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直流電気通電による軸索再生促進効果を利用した新しい治療法の確立

本研究の目的は、直流電気刺激を利用した、新たな末梢神経再生治療法を開発することである。軸索伸長速度は約0.5mm1mm/日と非常に遅いため、その間に効果器官の萎縮変性などが生じ、損傷前の状態への回復は困難である。軸索再生を促進するため、直流電流刺激に着目した。電気通電は、骨癒合促進への応用など物理療法として安全な治療法の一つとなりつつあり、in vivoで末梢神経の軸索再生を促進することは報告されているが、末梢神経再生治療への応用は確立でされていない。われわれは、シリコンシートを用いたオリジナルの電極を考案・作成し、Wistar系雄ラット10週齢を用いて、坐骨神経の圧挫損傷後の再生過程における効果を解析した。圧挫部を挟んでシート電極を装着し、パルス幅500μs,頻度10Hz,強度10V,通電時間15分の条件で毎日通電を行い、損傷後7日目,14日目にサンプルを回収した。損傷のみ群、損傷後末梢陰極通電群の2群で検討した。Neuregulin-1(NRG-1)およびBrain Derived Neurotrophic Factor(BDNF)のmRNA発現レベルをReal time PCR法で解析したところ、末梢陰極通電群でコントロール群に比べ、有意な上昇を認めなかった。われわれは平成20年度の研究で、NRG-1の発現上昇をタンパクレベルで示している。この結果は、神経栄養因子は、主に細胞体で産生され、軸索先端へ輸送されることを示しており、損傷部での電気刺激が、何らかのシグナルを介して細胞体へ伝達され、神経栄養因子が産生され、その後再生軸索へ輸送された可能性を示唆しており、直流電気通電の臨床応用へ向けて、重要な知見になると考える。この結果をふまえ、現在英文論文を作成中であり、さらに具体的な応用へ向けて研究を継続している。より臨床における治療に近い状況で通電実験を行えるように、シリコンシートを用いたオリジナルの電極を考案・作成した。Wistar系雄ラット10週齢を用いて、坐骨神経に圧挫損傷を加えた後、圧挫部を挟んでシート電極を装着した。パルス幅500μs,頻度10Hz,強度10V,通電時間15分の条件で毎日通電を行い、損傷後7日目,14日目にサンプルを回収した。実験群は、無処置群、損傷のみ群、損傷後末梢陽極通電群の4群で検討した。前脛骨筋の筋湿重量を測定したところ、7および14日目では無処置群に対し、他群で有意に減少していた。次に、損傷神経および前脛骨筋内のNeuregulin-1の発現量をWestern blotting法で解析したところ、末梢陰極通電群で有意にNeuregulin-1の発現が上昇していた。また、筋組織の免疫組織化学染色では、14日目にNeuregulin-1の発現が上昇していた。以上から、末梢陰極通電が再生軸索および筋組織内のNeuregulin-1の発現を上昇させ、末梢神経再生を促進させている可能性が示唆された(論文作成中)。来年度は、運動機能評価を行い、より長期的な変化を検討し、また、生化学的解析により再生メカニズムのさらなる解明を行う予定である。

この結果は、神経栄養因子は、主に細胞体で産生され、軸索先端へ輸送されることを示しており、損傷部での電気刺激が、何らかのシグナルを介して細胞体へ伝達され、神経栄養因子が産生され、その後再生軸索へ輸送された可能性を示唆しており、直流電気通電の臨床応用へ向けて、重要な知見になると考える。この結果をふまえ、現在英文論文を作成中であり、さらに具体的な応用へ向けて研究を継続している。
赤-青緑・二重拮抗型色受容野による色情報処理に関する研究

霊長類の視覚系で発見された赤-青緑・二重拮抗型色受容野を持つ神経細胞が、人の視覚系でも存在するのか否かを検証するための視覚心理実験を行った。人の視覚系で存在が明らかになっているL-M色メカニズム(Lは長波長に感度の最大値を持つ錐体、Mは中間波長に感度の最大値を持つ錐体)に対するS錐体(Sは短波長に感度の最大値を持つ錐体)の寄与の有無を検証するため、Quadrature Protocolを用いた等輝度L-M刺激のしきい値に対するS入力による変化を、空間周波数を変えながら測定した。その結果、心理学的には、S入力はMに対してではなく、Lに対して影響を与えることを明らかにした。すなわち、人の場合、赤-青緑型ではなく赤紫-緑型の二重拮抗型色受容野である可能性が高いことが分かった(研究目的1)。また、色収差の影響が排除できないので確定的なことはいえないが、空間周波数による違いから、S入力は帯域通過型の特性を有している可能性があることが示唆された(研究目的2)。今後、色収差の影響カミない実験系を構築し、さらに本研究を進める予定である。本研究を行う動機となった道路交通標識の実時間認識システムに関する研究は順調に進めることができ、今年度はITSシンポジウムで2件の講演を行った。赤色標識認識については円や直線境界の検出にRANSACを用い、円形領域の抽出や「止まれ」の逆三角形領域の検出をロバストに行えるようになった。また、「止まれ」の標識の特徴抽出にS-R特徴(統計的リーチ特徴)を用い、高い認識精度を得ることができた。また、認識処理に部分空間法を用いることで、ロバストなシステムを構築することができた。さらに、青い方向指示標識へと認識対象を拡張している。本年度は、先す今年度購入した視覚刺激作成装置ViSaGeを用いた実験系を組み上げ、赤-青緑・二重拮抗型色受容野の存在を実証するために必要な関連研究の追試を行った。錐体コントラストの計算に必要なCRTディスプレーの赤、緑、青の蛍光体の分光スペクトル特性を計測した。また、実験手法として採用予定のquadrature protocol法に関する先行研究のデータを再現できることを確認した。さらに、青錐体入力が赤みの検出に影響を与えているという先行研究のデータも再現することができた。以上の予備実験を元に、研究計画・方法に記載した内容に従って、錐体コントラスト空間における赤-緑軸から赤-青緑軸にかけての空間周波数特性の測定を開始した。赤-緑軸上で空間周波数変調した刺激による錐体コントラスト空間におけるしきい値の形状は、先行研究と同じ結果となった。さらに、青錐体コントラスト刺激を加えた実験を行っている。現在までの所、何らかの結論を得るまでのデータは集まっていないが、実験は順調に行われている。本研究を行う動機となった道路交通標識の実時間認識システムの構成は、順調に行われており、RGBからHSV空間への変換をテーブル化することにより、処理時間を約1/10に短縮することができた。また、識別パラメータを調整することにより、99%以上の認識率を達成することができた。これらの成果は、ITS(Intelligent Transportation Systems)に関する国際会議ITSWC2007で報告した。報告された関連研究の中で最先端を行っている内容であり、最優秀論文賞にノミネートされた。共同研究者の辻村誠一准教授は、本研究課題に開連した研究として、赤-緑輝度メカニズムに関する研究を引き続き行っている。
細胞の集団的移動と接触阻害の分子メカニズムの解明

本研究では細胞の集団的移動と接触阻害を制御する分子機序、および癌細胞において接触阻害が破綻する仕組みを明らかにすることを目的としている。平成24年度までに以下の点について明らかにした。(1)細胞の集団的移動のメカニズムの解明以前、私達はアクチン結合分子Girdinのノックアウトマウスおよび変異体導入ノックインマウスにおいて、脳室下帯で新生した神経芽細胞の集団移動(chain migration)が顕著に障害されていることを示した。その集団的移動のメカニズムを明らかにするため、Girdinの結合分子を生化学的手法で探索したところ、ダイニンのintermediate chain(以下DIC)を同定した。一方Girdinの変異体マウスでは神経芽細胞のN-cadherinの膜への局在が異常を示すことを明らかにした。現在、Girdin/DIC間の結合がN-cadherinの局在を制御するメカニズムについて探索している。(2)癌細胞の集団の先導細胞におけるインテグリンの発現制御機構以前より私達が機能解析を進めてきた転写調節因子RFP (Ret Finger Protein)が、癌細胞の集団的移動を制御し得る分子であることを見いだしその機能解析を進めている。本年度までにRFPが細胞集団を先導する細胞(leading cell)において転写因子MRTFと結合し、両者の会合が特定のmiRNAの発現制御を介してインテグリンの発現を制御していることを示した。この結果に一致して、扁平上皮癌の臨床検体組織の免疫染色では、癌細胞の集団の先導細胞でRFPおよびインテグリンの高い発現が確認された。上記の結果は、細胞集団の先導細胞とそれを追随する細胞(following cell)において特異的な分子の発現制御機構が存在することを示唆する所見であり、今後その詳細な生物学的意義の解析を検討する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では細胞の集団的移動と接触阻害を制御する分子機序、およびがん細胞において接触阻害が破綻する仕組みを明らかにすることを目的としている。平成23年度は以下の点について明らかにした。(1)細胞の集団的移動のメカニズムの解明以前、私達はアクチン結合分子Girdinのノックアウトマウスおよび変異体導入マウス(Basic-mutマウス)において脳室下帯で新生した神経芽細胞の集団的移動(chain migration)が顕著に障害されていることを示した。本年度はその集団的移動のメカニズムを明らかにするため、マウス脳の抽出サンプルを用いてGirdinの結合分子を免疫沈降と質量分析で探索した。野生型のマウスで特異的に検出され、Basic-mutマウスで検出されない分子のうち、現在ダイニンのintermediate chain(以下DIC)について着目し、生化学的検証をすすめている。平成23年度は免疫沈降法を用いてDICとGirdinの結合を確認した。(2)細胞の接触阻害の制御機構の解明本プロジェクトについては予想に反して難渋している。計画書どおりNIH3T3細胞において細胞密度依存的に発現が上昇する分子群をDNAマイクロアレイで同定した。そのうちロイシンリッチリピートを細胞外に有するISLR分子について着目して解析をすすめたが、ISLRをノックダウンした細胞と正常の細胞を用いて細胞の接触阻害を評価したところ、明らかな差異を認めることができなかった。一方で、(1)(2)の実験計画とは別に、以前より機能解析を進めてきたRFP(ret finger protein)が、がん細胞の集団的移動を制御し得る分子であることを見いだし、その機能解析を進めている。RFPは細胞集団の先頭の細胞(leading cell)で特定の分子の発現を制御している可能性があり、現在、その分子機構の解析をすすめている。

DNAマイクロアレイを用いた細胞の接触阻害を制御する分子のスクリーニングについては難渋しているが、細胞の集団的移動の制御メカニズム解明への糸口としてGirdinの新たな結合分子の同定に成功している。さらに当初の研究計画とは異なった経緯ではあるが、RFP分子が細胞の集団的移動、特にがんの集団的浸潤を制御している可能性を明らかにしており、今後さらに解析を進める予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。Girdinとダイニンintermediate chainの結合については、より詳細に結合様式(結合ドメイン)を決定する。具体的には精製タンパク質を用いた結合アッセイと、各種フラグメントの発現コンストラクトを用いた免疫沈降法を予定している。DNAアレイスクリーニングで同定されたISLRについては、細胞の接触阻害機構への関与は否定されたが、組織構築の制御に関わると予想される知見が得られており、今後も解析を継続する予定である。さらにがん細胞の集団的移動を制御するRFPについては、先頭のleading cellにおいて細胞間接着が失われることがRFPによる細胞運動能制御に重要であることが明らかになっており、今後はその分子機構を詳細に検討する予定である。
高機能性2-5Aアンチセンス・キメラの分子設計と合成

標的DNAなどを特異的に認識するアンチセンス部分と2-5A部分を結合させた2-5Aアンチセンス・キメラが選択的に特定のmRNAを分解することが判明し、抗ウイルス薬開発への取り組みが米国で開始された。アンチセンス部分による基質選択性は期待通りであったが天然型2-5A分子を組み込んだためか、現在のところ十分なRNase L活性化能は得られていない。そこで、我々が現在までに得た知見をもとにより強力なRNase L活性化能を有する2-5Aを分子設計し、その修飾2-5Aを組み込んだ高機能性2-5Aアンチセンス・キメラを構築すれば、十分なRNA分解活性を有する抗ウイルス薬や抗癌薬の開発が可能と考え本研究を実施した。1.我々は、RNase Lの活性化には3番目のアデノシン残基の存在が決定的な役割を果たし、8位に置換基を導入した誘導体に顕著な活性増強作用を確認している。そこで、アミダイト法を用いてRNase L活性化能の増強を目指した塩基部修飾、特に3番目のアデノシン残基の8位に置換基を導入した修飾2-5AのDNA自動合成機による合成法を確立した。2.生物学的安定性の向上を目指して、5'-末端をヒドロキシエチル基などで修飾した2-5Aアンチセンス・キメラを分子設計しDNA自動合成機を用いて合成した。5'-末端リン酸残基修飾2-5A誘導体は、RNase Lに対する活性化能を若干減弱するが、生物学的安定性を増大する知見を得た。3.高機能性2-5Aアンチセンス・キメラ構築のための基礎的知見を得るため、アンチセンス部分の分子設計・合成を行い、その生物学および物理化学的特性を評価し最適化を実施した。4.2-5Aの3番目アデノシン残基に8位メチル基を導入した修飾型2-5Aが、天然型と比べRNase L活性化能を増大することを確認した。インターフェロン(IFN)の抗ウイルス作用に2-5Aシステムが知られている。これは、IFNの感作により生成する抗ウイルス性オリゴアデニル酸2-5AがエンドヌクレアーゼであるRNase Lと結合し活性化する。活性化されたRNase LがmRNAを分解し、その結果タンパク質合成をストップすることにより抗ウイルス活性を示すと考えられている。一方、標的DNAなどを特異的に認識するアンチセンス部分と2-5A部分を結合させた2-5Aアンチセンス・キメラが選択的に特定のmRNAを分解することが判明し、抗ウイルス薬開発への取り組みが開始された。そこで、我々が現在までに得た知見をもとにより強力なRNase L活性化能を有する2-5Aを分子設計し、その修飾2-5Aを組み込んだ高機能性2-5Aアンチセンス・キメラを構築すれば、十分な活性を有する抗ウイルス薬や抗癌薬の開発が可能と考えた。まず本研究では、現在までに合成されている2-5A 2'-末端アデニン塩基部の2位および8位を修飾した2-5A誘導体のRNase L活性化能を、今回大腸菌にて発現し精製したヒト遺伝子組換えRNase Lを用いて系統的に調査した。その結果、2位修飾体よりも8位修飾体の方が活性が増強されることを見出した。そこで、2'-末端アデノシン8位修飾2-5A誘導体の合成を鉛触媒-P1 nuclease法にて合成した。

アデニン8位には、エチル基、メトキシ基、ブトキシ基、クロロ基を導入したpApAp(et^8A)、pApAp(meO^8A)、pApAp(buO^8A)、およびpApAp(cl^8A)を合成し、これらのヒト遺伝子組換えRNase L活性化を調べた。また、アミダイト化したアデノシン誘導体のモノマー・ユニットも合成し、現在2量化反応を検討している。標的DNAなどを特異的に認識するアンチセンス部分と2-5A部分を結合させた2-5Aアンチセンス・キメラが選択的に特定のmRNAを分解することが判明し、抗ウイルス薬開発への取り組みが米国で開始された。アンチセンス部分による基質選択性は期待通りであったが天然型2-5A分子を組み込んだためか、現在のところ十分なRNaseL活性化能は得られていない。そこで、我々が現在までに得た知見をもとにより強力なRNaseL活性化能を有する2-5Aを分子設計し、その修飾2-5Aを組み込んだ高機能性2-5Aアンチセンス・キメラを構築すれば、十分なRNA分解活性を有する抗ウイルス薬や抗癌薬の開発が可能と考え、以下の研究を行った。1.我々は、RNaseLの活性化には3番目のアデノシン残基の存在が決定的な役割を果たし、8位に置換基を導入した誘導体に顕著な活性増強作用を確認している。そこで、アミダイト法によるRNaseL活性化能の増強を目指した塩基部修飾、特に3番目のアデノシン残基の8位に置換基を導入した修飾2-5Aの合成法を確立した。2.生物学的安定性の向上を目指してアミダイト法による5'-末端リン酸残基修飾2-5A誘導体の合成を実施し、RNaseL活性化と生物学的安定性に関する知見を得た。3.更に、アンチセンス部分を結合させた2-5Aアンチセンス・キメラの合成ルートを確立することが出来た。4.既に、ヒト遺伝子組換えRNaseLの発現および精製には成功しているが、酵素活性測定などに必要とするに十分なタンパク量を得るには至っていない。そこで、RNaseLの分離精製を容易にするためHis-tag型RNaseLやGST結合RNaseLなど融合タンパクの精製法を確立し、これら酵素がRNase活性を有することを確認した。アンチセンス部分による基質選択性は期待通りであったが天然型2-5A分子を組み込んだためか、現在のところ十分なRNase L活性化能は得られていない。そこで、我々が現在までに得た知見をもとにより強力なRNase L活性化能を有する2-5Aを分子設計し、その修飾2-5Aを組み込んだ高機能性2-5Aアンチセンス・キメラを構築すれば、十分なRNA分解活性を有する抗ウイルス薬や抗癌薬の開発が可能と考え本研究を実施した。1.我々は、RNase Lの活性化には3番目のアデノシン残基の存在が決定的な役割を果たし、8位に置換基を導入した誘導体に顕著な活性増強作用を確認している。そこで、アミダイト法を用いてRNase L活性化能の増強を目指した塩基部修飾、特に3番目のアデノシン残基の8位に置換基を導入した修飾2-5AのDNA自動合成機による合成法を確立した。2.生物学的安定性の向上を目指して、5'-末端をヒドロキシエチル基などで修飾した2-5Aアンチセンス・キメラを分子設計しDNA自動合成機を用いて合成した。
iPSマクロファージを利用したアミロイドポリニューロパチーのアミロイド除去療法

FAP患者心臓の剖検組織ではコントロールと比較して、マクロファージの減少を認めており、特に抗炎症作用が強いと考えられているM2マクロファージの減少を認めた。一方でFAP患者の血清では、炎症性サイトカインIL-6の増加を認めており、FAPにおいて慢性的な炎症が生じ、様々な臓器障害を引き起こしている可能性がある。今回の研究では、iPS細胞からマクロファージを分化誘導、野生型および変異型のトランスサイレチン(TTR)と共培養するとTTRに対して強い貪食作用を示した。iPS細胞由来のM2マクロファージを分化誘導、FAP患者体内で増加させることが治療となる可能性がある。家族性アミロイドポリニューロパチー患者のリンパ球がトランスサイレチンに対してどのような作用をおよぼすか検討するために、フローサイトメトリーを用いてリンパ球を解析した。家族性アミロイドポリニューロパチー患者由来リンパ球では、健常人由来リンパ球と比較して炎症性T細胞であるインターフェロン-γ陽性細胞(CD4+およびCD8+)が増加する傾向を認めた。より効率的にトランスサイレチンを除去するマクロファージを検討するために健常人由来のCD14+細胞をM-CSF存在下で7日間培養したのちに、それぞれインターフェロン-γもしくはIL-4およびGM-CSF存在下で培養後にトランスサイレチン(野生型および異型)を添加した。添加後にマクロファージから産生されるサイトカインをBioplex assayをもちいて解析したところインターフェロン-γ存在下で分化誘導されたマクロファージ細胞(M1マクロファージ)は炎症性サイトカインであるIL-1β, IL-6, IL-15の産生が増加していた。一方ではIL-4およびGM-CSFにより誘導されたマクロファージ(M2マクロファージ)では、炎症性サイトカインが減少する傾向があった。トランスサイレチンの除去に関しては、炎症作用を強力に有するM1マクロファージがより効率的である可能性がある。健常人由来のiPS細胞よりマクロファージを分化誘導、トランスサイレチンと共培養をおこない、トランスサイレチン量が減少することが確認できており、今後はより分解活性が高く、神経保護作用が期待出来うるiPS由来マクロファージの分化誘導法を検討していく。家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)患者のリンパ球が、トランスサイレチン(TTR)に対してどのような作用を及ぼすかを検討するためにフローサイトメトリーを用いてリンパ球を解析した。FAP由来リンパ球では、健常人由来リンパ球と比較して炎症性T細胞であるインターフェロン-γ陽性細胞(CD4+およびCD8+)が増加する傾向を認めた。より効果的にTTRを除去するマクロファージを検討するために健常人由来のCD14+陽性細胞をM-CSF存在下で7日間培養したのちに、それぞれインターフェロンーγもしくはIL-4およびGM-CSF存在下で培養後にTTR(野生型および異型)を添加した。添加後にマクロファージから産生されるサイトカインをBioplex assayを用いて解析したところインターフェロン-γ存在下で分化誘導されたマクロファージ細胞(M1マクロファージ)は炎症性サイトカインであるIL-1β、Il-6, IL-15の産生が増加していた。FAP患者血清中の炎症性サイトカインに関してもBioplex assayを用いて測定したが、ほとんどのサイトカインは検出感度以下であったが、IL-6に関してはFAP患者で健常者と比較して、High sensitivitiy ELISAで高値を示した。つぎにFAP患者組織に対してマクロファージがどのように影響をおよぼすかを、FAP患者剖検心臓組織を用いて検討したところFAP患者心臓の剖検組織ではマクロファージの減少を認め、減少したマクロファージはM2マクロファージがほとんどであった。これらの検討よりTTRの除去に関しては、抗炎症作用を協力に有するM2マクロファージを増加させることがより効率的であると考えられた。今後はマウスでのトランスサイレチン沈着抑制を検討していく。当初は、分化誘導後にストックしたiPS細胞によりアミロイド分解活性が確認できていたが、実験を繰り返しおこなったところ、分解活性にばらつきが確認された。このため再度iPS由来マクロファージ細胞をiPS細胞より分化誘導する必要性が生じている。今後はモデルマウスで治療実験を行いたいと考えているが、適切なモデルマウスの作成、選択が目的の達成のためには必要不可欠である。iPSマクロファージ細胞にアミロイド分解効率を増加させるプロテアーゼ、抗体を遺伝子導入することでより効果的にアミロイド除去効率を高めることをおこなっていく。マクロファージの分化誘導あるいは培養条件を検討することでアミロイド除去効率を増強させるべく条件を検討していく。治療実験としてより効果が期待できるマクロファージ細胞を用いて治療実験をおこなっていく。

本年度はin vitroでの実験を主におこなったため、現段階では治療実験として検討している動物実験の準備が整っておらず、購入資金および飼育費用が余剰している。今後は動物実験を検討しており、次年度使用額として必要となってくる。家族性アミロイドポリニューロパチーモデルマウスの作成、購入および飼育費用として使用する。
炭素 14 年代による縄紋集落の研究

神奈川県大日野原遺跡の縄紋中期重複住居、および愛媛県上黒岩第2岩陰の縄紋早期岩陰居住を発掘調査し、年代測定をおこなった。山梨県堰口遺跡の火災住居構築材の準ウイグルマッチングなど縄紋中期を中心に測定し、先史時代集落の継続期間や住居の構築・作り替えの時間を検討した。住居作り替えが1015年程度が平均的で数年間で作り替えた例も指摘でき、縄紋では住居構築時に木材はその都度に伐採した可能性や、廃絶後10年以内で埋没した例と300年以上窪地が残った例を確認した。多様な集落景観から、移住・定住を含め様々な居住形態が復元可能である。AMS炭素14年代測定を利用して先史時代の集落・居住の継続期間を実年代で検討する目的で、いくつかの測定事例の蓄積をおこなった。主要作業としては、縄紋中期の大規模集落である神奈川県相模原市大日野原遺跡の重複住居群の発掘調査をおこない、7基の時期的に連続する重複住居群を確認した。本年度はそのうちの一番新しい住居および上部から掘り込まれた土坑について調査し、考古学的な調査記録を作成した。遺構の重複関係が検証できるセクション面から炭素14年代測定用の炭化物試料を採取した。測定用試料については、共伴土器・石器などの出土資料の基礎整理を行い、共伴関係の明確な炭化物試料について年代測定をおこなうこととして測定対象試料の選定を進め、連携研究者の坂本稔により、前処理など汚染除去を進めた。AMS測定については、来年度におこなう予定である。別に比較検討対象として、縄紋時代早期の炉穴群で著名な千葉県船橋市飛ノ台貝塚の炉穴出土炭化物を、飛ノ台遺跡資料館の保管資料から選定し、炭素14年代測定をおこなった。また、神奈川県横浜市三沢貝塚の貝層中出土炭化材、北海道キウス遺跡の盛土遺構の層位別出土炭化材の炭素14年代測定を行い、山梨県梅ノ木遺跡の縄紋住居の層位的出土資料の測定例についてはその出土状況との検討をおこなうなど、関連資料の炭素14年代測定研究を進めた。キウス遺跡では、土器付着物との比較から海洋リザーバー効果の影響の度合いについても検討可能であり、青森県三内丸山遺跡他の既存の測定例とも比較可能となった。この研究では、AMS炭素14年代測定を利用して先史時代の集落・居住の継続期間を実年代で検討する目的で、測定事例を蓄積しその比較検討を進めた。主要作業としては、昨年度に引き続き縄紋中期の大規模集落である神奈川県相模原市大日野原遺跡の重複住居群の発掘調査をおこない、7基の時期的に連続する重複住居群のうちほぼ主要部が調査区に含まれている4基について全面調査し、考古学的な調査記録を作成した。遺構の重複関係が検証できるセクション面から炭素14年代測定用の炭化物試料数十点を採取した。測定用試料については、共伴土器・石器などの出土資料の基礎整理を行い、共伴関係の明確な炭化物試料について年代測定をおこなうこととして測定対象試料の選定を進め、連携研究者の坂本稔により、前処理など汚染除去を進め、AMS測定については、14試料を測定した。別に比較検討対象として、縄紋時代早期の岩陰居住で短期的な居住と捉えられる愛媛県上黒岩第2岩陰遺跡の試掘調査をおこない、年代測定の成果を得た。また集落遺跡でも、弥生時代後期の集落で著名な東京都入間城山遺跡の火災住居出土炭化物や東アジアとしての位置づけをみる目的で韓国蔚山市細竹遺跡の新石器時代土器付着物を選定し、炭素14年代測定をおこなった。さらに、昨年に実施した北海道キウス遺跡の盛土遺構の層位別出土炭化材の炭素14年代測定結果についてはその出土状況と青森県三内丸山遺跡他の既存の測定例との比較検討をおこない論文として公表するなど、関連資料の炭素14年代測定研究を進めた。昨年度に引き続き、神奈川県大日野原遺跡の縄文時代中期の集落跡の発掘調査とその整理作業をおこなった。重複する縄文時代中期竪穴住居5軒の住居出土の炭化物について炭素14年代測定し、住居の構築の順番ごとの年代を推定した。その結果、最も古い5号住居の年代は絞りきれなかったが、曽利1式4式期の4軒の住居のうち曽利1式期の住居は200年度穂古いが、その後の曽利3b式曽利4b式の住居3軒については約100年間の間で住居を完全に埋め戻してから構築していく状況が復元できた。さらに比較材料として、山梨県梅之木遺跡・堰口遺跡や栃木県仲内2遺跡などの縄文時代中期住居の年代測定をおこない、1軒の住居の使用期間が10年程度と考えられる測定結果を得た。縄文時代中期集落の存続期間や一軒の竪穴の埋没にかかる時間を考察し論考にまとめるとともに、これまでの研究で検討してきた福島県井出上ノ原遺跡、神奈川県大日野原遺跡の発掘調査報告書を刊行した。

年代測定結果も合わせて報告したほか、大日野原遺跡の事例については学会発表もおこなった。山梨県内集落での火災住居出土の炭化材の年輪試料によるウイグルマッチングを利用した年代測定例について分析を進めるなど、住居の構築・使用・廃棄に係わる時間推定について、多くの成果を得ることができた。さらに比較対象として、縄文時代以外の事例である東京都入間城山遺跡の8世紀の火災住居炭化材のウイグルマッチングや、韓国新石器時代の土器付着物、青銅器時代集落の火災住居の炭素14年代測定を行い、その分析もおこなった。日本古代の火災住居では古材を混ぜて住居を構築した可能性を検討し、韓国青銅器集落では、集落内で同時期の火災住居例が認められるなど、集落の営みについての検討材料を得ることができた。研究の基幹を担う縄紋集落の実地発掘調査は、重複住居の調査を完遂し年代測定試料も多数得た上、歴博・山形大学の測定協力を得て、当初計画の10測定を上回る14測定をおこない、昨年の5測定とあわせて重複住居の変遷時間について探る材料を得た。さらに、比較検討資料も上黒岩第2岩陰の縄紋早期の岩陰居住をはじめ、縄紋時代・弥生時代・古墳時代とさらに韓国新石器時代の試料について得ることができたほか、韓国青銅器時代火災住居の事例について年代測定の準備ができた。来年度に縄紋さらにそれ以外の先史時代集落の継続期間や、住居の構築・作り替えの時間について、具体的に検討を加えることが十分可能となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画の通り、典型的な縄紋中期集落である大日野原遺跡竪穴住居の重複状況を調査し、考古学的情報を把握する。年代測定も進めるが、検討の基盤としてしっかりした考古学的成果を第一にまとめる。昨年までの研究を続け、各遺跡・住居の年代測定数を増し、環状集落の形成過程やその間の断続・継続について明らかにする。考古学的成果と測定結果を重ねることで、研究目的である縄紋集落の継続性、途中に断続があるかどうか、規模、一時的な集落景観について実証的に時間的復元を検討することができる。今年度の課題として関東地方以外の朝鮮半島から西日本・北海道までの、縄紋時代早期古墳時代における集落遺跡の継続期間の個別事例を集めたが、統合した成果にまとめる必要がある。そのため、測定した結果を同一の基準で相互に比較検討する。異なる地域・時代について比較検討する基準を整備できれば今後の研究にも大きく寄与するだろう。また、年代測定の方法論的整備も検討したい。ウイグルマッチングの検討など年輪年代や較正曲線とあわせ見ることが必要である。多面的な検討を重ねることで、年代測定の高精度化について検討していくことにもなり、自然科学研究にもフィードバックし得ると考える。
大腸炎ラットにおけるペプチド輸送担体の大腸異所発現の機構解明とペプチド食の影響

炎症性腸疾患時の腸管ペプチド輸送担体(PEPT1)の発現異常機構を調べる目的で、ヒト腸管Caco-2細胞単層培養系を用いて検討した結果、サイトカインのIL-6およびTNF-αがPEPT1の発現をmRNAレベルで調節していた。リポ多糖刺激により、PEPT1たんぱく質の有意な低下がみられ、これはたんぱく質の合成低下、あるいは分解亢進によることが示唆された。また、酸化ストレス負荷下において、PEPT1 mRNAは低下し、細胞間接着の低下が関わると考えられた。一方、大腸炎ラットにおいて食餌が血液指標などに与える影響を検討したが、ペプチド食の特異的な影響はみられなかった。潰瘍性大腸炎やクローン病は、未だ詳細な原因が明らかにされていない難治性の炎症性腸疾患である。本疾患患者や実験的大腸炎ラットにおける報告から、大腸における小腸ペプチド輸送担体(PEPT1)の異所性発現が炎症性腸疾患の炎症誘発に、小腸における発現低下が低栄養に深く関与することが推測され、これらの背景にIFN-γ、TNF-α、IL-1βといった炎症性サイトカインやリポポリサッカライド(LPS)が関与することを示唆するデータも蓄積されつつある。そこで本研究では、大腸異所発現および小腸発現低下と炎症性サイトカインおよびLPSの関与についてin vitroの系で調べるため、ヒト腸管由来Caco-2細胞の単層培養系を用い検討した。その結果、Caco-2細胞の刷子縁膜側および基底膜側のLPS刺激により、PEPT1のmRNAレベルには影響がないものの、たん白質レベルが約50%に低下することが明らかとなった。また、PEPT1たん白質と輸送活性の上昇が報告されているIFN-γやTNF-αによる基底膜側からの刺激において、PEPT1mRNAレベルが変化する傾向が認められなかった。以上より、LPS刺激によるPEPT1発現低下は、転写後の調節が関与することが示唆された。また、本実験系においては全細胞抽出液を用いて検討しているため、膜へのソーティングの変化が関与している可能性は考えにくく、新規たん白質合成の低下あるいはたん白質分解系の亢進による可能性が考えられた。現在、細胞の各画分における発現量の比較、たん白質分解系の阻害による影響等について検討する準備を始めている。さらに、サイトカイン刺激によるPEPT1mRNAレベルへの影響の有無については再現性を検討した上で、たん白質レベルにおける発現調節を上記と同様に調べる必要がある。これまでに、炎症性腸疾患時におけるPEPT1輸送担体の大腸異所発現および小腸発現低下と炎症性サイトカインおよびリポ多糖(LPS)の関与について、ヒト腸管Caco-2細胞の単層培養系を用いたin vitroの系において検討してきた。その結果、Caco-2細胞の刷子縁膜側および基底膜側のLPS刺激によりPEPT1のmRNAレベルには影響がないものの、基底膜側からのLPS刺激に特異的に反応し、PEPT1たん白質レベルが低下するという結果を得ている。そこで本年度は、LPSシグナルの下流において活性調節を受けることが知られているNuclear Factor-κB(NF-κB)を阻害した場合のPEPT1発現に与える影響を検討した。すなわち、NF-κB阻害剤(BAY-11)によるプレトリートメント後に、基底膜側からのLPS刺激を行った場合、BAY-11の添加濃度に依存してPEPT1たん白質の発現量がコントロール群レベルまで回復することが明らかとなった。本実験では、細胞の全抽出たん白質を用いて検討しているため、LPS刺激によるPEPT1たん白質の発現低下に細胞膜へのソーティング量の変化が関与しているのではなく、NF-κBシグナルの下流において新規たん白質合成の低下、あるいはたん白質分解の亢進のどちらかに依存していることが示唆された。また、この結果が本疾患時における小腸PEPT1の発現低下に一部関与している可能性も示唆された。現在、引き続き、NF-κBシグナルの下流の調節を含め、LPS等炎症惹起物質による影響を詳細に検討している。炎症性腸疾患の患者や実験的大腸炎ラットにおいて、腸管ペプチド輸送担体(PEPT1)の発現異常が報告されており、炎症悪化や栄養障害に関与していることが推測される。そこで本年度は、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)投与による大腸炎誘発ラットを用い、ペプチド食が種々のパラメーター(血液指標、栄養状態、病態等)へ与える影響を検討した。Wistar系ラット(雄、6週齢)を一週間馴化飼育したのち、水道水(C)あるいは5%DSS水(D)を一週間自由飲水させ、この期間、20%大豆たん白質食(PR)あるいは20%大豆オリゴペプチド食(OP)を自由摂取させた。DSS投与のD/PR群およびD/OP群において、摂餌量の減少に伴う体重停滞と減少がみられた。

また、day2より下痢が出現し、さらにその後血便が認められるようになった。次に各種血液指標について検討した結果、C群に対してD群で変化する傾向がみられた主なものは、アルブミン値、・血糖値・中性脂肪・カルシウム・ナトリウム・カリウム(低下)、遊離脂肪酸・マグネシウム・炎症マーカーのC反応性たん白(増加)であった。以上より、C/PR群およびD/PR群、C/OP群およびD/OP群においてDSS投与による栄養障害や病態変化は明らかであったが、これらに対するOP食の特異的影響は一部を除きみられなかった。体内のたん白質栄養状態、糖や脂質の代謝異常に摂餌量の減少が大きく関わったと考えられるが、既知の小腸PEPT1の発現低下もその一因であることが考えられる。今後その他の栄養素輸送担体の発現パターンと栄養状態および病態との関連性についても解析していく必要がある。本年度中にin vitro培養細胞系におけるヒトPEPT1の調節機構の検討を終了し、ラット大腸炎モデルを用いた動物実験を開始する予定であったが、培養細胞実験の過程で添加試薬類のロット変更・確認と再現性検証を行う必要性が生じ、再度実験を行ったため、動物実験計画が遅延した。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後、炎症性腸疾患モデルラットにおける腸管PEPT1の調節機構を、腸管の部位による調節の差異に着目して解析する。それらの結果を踏まえ、摂取した食餌中窒素源の違いが大腸炎ラットの腸管PEPT1発現および炎症や栄養状態のパラメーターへ与える影響を調べる。
細いヘンレの上行脚における細胞間隙ナトリウムイオン輸送の解析

哺乳類の尿濃縮機構において重要な役割を担っている細いヘンレの上行脚において、細胞と細胞の間を通過するナトリウムイオンの輸送機構を生理学的実験法により解析した。今回は、アルドステロンおよびインスリンといったホルモンの影響を検討したが、いずれのホルモンもこの尿細管分節におけるナトリウムイオン輸送には関与していないことが示唆された。また、実験回数が少なかったもののインスリン様成長因子-1も同様の結果を示唆した。2005年にLe Moellicらは、アルドステロンがクローディン4のリン酸化を促進し、タイト結合のイオン透過性を修飾するという報告をしている。そこで、マウスの細いヘンレの上行脚(ATL)におけるナトリウムイオン透過性にアルドステロンが関与しているか否かを単離尿細管灌流実験で確認した。その結果、ATLの定常状態における拡散電位は15.09±0.88 mV(n=5)であり、0.1mMのネオマイシンを浴液側に添加すると電位は16.17±0.73mVにまで上昇した。次に、10-9Mのアルドステロンを浴液側に加え、1520分間インキュベーションした後に、拡散電位を測定した。電位は、定常状態が15.01±1.25mVであり、0.1mMのネオマイシンで刺激すると16.25±0.99mVにまで上昇した。アルドステロンの添加前後の電位を比較したが、定常状態および0.1mMのネオマイシンで刺激した際の電位に統計学的有意差はなかった。すなわち、本実験結果からはアルドステロンの短時間インキュベーションは、マウスのATLにおけるナトリウムイオンやクロライドイオンの透過性に影響を及ぼさないことが示唆された。Le Moellicらの報告と異なる結果となったが、彼らは不死化細胞を用いた実験系であり、我々は単離尿細管を用いた実験だったからと推察した。従来からの検討で、長時間尿細管を灌流することは困難であることが判明していたため、Wangらの報告を参考にして、マウスから摘出して単離した尿細管の束を10%ウシ仔血清+DMEM溶液に入れて、一晩インキュベーションした後に尿細管灌流実験を行った。しかし、複数回この実験を行ったが、尿細管の単離が極めて困難であり、実験の再現性が非常に低かったため継続を断念した。そこで、再度長時間尿細管灌流実験に取り組んだ。3時間位までは細いヘンレの上行脚(以下、ATL)の経上皮電位は保たれたが、これ以上時間が経過すると徐々に電位が低下してしまうことを繰り返し、制限された時間内に確立させる見込みが低かったため、ATLにおけるNaCl輸送にEGFが及ぼす影響に関する検討を中断した。そこで、新たにインスリンやインスリン様成長因子-1(以下、IGF-1)がATLにおけるNaCl輸送に影響を及ぼすか否かを検討した。プロトコルは、30分間尿細管を灌流後に10-6Mのインスリンを血管側に添加して30分後にwashoutを行い、この間の経上皮電位を継時的に測定した。その結果、インスリン投与前の経上皮電位は14.5±0.4 mVで、インスリン投与30分後は14.2±0.8 mVであった。インスリン投与前後の経上皮電位は統計学的有意差がなく、今回の検討ではインスリンはATLにおけるNaCl輸送に影響を及ぼさないことが分かった。IGF-1に関しては、1回のみの検討であったが、インスリンと同じプロトコルで血管側に5×10-10Mを添加した際に経上皮電位は添加前15.1 mV、添加後14.9 mVであり、少なくとも生理学的濃度ではNaCl輸送に影響を及ぼさない可能性が示唆された。今年度は、研究の中心となるin vitro microperfusion法を用いた経上皮電位測定システムを再構築することにほとんどの時間を費やすことになってしまった。前任地である東北大学から現勤務先である日本大学医学部への移動があったため、研究システムをゼロから立ち上げる必要があったことと東日本大震災でダメージを受けた研究機器も一部あったために、その復旧に想定外の時間がかかってしまった。しかし、灌流システムや電気的ノイズを排除するためのケージなどに工夫を凝らし、これまでに使用していたシステムとほぼ同等のレベルまでに、漸く辿り着いた。また、本研究で用いる予定であったC-CPEを含むプラスミドを先の大震災で紛失してしまったため、国立大学法人大阪大学微生物研究所分子細菌学分野堀口教授に再度このプラスミドの分与をお願いし、平成23年12月中旬に再入手した。このプラスミドについては、無事に大腸菌を用いて培養保存することに成功し、今年度はこのプラスミドを大量に増やしたうえで、尿細管灌流実験で試薬として使用するために、C-CPEを分離精製する予定である。当初は、自身の研究室でこの作業を行う予定であったが、研究の進捗状況が芳しくないため、現時点では外部業者に委託して、時間の短縮を図る予定にしている。

最終的に、今年度の成果は残念ながらほとんど無かったが、実験開始状況が万端整ったので、この大幅な遅れを取り戻すべく、次年度は研究を推し進める予定である。クローディン4の特異的阻害薬であるClostridium perfringensenterotoxin(CPE)のC末端ペプチド断片の大量精製を昨年度試みたが成功しなかったため、別な手法で再度今年度行ったものの、十分量の精製されたC-CPEを得ることができず、この研究は一時的に保留せざるを得なかった。そのため、次年度に予定していたEpidermal Growth Factor(EGF)を用いた実験を前倒しで敢行した。ところが、EGFによるクローディン4蛋白発現増大効果を最大限に得るためには、長時間のインキュベーションが必要であることが実験中に解ってきた。しかし、長時間灌流法は細菌や真菌のコンタミネーションの問題があり、試行錯誤を繰り返しながら実験を継続してはいるものの、これらの困難のため研究の進展が遅れてしまっている。平成23年3月11日に発生した東日本大震災のため、前任地である東北大学は甚大な損害を受けました。さらに、研究代表者である森本は、平成23年4月1日付で駿河台日本大学病院小児科に転勤しました。研究を継続するために、日本大学医学部健診センターと東京医科歯科大学医歯薬学総合研究科に研究設備を再構築致しました。しかしながら、この東日本大震災の影響で、東北大学から日本大学および東京医科歯科大学への機器の搬入が大幅に遅れたことや搬入した一部の研究機器に不具合が見つかり、その復旧に多大な時間を費やしてしまった結果、研究の進捗状況が遅れております。次年度は、この遅れを挽回すべく研究に邁進する予定です。昨年のアメリカ腎臓学会で、単離した尿細管を1224時間経過後に、その尿細管機能を解析することができるという実験手法があることを知り得た。この手法は、マウス腎臓から標的尿細管分節を単離し、DMEM+10%FBSでインキュベーションした後に、灌流実験を行ないその特性を調べる手法であった。我々は、灌流しながら長時間インキュベーションすることをこれまで試みてきたが、コンタミネーションなどの問題があり実験手法を確立することができなかった。幸い、パーソナルインキュベーターは元々保有していたので、直ちにこの手法を習得すべく必要物品を揃え、予備実験を行なう準備を整えつつある。この手法を確立できれば、前年度に成功させることができなかったEGFを用いた灌流実験に取り組む予定である。また、C-CPEの精製に関しては、困難を極めているため異なる研究手法を検討している。上述の単離尿細管の長時間インキュベーション方が確立すれば、siRNAを用いた標的遺伝子のノックダウンも可能となりうるので、代替実験として行うことを視野に入れている。新しく尿細管灌流システムを作り上げたので、まず基礎データの取り直しを迅速に行う予定である。システムが従来と同等に稼働することを確認した後に、遅れている研究を早急に開始する。特に、直ぐに取り掛かることが可能な細いヘンレの上行脚におけるナトリウム輸送にかかわるシグナル伝達経路の解析を行う。
ヒトデ卵成熟機構におけるGTP結合蛋白質βσサブユニットの役割

ヒトデ卵母細胞は、ホルモンである1-メチルアデニン(1-MA)によって減数分裂を再開し成熟する。我々は、1-MA情報伝達系にGTP結合蛋白質(G)が関与することを見出し、Gのβγサブユニット(βγ)が卵成熟促進因子(MPF)の形成に働くことを明らかにして来た。本年度は、1)βγの卵内における分布、2)βγによって促進される蛋白質のリン酸化、について研究を行ない、下に示すような成果を得た。1)ヒトデGのβサブユニットに対する特異的なモノクローナル抗体を作成して、卵母細胞を蛍光顕微鏡観察したところ、細胞膜だけでなく、細胞内にも染色が認められた。細胞内には、約0.7μmおきにドット状またはビーズの様に染色される繊維が観察された。この繊維は網目状のネットワークを構成しており、細胞表層に密であるが、核の周囲においても存在していた。抗γ抗体を用いて二重染色したところ、全く同じ網目状のネットワークが得られた。これらの結果より、ヒトデ卵母細胞において、βγは細胞内の繊維上に存在することが明らかになった。さらに、この繊維は抗サイトケラチン抗体で染色されたことから、βγはヒトデ卵母細胞においてサイトケラチンと相互作用していると考えられる(Dev.Biol.,1995,in press)。2)MPF活性はリン酸化や脱リン酸化によって制御されていることから、βγによるMPF形成の過程にもリン酸化の関与が予想された。そこで本年度は、βγによってリン酸化される蛋白質の検出をin vitroで検出できる系を開発した。すなわち卵ホモゲネートに放射性のATPを加えたところ、64kDaの蛋白質がβγ特異的にリン酸化されることが明らかになった(未発表)。現在この蛋白質の同定を試みている。
金属中心キラリティー：オキソバナジウム錯体の動的不斉誘導と触媒的不斉反応

若手研究一年目は、オキソバナジウム錯体に着目した『金属中心キラリティー錯体の不斉誘導法の確立』を目指した。オキソバナジウム錯体は古くから有機合成や反応開発に利用されており、有機化学・生体化学において重要な化学種である。オキソバナジウム錯体は配位子の酸素原子で架橋した二核多核錯体を形成しやすく、ポリオキソ化体であるPOM錯体は例が多い。それに比べ四面体構造のオキソ金属錯体の合成例は少なく、アキラルな配位子から成る金属中心にキラリティーを有するオキソバナジウム錯体に至っては例がない。従って若手研究一年目は、まず1単核のバナジウム錯体を合成と2動的不斉誘導に焦点を当てて研究を行なった。1四面体構造を持つキラルオキソバナジウム錯体の合成検討アキラルな配位子を有する四面体構造の金属中心キラル錯体を合成するため、様々な二座配位子を新規設計・合成を行い、オキソバナジウム源{VO源= [VOCl3], [VO(OMe)3], [VO(Oi-Pr)3], [VO(Ot-Bu)3], [VO(OPh)3], [VO(H2O)nSO4], [VO(Phen)2SO4], [VO(acac)2]}との配位子交換反応による錯体の合成検討を行った。o-位にかさ高い置換基を有するビスフェノール型の二座配位子を利用した際、目的の四面体構造を持つオキソバナジウム錯体が得られることが判った。それらの構造・性質は各種NMR測定・分析測定、最終的に単結晶X線構造解析にて明らかにした。2キラル補助剤によるオキソバナジウム錯体の動的不斉誘導の検討合成単離した、アキラルなビスフェノール型の二座配位子を有する四面体構造のオキソバナジウム錯体に対し、キラル補助剤を作用することでキラル制御を試みた。キラル補助剤のキラルメモリーをオキソ金属錯体にインプリンティングすることで、金属中心キラル錯体を選択的に合成を試みた。若手研究一年目では、『アキラルな配位子から成る金属中心キラリティーを持つオキソバナジウム錯体の合成』を目的に研究を行った。以下に3つの課題を示す。1オキソバナジウム源の調整2四面体構造を持つキラルオキソバナジウム錯体の合成検討3キラル補助剤によるオキソバナジウム錯体の動的不斉誘導の検討12は概ね達成することができたが、3に関しては、ジアステレオ選択性を向上させる必要がある。アキラルな配位子からなる金属中心にキラルティーを有するオキソバナジウム錯体に対し、キラルアミン誘導体、キラルプロリン誘導体、キラルアルコール誘導体を検討した。キラルアミン誘導体およびキラルプロリン誘導体との検討は、想定した配位子交換反応が進行しなかった。しかし、一部キラルプロリン誘導体を利用した際、高収率でオキソバナジウム錯体による脱水反応が進行することを見出した。当初想定していなかったが、この結果はキラル補助剤によるキラル脱水反応の可能性を示唆している。また、この結果はDFT計算によってサポートされた反応経路である。一方、キラルアルコール誘導体との検討においても一部選択性が現れているので、配位子を再設計する事でジアステレオ選択性の向上を目指す。現在は、キラル脱水反応によるキラル転写とキラルアルコール誘導体によるジアステレオ選択性の向上に焦点を当てて検討している。1オキソバナジウム源の調整2四面体構造を持つキラルオキソバナジウム錯体の合成検討3キラル補助剤によるオキソバナジウム錯体の動的不斉誘導の検討今回の錯体はビスフェノール型の二座配位子のo-位にかさ高い置換基を導入することで、金属中心にキラリティーを導入し、さらに2つの置換基の大きさに差を付けることで、キラル補助剤によるキラル転写を試みたが、立体制御のみでは不十分であった。この問題点を解決するため二座配位子の再設計を試みる。即ち立体構造に加えて水素結合などの二次的相互作用(キレーション効果)を導入することで、キラル制御の効率化を目指す。具体的には、二座配位子のo-位のtert-ブチル基からホスフィンオキシド基やスルホニル基に変更する。立体構造は差がなく、酸素原子の孤立電子対によるキレーション効果が期待できる。1四面体構造を持つキラルオキソバナジウム錯体の合成検討

アキラルな配位子を有する四面体構造の金属中心キラル錯体を合成するため、様々な二座配位子を新規設計・合成を行い、オキソバナジウム源{VO源= [VOCl3], [VO(OMe)3], [VO(Oi-Pr)3], [VO(Ot-Bu)3], [VO(OPh)3], [VO(H2O)nSO4], [VO(Phen)2SO4], [VO(acac)2]}との配位子交換反応による錯体の合成検討を行った。o-位にかさ高い置換基を有するビスフェノール型の二座配位子を利用した際、目的の四面体構造を持つオキソバナジウム錯体が得られることが判った。それらの構造・性質は各種NMR測定・分析測定、最終的に単結晶X線構造解析にて明らかにした。2キラル補助剤によるオキソバナジウム錯体の動的不斉誘導の検討合成単離した、アキラルなビスフェノール型の二座配位子を有する四面体構造のオキソバナジウム錯体に対し、キラル補助剤を作用することでキラル制御を試みた。キラル補助剤のキラルメモリーをオキソ金属錯体にインプリンティングすることで、金属中心キラル錯体を選択的に合成を試みた。若手研究一年目では、『アキラルな配位子から成る金属中心キラリティーを持つオキソバナジウム錯体の合成』を目的に研究を行った。以下に3つの課題を示す。1オキソバナジウム源の調整2四面体構造を持つキラルオキソバナジウム錯体の合成検討3キラル補助剤によるオキソバナジウム錯体の動的不斉誘導の検討12は概ね達成することができたが、3に関しては、ジアステレオ選択性を向上させる必要がある。アキラルな配位子からなる金属中心にキラルティーを有するオキソバナジウム錯体に対し、キラルアミン誘導体、キラルプロリン誘導体、キラルアルコール誘導体を検討した。キラルアミン誘導体およびキラルプロリン誘導体との検討は、想定した配位子交換反応が進行しなかった。しかし、一部キラルプロリン誘導体を利用した際、高収率でオキソバナジウム錯体による脱水反応が進行することを見出した。当初想定していなかったが、この結果はキラル補助剤によるキラル脱水反応の可能性を示唆している。また、この結果はDFT計算によってサポートされた反応経路である。一方、キラルアルコール誘導体との検討においても一部選択性が現れているので、配位子を再設計する事でジアステレオ選択性の向上を目指す。現在は、キラル脱水反応によるキラル転写とキラルアルコール誘導体によるジアステレオ選択性の向上に焦点を当てて検討している。1オキソバナジウム源の調整2四面体構造を持つキラルオキソバナジウム錯体の合成検討3キラル補助剤によるオキソバナジウム錯体の動的不斉誘導の検討今回の錯体はビスフェノール型の二座配位子のo-位にかさ高い置換基を導入することで、金属中心にキラリティーを導入し、さらに2つの置換基の大きさに差を付けることで、キラル補助剤によるキラル転写を試みたが、立体制御のみでは不十分であった。この問題点を解決するため二座配位子の再設計を試みる。即ち立体構造に加えて水素結合などの二次的相互作用(キレーション効果)を導入することで、キラル制御の効率化を目指す。具体的には、二座配位子のo-位のtert-ブチル基からホスフィンオキシド基やスルホニル基に変更する。立体構造は差がなく、酸素原子の孤立電子対によるキレーション効果が期待できる。当初予定していたよりもバナジウム錯体が不安定であったため、不安定な錯体を合成する設備を整える必要が生じた。