hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高選択的な局所化学療法を目指した肝臓表面適用二層型シート製剤の開発

抗癌薬5-FUおよび代謝阻害剤ギメラシルを封入した二層型の肝臓表面適用シート製剤の作製を試み、さらに製剤の最適化を目指して、添加剤の含有が5-FUの肝臓内動態に及ぼす影響を調べた。生体内分解性の基剤とヒドロキシプロピルセルロースを用いて二層型の肝臓表面適用シート製剤を作製し、肝臓局所での集積性を向上させることができた。また、本シート製剤の担癌マウスでの肝内分布を調べたところ、有意な肝局所集積性が見られた。病巣部位選択的な薬物送達を目的とした肝臓表面への直接投与という新規の薬物投与経路を提案してきた。肝臓表面投与法の製剤化に向け、片面からの薬物放出を可能にする二層型シート製剤を設計し、5-FU含有二層型シート製剤をラット肝臓表面に貼付し、シート製剤からの5-FU放出性および薬物動態を評価した。poly (lactic-co-glycolic acid)、hydroxypropyl cellulose (HPC)、5-FUをacetoneに溶解し、溶媒を除去することでHPC封入率の異なる(0, 2, 10%) 3種類の5-FU含有シート製剤を作製した。さらに、PLGAとHPCのみでシート製剤を作製し、5-FU含有シート製剤と重ね合わせることで、5-FU含有二層型シート製剤とした。作製したシート製剤を肝臓表面に貼付し、一定期間飼育した。4, 14, 28日経過後、開腹し、シート製剤の回収および肝臓の摘出を行った。摘出した肝臓は二層型シート製剤直下であるsite 1、site 1以外の外側左葉であるsite 2、その他の葉であるsite 3に分け、肝ホモジネートを調製した。5-FU含有二層型シート製剤による肝臓表面投与を行った結果、28日間に渡り5-FUを持続的に放出し、肝臓中5-FU濃度を維持することに成功した。28日間における5-FU放出率では、HPC 0%封入したシート製剤と比較し、HPC 2, 10%封入したシート製剤で上昇する傾向が見られた。そして5-FUの肝臓中濃度はHPC 2%を封入したシート製剤で、site 1の濃度が選択的に上昇する傾向が見られた。以上の結果は、肝臓表面投与法の臨床応用に向け、重要な知見であり、今後、5-FUの代謝分解を抑制するgimeracilを含有させた二層型シート製剤の5-FU放出速度の最適化および腫瘍モデル動物への抗腫瘍効果を評価していく。今年度の大きな目的である、抗癌薬を封入した均一な形状の徐放化に優れた、片面からの薬物放出を可能にする二層型シート製剤の作製およびその肝臓内動態の評価については、予定通り達成できた。しかしながら、5-FUの代謝分解を抑制するgimeracilのシート製剤への添加については、高分子添加物の種類や組成といった製剤処方の最適化に、当初予定していた以上の時間を費やした。また、肝癌モデル動物の作製に着手したものの、肝臓内の特定部位に癌を作製するための、癌細胞の播種数や投与方法などの予備的検討にやや時間を要している。肝臓表面投与法の製剤化に向け、本年度では、局所化学療法を目指した担癌マウスの肝臓表面へ適用可能な抗癌薬5-Fluorouracil(5-FU)含有シート製剤(以下、シート製剤)を作製し、シート製剤適用時の5-FU肝内分布を正常マウスの結果と比較した。シート製剤の作製では、poly (lactic-co-glycolic acid)(PLGA)と5-FUをacetoneに溶解後風乾し、acetoneを留去した。乾燥後、直径12 mmの半円に切り取りPLGAのみのシートと重ね合わせ、5-FU含有量の異なる6種類のシート製剤を作製した。担癌マウスの作製では、Hepa1-6細胞(マウス肝癌由来細胞株)をC57BL/6Jマウスの肝臓に接種し、1週間飼育した。5-FU肝内分布の評価では、シート製剤を正常マウスの肝臓表面あるいは担癌マウスの腫瘍表面に貼付した。貼付1週間後の5-FUの肝内濃度および血漿中濃度をHPLC-UV(266 nm)により定量した。シート製剤を5-FU/PLGA比が0.11以下で作製可能であった。5-FUのシート製剤からの放出プロファイルを速度論的に解析したところHiguchi式に従い、マトリックス型製剤であることが示唆された。5-FU肝内分布を評価したところ、正常マウスおよび担癌マウスのいずれにおいても、シート製剤適用部位に5-FUが集積し、血漿中への5-FUの移行も抑制できた。さらに、正常マウスと比較して、担癌マウスのシート製剤適用部位における5-FU濃度は12倍高くなった。以上の結果より、肝臓表面へ適用可能なシート製剤を用いて病巣部位局所的に抗癌薬を送達できる可能性が示された。今後、5-FUの代謝分解を抑制するgimeracilを含有させた二層型シート製剤の5-FU放出速度の最適化および腫瘍モデル動物への抗腫瘍効果を評価していく。今年度の大きな目的である、マウスの肝臓表面へ適用可能な、抗癌薬を封入した均一な形状の徐放化に優れた、片面からの薬物放出を可能にする二層型シート製剤の作製、および担癌モデル動物における肝臓内動態の評価については、予定通り達成できた。しかしながら、担癌モデル動物作製、特に腫瘍細胞の播種条件の最適化に、当初予定していた以上の時間を費やした。また安定して、肝臓内の特定部位に癌を作製し、シート製剤の効果を判定する条件確立の予備的検討にやや時間を要している。

例数が非常に少ない予備的な検証結果として、シート製剤の抗腫瘍効果が認められたが、抗癌薬のシート製剤への含有量を上げたり、分解酵素阻害薬を併用したりする工夫が必要であることが示唆された。病巣部位選択的な薬物送達を目的とした肝臓表面への直接投与という新規の薬物投与経路を提案してきた。本手法の従来法からの優位性を評価する上で、担癌モデルマウスを用い抗腫瘍効果を検証する必要がある。マウスに適用する製剤の設計には、マウス肝臓表面からの吸収速度の推定が不可欠である。そこで本年度では、マウスとラットにおいて肝臓表面投与時の薬物動態に差異があるか調べるため、マウスにおいて拡散セルを用いて肝臓表面に各種薬物を投与し、肝臓表面からの薬物吸収性と分布を評価した。マウスの肝臓に、拡散セルを貼付し、マーカー物質であるphenolsulfonphthalein(PSP)、抗がん薬5-fluorouracilあるいは分子量の異なるFITC-dextranを拡散セル内に滴下した。一定時間後に拡散セル内残存液を回収し、下大静脈から採血後、肝臓を採取した。拡散セル内残存率、血漿中および肝臓中薬物濃度を測定した。拡散セル内残存率の経時的変化より吸収速度定数kaを求め、見かけの透過係数Pappを算出した。マウス肝臓表面からも一次速度式に従い吸収され、良好な薬物吸収が認められた。マウスにおいても分子量の増大に伴い吸収率が低下する傾向があり、Pappと分子量の平方根の逆数には良好な相関が見られた。ラットの肝臓表面からは分子量7万の物質が吸収されたのに対し、マウスでは4万程度が吸収の限界であることが明らかとなった。マウス肝臓表面からのPappはラットより低くなる傾向を示し、特に分子量が小さい物質でその傾向が顕著であった。静脈内および腹腔内投与と比較し、マウスにおいても投与部位に選択的で持続的なPSPの集積が認められた。したがって、マウスの肝臓表面投与において、特に低分子の薬物を適用する際は、ラットにおける吸収性との違いに留意する必要性が明らかとなり、今後の製剤設計を進める上で有益な知見が得られた。抗癌薬5-FUおよび代謝阻害剤ギメラシルを封入した二層型の肝臓表面適用シート製剤の作製を試み、さらに製剤の最適化を目指して、添加剤の含有が5-FUの肝臓内動態に及ぼす影響を調べた。生体内分解性の基剤とヒドロキシプロピルセルロースを用いて二層型の肝臓表面適用シート製剤を作製し、肝臓局所での集積性を向上させることができた。また、本シート製剤の担癌マウスでの肝内分布を調べたところ、有意な肝局所集積性が見られた。均一な形状の片面からの薬物放出を可能にする5-FU含有二層型シート製剤の作製方法を確立し、その肝臓内動態を検討し、腹腔内における局所送達性に優れるDDS製剤であることを確認することができた。しかしながら、5-FUの肝臓内濃度をさらに高めるために、5-FUの代謝分解を抑制する代謝阻害剤の添加が有効であるため、代謝阻害剤を含有させた二層型シート製剤の最適な製剤処方を検討する。作製した二層型シート製剤の腹腔内でのシート製剤自体の安定性、付着性、および臓器傷害性を十分に調べ、腹腔内での適切な滞留性が得られる添加剤濃度を決定する。このような代謝阻害剤含有二層型シート製剤の最適化が完了次第、肝癌モデル動物における二層型シート製剤の薬物吸収・分布実験、および二層型シート製剤の肝臓表面における有効性を評価する準備を進めていく。
可視光有機合成を実現する金属ナノ粒子／半導体ヘテロ相界面光触媒

金属ナノ粒子/半導体ヘテロ相界面光触媒により、ナノ粒子のプラズモン光吸収に基づいてファインケミカルを合成する新技術を開発する。本研究では、強接合ヘテロ相界面触媒を開発し、ホットエレクトロンの高効率生成を実現する。さらに、コアシェルナノ粒子触媒を開発して可視光応答性の向上を図るほか、合金ナノ粒子触媒の開発によりナノ粒子表面に酸化サイトおよび還元サイトを形成させ、様々な物質変換へ展開する。これらの検討を通して、可視光照射下で有機合成を進める新光触媒を開発する。平成30年度は、強接合ヘテロ相界面触媒の開発に取り組んだ。Auナノ粒子固定化TiO2(Au/TiO2)プラズモン光触媒に可視光を照射すると、Auナノ粒子上で光励起したホットエレクトロンがTiO2の伝導帯に注入されて電荷分離し、酸化・還元反応を進める。活性のさらなる向上を目的とし、ルイス酸性の5価のNb5+酸化物をAu-TiO2界面にドープしたAu/Nb5+/TiO2光触媒を合成した。その結果、本触媒は可視光照射下で、Au/TiO2よりも極めて高い効率でアルコールの酸素酸化反応を進めることを見出した。Au/Nb5+/TiO2触媒の高活性発現は、Auナノ粒子上で生成したホットエレクトロンが、Au-TiO2間の電子移動を阻害するショットキーバリアを通り抜ける「量子トンネル効果」により効率よく注入されることによる。Au/Nb5+/TiO2では、Au-TiO2界面に存在するルイス酸性の単核Nb5+酸化物により、界面近傍のTiO2は強い正電荷を帯びる。この正電荷がAuナノ粒子の負電荷を相殺することにより狭いショットキーバリアを形成し、量子トンネル効果による電子注入を促進することを種々の分光分析により明らかにした。Nb5+をドープしたAu/Nb5+/TiO2により可視光酸素酸化反応を効率よく進行させることが可能であることを明らかにした。半導体酸化物上でのナノ粒子の機能に関する知見が蓄積されてきており、今後の研究課題を順調にクリアできる感触を得ている。それゆえ、区分2に該当すると判断できる。これまでの研究により、Pt、AuおよびPdナノ粒子の光触媒特性を明らかにしてきたため、これらの知見は多く蓄積されてきている。特に、Au/TiO2界面へのルイス酸点のドープにより高い活性が発現することを明らかにしている。このような性質をうまく使うことにより、新たな性質を発現する可能性が極めて高い。これらの新規光触媒に関する基礎解析を行った上、物質変換反応への展開を図る。
粒界電子構造制御による高温用セラミックスの開発

本研究は、粒界量子構造という新規のパラメータを制御することによって耐熱セラミックスの開発を目指している。今年度は本研究の締めくくりとして、高純度アルミナおよび微量陽イオン添加アルミナの高温クリープ試験を行い、量子構造計算に基づく耐熱性向上のための最適ドーパントを見出す実験を行った。ドーパントの選択は、分子軌道計算によって予想されたものと、比較のために古典的パラメータである原子価及びイオン半径を指標として行った。その結果、アルミニウムイオンと同じ形式電価である3価の陽イオンが最もクリープ特性向上の効果が大きかったが、その他の価数を有する陽イオンについては、クリープ特性を向上させるものと、逆に劣化させるものとに分かれた。現有の高分解能電子顕微鏡やEELSスペクトルの分析から、こうしたドーパント効果は通常の原子サイズ効果や価数では整理できず、粒界における電子状態の変化に起因することを明らかにした。特に、空孔形成に伴う原子間結合力の変化は顕著であり、ドーパント効果の大きな要因となっている。実際、第一原理計算による分子軌道法計算の結果もこれを支持しており、換言すれば、添加原始の原子軌道エネルギーと、空孔形成による結合エネルギーの変化とのバランスが高温機械的性質を決定する重要なパラメータとなっていると言える。こうした知見は、従来経験的に添加物・添加量を選択しセラミックスを合成する手法に対し、より理論的な材料設計指針をもたらすものであると期待される。今年度得られた知見に関しては日仏セミナーおよびRex&GG国際会議等で研究代表者が口頭発表すると共に、学術論文として国際学会誌に発表された。高純度および種々のドーパントを添加したAl_2O_3系燃結体を作製し,高温における機械的特性を機会試験により検証した.その結果,Al_2O_3系セラミックス耐熱性改善には,イオン化数3価を取るランタノイド元素の微量添加が有効であることを見出した.一方,高分解能電子顕微鏡を利用した粒界構造解析と,電子顕微鏡に付属の電子エネルギー損失分光法(EELS)による分析結果から,ドーパントの粒界偏析に伴い,粒界におけるAl^<3+>イオン周辺の原子間化学結合状態が変化していることを突き止めた.さらに,DV-Xα法による第一原理に基づく分子軌道計算を行い,状態密度(DOS)を調べることによってEELSで検出された化学結合状態の変化を解析することに成功した.この化学結合状態の変化は,粒界に於ける陽イオン_陰イオン間の電子状態の変化に起因するものであり,イオン間に働くクーロン力等の化学結合力の上昇を伴うことが判明した.以上のように本年度は,Al_2O_3セラミックスの耐熱性というマクロな現象が,粒界微細構造と密接に関連していることを見出した.この結果は,耐熱セラミックス材料開発の理論的指針を得る上で極めて重要な知見である.種々のドーパントを添加したAl_2O_3をはじめとする酸化物系セラミックス多結晶体を作製し、高温機械的特性を高温圧縮ならびに引張り試験により検証した。その結果、Al_2O_3系セラミックス耐熱性改善には,イオン化数3価を取るランタノイド元素の微量添加が有効であり、4価や2価を取るドーパントは必ずしも特性向上に寄与しないことを見出した。一方、高分解能電子顕微鏡に付属の電子エネルギー損失分光法(EELS)を利用して、粒界に於ける量子構造の解析を試みた。その結果、ドーパントの粒界偏析に伴うAl^<3+>イオン周辺の原子間化学結合状態の変化を検出することに成功した。さらに粒界電子構造を調べるためにDV-Xα法による第一原理に基づく分子軌道計算を行ったところ、EELSで測定された化学結合状態の変化は、ドーパント偏析に伴う状態密度(DOS)の変化により説明された。この化学結合状態の変化は,粒界に於ける陽イオン-陰イオン間の電子状態の変化に起因するものであり、イオン間に働くクーロン力等の化学結合力の上昇を伴うことが判明した。

この解析手法は、種々のドーパントに対しても適用でき、例えば空孔の効果を検証することも可能である。以上の研究成果は、Al_2O_3に代表される酸化物系セラミックスの耐熱性というマクロな現象を粒界量子構造と密接に関連づけるものであり、高温用セラミックス開発の理論的指針を得る上で極めて重要な知見である。今年度は本研究の締めくくりとして、高純度アルミナの高温クリーブ試験を行い、耐熱性向上のための最適ドーパントを見出す実験を行った。ドーパントの選択は、古典的パラメータである原子価及びイオン半径を指標として行った。その結果、アルミニウムイオンと同じ形式電価である3価の陽イオンが最もクリープ特性向上の効果が大きかったが、その他の価数を有する陽イオンについては、クリーブ特性を向上させるものと、逆に劣化させるものとに分かれた。現有の高分解能電子顕微鏡やEELSスペクトルの分析から、こうしたドーパント効果は通常の原子サイズ効果や価数では整理できず、粒界における電子状態の変化に起因することを明らかにした。特に、空孔形成に伴う原子間結合力の変化は顕著であり、ドーパント効果の大きな要因となっている。こうした知見は、従来経験的に添加物・添加量を選択しセラミックスを合成する手法に対し、より理論的な材料設計指針をもたらすものであると期待される。今年度得られた知見に関しては日仏セミナーおよびRex&GG国際会議等で研究代表者が口頭発表すると共に、学術論文として国際学会誌に発表された。
動脈内皮細胞の物質透過性に関するマイクロバイオメカニクス的研究

動脈硬化をはじめとする血管病変は、太い動脈において特定な部位に生ずるため、血液流との関連が指摘され、とくに血液と直接接触する動脈内皮細胞の物質透過性が壁面せん断力によって影響を受ける事実が最近知られてきた。そこで本研究では、内皮細胞及び血管壁内の物質輸送機能が、血流によってどのような影響を受けるかを調べるため、培養内皮細胞における酸素および高分子物質の透過の様子を微小酸素電極および共焦点レーザー顕微鏡によって調べ、細胞レベルに関するマイクロバイオメカニクス的性質及び血管病変に関する病態生理的性質を明らかにする事を目的とする。培養内皮細胞に流れによるせん断応力を負荷する装置を製作ひ、流露内を培養液で満たしかん流させて内皮細胞にせん断応力を負荷した。そこで、流れの負荷に高分子物質アルブミンの取り込みを、TRITCの色素をラベルして、色素量を共焦点顕微鏡で観測し、取り込み量を評価した。その結果、取り込み量はせん断応力の大きさによって変化し、低せん断では,流れによってアルブミン取り込み量が増加しているが、高せん断応力になると、逆に取り込み量が下がるという事実が得られた。このような結果は、これまで例がなく、世界的な論争になっている動脈硬化病変の低せん断説を裏付けるものであり、極めて重要な知見である。さらに生体組織にあける酸素濃度を微小電極で測定し、微細血管内外の酸素濃度分布の様子から生体組織における酸素輸送の新しい形態が観測できた。以上、極めて独創的な知見が得られ、バイオメカニクスや臨床生理学の分野に大きな貢献をしたと思われる。動脈硬化をはじめとする血管病変は、太い動脈において特定な部位に生ずるため、血液流との関連が指摘され、とくに血液と直接接触する動脈内皮細胞の物質透過性が壁面せん断応力によって影響を受ける事実が最近知られて来た。内皮細胞は、血流に対する力学的適応によって形状を変えたり、カルシュウムなどの物質を分泌するなどの機能を持つことが最近の研究で明らかになっている。そこで本研究では、内皮細胞及び血管壁内の物質輸送機能が、血流によってどのような影響を受けるかを調べるため、培養内皮細胞における酸素および高分子物質の透過の様子を微小酸素電極および共焦点レーザー顕微鏡によって調べた。単細胞及びコンフルエント状の細胞では共に細胞内を透過する経路が存在することが共焦点顕微鏡によって明らかになった。さらにリバース型(陽極と陰極とが一体となっている同軸形の微小電極)の微小電極により、ラット挙睾筋細動静脈内外の酸素分圧を測定し、組織における酸素輸送に関して検討を加えた。
赤核脊髄路細胞における変性と修復の分子機構に関する研究

運動系の細胞の変性に対する修復には様々な機序が考えらるが,再生能力の非常に乏しい脳内の神経細胞の場合,シナプス発芽が非常に重要な役割を果たしていると考えられる.本研究の目的は,入力線維の損傷によって赤核脊髄細胞に起るシナプス発芽の分子機構を明らかにすることである.具体的方法としては主としてモノクローナル抗体と遺伝子組み換えの技術を用いて発芽制御因子の同定を試みる.赤核脊髄路細胞における発芽は,単にその変性に対する修復機構として現象面における理解が進んでいるばかりではなく,運動学習の基礎となっている可能性もあり,本研究によって運動系の制御・調節に関する理解が一段と深まることが期待される.上記目的達成のため,本年度は赤核に生じた変性の結果生ずるシナプス結合の再構成に関して詳細な解析をおこなった.幼弱期のネコの大脳皮質の一側性の損傷によって,正常では殆ど存在しない交差性の大脳-赤核投射が出現することについては既に報告したが,本研究ではまず異常な交差性投射についても体部位局在が存在するか否かを皮質の様々な部位にレクチン(PHA-L)注入することによって調べた.次に標的細胞である赤核脊髄路細胞をその軸索を切断することによって変性させた時に交差性投射の出現に変化が起るか否かを確かめた.その結果,皮質の損傷によって生ずる交差性投射にも体部位局在があること及び,赤核脊髄路細胞の変性によって交差性線維の出現が抑えられることが判明した.これらの事実は,異常な交差性投射が出現する際にも,投射の部位局在を定めるような分子機構が存在すること及び,交差性投射の形成には標的細胞に出現する分子が何らかの役割を果たしていることを示唆する.運動系の細胞の変性に対する修復には様々な機序が考えらるが,再生能力の非常に乏しい脳内の神経細胞の場合,シナプス発芽が非常に重要な役割を果たしていると考えられる.本研究の目的は,入力線維の損傷によって赤核脊髄細胞に起るシナプス発芽の分子機構を明らかにすることである.具体的方法としては主としてモノクローナル抗体と遺伝子組み換えの技術を用いて発芽制御因子の同定を試みる.赤核脊髄路細胞における発芽は,単にその変性に対する修復機構として現象面における理解が進んでいるばかりではなく,運動学習の基礎となっている可能性もあり,本研究によって運動系の制御・調節に関する理解が一段と深まることが期待される.上記目的達成のため,本年度は赤核に生じた変性の結果生ずるシナプス結合の再構成に関して詳細な解析をおこなった.幼弱期のネコの大脳皮質の一側性の損傷によって,正常では殆ど存在しない交差性の大脳-赤核投射が出現することについては既に報告したが,本研究ではまず異常な交差性投射についても体部位局在が存在するか否かを皮質の様々な部位にレクチン(PHA-L)注入することによって調べた.次に標的細胞である赤核脊髄路細胞をその軸索を切断することによって変性させた時に交差性投射の出現に変化が起るか否かを確かめた.その結果,皮質の損傷によって生ずる交差性投射にも体部位局在があること及び,赤核脊髄路細胞の変性によって交差性線維の出現が抑えられることが判明した.これらの事実は,異常な交差性投射が出現する際にも,投射の部位局在を定めるような分子機構が存在すること及び,交差性投射の形成には標的細胞に出現する分子が何らかの役割を果たしていることを示唆する.
RNA分解型アンチセンス核酸を用いた新たなウイルス治療法の開発

核酸医薬はRNA分解をはじめスプライシング制御およびタンパク質翻訳阻害などRNAに特異的に作用するため、新たな創薬シーズとして期待されている。筋ジストロフィーや脊髄性筋萎縮症などの遺伝性神経・筋疾患では勢力的に核酸医薬の開発が進んでいる一方、RNAを本体とするウイルスに対する治療学的効果は十分に検討されていない。そこで本研究では、我が国をはじめアジア諸国で問題となっている致死的な日本脳炎ウイルス(JEV)をモデルとして、ゲノム自体がRNAであるプラス一本鎖RNAウイルスに治療効果を示すRNA分解型アンチセンス核酸の開発を目的とした。今年度は実験計画に従いウイルスRNAに効果的に結合し、分解作用を示すアンチセンス核酸の設計および核酸医薬の抗ウイルス作用を評価するためのin vitroスクリーニング系の確立を試みた。JEV標準株および野外株で保存性の高い機能的ドメインを含むゲノム領域およびRNA二次構造のホモロジー解析、RNA分解作用に重要な核酸の化学修飾部位/組成を解析することで、JEVゲノムRNAに特異的に結合することが予測されるアンチセンス核酸配列を複数決定した。設計されたアンチセンス核酸のウイルス増殖抑制効果は、標的RNA配列の分解効率および感染性ウイルス粒子の定量により現在解析中である。本研究をさらに発展させた研究計画が2018年度の若手研究(課題番号18K14595)に採択されたため、今後はJEVゲノムRNA分解能が最も高いアンチセンス核酸配列をin vitroスクリーニングにより最適化し、RNA分解メカニズムと共にマウス生体を用いた感染実験によってその治療効果および薬理動態、安全性を調べる予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
サルモネラcpxR-A遺伝子の宿主細胞侵入能及び病原性への関与の検討

ShigellaのipaBCD遺伝子産物は菌の上皮細胞への侵入能を直接担う。また、このipaBCD遺伝子はvirF、invEという2つの制御遺伝子によって正に調節され、さらに、virFの発現は染色体上にコードされる2成分制御系遺伝子cpxR-cpxAによってpH依存的に制御される。Salmonellaにおいて侵入能を担うsipBCDはShigella ipaBCDに相同性を示し、それに対する2つの正の発現制御遺伝子hilA、invFが存在するという制御様式も共通点がある。このような背景から、Shigella virFとSalmonella hilAの発現を制御する因子も共通している可能性がある。これを基に、本研究ではSalmonellaにおけるcpxR-cpxA相同遺伝子のhilA、invFやsipBCD遺伝子発現、ひいては総体的な病原性への関与を検討、解明することを目的とした。SalmonellaのcpxR-cpxA相同遺伝子の存在確認後、それらをクローニングし、そのクローンを用いてSalmonellaのcpxR,cpxAそれぞれの遺伝子破壊株を作製した。これら野生株、及び各破壊株で、1)hilA発現レベル、2)SipC産物(タンパク)量、3)哺乳類培養細胞への侵入能、を培養pHを変化させて測定、比較した。結果、cpxA変異株においてpH6.0培養後にいずれも大きな低下が見られた。pH8.0培養後はhilA発現レベルで若干の低下が見られた以外、野生株との差は検出できなかった。cpxR変異株では野生株との差異は検出できなかった。野生株、cpxR変異株ではいずれの項目もpHによる変化がなかった。以上より、cpxA遺伝子は、pH6.0での培養条件でのhilA発現、従ってその制御下にあるsipBCD発現、最終的には細胞侵入能の活性化に強く関与することが分かった。cpxR-cpxAはペアーを成す2成分制御系遺伝子であるが、この制御系でセンサーであるCpxAと連絡し、ターゲット遺伝子の転写を行なうレギュレーターとしてCpxR以外のものが機能すると考えられ、それを同定することが次なる課題となった。SalmonellaとShigellaの腸管上皮細胞への侵入性発現機構には類似点が多い。Shigellaの場合、ipaBCD遺伝子産物が菌の上皮細胞への侵入脳を直接担う。ipaBCD遺伝子はvirF,invEという2つの制御遺伝子によって正に調節されることが明らかになっている。さらに、virFの発現はpHによる制御を受け、それには2成分制御系遺伝子cpxR-cpxAが関与することが報告されている。Salmonellaにおいて侵入能を担うsspBCDはipaBCDに相同性を示す。また、sspBCD遺伝子の発現制御遺伝子hilA,invFについて、invFはShigellaのvirFと相同性を示すことや、hilA発現はvirF発現同様、pHによる制御を受けること等が明らかにされた。このような背景から、両菌種間の侵入性遺伝子を環境条件依存的に活性化する因子も共通である可能性がある。本研究ではSalmonellaにおけるcpxR-cpxA相同遺伝子の探索、及びその遺伝子のhilA、sspBCD遺伝子発現や、総体的病原性への関与を検討することを目的とした。この目的のため、まずSalmonellaのcpxR-cpxAの探索を試み、当該遺伝子の欠損株を作製することとした。結果、先ず、SalmonellaがcpxR-cpxA相同遺伝子を持つことを大腸菌cpxR-cpxAをプローブとしたSouthern hybridizationで確認した。次いで、SalmonellaのcpxR-cpxA領域のクローニングを大腸菌cpxR変異株の表現型(クローン化した赤痢菌virFを発現できない)を相補するクローンを選択する方法で行った。クローン化された約6kbのSalI断片には、cpxR-cpxAオペロンと、大腸菌で報告されているcpxP遺伝子が完全に含まれていることが塩基配列決定によってわかった。この断片を材料に、Salmonella染色体との相同組み換えにより、cpxR,cpxAそれぞれの欠損株を作製した。今後、得られた、変異株と野生株について、前述の各表現型について比較を行う予定である。

結果、cpxA変異株においてpH6.0培養後にいずれも大きな低下が見られた。pH8.0培養後はhilA発現レベルで若干の低下が見られた以外、野生株との差は検出できなかった。cpxR変異株では野生株との差異は検出できなかった。野生株、cpxR変異株ではいずれの項目もpHによる変化がなかった。以上より、cpxA遺伝子は、pH6.0での培養条件でのhilA発現、従ってその制御下にあるsipBCD発現、最終的には細胞侵入能の活性化に強く関与することが分かった。cpxR-cpxAはペアーを成す2成分制御系遺伝子であるが、この制御系でセンサーであるCpxAと連絡し、ターゲット遺伝子の転写を行なうレギュレーターとしてCpxR以外のものが機能すると考えられ、それを同定することが次なる課題となった。
イギリスにおけるタウンセンターの小売商業の再生に関する地理学的研究

1990年代以降、イギリスでは、オフセンターでのスーパーストア、ショッピングセンターなどの小売商業の開発を規制しつつ、既存の小売商業地区の存続・維持・強化を図る地域政策が採られ(PPG6)、タウンセンターを筆頭として、小売商業地区の再生が大きな地域的課題となってきている。本研究では、こうした政策が実施されてきた背景とタウンセンター再生政策の実態および実際のタウンセンター等の小売商業地区の地域的動向について、検討した。その結果、(1)オフセンターでの各種の大規模小売商業施設の進展によって、小売商業地区ことに小規模小売商業地区の停滞・衰退化が進展してきたこと、(2)タウンセンター等の小売商業地区の再生は、当該商業地区の規模や地域事情によって多様であるが、その再生事業はフードデザート問題を抱える一部の小規模小売商業地区では、近隣再生事業の一環として小売商業地区の再生が行われているのに対して、タウンセンターないしシティセンターでは、全国的に広くタウンセンターの再生プランの策定・実施とタウンセンターマネージメントの導入によって、その再生がハード・ソフト両面から実施されてきていること、(3)具体的なタウンセンターの再生事業は、交通政策・土地利用政策などと一体となった計画が実施され、その再生が良好な結果を生んできているタウンセンターがみられる一方で、十分な成果をみていないタウンセンターも存在していること、(4)またタウンセンターの再生事業の進展によって、当該タウンセンターの商圏内の小規模小売商業地区の衰退を早めることになるケースもみられるなど、地域の小売商業をめぐる新たな問題も生まれてきていること、などの実態が明らかとなった。本年度は研究課題に関して、関係文献および地域政策に関する行政資料の分析を実施した。まず最初に、1990年代以降のイギリスにおける小売商業の地域政策の動向について検討した。その結果、(1)1980年代に、サッチャー政権下で進められた小売商業の開発に関する規制緩和によって、タウンセンターを筆頭とする既存の小売商業地区の停滞・衰退が進んできたこと、(2)1990年代になり、地球温暖化防止を目的とした自動車交通量の削減が重要な政治的課題となり、そのため郊外化を抑止して、公共交通を重視したコンパクトな都市の形成を促す地域政策への転換の必要性がクローズアップされてきたこと、などにより、1990年代の小売商業の地域政策は郊外地域などオフセンターでの小売商業開発を抑制し、既存の小売商業地区の再生(活性化)を促進する方向へと転換してきたことが明らかになった〔研究論文発表、伊東(2002)〕。次いで、1990年代以降の小売商業の開発動向とタウンセンターの再生に関する政策・戦略について、検討した。その結果、(1)1990年代の地域政策は1994年前後から機能し始め、1990年代中葉以降オフセンターでの小売商業開発が減少し、タウンセンター等の既存の小売商業地区の再生計画・事業が進展してきたこと、(2)タウンセンター再生事業の一つの柱となるタウンセンターマネージメント戦略が全国的に立案・実行されてきているが、その実態や効果について論議するには事例研究の蓄積が必要であること、(3)1990年代以降のタウンセンターの推移については具体的な地域における消費者購買行動や小売業の立地に関する動向を検討する必要があること、などが明らかになった。以上の結果、次年度以降の研究課題は主に上記の(2)および(3)となることが判明した。本年度は、研究課題に関して、関係文献の整理とイギリスでの事例調査を実施し、リーズ市、クロイドン市、カージフ市等の関係役所機関などでタウンセンターの動向と再生に関する資料の収集を行った。まず、タウンセンターに関する全国的な政策動向とタウンセンターマネージメント事業の展開と実態について検討した。その結果、(1)タウンセンターを含む既存の小売商業地区の再生事業が1990年代前半から全国的に展開し、今日ではそれが小売商業開発の焦点となってきたこと、(2)その内容は小売商業地区の規模によって、シティセンターないし大きな規模のタウンセンターを対象にしたタウンセンターマネージメント事業とディストリクトセンターないしマーケットタウンを対象にした小売商業環境の再生事業に大別され、それぞれがその目的・事業内容・事業主体をことにしていること、などが明らかとなった。

現在、現地調査を実施してきたタウンセンターの再生に関するイギリス都市の事例について検討している。現時点では、(1)タウンセンターの現状と課題は、1960年代以降の当該タウンセンターで展開してきた各種の(再)開発事業や小売商業の地域政策を反映するものであり、今日のタウンセンター再生事業はこうしたタウンセンターの歴史的展開過程のなかで、位置づけと評価を行うことが必要となること、(2)タウンセンターマネージメン主体の違いによってその事業内容等がことなり、さらにディストリクトセンターないしマーケットタウンを対象にした再生事業はスーパーストア等の大型食料品店舗の誘致を中心に展開してきていること、などが判明した。本年度は、前年度までおよび本年度に収集した関連資料の整理・検討を行い、研究成果の取りまとめ作業を実施した。タウンセンターの再生は、小売商業地区のネットワークの存続・強化をめざした1990年代以降の小売商業の地域政策(PPG6)によるものであるため、その政策・施策の内実について検討した。その結果、小売商業地区の規模によって、小売商業地区の再生をめぐる政策課題や手法ないし再生プランが異なることが明らかとなった。そこで、小規模タウンセンターを含む小規模小売商業地区の動向とその再生課題・再生事業の実態(伊東、2004)と小売商業地区のネットワークの頂点に位置する大規模タウンセンターないしシティセンターの再生に関する実態(伊東、,2004論文発表予定))について検討した。小規模小売商業地区の再生は、とりわけフードデザート問題が顕在化してきている地域において、近隣再生事業の一環として進展してきており、スーパーマーケット・スーパーストアを核とした小売商業の再生事業が中心であることなどの実態を明らかにした。一方、大規模タウンセンターないしシティセンターの再生は、タウンセンターマネージメントの導入とタウンセンター再生プランの策定・実施を柱として、全国的に広く実施されてきているが、具体的な事例調査から、個々の地域によって、その再生事業の内容と成果は大きく相違している。また、タウンセンター・シティセンターの動向は、近年の事業展開もさることながら、従来からの当該地域での小売商業政策・小売商業開発の蓄積が大きく規定していることも明らかとなった。
腫瘍透過ペプチド修飾ホウ素リポソームを用いたがん細胞選択的新規中性子捕捉剤の開発

これまでの研究にてリポソームへのホウ素化合物内包効率を上げるとともに、表面を細胞透過性ペプチドにて修飾を行うことでリポソームが腫瘍選択的に取り込まれるようにデザインした。しかし細胞透過性ペプチドの腫瘍選択性がホウ素中性子捕捉療法の要件を満たすほど高くはないことがわかった。そこでペプチド配列の立体構造の不安定性から腫瘍選択性に問題が生じていることを考え、ペプチド配列を再考することとした。腫瘍組織の中で細胞それぞれは不均一であることが知られ、薬物送達のために一定の受容体や表面マーカーを標的分子として利用しても、それら標的分子を発現していない細胞には効果が見込めず、治療後再発の原因となる。ホウ素薬剤がミクロレベルで取り込まれていない場合でも、腫瘍環境を治療の標的とするホウ素薬剤を併用することで、中性子照射により腫瘍細胞自体と腫瘍環境を同時に捕捉反応により攻撃し、抗腫瘍効果の増強につながる可能性がある。そこで今回、腫瘍組織に普遍的に存在し腫瘍組織の維持・増殖に欠かせない腫瘍血管を標的とするペプチド配列を用いることとした。腫瘍血管の標的分子としてIntegrin αvβ3に着目し、Integrin αvβ3に選択的に結合することが知られているcyclic RGDmotifを用いることとした。cyclic RGDmotifをペプチド鎖の末端に付与したシステインのおよびマレイミド脂質とのマイケル付加反応を用いてpost-conjugate法によりリポソーム表面を修飾し、腫瘍組織および周辺環境へのin vivo取り込みの評価を行った。また、ホウ素薬剤の薬物動態を調べる研究を皮下腫瘍を植え込んだモデルマウスを用いて行い、投与方法の違いによる各正常組織および腫瘍組織のホウ素薬剤集積の変化と中性子照射や事前濃度評価のタイミングの検討を行った。これらの結果を英文誌に投稿し、採択された。28年度が最終年度であるため、記入しない。リポソームに内包させるホウ素製剤としてヒトに対しても使用実績のある1分子あたり12個のホウ素原子を持つBSHを使用したが、BSHと使用を予定していたペプチド配列が相互作用を起こし凝集してリポソーム化後にうまく分散しないことが分かった。凝集の原因の一つとしてBSHの電荷が考えられたため、相互作用を低減させるためにアニオンであるBSHに対してカウンターカチオンとしてポリアミンを用いてBSHの電荷の影響を減らし、BSHとポリアミンを結合させた状態でリポソームに内包させることでペプチドとの相互作用を減弱させた。リポソーム表面のペプチドの修飾は、ペプチドC末にシステインをつけ、システインと脂質化ポリエチレングリコール-マレイミドとを化学的に結合させてペプチド誘導体としたものを用いて、post insertion法、逆相蒸発法によりそれぞれ行った。作成したリポソーム濃度を振って腫瘍細胞に投与し、表面をペプチドにて修飾していないホウ素内包リポソームに比べて、ペプチド修飾を行ったホウ素内包リポソームがどれくらい取り込み効率が増強されるかを調べたところ、ペプチド修飾を施したリポソームは最大1.7倍の取り込み増強効果を認めた。ペプチド配列の腫瘍特異性を確かめるため、ペプチド配列のC末にシステインをつけ、マレイミドを介してFITCを結合させ、FITC化ペプチドを様々な腫瘍細胞および線維芽細胞に投与しペプチド取り込みの腫瘍選択制を評価した。その結果、腫瘍細胞への取り込みだけでなく線維芽細胞にも腫瘍細胞とほぼ同等の取り込みを認め、ペプチドの修飾の方法などによっては腫瘍特異性に問題が生じる可能性が示唆された。今後用いるペプチド配列・立体構造を変化させることにより腫瘍特異性を損なわずにペプチド修飾リポソームによる取り込みをさらに増強させることができるよう検討していく。前年度までで作成したリポソームのin vitroでの評価は終えており、今度はin vivoでの腫瘍選択性を調べるために皮下腫瘍埋め込みヌードマウスおよび癌細胞へ結合する膜透過性ペプチドにより表面を修飾したリポソームを作成し動物実験を行った。マウスへそれぞれペプチド非修飾リポソーム、ペプチド修飾リポソームを投与し、正常組織及び腫瘍へのホウ素原子の集積の程度を高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法を用いて測定した。結果はペプチド修飾した効果は明らかには認められず、ペプチド修飾したリポソームも非修飾リポソームとほぼ同程度の取り込みしか認められなかった。in vitroでもin vivoでも腫瘍選択性または腫瘍へのペプチドの膜透過性に問題があることがわかったため、リガンドとして用いているペプチド配列と腫瘍が特異的な受容体を介して結合しうるかを調べた。化学修飾をした磁化ビーズ表面に目的のペプチドを結合させ、ビーズと腫瘍細胞抽出液と混ぜて生理的条件にて結合させた後、磁気分離・洗浄・タンパク分離を行い、ペプチドの受容体の候補たるタンパク質の同定を試みた。しかし、結果は非常に多くのタンパク質が非特異的に同定され、想定していたペプチド配列自体のリガンドとしての性質に問題があることがわかった。原因として立体構造の不安定性が考えられ、ペプチド配列の再考や立体構造を加味したリガンドの設計をする必要があることがわかった。当初まずは磁気分離による方法にて使用する細胞透過性ペプチドの標的を確定し、課題となっていた腫瘍選択性の問題がリポソーム表面へ修飾する際の立体構造の制限の問題なのか、リガンドと標的受容体の親和性または特異性の問題なのかを解明した後に、リガンドペプチドの細胞透過性と標的受容体との相互作用の核となるアミノ酸配列を同定し、アミノ酸配列のさらなる改善を行おうと計画していた。今年度の研究にて、リガンドと標的受容体の特異性の問題であることがわかり、そもそものペプチド配列を見直す必要があることがわかった。

従って、次に予定していた細胞透過性と標的受容体との相互作用の核となるアミノ酸配列の同定と、それらの解析をもとにしたより細胞透過効果の高いペプチド構造の検討には至らなかった。本研究の途中、ペプチド配列と腫瘍細胞のタンパク質との相互作用を解析する実験において、タンパク質・ペプチドと受容体の競合実験から、コントロールとして用いていたこれまで用いられていたホウ素薬剤とその受容体との関係を、ホウ素薬剤の類似体によってあらかじめホウ素薬剤投与前に競合阻害させることでホウ素薬剤の正常細胞と腫瘍細胞の取り込みに差をつけられることが思いもかけずにわかり、こちらに関しては発見した現象を英文誌に採択された。予定通りの実験結果がでないことが多く想定外の結果であったが、実験の過程での発見をまとめられたことはひとつ満足のいくものだった。これまでの研究にてリポソームへのホウ素化合物内包効率を上げるとともに、表面を細胞透過性ペプチドにて修飾を行うことでリポソームが腫瘍選択的に取り込まれるようにデザインした。しかし細胞透過性ペプチドの腫瘍選択性がホウ素中性子捕捉療法の要件を満たすほど高くはないことがわかった。そこでペプチド配列の立体構造の不安定性から腫瘍選択性に問題が生じていることを考え、ペプチド配列を再考することとした。腫瘍組織の中で細胞それぞれは不均一であることが知られ、薬物送達のために一定の受容体や表面マーカーを標的分子として利用しても、それら標的分子を発現していない細胞には効果が見込めず、治療後再発の原因となる。ホウ素薬剤がミクロレベルで取り込まれていない場合でも、腫瘍環境を治療の標的とするホウ素薬剤を併用することで、中性子照射により腫瘍細胞自体と腫瘍環境を同時に捕捉反応により攻撃し、抗腫瘍効果の増強につながる可能性がある。そこで今回、腫瘍組織に普遍的に存在し腫瘍組織の維持・増殖に欠かせない腫瘍血管を標的とするペプチド配列を用いることとした。腫瘍血管の標的分子としてIntegrin αvβ3に着目し、Integrin αvβ3に選択的に結合することが知られているcyclic RGDmotifを用いることとした。cyclic RGDmotifをペプチド鎖の末端に付与したシステインのおよびマレイミド脂質とのマイケル付加反応を用いてpost-conjugate法によりリポソーム表面を修飾し、腫瘍組織および周辺環境へのin vivo取り込みの評価を行った。また、ホウ素薬剤の薬物動態を調べる研究を皮下腫瘍を植え込んだモデルマウスを用いて行い、投与方法の違いによる各正常組織および腫瘍組織のホウ素薬剤集積の変化と中性子照射や事前濃度評価のタイミングの検討を行った。これらの結果を英文誌に投稿し、採択された。リポソーム作成に関して内包するホウ素
酸化物ヘテロナノワイヤ構造体の創成と物性評価

本研究では、電場・光・磁場等の外場に対して巨大応答を示す遷移金属酸化物を用いた原子層制御されたヘテロナノワイヤ構造体を自己集合的な手法により実現し、トップダウン的な手法限界を遥かに凌駕したナノ領域において汎用性基板上で実現可能な遷移金属酸化物へテロナノワイヤデバイスを創成した。これまでに構造及び形状制御が確立されたMgOコアナノワイヤ上に、in-situで機能性遷移金属酸化物シェル層をレーザMBE法により堆積した。堆積過程における種々の条件(アブレーションフラックス、雰囲気温度、酸素分圧等)を適切に制御し、均一な高品質シェル層を達成した。シェル層酸化物材料群として、室温で不揮発性メモリ効果を有するルチル型-TiO_2岩塩型-NiO及びスピネル型γ-Fe_2O_3を用いて、岩塩型-MgOコアナノワイヤ上におけるシェル層結晶成長メカニズム及びその結晶形・格子定数の差異による影響をX線回折や高分解能透過電子顕微鏡観察により多角的に評価・解析した。上記において作製されたコアシェルヘテロナノワイヤのマクロな電気輸送・磁気特性をマイクロ波電気伝導測定法及びSQUIDを用いて評価した。コアシェルヘテロ構造作製における種々の条件(雰囲気温度・酸素分圧等)が、ヘテロ界面における原子混合効果を介してマクロな電気・磁気物性に大きな影響を与えることを明らかにした。更にナノ電極架橋法によりナノ制限空間において不揮発性メモリ効果が発現することを明らかにした。シェル層酸化物材料群として、室温で不揮発性メモリ効果を有する岩塩型-NiO及びスピネル型Co_3O_4を用いて、岩塩型-MgOコアナノワイヤ上におけるシェル層結晶成長メカニズム及びその結晶形・格子定数の差異による影響をX線回折や高分解能透過電子顕微鏡観察により多角的に評価・解析した。上記において作製された酸化物ナノワイヤのマクロな電気輸送特性をマイクロ波電気伝導測定法及びミクロな特性をナノ電極法により評価した。また、ナノ電極法において電極界面における電荷注入効率に関する検討を行った。これらの検討の結果、単一の酸化物ナノワイヤ構造体(10nmスケール)において室温不揮発性メモリ効果が発現することを明らかにした。更に、制限電流を変調させることにより多値化動作がナノスケールで発現することを実証した。メモリ動作特性は印加電圧の極性に依存するバイポーラ型であった。不揮発性メモリ動作メカニズムを検証する為に、SET及びRESET時における電流・電圧特性に関する特徴的な傾向を見出した。この結果、発現しているメモリ効果が電圧誘起のイオンマイグレーションであることが明らかとなった。以上の結果は、従来困難であった機能性酸化物材料のナノワイヤ化を可能とし、その制限ナノ空間における物性(ここでは不揮発性メモリ効果)を明らかにした点に新規性がある。
保存系カオスにおけるクラスターの動的な形成と崩壊

少数多体系はその小ささのために系が熱平衡にある事を自明な事とする事ができない。このため、少数多体系での構造転移の時間的な発展を理解する為には、通常の熱平衡下で起きる転移とは異なり、系に内在する力学をきちんと取り扱う必要がある。本研究では、簡単化されたモデルで力学的特性をきちんと調べつつ構造転移を調べる事で、上記の問題に新しい知見を与える事を目的とし、今年度は以下のような成果を得た。まず、系の軌道不安定性を計算する際に、不安定さの大きさ(固有値)のみならず、不安定性の向き(固有ベクトル)も調べる事により、系の不安定性が微視的局所的(熱的)なものか、あるいは大域的協同的な物かを見分ける方法を作った。これにより、クラスター全体の揺らぎとクラスター内部の揺らぎを区別できる。ここで調べた不安定性は、カオスの基本プロセスの一つ「引き延ばし」を形成している。もう一つの基本プロセス「折り畳み」についてはこれまで良く調べる事ができなかった。これに対して、保存系カオスの結合写像系を例として、相空間内での共役点の分布から、折り畳みが均一ではない事を示し、副産物として安定多様体を検出する事ができた。カオスによって保存系に秩序構造を作り、その緩和過程を力学的に議論するというアプローチの応用例として、天体力学における楕円銀河の構造の問題をとりあげた。ここではモデル系における緩和過程の速度の粒子数(星の数)依存性について長年意見が分かれていたが、きちんと数値計算をし直す事により緩和過程に2種類(個々の粒子のエネルギー分配と、分布全体の変化)ある事を示し、この問題に解決を与えたと考えている。これらの研究において、系の状態を数値的に時間発展させる計算を大量に実行する必要があったが、補助金で購入したワークステーションがその性能を十分に発揮し大いに活躍した。また、購入したソフトウェアは数式処理およびグラフ作成において数値計算をサポートし、十分役に立った。
組織アンジオテンシンII生成におけるビッグアンジオテンシン-25の役割の解明

ビッグアンジオテンシン-25(Bang-25)の測定系を確立し、ヒト尿中のBang-25を測定した。腎臓疾患患者の尿中Bang-25濃度は、糸球体濾過量と負の相関が見られたが、尿タンパクとは相関していなかった。糖尿病患者では、尿中Bang-25濃度が健常人よりも高かった。以上より、尿中Bang-25は腎障害の程度を反映していると考えられた。また、アンジオテンシノーゲン(Aogen)の14番目の糖鎖解析の結果、糖鎖は少なくとも3種類存在する事が明らかとなり、糖鎖の違いによってAogenからBang-25もしくはアンジオテンシンIなど生成されるペプチドの種類が変化する可能性が示唆された。レニン・アンジオテンシン系(RA系)は、循環器・腎臓疾患の発症や進展において重要な役割を果たしている。しかしながら、組織中のアンジオテンシンII(Ang II)生成機構に関しては未だに不明な点が多い。ビッグアンジオテンシン-25(Bang-25)は2013年に研究代表者らが発見したヒト尿中に存在する主要なアンジオテンシン関連ペプチドであり、組織Ang II生成機構に関与している可能性が高いと考えられる。そこで本研究の目的は(1)Bang-25の測定系を確立し、(2)Bang-25の組織内の分布と病態生理学的意義の解明および(3)Bang-25の生成機構を解明する事で組織Ang II生成におけるBang-25の役割を解明し、将来的な循環器・腎臓疾患における診断薬・治療薬の開発を目指す事を目的として行った。Bang-25の測定法の確立にはパーキンエルマー社のAmplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay(Alpha)LISA法を利用した。その際にAng IIのN末端に特異的な抗体とBang-25のC末端に特異的な抗体を用いた。その結果N末端抗体をビオチン化し、C末端抗体をAlpla LISAアクセプタビーズに結合させる組み合わせがより高感度である事が明らかとなった。その後、アッセイバッファーの選択とビオチン化抗体の濃度を決定する事でBang-25のAlpha LISA法を確立する事ができた。またこの測定系を用いてヒトの尿・血液・組織中のBang-25濃度を測定した結果、尿中のBang-25が血中よりも数十倍多い事が明らかとなった。さらに腎臓疾患患者を含むおよそ200検体のヒト尿中Bang-25を測定した結果、糸球体濾過量(eGFR)と負の相関が見られたが、尿タンパクとは相関していなかった。つまり、尿中Bang-25は腎疾患における腎障害の程度を反映していると考えられた。レニン・アンジオテンシン系は、循環器・腎臓疾患の発症や進展において重要な役割を果たしている。ビッグアンジオテンシン-25(Bang-25)はヒト尿中に存在する主要なアンジオテンシン関連ペプチドであり、組織Ang II生成機構に関与している可能性が高いと考えられる。そこで本研究は、組織Ang II生成におけるBang-25の役割を解明し、将来的な循環器・腎臓疾患における診断薬・治療薬の開発を目指す事を目的とした。昨年度確立したBang-25の測定系を利用し、血液、組織抽出液と様々な疾患の尿中Bang-25を測定した。その結果、尿中のBang-25が血中よりも数十倍多い事が明らかとなり、胎盤組織抽出液からもBang-25が多量に検出された。次に腎臓疾患患者と糖尿病患者の尿中Bang-25を測定した結果、糸球体濾過量と負の相関が見られたが、尿タンパクとは相関していなかった。また、糖尿病患者の尿中Bang-25が健常コントロールよりも高い事が分かった。加えてBang-25の生成・変換機構を明らかにするためにアンジオテンシノーゲン(Aogen)の14番目に結合する糖鎖の構造解析を行った。その結果、Aogenの14番目の糖鎖は少なくとも3種類、存在する事が明らかとなり、そのうちの1つはBang-25と同じであった。またBang-25はレニンによるAng I生成に抵抗性を示すがAogenは14番目の糖鎖が欠損しているとレニンによってAng Iを生成する事ができないという報告がある事から、14番目の糖鎖の種類によってAogenからBang-25もしくはAng Iなど生成されるアンジオテンシン関連ペプチドの種類が変化する可能性が示唆された。