hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ストレスマネージメントによる微生物全細胞統制技術の開発

純酸素供給で細胞内に活性酸素が大量に生産されると思われるが、これにバブリング等のストレスが加わると、大腸菌は活性酸素による酸化ストレス応答のほかバブリングや振とうによるストレスへの対応が必要になり、上記培養条件では生きているが増殖できない状態にあったと考えらえた。バイブリングや振とうは大腸菌細胞にストレスとなり、その応答として大腸菌は鞭毛や繊毛運動にエネルギーを費やす。この運動のためのエネルギー消費は定性的だが相当に大きいようである。本研究では、酸素呼吸のための活性酸素応答、繊毛・鞭毛運動、細胞外多糖類の生成がエネルギー消費が大きいストレス応答であると考えられた。活性酸素は酸素呼吸の場合であり、繊毛・鞭毛運動と細胞外多糖類の生成は粗大バブリングや振とう培養のようなせん断ストレスのかかる培養の場合である。細胞の制御は、ストレス応答に要するエネルギー消費の大きさを考慮して、これらの主要なストレスの組み合わせを考えることにより実現できる。ヒトは生物であり、バクテリアもまた生物である。ストレスを感じ応答している。しかし、バクテリアがどのようなストレスをどの程度感じているのか、それがバクテリアの生存にどの程度重要なのか把握する方法はない。また、ストレスが小さい状態と比べて調べる必要があるが、その状態を作り出す方法がない。本研究で開発した超小型のマイクロバブル発生装置はバクテリアのストレスを極小にでき、本装置を用い、遺伝子の発現解析を合わせて行うことで、バクテリアの生存に影響の大きい主要なストレスを明らかにすることができた。そのストレスの与え方を操作すること(ストレスマネジメント)は、将来エコロジカルなバクテリア制御方法になる。本研究課題の最終目的は、本研究でストレス指標を解明することと、解明したストレス指標に基づいて微生物全細胞制御を実現することである。現在、ストレス指標が未解明である。そのためストレス指標に基づいた微生物反応リアクターの管理に至っていない。27年度に達成できるように計画しているが、余裕がある状態ではないため、現時点では「やや遅れている。」と考えることにした。ただし、本研究で開発している微細気泡発生装置を用いたリアクターと従来の培養を比較すると、微生物の表現型(増殖速度や細胞形態、塩素耐性など)に明確な違いが認められているため、ストレス指標解明のための実験系は様々な細菌類でほぼ確立できていると考えている。よって、これよりすみやかにストレス指標解明を進めていく。27年度が最終年度であるため、記入しない。環境微生物学1.ストレス応答評価によりストレスマネージメント指標の探索を行う。(昨年度から継続)処理性と微生物ストレスを対応づけるため、リアクターの処理性、細胞の応答、遺伝子発現応答の3つのスケールレベルで行う。作製したリアクターを用いて、溶存酸素濃度、基質濃度、気泡径および流速条件を操作因子として、リアクターの処理性(3-4年目)、細胞の応答(3-4年目)、遺伝子発現応答(4年目)の3つのスケールレベルで順次実験を行う。
2000年世界人口センサスの可能性と展望にかんする多面的研究

本企画研究では、第1に、諸外国の2000年世界人口センサスにおいて、行政→統計レジスターベースのセンサスが調査様式のセンサスに代って、人口センサスの代替法として試みられている実情を踏まえ、世界人口センサスの内外の政府統計体系にたいする影響の大きさを考慮することによって、文部省科学研究補助金の特定領域研究を設定する必要性を確認した(1998年7月日本統計学会)。つぎに、英国、米国や独国における実地調査と最新の情報にもとづき、世界人口センサスの準備・実施過程に実時間的な多面的機動的にアプローチする特定領域研究の設定のために、研究課題の構成とそれにそった計画研究チームと総括班の編制を進め、そのための全体の企画会議とサブテーマ別の研究集会を8月10月に2度開催することによって、4つの研究事項(A01人口センサスの精度と方法、A02人口センサスによる小地域分析、A03人口センサス関連統計のデータリンケージ、A04人口変動と人口予測)を設定し、8チームの計画研究を組織した。そして、このような総合的な研究課題に機動的に対応するために、関連分野の指導的な専門家と中核的なスタッフが連携した密度の高い目的意識的な実施計画と研究組織が設計できている。
宇宙論における新しい観測手段の確立

インフレーションにより作られる原始重力波により生成された温度ゆらぎがトムソン散乱により減衰され、スペクトルの歪み(化学ポテンシャル)を生成することを示しました。また、宇宙背景放射の揺らぎは小スケールではdiffusion dampingにより減衰しますが、そこに貯えられていたエネルギーが熱として開放され宇宙を加熱します。この現象の非等方性を用いることにより、小スケールを伴う原始密度揺らぎの非ガウス性に制限を与えました。さらに、この過程は揺らぎの二次以上の効果であり、モード・モード結合を取り入れても超ハッブルスケールで保存するような曲率揺らぎを導入し、音響再加熱について調べました。宇宙背景放射(CMB)の非等方性の理論と観測の発展等により、ここ数十年で宇宙論は大発展を遂げましたが、それも限界に近づきつつあり、宇宙論のさらなる発展のためには新しい観測手段の開発が喫緊の課題です。中でも、宇宙背景放射のスペクトルの歪みは、非等方性の観測では捉えることが出来ない小さなスケールでの揺らぎの性質を調べられるという点で大きな注目を浴びています。我々は、従来考えられていた宇宙背景放射のスペクトルの歪みを生成する機構とは全く異なる新しい機構を提唱しました。インフレーションにより作られる原始揺らぎとして、密度揺らぎの他に原始重力波(テンソル揺らぎ)があります。この原始重力波により生成された温度ゆらぎがトムソン散乱により減衰され、スペクトルの歪み(化学ポテンシャル)を生成します。この機構は、従来考えられてきた原始密度揺らぎによる生成機構、つまり、密度揺らぎがシルク減衰機構により減衰しスペクトルの歪みを生成する機構、とは大きく異なります。この新たな生成機構により、小スケールでの重力波の振幅に制限をつけることが可能になることを示しました。具体的には、もし、スケール不変な原始重力波が存在すると仮定した場合には、現在のPLANCK衛星からの制限を考慮すると密度揺らぎから作られるスペクトルの歪みよりも小さいスペクトルの歪みしか作られないことが分かりましたが、小スケールでより大きな振幅を持つ原始重力波に対しては強い制限をつけることが出来ることが分かりました。インフレーション中に生成される密度揺らぎのスケールは何十桁にも及ぶが、宇宙背景放射の非等方性の直接観測により調べられているスケールはわずか数桁である。従って、より小さいスケールの密度揺らぎの情報を調べることは、揺らぎ自身の性質のみならず、インフレーションのダイナミクスを調べる、という観点からも極めて重要である。そこで、音響再加熱と呼ばれる現象に着目した。宇宙背景放射の揺らぎは小スケールではdiffusion dampingにより減衰するが、そこに貯えられていたエネルギーが熱として開放され宇宙を加熱する。この現象の非等方性を用いることにより、小スケールを伴う原始密度揺らぎの非ガウス性に制限を与えた。具体的には、音響再加熱の非等方性は原始密度揺らぎの高次の効果として現れるため、作られる温度揺らぎも二次の効果となる。従って、この効果により作られる温度揺らぎは原始密度揺らぎの高次相関関数の情報を含む。また、この温度揺らぎの大きさが種々の衛星で実際に観測された温度揺らぎの大きさを越えてはならない、という条件から原始密度揺らぎの非ガウスに制限を与えることを見出し、実際に制限を加えた。音響再加熱と呼ばれる現象の非等方性に着目し、小スケールを伴う原始密度揺らぎの非ガウス性に制限を与える新しい方法を見出したため。インフレーション中に生成される密度揺らぎのスケールは何十桁にも及びますが、宇宙背景放射の非等方性の観測により直接的に調べられているスケールはわずか数桁です。これは、まだ何十桁にも渡って未開拓なスケールが残っていることを意味します。このような未開拓の小スケールの密度揺らぎの情報を調べることは、揺らぎ自身の性質のみならず、インフレーションのダイナミクスを調べる、という観点からも極めて重要です。宇宙背景放射の揺らぎは、小スケールではdiffusion dampingにより減衰し、そこに貯えられていたエネルギーが開放される結果、音響再加熱と呼ばれる現象が起きます。この現象を、再結合近くのトムソン散乱が重要になる時期において調べました。トムソン散乱のみでは、光子の分布をプランク分布にすることは出来ず、y歪みと呼ばれるスペクトルの歪みが生じ、これに伴いエントロピーが生成されることを確かめました。また、トムソン散乱の結果、光子の粒子数は保存されますが、エネルギーは電子とのやり取りの結果として保存せず、これに伴い、超ハッブルスケールにおいて等曲率揺らぎが生成されることを示しました。また、曲率揺らぎに非ガウス性があると生成された等曲率揺らぎが大スケールでもパワーを持ち、現在の観測から小スケールの揺らぎの性質について制限を与えられることを示しました。CMBのスペクトルの歪みや大規模構造形成等の新たな観測手段について、新たな進展の可能性を発見し、その解析をまだ行っているため。昨年度に引き続き、未開拓の小スケールの密度揺らぎの情報をどのようにして引き出すことが出来るかについて調べました。音響再加熱は揺らぎの二次以上の効果であるため、モード・モード結合が重要になりえます。このような場合でも、散乱やや非断熱非等方圧力がない場合に、超ハッブルスケールで保存するような曲率揺らぎを導入し、音響再加熱について調べました。

インフレーションにより作られる原始重力波により生成された温度ゆらぎがトムソン散乱により減衰され、スペクトルの歪み(化学ポテンシャル)を生成することを示しました。また、宇宙背景放射の揺らぎは小スケールではdiffusion dampingにより減衰しますが、そこに貯えられていたエネルギーが熱として開放され宇宙を加熱します。この現象の非等方性を用いることにより、小スケールを伴う原始密度揺らぎの非ガウス性に制限を与えました。さらに、この過程は揺らぎの二次以上の効果であり、モード・モード結合を取り入れても超ハッブルスケールで保存するような曲率揺らぎを導入し、音響再加熱について調べました。宇宙背景放射のスペクトルの歪みを生成する新しい機構を提唱することにより、従来の非等方性の観測では調べることが出来ない小さなスケールでの重力波の振幅に制限を与えることが出来たから。引き続き、宇宙論における新しい観測手段を探し、その手法を確立することを目指す。宇宙論引き続き、宇宙論における新しい観測手段を探し、その手法を確立することを目指す。研究会の参加や専門家への訪問のため前倒し請求をしたが、急遽、先方に費用を負担してもらえることになったため。また、研究計画遂行に必要な数値計算を行うポスドク研究員を次年度に雇うために経費の使用を若干控えたから。研究計画遂行に必要な数値計算を行うポスドク研究員を次年度に雇うために経費の使用を若干控えたから。研究計画遂行に必要な数値計算を行うポスドク研究員を雇う経費として使用。
北マリアナ海域における熱水性生物の個体群動態および幼生分散過程の研究

熱水鉱床の海底資源開発は、化学合成生態系の保全を考慮しつつ開発を進める必要がある。そのためには熱水性生物の幼生加入の解析が必要であるが、個体群解析を年齢ごとに解析されたことはない。そこで、加齢色素であるリポフスシンを年齢指標として、遺伝子解析も含めてサツマハオリムシの個体群解析をおこなった。その結果、同じ体サイズ組成であっても、年齢の異なる個体群があり、時期によって加入する遺伝子構成も異なることが分かった。また、人工化学合成生態系水槽の微生物相を調べたところ、深海の鯨骨生物群集ににた微生物相をもつことがわかり、今後熱水生物の着生と変態の観察に有効であることが分かった。マリアナ海域における熱水性幼生分散に関する研究のための調査航海が得られなかったため、航海に先立って事前に実験手法の確立と予備調査を行った。まず、マリアナ海域で確認されるサツマハオリムシの採集を鹿児島湾にて行った。サツマハオリムシは生物採集グラバーをもちいて採集した。採集された場所ごとの集団でリポフスシン量と遺伝子のCOI領域を解析した。その結果、リポフスシンは同じ採集場所から得られた個体群はほぼリポフスシン量がそろっており、様々な場所から集団から得られたものでは、リポフスシン量にばらつきが見られた。このことから、同じ場所にいる個体はほぼ同じ年齢の個体が集まっていることが示唆された。さらにCOI遺伝子を解析したが、解析できた個体数が少なく、まだ年齢と個体群の関係は明らかに出来ていない。また、ハオリムシの着底の条件をバクテリア相が関係していると仮定し、ハオリムシ類の飼育水槽および鹿児島で採集された際に得られた底質の泥からバクテリアとアーキアのクローン解析を行った。チューブワームが飼育されている水槽からは、γプロテオバクテリアに属するチューブワーム共生細菌の存在が確認された。バクテリアでは底泥サンプルからイオウ酸化細菌(SOx)の存在が確認された。アーキアについては、底泥サンプルの特に嫌気層において大量の嫌気的メタン酸化菌(ANME-3)グループの存在を確認した。さらに、熱水性ゴカイの分類のために過去に採集されたサンプルを整理してリストアップした。また、ニシノシマホウキガニが伊豆大島の南側の大室だしで採集されており、それらを飼育していたことから、ニシノシマホウキガニの遺伝子解析を行った。その結果、大室ダシにはニシノシマホウキガニと台湾に生息するニシノシマホウキガニの近縁種が含まれている可能性が見られ、黒潮にのって分散してきている可能性が考えられた。年齢指標として、加齢色素であるリポフスシンを用い、リポフスシンと年齢との関係を明らかにすることを目的とした。マリアナ海域への航海が得られなかったため、鹿児島湾のサツマハオリムシを用いて研究を行った。ハオリムシを採集し、採集したまとまりごとに個体群をわけた。また、まとまりが不明なものは全て混在させた鹿児島湾全体の個体群として扱った。これら採集されたハオリムシのハオリ部分はリポフスシンの解析に用い、エラよりも上の部分はDNA解析に用いた。DNAはこれまで報告の多いCOI遺伝子を解析した。さらに、ハオリムシ幼生の着生機構において底質のバクテリア相との関連をしらべるため、硫化水素を人工的に発生させる水槽内でバクテリア相を解析した。また、硫化水素の分布とハオリムシのルート形成についても同時に解析した。リポフスシンの量において、様々な採集ポイントから得られたハオリムシ個体群をまとめたグループでは、リポフスシン量の分布の幅が大きく、それぞれの採集地点におけるリポフスシン量はある分布の幅が決まっていた。また、DNAに関しては、COI遺伝子に3つのハプロタイプ(A, B, C)がみられた。鹿児島湾では本研究でのハプロタイプBがもっとも優先しているものと思われる。人工湧水域水槽においては、硫化水素の供給に必須であると思われる硫酸還元菌とイオウ酸化細菌の存在が確認された。また水槽底泥中のより深い部分の嫌気的環境と思われる層からは、メタン生成アーキアと嫌気的メタン酸化アーキアの存在が確認された。また、ハオリムシのルート形成と硫化水素濃度との関係においては、ルートが直線的に伸長している場所においては硫化水素濃度が低く、ルート部分が渦巻状になっているところでは硫化水素濃度が高いことが明らかになった。マリアナ海域の調査航海を得ることができず、鹿児島大学とかごしま水族館の協力を得て、サツマハオリムシの採集を行った。また、海洋研究開発機構の「なつしま」NT15-14航海で得られたタギリカクレエビを新江ノ島水族館で飼育中に幼生が得られた。また鹿児島大学「南星丸」によって採集されたタギリカクレエビからも幼生が得られた。さらに、飼育環境における熱水生物の幼生の着生に関するバクテリア相の解析を進めた。サツマハオリムシのリポフスシンおよびCOI遺伝子解析の個体数を233個体まで増やし、年齢とハプロタイプを加味した個体群解析をおこなった。その結果、同じ様なサイズ頻度分布を持つ個体群であっても、年齢構成が全く異なった。さらにハプロタイプをみると、古くから加入している個体や新しく加入した個体を認めることができ、新たな観点から個体群動態の研究ができるようになった。

しかし、沈設した時期の分かっている鯨骨に付着したサツマハオリムシを得ることが出来なかったため、リポフスシンによる絶対的な齢指標を算出することが出来ず、相対的な齢指標にとどまってしまった。また、タギリカクレエビ幼生に関しては、ふ化後約1ヶ月間のデータが得られたが、着底にまでは至らなかった。人工化学合成生態系水槽の微生物相の解析については、水槽底泥中に、バクテリアでは、硫化水素の供給に必須であると考えられる硫酸還元菌群(SRB)とイオウ酸化細菌群が確認された。アーキアでは低温環境に適応したメタン菌群が優占していた。また嫌気的メタン酸化の役割を担う可能性がある微生物群(ANME)が見い出され、ANMEとSRBによる硫酸還元コンソーシアムで硫化水素の供給を行う微生物系の存在が示唆された。またこれらの微生物群集構造は、深海の鯨骨直下の堆積物中でのものと類似していた。これは、水槽内の環境が有機物由来の化学合成生態系に近いことを示唆している。熱水鉱床の海底資源開発は、化学合成生態系の保全を考慮しつつ開発を進める必要がある。そのためには熱水性生物の幼生加入の解析が必要であるが、個体群解析を年齢ごとに解析されたことはない。そこで、加齢色素であるリポフスシンを年齢指標として、遺伝子解析も含めてサツマハオリムシの個体群解析をおこなった。その結果、同じ体サイズ組成であっても、年齢の異なる個体群があり、時期によって加入する遺伝子構成も異なることが分かった。また、人工化学合成生態系水槽の微生物相を調べたところ、深海の鯨骨生物群集ににた微生物相をもつことがわかり、今後熱水生物の着生と変態の観察に有効であることが分かった。JAMSTECでのマリアナ海域の航海が得られなかったため、現場での解析が出来ない状態となった。そのため、鹿児島大学及び鹿児島水族館の協力で南星丸の調査航海により得られたサツマハオリムシで研究を進めている。海洋生物学最終年度ではあるが、マリアナ海域における調査航海が得られなかった。しかし、南星丸の調査はあるため、そこで得られたサンプルから、深海熱水性生物の年齢差定法を確立する。さらに解析を進めて年級群を考慮した個体群解析を行い、幼生分散過程も明らかにしてゆきたい。そのためには、さらなるサンプリングポイントでの1採集ごとのサンプルが必要となる。また、幼生の分散も考える上では、実際にプランクトンネットでの幼生採集も試みる必要がある。また、硫化水素濃度と底質におけるバクテリア相の解析も進め、ハオリムシ幼生の着生と変態に関わる要因を明らかにする。当初、鹿児島湾でのサツマハオリムシの採集をリブリーザーを用いた潜水で採集することを考えていたが、安全面から潜水採集を中止した。その後、サツマハオリムシの採集について模索していたところ、過去に作成した、鹿児島水族館所有の深海生物採集グラバーがあり、これまで機器不調で使用されていなかったが、その深海生物グラバーが使用可能となったことがわかった。これにより、ようやく12月中旬および1月中旬の2回、サツマハオリムシの採集を行うことが出来た。サンプル数が少なかったが、リポフスシンの抽出に成功した。その結果、個体群のまとまりごとにリポフスシンの量がまとまっており、リポフスシンによる年齢解析が出来る可能性を見いだせた。しかし、遺伝子解析でのDNA抽出およびCOI塩基解析がうまくいかず、個体群解析するだけの情報を得ることが出来なかった。
非アデニン型抗サイトカイニンの検索合成

アデニン型およびジフェニルウレア型サイトカイニンと本研究代表者らにより開発されたアデニン型抗サイトカイニン(ピロローおよびピリドピリミジン誘導体)の活性発現機構に関するこれまでの成果にもとづき、非アデニン構造を有する新規な抗サイトカイニン活性物質の合成展開を行った。1.sートリアジン型抗サイトカイニンの開発アデニン型抗サイトカイニンにおいて必須構造であるアルキルアミノ基あるいはアリルアミノ基を保存し、かつ含窒素複素芳香環性を有する構造として置換sートリアジン構造を選択した。種々の置換様式を検討した結果、6位にアルキルアミノ基あるいはアリルアミノ基を導入し、2位および4位にそれぞれ塩素およびエチルアミノ基を導入した構造に抗サイトカイニン活性を期待した。一連の誘導体を合成し、タバコカルステストにより活性を検定したところ顕著な抗サイトカイニン活性を示し、活性の高いものは0.05μMのカイネチンの活性を10^<-7>Mレベルで50%抑制した。2.カーバメート型抗サイトカイニンの開発sートリアジン化合物が顕著な抗サイトカイニン活性を示したことにもとづき、さらなる構造改変を目ざして種々のフェニルカーバメートを合成した。これはNーフェニルカーバメート類が光合成系II阻害活性においてsートリアジンと高い生物学的等価性を有することにもとづく。タバコカルステストの結果は良好で、sートリアジン誘導体同様、10^<-7>Mレベルでサイトカイニンの活性を顕著に抑制する誘導体を得た。以上のことより、本研究において初めてsートリアジン構造とNーフェニルカーバメート構造を有する非アデニン型の抗サイトカイニンが開発された。新規な植物化学制御物質としてその利用が期待される。アデニン型およびジフェニルウレア型サイトカイニンと本研究代表者らにより開発されたアデニン型抗サイトカイニン(ピロロピリミジンおよびピリドピリミジン誘導体)の活性発現構造に関するこれまでの研究成果をふまえ,研究計画に沿った以下のような実験を行い所定の成果を得た.1.標的化合物の設定と合成.アデニン型サイトカイニンにおいて必須構造であるアルキルアミノ基はあるいはアリルアミノ基を保存しながら複素芳香還化合物であることを分子設計の基本とした.そして考えられるいくつかの可能性の中からS-トリアジン構造を,これまでに明らかにした活性発現に必要な構造要因を充足しうるものとして取り上げた.具体的にはS-トリアジンの6位にアルキルアミノ基あるいはアリルアミノ基を導入し,その他の2および4位には塩素とエチルアミノ基を導入した誘導体を合成した.合成は6位置換基の構造を系統的に変化させるように行った.2.抗サイトカイニン活性.抗サイトカイニン活性は,タバコ(ウイスコンシンNo, 38株)カルスの0.05μMカイネチンによる増殖を50%阻害する濃度をもってその指標とした.活性検定の結果, 6位置換基が炭素数3個から6個のシクロアルキルアミノ基か,あるいはα位にメチル基程度の大きさの枝分かれがあるアルキルアミノ基のとき,顕著な抗サイトカイニン活性を示すことが明らかになった.アリルアミノ基を持ったものにも活性が認められたが強いものではなかった.これらのことより,活性発現には6位置換基の立体形状が重要であることがわかった.以上のことより,本研究において初めて非アデニン型の抗サイトカイニンが開発された.またこれらの誘導体がアスパラガス実生に花芽を誘導する活性を示すことも明らかにされた.今後はより新規な非アデニン型抗サイトカイニンを標的として研究を行う.昨年度の本研究において、新規なアデニン型構造を有しない抗サイトカイニンとして6ーアルキルおよび6ーアリルアミノー2ークロロ-4ーエチルアミノーSートリアジンの開発合成に成功した。

本年度はこの成果にもとづいて、さらに新規な非アデニン型抗サイトカイニンの開発を目的として研究を行った。その結果、Nーフェニルカーバメート誘導体に顕著な抗サイトカイニン活性を見出し、その活性はSートリアジン型抗サイトカイニンのそれに匹敵するものであった。1.標的化合物の設定と合成検索合成の対象としてアルキルおよびアリル、Nーフェニルカーバメート化合物を設定した。これはNーフェニルカーバメート類が光合成系II阻害活性において、Sートリアジン化合物と高い生物学的等価性を有することにもとづく。すなわち両者はクロロプラスト中の32Kダルトン蛋白の同一サイトに作用して電子伝達を阻害することが知られており、一見構造の異なるこれら化合物が生物学的には同一の機能を発揮すると考えられる。同様の事がサイトカイニンの作用点においても発現されることが期待される。そこで種々のアルキルおよびアリル基をアルコール部置換基としたNーフェニルカーバメート類を合成し、その活性を検定した。2.抗サイトカイニン活性抗サイトカイニン活性は、タバコカルスの0.05μMカイネチンによる増殖を50%阻害する濃度をもってその指標とした。活性検定の結果、炭素数35のアルキルおよびハロゲン置換フェニルを有するNー(3,4ージクロロフェニル)カーバメートに10^<-5>10^<-6>Mレベルの活性が見出された。さらに高活性を目ざして種々のNーヘテロアリルカーバノートを合成した結果、Pーフルオロフェニル、Nー〔4ー(2ークロロ)ピリジル〕カーバメートにおいて、10^<-7>Mレベルの顕著な抗サイトカイニン活性を見出した。
レーザーの作る電磁場を利用した多元分離場による微粒子の分離分析法の研究

レーザー光の電磁場にレーザー光熱変換による温度場や直流電場を組み合わせることにより新たな多元分離場を設計し、この多元分離場下での液中微粒子の挙動を詳細に検討した。レーザー光泳動と電気泳動を組み合わせることにより、微粒子のサイズ、ゼータ電位、光吸収性などの性質の異なる微粒子を逆方向に泳動分離できることが分かった。特にレーザー波長に光吸収をもつ微粒子について多元分離場による効率的な分離が可能であることを示した。レーザー光の電磁場、レーザー誘起光熱変換による温度場や外部直流電場などの力場を複合した新たな多元分離場を設計し、多機能な微粒子の選別分離分析法を開発するための基礎検討を行った。まず、分離挙動に対する微粒子の吸光度や屈折率の効果を明らかにするための基礎的な検討として、任意のサイズ、任意の光学的性質が得られる有機液滴の作成を試みた。液滴作成のために吐出機を購入し、高速度カメラを用いて再現性の良い有機微小液滴の作成実験条件を探索、決定した。作成した水中のマイクロメートルサイズの液滴微粒子および着色ポリスチレン微粒子を対象として、多元分離場における微粒子の挙動を顕微鏡システムにて観測した。多元分離場として直流電場による電気泳動力および電気浸透流とレーザー光による光泳動力を同軸で作用させることができるセルを設計、製作した。石英製のキャピラリー中にレーザー光を全反射現象を利用して照射し、キャピラリー中に均一な輻射圧場を作成した。キャピラリー両端には白金電極を設置し、直流電場を印加できる構造とした。製作したセルを用い、輻射圧と電気泳動力、電気浸透流を同方向または逆方向に作用させて、微粒子の泳動挙動の観測を試みた。この結果、直流電場の印加により微粒子が泳動することが確認でき、さらにレーザー光の照射により、その泳動速度が変化することがわかった。この挙動の違いから電位勾配による電気泳動、レーザーの輻射圧による光泳動、媒体の電気浸透流が微粒子に及ぼす作用力をそれぞれ分離し、さらに微粒子のサイズ、吸光度、電荷などの性質と泳動挙動の関係を明らかにする予定であったが、作成したセルに長時間電場を印加すると白金電極から気泡が発生し、キャピラリー中に制御できない流れが発生することが判明した。さらにセルの構造に改良を加え、精密な泳動挙動観測ができるシステムを構築する予定である。多元分離場として直流電場による電気泳動力および電気浸透流とレーザー光による光泳動力を同軸で作用させ、微粒子の泳動挙動の観測を試みた。試料微粒子の光泳動速度は微粒子サイズにほぼ比例し、光吸収の大きな微粒子で大きくなることが確認できた。また、キャピラリー両端に電圧を印加した場合には、試料ポリスチレンビーズは、正極側に電気泳動することがわかった。ポリスチレンビーズは中性域で負のゼータ電位をもち、媒体の電気浸透流とは逆方向に泳動するためである。この電気泳動速度と光泳動速度を調整することにより、微粒子の泳動方向をレーザー光のON/OFFで制御できることがわかった。したがって、レーザー光泳動と電気泳動を組み合わせることにより、微粒子のサイズ、ゼータ電位、光吸収性などの性質の異なる微粒子を逆方向に泳動分離できると考えられる。また、光泳動におけるレーザー光熱変換による温度場の効果を明らかにするため、光吸収性ポリスチレン微粒子のレーザー光泳動挙動を詳細に解析し、理論的に導かれる光泳動速度と比較した。その結果、光吸収性微粒子の周囲の媒体がレーザー照射により加熱され、粘度が低下することにより、光泳動速度が劇的に増大することがわかった。この光熱変換効果による泳動速度の増大現象を利用すれば、光吸収の大きさによる微粒子の高効率分離が可能であることをがわかった。レーザー光の電磁場、レーザー誘起光熱変換による温度場や外部直流電場などの力場を複合した新たな多元分離場を設計し、多機能な微粒子の選別分離分析法を開発するための検討を行った。レーザー光熱変換による温度場の効果を明らかにするため、様々な吸光度をもつ微粒子のレーザー光泳動挙動を解析した結果、光吸収性微粒子では光熱変換による周囲媒体の温度上昇のため光泳動効率がMie散乱理論による計算値よりも大きくなることがわかった。たとえば532nmのレーザーを用いた場合、直径3μmの赤色微粒子では光吸収による光熱変換効果により泳動向率が2倍以上に増大することがわかった。また、このとき微粒子周囲の水媒体は70°C以上になっていることがわかった。このような泳動特性を利用してdouble-Y型のマイクロ流路を用い、レーザー波長における吸収の有無による微粒子の分離を試みた。

その結果、532nmのレーザーを用いることにより、吸収の大きい赤色微粒子のみを他の微粒子から分離できることを明らかにした。この原理を用いることにより、吸光度が異なる様々な微粒子を非接触・非破壊で分離する技術への応用が期待できる。さらに多元分離場として周期的光電磁場の設計を目指し、プリズムと反射鏡を用いて照射レーザーを2つのビームに分解し、これを交叉して照射する方法とフライアイコンデンサアレイを用いる方法を試みた。その結果、フライアイレンズアレイを用いることにより、等間隔で安定な周期的光電磁場を構築することができた。周期的光電磁場内での微粒子の挙動を観測したが、光泳動と思われる挙動を観測することはできなかった。周期的光電磁場内での泳動挙動を観測、研究するためには、レーザー強度をさらに大きくする必要があることが分かった。理
転写因子の核内分布と転写活性化・細胞分化誘導能の分子細胞化学的相関解析

転写活性化能あるいは転写因子のDNA結合能と転写因子の核内分布との関係が、細胞において普遍的な現象かを、転写因子Runx2で検討した。Runx2は多能性未分化間葉系細胞の骨芽細胞への分化に主体的な役割をなし、オステオカルシンなどターゲット遺伝子のプロモーター領域に結合し転写を調節する。本研究ではRunx2の核内分布が、その転写活性化能及び骨芽細胞・軟骨細胞分化と相関するかを分子細胞化学で解析した。1.前骨芽細胞にbone morphogenic protein-2を加えてRunx2遺伝子の発現を亢進させ分化を促進させたとき、Runx2は核質の異染色質に近い正染色質に強く染色された。2.ColII-Akt-Tg-GFPトランスジェニック(Tg)胎児マウスの軟骨では、Runx2は軟骨膜の未分化な間葉系細胞および増殖軟骨の細胞の核に弱く分布し始め、分化途中の成熟軟骨細胞の核質に強く分布し、その後の分化が進んだ肥大軟骨細胞では核の分布は減弱した。AktによるRunx2のDNA結合変化と核内分布、細胞分化との関係が示唆された。3.Runx2-Tgの新生児マウスでは、Runx2とβカテニンは脛骨の骨端軟骨周囲軟骨膜の未分化間葉系細胞の核に分布し始め、その後Runx2は分化中の骨芽細胞の核質に分布し、骨細胞では陰性であった。一方、Runx2-/-のE18.5胎児マウスでは、脛骨の骨端軟骨周囲軟骨膜の未分化間葉系細胞の核にはβカテニンおよびオステリックスは陰性であった。骨芽細胞への分化にRunx2とβカテニンとの核内分布の密接な関与が示唆された。4.Runx2/GFPを発現するアデノウイルスベクターをC3H10T1/2多能性未分化線維芽細胞に導入すると、Runx2を核質に発現している細胞の突起は減少・短縮し、アクチンは染色が減少し、βカテニンは細胞膜の分布から細胞質内に凝集した。Runx2の核染色質分布は細胞分化誘導と密接に関係していることが示唆された。前骨芽細胞の培養細胞(MC3T3-E1)を培養し、bone morphogenic protein-2 (BMP-2)を100ng/mlの濃度で培養液に加えてRunx2遺伝子の発現を亢進させ分化を促進させたとき、核内Runx2は特定の部位に分布するか否かを免疫組織化学法で検討した。その結果、骨芽細胞への分化が進んでいる培養後7日では、Runx2は核小体を除く核質に分布していて、特に核小体周囲の正染色質に強く染色されていた。

なお、Runx2の転写活性化能の指標となるオステオカルシン遺伝子発現レベル、dominant-negative (dn)-Runx2 stable MC3T3-E1を用いて核内Runx2は異染色質に分布するか否か、前軟骨細胞株ATDC5細胞を用いグルココルチコイドでRunx2のDNA結合を阻害したとき、あるいはAktの細胞内発現、あるいはCbfb^<-/->tgマウスの細胞を用いてDNA結合能を欠いたとき、Runx2のDNA結合変化と核内分布、細胞分化の関係、現在検討中である。本研究ではRunx2の核内発布とRunx2遺伝子の転写活性の変化および細胞の分化との関係を分子細胞化学的に解析してきた。1.ColII-Akt-Tg-GFPトランスジェニック(Tg)胎児マウスの軟骨では、Runx2は軟骨膜の未分化な間葉系細胞および増殖軟骨の細胞の核に弱く分布し始め、分化途中の成熟軟骨細胞の核小体を除く核の染色質に強く分布し、その後の分化が進んだ肥大軟骨細胞では核の分布は減弱した。AktによるRunx2のDNA結合変化と核内分布、細胞分化との関係が示唆された。2.Runx2-Tgの新生児マウスでは、Runx2とβカテンは脛骨の骨端軟骨周囲軟骨膜の未分化間葉系細胞の核に分布し始め、その後Runx2は分化中の骨芽細胞の核小体を除く核染色質に分布し、骨細胞では陰性であった。一方、Runx2-/-のE18.5胎児マウスでは、脛骨の骨端軟骨周囲軟骨膜の未分化間葉系細胞の核にはβカテニンおよびオステリックスは陰性であった。骨芽細胞への分化にRunx2とβカテニンとの核内分布の密接な関与が示唆された。3.Runx2/GFPを発現するアデノウイルスベクターをC3H10T1/2多能性未分化線維芽細胞に導入すると、Runx2を核染色質に発現している細胞の突起は減少・短縮し、アクチシは染色が減少し、βカテニンは細胞膜の分布から細胞質内に凝集した。Runx2の核染色質分布は細胞分化誘導と密接に関係していることが示唆された。4.Runx2の核内分布を人為的に変動させるため、Runx2とferritinの融合蛋白を発現するアデノウイルスベクターの作製は検討中である。また、核内分布を決定するRunx2のC端側アミノ酸配列を検索するためのC末端を種々に欠失させた変異体アデノウイルスベクターを設計中である。
ｆＭＲＩを用いた星状神経節ブロック治療効果の定量化

顎矯正手術後の知覚麻痺の治療法で星状神経節ブロック(SGB)とキセノン光照射(XLI)の効果を電流知覚閾値(CPT)とrengedCPT(RCPT)を用いその有効性を評価した。fMRIは同意が得られず撮像できなかった。顎矯正手術患者のオトガイ部98側を手術前、手術1週間後、SGB(29側)かXLI(69側)で10回治療後に3種類の周波数の刺激のCPTとRCPTを群間比較した。また手術因子の評価を行った。治療後SGB群の全てのCPTとRCPTの変化量はXLIに比べて有意に減少した。CPTとRCPTと手術因子に相関関係はなかった。SGBは顎矯正手術後の知覚麻痺の有効な治療法であると考えられる。顎変形症手術において、知覚異常は最も一般的な偶発症の一つである。その治療法として、星状神経節ブロック(SGB)があるが、その効果は定量化されていない。この研究では効果を定量化することを目的とする。顎変形症手術の前と手術後、星状神経節ブロック施行後にNeurometerにてCPT値およびR-CPT値を計測してそれぞれを数値による定量化を行った。研究対象を同じ術式、同じ術者、女性に限定したことから一年で対象数が統計学的検討を行う数に達しなかったものの、二年に渡り行ったことから対象数を増やすことができた。SGBとキセノン照射での治療効果に対する比較検討を行った研究がないことから、私は今回得られたCPTおよびR-CPT値を用いて、二群間の統計学的検討を行った。その結果、現時点で知覚をつかさどる「Aβ線維」を反映する「2000Hz」でのCPT値R-CPT値で相互作用および統計学的有意差を認めた。この結果から、侵襲的であるSGBが非侵襲的であるキセノン照射と比較して有効であることが明らかになった。今後対象数の増加に伴いその結果は変化するものと思われる。SGBを施行する際には生体監視モニタを装着することが推奨されていることから、今回購入したモニタを装着して循環器変動を確認しながら毎回施行している。fMRI撮像に関してははボランティアを用いて予備実験を数回行い、統計学的測定を行った。その結果を反映した条件をマニュアル化し、刺激装置を定量化することで、実験の撮像条件を定量化することが可能となった。<研究の目的>今回の研究の目的は顎矯正手術後の知覚麻痺の治療法として星状神経節ブロックとキセノン光照射の効果を定量化することである。したがって、電流知覚閾値と段階的電流知覚閾値を用いて比較して、その有効性を評価。今回、インフォームド・コンセントが得られなかったことから、患者にてfMRIの撮像は行うことができなかった。<対象、方法>顎矯正手術(Le Fort1および両側下顎枝矢状分割術)を施行する患者のオトガイ部の98側を手術前、手術1週間後、10回の治療後に3種類の神経線維の評価のために2k, 250, 5Hzの周波数の刺激の電流知覚閾値と段階的電流知覚閾値を計測した。治療は、星状神経節ブロック(29側)あるいはキセノン光照射(69側)で行い、これらの電流知覚閾値と段階的電流知覚閾値を星状神経節ブロック群とキセノン光照射群の2群間で比較した。また手術因子(オトガイ形成術や下歯槽神経の露出)の評価を行った。<結果>術前においては、異常値を認める対象はいなかった。術後、ほとんどの対象の電流知覚閾値と段階的電流知覚閾値が有意に知覚障害の値を示した。治療後、星状神経節ブロック群の全ての電流知覚閾値と段階的電流知覚閾値の変化量は、キセノン光照射に比べて有意に減少した。電流知覚閾値と段階的電流知覚閾値と手術因子には相関関係はなかった。<結論>星状神経節ブロックは顎矯正手術後の下歯槽神経知覚麻痺の治療方法として有効な治療法であると考えられる。現在、顎変形症と診断され当院口腔外科にて手術を行うことが決定した患者に対してインフォームドコンセントを行い、術前のSWテストとNeurometerを用いたR-CPT値、CPT値を測定している。また、手術後に知覚異常が出現した患者に対して、治療を行う前に上記のテストを行った後に治療方針を決定し、ある程度治療を行った後に上記のテストを行っている。つまり、手術後、治療前、治療後のデータを収集中である。

現在、順調に被験者数が増えており、CPT値、R-CPT値ともに計測できている。本来の目的であるfMRIの撮像は被験者の協力が得られないため、撮像ができていない。また、規格化された刺激装置が高価であることから、一定の刺激をマニュアルで行う方法を現在考案中である。今回、震災の影響で、申請額を最大限に取得できるかどうか不明であった。そのことから申請するNeurometerの種類を変更すべきかという想定外の問題が発生したことから、最大限に取得できるまで研究することができなかった。したがって、研究計画に大幅な遅れが生じている。しかしながら、倫理委員会の承認や周術期にかかわるプロトコールの作成などの当該研究を行うベースは行っている。撮像条件および、一定の刺激をマニュアルで行う事を数人ボランティアで行い、実際に解析を行う。その後撮像をスムーズに行えるようにプロトコール化する。確実に撮像後の解析の条件が揃った時点で、患者に十分なインフォームド・コンセントを行い、この研究の意図をしっかりと説明する。その被験者に対して撮像を行い、脳画像解析を行う予定である。今後、データ数を増やして比較検討を行う。また、MRIを撮影することのインフォームドコンセントへの同意がとれないことが予測される。磁場環境下で使用できうる安価な刺激装置が作成可能であれば、それを購入する。また、Neurometerの消耗品である、電極も購入する。今回、日本歯科麻酔学会にて発表する予定であることから旅費を算出する。今まで集計したデータのデータ解析ソフトを購入する。また、Neurometerの電極を購入する予定である。
少年司法における検察官の役割

共同研究は、(1)検察官の役割に関するわが国の実態調査、(2)諸外国における比較制度論的研究、(3)少年司法における検察官の役割に関する理論的諸問題という3つの柱に即して行なわれた。(1)では、共通の質問票を用いて、検察官関与事件を担当した弁護士付添人、家裁調査官、裁判官からヒアリングの形で約10人から事例調査を行ない、さらに逆送事件の公判の調査等も行った。検察官のヒアリングは、「職務上の秘密」を理由に拒否された。改正少年法は、検察官関与を事実認定のための審判の協力者として位置づけており、原告官・訴追官ではないとした。その点、運用ではどうかが、我々の関心事であった。調査の結果、その役割は多様であり、協力者の立場から、積極的な活動を展開しない事例がある反面、当事者主義に近い運用が行なわれた事例もあった。そうした違いは、少年が事実を強く争っているかどうか、および主宰する審判官の姿勢の如何によるようである。(2)の外国調査は、アメリカ、イギリス、フランス、ドイツを対象として、文献研究と現地調査を行った。現地調査では、検察官、裁判官、弁護士および処遇担当者からのヒアリング、および研究者との意見交換を行なった。アメリカ、イギリスでは、ほぼ完全な当事者主義的な手続が採用されており、すべての事件で弁護人が選任されている一方、検察官も全部の事件に関与している。事実認定に争いがある場合は、対審で審理が進められる。これに対して、フランス、ドイツでは、もともと刑事裁判が職権主義的手続を前提にしており、その枠組で少年審判も行なわれている。このように、各国少年司法における検察官の役割は、基本的には刑事裁判の構造に規制されている。また、アメリカでは検察官が少年事件の振り分けの権限を行使し刑事政策の積極的な担い手となろうという傾向が強まっている。同様な傾向は、フランス、ドイツでも見られる。イギリスでは、検察官ではなく、警察が主体となって、チームを作って少年事件を処理する方向が見られる。ただ、どの国においても、成人の刑事裁判と少年審判との違いは強く意識されており、少年の審判における意見表明、コミュニケーションの実質的な確保と少年の立ち直り、社会復帰を重視していることが明らかとなった。(3)については、研究会の内部でも見解の違いがあり、検察官関与そのものに批判的な見解、検察官が関与するのであれば、対審化させるべきであるとの見解、現行法の建前を実体化させるべきであるとの見解等があり、さらに運用の実態を観察し続ける必要がある。共同研究は、(1)わが国の少年司法における検察官の役割の調査・分析と(2)諸外国との比較法研究という二つの柱からなっている。1.わが国の少年司法における検察官の役割の調査・分析については、改正少年法のもとで始まった検察官関与事例について、審判に関与した弁護士付添人や家裁調査官から聞き取りを行った。

その結果、関与した検察官の役割は、原告官・訴追官という刑事手続における役割とは基本的に異なり、公益的立場からする審判の協力者としての役割を果たしている様子がうかがえる。他方、弁護士付添人たちは、検察官は「出席しているだけの存在」であって、検察官の関与など不必要であるとする意見が根強いことが明らかとなった。また、次年度以降の調査のために、50数項目からなる統一的なアンケート調査票を作成し、ほぼ完成した。これは、家裁の裁判官と調査官、弁護士付添人、検察官等に同じ質問を発して、回答を得るという構想のもとに作成されている。2.比較法研究としては、アメリカ、フランス、イギリスの調査を行った。このうち、アメリカでは、クック・カウンティ少年裁判所で特別許可をもらい4日間にわたって審判の傍聴と関係者のインタビューを行った。その結果、次のような事実が明らかとなった。事実認定手続(トライアル)は、完全に対審構造であり、非公開であるほかは、成人と変わりがない。ただ、処分決定においては,検察官も、少年の最善の利益を第一に考えるというのがインタビューで得た回答であった。事実認定手続だけではなく、勾留決定、罪状認否、プロベーションの違反などの審判においても、すべての事件で公設弁護士と検察官が立ち会っていた。また、検察官は少年裁判所への送致・不送致の選択権を持っており、不送致事件では修復的司法のプログラムが大規模に進められていた。なお、検察官は遺棄・放任事件では、親権剥奪の請求人としての役割を果たしている。昨年度から引き続いて、1.検察官の審判関与事例の調査、2.外国の少年司法における検察官の役割について調査を行った。1.事例調査今年度は、(1)北九州市における保護処分取消請求事件の審判、(2)東京における傷害致死保護事件の審判について、関係者から3回に分けてヒアリングを行った。検察官の役割は、少年審判官の手続主宰のあり方によって、機能が異なってくることが、これらの事例で明らかとなった。たとえば、(1)では、被害者が少年に有利な供述を行おうとしたところ、裁判所が検察官に対して補充捜査を行わせることで、これを撤回させた。裁判所が検察官に任せるのではなく、職権で取り調べた方が妥当と思われる事案であった。(2)では、傷害致死で家裁に送致された少年が正当防衛を主張し、過剰防衛が認定され、保護処分が言い渡された事案であった。少年が無罪を主張し、いわゆる事実が激しく争われた事案の一つである。この種の事案では、事実上対審化したといってよい。2.海外調査フランス(パリ)、ドイツ(キール)、イギリス(ロンドンおよびブリストル)の3カ国について、チームを組んで少年司法の現地調査を行い、検察官の役割について検察官自身にインタビューを行うとともに、裁判官および弁護士から検察官の役割に関する彼らの見方を探った。検察官の役割は、大きくは刑事裁判のそれに規定されること、にもかかわらず、検察官たちは少年の立ち直りに寄与したいと考えていることが、浮かび上がってきたといえる。昨年度に引き続き、1.検察官関与事例の調査、2.外国の少年司法における検察官の役割について、海外調査を行った。1.事例調査今年度は、検察官が審判に関与した、
虚アーベル体の単数指数の研究

上記研究課題の下で、私たちは、(2,2,2,2)型虚アーベル体K(つまり、2次体の合併体で、有理数体上16次のもの)の単数指数Q_Kを決定する公式を、その実2次部分体の基本単数から構成した。体Kが8分体を含まない場合は平成4年度に完成し、その結果をまとめた論文は既に受理されていて、本年度に校正が終了した。体Kが8分体を含む場合が本年度のテーマである。単数指数Q_Kの判定に必要なKの最大実部分体の単数を具体的に指定し、Q_Kが判定できる公式を構成した。この結果をまとめた論文を8月に投稿し、1月に受理された。単数指数Q_Kが現れるKの相対類数hK^^*をMallet行列式で表す公式はCarlitz-Olsonから始められ、最近Girstmairによって一般化された。私たちも虚巡回体Kの場合について、Girstmairと異なる方法でKの相対類数hK^^*を行列式で表すことができた。また、研究代表者はこれまでの虚アーベル体の単数指数、相対類数の結果を整理し、金沢大学大学院自然科学研究所に学位を申請し、受理された。さらに、学際的観点からの研究を押し進めるため、伊藤俊次氏(津田塾大学教授)を招請し、タイリングの理論、組み合わせ数学について研究打ち合わせを行った。この打ち合わせは非常に有意義であった。
三次元培養スキャフォルドを用いた血管新生制御による生体硬組織の再生

本研究では、立体的な硬組織再生のために、三次元培養可能なスキャフォルドに再生組織内部への酸素や栄養分の供給を可能とするための血管新生を誘導する結合組織増殖因子(CTGF)を担持させた足場材料を作製した。さらに、骨形成とともに血管形成を実現させるために、骨芽細胞と血管内皮細胞を共培養し、骨分化、血管新生過程における両細胞の相互作用の重要性を明らかにした。骨芽細胞と血管内皮細胞を共培養することで、骨分化レベルが促進され、同時に血管形成も確認された。血管新生誘導型のスキャフォルドと血管内皮細胞、骨芽細胞共培養系を組み合わせることにより、立体的な骨組織の形成を可能にすることができると考えられる。本研究では生体硬組織の再生を実現させるために、既存材料の中では最も優れた生体活性を示す水酸アパタイト(HAp)またはベータ-リン酸三カルシウム(beta-TCP)からなる多孔質スキャフォルド(Apatite-fiber Scaffold; AFSおよびTricalcium-fiber Scaffold; TFS)を創製し、三次元的な構造を有する骨組織を構築することを目的としている。さらに、骨再生過程における血管新生制御の重要性に注目し、血管新生能を有するタンパク質を担持させたスキャフォルドを創製し、血管誘導能を有する足場材料の開発を目指している。そこで、本年度は骨再生ならびに血管侵入により最適な足場材料を作出するために、材料特性の異なる数種のスキャフォルドを作製した。具体的には、溶解性の異なるHApおよびbeta-TCPファイバーを合成し、それらと気孔形成剤であるカーボンビーズを任意の割合で混合し、成形、焼結させることにより、AFSおよびTFSを創製した。この時、カーボンビーズの添加量や粒径を変化させ、溶解性と微細構造の異なるスキャフォルドを創製した。粒径の異なるカーボンビーズを用いることで、スキャフォルド内部の気孔径、連通性の制御を可能とし、さらに力学的強度を向上させた。また、作製したスキャフォルドを用いて、生物学的評価を実施した結果、骨芽細胞を用いたin vitro試験では、細胞はいずれの材料においても良好な増殖を示し、骨分化の進行も確認された。他方、in vivo試験においても、スキャフォルド内部への骨細胞の侵入が確認され、新生骨の形成も観察された。気孔率の高いスキャフォルドは細胞の侵入性や生体内での吸収性に優れるものの、力学的強度が乏しく、ハンドリング性に問題が残る。強度と細胞侵入性、新生骨の形成のバランスから候補のスキャフォルドの絞り込みを行なう必要性がある。本研究では生体硬組織の再生を実現させるために、既存材料の中では最も優れた生体活性を示す水酸アパタイト(HAp)からなる多孔質スキャフォルド(Apatite-fiber Scaffold; AFS)を創製し、三次元的な構造を有する骨組織を構築することを目的としている。平成26年度における研究成果により、溶解性と微細構造の異なるスキャフォルドを創製することが可能となり、作製したスキャフォルドを用いて、生物学的評価を実施した結果、in vitro, in vivo試験において、細胞は良好な増殖を示し、骨分化の進行、新生骨の形成も観察された。平成27年度は平成26年度に良好な細胞増殖性を示したスキャフォルドを用いて、in vitro, in vivo試験を実施した。in vitro試験では、血管内皮細胞と骨芽細胞をスキャドルド内で共培養した結果、スキャフォルド内部への血管侵入および骨形成能が促進されることを明らかにした。また、血管新生を促進させる因子をHApへ吸着させることで、細胞の接着性が促進することを確認した。さらに、ウサギを用いたin vivo試験では、血管新生能を有するタンパク質を担持させたスキャフォルドは拒絶反応を示すことなく、良好な生体適合性を示すことを明らかにした。今後は、in vivo試験における血管侵入性についてより詳細に解析し、血管新生および骨形成において有用なスキャフォルドの微細構造形態を明らかにする。本年度は、水酸アパタイト(HAp)からなる気孔率の異なる多孔質スキャフォルドApatite-fiber Scaffold (AFS)を用いて、血管内皮細胞と骨芽細胞を共培養することにより血管新生能を評価した。その結果、気孔率95-98%のスキャフォルドにおいて、骨芽細胞と共培養した血管内皮細胞は毛細血管様構造を形成し、スキャフォルド内へ血管が侵入することが分かった。また、骨芽細胞は血管内皮細胞と共存することにより、骨分化レベルが著しく促進されることが明らかになった。特に、微細な気孔(数十マイクロ程度のミクロ気孔)において、より骨分化が促進される傾向が認められた。これらの結果から、AFSは血管の侵入が可能で、骨芽細胞と血管内皮細胞が直接的に相互作用することが可能な三次元的な空間を提供していることが明らかになった。また、血管新生を促進させるために、今年度は、connective tissue growthfactor (CCN2/CTGF)に注目し、HApへこれを担持させた。その結果、CTGF担持HApは骨芽細胞の接着性を向上させる傾向にあることが分かった。さらに、このCTGFを担持させたスキャフォルドを作製し、ウサギの脛骨へのインプラント実験を実施した結果、良好な細胞増殖性を示すことも明らかになった。