hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機反応と酵素反応のワンポット化による高分子グライコマテリアルの最短合成

タンパク質に付加されている糖鎖と生理機能の相関関係を研究するためには、糖鎖構造が均一である糖タンパク質を作製する必要がある。抗体医薬品のような大きな糖タンパク質では、有機合成手法だけでは調製が困難であり、糖鎖リモデリング法(化学酵素合成法)の製法確立が望まれていた。前年度までに、本基盤研究を遂行するために必要不可欠な糖オキサゾリンの一段階合成を確立することができた。そこで、最終年度においては、均一な糖鎖をもつ糖タンパク質合成を試みた。その結果、(公財)野口研究所、株式会社免疫生物研究所との共同研究により、糖鎖リモデリング法により、糖鎖を均一化した抗HER2ヒト化モノクローナル抗体(以下、「トラスツズマブ」という)を創製することに世界で初めて成功した。本研究で開発した水溶液中、無保護糖から1段階でオキサゾリン体を合成する手法を用いて、まず数種類の均一糖鎖オキサゾリン体を調製し、次いでカイコから調製したトラスツズマブから均一なアクセプターを作製し、そしてこの両者を糖鎖合成酵素にて反応させることにより、糖鎖均一化トラスツズマブを創製する事に成功した。抗体のFc領域に結合している糖鎖にコアフコースが欠落しているとADCC活性が高まることが知られいるが、糖鎖均一化トラスツズマブでは6種のコアフコースのない糖鎖均一化トラスツズマブを作製し、ADCC活性を測定したところ、糖鎖により、それぞれ活性に差があることが判明した。今後更に糖鎖分解酵素のライブラリーを充実させ、種々の糖タンパク質で同様の糖鎖リモデリング研究を積み重ねることにより任意の均一な評価用糖タンパク質を作る有用な手段を提供していくことにより、トラスツズマブ以外の抗体医薬品の糖鎖均一化への応用が期待できる。有機反応と酵素反応のワンポット化を指向した糖オキサゾリン中間体を基盤とする基礎研究を行った。市販のSGオリゴ糖に各種糖加水分解酵素を順次作用させることにより,還元末端にN-アセチルグルコサミンをもつ各種オリゴ糖の調製を行った。得られた2-アセタミド-2-デオキシ糖に水溶性2ークロロイミダゾリニウム塩を作用させると,対応する糖オキサゾリンが95%以上の高収率で生成すること見出した。また,酵素活性の制御のためのモデル物質として,キトオリゴ糖含有熱応答性高分子を合成した。これらの結果を踏まえて,均一な糖鎖を有する糖タンパク質やヒトミルクオリゴ糖をワンポットで高収率で化学酵素合成することに成功した。本研究の中核をなす糖オキサゾリン供与体の合成において、水中、一段階で合成可能な画期的な手法を開発することができた。このことにより、これまで、糖供与体と配糖化反応を、それぞれ、有機溶媒と水溶媒を用いて行わなくてはならなかった状況を、出発原料から生成物までを水溶媒中のみで行えるようになった。以上のことから、当初の計画通り順調に進行していると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。糖鎖工学高分子合成本研究の第一目標である糖タンパク質の合成へ向けて、国内の他の研究者と協力しながら、推進する。具体的には、抗体医薬の画期的な合成法の確立に向けて、Nー結合型オリゴ糖のオキサゾリン誘導体の合成、ならびにそれを供与体とする抗体タンパク質への糖鎖の付加を行う予定である。合成標的化合物である糖タンパク質のオリゴ糖部分であるSGオリゴの調製を予定通り実施することができた。
ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達における残された課題への挑戦と創薬への試み

骨髄増殖性腫瘍(MPN)患者ではJAK2のJH2領域V617F変異がみられるが、その異常増殖や腫瘍形成に至る機序を解析した。(1)JAK2V617変異体発現細胞において、c-Mycを介したODCの活性化やAurkaの活性化、ならびにFANCCの活性化を見いだした。ODCの阻害剤はin vivoでの腫瘍形成を抑制した。(2)変異体細胞はCDDPのような抗がん剤抵抗性がみられたが、ファンコニ因子FANCCの活性化がその理由と考えられた。(3)フラーレン誘導体変異体細胞の増殖と造腫瘍性が抑制されることを明らかにし、MPN治療薬となる可能性を示した。本年度は、JAK2V617F変異体による異常増殖能の獲得ならびにin vivoにおける造腫瘍性に機序の解析を進めるとともに、種々の抗がん剤耐性の機序の解析を行った。得られた結果は、(1)V617F下流シグナルの中で、c-Mycの関与とその標的分子としてODCに着目した。ODCの阻害剤であるDFMOはV617F発現細胞のin vitroでの増殖ならびにin vivoでの腫瘍形成は著明に抑制した。すなわち、V617変異体による下流シグナルとしてc-Myc→ODCの関与が明らかにするとともに、ODC阻害剤による異常増殖の制御が可能であることを示した。(2)V617F発現細胞は、CDDP、MMCなどの抗がん剤に耐性を示した。この耐性機序を解析するために、V617F発現細胞に特異的に発現している遺伝子群のうち、ファンコニタンパク質のFANCCに着目した。FANCCはFANCD2のモノユビキチン化とFoci形成を誘導することにより、抗がん剤耐性を誘導していることを明らかにした。(3)JAK2 V617F変異体の異常増殖を著明に抑制する薬剤として、pyrrolidinium fullereneを見いだした。このfullerene誘導体はASK1の活性を抑え、JNK経路(ASK1-MKK4/7-JNK)を抑制することによってV617F変異体にアポトーシスを誘導した。pyrrolidinium fullereneの活性構造の検討から、pyrrolidiniumへの最適な置換基をもつ誘導体(2-4,N-4))を決定した。以上の結果は、平成25年26年3月にかけて英文原著論文3報にまとめ、発表した。JAK/STAT系はサイトカイン・増殖因子のシグナル系として重要であり、この経路を標的とする分子標的薬はがんの増殖、免疫炎症の制御に重要と考えられる。我々はこれまでに、JAK2V617F変異体発現細胞が増殖因子非依存的に増殖するのみならず、in vivoで腫瘍形成することを明らかにしてきたが、そのシグナル系の機序は不明である。今回、その機序について詳細に検討することをめざした。その結果、(1) JAK2分子内のリン酸化部位間のクロストークとJAK2活性化における制御機構を解明するこのために、CE-MS/MS解析により新たなTyrリン酸化ペプチドの同定を試みた。新たなリン酸化ペプチドの同定法として、CM-MSを用いたHAMMOC法(鶴岡先端生命研究所杉山研究員との共同研究)を用いて解析を行った。(2) JAK2 V617F変異体発現細胞での恒常的活性化と造腫瘍性を解析するために、下流のシグナル分子と実行因子を解析した。その結果、JAK2/STAT5の標的分子として、Akt, Aurora kinase, c-Myc, ODC, Pim-1,2, FANCC, SOCS, CISなどの分子を同定した。これらの分子のin vitroでの増殖に及ぼす効果の検討、ならびにin vivoでの腫瘍形成における役割を検討した。さらに、(3) JAK2V617Fの恒常的活性化を抑制する新規薬物の探索研究として、フラーレン誘導体ならびに天然物由来フラボン類に著明な増殖抑制と抗腫瘍効果のあることを見いだした。本研究は、JAK/STAT系のシグナル系における新たなリン酸化ペプチドの探索とアダプター分子の同定により、このシグナル系の増殖異常の解析になるとともに、新たな制御物質の探索として重要と考えている。JAK2は、IL-3/Epoなどサイトカインシグナル分子として重要である。我々は、骨髄増殖性腫瘍(MPN)患者にみられるJH2領域V617F変異体発現細胞が異常増殖や腫瘍形成に至ることを明らかにしたが、その機序は必ずしも明らかでなかった。本研究では、(1)JAK2の活性化にはSTAT5のリクルートが必要であり、とくにEpoRのY343のリン酸化が必要であることを示した。(2)JAK2V617

変異体発現細胞では、PI3-kinase/Aktの構成的な活性化が起きており、Aktは転写因子CREBをリン酸化してBcl-XLの発現し、またGSK-3βを不活化することで、proapoptoticタンパクMcl-1の分解を抑制し、アポトーシス経路を抑制することを明らかにした。(3)STAT5下流シグナルでは、c-Mycを介したODCの活性化やAurkaの活性化、ならびにFANCCの活性化の関与を見いだした。とくに、c-MycからのODC経路は重要であり、ODC阻害剤であるDFMOにより、in vivoでのJAK2V617による腫瘍形成が著明に抑制された。(4)JAK2V617F細胞ではCDDPやMMCのようなDNA架橋性抗がん剤に対して抵抗性がみられる。この際、STAT5活性化によりFanconi anemia (FA)構成タンパクFANCCの発現が亢進していて、核内でのFANCD2のモノユビキチン化とこれによるFoci形成が認められた。これがCDDPやMMCに対する薬剤抵抗性の一因と考えられた。(5) JAK2V617F細胞の増殖抑制やアポトーシス誘導活性を指標として、フラーレン誘導体であるピロリジニウム型フラーレンがin vivoでの造腫瘍性を抑制することを明らかにした。すなわち、フラーレン誘導体がMPNの治療薬になる可能性を示した。免疫学、生化学平成25年度は本プロジェクトの2年目であるが、本研究で、JAK2変異体による異常増殖、造腫瘍性の機序を解析し、新たな知見が得られた。本知見は、平成25年26年3月にかけて英文原著論文3報にまとめ、発表することができた。さらに、本遺伝子異常による疾患の治療薬の開発をめざして、有用な薬物を見いだしており、大きな進展が得られた。今後さらに、JAK2 V617F変異体のもつ異常増殖、造腫瘍性ならびに抗がん剤耐性の機序の解析をすすめる。とくに、V617F変異体の作用に必要なEpo受容体のリン酸化部位の重要性を明らかにする。また、種々の天然物由来化合物のスクリーニングを進め、本遺伝子異常による骨髄増殖性腫瘍に対する適切な治療薬の開発をめざす。すでに、予備的な実験であるが、フラーレン誘導体やプロポリス由来化合物、シソ科植物ケカニア由来のテルペノイドなどの有効な成分を同定している。JAK2分子内のリン酸化部位間のクロストークについては、今後さらに、種々の非リン酸化ペプチドを作成して重要なリン酸化部位の検討が必要であり、現在実験をすすめているところである。また、新たなリン酸化ペプチドの同定法として、CM-MSを用いたHAMMOC法を用いて解析を行っているが、JAK2活性化における制御機構を解明するこのために、CE-MS/MS解析により同定された膨大なTyrリン酸化ペプチドの意味付けが必要であると考えており、現在その作業をすすめている。さらに、前年度に得られたフラーレンやフラボン類のin vitroでの活性がin vivoでも再現できるか、マウスモデルにおいて検証をすすめることが必要と考えている。「該当なし」
材料表面のナノ構造を利用した低温固相接合技術の探求と接合メカニズムの解明

本研究では、Dealloying法によるナノポーラス構造に限定することなく、新たな3次元ナノ構造形成技術に取り組み「トップダウン型」と「ボトムアップ型」のぞれぞれの手法を用いて作製した3次元ナノ構造の接合への適用可能性を探求し、固体表面3次元ナノ構造を利用した低温固相接合技術の確立を目指した研究を実施する。
骨格筋分化の運命を決定する高次クロマチン構造制御機構の解析

本研究では、分化に伴って発現するすべての遺伝子の発現制御、つまり、高次制御の全容解明を行うため、発生胚を含めたゲノムワイドな解析系を構築した。その結果、骨格筋分化の発生段階ではH3.3のマーキングが形成されたゲノム領域ではH3K27me3とH3K4me3の双極性修飾が形成されること、分化に伴って双極性修飾がいずれか片方に変化していくことが明らかとなった。またH3.1を強制的に取り込ませた場合、H3.3と異なりH3K27me3の修飾のみが形成されることが明らかとなった。以上のことからヒストンバリアントはヒストン修飾の選択性を決定することで分化制御を行ってることが明らかとなった。本研究では、骨格筋分化を前駆細胞より成熟した筋線維分化する各分化段階でのクロマチン構造を、ヒストン修飾、クロマチンリモデリングをはじめとする遺伝子座領域の局所的領域の高次クロマチン制御から遺伝子座の位置を解析する染色体構造に至る多くのスケールレベルで解析を行うことで、骨格筋分化の運命決定に関わる制御機構の解明を目指している。本年度は分化段階の詳細な分類を、マウス胚組織と培養細胞の両方を用いてRNAseqを用いた遺伝子発現プロファイリングにより行った。また次にマウス胚等の各骨格筋分化段階の核を用いた解析により、骨格筋特異的な遺伝子座の空間配置制御が、プロモーターやエンハンサー領域に限局して、未分化時に同調して起こり、分化に伴い消失することを明らかにした。更にこのプロモーター、エンハンサー領域に着目し、様々なクロマチンリモデリング因子への変異導入を行うことで遺伝子座集積現象に関与する分子の探索を行った。その結果Chd2クロマチンリモデリング因子を同定した。Chd2の骨格筋分化における機能解析を進めた結果、ヒストンバリアントH3.3を骨格筋遺伝子座へ選択的に取り込みを行っていることが明らかにした。興味深いことに、Chd2は単独では、DNA結合能を有しておらず骨格筋特異的な転写因子であり分化のマスター遺伝子であるMyoDが、キャリアーとして機能することで、選択的なゲノムへのリクルートメントが行われていることを突き止めた。これは従来転写因子として知られていたMyoDが、転写そのものではなく、ヒストン置換に関わることを示唆している。細胞分化初期の骨格筋分化において、遺伝子座が核内で集積するジーンクラスタリング現象を見出してきた。この形成は骨格筋のみならず、脂肪細胞や色素細胞等複数の細胞分化、特にクロマチンリモデリング因子Brg1の活性化に関わるものに多く見られた。クロマチンリモデリング因子の活性化を抑止した細胞では遺伝子近接現象が消失し、且つ骨格筋分化も抑制された。同様の現象がシグナル伝達経路依存的に脂肪細胞分化にも起こることが明らかとなり報告をした。そしてBrg1を起点とするジーンクラスタリング現象について更に解析を進めることとした。その結果、Brg1の活性化を抑制した場合、これまでの骨格筋分化で見受けられた知見同様に(1)分化初期に認められるジーンクラスタリングがおこらない、(2)その後RNA factoryの形成も阻害される、ことが明らかとなった。これは転写において、ジーンクラスタリングが転写そのものを制御しているわけではなく、転写開始以前になんらかの高次制御を行っていることを示唆している。本発見は、我々のこれまでの知見を別の発生分化系である脂肪細胞分化系で検証できたものである。そこで我々は、更にギガシークエンサーを応用した4Cを用いた効率的なアプローチを取り入れた。バイアスなしにゲノムワイドなジーンクラスタリング現象の把握が可能であり、現在広く取り入れられている解析である。解析の結果、分化段階特異的な遺伝子座近接部位がゲノム上に存在すること、その多くが遺伝子のプロモーターもしくは他の制御領域に位置していることが明らかとなった。また、細胞を問わず常に他の遺伝子と近接している領域が存在しており、強固な高次構造の骨格となる構造体が存在していること、そしてこれらの構造がさまざまな遺伝子群の発現制御に正負両面から多面的に関わっていることが示唆された。細胞分化に必要な遺伝子の遺伝子座は、分化前に何らかの機序で選択的にマーキングされているのではないかと考えられる。本研究では、特に幹細胞から骨格筋分化への運命決定を行うクロマチン構造制御メカニズムをモデル系とし、“ゲノムマーキング"の動作機序の解明を進めてきた。本年度は高次クロマチン構造として、DNAやヒストンの修飾のみならず、ヒストン自体の置換減少や、選択的な遺伝子座の空間的近接(ジーンクラスタリング)を指標とし、複合的なゲノムワイドな解析を行った。骨格筋の分化運命決定を行う分子としてはMyoDが知られている。このMyoDの分化運命決定を行うメカニズムを解明するために、まずMyoD結合因子の探索を行いその結果、MyoDがクロマチンリモデリング因子の一つであるChd2と結合していることを見出した。

更にMyoD/Chd2複合体同定の過程で、この分子がヌクレオソームと高い親和性を示すこと、このヌクレオソームの中にH3.3とよばれるヒストンバリアントが含まれていることを発見した。分化前後におけるゲノム上のH3.3の分布をChIP-seqにより解析を行った結果、H3.3が分化前後で転写活性化される遺伝子座のみならず、分化前に、分化後に発現する遺伝子座にすでに取り込まれている知見を得た。また、MyoDの発現抑制解析によりH3.3の取り込みとChd2のゲノム上へのリクルートがMyoD依存的であることが明らかとなった。以上の知見をまとめ、ヒストンバリアントによるゲノムマーキング機構として報告した(Harada et al 2012 EMBO J)。更に、このゲノムマーキングがジーンクラスタリングについても4C-seqを組み合わさせて解析し、昨年の知見と合わせて投稿中である。高次クロマチン制御にかかわる因子としてChd2の機能を明らかにし、その分子機能がH3.3バリアントの選択的な取り込みを担っていること、さらにこの取り込みが染色体間の核内高次構造の形成に大きくかかわっていることを解明した。ここまで、予定されたペースを大幅に上回る形で解析が進んでいる。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は研究成果のみならず新たなゲノムワイド解析手法を確立して論文発表(Harada et al 2012EMBO J、Maehara et al 2012NucleicAcid Research)を行い当初予定を上回る成果を上げている。マウス胚より単離した核を用いた解析を現在進めている。当初予定していた核ソーティングによる純化による研究手法については既に確立していたが、研究を進める上で組織サンプルを効率的に用いるためには同一ロットからの複数のChIPseq解析行うには限界がある。そこで、上記プロジェクトに加えてバイオインフォマティクスにより、複数種類の細胞が混在する状態であっても、特定のヒストン修飾や転写因子の結合位置を指標として組織サンプルを用いたChIPseq解析により目的とする転写因子やヒストン修飾の挙動をランキングする手法(co-localization model)を確立した(kmaehara 2012 Nuceic Acid Reseach)。当初計画していた手法を補う形で更に発展的な解析が可能となり研究を進めている。また、3C-seqを用いた解析についても査読者の評価を踏まえて4C-seqを導入し解析することで、従来より更に高解像度での空間近接情報の抽出が可能になった。また本手法は本年度予定していた生化学的なChd2結合因子の探索において候補分子を予見するのに大きく貢献し研究の進捗スピードを飛躍的に高めている。以上より当初計画より大幅な進捗があると考えている。現在次世代シークエンサーを用いたChIP-seq解析により更に高次クロマチン構造解析を多角的に進めており、ゲノムワイドな視点での知見が蓄積されることが期待される。それに伴い当初予定していたマウス胚での解析に加えて培養細胞を併用した柔軟な解析対象の拡大も検討している。
電解液/電極界面構造の電位応答ヒステリシスのメカニズム解明

電解液/電極界面は電気化学反応場を構築する重要なナノ領域であり、近年既存モデルで説明できないイオン吸着・脱離挙動の電位応答ヒステリシスが注目を集めている。本研究はイオン液体を電解液に用いて電気化学測定・赤外-可視和周波振動分光(IV-SFG)・光電子分光を相補的に活用し、ヒステリシス挙動とイオン-電極間相互作用の相関を解明することでヒステリシスを説明する新規概念モデル構築を目指す。27年度は下記に示す通り主に(1)膜厚制御可能なイオン液体薄膜成膜技術の確立、(2)光電子分光を用いたイオン液体/電極界面の電子構造の計測、(3)IV-SFGを用いたイオン液体/電極界面の吸着構造の計測を図った。(1)既存の蒸着装置にてイオン液体成膜を試みたが、真空槽内を汚染する問題が生じた。そこで、新規イオン液体蒸着槽の設計・開発を行い、現在組み立てを行っている。(2)イオン液体塗布基板の光電子分光計測を試み、電子構造評価が可能であることを確認した。今後は上記蒸着槽を用いて電極界面の電子準位接続及び界面双極子の評価を行う。(3)様々なイオン液体の電極界面における吸着構造を計測し、そのヒステリシス挙動はイオン種依存性を有することが分かった。また、希釈電解液系ではヒステリシス挙動の強い電解質濃度依存性を見出した。これは拡散層のイオン配列構造がイオン吸着構造に大きな影響を与えることを示唆する。今後はヒステリシス挙動のイオン種・電解質濃度依存性を精査し、既存モデルとの差異を検討することでヒステリシスを説明可能な新規モデル構築を試みる。上記において、(3)は様々な電気化学デバイスの機能性が図らずもヒステリシス挙動に影響されている可能性を示す重要な成果と考えられる。今後は電気化学測定・光電子分光からイオン-電極間相互作用の情報抽出を行い、より普遍的で自己無撞着なモデル構築を目指す。27年度が最終年度であるため、記入しない。
純電子プラズマを用いた多粒子系の緩和と平衡に関する実験的研究

純電子プラズマの閉じ込めに関して、強磁場化と装置の高精度アライメントによって粒子損失を減少させ、長時間に渡る閉じ込めと、その間のゆるやかな緩和過程の観測が可能になっている。この特性を利用し、Penningトラップ中での純電子プラズマの平衡状態への遷移過程を観測する実験を行った。これまで非中性プラズマの平衡分布については、しばしば理想状態の理論モデルに基づいた議論がなされてきた。このモデルでは、温度ゼロで境界が無い自由空間内という条件が仮定されている。しかし、実験による観測技術が向上するにつれて、実際の実験条件と理想条件との差違による、モデルと実験結果のズレが顕在化してきた。そこで、我々は実際の実験条件を精確に反映するため、有限温度の効果と、境界となる導体壁に誘起される鏡像電荷の効果を考慮して、実験による観測結果から純電子プラズマの平衡分布を求めた。実験からは、CCDカメラを用いた観測により高精細な磁力線に沿って積分された密度分布が得られるが、ここから直接には軸方向の分布情報は得られない。そこで、電子は軸方向にボルツマン分布をしていると仮定し、実験から得られた径方向の線密度分布を拘束条件として、ボルツマン・ボアッソン方程式を緩和法的に解くことにより3次元平衡分布を導出した。さらに、ここで得られた高精度の密度・ポテンシャル分布を基盤にして、極少量のサンプリングから平衡状態にある純電子プラズマの温度を測定する手法を開発した。この手法により緩和過程にある純電子プラズマの温度を測定した結果、トラップ中への入射後5秒で0.08eVとなり、その後も温度はゆるやかに下降し15秒後には0.06eVとなった。この温度は室温の2倍程度であるため、室温に保たれている装置の導体壁やトラップ空間内の残留中性ガスがバックグラウンドの熱浴となっている可能性がある。これらの結果は、英文誌(Phys.Plasmas 13,112109)に投稿・掲載されている。純電子プラズマの閉じ込めに関して、強磁場化と高精度アライメントによって粒子損失を減少させ、長時間に渡る閉じ込めと、その間のゆるやかな緩和過程の観測が可能になっている。この特性を利用し、Penningトラップ中での純電子プラズマの平衡状態への遷移過程の実験的研究を行い、以下にまとめられる成果を得た。(1)初期状態を制御して平衡により近い状態から閉じ込めを開始することで、ディオコトロンなどの不安定性を排し、閉じ込め特性を高めた。この結果、1/e閉じ込め時間は600秒に達した。(2)実験的に観測された平衡状態にある純電子プラズマの2次元線密度分布から、フーリエ・ベッセル展開を用いたポテンシャル高速計算法を活用した数値計算により3次元密度分布を導出した。その結果、実験的な平衡分布は理論モデルに近い回転楕円体状のコアとその周縁部の低密度の分布領域から構成されていることが明らかになった。(3)エネルギーセレクションにより排出された電子の密度分布形状の解析から、純電子プラズマの温度を導出する手法を開発した。これを用いて、平衡状態への遷移過程にある純電子プラズマの温度変化を計測した。(4)純電子プラズマの既に確立されている計測法として、CCDカメラと蛍光面を用いた手法がある。ここに、今までにない高性能CCDカメラを導入し、高精度の画像観測システムを開発した。これにより、より詳細な純電子プラズマの渦運動などの微細構造を観測することが可能になった。(5)Penningトラップ中で平衡状態にある純電子プラズマの固有モードであるDubin modeについて、有限温度および鏡像電荷といった実験条件を反映したシミュレーションを行い、各モードの固有関数と分散関係を求めた。
エチレン酸化銀触媒表面の2種の吸着酸素原子の電子状態,構造,反応性の研究

清浄なAg(110)表面に酸素を約10,000ラングミュアー曝露すると、従来から知られている2x1-O表面の他に、わずかに表面作成条件を違えると、1x2-O表面がえらえることを見いだし、平成9、10年度科学研究費補助金による研究を行った。平成10年度は、1x2*-O表面の角度分解光電子を行ったが、1x2-O表面の構造を角度分解光電子スペクトルの解析から決定するには、既知の2x1-O表面の角度分解光電子スペクトルの解析から得られるLCAOパラメータが必要である。平成10年度は、2x1-O表面の角度分解光電子分光実験を再度行い、実験結果をより定量的に説明するLCAOパラメータを求める目的で研究を行った。実験結果については、10年秋に学会発表をした。現在、解析を進めており、平成11年度に論文発表の予定である。エチレンとの反応実験は、行なえかった。平成11年度は、昇温脱籬実験を行う予定である。清浄なAg(110)表面に酸素を約10,000ラングミュアー暴露して作成した2x1-Oおよび1x2-O表面の角度分解光電子分光スペクトル測定し,以下の結果を得た。(1)2x1-O表面の作成は試料温度400K-360K,1x2-0表面は380K-360Kで行った。いずれもシャープな2x1,1x2構造を示すLEED像を得た。時には、2相の混在を示すLEED像が得られたが、その時の光電子スペクトルは2つの相からの寄与の和として良く説明できた。(2)2x1-O表面については、これまでの報告と一致する結果であり、角度分解光電子分光スペクトルをLCAO解析して、Ag-O,Ag-Ag相互作用を定量的に決定することができた。(3)1x2-O表面では、酸素の2p成分が主要な表面電子状態は、2x1-O表面の場合と異なり、(001)方向で分解を示さず、(110)方向でわずかに分解した。(4)1x2-O表面のLEEDで、(0,1/2)スポット等が(0,1)スポット等とほぼ同じ強度で観測された。これは(110)Ag原子列が一列毎に欠落しているとすれば良く説明でき、また光電子分光スペクトルが(001)方向で分解を示さないこととも矛盾しない。(5)以上の結果をもとにして、最表面の(110)Ag原子列が一列毎に欠落し、酸素原子は残った(110)Ag原子列のオントップ、ブリッジ、または三回対称位置にあるとする構造モデルを考えた。それぞれのモデルにたいして、2x1-O表面のLCAO解析で得たAg-O相互作用等を用いて、表面電子状態を計算した。実験結果との一致は満足するものではないが、オントップまたはブリッジ位置が示唆された。
肺がん患者の生活調整支援モデルの有用性の検証

本研究の目的は,「肺がん患者生活調整支援モデル」について検証し,効果的な介入プログラムを提言していくことである.「肺がん患者生活調整支援モデル」の再検討を行い,介入プログラムの試案を完成させた.介入はA病院の緩和デイケアを利用している肺がん患者6名に行ったが,プログラムを完遂し追跡可能であった3名の分析をした.プログラム前後の変化では有意な変化は認められなかった.しかし,健康関連QOL尺度「SF-8」の租点は増加していたため,今後,ケースを蓄積していくことで試案モデルの実用可能性は否定できないと考えられた.本研究の目的は,「肺がん患者生活調整支援モデル」の効果について検証し,具体的で効果的な看護介入プログラムを提言していくことである.「肺がん患者生活調整支援モデル」は,研究者らが開発した多重指標モデル(2013)で,患者の肯定的自己評価と生活調整力を高める介入を組み合わせて行うことによって,QOLの向上が期待できることを想定し,検証した結果,適合度指標GFI(.963),AGFI(.930),CFI(.974),RMSEA(.040)であることから整合的であると評価された.平成25年度は,モデル構築時に,取り上げていない要因について変数を充実させ再検討をすることを目的として取り組んだ.まず肺がん患者6名に対し,診断されてからの生活を自由に語ってもらう中で,新たな生活として語られた内容の分析を行った.結果,肺がん患者が新たな生活を創り出すプロセスは、〈病気に向かう構え〉を創り出し,〈症状・副作用による生活の不便さ〉を感じて悪化しない対策をとっていた.また不便さが増強する経過の中で,徐々に〈役割の遂行〉ができなくなり,役割の委譲を余儀なくされる中でも〈今の生活が普通と思えてくる〉という生活感覚に変化していた.狭小化していく生活が普通と思えることへの関連要因は,病気になった自分の存在価値を見出す等の〈病気に向かう原動力〉を持ち続けること,仕事や趣味の内容を変更しながらも継続する〈時期に応じた人生の潤し方〉を見つけることであった.以上の結果を,「肺がん患者生活調整支援モデル」の変数と比較検討した結果,〈今の生活が普通と思えてくる〉という生活感覚が新たな変数として見出され,研究者らはこれを「上手なあきらめ」という自己受容(上田;1993)と解釈した.現在,研究協力施設へ質問紙調査のための手続きを終え,研究協力患者に質問紙の配布を始めた.本研究の目的は,「肺がん患者生活調整支援モデル」の効果について検証し,具体的で効果的な看護介入プグラムを提言していくことである.「肺がん患者生活調整支援モデル」は,研究者らが開発した多重指標モデルで,整合的であると評価された.平成25年度の研究成果では、モデル構築時に,取り上げていない変数として「上手なあきらめ」という自己受容と解釈できる変数が明らかになった.平成26年度は新たに変数に加えた自己受容(沢崎;1993、1995)について研究を進め、肺がん患者の自己受容の特徴や関連要因について明らかにする目的で質問紙調査を実施した.調査表は4施設に270部配布し、回収63部(回収率23.3%)、尺度の全項目に欠損のない59名分を分析対象とした.結果、肺がん患者の自己受容には診断後24ヵ月がターニングポイントであることが推測された.また「現在の自己」を受容するときに各領域の自己がどのように関わるかについて重回帰分析を行った結果、整済み決定係数.576で「身体的自己」(β=.538)次いで「過去の自分」(β=.335)が影響を及ぼしていることが確認できた.さらに文献検討から自己受容を高めるアプローチにおいて受容的な環境が自己受容を支える基盤になることが指摘されている.これらの結果をプログラム作成に反映させ、看護介入プログラム「肺がん患者生活調整支援モデル」の試案を作成した.その後、試案について、がん看護に関わる専門看護師および認定看護師の意見を聞いて修正した.自己受容を高めるために、症状コントロール法、体調管理ノートの活用、患者の情報ニーズへの対応、病気体験で得た利点を患者が自覚できるような関わり等、患者・家族が獲得しているコントロール感を強化できるような内容を盛り込んだ介入とした.本研究の目的は,「肺がん患者生活調整支援モデル」の効果について検証し,具体的で効果的な看護介入プログラムを提言していくことである.「肺がん患者生活調整支援モデル」は,研究者らが開発した多重指標モデルで,患者の肯定的自己評価と生活調整力を高める介入を組み合わせて行うことによって,QOLの向上が期待できると評価されたものである.平成25年度は「肺がん患者生活調整支援モデル」の再検討を行い,モデル構築時に取り上げていない変数として「上手なあきらめ」という自己受容と解釈できる変数を明らかにした.平成26年度は,研究者らの研究成果と文献検討から「肺がん患者生活調整支援モデル」の試案を作成し,がん看護に関わる専門看護師及び認定看護師の協力を得て完成させた.今年度は,A病院の緩和デイケアを利用している肺がん患者6名に「肺がん患者生活調整支援モデル」を用いた介入を行ったが,分析対象者は,プログラムを完遂し、フォローアップ可能であった3名となった.結果,生活の質(QOL)および特異的な症状を調べるいくつかの自記式評価尺度を用いてプログラム前後の変化を分析したが,有意な変化は認められなかった.

しかし「肺がん患者生活調整尺度得点」の租点,健康関連QOL尺度「SF-8」の租点,がんに対する心理的適応評価尺度「MAC」の租点は,プログラム後は前に比して増加していたため,今後,ケースを蓄積していくことで試案モデルの実用可能性は否定できないと考えられた.今後の課題として,ケースの蓄積は言うまでもないが,肺がんという予後が期待できないケースが多いという特徴から,短時間で実施可能で,患者の現実的問題を取り扱える介入法の開発がのぞまれる.また,グループ形式で介入を行うことは、相互サポートを受けられ,孤立感の軽減にも役立つが,心理的な課題など個別の対応が難しいことが生じた.介入形式も検討して行く必要がある.本研究の目的は,「肺がん患者生活調整支援モデル」について検証し,効果的な介入プログラムを提言していくことである.「肺がん患者生活調整支援モデル」の再検討を行い,介入プログラムの試案を完成させた.介入はA病院の緩和デイケアを利用している肺がん患者6名に行ったが,プログラムを完遂し追跡可能であった3名の分析をした.プログラム前後の変化では有意な変化は認められなかった.しかし,健康関連QOL尺度「SF-8」の租点は増加していたため,今後,ケースを蓄積していくことで試案モデルの実用可能性は否定できないと考えられた.肺がん患者への調査研究に際し、倫理委員会等の施設側との調整や対象者のリクルートに向けて予想以上の時間を費やした.調査は回収できたデータ数が必ずしも十分とはいえないが、残り1年でプログラム評価まで進めるために、プログラム試案へと進めた.がん看護平成25年度、26年度の基礎的研究や文献検討から看護介入プログラム「肺がん患者生活調整支援モデル」の試案を作成した.今年度はプログラム試案に基づいた介入と事例分析を計画している.実施は受容的な環境が望ましいことから緩和デイケアを実施している施設を選定し、現在施設の倫理審査委員会に申請中である.プログラムには、肺がん患者・家族が自己受容を高め、生活調整力を獲得し、QOLの向上に向けた教育的支援を行うこと、また患者・家族が療養生活の中で獲得しているコントロール感を保持、強化できるような情緒的支援や病気・治療に対する適切な認知を促す認知的支援などについて具体的な内容を盛り込んだ.以上の介入プロセスを通して、プログラム参加者の経験と生活への影響を記述し,期待される変化が生じているかを評価し、プログラム試案の有用性を検討する予定である.肺がん患者からのデータ収集に際して,施設側との調整や対象者のリクルート,に向けて予想以上の時間を費やした.参加予定であった学会(平成27年度3月開催)の参加申し込みを失念していたため、学会参加費が当日支払いとなり、結果、次年度に繰り越した.当初の計画では25年度中に研究者らが構築したモデルについて取り上げていない要因の変数を充実させ,「肺がん患者生活調整支援モデル」の再検討をする予定であった.しかし,対象者のリクルートに予想以上の困難があり,「肺がん患者生活調整支援モデル」の再検討に向けた変数の検討と、その仮説を検証する質問紙の準備に留まった.26年度は「肺がん患者生活調整支援モデル」の完成と,看護介入プログラムの作成を目指すことに計画を変更する.5.000円程度の繰越誤差のため、計画に支障はなく、予定通り資金を有効活用していく.
軸鞭毛遺伝子の解析によるボレリアの進化遺伝学的研究

微生物の系統比較は通常リボソームRNA遺伝子の塩基配列によって行われる。しかしながらこの分子における塩基配列の保存の程度は極めて高く、近縁な微生物個体間の系統比較には不適当である。本研究においては、ライム病ボレリア、回帰熱ボレリアおよび未分類のボレリア約30の分離株の鞭毛遺伝子の塩基配列を決定して、データベースに登録されている配列とあわせてボレリアの系統分類を行った。その結果、ライム病ボレリアおよび関連ボレリアのそれぞれの種間の鞭毛遺伝子塩基配列においては約5%の隔たりがあり、これまで報告されているライム病ボレリア3種と関連ボレリア2種のほかに5つの独立したグループが存在し、それぞれ新種である可能性が示唆された。このうち3グループについてはすでにリボソームRNA遺伝子の塩基配列を調べて、それぞれ新種とすべきであることを確認した。また日本に主に分布しライム病の病原体となっているボレリアはBorrelia gariniiに分類すべきであるが、遺伝的に少し異なった変種であることも明らかにした(鞭毛遺伝子配列で12%異なる)。また、われわれの研究の中から発見された、ライム病ボレリアの主たるベクターであるシュルツエマダニから分離されたにもかかわらず回帰熱ボレリア様の鞭毛遺伝子を有するボレリアは、種分類の規定に従って、DNA similarity、リボソームRNA塩基配列決定、ほかにいくつかの遺伝的および発現形質の比較を行って、新種であることが明らかになったので新種登録を行った(Borrelia miyamotoi)。このように、鞭毛遺伝子の塩基配列にもとづく微生物の系統比較は、近縁な生物の検討にとって極めて有用であることが明らかである。
LTPと学習の対応に関する生理学的・行動学的研究

シナプス伝達の長期増強(LTP)は,1973年に海馬で発見されて以来,記憶学習の基礎メカニズムと考えられてきた.しかし,一般に記憶学習に関与する神経回路の複雑さから,LTPと記憶学習の関係を神経回路を踏まえて説明することは難しい.本研究代表者らは,単一の中枢ニューロンによってトリガーされる魚の逃避運動を実験標本に用いて,学習におけるLTPの役割を明らかにしようとした.硬骨魚の最大の網様体脊髄路ニューロンであり延髄の左右に一対存在するマウスナー(M-)細胞は,音刺激による逃避運動(C-start)とをトリガーする.C-startは基本的に,聴神経・M-細胞・脊髄運動ニューロンの3ニューロン回路により発現する.我々は,逃避運動の閾値以下の弱い音刺激を繰り返してキンギョに与えると,1時間以上持続する逃避運動の脱感作が生じ,同時に,聴神経が両側のM-細胞に誘発する抑制性応答が長期間増大することを見いだした.一方,興奮性のシナプス電位やM-細胞が自分自身に与える反回性制御には変化が見られないので,聴覚入力からM-細胞への制御回路に選択的にLTPが発現したと結論した.これは,LTPと学習とのリンクを同定された神経細胞の上で初めて明らかにしたものであり,主要な研究成果は昨年度Nature誌に発表した.本年度は,M-細胞だけでは達成されない運動の多様性が,M-細胞と相同の網様体脊髄路ニューロンによって担われているのではないかという作業仮定のもとに,相同ニューロン間の機能分化と機能結合を調べ,相同ニューロンの神経網からなるシステムの可塑性の問題へと発展させた.シナプス伝達の長期増強(LTP)は,1973年に海馬で発見されて以来,記憶学習の基礎メカニズムと考えられてきた.しかし,一般に記憶学習に関与する神経回路の複雑さから,LTPと記憶学習の関係を神経回路を踏まえて説明することは難しい.本研究代表者らは,単一の中枢ニューロンによってトリガーされる魚の逃避運動を実験標本に用いて,学習におけるLTPの役割を明らかにしようとした.硬骨魚の最大の網様体脊髄路ニューロンであり延髄の左右に一対存在するマウスナー(M-)細胞は,音刺激による逃避運動(C-start)とをトリガーする.C-startは基本的に,聴神経・M-細胞・脊髄運動ニューロンの3ニューロン回路により発現する.我々は,逃避運動の閾値以下の弱い音刺激を繰り返してキンギョに与えると,1時間以上持続する逃避運動の脱感作が生じ,同時に,聴神経が両側のM-細胞に誘発する抑制性応答が長期間増大することを見いだした.一方,興奮性のシナプス電位やM-細胞が自分自身に与える反回性制御には変化が見られないので,聴覚入力からM-細胞への制御回路に選択的にLTPが発現したと結論した.これは,LTPと学習とのリンクを同定された神経細胞の上で初めて明らかにしたものであり,主要な研究成果は昨年度Nature誌に発表した.本年度は,M-細胞だけでは達成されない運動の多様性が,M-細胞と相同の網様体脊髄路ニューロンによって担われているのではないかという作業仮定のもとに,相同ニューロン間の機能分化と機能結合を調べ,相同ニューロンの神経網からなるシステムの可塑性の問題へと発展させた.1973年に海馬で発見されたシナプス伝達の長期増強(LTP)は,記憶学習の基礎メカニズムと考えられている.最近のノックアウトマウスを用いた研究は,この仮説を強く示唆する.しかし,一般に記憶学習に関与する神経回路の複雑さや,活動する多数のニューロンのごく一部しか調べられないなどの問題が,仮説の証明を阻んできた.本研究代表者らは,この問題を乗り越えて学習におけるLTPの役割を調べるために,神経回路が同定されている上に,単一の中枢ニューロンの単一の活動電位によってトリガーされる硬骨魚の逃避反射を対象にした.硬骨魚の最大の網様体脊髄路ニューロンであり延髄の左右に一対存在するM-細胞は,音刺激による逃避運動(C-start)をトリガーする.C-startは基本的に,内耳有毛細胞・M-細胞・脊髄運動ニューロンの3ニューロン回路により発現し,音刺激からわずか10msecで起こる.我々は逃避運動の閾値以下の音刺激を繰り返すと40分以上持続する脱感作が生じることを見いだした.脱感作を誘導する音刺激を与えると,聴神経が両側のM-細胞に誘発する抑制性シナプスコンダクタンスが,1時間以上増大した.一方,興奮性のcoupling potentialやM-細胞の反回性抑制には変化が見られない故,聴覚入力からM-細胞への抑制回路が選択的にLTPを発現したことが結論された.弱い音刺激を繰り返し与えると聴神経からM-細胞への抑制性応答が選択的に長期増強し,その結果,興奮性聴覚入力に対するM-細胞の活動電位発生率が下がり,逃避運動が長期間抑圧されると考えられる.このように,LTPと学習とのリンクを同定された神経細胞の上で初めて明らかにした.本研究成果は,Nature誌に発表した.シナプス伝達の長期増強(LTP)は,1973年に海馬で発見されて以来,記憶学習の基礎メカニズムと考えられてきた.

しかし,一般に記憶学習に関与する神経回路の複雑さから,LTPと記憶学習の関係を神経回路をふまえて説明することは難しい.本研究代表者らは,単一の中枢ニューロンによってトリガーされる魚の逃避運動を実験標本に用いて,学習におけるLTPの役割を明らかにしようとした.硬骨魚の最大の網様体脊髄路ニューロンであり延髄の左右に一対存在するマウスナー(M-)細胞は,音刺激による逃避運動(C-start)をトリガーする.C-startは基本的に,聴神経・M-細胞・脊髄運動ニューロンの3ニューロン回路により発現する.我々は,逃避運動の閾値以下の弱い音刺激を繰り返してキンギョに与えると,1時間以上持続する逃避運動の脱感作が生じ,同時に,聴神経が両側のM-細胞に誘発する抑制性応答が長期間増大することを見いだした.一方,興奮性のシナプス電位やM-細胞が自分自身に与える反回性抑制には変化が見られないので,聴覚入力からM-細胞への抑制回路に選択的にLTPが発現したと結論した.これは,LTPと学習とのリンクを同定された神経細胞の上で初めて明らかにしたものであり,主要な研究成果は昨年度Nature誌に発表した.本年度は,M-細胞だけでは達成されない運動の多様性が,M-細胞と相同の網様体脊髄路ニューロンによって担われているのではないかという作業仮説のもとに,相同ニューロン間の機能分化と機能結合を調べ,相同ニューロンの神経網からなるシステムの可塑性の問題へと発展させた.
粥状硬化形成におけるスカベンジャー受容体の役割解明と新規治療法開発への応用

我々はこれまでにアポE蛋白とクラスAスカベンジャー受容体(SR-AI,I)の二重欠損マウスにおいて、粥状硬化病巣サイズが約60%軽減することを確認したが、交雑系での検討であったので、今回の検討では、C57BL/6Jに純化したマウスを用いて7か月にわたって高脂肪食飼育を行った。その結果、SR-AI,II欠損マウスでは病巣形成が約70%抑制された。同様の実験系で高脂肪食飼育したC57BL/6Jマウスに抗酸化製剤であるBO-653を同時投与すると、病巣形成が約75%抑制された。つまり、通常の食餌性粥状硬化形成においてはSR-AI,IIの欠損によって粥状硬化形成が強く抑制されること、さらにBO-653によって脂質酸化を抑制するとSR-AI,II欠損マウスよりも強い病巣形成の抑制効果が得られたことになる。このことは、特定の受容体に対する拮抗剤を開発するよりも、脂質酸化を抑制する抗酸化製剤の方が有効である可能性を示唆した。SR-A以外のスカベンジャー受容体として、内皮に発現されるクラスE受容体LOX-1(Lectin-like oxidized LDL receptor-1)欠損マウスにおける粥状硬化病巣の形成過程を検討しているが、現在のところ正常マウスとの間に有意な差違を認めていない。一方、LDLの修飾因子としてoxidized α1-antitrypsinについて検討すると、ヒト血漿中には、oxidized α1-antitrypsin/LDL complex(AT-LDL)が存在し、AT-LDLはLDLより4倍速くマクロファージによって取り込まれ、マクロファージの活性化を引き起こすことがわかった。ヒトの粥状硬化病巣にも、AT-LDLの局在が確認され、AT-LDLが粥状硬化病巣におけるマクロファージの泡沫細胞化と活性化に関与する可能性が示唆され、創薬ターゲットとして注目される。現在、スカベンジャー受容体ファミリーは、クラスAからクラスEまでの6グループに分類されている。従来の私どもの検索で、クラスAに属するマクロファージスカベンジャー受容体(MSR)欠損マウスでは、粥状硬化が軽減するものの多数の泡沫化マクロファージの出現が観察され、残存する病巣には、クラスAに属するMARCO受容体、クラスBに属するCD36、クラスDに属するCD68/Macrosialinなどが発現することを証明した。今回の検討では、ヒト粥状硬化病巣においてもMSR以外の受容体が発現されていることが明らかとなった。つまり、粥状硬化の初期の内膜への浸潤マクロファージにはMSRが強く発現される一方、進行病変における粥腫中央部の泡沫化マクロファージにはCD36が強く発現されていた。この事実から、粥状硬化の進展に従って、変性脂質の取り込みに関わる受容体が異なることが示唆され、特定の受容体に対する拮抗剤を開発するよりも、脂質酸化を抑制する抗酸化製剤の方が有効であるものと推定された。抗酸化製剤に関しては、従来より検討を加えているBO-653に加えて、これとは異なる構造を示す新規薬物の検討を行っているが、未だ有意な効果を認めておらず、次年度以降の検討課題である。加えて、本研究では、泡沫細胞化に関して細胞内のコレステロールをエステル化するアシルコエンザイムA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ-1(ACAT-1)の細胞内局在についても検討を加え、泡沫細胞化に伴って本来小胞体に存在するACAT-1が小胞体由来の小胞構造(vesicle)に移行することを示した。

このことは、コレステロールとACAT-1の接触性を亢進させるために有利と考えられ、ACAT-1の阻害もマクロファージの泡沫細胞化阻止のターゲットとして有効であるものと思われた。従来の私どもの検索で、アポE蛋白とクラスAに属するSR-AI, IIの二重欠損マウスでは、粥状硬化病巣サイズが約60%軽減することが確認された。一方、LDL受容体とSR-AI, IIの二重欠損マウスでは、粥状硬化サイズの減弱は約20%にとどまった。この違いはアポE欠損とLDL受容体欠損という背景となる脂質代謝異常が異なることとともに、いずれの二重欠損マウスもバックグランドが純化されていない雑種であったことが要因と考えられる。今回の研究では、backcrossによってC57BL/6Jに純化されたマウスを用いて、7か月にわたって高脂肪食飼育を行った。その結果、SR-AI, II欠損マウスでは、病巣形成が約70%抑制された。更に、同様の実験系で高脂肪食飼育したC57BL/6Jマウスに抗酸化製剤であるBO-653を同時投与すると、病巣形成が約75%抑制された。つまり、通常の食餌性粥状硬化形成においてはSR-AI, IIの欠損によって、粥状硬化形成が強く抑制されること、さらにBO-653によって脂質酸化を抑制するとSR-AI, II欠損マウスよりも強い病巣形成の抑制効果が得られたことになる。このことは、特定の受容体に対する拮抗剤を開発するよりも、脂質酸化を抑制する抗酸化製剤の方が有効である可能性を示唆している。加えて、今年度は、LDLの修飾因子としてoxidized α1-antitrypsinに注目した。ヒト血漿中には、oxidized α1-antitrypsin/LDL complex(AT-LDL)が存在し、AT-LDLはLDLより4倍速くマクロファージによって取り込まれ、マクロファージの活性化を引き起こす。さらに、ヒトの粥状硬化病巣には、AT-LDLの局在が確認され、AT-LDLが粥状硬化病巣におけるマクロファージの泡沫細胞化と活性化に関与する可能性が示唆された。変性LDLをリガンドとする受容体はスカベンジャー受容体として包括され、6群に大別されている。私どもは、従来の検索でクラスAスカベンジャー受容体に属するSR-AI, IIとApoE蛋白の二重欠損マウスでは、粥状硬化病巣サイズが約60%軽減することを確認するとともに、抗酸化製剤BO-653を高脂肪食飼育したC57BL/6Jマウスに投与することによって、病巣形成が約75%抑制されることを見いだした。一方、SR-AI, IIとLDL受容体との二重欠損マウスでは、粥状硬化サイズの減弱は約20%にとどまり、高脂血症の形成機序によっては、SR-AI, IIの役割よりも他のスカベンジャー受容体が重要な役割を果たしている可能性を指摘した。今年度の検索では、内皮に発現されるクラスE受容体LOX-1(Lectin-like oxidized LDL receptor-1)に注目,し、LOX-1欠損マウスにおける粥状硬化病巣の形成過程を検討したが、現在までに正常マウスとの間で有意な差違は認められていない。また、抗酸化作用を有するビタミンEの影響を検討するため、ビタミンE欠乏食による飼育を行ったが、現在のところLOX-1欠損マウスと正常マウス間で有意差はみられず、粥状硬化病変形成におけるLOX-1の寄与は大きくないと思われる。ヒト粥状硬化病変におけるLOX-1の発現解析においても、内皮におけるLOX-1発現はわずかで、この結果を裏付けるものと考えられた。
発現パターンに基づく線虫遺伝子制御ネットワーク研究

初期胚におけるmRNA局在機構について、線虫C.elegans2細胞期にそれぞれ後極側、前極側に局在するpos-1 mRNA、mex-3 mRNAの局在に必要なシス配列とトランス因子を見出し、局在機構とその意義の手掛かりを得た。2)線虫初期胚において、β-catenin HMP-2がSrcの下流でWntパスウェイと並行して内胚葉誘導とABar紡錘体方向決定にシグナル伝達で機能していることを見出した。3)細胞特異的転写制御ネットワークについて、温度感受性神経細胞AFDの分化に必須であるgcy-8とgcy-18遺伝子のプロモータ活性領域を同定し、この発現に必要な転写因子CEH-11とTTX-1が協調的に働いていることを明らかにした。初期胚におけるmRNA局在機構については、pos-1 mRNAについて局在に必要なシス配列として2つのCYCACAのタンデムリピートと進化的に保存された30塩基を同定した。さらに、これと相互作用し局在化に関わるトランス因子としてRNA結合タンパク質であるMEX-1を同定した。また、MEX-5もシス配列に結合することを見出した。初期胚における遺伝子制御ネットワーク解明においては、線虫C.elegansの初期胚において、β-catenin HMP-2がSrcの下流でWntパスウェイと並行してシグナル伝達で機能していることを見出した。WntとSrcパスウェイは発生におけるシグナル伝達経路として広く使われており、β-cateninは両方のパスウェイでシグナル伝達とカドヘリン細胞接着複合体の因子として使われているが、線虫C.elegansではβ-catenin HMP-2は細胞接着に関与しているが、シグナル伝達機能については不明であったものである。線虫初期胚ではWntとSrcパスウェイは4細胞期の内胚葉誘導に関与し、ABar細胞の紡錘体の向きに関与する。発現パターンに基づき、初期胚で重要な機能が予想される遺伝子群のRNAi実験から、HMP-2がSrcパスウェイで機能していることを見出した。HMP-2は細胞境界と核に局在し、細胞境界の局在はSRC-1に負に制御されていること、SRC-1依存的にチロシンリン酸化が行われることを見出した。これらのことから、HMP-2はSrc経路の下流で働き、Wnt経路と並行して、内胚葉誘導とABar紡錘体方向決定に機能していることを提案した。初期胚におけるmRNA局在機構について1)2細胞期の後側に局在するpos-1 mRNAについては、これまでに局在に必要なシス配列とトランス因子を見出してきたが、これに加え、mRNA分解に関わるCCR4-NOT複合体の因子であるlet-711とccf-1がこの局在化に必要であることを見出した。2)pos-1とは逆に2細胞期前側に局在するmex-3 mRNAの局在化機構についても新たな知見を得た。シス配列については、3'-UTR上の179塩基の領域が局在化に必要十分であり、この中の線虫近縁種で保存されている35塩基部分が重要であることを見出した。MEX-3タンパク質自体も前側への局在が見られるが、この必要十分部分を欠くと新生MEX-3タンパク質の局在化も見られなくなることから、mRNA局在化がタンパク質局在化に重要な働きをすることを示唆した。トランス因子については少なくともCCCHタイプZINCフィンガーを持つRNA結合タンパク質であるMEX-5が受精後の初期胚で働いていることを明らかにした。MEX-5タンパク質は上記35塩基配列に特異的に結合することも確認でき、in situハイブリダイゼーションシグナル強度などからmRNA分解からの保護の方向の働きをしていると考えられた。MEX-5はmex-3 mRNAと同じく前側に局在するが、これは極性決定因子par-1の働きによる。また、MEX-3タンパク質は後極側の細胞運命を決定する転写因子PAL-1の発現を抑えることが知られている。以上のことから、初期胚極性を決めるpar-1によりMEX-5が前側に局在し、前側のmex-3 mRNAを保護し前側でのMEX-3タンパク質の局在を推進する。この結果、PAL-1の前側での働きが抑制され、前後の細胞運命の違いにつながっていくというモデルを構築した。また、遺伝子発現データベースを活用した内外の共同研究を推進した。1)初期胚におけるmRNA局在機構について、2細胞期前側に局在するmex-3 mRNAの局在化機構について研究を進めた。これまでにシス配列については、3'-UTR上の179塩基の領域が局在化に必要十分であり、この中の線虫近縁種で保存されている35塩基部分が重要であることを見出してきた。トランス因子についてはCCCHタイプZINCフィンガーを持つRNA結合タンパク質であるMEX