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配偶子幹細胞制御機構

平成25年3月をもって終了した新学術領域研究「配偶子幹細胞制御機構」の成果とりまとめを行った。本研究領域は、平成25年9月5日、文部科学省科学技術・学術審議会学術分科会科学研究費補助金審査部会生物系委員会による事後評価を受け、A(研究領域の設定目的に照らして、期待どおりの成果があった)との評価を得た。総合所見として、「(前略)領域代表者を筆頭に比較的若手の研究者が多く参画し、各動物種におけるGSC/ニッチシステムに関するいくつかの先駆的な成果を収めた。(中略)以上のことから、当初の設定目的を達成し、配偶子幹細胞制御という研究領域を一つの体系として発展させたことは高く評価できる。」との評価を得た。本研究(研究成果とりまとめ)では、最終的な研究成果をとりまとめ、学術誌に公表するとともに、領域のホームページを通して広く発信した。また、本研究領域でサポートしてきた「Germ Cellの会」を引き続きサポートし、本研究領域という枠に必ずしもとらわれない、研究者コミュニティーの育成に努めた。更に、事後評価野結果を踏まえて領域の成果をとりまとめ、報告書冊子を作成した。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、新学術領域研究「配偶子制御」領域の総括班研究として、研究の方向性を示して領域を牽引するとともに、研究を円滑割効果的に推進するために種々の運営を行う。本研究領域は、配偶子幹細胞(GSC : Gamete Stem Cells)とその自己複製と分化を制御する、ニッチ細胞とニッチの場の実体を動物種横断的に解析し、GSC/ニッチ・システムの基本メカニズムとともに、動物種ごとの生殖様式を生み出す制御機構を解明する。このとき、成り立ちや目的を異にする分野で研究を行って来た研究者が、上記目的を共有して集結し、新たな研究領域と研究者コミュニティーの醸成を目指す点が本領域の大きな特色であり、本総括班研究の目的である。そのために、領域内外の研究者間の連携や交流をサポートするとともに、研究の成果を、広く領域内外・国内外に対して発信する。平成20-24年度新学術領域研究(研究領域提案型)「配偶子幹細胞制御機構」では、配偶子幹細胞(GSC: Gamete Stem Cells)とニッチ細胞、およびニッチの場の実体を、動物種横断的に解析する研究領域である。ここでは、成り立ちや目的を異にする分野で研究を行って来た研究者が、「GSC/ニッチ・システムの解明とその応用」という目的を共有して集結した。その総括班研究である本研究では、この新たな研究者集団の連携や共同研究を推進し、関連分野への発信を積極的に行うことにより、国際的に当該分野をリードする研究者コミュニティーを醸成した。本研究により総括班を運営する新学術領域研究「配偶子制御」領域は、配偶子幹細胞(GSC : Gamete Stem Cells)とその自己複製と分化を制御する、ニッチ細胞とニッチの場の実体を動物種横断的に解析し、GSC/ニッチ・システムの基本メカニズムとともに、動物種ごとの生殖様式を生み出す制御機構を解明する。このとき、成り立ちや相的を異にする分野で研究を行って来た研究者が、上記相的を共有して集結し、新たな研究領域と研究者コミュニティーの醸成を相指す点が本領域の大きな特色である。本研究(総括班)では領域内外の研究者間の連携や交流をサポートするとともに、研究の成果を、広く領域内外・国内外に対して発信する。領域立ち上げの年となった本年度は、以下のように領域活動を行った。すなわち、第1回の総括班会議および領域会議を開催した(3月16-18日、葉山)。総括班会議では、本研究領域の目的、5年間の研究方針および到達目標について再確認するとともに、領域の運営方針について議論し、領域外(国内外)からの研究者の招聘、特に若手を中心とした海外研究集会への派遣を積極的にサポートすることを確認した。領域会議は、計画研究とともに、領域外からの講演者4名の参加を得た。時間をかけた討論により、各研究グループの研究内容の相互理解が深まり、共同研究の計画も具体的に進展した。また、「配偶子制御セミナー」を2回開催し、領域外の研究者(国外より1名)を招聘し、関連分野の情報の蒐集をおこなった。以上のような領域活動を広く周知するためにホームページを立ち上げた。本研究は、総括班研究として新学術領域研究「配偶子制御」領域を運営するものである。本領域の特徴として、配偶子幹細胞(GSC : Gamete Stem Cells)を共通の研究対象として、成り立ちや目的を異にする研究者が集結し、新たな研究領域と研究者コミュニティーの醸成を目指している。本研究では領域内外の研究者間の連携や交流をサポートするとともに、研究の成果を、広く領域内外・国内外に対して発信する。2年度目である昨年度の領域活動の成果は以下の通りである。まず、計画研究を相補する研究者による9件の公募研究、さらに、総括班に8名のアドバイザー研究者を迎え、領域研究が一層充実した。これらの参加を得て、第2回の総括班会議および領域会議を開催し(10月13-14日、葉山)、領域の運営方針、方法について確認、議論するとともに、研究者間の理解を深めた。本年度は12回(うち国外よりの講演者6名)の「配偶子制御セミナー」を開催し、領域内外の研究者の情報の交換をおこなった。

9月17日には、日本動物学会第80回静岡大会にて第1回「配偶子制御シンポジウム」を「配偶子幹細胞制御に関する研究の新展開」のタイトルのもと開催し、領域の成果と活動理念をコミュニティーに発信した。更に、第4回Germ Cellの会(11月10-11日、岡崎市)を共催し、広く関連分野の交流を進めた。また、班員間の共同研究として展開しているトランスクリプトーム解析(セルソーティングやマイクロアレイ実験)、これらから得られたデータ解析のためのプラットフォームの充実を図った。更に、領域活動と成果をより広く発信するためにホームページの充実を行った。本研究が総括班研究として運営する新学術領域研究「配偶子制御」では、配偶子幹細胞(GSC : Gamete Stem Cells)を共通の研究対象として、成り立ちや目的を異にする研究者が集結し、新たな研究領域と研究者コミュニティーを醸成している。22年度は、前年に引き続き6件の計画研究、9件の公募研究、8名のアドバイザーにより領域を構成した。まず、総括班会議・領域会議を2度開催し(6月3-5日下田[第3回]、11月8日葉山[第4回])、領域の運営方針と構成員の研究の相互理解を深めた。また班員間の共同研究から得られたデータ解析のためのプラットフォームの充実を図った。年間を通じて6回の「配偶子制御セミナー」を行なうとともに、6月21日には、日本発生生物学会第43回大会(京都)にて第2回、11月12日には第55回日本生殖医学会総会・学術講演会(徳島)にて第3回の「配偶子制御シンポジウム」を開催し、領域の成果と活動理念をコミュニティーに発信した。3月23-26日にドレスデン技術大学(ドイツ)で開催された日独合同発生生物学会においては、関連する新学術領域と並んでブース発表の場を与えていただき、国際的に発信した。更に、海外渡航若手サポートにより、3名の若手研究者を国際学会に派遣し、次世代の育成に務めた。加えて、第5回Germ Cellの会(12月3-4日、北杜市、東京海洋大学大泉ステーション)を共催し、広く関連分野との交流を進めた。以上の領域活動と成果は、ホームページおよび日本語総説集(細胞工学特集「配偶子幹細胞」)を通じて、広く社会に発信した。本研究は、新学術領域研究「配偶子制御」を運営する総括班研究である。23年度は、前年に引き続いて6件の計画研究、新規に採用した10件の公募研究、8名のアドバイザーにより領域を構成した。まず、総括班会議・領域会議を開催し(平成23年12月5-7日浜松(第5回))、領域の運営方針と構成員の研究の相互理解を深めるとともに、班員間の共同研究から得られたデータ解析のためのプラットフォームの充実を図った。更に、関連研究分野において世界をリードしている内外の研究者を招聘し、国際シンポジウム“Germline-Specification, Sex, and Stem Cells-"を開催した(基礎生物学研究所と共催)。本領域の多様な構成を反映して、世界的にもユニークなメンバーが一堂に会し、本領域の目指す研究の今後の方向性を深く議論した。
ジエン-ジエノフィル複分解:新しいメチレン転位反応

ニトロアルケン類をジエンとし、アルケンをジエノフィルとする「ジエン-ジエノフィル複分解」の適用範囲が示された。この反応は三つの一連の素反応より構成されている。即ち、ジエンとジエノフィルの環化、1,3-プロトトロピーによる環化付加体の二重結合の異性化、最後に、逆ディールス-アルダー分解である。この反応により、「ジエン」としてのニトロアルケンの酸素が脱離し、「ジエノフィル」としてのアルケンのメチレン部がニトロアルケンのβ位に転位したα,β-不飽和オキシムとなり、アルケンのもう一方のメチレン部はニトロアルケンの酸素と結び付きカルボニル化合物になるという新規なものである。中間体の六員環環状ニトロン酸エステルの形成および分解を検討の結果、この反応が進行するための条件が明らかになってきた。まず、「ジエン」としてのニトロアルケンはβ位にp-ニトロフェニル基やベンゼンスルフォニル基程度の十分に電子吸引性の置換基を有することが必要である。このような置換基は「ジエン」と「ジエノフィル」の環化した中間体のプロトトロピーおよびそれに続く逆ディールス-アルダー分解を促進させる効果を持つためである。「ジエノフィル」としてはビニルエーテル類はどのようなものでも良好な試薬であることが判明した。アルデヒドより誘導されるビニルスルフィド類は、環化中間体の段階でその6位水素の酸性度が高くなり、この水素の脱離による望ましくない副反応を起こすことが確かめられた。エナミンは環化中間体が開環しやすいため「ジエノフィル」として使用できない。また、3,5-ジニトロ-2-ピリドンはエチルビニルエーテルと反応して環状ニトロン酸エステルを与えることを見いだした。1.ニトロオレフィンをジエン成分とする逆電子要請DielsーAlder反応付加体の合成について以下の新しい知見が得られた。(1)α,pージニトロ桂皮酸メチルはビニルエ-テル類の他にも、ビニルスルフィド類とも同様に反応して、環状ニトロン酸エステル体(I)を与えることがわかった。(2)α,pージニトロ桂皮酸メチルは、四塩化チタンを触媒として存在させながら反応させると、シクロヘキセンやスチレンの様なπ電子過剰でないオレフィンとも逆電子要請DielsーAlder付加をすることがわかった。(3)1ー置換3,5ージニトロー2ーピリドン(II)は二当量のエチルビニルエ-テルと反応し、1:2付加体(III)を与えることがわかった。IIIの構造をIR, ^'H NMR,元素分析などで同定した結果、IIIに環状ニトロン酸エステル構造が存在することが明らかになった。このことよりIIIの生成経路は以下の様であることがわかる。すなわち、最初のビニルエ-テルがIIの環の3位から6位のジエン部へ逆電子要請DielsーAlder付加し、その結果生じたピリドン環4位ー5位のニトロオレフィン部に二番目のビニルエ-テルが再び逆電子要請DielsーAlder付加し、環状ニトロン酸エステル構造を形成したと考えられる。2.上記1.で得られた環状付加体I,IIIをアルカリで処理し、複分解生成物を単離することを試みた。(1)α,pージニトロ桂皮酸メチルとビニルスルフィドの付加体、およびシクロヘキセン、スチレンとの付加体などはナトリウムエトキシドのような強アルカリと処理すると分解はするが、目的の複分解生成物は得られなかった。(2)ジニトロピリドンIIとエチルビニルエ-テルの1:2付加体IIIはアルカリ処理により、好収率で目的の複分解生成物が単離できた。

1.ニトロアルケンをジエン成分とする逆DielsーAlder付加体の生成について。(1)電子吸引性置換基を持たない単純なニトロアルケン類はビニルエ-テルとは付加しにくいが、高温下で反応させると、目的の1:1環化付加体Iは全く得られないが、Iにビニルエ-テルがさらに1.3双極子付加した1:2付加体を与えることがわかった。単純なニトロアルケンよりIを得るためには、ルイス酸触媒を使った温和な条件下での反応を検討する必要がある。(2)上記1:2付加体IIは飽和OーNーO結合を有する不安定な構造を持っており、その反応性に興味を持ち、IIの酸触媒による分解反応を検討したところ、予想通りNーO結合開裂を含む分子内酸化還元反応を起こすことが明らかになった。しかし、この分解生成物の完全な構造同定には到っておらず、今後の課題としたい。(3)3,5ージュトロー2ーピリドンはそのC(3)ーC(6)部分をジエン成分として、求核性の低いPーXトキシスチレンと逆電子要請DielsーAlder付加し双環性のニトロアルケンIIIを安定に与えることがわかった。IIIはそのニトロアルケン部分をジエン成分として、エチルビニルエ-テルと反応し六員環境状ニトロン酸エステルを与える。しかし、この化合物をアルカリ処理しても所期の分解反応生成物は得られなかった。2.α,Pージニトロ桂弥酸メチルをジエン成分とした1:1環状付加体の分触について。このニトロアルケンはルイス酸触媒下、単純なシクロアルケンと反応し、1:1環化付加体IVを与えるが、IVのナトリウムアルコラ-トによる分解では目的の分解生成物が低収率ながらできていることが、これを2,4ージニトロヒドラゾンへ導くことにより確認できた。一方、IVをさらに強い塩基であるTーBuOKで分解すると、全く異なった物質に変換した。この生成物の構造は現在、同定中である。1.1-ベンゼンスルホニル-〓-〓トロプロペン(l)をジエンとし、エチルビニルエーテルをジェノフィルとする「ジエン-ジエノフィル複分解」を検討した。長時間(一週間)反応させることにより、室温という温和な条件下で、付加-異性化-逆ディールスアルダー分解の本反応の全ての素反応がワンポットで進行し、最終生成物のマ-ベンゼンスルホニル-3-ヒドロキシイミノ-1-ブテンが油状生成物として得られた。この化合物は2,4-ジニトロフエニルヒドラジン処理して単離確認した。これまでのニトロアルケンをジエンとした本反応では、環化付加体の5,6-ジヒドロ-4H-1,2-オキサジン1-オキシドを一度単離し、それを強塩基で処理することにより、逆ディールス-アルダー分解を起こさせていた。それに比べ、lをジエンとした反応では強塩基による処理が必要でないことが判明したことな非常に意義が深い。ニトロアルケンのB一位にスルホニル基やカルボキシル基の様な電子吸引性置換基を有する化合物が、本反応のジエンとして有効であることを示す結果である。2.α,P-ジントロケイヒ酸メチルとエチルビニルスルフィドの1:1環化付加体(2)を炭酸カリウムで処理すると期待した複分解生成物は全く得られず、2が異性化した6エチルチオ-6-ヒドロキシル-3-メトキシカルボニル-4-(4-ニトロフエニル)-5,6-ジヒドロ-4H-1,2-オキサジンが得られた。これは2の6位水素が6位置換基のエチルチオ基により活性化され、プロトンとして引き抜かれたことによる反応生成物であると理解できる。
神経因性疼痛患者に対する経皮的クロニジンの鎮痛効果と作用機序の臨床的解析

クロニジン添加リドカインを経皮投与した場合、リドカイン単独経皮投与に比べ鎮痛効果が増加するかを検討した。まずは、健常ボランティアの右前腕内側に10%リドカインゲルを1時間塗布し、同部での電流知覚閾値(2000Hz、250Hz、5Hz)と知覚テスト(触覚、温覚、冷覚、痛覚)、サーモグラフィーによる皮膚温度を塗布前と除去直後から5時間まで1時間おきに測定した。同様に、クロニジン300μg添加10%リドカインゲルにても同様に塗布、測定を行った。10%リドカイン単独投与群では、電流知覚閾値は5Hz(無髄C神経)で10%リドカインゲル塗布開始より3時間まで神経遮断効果が持続した。一方、250Hzでは塗布開始より5時間まで遮断効果が持続した。2000Hz(太い有髄A神経)では塗布開始より6時間まで遮断効果が持続し、5Hz(無髄C神経)と250Hz(細い有髄A神経)よりも効果時間が長かった。知覚テストでは全感覚が測定時間内有意に低下したままであった。クロニジン300μg添加10%リドカインゲル群では、電流知覚閾値は全ての周波数で10%リドカインゲル単独投与群に比べ、神経遮断効果が有意に延長した。知覚テストにおいても、全感覚の低下の程度が大きかった。塗布部位の皮膚温はリドカインゲル単独投与群に比べ、低い傾向にあった。リドカインゲルにクロニジンを添加し経皮投与した場合、リドカイン単独に比べ鎮痛効果は増強した。サーモグラフィー上、皮膚温は若干低下していたことから、クロニジンによる末梢血管収縮作用により、リドカインの局所蓄積量が増加したことが鎮痛効果増強の一因と考えられた。クロニジンを経皮投与した場合の鎮痛効果とリドカインと併用した場合の鎮痛効果増強作用の2点について定量的評価を行った。(1)クロニジンを経皮投与した場合の鎮痛効果について対象は健常ボランティア5名。健常ボランティアの右前腕内側にクロニジン300μgゲルを塗布しプラスチックフィルムにて1時間覆い、その後除去した。塗布部位と非塗布部位(左前腕内側)にて電流知覚閾値(2000、250、5Hz)と知覚テスト(触覚、温覚、冷覚、痛覚)、サーモグラフィーによる皮膚温度を除去後5時間まで1時間おきに両部位で測定した。また、血圧、意識状態、塗布部位の状態も観察した。塗布側と非塗布側の電流知覚閾値、各種知覚の程度、サーモグラフィーによる皮膚温は測定時間中、両部位で有意な変化は認められなかった。血圧、意識状態、塗布部位の状態も異常は認められなかった。(2)リドカインと併用した場合の鎮痛効果増強作用について対象は健常ボランティア4名。同一被験者にて、10%リドカインゲル1g単独、10%リドカインゲル1gにクロニジン300μgを添加したものを2週間以上の間隔をあけて(1)と同様に塗布、測定を行った。10%リドカインゲル1g単独投与した場合、電流知覚閾値は2000、250、5Hzでそれぞれ除去後2、4、5時間まで有意に上昇した。各種知覚の程度もすべて低下した。10%リドカインゲル1gにクロニジン300μgを投与した場合は、リドカイン単独投与した時と比べ、神経遮断効果は強い傾向にあったが統計学的には有意差は認められなかった。
アルカリ骨材反応により劣化したコンクリート構造物の診断技術の開発

北陸地方等のコンクリート構造物の維持管理上、問題となっているアルカリ骨材反応で劣化した構造物を対象に、低コストで適切な維持管理手法の開発が必要である。本研究では、コア削孔による応力解放法を用いた膨張ひずみの測定手法を検討した。その結果、埋込みセンサを用いることでコンクリート内部の解放ひずみが測定できること、3次元応力解析を用いて鉄筋応力や自由膨張量を算定できることを確認した。コア削孔による応力解放法を用いたコンクリート構造物のアルカリ骨材反応(ASR)による膨張ひずみ量の測定手法の開発を目的に、3つの課題の解決に取り組んだ。課題は、1計測方法の確立、2算定手法の確立、3構造物への適用である。1計測方法の確立:膨張コンクリートを用いた拘束供試体を製作し、(a)表面ひずみ計測法と(b)オーバーコアリング法によるコア削孔実験を実施した。(a)表面ひずみ計測法では良好なひずみデータが得られたが、コンクリートの乾燥収縮の影響を受けることやコンクリート内部に比べて解放ひずみが小さくなることが課題となった。(b)オーバーコアリング法ではひずみゲージを接着したエポキシ樹脂の剛性が低いことや計測の作業性が低いことが問題であった。そのため、新たに(c)埋込みセンサ法を開発した。(c)埋込みセンサ法とは長さ30mmの埋込み型ひずみ計を専用の治具で固定し、先行コア内に埋め込んで計測装置として用いる方法である。これにより、内部ひずみを良好に計測することが可能になった。2算定手法の確立:課題1で実施した拘束供試体のコア削孔実験をモデル化した3次元応力解析を実施し、内部ひずみ(自由膨張ひずみ)の入力に対して、想定通りの解放ひずみが得られる評価方法を確立した。3構造物への適用:鉄筋コンクリート供試体を用いることで、拘束鉄板に代えて鉄筋による拘束実験を行った。鉄筋による支圧力の角度を45度と仮定することで、拘束ひずみと解放ひずみがおおむね一致する結果が得られた。上記のいずれの実験も、ASR劣化を模擬した膨張コンクリートで実施したが、ASR劣化のためのコンクリートは、反応性骨材を用いた角柱供試体で膨張ひずみの計測を行った。コア削孔による応力解放法を用いたASR膨張ひずみ量の測定手法の開発を目的に、3つの課題の解決に取り組んでいる。課題は、(1)計測方法の確立、(2)算定手法の確立、(3)構造物への適用である。(1)計測方法の確立:膨張コンクリートを用いた拘束供試体を製作し、(a)表面ひずみ計測法と(b)オーバーコアリング法によるコア削孔実験を実施した。そのため、新たに(c)計測モールド法の適用を検討している。(c)計測モールド法とは直径50mmの円柱モルタルの中に埋込み型ひずみ計を配置し、モルタルを先行コアに埋め込んで計測装置として用いる方法である。(2)算定手法の確立:課題(1)で実施した拘束供試体のコア削孔実験をモデル化した3次元応力解析を実施し、内部ひずみ(自由膨張ひずみ)の入力に対して、想定通りの表面ひずみ(解放ひずみ)が得られる評価方法を確立した。解析結果は、課題(1)で挙げた課題を除き、実験結果と整合する結果となった。(3)構造物への適用:実構造物を模擬した鉄筋コンクリート供試体について、オーバーコアリング法によるコア削孔を実施した。課題(1)で実施した拘束供試体との違いを把握した。上記のいずれの実験も、ASR劣化を模擬した膨張コンクリートで実施したが、ASR劣化のためのコンクリートは、反応性骨材を取り寄せて角柱供試体で膨張ひずみの計測を継続している。実施項目「(1)計測方法の確立」として、(a)表面ひずみ計測法と(b)オーバーコアリング法による2つの方法でコア削孔実験を試みた。やや遅れている理由は、前記の2つの計測方法についての課題を解決するために、新たな方法「(c)計測モールド法」の適用を検討したことである。前記の2つの方法と同様に、要素実験として膨張コンクリートを用いた拘束実験で、(c)計測モールド法を使用した計測方法を確実に確立したのちに、実施項目

「(3)構造物への適用」に取り掛かる予定であり、実施項目(3)の着手が遅れている。本年度の研究は、当初の研究課題3つを一部修正して行う。(1)計測モールド法を用いた実験:膨張コンクリートおよびASRコンクリートの拘束供試体を用いたコア削孔実験を行い、「計測モールド法」による計測方法を確立する。(2)算定手法の確立:計測モールド法の実験を応力解析で再現する。加えて、実構造物への適用を考慮した算定手法を確立する。(3)構造物への適用:実構造物を模擬した鉄筋コンクリート供試体を製作し、コア削孔実験を行う。なお、研究課題(1)「計測モールド法」の検討で費用を要したため、鉄筋コンクリート供試体の製作は規模を縮小して行う予定である。24年度の主な研究費の使用計画・埋込み型ひずみ計200千円・拘束供試体の製作200千円・鉄筋コンクリート供試体の製作500千円
プラズマ電子加速技術を応用したスーパーカミオカンデ検出器較正の研究

本研究は、第一に電子ビームをプラズマ中に入射した際に励起される大振幅プラズマ波により加速された電子を用いた新たな検出器較正装置の開発を目的とする。本年度は、前年度に引き続きプラズマ発生装置の開発研究を行なった。ここではまず、前年度における議論の結果採用したポリプロピレン製Capillary(細管)に高電圧をかけることにより表面を溶解しプラズマを生成するCapillary放電方法の試験、および、使用する真空チェンバの組み立てを、連携研究者と協力して行った。本装置における重要な点は、安定した運転が可能であること、電子ビームの導入が容易であること、Capillaryの設置および調整が容易であること、プラズマ発生の確認や電流値や真空度の測定などの様々なモニタが正しく作動することである。それらの点に留意して試運転を行った。同時にシミュレーションを行い、電子が加速されるための条件の調査も行った。予定していた電子ビームラインへの装着については、今年度中に行うことができなかったが、必要な実験装置はすでに揃っており準備も完了しているので、今後も引き続き研究を行なう予定である。本研究における第二の目的は、将来的なレーザーによるプラズマ加速技術を用いた検出器較正装置の基礎的研究であるが、どのような設計が現実的に可能であるか、また実際の装置の配置などについても連携研究者と議論を行った。さらに関連する国際会議に参加し、外部研究者と議論を行うことで、様々な助言を得ることもできた。本年度は、特にプラズマ発生装置の開発研究を行なった。本研究分野ではこれまでに様々な方法での発生装置が使用されているが、これまでの研究状況を精緻に調査し、かつ、連携研究者と様々な議論をおこなった結果、実施計画にも記述したCapillary放電によるプラズマ生成法を採用した。これはポリプロピレン製Capillary(細管)に高電圧をかけることにより表面を溶解しプラズマを生成する方法である。これを採用した理由は、すでに技術がある程度確立されているだけでなく、より高い単一電子エネルギーの生成にも成功していることから、将来的な発展も見込まれること、同時に、装置の製作が安価で容易であること、また、連携研究者がこの方法の経験があることからなどである。また、平行して、真空チェンバーの製作も行なった。ここでも、連携研究者と様々な議論を通して、より良い装置の開発を行なった。まず、安定した運転が可能であること、電子ビームの導入が容易であること、Capillaryの設置および調整が容易であること、プラズマの発生を実際に確認できること、電流値や真空度の測定など様々なモニタの設置がなされていることなどに留意し、装置を開発した。さらに、必要な電子機器の試運転およびその作動に必要なソフトウェアの開発もあわせて行い、正常に動作していることも確認できた。来年度には、実際に開発した装置の運転を予定しているが、今年度の研究によりその準備は整った。
腫瘍選択的高ＬＥＴ高ＲＢＥ粒子線治療による治療抵抗性グリオーマ幹細胞制圧の試み

神経膠芽腫(GBM)株A172とこの細胞株より誘導しGSCで、CD133等のマーカーの変化確認しGSCのstemnessを確認した。この2種類の細胞株にほう素化合物非存在下で等物理線量のX線と中性子線を照射し、colony forming assay, gamma H2A assayでの細胞のダメージを評価した。本系における細胞障害の担い手は窒素中性子捕捉反応により生じる、高LET粒子線である陽子線であり、同一物理線量ではX線より細胞障害活性が高く、DNA double strand brakeの効率も高いことを示した。すなわち、高LET粒子線はGSCのX線抵抗性を克服することを証明した。神経膠芽腫が難治である原因はその浸潤的発育と、その腫瘍細胞内にわずかに存在するグリオーマ幹細胞が、放射線治療および化学療法に抵抗性を示すことによる。一方、腫瘍選択的粒子線治療である硼素中性子捕捉療法(BNCT)における殺細胞効果の担い手であるα,Li粒子は高LET,高RBEの粒子線であり、放射線(X線)治療抵抗性を示す腫瘍にも強い抗腫瘍効果を示すことが期待される。一方グリオーマ幹細胞における薬剤抵抗性の機序の一つに、薬剤排出能の亢進が考えられる。本研究ではグリオーマ幹細胞での薬剤排出能の制御による硼素化合物の細胞内集積および分子生物学的手法による新規硼素化合物作成とBNCTによる組み合わせにより、グリオーマ幹細胞の治療抵抗性の克復を試みることを研究の目的とする。既に入手していたGSC株がヒトGSCではなくラット由来細胞であることが平成23年9月に判明。以後、培養株化GBM細胞よりGSC様細胞の誘導樹立を行い、6ヶ月の遅延が生じた。何とか培養株化GBM細胞よりGSC様細胞の誘導樹立に成功し、その幹細胞としての性格を同定できたのが、平成24年9月であった。当初の目的通り、ほう素化合物のアミノ酸修飾による、GSCへのほう素化合物の集積増強は確認できたが、常時一定量のほう素(B10)を安定してGSC, GBMの細胞内に導入することは、困難であり、X線とBNCTでの主たる細胞破壊効果の担い手であるα、Li-線を同一の物理線量で比較することは困難であることが判明した。よって方針を変えて以下の研究により高LETの陽子線を利用した実験系に変更した。神経膠芽腫が難治である原因はその浸潤的発育と、その腫瘍細胞内にわずかに存在するグリオーマ幹細胞(GSC)が、放射線治療および化学療法に抵抗性を示すことによる。一方、BNCTにおける殺細胞効果の担い手であるα,Li粒子は高LETの粒子線であり、放射線(X線)治療抵抗性を示す腫瘍にも強い抗腫瘍効果を示すことが期待される。一方GSCにおける薬剤抵抗性の機序の一つに、薬剤排出能の亢進が考えられる。本研究ではGSCの薬剤排出能の制御による硼素化合物の細胞内集積および分子生物学的手法による新規硼素化合物作成とBNCTによる組み合わせにより、グリオーマ幹細胞の治療抵抗性の克復を試みることを研究の目的とした。しかし、ほう素化合物のアミノ酸修飾による、GSCへの集積増強は確認できたが、常時一定量のほう素を安定してGSC, GBMの細胞内に導入することは困難であり、X線とBNCTでの主たる細胞破壊効果の担い手であるα、Li-線を同一の物理線量で比較することは困難であることが判明した。すなわちGBM細胞株U251より、GSC誘導用の無血清培地でGSCを誘導した。この細胞株でのSOX-2、CD133等のマーカーの変化は確認しGSCのstemnessを確認した。後者での主たる細胞障害の担い手は窒素中性子捕捉反応により生じる、高LET粒子線である陽子線であり、同一物理線量ではX線より細胞障害活性が高く、DNA double strand brakeの効率も高いことを示した。神経膠芽腫内にわずかに存在するグリオーマ幹細胞が、放射線治療および化学療法に抵抗性を示し、難治となっている。

本研究ではグリオーマ幹細胞での薬剤排出能の制御による硼素化合物の細胞内集積および分子生物学的手法による新規硼素化合物作成とBNCTによる組み合わせにより、グリオーマ幹細胞の治療抵抗性の克復を試みることが研究の目的である。当初の目的通り、ほう素化合物のアミノ酸修飾による、GSCへのほう素化合物の集積増強は確認できたが、常時一定量のほう素(B10)を安定してGSC, GBMの細胞内に導入することは、困難であり、X線とBNCTでの主たる細胞破壊効果の担い手であるα、Li-線を同一の物理線量で比較することは困難であることが判明した。よって方針を変えて以下の研究により高LETの陽子線を利用した実験系に変更した。すなわちGBM細胞株A172より、GSC誘導用の無血清培地でGSCを誘導した。この二つの細胞株でのSOX-2、CD133等のマーカーの変化は確認しており、この誘導法でのGSCのstemnessは確認できた。この2種類の細胞株にほう素化合物非存在下で等物理線量のX線と中性子線を照射し、colony forming assay,での細胞のダメージを評価し、prelimminaryではあるが、同一物理線量ではX線より細胞障害活性が高かった。当初の目的で入手したグリオーマ幹細胞がラットグリオーマ細胞のコンタミネーションであることが判明したこと。および常時一定量のほう素(B10)を安定してGSC, GBMの細胞内に導入することは、困難であり、X線とBNCTでの主たる細胞破壊効果の担い手であるα、Li-線を同一の物理線量で比較することは困難であることが判明したこと。25年度が最終年度であるため、記入しない。方針を変えて以下の研究により高LETの陽子線を利用した実験系に変更した。この2種類の細胞株にほう素化合物非存在下で等物理線量のX線と中性子線を照射し、colony forming assay,での細胞のダメージを評価する。この系での主たる細胞障害の担い手は窒素中性子捕捉反応により生じる、高LET粒子線である陽子線であり、同一物理線量ではX線より細胞障害活性が高かった。gamma H2A assayを行い、DNA double strand brakeの効率も高いことを残りの研究期間で明らかにし、上記データをまとめたい。また、余力があればGSCの脳内移植モデルでのBNCTの治療実験を行う。GBM細胞株A172より、GSC誘導用の無血清培地でGSCを誘導する。親株とこの細胞株でのSOX-2、CD133等のマーカーの変化は確認しており、この誘導法でのGSCのstemnessは確認できた。
牛車腎気丸に含有される新規標的分子のナトリウムチャネルを介する疼痛制御機構の解明

牛車腎気丸は末梢神経障害の治療に使用されている。しかし、牛車腎気丸が神経因性疼痛をどのように抑制するかは依然として不明である。本研究は、電位依存性ナトリウムチャンネル電流に対する牛車腎気丸および牛車腎気丸含有の成分の効果を調べた。牛車腎気丸および牛車腎気丸に含まれる複数の成分によるナトリウムチャネルNav1.7電流阻害を介して、神経因性疼痛の抑制を示し得ることを示唆した。HEK293細胞にNav1.7を安定化発現させた。その細胞を用いて、牛車腎気丸およびブシ末におけるナトリウムチャネルに対する作用を電気生理学的に検討した。牛車腎気丸によるNaV1.7電位依存性ナトリウムチャネル電流の抑制効果を経時的に観察したところ、ナトリウムチャネル電流の抑制は牛車腎気丸の投与により生じた。牛車腎気丸におけるナトリウムチャネルの不活性化に関しては、1mg/mL牛車腎気丸存在下では、不活性化曲線における過分極側へのシフトが認められた。Nav1.7安定化発現HEK293(ヒト胎児腎細胞)細胞株を用い、附子末と附子末を含有しない六味丸のNav1.7に対する作用をパッチクランプ法を用いて電気生理学的に検討した。温熱抽出された附子末の投与により、Nav1.7チャネルのピーク電流は、(0.003mg/mL、0.006mg/mL、0.015mg/mL、0.03mg/mL、0.3mg/mL、3mg/mL)用量依存的な抑制が認められた。用量反応曲線からEC50は0.01751 mg/mLであった。附子末の不活性化曲線には、0.3mg/mL附子末存在下では、不活性化曲線の過分極側へのシフトが見られた。さらに、六味丸の投与により、Nav1.7チャネルのピーク電流は、(0.0125mg/mL、0.025mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL)用量依存的な抑制が認められた。。用量反応曲線からEC50は0.22689 mg/mLであった。六味丸の不活性化曲線は、controlに比べ、0.5mg/mL六味丸存在下では、附子末と異なり不活性化曲線の過分極側へのシフトは認められなかった。以上のことより、附子末および六味丸の投与により、Nav1.7チャネルのピーク電流の濃度依存的な抑制が認められた。また、附子末を含まない六味丸にもNav1.7チャネルの抑制に関与している生薬が存在すると考えられた。さらに、附子末存在下では、不活性化曲線の過分極側へのシフトが見られ、六味丸存在下では、不活性化曲線の過分極側へのシフトは認められなかったことから、附子末に不活性化曲線の過分極側へのシフトさせる成分が含まれていると考えられた。Nav1.7とTRPチャネル共発現する。細胞の作成に手間取っているが、概ね研究は順調に推移している。Nav1.7安定化発現HEK293細胞(ヒト胎児腎細胞)に対する牛車腎気丸と六味丸がナトリウムチャネルを抑制することが昨年までにわかった。本年度は、Nav1.7安定化発現HEK293細胞株を用い、附子末に対する作用を電気生理学的に検討した。附子末の投与により、Nav1.7チャネルのピーク電流は、controlに対して0.03mg/mLの附子末存在下では、Nav1.7電流の減少が見られた。薬液の濃度を変えて検討を行ったところ、Nav1.7電流の減少は、0.003mg/mL、0.006mg/mLの濃度では抑制が見られなかったが、0.015mg/mLの濃度で22±12%の抑制が見られ、0.03mg/mLでは43±8%の抑制、0.3mg/mLでは52±17%の抑制、3mg/mLでは57±10%の抑制であり、濃度依存的な抑制傾向が確認された。その結果からEC50は0.01751 mg/mLであった。また、附子末によるNav1.7電位依存性Na+チャネル電流の抑制効果を経時的に観察したところ、電位依存性ナトリウムチャネル電流の抑制は附子末の処置によって速やかに生じ、また附子末をwash outすることにより消失した。更に、附子末によるNav1.7チャネルの不活性化に対する影響を検討したところ、0.5mg/mL附子末投与後のNav1.7peak電流では32.6±0.09%の抑制が認められた。また、controlに比べ、0.5mg/mL附子末存在下では、投与前投与後の-80mVでのpeak電流Imaxとし、それぞれのカレントの抑制割合をプロットしたところ、約10mVの不活性化曲線の過分極側へのシフトが認められた。Nav1.7安定発現細胞に対する作用は概ね順調であったが、有効成分の抽出に時間がかかっている。今後は有効成分の抽出ができ次第残りの研究を進めていく。HEK293細胞にナトリウムチャネルのサブタイプであるNav1.7を発現させ、パッチクランプ法を用いて、電気生理学的にナトリウムチャネルのサブタイプであるNav1.7に対する牛車腎気丸およびその生薬成分について検討した。牛車腎気丸はNav1.7ナトリウムチャネル活性化のピーク電流を抑制し、不活性化曲線を過分極側へシフトさせた。

さらに、六味丸はNav1.7ナトリウムチャネル活性化のピーク電流を抑制したが、不活性化曲線には影響を与えなかった。また、牛車腎気丸の生薬成分である、地黄、牛膝、山茱萸、山薬、車前子、沢瀉、茯苓、牡丹皮、桂皮、附子の各種に置いて検討を行った。附子、牡丹皮、桂皮、車前子はNav1.7ナトリウムチャネル活性化を抑制する作用が認められた。さらに、牛車腎気丸で認められる不活性化曲線の過分極側へのシフトは附子のみで認められた。附子に含まれる、ネオリン、牡丹皮に含まれるペオノール、桂皮に含まれるケイヒアルデヒドにもNav1.7ナトリウムチャネル活性化のピーク電流を抑制が認められた。以上の結果より、牛車腎気丸はNav1.7ナトリウムチャネル活性化と不活性に関与し、痺れや痛みの抑制の一部関与している可能性があることが示唆された。しかし、各種生薬成分には様々な化合物が存在するため、疼痛制御機構の解明のため、さらなる探索が必要である。牛車腎気丸は末梢神経障害の治療に使用されている。しかし、牛車腎気丸が神経因性疼痛をどのように抑制するかは依然として不明である。本研究は、電位依存性ナトリウムチャンネル電流に対する牛車腎気丸および牛車腎気丸含有の成分の効果を調べた。牛車腎気丸および牛車腎気丸に含まれる複数の成分によるナトリウムチャネルNav1.7電流阻害を介して、神経因性疼痛の抑制を示し得ることを示唆した。Nav1.7安定化発現HEK293細胞における電気生理学的研究は概ね予定通りに進行しているが、Nav1.7チャネルとTRPチャネルを特異的遺伝子をテトラサイクリンでon/offする細胞の作成に手間取っており、Nav1.7とTRPチャネル共発現による、牛車腎気丸やその他の生薬のによるの相互作用を電気生理学的に検討する項目の進行が遅れている。六味丸を構成する生薬の中から、ナトリウムチャネル電流の抑制に関与する生薬成分を電気生理学的に探索していく。附子末に対する作用が明らかとなったので、六味丸に含まれている生薬成分、ジオウ、サンシュユ、サンヤク、タクシャ、ブクリョウ、ボタンピの作用について今後は明らかにしていく。中枢神経薬理六味丸にもナトリウムチャネル抑制物質が存在することが、明らかとなったため、六味丸の6つのどの生薬成分に抑制物質が含まれているを検討していく。Nav1.7とTRPチャネル共発現細胞の作成の進行が遅れているために、使用する金額が抑えられている。牛車腎気丸の有効成分の抽出に時間がかかっており、その成分が抽出されれば研究は遂行される。マニピュレーターと防振台などの購入は済んでいる。実験の進行状況にも記したが、TRPチャネルとナトリウムチャネル(Nav1.7)の共発現の項目が遅れており、この細胞実験に使う金額が残ってしまった。今後、細胞の作成のにDNAの購入などで使用金額が増える予定である。牛車腎気丸の生薬からの有効成分が抽出された後、研究を推進して行く。次年度にこの計画を進行していくため、使用差額はなくっていく予定である。
糖鎖細胞接着の分子機構に関する研究

白血球の血管内皮細胞上でのローリング現象や炎症部位への遊走、リンパ節内高内皮細静脈上での認識現象、血小板の凝集、がんの血行性転移など、免疫系を介する様々な生命現象や病態に深く関与するセレクチン・ファミリー(C-型レクチン)を標的として、糖鎖細胞接着の分子機構を明らかにした。即ち、(1)E-,P-,L-セレクチンに共通する糖鎖リガンドであるシアリル・ルイスX構造中のシアル酸、ガラクトース、フコース、及びグルコサミンを系統的に構造修飾し、シアル酸のカルボキシル基、ガラクトースの4,6位水酸基、フコースの2,3,4位水酸基がE-セレクチンの認識に必須であること、フコースの水酸基がCa^<2+>依存性に直接関与すること、(2)スルファチドとの比較から、カルボキシル基と硫酸基の役割、及びそのカウンターパートとしての塩基性アミノ酸の存在を分子、官能基レベルで解明した。(3)さらに、本年度の大きな成果として、六糖性シアリル・ルイスXのガラクトースかグルコサミンの6位水酸基、又はその両方に硫酸基を導入して、いわゆるキャッピングによるレセプター特異性の制御について新しい知見を得た。すなわち、3a)グルコサミンの6位水酸基が硫酸化を受けると、ヒトL-セレクチンの認識特異性が大きく増強されること、3b)ガラクトースの6位水酸基の硫酸化によって、E-セレクチンへの結合親和性が消失することを世界で初めて明らかにした。従って、セレクチン・ファミリーと糖鎖との接着機構には、フコースを含むカルシウム依存的機構とスルファチドの様なカルシウム非依存的機構、シアリル・ルイスXとスルホシアリル・ルイスXに見られるコア糖鎖の硫酸化によるキャッピングを介するレセプター特異性の制御が、分子及び官能基レベルで行われていることを合成糖鎖を用いて解明することができた。(4)一方、シアロアドヘシン・ファミリー(I-型レクチン)の糖鎖認識特異性を解明する研究の一環として、コリン作動性ニューロンに特異なポリシアロガングリオシドGQ1bαが、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)に対して極めて高い結合親和力を有することを世界で初めて明らかにした。当初に計画した研究目的はほぼ達成され、セレクチンを標的とした糖鎖細胞接着の分子機構が明らかになった。すなわち、E-セレクチンが完全にカルシウム依存的接着を示すのに対し、L-,P-セレクチンではその依存度が低下した。この知見は、フコースのデオキシ化により得た結果と相関しており、フコースの水酸基がカルシウム依存性に深く関与していることを世界で初めて分子レベルで証明した研究として高く評価される。しかし、セレクチン-糖鎖複合体の結晶化に至っていないために、カウンターパートとしてのアミノ酸残基の特定にはまだ時間を要する。また本研究の大きな成果の一つとして、セレクチンを介する細胞接着阻害剤の開発な挙げられる。特にスルホールイスX類縁体は、抗炎症剤として幅広い応用実験に供されている。他方、スルファチド類縁体を用いたセレクチンとの結合活性においては、特にL-セレクチンが高い親和性を示し、この結合がカルシウム非依存的に進行することを分子レベルで明らかにした。従って、セレクチンと糖鎖との接着機構には、カルシウム依存的機構とカルシウム非依存的機構があり、生体機能の発現が制御されているものと考えられる。一方、シアロアドヘシン・ファミリーの糖鎖認識特異性を解明する研究の一環として、ハイブリッド型ポリシアロガングリオシドの系統的合成法について検討し、コリン作動性ニューワンに特異的なGQ1bαの全合成ルートを確立した。

従って、セレクチン・ファミリーと糖鎖との接着機構には、フコースを含むカルシウム依存的機構とスルファチドの様なカルシウム非依存的機構、シアリル・ルイスXとスルホシアリル・ルイスXに見られるコア糖鎖の硫酸化によるキャッピングを介するレセプター特異性の制御が、分子及び官能基レベルで行われていることを合成糖鎖を用いて解明することができた。(4)一方、シアロアドヘシン・ファミリー(I-型レクチン)の糖鎖認識特異性を解明する研究の一環として、コリン作動性ニューロンに特異なポリシアロガングリオシドGQ1bαが、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)に対して極めて高い結合親和力を有することを世界で初めて明らかにした。白血球の血管内皮細胞上でのローリング現象や炎症部位への遊走、リンパ節内高内皮細静脈上での認識現象、血小板の凝集、がんの血行性転移など、免疫系を介する様々な生命現象や病態に深く関与するセレクチン・ファミリー(C-型レクチン)を標的として、糖鎖細胞接着の分子機構を明らかにした。そなわち、(1)E-,P-,L-セレクチンに共通する糖鎖リガンドであるシアリル・ルイスX構造中のシアル酸、ガラクトース、フコース、及びグルコサミンを系統的に構造修飾し、シアル酸のカルボキシル基、ガラクトースの4,6位水酸基,フコースの2,3,4位水酸基がE-セレクチンの認識に必須であること、フコースの水酸基がCa^<2+>依存性に直接関与すること.(2)スファチドとの比較から、カルボキシル基と硫酸基の役割、及びそのカランターパートとしての塩基性アミノ酸の存在を分子、官能基レベルで解明した。(3)さらに、本年度の大きな成果として、六糖性シアリル・ルイスXのガラクトースかグルコサミンの6位水酸基、又はその両方に硫酸基を導入して、いわゆるキャッピングによるレセプター特異性の制御について新しい知見を得た。すなわち、3a)グルコサミンの6位水酸基が硫酸化を受けると、ヒトL-セレクチンの認識特異性が大きく増強されること、3b)ガラクトースの6位水酸基の硫酸化によって、E-セレクチンへの結合親和性が消失することを世界で初めて明らかにした。従って、セレクチン・ファミリーと糖鎖との接着機構には、フコースを含むカルシウム依存的機構とスルファチドの様なカルシウム非依存的機構、シアリル・ルイスXとスルホシアリル・ルイスXに見られるコア糖鎖の硫酸化によるキャッピングを介するレセプター特異性の制御が、分子及び官能基レベルで行われている事を合成糖鎖を用いて解明することができた。(4)一方、シアロアドヘシン・ファミリー(I-型レクチン)の糖鎖認識特異性を解明する研究の一環として、コリン作動性ニューロンに特異なポリシアロガングリオシドGQlbαが、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)に対してきわめて高い結合親和力を有することを世界で初めて明らかにした。
コンデンシンによる染色体凝縮の制御機構

染色体凝縮は、細胞分裂の際に複製されたゲノムを2つの娘細胞に正確に分配するための基本的な細胞機能の1つである。近年の研究から、酵母からヒトにまで広く保存されたタンパク質複合体であるコンデンシンが染色体凝縮で中心的役割を果たすことがわかってきた。本研究では、出芽酵母をモデルとしてDNAに結合したコンデンシンが細胞分裂期にクロマチンDNAを折りたたむことを見出した。コンデンシンによるクロマチンDNAの折りたたみが、分裂期に観られる染色体凝縮の基本的な素反応の1つと考えられる。また、G1期においてもコンデンシンは染色体の折りたたみを制御していることを見出した。本研究では出芽酵母をモデルに、染色体凝縮で中心的役割を果たすコンデンシンが如何にしてクロマチンDNAをコンパクトに収納するのか、その機構の解明を目的とする。出芽酵母ゲノム上でコンデンシンは、1セントロメア、2ゲノム上に散在するtRNA遺伝子(tDNA)、及び3リボソームRNA遺伝子(rDNA)反復領域にあるRFBに結合する。中でも腕部上にあるtDNAに対するコンデンシンの結合は、RFB(単一コピー)のそれに対する1/10以下でしかない。そこで、本研究では、人工的にRFBを任意の染色体腕部上に複数挿入し、それらに結合したコンデンシンが、染色体凝縮に果たす役割を、chromosome conformation capture (3C)法によって調べた。昨年度までに、腕部上に約16kb隔てて2つのRFBを挿入すると、それらにコンデンシンが結合して、分裂中期(metaphase)に2つのRFBが物理的に相互作用して、その間のクロマチンが折りたたまれることを見出した。これが染色体凝縮の素反応の1つと考えられる。今年度は、細胞周期でRFB - RFB間相互作用の変化を調べた。その結果、1間期(G1)でもRFB間の相互作用が検出されること、2分裂中期では、間期に比較して相互作用が増加すること、3分裂後期(anaphase)ではRFB - RFB間の相互作用だけではなく、その周辺のクロマチン間の相互作用も上昇することが解った。この結果から、コンデンシンにより、間期でもクロマチン繊維は一定程度折りたたまれた状態にあり、分裂期に入るとより高密度に折りたたまれると考えられる。さらに、分裂中期から後期なると、RFB - RFB間での相互作用だけではなく、RFBに挟まれた領域のクロマチン繊維同士が複雑に相互作用して、RFBを基とした単純なループ構造から、より複雑に絡まった状態へと移行していることを示唆している。本研究では出芽酵母をモデルに、染色体凝縮で中心的役割を果たすコンデンシン複合体が如何にしてクロマチンDNAを折りたたみコンパクトに収納するのか、分子レベルでその機構と制御を調べることを目的とした。出芽酵母ゲノムのリボソームRNA遺伝子(rDNA)領域にあるRFB配列は、コンデンシンの最も強い結合配列である。このRFBをrDNA領域以外の任意の場所に挿入すると、そこにコンデンシンが特異的に結合するシス配列として機能する。染色体腕部の中程に約16kb隔てて2つのRFBを挿入して並べると、それらにコンデンシンが結合して、分裂中期(metaphase)に2つのRFBが物理的に相互作用して、その間のクロマチンが折りたたまれることが解った。今年度は、1コンデンシンによるRFB間相互作用の染色体上の位置の影響(position effect)を調べた。染色体セントロメア近傍(約6kb)の同一腕部上に2つのRFBを挿入した場合、腕部中央付近に挿入した場合と同等に分裂中期にRFB間相互作用が形成されることが解った。さらに、2セントロメアを挟んだ左右の異なる腕部上にそれぞれRFBを挿入した場合、RFB間の距離が同等(16kb)でも、それらの間の相互作用は著しく減少するが、有意に相互作用が観られることが解った。これらの事から、染色体の同一腕部上では位置によらずコンデンシンの結合に応じて等しくクロマチン折りたたみが生じる事が解った。一方、同一染色体上であっても、セントロメアを挟んだ異なる腕部間での相互作用は著しく阻害され得ることが示された。この阻害効果により、同一染色体であっても、左右の異なる腕部同士が無秩序に相互作用することによってクロマチンが折りたたまれることを抑制していると考えられる。本研究では出芽酵母をモデルに、染色体凝縮でコンデンシンが如何にしてクロマチンDNAをコンパクトに凝縮するのか、その機構の解明を目的としている。出芽酵母でコンデンシンは、1セントロメア、2腕部に散在するtRNA遺伝子(tDNA)、及び3リボソームRNA遺伝子(rDNA)領域にあるRFBに結合する。それらの中でRFBは最も多くコンデンシンを結合する部位である。本研究では、任意の染色体腕部に23コピーのRFBを並べ、コンデンシンに依ってRFB間の相互作用が生じる可能性を3C法によって調べた。成果として、分裂中期では、コンデンシン結合に依り2つのRFBが相互作用して、その間のクロマチンが折りたたまれることを見出した。また、間期でもRFB間相互作用が検出されること、そして分裂中期になると相互作用を示すシグナルが増加する様子が観られた。さらに分裂後期に移行すると相互作用を示すシグナルがさらに増大することに加え、RFBに挟まれた領域との相互作用を示すシグナルも増大することが解った。

以上の結果から、間期でもクロマチンDNAは一定程度折りたたまれた状態で、分裂期ではより高密度に折りたたまれると考えられる。さらに、分裂後期では、RFB間の相互作用だけではなく、RFBに挟まれた領域のクロマチン同士が複雑に相互作用して、RFBを基とした単純なループ構造から、より複雑な状態へと移行していると考えられる。また、染色体腕部に2つのRFBを並べた細胞を長時間培養により休止期に移行させ3C法を行った。その結果RFBにコンデンシンが結合する細胞では、休止期にRFB間相互作用を示す強いシグナルが観られた。以上の結果から、増殖期および休止期のいずれにおいても、コンデンシンが特定のDNA部位に結合することに依って、その結合部位同士のクロマチン間相互作用が促進され、染色体凝縮が誘導されることが解った。出芽酵母でコンデンシンは、1セントロメア、2染色体腕部に散在するtRNA遺伝子(tDNA)、3リボソームRNA遺伝子(rDNA)リピート領域にあるRFBが主な結合部位として特定されている。クロマチン免疫沈降法により、RFBが最も強い結合シグナルを示すことがわかった。このRFBをrDNA以外の任意の染色体腕部上に23コピー並べ、細胞周期の様々なステージでRFB間での相互作用をchromosome conformation capture (3C)法によって解析した。昨年度までに、1細胞周期の間期でもコンデンシンによりRFB間の相互作用が生じていること、2細胞分裂中期になると、RFB間の相互作用が上昇することが解った。今年度は細胞分裂後期でのRFB間相互作用を調べるために、後期の進行に必要な温度感受性変異(cdc15)を用いて、細胞周期を分裂後期で停止させ、RFB間相互作用の変化を調べた。その結果、3分裂中期から後期に移行するにつれてRFB間の相互作用がさらに増大するだけではなく、42つのRFBに挟まれた部位間での相互作用も増大することが確認された。これらの結果から、コンデンシンによりRFB同士の相互作用により、2つのRFBに挟まれた領域のクロマチンはループ状に折りたたまれることが解った。以上の結果から、細胞周期間期で既に基本的なクロマチン折りたたみ構造が形成されていること、そして分裂期中期に進むと折りたたみの頻度が上昇すると考えられる。さらに分裂後期へと進行するにつれて、RFB間の相互作用に加えてより複雑な相互作用が生じていると考えられる。酵母では細胞分裂期に、rDNAリピート領域が最も良く凝縮することが観察されている。本研究で明らかになった、RFB間での相互作用と、それに挟まれた領域での相互作用の少なくとも2つの段階により染色体凝縮が生じていると考えることが出来る。染色体凝縮は、細胞分裂の際に複製されたゲノムを2つの娘細胞に正確に分配するための基本的な細胞機能の1つである。近年の研究から、酵母からヒトにまで広く保存されたタンパク質複合体であるコンデンシンが染色体凝縮で中心的役割を果たすことがわかってきた。本研究では、出芽酵母をモデルとしてDNAに結合したコンデンシンが細胞分裂期にクロマチンDNAを折りたたむことを見出した。コンデンシンによるクロマチンDNAの折りたたみが、分裂期に観られる染色体凝縮の基本的な素反応の1つと考えられる。また、G1期においてもコンデンシンは染色体の折りたたみを制御していることを見出した。