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歯周病発症進展と宿主免疫応答の分子基盤

歯周病は病原性細菌の感染力と宿主生体防御能の間のバランスが破綻することによって発症する慢性免疫性疾患である。歯周病原生細菌および炎症局所に浸潤する炎症性細胞群が保有する蛋白質分解システムは、それぞれ病原性発現や宿主免疫応答において重要な役割を果たしている。なかでもPorphyromonas ginngiavlis(以下ジンジバリス菌)は、細胞内外に強力かつユニークなシステインプロテアーゼGingipainsを産生し、宿主に対しては強力な病原性を、菌自身には発育増殖に必須の生理活性を発揮している。一方、宿主細胞におけるエンドソーム・リソソーム蛋白質分解システムは、細胞内外蛋白質の分解だけではなく、自然免疫および獲得免疫を介する生体応答においてもきわめて重要な役割を果たしている。本研究は、宿主免疫応答において対極に位置する病原性細菌と宿主免疫細胞のそれぞれのプロテアーゼの宿主免疫応答における機能を解析し、歯周病発症進展の実体を明らかにし、歯周病の制御を目的とする新たな治療戦略の確立を図るものである。本研究期間において得られた成果は以下のとおりである。(1)Gingipainsの遺伝子産物の80%以上を占めると言われる菌体膜結合型酵素群の性状と機能を解析し、本菌の宿主防御系からの回避機構の一端をあきらかにした。(2)Gingipainsを構成する主要な2種類の病原性プロテアーゼRgpおよびKgpに対する特異的阻害剤を開発し、その有用性をin vitroおよびin vivoの実験系から明らかにした。(3)ジンジバリス菌感染が動脈硬化症の発症進展を促進することをin vivoのモデル系を用いて明らかにし、それがRgpによるLDLのapoB-100蛋白質の分解を通じて進行することをはじめて報告した。(4)ジンジバリス菌およびGingipains欠損株をそれぞれ野生型マウスおよびCathepsinE欠損マウス(CatE^<-/->)に注射して解析した結果、Cathepsin Eが本菌を含む細菌感染に対して重要な生体防御機能を担っていること、およびGingipainsが宿主に対するジンジバリス菌の病原性の本体であることが明らかとなった。病原性細菌および炎症局所に浸潤する炎症性細胞群のそれぞれが保有する蛋白分解システムは、病原性発現や宿主免疫応答において極めて重要な役割を果していると考えられている。しかし、歯周病における病原性側および宿主側のいずれの蛋白質分解システムについても不明な点が多い。本研究は、病原性側のプロテアーゼとしてジンジパイン(RgpおよびKgp)を、宿主側のプロテアーゼとしてエンドリソソーム酵素のカテプシンEをとりあげ、それぞれの酵素の機能の詳細を解明し、歯周病の発症進展の実体を明らかにするとともに、歯周病の制御を目的とする新たな治療戦略を確立することを目的としている。歯周病原性ジンジバリス菌を野生型マウスならびにカテプシンE欠損マウスに皮内注射すると、前者がほとんど生存する条件下で後者は時間経過とともに死亡する動物が増え、数日以内にすべてが死亡した。また、RgpおよびKgpを欠損させた変異体を同じ条件でカテプシンE欠損マウスに皮内注射すると、動物の死亡率は有意に抑制された。これらの結果は、カテプシンEが感染に対して重要な生体防御を担っていること、ジンジバリス菌の感染にはジンジパインが必要であることを強く示唆している。

カテプシンE欠損マウスは野生型マウスに比べて血清中の過酸化水素濃度が高く、本動物が強い酸化ストレスに曝されていることが明らかとなった。また、細胞レベルでも、マクロファージにおける活性酸素産生量もカテプシンE欠損マウスで有意に増大していることが明らかとなり、カテプシンE欠損によるエンドソーム・リソソーム蛋白質分解系の破綻が、全身性に酸化ストレスを誘導し、生体防御系の低下を招いていることがわかった。歯周病は病原性細菌の感染力と宿主生体防御能のバランスが破綻することによって発症する慢性免疫性疾患である。病原性細菌および炎症局所に浸潤する炎症性細胞群がそれぞれ保有するタンパク質分解システムは、細菌の病原性発現や宿主免疫応答において重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、歯周病における病原性側および宿主側のいずれの蛋白質分解システムも不明な点が多い。本研究は、病原性側のプロテアーゼとしてPorphyromonas gingivalisが産生する2種類のジンジパイン(RgpとKgp)を、宿主側のプロテアーゼとしてエンドリソソーム系酵素のカテプシンEを取り上げ、それぞれの酵素の宿主生体防御系における役割を解明するものである。本年度は、P.gingivalisの宿主免疫機構からの回避機構におけるジンジパインの機能を解析した。まず、RgpおよびKgpの大部分を占める膜結合型酵素分子の精製を行い、その性状解析を行った。その結果、精製した主要な膜結合型ジンジパイン分子は、RgpおよびKgpの両酵素活性ドメインとそれぞれの遺伝子産物のC末端付着因子サブドメイン、さらにリン脂質とリポ多糖からなる分子量600kDaの高分子複合体であった。酵素学的には、膜結合型酵素複合体は、RgpおよびKgpの酵素活性ドメインのみから成る単量体分子に比して、タイプIコラーゲンやエラスチンなどに対する分解活性が非常に強かった。複合体に含まれるリン脂質はP.gingivalisの宿主細胞や宿主蛋白質への接着に重要な役割を果たしていることがリポソームを用いた実験から示された。一方、複合体に含まれるリポ多糖は、そのまま(intact)の状態ではマクロファージなどの宿主細胞を刺激することができず、熱変性やプロテアーゼ処理したときにのみこれらの細胞からのサイトカインの産生を誘導した。このことから、菌体表面に存在するリポ多糖の大部分は複合体に包含されることによって、本菌の宿主免疫応答からの回避に大いに寄与していることが示唆された。本年度は、正常マウスに歯周病原性細菌ジンジバリス菌や本菌の主要なプロテアーゼGingipains(RgpとKgp)を欠損させた変異株を感染させ、経時的に動物個体の生存率や各種臓器・組織への影響を細胞生化学的に解析し、個体レベルで本菌感染におけるGingipainsの役割を検討した。また、in vitroの実験系では、ジンジバリス菌とGingipains欠損変異株をヒト血管内皮細胞に感染させ、細胞レベルで本菌の細胞感染におけるGingipainsの役割を追究した。
フランツ・ローゼンツヴァイクの後期思想に関する研究

平成26年度は、課題「フランツ・ローゼンツヴァイクの後期思想に関する研究」の最終年度として、平成25年度までの研究の成果をふまえつつ、ローゼンツヴァイクの教育論と律法についての見方に特に着目しながら研究を進めた。まず、初期から晩年にかけてのローゼンツヴァイクの教育論の変遷を追った。このことを通して、ローゼンツヴァイクが宗教教育によって一人ひとりのユダヤ人がユダヤ人としての自覚を獲得するというプロセスを重視していたことが明らかになった。このことを彼は「ユダヤ人になるJudewerden」ことと呼んでいる。彼は、初期から晩年まで一貫して、近代の(ドイツ・)ユダヤ人は家庭において自然にユダヤ人としての生活習慣や心構えを獲得するということができなくなっているから、あらためて「ユダヤ人にな」らなければいけないと考えていたのだ。このように初期思想と後期思想の連続性が明らかになったことで、後期ローゼンツヴァイクの、初期思想に対する自己批判の要点がはっきりとした。この「ユダヤ人になる」というプロセスは、初期思想の一つの到達点である『救済の星』においては、観念的に、読書と思考を通した世界観の変容として理解されていた。これに対し、後期では祈りや宗教儀礼への参加という実践的な要素が重視されるようになるのだ。しかし、このような儀礼の重視は、伝統的な正統派への退行を意味するのではないのだろうか。このような疑問を解明するために、ローゼンツヴァイクの思想を同時代の正統派の論客イザーク・ブロイアーと比較した。後期ローゼンツヴァイクとブロイアーは、律法の実践を重視することにおいて共通していた。しかし、前者においてはユダヤ人としての意識の獲得が律法の実践に先立つのに対して、後者においては逆に律法の実践を通してユダヤ人としての意識が涵養されると考えられていることがわかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、論文「後期ヘルマン・コーエンの宗教哲学とメシアニズム」を発表した。ヘルマン・コーエンは日本では新カント主義の哲学者として知られているが、彼が最晩年、ベルリンでユダヤ教の科学アカデミーで教鞭をとり、熱心にユダヤ教の事柄について論じていたことはあまり知られていない。コーエンは本研究対象のフランツ・ローゼンツヴァイクにも大きな影響を与えた人物である。ローゼンツヴァイクの背景を明らかにするためコーエンについて深く掘り下げた。コーエンが当時ユダヤ教社会のなかで代表していた立場は、ドイツユダヤ人の多数派の見解、すなわち、ユダヤ教徒のドイツ市民としてドイツ社会に同化し、キリスト教徒のドイツ人と平等な権利を獲得することを目指すリベラリズムである。リベラル派は多数派であったものの、反ユダヤ主義や、ユダヤ人内部からの民族主義の表出としてのシオニズムの台頭といった情勢のため、イデオロギーとしての影響力は低下していた。コーエンは、このリベラル派の最後期の論客であった。本論文では、非政治的なカント学者、体系哲学者であったコーエンが、晩年にユダヤ教に基づく宗教哲学を自らの主要な課題とするに至るまでの経緯を、彼の著述における宗教理解の変遷を追うことで明らかにし、これまで知られてこなかったコーエンの最晩年の宗教哲学の内容を彼の体系哲学的な著作との連関において解明した。この論文は自身多くの葛藤を抱えながら、リベラル派としてコーエンの最期を看取ったローゼンツヴァイクの思想を研究する際の重要な前提となる。また、ローゼンツヴァイクの「祈り」概念の変遷を青年期から晩年にかけて詳しく研究した。トロントで行われた国際ローゼンツヴァイク学会では、この内容について発表を行い、本研究課題である『フランツ・ローゼンツヴァイクの後期思想研究』の意義を世界のローゼンツヴァイク研究者に問い、彼らと有意義な意見交換を行うことが出来た。平成25年度は、ローゼンツヴァイクの後期思想の特質を際立たせるために、彼の初期思想を詳しく検討した。当初、ヘーゲル的な歴史哲学を構想したローゼンツヴァイクが、キリスト教への改宗の決断(そしてその撤回)をきっかけに、この構想を神学的な救済史へと組み替えていく過程を明らかにした。その際、後期思想に特徴的な、実存的な個人と神との対面性にかかわる問題系が、すぐには理論化できない問題として保留されているのを確認した。これらの成果のうち一部をまとめ、6月に京都ユダヤ思想学会において発表を行った。また、その内容をさらに洗練させ同学会が刊行する雑誌『京都ユダヤ思想』に投稿し、現在査読中である。また、ローゼンツヴァイクの思想研究と並行して、彼の思索や活動の背景となった、同時代のドイツにおけるユダヤ系知識人の論壇の状況にっいても研究を進めた。特に、20世紀初頭におこった「ユダヤ教の本質」をめぐる論争に着目し、この論争に参加した様々な派閥の見解を比較した。先行研究で注目されることのなかった、正統派やシオニスト、東ヨーロッパのユダヤ人の見解を取り上げたのが本研究の特色である。この比較研究を通して、当時起こっていた、改革派の求心力の低下とユダヤ・ナショナリズムの屈折した高揚を明確に描き出すことができた。この成果をまとめ、9月には日本宗教学会で発表を行った。また、論文「「ユダヤ教の本質」をめぐる論争と世紀転換期のドイツ・ユダヤ教」を書き、『一橋社会科学』誌に投稿、査読の結果掲載を許可され、近日刊行予定である。

さらに、この論争の中でヤーコブ・フローマーという人物がベルリンの共同体でひき起こした騒動を取り上げ、平成26年2月ドイツ民族主義宗教運動研究会において「エリアス・ヤーコブ事件と20世紀初頭のドイツ・ユダヤ人の自己理解」の題目で発表を行った。この事件には当時のドイツ・ユダヤ教の様子が非常によく反映されている。平成26年度は、課題「フランツ・ローゼンツヴァイクの後期思想に関する研究」の最終年度として、平成25年度までの研究の成果をふまえつつ、ローゼンツヴァイクの教育論と律法についての見方に特に着目しながら研究を進めた。まず、初期から晩年にかけてのローゼンツヴァイクの教育論の変遷を追った。このことを通して、ローゼンツヴァイクが宗教教育によって一人ひとりのユダヤ人がユダヤ人としての自覚を獲得するというプロセスを重視していたことが明らかになった。このことを彼は「ユダヤ人になるJudewerden」ことと呼んでいる。彼は、初期から晩年まで一貫して、近代の(ドイツ・)ユダヤ人は家庭において自然にユダヤ人としての生活習慣や心構えを獲得するということができなくなっているから、あらためて「ユダヤ人にな」らなければいけないと考えていたのだ。このように初期思想と後期思想の連続性が明らかになったことで、後期ローゼンツヴァイクの、初期思想に対する自己批判の要点がはっきりとした。この「ユダヤ人になる」というプロセスは、初期思想の一つの到達点である『救済の星』においては、観念的に、読書と思考を通した世界観の変容として理解されていた。これに対し、後期では祈りや宗教儀礼への参加という実践的な要素が重視されるようになるのだ。しかし、このような儀礼の重視は、伝統的な正統派への退行を意味するのではないのだろうか。このような疑問を解明するために、ローゼンツヴァイクの思想を同時代の正統派の論客イザーク・ブロイアーと比較した。後期ローゼンツヴァイクとブロイアーは、律法の実践を重視することにおいて共通していた。しかし、前者においてはユダヤ人としての意識の獲得が律法の実践に先立つのに対して、後者においては逆に律法の実践を通してユダヤ人としての意識が涵養されると考えられていることがわかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。つつがなく史料を収集したり、出張したりすることが出来た。「ユダヤ教の本質」をめぐるを詳細に見ていく過程で、ローゼンツヴァイクと同時代のユダヤ教分離正統派の論客イザーク・ブロイアーという人物を見出した。ローゼンツヴァイクと似た問題関心をもちながら全く異なる答えを導き出したプロイアーはローゼンツヴァイクの格好の比較対象となると思われる。研究は計画通り順調に進捗しているため、方針に変更はない。これまでどおり、史料の収集と分析に取り組み、結果を学会発表や学術雑誌で発表してゆく。平成25年度は日本宗教学会、京都ユダヤ思想学会での発表を予定しており、後者の学会誌に論文を投稿する予定である。当初の計画通り、ローゼシツヴァイクの後期思想に関する研究をまとめる。その際、上記(11.)のブロイアーとの比較を通して(そして、平成24年度までに研究していた、ヘルマン・コーエンやマルティン・ブーバーとの比較を通して)、ローゼンツヴァイクの思想の特徴を明らかにする。
卵巣明細胞腺癌の化学療法低感受性の改善へ向けて

本研究は、卵巣明細胞腺癌ではNNMT(nicotinamide N-methyltransferase)が下がると化学療法感受性が上がる可能性があり、NNMTと卵巣明細胞腺癌の化学療法の感受性との関係を明らかにすることを目的としている。近年プロテオミクス解析によりNNMTは癌関連繊維芽細胞の制御因子と報告されている(MA Eckert et al, Nature 2019)。そのことから今年度は卵巣明細胞癌細胞株のNNMTノックアウト細胞の作成と臨床検体におけるNMMT発現について検討を行った。卵巣癌明細胞腺癌細胞株で2D-DIGEにてラボネームXの発現が高いとわかっている細胞株、NNMTの発現の高い卵巣明細胞腺癌細胞株OVTOKO, OVMANAを用いてCRISPR-Cas9を利用したノックアウト細胞株の作成を試みた。しかしながらノックアウト細胞の作成はできなかった。そのため現在はshRNA法によるNNMTノックアウト細胞株の樹立を行っている。同時に臨床検体におけるNMMTの発現について予後との相関関係を検討したところ、NNMT発現の亢進が予後と相関する可能性がわかった。また明細胞癌のIII期、IV期の症例においてNMMTの発現は有意に高値となっており、播種や腹水産生メカニズムとの関連について研究を進めている。今後はshRNA法によるNNMTノックアウト細胞株の樹立を行い化学療法感受性について検討を行い、SCIDマウスに移植し、ラボネームXノックアウト株を移植した群とコントロール株を移植した群とに分けて、パクリタキセル感受性が異なるかどうか検討する予定である。NNMTの発現の高い卵巣明細胞腺癌細胞株OVTOKO, OVMANAを用いてCRISPR-Cas9を利用したノックアウト細胞株の作成を試みたが、ノックアウト細胞の作成はできなかった。そのため当初の研究計画と大幅な変更を行っている。今後はshRNA法によるNMMTノックアウト細胞株の樹立、臨床検体においてNMMTが高発現する細胞の同定と臨床的意義について検討する予定である。また明細胞癌だけでなく各組織型との比較も行う予定である。私たちのこれまでの研究ではパクリタキセルの感受性の高い卵巣明細胞腺癌細胞株2株と低い卵巣癌明細胞腺癌細胞株2株を蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動法(2D-DIGE)にて解析し、パクリタキセル感受性の低い細胞株で共通して高い細胞株にくらべて発現の高かったタンパク質スポットからラボネームXを同定し、ラボネームXは卵巣明細胞腺癌のパクリタキセル感受性マーカーとなり、この分子を標的とした分子標的治療により卵巣明細胞腺癌のパクリタキセル感受性が上昇する可能性があると考えていた。当該年度は、卵巣癌明細胞腺癌細胞株で2D-DIGEにてラボネームXの発現が高いとわかっている細胞株を用いて、CRISPERを用いたゲノム編集ノックアウトキットを用いて、ラボネームX特異的gRNAベクターをトランスフェクションした群とスクランブルコントロールベクターをトランスフェクションした群に分けて、安定発現株の作成を試みた。この細胞株を用いて、パクリタキセル投与時の細胞増殖やアポトーシスがそれぞれの群で異なるかどうか検討する。また、これらの細胞株をSCIDマウスに移植し、ラボネームXノックアウト株を移植した群とコントロール株を移植した群とに分けて、パクリタキセル感受性が異なるかどうか検討する予定である。卵巣明細胞腺癌臨床検体を用いて、ラボネームX抗体にて免疫組織化学染色を行い、標準化学療法であるパクリタキセル+カルボプラチン(TC)療法での化学療法感受性とラボネームXタンパク発現との関連や生命予後との関連を検討するため、臨床検体、臨床情報の収集を行った。研究代表者の人事異動による所属研究機関の移動があったため。安定発現株の作成を続け、パクリタキセル投与時の細胞増殖やアポトーシスがラボネームXノックアウト株とコントロール株で異なるかどうか検討する。

また、これらの細胞株をSCIDマウスに移植し、ラボネームXノックアウト株とコントロール株でパクリタキセル感受性が異なるかどうか検討する。卵巣明細胞腺癌臨床検体を用いて、ラボネームX抗体にて免疫組織化学染色を行い、標準化学療法であるパクリタキセル+カルボプラチン(TC)療法での化学療法感受性とラボネームXタンパク発現との関連や生命予後との関連を検討する。今後はshRNA法によるNMMTノックアウト細胞株の樹立、臨床検体においてNMMTが高発現する細胞の同定と臨床的意義について検討する予定である。また明細胞癌だけでなく各組織型との比較も行う予定である。当該年度は臨床検体についての免疫組織化学染色を行わず、臨床検体、臨床情報の収集のみで終わったため。研究代表者の出産、育児のため次年度使用額が生じた。
自動点滅する蛋白質ラベル化プローブ：１分子及び超解像顕微鏡応用

蛋白質の局在、動態の可視化は蛋白質の機能を解明するだけでなく、その生理機能に関わる疾患の治療法や薬剤の開発に貢献できる重要な技術である。特に近年、超解像イメージングが開発されたことで蛋白質局在が光の回折限界を下回る分解能で明らかにできるようになった。しかしながら、現状の超解像イメージング法では時間分解能や色素の光退色、生細胞への応用に課題が残っている。加えて、超解像イメージングに適した蛍光色素を目的の蛋白質に標識する手法も重要である。本研究では光照射により蛍光制御能を変化させる分子の開発と蛋白質ラベル化プローブの開発を実施した。PALM/STORM法やRESOLFT法を利用した超解像イメージングでは光スイッチング可能な蛍光制御分子が求められる。そこで、光照射により蛍光を制御できる分子の探索の結果、アリルアゾピラゾール(AAP)を消光剤として利用することに着目した。AAPはcis体、trans体を取りうるため、各異性体の蛍光色素に対する消光能を評価した。高コントラストな蛍光画像を得る上で、洗浄操作なしで迅速かつ低濃度で蛋白質を標識することのできる蛍光プローブの開発が重要である。このようなプローブに要求される条件は、遊離状態では非蛍光性で、標識されると蛍光強度が上昇するとともに、その標識速度が速い必要がある。これまでにPYP(Photoactive yellow protein)とよばれる小さな蛋白質をタグとしたラベル化技術を開発してきた知見を基に、PYPタグのリガンドとなる分子設計の拡張のため、PYPタグを介したラベル化の反応点となるCys69のチオール基と反応する新たな官能基を探索した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。蛍光分子の光スイッチングとタンパク質ラベル化技術は、超解像イメージングを可能とする重要な要素技術となっている。本研究では、光照射により蛍光制御能を変化させる分子の開発とタンパク質ラベル化プローブの開発を実施した。まず、蛍光制御分子として、光照射により蛍光分子の蛍光を制御できる分子の探索を行った。種々の蛍光色素と、これらの蛍光を制御できる分子の探索を行った。これらの分子に光照射を行い、その蛍光制御能を検討した。その結果、UV光と緑色光で光スイッチング可能な分子を見出した。また、これらの光スイッチング分子を標的タンパク質に結合させるためのタンパク質ラベル化技術の開発に取り組んだ。これまでの研究で、PYP(Photoactive yellow protein)をタグとしたラベル化技術を開発してきた。PYPは、紅色硫黄細菌由来の小タンパク質で、桂皮酸やクマリンの誘導体からなるリガンドと、チオエステル交換反応によりCys69と共有結合することが分かっている。そこで、桂皮酸をリガンドとして、TAMRAを蛍光色素としたプローブを開発した。このプローブは、遊離状態では非蛍光性で、ラベル化反応に伴い、蛍光強度を上昇させる蛍光スイッチを有していることが判明した。更に、細胞核内に核移行シグナルを融合したPYPタグを発現させ、プローブを添加したところ、特異的に細胞核から蛍光が観測された。この結果、プローブは、細胞膜を透過し細胞核内のタンパク質をラベル化・イメージングできることが示された。光スイッチングプローブは、超解像イメージングにおいて、極めて有用な分子ツールである。また、細胞内のタンパク質を超解像イメージングするには、合成プローブを特異的に標的タンパク質に結合させる必要がある。これらの二つの要素の基盤技術を開発することが本研究の目的であり、光照射により蛍光制御可能な分子の開発及び、ラベル化プローブの開発に成功していることから、概ね順調に研究が進展しているといえる。蛋白質の局在を高精細に明らかにする超解像イメージングでは、蛋白質を蛍光標識する技術と、その標識した色素の蛍光制御技術が重要となってくる。本年度は、前年度に引き続き蛋白質標識技術の改良と蛍光色素の蛍光強度を光制御できる蛍光プローブの開発に取り組んだ。これまでに、PYPタグとその特異的蛍光標識プローブを用いた蛋白質標識技術を開発してきた。高コントラストな蛍光画像を得るうえで、洗浄操作なしで迅速かつ低濃度で蛋白質を標識することのできる蛍光プローブの開発が重要である。このようなプローブに要求される条件は、遊離状態では非蛍光性で、標識されると蛍光強度が上昇するとともに、その標識速度が高いものである必要がある。そこで、PYPタグの新たな反応基としてハロアセチル基を有するジメチルアミノクマリン型蛍光プローブを設計した。本プローブを用いることにより、遊離状態では非蛍光性で、200 nM程度の低濃度で5分程度で細胞内PYPタグ融合蛋白質をラベル化することに成功した。次に、色素の蛍光制御技術の開発であるが、アゾ系色素の光異性化を利用して、BODIPY及びATTO655の蛍光強度の光制御に成功した。これらの光制御機構を、Stern-Volmerプロットを取り検証した。その結果、BODIPYに関しては、静的消光と動的消光が混在しており、ATTO655の場合は、光非照射時では静的消光であり、光照射により動的消光を示すことが判明した。以上の結果は、超解像イメージング技術を開発するうえで、極めて有用な知見を提供する。今年度の研究で、特異的、迅速、かつ高コントラストに蛋白質をイメージングする技術を確立した。また、蛍光制御可能なプローブの開発に必要な蛍光制御機構を明らかにすることができた。

本技術では、これらの要素技術の開発が極めて重要であり、本年度の進捗は、概ね順調であるといえる。蛋白質の局在、動態の可視化は蛋白質の機能を解明するだけでなく、その生理機能に関わる疾患の治療法や薬剤の開発に貢献できる重要な技術である。特に近年、超解像イメージングが開発されたことで蛋白質局在が光の回折限界を下回る分解能で明らかにできるようになった。しかしながら、現状の超解像イメージング法では時間分解能や色素の光退色、生細胞への応用に課題が残っている。加えて、超解像イメージングに適した蛍光色素を目的の蛋白質に標識する手法も重要である。本研究では光照射により蛍光制御能を変化させる分子の開発と蛋白質ラベル化プローブの開発を実施した。PALM/STORM法やRESOLFT法を利用した超解像イメージングでは光スイッチング可能な蛍光制御分子が求められる。そこで、光照射により蛍光を制御できる分子の探索の結果、アリルアゾピラゾール(AAP)を消光剤として利用することに着目した。AAPはcis体、trans体を取りうるため、各異性体の蛍光色素に対する消光能を評価した。高コントラストな蛍光画像を得る上で、洗浄操作なしで迅速かつ低濃度で蛋白質を標識することのできる蛍光プローブの開発が重要である。このようなプローブに要求される条件は、遊離状態では非蛍光性で、標識されると蛍光強度が上昇するとともに、その標識速度が速い必要がある。これまでにPYP(Photoactive yellow protein)とよばれる小さな蛋白質をタグとしたラベル化技術を開発してきた知見を基に、PYPタグのリガンドとなる分子設計の拡張のため、PYPタグを介したラベル化の反応点となるCys69のチオール基と反応する新たな官能基を探索した。これまでの研究で、光照射により光スイッチングが可能な分子のプロトタイプの探索に成功した。今後は、このプロトタイプをもとに、より効率的に光スイッチングが可能な分子の探索及び分子デザインを行っていく。また、この光スイッチング分子を標的タンパク質に導入するタンパクラベル化技術の高効率化及び高速化を目指す。ラベル化技術の性能向上の後に、光スイッチング分子をタンパク質に導入するためのラベル化プローブの開発に取り組んでいく。今後は、アゾ系色素やその他のフォトクロミック分子と種々の蛍光色素を連結した蛍光プローブを作成し、蛋白質標識技術と組み合わせて、超解像イメージング応用へと展開する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
多種抗原を同時標的とする食道癌血清抗体バイオマーカーの研究

血管新生因子であるVEGFに対する血清抗体検出方法を確立して、食道癌患者における陽性率を検討することを目的とした。VEGF抗体陽性率は、健常者群の平均値+3SDをカットオフ値とすると6.6%(6/91)であり、健常者対照群における陽性率は1.4%(1/74)であった。臨床病理学的因子ならびにp53抗体との相関関係は認められなかった。(1)本研究課題であるVEGFに関して、始めに標的抗原を調整する目的でVEGFのcDNAの塩基配列をアミノ酸配列に変換し、MHCPredウェブサイト(http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/)を用いてクラスII抗原部位を検索し、その領域を含むペプチドを人工合成した。(2)アミノ末端にビオチンを付加しておき、予めアビジンを固相化したプレートを用いて合成ペプチドを特異的に結合させ、洗浄後に血清抗体と反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体を用いて血清抗体レベルを測定する(ELISA)キットを試作した。(3)健常者血清におけるELISA測定レベルの平均値+2SDを基準値として、基準値を上回る症例を陽性判定することとした。(4)病理診断にて食道扁平上皮癌との診断が確定した食道癌患者について、文書により臨床研究の同意を得て解析に用いた。また、文書により了解を得た健常者の血清をコントロールとして用いた。(5)本ELISA検査にて、陽性と診断される食道癌患者は、10%前後であった。(6)健常者は、癌検診において固形癌を有していないと診断された100名である。偽陽性率は、2%前後であった。(7)本ELISA検査による陽性症例と既存の腫瘍マーカー検査による陽性症例との重複は少なく、両者を併用することで陽性率を向上させることが可能と判断された。(8)抗体価が低い症例において、基準値前後の抗体をより正確に検出できる条件設定を行った。(1) VEGF cDNAの塩基配列をアミノ酸配列に変換し、MHCPredウェブサイト(http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/)を用いてクラスII抗原部位を検索し、その領域を含むペプチドを人工合成する。(2)アミノ末端にビオチンを付加しておき、予めアビジンを固相化したプレートを用いて合成ペプチドを特異的に結合させ、洗浄後に血清抗体と反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体を用いて血清抗体レベルを測定する(ELISA)。健常者血清に比べ患者血清の抗体レベルが有意に高いペプチドを選択した。(3)バキュロウイルスを用いてVEGFペプチドを精製して血清VEGF抗体検索のためのELISAキットを作成する。作成したELISAキットの性能試験を実施し、健常者の基準抗体価を設定する。(4)健常者血清におけるELISA測定レベルの平均値+3SDをカットオフ値として、陽性と診断された患者血清は、510%程度であり、25%を上回ったものは同定できなかった。ただし、p53抗体陽性との重複が少ないことから、陽性率の上乗せ効果は期待できると思われた(5)東邦大学大森病院で入院・加療した食道癌患者の血清を文書により本人の了解を得てスクリーニングに用いた。解析対象の食道癌症例の血清は、治療前に採取し、血清分離後、マイナス80度にて研究開始まで凍結保存されたものを使用した。(1)VEGF cDNAの塩基配列をアミノ酸配列に変換し、MHCPredウェブサイト(http://wwwjennerac.uk/MHCPred/)を用いてクラスII抗原部位を検索し、その領域を含むペプチドを人工合成した。(3)バキュロウイルスを用いてVEGFペプチドを精製して血清VEGF抗体検索のためのELISAキットを作成した。作成したELISAキットの性能試験を実施し、健常者の基準抗体価を設定した。(4)健常者血清におけるELISA測定レベルの平均値+3SDを基準値とした。基準値を上回る奨励を陽性と診断した。その結果、食道癌患者における血清抗体陽性率は、510%程度であった。(5)陽性率は単独で新規腫瘍マーカーとして利用できるレベルに達しないが、p53抗体陽性との重複が少ないことから、複数の血清抗体を併用することで陽性率の上乗せを期待できると思われた。(6)平成23年度も研究計画とおりに、東邦大学大森病院で入院・加療した食道癌患者の血清を文書により本人の了解を得て収集保存した。
新規抗がん剤創製を目指したチューブリン制御分子の探索と活性発現部位の解明研究

がんの治療には、化学療法、外科療法、放射線療法、免疫療法の4種の治療方法が行われている。このうち、化学療法は、広範囲ながん治療の第一選択の治療方法として行われることが多い。すなわち、化学療法は、がんの転移もしくは転移の可能性がある場合や、広範囲に治療が必要な血液やリンパのがんの治療などに取り入れられている。更に、化学療法は、抗がん剤単独で治療を行うこともあるが、実際には、手術治療や放射線治療などの他の治療方法と抗がん剤治療を組み合わせて行うこともある。また、化学療法では、一種類の薬剤だけを使う場合と、多剤併用療法がある。このように、がん治療において、化学療法は広範囲で適用されている。しかし、薬剤耐性がん細胞の出現や薬剤の副作用などのために、薬剤投与量に制限が必要となり、十分な治療効果が得られない場合があることも知られている。従って、がん克服を実現するためには、化学療法で用いられる、より有効な新規抗がん剤を創出することが不可欠である。そのためには、新規抗がん剤開発の鍵となる抗がん物質のシード化合物の創成が求められる。本研究では、海洋無脊椎動物からチューブリン重合・脱重合阻害作用を示す成分を検索し、得られた成分を新規抗がん剤のシード化合物として開発するために、海洋生物の採集と活性成分の分離操作を行った。具体的には、海洋無脊椎動物のスクリーニングと活性成分の抽出・単離を行うことを目的として、1九州西岸海域に豊富に生息している海洋生物の採集を行い、2採集した各試料動物を処理して、粗抽出物を作成し。3第一次活性試験として、各粗抽出物について、神経成長因子共存下でPC12細胞に対する神経突起伸展作用を調べ、突起の伸展作用を示し、チューブリン機能に影響を与えている可能性を有する抽出物を選出した。4活性を示した抽出物について、活性を指標にしながら、活性成分の分離・精製を行っている。当初の計画どおりに、海洋生物に由来する粗抽出物の作製が進行し、一部は、活性成分の分離精製に写っている。チューブリン重合・脱重合作用の検討と精密構造解析を行うために、1単離した活性成分の作用点がチューブリン/微小管であることを確認するために、第二次活性試験として、ヒト線維肉腫細胞HT1080の細胞質微小管に対する作用を、抗チューブリン抗体を用いた免疫染色法で解析することによって、高感度かつ高い特異性をもって、チューブリン重合・脱重合への作用を確認する。作用を示すことが認められた成分について、各種機器スペクトルデータならびに化学的手法を用いて、化学構造の解明を行う。2構造の明らかになった成分について、さらに詳細(定量的)にチューブリン重合・脱重合への作用を調べる。特に、チューブリンの重合/脱重合に影響を及ぼすことが知られているcolchicine、vinblastineやtaxolをPositive Controlとして用い、活性強度を比較し、Control物質より顕著な活性を示す成分の検索に努める。

特に、チューブリンの重合/脱重合に影響を及ぼすことが知られているcolchicine、vinblastineやtaxolをPositive Controlとして用い、活性強度を比較し、Control物質より顕著な活性を示す成分の検索に努める。
高層建築骨組の縮約モデル-骨組逆置換法に基づく実用構造設計支援システムの開発

本研究の目的は、高層建築物の実用的、合理的かつ設計者の能力を最大限に発揮させるような構造設計支援システムを構築することにある。研究期間において以下のような成果を得た。1.高層建築物の構造設計において従来行なわれている「骨組モデルから剪断型モデルへの置換」とは逆の発想に基づく置換法を平面骨組および立体骨組に対して提案した。剪断型モデルから骨組モデルへの置換は、層剪断力-層間変位における復元力特性の等価性条件に基づいている。弾塑性復元力特性上の点の設計感度を増分型ではなくトータル量として表現する新しい効率的な方法を提案し、逆置換法において有効に利用した。また、トータル量表現を有効に用いることにより、増分解析を行うことなく塑性ヒンジ形成個所を見い出す方法が展開できることを示した。2.応答性能を画面上に表示し、設計者がよりよい性能を求めて、設計を数理的に改良し判断を下す過程が、画面上でコンピューターとインタラクティブに実施できるシステムを構築した。3.剪断型モデルを用いることなく、骨組モデルそのものに対する設計法も展開した。保有耐力以外に、層間変形や応力に関する制約条件も考慮した一般的な問題に勾配投影法を適用することにより、実用的な時間内で最適な設計を得る方法が構成できることを示した。4.主体骨組だけで制約条件を満足することができないような状況が発生する場合には、履歴ダンパーや粘性ダンパー等を用いる必要がある。そのような場合にも、適当な等価性(例えば1次固有周期や1次減衰定数)を導入することにより、同様の概念に基づく逆置換法が展開できることを示した。本研究の目的は,高層建築物の実用的,合理的かつ設計者の能力を最大限に発揮させ得るような構造設計支援システムを構築することにある。本年度において以下のような成果を得た。1.高層建築物の構造設計において従来行なわれている「骨組モデルから剪断型モデルへの置換」とは逆の発想に基づく置換法を平面骨組に対して提案した。剪断型モデルから骨組モデルへの置換は,層剪断カ-層間変位における復元力特性の等価性条件に基づいている。弾塑性復元力特性上の点の設計感度を増分型ではなくトータル量として表現する新しい効率的な方法を提案し,逆置換法において有効に利用した。さらに,平面骨組が並列する現実的な構造物モデルについて,平面骨組程度の計算量しか必要としない新しい縮約操作を組み込んだ設計法を展開するための基礎部分を展開した。2.レベル1地震動に対する制約条件やレベル2地震動に対するその他の制約条件を考慮した一般性のある設計法を構成するために,傾斜投影法に基づく新たな設計システムを構築した。3.設計支援システム構築のための準備を行った。CADと構造解析の両機能を兼ね備えた柔軟性のあるスフトウェアを購入して試用点検を行い,本研究用に改修する準備をした。4.主体骨組だけで制約条件を満足することができないような状況が発生することを想定し,履歴ダンパーや粘性ダンパー等を用いた場合の設計法の基本部分を展開した。本研究の目的は,高層建築物の実用的,合理的かつ設計者の能力を最大限に発揮させ得るような構造設計支援システムを構築することにある.本年度において以下の成果を得た。1.前年度に平面骨組に対して基本的部分を展開した縮約モデルー骨組逆置換法を,多構面から構成される立体建築骨組に拡張する方法を提案した。剪断型モデルから骨組モデルへの置換は,層剪断力ー層間変位における復元力特性の等価性条件に基づいている。全体構造物に対して自由度の縮約を行うのではなく,構面ごとに行うことで記憶容量,演算時間の両面で有効な設計法が展開できることを明らかにした。本設計システムを具体的な多構図の設計例に適用し,実用的な時間内で設計可能であることを示した。

2.60m以下の高層骨組では,保有耐力に関する制約が主要な制約条件として考慮される必要がある。このような問題にも,トータル量表現(力や変位を増分形式ではなく当該の力や変化そのもので表現するもの)を用いた方法が有用であることを示した。保有耐力以外に,層間変形や応力に関する制約条件も考慮した一般的な問題に勾配投影法を適用することにより,実用的な時間内で最適な設計を得る方法が構成できることを示した。3.トータル量表現を有効に用いることにより,増分解析を行うことなく塑性ヒンジ形成箇所を見い出す方法が展開できることを示した。この方法によりトータル量表現に基づく設計感度解析が一層効率的に実行可能となる。
組織リモデリングを制御する高ヒスチジン血漿因子群の分子機能解析

炎症や組織再生の過程は,様々な生理活性因子群による極めて精巧な生命活動であり,その破綻は連鎖的な組織リモデリング(病的な組織構造や機能障害)に続く重篤な難治性疾患(動脈硬化や喘息など)を引き起こす。従って,これに寄与する因子群の同定と制御機構の解明は,病態の未然防止や治療法開発に通ずる最重要課題と言える。研究代表者らは,組織リモデリングに働く可能性を秘めた因子群がヒト血液中に存在する事を認め,血漿因子の一つである高ヒスチジン糖タンパク質(HRG)や細胞表面接着因子を介した細胞間相互作用が炎症や組織再生にとって重要な役割を担っている事を見出した。HRGについては高いヒスチジン含有量に着目した特異的精製法を既に開発しているので,これを用いて高純度のHRGを調製し,組織炎症時の重要な生体現象とされる血管新生系並びに好中球走化性に及ぼす役割について検討した。マトリゲルを用いたプラグアッセイを用いて血管新生に及ぼす影響を検討した所,bFGFとヘパリン混合液による血管新生反応に対してHRGが極めて強い阻害作用を発揮する事を見出した。この作用はHRGの血中濃度に相当する1μMで観察され,HRG分子中のヒスチジンリッチドメインが機能を担う事も明らかとなった。走化性については,HRGが好中球に対し有意な遊走活性を示す事が明らかとなった。一方,単球細胞などの免疫担当細胞の機能解析研究の中で,細胞間相互作用を担う細胞表面接着因子群の発現変化が,生体防御の観点から極めて重要な役割を果たしている事やサイトカインなどの様々な因子によって発現が影響を受ける事も明らかとなった。これらの知見からヒト血漿中には炎症や組織再生に働く極めて多彩な生理活性を示す因子群が存在し,複雑な制御の下でそれらの機能を発揮している事が明らかとなった。組織再生や修復のプロセスは,多数の因子群が複雑に相互作用しあう生命活動である。この過程の破綻は,病的な組織構造や機能障害(いわゆる組織リモデリング)を生じ,時には動脈硬化や気管支喘息等の難治性疾患を招いてしまう。従って,関連する因子群を同定し病態への関与を明らかにする事は,疾患の発症機序を理解したり新規治療法を開発する上で最重要課題の一つと言える。申請者らは,組織リモデリングに働く可能性を秘めた因子がヒト血漿中に存在する事を見出し,その鍵分子として高ヒスチジン糖タンパク質(HRG)を既に同定している。本研究では,HRG分子のユニークな一次構造上の特徴,即ち極めて高いヒスチジン含有量に着目し,特異的精製法の開発を行うと共に,組織炎症時に重要な役割を果たす事で知られる好中球の走化性に及ぼすHRGの作用について検討した。その結果,Ni-NTAを特異的リガンドとして用いる事によって,ヒト血漿からHRGを簡便に精製する方法を確立できた。特異的ELISAを用いて回収率を求めた所,ヒト血漿(235ml)から最終的に29.2%の回収率で約6.72mgの精製ヒトHRG標品が得られた。精製HRG標品を用いて,好中球走化性の有無について検討した所,HRGは好中球に対して濃度依存的(0-1μM)に遊走活性を示す事が明らかとなった。この作用は陰性コントロール(BSA, HAS, ALP)では認められず,陽性コントロールであるfMLPに匹敵するものであった。亜鉛イオンを共存させても変化は認められなかった。好中球細胞が炎症等の組織修復過程に重要な役割を果たしている事はよく知られた事実である。

本知見は,この過程でHRGが何らかの重要な役割を示す可能性を示唆するものであり,種々の因子群が働く組織再生プロセスを理解する上で興味深いものと考えられる。炎症や組織再生の過程は,様々な生理活性因子群による極めて精巧な生命活動であり,その破綻は連鎖的な組織リモデリング(病的な組織構造や機能障害)に続く重篤な難治性疾患(動脈硬化や喘息など)を引き起こす。従って,これに寄与する因子群の同定と制御機構の解明は,病態の未然防止や治療法開発に通ずる最重要課題と言える。研究代表者らは,組織リモデリングに働く可能性を秘めた因子群がヒト血液中に存在する事を認め,血漿因子の一つである高ヒスチジン糖タンパク質(HRG)や細胞表面接着因子を介した細胞間相互作用が炎症や組織再生にとって重要な役割を担っている事を見出した。HRGについては高いヒスチジン含有量に着目した特異的精製法を既に開発しているので,これを用いて高純度のHRGを調製し,組織炎症時の重要な生体現象とされる血管新生系に及ぼす役割について検討した。マトリゲルを用いたプラグアッセイを用いてHRGの血管新生に及ぼす影響を検討した所,bFGFとヘパリン混合液による血管新生反応に対してHRGが極めて強い阻害作用を発揮する事を見出した。この作用はHRGの血中濃度に相当する1μMで観察され,HRG分子中のヒスチジンリッチドメインに存在する事も明らかとなった。HRG単独では血管新生系に影響を及ぼす事はなかった。一方,単球細胞を中心とした免疫担当細胞の機能解析研究の中で細胞間相互作用を担う細胞表面接着因子群の細胞表層での発現の増減が,生体防御の観点から極めて重要な役割を果たしている事やサイトカインなどの様々な因子によって発現が影響を受ける事も明らかとなった。前年度の研究成果と併せると,これらの知見からヒト血漿中には炎症や組織再生に働く極めて多彩な生理活性を示す因子群が存在し,複雑な制御の下でそれらの機能を発揮している事が明らかとなった。
地域環境問題における住民参加と専門家役割に関する社会学的研究

本研究では、住民による地域環境保全を対象として、住民と行政、伝統的な地域住民組織とボランティア型組織が、相互の緊張関係を克服し「自立と連携の両立」を成し遂げた過程を解明し、参加型環境保全の組織化現象としての把握と制度設計のための基本的枠組みを示すことができた。「I部地域環境ボランティアの組織論」では、1章において提示した「むらづくり型」(集落基盤型)、「協議会型」(組織新設型)、「ワークショップ型」(仮想集団型)の3類型ごとに事例研究を進めた。2章では、「協議会型」の事例として滋賀県守山市の「豊穣の郷赤野井湾流域協議会」をとりあげ、「自立型活動」「連携型活動」という活動の方向性をめぐる対立の克服の過程を明らかにした。3章では「むらづくり型」について、自治会型組織とテーマ型組織の関係性から「包摂型」「交叉型」「並立型」という類型を提示し、守山市内の3つの自治会を事例として、地域特性と組織化形態の適合性について検討した。4章では「ワークショップ型」の事例として横浜市のM公園の再整備事業をとりあげ、計画の立案、ボランティア組織の活動展開におけるコンフリクトとその克服について「自立/連携」をキーワードとして明らかにした。「II部地域環境ボランティア参加の規定要因」では、「赤野井湾流域協議会」の会員と守山市の一般市民を対象とするアンケート調査によって地域環境ボランティア参加の規定要因を明らかにした。5章、6章では、「地域環境ボランティア」活動は、イベントへの参加などの参加コストが小さい「第1段階の参加」と、組織の企画・運営などの参加コストが大きい「第2段階の参加」を区別することができ、それぞれの参加を規定する要因が異なることを示した。7章では、過去における「生活経験」が「地域環境ボランティア」への参加の重要な規定要因となっていることを示した。1.住民参加型で地域環境保全に取り組んでいる滋賀県守山市、横浜市鶴見区、滋賀県甲良町、京都市西陣地区において現地調査を継続し、地域特性と住民参加の様式の異なる事例研究を進めることによって比較・分析を進めた。2.滋賀県守山市に関しては、共同研究の成果を論文としてまとめた。「地域環境ボランティア組織における自立と連携」(『環境社会学研究』第8号)において、住民ボランティア組織が、「自立的活動」と「連携的活動」という2つの活動の方向性をめぐる内部対立を起こし、その後、2つの活動の方向性を両立させたプロセスについて明らかにした。3.横浜市鶴見区のM公園に関しては、第75回日本社会学会「パートナーシップの形成過程:都市公園再整備への住民参加を事例として」(大阪大学、2002年11月17日)において報告を行い、公園という都市コモンズにおける住民ボランティアと行政の間でのパートナーシップ形成のプロセスを明らかにした。ワークショップを契機とした住民の集団が、行政との「連携」と住民側の「自立」という両立困難な2つの方向性を抱えこみながら活動を展開し、NPO組織として成長しつつある。4.住民参加の現場における住民、行政、専門家の三者の関係形成は、様々な矛盾とコンフリクトを抱えている。今後は、住民参加の制度化に伴う組織論的問題点に関して、特に自立と連携のディレンマを抱えた流動的な住民参加の現場に専門家がどのように関与することが可能か、さらに事例研究を重ねるとともに理論的考察を進めていく。1.住民参加によって地域環境保全に取り組んでいる諸事例において現地調査を継続し、地域特性と住民参加の様式の異なる事例間の比較を進めている。2.横浜市鶴見区のM公園に関しては、都市コモンズとして公園を再定義する視点から、住民の公園整備への関与が「計画への参加」から「運営への参加」「管理への参加」へと発展してきた過程を「パートナーシップの形成過程」(『京都府立大学学術報告(人文・社会)』55号)において示した。

住民と行政が相互の緊張関係をのりこえて関係形成を成し遂げたプロセスを解明するかことによって、地域環境ボランティアという「有志の尊重」の制度設計に関して具体的知見が得られた。3.滋賀県守山市に関しては、共同研究の成果を論文「地域社会における水環境保全の『担い手』」(『水資源・環境研究』16号)にまとめた。地域住民組織を「自治会型組織」と「テーマ型組織」に分類し、自治会型組織によるテーマ型組織の「包摂型」、自治会型組織とテーマ型組織の「交叉型」、自治会型組織とテーマ型組織の「並立型」という三類型を設定し、それぞれに適合的な事例を取り上げて検討を行った。それぞれの「担いのしくみ」の差異と課題を示すとともに、その差異が混住化のタイプという地域特性の違いに基づくものであることを明らかにした。既存の伝統的な地域住民組織と近年のボランティア型住民参加をどのように結びつけていくかに関して具体的知見が得られた。4.住民参加の現場における「有志の制度化」に伴う組織論的課題に関して、抽出・記述・解釈のための一定の枠組みを示すことができた。さらに、事例研究を重ねるとともに理論的考察を進めていく。本研究の3年間の成果は、住民参加によって地域環境保全に取り組んでいる諸事例の比較に基づき、それらの組織現象としての把握のための枠組みを提示したことである。主要な論点は以下の3つである。(1)住民参加による地域環境保全について、「集落基盤型」「組織新設型」「ワークショップ型」の3類型、また、地域自治会レベルの類型として、自治会型組織によるテーマ型組織の「包摂型」「交叉型」「並立型」の3類型を構成し、各々の事例研究を進めた。(2)地域環境ボランティア参加を第1段階の参加と第2段階の参加に区分し、段階ごとの活動への参加を規定する要因を明らかにした。(3)住民参加と地域環境ボランティアの関係形成を記述する分析軸として「自立/連携」が有効であることを示した。滋賀県、横浜市、京都市の事例の相互比較により、住民と行政、既存の伝統的な地域住民組織とボランティア型組織が、相互の緊張関係をのりこえて「自立と提携の両立」を成し遂げたプロセスを解明し、また、住民参加の現場における「有志の尊重」の制度設計と組織的課題に関して、抽出・記述・解釈のための枠組みを示すことができた。中心的事例であるの滋賀県守山市の「豊穣の郷赤野井湾流域協議会」は、2004年9月に特定非営利活動法人の認証を受け、「NPO法人びわこ豊穣の郷」としてさらに活動を展開中である。調査研究の継続によって今後も研究成果が期待される。
高齢者のヘルスプロモーションにおける生活習慣と長寿信念に対する看護介入の研究

目的は、(1)高齢者のヘルスプロモーション・プログラムに活用できる高齢者の長寿に関する信念尺度を作成する。(2)高齢者の長寿に関する信念への気づきを高める看護介入のプログラムを開発し、高齢者のQOLを検討する、ことである。目的(1)に対しては、高齢者、看護者、介護者を938人を対象に質問紙調査を実施した。有効回答数は、675人(720%)であり、妥当性、信頼性について検討した。その結果、長寿信念尺度のうち長寿信念関連性尺度は、信頼性が確認されたが妥当性が確認されなかった。長寿信念容易性尺度は、信頼性と妥当性が確認され、長寿信念を測定する尺度として適切であることが確認された。長寿によいとされる行動への信念は、「長寿につながる日常生活行動を実行することが困難であるか・容易であるかの認識」により測定でき、有効である。目的(2)対しては、配偶者を亡くした農村地帯に生活する高齢者(了解の得られた)を対象に、エンカウンターによるグループアプローチ(非構成的、構成的による方法、平成11,12年度と同じ内容、方法による)を実施した。本年度の主なねらいは、配偶者の死を体験されたストレスの大きい高齢者の長寿に関する信念や気づき、またQOLの変化について明らかにしたく取り組ん拙主な結果は、平成12年度の結果とに相違がみられなかった。すなわち参加者は、グループでの話し合いをとおして人生を振り返る人間関係を持つことができ、グループ終了時の自己効力感がグループ前に比べて上昇した。また3年間における参加者は、42人であった。これらのうち前後の質問紙調査に回答を得た30人については、グループ後に長寿信念容易性尺度の第1因子<生活の充実・他者との交流>が上昇する兆候がみられた。エンカウンターを基盤にした看護グループアプローチは、高齢者のセルフエフィカシー(GSES)を高め、長寿に良いとされる生活行動を促進する動機づけになるということが明らかになった。成果は、国内学会で14回発表、国外学会で3回発表した。目的は、(1)高齢者のヘルスプロモーション・プログラムに活用できる高齢者の長寿に関する信念の尺度を明らかにする、(2)高齢者の長寿に関する信念への気づきを高める看護介入のプログラムを開発し、高齢者のQOLを検討する、ことである。目的1に対しては、高齢者、看護職、福祉職あわせて約500名を対象に質問紙調査を実施した。回収率は、約65%であり、現在データの入力、分析を実施中である。目的2に対しては、長寿の信念に対する気づきを高める看護介入プログラムとして、エンカウンターによるグループ・アプローチ(構成的、非構成的)を、参加者17人に実施した。実施は、4月12月にわたり10回の定期セッションと、1泊2日の合宿研修、前年度終了者との交流会1回が行われた。データ収集は、参加者の了解を得て会話記録や、参加者の撮影した写真により行われた。グループアプローチの会話分析では、345件の内容が抽出され7領域に分類された。参加者は、グループでの話し合いを通して人生を振り返る人間関係を持つことができ、自己効力感が上昇した。また参加者の撮影した写真分析からは、その持つ意味・意図が3つに分類された。