hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜特異的なVEGFの発現コントロールによる糖尿病網膜症モデルの開発

トランスジェニック・マウスと、TRE/VEGF(Tetracycline responsible element/VEGF)トランスジェニック・マウスを確立し、さらにこの両方の導入遺伝子をもつダブル・トランスジェニック・マウスを作成した。このマウスにおいては、Tet(テトラサイクリン)を与えることにより、ロドプシン・プロモーターが活性化され、さらにそれに反応してVEGFを網膜において過剰に発現することを確認した。このマウスではTetを与えるまでは網膜は正常に発育し、Tetを与えることにより非常に大量のVEGFを網膜において発現するようになり、網膜内に発生する新生血管はrho/VEGFマウスよりも激しいものであり、牽引性の網膜剥離が観察された。このトランスジェニック・マウスは有用な新しい動物モデルであり、糖尿病網膜症を代表とする眼血管新生の疾患の発症メカニズムの研究や治療方法の開発に大いに役に立つものと考えられる。
上皮-間葉移行に着眼した顎関節内障関節円板線維化の細胞生物学的病態解析

ヒト顎関節円板組織内にルミカン、ファイブロモジュリン、低分子ヒアルロン酸合成酵素の発現を確認し、同培養細胞でもIL-1β刺激でルミカンと低分子ヒアルロン酸合成酵素の発現の上昇を確認した。過開口運動させた野生型マウスに線維性癒着が生じたが、テネイシンCノックアウトマウスでは癒着が生じなかった。以上より、顎関節円板の細胞外マトリックスの病的変化を検索し上皮-間葉移行に関連した線維化誘導を解明する手がかりになると考えられた。我々はヒト顎関節内障患者から採取した関節円板の培養株を増加させるべく、様々な臨床症例において採取の努力を継続している。また、多くの研究者らが報告するTumor necroting factot-α(TNF-α)が顎関節内障の顎関節滑液や滑膜に増加している事実、重度なヒト顎関節内障円板に正常な顎関節円板には存在しないα-smooth muscle actinが変形部位に集積すると報告がされている事実。胸部疾患の肺線維化において低酸素環境が組織の線維化を亢進させる事実、損傷うけた兎の角膜ではルミカンが存在しないと上皮-間葉移行が乱れるという報告等を元に、既に培養細胞株として樹立したヒト関節円板細胞を用いて、上皮-間葉移行の一端の解明を行うべく、アミノ酸配列が50%以上相同性を持ちコラーゲン線維の走行の乱れを修復、形成を調整するとされているルミカンおよびファイブロモジュリンが、IL-1添加の条件にてどの様に産生され変化するのかを検索した。その結果、培養を開始すると早期にルミカンが増加するのに対してファイブロモジュリンは変化しない事実をPCR等にて明確に確認した。また、摘出した重篤な顎関節内障患者の関節円板内に、この二種類のタンパクが変形の起った部位に局在する事実を認めた。更には、成熟ラットの顎関節円板組織では、ルミカンが関節周囲組織に局在するのに対してファイブロモジュリンは円板内に多く局在する事実が免疫組織染色で判明した。そこで、今後の研究は、1、発生および成熟過程においてこの二種類のタンパクが顎関節組織においてどの様な分布を示すのかラットを用いて検索する。2、ルミカンのノックアウトマウスを用いて、顎関節運動に加重付加をかけた場合、組織内のTNF-α、α-smooth muscle actinの分布がどの様に有意に変化するのかを検索し上皮-間葉移行の解明を行う予定である。関節円板の癒着は顎関節症においてしばしば観察される所見である。我々は、関節円板の線維化の機序に着目して研究を進めている。ルミカンは、小型のプロテオグリカンの一つであり、コラーゲン線維の形成速度や、線維間の距離、線維の太さなどを調整する役割がある。また、CD34は、内皮細胞に存在するグリコプロテインであり、血管新生と関係している内皮細胞により産生される。VEGFは、血小板由来の成長因子であり、血管新生はVEGFの発現と関係している。免疫組織化学染色の結果、手術により摘出した、顎関節症のヒト関節円板にはルミカン、CD34、VEGFが発現し、ルミカンが発現している部位には線維芽細胞様細胞が存在していた。CD34とVEGFは、変形した関節円板組織内に存在する新しく形成された毛細血管に認められた。これらのことから、変形した関節円板内では血管新生がおこり、ルミカンによる新しいコラーゲン線維のネットワーク形成が認められることが証明された。さらに、顎関節症の関節円板においてヒアルロン酸合成酵素HAS3の発現についても免疫組織化学染色にて確認した。顎関節症の変形した関節円板内にはHAS3が発現していた。ヒトの関節円板細胞を低酸素状態かつIL-1βにて刺激すると、通常の酸素濃度かつIL-1βで刺激しない状態に比べてHAS3のmRNAの発現上昇がみられた。これらのことから、HAS3は顎関節症の病理変化に関係している因子であることが示された。今後は小型のプロテオグリカンであるファイブロモジュリン、デコリン、ビグリカンと関節円板の癒着の関係について研究をすすめていく予定である。研究成果の内容:1.ヒト顎関節関節円板組織を用いた免疫組織化学的染色。ルミカン:変形した関節円板の内方に強い発現を認めた。特に線維芽細胞様細胞の周囲に強い発現を認めた。ファイブロモデュリン:変形した関節円板の表層に弱い発現を認めた。CD34,VEGF:変形した関節円板組織内に発生した血管壁に強い発現を認めた。低分子ヒアルロン酸合成酵素:変形した関節円板の裂隙に存在する軟骨細胞様細胞に強い発現をみとめた。2.ヒト顎関節関節円板培養細胞を用いた実験。ルミカン:通常酸素下におけるIL-1β刺激24,48時間培養でmRNAの発現がIL-1β刺激なしと比較して有意に増加した。ファイブロモデュリン:通常酸素下におけるIL-

1β刺激でmRNAの発現を認めなかった。低分子ヒアルロン酸合成酵素:低酸素培養下におけるIL-1β刺激3,24時間培養でmRNAの発現がIL-1β刺激なしと比較して有意に増加した。以上の結果を英文誌に報告した。意義:ルミカンはIL-1βにより顎関節関節円板組織内の環境変化に対する調整、組織再構築の役割があることが示唆された。ファイブロモデュリンはIL-1βによる環境変化に影響を受けないことが示唆された。低分子ヒアルロン酸合成酵素は顎関節関節円板の病的変化に関与することが示唆された。顎関節関節円板組織の病的組織再構築に細胞外マトリックスであるルミカン、低分子ヒアルロン酸が関与していることがわかった。重要性:上記意義より、顎関節関節円板の細胞外マトリックスの変化を追及することが上皮-間葉移行の誘導を解明する大切な手がかりになると考えられる。
ダイアモンド・ブラックファン貧血のリボソームタンパク質リン酸化による造血制御解析

Diamond-Blackfan貧血(DBA)は、赤芽球への分化異常によって引き起こされる先天性疾患である。代表的な原因遺伝子はリボソームタンパク質(RP)をコードするRPS19である。興味深いことにRPS19以外のRP遺伝子の変異を持つDBA患者も数多く報告されており、全患者の約半数がRP遺伝子に変異を持つ。DBA発症機序として現在最も有力なのは、RP遺伝子の変異によりガン抑制遺伝子p53が活性化し、その経路が関与するというものである。しかし、疾患の分子機構については不明な点が多く、RP遺伝子に変異を持たない患者に関しては原因が不明なままである。また、全身に存在するリボソームの異常が、なぜ器官特異的な表現型を示すのか疑問であるが、それに対しては、各組織を構成する細胞種によってRP変異への感受性が異なるからだと考えている。そのため、様々な組織を比較する必要があり、細胞レベルではなく個体レベルでの解析が必須である。そこでモデル生物のゼブラフィッシュを用いた予備検討を行なった結果、RPS19のリン酸化が赤血球造血に関与する可能性が示唆された。そこで本研究では、ゼブラフィッシュを用いた独自のリン酸化解析システムにより、RPのリン酸化状態の違いによる造血への影響を解析する。また、以前培養細胞を用いてRPS19がリン酸化酵素PIM1によって強くリン酸化されることを明らかにしていることから、ゼブラフィッシュpim1の発現を抑制し造血への影響を解析する。これらによりRPのリン酸化を介した赤血球造血機構を明らかにし、DBAの分子機構として新たな知見を得ることを目指す。ゼブラフィッシュpim1に対するモルフォリノアンチセンスオリゴ(MO)を作成し、受精卵に微量注入した。その結果、受精後24時間で脳の形成異常、体軸の屈曲といった表現型が得られた。さらに受精後48時間の胚をヘモグロビン染色で評価したところ、発現抑制胚で赤血球数の減少を認め、造血に異常が見られた。そこで次にCRISPR/Cas9システムを用いたpim1ノックアウトゼブラフィッシュの作成を試み、変異体を得た。この変異体もMOによる発現抑制胚同様、脳形成に異常が見られ、赤血球数が減少した。以上から、pim1が赤血球造血に関与していることが示唆された。リン酸化が関与する赤血球造血因子の探索については、一部着手している。しかし、上記の発現抑制胚および変異体の作成、検証実験に時間を要したため、若干遅れを生じている。1.ゼブラフィッシュのrps19恒常的リン酸化モデルおよび恒常的非リン酸化モデルを用い、リン酸化が関与する赤血球造血因子の探索を行う。2.rps19リン酸化酵素pim1の発現抑制胚および変異体を用い、リン酸化が関与する赤血球造血因子の探索を行う。2.rps19
流域環境の視点からの食料生産と水・土地資源の保全・利用

農業による食糧生産は,人間生存の基本であり,これなくして人類の生存はあり得ない.世界の食料供給力と人口圧を考えるとき,自然環境と調和・均衡のもと,持続性をもち,しかも高次の生産性と安定性を備えた農業の創造が求められている.我が国では,日本学術会議の首唱のもと,地球圈-生物圏国際協同研究計画(IGBP)が協力に推進されているが,ここでも,農業は陸域生態系と水環境へのインパクトならびに人間活動の地球環境への影響が強く出現する産業部門として注目されている.農業は周知のように,土地および水を基盤として成り立っており,河川流域に広く展開している.本研究では,まず,(1)河川流域内に地域農業の原単位を設定し、流域環境の視点から農業生産に係わる水資源ならびに土地資源の保全と有効利用の方策を考究した.さらに,(2)地域農業の原単位を河川流域に拡大した場合の水循環およびそれによる物質環境の解明,ならびに広域土地利用に対する制約条件を明らかにした.これによって,(3)農業が自然のなかにあって農業生態系(二次的自然)を形成し,自然環境との調和のもとに存続する条件を明らかにし,河川流域を対象とした持続型農業システムの構築とこれを実現するための諸手法を探究した.これらの成果は,研究成果報告書として取りまとめ,印刷,公表した.農業による食糧生産は,人間生存の基本であり,これなくして人類の生存はあり得ない.世界の食料供給力と人口圧を考えるとき,自然環境と調和・均衡のもと,持続性をもち,しかも高次の生産性と安定性を備えた農業の創造が求められている.我が国では,日本学術会議の首唱のもと,地球圈-生物圏国際協同研究計画(IGBP)が協力に推進されているが,ここでも,農業は陸域生態系と水環境へのインパクトならびに人間活動の地球環境への影響が強く出現する産業部門として注目されている.農業は周知のように,土地および水を基盤として成り立っており,河川流域に広く展開している.本研究では,まず,(1)河川流域内に地域農業の原単位を設定し、流域環境の視点から農業生産に係わる水資源ならびに土地資源の保全と有効利用の方策を考究した.さらに,(2)地域農業の原単位を河川流域に拡大した場合の水循環およびそれによる物質環境の解明,ならびに広域土地利用に対する制約条件を明らかにした.これによって,(3)農業が自然のなかにあって農業生態系(二次的自然)を形成し,自然環境との調和のもとに存続する条件を明らかにし,河川流域を対象とした持続型農業システムの構築とこれを実現するための諸手法を探究した.これらの成果は,研究成果報告書として取りまとめ,印刷,公表した.
糖尿病外来栄養指導対象患者抽出法に関する研究～BDHQを用いた検討～

無床診療所における外来糖尿病患者の治療効果を向上させるため、BDHQから得られた食事調査結果を活用した新しい外来糖尿病栄養指導対象者抽出法を確立することを目的とした。その結果、糖尿病食事療法のうち、栄養基準が大きく変化する糖尿病性腎症第3期Bに該当する患者は、109名中25名であった。このうち、BDHQから得られたたんぱく質摂取量が1.0g/kg標準体重/日を上まっている患者は17名であり、特にこれらの患者は管理栄養士による詳細な栄養指導を受ける必要性が高いことが考えられた。地域に開かれた無床診療所には、管理栄養士はほとんど常勤しておらず、栄養指導が必要な生活習慣病患者に対する指導でさえも十分に実施できていない現状がある。また、糖尿病栄養指導対象者抽出については、医師の主観(治療歴、患者背景、患者の性格等)や血液検査値等の客観的指標のみを参考にしており、必ずしも食事調査結果に基づいた抽出をしている訳ではない。そのため、実際に食習慣が乱れており、糖尿病栄養指導の必要性が高い患者に対して効率良く栄養指導ができているとは言い難い。そこで我々は、無床診療所における外来糖尿病患者の治療効果を向上させるため、BDHQから得られた食事調査結果を活用した新しい外来糖尿病栄養指導対象者抽出法を確立することを目的として研究をすすめている。具体的には、M医院(大阪府阪南市)に通院している2型糖尿病患者のうち、研究の趣旨に同意が得られた109名(男性77名、女性32名、平均年齢64.7±7.4歳)にBDHQを実施し、ある1日の平均的な「栄養素摂取量」を算出。次いで当該患者カルテの検査値(HbA1c、クレアチニン等)を記録し、食事調査結果と組み合わせた栄養指導対象者抽出基準を検討している。このうち、BDHQから得られたたんぱく質摂取量が1.0g/kg標準体重/日を上まっている患者は17名であり、特にこれらの患者は管理栄養士による詳細な栄養指導を受ける必要性が高いことが考えられる。今後さらに詳細な分析を行っていく予定である。【目的】昨年度確立した方法を用いて抽出した糖尿病性腎症患者に対し、管理栄養士による継続的な個別栄養指導を実施し、その効果を検討した。【方法】M医院(大阪府、阪南市)に通院している糖尿病性腎症患者のうち、研究の趣旨に同意が得られた患者(計21名、平均年齢68.4±5.7歳)を無作為に2群に分け、『食事調査結果に対するコメントのみで食事管理する群(以下、コメント群)』、『食事調査結果に対するコメントと個別栄養指導で食事管理する群(以下、コメント+指導群)』と設定した。研究期間は1年間とし、両群とも6ヶ月に1度のペースで簡易型自記式食事歴法質問票(BDHQ)を用いた食事調査と血液・尿検査を実施した。また、コメント+指導群のみ、3ヶ月に1度のペースで約30分程度の個別栄養指導を実施した。【結果】1年間の研究期間における両群間の成績を比較したところ、体重変化率に有意差が認められた(コメント群:2.1±5.2%、コメント+指導群:ー3.8±3.6%、P=0.005)。一方、食事調査結果には差が認められなかった。【1年目(平成25年度)】M医院に通院している2型糖尿病患者にBDHQを実施し、ある1日の平均的な「栄養素摂取量」を算出した。次いで当該患者カルテの検査値(HbA1c、クレアチニン等)を記録し、食事調査結果と組み合わせた栄養指導対象者抽出基準を検討した。【2年目(平成26年度)】上記の患者を対象に、1年間の栄養指導介入を実施した。その結果、栄養指導群において有意な体重減少が認められた。【3年目(平成27年度)】上記の成果を論文にまとめ、大阪樟蔭女子大学研究紀要に発表した。研究協力者である医療法人松若医院松若良介院長のお力添えにより、対象患者様の協力がスムーズであったことが順調に進展している理由である。臨床栄養学当初の計画どおり、3年目は13年間を通しての総括と成果(学術論文、学会発表)の発信を行う予定である。また、無床診療所への啓蒙活動も行っていきたいと考えている。研究協力者である医療法人松若医院

松若良介院長のお力添えにより、対象患者様の協力がスムーズであったことが順調に進展している理由である。栄養指導を担当する予定であった管理栄養士(アルバイト)の手配が想像以上に困難であったため、人件費支出予定の変更を行ったため。当初の計画どおり、2年目は、1糖尿病の判定区分、投薬状況、食習慣の特徴を組み合わせた栄養指導対象患者抽出基準を設定。2栄養指導対象患者に、BDHQによる食事調査結果に基づいた栄養指導を行い、その有効性を検討。3年目は13年間を通しての総括と成果(学術論文、学会発表)の発信。の予定である。研究成果の発信に力を入れるとともに、無床診療所への啓蒙活動を目的とした出張やパンフレット等の作成に対しても予算をあてていきたいと考えている。年度末に予定していた出張が急遽中止になったため。翌年度に計画している旅費に上乗せして使用させて頂きたいと考えている。
不確実性を考慮した翼周り剥離流れの制御性能予測モデルの構築

本課題では,複雑形状周りの圧縮性流れの高精度数値解析手法として高次精度流束再構築法(Flux reconstruction method:FR法)を採用する.不確実性を含む支配方程式の場合,変数の多次元化と解の不連続性から数値不安定性が強まる事が予測され,これらを根本的に解決する手法が必須である.本年度は,差分法にて有効性が示されてきた「混合型移流項を用いた非線形安定化手法」のFR法への適用を試みた.混合型移流項の適用に際して必要となる定式化と簡単なベンチマークテストは既に終えていた為,本年度は3次元Taylor-Green渦など,より実用的な非線形性の強い乱流場を対象とした数値テストと安定性解析を試みた.その結果,空間16次精度という超高次精度の空間離散化手法を実現する事に成功した.本手法の鍵は,Navier-Stokes方程式の移流項を混合型へ書き換える事で,速度自乗量の保存を実現する事にある.その為に,FR法においては解の定義点をGauss-Lobatto点に置く事,セル界面にて適用される修正関数をg2関数とする事が十分条件である事を見い出した.本結果は2016年8月に行われた高次精度スキームに関する国際ワークショップにおいて発表し,他の参加者の示す高次精度スキーム(空間6次精度程度)よりも数十倍の効率(同一精度の数値解を得る為に必要な計算時間での比較)向上を示す事が出来た.本内容は現在,国際学術誌にて査読中である.また上記のFR法を用いた流体の不確実性評価法構築の第一歩として,Burgers方程式の不確実性評価手法の構築を行った.導出したstochastic Burgers方程式の空間離散化をFR法に基づき行い,簡単な1次元問題に対して安定に計算が行える事を確認した.これらの知見を圧縮性流体解析におけるFR法を用いた不確実性評価へと適用する事が可能と考えている.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
酸素耐性型窒素固定系を葉緑体へ導入することによる窒素固定植物の作出

酸素に対して耐性である窒素固定系を有する単細胞藍藻Synechococcus sp.Miami 043511株におけるニトロゲナーゼ構造遺伝子に関して、その遺伝子構造の解明と遺伝子発現制御の解析を行った。そこで、まず、これまでに明らかとなっているAnabaena sp.の塩基配列を元にデザインしたPCRプライマーを用いてPCR法によりnifH、nifD、nifKの3つの遺伝子についてクローニングを行い、ニトロゲナーゼ構造遺伝子の全配列を決定し、他の窒素固定生物との相同性を検討した。その結果、3つの遺伝子産物とも、他の窒素固定生物と極めて相同性が高いものであった。しかしながら、遺伝子間領域の塩基配列はまったく異なる配列であった。さらに、この領域には同-7塩基対が4回繰り返すという特徴がある配列が見つかった。これらのことから、他の窒素固定生物とは蛋白質としては、同様の性質を有する可能性が考えられるが、遺伝子発現制御機構は異なっていることが考えられる。したがって、窒素固定系が酸素耐性であることの理由が、酵素自体の性質によるのではなく、別の機構によってもたらされていることが考えられる。また、12時間明期12時間暗期の明暗周期培養条件下で、ニトロゲナーゼの構造遺伝子の発現の様子について、ノーザン・バイブリダイゼーションにより調べたところ、暗期になる直前(暗期0時間)にのみ発現していることが分かった。このことから、遺伝子発現は明期から暗期への環境変化によって誘導されるのではなくて、細胞周期により発現が制御されていると考えられる。また、ニトロゲナーゼ構造遺伝子はnifHDKが一つのオペロンとして転写されていることが明らかとなった。現在、これらの窒素固定関連遺伝子を植物に導入することを考えている。
人体への接触を目的としたロボットハンドの製作とマッサージ動作への適用

本年度では、まず、前年度の成果を基に外力吸収、推定機能を有する関節機構を搭載した3関節フィンガーモジュールを製作した。また、製作したフィンガーモジュールには接触力の吸収とその大きさの推定をより効果的に行うため、指先に半球状のシリコーンゴムクッションを新たに設計・製作し取り付けた。基本性能の検証実験により指先および根元関節での外力吸収特性と推定が有効かっ高精度で行われることが確認された。つぎに、開発した3本のフィンガーモジュールを用いてロボットハンドを製作し、本研究の目的であるマッサージ動作のための制御則の構築、および実験による評価を行った。対象としたマッサージ動作は人の肌を摩るマッサージ動作である。前年度までに得られた心地よいマッサージ動作の実現要件を基に接触力と摩擦力の変化を抑制するための制御則を構築した。構成した制御ループは本フィンガーモジュールの有する外力推定機能を利用し、接触力と摩擦力を推定し、その結果を基に目標値に追従するよう指先の位置を制御する位置制御をベースとしたものである。また、指先、関節内に搭載したシリコーンゴム製のクッションの柔軟性が、身体表面の起伏や摩擦状況の違いを克服し、安定した接触の維持に寄与するものと期待した。実際に人の腕を摩る動作制御を行った結果、目標値通りの接触力と摩擦力の安定した制御が行え、被験者による主観評価においても、"優しく触れられている"といった好印象を得ることができた。以上の成果は、国際学会論文2件、国内学会論文1件、およびインターナショナルジャーナル投稿論文1件としてまとめ公表した。本研究の目的はマッサージやスキンケアなどの身体ケアを行なうロボットハンドの製作とそれら作業の実現である.開発するハンドの特徴は多方向からの外力に対する受動柔軟性と外力の大きさを推定する機能を有すること,および皮膚温に近い表面温度を有することである.また,最終的には生理的,心理的効果の高いマッサージ動作を開発したハンドで実現することである.今年度は(1)外力吸収,推定機能を有するロボットハンド用モジュールの設計・製作とその基礎特性の解析,(2)マッサージ動作パターンに対する心理的評価の二つを主に行なった.(1)については関節内に組み込むシリコーンゴムクッションの設計・製作を行なった.その際に望まれる弾性特性を持たせるために形状設計のみならずシリコーンゴムの組成率も検討し製作した.次に,製作したクッションを組み込んだ人サイズのロボットフィンガーの設計・製作を行なった.特性解析実験により,ロボットフィンガーが当初の期待通り,多方向の外力に対する柔軟な応答が得られ,その大きさを精度良く推定できることも確認された.さらに,フィンガーモジュールを用いてスキンケアを模擬した制御実験も行い,摩擦の大小に関係なく,表面を滑らかになぞる動作が実現できた.これらの研究経過は,国際会議(2件),国内学会(1件)において公表し,高い評価を得た(ICMA2005 Best Paper Award Finalist).また,それらの成果をまとめたものを現在国内学会論文誌へ投稿中である.次に(2)は,効果的なマッサージ,スキンケア動作を実現するために必要となる動作パターンを得るために行なった.実験は人間の手を数種類の圧迫パターンで刺激する実験であり,このパターンの力学的パラメータと心理的評価の関係を解析した.その結果,圧迫力の初期増加率を抑えることが人にとって好ましい印象を与え得ることが確認された.この結果は,国内学会論文誌に投稿し,掲載が予定されている.本年度では、まず、前年度の成果を基に外力吸収、推定機能を有する関節機構を搭載した3関節フィンガーモジュールを製作した。
新しく開発した生体内線維連絡イメージングと多点電極を用いた顔領野の相互作用の研究

蛍光逆行性トレーサーコレラトキシン-Alexa 555をサル脳に少量注入し、約500μm(機能カラムサイズ)の注入部位を作り、1-2週間置いた後に、蛍光実体顕微鏡で脳表を観察すると、注入部位に投射するスポット状の領域を生体内で脳表から同定することが出来る(生体内線維連絡可視化法)。この手法と電気生理学的手法を組み合わせて、サル下側頭葉皮質における顔認知メカニズムを解明する試みについて本研究会で報告したい。サル下側頭葉皮質は、顔を含む物体認知に関わる腹側視覚経路の最終段階にあり、前部にあたるTE野と後部にあり、一段階前の領野と考えられるTEO野に分かれる。我々は、まずTE野の顔に強く反応するスポットを同定し、そこにトレーサーを注入し、生体内線維連絡可視化法より、その顔スポットに投射する小領域をTEO野内に生体内で同定し、これらのスポットおよびランダムに選んだスポットの視覚刺激に対する反応性を調べた。その結果、TEO野の投射スポットの視覚反応性は、ランダムに選んだTEO野のスポットに比べて、トレーサー注入部位であるTE野のスポットの視覚反応性とより高い相関を示した。しかし、TE野のスポットは、顔の構成パーツ(目、鼻、口)をシャッフルしたもの(シャッフル顔)よりも顔に対して有意に強く反応していたが、この傾向は、この部位に投射するTEO野のスポットにはなかった。これらの結果と、報告されているTEO野の小さな受容野あわせて考えると、TEO野は顔の部分の情報をTE野に送っているという考えを支持すると思われた。事実、TEO野において、reduction processを用いてcritical featureを決めると、サルの髪のtextureや、目と思われるfeatureである例が観察された。また、TEO野の投射スポットに抑制性神経伝達物質GABAアゴニスト・ムシモルを注入することにより、TE野のトレーサー注入部位のスポットの視覚反応性が大きく変わることを観察した。この大きな変動は、注入部位ではないTE野の記録では起こらず、また、TEO野内の任意の部位へのムシモル注入では、起こらないことを確認した。上記の結果は、TEO野からTE野への投射が強い影響力を持っている事を示唆している。サル下側頭葉皮質は、顔を含む物体認知に関わる腹側視覚経路の最終段階にあり、前部にあたるTE野と後部にありTEO野より下位に属するTEO野に分かれる。今回我々は、最近我々が開発した蛍光トレーサーコレラトキシン-Alexa555注入による生体内線維結合イメージングを用いて、TE野の顔に強く反応するスポットに投射する小領域をTEO野内に生体内で同定し、このスポットの顔を含む視覚刺激に対する反応性を調べた。また、このTEO野の投射スポットに抑制性神経伝達物質GABAアゴニスト・ムシモルを注入し、その投射部位であるTE野のスポットの視覚刺激反応性を調べた。TEO野の投射スポットの視覚反応性は、ランダムに選んだTEO野のスポットに比べて、トレーサー注入部位であるTE野のスポットの視覚反応性とより高い相関を示した。また、TEO野の投射スポットヘムシモルを注入することにより、TE野の視覚反応性が大きく変わることを観察した。この大きな変動は、トレーサー注入部位ではないTE野の記録では起こらず、また、TEO野内の任意の部位へのムシモル注入では、起こらないことを確認した。TE野とそれに投射するTEO野のスポットは高い相関を示していたものの、TE野のスポットは、顔の構成パーツ(目、鼻、口)をシャッフルしたもの(シャッフル顔)よりも顔に対して有意に強く反応していた。しかし、この傾向は、この部位に投射するTEO野のスポットにはなかった。また、TE野と投射TEO野スポットは、顔と食べ物を見せた時には高い相関を示したが、シャッフル顔と食べものを見せた時には、相関が低下する傾向を見せた。

しかし、TE野のスポットは、顔の構成パーツ(目、鼻、口)をシャッフルしたもの(シャッフル顔)よりも顔に対して有意に強く反応していたが、この傾向は、この部位に投射するTEO野のスポットにはなかった。これらの結果と、報告されているTEO野の小さな受容野あわせて考えると、TEO野は顔の部分の情報をTE野に送っているという考えを支持すると思われた。事実、TEO野において、reduction processを用いてcritical featureを決めると、サルの髪のtextureや、目と思われるfeatureである例が観察された。また、TEO野の投射スポットに抑制性神経伝達物質GABAアゴニスト・ムシモルを注入することにより、TE野のトレーサー注入部位のスポットの視覚反応性が大きく変わることを観察した。この大きな変動は、注入部位ではないTE野の記録では起こらず、また、TEO野内の任意の部位へのムシモル注入では、起こらないことを確認した。上記の結果は、TEO野からTE野への投射が強い影響力を持っている事を示唆している。
動的ネットワークにおける適応的な故障耐性をもつ分散近似アルゴリズムの研究

本年度の成果としては,局所的相互排除問題を局所的(l,k)-相互排除問題として一般化し,局所的(1,|N_i|)-相互排除問題について自己安定アルゴリズムの設計を行いました.この結果については,国際会議での発表を行い,論文誌に投稿中です.局所的(l,k)-相互排除問題は,ネットワーク上で自身に直接接続している計算機のうち,少なくともl台,高々k台が危険区域を実行できるという問題で,スケジューリングや資源共有問題,負荷分散などへの応用が考えられます.例えば,故障耐性やスムーズなレスポンスを保証するために少なくともl台のサーバが隣に居ることを保証します.そのうえで,サーバの役割をする計算機が多いとそれだけネットワーク全体としてはコストがかかっていることにもなりますので,それを常にk台で抑えるということを保証するということになります.あるいは,少なくともl台はサーバとして動作させつつ,少なくとも(|N_i|+1-k)台は充電やシステムの更新などのメンテナンスのためにサービスを停止させておくなどの運用も考えられます.このように,この一般化問題は様々な応用が考えられます.また,局所的(1,|N_i|)-相互排除問題は2つの互いに素で動的な支配集合を構築する問題であるとみることができます.このことから,センサーネットワーク上のクラスタリングなどへの応用が考えられます.さらに本年度は,互いに素な2つの静的な支配集合を求める問題に対しても,安全収束性を持つ自己安定アルゴリズムの設計を行いました.本年度の成果としては,最小連結支配集合問題に対して,非同期システム上で安全収束性を持つ自己安定分散アルゴリズムを設計し,論文誌に投稿した.本アルゴリズムはユニットディスクグラフ上で近似比6を保証する.通常の自己安定分散アルゴリズムでは収束するまでに故障やトポロジーの変化が起こってしまうと,そこから新たに計算を始めることになる.つまり,頻繁に起こる変化には対応できる保証がないというのが現実である.そこで,故障が起こった後の任意の状況から,短時間で解の質を問わない安全な状況に遷移させ,そこからは安全性を崩さずに最適な解に収束させるという「安全な収束」を実装した.また,記憶媒体を持たないロボットシステムにおいて,各ロボットが観測できる範囲を限定したモデルにおける集合問題についてアルゴリズムの設計と不可解である場合の条件の洗い出しを行った.さらに,記憶媒体を持たないロボットによる点被覆問題を考え,アルゴリズムを設計し,国際会議で発表した.これらのロボットシステムにおいて,ロボット同士は自身のカメラで他のロボットの配置を確認し,移動を行い,通常のような通信は行わない.これは各計算機の機能を極限まで絞り込んだ時にどこまでの事ができるのかという興味に基づいている.一般に無線センサーネットワークのセンサーノードの機能は限られているので,このテーマも無関係ではないと考えている.本年度の成果としては,昨年度設計した最小連結支配集合問題に対する非同期システム上で安全収束性を持つ自己安定分散システムについて証明,分析を行い,論文誌に掲載されました.本アルゴリズムはユニットディスクグラフ上で近似比6を保証します.通常の自己安定分散アルゴリズムでは収束するまでに故障やトポロジーの変化が起こってしまうと,そこから新たに計算を始めることになりますが,安全収束性を持つアルゴリズムは,短時間で解の質を問わない安全な状況に遷移し,そこから安全性を崩さずに最適解に収束するというものです.また,k-制約を考えるために,(l,k)-相互排除問題についての考察を進めています.これは,相互排除問題を一般化したものであり,critical sectionに同時に入ることのできるプロセス数を上限からだけでなく下限も抑える問題です.これにより,少なくともl個の隣接プロセスが支配集合であり,かつ,その数は高々kであるという状況を目指します.さらに,記憶媒体を持たないロボットシステムにおいて,トーラス上を移動するモデルにおける集合問題についてアルゴリズムの設計を行いました.これは,各計算機の機能を極限まで絞り込んだ時に何処までの事ができるのかという興味に基づいています.センサーノードなど通信機器の機能が限られているような状況では,このような問題も無関係ではないと考えています.k-制約について考察していくと,様々な難しい点が考えられたため,(l,k)-相互排除問題に着目して,そこから解決策を模索することにしました.こちらの問題についても取り組みの途中である状況です.また,昨年度作成したアルゴリズムについては,新たな応用方法も検討しております.本年度の成果としては,局所的相互排除問題を局所的(l,k)-相互排除問題として一般化し,それに対する分散アルゴリズムを設計し,証明,分析を行いました.この結果については,国際会議での発表,及び論文誌への投稿を行い,採録されました.局所的相互排除問題はネットワーク上の自身または隣接する計算機のうち,高々1台のみが危険域を実行できるという問題で,スケジューリングや資源共有などに応用されます.今回の一般化は,各計算機に対し,自身と隣接する計算機集合のうち,少なくともl台,高々k台が危険領域の実行を行うというものです.これにより,少なくともl個の自身か隣接する計算機が支配集合となります.この一般化問題もスケジューリングや資源共有,負荷分散などの応用が考えられます.

例えば,自身と隣接する計算機のうち少なくともl台はサービスAのサーバの役割を,他はサービスBのサーバの役割をすれば,少なくとも|N|+1-k台のBのサーバに隣接することが保証されています(|N|は隣接する計算機の数).あるいは,故障耐性やスムーズなレスポンスを保証するために少なくともl台のサーバに隣接しておきたいけれども,その帯域やコストを考えるとその数を高々k台に抑えたいという要求もあるかもしれません.あるいは,少なくともl台はサーバとして動かしつつ,少なくとも|N|+1-k台は充電などのメンテナンスのためにサービスを停止させておきたいかもしれません.このように,この一般化は様々な応用が考えられます.提案したアルゴリズムは自己安定性は持っていませんが,非同期システムで動くことを保証しています.今後,このアルゴリズムをもとに,自己安定分散アルゴリズムの設計も検討中です.k-制約についての考察の一環として,局所的(l,k)-相互排除問題という問題についてアルゴリズムを設計し,その自己安定化も検討中です.本年度の成果としては,大域的相互排除問題を大域的(l,k)-相互排除問題として一般化し,それに対する非同期分散アルゴリズムを設計し,証明,分析を行いました.この結果については,国際会議での発表を行い,論文誌に投稿中です.大域的(l,k)-相互排除問題は,ネットワーク上の計算機のうち,少なくともl台,高々k台が危険区域を実行できるという問題で,スケジューリングや資源共有問題,負荷分散などへの応用が考えられます.例えば,故障耐性やスムーズなレスポンスを保証するために少なくともl台のサーバがネットワーク上に居ることを保証します.そのうえで,サーバの役割をする計算機が多いとそれだけネットワーク全体としてはコストがかかっていることにもなりますので,それを常にk台で抑えるということを保証するということになります.あるいは,少なくともl台はサーバとして動作させつつ,少なくとも(n+1-k)台は充電やシステムの更新などのメンテナンスのためにサービスを停止させておくなどの運用も考えられます.このように,この一般化問題は様々な応用が考えられます.昨年度は同問題の局所的な場合の問題を考えました.局所的(l,k)-相互排除問題と大域的(l,k)-相互排除問題はトポロジが完全グラフのネットワーク上では同じ問題と言えます.本年度に提案したアルゴリズムは自己安定性は持っていませんので,現在,このアルゴリズムをもとに,自己安定分散アルゴリズムの設計を行っております.k-制約についての考察の一環として,大域的(l,k)-相互排除問題という問題についてアルゴリズムを設計し,その自己安定化を検討中です.本年度の成果としては,局所的相互排除問題を局所的(l,k)-相互排除問題として一般化し,局所的(1,|N_i|)-相互排除問題について自己安定アルゴリズムの設計を行いました.この結果については,国際会議での発表を行い,論文誌に投稿中です.局所的(l,k)-相互排除問題は,ネットワーク上で自身に直接接続している計算機のうち,少なくともl台,高々k台が危険区域を実行できるという問題で,スケジューリングや資源共有問題,負荷分散などへの応用が考えられます.例えば,故障耐性やスムーズなレスポンスを保証するために少なくともl台のサーバが隣に居ることを保証します.
メディアと都市言語-16世紀ニュルンベルクのパンフレット・ビラに関する文体研究

コミュニケーション上の大革命をもたらしたとされる活版印刷がドイツ文章語の成立に及ぼした影響を探るため,16世紀におけるニュルンベルクの都市言語を文体論の観点から分析した。その際,活版印刷が一般市民の私的テキストの文体に与えた直接的な影響は確認できなかったが,「新聞」が存在しない時代に,時事的な情報を幅広い層の人々に伝える役割を果たしたパンフレットとビラの文体が,当時の人々の文体意識の形成に寄与した可能性が見出された。本研究の目的は,16世紀のニュルンベルクにおいてパンフレットやビラという形態で出版された様々な種類のテキストの文体を分析することにより,新メディアである活版印刷が当時のニュルンベルク市民の言語使用に影響を与えた可能性を探ることであり,具体的な解明点の一つとして掲げられているのが「特定の種類のテキストに典型的な文体はあるか」という点である。そこで,研究代表者の森澤は,まず時事報告(Neuigkeitsberichte)を対象として,このテキスト種における関係詞の分布を調査した。時事報告は新聞の先駆けと言われるもので,調査対象としたテキストは遠隔地の政治・社会情勢の他,天の超常現象等を伝えるものである。16世紀においては,殊に関係詞der, so, welcherが競合するが,先行研究ではいわば無標のderに対し,soは官庁体的,welcherは教養語的な文体手段とされている。調査の結果,当時の威信言語である官庁語及び一般市民の言語とは異なり,時事報告ではso及びwelcherの出現率がいずれもderより高いことが分かった。そこで,時事報告においてderよりも高尚な文体手段が多用される一因を,多売を目的とするパンフレットやビラにはセンセーショナルな内容が欠かせず,それとともにその内容の信憑性を強調する必要があったこととの関連で説明する試みをした。以上の内容の一部は,ハレ大学ドイツ語学文学研究所のコロキウムで,また,他の一部は日本独文学会(ブース発表)で発表した。殊に市民の間ではsoやwelcherの使用は16世紀の流れの中で徐々に広まっていくことから,時事報告に見られるこれらの関係詞の多用が市民の言語使用の変化に影響を及ぼした可能性については,他のテキスト種を顧慮しつつ,さらに詳細な調査と考察を行なう必要のあることが確認された。研究代表者の森澤は平成20年度に,時事報告(Neuigkeitsberichte)における関係詞の分布が当時の威信言語である官庁語及び一般市民の言語のそれとは異なるとの調査結果を得,その一因を時事報告というテキストが持つ内容上の特質との関連で探る試みをした。関係詞に着目したのは,der及び16世紀にこれと競合するso, welcherは,先行研究においてそれぞれ異なる文体上の機能を持つと見なされていることから,その分布の調査はテキスト種の文体的特質を知るための一手段となりうることによる。平成21年度にはこの関係詞の分布とテキストの内容上の特質との関連性に関する考察をさらに深め,それをまとめて『福岡大学人文論叢』41巻2号に発表した。また,時事報告は,より詳細に検討するならば,天の超常現象,犯罪,社会情勢等,様々なジャンルのテキストに分類することができるため,その中の一つで,16世紀の市民に多大な関心を持って読まれたとされるトルコ情勢を報じるパンフレットを取り上げ,そこに見られる文体の分析も試みた。その成果の一部は『ドイツ文学』140号に掲載された拙論に反映されている。夏季及び春季休暇中には旅費を用いてドイツ及びスイスに出向き,時事報告以外のパンフレットとビラ,例えば宗教的内容のテキスト等についても収集を行ない,そこに現れる関係詞の分布に関する調査を進めた。平成21年度に研究代表者の森澤は,16世紀後半の時事報告(Neuigkeitsberichte)に見られる関係詞の分布が当時の威信言語である官庁語及び一般市民の言語のそれとは異なるとの調査結果をまとめた。具体的に言うならば,時事報告の特異性は,古高ドイツ語時代から使用されてきた,無標の関係詞derよりも,これとは異なる文体上の機能を持つso及びwelcherがともに数多く例証される点にある。

ただし,両関係詞の使用頻度は初期新高ドイツ語時代に徐徐に増した点が先行研究において指摘されていることから,平成22年度には外国旅費によるドイツ出張で資料を補足し,このような特異性が16世紀前半の時事報告にも見られるかという点を調査した。その結果,16世紀後半とは異なり,最も多く例証されたのはderであり,so及びwelcherの使用頻度はまださして高くなかったことが明らかになった。この分布は16世紀前半の官庁テキストに見られるそれと概ね同様の傾向を示すものである。この点に目を向けるならば,時事報告は16世紀の流れの中で,derとは異なる文体的特徴を持つ二つの関係詞を積極的に受容することにより,このテキストに典型的な文体をかなり急進的に形成したと言うことも可能であろう。この他,都市の言語使用の変遷をより広い視野のもとで考察するため,芸術理論書等の実用散文も資料とし,そこに見られる関係詞の分布について分析を進めた。
スピンフラストレーションによる[4n]π共役系のスピン状態制御

[4n]π共役系は縮退したフロンティア軌道を持つため単純なHund則から考えれば本質的に三重項ジラジカルであるが、実際には基底一重項状態となり、非芳香族または反芳香族性を示すことが知られている。これまでに様々な[4n]π反芳香族化合物が合成されてきたが、その三重項状態は単寿命の励起状態もしくは遷移状態化学種としてのみ観測されてきた。本研究ではそのような[4n]π電子系に対して電子スピンによる摂動を加えることで、基底状態での三重項ジラジカル性を誘起する新しい分子設計指針を提唱・実証する。[4n]π電子系のスピン状態制御に基づいた新たな化学を開拓する。
火山フロント直下における群発微小地震活動の超精密震源決定

栃木県西部の日光・足尾地域では活発な群発地震活動が続いている。本研究において行った観測により1995年1年間に震源の決められた微小地震の総数は約10,000個であった。この中でも、特に地震活動の活発だった足尾町直下の地域についてさらに詳しい解析を行った。始めに、時間的空間的に近接して発生する地震をクラスター分析により個々のクラスターに分類した。これにより数多くのクラスターが同定された。クラスターの活動期間は平均1時間1日であり、また、クラスターとクラスターの発生間隔は平均15日であった。これらの統計的数値は、この地域の群発地震活動の原因を考えるとき重要な制約条件となる。個々のクラスターについて、クロススペクトル法による高精度震源決定を試みた。その結果、1つクラスターに属する地震は、ほとんどが厚さ数10m、長さ100500mの板状の領域内に発生していることが明らかになった。このことは、クラスターの活動は1連の面的な破壊に対応していることを示唆している。また、クラスターの活動域は徐々に移動しており、いったん破壊した場所では新たな破壊が生じないことを示している。今年度の研究により、日光・足尾地域の群発地震活動の上述の様な特徴が明らかになった。また、クロススペクトル法の有効性を確認することができた。しかし、地震数の多さおよび大量のデジタルデータを用いなければならない解析手法のため、今年度中に最終的な結果をまとめるまでには至っていない。今後、クラスター内部の破壊の伝播様式、クラスター同士の活動の関連等を考慮にいれて解析および考察を行うことにより、当初の目的を達成できるものと考えられる。
後周期遷移金属メタラシクロブテンの新規調製法と反応性の研究:不斉触媒への展開

分子触媒の核となる遷移金属元素を含むメタラサイクル骨格に注目し、従来多くの高分子合成や精密合成の触媒の中間体であるとされてきた不安定な化合物を簡単な有機分子から構築し安定に取り出し、構造解析と安定性ならびに反応性を解明し、最終的には不斉合成に展開し,生成する有機物質の付加価値を高め利用性のある物質へと変換する方法として確立させることを目標として以下の研究を実施した。1)遷移金属メタラサイクルの一種であるメタラシクロブテン骨格は、メタセシス重合などの活性種として安定性や構造に関心がもたれているものである。従来アセチレンと配位カルベンから生成されてきたこのメタラシクロブテンをルテニウム錯体とビニルジアゾ化合物から合成する経路を検討したところ、目的と異なり新規なη^3-ハロアリル錯体がほぼ定量的に生成することを発見した。このハロアリル錯体からのカルベン生成反応も発見した。投稿中。2)上記に加え、窒素系配位子PYBOXを有するロジウムおよびイリジウム錯体とアセチレンおよびジイン誘導体から、酸化的付加により新規なメタラシクロペンタジエン錯体の単離に成功した。錯形成は室温にて進行する。アセチレン類の環化三量化反応の触媒作用も高温にて持ち合わせていることを確認した。さらに、非対称な置換基を有するジインを用いるとアピカル位にエステルが位置するという立体選択性があることを発見した。投稿中。
肺炎球菌ワクチン(PCV-7)の導入により、新たな流行クローンは出現す

2010年に日本において発売開始となった肺炎球菌ワクチン(PCV-7)の普及とともに、IPD症例数が激減し、そのワクチン効果がすでに現れつつあることが明らかとなった。ワクチン非対応血清型のわずかな増加傾向があるものの、海外で観察されたような代償的な流行株は、国内では今のところ見られていない。しかし、ペニシリンやマクロライド等に対する耐性率は依然として高く、今後も注意を要すると考えられた。20072010年に小児99例(髄膜炎2例、肺炎1例、潜在性菌血症他96例)・成人4例(死亡2例、髄膜炎1例、潜在性菌血症1例)の血液・髄液等無菌部位より分離された肺炎球菌103株を対象とした。薬剤感受性試験は微量液体希釈法を用い、PCGのMIC値(ug/mL)により、PSSP≦0.06、0.06<PISP<2、2≦PRSPと分類し、他の薬剤についてはCLSIの基準に基づいて判定した。血清型は、肺炎球菌型別用血清を用いて決定した。薬剤耐性遺伝子については、ペニシリン結合タンパク2x、2b、1a遺伝子配列の解析およびリアルタイムPCRによるerm(B)、mef(E)/(A)、tet(M)の検出を行った。MLSTは、http://spneumoniae.mlst.netに記載されている方法に基づいて実施した。20072012年3月に小児112例(髄膜炎2例、肺炎1例、潜在性菌血症他109例)・成人4例(死亡2例、髄膜炎1例、潜在性菌血症1例)の血液・髄液等無菌部位より分離された肺炎球菌116株を対象とした。20082010年の年平均の症例数は32.7例であったが、2011年は12例と大きく減少した。また、2010年までのPCV-7のカバー率は76.7%であったのに対し、2011年は30.8%と顕著な低下が見られた。一方でワクチンに含まれない血清型株による症例数には特に大きな変化は見られなかった。これは、PCV-7が2010年に国内で販売開始され、2011年頃から公費助成の広がりとともに普及が進んできたことから、その効果が現れてきたものと推測された。また、特定の血清型や遺伝子型株の増加は見られず、これまでのところ新たな流行株の兆候は感知されていない。前年度に引き続き、研究協力医療機関9ヶ所で血液より培養された肺炎球菌について解析を行った。薬剤感受性試験は微量液体希釈法を用い、PCGのMIC値(μg/mL)により、PSSP≦0.06、0.06<PISP<2、2≦PRSPと分類し、他の薬剤についてはCLSIの基準に基づいて判定した。20082010年の年平均の症例数は32.7例であったが、著明な減少が見られた2011年と同様、2012年も12例となった。また肺炎球菌ワクチン(PCV-7)のカバー率は、2010年までは76.7%であったが、2011年は30.8%、2012年は0%とさらに低下した。これは、PCV-7が2010年の販売から現在にかけて広く普及が進み、ワクチンによる予防効果が現れてきていることを示唆しており、これまでのところ侵襲性肺炎球菌感染症(IPD)全体で見た場合の減少率は約60%程度と見込まれた。また、薬剤耐性の程度およびその関連遺伝子の保有状況については特に変化は見られなかった。今後、海外で見られるように19A型の流行など、特定の血清型や遺伝子型株の増加の恐れもあるが、これまでのところ新たな流行株の兆候は感知されていない。近く、PCV-7より多くの血清型に対応したワクチンが販売されると言われており、早期の導入が期待される。

これまでのところ検体の収集やその解析に大きな問題はなかったが、2011年以降症例数そのものが大きく減少しており、データをまとめていく上で難しい状況である。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに引き続き検体収集と菌株解析を継続して実施する。症例数の減少については対処することが困難であり、研究期間を予定よりも延ばすことも検討する。また、健常者の保菌状況を調べてワクチンの影響等を見ることで、本研究のデータと比較できないか検討しており、今後共同研究者との調整をすすめる予定である。
脂質ラフト局在膜タンパク質の三次元構造とその膜小胞形成機構の解明

生体膜中の小胞形成に関与するタンパク質、ストマチンやフロチリンは脂質ラフトという脂質中の集合領域に存在しているが、どのように機能しているかは明らかになっていない。そこでヒトのストマチンやフロチリンの立体構造を決定することで機能の解明を目指した。大腸菌を用いることでこれらタンパク質を大量に得ることに成功した。続いてタンパク質の結晶を得ることができれば立体構造の決定が可能になる。本研究では、脂質ラフトに局在する膜タンパク質ストマチンまたはフロチリンによる膜小胞形成機構を解明するため、それらのコアドメインの三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにすることをめざした。はじめにヒトのストマチンとフロチリンを大腸菌で大量発現させるため、Hela細胞からRNAを抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりcDNAを得た。得られたcDNAを鋳型としてヒトのストマチンとフロチリンの遺伝子断片をPCRにより増幅してpET21b(+)プラスミドに挿入し、全長プラスミドを得た。さらに膜貫通部位などを除いたコアドメインについても同様にPCRを行いプラスミドを得た。作製したプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)CodonPlusRIL株を形質転換し、組換え大腸菌からの目的タンパク質の発現を誘導後、タンパク質精製装置AKTAprime plusを用いて、His Bindクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製を試みた。ストマチンとフロチリンのコアドメインについて、目的タンパク質の発現が確認できたが、大腸菌を超音波破砕するとほとんどが遠心沈殿画分となった。そこで1-2 M urea処理した後透析によりurea濃度を段階的に下げることで精製を行った。得られた精製サンプルを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化条件の探索を行っている。引き続き結晶化条件の探索を行うとともに、さらに異なるドメインを調製し結晶化に取り組む予定である。昨年度調製したヒトのストマチンとフロチリンの全長プラスミド、およびそれらの膜貫通部位などを除いたコアドメインのプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)CodonPlusRIL株を形質転換し、組換え大腸菌からの目的タンパク質の発現を誘導後、His Bindクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行った。昨年度、ストマチンとフロチリンのコアドメインについては目的タンパク質の発現が確認されたものの、大腸菌を超音波破砕後にほとんどが遠心沈殿画分となったため可溶性画分を大量に得ることができなかった。本年度は、1-2 M urea処理した後透析によりurea濃度を段階的に下げることで精製を行うことができたためそのサンプルを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化条件の探索を行ったが結晶は得られなかった。そこで大腸菌の培養条件(温度、誘導試薬の濃度)を種々検討、さらに異なるコアドメインを設計して発現15度の低温で誘導可能なプラスミドを用いた発現、などを試みたもののいずれの場合も可溶性画分を大量に得ることはできなかった。そこで新たに目的タンパク質の可溶性を高めるため融合タンパク質による発現系の調製を試み、ストマチンとフロチリンのアミノ末側にマルトース結合タンパク質を付加させたプラスミドを作製しその大腸菌でのタンパク質発現を試みている。これにより可溶性画分を安定して得ることができれば、結晶化条件の探索を行い、構造解析に取り組むことが可能になると考えられる。