hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時相論理と並行計算、オートマトンの統合化による自律性のある分散システムの設計支援

本研究では、従来個別に研究されていた形式的手法を統合化して、新しい分散システムの設計支援を実現するものである。そのポイントは、開放型システムとして分散システムをとらえて、実時間モデル及びハイブリッドモデルの観点からモデル化して、自動検証及び演縄的検証により設計の正当性を効率的に保証するものである。以上の観点より、我々は、以下の4つのモデルから、設計支援を実現した。(1)実時間型開放分散システムのAssume-guarantee方式による自動的設計支援:開放型分散システムの仕様記述言語として開放型時間オートマトンを形式化して、Assume-guarantee方式による時間模倣関係の自動検証及びreceptivenessの自動検証を実現した。これにより、実用レベルの分散システムの段階的詳細化設計が可能となった。(2)実時間型開放分散システムの演繹的設計支援:開放型分散システムの仕様記述言語として時間ステートチャートを形式化して、演繹的な詳細化検証の公理系を開発した。これにより、無限状態を有する分散ソフトウェアの段階的詳細化設計が可能となった。(3)実時間型開放分散システムのAssume-guarantee方式による演繹的設計支援:開放型分散システムの仕様記述言語としてクロック遷移モジュールを形式化して、Assume-guarantee方式による演繹的な詳細化検証の公理系及びreceptivenessの演繹的検証を開発した。これにより、実用レベルの分散ソフトウェアの段階的詳細化設計が可能となった。(4)ハイブリッドモデルに基づく開放分散システムの設計支援:開放型分散システムの仕様記述言語としてフェーズ遷移モジュールを形式化して、演繹的な詳細化検証の公理系を開発した。これにより、制御法則を含む分散ソフトウェァの段階的詳細化設計が可能となった。今後の課題としては、以上の開発した手法を本格的に計算機に実装して、大規模問題への適用及びその評価がある。研究開始から現在までに,分散システムの仕様記述言語と検証に関する理論が以下のように開発できた.1.まず,分散システムの並行性やタイミング制約,機能の統合的な仕様記述を実現する時間ステートチャートを提案した.時間ステートチャートのタイミング制約と機能により,時間ステートチャートは無限な状態遷移システムであり,分散システムの汎用的な計算モデルに相当する.2.次に,時間ステートチャートからPnueliらのクロック遷移システムに変換することにより,時間ステートチャートの操作的意味を定義した.この操作的意味により,時間ステートチャートのイベントによる動作と時間経過が形式化できた.3.次に,クロック遷移システム上の演繹的証明により,時間ステートチャートが安全性や活性を充足することが検証できた.一般的に,分散システムは無限な状態遷移システムを構成するので,演繹的検証手法のみによって検証可能である.4.最後に,クロック遷移システム上で詳細化検証の公理系を開発して,時間ステートチャートの詳細化の検証が実現できた.現在,以下の検討項目を研究中である.1.開放型分散システムの仕様記述を可能にするために,時間ステートチャートを拡張する.2.時間ステートチャートのAssume-Guarantee style検証を実現する.3.時間ステートチャートを有限化して,自動演繹的検証を実現する.本研究では、従来個別に研究されていた形式的手法を統合化して、新しい分散システムの設計支援を実現するものである。平成12年度では、前年度の成果の上に、以下のような成果を得た:1.有限状態モデルにおいて、以下の提案及び開発を行った。(1)分散システムを仕様記述可能とした拡張時間オートマトンを開発して、拡張時間オートマトンのAssume-Gurantee形式による自動詳細化検証手法を提案した。ここでの詳細化関係は、Milnerが提案した模倣関係を実時間制約で拡張した時間模倣関係である。(2)拡張時間オートマトンで仕様記述した分散プロセスが物理的に実装可能であることを保証する条件、いわゆるreceptivenessの自動検証手法を実現した。

Receptivenessは、環境と分散プロセスとの無限ゲームで形式化できる。(3)自動詳細化検証器の実装を行って、計算機実験により、提案手法の有効性を示した。2.無限状態モデルにおいて、時間ステートチャートのAssume-Gurantee形式による演繹的詳細化検証手法を開発した。さらに、receptivenessの演繹的検証手法を実現した。現在、以下の検討項目を研究中である:1.時間ステートチャートのAssume-Gurantee形式による演繹的詳細化検証手法の実装及び実問題への適用。2.分散システムのより高度なモデル化として、ハイブリッドオートマトンへの拡張。平成13年度では、前年度の成果の上に、以下のような成果を得た:1.無限状態モデルにおける実時間型開放分散システムにおいて、以下の提案及び開発を行った。(1)前年度開発した詳細化検証の公理系を改善した。具体的には、抽象度の高い仕様と低い仕様との間の詳細化関係を定義する詳細化写像の意味付けを形式化した。これにより、以下が明らかになった:・1991年にAbadiらが開発したリアクティブシステムの詳細化検証理論と等価であることが明らかになった。・提案した詳細化検証は時間模倣関係の検証であることが明らかになった。(2)改善した詳細化検証の公理系を計算機上に実現した。これはプロトタイプであるが、簡単な事例を対象として、本手法の有効性を確認した。2.ハイブリッド型開放分散システムにおいて、以下の提案及び開発を行った。(1)ハイブリッド型モデルによる仕様記述書語を開発した。これは、環境との相互作用が表現できるハイブリッド型計算モデルであり、より強力にアナログ動作が表現できる。(2)上記の仕様記述言語で記述したシステムのreceptivenessの検証手法を開発した。(3)さらに、上記の仕様記述言語で記述したシステムの詳細化検証手法を開発した。以上の(1)-(3)により、ハイブリッド型開放分散システムの設計支援の基礎を開発できた。今後の課題としては、以上の開発した手法を本格的に計算機に実装して、大規模問題への適用及びその評価がある。
減算のない非自励離散可積分系が創出する新たな箱玉系と数値計算アルゴリズムの研究

本年度は,非自励離散有限戸田格子と非自励離散有限Lotka-Volterra格子との間のMiura型変換と呼ばれるものを一般化し,有限R_<II>格子と非自励離散有限mKdV格子との間のMiura型変換を導出することに成功した. Miura型変換とは, mKdV方程式の解からKdV方程式の解への変数変換としてR. M. Miuraによって導出されたものに由来し,これが存在すればある力学系と別の力学系を同一の時間軸の上で直接的に結び付けることができる.例えば,非自励離散有限戸田格子の変数はある三重対角行列の固有値へと収束する性質があるので,固有値計算へと応用することが可能である.一方,非自励離散有限Lotka-Volterra格子から非自励離散有限戸田格子へのMiura型変換が存在するので,非自励離散有限Lotka-Volterra格子を用いても三重対角行列の固有値が計算可能であることが直ちに示される.このように, Miura型変換を調べることは応用上も重要な問題である.有限R_<II>格子については,昨年度の研究で三重対角行列束の一般化固有値計算アルゴリズムへの応用がなされているが,今年度の成果によって,非自励離散有限mKdV格子によっても三重対角行列束の一般化固有値計算が可能であることが明らかとなった.この成果については,可積分系理論専門のオンラインジャーナルであるSIGMA誌に論文を投稿し,既に出版されている.また,学会発表を国内で2件行い,その報告として九州大学応用力学研究所研究集会報告に和文論文1編が掲載された.なお,ここに現れた非自励離散mKdV格子とは,運搬車付き箱玉系を最初に導出する際に用いられたものであり,理論的にも興味深い結果となっている.(抄録なし)離散戸田格子に有限格子境界条件を課したものが,箱玉系や行列固有値計算アルゴリズムとの関わりから重要である.本研究では,非自励の離散戸田格子が直交多項式のスペクトル変形の両立条件として導出できることに着目し,より一般の双直交有理関数系であるR_<II>有理関数に付随する非自励離散可積分系(R_<II>格子と呼ぶ)を考え,そこから得られる箱玉系や数値計算アルゴリズムの性質を明らかにすること,および特に数値計算アルゴリズムについては実際に実用に耐えるものを構築することが目的である.本年度は,箱玉系の研究を中心に進めた.まず,有限離散戸田格子と箱玉系の関係についての基礎的な結果として,箱容量と運搬車容量と呼ばれる拡張を導入した箱玉系と対応する非自励の超離散可積分系についての結果を英文論文にまとめ,学術雑誌に投稿し出版された.この結果を念頭に置いて,有限超離散R_<II>格子と対応する箱玉系について解析を行ったところ,運搬車容量に加えて,あるルールに従って箱に蓋をするようなパラメータが導入されたものとなっていることが明らかになった.これは,箱容量がある場合に用いた手法を用いると,箱容量が時間と空間について可変になるような箱玉系と捉えることもできそうであるが,空間変数がソリトン単位であることが障壁となって,従来のKdV的な箱玉系の描像との対応についてはまだ明らかでない.この点については,次年度以降の課題として残されている.本年度は数値計算アルゴリズムについての研究を中心に行った.行列固有値計算アルゴリズムとしてよく用いられるdqds法の漸化式は,可積分系の観点から見ると非自励離散戸田格子の時間発展方程式と同一のものであり,具体的にHankel行列式で書ける初期値問題の解を与えることができる.そのために用いられる道具がモニックな有限直交多項式である.本研究では,モニックな有限R_<II>多項式に付随する非自励離散可積分系としてモニック型のR_<II>格子,およびその減算なしの漸化式を導出し,初期値問題の解について漸近解析を行うことで,これが一般化固有値を計算するアルゴリズムとなっていることを明らかにした.dqds法が三重対角行列を対象としていたのに対し,本研究で導出されたアルゴリズムは三重対角行列束を対象としたものとなっており,このクラスの問題に対しては,ある条件の下でパラメータを適切に選ぶことで従来法よりも高速・高精度に一般化固有値を計算できることが数値実験により確認された.以上の結果について,本年度は国内4件,国外2件の学会発表を行い,その報告として九州大学応用力学研究所研究集会報告に和文論文1編が掲載,数理解析研究所講究録にも和文論文が1編が掲載される予定となっている.また,英文論文1編を投稿中であり,そのプレプリントは既にarXivにて公開済みとなっている.加えて本年度は,本研究課題の背景にある直交関数系の理論と可積分系の関係について解説した和文論文を2名の共著者と執筆し,日本応用数理学会論文誌に投稿した.これについては,査読の結果採録が決定し,次号(23巻2号)に掲載される予定となっている.本年度は,非自励離散有限戸田格子と非自励離散有限Lotka-Volterra格子との間のMiura型変換と呼ばれるものを一般化し,有限R_<II>格子と非自励離散有限mKdV格子との間のMiura型変換を導出することに成功した. Miura型変換とは, mKdV方程式の解からKdV方程式の解への変数変換としてR. M. Miuraによって導出されたものに由来し,これが存在すればある力学系と別の力学系を同一の時間軸の上で直接的に結び付けることができる.例えば,非自励離散

有限戸田格子の変数はある三重対角行列の固有値へと収束する性質があるので,固有値計算へと応用することが可能である.一方,非自励離散有限Lotka-Volterra格子から非自励離散有限戸田格子へのMiura型変換が存在するので,非自励離散有限Lotka-Volterra格子を用いても三重対角行列の固有値が計算可能であることが直ちに示される.このように, Miura型変換を調べることは応用上も重要な問題である.有限R_<II>格子については,昨年度の研究で三重対角行列束の一般化固有値計算アルゴリズムへの応用がなされているが,今年度の成果によって,非自励離散有限mKdV格子によっても三重対角行列束の一般化固有値計算が可能であることが明らかとなった.この成果については,可積分系理論専門のオンラインジャーナルであるSIGMA誌に論文を投稿し,既に出版されている.また,学会発表を国内で2件行い,その報告として九州大学応用力学研究所研究集会報告に和文論文1編が掲載された.なお,ここに現れた非自励離散mKdV格子とは,運搬車付き箱玉系を最初に導出する際に用いられたものであり,理論的にも興味深い結果となっている.当初の計画通り,R_<II>格子の非自励パラメータが対応する箱玉系において果たす役割について基本的なことは解明され,また箱玉系の箱容量と超離散有限戸田格子の関係についての基礎的な理論については論文としてまとめられ出版された,次年度以降の研究を進めていくにあたり,土台は構築されたものと考える.RQ格子を用いた一般化固有値計算アルゴリズムが構成され,その有用性の一端も数値実験により確かめられた.以上が論文としてまとめられ投稿中であり,本年度までの計画については目的が達成されたものと考える.次年度は箱玉系についての研究をさらにすすめ,成果を論文にまとめることが目標である.また当初の計画通り,本年度の成果を踏まえて,有限R_<II>格子の数値計算アルゴリズム(行列の一般化固有値計算アルゴリズム)への応用についても本格的に着手していきたいと考えている.今年度は数値計算アルゴリズムについての研究が中心となり,箱玉系についての進展はあまり見られなかった.次年度は箱玉系についても研究を進めていきたいと考えている.また,今年度に構成された一般化固有値計算アルゴリズムについても,適用可能な問題のクラスが狭いという問題が残っており,この点についての改善も課題となっている.(抄録なし)
出芽酵母の細胞壁形成と核分裂をカップリングさせる細胞周期制御ネットワークの解析

出芽酵母において、有糸分裂開始前にグルカン合成が十分に行われることを保証する新たな『細胞壁チェックポイント』が存在することを提唱してきた。酵母細胞はグルカン合成が停止するとそれを感知してM期サイクリンClb2pを転写レベルで負に制御し、M期以前で細胞周期を停止する。そこで、この制御機構の詳細を明らかにするため、チェックポイント誘導時の転写制御と、チェックポイントがモニターする細胞壁欠損の解析を行った。細胞壁チェックポイントが誘導されると、M期サイクリンCLB1,2の転写因子であるFkh2pを介して発現制御している可能性を検証した。fkh2遺伝子破壊とwac1チェックポイント欠損の二重変異株ではグルカン合成停止時にwac1変異株のようには細胞周期停止をバイパスせず、M期以前で細胞周期を停止した。このことはfkh2遺伝子破壊がwac1変異を抑圧したことを示している。更に、グルカン合成停止時にFkh2pを過剰発現させると、M期進行が起き、細胞周期停止がバイパスされた。これらの結果は、細胞壁チェックポイントが誘導されると、Fkh2pを介してM期サイクリンの転写を制御することを示唆している。細胞壁チェックポイントがfks1変異(グルカン合成活性欠損)以外でも誘導されるかを確かめるため、グルカン合成酵素阻害剤であるEchinocandin B(EchB)と細胞壁構成成分であるマンノプロテインの合成に欠損を持つmnn10Δ変異による細胞周期進行への影響を調べた。EchB添加とmnn10Δ変異によりfks1変異株でみられたのと同様に、芽の形成が抑えられ、M期以前で、細胞周期が遅延していた。また、この細胞周期遅延はwac1変異によりバイパスされた。これらの結果から、細胞壁チェックポイントはグルカン合成だけでなく細胞壁合成全体、あるいは細胞壁の安定性をモニターしていると考えられた。出芽酵母において、核分裂が起こる前に細胞壁が十分に形成されることを保証する新たな『細胞壁チェックポイント』が存在することを明らかにしてきた。その機構には、ダイナクチン複合体の構成因子であるArp1が関与し、細胞壁合成が停止するとそれを感知してM期サイクリンClb2を転写レベルで負に制御することにより、紡錘体形成以前で細胞周期が停止することを示してきた。そこで、このチェックポイント機構を詳細に明らかにするために、細胞壁チェックポイント活性化時のスピンドル極体(SPB)の動向、チェックポイント欠損時の紡錘体の形態、紡錘体チェックポイントとの関連について解析した。SPBの構成因子であるSpc42とGFPとの融合タンパク質を発現させ、Spc42-GFPの蛍光抗体観察とその蛍光の輝度の測定を行うことにより、細胞壁合成停止時に細胞はSPBの複製後、SPBの分離前で細胞周期を停止していることが分かった。このことから細胞壁チェックポイントは細胞壁の異常に反応し、細胞周期をSPB分離前で停止させる新たなタイプの細胞周期制御機構であると考えられた。また、細胞壁チェックポイント欠損株では細胞壁合成停止時でも紡錘体が形成されるが、多くの細胞において紡錘体の伸長はみられなかったことから、細胞壁合成停止時にはM期への進行だけでなく、分裂中期から後期への移行においても未知の細胞周期制御が働いている可能性が示唆された。そのため、紡錘体チェックポイントとの関連が考えられたが、紡錘体チェックポイント因子であるMad2やBub2が細胞壁チェックポイントには関与していないこと、また細胞壁チェックポイント因子であるArp1は紡錘体チェックポイントに関与しないことから、細胞壁チェックポイントと紡錘体チェックポイントは異なることが明らかになった。現在、細胞壁チェックポイントに関与する新規因子単離のためのスクリーニングを行っている。

これらの結果から、細胞壁チェックポイントはグルカン合成だけでなく細胞壁合成全体、あるいは細胞壁の安定性をモニターしていると考えられた。
超高速デバイス用低干渉型III-V族半導体・シリコンヘテロ接合の製作と電子物性制御

従来のIII-V族半導体とSiで構成されるヘテロ接合では、相互拡散によりpn接合を構成することは期待できなかった。III族窒化物半導体とSiのヘテロ接合では、伝導形を制御することが期待できる。N原子はSi中で電気的に不活性であるので、Si側の界面はIII族窒化物から拡散したIII族原子によってp形を示すと期待できる。III族窒化物側に拡散したSi原子はInNやGaNなどのIII族窒化物においてn形不純物として振舞う。このことから、n形III族窒化物半導体とp形Siからなるヘテロ接合で、pn接合の形成が期待できる。本研究では、InNを、金属Inとrfプラズマ中で励起した窒素を原料とするMBE法によって、基板温度500°Cで成長した。成長層はRHEEDで配向性のあるリングパターンを示し、X線回折の結果、成長層の格子定数はInNのそれと一致した。また、XPS測定の結果より、成長層はInとNから構成されている。これより、成長層は多結晶InNと確認された。InN層の表面は鏡面で、禁制帯幅は1.96eVであった。不純物添加をしない状態で、成長層はn^+形の伝導形を示し、電子密度は3×10^<20>cm^<-3>、ホール移動度は28cm^2/Vsであった。Si上に成長した極薄膜InN(<3nm)を用いて、InN/Siヘテロ接合のバンドオフセットを、XPS法により決定した。InN/Siヘテロ接合のバンド配列はタイプIIである。InNの価電子帯の上端はSiのそれより1.60eV低エネルギー側に位置することが明らかとなった。InN/Siヘテロ接合はSi側から見て、正孔に対する障壁を形成することが示された。また、InNとSi基板の界面に形成される窒化シリコン(SiN)の形成機構について検討した。本研究ではシリコンよりも大きな禁制帯幅をもつ窒化インジウム(禁制帯幅:1.9eV)をシリコン上に結晶成長する手法を確立し、窒化インジウム/シリコンヘテロ接合の電気的性質が、ワイドギャップエミッタとして用いうる良好なものであることを示すことにある。分子線エピタキシー装置を用いてシリコン基板上に窒化インジウムを成長した.原料には金属インジウムと窒素ガスを用いた。窒素ガスは高周波プラズマ(13.56MHz)で分解し、励起活性種として基板に供給した。成長温度は500°Cとした。成長表面は鏡面を示し、電子線回折法の結果から、成長層は六法晶のc軸または立方晶[111]方向に配向性をもった多結晶であった.成長層のX線回折測定から求まる格子定数は,六方晶と仮定するとc=0.571nmであった。成長層の透過反射測定から,禁制帯幅は1.93eVと求まった.これらの値は窒化インジウムの報告値と一致しており、平坦性の良い窒化インジウムが得られた。成長層はn形で、室温におけるキャリア濃度は2.9×10^<20>cm^<-3>であった。シリコン基板上に4nm程度の極薄膜窒化インジウムを成長しXPS測定により、Si-InN接合界面における価電子帯側のバンドオフセットを測定した。シリコンの価電子帯は,窒化インジウムのそれより,1.49eV真空準位側と見積もれる。

Si-InN異種接合は正孔に対する障壁となりうるバンド構造といえる。従来のIII-V族半導体とSiで構成されるヘテロ接合では、相互拡散によりpn接合を構成することは期待できなかった。III族窒化物半導体とSiのへテロ接合では、伝導形を制御することが期待できる。N原子はSi中で電気的に不活性であるので、Si側の界面はIII族窒化物から拡散したIII族原子によってp形を示すと期待できる。III族窒化物側に拡散したSi原子はInNやGaNなどのIII族窒化物においてn形不純物として振舞う。このことから、n形III族窒化物半導体とp形Siからなるヘテロ接合で、pn接合の形成が期待できる。本研究では、InNを、金属Inとrfプラズマ中で励起した窒素を原料とするMBE法によって、基板温度500°Cで成長した。反射高速電子線回折(RHEED)、X線回折およびX線光電子分光(XPS)の結果から、成長層は多結晶InNと確認された。InN層の表面は鏡面で、禁制帯幅は1.96eVであった。不純物添加をしない状態で、成長層はn^+形の伝導形を示し、電子密度は3×10^<20>cm^<-3>、ホール移動度は28cm^2/Vsであった。Si上に成長した極薄膜InN(<3nm)を用いて、InN/Siヘテロ接合のバンドオフセットを、XPS法により決定した。InNの価電子帯の上端はSiのそれより1.60eV低エネルギー側に位置することが明らかとなった。InN/Siヘテロ接合はSi側から見て、正孔に対する障壁を形成することが示された。InNとSi基板の界面には窒化シリコン(SiN)層が1.5nm程度形成されていることをXPS法で明らかにした。Si基板の窒化実験の結果と比較することにより、InN/Si界面でのSiN層の形成には、Si表面に窒素の励起活性種が直接照射されることよる窒化と、InN/Si界面が形成された後の窒化の両方が同程度寄与していることを明らかにした。
表面形状・電位・分光特性が同時に測定可能な走査型フォース顕微鏡の開発研究

本研究では、まず、安定して表面近傍の高い引力勾配領域で接近走査するために、走査法にホッピング走査法という方法を適用した.この方法は、引力勾配を検出しながら、探針をサンプル表面に近づけ、引力勾配が設定値より大きくなった時点で探針位置を記憶する.次に探針がサンプルとぶつからない様に十分、探針を遠ざけ次の測定点に移動し、同様な操作を続ける.これらの操作を従来法とは異なるソフトウエアサーボにより実現した.この方法は、引力勾配を検出するロックインアンプとコンピュータの処理速度で全体の走査速度が律速されるため、高速なロックインアンプを購入するなどして、1点の測定が約0.1秒程度となり、ドリフトなどが問題にならない程度の高速化が実現された.この方法に引力勾配から表面電位分布測定する方法を適用することで、従来引力から表面電位分布を測定する方法に比べて、分解能が向上し、表面の凹凸変化が数百nm程度の急峻な勾配を持ち、導体、絶縁体部分を持つサンプルに対しても約2030nmの分解能で安定して像が得られるようになった(従来法の分解能数百nm).次にサンプルホルダをプリズムに厚さ100nm抵抗数ΩのITO薄膜電極をコートしたものを使い、サンプルホルダ裏面から照射する分光特性測定用光源として10mW830nm発振域の半導体レーザーを用いた.探針で散乱されるエバネッセント光の検出を試み、これにより探針とサンプル間距離により散乱光強度が変化することは確認できたが、像として得られるほどの感度が得られなかった.これはレーザーのパワーと検出系の感度が十分でなかったことが原因であると考えられる.以上、装置としては目的とした電位分布、表面形状と同時に分光特性を測定できる可能性を十分に確認でき、今後の研究に非常に有効な装置、及びデータが得られた.今後さらに光学系の改良を行えば、分光特性を明瞭に測定できると考えられる.本研究では、まず、安定して表面近傍の高い引力勾配領域で接近走査するために、走査法にホッピング走査法という方法を適用した.この方法は、引力勾配を検出しながら、探針をサンプル表面に近づけ、引力勾配が設定値より大きくなった時点で探針位置を記憶する.次に探針がサンプルとぶつからない様に十分、探針を遠ざけ次の測定点に移動し、同様な操作を続ける.これらの操作を従来法とは異なるソフトウエアサーボにより実現した.この方法は、引力勾配を検出するロックインアンプとコンピュータの処理速度で全体の走査速度が律速されるため、高速なロックインアンプを購入するなどして、1点の測定が約0.1秒程度となり、ドリフトなどが問題にならない程度の高速化が実現された.この方法に引力勾配から表面電位分布測定する方法を適用することで、従来引力から表面電位分布を測定する方法に比べて、分解能が向上し、表面の凹凸変化が数百nm程度の急峻な勾配を持ち、導体、絶縁体部分を持つサンプルに対しても約2030nmの分解能で安定して像が得られるようになった(従来法の分解能数百nm).次にサンプルホルダをプリズムに厚さ100nm抵抗数ΩのITO薄膜電極をコートしたものを使い、サンプルホルダ裏面から照射する分光特性測定用光源として10mW830nm発振域の半導体レーザーを用いた.探針で散乱されるエバネッセント光の検出を試み、これにより探針とサンプル間距離により散乱光強度が変化することは確認できたが、像として得られるほどの感度が得られなかった.これはレーザーのパワーと検出系の感度が十分でなかったことが原因であると考えられる.以上、装置としては目的とした電位分布、表面形状と同時に分光特性を測定できる可能性を十分に確認でき、今後の研究に非常に有効な装置、及びデータが得られた.今後さらに光学系の改良を行えば、分光特性を明瞭に測定できると考えられる.
血管石灰化の転写制御機構の解明

血管石灰化は、高齢者、糖尿病や腎不全患者で高率に認められ、内膜石灰化と中膜石灰化に大別される。また、弾性動脈や筋性動脈のどちらの石灰化も心血管イベントの発症を増加させる。これまで、石灰化は壊死過程の血管細胞にカルシウムが受動的に流入する動脈硬化の終末像として考えられてきたが、1990年にUCLAのBostromらが石灰化病変にBMP2(bone morphometric protein 2)の発現を示して以来、能動的なプロセスの存在が想定されてきた。しかしながら、血管石灰化の詳細なメカニズムについては不明である。そこで、本研究では、血管石灰化の分子機構を解析した。まず、私たちはCbfa1/Runx2が動脈硬化病変に発現し、平滑筋α-actinの発現とは相反する分布を示すことや、Cbfa1/Runx2がmyocardinの機能を抑制し、血管平滑筋細胞の分化を抑制すること、骨芽細胞特異的な遺伝子発現を増強し、ミネラル蓄積を促進すること、Notchの活性化は骨芽細胞への分化に重要な遺伝子Msx2の発現を増加させることが明らかにした。続いて、糖尿病や腎不全患者の血中に高レベルで存在するAGE(Advanced Glycation End-product)が血管石灰化を促進するか否かについて研究を進めた。AGEは受容体RAGE(Receptor for AGE)を介して細胞内情報伝達系を活性化することが知られていることから、RAGEを培養血管平滑筋細胞に強制発現し、AGEにて刺激をした。その結果、血管平滑筋細胞はアルカリホスファターゼや他の骨芽細胞特異的因子が陽性の骨芽細胞に変換した。また、そのメカニズムを解析した結果、RAGEの活性化はNotchシグナルを活性化することが明らかになった。RAGEシグナルとNotchシグナルが密接に相互作用することは世界に先駆けての発見であり、独創的な研究である。血管平滑筋細胞はプラーク内で未分化型へと形質転換し、動脈硬化進展因子を分泌し、血管内での炎症を波及させる。しかし血管壁石灰化における血管平滑筋細胞の役割に関しては不明である。近年、血管壁の石灰化の進展には血管壁細胞の骨分化に似た能動的な分子機序が一役担っている可能性が示唆され、その機序に骨分化に必須の転写因子であるCbfa-1の関連性が注目されている。私たちはこれまでにTGF-βはc-Src、SRF活性化を介し血管平滑筋細胞分化マーカーの発現を亢進させること、またFibroblast Growth Factor-2(FGF2)はSRFの転写活性を抑制しTGF-βの拮抗因子として働くことを明らかにしてきた。ヒト冠動脈アテレクトミー標本上、平滑筋α-actin陽性の細胞も中にはCbfa-1だけでなく、骨芽細胞分化に重要な因子であるBMP-2の標的因子であるMsx2も陽性を示す細胞も存在することが明らかになった。また、動脈硬化の基本的病態は炎症であるとのコンセプトが定着しているが、炎症反応が持続する分子機構については未だに不明な点が多い。内膜肥厚を伴う動脈壁中で、内膜平滑筋細胞は低酸素にさらされやすい。本研究では培養血管平滑筋細胞において低酸素に対する応答機構を検討した。その結果、低酸素下での培養により、PAI-1やVEGFの発現が亢進し、その過程にc-Srcのリン酸化が必須であること、およびc-Srcのリン酸化は、ミトコンドリア由来の活性酸素の産生によって引き起こされることを明らかにした。糖尿病や腎不全患者では高率に血管石灰化が見られる。

血管石灰化は内膜石灰化と中膜石灰化に大別されるが,いずれの石灰化も心血管イベントの発症を増加させる。しかしながら,血管石灰化の詳細なメカニズムについては不明である。私たちは糖尿病や腎不全患者の血中に高レベルで存在するAGE(Advanced Glycation End-product)が血管石灰化を促進するか否かを検討した。AGEは受容体RAGE(Receptor for AGE)を介して細胞内情報伝達系を活性化することが知られていることから,RAGEを培養血管平滑筋細胞に強制発現し,AGEにて刺激をした。その結果,血管平滑筋細胞はアルカリホスファターゼや他の骨芽細胞特異的因子(オステオポンチン,オステオカルシンなど)が陽性の骨芽細胞に変換した。また,そのメカニズムを解析した結果,RAGEの活性化はNotchシグナルを活性化することが明らかになった。私たちはこれまでにFGF2が平滑筋細胞の分化を抑制し,骨芽細胞への分化を促進すること,Cbfa1/Runx2が動脈硬化病変に発現し,平滑筋α-actinの発現とは相反する分布を示すことや,Cbfa1/Runx2がmyocardinの機能を抑制し,血管平滑筋細胞の分化を抑制すること,骨芽細胞特異的な遺伝子発現を増強し,ミネラル蓄積を促進すること,Notchの活性化は骨芽細胞への分化に重要な遺伝子Msx2の発現を増加させることが明らかにした。RAGEシグナルとNotchシグナルが密接に相互作用することは世界に先駆けての発見であり,独創的な研究である。
凍結ゲル内へのナノ粒子のin situ固定化による汚染物質除去フィルターの開発

ヒ素除去フィルターの開発を目的として、アクリルアミドをゲル骨格物質として、凍結ゲル調製後に鉄イオンを含浸させてゲル中で酸化水酸化鉄微粒子を精製させる含浸担持法、および凍結ゲル調製時にあらかじめ沈殿法で調製した酸化水酸化鉄微粒子を添加する微粒子添加法により、酸化水酸化鉄微粒子を内包した多孔質凍結ゲルの調製方法を確立した。調製した凍結ゲルのヒ素吸着特性を明らかにし、吸着除去条件を確立した。酸化水酸化鉄はアモルファス状態であるほうが吸着量が高いことを明らかにした。さらに多孔質凍結ゲルをカラムに充填した連続吸着実験を行った。多孔質凍結ゲルはヒ素の吸着速度が高く、吸着量も多いことを実証した。アクリルアミド、架橋剤、重合開始剤の水溶液を円筒形の容器に入れ、ー12ー20 °Cの凍結バスにて凍結し、約12時間ラジカル重合反応を行いポリアクリルアミド凍結ゲルを調製した。モノマー、架橋剤および開始剤などの濃度と凍結温度の調製条件がゲル構造におよぼす影響を明らかにした。得られた凍結ゲルをを塩化鉄(III)水溶液に浸漬し、ゲル壁内に鉄イオンを含浸浸透させた。その後取り出し、水洗後、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムもしくはアンモニア水溶液に浸漬し、ゲル壁内で酸化水酸化鉄のナノ粒子を析出させた(含浸担持調製法)。一方、予め塩化鉄(III)水溶液とアルカリ水溶液を混合して酸化水酸化鉄微粒子を生成させ、そこにアクリルアミド、架橋剤、重合開始剤の水溶液を加えて凍結ゲルとする調製も行った(沈殿物含有調製法)。塩化鉄濃度、アルカリ溶液の種類と濃度、析出過程の温度と時間、凍結ゲルの調製条件を変化させて、生成した酸化水酸化鉄の粒子形状をSEMで観察し、結晶構造と粒子径をXRDで測定し、粒径と分散状態を評価した。調製条件とナノ粒子形状との関係を明らかにした。さらに、ヒ素(V)の吸着実験を行い、調製条件と吸着特性を明らかにした。鉄酸化物沈殿そのものよりも、クライオゲルの方が100mg/g以上と非常に高いヒ素吸着量を示した。このことからゲル中で調製した鉄酸化物の微粒子はAs(V)の吸着能が高いことがわかった。また、沈殿物含有調製法クライオゲルの方が、含浸担持調製法クライオゲルよりも吸着量が高かったことから、より簡便な方法で、高い吸着力のあるヒ素吸着剤を調製できることが分かった。酸化鉄含有クライオゲルのXRD解析より、目立ったピークが観察されず、生成した鉄酸化物はアモルファス状態であると考えられる。アクリルアミドをゲル骨格物質として、凍結ゲル調製後に鉄イオンを含浸させてゲル中で酸化水酸化鉄微粒子を形成させる含浸担持法、および凍結ゲル調製時にあらかじめ沈殿法で調製した酸化水酸化輝微粒子を添加する微粒子添加法により、酸化水酸化鉄微粒子を内包した多孔質凍結ゲルを調製した。凍結ゲルの形状および酸化水酸化鉄の内包状態を観察し、最適な調製条件を明らかにした。また、内包されている酸化水酸化鉄をXRDにより分析した。さらにヒ素(V)の吸着平衡実験とカラム流通吸着実験を行った。沈殿法で調製した酸化水酸化鉄微粒子そのものよりも、凍結ゲル中に内包させた方が鉄重量あたりのヒ素の吸着量は高く、さらに微粒子添加法で調製した方がヒ素の吸着量は高かった。低いヒ素濃度からヒ素吸着量は高く、ヒ素濃度の増加と共に吸着量は緩やかに増加し、さらに高い領域でも吸着量が増加する傾向を示した。表面への吸着のみが起こる場合は、水相のヒ素濃度が高くなると吸着量が飽和に達して吸着が起こらない場合が多いが、凍結ゲルに内包させた酸化水酸化鉄は、ヒ素が高濃度となっても吸着量が増加しており、表面の吸着だけでなく、鉄との複合化合物や再溶解による共沈殿形成が示唆された。酸化水酸化鉄含有凍結ゲルのXRD分析より、沈殿形成させた酸化水酸化鉄や含浸担持法の凍結ゲルでは明確な酸化水酸化鉄の回折ピークが観察されたが、微粒子添加法の凍結ゲルでは明確なピークは見らず、アモルファス状態であることがわかった。酸化水酸化鉄内包凍結ゲルをガラスのカラムに充填し、流通法で吸着を行った。多孔質凍結ゲルとすることで通常のゲルに内包させるよりも吸着速度が速いことが確認された。プルシアンブルーナノ粒子を内包したアクリルアミド凍結ゲルを種々の条件で調製し、最適な調製条件を明らかにした。さらに、セシウムの吸着を行い、セシウムが吸着できることを実証した。

ポリアクリルアミドの凍結ゲル内に酸化鉄ナノ粒子を内包させた砒素の吸着フィルターを含浸担持調製法および沈殿物含有調製法で調製し、ゲル構造、ナノ粒子構造および砒素の吸着特性を明らかにすることが出来た。酸化鉄ナノ粒子が結晶性が低くアモルファス状態であるほうが砒素の吸着量が高くなり、また、これまで報告されている酸化鉄系吸着剤の砒素の吸着量にくらべ高い吸着量(100mg/g-dry gel)であることを示す事が出来た。これらの結果について論文としてまとめRecouces Processingに掲載された。一方、アクリルアミドゲルの調製にプルシアンブルーナノ粒子を添加する事により、プルシアンブルーナノ粒子内包凍結ゲルを調製することが出来、多孔質構造であることを確認出来た。以上の事からおおむね順調に進展していると評価した。工業物理化学・反応分離工学1.ナノ粒子を担持した凍結ゲルを用いた環境浄化フィルターの調製と浄化特性評ナノ粒子含有凍結ゲルの実際の分離プロセスでの利用形態で使用した場合の影響を検討する。ナノ粒子含有凍結ゲルをカラム内で調製しカラムフィルターで利用する場合、小さなナノ粒子含有凍結ゲルを大量に充填・積層したフィルターを形成する場合、ナノ粒子含有凍結ゲルを流動層状態で利用する場合、および回分操作について、砒素およびセシウムを含有した水の浄化処理を行い、処理量と除去特性の関係を明らかにし、利用方法を確立する。吸着剤の再生と繰り返し利用による除去特性、繰り返し利用の際の凍結ゲルフィルターの耐久性、廃棄の際の減容化について実証試験を行う。これらの成果を総合し、ナノ粒子含有凍結ゲルを利用した環境浄化フィルターの設計手法を確立し、実際の浄化プロセスの構築・提案を行う。2.金およびその他のナノ粒子を担持した凍結ゲルの開発と応用(大学生1名)調製した凍結ゲルへ、塩化白金酸水溶液を含浸浸透させ、その後、アルカリ水溶液やアスコルビン酸、ヒドラジンおよび尿素などの還元剤水溶液を含浸浸透させることによりゲル壁内で金ナノ粒子を形成させる。調製条件を変化させて、生成した金ナノ粒子の形状をSEMおよびTEMで観察し、粒径と分散状態を評価する。さらに、紫外可視吸収スペクトルによる金ナノ粒子の光学特性の評価を行う。調製条件とナノ粒子形状との関係を明らかにする。得られた金ナノ粒子内包凍結ゲルを用いて、硝酸態窒素の接触分解を行い触媒活性の評価を行う。凍結ゲル中に固定化された金ナノ粒子の表面修飾を検討する。チオール基の導入と抗体および官能基の固定化を行い、分子認識金ナノ粒子をin situで調製する。分子およびタンパク質との相互作用を吸着量測定、ラマンスペクトル、可視吸収スペクトルにより評価し、ゲルの色調変化から物質の高感度検出を目指す。物品費の中で、当初SEM観察に使用するオスミウムコーターを計画していたが、交付額の関係でオスミウムコーターに代わる機器の購入を検討していたが、適当な価格の機器が無かったために、物品費を使用しなかった。また、人件費・謝金については、研究を担当している修士学生のティーチングアシスタントや留学生チューターの採用で、研究補助による謝金支出が出来なかった。外部の研究補助の雇用を検討したが、適当な人材が見つからなかったために、使用できなかった。物品費については、本研究に必要かつ適切な機器・器具および試薬等を選定し、計画的に支出する。人件費・謝金については、研究補助の担当者として適当な人材が確保出来たため、雇用し研究補助を行い予定額の支出を行う。
長期的な前向きリンパ腫コホート研究の確立に基づく難治性リンパ腫の臨床病理学的研究

宮城県における悪性リンパ腫罹患数とそれを基にした罹患率および亜型分類不能症例を減じた亜型頻度の算出を目的とし、県内血液内科および他診療科と病理部門を対象として、2006年1月2010年12月に宮城県内で新規発症したリンパ腫とリンパ球性白血病2098例を解析した。生検により診断された症例が1853例、骨髄塗抹標本により診断された症例が232例、病理解剖により診断された症例が13例であり、10万人あたりの罹患率は5年平均で17.8となった。宮城県における罹患数とそれを基にした罹患率および亜型分類不能症例を減じた亜型頻度の算出を目的とし、県内血液内科および他診療科と病理部門を対象として、2006年1月2010年12月に宮城県内で新規発症したリンパ腫とリンパ球性白血病2098例を解析した。亜型頻度では、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非特異型(diffuse large B-cell lymphoma, NOS)37.6%、濾胞性リンパ腫(follicular lymphoma)15.7%、節外性濾胞辺縁体粘膜関連リンパ組織リンパ腫(extranodal marginal zone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT lymphoma)) 9.1%と続き、亜型分類不能症例は1.04%に留まった。各亜型における男女比では、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫は、欧米と異なり本邦では男性比率が高いことが報告されており、本研究でも2.89 (n=35)と同様の結果であった。成人T細胞性白血病/リンパ腫0.71(白血病型0.42)とMALTリンパ腫0.56(消化管0.6,非消化管0.49)にて女性比率の高さが明らかとなった。double hit lymphomaの臨床病理学的検討を行う予定であったが、DLBCLにおけるBCL2/MYC遺伝子再構成の検討例が限られていたため症例抽出が困難であった。昨年に引き続き、疫学調査として宮城県におけるリンパ腫の登録調査を進めている。従来の疫学調査は血液内科を中心としているためにデータ収集が困難とされた消化管・皮膚原発リンパ腫についても県内血液内科および他診療科と病理部門を対象にして、2006年1月2010年12月に宮城県内で新規発症したリンパ腫とリンパ球性白血病2098例を解析した結果を報告し(Leu Lym. 2017; 58: 80)、本年度はさらに消化管原発リンパ腫に着目して解析した。5年間で新規発症した消化管原発リンパ腫は350例であり、発症頻度は10万人あたり17.8人、亜型頻度ではdiffuse large B-cell lymphoma(DLBCL-NOS)47.4%、MALTlymphoma 32.6%、follicular lymphoma(FL) 8.3%と続き、成熟T細胞性リンパ腫は7.4%に留まった。部位別頻度では、胃原発92%、小腸14%、大腸14%と続き、いずれもDLBCL-NOSが半数以上だが、十二指腸は約7割をFL、多発病変は約5割を成熟T細胞リンパ腫が占める特徴がみられた。部位特異的な疾患として十二指腸原発FLの臨床病理学的特徴をみると、対象20例の年齢中央値63才、女性に多く(男女比0.53)、1例の形質転換例を除くと6例がリツキシマブ療法、14例が無治療経過観察のみで、観察期間中央値49.5ヶ月時点で1例の他癌腫合併例を除く全例が有病生存しており、非常に緩徐な経過であることが明らかとなった。また、腸管内の複数の部位に渡って多発する腸管原発T細胞リンパ腫は希少疾患であるが、2002年から2015年の14年間で臨床経過追跡可能であった22例の年齢中央値68才、男性に多く(男女比2.67)、亜型頻度をみると(成人T細胞性リンパ腫は除く)、末梢性T細胞リンパ腫(PTCL-NOS)59%、腸管症関連T細胞リンパ腫41%であった。臨床病理学的には亜型分類に関わらずKi-67発現が予後因子となることを見いだした。昨年に引き続き、疫学調査として宮城県におけるリンパ腫の登録調査を進めた。従来の疫学調査は血液内科を中心としているためにデータ収集が困難とされた消化管・皮膚原発リンパ腫についても県内血液内科および他診療科と病理部門を対象にして、2006年1月2010年12月に宮城県内で新規発症したリンパ腫とリンパ球性白血病2098例を解析した結果を報告した(Leuk Lymphoma. 2017;58:80)。前年度消化管原発リンパ腫に着目して解析した結果を、現在投稿中である。本年度は、濾胞性リンパ腫の形質転換における形態像と染色体異常に関する解析、皮膚リンパ腫の稀少病型に着目して解析を行った。

濾胞性リンパ腫はB細胞リンパ腫全体の約2割を占め,我々の疫学調査でも近年増加しつつある疾患であるが、その予後を規定する因子として形質転換は重要なイベントである。BCL2遺伝子転座およびMYC遺伝子転座を有するdouble hit follicularlymphomaと診断された形質転換例を解析し、病態と形態像に解離を認めることから形質転換における染色体異常の重要性を報告した(Leuk Lymphoma. 2018;59:758)。皮膚原発T細胞リンパ腫(CTCL)の多くは緩徐な経過をたどるが、稀にCD56陽性例が存在することが報告されている。CD56陽性CTCL(6例)を解析し、CTCL全集団と比較して生存期間が短く、Ki-67陽性率が高い特徴を有すること、さらに細胞障害性因子であるTIA-1発現がCD56陽性CTCLにおける予後因子の可能性を見いだした。宮城県における悪性リンパ腫罹患数とそれを基にした罹患率および亜型分類不能症例を減じた亜型頻度の算出を目的とし、県内血液内科および他診療科と病理部門を対象として、2006年1月2010年12月に宮城県内で新規発症したリンパ腫とリンパ球性白血病2098例を解析した。生検により診断された症例が1853例、骨髄塗抹標本により診断された症例が232例、病理解剖により診断された症例が13例であり、10万人あたりの罹患率は5年平均で17.8となった。免疫染色にてBCL2/MYCが強発現しているDLBCLをdouble expression lymphoma症例として抽出し、G分染やFISH解析を追加して両遺伝子再構成を認めるdouble hit lymphoma症例を抽出する。Double expression lymphomaとdouble hitlymphomaの両者で臨床病理学的特徴を検討する。さらに、double hit lymphomaの一部は濾胞性リンパ腫からの形質転換と推定されており、MYC転座陽性濾胞性リンパ腫の抽出とその遺伝子解析を行い、必要量の検体が入手できる例を対象に網羅的ゲノム解析(全エクソンシークエンス)を行う。当初の計画では、免疫不全関連リンパ増殖性疾患の臨床病理学的解析を行う予定であったが、腸管原発T細胞リンパ腫においてindolentな病型が近年報告されているが希少疾患ゆえにその特徴について特にaggressiveなタイプとの違いや鑑別については明らかにされていないため腸管原発T細胞リンパ腫に着目した解析を追加する。double hit lymphomaについては、免疫染色にて診断不可であることが臨床上最大の問題点であり、まずBCL2/MYCが強発現しているDLBCLをdouble expression lymphomaとして抽出し、G分染やFISH解析を追加して両遺伝子再構成を認めるdouble hit lymphomaとして抽出し、両者を詳細に比較検討することで、免疫染色での鑑別を試みたい。血液病理学年度内で行うべき研究については、使用する費用が充足したため。次年度の研究での使用できることが見込まれたため保留とした。年度内で行うべき研究については、使用する費用が充足したため。次年度の研究にあわせて使用予定。
甲状腺未分化癌の脱分化に関わる遺伝子発現異常の研究

甲状腺未分化癌における脱分化の期序を知る目的で遺伝子DNAのメチル化による遺伝子発現の変化についての検討を行った。甲状腺未分化癌細胞株5株(ACT-1,KTC-1,TTA-1,OCUT-1,OCUT-2)を用いた検討から、いずれの細胞株でもP16遺伝子の発現異常が確認された。ACT-1,OCUT-1,OCUT-2ではメチル化が、KTC-1では遺伝子の欠失が、TTA-1では遺伝子変異が認められる結果であった。また、TTA-1ではE-cadherin遺伝子のメチル化が認められたが、他の細胞株ではメチル化は認められなかった。また、BRCA-1,DAP kinase,h MLH-1遺伝子のメチル化はいずれの細胞株でも認められなかった。甲状腺の発生・分化に関係すると考えられる遺伝子、TTF-1,PAX-8はいずれの細胞株にとても発現が認められており、脱メチル化剤である5Aza-dCの暴露によって発現に変化は認められなかった。また、脱分化剤の暴露によっても、細胞の分化を示すような形態変化は認められなかった。以上より、甲状腺未分化癌細胞株における遺伝子のメチル化による発現異常は限られた遺伝子にのみみられ、過去の報告で示唆されているような普遍的な変化ではないと考えられた。さらに、脱メチル化剤による細胞増殖の変化について検討したが、有意な効果を認めることができなかった。甲状腺未分化癌に見られる特徴的な遺伝子発現以上のひとつとして、p16遺伝子の発現低下が示された。p16の発現低下は、細胞回転のG1期におけるチェックポイントの破綻により、癌細胞の無秩序な増殖を引き起こす。甲状腺癌の脱分化による未分化転化の過程において、G1チックポイントが重要な働きをしているものと考えられた。1)甲状腺未分化癌細胞株でのDNAメチル化の検討を行った。われわれの樹立したOCUT-1,OCUT-2に加え、国内の樹立株ACT-1,KTC-1,TTA-1を対象とし、P16遺伝子のプロモーターCpG islandのメチル化を検討した。OCUT-1,OCUT-2、ACT-1ではp16遺伝子のメチル化が明らかに認められ、KTC-1,TTA-1では、各々遺伝子挿入、欠失を疑わせる異常なサイズのバンドが検出された。これらはDNA配列をシークエンスにより確認する必要があり、来年度の課題としている。現在、脱メチル化剤により処理した細胞からの遺伝子を抽出し終えており、確認実験中である。今後他の遺伝子(hMLH1,DAP-kinase,THBS1,TIMP-3など)のメチル化の検討を予定しているが、特異的プライマーの作成、条件設定は終了している。2)脱メチル化処理によって、各々の細胞株でのサイログロブリンmRNAの発現をRT-PCR法で検討することを目的として細胞株を脱メチル化処理した後、mRNAを抽出してcDNAを作成した。現在、サイログロブリンに特異的なプライマーを用いてmRNAの発現を検討している。さらに、甲状腺の分化に関わるTTF-1,-2,PAX8,Na/IポンプやTSH受容体のmRNAについても検討を予定し、特異的プライマーを作成し、条件設定は終了している。3)培養液中に脱メチル化剤を添加した際の細胞増殖の変化をMTT法を用いた細胞のviabilityから検討した。同時に、形態の変化を観察し、脱メチル化剤添加による増殖抑制と細胞の星状の形態への変化が確認された。繰り返し実験による確認中である。以上の他、現在OCUT-3の樹立と細胞学的性質の解析を行っている。また、OCUT-1のテロメア解析を共同研究により進めている。

研究補助の決定が10月末でありました関係で、研究の開始時期が遅くなりました。今年度の検討結果は予定のほぼ半分でありますが、準備、条件設定はほぼ終了しており、来年度中に結果を出すべく検討を続行中です。1)甲状腺未分化癌細胞株でのDNAメチル化の検討を行った。OCUT-1,OCUT-2、ACT-1,KTC-1,TTA-1ではいずれもp16遺伝子のメチル化が認められた。他の遺伝子(hMLH1,DAP-kinase,E-Cad herin)のプロモーターCpG islandにおいても高頻度にメチル化が認められた。臨床検体を用いた実験では、マイクロダイセクションによる遺伝子DNAの抽出が予想に反して不安定であり、結果を出すことができなかった。手術後の標本の固定状態に難があるためと考えられ、この部分の計画を断念した。少数の新鮮標本より抽出したDNAでは異常なメチル化を観察し得なかった。以上の結果は、本研究の助成決定後に発表された論文(Schagdarsurengin U, et al. Thyroid 2006)の内容とよく一致していた。2)脱メチル化処理によって、各々の細胞株でのサイログロブリンmRNAの発現をRT-PCR法で検討することを目的として細胞株を脱メチル化処理した後、mRNAを抽出してcDNAを作成した。サイログロブリンに特異的なプライマーを用いてmRNAの発現を検討したところ、mRNAの発現状態に変化は認められなかった。さらに、甲状腺の分化に関わるTTF-1,-2,PAX8のmRNAについても検討を行ったが、明らかな発現状態の変化を観察し得なかった。3)培養液中に脱メチル化剤を添加した際の細胞増殖の変化をMTT法を用いた細胞のviabilityから検討した。同時に、形態の変化を観察し、脱メチル化剤添加による増殖抑制が確認された。しかしながら、分化度の変化と思われるような形態学的変化を認めることはできなかった。4)脱メチル化処理によって、各々の細胞株でのテロメラーゼの発現をTRAP法で検討することを目的として細胞株を脱メチル化処理した後、検討を行った。上述の増殖抑制に伴う変化があったものの、直接に発現を抑制していると思われるような大きな変化を認めなかった。以上の他、現在OCUT-3、4の樹立と細胞学的性質の解析を進めている。現在まで、継代は約15代を経て細胞の成育は続いている。