hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IgA腎症モデルマウスにおけるアンギオテンシンIIの免疫・炎症への関与機構の解明

【目的】IgA腎症モデルマウスにおいてIL12によって誘導された活動型IgA腎症類似の病変へのAngiotensin II receptor blocker(ARB)の影響を検討した。【方法】IgA腎症モデルマウス(HIGA)の46週令の雌にIL12及びARB投与5日間行い、その影響を比較検討した。【結果】腎病理組織において、半月体などの活動性病変は、IL12群で有意に増加していたが、ARBはこれを有意に改善した。蛍光抗体でもIgAの沈着はIL12群で有意に減少し、ARBはこれを有意に改善した。腎皮質のACE mRNAの発現は、IL12投与により有意に増加していた。腎皮質のIFN-γ・TNF-αなどのTh1サイトカインのmRNAの発現は、IL12投与により有意に増加していたが、ARB投与により、有意にその発現が減少した。腎皮質のTRX mRNAの発現は、IL12投与により有意に増加していたが、ARB投与により、有意にその発現が減少した。【考察】本研究において、IL12により誘導された活動性病変を、ARBが有意に改善した。本研究においても、IL12投与によりIFN-γ遺伝子発現が亢進し、同時にACE遺伝子発現も増加している。これらのことより、ARB(ARB)は、Th1サイトカインにより高まった腎組織でのレニンアンギオテンシン系を抑制することにより、急性期病変の改善に寄与した可能性が示唆された。さらに妊娠期においてメサンギウムへのIgAの沈着が減少していることに加えて、半月体などの活動性病変が増加している症例を経験した。妊娠期には、サイトカインバランスの変化が腎病変に影響を与えている可能性が示唆された。【方法】若年より均一に高IgA血症を呈する純系IgA腎症モデルマウス(HIGA)の46週令の雌にIL12(300ng/匹)単独を腹腔内投与5日間行い(IL12群、無投与(C)群、ARB併用群(各N=8)とともに、前後で採尿、採血、血圧体重測定を行い、5日目に屠殺して腎病理所見とあわせて比較した。【結果】IL-12投与により尿蛋白は有意に減少したが、ARB投与により、その効果は打ち消された。腎糸球体半月体は、IL-12群で有意に増加していたが、ARBはこれを有意に阻止した。腎皮質のACE mRNAの発現は、IL-12投与により有意に増加していた。腎皮質のIFN-γ・TNF-αmRNAの発現は、IL-12投与により有意に増加していたが、ARB投与により、有意にその発現が減少した。腎皮質のTRX mRNAの発現は、IL-12投与により有意に増加していたが、ARB投与により、有意にその発現が減少した。【結語】本研究において、IL-12により誘導された活動性病変を、ARBが有意に改善した。本研究においても、IL-12投与によりIFN-γ遺伝子発現が亢進し、同時にACE遣伝子発現も増加している。
ヒト不死化歯根膜細胞の作成とクローニング及び歯根膜細胞に特異的な分子の検出

ヒト歯根膜クローン細胞のキャラクタリゼーション昨年度までの研究において、報告者は正常なヒト歯根膜細胞にSV40 large T抗原及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を遺伝子導入した結果、初代の細胞と同様の表現型を有し、かつ分裂数が120を超えても依然として増殖能を示すヒト不死化歯根膜細胞が得られたことを報告した。今回この細胞を限外希釈法にてクローニングし20種類のクローン細胞を得た。この中で、未熟な歯根膜細胞のマーカーとして報告されているSTRO-1またはCD146を発現している3種のクローン細胞(1-4,1-11,1-24)を選択した。これらのクローン細胞は、石灰化能を有し、また骨関連タンパク(RUNX2,Col1,OPN,OCN,RANKL,OPG)そして腱関連タンパク(EphA4,scleraxis,Six1,COMP)のmRNAを発現しており、オリジナルの初代細胞の表現型を維持していた。このうち1-11細胞はSTRO-1及びCD146を共に発現しており、他のクローン細胞と比較して未熟な細胞であることが示唆されたことから、この細胞をβ-TCPと共にSCIDマウスの背部皮下に移植し4週間後に観察したところ、β-TCP周囲に石灰物を形成していた。次にこの組織を摘出し、RT-PCR法にて、最近セメント芽細胞に強く発現することが報告されているCP-23(Antonio et al., Bone, 2005)、そして歯根膜に強く発現するPeriostinについて調べた結果、これらのmRNAを強く発現していたことから、1-11によって形成された石灰化物はセメント質に極めて近いものであると考えられる。歯根膜の再生機構の解明には、セメント質の再生が重要な課題となっており、今回の研究で得られた細胞は有用性の高い細胞株であると思われる。また、CP-23はセメント質の研究のための鍵となる因子として捉えることができると考えている。(今回の研究は九州大学歯学研究院の生命倫理委員会にて認可されている)(1)歯根膜線維芽細胞の不死化矯正治療の目的で九州大学病院を受診した患者様に、今回の研究内容について十分に説明を行い、抜歯後の歯牙の利用に同意が得られた4名のボランティアの歯根膜線維芽細胞を用いて実験を行った(今回の研究は九州大学歯学研究院の生命倫理委員会にて認可されている)。歯根膜線維芽細胞に対するhuman telomerase reversetranscriptase(hTERT)の遺伝子導入は、当初予定していたリポフェクション法では導入効率が悪かったことから、エレクトロポレーション法に変更することによって導入効率を上げることに成功した。さらにPuromycinにて選択を行い、hTERT遺伝子を持った不死化細胞の樹立に成功した。(2)不死化歯根膜細胞のキャラクタリゼーション歯根膜細胞のクライテリアが少ないことから、最近歯根膜細胞によって強く合成されると報告(Gene.275:279-286,2001;J Cell Sci.115:4191-4200,2002)されたperiodontal ligament associated protein-1(PLAP-1)、runt-relatedtranscription factor-2(Runx2)、EGF receptor(EGFR)や、従来より歯根膜細胞が発現することが報告されているアルカリ性フォスファターゼ(ALP)やオステオカルシン(OCN)、オステオポンチン(OPN)、骨シアロプロテイン(BSP)等の発現をRT-PCR法を用いて解析を行った。方法として、不死化した歯根膜線維芽細胞をプライマリー細胞と比較することによって行った。その結果、PLAP-1の発現は減少したものの、他の遺伝子発現は維持されており、正常細胞の形質を維持した細胞株が得られたと考えられる。PLAP-1の発現の低下が細胞株全体を通して減少したものなのか、あるいは発現細胞の比率が低いことによるものなのかは、細胞のクローニングを行うことによって明かにすることが可能であると考えている。(1)歯根膜線維芽細胞と歯肉線維芽細胞との遺伝子発現についての比較検討歯根膜細胞と形態は類似しているが機能は異なるとされている歯肉の線維芽細胞を同様の操作によって不死化した細胞株と今回の実験で得られる歯根膜細胞株とを用いて、両細胞によって発現されるタンパク質あるいはmRNAの違いについて、DNAマイクロアレイ法にて比較検討した。その結果、歯根膜線維芽細胞にtype IV collagenが多く合成されていることが明らかになった。type IV collagenは基底膜に存在するタンパクであり、また歯根膜組織にはMallasezの上皮遺残とよばれる上皮細胞が存在していることから、線維芽細胞によるその合成が何らかの役割を果たしていると考えられる。今後このtype IV collagenの発現意義について解明していくことを計画している。(2)不死化歯根膜線維芽細胞株のクローニングとキャラクタリゼーション(今回の研究は九州大学歯学研究院の生命倫理委員会にて認可されている)ヒト歯根膜クローン細胞のキャラクタリゼーション昨年度までの研究において、報告者は正常なヒト歯根膜細胞にSV40 large T抗原及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を遺伝子導入した結果、初代の細胞と同様の表現型を有し、かつ分裂数が120を超えても依然として増殖能を示すヒト不死化歯根膜細胞が得られたことを報告した。

今回この細胞を限外希釈法にてクローニングし20種類のクローン細胞を得た。この中で、未熟な歯根膜細胞のマーカーとして報告されているSTRO-1またはCD146を発現している3種のクローン細胞(1-4,1-11,1-24)を選択した。これらのクローン細胞は、石灰化能を有し、また骨関連タンパク(RUNX2,Col1,OPN,OCN,RANKL,OPG)そして腱関連タンパク(EphA4,scleraxis,Six1,COMP)のmRNAを発現しており、オリジナルの初代細胞の表現型を維持していた。このうち1-11細胞はSTRO-1及びCD146を共に発現しており、他のクローン細胞と比較して未熟な細胞であることが示唆されたことから、この細胞をβ-TCPと共にSCIDマウスの背部皮下に移植し4週間後に観察したところ、β-TCP周囲に石灰物を形成していた。次にこの組織を摘出し、RT-PCR法にて、最近セメント芽細胞に強く発現することが報告されているCP-23(Antonio et al., Bone, 2005)、そして歯根膜に強く発現するPeriostinについて調べた結果、これらのmRNAを強く発現していたことから、1-11によって形成された石灰化物はセメント質に極めて近いものであると考えられる。歯根膜の再生機構の解明には、セメント質の再生が重要な課題となっており、今回の研究で得られた細胞は有用性の高い細胞株であると思われる。また、CP-23はセメント質の研究のための鍵となる因子として捉えることができると考えている。(今回の研究は九州大学歯学研究院の生命倫理委員会にて認可されている)
有機リン系農薬の生殖毒性及び内分泌系臓器におけるターゲット分子の同定

本研究ではフェニトロチオンが内分泌臓器に及ぼす影響を調査するために雄若齢ラットを用いて曝露実験を行った。その結果、フェニトロチオン30mg/kg/day投与群の副腎と脳下垂体重量の増加がみられた。またフェニトロチオン投与群ではテストステロン及びACTHの血中濃度が高くなることが示された。脳下垂体と副腎におけるプロテオーム解析を遂行し、コントロール群と比較し投与群において発現量が増減した蛋白を同定することができた。有機リン系化学物質は殺虫剤として広く使用されており、特にフェニトロチオンはスミチオンの商品名で販売されホームセンター等でも購入できる。フェニトロチオンはラジコンヘリによる空中散布で通常より高い濃度で使用され空気中に滞留することから、小中学校等に隣接した農地での使用が問題となっている。フェニトロチオンを長期に曝露した場合、神経系に様々な症状を引き起こすことが知られている。また近年、抗アンドロゲン作用が指摘されており、内分泌ホルモン系の動態に及ぼす影響が懸念されている。21年度における本研究では、有機リン系農薬であるフェニトロチオンについて、4週齢の雄ラットを用いて0.1、1、10mg/kgの濃度別の曝露実験を行い、非投与群との比較実験を行った。8週間(計40回)の投与終了後に全てのラットを解剖し臓器の重量を比較した。投与開始日から終了時における各群の体重増加量は、統計学的な有意差はみられなかったが、投与群における増加が大きくなる傾向がみられた。また解剖の結果、精巣や下垂体の重量に差がみられなかったが、肝臓、副腎の重量において非投与群との間に有意差がみられた。また、曝露による血中内分泌ホルモン濃度変動をELISA kitを用いて測定した結果、LH、FSH、テストステロン、プロゲステロンの血清中濃度においても非投与群との間に有意差がみられた。これらの結果から下垂体と副腎から可溶性タンパク質を抽出し、二次元電気泳動を行い得られたゲルの画像解析を遂行した。現在、各投与群において非投与群と比較し発現量が増減したタンパクスポットをMALDI-QIT-TOF-MSを用いて解析し、フェニトロチオンの影響による雄ラットの内分泌系臓器への作用機序を検討している。有機リン系化学物質であるフェニトロチオンは殺虫剤として広く使用されている。長期に曝露した場合、神経系に様々な症状を引き起こすことが知られている。また近年、抗アンドロゲン作用が指摘されており内分泌ホルモンの動態に及ぼす影響が懸念されているため、本研究を遂行した。当該年度においては、前年度に行ったフェニトロチオン投与実験と同様に若齢期にあたる4週齢の雄ラットを用いて0、0.1、1、10mg/kg各20匹の曝露実験を遂行し、さらにプロテオーム解析におけるフェニトロチオンの影響をより明確に検証するため、新たに30mg/kg投与群を加え、非投与群との比較実験を行った。投与終了時における各群ラットの体重は、非投与群と比較し30mg/kg投与群では有意な減少がみられたが、他の投与群では有意差はみられなかった。解剖の結果、30mg/kg投与群において左・右の副腎重量が有意に増加したが、10mg/kg投与群では前年度と同様に左の副腎で減少した。脳下垂体重量については、30mg/kg投与群で増加がみられた。ラットの場合、雌は雄と比較し副腎、脳下垂体重量が重いことが知られ、また副腎はストレスが加わることで肥大することから、明らかに脳下垂体-副腎機能系に影響を及ぼしていることが示された。各投与群と非投与群の血中内分泌ホルモン濃度変動をELISA kitを用いて測定した結果、FSH、テストステロン、プロゲステロンの血中濃度において非投与群との間に有意差がみられた。特にテストステロン濃度は投与量1、10、30mg/kgの増加に伴い血中濃度が高くなることが示された。これらの結果から脳下垂体と副腎の可溶性タンパク質を抽出し、二次元電気泳動を行い得られたゲルの画像解析を遂行した結果、非投与群と比較し各投与群において共通に発現量が増減したタンパク質スポットを複数発見し同定することができた。
骨導音と気導音のハイブリッド活用による音声信号の騒音抑制を目指したベイズフィルタ

騒音源の方向が特定できない高騒音環境下において、騒音スペクトルの事前情報やピッチ検出が不要な時間領域における騒音抑制法について研究開発した。具体的には、実環境下での音声認識を可能にするため、骨導音および気導音の同時計測に基づき、音声信号を精密に抽出するための信号処理法を、確率のベイズ定理を駆使することにより導出した。骨導音は周囲の騒音が混入しにくい個体伝搬音であるが、伝搬課程で高周波成分が減衰する。一方、気導音は空気伝搬音であるため、周囲からの騒音の混入は避けられないが、全ての周波数成分が保全され含まれている。したがって、両者の併用により、音声信号のみを精密に推定することが可能である。まず、音声信号と気導音の関係は音圧の加法性により線形モデルで捉え、音声信号と骨導音との関係は、未知パラメータを含む非線形モデルで捉え、モデルパラメータを音声信号と同時に推定できるよう条件付き結合確率分布に対するベイズ定理にまず着目した。次に、音声信号・骨導音・気導音との間の各種相関情報を展開係数に反映した級数展開型のベイズ表現を導出した。さらに、展開型ベイズ定理に骨導音および気導音に対する線形および非線形モデルを組み入れることにより、周囲騒音の影響を抑制し、高精度で音声信号を抽出するための新たなアルゴリズム(ベイズフィルタ)を研究開発した。また,骨導音と気導音の両者を逐次に同時観測することから互いの相関情報を反映した展開係数は膨大な数に及ぶため、計算に要する負荷を低減させるよう有効性の高い情報のみに着目し展開係数を計算するための新たな実用的アルゴリズを提案した。導出した音声信号推定法を、理想的な無響室および現実の住環境で測定した音声信号(女声信号および男声信号)に適用し、その有効性を実験的に確認した。その際、周囲騒音の統計量を種々変化させ異なるSN比において推定精度を詳細に検討した。携帯端末やヘッドセットマイクを用い音声のみによりデータ入力を行わねばならない作業現場等に音声認識を応用することを目的とし、周囲環境騒音下で、音声信号の精密な抽出に関する新たな実用的手法の開発を目指した。具体的には、周囲騒音の影響を受けにくい骨導音(声帯で発生した音声が骨など体内を伝搬し、喉など身体表面で測定される振動)および周囲騒音の影響を受けているが、音声信号に対する全ての周波数成分を保全した気導音(口から放射される変動音圧)の両者の同時計測に基づき音声信号を抽出するための信号処理法について検討を行った。周囲騒音のような多くの雑音変動は非ガウス型の複雑な形態を示し、一般には非白色で、観測される信号には高次の非線形相関が確実に存在している。本研究では、実環境下での音声認識を可能にするため、雑音変動のガウス性や白色性などの前提を必要とせず、しかも信号に関する高次の非線形相関情報をも考慮し、かつ音声の時間的変動形態が未知の場合でも適用できる新たな音声信号抽出法を開発することを最終目標とし、まず基礎研究として、骨導音と気導音の両者を観測することによる音声信号推定のためのベイズ原理に対する拡張を試みた。具体的には、まず、音声信号と骨導音との関係を簡単化のため線形モデルで捉え、モデルパラメータを音声信号と同時に推定できるようベイズ定理の級数展開型表現を導出した。簡易的な実験データに導出した推定手法を適用することにより、提案した手法は音声信号を精度よく推定することが確認された。今後、さまざまなSN比のもとで実験を行い、その有効性について検討を行う。昨年度においては次の研究成果が得られた。骨導音と気導音の両者を観測することによる音声信号推定のためのベイズ原理に対する拡張を試みた。具体的には、まず、音声信号と骨導音との関係を簡単化のため線形モデルで捉え、モデルパラメータを音声信号と同時に推定できるよう、信号とパラメータの同時確率密度関数に着目することによりベイズ定理の級数展開型表現を新たに導出した。その際、骨導音と気導音の両者を逐次に同時観測することを反映した条件付確率分布の形態で導出し、コンピュータ利用による逐次データ処理に整合した推定アルゴリズムを提案した。また、ベイズ定理の級数展開表示に基づき新たに提案した推定手法については、これまで測定された音響データに適用することにより、その有効性を確認した。上記の研究成果の一部については、昨年度に国内の学会で発表したが、本年度も国内・海外の専門の学会において発表の予定である。特に、実環境下での音声認識を可能にするため、周囲騒音のガウス性や白色性などの前提を必要とせず、しかも信号に関する高次の非線形相関情報をも考慮し、かつ騒音の統計的性質が未知の場合でも適用できる新たな音声信号抽出法の開発を目指した。具体的には、周囲騒音の影響を受けにくい骨導音、および周囲騒音の影響を受けるが音声信号に対する全ての周波数成分を保全した気導音の両者の同時計測に基づき、音声信号を抽出するための信号処理法について検討を行った。まず、音声信号と骨導音との関係を簡単化のため線形モデルで捉え、モデルパラメータを音声信号と同時に推定できるようベイズ定理の級数展開型表現を導出した。

次に、音声信号と骨導音・気導音との間の相関情報を反映した結合確率分布に着目し、各変量に関する低次・高次の各種相関情報を展開係数に反映した、級数展開表現による非線形の骨導音および気導音に対する伝播モデルを設定した。さらに、この非線形モデルにおける各展開係数を未知パラメータとみなし、これらのパラメータを音声信号と同時に推定した。その際、確率のベイズ原理に骨導音および気導音に対する非線形伝播モデルを組み入れることにより、周囲騒音の影響を抑制し、高精度で音声信号を抽出するための新たなアルゴリズム(ベイズフィルタ)を研究開発した。また、実際の音声信号および骨導音、気導音データを計測し、SN比や音声信号、骨導音、気導音の統計量など各種パラメータ値と音声信号推定精度の関係を整理・分類し、高性能の音声信号抽出法開発のための基礎的データベースを構築した。平成27年度に導出した骨導音と気導音の両者を観測することによる音声信号推定法を、より現実の状況に整合した形態に拡張した。具体的には、これまで導出した推定アルゴリズムでは、音声信号と骨導音との関係を簡単化のため線形モデルで捉えていた。また、音声信号に対し外来騒音の加法性を仮定しその統計量は既知としていた。平成28年度は、音声信号と骨導音の関係、および音声信号と気導音の関係をそれぞれ条件付き確率分布の級数展開表現で捉えることにより、非線形システムにも対応できる形態で拡張した。その際、条件付き確率分布に含まれる各相関情報を未知パラメータと見なし音声信号と同時に推定できるよう、信号とパラメータの同時確率密度関数に着目することによりベイズ定理の級数展開型表現を新たに導出した。また、骨導音と気導音の両者を逐次に同時観測することを反映した条件付確率分布の形態で導出し、コンピュータ利用による逐次データ処理に整合した推定アルゴリズムを提案した。無響室で測定した実験データに、導出した推定手法を適用することにより、提案した手法は音声信号を精度よく推定できることを確認した。さらに、ベイズ定理の級数展開表示に基づき新たに提案した推定手法の有効性を、これまで測定した各種音響データに適用することにより実験的にも確認した。上記の研究成果については、国内・海外の専門の学会において発表の予定である。例えば、作業現場のようにパソコンなどが設置できず、携帯端末やヘッドセットマイクを用い音声のみによりデータ入力を行わねばならない環境において音声認識を実現するためには、周囲環境騒音下で、音声信号の精密な抽出に関する新たな実用的手法の開発が必要である。本研究では、騒音源の方向が特定できない高騒音環境下において、騒音スペクトルの事前情報やピッチ検出が不要な時間領域における騒音抑制法について研究開発した。具体的には、実環境下での音声認識を可能にするため、骨導音および気導音の同時計測に基づき、音声信号を精密に抽出するための信号処理法を、確率のベイズ定理を駆使することにより導出した。骨導音は周囲の騒音が混入しにくい個体伝搬音であるが、伝搬課程で高周波成分が減衰する。一方、気導音は空気伝搬音であるため、周囲からの騒音の混入は避けられないが、全ての周波数成分が保全され含まれている。したがって、両者の併用により、音声信号のみを精密に推定することが可能である。
ホスファターゼの新規機能を介した染色体動態制御

細胞分裂期(M期)における遺伝情報の正確な分配は、遺伝情報の維持に必須である。M期にはDNA合成期(S期)に複製した姉妹染色体は互いに対合し、M期で高度に凝縮してM期染色体を形成する。M期染色体は、M期中期に細胞の赤道面に整列したのちに二つの娘細胞に均等に分配される。M期における、タンパク質のリン酸化と脱リン酸化は、M期における正常な染色体動態に重要な役割を果たしている。前年度の解析でPP2Aが染色体凝縮因子コンデンシンの局在を介した染色体の凝縮・脱凝縮を制御していることを見出した。本年度は昨年度に引き続き、キナーゼ・ホスファターゼによる染色体の動態制御機構を解析した。その結果、核小体因子NOL11が、M期キナーゼAurora Bのキネトコアへの局在を促進することにより、M期中期における染色体の細胞赤道面上での整列、及び姉妹染色分体間の接着に機能することを見出した。その分子メカニズムとして、1.NOL11がPP1を染色体腕部にリクルートする、2.PP1がAurora Bの結合部位となるヒストンH3のThr3リン酸化(H3T3ph)を脱リン酸化することにより、H3T3phのキネトコアから染色体腕部への拡散を防ぐ、3.その結果、Aurora Bのキネトコア局在が促進される、ことを見出した。さらに、核小体に存在するrRNAが、M期で核小体が崩壊するとM期染色体の周辺に結合し、NOL11、PP1などの核小体因子がM期染色体に結合するための足場として機能することを見出した。コンデンシンは、分裂期(M期)染色体凝縮に中心的な役割を持つタンパク質複合体である。高等真核生物ではコンデンシンIとIIの二つのアイソフォームが存在し協調的に染色体構築に機能している。コンデンシンの活性や局在は、可逆的なリン酸化により厳密に制御されている。代表者らは、ツメガエル卵抽出液を用いた染色体再構築系で、PP2Aの役割を解析した。PP2AはPP2A-A足場サブユニット、PP2A-C触媒サブユニット、PP2A-B制御サブユニットからなるSer/Thrホスファターゼである。PP2A-Bサブユニットは多様性に富んでおり、PP2Aの局在や基質特異性を制御する。代表者らは、PP2A-B'アイソフォームを含んだPP2Aの三量体が、コンデンシンIIの染色体局在に必要であることを見出した。このコンデンシンIIの染色体局在には、PP2Aのホスファターゼ活性は必要なく、PP2AがコンデンシンIIを染色体に運び結合させるリクルーターとして機能することが明らかになった。一方、代表者らはPP2A-Bアイソフォームを含んだPP2A三量体が、コンデンシンを脱リン酸化することを見出した。M期の終了時には、このタイプのPP2Aによりコンデンシンは脱リン酸化されて不活性化され染色体から解離する。これらの結果は、PP2A-B'アイソフォームは染色体の凝縮に、PP2A-Bアイソフォームは脱凝縮に機能することを意味する。
半導体デバイスの超微細化に向けた革新的な高濃度極浅接合形成技術の創出

半導体デバイスの超微細化に向けて極浅接合形成技術は重要な課題である。本研究はシリコン表面の極浅領域にノックオンイオン注入法によって高濃度に不純物を局在化させ,マイクロ波照射によってその領域のみを直接加熱しノックオン不純物を効率的に活性化させる革新的な極浅半導体接合技術を創出するものである。19年度に設計製作した基板ホルダーを回転させる機構を設けたマイクロ波照射チャンバーを用い,Ar注入により非晶質化したSi基板へ低エネルギーイオン注入したB原子のマイクロ波照射による活性化現象を解明した。2.45GHz,300Wのマイクロ波を30秒照射することは従来の電気炉では650°Cで8分のアニールに相当する。このときのSi基板温度は550°Cであり,B原子の再拡散は全くなかった。マイクロ波アニールにより低温活性化(実質約200°C)が可能であることが確認された。この結果を踏まえて,RFスパッタによりSi基板に堆積した50nm厚のAl膜を介してArイオン注入し,Al原子をSi表面にノックオン注入し,マイクロ波アニールによる活性化を行った。ノックオン注入によりSi表面に導入されたAl原子数はAr注入量により制御でき,その深さはいずれのノックオン注入条件においても約10nmに局在させることができた。Ar注入量が1E15/cm^2の場合には約30nmの深さまでAl原子の再分布が認められた。これは注入されたArイオンによるSi結晶欠陥に起因する。これらの試料に前記B不純物活性化と同じ条件でマイクロ波照射することにより,60秒で電気的活性化が可能になった。10nmの極浅p+層形成が実現できたことから本技術の有効性が実証された。本研究は、ノックオンイオン注入法によって極浅領域に高濃度に不純物を局在化させ、マイクロ波アニールによって不要な拡散を伴わずに効率的に活性化させる画期的な極浅半導体接合技術を創出するものである。マイクロ波をドーパントとなる不純物原子あるいは結晶欠陥に直接吸収させ、電界との相互作用としての分極や荷電粒子による渦電流損失により発熱させるため、マイクロ波をウェハに均一に照射することが不可欠な課題である。今年度は,アニールチャンバ内で入射マイクロ波を分散させ、また基板ホルダーを回転させる機構を設けた実験装置を設計・試作した。Si単結晶ウェハを用いたマイクロ波照射実験により、効率的にマイクロ波がウェハに吸収され、熱エネルギーに変換でき,極めて短時間でウェハ温度が上昇することを確認した。チャネリングを防止するためにArイオン注入により表面をアモルファス化したSiウェハにBイオンを注入し、この装置を用いてマイクロ波アニールを行った。B原子の電気的活性化のマイクロ波照射条件依存性を詳しく調べた結果、マイクロ波入射電力が300Wのときは1分以内で注入したB原子のほぼすべてが活性化し、p型ドーパントとなった。そのシート抵抗は通常の電気炉アニールの900°C、30分に相当する。シート抵抗の2cm平方内均一性は3%以下であった。ノックオン注入のp型およびn型ドーパント不純物としてはAl,InおよびSbを選んだ。それらのターゲット材料を準備してRFスパッタによる薄膜堆積条件を求めた。次年度では、マイクロ波アニール実験装置を用いてノックオン注入不純物原子の活性化を行う。特に、拡散の早いBでは実現が難しいp型極浅低抵抗層を実現する。
新しい神経性ペプチド、サブスタンスKの脳内分布様式と中枢機能発現との相関について

共にタキキニン・ペプチド群に属するサブスタンスK(ニューロキニンA;SKと略記)とサブスタンスP(SPと略記)は共通の前駆体に由来することから、本研究は常にSKをSPと対比させて実験した。1.SKおよびSPの脳内分布SKおよびSPの各特異的抗体(FK05およびFP03)を作製し、放射活性免疫学および組織化学的手法でSKとSPのラット脳内分布を調べた結果、SK:SPの含有比は1:14で両者の分布傾向は類似していた。しかしラットへのカプサイシン処置(生後2日目に50mg/kgの皮下注)による両ペプチドの脳内分布量の減少率は異なるものであった。2.脳内におけるSK性およびSP性神経の存在の可能性ラットの線条体-黒質系および孤束核への求心性神経を例にして検討した結果、これら両神経路でSKはSPと共に神経伝達物質として存在する可能性が示唆された。特にSKおよびSPの孤束核を経由する血圧作用発現は、タキキニン受容体亜型を介していると考えられる。しかし、この解明には受容体亜型を同定する特異的リガンドを必要とし、今後の重要な課題である。3.SKおよびSPの存在と中枢性血圧調節への意義上記カプサイシン処置で、血圧調節に重要な孤束核におけるSK量には有意な変化はなく、SPのみが半減した。このように関連神経路が一部変性した状態でも、圧受容器、化学受容器および体性-自律神経の各反射は完全に維持されていた。この場合における代謝機構の様式については未解決である。4.タキキニン受容体亜型リガンドの検索SPとSKに由来する数種のアミノ酸フラグメントとそのペプチドニ量体について、それぞれの薬理作用を検討した結果、タキキニン受容体亜型、NK-1型に特異的リガンドを発見した。標記の研究課題について、今年度はサブスタンスK(SK,ニューロキニンA)の中枢神経系内分布とその中枢機能への関与を検討したが、この物質がサブスタンスP(SP)と共通の前駆体から生合成されるので、実験は常にSKとSPとを対比させて行なった。1.SKとSPの生体内分布を調べるために、それぞれの抗体を用い放射性免疫学的定量法でSKとSPの含量を測定した。ラット中枢のSKはSPと同様に脳の黒質に最も多く存在し、SK:SPの含有比は1:14で両物質は脳内で類似の分布傾向を示した。これら両物質の中枢神経系内含量は、ラットにカプサイシン処置(生後2日に50mg/kgの皮下注)すると、生後4週、7週、10週および17ケ月後に延髄の孤束核と三叉神経路核および脊髄後角でSP量が有意の減少を示したが、中枢のSK量には有意の変化は認められなかった。2.ラット線条体ー黒質系にSP性ニューロンと共にSK性ニューロンが存在することを想定して、線条体を一側性に熱破壊した。その結果、黒質のSPおよびSK含量は破壊側で著明に減少した。次いでラットの黒質にプッシュ・プル・カニューレを装着し、潅流実験を行ない、高カリウム液による脱分極条件下でSKとSPはほぼ同じ割合で遊離が増加した。従ってこれら一連の実験から線条体ー黒質系にはSPの場合と同等にSK性ニューロンが存在し、その興奮によりSKの遊離を起こす可能性を示唆した。3.上記1の実験で行なったカプサイシン処置ラットは、脊髄後角のSPの減少により痛覚閾値が上昇することは知られている。本研究ではさらに孤束核のSP量の減少による生理的影響を圧受容器および化学受容器を介する血圧反射で調べた。

その結果、化学受容器反射のみにカプサイシン処置ラット群と対照群との間に有意差を認めた。標記の研究課題について今年度は,1.サブスタンスK(SK,ニューロキニンA)の中枢における役割について自律神経反射機構を観察して検討した.SKはサブスタンスP(SP)と共通の前駆体から生合成されることから,実験は常にSKとSPとを対比させて行なった.2.次いでSKおよびSPなどタキキニン・ペプチドの受容体の性質を調べる目的で,末梢の平滑筋組織であるモルモット回腸縱走筋およびラット輸精管を用いて実験した.1.SKおよびSPの脳内含量の変化と自律神経反射機構との関係について:ラットを生後2日目にカプサイシン(50mg/kg,S.C.)処置すると,4週齢,7週齢および10週齢の時点で脊髓後角,延髓の三又神経脊髓路核および弧束核でのSP含量は対照例の4060%程度減少した.しかしSK含量の減少率はSPのそれに比べると小さいものであった.このようなカプサイシン処置例について,圧受容器反射,化学受容器反射および体性ー自律神経反射への影響を血圧,心拍数および腎臓交感神経活動で調べ対照例と比較したが,いずれの反射にもカプサイシン処置の影響は認められなかった.以上の成績から,カプサイシンによりタキキニン・ペプチドを含む求心性神経の一部が変性した後でもこれら求心性神経を介する自律神経反射機構は維持されていることを示唆した.しかしこの場合にどのような代償作用が働いているかは未解決の問題として残っている.2.タキキニン・ペプチド受容体の性質:中枢のタキキニン・ペプチド受容体の性質を検討するに先立ち,平滑筋組織を用い収縮反応,放射活性標識リガンドによる結合実験およびイノシトール・リン脂質代謝を測定した.その結果,タキキニン・ペプチド受容体が数種のサブタイプに分類されることが示唆された.1.孤束核(NTS)におけるタキキニン・ペプチド性神経の存在圧受容器反射に関与する第IXおよび第Xの両脳神経がNTSに入力していることに注目し、次の実験を行った。(1)ラットのNTSへの微量(0.1μl)注入により、サブスタンスP(SP)とサブスタンスK(SK;ニューロキニンA)の濃度・血圧反応を検討した。(2)節状神経節切除による上記両神経の除神経後1週間経過したラットのNTSと関連部位におけるSKとSPの各含量を放射活性免疫学的定量法で測定した。これら実験結果は、SKがSPと共にNTSへの求心性神経の刺激伝達物質であることを示唆している。しかも血圧反応にみられる両考の差異から、NTSにタキキニン受容体亜型が存在し、これらを介して血圧反応を発現していることが考えられる。しかし、その解明には受容体亜型を同定する特異的リガンドを必要とし、さらにこれらペプチド作用へのノルアドレナリン性など古典的神経伝達物質を含む神経系の関与の有無を証明することが今後の課題である。2.タキキニン受容体亜型リガンドの検索SPおよびSKに由来する数種のアミノ酸フラグメントとそのペプチド二量体について、それぞれの生理作用(平滑筋収縮、唾液分泌および血圧の各作用)を比較、さらに受容体結合親和性を検討した。これらペプチドのいくつかのフラグメントをペプチド二量体にすることにより、タキキニン受容体亜型、NK1型への特異的リガンドになる可能性を示唆した。3.動物の種差によるタキキニン・ペプチド分布の比較哺乳類に至る種々の発達段階の脊椎動物の脳動脈について、タキキニン・ペプチド性神経の支配様式を比較した。
非拡散衝突モデルによる複雑系パターン形成の研究

最近、私たちは非拡散衝突モデルという新しいコンピューター・シミュレーション手法を開発した。この手法の最大の利点は、反応拡散方程式にかわって複雑系の空間パターンを容易に研究できるという点にある。昨年までは、この手法を主として生態系の空間パターン形成の問題に適用してきた。本研究の目的は、生態系だけでなく、化学反応系、さらには社会学や宇宙物理学のさまざまな“複雑系"に対しても、非拡散衝突モデルを適用し、計算機物理の中でその地位を確立させることを目的としていた。この目的は基本的に達成された。すなわち、生態系のみならず、社会学とりわけ選挙の問題さらには宇宙物理学の分野において、これまで得られて来なかった新しい知見を得ることができた。1.生態系では、具体的には拾食者と餌と空地の3つの状態から成る系を研究した。簡単な反応モデルによって空間パターンを自己組織的に作り出した。その結果次のような新しい知見を得た。ある生物を我々が除去し、又は殺しつづけても、その生物は減少するとは限らない。2.選挙とマスコミの問題では次のような成果を得た。(1)ある候補者がスキャンダルの公表によってマスコミからダメージを受けても、その候補者の支持層は減少するとは限らない。(2)マスコミから無視された候補者にも大きな影響が及ぶ。(3)選挙の直前のマスコミ報道は直接的な影響を有権者に及ぼす、これらの成果については産経新聞(3月6日付)にも大きく報道された。3.宇宙物理学の分野では、銀河内星間ガスの空間構造について考えた。銀河内星間ガスとしては、cold cloudやhot gasが非常に多く存在することができるの対して、warm gasが多く存在することができない理由を説明した。
アンモニアｐｈｏｔｏ－ＳＣＲおよびｐｈｏｔｏ－ＳＣＯに有効な実用的高速触媒の開発

採用1,2年目の検討により,ルテニウム色素で修飾した二酸化チタン光触媒が可視光照射下でのアンモニアを還元剤とした窒素酸化物の選択接触還元(アンモニア脱硝)に高い活性を示すことを見出し,自動車排ガスにおける実用的な高ガス流速条件下で,一酸化窒素の転化率が99%以上,窒素への選択率が99%以上と高活性な触媒開発に成功した.採用3年目の本年は,上記の可視光照射下で非常に高い活性を示すルテニウム色素修飾二酸化チタン上でのアンモニア脱硝の反応機構解析を行った.反応のブランクテストの結果,本反応は色素増感型の機構で進行することが示唆された.また,拡散反射紫外可視分光法を用いて,ルテニウム色素の一電子酸化体が,アンモニアを酸化的に活性化可能であることを確認した.各種分光法を用いた検討から,可視光照射下で色素から二酸化チタンへの電子注入が起こり,生成したルテニウム色素の一電子酸化体が,アンモニアを活性化し,アミドラジカル中間体を生成する反応機構を提案した.作用スペクトル測定から,可視光を照射した場合では,紫外光を照射した場合よりも見かけの量子収率が低いことが分かった.つまり,ルテニウム色素で修飾した二酸化チタン光触媒が高い活性を示したのは,ルテニウム色素による表面修飾により,可視光域の光を利用可能になったため,反応に使える光子数が増加したためであると結論した.上記以外にも,排ガス中に含まれる触媒被毒ガスである硫黄酸化物の添加効果を検討し,反応後の触媒のキャラクタりゼーションから,触媒被毒モデルを提案した.さらに,低温脱硝の概念を拡張し,二酸化チタンをベースとする光媒上へ窒素酸化物の酸化・吸蔵技術を新たに開発した.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,実用レベルの高いガス流速条件下で,アンモニアを還元剤として用いたNOの選択還元(アンモニア脱硝,NH3-SCR)に高活性を示す新規光触媒反応(photo-SCR)系の構築を目的としている.当初の計画通り,選択溶解析出法を用い,400°C以上の高温で焼成後にも高比表面積を維持したTiO2光触媒の合成に成功した.調製した触媒の活性試験を行ったところ,比表面積を増加させても活性はほとんど変化しなかった.比表面積が増加することで,反応ガス分子の吸着量は増加すると考えられるため,本触媒系では反応ガスの吸着以外の過程が反応速度を支配していると考えられる.つまり,本検討結果から,本触媒系の高活性化のためには,反応ガスの吸着以外の反応過程を促進する必要があることが示唆された.これまでの検討から,本反応の律速段階は反応中間体であるNH2NO種の分解過程であることがわかっている.そこで,NH2NO種の分解過程の促進による反応活性の向上を狙い,photo-SCRにおける反応温度の影響を検討した.NO転化率は反応温度に大きく依存し,433Kで最大(84%)となることがわかった.最高活性が得られた433Kにおいて,反応の時間経過に伴う触媒の失活は観察されず,本触媒は温度をかけた条件においても非常に安定である.また,反応速度論解析から,各温度領域で反応速度を支配しているファクターを明らかにした.光触媒反応に対して,流通型反応装置を用いた反応速度論的検討を行った例は少なく,本研究は光触媒反応の理解という観点でも意義深いものである.本研究では,実用レベルの高いガス流速条件下(ガス空間速度100,000 h-1)で,アンモニアを還元剤として用いた一酸化窒素(NO)の選択還元(アンモニア脱硝, NH3-SCR)に高活性化な光触媒開発を目的としている.採用1年目の研究により,基質ガスの吸着過程以外の反応過程が反応速度を支配していることが示唆された.そこで,本年度は吸着分子の光活性化過程の促進を検討した.光活性化過程を促進する手段として,利用できる光の波長領域を拡大することが挙げられる.これまで用いてきた二酸化チタンは可視光を吸収できない.可視光を利用できる触媒を開発できれば,光活性化過程が促進され,脱硝性能が向上すると期待できる.そこで,本研究では,可視光を吸収できる色素とTiO2との複合化による可視光応答光触媒の開発を検討した.複合化に用いる色素として,可視光域にソーレ帯及びQ帯と呼ばれる吸収をもつポルフィリン分子を選択した.ポルフィリンで修飾した二酸化チタン光触媒の脱硝性能を評価したところ,本触媒は可視光照射のみで高い脱硝性能を示すことを見出した(NO転化率66%,ガス空間速度50,000 h-1).紫外可視分光法により,触媒の吸収特性を評価したところ,可視光域にポルフィリンに由来する吸収が観察されたことから,狙い通り,色素が光を吸収することで反応が進行しているものと考えられる.また,修飾に用いる色素のスクリーニングの結果,ルテニウム系色素が非常に高い活性を示すことを明らかにした.

ルテニウム系色素の担持量及び担持条件の最適化の結果,ガス空間速度100,000 h-1の条件で可視光照射下NO転化率99%, N2選択率99%を達成した.採用1,2年目の検討により,ルテニウム色素で修飾した二酸化チタン光触媒が可視光照射下でのアンモニアを還元剤とした窒素酸化物の選択接触還元(アンモニア脱硝)に高い活性を示すことを見出し,自動車排ガスにおける実用的な高ガス流速条件下で,一酸化窒素の転化率が99%以上,窒素への選択率が99%以上と高活性な触媒開発に成功した.採用3年目の本年は,上記の可視光照射下で非常に高い活性を示すルテニウム色素修飾二酸化チタン上でのアンモニア脱硝の反応機構解析を行った.反応のブランクテストの結果,本反応は色素増感型の機構で進行することが示唆された.また,拡散反射紫外可視分光法を用いて,ルテニウム色素の一電子酸化体が,アンモニアを酸化的に活性化可能であることを確認した.各種分光法を用いた検討から,可視光照射下で色素から二酸化チタンへの電子注入が起こり,生成したルテニウム色素の一電子酸化体が,アンモニアを活性化し,アミドラジカル中間体を生成する反応機構を提案した.作用スペクトル測定から,可視光を照射した場合では,紫外光を照射した場合よりも見かけの量子収率が低いことが分かった.つまり,ルテニウム色素で修飾した二酸化チタン光触媒が高い活性を示したのは,ルテニウム色素による表面修飾により,可視光域の光を利用可能になったため,反応に使える光子数が増加したためであると結論した.上記以外にも,排ガス中に含まれる触媒被毒ガスである硫黄酸化物の添加効果を検討し,反応後の触媒のキャラクタりゼーションから,触媒被毒モデルを提案した.さらに,低温脱硝の概念を拡張し,二酸化チタンをベースとする光媒上へ窒素酸化物の酸化・吸蔵技術を新たに開発した.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。アンモニア脱硝に高い活性を示す光触媒の開発を目的として,高温焼成後でも高比表面積を維持したTiO2光触媒の合成を行った.TiO2の高比表面積化には成功したが,活性試験の結果,比表面積を上げることは活性の向上には結びつかなかった.この結果から本反応の高活性化のためには,反応ガスの吸着以外の過程を促進する必要があることがわかった.この知見を元に,中間体の分解過程を反応温度の効果によって促進することで,反応の高活性化に成功した。また,反応速度論解析から,各温度領域で反応速度を支配しているファクターを明らかにした.初年度の計画として,高活性な触媒系の探索を挙げていたが,それだけでなく反応機構に踏み込んだ検討を進め,その結果が査読付きの国際誌に受理されたという点で,当初の計画以上に進展したと判断した.本研究は,実用レベルの高いガス流速条件下(ガス空間速度100,000 h-1)で,アンモニアを還元剤として用いたNaの選択還元(アンモニア脱硝, NH3-SCR)に高活性化な光触媒開発を目的としている.当該年度に実施した研究により,色素修飾二酸化チタン光触媒が非常に高い活性を示すことを見出した.触媒の最適化の結果,色素修飾二酸化チタン光触媒は目標のガス流速条件下にて,実用条件で使用できるレベルの脱硝性能を示した(NO転化率99%, N2選択率99%).上記の通り,目標を上回る活性を示す触媒開発に成功したとう点で,当初の計画以上に進展したと判断した.これまでの検討で,TiO2上への反応ガスの吸着量を増加させても,反応速度は向上しないことがわかった.これは,活性向上のためには反応ガスの吸着過程以外の吸着分子の光励起過程や生成物の脱離過程を促進する必要があることを示唆している.光励起過程の効率を上げるためには,利用できる光の波長を拡大することが有効である.既に,色素でTiO2を修飾することで,これまでは利用できなかった可視光照射下で反応が進行することを見出している.
アミノ酸組成とその炭素・窒素安定同位体組成から見る生物起源粒子の輸送過程

本年度は、白鳳丸KH91ー3次航海のStn.A(45°N,165°E)で得られた懸濁粒子、沈降粒子、動物プランクトンおよび堆積物を試料として各種の分析を実施した。予備的に懸濁粒子と沈降粒子のアミノ酸組成を比較したところ、互いに大きく異なっていたので、各種の粒子試料について熱水抽出を行うことにより、低分子でかつ生体内では機能的役割を担っていると思われる画分(FAA,CAA=labile metabolic pool)と高分子(蛋白質)で構造的役割を持つ画分(PAA=structural pool)に分け、それぞれの試料中のアミノ酸の定性・定量を行った。その結果、懸濁粒子中のアミノ酸の80%以上がstrctural poolの画分によって占められていることが明かとなった。一方、沈降粒子についてみると50ー80%が低分子画分(metabolic pool)によって占められており、両者には著しい差異が認められた別に分析した新鮮な動・植物プランクトンでは、strctural poolが70ー80%を占めていたことから、沈降粒子は植物プランクトンが動物プランクトンに摂食されることにより、糞粒となる過程で大きな変質を受け、微生物分解を被り易い画分の多い粒子になっていることが示唆された。このmetabolic pool中には、粒子が生成してからの経過時間の指標となると思われる非蛋白構成アミノ酸(タウリン)が多量に含まれており、その鉛直分布を見てみると、懸濁粒子・沈降粒子とも表層部では高濃度であり、下層に行くにしたがって急減していた。このように粒子の質は明らかに変化しており、有光層内での盛んな生物活動をかいまみさせる。各種の動物プランクトンと表層堆積物の炭素・窒素安定同位体を分析したところ、種毎の栄養段階(食生態)違いが良く表現された。また、大西洋のものに比べて、太平洋の動物プランクトンの方が、炭素同位体比が軽いという傾向が見られた。
破骨細胞カルシウム流入特性を利用した骨量管理

破骨細胞の分化・成熟化には細胞内カルシウムシグナルの活性化と、それに続く様々な転写因子の作用、遺伝子発現誘導、タンパク機能が必須である。そこで、細胞機能の主軸となるカルシウムシグナルを駆動される機構に注目し、そのきっかけとなる細胞内カルシウム濃度の上昇はどのように引き起こされるのか、細胞内にカルシウムを流入させる膜局在カルシウムチャンネルTransient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4)の破骨細胞における機能調節機構を検討した。TRPV4の作用によりカルシウムカルモジュリン複合体が細胞内で増加し、それがTRPV4のカルモジュリン結合領域に応答すること、さらに非筋型ミオシンがカルモジュリン結合領域の構成分子となり、細胞の遊走性に関与していることが明らかとなった。カルシウムチャンネルTRPV4はマウス破骨細胞の機能を促進し骨代謝に関与することから、骨破壊制御による骨量調整への応用を目的とし、カルシウムチャンネルによる細胞内カルシウムイオン供給機構の重要性について検討を進めている。平成22年度は、TRPV4の活性型変異体を作製し、レトロウイルスシステムにより破骨細胞前駆細胞にて発現させた。分化誘導前から細胞内カルシウム濃度は野生型細胞に比較して変異体発現細胞で上昇し、さらに分化誘導後の細胞において骨吸収活性の増加が認められた。これらの結果より、カルシウムチャンネルにより調整される細胞内カルシウム濃度が破骨細胞機能に影響することが示唆された。次にカルシウムチャンネルの活性化が生体内の骨量を調節し得るかを検討するため、破骨細胞特異的TRPV4活性型変異体トランスジェニックマウスを作製した。TRPV4活性型変異体トランスジェニックマウスの骨量は、野生型マウスと比較して減少することがマイクロCTを用いたX線解析により確認された。一方、TRPV4の活性化調節については、細胞内カルシウム-カルモデュリン複合体がTRPV4分子内の応答領域に結合しカルシウム流入活性を促進する機構が報告されている。そこで、TRPV4活性型変異体のカルモデュリン結合領域を欠損させ、同様に破骨細胞特異的トランスジェニックマウスを作製した。現在これら変異体発現マウスの骨表現系、骨代謝マーカー等を解析している。破骨細胞機能における受容体型カルシウムチャンネルTRPV4の役割を調べるために、咋年度よりTRPV4活性型変異破骨細胞特異的レスキューマウスを作出解析を行なった。まず始めにTRAPプロモーターによりTRPV4活性型変異体の発現を制御した破骨細胞特異的トランスジェニックマウスを作成し、TRPV4欠損マウスとの交配を重ね、破骨細胞でTRPV4活性型変異体を発現するマウスを作出した。野生型マウスおよびTRPV4欠損マウスと比較して、TRPV4変異体マウスでは骨吸収の亢進による骨量の減少を観察した。次にこのチャンネルの活性化調節領域としてカルモジュリン結合領域に注目し、TRPV4活性型変異体からこの領域を除いたトランスジェニックマウスを作成したところ、TRPV4活性型による破骨細胞の骨吸収亢進作用は消失し、TRPV4のカルシウムチャンネルとしての機能発現にカルモジュリン結合領域が必要であると示唆された。さらに、この領域と応答する細胞内分子が破骨細胞機能に関わる可能性を調べるために、HEK293細胞にTRPV4を発現させ、カルモジュリン結合領域に応答する分子についてプロテオーム解析による同定を試みたところ、非筋型ミオシン(Myosin IIa)重鎖(MYH9)が候補分子として見出された。そこで、破骨細胞での内在型MHY9とTRPV4との相互作用をTRPV4抗体を用いた免疫沈降の後にウェスタンブロット解析を行ない、野生型の破骨細胞でのMHY9-TRPV4タンパク相互作用を確認した。これらの結果から、カルシウムシグナルは破骨細胞機能発現において重要な役割を担うこと既によく理解されているが、シグナルを起動させるカルシウム/カルモジュリン作用が再びカルシウムチャンネルにはたらきかけることが、さらなるカルシウムの細胞内への流入の契機となり、破骨細胞活性を維持させている可能性が挙げられた。昨年度に引き続き、受容体型カルシウムチャンネルTRPV4の機能と活性化制御機構に注目し、骨代謝担当細胞での細胞内カルシウム恒常性やカルシウムシグナルへの貢献、骨代謝における役割などについて検討を進めた。TRPV4の活性化にはカルシウムカルモジュリン複合体のチャンネル応答領域への結合ならびに、非筋型ミオシン分子の応答が関係することが見出されたことから、本年度は非筋型ミオシン分子の不活性化(脱リン酸化)がカルシウムチャンネルの機能と破骨細胞の細胞活動に及ぼす影響を検討した。これまでの報告からミオシン軽鎖の脱リン酸化により非筋型ミオシンの機能が障害されること、Rhoキナーゼ経路を抑制することでミオシンは脱リン酸されることが知られている。そこで、Rhoキナーゼの阻害剤で培養破骨細胞を処理し、細胞機能ならびにカルシウム流入を評価し、ミオシンの不活性化とTRPV

4機能の関連性について検討を行なった。骨髄マクロファージから破骨細胞を分化させる過程でRhoキナーゼ阻害剤により刺激すると、細胞の分化が遅延し、巨大な破骨細胞は出現せず、破骨細胞の成熟化には至らないことが観察された。さらにこの変化をタイムラプスイメージングシステムにより顕微鏡観察画像を取得し、細胞の遊走性を評価すると、Rhoキナーゼ阻害剤処理により分化段階で細胞の動きは減衰することから、細胞の分化に重要な細胞の融合率が低下することが考えられる。また分化した破骨細胞においてTRPV4の開口を特異的なアゴニストで刺激したところ、Rhoキナーゼ阻害剤処理によりカルシウム流入活性の減少を確認した。これらの結果から、破骨細胞の細胞機能に関与するTRPV4のカルシウム流入機構には、ミオシン分子の活性化が細胞の分化過程で関わると考えられる。作出した変異マウスでは予想通りの骨表現系を観察し、細胞の機能変化を個体レベルで再現することが出来た。またプロテオーム解析の情報をマウス組織より分離した細胞で確認し得たことで、注目している分子の細胞内での分子間相互作用の分子基盤が理解された。24年度が最終年度であるため、記入しない。培養細胞を用いて既に同定されたTRPV4応答分子が、細胞活動にいかに影響するかを詳細に検討する。特に破骨細胞を用いていることから、細胞が骨吸収の最中か、あるいは骨梁を移動しているのか、対象とするカルシウムチャンネルの機能が調整する細胞活動を調べる。