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日本産野生動物種の起源に関する遺伝学的研究

遺伝子(rDNA)をプロ-ブとして全国のユウレイボヤ類の多型を調べてきた。ホヤのゲノムには多型を示す反復配列が存在し、rDNAの多型と類似したパタ-ンであることが分かっている。反復配列とrDNAとの関係を明らかにするためにユウレイボヤのゲノムライブラリ-を作成しスクリ-ニングしたところ、10%弱のポジティブクロ-ンが得られ、塩基配列はマウスの18SRNAと80%のホモロジ-が存在した。2.日本産野生マウスのMHCクラスI遺伝子には、中国産野生マウスと共通してHー2Kf遺伝子およびその変異型が高頻度にみられる。これまで調査されていなかった中国西部の3地点で採集したマウスについて血清学的解析を行った。その結果、日本産野生マウスと同一のHー2Kf遺伝子が西域地区で採集されたマウスに発見された。このことは、Hー2Kf遺伝子が中国大陸に広範囲に分布していることを示している。3.日本に生息するモグラ類は、mtDNA、rDNA、酵素多型を解析した結果、サドモグラ、アヅマモグラ、コウベモグラの少なくとも3グル-プに分化していることが明らかになった。従来の分類でコモグラとされていた青森県、新潟県産のアヅマモグラは横浜産のアヅマモグラとは明らかに異なっていたが、山梨県青木が原のコモグラは横浜産と類似していた。「ワカヤマモグラ」は、関東以北のアヅマモグラとは明瞭に異なっているが、京都市産のアヅマモグラは「ワカヤマモグラ」と類似していた。4.マウスの亜種domesticus3種とmusculus1種の全塩基配列の比較により、mtDNAのDーloop領域には3ー5倍塩基置換の多い領域があることを見いだした。そこでこの高い塩基置換速度を示す領域を指標として日本産野生マウスの集団構造を解析した。日本産野生マウスのうち南方型(musculus型)に属している地域から10地点を選び比較した結果、これらは3グル-プに分類できた。1.日本産モグラの種分化および類縁関係について、アイソザイム、ミトコンドリアDNAおよびリボソ-ムDNAの遺伝生化学的手法を用いて調査した。その結果、日本のモグラ属はサドモグラ、アズマモグラ、コウベモグラの3つに大きく分かれ、アズマモグラは遺伝的変異が多く、コウベモグラは変異が少ないことが分かった。この結果は前者の渡来時期が古く、後者が比較的最近になって渡来したことを示唆する。サドモグラはアイソザイム多型からは他の2種と極端に離れているが、mtDNAではアズマモグラに、rDANではコウベモグラに含まれるような結果を得た。2.近交系マウス由来の代表的な6種類のMHCクラスI抗原に対するアロ抗血清を用いてアジア産野生マウスにみられるクラスI抗原を検索したところ、日本を含むアジアの広い地域でk^d,k^f,k^uの3種類の抗原のみが各々20%を越える高い頻度で検出され、その表現型頻度の合計は80%を占めることが分かった。この結果はヨ-ロッパの野生集団において多数の多型遺伝子が低い頻度で分布するのと対照的であった。k^uの分布はcastaneusの分布と、k^fはmusculusの分布と重なっている。これは日本産野生マウスの起源が2つの亜種のハイブリッドであるという見解と一致する。3.アリ-ルスルファタ-ゼ(Ars)遺伝子、骨片形成に関わるSm50遺伝子、ヒストン遺伝子を用いてバフンウニの地理的変異をDNAのRFLPの観点から調ベた。
野球選手におけるバントと打撃のわざを解明する-生理心理バイオメカニクスの観点から

本研究では,野球の諸スキルについてバイオメカニクスおよびスポーツ心理学的手法を用いて検討したところ,バントおよびゴロ捕球における身体運動制御機構について明らかにすることができた.また,打撃については,フィールドにおいて簡便に打撃スキルを客観的評価を行うための手法を開発することができた.これらの成果に基づき,野球技術における主観と客観のずれを克服するための基礎的な知見を得ることができた.本研究では,野球の諸スキルについてバイオメカニクスおよびスポーツ心理学的手法を用いて検討したところ,バントおよびゴロ捕球における身体運動制御機構について明らかにすることができた.また,打撃については,フィールドにおいて簡便に打撃スキルを客観的評価を行うための手法を開発することができた.これらの成果に基づき,野球技術における主観と客観のずれを克服するための基礎的な知見を得ることができた.平成22年度は,バントおよび打撃動作に熟練した選手および非熟練者を対象とした実験を行い,被験者の動作および動作感覚をデータとして採取し,その身体的スキルの違いを調査した.バント実験では,日本プロ野球機構で承認される公式球を使用し,バットは硬式用木製バットを使用し,被験者には投手から投じられたボールをバントするよう教示した.打球を転がす打球方向条件として1塁方向,投手方向,3塁方向の3条件を設定する.各打球方向条件において80試行ずつ計240試行を実施した.実験参加者は大学体育会硬式野球部選手5名であり,バットヘッドとバットグリップ部分に反射マーカーを付けて標点とした.高速度カメラ(本予算で購入予定)で撮影し,オフラインで解析し,バット角度,関節角度等を算出した.また,1試行ごとに質問用紙を用いて被験者の動作感覚を記録した(「満足度,成功度,ボールのコース・・・」など).その結果,打球方向の課題を達成するために,本研究の被験者はバットヘッドだけでなくグリップも移動させて適切なバット角度を形成させていた.また,投球の高さに対しては下肢関節運動を含めてバットヘッド,グリップを移動させて対応していた.インパクト時にみられた打球方向条件間でのバット角度の違いは,動作の開始期からみられた.本研究の結果から,実際の指導現場において指導されている内容と実際の動作との間に違いがみられ,平成23年度に実施する実験に対して研究課題を明確にすることができた.また,打撃動作については,客観的なパフォーマンスを簡便に指標化することを目的としてスピードガンを用いた打球速度計測実験を実施し,その測定法の信頼性と妥当性について確認を行った.この研究成果から,打撃動作における打球速度の主観的な調整機構について,平成23年度に実施予定である熟練した選手による客観的なパフォーマンスと主観的な動作調節との関係を検討する基盤を整えることができた.昨年度は,バントに熟練した選手および非熟練者を対象とした実験を行い,被験者の動作および動作感覚をデータとして採取し,その身体的スキルの違いを調査した.本年度は,打撃動作におけるスキルを解明するために,屋外における打撃動作の撮影を行い,打球方向コントロールにおける主観的情報と客観的情報のずれの定量化を試みた.しかしながら,現有装置を用いた実験では,高速度で移動するバットの三次元座標を数値化する点において三次元誤差が非常に大きくなってしまう問題点が発生した.この原因はカメラの台数不足とカメラの撮影周波数上のスペックにあることが判明し,打撃動作よりも動きが緩やかなゴロ捕球動作を用いて,同様の実験を実施することとした.そこで,ゴロ捕球実験として,安全に捕球できるようにプラスチック製のボールを用いて,ヒトが転がしたボールを捕球し,左前方へ送球する一連の動作を4台の高速度カメラを用いて撮影する実験を実施した.実験参加者は大学体育会軟式野球部選手4名であり,左右つま先に反射マーカーを付けて標点とした.また,質問用紙を用いて被験者の動作感覚を記録した.被験者には体育館にて,自分の左側に転がされたゴロを処理させた.その結果,4歩ステップ捕球の3歩目のステップでは,足の着地位置のばらつきが,構えおよび一歩目との間に有意に大きくみられた.そして,このばらつきの水平成分はその他のステップよりも大きく,特に一歩目と4歩目との間に有意な違いがみられた.また,ステップ長の変動係数においても,3歩目はその他のステップと比べて有意に大きい値を示した.4歩目のステップでは,足の着地位置のばらつきが,構えおよび一歩目との間に有意に大きい値であった.また,ばらつきの鉛直成分は水平成分よりも大きい値であった.ステップ角度の標準偏差においても,4歩目のステップはその他のステップよりも大きい値であった.以上より,3歩目のステップは主にステップ長を調節することでゴロの転がるコースに対して調節をする働きをもち,4歩目のステップはゴロを捕球する位置を前後で調節する働きを持つことが示唆された.
ホーネットシルクの細胞非接着活性メカニズムの解明

本研究は、スズメバチの幼虫が吐糸して作る繭(ホーネットシルク)が、高い細胞非接着活性を示すメカニズムを解明することを目的としている。平成19年度は、昨年度に続き、ホーネットシルクを構成するタンパク質のアミノ酸配列(一次)、二次および三次構造の解析、および生体材料としての利用するたあの素材化と安全性試験を行い、以下のことが明らかとなった。・キイロスズメバチのホーネットシルクを構成する主要タンパクをコードする遺伝子について、5'-RACEによる塩基配列決定を行い、昨年度に報告した予想塩基配列より高精度な配列情報を得た。また、ミツバチの幼虫が作るシルクとの二次構造比較から、ホーネットシルクのAla-rich領域とSer-rich領域の二次構造に関する知見を得た。・アミノ酸の規則正しい繰り返し配列を多く有するタンパク質がホーネットシルクに存在することを見出した。・国内に生息する主要スズメバチ6種のホーネットシルクのSDS-PAGEおよびN末端シーケンス解析結果の比較から、スズメバチ種によるホーネットシルクの差異と共通点を明らかにした。SDS-PAGEパターンにスズメバチの系統分類を支持する傾向が見られた。また、N末端の配列は、Vssilk1,3,4および5ではいずれのスズメバチ種も同一の配列を有しており、高い相同性を示唆した。一方で、Vssilk2のN末端配列については、スズメバチ種類問の差異が認められた。・固体NMR解析により、ホーネットシルクはCoiled coil構造を形成しやすく、その形成が発端となって、ゲル化が進行することを明らかにした。フィルム物性と、分子鎖絡み合い密度の関係を明ちかにすることにより、分子鎖ネットワークの構築がフィルム物性と関係していることを明らかにした。・ホーネットシルクの医療用素材としての安全性を評価するため、モルモットを使った皮膚感作試験を行った。結果は陰性であり、本研究で調べた範囲内では安全性が高いことを示唆した。この目的を達成するために、平成18年度は以下に示す4課題について研究を行った。1,ホーネットシルクを構成するタンパク質のアミノ酸配列(一次)、二次および三次構造の決定2,ホーネットシルク中に含まれる、タンパク質以外の含有成分の徹底分析。3,表面形状が異なるホーネットシルクフィルム間での細胞接着活性比較。4,細胞非接着活性を活かしたホーネットシルク素材の加工法の開発。上記の研究を行った結果、キイロスズメバチのシルクを構成する主要4タンパク質のアミノ酸配列を決定した。さらに、固体NMRを用いた二次構造解析の結果と、アミノ酸配列の結果を組み合わせることによって、ホーネットシルクの三次構造はCoiled-coil構造を形成している可能性が高いことが分かった。このことは,タンパク質のCoiled-coil構造形成確率の理論計算からも示唆された。ホーネットシルクがCoiled-coil構造の形成能が高いことは、ホーネットシルクの水溶液が不安定であり、容易にゲル化することにも反映されている。このホーネットシルクの高いゲル形成能を利用した新規フィルム化法(ゲルフィルム化法)を開発した。ゲルフィルム化法で作製したフィルムと、キャスト法で作製したフィルムで細胞非接着活性を比較したところ、キャスト法で作製したフィルムの方が、細胞非接着活性が高いという結果になり、フィルムの表面形状が細胞接着活性に影響を与えることが分かった。ホーネットシルク中には、タンパク質以外にワックス成分が多く存在していることが分かった。このワックスの構造をGC-MS、固体NMR、DSCを併用して詳細に解析した結果、幼虫の体表ワックスが付着したものであり、非常に結晶性が高い炭化水素を主体とする成分であることが分かった。
動脈硬化診断のための赤外分光カテーテルの研究

動脈硬化の主原因となる血管内膜の沈積コレステロールプラークの分布状態を,赤外分光法により分析可能な血管カテーテル状プローブの実現を目的とする.赤外光を血管内に導入するデバイスとして中空光ファイバATRプローブを使用した.ファイバおよび先端のATRプリズムについてそれぞれ最適化を行い,測定系の構築・光学系の改良などを行ったところ,口腔粘膜などインビボでの生体サンプルの吸収スペクトル測定が可能となった.動脈硬化の主原因となる血管内膜の沈積コレステロールプラークの分布状態を,赤外分光法により分析可能な血管カテーテル状プローブの実現を目的とする.赤外光を血管内に導入するデバイスとして中空光ファイバATRプローブを使用した.ファイバおよび先端のATRプリズムについてそれぞれ最適化を行い,測定系の構築・光学系の改良などを行ったところ,口腔粘膜などインビボでの生体サンプルの吸収スペクトル測定が可能となった.本研究の目的は,呼気中に含まれる微量成分の検出が可能な装置を開発することである.その方法として,導波機能を有する中空伝送路により構成した高感度かつ超低容量のガスセルを用いる手法を採用し,今年度においては次の2つの事項について検討を行った.1.細径中空光ファイバの低損失化および分光測定系の最適化分光測定用プローブとして使用する中空光ファイバ内面の反射率を増強させるために,干渉効果により特定の波長領域においてきわめて高い反射率が得られるようにポリマー層の厚さを選択した.カテーテルへの挿入が可能な直径0.5mm程度の細径ファイバを製作するためのポリマー薄膜形成条件の最適化を行った.また,可とう性が高く,破損の際にも安全な樹脂チューブを母材とするファイバについてもその製法の検討を行い,良好な特性のファイバの製作に成功した.2.減衰全反射(ATR)プリズムの設計,製作と評価中空光ファイバの先端に取り付けて使用するATRプリズムについて,血管内壁の測定に適したものが得られるように設計・試作を行った.入射端面に傾斜角を設けることによりプリズム側方の血管内壁の測定が可能な形状について,光線追跡法による設計を行い,その結果に基づく形状のプリズムの試作を行った.その結果,側方への光照射が得られることがわかった.また従来のSiと比較して低屈折率であり,より小さい反射損を示すことが期待されるダイヤモンドで構成したプリズムを試作し,光学特性および化学的耐久性において,より優れた特性が得られることを確認した.本研究の目的は,動脈硬化の主原因となる血管内膜の沈積コレステロールプラークの分布状態を分析可能な血管カテーテル状プローブを実現することにある.分析手法として,コレステロール等の分子構造を分析可能なフーリエ赤外分光法を用い,また赤外光を血管内に導入するデバイスとして,申請者らが開発してきた中空光ファイバATRプローブを使用することにより,血管内膜の吸収スペクトルを測定可能な装置を開発する.今年度においては次の2つの事項について検討を行った.1.ATRプローブ測定系の構築ATRプローブを用いた測定系を構築し,その基本特性の評価を行った.FT-IRから外部に取り出した赤外光は中空ファイバ入射端に結像される.ファイバを伝送した光はATRプリズムで全反射され,HgCdTe検出器でそのスペクトルを測定する.プローブの可とう性を向上させるために従来の直径2mmのファイバを1mmへと細径化することを試みた.光量の低下により若干SN比が低下するものの,光学系の改良やファイバ特性の改善を行うことにより,スペクトル測定が可能となった.2.生体サンプルの測定とカテーテル評価上記項目で構築した測定系を用いて生体の反射スペクトルをインビボで計測することを試みた.対象とする成分は糖尿病の指針となるグルコースを選択し,プローブを用いて口腔粘膜を測定することにより,グルコースの血中濃度の測定を行った.その結果,数%の濃度変化の検出に成功したが,プローブの押付圧力により出力強度が大きく変動することが問題となった.この問題を解決するために,基準ピーク値による校正や基準となる成分の添加などについて検討を行った.
酵素を用いた有機系多価イオンの簡易・高感度分析法の確立

本年度では,まず前年度から引き続き,提案する多価カチオン分析法の有用性の検証を行った。多価カチオン物質として,分析事例が比較的多いポリヘキサメチレンビグアナイドを検討した結果,同多価カチオン物質でも明瞭な酵素反応速度増大効果が確認され,吸光度計を用いた分析では0.1 ppmレベルでの定量分析が,また目視でも同レベルの半定量分析が可能であることが確認できた。この定量感度は他の比色法と比較しても十分高い。多価カチオン物質の酵素を用いた高感度定量法が構築できたため,これを利用したポリアニオン分析法の検討を行った。これはポリカチオンとポリアニオンの定量的ポリイオンコンプレックス形成を利用したものである。ポリアニオンとして,ポリビニル硫酸,ポリスチレンスルホン酸,アルギン酸,ポリアクリル酸,ヘパリンを用い,これらポリアニオンの所定のpHにおける電荷量を,コロイド滴定により見積もった。この値を用い,提案する分析法の妥当性を電荷量に基づく検量線を作製することで評価した。検討したすべてのポリアニオンにおいて実験誤差内で同一の検量線が得られ,ポリアニオンの定量分析が可能であることが分かった。その分析感度は1μeqMレベルであり,比色分析法として十分高い感度を示した。本法の実分析への応用として,血漿中のヘパリン分析に適用した結果,血漿中1-8 unit/mLヘパリンの分析が可能であり,実分析にも耐えうる分析性能を有していることが確認できた。我々グループでは,天然の抗菌活性物質であるε-poly-L-lysine (εPL)が,ある種のグルコースオキシダーゼ(GOx)酵素反応速度を1万倍も増大することを見出し,同効果を利用したεPL高感度分析法を提案してきた。同効果は,プロトン付加により正電荷を帯びたεPLと負電荷を帯びたGOx間の静電相互作用に起因する。故にεPL以外の他の多価カチオン物質においても同効果が期待され,本研究では同酵素反応系を利用した多価カチオン物質(及びポリアニオン物質)高感度分析法の構築を目指している。εPLは+25-35価の多価カチオン物質である。そこで当該年度の研究では,数価の多価カチオン物質(+3-6価程度)においても同効果が現れることを,リジンオリゴマー側鎖を持つ抗生物質ストレプトスリシン(ST),またアミノ基を複数持つアミノグリコシド系抗生物質(AG)を用い実証した。さらに電荷数の異なるいくつかのST及びAG種を用いた検討を行うことで,それらの速度増大効果が,電荷数依存的に増大することを明らかにした。後者の知見は,提案する分析法が,電荷数のより大きな多価カチオン選択的分析法に成り得ることを示す結果であり大変興味深い。提案する分析法の検出感度を調べた結果,STおよびAGにおいても,+4価以上であれば1ppm以下の検出感度を有することが示された。また提案する分析法の実分析への応用として,ST生産菌の培養液に本法を適用した結果,50 ppm程度のSTを,培養液の前処理なしに,市販の試薬と混ぜるだけで容易に検出可能であることを示した。さらに上述の検出感度特性を利用することで,本法がより長いリジン側鎖を持つST生産菌のスクリーニング法にも成り得ることを示した。その他,本研究課題の関連研究として,εPLのGOx酵素反応速度増大効果を利用したグルコースセンサ構築に関する研究も行い,センサ構築におけるεPLの有用性を示す知見を得た。当初の研究計画通り,数価の多価カチオン物質の酵素反応速度増大効果に関する詳細な知見を得ることができ,また提案する手法による多価カチオン高感度分析が可能であることを示せた。また当初の期待通り,多価カチオン物質の電荷数依存的な酵素反応速度増大効果が確認され,提案する分析法が,より電荷数の多い多価カチオン物質選択的な分析法であることを示せた。よって,本研究課題の進捗状況は,概ね計画通り進んでいると判断できる。

提案する分析法が多価カチオン分析法として広く有用であることを示すために,STやAG以外の他の多価カチオン物質においても,その高感度検出・定量が可能であることを示す。具体的にはスペルミンやスペルミジン等のポリアミン,また除菌剤として広く利用されているポリヘキサメチレンビグアナイド等を対象とした検討を進める。多価カチオン(ポリカチオン)は,所定の条件でポリアニオンとの定量的なポリイオン複合体形成反応を示す。よってポリアニオンはポリカチオンの酵素反応速度増大効果を定量的に妨害することが期待され,本研究で提案した多価カチオン分析法はポリアニオンの高感度分析法にも応用できることが期待される。そこで本年度の研究計画に従い,同多価カチオン分析法を応用した高感度ポリアニオン分析法の構築を進める。実際の研究の進捗状況に応じた適切な助成金の使用により,差額が生じたものと判断できる。その額は小さく,今年度の実験材料費,論文投稿費用などに利用する。
閉塞性肺疾患の増悪に関わるB7H1に対し既存薬再開発を含めた創薬をめざす基盤研究

閉塞性肺疾患の増悪誘因としてウィルス感染は重要である。ウィルス関連分子である2本鎖RNA刺激による培養気道上皮実験系を用いてB7-H1/PD-L1発現を抑制できるPI3-kinase-delta阻害薬を見出した。その臨床的応用へ向けての段階として、疾患モデルマウスを用いた検証をおこなった。マウスに合成2本鎖RNAを気管内投与することで、一般的なウィルス感染気道炎症モデルを作成した。このモデルにおけるB7-H1/PD-L1の発現動態および気道炎症を解析した。PI3-kinase-delta阻害薬は本モデルにおけるB7-H1/PD-L1の発現および気道炎症を抑制することを明らかにした。野生型マウスに合成2本鎖RNAを気管内投与することで一般的なウィルス性気道炎症モデルを作成した。すなわち、切除肺から酵素処理によって細胞浮遊液を作成し、蛍光標識抗EpCAM抗体、抗CD11c抗体、抗CD45抗体等を用いて上皮細胞、樹状細胞、肺胞マクロファージを選別標識し、各細胞群におけるB7-H1/PD-L1発現の程度をフローサイトメトリーで検討した。気道炎症はBALの細胞分画、免疫染色を含めた組織の画像解析などによって評価した。その結果、B7-H1/PD-L1発現は各細胞ごとに異なった発現経過プロフィールを示すことが判った。このモデルに対し、PI3-kinase-阻害薬を気管内投与し、B7-H1/PD-L1の発現動態および気道炎症への効果を検討した。阻害剤投与によって樹状細胞での発現に変化がみられる傾向があり、現在その詳細を検討中である。我々はsurfactant protein D (SP-D)欠損マウスが12週齢頃から肺気腫様病変を自然発症することを確認した。この欠損マウスに合成2本鎖RNAを気管内投与することで、COPDにおけるウィルス感染モデルの作成をめざしている。また、卵白アルブミンを模擬抗原とするアレルギー性喘息マウスモデルを確立しており、これに合成2本鎖RNAを気管内投与することで、喘息におけるウィルス感染モデルの作成をすすめている。これら複合病態モデルにおけるB7-H1/PD-L1の発現動態および気道炎症を解析することを次年度の主たる検討目標としている。C57BL6野生型マウスに合成2本鎖RNAを気管内投与することでウィルス感染モデルを作成した。このモデルにおけるB7-H1/PD-L1の発現動態を検討した。なお、先行モデルとして論文発表したkeratin陽性細胞を対象としたマウス合成2本鎖RNA気管内投与モデルではkeratin陽性細胞が上皮細胞系のみならず、一部の炎症細胞にもみられ、また活性化した肺胞マクロファージ系や樹状細胞において自己発光がみられ疑陽性反応が混在する可能性が提示された。今回のモデルでは蛍光標識抗EpCAM抗体、抗CD11b抗体、抗CD45抗体を組み合わせて自己発光細胞を除去し、さらにFSC,SSCのパネル上の分布パターンを参考にゲートすることによって上皮細胞系、顆粒球系、マクロファージ系、リンパ球系を選別標識することに成功した。このモデルにおいてPI3キナーゼgamma阻害薬、delta阻害薬の単独、および併用投与によって各細胞系のB7-H1/PD-L1発現動態がどのように影響を受けるかについて解析を進めている。従来の計画では28年度にこれらの薬剤効果の2/3程度が終了する予定であったが、研究者の所属する施設が耐震補強工事期間に入り、年度後半で別棟に移動することとなり動物実験全体の実施が数ヶ月にわたって中断を余儀なくされた。年度末において移動後の実験再開の目処が立ったため、29年度初めから実験を開始する予定である。さらに、某企業が開発段階にある抗炎症薬について、前臨床モデルとして我々のマウス合成2本鎖RNA気管内投与モデルを使った共同研究を開始する準備をすすめており、研究課題にしめす「既存薬再開発」の指向性に準拠した研究展開が期待される。また、気道上皮細胞にウィルスを感染させてB7-H1/PD-L1発現を誘導するin vitroモデルの開発にも着手し、29年度にさらに検討を進める予定である。

PI3キナーゼgamma阻害薬、delta阻害薬の単独、および併用投与によって各細胞系のB7-H1/PD-L1発現動態がどのように影響を受けるかについて解析を進めている。従来の計画では28年度にこれらの薬剤効果の2/3程度が終了する予定であったが、研究者の所属する施設が耐震補強工事期間に入り、年度後半で別棟に移動することとなり動物実験全体の実施が数ヶ月にわたって中断を余儀なくされた。年度末において移動後の実験再開の目処が立ったため、29年度初めから実験を開始する予定である。平成28年度までの本研究で、C57BL6野生型マウスに合成2本鎖RNAを気管内投与することでウィルス感染モデルを作成し、B7-H1/PD-L1の発現動態を検討した。当初のモデルではkeratin陽性細胞を対象としたB7-H1/PD-L1の発現動態を検討したが、keratin陽性細胞が主たる解析対象である上皮細胞系のみならず、一部の炎症細胞にもみられ、また活性化した炎症細胞で自己発光がみられるなど疑陽性反応が混在する可能性が示唆された(Hamano et al. J Inflamm, 2017に誌上発表)。そこで、発展型モデルとして蛍光標識EpCAM抗体、抗CD11b抗体、抗CD45抗体を組み合わせて自己発光細胞を除去し、さらにFSC, SSCのパネル上の分布パターンを参考にゲートすることとし、上皮細胞系、顆粒球系、マクロファージ・単球系、リンパ球系に選別標識することに成功した。このモデルを用いて各細胞系におけるB7-H1/PD-L1の発現動態を測定し、in vitroの実験系において気道上皮細胞上のB7-H1/PD-L1の発現を抑制する効果を持つことを確認しているPI3キナーゼdelta阻害薬の効果がin vivoでもみられるかを検証した。合成2本鎖RNAを気管内投与すると上皮細胞系、顆粒球系、マクロファージ・単球系でB7-H1/PD-L1の発現が増強し、PI3キナーゼdelta阻害薬の気管内投与はこれを抑制した。現在論文準備中である。複合病態モデルも予定中。また、培養ヒト気道上皮細胞株BEAS-2Bを合成2本鎖RNAで刺激してB7-H1/PD-L1の発現を誘導するin vitroモデルではIL-22投与がB7-H1/PD-L1の発現誘導を用量依存性に抑制し、その抑制作用はSTAT3を介することを明らかにした(Seki et al. BBRC, 2017に誌上発表)。閉塞性肺疾患の増悪誘因としてウィルス感染は重要である。ウィルス関連分子である2本鎖RNA刺激による培養気道上皮実験系を用いてB7-H1/PD-L1発現を抑制できるPI3-kinase-delta阻害薬を見出した。その臨床的応用へ向けての段階として、疾患モデルマウスを用いた検証をおこなった。マウスに合成2本鎖RNAを気管内投与することで、一般的なウィルス感染気道炎症モデルを作成した。このモデルにおけるB7-H1/PD-L1の発現動態および気道炎症を解析した。PI3-kinase-delta阻害薬は本モデルにおけるB7-H1/PD-L1の発現および気道炎症を抑制することを明らかにした。我々はsurfactant protein D (SP-D)欠損マウスが12週齢頃から肺気腫様病変を自然発症することを確認した。
粒子-水連成系のマルチスケール変形解析手法の開発

本研究は,非線形均質化理論に基づく水.粒子連成系のマルチスケール解析手法の開発を目的としている.また,開発した手法を用いて飽和度と全体構造の力学挙動の関係について微視的・巨視的両面から考察を行う.本研究において,飽和状態における問題の定式化,プログラム開発,評価のための実験を行った.その結果,飽和状態の挙動をある程度の精度で解析可能となった.砂のような,固体粒子と液体の連成問題の解析可能となり,種々の力学挙動の解析・検討が可能となった.本研究は,非線形均質化理論に基づく水.粒子連成系のマルチスケール解析手法の開発を目的としている.また,開発した手法を用いて飽和度と全体構造の力学挙動の関係について微視的・巨視的両面から考察を行う.本研究において,飽和状態における問題の定式化,プログラム開発,評価のための実験を行った.その結果,飽和状態の挙動をある程度の精度で解析可能となった.砂のような,固体粒子と液体の連成問題の解析可能となり,種々の力学挙動の解析・検討が可能となった.本研究は,非線形均質化理論に基づく水-粒子連成系のマルチスケール解析手法の開発を目的としている.本研究期間内に飽和状態から不飽和状態まで,幅広い飽和度に対応することのできる手法を確立することを目指している.また,開発した手法を用いて飽和度と全体構造の力学挙動の関係について微視的・巨視的両面から考察を行う.さらに,開発する手法は将来的に地盤の凍上現象のような相変化が関連するような複雑な問題の解析に展開できる一般性を目指している.平成21年度には,主に飽和状態における問題の定式化とプログラム開発を行った.また,平行してプログラム検証のための実験も実施した.まず,粒子と水から構成された問題の準静的なつり合い式を出発点として,飽和状態における粒子と水の連成マルチスケール境界値問題を変分法により定式化し,支配方程式を導出した.次に,支配方程式を離散化し,まず,微視スケール問題の解析コードを作成・確立した.さらに,微視スケール問題の解析コードを全体構造の巨視スケール解析に組み込み,マルチスケール解析手法を確立した.予定していた解析プログラムの性能評価には至っていないが,今後これらを実施すると共に不飽和状態に拡張したい,これによって平成22年度以降,本研究の目的である飽和度と全体構造の力学挙動の関係について微視的・巨視的両面から考察を実施可能となる.本研究は,非線形均質化理論に基づく水-粒子連成系のマルチスケール解析手法の開発を目的としている.本研究期間内に飽和状態から不飽和状態まで,幅広い飽和度に対応することのできる手法を確立することを目指している.また,開発した手法を用いて飽和度と全体構造の力学挙動の関係について微視的・巨視的両面から考察を行う.さらに,開発する手法は将来的に地盤の凍上現象のような相変化が関連するような複雑な問題の解析に展開できる一般性を目指している.平成22年度には,平成21年度に実施した飽和状態における問題の定式化とプログラム開発について,その性能の評価を実験と照合しながら行った.解析コードを改善し,飽和状態の挙動をある程度の精度で解析可能となった.次に不飽和状態の問題に対して定式化を行った.本年度は,不飽和状態の解析コード構築まで目指していたが,そこまでには到達していない.来年度実施したいと考えている.本研究は,非線形均質化理論に基づく水-粒子連成系のマルチスケール解析手法の開発を目的としている.本研究期間内に飽和状態から不飽和状態まで,幅広い飽和度に対応することのできる手法を確立することを目指してきた.また,開発した手法を用いて飽和度と全体構造の力学挙動の関係について微視的・巨視的両面から考察を行う.さらに,開発する手法は将来的に地盤の凍上現象のような相変化が関連するような複雑な問題の解析に展開できる一般性を目指している.平成23年度までに飽和状態における問題の定式化,プログラム開発,評価のための実験を行った.解析コードを改善し,飽和状態の挙動をある程度の精度で解析可能となった.砂のような,固体粒子と液体の連成問題の解析可能となり,種々の力学挙動の解析・検討が可能となった.
東海村臨界事故における中性子線被爆による染色体・遺伝子異常の解析

高線量の中性子線被爆がヒトの染色体および遺伝子におよぼす影響について、1999年9月30日茨城県東海村核燃料施設で発生した臨界事故において、中性子線を大量に含む放射線被爆を受けた患者2名を対象として以下の検討を行った。生物学的および物理学的な予測被爆線量は18Gy(Pt1)および8Gy(Pt2)であった。被爆後の末梢血および骨髄血の染色体分析においては、両名ともに著しい染色体の断片化と構造異常が観察された。被爆後両患者ともに造血幹細胞移植が施行され、一名については持続的な造血系が再構築された(Pt1)が、もう一名に関しては一時的に混合キメラの状態になったがもののDayに自己造血が回復し、移植片の拒絶が確認された。興味深いことに、理論的には二次被爆の影響は殆ど無視出来ると考えられる時期に移植が行われたにも関わらず、Pt1においては再構築された造血細胞においても染色体のランダムな異常が20分裂細胞中3細胞に観察され、大量の中性子線被爆後においては、直接的な放射線障害以外に染色体を障害する、細胞を隔てて作用するメカニズムが存在する可能性が示唆された。こ自己の造血が回復したPt2においては、染色体分析において、分裂細胞の60%ないし80%の細胞に細胞ごとに異なるランダムな染色体の異常が観察され、放射線被爆による染色体の異常が自己造血の回復ののちも再生した造血組織に維持されることが明らかとなった。しかし、これらの異常が最終的に造血器腫瘍を誘発するか否かについては、患者が被爆後早期に多臓器不全により死亡したため、検討不能であった。一方、剖検後に患者の遺族の同意を得て検討された被爆組織の遺伝子の突然変異をras遺伝子、p53遺伝子およびp16INK4A遺伝子について検討したが、これらの遺伝子における突然変異率の上昇は証明されなかった。
蛍光タンパク質を用いたヒト培養細胞での欠損型フィブリノゲンの解析

【目的】血液凝固因子の一つであるフィブリノゲン(FBG)は複雑な血液凝固システムの最終産物であるフィブリンの前駆物質として知られている。本研究では、タンパクレベルでのFBGの動態を解析するため、培養細胞を用いFBGを構成するAα、Bβ、γのポリペプチドを強制発現させ、それぞれが細胞内でどのような動態をとるのかを調べる。また、Aαを欠失した場合、他の2種のポリペプチドは細胞内でどのような動態をとるのかを調べ、FBG生合成のメカニズムを明らかにし、診断法や治療法の開発に役立てることを目的とした。【研究方法・研究成果】1.無フィブリノゲン血症患者の遺伝子解析によりAα鎖に1238bpの欠損を確認した。このことからAα鎖の合成が不完全となり、FBG全体の合成・分泌に異常を来たしたと考えられた。2.RNA干渉を用い、ヒト肝臓由来の培養細胞でAα鎖の合成を阻害する実験を行った。siRNAによりAα鎖の合成を抑制することにより細胞内での合成および培養液中に分泌されるAα鎖の量は減少を示した。培養液中に分泌された量が減少したことから、他のBβ鎖、γ鎖の分泌量も低下していると示唆された。3.ヒト肝臓由来のcDNAライブラリーよりFBGを構成するFGA,FGB,FGGの3つのcDNAをPCRにより単離した。タンパク発現ベクターに組込み、クローニングするために再度制限酵素サイトを付加したプライマーを用いPCRを行った。4.今後得られたPCR産物をクローニングし、FBG非産生培養細胞株HEK293に遺伝子導入し、タンパクを強制発現させる。蛍光タンパク質との融合タンパクにする予定であったが、蛍光タンパク自体の分子量やフィブリノゲンの複雑な構造上、動態を調べるには難しいと考え、それぞれの抗体で免疫染色することで3種類のポリペプチドの細胞内での合成・分泌などの動態やその局在の変化を蛍光顕微鏡にて観察を行う予定である【目的】血液凝固因子の一つであるフィブリノゲン(FBG)は複雑な血液凝固システムの最終産物であるフィブリンの前駆物質として知られている。蛍光タンパク質との融合タンパクにする予定であったが、蛍光タンパク自体の分子量やフィブリノゲンの複雑な構造上、動態を調べるには難しいと考え、それぞれの抗体で免疫染色することで3種類のポリペプチドの細胞内での合成・分泌などの動態やその局在の変化を蛍光顕微鏡にて観察を行う予定である
ラット及びマウス肝移植におけるキメリズムと免疫寛容に関する実験的研究

臓器移植の究極の課題は,ドナー特異的な免疫抑制状態(免疫寛容)誘導法を確立することである.肝移植には免疫寛容誘導能があることが知られていたが,その分子生物学的メカニズムを明らかにするためには,マウスを用いた同所性肝移植モデルが不可欠である.マウス肝移植モデルはこれまで世界で一施設から報告されているのみであったが,われわれは本助成費を受けて,1997年3月までに915例のマウス同所性肝移植を行い,最近14カ月間で手技的成功率97%を得ており,本邦で初めて,世界では2番目に本モデルを確立した.その結果,11種類の近交系マウスを用いて48種類の異系間移植を行ったが,いずれにおいても移植肝は生着し,ドナーの皮膚移植により完全な免疫寛容の誘導も確認された.同様の結果が,実験用マウスとは全く異なる遺伝的背景を持つ野生株マウスにおいても成立することも確認され,マウス同所性肝移植は免疫寛容誘導メカニズムを解明するうえで最適な実験モデルであることが明らかとなった.まず,本モデルを用いて,Starzlらが免疫寛容のメカニズムとして提唱したミクロキメリズムの意義をRT-PCR法と共焦点レーザー顕微鏡により検討した.その結果,ミクロキメリズムは移植後23週間は成立していたが,その後消失することが確認され,ミクロキメリズムは免疫寛容の原因ではなく,結果であることが明らかとなった.臓器移植の究極の課題は,ドナー特異的な免疫抑制状態(免疫寛容)誘導法を確立することである.肝移植には免疫寛容誘導能があることが知られていたが,その分子生物学的メカニズムを明らかにするためには,マウスを用いた同所性肝移植モデルが不可欠である.マウス肝移植モデルはこれまで世界で一施設から報告されているのみであったが,われわれは本助成費を受けて,1997年3月までに915例のマウス同所性肝移植を行い,最近14カ月間で手技的成功率97%を得ており,本邦で初めて,世界では2番目に本モデルを確立した.その結果,11種類の近交系マウスを用いて48種類の異系間移植を行ったが,いずれにおいても移植肝は生着し,ドナーの皮膚移植により完全な免疫寛容の誘導も確認された.同様の結果が,実験用マウスとは全く異なる遺伝的背景を持つ野生株マウスにおいても成立することも確認され,マウス同所性肝移植は免疫寛容誘導メカニズムを解明するうえで最適な実験モデルであることが明らかとなった.まず,本モデルを用いて,Starzlらが免疫寛容のメカニズムとして提唱したミクロキメリズムの意義をRT-PCR法と共焦点レーザー顕微鏡により検討した.その結果,ミクロキメリズムは移植後23週間は成立していたが,その後消失することが確認され,ミクロキメリズムは免疫寛容の原因ではなく,結果であることが明らかとなった.1,マウス同所性肝移植モデルの確立:世界では他に一施設の報告しかなかったマウス同所性肝移植モデルを確立した.1996年3月までに600例のマウス同所性肝移植を行い,その成功率は97%である.本モデルは肝移植の移植免疫反応の分子生物学的機序を解明するうえできわめて重要である。2,マウス肝移植における免疫寛容の誘導:異系間マウス肝移植では,MHCの組み合わせによらず,移植肝は必ず生着することが判明した.さらに,肝移植後donorの皮膚も生着することより,免疫寛容の成立も確認された.したがって,マウス肝移植においては免疫寛容を誘導する特異的なメカニズムが存在すると考えられた.3,マウス肝移植におけるキメリズムの意義の検討(1)共焦点レーザー顕微鏡による免疫組織学的検討:MHC抗原特異的なmonoclonal抗体による免疫組織染色でrecipientの脾臓,胸腺を解析したところ,移植後2週間目までdonortypeの細胞が存在し,キメリズムの成立を確認した.(2)Flowcytometryによる解析:donorおよびreciplentのMHC抗原に特異的なmonoclonal抗体による二重染色でrecipientの肝,脾,胸腺を解析したところ,脾臓,胸腺ではキメリズムは確認できず,キメリズムのレベルはFlowcytometryの感度以下であった.また,移植肝においてdonor typeとrecipient typeの両方が陽性となるdouble positive cellの存在が判明し,移植肝の免疫寛容誘導機序に密接な関係があると考えられた.(3)RT-PCRによる解析:donorおよびrecipientのMHCのclass Iおよびclass IIに特異的なprimerを設定し,recipientの肝,脾,腎,胸腺のRNAを抽出しRT-PCRを行った.その結果,RNAレベルでもキメリズムは移植後2週間目まで存在したが,以後消失していた.以上の結果より,キメリズムは免疫寛容の結果に過ぎず,肝移植においては免疫寛容誘導の未知のメカニズムが存在しており,マウス肝移植モデルにより,その分子生物学的機序の解明と人為的免疫寛容誘導法の確立が可能と考えている.臓器移植の究極の目的は,ドナー特異的な免疫抑制状態(免疫寛容)誘導法を確立することである.肝移植には免疫寛容誘導能があることが知られていたが,その分子生物学的メカニズムを明らかにするためには,マウスを用いた同所性肝移植モデルが不可欠である.

マウス肝移植モデルはこれまで世界で一施設から報告されているのみであったが,われわれは本助成費を受けて,1997年2月までに910例のマウス同所性肝移植を行い,最近1年間で手技的成功率97%を達成し,本邦で初めて,世界では2番目に本モデルを確立した.その結果,11種類の異系マウスを用いて,38種類の異系間移植を行ったが,いずれにおいても拒絶反応による死亡例はなく,ドナーの皮膚移植により免疫寛容が誘導されることも確認した.同様の結果が,実験用マウスとは遺伝的背景の全く異なる野生株マウスにおいても成立することから,マウス同所性肝移植は免疫寛容誘導メカニズムを解明するうえで最適な実験モデルであることが明らかとなった.本モデルを用いて,Starzlらが移植臓器生着および免疫寛容成立のメカニズムとして提唱したマイクロキメリズムをRT-PCR法と共焦点レーザー顕微鏡により検討した.その結果,マイクロキメリズムは移植後23週間は成立していたが,その後消失することが確認され,マイクロキメリズムは免疫寛容の原因ではなく,結果であることが明らかとなった.
酸素イオン導電性セラミック薄膜を用いた高感度pHセンサーの開発

湿性腐食における環境側因子には,その化学組成・濃度・温度等が考えられるが,その内で環境のpHを知ることは腐食問題を解決するための重要な因子の1つである.しかし,常温から高温・高圧の腐食環境で安定なpHセンサーはない.本研究は酸素イオン導電性セラミックス薄膜と金属とその酸化物からなる酸化-還元対を組み合わせて固体薄膜型pHセンサを作成し,腐食環境のpHをモニタすることにより,装置材料の寿命予測を可能にすることを目的とした.このようなセンサに適する欠陥の少ないCeO_2-Y_2O_3薄膜の作製条件の最適化及び,MgO基板表面の改善,スパッタダウン方式による均質で欠陥の少ない薄膜の合成,さらに、薄膜の析出構造の変更とセンサー構造の検討について実験を行い以下の結論を得た.1) MgO基板の表面状態に及ぼすスパッタ薄膜の効果を考慮し,基板のリン酸溶液中でのエッチングを試み最適エッチング条件を見つけた.2)単独および多層薄膜作製時のガス圧、ガス組成などの最適条件を決定した.3)作製したpH電極の応答性は,高配向性結晶薄膜では,僅かな電位変化を示すのみであった.これはMgOを溶解して自立薄膜を得る際に,残留応力により皮膜に亀裂が生じたためと考える.一方,低結晶性薄膜を用いて作製したpH電極は,pH513の領域で-54mV/pHの勾配を持つ応答性を示した.しかしながら,pH5以下ではほとんどpH応答を示さなかった.これについても,同様にCeO_2-Y_2O_3皮膜の欠陥によるものと考えられるが,現在のところ明確ではない.湿性腐食における環境側因子には,その化学組成・濃度・温度等が考えられるが,その内で環境のpHを知ることは腐食問題を解決するための重要な因子の1つである.しかし,常温から高温・高圧の腐食環境で安定なpHセンサーはない.本研究は酸素イオン導電性セラミックス薄膜と金属とその酸化物からなる酸化-還元対を組み合わせて固体薄膜型pHセンサを作成し,腐食環境のpHをモニタすることにより,装置材料の寿命予測を可能にすることを目的とした.このようなセンサに適する欠陥の少ないCeO_2-Y_2O_3薄膜の作製条件の最適化及び,MgO基板表面の改善,スパッタダウン方式による均質で欠陥の少ない薄膜の合成,さらに、薄膜の析出構造の変更とセンサー構造の検討について実験を行い以下の結論を得た.1) MgO基板の表面状態に及ぼすスパッタ薄膜の効果を考慮し,基板のリン酸溶液中でのエッチングを試み最適エッチング条件を見つけた.2)単独および多層薄膜作製時のガス圧、ガス組成などの最適条件を決定した.3)作製したpH電極の応答性は,高配向性結晶薄膜では,僅かな電位変化を示すのみであった.これはMgOを溶解して自立薄膜を得る際に,残留応力により皮膜に亀裂が生じたためと考える.一方,低結晶性薄膜を用いて作製したpH電極は,pH513の領域で-54mV/pHの勾配を持つ応答性を示した.しかしながら,pH5以下ではほとんどpH応答を示さなかった.これについても,同様にCeO_2-Y_2O_3皮膜の欠陥によるものと考えられるが,現在のところ明確ではない.
造血幹細胞移植治療が口腔内細菌叢に与える影響についての臨床および分子生物学的解析

悪性腫瘍の治療のために造血幹細胞移植を受けた小児において、口腔内の状況が悪化していることが多い。このことは、移植前後において口腔環境が激変することにより、口腔内の細菌叢が変化している可能性が示唆される。本研究では、移植前および移植後に唾液とプラークの採取しDNAを抽出し、それらを用いて代表的な口腔細菌についてPCR法を用いて検出した。その結果、口腔レンサ球菌の出現の頻度には大きな変化は無かったが、歯周病細菌においては術後に検出される菌の種類が増加していた。また乳酸桿菌は術後では9割の患者から検出された。以上の結果から、口腔内細菌叢は変化し、歯肉炎や重度の齲蝕を引き起こしている可能性が示された。小児の悪性腫瘍の治療法のひとつである造血幹細胞移植は,その侵襲が大きいため治療後に長期的なフォローアップが必要となる。口腔内においては,移植の際に行われる化学療法,免疫抑制剤の投与,放射線治療のために、口腔内衛生状態が悪く重篤な齲蝕や歯周疾患に罹患するケースが多い。本研究では,これらの病態に関連する原因菌を特定するために,周術期における患者の口腔内の細菌叢の変化について検討を行なった。岡山大学生命倫理審査委員会より承認を受け,岡山大学病院小児科を受診中で,造血幹細胞移植を行う患児において,保護者および本人の同意を得た後,唾液およびプラークサンプルの収集を行なった。当初の予定通り,サンプルの収集は,移植直前,移植後1か月,移植後3か月,移植後6か月とした。現在,10名の患児の保護者の同意が得ることができ,サンプルの収集を行なっている。口腔内細菌の採取方法については上下顎の犬歯の縁下プラークを採取し,通法に従って細菌のDNAを抽出し,各菌に特異的なプライマーを用いてPCR法を行い,菌を同定した。菌は,6種類の口腔レンサ球菌と10種類の歯周病原細菌とした。現在、患者の幹細胞移植前,1か月後について調査できたのは3名であり、その平均年齢は10.5歳13.7歳であった。移植後1か月後に口腔レンサ球菌が認められた患児は1名のみであり,歯周病原生細菌ではCapnocytophaga sputigenaが最も多く検出され、次いでPrevotella nigrescensが認められた。上記の内容については2016年6月に開催される第16回国際歯科学会において発表する予定である。本研究は岡山大学生命倫理審査委員会の承認を得て実験を開始した。また岡山大学病院小児科のご協力を得て,造血幹細胞移植を受ける予定の患者の入院予定の連絡も徹底しており,サンプルの収集も順調にできている。経年的な口腔内細菌叢を調査する研究であり,患児と保護者の理解が必要であるが,こちらも問題ない。2015年8月以降岡山大学医学部小児科血液腫瘍グループの全面的協力を得て、病棟往診を週12度定期的に行い、サンプルを採取している。また小児科病棟のカンファレンスに参加し、造血幹細胞移植を行う予定の患児が入院する場合はもれなく唾液およびプラークを採取ができるように体制が整っている。当初の予定通り、移植直前、移植後1か月、移植後3か月、および移植後6か月に唾液およびプラークの採取を行っている。4月6日現在21名の患児の保護者の同意が得られており研究を実施している。そのうち12名(男児8名、女児5名:6.5歳から17.0歳)については3か月までのサンプル回収が終了しており、12名の患児については口腔内診査を行った後、移植前、移植1か月後、および移植3か月後に唾液およびプラークを採取した。疾患については、急性リンパ性白血病が最も多く、続いて急性骨髄性白血病であった。PCR法による細菌種同定を行った結果、口腔レンサ球菌において、Streptococcus oralisが最も高頻度に検出された。歯周病菌においては、Capnocytophaga ocharaceaが最も多く、続いてPrevotella nigrescensだった。すべてのサンプルにおいて口腔レンサ球菌は検出されたが、検出される菌数は、移植前と比較して移植後は減少している傾向が認められた。また、乳酸菌が検出された患児の数は、移植3か月後が最も多く、移植前および移植1か月後では検出されなかった患児からの検出も認められた。以上のことから移植前後で口腔内の細菌叢は変化していることが明らかとなった。岡山大学生命倫理審査委員会の承認を得た後、岡山大学病院小児科の協力を得て造血幹細胞移植を受ける予定の患者については漏れなく掌握している。また、小児科のカンファレンスに参加しており、患児の状態を把握しサンプルの収集を行えている。小児科の診療の都合上、転院や治療内容の変更により中止した症例も数例あるが、おおむね経時的なサンプルの収集も順調に行なうことができている。悪性腫瘍の治療法の1つである造血幹細胞移植の際には、移植直後にみられる口腔内の炎症が一旦消退しても、口腔内衛生状態が悪く、重篤な齲蝕や歯周疾患に罹患している患者が多くみられる。このようなことは、移植前の化学療法、免疫抑制剤投与により口腔環境が激変することにより、口腔内の細菌叢が変化している可能性が示唆される。

本研究では造血幹細胞移植を行う小児患者の術前術後の口腔内の細菌叢の変化を調査するため、保護者の同意が得られた患者の術前、術後1か月および3か月後に唾液の採取を行い、細菌DNAを抽出し代表的な口腔細菌の存在についてPolymerase Chain Reaction法を用いて調査した。その結果、口腔レンサ球菌に関しては齲蝕原性細菌であるStreptococcus mutansおよびStreptococcus sobrinusを含めた5種類の細菌が存在を認め、術後3か月では、術前と比較してS. sobrinusの検出率が高くなっていた。歯周病菌については、健常児ではほとんど検出されないが、術前より歯周病菌の検出率が高く、術後ではさらに検出率が上昇し、特にPrevotella nigrescensとEikenella corrodensが3か月後に最も多く出現した。その他の歯周病菌も完全に術後に消失したものはほとんど認めなかった。また選択培地を用いて乳酸桿菌の出現について調査を行った。その結果、乳酸桿菌の出現については術前では約40%に認めたが、術後3か月では約90%に認められた。以上の結果から通常はあまり小児の口腔からは検出されない歯周病菌および乳酸桿菌が検出されており、歯周状態の悪化や重症齲蝕が発生しやすい口腔内の細菌叢へと変化していることが明らかとなった。このことから、造血幹細胞移植を受けた小児に対して継続的な口腔衛生指導および口腔内管理が必要と考えられる。悪性腫瘍の治療のために造血幹細胞移植を受けた小児において、口腔内の状況が悪化していることが多い。このことは、移植前後において口腔環境が激変することにより、口腔内の細菌叢が変化している可能性が示唆される。本研究では、移植前および移植後に唾液とプラークの採取しDNAを抽出し、それらを用いて代表的な口腔細菌についてPCR法を用いて検出した。その結果、口腔レンサ球菌の出現の頻度には大きな変化は無かったが、歯周病細菌においては術後に検出される菌の種類が増加していた。また乳酸桿菌は術後では9割の患者から検出された。以上の結果から、口腔内細菌叢は変化し、歯肉炎や重度の齲蝕を引き起こしている可能性が示された。資料採取を行う環境が整ったため,今後も昨年と同様に採取を行い,口腔内細菌特に齲蝕罹患状態や,歯周病関係の細菌の出現傾向の傾向と幹細胞移植後の粘膜病変の状態について検討を行う予定である。資料採取を行う環境が整ったため,今後も昨年と同様にサンプルの採取を行い,口腔内細菌特に齲蝕罹患状態や,歯周病関係の細菌の出現傾向の傾向と幹細胞移植後の粘膜病変の状態、齲蝕罹患状態の傾向等について検討を行う予定である。さらに口腔内細菌叢と疾患との関連も分析する予定である。1.吉田衣里,造血幹細胞移植患者における口腔内細菌叢の変化と対応第29回岡山大学病院小児医療センター合同カンファレンス, 2018年1月23日,マスカットキューブ(岡山県岡山市)小児歯科学分野