hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
デジタルフォトニクスの実現を目指す超低閾値光信号2値論理プロセッサの研究

このデバイスには,後段のマイクロリングレーザの発振光が前段に入射すると2値論理動作が困難になるため,後段のマイクロリングレーザは右回り発振光と左回り発振光の間で一方向にだけ強く発振する非対称発振が必要になる.この非対称発振のために初年度に,マイクロリングレーザ型光インバータの入射端側バスライン導波路に方向性結合器を介して入射端方向へ向かう光を反射させるループミラーを設けた非対称方向性発振マイクロリングレーザを設計し,その発振方向比を測定した.その結果,約7dBの非対称性は得られたものの,ループミラー部への注入電流を増加させて反射増幅率を増大させても発振方向比はほとんど変化がせず,ループミラー部とマイクロリング部の中間部分に電流を注入すると非対称発振が増強されることから,帰還光の位相制御が重要であるとの結論を得ていた.この仮説は平成28年度に実施した新しい測定法による測定結果でも裏付けられ,従来の2倍の長さの位相制御部を必要とすることが判明していた.最終年度の平成29年度は,帰還光によるインバータ動作とフリップフロップ動作の理論を構築し,また位相制御部注入電流と温度に関するデータを詳細に取得して理論と比較した結果,フリップフロップ動作とインバータ動作は帰還光の位相によって周期的に切り替わることを実験的に発見し,この現象がカー効果による振幅の非線形性と帰還光のバスライン導波路内でのファブリペロー共振に起因するバスライン結合部における位相の非線形性によって説明できることを理論的に明らかにした.量子井戸半導体マイクロリングレーザの隣接発振波長間の切り替わりを利用したインバータ動作を基本として,2段縦列接続による全光2値論理デバイスの実現を目指して,一方向選択発振の条件探索を行い,帰還光の位相が大きく関係することを発見して一方向発振マイクロリングレーザを設計した.また,同一のデバイスでフリップフロップ動作とインバータ動作を帰還光の位相によって周期的に切り替えられることを実験的に発見し,この現象がカー効果による振幅の非線形性と帰還光のバスライン導波路内でのファブリペロー共振に起因するバスライン結合部における位相の非線形性によって説明できることを理論的に明らかにした.初年度の非対称方向性発振マイクロリングレーザの試作と測定結果より,非対象方向性発振を得るためにはループミラー部の反射増幅量のみでなく帰還光の位相も重要であるとの結論を得ているが,これまでの非対称発振のための理論解析にはレート方程式を用いていたために,位相条件が含まれていなかった.そこで平成28年度は,複合共振器の共振条件を参考に,非対称方向性発振に必要な帰還量と位相の条件を理論的に解明して,位相制御部を設けて設計にフィードバックする.そして,この再設計に基づくデバイスを試作して,非対称方向性発振を確認する.また,インバータ動作はこれまでは入射波長の手動による切り替え(波長可変レーザの発振波長切り替え)によって確認していたが,動特性については不明であったので,現有の波長可変レーザに本研究によって整備するLiNbO3高速変調器とサンプリングオシロスコープを用いて,インバータ動作の動的特性(インバータ動作可能範囲のパルス強度とパルス幅依存性など)を測定して,インバータとしての動作可能速度を確認する.
ニフェジピン感受性歯肉培養線維芽細胞の増殖と細胞周期

本研究ではニフェジピン感受性(NIFr)および非感受性(NIFn)歯肉培養線維芽細胞を用いて,細胞周期と細胞周期制御因子の発現について検討した。細胞培養液中に10%血清を添加した場合,S期及びG2/M期への移行量はNIFrの方がNIFnに比べて多い傾向が見られたことから,NIFrとNIFnでは細胞周期上,異なった性質を有している可能性が示唆された。また,NIFnはNIFrに比較してp38MAPKの発現が多いことが認められ,アニソマイシンまたはIBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)で両細胞を刺激すると,NIFnでATF-2のリン酸化率がNIFrより高いことが認められたことから,NIFnはより強く細胞周期における抑制がかかっており,逆にNIFrは細胞周期が進みやすく増殖しやすい状況になっていることが考えられた。さらに,細胞周期およびサイクリン,サイクリン依存性キナーゼ(CDK)のmRNA発現に対するニフェジピン(NIF)とbFGFの影響を検討したところ,NIFは両細胞中のサイクリンA,B,D,Eに直接的には変化を与えないことが認められた。しかしながら,bFGFを作用させた場合,NIFrはNIFnと比較して,G0/G1期細胞の有意な減少とS,G2/M期細胞の有意な増加が認められた。また,両細胞共にbFGFの刺激によって,サイクリンD1,E,A,B1,CDK2,1 mRNA発現の亢進が認められたが,すべてのmRNA発現においてNIFrはNIFnより高い発現を示した。従って,NIFrはNIFnに比較してbFGFなど血清内の細胞成長因子に対する感受性が高いということが示唆された。申請者は,カルシウム拮抗薬による歯肉増殖の発症機序の解明のためにヒト歯肉培養線維芽細胞を用いて一連の研究を行ってきた。本研究では細胞周期がカルシウム拮抗薬による歯肉増殖にどのように関わっているか検討するため,ニフェジピン感受性および非感受性歯肉培養線維芽細胞の細胞周期をフローサイトメトリーを用いて解析した。ニフェジピン感受性および非感受性歯肉培養線維芽細胞を低濃度の血清(0.5%,DMEM-0.5)を含有する培養液中で培養することによって,arrestさせ,ついで,通常の血清量(10%,DMEM-10)を含有する培養液に交換した後,経時的に細胞を回収し,FACS CaliburによってDNA量を測定し,細胞周期上の分布を解析した。その結果,ニフェジピン感受性細胞では,DMEM-10に交換後15時間で,G_1期からS期への移行が見られ,21時間でG_2期への移行,さらに24時間でG_1期の増加が認められた。それに比較して,非感受性細胞ではG_1期からS期への移行に関しては,感受性細胞と同様の傾向を示したが,S期からG_2期への移行は24時間から認められた。したがって,S期の持続時間は感受性細胞(3時間)の方が非感受性細胞(6時間)に比べて,短い傾向が見られた。このことから,ニフェジピン感受性と非感受性細胞では細胞周期上,異なった性質を有している可能性が示唆された。ニフェジピン(NI)感受性培養歯肉線維芽細胞の増殖と細胞周期について検討した。NIF感受性患者から得られた歯肉線維芽細胞(NIFr)と非感受性患者から得られた歯肉線維芽細胞(NIFn)にNIの各種濃度を作用させ細胞増殖を調べると、従来報告されていた通り1μMのNIを作用させることによりNIFrで増殖が亢進したがNIFnでは変化が認められなかった。また、10μMのNIFを作用させると、NIFr、NIFnともに細胞増殖は亢進されなかった。

NIFr、NIFnにおける細胞周期に対するNIFの影響を検討した。細胞周期において、サイクリンが重要な機能を持っているが、サイクリンの阻害により細胞周期が停止することが明らかになっている。NIFrとNIFnとを比較すると、NIFnにおいてp38MAPKの発現が多いことが認められた。p38MAPKはサイクリンD1を阻害し、G1期で細胞周期を停止させることが明らかになっている。さらに、p38MAPKはM期でも細胞周期を停止させることが明らかになっている。これらのことから、NIFnはより強く細胞周期における抑制がかかっており、逆にNIFrは細胞周期が進みやすく増殖しやすい状況になっていることが考えられる。p38MAPKを活性化(リン酸化)するアニソマイシンでNIFrとNIFnとを刺激すると、NIFnでp38MAPKおよびp38MAPKでリン酸化されるATF-2のリン酸化率がNIFrより高いことが認められた。p38MAPKの活性化にcGMPを介する系があるので、cAMPおよびcGMPに作用するホスホジエステラーゼ阻害薬であるIBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)でNIFr、NIFnを刺激すると、同様にNIFnでp38MAPKおよびp38MAPKでリン酸化されるATF-2のリン酸化率がNIFrより高いことが認められた。以上の結果からNIFrおよびNIFnにはp38MAPKのカスケードが存在し、NIFnにより多く存在することが認められた。また、ニフェジピンが歯肉線維芽細胞(NIFrおよびNIFn)中のサイクリンA、B、D、Eに変化を与えないという結果も得ている。申請者はジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬のニフェジピンによる歯肉増殖症の発症機序の解明のため、ヒト歯肉培養線維芽細胞を用いて一連の研究を行なってきた。本研究では、ニフェジピン服用により、歯肉増殖症を発症した患者から得たヒト歯肉培養線維芽細胞(NIFr)と、歯肉増殖症を発症しなかった患者から得たヒト歯肉培養線維芽細胞(NIFn)を用いて、細胞周期および細胞周期に深く関与するサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)のmRNA発現について比較した。なお、細胞周期はフローサイトメトリー法(FACS Calibur, B-D Immunocytometry System)を用い、mRNA発現はRT-PCR法を用いて検討した。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)10ng/mlを細胞培養液中に作用させた場合、NIFrはNIFnと比較して、30-42時間でG0/G1期細胞が有意に減少し、それに伴ってS、G2/M期細胞が有意に増加した。また、NIFr、NIFnいずれの場合においても、bFCF(10ng/ml)の刺激によって、サイクリンD1、E、A、B1、CDK2、1 mRNA発現の亢進が認められた。これらmRNA発現の亢進はすべてのmRNAにおいてNIFrはNIFnより高い値を示した。これらの結果から、NIFrはNIFnよりもbFGFによってG0/G1期からS、G2/M期へと移行する細胞が多く存在し、さらに、bFGFによってNIFrはNIFnよりもサイクリンおよびCDK mRNA発現が亢進することが考えられた。従って、NIFrはNIFnよりもサイクリンやCDKの発現が亢進する結果として、bFGFなど血清内の細胞成長因子に対する感受性が高いということが示唆され、すでに我々が報告しているNIFrがNIFnより細胞倍加時間が短いという結果の一因となると考えられた。
ヒストンメチル化制御の異常による白血病発症機構の解析

我々はヒストン脱メチル化酵素であるFbxl10の造血幹細胞における高発現が白血病発症を誘導することを見いだした。この分子機構を解析する目的でFbxl10を高発現する造血幹細胞を用いてRNA-seq解析を行い、細胞内輸送に関わるneuron specific gene 2 (Nsg2)遺伝子および酸化的リン酸化に関わる遺伝子群の発現が亢進していることを見いだした。さらに、ChIP解析によりこれらの遺伝子はFbxl10の直接標的遺伝子であることを明らかとした。我々の結果は、ヒストンメチル化制御の異常による白血病発症機構に新しい知見をもたらしたものと考えられる。今年度は、Fbxl10トランスジェニックマウス(Tg)の造血細胞を用いて、Fbxl10の高発現の確認、ヒストンメチル化の変化、遺伝子発現変化、標的遺伝子の同定について検討を行った。まず、Fbxl10 Tgとコントロールマウスの造血幹細胞を用いてFbxl10 mRNAの発現解析を行ったところ、Tgの造血幹細胞においてコントロール造血幹細胞の約10倍の発現上昇を認めた。蛋白質レベルでこの上昇の確認を試みるため、Fbxl10 Tgに発症した腫瘍細胞に対して、Fbxl10 cDNAにタグとして用いた抗Flag抗体を用いてウエスタンブロット(WB)を行ったところ、目的の大きさのバンドを認め、腫瘍においてもFbxl10が高発現していることが明らかとなった。また、腫瘍のlineageを解析するために各種抗体を用いたFACSとJHおよびTCRβプローブを用いたSouthern blotを行い、腫瘍はmyeloidまたはB-cell性の腫瘍であることを明らかとした。また腫瘍細胞におけるヒストンメチル化の変化について、H3K36とH3K27の抗メチル化ヒストン抗体を用いてWBを行い、Fbxl10 Tgの造血前駆細胞において、H3K36のメチル化の低下を認め、Fbxl10はH3K36に対する脱メチル化酵素として機能していることが示された。さらに造血幹細胞を用いてトランスクリプトーム解析を行い、Fbxl10 Tgにおいては、Nsg2(Neuron specific gene 2)遺伝子と酸化的リン酸化経路の遺伝子群の発現が上昇していることを明らかとした。抗体を用いたChIP解析により、Fbxl10はNsg2遺伝子と酸化的リン酸化経路のいくつかの遺伝子に結合を認め、直接作用により遺伝子発現を亢進していると考えられた。我々は、骨髄異形成症候群および白血病で高頻度に欠失を認める第7番染色体長腕欠損の責任候補遺伝子を解析する過程で、ヒストン脱メチル化酵素をコードするFbxl10の過剰異常が白血病発症に関与していることを見いだした。さらに、Fbxl10を造血幹細胞で高発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作製し、Fbxl10 Tgマウスが生後約1年で白血病を発症した。この申請では、Fbxl10の過剰発現が白血病発症に関与する分子機構について解析を行った。コントロールマウスとFbxl10 Tgマウスの造血幹細胞を単離し、次世代シークエンサーを用いて網羅的なRNA発現解析を行った。得られた結果をGene set enrichment analysisにより解析を行ない、Fbxl10 Tgマウスの造血幹細胞においては、酸化的リン酸化経路の遺伝子群の発現が上昇していることを見いだした。そこで造血幹細胞におけるATPとROSの産生を解析したところ、Fbxl10 Tgマウスの造血幹細胞においてはATP産生が有意に増加しているがROS産生は上昇しておらず、Fbxl10過剰発現は純粋なエネルギー増加により造血幹細胞増殖を促していると考えられた。さらに、Fbxl10 Tgマウスの造血幹細胞において数十倍の発現上昇を認めたNsg2 (Neuron specific gene 2)遺伝子を正常造血幹細胞に導入したところ、サイトカイン存在下で分化障害を認め、移植マウスにおいては未熟な分化細胞の増加を認めた。これらの結果を総合すると、Fbxl10の造血幹細胞における過剰発現は、エネルギー代謝亢進と分化障害を誘導し、これらの経路を介して白血病発症に寄与していると考えられた。我々の結果は、ヒストン修飾因子の脱制御による白血病発症機構に、新しい知見をもたらしたものと考えられる。分子生物学Fbxl10 Tgの造血幹細胞と腫瘍細胞においてFbxl10の高発現を確認し、さらにH3K36を含めたヒストンリジン残基のメチル化の変化についても確認出来た。また、Fbxl10 Tgおよびコントロールの造血幹細胞を単離し、トランスクリプトーム解析により網羅的遺伝子発現解析を行いNsg2遺伝子と酸化的リン酸化経路の遺伝子群の発現上昇が確認出来た。今後は、Fbxl10の過剰発現によるH3K36のメチル化の低下とNsg2遺伝子および酸化的リン酸化経路の遺伝子群の発現上昇についてさらに解析を行い、Fbxl10 Tgの白血病発症における機能的関連について明らかにする。
象牙質表面に形成した生体ガラス被膜による象牙質知覚過敏症抑制法の開発

生体ガラス45S5 bioglassの象牙質知覚過敏症に対する治療への応用についての基礎的検討を行った。すなわち、45S bioglassをペースト状にし、抜去歯の象牙質面に塗布し、硬化させたところ、象牙質と連続した強固な膜の形成が、走査電子顕微鏡および透過前歯顕微鏡による観察で確認された。また、塗布したペーストに一定の条件で炭酸ガスレーザー照射を行うと極めて短時間に膜が形成されるが、レーザー照射をしなくても、時間はかかるものの同様な膜が形成されることが確認された。45S5 bioglassによって形成された被膜によって、象牙質は完全に被覆され、象牙細管の開口は認められなかった。これによって、象牙質知覚過敏を引き起こす様々な刺激を、歯根面の露出した象牙質から遮断できることが期待される。また、この被膜は耐摩耗性に優れていることを、歯ブラシ摩耗試験によって確認した。一方、45S5 bioglassの生体適合性について、ラット歯髄由来の細胞を用いて、細胞毒性試験によって評価を行ったところ、グラスアイオノマーセメントや水硬性の仮封用セメントに比べて低い細胞毒性を示し、高い生体適合性を有することが明らかになった。以上の、in vitroにおける研究によって、象牙質知覚過敏症に対して、生体ガラス45S5 bioglassをペースト状にして塗布する治療が有効である可能性が極めて高いことが明らかとなり、今後の臨床的検討を行うに当たっての有益な知見をえることができた。45S5BioglassはNa_2O、CaO、P_2O_5、SiO_2を含む、平均5μmの生体材料である。この45S5をリン酸溶液と混和することにより、象牙質表面上にリン酸塩を形成させることができる。この化合物はリン酸カルシウム層と呼ばれ、このリン酸カルシウム層の象牙質知覚過敏症に対する効果を評価する為、以下の実験を行った。1.「象牙質知覚過敏症治療における45S5リン酸カルシウム層の口腔内唾液にたいする耐久性」。2.「45S5リン酸カルシウム層の耐摩耗試験」。3.「45S5リン酸カルシウム層のPHの違いによる耐溶解性」。4.「CO_2レーザー照射後の45S5リン酸カルシウム層の物性の変化」5.「CO_2レーザー照射後の45S5リン酸カルシウム層と象牙質界面のTEM観察」6.「45S5バイオグラスの細胞毒性」である。これらの実験で得られた結果は第14回国際エジプト歯科学会(Egyptian Dental Association 14^<th> International Dental Congress : The title; Dentin Hypersensitivity)にて発表を行った。またその後得られた結果は、国際歯科学会(IADR : International Association of Dental Research in Barcelona)にて発表予定である。さらにJournal of adhesive dentistryに論文が掲載予定である。これらの結果から象牙質知覚過敏症の治療に45S5リン酸カルシウムが有効であると思われるが、今後さらなる検証が必要である。
脳傷害時のアストロサイト活性化におけるエンドセリン受容体の役割

1.エンドセリンによる神経栄養因子産生:ラット培養アストロサイトにおいてエンドセリン(ET)は、神経栄養因子であるGDNFおよびBDNFの転写を促進した。ET刺激はこれら神経栄養因子のmRNAおよびペプチド量を増加させた。ETによるGDNF産生は、細胞内Ca除去やERKの阻害で抑制されたが、グルココルチコイドやpyrrolidine dithiocarbamateでは阻害されず転写因子NFkBを介さない新たな機構であることが示唆された。また、BDNF産生については神経細胞で報告されているCa依存的な機構ではないことが示された。ラット脳室内へのET受容体刺激薬Ala-ET-1の投与は、投与7日で海馬と大脳皮質のGDNFmRNA量と線条体でのBDNFmRNA量を増加させた。免疫組織染色は、これらの産生がGFAP陽性細胞即ち活性化アストロサイトにより生じていることを示した。以上の結果は、アストロサイトのET受容体刺激が、神経栄養因子産生を促す薬物の標的になり得る可能性を示す。2.エンドセリンによるアストロサイト増殖の機構:ETの増殖作用をfocaladhesion kinase(FAK)との関連で研究し以下の結果を得た。ETは、培養アストロサイトでFAK活性化を促進した。外来野生型FAKの導入は、細胞増殖の促進を起こす一方、ETによる増殖は、dominant-negative型FAKの導入により阻害され、アストロサイトの増殖におけるFAKの関与が示唆された。細胞周期調節タンパクcyclin Dに対し、野生型FAKは、cyclin D3の発現を起こした。またdominant-negative型FAKは、ETによるcyclin D3発現を阻害した。これらの結果は、ETによるアストロサイトの増殖がFAKを介したcyclin D3発現により調節されていることを示唆する。エンドセリンによる神経栄養因子産生:ラット培養アストロサイトにおいてエンドセリン(ET)は、神経栄養因子であるGDNFおよびBDNFの転写を促進した。この作用は、ET_B受容体拮抗薬であるBQ788により阻害された。ラット脳室内へのET_B受容体刺激薬Ala-ET-1の持続的投与は、線条体でのGDNFのmRNA量を増加させた。これらの結果は、脳傷害時のET_B受容体活性化が、これら神経栄養因子を介して神経保護的に働くことを示唆する。エンドセリンによるアストロサイト増殖の機構:ETの増殖作用をfocal adhesion kinase(FAK)との関連で研究し以下の結果を得た。ETは、培養アストロサイトでFAK活性化の指標であるチロシン燐酸化を促進した。このETの作用は、cytochalasin処置により消失することを明らかにし、FAKの活性化には細胞骨格アクチンの裏打ちによる接着斑の形成が必要であることを示した。培養アストロサイトへの外来野生型FAKの導入は、細胞増殖の促進を起こした。一方、ETによるアストロサイトの増殖は、cytochalasin処置およびdominant-negative型FAKの導入により阻害された。細胞周期調節タンパクであるcyclin発現に対するETの作用を検討し、ETはcyclinD1およびD3の増加を起こすことを示した。ETによるcyclinD3の増加は、cytochalasin存在化では生じなかったが、cyclinD1の増加は認められた。野生型FAKを導入されたアストロサイトは、cyclinD3の発現を起こしたが、cyclinD1発現は起こさなかった。これらの結果は、ETによるアストロサイトの増殖がFAKを介したcyclinD3発現により調節されていることを示唆する。エンドセリンによる神経栄養因子産生:前年度に引き続き培養アストロサイトからのエンドセリンによるGDNFおよびBDNFの産生促進機構を検討した。エンドセリン刺激はこれら神経栄養因子のmRNAおよびペプチド量を増加させた。エンドセリンによるGDNF

産生は、細胞内Ca除去やERKの阻害で抑制されたが、グルココルチコイドやpyrrolidine dithiocarbamateでは阻害されず転写因子NFkBを介さない新たな機構であることが示唆された。また、BDNF産生については神経細胞で報告されているCa依存的な機構ではないことが示された。ラット脳室内へのエンドセリン受容体刺激薬Ala-ET-1の投与は、投与7日で海馬と大脳皮質のGDNFmRNA量と線条体でのBDNFmRNA量を増加させた。免疫組織染色は、これらの産生がGFAP陽性細胞即ち活性化アストロサイトにより生じていることを示した。以上の結果は、アストロサイトのエンドセリン受容体刺激が、神経栄養因子産生を促す薬物の標的になり得る可能性を示す。エンドセリンによるアストロサイト増殖の機構:ETの増殖作用をfocal adhesion kinase(FAK)との関連で研究し以下の結果を得た。細胞周期調節タンパクcyclinDのアストロサイトにおける発現機構について検討し、野生型FAKを導入されたアストロサイトは、cyclin D3の発現を起こすが、cyclin D1発現は起こさないことが示された。またdominant-negative型FAKは、エンドセリンによるcyclin D3発現を阻害した。これらの結果は、ETによるアストロサイトの増殖がFAKを介したcyclin D3発現により調節されていることを示唆する。
終末期ケアマネジメントと多職種チームの意思決定に関する研究

フランスとイタリアの終末期ケアの現状と多職種による意思決定支援についてヒアリング調査を行い、公開されている各種調査データを参考に分析した。フランスでは、高齢者施設と緩和ケアモバイルチームなど6か所のヒアリング調査を行った。その結果、1レオネッティ法(尊厳死)に則って、多職種での意志決定支援を実施していた、2国民の半数は事前指示書の作成を躊躇しており、その理由は「家族の決断を信頼している」と「考えたくない」であった、3緩和ケアモバイルチームによる相談・助言は高齢者施設内の看取り率を高める、4かかりつけ医を重層的に支える支援体制が有効、5緩和ケアの研修の制度化が進み、その中でもコーディネーター看護師等の配置が緩和ケアの質を向上させていた。イタリアでは、ボローニャ市内にある緩和ケアネットワークセンター、イタリア癌協会など6か所のヒアリング調査を行った。その結果、12018年に制定された事前指示書作成に関する法律は、健康な人を対象にしているため、病院や高齢者施設では、個別治療計画で対応している、2緩和ケアネットワーク形成は2段階で実施されている、3かかりつけ医の看取り経験は少なく、支援体制も脆弱である、4イタリア人は死に対する恐怖心が強く、死をタブー視しているため、事前指示書の普及には時間を要する、5緩和ケアの研修制度が未整備のため、職種による差が大きいなどであった。両国に共通していることは、1意思決定支援を支える法整備が進められている、2ネットワーク形成の構築に舵を切っている、3がん患者に対する支援が中心で、非がん患者への支援は道半ばであることである。また、先行研究を参考に地域終末期ケアマネジメント指標を作成し、A県にあるB市の地域マネジメント事業で展開し、指標の修正を行った。指標は、6領域25項目である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。高齢者の終末期ケアマネジメントと多職種チームの意思決定を明らかにする目的で、3つの調査に取り組んだ。調査1:意思決定プロセスに影響する要因の多面的分析では、意思決定プロセスと多職種チームの関与について、2つの調査を行った。1国内外の文献学的検討により、研究の到達点と課題を整理した。2現地調査(フランス・イタリア)を実施した。フランスでは介護職の資格再編が起こり、医療行為が可能な介護職が誕生し、多職種チームに加わった。さらに、尊厳死法であるレオネッティ法が改正され、事前指示書を義務付けるなど、より丁寧な意志決定がされるようになった。イタリアではボローニャ地域医療公社、癌協会、ホスピスでヒアリング調査を行ったが、いずれも多職種チームによる意思決定を実施していた。両国ともにコーディネーターは医師と看護師であった。調査2:死亡前2週間の症状マネジメントと多職種チームの役割と機能では、フランス終末期ケア研究センターが開発した調査票を日本語に翻訳し、さらに日本の実情に合わせた項目を追加した。さらに、本調査票の妥当性を確認するため、多職種数名によるプレ調査を行い、調査票を一部修正した。その結果、5領域50項目に整理した。調査3:終末期ケアの意思決定に資する多職種連携教育プログラム評価では、1多職種参加型の事例検討会を実施した。研修を積んだ助言者数名(薬剤師や看護師等)とファシリテーターがディスカッションをリードし、多面的な意見交換による豊かな事例検討会の方法を試みた。2フランスにおける医療従事者の連携教育プログラムについて、パリ大学医学部のPACES共通課程と、在宅医療・介護サービス会社全国連盟の独自プログラムについてヒアリングを行った。12ともにプログラムは緒についたばかりであり、評価まで至らなかった。高齢者の終末期ケアマネジメントと多職種チームの意思決定を明らかにする目的で、3つの調査に取り組んでいる。調査1:意思決定プロセスに影響する要因の多面的分析では、意思決定プロセスと多職種チームの関与について、2つの調査を行っている。1国内外の文献学的検討により、研究の到達点と課題を整理し、現在レビュー論文としてまとめている。2フランス新レオネッティ法と、イタリア癌協会が推奨している意思決定プロセスについては、現在情報収集の段階である。平成29年に現地ヒアリングを予定しているので、これらの知見をまとめ、現状と課題を整理したい。調査2:死亡前2週間の症状マネジメントと多職種チームの役割と機能では、質問紙を使ってのプレ調査を終了し、調査票を一部修正した。現在は、調査フィールドの確保をしている段階である。現時点で内諾を得ているのは、A県内の特別養護老人ホーム数十か所である。訪問看護や医療療養病床を管轄する団体への調査依頼を継続している。フランス(パリ・リヨン)での事例調査については、すでにフランス終末期ケア研究センターの内諾を得ている。研修を積んだ助言者数名とファシリテーターがディスカッションをリードし、多面的な意見交換による事例検討会の方法を試みた。平成28年は試行段階であり、事例の書式や運営方法を再検討している段階である。助言者(薬剤師等8名)については、研究協力への内諾を得ている。2フランスにおける医療従事者の連携教育プログラムについては、大学や職能団体へのヒアリングを継続しているが、わが国と同様に、プログラムは緒についたばかりであり、評価まで至っていないのが現状である。フランス看護協会などヒアリング対象を広げる準備をしている。

高齢者の終末期ケアマネジメントと多職種チームの意思決定を明らかにする目的で、3つの調査に取り組んだ。調査1:終末期ケアマネジメントの意思決定プロセスと多職種チームの関与について、6つの多職種チームへのヒアリングを行った。その結果、1ガイドラインの利用率は低い、2意思決定の手段としての、事前指示書やACPへの活用状況は低く、カンファレンスを重視している、3疾患や場によって看取りのプロセスは異なるため、一つのガイドラインでは限界がある、4ガイドラインに準拠した工程表が求められていることが明らかになった。調査2:死亡前2週間の症状マネジメントと多職種チームの役割と機能では、フランス終末期ケア研究センターが開発した調査票を日本語に翻訳して、予備調査を行った。その結果、5領域50項目に整理し、5か所の特養で調査を実施した。現在分析中であるが、調査対象が少ないことから、統計処理に限界があった。次年度は調査対象を増やし、幅広い視点での分析を試みたい。調査3:終末期ケアマネジメントにおける多職種連携教育の有用なプログラム・教材の開発と評価では、「多職種参加による事例検討会」を4回実施し、評価した。熟達したファシリテーターと助言者を配置し、ディスカッションの活性化を図った。評価項目は1多職種チームに関する新たな気づきや課題はあったか等、5項目を5件法で回答を得た。その結果、全項目の平均値は4.0で、学びの獲得に繋がっていることが示唆された。イタリア癌協会の緩和ケアに関するヒアリング調査では、1在宅サービスの平均利用期間は132日、患者一人あたりにかかる費用は2,280ユーロであり、これは医療機関に入院した場合の3分の1の費用であること、2ボランティアの人材育成プログラムについて情報提供を得た。高齢者の終末期ケアマネジメントと多職種チームの意思決定を明らかにする目的で、3つの調査に取り組んでいる。調査1:終末期ケアマネジメントの意思決定プロセスと多職種チームの関与について、多職種チームへのヒアリングを実施した。その結果、1疾患別・場所別ガイドラインの作成と、2ガイドラインに準拠した工程表が求められているなど、新たな研究課題が明らかになった。そのため、対象を「がん」「認知症・老衰」「心臓・肺等の臓器不全」の3種類に類型化し、療養支援の現状と課題、多職種チームで活用しているツール等を明らかにする。これまでの研究成果で、意思決定を支えるツールを開発しているので、これらを用いた調査を進めている。調査2:死亡前2週間の症状マネジメントと多職種チームの役割と機能では、フランス終末期ケア研究センターが開発した調査票を日本語に翻訳した、5領域50項目の調査を実施している。現在調査結果を分析中である。また、調査対象が少ないので、次年度は医療療養病床にも広げていきたい。調査3:終末期ケアマネジメントにおける多職種連携教育の有用なプログラム・教材の開発・評価では、「多職種参加による事例検討会」を2年間継続している。プログラムの一定の評価は出ているが、詳細な分析には着手していない。
運動無関心および身体不活動に対する運動疫学研究

本研究では、身体不活動と健康事象との関連性、運動関心状態からの離脱に関連する要因を検討した。その結果、男子大学生のメンタルヘルス低下に対し身体不活動は有意でないが高強度身体活動量が防御因子となること、座位時間が長さと運動無関心状態には関連があり、スポーツ系の課外活動が運動無関心状態から脱するきっかけとなりうること、加速度計で評価した座位時間は中年者の心血管代謝危険因子と有意な正の関連性を有し高齢者では肥満度との間に中強度以上の身体活動量を調整しても有意な関連性が認められること、質問紙法で評価した座位時間が4時間以上の者では骨格筋率が低く、体脂肪率が高いことを明らかにした。3年計画の2年目にあたる本研究事業では、運動不足者(身体不活動者)や運動無関心者に対する研究を以下のように進めてきた。研究代表者の山津は、昨年度までにベースラインデータを構築した大学生集団約1000名の追跡調査を実施した。その約半数にあたる559名に対する追跡調査を解析した結果、男子大学生ではベースライン時の高強度身体活動量が多い者ほど半年後のメンタルヘルス不良者が少ないこと、また、同じく男子大学生でベースライン時の運動自己効力感が高い者ほどメンタルヘルス不良者が少ないこととの結果が認められ、査読付の学術論文に掲載されるなどの成果をあげることができた。以上のことから、運動不足(身体不活動者)や運動に対する効力感の欠如が将来のメンタルヘルス不良の予測因子となりうることを明らかにした。次に、分担研究者の熊谷らも、地域在住高齢者と中年勤労者の2つのコホートの追跡調査を着実に実行することができた。そのコホートからの解析結果をもとに、地域在住の中高齢者の握力レベルと総死亡や数種の死因別死亡が統計学的に有意に関連することを見出した。また、地域在住高齢者コホートの解析結果から、認知症の予備軍と考えられている軽度認知障害を有する者は比較的多く存在するが、身体活動量や身体不活動量の高低と認知機能のレベルには統計学的な関連性が認められないという知見を明らかにした。以上のように、申請時に掲げた研究目的に対し、大学生、中年勤労者、地域在住高齢者の追跡調査を着実に実施し、最終年度に更なる研究知見を生み出す研究環境を整備できたと考えている。我々を含めた健康科学研究者は、運動などの健康行動の改善に関心の高い集団への介入法を確立させてきたが、運動行動の改善に関心を示さない運動不足者(身体不活動者)も全国民の約3割と多い。そこで、本研究では、身体不活動者や運動無関心者に対する研究を以下のように検討し進めてきた。まず、研究1では、運動行動変容ステージの前熟考ステージ(運動無関心)と関連する要因を明らかにするために、大学1年生566名を対象に質問紙を用いた横断調査を実施した。その結果、前熟考ステージの状態にある者は16.4%であり、ロジスティック回帰分析の結果、女性であること、総身体活動量・高強度の身体活動量・中等度の身体活動量が少ないほど、平日や休日の座位時間が長くなるほど前熟考ステージである可能性が高くなることが明らかとなった。次に、研究2では、研究1で前熟考ステージの状態にあった学生を6ヵ月後まで追跡した、前熟考ステージから脱し運動への関心を高めたり、運動開始に関連する要因の検討を行った。その結果、6ヵ月後に33.3%が前熟考ステージを脱していたこと、またロジスティック回帰分析の結果、ベースライン時の総身体活動量や歩行活動量が少ないものほど、運動系のサークルに所属したものほど前熟考ステージから脱する可能性が高まることが明らかとなった。最後に、研究3では、研究1の大学1年生を6ヵ月後まで追跡した結果、高強度の身体活動量が多い者ほど6ヵ月後のメンタルヘルス不良者は少ないことが明らかとなった。しかし、身体不活動とメンタルヘルス不良との関連性に有意差は認められなかった。以上の結果より、テレビ視聴時間などに代表される身体不活動は運動行動変容の意欲に関連性があること、身体不活動量が少ないものや運動系のサークルへの所属が運動への関心を高める可能性をもつことが考えられた。本研究事業では、運動不足者(身体不活動者)や運動無関心者に対する研究を以下のように進めてきた。研究代表者の山津は、運動無関心者への効果的なアプローチ法を検討するための第一ステップとして、大学1年生約1000名の運動行動ステージの横断的なデータセットを整備した。次年度以降には、本コホート集団に対し定期的に追跡調査を実施する体制を構築した。運動無関心者は運動教室などの健康支援プログラムの募集の呼びかけをおこなっても反応しにくく、運動介入の対象とすることがきわめて難しい集団として、これまでの介入研究では研究対象になりえなかった集団である。

本研究では、運動無関心者が運動への関心を高めるのに関連する要因を明らかにする縦断的な解析を進め、運動無関心者を減らすアプローチ法を明らかにしたい。次に、分担研究者の熊谷は、運動習慣とは独立して生活習慣病に関連すると報告されはじめている身体不活動に関する研究を進展させている。特に研究初年度の平成24年度には、地域在住高齢者約1000名および職域中高年者約1400名のベースラインデータを整備し、今後の追跡調査の体制を整えることができた。注目すべき点は、本コホート集団を用いながら、身体不活動の客観的かつ定量的な評価指標を確立すべく検討を進めていることである。今年度は客観性を重視し、3軸加速度計を用いた定量化の方法論を検討し、身体不活動とメボリックシンドローム危険因子やメンタルヘルス指標との因果関係の解明に向けた分析作業につなげる準備を進めている。申請時に計画していた研究課題が、ほぼ想定通り順調に進んでいると認識している。大学生、中年勤労者、地域在住高齢者のベースラインのデータセットが分析可能なレベルまで完成度を高め、今年度に入り回収した追跡調査も着々とデータベース化がほぼ完成している。一部の解析可能なデータセットを用いて得られた解析結果も随時学会発表しし、関連する研究者とのディスカッションを深めるなど、運動不足と健康事象に関連する知見は順調に出すことができている。また、本研究に関連した招待講演の業績もえており、本研究への関心も小さくないとの実感を得ている。本年度は研究1年目であるにもかかわらず、当初予定していたコホート集団のベースライン(大学生約1000名、職域中高年者約1400名、地域在住高齢者約1000名)の整備を進めることができ、今後の追跡調査の道筋を作ることができた。交付申請時の計画をほぼ達成できたと考えている。3つのコホートの追跡調査は順調に進んでおり、追跡調査とデータベースの構築は現在の体制で進めるべきだと考えている。今後は3つのコホートで解析可能な健康事象に対し解析を進め、国内外の査読付き学術雑誌への投稿を増やしていくことに重点を置きたいと考えている。特に、運動無関心者に対する知見の公表が十分ではないため、運動無関心者に対する解析を進め、その方面の研究業績を積極的に公表していきたい。研究2年目以降は、整備したコホート集団の追跡調査を実施していかなければならない。コホートの研究の質を大きく左右する追跡率を落とすことのないように、きめ細かな測定会の実施が不可欠である。また、得られた成果を即時に国内外で発表していきたいと考えている。次年度が最終年度となるので、これまでの研究成果や今後の解析結果を積極的に国際学会や国内外の査読付き学術雑誌に公表していく必要がある。そのため、最終年度は国内外の学会発表のための費用、また論文投稿に要する研究費の支出が中止となると想定している。コホート研究の質を落とさないために、今後は整備したコホート集団の追跡率を一定程度に袂必要がある。そのためにも、研究2年目の平成24年度は、測定者の質と量的側面の確保は不可欠であり、測定者雇用の人件費が最も要する費用である。また、コホート集団の横断的な解析結果や追跡調査後の成果を国内外の学会で公表していくための旅費を人件費に次ぐ費用と予定している。
T細胞の細胞極性とユーロポット形成におけるERMタンパク質Ezrinの役割

遊走中のリンパ球においては前後軸に沿って非常に明確な細胞極性が形成されるが、その極性形成の分子メカニズムは明らかにされていない。特に細胞後方にユーロポッドという特徴的な半球状の構造体が一つだけ形成され、細胞極性の成立に深く関わっている可能性が高いが、その構造の分子基盤についてもこれまで詳しくは解析されていなかった。ユーロポッドにはEzrinと呼ばれる細胞膜-骨格架橋タンパクとそれに結合するCD44といった膜タンパクが集積し、ユーロポッド分子複合体の一部を成していることから、これらの分子が解析の手掛かりになるとと考えられる。恒常的にユーロポッドを形成するEL4.G8リンパ腫細胞を用いて、Ezrinの細胞内局在とユーロポッド形成との関わりを検討した。EzrinはC末端のスレオニン残基のリン酸化により不活性型/活性型が制御され特にリン酸化型が膜-骨格架橋機能を有するが、擬似リン酸化型変異T567DEzrinはユーロポッドに限局して存在し、発現細胞はユーロポッドが肥大したほか細胞遊走能が増加した。一方、効果的な細胞遊走が起るためには、細胞体の後方が連続的に収縮する必要がある。一般的に、細胞収縮にはRhoGTPaseとその下流のキナーゼROCKが重要であることが知られているが、ドミナントネガティブT19NRhoの過剰発現やROCKの阻害剤Y27632処理はEL4.G8細胞のユーロポッドを破壊し、細胞遊走を阻害した。また、Rho活性化因子Dblはリン酸化型Ezrinに選択的に結合し、Rho活性可能を示した。以上のことから、Ezrinのリン酸化による膜-骨格架橋機能およびRho-ROCKシグナル伝達経路との連携がリンパ球の細胞極性とユーロポッド形成に重要な役割を担っていることが示唆された。遊走中のリンパ球には前後軸に沿って非常に明確な細胞極性が形成されるが、その極性形成の分子メカニズムは明らかにされていない。特に細胞後方にはユーロポッドという特徴的な半球状の構造体が一つだけ形成され、細胞極性の成立に深く関わっている可能性が高いが、その構造の分子基盤についてもこれまで詳しくは解析されていなかった。我々はGFPを融合したEzrinの様々な変異体の発現ベクターを作製し、恒常的にユーロポッドを形成するEL4.G8リンパ腫細胞を用いて、Ezrinの細胞内局在とユーロポッド形成との関わりを検討した。EzrinはC末端のスレオニン残基のリン酸化により不活性型/活性型が制御され特にリン酸化型が膜-骨格架橋機能を有するが、擬似リン酸化型変異Ezrinはユーロポッドに限局して存在し、発現細胞はユーロポッドが肥大したほか細胞遊走能が増加した。一方、非リン酸化型は細胞質に均一に存在したほか、野生型はユーロポッドに集積は見られるもののともに形質への影響はほとんど認められなかった。セリン/スレオニンリン酸化酵素の阻害剤であるスタウロスポリンはEL4.G8細胞のユーロポッドを破壊し、Ezrinの局在を阻害する。擬似リン酸化型Ezrin発現細胞ではスタウロスポリン処理によってユーロポッドは消失するが、CD44-Ezrin複合体が半球状に局在し細胞膜極性が保たれていた。また、この現象はアクチン結合能を欠損した擬似リン酸化型やアクチン細胞骨格を破壊するサイトカラシン処理では見られなかったことから、アクチン細胞骨格に依存していると考えられる。以上のことから、Ezrinのリン酸化による膜-骨格架橋機能がリンパ球の細胞極性とユーロポッド形成に重要な役割を担っていることが示唆された。

以上のことから、Ezrinのリン酸化による膜-骨格架橋機能およびRho-ROCKシグナル伝達経路との連携がリンパ球の細胞極性とユーロポッド形成に重要な役割を担っていることが示唆された。
脂質代謝と小胞体ストレスをつなぐCREBHの非アルコール性脂肪肝発症における役割

本課題ではCREBHが生活習慣病、特に非アルコール性脂肪肝の発症・進展にどのように関わっているかを検討した。CRISPR/Cas9システムを用いたCREBH肝臓特異的KO(LKO)マウスの作成に成功した。このマウスは絶食時に血中脂質の明らかな上昇を呈した。その原因の一つに脂肪酸・コレステロール合成の発現を支配する転写因子SREBPの上昇にあることを明らかにした。非アルコール性脂肪肝のモデルであるメチオニン・コリン欠損食をLKOマウスに負荷すると早期に激しい肝障害を呈した。本課題では新たな遺伝子改変マウスの作成方法を確立し、CREBHの欠損が非アルコール性脂肪肝を誘発させることを明らかとした。非アルコール性脂肪肝をマウスで再現するためには、通常、メチオニン・コリン欠損(MCD)食を8週間摂取させる必要がある。しかしながら、CREBHノックアウトマウスでは4週間ですでに病態が形成されていた。さらに、摂取期間を8週間に伸ばすと、肝臓機能が破綻してしまう結果を得た。病理所見としては、ノックアウトマウスでは炎症が惹起されており、マクロファージの浸潤が顕著にみられる。加えて炎症が発端となり、明らかな線維化も観察できている。遺伝子発現を検討したところ、マクロファージの浸潤によるものか炎症系サイトカイン、繊維化マーカーの発現が著しく増加していた。今後はさらに詳細な解析を行い、CREBHは小胞体ストレス遺伝子であるという報告もあることから、小胞体ストレスとの関連も視野にいれ解析を行う予定である。CREBHは肝臓と小腸に発現する転写因子であり、栄養代謝に関与することが今までの研究で明らかとなっている。本研究ではCREBHの非アルコール性脂肪肝に与える影響について解析を行っている。肝臓と小腸にCREBHは発現することから組織特的にCREBHを欠損するマウスをCRISPR/Cas9systemを用いて作成した。肝臓特異的CREBH欠損(CREBH LKO)マウスを非常に短期間で作成することができた。このマウスは絶食時に高トリグリセライド・高コレステロール血症を呈し、その際、肝臓では脂肪酸酸化遺伝子の発現低下、LPL活性を上昇させるアポリポタンパクの発現低下、コレステロール合成系遺伝子の上昇があり、これら変化が血中脂質の上昇を引き起こしたと考えられた。さらに、このマウスにメチオニン・コリン欠損(MCD)食を負荷したところ、著しい肝障害を示した。肝臓組織標本から明らかなマクロファージの浸潤、組織構造の崩壊、繊維化が観察された。遺伝子発現解析では炎症、繊維化のマーカー遺伝子の発現が有意に上昇しており、この変化が肝障害に結びついていると想定された。組織特異的なCREBH欠損マウスの作成が予定よりも早く作成でき、CREBHの欠損が非アルコール性脂肪肝を引き起こす結果が得られている。今後は分子メカニズムにどれだけ踏み込めるかが課題になる。すでに本年度の成果は論文に投稿済みである。小胞体ストレスにより活性が誘導するとされている転写因子CREBHの肝臓欠損マウスは食事誘導性の非アルコール性脂肪肝の病態を悪化させることを新たに見出した。CREBHは肝臓、小腸にのみ発現する転写因子である。しかし、現在までに全身の欠損マウスは作成されていたが、組織特異的なノックアウト(KO)マウスは作成されていなかった。本課題ではCRISPR/Cas9システムを用い、CREBHfloxマウスを作成後、肝臓特異的Cre Tgマウスと交配し、肝臓特異的CREBH KO(LKO)マウスを作製した。このマウスは正常(WT)マウスと比べ、血中脂質(トリグリセライド、コレステロール、脂肪酸)で有意な高値を示した。しかし、肝臓中の脂質量には違いがなかった。LKOマウスではトリグセライドのクリアランス能が明らかにWTマウスに比べ低下していた。肝臓の遺伝子発現でLPL活性を上昇させるApoA4、ApoA5、Apoc2が低下したことに起因している。また、脂肪酸酸化の調節因子PPARa、Cpt1aが低下していたことも原因の一つと考えられた。さらにLKOマウスにメチオニン・コリン欠損食を負荷し、非アルコール性脂肪肝を発症させた。KOマウスでは正常(WT)マウスに比べ著しい脂肪肝、肝炎を呈し、肝臓でのCREBH欠損が非アルコール性脂肪肝を惹起することを明らかにした。その際、肝臓での遺伝子発現はCREBH KOマウスでは脂質合成遺伝子、炎症マーカーの発現上昇は軽微であったのに対し、繊維化マーカー(Tgfb1、Acta2、Col1a1)の増加が顕著であった。結果として、LKOマウスでは肝炎、肝障害が悪化した。CREBH

欠損により著しく非アルコール性脂肪肝が悪化することを現在までに明らかにできている。加えて、その際のメカニズムについても解析の目処が立っている。予定以上に研究は進んでいる。今後はCREBH欠損による病態形成に関わる分子の特定が必要となる。CREBHはPPARaとの相互作用がある。そのPPARaも非アルコール性脂肪肝との関わりが明らかとなっている。CREBHKOマウスにPPARaアゴニストを投与し、病態の改善があるかを検討する。PPARa依存的、非依存的な効果が存在するのかが明らかにできる。また、CREBHと相互作用しうる転写因子を検索し、転写因子間の相互作用から病態形成の謎を解く予定である。応用健康科学CREBH欠損による非アルコール性脂肪肝の悪化がどの臓器が起因しているかを明らかにする。現在、使用するCREBHノックアウトマウスは全身でCREBHを欠損している。しかしながら、CREBHは肝臓、小腸の2つの臓器で発現しており、栄養吸収、栄養代謝のどちらからの影響であるかがはっきり出来ていない。そのため、CRISPR/Cas9システムを使い、組織特異的ノックアウトマウスを作成している。このマウスができれば、さらに非アルコール性脂肪肝での組織特異的なCREBHの機能について明らかにできる。
母体血中胎児DNAが自己免疫疾患の原因か?-マイクロキメリズムからのアプローチ

哺乳類の生殖において、母体と胎児の間にはマイクロキメリズムが生じる。本研究では、マイクロキメリズムと自己免疫疾患や妊娠中の免疫調節の間に関連があるか調べた。そのため、自己免疫疾患患者や不育症患者血清中のキメラ細胞由来のDNAおよびmRNA流入量を定量した。その結果、強皮症患者からはマイクロキメリズムが検出され、その他の疾患からはほとんど検出されなかった。マイクロキメリズムは強皮症と関連がある。本研究の主な目的は、自己免疫疾患患者血清中のキメラ細胞由来のDNAおよびmRNA流入量を定量し、マイクロキメリズムと自己免疫疾患の関連を明らかにすることである。そのため、長崎大学医学部・歯学部附属病院の皮膚科および内科膠原病班の協力を得て、自己免疫疾患患者の検体約50例を採取し集積した。集積した症例について、DNAについてDSY1遺伝子およびSRY遺伝子をターゲットとしたTaqManプローブを作成し、Roche AppliedScience社のLightCycler 480で定量的PCRを行った。その結果、現在までのところ強皮症症例の約25%にマイクロキメリズム由来のDNAが検出された。強皮症以外の自己免疫疾患およびからは今までのところ、マイクロキメリズム由来のcf社DNAは検出されていない。この結果、強皮症にはマイクロキメリズムの強い関与が考えられた。今後、マイクロキメリズムが存在した例を中心にキメラ細胞由来のmRNA流入量を測定する予定である。そのため、長崎大学医学部・歯学部附属病院の皮膚科および内科膠原病班の協力を得て、強皮症40例、強皮症以外の自己免疫疾患例22例を集積した。また長崎大学病院産婦人科において、同意の得られた習慣性流産と不育症の方の患者血清を23例集積した。集積した症例について、DNAについてDYS1遺伝子およびSRY遺伝子をターゲットとしたTaqManプローブを作成し、Roche AppliedScience社のLightCycler480で定量的PCRを行った。その結果、DYS1プローブで強皮症症例の10例にのみマイクロキメリズム由来のDNAが検出された。強皮症以外の自己免疫疾患からは、マイクロキメリズム由来のcf-DNAは検出されなかった。また、得られたRNAに対しては、Y染色体上に存在するminor histocompatibility antigen(mHA)をコードするSMCY遺伝子のTaqManプローブをデザインし、定量的PCRを行った。しかし、同プローブでは増幅産物は検出されなかった。そのため、ターゲットを変更して、mHAの一つであるDBY遺伝子のプローブも作成したが、結果は同様であった。これらの結果から強皮症にはマノクロキメリズムの強い関与が考えられたが、その他の自己免疫疾患や習慣性流産、不育症との関連は少ないと考えられた。