じて種ごとに凍結条件を修正する。さらに、凍結後の卵巣組織の体外培養も検討する。また、様々な動物種の卵巣を蓄積する利点を生かした、卵巣凍結における種差についての解析も進めていく。受け入れ研究者の村山教授のご協力で新たな液体窒素タンクも整備し、日本動物園水族館協会との連携も始まったことから、今後より野生動物の卵巣組織バンクを拡充させる計画である希少な野生動物のメスの遺伝資源を保全する生殖介助技術の構築を目指し、イヌとネコの卵巣を用いた未成熟卵子(原始卵胞)の保存と体外発育の研究に取り組んだ。はじめてに継続的な研究を可能にするため、研究試料としてイヌとネコの卵巣を提供してもらえる動物病院を探したところ、滋賀県の3病院、京都市の1病院の協力を得ることができた。卵巣組織の凍結保存では、特にイヌで良好な結果が得られた。異なる凍結保護剤、冷却方法(緩慢凍結法、ガラス化凍結法)、浸透時の温度(室温、4°C)による影響について調べたところ、低温下で異なる凍結保護材を組み合わせた条件下でガラス化凍結法を用いた場合、原始卵胞の生存性が高く維持できることが明らかになった。さらに、この条件で凍結融解を行った卵巣組織では、原始卵胞及び周辺細胞の組織構造が凍結前と同様に維持されていることも確認できた。これらの結果は、2つの国際学会で発表を行った(内1つは査読付き、口頭発表)。現在、凍結融解後の卵巣組織について、免疫不全動物を用いた細胞増殖能、卵胞発育能を解析中である。また、生細胞のみを染色するニュートラルレッドを用いて組織の状態を観察する手法を確立した。

この方法は組織の固定を必要としないことから、体外培養の前後、および組織凍結の前後で経時的に観察することが可能である。現在、この評価系は上述の凍結保存研究に用いるとともに、卵胞の長期体外発育を目指した体外培養条件の検討を行っている。上記に加え、野生動物への応用にも進展があった。学会などで知り合った日本国内の複数の動物園からの協力を得られ、飼育動物または保護された野生動物の卵巣が入手できた際に提供いただけるようになった。すでに野生イヌ科動物であるタヌキやネコ科動物であるライオン等の卵巣を入手し、モデル動物で有効であった保存方法を用いて凍結保存を行っている。当初、これまで生殖学の研究を行っていなかった所属先で研究をスタートさせることは時間を要し、対象動物を野生動物種へ広げることは3年目になると想定していた。しかし、受け入れ研究者の協力の下、研究設備を整え、さらにイヌとネコの卵巣を提供してもらえる動物病院の協力を早期に得ることができたため、研究体制を早い段階から整えることができた。特にイヌの卵巣組織の凍結保存研究が計画以上に進展し、原始卵胞保存に適した卵巣組織の凍結保存条件を見出した。また、国際学会での発表を通じで国内外の多くの研究者と情報交換を行うとともに、希少動物の保全研究で先駆的な研究機関である米国スミソニアン保全生物学研究所の研究者とも、より具体的な研究内容について情報交換を行った。さらに国内の研究者と情報交換・共同研究を進めることで、免疫不全動物を用いた研究など、当初の計画にはなかった研究にまで発展させることができた。そのことから、野生動物種の卵巣提供の依頼もはじめ、想定よりも早く国内動物園の協力を得ることが可能になった。現在すでに複数の動物園より合計5種の野生動物の卵巣を受け入れ、その卵巣解析と凍結保存を行っている。そのため、三年間の研究目標にしていた野生動物の卵巣組織バンクの体制作りを早い段階で推進することができた。これまで希少動物のメスの遺伝資源を保存する生殖介助技術の構築を目指して、イヌとネコの卵巣を用いた未成熟卵子(原始卵胞)の体外培養と凍結保存の研究を行ってきた。昨年度はイヌの卵巣組織の凍結保存の研究で特に進展があった。異なる凍結保護剤と凍結法を用いて、イヌの原始卵胞の発育能を維持する卵巣組織の凍結保存法について検討した。その結果、DMSOと細胞毒性の低いPVPを組み合わせた凍結保護剤を用いてガラス化凍結法を実施したところ、原始卵胞の形態及び生存性を凍結前と同程度維持することができた。さらに、免疫不全ラットを用いた凍結組織の移植実験を実施したところ、凍結条件によって大きな差が生じた。緩慢凍結法で凍結した卵巣組織は移植後5週目には形態的に維持された卵子が観察できなかったのに対し、上述の条件のもとガラス化凍結法を行った卵巣組織は9週間の移植によって原始卵胞からより発育の進んだ二次卵胞への発育誘導に成功した。このことから、この凍結保存法は発育能を保持した状態で卵胞を保存可能であることが示された。現在、上記の研究成果について論文を執筆中である。また、前所属先でスタートさせたネコの卵巣組織を用いた体外培養の研究に関しても、卵胞の発育誘導を誘起するメカニズムを体外で模倣することで、体外発育させることに成功し、論文を投稿中である。
4種の形態を持つ酸化タングステン粒子からの可視光応答型光触媒の作製

直方体状(単斜晶)、六角形状(六方晶)、球状およびディスク状(単斜晶と三斜晶の昆晶)のWO3粉末粒子に助触媒PtまたはCu2+を担持して、液相(メチレンブルー水溶液)と気相(アセトアルデヒド)を用いて、可視光照射による光触媒実験を行った。活性は直方体状WO3で液相、気相とも最大であり、次いで六角形状WO3であった。直方体状WO3は、単結晶に近い状態のため格子内欠陥が少なく、比表面積が大きく、さらに酸化反応面と還元反応面が分かれているため、最大活性となったと考えられる。六角形状WO3では、単位比表面積当たりの光触媒活性が両相で最大であった。これは六角形平面の吸着能が高いためと考えられる。4種の形態のWO3結晶粉末粒子、すなわち球状(単斜結晶+三斜晶)、ディスク状(単斜結晶+三斜晶)、キューボイド状(単斜晶)、六角形状(六方晶)を合成することに成功した。特に、従来の水熱法では六角形状結晶はキューボイド状結晶がかなり混ざった状態で得られたが、本研究において、希硝酸に、WO3の原料であるタングステン酸アンモニウムパラ五水和物の水溶液をすばやく一度に加えるなどの実験上の工夫により、キューボイド状結晶がごく少量混ざった六角形状結晶粒子を得ることに成功した。これは重要な成果である。これら4種のWO3結晶粒子に、助触媒PtまたはCu2+を担持して、4種の可視光応答型WO3結晶粒子を合成することに成功した。これらの粒子に対して、液相(メチレンブルー、PtおよびCu2+担持)または気相(アセトアルデヒド、Pt担持のみ)を用いて可視光照射による光触媒性実験を行い、Pt担持でもCu2+担持でも、キューボイド状および六角形状が高い光触媒活性を示すという結果を得た。また、Pt担持の場合について、単位比表面積当たりの光触媒活性は、六方晶結晶で高いことが分かった。高活性の理由について、WO3形態と結晶面、比表面積、Pt担持量などの観点から、一定考察を行った。一方、これら4種のPt担持WO3結晶粒子を、ゾル・ゲル法を用いてSiO2やTiO2のゲル膜中に固定化して光触媒膜を作製する実験を行った。その結果、SiO2の場合、水溶液中で膜が剥がれ落ちてしまうことが多かったが、TiO2の場合そういうことなしに安定な膜が得られた。形状の異なる4種類のWO3粉末(球状:N、ディスク状:D、直方体状:C、六角形状:H)を合成し、吸着法を用いて銅イオン1 wt%を担持した(Cu-WO3)。これらの粉末を用いて、青色LED(波長:473 nm)照射下における、水中のメチレンブルー(MB)の光触媒分解反応を行った。その結果、いずれのWO3粉末試料も光触媒活性を示し、MBを分解することができた。4種の形態を比較すると、未担持WO3およびCu-WO3試料とも、C-WO3が最も高い光触媒活性を示した。一方、4種のWO3に光析出法を用いて白金(Pt)を担持し、青色LED照射下での酢酸(気相)の二酸化炭素(CO2)への無機化反応に対する光触媒活性の評価を行ったところ、D-WO3が最も高い活性を示した.D-WO3の焼成温度を200°Cから1000°Cまで変化させると、形状が徐々に変化した。それら試料の活性は、700°Cの試料で最大であった。担持したPtの粒径に変化がみられなかったため、光触媒活性の向上には、WO3の比表面積と結晶性のバランスが重要であると考察された。最も高い活性を示した700°C焼成のD-WO3にPtを0.5 wt%担持した試料は、酢酸を完全に無機化することができた。さらに、4種のWO3光触媒の活性評価として、青色LED照射下で、電子供与剤(硫酸銀(20 mM)存在下における水溶液からのO2生成反応を調べた。その結果、C-WO3が最も高い光触媒活性を示した。C-WO3粉末の作製過程の焼成温度を変化させると(200-1000°C)、500°Cで焼成したものまでは直方体状の形状を保っていたが、600°C以上の温度で焼成すると直方体状の角がとれ、形状が崩れた。光触媒活性に対する焼成温度依存性を調査した結果、直方体状の粒子では、400°Cで焼成した試料が最も高い活性を示した。直方体状の形状が崩れた粒子では、800°Cで焼成した試料が最も高い活性を示した。当初計画した実験をほぼ行うことができ、国内学会で3件発表したため。しかし、国際会議での発表や論文発表はできなかった。形状の異なる4種類のWO3粉末(球状: N-WO3、ディスク状: D-WO3、直方体状: C-WO3、六角形状: H-WO3)を合成し、吸着法を用いて銅イオン1 wt%を担持した(Cu-WO3)。これらの粉末を用い、青色LED(波長: 473 nm)を2時間照射して、水中のメチレンブルー(MB)の光触媒分解反応を調査した。その結果、いずれのWO3粉末試料とも光触媒活性を示し、MBを分解することができた。

4種の形状を比較すると、未担持WO3では、活性の高い順に、C-、D-、N-、H-WO3となり、一方Cu-WO3では、いずれも未担持WO3より活性が向上し、活性の高い順に、C-、H-、N-、D-WO3となった。最大活性を示した試料はCu担持のC-WO3であり、Cu担持効果が最大であった試料はH-WO3であった。次に、上記のCu担持のC-WO3に対して、青色LED(波長: 450 nm)照射下でのアセトン(気相)の二酸化炭素(CO2)への分解反応を調査した。焼成温度200、300、400、500°Cで作製した試料について、5時間までの光照射時間に比例してCO2が生成したことから、Cu担持によって酸素の多電子還元が促進されて光触媒反応が進行していると考えられた。300°Cの試料でCO2の生成速度が最大であった。さらに、上記の4種のWO3に対して、青色LED(波長: 466 nm)照射下で、ヨウ素酸イオン存在下における酸素の生成量を定量して、水の酸化反応を調査した。助触媒として、光析出法により白金(Pt)を、また含浸法により酸化ルテニウム(RuO2)を担持した。最大活性を示した試料はPt担持のC-WO3であり、次に高い活性を示した試料はRuO2担持のC-WO3であった。直方体状(単斜晶)、六角形状(六方晶)、球状およびディスク状(単斜晶と三斜晶の昆晶)のWO3粉末粒子に助触媒PtまたはCu2+を担持して、液相(メチレンブルー水溶液)と気相(アセトアルデヒド)を用いて、可視光照射による光触媒実験を行った。活性は直方体状WO3で液相、気相とも最大であり、次いで六角形状WO3であった。直方体状WO3は、単結晶に近い状態のため格子内欠陥が少なく、比表面積が大きく、さらに酸化反応面と還元反応面が分かれているため、最大活性となったと考えられる。六角形状WO3では、単位比表面積当たりの光触媒活性が両相で最大であった。これは六角形平面の吸着能が高いためと考えられる。当初計画した実験を行うことができ、さらに国内学会・国際会議での発表のみならず、初年度に論文発表(掲載決定)を行うことができたため。Cu-WO3とPt担持WO3(Pt-WO3)について、気相と液相での可視光照射下光触媒活性評価を総括的に行い、結果を比較して、最も高活性な光触媒を見出す。同時に、比表面積測定や電子顕微鏡観察を総括的に行い、高活性の機構を明らかにする。また、Pt-WO3について、NaIO3水溶液でのO2生成反応に対する可視光照射下光触媒活性評価を行い、平成27年度の無担持の硫酸銀水溶液の結果と比較検討する。平成28年度は最終年度であることから、本研究の成果が得られるようにする。成果公表として、2報目、3報目の論文発表を目指す。無機物理化学Cu2+担持の場合について、気相(アセトアルデヒド)での可視光照射による光触媒性実験を行う。キューボイド状および六角形状が示す高い光触媒活性を詳細に比較検討し、その理由について、WO3形態と結晶面、比表面積、助触媒担持量などの観点から、引き続き検討する。4種の助触媒を担持した4種のWO3結晶粒子をゾル・ゲル法を用いてTiO2のゲル膜中に固定化した光触媒膜に対して、液相(メチレンブルー)および気相(アセトアルデヒド)光触媒性実験を行う。ゾル・ゲル法を用いてSiO2ゲル膜中に固定化した場合、水溶液中で膜が剥がれ落ちてしまった前年度の結果について、再検討する。
アデノウイルスEIA遺伝子エンハンサ-配列結合蛋白の構造と機能

アデノウイルスEIA遺伝子はウイルス感染後早期に発現するimmediate初期遺伝子に属し,ウイルスの増殖に必須である。またEIA蛋白はEIA自身の転写や他の初期遺伝子の転写を活性化する。以前,我々はEIA遺伝子の上流領域に21カ所のHeLa細胞核蛋白の結合部位をDNaseフットプリント法を用いて位置ずけた。この際,2種類のEIAエンハンサ-配列に共通に結合する蛋白を同定し,EIA factor(EIAーF)と名づけた。本研究で,エンハンサ-配列(A/C GGA A/T GT)をプロ-ブに用いて,サウス・ウエスタン法を試みた結果,λgtll HeLa細胞cDNAライブラリ-からEIAーF蛋白をコ-ドするファ-ジcDNAクロ-ン(λ3ー16)を分離した。λ3ー16ファ-ジの溶原化菌が産生するfusion蛋白を用いて,ゲルシフト法やメチル化阻害実験を行ったところ,fusion蛋白はEIAエンハンサ-配列に特異的に結合した。さらにcDNAの塩基配列はヒトcーets1やcーets2などetsがん遺伝子ファミリ-に高いホモロジ-を示し,その領域はDNA結合に必要なETSドメインに相当した(62%のアミノ酸が両者の間で同一)。この結果はEIAーFがetsがん蛋白ファミリ-に属する新しい蛋白であることを強く示唆した。また,このcDNAをプロ-ブに用いたノ-ザン法で,種々のヒト由来培養細胞株(KB,HeLa,HT1080,MG63)に2.5KbのmRNAが検出された。このmRNAはアデノウイルス感染初期において2ー5倍増加した。現在、ElA遺伝子の転写におけるetsがん遺伝子産物の機能を解析中である。また各種細胞を用いて,etsがん遺伝子の発現レベルとアデノウイルス宿主域との関連性を比較,検討する予定である。1.E1Aエンハンサ-結合蛋白の精製HeLa細胞や293細胞を材料にして,ヘパリンアガロ-ス,DEAEセフアロ-ス,DNAアフィニティ-カラムを用いEIAエンハンサ-結合蛋白を精製した。結合塩基配列の特異性から判断し,精製蛋白は我々が報告したEIAエンハンサ-結合蛋白(Nucleic Acids Res.17,10015,1989)に相違ないと考えられる。また、SDSーPAGEの結果からEIAエンハンサ-結合蛋白はヘテロダイマ-構造を有し,58KDと53KDの2種類のポリペプチドから構成されることが明らかになった。EIAエンハンサ-結合蛋白の結合塩基(C/AFFAAGT)はetsvoncogeneファミリ-の蛋白が結合する塩基配列(C/AGGAA)と酷似する。ヒトcーetsoncogene産物に反応するモノクロ-ン抗体を用いたウエスタンブロット法の分析から、反応の程度は弱いが,58KD蛋白はcーets2蛋白に,53KD蛋白はets蛋白群に類縁することが示唆された。2.EIAエンハンサ-結合蛋白をコ-ドするcDNAのクロ-ニング蛋白の結合塩基配列をプロ-ブにして,HeLa細胞のmRNA由来cDNAライブラリ-をサウス・ウエスタ-ン法を用いて、スクリ-ニングを行った。約200万個のプラ-クから,野性型の結合塩基を持つDNAに結合するが変異型のDNAプロ-ブに結合しないクロ-ンを数個分離した。現在、これらのファ-ジの溶原化菌をつくり、cDNA由来の蛋白を生産し、EIAエンハンサ-配列に特異的に結合するかどうか分析中である。

アデノウイルスEIA遺伝子の転写調節領域には数個のエンハンサ-が存在し、EIA自身の転写と他の初期遺伝子の転写調節を行っている。我々はEIAの転写制御機構の解明を目的にHeLa細胞核抽出液からEIAエンハンサ-コア配列(5'A/C GGA A/T GT 3')に結合する蛋白質を同定し、EIAーFと名づけた(Nucleic Acids Res.17,10015,1989)。今回λgtll HeLa細胞cDNAライブラリ-を用い,EIAエンハンサ-コア配列をプロ-ブとしてSouthーWestern法を試みた結果,このプロ-ブに特異的に結合するファ-ジクロ-ンを得た。そしてこのファ-ジクロ-ンが産生するfusion蛋白を用いてゲルシフト法,及びメチル化阻害実験を行ったところ,この蛋白はEIAエンハンサ-コア配列に特異的に結合した。さらにcDNAの塩基配列はets oncogeneファミリ-と非常に高いホモロジ-を示し,その領域はDNA結合に必要なETSドメインに相当した。また,このcDNAをプロ-ブとして用い,ヒト由来細胞株(KB,HeLa,HT1080,MG63)に約2.5KbのmRNAがノ-ザン法で検出された。さらにこのmRNAはアデノウイルス感染により2ー5倍増加した。現在、EIAーF蛋白の全構造を明らかにするためにN末端側の塩基配列を解析中である。またEIAーF cDNAをプロ-ブに用いてヒトの由来のゲノムDNAライブラリ-からEIAーF遺伝子を分離しており,遺伝子の構造についても検討中である。