hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト純化細胞を用いた肝多段階発がん過程におけるエピゲノムプロファイル解析

肝部分切除術検体から、計31検体分の正常肝細胞ならびに非がん肝細胞を純化し得た。比較対照の組織検体と共にゲノム網羅的DNAメチル化解析を行った。HCV陽性症例はHBV陽性症例に比してDNAメチル化異常の頻度が高く、HCV陽性症例ではDNAメチル化亢進の頻度が高かった。HBV特異的プロファイルは極めて少なく、一方でHCV特異的プロファイルはゲノム全体に高頻度で認められた。組織検体と純化肝細胞の結果は概ね一致していたが、純化細胞でより顕著に観察できる特徴もあった。純化細胞を用いることでChIP-seqが可能になり、臨床情報と紐付いたヒト臨床検体のヒストン修飾パターン取得が可能になった。17検体分の純化肝細胞を収集した。収集した肝細胞については、フェノール・クロロホルム法と透析法によって高分子量DNAを抽出し、高密度ビーズアレイであるInfinium HumanMethylation450k BeadChipを用いたゲノム網羅的DNAメチル化解析を施行した。肝細胞純化対象とした症例の性・年齢・肝炎ウイルス感染の有無、肝細胞がんの腫瘍径・分化度・静脈侵襲の有無・肝内転移の有無等の臨床病理学的因子の情報を収集した。特に肝炎ウイルス非感染肝細胞がん症例の病因とDNAメチル化異常を解析する場合、非がん肝組織の脂肪化の評価が重要であるが、一方で肝脂肪化は手術直近の栄養状態等に左右され、一定の訓練が必要である。肝臓病理の専門家に協力を仰ぎ、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪肝の脂肪化・線維化の程度の評価を習得した。純化肝細胞の収集は引き続き行いつつ、既収集凍結組織検体を解析に加える方針とした。大腸がん肝転移症例等の正常肝組織36検体、肝細胞がん症例の非がん肝組織36検体、肝細胞がん組織24検体について、Infinium HumanMethylation450BeadChip解析を行った。非がん肝組織において正常肝組織に比してすでに生じ、その異常が肝細胞がんに継承されるDNAメチル化の変化を示すCpG部位を21,106CpG検出した。肝細胞がん症例にはHBV陽性症例・HCV陽性症例の双方を含むように選択し、各肝炎ウイルス毎に肝発がんに寄与する可能性のあるDNAメチル化の変化を検出した。HCV陽性症例はHBV陽性症例に比してDNAメチル化異常の頻度が高く、HCV陽性症例ではDNAメチル化亢進の頻度が高いことがわかった。凍結組織と純化細胞による結果を比較すると、HBV陽性例の純化細胞において全体的なDNAメチル化減弱とCpGアイランドのDNAメチル化亢進のパターンが顕在化した点が異なっていたが、ゲノム全体を俯瞰したDNAメチル化パターンにおいては純化細胞と凍結組織に大きな差異はなかった。純化正常肝細胞の標準DNAメチル化プロファイルと比較すると、ウイルス感染を伴う肝細胞では正常肝細胞における個体差を遥かに凌駕するDNAメチル化変化があった。ウイルス種によるDNAメチル化変化の差異を比較すると、HBV感染肝細胞に比してHCV感染肝細胞ではより多くのDNAメチル化変化が蓄積していた。HBV感染肝細胞ではDNAメチル化亢進が、HCV感染肝細胞ではDNAメチル化減弱が目立っていたが、HBV感染肝細胞においてもCpGアイランドではDNAメチル化亢進が優位であった。個体差が少なく、DNAメチル化の変化から何らかの機序で保護されているとみられる転写開始点から200bp以内や第1エクソンにおいても、HCV感染肝細胞ではDNAメチル化の変化がみられ、保護機序の破綻が推察された。組織検体を用いたInfiniumビーズアレイ解析において、HBV陽性肝に比してHCV陽性肝ではDNAメチル化異常の頻度が高く、DNAメチル化亢進の頻度が高い結果が得られており、純化肝細胞の解析結果はこれと一致していることが確かめられた。組織検体のInfiniumビーズアレイ解析データより、HCV陽性肝細胞がんにおいて前がん状態より生じがんに受け継がれるDNAメチル化異常を示すCpG部位を特定し、その部分のヒストン修飾状態を純化肝細胞によるChIP-seqで評価した。同部位においてはH3K4me1とK27Acがより集積しており、肝発がんに寄与するDNAメチル化異常に先行するのはK4me1+K27Acのactiveマークの可能性があると考えられた。純化肝細胞の解析予定数の減少を、既収集組織検体による解析を加えることで補っている。

検体数を増やすことで統計解析における正確性を担保すると共に、純化細胞と血管・胆管・炎症細胞等を含む組織検体とのDNAメチル化プロファイルを比較することが可能になり、今後自他ともに増えていくとみられる、既収集組織バイオバンク試料を用いた観察研究の可能性について検討できると考えている。病理学、エピゲノム純化肝細胞のInfinium解析データのバイオインフォマティクス解析を行う。また、組織検体の検体数を増やし、Infiniumアレイ施行とデータ解析を行う。発がんに寄与する可能性のあるDNAメチル化プロファイル解析を進めると共に、純化細胞による結果と組織検体による結果を比較し、組織検体に混入していると思われる非肝細胞の結果に対する影響について検討する。純化肝細胞の収集がやや遅れている。肝組織片にカニュレーションして灌流する技術を持った研究協力者(本研究における分担研究者外)の転出と、同意・余剰組織量等で細胞純化に適切な症例数が収集予定期間において予想に比して少なかったことが主な理由である。カニュレーションを行わず細切のみで細胞分離を行う場合、カニュレーション施行時よりやや組織量の余裕が必要であるが、収集期間を延長することで検体の収集に尽力する。10円未満の微小な残金であり、これのみでは研究に有用な使途がないため。引き続き純化肝細胞の収集と核酸抽出、同検体を用いた高密度ビーズアレイによる網羅的DNAメチル化解析を行う。コホートのデータ全てが揃った段階で、平時より共同研究を行っているバイオインフォマティシャンと協力し、病因特異的なDNAメチル化プロファイルを解析する。病因特異的にDNAメチル化の変化を生じるゲノム領域の共通性を抽出し、その領域のChIP解析等を行う。それらの成果から、病因特異的・塩基配列特異的にエピゲノム異常が惹起される分子機構の理解を進める。さらに、慢性肝障害患者の発がんリスクの診断指標となり得る、病因特異的エピゲノム異常の絞り込みを行う。次年度交付額と合わせて、物品費等として使用する。
準粒子励起に敏感なプローブを用いた異方的超伝導体の超伝導対称性の研究

重い電子系超伝導体URu2si2において、転移温度Th=17.5Kに観測される比熱の大きなとびを伴う相転移は未だに秩序変数が明らかにされず、「隠れた秩序」と呼ばれる四半世紀にわたる大きな謎となっている。またT=1.5K以下で発現する超伝導は隠れた秩序相に内包される形で存在しており、この物質の超伝導発現機構を調べる上で隠れた秩序の秩序変数を明らかにすることは極めて重要であると考えられる。近年、磁気トルクの精密測定により隠れた秩序相において結晶に保たれている4回回転対称性が破れていることが報告された。そこで、我々は実際に「何」が回転対称性を破っているかを調べるためにサイクロトロン共鳴測定とシンクロトロン放射光を用いた精密X線構造解析を行った。サイクロトロン共鳴測定では電子構造の決定を行うことにより、サイクロトロン質量の特異な異方性を観測した。これは隠れた秩序相が4回回転対称性を破る電子ネマティック液体とよばれる状態であることを示唆している。またX線構造解析では、隠れた秩序の相転移温度17.5K以下でわずかな斜方晶歪みが出現することを観測した。この結果は、磁気トルク測定、サイクロトロン共鳴測定によって明らかにされた電子ネマティック液体状態になっていることを裏付ける物であり、さらに磁場をかけない状態で本質的に4回回転対称性を破っていることを明確に示した点で、非常に重要な結果である。重い電子系超伝導体URu2Si2の隠れた秩序相に関してサイクロトロン共鳴測定、シンクロトロン放射光によるX線構造解析により、回転対称性の破れを観測した。そのため研究は順調に進展していると言える。(抄録なし)重い電子系と呼ばれるf電子系化合物において超伝導電子対が形成されると強い電子間相互作用により特異な超伝導状態が実現する。その超伝導状態は多種多様にわたっており、例えば反強磁性や強磁性といった磁気秩序と共存するものが報告されてきた。これに対し重い電子系超伝導体URu2Si2は「隠れた秩序相」と呼ばれる、その秩序変数が四半世紀もの間明らかにされていない非磁性相と共存しており、非常に多くの興味がもたれてきた。磁気秩序と共存する超伝導物質の超伝導発現機構がその磁気秩序と密接に関連していることから、URu2Si2の超伝導状態を明らかにする上で隠れた秩序相を調べることは非常に重要であると考えられる。隠れた秩序相において「何の対称性が破れているのか」という最も根本的な問題を考えることは隠れた秩序相の秩序変数を解明する上で重要な役割を示すが、これに対して最近磁気トルクの実験で結晶に保たれている四回対称性が破られていることが明らかとなった。そこで我々は四回対称性が破れている更なる証拠を得るためにマイクロ波空洞共振器を用いてサイクロトロン共鳴を行った。サイクロトロン共鳴測定はFermi面の極値軌道を運動する電子の有効質量を直接測定できる強力な手法である。これによりFermi面の電子質量の角度依存性を明らかにし、さらにバンド計算と比較することによって隠れた秩序相における電子構造を決定した。また最も大きなホール面に対応すると考えられる共鳴線が[100]方向から[110]方向に磁場を面内で回転させたときに2つに分裂する振舞いを観測した。この分裂は有効質量が面内異方性をもち、電子構造自体が四回対称性を破っていることを強く示唆している。今後は超伝導状態においても電子状態の四回対称性が破れているかを調べ、隠れた秩序相と超伝導相との関連を調べたい。重い電子系超伝導体URu2Si2において転移温度Th=17.5Kに観測される比熱の大きなとびを伴う二次相転移に関して、未だに秩序変数が明らかにされず、「隠れた秩序」と呼ばれる四半世紀にわたる大きな謎となっている。またこの物質は超伝導相が隠れた秩序相に内包されており、その超伝導発現機構を研究する上で隠れた秩序を解明することは非常に重要である。そこで我々はシンクロトロン放射光を用いた精密X線構造解析を低温で行い、隠れた秩序の相転移温度17.5K以下でわずかな斜方晶歪みが出現することを観測した。この結果は、昨年行ったサイクロトロン共鳴による電子構造の決定により明らかにした特異な異方性から類推した、4回回転対称性を破る電子ネマティック液体とよばれる状態になっていることを裏付ける物であり、さらに磁場をかけない状態で本質的に4回回転対称性を破っていることを明確に示した点で、非常に重要な結果である。また隠れた秩序相と超伝導状態に関して同じ物質の熱電係数を測定したところネルンスト係数に関して超伝導転移温度より2倍以上高い温度から急激に増大していることが明らかとなった。この結果は銅酸化物高温超伝導体などにも観測されており、そのアナロジーからURu2Si2においても超伝導揺らぎが発達していることが考えられる。またこの振舞いは上部臨界磁場よりもはるかに高い磁場でも観測されたことから、URu2Si2は超伝導が完全に壊れているような広い磁場・温度領域で超伝導揺らぎが発達した特異な電子状態を持つ系であることを示唆している。

またT=1.5K以下で発現する超伝導は隠れた秩序相に内包される形で存在しており、この物質の超伝導発現機構を調べる上で隠れた秩序の秩序変数を明らかにすることは極めて重要であると考えられる。近年、磁気トルクの精密測定により隠れた秩序相において結晶に保たれている4回回転対称性が破れていることが報告された。そこで、我々は実際に「何」が回転対称性を破っているかを調べるためにサイクロトロン共鳴測定とシンクロトロン放射光を用いた精密X線構造解析を行った。サイクロトロン共鳴測定では電子構造の決定を行うことにより、サイクロトロン質量の特異な異方性を観測した。これは隠れた秩序相が4回回転対称性を破る電子ネマティック液体とよばれる状態であることを示唆している。またX線構造解析では、隠れた秩序の相転移温度17.5K以下でわずかな斜方晶歪みが出現することを観測した。この結果は、磁気トルク測定、サイクロトロン共鳴測定によって明らかにされた電子ネマティック液体状態になっていることを裏付ける物であり、さらに磁場をかけない状態で本質的に4回回転対称性を破っていることを明確に示した点で、非常に重要な結果である。今年度は熱電係数の測定手法をフランスの研究室で学び、帰国後はプローブの開発に従事してきた。また重い電子系超伝導体URu2Si2のサイクロトロン共鳴の測定結果を論文に投稿するために解析を進め、多くの学会で発表を行ってきた。そのため比熱測定プローブの開発を進めるのが遅くなってしまった。しかし、フランスで学んだノイズ除去の手法を用い、当初の予定よりずっと精度のよい比熱測定プローブを現在設計している。そのため研究はおおむね順調に進展していると言える。今年度は重い電子系超伝導体URu2Si2の隠れた秩序相に関して放射光測定により、その研究が大きく進展した。また熱電係数測定により大きな超伝導揺らぎが生じている新奇な電子状態を発見した。これらの結果から研究はおおむね順調に進展していると言える。重い電子系超伝導体URu2Si2の隠れた秩序相に関してサイクロトロン共鳴測定、シンクロトロン放射光によるX線構造解析により、回転対称性の破れを観測した。そのため研究は順調に進展していると言える。現在、開発を行っている熱電係数測定プローブを完成させフランスとの共同研究を完結する。その後、比熱測定プローブの開発を終えトンネルダイオード発振器と組み合わせて重い電子系超伝導体URu2Si2の超伝導ギャップ対称性について議論していきたい。またURu2Si2において磁気トルク実験により超伝導状態でも四回対称性が破れているか議論したい。ピエゾ素子を用いて圧力中の熱電係数を測定することにより重い電子系超伝導体URu2si2の隠れた秩序相におけるネマティック電子状態を明らかにする。またトンネルダイオード発振器を用いて超伝導対称性について議論したい。(抄録なし)
軟骨細胞における機械的刺激応答の細胞極性による制御

ATDC5細胞を軟骨分化誘導し、三次元コラーゲンゲル培養に伸展力を負荷することにより、アクチンの走行やextracellular signaling regulated kinase (ERK) 1/2の活性化の経時的変化を観察ことにより、軟骨前駆細胞株ATDC5が軟骨細胞へと分化するメカニズムと細胞極性や細胞内情報伝達分子との関わりについて調べた。軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化時において、アクチンフィラメントの走行の変化およびERK1/2の活性化と機械的刺激の大きさには密接な関わりがあることが示された。本研究は、三次元コラーゲンゲル培養法とタイムラプス顕微鏡を組み合わせ、軟骨細胞の分化メカニズムと細胞極性や細胞内情報伝達分子との関わりに注目し、機械的刺激応答の分子メカニズムの解明をめざす。ERK2-GFPfusionタンパク発現ベクターをATDC5細胞へトランスフェクションし、発現を確認した。また、ERK2-GFPを発現したATDC5をガラスボトムディッシュに播種し、ガラスニードルとマイクロマニピュレータを用いて伸展刺激を加えることにより、ERK2の核移行が認められることを再確認した。Cellmatrix Type I-Aを用い、ガラスボトムディッシュにコラーゲンゲル層(Base Layer)を作製した。その上に、細胞を混合したコラーゲンゲルをBase Layer上に注ぎ、Cell Layerとした。さらに、変位を評価するための指標となる蛍光標識したマイクロスフェア(Fluosphere、直径1.0 ...m、2.7x1010個/ml)を懸濁した1%アガロース/PBSでコーティングし、Top Layerとした。DMEM/F-12, 5%FBS下で培養を行い、観察直前にnuclear-ID Red DNA stainを添加したフェノールレッド不含のLibovit's L-15培地へ交換後、共焦点レーザー顕微鏡による解析を行うことにより、最適な細胞密度と蛍光マイクロスフェアの濃度を決定した。これにより、3次元コラーゲンゲル培養の条件設定が完了した。また、II型コラーゲンプロモーター・エンハンサー領域を含み、赤色蛍光蛋白(DsRed)をレポーターとして発現するプラスミドを作製、ATDC5にトランスフェクションを行った。Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)を添加し、軟骨分化誘導を行ったところ、蛍光顕微鏡下でDsRedの蛍光強度が増加した。これにより、軟骨前駆細胞が軟骨細胞へ分化するステップをリアルタイムで把握することが可能となった。これまでの研究から、軟骨細胞の分化は、機械的伸展刺激を負荷することにより阻害される一方、圧縮刺激により促進されることが分かってきた。しかし、軟骨細胞の指向性のある機械的刺激応答のメカニズムについては全く分かっていない。本研究では、軟骨細胞の極性と機械的刺激に対する応答特性の違いに着目し、三次元コラーゲンゲル培養法とタイムラプス顕微鏡を組み合わせ、軟骨細胞の分化メカニズムと細胞極性や細胞内情報伝達分子との関わりに注目し、機械的刺激応答の分子メカニズムの解明をめざす。これにより、軟骨細胞分化を制御し、顔面骨格組織の成長制御を可能とするための基盤的理論を確立する。軟骨胞分化における機械的刺激応答機構をリアルタイムに検討するため、顕微鏡下で単一細胞を観察しながら機械的刺激を負荷した。機械的刺激負荷装置としては、蛍光顕微鏡とマイクロマニピュレーターにて構築した装置を用い、GFP標識ERKおよびDsRed標識II型コラーゲンプロモーター発現するATDC5細胞をコラーゲンゲルに埋入した培養チャンバーを、マイクロマニピュレーターで水平方向への力を負荷したところ、細胞の位置は著しく変化したが、伸展率の指標として埋入している蛍光ビーズにより細胞周囲の伸展率を評価したところ、これまでの研究より低いものであった。また、水平方向への伸展により、伸展方向に垂直な方向には圧縮力が加わっている可能性が認められたため、培養チャンバーの構造とマイクロマニピュレーターとの接合部に関して、再検討を行った。培養チャンバーとマイクロマニピュレーターとの接合部のアダプター部分の再設計は完了し、現在、作製中である。改良したストレッチチャンバーとコラーゲンゲルを三次元モデル化し、有限要素法を用いて、チャンバー伸展に伴うゲルの変形のシミュレーションを行った。中央部の歪みは、チャンバー10%および20%伸展時、それぞれ約15%および約28%であった。これに対して、実際に伸展力を負荷した際、コラーゲンゲルに埋入した蛍光マイクロビースの位置変化によってゲルの伸展を評価したところ、チャンバー10%および20%伸展時、それぞれ約5%および約9%となり、有限要素モデルよりも伸展率が減少する結果となった。次に、GFP融合ERK2タンパクを発現するATDC5を蛍光ビーズとともにコラーゲンゲルに埋入し、実際にマイクロマニピュレーターにより伸展力を負荷した。その結果、チャンバーを20%伸展して経時的な変化を観察した結果、ERK2の細胞内局在の変化は認められなかった。そこで、用いるチャンバーと伸展装置を変更し、ストレックス社のストレッチチャンバーとネジ式伸展装置を用いることとした。ストレッチチャンバーをコラーゲンコートし、ATDC5を播種、翌日、培地交換10時間後に20%伸展力を加え、1時間後、12時間後にPBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒドにて固定を行った。ブロッキング後、4°Cにて抗リン酸化ERK、抗ERK抗体を反応後、翌日、PBSで洗浄後、二次抗体を反応させ、さらにアクチン染色を行った。その結果、伸展力負荷1時間後には、リン酸化ERKの核移行が認められ、12時間後にはアクチンフィラメントの走行に変化が認められた。ATDC

5細胞を軟骨分化誘導し、三次元コラーゲンゲル培養に伸展力を負荷することにより、アクチンの走行やextracellular signaling regulated kinase (ERK) 1/2の活性化の経時的変化を観察ことにより、軟骨前駆細胞株ATDC5が軟骨細胞へと分化するメカニズムと細胞極性や細胞内情報伝達分子との関わりについて調べた。軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化時において、アクチンフィラメントの走行の変化およびERK1/2の活性化と機械的刺激の大きさには密接な関わりがあることが示された。蛍光顕微鏡とマイクロマニピュレーターにて構築した機械的刺激負荷装置を使用して、GFP標識ERKおよびDsRed標識II型コラーゲンプロモーター発現するATDC5細胞をコラーゲンゲルに埋入した培養チャンバーを、マイクロマニピュレーターで水平方向への力を負荷したところ、細胞の位置は著しく変化したが、伸展率の指標として埋入している蛍光ビーズにより細胞周囲の伸展率を評価したところ、これまでの研究より低いものであった。また、水平方向への伸展により、伸展方向に垂直な方向には圧縮力が加わっている可能性が認められたため、培養チャンバーの構造とマイクロマニピュレーターとの接合部に再検討が必要となった。医歯薬学改良した培養チャンバーの完成後は、再度、伸展率の確認をし、実際に細胞に伸展力が加わっていることを確認する。生細胞を標識する蛍光試薬を用いて、軟骨細胞分化に伴う細胞極性の獲得過程を可視化する。脂質膜および核を、それぞれPHK26もしくはPHD67およびCYTO13もしくはCYTO17によって標識し、細胞分化と細胞形態の変化をリアルタイムで観察することにより、軟骨細胞の分化過程、細胞極性獲得過程、および機械的刺激応答特性を解析する。また、マイクロマニピュレーターのチップ先端に対して、全く加工を行わない物と、GRGDSPKペプチドあるいはGRADSPKペプチドなど、インテグリンと結合するペプチドをコートし、細胞膜の接着を誘導し、マイクロマニピュレーターを操作することにより細胞の接着力や細胞形態の評価、それに伴うGFP標識ERKの局在やDSRed標識II型コラーゲンプロモーターの活性についての検討を行う。ERKの活性化と軟骨分化活性の両方をリアルタイムで観察する準備が整っており、また3次元コラーゲンゲルに伸展力を負荷するための基礎的な条件設定が終了しているため。培養チャンバーの再製作を行ったことで、今年度行う培養実験に用いる消耗品の購入が減少したため。3次元コラーゲンゲル培養したERK-GFPおよびcol2a1 promoter-DsRedを発現する細胞に、マイクロマニピュレーターを用いることにより機械的刺激を負荷、蛍光顕微鏡下でERKやCol2a1の活性をリアルタイムで観察する。さらに、生細胞を標識する蛍光試薬を用いて軟骨細胞分化に伴う細胞極性の獲得過程を可視化する。
アイスランドの火山岩を用いた地磁気変化史及びマグマ形成史の研究

平成6年7月に4名の研究者(河野、田中・小屋口、牧島)と研究協力者1名(広井修)がアイスランドにおいて現地調査を行った。また現地側研究者(レオ・クリスチャンソン)は試料採集地点の予備調査を実施、またアイスランド大学の備品(交流消磁器)を貸与するなど、調査の成功に大きく貢献した。調査を主に(1)アイスランド西部、レイクホルト周辺、(2)北部、ストルチャルニール周辺、(3)東部、フリョツダルール、(4)東部、ヨクルダルールの4ヶ所において実施した。1.古地磁気資料の採集と予備測定上記4ヶ所において、連続露頭を形成している玄武岩溶岩合計264枚から1溶岩当り5本のコアサンプルを採集した。これらはいずれも太陽や磁気コンパスを用いて方向づけした定方位試料である。これらのうち一部は、持参したスピナ-磁力計及び借用した交流消磁装置を用いて現地において磁化を測定した。これにより大まかな正逆のパターンを把握するなど、サンプリングを進める上で大変有益な情報が得られた。2.地球化学用試料の採集古地磁気試料の採集をした溶岩から各1個の試料を採集した他、スネフェルスネス、ラキ、クラフラ、ヘクラ、ウェストマンヤ-ルなど最近1000年程度の期間内に噴出した比較的シリカの多い溶岩や火砕岩を採集した。これらの岩石は海嶺やホットスポットの噴出物から珪質の地殻が作られるプロセスの証拠を与える可能性がある。これらの試料に対して今後主成分分析、同位体分析などが行われる予定である。3.地磁気層序の検討古地磁気試料の磁化方位については、現在東大と東工大において測定が進められている。また同じ試料を用いK-Ar年代を決定するために、約50個の試料について現在測定が進められている。このうちカリウムの定量は地震研究所において炎光光度計により、アルゴンの定量は岡山大学地球内部研究センターの質量分析計を用いて共同利用によって実施されている。4.古地磁気強度の決定過去の磁場強度を求めるためにテリエ法を用いた実験が行われ、約200万年前の地磁気逆転を含むセクションについての結果がまとめられた。この結果はすでに論文として出版された。この結果によると、地磁気の逆転時に磁場は通常より1/4程度に弱くなっている。これはこれまでにすでに知られていた事だか、方向が普通の状態に戻ったあとも強度はしばらく回復しないことが今回の結果から明らかになった。5.古地磁気永年変化アイスランドも含めて世界中の過去1000万年間の古地磁気データを集め、地球磁場の長期的な変動の特性を検討している。磁場強度データに関しては我々がデータベースを作成し世界中に公開した。また方向データはフランスのグループが作成したデータベースを用いた。これから様々な興味のある統計的性質を引き出すことができ、現在研究を進めている。古地磁気永年変化のモデルはこれまである種の任意性を持った仮定の上に組み立てるのが通例であったが、今回ガウス係数から直接様々な観測量を導き出すことに成功した。この手法はもともとConstable and Parker(1998)によって開発されたものだが、我々はもとの方法とは独立でしかもより一般性をもつ方法を導き出すのに成功したものである。この結果によるとConstable and Parkerのモデルは球上で余りに一様な結果を与え、例えば仮想古地磁気極(VGP)の角度分散が緯度とともに増加することを説明できない。観測値を説明するには四極子項がかなり大きい必要があることが明らかになった。

4.古地磁気強度の決定過去の磁場強度を求めるためにテリエ法を用いた実験が行われ、約200万年前の地磁気逆転を含むセクションについての結果がまとめられた。この結果はすでに論文として出版された。この結果によると、地磁気の逆転時に磁場は通常より1/4程度に弱くなっている。これはこれまでにすでに知られていた事だか、方向が普通の状態に戻ったあとも強度はしばらく回復しないことが今回の結果から明らかになった。5.古地磁気永年変化アイスランドも含めて世界中の過去1000万年間の古地磁気データを集め、地球磁場の長期的な変動の特性を検討している。磁場強度データに関しては我々がデータベースを作成し世界中に公開した。また方向データはフランスのグループが作成したデータベースを用いた。これから様々な興味のある統計的性質を引き出すことができ、現在研究を進めている。古地磁気永年変化のモデルはこれまである種の任意性を持った仮定の上に組み立てるのが通例であったが、今回ガウス係数から直接様々な観測量を導き出すことに成功した。この手法はもともとConstable and Parker(1998)によって開発されたものだが、我々はもとの方法とは独立でしかもより一般性をもつ方法を導き出すのに成功したものである。この結果によるとConstable and Parkerのモデルは球上で余りに一様な結果を与え、例えば仮想古地磁気極(VGP)の角度分散が緯度とともに増加することを説明できない。観測値を説明するには四極子項がかなり大きい必要があることが明らかになった。平成5年7月1日から7月26日にかけてアイスランドでの現地調査を実施した。アクレイリ町東の鮮新世台地玄武岩の連続溶岩層序を2セクション(LT、SI)で火山層序の調査およびポ-タブルドリルによる試料採取を実施した。その後エギルススタディール町西南の鮮新世台地玄武岩を1セクション(MA)にて同様に調査した。最後にクラフラ火山やヘクラ火山にて単成火山の調査および試料採取を実施した。アイスランド側研究分坦者クリスチャンソンとの事前連絡を十分行っていたため、現地調査はたいへんスムーズに実施できた。合地玄武岩についてはアイスランド大の地質学科学生を調査補助に雇い、火山地質層序の詳細を短期間に解明できた。また小型スピナ-磁力計を日本から持ち込み、消磁はアイスランド大の装置で行い、現地にて各溶岩で一つの試料については古地磁気方向を決定した。この古地磁気方向を決定した。この古地磁気の現地測定は重要と判断される溶岩の再調査をすぐに可能にした。火山岩試料は手荷物として持ち帰り、古地磁気用試料は東工大にて、他は岡山大にて保存してある。古地磁気方向の測定に関しては、LT、SIの両セクションについてほぼ終了した。地磁気永年変化の程度を示す角度分散は約20度で世界的傾向に基づくモデルと一致した。また全平均の古地磁気極は地理極と一致するという仮定から溶岩の形成後の傾動を見積もったところ、現地での観察と同じ傾向ではあるがより小さな傾動値の約5度であることがわかった。
遺伝子プロモーターのメチル化を用いた自殺予測のためのバイオマーカーの開発

うつ病の自殺企図を予防する目的で、うつ病患者50例を対象に脳由来神経栄養因子・TrkB受容体・セロトニントランスポーター(5HTT)・セロトニン2c受容体遺伝子のCpGのメチル化率を計測し、自殺予測に関与するバイオマーカーの開発を試みた。メチル化率の解析は、末梢血由来のDNAを対象にMassARRAY法にて行い、合計149ヶ所のCpGを計測した。ハミルトンうつ病評価尺度による希死念慮の程度と有意な相関を示すCpGは検出されなかったが、うつ病者の自殺企図と関連する、不遇な養育環境と5HTTのCpGメチル化率に相関が得られ、5HTT遺伝子メチル化率は自殺企図のマーカーとなる可能性が示唆された。本年度の研究計画に沿って、自殺予測のためのバイオマーカーの探索を目的とした、下記の研究を行った。メチル化解析に関する基礎的研究:末梢血由来のDNAを対象に、セロトニン受容体(5-HT)1A, 2C遺伝子及びBDNFの受容体であるTrkB (NTRK2)遺伝子の、エクソン1をカバーするCpG island内及びshoreのCpGのメチル化解析をMassARRAYで行う方法を開発した。5-HT1A遺伝子の転写に重要な部位である領域(Chr X:113818520-113819453)のメチル化解析を行うため、合計5つのプライマーセット用いて解析する方法を開発した。5-HT2C遺伝子の転写に重要な部位である領域(Chr X:113818520-113819453)のメチル化解析を行うため、合計5つのプライマーセット用いて解析する方法を開発した。NTRK2遺伝子の転写に重要な部位である領域(Chr 9:87282548-87286336)のメチル化解析を行うため、合計3つのプライマーセット用いて解析する方法を開発した。メチル化およびmRNA発現に関する臨床的研究:うつ病患者を対象にHamilton Scale for Depression (HAM-D)で自殺念慮を評価した上で、末梢血由来のDNA, total RNAを用いて以下の解析を行った。SLC6A4(セロトニン・トランスポーター)遺伝子のmRNA発現量について、特に健康対照者との間に有意な差はなく、自殺念慮の程度との間に有意な関連はみられなかった。エクソン1をカバーするCpGのメチル化率について、特に健康対照者との間に有意な差はなく、自殺念慮の程度との間に有意な関連はみられなかった。メチル化解析に関する基礎的研究:昨年度に引き続き、末梢血由来のDNAを用いてうつ病患者50例と健康対照者50例を対象に、セロトニン・トランスポーター(SLC6A4)、セロトニン受容体(5-HT)1A, 2C、BDNF、TrkB (NTRK2)の各遺伝子の、エクソン1をカバーするCpG island内及びshoreのCpGのメチル化解析をMassARRAYで行った。各遺伝子のCpGのメチル化率とHamilton Rating Scale for Depression (HAM-D)の自殺念慮評価点との間に、有意な相関は得られなかった。うつ病の重症度を評価するHAM-D総得点と各遺伝子のCpGメチル化率との間には、SLC6A4遺伝子のCpG3, 76で有意な相関がみられた。うつ病患者群と健康対照者群の間でメチル化率に有意な差のみられるCpGを探索した結果、BDNF遺伝子の29か所とSLC6A4遺伝子の1か所のCpGで有意差がみられたが、他の遺伝子では有意差のあるCpGはみられなかった。メチル化およびmRNA発現に関する臨床的研究:うつ病患者を対象にHAM-Dで自殺念慮を評価した上で、昨年度に引き続き、末梢血由来のtotal RNAを対象にreal-time PCR法を用いてSLC6A4, BDNF遺伝子のmRNA発現量の解析を行った。SLC6A4, BDNF遺伝子のmRNA発現量について、特に健康対照者との間に有意な差はなく、自殺念慮の程度との間に有意な関連はみられなかった。今回のメチル化解析で対象とした遺伝子は、抗うつ薬の標的とされる遺伝子群であるが、今回の研究結果からみると自殺念慮という症状の形成には、これらの遺伝子の関与は乏しいと考えられた。これまでの研究では報告のない、5-HT1A, 5-HT2C受容体遺伝子の転写に重要な領域である、エクソン1をカバーする位置にあるCpG island, shoreのメチル化の解析法を、世界で始めて開発した。これまでに自殺者の死後脳を用いて報告のあるNTRK2

遺伝子に関しては、既報にある領域を超えて多くのCpGメチル化の解析を実施した。昨年度開発に成功したSLC6A4遺伝子メチル化解析法を用いて、うつ病患者の臨床症状とメチル化率やmRNA発現の解析が出来た。これまでの研究成果から、5-HTT遺伝子mRNA発現と自殺念慮やうつ状態とは密接な関係のあることが報告され、5-HTT遺伝子のエクソン1のプロモーター領域のメチル化の解析を試みた研究は幾つかある。しかしながらこの領域の複雑な遺伝子構造から、これまでの方法論ではごく一部のCpGのメチル化のみを解析したり、我々も当初は出来なかった部位を除いた領域のメチル化を解析した報告しかなかった。このため幾つかのプライマー設計を試しながら、MassARRAYによるメチル化解析を行う必要があったために初年度を費やす結果となっている。健康者由来の末梢血DNAを用いて、BDNF, NTRK2, SLC6A4, 5-HT1A receptor, 5-HT2C receptor遺伝子のexon 1のプロモーター領域にあるCpG island内およびshoreのCpGのメチル化解析方法を開発した。このため次年度には本年度以上に多数例のうつ病者を集め、各遺伝子のメチル化を解析して自殺企図や自殺念慮との関連を解析する。健康対照者を用いた末梢血由来のtotal RNA及びDNAから、各遺伝子mRNA発現計測やBDNF, 5-HTT遺伝子メチル化の解析が出来るようになったので、今後は自殺企図者や自殺念慮のある入院患者を対象とした研究を推進する。旅費:世界生物学的精神医学会に発表を含めて参加し、DNAメチル化とうつ状態や自殺との関連を解析している研究者と情報交換を行う。その他:英文論文の校正費用。実験試薬費:末梢血からのRNA抽出キット、mRNA発現計測のためのreal-time PCR用試薬と内部コントロール、末梢血からのDNA抽出キット、Bisulfite反応用試薬、MassARRAY用試薬など。旅費:米国神経科学会議に発表を含め参加して、DNAメチル化とうつ状態や自殺との関連を解析している研究者と情報交換を行う。その他:英文校正の費用
生涯学習のための水族館の教育機能に関する建築計画的研究

本研究は、水族館の社会教育的側面に着目し、その実状と諸問題を把握し、本来の教育効果を引き出すための展示解説・教育普及活動・建築計画に関する今後の水族館のあり方について基礎的知見を得ることを目的としている。本研究では、以下のような調査分析をおこなった。1.水族館来館者行動の解析来館者の具体的な観覧行動をVTR、カメラ、テープレコーダーなどにより詳細に映像記録をおこない、「学習的な観覧行為」の特徴を抽出した。2.解説、展示手法による効果に関する考察オリエンテーション、全体随行解説、部分解説などを試験的に行い、それによる観覧行動・動線・時間などの違いを観察調査し、影響や効果を捉えた。3.全国水族館関連施設の生涯学習機能のあり方の考察全国の水族館及び動物園などに対し、アンケート調査はおこない、教育学習動の実状を把握した。学校教育週5日制の導入により、来館者の多い大規模館園では何らかの対応プログラムを開始している。教育学習活動に関しては、今後も必要性がますます高まるものと考えられる。4.展示改築による観覧行動の変化の考察ある水族館における展示改修に関して、その前後の来館者の観覧行動の変化について考察した。展示物の順序や定時上映プログラムなどの変更点により、観覧行動が変化したことが分かった。最初の展示物が目立つかどうか、その向きと次の展示物の位置などの配置条件が、全体の観覧率を高める要因ともなっている。1.水族館来館者行動の解析来館者の具体的な観覧行動として、来館者の観覧動線・順序、観覧時間、観覧の位置、展示物への操作特性、滞在分布、具体的行動、視線、視点の位置、注視時間、随伴者との会話、などをVTR、カメラ、テープレコーダーなどにより詳細に映像記録をおこない、解析をおこなった。とくに、学校団体の利用による児童の観覧行為についての調査をおこない、一般来館者と学校利用児童との観覧行為の違いについて考察した。さらに、教育的効果を高めるために、館内の展示観覧だけでなく実習を合わせておこなっている活動を対象とした。この結果、実習やバックヤード見学の順序など、いくつかの条件の違いによって、展示観覧行為に影響が見られることが明らかになった。2.水族館来館者像の考察来館者の属性、来館目的、随伴者特性、意見・評価、学習効果の評価などについて、来館者に直接ヒアリングやアンケート調査などをおこなった。これにより、地域住民が水族館に求めている機能の動向を把握した。一般には、教育的施設というよりも、娯楽レクリエーションとして水族館を認識していることが分かった。3.解説、展示手法による効果に関する考察オリエンテーション、全体随行解説、部分解説などを試験的に行い、それによる観覧行動・動線・時間などの違いを観察調査し、影響や効果について考察した。解説員による現場解説については、観覧空間に解説員が常時居ることの重要性が指摘できた。1.全国水族館関連施設の生涯学習機能のあり方の考察全国の水族館及び動物園などに対し、アンケート調査をおこない、教育学習活動の実状を把握した。以前におこなわれた全国調査などの資料との比較により、教育学習活動に関しては、今後も必要性がますます高まるものと考えられる。2.展示改築による観覧行動の変化の考察ある水族館における展示改修に関して、その前後の来館者の観覧行動の変化について考察した。また、定時に上映する映像展示が、定時の展示解説と連動していた改修前よりも改修後の方が、観覧者の分散がなされ、結果的に全体の観覧率を高めていることなどの知見が得られた。3.増改築水族館の典型例に見る将来動向最近増改築をおこなった水族館の典型的な施設に対して、ヒアリングを行い、その後の観覧行動の変化などについて、観察をおこなった。増改築の要因としては、施設拡大要求や老朽化などのハード面の理由もあるが、同時に、最近の市民の利用増に対応した学習教育手法の様々な工夫が必要になってきたことも重要な視点としてあげられることが分かった。
セレンの摂取量、血中濃度、尿中排泄量と血圧との関連に関する多地域疫学研究

本研究は、栄養と血圧に関する4力国国際共同研究INTERMAPの一環として、わが国から参加した健常成人の4集団計約1,200人における食事中セレン摂取量、血清セレン濃度、24時間尿中セレン排泄量と厳密に測定された血圧値との関連を明らかにするものである。富山、和歌山、北海道の職域および滋賀の地域の各センターにおいて無作為抽出された40-59歳の男女約300人ずつ、計1,145人(男574人、女571人)に対しランダムゼロ血圧計による8回の標準化された血圧測定、4回の厳密な24時間思い出しによる食事調査、2回の24時間蓄尿を実施した。INTERMAP日本の食品成分表をもとにしたセレンについての成分表の作成を実施し、セレン摂取量を算出した。尿中セレン濃度測定は計約2,300検体における測定を行い、24時間尿中セレン排泄量の2回平均値を算出した。また、血清セレン濃度を富山センターの299検体について絶対検量線法にて測定した。食事調査からの1日平均セレン摂取量は男で191μg、女で151μgと評価された。年齢階級別では40代より50代での摂取が多かった。セレン摂取密度で見ると男女とも平均値は約85μg/1000kcalでほぼ等しかった。24時間尿中セレン排泄量の平均は男139μg、女116μgで、73-77%が尿中に排泄されるものと評価された。尿中排泄量は、1回目蓄尿と2回目蓄尿の相関がr=0.38と再現性が良かった。一部対象者における血清セレン濃度は、男女とも、24時間尿中排泄量、セレン摂取量、セレン摂取密度のいずれとも有意な相関を示さなかった。血圧値を目的変数とした重回帰分析を行ったところ、尿中セレン排泄量はいずれのモデルにおいても収縮期血圧、拡張期血圧と有意な関連は示さなかった。セレン摂取密度についても、いずれのモデルでも収縮期血圧、拡張期血圧と独立した関連は示さなかった。本研究は、栄養と血圧に関する4カ国国際共同研究INTERMAPの一環として、わが国から参加した健常成人の4集団計1,200人における食事中セレン摂取量、血清セレン濃度、24時間尿中セレン排泄量と厳密に測定された血圧値との関連を明らかにするものである。富山、滋賀、北海道の職域および滋賀の地域における研究対象者の無作為抽出によるリクルート、インフォームド・コンセント取得、血圧測定、2回の24時間蓄尿、血液採取はすでに終了している。各地区で40-59歳の男女300人ずつ、計1,200人に対し調査が行われた。尿中ナトリウム、カリウム濃度の測定はベルギーにて実施された。各地区で採取された2回の24時間蓄尿の一部検体(対象者一人あたり2検体、合計2,400検体)および血清サンプルは大型フリーザーにて冷凍保存されている。尿中セレン濃度測定は計2,400検体における測定を続けており、厳密な精度管理のもと行われている。また、血清セレン濃度の測定についても、高い精度管理のもと富山県衛生研究所において測定を継続中である。測定日による誤差をなくすため、検体はランダムに混ぜ合わせて順次測定されている。

また、INTERMAP日本の食品成分表をもとにした、セレンについての成分表の作成も現在進行中である。来年度には各測定データおよび栄養摂取データを用いて、血圧値との関連についての統計学的解析を進めて行く予定である。本研究は、栄養と血圧に関する4ヵ国国際共同研究INTERMAPの一環として、わが国から参加した健常成人の4集団計約1,200人における食事中セレン摂取量、血清セレン濃度、24時間尿中セレン排泄量と厳密に測定された血圧値との関連を明らかにするものである。富山、和歌山、北海道の職域および滋賀の地域の各センターにおいて無作為抽出された40-59歳の男女約300人ずつ、計1,145人(男574人、女571人)に対しランダムゼロ血圧計による8回の標準化された血圧測定、4回の厳密な24時間思い出しによる食事調査、2回の24時間蓄尿を実施した。INTERMAP日本の食品成分表をもとにしたセレンについての成分表の作成を実施し、セレン摂取量を算出した。尿中セレン濃度測定は計約2,300検体における測定を行い、24時間尿中セレン排泄量の2回平均値を算出した。また、血清セレン濃度を富山センターの299検体について絶対検量線法にて測定した。血圧値は8回測定の平均値を用いた。食事調査から評価された平均セレン摂取量は1日あたり171μg(男191μg、女151μg)であり、1000kcalあたりの摂取密度は85μg(男女とも85μg)であった。摂取密度は滋賀が最も高く(99μg)、富山が最も低かった(71μg)。富山における血清セレン濃度は121ng/ml(ppb)(男126ng/ml、女117ng/ml)であったが、セレン摂取密度との有意な相関は認めなかった。セレン摂取密度は総蛋白摂取密度(r=0.53)および動物性蛋白摂取密度(r=0.53)と強い有意な正相関を示した。肥満度、飲酒量、ナトリウム・カリウム摂取量をモデルに含めた重回帰分析により、血圧値とセレン摂取密度・血清セレン濃度との独立した関連を検討したが、有意な関連は認めなかった。尿中セレン排泄量については解析進行中である。
エネルギー代謝調節ペプチドグレリンの脂肪組織に対する作用

下垂体から分泌される成長ホルモン(GH)は筋肉と骨量を増加し、また脂肪分解を促進して、健康の維持・増進に重要な役割を担っている。加齢に伴うGH分泌低下はソマトポーズとも呼ばれ、筋肉と骨量の低下および内臓脂肪蓄積型肥満を誘導し、老化を促進する因子となっている。グレリンは生体のエネルギー同化に機能する生理活性ペプチドであり、胃内分泌細胞と視床下部の神経細胞で産生され、迷走神経のグレリン受容体を介してGH分泌や摂食の元進に機能している他、末梢組織に直接作用し、細胞の分化・増殖およびアポトーシス抑制にも機能している。本研究では、成長ホルモン分泌を増大させる一過性漸増運動と長時間持久性運動が、血中グレリンに及ぼす影響について検討を行った。被験者(健常成年男性)は、漸増運動負荷試験と多段階漸増運動負荷試験から算出した50%最大酸素摂取量の強度で、60分間の自転車ペダリング運動を実施した。運動中に経時的に採血を行い、血糖値、血漿中のグレリン、GH、カテコラミンおよびインスリン濃度を測定した。これらの結果、運動中にグレリンは漸減する一方で、GH、エピネフリン、ノルエピネフリンは漸増した。以上のことから運動中のGH分泌にグレリンは関与していないことが明らかとなった。運動中の血糖値と血中インスリン濃度は一定であったことから、グレリンの低下は液性のエネルギー代謝情報とは直接関係が無いことが推察された。またグレリンはノルエピネフリンと負の相関関係があった。本研究での運動中のグレリン濃度の低下は、交感神経系による分泌調節もしくは、血流再分配による循環血中への放出減少、末梢組織での利用の充進のいずれかによるものであると考えられた。グレリン補充が、運動療法の有効性を高めるための有効な手段として利用できるかどうかに関して、さらに研究が必要である。
抗癌剤耐性口腔扁平上皮癌細胞におけるポリADP-リボース合成酵素活性について

以前より当教室では、臨床材料より分離された口腔扁平上皮癌細胞であるブレオマイシン(BLM)高感受性株(SCCKN)および低感受性株(SCCTF)について、BLMの薬剤耐性機構を解析してきた。以前の研究で、BLM作用下でのポリADP-リボース合成酵素について検討すると、SCCTFで同酵素活性は、SCCKNに比して、急速に上昇することが分っていた。今回mRNAレベルでの同酵素発現について検討したが、SCCKN・SCCTF両株ともBLM処理による著明な変化は認められなかった。本研究に用いた両細胞株は異なる個体から分離された細胞株であった。臨床における抗癌剤耐性機構の解析においては、化学療法施行前後で同一個体から分離された細胞株において、比較検討すことがより臨床での薬剤耐性の現実を反映すると考えた。そこで本研究者は新たに、化学療法施行前後で切除された手術材料よりin vitroへの腫瘍細胞の分離を試みたところ、ヌードマウスで造腫瘍性を有し、軟寒天中でコロニー形成能を有する2種の扁平上皮癌細胞を分離培養することに成功した。新たに分離された細胞株は、ともに立方型の細胞形態を示し、細胞倍加時間、ヌードマウスでの造腫瘍性には差は無かった。臨床において使用した抗癌剤に対する感受性を検討すると、化学療法施行後に分離された細胞株では、PEPに対しては10倍、CDDPに対しては5倍感受性が低下していた。今回新たに分離培養に成功した扁平上皮癌細胞株は、抗癌剤耐性機構を解析する上で、さらに有用なモデルと考えられ、今後細胞生物学的に解析を行なう予定である。
鍼灸針電極によるInner muscle EMGの検討

本研究は、動作中の深部筋のEMG採取に鍼灸針電極(直径0.1mm交換型アンマ針ON201-145A、ユニークメディカル社製)が有用であることを検討する。実験は三段階を踏んだ。段階に従い方法・結果を述べる。1、ラット1匹を対象とし、左後肢に皮膚切開によって露出させたヒラメ筋と足底筋に鍼灸針電極を刺入し、坐骨神経に電気刺激を与えて不随意収縮を行わせた。その結果、次のことが判った。(1)被験筋に直接的に視認によって鍼灸針電極を刺入して、誘発電位を記録することができた。(2)頻回刺激に即応した電位及び張力が記録できた。2.健康な成人男性1名を対象とし、鍼灸針電極及び表面電極を用い、膝関節伸展の随意的等尺性収縮と膝蓋腱反射の2種類の運動について大腿直筋からEMGを導出した。(1)打腱時に、表面電極によるEMG発生と同一時機にEMGが採取できた。(2)徒手筋力検査法に対応した電位が記録できた。(3)鍼灸針に特有な"ひびき"を訴えたが、注射針刺入のような痛みは訴えなかった。(4)刺入による出血は無かった。3.健康な成人男性1名を対象とし、鍼灸針電極を用いて肩関節外旋・内旋の等尺性収縮と短縮性収縮の2種類の運動について、深部筋である棘下筋・大円筋からEMGを導出した。(1)棘下筋並びに大円筋の外旋(77.6deg/sec)・内旋(65.7deg/sec)運動時のEMGが記録できた。(2)通常のトレーニングに近い速さで深部筋EMGを記録できた。以上のことから、鍼灸針電極を用いることにより、低速度の運動時の深部筋EMG採取が可能である。また、電極の刺入に医師の手を煩わせないこと、刺入時の疼痛が軽微であることから、運動時の深部筋動態の検討に有用であることが示唆された。1.鍼灸針の筋電図用電極としての改変筋電図用鍼灸針電極は開発されてから日が浅いため、エポキシ樹脂蒸着のバラツキによって刺入する際の抵抗が発生していたが、業者との検討によって、そのバラツキが極めて少なくなった。2.鍼灸針電極の刺入と動作人体の下肢・上肢の深部筋(長趾屈筋、棘上筋)を対象に鍼灸針電極を刺入し、静止時における等尺性筋収縮では全く痺痛が起きないことが確認された。一方、随意的な短縮性収縮および伸張性収縮においては疼痛を訴える場合があったが、そのほとんどは刺入のやり直し(方向、深さ、部位)によって疼痛の程度は軽微になった。細く柔らかい鍼灸針電極の刺入には少なからず熟練を要することが判った。以上のことを踏まえ、低速の歩行および上肢外転運動における深部筋EMGの採取が可能であることが確認された。3.同一筋からのEMGにおけるCross Talkについて一般に、近接する電極から得られたEMGの周波数にはCross Talkが生じることが知られている。本研究に於いても、同一筋の表面に近接させて貼付した表面電極によるEMGの間には相互相関関数0.7(Time Lag 0.00sec)前後の高い値が認められた。しかし、同一筋に同一の深さに近接して刺入して得られた鍼灸針電極EMGの間には相互相関関数±0.2(Time Lag 0.00sec)以下の小さい値しか認められなかった。一方、Time Lag±0.01secにおいては相互相関関数±0.25前後の値が観察された。このことは、鍼灸針電極の先端の特徴(裸線1mm)から、記録する活動電位の範囲が極めて狭いことを意味していると共に、複数回の刺入によって得られたEMGを単純に比較することは避けるべきであることが確認された。3.健康な成人男性

1名を対象とし、鍼灸針電極を用いて肩関節外旋・内旋の等尺性収縮と短縮性収縮の2種類の運動について、深部筋である棘下筋・大円筋からEMGを導出した。その結果、次のことが判った。(1)棘下筋並びに大円筋の外旋(77.6deg/sec)・内旋(65.7deg/sec)運動時のEMGが記録できた。(2)通常のトレーニングに近い速さで深部筋EMGを記録できた。以上のことから、鍼灸針電極を用いることにより、低速度の運動時の深部筋EMG採取が可能である。また、電極の刺入に医師の手を煩わせないこと、刺入時の疼痛が軽微であることから、運動時の深部筋動態の検討に有用であることが示唆された。
アンジェルマン症候群の遺伝学的診断法と遺伝カウンセリングの確立

アンジェルマン症候群(AS)を対象として体系的遺伝学的診断法の開発を行なった。DNAメチル化テスト、多型解析、UBE3A変異解析、リアルタイムPCRを用いた微細欠失解析の組み合わせで、すべての遺伝学的群の診断が可能となり、体系的遺伝学的解析法を確立することができた。この体系的遺伝学的診断法を用いてAS非欠失例85例の解析を行うことができた。内訳は、片親性ダイソミー(UPD)7例、刷り込み変異7例、UBE3A遺伝子変異23例であり、44例には異常が検出できなかった。メチル化テスト陽性例のなかで、4名は両親の検体が入手できず、UPDと刷り込み変異との区別ができなかった。従って、非欠失例の67%の原因を同定することができた。UBE3A変異はエクソン8からエクソン16に広く分布した。そのなかで、エクソン16の3089-3095領域に5家系の変異が集中し、変異の好発部位であった。弧発例で母親の解析が8例に可能であった。そのなかで、2例の母が保因者であり、6例はde novoの変異であった。UBE3A変異同胞例の1家系においては、母親の生殖腺モザイクが発見され、母親の末梢血を用いた検査が正常であっても、再発危険率が高い可能性の存在が示された。これらの結果は日本人におけるASの遺伝学的分類の基礎データを提供し、遺伝カウンセリングを行うための重要な資料となる。このように、体系的遺伝学的診断法を行なうことにより、ASの確定診断を得ることができるだけでなく、遺伝カウンセリングの観点からも重要であることを明らかにすることができた。ASにおける解析法は遺伝性精神遅滞の診断モデルとして重要であるのみならず、エピジェネティクス解析と遺伝学的解析とを組み合わせる、複雑な遺伝背景を有する疾患の解析モデルを提供する点で独創的な役割を示すことができた。DNAメチル化テスト、多型解析、UBE3A変異解析、リアルタイムPCRを用いた微細欠失解析の組み合わせで、すべての遺伝学的群の診断が可能となった。これまでの検査体系では刷り込み変異における微細欠失に検出が十分でなかった。今年度の検討にてリアルタイムPCRを用いた微細欠失検出法の有用性を検討し、体系的解析法を確立することができた。この体系的遺伝学的診断法を用いてAS非欠失例66例を解析し、53%の35例の原因の同定が可能であった。欠失例は商業的にFISH法により診断可能であるために、今回の解析の対象とはしなかった。35例の内訳は、片親性ダイソミー(UPD)7例、刷り込み変異8例、UBE3A遺伝子変異20例であった。UPD例ではすべて孤発例であった。しかし、刷り込み変異では同胞例1家系2例、UBE3A変異例では4家系6例の家族例が存在した。母親の解析ができた孤発例4例中1例の母は保因者であり、3例はde novo変異であった。