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相性の定量化による協調作業の個人技能・集団技能統合アシスト

本研究課題では,複数の人間が介在する協調作業における集団技能要因の定量評価手法およびアシスト手法を提案した.協調作業では,他者の影響に伴う操作量が発生する.本研究では,これを「気づかい」とよび,機械学習により予め学習した単独作業モデルによる予測操作量との差分として定義する.本課題では,協調作業で各操作者が発する「気づかい」のバランスと,個人技能の影響を考慮した相対的なパフォーマンスとの間に相関性があることが認められた.さらに,そのバランスを用いたアシストにより,パフォーマンスに影響を与えることが示唆された.今後,「気づかい」を精査し,新たなチームワークアシストへと展開する.本課題は,相性の定量評価による個人技能および集団技能(チームワーク)の双方を総合的に促進する個人技能・集団技能統合熟達支援システムを目指す.人間機械系研究の多くは,個人技能に着目したものが多く,人間同士のチームワークについてはあまり論じられていなかった.そこで,本課題はチームワーク作業解析を目的とした実験プラットフォームの開発および協調評価指標としての気づかいの定量化および個人・集団技能アシストシステムの構築を目的としている.平成27年度は実験プラットフォームの開発および基礎理論の検証を中心に取り組んだ.実験プラットフォームは,ヘッドマウントディスプレイを用いて4人まで同時に参加できる仮想空間内でのタスクを設定した.現在の操作入力インタフェースはプロトタイプとして,フォースフィードバックのない回転検出のみで実装している.今後フォースフィードバックインタフェースの開発および実装に注力する.基礎理論については,複数の操作者の介在するタスクにおける気づかい量を推定するため,実験データログの収集を行っている.また,実験作業効率の向上のため,ニューラルネットワークにより学習した人間モデルを協力者に見立て,人数の変化に対する気づかいの変化を観測した.その結果,作業の参加人数が増えるほど,互いの気づかいと作業効率の関係性が薄れる傾向があることを確認した.この知見は,今後のチームワークアシストの生成において活用していく.また,個人技能については,操作者の戦略を推定する新しい熟達指標を提唱し,その有効性について検証を行った.これは,作業において迅速性・精確性のどちらに重きをおいているかをリアルタイムに推定することに成功した.今後,これらを用いた新しい個人技能アシストを検証する.おおむね順調に進展している.本課題に関する研究として国際会議2件,国内学会2件で発表している.引き続き成果を出していきたい.本研究は,複数の人間が介在する協調作業におけるチームワークに焦点をあてた,新しいアシスト手法について研究を進めてきた.そのキーワードとして,「気づかい」の定量評価手法を提案し,その応用可能性について検討している.これまで協調作業環境として,VR技術を用いた複数人により端点を把持されたプレート上においたボールをコントロールするプラットフォームを構築した.これにより,協調作業の総合的なパフォーマンスを集団技能として計測が可能となった.本年度は,個人技能と集団技能の比率を考慮した新しい集団技能評価指標を定義し,各操作者が発する「気づかい」のバランスとの関係について実験検証を行った.この結果,発する気づかいのバラつきが,集団技能に影響を与えることが示唆された.さらに,3名以上の作業タスクへ拡張するため,「気づかい」のバランスを,個々の発する気づかいの分散値として評価可能であることを明らかにした.さらに,作業者個人の技能向上については,操作対象のダイナミクスを気づかれることなく修正するサブリミナルキャリブレーションについて,異なる形状のインタフェースにおける評価を行い,その有用性を確認している.さらに,追従誤差の挙動に注目した機械操作熟達の過程を評価する新しい指標を提唱し,その有効性を確認した.今後,これらの個人技能を高めるアシストに加え,提案した「気づかい」に基づくチームワーク支援を組み合わせることで,新たな集団技能のアシスト手法を提唱する予定である.本課題において,これまでに行ってきた研究内容は主に以下の2点に大別できる.すなわち.1)「気づかい」の定量評価とそのバランスに注目した協調作業評価,2)操作者に気づかれずに機械ダイナミクスを修正するサブリミナルキャリブレーションによる個人技能向上,である.このうち,1)の「気づかい」は,VR空間内に協調作業プラットフォームを構築済みであり,1ー4名の実験協力者による作業評価が可能となっている.また,協調作業のパフォーマンスと「気づかい」のバランスに相関関係を見出している.これにより,協調作業パフォーマンスを高めるアシストを,「気づかい」にもとづいて設計することが可能となった.現在,この作業プラットフォームを拡張し,作業者が互いの力を感じられるよう,バイラテラル制御系の実装を行っている.これにより,他者の行動や意図を感じやすくなり,より厳密な意味での「気づかい」が抽出可能となると期待できる.力の相互作用の影響については,今秋に学会発表を行う予定である.2)の個人技能の向上は,操作対象のダイナミクスを修正するため,様々な応用が可能である.これまで,1自由度のジョイスティックや自動車運転を想定したステアリング形状,さらに3次元加速度センサによるワイヤレスデバイスなどに適用し,その有効性を確認している.さらに,熟達過程における位置誤差重視・速度誤差重視の傾向をエラーアトラクタにより,評価する手法を提案した.これにより,操作者の熟達特性を考慮した新しいアシストへの展開が期待できる.人間機械系研究の多くは,個人技能に着目したものが多く,人間同士のチームワークについてはあまり論じられていなかった.複数の人間が介在する協調作業では,個人のスキルに加え,他者との協調性に起因する集団技能(チームワーク)が重要となる.これまで,チームワークに関する研究は,アンケートによる主観的な事後評価が一般的であった.

本研究課題では,このチームワーク要因として,個人作業と協調作業の操作入力特性の変化に注目した.具体的には,事前に各実験協力者に単独作業を行ってもらい,その操作量決定モデルをニューラルネットワークにより学習する.次に,複数の操作者が同時に介在する協調作業を実施し,単独操作モデルの予測出力と協調作業時の操作量の差をリアルタイムに計測した.この差は,この差は他者の介在に伴う操作量の変化であり,本研究では「気づかい」と定義した.複数の操作者が介在する協調作業実験において,この「気づかい」のバランスと,操作パフォーマンスの関係を明らかにし,世界に例のない「気づかい」の定量評価に基づくチームワークアシストを提唱した.本課題では,正方形の板の端点を最大4名の実験協力者が把持し,板の上のボールを制御するタスクを実験対象とした.この作業空間はVRで構成され,ランダムに変化する目標ターゲットへいかに近づけているかを協調作業パフォーマンスとして評価対象とした.実験の結果,各操作者が発する「気づかい」のバランスを制御することで,作業パフォーマンスの向上,すなわちチームワークアシストが可能であることが示唆された.しかし,まだ個人差の課題が残っており,効率の改善が見込まれる.また,「気づかい」をキーとするメンバー間の相性の存在が示唆された.今後,これらの要因を追究することで,さらなるアシスト効果の改善と,理論の体系化を行う予定である.本研究課題では,複数の人間が介在する協調作業における集団技能要因の定量評価手法およびアシスト手法を提案した.協調作業では,他者の影響に伴う操作量が発生する.本研究では,これを「気づかい」とよび,機械学習により予め学習した単独作業モデルによる予測操作量との差分として定義する.本課題では,協調作業で各操作者が発する「気づかい」のバランスと,個人技能の影響を考慮した相対的なパフォーマンスとの間に相関性があることが認められた.さらに,そのバランスを用いたアシストにより,パフォーマンスに影響を与えることが示唆された.今後,「気づかい」を精査し,新たなチームワークアシストへと展開する.実験プラットフォームが完成したことから,引き続き実験データを蓄積し,新たな理論展開を目指す.今後,力覚フィードバックを協調作業プラットフォームへ実装し,力の相互作用を伴う協調作業での「気づかい」評価を行う.さらに,複数の単独作業モデルを導入することで,リーダーシップ特性と適応特性として「気づかい」を分割した場合について,どのような傾向が発生するか,さらに作業者間相性についてより深く追究する.また,同時に脳波計を導入し,「気づかい」と脳波の関係についても基礎的な知見を蓄積し,アシスト効率の向上を図る.また,個人技能アシストと協調作業アシストを同時に行った場合の影響について実験検証をすすめる.
次世代発酵技術のための酸化発酵の理解：追随する細胞内代謝の制御

酸化発酵は、高速高効率な微生物変換系であり、次世代発酵技術の基盤として期待されている。本研究では、酢酸菌細胞外での酸化反応の後に進行する細胞内資化系に焦点を当て、その制御機構を明らかにすることを目指した。本研究では、5ケトグルコン酸(5KGA)発酵をモデルとして、以下の成果を得た。(1)5KGAの細胞内輸送に関わる分子を見出した。(2)5KGA資化の発現には、輸送体分子の機能より細胞内資化系の活性化が重要であった。(3)5KGA生産時に発現する制御因子を見出し、本分子が追随して進行する細胞内代謝に重要であることを示した。これらの成果は、安定な5KGA酸化発酵系の構築に繋がると期待される。「酸化発酵」は、多彩な糖類を細胞外で強力に酸化して、ほぼすべての酸化生成物を培地中に蓄積する酢酸菌に特徴的な代謝系である。本代謝系は次世代発酵技術の基盤としても魅力ある反応系であり、その理解が求められている。最近、自然発生的変異株が単離され、酸化発酵に追随して、蓄積した生成物を細胞内に取り込み・資化・再増殖する現象が確認された。このことは、酢酸菌は酸化生成物の資化能を有しているにも関わらず、潜在的に抑制して酸化発酵を進めていることを示し、生理学的に興味深い。本研究課題は、酸化発酵を利用する上で新たな課題として見出された「追随して進行する細胞内代謝」の分子機構を解明して酸化発酵の理解を深め、その知見を新規発酵技術に展開することを目指している。平成27年度は、以下の研究を行い下記のような成果を得た。1.5KGAの資化に関わる分子群、とくに5KGAの細胞内輸送に関わる遺伝子の探索と同定ゲノム公開株について希少糖5KGAの細胞内輸送に関わる輸送体遺伝子の特定に注力した。ゲノム情報から、5KGA資化に関わる酵素近傍に位置する推定輸送体遺伝子に着目し破壊株を作成した。野生株は生成した5KGAを細胞内に取り込んで再増殖するのに対し、遺伝子破壊株は、培地中に安定に5KGAを蓄積するようになり再増殖はみられなかった。自然発生変異株についても、当該遺伝子の破壊により5KGAの安定生産が可能となったことから、本遺伝子が5KGAの細胞内輸送に寄与していることが明らかとなった。興味深いことに、公開されている酢酸菌のゲノムを広く調査すると、本遺伝子の相同性および周辺遺伝子の配座に基づいて2つのタイプに分類でき、このタイプの違いが5KGA輸送能に密接に関係していることを見出した。平成27年度の目標であった5KGAの細胞内輸送体遺伝子の同定について、ゲノム公開株についてはすでに完了した。現在、自然発生株と野生株の輸送体遺伝子における変異について調査しているところであり、大幅な遅延なく進展していると判断した。平成28年度は、以下の研究を行い下記のような成果を得た。1.自然発生変異株の変異箇所の同定と関連分子の生化学的解析昨年度、特定に成功した希少糖5-ケトグルコン酸(5KGA)の細胞内輸送に関わる輸送体遺伝子について、塩基配列を調査して比較解析を行った。ゲノム公開株と比較すると輸送体遺伝子に数塩基のミスマッチが確認されたが、自然発生変異株間では完全に一致していた。このことから、「酸化発酵に追随して進行する細胞内代謝」は輸送体遺伝子の変異に起因するものでないと判断した。現在、転写調節因子の変異を視野に入れて、変異箇所の同定に取り組んでいる。一方、5KGA輸送体遺伝子について、破壊株を用いて基質の取り込み能を調査した。本分子は5KGAだけでなくグルコン酸に対する取り込み能を示したが、2-ケトグルコン酸(2KGA)は全く取り込むことがなかった。以上のことから、本分子は5KGAおよびグルコン酸の取り込みに機能していることを明らかにした。平成28年度の目標であった5KGA輸送体の分子機能についての調査は完了した。現在、細胞内代謝の引き金となる重要変異点を調査しているところであり、大幅な遅延なく進展していると判断した。このことは、酢酸菌は酸化生成物の資化

能を有しているにも関わらず、潜在的に抑制して酸化発酵を進めていることを示し、生理学的に興味深い。本研究課題は、酸化発酵を利用する上で新たな課題として見出された「追随して進行する細胞内代謝」の分子機構を解明して酸化発酵の理解を深め、その知見を新規発酵技術に展開することを目指している。平成29年度は、以下の研究を行い下記のような成果を得た。3)定量的リアルタイムPCRによる転写調節の解析と代謝変化を誘引するシグナルの特定昨年度の結果より、希少糖5-ケトグルコン酸(5KGA)の細胞内代謝には、5KGAの細胞内輸送分子および5KGA代謝酵素の発現誘導に関わる転写因子の存在が示唆された。この転写因子が、輸送体と同様にグルコン酸代謝関連転写調節因子gntRが関与することを推測し、そのホモログの探索を行った。その結果、gntR4と名付けた因子が、その欠失破壊により5KGAの取込・資化に遅延が生じ、5KGAの「追随して進行する細胞内代謝」の中枢であることを明らかにした。一方、定量的リアルタイムPCRの結果、gntR4破壊株では、輸送体分子(GntP)および代謝酵素(5KGR)の発現が抑制されていたが、完全に抑制されることはなかった。以上のことから、5KGAの細胞内代謝は複雑な制御下にあることが伺い知れた。現在、転写調節因子gntR4がどのようなシグナルを検知しているのか、その特定に取り組んでいるところである。酸化発酵は、高速高効率な微生物変換系であり、次世代発酵技術の基盤として期待されている。本研究では、酢酸菌細胞外での酸化反応の後に進行する細胞内資化系に焦点を当て、その制御機構を明らかにすることを目指した。本研究では、5ケトグルコン酸(5KGA)発酵をモデルとして、以下の成果を得た。(1)5KGAの細胞内輸送に関わる分子を見出した。(2)5KGA資化の発現には、輸送体分子の機能より細胞内資化系の活性化が重要であった。(3)5KGA生産時に発現する制御因子を見出し、本分子が追随して進行する細胞内代謝に重要であることを示した。これらの成果は、安定な5KGA酸化発酵系の構築に繋がると期待される。平成28年度以降については、5KGA細胞内輸送体の機能および発現調節について明らかにするために、以下のような研究を推進していく。平成28年度には、5KGA輸送体の機能を明らかにするために、扱いやすく進行の早いゲノム公開株を中心に解析を進めていき、遺伝情報が乏しい自然発生変異株については、ゲノム公開株の情報を参考にしながら進めていく。平成29年度には、5KGA輸送体の発現調節について定量的リアルタイムPCRを行いながら、代謝変化の誘引に寄与するシグナルおよび転写調節因子について明らかにしていく。平成29年度については、細胞内代謝を誘導するシグナルを明らかにするために、5KGA輸送体の発現調節について定量的リアルタイムPCRを行いながら、代謝変化の誘引に寄与するシグナルおよび転写調節因子について明らかにしていく。応用微生物学
ナノプローブTEMによる炭素ナノ材料の表面原子構造操作と電気伝導機構の可視化

本研究は,透過電子顕微鏡(TEM)下でのナノプローブ操作により,炭素系ナノ材料の表面原子構造に対し直接物理的・化学的に操作し,同時に電子物性を評価・計測することから,材料の表面原子構造と電気伝導特性の制御と設計に関する新しい知見を得ることを目的とする.具体的には,TEM内でのナノプローブ操作と電子線ホログラフィーにより,ダイヤモンド表面,カーボンナノチューブ表面の気体分子の吸着・脱離現象と表面電子物性との関係及び電気伝導機構を明らかにする.バイアス印加中のカーボンナノチューブの内部電位計測はカーボンナノチューブの電気伝導を探る上でも極めて興味深い.これまでに,電子線ホログラフィー法による多層カーボンナノチューブの観察を実施し,電気伝導機構解明のための内部電位分布の解析についての予備的検討を行った.電子線ホログラフィーによるカーボンナノチューブの内部電位データ取得には15秒程度の露光時間を必要とする.現状のTEMにおいてはこの間の振動や試料ドリフト等が大きいため,これらの影響を如何に少なくするかが技術的課題であることがわかった.また,バイアス印加状態のカーボンナノチューブに対して金属プローブを押しつけることにより曲げ変形応力を印加した。この際のカーボンナノチューブ表面の構造変化と電流-電圧特性との関係について評価した.曲げ変形によりカーボンナノチューブの各層に弾性変形によるたわみが生じると,電気伝導が低下するスイッチング動作を示すことを判明している.一方,ダイヤモンド表面に水素や酸素等を終端させる超高真空処理装置を開発し,CVD合成の多結晶ダイヤモンド表面を水素終端させた試料を用いて,TEM内でのナノプローブ操作による電界放出特性について観察を実施した.TEM内での5分程度の電子線照射により,多結晶ダイヤモンド表面がアモルファス化することが観察された.このため,電界放出特性のその場観察を実現するには,電子線照射量を最適化する必要性があることが明らかとなった。本研究は,透過電子顕微鏡(TEM)下でのナノプローブ操作により,炭素系ナノ材料の表面原子構造に対し直接物理的・化学的に操作し,同時に電子物性を評価・計測することから,材料の表面原子構造と電気伝導特性の制御と設計に関する新しい知見を得ることを目的とする.具体的には,TEM内でのナノプローブ操作と電子線ホログラフィーにより,ダイヤモンド表面,カーボンナノチューブ(CNT)表面の気体分子の吸着・脱離現象と表面電子物性との関係及び電気伝導機構を明らかにする.これまでに,バイアス印加状態でCNTに対して金属プローブによる曲げ変形応力を印加し,その際の表面構造の変化過程と電流-電圧特性との関係を評価した.CNTは曲げ変形により各層にたわみ(弾性変形)生じると電気伝導が低下するスイッチング動作を示すことを明らかにした.また,電子線ホログラフィー法による多層CNTの観察を実施し,電気伝導機構解明のための内部電位分布の解析についての予備的検討を行った.電子線ホログラフィーによるCNTの内部電位データ取得には15秒程度の露出時間を必要とする.したがって,その間の振動,試料のドリフト等の影響を以下に少なくするかが,技術的課題であることがわかった.CNTに対してバイアス印加中のCNTの内部電位計測はCNTの電気伝導を探る上でも極めて興味深い.データ取得へ向けて実験手法の構築を目指して検討を行っている.一方,TEM試料として用いるダイヤモンド単結晶表面に水素や酸素を終端させる予備装置の開発にも取り組んでおり,その場計測を可能にする最適な試料の作製についても検討を進めている.本研究は,透過電子顕微鏡(TEM)下でのナノプローブ操作により,炭素系ナノ材料の表面原子構造に対し直接物理的・化学的に操作し,同時に電子物性を評価・計測することから,材料の表面原子構造と電気伝導特性の制御と設計に関する新しい知見を得ることを目的とする.具体的には,TEM内でのナノプローブ操作と電子線ホログラフィーにより,ダイヤモンド表面,カーボンナノチューブ表面の気体分子の吸着・脱離現象と表面電子物性との関係及び電気伝導機構を明らかにする.バイアス印加中のカーボンナノチューブの内部電位計測はカーボンナノチューブの電気伝導を探る上でも極めて興味深い.これまでに,電子線ホログラフィー法による多層カーボンナノチューブの観察を実施し,電気伝導機構解明のための内部電位分布の解析についての予備的検討を行った.電子線ホログラフィーによるカーボンナノチューブの内部電位データ取得には15秒程度の露光時間を必要とする.現状のTEMにおいてはこの間の振動や試料ドリフト等が大きいため,これらの影響を如何に少なくするかが技術的課題であることがわかった.また,バイアス印加状態のカーボンナノチューブに対して金属プローブを押しつけることにより曲げ変形応力を印加した。
細胞表層設計に基づいた希土類金属の高度分離のための新規吸着剤の開発

先端材料に不可欠な希土類金属は安定な供給が難しいため、高効率な分離回収法の確立が急務とされている。近年では、環境負荷が小さい微生物を、金属イオンの吸着剤として用いる生物学的分離法が注目されている。我々はこれまでに、大腸菌が希土類金属を吸着することを報告したが、そのままの大腸菌では、吸着剤としての性能が乏しかった。そこで、大腸菌の表層に、希土類親和性の高いジグリコールアミド酸骨格を導入し、希土類金属へ高い選択性と吸着能を付与することを試みた。その結果、希土類金属の分離性能が大幅に向上し、吸着能力も2倍以上に向上した。大腸菌の表層改変が、高効率のバイオ吸着材の開発に、有効性であることを検証した。バイオソープションは、従来の溶媒抽出法より環境への負荷が小さいため、金属回収法の新たな方法として注目されている。特に大腸菌は、次世代型の金属吸着剤としての応用が期待されている。しかし、大腸菌をそのまま用いると、吸着量や選択性がその細胞膜の組成に大きく依存する。そこで、本研究では、その吸着能力と選択性の向上を目的とし、本年度は、大腸菌細胞膜上の官能基の化学修飾を行った。本研究では、このジグリコールアミド酸型の配位子を大腸菌へ化学修飾することで、希土類金属に対して高い選択性を有するバイオ吸着剤の開発を試み、その金属吸着能を評価した。各種希土類金属(ネオジム(Nd3+)、ジスプロシウム(Dy3+)、ルテチウム(Lu3+))を含むモデル水相を調製し、化学修飾大腸菌および未修飾大腸菌を用いて、吸着率に対するpHの影響を検討した結果、未修飾大腸菌と比べ、pH 23における吸着率が著しく増加することが分かった。次に、吸着剤の選択性を検討するため、希土類金属と一般金属の吸着挙動を比較した。未処理大腸菌を用いた場合、希土類金属の定量的な吸着が可能となるpHでアルミニウム(Al3+)や銅(Cu2+)が80 %以上吸着されるため、これらの金属と希土類金属の分離は困難である。しかし、化学修飾大腸菌を用いた場合、希土類金属と一般金属の分離性能が大きく向上した。さらに、未修飾大腸菌を用いた場合、Langmuir型の吸着等温線が得られ、飽和吸着量Qmaxはそれぞれ、30.9、32.7、43.8 mg/ gであった。しかし、化学修飾大腸菌の場合、吸着量は指数関数的に増加しFreundlich型の吸着等温線が得られ、吸着挙動が変化することがわかった。また、その希土類金属の吸着量は80 mg/ g付近で平衡状態に達し、未修飾大腸菌と比べて最大で約2.5倍増加することが明らかとなった。金属資源のリサイクルや未利用資源から金属を分離回収するために、低コストで環境負荷の小さい技術として、微生物を用いる方法が注目されている。我々は、培養によって無限に複製することが可能な大腸菌の希土類金属の吸着剤として利用を検討した。その結果、金属の吸着性がpHによりコントロール可能で、抽出剤を用いた溶媒抽出法と同様、一連の希土類金属に特有の選択性を示すことが明らかとなった。さらにこの吸着が、大腸菌外膜表面のリン酸基、カルボキシル基による吸着であることを、化学的、分光学的に証明した。細胞表面での吸着は、数分以内に平衡に達し、実用面で有利である一方、その能力は微生物の表面特性に支配されるため,金属に適した微生物の探索が必要となる。そこで、我々は、大腸菌の外膜タンパク質を足場として、希土類高選択的官能基を細胞表面に提示した、迅速かつ高選択的金属の分離剤の開発を行った。外膜タンパク質に希土類金属認識能力を有するペプチド(His)7を遺伝子工学的手法により導入し、細胞表面が、官能基と金属の親和性とともに、サイズ認識効果をもたらすような表層設計を行った。しかしながら、遺伝子工学的に導入したペプチドの官能基以上に、周囲のアミノ基およびカルボキシル基が多数存在し、希土類金属に対する抽出能力は、わずかに増加するものの選択性の大幅な改善は見られなかった。そこで、さらに、細胞表面に数多くある反応活性部位を利用した希土類選択的官能基の化学的導入を試みた。つまり、大腸菌を人工的に化学修飾することで、その機能強化を試みた。その結果、大腸菌表層に、希土類金属に高い親和性を有するジグリコールアミド型(DODGA)の官能基を導入することによって、希土類金属への選択性が大きく向上することが明らかとなった。さらに、官能基の導入によって、吸着能力も従来の大腸菌に比べ、2倍以上に向上した。

本年度の提案プランに従い、細胞表層に、希土類金属と特異的に相互作用する官能基を導入し、希土類金属をより高度に分離する新規吸着材の開発に成功した。具体的には、希土類に対する吸着能力と選択性の向上を目指すことを目的に、大腸菌細胞膜上の官能基の化学修飾を行った。本研究では、最近溶媒抽出の新規抽出剤として注目されているジグリコールアミド酸型の配位子を大腸菌へ化学修飾することで、希土類金属(特にNdとDy)に対して高い選択性を有するバイオ吸着剤の開発を試み、その金属吸着能を評価した。その結果、ジグリコールアミド酸型の配位子を化学修飾した大腸菌を用いた場合、未修飾大腸菌と比べ、pH 23の領域における希土類の吸着率が著しく増加することが明らかとなった。この成果は、大腸菌に希土類金属に強い親和性を有する官能基を表面修飾することにより、希土類金属の吸着能力を増強できることを示すものであり、今後希土類金属の高度分離剤の開発に有用な知見を与えるものと考えている。以上のように、本研究は、おおむね順調に進展していると考えられる。分離工学ジグリコールアミド酸骨格の化学修飾により、大腸菌の希土類金属への選択性およびその吸着容量を改善することに成功した。さらに、大腸菌表層を適切に設計することにより、吸着剤としての性能を制御可能であることが示された。しかし、今回の化学修飾法において、反応条件が大腸菌細胞にとって厳しい条件であるため、最終的に得られる吸着剤の量が少量であることなどの問題点が生じた。そこで、今後は、目的金属に親和的な官能基に脂溶性分子を修飾し、脂溶性分子と細胞膜との相互作用を利用して、目的の官能基を大腸菌細胞にとって温和な条件で導入することにより、細胞表層設計に基づいた新規バイオ吸着剤の開発を検討する計画である。また、大腸菌外膜タンパク質の細胞表面に位置するペプチド部分と、表面に現れるC末端側とを、金属の認識素子としてデザインすることによって、特定金属の細胞表面での吸着を可能とする。すなわち、ここに希土類金属に特異的に結合するペプチドを挿入することによって、大腸菌表面に希土類高選択的な分離場を構築する。さらに、新規に調製した、吸着剤を用いて、モデル溶液を用いて希土類金属の吸着分離性能を検討する。希土類金属と一般金属の分離、希土類金属間の分離を行い、その性能を明らかにするとともに,吸着分離条件の最適化を行う。また、実溶液への応用も検討する。本研究計画を遂行するための主な装置・設備は,これまで研究室で蓄積した設備にて,ほぼ賄うことが可能であった。特に研究計画の初年度は、主に細胞表層の化学修飾を中心に研究を実行したため、実験操作に必要な物品費が従来から揃っており、高価な試薬や器具等の支出を必要としなかった。また、次年度に、遺伝子組み換え等高価な試薬を必要とする研究を行うために、意識的に次年度に繰り越しを行った。消耗品費は、本研究の特殊事情として,遺伝子組み換え用のDNAと培養および分析関連の試薬が必要となる。また、次年度は、金属分析のためのICP-AESにかなりのアルゴンガスを要するため,特別に計上する。あとは、その他合成試薬と種々金属塩、ガラス器具類が中心となる。旅費としては、化学工学会、イオン交換学会および生物工学会などの年次大会での研究成果発表ならびに情報収集のための旅費を計上している。また、希土類金属親和的なペプチド配列を見いだすため、かなりのアミノ酸配列の合成を行う必要があるため、資料整理の要員と併せて人件費を計上した。その他,論文投稿の際の英文校閲費もあわせて計上している。
超臨界ガスによる石炭液化油精製プロセスにおけるエントレーナー効果に関する研究

1.蒸気圧測定:超臨界ガスに対する溶解度の重要な支配因子となる石炭液化油成分の蒸気圧測定装置を開発した。測定原理は流通法であるが、ナフタリンについての検証実験の結果、既報の文献値との一致は十分であることが示された。測定例のない石炭液化油成分を中心に、データの収集を行っている。2.蒸気圧推算:複雑な分子構造を有する石炭液化油成分の蒸気圧の理論的予測は、プロセス設計上重要であるが、本研究では分子構造の知見のみで推算可能なグループ寄与法の適用性を検討した。その結果、単純な構造を有する成分についてはある程度推算可能であるが、複雑な環構造を有する化合物については推算誤差が大きくなることが明らかとなった。置換基の位置などを考慮した推算モデルを開発中である。3.溶解度測定:流通法に基づいた高圧ガスに対する高沸点化合物の溶解度測定装置を開発した。本装置は平衡セルと平衡コイルの交換により液状、固体のいずれの試料にも用いることができる。超臨界二酸化炭素に対するナフタリンの溶解度測定を試み、他の報告例と十分な精度で一致することを確認した。さらに、石炭液化油成分のなかでもとくに有用と思われる化合物について系統的にデータを収集している。4.溶解度推算:抽出条件を設定するうえで溶解度推算が不可欠となるが、本研究では摂動型状態方程式を用い溶解度推算式を提案した。物質定数の混合則には新たに局所モル分率の概念に基づく方法を採用し、各種超臨界ガスと石炭液化油成分の組み合わせについて、抽出量の推算を試み満足な結果を得た。5.エントレーナー効果:エントレーナー効果について摂動型状態方程式により予測したところ、二酸化炭素によるナフタリン抽出の場合、プロパンよりベンゼンの方が効果的であることが示された。これはナフタリンと同族体であるベンゼンの親和力がより強いためと考えられる。実験的確認を試みている。
培養神経細胞間のシナプス形成に関与する因子の解析

神経細胞は他の細胞とシナプスを形成することにより情報を伝達する。そして、脳としての高次機能もシナプスの形成に依存している。このシナプスの形成・維持は恒常的なものではなく、記憶・学習や神経疾患時に大きく変動することが示唆され、シナプスの可塑性と呼ばれている。本研究は、記憶・学習に重要な役割を果たしている海馬の培養神経細胞を用いて、数個から十個程度の細胞で簡単なネットワークを構築させ、その時のシナプス形成に必要な因子を特に細胞内カルシウム濃度の調節に重要なカルシウムチャネルを中心に解析することを目的とする。(1)細胞内カルシウム濃度の多点同時解析:ラット胎児(1618日齢)脳の海馬をカバーグラス上に710日間培養した。培養細胞にFura-2を負荷し、細胞内カルシウム濃度の時間的および空間的変動を記録した。複数の神経細胞内で同期した細胞内カルシウム濃度の変動が記録でき、シナプスが形成されていることが確認できた。神経成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子などの各種栄養因子を培養液に添加してみたが、短時間内での作用は認められなかった。長期作用としては、神経栄養因子の生存に対する効果との分離が今後の課題である。(2)単離細胞のカルシウム電流:生後2週齢のラット視床下部から神経細胞を単離し、カルシウムチャネル電流の解析を行った。塩基性線維芽細胞成長因子がLタイプのカルシウム電流を短期作用として増大させること、セロトニンが1A受容体を介してN型カルシウム電流を抑制することを明らかにした。
エピジェネティクスによる乳癌血中循環DNAの由来プロファイリングとその臨床応用

本研究は、血中浮遊DNAの由来をepigeneticで分類し、がん診断・治療効果予測に応用しようというものである。網羅的メチル化アレイデータより、種々の細胞種に特異的なepigeneticマーカーを同定し、それを活用したcfDNA由来プロファイリング法をデジタルPCR機器を用いて確立し、その後、この由来プロファイリング法が、乳癌転移再発症例、術前補助療法症例の効果予測、原発巣や術後再発の診断、他癌の診断に応用できるかを検証する予定である。乳癌細胞そのものの同定としてゲノム変異に対するPCRを用いる。乳癌に高率で遺伝子変異をしているPIK3CAのexon9, 20にあるHot spotに対するmutation(1624G>A, 1633G>A, 3140A>G, 3140A>T)を識別するPCR primer probeセットをデザインした。また、ルミナール型乳がんの再発症例で変異率が上昇しているESR1遺伝子の変異Hot spotであるリガンド結合ドメインの変異(1609T>A, 1610A>G, 1610A>C,1 613A>G )を検出するPCRもデザインした。また、それぞれの細胞種のepigenetics markerを、公的データベースから正常細胞、癌細胞の網羅的epigeneticsデータを入手しマーカーの同定を試みた。目的の細胞種以外で完全に無メチル化でその細胞腫のみメチル化しているという特異性の高いmarkerの同定が困難であることが判明。内・外・中胚葉由来マーカーなどとの組み合わせで、計算で由来細胞のプロファイリングをする方向性が必要であることが判明した。2018年に研究代表の所属が変更され、新所属先での研究体制を整備した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。内・外・中胚葉由来マーカーなどとの組み合わせで、計算で由来細胞のプロファイリングをする方向性が必要であると思われる。このプロファイリング方が確立した後、使用する標本は、収集を継続している。血中浮遊DNAの中で、癌細胞由来DNAを検出する部分に関しては、先行研究のepigenetic marker以外に、遺伝子変異を同定するPCRプライマーが出来た。この部分は進捗として予定通りである。正常細胞由来cfDNAに関して、最も理想的なのは、目的の細胞種以外で完全に無メチル化でその細胞腫のみメチル化しているという特異性の高いmarkerの同定であるが、その同定が困難uと判明した。より網羅的なDatasetを用いたマーカー同定解析を試みるとともに、内・外・中胚葉由来マーカーなどとの組み合わせで、由来細胞の割合を推測するアルゴリズムを開発するという方向転換が必要であり、若干進捗が遅れている。乳癌に高率で遺伝子変異をしているPIK3CAのexon9, 20にあるHot sp otに対するmutation(1624G>A, 1633G>A, 3140A>G, 3140A>T)を識別するPCR primer probeセットをデザイン。また、以前の乳癌マーカーの陽性率を、1024種の癌細胞株のメチル化アレイデータみると、特異度が高いマーカーと、汎腫瘍マーカーとにわけられた。

正常細胞由来cfDNAに関して、最も理想的なのは、目的の細胞種以外で完全に無メチル化でその細胞腫のみメチル化しているという特異性の高いmarkerの同定であるが、その同定が困難uと判明した。より網羅的なDatasetを用いたマーカー同定解析を試みるとともに、内・外・中胚葉由来マーカーなどとの組み合わせで、由来細胞の割合を推測するアルゴリズムを開発するという方向転換が必要であり、若干進捗が遅れている。本研究は、血中浮遊DNAの由来をepigeneticで分類し、がん診断・治療効果予測に応用しようというものである。網羅的メチル化アレイデータより、種々の細胞種に特異的なepigeneticマーカーを同定し、それを活用したcfDNA由来プロファイリング法をデジタルPCR機器を用いて確立し、その後、この由来プロファイリング法が、乳癌転移再発症例、術前補助療法症例の効果予測、原発巣や術後再発の診断、他癌の診断に応用できるかを検証する予定である。乳癌細胞そのものの同定としてゲノム変異に対するPCRを用いる。乳癌に高率で遺伝子変異をしているPIK3CAのexon9, 20にあるHot spotに対するmutation(1624G>A, 1633G>A, 3140A>G, 3140A>T)を識別するPCR primer probeセットをデザインした。また、ルミナール型乳がんの再発症例で変異率が上昇しているESR1遺伝子の変異Hot spotであるリガンド結合ドメインの変異(1609T>A, 1610A>G, 1610A>C,1 613A>G )を検出するPCRもデザインした。また、それぞれの細胞種のepigenetics markerを、公的データベースから正常細胞、癌細胞の網羅的epigeneticsデータを入手しマーカーの同定を試みた。目的の細胞種以外で完全に無メチル化でその細胞腫のみメチル化しているという特異性の高いmarkerの同定が困難であることが判明。内・外・中胚葉由来マーカーなどとの組み合わせで、計算で由来細胞のプロファイリングをする方向性が必要であることが判明した。2018年に研究代表の所属が変更され、新所属先での研究体制を整備した。現在、Illumina社のHM450Kというゲノム上の約48万箇所のDNAメチル化を測定するメチル化アレイを共通フォーマットとして、公共データを網羅的に解析することで、epigenetic marker同定を行っている。同定が困難なマーカーに関して、より新しいXXXというヒトゲノム上XXX万カ所のDNAメチル化を解析できるアレイでのデータ蓄積が進んでおり、高速シーケンサーによるデータと併せて、より網羅的にすることで、より特異的なマーカーの同定を試みる。また、胚葉別のマーカーなど、複数の細胞種類にオーバーラップしたマーカーから計算で由来細胞の割合を推定するアルゴリズムの開発も併せてすすめる予定。
腐食環境下における鋼の初期き裂の発生機構と、き裂進展特性に関する研究

微視き裂進展挙動は安定き裂挙動とは違って、破壊力学を適用する際、その力学的因子でさえ明確でないのが現状である。マイクロハイスコープを用いてリアルタイムで空気中、および腐食環境中における結晶粒レベルの微視き裂進展挙動の動的観察による(1)き裂発生機構(2)微視き裂進展挙動(3)表面と内部における微視き裂進展挙動(4)微視き裂領域のda/dNと微視き裂長さの関係(5)微視き裂進展速度と応力拡大係数との関係を検討した。そのまとめは以下のとうりである。まず、空気中において、(1)微視き裂のき裂伝播は、クラック先端を起点として荷重軸方向に対しほぼ45度と135度方向に成長したプロセスゾーンを形成し、き裂がこの2つのプロセスゾーンの境界近傍の結晶粒界に沿って進展していること明らかにした。(2)内部の微視き裂進展挙動においても結晶粒界に沿って進展していることを確かめた。(3)安定き裂においては、粒界破壊と粒内破壊が観察されるが、微視き裂領域においては、結晶粒界破壊だけが観察された。(4)微視き裂の成長特性は安定き裂の下限値界以下でも成長することを明らかにした。腐食環境中においては、き裂の発生に伴い、亀裂部からの漏水を防ぐために試験片と腐食セルボックスの間にBiodenフィルムを貼りNacl水溶液中での微視き裂の動的観察も可能にした。結果は以下の通りである。(1)同応力条件でのΔKとda/dNの関係では、腐食中が空気中よりもda/dNが高く、ΔKの下限値は、空気中のほうが低い値を呈する。(2)腐食環境下でのき裂長さとda/dNの関係では、繰り返し応力の低下に伴い微視き裂・安定き裂ともにda/dNは低下している。(3)腐食環境下でのΔKとda/dNの関係では、繰り返し応力の低下により、き裂発生時間は遅れ腐食中のほうが空気中よりも低応力にも関わらず、き裂発生が速い。微視き裂進展挙動は安定き裂進展挙動と違って、破壊力学を適用する際、その力学的因子でさえ明確でないのが現状である。マイクロハイスコープを用いてリアルタイムで結晶粒レベルの微視き裂進展挙動の動的観察による(1)き裂発生機構(2)微視き裂進展挙動(3)表面と内部における微視き裂進展挙動(4)微視き裂領域のda/dNと微視き裂長さの関係(6)微視き裂進展速度と応力拡大係数との関係を検討した。そのまとめは以下のとおりである。(1)微視裂のき裂伝播は、クラック先端を起点として荷重軸方向に対しほぼ45度と135度方向に成長したプロセスゾーンを形成し、き裂がこの2つのプロセスゾゾーンの境界近傍の結晶粒界に沿って進展することを明らかにした。

(5)安定き裂に関する応力拡大係数で、実験結果を整理すると、微規き裂領域では応力拡大係数が増拡大係数が増加するとともに、裂進展速度は小さくなり、安定き裂領域との間で停留する現象があることを確認した。平成6年度の研究実績は以上に述べたが、次年度の研究に対し、3極電極と、き裂観察するためのハイスコープの先端を挿入できる腐食セルを考案作成中である。また、NaCIの腐食溶液中でいかにして、鋼の結晶粒界レベルまで観察できるかは実験、考察中である。微視き裂進展挙動は安定き裂進展挙動と違って、破壊力学を適用する際、その力学的因子でさえ明確でないのが現状である。マイクロハイスコープを用いてリアルタイムで空気中、および腐食環境中における結晶粒レベルの微視き裂進展挙動の動的観察による(1)き裂発生機構(2)微視き裂進展挙動(3)表面と内部における微視き裂進展挙動(4)微視き裂領域のda/dNと微視き裂長さの関係(6)微視き裂進展速度と応力拡大係数との関係を検討した。そのまとめは以下のとおりである。まず、空気中のおいて、(1)微視裂のき裂伝播は、クラック先端を起点として荷重軸方向に対しほぼ45度と135度方向に成長したプロセスゾーンを形成し、き裂がこの2つのプロセスゾゾーンの境界近傍の結晶粒界に沿って進展することを明らかにした。(2)内部の微視き裂進展挙動においても結晶粒界に沿って進展していることを確かめた。(3)安定き裂においては、粒界破壊と粒内破壊が観察されるが、微視き裂領域においては、結晶粒界破壊だけが観察された。(4)微視き裂の成長特性は安定き裂の下限値界以下でも成長することを明らかにした。腐食環境中においては、き裂の発生に伴い、亀裂部からの漏水を防ぐために試験片と腐食セルボックスの間にBiodenフイルムを貼りNacl水溶液中での微視き裂の動的観察も可能にした。結果は以下の通りである。(1)同応力条件での△Kとda/dNの関係では、腐食中が空気中よりもda/dNが高く、△Kの下限界値は、腐食中のほうが低い値を呈する。(2)腐食環境下でのき裂長さとda/dNの関係では、繰り返し応力の低下に伴い微視き裂・安定き裂ともにda/dNは低下している。(3)腐食環境下での△Kとda/dNの関係では、繰り返し応力の低下に伴いda/dNは低下する。(4)腐食環境下での繰り返し応力の低下により、き裂発生時間は遅れ腐食中のほうが空気中よりも低応力にも係わらず、き裂発生が速い。
極微小領域ブリュアン散乱法の開発

物体のサイズが小さくなり構成する分子が有限個となる効果が現れると、物質はバルクとは違った物性をしめすようになる。また微小な領域に閉じ込められた物質は、界面との相互作用により液晶相にぬれ層などの特異な構造を示すことが知られている。これら微小領域の物性研究手段として熱フォノンを測定するブリュアン散乱法などの光散乱測定が有効である。しかしながら、散乱体積が小さくなるとセル壁面による迷光が測定の大きな障害となり、これまで微小領域の光散乱測定は極めて困難であった。本研究の目的は、迷光の影響をほとんど受けない新しい光散乱光学系を設計することにより、微小領域におけるブリュアン散乱測定が可能なシステムを構築することである。本年度の研究所では、上に述べた障害を克服するために新しい光のロックイン変調方式を考案した。この変調方式は、これまでの入射光の強度変調器(光チョッパー)にかえ電気光学効果を用いた光位相変調素子をもちいることにより、光の偏光面を時間的にスイッチするていうものである。これによって、ロックイン変調を受けた迷光によるショトノイズが偽信号となってスペクトルに現れるのを防ぐことができる。実際に散乱体積内に迷光の発生体として細い金属線を挿入してブリュアン散乱測定を行ったところ、偏光変調方式が迷光の除去に極めて有効であることが明らかとなった。さらに我々はこの新しい方式を用いて、薄い平行キャビティ中で熱フォノンの共鳴現象が起こることを初めて確認した。この共鳴現象は、平衡状態にある熱フォノンの位相の相関長を考慮することによって説明できることがわかった。
アジア地域での多剤および超多剤耐性結核菌の浸淫度調査

多剤および超多剤耐性結核の調査が不十分と考えられるアジアの国々のうち、特にミャンマー、バングラデシュならびにネパールに焦点を絞り、臨床分離結核菌株を収集し、リファンピシンならびにイソニアジド耐性と遺伝子変異の関係を調査した。ミャンマーの多剤耐性結核菌のrpoB遺伝子変異ならびkatG又はinhA遺伝子変異保有割合はそれぞれ71.3ならびに72.5%であった。一方、バングラでシュにおいてはrpoB遺伝子変異ならびkatG又はinhA遺伝子変異保有割合はそれぞれ95.0ならびに94.5%であり、ネパールにおいてはそれぞれ97.2ならびに93.8%であった。また、バングラデシュにおいて多剤耐性結核菌218株中7株、ネパールにおいては多剤耐性結核菌109株中13株の超多剤耐性結核菌を見出した。これらの超多剤耐性結核菌全てにおいてカナマイシン耐性rrsならびにgyrAまたはgyrB遺伝子上に変異が見られた。薬剤耐性と遺伝子変異の相関は国ごとに異なるものであり、遺伝子変異分析を基盤とする結核菌薬剤感受性試験を実施するにあたっては事前にその相関を調査する必要があるものと結論された。また、今回の調査により超多剤耐性結核菌の存在がバングラデシュならびにネパールおいて明らかになったことから、これらの伝播動態調査が急務と考えられた。アジア地域における多剤耐性および超多剤耐性結核菌の浸淫状況を調査し、これらの制圧のための基礎データを蓄積することを目的とした。本研究により得られる成果は、多剤耐性結核蔓延対策に貢献するものと考えられる。本研究では、アジアの国々のうち、特に薬剤耐性結核の浸淫状況調査が不十分と考えられるバングラデシュ、ミャンマーおよびネパールに焦点を絞り調査を遂行した。これらの国々において臨床分離結核菌を収集し、従来法である培養をベースとした薬剤感受性試験により薬剤耐性結核菌の蔓延状況把握を開始した。さらに薬剤耐性と遺伝子変異の関係を明らかにし、操作が煩雑で結果を得るまでに長時間を要する培養試験に代えて簡便な遺伝子解析による大規模サーベイランスを可能するための基礎データ所得を開始した。具体的内容は以下である。・調査対象国における薬剤耐性結核の侵淫度情報、疫学情報および薬剤耐性試験実施状況調査を開始した。・調査対象国の研究協力者とともに作成した標準手順に従ったバイオリソース収集を依頼し、バングラデシュおよびネパールにおいて、それぞれ220および109の結核菌株、結核菌DNAを収集した。ミャンマーにおいては結核菌株、結核菌DNAの収集を開始した。・上記において結核菌群菌の分類には申請者らが開発した低コスト・簡便・迅速抗酸菌鑑別法を用いた。また、結核菌群菌の人型結核菌、牛型結核菌、アフリカ結核菌への分類には申請者らが開発したマルチプレックスPCR法を用いた。また、学術調査対象国の研究者が独自に自国で精度の良いデータを取得できる様に指導した。・薬剤含有培地上に生育した菌株からDNA乃至は遺伝子増幅産物を抽出し、日本に輸入し、薬剤耐性に関与することが報告されている遺伝子の塩基配列を決定し、塩基置換を特定した。これまでにバングラデシュ由来の220株の塩基配列を決定した。・上記で得られた情報を、申請者らが開発した特定の遺伝子変異を検出することによる迅速な薬剤感受性試験法に反映させて、対象国の耐性結核菌の遺伝子変異の状況に対応した、安価で精度の高いものへの改良のためのデータを蓄積した。・学術調査対象国から輸入したDNAを対象にして、日本において遺伝子型データを取得した。申請者らが開発した多施設間比較が容易な分子疫学的解析法を低価格、簡便かつ信頼性の高いものへと改良中である。本研究では、アジア地域における多剤耐性および超多剤耐性結核菌の浸淫状況を調査し、これらの制圧のための基礎データを蓄積することを目的として本研究を遂行している。対象国としては、アジアの国々のうち、特に薬剤耐性結核の浸淫状況調査が不十分と考えられるバングラデシュ、ミャンマーおよびネパールに焦点を絞り調査を実行した。これらの国々において臨床分離結核菌を収集し、従来法である培養をベースとした薬剤感受性試験により薬剤耐性結核菌の蔓延状況を把握する。

さらに薬剤耐性と遺伝子変異の関係を明らかにし、操作が煩雑で結果を得るまでに長時間を要する培養試験に代えて簡便な遺伝子解析による大規模サーベイランスを実施するための基礎データを集積した。1)バイオリソースの収集とデータベースの構築(担当:鈴木、中島、海外共同研究者)平成21年度の研究を継続し、菌株バンク、DNAバンク、分離情報に関するデータベース、遺伝子型データベースおよび薬剤感受性データベースに総計500株以上を集積した。2)薬剤性菌侵陰度調査(担当:鈴木、松葉、中島、海外連携研究者)総計500株以上の結核菌由来DNAを対象として代わる遺伝子診断法を実施し、薬剤耐性結核の存在状況を把握した。3)遺伝子型データの蓄積(担当:鈴木、中島、海外共同研究者)薬剤耐性結核菌の遺伝子型データの収集を継続し、得られるデータを遺伝子型データベースに総計500株以上の結核菌由来データを格納した。さらに遺伝子型データを詳細に解析して、多剤および超多剤耐性結核菌の調査対象国における伝播状況調査した。また、調査対象国間の伝播についても調査した。[連携研究者]鳥取大学・医学部松葉隆司薬剤耐性結核菌データベースの構築本研究では、アジア地域における多剤耐性および超多剤耐性結核菌の浸淫状況を調査し、これらの制圧のための基礎データを蓄積することを目的とした。対象国としては、アジアの国々のうち、特に薬剤耐性結核の浸淫状況調査が不十分と考えられるに焦点を絞り調査を遂行した。これらの国々において臨床分離結核菌を収集し、従来法である培養をベースとした薬剤感受性試験により薬剤耐性結核菌の蔓延状況を把握した。さらに薬剤耐性と遺伝子変異の関係を明らかにし、操作が煩雑で結果を得るまでに長時間を要する培養試験に代えて簡便な遺伝子解析による大規模サーベイランスを実施するための端緒とした。以下に本年度の具体的実施内容を示す。1)ネパールにおいて多剤耐性結核菌株109株ならびに多剤耐性結核菌株49株を収集するとともに、これらの菌株からDNAを抽出し、バイオリソースとした。更に、全ての菌株についてリファンピシンならびにイソニアジド耐性関連遺伝子の塩基配列を決定した結果、薬剤耐性と遺伝子変異の間に97.2%ならびに93.8%という高い相関性を見出した。これらの結果を基にしてネパール用薬剤感受性試験様DNAアレイをデザイした。2)バングラデシュおいて多剤耐性結核菌株218株を収集するとともに、これらの菌株からDNAを抽出し、バイオリソースとした。更に、全ての菌株についてリファンピシンならびにイソニアジド耐性関連遺伝子の塩基配列を決定した結果、それぞれの抗結核剤に対する耐性と遺伝子変異の間に95.0%ならびに94.5%という高い相関性を見出した。これらの結果を基にしてバングラでシュ用薬剤感受性試験様DNAアレイをデザイした。3)ミャンマーにおいて多剤耐性結核菌株178株を収集するとともに、これらの菌株からDNAを抽出し、バイオリソースとした。
米国コア・カリキュラムの成立過程の研究：市民性教育における教科の役割に注目して

本研究は、市民性教育カリキュラムにおける教科の役割や必要性を明らかにすることを目指している。その際に、米国の市民性教育としての理念を掲げつつ、コアカリキュラムが成立していった、193050年代の主要なカリキュラム案とその理論的背景を比較検討する。この分析を通して、市民性教育のカリキュラム開発における「教科」という枠組みの役割についての論争点や、分析枠組みを得ることを目指す。
樹状細胞を用いた新たな免疫療法の確立と癌術後再発に対する効果の検討

平成9年度に行った樹状細胞の採取条件の検討結果に従い、マウス肝より分離した樹状細胞を腫瘍抗原に感作させた。腫瘍抗原の精製は腫瘍細胞を超音波破砕したそのままを抗原として用いる群と超遠心により細胞膜分画のみ精製した群、腫瘍細胞そのものを放射線照射して用いる群とを比較したが、前2者間で有為差はなく、腫瘍細胞そのものを用いた群ではその後に誘導しうる細胞障害性が弱かった。細胞内蛋白もMHCに提示され腫瘍抗原として免疫反応を誘導しうることが明らかとなっており、臨床的な応用を考えると腫瘍細胞を破砕したものを抗原として用いることで十分であると考えられた。樹状細胞を抗原刺激した後、様々なサイトカインおよび半球培養上清にて刺激しその抗原提示能を検討したが単球培養上清が最も強い活性化作用を有し、TNFaも弱い活性化を示した。Balb/cマウスにおけるcolon26脾注後肝転移モデルを用い、微小肝転移形成時における腫瘍抗原感作樹状細胞のin vivoにおける有効性を検討した。検討は腹腔内GM-CSF投与群、GM-CSF遺伝子導入マウス肝細胞前投与群、何も処置せず腫瘍抗原感作樹状細胞のみを投与する群の3者にて行った。なおIL-12遺伝子導入肝細胞の作成ができなかったためこれを併用する群等は置かなかった。現在までまだ最終的な結果は出ていないが、preliminalyな結果ではGM-CSF遺伝子導入マウス肝細胞の前投与群において肝腫瘍発育の抑制が観察されており、ヒト術後アデュバント治療として肝転移再発を抑制するのにGM-CSFの局所投与が有効な可能性が示唆された。今後更に最終的な結果の解析を待つとともに、IL-12を用いたアデュバント療法の可能性も検討していきたい。我々はヒト末梢血より樹状前駆細胞を血球分離装置を用いて分取し、in vitroにてこれを活性化させるに最も至適な条件の検討を行った。通常、体格良好な成人の場合、5リットルのアフェレ-シスを行い、バッフィーコートを採取。ついでフィコール比重分離を行って単核球層を採取し、さらにパーコール比重分離を行った。これにより10^8から10^9オーダーの樹状細胞に富む分画をとることが出来た。同時に行っているマウスにおける検討では脾より細胞を調整し、磁気細胞分離装置を用いた採取が最も効率がよいことが明らかとなった。腫瘍抗原の精製はマウスにてcell line皮下腫瘍を用い検討した。腫瘍を超音波破砕後そのまま抗原とした群、超遠心し細胞膜分画のみ精製した群、腫瘍細胞そのものを抗原として用いる群等に分け各群における至適条件を検討中である。今後各群間の差を検討し、いずれが臨床応用に最適かを検討する予定である。また腫瘍抽出抗原を用いて抗原刺激した後の細胞に、TNFa等のサイトカインで後刺激を加えることにより抗原提示能がいかに変動するかを検討中である。2)サイトカイン遺伝子導入マウス肝細胞の樹立我々がすでに樹立したマウス不死化肝細胞を用いて、これにGM-CSF発現ベクターを導入しクローンの作成中である。ELISAを用いて、そのサイトカイン産生能を検討しつつある。さらにIL-12の発現肝細胞の作成も試みている。