hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TRUEジーンサイレンシング法によるマイクロRNA制御による骨形成誘導法の開発

昨年度までに同定した骨芽細胞分化に機能するmiRNAは,古典的WntシグナルもしくはBMP-2によって発現量が増加するmiRNAである.骨芽細胞の分化段階にけるこれらのmiRNAの発現量の変化を調べるために,MC3T3-E1細胞を4週間培養し,1週ごとに全RNAを回収した.このRNAを用いてStep-OneによるリアルタイムPCR法によって発現量の変動を定量化した.骨芽細胞の分化が進むにつれて,これらのmiRNAの発現量は増大した.またこれらのmiRNAをantagomiRもしくはsgRNAを用いてノックダウンした.リアルタイムPCR法でこれらのmiRNAがほぼ検出限界以下までノックダウンさせることに成功した.これらのノックダウンによって骨芽細胞分化に関連するmRNAの発現を調べたところ,オステオカルシンのmRNAは有意に減少しなかったが,アルカリフォスファターゼmRNAは著しく減少していた.以上の結果から,これらのmiRNAは,骨芽細胞分化に関連するmiRNAである可能性が高いと考えられた.そこで,これらのmiRNAの標的となるmRNAの候補を,データベースより検索した.さらに,TRUEジーンサイレンシング法を用いたmiRNA抑制性sgRNA発現プラスミドのライブラリーを未分化間葉系細胞培養系に導入し,アルカリフォスファターゼ活性染色やリアルタイムRT-PCR法を用いて,Runx2,osterix,I型コラーゲン,オステオカルシン,ALP,BSP,MEPE,MMP-13などのmRNAの発現量を測定した.これらより骨芽細胞分化と関連するmRNAが誘導されるsgRNAが見出された.これらのsgRNAの骨・軟骨形成に及ぼす影響及び内軟骨性骨形成に対する影響について検討を行った.sgRNA発現プラスミドもしくは2'-O-methyl化sgRNAの導入によって骨形成マーカーの増加が観察され,これらのsgRNAは骨形成活性を有している可能性が考えられた.骨芽細胞分化に機能するmiRNAを同定するために, C2C12細胞にBMP-2を加えRNAを回収し, Step-Oneを用いてリアルタイムPCRを行った.BMP-2によりmiR-1,-133a,-206の発現が経時的に減少することが明らかになった.これらの減少が転写の抑制によるものかどうか調べるためpri-miRの発現量をRT-PCR法により調べた.BMP-2によりpri-miR-206の発現量が増加していたことから, miR-206の発現低下は転写レベルではなく,転写後の成熟過程における抑制と考えられた. miR-206をアンチセンスRNAによってノックダウンさせたが, miR-1の発現量は代償的な変化は認められなかった. TRUEジーンサイレンシング法を用いたmiRNA抑制性sgRNA発現プラスミドのライブラリーを骨髄間葉系細胞であるST-2,未分化間葉系細胞であるC2C12細胞培養系において導入し,アルカリフォスファターゼ活性染色,リアルタイムRT-PCR法を用いて, Runx2, osterix, I型コラーゲン,オステオカルシン,アルカリフォスファターゼ, BSP, MEPE, MMP-13などのmRNAの発現量を測定した.ある種のライブラリーでは,これらの骨芽細胞の分化指標のmRNAの増加が見出された.これらの結果から,このライブラリー中のmiRNAが同定されることによって,骨芽細胞分化に機能するmiRNA分子の明らかになると考えられた.骨芽細胞分化に機能するmiRNAを同定するために,古典的Wntシグナル経路を活性化したC2C12細胞やBMP-2を加えたC2C12細胞を培養し全RNAを回収した.このRNAを用いてmiRNAの発現をアレイにて測定し,古典的WntシグナルもしくはBMP-2によって発現が変化するmiRNAを数種類同定した.同定されたmiRNAについては,Step-Oneを用いたリアルタイムPCR法によって発現量の変動を定量化した.BMP-2によりmiR-1,-133a,-206の発現が減少した.古典的WntシグナルもしくはBMP-2によって発現が増加するmiRNAについて,各種細胞における発現量をリアルタイムPCR法によって測定したところ,骨芽細胞での発現が高かった.またこのmiRNAをantagomiRもしくはsgRNAでノックダウンしたところ,アルカリフォスファターゼ活性が低下した.これらのmiRNAは,骨芽細胞特異的なmiRNAである可能性が高いと考えられた。そこで,これらのmiRNAの標的となるmRNAの候補を,データベースより検索した.また,引き続き,TRUEジーンサイレンシング法を用いたmiRNA抑制性sgRNA発現プラスミドのライブラリーを骨髄間葉系細胞であるST-2,未分化間葉系細胞であるC2C12細胞培養系に導入し,アルカリフォスファターゼ活性染色,リアルタイムRT-PCR法を用いて,Runx2,osterix,I型コラーゲン,オステオカルシン,アルカリフォスファターゼ,BSP,MEPE,MMP-13などのmRNAの発現量を測定した.これらの骨芽細胞分化と関連するmRNAが誘導されるRNAが見出された.以上の結果から,このライブラリー中のmiRNAが同定されることにより骨芽細胞分化に機能するmiRNA分子が明らかになると考えられた.昨年度までに同定した骨芽細胞分化に機能するmiRNAは,古典的WntシグナルもしくはBMP-2によって発現量が増加するmiRNAである.骨芽細胞の分化段階にけるこれらのmiRNAの発現量の変化を調べるために,MC3T3-E1細胞を4週間培養し,1週ごとに全RNAを回収した.このRNAを用いてStep-OneによるリアルタイムPCR法によって発現量の変動を定量化した.骨芽細胞の分化が進むにつれて,これらのmiRNAの発現量は増大した.

またこれらのmiRNAをantagomiRもしくはsgRNAを用いてノックダウンした.リアルタイムPCR法でこれらのmiRNAがほぼ検出限界以下までノックダウンさせることに成功した.これらのノックダウンによって骨芽細胞分化に関連するmRNAの発現を調べたところ,オステオカルシンのmRNAは有意に減少しなかったが,アルカリフォスファターゼmRNAは著しく減少していた.以上の結果から,これらのmiRNAは,骨芽細胞分化に関連するmiRNAである可能性が高いと考えられた.そこで,これらのmiRNAの標的となるmRNAの候補を,データベースより検索した.さらに,TRUEジーンサイレンシング法を用いたmiRNA抑制性sgRNA発現プラスミドのライブラリーを未分化間葉系細胞培養系に導入し,アルカリフォスファターゼ活性染色やリアルタイムRT-PCR法を用いて,Runx2,osterix,I型コラーゲン,オステオカルシン,ALP,BSP,MEPE,MMP-13などのmRNAの発現量を測定した.これらより骨芽細胞分化と関連するmRNAが誘導されるsgRNAが見出された.これらのsgRNAの骨・軟骨形成に及ぼす影響及び内軟骨性骨形成に対する影響について検討を行った.sgRNA発現プラスミドもしくは2'-O-methyl化sgRNAの導入によって骨形成マーカーの増加が観察され,これらのsgRNAは骨形成活性を有している可能性が考えられた.
9員環状ラクトン構造を持つステロイド誘導体の合成研究

Furo[2.3-b]furan構造を持つ9員環ラクトンの合成:市販の1,2:5,6-ジ-O-イソプロピリデン-D-マンニトール(1)を出発原料とし、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化的に切断し,後処理することなく炭酸カリウム,Triethyl phosphonoacetateを加えることにより,E体のα,β-不飽和エステル(3)が好収率で得られた.(3)のエステル基をDiisobutyl aluminum hydlideで還元してアルコール(4)に導き,続いてTriethylorthoacetate中Hydroquinone存在下に加熱還流すると容易にClaisen転位が起き,β-位にビニル基のあるエステル(4)が好収率で得られた.4を80%メタノール中塩酸を加えアセトニドの加水分解と同時にラクトン化を行うとβ-ビニル-γ-ヒドロキシメチル-γ-ブチロラクトンが得られた.ビニル基をアルデヒド基に変換後酸処理をすれば,環の巻換えが起きFuro[2,3-b]furan骨格の形成が期待できる.しかしながら、ラクトン環形成反応における収率の向上を種々検討したがしたが思わしい結果が得られなかった。ジエン部分の合成:市販のHagemannエステルを出発原料とし、ベンゼン中、p-TsOH存在下にエチレングリコールと加熱還流すると、二重結合が3,4位に異性化したケタールエステルが高収率で得られた。このエステルを還元してアルコールとし、続いて活性MnO_2で酸化してアルデヒドへ導いた。得られたアルデヒドにPh_3P=CH_2によるWittig反応でビニル基に変換し、2,3のジエノフィルを用いて、Diels-Alder反応を検討してた。鎮咳,去啖作用が大きい漢方薬′′Pai-ch′en′′として中国で広く使用されている,ガカイモ科の植物に含まれるグロウコゲニンの全合成を最終目的として,平成10年度はグロウコゲニンAに含まれるFuro[2,3-b]furan骨格部分の合成を検討したので以下に述べる.市販の1,2:5,6-ジ-O-イソプロピリデン-D-マンニトール(1)を出発原料として,四酢酸鉛でジオール部分で酸化的に切断してアルデヒド(2)に導き,続いてTriethyl 2-phosphonopropionateを用いたWittig-Homer反応を行ってエステル基の導入を検討したが,望むエステル基とアセトニド基がシス体のエステルを主成分として得ることが出来なかった.そこでまずFuro[2,3-b]furan骨格の合成を検討することとした.先のD-マンニトールアセトニド(1)を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化的に切断し,後処理することなく炭酸カリウム,Triethyl phosphonoacetateを加えることにより,E体のα,β-不飽和エステル(3)が好収率で得られた.(3)のエステル基をDiisobutyl aluminum hydlideで還元してアルコール(4)に導き,続いてTriethylorthoacetate中Hydroquinone存在下に加熱還流すると容易にClaisen転位が起き,β-位にビニル基のあるエステル(4)が好収率で得られた.4を80%メタノール中塩酸を加えアセトニドの加水分解と同時にラクトン化を行うとβ-ビニル-γ-ヒドロキシメチル-γ-プチロラクトンが得られた.ビニル基をアルデヒド基に変換後酸処理をすれば,環の巻換えが起きFuro[2,3-b]furan骨格の形成が期待できる.他方,γ-ブチロラクトンから直接Furo[2,3-b]furan骨格の合成も検討している.γ-ブチロラクトンをDIBAHLで還元してラクトールに導き,続いてマロン酸モノエチルと縮合させた後ジアゾ化,Rh_2(OAc)_4によるインサーション反応で目的の化合物を得ようとしている。

グロウコゲニンAはガカイモ科の植物に含まれる高度に酸化の進んだステロイド誘導体の一つであり、漢方薬"Pai-ch'en"の成分の一つである。平成10年度ではグロウコゲニンAの活性の鍵部分と思われるFuro[2,3-b]furan骨格部分の合成について検討したが、期待した結果が得られなかった。平成11年度は、さらにその合成の検討とA,B環部分の合成に必要なDiels-Alder反応のジエン部分の合成を検討した。ジエン部分の合成については、市販のHagemannエステルを出発原料とし、ベンゼン中、p-TsOH存在下にエチレングリコールと加熱還流すると、二重結合が3,4位に異性化したケタールエステルが高収率で得られた。このエステルを常法によりLiAlH_4で還元してアルコールとし、続いて活性MnO_2で酸化してアルデヒドへ導いた。得られたアルデヒドにPh_3=CH_2によるWittig反応でビニル基に変換できる。他方、Hagemannエステルのケト基をMeOH中CeCl_3存在下にNaBH_4で還元してアルコールの異性体混合物を得た。このアルコールエステル水酸基をシリルエーテルで保護した後、C_2H_5ONaで二重結合を異性化しα、β-不飽和エステルに導いた。次にエステル部をBu_2AlHで還元して一級アルコールとした。このアルコールも酸化してアルデヒド、さらにWittig反応によりジエン誘導体が得られると思われる。現在は、種々のジエノフィルを用いて、Diels-Alder反応を検討している。
正則2次微分とタイヒミュラー空間

研究代表者は、リーマン面の間の調和写像が正則になるための必要十分条件を求めた。それは「双曲型の閉リーマン面間の定数でない写像が正則、または反正則になるための必要十分条件はPoincare計量とBergman計量の両方に関して調和である」ことである。証明のアイディアは、調和写像の特徴付けを正則2次微分に関連させれことにある。リーマン面の正則族のモノドロミーの元は、写像類群の元であるが、それはタイヒミュラー・モデュラー群の元とも見なすことができる。その元のタイプをNielsen-Thuston-Bersの観点から、タイヒミュラー空間と双曲幾何の手法を用いて分類することを研究した。特に、この正則族が小平曲面から定まるものであるとき、その分類を完全に行うことができた。この研究成果は、1999年3月の日本数学会年会で発表の予定である。また、その論文を執筆中である。小森は、1次元タイヒミュラー空間のRiley sliceとEarle sliceの形状を詳細に考察した。佐官は単位円周上の位相写像を単位円板内に複素数値の調和関数によって拡張したとき、それが擬等角写像になるかどうかの研究を行った。西尾は熱方程式との関連で多重温度と云う概念を導入し。その平均値の性質を考察した。さらに,研究分担者達によって、上記の内容に直積的あるいは間接的に関係する形でタイヒミュラー空間,擬等角写像,ポテンシャル論,結び目理論、微分幾何、確率過程、エルゴード理論などに関して多くの成果が得られた。研究代表者はタイヒミュラー空間論,クライン群,複素解析,および双曲三角法を応用して、種数2以上のコンパクトなリーマン面の間の非定数正則写像の個数を具体的に評価した。この方法は,コンパクトでない双曲的なリーマン面の間の非定数正則写像の個数評価にも適用可能であり,その研究成果を執筆中である.リーマン面の間の調和写像は,正則2次微分と密接に関連しているが,この観点から,ポアンカレ距離とベルグマン距離を用いて,リーマン面の間の調和写像と正則写像の関係を考察し,調和写像が正則写像になるための必要十分条件を得た.小森は,タイヒミュラー空間論を応用して,実3次写像の位相的エントロピーの単調性を証明した.これは,ミルナ-の実2次写像の場合の研究を発展させるものである.また,SL(2,R)の表現を使って,タイヒミュラー空間の半代数的な記述を行い,タイヒミュラー空間論への応用を行った.佐官は単位円周上の位相写像を単位円板内に複素数値の調和関数によって拡張したとき,それが擬等角写像になるかどうかの研究を行った.これは,タイヒミュラー空間を単位円周上の写像で西尾は熱方程式との関連で多重温度と云う概念を導入し,その平均値の性質を考察した.さらに,研究分担者達によって、上記の内容に直積的あるいは間接的に関係する形でタイヒミュラー空間,擬等角写像,ポテンシャル論,トポロジー,確率過程,エルゴード理論などに関して多くの成果が得られた.研究代表者は、リーマン面の間の調和写像が正則になるための必要十分条件を求めた。
概日時計の分子機構:遺伝子発現から行動リズムまで

哺乳類においてもショウジョウバエと同様、時計遺伝子蛋白が自身の転写を抑制する事により時計発振をしていると考えられている。まず、光修復酵素Cryが哺乳類の時計発振機構の抑制機構の中軸に位置する事を発見した。CRY1,CRY2は非常に強いPer1遺伝子の転写抑制作用があった。また、ショウジョウバエには見られず、哺乳類に特異的な核内への時計遺伝子蛋白の移行システムであるPER3を媒介とする新たなシステムを解明した。体内時計が全く動いていないmCry1/mCry2ノックアウトマウスの視交叉上核、及び肝臓で、時計遺伝子の発振ループが全く止まっていることを発見した。また、時計遺伝子のネガティブフィードバック機構を補助し、その振幅を増大するという新しい時計転写因子dbpを報告した。このdbpはこれまで知られていなかった結合領域に結合し、mPer1の転写活性を上げることを証明した。mPer1プロモーターの転写解析の結果、2つの転写開始点を見つけた。発光遺伝子導入トランスジェニックマウス(時計遺伝子プロモーターが活性化するとホタル発光遺伝子ルシフェラーゼが発現し、投与したルシフェリン基質によって光るマウス)を作成した。また、このマウスの視交叉上核の直上に微小光ファイバーを挿入し、連続的に数日間、昼に高く夜に低い、時計遺伝子発現をリアルタイムで検出する事に成功した。これは、自由行動下での脳機能遺伝子をリアルタイムで検出した初めての研究である。従来解析が困難であった生命現象の時間軸に沿った研究分野を切り開く事を目的とし、以下の三つの事項を行った。1)時計遺伝子の発現制御に関する研究マウスゲノムライブラリーより、mPer1遺伝子のプロモーター領域を含む約30kbpのゲノムを単離した。この領域には、24時間周期の遺伝子発現に重要であると考えられているE-box配列(CACGTG)や、光による発現誘導に必要とされるcAMP応答配列(TGACGTCA)、AP-1配列(TGANTMA)などが多数存在することを明らかにした。さらに、mPer,mTimは細胞および組織特異的時間特異的発現が知られており、蛍光観察倒立顕微鏡システムを用いて、mPER1の発現解析を行った。mPER1は視交叉上核で夕方にピークのある発現を示し、朝にはなにも発現していなかった。2)高感度フォトニクス・デヴァイスを利用したリアルタイムリズムモニター系の開発に関する研究次に、翻訳開始コドンより上流約7.2kbpのゲノムDNAをルシフェラーゼ遺伝子とつなぎ、GH3細胞に導入し、各種条件でプロモーター活性が変動することを示すことを明らかにした。単一細胞レベルでリズムをリアルタイムモニターできる超高感度微量光検出装置を用いたアッセイ系を開発し、ルシフェラーゼ活性が24時間周期に変動するものも見つけた。しかし、他のリズムを示すものも多く、もっと時計現象を描出できるセルラインの開発が必要と考えた。3)時計遺伝子のノックアウトマウスに関する研究時計遺伝子Cryのノックアウトマウスを用いて、視交叉上核と肝臓で、全くリズムが消失していることを発見した。このことは、CRY1,CRY2は非常に強いPer1遺伝子の転写抑制作用がある光修復酵素Cryが哺乳類の時計発振機構の抑制機構の中軸に位置するという考えを補強している。PER1/PER3、PER2/PER3はショウジョウバエには見られず、哺乳類に特異的な核内への時計遺伝子蛋白の全く新しい移行システムである事をを解明した。

dbpの転写もE-boxを介して強く時計遺伝子に制御されており、mPer1とdbpの発現位相はほぼ同様であることが解明された。ただし、蛋白レベルでは、mPER1の発現は遅れるがDBPは即座に起こった。mPer1プロモーターの転写解析の結果、2つの転写開始点を見つけた。発光遺伝子導入トランスジェニックマウス(時計遺伝子プロモーターが活性化するとホタル発光遺伝子ルシフェラーゼが発現し、投与したルシフェリン基質によって光るマウス)を作成した。また、このマウスの視交叉上核の直上に微小光ファイバーを挿入し、連続的に数日間、昼に高く夜に低い、時計遺伝子発現をリアルタイムで検出する事に成功した。
UPLC/MSを用いた自然毒の迅速・高感度一斉分析および新規毒物の検索

22年度は初年度に引き続きUPLC/MS/MSシステムを用いて、種々の毒物について、迅速・高感度検出及び定量法の開発を行った。我々は既にセミミクロLC/MSについて、体液中に含まれるアコニチンアルカロイド及びアマニチン類の分析法を確立しているが、感度や分析に要する時間は必ずしも満足のいくものではなかった。前述した毒物標準品のうちで特に分離が困難なアマニチンを用い、UPLCによる分離(分離カラムの選択、分離溶媒と分離勾配プログラムの検討)条件、質量分析装置のイオン化条件(スプレー電圧、イオン化モード)等について最適化を試みた。その結果、従来30分を要した分析時間を5分以内に短縮することができ、現在までに血清及び尿で検出限界濃度5ng/mLと、セミミクロLC/MSと同等の感度も得られている。ただ、試料間でのイオン強度のばらつきがやや大きいことが課題であるため、現在は特にイオン化効率への影響が大きい尿試料の精製法及び分析条件の最適化を行うことと、適当な内部標準物質の検索に重点をおいている。また我々は、向精神薬類の一斉分析法の開発も併せて行っている。これらの薬物の迅速分析は法医鑑定実務上非常に重要な位置を占めている。現在までに約50種類の薬物を4分以内という短時間に一斉同定することが可能である。また、検出限界濃度も概ね100pg/mL以下を達成している。また、体液のみならず毛髪や爪からの薬物検出も行い、ベンゾジアゼピン系向精神薬25種類の分析において50pg/mg程度の感度を得られるなど、良好な結果を得ている。初年度はUPLC/MS/MSシステムを用いて、種々の毒物について、迅速・高感度検出及び定量法の開発を行った。我々は既にセミミクロLC/MSについては、体液中に含まれるアコニチンアルカロイド及びアマニチン類の分析法を確立しているが、感度や分析に要する時間は必ずしも満足のいくものではなかった。前述した毒物標準品を用い、UPLCによる分離(分離カラムの選択、分離溶媒と分離勾配プログラムの検討)条件、質量分析装置のイオン化条件(スプレー電圧、イオン化モード)等について最適化を試みた。その結果、アコニチンアルカロイドに関しては従来35分を要した分析時間を5分以内に短縮することができ、現在までに血清で検出限界濃度1ng/mLと、セミミクロLC/MSと同等の感度も得られている。今後は更に精製法及び分析条件の最適化を行い、感度の向上を図る。問題点として、パリトキシン等の分子量が2kDaを超えるものに関し、装置の性能限界上分子イオンが検出できない例があり、今後の検討課題である。また、体液のみならず毛髪や爪からの薬物検出も行い、良好な結果を得ている。
スマート結晶パターニング基板の開発

本研究では,バイオミメティック(生物模倣)やバイオミネラリゼーション(生物無機物化)概念を導入した環境融合プロセスにより,微細構造制御した表面をもつ機能性結晶層(薄膜)の作製に成功した。特に,ゲルマトリックス中での拡散を利用したゲル法とマイクロミストの着弾を利用した超音波噴霧熱分解法により,さまざまな基板表面に,リン酸塩,タングステン酸塩,チタン酸塩などのスマートナノ・マイクロ結晶層のパターンを形成した。本研究の目的は,ナノ・マイクロ単結晶を各種基板上に三次元デザイン化し,産業用デバイスとしての新機能を発現する複合基板を作製することである。特に,バイオミメティック(生物模倣)やバイオミネラリゼーション(生物無機物化)概念を導入した環境融合プロセスにより,微細構造制御した酸化物系結晶薄膜の作製に注力した。はじめに,超はっ水/超親水デザインテンプレートの作製には,光触媒単結晶被覆法,CVD法および光リソグラフィー法を組み合わせた多段階プロセスを応用した。フラックス育成した光触媒ナノ結晶をコーティングすることで微細凹凸形状を形成した。その微細凹凸表面にさまざまな疎水性官能基を導入することで超はっ水表面の形成に成功した。その後,比較的低エネルギーの光照射により,超はっ水表面の疎水性官能基を光分解でき,超親水表面に改質できる技術を確立した。次に,超音波噴霧熱分解法を応用し,上記超はっ水/超親水パターン化表面にマイクロミストを噴霧し,加熱することで,酸化タングステン(WO_3)系結晶薄膜の形成に成功した。ミスト着弾などの成膜条件を制御することで,リング状結晶積層構造を作製できた。この光触媒(タンタル酸塩系結晶)/WO_3系結晶薄膜複合層は,近紫外光照射によりクロミック特性を示すことが確認された。最後に,次年度の立体配置制御した複酸化物結晶育成のための事前研究を実施し,きわめてユニークな形状をもつリン酸カルシウム球晶のゲル育成に成功した。この球晶はフレキシブルな超ロングウィスカーが複雑に絡み合った多孔質形状であり,ゲル育成条件により球晶形状を制御できることもわかった。次年度,この球晶の立体配置制御に関する研究に着手する。本年度の研究では,環境融合プロセスを用いて以下に記載する3項目の結晶育成に注力した。1.はじめに,ポリスチレン(PS)二次元コロイド結晶をテンプレートにした超音波噴霧熱分解法により,規則的なハニカム構造をもつタングステン酸ナトリウム(Na_2W_4O_<13>)結晶薄膜を作製することに成功した。PS二次元コロイド結晶テンプレートの作製には,超親水化したガラス表面を利用した。また,噴霧条件(特に出発原料種や加熱温度など)を制御することで,ハニカム構造を構成するタングステン酸ナトリウムをアモルファスから結晶面の発達した結晶まで変化させ,超多孔体構造を形成できた。タングステン酸ナトリウムは,紫外光照射下で光触媒特性を示すことが知られている。本研究で超多孔質化した結晶薄膜は,平坦な薄膜に比べ,その特性が向上することがわかった。2.つぎに,前年度確立した超はっ水/超親水デザインテンプレートを利用して,ゼラチンや寒天ゲルのライン&スペースを作製し,さまざまなリン酸塩結晶をゲルマトリックス中で育成した。特に,ゲルの内部にリン酸イオンを閉じ込め,外部からカルシウムイオンを供給することで,規則的なライン&スペースの水酸アパタイト結晶を育成できた。この水酸アパタイト結晶からなるラインは,無数のnmオーダーの針状結晶からなり,個々の針状結晶は自形が発達していた。育成期間や出発原料濃度などの育成条件により,ラインを形成するアパタイト結晶の形状やサイズ,あるいは充填率を制御できた。その他に,アップコンバージョン発光するYbPO_4 : Er結晶なども育成できた。3.さらに,上記2の水酸アパタイト結晶をポリマー基板上に育成した。その結果,高品質な水酸アパタイト結晶をポリマー上に育成でき,酸性や塩基性タンパク質であるアルブミンやリゾチームに対して,特異な吸着挙動を示すことがわかった。その結果,本研究のアパタイト結晶基板をバイオ応用できる可能性を見出した。
無機・有機複合自己組織型量子井戸物質の超高速非線形光学応答に関する研究

1.基礎物性に対するサイズ効果上記4種類の結晶について磁気光吸収測定をおこない,励起子のボーア半径・束縛エネルギーとバンドギャップを決定した。バンドギャップと束縛エネルギーは井戸層厚が小さくなるに従い急激に増大し,ボーア半径は逆に急激に減少する。この変化は第0近似では有効質量近似に基づく量子閉じ込め効果として理解できるが,井戸層が薄い場合には分子励起的な出発点に立ったモデルも有効となるように思われる。また,誘電率閉じ込め効果などの新しいメカニズムも働いている可能性がある。2.励起子共鳴超高速非線形分光3.2光子共鳴分光スペクトル分解四光波混合測定の結果から2励起子状態が弱く結合した2励起子状態と安定な励起子分子とからなっていることを示唆された。また,2光子共鳴ハイパーラマン信号が初めて観測された。今後,詳細な測定をおこない,2光子共鳴順位の解明につなげたいと考えている。本年度は(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4について縮退四光波混合測定を中心に研究をおこなった。いずれも測定試料は多結晶配向性薄膜、光源としてTi:サファイアレーザベースのOPA(パルス幅200fs)を用いた。測定温度は8Kである。1)励起子共鳴領域での縮退四光波混合最低励起子に共鳴するエネルギー領域で縮退四光波混合測定をおこない,(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4のX(^3)(-ω;ω,-ω,ω)の値を初めて測定した。X(^3)スペクトルは励起子とそのサイドバンドの吸収構造に対応した共鳴構造を示し、最低励起子共鳴点において1.6×10^<-6>esuにも達する。2)緩和時間測定縮退四光波混合測定によって得られた時間積分信号の形状から決定した励起子の横緩和時間はT_2=0.2psであった。また、トランジェントグレーティング法による測定によって縦緩和時間T^1=7psであることがわかった。上記1)とあわせて、この系の励起子が高速でかつ巨大な非線形光学応答を示すことを初めて示すことができた。3)四光波混合過程に対する2励起子状態の寄与励起光のピークエネルギーを最低励起子共鳴より低エネルギー側に設定し、励起子と励起子分子を同時に励起できるようにして四光波混合信号のスペクトル分解をおこなった。励起子分子-励起子遷移によるM発光のエネルギーに現れる信号に加えて、それより高エネルギー側の領域にブロードな信号が観測された。このことは、2励起子状態が弱く結合した2励起子状態と安定な励起子分子とからなっていることを示唆しているものと考えられる。今後,よりスペクトル幅の狭い光源を用いてこのエネルギー構造について調べていく予定である.昨年度の(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4(井戸層がPbI_6八面体1層からなる)の非線形分光の結果と比較をおこなうために,(C_6H_<13>NH_3)_2(CH_3NH_3)Pb_2I_7(井戸層がPbI_6八面体2層),(C_6H_<13>NH_3)_2(CH_3NH_3)_2Pb_3I_<10>(井戸層がPbI_6八面体3層),(CH_3NH_3)PbI_3(井戸層が無限大層)の各ペロブスカイト型結晶について線形・非線形分光をおこなった。(C_6H_<13>NH_3)_2(CH_3NH_3)Pb_2I_7について四光波混合測定をおこなった。x^<(3)>(-ω;ω,-ω,ω)の値は(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4と比べると一桁近く小さく,T_2はほぼ同じであった。

励起子分子については(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4とよく似ているものの弱く結合した2励起子状態ははるかにシャープであった。(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4の2光子吸収測定をおこなった。2励起子状態がかなりブロードであることを示唆する結果が得られ,前年度の四光波混合測定の結果と符合した。また,2光子共鳴ハイパーラマン信号が初めて観測された。今後,詳細な測定をおこない,2光子共鳴順位の解明につなげたいと考えている。
脳障害時におけるミクログリアおよびアストロサイトの機能変化の解析

アルツハイマー病は、著しい痴呆を伴う神経変性疾患である。昨年度は、免疫細胞の活性化および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)誘導に重要な役割を果たしている転写因子NF-kBびSTAT1はアルツハイマー病脳で有意に増加していることを明らかにした。本年度は、プログラム細胞死の調節蛋白質の変動を検討した。アルツハイマー病脳では対照群と比較して、細胞死を促進するBakおよびBad蛋白質量が増加していた。また細胞死を抑制するBcl-2およびBcl-x蛋白質量も増加していた。アルツハイマー病など脳障害時には著しい酸化ストレスが発生することが知られている。アルツハイマー病脳では細胞死を回避するため代償的にBcl-2およびBcl-xの発現量が高まることが推定された。脳障害時に異常に活性化したグリア細胞はiNOSを発現し、細胞死を引き起こすNOを大量に産生し、神経細胞死を引き起こす。しかしながら、グリア細胞はほとんど死に至らない。私は、強力な生体内抗酸化物質ビリベルジンを産生するヘムオキシゲナーゼに着目し、解析した。invitro培養グリア細胞およびinvivoラット海馬に細菌内毒素LPSおよびインターフェロンγ処置するとiNOS発現・NO産生が起こるが、その後、誘導型ヘムオキシゲナーゼ(HO-1)が発現されることが明かとなった。また、ラット海馬はカイニン酸処置によりCA3の神経細胞死が引き起こされるが、この時もグリア細胞は細胞死を引き起こすことなく、逆に細胞増殖し(グリオーシス)、HO-1を過剰に発現した。一方、神経細胞にはHO-1の発現は認められなかった。以上のことから脳障害時に、ミクログリアおよびアストロサイトなどグリア細胞はHO-1を発現するため酸化ストレスに対して耐性を獲得し、細胞死を回避することが推定された。この剖検脳では著しい神経細胞死が認められるが、この時脳の免疫機能を有するミクログリアおよびアストロサイトなどのグリア細胞がどのように機能変化しているかは明らかにされていない。免疫細胞の活性化および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)誘導に重要な役割を果たしている転写因子NF-κBおよびSTAT1はアルツハイマー病脳で有意に増加していた。しかし、私達が調べた6例のアルツハイマー病のうち、iNOS蛋白質の発現を認めたのは1例のみであった。他の5例のアルツハイマー病脳および対照群の6例の脳においては検出できなかった。一方、重度の痴呆を伴う後天性免疫不全症候群(エイズ)の脳ではiNOSの発現誘導が引き起こされると報告されている。これは、エイズ脳症ほど激しい炎症反応(グリア細胞の活性化)が起きないことを示唆している。最近、家族性アルツハイマー病に原因遺伝子として同定されたpresenillin-1(PS-1)遺伝子のプロモーター領域にSTAT1結合ドメイン配列が多数存在することが明らかとなり、アルツハイマー病脳におけるSTAT1の増加はPS-1の発現調節に関与している可能性が示唆される。一方、これまでグリア細胞は神経細胞に比べ細胞死に陥りにくいと考えられてきた。しかしながら、細胞周期の調節、DNAの修復および細胞死を調節しることが知られるp53蛋白質がアルツハイマー病脳においてグリア細胞で著しく発現していることが明らかとなった。これらのことを踏まえ、現在ミクログリアおよびアストロサイトが脳障害時になぜ神経細胞よりも障害耐性を示すのか、また酸化ストレスによるグリア細胞死の機構について詳細に解析中である。
レンサ球菌に対するオプソニン効果を有する免疫グロブリン融合タンパクの開発

マウス脾細胞cDNAライブラリーよりPCR法を用いてマウスCD44遺伝子およびIgG1 Fcフラグメントをコードする遺伝子を増幅した.ヒトフィブロネクチンタイプIリピート部分をコードする遺伝子断片は、ヒト末梢血cDNAライブラリーより同様に増幅した.増幅した遺伝子断片は、塩基配列を確認した後に、IK分泌シグナルをN末端に付加することができるベクターpSecTagにクローニングし、CD44-Fc融合タンパクを哺乳細胞内で発現するベクターpSecTag-CD44FcおよびpSecTag-FibFcを作製した.これらのベクターをハムスター由来のCOS細胞に遺伝子導入を行い、培養上清2LからプロテインAアフィニティーカラムを用いて、組換えタンパクを精製した.得られた融合タンパクの収量はCD44-Fcで約600ugFib-Fcで約2mgであった.そこで、まず最初にこれらを用いて、A群レンサ球菌の上皮細胞に対する付着・侵入の阻害効果について検討を加えた.A群レンサ球菌の莢膜に対するレセプターであるCD44の融合タンパクでは、A群レンサ球菌の上皮細胞への付着・侵入に対してはほとんど効果が認められなかった.しかし、フィブロネクチンのタイプIリピートを組み込んだFib-Fcでは野生株の細胞への付着・侵入を約40%、莢膜欠失株では約80%阻害することが明らかとなった.そこで、Fib-Fcを用いてさらにヒト末梢血の多型核白血球のA群レンサ球菌に対する貪食能を検討したところ、Fib-Fcを添加した場合、コントロールに加えたマウスのIgG1と比較して貪食が約2倍に増加した.これらの結果は、A群レンサ球菌の細胞表面に存在するF1,Sfb1,SfbII,Fbp54,Fbaなどのフィブロネクチン結合タンパクは菌の細胞への付着・侵入に最も重要な役割を果たしており、これらの結合を阻害することにより効果的に菌の付着・侵入を阻害できることが明らかとされた.さらに、Fcとの融合タンパクによりオプソニン作用も増強されることが明らかとなった。マウス脾細胞cDNAライブラリーよりPCR法を用いてマウスCD44遺伝子およびIgG1 Fcフラグメントをコードする遺伝子を増幅した.ヒトフィブロネクチンタイプIリピート部分をコードする遺伝子断片は、ヒト末梢血cDNAライブラリーより同様に増幅した.増幅した遺伝子断片は、塩基配列を確認した後に、IK分泌シグナルをN末端に付加することができるベクターpSecTagにクローニングし、CD44-Fc融合タンパクを哺乳細胞内で発現するベクターpSecTag-CD44FcおよびpSecTag-FibFcを作製した.これらのベクターをハムスター由来のCOS細胞に遺伝子導入を行い、培養上清2LからプロテインAアフィニティーカラムを用いて、組換えタンパクを精製した.得られた融合タンパクの収量はCD44-Fcで約600ug、Fib-Fcで約2mgであった.そこで、まず最初にこれらを用いて、A群レンサ球菌の上皮細胞に対する付着・侵入の阻害効果について検討を加えた.A群レンサ球菌の莢膜に対するレセプターであるCD44の融合タンパクでは、A群レンサ球菌の上皮細胞への付着・侵入に対してはほとんど効果が認められなかった.しかし、フィブロネクチンのタイプIリピートを組み込んだFib-Fcでは野生株の細胞への付着・侵入を約40%、莢膜欠失株では約80%阻害することが明らかとなった.そこで、Fib-Fcを用いてさらにヒト末梢血の多型核白血球のA群レンサ球菌に対する貪食能を検討したところ、Fib-Fcを添加した場合、コントロールに加えたマウスのIgG1と比較して貪食が約2倍に増加した.これらの結果は、A群レンサ球菌の細胞表面に存在するF1,Sfb1,SfbII,Fbp54,Fbaなどのフィブロネクチン結合タンパクは菌の細胞への付着・侵入に最も重要な役割を果たしており、これらの結合を阻害することにより効果的に菌の付着・侵入を阻害できることが明らかとされた.さらに、Fcとの融合タンパクによりオプソニン作用も増強されることが明らかとなった.マウス脾細胞cDNAライブラリーよりPCR法を用いてマウスCD44遺伝子およびIgG1 Fcフラグメントをコードする遺伝子を増幅した.ヒトフィブロネクチンタイプIリピート部分をコードする遺伝子断片は、ヒト末梢血cDNAライブラリーより同様に増幅した.増幅した遺伝子断片は、塩基配列を確認した後に、IK分泌シグナルをN末端に付加することができるベクターpSecTagにクローニングし、CD44-Fc融合タンパクを哺乳細胞内で発現するベクターpSecTag-CD44FcおよびpSecTag-FibFcを作製した.これらのベクターをハムスター由来のCOS細胞に遺伝子導入を行い、培養上清2LからプロテインAアフィニティーカラムを用いて、組換えタンパクを精製した.得られた融合タンパクの収量はCD44-Fcで約600ugFib-Fcで約2mgであった.そこで、まず最初にこれらを用いて、A群レンサ球菌の上皮細胞に対する付着・侵入の阻害効果について検討を加えた.A群レンサ球菌の莢膜に対するレセプターであるCD44の融合タンパクでは、A群レンサ球菌の上皮細胞への付着・侵入に対してはほとんど効果が認められなかった.しかし、フィブロネクチンのタイプIリピートを組み込んだFib-Fcでは野生株の細胞への付着・侵入を約40%、莢膜欠失株では約80%阻害することが明らかとなった.

そこで、Fib-Fcを用いてさらにヒト末梢血の多型核白血球のA群レンサ球菌に対する貪食能を検討したところ、Fib-Fcを添加した場合、コントロールに加えたマウスのIgG1と比較して貪食が約2倍に増加した.これらの結果は、A群レンサ球菌の細胞表面に存在するF1,Sfb1,SfbII,Fbp54,Fbaなどのフィブロネクチン結合タンパクは菌の細胞への付着・侵入に最も重要な役割を果たしており、これらの結合を阻害することにより効果的に菌の付着・侵入を阻害できることが明らかとされた.さらに、Fcとの融合タンパクによりオプソニン作用も増強されることが明らかとなった。
精神分裂病のドパミン受容体・代謝関連酵素の遺伝子領域における連鎖不均衡伝達テスト

血液サンプルからのDNAの抽出は標準的な方法で行い、その一部を用いて遺伝的多型の検出を行う条件設定を行った。ドパミン受容体(DRD15)とドパミン代謝に関連した酵素(Tyrosine Hydroxylase, DOPA-decarboxylase, Dopamine Beta-Hydroxylase, Monoamine Oxydase A and B, cathechol-O-methyltransferase)の遺伝子領域について、ブロモーター領域と翻訳領域に存在する既知の遺伝的多型を2ないし3つずつ選び、それそれの遺伝的多型の検出が行えるようにPCR条件の設定や制限酵素での切断の条件などを確立した。来年度以降はさらにサンプル数を増やし、genotypingを行って、統計学的な処理をしていく予定である。
表面断熱とアクティブ冷却による工作機械の熱変形制御

“表面断熱とアクティブ冷却による工作機械の熱変形制御"について平成元年度、平成2年度にわたり研究を行った結果、種々の有用な結果が得られた。(1)工作機械の表面を断熱したときの周囲の温度変化の影響について調べて結果,1)工作機械の表面を断熱材で覆った場合,断熱材の厚さを300mm以上としないと1日以上の周期を持つ温度変動の影響を除去することができない。2)工作機械表面を断熱材で2重に覆い,断熱材と断熱材の間に温度20°Cの空気を流すことにより工作機械構造は周囲温度の影響を受けず,一定温度に保たれることが明かとなった。なお,断熱材と空気流路を合わせた厚さは約20mmである。また,空気流速は12m/s程度で十分であった。(2)アクティブ冷却素子の性能に付いて,実機の主軸部の大きさのモデルを使ってシミュレ-ションを行った結果,軸受の発熱量に応じて温度をコントロ-ルした冷却水を熱源近傍に流すことによって工作機械主軸部の熱変形を制御できることが明かとなった。さらに,軸受の総発熱量に対する内輪側,外輪側の発熱量割合をある程度明らかにできたので,軸受の内輪側,外輪側を各々の発熱量に応じてアクティブ冷却できることが明かとなった。(3)熱源の位置の探査に関して検討を行った結果,工作機械構造の任意の5ヶ所の温度振幅や位相を測定することによって,熱源の位置と熱源での発熱量を計算により求めることができることが明かとなった。(4)内部及び外部熱源の発熱量が変動した際の冷却性能及び断熱性能に付いて調べた結果,本方法は内部及び外部熱源の発熱量の変動に十分対応できることが明かとなった。以上の結果から,本研究で提案した“表面断熱とアクティブ冷却"により工作機械の熱変形を十分に制御できることが明かとなった。“表面断熱とアクティブ冷却による工作機械の熱変形制御"について本年度は以下のような研究を行い、種々の有用な結果が得られた。(1)工作機械主軸部にある内部熱源の周囲をアクティブに冷却したときの温度変化や熱変形量について数値計算を行い理論的に検討した。その結果、内部熱源の発熱量に応じて温度をコントロ-ルした冷却水を熱源近傍に流すことにより、工作機械主軸部の平均温度を一定に保つことができることが明らかとなった。さらに、その変形挙動について調べた結果、熱源部分で半径方向に僅かに縮むが、それ以外のところではほとんど変形しないことが明らかとなった。(2)工作機械の表面を断熱したときの周囲の温度変化の影響について、モデル実験と数値計算により検討した。その結果、以下のことが明らかとなった。(1)工作機械表面を断熱材で覆った場合、1日以上の長周期の温度変動の影響は断熱材の厚さを300mm以上にしないと除去することができない。(2)工作機械を断熱材で2重に覆い、断熱材と断熱材の隙間に周囲温度の変動に応じて温度をコントロ-ルした空気を流すことによって、工作機械構造は周囲温度の影響を受けず、一定温度に保たれる。なお、断熱材と流路を合わせた厚さは、本研究では2030mm程度である。(3)温度コントロ-ルされた空気の流速は遅くても十分である。(4)断熱材の隙間に流す空気を循環式にした場合、温度をコントロ-ルするために必要なエネルギ-は非常に小さい。以上のように、本年度行った研究の結果、アクティブ冷却により工作機械を常に一定温度に保てることが明らかとなった。

"表面断熱とアクティブ冷却による工作機械の熱変形制御"について本年度は以下のような研究を行った結果,種々の有用な結果が得られた.(1)工作機械の熱源の位置の探査に関して検討を行った結果,工作機械構造の任意の5ヶ所の温度振幅や位相を測定することによって,熱源の位置と熱源での発熱量を計算により求めることができる.なお,本方法では熱源の位置を幾何学的に求めるため,各温度測定点は同一の構造物内にある方がよい.具体的には,各温度測定点は,主軸頭,コラム,ベッドなどに分散していない方がよい.(2)アクティブ冷却素子の性能に付いて,実機の主軸部の大きさのモデルを使ってシミュレ-ションを行った結果,軸受の発熱量に応じて温度をコントロ-ルした冷却水を熱源近傍に流すことによって工作機械主軸部の熱変形を制御できることが明かとなった.さらに,軸受の総発熱量に対する内輪側,外輪側の発熱量割合をある程度明らかにできたので,軸受の内輪側,外輪側を各々の発熱量に応じてアクティブ冷却できることが明かとなった.(3)内部及び外部熱源の発熱量が変動した際の冷却性能及び断熱性能に付いて調べた結果,本方法は内部及び外部熱源の発熱量の変動に十分対応できることが明かとなった.以上の結果から,本研究で提案した"表面断熱とアクティブ冷却"により工作機械の熱変形を十分に制御できることが明かとなった.
造血器悪性腫瘍に対する新たな免疫遺伝子療法の開発

新たな造血器腫瘍関連抗原の同定と、それらを標的とした細胞免疫療法の開発を目的に研究を行ない、下記の結果を得た。1)HLA-A24拘束性白血病特異的CTLを誘導する新たなWT1由来ペプチドを同定した。また、WT1特異的CTLは白血病に限らず、肺がん細胞に対しても強い細胞傷害性を示すことを明らかにした。肺がん細胞株移植ヌードマウスに、WT1特異的CTLクローンを静脈内移入したところ腫瘍細胞増殖の抑制が認められ、生存期間の明らかな延長が得られた。2)骨髄腫細胞もWT1特異的CTLによる細胞傷害性に強い感受性を有することを示した。3)BCR-ABL特異的CD4陽性T細胞クローンは、K562細胞添加樹状細胞に対してIFN-γ産生を示した。この反応は、拘束HLA-DR分子を共有する樹状細胞においてのみ認められ、抗HLA-DR抗体添加によって阻止された。他方、DEK-CAN特異的CD4陽性T細胞クローンは、FKH-1細胞添加樹状細胞に対してのみHLA-DR拘束性にIFN-γ産生を示した。また、CD4陽性T細胞は、ネクローシスおよびアポトーシス白血病細胞添加樹状細胞に対してほぼ同程度の反応性を示した。4)Fas欠損家系ならびにperforin欠損家系由来細胞を用いてCTLの細胞傷害機構を解析した。その結果、ヒトCTLにおいては、CD8+CTLに加えてCD4+CTLも主要な細胞傷害経路は、perforin/granzyme経路であることが判明した。高度悪性群リンパ腫に高発現する遺伝子をdifferential display法によって検索したところ、Aurora-2遺伝子がクローニングできた。Aurora-2は、正常組織においては精巣に強い発現が認められるのみであったが、腫瘍組織においては造血器腫瘍をはじめ種々の悪性腫瘍に高頻度に発現が認められた。白血病特異的CD8陽性CTLをHVSで不死化し、単純ヘルペスウイルスTK遺伝子を導入した。その結果、HVS不死化CTLは特異的細胞傷害性を維持したままIL-2依存性に増殖を続けた。さらに、これらのCTLクローンはガンシクロビル添加によって短期間にほとんど全て死滅することが確認された。白血病や悪性リンパ腫などの造血器悪性腫瘍に対する免疫遺伝子治療の開発の目的で研究を遂行し、以下の結果が得られた。1)転写因子であるWT1はほとんどの白血病細胞で高発現されているが正常細胞にはほとんど発現されていないことから、WT1は白血病免疫療法の理想的標的抗原と考えられた。そこでWT1由来ペプチドを作製し、WT1特異的HLA-A24拘束性CD8陽性細胞傷害性T細胞(CTL)クローンを樹立した。このCTLクローンは白血病細胞に対してHLA-A24拘束性に細胞傷害性を示すことが示された。2)同様に、hTERTが広く悪性腫瘍細胞に高発現していることから、HLA-A24アンカーモチーフを有するhTERTペプチド特異的CTLクローンを樹立し、造血器悪性腫瘍細胞に対する細胞傷害性を検討した。その結果、hTERT特異的CTLは白血病細胞をHLA-A24拘束性に傷害することが明らかとなった。3)WT1特異的ならびにhTERT

特異的CTLクローンにHerpesvirus saimiri(HVS)を接種し、HVSによってこれらのT細胞クローンを不死化させた。不死化CTLは、本来の機能を維持したまま長期間の培養が可能であった。以上の結果は、造血器悪性腫瘍の新たな免疫遺伝子治療の開発につながるものと考えられ、さらに検討を進めている。本研究では、細胞傷害性T細胞(CTL)に認識される新たなヒト白血病特異抗原の同定と白血病特異的CTLをHerpesvirus saimiri(HVS)感染によって不死化させ、自殺遺伝子導入によって安全性を獲得した免疫遺伝子療法の開発の目的で研究を行ない、下記の結果を得た。1.WT1およびhTERTのアミノ酸配列よりHLA-A*2402のアンカーモチーフを有する9 merペプチドを合成し、これらのペプチドをパルスした樹状細胞(DC)で自己CD8陽性T細胞を繰り返し刺激した。その結果、WT1ペプチドのうちWT1-T2 (CMTWNQMNL)およびWT1-T4 (RWPSCQKKF)、hTERTペプチドのうちTEL324 (VYAETKHFL)およびTEL461 (VYGFVRACL)に特異的なCTLクローンを樹立した。2.これらのCTLクローンの白血病細胞株および新鮮分離白血病細胞に対する細胞傷害性を検討したところ、HLA-A24陽性細胞株に対してのみ細胞傷害性を示し、この細胞傷害性は抗HLAクラスI抗体で阻止された。3.WT1高発現細胞株をWT1遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチドによって処理し、WT1蛋白発現を選択的に抑制したところ、WT1ペプチド特異的CTLの細胞傷害性の低下を認めた。4.これらCTLの正常骨髄細胞増殖への影響をコロニー形成試験で検討したところ、HLA-A24の有無に関わらず全く影響を示さなかった。5.WT1およびhTERT特異的CTLをHVSによって不死化させ、長期間培養を継続したが、ペプチド特異的細胞傷害性は保たれており、白血病細胞に対する細胞傷害性も保持された。さらに、HSV-1 tk遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターによって遺伝子導入した。tk遺伝子導入細胞は、ガンシクロビル添加によって死滅することが確認された。新たな造血器腫瘍関連抗原の同定と、それらを標的とした細胞免疫療法の開発を目的に研究を行ない、下記の結果を得た。1)HLA-A24拘束性白血病特異的CTLを誘導する新たなWT1由来ペプチドを同定した。また、WT1特異的CTLは白血病に限らず、肺がん細胞に対しても強い細胞傷害性を示すことを明らかにした。肺がん細胞株移植ヌードマウスに、WT1特異的CTLクローンを静脈内移入したところ腫瘍細胞増殖の抑制が認められ、生存期間の明らかな延長が得られた。2)骨髄腫細胞もWT1特異的CTLによる細胞傷害性に強い感受性を有することを示した。3)BCR-ABL特異的CD4陽性
教科と連環した新しいアクティブラーニング型環境教育の確立と教育効果測定指標の開発

4年計画の1年目は、サブテーマ「教科と連環したアクティブラーニング型・環境教育モデルの確立」を中心に研究を進めた。小学校の理科、社会科、家庭科、生活科、道徳の学習指導要領を対象に、テキストマイニング分析を行い、まず、「食と環境」に関する話題に着目し、各教科に離散した知識体系を束ねる“知のハブ"を形成できるよう、カテゴリ分類器を設計した。国が主導する第3次食育推進基本計画と対応させるように留意し、「食料の生産」、「加工・流通・販売」、「消費・調理」、「廃棄・再資源化」、「健康」、「地域とのつながり」、「生涯にわたる食の営み」、「文化」の各カテゴリにコーディングし、各教科・各単元の内容を分析した。その結果、家庭科では「加工・流通・販売」、「消費・調理」、「文化」等のカテゴリ、社会科では「食料の生産」、「廃棄・再資源化」等のカテゴリ、理科では「食料の生産」、「健康」等のカテゴリ、生活科では「地域とのつながり」のカテゴリ、道徳では「生涯にわたる食の営み」のカテゴリに該当する内容が離散していることがわかり、それらを連環させた教育モデルを可視化することができた。また、当初計画では34年目に取り組む予定にしていたサブテーマ「アクティブラーニングにおける教育効果測定指標の開発」について、学習者の発話を対象としたテキストマイニング分析の試行実験を行った。発話記録の形態素分析を元に語の出現頻度を求め、語彙の多様性を評価に加えるため、シャノンの情報量理論を適用してエントロピーを計算した。この方法論によって、学習者の発話から学習効果を量的に測定することができるか、予備的な検討を加えた。研究計画に従い、まずは小学校の学習指導要領のテキストマイニング分析からはじめ、概ね仮説どおりにクロスカリキュラムを組むことができることを確認した。また、当初計画では34年目に取り組む予定にしていたサブテーマについても予備的な検討をはじめ、方法論の妥当性を検証した。4年計画の2年目は、サブテーマ「教科と連環したアクティブラーニング型・環境教育モデルの確立」の目標年である。テキストマイニング分析によるコーディングの方法論は概ね確立できたので、分析対象を中学校の学習指導要領に拡大しながら、クロスカリキュラムの構築を進める予定である。また、3年目に向けて学習者の発話を対象とした感性分析について予備的な検討を開始したい。分担研究者との打ち合わせの回数が予定よりも少なくなったため、旅費の執行額が予定額よりも小さくなったことによる。翌年度の物品費に加えて執行したい。
半正定値計画問題に対する高速数値計算手法に関する基礎研究

本研究の目的『主双対内点法を半正定値計画問題を解く実用的な数値解法として発展させる』に沿って以下の研究を行った.1.研究代表者の小島等のグループが提案した線形計画問題の高速解法を半正定値計画問題に拡張し,その実験用ソフトウエアをMathematicaを用いて試作し,Power Machintosh状で改良のための数値実験を行った.2.上記1で試作したソフトウエアを改良し,C++言語で書き直し,3種類のワークステイションSPARC Station,Silicon Graphis,SONY RISCNEWSに実装した.この際,大規模な半正定値計画問題を計算効率よく高速に解くため,過疎なデータ構造を扱えるような工夫を組み込んだ.このソフトウエアは誰でも使えるように公開している.3.上記2のソフトウエアを組み合わせ最適化問題(グラフ分割問題,2次割り当て問題,最大クリーク問題等)や非凸2次計画問題から生ずるさまざまな半正定値計画問題に適用し,計算実験を続けている.4.これまでの実験を等して,提案した方法は局所的な収束性に難があることが判明した.これを改良するために2つの方法(a)予測子修正子法の組み込み(b)新しい探索方向を提案し,その理論的な基礎作りをした。