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チタンによる炭素－炭素結合の切断と生成を用いた炭素骨格変換法の創成

本研究では「金属錯体を出発物とする、炭素-炭素結合切断と生成を組み合わせた有機合成手法」をより一般性の高いものにすべく、「有機化合物」を出発物とした分子変換を開発することを目標としている。そのための初期検討として、チタンとの反応点をもつ種々のジヒドロインデン誘導体と、チタン錯体との反応について検討を行った。ジヒドロインデン誘導体の橋頭位に水素原子が存在すると、望まぬ副反応がチタンとの錯形成を妨げてしてしまうことがわかった。そこで橋頭位にアルキル置換基を導入した基質を設計し、その合成に関する検討を行った。また上述した研究に加え、チタンカルベン種によって引き起こされる骨格変換を制御するため、新しい炭素骨格を与える反応剤・添加剤の探索を併せて行った。出発物質をチタナシクロペンタジエンやジヒドロインデニルチタン錯体等のチタノセン錯体とし、窒素系の反応剤や添加剤を用いた分子変換についての検討を行った。その結果、2-アミノピラゾールがジヒドロインデニルチタン錯体のチタン中心に作用することで、新たな形式の炭素-炭素結合切断を誘起し、四置換ベンゼン誘導体を与えることを見出した。反応機構研究により、2-アミノチアゾールは本分子変換において窒素系の2座配位子としてはたらくことが強く示唆される結果を得た。また、ベンゼン骨格を形成する6炭素のうち、2炭素はチタノセン錯体のもつCp配位子から炭素-炭素結合切断によって切り出された2炭素ユニット由来であることがわかった。まず、ジヒドロインデン誘導体とチタン錯体の反応についての検討を行った。その結果、インデン骨格の橋頭位に水素原子が存在する場合に基質が分解してしまうことが明らかになった。そこで、橋頭位にアルキル置換基を導入した、チタンとの反応点をもつジヒドロインデン誘導を設計し、その合成に関する検討を行った。また、チタンの反応性を制御するための反応剤・添加剤の検討も行った。チタナシクロペンタジエンから容易に調製可能である、単離可能なジヒドロインデニルチタン錯体に対して2-アミノピラゾールを作用させると、新たな形式の炭素-炭素結合切断が誘起され、ベンゼン誘導体が得られることを見出した。この反応の基質適用範囲や反応機構を明らかにした。橋頭位にアルキル置換基を導入した、チタンとの反応点をもつジヒドロインデン誘導体の合成研究を引き続き行う。チタンとの反応点にはハロゲン置換基やシリル置換基を用いる。また今回の検討で得られた、チタンの反応性を制御するための反応剤・添加剤に関する知見を元に、新たな炭素骨格を与える分子変換法の開発を行う。
高度な計測信頼性を実現する新型近赤外脳機能計測システムの開発

従来の近赤外脳機能計測法の問題点であった、頭部へのプローブ装着安定性の改善、脳組織以外での血流変化の影響の除去法(プローブ多重配置法)などの我々の開発技術を実装した装置を実現し、その効果を実証した。さらに、新たな着想に基づく信号分離法(血流動態分離法)をこの装置を用いて検証した。この手法を多チャンネル計測に展開することにより、今までよりも高い信頼性をもって広い脳領野における神経賦活部位を検出できることを実証した。今年度の配算が新規に装置を構築する必要額に満たないこと、また島津製作所の三波長型市販装置を使用できる環境が整ったことなどを踏まえて、既存の試作装置に改造を施すことで経費を圧縮し、一方で、当該技術の検証を高い信頼性で行うために生体機能モニタリング用のポリグラフ装置を購入した。これらの整備に基づき、独自に開発したプローブホルダシステムを有する高時間分解能三波長のmultidistance型近赤外脳機能計測(multidistance fNIRS)システムを完成させた。完成したシステムを用いた被験者実験を行い、より高い信頼性でmultidistance fNIRS計測が行えること、また二つの光源-検出欄距離を15mm,3mmに変更した場合にも遜色のない計測が可能であることを確認した。これらのデータを島津製作所に開示し、同社とmultidistance fNIRSの技術移転を目標に共同研究契約を締結した。さらに我々は、これらの実験データを詳細に解析することにより、頭部血流変化を二つの様態、すなわち容積性の変動成分と流速性の変動成分の混合として考える新たな血流モデルを着想した。このモデルに基づいて、通常のfNIRSデータを上記二つの成分に一意に信号分離するアルゴリズムを構築した。そして、脳機能課題およびアーティファクト課題での実験データに適用して検証を行った。その結果、体位変化や呼吸状態の変化などの影響は容積性成分に、脳機能に伴う局所的な血流変化は流速性成分にそれぞれ生じることが明らかとなった。この結果は、市販のfNIRS装置でも何ら装置改変せず、multidistance fNIRSと同等の高い計測信頼性が獲得できることを示す極めて重要なものである。これらの成果は平成23年度に関連諸学会で発表を予定している。並行して、手法の特許出願準備および論文投稿準備を進めている。我々がすでに開発した多重配置fNIRS法は、大脳灰白質の血流変化を信頼性高く計測できる点で近年内外の注目を集めている一方、実装面では、市販装置に大幅な改造が必要なことや、一つの計測点に対して合計3つのプローブを必要とするため広範な部位での多チャンネル計測では非効率的であることなどがあり、技術普及上のボトルネックとなってきた。そこで我々はH22年度H23年度での研究を通じて完成させた装置を用いて計測したデータを詳細に検討することによって、市販装置で得られる信号を脳機能信号と全身性信号に分離する新規な信号分離技術を開発した。この手法は、脳機能性血流変動とその他の生理的血流変動ではNIRSで計測される生体組織中の酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの時間変化の相関が異なるという経験的な知見および理論的推測に基づいて、この相関の異なる二つの成分に元の信号を分離するものである。元の信号としては、市販装置のように一つの測定点について二つのプローブ用いて測定されたものを用いればよいので、測定点の高密度化や広汎な領域での多チャンネル計測への適合性も高い。平成23年度の主な実績は以下の通りである。(1)この手法の技術普及とりわけ装置製造企業への技術移転を念頭に、プログラムを整備し、特許出願を行った。(2)理論・実験の両面での検証をさらに進め、その成果を関連学会で報告し、学術雑誌に論文投稿した。(3)測定点の高密度化や広汎な領域での多チャンネル計測へと展開するために、平成22年度に完成させた高時間分解能3波長fNIRS装置に対して、プローブの増設を行った。最終年度である今年度は、昨年度までに完成させた16光源16検出器を備える多チャンネル高時間分解能fNIRS装置を本格稼働させ、44チャンネル, 15mm×15mm間隔の高密度で、神経活動に伴う脳血流変化を計測した。fMRI計測を用いて予め大脳皮質運動野の神経賦活部位を特定した複数の被験者に対して、手指運動課題遂行時の計測を行い、従来手法で血流変化のデータを算出した。このデータに対して我々が開発した血流動態分離法を用いることにより脳機能信号成分と全身性信号成分に分離した。従来法で得られたデータでは、運動手指の左右による差が見られず、両側大脳半球の運動野を含む広い範囲で大きな信号変動が生じていた。これは、運動野の神経活動に由来しない全身性信号成分の混在を強く示唆している。このデータを血流動態分離法で分離したところ、脳機能信号成分は運動手指の対側運動野で顕著に生じた。

また、その信号成分が生じる部位は、予め特定した手指運動によってfMRI-BOLD信号が生じる部位と極めて良好な一致を示した。fMRI-BOLD信号と神経賦活との相関は広く知られており、この一致は、fNIRSの計測信頼性を従来よりも飛躍的に向上できたことを意味している。以上は、2013年7月IEEE関連部会の国際会議での発表が採択されている。こうした高密度計測では、通常よりも多数のプローブ導入が必要である。このため、各プローブの装着不良の検出/改善に時間がかかり、これが計測の実用上大きな困難をもたらすことが、上記の実験実施から分かってきた。我々は、装着不良時のデータと正常データの挙動の違いを詳細に解析し、装着不良の2つの側面、即ち、1密着不良と2固定不良を自動的に識別するアルゴリズムを開発した。これにより、プローブ装着不良の検出/改善に要する時間を飛躍的に短縮できる。この結果は特許出願を済ませ、関連学術誌に採録された。本研究の主眼であったNIRS装置を完成・稼働させた上で、計測データの詳細な解析に基づいて新たな信号分離法を考案した。さらに多重配置fNIRS計測法との同時計測により新手法の信頼性を評価し、特許出願の成果を生んだ。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究のゴールはfNIRS技術を「誰がどのような状態にある被験者を計測しても脳機能活動を検出できる技術」に成熟させることにある。その意味で残された課題は主に2つある。(1)脳活動由来の信号を計測感度領域の大きさと同等の15mm×15mm程度の間隔で計測すること、(2)計測部位の毛髪の多寡がデータのS/N比に与える影響の排除、である。最終年度は完成された装置を用いてこれらの課題に取り組んでいく。
ウェルナー症候群原因遺伝子産物の機能の解明と老化関連疾患の発症機構の解析

本研究では、WRNのDNA複製、修復における役割を明らかにすることにより、ウェルナー症候群患者の染色体の不安定化による発癌と、糖尿病を初めとする老化関連疾患の発症の分子機構の解明を目指した。解析にあたっては、酵母のモデル系を使ってWRNやWRNIP1(我々が発見したWRNに結合するタンパク質)とDNA polymeraseδとの機能的関連に関する情報を得るとともに、ニワトリのDT40細胞を用いて種々の遺伝子破壊株を作製し、これらの破壊株を用いてWRNが関与する修復経路を遺伝学的に決定することを試みた。さらに、WRN、WRNIP1の機能を明らかにするために、精製酵素・タンパク質を用いた生化学的解析も行った。酵母を用いた解析ではPolδのサブユニットのPol31の変異株を多数分離し、WRNやWRNIP1とPol31との機能的関連に関する情報を得ることができた。また、DT40細胞の遺伝子破壊株用いてWRNが関与する経路の同定を試み、WRNがRAD52とともに機能する可能性があることが示唆する結果を得ることができた。また、DNAの傷害の種類によっては、WRNとRAD18が同一の経路で機能することが判明した。さらに、WRNIP1もDNAに特定の傷害が生じた場合にはRAD18が機能する経路で働くことが示唆された。また、細胞や精製したタンパク質を用いた解析からWRNIP1とRAD18が直接結合することが判明した。最後にWRNの機能と酸化ストレスとの関係を解析するために、スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子(SOD1、SOD2)の条件欠損株の作製し、その解析を行った。SODの条件欠損株の解析ではWRNの機能と酸化ストレスとの関係を解明するまでには至らなかったが、解析を進めるための基盤を確立することができた。本研究は、WRNのDNA複製、修復における役割を明らかにすることにより、ウェルナー症候群患者の染色体の不安定化による発癌と、糖尿病を初めとする老化関連疾患の発症の分子機構の解明を目指すものである。1.WRN及びWRNIP1はDNA polymerase δ(Polδ)に結合しその活性を促進することから、WRNやWRNIP1(我々が発見したWRNに結合するタンパク質)とPolδとの機能的関連を解析する目的で、出芽酵母のPolδのサブユニットのPol31の変異株を多数分離した。これらの変異株の生育にはSgs1(WRN)の機能が必要であること、Pol31のWRNIP1(酵母ではMgs1)の結合部位はC末側のregion VIIにあることを示唆する結果が得られた。2.DT40細胞を用いてこれまでに作製した、種々の修復系に関与するタンパク質をコードする遺伝子とWRN遺伝子との遺伝子二重、三重破壊株や、それぞれの遺伝子の単独破壊株を用いてWRNが関与する修復系の同定を試みたところ、WRNは、RAD18が関与するDNA複製後修復経路で機能する可能性が示唆された。また、WRN遺伝子破壊株が、DNA合成阻害剤であるヒドロキシウレアに対して野生株に比べ抵抗性であるという予想外の発見をした。3.WRNの機能と酸化ストレスとの関係を解析するために、スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子(SOD1、S0D2)とWRNとの二重変異株の作製を行い、その解析を通じてWRNの機能と酸化ストレスとの関係を明らかにする。18年度はSOD1、SOD2遺伝子単独破壊株の作製を試み、それぞれの遺伝子の単独破壊株を作製することができた。

1. DT40細胞を用いてこれまでに作製した、種々の修復系に関与するタンパク質をコードする遺伝子とWRN遺伝子との遺伝子二重、三重破壊株や、それぞれの遺伝子の単独破壊株を用いてWRNが関与する経路の同定を試み、RAD52とともに機能する可能性があることが示唆された。また、DNAの傷害によっては、WRNとRAD18が同一の経路で機能する可能性を示唆する結果を得ることができた。2. 1と同様に種々の遺伝子破壊株を作製して解析することにより、カンプトテシンによりDNAに傷害を生じさせた場合には、WRNIP1(我々が発見したWRNに結合するタンパク質)とRAD18が同一の経路で機能することが判明した。また、WRNIP1とRAD18が結合することがわかった。3・WRNの機能と酸化ストレスとの関係を解析するために、DT40細胞を用いてスーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子(SOD1、SOD2)の条件欠損株の作製を行い、その解析を行った。SOD2欠損によりDNAに顕著な傷害は生じることはなかったが、この細胞ではG1期からS期への進行が遅延した。また、SOD1の欠損では、DNAに傷害が生じ細胞が致死になることが判明した。
下垂体ホルモンの分泌顆粒形成機構に関する研究

ラットGHのcDNAは既にATTCより入手済みであった。ラットrab3BのcDNAをラット下垂体組織よりmRNAを抽出し、RT-PCRにより作製した。GHとrab3BのそれぞれのcDNAに対して制限酵素サイトをPCRに付加し組換えを行い、2種類のgreen fluorescent protein(GFP)、すなわち、GHにはYFPを、rab3BにはCFPを融合させた。GH-YFPとrab3Bの組換え遺伝子を、ラット下垂体細胞株であるGH3細胞に導入した。トランスフェクションは、lipofectamineを用いて行った。GH-YFPを発現する細胞については、stable cell lineを確立した。その発現を生細胞内で共焦点レーザー顕微鏡下に観察し、確認した。細胞外Kを高濃度にし、Caイオンの流入をおこさせ、GHの分泌をおこさせた。このstable cell lineに対して、rab3B-CFPを一過性にトランスフェクションした。現在、GHの分泌顆粒の細胞内輸送の過程でrab3Bが関与していることを確認した。Regulatory pathwayとconstitutive pathwayの両方において、rab3Bの役割を確認した。chromogranin A、secretogranin 3, carboxypeptidase E, phogrinについても同様の実験を行い、GH分泌顆粒形成過程で、これらのいずれの蛋白もが関与していることを明らかにした。現在、GHの分泌顆粒の細胞内輸送の過程でrab3Bが関与していることを再度確認した。Regulatory pathwayとconstitutive pathwayの両方において、rab3Bの役割を再度確認している。今後chromogranin A、secretogranin 3, carboxypeptidase E, phogrinについても同様の実験を行い、GH分泌顆粒形成過程で、これらのいずれの蛋白も関与していることを明らかにする段階である。
細胞内分泌装置の3次元構造とリーディング機構の解明

私達は糖鎖マーカーであるレクチンを用いて細胞組織化学的検討を行ってきた。消化管の粘液分泌細胞においてはゴルジ装置で糖鎖付加が活発に行われているので、レクチンを用いてゴルジ装置を特異的に染色することが可能である。さらに十二指腸腺細胞のようによく発達した層板をもつゴルジ装置の場合には、シス側層板、中間層、トランス側層板で付加される糖鎖が異なることに基づいて各層板ごとの染め分けが可能となる。そこで、レクチンの多重染色を行ってコンフォーカルレーザー走査顕微鏡で観察することにより、層板を区別して染色されたゴルジ装置が「細胞という3D空間」の中でいかに広がりをもって存在しているかを明らかにすることを試みた。今回の研究において明らかになったゴルジ装置3次元構造は、通説とは逆向きで、核上部にドームをかぶせたような形で存在するというものであった。すなわち、ゴルジ装置のシス側層板がドーム状のネットワーク構造を形成して最も外側に存在し、その内側に同じ様なネットワークを形成して中間層が配置し、さらにその内側にトランス側層板が配列していた。また、分泌顆粒はゴルジ装置のなすドーム構造の内側の空間に向かって形成、放出された後、層板のなすネットワークの網目を通過して細胞頂部に移動するという結果も得られた。さらに、この構造が十二指腸腺細胞に限った特殊な構造ではなく、活発に粘液を合成している細胞において普遍的な構造ではないかという結果も得られた。以上のことから、コンフォーカルレーザー走査顕微鏡を用いて細胞内小器官を観察する事により、電子顕微鏡では得られなかった3次元構造の新しい知見を得ることができた。今後さらに、新たに導入されつつある3次元観察法や3次元解析ソフトを駆使し、細胞内小器官レベルでより詳細な3次元構造を追求したいと考えている。細胞内分泌装置の中心的役割を担うとされるゴルジ装置の立体構造を明らかにすることを試みた。そのために3つのレクチンを用いてマウス十二指腸腺細胞のゴルジ装置のもつ糖鎖を蛍光多重染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察することにより三次元構造解析を行った。レクチンとしてゴルジ装置のシス側の糖鎖を認識するダイズレクチン(SBA)、中間層から顆粒にかけて存在する糖鎖を認識するバンデリアマメレクチン(GSA II)、トランス側から顆粒にかけて存在する糖鎖を認識するハリエニシダレクチン(UEA I)を用いることにより、ゴルジ装置を構成する主な層板の位置関係を把握したうえで三次元構造解析を行った。その結果、ゴルジ装置は核上部にドームをかぶせたような形で存在すること、そしてSBAで染色されるシス側層板がドーム状のネットワーク構造を形成して細胞質とゴルジ装置との境界をつくり、そのネットワークを裏打ちする位置にGSA IIで染色される中間層が配置し、さらにその内側にGSA IIとUEA Iとで染色されるトランス側の層板がタイル状に配列していることが明らかになった。従って、分泌顆粒はゴルジ層板のつくるドームの内側に向かって形成され、ドームの網目を通って細胞頂部に運ばれることも明らかとなった。以上のことから、これまでの電子顕微鏡を用いた観察から層板の重なりとして把握されていたゴルジ装置が、実際には「ゴルジ空間」ともいうべき細胞内小器官であることが明らかとなり、さらにここで得られた結果は、消化管粘膜に存在する杯細胞などで示されているゴルジ装置の立体構造とは全く逆の三次元配置であり、今後その意義や機構について研究を進めていく予定である。

細胞内分泌装置の中心的役割を担うとされるゴルジ装置の立体構造を明らかにするため、レクチンを用いてマウス十二指腸腺細胞のゴルジ装置のもつ糖鎖を蛍光多重染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察することにより3次元構造解析を行った。平成8年度の研究結果から、ゴルジ装置は核上部にドームをかぶせたような形で存在すること、シス側層板がドーム状のネットワーク構造を形成して細胞質とゴルジ装置との境界をつくり、それを裏打ちする位置に中間層が配置し、さらにその内側にトランス側層板が配列していることが明らかになった。そこで9年度はまず、ゴルジ装置の内側に形成されると考えられる分泌顆粒がどのように細胞頂部へ輸送されるかを検討した。レクチンの2重染色を組み合わせて検討した結果、分泌顆粒がゴルジ装置の内側にまず形成されることが確認され、また、顆粒が層板のつくるネットワークの網目を通過して細胞頂部に移動するということで示す結果を得ることができた。レクチンの3重染色を行った観察でも、これまで考えてきたゴルジ層板の配列を支持する結果が得られた。次に、その他の細胞としてマウス下行結腸の杯細胞で同様の観察を試みたところ、粘液を盛んに生合成していると考えられる腸陰窩底部の細胞では十二指腸腺細胞とよく似た3次元構造をもつゴルジ装置が観察された。以上のことから、コンフォーカルレーザー走査顕微鏡を用いて細胞内小器官を観察することにより、電子顕微鏡では得られなかった3次元構造の新しい知見を得ることができた。ゴルジ装置を中心とする分泌装置の機能を探る試みとして、ラベル物質を封入したリポソームを作製する検討も平行して行ってきた。成果の発表には至っていないが、基礎的条件や操作法に関するデータは蓄積しつつあるので、今後引き続き研究を進めていく考えである。
機能性化学モデルを用いたP450活性中間体の動的解析

筆者は、シトクロムP450の活性中心モデルであるSR錯体の様々な誘導体をデザイン・合成し、錯体の構造や物性、酸化活性等への効果を検討し、さらにはP450の強力な酸化活性の本体である活性種の構造を明らかにすることを目的として研究を行ってきた。シトクロムP450による酸化反応は、従来compound Iと呼ばれる高原子価錯体を中間体とする反応機構が広く受け入れられてきたが、最近になって、この定説に疑問がもたれるようになってきた。そこで本研究では、触媒的酸化反応を行いうる唯一のP450化学モデルであるSRを用いて、酸化反応中に生成する複数の中間体と基質との相互作用を考慮した動的な反応解析を行い、その反応を詳細に解析することによって実際に酸化反応に関わる活性種の構造を明らかにすることを当研究の目的とした。先年、筆者は主にアルカン・アルケン競争的酸化反応を指標とし、この反応解析を行ったが、本年はより一般的な反応について解析を行い、様々なタイプの酸化反応における各中間体の寄与を見積もった。C-H結合エネルギーが異なる様々なアルカンの競争的酸化反応には、Hラジカル引き抜きに関わる活性種の特性が現れる。また、その重水素同位体効果も反応機構の重要な指標となりうる。これらの得られた知見を合わせ、より一般的な酸化反応に関わる活性中間体を明らかにした。従来、活性種の構造の決定は、極低温下など反応性を抑えた条件下で中間体を調製し、その分光学的性質を検討することにより行ってきた。しかし筆者は、真の反応中間体を明らかにするには、基質共存下で実際に触媒的酸化反応を行い、その解析を行うことが不可欠であると考え、研究計画に基づき中間体の反応選択性・反応様式等の動的解析から中間体の構造を決定する手法を新たに試みた。そのために、種々の置換基を有する過安息香酸類を酸化反応の酸素供与体として多数合成した。そしてその過安息香酸類を用い、SR錯体を触媒として実際に酸化反応を行い、その反応選択性・反応様式等への過安息香酸類の置換基効果を検討した。SR錯体の触媒する酸化反応は他の鉄ポルフィリン類に較べ非常に速く、その解析は困難であるが、筆者は酸化反応に基質として様々な化合物を用い、その競争的酸化反応を解析することによりその困難を克服した。以上の反応解析の結果、ヘム-チオレートによる基質酸化は、用いる酸素供与体に依存する過程であることが明らかとなり、反応の過程で酸素供与体と酸化基質との間に明確な相互作用が認められた。これは、従来信じられてきた鉄オキソ中間体を活性種とする機構では説明が出来ず、ここからヘム-チオレート錯体では初めて、酸化反応への鉄-acylperoxy中間体の関与が示された。
フィールドバスを用いた分散型エネルギーシステムの遠隔監視・異常診断統合技術の開発

エネルギーを有効に利用するための分散型エネルギーシステムの普及を促進するための支援技術として,分散型エネルギーシステムの主要構成要素の一つであるシェルアンドチューブ式熱交換器を用いた温水生成プロセスを対象とした自律的な異常診断とプロセスの伝熱性能の遠隔監視とを統合したプロセス運用技術の開発を行った.本研究では,プロセスでの自律的な診断さらには運転を実現するために,フィールドバス通信(機器間の双方向多重ディジタル通信)対応の計測機器を使用していることに特徴がある.具体的な成果として,早稲田大学喜久井町キャンパス(東京都新宿区)に既設の熱プロセス実験設備及びフィールドバス機器を使用した計測制御システムを対象に,このプロセスの代表的な異常であるシェル内への空気滞留(脱気装置の故障),シェル内へのドレイン滞留(スチームトラップの故障)を検知する診断アルゴリズムの構築・実証実験を行った.さらに,分散型エネルギーシステムの運用に有効なプロセス特性の代表変数として,熱通過率が有効であることを明らかにした.また,フィールドバス通信型レコーダ(Webサーバ機能搭載)を用いることにより,監視用PC(大阪府立大学)からの熱通過率の遠隔監視および制御ループの遠隔操作と,ホストPC(早稲田大学)でのプロセスの自律的な異常診断をEthernetとフィールドバスを介して統合することができた.本研究で構築した統合技術は,今後機能ブロックとして,フィールドバス機器に搭載することで実現可能になるものと考える.今後のエネルギーシステムは,中小規模かつ自立分散型の形態を採り,発電した電気エネルギーに加え同時に生成される熱エネルギーをも有効利用することが重要となる.分散型システムの普及を促進するためには,複数台のシステムを集中管理センターより遠隔監視する必要があるが,各システムで自律的に異常診断を行うことができれば,極めて有効な遠隔監視の支援技術になる.本研究では,フィールド機器間で双方向ディジタル通信を行うフィールドバス技術を利用して,分散型エネルギーシステムのエネルギー利用度を評価指標とした汎用性の高い運転監視・異常診断技術を,フィールド機器レベルで構築することを目的とする.研究の第1段階として,分散型エネルギーシステムの主要構成要素の一つである水蒸気と水の熱交換プロセスに対して,フィールドバス機器を使用した計測制御システムを構築し,プロセスに異常(性能劣化)が発生した場合に,フィールド機器から得られる種々の情報を用いてその検知を行う診断方法について検討を加えた.熱交換器周りの異常(性能劣化)の発生要因には様々なものが考えられるが,ここではその一つとしてシェル内に空気が滞留する不具合に着目した.まず,プロセス特性実験を通して,シェル内に空気が滞留すると熱抵抗が増大して伝熱性能が低下するが,これは水加熱器の熱通過率を監視することで把握できることを明らかにした.そこで,運転中に常時監視する熱通過率が低下した場合にその原因を解明する異常診断アルゴリズムをホストPC上に構築し,その実証実験を行った.その結果,シェル内への空気の滞留のみでなく,熱通過率を低下させる他の要因も検知しうることを確認した.フィールドバスを使用して必要なデータをする場合には,プロセス値のみならずフィールド機器の動作状態をも把握することができるため,プロセスとフィールド機器を併せて診断対象とすることも可能になった.エネルギーを有効に利用するための分散型エネルギーシステムの普及を促進するための支援技術として,分散型エネルギーシステムの主要構成要素の一つであるシェルアンドチューブ式熱交換器を用いた温水生成プロセスを対象とした自律的な異常診断とプロセスの伝熱性能の遠隔監視とを統合したプロセス運用技術の開発を行った.本研究では,プロセスでの自律的な診断さらには運転を実現するために,フィールドバス通信(機器間の双方向多重ディジタル通信)対応の計測機器を使用していることに特徴がある.具体的な成果として,早稲田大学喜久井町キャンパス(東京都新宿区)に既設の熱プロセス実験設備及びフィールドバス機器を使用した計測制御システムを対象に,このプロセスの代表的な異常であるシェル内への空気滞留(脱気装置の故障),シェル内へのドレイン滞留(スチームトラップの故障)を検知する診断アルゴリズムの構築・実証実験を行った.さらに,分散型エネルギーシステムの運用に有効なプロセス特性の代表変数として,熱通過率が有効であることを明らかにした.また,フィールドバス通信型レコーダ(Webサーバ機能搭載)を用いることにより,監視用PC(大阪府立大学)からの熱通過率の遠隔監視および制御ループの遠隔操作と,ホストPC(早稲田大学)でのプロセスの自律的な異常診断をEthernetとフィールドバスを介して統合することができた.本研究で構築した統合技術は,今後機能ブロックとして,フィールドバス機器に搭載することで実現可能になるものと考える.
金属超格子における超弾性効果の研究

金属超格子において、その弾性定数がバルクの値の数倍も増大する、超弾性効果の発現機構を明らかにするために、計算機シミュレ-ションを行った。まず、分子動力学法によって、様々な積層周期と界面歪を有する準安定な金属超格子の構造を作製する。積層周期方向、薄膜の横手方向のサイズを可変にして構造緩和を行うため、圧力ー温度一定のアルゴリズムを用いた。今回は、界面整合歪の影響に注目してその効果を検討するために、2次元構造について計算した。また、原子間相互作用は、レナ-ド・ジョ-ンズポテンシャルを仮定した。弾性定数は、得られた「試料」の「引っ張り試験」を計算機上で行うことによって求めた。すなわち、緩和後の構造に対して、膜面に垂直方向または横手方向に引っ張り・圧縮の圧力を付加して、系のエネルギ-変化を計算する。その結果得られる応力ー歪曲線から、超格子構造の弾性定数を求めた。界面歪5%のコヒ-レントな3層/3層の超格子構造についての結果は、超弾性効果の発現を示していない。界面における整合歪は、一方で引っ張り、他方で圧縮を受けているので、引っ張り・圧縮応力の付加に対して、系のエネルギ-の増分を打ち消すように応答する。したがって、界面における整合歪は、超弾性効果の発現の原因にはなり得ない。他方、膜面に垂直な積層方向の面間隔の歪についても、構造緩和が完全であれば、界面で原子面が膨張していればそれに垂直な方向に面間隔が縮小し、界面が圧縮を受けていれば積層方向の面間隔は膨張する。したがって、積層方向面間歪についても、外部から印加した応力に対して、系のエネルギ-増分への寄与は小さくなる。このように考えると、超弾性効果の発現のためには、試料が何らかの残留応力を持っている事が必要である。実際、横手方向の長さを固定しておいて、同様な計算を行うと、薄膜に圧縮または膨張の歪が残留し、弾性定数に有意な変化が現れた。
肝線維化機序の解明とその制御〜骨髄由来細胞の関与〜

近年,骨髄由来細胞幹細胞の存在が報告され,さらに骨髄移植後のウイルス性肝炎における肝臓の筋線維芽細胞が骨髄由来である可能性が報告されるなど、臨床的にも多くの骨髄由来細胞が肝線維化の過程に関与している可能性が注目されている。本研究では肝線維化に関与する骨髄由来細胞の動員が、いつどのように誘導されるかを肝内外の病変について明らかにすることを目的とした。肝線維化モデルにおける骨髄細胞の供給と分化誘導を検討するために,放射線照射マウスの骨髄をグリーンマウス骨髄細胞で置換し、骨髄が生着した時点で胆管結紮を行って肝線維化モデルを作成した。検討は生体下のGFP蛍光量の測定による細胞量の定量化,組織標本作成後の免疫染色による肝構成細胞への分化などにより行った。特に免疫多重染色により各細胞の分化過程を明らかにし総合的に肝線維化過程における骨髄由来細胞の関与を検討した。胆管結紮後14日までの肝の組織学的変化について観察を行ない、線維芽細胞の由来について検討した。この際、anti-fibroblast specific protein(FSP)-1antibody,anti-alpha-smooth muscle actin(α-SMA)antibodyを用いた免疫染色を行った。以上の結果、胆管周囲の線維化は胆管結紮後7日までの早期において線維芽細胞の存在が確認され、線維化に関わる細胞の多くはグリーンマウス由来ではなかったが、グリーンマウス骨髄由来の細胞も散見された。さらにグリーンマウス骨髄由来細胞中にはFSP-1抗体陽性細胞、α-SMA線維芽細胞抗体陽性も見受けられた。これら骨髄由来細胞が胆管結紮稜の肝線維化に関わっていることが明らかとなった。平成18年度は,肝線維化モデルにおける骨髄細胞の供給と分化誘導を検討するために,放射線照射マウスの骨髄をグリーンマウス骨髄細胞で置換し、骨髄が生着した時点で胆管結紮を行って肝線維化モデルを作成した。これら骨髄由来細胞が胆管結紮後の肝線維化に関わっていることが明らかとなった。

本研究では肝線維化に関与する骨髄由来細胞の動員が、いつどのように誘導されるかを肝内外の病変について明らかにすることを目的とした。平成19年度は,肝線維化モデルにおける骨髄細胞の供給と分化誘導を検討するために,放射線照射マウスの骨髄をグリーンマウス骨髄細胞で置換し、骨髄が生着した時点で胆管結紮を行って肝線維化モデルを作成した。検討は生体下のGFP蛍光量の測定による細胞量の定量化,組織標本作成後の免疫染色による肝構成細胞への分化などにより行った。特に免疫多重染色により各細胞の分化過程を明らかにし総合的に肝線維化過程における骨髄由来細胞の関与を検討した。胆管結紮後14日までの肝の組織学的変化について観察を行ない、線維芽細胞の由来について検討した。この際、anti-fibroblast specific protein (FSP)-1antibody,anti-alpha-smooth muscle actin (α-SMA) antibodyを用いた免疫染色を行った。以上の結果、胆管周囲の線維化は胆管結紮後7日までの早期において線維芽細胞の存在が確認され、線維化に関わる細胞の多くはグリーンマウス由来ではなかったが、グリーンマウス骨髄由来の細胞も散見された。さらにグリーンマウス骨髄由来細胞中にはFSP-1抗体陽性細胞、α-SMA線維芽細胞抗体陽性も見受けられた。これら骨髄由来細胞が胆管結紮後の肝線維化に関わっていることが明らかとなった。
外因子により構造が変化する架橋部を持つ常磁性金属錯体の超分子構造の研究

安定なπホールを有するフタロシアニン二層型ルテチウム錯体を単位とする種々の超分子構造を研究するために周辺を15-クラウン-5エーテルで修飾した二種類の化合物を合成した。一つは架橋部位が4つあるテトラクラウン体で、溶液中でK^+をクラウン部で挟み込むことで、四回回転軸を共有する固定した構造を取る。もう一つは架橋部位が一つのモノクラウン体で、この場合得られる超構造は二つの錯体の相対位置に関して回転の自由度を持つ。これらの超構造のイオン、溶媒の違いによる影響を調べた。テトラクラウン体ではK^+の他にNH_4^+、Cs^+による超構造形成が観測された。三重項のゼロ磁場分裂定数は三つの場合でほとんど変化がなく、サイト間の距離に対するイオン半径の影響は小さい。Na^+を用いた場合、超構造の形成はなかった。イオンがない場合でも溶媒中のアルコール含量が増えることで超構造形成が見られた。この場合三重項のゼロ磁場分裂定数は減少し、サイト間の距離が減少している。これはサイト間の面間距離は変化しないものの横方向にずれた構造をとっていることを示唆している。またこのゼロ磁場分裂定数はモノクラウン体-K^+系の場合とほぼ同じ値であり、構造に自由度がある場合は、常にある量の横ずれが生じることを示唆している。また、フタロシアニン二層型、三層型錯体ではπ電子不足型の電荷状態を作り出すことができる。これらの系で近赤外領域に現れる特徴的な吸収帯はフタロシアニンの数およびπ電子不足数により異なってくる。これらの吸収帯の励起エネルギーを統一的に解明することを目的として、それそれの系について磁気円二色性測定とを行い、励起エネルギーと磁気円二色性の理論計算を行った。これにより可視、近赤外領域の電子励起吸収帯の帰属を行った。近赤外領域の吸収帯のエネルギー変化が、二層型、三層型錯帯でそれぞれ、近似的に二つの二電子項のみで表せることを示した。二つのフタロシアニン環が層状に重なった構造を持つ金属錯体ではいくつかの安定な電荷種を取りうる。そのうち最も安定な中性種では二つの環に非局在したホールを持つπラジカルとして存在する。この錯体群は固相中においては化合物半導体として挙動し、その電気伝導性はホールのホッピングにより生じる。この錯体を単位とする集合体構造を研究するためにまず二種類の超分子構造を形成する15-クラウン-5エーテル修飾希土類フタロシアニン二量体を合成した。一つは架橋部位が4つあるテトラクラウン体で、四回回転軸を共有する固定した構造を取ると予想される。もう一つは架橋部位が一つのモノクラウン体で、この場合二つの錯体の相対位置に関して回転の自由度を持つ超構造が得られると予想される。実際にこれらは溶液中でカリウムイオンを加えることで超分子構造を生成し、電子三重項を示すESRスペクトルが観測された。テトラクラウン体では垂直に積層した構造を形成し、モノクラウン体ではフタロシアニン面の一部分だけが重なった積層構造を取ることを理論計算によるESRスペクトルのシミュレーションにより明らかにした。この計算により、回転角が増加するに従って二つの錯体間の交換相互作用が負から正に逆転することが分かった。テトラクラウン体からなる超構造では一重項が、モノクラウン体からなる超構造では三重項が基底状態であることを明らかにした。テトラクラウン体ではカリウムイオンの添加による吸収スペクトルの変化が観測されたが、モノクラウン体では観測されなかった。これは前者では後者に比べてクラウン部での錯形成による構造のゆがみが大きいためであると結論した。

これにより可視、近赤外領域の電子励起吸収帯の帰属を行った。近赤外領域の吸収帯のエネルギー変化が、二層型、三層型錯帯でそれぞれ、近似的に二つの二電子項のみで表せることを示した。
東欧・バルカンの民族問題と欧州安全保障体制に関する研究

本研究では、東欧及びバルカン地域の民族問題がなぜそして如何にして発生し、欧州国際社会が同問題に如何に取り組んできたのかを明らかにした。具体的には、1.東欧及びバルカン地域の民族問題は、諸大国の「狭間」という地政学が一つの要因となって生じた。2.この地の民族問題は、第一次世界大戦後に敷かれた国境線と民族分状況との乖離のなかで生まれた。3.欧州国際社会が少数民族問題に対処し始めたのは、主権国家からなる国際システムを導入したウェストファリア会議にまで遡り、同会議では主権国家の擬制性を克服するための一手段として宗教上のマイノリティー保護が謳われた。4.このマイノリティー保護の概念は1878年のベルリン会議へと引き肇がれていき、バルカン諸国の独立は少数民族の権利遵守を条件に認められた。5.深刻な少数民族問題を内包るに至ったヴェルサイユ体制は、国際連盟を軸とした少数民族保護システムを構築したが、国家主権原則の壁と弱なヴェルサイユ体制の中で機能不全に陥った。6.東欧及びバルカンの民族問題は冷戦後再び顕在化したが、すべてが武力紛争を惹起したわけではなく、バルトの「エスニック民主主義モデル」や中欧の「ハンガリー人問題解決モデル」のように相対的な安定性を確保した例も見られた。7.そこでは、ユーゴスラヴィア紛争という現実の国際政治を介して構築された欧州安全保障体制が、少なからぬ影響を及ぼしていた。同体制は、(1)少数民族問題を欧州安全保障上の問題と捉える価値観と、「領土保全と少数民族の権利保障」を一体とする原則、(2)OSCE,CoE(欧州審議会),EU,NATOからなる相互補完的な安全保障体制の制度化と、それらが展開する予防外交、(3)EUINATO拡大のコンディショナリティー効力、(4)「人道的介入」概念の導入とNATOによる強制力の行使、(5)復興のための国際分業協力体制、といった特徴からなる。本年度は、1)ルーマニアにおけるハンガリー少数民族問題の研究と、2)モルドヴァのトランスニストリア問題に及ぼすロシアの影響力、およびそれに対するEUおよびアメリカの戦略について、新たな成果を得た。1.ルーマニアに在住するハンガリー人の思考様式が、1990年代はじめと現在とでは、かなり異なってきていることを発見した。少数民族の権利が以前に比べて大幅に承認されてきているにもかかわらず、また、EUが拡大し、ハンガリー人共同体が国家の壁を越えてシェンゲン協定の枠組みにおいて、自由に成長を遂げることができるにもかかわらず、自治の要求を強めている。それは、一つには、ボスニア紛争やコソヴォ紛争の影響が、ハンガリー共同体にも少なからぬ影響を及ぼしているためであろう。もう一つは、EU拡大は確かにコンディショナリティー効果をもたらしはしたが、地位法に代表されるように、EUは必ずしもナショナリズムの弱体化をもたらすものではないと言うことである。したがって、我々は、国家の壁を乗り越えて連邦制を主張するEUが、なぜナショナリズムの弱体化をもたらすことができないのかについて、さらに研究を深めていく必要がある。2.ロシアのトランスニストリア問題に対する基本政策は、所謂コザック・メモランダムに余すところなく網羅されているように、モルドヴァの対ロシア従属化の恒久化である。これに対し、EUはENP政策を打ち出し、またアメリカは民主主義攻勢を掛けて、旧ソ連邦地域に迫っている。この二つの相反するヴェクトルの衝突こそ、グルジアのバラ革命であり、ウクライナのオレンジ革命であり、コザック・メモランダムをめぐる欧米対ロシアの凄まじい抗争であった。

また、ロシアと米欧のWNISに対する政策の根本的な相違が、WNISの親欧米政策を生み出してきていることも、新たに発見できた。今年度は二つの現地調査を行った。一つは、トルコ共和国(イスタンブールおよびアンカラ)にて、EU加盟交渉を開始したトルコ共和国の内政および外政について、もう一つはアメリカ合衆国(ワシントン)にて、アメリカの対黒海地域政策と同地域をめぐるロシアとの関係について調査した。その研究成果は以下の通りである。トルコの最優先外交目標がEU加盟にあることは言うまでもないが、ルーマニアなどと異なりトルコは多角外交を展開している。NATO加盟国、アメリカとの同盟国でありながら、対中東外交や対黒海・カスピ海外交はもとより、近年ロシアとの関係強化を図ってきた。例えば、ブルーストリーム・ガスパイプラインの建設など経済面だけでなく、トルコはNATO地中海作戦「アクティヴ・エンデヴァー」の黒海への延長を、モントルー条約を盾にロシアと共に阻んできたのである。黒海を自国の内海と見なすトルコは、影響力の温存を図るために、現状維持を外政の柱に据えている。民主化、イスラム、キプロスをめぐる西側諸国との確執や、イラク戦争時のアメリカやトルコとの軋みに加え、EU加盟交渉にまつわる外交上の駆け引き、さらには地政学的要件や地域大国としての国力が、多角外交の促進要因となっている。他方、アメリカの対黒海政策は、エネルギー問題に9.11以後の対テロ対策が重なって、益々積極性を増している。バラ革命やオレンジ革命の旧ソ連諸国や中東への波及効果を期待してのことである。NDIやIRIは、政党の強化、現地NGOを育成など、積極的な民主化政策や公正な選挙と取りくんできた。また、欧州バルカン中東中央アジアを結ぶ地政学的要因も、アメリカの対黒海政策推進要因となっている。ただ、アメリカは現在対黒海政策を再検討中と言われ、その結果をフォローしていく必要がある。EUに加盟したエストニア、ラトヴィア、ルーマニアは、民族問題を解決して加盟したはずであったが、いまだに民族問題がくすぶり続けている。エストニアの首都タリンではロシア系住民による暴動が起き、ルーマニアのトランシルヴァニアでは自治要求運動が展開されている。これらのケースは、EU加盟が民族問題の消滅に繋がるとする考えに疑問を投げかけるものである。なかでも、後者の例は、EUに加盟すれば国境がなくなりディアスポラ間の行き来が自由になるため民族問題は消滅する、との考えに修正を迫るものである。他方、1996年に開始されたEUの対西バルカン政策は、1999年から安定連合プロセス(SAP)として着々と進められ、2006年にはそれまでの5つの支援プログラムを統合する形で「加盟前支援手段」(IPA)が導入された。20072013年におよそ115億ユーロのIPAが予定されている。かかるEUの関与の効果として、クロアチアはEUと加盟交渉を開始するまでとなり、マケドニアもEU加盟候補国家として認定されるに至った。また、アルバニアは安定連合条約に調印し、ボスニア-ヘルツェゴヴィナ、モンテネグロ、セルビアは同条約締結に向けEUと交渉中である。コソヴォも法的地位の問題が解決すれば、SAPに加わると考えられている。さらに、モンテネグロも、EUの影響下において、平和里に独立を達成することができた。
胸部悪性疾患に対する腫瘍特異的細径ナノ粒子を用いた光線力学的治療法の確立

今年度は北海道大学薬学研究院薬剤分子設計学教室の協力を得て,本研究の核となるレザフィリン(NPe6 )を含有した新規ナノ粒子の開発を行った.まず,完成した新規ナノ粒子を北海道大学工学研究院超高圧電子顕微鏡研究室の協力を得て電子顕微鏡にて微細構造を観察していただいた.次に,当研究室において肺癌細胞株(A549),悪性胸膜中皮腫細胞株(H2052,H2452,H28,H226,211H)を用いて新規ナノ粒子のがん細胞への集積の検討を行った.Flow cytometryを用いた解析では,各細胞株にNPe6単独群とナノパーティクル封入NPe6群(以後Nano-NPe6群)を0.3, 1.0μg/mlの濃度で導入し,2時間のincubateの後にそれぞれの細胞への集積を検討した.いずれの細胞においてもNPe6単独群では非投与群と比較してほとんど波形に変化を認めなかったが、Nano-NPe6群では著明な右方移動を示し,NPe6をナノ粒子へ封入したことにより、がん細胞内への取り込みが優位に亢進していることが示された.さらに蛍光顕微鏡を用いて細胞内への集積の確認を行った.いずれの細胞株においてもNPe6単独群では細胞質内にはほとんど蛍光を観察できなかったが,Nano-NPe6群では細胞質への著明な蛍光の取り込みを確認することができた.以上より,NPe6をナノ粒子へ封入することによって予想通り細胞内へのuptakeが著しく亢進していた。本結果は今後の実験計画として予定しているレーザー照射による治療効果検討において著明な殺細胞効果の増強が大いに期待されるものであると考えている。本実験に不可欠であるナノ粒子作製が、共同研究先である北海道大学薬学研究院の担当者が急遽他大学へ移動になったことより4か月実験が遅れたが、後任の方の協力でその開発に成功した。しかし、本ナノ粒子を用いて細胞株を用いた実験を施行する予定であったが、2018年9月北海道胆振東部地震によりストックしていた細胞も全滅してしまったことより4か月計画が遅延した。したがって当初の計画より計8ケ月計画が遅延している。今後の展望として同細胞株にNano-NPe6群とNPe6単独群を導入し,その後レーザー照射を施行し,MTS assayを用いてがん細胞に対する殺細胞効果を検討する.その後にヌードマウスを用いた肺癌,悪性胸膜中皮腫の皮下腫瘍モデルを用いて尾静脈より経静脈的にNPe6単独とNano-NPe6を全身投与し,Nano-NPe6群の優位性を示す仮説の元,腫瘍病変をin vivo蛍光システムを用いてその診断能を評価する.さらに最終目標としてマウス皮下腫瘍にNano-NPe6を投与後,レーザー照射を行い抗腫瘍効果をそ検討する予定である.今年度は北海道大学薬学研究院薬剤分子設計学教室の協力を得て,本研究の核となるレザフィリン(NPe6 )を含有した新規ナノ粒子の開発を行った.まず,完成した新規ナノ粒子を北海道大学工学研究院超高圧電子顕微鏡研究室の協力を得て電子顕微鏡にて微細構造を観察していただいた.次に,当研究室において肺癌細胞株(A549),悪性胸膜中皮腫細胞株(H2052,H2452,H28,H226,211H)を用いて新規ナノ粒子のがん細胞への集積の検討を行った.Flow cytometryを用いた解析では,各細胞株にNPe6単独群とナノパーティクル封入NPe6群(以後Nano-NPe6群)を0.3, 1.0μg/mlの濃度で導入し,2時間のincubateの後にそれぞれの細胞への集積を検討した.いずれの細胞においてもNPe6単独群では非投与群と比較してほとんど波形に変化を認めなかったが、Nano-NPe6群では著明な右方移動を示し,NPe6をナノ粒子へ封入したことにより、がん細胞内への取り込みが優位に亢進していることが示された.さらに蛍光顕微鏡を用いて細胞内への集積の確認を行った.いずれの細胞株においてもNPe6単独群では細胞質内にはほとんど蛍光を観察できなかったが,Nano-NPe6群では細胞質への著明な蛍光の取り込みを確認することができた.以上より,NPe6をナノ粒子へ封入することによって予想通り細胞内へのuptakeが著しく亢進していた。今後の展望として同細胞株にNano-NPe6群とNPe6単独群を導入し,その後レーザー照射を施行し,MTS assayを用いてがん細胞に対する殺細胞効果を検討する.

その後にヌードマウスを用いた肺癌,悪性胸膜中皮腫の皮下腫瘍モデルを用いて尾静脈より経静脈的にNPe6単独とNano-NPe6を全身投与し,Nano-NPe6群の優位性を示す仮説の元,腫瘍病変をin vivo蛍光システムを用いてその診断能を評価する.さらに最終目標としてマウス皮下腫瘍にNano-NPe6を投与後,レーザー照射を行い抗腫瘍効果をそ検討する予定である.
合成ペプチドを用いたHHV-6A、HHV-6B特異抗体測定法の開発

HHV-6Aの初感染臨床像、血清疫学はともに不明なままである。潜伏感染するヘルペスウイルス群の特性から、種特異的血清学的検査法の確立が必須である。そこで、種特異的合成ペプチドを用いたELISA法による抗体測定系を確立することを目的とした。今回の我々の結果より、HHV-6A合成ペプチドは7種類の中から優位な結果を得ることが出来なかった。HHV-6BにおいてはHHV-6B 1ペプチドが最も良い結果を得たが、突発疹を診断するには物足りない結果であった。Human herpesvirus 6 (HHV-6)は、現在2種類の種(species)(HHV-6AとHHV-6B)に分けられている。HHV-6Bは小児の一般的な熱性発疹症である突発性発疹症(突発疹)の起因ウイルスであることが明らかになっているが、HHV-6Aの初感染臨床像、血清疫学はともに不明なままである。我々はこれまで、イムノブロット法にてウイルスに特異的な抗原蛋白が各ウイルスに対する特異抗体と反応することを証明した(J Clin Microbiol. 2012 50:1245-51)。本研究では宿主免疫の標的となり、且つ2種類の種間で相同性の低い遺伝子領域で合成ペプチドを作製し、それらを抗原としたELISA法による抗体測定系を確立することを目的とする。HHV-6のゲノム全体の相同性は約95%であることから、我々はHHV-6A, B間で相同性の低い(identity:80.1%)U11遺伝子領域を選択した。さらに蛋白の立体構造解析から細胞表面に現れていると推定される箇所を選択しHHV-6A特異的ペプチド10種類、HHV-6B特異的ペプチド10種類、HHV-6A、B共通ペプチド5種類の合計25種類を作製した。ELISA法の条件設定として突発疹(ES)および薬剤性過敏症症候群(DIHS)のペア血清を使用し、血清希釈倍率を100倍、500倍、1000倍の3段階で、発色試薬添加後の反応時間を3分および30分の2段階で検討を行った。その結果、100倍希釈の血清を使用し、発色時間は30分で行うことで最も吸光度差が大きくなることが分かった。我々はHHV-6A, B間で相同性の低い遺伝子領域U11を選択し、さらに蛋白の立体構造解析から細胞表面に現れていると推定される箇所からHHV-6A特異的ペプチド10種類、HHV-6B特異的ペプチド10種類、HHV-6A、B共通ペプチド5種類の合計25種類を作製した。ELISA法の条件設定を行った結果、100倍希釈の血清を使用し、発色時間は30分で行うことで、HHV-6初感染時と再活性化時で最も吸光度差が大きくなることが分かった。より良いELISA法の条件を求め、合成ペプチドに対するキャリア蛋白の付加を試みた。キャリア蛋白を付加することで、合成ペプチドがELISAプレートに立体的に固相化され、抗原抗体反応が起こりやすい状況を作り出すことができる。これにより高感度化が期待される。25種類の合成ペプチドの中からHHV-6A特異的ペプチド3種類、HHV-6B特異的合成ペプチド3種類を選択し、キャリア蛋白を付加してELISA法を実施したが、あまり優位な結果が得られなかった。本研究は合成ペプチドの作製、ELISA法の条件設定、合成ペプチドを用いたHHV-6Aの血清疫学、初感染臨床像の調査に分けることができる。合成ペプチドの作製については、平成26年度にU11遺伝子領域からHHV-6A特異的ペプチド10種類、HHV-6B特異的ペプチド10種類、HHV-6A、B共通ペプチド5種類の合計25種類を作製した。ELISA法の条件設定については、1次抗体で使用するペア血清の希釈倍率の設定、および発色試薬での発色時間の検討を行った。その結果、血清100倍希釈、発色時間30分で最もペア血清で吸光度の差が大きくなることが分かった。さらにキャリア蛋白を付加し、ELISA法の特異度、高感度化を目指したが、現時点では優位な結果は得られていない。平成28年度はさらにELISA法の条件設定を詰める予定である。キャリア蛋白の付加位置、合成ペプチド(抗原)の濃度設定を中心に、血清との反応性が高い3種類のHHV-6B特異的ペプチドで実施する。