hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
打撃能力と動体視力向上のためのトレーニングに関する研究‐球速・球種に着目して‐

本研究では、打席においてボールを見るというトレーニング方法が打撃能力や動体視力に及ぼす効果を明らかにすることを目的とした。被験者を、時速100kmのストレートを見る群、打撃する群、時速115kmのストレートを見る群、打撃する群、時速100kmのカーブを見る群、打撃する群の6つに分けた。それぞれ、トレーニングを約週3回4週間実施した。その結果、全体として打撃能力は向上する傾向にはあったが、比較的、打撃練習を行う群は打撃能力に対して、見るトレーニングでは視覚機能に対して効果が得られる傾向にあったと思われた。スポーツのトレーニング・練習には科学的根拠のある方法が重要となるが、野球等の打撃を対象とした研究例は少ない。近年、スポーツにおける視覚の重要性が指摘されており、「眼」や「見る」という観点からの効率的なトレーニング方法を明らかにすることは、野球等の打撃を行うスポーツにおいて価値ある研究課題と言える。本研究では、打席においてボールを見るというトレーニング方法が打撃能力や動体視力に及ぼす効果を明らかにすることを目的とし、当該年度では、時速115kmの直球を用いたトレーニング実験を実施した。今年度に実施した実験の被験者として、野球経験がない少ない者の14名が参加した。被験者を時速115kmのボール(直球)を週3回4週間、打撃練習する群と、見るトレーニングを行う群に分けた。トレーニングの前後には、打撃能力の評価を行うテストと、各種視機能測定を実施した。打撃能力テストは、直球:時速100km、直球:時速115km、変化球:カーブボール:時速100kmとした。視機能測定では、スポーツにおいて重要となる視機能を中心に、動体視力、距離感を測定する深視力、眼で見た視標に対して素早く正確に反応できる能力である眼と手の協応動作等の測定を実施した。また、本実験は、比較的危険性の低い軟式野球ボールを使用して行い、安全に効率的に研究が行えるようピッチングマシーンを活用して実施した。分析の結果、どちらの群においても打撃能力は向上する傾向にあった。特に、実際に打撃を行う群は、時速100kmの直球条件において、有意に打撃能力が向上していた。また、視機能に関して、ボールを見る群の眼と手の協応動作は、トレーニング前に比べて有意に改善されていた。最終年度の実験結果も踏まえて、引き続き分析を行っていく。スポーツにおける視覚の重要性が指摘されており、「見る」や「眼」という観点からの効率的なトレーニング方法を研究することは、野球等の打撃を行う種目において重要な課題と言える。本研究では、打席においてボールを見るというトレーニング方法が打撃能力や動体視力に及ぼす効果を明らかにすることを目的とし、最終年度では時速100kmのカーブを用いたトレーニング実験を実施した。今年度の被験者は16名であった。被験者を時速100kmのカーブを週3回4週間、打撃練習する群と、見るトレーニングを行う群に分けた。トレーニングの前後には、打撃能力の評価を行うテストと、各種視覚機能測定を実施した。打撃能力テストは、直球:時速100km・115km、カーブ:時速100kmであった。加えて、動体視力、距離感を測定する深視力、眼で見た視標に対して素早く正確に反応できる能力である眼と手の協応動作等の測定を実施した。実験は比較的危険性の低い軟式野球ボールを使用して行い、安全に効率的に研究が行えるようピッチングマシーンを活用して実施した。データ分析の結果、どちらの群においても打撃能力は向上する傾向にはあった。特に、実際に打撃を行う群は、時速100kmのカーブボール条件において、有意(p<0.05)に打撃能力が向上していた。また、見るトレーニングを行った群は、時速100kmの直球条件において、有意(p<0.05)に打撃能力が向上していた。これまでも、時速100kmの直球を用いた打撃練習、または見るトレーニングを行う条件を設定した実験、時速115kmの直球を用いた打撃練習、または見るトレーニングを行う条件を設定した実験を行った。全体として打撃能力は向上する傾向にはあったが、打撃練習を行う群は打撃能力に対して、見るトレーニングでは視覚機能に対して、比較的効果が得られる傾向にあったと思われた。本研究では、打席においてボールを見るというトレーニング方法が打撃能力や動体視力に及ぼす効果を明らかにすることを目的とし、当該年度では、時速100kmの直球を用いたトレーニング実験を実施した。今年度に実施した実験の被験者として、野球経験がない少ない者の16名が参加した。

被験者を時速100kmのボール(直球)を週3回4週間、打撃練習する群と、見るトレーニングを行う群に分けた。トレーニングの前後には、打撃能力の評価を行うテストと、各種視機能測定を実施した。打撃能力テストは、直球:時速100km、直球:時速115km、変化球:カーブボール:時速100kmとした。視機能測定は、動体視力、距離感を測定する深視力、眼で見た視標に対して素早く正確に反応できる能力である眼と手の協応動作等のスポーツにおいて重要となる視機能を中心に行った。また、本実験は、比較的危険性の低い軟式野球ボールを使用して行い、安全に効率的に研究が行えるようピッチングマシーンを活用して実施した。分析の結果、どちらの群においても打撃能力は向上する傾向にあった。特に、実際に打撃を行う群は、各球速・球種条件において有意に打撃能力が向上していた。また、視機能に関しては、ボールを見る群の動体視力はトレーニング前に比べて有意に改善されていた。次年度以降の研究結果も踏まえて、引き続き分析を行っていく。当該研究の目的を明らかにするために、当初計画した通りに実験を計画・実施し、データを取得した。分析に関しては、わずかに予定よりは遅れてはいるが、次年度以降のデータも含めて分析する必要があるため、おおむね順調に進展していると考えている。当初計画した通りに実験を計画、実施し、データを取得した。最終年度となる、来年度については、トレーニング実施時に用いる球種をカーブに変え、球速は時速100kmに設定して、トレーニング研究を行う。当初の計画通りに研究を遂行する予定である。また、学会発表や論文投稿準備を進める。来年度については、トレーニング実施時に用いる球速を時速15km上げて、研究を行う。当初の計画通り、実験用のボール等の消耗品、成果発表のための旅費、データ入力・分析等の謝金、被験者への謝金として、研究費を使用する予定である。また、論文の投稿に向けて、英文翻訳などに研究費を有効活用していく計画である。
非水系酵素反応による構造性多糖分子の合成と糖鎖構造体材料の機能創出

糖鎖はその構造多様性を情報記述子として活用することで、あらゆる生命活動に深く関与している。近年、糖鎖の工学的利用の試みが数多くなされているが、自身の複雑な構造のために合成は困難を極める。そこで、簡便かつ自由に糖鎖を合成可能な新規合成技術の構築が希求されている。本研究では、界面活性剤で機能保護した酵素を構造性糖鎖の良溶媒中で用いることで、100量体以上のセルロース合成に成功している。本年度はこの技術のより精密に制御することを目的として機構解明を試みた。まず、セルラーゼ粗酵素から触媒形態の違いにより4種を分離・精製した。精製酵素を用いて溶媒耐性試験・合成試験を行った。その結果、溶媒耐性はエンド型酵素の方が高く、また、合成試験ではエキソ型酵素ではオリゴ糖が得やすく、エンド型では長鎖分子が得やすいことが明らかとなった。本研究では、安価な加水分解酵素を用い、未修飾の糖基質からワンステップでの糖鎖合成および修飾が可能であった。さらに、本手法は、基質・酵素・反応場の組み合わせを変えることで種々の糖鎖材料の創出に応用可能であることも示された。また、1月から3月にかけてオーストリアのRosenau教授のもとで研究活動を行い、非水系酵素触媒反応による幅広い糖鎖合成を目指して非天然モノマーの合成を行うことができた。研究成果は、論文発表(共著者1報)および学会発表(口頭発表、国内1件・国際1件)を行い、特に国際学会での口頭発表では有意義なディスカッションを行うことができた。本研究では、界面活性剤で機能保護した酵素(SEE)を構造性糖鎖の良溶媒中で用いることで、100量体以上のセルロース合成に成功している。本年度はこの技術を応用し、セルラーゼの水系糖転移反応のドナーとなるラクトースやキチンの構成糖であるキトビオースなどを基質とし、セルラーゼおよびリゾチームから調製したSEEによる非水系オリゴ糖合成を試みた。まず、ラクトースを基質とした合成反応では、NMRおよび糖分析から、ラクトースユニットがβ-1,6結合で連なった非天然糖鎖が得られたことが明らかとなった。次に、セロビオシルアミンを基質とした合成反応では、HPLC分析より、セルロースとは異なる構造のオリゴ糖が得られたことが明らかとなった。また、キトビオースを基質とし、リゾチームのSEEを用いた合成反応では、X線回折測定より、生成物が特定の回折パターンを示し、キチン様構造性多糖の生成が示唆された。本研究では、安価な加水分解酵素を用い、未修飾の糖基質からone-stepでの糖鎖合成に成功した。さらに、本手法は、基質・酵素・反応場の組み合わせで種々の糖鎖合成に応用可能であることも示された。研究成果は、学会にて発表し(国内2件、国際2件)、中でも国際学会2件ではポスター賞を授与され、国際的フィールドにおいても高い評価を得た。本年度はこの技術を応用し、非水系糖鎖合成機構の解明およびセルロース固体表面の機能糖修飾を試みた。また、材料設計への応用展開として、固体基材にろ紙、ドナーにラクトースを用いた一段階での固体表面非水系酵素触媒反応による糖鎖修飾を試みた。得られた材料を細胞培養試験に供したところ、良好な接着が観察され、セルロース固体表面への生理活性付与が示された。研究成果は、論文発表(筆頭著者1報、共著者1報)および学会発表(国内3件、国際1件)をし、特にセルロース学会ではポスター賞を授与され、専門分野における高い評価を得ることができた。

本年度はこの技術のより精密に制御することを目的として機構解明を試みた。まず、セルラーゼ粗酵素から触媒形態の違いにより4種を分離・精製した。精製酵素を用いて溶媒耐性試験・合成試験を行った。その結果、溶媒耐性はエンド型酵素の方が高く、また、合成試験ではエキソ型酵素ではオリゴ糖が得やすく、エンド型では長鎖分子が得やすいことが明らかとなった。本研究では、安価な加水分解酵素を用い、未修飾の糖基質からワンステップでの糖鎖合成および修飾が可能であった。さらに、本手法は、基質・酵素・反応場の組み合わせを変えることで種々の糖鎖材料の創出に応用可能であることも示された。また、1月から3月にかけてオーストリアのRosenau教授のもとで研究活動を行い、非水系酵素触媒反応による幅広い糖鎖合成を目指して非天然モノマーの合成を行うことができた。研究成果は、論文発表(共著者1報)および学会発表(口頭発表、国内1件・国際1件)を行い、特に国際学会での口頭発表では有意義なディスカッションを行うことができた。
3テスラ、1. 5テスラ磁気共鳴装置による塞栓脳動脈瘤再破裂徴候検出法の研究

3テスラ、1. 5テスラ磁気共鳴装置による塞栓術後の脳動脈瘤の経過観察法の研究を行った。塞栓脳動脈瘤の評価に造影剤を使用したMRAの元画像による評価が再発・残存腔の遅い血流、瘤内血栓、さらに瘤壁の増強効果による瘤径の拡大傾向といった治療法の変更や再塞栓術につながる情報の提供をしていることを突き止めた。一方で明らかに不十分な塞栓に終わっているにもかかわらず瘤壁の増強効果を示さない症例も認められ、今後の課題となる。塞栓術後の脳動脈瘤の評価に1.5T、3Tという静磁場強度の違いにより拡大したパルスシークエンスのバリエーションを利用して、造影剤を使用した画像法も合わせ、コイルコンパクションや瘤径の拡大などの再塞栓術を急ぐ画像的サインを見いだすための最適なMRA撮像法を研究した。生体外でのGDCコイルの画像解析:GDCコイルをTOF法やSE法T1強調画像、SE法T2強調画像、efgre 3D法で周波数エンコード方向と位相エンコード方向を90°入れ替えて撮像を行い、コイルとコイル周囲に出現する磁化率効果に起因すると思われる高信号のリム状構造が強いものから順にTOF法、SE法T2強調画像、SE法T1強調画像、efgre 3D法の順に出現することが明らかとなりた。またこの高信号のリム構造は周波数エンコード方向に出現した。生体内での造影剤注入に対する信号上昇解析:造影剤総量を体重あたり1.0mmol/kgに設定し、注入速度を3.0cc/secとし、生理的食塩水での後押しを加えた信号上昇では、注入開始から25秒後に動脈内高信号ピークが現れた。動脈瘤の残存腔ではこの正常の動脈のピークより5秒ほど遅れて信号のピークが訪れた。臨床例のMRA,DSAデータの解析:今年度の新規の脳動脈瘤塞栓術例でDSA、MRAの対比の可能な症例は15例であった。塞栓術後の再破裂例は1例であった。本例はもともと破裂動脈瘤に対する塞栓術であったこともあり、患者の状態が不良であったため、造影MRA検査を行うことができなかった。その他の経過観察症例での再破裂症例は認められなかった。塞栓術後の脳動脈瘤の評価に1.5T、3Tという静磁場強度の違いにより拡大したパルスシークエンスのバリエーションを利用して、造影剤を使用した画像法も合わせ、コイルコンパクションや瘤径の拡次などの再塞栓術を急ぐ画像的サインを見いだすための最適なMRA撮像法を研究した。臨床例のMRA,DSAデータの解析について:今年度の新規の脳動脈瘤塞栓術例でDSA、MRAの対比の可能な症例は10例であった。塞栓術後の再破裂例は認めなかった。これまでに蓄積されたデータを統計解析した結果、現時点では塞栓術後の脳動脈瘤に関して、最も重要な合併症である再破裂を予想する因子として、くも膜下出血での発症であったか否か、塞栓術が完壁に行われたかどうか、動脈瘤の頚部に残存腔が認められた状態であったかどうか、初回治療時点での動脈瘤のサイズはどうであったか、その上で動脈瘤の径の増大が経過中に認められたかどうか、を挙げて検討した。統計学的なパラメータとして動脈瘤の壁の増強効果の有無を対比させ、上記の因子との有意差の検討を行った。結果:塞栓術の完璧性、動脈瘤の頚部の残存、動脈瘤の径の増大傾向を認めること、に関して瘤壁の増強効果の有無での統計学的有意差(p<0.001)が認められた。くも膜下出血での発症であったかどうか、動脈瘤のサイズが10mmを超えるかどうか、には有意差は認められなかった。結論:動脈瘤壁の増強効果の有無には臨床的意義があると判断する。今後の展開:統計学的処理の行うことが難しかい消失傾向を示す動脈瘤壁の増強効果に関しての臨床的検討を行っていく。塞栓術後の脳動脈瘤の評価に再塞栓術を急ぐ画像的サインを見いだすための最適なMRA評価法を研究した。臨床例のMRA,DSAデータの解析:塞栓術後の脳動脈瘤に関して、再破裂を予想する因子として、くも膜下出血での発症であったか否か、塞栓術が完璧に行われたかどうか、動脈瘤の頚部に残存腔が認められた状態であったかどうか、初回治療時点での動脈瘤のサイズはどうであったか、動脈瘤の径の増大が経過中に認められたかどうか、を検討した。今年度の新鮮症例での脳動脈瘤塞栓術例の臨床経過情報と塞栓粥後のDSA、MRAデータ登録は28例であった。今年度は塞栓術後の再破裂例は1例であり、本例にも造影MRA検査を行うことができた。

結果:塞栓術の完璧性、動脈瘤の頚部の残存、動脈瘤の径の増大傾向を認めること、に関して瘤壁の増強効果の有無での統計学的有意差(p<0.001)が認められた。くも膜下出血での発症であったかどうか、動脈瘤のサイズが10mmを超えるかどうか、には有意差は認められなかった。今年度、再破裂症例は最初の塞栓術後には動脈瘤壁の増強効果は認められなかった。動脈瘤塞栓術がきわめて不十分な塞栓に終わっていた症例であり動脈瘤壁にコイルの密着の不良な場合にも動脈瘤壁の染まりを意味する外膜の新生血管増生は来さない可能性が示唆された。また瘤内に血栓形成を認める3例に関しては前例瘤壁の増強効果を認め、造影剤使用による血栓の描出の明瞭化は追加塞栓術の断念という形ではあったが有用な情報を与えてくれた。結論:造影剤を用いたMRAは流速の遅い瘤内血流の評価に優れ、またその元画像は動脈瘤壁の増強効果の有無とともに治療方針を左右する情報を付加することができる。これは塞栓脳動脈瘤の再破裂徴候検出のために意義のあるものである。
疼痛認知における大脳領域間の機能連関の解明と慢性疼痛治療への応用

神経障害性疼痛モデルラットを用いて、複数の脳領域における脳活動や各脳領域間の活動連関と行動変化の相関について解析を行った。まず、神経障害性疼痛ラットを作製し、痛み閾値を測定したところ、神経障害後1週間より機械刺激に対する痛み閾値の低下が認められ、神経障害後2ヶ月まで持続していた。また、神経障害後2ヶ月において、ショ糖嗜好試験を行ったところ、ショ糖に対する嗜好性が低下していたことから、抑うつ状態である可能性が示された。次に、神経障害性疼痛時の脳活動の変化を明らかにするため、大規模多点電気生理学的測定を、無麻酔・無拘束状態の神経障害性疼痛モデルラットで行った。神経障害性疼痛の持続により、脳活動の変化が顕著に見られる脳領域が複数明らかになり、また、周波数に特異的な活動の変動を示すことが明らかになった。また、特定の脳領域間の興奮同期性や周波数依存的な情報伝達・因果性が高まることが明らかになった。特に、動物の覚醒状態に依存せず、脳活動の変化が常に認められる脳領域が複数認められ、これらの脳領域が神経障害性疼痛の持続により、影響を強く受ける脳領域であることが示唆された。この領域は、体性感覚認知に関係する脳領域だけではなく、情動面の調節を行っている脳領域も含まれていた。さらに、脳活動としては、θ帯域神経活動やβ帯域神経活動が上昇しており、γ帯域神経活動が減少することを見出した。これらの帯域神経活動において、複数の脳領域間の活動同期性が有意に変化することも明らかにした。これらの結果より、神経障害性疼痛の持続により、大脳の活動に対して大きな影響が現れ、特に体性感覚や情動を処理する脳領域の機能が著しく変化することが示され、これらの脳活動の変化が痛みの持続による抑うつ状態の原因になっている可能性が示された。研究計画では、当該年度において、大規模脳活動測定の手法を習得し、多数の脳領域から神経活動を同時測定することを目指していた。本年度の研究結果より、大規模脳活動の測定を無麻酔・無拘束の状態で行うことができ、さらに、神経障害性疼痛モデル動物の脳活動を測定して、解析することまで達成できた。2018年度の研究成果から、複数の脳領域の興奮性が変化することがわかり、また、脳領域間の活動同期性や周波数依存的な情報伝達・因果性が変化することが明らかになった。今後は、これらの脳領域における興奮性の変化を抑制することで、神経障害性疼痛が改善するかを行動学的に明らかにし、また、大脳の活動変化に対する影響についても検討を行う。脳活動の変化を改善する手法として、光遺伝学や化学遺伝学的な手法を用いる。さらに、神経障害性疼痛モデルにおいて変化が顕著であった情動を調節する脳領域の活動制御を中心に、多脳領域における神経活動への影響についても検討を行う。最後に、神経障害性疼痛時に見られる特徴的な脳活動の変化が、興奮性神経や抑制性神経、神経系細胞(グリア細胞など)のいずれの細胞群の機能変化によるものかについても同定し、慢性疼痛の持続による脳活動へ与える影響の詳細なメカニズムについて検討を行う予定である。内定年度:2017神経障害性疼痛モデルラットを用いて、複数の脳領域における脳活動や各脳領域間の活動連関と行動変化の相関について解析を行った。

2018年度の研究成果から、複数の脳領域の興奮性が変化することがわかり、また、脳領域間の活動同期性や周波数依存的な情報伝達・因果性が変化することが明らかになった。今後は、これらの脳領域における興奮性の変化を抑制することで、神経障害性疼痛が改善するかを行動学的に明らかにし、また、大脳の活動変化に対する影響についても検討を行う。脳活動の変化を改善する手法として、光遺伝学や化学遺伝学的な手法を用いる。さらに、神経障害性疼痛モデルにおいて変化が顕著であった情動を調節する脳領域の活動制御を中心に、多脳領域における神経活動への影響についても検討を行う。最後に、神経障害性疼痛時に見られる特徴的な脳活動の変化が、興奮性神経や抑制性神経、神経系細胞(グリア細胞など)のいずれの細胞群の機能変化によるものかについても同定し、慢性疼痛の持続による脳活動へ与える影響の詳細なメカニズムについて検討を行う予定である。
熱圧力分析装置の開発とホイスラー型化合物の水素、窒素気体との反応過程の研究

Co原子を含むCoTiSn,CoZrSn化合物の窒素および水素ガスとの反応過程について、以下の順に従って研究を進めた。装置からの反応ガスの微量な漏れをほぼ完全に克服した。一部の測定プログラムを改良することにより、測定精度の向上が実現できた。(2)CoTiSn, CoZrSn化合物の窒化、水素化よる生成物の同定金属顕微鏡観察、EPMA観察および定量元素分析により、母体化合物および窒化生成物の化学組成比を決定した。粉末中性子回折実験により、母体化合物および窒化生成物の結晶構造および化学組成比を決定した。(3)TPAによるCoTiSn, CoZrSn化合物の窒化、水素化温度の決定CoTiSn化合物中に不純物として含まれるTi-Sn化合物と窒素ガスとの反応は500°C以上で急激に起こることを見出した。CoTiSn化合物は水素とは反応しないものの、CoZrSn化合物は窒素ガスとも水素ガスとも反応することが判明した。CoTiSn,CoZrSn窒化生成化合物中における各元素の回りの局所構造、侵入原子の配位の決定を行なった。CoZrSn水素化合物の水素原子の占有位置についてモデルをたてて解析を行なった。
推論の脳内過程

推論は、思考の中核をなす機能である。推論機能を持つ動物は、条件づけや弁別学習によってことにより、今回の研究では、すでに学習している比較的単純な知識を組み合わせて使うことが要求される推論課題をサルに学習させ、その行動解析を行うと同時に、この課題遂行中の前頭前野のニューロン活動を記録・解析した。この課題は2つの弁別課題を連続して行う形をとっており、最初の刺激の呈示により将来呈示される刺激やそれに対する反応に伴う報酬結果を予測することができるようになっている。行動解析の結果、サルが報酬に関する情報と刺激のシークエンスに関する情報を、状況に応じて結びつけ、報酬の予測を行っていることを示唆する結果を得た。上記連続弁別課題遂行中のサルの前頭前野(主に主溝周辺領域)からニューロン活動を記録した。前頭前野には報酬の予期に伴って刺激弁別性を上昇させ、より選択性の高い反応を導くニューロングループ(motor integration type)が存在した。その一方で、多くのニューロンが、直接報酬とは関係しない(しかし、報酬情報を最初にもたらす)第1刺激の報酬との関係を強く反映した活動を見せた。このグループのニューロン(reward monitor type)は、報酬獲得反応に時間的に一番近い第3刺激には、弁別的応答を見せなかった。このことは、前頭前野には、動機づけ情報を認知行動に反映させる役割を果たすニューロンと、反応と切り離して状況の主観的な価値を判断するニューロンが存在することがわかった。行動実験の結果とあわせて考えると、後者のニューロングループが、この状況での「推論」機能に重要な役割を果たしていることが示唆される。中枢神経系が行うことができるもっとも高等な情報処理が、思考である。しかし、現在の段階では、脳がどのようにこの計算を行っているかは、ほとんど何もわかっていない。我々は、思考の基礎となる推移的推論機能を、脳、特に前頭連合野がどのように計算しているかを明らかにするための基礎研究を始めた。ニホンザルに、サッケード反応型見本あわせ課題を学習させた。シングルステップ課題では、最初に呈示された絵にしたがって、後で呈示される2種類の色の中から1つを選びその位置にサッケード反応を行うものと、1種類の色が呈示された後、2種類の線画の中から1つを選んでサッケードを行うものが使われた。この学習が完了した後、2種類のシングルステップ課題を連続して行うダブルステップ課題を学習させた。ここでは、シングルステップ課題での見本あわせルールにしたがい、絵→色→線画と連続して選択的サッケード反応を行う。シングルステップ課題の訓練を通して、特定の絵に対してマッチさせる色は決まっており、色に対してマッチさせる線画もあらかじめ決まっているので、ダブルステップ課題では、サルは最初の刺激が呈示された段階ですべての正刺激(正反応)を予測することができる。被検体はこれらの課題を高い正答率で遂行することができるようになった。現在、これらの課題遂行中のサルの反応時間を計測することにより、予測が行動におよぼす効果を解析している。まもなく、この課題遂行中のサルのニューロン活動の記録も始める。
石器時代におけるサヌカイト原材獲得方法の研究

本研究では,次の点について研究を実施し,以下の研究成果が得られた。1.サヌカイト原産地の調査(研究内容)香川県五色台および金山周辺サヌカイト原産地の実地分布調査を1週間にわたり実施した。(研究成果)新たな知見として,従来縄文時代以降のサヌカイト採取地しか確認されていなかった金山周辺において,今回の調査で,旧石器時代においてサヌカイトを採取した可能性の高い地点が存在することが明らかとなった。2.サヌカイト消費遺跡の調査(研究内容)中・四国地方のサヌカイト消費地遺跡10遺跡について,(1)使用石材,(2)サヌカイト製石器の比率と種類,(3)サヌカイト原材の形態などの特徴および出土状況などの項目について実地観察による検討を実施した。(研究成果)新たな知見として,従来島根県隠岐島産黒曜石をほぼ100%使用しているといわれた島根半島においても,サヌカイトが一定量つかわれていることが明らかとなった。3.サヌカイト原産地および消費遺跡で収集した資料の分析・比較検討(研究内容)1.サヌカイト原産地と2.サヌカイト消費遺跡の調査で得たデータの分析・比較検討を実施した。(研究成果)新たな知見として,今回発見した金山旧石器時代石材採取地点の資料の検討によると,縄文時代以降の石材採取地点が石材の採取に中心があるのとは様相が異なり,石器素材剥片の生産や石器の製作もおこなっていることが判明した。五色台旧石器時代石材採集地点との比較が今後の課題として生まれてきた。
肺がんの分子病態をノンコーディングRNAから俯瞰するシステム的統合研究

代表的ながん遺伝子MYCの転写活性制御に関わるMYMLRlncRNAをシステム生物学的解析を通じて同定し、結合蛋白として見出したPCBP2がMYMLRとMYCのエンハンサーとの結合に必要なことを示してきた。本年度は、さらにMYMLR或いはPCBP2のノックダウンによって、MYCのプロモーターとエンハンサーとのループ構造の形成が破綻することを見出した。MYMLR或いはPCBP2のノックダウンは、MYC mRNAの新規合成を著しく抑制したが、その半減期にはほとんど影響を与えなかった。また、MYCの5'-UTRをluciferaseに融合させてMYCの翻訳制御を検討した結果、PCBP2はMYCの翻訳を制御するが、一方でMYMLRは寄与しなかった。つまり、MYMLRは、PCBP2によるMYCの発現制御のうち、エンハンサーを介した転写制御に必須であることを明らかにした。“京"スーパーコンピュータによるシステム生物学的解析を通じて、TTF-1の制御下にある新規lncRNAとして同定したSFTA1Pの機能解析を進めた。SFTA1Pによる細胞の運動能制御の分子機序を明らかにするために、SFTA1Pをノックダウンしたのちにマイクロアレイ解析を行ったところ、全遺伝子の中で最上位の標的遺伝子としてMYBPHが上がってきた。興味深いことにMYBPHは、かつて我々がTTF-1によって転写活性化を受けてROCK1と結合して活性を阻害し、細胞の運動能を負に制御することを明らかとしている。そこで、SFTA1PとMYBPHの両者のノックダウンを行ったところ、SFTA1Pのみのノックダウンによってみられた細胞の運動能の抑制が、両者のノックダウンによって再び運動能が上昇した。これらの結果は、SFTA1P lncRNAが、MYBPHの発現制御を介して細胞の運動能を制御すること示唆している。代表的ながん関連転写因子に関わるlncRNAの探索・同定を目指して、ドライとウェットの統合的な解析を進めつつある。MYC遺伝子の転写活性を制御するMYMLRlncRNAについては、その癌細胞の増殖制御の分子機構解明へ向けた研究が順調に進みつつある。本年度の研究成果によって、MYC mRNAの転写の維持には、MYMLRとPCBP2が共に必要とされることを、初めて明らかとすることができた。また、肺腺がんのリネジ生存がん遺伝子として、我々が世界に先駆けて同定したTTF-1遺伝子の機能に関わるlncRNAの探索では、SFTA1Pに関する検討を継続した。その結果、網羅的遺伝子発現プロファイル解析を通じ、有力な標的遺伝子候補としてMYBPHを同定するに至った。今後はSFTA1PがどのようにしてMYBPHの発現を制御するのか、その分子機序を明らかにし、リネジ生存がん遺伝子であるTTF-1による複雑ながんの制御の分子機構に迫りたい。システム生物学的アプローチと分子細胞生物学的な解析を統合的に駆使して、これまでにMYCがん遺伝子の転写活性化に関わるMYMLR lncRNAを同定し、その分子機序の詳細を明らかとしてきた。今後は、MYMLRによる複雑ながんの増殖制御機構の全容に迫ると共に、MYMLRのノックアウトマウスの樹立を含めた個体レベルでの検討を進める予定である。また、TTF-1によって制御される新規SFTA1P lncRNAの機能解析では、網羅的な遺伝子発現解析により、標的遺伝子の同定へと繋がった。そこで次年度は、SFTA1Pの結合タンパク質の同定などを通じ、その分子機能の詳細に迫ることを目指す。また、肺がんのみならず様々な癌種において重要な働きをするp53の機能に関わるlncRNAの研究に関しても、予備的実験より得られた候補lncRNAの分子機序の解明を進め、がん関連転写因子とlncRNAの複雑な遺伝子発現制御ネットワークに迫りたいと考えている。肺がんの発生・進展に関わるノンコーディングRNAの全ゲノム俯瞰的な探索を、計画研究の宮野らが開発しスーパーコンピュータ“京"に実装した、local distance correlation統計量を基盤とするGIMLETプログラムを用いて進め、MYC遺伝子の転写制御活性に影響を与えるノンコーディングRNA遺伝子の候補を抽出した。MYC-modulating lncRNA(MYMLR)と名付けたlncRNAについて、肺がん細胞株における細胞増殖やアポトーシス誘導等との関連を検討した結果、MYMLRが細胞周期の進行に関わることが明らかとなった。また、MYMLRをノックダウンした肺がん細胞株からRNAを回収してマイクロアレイ解析を行い、gene set enrichment analysis (GSEA)解析を加えたところ、HALLMARK MYC TARGETSなどのMYC関連遺伝子セットへの強い影響が観察された。さらに、MYMLRのノックダウンが、MYCの転写活性化標的のmiR-17-92マイクロRNAクラスターの発現低下を引き起こすことを定量PCR法によって、また、同遺伝子のプロモーター活性の低下をルシフェラーゼアッセイによって確認した。興味深いことに、これらのMYMLRのノックダウンによる影響は、MYCタンパク自身の発現低下によることが明らかとなった。これまでに、MYMLRがMYC遺伝子の転写活性の維持に関わっていることを示唆する結果を得ており、現在MYMLR結合蛋白質の網羅的な探索を含めた分子機構の全貌解明へ向けた取り組みを進めている。なお、MYMLRに関する上述の研究の遂行に加えて、肺がんの発生・進展に重要な役割を担うことが知られている、TTF-1とp53の機能の制御に関わるlncRNAについても探索を開始した。代表的ながん遺伝子であるMYCに関わるlncRNAの探索・同定は、ドライとウェットの統合的な解析を通じて順調に進行した。

当初はMYC遺伝子産物の機能を修飾するようなlncRNAの同定を予想していたが、MYC遺伝子の転写活性を制御するlncRNA(MYMLR)の同定という、今後の分子機構の全貌解明が待たれる非常に興味深い成果が得られた。一方で、肺腺がんのリネジ生存がん遺伝子として世界に先駆けて同定したTTF-1遺伝子と、代表的ながん抑制遺伝子であるp53遺伝子の機能に関わるlncRNAの探索は、解析の立ち上げ等にやや手間取ったが、その後は順調に推移しており、次年度以降の成果を期待できる状態になりつつある。前年度までに、システム生物学的な解析を通じた網羅的探索によって、代表的ながん遺伝子MYCの転写活性制御に関わる新規lncRNAとしてMYMLR遺伝子を同定し、それがMYC遺伝子自身の転写制御を介することを示唆する結果を得てきた。本年度は、MYMLRによるMYCの転写制御の分子機構の詳細について、多角的に検討を加えた。それによって、MYMLR結合タンパク質の網羅的探索を通じてPCBP2を同定するとともに、MYMLRと同様にPCBP2のノックダウンが、網羅的な遺伝子発現解析に基づくGene Set Enrichment analysis (GSEA解析)において、MYC関連遺伝子セットに有意な影響を及ぼすことを確認した。さらに、MYMLRのMYCエンハンサー領域への結合には、PCBP2が必須であることを明らかとするとともに、MYMLRとPCBP2の両者が、肺がん細胞におけるMYCの転写活性化、及び、生存・増殖に重要な役割を担っていることを明らかとした。また、“京"スーパーコンピュータによるシステム生物学的解析を通じて、肺腺癌のリネジ生存がん遺伝子TTF-1の活性を制御したり、逆にTTF-1によって制御されるlncRNAの網羅的探索を進めた。TTF-1の活性を示すTTF-1モジュールと大規模な遺伝子発現プロファイルデータをもとに、local distance correlationにもとづくGIMLETプログラムを用いた網羅的探索を行った。その結果、TTF-1によって制御される新規lncRNAとしてSFTA1Pが有力候補として浮かび上がった。その制御機序に関する分子生物学的な解析を開始した。これまでにTTF-1がSFTA1Pのプロモーターに結合し、SFTA1Pの発現を直接転写活性化していることを確認するとともに、SFTA1Pをノックダウンすると肺癌細胞の運動能が著しく抑制されることを見出している。興味深いことに、SFTA1Pが、我々が以前にTTF-1によって発現誘導されて細胞骨格系の制御を通じてがん細胞の運動能を抑制することを報告した、MYBPHの発現制御に関わることを示唆する結果を得ている。代表的ながん遺伝子であるMYCに関わるlncRNAの探索・同定は、ドライとウェットの統合的な解析を通じて順調に進行している。MYC遺伝子の転写活性を制御するlncRNA(MYMLR)を同定し、その分子機構の全貌解明へ向けて順調に研究は推移している。
フィルタ-ケ-キの熱間等方圧焼結による水酸化アパタイト系生体用複合材料の合成

本研究では、湿式合成水酸化アパタイト粉体のもつ優れた粉体特性、そのフィルタ-ケ-キ成形体の有するきわめて高い焼結活性、ならびに熱間等方圧焼結法の非常に優れた高密度達成能力に着目し、これら3者を組み合わせることにより焼結温度の著しい低温化を達成し、高性能生体用セラミックスの開発を行った。あわせて、高い信頼性を有する高性能材料を得るための指針も求めた。以下にその成果を記す。まず、水酸化アパタイト粉体合成の再検討を行い、その化学的特性である化学量論性、ならびに重要な粉体工学的特性である粉径などを独立に制御するための方法を見いだした。次に、合成した粉体を熱間等方圧焼結することにより、そと粉体が優れた焼結性をもつこと、および粉体の成形は優れたセラミックスを得るうえで非常に重要であることを示した。この方法で得られたセラミックスは透明であり、粉体の焼結性が非常に高いことが実証された。さらに、合成粉体にジルコニア粒子を分散させ、そのフィルタ-ケ-キ成形体を1100°C、100MPa、2hの条件で熱間等方圧処理することにより、高い強度と靭性をもつ材料が得られることを示した。得られた材料の靭性と強度は次のとおりである。強度190MPa、靭性2.3MPam1/2。これらの値は生体用材料の実用化に要望される値を越えている。その他、本研究に関連して、熱間等方圧焼結における微細構造の理論的制御法、および成形体の新しい評価法の開発などの成果が得られた。湿式合成水酸化アパタイト沈澱のもつ優れた粉体特性、そのフィルタ-ケ-キ成形体の有する極めて高い焼結活性、ならびに熱間等方圧焼結法の非常に優れた高密度達成能力に着目し、これら3者の組み合わせることにより焼結温度の著しい低温化を達成し、高性能生体複合材料の開発に応用するとともに、複合材料開発のための指針を確立することを目的に研究を進めた。平成元年度は以下の点に特に重点を置き検討を行った。1.水酸化アパタイトの合成法、2.それにジルコニア微粒子を均一に分散させた沈澱の合成法、3.粒子混合系におけるフィルタ-ケ-キ成形法、4.常圧焼結体の硬度測定。水酸化アパタイトの合成ではその組成のコントロ-ルを行ううえで興味ある現象を見いだし、その成果をまとめた論文は別記のとおり受理されている。平成元年度の経費で購入した微小硬度試験器による硬度測定では、常圧焼結体の硬度が組成により殆ど影響を受けないことを明らかにした。さらに成形体について予備的に熱間等方圧焼結をおこない、処理温度1000°Cにおいてジルコニア分散相が正方晶を保っていることを確認するとともに、焼結体の靭性および強度が向上することを確認した。まず、水酸化アパタイト粉体合成の再検討を行い、その化学的特性である化学量論性、ならびに重要な粉体工学的特性である粒径などを独立に制御するための方法を見いだした。次に、合成した粉体を熱間等方圧焼結することにより、その粉体が優れた焼結性をもつこと、および粉体の成形は優れたセラミックスを得るうえで非常に重要であることを示した。

この方法で得られたセラミックスは透明であり、粉体の焼結性が非常に高いことが実証された。さらに、合成粉体にジルコニア粒子を分散させ、そのフィルタ-ケ-キ成形体を1100°C、100MPa、2hの条件で熱間等方圧処理することにより、高い強度と靭性をもつ材料が得られることを示した。得られた材料の靭性と強度は次のとおりである。強度190MPa、靭性2.3MPam^<1/2>。これらの値は生体用材料の実用化に要望される値を越えている。その他、本研究に関連して、熱間等方圧焼結における微細構造の理論的制御法、および成形体の新しい評価法の開発などの成果が得られた。
光を用いた配位化合物の機能に関する新展開

この研究課題の主な目的は、21世紀に向けた物質創製と、その設計の新しい概念を確立することにある。配位化合物の光物性は機能性物質設計の骨格を成すものであり、機能物質設計の新しい概念を確立するためにどうすればよいか議論するため、配位化合物の光化学、光物理、光触媒反応、光機能性を研究している広い分野の研究者が集まって、これまでの研究成果とその背景および問題点の検討を行い、さらに近接した分野でそれぞれの分野の考え方・技術を共有するための研究会を行った。今後ますます基礎的研究の重大性が増すこと、それに伴い基礎的分野の活性と基礎から応用まで含めた研究の交流とそれを実現するための体制を確立することの必要性が認識された。研究成果の一部を次に示す。固体中でのクロム(III)複錯体間のエネルギー移動において、キラルな錯体間の発光スペクトルとラセミ錯体間の発光スペクトルとを比較し、アルミニウム錯体希釈の系では、ラセミ錯体間でもキラル構造が観測され、キラル錯体間で見つけられた異常なスペクトル形状は三次元螺旋構造が原因であることを見いだした。また複錯体間の固相中のエネルギー移動および電子移動反応についても新しい知見が得られた。オキソチタン(V)フタロシアニンがジクロロメタン-三クロロ酢酸中で安定であることを見いだし、オキソチタン(V)フタロシアニンの単分子層の生成に成功した。種々の分光学的測定の結果、特殊な分子配向をとっていることが分かった。また親媒性ポルフィリンメタルフリー化合物および亜鉛化合物が超薄膜を作り、薄膜中で特殊な分子会合体を作っていることが分光学的手法から明らかになった。配位化合物の光物性は機能性物質設計の骨格と言うべきもので、この視点から、21世紀に向けた物質創生と、その設計の新しい概念を確立するには、どうすればよいかを検討するため、東京で研究会を開催した。現在の研究を総括し、また現在の研究方法を検討し、今後の研究の方向について討論した。今後ますます基礎的研究の重大性が増すこと、それに伴い基礎的研究分野の活性化の方策について検討したが、そのために基礎から応用を含めた研究体制を確立することの必要性が認識された。本年度の研究成果は「1.光励起電子状態の磁気的・電子的性質とエネルギー緩和との相関、2.光誘起電子移動・エネルギー移動および光励起によって誘起される分子内および分子間の電子移動反応のダイナミックスとメカニズム、3.機能性材料群としての、配位化合物の特性について」の三分野それぞれに成果をあげることが出来た。また当初の予定にはなかったが、これら三つのテーマが相互に関連し、互いにまたがった領域についても研究の成果がみられた。パルスESR法による金属ポルフィリン-キノン系の反応中間体のイオン対の分離、また同じ手法を用いて光励起による分子スイッチの可能性の検討、高純度無置換金属フタロシアニンの新規合成法の開発と分子配向制御の成功、ドナー/アクセプターの配向の電子移動に対する効果、フラーレンへの有機金属化合物の光付加反応、長鎖アルキル基を有するビピリジンルテニウム錯体やポルフィリン金属錯体の界面における組織化と光第二高調波発生、および金属錯体を用いた光触媒反応について新しい知見が得られた。配位化合物の光物性は機能性物質設計の骨格をなすものである。この視点から、21世紀に向けた物質創成と、その設計の新しい概念を確立するために、配位化合物の光化学、光物理、光触媒反応、光機能性を研究している広い分野の研究者が集まって、現在の研究の成果および問題点の検討と近接した分野の交流を図るために12月に東京で研究会を行った。

今後ますます基礎的研究の重大性が増すことが認識され、それに伴い基礎的分野の活性と基礎から応用まで含めた研究の交流およびそれらを実現するための体制を確立することの必要性が認識された。本年度の研究成果は次の通りである。1.固体中でのクロム(III)複錯体間のエネルギー移動において、キラルな錯体間の発光スペクトルとラセミ錯体間の発光スペクトルとを比較し、アルミニウム錯体希釈の系では、ラセミ錯体間でもキラル構造が観測され、これら錯体間で見つけられた異常なスペクトル形状は三次元螺旋構造が原因であることを明らかにした。また複錯体間の固相中のエネルギー移動および電子移動反応についても新しい知見が得られた。2.フタロシアニンチタン酸化物がジクロロメタン-三クロロ酢酸中で安定であることを見いだし、フタロシアニンチタン酸化物の単分子相の生成に成功した。種々の分光学的測定の結果、特殊な分子配向をとっていることが分かった。また親媒性ポリフィリンメタルフリー化合物および亜鉛化合物が超薄膜を作り、薄膜中で特殊な分子会合体を作っていることが分光学的手法から明らかになった。3.種々の配位化合物の光触媒反応について明らかにされた。[Re(bpy)(CO)_3{P(OEt)_3}]^+はCO_2からCOへの選択的還元反応に非常に高い活性を示し、[CoH{PPh(OEt)_2}_4]は水素中でオレフィンの水素添加触媒として、さらに[Sb(V)TPP(OCH_3)_2]Brは水によるシクロヘキセンの酸素化の触媒として働くことを見いだした。
マイクロサージャリーを応用したハイブリッドボーンの作製実験

平成8年度は1.ラット脛骨骨膜とハイドロキシアパタイト(以下HA)を組み合わせた血管柄付き人工骨のモデルを完成させ、経時的な骨量の増加を脱灰組織標本で評価できた。対照実験として筋膜とHAを組み合わせたモデルでは骨は形成されず、骨膜と血流の双方が骨形成に重要であることがわかった。2.骨膜のOsteocalcinをm-RNA発現レベルで測定した。平成9年度は1.上記モデルで作製したHAを生化学的に定量し、経時的にそのALP活性値を測定した。また、経時的にOsteocalcinのm-RNA量を測定した。これにより、血管柄付き骨膜の骨形成を定量した。2.人工骨のvascularizationをmicroangiographyで経時的に評価した。骨膜モデル、筋膜モデルの両群とも、経時的にHA内への血管進入は進んでいたが、骨膜モデルにのみ骨形成が認められ、血管進入と骨形成には関連がないことがわかった。(平成9年11月20、21日日本マイクロサジャリー学会東京において口演した)平成10年度は1. m-RNA発現レベルでのOsteocalcin量を比較検討し、平成8、9年度に確認した蛋白発現に先行して発現していることを確認した。また、術直後から骨膜が骨形成能を持つことがわかった。(平成10年10月30、31日日本マイクロサジャリー学会東京において口演した)2.上記HAに骨髄細胞を注入したモデルを作製し、より早期の骨形成が確認できた。術直後から多数の軟骨細胞が骨膜下に出現し、その後骨形成が生じた。術後1週の骨髄細胞注入モデルは注入しないモデルに対し、有意にALP活性値が高かった。骨髄細胞は、本モデルにおいて未分化間葉細胞の骨芽細胞への細胞分化を促進していると考えられた。1.ラットの血管柄付き骨膜とハイドロキシアパタイトを用いたハイブリッドボーンのモデルを作製し、皮下でこの人工材料に骨が形成されることをHE染色による脱灰組織標本で確認した。ハイドロキシアパタイト移植後、1、2および4週間でこれを採取し、経時的な骨量の増加が認められた。又、対照実験として骨膜のかわりに筋膜を用いたモデルでは、骨は形成されなかった。2.骨膜における骨形成能を調査したところ、ALP、BGPともRNAレベルでの発現が認められ、骨形成能が評価できた。ひきつづき、1.人工骨へのvascularizationをmicro-angiographyを用いて評価する。2.ハイドロキシアパタイトに骨髄細胞を注入したモデルを作製し、その骨形成を生化学的に評価する。対照実験として骨膜のかわりに筋膜を用いたものを作製する。を行なう予定である。平成8年度は1.ラット脛骨骨膜とハイドロキシアパタイトを組み合わせた血管柄付き人工骨のモデルを完成させ、経時的な骨量の増加を脱灰組織標本で評価できた。対照実験として筋膜とハイドロキシアパタイトを組み合わせたモデルでは骨は形成されず、骨膜と血流の双方が骨形成に重要であることがわかった。2.骨膜の骨形成能をm-RNAレベルで測定した。平成9年度は1.上記モデルで作製した人工骨を生化学的に定量し、経時的にそのALP値を測定した。また、経時的にBGPのm-RNAを測定した。骨膜モデル、筋膜モデルの両群とも、経時的に人工骨内への血管進入は進んでいたが、骨膜モデルにのみ骨形成が認められ、血管進入と骨形成には関連がないことがわかった。

(平成9年11月20、21日日本マイクロサジャリー学会東京において発表した)ひきつづき平成10年度は1.上記モデルに骨髄細胞を注入したモデルを作製し、ALPおよびBGPを測定する。骨髄細胞を注入したものとそうでないものとの比較を行ない、骨形成能を評価する。2.術後、さまざまな時期に血流を途絶させたサンプルを作製し、人工骨の骨形成には、術後どの時期までの血流が重要かを調査する。平成8年度は1.ラット脛骨骨膜とハイドロキシアパタイト(以下HA)を組み合わせた血管柄付き人工骨のモデルを完成させ、経時的な骨量の増加を脱灰組織標本で評価できた。対照実験として筋膜とHAを組み合わせたモデルでは骨は形成されず、骨膜と血流の双方が骨形成に重要であることがわかった。2.骨膜のOsteocalcinをm-RNA発現レベルで測定した。平成9年度は1.上記モデルで作製したHAを生化学的に定量し、経時的にそのALP活性値を測定した。また、経時的にOsteocalcinのm-RNA量を測定した。これにより、血管柄付き骨膜の骨形成を定量した。2.人工骨のvascularizationをmicroangiographyで経時的に評価した。骨膜モデル、筋膜モデルの両群とも、経時的にHA内への血管進入は進んでいたが、骨膜モデルにのみ骨形成が認められ、血管進入と骨形成には関連がないことがわかった。(平成9年11月20、21日日本マイクロサジャリー学会東京において口演した)平成10年度は1. m-RNA発現レベルでのOsteocalcin量を比較検討し、平成8、9年度に確認した蛋白発現に先行して発現していることを確認した。また、術直後から骨膜が骨形成能を持つことがわかった。(平成10年10月30、31日日本マイクロサジャリー学会東京において口演した)2.上記HAに骨髄細胞を注入したモデルを作製し、より早期の骨形成が確認できた。術直後から多数の軟骨細胞が骨膜下に出現し、その後骨形成が生じた。術後1週の骨髄細胞注入モデルは注入しないモデルに対し、有意にALP活性値が高かった。骨髄細胞は、本モデルにおいて未分化間葉細胞の骨芽細胞への細胞分化を促進していると考えられた。
二酸化炭素気相下におけるボツリヌス菌胞子の発芽生理に関する研究

ボツリヌス菌胞子の発芽初期現象とそれに対するストレス(低温、加熱など)への影響を明らかにすることはガス置換包装食品のボツリヌスリスク評価上重大な知見をもたらすと同時に細菌胞子の生理学上も興味深い。申請者は、二酸化炭素を用いたガス置換包装水産食品のボツリヌス菌の危害評価に関する研究の過程で、低温下(以下)で高濃度二酸化炭素気相下に置くと徐々にではあるがボツリヌス胞子が死滅する可能性があるという、興味深い現象をE型菌胞子の予備実験で見い出していた。そこで、本研究では、まず、この現象の作用機構を検討したいと考えた。また、E型菌胞子の耐熱性消失を中心とした発芽初期現象に及ぼす二酸化炭素の影響と他の物理的因子(温度など)や化学的因子(培地成分など)との関連についても検討を行うことを目的とし、研究をすすめた。この過程で、これまでにないボツリヌスE型菌胞子の加熱条件緩和技術に結びつく知見を得ることができた。また、二酸化炭素とボツリヌス胞子の発芽・増殖・毒化までの過程に及ぼす影響を総合的に解明するために、加熱生残したボツリヌスA型菌胞子が二酸化炭素気相包装食品においてどのような挙動をとるかについても検討し、リスク機構を明らかにした。さらに、これらのボツリヌス菌胞子発芽およびその後の増殖および毒素産生によるリスクに関する研究遂行中に、これまでのようなマウスアッセイに頼らない遺伝子手法によるボツリヌス菌モニタリング法も開発することができた。二酸化炭素気相下におけるボツリヌス菌胞子の発芽生理に関する研究のなかで、今年度は特に以下の点を解明した。ボツリヌスE型菌胞子(Iwanai株)を低温(5°C以下)、高濃度二酸化炭素気相下に置くと、徐々にではあるが死滅する現象の詳細を解明した。0°C下で培養した胞子を位相差顕微鏡により直接観察した結果、CO_240%では5日後(低温死滅が確認される)の時点でほとんど全ての胞子が暗黒化を示したが、N_2100%及び含気区(生菌数が変化していない)ではほとんどが輝度を有した状態を保持していた。またCO_240%では、5日後の時点で暗黒化は確認されたが、伸長は20日後においても確認されなかった。このことから、CO_2により胞子発芽の初期現象が引き起こされたが、その後伸長することなく温度やCO_2やpHなどの影響により死滅が起きたという作用機作が推定された。また、胞子の死滅現象が、培地の違い(すなわち、化学的環境の違い)、菌株の違い(生物学的普遍性)、胞子形成条件の違いにより普遍的に認められるか否かを検討結果、低温(5°C以下)且つ高濃度二酸化炭素気相下における死滅現象は、培地の種類による差違、菌株による差違、胞子の前処理による差違にかかわらず認められることを明らかとした。以上の成果は平成12年度当初の計画をほぼ達成したと考えている。昨年度研究で、ボツリヌスE型菌胞子を低温(5°C以下)且つ高濃度二酸化炭素気相下に置くと徐々に死滅することを見い出し、その作用機構として発芽初期現象が密接に関与していることを明らかにした。本年度は、二酸化炭素と低温によるボツリヌス初期発芽生理に及ぼす影響についてE型菌以外についても検討した。ボツリヌスB型菌(Karashi株他2株)について、超音波処理、酵素処理により栄養細胞を除去した胞子液を調製後、寒天培地に塗沫し、低温・二酸化炭素気相下で位相差顕微鏡により光屈折性を喪失した発芽過程の胞子数を計測した。その結果、胞子発芽初期現象と低温・二酸化炭素気相の関係が経時的に詳細に明らかとなり、また、光屈折性を喪失や耐熱性の消失が菌株の違いにかかわらず普遍的に認められることを明らかとした。また、二酸化炭素とボツリヌス胞子の発芽・増殖・毒化までの過程に及ぼす影響を総合的に解明するために、鮮魚包装におけるボツリヌスE型菌および加熱生残したボツリヌスA型菌胞子が二酸化炭素

気相包装食品においてどのような挙動をとるかについても検討した。ボツリヌスE型菌およびA型菌の胞子発芽から増殖・毒化までに及ぼす二酸化炭素の影響を、それぞれ、鮮魚包装、加熱米飯包装において検討した。含気、100%N_2、65%N_2と35%CO_2の混合気体の3種類の気相条件で包装したハマチ魚肉サンプルを4°C、8°C、16°C貯蔵した結果、本菌の胞子発芽とその後の増殖は16°Cおよび8°Cで確認され、両温度における全てのサンプルが貯蔵期間中に毒化を示したが、4°Cでは全ての気相条件において毒化が認められなかった。また、無菌米飯におけるリスクは、ボツリヌスA型菌のみの汚染の場合、食中毒の危険性は極めて低いこと、A型菌とバチルスの混合汚染の場合、二酸化炭素含量に関わらず、酸素0%の系で毒素検出がサンプルの腐敗よりも早く生じ、食中毒の危険性が極めて高いことがあきらかとなった。以上の成果は平成12年度当初の計画をほぼ達成したと考えている。平成12,13年度の研究により、二酸化炭素と低温こよるボツリヌス初期発芽生理に及ぼす影響について検討した結果、胞子発芽初期現象と低温・二酸化炭素気相の関係が経時的に詳細に明らかとなり、また、光屈折性を喪失や耐熱性の消失が菌株の違いにかかわらず普遍的に認められた。このように二酸化炭素処理によりボツリヌスE, B型菌の耐熱性が消失することから、カニなどの水産食品やその他の加熱緩和チルド食品の殺菌に応用できる可能性を考え、最終年度である本年度研究では、この点を重点的に検討した。Clostridiumbotulinum type E (Iwanai)の胞子液をTPGY培地に塗抹後、CO_240%(N_260%)、およびN_2100%でガス置換包装し、5、10°Cで4、8時間培養した。培養後、耐熱性試験(洗いこみ試料を60°Cで30分加熱処理し、生残胞子数を計数)を行った。また、カニ肉にIwanai、ジャガイモ、鶏肉にQCの胞子液をそれぞれ接種し、耐熱性試験を行った。その結果、N_2区では耐熱性消失(加熱処理による胞子の死滅)が確認されず、CO_2区では10°C培養においてのみ確認された。また、すべての食品において耐熱性消失が確認されたが、カニ肉、鶏肉では、ジャガイモに比べ耐熱性消失が短時間のうちに起こり、死滅した胞子数も多かった。以上の結果より、CO_2ガスを利用した本加熱殺菌法は低減加熱食品における低温増殖性ボツリヌス菌胞子の殺菌条件緩和において有効であると示唆された。