hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブドウ果実における二次代謝産物の環境応答機構の解析

昨年度までの検討において、各種環境下における発達時期別の果実サンプルを用いて、各種フェノール化合物及び香気成分前駆体など二次代謝成分の組成の変動の詳細を明らかとするとともに、同サンプルを用いて、網羅的な遺伝子発現解析を行った。これらの遺伝子発現解析データを用いて、フェノール化合物やテルペノイドの変動に同調した発現変動を示す遺伝子について抽出を行った。果房周囲の光条件を完全遮光処理によって変更することによって、果実中では、フェノール化合物やテルペノイドの大幅な減少がみられたが、これらの成分は発達時期によっても変動した。そこで、生育期に発現が高く、かつ光環境の変化に応じた変動を示す遺伝子群に着目し、その抽出を行った。近年、ブドウを含む植物において、bZIP型の転写制御因子がフェノール化合物の生合成系構造遺伝子及びその制御因子(MYB遺伝子)を制御しているという報告があることから着目して調べたところ、他植物で光応答に関連すると考えられる遺伝子のブドウのホモログが含まれていることがわかった。そこで、定量PCRにてブドウ組織での発現をみたところ、この遺伝子は、花、幼葉、幼茎、まきひげなどで発現が高く、果実中では果皮、種子で発現が高かったが、特にベレゾン期周辺で発現が極大となることがわかった。また、果皮中で遮光、遮光解除処理に応答して発現量の変動がみられることがわかった。引き続きその機能の解析を行う予定である。種々の栽培処理した果実中のフェノール化合物や香気成分前駆体の詳細な解析を行い、その結果のとりまとめ及び論文化するにあたって時間を有したため、実験計画に遅れが生じている。本年度、フェノール化合物やテルペン類などの制御に関連すると考えられる転写制御因子を絞り込んだが、その詳細な機能解析までは至っていない。本年度に引き続き、遺伝子発現解析結果をもとに、香気成分の生成・制御に関連する候補遺伝子のスクリーニングを行う。また、着目したbZIP型転写制御因子について、形質転換体作成等による機能解析を実施する予定である。ブドウ果実における機能性成分であるフェノール化合物、また、テルペノイド、ノルイソプレノイド等の揮発性成分などの主要な二次代謝産物を網羅的に測定するHPLC及びGCーMSを用いた系を確立した。テルペン類などの揮発性成分については、ブドウ中で配糖体(結合型)として存在している割合が高い。結合型の揮発性成分の分析は、固相抽出カラムにて分画後、酵素処理等によって遊離型とし、SBSE-GCMS法により網羅的な解析を行った。この分析方法を活用し、日本で栽培されている代表的な白ワイン用ブドウ2品種の収穫期の果実を分析し100成分を仮同定した。次に、遮光処理、各種植調剤処理を行った成熟期のブドウ果実中における二次代謝成分の変動について解析を行った結果、品種や処理によって特徴的に変動する成分が抽出された。また、同品種の前年度に処理を行ったサンプルを使用しこれまでに実施済みのマイクロアレイデータの再解析を行い、二次代謝系の成熟期における変動について解析した。また、赤ブドウについては、国産赤ワイン用品種16品種におけるフェノール化合物組成について網羅的な解析を行った。プロアントシアニジンについてはフロログルシノール分解法を用い、ポリマー構成成分組成に関して分析した。アントシアニン、プロアントシアニジン、フラボノール及びスティルベン計48成分について定量し、プロファイルの比較を行った。ヨーロッパ系品種、アメリカ系交配種、山ブドウ系交配種においてそれぞれ特徴的な成分が抽出された。現在、その環境応答性について調査を実施している。赤ブドウのポリフェノールの特徴解析に関して、データをとりまとめ、国際学会発表を行う予定である(平成28年6月)。ブドウにおける二次代謝産物の網羅的な解析系をたちあげ、各種環境下、多品種の果実におけるその組成解析を行い、変動を示す成分を抽出することができた点については、計画どおり進捗していると考えられる。計画している遺伝子発現解析については今年のサンプルでは実施できていないが、同品種の前年度に処理を行ったサンプルを使用しこれまでに実施済みのマイクロアレイデータの再解析を行い、二次代謝系の成熟期における変動について解析した。また、遺伝子発現解析用のサンプルは凍結保存しており、来年度すみやかに実施可能であると考えられる。以上のことから、本年の計画はおおむね順調に進展していると考えられる。国産赤ワイン用16品種(ヨーロッパ系品種、アメリカ系交配種、及び山ブドウ系交配種)の果実中のフェノール化合物組成について網羅的な解析を行い、それぞれの品種に特徴的な成分を明らかとした。さらに、山ブドウ系交配種とヨーロッパ系品種の遺伝子の違いについてDNAマイクロアレイデータの再解析を行い、フェノール化合物代謝の違いについて検討した。これらのデータをとりまとめ、国際学会発表1件を行うとともに、論文発表1件を行った。昨年度の検討により、各種環境条件下で栽培されたブドウより、果実中のフェノール化合物、テルペノイド及びノルイソプレノイド等香気成分前駆体の組成の違いがみられたサンプルを選抜し、マイクロアレイ解析を行い、実施済みのマイクロアレイデータとあわせて、これら二次代謝産物及び既知生合成関連構造遺伝子の変動と同調した発現を示す遺伝子のスクリーニングを行った。さらに、当課題とは別に、所属機関で実施したQTL解析によって、得られた二次代謝成分(フェノール化合物、テルペノイド、ノルイソプレノイド)組成に関連する遺伝子座の領域中に含まれる遺伝子とも比較することにより、候補遺伝子の絞りこみを行っている。本年度、環境応答に関するイソプレノイド生合成系の因子の探索を計画していたが、予定どおり、複数の果実サンプルにおけるマイクロアレイ解析を実施し、得られた遺伝子プロファイルより候補遺伝子のスクリーニングを実施している。

しかし、ターゲットとなる候補遺伝子の確定までは至っておらず、引き続き、来年度も実施する必要がある。白ワイン用ブドウ品種である甲州及びシャルドネ果実中の結合型及び遊離型揮発性成分(香気成分)及びフェノール化合物組成について網羅的な解析を行い、両品種の組成の違いについて検討するとともに、環境要因(光照射、植物ホルモン)が、これらの二次代謝産物組成に及ぼす影響について明らかとするため、成熟期の両品種の果実への植物ホルモン(アブシジン酸、プロヒドロジャスモン酸)散布処理及び果房への遮光処理を実施した。甲州果実は、ヒドロキシシンナム酸などのフェノール化合物及び揮発性フェノールの前駆体を高濃度で含む一方、シャルドネ果実はいくつかのテルペノイド、ノルイソプレノイド、ベンゼン誘導体の前駆体を顕著に含んでいるなど両品種の二次代謝成分の組成は大きく異なった。特に、成熟期後期のプロヒドロジャスモン酸処理によって、種々のテルペン化合物前駆体及びスティルベン類の増加がみられた。さらに、光照射によるノルイソプレノイド類の顕著な増加、アブシジン酸処理により、C6化合物の増加がみられた。これらの結果について、昨年度に学会発表を1件を行い、本年度には論文執筆を行った。さらに、昨年度に実施済みの遺伝子発現解析データを用いて、同サンプル中の二次代謝産物及び生合成関連構造遺伝子の変動と同調した発現を示す遺伝子のスクリーニングを行った結果、香気成分の品種や環境応答に関連すると考えられるいくつかの候補遺伝子が得られた。ブドウ果実中の揮発性成分の前駆体分析を含めた、二次代謝成分の網羅的な解析系の立ち上げ、種々の栽培処理によるこれらの代謝成分の変動の解析に予想以上の時間を有したため、以降の実験計画に遅れが生じている。本年度、品種間及び環境応答に関する、香気成分生合成系の因子についてスクリーニングを実施した結果、いくつかの候補遺伝子の絞り込みが可能であったが、その詳細な機能解析までは至っていないため。昨年度までの検討において、各種環境下における発達時期別の果実サンプルを用いて、各種フェノール化合物及び香気成分前駆体など二次代謝成分の組成の変動の詳細を明らかとするとともに、同サンプルを用いて、網羅的な遺伝子発現解析を行った。これらの遺伝子発現解析データを用いて、フェノール化合物やテルペノイドの変動に同調した発現変動を示す遺伝子について抽出を行った。果房周囲の光条件を完全遮光処理によって変更することによって、果実中では、フェノール化合物やテルペノイドの大幅な減少がみられたが、これらの成分は発達時期によっても変動した。そこで、生育期に発現が高く、かつ光環境の変化に応じた変動を示す遺伝子群に着目し、その抽出を行った。
新たな癌幹細胞特異的因子をターゲットにした消化器癌治療戦略

本研究では、癌幹細胞の本態を学術的に探求するとともに、消化器癌幹細胞標的治療の開発を目指した。そのため、以下の検討を行った。1)腸管においてDclk1を軸とした複数の幹細胞マーカーを利用して、癌幹細胞のトランスクリプトームを解析した。2)胃癌、膵癌、胆嚢癌モデルで、Dclk1および新規の癌幹細胞特異的因子の意義を検討した。3)癌モデルマウス、癌スフェロイド3次元培養系を用いて、癌幹細胞に発現するキナーゼ、細胞膜表面蛋白などの消化器癌治療標的としての可能性を検証した。これら1)3)の検討により、癌幹細胞標的療法へ向けた基盤整備を行うことができた。次世代の癌治療を担う重要なストラテジーのひとつである、「癌幹細胞を標的とする治療」実現のためには、正常組織幹細胞に発現しない「癌幹細胞特異的なマーカー」を見いだすことが重要である。研究代表者らは、doublecortin-like kinase 1(Dclk1)が腸管の癌幹細胞と正常組織幹細胞を明確に区別する「癌幹細胞特異的マーカー」であることを報告した。そこで本研究では、平成26年度に以下の項目について検討した。(1)腸管における新規の癌幹細胞特異的因子の網羅的同定: Dclk1の他、Lgr5、Bmi1など種々の代表的な幹細胞マーカーGFPマウスとApcMinマウスとを交配し、Dclk1および他の幹細胞マーカーが高発現している腫瘍および正常組織幹細胞分画をFACSによって収集した。そのうえで、cDNAマイクロアレイ解析を行い、Dclk1陽性癌幹細胞特異的な因子を絞り込んだ。(2)胃、膵臓、胆嚢など多臓器での癌幹細胞特異的因子の検証:胃癌(K19-Wnt1/C2mEマウス)、膵癌(Ptf1a-Cre; KrasG12Dマウス)、胆嚢癌(BK5.ErbB2トランスジェニックマウス)など各種消化器癌のモデルマウスと、Dclk1-CreERT2ノックインマウスとを交配し、リニエージ・トレーシングによってDclk1が癌幹細胞マーカーであるかを検証した。その結果、Dclk1は膵においても腫瘍特異的幹細胞マーカーであることが示された。また、DClk1は胃においても腫瘍幹細胞の一部をマークすることが示された。(3)消化器癌を横断する癌幹細胞標的治療の開発:Dclk1陽性癌幹細胞に特異的に発現するキナーゼ類を2種類同定し、癌スフェロイド3次元培養系を用いて、siRNAや阻害剤による阻害実験を行った。その結果、それらの阻害によって、癌スフェロイドの成長が阻害されることを見いだした。申請者らは、doublecortin-like kinase 1(Dclk1)が腸管の癌幹細胞と正常組織幹細胞を明確に区別する「癌幹細胞特異的マーカー」であることを報告した。そこで本研究では、平成27年度に以下の項目について検討した。(1)腸管における新規の癌幹細胞特異的因子の網羅的同定:平成27年度は、腸管においてDclk1および他の幹細胞マーカーを用いて癌幹細胞分画をFACSによって収集した。cDNAマイクロアレイにより、Dclk1陽性細胞特異的に発現する因子を解析し、脂質代謝、酸化ストレスを制御する因子が高発現していることを見いだした。引き続いて、薬剤耐性や抗酸化ストレスなどの関連を検討中である。(2)胃、膵臓、胆嚢など多臓器での癌幹細胞特異的因子の検証:平成26年度に作製した各臓器の癌モデルマウスとiDTRマウスとの交配を進めた。さらに、平成26年度に同定した腸管における癌幹細胞特異的な因子が、胃、膵臓、胆嚢など様々な消化器癌モデルマウスでどのような局在を示すかを免疫染色等で検討し、Dclk1陽性細胞に発現する諸因子は、消化器臓器横断的に癌幹細胞に発現していることを見いだした。(3)消化器癌を横断する癌幹細胞標的治療の開発:平成26および27年度に引き続き、癌幹細胞に特異的に発現するキナーゼや酵素類の意義を確認した。その結果、複数のキナーゼ、および低分子量Gタンパク質の阻害によって、ヒト大腸癌細胞株、およびApcMinマウス腸腫瘍の増殖抑制が生じることを見いだした。また、本研究を進める過程で得られた新たな癌幹細胞特異的な膜表面蛋白候補を絞り込むことにも成功した。平成27年度には、当初計画していた実験のうち、そのほとんどにおいて、おおむね順調な進捗を示した。具体的に各項目を検討すると、(1)腸管における新規の癌幹細胞特異的因子の網羅的同定:癌はTCA回路以外に、グルタミノリシスや低酸素環境に適応できる特異な代謝系を持つ。さらに幹細胞にも特有の代謝系が想定され、それらが癌幹細胞の治療抵抗性を含めた特異な性質に寄与している。平成27年度は、腸管においてDclk1および他の幹細胞マーカーを用いて癌幹細胞分画をFACSによって収集した。

引き続いて、薬剤耐性や抗酸化ストレスなどの関連を検討中である。(2)胃、膵臓、胆嚢など多臓器での癌幹細胞特異的因子の検証:平成26年度に作製した各臓器の癌モデルマウスとiDTRマウスとの交配を進めた。さらに、平成26年度に同定した腸管における癌幹細胞特異的な因子が、胃、膵臓、胆嚢など様々な消化器癌モデルマウスでどのような局在を示すかを免疫染色等で検討し、Dclk1陽性細胞に発現する諸因子は、消化器臓器横断的に癌幹細胞に発現していることを見いだした。(3)消化器癌を横断する癌幹細胞標的治療の開発:平成26および27年度に引き続き、癌幹細胞に特異的に発現するキナーゼや酵素類の意義を確認した。その結果、複数のキナーゼ、および低分子量Gタンパク質の阻害によって、ヒト大腸癌細胞株、およびApcMinマウス腸腫瘍の増殖抑制が生じることを見いだした。また、本研究を進める過程で得られた新たな癌幹細胞特異的な膜表面蛋白候補を絞り込むことにも成功した。これらの実験結果は、当初の計画のほとんどを充足するものと思われ、本研究計画は、おおむね順調な達成状況を示すものと判断した。次世代の癌治療を担う重要なストラテジーのひとつである「癌幹細胞を標的とする治療」実現のためには、正常組織幹細胞に発現しない「癌幹細胞特異的なマーカー」を見いだすことが重要である。申請者らは、doublecortin-like kinase 1(Dclk1)が腸管の癌幹細胞と正常組織幹細胞を明確に区別する「癌幹細胞特異的マーカー」であることを報告した。そこで本研究では、Dclk1陽性癌幹細胞を軸として、以下の検討を行った。(1)腸管における新規の癌幹細胞特異的因子の網羅的同定:Dclk1をはじめ、Lgr5、Sox9など複数の幹細胞マーカーも併用して、マウス腸腫瘍幹細胞のオミックス解析を行い、新規の癌幹細胞特異的因子候補を同定した。(2)胃、膵臓、胆嚢など多臓器での癌幹細胞特異的因子の検証:胃癌、膵癌、胆嚢癌モデルマウスでリニエージ・トレーシングを行い、癌幹細胞マーカーとしてのDclk1の臓器特異性を検証した。その結果、臓器横断的な癌幹細胞特異的因子の意義が検証できた。(3)消化器癌を横断する癌幹細胞標的治療の開発:本研究で新しく同定した治療標的候補について、まず癌スフェロイド3次元培養系を用いて、Dclk1陽性癌幹細胞特異的に発現するキナーゼ、酵素類の阻害実験を行い、核酸医薬・小分子化合物開発を視野に入れた検討を行った。さらにDclk1陽性癌幹細胞特異的な細胞膜表面蛋白を標的とする新規医薬開発へ向けた基礎的知見を得た。これらの研究を通じて、癌幹細胞の本態を学術的に探求するとともに、新規かつ普遍的な癌幹細胞標的治療開発へ向けた前臨床的研究を展開することができた。本研究では、癌幹細胞の本態を学術的に探求するとともに、消化器癌幹細胞標的治療の開発を目指した。そのため、以下の検討を行った。1)腸管においてDclk1を軸とした複数の幹細胞マーカーを利用して、癌幹細胞のトランスクリプトームを解析した。2)胃癌、膵癌、胆嚢癌モデルで、Dclk1および新規の癌幹細胞特異的因子の意義を検討した。3)癌モデルマウス、癌スフェロイド3次元培養系を用いて、癌幹細胞に発現するキナーゼ、細胞膜表面蛋白などの消化器癌治療標的としての可能性を検証した。
超安定不斉アセタールのマルチ機能開発

アルケニルエーテルとアルコールを弱酸で処理してアセタールを生成させる反応は,有機合成反応の要と言える炭素-炭素結合生成反応やヒドリド還元反応等の非水系強塩基反応において,反応に関与しない水酸基を保護する反応として数え切れない合成反応に応用されてきたが,一方で生成するアセタールの不斉が全く制御できない事から,単離精製や化合物の精密なアサイメントに意味のない苦労を有していた。筆者はこの問題を解決するために,精製するアセタール炭素の不斉を完全に制御できるアルケニルエーテルの分子設計を行い,bicyclo[3.3.0]型骨格がシスフューズのみを安定に与える事を利用した新規なアルケニルエーテルを合成し,その完全不斉制御が目論見通り成功を収めた。まず最初にその不斉制御の実態を探る意味で,dl体を用いて,ジアステレオ選択性から検証した経緯のため,次に標的化合物を光学活性体として合成する事に着手した。鍵反応として行ったパラジウム触媒反応を市販の光学活性ホスフィン6種を触媒配位子として検討したが,残念ながら未だ1020%エナンチオマー過剰率しか得られず,満足のいく結果となっていないが,まだこれから様々に反応条件を検討する予定である。一方,dl体とはまったく異なる合成経路も検討した。その鍵となる反応段階はプロキラルなジオールの酵素による不斉酢酸エステル化反応であるが,これは90%ジアステレオマ-過剰率を得ることができ,難関と思われた反応段階もクリアし,まもなく予定の化合物を光学活性体として得る事ができる予定である。
全球河川モデルと衛星高度計を用いた水面下の河道深さ推計

本年度は、昨年度までに構築した高解像度標高データMERIT DEMと高解像度河川データMERIT Hydroを全球河川モデルCaMa-Floodで活用するために、河道網アップスケール手法FLOWを新データに対応するようにアップデートした。その際、アップスケール手法そのものも更新し、サブ流域形状やノード間長さの均一化を行うアルゴリズムを実装し、水動態シミュレーションの高速化・安定化を図った。これにより、最先端の水文地形データを反映した全球地表水動態シミュレーションが実現し、これまでは地形データに含まれるバイアスなどのために不可能であったモデルと衛星観測データとの直接比較が可能になった。水面下地形を推定するために、25km解像度の河川シミュレーション出力と、70mフットプリントの地点データである衛星高度計ICESatデータを比較するためのモデル出力の内挿方法などを検討し、河川モデルが計算する水面標高のバイアスなどを評価できるようになった。また、衛星高度計の水面標高観測を河川モデルにデータ同化する際に、どの程度離れた観測データまで活用できるかを検討するために、Variogramを用いて空間相関を求める手法を開発した。河川流れは大気物理と比較して地形に強く依存するため、空間相関が高い領域は観測点からの距離だけでは決まらず、流域の地形や上流集水面積などに大きく影響を受けることが分かり、Variogramを用いてデータ同化で考慮する範囲を客観的に求める手法に目処がたった。今年度に開発した標高データ・河道網データ・河道幅データを統合し、全球河川モデルCaMa-Floodに最新の水文地形データを反映することができた。衛星高度計ICESatとの水面標高比較の方法もほぼ確立し、データ同化などによる河道深さ推定に着手しつつある。また、昨年度に論文発表した全球標高データMERIT DEMに非常に高精度であると評価されている。多数のデータ提供リクエストに対応するため、ライセンスをCC-BY-NC4.0およびODbL1.0に変更した、データ利活用の利便性を上げたところ、現在までに2019年4月現在で約600機関がユーザー登録し、研究・教育および一部は商用にも活用されている。最新の水文地形データを反映した全球河川モデルCaMa-Floodを用いたシミュレーションを精査し、まずは計算コードや入力データなどに問題がないことを確認する。モデル出力と衛星観測で水面標高を比較により河道深さを推定するアルゴリズムを確立するとともに、入力流出量データや河道深さ以外の地形データに起因する不確実性についても評価する。また、衛星高度計の観測データを最大限活用するために、2018年度に実施したVariogramによる水面標高の空間相関からLETKFによるデータ同化のローカルパッチサイズを最適化する手法を検討する。さらに、昨年度投稿した全球表面流向データについての論文が受理見込みであり、WebPageなどでのデータ公開を進める。収集したデータを整理・比較した結果、既存の標高データには大きなバイアスがあるために、そのままでは河川モデルと衛星高度計との水面標高の比較による水面下の河道深さ推定は難しいことが分かった。そのため、平成29年度は河道深さ推定アルゴリズムの準備作業として、標高データに含まれる誤差の補正を中心に行った。標高データ・水面データ・森林データ・衛星高度計データを組み合わせて、点状ノイズ・縞状ノイズ・絶対標高バイアス・植生バイアスの4つの誤差成分を分離・除去するアルゴリズムを開発し、それを収集した標高データに適用することで全球高精度の新たな標高データを構築した。既往標高データに含まれるバイアスのために初年度は河道深さ推定アルゴリズムの開発には着手できなかったが、標高データの誤差補正はほぼ完了することができた。全球スケールで標高データに含まれる複数の誤差要因の分離・除去を実現したのは世界初の成果であり、開発した高精度標高データは本研究の目的である河道深さの推定の他にも様々な分野で利用される見込みである。誤差補正の手法および開発した高精度標高データについて学術論文にまとめてGeophysical Research Letters誌で査読中であり、受理されたタイミングでデータを公開する予定である。また2016年12月にAGU Fall Meetingにて開発した高精度標高データを紹介したところ、論文出版前にもかかわらずデータ提供要請を受けるなど注目を集めている。河道深さ推定アルゴリズムの開発に関してはやや遅れているが、必要な基礎データの整備開発については世界をリードする成果を出しており、全体として研究計画はおおむね順調に進んでいると考えられる。本年度は、昨年度に構築した高精度標高データMERIT DEMを全球河川モデルCaMa-Floodで利用可能にするために、河川ネットワークを表現する表面流向データの計算に取り組んだ。標高データ単独では表面流向を精度よく推定できないことが分かったため、最新の高解像度水域データであるG1WBMとGSWO、さらにベクター形式のオープン地図データOpenStreetMapの水域レイヤを統合した。高解像度で表面流向を精度良く自動計算するアルゴリズムは存在しなかったため、Fortran90を用いて独自の表面流向計算コードを作成した。とくに、乾燥域に多数存在する窪地を、標高データの誤差による凹領域から分離する際に土地利用などに応じて複数の閾値を用いるなどの工夫を行い、ほぼ手作業による修正なしに広域の表面流向データを計算が実現した。さらに、表面流向データと整合性が取れるように、2014年に開発した全球河道幅データGWD-LRを更新した。標高データ・表面流向データ・河道幅データを高精度化したことで、河川モデルと衛星高度計との水面標高比較が用意になり、本課題の最終目標である水面下地形の推定に取り組める状態になった。

また、衛星高度計を用いたデータ同化による河道深さ推定を実現するために、全球河川モデルのシミュレーション結果から作成した仮想的な水位観測データを用いて、河道深さを推定するOSSE実験(Observation System Simulation Experiment)を行った。その結果、背水効果によってローカルな水位が下流に影響を受ける地点では改善の必要があるものの、既存のデータ同化アルゴリズムを拡張することで河道深さ推定ができる可能性があることが示された。今年度までに標高データ・河道網データ・河道幅データの整備が完了し、次年度からは本研究課題の目標である衛星高度計を用いたデータ同化による河道深さ推定に取り組める状態になった。河道深さ推定アルゴリズムのプロトタイプもOSSE実験によって構築しており、次年度からは実データを用いた河道深さの推定を行える段階になっている。また、昨年度に開発した全球高精度標高データMERIT DEMの記述論文がGeophysical Research Letter誌に受理・掲載された。高精度標高データは、本研究課題の河道深さ推定だけでなく、幅広い地学分野で必要な基礎データであるため。論文受理後にWebPageでのデータを公開したところ、多数の研究者からデータ提供要請を受け、2018年4月現在で約240機関にデータを提供し、研究および教育に活用されている。本年度は、昨年度までに構築した高解像度標高データMERIT DEMと高解像度河川データMERIT Hydroを全球河川モデルCaMa-Floodで活用するために、河道網アップスケール手法FLOWを新データに対応するようにアップデートした。その際、アップスケール手法そのものも更新し、サブ流域形状やノード間長さの均一化を行うアルゴリズムを実装し、水動態シミュレーションの高速化・安定化を図った。これにより、最先端の水文地形データを反映した全球地表水動態シミュレーションが実現し、これまでは地形データに含まれるバイアスなどのために不可能であったモデルと衛星観測データとの直接比較が可能になった。水面下地形を推定するために、25km解像度の河川シミュレーション出力と、70mフットプリントの地点データである衛星高度計ICESatデータを比較するためのモデル出力の内挿方法などを検討し、河川モデルが計算する水面標高のバイアスなどを評価できるようになった。また、衛星高度計の水面標高観測を河川モデルにデータ同化する際に、どの程度離れた観測データまで活用できるかを検討するために、Variogramを用いて空間相関を求める手法を開発した。河川流れは大気物理と比較して地形に強く依存するため、空間相関が高い領域は観測点からの距離だけでは決まらず、流域の地形や上流集水面積などに大きく影響を受けることが分かり、Variogramを用いてデータ同化で考慮する範囲を客観的に求める手法に目処がたった。
頭頸部癌に対するプラスミドベクター電気穿孔法を用いた遺伝子治療法の開発

プラスミドベクター電気穿孔法を用いた頭頸部癌に対する遺伝子治療の開発を目的に実験を行った。まず、EBウイルス由来プラスミドベクターを用い自殺遺伝子(HSV-tk)の導入を試みた。EBベクターにHSV-tkを組み込んだプラスミド(pEB3-CAG-HSV-tk)は唾液腺癌細胞であるHSGとTYSを標的としたin vitroでのトランスフェクションでは電気穿孔法あるいはリポゾーム法ともに高い導入効率が得られたが、ヌードマウスに形成した腫瘍への導入効率が上げられなかった。そこで、in vivoヌードマウス腫瘍に対する導入効率を検定するために、通常のプラスミドベクターにSV40のプロモーターでドライブされる蛍ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして有するプラスミド(pGL3-control)を用いた。HSG細胞をヌードマウスに移植し、種々の条件でpGL3-controlを腫瘍内に導入した。2日後に腫瘍を摘出し、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性を測定した結果、プラスミド5μgを用い、経皮的にパルスを負荷した場合に最も導入効率が高いことが明らかとなった。さらに、ヌードマウス腫瘍細胞内での導入遺伝子の発現と局在を明らかにするためにレポーターとしてCMVプロモーターでドライブされる蛍光蛋白質GFP遺伝子を有するプラスミド(pEGFP-C3)を用いた。2日後に腫瘍を摘出し凍結切片を作製し蛍光顕微鏡にてGFPの発現を確認すると、数パーセントの細胞にGFP蛍光が認められた。以上のようにプラスミドベクターを電気穿孔法により腫瘍細胞に導入・発現させることが可能であり、導入効率を上昇させることにより安全なプラスミドベクターを用いた遺伝子治療への応用が可能であることが示唆された。単純ヘルペスチミジンキナーゼ(HSV-tk)遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを電気穿孔法で頭頸部癌に導入しガンシクロビルにより遺伝子導入細胞を死滅させる遺伝子治療の開発を目的に実験を行っている。まず、HSV-tk遺伝子をプラスミドベクター(pEV3-CAG)に組み込んだ。pEV3-CAGはEBウイルスの特徴を保持しており細胞内に導入された後、宿主細胞の染色体遺伝子にはインテグレイトされないで染色体外遺伝子として、宿主細胞の細胞分裂後も娘細胞に伝搬される。このプラスミドを用いるとトランジエントに発現した遺伝子はそのまま発現し続ける特徴があり、遺伝子導入の効率は極めて高く培養細胞では一般に約80%である。さらにこのプラスミドはGFP(green fluorescent protein)遺伝子を保有しており、組み込まれた目的の蛋白質はGFPとの融合蛋白質として発現するため、目的のクローンは紫外線で励起されると緑の蛍光を発する。pEV3-CAGにHSV-tkを組み込んだプラスミド(pEV3-CAG-HSV-tk)を構築するのと平行して、唾液腺癌細胞であるHSGとTYSにin vitroでpEV3-CAGを導入し遺伝子の導入効率を検定した。その結果、リポフェクチン法および電気穿孔法ともに約70%の細胞に遺伝子導入が可能であった。遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡下で観察すると紫外線で励起された緑の蛍光を発した。トランスフェクタントのin vitroの増殖は親株と変わらず、ヌードマウスでの腫瘍原性の変化も認められなかった。また、ヌードマウス腫瘍も培養細胞同様に蛍光が認められた。今後、pEV3-CAG-HSV-tkをin vivoすなわちヌードマウス腫瘍に電気穿孔法で導入する最も良い条件を設定する必要がある。昨年度の検索にてEBベクターにHSV-tkを組み込んだプラスミド(pEB3-CAG-HSV-tk)は唾液腺癌細胞(HSGとTYS)を標的とした電気穿孔法あるいはリポゾーム法によるin vitroでのトランスフェクションでともに高い導入効率が認められた。しかしながら、pEB3-CAG-HSV-tkはヌードマウスに形成した腫瘍への導入効率が上げられなかった。

そこで、in vivoヌードマウス腫瘍に対する導入効率を検定するために、通常のプラスミドベクターにSV40のプロモーターでドライブされる蛍ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして有するプラスミド(pGL3-control)を用いた。HSG細胞をヌードマウスに移植し約5mmの腫瘍を形成させ、その腫瘍内部にpGL3-control(5μg、50μg)を50μlの培養液に溶解し注入した。皮膚の上から、あるいは皮膚に切開を加え腫瘍を露出させた条件でエレクトリックセルジェネレーターのピンセト電極で腫瘍をはさみ、スクエアーパルス1KV、99μsec、8回高周波パルスを負荷した。2日後に腫瘍を摘出し細胞抽出液のルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、プラスミド5μgを用い、経皮的にパルスを負荷した場合に最も導入効率が高いことが明らかとなった。さらに、ヌードマウスに腫瘍細胞内での導入遺伝子の発現と局在を明らかにするためにレポーターとしてCMVプロモーターでドライブされる蛍光蛋白質GFP遺伝子を有するプラスミド(pEGFP-C3)をヌードマウス腫瘍に導入した。2日後に腫瘍を摘出し凍結切片を作製し蛍光顕微鏡にてGFPの発現を確認すると、数パーセントの細胞にGFP蛍光が認められた。以上のようにプラスミドベクターを電気穿孔法により腫瘍細胞に導入し得る事が明らかとなった。
神経保護性ミクログリア特異的PETイメージング剤の開発

本研究課題では、ミクログリアの機能調節に関わる分子としてP2X7受容体に着目してPETプローブ開発を行った。ピログルタミン酸骨格をリード化合物とする11C標識PGAA類(3種類)についてLPS誘発神経炎症モデル動物を用いた評価を行った結果、いずれも神経炎症部位に高集積が確認され、神経炎症イメージングプローブとしての可能性が示された。しかし、脳移行性が低いことや特異結合成分が明らかとならなかったことなど、改良すべき課題が明らかとなった。今後は、P2X7受容体のイメージング標的としての意義を明らかにするとともに、改良型P2X7受容体特異的PETプローブの開発が重要であると考えられる。本研究では、脳での炎症反応において中心的役割を担うミクログリアの機能・性質を特定できるようなPETプローブの開発を目指している。活性化ミクログリアは神経保護性にも障害性にもはたらくことがわかっており、これまでに神経保護性ミクログリアへの形質転換を制御する因子としてATP感受性プリン受容体サブタイプ(P2X7)の関与が報告されている。そこで、我々はP2X7受容体アンタゴニストとして、Λ/-[(2-chloro-4-fluorophenyl)methyl]-1-methyl-5-oxo-prolinamide等に共通する構造であるPyroglutamic acid amide(PGAA)骨格に着目し、PGAAをリード化合物とする11C標識PETプローブ3種類の合成を行った(11C-PGAA1, 11C-PGAA2, 11C-PGAA3)。これらをP2X7受容体特異的PETプローブの候補として、神経炎症モデルラットを用いたPET撮像実験による評価を行ったところ、11C-PGAA1、11C-PGAA2、11C-PGAA3の3種類すべてがラットの脳内炎症部位に高い集積を示すことがわかった。また、免疫染色の結果、上記PETプローブの高集積部位にはP2X7Rを発現する活性化ミクログリアがあつまっていることも確認された。以上のように、本年度は11C標識PGAA類の合成系および評価系の確立を行い、さらに評価の結果から11C標識PGAA類にP2X7Rイメージング用プローブとして炎症診断に有用な可能性を見出すことができた。当該年度(平成27年度)では、P2X7R特異的PETプローブとして3種類の11C標識PGAA類の合成を行い、神経炎症モデル動物を用いたin vivo条件下での評価までを完了した。このPET撮像実験による評価の結果、11C-PGAA1、11C-PGAA2、11C-PGAA3はいずれも神経炎症部位に高集積を示すことがわかり、P2X7受容体特異的PETプローブとしての将来性を見出すことができた。しかし、動態解析の結果、11C標識PGAA類は脳移行性が低いことが明らかとなっており、その改良のため新たな候補化合物に関する検討を行っているところである。また、11C標識PGAA類が神経炎症部位の検出に有用であることを示唆する結果が本年度の検討から得られてはいるものの、各PETプローブのP2X7受容体への特異性や選択性は未だ明らかとなっていない。上記の状況を踏まえると、11C標識PGAA類はPETプローブとして求められる基本的性質について様々な課題が明らかになりつつも、本年度は1本研究の基軸となる11C標識PGAA類の標識合成方法を確立できた2in vivo条件下での評価を実施し、目的の一つである神経炎症イメージング剤としての将来性を見出すことができたという点から、研究は順調に進展していると評価できるのではないかと考える。本研究では、脳での炎症反応において中心的役割を担うミクログリアの機能や性質を特定できるようなPETプローブの開発を目指し、ATP感受性プリン受容体サブタイプ(P2X7)に着目してPETプローブの開発を進めている。H28年度は下記の項目について検討を進めた。1. Pyroglutamic acid amide(PGAA)骨格に着目し、前年度に開発を行った3種のPETプローブ(11C-PGAA1, 11C-PGAA2, 11C-PGAA3)がリポポリサッカライド(LPS)注入によるラット脳内炎症に高い集積を示したことから、炎症部位のミクログリア/マクロファージの性質(M1/M2)を同定するために免疫染色を行った。結果、PETプローブ集積の亢進が認められたLPS注入3日後の神経炎症部位におけるP2X7Rの発現は、活性化ミクログリア/マクロファージの中でも、M2型のマーカーであるCD163陽性細胞に多く確認された。2.前年度に開発した11C-PGAA類のうち、11C-PGAA3のベンジルアミド部位に関わる立体異性体をそれぞれ合成し、PET撮像実験による評価を行った。その結果、R体よりもS体の方が炎症部位へ高い集積を示すことがわかった。しかし、脳への集積率は依然として低いままであるため、実用化に向けては脳内移行性の改良が必須であると考えられた。3.脳内移行性およびP2X7R結合親和性の向上を目指した新規候補化合物のPETプローブ化にあたり、候補化合物のP2X7R結合親和性の評価試験法の検討を行った。当初、プラスミドDNAを導入することによりP2X7R高発現細胞を樹立し、試験に用いることを試みたが、芳しい結果が得られなかったため、元来P2X7Rを高発現するA431

細胞を用いてYO-PRO-1取り込み量の変化から、候補化合物のP2X7R結合性を確認することとした。現時点でPETプローブ化が完了している候補化合物については、脳内移行性が低く、鮮明なPET画像が得られていない状況にはあるが、脳内移行性およびP2X7R結合親和性の改良を目指して新たな化合物の設計、合成に着手し始めている。また、in vitro条件下での結合評価系を検討、確立できたことから、次年度以降に順次評価を進める体制を整えることができたと考えられる。本研究の主軸である「神経保護性ミクログリアのイメージング」の観点では、PETプローブが高集積を示した炎症部位においてP2X7RがM2型ミクログリア/マクロファージに発現することを示唆する結果が得られたことから、P2X7Rがミクログリアの機能性を反映したイメージングターゲットとして期待されることが実証されたと言える。本研究では、脳での炎症反応において中心的役割を担うミクログリアの機能や性質を特定できるようなPETプローブの開発を目指し、ATP感受性プリン受容体サブタイプ(P2X7)に着目してPETプローブの開発を進めてきた。前年度までに、Pyroglutamic acid amide(PGAA)骨格を有するPETプローブ(PGAA1、PGAA2、PGAA3)がラット脳炎症部位に高い集積を示すことを確認したが、脳内移行性が低いことやP2X7R結合親和性をさらに高める必要があるという問題点も明らかとなった。そこで、今年度は、これらの課題を改良したPETプローブの開発を目指し、新規化合物(PGAA4)の合成と評価実験を実施した。しかし、ヒトP2X7R高発現細胞を用いて、候補化合物が蛍光カルシウムプローブの細胞内流入量に及ぼす変化を測定した結果、明らかなP2X7R阻害効果を確認することはできなかった。一方、P2X7受容体がミクログリアの機能に及ぼす影響を明らかにする目的で、既存のP2X7R阻害剤による細胞変化を免疫染色により検討した結果、ミクログリアの活性化は顕著に抑制されることが明らかとなった。以上の通り、本研究では、PGAA骨格を有するPETプローブがP2X7受容体のイメージングプローブとして有用であることが明らかとなったが、さらなる応用にむけて必要な条件(脳内移行性や結合親和性)を満たすPETプローブを新たに創生するには至らなかった。P2X7阻害剤を用いた検討からは、炎症反応の調節機構にP2X7受容体が深く関与することが示されたことから、P2X7受容体は神経炎症のイメージング標的として重要であり、今後もPETプローブ開発を推進すべきであると考えられる。本研究課題では、ミクログリアの機能調節に関わる分子としてP2X7受容体に着目してPETプローブ開発を行った。ピログルタミン酸骨格をリード化合物とする11C標識PGAA類(3種類)についてLPS誘発神経炎症モデル動物を用いた評価を行った結果、いずれも神経炎症部位に高集積が確認され、神経炎症イメージングプローブとしての可能性が示された。しかし、脳移行性が低いことや特異結合成分が明らかとならなかったことなど、改良すべき課題が明らかとなった。今後は、P2X7受容体のイメージング標的としての意義を明らかにするとともに、改良型P2X7受容体特異的PETプローブの開発が重要であると考えられる。目的とするP2X7受容体特異的PETプローブの開発に向け、平成27年度の研究成果を踏まえて下記の計画の通りに研究を進める予定である。
イネに寄生する糸状菌のカビ毒産生能の遺伝的要因解明

イネばか苗病菌(Fusarium fujikuroi)の中には、ブタ肺水腫やウマ白質脳症を起こすカビ毒であるフモニシンを産生する集団と産生しない集団が存在する。本課題ではフモニシン産生能喪失の原因を遺伝子レベルで解明した。喪失の原因変異はフモニシンの生合成に関わる遺伝子クラスター中の複数の領域に分散して存在していると推定された。そのうちの1つは他のフモニシン生合成遺伝子の転写制御因子となっているFUM21遺伝子中のg.2551G>T(p.G678*)置換であり、コードされたタンパク質のC末端側11アミノ酸が欠失することで機能を失っていると予想された。フモニシンはウマの白質脳症、ブタの肺水腫の原因物質となっているカビ毒で、ヒトでは食道ガンに関係しているとされている。本研究はイネばか苗病菌の一部においてフモニシン産生能が喪失している原因を遺伝子レベルで解明することを目的としている。この研究は大きく、候補遺伝子の探索と原因変異の特定から成っており、本年度については当初の計画に沿って候補遺伝子の探索におけるフモニシン遺伝子クラスターの発現比較を実施した。昨年度までにフモニシン産生株とフモニシン産生能喪失株の16種類の遺伝子で構成されているフモニシン遺伝子クラスターの全塩基配列が解読されている。今年度はまず、解読された塩基配列をもとに、それぞれの遺伝子に対応した16ペアのRT-PCR用プライマーを設計した。フモニシン産生を誘導するGYAM液体培地により、フモニシン産生株とフモニシン産生能喪失株をそれぞれ培養してRNAを抽出した。その際、フモニシン産生株の場合は培養液中にフモニシンが検出されるのに対し、フモニシン産生能喪失株の場合はフモニシンが検出されないことを確認した。RT-PCRの結果、フモニシン産生株については、16種類の遺伝子全てについて予想サイズのRT-PCR産物が検出された。一方、フモニシン産生能喪失株では6種類の遺伝子については予想サイズのRT-PCR産物が検出されたが、10種類の遺伝子(FUM6、FUM7、FUM3、FUM10、FUM11、FUM2、FUM13、FUM16、FUM17、FUM18)についてはRT-PCR産物が検出されなかった。ゲノムDNAを用いた場合には、イントロンを含むサイズのPCR産物が検出されていることから、フモニシン産生能喪失株においてはこれらの遺伝子の転写に異常が生じていることが明かになった。この研究は大きく、候補遺伝子の探索と原因変異の特定から成っており、本年度については当初の計画に沿って候補遺伝子の探索を実施した。1、フモニシン産生能が喪失の原因がフモニシン遺伝子クラスターに存在する確証を得るために、連鎖解析に用いる交配子孫株をこれまでの10株から100株に増やしてフモニシン産生能を調べた。その結果、フモニシン産生能を持つものが81株、持たないものが19株であった。また、マーカーをこれまでの4種類から7種類に増やして100株子孫株全てのデータを取得したところ、58株については交配に用いたいずれかの親株とデータが一致し、それらは交配子孫株を得た際に混入した親株の分生胞子に由来した株と予想された。そこでそれらを除いた42株を用いて連鎖解析を行った結果、フモニシン遺伝子クラスター内の2つのマーカーがフモニシン産生能と完全連鎖していることが確認された。2、フモニシン産生株では約50Kbpからなるフモニシン遺伝子クラスターの全塩基配列が解読されている。そこで新たにフモニシン産生能喪失株のフモニシン遺伝子クラスターの全塩基配列を解読してフモニシン産生株との違いを調べた。その結果、フモニシン産生能喪失株のフモニシン遺伝子クラスターにはフモニシン産生株のものと同様の構造が見られたが、各遺伝子には塩基配列で0.3-1.6%、アミノ酸配列で0.2-2.7%の違いが検出された。本年度は最終目標としていた原因変異を特定するため、遺伝子導入によるフモニシン産生能の回復実験を実施した。転写因子をコードするFUM21遺伝子、ポリケチド合成酵素をコードするFUM1遺伝子をそれぞれ単独で導入した形質転換体ではフモニシンの産生は認められなかった。

また、FUM6、FUM7遺伝子領域、FUM8、FUM3、FUM10遺伝子領域、FUM11、FUM2、FUM13遺伝子領域、FUM14、FUM15、FUM16遺伝子領域それぞれを導入した形質転換体でもフモニシンの産生は認められなかった。そこでFUM6、FUM7遺伝子領域とFUM8、FUM3、FUM10、FUM11、FUM2、FUM13遺伝子領域を導入した形質転換体にFUM21遺伝子領域を追加導入したところ、フモニシン産生能の回復が認められた。従ってフモニシン産生能喪失の原因はクラスター中の複数の領域に分散しているものの、そのうちの1つはFUM21遺伝子に存在すると考えられた。フモニシン産生能喪失株のFUM21遺伝子はg.2551G>T(p.G678*)によりC末端側11アミノ酸が欠失している。そこで、先の実験でFUM21遺伝子領域を追加導入することでフモニシン産生能を回復させられることが分かっている形質転換体について、人工的な点変異導入でg.2551G>T(p.G678*)のみを置換したFUM21遺伝子領域を追加導入してみたところ、フモニシン産生能の回復が認められなかった。以上の結果からフモニシン産生能喪失の原因変異は、少なくともFUM21中のg.2551G>T(p.G678*)によるC末端側11アミノ酸が欠失と特定した。菌学本研究の目的は、イネばか苗病菌の一部においてフモニシン産生能が喪失している原因を遺伝子レベルで解明することである。研究計画上、2年目となる今年度は候補遺伝子の探索におけるフモニシン遺伝子クラスターの発現比較が予定されており、計画通り全16遺伝子についてRT-PCRによる発現比較を終了した。本研究の目的は、イネばか苗病菌の一部においてフモニシン産生能が喪失している原因を遺伝子レベルで解明することである。研究計画上、初年度となる今年度は連鎖解析の精度向上とフモニシン産生能喪失株のフモニシン遺伝子クラスターの全塩基配列の解読が予定されており、計画通りにそれら両方が終了した。当初の計画に沿って、次年度には遺伝子導入によるフモニシン産生能の回復実験を実施して、フモニシン産生能が喪失した原因の変異を特定する予定である。昨年度のフモニシン遺伝子クラスターの発現調査により、フモニシン産生能喪失株では転写制御因子であるFUM21遺伝子の転写が確認されたが、フモニシン産生能喪失株では多くの遺伝子(16種類中の10種類)で発現異常が見られているため、まずはFUM21遺伝子の導入によるフモニシン産生能の回復を調べる。回復しない場合には更に他の遺伝子についても導入してフモニシン産生能の回復を調べてゆく予定である。当初の予定に沿って、次年度(平成25年度)にフモニシン遺伝子クラスターの発現比較、平成26年度に遺伝子導入によるフモニシン産生能の回復実験を実施し、最終的にフモニシン産生能が喪失した原因の変異を特定する。フモニシン遺伝子クラスターの発現比較では、フモニシン産生株とフモニシン産生能喪失株を用いてクラスター内の遺伝子にフモニシン産生能喪失株で発現が異常となっているものがないかをRT-PCRで調べる。RT-PCRに必要なプライマーは、今回解読したフモニシン遺伝子クラスターの全塩基配列をもとに設計する。次年度(平成26年度)は遺伝子導入によるフモニシン産生能の回復実験を実施する。消費税の導入などで消耗品の費用が当初の予定より必要になった。遺伝子導入によるフモニシン産生能の回復実験の実施にあたって必要となる物品費として使用する。
マクロファージ特異的遺伝子の塩基配列の検索

我々はヒトマクロファージ(Μφ)-マウス骨髄腫間融合細胞(a-HINS-B3細胞;Μφ形質を発現)のポリ【(A)^+】RNAから独自のcDNAサブトラクション法によりa-HINS-B3細胞特異的な種々のcDNAクローンを樹立した。これらのクローンのうち今年度はコピー数が多いあるいは細胞特異性が高いなどの興味あるクローンの塩基配列をジデオキシ法により解析した。HIC4はコピー数が多いこととa-HINS-B3細胞を含む他のΜφ化融合細胞やマウスΜφcell line,RAW264細胞などにのみ転写される遺伝子クローンであり、まずこのクローンについて解析した。その結果、この遺伝子はモロニーマウス白血病ウィルスあるいはそのMCFウィルスの3 ́long terminal repeat(LTR)と酷似した構造とenv遺伝子の3 ́側の断片からなる560bpの遺伝子であることが判明した。HIC4についてはさらにa-HINS-B3細胞DNAをEMBL3に挿入したファージクローンライブラリーから約10クローンを釣り上げ当該ウィルスの全構造とプロウィルスの組込み部の周辺遺伝子構造ならびに転写状態を検討した。その結果5 ́LTRの上流約4Kbの部にある2Kbの細胞遺伝子がΜφ化した融合細胞およびRAW264細胞で特異的に転写されていることが判明した。このようにHIC4関連遺伝子の周辺遺伝子の活性化がみられることから、これがΜφ化とどのような相関を持つかについて検討を進めている。次に【II】E4は約1Kbの転写物をコードする遺伝子であり、種々の細胞でもある程度の転写が見られるが、Μφで最も発現が強い。この遺伝子の約半分の長さに相当する塩基配列の検索では、これ迄に報告されていない遺伝子であった。次にMS2およびMS7は各々約5Kbと2.1Kbの転写物をコードするΜφ化融合細胞,RAW264およびΜφでのみ発現されている真にΜφ特異的な遺伝子であり、現在pUCプラスミドへの再クローン化も終え、塩基配列の検索を進めている。この他MS5は塩基配列によりクラス【I】抗原をコードする遺伝子であることが判明した。
耕作放棄地の地域的展開に関する地理学的研究

本研究では,耕作放棄地の地域的展開について,(1)農村地域分化と年次変化,(2)土地管理への村落社会や自治体等の機能との関連性に焦点を絞り,197090年の農業集落カードを主なデータソースとした低成長期の長崎県半島部の分析によって実証的に明らかにした。その結果は,以下の諸点に要約される。(1)主成分分析とクラスター分析によって,対象地域が,農業生産性と農業経営形態の各次元で説明される,より複雑な地域構造から比較的単純なものへ変化したことを指摘できる。この間、非生産的地区の脱農業化と農業労働力の高齢化,野菜地区の生産性高低への二極分化,果樹・茶地区の生産強化が顕著で,1990年には,稲作地区と非生産的畑作地区が全域(後者は特に近郊地域)に分布する一方で,長崎・西彼=生産的果樹,北松=生産的茶・畜産,島原半島=生産的野菜・畜産という地域的モザイクが強まる傾向にある。(2)放棄地率の平均値は急増しているが,逆に標準偏差は横ばい傾向にある。地域的には,非生産的性格を持った畑作地域で放棄地率が高く,それら(特に長崎・佐世保周辺,島原半島西部・東彼)では,それと農業条件(特に労働力の高齢化)及び農業経営の専門性(特に脱専門化・稲作拡大)が負の相関関係にある。(3)村落社会の土地管理機能の弱体化とには,ある程度の関連性が指摘できるが,その因果関係は明かではなく,むしろ他の要因による複合的な作用が暗示される。(4)実態調査によれば,出作・入作等の農地流動と機械化及び区画整理・基盤整備が,それらの鍵として指摘できる。前者では,村落社会の調整機能には限界があり,現在では個人的ルートが主要な回路となっているが,特に広域的なそれに県主導の調整が重要な役割を演じつつある。後者は労働力の高齢化に関わって重要だが,特に果樹・茶地域で自治体等の補助金と村落の空間的連続性が重大な意味を持つ。これらの詳細については,今後の課題である。
アーク放電を用いたカーボンナノホーン量産技術の開発研究

カーボンナノホーン(CNH)は,グラフェンシート(六員環炭素シート)が円錐状に丸まった構造を呈するもので,通常,それらが凝集して微粒子(CNH粒子)を形成する。CNH粒子は,携帯用ダイレクトメタノール型燃料電池のプラチナ触媒担持体としての利用が期待されている。現在,CNH粒子は高価な連続発振高出力CO_2レーザを用いて量産技術の確立が進められている。これに対し,本研究では,このようなCNH粒子をアーク放電によって安価にかつ量産的に連続合成する技術を研究開発することを目的とした。以下,各年度で得られた主な成果を示す。初年度:所有のアーク放電実験装置を用いてCNH粒子の収率を約80%にまで向上する条件を見出した。その際の合成量は1.5g以上であった。この結果を元に1時間連続運転の実験装置を設計した。次年度:連続実験装置の詳細設計と一部製作を行った。また,収率を向上させるためのアーク放電条件の洗い出し(つまり,放電条件と生成物の関係の明確化),および篩い分け等の後加工プロセスの検討を行なった。更にまた,アーク法製造のCNHの高温特性を調べ,約2000°C以上に加熱するとカーボンナノバルーンへと変形することを明らかにした。最終年度:設計製作した連続合成装置の問題点の解決および完成を目指し,圧力制御装置,ガス導入装置,回収装置の改良を行った。また,アーク条件(電条件と生成物の関係の明確化)の確認を行った。その結果,高気圧において,目標値に近い収率を得た。しかし,アーク放電現象との関係から原料黒鉛棒の連続供給が最適でないことが判明し,装置上のメカニカルな改善点が示された。また,燃料電池電極への応用に向けては,必ずしも,ホーン型ナノカーボンが優れているわけではなく,より好適なナノカーボンを見出すことができた。これに対し,本研究では,このようなCNH粒子をアーク放電を用いて安価にかつ量産的に連続合成する技術を研究開発する。具体的な研究開発の目標は以下のとおりである。(1)CNH粒子の収率60%以上(現状のアーク放電法では2030%;レーザ蒸発法では90%以上)。(2)連続運転時間1時間以上(現状アーク放電法では2秒)。(3)生産量20g/h(現状アーク放電法では連続合成できない;レーザ蒸発法で10g/h)。(4)生成物の雰囲気圧力依存性(収率,生産性,CNH形状,CNH粒子形状・サイズ,比表面積)。(5)アークプラズマの状態と生成物との関係の学究的明確化初年度は,これらのうち,所有のアーク放電実験装置を用いてCNH粒子の収率を80%にまで増加する条件を見出した。また,連続運転時間は2分間まで増加することができた。同装置が機能すれば,45g/hのCNH粒子の合成が可能となると期待できる。