hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
揮発性全身麻酔薬の副作用の分子機構:モーター蛋白1分子レベルでの解明

細胞内モーター蛋白キネシン-微小管系の運動再構成モデルを用い、揮発性麻酔薬セボフルラン・イソフルランがキネシン運動能に与える直接作用を調べた。実験系を揮発性麻酔薬で飽和させることにより、大部分の微小管が滑り運動を停止し、麻酔薬を除去すると大部分の微小管の滑り運動が再開することが確認された。以上から、揮発性麻酔薬は細胞内モーター蛋白キネシンの運動能を直接阻害すること、またこの阻害作用については可逆性が認められることが確認できた。本年度は細胞内モーター蛋白キネシン-微小管系の運動再構成モデル(多分子系)を用い、揮発性麻酔薬セボフルラン・イソフルランがキネシン運動能に与える直接作用を調べた。蛍光顕微鏡を用いたキネシン・微小管のin vitro運動再構成系で、カバーガラス表面に吸着させるキネシン濃度を調整することにより、蛍光標識された微小管の80-90%に(キネシンに沿った)滑り運動が認められるような実験系を作成した。この系を5%セボフルランで飽和させたところ、大部分の微小管が滑り運動を停止した。また、この系のセボフルランを洗い流すことにより、再び大部分の微小管が滑り運動を再開した。もう1種の揮発性麻酔薬イソフルランについても、実験系を4%イソフルランで飽和させることにより、大部分の微小管が滑り運動を停止することが確認された。以上から、揮発性麻酔薬セボフルラン・イソフルランは細胞内モーター蛋白キネシンの運動能を直接阻害すること、またセボフルランの阻害作用については可逆性が認められることが確認できた。キネシンスーパーファミリー蛋白は神経軸索・神経突起の伸長制御や記憶・学習に重要な役割を担っており、上記の現象は揮発性麻酔薬が神経発達過程における脳細胞の広範な障害を引き起こすメカニズムの一つである可能性が高い。次年度は上記の実験結果を確固たるものにするための実験に加え、同様の実験を別の細胞内モーター蛋白であるアクトミオシンのin vitro運動再構成系についても行う予定である。これによって揮発性麻酔薬が細胞内モーター蛋白の運動能全般に直接阻害作用を有することが示されれば、揮発性麻酔薬の種々の副作用の分子メカニズムを一元的に解明することができるであろう。さらに未だ知られていない揮発性麻酔薬の生体作用の発見や新しい臨床応用の発見にもつながる可能性があると期待される。本年度はまず、昨年度preliminaryな結果が得られた揮発性麻酔薬セボフルラン・イソフルランがモーター蛋白キネシン運動能に与える直接阻害作用を確固たるものとするため、キネシン-微小管系の運動再構成モデル(多分子系)を用い、再実験・解析を行った。揮発性麻酔薬非存在下でほぼ全ての微小管に滑り運動が認められるin vitro motility assayの系を、セボフルラン(5%)あるいはイソフルラン(4%)で平衡させたbufferで灌流したところ、大部分の微小管の滑り運動が停止した。次にこの系を麻酔薬を含まないbufferで再灌流したところ、8割以上の微小管で滑り運動の再開が認められた。灌流前後の微小管の滑り運動速度に有意差は認められなかった。以上から、セボフルラン・イソフルランはいずれもキネシン運動能を直接・可逆的に阻害することが明らかとなった。次に、揮発性麻酔薬による上記の阻害作用がキネシンATPase活性を阻害することによるものか否かを検討するため、揮発性麻酔薬存在下・非存在下においてmicrotubule-activated kinesin ATPase活性測定を行った。揮発性麻酔薬存在下でのATPase活性測定は困難を極めたが、MESG/PNP法を改変することにより測定に成功した。結果、セボフルラン(5%)あるいはイソフルラン(4%)存在下において、kinesin ATPase活性は麻酔薬非存在下と同等のVmax値を示し、セボフルラン・イソフルランによるキネシン運動能阻害作用はATPase活性を介するものではないことが示された。これは研究代表者らが以前局所麻酔薬について示した結果と同等の結果であり、揮発性麻酔薬も局所麻酔薬と類似のメカニズムでキネシン運動能を阻害することが明らかとなった。以上の研究成果は、第56回日本麻酔科学会学術集会(2009年5月)にて発表予定である。揮発性麻酔薬の種々の副作用のうち心筋収縮抑制作用については、細胞内カルシウム濃度の低下に加え、アクトミオシン系の直接抑制作用によるものである可能性も大きいと考えられる。本年度はまず、揮発性麻酔薬セボフルラン・イソフルランがモーター蛋白ミオシン運動能に与える直接作用を検討するための実験を行った。アクチン・ミオシンはウサギ骨格筋から抽出精製し、アクチンモノマーに蛍光色素テトラメチルローダミンをラベル、重合させて蛍光アクチンフィラメントを作成した。

ミオシン分子をカバーガラス表面に吸着させ、その上に蛍光アクチンフィラメント・2mM ATPを含むbuffer (20mM HEPES [pH 7.4], 25mM KC1, 5mM MgCl_2, 25°C)を灌流、アクチンフィラメントがカバーガラス表面のミオシン分子上をATP存在下で滑走する様子を蛍光顕微鏡下に観察、画像処理用コンピュータに画像を記録観察した。麻酔薬を添加しないコントロールの条件でのアクチンフィラメントの滑走速度が安定しなかった為、本年度は麻酔薬の効果の評価までには至らなかった。昨年度までにある程度成果の得られたキネシン-微小管運動再構成系に対する揮発性麻酔薬の直接・可逆的な運動抑制作用については、実験結果を確固としたものとするための再実験(in vitromotility assay, MT-activated kinesin ATPase活性測定)を行い再現に成功し、現在学術論文の執筆を進めている。また、以上一連の研究結果は以前の我々の研究で得られた局所麻酔薬がアクトミオシン系やキネシン-微小管系に与える効果の結果(Biophys J 71 : 2733-2741, 1996, Biophys J 78 : 940-949, 2000)と併せ、本年度の第57回日本麻酔学会学術集会(2010年6月)のシンポジウムにて発表予定である。
光合成細菌の電荷分離反応に関わる機能分子のエネルギー準位相関解明

本研究は、驚異の光エネルギー変換効率を実現している光合成細菌の電荷分離反応につき、効率の要因の一つとされる機能分子エネルギー準位相関の解明を目的に、電子供与体・受容体の酸化還元電位を分光電気化学計測法により実測した。さらに生物種による異同を調べることで、電荷分離反応における機能分子エネルギー準位の調節機構を明らかにし、光合成反応の必然性と許容性について議論を展開した。本研究は、驚異の光エネルギー変換効率を実現している光合成細菌の電荷分離反応につき、効率の要因の一つとされる機能分子エネルギー準位相関の解明を目的に、電子供与体と電子受容体の酸化還元電位を分光電気化学計測法により実測することを目指すものである。初年度は、酸素発生型光合成光化学系IIを用いて、電子受容体の酸化還元電位の計測手法を確立した。一次電子受容体フェオフィチンaについては、密封型薄層電解セルを作成し、水素過電圧の高い水銀を金メッシュ電極にメッキしたものを作用電極として用い、分光電気化学計測に適用したところ、従来では不可能であった生理的pHでの計測が可能となり、シアノバクテリアから精製した光化学系IIを用いて測定した結果pH6.5で-505±6mVと決定した(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 106,17365-17370(2009))。これは30年前に報告されていた値(-610±30mV、pH11)よりも100mV貴であるが、本手法によってより実態に近づいた値を提示できたといえる。二次電子受容体についても、蛍光法と電気化学法を組み合わせることで、初めて二次電子受容体プラストキノンの分光電気化学的計測手法を確立し、シアノバクテリアの光化学系において-140mVと決定した(Biochemistry,48,10682-10684,(2009))。この結果と先のフェオフィチンaの結果より、自由エネルギー差ΔGは-300-370mVにあるはずだといえ、酸化還元電位測定の結果により初めてエネルギー相関を提示できた。本年度は、まず昨年度に確立した計測技術をもとに、さまざまな酸素発生型光合成光化学系IIを用いて、二次電子受容体プラストキノンの酸化還元電位の測定を行った。具体的には、昨年度に計測に成功したシアノバクテリアThermosynechococcus eleongatusに加えて、高等植物ホウレンソウ、珪藻Cyanidium caldarium、緑藻Chlamydomonas reinahrdtiiの4種を実験対象とした。測定の結果、QAの電位は生物種によって異なり、それぞれ-140±2mV、-162±3mV、-104±4、-171±3mVと最大で67mV異なることが明らかとなった。こうした違いは、他の電子伝達機能分子の電位にも影響してくるものと考えられ、これまで報告されている速度論敵解析によるデータとつきつめると、水酸化を担うP680の電位も生物種によって異なる可能性があるといえる。次年度には、この結果を基に、さらにエネルジェティックスの議論を深める予定である。また、光化学系IIの祖先とされる紅色光合成細菌の反応中心を用いて、各機能分子の電位計測も展開している。本年度は昨年度に確立した反応中心分画を引き続き行い、まず一次電子供与体P870の電位計測を行った。結果+490mVほどと既報とほぼ一致した数値を得ており、本研究の推進の足がかりをつかむことができたものといえる。これをもとに次年度は供与体・受容体間の電位の相対関係について明らかにすることを目指す。1好熱性藍色細菌の光化学系IIにおける反応中心蛋白質の違いが酸化還元電位および電子伝達特性に及ぼす影響好熱性藍色細菌Thermosynechococcu selongatusのゲノムには系II反応中心蛋白質PsbAをコードする遺伝子が3つあり、これらの発現様式は培養条件によることが知られている。通常ではpsbA1が、光ストレスを受けるとpsbA3が発現し、後者のほうが酸素発生活性が1.8倍ほど高いことが報告されている(杉浦ら、2010)。この活性の違いは、PsbAを構成する344アミノ酸残基のうちの21個の違いによるとされるが、それが各種機能分子にどのように影響するかは明らかにされていなかった。そこで、分光電気化学計測を一次電子受容体フェオフィチン(Ph)と二次電子受容体プラストキノンQAに適用したところ、それぞれ17mV、40mVほどPsbA3において高電位側にあることを見出し、Ph・QA間およびPh・P680間の自由エネルギー変化が大きくなっていることを明らかにした(論文投稿中)。

2紅色光合成細菌の反応中心における機能分子の酸化還元電位相関と電子伝達特性酸素発生型光化学系IIの祖先とされる紅色光合成細菌のうち、Rhodobacter sphaeroidesとRhodopseudomonas palustris、Blastochloris viridisの3種を研究対象とし、分光電気化学計測により電子供与体・受容体の電位相関を明らかにすることを目指した。電子供与体の電位は、それぞれ+495mV、+511mV、+513mVと必ずしも同じではないことを明らかにし、その差異を明確にした(論文取り纏め中)。しかし、電子受容体は、光化学系IIのPhが酸化還元反応を示すような電位領域では反応が観測されず、電位相関は明らかにできなかったが、さらに負の電位領域にあることが示唆された。
霧島温泉地域における大気中への噴出蒸気(自然エネルギー)を利用した発電装置の開発

研究の目的鹿児島県霧島市の霧島地区は国内でも有数な温泉地帯であり、大気中に温泉蒸気が噴出する場所が多数存在し、その自然エネルギーは活用されないまま放出されている。平成22年3月11日に発生した東日本大震災及び福島原子力発電所事故以降、全国的に特に夏場の電力不足が懸念された。これらをきっかけに大規模太陽光発電システム、地熱や風力エネルギーを活用した発電、及び温泉蒸気等を利用したバイナリー発電設備が各地に設置されたが、気象条件に大きく左右され夜間等常時発電ができないなどの欠点がある設備もある。また、施設設備の規模が大きく初期費用も莫大である。そこで、鹿児島県などでは小規模地産地消の再生可能エネルギーを活用した、小水力発電等の発電システムの研究が注目されている。本研究は霧島温泉地域において、有効利用されずに大気中に放出されている噴出蒸気を活用し、一般家庭一世帯分(約1kw程度)を賄う小規模で低コストの発電設備の開発と、高専・霧島市・地元企業と三位一体で連携し地域貢献・発展に寄与し、また、鹿児島高専の一日体験入学や高専の日等のイベントに利用する事を目的とする。方法まず、霧島地区の実証試験地で、噴出蒸気量、蒸気温度等の調査を実施し、その結果を基に発電装置を製作した。発電を効率良くするために、噴出蒸気が直接当たり回転するスチームタービンの直径、幅、フィン枚数等の検討をし、実験を繰り返した。成果発電装置を製作し、実証試験地で発電実験を繰り返し行った。28年度の成果として、60Wの電球を点灯する程度の発電は可能であったが、一般家庭一世帯分を賄うまでには至らなかった。今後は噴出蒸気量の再調査と、効率よく発電するために、スチームタービンの直径、幅、フィン枚数等の再検討を行い、効率よく発電できる設備を開発する予定である。
算額の発掘保存と分野横断的研究推進に向けたオープンマップデータベースの提案と構築

本研究では、算額に関して可能な限り新しい調査結果や研究成果を、歴史研究者や和算研究会の協力を得て収集し、その情報をもとにオープンマップを作成する。劣化算額のうち判読の必要性が高いものを分析して視覚化し、これも情報に加える。作成したマップを利用し、各自が得意な分野・興味がある分野の研究を進め、研究成果を追加してさらにマップを充実させていく。以上により、算額情報の共有と発信ができるシステムを提供する。
ホロカルボキシラーゼ合成酵素遺伝子の異常と小児疾患

ホロカルボキシラーゼ合成酵素(HCS)は、アポカルボキシラーゼにビオチンを付加してホロカルボキシラーゼにする酵素であり、生体内で重要な役割を果たしている。本酵素の欠損症は新生児、乳児期に重篤な有機酸血症を引き起こすが、これまで報告されている全症例がビオチン反応性を示している。ヒトHCSのcDNAは我々によってクローニングされ、最近ゲノム構造も明らかにされた。本研究の目的はそれらの情報をもとに多くの患者の遺伝子解析を行い、病態を解明することにある。これまで日本人患者8家系、スエーデン、フランス、ドイツ人の各1家系を解析した。発現蛋白を用いて各変異蛋白の動力学的特性を検討したところ、ビオチンに対するKm値が高値を示すものと全く正常のもの(典型例;IVS10^<g+5a>変異)が存在した。Vmax値はすべて正常よりは低下していたが、その程度はプロピオニルCoAカルボキシラーゼ活性を正常化する能力を持つ程度のものから、わずかに上昇させるにとどまるものまで多岐にわたった。Kmが正常の変異HCSを持つ患者がビオチンに反応する機序は組織ビオチン濃度がKm値より低く、通常のビオチン濃度ではHCS活性は全活性を示していないためと考えられる。患者の遺伝子型と表現型は良く一致しており、遺伝子型より適切な治療および予後の推定が可能である。ホロ力ルボキシラーゼ合成酵素(HCS)は、アポカルボキシラーゼにビオチンを付加してホロカルボキシラーゼにする酵素であり、生体内で重要な役割を果たしている。遺伝子解析法として(1)RT-PCRによって増幅されたHCScDNAについて塩基配列を決定する。(2)HCSの翻訳領域は9個のエクソンからなっているが各々のイントロン・エクソン結合部位を含むエクソンを増幅し、各々の塩基配列を決定する。以上の方法で、日本人患者8家系、スエーデン、フランス、ドイツ人の各1家系を解析した。日本人患者ではL237P変異5アレル、deIG 1067変異3アレル、V550M変異2アレル、R508W変異2アレル、R565X.L470S.InsA219変異各1アレルを同定した。一方、ヨーロッパ白人ではIVS10+5(g→a)変異が4アレル、delT1876及びdelC2279変異が各1アレルずつであった。発現蛋白を用いて各変異蛋白の動力学的特性を検討したところ、ビオチンに対するKm値が高値を示すものと全く正常のもの(典型例;IVS10+5(g→a)変異)が存在した。Vmax値はすべて正常よりは低下していたが、その程度はプロピオニルCoAカルポキシラーゼ活性を正常化する能力を持つ程度のものから、わずかに上昇させるにとどまるものまで多岐にわたった。Kmが正常の変異HCSを持つ患者がビオチンに反応する機序は組織ビオチン濃度がKm値よサ低く、通常のビオチン濃度ではHCS活性は全活性を示していないためと考えられる。しかし、翻訳開始点の候補は3カ所(Met^1、Met^7、Met^<58>)あり、HCS蛋白の全体像は未だ明らかではない。本研究でHCScDNAのコードする蛋白質に対する抗体を作製し、ヒトにおけるHCS蛋白質を同定するととに、遺伝子機能部位の検討を行った。

使用した抗体は(1)部分HCS蛋白質(Ile^<128>-Pro^<398>に対する抗体、(2)Met^1-Lys^<15>に対するペプチド抗体、(3)Met^<58>-Glu^<72>に対するペプチド抗体の3種類である。先ず、ヒト胎盤サイトゾル画分から部分精製HCSおよびHCScDNA発現蛋白について、抗体(1)を用いてウエスタンブロットを行ったところ、両者で約86、82及び76Kdaにバンドが検出された。次いで、抗体(2)および(3)を用いて、各々のHCS蛋白との交差反応性を見たところ、抗体(3)は3種のすべてのHCS分子を認識したのに対し、抗体(2)では86及び82Kdaのみを認識した。以上の結果はヒトHCS蛋白質はその分子量の大きさから3種類存在し、それらは翻訳開始点の相違に基ずく産物であることが考えられる。HCSのN端の機能を見るために、Met^1からの蛋白質、Met^<58>からの蛋白質、Ile^<117>(Metに変換)からの蛋白質およびMet^<234>からの蛋白質を発現させ、各々の蛋白質のHCS活性を測定した。この結果から、Ile^<117>からMet^<234>までのアミノ酸配列はHCS活性に極めて重要な部分であること、Met^1からIle^<117>までは活性調節領域であることを示唆した。
EPO併用骨髄細胞移植を用いた血管新生治療の基礎研究と臨床試験

1.エリスロポエチン(EPO)を併用した骨髄単核球移植のヒト臨床治験(2)BMI+EPO 6,000IUx5日間連続投与:4例施行。1例は安静時疼痛が改善し臨床効果を認めるも、残りの3例は足部もしくは下腿レベルの下肢切断術を施行され、効果を認めず。2.赤芽球系細胞およびEPOの血管新生作用に対する基礎研究(1)EPOのBMI増強作用について(in vivo):マウス下肢虚血モデルを作成しBMIとEPOを同時投与したところ、EPOはBMI単独による救肢効果を増強した(JMCC 2006;40:629-38).(3)赤芽球系細胞の重要性の検討:マウス下肢虚血モデルに対するBMI治療においてこの細胞群から赤芽球系細胞を除くと血管新生効果が消失することがわかった。一方、赤芽球系細胞単独でも、やはり虚血下肢の救肢は認められなかった。赤芽球系細胞は骨髄において内皮下マクロファージと共に赤芽球島を形成している事から、CD14陽性細胞と赤芽球を同時に移植したところ、虚血下肢の部分的改善が得られた。さらにCD34陽性細胞(幹細胞のマーカー)を加えることにより、なお一層の改善が得られ、ほぼBMIの治療効果に匹敵した(JMCC 2006;40:629-38)。1.エリスロポエチン(EPO)を併用した骨髄単核球移植のヒト臨床治験(1)骨髄単核球移植(BMI)単独治療本治療を合計12例の症例に施行した。特に閉塞性動脈硬化症患者においては移植されたCD34陽性細胞数が、唯一の治療効果の規定因子であった(Circ J.2004;68:1189-93)。ヒトに対する副作用がないことを確認するため、6,000 IUのEPOを骨髄単核球に混注し、虚血下肢に細胞移植を行った。合計で7例の症例に行い、特記すべき副作用は認めなかった。しかし、上乗せの効果は認められなかった。次に、EPO24,000 IUの1回投与をBMIに併用した。本治療は合計4例の症例に施行した。4例中1例は、1年前にBMIを施行していることから、治療効果を比較検討できた。BMI単独では、4週間後の下肢上肢血圧比(ABI)が0→0と変化を得られなかったが、24,000 IU併用においては、ABI 0→0.67と著明に改善した。2.赤芽球系細胞およびEPOの血管新生に対する基礎研究(1)赤芽球系細胞の重要性我々は、すでにBMIにEPOを組み合わせて投与すると、マウス下肢虚血が改善することを報告した。骨髄細胞から赤芽球系細胞を取り除くと、BMIの効果が完全に消失した。(2)赤芽球細胞+CD14陽性細胞(単球系細胞)一方、赤芽球系細胞のみをとりだして移植を行っても虚血肢の改善は認められなかった。骨髄内においてマクロファージ(CD14陽性細胞)は遊走能をもたない赤芽球系細胞と共に赤芽球島を形成しており、さらにCD14陽性細胞そのものが血管内皮前駆細胞であるとの報告もあることより、CD14陽性細胞と赤芽球系細胞を同時に移植したところ、虚血下肢の部分的改善が得られた。2.赤芽球系細胞およびEPOの血管新生作用に対する基礎研究(3)赤芽球系細胞の重要性の検討:マウス下肢虚血モデルに対するBMI治療においてこの細胞群から赤芽球系細胞を除くと血管新生効果が消失することがわかった。

一方、赤芽球系細胞単独でも、やはり虚血下肢の救肢は認められなかった。赤芽球系細胞は骨髄において内皮下マクロファージと共に赤芽球島を形成している事から、CD14陽性細胞と赤芽球を同時に移植したところ、虚血下肢の部分的改善が得られた。さらにCD34陽性細胞(幹細胞のマーカー)を加えることにより、なお一層の改善が得られ、ほぼBMIの治療効果に匹敵した。
有機―無機相互作用を利用した不斉多孔質無機材料の創製と応用

キラルメソポーラスシリカ(CMS)において,些細な合成環境の変化により得られるねじれたロッド状粒子の形態が変化してしまう問題があり合成手法の改善が必要であった.H20年度において,CMSの合成系に塩基性アミノ酸であるL-Arginineを添加することにより,再現よく,質の高いCMSが得られることを見出した.しかしながら,以前として得られるねじれたロッド状粒子は左巻き:右巻き=75:25あるいは25:75の割合にとどまっていた.不斉分野での応用を考えた場合,ねじれの向きを完全に制御されていることが望ましい.H21年度において,CMSの合成系にさらにTEOSの代わりに1,2-bis(triethoxy-silyl)ethylene(BTEE)、界面活性剤としてC_<14>-L-AlaAを用い塩基性アミノ酸であるL-Arginineを添加することにより、粒子のねじれの向きを左巻き:右巻き=0:100の割合とすることに成功した.このようにして調製したものはchiral periodic mesoporous organosilica(CMOS)であり,多彩な応用が考えられる,しかしながら無定形の粒子も多く生成していた.そこでH21年度において,合成手法の改良に取り組むとともに得られキラルシリカの詳細な構造解析を実施した.主にBTEEとTMAPSを加えてからの攪拌時間ならびに熟成温度の最適化を行った.C_<14>-L-AlaA/L-Arginineの系より,質の高い右巻き100%にねじれたロッド状粒子であるCMOSの合成に成功した。H20年度において、CMSを合成し、吸着カラムクロマトグラフィーを行い、不斉吸着剤としての応用を検討した。その結果、吸着質として用いたN-trifluoroacetylalanine ethyl esterのラセミ体(TEA-DL-Ala-OEt)に対して、左巻き過剰粒子のCMSはTFA-D-Ala-OEtとより相互作用をした。一方、右巻き過剰粒子のCMSはTFA-L-Ala-OEtとより相互作用をするという結果が得られた。すなわち、CMSは光学分割能を示したといえる。エナンチオマー過剰率は現段階ではわずかな値しか得られていないが、左巻き粒子と右巻き粒子とで逆の選択性を示しており、確かに光学分割能を有していることがわかり、CMSの不斉吸着剤としての応用の可能性を示すことができた。
Foxc転写因子と糸球体硬化症

コンディショナルノックアウトマウスを作製してFoxc1とFoxc2(Foxc1/2)の腎臓における役割を解析した。Foxc2を腎発生の初期から欠損するマウスでは、腎形成が阻害される(低形成腎)と共に糸球体嚢胞が観察された。ポドサイト形成の初期からFoxc1/2の双方を欠損するマウスでは、生後2週目に高度なタンパク尿が認められた。誘導型Creにより、生後8週目からFoxc1/2を欠損するマウスでは、12週で高度なタンパク尿が認められ、16週には硬化糸球体が認められた。以上のことからFoxc1/2は腎発生のみならず、ポドサイト機能の維持にも重要な役割を果たすことが明らかとなった。本研究は、ポドサイトに限局して高発現する転写因子Foxc1とFoxc2に着目し、増殖不可能なポドサイトを維持する機構とその破綻による糸球体硬化症の発症および進展機序を明らかにすることを目的とする。Foxc1とFoxc2の片方のアリルがそれぞれ欠失するダブルヘテロノックアウトマウス(Foxc1+/-; Foxc2+/-)では、重複腎、糸球体嚢胞や糸球体係蹄の形成異常が散見された。嚢胞を形成する糸球体において、ボーマン嚢と尿細管との連絡はきちんと保たれており、尿細管が欠落した腎小体に尿が蓄積し、それによって糸球体嚢胞が形成されるのではないと考えられた。また、糸球体係蹄の形成異常は血管内皮細胞の糸球体への陥入の抑制によることを示唆する結果が得られた。Foxc1やFoxc2ノックアウトマウスの胎生致死を回避するため、ポドサイトでのみCreリコンビナーゼを発現するNephrin-Creマウスを用いて解析を行っている。Foxc1をポドサイトで欠失するNephrin-Cre; Foxc1 loxP/-マウスでは、生後1年が経過しても腎の異常は確認できなかった。Foxc2の片方のアリルをさらに欠失させたNephrin-Cre; Foxc1loxP/loxP; Foxc2 +/-においても、生後6か月が経過した現在も、尿タンパクや腎組織の異常は確認されていない。一方で、Foxc2を組織特異的に欠失させるためのFoxc2 loxPマウスの作製も順調に進み、Nephrin-Creマウスとの交配を開始している。また、誘導型Creを全身で発現するマウスや、腎発生の初期からCreを発現するPax2-Creマウスの導入を終了し、各loxPマウスと交配している。ポドサイトは高度に分化した細胞であり増殖再生することができないため、一度傷害を受けて失われると補充が効かない。したがってポドサイト傷害は糸球体硬化の進行において中心的な役割を担っており、この細胞を保護することが慢性腎不全の進行を抑制するためのカギである。本研究では、ポドサイトに限局して高発現する転写因子Foxc1とFoxc2に着目し、ポドサイト機能維持の機構と糸球体硬化症の発症および進展機序を明らかにしていく。昨年度には、Foxc1-Foxc2ダブルヘテロマウス(Foxc1+/-; Foxc2+/-)の表現型解析の詳細を報告した。今年度は、ポドサイト特異的にFoxc1を欠失しさらにFoxc2をヘテロ欠失するマウス(Nephrin-Cre; Foxc1 loxP/loxP; Foxc2 +/-)が、生後1年で尿タンパクを呈し尿円柱を生じることが明らかになった。マイルドながらも糸球体硬化を呈する個体も認められた。また、Foxc2 loxPマウスとNephrin-Creマウスとの交配では、現在までに腎障害は認められていないので、Foxc1 loxPマウスとの交配も開始した。この交配により、ポドサイトでFoxc1とFoxc2の両方を欠失するマウスNeprin-Cre; Foxc1 loxP/loxP; Foxc2 loxP/loxPが得られるので、尿タンパクの出現がいつ起こるか注意深く観察していく予定である。腎発生の初期から腎臓でFoxc2を欠失させたマウス(Pax2-Cre;Foxc2 loxP/loxP)は、低い確率でしか出生せず、生まれてもすぐに亡くなってしまった。しかし、このマウスでは新生仔の腎臓が低形成となっており、尿細管の伸長が遅れていることがその原因であると推察された。また、ボーマンのうの拡張を伴ういわゆるのう胞糸球体が散見された。以上の結果を論文化した。生後8週になってからタモキシフェンの投与によってCre活性を誘導し、Foxc1とFoxc2を欠失させたマウス(Rosa26-CreERT2; Foxc1 loxP/loxP; Foxc2 loxP/loxP)では、タモキシフェン投与後4週で明らかな尿タンパクが認められ、8週では糸球体硬化が認められる個体も散見された。

タンパクによる尿円柱や過剰な再吸収によるとみられる尿細管のProtein dropletsが認められ、ポドサイト傷害による大量の尿タンパクが発生したことが確認された。また、ポドサイト傷害の程度がFoxc転写因子の濃度に依存することと、ポドサイトの機能維持にはFoxc2がより重要であることも確認された。ポドサイトでFoxc1とFoxc2を欠失させたマウス(Nephrin-Cre; Foxc1 loxP/loxP; Foxc2 loxP/loxP)でも同様なポドサイト傷害が確認されている。当初予定していたマウスの作成は終了し、実験や解析に利用可能となっている。本研究は、ポドサイトに限局して高発現する転写因子Foxc1とFoxc2に着目し、ポドサイト機能維持の機構と糸球体硬化症の発症および進展機序を明らかにしていくことを目的とする。生後8週になってからタモキシフェンの投与によってCre活性を誘導し、Foxc1とFoxc2を欠失させたマウス(Rosa26-CreERT2; Foxc1 loxP/loxP; Foxc2 loxP/loxP)では、タモキシフェン投与後4週で明らかな尿タンパクが認められ、8週では糸球体硬化が認められる個体も散見されたことを昨年度に報告した。タンパク性の尿円柱や過剰な再吸収によるとみられる尿細管のProtein dropletsが認められ、ポドサイト傷害による大量の尿タンパクが発生したと思われた。光顕レベルではポドサイトの空胞変性が確認され、この細胞が激しく傷害されていることを示した。電顕では、光顕で正常に見えるポドサイトにおいても、足突起の消失やMicrovillous transformationといった傷害が起こっていることが明らかとなった。また、ポドサイト傷害の程度がFoxc1/2の濃度に依存することと、ポドサイトの機能維持にはFoxc2がより重要であることが判明した。遺伝子発現プロファイルの比較により、Foxc1/2がPodocinやCxcl12などのポドサイトの機能発現に重要な因子の発現を担っていることが示唆された。ポドサイトでFoxc1とFoxc2を欠失させたマウス(Nephrin-Cre; Foxc1 loxP/loxP; Foxc2 loxP/loxP)は離乳期まで生存するマウスがほとんどいなかった。生後2週目で、尿を採取し電気泳動を行うと、多量の非選択的蛋白尿が生じていた。これらのマウスの組織像も、先に述べた誘導型Creマウスと同様の所見が得られた。以上の結果を論文化した。当初予定していた実験はすべて終了し、他の転写因子との関連について検討する段階に入っている。本研究は、ポドサイトに限局して高発現する転写因子Foxc1とFoxc2に着目し、ポドサイト機能維持の機構と糸球体硬化症の発症および進展機序を明らかにしていくことを目的として実施した。昨年度までの検討で1生体でFoxc1とFoxc2を欠失させたマウスにおいても、ポドサイト特異的にこれらの因子を欠失させたマウスにおいても、高度の尿タンパクが出現すること、2ポドサイト傷害の程度がFoxc1/2の濃度に依存すること、3ポドサイトの機能維持にはFoxc2がより重要であること、4Foxc1とFoxc2がPodocinやCxcl12などのポドサイトの機能発現に重要な因子の発現を担っていることが明らかになり、論文化したことを報告した。本年度は、Foxc1とFoxc2がポドサイトで形成する転写因子ネットワークを解析するために、ChIP-Seq解析による検討に着手した。まず、マグネットビーズを用いてマウス成体腎から単離した糸球体を培養し、初代培養ポドサイトを得た。
多年生草本植物における生活史戦略の適応進化に関する数理的研究

生育段階構造と密度依存性を表現できるモデルを用いて、植物の生活史の進化および動態に関する研究が行われた。主なテーマは、(1)上記モデルにおける突然変異種の侵入可能条件の解析、(2)上記モデルを用いた個体群動態の解析手法の開発、(3)繁殖回数の進化、(4)種子繁殖・栄養繁殖への最適分配戦略、である。(1)の成果については、初年度にMathematical Biosciences誌に、また次年度に数理解析研講究録に発表された。(2)に関しては、温帯林の毎木調査のデータを利用して、密度依存性を表現できるモデルを用いた個体群動態の解析の手法を開発した。その成果は現在Journal of Ecologyに投稿されている。次に、(1)の侵入可能条件を用いて、(3)のテーマについて解析を行った。この結果は英文論文としてまとめられ、現在Journal ofTheoretical Biologyに投稿中である。また、(1)の侵入可能条件を用いて、(4)のテーマについても解析が行われた。この結果もまた英文論文としてまとめられ、現在Evolutionに投稿中である。この解析結果を利用して林床植物ヤブレガサの最適分配戦略を求めたところ、栄養繁殖にだけ投資するのが最適であるという結論が得られた。この結果は和文論文にまとめられ(論文題目「推移行列モデルを用いた生活史進化の解析」)、個体群生態学会会報に発表される予定である。また、植物の個体群動態を解析するためによく用いられてきた拡散方程式モデルと今回の解析で用いられている推移行列モデルの間の関係について研究され、その結果がJournal of Mathematical Biologyに発表される予定である。2年間のこれら一連の研究による成果は、発表論文2編、発表予定論文2編、投稿済み論文3編、分担執筆により図書の一部となっている発表論文1編であった。植物の生活史の適応戦略の研究は、Caswell(1978,1982)の先駆的研究以来、推移行列モデルを用いて何例か行われてきている。しかし、いずれの研究においても、植物に特徴的な成長の可塑性や運動能力の欠如を考慮したものではなかった。本研究では、その欠点を克服するために、成長の可塑性を表現できるモデルを用いると共に、運動能力の欠如によって引き起こされる密度依存性を表現できるモデルを開発した。さらに、生活史の適応進化を解析するために、突然変異種の侵入可能性条件を求めた。この条件を用いて、栄養繁殖率と多回繁殖性の関係について解析した。この結果は、Mathematical Bioscience誌(1992)に発表された。この論文では、(1)栄養繁殖率が高い種は多回繁殖性を強め、逆にそれが低い種は一回繁殖性に近づいていく(2)種子生産要する資源量が少ない種では、一回繁殖型にやすい、ことが見いだされた。また、「繁殖回数の進化に与える密度効果の影響の解析」についても、既に解析が終了し、現在平成5年度内の論文発表を目標として、American Naturalist誌に投稿中である。この解析では、密度効果を受ける個体群における生活史の進化条件と密度効果を受けない個体群における生活史の進化条件とが比較されている。その結果、前者の個体群では、繁殖回数の進化は生産種子数と繁殖個体の生存率にだけ依存するのに対して、後者の個体群では、幼植物時の生存率にも依存することが示された。さらに、繁殖回数の進化に関するこれらの内容を総説的にまとめた論文(「植物の生活と数学モデル」)が、北大出版会より刊行される著書の中に投稿され、現在印刷中である。初年度の研究に引き続き、生育段階構造と密度依存性を表現できるモデルを用いて、植物の生活史の進化および動態に関するいくつかのテーマを解析した。

一つのテーマは、「密度効果と生育段階構造が繁殖回数の進化に与える影響の解析」である。解析の結果、生育段階構造は繁殖回数の進化にあまり大きい影響を与えないことがわかった。また、密度効果が強い個体群では繁殖回数の進化は生産種子数と繁殖個体の生存率にだけ依存するのに対し、密度効果の弱い個体群では幼植物時の生存率にも依存することが示された。その成果は現在Journal of Theoretical Biologyに投稿中である。もう一つのテーマは、「種子繁殖・栄養繁殖への最適分配戦略の解析」である。解析の結果、密度依存性が強い場合には、種子食の動物や実生個体を捕食する草食動物はその最適分配戦略に影響を与えないこと、幼植物段階の生存率が高い環境では栄養繁殖へのより高い投資が選択されることなどが示された。その成果は現在Evolutionに投稿中である。また、この解析結果を利用して林床植物ヤブレガサの最適分配戦略を求めたところ、栄養繁殖にだけ投資するのが最適であるとう結論が得られた。この結果は和文論文にまとめられ(「推移行列モデルを用いた生活史進化の解析」)、個体群生態学会会報に発表される予定である。他にも、上記のモデルを用いて個体群動態を解析する新たな手法が開発され、その方法を記した論文がJournal of Ecologyに投稿されている。また、植物の個体群動態を解析するためによく用いられてきた拡散方程式モデルと今回の解析で用いられている推移行列モデルの間の関係について研究され、その結果がJournal of Mathematical Biologyに発表される予定である。
研究開発・製品開発組織における知識とモチベーションのマネジメント

平成20年度は当初計画のとおり研究を進めた。本研究は企業の研究者や技術者のモチベーションの分析と、彼らの知識を組織内で共有・活用するマネジメント知見を得ることが目的である。年度当初、日本の製造業企業でのサーベイとインタビュー調査によるデータ収集・分析を行った。調査では特に製品開発組織に所属するミドル・マネジャーを対象にした自律性に着目したインタビューを実施し、サーベイ調査の結果を補完した。研究はおおむね計画通りに進捗しているが他の企業での調査が研究の発展に必要である。現在はこの開拓と実務家との交流を活発化させている。今後はこれらをふまえた成果発信に努める予定である。
トーラスプラズマにおける磁気島の発生・成長機構の解明および能動的制御に関する研究

新古典テアリングモード(NTM)に起因する磁気島に着目し、その発生・成長過程における構造を解析した。その結果、「NTMが検出限界以下の幅から徐々に成長する」場合に加え、NTM発生位置における別の崩壊現象に誘起される場合があることがわかった。後者は前者に比べ発生時の規格化ベータ値(圧力に関連)が高く、NTM発生場所での圧力勾配も高いことがわかった。また、磁気島の回転が停止する際の磁気島幅は停止から再回転する際の磁気島幅より大きい(ヒステリシスがある)ことがわかった。また、磁気島の能動的制御装置(2周波数ジャイロトロン)の開発を進め、定格出力に向けよい見通しを得た。トーラス形状の磁場閉じ込め核融合装置では、磁力線が「磁気面」を形成しさらにその磁気面が同心円状の構造を持つようにすることで磁気面に垂直な方向の熱や粒子の拡散を抑えプラズマを閉じ込める。核融合プラズマにおいては磁気面が結合することにより磁気島と呼ばれる構造が形成される。磁気島が現れるとその部分での閉じ込め性能が劣化した結果プラズマの圧力が低下し、さらにトカマクにおいてはディスラプションに至る可能性がある。このことから、磁気島の発生・成長機構の解明し能動的制御のための手法を確立することが重要である。平成22年度は主にJT-60Uの新古典テアリングモード(NTM)に起因する磁気島がプラズマ回転に与える影響を調べた。本研究では磁気島の大きさを変えるために、磁気島近傍での電子サイクロトロン電流駆動の位置をわずかに変えることによりNTM磁気島を能動的に不安定化または安定化させた。その結果、磁気島幅が増加にするにつれモード周波数が減少する(トロイダル回転速度が減少することに対応)ことがわかった。また、その変化はf/f0=0.5*[1-(B/B0)]^(0.5)の形の関数でフィッティングできることを明らかにした。ここで、f、Bはそれぞれモード周波数、磁場揺動強度(磁気島幅の0.5乗に比例)であり、f0、B0は係数である。さらに、モード周波数が「磁気島幅がゼロのときの値」の半分までに減少するとそれまでのモード周波数の1/5程度までに急激に減少することがわかった。この状態で磁気島幅を徐々に減少させるとある磁気島幅でモード周波数が急激に増大することを観測した。このことは、この「遷移現象」が起きる磁気島幅にヒステリシスがあることを示している。プラズマ回転は抵抗性壁モードなどの不安定性を抑制するために重要と考えられていることから、このような遷移現象を回避することが重要であることが明らかとなった。本研究での目標は、(1)JT-60Uを初めとするトカマク型装置、およびヘリカル型装置における磁気島(磁気島に類似した現象も含む)の挙動の解明、(2)JT-60SAなどの将来の装置における磁気島の予測・制御装置の開発、(3)磁気島を能動的に制御することが可能な装置の1つである電子サイクロトロン加熱/電流駆動装置の開発から構成される。本年度の本予算枠では、(1)と(4)について研究を行った。(3)に関連して、JT-60SAにおける新古典テアリングモード(NTM)安定化について検討した。その結果、110GHzまたは138GHzの電子サイクロトロン(EC)波を7MW入射することにより、NTM発生位置において自発電流密度と同程度以上のEC電流駆動が可能であり、効果的なNTM安定化や電流分布制御が可能であることがわかった。また、実機での発振実証として、2周波数ジャイロトロンの開発運転を開始し、110GHzで1MW、138GHzで0.5MW(発振幅はいずれも0.1秒)の発振に成功し、2周波数発振に向けた見通しが得られた。既存の110GHzジャイロトロンを用いた開発では、1MW出力で70秒、1.4MW出力で9秒間(いずれも110GHz帯の同パワーでは世界最長)の維持に成功した。これらの成果を第24回IAEA核融合エネルギー会議(米国・サンディエゴ)およびプラズマ・核融合学会第29回年会(福岡・春日)で発表した。(1)に関連して、米国・ジェネラルアトミックス社のDIII-DにおけるNTM磁気島について検討した。DIII-Dにおいては、JT-60Uと同様に、NTM磁気島が成長するとともにモード周波数が減少することが観測されている。また、モード周波数が減少した後は、周波数が時間的に不規則に変化する点も似ている。計測データによるとプラズマ回転が不規則になっている可能性があることがわかった。

今年度の研究項目は、(1)複数のトカマク型装置における磁気島の比較、(2)JT-60SAなどの将来の装置における磁気島制御に向けた予測計算、(3)磁気島の能動的制御が可能な装置の1つである電子サイクロトロン(EC)加熱/電流駆動装置の開発から構成される。(1)に関連して、米国・ジェネラルアトミックス社のDIII-Dトカマクにおける磁気島の解析を行った。DIII-Dではm/n=2/1(mはポロイダルモード数、nはトロイダルモード数)の磁気島を外部磁場摂動によりトロイダル方向に回転させた際、ミリ秒オーダーで急速に起こる崩壊現象が観測された。解析の結果、崩壊はm/n=2/1および3/2の共鳴面付近で最も早く観測されており、また、崩壊直前にm/n=3/2の磁気島が成長していることがわかった。このことから崩壊現象は2つの磁気島の結合により現れた可能性がある(JT-60Uでは観測例なし)。また、磁気島の構造を解析した結果、磁気島の回転が低下するにつれて磁気島が歪んで見えることがわかった。同様の現象は過去にJT-60Uにおいて観測されており、このことはEC波のパワー変調により磁気島を安定化する際にはこの歪みを考慮に入れる必要があることを示唆している。(2)に関しては、JT-60SAおよびITERにおける電子サイクロトロン電流駆動(ECCD)特性の計算を行った。前者においては、各種の平衡において駆動電流量を最大化するための入射条件を明らかにした。後者においては、水平ランチャーからの新しいEC波入射範囲に基づくECCD特性を計算した結果、新しい駆動範囲により電流駆動位置が拡大できることがわかった。(3)に関しては、2周波数ジャイロトロンの開発を進め、110GHzと138GHzの周波数において出力1MW、出力時間10秒を達成し、最終目標(1WM、100秒)に向けて明るい見通しを得た。本研究での目標は、(1)JT-60Uを初めとするトカマク型装置、およびヘリカル型装置における磁気島(磁気島に類似した現象も含む)の挙動の解明、(2)JT-60SAなどの将来の装置における磁気島の予測・制御装置の開発、(3)磁気島を能動的に制御することが可能な装置の1つである電子サイクロトロン加熱/電流駆動装置の開発から構成される。本年度の本予算枠では、(1)に関連してJT-60Uの新古典テアリングモード(NTM)が発生・成長する過程を解析した。ほぼ同一の実験条件の下で、NTM発生時の磁場揺動や電子温度揺動の分布を解析した結果、約80%の放電においては明確な電磁流体力学的不安定性がなくてもNTMが発生し、残り20%においてはNTM発生位置における小コラプスによりNTMがトリガーされていることがわかった。前者の場合は、NTMは周期的な振動から成長し、振幅が大きくなるとモード周波数が急激に減少する(「モードロック」)のに対し、後者の場合は、小半径の10%程度以上の幅をもつ磁気島が発生直後から現れ、回転周期も不規則となることがわかった。この小コラプスは以前JT-60Uで観測されたBarrier Localized Mode(BLM)であると考えられる。BLMがNTMをトリガーする現象は今回初めて明らかになった。BLMによりトリガーされたNTMは周波数が不規則に変化することから、電子サイクロトロン(EC)波のパワー変調による安定化が困難となる。このことからBLMを回避することが重要であることが示唆された。この成果をPlasma and Fusion Research誌に投稿した。本論文は査読の結果受理された。トカマク装置JT-60Uにおける磁気島の特性に関する解析が進展した。
ミトコンドリアタンパク質の交通管制機構とその改変

ミトコンドリアタンパク質の交通を管制するトランスロケータについて,メンテナンス因子Tam41を発見,受容体Tom20とTom22による協調した「行き先シグナル」認識機構の解明,TOM40複合体とTIM23複合体の連携機構の解明,インポートモータ補助因子Tim15の構造決定,外膜行きシグナルとマトリクス/内膜行きシグナルの優位性決定機構の解明,外膜トランスロケータのサブユニットTom22の相互作用マッピング,受容体Tom20の行き先シグナル認識能の改変を行った。真核生物の細胞内でタンパク質は,生体膜で仕切られた区画(オルガネラ)に集合して半自律的システムをつくり,複雑な細胞機能を分散管理している。細胞にはこうしたタンパク質群の移動や集合を実現し,維持する巧妙な交通管制システムが存在する。オルガネラを生合成し,維持するためには,細胞内で合成される膨大なオルガネラタンパク質を正確にオルガネラに移行させ,オルガネラ内の適切な部位に配置し,正しい高次構造,複合体形成,膜配向を実現しなければならず,この役割を担うのが各オルガネラ膜上のトランスロケータである。トランスロケータは,基質タンパク質自身に書き込まれた「行き先シグナル」を読み取り,オルガネラ膜を舞台とするタンパク質の適切な配置を実現する。本研究では,申請者らがこれまで行ってきた研究を発展させて,ミトコンドリアの多様なトランスロケータの全貌と動態を緊急に把握し,続いて各トランスロケータの作動原理の一般性と特異性を明らかにし,トランスロケータ間の連係プレーによるタンパク質の交通管制のメカニズムの全貌を解明することを目指す。さらにそれらの知見に基づき交通管制システムを人為的に改変し,オルガネラへのタンパク質の流れをバルクで操作することを試みるミトコンドリアタンパク質の交通を管制するトランスロケータについて,メンテナンス因子Tam41を発見,受容体Tom20とTom22による協調した「行き先シグナル」認識機構の解明,TOM40複合体とTIM23複合体の連携機構の解明,インポートモータ補助因子Tim15の構造決定,外膜行きシグナルとマトリクス/内膜行きシグナルの優位性決定機構の解明,外膜トランスロケータのサブユニットTom22の相互作用マッピング,受容体Tom20の行き先シグナル認識能の改変を行った。ミトコンドリア内膜トランスロケータTIM23複合体のモータ因子mtHsp70の補助因子であるTim15の機能を明らかにするために,Tim15のコアドメインを大腸菌に発現・調製し,そのNMR構造を決定した。決定されたNMR構造はL字型で,表面電荷の分布は不均等であった。そこで電荷分布をもとに様々な残基を置換し,変異Tim15のみを発現する酵母株の増殖を調べることにより,Tim15の機能に必須のアミノ酸残基を同定した。さらに,mtHsp70の溶解度(Tim15が発現しないとmtHsp70は凝集する),大腸菌細胞内で変異Tim15を発現した時のmtHsp70の溶解度を調べたところ,これらのアミノ酸残基が置換すると,mtHsp70の溶解度も低下することが分かった。したがって,Tim15の機能はmtHsp70との相互作用と関連し,その相互作用はmtHsp70を可溶性に保つ働きがあることが分かった。ミトコンドリアのマトリクスや内膜へ移行するタンパク質は外膜トランスロケータTOM40複合体によって外膜を通過後,内膜のトランスロケータTIM23複合体により内膜を通過,または内膜に組み込まれる。TIM23複合体サブユニットTim23とTim50はともに膜間部にドメインを持ち,前駆体の受容体として働く機能が提案されている。Tim23およびTim50の膜間部ドメインはコイルドコイルを作って相互作用する可能性があるので,両者のコイルドコイル領域に変異をいれて両者の相互作用を壊すような変異体を多数作成し,膜間部におけるTim23-Tim50相互作用とインポート機能との関係を解析中である。TIM23複合体サブユニットTim23とTim50はともに膜間部にドメインを持ち,コイルドコイルを作って相互作用する。そこで両者のコイルドコイル領域の各種変異体を多数作成し,インポートへの影響を解析した。その結果,膜間部におけるTim23-Tim50相互作用は,外膜から内膜への前駆体の受け渡し,およびマトリクス側でのモータ機能の制御という2つの重要な役割を担うことが明らかになった。Tom40やポリンなど,ミトコンドリア外膜のβバレル型膜タンパク質は,外膜のTOM40複合体を通っていったん膜間部に移行した後,外膜のSAM/TOB複合体を介して外膜に組み込まれる。しかしこうしたアセンブリー経路が,どのような仕組みでマトリクスや内膜に向かう経路から分岐するのか,small Timタンパク質の具体的機能は何かなど,まだ不明な部分が多い。そこでマトリクスや内膜,膜間部に移行する前駆体部分をTom40のN端に付加し,ミトコンドリアへのインポートに際してどちらの仕分けシグナルが優勢になるかを解析した。マトリクス行きシグナルは,Tom40部分の外膜への経路より優勢であるが,Tom40部分が内膜を通過できず,中間体として留まる。

一方内膜行きシグナルの場合は,Tom40部分はSAM/TOB複合体と相互作用するステップまでは進めるが,その先のステップに進めなくなる。内膜行きシグナルが切断される膜間部行きシグナルの場合は,Tom40部分は正常に外膜に組み込まれる。またsmall Timタンパク質はTom40部分の外膜透過を駆動する機能と,その後SAM/TOB複合体に正しく受け渡す機能の,2つの役割があることも明らかになった。(1)ミトコンドリア外膜から内膜へのタンパク質移行の仕組みの解明ミトコンドリアのマトリクスや内膜へ移行するタンパク質は,TOM40複合体によって外膜を通過後,内膜のTIM23複合体により内膜を通過,または内膜に組み込まれる。両複合体の相互作用はこれまで見いだされていなかったが,今回,in vivo部位特異的光架橋により,TOM40複合体のTom22とTIM23複合体のTim50,Tim23の相互作用を検出した。両者の相互作用は一時的,もしくは動的なものであるため,光架橋のような方法を使わないと見いだしにくかったと考えられる。外膜と内膜のトランスロケータが動的に相互作用することにより,外膜から内膜へと効率的に基質タンパク質が受け渡されることが明らかになった。(2)受容体Tom20の改変ミトコンドリアタンパク質のプレ配列受容体であるTom20を改変し,野生型Tom20には依存せず,改変Tom20にのみ依存してミトコンドリアに取りこまれるような新規プレ配列を選別する酵母スクリーニング系の構築を試みた。酵母ミトコンドリアのCoxIV(シトクロム酸化酵素のサブユニット)の遺伝子欠損株は呼吸能がないが,ここにプラスミドでCoxIV前駆体の遺伝子を供給すると,発現産物がミトコンドリア内に移行し,シトクロム酸化酵素に組み込まれるため呼吸能が回復する。ここで,Tom20を改変Tom20に置き換えると,CoxIV前駆体のプレ配列が認識されないため,CoxIVはミトコンドリアに移行できず,呼吸能は回復しない。プラスミドで供給するCoxIV前駆体遺伝子のプレ配列部分にランダムに変異を入れ,この中から,CoxIV遺伝子欠損株の呼吸能を回復できるものを選別することで,改変Tom20に認識される変異プレ配列の探索を試みた。1.ミトコンドリア外膜トランスロケータサブユニットTom22の相互作用マッピングミトコンドリア外膜のトランスロケータTOM40複合体の中心因子であるTom22の様々な部位に,in vivoで部位特異的に,光架橋性アミノ酸BPAを導入した。紫外線照射によりBPA近傍のタンパク質との架橋を行い,架橋産物を抗体で検出した。さらにTOM40複合体に基質である前駆体を膜透過中間体として蓄積させ,Tom20の相互作用マッピングのパターンがどのように変化するかを解析した。またTom22がTOM40複合体に組み込まれる前に,サイトゾルのシャペロン等の因子と一時的に相互作用することも見いだした。2.受容体Tom20の改変ミトコンドリアタンパク質のプレ配列受容体であるTom20を改変し,野生型Tom20には依存せず,改変Tom20にのみ依存してミトコンドリアに取りこまれるような新規プレ配列を選別する酵母スクリーニング系の構築を試みた。