hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゆらぎの確率過程を用いたマイクロ流体デバイス内の現象予測と信頼性評価技術の開発

本研究ではマイクロ流体工学における技術設計における性能予測および技術の信頼性評価の新たな指針を示すことを目的として,決定論と確率過程を用いた新たな評価技術の開発およびマイクロ流体デバイスを用いた評価を行った.評価対象とするマイクロ流体デバイスは細胞と粒子を高速(1,000個/s以上)に分取(Sorting)するものであり,細胞と粒子の位置決めと同期の精度が技術の性能を定める重要な要素である.装置としてレール型,梯子型,フリップ型電極を付設した流路により誘電泳動力を用いて細胞・粒子の整列,タイミング制御,分取を高速・高精度に行える申請者が新たなに開発した技術を用いた.この流路と電極領域を流れる粒子の位置とタイミング,速度を高速度カメラにより撮影した動画を画像解析により求め,その精度を確率密度分布により評価した.次に,より高い性能を示す機器を設計するために,これらの指標の値とそのばらつきが流路下流に向かって発展する様子を,本課題で提案する手法により見積もった.さらに数値解析により誘電泳動力と粒子運動を計算し,電極形状による影響を求めた.この計算に本手法による“ゆらぎ"の効果を合わせることで電極領域出口における粒子位置とタイミング制御の精度とばらつきを予測した.これらの計算と実験の結果を比較してモデルの妥当性を検証すると共に,各指標の精度を向上させる適切な電極形状,流路寸法,流量を導出した.これらの知見をもとに新たにBoxcar型電極を設計し,それを導入したマイクロ流体デバイスを製作して性能の検証実験を行った.その結果,粒子の位置とタイミング制御が5%という高精度で行えることを確認した.これは梯子型電極と比較して50100%の性能向上を達成したことになる.この成果はAnalytical Chemistryにて論文掲載され,さらに2つの国際会議と2つの国内会議にて発表を行った.本研究は,現象や性能で見られる“ゆらぎ"の確率過程を確率微分方程式で解くことにより求まる時間予測と高度信頼性評価の手法を開発し,これをマイクロ流体デバイス(Microfluidics)を用いた高速細胞分取装置に適用することで,細胞運動予測と分取機能の信頼性評価を行うことを目的とする.平成29年度は高速細胞分取用マイクロ流体デバイスの製作と信頼性評価を行うためのマイクロ粒子と細胞の位置,速度,間隔,同期の制御および分取特性の計測とデータ整理を行った.粒子と細胞の位置決めと運動は梯子型電極により誘電泳動力を形成し,空間と時間で周期的に粒子と細胞に力を付加する申請者等の開発技術を用いて制御を行った.粒子の位置,速度,同期の情報は梯子型電極入口(上流)と出口(下流)にて収集し,制御目標値に対するばらつきの分布を求めた.これらに上記の確率微分方程式を解いたモデルおよび簡易モデルとしてPolynomial Chaos Expansion法を適用して諸特性の正確な分布を模擬するだけでなく,上流の初期値(入力)から下流の分布(出力)を高度に予測できる手法の開発への応用展開を図った.確率微分方程式やPCE法では,モデルの一部に物理現象を定式化して導入する必要がある.すなわち梯子型電極によって粒子と細胞の位置,速度,間隔,同期が制御できる原理を数学的に証明する必要がある.本年度では,この制御機構に関して摂動論を用いて説明することが出来た.この数理モデルから予測した粒子運動特性と実験で計測したものを比較すると両者は良好な一致を示した.この決定論的運動特性を運動予測と信頼性評価のモデルに導入する予定である.これらの成果は3件の学会にて発表を行い,平成30年度の国際会議での発表と学術論文に投稿する予定である.研究計画で示した本年度の予定の1つである確率過程の解析を導入した高度運動予測・信頼性評価モデルの開発については“ゆらぎ"の確率微分方程式とPolynomial Chaos Expansion法を用いた基礎構造とプログラミングは完了し,具体的に決定論に基づく支配方程式に適用できる状態である.さらに研究分担者も計画の1つである固体表面の欠陥形成過程とプロファイルの確率統計解析と信頼性評価について,単結晶シリコン基板中の欠陥面密度を光変調反射率分光法の適用により算出し,平行して反転層電気容量解析手法によりガス種に依存した欠陥密度プロファイルを同定し,統計的効果の解明に必要なデータ取得を行った.これに欠陥構造の電子状態を第一原理計算に上記の確率解析手法を適用した欠陥生成過程予測プログラムを適用して欠陥プロファイルの予測精度を検証している.研究実績の概要で述べたとおりマイクロ流路の実験もデータを取得するところまで進んでいる.一方,研究計画に示した確率過程のモデル定数のための3次元数値シミュレーションは十分なデータが収集できていない.このため粒子のように“ゆらぎ"をもたらす要因が少ない場合は実験データへのモデルの適用が可能であるが,細胞を対象とした場合には決定論および確率微分方程式に適用すべきパラメータが揃っていない.さらにマイクロデバイスでも位置,速度,同期に関するデータは粒子以外では限られた種類の細胞のみであるため,モデルを実証するためには情報を増やす必要がある.このため現在の進捗状況は「おおむね順調に進展している」である.本研究ではマイクロ流体工学における技術設計における性能予測および技術の信頼性評価の新たな指針を示すことを目的として,決定論と確率過程を用いた新たな評価技術の開発およびマイクロ流体デバイスを用いた評価を行った.評価対象とするマイクロ流体デバイスは細胞と粒子を高速(1,000個/s以上)に分取(Sorting)するものであり,細胞と粒子の位置決めと同期の精度が技術の性能を定める重要な要素である.

装置としてレール型,梯子型,フリップ型電極を付設した流路により誘電泳動力を用いて細胞・粒子の整列,タイミング制御,分取を高速・高精度に行える申請者が新たなに開発した技術を用いた.この流路と電極領域を流れる粒子の位置とタイミング,速度を高速度カメラにより撮影した動画を画像解析により求め,その精度を確率密度分布により評価した.次に,より高い性能を示す機器を設計するために,これらの指標の値とそのばらつきが流路下流に向かって発展する様子を,本課題で提案する手法により見積もった.さらに数値解析により誘電泳動力と粒子運動を計算し,電極形状による影響を求めた.この計算に本手法による“ゆらぎ"の効果を合わせることで電極領域出口における粒子位置とタイミング制御の精度とばらつきを予測した.これらの計算と実験の結果を比較してモデルの妥当性を検証すると共に,各指標の精度を向上させる適切な電極形状,流路寸法,流量を導出した.これらの知見をもとに新たにBoxcar型電極を設計し,それを導入したマイクロ流体デバイスを製作して性能の検証実験を行った.その結果,粒子の位置とタイミング制御が5%という高精度で行えることを確認した.これは梯子型電極と比較して50100%の性能向上を達成したことになる.この成果はAnalytical Chemistryにて論文掲載され,さらに2つの国際会議と2つの国内会議にて発表を行った.マイクロデバイスにおける粒子と細胞の運動制御に関しては機器の性能と信頼性を表す粒子と細胞の位置,速度,同期のデータを収集し,その分布に対して確率微分方程式とPCE法を用いたモデルの適用を開始している.平成30年度では,各モデルにおける決定論として支配方程式とモデル定数を定め信頼性評価に関する精度と特性を検討する.つぎにマイクロデバイスでの試料流入部(入力)と出口(出力)間での決定論と確率論に係る要素を抽出し,これらをモデルに適用することで入口の状態に基づく出口での粒子と細胞の特性(出力)の予測を図る.この場合,例えば梯子型電極の各要素に意図的に不具合を生じさせて測定を行うことで事象を強調し,モデルの妥当性と各種要素の影響の検証を行う予定である.一方,進捗状況で述べたとおり,細胞の形状と力学特性に基づく流体内の運動に関する決定論と確率論に基づく“ゆらぎ"を求めるために3次元数値解析を行う必要がある.既に数値解析プログラムは完成させているが,モデル定数を導出するための計算データ数が不足しているため,各種条件について計算を行う.研究実績の概要と進捗状況の理由で述べたとおり,実験と数理モデルは順調にデータ収集とモデル開発は共同研究者と共に進めているが,3次元数値解析では細胞の力学モデルの構築と計算の実行が予定よりも遅れている.このため研究計画に示した設備備品である高性能計算ワークステーションの選定と購入が遅れている.計算および計算機の購入は平成30年度の前半に行う予定である.
超高分子量バイオポリマーを用いた高強度かつ高ゴム弾性を有する生体吸収性繊維の開発

微生物が糖や植物油から体内に蓄積する微生物産生ポリエステルは、環境分解性および生体吸収性を有することから、海洋マイクロプラスチック問題の解決や手術用縫合糸をはじめとする医療材料への応用展開が期待されている。本研究では、微生物産生ポリエステルの高性能部材化を目指し、ゴムのように伸縮性を持ち、かつ、引張強度にも優れた高伸縮性・高強度フィルムおよび繊維を開発することを目的としている。本年度、ソルベントキャストフィルムを所定の倍率に延伸することにより、高伸縮性が発現することを見出した。さらに、熱処理を行うと、高伸縮性を保持しながら、高強度になることも分かった。この高伸縮性・高強度フィルムの発現機構の解明を目的に、大型放射光(SPring-8)の広角X線回折および小角X線散乱を用いて、延伸しながら、かつ引張強度を同時測定しながらのX線回折実験を行った。その結果、延伸前では通常の結晶構造を示唆する回折ピークしか現れなかったが、延伸を施すと新たな回折ピークが出現することが分かった。現在、この回折ピークがどのような構造に起因するかを解析中である。一方、小角X線散乱では、結晶配向と長周期に由来する回折が観察されるときと、されないときに分かれた。この原因についても現在解析中である。また現在、微生物産生ポリエステルから様々な条件(溶融温度、ダイの径、押出速度、巻き取り速度など)を精査し、溶融紡糸繊維の作製を試みている。これまで微生物産生ポリエステルは結晶性が高く、ガラス転移点が室温以下であることから硬くてもろいことから、伸縮性を持つ材料の開発は不可能と考えられてきた。しかし今回、伸縮性のある材料の開発に成功したため。まずは、今年度の成果を踏まえ、高伸縮・高強度材料を再現性良く作製する方法の開発を精査する。さらに、大型放射光を用いての構造解析を行い、高性能の発現機構の解明を行う。また、高伸縮性・高強度繊維の作製条件の検討を行う。播磨大型放射光施設(SPring-8)で3回の実験を予定していたが、ビームラインの都合で2回しか実験ができなかったため、若干の予算が余った。これについては次年度のSPring-8での実験で使う予定である。
がん細胞イメージングを目指した共有結合型蛍光プローブの開発

がん細胞特異的な蛋白質に結合する低分子化合物(リガンド)に蛍光団を導入した蛍光プローブは、がん細胞に対して選択的に結合することでその可視化を可能にする。しかしながら本手法ではリガンドと標的蛋白質との結合が維持される必要があるため、がん組織の固定化処理を行うと蛋白質の変性と共にその結合が損なわれ、組織標本の作製は困難であることが問題であった。そこで、我々はプローブと標的蛋白質との間に共有結合を形成できるように設計することで、固定処理でも蛍光が損なわれることなく、組織標本中でも高感度にがん細胞の分布を調べることができる蛍光ラベリングプローブの開発を目指す。
血小板・血管内皮機能から見たVAD装着後の後天性VW病の病態解明に関する研究

近年,植込み型補助人工心臓(Ventricular assist device, VAD)は,連続流血液ポンプの使用が主流となり重症心不全患者の治療に大きく貢献している.しかし一方では,VADの安定的な長期治療が可能になることにより,新しいデバイス由来の出血性合併症が注目されるようになっている.この遠隔期における易出血性の患者には,血液学的にvon Willebrand factor(VWF)の活性低下およびVWF高分子量マルチマーの減少が高頻度に認められ,後天性von Willebrand(VW)病を発症していることが明らかにされている.これらデバイス由来の後天性VW病は,使用する機器により発生頻度が異なり,さらに本邦のVAD装着患者では海外報告と同様の割合で後天性VW病が認められたものの,出血性合併症の発症がきわめて少ないことが報告され,本病態の全容は一筋縄ではいかない.我々のグループの基礎的な研究からは,連続流血液ポンプによるVWF高分子量マルチマー動態が血小板の存在の有無により異なることを見いだしている.本結果は従来に議論されてきたデバイスによる後天性VW病が,単に血液ポンプのShear stressという物理的な要因のみに起因するのでは無く,生体側の要因,特にVWF供給に係わる血管内皮機能や血小板の活性化の影響も関与している可能性を示唆している.従って,本現象の解明には,過去に議論されてきた血液ポンプ内のShear stressに起因するVWFの切断以外にも,同時に発生する血小板の活性化やVWFの再供給についても注目する必要がある.さらにVWFの重要な供給器官である血管内皮細胞の機能についても今後検討を加えていく必要があると考えられる.液ポンプによるVWF高分子量マルチマーの切断現象を解析するために,現在,国内で市販されている植込み型VAD4機種(HeartMate2,DuraHeart(販売中止),EvaHeart,Jarvik2000)を用いて,還流試験を実施した.Duraheartはメーカーが販売供給の中止を決定したため,今後,本機の入手は困難となる可能性があるが,本試験では中止前に試験を実施していたため,本研究は可能であった.また,Jarvik2000については,契約手続きの遅延などから入手が遅れたが,年度末より実験を実施することが可能となり,平成30年度にかけて本計画を遂行している.このことによる研究計画への影響は小さいと考えられる.本試験により,連続流血液ポンプ内で発生するShear stressによるVWF高分子量マルチマーの切断について,血液ポンプ毎の固有値および血小板活性による再供給量の特性が解析可能であった.当該試験で行われるウシ血を用いたVWF高分子量マルチマー解析については,実験条件がヒトとは異なり,国内では,ほぼ当センター研究所の分子病態部でしか実施できないものであった測定する項目は,VWF抗原量,およびVWF活性(検査会社に外注),VWF高分子量マルチマー解析,ADAMTS-13活性量(国立循環器病研究センター研究所分子病態部で実施),血小板数を含む血球数(国立循環器病研究センター研究所人工臓器部で実施)を計測する.更にはトロンボエラストメトリー法を用いた血液凝固能(ROTEM)および電気的インピーダンス法を用いた血小板凝集能(Multiplate)を測定し(国立循環器病研究センター研究所人工臓器部で実施),VAD装着後の後天性VW病が血液凝固・血小板凝集状態へ与える影響について検討を実施する.体内植え込み型補助人工心臓を装着した患者においては,術直後や術後遠隔期の出血合併症の発生が問題となっている.かかる合併症には,近年高分子量von Willebrand factor multimerの減少による後天性von Willerand病の関連が報告され,これら病態のくわしい解析が望まれている.そこで我々は,補助人工心臓が血液中のvon Willebrand factorに与える影響およびその病態機序について検討を実施した.本研究では,動圧浮上軸流型ポンプおよび軸シール型遠心ポンプの2種類の植え込み型補助人工心臓を対象とし,新鮮ウシ血液を用いたin vitro試験により,血液還流後のvon Willebrand factor multimerの変化について検討を実施した.SDS-Agaroseゲル電気泳動による解析では,軸流ポンプでは血液還流開始(2 L/min, 100mmHg)直後より経時的な高分子量multimerの減少が認められ,一時間後にプラトーとなっていた.この結果は,後天性von Willebrand病が術後遠隔期の合併症であるという従来の見解と異なり,術直後の出血合併症にも関与している可能性を示唆いていた.一方で,遠心ポンプを使用した検討では,血液還流後(5 L/min, 100 mmHg)の高分子量multimerの減少は,軸流ポンプに比較し非常に軽度であり,ポンプ形式により血液中von Willebrand factorへの影響が異なることも示された.また,von Willebrand factorの特異的切断酵素であるADAMTS13の働きを阻害した同様の実験では,軸流ポンプにおいても高分子量multimerの減少は認められず,本病態にはADAMTS13の働きが強く関与している可能性が示唆された.血液ポンプによるVWF高分子量マルチマーの切断現象を解析するために,現在,国内で市販されている植込み型VAD4機種(HeartMate2,DuraHeart(販売中止),EvaHeart,Jarvik2000)を用いて,還流試験を実施した.Duraheartはメーカーが販売供給の中止を決定したため,今後,本機の入手は困難となる可能性があるが,本試験では中止前に試験を実施していたため,本研究は可能であった.

また,Jarvik2000については,契約手続きの遅延などから入手が遅れたが,年度末より実験を実施することが可能となり,平成30年度にかけて本計画を遂行している.このことによる研究計画への影響は小さいと考えられる.本試験により,連続流血液ポンプ内で発生するShear stressによるVWF高分子量マルチマーの切断について,血液ポンプ毎の固有値および血小板活性による再供給量の特性が解析可能であった.当該試験で行われるウシ血を用いたVWF高分子量マルチマー解析については,実験条件がヒトとは異なり,国内では,ほぼ当センター研究所の分子病態部でしか実施できないものであった近年,植込み型補助人工心臓(Ventricular assist device, VAD)は,連続流血液ポンプの使用が主流となり重症心不全患者の治療に大きく貢献している.しかし一方では,VADの安定的な長期治療が可能になることにより,新しいデバイス由来の出血性合併症が注目されるようになっている.この遠隔期における易出血性の患者には,血液学的にvon Willebrand factor(VWF)の活性低下およびVWF高分子量マルチマーの減少が高頻度に認められ,後天性von Willebrand(VW)病を発症していることが明らかにされている.これらデバイス由来の後天性VW病は,使用する機器により発生頻度が異なり,さらに本邦のVAD装着患者では海外報告と同様の割合で後天性VW病が認められたものの,出血性合併症の発症がきわめて少ないことが報告され,本病態の全容は一筋縄ではいかない.我々のグループの基礎的な研究からは,連続流血液ポンプによるVWF高分子量マルチマー動態が血小板の存在の有無により異なることを見いだしている.本結果は従来に議論されてきたデバイスによる後天性VW病が,単に血液ポンプのShear stressという物理的な要因のみに起因するのでは無く,生体側の要因,特にVWF供給に係わる血管内皮機能や血小板の活性化の影響も関与している可能性を示唆している.従って,本現象の解明には,過去に議論されてきた血液ポンプ内のShear stressに起因するVWFの切断以外にも,同時に発生する血小板の活性化やVWFの再供給についても注目する必要がある.さらにVWFの重要な供給器官である血管内皮細胞の機能についても今後検討を加えていく必要があると考えられる.液ポンプによるVWF高分子量マルチマーの切断現象を解析するために,現在,国内で市販されている植込み型VAD4機種(HeartMate2,DuraHeart(販売中止),EvaHeart,Jarvik2000)を用いて,還流試験を実施した.Duraheartはメーカーが販売供給の中止を決定したため,今後,本機の入手は困難となる可能性があるが,本試験では中止前に試験を実施していたため,本研究は可能であった.また,Jarvik2000については,契約手続きの遅延などから入手が遅れたが,年度末より実験を実施することが可能となり,平成30年度にかけて本計画を遂行している.
膵腫瘍の癌化および浸潤様式:分子標的治療へのアプローチをめざして

IPMN由来癌はintestinal type IPMNからのものが多く,その多くは粘液癌であった. Gastrictypeからのものの一部はpancreatobiliary typeを経由していると推測された.膵癌症例の腫瘍辺縁部における浸潤様式は,小葉内,小葉間,混合型浸潤パターンに分けられ,免疫組織化学で一見すると腺房細胞やランゲルハンス島への分化を思わせる場合でも,ほとんどの症例は既存の腺房細胞やランゲルハンス島の細胞に癌細胞が浸潤し,それらの組織を巻き込み,置換しつつある像と考えられた.IPMN由来癌はintestinal type IPMNからのものが多く,その多くは粘液癌であった. Gastrictypeからのものの一部はpancreatobiliary typeを経由していると推測された.膵癌症例の腫瘍辺縁部における浸潤様式は,小葉内,小葉間,混合型浸潤パターンに分けられ,免疫組織化学で一見すると腺房細胞やランゲルハンス島への分化を思わせる場合でも,ほとんどの症例は既存の腺房細胞やランゲルハンス島の細胞に癌細胞が浸潤し,それらの組織を巻き込み,置換しつつある像と考えられた.PanIN病変病変ではPanIN-1,2に相当するいわゆるlow-grade PanINがgastric type IPMNの周囲に存在している症例が多く,intestinal type IPMNではその傾向が少なかった.さらに粘液形質に関してはlow-grade PanINとgastric type IPMNではNMUC1(-), MUC2(-), MUC5AC(+), MUC6(+/-)で,両者はほぼ同じと考えられた.なお,MUCに関しては症例により若干のばらつきがみられた.細胞増殖に関しても有意な差は認められなかった.血管新生に関しては評価が困難で,一定の傾向は得られなかった.また,今回の検討中にITPN (intraductal tubulopapillary neoplasm)と判断できる病変を認めた.一方,IPMN由来癌に関しては,報告例をみるとその定義が一定しておらず,典型例はintestinal type IPMNからのmucinous carcinomaといえるが,問題となるあるいは鑑別すべき症例として以下の傾向が認められた.1) pancreaticadenocarcinomaでductがcystic changeを示したもの,2) pancreaticadenocarcinomaで,その周囲に拡張したPanIN病変が存在するもの,3) pancreaticadenocarcinomaとその周囲に[隣接するのではなく]IPMNが存在する場合などが,代表的なもので,明らかなIPMNから連続してadenocarciomaが認められる症例に限定する必要があると考えられた.またIPMN由来癌はintestinal typeからのものが圧倒的に多く,その多くは粘液癌であった.Gastric typeからも浸潤癌は発生するが,その一部はpancreatobiliary typeを経由していると考えられた.膵癌の発生母地は小葉間膵管ないしは小葉内膵管と考えられており,腫瘍がある一定の大きさを超えた時点で間質への浸潤が始まると考えられている.今回膵癌(腺癌)症例について,癌の辺縁部でどのように正常膵へ浸潤していくのかを検討した.HE染色標本では,腫瘍辺縁部における浸潤様式は大きく,小葉内浸潤パターン,小葉間浸潤パターン,混合型浸潤パターンに分けられた.高分化型では混合型が多く,中分化型では半数が小葉内主体の浸潤様式を示し,低分化型はいずれも混合型を示した.さらに,CKI9, trypsin, chromogranin Aの免疫三重染色,またリンパ管侵襲に関してはD2-40の免疫染色を行い,正常膵の膵管,腺房細胞,ランゲルハンス島にどのように浸潤していくのか観察を行った.一見すると膵管癌の腺房細胞やランゲルハンス島細胞への分化を示すような像がみられたが,HE染色の所見と詳細に対比してみると,実際には既存の腺房細胞やランゲルハンス島の細胞に癌細胞が浸潤し,それらの組織を巻き込み,置換しつつある像であることが確認された.また,癌の発育様式に関しては,腺癌細胞が高分化型であれ,低分化型であれ,いずれも膨張性発育というよりは浸潤性に増殖する傾向が強いと考えられた.症例によっては癌が浸潤していっても.既存の膵管,腺房,あるいはランゲルハンス島がある程度残存する症例や,ほぼ全置換性に浸潤する症例があり,どの成分が残存するかは症例によって開きがみられた.正常膵組織の残存率をみる限りでは,ランゲルハンス島の残存率が最も高く,腺房および膵管に関しては症例により異なる傾向がみられた.前年度,膵癌が正常膵組織に浸潤していった場合,ランゲルハンス島(以下,ラ氏島)の残存率が最も高かったことから,特にラ氏島に着目して検討を行った.CK19,trypsin,chromogranin Aの免疫三重染色による検討では,desmoplasticな間質でのラ氏島以外に,腺癌部の異型腺管にentrapされる形で孤在性,連続性,もしくは集籏性にラ氏島が認められた.

このentrapされたラ氏島は主として癌細胞の基底側に位置していた.また,詳細に観察するとこれらのラ氏島細胞には異型性はみられず,HE染色でも認識可能であった.逆にラ氏島内に癌の腺管がentrapされていると思われる症例も存在した.検索した範囲では膵癌細胞自体がendocrine differentiationを示したと考えられる症例は認められなかった.免疫組織化学的に,一見endocrine differntiationを示すような症例であっても,膵癌症例においてはまずラ氏島のentrapmentと考えるべきであると思われた.次に扁平上皮への分化について検討したが,当院症例では腺扁平上皮癌の頻度が高く,全体の12%(文献的には3.4%)にみられた.これらの症例では少なくとも30%以上が扁平上皮癌成分であり,定義上問題のない症例であった.また,免疫組織化学的にp63,CD44,CK5/6が扁平上皮への分化を示す部分で陽性であった.なお,CD5/6に関しては腺癌成分でも陽性を示すものの,その染色性は扁平上皮癌部に比べ弱い傾向がみられた.上皮・間葉系変移に関しては明瞭な結果は得られなかった.今後は浸潤様式を分析する上で,3次元的な解析が必要となると思われる.
Thrombospondin1はTGFβ-1を誘導し腫瘍増殖を抑制する

個体レベルの癌の進展には、血管新生は必要不可欠な存在であり血管新生促進因子、抑制因子が多数同定されているが、その抑制因子の中の一つ、Thrombospondin1(TSP1)に着目し、in vivo実験系においてのTSP1の多機能性を検討中である。血管新生の抑制、さらに腫瘍増殖抑制効果を検討するには腫瘤を作成しなければならなく、Fisher Ratを用い脾注肝転移(癌形成)モデルを作成した。Control群として雄性Fisher Rat(体重200250g)を使用し、開腹してRat結腸癌高肝転移株(RCN-H-4 cell line)を用い、4×10^6個脾注し肝転移モデルを作成し肝転移腫瘤を形成させ、1, 2, 3週間後、腫瘤を摘出し、サイズ、個数を確認、また血清も保存した。脾注後1週間後では、直径1mm以下の腫瘤が多数形成されており、脾注後2週間後では、直径12mmの腫瘤が多数形成されており、また脾注後3週間後では、直径23mmの腫瘤が多数形成されていた。各サイズの腫瘤をそれぞれホルマリン固定し、免疫組織化学染色を用い、各サイズ標本の血管数を第VIII因子関連抗体にて腫瘍血管密度を評価抗TSP1抗体を用い発現分布を評価したところ、TSP1は腫瘍内間質にその発現を認め、腫瘤が大きくなるにつれ腫瘤内の間質も増生し高発現になる傾向が見られ、また微小血管数は腫瘤サイズが大きくなるにつれ増加傾向を示した。また、TSP1 ELISA kitを作成し、各サイズ生標本をhomogcnateし、組織抽出液を作成し、TSP1発現レベルをELISA法にて測定したところ、TSP1は腫瘤サイズが大きくなるにつれ、やや高くなる傾向が見られた(ともに有意差なし)。
心臓刺激伝導系の全貌、結節間伝導路の解明と伝導系プラスティネーションの作製

心臓の洞房結節で起こった興奮は心房内に広がり、一部は結節間伝導路を通って房室結節(田原結節)にいたる。ここでいったん伝導は遅延され、ヒス束-田原の脚-プリキンエ線維系を経て心室筋に伝わる。平成14年度から16年度にかけて、次のような研究成果が得られた。1.結節間伝導路の解明卵円窩周囲、Bachmann筋束、冠状動脈洞周囲の心房筋は心耳心房筋(作業心筋に属する)に比べて、豊富な中間径フィラメント(細胞骨格)を有し、介在板の三次的構築は脚のそれと近似していた。また、ギャップ結合蛋白Connexin 40はこれらの部位に見られた。2.伝導系プラスティネーションの作製ホルマリン固定したヒト、ヒツジ、仔ウシの心臓から、刺激伝導系を実体顕微鏡下で剖出した。続いてアルコール系列で十分に脱水し、シリコンを-30°C、真空下で浸透させ、恒温器内(60°C)で乾燥させた。得られた心臓のプラスティネーションはほとんどにおいがなく、やや弾力性があり、手軽に手にとって観察することができた。心臓の拍動は特殊心筋からなる刺激伝導系によって調節されてい.る。洞房結節(ペースメーカー)でおこった興奮は心房全域に伝わり、心房筋の収縮が始まる。続いて、洞房結節から房室結節(田原結節)に伝わった興奮は、ヒス束から左右の脚(田原の脚)を経て、左右の心内膜下に分布するプルキンエ線維網へと伝わり、最終的に心室筋へ達して、心室の収縮となる。本研究は洞房結節と房室結節との結節間通路の解明と心臓刺激伝導系を剖出した心臓プラスティネーション(模型)の作製に着手した。1.結節間伝導路結節間伝導路であると予想されている分解稜、Bachmann筋束、卵円窩周囲の心房筋細胞は心耳にある作業心房筋細胞と比較して、顕著な形態的差異はみられなかった。しかしながら、心筋細胞間結合部、いわゆる介在板の立体構築に両者の差がみられた。作業心房筋細胞の介在板は、多数の指状突起の存在(物理的結合)によって特徴づけられたが、上述の結節間伝導路と予想されている部位では指状突起は少なく、心室にみられるプルキンエ線維に似ていた。gap junction蛋白であるconnexin40と43は作業心筋と伝導路の細胞のいずれにも分布していた。次年度、中間径フィラメントの分布密度を免疫組織化学的に比較検討する。心室の伝導系細胞は豊富な中間径フィラメントを有していた。1.刺激伝導系のプラスティネーションヒト、ヒツジ、ウシの心臓を使って房室結節(田原結節)、房室束、右脚、左脚を実体顕微鏡下で剖出した。これらの心臓をアルコール系列で十分に脱水し、続いてシリコンゴムを-30°C、真空下で浸透させた。最終的に心臓を乾燥させ、心臓プラスティネーションを試作した。ほとんど粘りもなく、においのないものが完成したが、硬さについて改良を加える必要性があった。心臓は機能的に拍動を直接担う作業心筋と興奮を発生し、それを伝える特殊心筋(刺激伝導系)に区分される。さらに刺激伝導系は拍動のペースメーカーとなる洞房結節(キース・フラックの結節)、伝導遅延の役割をもつ房室結節(田原結節)、そして心房から心室に興奮を伝える房室束(ヒス束)-右脚と左脚(田原の脚)-終末分枝(プルキンエ線維)系からなる。本年度は次の内容に着手した。1.刺激伝導系のプラスティネーション模型の作製ウシ、ヒツジの心臓から刺激伝導系を実体顕微鏡下で剖出した。昨年度の実験結果をもとに、今回作製されたプラスティネーションはほとんどねばりがなく、ある程度硬さを有し、においのないものが仕上がった。2.免疫組織化学1)細胞間の興奮伝導に直接関与しているgap junction蛋白(connexin40)は作業心筋の他に、伝導系のヒス-田原-プルキンエ線維系と結節間伝導路であると推察されているBachmann筋束、卵円窩周辺の心房筋線維に存在していた。

2)細胞骨格としての役目をもつ中間径フィラメント(デスミン蛋白)は作業心筋よりも刺激伝導系の特殊心筋細胞内に多く存在し、伝導系の細胞が心臓の拍動中でも、細胞の形を維持し、安定した興奮伝導を営んでいることが暗示された。3.介在板の立体構築心筋細胞間の結合部である介在板を研究者独自の方法を使って走査電子顕微鏡で立体的に捉えた。伝導系各領域が特異的な構築を示す介在板を有していた。この研究内容をアメリカ解剖学会(4月、ワシントンDC)で開催される心臓刺激伝導系に関するシンポジウムで発表することになっている。心臓は機能的に拍動を直接担う作業心筋と興奮を発生し、それを伝える特殊心筋(刺激伝導系)に区分される。さらに刺激伝導系は拍動のペースメーカーとなる洞房結節(キース・フラックの結節)、伝導遅延の役割をもつ房室結節(田原結節)、そして心房から心室に興奮を伝える房室束(ヒス束)-右脚と左脚(田原の脚)-終末分枝(プルキンエ線維)系からなる。本年度は次の内容に着手した。1.刺激伝導系のプラスティネーション模型の作製ウシ、ヒツジに加えて,本年度はクジラの心臓から刺激伝導系を剖出し,現在アルコール系列で脱水中である。2.総括(学会発表と論文)上記題名で国際誌Anatomical Record 280A:940-951(2004)に掲載された。なお,私の論文の写真が雑誌の表紙に採用された。
状態遷移時間を考慮したコンフリクト分析方法の開発・統合・実装・公表

本研究課題では、(ア)「遷移時間分析」の方法の開発、(イ)分析方法の数理モデル研究、(ウ)分析方法の統合のための研究、(エ)「コンフリクト解決のための方法論パッケージ」の実装・公表という個別テーマを設定している。平成30年度は、平成29年度の研究計画として当初予定していたものの十分に進捗しなかった、(1)遷移時間分析の分析例の蓄積、(2)5つの分析方法の数理モデル研究、(3)5つの分析方法の統合方法の改良、および、(4)5つの分析方法の方法論パッケージとしての実装と公表を、研究期間を1年間延長して、実施した。(1)および(2)に関する実績としては、従来の「阻止(blocking)行動」に代わる新たな行動である「回避(avoiding)行動」を用いた遷移時間分析の方法の開発、および、その方法を用いた囚人のジレンマの状況の分析が挙げられる。(2)についての実績としては、(3)および(4)についての実績としては、本研究課題のWebサイト(http://www.shs.ens.titech.ac.jp/inohara/GMCR/)において公表した、「社会システムの態度分析・合理性分析・効率性分析・安定性分析」の統合計算プログラムや「グラフモデルの提携分析と効率性分析」の統合計算プログラム、および、「社会的意思決定状況の安定性分析」計算プログラムが挙げられる。これらの計算プログラムにより、小規模なコンフリクトや社会的意思決定状況の統合的な分析が容易に実行可能になった。実際、例えば、3主体による「共有地の悲劇」の状況における効率的な結果の達成に対しては、利他的な行動が提携形成以上の効果を持つことが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は研究体制と研究組織を整え、また、研究の第一段階である「遷移時間分析」の方法の開発を行った。研究体制として、(1)「遷移時間分析」の方法の開発、(2)分析方法の数理モデル研究、(3)分析方法の統合のための研究、(4)「コンフリクト解決のための方法論パッケージ」の実装と公表という4つの個別研究内容を設け、それぞれ研究協力者を配置して研究組織を整えた。また、研究遂行上必要な事務を担当する者の雇用、および、研究計画期間を通じて用いる物品の整備を行った。さらに、当研究課題の研究内容や研究成果を公表するためのWebページを作成し、公開した。(1)「遷移時間分析」の方法の開発は、研究代表者の研究グループがこれまでに行ってきた、「提携分析」、「態度分析」、「選好変化分析」、「意思決定ルール分析」の方法の開発と同様の、数理モデル研究という方法をとった。「遷移時間分析」の方法の開発後、開発した方法の基礎的な数理的性質についての知見を得た。また、開発した方法を使ったコンフリクトの分析例を蓄積し、その有効性を確かめた。その他の個別研究内容については、それぞれ平成27年度以降の本格的な研究に備えて、準備を進めた。具体的には、(2)「分析方法の数理モデル研究」については、既に開発済みの4つの分析方法の性質を明らかにするための数理モデル研究を、(3)「分析方法の統合のための研究」については、分析方法の統合方法の検討を、(4)「コンフリクト解決のための方法論パッケージ」の実装と公表については、既に開発済みの4つの分析方法の計算機上のプロトタイプの実装と改良を、それぞれ進めた。そして、(2)における「提携分析」の数理モデル研究の成果を、雑誌論文1編、国際学会発表3件として発表し、(4)における「提携分析」の計算機上のプロトタイプの実装と改良を終えた。平成27年度は、平成26年度に開発した「遷移時間分析」の方法、および、既に開発済みの4つの分析方法(「提携分析」、「態度分析」、「選好変化分析」、「意思決定ルール分析」)の性質を明らかにするための数理モデル研究を実施、その成果を、雑誌論文(いずれも査読付き)3件と学会発表(いずれも国際学会)2件として発表した。平成26年度は研究の進捗が計画からやや遅れていたものの、海外研究協力者からうけた助言をもとに研究計画の方向性を再確認し、また、人件費により雇用したRAの研究補助の効果により、平成26年度までの遅れを取り戻し、当初研究計画通りの進捗に戻った。研究成果の公表も進んでおり、当研究課題の研究はおおむね順調に進んでいると判断できる。平成28年度は、コンフリクト解決のための包括的な分析方法の確立のために、(ア)「遷移時間分析」の方法の開発、(イ)分析方法の数理モデル研究、(ウ)分析方法の統合のための研究、(エ)「コンフリクト解決のための方法論パッケージ」の実装・公表の4点を推進した。(ア)については、従来の分析例に比べて8倍以上の状態表現規模を持つ分析例を蓄積した。この成果は学術論文としてまとめた上で今後公表する予定である。(イ)については、コンフリクトの例としてマッチング問題と地方自治体の合併推進のための補助金政策の策定を取り上げて、その分析方法について数理モデル研究を行った。この成果は4件の国際学会発表(うち3件は査読つき予稿集発行)として公表済みである。

(ウ)については、「遷移時間分析」と「提携分析」の統合が完了し、1件の学会発表(猪岡匠,猪原健弘,状態遷移時間と提携の導入による紛争解決のためのグラフモデルにおける新規安定性概念,社会情報学会関東支部2016年度ポスター発表会,千葉工業大学(津田沼キャンパス),2016年11月6日)として発表済みで、本発表は優秀賞を受賞した。一方、当初予定していた5つの分析方法すべての統合は完了しなかったので、平成29年度に残りの部分の統合を完了させる予定である。(エ)については、(ウ)に関する部分の計算機上の実装が完了した。これについては、関係のプログラムを整理した上で、東京工業大学猪原健弘研究室ホームページ(http://www.shs.ens.titech.ac.jp/inohara/GMCR/accomplishments.html)にて近日中に公表予定である。「遷移時間分析」の方法の開発について、従来の分析例に比べて8倍以上の状態表現規模を持つ分析例を蓄積したものの、まだ成果発表にいたっていないため。また、分析方法の統合のための研究について、当初予定していた5つの分析方法すべての統合が完了しなかったため。さらに、「コンフリクト解決のための方法論パッケージ」の実装・公表について、プログラムの研究室ホームページへの掲載が遅れているため。本研究課題では、(ア)「遷移時間分析」の方法の開発、(イ)分析方法の数理モデル研究、(ウ)分析方法の統合のための研究、(エ)「コンフリクト解決のための方法論パッケージ」の実装・公表という個別テーマを設定している。平成29年度は、(ア)に関する分析例の蓄積、(イ)に関する5つの分析方法の数理モデル研究、(ウ)に関する5つの分析方法の統合方法の改良、および、(エ)に関する5つの分析方法の方法論パッケージとしての実装と公表に関する研究を実施した。(ア)に関する研究実績としては、遷移時間分析の計算機プログラムのプロトタイプのベンチマークとして行ったElmilaコンフリクトに関する分析例の蓄積の、本研究課題のWebサイト(http://www.shs.ens.titech.ac.jp/inohara/GMCR/)での公開が挙げられる。(イ)に関しては、1件の査読つき学術論文の公表が挙げられる。(ウ)の研究業績として挙げられるのは、上記(ア)の研究実績で挙げた遷移時間分析の計算機プログラムのプロトタイプの、上記Webサイトでの公開である。(エ)に関しては、方法論パッケージの基礎となる各種(具体的には、「推移的閉包」、「社会ネットワークの安定性」、「反射的Nash均衡」、「態度分析」)の計算機プログラムのプロトタイプの上記Webサイトでの公開を行った。これら平成29年度の研究実績は、研究成果発表、および、研究全体の取りまとめ、および、今後の研究実施に有用である。特に、(ア)と(イ)の研究実績と、(ウ)と(エ)の研究実績は、本研究課題の目的である「現実社会の多様なコンフリクトの円滑な解決に資する諸分析方法と知識の体系化・精緻化」、および、「コンフリクト解決のための方法論パッケージの公表」にそれぞれ貢献する。平成29年度の研究計画として当初予定していた、遷移時間分析の分析例の蓄積、5つの分析方法の数理モデル研究、5つの分析方法の統合方法の改良、および、5つの分析方法の方法論パッケージとしての実装と公表が、十分には進捗しなかったため。
宇宙用シース型ホール推進機の開発とその物理現象の解明

1.放電振動現象の解明シース型ホール推進機の安定作動には加速チャンネル内のプラズマ振動に関する理解と,放電不安定に対する対策が必要であることが明らかとなったため、リニア型ホール推進機(作動が安定で容易)を利用して、振動現象の研究を行た.その結果、電離不安定が放電振動の主たる原因であることを突き止め、さたに摂動を加えたイオンと中性粒子の運動方程式から得られる分散式の解析により、振動周波数が電離周波数のファクター倍になることを予言し、実験で確かめた。この結果は、アメリカ航空宇宙学会のジョイント推進会議(AIAA Paper 98-3638)等で発表され、Transactions of Japan Society for Aeronautical and Space Sciencesに掲載された。2.シース型ホール推進機の性能測定シース型推進機を製作し性能測定を行った。これまでの放電振動現象の研究から、電離不安定が起きないように電極設計に工夫をした。すなわち、陽極にホローアノードという技術を導入し、加速部より上段の磁場・電界の領域で電離の一部を行わせるよう設計した。その結果、加速長がほとんどないにも関わらず、安定に作動する領域を容易に見つけることができた。また推力測定の結果、比推力1400秒、推進効率25%という性能を達成した。この結果は、平成10年度航空原動機・宇宙推進講演会で発表を行った。また今後、スケール効果を調べることにより更なる性能向上が期待できる。1.シース型ホール推進機の性能測定シース型作動を実現するために,加速チャンネル長さを数ミリのレベルまで短く設計して,性能測定実験を行ったところ,シース型ホール推進機の安定作動には加速チャンネル内のプラズマ振動に関する理解と,放電不安定に対する対策が必要であることが明らかとなった.高時間分解能を有する光学,探針プラズマ診断実験により,放電不安定に最も影響を及ぼすと考えられる10KHzおよび200KHz付近のプラズマ振動の原因が,それぞれ電離周波数,ExBドリフト不安定に由来するものではないかということを示唆する結果を得た.電離周波数に関してはプラズマ放射光のスペクトル解析より得られるボルツマンプロット及び多線強度法により電離度を求め,探針測定より得られる電子温度,密度のデータとあわせて算出した.ExBドリフト不安定に関しては,チャンネルの円周方向に配した光ポート及び探針信号の時間履歴データから,円周方向に伝播する波の位相速度を求めた.未だ理論周波数との間に若干のオフセットが存在するため,今後さらに研究を行う必要がある.2.マイクロ波放電型電子源の研究宇宙科学研究所が開発中のマイクロ波放電型電子源を借りて,電子源作動特性とオリフィス部分のプラズマ診断を行った.さらにシース型ホール推進用の電子源の設計に向けて,1)磁場有限要素法解析と2)高周波電磁場の共鳴固有値解析を行って,放電室形状とマイクロ波発振周波数の最適化について研究を行った.今後はさらに3)プラズマ流れ解析とカップルさせて,高性能な電子源の開発を試みる.1.放電振動現象の解明シース型ホール推進機の安定作動には加速チャンネル内のプラズマ振動に関する理解と,放電不安定に対する対策が必要であることが明らかとなったため、リニア型ホール推進機(作動が安定で容易)を利用して、振動現象の研究を行た.その結果、電離不安定が放電振動の主たる原因であることを突き止め、さたに摂動を加えたイオンと中性粒子の運動方程式から得られる分散式の解析により、振動周波数が電離周波数のファクター倍になることを予言し、実験で確かめた。

また推力測定の結果、比推力1400秒、推進効率25%という性能を達成した。この結果は、平成10年度航空原動機・宇宙推進講演会で発表を行った。また今後、スケール効果を調べることにより更なる性能向上が期待できる。
邦人海外渡航者の渡航前・渡航中・渡航後のメンタルヘルスサービスの需要に関する研究

渡航前から帰国後までの邦人海外渡航者のメンタルヘルスサービスの需要及び課題を探索的に明らかにすることを目的とし大手の海外進出事業場及び、渡航者に対し半構造化面接を行った。調査からは、渡航者のメンタルヘルス問題の発症予防から早期危機介入、再発防止について検討していくための重要な見解を得られた。また、予防活動として渡航者に向けたメンタルへルスに関する簡易版啓発教育冊子を作成し渡航者への配布を行った。本調査ではまず、渡航前から帰国後までの邦人海外渡航者のメンタルヘルスサービスの需要及び課題を探索的に明らかにすることを目的とし海外進出をしている大手事業場を対象に半構造化面接を行い、現状や抱えている問題、さらに専門機関に求めるサービスについて情報を得た。次に、サービスを受ける側である邦人海外渡航者に対しても半構造化面接を行い、サービスの需要及び抱えている心理的不安等を探索的に明らかした。これらの聞き取り調査から、今後海外へ渡航する邦人のメンタルヘルス問題の発症予防から早期危機介入、再発防止について検討していく上で重要な見解を得られたと考える。さらに、邦人海外渡航者へ向けた簡易版啓発教育冊子『海外滞在中のこころの健康快適な海外生活を送るために』を作成した。これまで海外へ渡航する邦人に向けたメンタルヘルスに関する啓発冊子はあまり作成されておらず、渡航前や滞在中に気軽に読むことができ、メンタルヘルスへの一次予防二次予防として活用できることを目的として作成した。平成24年度は作成した簡易版啓発教育冊子の有用性や情報伝達の手段について、これから長期間(3ヵ月)に渡り海外へ渡航する邦人を対象にアンケート調査を行った。海外へ渡航する邦人にとってメンタルヘルスに関する情報は少なく、このような冊子は有用であると考える。アンケート調査からは、今後、冊子を改定するにあたり必要と考える意見等が得られた。その他にも渡航に際する不安及び、こころの健康に関する不安についても記載してもらい、メンタルヘルスサービスの需要についても調査を行った。また、平成23年度から行っていた、事業場への面接調査から得られた見解を多文化間精神医学会にて発表した。本研究は、渡航前から帰国後までの邦人海外渡航者のメンタルヘルスサービスの需要及び課題を探索的に明らかにすることを目的としている。まず、海外へ進出している従業員が2,000名以上の大手事業場のうち、承諾を得られた海外人事関係者を対象に半構造化面接を行った。本調査では、2012年2月までで16社から大手事業場が取り組んでいるメンタルヘルスサービスの現状や抱えている問題、さらに専門機関に求めるサービスについて情報を得ることができた。次に、メンタルヘルスサービスを受ける側である海外へ渡航する邦人を対象に、抱える心理的不安等を探索的に明らかにすることも目的とし、半構造化面接を行った。本調査では、偏った特徴を有する一部の渡航者だけでなく、様々な渡航目的を有する渡航者(41名)を対象に行うことができた。これらの聞き取り調査から、今後海外へ渡航する邦人のメンタルヘルス問題の発症予防、早期危機介入、再発防止について検討していく上で重要な見解を得られたと考える。さらに、主に1次予防を目的として渡航前の渡航者へ簡易版啓発教育冊子(仮版)を配布し、渡航後3ヵ月を目処に冊子が渡航前・渡航中・渡航後にどの程度役立ったか、また足りなかったと思われる情報について、メールにてアンケート調査を行った。アンケートの回収率は19%と低かった。また、簡易版をもとに冊子『海外滞在中のこころの健康快適な海外生活を送るために』の作成を行った。冊子には、メンタルヘルスに関連する問題や症状の重篤化を予防するための取り組みとして、セルフケアをはじめ、専門家へ援助を要請することの必要性について記載した。邦人海外渡航者調査において、渡航関係者である大手事業場への聞き取り調査及び、渡航前の邦人渡航者への聞き取り調査を遂行することができた。一方、渡航関係者と位置付けている医療従事者及び旅行代理店等への聞き取り調査が終了していない。これまで収集したデータからだけでは、渡航者全般のメンタルヘルスサービスの需要と課題を、渡航前・渡航中・渡航後の3つの視点から抽出することが難しく、また課題に対する具体的対策について検討できていないため、上記のとおりの評価とする。次年度では、渡航関係者(旅行代理店等)へのメンタルヘルスサービスの需要と課題に関する聞き取り調査及び、これまで行った面接調査の分析を行う。また、当初の計画からの変更点として、本年度はこれまでの面接調査で得られたデータをもとに学会発表を行う予定である。当初の研究計画予定よりも得られた協力者数が少なく面接調査期間の延長を行ったため、計画している邦人海外渡航者調査における渡航関係者への面接調査が終了していない。そのため未使用額については、面接調査を行うための費用、面接調査より得られたデータの解析、さらに学会発表等を遂行するための経費に充てる計画である。
プリオン天然変性部位の異常立体構造変換における役割

^<15>Nラベル・リコンビナントプリオン(mPrP (23-231))タンパク質を大腸菌で発現し、CPMG緩和時間分散法測定で遅い揺らぎを測定した。NMRは、800MHz(クライオプローブ付き)、及び600MHz(クライオプローブ付き)を使用し、パルス系列はConstant time CPMG緩和時間分散法を使用した。スペクトル解析は、nmrPipeとSparkyを使用した。遅い揺らぎは、等法的な振動モードとは異なり、強い異方性を持つと考えられたため、特にプリオンのN端末の異方性を特徴づけるためパラメーターを最適化した。その結果、プリオンのポリT領域(190-193、TTTT)とポリA領域(115-118、AAAA)のみに、マイクロ秒からミリ秒の遅い揺らぎが観測された。これは両領域が、ミリ秒に近いオーダーの非常に遅い揺らぎを行っている可能性があることを示している。また、これらの領域は、A120における2面角の回転により、接触と離開を行うことがMD計算により分かった。ポリA領域は、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類を通じて保存されている。一方、ポリT領域は、哺乳類にのみ存在する。プリオン病は、哺乳類でのみ見られることから、ポリTがその発症に関わっていることが示唆される。また、これら二つの領域の接触が初期核形成に関与している、と考えられる。これまで我々が開発してきたケミカルシャペロンとしての抗プリオン化合物は、効果の強いものほど、ポリT領域に強く結合することが分かっている。今後、接触立体構造が分かれば、プリオン構造変換機構の解明や、新しい治療薬の開発につながる、と考えられる。当初の研究目的をを概ね達成している。励起構造のポピュレーションを増加させるため、高圧NMRを用いた緩和実験を計画している。これらの研究は、キネティックNMRの開発に接続される(桑田一夫:基盤研究B)。問題点としては、緩和測定に一ヶ月以上の時間がかかることである。励起構造のポピュレーションを増やして、効率よく測定できるシステムを構築する予定である。正常型プリオン(NMR構造)では、N端半分が天然変性状態でC端半分が立体構造を形成している。N端部分とC端部分に構造的な干渉が見られ、また天然変性部分を取り除いたプリオンは異常型に変換しないことから、天然変性部位がプリオンタンパク質の熱安定性や異常立体構造変換に大きく関わっていることが推察される。本研究では、PrP^cの天然変性部位と構造形成部位の相互作用を解明するが、特に天然変性部位がとると予想される中間体構造や、変性剤やCuとの結合によるマイクロミリ秒の揺らぎの変化をCPMG緩和分散法を用いNMRで観測することにより明らかにする。また、CPMG緩和分散法のパルス系列も根本的に改良し、さらに天然変性部位の中間体構造から、プリオンの立体構造変換過程を解明する計画である。本年はまず、マウスプリオンのトリプトファンの位置を変えた置換した変異体を作成した。これを用い、内因性トリプトファン蛍光観測による連続フロー法から、速度論的中間体の検出に成功した。また、プリオンは銅が結合すると構造が変化するが、その振る舞いはよく理解されていないため、銅の結合に伴うESRスペクトルの変化を詳細に測定した。今後、理論予測値と比較する予定である。また、プリオンタンパク質をプリオン感染マウスの脳乳液と混合し、プリオンタンパク質の励起状態を直接観測した。具体的には、in vitro conversion法をすでに確立しているので、これをNMR試料管内で行った。また、N末端半分の領域を2種類の蛍光色素でラベルしたプリオンタンパク質の作成を行った。これを用い、温度ジャンプを1分子で行い、N端半分における天然変性状態から励起状態への転移反応を直接観測するための、1分子FRET観測用レーザー温度ジャンプ法測定装置を作成中である。

当初の研究目的をを概ね達成している。励起構造のポピュレーションを増加させるため、高圧NMRを用いた緩和実験を計画している。これらの研究は、キネティックNMRの開発に接続される(桑田一夫:基盤研究B)。問題点としては、緩和測定に一ヶ月以上の時間がかかることである。励起構造のポピュレーションを増やして、効率よく測定できるシステムを構築する予定である。