hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非晶構造解析に基づく高効率塗布型ホストフリーＴＡＤＦ材料の設計と開発

平成30年度は、平成29年度の課題であった「ホストフリー」化に取り組んだ。これまでに開発した材料の中において、アダマンタン置換に基づいた深青色TADF材料「MA-TA」は、非晶ニート膜中においても、PL量子収率が極めて高く、かつ明確な遅延蛍光を示すことがわかった。また、MA-TAは塗布法、真空蒸着法に依存せず高いPL量子効率を実現可能という特長を有していた。深青色発光材料に適した塗布成膜可能な電荷輸送材料が利用可能でなかったため、ホストフリー素子の作製には真空蒸着法を用いたが、実際に、MA-TAの非晶ニート膜を有機EL素子の発光層に用いることにより、高効率な有機EL素子を得ることに成功した。さらに、ホストフリー化の取り組みに加えて、ホスト種依存に関する研究も合わせて進めた。MA-TAはこれまでの深青色TADF材料と異なり、様々な極性を有するホスト材料へドープした場合においても、常に高効率な発光を与えることが明らかとなった。この特長により、有機EL素子の構成に最適な電荷輸送性能を有するホスト材料の選択が可能となり、高輝度においても高効率を示す有機EL素子が実現できた。以上、平成30年度は、ホストフリー化に関する研究に加え、発光特性がホスト種に大きく依存しないTADF材料の設計指針が得られた。ホスト材料の選択肢が比較的少ない深青色TADF発光材料において、様々なホスト材料を使用可能である利点は大きく、その開発は極めて意義深い。ホストフリーと並び、極めて有効なTADF分子の設計指針であり、今後のTADF材料開発のさらなる推進が期待される。平成30年度は、当初の計画通り、ホストフリー化の研究を推進した。その結果、平成29年度に開発した深青色TADF材料MA-TAを用いることにより、ニート膜においても高いPLならびにEL量子効率を実現することに成功した。さらに、このMA-TAでは、ホストの種類によらず常に高いPLおよびEL量子効率を示すことも実験的に確証された。従来の深青色TADF材料においては、高極性ホストを用いた場合にのみ高効率なTADFを発現可能な場合が多く、発光波長の長波長化や、ホールおよび電子の電荷輸送のバランスを問題点として抱えていた。その点、MA-TAは様々なホストにおいて高効率発光を示すため、ホストの極性を考慮することなく、電荷輸送に好ましい材料を選択できるといった、汎用性の高さが特長となる。このように、自身を取り巻く周辺分子を選ばないTADF材料の開発は、実用化の観点においても意義深い。また、ホストフリー化の研究のみならず、深青色発光材料に対するホストに依らない材料の開発指針を得ることができたことは、当初の予定以上の結果であった。また、ニート膜においては、TADF分子自身がホストとしてふるまうことに相当するため、周囲の環境に依存しない分子設計は、ホストフリーの分子設計にもフィードバックできる重要な知見である。以上、分子の設計指針確立に向け、研究を大きく推進することができた。これまでの研究において、高効率な発光特性を示す塗布成膜可能な深青色TADF材料を開発し、高効率塗布型有機EL素子を実現した。さらに、高効率なホストフリー有機EL素子の開発にも成功した。以上のことから、当初目的としていた、「ホストフリー化可能な高効率塗布型深青色TADF材料の開発」は達成できたことが明確である。一方、それら材料開発の際の着眼点として掲げた、「非晶凝集膜の構造解析、並びにそれに基づいた材料設計指針の確立」が明確な形としては得られていない。その原因の一部としては、解析対象となる材料のサンプル数が限られていたことが挙げられる。これまでの平成29,30年度の研究により、ホストフリー化可能なもの、そうでないものがさらにいくつか得られたため、それら新規化合物も含め、令和元年度は、非晶凝集膜の構造解析および、それに基づいた材料設計指針の確立に注力する予定である。本研究は、塗布成膜可能かつ非晶neat膜において高効率深青色発光を示す熱活性型遅延蛍光(TADF)材料の分子設計指針の確立を第一の目標としている。その材料が有すべき性質としては、1深青色、2ホストフリー、3高い非晶安定性(熱安定性)、4高い塗布成膜性である。平成29年度は塗布成膜可能な深青色発光材料の分子設計に関して成果が得られた。具体的な方策は、アダマンタン骨格をTADF分子の一部に置換基として導入するという戦略である。この方策により、発光色の劇的な深青色化に成功し、MA-TA、FA-TA、PA-TAと名付けた高効率深青色TADF材料群を得た。これら材料は遍在するH、C、N元素のみから構成される点が大きな特長であり、また、これら材料はハロゲン溶媒のみならず、非ハロゲン溶媒にも高い溶解性を持っている。さらに、飛躍的な熱安定性の向上も併せて実現できた。塗布型有機EL素子においては、特にMA-TAやFA-TAを発光材料に用いた場合に、極めて高効率な深青色EL発光が得られている。国際照明委員会が定める色度座標CIE(x,y)を用いると、それぞれy<0.2およびy<0.15という深い青色領域において2018年3月現在、世界最高効率を示している。以上、本研究成果から、1、3、4を同時に満たす分子設計指針の一つとして、アダマンタン置換という簡便な方策を得ることに成功した。一方、産業面において、有機ELは、省電力化、低コスト化に課題を抱えている。

深青色発光の高効率化は、大幅な省電力化を可能とする。さらに塗布法は、有機EL素子作製の低コスト化に大きく貢献する。もちろん、熱安定性向上等の高耐久化も省電力化、低コスト化の一助となる。本研究成果は、安価な元素からなり、高い熱安定性をもつ、塗布成膜可能な高効率青色発光材料を得る分子設計指針が得られたという点が意義深く、産業的な波及効果も期待される。平成29年度には、主に固体NMRを用いた熱活性型遅延蛍光(TADF)材料の非晶膜に対する構造解析、平成30年度には塗布成膜可能な深青色発光材料の開発を計画していたが、これらの取り組みの中で、塗布成膜可能な深青色発光材料の開発に大きなめぼしが付いたため、平成29年度は、一足飛びに平成30年度計画を推進した。その結果、アダマンタン骨格を用いることで、「深青色」「高い塗布成膜性」を有する新規TADF材料の開発に成功した。さらに、飛躍的な熱安定性の向上も併せて実現でき、「高い非晶安定性(熱安定性)」を有する分子設計指針であることも分かった。平成29年度に得られた成果は、本研究課題が第一目標に定める、「塗布成膜可能かつ非晶neat膜において高効率深青色発光を示す熱活性型遅延蛍光(TADF)材料の分子設計指針の確立」実現に向けて研究を大きく加速させるものである。平成30年度は、平成29年度の課題であった「ホストフリー」化に取り組んだ。これまでに開発した材料の中において、アダマンタン置換に基づいた深青色TADF材料「MA-TA」は、非晶ニート膜中においても、PL量子収率が極めて高く、かつ明確な遅延蛍光を示すことがわかった。また、MA-TAは塗布法、真空蒸着法に依存せず高いPL量子効率を実現可能という特長を有していた。深青色発光材料に適した塗布成膜可能な電荷輸送材料が利用可能でなかったため、ホストフリー素子の作製には真空蒸着法を用いたが、実際に、MA-TAの非晶ニート膜を有機EL素子の発光層に用いることにより、高効率な有機EL素子を得ることに成功した。さらに、ホストフリー化の取り組みに加えて、ホスト種依存に関する研究も合わせて進めた。MA-TAはこれまでの深青色TADF材料と異なり、様々な極性を有するホスト材料へドープした場合においても、常に高効率な発光を与えることが明らかとなった。この特長により、有機EL素子の構成に最適な電荷輸送性能を有するホスト材料の選択が可能となり、高輝度においても高効率を示す有機EL素子が実現できた。以上、平成30年度は、ホストフリー化に関する研究に加え、発光特性がホスト種に大きく依存しないTADF材料の設計指針が得られた。ホスト材料の選択肢が比較的少ない深青色TADF発光材料において、様々なホスト材料を使用可能である利点は大きく、その開発は極めて意義深い。ホストフリーと並び、極めて有効なTADF分子の設計指針であり、今後のTADF材料開発のさらなる推進が期待される。平成30年度は、当初の計画通り、ホストフリー化の研究を推進した。その結果、平成29年度に開発した深青色TADF材料MA-TAを用いることにより、ニート膜においても高いPLならびにEL量子効率を実現することに成功した。
ナノペーパーと導電性インクの秩序構造形成を司る統計的流動の力学

プリンティッドエレクトロニクスとフレキシブルデバイスの両方の文脈で注目される素材であるナノペーパー,すなわちセルロースナノファイバー分散水を乾燥させて作製するシート状の材料について,そのセルロースナノファイバー分散水の微視的(ミクロ)な状態を実験的に評価する方法論を確立した.個々のセルロースナノファイバーのフィラメントは細いため光学顕微鏡で直接観察することができない.また,SEMで乾燥試料が観察されることが多いが,水中の試料を観察することができない.一方,AFMでは試料の表面だけが測定の対象となる.このような背景から,マクロな系としては幾つかの報告事例があっても,セルロースナノファイバー分散水の微視的な状態を実験計測する試みは例がなかった.本研究では,試料に微粒子を分散させて光学顕微鏡とカメラで動画を撮影し,得られたブラウン運動の軌跡群データを統計力学的に読み解くことによって,セルロースナノファイバー分散水の微視的状態を定量評価できることを明らかにした.粘度と対応関係のある拡散係数の値だけではなく,変位分布や平均二乗変位の時間的なスケーリング挙動から微粒子に対する空間的拘束の状況を定量評価できる.この手法の有用性は多岐にわたるが,本研究の現在の状況において特に有用であるのは,セルロースナノファイバー分散水の試料作製方法が試料の状態に与える影響を評価できるということである.セルロースナノファイバー分散水の濃度を調整する際には,適宜希釈してから攪拌を行う必要がある.攪拌の方法には,機材だけでも多岐にわたる選択肢がある.しかも,それらの機材をどのような条件と手順で使用するかによっても,攪拌の効果は異なってくる.このような理想から離れだ状況で個別的な条件の影響を知りたい場合,実験データを直接解析することによって定量評価が実現することは大変有意義である.セルロースナノファイバーを水中に分散させた試料について,SEMでもAFMでも光学顕微鏡でも直接観察ができないという技術的課題に対して,微粒子を分散させてブラウン運動の特徴から試料の微細構造を定量的に解析することを可能にした.実験計測データ解析に基づくアプローチであるため,試料の作製方法など個別的で理想化の難しい対象に柔軟に対応できる体制を確立できた意義は大きい.セルロースナノファイバー分散水と導電性インクの両方に対して,顕微鏡動画データ解析に基づく現象のメカニズム解明を進めてゆく.プリンティッドエレクトロニクスとフレキシブルデバイスの両方の文脈で注目される素材であるナノペーパー,すなわちセルロースナノファイバー分散水を乾燥させて作製するシート状の材料について,そのセルロースナノファイバー分散水の微視的(ミクロ)な状態を実験的に評価する方法論を確立した.個々のセルロースナノファイバーのフィラメントは細いため光学顕微鏡で直接観察することができない.また,SEMで乾燥試料が観察されることが多いが,水中の試料を観察することができない.一方,AFMでは試料の表面だけが測定の対象となる.このような背景から,マクロな系としては幾つかの報告事例があっても,セルロースナノファイバー分散水の微視的な状態を実験計測する試みは例がなかった.本研究では,試料に微粒子を分散させて光学顕微鏡とカメラで動画を撮影し,得られたブラウン運動の軌跡群データを統計力学的に読み解くことによって,セルロースナノファイバー分散水の微視的状態を定量評価できることを明らかにした.粘度と対応関係のある拡散係数の値だけではなく,変位分布や平均二乗変位の時間的なスケーリング挙動から微粒子に対する空間的拘束の状況を定量評価できる.この手法の有用性は多岐にわたるが,本研究の現在の状況において特に有用であるのは,セルロースナノファイバー分散水の試料作製方法が試料の状態に与える影響を評価できるということである.セルロースナノファイバー分散水の濃度を調整する際には,適宜希釈してから攪拌を行う必要がある.攪拌の方法には,機材だけでも多岐にわたる選択肢がある.しかも,それらの機材をどのような条件と手順で使用するかによっても,攪拌の効果は異なってくる.このような理想から離れだ状況で個別的な条件の影響を知りたい場合,実験データを直接解析することによって定量評価が実現することは大変有意義である.セルロースナノファイバーを水中に分散させた試料について,SEMでもAFMでも光学顕微鏡でも直接観察ができないという技術的課題に対して,微粒子を分散させてブラウン運動の特徴から試料の微細構造を定量的に解析することを可能にした.実験計測データ解析に基づくアプローチであるため,試料の作製方法など個別的で理想化の難しい対象に柔軟に対応できる体制を確立できた意義は大きい.セルロースナノファイバー分散水と導電性インクの両方に対して,顕微鏡動画データ解析に基づく現象のメカニズム解明を進めてゆく.
シクロブテンカルボン酸エステルを基質とする連続メタセシス反応の開発とその応用

オレフィンメタセシス反応は、現代有機化学において最も有用な合成法のひとつである。最近では、いくつかのメタセシスを組み合わせて連続反応とする新しい方法も開発されている。本研究では、今までに積極的に利用されることが少なかったシクロブテンカルボン酸エステルを基質に用いた新規な連続メタセシス反応(開環/閉環メタセシス)の開発に主眼を置いて研究を行い、効率良くγ-ブテノリド骨格を構築する方法を見出すことができた。さらに、本合成法を用いて、生物活性天然物であるクラビラクトン類の不斉全合成に成功した。連続メタセシス反応は、一度の反応操作で複数の炭素ー炭素結合の形成もしくは切断がおこり、より直截的に骨格変換を達成できる特長を有している。本研究では、今までに積極的に利用されることが少なかったシクロブテンカルボン酸エステルを基質に用いた新規な連続メタセシス反応の開発に主眼を置き、それに基づく生物活性天然物の全合成を目的とする。このような骨格転位を伴うγ-ブテノリドへの変換反応は既知の方法論とは異なる独創的なものであり、有機合成化学上、大いに意義のあるものと考えている。平成23年度はシクロブテンカルボン酸エステル誘導体を基質に用いて、開環ー閉環メタセシスの検討を行った。その結果、効率良くγ-ブテノリドへの変換反応が進行する条件を見出すことができた。汎用性の実証のため、置換様式の異なるいくつかのベンゼン誘導体を出発物質に用いてシクロブテンカルボン酸エステル誘導体に導き、開発した開環ー閉環メタセシスを行った。いずれの基質においても、満足のいく収率でγ-ブテノリド誘導体に変換することができた。平成24年度においては、本反応を生物活性天然物クラビラクトンの全合成に応用することを考えた。クラビラクトン類はハラタケの一種であるホテイシメジの培養液より単離された天然有機化合物である。これらの化合物は上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)阻害活性を有しており、ヒトがん細胞に対し細胞増殖抑制活性を示すことが報告されている。クラビラクトンの全合成のため、多置換ベンズアルデヒド誘導体から誘導したシクロブテンカルボン酸エステル誘導体を用いて開環ー閉環メタセシスを行ったところ、望むγ-ブテノリド誘導体が収率良く得られた。さらなる化学変換の検討の結果、閉環メタセシスによる10員環構築を経てクラビラクトンAのラセミ全合成を達成した。本研究では、今までに積極的に利用されることが少なかったシクロブテンカルボン酸エステルを基質に用いた新規な連続メタセシス反応の開発に主眼を置き、それに基づく生物活性天然物の全合成を目的とした。これらの化合物は上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害活性を有しており、ヒトがん細胞に対し細胞増殖抑制活性を示すことが報告されている。平成25年度においては、確立した合成経路に不斉合成反応を取り入れ、(+)-クラビラクトンAおよび(-)-クラビラクトンBの不斉全合成に成功した。本研究により、シクロブテンカルボン酸エステルを基質に用いた開環ー閉環メタセシスの有用性を実証することができた。

このような骨格転位を伴うγ-ブテノリドへの変換反応は既知の方法論とは異なる独創的なものであり、有機合成化学上、大いに意義のあるものと考えている。平成23年度はシクロブテンカルボン酸エステル誘導体を基質に用いて、開環ー閉環メタセシスの検討を行った。シクロブテン環の歪みが大きいことから、官能基選択的にメタセシス反応が進行することを期待した。その結果、効率良くγ-ブテノリドへの変換反応が進行する条件を見出すことができた。そこで、本反応を生物活性天然物クラビラクトンの全合成に応用することを考えた。クラビラクトン類はハラタケの一種であるホテイシメジの培養液より単離された天然有機化合物である。これらの化合物は上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)阻害活性を有しており、ヒトがん細胞に対し細胞増殖抑制活性を示すことが報告されている。クラビラクトンの全合成のため、置換様式の異なるいくつかのベンゼン誘導体を出発物質に用いてシクロブテンカルボン酸エステル誘導体に導き、開発した開環ー閉環メタセシスを行った。いずれの基質においても、満足のいく収率でγ-ブテノリド誘導体に変換することができた。平成23年度において、シクロブテンカルボン酸エステル誘導体からγ-ブテノリド誘導体へと効率良く変換する開環ー閉環メタセシスの反応条件を見出すことができた。さらに、平成24年度には生物活性天然物クラビラクトンAのラセミ全合成も達成しており、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。条件検討の結果、シクロブテンカルボン酸エステル誘導体からγ-ブテノリド誘導体へと効率良く変換する開環ー閉環メタセシスの反応条件を見出すことができた。予定通り、生物活性天然物の全合成研究にも着手しており、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。当初の計画通りに、開環ー閉環メタセシスに続く閉環メタセシスもしくは交差メタセシスを検討し、さらなる炭素骨格構築法の開発を行う。また、ラセミ体として達成したクラビラクトンの全合成を不斉全合成に発展させる。さらに、抗真菌活性を有するゼイラニジンの全合成もあわせておこなっていく。また、生物活性天然物の全合成研究もあわせて行っていく。平成24年度において18万円ほどの未使用額が発生した。これは消耗品等の節約を行った結果である。これを次年度の使用額とさせていただくが、研究計画や研究費使用計画に大きな変更はない。平成23年度において25万円ほどの未使用額が発生した。
異なる生物種はヘムオキシゲナーゼをどう使い分けるか-ヘム分解特性の種依存性の解明

1.ダイズヘムオキシゲナーゼ-1(GmHO1)の分子特性とヘム代謝機構の解明:大腸菌発現系を構築し、植物由来ヘムオキシゲナーゼ-1のタンパクを初めて得ることができ、それについて以下の成果を得た。(1)ヘム結合の化学量論、配位数及び配位子の決定、ヘム鉄のスピン状態、配位子場の特徴、およびヘム配位水の酸解離指数の決定。(2)ヘム分解に必要な電子の供与系がNADPH/FNR/FDであり、アスコルビン酸も電子供与体として機能すること。ヘム分解過程は既知のHOと同様であるが、ベルドヘムと遠位残基との相互作用が異なること。(FEBS Journalに発表)(3)EPR法で生理的条件下でのヘム複合体のヘム分解反応の追跡を行い、低スピン型ベルドヘム中間体を始めて検出した。(Biochem Biophys.Res.Commun.に投稿中)(4)ヘムと遠位残基との相互作用を調べるため変異体を作成し、ヘム複合体の特徴を調べるとともにヘム分解の速度論解析を行った。その結果動物HO1のアスパラギン酸に代わってヒスチジン残基が活性に必須のプロトンリレーを担っていること、また周辺残基もそれを補助していることが明らかになった。(FEBS Journalに投稿準備中)2.ラットおよびシアノバクテリアHO-1による、アスコルビン酸を電子供与体とするヘム分解反応速度の違いを支配する因子を解明するために、ヘムポケットの近位ヘリックスを構成する残基を変異させ速度論解析を行った。ヘムの近位配位子と水素結合を介して結合した近位ヘリックスとの分子振動がヘムの酸化還元電位を変化させ、近位側でもヘム分解調節が行われていることを実験的に始めて明らかにした。(Biochemistryへ投稿中)3.ラットHO-1での電子伝達経路を明らかにするために、芳香族アミノ酸の20残基をロイシン置換した変異体を調製し、変異導入によるヘム複合体の構造への影響とヘム分解反応への影響を検討し、電子の入り口に当たる残基を提案した。さらに、ヘム-HO-1複合体と、電子供与体であるシトクロムP450還元酵素(CPR)との解離定数を、CPRの蛍光消光から求め、その値が野生型酵素と変わりなく、したがって、提案した"入り口残基"の妥当性を強く支持する結果を得た。(J. Biol.Chem.に投稿準備中)1.ダイズヘムオキシゲナーゼ-1(GmHO1)の分子特性とヘム代謝機構の解明:大腸菌発現系を構築し、植物由来ヘムオキシゲナーゼ-1のタンパクを初めて得ることができ、それについて以下の成果を得た。(J. Biol.Chem.に投稿準備中)1.ダイズHO-1の分子特性とヘム代謝機構の解明(1)大腸菌発現系を構築し、ダイズHO-1タンパクGmHO-1の大量発現系を確立し、高純度タンパクを得た。(2)Gm HO-1へのヘム結合の化学量論が1対1であることを決定し、分光光度法とEPR法で、ヘム複合体の電子状態を明らかにした。(3)UV-VIS、ESRの測定から、複合体ヘム鉄の配位数が6であり、高スピン状態であることを明らかにし、またヘムの近位配位子が、ヒスチジンであることを示唆する結果を得た。

(4)近位配位子を決定するため、His-30をグリシンに置換した変異体タンパクを調製し、EPRとヘム分解活性の測定から、His-30が近位配位子であることを明らかにした。(5)ニトロシルヘムHO-1複合体を作成し、EPRスペクトルを測定してヘム周辺の配位子場が、ラットHOとシアノバクテリアHOとの中間的であることを明らかにした。(4)ダイズHO-1によるヘム代謝機構にっいて、a.アスコルビン酸あるいはNADPH-フェレドキシン還元酵素-フェレドキシンを電子供与体として、Gm HO-1はヘムを部位特異的に解裂し、α-ビルベルディンだけを生成することを明らかにした。b.反応過程で、一酸化炭素が放出されることを、COと高い親和性をもつミオグロビン変異体H64Lを調製の上、このタンパクの共存下でヘム分解を行い、H64LがCOを捕捉した事実によって確定した。d.Gm HO-1のヘム分解過程をUV-VIS分光法で追跡し、中間体のスペクトルが、既知のHO反応のものとは異なることを見出し、この中間体の帰属を行うため、イミダゾール錯体としてヘモクロームを抽出し、ベルドヘムであることを明らかにした。2.ラットおよびシアノバクテリアHO-1による、アスコルビン酸を電子供与体とするヘム分解反応の速度の違いを支配する因子を解明するために、詳細な反応速度解析を行った。また、ヘム近位配位子と相互作用しているタンパク残基を変異させ、反応速度への影響を調べた。3.ラットHO-1での電子伝達経路を明らかにするために、20の芳香族アミノ酸のロイシン置換体を調製し、変異導入によるヘム複合体の構造への影響とヘム分解反応への影響を検討した。2および3については、投稿準備中である。1.ダイズHO-1(GmHO1)の分子特性とヘム代謝機構の解明(1)電子スピン共鳴法による生理的条件下でのヘム複合体のヘム分解反応の追跡を行い、低スピン型ベルドヘム中間体を始めて検出した。(Biochem.Biophys.Res.Commun.に投稿中)(2)ダイズHO-1によるヘム分解は他の生物種のHOと同様の化学課程を経て逐次的に進行するが、中間体のベルドヘムと、ヘムのα-メソ炭素が解離して発生する一酸化炭素との親和性が低く、またベルドヘムからビリベルディン複合体への過程が遅いという特徴がある。この原因を明らかにするために、遠位側の残基の部位特異的変異体を調製し、それぞれのヘム複合体の特徴を分光法で調べるとともに、ヘム分解の速度論解析を行った。その結果、動物HO1のアスパラギン酸残基に代わってヒスチジン残基がヘム鉄上での酸素活性化に必須のプロトンリレーを行っていること、および、その周辺残基もプロトンリレーを補助していることが明らかになった。(FEBSJournalに投稿準備中)2.ラットおよびシアノバクテリアHO-1による、アスコルビン酸を電子供与体とするヘム分解反応の速度の違いを支配する因子を解明するために、ヘムポケットの近位ヘリックスを構成する残基の中で、シアノバクテリアHO-1と異なるラットHO-1の残基を変異させ、速度論解析を行った。またヘム近位配位子ヒスチジンと水素結合しているグルタミン酸残基をアラニン置換することで、ヘム分解速度が大きく変化し、近位側によるヘムの酸化還元電位の調節が、アスコルビン酸共役によるヘム分解反応を調節していることを明らかにし、近位側でのヘム分解調節の実験的証拠を始めて明らかにした。(Biochemistryへ投稿中)
溶存酸素の安定同位体比解析による懸濁粒子内部での新しい酸素消費過程の解明

海洋観測および実験室実験から得られた海水中の溶存酸素濃度とその安定同位体比(d-18O)の関係から、酸素飽和度が低い時に(<60%)、同位体分別が非常に小さいもしくは分別を伴わない酸素消費プロセスが存在するという可能性を3-Dモデルにより検証した。これまで一般的に受け入れられている同位体分別効果(20‰)よりも小さい値(10‰)を中深層に適用した場合、全ての観測値をモデルで再現することができた。酸素が乏しい中深層では、酸素消費過程の際に生じる同位体分別効果がこれまで一般的に受け入れられている分別効果よりも小さくなるプロセスが作用していることが明らかになった。本研究は、「海水中の懸濁粒子内部で同位体分別が非常に小さい、もしくは分別を伴わない酸素消費プロセスが存在する」という新たな酸素消費プロセスについての仮説を検証するために、本研究では海水中の溶存酸素濃度とその安定同位体比(δ18O)の関係から得られる同位体分別係数と、懸濁粒子の粒子分析から得られる粒子物理化学特性との関係を明らかにすることを目的としている。本年度は実際の海水試料を用いて培養実験を行い、溶存酸素の酸素消費過程における酸素同位体分別係数を求めることを目的とした。海水試料は、大槌湾湾央にてバケツ採水により表層水を採取した。採水した海水試料は目視で確認できるほど多くの凝集物が存在していた。この海水試料について、1部を実験室に持ち帰り後すぐに溶存酸素の濃度および酸素安定同位体比(δ18O)分析を行い、残りの試料については20°Cの培養室にてバイアルローテータを用いて大型の凝集物生成を行い、一定の時間経過後に試料中に残っている溶存酸素の濃度および酸素安定同位体比(δ18O)分析を行った。海水試料(30ml)中の溶存ガスは、Heキャリヤーガスを用いたバブリング法により脱気し、脱気した溶存ガスはコールドトラップ(-180°C)によりH2OおよびCO2を除去した後、Molecular sieves5A+liqN2にて残りのガス(主にN2,O2,Ar)を濃縮トラップして、その後キャピラリーカラム(Molecular sieves5A, 25m)にて分離し、同位体質量分析計(DELTA Plus XP)に導入して、δ18O値を得た。48時間の培養実験後、酸素濃度は322 umol/kg (t = 0)から133 umol/kg (t = 72hr)まで減少し、48時間後の酸素飽和度は、60.3%であった。酸素安定同位体比(δ18O)は、-1.3‰(t = 0)から+12.8‰(t = 72hr)まで増加した。得られた酸素飽和度と酸素安定同位体比(δ18O)の関係から、closedモデルを適用して同位体分別係数を求めた。「海水中の懸濁粒子内部で同位体分別が非常に小さい、もしくは分別を伴わない酸素消費プロセスが存在する」という新たな酸素消費プロセスについての仮説を検証するために、本研究では海水中の溶存酸素濃度とその安定同位体比(δ18O)の関係から得られる同位体分別係数と、懸濁粒子の粒子分析から得られる粒子物理化学特性との関係を明らかにすることを目的とした。3年計画の初年度として、海水中の溶存酸素安定同位体比の高感度分析手法の確立、および大型の懸濁粒子の生成とその海水添加実験の2点を主として実施した。溶存酸素安定同位体比の高感度分析手法の確立のために、バブリング法による海水中溶存ガス抽出ラインを製作し、これを現有の同位体比質量分析計(Thermo, DELTA Plus XP)と連結した。試料導入量、キャリヤーガスの流量等を調節し、酸素安定同位体比についての分析条件を最適化した。現在の測定精度はδ18Oについて0.12‰である。次に懸濁粒子の粒径および粒子数、体積や化学組成などの物理化学的特性と溶存酸素の酸素消費プロセスにおける同位体分別係数の変化との関係の定量化に取り組んだ。大型の懸濁粒子を生成するために、実験室でローリングタンクを用いて人工的に粒子の凝集を生じさせる実験を行ったが、大型の懸濁粒子は空隙率の高い非結晶の不定形であり且つ構造的に非常に脆いため生成することが困難であった。そこでまずは懸濁粒子が多く存在する沿岸海水について、懸濁粒子の粒子分析と溶存酸素濃度とその安定同位体比(δ18O)の測定を行うために、近場である東京湾の沿岸海水試料の採取を行った。

海洋観測および実験室実験から得られた海水中の溶存酸素濃度とその安定同位体比(d-18O)の関係から、酸素飽和度が低い時に(<60%)、同位体分別が非常に小さい、もしくは分別を伴わない酸素消費プロセスが存在するという可能性を3-Dモデルにより検証した。有機物分解や呼吸による酸素消費速度および物理場(移流・拡散)についての感度実験を行った結果、これらの要因では、実際に得られた海水中の溶存酸素濃度とその安定同位体比(d-18O)の関係を説明することは不可能であった。中深層での酸素消費過程における酸素同位体分別効果を、これまで海洋表層や実験的に得られた値(20‰)よりも小さい値(10‰)へと変化させた場合に、酸素飽和度<60%の酸素安定同位体比(d-18O)を含む全ての観測値を3-Dモデル計算で再現することができた。これらの結果から、比較的酸素飽和度が大きい海洋表層などでは、酸素消費過程における同位体分別はこれまで報告されている20‰で酸素消費プロセスが行われているが、酸素が乏しい中深層では、酸素消費プロセスの際に生じる同位体分別効果がこれまで一般的に受け入れられている分別効果よりも小さくなるプロセスが作用していることが明らかになった。化学海洋昨年度において、当初研究計画にあった実験室実験による大型の懸濁粒子の生成が予定通りに進まなかったが、今年度は生物生産の高い海域における海水を用いることで大型の懸濁粒子生成実験に成功し、大型懸濁粒子を含んだ海水試料を用いた溶存酸素消費過程に伴う酸素同位体比の変化を捉えることができた。しかし本来ターゲットとしている酸素飽和度40%以下のより低酸素濃度下における酸素安定同位体比のデータ取得については、海水試料を低酸素濃度に減少させるための培養実験に時間がかかっており、全体としては当初の研究計画よりもやや遅れている。海水中の溶存酸素安定同位体比の高感度分析手法の確立については、バブリング法による海水中溶存ガス抽出ラインを製作し、同位体比質量分析計(Thermo, DELTA Plus XP)への試料導入量、キャリヤーガスの流量等を調節して分析条件を最適化することで、測定精度をδ18O=0.12‰まで達成させることができた。しかし実験室実験による大型の懸濁粒子の生成は当初計画したよりも難しく、生成実験の方法を再検討行う必要がある。引き続き、大槌湾表層の生物生産の高い海水を用いて培養実験を行い、より低酸素濃度下(飽和度40%以下)での海水中の溶存酸素の濃度とその安定同位体比の変化を得る。室内実験で得られた海水中の溶存酸素濃度とδ18Oの関係から、閉鎖系モデルを適用して酸素消費プロセスにおける酸素同位体分別係数を求める。粒度測定装置や接眼マイクロメーター顕微鏡を用いて懸濁粒子内部の酸素移動量に直結する粒子径および体積などの物理化学的特性を測定し、これらと海水中溶存酸素の同位体分別係数との関係を明らかにする。年度後半には、得られた成果をまとめ、学会で発表、国際誌等へ投稿する。初年度に採取した東京湾沿岸海水を用いて、海水中の溶存酸素の濃度と安定同位体比の変化を測定する。これにより求められる同位体分別係数の変化と、同海水試料についての懸濁粒子の粒径および粒子数、体積や化学組成などの物理化学的特性の分析との関係について定量化を行う。海水中の懸濁粒子は、接眼マイクロメーター顕微鏡を用いて粒子径を測定し、海水を濾過して捕集を行い、粒状有機体炭素・窒素を高温燃焼酸化法により、無機物質(ケイ酸塩・炭酸Ca・鉱物組成)についてはX線回折分析により、重量を乾燥重量法により計測する。再度実験室で懸濁粒子の生成実験を行い、生成した懸濁粒子の海水添加を行い、その系内の溶存酸素濃度およびδ18Oの時間変化を明らかにする。当初研究計画にあった実験室実験による大型の懸濁粒子の生成が予定通りに進まなかったため、溶存酸素の酸素安定同位体比の測定に取りかかることに大幅な遅れが生じた。
BHK細胞へ発現させた心筋L型Caチャネルの機能調節とサブユニット構造

チャネルを構成する個々のサブユニットのcDNAを組み合わせたクローンチャネル発現実験では、燐酸化を介したCaチャネル活性の調節を再現させることは容易でないことが指摘されている。こうしたなかで我々はBHK細胞(baby hamster kidney cell)に,心筋由来のL型Caチャネルα1サブユニット,骨格筋由来のβとα2/δ,γサブユニットを組み込んで発現させたCaチャネルがnativeのものに極めて近い電気生理学的特性を示し、PKAやPKCを活性化させる操作よって修飾を受けることを確認した。このBHKC12細胞からsingle channel電流を記録すると、灌流液に8Br-cAMPを加えることによりsweepあたりのチャネル開口数の増加と共にチャネル開口時間の増加も認められ、全体としてのチャネル開口確率(NPo)の増加は平均5.7倍に及んだ。一方灌流液にphorbol esterのPMAを加えるとNPoは平均約50%の増加を示したが、PKC活性化作用の無いphorbol esterの4αPDDは無効であった。なお、BHKC12細胞では、これまでnativeの心筋細胞で報告されているもの以外にも複数の小さな開口レベルが観察される。これらのレベル間では相互のtransitionがみられること、また小さな振幅の開口も8Br-cAMPの投与により通常の開口レベルのものと同様の増強効果が見られた点などからこれらのチャネル開口はsubconductance stateであることが推測された。このような小さな振幅のチャネル開口は、頻度は多くないものの、モルモット心室筋などnativeのCaチャネルでも観察された。
食道癌に対する低用量ドセタキセルとHDAC阻害薬併用化学放射線療法の基礎的検討

食道癌細胞の放射線感受性に対する。バルプロ酸と低濃度ドセタキセルの影響とその機序につき検討した。その結果バルプロ酸は、ヒストンのアセチル化によるクロマチンの弛緩と放射線障害により引き起こされるDNA二重鎖切断を修復する酵素のうちRad51の発現を低下させ相同末端結合を阻害するとともに、Ku70のアセチル化による非相同末端結合を阻害することにより食道癌細胞の放射線感受性を増強した。またドセタキセルは低濃度ではG1期、高濃度ではG2M期で細胞周期を停止させ、放射線感受性を増強した。本研究は、食道癌に対する放射線感受性を増強する薬剤としてHDAC阻害薬であるValproic acid(VPA)に着目し、食道癌に対する低用量ドセタキセルとVPA併用による放射線の増強効果につきin vitr。に検討し、食道癌に対する新しい化学放射線療法の可能性につき基礎的に検討することを目的とする。平成22年度は、食道扁平上皮癌培養細胞株(TE9,TE10,TE11,TE14)を用いVPAのヒストン脱アセチル化阻害作用と放射線感受性増強効果を確認した。その結果全ての細胞株においてVPAはヒストンH3 H4のアセチル化を促進すると共に放射線感受性を増強することが明らかとなった。さらに放射線感受性増強効果のメカニズムを解明する目的で、FACSを用いたVPAによる各細胞の細胞周期の変化の確認、免疫細胞染色とWestern blotによるDNA二重鎖切断により誘導されるγH2AXのリン酸化の変化、およびWestern blot法によりDNA二重鎖切断修復酵素であるKu70,Ku80,Rad51,DM-PKcsの発現量の変化を検討した。その結果VPAはいずれの細胞においても細胞周期の割合に明らかな変化を引き起こさなかった。しかしVPA併用により放射線照射により誘導されるγH2AXのリン酸化は増強されDNA二重鎖切断が増強されていることが明らかとなった。さらにDNA二重鎖切断修復酵素であるRad51の発現はVPA投与で抑制されており、VPAは食道癌において放射線による二重鎖切断を増強しかっ、その修復を抑制することにより放射線感受性を増強させることが明らかとなった。来年度は低用量ドセタキセルとVPA併用による放射線の増強効果をin vitroおよびin vivoに検討する予定である。本研究は、食道癌に対する放射線感受性を増強する薬剤としてHDAC阻害薬であるValproic acid (VPA)に着目し、食道癌に対する低用量ドセタキセルとVPA併用による放射線の増強効果につきin vitroに検討し、食道癌に対する新しい化学放射線療法の可能性につき基礎的に検討することを目的とする。平成22年度の研究によりVPAのヒストン脱アセチル化阻害作用と放射線感受性増強効果を確認した。またVPAのDNA二重鎖切断修復酵素阻害作用も確認された。平成23年度は、食道扁平上皮癌培養細胞株(KES)を用い低用量ドセタキセルの放射線感受性増強効果を確認した。その結果KES細胞において、ドセタキセルは増殖抑制効果の少ないInMの濃度で放射線感受性を増強することが明らかとなった。さらに放射線感受性増強効果のメカニズムを解明する目的で、FACSを用いたドセタキセルによる細胞周期の変化の確認、免疫細胞染色によるDNA二重鎖切断により誘導されるγH2AXのリン酸化の変化を検討した。その結果ドセタキセルはKES細胞においてもInMより低い低濃度ではG1期で細胞周期を停止させ、5nMより高い濃度ではG2M期で細胞周期を停止させた。またInMの濃度で放射線照射によるγH2AXのリン酸化誘導を増強していた。またドセタキセル単独ではInMの濃度ではKES細胞のアポトーシスを誘導しないが、放射線照射後のアポトーシス誘導を増強した。以上より、低濃度ドセタキセルの放射線感受性増強作用は、細胞周期のG1期停止による、放射線照射後DNA二重鎖切断の増強であることが明らかとなった。またVPAはヒストンをアセチル化しクロマチンを弛緩させ放射線感受性を増強するとともにDNA二重鎖切断修復酵素のうち相同末端結合に関与するRad51の発現を阻害することにより食道癌細胞の放射線感受性を増強することが確認された。ドセタキセルは低濃度ではG1期、高濃度ではG2M期で細胞周期を停止させ放射線感受性を増強した。平成24年度は、食道癌細胞株の放射線照射に伴うDNAの二重鎖切断に伴って誘導される

γH2AXのリン酸化の変化がVPAによりどのように変化するか経時的に検討した。その結果種々の食道癌細胞株において放射線照射後γH2AX発現はVPAにより増強されるが、放射線照射数時間後まで増強効果は遷延することが明らかとなった。これまでの研究によりVPAはDNA二本鎖切断修復のうち相同組換えに不可欠なタンパク質であるRad51の発現を低下させることがわかっていたが、一方非相同末端結合に関与するKu70,Ku80,DNA-PKcsの発現性に変化は認められなかった.そこで免疫沈降法を用いて非相同末端結合に関与する修復酵素の主要タンパクであるKu70のアセチル化につき検討を行ったところ、VPAはKu70をアセチル化することにより機能阻害することが判明した。本研究では低用量ドセタキセルとHDAC阻害剤であるバルプロ酸併用による食道癌化学放射線療法の基礎的検討を3年間で行う研究である。これまでの2年間の研究により低用量ドセタキセルとHDAC阻害剤であるバルプロ酸それぞれ単剤での放射線感受性増強効果とそのメカニズムが解明された。最終年度では2剤の併用効果を確認する予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。22年度・23年度と同様な手法により24年度の研究を遂行することが可能と考えられる。研究計画の変更や問題点は現時点では認められない。
チョーク層連続分析による温室地球から寒冷地球への環境変遷史の研究

平成12年度の成果としては、黒色頁岩のラミナの成因について次ぎのことが分かったことである。黒色頁岩のラミナは下部から上部へと次ぎのサイクルをなす。1.粘土層2.黒色頁岩3.放散虫を含む黒色頁岩4.粘土層である。Cenomanian/Turonianの黒色頁岩にはこのようなサイクルが少なくとも10サイクル以上含まれている。この内、放散虫を含む黒色頁岩では、硫化鉄の含有量が少ないことが分かった。以上のサイクルの成因として次ぎのことが考えられる。1.粘土層は海洋成層構造の発達と生物生産の低下時期に伴う非生物砕屑粒子層2.海洋成層構造の発達とシアノバクテリアあるいは光合成細菌による生産活動に夜有機物の堆積。3.成層構造の一時的崩壊と湧昇、青潮による表層への栄養塩の供給、そして放散虫の発生。白亜紀の中頃、約1億年前、の地球の姿はつぎのようなものであった。1)海洋底の拡大速度が大きかった。2)海陸全体にわたり莫大な火成活動があった。3)海水面が高く、大陸の上に広く浅い海がひろがった。4)海水、とくに深層水の温度が異常に高かった。5)極地域に氷床が発達していなかった。6)海底で広く有機物に富む黒色泥が堆積した。7)浮遊性有孔虫と石灰礁の衰退が起こった。白亜紀から新生代に書けて地球は寒冷化を歴史をたどっていった。本研究を通じて、白亜紀は低生物生産、海洋成層構造の発達した時代であり、新生代は高生物生産、湧昇循環の発達した時代であることが明らかになり、白亜紀環境の特徴は、本研究で明らかになった白亜紀超温暖期の海洋構造と生物生産モデルによって理解することができる。本年度は、以下の研究を行なった。(1)イタリア白亜紀チョーク層のうち下部白亜紀と中部白亜紀の地層、とくに黒色頁岩を挟む地層の詳細な岩相の記載。これに関しては約200枚の薄片の観察と画像の取り込みを行なった。(2)この結果、黒色頁岩中に魚の化石が含まれていることが発見された。これは、黒色頁岩が無酸素状態で堆積したことを示す証拠であり、現在、鑑定中である。(3)セノマニアン/チュロニアン境界の黒色頁岩を挟んで炭素同位体の重い値への変化が認められる。また硫酸化合物の硫黄同位体比は、大きく重くなる。これらは、有機物の堆積、硫酸還元菌による軽い硫黄の固定(硫化鉄)を示す。(4)黒色頁岩層の中に、放散虫の薄いラミナが見つかった。これの成因については、以下のように考える。黒色頁岩は密度成層した水塊の発達によって堆積した。しかし、放散虫のラミナは、この水塊構造が一時的に壊れて、有機物に富む無酸素水塊が表層にターンオーバーしたとき(青潮の発達)に放散虫が増えたことを表す。この仮説を検証するためのデータを現在取得中である。(5)黒色泥岩に含まれる有機物の窒素同位体比より、この有機物を作った生物は大気からの窒素固定を行っていたことがわかってきた。また有機物の分析より、脂質としてホパノールとホパン酸を多く含み、また色素としてはクロロフィル分解生成物に比較してカロチノイド系化合物が少ないことがわかってきた。これらの特徴は、この黒色泥岩の有機物は、貧栄養環境にすむラン藻類起源であることを示している。

(6)白亜紀の無酸素事件について、何が原因であったのかを探るために、詳細な白亜紀古地理図を作製している。平成11年度は次の研究を行なった。1)イタリアチョーク層の薄片についてデジタル画像による薄片柱状図の作成を行なった。2)放散虫群集について解析を開始した。フッ酸処理による個体の抽出を実行中である。3)チョーク層中の陸起源物質の固定を行なうためにXRFによる元素組成分析を行なった。このデータと有孔虫の化石層序年代から、C/T境界の黒色頁岩の堆積間隔は約100万年と見積もられた。4)酸素・炭素同位体比測定のための粉末試料の作成(300サンプル)を行なった。5)海洋無酸素事件における硫黄の挙動についてのシミュレーションを行なった。6)白亜紀の総合柱状図の作成を行なった。7)白亜紀の気候分布図の作成を行なった。平成12年度の成果としては、黒色頁岩のラミナの成因について次ぎのことが分かったことである。黒色頁岩のラミナは下部から上部へと次ぎのサイクルをなす。1.粘土層2.黒色頁岩3.放散虫を含む黒色頁岩4.粘土層である。Cenomanian/Turonianの黒色頁岩にはこのようなサイクルが少なくとも10サイクル以上含まれている。この内、放散虫を含む黒色頁岩では、硫化鉄の含有量が少ないことが分かった。以上のサイクルの成因として次ぎのことが考えられる。1.粘土層は海洋成層構造の発達と生物生産の低下時期に伴う非生物砕屑粒子層2.海洋成層構造の発達とシアノバクテリアあるいは光合成細菌による生産活動に夜有機物の堆積。3.成層構造の一時的崩壊と湧昇、青潮による表層への栄養塩の供給、そして放散虫の発生。白亜紀の中頃、約1億年前、の地球の姿はつぎのようなものであった。1)海洋底の拡大速度が大きかった。2)海陸全体にわたり莫大な火成活動があった。3)海水面が高く、大陸の上に広く浅い海がひろがった。4)海水、とくに深層水の温度が異常に高かった。5)極地域に氷床が発達していなかった。6)海底で広く有機物に富む黒色泥が堆積した。7)浮遊性有孔虫と石灰礁の衰退が起こった。白亜紀から新生代に書けて地球は寒冷化を歴史をたどっていった。本研究を通じて、白亜紀は低生物生産、海洋成層構造の発達した時代であり、新生代は高生物生産、湧昇循環の発達した時代であることが明らかになり、白亜紀環境の特徴は、本研究で明らかになった白亜紀超温暖期の海洋構造と生物生産モデルによって理解することができる。
園芸植物の発育における相変化とその制御

クリスプヘッド型レタスとバターヘッド型レタスを栽培し,葉の形,屈曲の程度,分化葉数,茎の生長のアロメトリー等について,その経時変化を調べ,レタスの発育相の転換時期を明らかにしようとした。その結果,分化葉に対する展開葉の比,葉長と葉幅の比(葉形比)、屈曲などの点から見て,クリスプヘッド型レタスの方がバターヘッド型レタスよりも早く相変化が進むと考えられた。バターヘッドレタスの茎頂部分の展開開始直後の葉を紙袋で被覆し,遮光したところ,第11葉以上の葉を遮光した場合,第1115葉で大きく屈曲したが,第19葉以上では屈曲が認められず,球の形成には至らなかった。また,第19葉以上の葉を遮光した場合,葉形比や葉の屈曲程度に大きな変化は現れず,光によって球形成を促進することはできなかった。茎の乾物重と茎の長さの関係を両対数グラフにプロットしたところ,花芽分化前のプロットは直線にのったが,花芽分化後のプロットは直線から乖離した。茎の直径と茎の長さの関係,茎乾物重と葉乾物重の関係も両対数グラフにプロットすると,花芽分化時までは直線に当てはめることができた。以上,本研究の結果,レタスは発育の過程で幾つかの相を経過し,その結果,結球,抽たいなどの形態的変化を示すことが明らかになった。すなわち,レタスの葉球の形成は,葉の分化と生長との関係の変化,葉の形態の変化,葉の屈曲能力の変化に関し,異なる性質を示す幾つかの段階を経た後に起こるのであって,環境条件を変えて屈曲能力を変化させても結球は起こらないことが明らかになった。このようにレタスの発育相の変化は発育のパターンを決定する重要な要因であることが明らかになった。レタスの葉の形態や機能の違いを基に,植物の発育の相変換が起こる時期を推定しようと試みた。このため,比較的早く球を形成するクリスプヘッド型レタスと球形成の遅いバタ-ヘッド型レタスを昼温23°C,夜温17°Cの人工気象室で栽培し,それぞれの葉の形,屈曲程度,分化葉数,展開葉数の経時変化を調査した。クリスプヘッド型レタスでは分化葉数28枚,バタ-ヘッド型レタスでは40枚を境に分化葉数に対する展開葉数の比が上昇した。両型とも葉長と葉幅の比は葉数の増加とともに低下したが,クリスプヘッド型レタスでは第13葉の葉茎比が1を下回った播種後42日目に第1619葉で葉の屈曲が認められ,48日目に結球が開始した。バタ-ヘッド型レタスでは第29葉の葉茎比が1を下回った播種後51日目に第2429葉で屈曲が認められたが,実験終了時まで結球は認められなかった。また,11枚目の葉がっそれぞれ2cmになった時,11枚目以降の葉に黒い紙袋を被せて遮光したところ,クリスプヘッド型では遮光の有無に関わらず,11枚目以降の葉では屈曲が起こり,球を形成した。一方,バタ-ヘッド型レタスでは遮光処理をした場合のみ葉の屈曲が起こったが、球の形成は見られなかった。したがって、葉の形、光に対する屈曲反応という点から見て、レタスでは葉位1012枚目、サラダナでは20枚程度を境に幼若相と成熟相とが区分されると推論した。

しかし、葉の形や暗黒下での屈曲の程度に見られる変化は,相に特異的な変化ではなく、むしろ体内の生理的な変化の反映である可能性も否定できない。この点を明らかにするためには、葉の形以外に相変化と一致して2相的な変化を示す特性を見いだす必要がある。レタスの葉や茎頂の形態から発育相の変化を推定しようした。このため,実験1ではレタス品種テルミーを昼温25°C,夜温20°Cと昼温20°C,夜温15°Cの人工気象室で栽培し,花芽分化の時期を調べた。また,実験2では,品種極早生シスコを昼温23°C,夜温17°Cの人工気象室で栽培し,葉位別に葉の屈曲程度と葉柄におけるデンプンの局在性を調査した。実験1において,軸に垂直な茎頂切片を観察すると,はじめ平板状であった生長点は,わずかに丸く肥厚した後,突出した。突出した生長点部に形成される葉原基の腋部には,その後新たな生長点が形成された。平板状の生長点が丸く肥厚し始める時期を花芽分化初期,突出した生長点部に形成される葉原基の腋部に新しい生長点が確認できた時期を側花房分化期とした。花芽分化初期は25/20°C区では播種後3033日目,20/15°C区では39日目であった。また,側花房分化期は25/20°C区では播種後38日目,20/15°C区では54日目であった。花芽分化初期における長さ1cm以上の葉の数は温度に関わらずほぼ18枚で一定であり,また葉原基数は3540で温度による差は小さかった。これは,一定の発育段階に達した後に初めて栄養生長から生殖生長への相転換が起こるのであり,それ以前には花成刺激を受けても反応が起こらないことを示唆するものと考えられた。実験2において、レタスの屈曲は20葉前後の葉で見られた。また,屈曲を示さない第9葉と屈曲を示した第25葉の中肋におけるデンプン粒の分布を調べたところ,どちらの葉においてもデンプン粒は維管束周囲の細胞にのみ観察され,しかも細胞内では胚軸側に分布するものの割合が多かった。すなわち,デンプン粒の数や分布で見る限り,葉の組織化学的特性は発育段階によって変化しないと考えられた。多くの植物は一定のの大きさに達しないと、花芽を分化しない。そこで、一定の大きさに達するまでの時期を幼若相、花芽分化の能力を獲得するようになった時期を成熟相と呼んで区別する。木本植物では、果実を早く生産するため,成熟相に早く転換させることが重要である。しかし,多年生草本植物では,成熟相にある植物と幼若相にある植物の花成促進処理に対する反応の違いは明らかになっていない。そこで,この点を明らかにすることを目的に以下の実験を行った。16時30分から翌朝7時までイチゴ'とちおとめ'のランナー苗を15°Cの冷蔵庫に3週間入れて,花芽分化させた。対照として,夜冷処理を施していないランナー苗を供試した。9月8日に1.5 1のポットに移植し,翌日,夜冷処理を施した個体と施していない個体の各半数について,茎頂をメスで切除した。残り半数は茎頂を切除せず,そのまま日長15時間,昼温25,夜温20°Cの温室で栽培を続けた。これら4処理の固体について,7週間にわたり,花芽分化の状況を調査した。花芽分化の有無に関わらず,茎頂を切除すると,新たな茎頂を形成した。しかし,花芽の形成には差が認められ,花芽分化後,茎頂を切除した植物体では,長日,高温の条件下においても約1か月後に花芽の分化が確認できた。一方,花芽を分化していない個体では,茎頂を切除すると実験終了時まで花芽の分化は起こらなかった。これらの結果は栄養生長から生殖生長への転換が起こると,花芽分化が起こりやすい体勢になることを示していると考えられる。
人工線維の肺胞マクロファージに及ぼす毒性評価実験への磁界測定の応用

石綿の発癌性が指摘されている事は広く知られているところであり、石綿代替物質の開発・普及も著しく進展してきている。しかし、石綿代替物質の人への健康影響については未だ不明な部分が多く、安全性評価に関する研究が課題となっている。そこで、今回我々は、これら代替物質の人への健康影響を明確にするため、以前より報告してきたような我が教室独自の方法である細胞磁界測定を用いたハムスターの肺胞マクロファージへの細胞毒性評価方法を用いて検討した。その結果、2種類の代替物質SiCとTiO_2共にコントロール群に比較して量影響的に緩和曲線は遅延し、緩和係数も低値を示した。障害細胞から逸脱するLDHの酵素活性値に関しても量影響的にLDH放出率が高くなる結果が得られている。また、形態学的にも細胞質内に多発性の空胞が出現し、核の変形・核クロマチンの凝集も観察され、その出現頻度もコントロール群に比較して多いということが認められた。さらに、TUNEL法及びDNAladder法によるアポトーシスの観察においても、SiCでは若干ながらアポトーシスが認められた。しかしながら、アポトーシスは本来、正常細胞においても数%認められるので、今回得られた所見が、添加物質による影響によるものかを、更に検討する必要がある。以上のことから、今後さらに、量影響関係や細胞毒性の機序などの検討が必要である。そこで、今回我々は、これら代替物質の人への健康影響を明確にするため、以前より報告してきたような我が教室独自の方法である細胞磁界測定を用いてハムスターの肺胞マクロファージへの細胞毒性評価方法を用いて検討した。その結果、2種類の代替物質SiCとTiO共にコントロール群に比較して緩和曲線は遅延し、緩和係数も低値を示し有害性があると考えられ、量影響関係も考慮しておく必要があると推察される。現在、障害細胞から逸脱する、LDHやβ-グルクロニダーゼ等の酵素活性値を測定し緩和現象と対比検討し、形態学的についても併せ観察検討している。今後は、繊維状物質の形態(大きさ・長さ)の違いによる毒性影響も検討し、その他の代替物質の検討も順次行う予定である。また、肺胞マクロファージにSiC,TiO2を添加したものに、免疫染色を施して、アポトーシス細胞の割合を計測したところ、軽度に量影響関係を示す結果を得ている。しかしながら、アポトーシスは本来、正常細胞においても数%認められるので、今回得られた所見が、添加物質による影響によるものかを、更に評価する必要性がある。