hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イレウス腸管における腸管内圧の変化および内圧除去による影響

我々は、イレウスの病体生理において最も基本的かつ重要な、閉塞腸管における腸管内圧の上昇とそれに伴う各種病態との関連を解明する目的で、閉塞腸管の内圧の変化を調べた。さらに、イレウス時における腸管局所血流量の変化、血中エンドトキシンの変化およびエンドトキシン注入時の血行動態の変化について併せて検討を加えた。腸管内圧の測定は、実験的にイヌに完全閉塞を作成し、閉塞後3日間にわたり、無麻酔・意識下において行った。内圧測定にはインフュ-ジョン式内圧測定装置(アンドルファ-:AMSー600)を用い、同時にパ-ソナルコンピュ-タ-に入力し、内圧解析用プログラム(帝京大学研究用コンピュ-タ-室の協力により開発)により解析を行った。これにより、イレウス腸管のより生理的な腸管内圧を絶対値として測定することが可能となった。小腸の上部および下部に完全閉塞を作成した場合に、有意な腸管内圧の上昇が認められた。内圧の値は閉塞後3日目において小腸上部で17.9mmHg、小腸下部で20.2mmHgであった。この値は過去の報告者の値に比べ高い値であり、特にプロスタグランジンの静脈投与による腸管運動時には平均で30mmHgを越えることが判明した。さらに、イレウス時には単純閉塞といえども、腸管局所血流量になんらかの障害がおこること、および血中エンドトキシンが上昇することが確認された。以上の研究の結果から、単純閉塞における病態生理は「腸管閉塞→腸管内圧の上昇→腸管組織血流量の減少→腸管組織の虚血壊死」という単純な図式ではなく、腸管内圧の上昇、細胞の分泌亢進、腸管組織の吸収障害、腸管内部の細菌の異常な増加、ケミカルメディエ-タ-、血行動態の変化などの様々な要因が複雑に絡み合って、イレウスの病態を作り出していると考えられた。イヌの小腸に実験的に完全閉塞を作成し、同時に内圧測定用のカテ-テルを挿入固定する事により、閉塞腸管内圧の変化を調べた。内圧の測定は、インフュ-ジョン式内圧測定装置(アンドルファ-・内圧測定システム:AMSー600)を用いることにより、生体に侵襲を加えずより生理的な腸管内圧を絶対値として測定することが出来た。さらに、帝京大学研究用コンピュ-タ-室の協力により作成された、腸管内圧解析用プログラムにより、内圧測定装置からのデ-タ-をパ-ソナルコンピュ-タ-に入力し、解析を行なうことが可能となった。これらのシステムを用いて、イレウス時の腸管内圧を測定した結果、イヌの上部小腸(Treitz靭帯の下方約50cm)に完全閉塞を作成した場合においては、腸管内圧は閉塞後3日目の安静時でも平均約15mmHgで、正常時腸管内圧に比べて、著名な内圧の上昇は認められなかった。しかし今回測定された完全閉塞時の腸管内圧の値は、過去において報告された値よりも高い値を示している。これは今回の腸管内圧の測定が、閉腹・意識下においてなされた為と考えられ、より生理的なイレウス時の腸管内圧測定されたものと思われる。また、特にプロスタグランディン投与による腸管収縮時の内圧は平均約20mmHgで、一時的には50mmHgを越える値も記録された。しかし、これらの値は閉塞を作成していない正常の腸管内圧に比べて、さほど高い値ではなく、イレウス時の腸管内圧の上昇が直接的にイレウス時におこる血行動態の変化などの病態を引き起こすとは考え難い。

今後、実験的完全閉塞をイヌの小腸下部および結腸部に作成し、その後の腸管内圧の変化を追求するとともに、腸管内圧の上昇とケミカルメディエ-タ-などとの関連についても検討を加えたい。我々は、イレウスの病体生理において最も基本的かつ重要な、閉塞腸管における腸管内圧の上昇とそれに伴う各種病態との関連を解明する目的で、閉塞腸管の内圧の変化を調べた。さらに、イレウス時における腸管局所血流量の変化、血中エンドトキシンの変化およびエンドトキシン注入時の血行動態の変化について併せて検討を加えた。腸管内圧の測定は、実験的にイヌに完全閉塞を作成し、閉塞後3日間にわたり、無麻酔・意識下において行った。内圧測定にはインフュ-ジョン式内圧測定装置(アンドルファ-:AMSー600)を用い、同時にパ-ソナルコンピュ-タ-に入力し、内圧解析用プログラム(帝京大学研究用コンピュ-タ-室の協力により開発)により解析を行った。これにより、イレウス腸管のより生理的な腸管内圧を絶対値として測定することが可能となった。小腸の上部および下部に完全閉塞を作成した場合に、有意な腸管内圧の上昇が認められた。内圧の値は閉塞後3日目において小腸上部で17.9mmHg、小腸下部で20.2mmHgであった。この値は過去の報告の値に比べ高い値であり、特にプロスタグランジンの静脈投与による腸管運動時には平均で30mmHgを越えることが判明した。さらに、イレウス時には単時閉塞といえども、腸管局所血流量になんらかの障害がおこること、および血中エンドトキシンが上昇することが確認された。以上の研究の結果から、単純閉塞における病態生理は「腸管閉塞→腸管内圧の上昇→腸管組織血流量の減少→腸管組織の慮血壊死」という単純な図式ではなく、腸管内圧の上昇、細胞の分泌亢進、腸管組織の吸収障害、腸管内部の細菌の異常な増加、ケミカルメディエ-タ-、血行動態の変化などの様々な要因が複雑に絡み合って、イレウスの病態を作り出していると考えられた。
卵成熟誘起ホルモン産生を触媒する酵素(20β-HSD)のクローニングと活性

脊椎動物の多くでは卵が受精可能になるまでには、卵成長、卵成熟の過程を経なくてはならない。十分に卵黄蓄積して卵が成長すると、20β水酸基脱水素酵素活性の作用により卵ろ胞から卵成熟誘起ホルモンが分泌され、この作用により卵が成熟することが知られている。当研究室ではその卵成熟誘起ホルモンの実体を脊椎動物で初めて明らかにしたが、その産生触媒を行う酵素の実体は明らかでなかった。この実体を明らかにするために、理由は判らないがその卵成熟誘起ホルモンが多量に精巣に存在することが知られていたので、まずブタ精巣からこの酵素を精製、cDNAをクローニングした。この結果、20β水酸基脱水素酵素は生物学的意義の不明なカルボニルリダクターゼと高い相同性を示していることが明らかとなった。今年度はこの酵素が卵で卵成熟誘起ホルモン産生酵素として働いているか否かを調べるために、卵成熟誘起ホルモンの明らかなアユの成熟卵巣からcDNAライブラリーを構築し、ブタカルボニルリダクターゼと相同生の高いcDNAを単離した。次に、この酵素を大腸菌で発現、精製し、カルボニルリダクターゼ活性と20β水酸基脱水素酵素活性とをそれぞれ分光光学的手法、再結晶法とで調べ、双方の活性が存在することを示した。また更に、最終成長期の卵巣と成熟期の卵巣からRNAを調整し、転写物量を比較したところ、成熟期には20β水酸基脱水素酵素の転写物は少なくとも1.5倍以上増加していることがノーザンブロット法で明らかとなった。以上のことは、今まで生物学的生理活性の明らかでなかったカルボニルリダクターゼが卵巣では20β水酸基脱水素酵素活性として働き、卵成熟誘起ホルモン産生に関与している可能性を強く示唆している。
腫瘍における多能性維持転写因子NACC1発現の意義と活性阻害剤開発に関する研究

NACC1は多能性維持に関連する転写因子ネットワークの一員として認識され、その過剰発現は腫瘍の悪性形質と関連が指摘されている。本研究では、NACC1が細胞質内ヒストン脱アセチル化酵素HDAC6と結合し、細胞骨格関連分子(α-tubulin、cortactin)のアセチル化制御により腫瘍の浸潤・転移能の制御に関与していた。また、NACC1は乳癌のHSP90のアセチル化制御によりERBB2の発現の維持にも関与していた。核内ではSUMO化を受けたPML分子と結合し細胞増殖、アポトーシスに影響を与えていた。NACC1の過剰発現は腫瘍の悪性形質を誘導し、細胞運動・浸潤・増殖能に影響を与えており格好の治療法的分子となり得る可能性が示唆された。近年、ES細胞を初めとした幹細胞の多能性維持に関連する転写因子ネットワーク(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Dax1, Rex1, Zpf281, NACC1)の活性化が、腫瘍の分化度や予後と密接な関連を持つことが報告された。我々は、このネットワークの一員であるNACC1(nucleus accumbence associated 1)が、核内外で多彩な翻訳後修飾を受けることで、複数のがん関連蛋白質との相互作用を生じ、その生物学的特性の形成に関与していることを解析している。本年度は、以下の事を明らかにした。●NACC1の過剰発現は、悪性黒色腫の予後予測因子となり得た。●NACC1の過剰発現はがん遺伝子ERBB2の細胞膜での安定的誘導につながり、乳癌細胞のHerceptinに対する感受性に影響を与えた。●年度後半までにNACC1の市販抗体(Life Span)および自作の抗体で免疫染色をい肝癌の予後と関連することを明らかにした。●次世代シークエンサーによるNACC1下流遺伝子の網羅的解析を行った。近年、ES細胞を初めとした幹細胞の多能性維持に関連する転写因子ネットワーク(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog,Dax1,Rex1,Zpf281,NACC1)の活性化が、腫瘍の分化度や予後と密接な関連を持つことが報告された。本年度鉢、以下の事を明らかにした。●NACC1の過剰発現は、悪性黒色腫の予後予測因子となり得た(論文を発表した)。●肝癌ではNACC1と相互作用するHDAC6の発現が肝内転移と相関し、肝細胞の運動能に影響を与える事が明らかとなった。また、この相互作用の阻害にはCYLDの遺伝子産物が有効である事が判明した。●次世代シークエンサーによるNACC1下流遺伝子の網羅的解析を行い、Wnt signal伝達系に係わるCHD8の発現が制御されていることが明らかとなった。近年、ES細胞を初めとした幹細胞の多能性維持に関連する転写因子ネットワークの活性化が、腫瘍の分化度や予後と密接な関連を持つことが報告された。我々は、このネットワークの一員であるNACC1 (nucleus accumbence associated 1)が、核内外で多彩な翻訳後修飾を受けることで、複数のがん関連蛋白質との相互作用を生じ、腫瘍の生物学的特性与える影響について解析した。NACC1は、cortactin、tubulinの脱アセチル化機構に影響を与え細胞骨格分子の制御による細胞運動の亢進に影響を及ぼした。がん遺伝子ERBB2の細胞膜での安定的誘導につながり、乳癌のHerceptinに対する感受性に影響を与えた。NACC1と相互作用するHDAC6は肝内転移と相関し、肝細胞の運動能に影響を与えた。NACC1下流遺伝子の網羅的解析を行い、NRF2-KEAP1が防御的に働く酸化還元酵素群の発現制御に関与していた。悪性黒色腫の一部には、次世代シークエンサーのtranscriptome解析から、NRF2-KEAP1に変異が存在することが明らかとなり、これらはワールブルグ効果と呼ばれる一連の解糖系エネルギー代謝への移行がなくとも、細胞質内の活性酸素の発生や低酸素ストレスの回避に役だっていることが明らかとなった。NACC1の過剰発現はNRF2-KEAP1の活性化を誘導し、低酸素ストレスや電子伝達系で発生する活性酸素の作用を軽減し、がん幹細胞の保護に働く作用を有している事を明らかにした。

また、これらの作用は、ダカルバジンやシスプラチンなどの活性酸素種の発生がその薬理効果に影響を与える抗癌薬の作用も弱めることが明らかとなった。また、NACC1に見られるSUMO化翻訳後修飾NACC1の核内移行に大きく関与していてた。これまで不明であった多くのNACC1の機能が明らかとなった。昨年の震災により、当初の研究計画から若干の遅れが生じた。そのため論文作成に必要なデータ収集・投稿の時期が3ヶ月ほど遅れたがその後の努力により概ね投稿は終了し成果公開の寸前まで事業は進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究は、NACC1-HDAC6の阻害剤のスクリーニングに力を入れ、特許の申請を目指す方向で検討している。
統合失調症における髄鞘の分化・発達異常と選択的スプライシング因子hnRNPA1

ヒトの遺伝子は高々2万2千個であるが、発達段階・組織特異的に選択的スプライシングを行うことで20万種類以上の蛋白質が機能している。このスプライシングの破綻は、発達段階や多くの疾患病態に関与しており、精神・神経変性疾患等の患者脳内でも、種々の遺伝子のスプライシング異常が知られている。一方近年の脳研究がめざましい進歩を遂げているが、統合失調症(SZ)研究は未だ萌芽状態である。昨年度までに、1)SZリンパ球ではhnRNPA1が有意に上昇していた。2)この上昇は髄鞘形成に関するErbB4の相互排他型様選択的スプライシング産物を産生した。3)この異常産物は、実際にSZリンパ球内でも確認できた、などを報告した。本年度は、実際にhnRNPA1の発現量の撹乱が、オリゴデンドロサイト(ODC)の分化異常をきたすか否かに重点を置いた。【結果】1)ヒトODC前駆細胞株において有意なODC分化制御が観察された。これは細胞密度に依存的で、高密度による分化過程では、全く逆の分化増強が見られた。2)hnRNPA1過剰発現によるODC分化への影響は、少なくともErbB4,NRG1,ESR1遺伝子のスプライシングを抑制することに起因していた。3)この時の全体的遺伝子発現をチップ解析すると、SZで既に関連が指摘されている因子群が多くヒットした。また、パスウェイ解析によって細胞密着系のパスウェイが特異的にヒットしてきた。4)hnRNPA1のノックダウンによる影響を検討した結果、同様にODC分化撹乱することが明らかになった。これら結果は、現在までほとんど当該領域で着目されてこなかったhnRNPA1が、脳構築において重要な一端を担い、さらにはその破綻が脳発達異常に起因する精神疾患に関与する可能性を示唆するものである。このスプライシングの破綻は、発達段階や多くの疾患病態に関与しており、精神・神経変性疾患等の患者脳内においても、種々の遺伝子のスプライシング異常が知られている。一方近年の脳研究がめざましい進歩を遂げているが、統合失調症研究は未だ萌芽状態にあると言える。当疾患の1%という高い有病率や10%にもおよぶ自殺率等、多岐にわたる精神症状が社会に及ぼす深刻な影響に鑑みれば発症機構解明と有効な治療法開発は焦眉の急である。近年妊娠マウスにインフルエンザウィルスを感染させた後に得られた仔が統合失調症様の行動を呈するという報告がなされ、我々は、このマウスが脳内でのオリゴデンドロサイト(ODC)の分化・発達異常をきたすことも明らかにした。今回我は、統合失調症の病態が多岐にわたることと、グローバルなスプライシング抑制因子hnRNPA1の機能異常に相関性があり、それが髄鞘形成に異常を呈する可能性を検討した。【結果】統合失調症患者リンパ球では、hnRNPA1が有意に上昇していた。この上昇は髄鞘形成に関連するErbB4のExon25と26の相互排他型様選択的スプライシング産物を産生した。hnRNPA1はこのExon25と26の含有パターンを変化させた。さらにこの異常産物は、実際に統合失調症リンパ球内でも確認できた。そこで周辺の配列を研削した結果、Exon24や27周辺にはhnRNPA1認識配列が一つもなかったのに対して、Exon25周辺には15ヵ所も存在することが明らかとなった。
RNAiを用いた遺伝子ノックアウト(ノックダウン)マウスの作製

RNAi-TGの系はマウスだけでなくラットにおいても応用可能であることがすでに分かっている。そのためES細胞がないような動物種においても、RNAi-TGの系を使うことにより個体における遺伝子の機能解析ができる可能性が出てきた。しかしながら、これまでにsiRNAが発現しない個体が出現することやRNAi効果が加齢とともに減弱するといった問題点も分かっており、RNAi-TG法はまだ完成された方法ではない。そこでわれわれはこれらの原因として、プロモーターの不安定さや発現量の少なさを考え、培養細胞を用いた系ですでに有効性が証明されているtRNAプロモーターを用いてRNAi-TGマウスを作製し、マウス個体におけるRNAiをより詳細に解析することを目的に実験を行なった。tRNAプロモーターによるRNAiトランスジェニックマウスを作製し、ファウンダーマウス及びF1マウス個体においてRNAi効果を確認した。その結果、(1)世代を経ることにより、RNAiトランスジーンを持っているにも関わらずsiRNAが発現しない個体が出現し、そのような個体においてRNAi効果は見られなくなることを確認した。(2)いったんsiRNAが発現しなくなった親からsiRNAの発現が回復した子供は得られなかった。(3)EGFPの発現が非常に強力なグリーンマウスにおいて、EGFPに対するRNAi効果は加齢とともに減弱することを確認した。(4)EGFPの発現がより低いLG-002マウスを用いるとEGFPに対する持続的なRNAi効果があることが確認された。哺乳類において、長いdsRNAを用いたRNAiは毒性があることや効果の持続性がないことなどから、毒性のないsiRNAを用いRNAiを持続的に作用させる実験系を立ち上げた。RNAポリメラーゼIIIプロモーターでsiRNAを発現することができるベクターシステムを構築し、先ずはRNAiの効果をin vitroで検討した。EGFPを標的としたRNAiベクターを作製し、EGFPが安定に発現したES細胞に導入してみたところ、十分なRNAi効果が観察され、EGFPの発現が抑制された。さらなる応用として、RNAiベクターを用いトランスジェニックマウスを作製し、"green mouse"におけるEGFPの発現を抑制させることに成功している。この遺伝子発現抑制効果は、初期胚、新生仔、成熟したマウスにおいて、ほぼすべての組織で観察された。しかしながら、このRNAi法はまだ完成されたとはいえず、一部のRNAiトランスジェニックマウスにおいてRNAi効果がマウスの成長と共に無くなったり、標的とする遺伝子のどの配列でRNAiを行なうか、というように克服しなければならない点もある。これらの点を克服するために、安定して遺伝子発現が抑制できる新しいベクターの開発が必要だと考えており、その第一歩として、新しいプロモーターの探索を行ない、すでにリボザイムの発現系で用いられたtRNAの内部プロモーターを用いることで、RNAi法の効率化が図れることを見いだした。また、ベクターに導入する配列を一部改変することで、ベクターを安定化することに成功した。さらに現在は、このベクターを用いてEGFPを発現するラットに対してRNAiを行ないその効果を解析中である。
サイトカインネットワークを応用した新しい心筋保護法の確立に関する研究

1)本研究においては、まず、これまでほとんど困難であった成熟ラット心筋細胞を分離するとともに、ラット冠動脈内皮細胞を分離培養し、これを用いて、ボイデンチャンバー法を応用した、in vitro心筋モデルを確立した。2)さらにこのモデルにおいて、低酸素再酸素化を施行するとともにラットより採取した好中球を再酸素化時に添加し、in vivoにおける心筋虚血再潅流障害モデルを再現し得た。さらにこのモデルにおける種々の評価法を確立した。3)さらにこのモデルを用いて、心筋虚血再潅流における好中球の関与とその機序へのICAM-1及びサイトカインの関与を検討し得た。4)その結果として、心筋虚血再潅流障害には好中球が関与しさらに、その機序には接着因子とIL-6等の接着因子が関与していることが明らかとなった。5)このことより、これらの虚血再潅流障害の関与因子の制御が臨床上重要となってくると考えられる。即ち、積極的な好中球除去、ICAM-1やIL-6のモノクロナール抗体の臨床応用が期待される。3-4週齢のラット心を摘出し、ランゲンドルフ潅流装置を用いて、collagenaseを逆行性に潅流し心筋細胞及び冠微小血管内皮細胞を単離し、percollを用いた分離分画法によりそれぞれを分離する方法を開発した。血管内皮細胞は2代目まで継代培養されたものをcollagen膜上に培養し下層には単離後24時間以内の心筋細胞を培養するin vitro心筋モデルを作成し、好中球の接着浸潤を中心とした心筋虚血再潅流傷害の機序を検討した。特に好中球の接着浸潤率の検討には、非特異的細胞表面染色蛍光色素であるPKH2を用いて、蛍光分光高度計による定量化する方法を開発確立した。in vitro心筋モデルを機密式ボックス内にいれ、palladium catalystに水を加え、酸素を消費し、水素と二酸化炭素を発生させ、低酸素状態を作成した。この時のpO2は8-10mmHgであった。またhypoxiaの時間と心筋細胞障害の程度を検討したところ、超微細構造において、2時間までが不可逆的変化を示し、3時間以上では50%以上の細胞が不可逆的変化を示した。ボックスより心筋細胞を取り出し、再酸素化を行い、心筋虚血再潅流傷害モデルを作成した。この障害程度の評価法として、生物微弱発光検出器を用い、ATP、chemiluminescence及びtrypan blue染色による細胞可逆的変化の測定を行った。2時間のhypoxia及び再酸素化により心筋モデルはATP、chemiluminescence及びtrypan blue染色において有意に傷害されたが、さらに好中球を添加することにより傷害は有意に増悪した。以上、本年度は基本的には、細胞分離法の確立、モデルの開発及び心筋再潅流傷害の再現とその傷害程度の評価法の確立を中心に研究を行った。次年度において、これらのモデルを用いて、機序に関与する種々のfactorの解明に取り組む予定である。1。接着因子の関与a)低酸素による心筋及び内皮細胞におけるICAM-1の発現Normoxiaの心筋細胞及び血管内皮細胞においてconstitutiveなICAM-1の発現は、hypoxiaにより明らかに高度となった。b)好中球透過率及び接着率好中球透過率及び接着率は2時間hypoxiaにより有意に亢進したが、ICAM-1のモノクロナール抗体はこれを有意に軽減した。chemiluminescence値も2時間hypoxiaにより有意に亢進し、心筋細胞も有意に傷害されたが、ICAM-1のモノクロナール抗体はこれらを有意に軽減した。2。サイトカインの関与a)開心術症例における虚血再潅流時のIL-6産生開心術症例において、体外循環中においてIL-6は産生増加されており、さらに冠静脈血との差異から求められた心筋におけるIL-6の産生は大動脈遮断により有意に増加した。b)心筋細胞からのIL-6心筋細胞培養上清中のIL-6は、2時間hypoxiaの心筋細胞でNormoxiaに比し、有意に高値であった。しかし、2時間hypoxia及びNormoxiaの冠血管内皮細胞間に有意差を認めなかった。

c)好中球透過率好中球透過率は2時間hypoxiaにより有意に亢進しが、IL -6のモノクロナール抗体はこれを有意に軽減した。以上より、心筋虚血再潅流障害には好中球が関与しさらに、その機序には接着因子とIL-6等の接着因子が関与していることが明らかとなった。
ルーチンの病理組織標本を用いた胞状奇胎の簡便な確定診断ストラテジーの確立

胞状奇胎の簡便な診断法を確立することを目的とした。一般検査室レベルでの適応を念頭にChromogenic in situ hybridization法(以下CISH法)を用いてホルマリン固定・パラフィン包埋された絨毛検体の染色体の倍数性の評価を試みた。試験的に富山大学付属病院に保存されている絨毛検体のうち、すでに通常の染色体分析によって倍数性が判明しているものについて、CISH法で倍数性を検討したことろ概ね通常法と結果が一致したが、精度が十分とは言えなかった。今後、精度の向上をはかった上で、対象を協力病院の症例に拡げて、より多数例での検討を行っていく予定である。本研究は胞状奇胎の簡便な診断法を確立することを目的としている。具体的には特に部分奇胎の倍数性を一般検査室レベルで簡便に評価する方法を検討しており、平成25年度はホルマリン固定・パラフィン包埋された絨毛検体を対象としたChromogenic in situ hybridization (CISH)法を用いて染色体の倍数性評価を試みた。主に富山大学付属病院で経験された症例にうちすでに凍結検体の染色体分析にて倍数性が判明しているものについて、ホルマリン固定・パラフィン包埋後の検体を用いてCISH法で評価したところ、概ね凍結検体の染色体分析の結果と合致する結果が得られている。ホルマリン固定・パラフィン包埋後の検体で倍数性の評価が可能であることは、一般病理検査用に提出された検体を用いた評価が可能であることを示しており臨床的に非常に意義があるものを考えている。今後症例数を増やしてのさらなる検証およびp57の免疫組織化学的検査と組み合わせた胞状奇胎の診断法についてその精度の検証を行う予定である。特に部分奇胎の倍数性を一般検査室レベルで評価する方法を検討しており、ホルマリン固定・パラフィン包埋された絨毛検体(病理診断用の検体)を対象としたChromogenic in situ hybridization法(以下、CISH法)を用いて染色体の倍数性の評価を試みた。試験的に富山大学付属病院に保存されている検体のうち、すでに通常の染色体分析によって倍数性が判明しているものについて、倍数性の評価ができるものか検討したことろ概ね通常法と結果が一致した。より多数例での検討がのぞまれたため他病院の症例でも検討したが、本期間においては精度が実用レベルに至らず、研究実績を発表することができなかった。今後、CISH法のより安定した条件設定による精度の向上を目指していく予定である。人体病理学CISH法の習熟に想定したよりも時間を要したため。部分奇胎をCISH法で診断する際の精度を、症例数を増やして検証する。今後は富山大学付属病院以外の協力病院の症例を収集する予定である。その後、p57の免疫組織化学的検査による全奇胎の検討とCISH法による部分奇胎の検討を組み合わせた診断法による胞状奇胎の診断の精度を統計的に検証する予定である。物品(CISH用薬品)購入に使用する予定であったが、当該年度内に物品の選定ができなかった。次年度で、予定物品を購入予定である。
超求電子性ルテニウム錯体による三久選択的メタセシス重合

ルテニウム錯体は三塩基化ルテニウムをはじめ、メタセシス重合活性が古くから知られていた。最近ではGrubbsのトリシクロヘキシルホスフィンをもつ2価ルテニウム錯体の多様な触媒機能が注目されている。本研究ではペンタメチルシクロペンタジエニル・ルテニウム(Cp^*Ru)活性種の配位子による面規制を制御因子とするノルボルネンの立体選択的メタセシス重合を検討した。立方体構造をもつ[Cp^*RuCl]_4を触媒とし、極少量の分子状酸素または過酸の存在化に、ノルボルネンを重合させると(60°C,THF中)35日でメタセシス重合は完結し、立体選択的にオレフィン部位がトランス構造をもつメタセシスポリマーが生成した。この重合系における酸素の効果はルテニウム・オキソ結合の生成と、そのノルボルネンとの[2+2]メタセシスによる末端ホルミル基とルテニウムカルベノイド活性種生成にあると推定した。Cp^*配位子に加え、第2の面規制因子として、共役ジエンを導入したCp^*Ru(ブタジエン)Clをカオチン化して、同様の条件下にノルボルネンを重合させたところ、低収率(8%)ではあるがオレフィン部位の立体選択性が逆転した(シス:トランス=80:20)シス選択性ポリマーを得ることに成功した。この収率の向上を目的として種々のルテニウム錯体を検討したところ、筆者らが先に開発した。ルテニウム(π)アリル錯体、Cp^*RuCl(C_3H_4R)、2当量の銀トリフラート、およびトリメチルシリルジアゾメタンの組み合わせから生じるカチオン性ルテニウムカルベノイドが、40°CでR=Hの場合90%収率(シス:トランス=70:30)、R=2-CH_3の場合に64%収率(シス:トランス=81:19)でシス選択性ポリマーを与えることを発見した。
コモンウェルスと「帝国後」の国際制度・規範の模索、1963～71年

本研究では、第二次世界大戦後、イギリスの公式帝国(植民地、保護領、信託統治領などイギリス政府の法的な管轄下に置かれた地域)が急速に解体に向かうなかで、コモンウェルス(英連邦)を通して行われた「帝国後」の新たな国際制度・規範の模索について歴史的に分析を行った。特に、イギリスの公式帝国の解体後に残された政治的混乱や貧困、人種差別などの深刻な課題を受けて、コモンウェルス諸国間で常設のコモンウェルス事務局の設立(1965年)やンシンガポール宣言(1971年)を通して、そうした様々な「帝国後」の課題に対処する試みがなされたことについて検討した。本研究は、第二次世界大戦後、イキリスの公式帝国(植民地、保護領、信託統治領などイキリス政府の法的な管轄下に置かれた地域の総称)が急速に解体へと向かうなかで、コモンウェルス(英連邦)を通して行われた「帝国後」の新たな国際制度・規範の模索について歴史的に分析を行うものである。特に、本研究では、イギリスの公式帝国の解体後に残された政治的混乱や貧困、(特に多人種が併存する地域での)人種差別などの深刻な問題を受けて、コモンウェルス諸国間で常設のコモンウェルス事務局の設立(1965年)やンシンガポール宣言(1971年)を通して、そうした様々な「帝国後」の課題に対処する試みがなされたことについて検討する。3年間の研究計画の初年度にあたる平成21年度においては、基礎的な作業として、上記のテーマに関する二次文献や報告書・パンフレットなどの収集・分析を進めるとともに、(1)イギリス国立公文書館(ロンドン)、(2)チャーチル・アーカイブス・センター(ケンブリッジ)、(3)コモンウェルス事務局文書館(ロンドン)、(4)シンガポール国立公文書館(シンガポール)において、各国政府や国際機関の一次文書の閲覧・収集を行った。それらの研究の部分的な成果については、「カナダの反人種差別外交の展開-コモンウェルスとの関係を中心に-」日本カナダ学会第34回年次研究大会(国立民族学博物館、2009年9月13日)において報告を行った。また、「脱植民地化とイギリス対外政策-公式帝国・非公式帝国・コモンウェルス-」北川勝彦編著『イギリス帝国と20世紀第4巻脱植民地化とイギリス帝国』(ミネルヴァ書房、2009年)25-68頁の公刊も行い、研究成果を広く社会に発信した。本研究は、第二次世界大戦後、イギリスの公式帝国(植民地、保護領、信託統治領などイギリス政府の法的な管轄下に置かれた地域の総称)が急速に解体へと向かうなかで、コモンウェルス(英連邦)を通して行われた「帝国後」の新たな国際制度・規範の模索について歴史的に分析を行うもめである。3年間の研究計画の2年目にあたる平成22年度においては、基礎的な作業として、上記のテーマに関する二次文献や報告書・.パンフレットなどの収集・分析を進めるとともに、(1)カナダ国立公支書館(オタワ)、(2)ブリティッシュ・コロンビア大学図書館(バンクーバー)、(3)香港中央図書館において、各国政府や国際機関め未公刊の一次文書や公刊一次資料の閲覧・収集を行った。それらの研究の部分的な成果については、「イギリス帝国と三つの「脱植民地化」-公式帝国・非公式帝国・コモンウェルス-」2010年度中部政治学会(名古屋大学法学部、2010年7月11日)において報告を行った。また、「「三つのサークル」のなかのイギリス」木畑洋一・秋田茂編著『近代イギリスの歴史-16世紀から現代まで-」ミネルヴァ書房、2011年3月、239-255頁の公刊も行い、研究成果を広く社会に発信した。本研究は、第二次世界大戦後、イギリスの公式帝国(植民地、保護領、信託統治領などイギリス政府の法的な管轄下に置かれた地域の総称)が急速に解体へと向かうなかで、コモンウェルス(英連邦)を通して行われた「帝国後」の新たな国際制度・規範の模索について歴史的に分析を行うものである。

3年間の研究計画の最終年度にあたる平成23年度においては、上記のテーマに関する二次文献や報告書・パンフレットなどの収集・分析を進めるとともに、(1)イギリス国立公文書館(ロンドン西部郊外のキュー)、(2)ロンドン大学経済政治学院(LSE)および東洋アフリカ学院(SOAS)の図書館(いずれもロンドン)において、イギリス政府の未公刊の一次文書やイギリスを含むコモンウェルス諸国の公刊一次資料の閲覧・収集を行った。それらを含めて、平成21年度平成23年度の研究成果をもとに、現在、コモンウェルスの歴史的変遷についてまとめた単著の出版に向けて準備を進めている。また、本研究の部分的な成果を活かし、「イギリス」森井裕一編『ヨーロッパの政治経済・入門』有斐閣、2012年3月、55-75頁の公刊も行い、研究成果を広く社会に発信した。
解離性動脈瘤に対する血管内癒着療法の開発

犬を用いて確立した「動脈壁の中膜の損傷後に内膜の欠損を加えた」頸動脈解離性動脈瘤モデルをさらに発展させる形で、実際の臨床例に見られるような紡錘状の動脈瘤の作成をめざすべく、解離性動脈瘤発展モデルを考案中である。ビーグル犬(約10頭)の頸動脈に対しさらに血管壁の損傷の範囲を広くして手術操作を加え、経時的変化を血管撮影・超音波血流計で経過観察している。血管壁の損傷が大きいと高度狭窄から閉塞を示す傾向があり、現在のところ紡錘状の動脈瘤は作成できていない。さらに血管壁の損傷方法の検討を行い新たな解離性動脈瘤モデルの確立をめざしてゆきたいと考えている。ただ、前回のモデルで示されたように嚢状の動脈瘤は作成されている。まずは、これらの動脈瘤壁および親血管に対してマイクロカテーテルおよびバルーンカテーテルなどを用いた血管内手術手技にて内膜増殖因子の導入について予備実験をしている。また組織学的検討も加えて有効な増殖因子の導入法について検討中である。内膜増殖因子の導入の一方法および治療法のオプションとして、これらの増殖因子を膜に導入させたカバードステントグラフトを用いることを考えている。現在予備実験としてステントをビーグル犬の頸動脈に経カテーテル的に留置し、留置に対する技術的な問題、ステントに対する血栓形成などの形態変化について検討中である。また、カバードステントに使用する膜の材質・最適な増殖因子の導入方法についても検討を続けているところである。
ヘテロ原子ドープグラフェンナノリボンの合成法の開発・物性測定

本研究課題は、グラフェンナノリボン(GNR)へのヘテロ原子導入によるp型、n型GNRのボトムアップ合成、および太陽電池としての応用を最終目的としている。本年度は硫黄ドープ窒素ドープGNR用モノマーを有機合成し、前駆体高分子の生成に成功した。また窒素ドープGNR用モノマーについても有機合成の検討を行った。GNRは幅が数ナノメートル以下の縮環導電性高分子であり、その特異的な高移動度を示す性質により太陽電池やトランジスタなどの高性能デバイスへの応用が期待されている。さらにGNRにヘテロ原子を導入したヘテロドープGNRは、HOMO、LUMOの調節ができるため、p型半導体とn型半導体の作製が可能である。有用なn型有機半導体の材料はフラーレンに限られているのが現状であり、n型GNRは新たな高性能n型有機半導体材料として期待される。また、合成したn型GNRとp型GNRからなる高効率太陽電池への応用を目指した。昨年度、新たに合成に成功したアセン軸を有するGNRはヘテロ原子を導入したヘテロ原子ドープGNRのモノマー構造にも応用することができる。末端にチオフェンを導入した硫黄ドープGNR用モノマー、ピリジンを導入した窒素ドープGNR用モノマーの合成および2zone RP-CVDによるGNR化を目指した。アセン軸を有する基本骨格にチオフェンを導入した硫黄ドープGNR用モノマーを有機合成した。合成したモノマーを2zone RP-CVD法を用いてGNR化の条件検討を行い、前駆体高分子の生成をSTM(走査型電子顕微鏡)観察により確認した。GNR化についても、温度条件の検討により生成が見込まれる。ピリジンを有する窒素ドープGNR用モノマーは、クロスカップリング反応の条件検討を多数試みたが、残念ながら成功しなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度はヘテロ原子を含まない新規原料低分子の合成と新しいボトムアップ手法として、2-zoneラジカル重合型化学気相成長法の開発に携わった。GNRのバンドギャップはその幅とエッジの形状に依存するため、幅とそのエッジの均一性を制御できるボトムアップ型の手法によるGNRの作製を行う必要がある。しかしボトムアップGNRの合成例は超高真空環境における蒸着重合法など少数の報告例はあるものの、未だに大量合成の有効な手法の確立には至っていない。所属研究室では、従来の合成法にはない低真空下(1 Torr)で、かつ大量合成可能な新規ボトムアップ的GNR合成法(2-zoneラジカル重合型化学気相成長法)を開発した。本手法を用い、幅の異なるGNRを目指し、各原料低分子(ジブロモペリレン、ジブロモビスアントラセン、ビス(グロモフェニル)テトラフェニルトリフェニレン)の設計・合成を行った。合成した原料低分子により幅の異なる3種類(テトラセン幅(3p)、アントラセン幅(3p+1)、ナフタレン幅(3p+2) p :整数)の極細線GNRの合成に成功した。合成したGNRは走査型トンネル顕微鏡を用いた幅や長さの表面観察、可視吸収スペクトル、及びラマンスペクトルにより構造の同定を行った。グラフェンナノリボン(GNR)は幅が数ナノメートル以下の縮環導電性高分子であり、その特異的な高移動度を示す性質により太陽電池やトランジスタなどの高性能デバイスへの応用が期待されている。所属研究室では、従来の合成法にはない低真空下で、かつ大量合成可能な新規ボトムアップ的GNR合成法(2ーzoneラジカル重合型化学気相成長法:2zone RPーCVD)を開発した。本手法を用い幅の異なる3種類(テトラセン幅、アントラセン幅、ナフタレン幅)の極細線GNRの合成に成功した。また2ーzone RP-CVDを用いることで、これまで報告例のない側鎖を持たないアセン軸を有するGNRの合成法を開発し、その物性の探索を行った。適切なモノマーを設計、合成し、2zone RPーCVDを用いて、側鎖を持たないアセン骨格を持つGNRを金基板上に合成することに初めて成功した。さらに、そのモノマーの構造を応用することで2種類の分子幅を作り分けることにも成功した。合成した2種類のGNRをトンネル顕微鏡(STM)により直接観察した結果、CVD法によって合成されたこれまでのGNRと比べ非常に配向性よく生成していることが分かった。走査トンネル分光及び光吸収スペクトルから合成した2種類のGNRのバンドギャップを測定し、、このタイプのGNRもこれまで報告されているアームチェア型GNRと同様にバンドギャップを持ち、その分子幅によってバンドギャップが変化することを明らかにした。

本年度は硫黄ドープ窒素ドープGNR用モノマーを有機合成し、前駆体高分子の生成に成功した。また窒素ドープGNR用モノマーについても有機合成の検討を行った。GNRは幅が数ナノメートル以下の縮環導電性高分子であり、その特異的な高移動度を示す性質により太陽電池やトランジスタなどの高性能デバイスへの応用が期待されている。さらにGNRにヘテロ原子を導入したヘテロドープGNRは、HOMO、LUMOの調節ができるため、p型半導体とn型半導体の作製が可能である。有用なn型有機半導体の材料はフラーレンに限られているのが現状であり、n型GNRは新たな高性能n型有機半導体材料として期待される。また、合成したn型GNRとp型GNRからなる高効率太陽電池への応用を目指した。昨年度、新たに合成に成功したアセン軸を有するGNRはヘテロ原子を導入したヘテロ原子ドープGNRのモノマー構造にも応用することができる。末端にチオフェンを導入した硫黄ドープGNR用モノマー、ピリジンを導入した窒素ドープGNR用モノマーの合成および2zone RP-CVDによるGNR化を目指した。アセン軸を有する基本骨格にチオフェンを導入した硫黄ドープGNR用モノマーを有機合成した。合成したモノマーを2zone RP-CVD法を用いてGNR化の条件検討を行い、前駆体高分子の生成をSTM(走査型電子顕微鏡)観察により確認した。GNR化についても、温度条件の検討により生成が見込まれる。ピリジンを有する窒素ドープGNR用モノマーは、クロスカップリング反応の条件検討を多数試みたが、残念ながら成功しなかった。ヘテロ原子ドープグラフェンナノリボンの合成に向け、予定ではグラフェンナノリボンの合成を終わらせているとしているが、原料モノマーの合成段階であるためやや遅れているとした。昨年度予定していた分子では反応が進行しないことが判明していたが、本年度その分子設計を改善し、基本骨格の確立できたため今後計画内容に従って実験を進められると考えらる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度、ヘテロ原子ドープグラフェンナノリボンの合成に用いるモノマー分子の基本骨格を確立できた。現在、基本骨格にヘテロ原子を導入したモノマーを合成しており、合成でき次第2ーzone RPーCVDによるグラフェンナノリボン化の検討を行う予定である。研究課題の推進方策において大きな計画の変更はない。申請書に記載した原料低分子を合成しグラフェンナノリボン(GNR)化を目指したが、重合が低分子量でとどまり、長鎖化しなかった。そのため、申請書に記入した原料低分子の分子設計を見直し、幅の異なる新規GNRを目指した各原料低分子の設計・合成を行った。合成した原料低分子により幅の異なる3種類(テトラセン幅(3p)、アントラセン幅(3p+1)、ナフタレン幅(3p+2) p :整数)の極細線GNRの合成に成功した。今後の推進方策として申請書に記載した長鎖化しなかった原料低分子を見直し、改善が見込まれる類似原料低分子の合成を進めている。類似原料低分子の合成により、珀請書に記載した内容の実現が見込まれる。
空間行動と共存群集の進化:C.elegansをつかった実験進化生態学の開拓

本年度の研究で以下の成果を得た(1)大腸菌のパッチによる空間構造の変化、卵植え継ぎによる経代実験の確率、GFPによる遺伝型の計測など、C.elegansによる進化実験系を確立した。(2)17のストレインについて、増殖率、分散率などを調べた。また、密度依存増殖、密度依存分散についても基礎データを得た。多くのストレインではパッチから別のパッチに移動する分散率は低く、0.2以下であるが、いくつかのストレインで高い分散率を示すものがあった。これは主に、餌感知などに関わる突然変異個体であった。また、GFPを導入した野生型ストレインで密度依存分散の行動に異常がみられ、GFPの挿入された部位がこの行動に関係しているものと予測された(3)空間構造のある条件とない条件で、密度依存分散をする低分散型と密度依存分散をしない高分散型ストレインを競争させたところ、通常、空間構造がある条件では高分散が選択されるが、密度依存分散をする低分散型ストレインが10世代後に増加し、密度依存分散が空間構造のある条件で重要なことが示された(4)空間構造のある条件とない条件で、低分散型・低増殖率と高分散型・高増殖率のストレインを競争させた。通常、パッチが飽和環境にある場合は、空間構造がなし条件で低分散型ストレインが増加することが予測されたが、実験では、空間構造があるなしにかかわらず、高分散型・高増殖率が増加した。線虫では、分散率と増殖率の間でトレード・オフはみられず、パッチに侵入してからの増殖率が競争において重要であることが示された。本研究は、C.elegansを用い、線虫の空間行動の進化を実験的に確かめることを主な目的とした。本年度は、実験を開始するにあたって、線虫の変異体間でみられる分散率、繁殖率、生存率、密度依存性などの基礎データをとること、および、進化実験のための系代飼育の確立を行った。分散率は、C.elegansの16の異なる変異体を用い、個体の分散率の違いを調べた。分散率を調べるために、大腸菌のパッチを3cm離してつくり、線虫が他のパッチへ移動する率を調べた。その結果、変異体によって分散率が0から0.7まで異なり、CB1066株では、ほとんど分散しないのに対し、RC301株では、0.3から0.7という高い分散の率を示した。また、線虫は、大腸菌数の減少、密度の増加によって産卵数が減少するという明瞭な密度依存型の増殖を示した。また、それぞれの変異体のRO(繁殖率)を測定し、進化実験の基礎資料とした。さらに、卵をパッチに一定数植え継ぐことにより、安定した系代飼育が可能になることがわかり、進化実験が可能であることが明らかになった。現在、分散率の異なる2つの変異体を用い、パッチの質が変動する環境において、分散行動の進化が生じるかを実験中である。
高分子の物性多重検出用GPC/小角光散乱/反転パルス電気複屈折直結型装置の試作

高分子の重量平均分子量,分子量分布,電気光学・流体力学的等の諸特性を迅速かつ同時決定できるフロー型GPC/小角光散乱(LALLS)/反転パルス電気複屈折(RPEB)装置を試作した。GPC/LALLS部は,市販品(東ソ-(株),LS=8000S)に一部改良を加えて使用した。本試作研究の心臓部となるRPEB部は,我々が先にバッチ測定用に自作した装置を基本として,±13kv/cm,巾500μmsecの反転パルスが印加できるように改良を加えた。連続して送液されてくる試料溶液の複屈折測定用フローセルは,新たな工夫のもとに,設計・製作した。まず,使用できるセル面数の制限から,平行板電極のかわりに給・排液と電極を兼用する細孔ステンレス管を使用し,光学系へのセルの装着面を確保した。この手法は電極に給・排液が存在するため,電極の孔の近傍で電気力線に歪みをを生じるが,光路中央部にはあまり影響しないため,フローセルには極めて適した設計である。つぎに,電極管の開放部での試料溶液の再混合の問題は,中央に0.2mmの孔をもつ巾0.5mmの微小電極を製作し,セル容量をできるだけ小さく(0.2μl)することで回避した。また,当初計画したイオン強度調節用の連続脱イオン装置は,これを組み込むことにより溶液の再混合が生じ,その後のデータの信頼性を無くすことが判明したので,一時組み込みを中止しているが,今後も最適な脱イオン装置の開発を継続する。計測制御は,GPC/LALLS装置が市販品であり,自作の電気複屈折装置の計測制御を含めて1台のマイクロコンピュータで行うには,両装置のインターフェイス仕様の違いから困難であり,2台のコンピュータで制御することとした。両コンピュータは,サンプル注入時に出力される信号をトリガーとしてそれぞれ計測を開始する。以後,流速が一定であるため,データは一定時間ごとにトランジエント・コンバータを通して収集され,コンピュータに蓄えられる。電気複屈折データは,フロッピ-ディスク一枚に納まるデータ量に対応する11.5分の測定とした。以上で基本装置の開発・製作・組立が終わり,全装置系の性能検査,微調整及び必要箇所の再調整を完了した。現在,高分子溶液について基礎的データの収集を行い,物性研究を継続中である。研究経費中の設備備品費による光散乱光度計一式の購入手続きを完了し,装置(東ソ-社製:LS8000)を11月中に納入設置した。当研究室所有のGPCシステム(東ソ-社製)と接続し、現在、超音波切断カラギ-ナンの分子量とその分布曲線の研究(主たる担当者:上田)、三重鎖及び四重鎖合成核酸の分子量とその分布曲線の研究(主たる担当者:山岡)、同じく合成高分子電解質の研究(主たる担当者:落合、福留)が進展している。光散乱光度計(LALLS)から流出した試料溶液をそのまま連続的にステンレス細管に通し、電気複屈折装置内の平行平板電極内蔵微小測定セルに導くオンラインのフロー・セル並びに流出試料溶液のイオン強度調節用脱塩装置の組込システムを設計中であるが、予想外の困難に直面している。

(主たる担当者:上田、落合、沖崎)。校費によりトランジエント・コンバータ(理研電子:TCDE 4000)を購入し、電気複屈折信号の取込みを行うことに成功した。この目的のため、インターフェイスの製作及び設備費として購入したコンピュータ(日本電気:NEC9821Bf/U8W)によるデータ収集・処理回路の製作を完了し(主たる担当者:複留・山岡)、活用している。(4)オンライン計測用高速反転パルス電気複屈折測定装置の設計・製作に必要な部品の購入を完了した(主たる担当者:山岡)。本試験研究は平成6年度からの開始であり、装置の試作が研究課題の中心となっているため、必要設備の購入あるいは各種電気的及び光学的部品の発注に多くの時間を割いたが、GPC/LALLS装置、反転パルス電気複屈折装置はそれぞれ単体として使用可能である。システムの組立てと平行して、これらを用い基礎的データを収集し、2編の報文を公表した(裏面参照)。また、学会等でも口頭発表を行った。本試作研究の心臓部となるオンライン計測用反転パルス電気複屈折測定装置は,我々のグループが先にバッチ測定用に自作した装置を基本として,±13kv/cm,巾500μmsecの反転パルスが印加できるように改良を加えた。連続して送液されてくる試料溶液の複屈折測定用フローセルは,従来のバッチセルにはない測定中の試料溶液の同時給・排液機構を必要とし,新たな工夫のもとに,設計・製作した。まず,使用できるセル面数の制限から,平行板電極のかわりに給・排液と電極を兼用する細孔ステンレス管を使用し,光学系へのセルの装着面を確保した。この手法は電極に給・排液が存在するため,電極の孔の近傍で電気力線に歪みをを生ずるが,光路中央部にはあまり影響しないため,フローセルには極めて適した設計である。つぎに,電極間の開放部での試料溶液の再混合(溶質のサイズ順に溶離した試料流の乱れ)は,中央に0.2mmの孔をもつ巾0.5mmの微小電極を製作し,セル容量をできるだけ小さく(0.2μl)することで回避した。計測制御は,GPC/LALLS装置が市販品であり,自作の電気複屈折装置の計測制御を含めて1台のマイクロコンピュータで行うには,両装置のインターフェイス仕様の違いから困難であり,2台のコンピュータで制御することとした。両コンピュータは,サンプル注入時に出力される信号をトリガーとしてそれぞれ計測を開始する。以後,流速が一定であるため,データは一定時間ごとにトランジエント・コンバータを通して収集され,コンピュータに蓄えられる。電気複屈折データは,フロッピ-ディスク一枚に納まるデータ量に対応する11.5分の測定とした。当初計画したイオン強度調節用の連続脱イオン装置は,これを組み込むことにより溶液の再混合が生じ,その後のデータの信頼性を無くすことが判明したので,一時組み込みを中止しているが,今後も最適な脱イオン装置の開発を継続する。以上で基本装置の開発・製作・組立が終わり,全装置系の性能検査,微調整及び必要個所の再調整を完了した。現在,高分子溶液について基礎的データの収集を行い,物性研究を継続中である。
Transwellを利用した極性をもつ網膜色素上皮細胞の培養法の確立

H22年度は、ブタ網膜色素上皮細胞(RPE)の初代培養細胞を用いて、細胞極性をもつRPEの培養を試みた。ブタ眼球からRPEを単離して、12ウェル用transwell^<TM>上に細胞を播種(5×10^4個)し、1%ブタ血清含有特殊培地を用いて約1ヶ月間培養を行った。その結果、培養細胞はTight junction蛋白であるZO-1,oculudinやNa-K ATPaseの発現を認め、上皮細胞が持つバリア機能の指標である、transepithelial resistanceも150Ω・cm^2以上となった。電子顕微鏡検査でも微絨毛や基底陥入といったRPEの特徴的な構造を認めたことから、極性を持つブタRPEの培養を確立できたと考えた。これらの細胞を用いて、RPEで発現が高値であるVEGFやPEDFの分泌量をELISA法にて測定した。VEGFは、上皮側よりも基底膜側に約2.5倍高い発現を認め、一方PEDFは反対に上皮側に2倍強い発現を認めた。VEGF、PEDFの発現パターンは生体と同様で、サイトカイン産生の面でもより生体に類似していると考えられる。以上から、今回我々が確立してブタRPE極性細胞を利用することで、より正確な病態把握につながり、病因の解明につながると考えている。来年度は、代表的な眼疾患である糖尿病網膜症を念頭に置き、低酸素モデル、TNFa刺激を極性細胞に行って解析をする予定である。また、transwellを利用した研究における優位点は、極性を持っている事、transwellにより培養チャンバー内が上下2つのコンパートメントに分けられるため、RPE上皮面・基底面と分けての解析が可能なこと、さらにtranwell上での免疫染色が可能なため、極性を維持した状態で実験ができることが挙げられ、より生理的な状況での解析が可能である。そこで、炎症性サイトカインであるTNF-aをブタRPEに作用させた実験では、極性を持たないRPEと極性を持つRPEとではVEGF分泌における反応が異なること、またTNF-aではバリア機能を反映するTERやtight junction蛋白であるZO-1の発現が低下し、その作用にはp38MAPKが重要である事を確認した。すなわち、従来までのARPE-19を中心とする、極性を持たないRPE培養系を用いた場合と異なる結果或いは確認できなかった現象を再現できた。すなわち、より生体RPEに近い状態での解析が可能であった。今後これらの研究を継続して、網膜疾患のより正確な病態メカニズムの解析を行うことが可能であると考えている。