hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘリコバクターピロリ病原因子CagAの分子構造と機能解析

(1)全長CagAのプロテアーゼ限定分解解析の結果から、CagAはN末端側およびC末端側それぞれにドメイン構造を有しており、CagAのC末端側フラグメントは^1H NMR及びCDスペクトル解析から高次構造を形成しない内因性不規則構造タンパク質であることが示唆されていた。そこで、CagAと標的分子間の分子相互作用機構を解明するため、PAR1との結合に十分なCagA C末側34アミノ酸残基の同定を行い、^<15>N標識ペプチドを用いたPAR1共存下HSQCスペクトル解析を行った。その結果、PAR1結合に関わるCagAのアミノ酸残基による化学シフトの観測に成功した。(2)CagA分子内相互作用に関わる構造基盤の解明を目的として、CagA分子内相互作用に関わる結合責任領域の同定をおこなった。CagAのN末側領域(アミノ酸1-876)に対する一連の欠失変異体を用いた実験から、CagA C末側領域(アミノ酸877-1186)との分子内相互作用にはN末側アミノ酸配列554-617及び708-821の双方が必要であることが明らかとなった。一方、CagA C末側領域配列を基に合成されたペプチドによる競合阻害実験から、CagAアミノ酸977-1077に相当するペプチドの存在により、CagA N末側及びCagA C末側フラグメント間の結合が抑制された。これらのことから、CagAはN末側領域における2つの領域が近接した立体構造をとり、この部位に対してアミノ酸977-1077で構成されるC末側領域が分子内相互作用すると推察された。また、CagAのC末側フラグメントを単独発現させた場合に比べ、N末側及びC末側フラグメントを共発現させた胃上皮AGS細胞において、より顕著な細胞形態変化が確認されるとともに形態変化を示した細胞数の増加が見られた。(1)申請者はこれまでに、ヘリコバクターピロリ菌病原因子CagAの組換えタンパク質を用いた構造解析結果からCagAが二つのドメインで構成され、CagA生物活性に重要なC末端領域においては高次構造の存在する一方で、自由度の高い不規則構造も併せて存在していることを報告した。今年度、C末端領域フラグメントを断片化したペプチドを用いてさらなる構造解析をすすめたところ、C末端領域において顕著な高次構造は形成されずその全般が不規則構造で構成されていることが明らかとなった。マイクロインジェクション法を用いて、組換えC末端フラグメントを胃上皮細胞へ直接注入し、組換えタンパク質の生物活性を細胞形態変化誘導活性を指標に検討した。その結果、不規則構造から構成されているC末端フラグメントは全長CagAタンパク質と同様に細胞形態変化を誘導た。CagAは主要な生物活性に重要なEPIYA領域周辺を不定形構造として持つ内因性不規則構造タンパク質であることが強く示唆された。一方、CagA分子のN末端フラグメントを用いた結晶化スクリーニングを行ったところ、複数の沈殿化剤によりN末端フラグメントのタンパク質結晶を得ることに成功した。得られたタンパク質結晶のX線構造解析を遂行中である。(2)外科切除固形腫瘍検体を用いてCagAの標的分子であるSHP-2タンパク質をコードするPTPN11遺伝子変異のスクリーニングを行い、肝細胞癌症例においてSHP-2のスレオニン(T)507からリシン(K)への置換を引き起こすミスセンス変異の同定に成功した。T507K変異は基質特異性の変化を伴うホスファターゼ活性の亢進を惹起することを見出した。さらに、T507K SHP-2を安定発現するNIH3T3細胞はヌードマウスに対して造腫瘍性を示しT507K SHP-2は発癌性RAS変異体と同様の悪性形質転換能を持つことが明らかになった。

また、CagAのC末側フラグメントを単独発現させた場合に比べ、N末側及びC末側フラグメントを共発現させた胃上皮AGS細胞において、より顕著な細胞形態変化が確認されるとともに形態変化を示した細胞数の増加が見られた。
エージェントの限定合理性を導入した人工システムの共創的意思決定に関する研究

近年,組織や社会,さらに人間が設計し操作する人工システムにおいてさえも,それを取り巻く環境は大規模・複雑化し,構造自体も複雑多様化している.この状況下で目的を実現するシステムを設計するためには,複雑系研究の基本原理である創発的手法に根ざした共創的意思決定の方法論に基づくアプローチを確立することが有効であると本研究では考えている.さらに研究代表者は,実世界のエージェントの合理性には限界がある点に着目し,限定合理性を導入した人工システムの共創的意思決定の方法論を構築・検証することを目指して研究を進めてきた.平成18年度は,入念な関連分野の調査と体系化,限定合理性のモデルの提案およびマルチエージェントシミュレーションによる提案モデルの妥当性の検証をおこなった.その結果,限定合理性が利他性や役割分担の創発に繋がり,システムの性能を向上させる可能性が示された.さらに,限定合理性の質の違いにより,その導入が有効性を発揮する環境の条件が異なることが示唆された.それに引き続き本年度は,モデルを発展させた実験を進めた.その結果,環境の不完全性の種類と程度に応じて,環境条件に応じた非合理性,自分の中の規律に応じた非合理性,環境条件と規律の適合によって発現する非合理性の3つの性質の有効性が異なることが示された.さらに共創研究の発展として,サービス市場における価値創成に関する研究に取り組んだ,サービス市場は,消費者同士の相互作用により嗜好やサービスの価値そのものも変化するという困難さがある.これに対し,市場を共創システムと捉え,提供者と消費者さらにはサービスが,互いに相互作用しながら価値を創成するマルチエージェントシステムモデルの基礎を作り,簡単なシミュレーションによりその妥当性を検証した.この研究は共創研究の領域横断的拡張の足がかりと成り得る.近年,組織や社会,さらに人間が設計し操作する人工システムにおいてさえも,それを取り巻く環境は大規模・複雑化し,構造自体も複雑多様化している.この状況下で目的を実現するシステムを設計するためには,複雑系研究の基本原理である創発的手法に根ざした共創的意思決定の方法論に基づくアプローチを確立することが有効であると本研究では考えている.さらに本研究は,実世界のエージェントの合理性には限界がある点に着目し,限定合理性を導入した人工システムの共創的意思決定の方法論を構築・検証することを目指している.限定合理性は主に経済学・認知心理学分野において分析的に議論・モデル化されているが,本年度の研究において,この性質を工学的エージェントモデルと関連づけて論じ,分析のみでは導出され得ない限定合理性のモデルを創出し,従来の議論を体系化した.この成果は,経済学・認知心理学分野の限定合理性研究に対する貢献といえる.また工学的には,限定合理性はエージェントのもつ情報の不完全性や能力の限界として捉えられてきたが,本研究は,その捉え方では制約条件下での「最適化」という従来の工学の枠組みを逸し得ないと指摘し,モデル化を通して,"動機の不完全性"という限定合理性の側面を明らかにした.さらにその性質が,システム全体として観れば性能向上に寄与することを,汎用的モデルであるアリの群れの餌集め行動シミュレーションと,複雑な人工システムの典型である生産システムのシミュレーションの2つによって示した.また,トップダウン的なルールや情報を与えることなく,合理的エージェントと限定合理的エージェントとの間に役割分担が創発し,限定合理的エージェントには利他性が創発しているという結果が得られた.これにより,工学が暗黙の前提としてきた合理性・最適性を緩和するというアプローチの新たな可能性の示唆を得た.近年,組織や社会,さらに人間が設計し操作する人工システムにおいてさえも,それを取り巻く環境は大規模・複雑化し,構造自体も複雑多様化している.この状況下で目的を実現するシステムを設計するためには,複雑系研究の基本原理である創発的手法に根ざした共創的意思決定の方法論に基づくアプローチを確立することが有効であると本研究では考えている.さらに研究代表者は,実世界のエージェントの合理性には限界がある点に着目し,限定合理性を導入した人工システムの共創的意思決定の方法論を構築・検証することを目指して研究を進めてきた.平成18年度は,入念な関連分野の調査と体系化,限定合理性のモデルの提案およびマルチエージェントシミュレーションによる提案モデルの妥当性の検証をおこなった.その結果,限定合理性が利他性や役割分担の創発に繋がり,システムの性能を向上させる可能性が示された.さらに,限定合理性の質の違いにより,その導入が有効性を発揮する環境の条件が異なることが示唆された.それに引き続き本年度は,モデルを発展させた実験を進めた.その結果,環境の不完全性の種類と程度に応じて,環境条件に応じた非合理性,自分の中の規律に応じた非合理性,環境条件と規律の適合によって発現する非合理性の3つの性質の有効性が異なることが示された.さらに共創研究の発展として,サービス市場における価値創成に関する研究に取り組んだ,サービス市場は,消費者同士の相互作用により嗜好やサービスの価値そのものも変化するという困難さがある.これに対し,市場を共創システムと捉え,提供者と消費者さらにはサービスが,互いに相互作用しながら価値を創成するマルチエージェントシステムモデルの基礎を作り,簡単なシミュレーションによりその妥当性を検証した.この研究は共創研究の領域横断的拡張の足がかりと成り得る.
カルボニル化合物の触媒的フッ素化反応の開発

本研究では、猛毒で危険なフッ素ガスを用いない安全かつ簡便なフッ素化反応を開発した。1入手容易なフッ化水素酸をヨードシルベンゼンと組み合わせるという単純な操作で、1,3-ジカルボニル化合物から含フッ素ジカルボニル化合物を簡便かつ安全に製造する方法を開発した。2フッ化水素酸/PhIO反応剤を用いるケトンのフッ素化反応を開発した。フッ素ガスを用いないケトンの直接的フッ素化はこれまで例がなく、有用なフッ素化技術として有用である。3ヨードベンゼンを触媒とする触媒的フッ素化反応を開発した。ヨードベンゼン触媒によるフッ素化反応は遷移金属を全く使用しないため、メタルフリーの画期的な触媒反応が達成できる。α-フルオロカルボニル化合物は農薬、医薬品などの合成中間体として極めて有用な物質である。しかしながら、その合成は、工業的には猛毒で極めて危険なフッ素ガスを使用するため特殊な設備や熟練した技術が必要である。安価で安全な代替フッ素化剤が強く望まれている。本研究では、申請者がこれまで行ってきた超原子価ヨウ素化学に関する研究成果を基礎に、フッ素ガスを用いないカルボニル化合物の安全かつ簡便な新しいフッ素化反応を確立するとともに、ヨードベンゼンを触媒とするメタルフリーの触媒的フッ素化反応を開発することを目的とする。(1)1,3-ジカルボニル化合物のフッ化水素酸/PhIOによるフッ素化反応の開発:フッ化水素酸とヨードシルベンゼンを混ぜて調製した反応溶液を1,3-ジカルボニル化合物と反応させることにより、2-フロオロ-1,3-ジカルボニル化合物の合成法を確立した。種々の置換基を有する1,3-ジカルボニル化合物に適用でき、本反応の一般性を明らかにした。ヨードシルベンゼンの他に、o-ヨードシルトルエン、o-ヨードシルアニソールがヨードシルアレーンとして優れていることがわかった。(2)ケトンのフッ素化反応の開発:ケトンの直接的フッ素化は非常に有用であるが、モノケトンに対してはほとんど反応が進行しなかった。そこで、ケトンに対しては、フッ化水素酸を検討することにより反応が進行することが判明したため、今後、反応条件を確立する予定である。(3)ヨードベンゼンによる触媒的フッ素化反応の開発:ヨードベンゼン類を触媒的に利用できれば、画期的なフッ素化反応が開発できる。そこで、種々、酸化剤、触媒量のヨードアレーンを検討した結果、フッ化水素酸によるβ-ケトエステルの触媒的フッ素化反応が起ることを見出した。今後、種々の反応条件を検討し、触媒的フッ素化反応の開発を行う。(1)1,3-ジカルボニル化合物のフッ化水素酸/PhIOによるフッ素化反応の開発:1,3-ジカルボニル化合物の超原子価ヨウ素を用いるHFによるフッ素化反応では、ほぼ目標の基質に関して達成することができた。今後、医農薬の合成中間体として有用な2-フルオロマロン酸エステルのフッ素化反応を検討する。(2)ケトンのフッ素化反応の開発:種々の反応条件の検討結果、ケトンのフッ素化反応では、TEA・5HFをフッ素源に用いることにより、アセトフェノン誘導体について効率的にフッ素化反応が進行し、α-フルオロアセトフェノン誘導体を簡便に合成することができた。(3)ヨードベンゼンによる触媒的フッ素化反応の開発:ヨードベンゼン類を触媒的に用い、1,3-ジカルボニル化合物のHFによる触媒的フッ素化反応が効率よく進行する条件を確立した。これにより、種々の触媒的フッ素化反応を今後検討する。1.入手容易で安価なフッ化水素酸(市販品)をヨードシルベンゼン(PhIO)と組み合わせるという単純な操作で、1,3-ジカルボニル化合物から含フッ素ジカルボニル化合物を簡便かつ安全に製造する方法を開発した。フッ素ガスを用いないため、特殊な設備や熟練した技術も必要とせず、簡便にフッ素化反応が実施可能となった。2.フッ化水素酸/PhIO反応剤を用いるケトンのフッ素化反応を開発した。フッ素ガスを用いないケトンの直接的フッ素化はこれまで例がなく、有用な技術が開発可能となった。3.ヨードベンゼンを触媒とする触媒的フッ素化反応を開発した。ヨードベンゼン触媒によるフッ素化

反応は遷移金属を全く使用しないため、メタルフリーの画期的な触媒反応を確立した。本研究では、猛毒で危険なフッ素ガスを用いない安全かつ簡便なフッ素化反応を開発した。1入手容易なフッ化水素酸をヨードシルベンゼンと組み合わせるという単純な操作で、1,3-ジカルボニル化合物から含フッ素ジカルボニル化合物を簡便かつ安全に製造する方法を開発した。2フッ化水素酸/PhIO反応剤を用いるケトンのフッ素化反応を開発した。フッ素ガスを用いないケトンの直接的フッ素化はこれまで例がなく、有用なフッ素化技術として有用である。3ヨードベンゼンを触媒とする触媒的フッ素化反応を開発した。ヨードベンゼン触媒によるフッ素化反応は遷移金属を全く使用しないため、メタルフリーの画期的な触媒反応が達成できる。研究目的の(1)1,3-ジカルボニル化合物のフッ化水素酸/PhIOによるフッ素化反応の開発、(2)ケトンのフッ素化反応の開発、(3)ヨードベンゼンによる触媒的フッ素化反応の開発、いずれも予定の目標をほぼ達成することができたため、当初の計画以上に進展していると判断した。有機化学(1)1,3-ジカルボニル化合物のフッ化水素酸/PhIOによるフッ素化反応の開発1,3-ジカルボニル化合物の超原子価ヨウ素を用いるHFによるフッ素化反応では、医農薬の合成中間体として有用な2-フルオロマロン酸エステルのフッ素化反応を検討する。(2)ヨードベンゼンによる触媒的フッ素化反応の開発では、実用的な反応開発のため、簡便な触媒反応の開発を検討する。研究計画の(1)「1,3-ジカルボニル化合物のフッ化水素酸/PhIOによるフッ素化反応の開発」はほぼ予定通り研究が進行し、100%近く研究成果を出すことができた。研究計画(2)の「ケトンのフッ素化反応の開発」は、まだ、検討中であるが、フッ化水素反応剤を検討することにより効率良くフッ素化反応が起ることを見出すことができたので、当初予定よりははるかに進展している。研究計画の(3)「ヨードベンゼンによる触媒的フッ素化反応の開発」も、ヨードシルアレーンを触媒とするフッ素化反応を構築することができたため、当初よりはるかに研究は指針でいると考える。したがって、本研究は当初の計画以上に進展していると判断した。(1)1,3-ジカルボニル化合物のフッ化水素酸/PhIOによるフッ素化反応の開発では、さらに本反応を有用なものとするために、官能基を有するカルボニル化合物類を検討する。(2)ケトンのフッ素化反応の開発では、フッ化水素酸を検討することによりフッ素化反応が進行することが判明したので、反応条件の確立と適用範囲を明らかにする。(3)ヨードベンゼンによる触媒的フッ素化反応の開発では、酸化剤及びヨードアレーンを検討することにより、触媒的フッ素化反応が起ることを見出した。今後は、種々の条件検討並びに基質適用範囲を明らかにする。今年度は予想以上に研究が進展したために、薬品等の物品費に予算以上の費用が必要となった。しかし、当初予定していた学会発表の予算等を削減し調整したため、次年度使用額が「0」より大きくなった。次年度も薬品等の物品に費用がかかると予測されるため、物品費として、次年度使用額の「18,929円」を次年度の物品費と合わせて使用したい。
抗癌剤によるセロトニン3受容体の応答調節

抗癌剤投与の刺激により小腸からセロトニンが分泌され、それがセロトニン3受容体を刺激し、嘔気・嘔吐が引き起こされる。一般的に制吐剤として、セロトニン3受容体の阻害剤が使われている。しかし我々はイリノテカン自体がセロトニン3受容体の応答を抑制することを見出した。この結果によりイリノテカンがセロトニン3受容体の応答を抑制することで、制吐作用も有する可能性がある。頭頸部癌の場合、そのステージによっては放射線療法や化学療法が用いられる。しかし、これらは副作用として激しい嘔吐を引き起こすことが問題になる。嘔気・嘔吐は主にセロトニン3受容体の活性化によって引き起こされるが、抗癌剤の投与によって多量のセロトニンが分泌されることで、この受容体が活性化され嘔気・嘔吐が引き起こされると考えられていた。しかし抗癌の中には激しい嘔吐を引き起こすもの、ほぼ引き起こさないものなど様々あり、抗癌剤によるセロトニン分泌のみでは説明がつかない。そこで我々は抗癌剤が直接セロトニン3受容体の応答を調節する可能性があるのではないかと予想した。そこでいくつかの抗癌剤について検討したところ、大腸癌などの固形癌で幅広く使用されている抗癌剤イリノテカンがセロトニン3受容体の応答を直接抑制することが明らかとなった。またその抑制効果はセロトニン3受容体のサブユニット構成によって異なった。抗癌剤が直接セロトニン3受容体の応答調節に関わるという本研究の結果により、催吐作用の少ない抗癌剤の開発につながると考えられる。しかしこれらは副作用として激しい嘔気・嘔吐を引き起こすことが問題になる。抗癌剤の投与によって傷害された細胞からラジカルが放出され、腸内に存在するエンテロクロマフィン細胞を刺激し、大量のセロトニンが分泌される。高濃度のセロトニンは迷走神経終末に存在するセロトニン3受容体を開き、その刺激が嘔吐中枢である延髄の孤束核に伝わることで最終的に嘔吐が引き起こされる。しかし抗癌剤の中には激しい嘔吐を引き起こすもの、ほぼ引き起こさないものなど様々ありその詳しいメカニズムはわかっていない。抗癌剤による応答の副作用の強さは、一般に4群にわけられるが、激しい応答を引き起こす抗癌剤の化学構造は小さい傾向があることに気付いた。そこで我々は抗癌剤がセロトニンの濃度が上昇することで間接的にセロトニン3受容体が刺激されるという経路に加え、抗癌剤が直接セロトニン3受容体の応答性を変化させる可能性があるのではないかと考えた。そこでアフリカツメガエルの卵母細胞にセロトニン3受容体を発現させ、入手可能な様々な抗癌剤を投与し、セロトニンの応答性を調節するかどうか検討したところ、抗癌剤イリノテカンが直接セロトニン3受容体の応答を調節することを見出し、第一報目としてBiochemical and Biophysical Research Communicationsに報告した。抗癌剤が目的の受容体に及ぼす影響について検討していたところ、ある種類の抗癌剤が応答調節に関与していることがわかってきた。1つ目の成果として平成23年11月にBiochemical and Biophysical Research Communicationsに報告した。抗癌剤が目的の受容体に及ぼす影響について検討していたところ、予想以上に多くの抗癌剤が応答調節に関与していることがわかってきた。その結果、これら応答調節に関与する1つ1つの抗癌剤についてさらに詳しく検討する必要がある。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
単粒子解析による高分解能構造解析技術の開発

X線結晶構造解析により原子モデルが既に研究分担者により得られているThermos thermophilus由来のシャペロニンGroEL-GroES-ADP複合体を用いて、その単粒子解析を行った。天然から得た試料は、翻訳されたポリペプチドが折り畳まれるために複合体と相互作用しており、基質も含んだ複合体の立体構造が得られることが期待できた。その結果、2.7nm分解能の構造が得られ、そのcis-cavity中に、いろいろな基質が平均されたと考えられるコントラストを明瞭に観察することができた。その平均された基質のコントラストは、ciscavityを形成しているシャペロニンとは直接接触しておらず、これは、すべての基質が結合するような相互作用部位が存在しないことを示唆していると考えられる。加えて、X線結晶構造解析では、シャペロニンが7回対称性を持っていなかったが、単粒子解析においても同様にcis-cavityに近い部分が7回対称性からずれていることが観察できた。またシャペロニン以外に,単粒子解析を検討していた,同じくThermos thermophilus由来のV-ATPaseについては,その膜内在部分Voドメインを用いて二次元結晶を得ることができたので,その解析を行った。低温電子顕微鏡像から7Å分解能で投影像を計算したところ,12個のIサブユニットからなるリング構造が明らかになった。今まで,このリング部分についてはATPase部分の構成サブユニット数である3の倍数のものはほとんど見つかっていなかったので,その対称性のミスマッチが機能に重要であると考えられていたが,この12個のサブユニットの観察により,対称性のミスマッチは重要でないと強く示唆された。今年度はMAPEGファミリーのメンバーであるMicrosomal Glutathione Transferase 1(MGST1)について、その二次元結晶を用いて3.2Å分解能の結晶構造を電子線結晶学により明らかにした。このタンパク質はグルタチオンを利用した、酸化ストレスへの対応や解毒のための生体内変換を行う。その立体構造は、1分子が4本の膜貫通・-ヘリックスから構成され、膜内では三量体として12本のヘリックスから成る、シトクロムcオキシダーゼのサブユニットIと似た、安定な膜貫通部分を持つことが明らかになった。また、三量体の分子間にあるグルタチオンの結合サイトも同定でき、酵素活性の調節に三量体の相互作用が関与していることが示唆された。このような電子線結晶構造解析の経験や技術を利用して、X線結晶構造解析により原子モデルが既に得られているThermos thermophilus由来のシャペロニンGroEL-GroES-ADP複合体を天然から得て、その単粒子解析を進めている。天然から得た試料は、翻訳されたポリペプチドが折り畳まれるために、複合体中に取り込まれており、基質も含んだ複合体となっている。現在、その立体構造が2.5nm分解能で得られており、そのcis-cavity中に、いろいろな基質が平均されたと考えられる電位図を観察することができる。このような密度はX線結晶構造解析では見られなかったが、これは高分解能では基質が平均されることで明瞭な密度を与えることができなかったためと考えられる。また、X線結晶構造解析では、シャペロニンが7回対称性を持っていなかったが、単粒子解析においても同様にcis-cavityに近い部分が7回対称性からずれていることが観察でき、基質とシャペロニンとの相互作用により、このような対称性の破れが起こっていることが示唆された。
言語的マイノリティの子どもの二言語リテラシーの習得研究

本研究の目的は、1)日本国内の言語的マイノリティの子どもの二言語の読書力の発達過程を縦断調査により明らかにし、教育の指針となる「読書力発達段階参照枠」を記述すること、2)「二言語での対話型段階的読み学習」を教育現場との協働で実践し、「読書力発達段階参照枠」に応じた具体的な指導方法を提唱することであった。目的1.に関しては、これまでに収集した外国ルーツ児童生徒及び日本語母語児童生徒計428名の音声録音データを文字化・分析し、その結果をもとに、読書力発達段階参照枠の妥当性を検証し、国内外の学会等で公表した。目的2.に関して、これまでに引き続き、大阪府下のS小学校において、母語教育カリキュラムの作成とその実践(全ての中国語ルーツの児童対象)、また、日本語の対話型段階的読み学習の実践(全ての中国語ルーツの児童及び、日本語母語児童4年生を対象)をおこなった。母語教育は、アイデンティティの確立とリテラシーの基礎を身につけることを目的に、運用面を重視したプロジェクト型のカリキュラムであり、対話型段階的読み学習は、個々の本読みの目標冊数を決め、レベルに応じた本を継続して読む中で総合的な読書力を身につけるという取り組みである。今年度終了時の3月に、この3年に渡り、上記の実践を特に力を入れて行ってきた5年生の中国ルーツの児童8名を対象に、二言語読書力評価を実施した。その結果、すべての児童が二言語ともに読み書きの力が伸びているという結果が得られた。また、インタビューから、8名全員、中国・中国語に対する肯定感が育っており、ルーツに対してネガティブな感情を持つ児童が一人もいないことが確認された。さらに、日本語及び教科学習に対しても、全員が肯定的に捉えており、教科学習の基礎となる読み書きの力が、二言語で培われている様子が確認できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、1)日本国内の言語的マイノリティの子どもの二言語の読書力の発達過程を縦断調査により明らかにし、教育の指針となる「読書力発達段階参照枠」を記述すること、2)「二言語での対話型段階的読み学習」を教育現場との協働で実践し、「読書力発達段階参照枠」に応じた具体的な指導方法を記述すること、の2つを目的とし、行ってきた。2013年47月にかけて、6つの市の学校教育現場において、計55名の児童に第1回目の読書力評価を実施した。この結果については「読書力発達段階参照枠」の作成に向け、現在分析中である。一方で、これらのフィールドの一つであるS小学校において、二言語読書力評価を実施した3年生児童11名に焦点をあて、母語教育カリキュラムの作成と対話型段階的読み学習の実践を試みた(67月はトライアル期間、2013年9月2014年3月まで本格的に実施)。母語教育については、二言語教育理論に基づき、アウトプットを重視したプロジェクトベースのカリキュラム(運動会の招待状作成や劇・発表会の開催など)を作成し、週1回の母語教室を実践した。対話型段階的読み学習では、個々の本読みの目標冊数を決め、レベルに応じた本を継続して読むという取り組みを実施した。retellingによって内容理解を深めた上で、その粗筋を写真やシール付きの読書日誌に記録していくというやり方で、児童のやる気を持続させた。この取り組みを年度末まで続けた後、2014年3月に二度目の対話型読書力評価を実施した。成果としてどの児童にも日本語読書力、母語の会話力、読書力に伸びが見られた。現場の教員、子どもたち自身にも効果が実感されたため、2014年度は、「特別の教育課程」の一環として、課内の授業の一つとして取り入れられることとなった。言語的マイノリティの子どもの二言語(日本語と中国語、日本語とスペイン語)の読書力調査を初年度に引き続き、大阪府及び神奈川県下の複数の小中学校で実施した。そして、その収集データをもとに、子どもの二言語の読書力の発達過程を5つの年齢枠別、言語能力の6のステージ別に記述し、読書力の発達段階の参照枠の記述を行った。また、それぞれのステージにおける子どもの事例(読書力評価の過程で三られた発話事例)を分析した。また、調査フィールドうちの一つの学校(S小学校)において、3年生6名(本年度から実施)、4年生9名(昨年度から継続的に実施)を対象として、母語教育カリキュラムの作成と日本語の対話型段階的読み学習の実践をおこない、その実践の成果を検証した。母語教育については、アイデンティティの確立とリテラシーの基礎を身につけることを目的として、実生活に関わる言語活動(運用面)を重視したプロジェクトベースのカリキュラムとし、中国語母語話者である本学の大学院生にもその指導・支援に加わってもらった。本年度は、昨年度に作成したカリキュラムの改善に力をいれた。retellingによって内容理解を深めた上で、その粗筋を写真やシール付きの読書日誌に記録していくというやり方で、児童のやる気を持続させるとともに、書く力の育成にも力を注いだ。3、4年生は、どの児童も日本語の読書力に大幅な伸びが見られ、母語である中国語の伸長もみられた。この2つの取り組みにより、言語的マイノリティの子どもの二言語での読み書きの力を伸ばすために、子どもの年齢と言語能力のステージに応じてできる公立学校での教育実践の一つの方法を示すことができたと考える。

本研究の目的は、1)日本国内の言語的マイノリティの子どもの二言語の読書力の発達過程を縦断調査により明らかにし、教育の指針となる「読書力発達段階参照枠」を記述すること、2)「二言語での対話型段階的読み学習」を教育現場との協働で実践し、「読書力発達段階参照枠」に応じた具体的な指導方法を提唱することであった。目的1.に関しては、これまでに収集した外国ルーツ児童生徒及び日本語母語児童生徒計428名の音声録音データを文字化・分析し、その結果をもとに、読書力発達段階参照枠の妥当性を検証し、国内外の学会等で公表した。目的2.に関して、これまでに引き続き、大阪府下のS小学校において、母語教育カリキュラムの作成とその実践(全ての中国語ルーツの児童対象)、また、日本語の対話型段階的読み学習の実践(全ての中国語ルーツの児童及び、日本語母語児童4年生を対象)をおこなった。母語教育は、アイデンティティの確立とリテラシーの基礎を身につけることを目的に、運用面を重視したプロジェクト型のカリキュラムであり、対話型段階的読み学習は、個々の本読みの目標冊数を決め、レベルに応じた本を継続して読む中で総合的な読書力を身につけるという取り組みである。今年度終了時の3月に、この3年に渡り、上記の実践を特に力を入れて行ってきた5年生の中国ルーツの児童8名を対象に、二言語読書力評価を実施した。その結果、すべての児童が二言語ともに読み書きの力が伸びているという結果が得られた。また、インタビューから、8名全員、中国・中国語に対する肯定感が育っており、ルーツに対してネガティブな感情を持つ児童が一人もいないことが確認された。さらに、日本語及び教科学習に対しても、全員が肯定的に捉えており、教科学習の基礎となる読み書きの力が、二言語で培われている様子が確認できた。読書力の発達段階参照枠に基づいて行ったS小学校での二言語読書力育成の協働実践により、対象となった子どもたちの二言語読書力に伸びがみられ、さらに、二言語の学習に対しても前向きな姿勢を示すようになった。また、本実践について、S小学校教員に、シドニー日本語教育国際研究大会(2014年7月)及び、多文化共生社会における日本語教育研究会(2015年2月)にて発表をしてもらったり、教育委員会主催の研修会において実践報告をしてもらったことで、これらの先進的な実践が認められ、S小学校が、文部科学省が推進する「特別の教育課程」の研究推進指定校(平成27年度)に指定された。さらに、文部科学省が毎年1回実施している全国規模の「外国人児童生徒等に対する日本語指導指導者養成研修」(平成27年度)において、本実践を発表することとなった。並行して、平成26年度から、本研究を基礎研究の一部として文部科学省により開発された「外国人児童生徒のためのJSL対話型アセスメント」という言語能力評価ツールの普及がはじまっており、この評価ツールの開発に携わってきた筆者のもとにも各地の教育委員会から講演・講座の依頼があり、アウトリーチ活動の一環として、積極的にそれらを引き受けてきた。このことにより、本研究の成果を教育現場に広く還元することができたと考える。一方で、これらの研究・実践の成果を学会誌や著書として発表できておらず、その点に関しては来年度の課題としたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在進めているS小学校での二言語教育の実践については、引き続き、進めていく予定である。
機能材料開発のための異種反応性官能基を持つ有機ケイ素モノマーの合成

ヒドロシラン類の新しいフルオロ化剤としてCuCl_2(CuI)/KF試剤を開発することに成功した。同試剤とヒドロシランをTHF中室温で反応させると、H-Si結合が効率よくF-Si結合に変換され、高収率で対応するフルオロシランが得られることが明らかになった。同様の反応はポリヒドロシランのフルオロ化にも適用できる。興味深いことにCuCl_2(CuI)/KF試剤とポリヒドロシランの当量を操作することでジヒドロシランからヒドロフルオロシラン、ジフルオロシランを、またトリヒドロシランからはジヒドロフルオロシランヒドロジフルオロシラン、トリフルオロシランを容易につくり分けることができる。反応は高選択的に進行し、目的のフルオロシラン以外のものは全く生成してこない。得られたヒドロフルオロシランをさらにクロロ化することで混合ハロシランであるフルオロクロロシラン、ヒドロフルオロクロロシランへと導くことが可能である。このようにして得られた混合ハロシランは同一ケイ素原子上に異なったハロゲン原子を有しておりハロゲン-ケイ素結合の反応性の違いを利用すれば選択的に有機基等を導入できると予想され、種々のハロシラン化合物合成の出発物質として期待できる。また、ヒドロシランをCuBr_2(CuI)試剤と反応させると選択的かつ高収率でブロモシランに変換できることも見いだした。本反応はポロヒドロシランを選択的に高収率でフルオロ化あるいはブロモ化できる初めての例で、アルキルシラン、アリールシランのどちらにも適用できるので有機ケイ素モノマーの合成に有用である。
ブロックコポリマーによるベシクル構造体等の形成とその表面固定化過程の解析

有機溶媒分散による粒子配置の観察PS-b-PMMA(50.0K-20.9K)/Toluene濃度を変えて,表面張力を測定し,表面張力の低下率の変化から1.4wt%から2.9wt%でミセルが形成されはじめることが推測された.この濃度以下とこの濃度範囲でスピンコート+熱アニーリングしたサンプルを比較したが,両者とも自己組織化は部分的なものに留まり,分子量が絡み合いを形成する長さでないために被覆状態が不均一である予想された.一方,2ないし4つ程度の絡み合いを形成するPS-b-PMMA(166.2K-42.0K)/Tolueneについては,濃度の依存性は小さく,直径33±9nmのドットを有する自己組織化した薄膜が得られた.50:50で混合したPS-b-PMMA(50.0K-20.9K)/PS-b-PMMA(166.2K-42.0K)/Toluene溶液では,その形成密度が0.8倍程度に低下し,下地にランダムコポリマーを配置した場合,1.1倍程度のドットの集積性が増大した.溶媒種をTolueneからdichlorobenzeneに変更した場合も同様の傾向が得られたが,僅かながらドットサイズの増加が見られた.C60をPS-b-PMMA溶液へ溶解させた場合,dichlorobenzeneよりもToluene溶媒を利用した方がPMMA相またはPS相とPMMA相の界面への選択配置は良好にようにAFM観察からは判断されたが,ドット構造が崩れた.一方で,Co(III)/Acetate, Cr(III)/Acetateを用いた場合,金属錯体のμmサイズの凝集体が多くみら,ナノサイズの自己組織化構造形成を阻害した.一方でFe_3O_4粒子は公称で10nm粒子であるが,まばらに凝集し30nmサイズ程度の凝集体を形成しPS相へ選択的に配置されていることがAFM観察された.二酸化炭素による可塑化効果の検討PS-b-PMMA(166.2K-42.0K)/Tolueneによる表面凹凸が2nm程度の平滑な直径33±9nmのドットを有する薄膜に超臨界二酸化炭素暴露した.超臨界二酸化炭素(10MPa,40°C,12h以上)でドームが重なった表面が形成され,より高圧(17MPa25MPa,6h以上)では検討した範囲では,PS相が押しつぶされ,PMMA相が盛り上がった構造が形成された.(1)ブロックコポリマーのセグメント間とシリコン基板との相互用の設定と基膜の作成市販されているPS-b-PMMAブロックコポリマー、C60を購入し、トルエン、クロロホルム、MEK溶媒に1wt%前後の濃度で溶解または分散させ、100面のSiウエハー、PET、PESを基材として、成膜厚さを40nm程度となるようにスピンコートした。PET、PESは表面自由エネルギーが高く、コーティング時に溶液がはじかれやすいため、回転数をSiウエハーを利用した場合に比べ半分の速度とした。尚、基材は、比較のために0.5wt%以下のHF溶液を用いて常温で1分、3分間酸処理することで、コポリマーセグメントと基板の表面自由エネルギーとのバランスを調整した。Siウエハー基板では170°Cで2日間、PET、PESではTg程度の温度で2日間真空中でアニールした。AFMによる観察により、Siウエハーを3分間処理し、トルエン溶媒を利用した場合に基板に垂直なシリンダー構造が形成されたが、他の溶媒やC60を分散させた系では構造が形成されなかった。C60は溶液乾燥後の観察の結果、μmサイズに不均一に凝集した。これは、コポリマーとともに分散させた場合について同様であった。PET、PES基板では、低誘電体であるため、耐電性が高く、静電反発の影響を受け、AFMによる観察が出来ていない。来年度は、静電除去法も検討する。また、基板の表面自由エネルギーは、購入した表面張力測定機を用いて測定したが、有機溶媒の蒸発速度が速く、装置セル部を一部改良した。来年度は、表面自由エネルギーの評価マップを作成する。また、来年度は、ナノ粒子の配置方法を検討するために、薄膜形成した後にUV照射により凹凸形成し、溶液分散したC60を塗布することでドット配置可能かどうかを実施する。(2)二酸化炭素による可塑化効果の検討(1)にて作成した薄膜を超臨界二酸化炭素による可塑化効果を検討したが、二酸化炭素の送液ポンプが不良のため、比較データがとれていない状況である。来年度の引き続き実施する。一方、Sanchez-Lacombe状態方程式によるセグメントの可塑化効果の見積もりを行った。来年度は、二酸化炭素の可塑化効果を利用した相互作用のコントラスト化について、実験的にも検討する。また、粗視化モデルによる構造形成のシミュレータの開発を実施する。有機溶媒分散による粒子配置の観察PS-b-PMMA(50.0K-20.9K)/Toluene濃度を変えて,表面張力を測定し,表面張力の低下率の変化から1.4wt%から2.9wt%でミセルが形成されはじめることが推測された.この濃度以下とこの濃度範囲でスピンコート+熱アニーリングしたサンプルを比較したが,両者とも自己組織化は部分的なものに留まり,分子量が絡み合いを形成する長さでないために被覆状態が不均一である予想された.

一方,2ないし4つ程度の絡み合いを形成するPS-b-PMMA(166.2K-42.0K)/Tolueneについては,濃度の依存性は小さく,直径33±9nmのドットを有する自己組織化した薄膜が得られた.50:50で混合したPS-b-PMMA(50.0K-20.9K)/PS-b-PMMA(166.2K-42.0K)/Toluene溶液では,その形成密度が0.8倍程度に低下し,下地にランダムコポリマーを配置した場合,1.1倍程度のドットの集積性が増大した.溶媒種をTolueneからdichlorobenzeneに変更した場合も同様の傾向が得られたが,僅かながらドットサイズの増加が見られた.C60をPS-b-PMMA溶液へ溶解させた場合,dichlorobenzeneよりもToluene溶媒を利用した方がPMMA相またはPS相とPMMA相の界面への選択配置は良好にようにAFM観察からは判断されたが,ドット構造が崩れた.一方で,Co(III)/Acetate, Cr(III)/Acetateを用いた場合,金属錯体のμmサイズの凝集体が多くみら,ナノサイズの自己組織化構造形成を阻害した.一方でFe_3O_4粒子は公称で10nm粒子であるが,まばらに凝集し30nmサイズ程度の凝集体を形成しPS相へ選択的に配置されていることがAFM観察された.二酸化炭素による可塑化効果の検討PS-b-PMMA(166.2K-42.0K)/Tolueneによる表面凹凸が2nm程度の平滑な直径33±9nmのドットを有する薄膜に超臨界二酸化炭素暴露した.超臨界二酸化炭素(10MPa,40°C,12h以上)でドームが重なった表面が形成され,より高圧(17MPa25MPa,6h以上)では検討した範囲では,PS相が押しつぶされ,PMMA相が盛り上がった構造が形成された.
構成的ヘテロクロマチンと条件的ヘテロクロマチンの共通点と相違点

条件的ヘテロクロマチンである不活性X染色体の転写抑制にはポリコーム複合体であるPRC1とPRC2が、凝縮したヘテロクロマチン形成にはHP1-HBiX1-SMCHD1複合体が関与することが知られている。HP1-HBiX1-SMCHD1複合体とポリコーム複合体のうち少なくともPRC2とは、それぞれ独立に非コードRNAであるXISTに依存して不活性X染色体に濃縮されている。最近、hnRNPKがXISTに特異的に結合することにより、PRC1を呼び込み、それによるH2Aのユビキチン化によりもう一つのポリコーム複合体であるPRC2複合体が呼び込まれることが報告された。HP1-HBiX1-SMCHD1のXIST依存性がhnRNPを介しているか否か検証するために、hnRNPをヒト体細胞由来細胞株から除去したが、HP1-HBiX1-SMCHD1複合体の不活性X染色体への局在には影響しなかった。一方で、SMCHD1の機能ドメイン解析を行ったところ、C末端に存在するSMCヒンジドメインのみでXIST RNAと結合しうることが示唆された。これらのことから、体細胞において、HP1-HBiX1-SMCHD1はhnRNPKを介さずに、直接あるいは異なる経路を介してXISTと結合することにより不活性X染色体に濃縮され、凝縮したヘテロクロマチン形成に寄与していると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。構成的ヘテロクロマチンと条件的ヘテロクロマチンは、異なる構成因子やエピゲノムマークを使用していること、かたやテロメアやセントロメアなどの染色体の意地伝達に、かたや発生・分化に関与する遺伝子発現制御に機能することから、全く異なるものとして議論されてきた。しかしながら、申請者らの研究成果などから、互いに代替可能で共通の構成要素や機能を持つこと、また、互いに連携して働きうることを示す知見が蓄積している。本課題では、構成的、条件的ヘテロクロマチンの機能構造をそれぞれについて明らかにし、その共通点と相違点を理解することを目的とした。本年度は、1)ポリコーム複合体(PcG)の不活性X染色体のヘテロクロマチンへの影響、2)HP-SENP7-SETDB2-SMBP1の相互作用様式の解析、3)これら因子とhoechst denseなクロマチン高次構造との関係を明らかにすることとした。1)に関しては、PcGのコア複合体の構成因子であるSUZ12を細胞から除去して、多点FISH法にて凝縮度を解析したところ、H3K27me3領域の凝縮度に影響しなかった。このことから、PcGはXISTの下流でヒストン修飾に主に関与していると考えられる。2)に関しては、SETDB2のMBDがSMBP1との結合に必要なこと、また、SMBP1が持つC末端のRing fingerがSETDB1およびSETDB2との結合に必要であることを見出した。SETDB1およびSETDB2のMBDの機能は不明であったが、SMBP1と複合体を形成した状態で機能を解析を進めれば良いことが示唆された。3)SETDB2とSENP7を同時に発現させると、SATIIあるいはSATIIIへのHP1の局在が促進された。このことは、この複合体がヒストン修飾かクロマチン高次構造に働きかけることを示唆するものである。本年度の研究により、計画通り、ポリコーム複合体の不活性X染色体のヘテロクロマチンへの影響、HP-SENP7-SETDB2-SMBP1の相互作用様式の解析、これら因子とhoechst denseなクロマチン高次構造との関係が明らかになりつつあり、全体の計画は概ね順調に進行していると考える。本年度は、高次構造の検出方法について検討を行った。これまでに、不活性X染色体のヘテロクロマチン構造を等間隔に配置したDNAプローブを用いたDNA FISHにより検出することに成功している。この系で、HBiX1-SMCHD1を細胞から除去することにより、不活性X染色体の凝縮ー脱凝縮が観察することができる。しかしながら、HBiX1-SMCHD1パスウェイによるヘテロクロマチンを阻害しても転写発現は回復しないことから、このパスウェイ以外のクロマチン高次構造の存在が示唆される。、理研CDB平谷博士らにより複製開始時期とトポロジカルドメインとの間に相関があることが示され、Hi-C技術と比べて比較的簡便にクロマチン高次構造が検出できる方法であると考えられた。実際に、平谷らから技術導入を行い、ヒト細胞においてSMCHD1を機能阻害すると、不活性X染色体上の一部の領域で複製時期に変化が見られ、高次構造変化をマッピングするためのFISH以外の方法として適していることが明らかとなった。

今後、構成的、条件的それぞれのヘテロクロマチンについて、FISH法と複製開始時期の両方を併用したクロマチン高次構造の評価を行う。本年度の研究により、クロマチン高次構造を解析できる系が揃いつつあり、構成的ヘテロクロマチンと条件的ヘテロクロマチンの構造を異なる方法で評価し、展開できることから、解析全体の計画は概ね順調に進行していると考える。条件的ヘテロクロマチンである不活性X染色体の転写抑制にはポリコーム複合体であるPRC1とPRC2が、凝縮したヘテロクロマチン形成にはHP1-HBiX1-SMCHD1複合体が関与することが知られている。HP1-HBiX1-SMCHD1複合体とポリコーム複合体のうち少なくともPRC2とは、それぞれ独立に非コードRNAであるXISTに依存して不活性X染色体に濃縮されている。最近、hnRNPKがXISTに特異的に結合することにより、PRC1を呼び込み、それによるH2Aのユビキチン化によりもう一つのポリコーム複合体であるPRC2複合体が呼び込まれることが報告された。HP1-HBiX1-SMCHD1のXIST依存性がhnRNPを介しているか否か検証するために、hnRNPをヒト体細胞由来細胞株から除去したが、HP1-HBiX1-SMCHD1複合体の不活性X染色体への局在には影響しなかった。一方で、SMCHD1の機能ドメイン解析を行ったところ、C末端に存在するSMCヒンジドメインのみでXIST RNAと結合しうることが示唆された。これらのことから、体細胞において、HP1-HBiX1-SMCHD1はhnRNPKを介さずに、直接あるいは異なる経路を介してXISTと結合することにより不活性X染色体に濃縮され、凝縮したヘテロクロマチン形成に寄与していると考えられた。本年度の研究成果をもとに、計画どおり、不活性X染色体、および、SATIIあるいはSATIIIのようなリピート領域に形成されるヘテロクロマチンの構成要素とその役割をタンパク質相互作用を基軸に明らかにしていく。それと関連して、数Mbレベルの折りたたみによる大きな構造、数kbベースを単位とする小さな構造に関して、それぞれ、FISHによる解析法、high C技術による解析法を想定しており、計画通り進める予定である。一方で、生きた細胞では計測が難しいこと、コストや労力のことを鑑みて、ゲノム編集法を応用した新たな技術開発も検討したい。HP1、SENP7、KAP1、SMBP1、SETDB1、SETDB2を機能阻害した時のクロマチン構造変化を、複製時期解析、FISH法による解析、ヘキストの輝度の解析について行い、SMCHD1、HBiX1を機能阻害した時と比較しながら、それぞれ因子のクロマチン高次構造に対する影響を検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ナノ制限空間における界面動電現象の極限可視化技術

本研究では,ナノ制限空間におけるイオン流動および界面動電現象を対象とした可視化計測技術を開発し,詳細流動を明らかにすると共に,物理現象を利導した新しい単一分子分析技術の基盤を構築することを目的とした.具体的には,まず,ナノ流路およびナノポアにおける生体高分子の流動に関して可視化流動計測を行い,ナノスケール構造の拘束が生体高分子の流動性を低下させる事を明らかにした.次に,計測技術を拡張し,微小ポアを用いた細胞電気穿孔法におけるイオン・生体高分子流動の計測を行い,局所・瞬時電場の推定を可能とした.最後に細胞電気穿孔法と分子ふるいの効果を利用したRNAおよびDNA同時抽出・分離法に関して検討した.本研究では,ナノ制限空間におけるイオン流動および界面動電現象を対象とした可視化計測技術を開発し,詳細流動を明らかにすると共に,物理現象を利導した新しい単一分子分析技術の基盤を構築することを目的とした.具体的には,まず,ナノ流路およびナノポアにおける生体高分子の流動に関して可視化流動計測を行い,ナノスケール構造の拘束が生体高分子の流動性を低下させる事を明らかにした.次に,計測技術を拡張し,微小ポアを用いた細胞電気穿孔法におけるイオン・生体高分子流動の計測を行い,局所・瞬時電場の推定を可能とした.最後に細胞電気穿孔法と分子ふるいの効果を利用したRNAおよびDNA同時抽出・分離法に関して検討した.本研究では,ナノ制限空間におけるイオン流動および界面動電現象を対象とじた独創的な可視化計測技術を開発する.そして,対象の詳細流動を明らかにすると共に,物理現象を利導した新しい単一分子分析技術の基盤を構築することを目的としている.ナノ制限空間とは,ナノ流路あるいはナノボア(孔)等のナノスケールの構造や界面に拘束された流動場であり,バルクとは全く異なる性質を示すと考えられる.本年度は,代表寸法が2001,000nm程度のナノ流路を対象として,内部に拘束された長鎖DNAの流動イオン流動および界面動電現象について詳細に計測を行った.ここで用いたナノ流路は対向する流路壁面がカバーガラスで構成されており,比較的容易に光学計測を適用することが可能である.そこで,独自に考案した二種のトレーサ粒子を用いた界面動電現象の計測技術を用い,ナノ流路における長鎖DNAの電気泳動および溶媒の電気浸透流について詳細に計測した.その結果,ナノ流路の強い拘束により,長鎖DNAの流動性がバルク中と比較して顕著に低下することが確認された.また,ナノ流路の深さ,すなわち拘束の程度に応じて,流動性の低下量が変化することが分かった.さらに,これらの実験的知見に基づき,本流動性の変化を説明する数理モデルを構築し,その詳細メカニズムを考察した.ここでは,長鎖DNAとナノ流路壁面間における溶媒の流れに着目し,その流動場から長鎖DNAに生じる力を評価した.以上の結果を,国際雑誌や専門会議で公表することができた.代表寸法が200nm-1000nmのナノ流路における界面動電現象を対象にして,平成22年度から23年度初旬にかけて可視化流動計測に取り組んだ.ここでは,ナノ流路の拘束により鎖状生体高分子の流動性が低下することを実験的に明らかにし,本現象を対象とした理論モデルの構築を行った。この研究成果については,平成23年度に米国機械学会の雑誌論文として掲載されており,高い評価を得ている.平成23年度後半からは,200nm以下のナノ流路を対象として界面動電現象の計測を実施している.ここでは,可視化計測に加えて,ナノ流路を介した微小電流の計測を行い,流動計測の時間分解能向上を試みている.これにより,これまで困難であった非定常の流動現象を対象とした計測技術を確立できる.これまでに,ナノ流路における生体高分子の流動について可視化と微小電流の同期計測を実施し,生体高分子がナノ流路に侵入し,拘束される過程に対応する信号の取得に成功している.本計測で得られた知見は,近年注目されているナノボアを用いた単分子計測技術への応用も期待できる.さらに,非定常電場および液体流動を利用した鎖状生体高分子の伸長方法を考案し,実験による有効性の検討を行った.そして電極表面近傍における生体高分子のコンフォメーション変化を詳細に計測するため,マイクロ流路の製作プロセスに工夫を加え,流路の接合と電極表面における流動の可視化の両立を実現した.開発した装置により,生体高分子の伸長現象を計測し,コンフォメーション変化の特徴時間に比して非定常電場のそれが短い条件において,伸長現象が顕著であることを明らかにした.本年度は一細胞からRNAおよびDNAを分離・抽出し,それぞれを定量する方法を開発した.本方法は一細胞を流路内に導入する作業以降は全て電気的に制御しており,約4分で一細胞あたりのRNAの絶対定量およびDNAの相対定量を行える.また,界面動電現象を利用した等速電気泳動法により抽出分子を濃縮し,高精度の定量を可能にした.マウスのリンパ球(A20)を利用した実験において一細胞あたり平均で14 pgのRNAの抽出・定量が可能である事を示した.