hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非加熱光加工によるがん組織任意形状光蒸散治療の創出

本研究では,穿刺の問題点を“針を目的の所に到達"させることと,“焼灼範囲制御"の2点に切り分け,後者の問題点に絞り解決するために,(A)所有の超短パルスレーザー光を集光して光ファイバーに導光することにより,超短パルスファイバーレーザーを構築し,(B)生体組織への光蒸散により非熱加工の実現性を明らかにする.さらに,(C)ファイバー先端レンズ一体成型技術を応用し,光ファイバー先端を加工し任意方向への集光を実現する.最後に,(D)医師の協力のもと動物実験により本手法の有用性を明らかにする.研究の初年度は,所有の超短パルスレーザー(波長:1060nm)を利用して超短パルスファイバーレーザーの開発に重点を置き,主に(A),(C)について取り組むと共に,項目(B)(D)の一部についても研究を実施した.(A)空間出しレーザーを光ファイバーに導光するための光学系の設計を行い,ファイバーへの導光を実現した.(B)生体組織への光蒸散により非熱加工の実現性の検証を行った.所有の装置と借用したレーザーの両方を用い,幅広いレンジにパラメータを振り,光蒸散による生体組織への影響を調査した.サーモグラフィにより蒸散部周辺に熱的影響がないことを確認した.さらに,蒸散部位の病理切片を作成し,顕微鏡観察により蒸散部位周辺に熱的影響がないことを確認した.(C)照射方向を規定するファイバーレンズの設計・開発を行った.しかし,レーザーの出力が高いため,レンズの焼き付きの問題が発生し,問題解決に取り組んでいる.当面は,硬性鏡を利用することによりこの問題を解決するが,ファイバー先端のレンズに関して引き続き研究開発を行う.(D)動物組織を用いた焼灼実験を実施するための実験方法や条件の洗い出しを行った.装置の検証でき次第,小動物を用いた肝臓の焼灼実験を行えるように準備した.次年度以降に順次実験を実施する.2年目以降に実施する予定の生体組織への影響の確認が初年度に実施することができた.しかし,ファイバー先端のレンズ加工には問題が生じ,問題解決に取り組んでいる.よって,当初の計画以上に進んでいる項目もあるが,“概ね順調に進展している"とした.初年度において光を利用して生体組織への非熱加工が実現できることを実証したので二年目以降の研究の方策は,適宜ハードウェアの改良を行いつつ,主に生体への影響検証に重点を置き,小動物実験が実施できるように準備を行う.初年度では,空間出しレーザーを光ファイバーに導光するための光学系の設計を行い,ファイバーへの導光を実現することができたが,ファイバー先端のレンズの実用化には至っていない.二年目以降では,構築した超短パルスファイバーレーザーで小動物を用いた焼灼実験が実現できるように,高出力に耐えうるファイバー先端のレンズの設計開発を実施する.同時に,硬性鏡を利用した実験を実施することにより,小動物実験を実施できる体制を作る.実験装置ができ次第,小動物での実験を開始する.実際に焼灼を行うことで焼灼範囲の検証,熱変性範囲の検証を組織学的に行う.本研究では,穿刺の問題点を“針を目的の所に到達"させることと,“焼灼範囲制御"の2点に切り分け,後者の問題点に絞り解決するために,(A)所有の超短パルスレーザー光を集光して光ファイバーに導光することにより,超短パルスファイバーレーザーを構築し,(B)生体組織への光蒸散により非熱加工の実現性を明らかにする.さらに,(C)ファイバー先端レンズ一体成型技術を応用し,光ファイバー先端を加工し任意方向への集光を実現する.最後に,(D)医師の協力のもと動物実験により本手法の有用性を明らかにする.研究の初年度は,所有の超短パルスレーザー(波長:1060nm)を利用して超短パルスファイバーレーザーの開発に重点を置き,主に(A),(C)について取り組むと共に,項目(B)(D)の一部についても研究を実施した.(A)空間出しレーザーを光ファイバーに導光するための光学系の設計を行い,ファイバーへの導光を実現した.(B)生体組織への光蒸散により非熱加工の実現性の検証を行った.所有の装置と借用したレーザーの両方を用い,幅広いレンジにパラメータを振り,光蒸散による生体組織への影響を調査した.サーモグラフィにより蒸散部周辺に熱的影響がないことを確認した.さらに,蒸散部位の病理切片を作成し,顕微鏡観察により蒸散部位周辺に熱的影響がないことを確認した.(C)照射方向を規定するファイバーレンズの設計・開発を行った.しかし,レーザーの出力が高いため,レンズの焼き付きの問題が発生し,問題解決に取り組んでいる.当面は,硬性鏡を利用することによりこの問題を解決するが,ファイバー先端のレンズに関して引き続き研究開発を行う.(D)動物組織を用いた焼灼実験を実施するための実験方法や条件の洗い出しを行った.装置の検証でき次第,小動物を用いた肝臓の焼灼実験を行えるように準備した.次年度以降に順次実験を実施する.2年目以降に実施する予定の生体組織への影響の確認が初年度に実施することができた.

しかし,ファイバー先端のレンズ加工には問題が生じ,問題解決に取り組んでいる.よって,当初の計画以上に進んでいる項目もあるが,“概ね順調に進展している"とした.初年度において光を利用して生体組織への非熱加工が実現できることを実証したので二年目以降の研究の方策は,適宜ハードウェアの改良を行いつつ,主に生体への影響検証に重点を置き,小動物実験が実施できるように準備を行う.初年度では,空間出しレーザーを光ファイバーに導光するための光学系の設計を行い,ファイバーへの導光を実現することができたが,ファイバー先端のレンズの実用化には至っていない.二年目以降では,構築した超短パルスファイバーレーザーで小動物を用いた焼灼実験が実現できるように,高出力に耐えうるファイバー先端のレンズの設計開発を実施する.同時に,硬性鏡を利用した実験を実施することにより,小動物実験を実施できる体制を作る.実験装置ができ次第,小動物での実験を開始する.実際に焼灼を行うことで焼灼範囲の検証,熱変性範囲の検証を組織学的に行う.次年度使用額が生じた理由は,超短パルスレーザーを無料で借用することにより,試作が減り,ファイバーレーザー集光用光学設計・加工費が大幅に削減できたためである.翌年度分として請求した助成金は,初年度問題が発生したファイバー先端のレンズ設計・開発に利用する.
受容体-Snapin-TRPC複合体を介する新しい受容体作動性Ca2+流入機構

本年度は受容体の活性化後に見られる3分子からなるトランスポートソームの形成の分子機構を、Snapinの変異体を用いて明らかにしてきました。私たちは、α_1受容体と結合したSnapinとTRPCチャネルと結合したSnapinが1:1に小胞体膜上で結合することにより、このSnapinを2分子含んだ4量体トランスポートソームが形成されるという仮説をたてました。この仮説は、昨年度の実験で相当確からしさを増してきましたが、本年も以下の実験にて下記の結果を得ました。この結果は現在論文にまとめ、投稿を準備しています(すべての結果を記載することは出来ません)。1.変異体Snapinを用いたSnapin-Snapin複合体(ダイマー)が形成される。今年度は、Snapinの変異体を用いて、昨年度と同様にSDS-PAGEによるダイマー形成の有無、bimolecular fluorescence complementation analysis (BiFC)法を用いて、Snapin-Snapin複合体ダイマーが形成されるかどうかを明らかにしてきました。Snapin-Snapin複合体に関与するドメインについては、膜内に入っている領域である戸考えられているN末であることが明らかになり、これはSnappingが小胞体膜上で会合するのに大変都合の良い構造であることが明らかになりました。2. α_1受容体との結合に関与するSnapin蛋白のドメインの同定、ならびに、TRPCとの結合に関与するSnapin蛋白のドメインの同定上記と同様の手法を用いて、Snapinと受容体、Snapinとイオンチャネルとの結合に必要なドメインも明らかにしました。また、変異体を作成し、Snapinとこれらのタンパクが結合出来ないと、ROCが起こりにくい事などを、Fura-2を用いたRatiometryなどによって明らかにしました。平成20年度は受容体の活性化後に見られる3分子からなるトランスポートソームの形成の分子機構を明らかにしてきた。我々は、これまでα_1受容体とSnapinとTRPCチャネルが相互に作用することにより、α_1受容体刺激後の受容体作動性Ca^<2+>流入が起こることを示してきた。平成20年度は、BiFCやSDS-PAGEなどの方法を用いて、α_1受容体とSnapin、およびTRPCチャネルと結合したSnapinが、それぞれ1:1に小胞体膜上で結合することにより、このSnapinを2分子含んだ4量体トランスポートソームが形成されるという仮説を照明してきた。このことは、Snapinが小胞体膜上でダイマーを形成することを示唆するばかりでなく、Snapinを介して様々な蛋白が結合しうることを示唆している(鈴木、2009年日本薬理学会シンポジウム発表)。現在、同様の手法を用いて、受容体-SnapinやSnapin-TRPCの蛋白相互作用に関係する分子内領域を同定している。
廃棄物の環境経済史:近代イギリスにおける海・都市・農村のリン循環

持続可能性の観点から,近代イギリスにおける有機性廃棄物の肥料利用の実態を解明するため,ノーフォーク州文書館などに所蔵される資料の収集と分析を行った。その結果,都市(ロンドン,エディンバラならびに地方都市)の屎尿の肥料利用,ならびに沿岸地域(ノーフォーク州)での海藻等の有効利用について,その回収方法や金額が明らかになった。これは,都市から農村,または,海域から陸域への栄養分(リンを含む)の循環的利用が実現していたことを示唆するものである。本研究は,持続可能性(Sustainability)の観点から,近代イギリスにおける有機性廃棄物の肥料利用の実態を解明するものである。研究の成果としては,特に,都市(ロンドン,エディンバラならびに地方都市)の屎尿ならびに沿岸地域(ノーフォーク州)での海藻等の肥料利用について,その時期・回収方法・金額等が判断できる史料を収集することができた。これらの史料は,都市から農村,または,海域から陸域への栄養分(リンを含む)の循環的利用が実現していたことを示唆するものであり,現在,その史料の分析を進めている。また,現在の有機性廃棄物(下水汚泥)の資源化政策についても関係者から聞き取りを行い,その歴史的事例の現代的意義についても考察した。平成25年度の実施計画については,平成24年度末に若干の修正を行ったが,その計画に従って,1イギリスでの追加的な資料収集と文献考証,2研究会等での発表,3論文の執筆を行った。1については,8月に,Norfolk Record Office,The National Archives,National Library of Scotlandにてそれぞれ追加的な資料収集を実施し,文献の考証を引き続き進めている。2については,「廃棄物の環境史」(越境する歴史学研究会,於京都大学人文科学研究所),「廃棄物の環境経済史ーイギリスの海・都市・農村(1793ー1880年)ー」(社会経済史学会近畿部会例会,於大阪学院大学)の2件の報告を行い,助言を得た。3については,紀要「下水汚泥の資源化にみる意識改革」が刊行され,図書原稿「英国におけるバイオソリッドと嫌気性発酵戦略」が刊行予定(校正中)である。また,図書原稿「リンの循環と環境問題(仮題)」を執筆中(2015年刊行予定)である。研究の目的は,有機性廃棄物が肥料という資源として農業利用されてきた経緯や方法を解明することである。特に,都市の屎尿など(生活廃棄物),または,漁場の海藻や腐敗した魚など(産業廃棄物)の肥料化に着目し,都市から農村,または,海域から陸域への栄養分の循環的利用が実現していたことの証左を得,その現代的意義を考察である。平成24年度の実施計画では,1イギリスでの資料収集と2学会報告ならびに論文作成を予定していた。2学会報告は,前年度までに収集していた資料の分析を中心に,「魚肥と海藻肥料の環境経済史」(社会経済史学会),「屎尿経済の再構築と社会的条件」(環境経済・政策学会)の2つを行った。ほか,研究会での報告を実施した。論文については,図書の担当章「下水汚泥の嫌気性発酵(メタン発酵)にみる英国の環境政策」と,紀要「下水汚泥の資源化にみる意識改革」を執筆(2013年度刊行決定)し,近現代のイギリスでの下水汚泥の肥料化の動向について発表する機会を得た。平成24年度の実施計画では,1イギリスでの資料収集と2学会報告ならびに論文作成を予定していたが,それらについてはおおむね計画通りに実施できた。1イギリスでの資料収集については,ウェブ上での事前調査をもとに現地の資料館に所蔵資料の請求をしたうえで,現地にて閲覧・確認を行った。結果,都市廃棄物ならびに海藻肥料については,分析するうえで重要であると考えられる資料が収集できた。ただし,魚肥の利用については資料がやや不足している。2学会報告については,予定通り,2つの学会の全国大会において報告を実施した。そのほかに,研究会(三俣延子「食料生産のための地域資源活用術ー2つの島国の事例ー」(「都市・地域研究」研究者会議,於同志社大学人文科学研究所,3月8日)での報告を実施し,イギリス調査後の資料の分析について考察を深めた。また,論文については,当初の実施計画にはなかったが,紀要と図書の原稿を執筆する機会があり(いずれも2013年度刊行決定),イギリス調査の結果の一部を発表するという成果を得た。まず,上記1イギリス調査において収集した一次資料の分析を進めることが課題である。

すでに,平成24年度に学会・研究会での報告を合計3件実施しているが,今年度も,三俣延子「廃棄物の環境史ー近代イギリスにおける海・都市・農村のマテリアル・サイクルー」(越境する歴史学研究会,於京都大学人文研究所,4月20日),三俣延子「廃棄物の環境経済史ーイギリスの海・都市・農村(1793ー1880年)ー」(社会経済史学会近畿部会例会,於大阪学院大学,6月15日)での報告があり,そこで得るアドバイスも踏まえながら,分析・考察を深めたい。その文献考証については,上述(「現在までの達成度」)の通り,また,交付申請書の実施計画でも言及した通り,特に魚肥については,追加的な資料の収集が必要になっている。したがって,追加的な資料収集を実施しながら,研究者との交流を行い,文献考証を引き続き行って,論文作成につなげることが今年度の推進方策である。予定通り,追加的な資料収集や研究会のために研究費を使用する計画である。ただし,国内での資料収集については,本研究課題の採択後に採択された別の外部資金(平成24年度大学コンソーシアム京都「未来の京都創造研究事業」,50万円)によって,すでに平成24年度中に購入できた図書や資料がある。そのため,交付申請時の実施計画では,平成25年度には国内で資料収集するための予算を多く計上していたが,現状では,そのために予定した研究費を他の予算に再配分することも可能になっている。また,今年度中に予定していた英文校正は,平成24年度のイギリス調査時に一度に効率的に実施したため,そのために予定してた研究費も他の予算に再配分することも可能になっている。したがって,これらの予算を再配分することによって,追加的な資料収集のために再度イギリス調査を実施する予算をねん出することも可能である。これが妥当かどうか,現在検討中である。ただし,その場合にも,追加的な資料のみを収集することを目的とし,比較的短期間での滞在に留めるなど,効率的な研究費の使用ができるように工夫する。
ナノスケール探針のシャドー効果による光・電子照射測定の空間分解能向上の試み

本研究の目的は、走査型プローブ顕微鏡(Scanning Probe Microscope:SPM)の機構を用いて、光や電子線照射領域を絞り込む単純で新しい方法の可能性を調べることである.検討した手法は、広領域に光または電子が照射された試料表面に原子スケールで鋭いSPM探針を接近させ、そこに作られる光や電子線の影(シャドー)を利用する方法である.探針が光・電子照射されている試料に接近すると、回折効果を無視すれば、光・電子照射領域には影ができ、影の部分は光や電子線が照射されなくなる.その信号変化を利用して、ナノスケールの構造解析をめざした.本年度は、この手法の応用の一例として、高電界を探針に印加したときにその先端から放射される電子を銅のグリッドに照射し、その電子がグリッドで散乱されるときにできる影(シャドー)を、グリッド後方に設置した蛍光スクリーンに拡大投影する顕微鏡法を実践した.この手法では、グリッドを探針先端に接近させればさせるほど、グリッドと探針間の距離は近くなり、スクリーン上に映し出されるグリッドのシャドーは大きくなる.拡大率は1000倍を遙かにしのぐ.また、その距離が減少するにつれて、探針表面近傍の電界は高くなり電子放射強度が向上し、コントラストの強い像が得られる.この顕微鏡法で、SPMの一つである原子間力顕微鏡(AFM)用のカンチレバー上に形成された探針を用いて、グリッドのシャドーを観察した.通常のAFMカンチレバー探針は、走査型トンネル顕微鏡の探針と比べ複雑な構造をもち、その探針先端部に電界を集中させ、そこから電子を放出させることは難しい.グリッドを接近させて引出し電極として働かせることにより、この困難を除去した.電子の放射パターンは探針先端の形状や電子状態に敏感である.シャドーを観察しながら探針を通電加熱することにより、AFM探針の先鋭化とその評価ができる可能性が開けた.本研究の目的は、走査型プローブ顕微鏡(Scanning Probe Microscope:SPM)の機構を用いて、光や電子線照射領域を絞り込む単純で新しい方法の可能性を調べることである.検討している手法とは、広領域に光または電子が照射された試料表面に原子スケールで鋭いSPM探針を接近させ、そこに作られる光や電子線の影(シャド-)を利用する方法である.探針が光・電子照射されている試料に接近すると、回折効果を無視すれば、光・電子照射領域には影ができ、影の部分は光や電子線が照射されなくなる.したがって、このときの反射する光・電子の信号の微小な変化を検出できれば、その変化は隠された領域から発生したものであるので、その信号変化に対応した表面上の信号発生源の位置が特定できることになる.本年度は、超高真空中で稼動する既存の走査型トンネル顕微鏡(STM)を改造して、探針先端を試料に接近させたときに生じる「シャド-による効果」を検出する機構を開発した.主な点は、1.既存の真空装置中の試料面に浅い角度で光の導入ができるように改造した.2.電子線照射のために、電界放射針を利用した安価な電子源を製作した.予備実験として、電子照射領域から散乱される電子のエネルギースペクトルを測定し、探針に電圧を印加したときの効果を、SEM機能を合せ持った走査型オージェ電子分光器(SAM)で調べた.その結果、電子軌道の歪みにともなうSEM像の変化と印加電圧分のオフセットをもった2次元電子のスペクトルが測定された.近接領域での多重散乱の可能性を示唆するデータが得られた.本研究の目的は、走査型プローブ顕微鏡(Scanning Probe Microscope:SPM)の機構を用いて、光や電子線照射領域を絞り込む単純で新しい方法の可能性を調べることである.検討した手法は、広領域に光または電子が照射された試料表面に原子スケールで鋭いSPM探針を接近させ、そこに作られる光や電子線の影(シャドー)を利用する方法である.探針が光・電子照射されている試料に接近すると、回折効果を無視すれば、光・電子照射領域には影ができ、影の部分は光や電子線が照射されなくなる.その信号変化を利用して、ナノスケールの構造解析をめざした.本年度は、この手法の応用の一例として、高電界を探針に印加したときにその先端から放射される電子を銅のグリッドに照射し、その電子がグリッドで散乱されるときにできる影(シャドー)を、グリッド後方に設置した蛍光スクリーンに拡大投影する顕微鏡法を実践した.この手法では、グリッドを探針先端に接近させればさせるほど、グリッドと探針間の距離は近くなり、スクリーン上に映し出されるグリッドのシャドーは大きくなる.拡大率は1000倍を遙かにしのぐ.また、その距離が減少するにつれて、探針表面近傍の電界は高くなり電子放射強度が向上し、コントラストの強い像が得られる.この顕微鏡法で、SPMの一つである原子間力顕微鏡(AFM)用のカンチレバー上に形成された探針を用いて、グリッドのシャドーを観察した.通常のAFMカンチレバー探針は、走査型トンネル顕微鏡の探針と比べ複雑な構造をもち、その探針先端部に電界を集中させ、そこから電子を放出させることは難しい.グリッドを接近させて引出し電極として働かせることにより、この困難を除去した.電子の放射パターンは探針先端の形状や電子状態に敏感である.シャドーを観察しながら探針を通電加熱することにより、AFM探針の先鋭化とその評価ができる可能性が開けた.
変調励起下でのスピン波系非線形緩和の研究

大電力マイクロ波によって強磁性体や反強磁性体のマグノンを励起すると,その非線形緩和のためにマグノン数に自励発振さらにはカオスが発生する.この発振現象について以下の2点について研究を行った.1.変調励起下での引き込み現象の観測一般に2つの振動子系が非線形に結合されている場合に,周波数の引き込み現象や準周期ルートからのカオスが観測される.今回マグノン系の自励発振に,励起マイクロ波に振幅変調を加える方法と,外部静磁場に変調を加える2つの方法を用いて,発振の引き込み現象について研究を行った.どちらの場合も,ア-ロルドの舌と呼ばれている状態図によく似た引き込みの相図を得ることができた.このことは,励起マイクロ波及び外部静磁場が非線形なコントロールパラメータとして発振現象に関与していることを示唆している.従って今後このパラメータを精密に制御する事によって,カオス発生点近傍及びカオス-カオス転移点での普遍性などの研究が可能であると思われる.2.マグノンの緩和定数と自励発振の関係一定の励起周波数のもとで外部静磁場を変化させると,励起されるマグノンの波数が増滅し緩和定数を変化させることができる.この時,自励発振周波数がどう変化するか測定を行った.磁場を低磁場側に変化させ,励起されるマグノンの緩和時間を短くすると発振周波数は高くなる結果を得た.次にシミュレーションで同様に緩和時間を変化させたところ,自励発振周波数は高周波数側にシフトしたが,変化の様子は実験とは異なっていた.このことから,自励発振機構には波数依存性を持つ他のパラメータが重要であることがあらためて明らかとなった.大電力マイクロ波によって強磁性体や反強磁性体のマグノンを励起すると,その非線形緩和のためにマグノン数に自励発振さらにはカオスが発生する.この発振現象について以下の2点について研究を行った.1.変調励起下での引き込み現象の観測一般に2つの振動子系が非線形に結合されている場合に,周波数の引き込み現象や準周期ルートからのカオスが観測される.今回マグノン系の自励発振に,励起マイクロ波に振幅変調を加える方法と,外部静磁場に変調を加える2つの方法を用いて,発振の引き込み現象について研究を行った.どちらの場合も,ア-ロルドの舌と呼ばれている状態図によく似た引き込みの相図を得ることができた.このことは,励起マイクロ波及び外部静磁場が非線形なコントロールパラメータとして発振現象に関与していることを示唆している.従って今後このパラメータを精密に制御する事によって,カオス発生点近傍及びカオス-カオス転移点での普遍性などの研究が可能であると思われる.2.マグノンの緩和定数と自励発振の関係一定の励起周波数のもとで外部静磁場を変化させると,励起されるマグノンの波数が増滅し緩和定数を変化させることができる.この時,自励発振周波数がどう変化するか測定を行った.磁場を低磁場側に変化させ,励起されるマグノンの緩和時間を短くすると発振周波数は高くなる結果を得た.次にシミュレーションで同様に緩和時間を変化させたところ,自励発振周波数は高周波数側にシフトしたが,変化の様子は実験とは異なっていた.このことから,自励発振機構には波数依存性を持つ他のパラメータが重要であることがあらためて明らかとなった.
新規微生物酵素フェニルアラニン脱水素酵素の構造、機能および応用に関する研究

近年、生体触媒である酵素が示す優れた特性を光学活性物質の合成や微量定量に利用しようとする研究が世界的規模で開始されている。本申請者らは、Bacillus属およびSporosarcina属細菌がフェニルアラニン脱水素酵素を生産することを世界に先駆けて見いだした。これらの酵素をアメリカ合衆国コ-ネル大学医学部ク-パ-教授に分与することから一連の共同研究が開始された。この二年間の共同研究で得た研究結果は次のとおりである。(1)細菌Bacillus shaericus,B.badius,Sporosarcina ureae由来のフェニルアラニン脱水素酵素の酵素化学的特性および基質特異性を合成基質を用いて詳細に調べた。従来の化学合成法や光学分割法の問題点を回避すべく、プロキラルなα-ケト酸を原料として多種類の光学活性L-アミノ酸の立体選択的合成を行った。本酵素と酵母Candidaの蟻酸脱水素酵素を組み合わせて用いると、L-アミノ酸を収率よく合成することができる。本酵素は、フェニルピルビン酸のみではなく、他のα-ケト酸の還元的アミノ化にも利用でき、天然型、非天然型を問わず、L-アミノ酸の立体特異的合成、さらに、^<13>Nで標識したL-アミノ酸の合成が可能になった。特に、医薬原料であるL-ホモフェニルアラニンをも効率良く合成することが可能になった。(2)ポジトロン・エミッション・トモグラフィー(PET)は、極めて短い半減期の陽電子放出核種で標識化した化合物を、体内に投与してイメージングを行うものである。本酵素を用いることにより、半減期の極めて短い^<13>Nを用いて容易に標識化芳香族L-アミノ酸を合成することができた。すなわち、^<13>Nで標識化されたアンモニウムイオンとα-ケト酸を基質とし、固定化した本酵素を用いて還元的アミノ化反応を行い、^<13>N標識化したL-フェニルアラニン、L-チロシン、およびL-DOPAを得た。(3)遺伝子工学的研究により、これらの数種類の酵素タンパク質のアミノ酸配列および塩基配列を明かにした。本研究により、本酵素が、ロイシン脱水素酵素、放線菌由来の耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素、およびグルタミン酸脱水素酵素と類似性を示すことが明らかになった。(4)乳幼児のマススクリーニングにおいて、フェニルケトン尿症は重要な臨床検査の項目となっている。本酵素を体液中のL-フェニルアラニンの微量定量の素子として用いる方法が開発され、従来の微生物法による検査法を置き換えつつある。また、フェニルピルビン酸の定量にも有効に利用できた。(5)コ-ネル大学グループが有するグルタミントランスアミナーゼK遺伝子およびフェニルアラニンアラニン脱水素酵素は共通の基質を利用する。また、各種の脱水素酵素の間で阻害剤も共通する可能性がある。そこで、非天然型のα-ケト酸を新規合成し、α-ケト酸を基質とする各種酵素に対する挙動について検討を加えた。不飽和結合を有するα-ケト酸である、1-シクロヘキセンピルビン酸合成法の開発途中に得られたスピロラクトン体である、3-ヒドロキシ-2-オキソ-1-オキサスピロ[4.5]-デセ-3-エンが乳酸脱水素酵素(LDH)の強力な阻害剤として作用することを見いだした。LDHに特異的な阻害剤は、虚血性心疾患の研究において血流停止中の脳内のpH低下を防ぐ目的で、大いにその開発が期待されている物質である。種々検討の結果、同化合物は0.32mMの阻害定数をもってLDHのNADH結合部位に作用し、拮抗的に阻害した。同化合物はLDHに対して特異的に作用し、他のα-ケト酸を基質とする各種の酵素に対しては全く阻害効果を及ぼさなかったことから、本酵素の特異的阻害剤開発のテンプレートとして期待がもたれる。

本酵素を用いることにより、半減期の極めて短い^<13>Nを用いて容易に標識化芳香族L-アミノ酸を合成することができた。すなわち、^<13>Nで標識化されたアンモニウムイオンとα-ケト酸を基質とし、固定化した本酵素を用いて還元的アミノ化反応を行い、^<13>N標識化したL-フェニルアラニン、L-チロシン、およびL-DOPAを得た。(3)遺伝子工学的研究により、これらの数種類の酵素タンパク質のアミノ酸配列および塩基配列を明かにした。本研究により、本酵素が、ロイシン脱水素酵素、放線菌由来の耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素、およびグルタミン酸脱水素酵素と類似性を示すことが明らかになった。(4)乳幼児のマススクリーニングにおいて、フェニルケトン尿症は重要な臨床検査の項目となっている。本酵素を体液中のL-フェニルアラニンの微量定量の素子として用いる方法が開発され、従来の微生物法による検査法を置き換えつつある。また、フェニルピルビン酸の定量にも有効に利用できた。(5)コ-ネル大学グループが有するグルタミントランスアミナーゼK遺伝子およびフェニルアラニンアラニン脱水素酵素は共通の基質を利用する。また、各種の脱水素酵素の間で阻害剤も共通する可能性がある。そこで、非天然型のα-ケト酸を新規合成し、α-ケト酸を基質とする各種酵素に対する挙動について検討を加えた。不飽和結合を有するα-ケト酸である、1-シクロヘキセンピルビン酸合成法の開発途中に得られたスピロラクトン体である、3-ヒドロキシ-2-オキソ-1-オキサスピロ[4.5]-デセ-3-エンが乳酸脱水素酵素(LDH)の強力な阻害剤として作用することを見いだした。LDHに特異的な阻害剤は、虚血性心疾患の研究において血流停止中の脳内のpH低下を防ぐ目的で、大いにその開発が期待されている物質である。種々検討の結果、同化合物は0.32mMの阻害定数をもってLDHのNADH結合部位に作用し、拮抗的に阻害した。同化合物はLDHに対して特異的に作用し、他のα-ケト酸を基質とする各種の酵素に対しては全く阻害効果を及ぼさなかったことから、本酵素の特異的阻害剤開発のテンプレートとして期待がもたれる。フェニルアラニン脱水素酵素産生菌として、土壌中よりスクリーニングされたBacillus spaericus及びSporosarcina ureae由来のフェニルアラニン脱水素酵素を、本酵素遺伝子を有する組み換え大腸菌より数十mg単位で高度に精製した。また、Sporosarcina ureae野性株より本酵素を高度に精製した。フェニルアラニン脱水素酵素産生菌として、保存菌株中よりスクリーニングされたBacillus badiusの無細胞抽出液よりフェニルアラニン脱水素酵素を結晶状に単離した。酵素標品をリジルエンドペプチダーゼで分解後、得られた部分的ペプチド断片をHPLCで分取し、プロテインシーケンサーを用いて酵素内部のアミノ酸配列を決定した。すでに全一次構造の明らかになっているBacillus sphaericus由来のフェニルアラニン脱水素酵素の配列と比較検討を行ったところ、両酵素間で優位なホモロジーが確認された。
水電解による水素製造の最適条件モデル化(沸騰現象との類似性)

水電解による水素製造効率は、電極間の発生気泡の影響を受ける。すなわち、電極間隔が狭くなると、基本的には電解液の電気抵抗ロスが減少し効率は上昇するが、発生気泡の増大は電極間ボイド率を上昇させ電気抵抗が増大するために、電極間隔には最適条件が存在する。昨年度は、この水電解セルの第1次近似的な物理モデルを構築し、その検証を目的として局所電流密度を測定し、モデルの妥当性を確かめた。本年度は、物理モデルの改良を目的として実験等を行い、以下の知見を得た。1.【水電解の最適条件を求める実験】昨年度と同様に種々のパラメータ(電解液温度と濃度、電極間隔、電流密度)を細かく変化させてアルカリ水電解の最適条件を実験的に求めた。その結果、電流密度の増大に伴い最適電極間隔も増大することを実験的に確かめた。また、最適間隔より狭くなると、電極間ボイド率が非常に大きくなり、電気分解が事実上不可能となる電極間隔が存在することも分かった。2.【発生気泡に関する情報の取得】発生気泡の直径およびその上昇速度については、デジタルビデオカメラあるいはスチルカメラによる撮影と画像処理により測定できた。電流密度が高く、電解液濃度が低く、電解液温が高いほど、気泡上昇速度が大きいことが分かった。気泡の直径(約0.01mm0.8mm)については、電流密度が増大すると、合体により直径分布は大直径側へシフトしていくことが分かった。問題点としては、電極間隔が狭い場合(最適間隔近辺)には、ボイド率が非常に大きいため、上昇速度や気泡直径の測定が出来なかったことが挙げられ、今後の課題である。3.【物理モデルの再検討】昨年度構築し今年度改良を行った水電解セルの物理モデルは、1.で述べた実験結果を定性的に説明できることを確かめた。また、2.で得られた気泡の上昇速度や気泡直径の情報により、物理モデルがより改善される可能性を確認した。この最適条件の物理的モデル構築と検証を目的として実験等を行い、以下の知見を得た。1.【水電解の最適条件を求める実験】種々のパラメータ(電極サイズ、電極の種類、姿勢、電解液温度と濃度、電極間隔、電流密度)を広範囲に変化させて、水電解の最適条件を実験的に求めた。電解質には水酸化カリウム、電極材料にはニッケルまたは白金を用いた。その結果、筆者らが以前行った予備的実験と同様に、電極間隔には最適条件が存在することを確認した。この最適条件は、電極間隔が狭く、電流密度が大きいほど顕著に現れる。2.【水素泡に関する情報の取得】水素泡の直径およびその上昇速度については、デジタルビデオカメラにより撮影し、おおよその値を画像処理により求めることができた。電極上の水素発生点密度については、発生気泡数が膨大なため、精度の良い測定が出来なかった。来年度継続して行う予定である。3.【最適条件モデルの検討】電極間の気泡の影響を考慮した第1次近似的な水電解セルの物理モデルを構築した。つまり、局所電極間ボイド率を発生気泡体積と上昇気泡体積により評価し、その値により局所電極間電気抵抗が定まるとしてモデルを構築した。本モデルは多くの仮定を含んでおり、来年度さらに改良する予定であるが、電極間隔の最適条件の存在を示すことができる。4.【モデル検証のための局所電流密度の測定】上記のモデルでは、局所電流密度は電極下端から単調に減少する。このことを実験的に検証するため、局所電流密度を測定する電極面を作成し実験を行った。その結果、定性的にはモデルと同様の傾向が得られた。

問題点としては、電極間隔が狭い場合(最適間隔近辺)には、ボイド率が非常に大きいため、上昇速度や気泡直径の測定が出来なかったことが挙げられ、今後の課題である。3.【物理モデルの再検討】昨年度構築し今年度改良を行った水電解セルの物理モデルは、1.で述べた実験結果を定性的に説明できることを確かめた。また、2.で得られた気泡の上昇速度や気泡直径の情報により、物理モデルがより改善される可能性を確認した。
抗原特異的T細胞由来のヒトiPS細胞を用いた新しい細胞治療法の開発

抗原特異的T細胞の輸注療法は多くの腫瘍や慢性ウイルス感染症に対して効果的な治療法と考えられている。しかしその効果は、抗原特異性T細胞の疲弊現象によって大きく減ぜられることが知られる。我々はその問題を克服するために抗原特異的T細胞を初期化し、そこからT細胞受容体遺伝子再構成(抗原特異性)の保存されたiPS細胞を樹立した。更には、それらのiPS細胞をT系譜細胞へ再分化させることに成功した。再分化したT系譜細胞の抗原特異性は元になったT細胞と同一と考えられた。本手法を発展させれば、抗原特異的なメモリーT細胞を体外で無尽蔵に誘導することが可能と考えられ、治療開発への展開が期待される。(1)、細胞障害性T細胞由来ips(T-ips)細胞の樹立研究初年度である本年は、がん抗原あるいはウイルス抗原に特異的な細胞障害性T細胞由来ips細胞の樹立を試みた。テトラマー法あるいは抗原ペプチド刺激によるサイトカイン補足法によって抗原反応性細胞をフローサイトで単離することができた。抗原非特異的なCD8 T細胞、各種のがん抗原あるいはウイルス抗原に反応性のある新鮮分離CD8 T細胞、繰り返し抗原刺激によって得られたCD8 T細胞、ペプチドによるクローン化済みCD8 T細胞などをソースとして、各種ウイルスベクターによる山中因子導入を行い、CD8陽性T細胞をリプログラミングするために必要な因子と培養条件を絞り込んだ。しかし現時点では新鮮CD8 T細胞を用いてもリプログラミング効率が0.001%程度であり、少数の抗原特異的CD8 T細胞から確実にips細胞を樹立するための手法を引き続き開発する。(2)、TCR遺伝子再構成を持つT-ips細胞からの細胞障害性Tリンパ球の誘導抗原非特異的な手法で得られたT-iPS細胞をソースに、in vitroならびにin vivoの双方の系を用いて成熟分化T細胞を得ることを試みた。in vitroにおいて、既報ではES細胞をCD4/CD8両陽性T細胞より先の成熟段階に分化誘導することは困難とされているが、サイトカインとフィーダーの最適化により、CD4あるいはCD8陽性のT細胞分画を得ることが出来た。また、in vivoにおいてNOD/JAK3(-/-)マウスをレシピエントとすることで、ヒト胎児胸腺を用いずにCD4あるいはCD8陽性のT細胞分画を得ることが出来た。現在はこれらの細胞の機能解析を行うとともに、抗原特異的CD8 T細胞に由来するips細胞をソースに成熟分化T細胞の誘導を試みている。研究最終年度である本年は、MHC Class I抗原結合テトラマーにて取得したウイルス抗原に特異的な細胞障害性T細胞をクローン化して、ヒトT細胞由来iPs細胞(T-iPs細胞)の樹立を試みた。具体的にはHIV感染細胞が提示するClass IペプチドであるNef蛋白ペプチドで刺激を繰り返し、HIV感染症患者よりT細胞クローンを樹立した。その後センダイウイルスベクター法を中心に同T細胞クローンのリプログラミング効率を向上させ、昨年までの樹立効率から100倍程度改善した0.01%程度のリプログラミング効率が得られるようになった。また、樹立されたT-ips細胞を用いてCD8陽性T細胞を分化する系の開発を試みた。具体的にはT系譜へと分化した細胞とフィーダー細胞をin vitroで共培養しつつ、サイトカイン存在下に抗原刺激を繰り返すことによって、CD8陽性細胞を得ることに成功した。これらのCD8陽性細胞は、ソースとなった細胞障害性CD8陽性T細胞と同一のテトラマーへの結合性を示し、抗原特異性がリプログラミングと再分化誘導においても保たれることが示された。ヒト多能性幹細胞をソースとしたT細胞誘導に関する現在までの報告では、抗原特異性の確保にまで至っていないものが多く、本課題で開発された手法の有用性が示唆された。今後は、ウイルス抗原に比して抗原性の比較的低い腫瘍抗原を認識するT細胞からの、同手法を用いたリプログラミングと再分化誘導の最適化が必要と考える。
出芽酵母において“超”高次倍数体の育種はどこまで可能か？

倍数性は現代生命科学の重要な研究テーマのひとつである。また産業酵母の多くは高次倍数体であることから、倍数性はバイオテクノロジーの観点からも興味ある課題である。しかし高次倍数体育種技術が開発されていないことから研究は進んでいなかった。これまでの研究により、酵母の特異な接合型変異(matα2-102)を利用して、次々と“超"高次倍数体を育種する技術を開発し、昨年までに、報告のなかった6、8、10倍体を育種した。本研究では、どこまで"超"高次の倍数体が育種できるかに挑戦した。“超"高次倍数体を分離するため、matα2-102変異遺伝子とLEU2マーカーを持たせたプラスミドを持つα型2倍体株をエチジウムブロミドで処理し呼吸欠損にした。この株と、呼吸正常なa型株を交雑後、炭素源をグリセロールとしたロイシン非含有培地で選択すると、交雑体のみが生育した。そこで、この選択法を用いて、まず種々の高次倍数体を作成後、それら高次倍数体同士の交雑を行い、超"高次倍数体がどこまで育種できるかを検証した。α型2、4、8、12倍体とa型6、8、20倍体との交雑を行ったところ、全ての交雑で接合反応が見られた。従って、少なくとも32倍体までは作成可能であると思われた。次に、顕微鏡観察によって交雑体の細胞の大きさを比較した。その結果、倍数性が上がるにつれ大きさが大きくなっているものの、細胞集団には細胞が小さいものも存在することがわかった。さらにFACS解析により細胞当たりのDNA含量を測定したところ低次倍数体が存在していることが明らかになった。これらの結果より、酵母において“超"高次倍数体の育種は少なくとも32倍体まで可能と考えられるが、"超"高次倍数体では高頻度で低次倍数体化が起こるので、実際に交雑体細胞集団の中にも32倍体細胞が存在することを明確に示す必要があると考えられた。酵母の特異な接合型変異であるmatα2-102変異を利用した“超"高次倍数体の育種技術は、ほぼ確立したと考えている。当初は、交雑体の選択にロイシン要求性と薬剤耐性セルレニンを用いていたが、倍数性が上昇するにつれ交雑倍数体の選択に困難が認められたため、セルレニンに替えて呼吸欠損形質を利用することにした。その結果、炭素源をグリセロールとしたロイシン非含有培地を使えば、倍数性が上昇しても交雑体が効率よく選択できることがわかった。この選択法により、次々と高次倍数体を選択する方法論が確立したことも申請課題が順調に進捗した要因である。しかし、一方では、作成した高次倍数体の倍数性が安定に維持できない可能性も示唆された。本申請課題の目的を最終的にどのようなものに設定するかにもよるが、"超"高次倍数体が育種できるかどうかの観点から言えば、本年度は、少なくとも32倍体まで育種可能であることを示すことができたので、これ以上の倍数性を持つ"超"高次倍数体を育種できる可能性も十分であると考えている。しかし、同時に育種した高次倍数体の倍数性が安定に維持されないことも明らかになった。従って、本プロジェクトの最終的な目標の中に、高次倍数性を安定維持する方法論の開発を含めることも視野に入れたいと考えている。これは生命科学におけるかなり困難な課題になると想像できるが、重要で挑戦的な課題であるので、ぜひとも挑戦したいと思っている。どこまで“超"高次倍数体を育種できるかに応え得る育種技術は確立したと判断しており、この観点からは特段の推進方策を考える必要性はないと考えている。しかし、高次倍数性を安定に維持できることを研究の目的に含めるのであれば、その推進方策を考える必要があろう。例えば、高次倍数体の低次倍数体化のひとつの原因は、複数の染色体セットを持つ高次倍数体では、染色体の不均等分離の頻度が必然的に高くなることであろう。また、4倍体までのデータしか報告されていないが、倍数性が高くなるにつれ、染色体の不均等分離頻度自身も加算的に高くなることが知られている。従って、高次倍数体の低次倍数体化を防ぐには、染色体の不均等分離の頻度を低く抑えることもひとつの方策である。こうした方策はただちに思い浮かばないが、そうした表現型を示す変異株を分離することはできるかもしれない。例えば、染色体が均等分離すれば生存可能な仕組みを酵母細胞に持たせることができれば、そうした現象を利用して染色体の均等分離頻度が上昇した変異株を分離することができるかもしれない。逆に、染色体の不均等分離をモニターすることができる仕組みもこうした変異株の分離に利用することができる。その例として、URA3遺伝子を持つ酵母細胞は、培地に5-FOAを含ませておくと致死となる現象がある。従って、URA3遺伝子を持つ染色体が不均等分離をすれば、URA3を持たない細胞はコロニーを形成できる。従って、染色体の均等分離の頻度が上昇すれば、5-FOA培地におけるコロニー形成頻度が低下することが期待される。こうした表現型を持つ変異株は、微小管重合阻害剤に耐性を示す変異株として分離できるのではないだろうか。

もし、そうした変異株が分離できれば"超"高次倍数体の低次倍数体化を低減する方策についてのヒントを与えてくれるのではないかと考えている。倍数性は現代生命科学の重要な研究テーマのひとつである。また産業酵母の多くは高次倍数体であることから、倍数性はバイオテクノロジーの観点からも興味ある課題である。しかし高次倍数体育種技術が開発されていないことから研究は進んでいなかった。これまでの研究により、酵母の特異な接合型変異(matα2-102)を利用して、次々と“超"高次倍数体を育種する技術を開発し、昨年までに、報告のなかった6、8、10倍体を育種した。本研究では、どこまで"超"高次の倍数体が育種できるかに挑戦した。“超"高次倍数体を分離するため、matα2-102変異遺伝子とLEU2マーカーを持たせたプラスミドを持つα型2倍体株をエチジウムブロミドで処理し呼吸欠損にした。この株と、呼吸正常なa型株を交雑後、炭素源をグリセロールとしたロイシン非含有培地で選択すると、交雑体のみが生育した。そこで、この選択法を用いて、まず種々の高次倍数体を作成後、それら高次倍数体同士の交雑を行い、超"高次倍数体がどこまで育種できるかを検証した。α型2、4、8、12倍体とa型6、8、20倍体との交雑を行ったところ、全ての交雑で接合反応が見られた。従って、少なくとも32倍体までは作成可能であると思われた。次に、顕微鏡観察によって交雑体の細胞の大きさを比較した。その結果、倍数性が上がるにつれ大きさが大きくなっているものの、細胞集団には細胞が小さいものも存在することがわかった。さらにFACS解析により細胞当たりのDNA含量を測定したところ低次倍数体が存在していることが明らかになった。これらの結果より、酵母において“超"高次倍数体の育種は少なくとも32倍体まで可能と考えられるが、"超"高次倍数体では高頻度で低次倍数体化が起こるので、実際に交雑体細胞集団の中にも32倍体細胞が存在することを明確に示す必要があると考えられた。酵母の特異な接合型変異であるmatα2-102変異を利用した“超"高次倍数体の育種技術は、ほぼ確立したと考えている。当初は、交雑体の選択にロイシン要求性と薬剤耐性セルレニンを用いていたが、倍数性が上昇するにつれ交雑倍数体の選択に困難が認められたため、セルレニンに替えて呼吸欠損形質を利用することにした。その結果、炭素源をグリセロールとしたロイシン非含有培地を使えば、倍数性が上昇しても交雑体が効率よく選択できることがわかった。この選択法により、次々と高次倍数体を選択する方法論が確立したことも申請課題が順調に進捗した要因である。しかし、一方では、作成した高次倍数体の倍数性が安定に維持できない可能性も示唆された。本申請課題の目的を最終的にどのようなものに設定するかにもよるが、"超"高次倍数体が育種できるかどうかの観点から言えば、本年度は、少なくとも32倍体まで育種可能であることを示すことができたので、これ以上の倍数性を持つ"超"高次倍数体を育種できる可能性も十分であると考えている。しかし、同時に育種した高次倍数体の倍数性が安定に維持されないことも明らかになった。従って、本プロジェクトの最終的な目標の中に、高次倍数性を安定維持する方法論の開発を含めることも視野に入れたいと考えている。これは生命科学におけるかなり困難な課題になると想像できるが、重要で挑戦的な課題であるので、ぜひとも挑戦したいと思っている。どこまで“超"高次倍数体を育種できるかに応え得る育種技術は確立したと判断しており、この観点からは特段の推進方策を考える必要性はないと考えている。
中枢神経系グリア細胞発生制御機構の解析

オリゴデンドロサイトの発生起源は腹側領域にのみあると考えられてきたが、近年ではオリゴデンドロサイトの発生起源が背側領域にも存在することが示唆された。しかしながら、その時期・領域特異性は明らかではない。Olig2-CreERマウスは時間特異的にオリゴデンドロサイト前駆細胞を標識できるが、背側オリゴデンドロサイトが発生する時期は腹側由来のオリゴデンドロサイトが発生した後であると推測されるので、このトランスジェニックマウスを利用して背側由来のオリゴデンドロサイトの発生起源を明らかにすることは不可能である。そこて神経幹/前駆細胞を時間特異的に標識できるNestin-CreER tgマウスを作製した。このマウスでは脳室層周囲特異的にCreの発現が観察され、タモキシフェン投与によって時期特異的にオリゴデンドロサイトを標識で切る事を明らかにした。このマウスを使用し、発生初期、中期、後期、生後に神経幹/前駆細胞を標識する事で、いつ背側に存在するオリゴデンドロサイトが神経幹/前駆細胞から産生されるか明らかにすることが可能である。また、in utero electroporation法によりCre-recombinaseを背側領域特異的に胎齢16日のマウス胎仔の脳室層細胞に発現させ、背側脳室層細胞を特異的に標識した。これらの細胞系譜を解析した結果、オリゴデンドロサイト前駆細胞が背側領域の脳室層全体から発生することを示唆した。今後はこれらのオリゴデンドロサイト前駆細胞が成熟オリゴデンドロサイト前駆細胞になるか検討をおこなう必要がある。また、昨年度の研究成果を二報の国際雑誌に発表した。従来神経細胞の支持細胞として考えられてきたグリア細胞が、神経伝達などの脳機能に積極的に関わっていることが急速に明らかになりつつある。しかしながら、発生期の神経幹細胞からのオリゴデンドロサイト・アストロサイトの運命決定の制御機構は不明な点が多い。本研究では、当研究室でアストロサイトの分化誘導因子として単離されたシスタチンCが、オリゴデンドロサイトへの分化を抑制することを、胎齢14.5日の脳細胞を用い、神経幹細胞の培養系であるneurosphere assayと初代培養系であるprimary cultureを用いて明らかとした。FGF-2がin vivoで背側脳室層からオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の分化を誘導することをin utero microinjection法を用いて明らかにした。オリゴデンドロサイトは、胎生期には腹側領域からのみ産生されることが知られている。FGF-2を子宮内にてマウス胎仔側脳室内に投与すると、通常OPCのマーカーがまったく観察されない大脳皮質脳室層においてOPCマーカー陽性細胞が出現した。さらに、その細胞を含む領域を培養すると、その一部はオリゴデンドロサイトに分化した(論文投稿中)。すなわち、胎生期大脳皮質においては脳室層に存在している細胞はFGF-2依存的にオリゴデンドロサイトに分化する能力を有しているものの、生体内ではその量が十分ではなくオリゴデンドロサイトの分化が抑制されていることを示唆した。これらの研究により、オリゴデンドロサイト発生、分化を制御する新たな因子の作用を明らかにした。
重症ドライアイにおける眼表面ムチンの発現についての検討

我々は、重症眼表面疾患の治療に有用な培養口腔粘膜シートにおける膜型ムチンの解析を行ってきた。口腔粘膜組織ではほとんど見られないMUC16が、培養して上皮シートを作成すると、重層化した上皮の最表層にMUC16が発現していることが明らかになった。これは、培養過程において何らかの因子が口腔粘膜上皮のMUC16発現を賦活化した可能性が考えられるが、MUC16の発現因子を解明するヒントになると思われる。重症ドライアイの原因として、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、角膜化学外傷などが挙げられる。これらの疾患の治療として、近年になって、培養自己口腔粘膜上皮シート移植の有効性がわが国を中心として報告されている。今回、我々は、培養口腔粘膜上皮シートに発現する膜型ムチンについて、正常ボランティアから採取した口腔粘膜上皮をもちいて培養シートを作成し、検討を行った。Real time PCRをもちいてmRNAレベルの検討と、膜型ムチン抗体をもちいた蛋白レベルでの組織での検討を行ったところ、興味深いことに、組織における口腔粘膜上皮は、膜型ムチンを発現しておらず、RT-PCRにてmRNAレベルでわずかにみられるのみであったが、シート化した培養口腔粘膜上皮は、膜型ムチンであるMUC1,MUC4,MUC16の発現がmRNAおよび蛋白レベルで発現しており、その発現は最表層細胞のapical側に特異的にみられ、口腔シートと角膜上皮における発現パターンは一致していた。以前より、膜型ムチンは、上皮細胞のapical側に存在するmicorvilliの先端に発現していると考えられている。今回行った走査型電子顕微鏡における検討では、口腔粘膜上皮組織に比べて培養口腔粘膜シートの方が、microvilliの密度や大きさが有意に増加しており、膜型ムチンの発現は、これらmicorvilliの発現量の差と関連している可能性が示唆された。膜型ムチンの発現パターンが口腔粘膜上皮シートと角膜上皮シートにおいて一致していることは、異所性の組織である培養口腔粘膜上皮が角膜上皮疾患の治療として、角膜上皮と同様な働きを眼表面で行っており、この移植方法が有効であることの理由の一つであると考える。現在、わが国には、800万人を超えるドライ患者がいるといわれている。そのうち、激しい眼痛や視力障害を伴うなど、QOLが著しく低下する重症ドライアイの原因として、Stevens-Johnson症候群、眼類天庖瘡、角膜化学外傷などが挙げられる。これらは以前は、従来の角膜移植では治療が困難だといわれていた。しなしながら、近年になって、これらの疾患に対し、培養自己口腔粘膜上皮シート移植を行うことがわが国を中心として報告され、その有効性が明らかになっている。以前より、我々は、眼表面に発現するムチンについて研究をおこなってきた。今回、我々は、培養口腔粘膜上皮シートに発現する膜型ムチンの発現についての研究を行っている。現在まで、正常ボランティアから採取した口腔粘膜組織をもちいて、膜型ムチンはmRNAレベルにおいてもタンパクレベルにおいても発現が著しく抑制されているが、それらの上皮を培養し、重層の培養シートを作成すると、MUC1,MUC4,MUC16において上昇がみられることが明らかになった。この発現パターンは、正常の角結膜上皮が発現する膜型ムチンの発現パターンと一致している。タンパクレベルにおいても特にMUC16は、培養口腔粘膜上皮シートの最表層細胞のapical側にのみ特異的にみられ、口腔シートと角膜上皮における発現パターンは一致していた。走査型電子顕微鏡での検討では、両者ともmicorvilliが細胞表面に発現しており、micorvilliの発現の有無が、膜型ムチンの発現と相関していなかった。したがって、膜型ムチンの発現を制御している因子があり、その因子が、口腔粘膜と眼表面において膜型ムチンのプロモーター領域に何かしらの作用を起こしている可能性がある。今後は、膜型ムチン(特にMUC16)のプロモーター領域に焦点をあて、MUC16の発現を制御している因子を解明していきたいと考えている。スティーブンスジョンソン症候群や眼類天疱蒼などの重症オキュラーサーフェス疾患においては、角膜上皮の幹細胞が障害され、正常な角膜上皮で眼表面を覆うことができないため、著しい視力低下をきたす。我々は、正常ボランティアから採取した口腔粘膜組織をもちいて、口腔粘膜シートの解析を行ってきた。口腔粘膜組織および培養口腔粘膜シートは豊富な微絨毛(microvilli/microplicae)で覆われていることが走査型電子顕微鏡で明らかになった。培養口腔粘膜上皮シートは、培養角膜上皮シートと形態学的に類似しており、両者は同様の膜型ムチンの発現パターンを呈することが明らかになった。このことは、もともと角膜とは異なった組織である口腔粘膜を培養して角膜に移植しても、長期にわたって健常な眼表面を維持できることの理由の一つに挙げられると思われる。また、膜型ムチンMUC16の発現であるが、培養口腔粘膜