hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノウイルスベクター法を用いた早期osseointegrationの獲得

休止期や分裂増殖の遅い細胞へも高い効率で遺伝子導入が可能であり,in vivo遺伝子導入が容易な,アデノウイルスベクター法を用い,アデノウイルスベクターに骨形成能が高いCTGF, TGF-βの遺伝子を組み込む方法を用い,続いて,ラット脛骨にアデノウイルスベクターを投与し,周囲組織(骨芽細胞,間葉系細胞)に感染,遺伝子導入させることで,持続的にそれらの遺伝子を発現させ,早期osseointegrationの獲得を試みることを目的とした実験を行ってきた。前年度において,アテロコラーゲンとウイルスベクターの複合化と,複合化したウイルスベクターのin vivo LacZ遺伝子導入を行った。しかし導入効率が低く他のキャリアを用いた実験系が必要であると考えられた。そこで本年度はポリ乳酸や他の高分子生体材料をキャリアとして用いウイルスベクターと複合化を行いin vivo実験を行った。1.ポリ乳酸とウイルスベクターの複合化ポリ乳酸とウイルスベクター液を混ぜ凍結乾燥を行い,複合化させることに成功した。2.複合化したウイルスベクターのin vivo LacZ遺伝子導入ラット脛骨内に1で作製したLacZ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを注入し,経時的にラットを屠殺し,脛骨におけるLacZ遺伝子発現をX-gal染色にて観察したところ,ポリ乳酸を用いても導入効率の上昇にはつながらなかった。3.ウイルスベクターの他臓器への感染の有無2のラット屠殺時,固定直前に気管,肝臓,膵臓,腎臓,骨格筋を摘出し,total RNAを抽出し,LacZに対するprimerを用い,RT-PCRを行ったところ,他臓器にLacZ遺伝子の発現は認められなかったことから,ウイルスベクターの他臓器への影響がないことが確認できた。1においてはLacZ遺伝子とその転写制御を行うプロモーター(CAGプロモーター)、転写されたmRNAの安定性に必要なポリA部位から構成される外来遺伝子発現ユニットを有するプラスミドDNAをアデノウイルスゲノムDNAと293細胞(ヒト胎児腎細胞由来)へco-transfectし、相同組換えによりアデノウイルスベクターを作製した。2ではこのアデノウイルスベクターをマウス骨芽細胞株であるMC3T3E1細胞にMOI5,10,50で感染させ、X-gal染色ならびにβ-ガラクトシダーゼ活性を測定し、また、LacZ遺伝子の発現をRT-PCRにて観察した。その結果、遺伝子導入効率はウイルス濃度依存的に高くなりMOI50で最も高い値を示した。また、導入遺伝子の発現期間は7日を経てもまだ認められた。本研究結果よリアデノウイルスベクターにより骨芽細胞に遺伝子導入を行う際はMOI50が適当であると考えられた。現在CTGF遺伝子やTGF-β遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを作製し、同様にin vitro遺伝子導入実験を行っている。また、ラット脛骨へのin vivo LacZ遺伝子導入実験も始めているが、動物骨組織内ではウイルスが拡散してしまい導入効率が低い結果を得ている。そのため経時的にウイルスベクターが徐放されるためのシステム(Drug Delivery System)考案中である。その一つとしてアテロコラーゲンを用いた方法を現在試みている。昨年度では1.レポータージーンであるLacZ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの作製ならびに2.骨芽細胞へのin vitro LacZ遺伝子導入実験を行った。本年度はBMP遺伝子を強制発現させるアデノウイルスベクターを作製予定であったが、BMP遺伝子の入手が困難であったため、BMPと同様に骨芽細胞に増殖や分化に関与しているCTGFをBMPの代わりとして選択した。CTGF遺伝子とその転写制御を行うプロモーター(CAGプロモーター)、転写されたmRNAの安定性に必要なポリA部位から構成される外来遺伝子発現ユニットを有するプラスミドDNAをアデノウイルスゲノムDNAと293細胞(ヒト胎児腎細胞由来)へco-transfectし、相同組換えによりCTGF遺伝子を強制発現させるアデノウイルスベクターを作製した。現在MC3T3-E1 cellを用いたin vitroでの遺伝子強制発現ならびに蛋白産生を確認し、CTGFの産生によってもたらされる骨芽細胞への効果を検討中である。また、in vivo遺伝子導入の昨年度の結果では動物骨組織内ではウイルスが拡散してしまい導入効率が低くかったため本年度は経時的にウイルスベクターが徐放されるシステム(Drug Delivery System)としてアテロコラーゲンをキャリアーとして用いた方法を実施した。液体コラーゲンとウイルスベクターの複合化は凍結乾燥により上手く行えた。しかし、複合化したベクターを人工的に欠損部を作製したラット脛骨内に埋植した後、レポータージーンであるlacZ遺伝子の発現を確認することができなかった。現在その原因を検討中であり、アテロコラーゲン以外の高分子生体材料を模索中である。

2.複合化したウイルスベクターのin vivo LacZ遺伝子導入ラット脛骨内に1で作製したLacZ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを注入し,経時的にラットを屠殺し,脛骨におけるLacZ遺伝子発現をX-gal染色にて観察したところ,ポリ乳酸を用いても導入効率の上昇にはつながらなかった。3.ウイルスベクターの他臓器への感染の有無2のラット屠殺時,固定直前に気管,肝臓,膵臓,腎臓,骨格筋を摘出し,total RNAを抽出し,LacZに対するprimerを用い,RT-PCRを行ったところ,他臓器にLacZ遺伝子の発現は認められなかったことから,ウイルスベクターの他臓器への影響がないことが確認できた。
再呼吸モデルによる乳児寝具環境評価法の生体的実証の試み

乳児突然死についてリスク要因とされるうつ伏せ寝の原因仮説に再呼吸を引き起こす寝具環境がある。これについて麻酔をかけたウサギを用いて実証実験を行ったところ、再呼吸を起こすこと自体が認められただけでなく、定量評価が可能なレベルの再現性が得られ、今後の目標である、非生体的な評価法の確立につながると考えられた。本研究ではウサギの気管と救急蘇生訓練用乳児人形の鼻孔を接続して、人形を寝具にうつぶせにすることによる、呼吸の影響を調べた。ウサギはケタミンおよびキシラジンで全身麻酔を浅くかけ、さらに局所麻酔を併用して呼吸の抑制が最小限になるようにした上で、気管切開を行ってチューブを接続した。また、実験終了後は100%二酸化炭素を吸入させて安楽死させた。測定結果を分析したところ、寝具により程度は異なるものの、再呼吸による酸素濃度の減少と二酸化炭素濃度の増加がみられ、酸素濃度の減少が二酸化炭素濃度の増加より大きく、この二つが比例関係にあること、時間経過が事前に予測された数式である、FiCO2(t)=C(1-e^<-Dt>)、FiO2(t)=0.21-A(1-e^<-Bt>)に合致すること、動物実験であっても再現性が良いことが確認された。これは実験に用いた寝具環境及びウサギの一回換気量・呼吸回数の条件下で再呼吸が生じており、しかも二酸化炭素濃度を指標とした場合は酸素濃度を指標にした場合に比べて過小評価になるため、危険な寝具環境を軽視しかねないことを示唆するものである。以上の成果は平成21年5月半ばに開催される日本法医学会学術全国集会で発表する予定である。また、旧年度の成果により測定回路の改良点が見つかったため、新年度はその点を踏まえて測定回路に改良を施した上で、旧年度に測定した寝具環境及び新規の寝具環境で実験を行う予定である。本研究の主たる目的は乳児突然死症例の中でもうつぶせ寝に代表されるような寝具が関わる症例において、その呼吸環境を評価する方法を確立するために行うものである。麻酔をかけたウサギを気管切開し、チューブを挿入した。チューブの途中に麻酔モニタ用の分岐を挿入し、他端は綿を詰めたパイプないし乳児型人形の鼻孔に接続した。綿を詰めたパイプは低換気環境のモデルであり、人形は寝具にうつぶせにしてそれぞれ麻酔モニタで記録を取った。その結果、二酸化炭素濃度は上昇し、酸素濃度は低下したが、二酸化炭素濃度の上昇に比べて酸素濃度の低下がパーセンテージで1.5倍程大きいことが確認された。また、濃度の変動は初めの数分程度で急激に生じ、その後はほぼ濃度が安定したこと、個体差や麻酔深度の影響があまりないことも確認された。変動幅については概ね環境によって定まっており、ほぼ顔面が解放された環境から、限りなく窒息に近い状況まで多様な結果を得た。ただし、一回換気量と呼吸回数が概ね揃っていたことから、これらの因子の影響にはなお検討が必要である。法医鑑定業務において、乳児突然死症例の中にしばしば寝具が乳児の呼吸環境に悪影響を与えたことを疑わせる症例が見られるが、本研究の結果から悪影響の程度についてはほとんど無関係な場合から窒息が主たる死因となるものまで様々な場合が考えられるため、定量的な評価が欠かせないと考えられた。研究期間内においては動物実験のデータを得るにとどまったものの、従来から行っている人工呼吸器による計測結果とも照合して、人工呼吸器による測定で定量評価が十分であることを示す予定である。
侵入害虫の定着と種分化への道

アメリカシロヒトリは戦後アメリカから侵入し、分布を広げており、侵入害虫の定着に伴う生活史の変化の研究のモデル生物である。生活史適応は、種の存在様式を決定する大事な形質で、この分化によって新しい種を生み出したと考えられる。このような適応の様式が地球温暖化の中でどのように動くかを、調査するのが本研究の目的である。アメリカに葉、日本に侵入したものとは異なる姉妹種がいて、本国では一部同所的な分布をする。また、競争種を欠く分布をするストックもある。本研究では全米から多数の個体群を採集し、その生活史形質と遺伝的分化、時間的な隔離機構の調査を行った。2種の生殖隔離には時間的な隔離が重要な役割を果たすことが明らかになった。また、北陸地方で温暖化に伴う、休眠の臨界日長の調査(すなわち3化型生活史の北上)をおこなった。二化と三化の境界は、現地の平均気温と明確な対応を見せることが分った。アメリカシロヒトリは北米原産種であるが、アジアとヨ-ロッパに侵入し、そこで新しい生活史適応を示している。また、原産地では季節的な隔離による種分化を強く示唆する同胞種が存在する。地球温暖化の影響と、種間関係が、種の存在様式にどのような影響を与えるかというモデル系として、また侵入害虫の進展地での適応のモデルとして、この虫の生活史形質の空間的・時間的な変化をたどることは極めて興味深い。アメリカ南部および北西部のアメリカシロヒトリの個体群を採集し、人工照明、恒温条件で飼育し、発育速度、発育零点、発育必要積算温量、休眠調節における光周性、高温耐性、さまざまな低温処理後の休眠深度の変化、羽化リズムを調べた。赤頭型と黒頭型の実験個体群を確立し、これらの交雑実験を行った。実験室内の条件では両"種"は比較的容易に交尾するが、子世代でオスと雌の比、及びオスと雌の蛹期間が著しく偏り、野外では生活史形質の差や行動の分化と合わせ、両者の自由な交雑は妨げらていると考えられた。したがって、両者は、別種と考えられた。現在、これらの個体群のミトコンドリアDNAによる、分化程度を調査中である。黒頭型は、ルイジアナ州バトンルージュのもので、この個体群のオスは斑点を持つ上翅を持つものが多く、幼虫の頭殻の色と合わせて、北西部の個体群との交雑実験によって、斑紋や頭殻の色、体色の遺伝子支配、休眠深度の遺伝子支配、幼虫の行動や、吐糸量の遺伝子支配が明らかにされるだろう。北西部の個体群を野外で採集したが、カスケード山脈をはさんで、幼虫の頭殻の色に大きな違いが確認された。北西部の個体群内の変異性についてさらに詳細な調査を計画中である。黒頭型の幼虫は南部産にもかかわらず、高温には弱く、31,5度より高い温度では発育しないし、卵の艀化率も30度以上では低くなる。日本における、黒頭型の個体群における化性の分化は進行中で、福井、金沢近辺の移行地帯における、年代別の定点観測の結果、臨界日長のシフトが見られ、これは気候の温暖化とパラレルに進行している。1)前年アメリカ合衆国北西部で採集してきた赤頭型野外個体群を、さまざまな期間5°Cに置き、25°Cに戻した後、羽化までに期間を比較した。これとルイジアナ州で採集した黒頭型を比較した。黒頭型は50日低温処理で30日前後であったが、赤頭は150日低温処理しても羽化まで50日以上かかった。これは、以前のデータあきらかになった、東海岸の個体群よりは休眠深度は浅かったが、黒頭型のものに比べかなり休眠深度の深い個体群であった。2)両者の交雑を試み、発育期間を比較した。幼虫期は黒頭型に近い発育速度となった。蛹期間は雑種強勢の傾向が示された。通常雌が先に羽化するが、交雑個体では雄の羽化が先行し、雌がやや遅れて羽化した。3)臨界日長(25°C)は、Woodburnが15時間32分、Pullmanが15時間43分となりかなり長い値になった。

4)発育期間(25°C、17L-7D)はWoodburnの幼虫期間が39.90±2.83日、蛹期間が12.26±1.14日(N=125)、Pullmanの幼虫期間が41.73±3.55日、蛹期間が14.97±13.53日(N=154)となった。Pullmanの方がばらつきが大きく、Cle Elumの個体群は、17Lでもほとんど全て休眠た。Cle Elumは標高が少し高いので、おそらく1化性だと思います。WoodburnとPullmanは2化性だと考えられる。5)8月中旬にテキサス州を最南端からカンザス、ミズーリ、アーカンソーまで、採集をおこなった。赤頭型は湾岸をテキサス最南端まで分布していること、黒頭型は赤の最も好むペカン園でも棲息することを確認した。アメリカ合衆国北西部からアメリカシロヒトリ個体群を採集し、前年度サンプリングのものと合わせ、ミトコンドリのアチトクローム・オキシダーゼ・サブユニットIの塩基配列から、極東(日本、韓国)、米国西海岸、東海岸に分布する黒頭型、赤頭型、マダラ型の近縁度を比較したところ赤頭型とマダラ型は非常に近縁で、黒頭型とマダラ型が最も離れていた。同所的に存在する赤頭と黒頭には休眠深度にも大きな隔たりがあることが判った。休眠深度の分化は春の羽化の時期を隔てる機構で同所的に競争者の存在するのも同士で分化が大きいということは、この部分に形質置換が働いていることを示すものであり、同所的に異時的なニッチが開いていると、この部分を専有する形で種分化に至る可能性を示唆するもので興味深い。合衆国本土の黒頭と極東の黒頭型の変異は極めて小さかった。日本では温暖化により2-3化の移行地帯が北上した。北米産のアメリカシロヒトリまだら頭型の3個体群の休眠誘導の光週反応および発育形質の調査を行った。その結果、Woodburn(45.1°N,122.9°W)およびPullman(46.7°N,117.1°W)個体群と比較して、Cle Elum(47.2°N,120.9°W)個体群では休眠誘導の臨界日長や発育形質にかなり違いが認められた。Bordmanの個体群の休眠は他の北西部のものと比べ深い。このように北西部の個体群には生活史・休眠形質に顕著な違いがあることが明らかになった。これまで、まだら頭型の生活史についてはまったく調査されておらず、本種の北米での分化を考える上で重要な知見が得られた。またミシシッピ州の赤頭型の発育パラメータ、光周反応を調べた。ほぼ同地域に分布するルイジアナ州の黒頭型との生活史、化性の分化が明らかになった。交雑実験を行ったところ、交雑は1方向においては可能(赤頭雄x黒頭雌)で、次世代も生存力があることが分った。また発育速度は雌親の影響が強く現れた。羽化リズムの位相も赤頭型と黒頭型は分離し、まだら頭型は赤に近かった。これらのことから、生殖隔離機構は部分的に成立していることが分った。日本のアメリカシロヒトリ黒頭型の北陸個体群の生活史進化については、特に温暖化との関係について調査を行った。その結果、1990年代半ばまで2化性の生活史であることが確認されていた福井市個体群が、近年になって3化性に変化しており、3化性個体群の分布域が北上していることが明らかになった。この成果は、温暖化が昆虫に与える影響を評価する上で重要な知見である。
バングラディシュの深層帯水層における持続可能な低ヒ素水資源の探索

研究目的:バングラデシュでは、飲用水として地表水を長年利用していたが、感染症が広がったことから、WHOが主導して地表水から地下水への切り替えが全国的に行われた。ところが、1980年代にこの地下水が自然由来のヒ素で汚染されていることが分かり、一億を超える人口の2割以上がWHOの安全基準の5倍以上の高濃度ヒ素汚染地下水に頼る生活を送っており、安全で大量の水資源の確保が最大の課題となっている。本研究は、(1)な南西バングラデシュ地域での試料や資料を収集して堆積構造を調べ理論の汎用性を確認すること、また(2)深層地下水を大量に取水した場合の安全持続性を,ヒ素鉱物の溶出平衡特性モデルを構築して理論的に調べること、の2つを研究目的とし、これによって広域、安全、持続可能な水資源の探索を図るものである。本年度は、東西軸に沿って3箇所の井戸を掘削し地下水および土砂試料を採取した。地下水試料は、各種イオンの含有量を分析した。土砂試料は、ヒ素、鉄、アルミニウムの含有量を測定した。また、吸着・溶出試験を行い、反応定数や分配係数を同定した。さらに、土砂試料、地下水試料中のヒ素濃度の鉛直構造を調べ、前者は地表に近くなるほど濃度が高く、後者は6-46mにある極細砂の帯水層で最大となることを示し、そのメカニズムを明らかにした。さらに、深層地下水を取水した場合の、地下水とヒ素の輸送問題を数値解析し、深層地下水が持続可能な水資源であることを明らかにした。バングラーシュでは、数百万人が高濃度に自然由来のヒ素で汚染された地下水を使って生活している。本研究は安全で十分な量の水資源の探索と、その水資源の長期間安全に利用可能な持続性を予測することを目的として研究を行っている。これを達成するため、バングラディシュの中でも特に汚染の深刻なガンジスーメグナ川流域を研究対象とし、この中に15地点を設定し、井戸を掘って帯水層の土砂と水のサンプルを採取した。これらの、サンプルの中に含まれる化学成分を分析した。また、土砂サンプルを用いて、実験室において吸着・脱着試験を行い、分配係数や反応速度係数などの特性を調べた。この結果、地下水に溶出したヒ素は、酸化状態にある深層帯水層の土砂に高い効率で吸着され、これが深層地下水に含まれるヒ素濃度を低下させていることが分かった。このことは、自然の緩和作用を利用して、持続可能な低ヒ素水資源の確保に期待を抱かせるものである。次に、吸脱着平衡状態を表す分配係数を決めるモデルを回帰分析および表層錯体モデルを用いた理論により構築した。鉄濃度、アルミニウム濃度,水素イオン濃度の3つの因子により説明するものである。これは、今後深層地下水を大規模に取水したときに、安全な水資源として持続司能かどうかの予測を行う上で必要となる基本的なモデルである。これらの研究成果は、11.の研究発表の欄にリストした2つの国際学術論文として公表した。バングラディシュでは、水系感染症のリスクを避ける目的で、WHOやunicefが主導し地下水の利用が進められた。しかし、ガンジスデルタの広い範囲で、地下水が自然由来の高濃度ヒ素に汚染されていることがわかり、慢性ヒ素中毒が広がった。特に浅い帯水層の地下水でヒ素濃度が高く、深さが100mを超える深層帯水層では濃度が低いことが、これまでの筆者らの調査で明らかにされている。しかし、深層地下水を汲み上げ続けると、上層にある高濃度ヒ素に汚染された地下水が下方に移動し、深層地下水を汚染するリスクが考えられ、水資源の持続可能性が損なわれる。本研究では、現地において各深さの帯水層および地下水を採取し、ヒ素の溶出・吸着特性を調べ、低ヒ素深層地下水の取水持続可能性を調べることを目的とするものである。実験室における分析の結果、浅い帯水層の地下水にはヒ素を多く含んだ鉱物から有機物の作用によりヒ素が溶出していることがわかった。したがって、有機物を多く含んだ年代の新しい帯水層の地下水は利用することができない。一方、鉄やアルミニウムの酸化物はヒ素の吸着能力が高く、表面積が大きい細粒土砂では94%、中粒径の土砂では72%の吸着能をもつことがわかった。したがって、ヒ素をほとんど含まない深層帯水そうから取水した場合、浅層で溶出し高濃度にヒ素で汚染した地下水も、中間の地層を通って、深層に達するまでに吸着が進みヒ素の濃度が下がることを意味している。この研究成果は、安全な水を持続的に確保したいという要求に応えるものであり、地質学者や、水資源の管理者が、地下水を利用するに当たっての重要な指針となるものである。

本研究は、(1)な南西バングラデシュ地域での試料や資料を収集して堆積構造を調べ理論の汎用性を確認すること、また(2)深層地下水を大量に取水した場合の安全持続性を,ヒ素鉱物の溶出平衡特性モデルを構築して理論的に調べること、の2つを研究目的とし、これによって広域、安全、持続可能な水資源の探索を図るものである。本年度は、東西軸に沿って3箇所の井戸を掘削し地下水および土砂試料を採取した。地下水試料は、各種イオンの含有量を分析した。土砂試料は、ヒ素、鉄、アルミニウムの含有量を測定した。また、吸着・溶出試験を行い、反応定数や分配係数を同定した。さらに、土砂試料、地下水試料中のヒ素濃度の鉛直構造を調べ、前者は地表に近くなるほど濃度が高く、後者は6-46mにある極細砂の帯水層で最大となることを示し、そのメカニズムを明らかにした。さらに、深層地下水を取水した場合の、地下水とヒ素の輸送問題を数値解析し、深層地下水が持続可能な水資源であることを明らかにした。
強誘電性液晶を用いた光アドレス型高速空間光変調器に関する研究

光コンピュ-タは各種の情報を光学的に並列同時処理できるものとして,将来の情報処理装置としての期待が大きい。従来から液晶空間光変調器がその基本的構成要素である素子として画像の投影や情報処理に応用されてきた。我々はこういった光情報処理素子の開発を目指し,強誘電性液晶とアモルファス・シリコンを用いた液晶空間光変調器を作製してきた。平成2年度は前年度に新らたに開発した高周波駆動により任意時間の光書き込み・読み出しが可能である高周波駆動型強誘電性液晶空間光変調器の解像度,メモリ性,応答時間の改善を目標に研究を進めた。強誘電性液晶は自発分極によって高速応答性を有するが,この分極によって生じる内部反電界の存在によって応答速度やコントラスト比,メモリ性を劣化させるという自己矛盾を持っている。これを改善するために反電界を緩和させる電荷移動錯体の添加を試みた。その結果,ZLIー3654液晶に1.0wt%の電荷移動錯体LOCーIを添加することによって応答時間を185μsと大幅に改善できた。またバイアスを加えずに1週間以上画像をメモリすることができた。解像度はUSAFテストタ-ゲットを画像パタ-ンとして素子に入力し,出力画像をスクリ-ンに投影して測定した。それによると11.3lp/mmとなり,素子の有効面積15×15mm^2から画素数約3万画素と当初の目標に近い値が得られた。この値は測定光学系の精度にも依存しており,実際はさらに高い解像度が得られていると考えられる。コントラスト比はZLIー3654を用いて22:1,CSー1024を用いて88:1が得られた。最後に作製した光変調器を用いて画像の光論理演算(AND,OR,NOT)をおこない,2値2変数の16関数動作が可能であることを確認した。これにより,本素子が画像処理などの光情報処理素子として応用できることがわかった。今後の課題は消費エネルギ-の低減である。
海洋生物の生態に関与する複雑系天然有機分子の機能解明

本研究では、海洋生物の共生現象に関わる機能未知の海洋生理活性物質の構造と生物機能の関わりについて解明を目指す。海洋生物の共生関係の主役を担っている生物は渦鞭毛藻(褐虫藻)である。渦鞭毛藻が宿主とする海洋無脊椎動物は造礁サンゴ・クラゲ・イソギンチャク・二枚貝など多岐にわたり、共生メカニズムの理解は微視的な生物間コミュニケーションを超えて、地球規模での環境維持の理解へと発展する可能性を秘めている。そこで、海洋生物と共生生物の生態に着目し、それらを採集・飼育することで研究に活用し、新たな微量活性物質の分離・構造決定・機能解明を実施することで、共生に関わる化学物質について総合的な理解を目指して研究を開始した。その結果、新しい渦鞭毛藻数種がこれまでに報告のない5,000を超える分子量を有する分子を生産することを藻体抽出物の質量分析結果から確認した。最大のものは、分子量8,245であり大変興味深い。この分子を取得し、構造及び生物活性を明らかにすることができれば研究の展開に資すると考える。現在この株の大量培養を進めている。また、古来知られていたにもかかわらず解明されていなかったウミケムシ由来コンプラニンのPKC活性化作用、クロイソカイメン由来ハリコニンCの抗腫瘍活性等に新たな価値を見出すことができた。
オミクス技術を駆使した包括的ALS 治療戦略の確立

昨年度同定したRepeat長依存性開始コドン非依存性翻訳(RAN翻訳)抑制化合物の有効性を動物モデルで確認するために、Jackson LaboratoryよりC9orf72遺伝子高発現モデルマウスを導入し、SPF化とホモ化を行った。同マウスの大脳切片を用いてRAN翻訳産物に対する免疫組織染色を行い、実際にRAN翻訳が起こっていることをin vivoで確認した。現在抗体の選択と染色の最適化を進めている。今後本マウスを用いてRAN翻訳抑制化合物の有効性を確認する予定である。C9orf72遺伝子がRAN翻訳により産生するジペプチドのうちアルギニンを含むpoly-PRとpoly-GRが神経毒性の中核を担うと予想されている。我々は1) poly-PRのアルギニンの正電荷がRNAのリン酸基の負電荷と引き合うことにより、オリゴマー化を促進し、液体液体相分離を起こすこと、2)アルギニンを含む他のペプチドと異なり、蛋白翻訳抑制を示すこと、3)細胞毒性はペプチドの長さに依存することなどを明らかにし、報告した(Kanekura et al., Sci Rep 2018)。アルギニンを含むpoly-PR/GRはin vivoにおいても蛋白翻訳を抑制して神経細胞死を起こすことが他機関からも追試され(Zhang et al., Nat Med 2018)、C9orf72によるALS発症機構に極めて重要な役割を果たすことが確認された。Coriell Instituteから導入したC9orf72患者由来細胞については皮膚線維芽細胞での表現系が得られなかったため、iPS細胞での表現系の探索を続けている。まず正常iPS細胞を用いて神経系への誘導を行い、繰り返して神経系への分化を確認したため、今後これらの患者由来細胞に基づいた神経細胞を樹立し、RAN翻訳を確認した上でRAN翻訳抑制化合物の有効性を検討する。本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72遺伝子変異による神経細胞死機構を解明し、小化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。本研究で昨年度までにC9orf72遺伝子変異による神経毒性の中核となるジペプチドを産生するRAN翻訳抑制化合物を同定しており、本年度はその検出系の最適化を行った。米国Jackson LaboratoryよりC9orf72トランスジェニックマウスの導入を行い、SPF化およびホモ化と免疫組織染色の最適化によるジペプチドの検出系の確立を行った。また患者由来神経細胞の樹立へ向け、コントロールiPS細胞での神経細胞樹立も順調に進んでいる。次年度これらの確立された評価系を用いてRAN翻訳抑制化合物の有効性を検討する。また、C9orf72遺伝子変異による神経毒性の中核となるジペプチドの神経毒性機構についてさらに知見を深め、原著論文として発表した(Kanekura et al., Sci Rep 2018)。我々が報告したpoly-PR/GRの蛋白翻訳抑制による神経細胞死機構についてはin vivoでも追試され、C9-ALSの発症に極めて重要であると考えられる。本研究で前年度までにC9orf72遺伝子変異による神経毒性の中核となるジペプチドを産生するRAN翻訳抑制化合物を同定していたが、同化合物の有効性は高発現レポーター活性で検出していたため、より生理学的な評価系として本年度Jackson LaboratoryよりC9orf72トランスジェニックマウスを導入した。本マウスの大脳を用いた免疫組織染色により、C9orf72由来のジペプチドの検出系が確立された。また現在進めている患者由来神経細胞をiPS細胞より樹立し、RAN翻訳の評価を患者由来神経細胞で行う予定である。これらの確立された評価系を用いて、前年度我々が同定したRAN翻訳抑制化合物の有効性を検討する。本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小分子化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。本年は液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリーによるプロテオミックスクリーニングとCRISPRを用いたゲノミックスクリーニングを進めた。GFP-poly-PRおよびGFP-poly-GAを発現した細胞を用いた網羅的プロテオミックスクリーニングによりこれらのジペプチドとの新規結合因子群を同定した。特にpoly-PRについては以前のスクリーニングで同定した蛋白に加え、数百種におよぶRNA結合蛋白質群が同定され、現在それらの機能解析を進めている。次にCRISPR遺伝子破壊ライブラリーを発現した細胞をpoly-PRジペプチド処理し、遺伝子破壊スクリーニングを施行した。HiSeqを用いた次世代シーケンサーで細胞死に必要な経路の探索を行った。一度目のスクリーニングを終了し、2度目のスクリーニングを行っている。創薬標的についてより詳しい検討を行っており、RNAおよびRNA結合蛋白とジペプチドとの結合機構について詳細なメカニズムを解明し、現在論文執筆中である。また、創薬スクリーニングのシステムの構築のためオートドロッパーを導入した。次年度以降の新規ALS動物モデル作成のためのアデノ随伴ウイルスベクターの作成を完了し、細胞モデルで目的の蛋白質が発現することを確認した。次年度よりマウス脳室内投与を開始し、神経機能の評価および病理学的評価を行う予定である。また、次年度以降の細胞モデル樹立のためのC9orf72変異ALS患者由来の細胞株を米国より輸入し、その表現系を解析している。

今年度は予定した通り、LC-MS/MSを用いたプロテオミックスクリーニングとCRISPRライブラリーを用いたゲノミックスクリーニングを遂行し、それぞれ非常に興味深い結果が得られている。ゲノミックスクリーニングについては再現性をとるため、実験を繰り返している。また、次年度以降の新規ALS動物モデル作成のためのアデノ随伴ウイルスベクターの作成を完了し、細胞モデルで目的の蛋白質が発現することを確認した。次年度よりマウス脳室内投与を開始し、神経機能の評価および病理学的評価を行う予定である。小分子スクリーニングの準備も整えているが、より創薬標的を分子レベルまで絞り込むためにRNAおよびRNA結合蛋白とジペプチドとの結合機構について詳細なメカニズムを解明した。今後創薬標的となりうる分子について検討を進める。また、次年度以降の細胞モデル樹立のためのC9orf72変異ALS患者由来の細胞株を米国より輸入し、その表現系を解析している。本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。昨年度LC-MSおよびgenomicscreeningを行い、様々なC9orf72遺伝子産物結合タンパク質および細胞死関連遺伝子群を同定したが、細胞死関連遺伝子群については、群間のばらつきが大きく、再現性が不十分であった。そこでプロテオミックスクリーニングから得られた結合因子を元にC9orf72遺伝子の毒性に関与しうる因子を独自に作成したsiRNAライブラリーでscreeningを実行し、C9orf72変異ALSの発症に重要であるrepeat-associated non-ATG translation (RAN翻訳)の促進因子および抑制因子を同定した。特に促進因子については阻害剤を用いてRAN翻訳を抑制しうることを確認したため、今後患者由来モデル細胞およびモデル動物への投与を計画している。C9orf72遺伝子変異を持つ患者由来皮膚線維芽細胞は米国Coriell研究所より購入し、表現系を調べているが、生育には違いがなく、また線維芽細胞のままではRAN翻訳は検出されなかったため、神経細胞へのtrans-differentiationが必要であると考えられた。C9orf72変異ALSのモデル動物としてGFP-poly-PR高発現アデノ随伴ウイルスおよびC9orf72の(GGGGCC)配列高発現アデノ随伴ウイルスを作成し、精製を行った。これらのウイルスを脳室内に投与したモデルマウスを作成したが、発現量が低く神経変性等明らかな表現系を得られなかったため、Jackson laboratoryよりC9orf72遺伝子トランスジェニックマウスを購入し、screeningで得られた化合物のin vivoでの作用を確認する予定である。
ストレス応答機構を軸とした変形性関節症に対する分子標的治療の新展開

本研究では5MPaの静水圧下では培養軟骨細胞におけるHIF-2αの発現はNF-κBの発現上昇を伴うことなく誘導されることが明らかとなった.HIF-2αおよびその下流にあるMMPsはOAの発症と進行に関与していることから,本研究の結果はOAの病態解明に役立つ可能性がある.また,10m/min群と12m/min群と比べて,20m/min群でOAが進行していたことから,20m/min群の運動負荷は過度であることが明らかとなった.過度な強制走行は軟骨代謝とタンパク分解酵素の遺伝子発現を制御してOAを進行させると考えた.変形性関節症の治療標的として、蛋白分解酵素、肥大分化関連因子およびこれらの上流に位置するHIF-2α/NF-κBシグナルが注目されている。一方、生体内において軟骨細胞はさまざまなストレスに曝露されている。その中でも、静水圧ストレスによる軟骨細胞におけるこれらの遺伝子発現の影響について検討した。本年度は、in vitroの実験を施行した。日本白色家兎から単離した軟骨細胞を平板培養後、テフロン容器に入れて持続的静水圧負荷(時間:2時間、圧力:5MPa、10MPa、30MPa、50MPa)を加えた。対照群は、テフロン容器に入れてから2時間インキュベータに設置した。圧力負荷終了30分後に細胞を回収し、real-time RT PCR法でHSP70、HIF-2αおよびRel(NF-κB)の遺伝子発現を検討した。対照群、5MPa群、50MPa群においてはMMP-13、MMP-3およびVEGFの遺伝子発現も検討した。HSP70遺伝子発現は圧力負荷依存的に上昇し、50MPaでは対照群の約33倍に亢進した。過去に我々がchondrocyte-like cell lineに対して持続的静水圧負荷を加えたときも圧依存性にHSP70発現は亢進したが、今回の実験で初代培養軟骨細胞も同様の性質を示すことが明らかとなった。RelおよびVEGF遺伝子発現も同様に圧依存性に上昇し、50MPaでは対照群の約3倍に亢進した。一方、HIF-2α、MMP-13およびMMP-3の遺伝子発現は5MPa群で最も上昇し、50MPaを負荷することで低下した。以上から、蛋白分解酵素や肥大分化関連因子の遺伝子発現は静水圧負荷による影響を受けていることが明らかとなった。平成25年度は軟骨細胞に対するストレスが肥大分化関連因子に与える影響を検討した。日本白色家兎から単離した軟骨細胞に、0,5,10,または50MPaの静水圧ストレスを2時間負荷した。30分後にRNAを回収し、NF-κB、HIF-2α、MMP-13、およびMMP-3の遺伝子発現を解析した。NF-κBは静水圧依存性に遺伝子発現が増強したが、HIF-2α、MMP-13、MMP-3の遺伝子発現は5MPaを負荷した群で最大となり、50MPa群では5MPa群と比較して有意に低値であった。変形性関節症の関節軟骨でHIF2-αが出現すること、HIF-2αKOマウスではOA進行が抑制されることが明らかにされている。本研究では5-10MPaの静水圧ではHIF-2α/NF-κBに連動して蛋白分解酵素も反応したが、50MPaではNF-κBのみ上昇した。以上から、5-10MPaの静水圧ストレスによってHIF-2α/NF-κBシグナルと蛋白分解酵素はともに変動するが、非常に高い静水圧では違う経路が働く可能性があると考えた。次に軟骨細胞に対する炎症性ストレスの影響を検討した。同様に単層培養した軟骨細胞を3群に分けた。コントロール群は無処置、Il-1β群にはIL-1β刺激を、HS+IL-1β群にはGln含有培地で41°Cの温熱刺激を30分加えてからIL-1β刺激を負荷した。それぞれ24時間後にRNAを回収し、NF-κB、HIF-2α、MMP-13、およびMMP-3の遺伝子発現を解析した。炎症性刺激を加えることでこれらの遺伝子発現は全て亢進した。一方、軟骨保護作用を持つ適切な温熱刺激やグルタミンによりMMP-13とMMP-3は有意に低下したが、NF-κBやHIF-2αは変化しなかった。これらの結果から、*炎症性刺激によるMMPの遺伝子発現の上昇はHIF-2αに依存しない経路が関与していると考えた。動物実験を用いて、in vivoでのメカニカルストレスが関節軟骨に与える影響を検討した。12週齢雄性Wistar系ラット(n=8)を走行速度に応じて12 m/min群、20 m/min群に分けた。1日1時間、週5回の走行を行った。自由飼育したものを対照群(n=4)とした。6週間後に左膝関節軟骨からRNAを抽出し、軟骨代謝関連因子としてアグリカン、2型コラーゲン、MMP-13およびADAMTS5の遺伝子発現をreal time RT-PCRで解析した。右膝関節に対してSafranin O染色を行い、軟骨の組織学的変性度をmodified Mankin scoreで定量的に評価した。20 m/min群のアグリカンの遺伝子発現は12 m/min群より有意に低下し、反対に2型コラーゲンの発現は12 m/min群と比べて有意に低かった。20 m/min群のMMP-13の遺伝子発現は対照群と比較して有意に亢進していた。

ADAMTS5は各群間で有意差を認めなかった。modified Mankinscoreは他の群より20 m/min群で有意に高値であった。動物実験でin vivoでのメカニカルストレスが関節軟骨に与える影響を検討した.12週齢雄Wistar系ラットに対してトレッドミル装置を用いて12m/min,20m/min,45分間の単回強制走行を行った.自由飼育したものを対照群とした.強制走行終了直後にサクリファイスし,左膝関節軟骨を免疫組織学的に解析した.同時に右膝関節から関節軟骨を採取し,凍結破砕を加えた後に遺伝子発現をreal-time RT-PCRで解析した.単回走行刺激により,膝関節内外側ともにHIF-1αの染色性は対照群と比較して上昇しており関節軟骨が対照群と比較してさらなる低酸素環境となっていることが分かった.HIF-2αは内側優位に染色性が亢進しており,対照群と比較して内側優位にメカニカルストレスがかかっていると考えた.また,単回走行刺激によりADAMTS-5のmRNA発現が優位に亢進していた.Col10a1も増加傾向を認めた.過剰な運動刺激は関節軟骨細胞の細胞外マトリクス分解酵素の発現を亢進させることが分かった.本研究では5MPaの静水圧下では培養軟骨細胞におけるHIF-2αの発現はNF-κBの発現上昇を伴うことなく誘導されることが明らかとなった.HIF-2αおよびその下流にあるMMPsはOAの発症と進行に関与していることから,本研究の結果はOAの病態解明に役立つ可能性がある.また,10m/min群と12m/min群と比べて,20m/min群でOAが進行していたことから,20m/min群の運動負荷は過度であることが明らかとなった.過度な強制走行は軟骨代謝とタンパク分解酵素の遺伝子発現を制御してOAを進行させると考えた.これまでの研究によって、in vivoにおけるメカニカルストレスが関節軟骨に与える影響を一部明らかにした。しかし、予定していた検討項目に到達していない。27年度が最終年度であるため、記入しない。整形外科学2型コラーゲンの分解ではMMP-13が中心的役割を担う。トレッドミル走行を用いた過度の運動負荷による2型コラーゲンの産生低下にMMP-13が関与していると考えた。6週間の走行後、関節軟骨は組織学的にOAの所見を呈しており、過度の走行によるコラーゲンやコラゲナーゼの遺伝子発現変化は正常軟骨とOA軟骨で類似している可能性を示している。アグリカンの分解については、ADAMTS5以外にMMP-13も関与していることが明らかにされている。過度の運動負荷によるアグリカンの分解にはアグリカナーゼではなく、コラゲナーゼが主に関わっていると考えた。しかし、サンプル数が少ないことや短時間でのストレスが関節軟骨に与える影響などを今後検討する必要がある。ストレス応答機構の発現する持続静水圧負荷は、軟骨細胞におけるNF-κB/HIF-2αシグナルに影響を与えることが判明した。これまでの研究によって、ストレス刺激に対する変形性関節症の治療標的の変動、およびストレス応答機構をin vitroのレベルで評価することができた。静水圧ストレスによりHSP70とHIF-2αが同様の遺伝子発現変化を認めると予想していたが、実際には異なる動きであった.このためHSP70の抑制実験を行わなかった.そのため,未使用額が生じた.静水圧以外によるストレス応答機構に関しても解析を行う。
ラスマルテンサイトの組織形成および引張特性に及ぼす母相粒界の影響

本研究では、高強度鋼において重要となるラスマルテンサイト変態の組織形成に及ぼす母相粒界の影響について検討を行い、特に加工硬化オーステナイトからマルテンサイト変態させる変態前加工処理、いわゆるオースフォーミングを施した場合の組織形成、組織サイズおよび結晶学的特徴に及ぼす母相粒界の影響について明らかにすることを目的とした。本研究では母相粒界の影響を調査するため、多結晶試料とともに単結晶試料が必要となる。しかしながら、ブリッジマン法を用いた単結晶試料作製の試みは、適切な条件の選定には至らず、単結晶試料の作製はできなかった。このため、厳密な母相粒界の影響について検討することは本研究においてできなかった。そこで、母相粒径の異なる種々の試料に対して変態前加工を施し、加工硬化オーステナイトから変態したラスマルテンサイト組織について調査を行い、間接的に母相粒界の影響を調査した。その結果、母相粒径の大小に関わらず、変態前加工処理により加工硬化オーステナイトから変態するラスマルテンサイト組織のサイズに大きな差は見られず、Vickers硬度にも差は見られなかった。また、結晶方位解析の結果、微細な母相粒径を有する試料では結晶学的な集合組織の発達を確認したが、粗大な母相粒径を有する試料ではその度合いは小さく、変態前加工時に問題となる力学特性の異方性を抑制できる可能性を見出した。以上の結果より、母相粒径を粗大にすることで変態前加工時のオーステナイト強度を低下させることは、力学特性を担保しながら操業的な利点を得る、新たな組織制御の指針となりえると期待される。当初の計画では、当該年度においてFe-23Ni合金の母相オーステナイト相の単結晶試料について作製することを予定していたが、現在までに単結晶試料の作製に成功していない。そこで当該年度はオーステナイト粒径の異なる2種類の試料を作製し、これに対して変態前加工を施した際に形成されるラスマルテンサイト組織について、組織観察および結晶解析を行った。粗大粒試料(オーステナイト粒径:213μm)および微細粒試料(オーステナイト粒径:29μm)の未加工材では従来の報告通り、オーステナイト粒径の粗大化に伴い、ラスマルテンサイト組織のサイズが粗大化することを確認した。これらの試料に対して700°Cに加熱した炉で10分間の熱処理後、圧延により変態前加工を施した試料では、両試料で同程度の組織サイズとなることが分かった。従って、変態前加工材で形成されるラスマルテンサイト組織のサイズに及ぼす母相粒径の影響は小さく、組織のサイズは変態前加工条件によって支配されるものと考えられる。また両試料のビッカース硬度も組織とよく一致しており、変態前加工後の両試料の硬度差はなくなる。また、上述の2つの試料についてEBSDを用いた結晶解析を行った結果、微細粒試料では著しい集合組織の発達が確認される一方、粗大粒試料ではその傾向が弱いことも明らかとなった。Fe-23Ni合金ではせん断型の逆変態が発現するため、変態前加工の影響に加えて逆変態時に形成される転位組織も影響することが考えられるため、それぞれの影響についても個別に検討する必要がある。単結晶試料の作製には至っていないが、並行して進めているオーステナイト粒径の異なる試料に対して変態前加工を施した際の組織の評価は進捗があり、変態前加工により形成される組織に及ぼす母相粒界の影響が示唆される結果を得た。当該年度の単結晶化実験では、種々の単結晶化条件を試みた。その結果、初めに融点よりも十分に高い温度に加熱してFe-23Ni合金を溶融させ、その後、1mm/hourでステージを降下させた場合に、比較的粗大なオーステナイト粒組織が形成された。この結果を受け、平成30年度はるつぼの形状を一部変化させ、その後の変態前加工に用いる単結晶試料の作製を行う。

また、多結晶試料においても前年度に得られた結果の妥当性を種々のオーステナイト粒径および加工度について調査し、明瞭な差が生じた試料を用いて力学特性の評価を行う。
脳転移指向性乳癌細胞株および乳癌原発組織を用いた脳転移予測バイオマーカーの探索

MDA-MB231および231BRの2細胞株間で遺伝子発現解析を次世代シーケンサーにて行った。MDA-MB231が231BRに対して10倍以上の発現差を示した遺伝子は、BC034319、CHRDL1、TMEM98、XLOC_002077、XK、F2RL2、SLCO3A1、LOC283352、CC2D2A、RORA、XLOC_012848、ACOXLの13種類であった。逆に、231BRにおいて10倍以上の発現差が認められた遺伝子は、SLC14A1、GRB14、XLOC_003832、AZU1、PDE1C、SOX30、KAAG1、IL17Fの8種類であった。それら高発現差遺伝子の生物学的機能を文献的に検索すると、乳癌細胞分裂能、能遊走および浸潤能、乳癌術前化学療法、後予後因子、乳癌予後因子、等の乳癌関連遺伝子を認める一方、機能未確認遺伝子や他癌腫関連遺伝子も含まれていた。特に、CHRDL1はMDA-MB231を用いた研究によって骨形成関連遺伝子であることが報告されており、骨転移との関連が示唆されている。また、SLC14A1は文献学的に膀胱癌との関連が示唆されていた。次にMDA-MB231および231BRの2細胞間の遺伝子変異解析を行った。現在、raw dataからノイズの削除や閾値設定を行っているため、結果の比較検討には至っていないが、明らかな変異頻度の差を複数の遺伝子で認めており、引き続き解析を進める予定である。遺伝子発現解析と遺伝子変異解析の結果解釈についてノイズの除去や有意水準の検討等、他領域の専門科とのコラボレーションに時間を要しているため。また、ヒト切除検体を使用するため倫理委員会審査手続きにも時間を要しているため。遺伝子発現解析と遺伝子変異解析によって抽出された候補遺伝子の責任タンパク質を用いた組織マイクロアレイ実験、およびそこからさらに選別された候補遺伝子についてノックダウンもしくはトランスフェクション細胞を作成し、Yonedaらの行ったマウス実験によって転移能の変化を確認する。予定していた研究に遅延によって、後実験で使用予定の試料購入が行われていないため。
肺におけるNMDA受容体の存在の分子生物学的解明と、その病態生理学的意義の研究

1.肺、気管支におけるNMDA受容体のmRNAの確認:ラットの肺においてNR2CmRNA、NR2DmRNの存在を、気管支においてNR2DmRNの存在を、rtPCRにて確認したが、他のサブユニットは確認されなかった。次にノーザンブロット法においてこれらの存在を検討した。しかし、通常使用される20,30,40,50,100μgのtotal RNAではそれらの発現は確認できなかった。これはmRNAの発現量が非常に少ないためと考え、500μgのtotal RNAから精製したpolyA RNAでノーザンブロット法を行ったところNR2DmRNAが肺のみで確認された。この方法にてもNR1は確認できなかった。また、Western BlotにてNR2C,NR2Dのタンパクは認められなかった。以上より、NR2C,NR2DのmRNAは非常に微量に肺に存在するが、そのタンパクの有無は不明である。2.肺におけるNMDA受容体の病態生理学的研究:ラット肺潅流実験系を用いNMDAが肺動脈圧、気道内圧、肺水腫の有無を調べたが、有意の変化は見られなかった。本実験系はSaidらの報告とは異なるため、いろいろな条件を変えまたモルモットでも実験を行ったが、結果は同様であった。次に、薬理学的実験として、気管、気管支、肺動静脈を摘出し、潅流液中にてNMDAを加えこれらの収縮を調べたが、本実験系においても有意の変化を認めなかった。3.肺にはNMDA受容体のsubunitであるNR2DのmRNAは微量には存在するが、そのタンパクの存在は確認されず、その病態生理学的意義は今回の研究では認められなかった。肺におけるNMDA受容体の存在は、Saidらにより1996年示唆された。しかし、その後肺におけるNMDA受容体の存在を分子生物学的に示す報告はでていない。平成10年度の我々の目標は、分子生物学的にその存在を明らかにすることであった。2.ノーザンブロット法によるNMDA受容体のmRNAの確認:ラットの肺、気管気管支をエーテル深麻酔下に摘出、ただちにTRIZolに入れRNAの分解を防いだ。total RNAを抽出し、ノーザンブロット法によりNMDA受容体のどのサブユニットのmRNAが発現しているかを調べた。通常使用される20,30,40,50,100μgのtotal RNAではそれらの発現は確認できなかった。これはmRNAの発現量が非常に少ないためと考えた。そこでmRNAをカラムで精製し、これでノーザンブロット法を行ったところ、2,5μgのmRNAでNR2CmRNAが肺のみで確認された。3.肺、気管気管支に存在するNMDA受容体のサブユニットのmRNAは量的に非常に少なかった。このため今年度に予定していたNMDA受容体mRNA発現細胞の確認はできなかった。4.これまでの成績は、1999年4月にWashington,DCでおこなわれるExperimental Biology99にて発表する。1.ノーザンブロット法によるNMDA受容体のmRNAの確認:前年度はラットの肺においてNR2CmRNAが確認され報告した。今年度はNR2CmRNの存在を確認した。通常使用される20,30,40,50,100μgのtotalRNAではそれらの発現は確認できなかった。そこで500μgのtotalRNAから精製したpolyA RNAでノーザンブロット法を行ったところNR2DmRNAが肺のみで確認された。2.肺におけるNMDA受容体の病態

生理学的研究:ラット肺潅流実験系を用いNMDAが肺動脈圧、気道内圧、肺水腫の有意を調べたが、有無の変化は見られなかった。本実験系はSaidらの報告とは異なるため、いろいろな条件を変え多くの動物を使用して実験を行ったが、結果は否定的であった。次に、気管、気管支、肺動静脈を摘出し、潅流液中にてNMDAを加え収縮を調べたが、本実験系においても有意の変化を認めなかった。1.肺、気管支におけるNMDA受容体のmRNAの確認:ラットの肺においてNR2CmRNA、NR2DmRNの存在を、気管支においてNR2DmRNの存在を、rtPCRにて確認したが、他のサブユニットは確認されなかった。次にノーザンブロット法においてこれらの存在を検討した。しかし、通常使用される20,30,40,50,100μgのtotal RNAではそれらの発現は確認できなかった。これはmRNAの発現量が非常に少ないためと考え、500μgのtotal RNAから精製したpoly A RNAでノーザンブロット法を行ったところNR2 DmRNAが肺のみで確認された。この方法にてもNR1は確認できなかった。また、Western BlotにてNR2C,NR2Dのタンパクは認められなかった。以上より、NR2C,NR2DのmRNAは非常に微量に肺に存在するが、そのタンパクの有無は不明である。2.肺におけるNMDA受容体の病態生理学的研究:ラット肺潅流実験系を用いNMDAが肺動脈圧、気道内圧、肺水腫の有無を調べたが、有意の変化は見られなかった。本実験系はSaidらの報告とは異なるため、いろいろな条件を変えまたモルモットでも実験を行ったが、結果は同様であった。次に、薬理学的実験として、気管、気管支、肺動静脈を摘出し、潅流液中にてNMDAを加えこれらの収縮を調べたが、本実験系においても有意の変化を認めなかった。3.肺にはNMDA受容体のsubunitであるNR2DのmRNAは微量には存在するが、そのタンパクの存在は確認されず、その病態生理学的意義は今回の研究では認められなかった。
高分子薬品の生体内移行性の速度論的解析に基づく新規投与システムの開発

1.モデル高分子としてovalbumin(OVA)を用い、経口投与後の消化管粘膜からの吸収を定量的に評価した。経口投与後のOVAの血液及びリンパ液中への移行性は極めて低く、投与量に対する移行量は血液中で、0.008%,リンパ液中で0.002%程度であった。これは、この様な高分子物質の生体内移行に対して消化管粘膜が強いバリヤ-として働いていることを示している。またこの時、OVAが小腸のみからでなく胃粘膜からも吸収されることが明らかとなった。胃粘膜からの血液中移行量は約0.003%であったが、リンパ液中への移行はほとんど認められず、胃と小腸との吸収メカニズムの違いが示唆された。次に、鼻腔内投与後のOVAの吸収について検討を行い、消化管からの吸収との比較を行った。鼻腔内投与では、投与量が少ないにも関わらずOVAの血中移行量は経口投与に比べて高く、鼻腔内投与が蛋白質などの高分子物質の投与法として有効であることが示された。2.消化管からのOVA吸収を改善することを目的として、OVAをliposome内に封入して投与した結果、血液及びリンパ液中への移行性は上昇する傾向を示した。これは、特にリンパ移行において顕著であり、liposomeに内封されたOVAの吸収にパイエル板からの取り込みが関与していることが推察された。しかしながら、この場合にも血液中及びリンパ液中への総移行量は、投与量の0.1%以下であり、経口投与によって高分子医薬品を生体内へ充分に送達し、一定の治療効果を得るためには、より高度な経口投与システムの開発が必要であると考えられた。