hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サケ科魚類の伝染性造血器壊死症ウィルス(IHNV)の垂直感染防止法に関する研究

本研究ではサケおよびサクラマスの卵を供試し、受精直後から孵化に至る期間、1週間毎に採取した卵内容物中にIHNVを懸濁し、IHNVの消長を観察した。IHNVの感染価は発眼期までの卵内容物中では減少したが、発眼以後は減少しなかった。一方受精直後に卵内に接種したIHNVは不活化されたが、発眼期に接種したIHNVは胚胎に感染増殖した。接種胚はいずれの時期も死亡した。以上の結果から卵表面の消毒は発眼期までもしくは発眼初期に行なうべきであることが明らかとなった。ついで市販の消毒剤のウイルス不活化効果をサケ・マス類の棲息温度および飼育環境温度下(0、15、25°C)で検討し、さらに体表粘液や体腔液等の有機物混入時の消毒効果も検討した。市販の消毒剤はいずれも公称濃度で十分ウイルスを不活化することが出来たが、一部低温下や有機物存在下で効果の低下するものがあった。卵に対してはヨ-ド剤が最も毒性が少なく効果的であった。しかしヨ-ド剤は有機物存在下で効果が低下し反復使用は不可と考えられた。ついで河川水および魚類飼育水中のIHNVの検出法を限外濾過濃縮法を用いて検討した。供試水に肉エキスを0.01%の割合に加え、分子量300,000の限外濾過膜を用いて1000倍に濃縮したところ、IHN発症池では5.6TCID_<50>/1、また長野県下の河川水からは0.56TCID_<50>/1のIHNVが検出された。一方IHNVは10^4μW・sec/cm^2の紫外線照射で完全に不活化され、IHNV汚染河川水を紫外線処理することによりニジマスの飼育が可能と考えられた。濾過紫外線殺菌装置を用いることによりIHNV汚染河川水を用いてのニジマスの飼育が可能となった。以上の成果はIHNV汚染地域のIHNVキャリヤ-親魚から採取した卵でも、発眼期に死卵を除去し、卵をヨ-ド剤(50ppm,15分)で消毒後、ウイルスフリ-の湧水あるいは紫外線処理した河川水を用いて飼育することによりIHN被害を防止出来るという仮説を裏付ける結果となった。
昆虫を指標に用いた都市環境評価のこころみ

研究成果は次の4つに集約できる。1.対象地域の選定と緑地面積の算定大阪市近郊の3つの住宅地域、すなわち守口市大和田、枚方市牧野、枚方市長尾台を調査対象地として選定し、3地区内の緑地面積を、ランドサット衛星画像データのパーソナルコンピュータでの解析により算定したところ、それぞれ7.3%、14.0%、51.5%であった。2.各地区のセミの抜け殻分布の比較各地区の中心に位置する3つの大学構内のセミの抜け殻の種構成を比較した。大和田ではアブラゼミ27.8%、クマゼミ72.2%、牧野ではアブラゼミ67.4%、クマゼミ32.5%、その他0.1%、長尾台ではアブラゼミ91.3%クマゼミ1.8%、その他6.9%であり、都心に近く緑地の割合の低い地域ほどクマゼミの比率が高かった。3.各地区のチョウの分布密度と種多様度の比較各地区内に約2kmのルートを設定して、チョウのトランセクト調査を1996年と1997年の2年間にわたり実施し、チョウの生息密度といくつかの多様度指数、および環境指数を算出した。その結果、巣瀬の提唱したEI数と都市適応種以外の種の群集内での占有率が郊外の住宅地ほど大きな数値になることが明らかになった。4.日常生活で目撃するチョウとトランセクト調査で目撃するチョウの差異京都市桂の住宅地域において、1997年と1998年にチョウのトランセクト調査を行い、同地域における19911996年のチョウの採集・目撃記録と比較した。単年度のトランセクト調査では日常生活で目撃頻度の高い種を見落とす場合があるが、2年間のトランセクト調査では偶産種をのぞいて目撃可能な種をほとんど観察していた。このことから都市近郊住宅地のトランセクト調査は少なくとも2年行うことが望ましいと結論した。以上の結果から、都市の自然度の指標として、少なくとも大阪近郊では、セミ群集に占めるクマゼミの比率、チョウ類群集における都市適応種以外の種の比率、およびチョウ類群集に対する巣瀬のEI指数が有効であると判断した。平成8年度は、対象地選定、緑地面積算定、セミ抜け殻分布とチョウの分布密度・種多様度調査を実施した。1.対象地域の選定と緑地面積の算定大阪市中心部から1025kmの範囲に位置し、住宅の密集度に大きな違いがある3つの住宅地域、すなわち守口市大和田、枚方市牧野、枚方市長尾台を調査対象地として選定した。3地区内の緑地面積を、ランドサット衛星画像データのパーソナルコンピュータでの解析により算定した。各地区の緑地面積を、各地区の中心に位置する大阪国際女子大学(大和田)、関西医科大学教養部(牧野)、大阪国際大学(長尾台)を中心とする半径3kmの円内の緑地比率として表示すると、大和田7.3%、牧野14.0%、長尾台51.5%であった。2.各地区のセミの抜け殻分布の比較各地区の中心に位置する3大学の構内のセミの抜け殻の種構成を比較した。大和田ではアブラゼミ27.8%、クマゼミ72.2%、牧野ではアブラゼミ67.4%、クマゼミ32.5%、その他0.1%、長尾台ではアブラゼミ91.3%、クマゼミ1.8%、その他6.9%であり、都市化が進行し緑地の割合いの低い地域ほどクマゼミの比率が高かった。

3.各地区のチョウの分布密度と種多様度の比較各地区内に約2kmのルートを設定し、チョウのトランセクト調査を510月に、12ないし13回実施した。各地区のチョウの平均生息密度(頭数/km)は大和田5.31、牧野18.42、長尾台11.41であり、観察種数は大和田8、牧野15、長尾台23であった。これらのデータをもとに多様度指数(平均多様度、相対多様度、森下のβ指数、シンプソンの多様度指数)、階級存在比、EI指数を算出し、チョウの種多様度の比較を試みた。平成9年度は、前年度に選定した対象地において、引き続きチョウの分布密度・種多様度調査を実施し、多様度指数や環境指数の経年変化について検討した。また、新たに京都市内においてもチョウの分布密度・種多様度調査を実施した。1.チョウの分布密度と種多様度の経年変化前年度に引き続き、守口市大和田、枚方市牧野、枚方市長尾台の3地区のルートにおいて、チョウのトランセクト調査を410月に、月2回合計14回実施した。各地区のチョウの種数と各種の生息密度から、種々の多様度指数(平均多様度、相対多様度、森下のβ指数、シンプソンの多様度指数)、階級存在比、EI指数を算出し、前年度との比較を試みた。大和田では、種数と生息密度に関して、前年と同様の数値を得た。牧野と長尾台は、いずれも前年に比較して、種数と生息密度は大きな数値となった。多様度指数は、大和田と牧野では、ほぼ前年と同様の数値となったが、長尾台では特定の種(モンシロチョウ)密度が増大した影響で前年よりもむしろ低下した。2.チョウの種数とEI指数の変動要因都市で目撃されるチョウの種数と種数にもとづく環境指数であるEI指数がどのように経年変化するかを、京都市・桂の住宅地域での19911996年のチョウの採集・目撃記録をもとに検討した。また、この記録を1997年に実施したトランセクト調査の結果とも比較し、「たんなる採集・目撃記録の積み重ね」と「一定のルールに従った調査」の間にどのような差があるかを検討した。19911996年に京都市・桂で採集・目撃したチョウは、のべ31種であり、この種数をもとに算定したEI指数は60であった。年ごとの観察種数とEI指数は、それぞれ1320種と2236の範囲にあり、平均値は16.7であった。一方、1997年(平成9年)に同地域で月2回実施したトランセクト調査においては、23種(EI指数41)のチョウが観察され、過去6年間の観察種数の最高値20や過去の年ごとの観察種数の平均値16.7(率では51%)を大きく上回った。このことより、種数という定性的データに対しても、「一定のルールに従った調査(つまり月2回のトランセクト調査)」が「採集・観察記録の積み重ね」よりも、より多くの、精度の高い情報を提供できることを示すものと考える。平成10年度は、京都市内におけるチョウの生息密度・種多様度調査を継続し、過去の目撃記録との比較から、トランセクト調査に求められる要件を検討した。また東京都内でも若干のチョウの調査を行った。1.日常生活で目撃するチョウとトランセクト調査で目撃するチョウの差異京都市・桂の住宅地域において前年に引き続きチョウのトランセクト調査を行い、19911996年のチョウの採集・目撃記録と比較検討した。これに対して、2年間のトランセクト調査で目撃したチョウは29種、EI指数は55であった。
自己組織化数層グラフェンの糖鎖修飾による高病原性鳥インフルエンザセンサの開発

電荷の変化を電流変化として検出するためのナノカーボン材料の成長制御と、ウイルスの検出部位である糖鎖の最適化を行った。まず、自己組織化成長のための微細加工条件と配列化の様子を調べた。次に、温度変調プロセスによる電気伝導率向上、バッファー層の導入を検討した。さらに、デバイス作製時のプラズマプロセスの最適化を行った。一方、糖鎖分子の最適化として、凝集等を検討すると共に、高さの検討を行った。そして、ウイルスのヒト型受容体、鳥型受容体への結合性を評価し、鳥型、ヒト型に応じて、反応性が高い糖鎖の配位が異なることが分かった。また、自然界で分離された鳥およびヒトインフルエンザウイルスの反応特異性も評価した。本課題では、電荷の変化を効率的に電流変化として取り出すためのナノカーボン材料の成長制御と、ウイルスの検出部位である糖鎖の最適化を行う。ナノカーボン材料の成長制御として、自己組織化成長では、電子線リソグラフを用いてSi基板上にグラフォエピタキシーで配列化させるため、微細加工条件と配列化の様子を調べた。凹凸パターンが狭い場合は、数層グラフェンがパターンをブリッジした。一方、凹部が広い場合は、凹部にランダム成長するが、適当な間隔の場合は、凹部のカーボン材料も拡散により凸部のエッジに集中するため配列化成長する。次に、成長時の温度・成長時間の影響をラマン分光法、透過型電子顕微鏡で調べ、電気伝導特性と比較した。低温成長では形状触媒効果により凸部のエッジに材料が集中するため、ラマンのG/D比に増大効果が見られた。一方、500°C程度の成長温度の場合は、配列化による歪の効果で粒界界面散乱が導入され、ラマンのG/D比の減少が見られると共に電界効果トランジスタが半導体特性を示した。同様に、初期成長時にも成長促進効果が見られた。電子顕微鏡観察から高温成長、及び、長時間成長でグレインの成長が起こることが分かり、この時に電気伝導率が向上した。これらの結果を論文にまとめて発表した。一方、ヒト型インフルエンザウイルスが効率的に結合する糖鎖を明らかにするため、ヒト肺の糖鎖の構造解析を行った。その中には、シアル酸を含む構造が異なる26種類以上の糖鎖が存在していた。また、糖鎖分子の大きさの評価として、分子間力で基板に結合させたシアリルラクトースを走査型プローブ顕微鏡で観察し、1 nm以下程度の高さであることが分かった。そのため、シアリルラクトースは、デバイ遮蔽長内に入る大きさであり、特異検出用分子として使用可能な候補の一つであると言える。材料プロセスの最適化では、温度変調プロセスによる数層グラフェンの電気伝導率向上として、電気抵抗の主要因が、配列化プロセスによるひずみでグレイン境界での散乱がエンハンスされるためなので、バッファー層を用いて基板との相互作用を弱めること、及び、電気特性の時間変化の解析を行った。400°C成長の数層グラフェンをバッファー層(LTバッファー層)にし、メインの成長温度を変化させてラマン測定により評価した。その結果、LTバッファー層の導入によるG/D比の向上が観測された。電気特性は比較的低温の500°C成長でもすべての素子が金属特性を示すようになりシート抵抗が45 kΩ程度以下となった。また、ドレイン-ソース電流の時間変化をノイズスペクトルとして解析し、LTバッファー層の導入によるノイズ強度の減少、成長温度の向上によるノイズの減少を明らかにした。これは、グレイン界面での散乱過程がノイズの主要因であり、その散乱が減少したことによるためで、ノイズ解析による品質評価にも成功したので論文発表を行った。さらに、デバイスノイズの減少はセンサーとしての分解能向上にも有用である。一方、糖鎖分子の開発・デバイス化として、平成26年度にシアロ糖鎖の大きさを評価したので、平成27年度はクロマトグラフィーでウイルスとの反応性を評価した。その結果、ヒト型、鳥型ウイルスの選択性が確認できたので、デバイスを作製した。糖鎖分子修飾デバイスでの選択性をソースードレイン電流の変化で調べ、濃縮技術を用いない検出技術として最高感度の105個/0.1mLのウイルス検出が可能であることが分かった。数層グラフェンの成長最適化を行うと共に評価方法を検討し、グレイン構造と電気伝導率の関係が分かった。特に、低温バッファー層の導入により、配列化制御と境界散乱を同時に制御できることが分かった。一方、糖鎖分子とウイルスとの反応を調べ、デバイ遮蔽内に入る分子系でウイルスの特異性があることが分かり、また、電荷によるウイルスの検出が可能であることが分かった。ここまでは、予定通りであると言える。ただし、糖鎖構造の大域的制御など、シアル酸の構造以外の最適化も必要であることが分かったので、やや遅れていると判断した。本課題では、電荷の変化を電流変化として検出するためのナノカーボン材料の成長制御と、ウイルスの検出部位である糖鎖の最適化を行った。材料プロセスの最適化では、デバイス作製時のプラズマプロセスの最適化を行った。ゲート酸化膜の欠陥を避ける等のために、チャネル領域以外の配列制御していないナノカーボン層を除去する必要がある。酸素プラズマによるエッチングと転写法による除去を試みて、酸素プラズマエッチングで6桁程度ゲートリーク電流を減少させることが出来、転写法ではさらに1/3になった。その結果、p型のゲート電圧ー

ドレイン電流特性が得られた。また、金属特性の素子では水素エッチングにより電気伝導率が向上した。その際、ノイズ解析から電極界面でのコンタクトの改善が出来たことが分かった。これらの結果は学会発表を行うと共に、論文投稿中である。糖鎖分子の最適化として、電気的検出では分子サイズが重要となるため、Sialylglycopeptide (SGP)と高分子であるシアロ糖鎖ポリマーを比較した。シアロ糖鎖ポリマーとHAタンパク質の反応に対する吸光度を評価することで、ヒト型受容体、鳥型受容体への結合性を評価し、鳥型、ヒト型に応じて、反応性が高い糖鎖の配位が異なることが分かった。一方、SGPでは、その差の判別が難しかった。この結果を、学会発表した。また、原子間力顕微鏡を用いて凝集等を検討すると共に、高さの検討を行い、デバイス化に関する議論を行った結果を論文発表した。また、自然界で分離された鳥およびヒトインフルエンザウイルス(日本国内分離株、及び、実際に鳥からヒトへ伝播している国での分離株)の反応特異性を評価した。その過程で、エジプトやインドネシアで分離された高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)の中に、ヒト型、鳥型レセプターシアロ糖鎖の両方へ結合性をもつ変異ウイルス株を見いだした。電荷の変化を電流変化として検出するためのナノカーボン材料の成長制御と、ウイルスの検出部位である糖鎖の最適化を行った。まず、自己組織化成長のための微細加工条件と配列化の様子を調べた。次に、温度変調プロセスによる電気伝導率向上、バッファー層の導入を検討した。さらに、デバイス作製時のプラズマプロセスの最適化を行った。一方、糖鎖分子の最適化として、凝集等を検討すると共に、高さの検討を行った。そして、ウイルスのヒト型受容体、鳥型受容体への結合性を評価し、鳥型、ヒト型に応じて、反応性が高い糖鎖の配位が異なることが分かった。また、自然界で分離された鳥およびヒトインフルエンザウイルスの反応特異性も評価した。数層グラフェンの成長制御を行い、グレイン構造と電気伝導率の関係、自己組織化成長の電気伝導に与える影響が分かった。しかしながら、成長時間制御で層数を減少させた際に、成長を抑えているため、グレインサイズが小さくなり、そのため、電気伝導率が十分に上がらなかった。糖鎖分子の大きさの評価を行い、デバイ遮蔽長内に入り、特異検出用分子として使用可能な候補の一つであることがわかったが、ウイルスとの反応を調べる実験が不十分であった。そのため、やや遅れていると判断した。糖鎖修飾したグラフェンデバイスを作成し、ウイルスが細胞にアタックするタンパク質であるヘマグルチニン(HA)との反応、及び、ウイルスとの反応を調べると共に、光学的手法による既存の手法との比較を行う。その際、糖鎖濃度や分布などプロセスの違いによるデバイス構造の相違を電子顕微鏡等で調べて評価する。また、糖鎖の構造や分布状態による違いを調べるために、構造解析と分布制御を行い、反応性を広範に調べることで、デバイスの最適化を行う予定である。
環境ストレスセンサーの研究

1.ランソウSynechocystis sp.PCC 6803は47個のヒスチジンキナーゼ(Hik)と45個のレスポンスレギュレーターの遺伝子を持っているが、それら全てのノックアウトを試み、3個のHikと3個のRreの遺伝子を除く全ての遺伝子のノックアウト・ライブラリーを作成した。これらのノックアウト・ライブラリーを、特異的な環境ストレスで誘導される遺伝子の発現をマーカーとして、DNAミクロアレイ法によりスクリーニングし、以下の二成分シグナル伝達系を明らかにした。2.野生型Synechocystisでは高浸透圧(0.5Mソルビトール)により246個の遺伝子の発現が誘導されるが、それらのうちの60%の遺伝子が5つの二成分シグナル伝達系(Hik33/Rre31、Hik16/Hik41/Rre17、Hik34/Rre1、Hik2/Rre1、Hik10/Rre3)によって発現制御されている事を明らかにした。残りの40%の遺伝子は、上記以外の未同定のシグナル伝達経路によって発現制御されている事も判明した。3.塩ストレス(0.5M NaC1)は294個の遺伝子の発現を誘導するが、それらのうちの70%の遺伝子が5つの二成分シグナル伝達系(Hik33/Rre31、Hik16/Hik41/Rre17、Hik34/Rre1、Hik2/Rre1、Hik10/Rre3)によって発現制御されている事を明らかにした。これらのシグナル伝達系は高浸透圧のシグナル伝達系と同じであるが、各シグナル伝達系に支配されている遺伝子は塩ストレスと高浸透圧ストレスとの間で異なっていた。残りの30%の遺伝子は、上記以外の未同定のシグナル伝達経路によって発現制御されている事が判明した。ラン藻Synechocystissp. PCC6803において通常条件下で抑制型因子として機能している環境ストレスセンサーとそれらと協調して環境ストレス誘導性遺伝子の発現を制御しているレスポンス・レギュレーターをシステマティック・ゲノミクスの手法により同定した。(1)ヒスチジン・キナーゼから種々の環境センサーを同定する研究ラン藻Synechocystisの全ヒスチジン・キナーゼ遺伝子のノックアウト・ライブラリーを用いて非ストレス条件下での遺伝子発現パターンをDNAミクロアレイ法により網羅的に解析した結果、マンガン欠乏センサー(ManS)、高温センサー(Hik34)およびカリウム欠乏センサー(Hik20)を同定した。これらのヒスチジン・キナーゼのノックアウトにより通常条件下において抑制される遺伝子群が発現しており、これらが通常条件下で抑制型因子として活性化されている環境センサーであることが明らかとなった。この場合、ManSのノックアウトの効果はマンガン・イオン輸送系の各因子をコードするmntCABオペロンに、またHik20のそれはカリウム・イオン輸送系因子をコードするkdpペロンにそれぞれ特異的であったが、Hik34はいくつかの高温誘導性遺伝子の発現に関わっていた。(2)レスポンス・レギュレーターのスクリーニングラン藻Synechocystisの全レスポンス・レギュレーター遺伝子のノックアウト・ライブラリーの作製を完了した。これを用いてDNAミクロアレイ法による非ストレス条件下での遺伝子発現パターンの解析を行い、これまでにmntCABオペロンが通常条件下においても発現している変異株を見出している。このオペロンはManSの支配下にあることから、変異の原因遺伝子であるレスポンス・レギュレーター(ManR)がManSとマンガン欠乏シグナル伝達経路を構成していると考えられた。さらに、ManRがマンガン欠乏誘導性遺伝子のプロモーター領域に結合したことから、これが通常条件下で抑制型転写因子として機能していることが明らかとなった。現在、Hik34やHik20と協調して働くレスポンス・レギュレーターの同定を同様の方法で行っている。ラン藻Synechocystis

sp. PCC 6803において塩ストレス条件下で遺伝子発現を活性化する因子として働く環境ストレスセンサーとそれらと協調して働くレスポンス・レギュレーターをシステマティック・ゲノミクスの手法により同定した。(1)ヒスチジン・キナーゼから種々の環境センサーを同定する研究ラン藻Synechocysticの全てのヒスチジン・キナーゼ遺伝子のノックアウト・ライブラリーを用いてストレス条件下での遺伝子発現パターンをDNAミクロアレイ法により網羅的に解析した結果、塩ストレスセンサー(Hik33、Hik34、Hik10、Hik16、Hik41)を同定した。これらのヒスチジン・キナーゼのノックアウト株では、それぞれ異なる遺伝子の塩ストレス誘導的な発現が抑制されることから、これらが塩ストレスにより活性化される環境センサーであることが明らかになった。膜結合型センサーであるHik16と細胞質存在型センサーであるHik41は同じ塩ストレス誘導性遺伝子の発現を制御しておりこれらが同じシグナル伝達経路上に存在する可能性が示唆された。またHik33は低温、浸透圧、及び塩ストレス下では異なる遺伝子の発現を制御していることからマルチストレスセンサーとして機能していることが明らかになった。(2)レスポンス・レギュレーターのスクリーニングラン藻Synechocystisの全レスポンス・レギュレーター遺伝子のノックアウト・ライブラリーを用いて塩ストレス条件下での遺伝子発現パターンをドットブロット法並びにDNAミクロアレイ法の併用により網羅的に解析した結果、Hik33、Hik10及びHik16-Hik41と協調して働くレスポンス・レギュレーターとして、それぞれRre31、Rre3、及びRre17を同定した。ラン藻Synechocystis sp.6803において高浸透圧ストレス条件下で遺伝子発現を活性化する因子として働く環境ストレスセンサーとそれらと協調して働くレスポンス・レギュレーターをシステマティック・ゲノミクスの手法により同定した。1.ヒスチジン・キナーゼから種々の環境センサーを同定する研究ラン藻Synechocystisの全てのヒスチジン・キナーゼ遺伝子とレスポンスレギュレーター遺伝子のノックアウト・ライブラリーを高浸透圧ストレス条件下での遺伝子発現パターンをDNAミクロアレイ法により網羅的に解析した結果、高浸透圧ストレスセンサーとしてHik33、Hik34、Hik10、Hik16、Hik41及び転写調節因子としてRre31、Rre1、Rre3、Rre17を同定した。これらの因子のノックアウト株では、それぞれ異なる遺伝子の塩ストレス誘導的な発現が抑制されることから、これらが高浸透圧ストレスにより活性化される二成分系であることが明らかになった。これらの二成分系は塩ストレスの二成分系とは全く同じであるにも関わらず、ストレスの違いによって異なったセットの遺伝子を誘導した。これらの事実から、各ストレスに対して特異性を示す未知因子(タンパク質)の存在を予測した。それらの同定は今後の需要な研究テーマである。2.通常の条件で培養したSynechocystisに0.5M Sorbitol
ガス光検出器の開発

本研究では、我々が独自に開発を進める細孔型のマイクロパターンガス検出器(MPGD)とメッシュ型ガス検出器(MPGD)、そして光電子変換金属(光電面)を複合化させた『ガス光検出器』の技術開発を行い、紫外から可視光の波長領域に高い感度特性を持ち、大きな有効面積と高磁場環境下においても動作可能な「新型光検出器」の基礎開発を摂り進めた。このマイクロパターンガス検出器(MPGD)は、微細加工技術や半導体製造技術を用いて製作した微小な電極から構成されるガス放射線検出器の一つで、優れた位置分解能と高い時間分解能、そして高計数率での動作が特徴である。本年度は有限要素法電場解析シミュレーション(Maxwell-3D)とガス検出器のシミュレーションプログラム(Garfield)を用いてマイクロパターンガス検出器(MPGD)の設計を行い、アルカリ光電面と化学的相性の良い材質を用いてMPGDを製作し、希ガスの混合ガスを封入して評価試験を行った。具体的にはCsI光電面と細孔型のMPGDとで構成される『ガス光検出器』にネオンを主ガスとした混合ガスを0.9気圧封入し紫外線を照射して特性を調べた。この基礎特性試験の結果から、10万以上の電子増殖度を達成することができ、その成果を国際会議で発表した。
乳がん・婦人科がん術後リンパ浮腫治療に用いる弾性着衣装着に関する検証と臨床応用

本研究は、今後も増加が予測されるリンパ浮腫患者の苦痛・負担を軽減する効果的な弾性着衣の臨床応用に向けて、乳がん・婦人科がん術後リンパ浮腫患者から弾性着衣に関する主観的情報、および筋電図・動作分析などを用いた客観的情報を得て、多職種チームで効果的な装着方法について検証することを目的としている。2018年度は当初の予定度通り倫理委員会申請に向けて準備をすすめ、現在は承認通知を待っている状況である。倫理委員会の申請書類の参考にするため以下の内容を検討・実施した。まず、乳がんで手術をした患者の退院支援にかかわる看護師に調査を行い、リンパ浮腫に関する退院支援実施状況を明らかにした。この結果、退院支援の項目の中でリンパ浮腫に対する知識と実施が、他の項目より低いことが明らかになり、看護師に対してもリンパ浮腫や弾性着衣に関連した情報提供の必要性が示唆された。なお、現在、この結果に関して投稿中である。次に、1名の婦人科がんで手術を受けた対象者に協力いただき、弾性ストッキングを着脱する際の動作分析を実施した。その結果、市販のストッキングでは橈尺手根屈筋で持続的な活動が観察された。また、弾性ストッキングでは常に100%MVCを超える活動量が持続的に確認され、弾性ストッキング着脱の際の痛みの増悪に関与する可能性が明らかになった。これらの知見は、学術集会にて発表を行った。さらに、乳がん・婦人科がん患者に対するリンパ浮腫による日常生活動作の測定項目の検討を実施した。次年度は、倫理委員会の承認後、乳がん・婦人科がん患者各3名にプレ調査を実施する予定である。2018年度は、倫理委員会の承認後に乳がん・婦人科がん患者、各3名に予備調査の実施予定であった。倫理委員会申請までの準備に時間を要したため、予定通り調査ができなかった。2019年度は、倫理委員会の承認後に乳がん・婦人科がん各3名に予備調査を実施する。また予備調査の結果をもとに、乳がん・婦人科がん各30名に「手術後リンパ浮腫の実態と弾性着衣による心身の影響」について質問紙調査を実施する。この結果は学会発表および投稿する予定である。2020年度は、質問紙調査の結果を基にして、乳がん・婦人科がん患者各15名に本調査を実施する。ここでは弾性着衣の着脱時の動作分析が主となり、適宜学会発表・論文投稿を実施する。さらに2020年度は申請の最後の年になるため研究の総括を実施する。2018年度は、乳がん・婦人科がん患者各3名に面接調査を実施予定であり、謝金と交通費を計上していた。また乳がん・婦人科がんがん患者各30名に郵送調査を実施予定であったため、通信費を計上していた。当初の予定より倫理委員会の承認を得るのが遅くなったため、上記の調査が実施できず、次年度使用額135563円が生じた。
熱外中性子速度選別器の基礎研究

パルス熱外中性子ビームの単色度を向上させる光学系として、拡張したスピンフリップチョッパーの性能を考察しJ-PARCパルス中性子源に配備した場合の性能を求めた。物質研究における汎用性を勘案し、適用エネルギー範囲を200eV程度まで拡張することを想定して研究を進め、得られるビーム強度の算定までを終えた。この結果をもとにJ-PARCパルス中性子施設に配備する可能性の検討に入った。なお、この実現には、熱外中性子スピンフィルターと高反射臨界角中性子導管が必要となるため、開発研究に着手することにしている。前年度に明らかにした単色熱外中性子強度を達成するためのコイルの仕様をもとに、熱外中性子を単色化した際の中性子スピン反転用コイルの製作を進めている。このコイルはおよそ1ミリの間隔で平行に置かれた金属板であり、中性子の進行に同期して順次電流を流すことで、進行磁場を生成する。この平行に並んだ金属板は、一定間隔で配置した二列の支柱にジグザグに渡すことで製作することとした。これに対してパルス電流を流すことで、そのコイル前後を通過する中性子に同期した進行磁場とする。パルス電流を流すための電気回路を設計し、製作を開始している。熱外中性子の単色度の向上のためには、中性子の飛行時間に追随して中性子スピンを制御する磁場を発生するための高速動作コイルが必要である。コイルの基本的な設計を行なった後、現実のパルス中性子源の時間構造における適合性を確認するための研究を行った。具体的には、J-PARCにあるパルス中性子源の時間特性のデータをもとに、単色化後の中性子強度を求めた。その量は100eVの中性子に対して1平方センチあたり毎秒50中性子程度である。これによって、現存するパルス中性子源を用いて実験研究を可能とする程度の強度が得られることが明らかになった。この結果をコイル設計に反映させて、平成25年度において性能の評価を行う。また本研究課題の範囲ではないが、最終的に熱外中性子の速度選別を実行する上では、多層膜中性子ミラーの量産が必要であるため、従来に無い材料で多層膜ミラーを作成する基礎研究を別途行なっており、それらの別研究の成果を取り入れることで、熱外中性子の速度選別の実用上の性能を評価するところまで実行できるものと期待している。パルス熱外中性子ビームの単色度を向上させる光学系として、拡張したスピンフリップチョッパーの性能を考察し、J-PARCパルス中性子源に配備した場合の性能を求めた。その結果をもとに、高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所における中性子S型課題として、J-PARCのパルス中性子施設に配備する可能性の検討に入ることとなった。なお、この実現のためには、熱外中性子の偏極子と熱外中性子導管が必要になる。熱外中性子の偏極子には、$1$eV付近では偏極$^3$Heスピンフィルター、より高いエネルギー領域($100$eV付近)では偏極陽子フィルターを用いるのが適当と考えられる。熱外中性子導管としては、$m=10$という巨大な反射臨界角のスーパーミラー導管を用いることが望ましい。現状ではそのような導管の作成に成功した例は報告されていないが、$m=10$に相当する広帯域モノクロメータの作成は成功しており、J-PARC BL05において超冷中性子発生に用いられている。これらの光学デバイスは物質研究に限らず、また熱外中性子利用に限らず必要となるものであり、別途に開発研究が進められている。素粒子原子核物理学これまでに、既存のスパレーション中性子源を用いた場合の単色を向上した熱外中性子のビーム量を算定し、実用可能な領域にあることを示した。またその単色化熱外中性子ビームを実現するために、中性子の飛行と同期した進行磁場を発生するためのコイルの製作及びこのコイルにパルス電流を流すための電気回路の設計製作を行っている。これらの基本的な設計を終了し、製作段階に入っている。これまでに中性子スピン反転用のコイルと同調回路をを製作した。同調周波数を調整するための同調回路及びその駆動系を製作し、その動作を確認する段階に至った。これまでに、中性子の飛行と同期した進行磁場を発生するためのコイル、及びこのコイルにパルス電流を流すための電気回路の製作が終了した時点で、これらの回路的特性を測定し、その性能をもとに、既存のスパレーション中性子源を用いた場合のの単色化熱外中性子ビームの強度の算定を行う。また本年度より本学で始まった加速器駆動型小型中性子源計画では、連続熱外中性子ビームが発生される予定である。この連続中性子ビームへの応用の可能性を主目的と合わせて検討する。昨年度試作したコイルを熱外中性子スピン反転用に改良して、特性を評価する予定である。初期設計に問題があり、機器製作が遅れたため。
関数解析的方法方法による非線型波動方程式の研究

時間遅れを持つ非線形波動方程式(1)d^2u(t)/dt^2+∂Φu(t)+∂Ψu(t-h)+∫^0_<-h>a(-s)∂Φu(s+t)ds∋fを実ヒルベルト空間H(L^2(Ω))で考える。ここでΦ、ΨはHから(-∞,∞)への下半連続な凸関数でその劣微分を∂Φ、∂Ψと表わしている。しかしこのままの非線型で考えるのは大変難しいので、まず線型の場合を考えた。すなはちAを自己共役な正値線形作用素、A_1を線形閉作用素(A⊂A_1)とし、∂Φ=A、∂Ψ=A_1としたとき上記の解の存在と一意性を調べた。遅れを持つ作用素や外力f、初期値u(0)=a,(du/dt)(0)=bがA_nのn乗巾の領域に入っていることと(1)の解の存在域との関係がはっきりしてきた。また非斉次項fの微分可能性と解の存在域との関係も同様にわかってきた。これらから線型方程式の場合の解の存在と一意性についての十分条件が(ほぼ必要条件)見つかったと思う。今原稿の作成中である。また非線型方程式については∂Ψ(X)のnormがΦ(X)で押えられるなら解の存在はいうことができた。しかしいまだ満足するものではなくいましばらく研究を要すると思う。また遅れを含む方程式という観点から、遅れを含む非線型拡散方程式du(t)/dt+∂Φu(t)+∂Φu(t-h)+∫a(-s)∂Φu(s+t)ds∋fにつても調べた。fがL_1(0,T;H)に含まれているとき、今までにわかっていた連続解よりは滑らかな無条件連続な解を見つけることができた。ただしΦには適当な仮定が入る。しかしこの仮定は線型の場合は無条件に成るような仮定である。またこの場合の方程式は生物モデルも含んでいるので、生物モデルに現われる楕円形方程式についても調べた。すなはち一点で特異性を持つ楕円型方程式の解の一意性についてである。
膜蛋白質と相互作用する生体機能分子の合成と機能解析

アンフォテリシンB(AmB)は,重要な抗真菌剤として感染症治療に広く使われており,生体膜中でイオン透過性を持つチャネル複合体を形成して活性を発現すると考えられているが,詳細な構造は不明である。本研究者は,AmBによって形成されるチャネル複合体の構造を明らかにするために,膜系の測定に有効な固体NMR,すなわち,異種核間距離測定法の一つである^<13>C{19F}REDOR法を適用することを計画し,一方を19Fで他方を13Cで標識化したAmBを用い,炭素-フッ素間の距離を測定することにした。天然物からの誘導および化学合成によって調製した19F-AmB誘導体および培養によって得られた13C-AmBを用いて固体NMRを行ったところ有意なREDOR減衰が観測され,本方法論がチャネル複合体の構造解析に有効であることが示された。サリシリハラミドAは,哺乳類の液胞型ATPアーゼ(V-ATPase)に特異的作用する抗腫瘍性天然物である。V-ATPaseは,ATPの加水分解と共役したプロトンポンプ(膜蛋白質)であり,種々の生命活動において重要な働きを担っている。さらに癌細胞の表面にも存在することが知られており,癌の浸潤や転移などに深く関わっている。本研究では,膜系での構造解析に有効な固体NMRを用いてサリシリハラミドAと液胞型ATPアーゼとの分子複合体の構造を明らかにし,分子レベルでの生理活性発現機構を明らかにすることを目的として,4-19F-標識化サリシリハラミドAを化学合成によって調達した。フッ素標識体は天然物と同等のV-ATPase阻害活性を示し,生理活性発現機構のための分子プローブとして有用であることが明らかとなった。本研究の目的は,標識化天然有機化合物の実践的合成法を開発するとともに,合成した分子プローブと膜タンパク質複合体の構造を固体NMR測定により解明し,分子レベルでの作用機構を明らかにすることである。具体的には,プロトンの能動輸送に関与する生理学的に重要な働きをもつ膜タンパク質である液胞型ATPアーゼ(V-ATPase)を対象とし,V-ATPaseの特異的阻害剤であるサリシリハラミドA,バフィロマイシン,あるいはマイクロモノスポリドなどのマクロライド抗生物質の炭素-13,窒素-15などの天然同位体標識体やフッ素-19で標識した分子プローブを化学合成し,さらに位置特異的にアミノ酸を標識したATPaseサブユニットを化学的に調製して両者の結合を固体NMRによって精査する。本年度は、まず標識体の化学合成を検討した。構造が最も簡単なサリシリハラミドAをまず合成ターゲットとして選び,4位をフッ素-19で標識した分子プローブの合成を検討した。サリシリハラミドAは,サリチル酸部分,マクロライド環,およびエナミド側鎖部分に分け,それぞれのフラグメントを合成した後に連結した。サリチル酸部分はStilleカップリング反応を,マクロライド環は光延エステル化反応と閉環メタセシス反応をそれぞれ鍵段階として合成した。銅触媒を用いたエナミド側鎖の導入を試みたが低収率であったため今後の検討課題である。また,フッ素標識化サリチル酸部分の合成を現在検討中である。我々は,AmBによって形成されるチャネル複合体の構造を明らかにするために,膜系の測定に有効な固体MNR,すなわち,異種核間距離測定法の一つである^<13>C{^<19>F}REDOR法を適用することを計画し,一方を^<19>Fで他方を^<13>Cで標識化したAmBを用い,炭素原子とフッ素原子間の距離を測定することにした。C1-C21セグメントは,天然物からオゾン分解,高井オレフィン化等を経て調製し,C22-C37セグメントは,ヨードオレフィンとビニルスズのStilleカップリング,続くホスホネートとのHorner-Emmons反応により合成した。両セグメントのStilleカップリング,マクコラクトン化,および脱保護を行い28-^<19>F-AmBの合成に成功した。同様の手法により25-^<13>C-AmBの合成にも成功した。これらの標識体を用いた固体NMRを開始した。渦鞭毛藻が生産する梯子状ポリエーテル天然物は,強力な神経毒性や細胞毒性など多岐にわたる生理活性を示す。その特異な構造に由来する生体分子(膜蛋白質など)との分子認識機構に興味が持たれるが,天然から極微量しか得られないため詳細な研究は滞っている。我々は,天然物の特徴を備えつつ,より合成が容易なモデル分子を用いることで梯子状ポリエーテルの機能解析を行うことを計画した。6,7員環エーテルと角間メチル基からなる四環性,七環性,十環性人工モデル分子は,我々が開発したα-シアノエーテルを経由する二環構築型収束的合成法を用いて合成した。蛋白質(グリコホリンAや他の膜貫通型蛋白質)の脱会合活性を指標とした相互作用解析を開始した。シガテラ食中毒の原因物質の一つであるマイトトキシン(MTX)は,渦鞭毛藻が生産する梯子状ポリエーテル天然物の一つであり,二次代謝産物の中では最大の分子量および最強の毒性を有している。

MTXの構造決定は,複雑な構造ゆえ長い年月を要し,発見以来20年以上経過した現在でも,作用標的分子は明らかになっておらず,分子レベルでの活性発現機構の解明が重要視されている。MTXの疎水性部分に相当するWXYZA'B'C'環部は,コンポメーションの自由度が大きい二つの中員環と1,3-ジアキシアルの位置に並ぶ角間メチル基が数多く存在するため,構造決定上困難を伴った部分である。また,この部分はMTXのラット細胞内カルシウムイオン流入促進作用を阻害するブレベトキシンBの骨格と類似した構造をしており,活性発現(膜蛋白質との相互作用)に関与している可能性が高い部分でもある。さらに合成化学的に見ても,このような角間メチル基を多数有するポリエーテル骨格を合成した例はほとんどなく,興味深い合成標的である。そこで,この合成的に困難であるMTXのWXYZA'B'C'環部を化学合成し,その化学構造を確認するとともに,天然のMTXの生物活性に対する阻害作用を評価することを研究目的とした。すなわち,当研究室で開発したα-シアノエーテルを経由する収束的な合成法を用いてまず,Z環セグメントとW環セグメントからアセタール化とアセタールの位置選択的開裂を行い,α-シアノエーテルへと誘導し,WXYZ環セグメントを合成することに成功した。続いてこのWXYZ環セグメントとC'環セグメントからα-シアノエーテルへと導き,閉環メタセシス,還元的エーテル化を経て,目的のWXYZA'B'C'環部の収束的合成を達成した。合成品のNMRスペクトルは天然物と良い一致を示し,MTXのこの疎水性部分の化学構造が正しいことが証明された。アンフォテリシンB(AmB)は,重要な抗真菌剤として感染症治療に広く使われており,生体膜中でイオン透過性を持つチャネル複合体を形成して活性を発現すると考えられているが,詳細な構造は不明である。本研究者は,AmBによって形成されるチャネル複合体の構造を明らかにするために,膜系の測定に有効な固体NMR,すなわち,異種核間距離測定法の一つである^<13>C{19F}REDOR法を適用することを計画し,一方を19Fで他方を13Cで標識化したAmBを用い,炭素-フッ素間の距離を測定することにした。天然物からの誘導および化学合成によって調製した19F-AmB誘導体および培養によって得られた13C-AmBを用いて固体NMRを行ったところ有意なREDOR減衰が観測され,本方法論がチャネル複合体の構造解析に有効であることが示された。サリシリハラミドAは,哺乳類の液胞型ATPアーゼ(V-ATPase)に特異的作用する抗腫瘍性天然物である。V-ATPaseは,ATPの加水分解と共役したプロトンポンプ(膜蛋白質)であり,種々の生命活動において重要な働きを担っている。さらに癌細胞の表面にも存在することが知られており,癌の浸潤や転移などに深く関わっている。本研究では,膜系での構造解析に有効な固体NMRを用いてサリシリハラミドAと液胞型ATPアーゼとの分子複合体の構造を明らかにし,分子レベルでの生理活性発現機構を明らかにすることを目的として,4-19F-標識化サリシリハラミドAを化学合成によって調達した。フッ素標識体は天然物と同等のV-ATPase阻害活性を示し,生理活性発現機構のための分子プローブとして有用であることが明らかとなった。
人体の移動により金属筐体内に生じる誘導電圧

人体は,例えばセーターを脱いだり,車から降りたり,スリッパで床を擦りながら歩いた後でドアノブ等の金属(導体)に触れる瞬間,10キロボルトかそれ以上に高い電圧に帯電することがある。高い電圧に帯電した物体(例えば人体等)が電子機器の近くを移動すると,静電誘導により機器内の電子回路基板等の導体部分に電圧(誘導電圧)が発生する可能性がある。近年,電子機器内の電子デバイスは数ボルト程度の電圧が原因で誤動作することが知られている。したがって,帯電した物体が電子機器の近くに存在し,その物体が移動するだけで,電子機器の誤動作が容易に発生する可能性がある。帯電した物体の存在やその物体の移動により発生する電子機器の誤動作を未然に防止するには,電子機器の設計に指針を与える必要がある。しかし,静電誘導により開口部のある金属筐体内の電子回路基板等の導体部分に生じる誘導電圧に関連する研究は国内外でほとんど行われていないため,帯電した物体の移動に起因する電子機器の誤動作の防止に関する設計指針は研究代表者の知る限りでは存在しない。本研究では,帯電した人体を模した帯電物体が移動したときに金属筐体内に生じる誘導電圧を明かにし,電子機器の誤動作防止に関する独自の基礎的な防護指針を提案することに成功した。本研究で提案した防護指針を履行することにより,静電誘導電圧に起因する誤動作を防止できる機器設計基準を具現化できるものと考えている。本研究で得られた成果の一部は,以下の博士論文にまとめた。市川紀充:「放電・静電気によるEMI障害とそのEMC対策に関する研究」,芝浦工業大学博士学位論文(平成20年3月),pp.1-164.放電・静電気の応用は、複写機等に利用される役に立つ面と、障害(電磁障害による電子機器の誤動作)として作用する面がある。マイクロ・エレクトロニクス化の進展にともない、この障害は今後もますます増加する。例えば帯電した人体やツールワゴン等が電子機器の金属筐体(開口部付き)の近くを移動すると、筐体内の電子回路基板の導体部分に誘導電圧が発生し、機器が誤動作することがある。衣服を着用した人体は、床の上を歩くと10キロボルト程度に帯電する。電子部品の動作電圧は低下する傾向にあり、数ボルトの誘導電圧が電子回路基板に生じるだけで機器が誤動作するといわれている。したがって、帯電した人体が電子機器の近くを移動するだけで、金属筐体内には相当大きな誘導電圧が生じる可能性がある。本研究は、誘導電圧による電子機器の誤動作を防止するため、帯電物体(人体)が金属筐体の近くを移動したときに筐体内の電子回路基板に生じる誘導電圧を測定し、測定した結果に基づいて対策(電子回路基板の設計に指針を与える)を講じることを最終目標として実施している。今年度は、これまでの研究で得られた成果を論文に発表するとともに、次の実験研究を行った。人体(帯電電圧:約10キロボルト)が金属筐体の開口部の前面を通過したときに、筐体内に発生する誘導電圧の測定を試みた。この実験の結果、本研究で提案した誘導電圧測定法では、人体が金属筐体の近くを移動したときに筐体内に生じる誘導電圧を測定することは困難であることがわかった。今後の研究では、実験の実施が可能な環境を整備するため、実際の人体を模擬した発泡スチロール製の人体モデルを用いて実験を実施することにした。この人体モデルを用いて実験を行うことにより、より現実的な環境を模擬することが可能になる。市川紀充:「放電・静電気によるEMI障害とそのEMC対策に関する研究」,芝浦工業大学博士学位論文(平成20年3月),pp.1-164.
混合粉砕法による自己乳化型医薬品封入ナノ微粒子の開発

微粒子化メカニズムの解明:微粒子化メカニズムについては、これまで固体NMRによる検討を行ってきており、薬物と水溶性高分子および水溶性高分子と界面活性剤との相互作用が明らかになった。今年度、probucol/PVPK12/SDS3成分混合粉砕物について高分解能SEM観察により粉砕物の微粒子状態を観察したところ、約20nm程度のナノ微粒子(一次粒子)形成が確認された。WetSEM測定による水分存在下での微粒子形状について観察したところ、100-200nm程度の凝集した微粒子の存在が確認された。このようにPVP分子量のちがいにより形成される一次粒子および二次粒子の形状が明らかとなり、これら一次粒子が水中で凝集することにより100-200nm程度の医薬品微粒子が形成するものと推察された。各種添加剤を用いた機能性微粒子の調製:分子量の大きい医薬品や調製した微粒子に機能性を付与する目的で、別の界面活性剤(CTAB、DCNa、Brij)や水溶性高分子(HPC, MC, HPMC, Eudraguit, PEO)を用いて混合粉砕による微粒子化を試みた。その結果、probucolを用いた場合には、いずれの界面活性剤を用いた場合でもナノ微粒子形成が確認された。一方、別の医薬品を用いた場合にはナノ微粒子が形成しないものも存在した。これまでの検討結果から、微粒子化には3成分間の相互作用が重要であり、医薬品に適した界面活性剤や水溶性高分子の選択が重要であると考えられた。各種難水溶性医薬品をポリビニルピロリドン(PVP)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と混合粉砕することで医薬品ナノ微粒子の調製を試みたところ、17種類の医薬品のうち、15種類の医薬品においてナノ微粒子形成が確認された。混合粉砕を行う際のDrug/PVP/SDS 3成分の組成と粒子径の関係を検討したところ、多くの医薬品において重量比1:3:1の組成が微粒子形成に最適な組成であることが明らかとなった。PVPとSDSを用いた3成分混合粉砕により微粒子形成が認められなかったトルブタミド、フルルビプロフェンについて、PVPのかわりに水溶性高分子のヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)を用いてDrug/HPMC/SDS 3成分混合粉砕による微粒子調製を試みたところ、両薬物ともに400nm以下の微粒子形成が観察された。また、SDSのかわりに胆汁酸塩のデオキシコール酸ナトリウム(DCNa)を用いることでナノ微粒子化が進行する薬物も存在することから、医薬品に適した水溶性高分子や界面活性剤の選択が粉砕による医薬品のナノ微粒子化に重要であることが明らかとなった。各種組成で調製した医薬品ナノ微粒子は水に分散後、少なくとも1ヶ月は安定であった。また、混合粉砕物として一定期間低湿度下で保存した試料を水に分散した際にも微粒子形成が確認された。医薬品としてプロブコールを用い、プロブコールPVP/SDS3成分混合粉砕による微粒子形成に及ぼすPVP分子量の影響を検討したところ、PVP分子量の低下に伴い、生成する微粒子の粒子径が減少した。この微粒子生成にはプロブコール、PVP、SDS間の相互作用が関連していると考えられ、現在固体NMRを用いて検討している。probucol/PVP/SDS(重量比1:3:1)の混合粉砕物(GM)を水に分散することで、PVPの分子量に依存したナノ微粒子形成が起こることを報告してきた。今回、probucol/PVPK17/SDS混合粉砕物について、固体及び懸濁液状態での安定性、混合粉砕物中の3成分の分子状態について検討した。3成分GM懸濁液の粒度分布を測定した結果、平均粒子径約90nmのナノ微粒子だ得られた。一方、2成分系(probucol/PVP、probucol/SDS)のGMを水中に分散してもナノサイズの微粒子は形成しなかった。調製した3成分GMを固体状態のまま40°C、22%RHで6ヶ月保存した後、水に分散すると保存前と同様のナノ微粒子形成が認められた。また、GMを水に分散して調製した懸濁液を25°Cで長期保存したところ、1ヶ月が経過してもほとんどの薬物が粒子径約130nmのナノ微粒子として存在できることが明らかとなった。混合粉砕時に生じる3成分間の相互作用について、固体NMR測定を行ったところ、probucolのOH基に隣接する炭素の低磁場シフト及びベンゼン環周辺の環境変化に由来すると考えられる新しいピークが観察された。これは粉砕中にPVPとprobucol間に水素結合が形成したためと考えられた。さらに、SDSのSO_4に隣接する炭素においても高磁場側に肩ピークが観察され、PVPとSDS間の相互作用に由来すると考えられた。以上の結果より、粉砕により生じるprobucol-PVP及びPVP-SDS間の相互作用によりナノ微粒子が形成されたと考えられた。

このようにPVP分子量のちがいにより形成される一次粒子および二次粒子の形状が明らかとなり、これら一次粒子が水中で凝集することにより100-200nm程度の医薬品微粒子が形成するものと推察された。各種添加剤を用いた機能性微粒子の調製:分子量の大きい医薬品や調製した微粒子に機能性を付与する目的で、別の界面活性剤(CTAB、DCNa、Brij)や水溶性高分子(HPC, MC, HPMC, Eudraguit, PEO)を用いて混合粉砕による微粒子化を試みた。その結果、probucolを用いた場合には、いずれの界面活性剤を用いた場合でもナノ微粒子形成が確認された。一方、別の医薬品を用いた場合にはナノ微粒子が形成しないものも存在した。これまでの検討結果から、微粒子化には3成分間の相互作用が重要であり、医薬品に適した界面活性剤や水溶性高分子の選択が重要であると考えられた。