hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポリアミノ酸の二次構造を利用する新規核酸吸着剤の開発

本研究では,幅広いいイオン強度域で核酸選択吸着能を維持できる新規吸着剤の開発を目的とし,ポリアミノ酸球状粒子および架橋ポリエチレンイミン(PEI)球状粒子を調製した。両粒子の酸性タンパク質水溶液からの核選択除去能について詳細に調査した。その結果、両粒子は以下のような特長を示した。(1)細大細孔径がM_<1im>500-2×10^6(糖の分子量として)で、アミノ基含有量が0.1-3.5meq/gのアミノ化ポリ(γ-メチルL-グルタメート)粒子を調製した。の核酸吸着能を評価した結果、同粒子のアミノ基含有量が多いほど、細孔径が大きいほど核酸吸着能が高いことがわかった。同粒子は、核酸を幅広いイオン強度域および幅広いpH域で吸着維持できるが、アルブミンなどの酸性タンパク質を吸着するため、同タンパク質水溶液からの核酸に対する選択吸着除去は困難であった。(2)細大細孔径M_<1im>500-1×10^4,PEI含有料50-90mol%の架橋PEI粒子の核酸吸着能を評価した。その結果、アルブミンに対する吸着能においては,粒子のPEI含有量よりも細孔径の及ぼす影響の方が大きいことがわかった。糖の排除分子量として1×10^4以上の細孔径をもつ両球状粒子は,種々のタンパクに対してイオン性あるいは疎水性の吸着活性を示した。結果として,M_<1im>2000,PEI含有料80mol%の架橋PEI粒子率は,緩衝液のイオン強度がμ=0.2,pH7.0の条件下で、タンパク質を吸着することなく核酸に対する選択吸着活性が高かった。本研究で開発された種々のカチオン性高分子粒子は,それらのイオン性,疎水性,表面構造が異なるため,核酸やタンパク質に対する吸着容量や吸着活性が維持できるpHおよびイオン強度域が異なることがわかった。これらの条件を考慮して吸着処理を行うことでタンパク質-核酸混合溶液からの核酸の選択吸着除去が可能になることが明らかとなった。本年度は、懸濁共重合法により、イオン性、疎水性、空孔率および細孔径の異なる種々のポリアミノ酸を球状粒子化した。また、得られた粒子の特性評価も行った。(1)粒子化条件の温度,多孔化剤,攪拌速度等を制御することにより、粒径10-200μm、細大細孔径500-45000(糖の分子量として)、アミノ基含有量0.15.0meq/gのアミノ化ポリ(γ-メチルL-グルタメート)(PMLG-MH_2)粒子および橋かけポリ(ε-リジン)(PL)粒子が得られた。(2)PMLG-MH_2粒子のイオン性は導入するアミノ基量を増大させることにより,PL粒子のイオン性は導入する橋かけ剤を減少させることにより増大させることができた。(3)3.5meq/g以上のアミノ基含有量をもつPMLG-MH_2粒子およびPL粒子は、pH5.0pH10,イオン強度μ=0.050.2で高い核酸(サケ精巣由来)吸着活性をもつことがわかった。(4)種々のタンパクの両球状粒子に対する吸着活性は,粒子の細孔径に大きく依存した。糖の排除分子量として10000以上の細孔径をもつ両球状粒子は,種々のタンパクに対してイオン性あるいは疎水性の吸着活性を示した。

本研究の目的の一つである核酸吸着活性の高い吸着剤の調製は、粒子のアミノ基含有量を増大させ、かつ疎水性を増大させることにより可能となった。次年度は、粒子のタンパク質に対する吸着能を詳細に調査し、核酸選択吸着剤としての評価を明確なものにする計画である。本年度は、前年度に合成した種々のカチオン性高分子球状粒子の核酸吸着能を評価した。(1)細大細孔径500-45000(糖の分子量として)、アミノ基含有量0.15.0meq/gのアミノ化ポリ(γ-メチルL-グルタメート)(PMLG)粒子および橋かけポリ(ε-リジン)(PL)粒子の核酸吸着能を評価した。その結果、同粒子のアミノ基含有量が多いほど、細孔径が大きいほど核酸吸着能が高いことがわかった(2)上記実験に用いた種々の粒子のタンパク質吸着能を評価した。その結果、アルブミンに対する吸着能においては,粒子のアミノ基含有量よりも細孔径の及ぼす影響の方が大きいことがわかった。糖の排除分子量として10000以上の細孔径をもつ両球状粒子は,種々のタンパクに対してイオン性あるいは疎水性の吸着活性を示した。また,すべての粒子のγ-グロブリン吸着率は、緩衝液のイオン強度がμ=0.050.8の条件下で3%以下であった。(3)とくに、アミノ化PMLG球状粒子が核酸を幅広いイオン強度域および幅広いpH域で吸着維持できることより,核酸と同粒子との吸着活性がイオン的な吸着と疎水的な吸着との相乗効果によって引き起こされていることが示唆される。以上の結果より、カチオン性高分子球状粒子の細孔径およびアミノ基含有量や、緩衝液のpHおよびイオン強度を制御することにより、核酸選択性を向上させることが可能であることがわかった。次年度は、種々の粒子を用いて、生体関連物質水溶液から核酸の選択除去を試みる。本年度は、前年度までの基礎実験結果をもとに、試作吸着剤を製造し、その性能を評価した。またワクチン製造業者、試薬会社及び種々の研究期間へも試作吸着剤配付し、性能評価を依頼した。1)試作吸着剤の製造:クロマトグラフィー法に使用するための試作吸着剤の基材としてセルロースビーズを製造した。製造は、チッソ株式会杜水俣工場で、従来のセルロース粒子製造法により製造した。粒径は、タンパク質等の有効成分を目詰まりなく通液させるために40100μmに設計した。また、核酸の選択吸着には粒子の細孔径が重要であるので、細孔径が糖の最大排除分子量(M_<lim>)で1×10^6と1×10^3の2種類の粒子を製造した。さらに同粒子にポリ(ε-リジン)(PL)を固定化し、試作用の核酸吸着剤(Cell-PL)を製造した。2)核酸吸着システムの開発:末端ユーザーが試作吸着剤を用いて、エンドトキシンを簡便に除去できるように設計された吸着システムを開発した。<バッチ法>小規模で、3時間程度で、簡便に行えるエンドトキシン吸着処理システムを開発した。<カラム法>小規模(カラムサイズとして1mL-50mLを想定)で、研究者や医師がその場で薬液や培地をシリンジなどで通液することでエンドトキシンを除去できるプレパックカラムの開発を検討中である。3)試作品性能評価上記試作吸着剤をパックしたカラムを用いて、タンパク質と核酸の混合溶液からの核酸の選択吸着除去を試みた。大きい細孔径(M_<lim>×10^6)をもつCell-PL-10^6
篤農技術継承のための知農ロボットスキーム

篤農技術の継承をめざす知農ロボットシステムの要件を「判断プロセスの記録」と「データベースカテゴリ」及び「知農ロボット機能カテゴリ」から解明した。判断プロセスはデータ,情報,知識,知恵の4階層,データベースは作物,土壌,病害虫,流通販売の4カテゴリ,知農ロボットは農業知財,暗黙知,農場管理,福祉安全,作業記録の対話機能が必要である。統合農業知の可視化によるユーザーイノベーション実践科学を提案した。本研究では,判断プロセスの記録,データベースカテゴリ,知農ロボット機能カテゴリの三つのタスクフォースを設置し,篤農家(本庄精密農法研究会所属)と守秘義務契約を結んだ。主な研究成果は次の通りである。○判断プロセスの記録(南石,星,澁澤,荻原,岡山)判断の場あるいは背景・文脈状況を整理した。技術環境を「ITを活用した農業技術の新技術と展開」(澁澤)としてとりまとめ,利潤と栽培の動機を統一したコミュニティベース精密農モデルを整理した(澁澤)。「農作業情報自動計測と営農可視化システム」(南石)および「施設植物生産の情報化を推進するプラットホーム」の視座から,判断プロセス記録のスキームを整理した。篤農家との守秘義務契約を行い(澁澤,南石,星),ヒアリング計画を立てた。○データベースカテゴリ(星,植竹,荻原,南石,澁澤)「施設植物生産におけるユビキタスセンシングとコントロール」(星)および「農業イノベーションとクラウドサービス」(南石)の事例研究を通じて,農業者の判断ニーズからみたデータ・情報の類型を整理した。○知農ロボット機能カテゴリ(澁澤,岡山,佐々木,植竹)最終年度として、三つのタスクフォースである「判断プロセスの記録」,「データベースカテゴリ」,「知農ロボット機能カテゴリ」の研究成果を統合して知農ロボットシステムのスキームを整理し,それらを包括する統合農業知の新学術分野として,日本学術会議の大型研究計画「統合農業知の可視化によるユーザーイノベーション実践科学」を提案し,平成26年3月に採択公表された。それぞれの個別課題の成果は次の通りである。○判断プロセスの記録(南石,星,澁澤,荻原,岡山、近藤):水田管理作業(南石)、野菜園芸ハウスの管理作業(星・岡山・澁澤)、果樹園芸ハウスの管理作業(荻原)の重要な管理点の数および農作業判断プロセスの文脈構造を記録に基づいて整理した。畜産や水産分野のおける判断プロセスの作業仮説を提案した(近藤)。その結果、データベースカテゴリのマクロ構造が明らかとなった。○データベースカテゴリ(星,植竹,荻原,南石,澁澤):従来の農業情報データベースの構造と限界について整理し(星・南石)、農業者の判断ニーズからみたデータ・情報の類型を整理した(澁澤・荻原・星・南石)。作業者の視線解析による判断プロセスの安定・不安定判定法を提案し,実験的確認を進めている(植竹・澁澤)。農業知の集積と統合および活用の三つのステージにおけるデータベースカテゴリの普遍性と変動性を整理し,構想提案に結実させた。○知農ロボット機能カテゴリ(澁澤,近藤,岡山,佐々木,植竹):拡張現実感を用いた農作業支援システムの提案(岡山・澁澤)、農作業自動記録による暗黙知抽出法の提案(佐々木・澁澤)、人間協調システムも含めた包括的な知農ロボットシステムの機能カテゴリの提案(澁澤・近藤・植竹)を行い,実験的検証を進めた。四季を同時に実現する植物工場システムは,知農ロボットシステムの農業知財記録機能が埋め込まれたものである。知農ロボットシステムの構想を具体化するため,農業ロボット研究の第一線で活躍している近藤直(京都大学)を研究分担者に加え「知農ロボットカテゴリ」タスクフォースを強化した。IT企業の富士通やNECと技術交流を進め、また、本庄精密農法研究会や農業法人との連携を深めた。○判断プロセスの記録(南石,星,澁澤,荻原,岡山):昨年に続き,作物栽培の重要な管理点の抽出と農作業データ収集およびプロ農業者へのヒアリングを実施した。分担者の南石と星は,「農匠ナビ」プロジェクトに関連して収録した農作業データに対して管理点の整理を行った。澁澤と荻原は,都市型先進植物工場におけるブルーベリー栽培管理およびプロ農業者の温室トマト栽培作業の管理点と農作業判断の文脈構成に関するヒアリングを実施した。○データベースカテゴリ(星,植竹,荻原,南石,澁澤):昨年に続き,星と南石は,農業情報データベース構造の利用者依存性について検討を加えた。澁澤と荻原及び星と南石による農作業判断プロセスの作業仮説を受け,判断ニーズからみたデータ・情報の文脈構成を整理した。植竹は、農作業安全仮説をもうけ,特に注視行動に着目したデータベースの特性や機能を検討した。○知農ロボット機能カテゴリ(澁澤,近藤,岡山,佐々木,植竹):昨年に引き続き,知農ロボットシステムの機能カテゴリ仮説を実証的に検討した。ここでは三つの検証アプローチを実施した。ひとつは,機構と通信・情報システムから提起されるカテゴリで,感性ロボット構想をもつ佐々木と論理会話の研究実績のたる岡山が解析した。

人間の負荷あるいは快適性の視座から,協調・同伴作業をする知農ロボットスキームは,人間工学の素養をもつ植竹が担当した。農業ロボット作業体系および利潤動機と栽培科学の両視座から求められる知農ロボットスキームは,澁澤と近藤が担当した。知農ロボットスキーム構築のため,を課題とするタスクフォースを組織し,また,篤農家あるいは勉強熱心で先準経営を実施している農業者の判断・作業を解読・再現するという共通の目標を共有した。分担課題に関する研究成果の取り纏めとして論文発表および学会発表の実績があがりつつあり,おおむね順調に進展していると判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。知農ロボット機能カテゴリのタスクフォースを強化するため、第一線の農業ロボット研究者を分担者に加え、農業ロボット研究の到達点と課題を整理した。篤農家および熱心な農業法人を協力者に加え、農作業の判断プロセスの記録と判読に協力を得た。当初計画通り,判断プロセスの記録手法,データベースカテゴリの構築法,知農ロボット機能カテゴリの構築の三つのタスクフォースの研究活動を推進し,研究分担者の研究成果を集約するためのセミナーを開催する。篤農家のヒアリングには,共通する言葉や共感できる仕草が必ずしも完備している訳ではないので,特段の困難が予想される。そのため,篤農家と本研究組織との交流の場を設け,相互理解を促進する用語解説を準備する。選果・収穫ロボットの第一人者である近藤直氏(京都大・教授,承諾済み)を加え,農業者の動作シミュレータ解析を強化し,知農ロボット機能カテゴリの具体的な整理をする。最終年度として、研究成果のとりまとめを行う。本研究では、農作業プロセスに力点を置いた知農ロボットシステムの課題と解法を焦点に進めてきた。その結果、対象とする知識・技能や情報・データが複雑で多岐にわたり、かつ空間的にも時間的にも階層構造をもっていることが見えてきた。改めて、統合農業知に関するユーザーイノベーションの学術領域創出も念頭においた課題展開を進める。
慢性糸球体腎炎患者の腎生検標本における各種サイトカインの発現について

平成五年度より七年度までの三年間に表記の研究課題に基いて多くの成果が挙げられた。それらを大別すると以下の7つとなる。1.ヒト腎生検組織における遺伝子発現を視認する新しい方法の開発:ヒトの腎生検組織上での遺伝子発現をin situ hybridization法によって視認する方法として、非放射性物質を用いた安全で特異性の高い方法を世界ではじめて開発することに成功した。2.活性酸素の関与機序の解明:日本において各種腎炎中最多頻度を占めているIgA腎症患者において、患者血中に増加するIgAが多核白血球上のFcαレセプターを誘導して活性酸素を発生させる事を示した。3.TGF-βの関与形態の解明:慢性腎炎における腎機能低下の主要原因である糸球体メサンギウム領域の拡大をもたらすサイトカインとして注目されているTGF-β1のmRNAが糸球体内のメサンギウム細胞とボ-マン嚢で発現し、組織障害度と平行していることが判明した。4.IL-6の関与形態の解明:メサンギウム細胞の増殖を促進する作用を持つIL-6がIgA腎症では組織障害度と平行してmRNAの発現を示すが、非炎症疾患の糖尿病性腎症では反比例していた。5.免疫グログリン産生に関与するサイトカインの同定:IgA腎疾患者ではIgA産生を促進する機序としてIL-4とsCD23が主要な働きをしていることを示した。6.コラーゲン代謝因子の関与:メサンギウム拡大に伴ってIgA腎症ではその分解酸素ならびに抑制物質のmRNA発現が増加していた。7.サイトカイン関与状態の集大成:多くのサイトカインを検証した結果、IL-4,IL-12およびINF-γが糸球体硬化機序に関与していることが明らかとなった。以上よりこれまで不明であった慢性糸球体腎炎におけるサイトカインの具体的な関与状況が明らかとなった。本年度は、当初の研究計画に基いて現在までに存在が確認されている各種サイトカインおおび糸球体構成成分について、筆者方が従来確立して来た手段に基いて競合PCR法を用いて腎生検組織全体における各種mRNAの発現を検討し、さらにこれと平行して現在までに当教室で開発に成功した4層式のin situhybriddizationを現行のIL-6から順次他の物資へ拡大することを開始して、本年度はTGF-beta1のmRNA発現について検討を行った。その結果慢性糸球体腎炎特にIgA腎症においては組織障害度が進行中と思われる症例の腎組織においてサイトカインではIL-6,TGF-beta1,PDGFなどの有意な増加を認め、これと平行してcollagen typeIVのalpha2およびalpha3鎖のmRNA増加を認めた。TGF-beta1のin sitn bybridization法による検討の結果、このサイトカインはメサンギウム,ボーマン曩および尿細管上皮に強く発現し、糸球体が硬化するにつれて消滅することは示された。これらの成果は本年2月の第6回国際IoA腎症シンポジウムにて発表し、引続き国際誌にて印刷中である。平成6年度は、当初からの計画に基き、前年度で糸球体内での増加が確認されたサイトカインのmRNAについて、順次in situ hybridizationを開始し、従来の臨床的・病理学的ならびに免疫学的所見との対比を行って、本法の有用性と信頼性についての検討を開始した。その結果、TGF-βとIL-6については腎生検標本の組織障害度とほぼ平行して糸球体メサンギウム領域、ボ-マン嚢ならびに間質にmRNAの発現増加を認め、糸球体の硬化線が完成するにつれてその発現は低下した。PDGFについても同様の所見であった。

さらに、コラーゲンTypeIVのα2およびα3鎖と、それらの分解酵素であるstromelicin(MMP-3)とその抑制抱負であるTIMP-1も、おおむね同一のメサンギウム細胞およびボ-マン嚢上皮と間質細胞上に平行して発現していた。以上の成績から、メサンギウム細胞の増殖と基質の増加を示す疾患においては、上記のサイトカインが促進的な作用を有することが、臨床材料である腎生検標本上ではじめて総合的に示された。平成7年度は本研究の最終年度に当るため、これまでの成果をふまえて本研究課題が目的とした事項についての集大成を行い、その結果以下に記す3つの総括的な成果を得た。1.免疫グロブリン産生に関与するサイトカインの同定慢性腎炎の中でわが国において最大頻度を占めているIgA腎症では患者のIgA産生能が亢進しているが、その機希は現在まで不明であった。患者のリンパ球におけるサイトカイン発現を多くの物質について検討した結果、IL-4とSCD23とがin vitroとin vivoの両方でIgAの産生に強く関与していることが明らかとなった。2.コラーゲン代詞因子の関与腎炎における慢性的な腎機能低下の主要原因である糸球体メサンギウム領域の拡大の中心的物質であるTV型コラーゲンとその分解酸素(MMP3)およびその抑制物質(TIMP-1)の腎生検組織上でのmRNA発現をin situ hybridization法によって検討した結果、IgA腎症では組織障害の進度に伴ってこれらの遺伝子発現が活性化することが示された。3.サイトカイン関与状況の集大成各種の慢性糸球体腎炎におけるサイトカインの関与を包括的に解析した結果、対象としたサイトカインIL-1,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-12,INF-γ,TGF-β,TNF-α,PDGFおよびMCP-1のうち、長期にわたる進行性の糸球体硬化にはIL-4,IL-12およびIFN-γが強く関与していることが明らかとなった。以上の成績から、これまで不明であった慢性糸球体腎炎の進展においてどのようなサイトカインがどの時期に関与しているかが具体的に示された。今後はこれらの結果をふまえて糸球体と問冥の相互作用における分子的塁率を解析することが、糸球体硬化の機希解明上重要と思われる。
頭部低位麻酔時の脳脊髄液吸収能低下の機序に関する実験的研究

水平位から頭部低位への体位変換により、側脳室圧(LVP)、上矢状静脈洞圧(SSSP)は上昇したが、両者の変化量は同程度であり、脳脊髄液呼吸の作動圧であるECSFPには有意な差は認めなかった。平均体動脈圧(MAP)は、10分後には対照値に対し上昇を認めたが、70分後は有意な差は認めなかった。脳脊髄液産生量(Vf)、呼吸量(Va)は、水平位と頭部低位との間で差は認めなかった。しかし、15cmH_2Oの頭蓋腔内静水圧負荷により、産生量は、水平位、頭部低位とともに減少した。呼吸量は、両体位とも増加したが、変化量は頭部低位の方が大きかった。以上のように、頭部低位状態下では、CSFの吸収能の亢進が明らかとなった。しかし、ECSFPが同一であるにもかかわらずこの現象をみたことは、CSF呼吸機構に関与する他の因子の存在が示唆された。
栓球による魚類免疫応答の活性化と制御の分子機構

栓球は哺乳類以外の脊椎動物に存在する、血液凝固に関わる血球である。哺乳類の血小板とは異なり有核の細胞であり、形態的には他の白血球と類似している。血液凝固作用以外にも、炎症関連分子の発現、外来異物を取り込む貪食作用等、免疫系への関与も示唆されているが、その詳細は不明なままであった。本研究では、栓球が生体防御において果たす役割を明らかにするため、魚類や両生類といった下等脊椎動物をモデル生物として用い、栓球を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて栓球を標識し、その機能を解析した。その結果、栓球が止血作用のみならず、病原体の排除に対しても大きく貢献していることが明らかとなった。本研究では、栓球が生体防御において果たす役割を明らかにするため、コイをモデル生物として用い、各魚種の栓球を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて栓球を標識し、その機能を解析した。まず、外来異物のモデルとして蛍光ビーズ、大腸菌を投与したin vitro貪食試験では、栓球による活発な異物の取り込みが認められた。この栓球による異物の取り込みは、温度、培養時間、細胞伸長の阻害剤の影響を顕著に受け、補体の結合によるオプソニン化によって促進される等、既知の典型的な食細胞と同様なメカニズムによるものであることが確認された。その一方で、これらの栓球の異物取り込みは、単離した栓球ではほとんど認められず、他の白血球の存在下もしくはその培養上清の添加によって誘起されたことから、免疫系における栓球と他の免疫細胞との密接な相互作用が示唆された。コイ生体に直接ビーズを注射したin vivo貪食試験では、末梢血中、脾臓、腎臓でビーズを取り込んだ栓球が観察された。特に末梢血中では実際にビーズを取り込んだ白血球の半数近くが栓球であったことから、生体内に侵入した異物の除去に栓球が大きく貢献していることが示唆された。さらに、異物取り込み後の栓球による異物分解、殺菌活性の検出を試みた。異物を取り込んだキンギョおよびコイの栓球では、取り込んだビーズや菌体の周囲にlysosomeと考えられる酸性の細胞小器官が集合・融合し、phagolysosomeを形成することが、lysosome標識蛍光色素を用いた顕微鏡観察によって確認された。さらに、コイ栓球に大腸菌の生菌を加え培養、貪食させると、栓球内に取り込まれた生菌数が経時的に減少したことから、栓球は異物の取込みのみならず、殺菌能をも備えた機能的に完全な食細胞として機能することが確認された。本年度においては、栓球の凝固作用や食作用を媒介する細胞表面受容体タンパク質、凝固・貪食刺激による細胞内でのタンパク質発現の違い、これら栓球刺激によって起こる魚類免疫系の活性化・制御作用を解明することを目的として、栓球の食作用に及ぼす各種活性化因子の作用機序の解明を遺伝子・タンパク質レベルで試みた。その結果、栓球が活発な食作用として機能するために、補体などのオプソニンを認識する受容体(インテグリンCD18/CD11、CD46)や抗原提示用の主要組織適合性抗原MHC Class IIなどを発現することを発見した。さらに興味深いことに、この食作用活性が栓球単独では起こらず、LPSやポリI:Cなどの病原体分子パターンによって他の白血球が活性化されると初めて、栓球の食作用も活性化されることが判明した。他の白血球による栓球の活性化は、他の白血球から分泌される可溶性因子によって媒介されることも明らかにした。おそらく、この可溶性因子はサイトカインの一種であろうと考えれれるので、そのサイトカインの同定を目指し、貪食によって活性化される栓球および他の白血球において発現が上昇する遺伝子の網羅的同定をRNAseq法によって進めた。現在のところ、明確に栓球の貪食活性を上昇させるサイトカイン候補遺伝子の同定には至っていない。これにはタンパク質レベルでのアプローチも必要であり、検出可能な量の活性化因子を得るために必要な、栓球および末梢血白血球の大量調製法の確立にも着手した。その結果、モノクローナル抗体を用いた磁気ビーズ法に若干の改変を施して、栓球および栓球を含まない末梢血白血球をこれまでの10倍量調製することに成功し、タンパク質レベルでの機能解明に繋がる方法論を確立することができた。本年度においては、栓球の血液凝固作用と食作用、自然免疫活性化調節作用を媒介する細胞表面レセプター分子および分泌タンパク質の発現変動について、網羅的mRNA発現解析の結果を基に、タンパク質レベルでのより詳細な機能解析を目指した。mRNA発現解析の結果、興味深いことに、栓球が他の食細胞やBリンパ球と同様に、抗原提示に重要な役割を果たす主要組織適合性遺伝子複合体の産物(MHC class II)を高いレベルで発現することが判明した。さらに、自然免疫のエフェクター因子である補体系を構成する成分の幾つかの発現も認められた。特に、補体第2経路の活性化を促進するプロパージンと、細胞膜上での過剰な補体活性化を抑制するCD46のホモログも有為に発現することが判明した。プロパージンの機能をタンパク質レベルで精査するために、組換えコイプロパージンを大腸菌で調製し、抗コイプロパージン抗体をウサギで作成した。

この抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、コイプロパージンは分子量約30万の6量体構造をとること、補体の活性化に伴いグラム陽性・グラム陰性細菌表面に結合すること、その結合は菌体への直接結合でなく、おそらくC3bなどの補体成分を介した、間接的な結合であることが明らかとなった。CD46の機能についてもタンパク質レベルでの解析を進めた。抗コイCD46モノクローナル抗体および各種コイ補体成分に対する特異抗体を用いたフローサイトメトリーおよび細胞傷害試験により、コイCD46はC3bおよびC4bの沈着を阻害すること、および補体による細胞傷害を有為に抑制することを突き止めた。以上の結果より、栓球は、免疫応答調節作用を担う多様な分子を発現し、魚類の自然免疫において重要な防御反応を担うことが判明した。栓球の防御機能の一翼を担う分子のタンパク質レベルでの機能解析を進めることができた。ただし、プロパージンやCD46の機能に関しての学会発表、論文発表が未完である。栓球は、哺乳類以外の脊椎動物において血液凝固を担う血液細胞で、哺乳類の血小板(巨核細胞から遊離した無核の細胞小片)と異なり、紡錘形あるいは球形の有核細胞である。血液凝固に加えて、栓球が異物の貪食などの免疫反応にも関与することが示唆される一方で、否定的な報告もあり、その免疫機能の真相は不明なままであった。そこで本研究では、栓球が生体防御において果たす役割を明らかにするため、コイ、ヒラメ、ツメガエルといった下等脊椎動物をモデル生物として用い、各魚種の栓球を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて栓球を標識し、その機能を解析した。まず、コイ、キンギョ、ヒラメ、アフリカツメガエルの何れの種においても、栓球による活発な異物の取り込みが認められた。さらに、栓球は異物の取込みのみならず、殺菌能をも備えた機能的に完全な食細胞として機能することが確認された。特にin vivo貪食試験では、末梢血中、脾臓、腎臓でビーズを取り込んだ栓球が観察された。末梢血中では実際にビーズを取り込んだ白血球の半数近くが栓球であったことから、生体内に侵入した異物の除去に栓球が大きく貢献していることが示唆された。以上の結果から、比較的原始的な脊椎動物においては、栓球が止血作用のみならず、他の白血球と連携して、侵入した病原体の排除に対しても大きく貢献していることが明らかとなった。さらに栓球が食細胞として機能することは、近年提唱されている脊椎動物血球の新たな分化・系統分類モデルを支持するものであり、免疫細胞の系統発生の解明にも貢献する知見である。栓球は哺乳類以外の脊椎動物に存在する、血液凝固に関わる血球である。哺乳類の血小板とは異なり有核の細胞であり、形態的には他の白血球と類似している。血液凝固作用以外にも、炎症関連分子の発現、外来異物を取り込む貪食作用等、免疫系への関与も示唆されているが、その詳細は不明なままであった。本研究では、栓球が生体防御において果たす役割を明らかにするため、魚類や両生類といった下等脊椎動物をモデル生物として用い、栓球を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて栓球を標識し、その機能を解析した。その結果、栓球が止血作用のみならず、病原体の排除に対しても大きく貢献していることが明らかとなった。当初予定した実験を実施することができた。ただし、RNAseqによる包括的な発現解析によって、栓球の活性化や栓球による自然免疫の活性化に関わる因子を網羅的に同定することを目指していたが、予想以上に発現変動を示す遺伝子が多く見つかり、各種活性化院試を明解に同定することはできなかった。
矯正力による歯の移動に伴うストレスタンパク質の発現と機能に関する研究

本研究は、矯正力による歯周組織の改造機構におけるストレスタンパク質の役割を明らかにすることを目的として、臨床的に健康な歯周組織を有しているヒト小臼歯の歯根より得た歯根膜線維芽細胞(PDL)にin vitroで持続的圧縮力と周期的伸展力を負荷して、メカニカルストレスによるストレスタンパク質の発現を調べた。持続的圧縮力は粒状鉛で1,2,4,6g/cm^2に重さを調節したガラス円筒を細胞の上に直接乗せることにより30分3日間負荷した。周期的伸展力は、FLEXCELL社製のFlexcercellで1秒間伸展-1秒間リラックスの30周期/minで最大15%elongationの様式で30分4日間負荷した。メカニカルストレス負荷後細胞破砕液を調整し、ストレスタンパク質のタンパク発現を抗HSP27,47,60,70,90モノクロナール抗体を用いてウェスタンブロッティング法により解析した。その結果,PDLは持続的圧縮力によりHSP47,60,70の発現の増強を認めたが、HSP27に関しては発現の増強は認められず、逆に発現の抑制が認められた。HSP47,60,70共に一時的な発現の増強が認められたがその後負荷前の発現に戻るか逆に発現の抑制が認められた。以上のような変化は負荷開始数10分から数時間の間に起こり、数時間後には元の発現状態に戻り、HSP60と70に関してはその後負荷開始72時間後まで変化は認められなかった。それに対して周期的伸展力をPDLに負荷すると、負荷直後の変化は認められないが、負荷開始12時間以降でHSP47,60,70の発現の変化を示し、その後96時間後まで発現の増強を認めた。以上の結果より、PDLにはメカニカルストレスによる発現の制御機構が存在することが明らかになり、ストレスタンパク質は歯周組織におけるメカニカルストレスの細胞レベルでの情報伝達機構と改造変化において重要な役割を果たしていることが示唆された。In vivoの実験として、Wistar系ラットを用いて種々の大きさの矯正力で歯を移動し、1,3,5,7,14日後に屠殺し、通法に従い固定、脱灰、包理、薄切後、HSP60,70に対する抗体を用いて、ストレスタンパク質の発現と局在を免疫組織化学的手法により調べた。平成7年度は基本的に抗HSP60,70抗体による免疫染色法を確立するための基本的実験を行った。In vivoの実験は、矯正治療患者の便宜抜去歯歯根より歯根膜細胞を分離し、培養する系を確立した。また外科矯正患者より部分切除された下顎断片より骨芽細胞を分離、培養する系も確立した。これらの細胞培養系を用いて、基本実験として培養ディッシュ上で1,2,4g/cm^2の圧縮力を細胞に負荷して、HSP60,70の経時的なタンパク発現をこれらのストレスタンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロッティング法と免疫組織染色法により調べた。その結果歯根膜細胞についてはHSP60,70共に圧縮力負荷開始30分後から発現の増強が認められ、数時間後には負荷前の発現状態に戻ることが示された。また、圧縮力の大きさの増加に伴い発現の増強が認められた。また、メカニカルストレスに対する基礎的な細胞内情報伝達機構を調べるために、in vivoにおける骨芽細胞様細胞の成熟過程とカゼインキナーゼなど細胞内情報伝達機構に関係している酵素活性の変化に関する研究を行い、細胞質内カゼインキナーゼは石灰化開始期の細胞内情報伝達機構に関与していることが明らかになった。

ヒト小臼歯の歯根より得た歯根膜線維芽細胞(PDL)にin vitroで持続的圧縮力と周期的伸展力を負荷して、メカニカルストレスによるストレスタンパク質の発現を調べた。持続的圧縮力は粒状鉛で1, 2, 4, 6 g/cm^2に重さを調節したガラス円筒を細胞の上に直接乗せることにより30分3日間負荷した。周期的伸展力は、FLEXCELL社製のFlexcercellで1秒間伸展-1秒間リラックスの30周期/minで最大15%elongationの様式で30分4日間負荷した。メカニカルストレス負荷後細胞破砕液を調整し、ストレスタンパク質のタンパク発現を抗HSP27、47、60, 70、90モノクロナール抗体を用いてウェスタンブロッティング法により解析した。その結果、PDLは持続的圧縮力によりHSP 47、60, 70の発現の増強を認めたが、HSP 27に関しては発現の増強は認められず、逆に発現の抑制が認められた。HSP 47、60, 70共に一時的な発現の増強が認められたがその後負荷前の発現に戻るか逆に発現の抑制が認められた。以上のような変化は負荷開始数10分から数時間の間に起こり、数時間後には元の発現状態に戻り、HSP 60と70に関してはその後負荷開始72時間後まで変化は認められなかった。それに対して周期的伸展力をPDLに負荷すると、負荷直後の変化は認められないが、負荷開始12時間以降でHSP 47, 60, 70の発現の変化を示し、その後96時間後まで発現の増強を認めた。In vivoの実験として、Wistar系ラットを用いて種々の大きさの矯正力で歯を移動し、ストレスタンパク質の発現と局在を免疫組織化学的手法により調べたが結果に関しては現在解析中である。
高齢者の脱水状態を簡便にアセスメントする方法の開発

若年者と前期高齢者,後期高齢者の体格の比較から,加齢に伴う細胞内液量の減少により,後期高齢者はわずかな水分摂取不足でも脱水に陥りやすい可能性があることが明らかになった。また比較的活動量の少ない軽費老人ホーム入所者を対象に手首内側,肘関節内側,足首内踝,後頚部の皮膚水分を測定したところ,後頚部は比較的水分保持ができる部位であることから,脱水状態を早期に発見できる観察部位として使用できる可能性があることが示唆された。本研究は,高齢者の脱水状態を早期にアセスメントできる腋窩以外の有効な部位を検討し,脱水状態を簡便かつ客観的にアセスメントする方法の開発を目的としている。研究代表者の研究において,腋窩の皮膚水分と細胞内液量間には有意な相関があることを示しており,手首内側の皮膚水分が脱水状態を示す評価部位となる可能性があることを示した。今年度は,療養型病床を有する病院やケアハウスに入所する高齢者を対象に部位別生体インピーダンス法と皮膚油水分測定を実施することを目標とした。軽費老人ホームで生活している方を対象に研究意義・研究目的の理解と研究協力を得るため,入所高齢者に研究意義・研究目的の説明ならびに脱水予防の方法を説明した。その結果,同意の得られた28名(介護度なし介護度3)を対象に部位別生体インピーダンス法と皮膚油水分測定を9ケ所(両側の腋窩・肘関節内側・手首内側・内踝ならびに後頚部)の測定を実施した。測定時期は季節間の比較のため,8月ならびに同意の得られた同一の対象者26名に3月にも実施した。測定結果については整理途中であり,体内水分量と皮膚油水分との関連,皮膚油水分の部位比較を今後分析していく予定である。予定した日常生活行動調査(生活時間,1日の食事摂取と飲用水の内容・量の測定,排尿量の測定)を対象者自身に測定してもらうことが困難であり,計画の修正が必要である。また今年度は比較的自立している方を対象とし測定を実施したため,今後は医療型療養施設で,さらに介護度の高い方を対象とし,同様の測定が実施できるよう現在進行中である。本研究は,脱水状態に陥りやすい高齢者を対象に脱水状態を早期にアセスメントできる有効な部位を検討すること,脱水状態を簡便かつ客観的にアセスメントする方法の開発を目的としている。脱水状態は一般的に腋窩や口腔の乾燥が有効な部位であることが示されおり,研究代表者の研究においても腋窩の皮膚水分と細胞内液量間には有意な相関があることを示した。しかし,腋窩の乾燥はすでに脱水状態を示している可能性が高く,脱水状態を早期にアセスメントする部位としては手遅れになることが考えられ,脱水状態を早期にアセスメントできる腋窩以外の有効な部位を検討していくことが求められる。研究代表者の研究において,手首の皮膚水分と細胞内液量間に有意な相関があり,手首は脱水状態を示すアセスメント部位となる可能性があることを示した。自立した高齢者と軽費老人ホームで生活している高齢者を対象に皮膚油水分測定9か所(両側の腋窩,両側の肘関節内側,両側の手首内側,両側の内踝,後頚部)と部位別生体インピーダンス法による体内水分量(細胞内液量,細胞外液量)の測定を実施したが,介護の高い高齢者の測定は未実施である。今年度はより筋肉量の少ない介護度の高い高齢者を対象にデータを重ねていく予定であったが,予定より遅れている現状であり,計画の再修正が必要である。また測定結果を整理している最中であり,自立した高齢者と軽費老人ホームで生活している高齢者の比較を行い,研究結果を公表する準備を行う予定である。今年度は本研究に関連した研究成果である「若年者と高齢者における体格の変化と細胞内液・外液量と易脱水状態の特徴」を公表した。この研究結果では,体格ではBMIは若年者と前期高齢者(p<0.001),若年者と後期高齢者(p<0.001)に有意な差がみられ,体脂肪率は若年者と前期高齢者(p<0.01),若年者と後期高齢者(p<0.05)に有意な差がみられた。細胞内液量は若年者と前期高齢者(p<0.001),若年者と後期高齢者(p<0.001),前期高齢者と後期高齢者(p<0.001)に有意な差がみられ,細胞外液量は若年者と前期高齢者(p<0.01)に有意な差がみられた。これらの結果から細胞外液量は加齢に影響されにくいため比較的保持できることに対し,細胞内液量は加齢に伴い減少するという先行研究と同様の結果を得た。特に後期高齢者はわずかな水分摂取不足でも脱水に陥りやすい可能性があることの示唆を得た。若年者と高齢者の体格と体内水分量から高齢者は容易に易脱水状態に陥りやすいことが示され,脱水状態を早期に簡便かつ客観的にアセスメントする方法を開発することは意義がある。本研究では,自立した高齢者と軽費老人ホームで生活している高齢者を対象に皮膚油水分(両側の腋窩,両側の肘関節内側,両側の手首内側,両側の内踝,後頚部)の測定を実施しており,体内水分量を含めた分析をすすめ,研究結果を公表する準備をすすめていく。

本年度は研究成果を分析し,研究成果を発表する予定であったが,親の介護ならびに目前の教育業務が多忙であり,当初の計画より大幅な遅れが生じた。次年度は,研究成果の分析をすすめ,研究成果の発表準備をすすめていく。また研究継続のための情報収集ならびにデータ協力施設への依頼の準備をすすめる。本研究では脱水状態に陥りやすい高齢者を対象に,暑熱障害の一つである脱水状態を早期にアセスメントできる有効な部位の検討をすること,脱水状態を簡便かつ客観的にアセスメントする方法の開発をすることを目的としている。本研究では若年者と高齢者の体格を比較し,高齢者は加齢に伴い,細胞内液量の減少がみられ,わずかな水分摂取不足でも脱水に陥りやすい可能性があることを示した。今年度は「軽費老人ホーム入所者における身体各部位の皮膚水分の特徴」を明らかにした。比較的活動量の少ない高齢者26名(男性4名,女性22名)を対象に,油水分測定機WSKーP500U(WAVE CYBER CORP社製)を用いて,右腋窩,右手首内側,右肘関節内側,後頚部,右足首内踝の5か所を測定した。対象者は66歳から94歳で平均年齢81.7±7.2歳であり,介護度は要介護3(1名),要介護2(2名),要介護1(5名),要支援2(3名),非該当(11名)であった。皮膚水分の平均値(最小値-最大値)は右腋窩65.6±19.2(30-96),右手首内側51.7±11.1(26-70),右肘関節内側55.8±14.7(4-72),後頚部70.0±10.4(48-85),右足首内踝32.7±16.4(5-73)であった。皮膚は加齢変化に伴い,表皮における角層水分保持能は低下することで乾燥し,乾燥度は頚部と比較すると体肢遠位部,特に下肢が高いといわれており,本研究においても足首内踝の皮膚水分は他の部位と比較しても少なく,同様の結果を得た。また比較的水分保持能のある後頚部を脱水状態を早期に発見する観察部位のひとつとして使用できる可能性があることが示唆された。若年者と前期高齢者,後期高齢者の体格の比較から,加齢に伴う細胞内液量の減少により,後期高齢者はわずかな水分摂取不足でも脱水に陥りやすい可能性があることが明らかになった。また比較的活動量の少ない軽費老人ホーム入所者を対象に手首内側,肘関節内側,足首内踝,後頚部の皮膚水分を測定したところ,後頚部は比較的水分保持ができる部位であることから,脱水状態を早期に発見できる観察部位として使用できる可能性があることが示唆された。予定していた医療型療養施設での測定準備が整わず,介護度の高い対象者への測定が実施できなかった。医療型療養施設での測定のためには家族の同意が欠かせず,施設へ出向けなかったことが原因の一つである。今後は,予定していた施設のみならず,協力施設を依頼し測定できる準備を行いたいと考える。次年度は本研究成果を公表するための準備を行い,学会発表する予定としている。また研究継続のための情報収集ならびにデータ収集に協力していただける施設への依頼の準備をすすめ,研究を継続していく環境を整える予定である。基礎看護学今年度が最終年度であるが,測定準備に時間を要するため計画の修正が必要である。今年度は測定の実施を予定していた施設へ出向き,家族の同意を得,測定を実施する。また予定していた施設のみならず介護度の高い高齢者のいる施設へ協力を依頼し,測定を実施できる環境を整え,実施する。その結果を整理,分析し,公表する準備を行う。予定していた軽費老人のホームでの測定を実施することができた。
肺の間質性炎症に関わる免疫担当細胞応答の追跡-膜表面抗原解析を用いた研究-

特発性間質性肺炎(IPF)の急性期あるいは活動期では、気管支肺胞洗浄液(BALF)の総細胞数、リンパ球比率が増大していた。CD3+リンパ球が増加しており、Tリンパ球の増加を示唆した。定説と異なり、CD4+リンパ球とCD8+リンパ球の比は低値であり、CD8+リンパ球が増大していた。CD8+S6F1+もしくはCD8+CD11a+リンパ球を細胞障害性Tリンパ球(CTL)として測定したが、CTLの比率は著増していた。発病より、やや時間が経過したIPF症例では、急性期症例よりもBALF中のリンパ球比率が低下し、CD4+/CD8+比の低下が著明ではなく、CTL比率の著増を認めなかった。IPF症例の急性期にCD8+リンパ球が増加し、そのCTL分画が著増していた観察結果は、従来特発性とされている間質性肺炎で、ウイルスなどの外的抗原に対する免疫応答がその発症に関与している症例が存在する可能性を示すものであると考えた。また、膠原病のひとつである多発性筋炎の症例でも、CTL分画の著増が見られた。さらに、gammadelta陽性リンパ球は0.7%3.4%、ナチュラルキラーリンパ球は0.7%19.9%と少なかった。CD4+CD45RA+リンパ球は0.2%0.3%、CD4+CD45RO+リンパ球は5.9%12.0%であり、これらの臨床的意義にはさらに検討が必要であると考えた。一方、サルコイドーシスでは、BALF中のCD4+/CD8+リンパ球比は増大しており、肺間質性炎症の発症機序としての免疫応答が特発性間質性肺のそれと異なることが示唆された。
企業の潜在的財務指標の推定とその新展開

本研究では,リスクを考慮に入れた企業の潜在的財務指標を推定する理論モデルを構築し,そのモデルを用いて実証研究を行った.特に,企業の経営者と株主の間に情報の非対称性から利害対立を仮定した上で企業のプロジェクト評価式を提示した.本研究では,リスクを考慮に入れた企業の潜在的財務指標を推定する理論モデルを構築し,そのモデルを用いて実証研究を行った.特に,企業の経営者と株主の間に情報の非対称性から利害対立を仮定した上で企業のプロジェクト評価式を提示した.2007年度の研究では,リスクを明示的に取り入れた企業の潜在的な財務指標を計測するための理論モデルの構築を行った.具体的な研究実績は,掲載決定論文2本,学会発表3回,ワーキングペーパー3本に集約されている.まず,次の論文が国際ジャーナルに掲載された(一つは掲載決定).European Journal of Operational Researchに掲載された論文では,企業が投資活動において市場の情報を完全には観測できないと仮定した上で,その情報の不確実性を考慮に入れた投資プロジェクト評価モデルを構築した.Operations ResearchLettersに掲載が決定された論文では,企業内のエージェンシー問題(株主所有者と経営者の利害対立)を考慮にした上で,企業のプロジェクト評価モデルを構築した.次に,国内学会で1回,国際学会で2回,研究報告を行った.具体的には,6月に大阪学院大学で開催された日本経済学会春季大会,7月にチェコ・プラハで開催されたEuropean Conference on Operational Research,12月にオーストラリア・シドニーで開催されたQuantitative Method on Finance 2007において,企業の潜在的財務指標に関する理論モデルについて研究報告を行った.最後に,ワーキングペーパーを3本発表し,国際ジャーナルに投稿した.2008年度の研究では,リスクを明示的に取り入れた企業の潜在的財務指標を計測する理論モデルを構築した.具体的な研究業績は,国際ジャーナルに論文3本掲載(1本は掲載決定すみ印刷中),国内ジャーナルに論文1本掲載,書籍1冊出版に集約される.Shibata(2008)では,非完備情報と企業の投資プロジェクト評価方法を提示し, Nishihara and Shibata(2008)やShibata(2009)では,株主と経営者の情報の非対称性から生じる両者の利害対立を考慮に入れた上で,企業の投資プロジェクト評価方法を提示した.また,芝田・山田(2008)では,複数の銀行がある特定の企業に融資をしている場合,企業業績の悪化に伴い,複数の銀行が戦略的債権回収を企業に要求する結果,企業にどのような影響を与えるのかについて分析し,その効果を考慮した上での企業の負債価値評価式を提示した。さらに, 2008年8月に朝倉書店から書籍「リアルオプションと投資戦略」を刊行した.また,国際学会にて5回,海外大学にて1回,論文を発表した。具体的には, 6月にフランス・パリで開催されたComputing in Economics and Finance, 7月にフランスのCompiegneで開催されたInternational Workshop on Applied Probability, 7月にイギリス・ロンドンで開催されたBachelier Finance Society Fifth World Congress, 12月にオーストラリア・シドニーで開催されたQuantitative Methods in Finance Conference, 2009年1月にアメリカ・ワイキキで開催されたApplied Business Research Conferenceにおいて,企業の潜在的財務指標に関する論文を報告した。また, 2009年3月に韓国延世大学にて同内容の論文を発表した.最後に,ワーキングペーパーを4本執筆し,国際ジャーナルに投稿した.2009年度の研究では,リスクを明示的に取り入れた企業の潜在的財務指標を計測する理論モテルの構築とそのモテルを用いた実証分析を行った、具体的な研究業績は,学術論文5編,学会発表3回,書籍3編に集約されている.まず学術論文では,Shibata(2009)やShibata and Nishihara (2010)において,株主と経営者の情報の非対称性から生じる両者の利害対立を考慮し,企業の投資プロジェクト評価法を提示した.Shibata and Yamada (2009)では,複数の銀行がある特定の企業に融資をしている場合,企業の業績悪化に伴い,複数の企業が戦略的債権回収を企業に要求する結果,企業にどのよりな影響を与えるかについて分析し,その効果を考慮した上で企業の負債価値評価式を提示した.Nishihara and Shibata (2010)では.企業が負債による資金調達を仮定した上で,複占市場における企業の投資戦略について考察し,その企業のプロジェクト評価式を導出した.Shibata and Tian (2010)では,企業の再年スキームを考慮に入れ,企業の最適再生戦略について考察し,その戦略の考慮した上での企業の株式および負債価値の評価式を導出した.次に,学会報告では,6月にポルトガルで開催されたリアルオプション学会,7月にオーストラリアで開催された国際ジャーナルJEDCが主催するコンピュテーショナル経済学会,9月にギリシャで開催された応用数学学会において,企業の潜在的財務指標を計測する理論モデルについての研究報告を行った.
ネズミマラリア原虫ミトコンドリア呼吸鎖成分の生化学解析

本研究では、生化学的解析に十分耐えうるネズミマラリア原虫(赤内型)ミトコンドリアの調製法を確立し、その重要な機能の一つである呼吸鎖電子伝達系の生理的意義と宿主ミトコンドリアとの相違点を明らかにすることを目的としている。これまでの研究から我々は、N_2 cavitationによるマイルドな細胞破砕と密度勾配遠心分画を併用し、生化学および電顕形態学的にも比較的良好なミトコンドリア分画を得ている。本年度はこのように調製したミトコンドリア分画のintactnessを評価し、また、マラリア原虫ミトコンドリアの選択的プローブとしての有用性を検討する目的で、2種類の蛍光色素、すなわちこれまですでに使用されているローダミン色素と、抗癌作用を有するロダシアニン系色素MTK-077の取り込みを比較検討した。まず、最初に当該色素のネズミマラリア原虫(P. berghei)赤内型への取り込みを蛍光顕微鏡で調べたところ、MKT-077はローダミン123と同様、感染赤血球内のマラリア原虫に取り込まれることが明らかになった。次に、赤内型マラリア原虫ミトコンドリア分画と色素をincubate後、密度勾配遠心し、勾配上の色素の分布をしらべた結果、ローダミン123と同様、MKT-077を取り込むことが示唆された。さらに、定法により単離したマウス肝臓ミトコンドリアによる色素取り込みを、フローサイトメトリーで検討すると、本ミトコンドリアはローダミン123を取り込むが、MKT-077は取り込まなかった。これらの結果はMKT-077はマラリア原虫ミトコンドリアに比較的選択的に取り込まれることを示唆するものであるが、現在、他の蛍光色素もふくめさらに詳細な検討を行っている。
早産における分子状水素の予防効果と母獣長期投与の胎仔への影響

周産期医療が発達しているにも関わらず、早産の合併症による新生児死亡や脳性麻痺の発生率も改善していない。早産の病態に炎症が関与すること、さらに酸化ストレスや炎症性サイトカインが児の予後に影響することが報告されている。今回我々は近年抗酸化作用や抗炎症作用があるといわれている分子状水素に着目し、炎症性早産モデルマウスにおける効果について検討した。その結果受傷前に50%飽和水素水を母獣に投与した群では妊娠期間の延長を認め、また子宮組織の炎症性サイトカインなどの早産に関わる因子の発現を有意差を持って抑制した。また50%飽和水素水母獣投与による胎仔催奇形性は認めず、安全に母体へ投与できることを証明した。平成27年度は、CD-1妊娠マウスを用いて、妊娠15.5日目にリポポリサッカライド(LPS)を500μg/kg腹腔内投与した群をLPS群(炎症性早産モデル)とし、腹腔内投与24時間前から50%飽和水素水を母獣に自由飲水させる群を分子状水素-LPS群として、妊娠継続期間を比較したところ、LPS群では腹腔内投与後24時間以内の早産を90%に認めたのに比べ、分子状水素-LPS群では60%と改善傾向であった。またLPS群の腹腔内投与後から早産に至るまでの時間の中央値は15時間であったのが、分子状水素-LPS群では20時間と5時間の妊娠期間の延長を認めた(p=0.014)。さらに、妊娠15.5日目にPBSを腹腔内投与する群をコントロール群とし、前述したLPS群と分子状水素-LPS群の3群(各群n=6)で、PBSまたはLPSの腹腔内投与6時間後に子宮組織を回収し、炎症性サイトカイン(IL-6、TNFα、IL-8)や子宮収縮関連タンパク(Cox-2、コネキシン43(Cx43)、オキシトシンレセプター(OTR))、また早産に重要な役割を果たしていると言われるエンドセリン-1(ET-1)について、半定量RT-PCRを用いてmRNAレベルでの発現を比較検討した。その結果、LPS群でいずれの因子も発現が上昇していたが、分子状水素-LPS群でIL-6、TNFα、Cox-2、Cx43、OTR、ET-1では有意差をもって発現が低下していた(すべてp<0.05)。半定量RT-PCRの結果では、子宮組織において、早産の重要な分子であるIL-6やET-1などの分子や、子宮収縮関連タンパクであるcox-2やCx43、オキシトシンレセプターがLPS投与によってmRNAレベルで発現上昇することを、分子状水素の前投与により有意差を持って改善させることが分かった。またLPSによる早産を、分子状水素投与により妊娠期間延長を認めた。しかし引き続き水素の至適投与法や至適濃度など、より効果のある投与方法を検討していく必要があると思われる。本研究は昨年度、炎症性早産モデルマウスに対し、抗酸化剤である分子状水素を用いて早産の予防が可能かどうかを検討し、妊娠期間の延長を認めた。そこで本年度は、分子状水素は食品添加物として認可されているが、妊婦や胎児への安全性が確認されていないため、引き続き妊娠マウスを用いた催奇形性試験と毒性試験を行った。まず、催奇形性試験では、妊娠5.5日目から15.5日目の器官形成期に限定して、母獣に50%飽和水素水を自由飲水させた。その後自然分娩に至った新生仔の外表奇形や死産率を確認した。コントロール群は通常水を自由飲水し、同じく自然分娩に至った新生仔とした。その結果コントロール群と水素水群はいずれも明らかな外表奇形を認めなかった。また、毒性試験のプロトコールは、妊娠0.5日目から母獣にコントロール群は通常水を、水素水群は50%飽和水素水を自由飲水させた。自然分娩した後も引き続き水素水群の母獣に50%飽和水素水を自由飲水させ、新生仔の体重を記録した。生後21日目で離乳させたあと、水素水群の新生仔には生後70日目(10週齢)まで50%飽和水素水を自由飲水させ、体重を記録した。コントロール群と比較した結果、授乳中の新生仔の体重は、水素水群でやや重い傾向があった。また離乳後はコントロール群の雄と雌、水素水群の雄と雌の4群で比較したが、性別で比較したところ、成長や発達に有意差は認めなかった。以上のふたつの試験から、分子状水素の母獣投与の仔への安全性を確認した。今後は臨床応用に向けて、ヒトにおける分子状水素の投与方法のプロトコールを確立して、早産抑制効果についても検討する。

引き続き、水素の至適投与法や至適濃度など、より効果のある投与方法を検討していく。また子宮組織における分子状水素の炎症性早産の予防効果を分子学的に解明するために、現在までに出ている炎症性サイトカインや子宮収縮関連タンパクの結果について考察し、分子状水素の作用機序にせまる。その結果をまとめて、論文報告する。28年度が最終年度であるため、記入しない。周産期28年度が最終年度であるため、記入しない。