hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食用植物油摂取が生活習慣病進展に及ぼす影響の研究

生活習慣病疾患モデルの一種の脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)にカノーラ油を6週間摂取させ、血圧調節に関わる器官である腎臓に対する影響のメカニズムを解明することを目的とした。SHRSPにおいても、正常血圧WKYラットにおいても、脂質酸化依存性の酸化ストレスの増加を伴った血漿脂質レベルの上昇を誘導するが、機能障害をほとんど伴わない腎傷害はSHRSPでのみ認められることが明らかとなった。また同時に、腎臓でのCOX-2およびe-NOSたんぱく発現が増大することが示唆されたが、高血圧関連疾患の進行促進へのこれらの関与についてはさらに検討が必要であることが明らかとなった。これまでに,カノーラ油を摂取した脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)では,高血圧関連疾患の進行促進と,心臓および腎臓での炎症が認められることを確認している。そこで本研究では,生活習慣病疾患モデルであるSHRSPにカノーラ油を摂取させ,血圧調節に関わる器官である腎臓に対する影響のメカニズムを解明し,高血圧促進との関連について調べることを目的とした。実験では,無脂肪精製粉末飼料に10%カノーラ油または大豆油を添加し,SHRSPおよび正常血圧Wistar-Kyoto(WKY)ラットに6週間摂取させた。投与期間終了直前に行った腎機能検査では,SHRSPのカノーラ油群の尿量が大豆油群と比較して増加していたが,電解質排泄量やクレアチニンクリアランス等には差が認められなかった。また解剖時に得た血漿を用いて生化学検査を行った結果,両系統ともカノーラ油群で血漿脂質濃度およびアルドステロン濃度が上昇した。腎臓の病理組織学所見は,WKYラシトでは両群間に差が認められなかったが,SHRSPのカノーラ油群では,糸球体硬化,細動脈壁肥厚,好塩基性尿細管が高頻度に観察され,免疫組織染色法により,腎傍糸球体装置のmaculadensa細胞でのCOX-2発現増大が認められたが,腎全体をサンプルとしたWesteroblotting法での検索では差を明らかにすることができなかった。またSHRSPでは,カノーラ油群のe-NOSタンパク発現誘導が認められた。以上のことから、カノーラ油の6週間摂取は,生活習慣病モデルとして使用したSHRSPでもWKYラットでも血漿脂質を増大するが,機能障害をほとんど伴わない腎傷害はSHRSPでのみ認められ,このとき腎臓でのCOX-2およびe-NOSたんぱく発現が増大することが示唆された。これまでに,カノーラ油を摂取した脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)では,高血圧関連疾患の進行促進と,心臓および腎臓での炎症が認められることを報告している.そこで本研究では,生活習慣病疾患モデルの一つであるSHRSPにカノーラ油を摂取させ,血圧調節に関わる器官である腎臓に対する影響のメカニズムを解明することを目的とした.実験では,無脂肪精製粉末飼料に10%カノーラ油または大豆油(対照)を添加し,SHRSPおよび正常血圧Wistar-Kyoto(WKY)ラットに6週間摂取させた.同条件で摂取させた動物を用いた前年度の実験では,両系統ともカノーラ油群で血漿脂質濃度が上昇した一方,腎臓の病理組織学的所見には,WKYラットでは両群間に差が認められなかったのに対し,SHRSPのカノーラ油群では糸球体硬化,細動脈壁肥厚,好塩基性尿細管が観察され,腎膀糸球体装置のmacula densa細胞でのCOX-2発現増大,e-NOSタンパク発現誘導が認められた.今年度は,酸化ストレスの関与を検討するため,酸化ストレスマーカーを測定したところ,両系統のカノーラ油群で,非酵素的脂質酸化依存性の酸化ストレスの指標である尿中8-isoprostane量の増加,一酸化窒素依存性マーカーのニトロチロシン量の減少が認められた.以上をまとめると,カノーラ油の6週間摂取は,生活習慣病モデルとして使用したSHRSPにおいても,WKYラットにおいても,脂質酸化依存性の酸化ストレスの増加を伴った血漿脂質レベルの上昇を誘導するが,機能障害をほとんど伴わない腎傷害はSHRSPでのみ認められることが明らかとなった.また同時に,腎臓でのCOX-2およびe-NOSたんぱく発現が増大することが示唆されたが,高血圧関連疾患の進行促進へのこれらの関与についてはさらに検討が必要である.
ミセル化抗癌剤による頭頸部癌の転移リンパ節を標的とした新規リンパ管化学療法の開発

頭頸部癌の最大の予後因子である転移リンパ節の制御にリンパ管を利用したlymphatic chemotherapyを頭頸部癌で確立し、選択的に低侵襲に転移リンパ節を治療する画期的な治療の実用化を目指した基礎研究である。本治療の確立には抗癌剤を効率的にリンパ管経由で転移リンパ節に運ぶDrug Delivery System(DDS)の確立が必要である。DDSは、縦隔リンパ節等の遠位の転移リンパ節にも効率よく集積する最適な薬剤と形態が必要である。最適な薬剤はリンパ節指向性が強いミセル化したCDDPを使用し、抗癌剤の移動をICG蛍光法で可視化した。有用性をリンパ節内CDDP濃度と病理学的検討した。頭頸部癌の最大の予後因子である転移リンパ節の制御にセンチネルリンパ節理論に基づきリンパ管を利用したlymphatic chemotherapyを頭頸部癌で確立し、低侵襲に、転移リンパ節に強力な治療効果を発揮する治療の実用化を目指した研究である。重要な点は原発巣と転移リンパ節がリンパ管で結合していることである。このリンパ管を可視化するのに従来の放射性物質に代わり近赤外蛍光イメージングを利用した。(文献番号)。再発や巨大な転移リンパ節の制御には頸動脈を含めて切除再建が必要で、合併症の少ない新しい方法を開発した2)原発巣の制御に抗癌剤を動注し、同時にリンパ節の制御をFDG-PETで検討した3)耳下腺癌等の頭蓋底浸潤例に対して低侵襲に原発巣を制御と低侵襲な再建法による合併症の軽減と転移リンパ節の制御を検討した4,8)最近増加するHPVが原因の中咽頭癌の診断法と転移が多くても予後良好の原因を従来のたばこれが原因で発症する中咽頭癌と比較検討した1,5)頭蓋底リンパ節に転移すると予後と術後合併症が問題であるが、近赤外蛍光イメージングをガイドに転移リンパ節を確認する最適時期の決定と、口腔内より切除する低侵襲手術を報告した6,9)また、上顎洞癌の治療時にCT-アンギオが最適とされているが、この方法の欠点を補う近赤外蛍光イメージングの有用性と転移リンパ節の制御を報告した7)侵襲を伴う長時間の再建手術を回避し、新しい素材ポリグリコール酸を利用した再建法と転移リンパ節の効率的制御法について報告した10)基礎実験では転移リンパ節に効率に移行し治療効果を発揮する最適な薬剤としてリンパ節に指向性が高いミセル化したPTX,ADM,CDDPを使用し、抗癌剤の移動を蛍光法で可視化する新たな研究を好転移性のVX2扁平上皮癌をNZWに移植し、頭頸部癌の転移モデルを作成し計画書通り実施中である。本研究は頭頸部癌の最大の予後因子である転移リンパ節の制御にセンチネルリンパ節理論に基づきリンパ管を利用した“リンパ管化学療法“を頭頸部癌で確立し、低侵襲療法の実用化である。重要な点は原発巣と転移リンパ節がリンパ管で結合し、このリンパ管の可視化に従来の放射線被曝のない近赤外蛍光イメージングを開発した。(文献番号は別紙参照)。原発巣の制御に抗癌剤を動注し、リンパ管経由のリンパ節の制御をFDG-PETと他のPETで検討した10,17)。巨大転移リンパ節の制御には頸動脈を含めて切除再建が必要で、合併症の少ない新しい方法を開発した13,16)。耳下腺癌等の頭蓋底浸潤例に対して原発巣制御とリンパ管を考慮した低侵襲な転移リンパ節の制御を検討した2,3,4,8,18)。最近増加するHPV関連中咽頭癌の診断法と転移が多くても予後良好の原因を従来のたばこ関連中咽頭癌と比較検討した15)。頭蓋底リンパ節転移例は予後不良で術後合併症が問題となるが、蛍光イメージングをガイドに転移リンパ節を確認し、口腔内より切除する低侵襲法を開発した14,19)。放射線治療後の嚥下障害をリンパ管の観点よりリハビリに活用し嚥下障害を回避した9).上顎洞癌治療時にCT-anngiographyと蛍光イメージングの併用が転移リンパ節の制御にも有用と報告した12)。従来の侵襲を伴う長時間の再建手術を回避し、リンパ管を考慮した低侵襲再建法と転移リンパ節の効率的制御法について報告した1,4,5,6,7,11)。基礎研究では転移リンパ節に効率に移行し治療効果の高い最適なTargeting Chemotherapyの薬剤としてリンパ節指向性が高いミセル化PTX,ADM,CDDPを使用し、抗癌剤の移動を蛍光法で可視化する新たな研究を好転移性のVX2扁平上皮癌をNZWに移植し、頭頸部癌の転移モデルを作成し計画書に従い実施中である。頭頸部癌の最大の予後因子である転移リンパ節の制御にセンチネルリンパ節理論に基づきリンパ管を利用した“リンパ管化学療法“を頭頸部癌で確立し、低侵襲に転移リンパ節を制御する治療の実用化を目指した研究である。重要な点は原発巣と転移リンパ節がリンパ管で結合し、このリンパ管を可視化するのに従来の放射線被曝を伴う同位元素に代わる近赤外蛍光イメージの開発である。(文献番号は別紙の番号に一致)。センチネルリンパ節は原発巣からのリンパ増殖因子によりリンパ管が増殖し転移の準備ができていることが非センチネルリンパ節との比較検討で判明した1)。

最近増加するHPVの関与する中咽頭癌の診断法と転移が多くても予後良好の原因を従来のたばこが関与する中咽頭癌と比較検討し,ロボット等の低侵襲手術と放射線治療と比較検討した2,3,4,5,6,17)。原発巣に抗癌剤を動注し、リンパ管経由のリンパ節の制御をFDG-PETと他の核種のPETで検討した15)。巨大な転移リンパ節の制御には頸動脈を含めて切除再建が必要で、合併症の少ない新しい方法を開発した16)。耳下腺癌等の頭蓋底浸潤例に対して原発巣制御とリンパ管を考慮した低侵襲な転移リンパ節の制御を検討した7,8,13)。放射線治療後の再発例は予後不良で術後合併症が多く、口腔内より切除する低侵襲手術を報告した2,11,12)。放射線治療と嚥下障害をリンパ管の観点よりリハビリに活用し嚥下障害を回避した9,14)。従来の侵襲を伴う長時間の再建術を回避し、低侵襲再建法と転移リンパ節の効率的制御法について報告した2,4,6,8,9,11,12,13,16)。基礎研究では計画書に従い転移リンパ節に効率に移行する最適なリンパ指向性が高いミセル化CDDPをVX2扁平上皮癌をNZWに移植した頭頸部癌の転移モデルに投与し、抗癌剤の移動を蛍光法で可視化した。現在解析し投稿中である。頭頸部癌の最大の予後因子である転移リンパ節の制御にリンパ管を利用したlymphatic chemotherapyを頭頸部癌で確立し、選択的に低侵襲に転移リンパ節を治療する画期的な治療の実用化を目指した基礎研究である。本治療の確立には抗癌剤を効率的にリンパ管経由で転移リンパ節に運ぶDrug Delivery System(DDS)の確立が必要である。DDSは、縦隔リンパ節等の遠位の転移リンパ節にも効率よく集積する最適な薬剤と形態が必要である。最適な薬剤はリンパ節指向性が強いミセル化したCDDPを使用し、抗癌剤の移動をICG蛍光法で可視化した。有用性をリンパ節内CDDP濃度と病理学的検討した。海外出張後施設移動し、環境整備と実験室の使用時間等について調整に時間を要した。医歯薬1)原発巣と転移リンパ節はリンパ管により直接結合している。その結合の仕方はセンチネル理論によるとされています。このリンパ管の可視化に従来の放射線被曝を伴う放射線同位元素がよく利用されていたが、実験室等の使用制限があり、研究推進の律速段階となっていた。最近発達した近赤外線光学によりより深部可視化が可能となり、同位元素を使用しない研究が軌道に乗ってきました。2)安定した実験計の確立により効率的な実験を進める。腫瘍効果を確認するため大きめの腫瘍を発育させて効果を確認していましたが、遠隔転移や栄養障害で予後を確認するまで経過観察出来ない症例もあるので早期転移例にターゲットを当てて研究を進めます。研究時間が限られていることと好転移性であり遠隔転移も起きやすく実験が予定どうりに進展していません。海外研修とその後の施設移動に伴い予定した研究の速やかな実施が困難であったため。1)原発巣と転移リンパ節はリンパ管により直接結合している。その結合の仕方はセンチネル理論によると考えられています。:赤外線カメラを用い、被曝のない安全な蛍光イメージングにより転移リンパ節と近傍の非転移リンパ節とリンパ管を可視化し、区別する。現在最適とされている蛍光色素はICGであるが深さは表面より1cm以内とされています。もう少し深部まで可視化出来れば安全で効率的な転移リンパ節とリンパ管の確認が可能です。
発育過程における生体の「揺らぎ現象」の年齢特性に関する研究

脳波,心臓拍動,姿勢などの制御系の揺らぎ現象に自己回帰解析を施し,発育しつつある生体に潜む動的活動の年齢特性を明らかにすることを目的として,昭和60年より62年に至る3年間に次の実績をえた.1脳波解析による正常小児脳活動の発達現象に関する定量的研究未熟児より15歳に至る健康小児の覚醒・睡眠脳波に自己回帰・要素波解析を施すと,複雑な脳波活動を構成する要素波の周波数,パワー,減衰時間持続性,情報活動量などの諸特性を求めることができる.そこで,新生児から学童に至る小児の各脳部位導出脳波の要素波特性の発達に伴う変化を明らかにした(昭60).さらに,自己回帰モデルを応用した脳波の2次元表示の手法を開発し,互に有意差のない脳波群からなるいくつかの2次元脳電図の平均パターンを図示する方法や, 2つの2次元脳電図を比較して推計学的に有意差のある部分を図示する方法を開発し(昭61),未熟児や学童の発達に伴う2次元脳電図の定量的変化を明らかにした(昭62).2直立姿勢調節制御活動の解析と,その発達特性に関する研究健康幼児・学童の前後・左右の揺らぎ曲線に自己回帰解析を施し,構成要素波を求める手法を開発し(昭60), 5歳から12歳に至る正常児の直立姿勢の揺らぎの発達を求め(昭61),さらにパターン識別によって発達過程の定量的変化を明らかにした(昭62).3心拍変動の揺らぎの解析と,その発達特性に関する研究任意の時刻の心拍変動はそれ以前の過去の刻々の拍動状態の歴史に確率的に関連する面としない面とがあるので,拍動周期の時系列も自己回帰性を示す.そこで, R-R間隔時系列の自己回帰解析システムを開発し(昭60),それを用いて新生児の心拍変動を生直後より解析し(昭61),さらに静・動睡眠期での発達特性を明らかにした(昭62).脳波,心臓拍動,姿勢などの制御系の揺らぎ現象に自己回帰解析を施し,発育しつつある生体に潜む動的活動の年齢特性を明らかにすることを目的として,昭和60年より62年に至る3年間に次の実績をえた.1脳波解析による正常小児脳活動の発達現象に関する定量的研究未熟児より15歳に至る健康小児の覚醒・睡眠脳波に自己回帰・要素波解析を施すと,複雑な脳波活動を構成する要素波の周波数,パワー,減衰時間持続性,情報活動量などの諸特性を求めることができる.そこで,新生児から学童に至る小児の各脳部位導出脳波の要素波特性の発達に伴う変化を明らかにした(昭60).さらに,自己回帰モデルを応用した脳波の2次元表示の手法を開発し,互に有意差のない脳波群からなるいくつかの2次元脳電図の平均パターンを図示する方法や, 2つの2次元脳電図を比較して推計学的に有意差のある部分を図示する方法を開発し(昭61),未熟児や学童の発達に伴う2次元脳電図の定量的変化を明らかにした(昭62).2直立姿勢調節制御活動の解析と,その発達特性に関する研究健康幼児・学童の前後・左右の揺らぎ曲線に自己回帰解析を施し,構成要素波を求める手法を開発し(昭60), 5歳から12歳に至る正常児の直立姿勢の揺らぎの発達を求め(昭61),さらにパターン識別によって発達過程の定量的変化を明らかにした(昭62).3心拍変動の揺らぎの解析と,その発達特性に関する研究任意の時刻の心拍変動はそれ以前の過去の刻々の拍動状態の歴史に確率的に関連する面としない面とがあるので,拍動周期の時系列も自己回帰性を示す.そこで, R-R間隔時系列の自己回帰解析システムを開発し(昭60),それを用いて新生児の心拍変動を生直後より解析し(昭61),さらに静・動睡眠期での発達特性を明らかにした(昭62).脳波、心拍動、姿勢などの制御系の揺らぎ現象に自己回帰解析を施し、そのなかに潜む動的活動の年齢特異性を明らかにすることを目的として、昨年度にひきつづき次の実績をえた。1脳波解析による正常小児脳の発達現象に関する研究学童で、各年齢群200名ずつを選び、左右前頭、中心、後頭部脳波の周波数、パワー、減衰時間の持続性、情報活動量などの諸特性を求め、本年度は特にα波の諸特性の部分的、年齢的変化を定量的に明らかにした。ついで、すでに開発した自己回帰モデルを応用した脳波の2次元表示の手法を用いて、互いに有意差のない脳波群からなるいくつかの2次元脳電図の平均パタンを図示する方法や、2つの2次元脳電図を比較して5%ないし1%の危険率で有意差のある部分を図示する方法を開発した。また、正常児群と自閉症児群との大脳誘発電位を比較し、自閉症の大脳誘発電位の特性を明らかにした。2直立姿勢調節活動の揺らぎの解析と、その発達特性に関する研究健康学童455名を対象として、前後軸、左右軸の揺らぎ曲線を磁気記録、AD変換し、自己回帰パワースペクトルを求めた。その結果、前後軸では閉眼で7個の、開眼で9個の、左右軸では開閉眼ともに6個の、それぞれ1%の有意差で周波数帯域に分けられることを明らかにした。

3心拍変動の揺らぎの解析と、その発達特性に関する研究任意の時刻の心拍変動はそれ以前の過去の刻々の拍動状態の歴史に確率的に関連する面としない面とがあるので、拍動周期の時系列も自己回帰を示す。そこで、出生4時間後より日齢6日に至る健康新生児20例のR-R間隔時系列を求め、自己回帰を施すと日齢5より要素波は0.05、0.10.3、0.4cycles/beatの3個の周波数帯域に分けられ、それぞれ、体温、血圧、呼吸の中枢から影響をうけていることが示唆された。脳波,心拍変動,姿勢などの制御系の揺らぎ現象に自己回帰モデルを応用した解析を施し,そのなかに潜む動的活動の年齢特異性を明らかにすることを目的として,昨年度にひきつづき次の実績をえた.1.脳波解析による正常小児脳機能の発達現象に関する研究小学校,幼稚園の小児876名(男子439名,女子437名)を対象として左右前頭,中心,教頭各部より脳波を単極導出,磁気記録し,自己回帰解析を応用したパターン識別法を用いて男女間の脳波を比較した.その結果, 6歳と10歳の右側前頭部に1%の危検率で有意差がみられ,この年齢群の脳機能の発達に性差がみられることを知った.次に,新生児脳波の2次元脳電図を求め,静・動睡眠期で2次元脳電図パターン識別を行った所, 1%の危険率で静睡眠期優位に後頭部に有意差のあることが明らかになった.また,教室で開発した連続的脳機能モニターシステムで受胎後31週から脳波に律動性がみられることを明らかにした.2.直立姿勢調節制御の解析と,その発達特性に関する研究昨年にひきつづき直立姿勢動揺の前後軸,左右軸に自己回帰析を施し,パターン識別法を用いて正常健康11歳と12歳との差を検討した所,開・閉眼時において前後・左右ともに1%の危険率で有意差がみられ,年長児でも立直姿勢に有意の発達がみられることを知った.3.心拍変動の揺らぎの解析と,その発達特性に関する研究昨年にひきつづき,新生児心電図のRR間隔時系列に自己回帰・要素波解析を施し,新生児心拍周期制御活動の発達を知らんとして,静・動睡眠期におけるパターンを比較した.その結果,静睡眠期では受胎後34週で体温,血圧,呼吸の影響が明らかになるのに対して,動睡眠期では受胎後40週ではじめて3つのピークが認められた.
膵癌の早期診断及び術後予後マーカーの同定とその臨床応用に向けた研究

膵癌は他の癌と比較して悪性度が高く、極端に治療成績が悪いため、診断や治療効果の向上に繋げる技術開発が求められている。本研究では膵癌患者の手術で切除した組織に加えて手術前後の採血検体を採取し、遺伝子の発現を解析することを目的としている。日本発の技術である包括的高感度転写産物プロファイリング法(High Coverage Expression Profiling: HiCEP)を活用し、さらに次世代シークエンサーを組み合わせた新規の高感度解析法により、身体への負担の少ない早期診断マーカー等を探索する。浸潤性膵管癌(以下膵癌)は他の癌と比較して悪性度が高く、極端に予後不良な「21世紀に残された消化器癌」と言われ、その対策は急務である。膵癌細胞の分子的背景は不明な点が多く、その特性を解析して非侵襲的早期診断や治療効果の向上に繋げる技術開発が求められている。そこで本研究では、膵癌患者の手術検体組織に加えて、手術前後に末梢血検体を採取し、日本発の技術である包括的高感度転写産物プロファイリング(High Coverage Expression Profiling: HiCEP)法を活用し、かつ次世代シークエンサーを組み合わせた新規の高感度解析法により、高悪性度である膵癌に特異的な分子を探索することを目的とする。HiCEP法では、高感度かつ網羅的、定量的な発現解析を行うことが可能であり、実験の再現性も非常に高いという特徴がある。しかし、得られたピークの解析には、再度の電気泳動によるピークの個別分取と精製、シークエンシングが必要であり、これまでは転写物の配列決定に時間と手間を要した。そこで本研究において、ヒトにおいて初めてとなるHiCEP法の新たな解析手段を行った。すなわち、通常のHiCEP解析に加え、HiCEP法の途中で作成される全cDNAフラグメント(256対のプライマーを用いて網羅的に増幅されたcDNAの集合体)を対象に次世代シークエンサーで配列及びサイズを決定し、これによりHiCEPフラグメントのカタログ化を行った。カタログ化された情報を既に全配列が決定されているヒトゲノムにおいてアノテーションすることにより、ピークに該当する転写物の同定を、効率的に、かつ高い確率で行うことができるようになった。この新規の高感度解析法により、癌部での発現が非癌部での発現と比較して増加している共通のピーク(転写物)、及び減少している共通のピーク等の発現解析を進めることが可能になった。本研究においては、膵癌手術検体を癌部と肉眼的非癌部に分けて採取している。昨年度までに49検体採取することができ、今年度も採取を継続していく。さらに血液検体は担癌状態の有無での差を検討できるよう術前、術後1週間、術後1ヶ月以降の計3回採取している。それぞれの検体において、total RNAを抽出後にcDNAに転写し、発現解析を実施している。膵癌6症例の手術検体から採取した癌部、肉眼的非癌部の計12検体に対して、HiCEP法での発現解析を実施した。術前化学療法を受けた1症例を除いた5症例で共通して、非癌部と比較し癌部で3倍以上発現が増加しているピークを7個、癌部と比較し非癌部で3倍以上発現が増加しているピークを9個同定することができた。次世代シークエンサーを用いたHiCEPフラグメントのカタログ化により、得られたピークの配列を決定することができた。これら配列決定された遺伝子のうち、今まで膵癌との関連が報告されていない新規遺伝子として、癌部において発現が増加している遺伝子2個、非癌部において発現が増加している遺伝子5個を候補遺伝子として同定することができた。また、膵癌の他、腎癌においても同様の手法で発現解析を進めている。腎癌においては、全6症例で共通して非癌部と比較し癌部で5倍以上発現が増加しているピークを16個認めた。これらの中で配列決定された遺伝子のうち、今まで腎癌との関連が報告されていない新規遺伝子を4個同定することができた。さらに、HiCEP法で解析した膵癌の計12検体と同6症例の術前・術後の採血に関して、一般的に行われている既存の手法であるRNA-seq法でも解析を行っており、HiCEPでの発現解析結果と比較検討を行っている。これらの研究成果を、2019年6月の第31回日本肝胆膵外科学会・学術集会と9月の第78回日本癌学会学術総会において発表を予定している。今回のHiCEP法と次世代シークエンサーを組み合わせた新規発現解析方法におけるデータベース構築により、発現量や遺伝子の種類等、様々な条件で遺伝子発現の変化を検出することができるようになり、候補遺伝子を絞ることが可能となった。また、症例における病期診断や病理診断、治療効果等の臨床データを対比させ、その関連について解析・検討を行う。また、一般的に行われている既存の手法であるRNA-seq法で行った膵癌検体の解析結果とも比較検討することにより、候補遺伝子の検索を行う。それら候補遺伝子について再現解析を行い、まずRT-PCR法(SYBR Green)により他検体での発現を解析する。さらに、探索した候補分子の生体における働きを見るため、in situ hybridizationや免疫組織化学染色により膵癌組織における局在解析を行う。また、必要に応じて、細胞レベルでのin vitro発現実験により候補分子の生理学的または病態学的機能を検討する。また今回の手法により、膵癌症例の術前・術後血液検体でも同様に網羅的発現解析を進めていく。

これらの研究の結果、得られた研究成果を取りまとめ学会や論文での発表を行う。膵癌は他の癌と比較して悪性度が高く、極端に治療成績が悪いため、診断や治療効果の向上に繋げる技術開発が求められている。本研究では膵癌患者の手術で切除した組織に加えて手術前後の採血検体を採取し、遺伝子の発現を解析することを目的としている。日本発の技術である包括的高感度転写産物プロファイリング法(High Coverage Expression Profiling: HiCEP)を活用し、さらに次世代シークエンサーを組み合わせた新規の高感度解析法により、身体への負担の少ない早期診断マーカー等を探索する。浸潤性膵管癌(以下膵癌)は他の癌と比較して悪性度が高く、極端に予後不良な「21世紀に残された消化器癌」と言われ、その対策は急務である。膵癌細胞の分子的背景は不明な点が多く、その特性を解析して非侵襲的早期診断や治療効果の向上に繋げる技術開発が求められている。そこで本研究では、膵癌患者の手術検体組織に加えて、手術前後に末梢血検体を採取し、日本発の技術である包括的高感度転写産物プロファイリング(High Coverage Expression Profiling: HiCEP)法を活用し、かつ次世代シークエンサーを組み合わせた新規の高感度解析法により、高悪性度である膵癌に特異的な分子を探索することを目的とする。HiCEP法では、高感度かつ網羅的、定量的な発現解析を行うことが可能であり、実験の再現性も非常に高いという特徴がある。しかし、得られたピークの解析には、再度の電気泳動によるピークの個別分取と精製、シークエンシングが必要であり、これまでは転写物の配列決定に時間と手間を要した。そこで本研究において、ヒトにおいて初めてとなるHiCEP法の新たな解析手段を行った。すなわち、通常のHiCEP解析に加え、HiCEP法の途中で作成される全cDNAフラグメント(256対のプライマーを用いて網羅的に増幅されたcDNAの集合体)を対象に次世代シークエンサーで配列及びサイズを決定し、これによりHiCEPフラグメントのカタログ化を行った。カタログ化された情報を既に全配列が決定されているヒトゲノムにおいてアノテーションすることにより、ピークに該当する転写物の同定を、効率的に、かつ高い確率で行うことができるようになった。この新規の高感度解析法により、癌部での発現が非癌部での発現と比較して増加している共通のピーク(転写物)、及び減少している共通のピーク等の発現解析を進めることが可能になった。本研究においては、膵癌手術検体を癌部と肉眼的非癌部に分けて採取している。昨年度までに49検体採取することができ、今年度も採取を継続していく。さらに血液検体は担癌状態の有無での差を検討できるよう術前、術後1週間、術後1ヶ月以降の計3回採取している。それぞれの検体において、total RNAを抽出後にcDNAに転写し、発現解析を実施している。膵癌6症例の手術検体から採取した癌部、肉眼的非癌部の計12検体に対して、HiCEP法での発現解析を実施した。術前化学療法を受けた1症例を除いた5症例で共通して、非癌部と比較し癌部で3倍以上発現が増加しているピークを7個、癌部と比較し非癌部で3倍以上発現が増加しているピークを9個同定することができた。
抗がん剤感受性を決定するアクチン動態の解析および新規治療標的の同定

我々は、遺伝子変異や柔らかい足場環境下での生育によりがん抑制遺伝子p53の機能が低下した細胞に対して、抗がん剤処理などのDNA損傷刺激を与えることで核内のアクチンが強固なファイバーを形成することを見出した。この核アクチンファイバーの形成が、細胞の抗がん剤感受性を制御していると考え、この構造体の太さや向きなどの構造的特長、形成に関わる遺伝子やタンパク質との位置関係、クロマチン構造との関係性について電子顕微鏡や共焦点顕微鏡を用いて解析を行う。それにより、この構造体の機能や生理学的意義を明らかにし、抗がん剤耐性を獲得した細胞に対しても高い効果が期待できる治療法の確立を目指す。
Pin(2)モノポール方程式と4次元トポロジー

本研究は,Pin(2)モノポール方程式の理論的発展,および4次元多様体のトポロジーや幾何への応用の可能性を深く追求することを目的とする.ここでPin(2)モノポール方程式とは,spin-c構造の複素共役から得られるSeiberg-Witten方程式の変種である.具体的には以下の項目の研究を行う.1.実構造をもつ複素曲面上のPin(2)モノポール方程式2.安定コホモトピー版のPin(2)モノポール不変量本研究は,Pin(2)モノポール方程式の理論的発展,および4次元多様体のトポロジーや幾何への応用の可能性を深く追求することを目的とする.ここでPin(2)モノポール方程式とは,spin-c構造の複素共役から得られるSeiberg-Witten方程式の変種である.具体的には以下の項目の研究を行う.1.実構造をもつ複素曲面上のPin(2)モノポール方程式2.安定コホモトピー版のPin(2)モノポール不変量
パウダージェット法と硬組織自己再構成法による瞬時小窩裂溝填塞術の開発

パウダージェットデポジション(PJD)法を応用して歯質上に歯の主成分であるハイドロキシアパタイト(HAp)膜の生成し,歯質-生体材料間に全く新しいインターフェイスの創成を実施した。エナメル質の成膜に関しては、PJD装置、HAp微粒子,噴射条件等を検討してきた結果、小窩裂溝内への成膜が確認された。特にPJD装置では、実験用装置ではなく、ハンドピース型装置での成膜が可能になっており、実際の治療に準じたハンドピース先端の噴射ノズルの速度、角度等の条件を自由に設定することにより、より良い成膜条件の検討を可能とした。様々な粒子半径、焼成温度のHAp微粒子を使用し、成膜に適した条件(粒子半径3-4μm,焼成温度1200°C)を明らかにした。さらに、HAp膜の象牙細管透過性へ与える影響を中心に評価を行ったところ、HAp粒子が象牙細管に入り込み、象牙細管開口部を閉鎖し、象牙細管透過性が低下することが判明した。また、条件を変化させることで、PJD装置をそのまま利用して、歯質を切削するアブレイシブジェット加工も行えることが判明した。これらの結果から、今回申請した方法で、軟化象牙質と脱灰エナメル質の選択的除去し清掃された硬組織の実質欠損部分に、PJD法にてハイドロキシアパタイトの歯質と一体化したハイドロキシアパタイト膜を形成させて象牙細管の封鎖と歯髄の保護を行う裏層を施し、その上で充填術を施す全く新しい治療法の可能性が示唆された。Powder Jet Deposition法を用いて小窩裂溝填塞術を実施するために必要な技術的な問題点を抽出し、その問題点に対する対策と検証を実施した。始めに規格化した裂溝の形成であるが、実験開始時の予定した通常の研磨装置での規格化裂溝製作では、破折しやすいハイドロオキシアパタイト・ブロックからの削り出しによる50μmの規格化裂溝の製作に於いて精度の面で十分でないことが判明し、精密研磨装置の実験への購入によりその製作が可能となった。さらに、裂溝へのハイドロオキシアパタイト粉体の緊密填塞状況の解析には、裂溝内での粉体の固定に使用する固定剤の浸透が難しいことが判明し、充填部の裂溝を分解して充填状況をTransversal Microradiography(TMR)を使った検証実験よりも、マイクロフォーカスCTを用いた方法との併用した検証が必要なことが判明し、マイクロフォーカスCTの実験に合わせて試料を最適化した。より小窩裂溝填塞術に適するハイドロオキシアパタイト粉体の選択を行った事により、ハイドロオキシアパタイト粉体の積層条件の決定のための実験が可能となった。一方で、唾液にてハイドロオキシアパタイト積層粉体の再石灰化を検証するために、ハイドロオキシアパタイト試験片の口腔内保持装置を開発した。幾つかの大きな実験の実施に関わる課題を解決した事は、積層実験の実験の遅れを取り戻す次年度の実験計画をより確実にした基盤研究を行った結果となった。
糖尿病性腎症におけるポドサイト障害：MR蛋白修飾の制御による新たな治療法の確立

初年度は動物実験室の工事開始の予定があり、まず腎線維芽細胞を用いたin vitroの研究を主に行った。糖尿病性腎症は慢性腎臓病(CKD)で最も多い原因疾患であり、腎機能低下に伴い体内に様々な尿毒素物質が蓄積することが知られている。その中でもインドキシル硫酸(IS)とミネラルコルチコイド受容体(MR)は両者とも腎臓において酸化ストレスや間質線維化を惹起し腎障害の進展に寄与することが報告されているが、CKDにおけるIS増加とMR活性化の関連性については不明である。腎線維芽細胞を用いてISとMR活性化について検討した。(方法)アフリカミドリザル腎線維芽細胞(COS-7)にMRプロモータープラスミドをトランスフェクションし、アルドステロン(Ald)を添加もしくは添加しない条件下でISを負荷し、MR活性をルシフェラーゼアッセイで評価した。また、スピロノラクトン、抗酸化薬(αリポ酸)共添加でMR活性が抑制されるか検討した。さらにhMRを発現させたCOS-7にISおよびAldを負荷し、ウェスタンブロットでMR発現について評価した。(結果)COS-7細胞において、ISはアルドステロンの存在、非存在化のどちらにおいてもMR活性化を惹起した。これらの作用はスピロノラクトンと同様にαリポ酸でも抑制された。また、IS投与により、MR蛋白発現レベルが増加し、αリポ酸投与により抑制された。COS-7においてISはMR活性化をきたし、そのメカニズムの一つとして酸化ストレスを介したMR蛋白発現レベルの増加が関与することが示された。本学の実験動物センターの再整備に伴い、in vivoの実験の進行が遅れる状況がしばらく続く予定である。飼育可能なラットの数に制限がある中で、パイロット実験を行ってできるかぎり効率的にin vivo実験も遂行できるように努めていきたい。初年度において、CKDに伴いミネラルコルチコイド受容体の活性化が惹起されるメカニズムとして、尿毒素物質のインドキシル硫酸の蓄積が酸化ストレスを介してミネラルコルチコイド受容体蛋白レベルを増加させて、MR活性化を腎線維芽細胞できたすことを見いだすことができた。これらの結果は、申請者らが報告している「MR関連高血圧」がCKDの腎組織においても当てはまることを初めて明らかにできたもので、本研究内容の遂行が現実的に可能であることを支持する結果が得られている。今年度以降にさらにin vitroのシステムにおいて、MR蛋白レベルの増加が、MR遺伝子転写レベルか、あるいは蛋白分解の抑制かを次に検討し、MRの翻訳後蛋白就職として、すでに申請者らが報告しているPKCbetaを介するリン酸化経路、EGFR-tyrosine kinase-ERKを介するリン酸化経路、O-GlcNAc修飾を介する糖鎖修飾などの関与について各種拮抗薬やsiRNAを用いて、詳細な分子機構の解明とそれらをもとにin vivoの実験にて検証することを目指す予定である。

今年度以降にさらにin vitroのシステムにおいて、MR蛋白レベルの増加が、MR遺伝子転写レベルか、あるいは蛋白分解の抑制かを次に検討し、MRの翻訳後蛋白就職として、すでに申請者らが報告しているPKCbetaを介するリン酸化経路、EGFR-tyrosine kinase-ERKを介するリン酸化経路、O-GlcNAc修飾を介する糖鎖修飾などの関与について各種拮抗薬やsiRNAを用いて、詳細な分子機構の解明とそれらをもとにin vivoの実験にて検証することを目指す予定である。初年度に動物実験が実験動物センター改築の関係でほとんど行うことができずに、主に培養細胞を用いたシステム確立とin vitroの実験を中心に行ったため。
多次元異種データ統合モデルによる個別化病態の経過予測とその制御

本研究は、患者個人から得られるゲノム時系列データを含む異種多次元情報を統合し、個人の異質性を考慮した上で、病態の経過を予測しかつ制御するための情報を抽出する数理的方法論を構築することを目的としている。この目的の為、初年度は、適切に研究を推進できるような研究の基盤整備をまず行なった。次に、患者個人の予後に寄与するバイオマーカーとして、血清中の腫瘍由来循環DNA(ctDNA)に注目し、予後との関連の予備検討を行った。また個人間の異質性を考慮したスパース制約を課した異種ランダム効果モデルの開発を進めた。具体的には以下の通りである。1)後方視的観察研究計画書の策定と倫理申請:東京大学医科学研究所附属病院で取得された、血液疾患患者のデータを使用し、情報を抽出するための研究計画書を準備し、機関内の倫理審査申請を行なった。2)数理モデル作成のための症例選定と同意の取得:治療歴があり、ゲノムデータ解析の為の腫瘍検体が利用可能な症例200例の同意を取得した。3)ゲノム解析:2)のうち69例の急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)の症例において治療前の腫瘍検体を用いたゲノム解析を行ない、症例毎に異なるAMLのドライバー変異を同定した。4) ctDNA検出アッセイの作成:症例毎に異なるAMLのドライバー変異を基に、血清中ctDNA検出アッセイを作成し、治療後(移植含む)の血清検体を用いてctDNA検出を試みた。5)血清中ctDNAと予後の相関の検討:検出されたctDNA中の変異と予後の相関を検討し、移植や治療後ctDNAが検出される症例では、有意に再発率が高く予後不良であることを明らかにした。さらに、血清由来のctDNAを用いた再発予測性能は、骨髄を用いた場合と同等である事を証明した。6)スパース制約を課した新規ランダム効果モデルの定式化および性能検証を行った。初年度は、適切に研究を推進できるような研究の基盤整備をまず行なった。具体的には以下のように進捗している。3)ゲノム解析:2)のうち69例の急AML、MDSの症例において治療前の腫瘍検体を用いたゲノム解析を行ない、症例毎に異なるAMLのドライバー変異を同定した。4) ctDNA検出アッセイの作成:症例特有のドライバー変異を基に、血清中ctDNA検出アッセイを作成し、治療後(移植含む)の血清検体を用いてctDNA検出を試みた。上記の予備的知見から、特に治療後の骨髄などの腫瘍検体が得られない症例においては、ゲノム時系列データの代替として、ctDNAも数理モデルにパラメータとして組み込むべきであると考えられた。更に、開発中の新規モデルの適用の検討も進めている。本年度は数理方法論構築に資するデータ抽出を引き続き推進したい。具体的には、同意の得られた症例において、引き続きゲノム解析を推進したい。特に造血幹細胞移植症例に関しては、治療内容が均一であり、モデルの作成に適していると考えられる。そこで、本年度は造血幹細胞移植症例100症例を含む130例を目標にゲノム解析と治療後のctDNAの解析を行う予定である。また同時に、得られたデータを基に個人の異質性を考慮した数理的方法論の構築を進める予定である。具体的には、昨年までのctDNA等のバイオマーカを用いた予備的検討では、個人の異質性を考慮しない、単変量解析に基づく予後との相関解析を用いた、ここに昨年度に開発を進めた、個人の異質性を考慮した、スパース制約付きランダム効果モデルの適用を進め性能の検証を行うとともに、推定された個人の異質性を表現するのに重要な変数群(変異等)の医学的および生物学的意義を吟味し、新規知見の抽出を狙う。さらに、同一個人の病態進展、治療前後などの時系列データに対応したモデル構築も進める予定である。

また個人間の異質性を考慮したスパース制約を課した異種ランダム効果モデルの開発を進めた。具体的には以下の通りである。1)後方視的観察研究計画書の策定と倫理申請:東京大学医科学研究所附属病院で取得された、血液疾患患者のデータを使用し、情報を抽出するための研究計画書を準備し、機関内の倫理審査申請を行なった。2)数理モデル作成のための症例選定と同意の取得:治療歴があり、ゲノムデータ解析の為の腫瘍検体が利用可能な症例200例の同意を取得した。3)ゲノム解析:2)のうち69例の急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)の症例において治療前の腫瘍検体を用いたゲノム解析を行ない、症例毎に異なるAMLのドライバー変異を同定した。4) ctDNA検出アッセイの作成:症例毎に異なるAMLのドライバー変異を基に、血清中ctDNA検出アッセイを作成し、治療後(移植含む)の血清検体を用いてctDNA検出を試みた。5)血清中ctDNAと予後の相関の検討:検出されたctDNA中の変異と予後の相関を検討し、移植や治療後ctDNAが検出される症例では、有意に再発率が高く予後不良であることを明らかにした。さらに、血清由来のctDNAを用いた再発予測性能は、骨髄を用いた場合と同等である事を証明した。6)スパース制約を課した新規ランダム効果モデルの定式化および性能検証を行った。初年度は、適切に研究を推進できるような研究の基盤整備をまず行なった。次に、患者個人の予後に寄与するバイオマーカーとして、血清中の腫瘍由来循環DNA(ctDNA)に注目し、予後との関連の予備検討を行った。具体的には以下のように進捗している。3)ゲノム解析:2)のうち69例の急AML、MDSの症例において治療前の腫瘍検体を用いたゲノム解析を行ない、症例毎に異なるAMLのドライバー変異を同定した。4) ctDNA検出アッセイの作成:症例特有のドライバー変異を基に、血清中ctDNA検出アッセイを作成し、治療後(移植含む)の血清検体を用いてctDNA検出を試みた。上記の予備的知見から、特に治療後の骨髄などの腫瘍検体が得られない症例においては、ゲノム時系列データの代替として、ctDNAも数理モデルにパラメータとして組み込むべきであると考えられた。更に、開発中の新規モデルの適用の検討も進めている。本年度は数理方法論構築に資するデータ抽出を引き続き推進したい。具体的には、同意の得られた症例において、引き続きゲノム解析を推進したい。
光駆動性の生物学的レアメタル濃縮系の開発とメタロミクスによる金属動態の理解

産業上重要なレアメタルを希薄水溶液から光合成細菌により濃縮し細胞の形で回収する技術開発に取り組んだ。レアメタルの中でも、特にモリブデンは植物の硝酸還元酵素の働きにも必要不可欠な元素である。本研究において、光合成細菌の培養時に無機態窒素の有無で細胞における金属含量組成比が大きく変化し、窒素制限により選択的にモリブデンを濃縮可能であることが示された。モリブデンを高含量で集積した光合成細菌の細胞は、農地へのモリブデン供給のための生物資材としての利用が考えられる。産業的価値が高いレアメタル資源を従来技術で困難であった希薄水溶液から回収することが可能になれば、希少資源の再資源化の観点からその意義は大きい。本研究ではモリブデンやバナジウム、アンチモンといったレアメタルを、光合成系と生物濃縮系との共役により太陽光を主たるエネルギー源として利用し濃縮する技術を開発し、日本の産業基盤上脆弱なレアメタル供給源を補強することを目的とする。このために、平成23年度は3つの研究課題に取り組み以下の成果を得た。(I)レアメタル濃縮能を強化した組換え光合成細菌育種を目的として、大腸菌のモリブデン結合タンパク質をコードするmodE、アンチモンへの結合能が期待され重金属耐性転写調節因子をコードする大腸菌のarsRあるいは黄色ブドウ球菌のcadC遺伝子を細胞に導入した菌株を育種した。今後はこれら組換え光合成細菌のレアメタル濃縮能についての評価を行う予定である。(II)メタロミクスにより、光合成細菌野生株における金属動態の解明を試みた。光合成細菌野生株を、モリブデン蓄積が期待される選択的条件と通常の増殖条件で培養し、培地から細胞内への各金属元素の動態を測定可能な全ての元素種において明らかにした。その結果、増殖と連動して取り込まれる必須元素の動態と比較し、増殖と連動しない選択的な条件によりモリブデン濃縮が認められた。(III)レアメタル濃縮細菌から高いエネルギー効率で大半の水を除くための手法を開発する。このために光合成細菌野生株の凝集体形成を、培養環境の変化そして増殖フェースに基づき詳細に解析した。その結果、最も大きく、かつ安定な細胞塊を形成する条件と回収時期を設定した。さらに凝集に関与する細胞外マトリクスの分子種について明らかにした。活性中心にモリブデンと鉄を配位するニトロゲナーゼの遺伝子は、アンモニアの存在しない条件下(N(-))で発現する。このため、N(-)条件と、一定濃度の塩化アンモニウムを添加したN(+)条件でそれぞれ培養して得られた光合成細菌の各金属含量をICP発光分光分析法と黒鉛炉原子吸光分析法により測定した。淡水性光合成細菌の培養において、N(-)条件ではニトロゲナーゼの遺伝子発現が確認され、N(+)条件では遺伝子発現が認められなかったことから、N(-)条件でのみニトロゲナーゼタンパク質が生合成されていることが推察された。これらの条件で培養後に回収された細胞の金属含量を比較したところ、含量の比較的高いカルシウム、マグネシウムにおいては、活発な増殖が行われるN(+)条件下で高い値を示した。一方、含量が比較的低い元素においては、マンガン以外でN(-)条件での値が高くなった。特にモリブデンの増加が顕著であったことから、N(-)条件で培養を行うことで培地中のモリブデンの細胞内への取り込み量が選択的に増大することが示された。モリブデンと同様にニトロゲナーゼの活性中心に配位する鉄でもN(-)条件で含量の増加が認められたが、鉄の含量がモリブデンの含量よりも桁違いに高いため、ニトロゲナーゼの生合成が鉄の含量増加に寄与する割合は少ないことが推察される。同様に、海水性光合成細菌を用いて試験を行った。その結果、含量が比較的高いカルシウムとマグネシウム、鉄においてはN(+)条件下でより高い値を示した。一方、モリブデンと銅、亜鉛ではN(-)条件での含量が高くなった。これらの傾向は異なる光合成細菌種で同様に認められており、異種由来のモリブデン結合タンパク質の遺伝子を光合成細菌に導入するよりも窒素源非存在下での培養の方が、モリブデンの細胞内への選択的濃縮においてより効果的であることが明らかとなった。モリブデン応答性転写因子であるModEタンパク質の全長、あるいはそのC末端側に位置するモリブデン結合ドメインをコードする遺伝子を導入し、モリブデン濃縮能を強化した組換え紅色非硫黄細菌を育種した。導入した遺伝子が発現し機能した結果、モリブデンの細胞内含量が向上した。また、遺伝子導入の細胞増殖に対する阻害的効果は限定的であった。遺伝子導入により、培地に添加した8種類の金属の細胞含量の総和に対するモリブデン含量の比率が向上したことから、モリブデンに対する選択的濃縮能が向上したことが明らかになった。遺伝子導入の効果は、C末端側モリブデン結合ドメインをコードする遺伝子を導入した光合成細菌においてより顕著に現れた。

また、遺伝子導入の効果をニトロゲナーゼを誘導した細胞とニトロゲナーゼを誘導していない細胞とで比較した場合、ニトロゲナーゼを誘導していない細胞において、より顕著にモリブデンの選択的濃縮が認められた。ニトロゲナーゼを誘導した場合には、合成されたニトロゲナーゼタンパク質と、細胞内に取り込まれた多くのモリブデンが結合するため、組換えModEタンパク質との結合によって細胞内に保持されるモリブデンの割合が減少するものと考えられる。また、モリブデンやバナジウムを選択的に濃縮するための光合成細菌宿主として、特に細胞塊の形成能に優れたフィラメント状シアノバクテリア(Anabaena variabilis)株の選抜を行った。紅色非硫黄細菌Rhodovulumsulphidophilumの凝集性に関わる細胞外マトリックスとして核酸が関与することを明らかにした。その核酸は、RNAや特定の塩基配列を有するDNAフラグメントではなく、細胞外に漏出あるいは搬出されたゲノムDNAが関与することが示唆された。レアメタル濃縮能を強化した組換え光合成細菌育種、メタロミクスによる組換え菌株における金属動態の解明、および水相からの効率的なレアメタル回収法の開発の3つの課題について一定の成果を得ることができた。平成23年度については、特に野生株における金属動態の解明において、今後の組換え株を用いたメタロミクス解析において基盤となる技術的課題を克服することができたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。モリブデン濃縮能を強化した組換え紅色非硫黄細菌を育種し、遺伝子導入の各種金属動態に及ぼす影響について詳細に検討することができた。特に、遺伝子導入の効果が、中心元素としてモリブデンを配位するニトロゲナーゼの合成の有無により大きく変化することを明らかにするなど、新たな知見を得ることができた。また、紅色非硫黄細菌の凝集性に関わる細胞外マトリックスとして核酸の関与を明らかにすると共に、それがRNAや特定の塩基配列を有するDNAフラグメントではなくゲノムDNAであることを示すことができた。また、細胞塊の形成に優れたシアノバクテリア株を選抜することもできた。これらの結果から、モリブデンの選択的濃縮に優れた紅色非硫黄細菌株の育種、メタロミクスによる組換え菌株における金属動態の解明、および水相からの効率的なレアメタル回収法の開発の主要な3つの課題について一定の成果を得ることができたと考える。より高い選択性と濃縮能を有する組換え光合成細菌株の育種に取り組む。光合成細菌宿主として、これまでの紅色非硫黄細菌に加えてフィラメント状シアノバクテリアを検討する。レアメタル濃縮能を強化した光合成細菌の組換え株を用いて、平成23年度実施予定の野生株に対する分析と同様に水試料から細胞内への物質フローとキレート分子-金属複合体形成を測定可能な主要金属元素において明らかにする。得られた複数の組換え株の中から有望な株を選択する際には主としてICP-発光分析装置を用いた評価を行う。その後に選抜株を用いたより精度の高い解析をICP-MSにて行い、外来のレアメタル・キレート分子の生合成が主要金属元素の物質フローと、金属-生体分子間相互作用にどのような影響を与えるのかを明らかにする。平成24年度には紅色非硫黄細菌の凝集性に関わる遺伝子の解明を凝集性消失株の解析により行う。