hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
周産期と乳児期初期をつなぐ生後1ヶ月齢児の脳・身体活動から探るヒトの発達の連続性

体温センサーは、装着が容易であり、児の身体的負担も少ないことから、この指標により簡便に睡眠の状態をモニタできることは、新生児を含む医療現場での計測において有意義なことと考えられる。生後1ヶ月までの児の計測に関しては、これまでに引き続き、病院の小児科での計測を継続した。43チャンネルのfNIRS計測を実施し、10名のデータを追加計測することができた。本研究における脳機能計測においては、当初はfNIRSを用いた計測に特化した計画であったが、マルチセンサーシステムの導入により脳波等の複数の生体信号を得る環境ができたことは、当初の目的を上回る成果であった。fNIRSで計測される脳の酸素化状態と、脳波等で明らかにされる睡眠の状態を同時に解析するシステムを確立できたことは、今後の新生児・乳児期の脳機能の発達を解明するための重要な基盤と位置付けられる。周産期から乳児期初期における脳の機能発達を明らかにするため、近赤外分光法(fNIRS)を用いた計測データより、脳の血流における酸素化ヘモグロビン(oxy-Hb)と脱酸素化ヘモグロビン(deoxy-Hb)の位相差を表す指標(hPod)を算出した。満期産児および早産児を対象に、出生から生後6ヶ月の時期においてhPodを検討したところ、同位相から逆位相への発達的変化が認められたが、出生から数ヶ月経過した時点においては、早産の児の中でもより早く生まれた群(early preterm群)で、逆位相への変化が緩やかであることが示された。hPodは発達初期の脳の機能発達を示す有用な指標と考えられる。1年を通じてコンスタントに計測を実施し、また解析方法の検討・確立も進めることができた。異なる母集団との比較に関しては、現在進めている最中である。多チャンネルNIRSを用いた計測によって取得されたデータを解析することにより、脳のさまざまな部位における脳機能ネットワークの発達の検討を進める予定である。また、定型発達の児のデータを集中して取得することにより、それらと比較した病児・リスク児の特徴を明らかにすることを目指す。身体運動特性の解明のため、自発運動および神経学的検査項目の実施を進める。多チャンネルNIRSによる計測データを蓄積してきた。このデータを解析・検討することにより、より高い空間分解能での新生児期・乳児期前半の脳機能の発達を明らかにすることが期待される。脳の異なる部位で、分化した発達過程が見られるのかどうかを検討する予定である。また、これまで脳機能計測は、NIRSを用いておこなっていたが、今後、脳波による脳機能計測を導入することとした。これにより、より時間分解能が高い計測が可能になることが期待される。瞬時の生体応答を捉えることを目指す。発達科学脳の機能発達に関しては、定型発達を呈する児の計測をさらに進める予定である。特に、生後1ヶ月の時点でのデータを、さらに蓄積し、その前後(新生児期および乳児期)との比較を丁寧におこなう。また、計測部位(チャンネル数)を増やすことにより、より広い範囲の脳の活動の様子について解明する。次年度以降は、当初の予定通り、身体運動特性の解明に取りかかる予定である。H27年度は、H26年度に計測したデータの解析に重点を置いた。
f-π複合系の電磁物性

平成10年度には,これまで開発・基本物性評価をおこなった(BEDT-TTF)_4[Ln(NCS)_6]・CH_2Cl_2の磁性詳細測定と,希土類錯体を含む新しい分子性伝導体(BEDO-TTF)_x[Ln(NCS)_6]の開発・物性評価をおこなった。これらは重希土類元素(Ln=Ho,Er,Yb,Yなど)と有機伝導体成分分子(πドナー)の複合化合物で,f電子とπ伝導電子系の数少ない安定集積系として,有機伝導体の低次元的伝導性に希土類イオンのもつ特異な磁性や光物性を付加する試みとして開発した。特に平成10年度に得た(BEDO-TTF)_x[Ln(NCS)_6]は極低温まで金属伝導を示すf-π複合電子系の最初の例である。f-π複合電子系は,極端に性格の異なる電子系がほとんど相互作用せずに共存する特徴をもつが,磁性-伝導性複合物性の実現には,弱いf-π間相互作用が働く必要がある。この点に注目して(BEDT-TTF)_4[Ln(NCS)_6]・CH_2Cl_2の低温磁性を研究し,π電子系が4K以下で反強磁性になること,f電子とπ電子がほとんど独立に振舞っていること,f電子磁気モーメントの温度変化は結晶場効果と考えられることを磁化率・比熱・ESRで示した。新規含希土類分子性金属(BEDO-TTF)_x[Ln(NCS)_6]の物性として次の点を明らかにした。格子定数は他のBEDO-TTF塩と類似し,β"構造という二次元分子配列をとっていることが推定できる。電気抵抗は1.3K以上で金属的で,広い温度範囲で温度の2乗に比例する。f電子をもたないLn=Yの磁化率はPauli常磁性的であり,Ln=Ho,Erではf電子の大きな異方的磁気モーメントが観測される。Ln=Ybは特異的で,低磁場(約1k0e)で磁場誘起一次相転移が見出され,これはf電子が独立ではなく,格子系または伝導電子系を介して協同的にふるまっていることを意味する。
高発がん性EBウイルス株は存在するか？

日本人に多い胃がんの約1割にEBウイルスの感染が認められ、発がんへの関与が疑われている。本研究では、ゲノム編集技術を応用して、EBウイルス陽性胃がん細胞から二種の全長EBウイルスゲノムDNAを単離して全ウイルスゲノム塩基配列を決定した。系統樹解析から、両者はいずれも東アジア地域に分布するウイルス株のグループに分類された。得られた胃がん細胞由来EBウイルスを不死化上皮細胞に感染させたところ、がん遺伝子産物高発現で誘導されるはずの細胞死が阻止されたことから、上皮がん発生の初期段階においてEBウイルス感染が関与する可能性が示唆された。近年、次世代シークエンサーの導入により、EBウイルス株のウイルスゲノム塩基配列の多様性が明らかになり、疾患病原性との関連が注目されている。英国のグループが中心となって、様々な疾患由来EBウイルス株の塩基配列決定が行われつつある。しかしながらこうした解析は、EBウイルス潜伏感染細胞の全ゲノムDNAにわずかに含まれるウイルスDNAをhybrid capture法で濃縮してから行われ、しかもリードが短い次世代シークエンサーは反復配列を苦手とするため、得られた配列は「虫食い状態」である。また塩基配列が決まったとしても、当然のことながら感染性ウイルス粒子の再構成はできない。平成27年度の研究では、EBウイルス潜伏感染細胞に対して、ウイルス環状ゲノム(エピゾーム)を一ヶ所切断するゲノム編集プラスミド、およびドナープラスミドを同時に導入することで、相同組換え修復によりウイルスゲノムDNA全長(約170キロベース)を効率良くBAC(bacterial artificial chromosome、大腸菌人工染色体)クローン化する技術を確立した。この方法により胃がん細胞株由来の全長EBウイルスゲノムを2株BACクローン化し、第3世代シークエンサーで反復配列を含む全ウイルスゲノム塩基配列を決定した。クローン化したウイルスDNAを安定導入したHEK293細胞は感染性ウイルスを産生した。すなわち胃がん細胞株内では厳密な潜伏感染状態で維持されていたウイルスを、感染性ウイルスとして再構成できた。このウイルスを不死化ケラチノサイトに感染させて安定潜伏感染細胞を樹立すると、変異型RAS誘導発現による細胞死が阻止された。胃がん、上咽頭がん、NK/Tリンパ腫など様々な疾患の発生過程におけるEBウイルスの関与を考えていく上で、その過程に関与したと考えられるウイルス株そのものを単離・再構成できるという点で、本法の有用性が期待される。当初平成27年度に予定していた胃がん細胞株由来のEBウイルス株のクローン化および塩基配列のみならず、平成28年度に予定していた組換えウイルス産生、さらには感染上皮細胞の形質変化の確認まで研究が進んだため。上咽頭がんや胃がんにおいてEBウイルスの感染が認められ、ウイルスの上皮細胞がん化への関与が強く疑われている。しかしながらこうしたがん細胞由来のEBウイルス株の解析例はほとんどない。そこで本研究では、ヒトがん細胞由来EBウイルスゲノムDNAの単離(クローン化)および機能解析を試みた。平成27年度の研究において、ゲノム編集技術を用いた新しいEBウイルスゲノム単離法を開発し、胃がん由来のEBウイルス株2株(SNU719株およびYCCEL1株、いずれも韓国にて樹立された細胞株)の全長ウイルスゲノムDNAをクローン化した。その結果、両者の間には潜伏感染蛋白質のサイズ、反復配列のコピー数などに様々な違いが認められた(Kanda T et al, J Virol, 90:4383, 2016)。系統樹解析から、単離した二種のEBウイルス株は、いずれも東アジア地域に分布するウイルス株のグループに属し、Bリンパ芽球由来株の代表として広く実験に使われているB95-8株とは系統が異なることが明らかになった。得られたがん細胞由来EBウイルス株の組換えウイルスを産生し、不死化上皮細胞に感染させたところ、がん遺伝子産物高発現で誘導されるはずの細胞死が阻止された。以上より、上皮がん発生の初期段階におけるにEBウイルスの関与が疑われた。さらにこうした解析を進める上で、日本人由来EBウイルス株の解析が必須と考え、自然樹立された日本人由来リンパ芽球様細胞株から同様の手法により全長ウイルスゲノムの単離(クローン化)を行った。今後、より多くの日本人由来自然樹立リンパ芽球様細胞株から対照となるEBウイルス株を取得した上で、胃がん由来EBウイルス株との比較を行うことで、「高発がん性EBウイルス株」の存在の有無を検証する予定である。平成28年度は、新しい所属への異動に伴い、研究室整備および大臣確認実験の再申請が必要となる。そこで大臣確認を必要としない実験から開始することを予定している。すなわち平成27年度の研究により確立した技術を用いて、様々なEBウイルス潜伏感染細胞からのウイルスゲノムDNAのクローン化を試みる予定である。ウイルス学平成27年度の研究費の一部を、別財源でまかなうことができたため。平成28年度に繰り越して、その研究計画の遂行のために使用する。
膵β細胞新生に関与する転写因子・増殖因子の発生工学的解析

【目的】私はこれまで共同研究者らとともにEGFファミリーに属する増殖因子であるベータセルリンが、膵外分泌由来の細胞株であるAR42J細胞をインスリン分泌細胞に分化させる能力を有することを明らかにし(J Clin Invest 97:1647,1996)、ベータセルリンが膵導管細胞およびα、β細胞に発現しており膵組織においても生理的なβ細胞の分化や機能維持に関与している可能性を示してきた(Endocr J46:755,1999)。さらに、同因子のβ細胞分化誘導能を利用し、ベータセルリンを外因性に糖尿病モデル動物に投与すると膵β細胞の新生が促進され耐糖能が改善することを明らかにした(Diabetes 49:2021,2000)。今回、ベータセルリンを膵組織特異的に過剰発現させたトランスジェニックマウスを作製し、膵β細胞の分化・新生機構における同因子の役割を、機能の詳細が明らかでないHNFファミリーなどの転写因子群とともに明らかにし、膵β細胞分化・新生機構のさらなる解明を試みることを目的とした。【方法】膵導管細胞特異的ベータセルリン発現系(エラスターゼ1のプロモーターを利用したもの)と膵α(グルカゴン)細胞特異的ベータセルリン発現系(グルカゴンのプロモーターを利用したもの)の2種類のベータセルリン-トランスジェニックマウスを確立した。前記2種類の内因性ベータセルリン過剰発現系トランスジェニックマウスの膵組織像を発生段階から経時的に観察し、膵島の数や大きさおよび導管に接した膵島様構造物の数等に対する形態計測を行うとともに、ベータセルリン過剰発現特異的な膵組織の変化を免疫組織化学的に検討した。腹腔内ブドウ糖負荷試験を指標とした耐糖能も経時的に検討した。【結果】耐糖能は、検討した範囲の週令ではwild typeと明らかな差がなかった。膵組織を観察したところ、導管に接したβ細胞を含む小さな膵島様構造物がwild typeに比し多数認められた。【目的】ベータセルインを膵組織特異的に過剰表現させたトランスジェニックマウスを作製し、膵β細胞の文化・新生機構における同因子の役割を明らかにする。また、膵β細胞の発生及び分化において重要な役割を演じていると考えられているものの、標的遺伝子については不明なものの多い転写因子群の発現様式も明らかにし、膵β細胞分化・新生機構のさらなる解明を試みることを目的とする。【方法】導管細胞特異的ベータセルリン発現系(エラスターゼ1のプロモーターを利用したもの)と膵α(グルカゴン)細胞特異的ベータセルリン発現系(グリカゴンのプロモータを利用したもの)の2種類のベータセルリン-トランスジェニックマウスを確立した。前記の2種類の内因性ベータセルリン過剰発現系トランスジェニックマウスの膵組織像を発生段階から経時的に観察し、膵島の数や大きさおよび導管に接した膵島様構造物の数等に対する形態計測を行うとともに、ベータセルリン過剰発現特異的な膵組織の変化を免疫組織化学的に検討した。耐糖能も経時的に検討した。【結果】耐糖能は、検討した範囲内ではwild typeと明かな差がなかった。膵組織を観察したところ、導管に接した膵島様構造物がwild typeに比し多数認められた。【今後の予定】ベータセルリン-トランスジェニックマウスの膵β細胞をアロキサンなどにより破壊し、糖尿病状態にしたときの膵β細胞の再性能を検討する。
神経解剖学・生理学の知見に基づく脳幹・脊髄神経系の超詳細数理モデルの構築

本研究では脳幹・脊髄神経系の超詳細大規模数理モデルの構築を目指した.モデルの構築に際しては,可能な限り神経解剖学と電気生理学的知見に忠実に,複数の計算機内に階層的かつ分散ネットワーク的に構築することを目標とし,神経解剖学データに基づき,神経回路網の結線構造と各神経細胞の形態を3次元的再構成を実施した.また,文献サーベイに基づき,各神経細胞の電気的興奮現象を,イオンチャネルコンダクタンスベースの微分方程式モデルとしてとして構築した.このとき,徹底的なオブジェクト指向に基づき,神経回路網と細胞の構造,構成要素のダイナミクスの双方を計算機内に構築した.最終年度である本年度は,まず,昨年度に引き続いて,階層的マルチオブジェクトネットワークモデルを種々のオブジェクトに対して構築できるモデル構築支援システムの開発・高度化を行った.また,生理学的に詳細なニューロンオブジェクトからなる階層的ネットワーク全体の電気生理学的ダイナミクスをシミュレートでき,かつモデル構築に際しては必要に応じてニューロンオブジェクトやネットワーク構造を容易に変更・編集できるシステムの高度化を実施した.さらに,PCクラスタを用いて,64CPUに分散された電気生理学的に詳細な介在ニューロンモデルから構成した神経系全体の動態シミュレーションを実施した.ここでは解剖学的に詳細なモデルそのものの動態シミュレーションは今後の課題とし,ニューロン数は224個に限定した.その結果,構築モデルが伸屈筋および脊髄の左右側ニューロン群間が交番的に興奮する振動的時空間パターンが生成することを示した.本研究構築したモデルは,大規模ニューラルネットワークの動態が,系を構成する個々のニューロンやそのイオンチャネル,あるいはシナプス結合様式等の性質に,どのように依存するかを解析するプラットフォームとしての役割を果たすことが期待される.本研究では脳幹・脊髄神経系の超詳細大規模数理モデルの構築を目指した.モデルの構築に際しては,可能な限り神経解剖学と電気生理学的知見に忠実に,複数の計算機内に階層的かつ分散ネットワーク的に構築することを目標とし,神経解剖学データに基づき,神経回路網の結線構造と各神経細胞の形態を3次元的再構成を実施した.また,文献サーベイに基づき,各神経細胞の電気的興奮現象を,イオンチャネルコンダクタンスベースの微分方程式モデルとしてとして構築した.このとき,徹底的なオブジェクト指向に基づき,神経回路網と細胞の構造,構成要素のダイナミクスの双方を計算機内に構築した.最終年度である本年度は,まず,昨年度に引き続いて,階層的マルチオブジェクトネットワークモデルを種々のオブジェクトに対して構築できるモデル構築支援システムの開発・高度化を行った.また,生理学的に詳細なニューロンオブジェクトからなる階層的ネットワーク全体の電気生理学的ダイナミクスをシミュレートでき,かつモデル構築に際しては必要に応じてニューロンオブジェクトやネットワーク構造を容易に変更・編集できるシステムの高度化を実施した.さらに,PCクラスタを用いて,64CPUに分散された電気生理学的に詳細な介在ニューロンモデルから構成した神経系全体の動態シミュレーションを実施した.ここでは解剖学的に詳細なモデルそのものの動態シミュレーションは今後の課題とし,ニューロン数は224個に限定した.その結果,構築モデルが伸屈筋および脊髄の左右側ニューロン群間が交番的に興奮する振動的時空間パターンが生成することを示した.本研究構築したモデルは,大規模ニューラルネットワークの動態が,系を構成する個々のニューロンやそのイオンチャネル,あるいはシナプス結合様式等の性質に,どのように依存するかを解析するプラットフォームとしての役割を果たすことが期待される.本研究は,入手可能な限りの神経解剖学と電気生理学的知見に忠実に,複数の計算機内に階層的かつ分散ネットワーク的に脳幹・脊髄神経系の超詳細大規模数理モデルを構築することを目指している.これは,神経解剖学データに基づく神経回路網の結線構造と各神経細胞の形態を3次元的に再構成,電気生理学的データと文献サーベイに基づく神経細胞のイオンチャネル(コンダクタンス)ベースの微分方程式モデルおよびアナログ/デジタルデバイスとしてモデル構築を含む.徹底的なオブジェクト指向に基づき,神経回路網と細胞の構造,構成要素のダイナミクスの双方を計算機内に構築することを目指しており,システム構築後は,ユーザが,あたかもそこに実際の神経系が存在するかのような感覚で,系の全体とその構成要素へアクセスすることを可能になる.期間の最終段階には,構築した神経系全体のダイナミクスシミュレーションの実施を目指す.この目的を達成するために,研究初年度である16年度は,初期段階の小規模モデルの構築が行える環境を整備した.具体的には,システムの構成要素である介在ニューロンの数理モデル化およびアナログ・デジタルハイブリッドシステムとしてのオブジェクト化を実施した.また,本研究で開発・利用するモデル構築システムは,サブシステムの構築,サブシステム同士の並列結合,サブシステムの内部に階層的にサブシステムを配置できることが特徴である.本年度は,この特徴を実現する基盤システム(プログラム)として,STLライブラリおよびSQLデータベースシステムを融合した新たなデータ構造の設計・構築を実施した.これにより,ニューロンのネットワーク構築は,大局的サブシステムの構築とネットワーク化,局所的微細構造の構築とネットワーク化の両面から進めることが可能になった.この結果に基づき,平成17年度はより具体的なシステム構築を実施する.本研究は脳幹・脊髄神経系の超詳細大規模数理モデルを構築することを目指している.本モデルは,入手可能な限りの神経解剖学と電気生理学的知見に忠実に,複数の計算機内に階層的かつ分散ネットワーク的に構築する.神経解剖学データに基づき,神経回路網の結線構造と各神経細胞の形態を3次元的に再構成する.

また,電気生理学的データと文献サーベイに基づき,各神経細胞の電気的興奮現象を,イオンチャネル(コンダクタンス)ベースの微分方程式モデルおよびアナログ/デジタルデバイスとしてとして構築する.徹底的なオブジェクト指向に基づき,神経回路網と細胞の構造,構成要素のダイナミクスの双方を計算機内に構築する.したがって,一旦モデルが構築できれば,本システムのユーザは,あたかもそこに実際の神経系が存在するかのような感覚で,系の全体とその構成要素にアクセスすることができる.期間の最終段階には,構築した神経系全体のダイナミクスシミュレーションの実施を目指す.この目的を達成するために,本年度は,階層的マルチオブジェクトネットワークモデルを種々の汎用的物理的オブジェクトに対して構築できるモデル構築支援システムを開発した.また,生理学的に詳細なニューロンオブジェクトからなる階層的ネットワーク全体の電気生理学的ダイナミクスをシミュレートし,かつモデル構築に際しては必要に応じてニューロンオブジェクトやネットワーク構造を容易に変更・編集できるシステムを開発した.これにより,解剖学的・電気生理学的に詳細な脊髄神経回路の構築が実施できる体制が整った.本研究では脳幹・脊髄神経系の超詳細大規模数理モデルの構築を目指した.モデルの構築に際しては,可能な限り神経解剖学と電気生理学的知見に忠実に,複数の計算機内に階層的かつ分散ネットワーク的に構築することを目標とし,神経解剖学データに基づき,神経回路網の結線構造と各神経細胞の形態を3次元的再構成を実施した.また,文献サーベイに基づき,各神経細胞の電気的興奮現象を,イオンチャネルコンダクタンスベースの微分方程式モデルとしてとして構築した.このとき,徹底的なオブジェクト指向に基づき,神経回路網と細胞の構造,構成要素のダイナミクスの双方を計算機内に構築した.最終年度である本年度は,まず,昨年度に引き続いて,階層的マルチオブジェクトネットワークモデルを種々のオブジェクトに対して構築できるモデル構築支援システムの開発・高度化を行った.また,生理学的に詳細なニューロンオブジェクトからなる階層的ネットワーク全体の電気生理学的ダイナミクスをシミュレートでき,かつモデル構築に際しては必要に応じてニューロンオブジェクトやネットワーク構造を容易に変更・編集できるシステムの高度化を実施した.さらに,PCクラスタを用いて,64CPUに分散された電気生理学的に詳細な介在ニューロンモデルから構成した神経系全体の動態シミュレーションを実施した.ここでは解剖学的に詳細なモデルそのものの動態シミュレーションは今後の課題とし,ニューロン数は224個に限定した.その結果,構築モデルが伸・屈筋および脊髄の左右側ニューロン群間が交番的に興奮する振動的時空間パターンが生成することを示した.
絹の遺伝子組み換えと精密構造制御を基盤とするアパタイトナノ結晶複合体の創製

繊維・高分子材料/アパタイト複合体の開発に関する研究は、老齢人口の増加を背景とした社会からの骨や歯の再生に関する高い材料開発の要請を受けて極めて活発である。本研究の目的は、厳密に構造制御された絹の繰り返しラメラ構造を基盤とし、遺伝子組み換え法を用いて基盤表面のターン構造部位へ規則的にカルシュウム結合部位を導入、それにより絹基盤表面上へアパタイトナノ結晶を生成、新規骨補填材料を開発することである。絹の構造制御によるラメラ構造の発現に関して、(AG)_<15>をモデル系とし、固体NMRの各種解析技術を用いて構造の解明を進めた結果、繰り返し構造部分が8残基からなるラメラ構造が高い確率で出現することを明らかにした。一方、CalbindinD9Kのカルシュウム結合部位ならびにアコヤ貝真珠層に存在するカルシュウム結合部位に着目し、それを各種絹の繰り返し構造(Ala)_<12>,(Ala-Gly)_6,(Ala-Gly-Gly)_4,(Ala-Gly-Gly-Gly)_3で挟んだ一連のモデルペプチドを合成し、固体NMRを用いて、その構造を詳細に検討した。さらに、家蚕絹結晶部の繰り返し構造の間に、接合部として、アコヤ貝真珠層のカルシュウム結合部位を導入した新しい絹様タンパク質を遺伝子組み換え法を用いて生産した。ファーメンターを用いた培養によって、数十mg/lの試料を得ることができた。また、カルシュウムとリンを含む水溶液中に交互浸漬を行うことによって、カルシュウムを表面に沈積させ、ハイドロキシアパタイトと推定される絹様材料を作成することができた。一方、これらの絹様タンパク質の新規骨補填材としての評価をウサギ大腿骨への移植実験により行い、長期にわたる絹様タンパク質の分解と新生骨の生成に関して検討した。絹様タンパク質が、それらの観点から極めて優れていることを見出し、関連学会で報告した。CalbindinD9Kのカルシュウム結合部位14残基を機能部位とし、(Ala)_<12>を基盤として両側から挟んだ、合わせて38残基からなるモデル化合物を固相法で合成、蟻酸処理を行った後、固体NMRを用いて精密な構造評価を行った。さらに、基盤部位を(Ala-Gly)_6,(Ala-Gly-Gly)_4,(Ala-Gly-Gly-Gly)_3と変化させたモデル化合物についても合成を行い、構造を比較した。その際、機能部位の構造情報を選択的に得るため,機能部位の安定同位体ラベル化を行った。(Ala)_<12>および(Ala-Gly)_6を基盤部位とした場合、規則的なβ-シート構造を形成すること、カルシュウム結合部位は、CalbindinD9K中と同様の構造をとり、カルシュウムと強く結合することを確認した。基盤部位を同様に4種選び、機能部位をアコヤ貝真珠層に存在するカルシュウム結合部位に変えた場合についても、モデル化合物を固相法で合成、構造とカルシュウム結合性を検討した。さらに、現在、ラメラ構造の発現と関連した詳細な固体MR構造解析とSEM観察、生体適合性を検討するためのカルシュウム結合性、石灰化実験、ウサギ大腿骨への移植実験を行っている。最終的に、絹をベースとした優れた新規骨補填材料、歯科用材料を開発するための指針を得る予定である。これらの成果は関連学会で発表するとともに、国際関連誌に投稿予定である。また、関連した、基盤としての絹の構造と生体材料への応用に関する研究報告もまとめた。繊維・高分子材料/

アパタイト複合体の開発に関して、絹は十分な強度を有するとともに長年にわたり優れた縫合糸として使用されてきた実績があることから、国内外を問わず、その材料の候補としてよく用いられている。本研究の目的は、厳密に構造制御された絹の繰り返しラメラ構造を基盤とし、遺伝子組み換え法を用いて基盤表面のターン構造部位へ規則的にカルシュウム結合部位を導入、それにより絹基盤表面上へアパタイトナノ結晶を生成、新規骨補填材料を開発することである。本年度は、前年度の成果をさらに発展させ、家蚕絹結晶部の繰り返し構造の間に、接合部として、アコヤ貝真珠層に存在するカルシュウム結合部位を導入した化合物を遺伝子組み換え法を用いて生産した。ファーメンターを用いて大腸菌の培養条件の検討を詳細に行い、できるだけ収量を上げるように、培養条件を最適化した。その結果、数十mg/lの試料を得ることができ、SDS-Pageや^1H溶液NMRを用いて生産物の確認を行った。また、絹様タンパク質のフィルムを作成し、蟻酸処理またはメタノール処理によってラメラ構造を発現させ、前年度、用いてきた各種固体NMRの手法を用いて、そのキャラクタリゼーションを行った。カルシュウムとリンを含む水溶液中に交互浸漬を行うことによって、前年度、作成した試料同様、カルシュウムを表面に沈積させることができた。さらに、絹の構造に関する基礎的研究を主に固体NMRを用いてすすめ、絹の基盤構造について知見を蓄積し、多くの論文を関連の国際雑誌に報告した。一方、日本大学松戸歯学部において、絹様タンパク質の新規骨補填材としての評価をウサギ大腿骨への移植実験により行い、絹様タンパク質の分解と新生骨の生成に関する実験を行い、絹様タンパク質が、それらの観点から極めて優れていることを見出し、関連学会で報告した。
ブテノライド型誘導因子を介した放線菌二次代謝の潜在能開拓

本研究では、放線菌二次代謝シグナル系の改変による休眠物質の生産覚醒化とその生合成系の解明、またブテノライド型シグナル系を有する放線菌種の同定とその二次代謝系の解明、を主目的とした。本研究により、抗寄生虫薬エバーメクチン生産菌において、シグナル受容体の遺伝子破壊がフトキサゾリンAの生産を覚醒すること、またフトキサゾリンA生合成クラスターが公開ゲノム情報にない領域にコードされていることを解明した。また、ブテノライド型シグナル活性を示す物質を同定し、ブテノライド型シグナルの構造活性相関を解明したのに加え、二次代謝シグナルを介した化学シグナルトークを示した。放線菌は多彩な二次代謝産物を生産する能力をゲノムにコードする一方、意外にも、それらの能力はほぼ休眠状態にある。これらの潜在能力を開拓できれば、限られた生物資源から新規の有用物質を高確率に発見できると考えられる。研究代表者は、放線菌二次代謝を誘導する新規シグナル物質(ブテノライド型シグナル)を単離し、新たな二次代謝制御系を報告している。本研究では、1.ブテノライド型シグナル制御系の人為的操作による休眠物質の生産覚醒化とその生合成系の解明、2.本制御系を有する放線菌種の同定とその二次代謝系の解明、を主たる目的とする。本年度は、まず、ブテノライド型シグナルの受容体様遺伝子の機能喪失により生産覚醒する、セルロース生合成阻害剤フトキサゾリンの生合成遺伝子について、解析した。フトキサゾリンの基本骨格に基づいて、予想される生合成遺伝子群を複数、機能喪失させたが、いずれもそのフトキサゾリン生産能に変化はなかった。したがって、フトキサゾリン生合成には予想困難な新規酵素が関与している可能性が示唆された。現在、ゲノム大規模欠失株を構築しており、そのフトキサゾリン生産能の解析により、フトキサゾリン生合成に関与するゲノム領域を限定化している。2つ目に、同定していたブテノライド型シグナル活性を示す放線菌において、シグナル制御系の二次代謝における機能について解析した。シグナル生合成に関与する遺伝子を同定し、その機能破壊株を構築した結果、ブテノライド型シグナル活性が顕著に低下するともに、代謝物プロファイルが大きく変化した。このような変動を示す放線菌種を複数、見出していることより、ブテノライド型シグナル制御系は放線菌において、広く分布する可能性が示されつつある。現在までに、フトキサゾリン生産に関与するゲノム領域の限定化は順調に進んでいる。また、他の休眠覚醒化物質の生合成遺伝子については、異種放線菌発現系を利用したことにより、その機能解析が進んでおり、生合成中間体の獲得を経て、生合成系が明らかになりつつある。同時に、覚醒化物質の類縁体の創出も進んでいる。ブテノライド型シグナル制御系を有すると推定される放線菌を、予想外にも、複数種、見出したことより、今後、放線菌二次代謝におけるブテノライド型シグナル制御系の普遍性が明らかになると期待される。研究代表者は、放線菌二次代謝を誘導するブテノライド型シグナルを単離し、その二次代謝制御系を解明している。本研究では、1.シグナル制御系の人為的操作による休眠物質の生産覚醒化とその生合成系の解明、2.本制御系を有する放線菌種の同定とその二次代謝系の解明、を主たる目的とする。初年度に、シグナル受容体様遺伝子の機能破壊により生産覚醒するフトキサゾリンの生合成系について解析した。しかし、複数の推定生合成酵素を遺伝子破壊したが、フトキサゾリン生産能に変化はなく、生合成遺伝子群の同定には至っていなかった。本年度は、フトキサゾリン生合成に関わる領域を限定するため、Cre/loxP法などにより、ゲノム大規模欠失株を構築した。その結果、約690 kbを欠失させた株がフトキサゾリンの生産を停止したため、ゲノム欠失株の構築を継続し、その生合成遺伝子を探索している段階にある。二つ目の目的において、シグナル活性を示す放線菌において、推定シグナル生合成酵素を遺伝子破壊した結果、シグナル活性が低下し、代謝物プロファイルが変化することを見出していた。本年度は、これらの変化が、当該遺伝子の破壊によるものかを検証するため、遺伝子相補株を構築し、その表現型を解析した。その結果、表現型が相補されたため、シグナル活性は当該酵素に起因すると結論した。一方、シグナル活性を示す培養液を生合成酵素破壊株に添加したところ、代謝物プロファイルに変動が観察されなかった。そこで、野生型株に存在し、生合成酵素破壊株では生産されない化合物を同定した結果、ブテノライド環を含む新規物質であることが明らかとなった。このような表現型を示す放線菌種を複数、見出していることより、ブテノライド型シグナルを生産する放線菌が広く分布することが示されつつある。現在まで、フトキサゾリン生産に関与するゲノム領域の限定化は順調に進んでいる。また、他の休眠覚醒化物質の生合成系解析では、複数の生合成中間体を同定しているため、その生合成系が明らかになりつつある。加えて、7種類の覚醒化物質類縁体を創出することに成功した。前年度に加えて、複数種のブテノライド型シグナル制御系を有する放線菌を見出したことから、今後、放線菌二次代謝におけるブテノライド型シグナル制御系の普遍性が明らかになると期待される。

研究代表者は、放線菌二次代謝を誘導するブテノライド型シグナルを単離し、その二次代謝制御系を解明している。本研究では、1.シグナル制御系の人為的操作による休眠物質の生産覚醒化とその生合成系の解明、2.本制御系を有する放線菌種の同定とその二次代謝系の解明、を主たる目的とする。初年度に、シグナル受容体様遺伝子の機能破壊により覚醒するフトキサゾリン生合成系について解析した。昨年度までに、フトキサゾリン生合成遺伝子を同定するため、ゲノム大規模欠失株のフトキサゾリン生産能を解析していた。本年度も継続したが、生合成遺伝子の同定に至らなかったため、全ゲノム再解析を実施した。その結果、想定外のゲノムDNA領域にフトキサゾリン生合成を担う遺伝子群を見出した。以上より、二次代謝シグナル系の改変が、当初期待もしないエバーメクチン生産菌のゲノム構造変遷を解明し、また新しいタイプのI型ポリケタイド合成酵素の発見に結びついた。二つ目の目的において、シグナル活性を示す放線菌の推定シグナル生合成酵素を遺伝子破壊した場合、シグナル活性が低下し、代謝物プロファイルが変化する現象を昨年度までに見出していた。そこで、野生型株に存在し、生合成酵素破壊株では生産されない化合物を解析した結果、ブテノライド環を含む複数の物質を同定した。これらの二次代謝誘導活性を調べたところ、ブテノライド型シグナルの構造活性相関が明らかとなった。また、シグナル活性を示す放線菌をシグナル活性を失ったエバーメクチン生産菌と共培養させたところ、エバーメクチンの生産が回復したことから、ブテノライド型シグナルが放線菌の種間を超えて作用することが明らかとなり、放線菌間の二次代謝シグナルを介した化学コミュニケーションが実在することを示した。本研究では、放線菌二次代謝シグナル系の改変による休眠物質の生産覚醒化とその生合成系の解明、またブテノライド型シグナル系を有する放線菌種の同定とその二次代謝系の解明、を主目的とした。本研究により、抗寄生虫薬エバーメクチン生産菌において、シグナル受容体の遺伝子破壊がフトキサゾリンAの生産を覚醒すること、またフトキサゾリンA生合成クラスターが公開ゲノム情報にない領域にコードされていることを解明した。また、ブテノライド型シグナル活性を示す物質を同定し、ブテノライド型シグナルの構造活性相関を解明したのに加え、二次代謝シグナルを介した化学シグナルトークを示した。ゲノム大規模欠失株におけるフトキサゾリン生産能解析を経て、フトキサゾリン生合成に関与する遺伝子群を同定する。ブテノライド型シグナル生合成遺伝子破壊株の表現型を、遺伝学的と化学的な相補解析の両面により証明すると同時に、ブテノライド型シグナルが制御する化合物を同定する。ゲノム欠失株におけるフトキサゾリン生産能解析を経て、フトキサゾリン生合成に関わる遺伝子を同定する。シグナル活性を示す新規物質の構造を同定すると同時に、シグナルが制御する化合物を同定する。フトキサゾリンとは異なる休眠覚醒化物質の生合成系の全貌を、異種発現解析と休止菌体アッセイを駆使することにより、明らかにする。応用微生物学
ステロイド依存性アポトーシスにおけるDIG-1遺伝子の機能解析

1.正常マウスの胸腺細胞および末梢リンパ球では発現していないが、デキサメサゾン(DEX)で刺激すると30分以内に主にCD4+CD8+胸腺細胞に発現する遺伝子としてDIG-1遺伝子を同定した。2.DIG-1遺伝子は7回膜貫通型蛋白をコードしており、G蛋白結合受容体に属する分子である。3.DIG-1遺伝子をlckプロモーターの支配下においた遺伝子導入マウス(以下DIG-1 TG)の3系統を樹立した。4.DIG-1 mRNAの発現が高いB系統、中等度のC系統、低いE系統である。対照群に比して、BとC系統のTGでは、胸腺重量が有意に低下していた。B、C、Eの全ての系統において100μgのDEX腹腔内投与により、対照群に比し有意な胸腺細胞の重量低下とアポトーシス細胞の増加を認めた。アポトーシスを示す細胞は主に胸腺皮質に存在し、CD4+CD8+胸腺細胞であった。胸腺に比べて少数ではあるがTGではDEX投与後脾臓でもアポトーシスを示す細胞が増加した。5.アポトーシス関連分子であるBcl-2とBAX蛋白の発現をDEX投与前後で検討したが、DEX投与前後で有意な変化はなく、対照群と比較しても有意差は認めなかった。(1)DIG-1遺伝子発現の解析。正常の胸腺細胞および末梢リンパ球では、DIG-1遺伝子の発現はほとんど見られないが、デキサメサゾン(DEX)で刺激すると30分以内に主にCD4+CD8+胸腺細胞とCD4+CD8-胸腺細胞に発現することを明らかにした。さらにDIG-1蛋白の細胞内局在を明らかにするために、Myc標識DIG-1遺伝子を作製し、COS細胞に一過性に遺伝子導入した。細胞分画法およびレーザー顕微鏡によるMyc蛋白の局在をマーカーとしてDIG-1蛋白の局在を検討した。プラズマ膜に局在することを明らかにした。(2)DO11.10細胞にDIG-1遺伝子を導入し、恒常的にDIG-1遺伝子を発現するクローンを得た。グルココルチコイドにより誘導される未熟胸腺細胞のアポトーシスは、生理的な胸腺細胞セレクションであるにもかかわらず、その分子機序はほとんど解明されていない。我々はDifferential Display法にてマウス胸腺細胞が生理的濃度のグルココルチコイドによってアポトーシスにおちいる際に、発現誘導される新規遺伝子DIG-1をクローニングした。DIG-1は7回膜貫通型蛋白をコードしており、G蛋白結合スーパーファミリーに属する興味ある分子である。胸腺細胞分化・成熟におけるDIG-1遺伝子の機能を明らかにする目的でlckプロモーターを用いてDIG-1遺伝子導入マウスの作製を行った。異なるコピー数の遺伝子が導入された5系統のトランスジェニックマウス(TG)が樹立された。このうち2系統のTGではノザンブロット法によりDIG-1mRNAが胸腺細胞に高発現していた。このうち、3ヶ月齢に達した♂マウスを用いて解析を行った。胸腺は対照群に比し明らかに小さく、CD4^+CD8^+のいわゆるダブルポジティブ(DP)細胞が著明に減少し、CD8細胞が増加していた。CD4^-CD8^-のダブルネガティブ(DN)細胞の絶対数は対照群とほぼ同様であるが、比率は上昇していた。しかもDN細胞のなかで、TCRβ鎖ブライトの群が著明に増加していた。組織学的にも胸腺の皮質が対照群に比し、明らかに萎縮していた。今後このTGマウスを用いることで、グルココルチコイドにより誘導されるアポトーシスの分子機序の解明が促進されることが期待される。平成11年度に樹立したDIG-1遺伝子トランスジェニックマウス(以下DIG-1 TGと略する)の3系統を用いて研究を行った。DIG-1 mRNAの発現の異なるB(高発現TG)、C(中等度発現TG)、及びE(低発現TG)を解析に用いた。対照群に比し、BとC系統のTGでは、胸腺重量が有意に低下していた。

B、C、Eの全ての系統において、100μgのデキサメサゾン(以下DEX)の腹腔内投与12時間後の胸腺重量および胸腺細胞数は有意な低下を示し、アネキシンV陽性のアポトーシス細胞が増加した。50μgのDEX投与によっても同様の結する目的でlckプロモーターを用いてDIG-1遺伝子導入マウスの作製を行った。異なるコピー数の遺伝子が果を得たが、300μgのDEX投与では、TG群と対照群間にアネキシンV陽性アポトーシス細胞数で有意な差は認められなかった。DEX投与後アポトーシスを示す細胞は主に、胸腺皮質で存在し、TGでは脾臓でも増加していた。TGおよび対照群より胸腺細胞を分離し、10^<-7>10^<-11>MのDEX存在下に16時間培養し、アネキシ陽性細胞数を検討した。10^<-9>10^<-11>M及び0Mで、B系統は50%アネキシンV陽性となるのに対し、対照群では約35%であり、陽性数に有意な差を認めたが、TG胸腺細胞のDEXに対する感受性に差は全く認められなかった。次にアポトーシス関連分子であるBcl-2とBAX蛋白の発現をDEX投与前後で検討した。TG胸腺細胞におけるBclとBAX蛋白の発現はDEX投与前後で有意な変化はなく、対照群と比較しても有意な差は認められなかった。
明治・大正・昭和戦前期の民事判決原本の保存および利用に関する総合的研究

本科研費による共同研究においては.10国立大学法学部(北大・東北大・東大・名大・阪大・香川大・岡山大・広島大・九大・熊本大)が.最高裁の方針により廃棄の運命にあった明治初年から昭和18年確定分までの民事判決原本を.各地の裁判所から暫定的に移管をうけたのを契機として.この貴重な史科群の保存利用に関し、多面的な検討を行った.具体的には.本研究会に4分科会を設け(外国法制研究、恒久計画測定.保存対策.プライヴァシ-.データベース).それぞれが核となって検討を重ねた結果、以下の知見を得た:1.民事判決原本に関する外国法制調査ヨーロッパ諸国(ドイツ・フランス・イギリス・イタリア・北欧).アメリカ合衆国.韓国.台湾.パナマといった諸国において.民事判決原本が如何なる機関において.如何なる期間保存され.どのように利用に供されているかを.現地調査やヒヤリングをも含めて調査した.この結果、国立の公文書館において.行政・立法の公文書とあわせて現用をおえた司法府の公文書を保存し.利用に供するのが一般的であること.そのシステムは.日本に比して発達した公文書館制度と表裏をなしていることが明確になった.2.日本における民事判決原本恒久保存施設の模索上記1に得た比較法的知見を踏まえて9民事判決原本の恒久的保存利用施設として如何なる機関が適切であるかを検討したところ.大学での保管はあくまで暫定的でイレギュラーな緊急〓措置であり.国立公文書館・国立国会図書館といった既存施設にもそれぞれ難点があるので.やはり.(名称はともあれ)司法資料を収容する国立の文書館を新設するのが筋であるという結論に達した.なお.このことと.民事判決原本を地域的に一箇所に集中するか地方分散とするかは.必ずしも必然的に結びつくものでないということが了解された.3.大学保管中の保存対策2の恒久保存施設に民事判決原本を移管するまで.3乃至4年間をめどに大学が保管の責務を負うのであるが.その間の保存対策について.史料保存学専門家の意見をきいて.協議し.空調・防虫対策・保安措置等について.各大学に助言を行うことができた.4.大学保管中の利用ガイドライン策定大学保管中に.大学は.可能な限り民事判決原本を学術利用に供することが移管に関する最高裁との協定からも望ましいが.これには.史料の性質上.プライヴァシ-保護を中心とする微妙な配慮を必要とする.これらの点を考慮しつつ.本研究会は.学術利用と事件当事者による閲覧との二類型を念頭においた詳細な利用ガイドラインとそれに応じた利用申請書式を策定し.それを.各保管大学で使用することとした.5.民事判決原本のデータベース化これまで民事判決原本へのアクセスを困難にしてきた最大の理由は.その検索の困難性にあった.この点は.民事判決原本に含まれるデータをデータベース化することによって大きく改善される.と同時に.原本自体を画像入力することによって.貴重な原本の損耗を防止できる.この見地から.フィージブルな民事判決原本データベースを模索した結果.明治23年までの判決原本を全文画像入力し.これに.最小限の項目データを付して検索の便を図ることが最善であるとの結論に達し.国際日本文化研究センターがこの作業を引き受けることとなった.本年度は、研究の第1年度であるので、「判決原本保存利用研究会」の全体会(42名)とその下に5つの分科会を組織し、次の通り、研究活動を行った。(1)研究会の結成と活動94年9月17日に「判決原本保存利用研究会」の初会合を開き(大阪)、「保存対策」「プライバシー」「データベース」「外国法制」「恒久計画策定」の5分科会を組織し、3年間の研究計画を立案し、実行に移した。本年度の各分科会の開催は、次の通りであり、それぞれの分科会に与えられた課題につき、できるだけ第2年度中に報告書をまとめるべく、研究を行った。「保存対策分科会」(座長=紺谷浩司、浅古弘)(1)94年9月17日(大阪)、(2)12月4日(東京)、(3)95年1月21日(東京)「プライバシー分科会」(座長=太田知行、国井和郎)(1)94年9月17日(大阪)、(2)12月4日(東京)、(3)95年3月26日(予定、大阪)「データベース分科会」(座長=加藤雅信、梅本吉彦)(1)94年9月17日(大阪)、(2)12月4日(東京)、(3)95年2月5日(東京)、(4)3月26日(予定、大阪)「外国法制分科会」(座長=小島武司、河野正憲)(1)94年9月17日(大阪)、(2)10月29日(東京)、(3)12月4日(東京)「恒久計画策定分科会」(座長=林屋礼二、青山善充)(1)95年3月30日(予定、東京)。(2)シンポジウムの開催各地の歴史学者、地方史研究者、資料管理専門家等の意見を広く聴くために、「民事判決原本の保存を考える」シンポジウムを、大阪(94年9月17日)と東京(12月3日)でそれぞれ開いた(各6070名参加)。

研究第2年度である平成7年度は次の通り研究を行った。(1)分科会関係全体研究会の下に5つの分科会をおいて研究を進める体制は第1年度と同じである。各分科会の研究活動と実績は次の通り。【.encircleda.】保存対策分科会:国立10大学に移管された判決原本の簿冊1冊1冊につき保存状態を調査して、1枚ずつカードを作った。その状況は「10大学における判定原本の受入れ及び保管の現状」ジュリスト1078号にまとめられた。【.encircledb.】プライバシー分科会:判定原本を利用に供する場合に留意すべきプライバシー保護基準について検討。その中間報告として、国井和郎「判決原本利用とプライバシー保護」ジュリスト1078号。【.encircledc.】データベース分科会:判決原本をデータベース化する場合のシステム、入力項目を研究し、一部実験的に国際日本文化研究センターと提携して入力している。研究の成果として、梅本吉彦「判決原本の管理・利用とデータベース化」ジュリスト1078号。【.encircledd.】外国法制研究会:「裁判資料保存についての各国の法制と実情」を次の国について調査に公表した。アメリカ(浅古弘)、ドイツ(和仁陽)、フランス(瀬川信久、山本和彦)、イタリア(飯塚重男)、オーストラリア(金祥洙)、韓国(季鎬元)、北欧(萩原金美)、パナマ(マルタ・アチューラ、三谷忠之)=以上、いずれもジュリスト1078号。【.encirclede.】恒久計画策定分科会:成果として青山善充「民事判決原本の保存と利用」ジュリスト1078号。(2)シンポジウム関係名古屋(平7. 9. 30)と東京(平8. 1. 27)でシンポジウムを開いた。国立10大学法学部で保管中の民事判決原本につき、「保存対策分科会」は資料の保存状態につき調査するとともに,その詳細を2回のアンケート調査によってまとめた。「プライバシー分科会」は,各大学の保管体制が整備されて閲覧の要望に応じるようになった場合に備えて「判決原本閲覧利用の要綱(ガイドライン)」を作成した。「データベース分科会」は判決原本をデータベース化するためのシステムの構築、入力項目の決定を行い,国際日本文化研究センターと協力して試験的に資本の入力を行った。「外国法制分科会」は裁判資料の保存・利用に関する諸外国の法制と実情を調査した。最後に、「恒久計画分科会」は,日本における行政関係文書,立法関係文書に対して司法関係文書の体系的継続的な収集保存体制が備っていないことを背景として「国立司法公文書館」の創設を提唱した。本科研費による共同研究においては.10国立大学法学部(北大・東北大・東大・名大・阪大・香川大・岡山大・広島大・九大・熊本大)が.最高裁の方針により廃棄の運命にあった明治初年から昭和18年確定分までの民事判決原本を.各地の裁判所から暫定的に移管をうけたのを契機として.この貴重な史科群の保存利用に関し、多面的な検討を行った.具体的には.本研究会に4分科会を設け(外国法制研究、恒久計画測定.保存対策.プライヴァシ-.データベース).それぞれが核となって検討を重ねた結果、以下の知見を得た:1.民事判決原本に関する外国法制調査
インテグリンαvβ3の構造・機能解析-αv鎖の機能部位の決定および制御法の開発-

インテグリンαvβ3は内皮細胞、平滑筋細胞などの血管構成細胞や腫瘍細胞に多数発現しており、病的血栓形成、病的血管新生および腫瘍増殖・転移に重要な接着分子と考えられている。このように、インテグリンαvβ3の機能発現機構を明らかにしそれを制御することは血栓症や動脈硬化といった血管病、さらには悪性新生物などの成人病の新たな治療法として必須と考えられる。本研究ではαvβ3、なかでもαv鎖の機能部位を同定しその制御法を開発することを目的としている。αv鎖の機能部位の同定およびミュータントαvβ3発現細胞株の樹立:申請者は今回の研究計画においてαV鎖内にAla変異を系統的に導入することによりインテグリンαv鎖の機能部位の同定に成功した。即ち、αv鎖N末端領域内のTyr178をκaへ置換したαvβ3がリガンド結合能を欠如したことから、Tyr178が機能部位として必須の残基であることが明らかとなった。さらに、αvインテグリンを欠損したvariant typeのmelanomacell lineを用いて機能欠損αvβ3(Tyr178Alaαvβ3)を発現する細胞株を樹立した。ミュータントαvβ3を発現する細胞はそのリガンドであるフィブリノーゲンおよびピトロネクチンへの接着能を著しく障害しておりαV鎖内Try178が機能部位として重要であることが確認できた。ミュータントαvβ3の機能解析およびαvβ3の制御法の開発:野生型αvβ3を恒常的に発現するhuman embryonic kidney cell(β3-293cell)に上記ミュータントαvβ3を一過性に発現させることで細胞接着能への影響につき検討したところ、親株細胞のフィブリノーゲンへの接着能が著しく障害された。内因性αvβ3の発現量は減少しておらず、Tyr178Alaαvβ3の過剰発現はドミナントネガティブに働くと考えられた。インテグリンαvβ3は内皮細胞などの血管構成細胞や腫瘍細胞に多数発現しており、病的血栓形成、病的血管新生ならびに腫瘍増殖・転移に重要な分子と考えられている。このことから、インテグリンαvβ3の機能発現機構を明らかにしそれを制御することは血栓症・動脈硬化などの血管病および悪性腫瘍といった成人病の新たな治療法として不可欠と考えられる。本研究ではαvβ3なかでもいまだ不明であるαv鎖の機能部位を同定しその制御法を開発することにある。インテグリンαv鎖の機能部位の同定:今回の計画によりαv鎖のリガンド結合部位として重要と予測される2つのループ(W3の4-1ループおよび2-3ループ)に着目し、このループ内にアラニン変異を系統に導入した(13種類のミュータントを作製)。その結果、W3の2-3ループ内の178番目のTyrをアラニンに置換したミュータントαvβ3はリガンド類似抗体(WOW-1)およびフィブリノーゲンの結合能を消失し、αv内のTyr178がリガンド結合に重要な残基であることが明らかとなった(Blood,2001)。現在、αvインテグリンを欠損したメラノーマ細胞(M21L)にTyr178Alaαvを遺伝子導入し機能欠失αvβ3を恒常的に発現する細胞株を樹立中である。αvβ3の制御法の開発:獲得した機能欠失ミュータントαvを一過性に過剰発現させることでドミナントネガティブ効果が誘導できるか否かにつき検討中である。

これまでのところミュータントαvを過剰発現させることにより親細胞株の細胞接着能を抑制する成績を得ている。現在その他の細胞現象に対する影響およびメカニズムにつき検討中である。インテグリンαvβ3は内皮細胞、平滑筋細胞などの血管構成細胞や腫瘍細胞に多数発現しており、病的血栓形成、病的血管新生および腫瘍増殖・転移に重要な接着分子と考えられている。このことから、インテグリンαvβ3の機能発現機構を明らかにしそれを制御することは血栓症や動脈硬化といった血管病、さらに悪性新生物などの成人病の新たな治療法として必須と考えられる。本研究ではαvβ3、なかでもαv鎖の機能部位を同定しその制御法を開発することを目的としている。ミュータントαvβ3発現細胞株の樹立:申請者は前年度の研究実績においてαv鎖N末端領域内のTyr178がαvβ3における可溶化リガンドとの結合に必須の残基であることを明らかにした。さらに、今年度の研究計画においてαvインテグリンを欠損したvariant typeのmelanomacell lineを用いて機能欠損αvβ3(Tyr178Alaαvβ3)を発現する細胞株を樹立した。獲得されたTyr178Alaαvβ3を発現する細胞は可溶化リガンドに加えて固相フィブリノーゲンおよび固相ビトロネクチンへの接着能も著しく障害されておりαv鎖内Tyr178が機能部位として重要であることが確認できた。ミュータントαvβ3の機能解析およびαvβ3の制御法の開発:野生型αvβ3を恒常的に発現するhuman embryonic kidney cell (β3-293 cell)に上記ミュータントαvβ3を一過性に発現させることによる細胞接着能への影響を検討したところ、親株細胞の固相フィブリノーゲンに対する接着能が著しく障害された。内因性αvβ3の発現量は減少しておらず、Tyr178Alaαvβ3の過剰発現は親株細胞の接着能に対しドミナントネガティブに働くと考えられた。
日本の農政改革と環太平洋経済連携協定（TPP）加入による経済効果の定量分析

2015年10月、TPP協定交渉が大筋合意に至った。本研究の目的は、(1)想定されるTPP拡大のシークエンスを動学的CGEモデルに組み込み、政策的な意味合いを持つ結果を示すこと、及び(2)TPPの直接的経済効果だけでなく、TPPに起因するところが大きい日本の農政改革と競争促進による生産性への影響を評価することである。農政改革が日本農業の生産性の向上をもたらす場合、乳製品を除いて、農産品と加工食品へのマイナスの影響が大幅に減少することが示された。競争促進によって生産性が向上する場合、すべてのメンバー国において経済厚生が大きく増加する。27年度が最終年度であるため、記入しない。経済政策27年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者が2015年3月16日23日の間入院したため、2015年3月下旬に予定していた国内出張を中止しなければならなかったことが理由である。平成27年度は、積極的に国際学会等で研究成果を報告する計画を立てている。そのため、平成26年度の残額は旅費に使用する予定である。データ収集に要した時間が当初計画していたよりも少なく済んだため、研究補助のアルバイト雇用時間数が予定より減少したことが主な理由である。平成26年度は、より積極的に国際学会等で研究成果を報告する計画を立てている。そのため、平成25年度の残額は旅費に使用する予定である。