hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高ガスバリア性樹脂製造のための新触媒プロセス開発

ポリエステルの水素化反応によるポリオール合成を目指し、ポリエステル類の部分構造を模した低分子エステル類を調製し、ルテニウム触媒を用いた水素化反応の化学選択性や触媒活性について系統的な評価を行った。その結果モデルとしたモノエステル類では水素化反応と競合するアルコール交換反応が、反応速度の低下を招くのみで化学選択性には悪影響を与えないものの、オリゴエステル類では隣接エステル基間において併発するため深刻な副反応となること、加えてこの問題は優れた水素化触媒として報告されている如何なるルテニウム触媒を用いても簡単には解決できないことが明らかとなった。エステル類の水素化反応に有効とされる種々のRu触媒を用いて、未だ報告例のないα位に四級炭素原子をもつエステル化合物として2,2-ジメチル,2,2,4-トリメチル、ならびに2,2,4,4-テトラメチルグルタル酸ジメチルを取り上げて水素化反応を実施した。その結果、前の二つの化合物は円滑に反応が進行して対応するジオール類が収率よく得られたのに対して、最後の化合物は同様の条件下では全く反応しないことが判った。そこで次に2,2-ジメチルグルタル酸ジメチルから2,2-ジメチル-1,5-ペンタンジオールが得られる反応経路の詳細について反応条件をより穏やかにして調べたところ中間生成物としてα,α-ジメチル-δ-バレロラクトンが観測された。以上のことからα位に四級炭素原子をもつエステル基の水素化はいかなるRu触媒をもちいても容易ではないものの,隣接水酸基によってラクトン構造に変換されれば、活性化エネルギーが低減されアルコールへの変換反応が加速することが示唆された。そこで近傍に種々の水酸基を配したピバル酸エステルと単純なピバル酸エステルの水素化反応における活性を比較したところ、水酸基を配したピバル酸エステルが選択的にアルコールへと変換されることが明らかとなった。本結果はポリメタクリル酸エステルからポリメタリルアルコールに導く際に、遊離水酸基をもつ原料を用意すれば、Ru触媒による水素化反応を活用できることを示唆する重要な結果である。ポリエステルの水素化反応における脱離基としてどのような構造が最も適切かを調べる為に,モデル基質として種々の脱離基をもつピバル酸エステルを調製してRu触媒による水素化反応を実施した.いずれの場合も反応は高選択的に進行し,還元生成物ネオペンチルアルコールと対応する脱離アルコールを与えた.その中でピバル酸エステルとしてピバル酸メチルやピバル酸エチルを水素化した場合に比べてエチレングリコール,1,2-プロパンジオール,1,3-プロパンジオール,グリセリンのモノピバレートを水素化した場合には反応速度が同等もしくはそれ以上となった.この結果はエステルの脱離基に配した遊離水酸基が,還元されるカルボニル基の活性化に寄与している可能性を示唆する重要な結果である.そこで次に,2-ヒドロキシエチルピバレートをエステル基質として取り上げ,筆者が開発したRu触媒と市販の4つのRu触媒とを,同一反応条件下に比較し触媒活性を相対評価した.その結果,筆者の開発したRu触媒が他のものと比べて同等あるいは高活性であることが明らかとなった.そこで最後に,2-ヒドロキシエチル基を脱離基としてもつメタクリレートをモノマーとする単独ラジカル重合によって鎖長の異なるポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)を種々調製した.現在,これらのポリエステルの反応媒体に対する溶解性とRu触媒を用いた水素化反応に対する反応性を総合的に評価する作業を行っている.テクニカルスタッフの訓練教育が功を奏して現在スムーズに研究が進展しているが,継続的に研究を進展させる為には他の外部資金などによる人件費の充当が必要不可欠である.カルボニルα位に4級炭素をもつエステル類の水素化反応について、さまざまなルテニウム触媒を用いて脱離アルコールの分子構造が反応性に与える影響を詳細に検討した。遊離ヒドロキシル基をもつ直鎖状エステル類は、一様に基質の消失速度が向上するものの、水素化反応に加えてトランスエステル化が顕著に併発するために選択性が著しく低下することが明らかとなった。一方で環状エステル類は遊離ヒドロキシル基の有無に関わらず水素化反応が高選択的に進行し対応するジオール類を高効率に与えることがわかった。そこで環状エステルを側鎖に含む高分子基質としてα-メチレンブチロラクトンとスチレンの共重合体を種々調製してルテニウム触媒を用いる水素化反応を実施した。その結果、反応溶媒に可溶な高分子基質から、環状エステル部位が還元的に変化した高分子生成物が得られた。本高分子生成物の詳細な分子構造の究明とフィルム化を通じたガスバリア性の評価が今後の課題である。テクニカルスタッフの雇用と教育ならびに実験環境の整備に時間を要したが、企業の協力を仰ぎ、当初の計画からの遅れは取り戻しつつある。

本研究に関連する研究について平成27年度に共同研究契約を締結した企業と平成28年度も継続的に共同研究を進める予定であり,ポリエステルの触媒的水素化によるポリオール合成を推進する予定である.またポリオールの構造決定やガスバリア性評価については筆者が属する研究組織の専門家に協力を仰ぐ予定である.分子触媒化学27年度からは新たな企業からの協力を仰ぎ、総じて研究は加速する見込みである。研究を加速する為にテクニカルスタッフを雇用し当初の計画より人件費を増額して執行する予定としたものの、適切な人材を見つけるのに時間を要したため結果的に物品費が余ってしまった。本年度購入を控えた消耗品(真空ラインやマグネティックスターラー等)の購入に充当する。
危急種ナリヤラン(ラン科)を保護・増殖するための種子繁殖に関する研究

交配システム昨年と同様の方法を用いて以下の点を解明した。(1)柱頭は開花当日から開花後5日目まで花粉の受け入れが可能で、高率(79100%)で結実することが再確認された。(2)花粉塊は開花後4日目の花から取り去ったものではほぼ100%の割合で受精する能力をもつ。また、5日目以降8日目までの花粉も稔性を保持していることが今回新たに判明した。これらのことは、花から取り去られた花粉が最低でも1週間は稔性をもち、花を受精できることを示している。ただし、それらの"古い"花粉が稔性をもつ確率は概して低く、8日目の花粉では33%となった。花粉が長命という特性は、昆虫の訪花頻度が低いことと関連すると推測される。送粉昆虫昨年確認できた3種以外にヤエヤマキバラハキリバチ(♂)とツチバチの1種(♂)を花粉媒介昆虫として確認できた。特にヤエヤマキバラハキリバチは優秀な花粉媒介種で、多くの個体が花粉塊を中胸背面に付着させていた。興味深いことに本種は夕刻になると、ナリヤランの枯茎の先端部に頭部を真下にして大顎でつかまり、夜を過ごす。これらの個体にマークをしてその動向を調査したところ、再捕率はゼロであった。この結果はハチが毎日越夜する場所を移動するために生じたのか、あるいはマークをつけるためにハチを一時捕獲したために生じたのかは不明だが、もしも自発的に移動しているのであれば、ハチの移動が結果的にランの花の他家交配を促進する効果をもつといえる。花を訪れる昆虫以外に、花外蜜線を訪れる昆虫の目録を作成した。特にクロトゲアリを含むアリ類が蜜を頻繁に利用していた。生存阻害要因植生遷移の進行にともなって侵入してくるシダ植物6種の繁茂がナリヤラン個体群の最大の衰退原因であることを突き止めた。特にコシダとイリオモテシャミセンズルがナリヤラン開花株の衰退と次世代個体(実生)の生長阻害を引き起こす最大の原因となっている。1.生育状況の調査西表在住の104人にヒアリング調査をして、現在および過去の生育状況の把握を試みた。その結果、かつては西表島南端の豊原から西部の白浜(および内離島)までの全域にわたってたくさんの自生地が存在し、特に仲間崎や宇那崎付近、上原および浦内付近の海岸線と山地との間の平野部には大生育地があったことが判明した。しかし現在は、農地改良事業によってその大部分が完全に消滅している。現在でもまとまった数(500<)の開花株の生育が認められる自生地は、上原と仲間崎付近の2ヶ所を残すのみである。ナリヤランは陽光要求性の強いパイオニア種で、植生遷移の進行に伴いコシダなどの高丈植物が密生すると、開花株の衰退と地表部での実生更新が阻害され消失してしまうことが判明した。したがって、残存する生育地が土地開発を免れたとしても、草刈り(あるいは火入れ)などによって植生遷移の進行を人為的に阻止しない限り、現状を維持するのも困難な危機的状況にある(残存する生育地の大多数には既に高丈植物が侵入している)。自然環境下における本種の保全には、明らかに生育地管理が必須である。2.交配システム人為的な受粉処理を開花後日数の違う花に施すことで以下の諸点を解明した。(1)本種は自動的な同花受粉機構を欠くため、種子生産のためには送粉昆虫の介在が不可欠である。しかし、(2)同花受粉の処理をすれば高率(90.9%=44/50)で実を結ぶので、自家和合性である。(3)柱頭は開花直後から花粉の受入れが可能で、少なくとも開花4日目までは高い結果率(83-94%)を保つ。(4)花粉塊は最低でも4日間は稔生を保つ(次年度はさらに古い花粉塊を用いて実験を行い、どれくらい送粉昆虫の体に着いたままでも受精が可能かを明らかにする)。3.送粉昆虫の予備調査送粉昆虫としてタカオルリモンハナバチ、ミナミアオスジハナバチ、オオフタビドロバチを同定した。しかし、ヒアリング調査中に得た情報によれぱ、ナリヤランの開花期は6月から12月までの長期に及ぶため、時期ごとに異なる種類の昆虫が花粉を媒介していると推測される。次年度は今回明らかにできなかた開花の初期と終期における送粉昆虫種の解明とその定量的評価を試みたい。

特にヤエヤマキバラハキリバチは優秀な花粉媒介種で、多くの個体が花粉塊を中胸背面に付着させていた。興味深いことに本種は夕刻になると、ナリヤランの枯茎の先端部に頭部を真下にして大顎でつかまり、夜を過ごす。これらの個体にマークをしてその動向を調査したところ、再捕率はゼロであった。この結果はハチが毎日越夜する場所を移動するために生じたのか、あるいはマークをつけるためにハチを一時捕獲したために生じたのかは不明だが、もしも自発的に移動しているのであれば、ハチの移動が結果的にランの花の他家交配を促進する効果をもつといえる。花を訪れる昆虫以外に、花外蜜線を訪れる昆虫の目録を作成した。特にクロトゲアリを含むアリ類が蜜を頻繁に利用していた。生存阻害要因植生遷移の進行にともなって侵入してくるシダ植物6種の繁茂がナリヤラン個体群の最大の衰退原因であることを突き止めた。特にコシダとイリオモテシャミセンズルがナリヤラン開花株の衰退と次世代個体(実生)の生長阻害を引き起こす最大の原因となっている。
多次元格子上の離散方程式における可積分性判定

多次元格子上で定義された離散方程式の可積分性に関する研究を、方程式の各項の分子分母の因子の打消しという観点から行った。まず、互いに素条件と呼ばれる性質を適当に拡張し、より多くの方程式に適用できるようにした。さらに、拡張離散戸田方程式がこの性質を満たすことを示した。また、特異点閉じ込めから方程式の可積分性を判定するための手法の開発も行った。2階の方程式の場合に、代数幾何学的な手法を用いてその意味を明らかにした。離散可積分系についての研究を、多次元格子上の方程式の可積分性判定という観点で行った。用いた主な道具は、代数的エントロピー、Laurent性、互いに素条件である。1.離散戸田方程式を拡張して得られる方程式を調べた。離散戸田方程式の双線形形式をうまく拡張することでLaurent性を持つ方程式の系列が得られるが、これらの方程式が互いに素条件を満たすことを示した。さらに、離散戸田方程式の非線形形式に対応する方程式を拡張後に考え、この方程式の互いに素条件について調べた。その結果、互いに素条件やLaurent性の概念はもう少し拡張する必要がありそうだという結論が得られた。2.既約性が成り立たないにもかかわらず互いに素条件が成立するような方程式について考察した。定義式自体が因子の積に分解してしまうような方程式の場合、方程式の解も自明に分解してしまうため、決して既約になることはない。しかし、このような場合であっても、方程式の解がどのように分解されるか細かく追うことで、既約性が成立する場合と同様、互いに素条件に関する議論ができることがわかった。3.多次元格子上の方程式を考える際の領域に関する考察をした。離散双線形方程式の場合には既に考えるべき領域が定式化されていたが、これを他のいくつかの方程式の場合に考察した。4.特異点閉じ込めを通過するような非可積分系をリダクションして得られる方程式について細かく調べた。方程式が互いに素条件を満たすことを示すとともに、代数的エントロピーの値も求めた。1次元格子上の方程式に関する解析は当初の予定より少し遅れている一方、多次元格子上の方程式に関しては当初の予定よりも少し進んでいる。総合的に判断すれば、進展はおおむね順調であると言える。1.前年度の研究の結果、因子の打消しの言葉を用いて方程式を正しく解析するためには、互いに素条件やLaurent性の概念を拡張する必要がありそうだという結果が既に得られていた。そこで本年度は、方程式の特異点の情報を用いて互いに素条件とLaurent性を実際に拡張した。具体的には、方程式から自明に発生してしまう因子を例外扱いすることで、より幅広い方程式が扱えるようになっただけでなく、方程式の座標変換に対しても柔軟に対処ができるようになった。さらに、拡張離散戸田方程式の非線形形式が、拡張されたこれらの性質を満たすことを示した。2.線形化可能な2次元格子上の方程式を新たに構成した。行列式を用いて線形化を具体的に与えると同時に、この方程式を因子の打消しという観点からも詳しく調べた。3.互いに素条件を満たすいくつかの多次元格子上の方程式を1次元にリダクションし、その性質を詳しく調べた。特に、いくつかのケースについて、因子の打消しを調べることで代数的エントロピーを厳密に求めた。4.特異点閉じ込めを通過する方程式について、特異点パターンの情報のみから方程式の代数的エントロピーを計算する手法について研究した。数多くの具体的な方程式でこの手法が有効であることを確認した後、2階の方程式の場合に、代数幾何学的な手法を用いてその意味を明らかにした。今後も引き続き、多次元格子上の方程式の可積分性判定という観点で研究を行う。初年度の研究により、一般の場合を考察するためには互いに素条件やLaurent性の概念を少し拡張する必要がありそうだという結果が得られたので、どのような拡張が適切なのかについても調べる。29年度が最終年度であるため、記入しない。数物系科学・数学29年度が最終年度であるため、記入しない。
自閉症の聴覚情報処理過程における弱い中枢性統合の影響に関する検討

【具体的内容】今年度は,広汎性発達障害の診断を受け,精神遅滞を伴わない成人臨床群(高機能自閉症,アスペルガー症候群を持つ人)を対象に,4種類の純音によって誘発されるM100と呼ばれる基礎的な聴覚情報処理を反映する脳活動をmagnetoencephalography(脳磁図)を用いて計測した.その結果,臨床群のM100は,定型発達に比べて遅延する傾向があることが明らかになった。また,M100の主要な信号源(発生元)は左右の側頭葉であるが,臨床群は左側頭葉信号源におけるM100強度が右側頭葉信号源におけるM100強度よりも強く,この左優位性は定型発達には見られなかった.更に,この左側頭葉信号源におけるM100強度と,感覚過敏,自閉症的認知傾向,知的機能との相関を調査したところ,言語性知能と有意な正の相関が見いだされた.【意義および重要性】精神遅滞を伴わない広汎性発達障害成人を対象としてM100を計測した研究はこれまでになく,広汎性発達障害の子どもから青年を対象とした先行研究と一致する点(M100の遅延)と異なる点(左側頭葉の優位性)の両方を見いだしている.この結果は,広汎性発達障害の神経発達において,比較的常に生じる特異性と,発達あるいは知的機能に応じて生じる特異性が存在することを示唆する.このことは,広汎性発達障害の神経活動の発達的変化に関する知見を提供する点で意義がある。また,広汎性発達障害臨床群に特有な左半球優位性に関連して,言語性知能の高さがあることを示唆する結果を得たことは,かなり基礎的な音入力に対する反応が,高次の知能に関連することを示唆する.低次な聴覚情報処理のトレーニングが,高次の読み書き機能を改善するという研究が存在するが,本研究の結果もこれを間接的に支持するものであり,将来的に広汎性発達障害の言語障害に対する臨床的介入に貢献しうるものである.通常,ヒトは入力した情報の全体(文脈)を優先的に処理し,部分(細部)の処理は追加的・意図的なものになることが知られている。しかしながら,自閉症を持つ人は,少なくとも視覚入力においては,このような強力な統合過程が働かず,部分の処理を優先的に行ってしまう傾向さえあるとされる。このような傾向を,弱い中枢性統合(weak central coherence.WCC)と呼び,自閉症の全てのモダリティにはこのWCCの影響があると考えられている。そこで,自閉症を持つ人が,聴覚においてWCCの影響を受ける(あるいは受けない)ことを明らかにするため,注意を向けなくても出現するとされるMismatch negativity(MMN)と呼ばれるERP成分の,磁場における対応成分であるMismatch field(MMF)をMagnetoencephalography(MEG)を用いて測定することとした。MMN及びMMFは,なんらかの変化が生じたときに,不随意に発生する成分であり,その強度によって個人(あるいは群)の変化検出の精度を推定することができるとされる。そこで,文脈が変化する音列と細部が変化する音列を用意し,この音列を,参加者が動画を鑑賞しているときに,注意を向けずに提示することでMMFを測定した。MEGの測定は,脳活動によって生じる微細な電位変化によって生じる磁場を測定することであるため,体動を比較的制限される。そのため,臨床群に対しては不快感を与える可能性があり,健常群のアナログ研究である程度臨床群の結果を予想し,洗練されたパラダイムを設定する必要があった。そこで,本年度はAutism-spectrum Quotient(AQ)質問紙によって,健常者を自閉症傾向によって群分けして検討を行った。その結果,文脈-細部の変化検出過程そのものというよりは,音列に対する慣れや神経不応が,自閉症傾向が高い群において生じにくい可能性が示唆された。現在は,この結果をもとに,より洗練した(短時間で計測可能な)パラダイムを設定し,臨床群に対する研究を計画している。本年度は,自閉症の聴覚情報処理過程における弱い中枢性統合の影響,すなわち,聴覚情報の全体的側面の処理(統合)が困難であることが,部分要素の処理を亢進させるかどうかについて検討するため,聴覚入力における重要な部分要素のひとつである持続時間(音の長さ)の処理についての研究を実施した.指標として用いた,変化検出感度に対応して出現するミスマッチ陰性反応には,測定上の問題が存在することが知られており,この問題を解消するための方法を開発した.具体的には,通常ミスマッチ陰性反応は,単一シークエンス内の低頻度刺激に対する脳活動から,高頻度刺激に対する脳活動を差し引くことによって得られるが,別のシークエンスで低頻度刺激と同一頻度で呈示する統制刺激に対する脳活動を測定し,この脳活動を低頻度刺激から差し引くことによってより正確なミスマッチ陰性電位を導出した.これにより,変化検出を除いた個人の脳活動の違いを差し引いたより正確なミスマッチ陰性反応を得られたことを示唆する結果を得た.自閉症を持つヒトは,変化検出以前の非常に早い聴覚情報処理過程の段階で既に健常者と異なる脳活動を示すことが知られており,この方法を用いることで変化検出過程における異常のみを抽出できることが期待できる.【具体的内容】今年度は,広汎性発達障害の診断を受け,精神遅滞を伴わない成人臨床群(高機能自閉症,アスペルガー症候群を持つ人)を対象に,4種類の純音によって誘発されるM100と呼ばれる基礎的な聴覚情報処理を反映する脳活動をmagnetoencephalography(脳磁図)を用いて計測した.

その結果,臨床群のM100は,定型発達に比べて遅延する傾向があることが明らかになった。また,M100の主要な信号源(発生元)は左右の側頭葉であるが,臨床群は左側頭葉信号源におけるM100強度が右側頭葉信号源におけるM100強度よりも強く,この左優位性は定型発達には見られなかった.更に,この左側頭葉信号源におけるM100強度と,感覚過敏,自閉症的認知傾向,知的機能との相関を調査したところ,言語性知能と有意な正の相関が見いだされた.【意義および重要性】精神遅滞を伴わない広汎性発達障害成人を対象としてM100を計測した研究はこれまでになく,広汎性発達障害の子どもから青年を対象とした先行研究と一致する点(M100の遅延)と異なる点(左側頭葉の優位性)の両方を見いだしている.この結果は,広汎性発達障害の神経発達において,比較的常に生じる特異性と,発達あるいは知的機能に応じて生じる特異性が存在することを示唆する.このことは,広汎性発達障害の神経活動の発達的変化に関する知見を提供する点で意義がある。また,広汎性発達障害臨床群に特有な左半球優位性に関連して,言語性知能の高さがあることを示唆する結果を得たことは,かなり基礎的な音入力に対する反応が,高次の知能に関連することを示唆する.低次な聴覚情報処理のトレーニングが,高次の読み書き機能を改善するという研究が存在するが,本研究の結果もこれを間接的に支持するものであり,将来的に広汎性発達障害の言語障害に対する臨床的介入に貢献しうるものである.
可溶性 VEGF-C 受容体を用いたがん転移抑制の試み

本研究は、可溶性VEGF-C受容体をレトロウイルスベクターによりマウス線維芽細胞あるいは、肺癌細胞に導入しリンパ管新生抑制効果を検討した。その結果、in vitroでは、マウス線維芽細胞に十分な可溶性VEGF-C受容体が発現し、VEGF-Cと強い結合性が免疫沈降反応により確認された。また、in vivoにおいては、肺癌細胞に導入した結果、原発巣において有意にリンパ管新生を抑制することが判明した。Mouse lung cDNA library(Takara)よりbase 199-2084をPCR法にて増幅し、合成委託して作製したbase 1981-2340をbase2037のHind III siteを用いて合体し、全coding sequence(base 199-2340)がクローニングされたpBluescript-svegfr-2を作製した。全塩基配列は、ABI社Genetic Analyzer310を用いてGene Bankと相違が無いことを確認した。Gene bankのデータは、EU884114.1を使用した。Svegfr-2断片は、レトロウイルスベクターpDON-5(Takara)にクローニングされた後に、ウイルス粒子を一過的に産生させるためパッケージング細胞PT67(Takara)にトランスフェションされ、産生されたウイルス粒子が、svegfr-2の全長を有し、十分な感染値を持つことを確認した。このウイルス粒子をC57に感染し、導入されたsvegfr-2の遺伝子並びにその転写物をPCR並びにRT-PCR法にて確認し、治療細胞C57-svegfr-2を作製した。平成22年度は、クローニングが難航したが、ほぼ予定通り研究計画が進行したため、今後は、リンパ管新生因子であるVEGF-CがC57-svegfr-2において選択的にトラップされるかウエスタンブロット法などにより確認し、肺癌転移モデルにおける動物実験によりその作用機序を検討したい。平成22年度においては、可溶性VEGF-C受容体(svegfr-2)をマウス線維芽細胞C57に欠損レトロウイルスベクターを用いて導入したC57-svegfr-2を作製した。この細胞をC57マウス血管・リンパ管新生モデルに移入し、Lyve-1免疫染色法によりリンパ管新生を検討した。対照としては、レトロウイルスベクターだけをC57に導入したC57-EV細胞移入群を用いた。その結果、移入したウレタンススポンジによるバックグラウンドが高く、両群で有意な差が得られなかったため、皮下から肺への転移能を有するLweis Lung Carcinoma(LLC)細胞にsvegfr-2を導入した、LLC-svegfr-2を作製した。また、血管・リンパ管新生を亢進すると考えられているvascular endothelial growthfactor(VEGF)-A及びリンパ管新生を亢進するVEGF-Cをそれぞれ導入したLLC-VEGF-A,LLC-VEGF-Cを作製した。対照としては、同様にLLC-EVを用いた。2x10^6個のLLC-VEGF-A,LLC-VEGF-C,LLC-svegfr-2,LLC-EVをそれぞれC57マウスの背部皮下に移入し、10日後に原発巣、21日後に肺転移巣の病理学的解析を行った。その結果、Lyve-1免疫染色法により、原発巣にてLLC-VEGF-C移入群で有意にリンパ管新生が亢進し、逆にLLC-svegfr-2移入群では有意に抑制することが判明した。血管を特異的に染色するCD34に免疫染色では、LLC-VEGF-A移入群でやや血管新生が亢進していた。また、肺転移巣においては、LLC-VEGF-A,LLC-VEGF-C移入群で有意に転移コロニーが増加していた。LLC-svegfr-2に関する転移に関する実験は現在進行中である。1.C57-svegfr-2における可溶性VEGF-C結合性の確認(大学院博士4年中村正樹、北里英郎)平成22年度において作成したC57-svegfr-2上清及び陽性コントロールとしてC57-VEGF-C上清を用い、それぞれの抗体anti-svegfr-2, anti-VEGF-Cを用いてウェスタンブロット法によりタンパクの発現を確認した。また、それぞれの上清とanti-VEGF-C抗体を用い2.肺がん転移モデルにおけるLLC-svegfr-2によるリンパ管新生抑制効果の検討(大学院博士4年中村正樹、馬嶋正隆、松本和将、片桐真人)平成23年度において作製した、マウス肺がん細胞(LLC)にsvegfr-2を導入したLLC-svegfr-2を200000個C57マウスの背部皮下に移入し、10日に原発巣の病理学的解析を行った。また、陰性の対照としては、レトロウイルスベクターだけを導入した、EV-LLC,陽性の対照としては、VEGF-Cを導入したLLC-VEGF-Cを用いた。その結果、Lyve-1による免疫染色にて、LLC-EV群と比較して、LLC-VEGF-C

移入群で有意にリンパ管新生が亢進し、逆にLLC-svegfr-2移入群では有意に抑制することが判明した。また、細胞移入後、3週後に肺における転移をHE染色にて検討した結果, LLC-VEGF-C移入群で有意に転移コロニーが増加していたが、LLC-svegfr-2に関する転移に関する実験、作用機序の解明は現在進行中である。当初の計画では、C57細胞に可溶性受容体を導入し、細胞治療によるリンパ管新生抑制の機序を検討する予定であったが、LLCに直接導入したLLC-svegfr-2を作製したため、転移に関する研究がやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。可溶性VEGF-C受容体を導入したC57-svegfr-2,LLC-svegfr-2におけるウェスタンブロットがうまくいっていないが、今後、抗体を変更し、確実に蛋白を同定する予定である。平成24年度は、可溶性VEGF-C受容体による転移抑制の機序解明を中心に本課題を総括したい。
ポリネシアにおけるマイクロ-デモグラフィに関する研究

ツアモツ群島東南端に孤立したレアオ・プカルア両島が群島中、人類学的にユニ-クな存在であることは古くから衆目の一致するところであった。レアオには血縁集団毎に儀れに使用された遺跡が40ケ所以上に及び、かなりの人口が予想された。100年余りの出生・死亡・婚姻に関する記録と共にフィ-ルドワ-ク時に作成した家系図から一世紀にわたる人口の動態を考察した。従来のように考古学や言語学の研究に依存して仮説をたてるのではなく、実際の人の動きから移住を論ずるのである。先づ、アイランド・グル-プを設定してその中での移動を考察した。その結果、東ポリネシアではポリネシア人の東方への移動が直接的になものではなく、アイランド・グル-プ内で往来を重ねつつ徐々に東へ向かって移動していったことが明らかとなった。1834年、カソリック・ミッションのマンガレヴァ上陸以来、レアオとマンガレヴァの往来があったことは、レアオ島民が34世代前の祖先をマンガレヴァ及びイ-スタ-島にもつ者が多いことから判明した。環礁できびしい生活をしていた人びとにとって最寄りの唯一の火山島はマンガレヴァであった。一方、マンガレヴァでは、地方毎に抗争が絶えず戦いに破れ四散した人びとが殺りくを逃れツアモツ群島東南部の環礁に漂着したことはFr.LavalやPeterBuckにより報告されている。19世紀後半まではレアオ・プカルア両島民がマケモ,ルルツからの漂流者を除き接触していたのはマンガレヴァ及びイ-スタ-島民であったことは大きな発見であった。今回の研究でポリネシア人の移住を論じるにあたって巨規的にとらえるだけでは科学的論証がえられないという結論をえた。1960年以来、コプラスク-ナの来島頻度の増加、核実験の観測基地となり軍隊の駐留により温血の増加は、レアオ島の人口構成を急激に変貌させたのである。
大学生のメンタルヘルスと発達障害に関する支援ニーズ把握質問紙の開発

本研究では、これまでメンタルヘルスのスクリーニングに広く用いられてきたUPIの改良版であるUPI-RSと、2種類の発達障害関連のニーズ把握質問紙を統合した短縮版を作成した。短縮版は、UPI-RSから25項目、二つのニーズ把握質問紙から26項目を抽出したものである。高得点者を抽出するルールを作成し、高得点を示した者および相談希望があった学生に連絡を取り、研究代表者である総合健康安全センター医師、カウンセラーが個別面接を行った。発達障害の診断のある学生における得点について検討した結果、発達障害関連の困り感が診断のない学生よりも高いことが明らかになった。本研究ではメンタルヘルスから発達障害に関するものまで、学生の幅広い支援ニーズを早期に把握し支援に結びつけることができるような、短時間で実施可能な質問紙を開発することを目的とする。具体的には、これまでメンタルヘルスのスクリーニングに広く用いられてきたUPIの改良版であるUPI・RSと、2種類の発達障害関連のニーズ把握質問紙を統合した短縮版を作成する。平成22年度には、短縮版作成のための基礎データの収集を目的に、UPI・RSと発達障害関連支援ニーズ把握質問紙を実施した。UPI・RS(高橋・小林,2004)はメンタルヘルスのスクリーニングテストであるUPIを高橋・小林(2004)が4件法の評定尺度に改訂したもの。ASD困り感尺度(山本・高橋,2009)は自閉症スペクトラム障害関連の支援ニーズを把握するための質問紙。ADHD困り感尺度(岩渕・高橋,2009)は注意欠陥多動性障害関連の支援ニーズを把握するための質問紙であった。これらを、約2200名の信州大学1年生全員を対象に、総合健康安全センターが担当している授業(全1年生必修)を利用して、UPI・RSはオンラインで前期に全員を対象として、2種類の発達障害関連質問紙は前後期にわたって半数ずつの学生に実施した。質問紙において相談希望があった学生に連絡を取り、研究代表者である健康安全センター医師、カウンセラーが個別面接を行った。より正確なニーズ把握を行い、必要に応じて医療機関の紹介、継続面接を行った。また、これらのデータを分析することで、現時点での短縮版の原案を作成した。具体的には、これまでメンタルヘルスのスクリーニングに広く用いられてきたUPIの改良版であるUPI-RSと、2種類の発達障害関連のニーズ把握質問紙を統合した短縮版を作成する。平成23年度には、短縮版作成のための基礎データの収集を目的に、UPI-RSと発達障害関連支援ニーズ把握質問紙を実施した。UPI-RS(高橋・小林,2004)はメンタルヘルスのスクリーニングテストであるUPIを高橋・小林(2004)が4件法の評定尺度に改訂したもの。これらを、約2200名の信州大学1年生全員を対象に、総合健康安全センターが担当している授業(全1年生必修)を利用して、UPI-RSはオンラインで前期に全員を対象として、2種類の発達障害関連質問紙は前後期にわたって半数ずつの学生に実施した。また、相談利用学生および自殺学生のUPIデータを検討することで、UPI-RS短縮版に含む項目の検討を行った。困り感尺度については主に相談希望の有無との関連から短縮版を作成した。具体的には、これまでメンタルヘルスのスクリーニングに広く用いられてきたUPIの改良版であるUPI-RSと、2種類の発達障害関連のニーズ把握質問紙(自閉症スペクトラム障害と注意欠如多動性障害)を統合した短縮版を作成する。平成25年度には、23年度末に作成した全51項目からなる短縮版を信州大学1年生を対象に実施した。短縮版は、UPI-RSから26項目、二つのニーズ把握質問紙から25項目を抽出したものである。いずれも4件法であり、これらの項目に加え、相談希望を問う質問も設けた。

高得点者を抽出するルールを作成し、高得点を示した者および相談希望があった学生に連絡を取り、研究代表者である総合健康安全センター医師、カウンセラーが個別面接を行った。より正確なニーズ把握を行い、必要に応じて医療機関の紹介、継続面接を行った。短縮版の実施にあたり、従来のマークシート方式ではなく、オンライン方式で学生が自主的にサイトにアクセスして回答する形式にした。回答率の低下という問題もあったが、他者がいない環境で回答が可能なことから、より正直に回答できている可能性もある。呼び出し結果の詳細については、平成24年度、25年度のデータを統合して分析を進める予定である。以上に加え、UPI-RSの短縮版の作成過程について、成果発表を行った。本研究ではメンタルヘルスから発達障害に関するものまで、学生の幅広い支援ニーズを早期に把握し支援に結びつけることができるような、短時間で実施可能な質問紙を開発することを目的とする。具体的には、これまでメンタルヘルスのスクリーニングに広く用いられてきたUPIの改良版であるUPI-RSと、2種類の発達障害関連のニーズ把握質問紙(自閉症スペクトラム障害と注意欠如多動性障害)を統合した短縮版を作成する。平成24年度には、23年度末に作成した全51項目からなる短縮版を信州大学1年生を対象に実施した。短縮版は、UPI-RSから26項目、二つのニーズ把握質問紙から25項目を抽出したものである。いずれも4件法であり、これらの項目に加え、相談希望を問う質問も設けた。呼び出し結果の詳細については、平成25年度のデータを加えて分析を進める予定である。以上に加え、平成23年度末に完成した実施マニュアルを、全国の大学の保健センター、相談室等に送付した。平成26年度には、23年度末に作成した全51項目からなる短縮版を引き続き信州大学1年生を対象に実施した。また、工学部においては、すべての学部生、大学院生を対象に実施した。
アクアバイオセンサーとしてのGFPトランスジェニックメダカ系統の開発

本研究の目的は、生体が放射線等の有害な因子に暴露されたときにGFPレポーター遺伝子を発現し、リアルタイムに生きたままその影響をおっていけるメダカ系統を開発することである。まず、候補遺伝子としてGADD45αに焦点をさだめ実験をおこなった。その理由は、1)GADD45α遺伝子は、ヒト培養細胞の系で低線量の放射線で照射後数時間後には発現が増大することが確認されていること、2)通常時ではほとんど発現が見られないこと、3)ヒトなどの哺乳類で発現転写調節領域が詳細に解析されていること、などが挙げられる。GADD45α遺伝子は未だメダカではクローニングされていない遺伝子なので、そのクローニングをおこなった。哺乳類などで取られているGADD45の配列を元に、メダカのゲノムデーターベースを検索、メダカGADD45αのゲノム構造を予想し、メダカゲノムDNAからPCR法でGADD45α全長をクローニングした。メダカGADD45αはヒト同様4つのエキソンから成り、ヒトとのホモロジーは約80%であった。次に、このGADD45αがメダカで実際に放射線照射後に発現が増大するかどうかを調べた。その結果、ヒト同様照射後数時間で発現が増大すること、また線量依存的に発現が増大することが観察された。これまでのヒトなどの知見で知られている発現に必要不可欠と言われている領域をメダカで予想し、GFPベクターに挿入したいくつかのコンストラクトを作製した。それらコンストラクトをメダカ受精卵にマイクロインジェクションし、5GyのX線を照射し、GFPレポーター遺伝子の発現を観察しているが、これまでのところ顕著にGFPの発現する系統はとられていない。現在新しい別のコンストラクトを作成中である。これらの知見は2005年度の日本動物学会、小型魚類研究会で発表をおこなっている。
ＰＹＰタグと長波長発蛍光プローブを用いた蛋白質マルチカラーイメージング技術の開発

グルコーストランスポーター4 (GLUT4)は、インスリン刺激に応答して、血中グルコースの恒常性を保つ膜蛋白質であり、糖鎖修飾を受ける糖蛋白質でもある。通常、細胞内のGLUT4貯蔵小胞に局在しているGLUT4は、インスリン刺激によるシグナル伝達を経て細胞膜へと移行し、血中グルコースを細胞内に取り込む。GLUT4の動態の異常は二型糖尿病に深く関与することが報告されているが、複合的に生じるトラフィッキングメカニズムについては未だ不明な点が多い。特に、GLUT4動態に対する糖鎖の役割というのは未だ議論されていた。本研究では、これまでに開発したPYPタグを用いた蛋白質ラベル化技術を応用することにより、GLUT4動態の解明に取り組んだ。細胞膜非透過性の発蛍光プローブとして開発したAT-DNB2は、高い蛍光OFF/ON比と速いラベル化反応速度を有する。このプローブを利用することで、細胞内に存在するGLUT4を標識することなく、細胞膜上に移行してきたGLUT4のみを選択的にリアルタイムにイメージングすることに成功した。さらに、本ラベル化技術を用いることで、GLUT4動態に対する糖鎖の役割を解明した。AT-DNB2を用いることで、正常のGLUT4及び糖鎖欠失GLUT4ともにインスリン刺激によって細胞膜へ移行する証拠を掴むことに成功した。そして、正常のGLUT4は、膜上に保持される一方で、本来の糖鎖構造を持たないGLUT4は短期間だけ細胞膜に移行し、膜に留まることなくすぐに内在化する様子を捉えることに成功した。以上の結果より、GLUT4の糖鎖が膜局在の維持に関与していることを初めて明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。蛋白質の蛍光イメージングは、生体内蛋白質の局在や挙動を直接可視化できる極めて有力な技術の一つである。我々のグループにおいても、Photoactive Yellow Protein (PYP)タグをタグ蛋白質とした蛍光イメージング技術を開発している。特に、標的蛋白質と結合したときにのみ、異なる色の蛍光を発する発蛍光プローブを開発し、蛋白質の無洗浄マルチカラーイメージングを達成している。本研究では、開発した発蛍光PYP標識技術を、グルコーストランスポーター4(GLUT4)の膜輸送イメージングへ応用する。これまでのGLUT4動態の解析には、蛍光蛋白質や抗体が広く用いられてきた。しかし、これらの手法は標識の制御や様々な部位に局在するGLUT4を区別することができず、トラフィック経路の直接な解析が困難であった。申請者は、PYP標識技術と細胞膜非透過性の発蛍光プローブを用いることで、膜移行したGLUT4のみを選択的にイメージングする技術を開発し、GLUT4動態解明の基盤技術の構築を目指す。本年度、PYP-GLUT4をコードするDNAの構築や、融合蛋白質の発現条件の検討を行った。その結果、HeLa細胞でのPYP-GLUT4の発現を確認でき、インスリン添加によって細胞内から細胞膜へと移行することも観察できた。さらに、PYP-GLUT4発現HeLa細胞に、新たに開発した高い蛍光OFF/ON比を有する発蛍光プローブを添加することで、インスリン刺激により膜移行したPYP-GLUT4のみを選択的にイメージングすることに成功した。現在では、多色の発蛍光プローブを組み合わせたGLUT4のマルチカラーイメージングに取り組んでいる。このようなGLUT4のマルチカラーイメージング及びトラフィック経路の解析は、生活習慣病として知られる二型糖尿病の解明につながることが期待され、その社会的な意義は非常に大きい。本年度、初めに脂肪細胞や筋肉細胞を用いたアッセイ条件の検討を試みた。これらの細胞がインスリン応答性を示すためには分化させる必要があるため、まず、それぞれの細胞の分化条件を検討した。

その結果、分化した脂肪細胞にのみ見られる脂肪滴、筋肉細胞の多核化を観察することができ、最適な分化条件を見ることができた。次に、それぞれの細胞に構築したPYP-GLUT4が高発現するトランスフェクション条件の検討を行った。様々なトランスフェクション条件を検討したけれども、これらの細胞では、PYP-GLUT4がうまく発現しないことが示された。そこで、HeLa細胞やCHO-K1細胞でGLUT4がインスリンに応答して細胞膜移行することが報告されていたため、これらの細胞を用いてPYP-GLUT4のトランスフェクション条件を検討した。結果として、PYP-GLUT4の発現をウエスタンブロットにより確認できた。次に、PYP-GLUT4発現HeLa細胞に細胞膜非透過性の発蛍光プローブ(Cy5DNB2)を添加し、インスリン添加前後でのイメージングを行った。その結果、洗浄操作により、遊離プローブを取り除くことで、細胞膜に移行してきたPYP-GLUT4のみをCy5DNB2で標識することに成功した。一方で、無洗浄では有意な差が見られなかった。この原因として、Cy5DNB2の蛍光OFF/ON比が低いことが問題と考え、より高い蛍光OFF/ON比を有する発蛍光プローブを開発した。新規発蛍光プローブは、大きな蛍光OFF/ON比を有することが示されたため、本プローブを用いることで、GLUT4のリアルタイムイメージングを試みた。その結果、膜移行したPYP-GLUT4のみを選択的にイメージングすることにも成功した。以上より、研究はおおむね順調に進展していると思われる。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでは一つの発蛍光プローブを用いることで、GLUT4のイメージングを行っていた。これにより、目標の一つであった膜移行したGLUT4の選択的なイメージングに成功した。今後の研究の推進方策としては、これまでに開発した様々な発蛍光プローブを用いることにより、多色の蛍光を組み合わせたマルチカラーイメージングで、GLUT4の細胞内動態をより詳細に解析する。特に、GLUT4の57番目のアスパラギンに修飾される糖鎖に注目している。今日、糖鎖の有無によってGLUT4動態が変化するかどうかが議論されている。α-マンノシダーゼIの阻害剤であるキフネンシンをGLUT4発現細胞に添加すると、糖鎖修飾が阻害される。そこで、キフネンシンで処理したGLUT4発現細胞と通常のGLUT4発現細胞を用いたイメージング結果を比較し、細胞内外のプローブ蛍光の挙動を観察する。さらに、キフネンシン処理前にGLUT4を一つ目の蛍光プローブで標識し、キフネンシンを添加後、二つ目の蛍光プローブで標識するパルスチェイスイメージングを行う。これにより、一定期間内に発現したGLUT4のみの動態を二つ目の蛍光プローブで追跡することが可能となる。今後は、阻害剤アッセイ条件の最適化を行い、糖鎖修飾が阻害されたかどうかをウエスタンブロット等により観察する。さらに、上記で示したイメージング条件の最適化を行うことで、GLUT4動態の解析に一石を投じることができる成果が得られると考えている。
リゾスフィンゴ脂質の細胞障害、特に細胞呼吸抑制機序とその“解毒"機構

多くのスフィンゴリピド-シスにおいては、酵素欠損が見いだされている。しかし、その酵素欠損がどのようにして病態を生じさせるかについては殆ど解明されてはいない。我々は、先に、スフィンゴリピド-シスの1つであるKrabbe病において、絶対量としては大きくはないものの、サイコシン(リゾ型セレブロシド)の蓄積が病変の主座である脳に蓄積することを見いだした。更に、サイコシンは細胞毒であることより、Krabbe病の重篤な神経症状はサイコシンの細胞毒性で説明しうることを示した。一方、他のスフィンゴリピド-シス、例えば、Gaucher病、TayーSachs病でも、リゾ型の脂質の蓄積が報告され、これらにおいても、同様の機序が働いている可能性が考えられた。しかし、これらのリゾ型脂質がどのようにして「毒」性を発揮するかは不明であった。そこで、このことについて検討し、少なくともin vitroでは、サイコシン、リゾ型グルコシルセラミドおよびスフィンゴシンが、細胞呼吸に重要なミトコンドリアのシトクロ-ムCオキシダ-ゼを強力に抑制することを見いだした。その効果は、いずれもシアンとも比肩可能な程であったが、シアンとは異なり、ミトコンドリア内膜の酵素環境を変化させることによることを明らかにした。また、これらの脂質の作用はいずれも、アルブミンにより抑制された。このアルブミンによるリゾ型スフィンゴ脂質の「毒」性抑制の背後には、アルブミンの強力な結合作用があることがわかった。このことより、アルブミンの治療(対症的ではあるが)への応用の可能性も考えられた。一方、生物の体内でも生成されうるアンモニアが脳のエネルギ-代謝産物レベルを変化させること、また、内因性「毒」として存在しうるかもしれないアクリルアミドがクレアチンキナ-ゼ(CK)活性を抑制することも見いだした。CKは生体エネルギ-(ATP)レベル維持に関与していると思われることから、これらについても更に検討する価値があるものと思われた。サイコシン(ガラクトシルスフィンゴシン)は、哺乳類の脳内でUDPーガラクト-スとスフィンゴシンから合成される。この脂質の分解酵素はKrabbe病で欠損しており、本疾患に侵された、ヒト、イヌ、マウスの脳内にはサイコシンが蓄積する。サイコシンは細胞毒であり、Krabbe病の重篤な神経障害はその「毒」作用によるものと考えられている。また、他のスフィンゴリピド-シスでも、サイコシン類似のリゾスフィンゴ脂質の蓄積が見いだされており、Krabbe病におけるのと類似の病態発生機序が働いている可能性が考えられる。しかし、これらのリゾ型脂質がどのような機構で「毒」性を発揮するのかわ明らかではない。我々は、先に、サイコシンが少なくとも、in vitroでは、ミトコンドリアのシトクロ-ムCオキシダ-ゼ活性を協力に抑制し得ることを見いだした。リゾスフィンゴ脂質の作用発現機序いついて、更に検討した。その結果、これらの脂質は一次的にミトコンドリア内膜をふくむ細胞膜を障害することをしめす結果を得た。さらに、その作用には、スフィンゴシン部分の遊離アミノ基が重要な働きをしていることを明らかにした。一方、リゾ型スフィンゴ脂質の作用はアルブミンにより完全に抑性し得ることも見いだした。そこで、特に、^3Hラベルしたサイコシンを用いて、アルブミンとの結合について検討した。

その結果、ヒト血清アルブミンのサイコシン結合部位は比較的限定されているものの、平均解離定数は小さく、全体として相当な大きな結合能力をもちことが明かとなった。これらから、アルブミンはサイコシンを結合し、その遊離アミノ基の作用を抑制することが考えられた。更に、アルブミンは他のリゾ型スフィンゴ脂質に対しても同様の結合能力を持つことが推測された。これらのことは、スフィンゴリピド-シスの治療にアルブミンの応用の可能性を示唆するものと考えられた。我々は、リゾ型スフィンゴ脂質(サイコシン、グルコシルスフィンゴシン、スフィンゴシン)が、少なくともin vitroでは、いずれも、細胞呼吸(ATP生成)に重要なミトコンドリアのシトクロ-ムCオキシダ-ゼ活性を阻害することを見いだした。その効果は強力で、シアンとも比肩可能な程であった。しかし、その作用はいずれも、精製酵素に対しては見られず、内膜構成リン脂質と再構築して始めて明らかになることより、酵素の膜環境を変化させることによったと考えられた。一方、これらのリゾ型脂質の効果はいずれも、アルブミンにより抑制された。これらについて、各リゾ型脂質の間に大きな差は見いだされず、アルブミンはこれらのいずれに対しても強力な結合能力を発揮し得るものと思われた。また、少なくともサイコシンについては、pH、温度の変化によっても大きな影響はうけなかった。これらから、スフィンゴリピド-シスにおいて、アルブミンが対症的とはいえ治療に応用され得る可能性が考えられた。一方、生体内で生成され得るアンモニアが、脳のエネルギ-代謝産物(ATP、クレアチンリン酸等)レベルを変化させること、生体内に存在するかもしれないアクリルアミドがクレアチンキナ-ゼ(CK)活性をin vitroおよびin vivoで阻害することを見いだした。CKは生体内でATPレベル保持に重要と考えられている。すなわち、これらは内因性神経「毒」(あるいはその可能性のある物質)がいずれもエネルギ-代謝に重大な影響をおよぼし得ることを示しており、これらについて、今後更に追究する価値があるものと思われた。
アルコールはセルトリ細胞のオートファジーを増加させる

慢性アルコール中毒により胚細胞である精細胞はアポトーシスで死滅する。一方、体細胞であり支持細胞であるセルトリ細胞には空胞変性と脂肪滴の蓄積が起こるが細胞死には陥らない。すなわち、セルトリ細胞は活性酸素によりダメージを受けたミトコンドリアをミトファジーで積極的に処理し、蓄積された脂肪滴をオートファジーで処理し生存に必要な栄養分とすることで生き延びている。慢性アルコール中毒のセルトリ細胞はオートファジーを活性化することにより、生存しているのではないかと仮説をたて、実験を行った。また、アルコールにより多量のリピッドが蓄積するアルコール肝を体細胞の例として比較検討した。Wistarラットに5%のエチルアルコールを加えたLiever-DeCarli liquid dietを12週間与えた後の精巣を試料とした。TUNEL法でアポトーシスを検討すると、精細胞にはアポトーシスが観察されたがセルトリ細胞では認められなかった。電顕観察で慢性アルコール中毒のセルトリ細胞の細胞質にはオートファジックバキュオールが多数観察された。また、オートファジックバキュオールの内容物の多くは変性したミトコンドリア、脂肪滴であり、ミトファジーまたはリポファジーが起こっていると考えられた。オートファジーのマーカーであるLC3、オートファゴソームのマーカーLAMP2で免疫染色すると、慢性アルコール中毒のセルトリ細胞の細胞質に点状に多数のオートファジックバキュオールが観察された。電顕レベルの免疫染色でミトコンドリアを隔離したオートファゴソームにLC3が認められた。アルコール肝細胞においても多量のリポファジーが起こっており、処理できない場合にはアポトーシスに陥っていた。以上から、セルトリ細胞はアルコールによりダメージを受けたミトコンドリア、傷ついた不飽和脂肪酸をオートファジーで処理することで生存していることが確認できた。アルコールの過剰摂取により性交不能症、精巣委縮、不妊症になることは慢性的アルコール中毒症の男性で知られている。一方、オートファジーは細胞小器官や不良タンパク質の分解のための主な代謝経路で、分解されるものは隔離膜から形成されたオートファゴソームと呼ばれる大きなvesicleに取り込まれ、lysosomeの融合により加水分解酵素によって消化される。現在、オートファジーはanti-apoptoticmechanismとして捉えられており、うまく実行されない場合にはアポトーシスにより細胞は排除されると考えられている。われわれは前年度までに、慢性的アルコール摂取によりROS(活性酸素)産生が増加、セルトリ細胞に空胞変性と脂肪滴の蓄積を引き起こし、その結果、精細胞のアポトーシス増加をまねく。しかし、精細胞を保護するセルトリ細胞自体は脂肪滴、ダメージを受けたミトコンドリアを選択的オートファジーすなわちミトファジーにより排除することで細胞死(アポトーシス)から逃れていることを報告した。本年度はcytprotective mechanismとオートファジーの観点から、somatic cellの代表としてアルコール中毒のダメージが現れやすいと考えられる肝臓について研究を進め、精巣と比較検討した。同様に慢性アルコール中毒肝を作製し、電顕観察、免疫染色(光顕および電顕的)で詳細に観察した結果、われわれは慢性アルコール中毒症の肝臓細胞でセルトリ細胞と同じくミトファアジーがcytprotectiveに働いていると考えた。また、ダメージを受けた肝細胞のミトコンドリアでは、オートファジー関連タンパクのPINK1とParkinの発現が亢進していた。セルトリ細胞は肝細胞と同じくsomatic cellであり、ミトファアジーの制御が活性酸素から回避するために重要であり、PINK1とParkinがそのkey factorと考えられる。慢性アルコール中毒により精細胞はデスレセプターパスウェイによりアポトーシスで死ぬが、セルトリ細胞は空胞化を起こすのみで死ぬことはない。Wistarラットに5%のエチルアルコールを加えたLiever-DeCarli liquid dietを12週間与えたのち、精巣を摘出しパラフィン包埋試料と透過型電子顕微鏡用試料を作製した。また、オートファジックバキュオールの内容物の多くは変性したミトコンドリアであり、ミトファジーが起こっていると考えられた。以上から、セルトリ細胞はアルコールによりダメージを受けたミトコンドリアをオートファジーで処理することで生存していることが確認できた。今年度までにin vivoでセルトリ細胞はアルコールによりダメージを受けたミトコンドリア、傷ついた不飽和脂肪酸(脂肪滴)をオートファジーで処理することで生存していることが確認できた。また、目標としていたJapan-Asean conference on men's health & agingにおいても発表し、肝臓におけるオートファジーについて論文を発表している。