hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞外マトリックスに着目した創傷治癒研究

本研究では創傷部位で特にコンドロイチン硫酸鎖を有するバーシカンに焦点を当てた。その創傷治癒過程での空間的・時間的発現を免疫組織学的に解析したところ、その一過性(受傷後3-7日)の発現を見出した。さらにVer-Creマウスを作成しVer-Cre;ROSA26Rマウスでトレース実験を行ったところ、バーシカン産生細胞は5日前後で最も多くなり、免疫染色の結果と一致を見せた。これらの事実から創傷治癒過程において一過性に出現するマトリックスは構成成分としての機能以外の役割を担っており、細胞遊走などとの関連の存在を示唆していると考えた。創傷治癒において細胞外マトリックス(extracellular matrix:ECM)が盛んに合成・蓄積され、細胞成分と共同して肉芽を形成し、組織欠損部を充填し、最終的に表皮遊走を誘導し創傷閉鎖へと進む。一方、そのECM産生異常により過剰に蓄積を起こすと、肥厚性瘢痕・ケロイドとなる。本研究では創傷部位でのECM、特にグリコスアミノグリカン(GAG)であるコンドロイチン硫酸鎖を有するバーシカンに焦点を当て、創傷治癒過程での空間的・時間的発現とその機能を解析した。その結果、バーシカンは創傷後3日目よりタンパク質として検出され、5日目がそのピークを迎え、10日目では健常部皮膚と同レベルに戻っていた。このことは、そのmRNAの量ともよい相関を示した。このことから、バーシカンは創傷治癒において、早期3日目には転写を増すことによりそのタンパク量が増加し、5日目に最も多く沈着することが判明した。また一旦治癒した後は速やかに創傷から減少し、10日目にはほぼ消失した。次にバーシカンを発現する間葉系細胞(VMC)をトレースするためにトランスジェニックマウスを新たに作成した。本マウスを用いて背部皮膚創傷治癒実験を行った結果、この細胞は創傷治癒過程で出現し、タンパク質の挙動と同調するパターンで出現、消失していった。この細胞の由来を検討することなどを含めさらなる解析が、ECMからみた新たな難治性皮膚潰瘍治療への創薬に繋がり得ると考える。創傷治癒では組織欠損部を充填するために細胞外マトリックス(extracellular matrix:ECM)が盛んに合成・蓄積され、細胞成分と共同して肉芽を形成し表皮遊走を誘導し創傷閉鎖へと進む。一方、そのECM産生異常により過剰に蓄積を起こすと肥厚性瘢痕・ケロイドとなる。前年度、創傷部位でプロテオグリカンの1つであるバーシカンに焦点を当て、創傷治癒過程での空間的・時間的発現を解析した。本年後はバーシカン産生間葉系細胞を創傷治癒時にトレースするために作成したトランスジェニック(V-TG)マウスを複数系統用いて創傷の治癒過程を詳細に解析した。1)V-TGマスウスの解析バーシカンプロモーターを有する本マウスは、小脳、網膜、毛乳頭、血管平滑筋などでX-gal染色で陽性細胞が同定できた。2)創傷で間葉系細胞をラベルすることができた。3)創傷経時的変化:背部皮膚創傷作成後一過性にバーシカン産生細胞は出現し10日目には組織から消失した。このことは、バーシカンの免疫染色の結果と一致した。4)X-galにてラベルされる細胞は、血管、筋線維芽細胞とは異なる細胞であることが免疫染色にて明らかになった。H27年度:創傷部位に出現するバーシカン産生細胞が以前より皮膚に存在するたとえば毛乳頭細胞由来かを検討するためにVersican promoter-Cre-ERマウスを作成する。タモキシフェン投与後にバーシカン産生を誘導される細胞だけをラベルできる可能性が高いため、より詳細に産生細胞の起源を明確化できると期待される。創傷治癒では組織欠損部を充填するために細胞外マトリックス(extracellular matrix:ECM)が盛んに合成・蓄積され創傷閉鎖へと進む一方ECM産生異常により過剰に蓄積を起こすと肥厚性瘢痕・ケロイドとなる。本研究ではコンドロイチン硫酸鎖を有するプロテオグリカンであるバーシカンに焦点を当て、創傷治癒過程での空間的・時間的発現を解析した。さらにトランスジェニックマウスを新たに作成し、バーシカン産生間葉系細胞をトレースした。1型コラーゲン分子と違い、バーシカンは再上皮化が終了すると真皮から速やかに消滅し、正常皮膚と同様に毛乳頭・毛包周辺に残存するのみとなった。このような一過性に発現するECMバーシカンは、細胞浸潤が盛んな時期に一致して存在するため、細胞遊走と関連を有する可能性を示唆した。Ver-Creマウスを作成しVer-Cre;ROSA26Rマウスでトレース実験を行ったところ、本研究で使用しているプロモーターは創傷部位に一致し転写を増強させる活性があることが確かめられた。創傷におけるトレースの結果、バーシカン産生細胞は7日前後で最も多くなり14日には完全に消滅することが分かり、免疫染色で確かめられたバーシカン沈着とその減少と一致を見せた。本知見ならびにケロイドではバーシカン産生が明らかに認められることから、ケロイドにおいてはバーシカン産生細胞が消滅しないでゆるやかな増殖を続ける性質を維持していることが想像された。

創傷治癒でのバーシカンの役割をより詳細に解析したこの研究は、バーシカンが潰瘍治療において新たな分子ターゲットとなり得ることを示唆していると共に、この研究から得られた知見は難治性潰瘍治療への「創薬」に繋がると考えた。本研究では創傷部位で特にコンドロイチン硫酸鎖を有するバーシカンに焦点を当てた。その創傷治癒過程での空間的・時間的発現を免疫組織学的に解析したところ、その一過性(受傷後3-7日)の発現を見出した。さらにVer-Creマウスを作成しVer-Cre;ROSA26Rマウスでトレース実験を行ったところ、バーシカン産生細胞は5日前後で最も多くなり、免疫染色の結果と一致を見せた。これらの事実から創傷治癒過程において一過性に出現するマトリックスは構成成分としての機能以外の役割を担っており、細胞遊走などとの関連の存在を示唆していると考えた。創傷におけるバーシカンの変動を複数のVer-Cre;ROSA26Rトランスジェニックマウスを用いて創傷治癒実験を実施できたことによる。皮膚科学1)トランスジェニックマウスを用いて、バーシカン発現細胞のトレースを繰り返し、経時的に行うことでデータを補強する。2)創傷部位に発現するサイトカインなどをアレイにて経時的に検討し、バーシカン発現への影響をみる。創傷におけるバーシカンの変動を検討できたことと、Ver-Cre;ROSA26Rトランスジェニックマウスを用いての創傷治癒実験を実施できたことによる。1)創傷治癒部位の経時的マイクロアレイを十分な数で行えなかったため結果にばらつきが生じた。十分な数で行えなかったことが次年度使用額が生じた理由の1つである。2)Versican promoterトランスジェニックマウスは堅調に維持できている。しかしマウスの数を増やして実験を行うまでには至らなかった。既述のマウス背部を用いての創傷治癒実験を、例数を増やして行う。またトランスジェニックマウスを用いて、バーシカン発現細胞のトレースを繰り返し、経時的に行うことでデータを補強する。創傷作成後経時的にサンプルを回収する。mRNAも回収し、ECM,サイトカインなどをマイクロアレイにより発現増強分子のスクリーニングを行う。サイトカインのバーシカン産生制御:マイクロアレイにより創傷に関連するサイトカインのバーシカン発現への効果を解析する。またそのサイトカインのバーシカンへの効果はin vivoとvitroの双方の実験系で確認する。創傷時出現するバーシカン産生間葉系細胞のトレース実験は、Ver;ROSA26Rにて行っているが、創傷時のみに限定してバーシカンを発現する細胞のトレースをするためにVer-Cre;ROSA26Rマウスを作成した。また1系統確立して、その誘導発現をみている段階であるが、今後創傷部位への細胞の出現を検討してゆく。1)創傷治癒部位の経時的マイクロアレイ75万円2)新たにVersican promoter-Cre-ERマウスを作成するため、100万円。3)免疫組織科学的に細胞を染色して同定してゆくため複数の抗体の購入のため45万円必要である。今後マイクロアレイを行うためのmRNA回収を創傷部位より経時的に行ってきた。アレイ実験は施行し得なかったため、H26年度以降でアレイを複数回行う。また創傷部位で変化するサイトカインをアレイにて判定したのちに、その効果をin vivoとvitroの双方で検討する予定である。
深海底堆積物中の微生物による有機塩素化合物分解に関する研究

平成16年度の研究の結果、海洋底に広がる通常の堆積物中での有機塩素化合物分解活性は、非常に低いことが示唆された。このことは海洋底における有機塩素化合物分解活性がないことを示しているのではなく、海洋底の普通の堆積物自体の微生物活性が低いことを反映している可能性が高い。そこで、本年度は、活動的な微生物群集の存在が示唆されている冷湧水帯及び熱水活動域の堆積物を対象とした解析を試みた。なお、活性測定及び集積培養に関する研究は、熱水活動域を対象とした航海(なつしま-ハイパードルフィンNT05-03航海)において悪天候により、十分な試料を採取することが出来なかったため断念し、平成15年以前に採取し保存されていた冷湧水帯及び熱水活動域の堆積物試料について分子生物学解析のみ行った。冷湧水帯では、湧水中に含まれる高濃度のメタンと海水から供給される硫酸に依存する嫌気的メタン酸化アーキア・硫酸還元菌共生系による一次生産が、堆積物中の有機物に依存する微生物活動を支えていると推測される。そこで、南海トラフより採取した堆積物試料を用い、16S rRNA遺伝子クローン解析、有機塩素化合物還元遺伝子増幅と共に、冷湧水帯における一次生産の規模を示す指標とし、嫌気的メタン酸化の鍵酵素であるMethyl CoM reductase遺伝子(mcrA)を選び、その存在量を定量するための定量PCR系の構築を試みた。また、第四与那国海丘熱水活動域より採取した堆積物試料を用い、16S rRNA遺伝子クローン解析を行うと共に有機塩素化合物還元遺伝子検出を試みた。本年度の研究の結果、冷湧水帯の微生物活性の簡便な指標となりうる嫌気的メタン酸化アーキアに由来するmcrA定量法の確立には成功したが、有機塩素化合物還元遺伝子を検出することは出来なかった。なお、熱水活動域由来の堆積物試料については現在詳細な解析を続けている。本年度の研究では、南海トラフ、沖縄トラフから採取した深海底表層堆積物を対象に研究を行った。堆積物中に有機塩素化合物を添加し、長期間のインキュベーション実験を行い、有機塩素化合物の分解活性の測定を行っているが、これまでに有意に明確な活性を示す試料はない。この結果は、16S rRNA遺伝子として検出されているDehalococcides近縁種が有機塩素化合物を分解することは出来ないという証明にはならない。むしろ、海洋底堆積物中の微生物活性の低さを反映していると考える。なぜなら、海底下数m以深においては、一般的な従属栄養細菌の培養すら困難であり、一般的な深海底においては活動的な微生物生態系は表層に限られていると考えられているからである。特に今回は、Dehalococcides近縁種が高頻度で検出される、比較的貧栄養と考えられる海域の堆積物を解析に用いたことにも、原因があると考えられる。次年度は、遺伝子レベルの出現頻度が低くとも、微生物生態系自体の活性が高い冷湧水帯や熱水活動域内の堆積物を用いて再度、研究を行いたい。一方、培養によらない研究として、dehalogenase等の有機塩素化合物を分解する酵素をコードする遺伝子について、既知の有機塩素化合物分解菌由来の各種dehalogenaseの塩基配列を元に、プライマーを設計し、PCRによる増幅を試みたが、これまでのところ成功していない。PCRによる遺伝子検出は既知の遺伝子配列に基づくプライマー設計に依存するため、今年度の結果がdehalogeneaseの存在を否定することにはならない。今後はメタゲノム解析を視野に入れた研究を進める予定である。
新たな白内障モデル動物の開発：水晶体破裂と眼内炎抑制に関する研究

CF#1系由来遺伝性水晶体破裂マウスの発症の兆候は、赤い眼に小さい白い点が出現することであった。その後、その白い点が大きくなり、最終的には眼球全体が白くなった。本マウスの水晶体の破裂は乳がん関連遺伝子(Bcar3)の異常によって起こることが分かった。水晶体破裂には眼内炎を伴うことが多いが、本マウスは眼内炎を発症しない。本マウスにおいて、水晶体を保護する熱ショック蛋白(αBクリスタリン)は減少するが、ストレスなどの原因で生じるリン酸化αBクリスタリンは増加しない。このことが、水晶体破裂を示すにもかかわらず、眼内炎を発症しないという本マウスの特性に関係していると推察された。本研究はCF#1系マウスに新たに発見された遺伝性水晶体破裂マウスの特性を明らかにするとともに、眼内炎発症抑制機構に関する解析を行うことによって新しい疾患モデル動物として確立することを目的としている。本年度はCF#1系由来遺伝性水晶体破裂(CF#1/lr)マウスに関して以下の成績を得た。1成熟後の水晶体におけるFGFとそのレセプター(FGFR)の局在:成熟個体におけるCF#1/lrマウスの水晶体上皮細胞のFGF1抗体ならびにFGFR1抗体に対する反応は対照として用いたddY系マウスに比べて強かったが、FGF2抗体ならびにFGFR2抗体に対する反応には明らかな差は認められなかった。2幼若期の水晶体におけるFGFとFGFRの局在:3週齢ならびに4週齢におけるCF#1/lrマウスの水晶体上皮細胞のFGF1抗体に対する反応はddY系マウスに比べて強かった。3週齢ではFGFR2抗体に対する反応も強かった。それに対して、FGF2抗体ならびにFGFR1抗体に対する反応には明らかな差は認められなかった。3水晶体破裂の候補遺伝子の探索:平成24年度に原因遺伝子の存在する領域として絞り込んだ部分に位置するBcar3遺伝子のシークエンス解析(エキソンを挟む形でゲノムを解析)によりエキソン7に一塩基の挿入変異が認められた。その一塩基挿入によって、本来存在しない終止コドンが形成されていた。以上のように、CF#1系由来遺伝性水晶体破裂における細胞増殖因子とそのレセプター(FGFとFGFR)の局在および水晶体破裂白内障の候補遺伝子が明らかになった。今後は、発症を軽減するような修飾遺伝子の存在の有無ならびに眼内炎発症抑制機構を明らかにするための実験を計画している。本研究はCF#1系マウスに新たに発見された遺伝性水晶体破裂マウスの特性を明らかにするとともに眼内炎発症抑制機構に関する解析を行うことにより、新しい疾患モデル動物として確立することを目的としている。本年度はCF#1系由来遺伝性水晶体破裂マウスに関して以下の成績を得た。1CF#1由来遺伝性水晶体破裂白内障マウスの病変は肉眼的には生後5週齢から水晶体の白濁として観察され、症状が進むにつれ、白濁部位が本来の水晶体領域から脱落し、水晶体破裂を呈した。2発症個体同士の交配では雌雄ともに発症率は100%で、非発症個体とのF1世代では発症個体が認められなかった。F2世代での発症率は25.2%、戻し交配世代での発症率は45.6%で雌雄間に有意差は見られなかった。このことから、本水晶体破裂白内障マウスにおける疾患の遺伝様式は常染色体劣性遺伝で原因遺伝子は単一であることが分かった。3組織学的には、3週齢で水晶体赤道部に空胞、5週齢で水晶体核領域の後方への脱出が認められた。4BALB/c系マウスとの戻し交配発症個体に関する連鎖解析により、原因遺伝子は第3染色体D3Mit79D3Mit216の2.4cM領域に存在することがわかった。この領域に存在するBcar3遺伝子のノックアウトマウスは水晶体破裂を示すことが報告されており、本破裂白内障の候補遺伝子と考えられたが、Bcar3のタンパクコード領域に塩基配列の異常は認められなかった。以上のように、CF#1系由来遺伝性水晶体破裂マウスにおける遺伝様式、形態学的特性、原因遺伝子の染色体上での詳細な位置が明らかになった。今後は、原因遺伝子の同定および細胞増殖因子ならびに水晶体タンパクの発現変化を明らかにするとともに、発症を軽減するような修飾遺伝子の解明を含む眼内炎発症抑制機構を明らかにするための実験を計画している。本研究はCF#1系マウスに新たに発見された遺伝性水晶体破裂マウス(CF#1/lrマウス)の特性を明らかにし、眼内炎発症抑制機構に関する解析を行うことによって新しい疾患モデル動物として確立することを目的としている。本年度は以下の成績を得た。

1肉眼的観察において、水晶体混濁の進行とともに、点状(pinhead)、大きな点(large)、真っ白(white)になり、それらの病変はそれぞれ3週齢、4週齢、6週齢から認められた。組織学的にはまず水晶体線維の膨化が、続いて水晶体上皮の空胞化が認められ、その後水晶体皮質の空胞化と水晶体核の脱落が引き起こされることがわかった。2発症パターン別にFGF1, 2及びそのレセプター(FGFR1FGFR4)ならびにTGF-β1及びそのレセプター(TGF-βRIとTGF-βRII)の局在を調べた。水晶体上皮細胞のFGF-1抗体に対する反応はwhiteで、TGF-β1抗体に対する反応はlargeで対照群に比べて強かった。3熱ショック蛋白で、そのシャペロン機能によって水晶体の透明性を保つαB crystallin及び同じく熱ショック蛋白で、障害から水晶体を防御するHspB1の発現はlargeで対照群に比べて弱かった。αB crystallinの変異体で、水晶体に障害を与えるリン酸化(P)αB crystallinの発現は発症パターンに関わらず、対照群に比べて弱かった。以上のことから、CF#1/lrマウスの発症に関連してFGF-1、TGFーβ1の発現の増加、αB crystallin、HspB1の発現の減少が起こっていることがわかった。また、αB crystallinの減少にもかかわらず、PαB crystallinの増加が見られないことが、水晶体破裂を示すにもかかわらず、眼内炎を発症しないという本マウスの特性に関係しているものと考えられた。実験動物学CF#1系由来遺伝性水晶体破裂(CF#1/lr)マウスに関して平成24年度に得られた結果(遺伝様式、発症時期、ならびに組織学的変化の解明と原因遺伝子の染色体上での詳細な位置決定)に加えて、平成25年度はA)水晶体における細胞増殖因子とそのレセプターの局在に関する解析およびB)候補遺伝子の検出を行った。A)の水晶体における細胞増殖因子とそのレセプターの局在に関する解析では、CF#1/lrマウスの成熟個体ならびに幼若個体に関して、FGF(発生期の水晶体形成に重要な役割を果たす一方で、過剰に発現した場合には形成異常を引き起こすことがわかっている細胞増殖因子)とそのレセプターの局在を明らかにした。TGFβ(水晶体上皮細胞に形質転換を引き起こし、白内障発生に関与することが報告されている細胞増殖因子)については現在解析中で、平成26年度も継続して実施する予定である。B)の候補遺伝子の検出では、Bcar3遺伝子(本遺伝子のノックアウトマウスにおいて水晶体破裂が引き起こされることが報告されている)に一塩基挿入変異が存在することが明らかになり、候補遺伝子として特定するに至った。このことにより、平成26年度に実施する予定の修飾遺伝子の探索方法として、交雑実験以外の方法(Bcar3の変異を近交系マウスに導入し、解析する)も考えられ、解析の選択肢が広まった。以上のように、平成25年度に計画していた実験で一部得られなかった面もあるが、平成26年度に実施することを計画していた実験の一部は終えることができており、おおむね計画通りに進んでいると判断できる。平成24年度はA)水晶体に関する解析(形態学的特性ならびに水晶体構成蛋白の変化の解明)およびB)遺伝学的解析(原因遺伝子が存在する染色体の決定)を行った。A)の水晶体に関する解析では、組織学的観察は予定どおり成果を得た。
事故予防を目的とした登山食の提案と有用性に関する検討

2018年度は,348名を対象に登山活動時の食事や行動食の現状および登山食に求められる条件等を調査した。登山活動時の食事は,おにぎりと手作り弁当が多く,登山経験回数が多いものほど,おにぎり単品摂取割合が上昇した。行動食は持参しないが約60%であった。登山食で食べたいものは,登山経験の回数に関わらず,のどごしの良いものという回答がもっとも多かった。登山活動では,持参しているものと食べたいものは必ずしも一致しなかった。登山活動時の食事で重視する条件としては,重量がもっとも多く,行動食においては,甘味があるものが多かった。登山経験者は,荷物の重量を減らすため食事を制限する可能性が考えられた。アンケート調査で得られた条件をもとに,2017年度に開発した昼食と行動食の登山レシピ内容を修正した。レシピは,登山活動時に必要なエネルギーや栄養価を満たしたものとした。成人女性10名を対象に,登山用の調理器具および食材をザックに入れ,登山活動を行った。頂上で昼食と行動食の計2品を作成し、昼食は頂上で摂取し、行動食は昼食後から下山までに摂取した。摂取後、食材およびレシピに関する評価アンケートを実施した。重量については,適切と回答とした対象者が昼食の豆乳パスタでは8名,行動食のグラノーラーバーでは7名であった。しかしながら,登山活動に持参し調理したいと回答した対象者は昼食が7名,間食が0名と重量に比較し少なかった。昼食,間食とも「分量が多い。」という意見が多くみられた。これらのことから登山活動による疲労や食欲減退等がみられたことが要因であると考えられた。2019年度は,登山活動時の生理学的変化の特性を考慮しレシピを再考していく必要性が考えられた。2019年度は,対象者数を増やしフィールド調査を行う。2018年度のアンケート調査およびフィールド調査によって,レシピ再考の必要性および方向性が明らかになり,2019年度のフィールド調査にむけて新たな評価項目等も検討することが出来た。2019年度は,以下の研究課題を行う。研究課題1登山食レシピの開発2018年度の結果からレシピを再考し,重量や嵩に関する負担度,調理手間や嗜好性の適切性について評価を行う。研究課題1開発した登山食レシピの有用性の検討宿泊登山を行う成人男女を対象に,開発したレシピを摂取した際の尿中成分等の生理学的指標および心理学的指標の変化を明らかにする。登山中のエネルギーや栄養素の不足は滑落事故など重大な事故につながる。本研究の目的は,栄養価を考慮し,軽量で保存性が高い食材を使用した登山食レシピを提案することである。2017年度は,登山用の調理器具を用いて試作し,レシピ7品(2日分)を開発した。18歳29歳女性が登山活動7時間を行った際の推定エネルギー必要量を算出し,朝食,行動食(13食),夕食の合計で1日分の栄養価が±10%になるようにレシピを開発した。レシピ開発後に,37名を対象に登山活動及び登山食に関するアンケート調査,レシピ7品に関する評価アンケートを実施した。レシピ評価は,味,重さ,価格,調理手間を4段階で行い,4項目の合計点を総合評価とした。本研究において,ミルクパスタ,小魚のカレーピラフ,ミネストローネ風パスタ,さんまの味噌煮スープパスタ,焼きラーメン,コーン豆乳リゾット,高野豆腐の蒸しパンのレシピを開発・提案した。総合評価にレシピ間の有意な差はみられなかった。登山食に関するアンケート調査の結果から,1食分に充てる許容価格は,300400円が最も多かった。本研究で開発したレシピは,7品とも400円以内であった。疲労感等による食欲低下を考え,のど越しをよくするため,水気の多いレシピを提案したが,重さに関する評価は,水を多く含むレシピが低い傾向にあり,特に500gを超えると低下した。香辛料等の工夫により,水気を押さえた食欲増進を図るレシピ開発を行うことで,より満足度の高い登山食を提案できると考えられた。登山食に関するアンケート調査および開発した登山食レシピの嗜好調査の結果から,登山食に求められる条件および改善点を明らかにすることができた。2018年度は,開発したレシピが登山活動時に適切であるかのフィールド調査を行い評価する。2017年度は,プレ実験を行い,フィールド調査の研究計画の立案も行うことができた。

頂上で昼食と行動食の計2品を作成し、昼食は頂上で摂取し、行動食は昼食後から下山までに摂取した。摂取後、食材およびレシピに関する評価アンケートを実施した。重量については,適切と回答とした対象者が昼食の豆乳パスタでは8名,行動食のグラノーラーバーでは7名であった。しかしながら,登山活動に持参し調理したいと回答した対象者は昼食が7名,間食が0名と重量に比較し少なかった。昼食,間食とも「分量が多い。」という意見が多くみられた。これらのことから登山活動による疲労や食欲減退等がみられたことが要因であると考えられた。2019年度は,登山活動時の生理学的変化の特性を考慮しレシピを再考していく必要性が考えられた。2019年度は,対象者数を増やしフィールド調査を行う。2018年度のアンケート調査およびフィールド調査によって,レシピ再考の必要性および方向性が明らかになり,2019年度のフィールド調査にむけて新たな評価項目等も検討することが出来た。2018年度は,以下の研究課題を行う。研究課題1登山時の身体活動量と登山食の実態調査日帰り登山および宿泊登山を行う成人男女を対象に,登山活動時の推定エネルギー必要量(活動量計による計測)と登山食の内容について調査を行う。研究課題2登山食のレシピ提案2017年度に開発したレシピを登山活動時に持参し,重量や嵩に関する負担度,調理手間や嗜好性の適切性について評価を行う。2019年度は,以下の研究課題を行う。研究課題1登山食レシピの開発2018年度の結果からレシピを再考し,重量や嵩に関する負担度,調理手間や嗜好性の適切性について評価を行う。研究課題1開発した登山食レシピの有用性の検討宿泊登山を行う成人男女を対象に,開発したレシピを摂取した際の尿中成分等の生理学的指標および心理学的指標の変化を明らかにする。2017年度に行う予定であった「登山時の身体活動量と登山食の実態調査」と2018年度に行う予定であった「登山食に関するアンケート調査とレシピ開発」を入れ替えて行ったため,旅費が2018年度以降の支出となったため。(理由)来年度に行うフィールド調査のためのパイロット実験として2018年度に複数の機器を購入する予定にしていたが,調査項目の再検討が必要となった。(購入計画)調査項目の変更により,購入機器の変更を行い2019年度に計上する。
知的障害教育の各教科等の目標を踏まえた特別支援学校の指導計画作成システムの構築

特別支援学校における知的障害教育及び知的障害を併せ有する重複障害教育では、知的障害者のために独自に設けられている各教科等を基に教育課程が編成されるが、指導の多くは各教科等を合わせた指導や自立活動を主とした指導という形態で展開されている。このため、各教科等の目標が十分検討されないまま指導が展開されていることや、評価が曖昧であることが長年に渡り指摘され続けている。本研究では、これらの現状の背景を明らかにした上で、各教科(知的障害)等の目標の検討を容易にし、学習の積み重ねが可視化できる個別の指導計画作成のためのツール及び教員研修資料の開発を行い、実践を通して学校のシステムとしての確立を目指す。
嗅球の誘導の分子機構

1.嗅球神経回路の誘導および形成に関わる機能分子の探索プロテオミクス解析で得たマウス嗅球の嗅神経層、糸球体層、外叢状層に存在する細胞膜蛋白分子群の発現パターンをスクリーニングし、細胞外にロイシンリッチリピートを持つ接着分子が嗅球の一部の介在神経細胞に発現していることを見出した。この分子は介在神経細胞の樹状突起上に豊富に分布しており、その樹状突起は外叢状層のなかの特定の層で多くの分枝を作っていた。また、この分子発現は個体の発達過程において、シナプス形成の時期に強く誘導されていた。以上より、この分子は嗅球内の特定の神経回路の形成に関わる重要な分子であると考えられた。2.入力依存的な嗅球神経細胞および嗅球神経回路の誘導メカニズムの解析嗅球では成体においても介在神経細胞(顆粒細胞および傍糸球細胞)が新生し、神経回路に組み込まれている。前年度に、新生顆粒細胞の生存は匂い入力の有無で調節されていること、新生顆粒細胞の生存が匂い入力に左右される特定の時期(臨界期)が存在することを示した。本年度は、匂い入力遮断で新生顆粒細胞が除去される際にはアポトーシス経路の活性化を伴っていること、アポトーシスに至る顆粒細胞は生まれてからある一定の日数を経た特定の細胞集団であることを見出した。さらに、匂い入力依存的な新生顆粒細胞の生存の臨界期は、薬剤投与によっても再現できることを見出した。これらの観察により、匂い入力依存的な嗅球新生神経細胞の生存調節および嗅球神経回路の再構成の分子メカニズムの、鍵となる分子を知ることができた。(1)「嗅球匂いマップ」の解明細胞接着分子OCAMは、嗅上皮の4つの匂い受容体発現ゾーンのうち、ゾーンII、III、IVの嗅細胞軸索で発現しているが、ゾーンIの嗅細胞軸索では発現しない。またOCAMを発現した嗅細胞軸索は嗅球の尾側・腹側ゾーンへと選択的に投射する。今回私達は、OCAM以外の細胞接着分子で、特定のサブセットの嗅細胞軸索だけに発現する分子を探索し、2種類の分子をみいだした。OCAMを含めた3種類の細胞接着分子はそれぞれ、嗅細胞軸索の異なったサブセットに発現していた。さらに、細胞接着分子陽性軸索の嗅球での空間配置を調べると、それぞれ特定の領域(CAMドメイン)に集合していることが見いだされた。このようにして決定されたCAMドメインと、特定の匂い受容体に対応した糸球の位置との対応関係を調べることにより、「嗅球における匂いマップ」の概要を始めて明らかにした。(2)成体脳における、嗅細胞、嗅球1nterneuronsの誘導と、新生ニューロンの神経回路への組み込み成体脳における神経幹細胞および新生ニューロンを可視化する目的で、神経幹細胞特異的な発現を誘導するNestin Promoteの支配下に、Green FruorescentProtein(GFP)遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成した。この結果、嗅上皮および鋤鼻感覚上皮にGFP陽性の幹細胞が観察され、嗅神経や鋤鼻神経切除時には多数の新生感覚細胞がGFP陽性となった。また、成体においても新生することが知られている嗅球の顆粒細胞および傍糸球細胞にG印が観察された。(1)「主嗅球での匂いマップ」と「副嗅球でのフェロモンマップ」の解析平成10年度に(1-a)OCAMを含めた3種類の細胞接着分子がそれぞれ嗅細胞軸索の異なったサブセットに発現していること、(1-b)それぞれの細胞接着分子を発現した嗅細胞軸索は、主嗅球の特定の領域(CAMドメイン)に投射していること、をみいだし、「主嗅球における匂いマップ」の概要を始めて明らかにした。本年度はこの仕事を発展させ、「匂い受容体マップ」の詳細を明らかした。さらに、本方法を副嗅覚系に適用し、「副嗅球におけるフェロモンマップ」の概要を明らかにした。すなわち、副嗅覚系ではOCAMおよび他の2種類の細胞接着分子が、特定のサブセットの鋤鼻神経軸索に発現しており、これらの軸索は副嗅球の特定のドメインに投射することをみいだした。これらの結果より、「主嗅球での匂いマップ」や「副嗅球でのフェロモンマップ」の誘導の分子メカニズム解析にむけての手がかりが得られた。(2)副嗅覚系の感覚細胞の誘導メカニズムの解析鋤鼻神経の切断により、鋤鼻感覚上皮の幹細胞から新規の鋤鼻感覚細胞を誘導し、各種の分子マーカーの発現の時間経過を調べることにより、鋤鼻感覚細胞の分化過程を調べた。この結果、幹細胞の分裂により生じた鋤鼻感覚細胞は特定の幼若な過程をへてサブセットの感覚細胞へ分化していくことがわかった。(3)CAM欠損マウスの作成「主嗅球での匂いマップ」や「副嗅球でのフェロモンマップ」の誘導にOCAMが関与していないかどうかを決定する為に、genetargeting法を用いてOCAM欠損マウスを作成した。現在、OCAM欠損マウスにおける「主嗅球での匂いマップ」や「副嗅球でのフェロモンマップ」の詳細を解析している。(1)我々のグループは平成11年度に、マウスの嗅細胞軸索のサブセットに発現している3種の細胞接着分子の解析により、「主嗅球の糸球層における匂い受容体地図」の構造を明らかにした。

平成12年度はラットの主嗅球での「匂い受容体地図」を決定するとともに、麻酔下のラットの嗅球の糸球層より多種多様な匂い刺激に応答する内因性信号を光学的に測定し「匂い応答機能地図」を見い出すことに成功した。「匂い受容体地図」と「匂い応答機能地図」を比較することにより、嗅球の「匂い地図」の機能構築の一部が判明した(内田ら、Nature Neurosci.,2000)。また、匂い地図内には「ゾーンと垂直方向の軸」と「腹側から背側へむかう軸」に沿って糸球が並んでいることがわかり、「嗅球匂い地図パターン形成」の手がかりが得られた。(2)新生ニューロンを選択的に可視化する目的で、NestinのプロモーターのもとにGreen Fluorescent Protein(GFP)を発現するトランスジェニックマウスを作成した。このマウスを用いることにより、嗅神経切断後の新生嗅細胞や、Subventricular Zoneから嗅球へとMigrationする新生顆粒細胞を観察することが可能になった(山口ら、NeuroReport,2000)。(3)マウス鋤鼻神経のサブセットに発現している数種類の細胞接着分子の解析により「副嗅球におけるフェロモン受容体地図」の中にドメイン構造があることを見い出した。(1)平成12年度に、内因性信号の光学的測定法を用いることにより、マウスの嗅球の「匂い応答地図」における機能単位である'Molecular Feature Domain'を見い出した。しかし、光学的測定法は嗅球の背側面でしか測定できない。そこで、平成13年度は、内因性信号の光学的測定法と、匂い刺激によって誘導されるZif268のマッピング法を組み合わせることにより、この機能単位が嗅球の全面に存在するかどうかを調べた。この結果、'Molecular Feature Domain'が嗅球全体にわたって存在し、どの個体においても、一定の位置に決まった方向をもつて配置されていることがわかった(論文投稿中)。(2)軸索ガイダンス分子の一つであるセマフォリン3A分子の、嗅球「匂い地図」形成における役割を調べた。セマフォリン3A分子を欠損したマウスを用い、その嗅球での「匂い応答地図」を調べたところ、ニューロピリン1(セマフォリン3Aの受容体)を発現した嗅細胞軸索の投射標的糸球の空間配置が大きく変化し、嗅球の「匂い応答地図」にも大きな変動がみられた。また特定のサブセットの糸球の形成ができなくなっていた。この結果は、セマフォリン3Aによる嗅細胞軸索のガイダンスが欠損すると、成体の嗅球における「匂い地図」に大きな歪みが生じることを示す(論文投稿中)。1.嗅球における匂い地図の構築解析と、その誘導形成の分子機構探索Sema3A KOマウスの嗅球匂い地図を、細胞接着分子に規定されるドメイン構造と、匂い刺激による内因性信号の分布を指標に検討し、(1)Sema3Aの受容体であるneuropilin-1陽性の嗅神経軸索が投射する糸球の配置が乱れている、(2)舌領域と呼んでいる特定部位の糸球が消失している、(3)酸応答ドメインが内側方向に移動しているなど、匂い地図に特定のパターンの変化が生じていることを見出した。また、マウス嗅球の嗅神経層、糸球体層、外叢状層の細胞膜画分のプロテオミクス解析によって、発現する細胞膜蛋白分子をスクリーニングした。一部の嗅神経や一部の僧帽細胞に発現する細胞接着分子を複数種同定し、嗅神経と僧帽細胞の特異的な神経連絡形成に関与しうる候補分子を得た。2.嗅覚系ニューロンの誘導、分化のメカニズム解析成体
強相関酸化物３Dナノ構造スケーリング物性解明と電子相変化デバイス応用

本研究では100nmから10nmでの極微3Dナノ構造デバイス形成により巨大電子相変化機能をデモンストレーションすることを目的とした。マイクロ/ナノVO2ワイヤにおいて巨大な抵抗変化を創出できる【ナノ構造増感効果】を見出した。さらに三次元ナノテンプレートパルスレーザ蒸着技術確立により、最小幅20nmの酸化物ナノウォール形成、電流誘起相転移のナノ構造増感効果観測、顕微分光による50nm級ナノ電子相の直接観測、VO2平面型FETおよびハイブリットゲートVO2-FETの作製に成功した。これらを通じVO2チャネルFETにおいて最高の変調率を達成した。1ナノインプリントリソグラフィーを用い、線幅200nmのVO2ナノワイヤデバイスを形成した。通常の2D薄膜デバイスに比し、ナノ構造増感効果による非常に急峻な電流誘起絶縁体→金属スイッチを観測した。これによりデバイスの極小化およびスイッチングの急峻化により1/1000の省電力化を実現した。さらに、パルスレーザ蒸着法(PLD)でテンプレート側面へ薄膜結晶を成長させる3次元ナノテンプレートパルスレーザ蒸着法(3DナノテンプレートPLD法")により、直接ナノインプリント法の解像度をを超えた70nm幅のVO2ナノウォールワイヤおよび(La,Pr,Ca)MnO3ナノワイヤの形成に成功した。2さらに電界効果トランジスタデバイスとして、ナノインプリント法により、VO2ナノチャネルを有するのサイドゲート型エアギャップ電界効果トランジスタ(FET)構造を作成した。ナノチャネル幅は最小200nm、エアギャップ幅は400nmである。このナノデバイスおいて、大気中と乾燥N2中で電界誘起金属絶縁体変化に起因する抵抗変化を形成し、動作環境で異なる二つの動作モードが存在することを確認した。大気中においては、吸着水の電気分解により水素がVO2ナノチャネルにドープされ、それに伴い電子がドーピングされていることが機構であることを明らかにした。3巨大な電界を印加することが可能なイオン液体をゲート層として用い、強磁性半導体(Fe,Zn)3O4薄膜および磁場・温度誘起金属ー絶縁体((La,Pr,Ca)MnO3薄膜電界効果トランジスタ(FET)デバイスを作成に、印加電界により二つの動作モードが存在することを同様に明らかにした。すなわち静電的なキャリア変調効果と酸化還元に伴う物性変調効果である。併せてこれらは物質の組成および印加電圧の大きさによりモード選択が可能であることを示した。巨大金属-絶縁体相転移VO2や超巨大磁気抵抗(La,Pr,Ca)MnO3を用い、以下を達成した。●電界効果トランジスタデバイスとして、ナノインプリント法によりVO2ナノチャネルを有するサイドゲート型エアギャップトランジスタ(FET)構造を作製した。昨年度に見出した、大気中においての水素ドーピングに加え、乾燥N2中においては純粋な電子キャリア変調に伴う抵抗変調が生じていることを明らかにした。またナノチャネル幅依存性を1000nmから200nmまで系統的に計測し、チャネル幅の減少に伴い、抵抗変調率が大幅に増加すること、その大きさが従来のバンド理論に比して極めて大きいことを見出した。●また有機物誘電体(パリレン)/アモルファイル酸化物誘電体(TaOx)からなるハイブリットゲート層を、ナノインプリントで作成したVO2ナノワイヤに組み合わせた、ナノスケール強相関酸化物ハイブリットゲートFETを作製し、高品質界面実現による高効率電界抵抗変効果を見出した。サイドゲート型エアギャップFETと同様に、その変調率は従来のバンド理論に比して極めて大きいことを見出した。●単結晶VO2薄膜において、ケルビンプローブ顕微鏡により20nmスケールの、強相関相転移単位(電子相ドメイン)の観測に成功した。(La,Pr,Ca)MnO3ナノウォール(線幅50nm)試料において、カソードルミネッセンス走査型電子顕微鏡により、ナノ構造に捕獲された電子相ドメインの直視に成功した。VO2電界効果トランジスタデバイス(サイドゲート型、ハイブリットゲート)において、予想を超える大きな変調率を得ることに成功したため。巨大金属-絶縁体相転移VO2およびSmNiO3を用い、以下を達成した。●有機物誘電体(パリレン)/アモルファイル酸化物誘電体(TaOx)からなるハイブリットゲート層を、ナノインプリントで作成したVO2ナノワイヤに組み合わせた、ナノスケールFETを作製し高効率電界抵抗変効果を見出した。変調率は従来のバンド理論に比して極めて大きいことを見出した。また電子線描画リソグラフィーによりギャップ幅20nmのナノギャップ電極の作製に成功し、VO2薄膜の温度誘起金属絶縁体相転移が非常に急峻になることを見出した。●高温(約400K)で、金属絶縁体転移を示すSmNiO3においてイオン液体をゲート層とする電界効果トランジスタを作製し、電界による抵抗変調を観測した。X線光電子分光によりNiの価数を評価することにより、電界により誘起された酸素欠損が変調機構であることを明らかにした。●VO2と原子層物質'(n型半導体MoS2およびp型半導体WSe2)を積層したハイブリットショットキー接合を形成し、n型MoS2との組み合わせにおいては整流性はほとんど観されず(オーミック特性近い)、p-型WSe2との組み合わせにおいて良好な整流作用を見出した。●VO2フリースタンディング構造(ブリッジ部分ワイヤ幅400nm)の作製に成功し、通常の薄膜に比して非常に小さい投入電力量で金属絶縁体相転移を生じさせることが可能であることを示した。

本研究では100nmから10nmでの極微3Dナノ構造デバイス形成により巨大電子相変化機能をデモンストレーションすることを目的とした。マイクロ/ナノVO2ワイヤにおいて巨大な抵抗変化を創出できる【ナノ構造増感効果】を見出した。さらに三次元ナノテンプレートパルスレーザ蒸着技術確立により、最小幅20nmの酸化物ナノウォール形成、電流誘起相転移のナノ構造増感効果観測、顕微分光による50nm級ナノ電子相の直接観測、VO2平面型FETおよびハイブリットゲートVO2-FETの作製に成功した。これらを通じVO2チャネルFETにおいて最高の変調率を達成した。当初予定のナノ構造による増感効果による省電力デモンストレーションを行ったことに加え、さらにサイドゲートFETデバイスおよび薄膜FETデバイスにおいて当初予定の静電的効果による動作モードに加え、酸化還元・水素ドープによる新たな動作モードを見出すことが出来たため。これまでに確立したナノ構造形成法(酸化物ナノインプリト法および3次元ナノテンプレートパルスレーザ蒸着法)を利用し、ナノ構造(ワイヤ・ウォール幅)をさらに20nmまで減少させ、各種ゲート層(サイドゲート、ハイブリッドゲート、イオン液体ゲート)を組みわせえた極小ナノ構造FETを作製により一層巨大な変調効果を見出す。イオン液体ゲートにつては、これまでの知見に加え、パデュー大(米)グループと共同研究を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。機能性酸化物エレクトロニクス1今後は現行のサイズ(ワイヤ幅)をさらに減少させ、物性変調度(抵抗変化率)、省電力特性(抵抗変化率/投入電力)の測定を行う。現行の200nm幅のナノワイヤデバイスから100nm以下のデバイスに移るにしたいその効果は一層向上すると期待され、その効果の検出に務める。2薄膜デバイスで動作を確認したイオン液体ゲートをナノワイヤデバイスに適用に、電界効果におけるナノ増刊効果を検証する。この為、イオン液体ナノワイヤ電界効果デバイスの作成法を確立に努め動作デモンストレーションを行う。3前年度見出した二つの動作モード、【静電的効果】動作モードおよび【酸化還元・水素ドープ】動作モードの比較検証をおこないそれぞれの長所・短所を明らかにする。
切断部位特異抗体を応用した水疱性類天疱瘡の新規診断ツール開発

本研究の目的は、自己免疫性水疱症である水疱性類天疱瘡(bullouspemphigoid, BP)の病態メカニズムを解明し、早期診断の手がかりとなる新知見を得ることである。BPでは水疱が多数生じるが、BPの水疱内容液が自己抗原であるCOL17タンパクを切断することが知られている。本研究によって、高度に精製されたリコンビナントヒトCOL17タンパクの作製が可能となり、実際にBP患者水疱内容液により、リコンビナントタンパクが細胞膜近傍のNC16A領域で切断されることを確認した。本研究の目的は、自己免疫性水疱症である水疱性類天疱瘡(bullous pemphigoid,BP)の病態メカニズムを解明し、新規診断ツールの作製に応用することである。研究方法として、BPの自己抗原である17型コラーゲン(COL17)が病変部特異的に切断される部位を特定し,COL17の病的切断部を特異的に認識する抗体の作製を計画した。病変部特異的なCOL17の切断部位特定には、BPの水疱内容液がCOL17タンパクを切断する点に着目し、リコンビナントヒトCOL17タンパクを作製しBP患者の水疱内容液と反応させる手法を計画した。計画通り、リコンビナントCOL17は極めて高純度に精製出来たが、BP患者水疱内容液によって切断される部位の特定には至らなかった。その原因として、COL17の切断後に生じる120kDのタンパク断片と同じ分子量に多くの交雑タンパクが水疱内容液中に含まれていたためと思われた。そのため、異なるアプローチとして、BP患者抗体の結合によりCOL17の構造が変化し切断が亢進する可能性を想定し、膜通過領域近傍にアミノ酸置換を導入しCOL17の構造変化を誘導させるリコンビナントCOL17を作製し293細胞へ発現させた。その結果、生理的な切断部位とは異なる部位(R507S508間)でCOL17が切断されることが明らかとなった。切断されたS508断端部位を特異的に認識するラビット抗体(Ab-S508)を作製したところ、AB-S508は全長のCOL17には反応せず、構造変化を伴った結果、切断されるCOL17の細胞外領域のみを特異的に認識した。しかしBP患者皮膚にはAb-S508抗体は反応しなかったため(n=10)、BP患者皮膚では、COL17のR507S508間切断は生じていないと思われた。今後、異なるアプローチのもとBP患者皮膚においてCOL17が特異的に切断される部位を特定し、新規診断ツール作製に応用していく予定である。
咀嚼筋痛障害モデル動物を用いた咀嚼筋痛障害に伴う慢性痛発症機序の解明

本研究では咀嚼筋痛障害の治療法開発に向けた基礎研究として、咀嚼筋痛障害に伴う慢性痛発症機序の解明を目指した。まず研究の基礎となる咀嚼筋痛障害モデル動物を作製し、咀嚼筋痛時の中枢および局所における経時的変化について、組織化学的、生理学的、ならびに生化学的手法を用いて検索することにした。モデル動物の作製にあたって、刺激する試薬や刺激の頻度、観察期間などに関する条件設定が必要であった。従って、本研究ではラット腓腹筋障害モデル作製を行った先行研究を参考にし、当該研究に準じた方法でモデル動物を作製することを目指した。脊髄でのグリア細胞の活性化が炎症性疼痛や神経因性疼痛、痛覚過敏やアロディニアの発現機序への関与が示唆されていることから、本研究ではモデル動物作製の前に、咬筋に刺激を与えた際の脳幹におけるグリア細胞の活性化について検討した。炎症性要因であるLPSおよび侵害要因である6%高張食塩水を投与して咀嚼筋に炎症を起こした場合、咬筋の炎症は消退してもなお脳幹においてマイクログリアおよびアストロサイトの活性化が持続した。口腔顎顔面領域の神経損傷由来の慢性痛に関しては、先行研究で数多くのことが解明されてきた。しかし咀嚼筋痛障害の病態について未だ解明されていない点が多く、治療法も確立されていなかった。本研究により、咀嚼筋に炎症を起こした場合、局所の炎症は消退してもなお脳幹においてグリア細胞および細胞内情報伝達系の活性化が持続し、痛みの慢性化に移行する可能性があることが示唆された。このことより、咀嚼筋痛障害や筋筋膜痛症候群の治療のターゲットの1つとしてグリア細胞を検討する必要があることを示した。また、本法により咀嚼筋痛障害モデル動物の作製を目指すことは有効であることも示された。今後さらに長期間での観察を行い、引き続き研究を進めていく。咀嚼筋痛障害は顎関節症(Temporomandibular disorders:TMD)の主要な病態であり、痛みに苦しむ患者は非常に多い。スプリントが無効な重症例は全身に広がる慢性的な筋痛である線維筋痛症に移行すると言われる。口腔顎顔面領域の慢性痛に関し、神経損傷由来の病態については研究が盛んに行われ、中枢および局所における動態について数多くのことが解明されてきた。しかし咀嚼筋痛障害の病態については未だ解明されていない点が多く、治療法も確立されていない。また病態解明に不可欠な咀嚼筋痛障害モデル動物の開発も進んでいない。本研究では咀嚼筋痛障害の治療法開発に向けた基礎研究として、まず咀嚼筋痛障害モデル動物を作製することにした。平成28年度はまず雄性Sprague-Dawley (SD)ラット(250g)の左側咬筋に、炎症性要因としてLPS (E.Coli) 2μg/kgを生理食塩水に溶解したものを50μl投与し、24時間後に侵害性要因として6%高張食塩水を50μlずつ、90分間隔で5回投与したものを実験群とした。比較対照群はLPS 2μg/kgを生理食塩水に溶解したもの、もしくは生理食塩水を50μl投与し、24時間後に同じものを50μlずつ、90分間隔で5回投与したものとした。現在脳幹の形態変化の過程をHematoxylin-Eosin (HE)染色にて観察するとともに、炎症メディエーターの抗体を用い、免疫組織化学的染色を行って可塑的変化を検索している。また細胞内情報伝達物質の発現について、免疫組織化学的染色を行って免疫陽性細胞数をカウントしている。雄性Sprague-Dawley (SD)ラット(250g)の左側咬筋に、炎症性要因としてLPS (E.Coli) 2μg/kgを生理食塩水に溶解したものを50μl投与し、24時間後に侵害性要因として6%高張食塩水を50μlずつ、90分間隔で5回投与したものを実験群、LPS 2μg/kgを生理食塩水に溶解したもの、もしくは生理食塩水を50μl投与し、24時間後に同じものを50μlずつ、90分間隔で5回投与したものを比較対照群として実験を進めている。刺激開始2週後、ならびに3週後に脳幹および咬筋を取り出し、脳幹については炎症メディエーターの抗体を用い、免疫組織化学的染色を行って可塑的変化を検索した。研究はやや遅れている。理由は筋の可塑的変化の検索の際、より研究の精度を高めるためにはin vitroでの実験も必要ではないかと考え、実験内容の追加について検討を重ねていたためである。脳幹に関するデータは現在収集中であるが、収集終了後解析を行う予定である。

しかし咀嚼筋痛障害の病態については未だ解明されていない点が多く、治療法も確立されていない。また病態解明に不可欠な咀嚼筋痛障害モデル動物の開発も進んでいない。本研究では咀嚼筋痛障害の治療法開発に向けた基礎研究として、まず咀嚼筋痛障害モデル動物を作製することにした。平成28年度はまず雄性Sprague-Dawley (SD)ラット(250g)の左側咬筋に、炎症性要因としてLPS (E.Coli) 2μg/kgを生理食塩水に溶解したものを50μl投与し、24時間後に侵害性要因として6%高張食塩水を50μlずつ、90分間隔で5回投与したものを実験群として試料を作製した。また比較対照群はLPS 2μg/kgを生理食塩水に溶解したもの、もしくは生理食塩水を50μl投与し、24時間後に同じものを50μlずつ、90分間隔で5回投与したものとし、同じく試料を作製した。雄性Sprague-Dawley (SD)ラット(250g)の左側咬筋に、炎症性要因としてLPS (E.Coli) 2μg/kgを生理食塩水に溶解したものを50μl投与し、24時間後に侵害性要因として6%高張食塩水を50μlずつ、90分間隔で5回投与したものを実験群、LPS 2μg/kgを生理食塩水に溶解したもの、もしくは生理食塩水を50μl投与し、24時間後に同じものを50μlずつ、90分間隔で5回投与したものを比較対照群として実験を進めている。刺激開始1週後、2週後、ならびに3週後に脳幹および咬筋を取り出し、脳幹の形態変化の過程をHematoxylin-Eosin (HE)染色にて観察した。次にアストロサイトおよびphosphorylated extracellular signal-regulated kinase (pERK)の脳幹での発現について検索するために免疫組織化学的染色を行い、免疫陽性細胞数をカウントした。また咬筋について免疫組織化学的染色を行い、tumor necrosis factor α(TNFα)およびbradykinin receptor B2 (BKRB2)の発現について検索した。脳幹について、実験群および対照群それぞれの結果を解析し、群間の差について分析している。研究はやや遅れている。理由は試薬投与後の咬筋におけるTNFαおよびBKRB2の発現についての分析は一旦終了したが、脳幹におけるアストロサイト陽性細胞およびpERK陽性細胞の発現について分析途中であることによる。本研究では咀嚼筋痛障害の治療法開発に向けた基礎研究として、咀嚼筋痛障害に伴う慢性痛発症機序の解明を目指した。まず研究の基礎となる咀嚼筋痛障害モデル動物を作製し、咀嚼筋痛時の中枢および局所における経時的変化について、組織化学的、生理学的、ならびに生化学的手法を用いて検索することにした。モデル動物の作製にあたって、刺激する試薬や刺激の頻度、観察期間などに関する条件設定が必要であった。従って、本研究ではラット腓腹筋障害モデル作製を行った先行研究を参考にし、当該研究に準じた方法でモデル動物を作製することを目指した。脊髄でのグリア細胞の活性化が炎症性疼痛や神経因性疼痛、痛覚過敏やアロディニアの発現機序への関与が示唆されていることから、本研究ではモデル動物作製の前に、咬筋に刺激を与えた際の脳幹におけるグリア細胞の活性化について検討した。炎症性要因であるLPSおよび侵害要因である6%高張食塩水を投与して咀嚼筋に炎症を起こした場合、咬筋の炎症は消退してもなお脳幹においてマイクログリアおよびアストロサイトの活性化が持続した。口腔顎顔面領域の神経損傷由来の慢性痛に関しては、先行研究で数多くのことが解明されてきた。しかし咀嚼筋痛障害の病態について未だ解明されていない点が多く、治療法も確立されていなかった。