hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
葉緑体が獲得したプロセッシブな蛋白質・核酸分解と機能分化の統合理解

本研究では、シアノバクテリアの細胞内共生により生じた葉緑体が、前駆体であるプロプラスチドから葉緑体に分化し維持されるために必須なプロセッシブ分解の調節機構を明らかにするとともに、分解産物であるペプチド・ヌクレオチドの葉緑体外輸送など、その生理機能についても着目し、葉緑体のホメオスタシス・機能転換と生体高分子分解の関係を統合的に理解する。以下の3つの項目について研究を進めた。(1)プロセッシブなタンパク質分解酵素FtsHの制御機構:FtsHはチラコイド膜の主要プロセッシブタンパク質分解酵素である。H30年度はFtsH2のリン酸化部位についてS212, T337, S380, S393のセリンおよびスレオニン残基がリン酸化されていることを推定した。それぞれの残基をアラニンに置換したFtsH2を発現する遺伝子をFtsH2欠損変異体に導入したところ、S212Aの変異ではFtsHの蓄積が低下していた。(2)プロセッシブな核酸分解酵素DPD1の制御機構:昨年度までに作製した、エストラジオール誘導系により変異型および野生型DPD1を発現するシロイヌナズナトランスジェニック個体について、ホモ化した系統を用いてDPD1の誘導を確認した。転写レベルでの発現誘導は確認されたが、ウエスタン解析によるDPD1タンパク質の発現が確認できなかった。これまでDPD1恒常的発現系でもDPD1の発現に成功しておらず、DPD1発現の毒性あるいは他の影響が考えられたので、本実験の続行は再検討することにした。(3)分解産物の葉緑体排出の解析:内包膜に局在するABCトランスポーターTAP1によるペプチド排出機構があることを明らかにした。tap1変異体でのペプチド残存には優位な増加は検出されなかった。TAP1の欠損が葉緑体機能にどのような影響を及ぼすかをRNAseq等で検討した。本研究では、葉緑体でのプロセッシブ分解を担う酵素として、FtsHプロテアーゼ、DPD1ヌクレアーゼに着目しているが、それぞれの研究で当初の計画通りに進捗している。DPD1については、総説と論文を成果として発表することができた。また、ペプチド分解産物の葉緑体排出については、TAP1ホモログに着目した解析も計画通りに進んでいる。FtsHのリン酸化制御によるタンパク質分解の解析では、推定リン酸化部位にアミノ酸置換を導入した形質転換植物の解析を継続して進め、リン酸化とFtsH複合体形成について考察する。研究の過程で、ジスルフィドによるFtsHの修飾も報告されたことから、これらについても国際共同研究で今後研究を進める。DPD1による核酸分解については、得られた形質転換植物でエストラジオールによるDPD1タンパク質の発現を調べたが、残念ながら発現がウエスタンブロットで確認できていない。H31も継続するが、生化学的解析が困難な場合はこの実験を終了し、代わりにイネのゲノム編集で作出しているDPD1欠損個体を用いた解析を進め、今後はDPD1機能の普遍性について検証する。ペプチド分解産物排出機構の研究については、TAP1トランスポーターについて引き続き解析を進める。特にTAP1欠損シロイヌナズナ変異体における葉緑体機能への影響を、var1, var2など関連する変異体と交配し、詳しく調べる。H29年度はFtsHがリン酸化されていることをPhos-tagにより検出し、リン酸化が光条件に影響されないこと、STN7キナーゼに依存しないことを明らかにした。加えて、質量分析結果からリン酸化部位のセリン残基を予測するとともに、それらにアミノ酸置換を導入したFtsH2を発現する植物の作製を進めた。(2)プロセッシブな核酸分解酵素DPD1の制御機構:点変異(A236V)を導入したDPD1タンパク質を大腸菌発現系により調製し、ヌクレアーゼ活性が低下していることをin vitronuclease assayにより明らかにした。更に、この変異を持つDPD1遺伝子をエストラジオール誘導系ベクター(pER8)に導入し、植物(シロイヌナズナ)に形質転換した。現在までに、目的の遺伝子コンストラクトを保持した10系統の植物体を得ている。(3)分解産物の葉緑体排出の解析:H29年度はタンパク質分解により生じた短鎖ペプチドの葉緑体排出の可能性について解析を進めた。BタイプのABCトランスポーターでセンチュウのペプチドトランスポーターTAP1と類似性のあるホモログに着目した。TAP1ホモログが内包膜にホモダイマーとして局在し、ヌクレオチド結合領域をストロマ側に配向することから排出活性を示す可能性が支持された。分解産物の葉緑体排出については、TAP1ホモログに着目した解析も計画通りに進んでいる。

本研究では、シアノバクテリアの細胞内共生により生じた葉緑体が、前駆体であるプロプラスチドから葉緑体に分化し維持されるために必須なプロセッシブ分解の調節機構を明らかにするとともに、分解産物であるペプチド・ヌクレオチドの葉緑体外輸送など、その生理機能についても着目し、葉緑体のホメオスタシス・機能転換と生体高分子分解の関係を統合的に理解する。以下の3つの項目について研究を進めた。(1)プロセッシブなタンパク質分解酵素FtsHの制御機構:FtsHはチラコイド膜の主要プロセッシブタンパク質分解酵素である。H30年度はFtsH2のリン酸化部位についてS212, T337, S380, S393のセリンおよびスレオニン残基がリン酸化されていることを推定した。それぞれの残基をアラニンに置換したFtsH2を発現する遺伝子をFtsH2欠損変異体に導入したところ、S212Aの変異ではFtsHの蓄積が低下していた。(2)プロセッシブな核酸分解酵素DPD1の制御機構:昨年度までに作製した、エストラジオール誘導系により変異型および野生型DPD1を発現するシロイヌナズナトランスジェニック個体について、ホモ化した系統を用いてDPD1の誘導を確認した。転写レベルでの発現誘導は確認されたが、ウエスタン解析によるDPD1タンパク質の発現が確認できなかった。これまでDPD1恒常的発現系でもDPD1の発現に成功しておらず、DPD1発現の毒性あるいは他の影響が考えられたので、本実験の続行は再検討することにした。(3)分解産物の葉緑体排出の解析:内包膜に局在するABCトランスポーターTAP1によるペプチド排出機構があることを明らかにした。tap1変異体でのペプチド残存には優位な増加は検出されなかった。TAP1の欠損が葉緑体機能にどのような影響を及ぼすかをRNAseq等で検討した。本研究では、葉緑体でのプロセッシブ分解を担う酵素として、FtsHプロテアーゼ、DPD1ヌクレアーゼに着目しているが、それぞれの研究で当初の計画通りに進捗している。DPD1については、総説と論文を成果として発表することができた。また、ペプチド分解産物の葉緑体排出については、TAP1ホモログに着目した解析も計画通りに進んでいる。FtsHのリン酸化制御によるタンパク質分解の解析では、推定リン酸化部位にアミノ酸置換を導入した形質転換植物の育成が進んでいるので、H30はこれらの世代を促進させてさらなるリン酸化とFtsH安定性、あるいは光化学系II修復作用との関連性を調べる。DPD1による核酸分解については、H29までに得られた形質転換植物でエストラジオールによりDPD1を発現させ、DPD1に対する特異抗体を用いた共免疫沈降法によりDPD1と生体内で相互作用している因子の単離と同定を試みる。分海産物排出機構の研究については、TAP1ホモログについてH30も引き続き解析を進める。特にTAP1のペプチド輸送活性について、プロテオリポソームを用いた研究について考察する。FtsHのリン酸化制御によるタンパク質分解の解析では、推定リン酸化部位にアミノ酸置換を導入した形質転換植物の解析を継続して進め、リン酸化とFtsH複合体形成について考察する。
糖尿病における臓器血管收縮性亢進の細胞内機構および麻酔薬の修飾作用に関する研究

糖尿病および非糖尿病ラットの大動脈および他臓器血管平滑筋を用いて、内因性血管収縮物質(ノルアドレナリン、アンギオテンシンII)による血管収縮作用、平滑筋細胞内カルシウム濃度、蛋白リン酸化酵素isozyme活性を測定し、慢性高血糖による血管平滑筋収縮・弛緩機構の特性を明らかにし、これに対する麻酔薬の影響を検討することを本研究の目的とした。その結果、1.糖尿病ラット群では、アンギオテンシンII(10^<-8>3×10^<-7>M)による血管収縮性が非糖尿病ラット群にくらべて亢進しており、揮発性麻酔薬であるセボフルランが濃度依存性にこれを抑制した。一方、イソフルランではこの抑制は認められなかった。2.上記の現象に対して細胞内機構の検討を行った結果、細胞内カルシウム濃度測定で有意な変化がみられずWestern blot法によりProtein kinase Cの発現が抑制されたことより、セボフルランは血管収縮蛋白のカルシウム感受性を抑制することが示唆された。4.セボフルランとイソフルランはAngII,PEによるMLCリン酸化を濃度依存性に抑制した。5.バゾプレッシン惹起等尺性張力変化に対する揮発性麻酔薬の影響を検討した結果、セボフルラン、イソフルランともに濃度依存性に抑制作用が認められた。その機序について各リン酸化酵素の阻害薬を用いて調べた結果、Rho kinaseの関与が認められた。平成17年度の研究結果1.実験動物の準備(1)正常(非糖尿病)ラット:LETO2.アンギオテンシンII投与による等尺性張力変化測定アンギオテンシンII(10^<-8>3×10^<-7>M)による血管収縮性:糖尿病ラットより摘出した大動脈における等尺性張力は糖尿病群において有意に亢進していることが確認された。3.アンギオテンシンII収縮に及ぼす揮発性麻酔薬の影響揮発性麻酔薬であるセボフルランは、糖尿病群において濃度依存性にアンギオテンシンII収縮を抑制した。その機序として細胞内カルシウム濃度の減少が示唆された。一方、イソフルランでは上記の抑制は認められなかった。4.アンギオテンシンIIによる血管収縮機構の差異に関する検討PKC inhibitor(BIS1)およびRho kinase inhibitor(Y27632)を用いてアンギオテンシンII(10^<-77>M)による血管収縮反応の抑制における差異について現在検討中である。平成18年度の実験結果前年度、われわれは、糖尿病ラット群ではアンギオテンシンII(10^<-8>3×10^<-7>M)による血管収縮性が非糖尿病ラット群にくらべて亢進しており、揮発性麻酔薬であるセボフルランが濃度依存性にこれを抑制することを示した。今年度は、糖尿病による血管弛緩反応の減弱(血管収縮性の亢進)を内皮細胞傷害の観点から"血管平滑筋"細胞内機構について検討することを目的とした。(研究概要)通常、内皮由来弛緩因子/NOはスーパーオキサイド(・O_2^-)により不活化される。糖尿病患者では、酸化ストレス増大の結果スーパーオキサイドが増加し、NOによる血管弛緩反応が減弱すると言われている。当初実験予定の内皮SOD(EC-SOD)活性測定方法の確立が困難であったため、糖尿病と同様に血管平滑筋細胞内スーパーオキサイド(・O_2^-)過剰産生状態を作成し検討することとした。(1)揮発性麻酔薬であるセボフルランによる濃度依存性のアンギオテンシンII収縮の抑制の細胞内機構の検討(細胞内カルシウムイオン濃度測定)有意な変化がみられなかった。以上の結果より、セボフルランは血管収縮タンパクのカルシウム感受性を抑制することが示唆された。(2)SOD投与による血管弛緩反応のreversibilityおよび麻酔薬による影響の検討

われわれは、ラット摘出血管におけるニトログリセリン耐性発現モデルがニトログリセリン(10^<-8>M)30分間暴露により作成されたが、・細胞膜透過性の高いラジカルスカベンジャー投与やESR法による細胞外検出法を用いた結果、血管平滑筋細胞内においてスーパーオキサイドが過剰産生されることを確認した。・その耐性発現がセボフルラン同時暴露により増強されるがイソフルランでは影響されなかった。・スーパーオキサイドおよびセボフルランが血管平滑筋細胞solubleguanylate cyclaseを抑制することが示唆された。本年度は、ラットの摘出血管を用い内因性血管収縮物質(フェニレフリン、アンギオテンシンII、バゾプレッシン)による血管収縮作用と蛋白リン酸化酵素isozyme活性を測定し揮発性麻酔薬の影響について検討した。その結果、以下のような知見が得られた。2.麻酔薬はアゴニストが作用していない状況では上記のリン酸化には影響しなかった。3.セボフルランとイソフルランはAng II,PEによるMLCリン酸化を濃度依存性に抑制した。4.セボフルランはCPI-17リン酸化を抑制したが、イソフルランには抑制作用は認められなかった。5.セボフルランはAng IIやPEによるMYPT1/Thr853リン酸化をどちらも抑制した。イソフルランはAng IIによるリン酸化を抑制したが、PEによるリン酸化は抑制しなかった。6.バゾプレッシン惹起等尺性張力変化に対する揮発性麻酔薬の影響を検討した結果、セボフルラン・イソフルランともに濃度依存性に抑制作用が認められた。その機序について各リン酸化醇素の阻害薬を用いて調べた結果、Rho kinaseの関与が認められた。
フィールド観測と風洞実験による里山の大気浄化機構の解明

滋賀県瀬田丘陵の里山、龍谷の森で大気汚染物質の濃度を観測したところ、樹冠から林床にかけて濃度が減少した。この濃度減少は樹木への沈着だけでなく、樹木の遮風効果によっても起こる。樹木模型を用いたトレーサガス拡散の風洞実験を行い、里山における大気浄化におよぼす両者の効果を区別した。また、龍谷の森はオゾンのシンクになっていることがわかった。微小粒子状物質PM2.5については、瀬田丘陵で観測した化学成分を近隣の市街地と比較し、自動車排ガスの影響による差を見いだした。里山における大気汚染物質の浄化作用の実態把握とその機構解明のために下記を実施した。(1)フィールド観測による大気質の実態把握:滋賀県瀬田丘陵の里山林内外においてオゾンO3、窒素酸化物NOx(一酸化窒素NO,二酸化窒素NO2)、微小粒子状物質PM2.5、粗大粒子PMcの観測と解析を行った。パッシブサンプラーによりO3, NOxの捕集を行い、イオンクロマトグラフ、吸光光度計による濃度の定量を行った。観測は林内の25m高のタワーなどを使って1ヶ月に12回実施した。里山に隣接する龍谷大学瀬田学舎では自動計測装置によりPM2.5, PMc, O3の連続濃度測定を行った。高濃度日のPM2.5, PMcについてはイオンクロマトグラフによって陰イオンの成分、走査型電子顕微鏡SEMによって金属イオンを分析した。合わせて風速や日射量等の気象を観測した。これらの観測により、1里山林内のキャノピー層、トランクスペースにおいてO3とNO2濃度が上空から地表にかけて減衰すること、2O3とNO2の濃度減衰は葉の現存量が多い夏季に大きいこと、3黄砂飛来時にPM2.5, PMcの濃度が上昇し、黄砂由来の金属成分の検出が顕著であること、4PM2,5の成分は年間を通じて硫酸イオンが卓越していることなどを把握した。(2)風洞実験による林内濃度減衰の機構解明:林内において大気汚染物質の濃度が減衰する機構を流体力学的観点から解明するために、気象庁気象研究所の大型風洞(長さ18m、幅3m、高さ2m)を用いて実験を行った。樹木模型列の外側から放出高さを7通りに変えて、トレーサガスのプロパンを放出し、樹木列内で濃度の鉛直分布を測定した。実験結果から1樹木列内の濃度分布におよぼす樹冠の有無や樹木単体の通風率の影響はほとんどないこと、2林内の濃度減衰は樹木列数を増加することによって得られるなどが明らかになった。(1)フィールド観測による大気質の実態把握:滋賀県瀬田丘陵の里山林内外において、オゾンO3、窒素酸化物NOx、微小粒子状物質PM2.5の観測と解析を行った。O3、NOxの観測はパッシブサンプラーを用いて、林内の25m高のタワーや里山に隣接する龍谷大学瀬田学舎の建物を利用して行った。O3については林内と瀬田学舎で自動計測装置による時間変動の測定も行った。瀬田学舎では自動計測装置によりPM2.5の連続測定を行い、陰イオン、陽イオン、金属成分の分析を行った。林内ではポータブル粉じん計によるPM2.5の測定を行った。分析にはイオンクロマトグラフ、吸光光度計、走査型電子顕微鏡を用いた。これらの観測により、1O3、NOxの林内の濃度減衰率は林外より大きく、夏季の林内のO3濃度は昼夜継続して林外より低いこと、2林内のPM2.5の重量濃度や硫酸イオン濃度は林外より低いこと、3PM2.5の高濃度の主要な原因は黄砂であるが桜島噴火の影響も受けていること、4硫酸イオンはPM2.5側に硫酸アンモニウムの形で存在し、硝酸イオンは夏季に揮散していることがわかった。(2)風洞実験による林内濃度減衰の機構解明:林内において大気汚染物質の濃度が減衰する機構を流体力学的観点から解明するために、気象庁気象研究所の大型風洞を用いて実験を行った。樹冠・樹幹の形状が異なる3種類の模型を用いて、放出高さを変えたトレーサガス拡散実験、レーザードップラー流速計による乱流計測実験、煙による可視化実験を行った。その結果、1トレーサガスは樹木上空へ輸送され、林内への流入が制限されること、2樹木列内では根元部から流入したトレーサガスが循環、混合して濃度の一様化が起こること、3一様化の程度は樹冠層の面積が大きい模型ほど顕著であることがわかった。(1)フィールド観測による大気質の実態把握:滋賀県瀬田丘陵の里山林内外において、オゾンO3、窒素酸化物NOx(NO、NO2)、微小粒子状物質PM2.5の観測を行った。O3、NOxについてはパッシブサンプラー、自動計測装置により濃度を測定した。PM2.5については自動計測装置により質量濃度の連続測定を行い、フィルターに捕集した粒子の成分分析を行った。これらの観測により以下の成果を得た。1O3、NO2とも林内では樹木による遮蔽や吸着のため林外より濃度が低くなるが、水平方向の地表濃度分布はO3は変動が大きく、NO2はほぼ一様であった。濃度分布パタンの違いには両物質の光化学反応特性の違いが関係している。2林内ではO3の生成と消滅の平衡作用が働いている。

揮発性有機化合物VOCsのデータと合わせて解析すると、O3生成におよぼすVOCsの影響は小さく、里山はO3のシンクになっている。3PM2.5の成分について、アンモニウムイオンと硫酸イオンの濃度の時間変動は基本的に連動していたが、桜島など九州の火山の影響がある場合は硫酸イオンの濃度が高くなった。(2)風洞実験による林内濃度減衰の機構解明:林内において大気汚染物質の濃度が減衰する機構を流体力学的観点から解明するために、気象庁気象研究所の大型風洞を用いて拡散実験を行った。ジオラマ樹木模型を104207本敷き詰めて森を再現した。その結果、1樹木密度が密な場合は前年度までの単純形状、少数配列の樹木模型と同様に林内でトレーサガス濃度の一様化がみられたが、粗の場合には顕著ではなかった。2林内の濃度分布が相似になるには樹木高さの45倍の吹走距離が必要なことがわかった。(3)都市大気改善策の提案:都市のストリートキャニオンを対象に樹木配置による緩和策の風洞実験を行った。樹木は樹冠を接するより離して配置する方が緩和効果があることがわかった。滋賀県瀬田丘陵の里山、龍谷の森で大気汚染物質の濃度を観測したところ、樹冠から林床にかけて濃度が減少した。この濃度減少は樹木への沈着だけでなく、樹木の遮風効果によっても起こる。樹木模型を用いたトレーサガス拡散の風洞実験を行い、里山における大気浄化におよぼす両者の効果を区別した。また、龍谷の森はオゾンのシンクになっていることがわかった。微小粒子状物質PM2.5については、瀬田丘陵で観測した化学成分を近隣の市街地と比較し、自動車排ガスの影響による差を見いだした。26年度計画では、(1)大気質の実態把握として、里山林内外におけるオゾンO3、窒素酸化物NOx、微小粒子状物質PM2.5のフィールド観測と解析、(2)林内濃度減衰の機構解明として、風洞実験の実施と気流、拡散過程の解析を行い、里山における大気汚染物質の浄化作用の実態把握と機構解明に必要なデータの取得・蓄積と解析を行うとしていた。(1)のフィールド観測については、ほぼ年間を通じた観測を実施し、25年度に観測された林内のO3、NOxの濃度減衰に加えて、林内外におけるO3濃度の時間変動特性やPM2.5の重量、成分濃度の特性を把握することができた。PM2.5については新たに陽イオン成分を含めたデータ取得や長距離輸送モデルによる解析ができた。(2)の風洞実験では、計画通り樹木・樹冠に着目するため、形状の異なる3種類の模型を対象にした実験と解析を行った。また、煙の可視化実験を行い、樹木間の物質移動のメカニズムが把握できた。以上から研究はほぼ計画通り、順調に進展している。大気環境工学当初の計画通り、以下のように研究を推進する。大気質の実態把握については、里山林内外においてパッシブサンプラー、自動計測装置を用いてオゾンO3、窒素酸化物NOx、微小粒子状物質PM2.5の観測を継続する。PM2.5については陽イオン、陰イオン、金属成分の分析を行う。3ヶ年の観測、分析結果や長距離輸送モデル計算をもとに、年変動や季節変動を評価する。また、揮発性有機化合物質のデータや物質相互の関連を考慮して、林内の大気汚染物質の濃度減衰メカニズムを評価する。林内濃度減衰の機構解明については、樹木の形状や配列に着目した風洞実験を実施する。3ヶ年の風洞実験結果と里山におけるフィールド観測結果を比較、解析して、林内における大気汚染物質の濃度減衰を再現する条件を明らかにする。上記の結果や流体力学モデルによる計算をもとに、大気汚染緩和策に適した樹木や建物の設置、配置について提案する。
医原性卵巣機能不全に対する妊孕性温存を目的とした卵巣組織凍結・再移植の基礎的研究

がん治療の進歩により生命予後は大きく改善されたが,がん治療において,性腺毒性有する抗がん剤を用いた化学療法や,性腺を照射野に含む放射線療法は,医原性の卵巣機能不全や難治性の不妊症の原因となり得る.治療の前後に妊孕性を温存することは,がん治療を受ける女性のQOLの改善に寄与するものと考えられる.卵巣組織凍結は迅速に施行可能であり,さらに,大量に卵胞を温存できる可能性や,融解後に体内に再移植した際に自然月経の再開と自然妊娠が望める可能性もある.しかし,移植後の卵巣組織では原始卵胞が著明に減少し,卵巣機能を維持できる期間が短い例が多く,卵巣組織への低酸素ストレスや,再灌流後障害が関与していると考えられている.本研究では,婦人科疾患で手術が必要な症例からインフォームドコンセントを得て卵巣組織を生検し凍結させた後に融解し,ヌードマウスの腹腔内に移植するモデルを作出し,卵巣組織の凍結および移植が卵巣皮質中の卵胞および間質細胞に与える影響を組織学的あるいは分子レベルで客観的に評価することを試みる.また,ヌードマウスに血管新生や血行を促進する薬剤を投与し,卵巣組織の機能保持に有用な薬剤を明らかにしたい.さらに,移植部位別に卵胞の保存状態を組織形態学的に評価し,卵胞発育に適した環境について検討する.平成30年度は,平成28年度と平成29年度に収集し,ガラス化法または緩慢凍結法で凍結した検体を融解し,ガラス化法群と緩慢凍結群にわけて,ヌードマウス各6匹の腸間膜上に移植した.移植後4週間で組織を回収した群と移植後3ヶ月で組織を回収した群とに分け,生着率の検討を行った.すべてのヌードマウスにおいて,肉眼的には卵巣組織と判断した切片を拐取することができたが,永久標本で検討すると,ほとんどの卵巣組織が著明に萎縮しており,実際の生着率は約10%と考えられた.ヒト卵巣組織凍結・融解,ヌードマウスへの移植手技は熟達することができたが,腸間膜上に移植した卵巣組織の生着率が予想より低くく,摘出できた卵巣組織も萎縮が強い例が多く,計画にある組織検討が十分に行えなかった.移植部位を傍子宮血管上に変更し,摘出までの期間を全例3ヶ月に延長して追加実験を行う必要があり,移植実験および卵巣組織の組織学的検討が予定よりやや遅れていると判断した.摘出したヒト卵巣組織の連続切片を作成し,原始卵胞およびその周囲の組織構築について組織学的な検討を行う.また,ヒト卵巣組織凍結を行う際に,ヌードマウスに血管新生を促進する薬剤や血行を促進する薬剤を投与したモデルを作成し,摘出した組織の形態学的な変化について検討する.薬剤を投与しなかった群と比較し,薬剤がどのような組織形態学的な変化を与えるか,また,薬剤投与モデルにおける凍結方法による組織形態学的な差異についても検討する.さらに,移植モデルと並行して凍結・融解のみを行った卵巣組織とも比較・検討する.なお,これまでに摘出したヒト卵巣組織が著明に萎縮していた原因として,異種間移植による生着不全が考慮されるため,移植から摘出までの期間は適宜変更し,移植期間による形態学的な差異についても検討を行う.がん治療における性腺毒性を有する抗がん剤を用いた化学療法や,性腺を照射野に含む放射線療法は,医原性の卵巣機能不全を惹起し,難治性の卵巣性不妊症や女性ホルモン欠落による骨粗鬆症や血管障害の原因となり得る.がん治療の進歩に伴い予後は大きく改善されたが,一方でがんを克服した若年女性の治療後のQOLが注目されるようになった.治療の開始前に妊孕性温存を試みることは,これら女性の治療後のQOLの改善に大きく貢献すると考えられる.胚凍結や未受精卵子凍結に比べ,卵巣組織凍結は排卵誘発が不要で速やかに行える点,大量の卵胞を保存できる点,融解後に体内に再移植した場合に自然月経の再開と自然妊娠が望める点で優れている.一方で再移植後の卵巣組織では原始卵胞が著明に減少し,卵巣機能を維持できる期間が短い例が多く,卵巣組織への低酸素ストレスや再灌流障害が関与していると考えられている.本研究では,婦人科疾患で手術が必要な女性からインフォームドコンセントを得て卵巣組織を生検し凍結させたうえ,融解したのちにヌードマウスに移植するモデルを作出し,卵巣組織の凍結および移植が卵巣皮質中の卵胞および間質細胞に与える影響を組織学的あるいは分子レベルで客観的に評価することを試みる.また,ヌードマウスに血管新生や血行を促進する薬剤を投与し,卵巣組織の機能保持に有用な薬剤を明らかにしたい.さらに,移植部位別に卵胞の保存状態を組織形態学的に評価し,卵胞発育に適した環境について検討する.平成28年度は検体収集に努め,婦人科疾患で手術を受ける女性からインフォームドコンセントを得て,卵巣組織の一部を生検しガラス化法で凍結保存した.今年度に収集した検体は再凍結・融解が組織に及ぼす影響を組織学的に検討するため,凍結時には特別な薬剤は付与せずに行った.当科で婦人科疾患により手術を受ける女性からインフォームドコンセントを得て,卵巣組織の一部を検体として収集したが,卵巣に器質的異常がない女性や性成熟期の女性の症例数が少なく,検体数が目標数に達していないため.なお,採取した卵巣組織はガラス化法により凍結し,凍結手技は問題はなく行うことができ習熟した.

組織学的検討が可能なヌードマウスモデルの作成には至らなかったため,予定した進捗状況より遅れていると判断した.がん治療における性腺障害性を有する抗がん剤を用いた治療や,性腺を照射野に含む放射線療法は,医原性の卵巣機能不全を惹起し,難治性の不妊症の原因となり得る.また,女性ホルモンの欠落症状による骨粗鬆症や動脈硬化および心血管系疾患に罹患するリスクが増加する.がん治療の進歩により生命予後は大きく改善され,それに伴い治療後の女性のQOLが注目されるようになった.治療の前後に生殖機能(妊孕性)を温存することは,がん治療を受ける女性のQOLの改善に大きく貢献するものと考えられる.妊孕性温存の方法として胚凍結や未受精卵子凍結では調節卵巣刺激が必要だが,卵巣組織凍結は比較的迅速に施行可能である点,大量に卵胞を温存できる点,融解後に体内に再移植した際に自然月経の再開と自然妊娠が望める点で優れている.一方で移植後の卵巣組織では原始卵胞が著明に減少し,卵巣機能を維持できる期間が短いことが指摘されている.これらには卵巣組織への低酸素ストレスや,再灌流後障害が関与していると考えられている.本研究では,婦人科疾患で手術が必要な症例からインフォームドコンセントを得て卵巣組織を生検し凍結させた後に融解し,ヌードマウスの腹腔内に移植するモデルを作出し,卵巣組織の凍結および移植が卵巣皮質中の卵胞および間質細胞に与える影響を組織学的あるいは分子レベルで客観的に評価することを試みる.また,ヌードマウスに血管新生や血行を促進する薬剤を投与し,卵巣組織の機能保持に有用な薬剤を明らかにしたい.さらに,移植部位別に卵胞の保存状態を組織形態学的に評価し,卵胞発育に適した環境について検討する.平成29年度は平成28年度に収集・凍結した検体を融解し,ヌードマウスの腹腔内に移植した.移植後4週間で組織を回収した群と移植後3ヶ月で組織を回収した群とに分け卵胞および周囲間質の組織構築を検討した.前年度の検体収集数が目標数に達しなかったため,今年度の前半は組織収集に努めた.採取した組織をガラス化法および緩慢凍結法により凍結し,凍結手技は問題なく行えた.融解した卵巣組織を凍結法別にヌードマウスの腹腔内に移植したモデルを作出し,摘出した組織片の検討を行ったが,薬剤投与モデルを作出するには至らなかったため,予定した進捗状況よりもやや遅れていると判断した.がん治療の進歩により生命予後は大きく改善されたが,がん治療において,性腺毒性有する抗がん剤を用いた化学療法や,性腺を照射野に含む放射線療法は,医原性の卵巣機能不全や難治性の不妊症の原因となり得る.治療の前後に妊孕性を温存することは,がん治療を受ける女性のQOLの改善に寄与するものと考えられる.卵巣組織凍結は迅速に施行可能であり,さらに,大量に卵胞を温存できる可能性や,融解後に体内に再移植した際に自然月経の再開と自然妊娠が望める可能性もある.しかし,移植後の卵巣組織では原始卵胞が著明に減少し,卵巣機能を維持できる期間が短い例が多く,卵巣組織への低酸素ストレスや,再灌流後障害が関与していると考えられている.本研究では,婦人科疾患で手術が必要な症例からインフォームドコンセントを得て卵巣組織を生検し凍結させた後に融解し,ヌードマウスの腹腔内に移植するモデルを作出し,卵巣組織の凍結および移植が卵巣皮質中の卵胞および間質細胞に与える影響を組織学的あるいは分子レベルで客観的に評価することを試みる.また,ヌードマウスに血管新生や血行を促進する薬剤を投与し,卵巣組織の機能保持に有用な薬剤を明らかにしたい.さらに,移植部位別に卵胞の保存状態を組織形態学的に評価し,卵胞発育に適した環境について検討する.
酸化物ナノ粒子・カーボンの直接複合化のための液体燃焼合成

リチウムイオン電池のエネルギー密度の向上には、負極活物質の容量密度の向上が不可欠である。そのため、従来のグラファイトより2倍以上の容量を有する安価な遷移金属酸化物に着目された。酸化物を負極材料に適用する際の問題は、充放電に伴う体積膨張・収縮や低い導電性であり、このため良好な出力およびサイクル特性が得られない。そして、本研究では、液体燃焼合成法により遷移金属酸化物のナノ化及び炭素との複合化によって、リチウムイオン電池負極材料としての出力及びサイクル寿命を改善できた。近年省エネルギー化・地球温暖化解消の観点から、太陽光や風力などの再生可能エネルギーを有効に活用するため、優れたエネルギー貯蔵・輸送技術及びデバイスの開発が不可欠である。中でも、モバイルエレクトロニクス、電気自動車やハイブリッド車等の研究が注目されており、そのためリチウムイオン二次電池等の優れた蓄電池の開発は大変重要である。そして、本研究の目的は、液体燃焼合成法により遷移金属酸化物のナノ化及び炭素との複合化によって、リチウムイオン電池負極材料としての出力及びサイクル寿命の改善である。平成27年度の実施内容と成果は以下の通りである。(1)鉄酸化物・炭素複合体の合成:硝酸鉄・グリシンを使った液体燃焼合成によって、多量のグリシン燃料の添加が炭素源となり、不活性雰囲気下での熱処理によりナノ酸化鉄・炭素複合体の作成に成功した。得られた複合体は、XRD、SEM、TEM等の分析技術を利用して、その形態及び構造を同定した。加え、複合体の充放電等の電気化学特性を評価した。従来のグラファイト負極に比べ2倍ぐらいの容量を有する複合体の開発に成功した。(2)酸化マンガン・炭素複合体の合成:上記鉄酸化物・炭素複合体の合成と同様に、酸化マンガン・炭素複合体の作製にも成功した。その最適な合成条件を明らかにした。これらの研究成果の一部を国際学会・論文で発表した。各項目共に当初計画した事項は順調に進展している。そのため、従来のグラファイトより高い容量を有する安価な負極材料の開発が求められている。遷移金属酸化物(Fe、Mn、Ni、Cu等の酸化物)はリチウムイオンと反応し、遷移金属と酸化リチウムを可逆的に生成する。遷移金属酸化物はリチウム金属に対して約1Vの電位、6001200 mAh/gの高い理論容量を有しているため(従来のグラファイトの2倍以上)、リチウム電池の負極材料として極めて有望である。遷移金属酸化物を負極材料に適用する際の問題は、充放電に伴う体積膨張・収縮や低い導電性であり、このため良好な出力およびサイクル特性が得られない。本研究の目的は、液体燃焼合成法により遷移金属酸化物のナノ化及び炭素との複合化によって、リチウムイオン電池負極材料としての出力及びサイクル寿命の改善である。H28年度の実施内容・成果は下記の通りである。H27年度の実施結果により更なる電気化学特性が有する複合体を合成するため、液体燃焼合成のゲル原料を高導電性のケッチェンブラック・グラフェンナノフレークと混合し、不活性雰囲気下でのone-step燃焼合成により高性能複合体を直接合成できた。一方、バイオマス原料であるコットンファイバーをテンプレート・炭素源として利用し、酸化物・炭素複合体の合成も試みた。上記研究をさらに発展し、多孔質炭素の合成にも適用できた。これらの研究成果は国際学会・論文で発表した。最終年度(H28年度)は、更なる電気化学特性が有する複合体の合成に着目する。具体的に、液体燃焼合成のゲル原料を多孔質炭素母材(例えばケッチェンブラック、活性炭等)へ含浸し、不活性雰囲気下での燃焼合成により複合体を直接生成する。さらに、電気容量とサイクル特性を向上するため、適切なバインダーを選定する必要がある。また、電気化学サイクリックボルタンメトリー(CV)やインピーダンス等の測定を行い、反応途中の生成物の詳細な観察により、コンバージョン反応のメカニズムを解明し、理論に基づいて電極開発を実施する。材料工学
脳回形成における脳室下帯神経幹細胞の役割

フェレットにおいて57日齢(神経新生後期)にバルプロ酸(VPA)を投与し、脳回形成が完了する20日齢に脳を取り出した。MRI画像解析から大脳皮質の体積と表面積は2群間で差はなかった。しかし、脳溝形成頻度(GI)はVPA投与群で低く、とくに内側面と前頭領域の脳溝のGIが小さかった。皮質厚はVPA投与群でGIが低値を示した領域で厚くなっていた。また、免疫蛍光多重染色解析から自己複製後に分化したニューロンの密度は前頭前領域、帯状領域、頭頂後頭領域で高かった。以上よりフェレットでは神経新生後期の曝露によって一部領域で皮質が厚くなることで折り畳みが(脳回の形成)が甘くなることが明らかになった。本研究は、脳溝・脳回を有する小型実験動物であるフェレットを用いて、発生過程の大脳皮質において一時的に出現する脳室下帯(SVZ)神経幹細胞の脳回形成への寄与を明らかにすること目的としている。平成27年度は、バルプロ酸(VPA)投与直後のフェレット仔の脳のサンプリングと、幼若動物の脳のT1強調MRI画像の計測条件の検討を行った。4例の妊娠動物から計6例の雄仔動物を得た。このうち4例に脳回形成が最も盛んになる直前(57日齢)にバルプロ酸(VPA; 30μg/g体重)を腹腔内投与した。VPA投与直前に新生する細胞を標識するため、投与の2時間前にEdUを腹腔内投与した。さらにVPA投与後に新生する細胞を標識するためVPAの最終投与時にBrdUを腹腔内投与した。対照として2例にEdUとBrdUのみ投与)を投与した。BrdU投与の2時間後に仔動物を灌流固定し、脳を取り出した。取り出した幼若動物の脳のT1強調画像の計測条件を7-tesla MRI装置を用いて検討した。成獣の脳に比べ、水を多く含み、ミエリン化も進んでいないため、T1強調シグナルの強いコントラストは得られなかったが、大脳皮質(灰白質)と皮質下白質を区別できる計測条件の決定に成功した。また、90日齢のフェレットにおいて皮質各層の厚さとI層のミエリン線維密度が脳回領域と脳溝領域で異なることを明らかにし、脳溝・脳回形成の組織レベルでの評価を可能にした。今回実験に用意した4例の母獣のうち2例が出産後、仔を食殺してしまい、実験に用いる仔動物が6例しか得られなかった。大脳皮質の神経幹細胞の増殖および分化へのVPA投与直後(生後5,6,7日に30μg/g体重を投与し、最終投与の2時間後に脳をサンプリング)の効果を調べるために、実験群、対照群ともに4例(計8例)以上を予定していたため、実験に必要な動物数を確保することができなかった。また、幼若動物の脳は水を多く含み、ミエリン化も進んでいないため、MRI画像においてT1強調シグナルの強いコントラストが得られなかったため、その計測条件の決定に予定以上の時間を要してしまった。平成27および28年度は、脳回形成が最も盛んになる57日齢にバルプロ酸(VPA; 200 mg/g体重)を投与した雄フェレット仔について、投与直後(7日齢)およびVPA最終投与13日後(20日齢)の脳のサンプリングを行った。VPA投与直前に新生する細胞を標識するため、投与の2時間前にEdUを腹腔内投与し、更にVPA投与後に新生する細胞を標識するためVPAの最終投与時にBrdUを腹腔内投与した。取り出した脳については順次T1強調MRIの計測を行った。MRI画像をもとに3Dボリュームレンダリングイメージを作成したところ、20日齢のVPA投与群で頭頂領域の脳回(上シルビウス回)の発達が対照群に比べてよくないことが明らかになった。また、MRI計測後の脳の組織切片を作成し、免疫組織化学解析の予備実験(条件検討)を試みた。7日齢の仔においてはEdU、BrdU、Pax6(basal radial gliaを標識)の免疫蛍光三重染色に、20日齢の仔においてはEdU、BrdU、Parvalbumin(一部のGABA作動性ニューロンを標識)の免疫蛍光三重染色にそれぞれ成功した。7日齢の対照群では、脳室下帯外層(oSVZ)でEdU+BrdU+Pax6三重陽性細胞がみられ、2回の分裂を経験したbasal radial glia (bRG)の標識に成功した。更に、20日齢の対照群においては大脳皮質II層の浅部でEdU+BrdU二重陽性細胞(5日齢および7日齢に二度の分裂を経験しているbRG由来であると考えられる)がみられ、更にEdU+BrdU二重標識細胞のほとんどがParvalbumin陽性であることを確認した。平成27および28年度で12例の妊娠動物から計19例の雄仔を得た。このうち9例に脳回形成が最も盛んになる直前(57日齢)にバルプロ酸(VPA; 200 mg/g体重)を腹腔内投与した。対照には10例にEdUとBrdUのみ投与した。

VPA投与群5例と対照群4例の仔(7日齢)に対してBrdU投与の2時間後に灌流固定を行い脳を取り出した。残りのVPA投与群4例と対照群6例の仔については20日齢まで生存させ、灌流固定を行い脳を取り出した。取り出した各群仔の脳のT1強調画像を7-tesla MRI装置を用いて取得した。MRI画像をもとに3Dボリュームレンダリングイメージを作成したところ、20日齢のVPA投与群で頭頂領域の脳回(上シルビウス回)の発達がよくなかった。また、MRI画像取得後の一部の動物の脳の凍結切片を作成し、免疫組織化学解析の予備実験(条件検討)を試みた。7日齢の仔においてはEdU、BrdU、Pax6(basal radial gliaを標識)の免疫蛍光三重染色に、20日齢の仔においてはEdU、BrdU、Parvalbumin(一部のGABA作動性ニューロンを標識)の免疫蛍光三重染色にそれぞれ成功しており、組織定量評価の準備が整いつつある。以上の様に28年度までに予定していたフェレット脳のサンプル採取は完了し、順次MRI計測および定量解析を進めている。更に組織解析のための準備も整いつつあることから、研究計画はおおむね順調に進んでいると思われる。本研究は脳溝・脳回を有するフェレットを用いて、発生過程の大脳皮質において一時的に出現する脳室下帯(SVZ)神経幹細胞の脳回形成への寄与を明らかにすること目的とした。脳回形成が最も盛んになる57日齢にバルプロ酸(VPA; 200 mg/g体重)を投与した雄フェレット仔について投与直後(7日齢)および20日齢に脳を摘出した。VPA投与直前に新生する細胞を標識するため、投与の2時間前にEdUを投与し、更にVPA投与後に新生する細胞を標識するためVPAの最終投与時にBrdUを投与した。取り出した脳から高分解能7-tesla MRI装置を用いてT1強調MR画像を取得した。MR画像をもとに形態計測を行った結果、20日齢においては大脳半球の前頭後頭極長は2群間で差はなかったが、尾側半での半球幅がVPA投与群で有意に小さかった。大脳皮質の脳溝形成頻度(global-GI)は、VPA投与群で有意に小さく、これは内側面および前頭領域の脳溝のsulcalGI低値に起因していた。皮質厚は、VPA投与群において前頭前領域の前S字回で有意に大きかった。また、VPA投与群では板状溝や上溝吻側部の底部の皮質も厚く、これらはVPA投与群においてsulcal GIが小さい溝と一致した。免疫蛍光多重染色による解析では、20日齢においてEdU/BrdU二重標識ニューロンは皮質上層に多くみられ、その密度は前頭領域や側頭領域に比べて前頭前領域、頭頂後頭領域、帯状領域など系統発生的に新しい皮質領域で高かった。以上よりフェレットでは神経新生後期のVPA投与によって前頭前領域でおよび前頭領域で皮質が厚くなることで折り畳みが(脳回の形成)が甘くなることが明らかになった。また、前頭前領域における脳回形成には神経新生後期に神経幹細胞(basal RG)の自己複製によって産生したニューロンが関与する可能性が示唆された。フェレットにおいて57日齢(神経新生後期)にバルプロ酸(VPA)を投与し、脳回形成が完了する20日齢に脳を取り出した。MRI画像解析から大脳皮質の体積と表面積は2群間で差はなかった。しかし、脳溝形成頻度(GI)はVPA投与群で低く、とくに内側面と前頭領域の脳溝のGIが小さかった。皮質厚はVPA投与群でGIが低値を示した領域で厚くなっていた。また、免疫蛍光多重染色解析から自己複製後に分化したニューロンの密度は前頭前領域、帯状領域、頭頂後頭領域で高かった。
配向分極した有機薄膜への電荷注入機構の解明とその薄膜のデバイスへの展開

本研究の目的は極性分子をドーパントとして利用し,その自発的な配向により発現する分極電荷によって,電極から有機層への電荷注入を高効率化するという素子の設計指針を提案し,その妥当性を検証することである.本年度は,分極電荷による電荷注入効率向上の可否を調べるために,1金属/絶縁層/有機層/上部電極からなる素子における電子注入特性評価,また,共蒸着膜における分極電荷の存在を検証するために,2ケルビンプローブによる極性分子・非極性分子共蒸着膜の表面電位測定の2つの実験を行った.1では有機材料としてAlq3(上部電極界面に正の分極電荷が存在),Al(7-prq)3(負の固定電荷が存在)を用いて評価を行った.両デバイスの静電容量(C)の電圧依存性を調べた結果,Alq3素子では電子注入に伴いCが急峻に増加し(過程I),その後Cは徐々に増加して電子が絶縁層界面に蓄積した(過程II).一方Al(7-prq)3素子では電子注入に伴いCは緩やかに増加し,そのまま絶縁層界面に蓄積した(過程III).またこの素子では電子放出の大幅な遅れ(過程IV)も現れた.これらの過程は,正の分極電荷による電子注入の促進(過程I),負の固定電荷による電子蓄積の抑制(過程II),負の固定電荷による電子注入の抑制(過程III),正の固定電荷による電子放出の抑制(過程IV)によると考えられる.2ではAlq3を非極性分子であるCBPにドープし表面電位測定を行った.その結果共蒸着膜においても分極電荷が存在することを見出した.Alq3の濃度を薄めていくと,約45%-90%の範囲で分極電荷密度は100%時よりも大きくなり,さらに薄めると減少した.また濃度が薄いほど配向度が増した.これは高濃度領域では反電場効果によってAlq3の自発分極が抑制されている可能性を示唆している.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
発達障害児の頭部-眼球運動の協調性の特性と生活・学習上の課題との関連に関する研究

日常生活動作(以下、ADL動作)を適切遂行する上で、眼球ー頭部協調運動は重要な運動機能の一つとして考えられるが、その詳細については不明な点が多い。本研究では健常成人21名を対象にADL動作中の眼球・頭部協調運動の特徴を明らかにするために、JINS MEME(JINS社製JINS MEME ES-R)を用いて、単純追従課題・食事・トイレへの移乗動作時の頭部の加速度、頭部の角加速度、眼電図を測定した。その結果、机上での追視課題では、視角の増加に伴って眼電位・頭部の角速度共に増加していた。また、眼球頭部協調運動での眼電位と頭部の角速度も同様の傾向が得られたが、眼球運動のみ、頭部運動のみに比べると値は小さくなった。ADL課題では食事動作において目が先行して協調運動を行う者が有意に多かった。頭部運動では平皿と深皿で有意差が認められた。移乗動作ではすべての対象者で頭部が先行し、方向転換と立ち上がりの間で頭部運動に有意な差がみられた。また、立ち上がり動作では便座の高さによって眼電位にも有意な差がみられた。これらの結果から動作特性に応じて入手しなければならない視覚情報のパターンが変わることや、姿勢条件の変化に合わせて、健常者では眼球運動と頭部運動の協調性を変化させて適応させている可能性が考えられ、今後新たな評価・治療介入の指標として本研究結果が利用できる可能性が示唆される結果が得られている。眼球・頭部協調運動の評価機器の選定と、実験への適応のための改良に時間を要したために、動作単位での測定が遅れてしまった。評価機器の構成が30年度で決まったことから、当初予定にある発達障がい者でのデータ収集に取り掛かる予定である。健常者の眼球・頭部協調運動の測定を継続し行い、健常成人の動作種毎のパターンを明確化するとともに、発達障がい者のデータ収集も行い障害特性との関連について分析を進める。眼球・頭部協調運動の測定として眼電位とジャイロセンサーを用いていたが、現在用いている機器では眼電位の測定結果が不安定なため、アイカメラによる測定も同時に行い、視線停留と動作種との関連についても分析を行う予定である。本研究の目的は、日常成果の諸活動における眼球運動の関与を、頭部-眼球運動の協調的な活動から明らかにすることであり、29年度は簡易的に眼球・頭部運動を同時に測定できるMEME(JINS社製)の測定機器としての信頼性と妥当性を検証した。椅子座位にて視線前方60cmに設置した27インチモニター上に、ターゲット(直径1cmの円画像)を、左右(視角30°)と上下(視角15°)に2Hzに往復する追従刺激を提示し、この際に、顎台を用い頭部を固定し眼球のみでターゲットを追視する条件と、眼球を動かさずに頭部の動きでターゲットを追従する2条件を設定し、MEMEと3軸ジャイロセンサー(共和電業社製)・眼電位図(日本光電社製)を同時に測定した。その結果、眼球・頭部運動の開始に伴う潜時では10-15msec程度の誤差は認められるものの、視角や頭部回旋・前後屈角度の測定は同等の精度があることを確認できた。そこで、健常成人3名を対象に食事動作(前方に設置した机上に置かれた皿から大豆を箸で把持して口元まで持ってくる動作)と、40cmに設定した便座に相対した開始位置から着座するまでの移乗動作、timed up & go test(以下、TUGテスト)の3条件で、MEMEを用いた頭部-眼球運動の協調性について測定を行った。その結果、食事動作では頭部前屈の動きが40msec前後先行し生じ、箸が口元に来ると眼球の下転と頭部の後屈が協調的に生じていることが確認できた。トイレへの移乗動作では、便座に座るために移動(右周りに身体を回旋させる)する際には、眼球は左側へ律動的(約15msec周期)に動くのに対して頭部は固定されており、着座する際には眼球運動の律動的動きは維持されたまま頭部の前屈が生じていることが確認できた。一方、TUGでは動作に伴う筋電図と推測されるノイズが大きく生じ、分析可能なデータが測定できなかった。研究計画に沿って概ね進捗しているが、動作に伴うノイズが測定結果に大きく影響する活動が多く、測定対象とする日常生活動作の設定について見直しを行う必要があり遅れが生じている。また、小児や発達障害を抱える対象者で測定を行うためにも、健常成人で基本的なデータの収集が必須であり、30年度も継続して研究を継続していく。

移乗動作ではすべての対象者で頭部が先行し、方向転換と立ち上がりの間で頭部運動に有意な差がみられた。また、立ち上がり動作では便座の高さによって眼電位にも有意な差がみられた。これらの結果から動作特性に応じて入手しなければならない視覚情報のパターンが変わることや、姿勢条件の変化に合わせて、健常者では眼球運動と頭部運動の協調性を変化させて適応させている可能性が考えられ、今後新たな評価・治療介入の指標として本研究結果が利用できる可能性が示唆される結果が得られている。眼球・頭部協調運動の評価機器の選定と、実験への適応のための改良に時間を要したために、動作単位での測定が遅れてしまった。評価機器の構成が30年度で決まったことから、当初予定にある発達障がい者でのデータ収集に取り掛かる予定である。測定可能な動作を明確にした上で、小児および発達障害を抱える対象者に対して実施可能な動作の決定をしていく。更に動作中の映像情報を頭部に設置する小型カメラから得る実験条件を加え、頭部-眼球運動協応性に、視覚情報が関与しているのか否かいついても分析を進めていく予定である。健常者の眼球・頭部協調運動の測定を継続し行い、健常成人の動作種毎のパターンを明確化するとともに、発達障がい者のデータ収集も行い障害特性との関連について分析を進める。眼球・頭部協調運動の測定として眼電位とジャイロセンサーを用いていたが、現在用いている機器では眼電位の測定結果が不安定なため、アイカメラによる測定も同時に行い、視線停留と動作種との関連についても分析を行う予定である。機器の信頼性と妥当性の検証に時間を要してしまったことから、当初2台購入予定であった機器を1台購入に留め研究を進めてきた。次年度は、一定の信頼性と妥当性の確認ができたことから2台追加で購入し、研究を進めていく予定である。また、研究成果の報告も息柄対象とする活動が決定することで、可能となるため学会報告等の旅費も予定通り使用していく。眼球・頭部協調運動を適切に測定できる機器の構成の決定が遅れたため、これらの機器購入が年度内に行えなかった。次年度は決定した機器構成に関する購入を進めていく予定である。
シアリダーゼ遺伝子による細胞リモデリングとその臨床応用

先に、ウシ脳のシナプトソーム膜に局在するシアリダーゼのcDNAクローニングに成功し、一次構造を明かにした。このたび、COS細胞での発現実験によって、このcDNAはガングリオシドにほぼ特異的に作用し、N-末端が細胞外を向いている非典型膜タンパクをコードしていることがわかった。このシアリダーゼに高いホモロジーを有する酸素がヒトやマウスにも存在することがわかったので、PCRやハイブリダイゼーション法によって、ヒトおよびマウス酸素遺伝子のクローニングを行った。これらの一次構造はそれぞれウシ酵素の83%および78%相同性を示し、予想される高次構造も類似していた。ヒトシアリダーゼcDNAを用いて、各組織の転写レベルを調べると、筋・神経組織で高く、消化器系組織では非常に低いことがわかった。これらの結果を基にがん組織における発現状態を調べたところ、消化器がん組織、とくに大腸がんで著しく高発現していることが明らかになった。しかし、がん転移能との相関性は得られなかった。また、マウス酵素cDNAをプローブとして、神経芽腫細胞Neuro2aの分化時における本酵素の役割を観察すると、神経突起形成につれて転写および活性両レベルでの亢進が認められた。以上のような発現の変化の機構や意識の解明をめざして、ゲノムDNAの検索や細胞への導入実験、トランスジェニックマウスの作成を行い、機能の実体を追及中である。今後は、リソゾーム膜性シアリダーゼなど、GM2を水解するガングリオシド・シアリダーゼのクローニングも完成させ、主要なシアリダーゼcDNAをすべて駆使することによって、生理的脱シアリル化の全貌を把握し、がんや脳神経・筋疾患などの病態機構の解明をめざしたい。
アレルギー疾患の発症及び進展を予防する食生活のあり方に関する基礎的実験的研究

1.ラットの喘息モデル(オバルブミン感作Brown Norway雄性ラット)を用いてドコサヘキサエン酸(DHA)がアレルゲン吸入後の好酸球の気道内浸潤にどのような影響を及ぼすのかを検討した。オバルブミン感作ラットに対するオバルブミン吸入はBALF中の好酸球数、好中球数、リンパ球数を有意に増加した。とりわけ好酸球数の増加は著明であった。DHA-TGを用いた前処置は、アレルゲン吸入後のBALF中のマクロファージ数には影響を及ぼさなかったが、好酸球数、好中球数、リンパ球数を50%以上減少させた。一方、大豆油による前処置ではBALF中のマクロファージ数、好酸球数、好中球数、リンパ球数に有意な変化を与えなかった。2.DHA-TGを投与したBrown Norway雄性ラットの血漿及び肺実質のリン脂質中の脂肪酸組成は現在検討中である。3.DHAがアレルゲン吸入後の好酸球、好中球、リンパ球の気道内浸潤を抑制したことから、本研究はDHAの強化食がアレルギー疾患に有効な治療法である可能性を強く支持している。このモデルで観察された好酸球の浸潤はシクロスポリンA、デキサメサゾンの前投与で著明に抑制されることから、好酸球浸潤は主にTリンパ球の活性化を通して引き起こされると考えられている。したがって、DHAはこれらの薬剤と類似した抗アレルギー炎症作用、免疫抑制作用を有することが示された。1.栄養価計算システムNUT Version 4.0を用いて食物除去療法中のアレルギー疾患患児の栄養調査を行った。その結果、健常児に比べ、コレステロール、カルシウム、食物繊維の摂取量が有意に低値であることが明らかとなった。また、栄養指導を受けずに食物除去療法を行っている患児のなかには栄養摂取が極端に不良のものが認められた。2.脂肪酸の摂取量及び摂取内容と血漿リン脂質中の脂肪酸組成とに明瞭な関連性を見い出せなかった。この点は、脂肪酸摂取に関する栄養指導のあり方を決定するうえで今後の検討課題となる。4.ポリミキシンB感作モルモットにポリミキシンBとEPA、DHAあるいはリノール酸を腹腔内に投与し、40時間後に採取した腹腔内好酸球のLTB4に対する遊走能・運動能を検討した。コントロール群に比べて、DHA及びEPA投与群では好酸球の遊走能および運動能が有意に抑制されたが、リノール酸投与群ではいずれの細胞活性に関しても差を認めなかった。今回の結果(3、4)は、n-3系多価不飽和脂肪酸の抗アレルギー作用の機序のひとつを示唆するものであろう。5.今後の検討課題-n-3系多価不飽和脂肪酸の抗アレルギー作用の機序をさらに詳しく解明してゆくことは、これらの脂肪酸の臨床応用の道を開くことに繋がると考えられる。