hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい網羅的遺伝子解析を用いた食道癌化学放射線療法耐性遺伝子の解明

それぞれの抗癌剤耐性株および野生株をそれぞれマウスに移植し、実際に抗癌剤をマウスに投与し野生株、耐性株の抗癌剤感受性を比較検証する。さらにそれぞれの耐性遺伝子の耐性の獲得のメカニズムを解明していく。過去の臨床検体を用いて、それぞれの遺伝子発現と実際の化学療法の効果とを比較して、その遺伝子が化学療法の効果予測のsurrogate markerになり得るかを検証する。トランスポゾンを用いた網羅的遺伝子解析の手法によって37の候補遺伝子が同定され、その中にはMRP1 (Multidrug resistance protein1)を含んでおり、既知の耐性遺伝子を含んでいることより、この実験手法が十分に機能していることが確認できた。今年度に動物実験をする予定であった、来年度に施行することになっため、当初の予定より支出が減少したため。また、学会参加費などを次年度に使用することにしたため。同定した遺伝子が実際に薬剤耐性遺伝子であることの確認する。1.耐性遺伝子を食道細胞野生株へ導入し、シスプラチン耐性が生じるか否かを検証する。2.耐性遺伝子を有する食道細胞野生株からsiRNAにて遺伝子をknockdownし、シスプラチンへの感受性が上がるかを検証する。3.マウスxenograftでの薬剤耐性の判定。食道癌野生株と、耐性遺伝子を導入した治療耐性株のマウスxenograftモデルを作成し、シスプラチンによる治療効果を判定する。4.臨床検体における遺伝子発現状況と薬剤効果との相関を評価する。次年度はマウスを用いたin vivoの実験を施行する予定であり、マウスを購入予定である。また、研究成果を学会で報告するため、旅費として使用する予定である。効果的な物品調達を行い、まだ調査研究費、成果報告する段階ではないため、費用としての国内・国外旅費、謝金、その他の支出を最小限としたため。翌年度のマウスの購入費用、抗体・試薬費用、細胞培養機器・培養液などの購入費用、調査研究費、成果報告費用として国内・国外旅費に充てる予定である。平成26年度は主にin vitroと動物モデルを用いた研究を行う。また臨床検体における遺伝子発現状況と薬剤効果との相関を評価する。そのため、マウスの購入費用、抗体・試薬費用、細胞培養機器・培養液などの購入費用が主となる。調査研究費、成果報告費用として国内・国外旅費を計上する。また謝金、その他は必要最小限とるする見込みである。
歯周病原細菌のECFシグマ因子を利用した新たな歯周病予防法の開発

本研究では、歯周病原細菌Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株における5種類のECFシグマ因子と病原性について検討した。野生株と比較し, PGN_0274変異株は赤血球凝集能を認めず,自己凝集能の低下を認めた。さらに透過型電子顕微鏡による菌体表層構造の観察では, PGN_0274変異株においてvesicle形成の増加と,細胞壁部分の厚みの低下が認められた。これらの実験結果を考慮すると、P. gingivalis ECFシグマ因子PGN_0274の働きを阻害することによりP. gingivalisの歯周病原性を弱め、歯周病の予防へと繋がることが期待できる。1.PGN_1740変異株のバイオフィルム形成増加に関与する遺伝子の同定我々は最初にPGN_1740変異株におけるバイオフィルム形成増加に線毛が関与するとの予測をたて、P. gingivalis線毛遺伝子(fimA, mfa1)の転写量をリアルタイムPCR法により解析を試みた。その結果、野生株とPGN_1740変異株において両遺伝子の転写量は同程度であった。また、PG1827変異株において線毛発現に関与する二成分制御系の構成タンパクFimSの転写量が増加するという現象がすでに他グループにて報告されており、我々も同様の解析を試みた。だが、野生株とPGN_1740変異株においてfimSの転写量は同程度であった。これらの結果よりPGN_1740変異株のバイオフィルム形成量の増加は、線毛以外の要因に起因する可能性が示唆された。次に、線毛以外にバイオフィルム形成に関与すると推測される遺伝子について野生株およびPGN_1740変異株にて転写量の変化をリアルタイムPCR法にて解析を試み、現在数種類の遺伝子を候補としてリストアップしている。2.5種類のECFシグマ因子変異株におけるジンジパイン(Rgp, Kgp)活性測定P. gingivalisの病原性に深く関与するジンジパイン(システインプロテアーゼ)Rgp, KgpとECFシグマ因子の関連性について解析を試みた。野生株(ATCC33277株)とECFシグマ因子変異株5種類を用い静止期におけるRgp, Kgp活性を測定した。その結果PGN_0274変異株にてRgp, Kgp活性の顕著な低下を認めた。この結果は、PGN_0274変異株が血液寒天培地上にて黒色集落を形成せず透明な集落を形成するという事実と矛盾しない結果となった。1.PGN_1740が直接転写調節しているバイオフィルム形成増加因子の同定PGN_1740変異株におけるバイオフィルム形成増加に関係すると予測されるタンパク質Xについて、PGN_1740が直接そのタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に結合するかEMSA解析を行うことにした。最初にPGN_1740の組換えタンパク質(ヒスチジンタグ)を大腸菌にて発現・精製した。次に5'-RACE法によりタンパク質X遺伝子の転写開始点を同定した。次に予測されるプロモーター領域のオリゴを合成し、EMSA解析を行った。その結果、PGN_1740はタンパク質X遺伝子のプロモーター領域に結合することが判明した。よって、PGN_1740はあるタンパク質Xの転写を調節し、菌のバイオフィルム形成をコントロールしていることが判明した。2.ECFシグマ因子と薬剤感受性との関連性Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)の薬剤感受性とECFシグマ因子との間の関連性の有無について解析を試みた。実験方法としては、抗菌薬(細胞壁合成阻害剤:アンピシリン、タンパク合成阻害剤:テトラサイクリン、核酸合成阻害剤:オフロキサシン)を用い野生株とECFシグマ因子変異株のMICを測定することで比較検討した。その結果、テトラサイクリン、オフロキサシンに対する感受性に顕著な変化は認められなかったものの、アンピシリンに対する感受性はPGN_0274変異株で増加、PGN_0450, PGN_1740変異株で低下した。平成27年度の研究実施計画にて当初予定していた「PGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子群のプロモーター解析」の、PGN_1740に関しては計画通り進み、結果も得ることができたからである。PGN_0274については、連携研究者の中山浩次教授の教室にて解析が進み今年度学術論文として報告をしている。(Kadowaki T. et al., Sci Rep. 2016 Mar 21;6:23288)またこの論文にて、前年度の研究計画に挙げていた「ジンジパイン分泌および酸化ストレス回避におけるPGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子群の解析」の研究のPGN_0274に関しては、P. gingivalisのPor分泌システムに属する二成分制御系PorX, PorYのPorXとPGN_0274が連動してジンジパインの膜外輸送を行っていることが報告された。以上の実験と同時に行う予定であった、「PGN_0274, PGN_1740支配下タンパクに関するプロテオーム解析」は行うことができなかった。この理由として、「PGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子群のプロモーター解析」に予想外の研究期間がかかったためである。PGN_1740の組換えタンパク質を大腸菌にて発現する時、可溶性画分に発現が増加する条件の検討に時間を要したことが一番の原因である。

このことより実験計画の遅れを予想したため、来年度の予備実験になり実験準備にあまり時間がかからない薬剤感受性試験を今年度行い、P. gingivalisの病原性とECFシグマ因子との関連性について解析した。本研究では、歯周病原細菌Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) ATCC 33277株における5種類のECFシグマ因子遺伝子挿入変異株を用いて、ECFシグマ因子と病原性の関連について検討した。野生株と比較し, PGN_0274変異株は赤血球凝集能を認めず,自己凝集能の低下を認めた。さらに透過型電子顕微鏡(TEM)による菌体表層構造の観察では, PGN_0274変異株においてvesicle形成の増加と,細胞壁部分の厚みの低下が認められた。当初の研究目的の「PGN_0274とPGN_1740を標的とした歯周病予防薬開発の可能性」を検討する際、ECFシグマ因子PGN_0274は、P. gingivalisの歯周病原性と深い関わりがあるかどうかが重要となる。しかし、今年度の実験結果を考慮すると、PGN_0274はP. gingivalisの歯周病原性発現に重要な役割を果たしていることが認められ、歯周病予防薬開発の際に、候補分子とする根拠となるデータを得ることができたことが、非常に意義あることと考える。我々と他の研究グループによって、PGN_0274は菌体膜輸送に重要な役割を果たし、強力なタンパク質分解酵素であるジンジパイン(Rgp, Kgp)の分泌に関わることを明らかにした。またPGN_1740は偏性嫌気性菌であるP. gingivalisの酸化ストレス防御に深く関わるとの報告もある。今年度の結果と前年度までの実験結果を考慮すると、P. gingivalis ATCC 33277株におけるECFシグマ因子PGN_0274とPGN_1740の働きを阻害することでP. gingivalisの歯周病原性を弱め、歯周病の予防へと繋がることが期待できる。本研究では、歯周病原細菌Porphyromonas gingivalis ATCC 33277株における5種類のECFシグマ因子と病原性について検討した。さらに透過型電子顕微鏡による菌体表層構造の観察では, PGN_0274変異株においてvesicle形成の増加と,細胞壁部分の厚みの低下が認められた。これらの実験結果を考慮すると、P. gingivalis ECFシグマ因子PGN_0274の働きを阻害することによりP. gingivalisの歯周病原性を弱め、歯周病の予防へと繋がることが期待できる。平成26年度の研究実施計画にて当初予定していた「バイオフィルム形成に関わるPGN_0274, PGN_1740支配下遺伝子群の解析」については、PGN_1740を中心に今年度は解析を行い、PGN_0274についてはまだ解析していないという状況である。その理由として、本学に次世代シークエンサーが年度末に配置される予定であったため、配置後次世代シークエンサーを用いて研究を進める予定に変更を行ったためである。よって、次年度である平成27年度にPGN_0274およびPGN_1740の支配下遺伝子の探索を次世代シークエンサーにて行うこととしている。
耐塩性イネにおけるシアン耐性呼吸の生理学ならびに分子生物学的解析

イネの耐塩性程度にはNa吸収が密接に関係し,耐塩性の向上にはNa吸収抑制が重要である.本研究では,シアン耐性呼吸が細胞pHの制御を通じて,Na+吸収抑制に貢献しているかどうかを検討した.その結果,シアン耐性呼吸は,細胞pHの制御を通じてNa吸収抑制に関与することが明らかになった.しかし,この機構が耐塩性の品種間差におよぼす影響は,比較的小さいと考えられた.イネは世界の主要な作物の一つであるが,他の作物と比較して塩に弱いために耐塩性の向上が求められている.これまでの研究で耐塩性のイネ品種IR4595-4-1-13 (以下IR4595)は塩感受性品種のMangasaと比べてシアン耐性呼吸が高い事が報告されている.これまでに,塩条件においてシアン耐性呼吸は活性酸素の発生抑制に関わることが報告されており,さらに,細胞内pHの制御を通じてイネの耐塩性の向上に関わることが,塩処理後の根表面のpH測定から示唆されている.しかしながら,根表面のpHが細胞内pHと一致するかどうかは明らかでない.そこで本研究では,イネ2品種を用いて塩条件下での根表面のpHと,根を磨砕して得られた液のpHを比較するとともに,プロトプラストを作成して,細胞内pHならびに細胞内Na+濃度の測定法を検討した.その結果,塩処理12時間後のIR4595の根表面のpHはMangasaよりも高く,6時間後と24時間後でも同様の傾向があった.またSHAM処理では根表面pHの低下が認められ,シアン耐性呼吸のpH制御への関与が示唆された.2品種の対照区と塩処理区の根磨砕液のpHは5.6から6.1の範囲にあり,SNARF-4Fによる根表面のpH測定値より低く,品種間差及び塩処理の影響も根表面の測定と異なった.根磨砕液にはアポプラスト液が多く含まれると考えられることから,細胞内pHの測定が必要と考えられた.そこで,葉のプロトプラスト細胞内pHを測定したところ,塩処理1時間後にMangasaで低下する傾向が示され,SHAM処理では両品種のpHの低下が認められ,根表面のpH測定とほぼ一致した.しかしながら,細胞内pHの値にはばらつきが大きく,測定精度をさらに上げる必要がある.昨年度までの実験から,イネのシアン耐性呼吸が根の細胞pHの制御を通じて,Na吸収抑制に関与することが示された.しかしながら,根プロトプラストにおける細胞質pHの測定値の変動が大きく,さらなる検討が必要であった.また,イネの耐塩性は根のNa排除が重要とされるため,シアン耐性呼吸によるNa排除におよぼす影響の程度を見積もる必要がある.そこで,培養液のpHを変えることで,細胞内外のpH差をつくり,耐塩性の異なる29品種を用いてNa排除におよぼす影響を検討した.その結果,塩処理を行った根のプロトプラストには,死細胞が多く含まれており,このことが細胞質pHの測定値を大きく変動させていた.このため,蛍光pH指示薬に死細胞染色試薬を加えることで,測定精度は大きく改善されたが,根のプロトプラストでは,酸性条件での塩処理では生存率が極めて低く,細胞質pHの校正曲線の作成が困難であった.また,供試した何れの品種でも培養液pHが高いほどNa吸収が高まり,Na吸収は細胞内外のpH差の影響を強く受けることを示された.しかしながら,どのpHでも耐塩性品種は感受性品種よりもNa吸収が低かった.このため,シアン耐性呼吸は,細胞質pHの制御を通じてNa吸収抑制に関与するものの,Na吸収の品種間差には,細胞内外のpH差に依存するNa排出機構以外の要因の影響が大きく,シアン耐性呼吸によるNa吸収抑制効果も比較的小さいと考えられた.イネの耐塩性程度にはNa吸収が密接に関係し,耐塩性の向上にはNa吸収抑制が重要である.本研究では,シアン耐性呼吸が細胞pHの制御を通じて,Na+吸収抑制に貢献しているかどうかを検討した.その結果,シアン耐性呼吸は,細胞pHの制御を通じてNa吸収抑制に関与することが明らかになった.しかし,この機構が耐塩性の品種間差におよぼす影響は,比較的小さいと考えられた.土壌の塩類化は世界で大きな問題となっているが,主要作物のイネは他の作物に比べて塩に弱いことが報告されている.このため,イネの耐塩性の向上が求められている.これまでにイネの耐塩性品種IR4595-4-1-13 (以下IR4595)は,感受性品種のMangasaに比べてシアン耐性呼吸が高く,活性酸素の発生抑制を通じて耐塩性の向上に関わると考えられた.一方,シアン耐性呼吸は,細胞pHの制御にも関与することが報告されている.また,細胞でのNa+の排出と液胞への隔離には,細胞pHが密接に関与することが報告されている.そこで、本研究では,塩条件下でのシアン耐性呼吸が細胞pHとNa+吸収に及ぼす影響を明らかにするため,蛍光試薬を用いて根における細胞pHおよびNa+蓄積を解析する手法を確立するとともに,塩条件下でのシアン耐性呼吸が細胞pHに及ぼす影響ならびに根のNa+蓄積について検討した.その結果, IR4595と比較してMangasaでは根端部分と先端から1cm付近の両方で強い蛍光が認められ,1cm付近では木部部分が強く蛍光しており,これらの部分にNaが多く蓄積していることが示された.

さらに,塩処理と同時にシアン耐性呼吸の阻害剤を与えた場合,両品種とも根のpHが大きく低下し,シアン耐性呼吸はpHの制御に密接に関与していると考えられた.さらに,Mangasaの根表面では,根端部分と先端から1cm付近の両方で塩処理によりpHが大きく低下したのに対して,IR4595の根端部分ではpHの低下が小さく,1cm付近ではpHの変化が認められなかった.これらのことから,シアン耐性呼吸は,根の細胞pHの制御に密接に関与することが明らかになるとともに,IR4595では塩条件下でも根の細胞pHが高く維持されており,このことが, Na+吸収の抑制に貢献しているものと考えられた.生理的機構に関する研究では,シアン耐性呼吸の阻害剤を用い,根表面とプロとプラストのNaとpH測定を行い,シアン耐性呼吸が細胞pHに密接に関わっていることを明らかにした.一方,AOXの過剰発現体の作出が進んでおらず,このためAOXが耐塩性に関係することを証明するための研究がやや遅れている.23年度の計画として予定していた,根のNa局在の可視化と細胞質pHの方法の確立を行った.一方,耐塩性品種と感受性品種のシアン耐性呼吸に関与するオルターナティブオキシダーゼの塩基配列の測定を計画していたが,この実験は24年度に行うこととし,代わりに24年度の計画していたシアン耐性呼吸の阻害剤を用いた場合の根のNaとpH測定を行い,シアン耐性呼吸が細胞pHに密接に関わっていることを明らかにした.全体的には,おおむね順調な進展状況にあると言える.現在,AOXの過剰発現体の作出が困難であることから,他国で作出されたAOXの遺伝子組み換え体を輸入して,AOXの生理的意義に関する実験を展開させる.23年度に予定していたオルターナティブオキシダーゼの塩基配列の測定を24年度に行うこととした.この理由としては,シアン耐性呼吸が細胞pHに密接に関与することを明らかにすること,耐塩性品種のNa吸収抑制にも密接に関係していることを明らかにすることがより重要であると考えたためである.なお,この実験は24年度に予定していた実験である.24年度は,まずはこのオルターナティブオキシダーゼの塩基配列の測定を行い,耐塩性品種と感受性品種のシアン耐性呼吸活性の差の原因を検討する.さらに,シアン耐性呼吸が細胞pHの制御を通じてどのようにNaの吸収抑制に関与しているかを調べる.AOXの過剰発現体の作出の遅れに伴い,その材料を用いた研究のための予算執行が遅れている.今年度は,他国から,遺伝子組換え植物を輸入し,それを材料に予定していた実験を行い,生理的実験と遺伝子解析のための試薬類に研究費の大部分を使用する予定である.23年度と24年度の一部の実験の順番を入れ替え,23年度に遺伝子の解析に用いる物品の購入を行わなかったため,23年度は予定していた金額よりも使用額が少なかったが,24年度には遺伝子解析のための物品が必要になる.さらに,プロトプラストにおける,Naの定量やpHの測定には,高価な蛍光試薬が必要であり,生理的実験と遺伝子解析のための試薬類に研究費の大部分を使用する予定である.
全光信号処理のための超小型全光ダイオードの実現に向けた研究

光通信機器における信号処理を全て光信号で行う「全光信号処理」を実現する全光デバイスは、デバイスの消費電力を3桁程度削減可能であるものとして期待されている。これまで、2010年には全光スイッチ、2012年には全光メモリが実験的に確認されたことで,世界的な注目を集めてきたが、光整流ダイオード(全光ダイオード)については、順方向透過率や整流特性、波長特性が乏しく、未だ実現が困難な状況である。そこで本研究では、優れた整流特性および高い実現可能性を有する全光ダイオードを設計開発することを目的として、フォトニック結晶共振器を用いたシリコン全光ダイオードの研究を進めてきた。前年度までに、従来報告されてきた全光ダイオードと比較して、より実現性の高く、高い透過特性および整流特性を有するダイオードが実現可能であることを理論的に確認した。2年目となる本年度は、前年度設計した全光ダイオードを作製し、測定実験を行う予定であったが、フォトニック結晶デバイスを設計通りに作製することができず、ダイオード動作の実験実証までには至らなかった。具体的には、フォトニック結晶光共振器の入出力導波路部分に問題があり、空孔間隔や、曲げ導波路の配置を工夫して、シミュレーション通りの実験測定結果が得られない問題を回避した。現在、改めて設計デバイスのチップ作製を行っている最中であり、実際に実験測定のフェーズに入るのは次年度以降となる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、1年目の研究実施計画にしたがって、全光ダイオードの構成要素であるフォトニック結晶光共振器の基本特性を調査するとともに、全光ダイオードの設計を行ってきた。これまで、サイドカップル型フォトニック結晶光共振器を多段にカスケード接続したタイプ、1次元フォトニック結晶結合共振器型光導波路を用いたタイプ、ならびに、1ポート共振器と4ポート共振器を組み合わせたタイプの、全3種類のデバイスを新規に設計し、従来報告されてきた全光ダイオードと比較して、より実現性の高く、高い透過特性および整流特性を有するダイオードが実現可能であることを理論的に確認した。以上の研究成果については、既に査読付き国際学術論文誌に1件採録されており、1件の国内学会におけるポスター発表、ならびに、1件の国際会議における口頭発表を行った。全光ダイオードの理論設計を行った結果、優れた整流特性および高い実現可能性を有する3種類の全光ダイオードが新規提案された。(1)まず、サイドカップル型フォトニック結晶光共振器を多段にカスケード接続し、各共振器の配置を適切に制御することで、順方向透過特性を損なうことなく、高い整流特性を得られることが明らかとなった。(2)次に、光バンド内遷移に基づく、1次元フォトニック結晶結合共振器型光導波路を用いた全光ダイオードを新規に設計したところ、簡易な構成で整流特性が得られることが理論的に確認された。(3)さらに、1ポート共振器と4ポート共振器を組み合わせた全光ダイオードについても検討したところ、広帯域な整流特性が得られることがが理論的に確認された。これらの全光ダイオードのうち、(1)のデバイスについては、CMOSファウンダリを用いたデバイス試作段階に入ったところである。以上より、全光ダイオードの理論設計が滞りなく進められ、デバイス試作についても進行中であることから、本研究は当初の計画通り、おおむね順調に進展していると判断した。具体的には、フォトニック結晶光共振器の入出力

導波路部分に問題があり、空孔間隔や、曲げ導波路の配置を工夫して、シミュレーション通りの実験測定結果が得られない問題を回避した。現在、改めて設計デバイスのチップ作製を行っている最中であり、実際に実験測定のフェーズに入るのは次年度以降となる。当初の計画通り、フォトニック結晶の基本特性調査、および、3種類の全光ダイオード設計については既に終えている。今後は、1次元フォトニック結晶結合共振器型光導波路を用いた全光ダイオードに関する研究成果、および、1ポート共振器と4ポート共振器を組み合わせた全光ダイオードに関する研究成果を、国内外の学会・学術誌等で報告していく。また、サイドカップル型フォトニック結晶光共振器を用いた全光ダイオードについては、現在試作中のデバイスが完成次第、本年度中にデバイス実験測定を行い、その結果について報告していく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
プロテオミクスによるWntシグナルと核内受容体の脂肪細胞におけるシグナル統合解析

脂肪細胞分化において、分化誘導のマスターレギュレータPPARγが分化を完成させるメカニズムの一端として、ヒストン修飾酵素の発現を制御し、エピジェネティックな制御機構を担うことを解明した。また、Wntが脂肪細胞分化を抑制する機構として、核内受容体COUP-TFIIの転写を促進し、これがPPARγの転写調節領域に結合し、ヒストン脱アセチル化複合体を介してPPARγ発現を抑制するメカニズムを解明した。A.WntがPPAR_Y(さらにC/EBPα)遺伝子発現を抑制する機序:ssカテニンのChIP on ChipからCOUP-TFIIがWnt/ssカテニンの直接の標的遺伝子であることを、まず明らかにした。COUP-TFIIの3T3L1への強制発現は脂肪細胞の分化を抑制し、逆にRNA干渉によりCOUP-TFIIの発現を低下させると脂肪細胞に分化しやすくした。さらにCOUP-TFIIが脂肪細胞分化を制御するメカニズムを解析するために、COUP-TFII抗体を用いてChIP on Chipを行った。その結果、COUP-TFIIは脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるPPAR_Y遺伝子の開始コドンを含むエキソンのすぐあとのイントロンに結合することを見いだした。では次にCOUP-TFIIはどのようにしてPPAR_Y遺伝子発現を抑制するかを解析した。ヒストン脱アセチル化酵素複合体の1つであるSMRTはCOUP-TFIと複合体を形成すると報告されている。私たちはChIPによりSMRTがPPAR_Yのイントロン領域にリクルートされていること、そしてRNAi干渉によりSMRTの発現を低下させると、COUP-TFIIによる脂肪細胞分化抑制が解除されることを見いだした。このことは、COUP-TFIIがPPAR_Y2遺伝子上でヒストン脱アセチル化酵素複合体のひとつSMRTと複合体を形成すること、PPAR_Y遺伝子上にリクルートされ、PPAR_Y遺伝子を脱アセチル化することを示すものである。以上より、細胞外分泌蛋白であるWntが脂肪細胞の分化を抑制するメカニズムとして、核内受容体COUP-TFIIを介し、脂肪細胞のマスターレギュレーターであるPPAR_Y遺伝子発現をヒストンの脱アセチル化を介して抑制する一連のメカニズムを明らかにした。この成果はProc Natl Acad Sci USA.10, 5819-5824, 2009に掲載された。B.核内受容体PPAR_Yの標的遺伝子のゲノムワイド解析(ChIP on Chip解析)から、エピゲノムを制御する標的遺伝子の探索を行った。その結果、PPAR_YによってヒストンH3の9番目のリジン(H3K9)のメチル化修飾をするSetdb1は転写レベルで負に、ヒストン4の20番目のリジン(H4K20)のモノメチル化酵素Setd8は正に制御される標的遺伝子であることを見いだした。さらに、H3K9トリメチル修飾は脂肪細胞分化抑制に、そしてH4K20モノメチル化は分化促進に働くことを見いだした。以上より、PPAR_Yはこれらヒストン修飾酵素遺伝子のメチル化状態を変えることでこれらの遺伝子発現を制御し、さらにこれを介して脂肪細胞の分化をエピゲノム修飾から制御する経路があることを発見した。この成果はMol.Cell.Biol., 29, 3544-3555, 2009に掲載された。1.WntがPPARγ(さらにC/EBPα)遺伝子発現を抑制する機序:βカテニンのChIP on ChipからCOUP-TFIIがWnt/βカテニンの直接の標的遺伝子であることを、まず明らかにした。その結果、COUP-TFIIは脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるPPARγ遺伝子の開始コドンを含むエキソンのすぐあとのイントロンに結合することを見いだした。では次にCOUP-TFIIはどのようにしてPPARγ遺伝子発現を抑制するかを解析した。私たちはChIPによりSMRTがPPARγのイントロン領域にリクルートされていること、そしてRNAi干渉によりSMRTの発現を低下させると、COUP-TFIIによる脂肪細胞分化抑制が解除されることを見いだした。このことは、COUP-TFIIがPPARγ2遺伝子上でヒストン脱アセチル化酵素複合体のひとつSMRTと複合体を形成すること、PPARγ遺伝子上にリクルートされ、PPARγ遺伝子を脱アセチル化することを示すものである。以上より、細胞外分泌蛋白であるWntが脂肪細胞の分化を抑制するメカニズムとして、核内受容体COUP-TFIIを介し、脂肪細胞のマスターレギュレーターであるPPARγ遺伝子発現をヒストンの脱アセチル化を介して抑制する一連のメカニズムを明らかにした。

この成果はProc Natl Acad Sci USA.10, 5819-5824, 2009に掲載された。2.核内受容体PPARγの標的遺伝子のゲノムワイド解析(ChIP on Chip解析)から、エピゲノムを制御する標的遺伝子の探索を行った。その結果、PPARγによってヒストンH3の9番目のリジン(H3K9)のメチル化修飾をするSetdb1は転写レベルで負に、ヒストン4の20番目のリジン(H4K20)のモノメチル化酵素Setd8は正に制御される標的遺伝子であることを見いだした。さらに、H3K9トリメチル修飾は脂肪細胞分化抑制に、そしてH4K20モノメチル化は分化促進に働くことを見いだした。以上より、PPARγはこれらヒストン修飾酵素遺伝子のメチル化状態を変えることでこれらの遺伝子発現を制御し、さらにこれを介して脂肪細胞の分化をエピゲノム修飾から制御する経路があることを発見した。この成果はMol.Cell.Biol., 29, 3544-3555, 2009に掲載された。また、上記1および2の論文はレビューとしてOrganogenesis, 6, 24-32, 2010に掲載した。
ALS患者組織でのRNA結合タンパク質メチル化修飾とストレス防御機構の検証研究

筋萎縮性側索硬化症(ALS)とは、運動ニューロンが進行性の細胞死に陥る神経変性疾患である。最近ではRNA代謝制御機能を持つRNA結合タンパクの機能異常がALS発症にかかわる可能性がある。ALSモデル細胞で、RNA結合タンパク質機能に異常が生じた細胞ではRNA保護機構が正常でなくなることが確認され、アルギニンメチル化酵素PRMT1によりRNA認識領域でのジメチル化修飾が付与されることが知られている。本研究では、ヒトのALS患者におけるPRMT1遺伝子の変異発現の検出・検証を行い、RNA結合タンパク質へのアルギニンメチル化修飾制御機構とメカニズムの解明を行い、分子標的治療の可能性を検証する。
心筋ストレッチ応答チャネル周辺の情報伝達機構とその循環病態生理における意義の研究

心臓は常に収縮・拡張の物理力の影響下におかれており伸展刺激により活性化されるイオンチャネルの生理的意義は大きい。本研究計画では伸展刺激活性化チャネル周辺の情報伝達の分子機構を明らかにするため同チャネルに結合する分子を心臓cDNAライブラリーから酵母2ハイブリッド法を用いスクリーニングし蛋白-蛋白相互作用による機能調節を検討した。伸展刺激活性化クロライドチャネルであるCIC-2のカルボキシ末端には細胞周期に関連する蛋白が3種類結合した。In vitroりん酸化アッセイではCIC-2のカルボキシ末端が細胞分裂期(M期)の活性の上昇するp34cdc2/cyclineBおよびMAPキナーゼにより直接りん酸化をうけること、電気生理学的アッセイによりCIC-2チャネルがp34cdc2/cyclineBによるりん酸化により機能抑制をうけ、蛋白脱りん酸化酵素によりチャネル活性が上昇することが判明した。また卵母細胞の発現システムを用いた実験ではCIC-チャネル活性化により細胞容積が減少し、CIC-2チャネル抑制により細胞容積が増大することが判明した。半定量的逆転写PCR法を用いた実験ではCIC-2のメッセージは胎児期および肥大心で増加していた。以上の結果からCIC-2チャネルは細胞分裂における急激な細胞容積変化に重要な役割を演じるチャネルであり、サイクリン依存性キナーゼによる可逆的りん酸化・脱りん酸化によりチャネル活性が機能調節をうけること、転写レベルでも細胞周期のステージにより発現調節をうけることが示唆された。心筋細胞における伸展刺激応答チャネル周辺の情報伝達機構を解明するうえで得られた本年度の研究実績は以下の通りである。(1)伸展刺激応答チャネルClC-3をプローブとして心筋細胞に発現する類似チャネルのクローニングを試みた。心筋cDNAライブラリーからClC-3の選択的スプライシング亜型を得、全塩基配列を決定した。同cDNAは従来のClC-3と比較して塩基配列が長いためClC-3Lと呼ぶことにする。組織分布をNorthern blotting法・逆転写PCR法にて検索したところClC-3はすべての組織に分布するのに対してClC-3Lは上皮細胞系と心臓・脳に局在していた。(2)蛋白-蛋白相互作用の観点から伸展刺激応答機構を検討するため、ClC-3およびClC-3Lと結合する蛋白をスクリーニングした。ClC-3のC端と結合する蛋白が3種類、ClC-3LのC端と結合する蛋白が1種類得られた。ClC-3 C端と結合する蛋白の一つはアポトーシスを起こす細胞で細胞縮小直前に発現する蛋白であり、この相互作用がアポトーシスの細胞縮小に関連する可能性を検討中である。(4)伸展刺激応答チャネルClC-3の発現量が循環器病態で修飾を受けるか否か検討するため、圧負荷・容量負荷で伸展刺激がかかったときClC-3発現量が変化するかどうか半定量逆転写PCR法で検討した。圧負荷・容量負荷はラット腹部大動脈狭窄モデルを使用した。その結果ClC-3は圧負荷にてup-regulationされることが分かった。現在この情報伝達に関する詳細の検討を計画している。来年度はこれら蛋白-蛋白相互作用から心筋伸展刺激応答チャネル周辺の情報伝達機構を更に詳細に検討する。心臓は常に収縮・拡張の物理力の影響下におかれており伸展刺激に活性化されるイオンチャネルの生理的意義は大きい。本研究計画では伸展刺激活性化チャネル周辺の情報伝達の分子機構を明らかにするため同チャネルに結合する分子を心臓cDNAライブラリーから酵母2ハイブリッド法を用いスクリーニングし蛋白-蛋白相互作用による機能調節を検討した、伸展刺激活性化クロライドチャネルであるClC-2カルボキシ末端には細胞周期に関連する蛋白が3種類結合した。In vitroりん酸化アッセイではClC-2カルボキシ末端が細胞分裂期(M期)に活性の上昇するp34cdc2/cyclineBおよびMAPキナーゼにより直接りん酸化をうけること、電気生理学的アッセイによりClC-2チャネルがp34cdc2/cyclineBによるりん酸化により機能抑制をうけ、蛋白脱りん酸化酵素によりチャネル活性が上昇することが判明した。

また卵母細胞の発現システムを用いた実験ではClC-チャネル活性化により細胞容積が減少し、ClC-2チャネル抑制により細胞容積が増大することが判明した。半定量的逆転写PCR法を用いた実験ではClC-2のメッセージは胎児期および肥大心で増加していた。以上の結果からClC-2チャネルは細胞分裂における急激な細胞容積変化に重要な役割を演じるチャネルであり、サイクリン依存性キナーゼによる可逆的りん酸化・脱りん酸化によりチャネル活性が機能調節をうけること、転写レベルでも細胞周期のステージにより発現調節をうけることが示唆された。
相分離界面に関連した長距離相関を持つ確率場の研究

本研究では相分離界面や細胞膜などの数学的な解析を目指し,関連した長距離相関を持つ確率場の研究を行った.特に確率界面モデルの一つであるΔφモデルに対し以下の結果を得た.(1)3次元以下の場合に場が常に正となる確率の評価を与え,その挙動が高次元の場合や他の界面モデルと比べて大きく変わることを示した.(2)2次元以上の場合に場にピンニング効果を加えるとその強さによらず対応する自由エネルギーが常に正となり場が常に局在化することを示した.例えば0度における水と氷といったような相転移が起きている状況で現れる異なる二相を分離する相分離界面に関する物理現象の数学的な解析を目指し,∇φ界面モデル,Δφ界面モデル, SOSモデルといったいくつかの長距離相関をもつ確率場を取り上げ,様々な外場の加わった下での確率場の漸近挙動を調べることが本研究の目的であった.2014年度はΔφモデルに対し場を正に条件付けた下での界面の挙動に関する問題に取り組んだ.この問題は∇φモデルに対してはこれまでに様々な研究がなされている.Δφモデルに対しては研究代表者坂川が以前に与えた高次元の場合の部分的な結果に続いて,Kurt(2008, 2009)によって4次元以上の場合は完全に解決され,更にCipriani(2013)によって対応する4次元格子上のGauss場の最大値の精密な評価がなされていたが,3次元以下の場合は未解決であった.これに対し最近Δφモデルに関連した別のGauss場の解析で用いられた離散フーリエ解析の手法を援用することで,3次元以下のΔφモデルで場が正となる事象が考えている系のサイズNに依らず正の確率で起こるという結果を得た.これは∇φ界面モデルでは対応する確率が0に収束するのと比べて大きく異なる結果である.しかしながら,確率の評価を与えることができたのは場が正となる領域がモデルを考えている領域全体ではなく,一辺のサイズO(N)の小さな領域に制限した場合だけで,得られた結果は部分的なものにとどまっている.これはΔφ界面モデルの特徴として相互作用が強磁性的でないためFKG不等式などの相関不等式が使えないことが理由であるが,この問題の解決については研究を継続することとした.本研究の目的は,複数の相を分離する境界面,いわゆる界面の確率モデルに関連したいくつかの長距離相関を持つ確率場を取り上げ,その漸近挙動に関する研究を通して相分離界面に関する物理現象の数学的な解析を目指すことであったが,対象とするモデルのひとつにΔφ界面モデルが挙げられる.このモデルは物理的には系のエネルギーが雑にいって界面の曲率から定まり,細胞膜のモデルに対応することが知られている.2015年度は1次元の場合にHryniv-Velenik(2009)によって証明されたΔφモデルに対する関数型中心極限定理を応用することで,一般の相互作用ポテンシャルを持つ場合において,境界から離れた領域で場が常に正となる確率が一様に正であることを証明した.2014年度には,3次元以下で相互作用ポテンシャルが2次関数で与えられ場がGauss的な場合の部分的な評価を得ていたが,それを少し改良したものとあわせて論文にまとめ投稿し(RIMS Kokyuroku Bessatsu),掲載受理となった.この問題では4次元以上では,正となる領域の大きさを無限大にする極限を取った時に,次元に応じた速さで対応する確率が0に収束することが坂川(2003), Kurt(2008, 2009)によって証明されている.得られた結果は3次元以下ではその確率が常に正となることであり,これは高次元の場合と比べ場の挙動が大きく変わることを示している.Δφモデルで場が正となる確率の評価に関する問題については結果が得られ,論文の投稿・掲載受理となり一定の成果を挙げることができたが,その他の問題についてはあまり進展がないため.本研究の目的は,複数の相を分離する境界面,いわゆる界面の確率モデルに関連したいくつかの長距離相関を持つ確率場を取り上げ,その漸近挙動に関する研究を通して相分離界面に関する物理現象の数学的な解析を目指すことであったが,対象とするモデルのひとつにΔφ界面モデルが挙げられる.このモデル物理的には系のエネルギーが雑にいって界面の曲率から定まり,細胞膜のモデルに対応することが知られている.いま, Δφ界面モデルにおいて場を高さ0のレベルに引き付けるピンニング効果を加えた場合の挙動について考える.1次元の場合はCaravenna-Deuschel(2008)によってピンニングの強さに応じて局在/非局在が変わる相転移が起こることが証明され,4次元以上ではピンニングの強さに関わらず場が常に局在化することを以前(2012)に研究代表者坂川が証明していたが,2, 3次元の場合は未解決であった.2016年度はこの問題に取り組み, Δφ界面モデルにおいてピンニング効果を加えた場合は2次元以上ではピンニングの強さに関わらず常に場が局在化することを対応する自由エネルギーが常に正となるということを示すことで証明できた.また,ピンニング効果と同時に場を正の方に押しやる反発的なポテンシャルを加えた場合についても考え,この場合は5次元以上では常にピンニング効果が勝って場が局在化すること証明した.これらの結果は論文にまとめ現在投稿中である.本研究では相分離界面や細胞膜などの数学的な解析を目指し,関連した長距離相関を持つ確率場の研究を行った.特に確率界面モデルの一つであるΔφモデルに対し以下の結果を得た.(1)

3次元以下の場合に場が常に正となる確率の評価を与え,その挙動が高次元の場合や他の界面モデルと比べて大きく変わることを示した.(2)2次元以上の場合に場にピンニング効果を加えるとその強さによらず対応する自由エネルギーが常に正となり場が常に局在化することを示した.3次元以下のΔφモデルで場が正となる事象の確率の評価を与えることができたが,いくつかの技術的な理由により部分的な結果にとどまっており,論文として投稿・出版できる段階まではまだ達していない.引き続き長距離相関を持つ確率場の漸近挙動に関する解析を進める.特に,対象としているΔφモデルではFKG不等式などの相関不等式や,相関関数のランダムウォーク表現などの確率論的手法の多くが成立しないという技術的な困難があるが,関数解析などを用いた解析的な手法による結果が他の研究者によって最近いくつか得られており,それらが考えている問題に対し有効でないか検討したい.確率論今後も引き続いて相分離界面に関連した長距離相関を持つ確率場の漸近挙動に関する解析を進める.参加を予定していた研究集会に都合により参加できなくなったため.参加を予定していた研究集会に都合により参加できなかったため.当初の計画と大きく変えることはせず,次年度分と合わせ旅費および物品費に使用する予定である.次年度分と合わせ計画通り旅費および物品費に使用する予定である.
拡張重力理論の検証

現在の宇宙の加速膨張や宇宙初期のインフレーションを説明するために様々な模型を考え、その観測による検証について考察した。新たに考えた模型としてF(G)重力模型にラグランジェ乗数場を導入したものがある。F(G)重力理論はアインシュタイン重力理論にガウス=ボンネ不変量であるGの関数を加えたもので、現実の膨張をよく再現するが、ゴーストというものが現れ理論的には矛盾する模型であった。我々はラグランジェ乗数場を導入することでゴーストを取り除き矛盾のない模型が得られるとともに、観測とも矛盾のない模型が作れることを示した。また、スカラー場の高階微分を持つ模型とF(R)重力理論を合わせた模型を提案し、インフレーションについて議論した。F(R)重力単独では現実と矛盾していたモデルもスカラー場の高階微分項を含めることで、観測と矛盾のない模型が得られることが分かった。また、再構築の方法によって模型を構成し、インフレーションの観測量を計算し、観測と矛盾のないことを示している。またこの模型では一般にゴーストが現れるが、それが現れない条件を求めた。宇宙にある物質の集団において宇宙膨張によって生じる潮汐力と重力が釣り合う展開半径というものがあり、これが宇宙の大規模構造のスケールを決める重要なパラメーターとなっている。この展開半径を拡張重力理論で求め、模型に対する観測的な制限を求めた。また、いわゆるツァリス統計と拡張重力理論の関係を考察し、その統計性から加速膨張が起こりうることを示し、観測と矛盾のない模型を構成した。その他、宇宙項の量子的な問題を解決するために位相的場の理論の模型を考察したほか、様々な媒質中での重力波の伝播を研究している。研究計画では、拡張重力理論のうちどの理論が現実の宇宙を記述する理論になっているかを検証するために、拡張重力に現れるスカラー粒子が暗黒物質となる可能性からの検証、重力波の伝播の違いによる検証、宇宙の大規模構造形成による検証、を上げている。暗黒物質としての検証については私の元学生で現在中国で研究をしている桂川大志氏及びその学生らと議論を続けている。また、重力波の伝播に関する研究はノルウェーの研究者であるIver Brevik氏と共同研究を行い、粘性流体が加速膨張を引き起こすシナリオに基づき、粘性流体中で伝播することにより重力波が強められる可能性を示し、論文として投稿中である。また、宇宙の大規模構造の非摂動論的研究については上記のように転回点を使った研究を行った。また、加速膨張について新たの模型の可能性などを示しており、当初の計画以上に研究が進展している。2018年度に引き続き、拡張重力理論について、拡張重力に現れるスカラー粒子が暗黒物質となる可能性からの検証、重力波の伝播の違いによる検証、宇宙の大規模構造形成による検証を行う。暗黒物質についてはF(R)重力以外の拡張重力理論についても考察を行う。重力波の伝播についてはこれまでにスカラー・テンソル理論、F(R)重力理論、粘性流体理論について調べてきたが、他の様々な模型における伝播についても明らかにする。宇宙の大規模構造の非摂動論的研究についても繰り込み群的な手法を取り入れる。これらの知見から、アインシュタイン重力理論の背後にある量子論との整合性を持つ重力理論についての手掛かりを得る。

また、重力波の伝播に関する研究はノルウェーの研究者であるIver Brevik氏と共同研究を行い、粘性流体が加速膨張を引き起こすシナリオに基づき、粘性流体中で伝播することにより重力波が強められる可能性を示し、論文として投稿中である。また、宇宙の大規模構造の非摂動論的研究については上記のように転回点を使った研究を行った。また、加速膨張について新たの模型の可能性などを示しており、当初の計画以上に研究が進展している。2018年度に引き続き、拡張重力理論について、拡張重力に現れるスカラー粒子が暗黒物質となる可能性からの検証、重力波の伝播の違いによる検証、宇宙の大規模構造形成による検証を行う。暗黒物質についてはF(R)重力以外の拡張重力理論についても考察を行う。重力波の伝播についてはこれまでにスカラー・テンソル理論、F(R)重力理論、粘性流体理論について調べてきたが、他の様々な模型における伝播についても明らかにする。宇宙の大規模構造の非摂動論的研究についても繰り込み群的な手法を取り入れる。これらの知見から、アインシュタイン重力理論の背後にある量子論との整合性を持つ重力理論についての手掛かりを得る。当該年度に比べ、次年度に、国内外へ出張し、共同研究や学会発表、資料収集の機会が増えると判断したため、次年度に助成金を繰り越し、国内外への出張に必要な経費の一部とする。
超高速回転用空気軸受に関する研究

本研究では高速安定性に優れかつ剛性が高く,消費動力の小さい軸受構造として,スロット絞り軸受を応用した浮動ブシュ静圧気体ジャーナル軸受を提案し,その基本特性について検討を行なった.本軸受構造ではまず軸受剛性を上げるため,浮動ブシュ内外周における軸受すきまを1015μm程度の狭いすきまとした.さらに浮動ブシュ内周側の軸受すきまへも給気圧力を直接導入できるように,浮動ブシュ側面より給気する軸受構造とした.本年度は,おもに本軸受の基本特性を理論的に明らかにし,超高速スピンドル用軸受としての最適設計手法を確立するとともに,若干の実験を行ない理論結果との比較検討を行なった.その結果次のようなことが明らかとなった.(1)本軸受の負荷容量および剛性は,従来の環状スロット給気軸受に匹敵する比較的高い値とすることができる.(2)本軸受の高速における安定性は,浮動ブシュ内外周の空気膜剛性比にα:k_1/k_2に依存するか,剛性比が1以下の領域(内周側剛性が高い領域)では,ホワール比(安定限界速度/共振速度)が4以下のきわめて優れた高速安定性を持つ軸受を得ることができる.(3)本軸受では,浮動ブシュが軸とともに回転する構造となっているため,軸受すきまが小さいにもかかわらず,従来の環状スロット絞り軸受に較べ消費動力を小さくすることができる.(4)本軸受では,狭い軸受すきまを用いているため,軸受すきま内の気体の慣性が小さく無視できることから,基礎方程式が簡略化でき比較的精度よく安定限界値を理論的に予測することができる.以上のことより,本軸受構造が超高速スピンドル用軸受としてきわめて有効なことが明らかとなった.本研究では高速安定性に優れかつ剛性が高く,消費動力の小さい軸受構造として,スロット絞り軸受を応用した浮動ブシュ静圧気体ジャーナル軸受を提案し,その基本特性について検討を行なった.本軸受構造ではまず軸受剛性を上げるため,浮動ブシュ内外周における軸受すきまを1015μm程度の狭いすきまとした.さらに浮動ブシュ内周側の軸受すきまへも給気圧力を直接導入できるように,浮動ブシュ側面より給気する軸受構造とした.本年度は,おもに本軸受の基本特性を理論的に明らかにし,超高速スピンドル用軸受としての最適設計手法を確立するとともに,若干の実験を行ない理論結果との比較検討を行なった.その結果次のようなことが明らかとなった.(1)本軸受の負荷容量および剛性は,従来の環状スロット給気軸受に匹敵する比較的高い値とすることができる.(2)本軸受の高速における安定性は,浮動ブシュ内外周の空気膜剛性比にα:k_1/k_2に依存するか,剛性比が1以下の領域(内周側剛性が高い領域)では,ホワール比(安定限界速度/共振速度)が4以下のきわめて優れた高速安定性を持つ軸受を得ることができる.(3)本軸受では,浮動ブシュが軸とともに回転する構造となっているため,軸受すきまが小さいにもかかわらず,従来の環状スロット絞り軸受に較べ消費動力を小さくすることができる.(4)本軸受では,狭い軸受すきまを用いているため,軸受すきま内の気体の慣性が小さく無視できることから,基礎方程式が簡略化でき比較的精度よく安定限界値を理論的に予測することができる.以上のことより,本軸受構造が超高速スピンドル用軸受としてきわめて有効なことが明らかとなった.
心筋リバースECカップリングにおける細胞膜CaポンプとNa/Ca交換の機能連関

心筋の細胞膜には、細胞膜Caポンプ(PMCA)とNa/Ca交換(NCX)の2種類のカルシウム輸送体が存在する。本課題ではマウス心筋細胞からのホールセルクランプ記録と局所Ca2+濃度分布のコンピュータシミュレーションを用いてこれらの機能連関を調べ、次の結論を得た。1)心筋細胞のPMCAは自身の近傍の細胞内Ca2+濃度を低く維持し、その局所Ca2+濃度をシグナル媒体としてNCXを調節する。2)このNCX調節はリバースECカップリングを抑制し、活動電位の過度な延長を防止する。心筋細胞の細胞膜には、細胞膜Caポンプ(PMCA)とNa/Ca交換(NCX)の二種類のCa^<2+>排出機構が存在する。なぜ心筋に二種類のCa^<2+>排出機構が必要なのか、両者がどのように機能分担しているのかは、心筋の生理を理解する上できわめて重要な問題である。私はマウス心筋細胞において、PMCAによるCa^<2+>排出が細胞膜近傍のCa^<2+>濃度変化を介してNCXの活性を調節していることを発見し、その成果を発展させるため、今年度はつぎの実験を行った。1.ホールセルクランプしたマウス心筋細胞からNCX電流を記録し、PMCAによるNCX活性の調節についてさらに検討した。カルボキシエオシンやバナジン酸の細胞内投与でPMCA活性をさまざまなレベルに抑制し、それがNCX電流の振幅や細胞内Ca^<2+>依存性に及ぼす影響を詳細に検討した。2.細胞内Ca^<2+>によるPMCAとNCXの共役様式について検討を加えた。PMCA活性によるNCX電流の調節が、Ca^<2+>キレート剤を用いた細胞内Ca^<2+>の緩衝によってどのように影響されるか調べ、細胞内Ca^<2+>拡散障壁の関与が示唆された。3.PMCAとNCXの共役によるNCX電流の調節が、細胞の活動電位波形にどのような影響をおよぼすか検討した。カルボキシエオシンやバナジン酸によるPMCAの抑制が、心筋活動電位を活動電位を延長させることが明らかになった。4.マウス心筋細胞からのPMCA電流の単離記録を試みた。主要な膜電流系およびNCX電流を、保持電位や各種ブロッカーによって抑圧した条件でカロキシン感受性の外向き電流として単離することを試みた。しかし安定な記録のためには、さらに詳細な実験条件の検討が必要であった。以上の成果の詳細は、2011年度の6回の学会で報告した。昨年度の研究に引き続き、心筋リバースECカップリングにおける、細胞膜Caポンプ(PMCA)とNa/Ca交換(NCX)の二種類のカルシウム排出機構の機能分担の解明を目的として実験を行った。1)マウス単離心室筋細胞を用いて、PMCAが心筋細胞のリバースECカップリングにおよぼす影響について検討した。PMCAを抑制した条件では、CaトランジェントにともなうNCX電流振幅の増大と、活動電位プラトー相の延長が認められ、PMCAによるNCX活性調節がリバースECカップリングに寄与していることが支持された。2)ホールセルクランプ下でPMCA電流の記録を試みた。PMCA電流は、信号対雑音比の問題から、明瞭な記録を得られなかった。いっぽうで高感度カメラによる蛍光Caイメージングを現在進めているが、PMCAによる細胞内Ca濃度変化の検出に至っていない。3)細胞内CaによるPMCAとNCXの共役様式について、細胞内Caバッファの効果について調べた。PMCA抑制にともなうNCX電流の増強は、細胞内マイクロドメイン内の局所的Ca濃度変化によることが示された。この結果は、Ca拡散のコンピュータシミュレーションからも支持された。4)心筋症モデルの遺伝子改変マウスを用いて、心室性不整脈の発生とリバースECカップリングの変化について、単離心室筋細胞から活動電位波形、膜電流、およびNCX電流のデータを収集した。以上の研究成果は、心筋PMCAとNCXの細胞内Caマイクロドメインを介した共役を強く支持し、その異常が心室性不整脈の発生に関与することを示唆する重要な意義をもつ。これらの成果の概要は、平成23年度の3回の学会で報告した。本年度は、昨年度の研究に引き続き、plasma membrane Ca2+-ATPase (PMCA)によるNa/Ca exchanger (NCX)の調節が心筋リバースECカップリングに及ぼす影響について詳細に検討した。1) PMCA阻害が、活動電位波形および細胞内Caトランジェントに伴う内向きNCX電流におよぼす影響を検討した。選択的阻害薬carboxyeosinによるPMCAの抑制は、マウス心筋細胞からパッチクランプ法で記録した活動電位持続時間(APD)と、Caトランジェント誘発性内向きNCX電流振幅の両方を増強した。しかし、カルシウムイメージングの実験からは、同時に筋小胞体のカルシウム負荷量が変化している可能性が考えられ、その影響の詳細な検討が必要になった。2) PMCAとNCXの共役様式について詳しく調べた。