hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発酵性糖質によるウサギの窒素利用性改善とその作用機構の解明

胃や小腸での消化を免れる糖質(難消化性糖質)フラクトオリゴ糖やマンニトールの摂取は,ウサギの飼料タンパク質利用効率を改善させ,その効果は「難消化性糖質が盲腸内微生物増殖を促し,血中尿素の微生物態タンパク質への移行量を増大させる。増大した微生物を良質のタンパク質源としてウサギが摂取する」ことにより発現することを示した。これは生産効率改善ならびに窒素排泄低減をもたらす飼養技術として実用化できる。成熟ウサギの飼料タンパク質(窒素)利用効率に及ぼす異なる難消化性糖質(フラクトオリゴ糖(FOS),D-マンニトール,ペクチン)の影響を調べるために,食糞を許可あるいは阻止したウサギに難消化性糖質を添加した飼料を与えて,飼料成分の消化率,糞や尿中に排泄される窒素量を測定した。その結果,食糞を許可したウサギでは,フラクトオリゴ糖やマンニトールの飼料への添加によって,尿中窒素排泄量が有意に減少し,摂取窒素量に対する体内窒素保持量の割合(窒素蓄積率)が増加することが示された。しかしペクチンの飼料への添加では尿中窒素排泄量,窒素蓄積率に影響は見られず,糖質の種類によって効果が異なることも判明した。一方,食糞を阻止されると,フラクトオリゴ糖やマンニトールの窒素蓄積率改善効果は消失した。そのとき採取した盲腸糞中の窒素含量や,摂取窒素量に対する盲腸糞中窒素の割合は有意に増加していた。以上から,フラクトオリゴ糖やマンニトールはウサギの飼料タンパク質の利用効率を向上させることが示され,この作用は,これらの糖質が盲腸内微生物増殖を促すことにより,血中尿素を素材にして増殖した微生物体タンパク質のウサギによる摂取が増大したことによる可能性が示された(現在実証試験を行っている)。本研究は,難消化・発酵性糖質を利用して,ウサギの飼料中窒素の利用性を向上させ,草類からの動物性タンパク質生産を,効率よく達成するための理論の構築とその応用をめざしている.上述のように,これまでにフラクトオリゴ糖やマンニトールには飼料窒素利用性改善効果があり,その効果発現メカニズムは,ウサギの特徴的な栄養摂取戦略である盲腸内容物の摂取(食糞)が関係することを明らかにすることができ,所期の成果が得られている。これらの成果は,効率的なウサギ生産技術創出への寄与だけではなく,環境に対する窒素負荷の軽減につながる点でも意義は大きい。難消化性糖質であるフラクトオリゴ糖(FOS)やマンニトール(MN)によるウサギの飼料タンパク質(窒素)利用効率改善効果の発現機構を解明するために,平成23年度は,異なる飼料条件下でのウサギの窒素利用効率改善効果の再現性,さらに血中尿素の盲腸微生物タンパク質への移行,血中尿素の尿中尿素への移行等について検証した。まず,前年度の試験とは異なる飼料(チモシー乾草あるいは尿素添加飼料)を基礎飼料とし,食糞を阻止しない場合と阻止した場合について検証した。FOSやMNを0%あるいは5%添加した試験飼料を,ウサギに与えて代謝試験を行った結果,前年の試験と同様に,食糞許可条件下でのみ難消化性糖質摂取が窒素蓄積効率を向上させることが確認できた。次に,血中尿素のトレーサーとして^<15>N標識尿素を静脈内投与し,1時間経過後に門脈血,循環動脈血,盲腸・結腸内容物,尿を採取し,血液・尿中の尿素態窒素・アンモニア態窒素,盲腸内総窒素,盲腸内バクテリア態窒素,盲腸内アンモニア態窒素の窒素濃度または量,さらにこれらの窒素中の^<15>N含有率(atom% excess)を測定し,体内尿素態窒素の動態に及ぼす難消化発酵性糖質摂取の影響を調べた。その結果.マンニトール投与により,血中からの盲腸内への^<15>Nの移行量,盲腸内バクテリアへの^<15>Nの取り込みが増大し,尿中への^<15>Nの排泄が減少した。これらのことにより,すでに前年度に行った代謝試験等でも示唆されてきたように,難消化性糖質摂取による窒素利用改善効果の発現は,「難消化性糖質が盲腸内微生物増殖のためのエネルギー源となり,十分なエネルギー源を得た盲腸内微生物が血中尿素を窒素源として活発に増殖し,増大した盲腸内微生物タンパク質が効率よくウサギに摂取(食糞)されることによって発現する」という機序によることを明らかにすることができた。前年度までに明らかにしたウサギ飼料への難消化性糖質の添加が血中尿素の盲腸内バクテリアへの移行量を増大させ,食糞を介した窒素利用性を改善するという現象が,ウサギの増体や成長率に反映するか確認することをめざして,今年度は難消化・発酵性糖質マンニトールの飼料への添加が成長中のウサギの成長や窒素蓄積に及ぼす影響を調べた。

在来小型種ウサギ(35日齢)を用い試験飼料(グルコース5%(対照),マンニトール5%)を与えて61日間飼育し,その間2回代謝試験を行い,窒素出納を評価し,飼育試験終了時には,血液(動脈,門脈),肝臓,盲腸,結腸,枝肉を採取した。盲腸,結腸については内容物中の有機酸量,微生物態タンパク質量,総タンパク質量などを測定し,血液については尿素態窒素濃度を測定した。得られた結果から,試験期間の前半と後半のマンニトールの効果に差異があることが認められた。すなわち飼育試験後半にのみ所期に期待されたマンニトール添加による窒素利用効率改善効果(尿中窒素排泄量の減少と吸収された窒素量(可消化窒素量)に対する蓄積窒素の割合の増大,盲腸内微生物態タンパク質量の増大)が発現したものの,試験期間全体では飼料効率や窒素蓄積効率,枝肉重量にはマンニトール添加効果を示すことはできなかった。試験前半では,尿中窒素排泄量や窒素利用効率に対するマンニトール添加の効果が認められなかっただけでなく,むしろマンニトール添加群の増体量がわずかではあるが,グルコース群と比べて低下傾向にあった。このことは,試験期間前半ではマンニトールの窒素代謝に対する効果はほとんど発現せず,マンニトールのエネルギー源としての利用性がグルコースと比較して低いことと関係する可能性が示唆された。以上からマンニトールの窒素利用性改善効果発現の条件として,ウサギの成長段階と関係する盲・結腸の機能の成熟が必須と考えられる。当初計画した代謝試験ならびにトレーサー試験は順調に遂行することができ,得られた成果は論文として学術誌に掲載することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに得られた技術的,理論的成果が,実際のウサギの産肉性向上と結びつくかを検証するために,長期間の飼育試験による効果の検証,また効果発現に影響する飼料条件の検証を進める。
低酸素虚血負荷後の脳循環と脳波測定による脳障害の重症度予測に関する基礎的研究

本研究では、低酸素虚血負荷後の脳波と脳循環酸素代謝変化をamplitude integrated EEGと時間分解分光装置を用いて測定し、その病理学的脳障害との関係を調べた。その結果、負荷後の脳血液量増加は脳波抑制時間と相関し、病理学的脳障害の重症度とも相関した。また、臨床においても、低酸素性虚血性脳症児においても、生後12時間以内に脳血液量が増加するものは、生命予後及び神経学的予後が不良であることを報告した。これらの結果より、脳血液量と脳波抑制時間は、生後早期に脳障害を簡便に且つ定量的に評価できるパラメーターとして有用であることが明らかとなった。今年度は、軽度・中等度・重度負荷の仮死モデルを作成し、それらの低酸素虚血負荷後6時間以内の脳血液量変化と脳波変化の間に関係性があることを発見し、報告した(Nakamura S,et. al. Brain & Dev 2013)。この研究成果から我々は、脳障害の重症度が脳波だけではなく、脳循環パラメーターの一つである脳血液量変化からも判定できる可能性を見出した。近年、臨床において、脳の酸素消費が脳障害を診断しうる実践的パラメーターとして注目されているが、この脳血液量変化は、それらよりもより早期に、低酸素性虚血性脳症重症度の診断に大きく寄与することが期待できる。今年度は、新生仔豚仮死モデルを用いて、低酸素虚血負荷後6時間以内の脳血液量増加が病理組織学的脳障害の重症度に有意に関係することを発見し、報告した(Nakamura M et al, International Journal of Developmental Neuroscience 2015)。この研究成果から、低酸素性虚血性脳症(HIE)児において、ベッドサイドで行うことができる脳機能モニターの中で、脳波だけが生後6時間以内における脳障害重症度判定方法が有用とされてきたが、この研究成果から、近赤外分光装置を用いた脳血液量測定が新しい脳障害重症度判定に有用であることが示された。また、臨床研究では、HIE児における生後6時間から72時間におけるCBV、脳内Hb酸素飽和度(ScO2)と神経学的予後の関係について報告をした(Nakamura S et al,. Brain & Dev 2015)。この報告から、生後6時間以内の脳血液量が高値のものは、予後不良である中等症・重症度であることが示され、また生後24時間におけるCBVとScO2を用いた場合、予後不良判定が正確にできることも示された。これにより、CBVとScO2の2つのパラメーターを用いれば、低他院療法施行前に脳障害重症度判定を行えるだけでなく、治療後の生後24時間に治療効果判定も行える可能性が示唆された。今後、更に軽度、中等度、重度負荷における脳障害のパターン、低体温療法に対する脳循環パラメーターの変化の違いについて調べていく予定である。今年度は、軽度、中等度、重度負荷における低酸素負荷中とその後の脳血液量変化パターンに着目し、負荷中の脳循環パターンが、その負荷後の脳循環変化パターンに大きく影響していることを明らかにした。すなわち、負荷中の脳血液量低下が負荷前値以下となる重度負荷群では、負荷後の脳血液量変化は負荷後1時間と、3時間以降に二峰性の増加を示し、負荷中の脳血液量低下が負荷前値以上であった脳血液量中等度負荷群では、負荷後1時間以内に脳血液量増加は認めたが、その後は低下を示した。このように、負荷後の脳血液量変化パターンは、負荷の程度を大きく反映していることが明らかとなった。子宮内低酸素虚血負荷の定量的評価は、低体温療法適応決定のために、客観的診断指標として必要であることから、この負荷後の脳血液量増加パターンを定量的に解析することにより、これに応用できることが予想された。また、中等度負荷群(n=6)に加え、低体温療法(HI)を中等度負荷群(n=6)に対して行い、HTがどのように負荷後の脳血液量、脳波変化に影響を及ぼすかを検討した。これまでに、脳活動抑制状態を反映する低振幅脳波持続時間(LAEEG時間)は、HTでは有意に延長されることが報告されたが、本研究では、低体温療法非施行(NT)群と比して、有意な延長は認めなかった。またNT群では、このLAEEG時間は脳血液量増加と有意に相関関係にあることを既に我々は報告したが(Nakamura S、Brain & Dev 2014)、HT群では逆相関の関係を認め、脳血液量は重症のものほど低下しやすい傾向を認めた。。これらの結果より、中等度脳障害では、HTによる脳波抑制延長の影響は少ない事が、脳血液量はその脳血管径調節機構の破綻により、HTによる血管収縮の影響を受けやすい事が示唆された。現在までに目標実験頭数の8割程度を施行していること、また、データ解析も順調に進んでいる。その研究成果報告を論文投稿により達成していることから、上記のように考えている。今年度は、低酸素虚血による脳障害の重症度を病理組織学的に評価を行った。HE染色では、評価部位を細かくし、評価を行った。その結果、白質における浮腫が、脳障害の重症度を反映していることが晶かとなった。そこで、免疫染色であるGFAPを用い、活性化アストロサイトを調べ、白質の浮腫の程度を、GFAP陽性アストロサイト数が反映するかどうかを検討した。

全ての解析結果は出ていないが、GFAP陽性アストロサイトはHE染色の重症度をよく反映していることから、本研究における重症度評価の新たな指標になることが考えられた。本研究では、低酸素虚血負荷後の脳波と脳循環酸素代謝変化をamplitude integrated EEGと時間分解分光装置を用いて測定し、その病理学的脳障害との関係を調べた。その結果、負荷後の脳血液量増加は脳波抑制時間と相関し、病理学的脳障害の重症度とも相関した。また、臨床においても、低酸素性虚血性脳症児においても、生後12時間以内に脳血液量が増加するものは、生命予後及び神経学的予後が不良であることを報告した。これらの結果より、脳血液量と脳波抑制時間は、生後早期に脳障害を簡便に且つ定量的に評価できるパラメーターとして有用であることが明らかとなった。脳障害重症度判定方法の確立を目指している本研究では、今年度、負荷後6時間以内の脳血液量増加が脳障害重症度に有意に関係する事を示し、更に、臨床研究においても、生後6時間での脳血液量高値が予後不良を示唆することを発見した。このことにより、脳血液量測定が生後早期の重症度判定方法に有用であることが基礎研究と臨床研究から支持された。これにより、今後、本研究が大きく進展していくことが予想される。引き続き、新生仔豚仮死モデルを用いて、追加実験を行う。また、病理組織学的、免疫組織学的脳障害評価を進め、その脳障害重症度と脳循環変化の関係を明らかにする。今年度の研究結果をもとに、臨床においても低酸素性虚血性脳症児に対し、生直後から脳血液量の持続モニタリングを行い、特に生後6時間以内の脳血液量変化が生後1週間でのMRIによる脳障害重症度とどのように関係があるのかを明らかにしていく予定である。新生児今後、新生仔豚仮死モデルに対し、低体温療法を行い、低体温療法が及ぼす脳循環パラメーターへの影響について、負荷の軽度、中等度、重度のグループ間での違いを調べる。また、引き続き、臨床においても同様に、低体温療法の脳循環に及ぼす影響を調べる予定である。脳障害の重症度判定方法の確立を目指している本研究で、初年度で、低酸素虚血負荷後の脳波と脳血液量変化が有意な相関関係にあることを示した。これにより、脳障害の程度と相関する脳波変化と並び、脳血液量変化もまた、その重症度判定のパラメーターとなりうる可能性がある。今後、更に研究を進めていけば、脳波と脳血液量の両方を用いた脳障害重症度判定方法確立の実現にむけて、大きく進展することが考えられる。追加実験を行う必要があることと、組織、免疫学的脳障害評価には時間を要するため実験がうまく進まなかった為追加実験にかかる基本的な物品費用に加え、上記のために必要な試薬などの備品などの購入を行う予定である。今後は、仮死モデルに対し脳低温療法を行い、その脳波と脳循環変化の関係、脳障害との関係を調べる。また各生理学的パラメーターを、低体温療法施行群と非施行群で比較する。実験および物品購入にあてる。研究をさらに進展させるため、研究機材(パソコン、解析用ソフト、測定機器)購入のために必要となる。解析用パソコンを数台、統計ソフト、測定用解析ソフトを複数個購入する。それらを用いて、現在進行を予定している実験効率をあげる。
感染症に対するリスクマーカーとしての根面う蝕に関する研究

目的:根面う蝕の多発傾向が種々の全身疾患,特に感染症のリスクマーカーになりうるかどうかを検討すること。対象及び方法:ベースライン調査を実施した新潟市在住の70歳の599名(男性306名,女性293名)のうち,1年後,2年後の追跡調査を受けた有歯顎者373名(男性195名,女性178名)を分析対象者とした。根面う蝕の発生は,健全歯面から未処置う蝕が発生した場合とした。根面う蝕発生の有無別にベースライン時と2年後の追跡調査時の血液検査値,血圧,体格指数(Body Mass Index:BMI)の平均値,さらに追跡期間中の変化量の平均値を求めた。結果及び考察:根面う蝕の一人平均発生歯面数は0.93±1.96(男性1.11±2.16,女性0.72±1.69)であった。根面う蝕発生率は35.9%(男性41.5%,女性29.8%)であり,男女間で有意差が認められた(p<0.05)。追跡期間中に根面う蝕発生の認められた者とそうでない者を比較すると,男性ではベースライン時のBMI平均値が根面う蝕発生のあった者のほうが低かった。女性では,根面う蝕発生の認められた者のほうがベースライン時及び2年後のクレアチニン平均値が低かった。また,追跡期間中の変化量を比較すると,女性では,根面う蝕発生の認められた者は血圧が上昇していた一方,総タンパク,アルブミンは減少していた。今回の結果から,根面う蝕の発生は全身的栄養状態の低下と関連があることが示唆された。しかし,今回の調査では比較的健康な集団を対象としたため,特定の疾患が疑われる者は非常に少なかったことから,全身疾患との詳細な関連は明らかでなかった。また,2年間での根面う蝕発生は非常に少なかったため,この点について明らかにするためにはさらに追跡調査を行う必要があると考えられる。目的:根面う蝕の多発傾向が種々の全身疾患,特に感染症のリスクマーカーになりうるかどうか検討すること。対象及び方法:コホート調査中である新潟市在中の70才の599名(男性306,女性293)のデータ分析を行った。調査対象者のうち有歯顎者544名(男性281,女性273)を分析対象者とした。根面は歯面単位で,露出が認めれた根面のみを診察し、う蝕は活動性のう蝕と停止性のう蝕,またう蝕による充填と楔状欠損(WSD)による充填を区別した。結果及び考察:分析対象者の現在歯数の平均値は18.8だった。根面う蝕(D)の所有者率は男性21.7%,女性19.8%で,歯冠と比較すると根面のほうが高かった。また歯牙単位一人平均根面DFTは男性0.46,女性0.32で男性が多く,所有者率と同様,根面のほうが歯冠より多かった。歯面単位一人平均露出歯面数は男性28.5,女性19.3,WSDが1.44,0.67,WSDによる充填が1.52,0.88,停止う蝕が0.74,0.47,う蝕歯面数(DS)が0.64,0.39,処置歯面数(FS)が1.64,1.37,う蝕及び処置歯面数(DFS)が2.29,1.76であった。歯種別にみると根面DSは大きい差はなかっが,根面FSは上顎犬歯が最も多く,ついで上顎切歯,下顎犬歯,上顎小臼歯の順に多かった。また根面Dは遠心が最も多く,舌側に少なかった。根面Fは頬側が顕著に多かった。来年度に追跡調査を行い,根面う蝕の発生,進行と全身疾患の因果関係を明らかにする予定である。

また,追跡期間中の変化量を比較すると,女性では,根面う蝕発生の認められた者は血圧が上昇していた一方,総タンパク,アルブミンは減少していた。今回の結果から,根面う蝕の発生は全身的栄養状態の低下と関連があることが示唆された。しかし,今回の調査では比較的健康な集団を対象としたため,特定の疾患が疑われる者は非常に少なかったことから,全身疾患との詳細な関連は明らかでなかった。また,2年間での根面う蝕発生は非常に少なかったため,この点について明らかにするためにはさらに追跡調査を行う必要があると考えられる。
法医学領域における外傷の重傷度評価法の開発

法医解剖症例90例の血清について、ELISA法を用いてIL-6(Interleukin-6)の測定を行った。試料は、死後2日以内の死体について剖検時に採取した心臓血を直ちに遠心分離し-30°Cで凍結保存したものを用いた。結果は予め剖検により得られた死因によって、外傷による死亡群(外傷群)、疾患による死亡群(疾患群)、前二者に含まれない死亡群(非外傷群)に分類して評価した。外傷群は疾患群及び非外傷群より有意に高値であったが、法医解剖症例の場合、受傷から死亡までの経過時間及び死亡から剖検開始までの時間が不詳の場合が多く、受傷後の経過時間とIL-6値の関係の評価は困難であった。なお、本研究の当初の目的であった外傷性ショック症例についての評価では、全症例でIL-6は高値を示したことから、剖検で致死的損傷が確認されなくても生体は高度の侵襲を受けていることが証明できた。ところで、本研究では、従来は外傷受傷後数時間半日程度してから上昇すると言われていたIL-6が、即死したと思われる重傷患者でも高値を示すことが確認された。また、非外傷群の中には、従来IL-6が上昇すると考えられていた外傷・感染症・腫瘍などの病態がみられなくてもIL-6の異常上昇を呈す症例がみられるという大変興味深い知見が得られた。特に、後者の知見は剖検しても直接死に至るような損傷や致死的疾患がみられないような症例の際に、生体が受けていた侵襲の評価を行うことによって死因判断への糸口が見つかる可能性があることから、今後法医学的死因診断に大きな役割を持つものと期待できる。現在、IL-6以外の侵襲のマーカーとなるサイトカインについてもデータを集積中であり、次年度はこれらを総合的に評価することによって、より詳細な侵襲の評価法を確立したい。
血清検体を用いたＥＭＬ４－ＡＬＫ検出

本研究では、肺がんにおいてALK阻害剤が著効するEML4ーALK融合遺伝子の非侵襲的検出法の確立を目的として、血清検体におけるEML4ーALK検出を検討した。がん研有明病院の協力を得て、EML4ーALK融合遺伝子陽性の患者血清を採取、収集し、血清検体からのEML4ーALK融合遺伝子の検出を検討した。EML4ーALKの複数存在するバリアントの同時検出および検出感度の向上をめざし、血清からの核酸抽出方法や測定条件、鋳型として用いる核酸の種類の検討を行い、検出方法の最適化を行った。この結果、EML4ーALK融合遺伝子陽性患者12例中2例の患者血清からEML4ーALK融合遺伝子の検出に成功した。肺がんにおいてALK阻害剤が著効するEML4ーALK融合遺伝子の非侵襲的検出法の確立を目的として、血清検体におけるEML4ーALK検出を検討した。平成24年度には、EML4ーALK融合遺伝子は複数のバリアントが存在することから、マルチプレックスによる検出系の検討を行った。また、血清検体でのEML4ーALK融合遺伝子の測定条件の最適化を目指し、測定条件の検討を行った。その結果、EML4ーALK陽性患者2名の血清から、EML4ーALKのバリアント1およびバリアント3aの検出に成功した。一方で、EML4ーALK陽性患者の血清から検出可能であったEML4ーALK融合遺伝子の検出成功率は、12例中2例と低いものであったことから、平成25年度には、血清からのRNA抽出手法の改善を試みた。これまでに用いてきた、カラム法によるRNA抽出法に加えて、磁性ビーズを用いた抽出およびフェノール・クロロホルムによる抽出を行い、カラム法との比較を行った。RNA収量はフェノール・クロロホルムによる抽出法においてもっとも高収量が認められたが、EML4ーALK融合遺伝子の検出成功率に改善は認められなかった。この一因として、血清中に遊離しているRNAが微量でかつ不安定であることが考えられ、RNAよりも安定なDNAを用いた検討を行った。まず、DNA上でのALKの融合部位を検討した結果、EML4遺伝子との融合はALKのイントロン19の約2,000bpの間でランダムに起こっていることが明らかとなった。約2,000bpのイントロン19の領域をすべて増幅できるプライマーのデザインを行い、最適化の検討を行うことで、DNAを鋳型としたEML4ーALK融合遺伝子の検出が可能と考えられる。本研究を通じて、血清中のRNAを鋳型として、低効率ではあるもののEML4ーALK融合遺伝子の検出が可能であった。(1) EML4ーALK融合遺伝子測定系のマルチプレックス化の検討: EML4ーALK融合遺伝子のマルチプレックス化を試みた。EML4ーALK融合遺伝子の9種のバリアントのマルチプレックス測定用プライマーをデザインし測定系の検証を行ったが、プライマー相互作用によりマルチプレックス化が困難であった。そのため、EML4ーALK融合遺伝子の主たるバリアントであるバリアント1、2、3に絞ったマルチプレックス測定系を構築した。(2)血清検体でのEML4ーALK測定条件の最適化:まず、血清からのRNA抽出条件として、TRIzol法とカラム法を検討した結果、収量と操作安定性の観点からカラム法を選択した。血清由来RNAの逆転写反応には、組織検体で用いたRandom Hexamerではなく、ALK特異的プライマーを使用した。最終的に、血清由来RNAを鋳型としたEML4ーALK融合遺伝子の検出には、逆転写反応用プライマーとしてALK特異的プライマーを用い、OneーStep RTーPCRによる目的部位の増幅を行うことで検出が可能となった。(3)血清を用いた測定実施のための準備: EML4ーALK陽性患者の血清の収集のため、試料提供機関である癌研有明病院呼吸器センターおよび測定機関である近畿大学医学部に申請、承認された研究計画に基づき、蛍光in situハイブリダイゼーションによる12名のEML4ーALK陽性患者および12名のEML4ーALK陰性患者の血清の収集を行った。(4)血清検体の測定: (2)で検討した手法を用いて、血清検体での測定を実施した結果、EML4ーALK陽性患者の血清からバリアント1(1/12)およびバリアント3a(1/12)を検出した。検出されたEML4ーALK融合遺伝子は、サブクローニングとダイレクトシークエンスにより確認した。本年度、血清由来RNAを鋳型としたEML4ーALK融合遺伝子の検出系を確立し、実際に臨床検体を用いた測定を実施した。その結果、蛍光in situハイブリダイゼーションにより決定されたEML4ーALK

陽性患者の患者血清からEML4ーALK融合遺伝子を検出した。本年度の研究計画に対する目標は達成しており、概ね順調に進展していると考えられる。EML4ーALK陽性患者の患者血清から検出されたEML4ーALK融合遺伝子の割合は、12例中2例と低いものであった。血清中に遊離している腫瘍由来RNAが微量かつ不安定であることが一因と考えられるため、血清からのRNA抽出法として磁性ビーズを用いた抽出RNAの収量の改善を図る。また、患者血清とペアの組織検体を用いて組織検体でのEML4ーALK融合遺伝子検出の一致率を検討する。RNA抽出法の改善を図るため、磁性ビーズによる抽出法の検討を実施する。また、組織検体でのEML4ーALK融合遺伝子の検討を行い、血清中での検出検体との比較を行う。
血管内投与型ＡＡＶベクターによる神経変性疾患の病態解析

神経変性疾患の病態解明と遺伝子治療法の開発を目的として研究を実施した.独自に新規開発した血管内投与により広範な中枢神経領域の神経細胞に効率よく遺伝子を導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを応用した.このベクターはマウス・ラットだけでなくカニクイサルなど大型動物の脊髄前角神経細胞にも遺伝子導入できる.認知症を呈する前頭側頭葉変性症(FTLD)において神経細胞内のユビキチン陽性封入体の成分として同定され,その後,家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)で遺伝子変異が見いだされたTDP-43は,神経変性疾患の病態解明の鍵となる分子として注目されている.本研究では, TDP-43を発現する血管内投与型AAVベクターを応用してモデル動物を作製した.変異型TDP-43を脳・脊髄の神経細胞で発現さマウスでは運動機能の障害が認められた.また,神経変性疾患に対する新規遺伝子治療としてAlzheimer病モデルマウスの脳内の広範な領域でAβ分解酵素のNeprilysinを発現させることにより認知機能の改善効果を得た.さらにmiRNAを発現するベクターを作製し,筋肉・血管・心腔・脊髄腔などから中枢神経内の神経細胞へ送達することに成功した.球脊髄性筋萎縮症(SBMA)の病態に関連したmiRNAをSBMAモデルマウスの筋肉内に投与することにより,脊髄の異常アンドロゲン受容体(AR)蛋白の発現を減少させ表現型の改善が得られた.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。神経変性疾患の病態解明と新規治療法を開発することを目的として,血管内投与により広範な中枢神経領域の神経細胞に効率よく遺伝子を導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを応用して研究を実施した.前頭側頭葉変性症(FTLD)において神経細胞内のユビキチン陽性封入体の成分として同定され,その後,家族性の筋萎縮性側索硬化症(ALS)で遺伝子変異が見いだされたTDP-43は,病態解明の鍵となる分子として注目されている.本研究では,TDP-43を発現する血管内投与型AAVベクターを応用してモデル動物を作製した.AAVベクターを成体動物に投与することにより,従来の遺伝子改変動物とは異なる発達過程の影響を受けない神経変性疾患のモデル動物を作製できる.23年度は成体マウスへ投与し運動機能障害を呈するモデル動物を作製した.さらに血管内投与型AAVベクターを応用した新規遺伝子治療法として,miRNAを発現するベクターを作製し,中枢神経内の神経細胞へ送達することに成功した.神経変性疾患の病態解明と遺伝子治療法の開発を目的として研究を実施した.独自に新規開発した血管内投与により広範な中枢神経領域の神経細胞に効率よく遺伝子を導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを応用した.このベクターはマウス・ラットだけでなくカニクイサルなど大型動物の脊髄前角神経細胞にも遺伝子導入できる.認知症を呈する前頭側頭葉変性症(FTLD)において神経細胞内のユビキチン陽性封入体の成分として同定され,その後,家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)で遺伝子変異が見いだされたTDP-43は,神経変性疾患の病態解明の鍵となる分子として注目されている.本研究では, TDP-43を発現する血管内投与型AAVベクターを応用してモデル動物を作製した.変異型TDP-43を脳・脊髄の神経細胞で発現さマウスでは運動機能の障害が認められた.また,神経変性疾患に対する新規遺伝子治療としてAlzheimer病モデルマウスの脳内の広範な領域でAβ分解酵素のNeprilysinを発現させることにより認知機能の改善効果を得た.さらにmiRNAを発現するベクターを作製し,筋肉・血管・心腔・脊髄腔などから中枢神経内の神経細胞へ送達することに成功した.球脊髄性筋萎縮症(SBMA)の病態に関連したmiRNAをSBMAモデルマウスの筋肉内に投与することにより,脊髄の異常アンドロゲン受容体(AR)蛋白の発現を減少させ表現型の改善が得られた.24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの血管内投与型のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを改良し,一層効率よく脳と脊髄の神経細胞に遺伝子導入可能なベクターを開発した.このAAVベクターにTDP-43遺伝子を搭載し,成体マウスの血管内に投与した.このマウスでは運動機能の障害が認められ,脳の組織解析で導入したTDP-43の遺伝子発現を確認した.miRNAを発現する血管内投与型ベクターを開発した.このベクターを使用して球脊髄性筋萎縮症(SBMAの病態に関連したmiRNAをSBMAのモデルマウスに投与したところ,脊髄の異常アンドロゲン受容体(AR)蛋白の発現が減少し,表現型の改善が得られた(名古屋大学との共同研究).24年度が最終年度であるため、記入しない。前年度までに作製したAAVベクターによりTDP-43を過剰発現させたモデルマウスを使用して病態解析を継続する.びまん性レビー小体病(DLB),パーキンソン病,多系統萎縮症(MSA)の病態発現に関わるα-synucleinを搭載した血管内投与型AAVベクターを使用して,モデル動物を作製する.霊長類のモデル動物を作製する.
介護保険施設における認知症看護の質評価指標の開発と検証

本研究の目的は、介護保険施設(介護老人福祉施設、介護老人保健施設)で療養する認知症高齢者に対し、認知症ケアのプロセスに焦点をあてたケアの質を具体的に評価するための指標を開発することである。2018年度は文献検討を行い、質的研究のメタ統合により、介護保険施設における看護職と介護職の認知症ケアの実践内容を明らかにした。看護職と介護職に共通する認知症ケアは、3要素からなる10カテゴリーが見出され、1認知症高齢者が過ごしやすい生活を支えるために、慣れ親しみ安心して生活できる環境づくりや、できる能力を引き出し維持する関わり、個別性や意思の理解を深めて日々の生活に活かす、思いやりを感じてリラックスできる関わり、社会とのつながりのある生活を支える実践を行っていた。2安全に過ごせる生活を支えるでは、心身の健康に気を配り整えることや、事故や感染などから入居者を守る取組みを行っていた。3多職種と家族との協働により生活を支えるでは、家族との関係性を保ち共に入居者を支える、多職種間で話し合い最良のケアを目指す、多職種や家族と協働して入居者の最期を看取るといった実践が行われていた。これら結果を基礎資料とし、指標項目の素案を作成し研究者らで検討を行った。更に、介護保険制度の見直し更新に応じた看取りケアなどのケア実践が反映された指標項目の作成ができるように、介護保険施設の介護・看護職を対象に認知症ケアの具体的実践内容についてインタビューを行い質的に分析を行っている。2018年度は、インタビューにより質評価指標の項目選定の基礎資料つくりを予定していたが、対象者を介護職と看護職に拡大したことにより、研究対象者数が増加して研究調査期間が延長された。現在も継続的に依頼を行い、データ収集を行っているため、分析の実施が遅れている。2019年度は、インタビュー調査を継続して実施して分析結果をまとめ、評価指標案の項目精選を行う。項目素案について、エキスパートパネル会議を用いて検討を行い、項目素案の確定後に全国調査による評価項目の分析を行い、信頼性と妥当性の検証を実施することを計画する。本研究の目的は、介護保険施設(介護老人福祉施設、介護老人保健施設)で療養する認知症高齢者に対し、認知症ケアのプロセスに焦点をあてた看護ケアの質を具体的に評価するための指標を開発すること。さらに、作成した認知症ケアの質評価指標を用いて看護師による認知症ケアの自己評価の調査を実施し、認知症ケアの実践活動状況を明らかにするとともに質評価指標の検討をすることである。平成28年度は質評価指標の素案作りの基礎資料を得ることを目的に、介護保険施設における認知症看護の方法および困難内容や認知症高齢者への対応内容について文献検討を行った。文献検討のキーワードは「認知症」「介護保険施設」「対応困難」「認知症の行動・心理症状(BPSD)」を用いた。文献検討により得られた介護保険施設の看護師が対応困難と感じている内容は、認知症症状の個別性に応じた対応、信頼関係の築きにくさ、時間や人材の余裕のなさ、増悪するBPSDへの対応などであった。さらに、介護保険施設における看護師の認知症高齢者への対応内容については、安全な療養生活の提供、BPSD悪化の予兆をとらえる、健康管理による体調不良の予防、人間関係の構築、意思や自律の尊重などが行われていた。文献検討により介護保険施設に入所する認知症高齢者に対し看護師が体験している困難の様相を把握した。この結果を参考に、介護保険施設に所属する認知症看護認定看護師が実践している看護内容を調査するためのインタビューガイドの検討を行っている。平成28年度は介護保険施設における認知症看護の方法および困難について文献検討を行ったが、当事者と家族が望む看護師の役割に関する文献検討が不足していた。また、介護保険施設に所属する認知症看護認定看護師が実践している看護内容について、施設に入所する認知症高齢者の家族へのインタビュー調査を計画していたが、文献検討に時間を要したことにより、インタビュー実施に至らなかった。平成29年度は、質評価指標を使用する対象者について検討を行い、施設での認知症ケアは、看護職と介護職の連携により実践されているため、看護職のみの対象から看護職と介護職の両者が活用できる質評価指標作成を目指すことに変更した。そのため、文献検討を追加し、認知症症状の安定に有効な認知症ケアや非薬物療法、認知症症状にとQOLの関連性、認知症ケアに関連する既存のアウトカム評価やケア指針について確認した。認知症の非薬物療法は、先行研究のシステマティックレビューの結果から判断し、ケアとしてパーソン・センタード・ケアに基づくケア実践が有効であることが明確となった。認知症高齢者の疾患特性からケアに依存せざるを得ないこともありケアの質とQOLは密接に関連しており、ケアの質がQOLに大きな影響を与えていることが分かった。今後もQOLを高めるケア技術を明らかにする分析を続ける予定である。既存の認知症ケアに関連する指針や尺度については項目内容を概観し、項目選定の資料とする予定である。また、認知症ケアの質指標項目の選定に向けた文献レビューとして、認知症ケアの具体的方法や技術を明確にするために、介護保険施設での認知症ケア実践が語られている文献を収集し、質的に分析中である。

平成29年度は、インタビューを行い、質評価指標の項目選定の基礎資料作りを予定していたが、質評価の指標を活用する対象者を介護者にも広げたことより、介護者の認知症ケア実践も包括して文献を検索を行うことに計画修正を行った。また、質の高い認知症ケアの具体的実践内容を文献より質的に分析し、質評価指標の項目選定案を作成することへ計画修正を行った。本研究の目的は、介護保険施設(介護老人福祉施設、介護老人保健施設)で療養する認知症高齢者に対し、認知症ケアのプロセスに焦点をあてたケアの質を具体的に評価するための指標を開発することである。2018年度は文献検討を行い、質的研究のメタ統合により、介護保険施設における看護職と介護職の認知症ケアの実践内容を明らかにした。看護職と介護職に共通する認知症ケアは、3要素からなる10カテゴリーが見出され、1認知症高齢者が過ごしやすい生活を支えるために、慣れ親しみ安心して生活できる環境づくりや、できる能力を引き出し維持する関わり、個別性や意思の理解を深めて日々の生活に活かす、思いやりを感じてリラックスできる関わり、社会とのつながりのある生活を支える実践を行っていた。2安全に過ごせる生活を支えるでは、心身の健康に気を配り整えることや、事故や感染などから入居者を守る取組みを行っていた。3多職種と家族との協働により生活を支えるでは、家族との関係性を保ち共に入居者を支える、多職種間で話し合い最良のケアを目指す、多職種や家族と協働して入居者の最期を看取るといった実践が行われていた。これら結果を基礎資料とし、指標項目の素案を作成し研究者らで検討を行った。更に、介護保険制度の見直し更新に応じた看取りケアなどのケア実践が反映された指標項目の作成ができるように、介護保険施設の介護・看護職を対象に認知症ケアの具体的実践内容についてインタビューを行い質的に分析を行っている。2018年度は、インタビューにより質評価指標の項目選定の基礎資料つくりを予定していたが、対象者を介護職と看護職に拡大したことにより、研究対象者数が増加して研究調査期間が延長された。現在も継続的に依頼を行い、データ収集を行っているため、分析の実施が遅れている。認知症高齢者と家族が望む看護師の役割について継続的に文献検討を行い、介護保険施設に所属する認知症看護認定看護師、施設に入所する認知症高齢者を持つ家族に対し、半構成的面接法により調査を実施できるように、倫理審査申請の準備を行う。インタビューの実施後は、インタビュー内容を質的に分析し、結果に基づき質評価指標の素案作りの資料とする。平成30年度は、認知症ケアの実践について文献検討を行い、その結果を基に質評価指標項目の素案作りを実施する。項目素案について、研究者らにて検討を行い、項目素案の確定を実施する予定である。2019年度は、インタビュー調査を継続して実施して分析結果をまとめ、評価指標案の項目精選を行う。項目素案について、エキスパートパネル会議を用いて検討を行い、項目素案の確定後に全国調査による評価項目の分析を行い、信頼性と妥当性の検証を実施することを計画する。平成28年度研究の計画では、介護保険施設に所属する認知症看護認定看護師および施設に入所する認知症高齢者の家族を対象にインタビュー調査を行う予定であったが実施に至っていない。そのため、インタビュー調査に必要な旅費および謝金、ICレコーダー等物品購入費が未使用となっている。
ノンコーディングRNA獲得による霊長類脳エピゲノム成立機構の実験的解明

脳の形態学的・機能的な違いは遺伝的に98%の相同性を示すヒト・サルでも明らかであり、実験動物として汎用されるマウスも、殆どの遺伝子セットを共通に利用していながら、独特な神経系を獲得している。一方、タンパクになれないノンコーディングRNAセットは種間多様度が極めて高い。本課題では、ノンコーディングRNAを高度に利用し、それにより、霊長類大脳皮質の遺伝子発現制御をげっ歯類細胞に再現することで、マウスのようなモデル実験動物種を異なる動物種の形質理解のために利用できるようにリソース化を目指す。
最先端研究に役立つラットの解剖学書作成のための研究

ラットは、薬物の毒性、薬効評価のための前臨床試験、微生物学的研究、発癌性実験、栄養学、生理学、学習行動学など広い分野の研究に用いられている。一方、これら研究の基礎となるラットの解剖学書は、死体を固定し、イラスト化または一部写真画像として表示したものが多く、それらの画像だけでは、動物実験を行おうとする初学者にとって十分とは言い難い状況が想像された。また近年CT(computed tomography)、超音波エコーおよびMRI(magnetic resonance imaging)等のコンピュータを利用した断層診断装置の発達により、生体内の情報が無侵襲に手に入るようになり臨床診断や研究に大きく貢献している。これらの画像解析には断面的・立体的な解剖学的知識がより一層要求される関係から、生体の情報が理解しやすいかたちの解剖学の参考書が要望されるようになってきた。本研究の目的は、上記の要求を満たすような最先端研究に役立つラットの解剖学書を作成することであった。幸い当初の計画どおりに研究が進み、本研究の成果として、実験動物用ラットの矢状断、水平断、前頭断および関連する肉眼写真を体系的に配列した解剖学のカラーアトラス集(実験動物の断面解剖アトラス・ラット編:チクサン出版.東京)を出版することができた。本研究は、先端研究にも役立つと思われる生体に近い解剖画像情報を網羅したラットの解剖アトラスの成書を作ることを目標に以下の実施計画を遂行し、下記の成果を得た。2)我が国で市販されている主要な系統のラット(クローズドコロニー,近交系,ミュータント系)を購入し麻酔薬の過剰投与で安楽死させ、軟X線撮影後-80°Cで凍結、軟X線写真を基に切断場所、切断枚数、厚さ、角度および立体的な方向等を検討した。ダイヤモンドソ-ブレ-ドを装着した断面標本作製機(マルト-:MC-140D)を使い、連続した一連の断面解剖標本(12mm間隔・前頭断、水平断および矢状断等)を作成し、生理食塩水にて融解後、写真撮影(Hasselbladマクロ撮影用カメラおよび医用写真撮影装置:杉研MPS-11)を行った。断面標本はCMCで接着再構築後、再び軟X線撮影し前後の写真から正確な切断場所を確認した。2)安楽死直後の動物を使い、断面解剖標本に相応するマクロ解剖写真を撮影した。また一部の動物は潅流後、血管内に色素を混入したラテックスゴムまたは造影剤等を注入することで動静脈系を強調させた画像を撮影することができた。3)上記方法で現在まで約120本近いフイルムを撮影し、その中から約120ページ(140画像)に相当する画像をコンピュータでデジタル情報として取り込み、その画像をDPTソフトに貼り付け、引き出し線と解剖名を記載する作業を行っているが、これらの画像は、ラットの解剖学アトラスの成書を版下として利用可能と確信できる結果が得られている。ラットは,薬物の毒性,薬効評価のための前臨床試験,微生物学的研究,発癌性実験,栄養学,生理学,学習行動学など広い分野の研究に用いられている。一方,これらの研究の基礎となるラットの解剖学書は,死体を固定し,イラスト化または一部写真画像として表示したものが多く,それらの画像だけでは,動物実験を行おうとする初学者にとって十分とは言い難い状況が想像された。また近年CT(computed tomography),超音波エコーおよびMRI(magnetic resonance imaging)等のコンピュータを利用した断層診断装置の発達により,生体内の情報が無侵襲に手に入るようになり臨床診断や研究に大きく貢献している。これらの画像解析には断面的・立体的な解剖学的知識がより一層要求される関係から,生体の情報が理解しやすいかたちの解剖学の参考書が要望されるようになってきた。本研究における成果の一つとして,実験動物用ラットの矢状断,水平断,前頭断(約1-3mm間隔で切断)および関連する肉眼写真を体系的に配列した解剖学のカラーアトラス集(実験動物の断面解剖アトラス・ラット編:チクサン出版,東京)を出版した。以下に本書の特徴を列記する。1)無固定(凍結状態で切断,融解後写真撮影)で生体に近い状態の解剖カラーアトラスを作成し,生体の断面情報を研究する研究者の参考に成り得ることを計った。2)図譜は全てカラー写真で構成し,またサイズもB4版と大型にし,細部まで検討できるように企画した。

3)カラー写真から線を引き出し,解剖名をカラー写真に接近して表記することで,参考とする臓器名や組織名が理解または検索できるようにした。4)解剖名は日本語,ラテン語,英語を同時に表記し,読者が日本語のみならず他の解剖学名も同時に把握できるように企画し,索引は日本語,英語,ラテン語別に配し,何れの解剖学用語でも検索できるように企画した。5)断面解剖と平行してマクロ解剖写真(無固定・解剖名付記)を配して,断面アトラス画像より理解しやすいように工夫した。
フラボノイドの生理作用発現と迷走神経の関連性の解析

フラボノイドの生理作用発現におけるメカニズムを明らかにする目的で、様々な臓器間を連絡している迷走神経(VN)のフラボノイドの生理作用発現における役割を評価する実験を行った。最初に、フラボノイド高含有の黒大豆色素抽出物(BE)の糖代謝に及ぼす影響と、それに対するVNの役割を評価した。VNの切除(Vx)または偽手術(Sham)を行ったラットを用意し、インスリン抵抗性を誘導するための高脂肪食(HF)、またはBE添加高脂肪食(BF)をそれぞれのラットに12週間投与した。その結果、Sham-HFラットと比較し、Sham-BFラットでは食餌効率(摂取した飼料1gに対する体重増加量)が有意に低下し、脂肪の消費を促進する脱共役タンパク質(UCP)が増加する傾向が見られたが、Vx-BFラットではそれらの変化が消失した。このことから、高脂肪食摂取による肥満は黒大豆色素摂取により抑制されたが、その機構としてVNを介したUCPの発現量増加が部分的に関与する可能性が示唆された。また、VxまたはShamを行ったマウスに対し、ストレプトゾトシンを投与することで糖尿病を発症させ、それぞれに正常食(CT)またはBE添加食(BC)を6週間投与したが、血液等の各種指標において、群間の有意差は見られなかった。次に、BEの不安抑制作用を評価した。予備実験により、当初予定していた評価系であるビー玉埋め試験はさらなる条件検討を要すると判断したため、オープンフィールド試験に変更した。また、強制投与ではマウスの行動に影響が出るほどのストレスがかかったことから、食餌を介してフラボノイドを投与することにした。それを踏まえ、VxまたはShamを行ったマウスに対してCTまたはBC食を1週間投与し、高架式十字迷路試験とオープンフィールド試験に供した。現在、解析を進めている。当初予定していた高脂肪食による糖代謝異常ラットに対するフラボノイドの作用機序の解明と迷走神経の肝分枝の役割を評価することが出来た。また、フラボノイド投与動物における抗不安作用についても、現在、解析段階にある。糖尿病動物に対するフラボノイドの効果と迷走神経の役割に関する評価も、望んでいた結果ではなかったものの、一応、評価することが出来た。高果糖食による糖代謝異常と迷走神経の関連性についても論文投稿中であることから、当初の予定通り、研究が進捗していると考えられる。フラボノイドの抗不安作用と迷走神経の関連性を見た試験の解析を進める。また、本年度実施した高脂肪食投与ラットでは糖代謝よりも脂質代謝の異常が強く出ており、フラボノイドがそれを改善したと考えられることから、次年度にコレステロール添加飼料を用いた脂質代謝異常動物に対するフラボノイドの効果と迷走神経の役割を評価する。また、本年度実施した実験の解析を進め、結果を論文として投稿する。本年度は、最初に迷走神経肝分枝(HV)切除の手技(HVx)の確認を含めて糖質の違いによるエネルギー代謝調節と迷走神経の関連性を調べた。ラットにHVxまたは偽手術を行い、それぞれの動物に通常食または高果糖食を6週間摂取させた。その結果、ANOVA解析により体重増加量、食餌効率(食餌摂取量1g辺りの体重増加量)でHVx処理の影響が見られた。また、耐糖能試験においてHVxの影響は見られなかったが、インスリン濃度においてHVx処理により血中濃度が増加した。さらに、血中レプチン濃度および脂肪組織におけるレプチンのmRNA量についてもHVx処理による有意な増加が見られた。以上のことから、インスリンの感受性に迷走神経が関与していることが明らかになった。一方、高果糖摂取により、体重増加量の減少、血中の尿酸値および中性脂肪濃度の上昇、肝臓中の糖代謝および脂質代謝の関連酵素が変動することを明らかにした。次に、HVxまたは偽手術をしたラットにストレプトゾトシンを投与しI型糖尿病を誘発し、黒大豆種皮抽出物(BE)の経口投与による糖尿病改善作用を評価した。その結果、BE投与により、糖尿病の指標である空腹時血糖値の上昇が有意に抑制され、正常動物と同程度まで改善されたが、HVxではその抑制は見られなかった。また、耐糖能試験においても、BE無投与群と比較してBE投与群で血糖値上昇の抑制とインスリンの分泌応答が改善する傾向が見られたが、HVxではその傾向は消失することを見出した。I型糖尿病に対する黒大豆色素と迷走神経切除の影響を見た実験では、予定通り、実験が終了している。高脂肪食摂取による肥満動物における黒大豆種皮抽出物摂取の影響と迷走神経の関連性を評価する試験において、予定通り、動物飼育まで終了している。また、行動解析試験の導入を行う予定であった。このうち、機器の導入およびメーカーによる操作方法の説明まで完了している。一方、強制水泳を試行する予定もあったが、よりストレスのかからない試験系のへ改良を検討している。以上のことから、研究は概ね順調に推移していると考えられる。

その結果、Sham-HFラットと比較し、Sham-BFラットでは食餌効率(摂取した飼料1gに対する体重増加量)が有意に低下し、脂肪の消費を促進する脱共役タンパク質(UCP)が増加する傾向が見られたが、Vx-BFラットではそれらの変化が消失した。このことから、高脂肪食摂取による肥満は黒大豆色素摂取により抑制されたが、その機構としてVNを介したUCPの発現量増加が部分的に関与する可能性が示唆された。また、VxまたはShamを行ったマウスに対し、ストレプトゾトシンを投与することで糖尿病を発症させ、それぞれに正常食(CT)またはBE添加食(BC)を6週間投与したが、血液等の各種指標において、群間の有意差は見られなかった。次に、BEの不安抑制作用を評価した。予備実験により、当初予定していた評価系であるビー玉埋め試験はさらなる条件検討を要すると判断したため、オープンフィールド試験に変更した。また、強制投与ではマウスの行動に影響が出るほどのストレスがかかったことから、食餌を介してフラボノイドを投与することにした。それを踏まえ、VxまたはShamを行ったマウスに対してCTまたはBC食を1週間投与し、高架式十字迷路試験とオープンフィールド試験に供した。現在、解析を進めている。当初予定していた高脂肪食による糖代謝異常ラットに対するフラボノイドの作用機序の解明と迷走神経の肝分枝の役割を評価することが出来た。また、フラボノイド投与動物における抗不安作用についても、現在、解析段階にある。糖尿病動物に対するフラボノイドの効果と迷走神経の役割に関する評価も、望んでいた結果ではなかったものの、一応、評価することが出来た。高果糖食による糖代謝異常と迷走神経の関連性についても論文投稿中であることから、当初の予定通り、研究が進捗していると考えられる。本年度行った高果糖食摂取に対する迷走神経切除の影響評価試験は、ほぼデータ収集が終わっており、本年度中に論文としてまとめる。I型糖尿病モデル動物に対する黒大豆色素と迷走神経切除の影響評価試験は、糖尿病に対する黒大豆色素の影響が十分には見えなかったことから、次年度は動物をマウスに変更した上で飼育期間を長くして、再実験を行う。また、高脂肪食摂取による肥満動物に対する黒大豆色素と迷走神経切除の影響を評価した試験では、実験飼育と各臓器のサンプリングまで終了しており、本年度は各種サンプルにおける遺伝子およびタンパク質の発現等の分析を行い、論文にまとめる作業に着手する。さらに、うつ様症状に対するケルセチン投与の影響評価を見る予定であったが、強制水泳試験によるうつ様症状ではなくマーブルベリー試験および高架式十字迷路試験を用いて、不安に対するケルセチン投与の影響を評価する試験を行う。フラボノイドの抗不安作用と迷走神経の関連性を見た試験の解析を進める。また、本年度実施した高脂肪食投与ラットでは糖代謝よりも脂質代謝の異常が強く出ており、フラボノイドがそれを改善したと考えられることから、次年度にコレステロール添加飼料を用いた脂質代謝異常動物に対するフラボノイドの効果と迷走神経の役割を評価する。また、本年度実施した実験の解析を進め、結果を論文として投稿する。
アポトーシス増強に着目した制癌剤の開発と獣医臨床応用

本研究は、アポトーシスによる細胞死を効率的に引き起こすことを目指したヌクレオシド系増感剤を開発し、獣医領域で問題となるネコ白血病、イヌリンパ腫などの治療のための制がん剤の開発を目的とする。モデル細胞としてヒト胃癌細胞MKN-45細胞とMOLT-4細胞の制がん剤による細胞死の機構を検討した。制がん剤としては1-(3-C-ethynyl-beta-D-ribo-pentofuranosyl)cytosine(Ecyd)と2'-chrolo-deoxyadenosine(Cl-dAde)を化学合成し、それぞれ検討した。その結果、両細胞ともそれぞれの制がん剤でカスパーゼファミリーの活性化を伴うアポトーシスを効率よく引き起こすことが明らかとなった。そのメカニズムには細胞によって差があり、MKN-45細胞についてはp53依存性のアポトーシスであり、MOLT-4の場合はp53非依存性、Fas活性化依存性のアポトーシスであることが明らかとなった。MKN-45細胞の場合は、蛋白合成に非依存性のカスパーゼ3依存性のアポトーシスを、MOLT-4細胞の場合は、アポトーシス誘導に蛋白質合成を必要とし、FASの活性化、カスパーゼ8を活性化し、カスパーゼ3に依存するアポトーシスを引き起こすことが明らかとなった。この結果は、細胞の種類に依存してアポトーシスを引き起こすシグナル経路の違いを意味している。また、単独では細胞死を起こさない量のEcydで処理した細胞は、放射線照射によって、効率よくネクローシスをアポトーシスに変換できることも明らかとなった。そのメカニズムとして放射線誘発G2期停止のECydによる解除作用が重要であり、G2期解除に伴ってアポトーシスが誘導されることが明かとなった。動物癌細胞への応用という点では、イヌリンパ腫由来CL細胞で、あるいはネコ白血病由来末梢リンパ球でもこれらの薬剤は有用であることが確かめられた。以上の結果は放射線や制癌剤による獣医臨床応用において重要な知見である。本年度は、計画に用いるモデル細胞としてヒト胃癌細胞MKN-45細胞とMOLT-4細胞の制がん剤による細胞死の機構を検討した。MKN-45細胞の場合は、BAXの増加とBCL-2の低下が起き、ミトコンドリアの機能低下、チトクロームCなどのアポトーシス活性化因子の遊離によってカスパーゼ3を活性化することが明らかとなった。一方、MOLT-4細胞の場合は、アポトーシス誘導に蛋白質合成を必要とし、FASの活性化、カスパーゼ8を活性化し、カスパーゼ3を活性化しアポトーシスを引き起こす経路がメインであることが明らかとなった。この結果は、細胞種に依存してアポトーシスを引き起こすシグナル経路の違いを意味している。