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中世東国武家文書の成立と伝来に関する史料学的研究-陸奥白河結城家文書を中心に-

「白河結城家文書」は、中世、東北と関東のつなぎ目にある白河の地を押さえ、京都や鎌倉を含む各地の勢力から重要視されていた白河結城家が伝えた古文書で、800通を超える数をもつ東国有数の武家文書である。しかし、戦国から近代にかけて同家を見舞った厳しい歴史のなかで、文書は東日本の各地に分散したため、現在の研究水準のもとで全体を見わたした史料学的研究が必要と考えた。「白河結城家文書」の原本につき、所蔵者の意向で調査が許されなかった1か所(須賀川市)を除くすべての所蔵先で調査を実施し、原本の詳細な観察調査と1点ごとの調書作成、デジタルカメラによる数種類の写真撮影(全体、部分、顕微鏡など)を実施した。調査地は、白河・東京・川崎・仙台・多賀城・津・蒲郡・秋田・大館・福井の各地に及んだ。そのほかに、古文書の材料となる「紙」についての知見を深めるべく、高知県立紙産業技術センター(高知県いの町)へ研究出張に赴いた。原本調査を踏まえた研究の成果を、随時総括するために、1年目に2回、2年目に1回、3年目に2回の研究会を、東京大学史料編纂所または調査先の各地で開いた。また、平成18年11月に、白河市で、地元市民をおもな対象として、シンポジウムと現地史跡見学会で構成される「白河結城文書サミット」を開催し、研究成果の社会還元をはかった。以上の機会に本研究メンバーが発表した研究成果は、「研究成果報告書」に13編の論文として結実した。これは今年度に一般書籍として刊行する予定である。採集した厖大な画像・文字データを整理統合して、データベース「白河結城文書総合目録」を作成し、全データを収録したDVDを作成した。その一部のデータを抽出したものを、研究成果報告書に付録として掲載した。このデータベースを踏まえて、今年度に史料集「白河結城文書集成」を出版助成を得て刊行すべく、現在編集作業を進めている。今年度は、まず二〇〇四年六月に参加者の顔合わせを兼ねて全体会議をおこない、研究の初期設定として調査手順や調書様式、また初年度の調査先を確定した。さらに今後の調査の参考とするため、白河結城文書の歴史・概要、及び各所蔵機関における文書の内訳とその伝来について、研究分担者が解説をおこなった。これらの議題での決定事項を踏まえ、研究の基本方針として、原本の紙質・重量・厚みなど料紙のデータを丹念に採取するとともに、各文書群の成立・伝来を解明する手がかりとなる付箋・貼紙・包紙に見られる記載に注目していくことを確認した。八月には早稲田大学と東京国立博物館において調査をおこなった。この二カ所でともに文書の写真撮影と調書作成をおこなうと同時に、全体会議で検討した調査方法を試行した。九月には高知県立紙産業技術センターへ赴き、紙漉技法を用いた和紙の製造工程や、顕微鏡観察で確かめられる原料の特徴など、料紙そのものに関する知識を深めた。十一月には、現在最多の文書を所蔵する機関である福島県白河市の白河集古苑において調査をおこない、さらに白河結城氏の本拠地でもあることから、同氏関連遺跡のフィールドワークも実施した。二〇〇五年三月には国学院大学において調査をおこない、最終日には今年度調査を総括するとともに、来年度調査の日程を決定した。さらに白河集古苑所蔵文書調査のなかで得られた知見をもとに、付箋・貼紙・包紙にみられる記載パターンを分類し、後世の度重なる文書整理作業のどの段階に付されたものであるか見通しをたてた。

また今年度を含め、蓄積されつつある調書内容を将来データベース化するにあたって、その様式について意見を取り交わし、雛型を作成した。白河結城家文書の分散先の調査として、本年度は、熱海孝治氏所蔵文書(6月)、東北大学・東北歴史博物館(8月)、結城神社(11月)、竹本泰一氏所蔵文書(3月)といった大部の所蔵先を始め、仙台市立博物館所蔵文書(8月)、阿保文書(11月)、大館市立中央図書館所蔵文書(12月)など比較的少規模な文書群に至るまで、写真撮影・紙質調査・調書記入など所期のデータ採取を行った。また、前年度の調査の内、採取データに不足のあった早稲田大学中央図書館・東京国立博物館について、4月に再調査を実施した。以上によって、計画発足当初に予定した調査対象は、一、二の例外を除いてほぼ網羅することができた。またお茶の水図書館成簣堂文庫文書において未紹介の文書数点を確認するとともに、秋田県立公文書館で秋田藩修史事業時の家伝文書目録および藩内各家の文書伝来を示す由緒類を閲覧したことで、白河結城家旧蔵文書の分散・伝来経緯に関する情報をさらに増補することができた。研究会は、3月の竹本氏所蔵文書調査終了後、愛知大学において、若手メンバー5名から報告を得て実施した。なお、これらの調査で蓄積されたデータについては、来年度公開予定の関連文書総目録・データベースへの移行を視野に入れて、表計算ソフト上での統合とデジタル化を逐次進めている。データベースの形態については、各調査の前後に開いた研究会のなかで、調査成果の整理と併せて具体的議論を重ねている。また、最終年度の研究成果報告を白河市民対象に行う「白河結城文書サミット」の実現に向けて、白河市(市長・教育長)との協議を行い、最大限の協力をいただけることになった。本年度は、研究内容の発表・公開という目標を見据え、前年度までの調査内容の点検、および関連文書所蔵先のうち未調査分に対する調査を行なった。まず8月に藤島神社(福井県福井市)にて文書1点の補充調査、翌9月には、白河集古苑への寄託が予定されている白河結城家文書近世分の調査をおこなった。さらに12月には秋田県公文書館において、秋田藩採集文書について改めて調査し、那須氏や石川蒲田氏らの家に伝わった文書群が、白河結城文書の中に組み込まれていく様相について分析をおこなった。以上の調査結果を踏まえることで、関連文書の伝来過程について近世段階をも視野に入れた分析を加えることが以前にも増して可能となったといえる。なおこれらの調査と並行して、3年度にわたる研究成果を市民に向けて広く公開し、地元の持つ歴史に対する興味関心を喚起する目的で、11月11日・12日両日に「白河結城文書サミット」を白河市内で開催した。特に初日のシンポジウムでは、白河結城氏とその庶家小峰氏とが当地域さらに東国の中で展開した政治史や、モノとしてみた古文書の魅力、また地元に残された史跡に対する考古学的アプローチなど、計6本の報告をおこない、250名もの参加者を得ることができた。その後は調査成果の整理に取り組み、その結果、13本の論考と文書目録、関係文献目録からなる成果報告書500部を年度末に刊行した。また調査を通じて入手した各文書の書誌データや画像のうち、掲載許可が得られたものを素材として「白河結城氏文書データベース・暫定版」を構築し、中世史研究者や各学術機関、そして白河市に頒布(100部)した。
酸素欠乏による中枢ニュ-ロンの機能的変化に関する電気生理学的研究

昭和63年度概要1).モルモット又はラット脳スライス標本の海馬CAI錐体細胞は酸素あるいは糖欠乏に対して極めて抗抵性が高く、膜電位も一旦過分極した後、緩徐な脱分極に移行したのみであった。過分極電位は膜電位非依存性Kチャネルの活性化によって、脱分極電位は細胞外K蓄積により生じることが判明した。2).同上標本も酸素・糖欠乏状態にすると、海馬錐体細胞は一旦過分極した後、急峻な脱分極に移行し、6分後には膜電位が消失して細胞死を来たした。この膜電位変化は脳虚血のin vivo実験によるCD電位変化と経時的によく一致することから、本標本は脳虚血のモデル標本となり得ることが判明した。亦、非可逆的障害をもたらす急峻な脱分極電位は多分Ca依存性非選択的陽イオンチャネルの活性化によって生じ、細胞内Ca蓄積はCa汲み出し機構の障害と細胞外からのCa流入に基因することが明らかになった。平成元年度概要1).酸素・糖欠乏による海馬錐体細胞の急峻な脱分極電位発生は低温環境(2627°C)、ATP細胞内注入、procaineによる標本前処置により完全に防止でき、有機Ca拮抵薬、細胞内Ca遊離阻害薬、NMDA受容体遮断薬、pentobarbitalやhydrocortisoneなどの脳保護薬、プロスタグランディン産生阻害薬の前処置により部分的に阻止できた。2).正常酸素分圧下で高K(6075mM)溶液で標本を灌流すると、海馬錐体細胞はOmV附近まで脱分極し、細胞死を来たした。この細胞死は無機及び有機Ca拮抵薬で阻止でき、阻止効果は尖端樹状突起上に局在するL型Caチャネルのブロックに基因することが判明した。以上、脳虚血による中枢神経細胞死には細胞内Ca蓄積が大きな要因となることが明らかにされた。昭和63年度の研究実績1、モルモット又はラット脳スライス標本の海馬CA1錐体細胞は、無酸素あるいは無グルコース単独瀑露に対してきわめて抵抗性が高く、細胞膜は最初の数分間過分極した後、緩徐な脱分極に移行し、コントロールの静止膜電位より約20mV脱分極レベルに保持された。40分間の瀑露の後正常クレブス液に置換すると膜電位は迅速に瀑露前のレベルに回復した。初期の過分極位は細胞内ATPの減少によってATP依存性Kチャネルの活性化によって、緩徐な脱分極電位はNaポンプの一部不活性化の為細胞外K蓄積が生じることによって発生していることが明らかになった。2、無酸素+無グルコース同時瀑露によっても初期の過分極電位とその後の緩徐脱分極電位が生じるが、単独瀑露と異なり、瀑露78分に急峻な脱分極電位が発生して膜電位は0mVとなり、膜は非可逆的変化を示した。この急峻な脱分極電位の発生と細胞内自由Ca濃度の急激な上昇とはほぼ平行して生じた、外液Ca濃度を減少させるか、無機あるいは有機Ca拮抗薬を投与すると、脱分極電位発生勾配は緩徐になった。一方、外液Na、Cl濃度を減少させても脱分極電位に有意の変化をもたらさなかった。これらの結果は、急峻な脱分極電位発生が膜の非可逆的変化をもたらすこと、Ca influxとATP依存性CaポンプおよびNa/Ca交換機構の不活性化がこの電位発生の一義的要因として考えられることを示唆している。

1.酸素及び糖欠乏液負荷による海馬錐体細胞の非可逆性障害発生機序と非可逆性障害発生防止法酸素・糖欠乏Krebs液で脳スライス標本を灌流すると、ラット海馬錐体細胞は一旦過分極した後、急峻な脱分極に転じ、約6分後には膜電位が消失して細胞死をおこした。この脱分極電位は主にATP減少による細胞内Ca汲み出し機構の障害と脱分極による細胞外からのCa流入増大に起因することが示唆された。低温環境(2728°C)、ATPの細胞内注入、procaine(0.31mM)による標本前処置は脱分極の発生を防止した。また、有機Ca拮抗薬(flumarigine 110μM)細胞内Ca誘起性Ca遊離拮抗薬(ryanodine 20μM)、NMDA受容体遮断薬(APV0.25mM)、脳保護薬(pentobarbotal0.1mM,bydrocortisome 1μM)は脱分極電位発生潜時を延長させ、かつ、脱分極発生時に酸素・糖会有Krebe液で標本を再灌流すると、膜電位はコントロ-ルのそれに回復した。以上の結果は上述の脱分極発生機序を関節的に支持した。2.高カリウム(K)液負荷による海馬錐体細胞の非可逆性障害発生機序
抑制性神経回路の発達スイッチングの制御機構

代表的抑制性伝達物質であるグリシンが神経終末からの放出開始後に起こるグリシン受容体の集積や動態について、マウス培養脊髄神経細胞標本を用いて電気生理学的および分子イメージングを用いて検討した。受容体ブロッカー存在下で培養した脊髄神経細胞において、ブロッカーを除去すると、グリシン作動性微小シナプス電流の漸増と蛍光Qドットでタグしたグリシン受容体のシナプス下での動態速度の低下が観察された。さらに、樹状突起局所においてグリシンが結合したグリシン受容体は側方移動速度が低下していることが判明した。このグリシン結合による受容体移動の低下は細胞内PKC依存性である可能性が示唆された。発達期や障害に伴って大きな機能変化を示す抑制性神経回路に関して、2つの視点からの研究を行っている。一つは、GABAやグリシン応答が脱分極(しばしば興奮性)から抑制性に発達変化する分子機構とその制御機構である。これは細胞内クロールイオンのくみ出し分子であるカリウムークロール共役担体(KCC2)の発達に伴う発現上昇に依存している。一方で、神経障害時には、KCC2の機能および発現の低下が起こりGABAの脱分極(興奮性)作用が再出現する。障害後の回復期には、KCC2の蛋白・機能発現が再上昇する。このように発達期・障害後および回復期における脳機能変化とKCC2の発現の相関関係が見られる。しかし、その因果関係は不明である。そこで、KCC2の発現を制御可能なKCC2-tetOマウス(作成済)を利用して、発達および障害回復期における脳機能変化について行動学的な評価を主な指標として検討することを目的とする。初年度は、カルモジュリン依存性キナーゼ2(CAMKII)をプロモーターとしてKCC2tet-Oマウス交配させたマウスを作成した。このマウスにおいて、餌からドキシサイクリン(Dox)を除去すると大脳皮質や海馬の錐体神経細胞でKCC2が過剰発現されることを確認するとともに、Doxを再投与すると2週間でKCC2の発現が正常レベルまで減少することを組織染色法で確認した。また、KCC2強制発現マウスの行動実験を開始し、正常マウスと比較し多動であるとの予備実験結果が得られた。もう一つの提案した抑制性神経回路再編はGABA/グリシンという伝達物質のスイッチングについて、伝達物質が変化すると受容体も動的な変化が起こるのかということである。グリシン伝達が開始したときのグリシン受容体がシナプス下膜に集積する過程について、培養神経細胞においてQドットを利用したライブイメージング技術の構築を行った。発達期における抑制性様式の変化について、脳幹聴覚中経路核において、伝達物質がGABAからグリシンへスイッチすることをこれまで見いだしており、脊髄においても伝達様式が変化することが報告されてきた。一方で、伝達様式の変化は伝達物質の変化に連動して、シナプス後細胞に存在する受容体の変化を伴うことが示唆される。本研究においては、伝達物質により、受容体のシナプス後部位への集積について、その動的な動きとシナプスへの集積のメカニズムを明らかにすることを目的としている。グリシン受容体の阻害薬であるストリキニンを培養初期から投与して、グリシン結合を経験していない培養標本において、ストリキニンの投与を中止すると抑制性神経伝達機の指標である抑制性微小シナプス電流は次第にその大きさが大きくなった。このことは、シナプス硬膜に存在するグリシン受容体の密度が、グリシン受容体の活性化の機会に集積してくることを示唆する。さらに個々のグリシン受容体の動的特徴を観察するために、細胞膜上のグリシン受容体を可視化し、その動きをリアルタイムで観察を行った。グリシン受容体に結合させたQドットなどを指標としてグリシン受容体の動きを計測した結果、グリシン受容体は細胞膜上を盛んに側方移動していることが判明した。シナプスマーカーであるゲフリン(グリシン受容体の細胞内結合蛋白)が集積している部位(シナプス後部位と考えられる)に入るとグリシン受容体の動きは著しく低下し、滞留時間が増大した。その後ゲフリン集積部位から離れると、その動態は再度少し上昇した。この結果から、抑制性シナプスの形成に関して、グリシン受容体の活性化ー移動速度の上昇ーシナプス硬膜への集積ー機能的な抑制性シナプスの形成が起こることが判明した。今後はその分子メカニズムの解明を行う予定である。培養細胞上においてグリシン受容体のライブイメージング技術の確立を行い、遺伝子改変マウスなどを用いてグリシン神経終末の可視化に成功するなど、観察技術の構築は終了した。また、グリシン受容体の細胞膜において同受容体の動きの経時的な観察技術の確立を完了した。また、各種データの取得を進めることが可能となった。代表者がこれまで報告した齧歯類の脳幹聴覚経路において抑制性神経伝達物質がGABAからグリシンへ発達スイッチする結果を背景に、伝達物質が変化したときに、それを受容する受容体のシナプス後膜における動態を検討することを目的とした。グリシン伝達を当初からブロックした脊髄培養神経細胞からパッチクランプ法を用いて抑制性シナプス電流を記録した。グルシン受容体阻害薬であるストリキニンを細胞外液から除去すると、グリシン作動性シナプス電流の大きさが次第に増大した。この結果は、グリシン伝達開始によりシナプス部位におけるグリシン受容体密度が増大したことによる可能性が示唆された。これを検証するために、蛍光蛋白をタグしたグリシン受容体を神経細胞に強制発現させ、グリシン伝達開始から、シナプス内・外のグリシン受容体の動態を観察した。

グリシン受容体はグリシン伝達開始後にシナプス硬膜に次第に集積してくることが判明した。さらに、グリシン受容体に蛍光Qドットをタグさせて、一分子動態の観察を行おこなった。Qドットは、シナプス伝達開始後にはシナプス部においてその移動速度が優位に低下した。そのメカニズムの検討を行った。幼若期はGABAやグリシンは興奮性に作用し、細胞内カルシウム上昇に依存した細胞内環境変化によってぞれぞれの受容体がシナプス直下への集積がおこることが報告されている。しかし、今回用いた培養標本では、カリウムークロライドトランスポーターの発現は上昇しており、GABAやグリシンは抑制性であった。各種細胞内生理活性酵素阻害薬を用いた実験結果から、スタウロスポリンが作用する細胞内シグナル伝達系が関与していることが判明した。この結果から成熟後にも抑制性シナプスの形成が見られるが、その際もシナプス前からグリシンが放出されるとシナプス後膜に対応する受容体の速度低下により集積し、シナプス伝達の増強が起こることが判明した。代表的抑制性伝達物質であるグリシンが神経終末からの放出開始後に起こるグリシン受容体の集積や動態について、マウス培養脊髄神経細胞標本を用いて電気生理学的および分子イメージングを用いて検討した。受容体ブロッカー存在下で培養した脊髄神経細胞において、ブロッカーを除去すると、グリシン作動性微小シナプス電流の漸増と蛍光Qドットでタグしたグリシン受容体のシナプス下での動態速度の低下が観察された。さらに、樹状突起局所においてグリシンが結合したグリシン受容体は側方移動速度が低下していることが判明した。このグリシン結合による受容体移動の低下は細胞内PKC依存性である可能性が示唆された。KCC2蛋白を任意の神経細胞群に過剰発現可能なマウスの作成とその検証が終了した。また正常マウスにおけるKCC2の過剰発現による行動変化の検証を開始した。加えて、グリシン受容体の動態を一分子レベルで観察することができる技術を構築し、シナプスとシナプス外でのグリシン分子動態の観察と解析法を確立し、次年度からの研究を推進する技術の整備を完了した。これにより、当初計画したものは概ね順調に進んでいると思われる。今後は、グリシン受容体の活性化によりなぜ、グリシン受容体がゲフリン集積部位でその側方移動を低下させるのかなど、細胞内メカニズムについて検討を行なうことが必要となる。また、これまで、グリシンシナプスの変化のメカニズムについては、幼若期のGABAやグリシンが脱分極を引き起こす時期の理論、つまりGABAやグリシン受容体の活性ー脱分極-細胞内やシナプスにおけるカルシウム上昇ー受容体の集積と云われてきたが、生体2光子励起顕微鏡を用いて、GABAグリシン応答が過分極である成熟個体においても抑制性シナプスの形成が観察されるため、これまでの脱分極理論は適用できない。抑制性シナプス形成のメカニズムの再構築を行う必要があるのか等を本研究課題の最終目的の一つとして設定したい。27年度が最終年度であるため、記入しない。一般生理学KCC2過剰発現を発達期に誘導するためのプロモーターの検索を行う。
アルコール離脱症状の遺伝疫学的研究

(1)アルコール離脱症状のうち個体差が顕著な症状であるけいれん、幻覚の発症の遺伝的背景を調べるため、抑制性に作用する神経伝達物質のひとつであるGABAの代謝・産生に関与するGABA-Transaminase(GABAT)のアイソザイム変異を検索した。アルコール依存症患者のうち幻覚症状を呈していた患者のGABAT1型は0%、2-1型75%、2型85.7%となりGABATの表現型と幻覚発症との間に何らかの相関があることをうかがわせた。(2)GABAのagonistとして知られるdelta-aminolevulic acid(ALA)はGABAと競合的にGABAautoreceptorに作用し、GABAの放出を抑制することが知られている。一方、一連のヘム合成系の第二番目に位置するALAdehydratase(ALAD)には二種の対立遺伝子により産生される三表現型(1,2-1,2)が存在する。この遺伝的多型とアルコール離脱症状との相関を検索するため、アルコール依存症患者の遺伝子型のタイピングを行った。対照群としては、非アルコール性患者および一般健常人集団を用いた。その結果、アルコール依存症には1型遺伝子のみ検出されたのに対し、対照群には1型遺伝子のみならず2型遺伝子も検出され、両群の間には有意の差(P<0.005)が存在した。GTP結合蛋白のうちstimulatory GPT(Gs)蛋白に注目し、これの活性値を健常者とアルコール依存症との間で比較した。また飲酒量との相関についても検討を行った。Gs蛋白の活性はCYC membraneのNaF-stimulated ACを再構成能として表わし、赤血球膜中のGsを用いた。アルコール依存症患者では非飲酒者のそれと比較し、35%の活性低下が認められた。次に健常者群の間でアルコール摂取量とGs活性との相関についても調べた。50g/week以下ではGs活性に変化はなく、50150g/weekではむしろ14%ほど活性は上昇した。これに対し150550g/weekでは遂に活性が低下していた。同様にNaK-ATPaseおよびGGTにも上昇がみられた。以上の結果より、アルコール離脱症状の出現にはGABA代謝の障害、GABAautoreceptorに対するALAの競合、受容体とアデニールシクラーゼの共役機構として働くGs蛋白の活性低下が関与することが判明した。アルコ-ル離脱症状としては嘔吐、発汗、不眠、意識障害、幻覚、振戦、けいれん、血圧変動など多くの症状が合併して発症することが多い。このうち特に幻覚、けいれんは個体差が著しく、発症する患者としない患者が存在する。本研究においては記述疫学の手法を用いてアルコ-ル性幻覚・けいれんに関し、宿主側の遺伝的素因を解明し、アルコ-ル乱用者の断酒後の症状の出現の予知および治療プログラムの基礎デ-タを得るために、抑制系神経伝達機構の異常に関連したGABAーTransaminase(GABAT)の遺伝的個人差およびその受容体に関する分子生物学的研究を行った。

我々はGABAT検出の新しい手法を開発し、これに基づき健常者およびアルコ-ル依存症患者の表現型の分布を調べてみたところ、アルコ-ル依存症患者に有意に高い割合でGABATー2型遺伝子が検出された。とりわけ幻覚症状を呈した患者のうちGABATー1型の頻度は0%で、2ー1型は75%、2型は85.7%となりGABATの表現型と幻覚症状との間に何等かの相関があることが判明した。更にGABATのタイピングを血液から行なうために必要な特異的抗体を作成するため、その精製法を確立する一方、肝GABATの生化学的性状も調べた。GABAのような抑制系に作動する情報伝達物質と離脱症状との関連を調べるためには、その受容体とのかかわりを検索する。そこで受容体からの刺激をサイクリックAM生成触媒部位に伝達するGPT結合蛋白(Gs)の生物活性の変化を調べアルコ-ル離脱症状解明の遺伝生化学的デ-タを得た。赤血球膜Gs蛋白をAC活性を指標として検査すると、nonーdrinkerに対するその相対値はアルコ-ル摂取量に比例し、50ー150ml ethanol/weekで最高値を示し、以下酒量が増えるに従い減少した。また、アルコ-ル依存症患者ではGs活性はnonーdrinkerや非アルコ-ル性疾患患者に比べ、有意(P<0.01)に低い値を示した。アルコール離脱症状のうち、個体差の大きい幻覚およびけいれん発症に関する遺伝的素因を解明することを目的に研究を行ってきたが、今年度は離脱期の抑制系神経伝達機構の異常と関連の深いGABA-Transaminase(GABAT)の受容体に関する研究を行った。GABA受容体に神経伝達物質としてのGABAが結合する際に競合的に作用する第二の物質としてδ-aminolevulin(ALA)が知られている。さらにこのALAはポリフィリン代謝系経路の第二番目に位置するALA dehydratase(ALAD)によりporphobilinogen(PBG)へ代謝される。ALADには遺伝的多型が存在し、ALAD1およびALAD2の対立遺伝子が報告されてきたが、我々は末梢血から精製したDNAによるタイピング法を確立し、アルコール依存症者と健常者における遺伝子型の分布を調べた。一般健常人集団では、1型:82.7%、2-1型:15.4%、2型:1.9%であったのに対し、アルコール依存症患者群はすべて1型を示した。アルコール性肝疾患群でなぜ1型のみしか検出されない理由として、ALADの1型アイソザイムが疾患に対する脆弱性要因を秘めていることが考えられる。すなわち、アルコールの乱用により生体組織中の酸化型グルタチオン(GSSG)と還元型グルタチオン(GSH)との比が高まり、この過剰になったGSSGがALADに対する阻害作用が1型と2型で異なり、1型の方が2型より阻害され易い。そのためALAの代謝阻害が生じ、ALAが何等かの影響を細胞内の恒常性維持に及ぼす。そのため1型および2型個体より部分精製したALADによりin vitroでの阻害実験を行った。結果は1型はGSSG低濃度で急速に失活するのに対し、2型は一度活性化された後、徐々に阻害された。つまりGSSGに対する阻害され方が1と2型の間で違いが見られた。
集水域森林においてシカ害が生じた河川における環境影響評価手法の開発

1)シカの個体数増加による森林生態系への悪影響が日本全国において問題となっている。2)集水域森林においてシカ害が生じた河川生態系において、なにを、どのように調べれば適切な影響評価が行えるのかという手法は確立されていない。3)様々な要因が同時に影響しうる河川生態系において、シカ害の影響を検証するため、本研究では多地点比較によるアプローチを行う。4)生態系モニタリングを多地点で効率よく行うため、環境DNAメタバーコーディングによる生物観測を導入する。5)本研究により、シカ害の影響について多地点における迅速な河川生態系への環境影響評価の実施が可能となる。
基礎研究解析データに基づく大腸がん治療薬の非網羅的バイオマーカー検証研究

本研究は、消化器がんの中でも特に大腸がんにおける新規抗がん剤の治療効果に関する効果的なバイオマーカーの同定を目的とするが、効果予測バイオマーカーの同定に関する新しい方法論の確立を目指すものでもある。すなわち基礎研究から予測される候補バイオマーカーを臨床サンプルで非網羅的に検証することで、これまで一般的であった後ろ向き探索研究と比較して短い期間で信頼性の高いバイオマーカーを臨床の場に導入することを目標としている。我々はこれまでにがん細胞株の薬剤感受性に関する独自のデータベースJFCR39(がん細胞パネル)、及び、包括的トランスクリプトーム解析を用いてFTDの効果予測因子の候補を抽出した。次にTAS-102を投与される群(TAS-102群)、レゴラフェニブを投与される群(control)とで候補因子の治療中における血清学的定量を行った。その結果、候補因子の一部はTAS-102群においてpreclinicalと同様な結果を示し、control群では示さなかった。現在、TAS-102に血管新生阻害剤を併用する新たなコホートを集積し、先々validation解析を行う予定である。レゴラフェニブに関しては以前報告したCCL5/CCR5 signaling pathwayと予後予測についての関連する遺伝子多型について調査を行っている。さらに基礎データにより候補となった別なpathwayについても検討を行っている。予定臨床サンプル数の集積ならびに実験についてもほぼ予定通りに行われている。臨床サンプル集積にはさらに1年ほど時間を要する。観察期間も必要であり、最終的な解析は最終年度になると思われる。引き続き、新規症例の集積を行なっていく。Pre clinical dataを用いて効果予測マーカーの臨床的意義を解明する。得られた成果に対して学会発表、論文発表を随時行う予定である。(理由)ほぼ前年度の残額はなかった。サンプル数に対して使用する検査キットの購入額が、残額を上回っていたため。(使用計画)次年度分と合わせて検査キットを購入し、測定に使用する予定である。
遺伝性プロテアソーム不全症である中條－西村症候群の病態解明と酵素補充療法の試み

中條-西村症候群は乳児期に凍瘡様紅斑で発症し、次第に間欠的な発熱と浸潤を伴う皮疹を繰り返し、限局性脂肪萎縮を呈する疾患である。免疫プロテアソーム遺伝子であるPSMB8遺伝子のホモ変異が原因遺伝子として同定された。この研究では、MHCクラスI、IIに異常がないか、患者血球より作成した不死化B細胞とPBMCを用いて検討を行った。患者の不死化B細胞の細胞表面のHLA-DRの発現は見られなかったが、細胞内での発現は確認できた。HLA-DRの構造異常を想定し、ヒッチハイク変異を検討するため、遺伝子検索をおこなったが、有意な変異は確認できなかった。中條-西村症候群は遺伝性プロテアソーム機能不全症として位置づけられる疾患である。申請者は本疾患患者の主治医であり、病態解明に向け、本年も患者検体を用いた研究を中心に行った。平成24年度には中條-西村症候群患者の末梢血単核球におけるユビキチンの細胞内、特にリソソーム内の蓄積を確認するとともに、MHC classIIの発現異常を見いだし、特異抗体による認識の違いからHLA-DRの構造異常を想定したが、PSMB8変異に関連する有意なヒッチハイク変異はみられなかった。特異抗体による認識も安定せず、細胞表面発現が不安定という結論に至った。平成25年度は、京都大学iPS細胞研究所で進行している患者由来iPS細胞の解析に平行して、患者末梢血単球および不死化B細胞を用いて、様々な刺激に対するサイトカイン産生をELISAで測定し、iPS細胞由来細胞との比較を行った。その結果、IFNgamma刺激によるIP-10産生は末梢血単球とiPS由来単球で共通に健常者細胞に比べ有意に高値を示したが、不死化B細胞では一定しなかった。また不死化B細胞のプロテアソーム活性についてキットを用いて測定した結果、患者由来細胞では健常者あるいはヘテロ変異を持つ両親由来細胞に比べてキモトリプシン様活性の低下を認めた。以上の結果から、末梢血単球のIFNgamma刺激によるIP-10産生と不死化B細胞におけるキモトリプシン様活性の低下が、中條ー西村症候群の病態を反映する指標になると考えられた。今後、これらの実験系を指標に、正常プロテアソームの補充や異常beta5iサブユニットの発現抑制による病態改善効果の検討を進めたい。また、中條-西村症候群の特徴である脂肪萎縮の病態を反映すると想定される血清中のアディポサイトカインであるレプチンとアディポネクチンについて、抗IL-6受容体抗体製剤投与前後での活性を検討中である。中條-西村症候群は遺伝性プロテアソーム機能不全症として位置づけられる疾患であるが、病態の解明、有効な治療はまだ見出されていない。申請者は本疾患患者の主治医であり、患者検体を用いた研究を中心に行った。中條-西村症候群患者の末梢血からlymphoprepによりPBMCを採取し、サイトスピン標本を免疫染色し、ユビキチンが細胞内に蓄積していることを確認した。MHC classI、IIの発現について、PBMCの細胞内、細胞外蛍光染色したものをFACSで確認したところ、MHC classIの発現は正常であったが、classIIの細胞外発現はみられなかった。患者の不死化B細胞でも同様の結果であった。PBMCにおいてHLA-DRの細胞内染色を行い、サイトスピン標本で観察すると、細胞内では発現がみられた。細胞表面へのMHC classIIの輸送障害がclassIIの発現に影響している可能性を考え、サイトスピン標本でearly endosome、phagolysosome、Golgi体を免疫染色した。HLA-DRは主に細胞膜近傍に観察され、いずれの器官にも蓄積はみられなかった。細胞内外を染色する数種類の異なるepitopeに対する抗体を用いて染色すると、抗体によりHLA-DRの染色に差がみられた。以上の結果より、HLA-DRの構造異常が存在する可能性があり、PSMB8遺伝子変異に伴うヒッチハイク変異の存在が示唆された。中條-西村症候群の患者において、HLA-DRの異常は自己抗体陽性の原因の一つとなり得るため、HLA-DRの発現異常の検索は本疾患の病態解明に寄与するものと考えられる。PSMB8 cDNAを組み込んだ発現ベクターを患者の不死化B細胞にelectroporationで導入し、遺伝子導入を行った不死化B細胞にHLA-DRの発現がみられるか確認したが、発現はみられなかった。患者検体を用いた病態解明については、実験をすすめているが、MHC classIIの発現異常が研究の中心となったため、酵素補充療法についてはまだすすんでいない。

中條-西村症候群では特徴的な頬のやせた顔貌と節くれだった指、四肢を中心とした限局性脂肪委縮がみられているので、患者血清中のレプチン、アディポネクチンなどの脂肪細胞成熟マーカーの検討を予定していたが、まだ行えていない。患者血清の採取・保存は行っているため、検体が集まれば、測定を開始する予定である。1.中條-西村症候群患者検体を採取・保存し、レプチン、アディポネクチンなどの脂肪細胞成熟マーカーの測定・検討を行う。可能であれば、病勢増悪期、寛解期で差がないか検討したい。2.ヒトとマウスの正常免疫プロテアソームβ5iサブユニット蛋白質の生成に着手する。3.中條-西村症候群の患者末梢血や皮膚組織で見られた異常な表現型が変異PSMB8遺伝子ノックインマウスでもみられるか、検討する。4.市販されているヒト20Sプロテアソームを変異PSMB8ノックインマウスに投与し、異常な表現型が回復できるか検討する。ついで、生成されたヒトとマウスの免疫プロテアソームβ5iサブユニット蛋白質の投与により、HLA-DRの染色異常などの、患者由来細胞やノックインマウスで認められた異常な表現型を回復できるか検討する。・消耗品1)各種抗体400,000円2)遺伝子関連試薬・器具400,000円3)染色関連試薬・器具400,000円・学会関連費1)学会参加費100,000円2)国内・海外学会参加旅費200,000円3)年会費(間接費)・成果報告にかかわる費用1)論文校正、投稿費、別刷り代100,000円合計1,600,000円
眼組織幹細胞の分化誘導と再生医療への応用

難治性眼疾患に対する再生医療の実践のため、我々はセルソースとして眼組織幹細胞を検討した。網膜再生医療において、ヒト網膜幹細胞からChx10VP16・Crx,・Otx2の共発現が、最も効率良く網膜視細胞へ分化誘導することを示した。本結果はStemCells(Inoue.T, et al. 2009)に報告した。角膜再生においては、細胞シート移植実験を確立するためのフィーダー細胞の開発を検討した。難治性網膜疾患に対する再生医療のセルソースとして、近年単離された網膜幹細胞が注目されているが、各細胞型への分化誘導の詳細は不明である。われわれは網膜発生において重要な転写因子群のどれが分化誘導に効果的か検討するため実験をすすめた。まず、網膜再生医療において、視細胞をはじめとする特異的分化細胞をより効率よく産出するための条件を決定するために、網膜特異的細胞再生のための細胞源としてヒト成体由来網膜幹細胞の初代培養を使用して、従来の浮遊培養を基盤として、より産生効率のよい付着培養の条件を確立した。これにより微量サンプルから未分化細胞を大量に増幅することが可能になった。また、動物モデルの網膜発生過程において網膜固有細胞への分化に不可欠と考えられている転写因子群をクローニング(Crx,Otx2,Mash1,Nrl,NeuroD,Chx10,Ath5,NHLH,MITF,Chx10VP16)してレンチウイルスベクターに導入し、各因子を発現するレンチウイルスを作製した。網膜幹細胞を樹立後、各レンチウイルスを感染させて分化誘導後に網膜視細胞(Rho)・色素上皮細胞(RPE65)・神経節細胞(NF)の分化マーカーをrealtimePCRを試みた。その結果網膜幹細胞からChx10VP16により視細胞マーカー、網膜色素上皮細胞マーカー、神経節細胞マーカーの上昇が認められ、各細胞型への分化が誘導された。角膜再生医療においては、RNA解析にて網羅的に検索中する角膜細胞マーカーを選択した。難治性眼疾患に対する再生医療のセルソースが注目されている。われわれは、眼組織細胞の各細胞型への分化誘導のメカニズムを検討している。まず、網膜再生医療において、固有の網膜細胞を得るために網膜幹細胞に着目した。さらに分化誘導にはたらく転写因子群を決定するために、網膜発生において重要な転写因子群を網膜幹細胞に強制発現させて、どの因子が網膜固有細胞に効率よく分化するかを解析した。前年度に作成した網膜発生において重要な役割をもつことが報告されている転写因子群(Crx, Otx2, Mash1, Nr1, NeuroD, Chx10, Ath5, NHLH, MITEChx10VP16)を発現するレンチウイルスを網膜幹細胞に感染させて、分化誘導後に網膜視細胞(Rho)・色素上皮細胞(RPE65)・神経節細胞(NF)の分化マーカーをRNAレベルで検討したところ、Chx10VP16が視細胞マーカー、網膜色素上皮細胞マーカー、神経節細胞マーカーの上昇が認められ、各細胞型への分化が誘導された。さらに今年度は蛋白レベルでも同様の結果が得られることを確認した。さらなる誘導力の向上を目指して、CHXVP16とその他の因子を同時に強制発現させるベクターを構築した。次年度はこの因子の組み合わせによってさらなる分化率の向上が得られるかを検討し、動物モデル(視細胞変異マウス)への移植実験などにて、vivoでの誘導細胞の挙動を検討する。角膜再生医療においては、データベース解析にて網羅的に検索し、角膜内皮細胞に特に発現量の多い因子を5つ選択した。それらをプローブとして、USAアイバンクから購入したヒト角膜組織において、in situ hybridizationを施行して角膜組織特異的発現があるか確認中である。難治性眼疾患に対する再生医療の実践していくためには、目的細胞に分化していくセルソースの確保および分化機転に働く分子メカニズムの解明が必要不可欠である。われわれは、眼組織細胞の各細胞型への分化誘導のメカニズムを検討した。網膜再生医療において、固有の網膜細胞を得るために組織幹細胞で毛様体上皮に存在するヒト網膜幹細胞を単離し利用した。また機能的分化細胞への分化誘導機構をつかさどる転写因子群を、重要な機能的分化細胞ごとに評価した。網膜発生において重要な転写因子群を網膜幹細胞に強制発現させて、どの因子が網膜固有細胞に効率よく分化するかを解析した。当研究にて用意した転写因子群(Crx, Otx2, Mash1, Nrl, NeuroD, Chx10, Ath5, NHLH, MITF, Chx10VP16)を発現するレンチウイルスを網膜幹細胞に感染させて、分化誘導アッセイ後に網膜視細胞・色素上皮細胞・神経節細胞の分化マーカーをRNAレベルで検討したところ、Chx10VP16が視細胞マーカー、網膜色素上皮細胞マーカー、神経節細胞マーカーの上昇が認められ、各細胞型への分化が誘導された。視細胞誘導に関しては、蛋白レベルにて、Chx10VP16・Crx,・Otx2の共発現が、もっとも効率良く、網膜幹細胞から網膜視細胞へ分化誘導した。

さらに、Chx10VP16・Crx,・Otx2の共発現網膜幹細胞を動物モデル(視細胞変異マウス)へ移植実験することによって、生体網膜において、移植細胞が生着・視細胞へ高率に分化して、電気学的・行動学的に視細胞分化を示す結果が得られた。本結果はStemCells(Inoue.T,et al.2009)に報告した。角膜再生においては、データベース解析にて網羅的に検索し、角膜内皮細胞に特に発現量の多い因子を選択検討した。また、自己細胞シート移植実験を確立するための培養系を検討中である。
脂肪性肝疾患の光計測

2016年までに、マウスにおける虚血・再灌流モデルで、接触型光ファイバープローブまたはカメラを用いて、可視光および近赤外光の吸収、散乱を計測することで、(1)組織酸素飽和度、(2)ミトコンドリアのエネルギー障害、(3)細胞の形態異常を検出できることを見出し、発表した(Akter S, et al. J Biomed Opt. 2015, 20(7):076010., Akter S, et al. Biomed Opt Express 2017, 8(2):974-992.)。また、ヒトの糖尿病/脂肪肝の病態に類似した疾患モデルマウス(STAMマウス)を使用して、同様の実験を行い、コントロール(健常マウス)に比較して、全週齢(6、8、12週)で波長1204 nmにおける拡散反射光スペクトル(NIR)の2階微分値(脂質量を反映)の増加を認め、病理組織標本の脂肪肝スコアは、NIR2階微分値と強い相関を示す結果を得て学会(日本外科学会2017横浜)発表した。これにより脂肪性肝疾患の重症度をリアルタイムにモニタリングできる可能性が示唆された。同光学手法を手術症例に適用するため,本年度はヒト肝臓用のハンドヘルド型光ファイバープローブ、可搬式小型分光システム、および脂肪肝スコアの自動算出ソフトウェアを試作し、術中リアルタイムに同情報を取得できるかを検討する。大学院生の研究開始が1年半遅れたため、研究期間を1年間延長させていただき、本年度ですべての目標を達成することを目標にして、研究を続けている。計測データを数値化するソフトウェアの開発は終了している。今年度はヒト肝に対する計測を行う。ヒト肝に対する光学計測システムを作成した。また、超音波せん断波による脂肪肝の計測ができるようになった(FibroScan)ので、それとの比較検討も行う。生体組織に対して非侵襲性で比較的高い透過性を有する可視近赤外光(波長=6001300nm)を用いて、脂肪肝の非侵襲的な定量計測系を構築することを目的として、実験系を構築中である。これまでに小動物肝虚血ー再灌流モデルを作成し、麻酔下に露出したマウス肝臓に光ファイバー対を接触させ,in vivoで拡散反射光スペクトルを計測し、虚血-再灌流中および窒素吸入による安楽死時の吸収係数μaスペクトル、肝組織酸素飽和度StO2、散乱係数μs'スペクトルの時間変化(相対変化)を評価した。それにより、1)Akter S, et al. Journal of Biomedical Optics 2015;20(7):076010-1-027003, 2) Akter S, et al. Optical review 2016;23(2):354-359,3) Akter S, et al. Biomedical Optics Express 2017;8(2):974-992.を発表している。すでに、マウス脂肪肝の計測で肝組織脂肪量と拡散反射スペクトルの2階微分値がよく相関することを見出しており、英文論文作成中である。これまでは、計測データを都度、マニュアルで数値化していたので、結果解析にかなりの時間を要した。今年度は、まず取得データの自動解析のためのソフトウェアを開発することを目標にしている。大学院生の研究開始が1年遅れたため、毎日実験を行うことができておらず、また自作プローブについても作成が少し遅れている。すでに、マウスにおける虚血・再灌流モデルで、接触型光ファイバープローブまたはカメラを用いて、可視光および近赤外光の吸収、散乱を計測することで、(1)組織酸素飽和度、(2)ミトコンドリアのエネルギー障害、(3)細胞の形態異常を検出できることを見出し、発表した(Akter S, et al. J Biomed Opt. 2015, 20(7):076010., Akter S, et al. Biomed Opt Express 2017, 8(2):974-992.)。また、ヒトの糖尿病/脂肪肝の病態に類似した疾患モデルマウス(STAMマウス&reg;)を使用して、同様の実験を行い、コントロール(健常マウス)に比較して、全週齢(6、8、12週)で波長1204 nmにおける拡散反射光スペクトル(NIR)の2階微分値(脂質量を反映)の増加を認め、病理組織標本の脂肪肝スコアは、NIR2階微分値と強い相関を示す結果を得て学会(日本外科学会2017横浜)発表した。大学院生の研究開始が1年半遅れたため、最後の1年ですべての目標を達成しなければならない状況である。システム開発は少しずつ進めている。

2016年までに、マウスにおける虚血・再灌流モデルで、接触型光ファイバープローブまたはカメラを用いて、可視光および近赤外光の吸収、散乱を計測することで、(1)組織酸素飽和度、(2)ミトコンドリアのエネルギー障害、(3)細胞の形態異常を検出できることを見出し、発表した(Akter S, et al. J Biomed Opt. 2015, 20(7):076010., Akter S, et al. Biomed Opt Express 2017, 8(2):974-992.)。また、ヒトの糖尿病/脂肪肝の病態に類似した疾患モデルマウス(STAMマウス)を使用して、同様の実験を行い、コントロール(健常マウス)に比較して、全週齢(6、8、12週)で波長1204 nmにおける拡散反射光スペクトル(NIR)の2階微分値(脂質量を反映)の増加を認め、病理組織標本の脂肪肝スコアは、NIR2階微分値と強い相関を示す結果を得て学会(日本外科学会2017横浜)発表した。これにより脂肪性肝疾患の重症度をリアルタイムにモニタリングできる可能性が示唆された。同光学手法を手術症例に適用するため,本年度はヒト肝臓用のハンドヘルド型光ファイバープローブ、可搬式小型分光システム、および脂肪肝スコアの自動算出ソフトウェアを試作し、術中リアルタイムに同情報を取得できるかを検討する。大学院生の研究開始が1年半遅れたため、研究期間を1年間延長させていただき、本年度ですべての目標を達成することを目標にして、研究を続けている。小動物での計測系はすでに所有しているが、ヒトに対する同様の情報取得を目的に、滅菌可能なプローブを自作し、測定系を作成することをもう一つの目標にして、現在進行中である。ヒトに対する検討はすでに院内の倫理審査を通過しており、動物実験と並行して、研究を開始する予定である。計測データを数値化するソフトウェアの開発は終了した。今年度で疾患モデルマウスの計測の仕上げと並行して、ヒト肝に対する計測を行う。ヒト肝に対する工学計測システムを作成中である。また、超音波せん断波による脂肪肝の計測ができるようになったので、それとの比較検討も行う。計測データを数値化するソフトウェアの開発は終了している。今年度はヒト肝に対する計測を行う。ヒト肝に対する光学計測システムを作成した。また、超音波せん断波による脂肪肝の計測ができるようになった(FibroScan)ので、それとの比較検討も行う。今年度は、まず取得データの自動解析のためのソフトウェアを開発することを目標にしており、現在開発中である。まだ完成し納入されていないので、支払が発生していない。また、ヒトでの計測のための機材の購入は別途研究費で賄ったため、当該研究費は使用しなかった。今年度は大学院生がフルに研究できなかったため、消耗品費や出張旅費の使用がなかった。今年度は大学院生がフルに研究できなかったため、研究期間を1年延長した。計測値を自動表示するソフトウェアの支払は今年度発生予定。ヒト計測は今年度開始するので、消耗品(ファイバーなど)の支払が発生する予定である。
調理操作による食物中の抗酸化性配糖体の変化に関する研究

野菜にはフラボノイドをはじめとする多くの抗酸化性物質が含まれており、生活習慣病の予防をする上で有効であることがわかっている。野菜を摂取する場合には生食ばかりではないことを考えると調理操作によって抗酸化性物質がどのように変動するのか非常に興味深い。そこで、今回フラボノイドとその配糖体に着目し、日常よく使われているタマネギ、キャベツ、ブロッコリーを取り上げ調理操作による含有量の変化を中心に検討した。タマネギは「炒め」「水煮」「電子レンジ加熱」、キャベツは「水さらし」「水煮」「炒め」、ブッロコリーは「水ゆで」「塩ゆで」「電子レンジ加熱」について実験を行い、それぞれの試料に含まれるケルセチン配糖体および、総ケルセチン、ケンフェロール量、フェノール性物質量、ビタミンC量を主として高速液体クロマトグラフィーを使って定量分析した。得られた値はmg/100g新鮮タマネギ重量に換算した。今回の実験より、水を媒体とする調理操作によってフラボノイド配糖体はそのままの形でゆで汁に移行することがわかった。また、炒め調理のように日常行われる程度の高温をかけても総ケルセチン、ケンフェロール量やケルセチン配糖体量には影響を及ぼさず、ほとんど減少しなかった。キャベツに関してフラボノイド配糖体だけでなく他の配糖体についても検討したが、同様の結果になった。フェノール性物質全体では炒めることにより増加し、ゆでることで減少した。ブロッコリーにおいて塩を2%添加すると残存率はいくらか良くなり、キャベツやタマネギを炒める場合に油を添加しても残存率に影響しなかった。緑黄色野菜と淡色野菜間での減少率の相違はみられず、いずれの減少率の傾向も似ていた。従って、野菜を調理して摂取した場合、野菜中のフラボノイド量の減少はゆで汁も含めて全体としてみると変化しないと言える。ビタミンC量の変化とフラボノイド量の間に相関はみられなかった。前からの研究結果よりタマネギをモデルとして用いることにし、今年はタマネギより配糖体を抽出するための条件と抽出物の高速液体クロマトグラフィーによる分析条件の決定、および含有配糖体の同定を行った。今回は、1995年兵庫県神埼部産の晩生種黄色タマネギ「パワー」を6月に収穫し、乾燥させて使用した。抽出条件として水とメタノールの混合溶媒を各溶媒抽出液の総ポリフェノール量を定量する事により検討したところ、80%メタノールを用いて一昼夜浸漬(30°C)して抽出すると最も効率良く抽出できることが判明した。高速液体クロマトグラフィーの分析条件は溶出溶媒;水:メタノール:ギ酸=60:39:1(v/v/v)、流速1ml/min、検出波長370nm、カラムは東ソ-社製TSK-GEL ODS-80Ts(粒径5μm,4.6x150mm)が良く、抽出物を分析した結果ルチン(ケルセチン-3-ルチノシド)とケルセチン-4′-グルコシドが主成分であることが確認できた。これは現在各種スペクトルを用いて構造を確認中である。今後これを応用して「炒める」「焼く」「煮る」「揚げる」とマイクロ波加熱の各調理操作についてタマネギに含まれる総ポリフェノール量、個々のケルセチン配糖体含有量(主としてルチンとケルセチン-4′-グルコシド)および総ケルセチン量の変化を検討する予定である。ケルセチンは食物中に含まれる代表的な抗酸化性物質である。今回、ケルセチンが多く含まれている黄色タマネギを用いて、「炒める」・「電子レンジ加熱」の2種類の調理操作について検討した。

「炒める」については更に(1)油なしで炒めたもの、(2)コーン油を用いて炒めたもの、(3)バタ-を用いて炒めたもの、の3種類を検討した。実験は、淡路産黄色タマネギを一括購入して調理し、調理したものを凍結乾燥した後、その凍結乾燥物を80%メタノールで抽出し、濃縮・定容して試料溶液とした。試料溶液についてケルセチン配糖体と遊離ケルセチン、及び抽出液を加水分解して得られるケルセチンを高速液体クロマトグラフィーで、フェノール性化合物全体をFolin-Denis法で検討した。それぞれの値はmg/100g新鮮タマネギ重量に換算した。今回実験した結果、試料に用いた黄色タマネギにはケルセチンのモノグルコシドとして、quercetin-4′-glucoside(Q4′G),quercetin-3-glucoside(Q3G)が多く含まれており、最も多いQ4′Gの含有量で平均5mg/100g新鮮重量であった。3種類の「炒め」操作における総ポリフェノール量を比較すると、バタ-炒めを除く2種類の炒め操作において20分経過後に増加したが、バタ-炒めではそれほど変化が見られなかった。また、Q3G,Q4′Gや遊離ケルセチン量はいずれの調理操作においても大きな変化が見られなかった。また、総ケルセチン量も5分後にやや増加したものの大きな変化は見られなかった。従って、炒めたり電子レンジで加熱した場合、タマネギ中のフラボノイド量は変化しないものと考えられた。今後、「水煮」や他の野菜についても検討する予定である。野菜にはフラボノイドをはじめとする多くの抗酸化性物質が含まれており、生活習慣病の予防をする上で有効であることがわかっている。野菜を摂取する場合には生食ばかりではないことを考えると調理操作によって抗酸化性物質がどのように変動するのか非常に興味深い。そこで、今回フラボノイドとその配糖体に着目し、日常よく使われているタマネギ、キャベツ、ブロッコリーを取り上げて調理操作による含有量の変化を中心に検討した。タマネギは「炒め」「水煮」「電子レンジ加熱」、キャベツは「水さらし」「水煮」「炒め」、ブロッコリーは「水ゆで」「塩ゆで」「電子レンジ加熱」について実験を行い、それぞれの試料に含まれるケルセチン配糖体および、総ケルセチン、ケンフェロール量、フェノール性物質量、ビタミンC量を主として高速液体クロマトグラフィーを使って定量分析した。得られた値はmg/100g新鮮タマネギ重量に換算した。今回の実験により、水を媒体とする調理操作によってフラボノイド配糖体はそのままの形でゆで汁に移行することがわかった。また、炒め調理のように高温をかけても総ケルセチン、ケンフェロール量やケルセチン配糖体量には影響を及ぼさず、ほとんど減少しなかった。キャベツに関してフラボノイド配糖体だけでなく他の配糖体についても検討したが、同様の結果になった。フェノール性物質全体では炒めることにより増加し、ゆでることで減少した。ブロッコリーにおいて塩を2%添加すると残存率はいくらか良くなり、キャベツやタマネギを炒める場合に油を添加しても残存率に影響しなかった。緑黄色野菜と淡色野菜間での減少率の相違はみられず、いずれの減少率の傾向も似ていた。従って、野菜を調理して摂取した場合、野菜中のフラボノイド量の減少は全体としみると変化しないと言える。