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エンドトキシンショックにおける脂質伝達物質の役割に関する研究

エンドトキシンショックはグラム陰性桿菌菌体成分のリポ多糖体(LPS)が炎症細胞のLPS受容体に結合し、血小板活性化因子(PAF)をはじめとする二次性伝達物質を放出することによつて引金が引かれる。本研究では、1)LPS受容体に連関する情報伝達機構、ことにsrc型キナーゼを介する伝達機構を解明し、治療標的となる細胞内機能分子を同定する、2)PAF受容体高発現、ノックアウトマウスを用いて、エンドトキシンショック動物モデルにおけるPAF受容体の役割を考察することを目的とした。本年度の成果を1)2)のそれぞれについて以下に報告する。1)LPS受容体の情報伝達機構近年LPS刺激細胞においてsrc型キナーゼが活性化されることが報告され注目をあびたが、炎症機能にsrc経路が必須のものであるか否かは未確認の問題であった。そこでマクロファージ細胞株にsrcを抑制するあらたな機能分子、C末端srcキナーゼ、その変異体を導入し、LPSによるsrcの活性化が完全に遮断された変異細胞を確立した。意外なことに、この細胞ではsrcの直下にあるshcのリン酸化、非刺激時の細胞内チロシンリン酸化などはほぼ完全に抑制されているにも関わらずMAPキナーゼ、アラキドン酸遊離、一酸化窒素遊離、活性酸素放出は元株と変わりがない。すなわち、LPSによるsrcの活性化は、炎症機能の面から見ると単なるby-stander的な現象にすぎないことを証明することができた。2)モデルマウスを用いたPAF受容体の役割の解析PAF受容体ノックアウトマウスはPAF静注によるショックに対して抵抗性であり、我々の単離した受容体が炎症を担う唯一のPAF受容体であること、おそらく他のアイソフォームは存在しないことが確認された。しかし同マウスはLPSによるショックには感受性であり、のエンドトキシンショックはPAF受容体遮断のみでは解除されないことが解った。この現象は5-lipoxygenaseノックアウトマウス(leukotrieneができない)と同様であり、単一の伝達物質遮断の限界を示している。今後、他のノックアウトマウスとの掛け合わせによるダブルノックアウトマウスの作成とその表現型の追求などあらたな方法を試みる必要がある。
特殊反応場触媒設計に役立つパラジウムクラスター錯体の化学

本研究の目的は、特殊反応場触媒の研究で大きな役割を果たすバルクパラジウムやバルク白金の表面吸着モデルとして、不飽和炭化水素を配位させたパラジウムクラスター錯体を合成し、表面の吸着分子の物理的特性や化学的特性を、分子、原子レベルで解明するための基礎知見を明示することである。1)μ-ブタジエンパラジウム2核錯体の配位子交換と3核錯体への誘導ゼロ価パラジウム単核錯体と2価パラジウムハロゲン化物錯体をブタジエン存在下反応させるとカチオン性、中性およびアニオン性Pd-Pd骨格上にジエンが架橋配位した錯体が得られた。このようにして得た錯体のブタジエン配位子は、他の共役ジエンとの間で容易に配位子交換を行うことが分かった。ここで添加するジエンとして2位でパラジウムにσ結合するジエンを用いると、立体的混みあいを克服して3核パラジウム架橋ジエン錯体を収率よく与えた。この錯体の構造はX線解析で明らかにし、ジエン部分のs-トランス構造やC1-C2結合よりもC2-C3結合の方が短くなっていることなど、特異な構造特性が明らかになった。同様の配位子交換を利用すると、カチオン性Pd-Pd骨格にジエノラートアニオンがπ-配位した新奇な錯体の合成と構造決定も行うことができた。2)μ-ジエン配位子と求核剤の反応μ-ハロゲン配位子の存在する錯体中のμ-ジエン配位子はアセトニトリルなど弱い配位子では簡単に追い出されない。ところがμ-ハロゲン配位子を銀塩で引き抜きカチオン電荷を増やすと、μ-ジエン配位子は解離しやすくなり、アセトニトリルやスルフィドなどとホスフィンだけが配位した2核ジカチオン性Pd-Pd錯体が生成した。これらは溶液中でも比較的安定で、Pd-Pd結合がかなり強固に形成されていることを示唆する。このような型のパラジウム複核錯体はいままでほとんど例を見ない新型クラスターである。
イオン性溶融ナノ液膜触媒の開発と応用

低融点の溶融塩をナノスケールの液膜として多孔性物質の細孔壁に被覆した構造を有する新規な「イオン性溶融ナノ液膜触媒」を開発することを目的として、1融体触媒のスクリーニング、2液膜触媒の設計および調製、3構造・物性解析、4触媒反応開発、および5反応機構解析を進めている。30年度は特に3および4を中心に検討した。29年度までの成果をもとに多孔質担体に各種の融体液膜を担持した候補物質について、構造を調べるとともに複数の候補触媒反応へ適用し、活性および耐久性を評価した。3では融体内に存在するバナジン酸イオンの配位多面体について高温Raman分光法を用いて雰囲気を制御した上でその場解析し、オキソ酸塩や金属酸化物の局所構造に関する情報を得た。溶融状態での酸化還元および気体溶解・放出特性を高温環境SEM、XPS、O2-TPD、TG/MSなどの手法で調べるとともに、それに伴う局所構造の変化を明らかにした。4ではバナジン酸塩系溶融液膜触媒を用いる反応として、SO3分解(SO3 = SO2 + 1/2O2)について検討した。同じ組成のバナジン酸塩が固相か液相かによって活性化エネルギーや分圧依存性に顕著な違い示すことを明らかにした。また、バナジン酸塩融体の化学組成による反応雰囲気における耐久性の違いを明らかにした。このほかに本研究で開発した種々の溶融液膜触媒を用いてNO分解やNO酸化、プロパン部分酸化などの反応を試みた。本研究は低融点の溶融塩をナノスケールの液膜として多孔性物質の細孔壁に被覆した構造を有する、新規な「イオン性溶融ナノ液膜触媒」を設計し、不均一系触媒と均一系触媒の長所を併せもつ新機能を発現させることを最終的な目的としている。29年度の研究によって、バナジン酸塩系が有望なPtに匹敵する高性能なSO3分解触媒であることを明らかにしたが、30年度は特に500650°C程度の中低温域において、従来の金属酸化物触媒をはるかに凌駕する性能を示すことを見出した。また、融体と固相のバナジン酸塩に触媒特性ついて、活性化エネルギーや分圧依存性に顕著な違いを見出すことができた。融体液膜触媒の構造についても、高温環境SEMで融体の細孔内での浸透挙動を初めてその場観察することに成功するなど、興味深い知見が得られた。項目1融体触媒のスクリーニング、2液膜触媒の設計および調製、3構造・物性解析、4触媒反応開発、および5反応機構解析の中で、今後は主に4および5について検討する。これまでの結果をもとに多孔質担体に融体液膜を担持した触媒を用いて種々の触媒反応を試みるとともに、反応機構や劣化機構の解析を進める。全研究期間の成果を総括し、融体触媒の物性、機能および触媒作用を体系化する。具体的な計画について以下に記す。(1)これまでに開発した種々の溶融液膜触媒を用いて新規な触媒反応を開拓する。対象とする反応の候補は、SO3分解のほかに、NO分解・吸蔵/リーンNOx還元、ディーゼルパティキュレート燃焼等の環境関連反応、およびC3H8脱水素、C3H8酸化、NH3分解などのエネルギー関連反応の中から検討する。(2)溶融液膜触媒の耐久性を評価する。触媒反応を100時間以上継続し、劣化挙動を追跡する。速度解析により劣化機構を解明し、耐久性を高めるための対策を検討する。(3)溶融液膜触媒について反応速度の気相分圧依存性や活性化エネルギーを調べ、溶融状態が反応速度に及ぼす影響を明らかにするとともに反応機構に関する情報を得る。また、融体を構成する化学種と反応分子との相互作用についてin situ Raman等を用いた解析を試みる。(4)研究期間に得られた成果をまとめて、「イオン性溶融ナノ液膜触媒」の物質設計と反応特性・反応機構に関する知見を体系化し、将来の応用展開のための指針を提案する。均一系触媒・不均一触媒とは異なる融体触媒の特性を明確にする。低融点の溶融塩をナノスケールの液膜として多孔性物質の細孔壁に被覆した構造を有する、新規な「イオン性溶融ナノ液膜触媒」を設計することを目的として、1融体触媒のスクリーニング、2液膜触媒の設計および調製について検討した。1では熱力学的状態図をもとに融体組成の候補を抽出し、反応分子の溶解を促進するための物性制御法を検討した。2では多孔質担体に融体液膜を担持した触媒を設計し、その調製法を検討した。1では遷移元素、アルカリ元素等を含むバナジン酸塩から構成される低融点のイオン性融体の構造と触媒作用について三酸化硫黄分解をモデル反応として調べた。バナジン酸塩融体中への三酸化硫黄の溶解促進と遷移元素の酸化還元作用によって、三酸化硫黄分解が促進される現象を明らかにした。ホウ酸塩系ではB2O3に種々の遷移元素を加えた系をスクリーニングした結果、ホウ酸融体中にAgを含む場合にホウ酸銀が高分散した構造が形成することを見出し、その酸化還元挙動および炭化水素酸化および脱水素反応に対する触媒作用について検討した。2では融体触媒をナノ液膜化して担持するための多孔質担体材料をスクリーニングした。バナジン酸塩およびホウ酸塩融体のコロージョン作用によってAl2O3、MgO、TiO2、ZrO2など金属酸化物担体の細孔構造は著しく崩壊した。

これに対してSiO2では比較的影響が少なく、中でも三次元メソポーラスシリカが有望であることが明らかになった。シリカ表面は融体の濡れ性も高く、細孔内部へと融体を速やかに浸透・拡散させ、ナノメートル程度の厚みの液膜を細孔表面に均一に形成することが可能になった。この間、メソ孔はマクロ孔へと変換されるが、一旦マクロ孔が形成すると結晶構造、比表面積および細孔構造は安定に保持された。以上の結果をもとに、触媒反応に有効な担持溶融ナノ液膜触媒の設計が可能になった。本研究は低融点の溶融塩をナノスケールの液膜として多孔性物質の細孔壁に被覆した構造を有する、新規な「イオン性溶融ナノ液膜触媒」を設計し、不均一系触媒と均一系触媒の長所を併せもつ新機能を発現させることを最終的な目的としている。本目的の達成には、第一に多様な溶融液膜触媒の候補物質を開発する必要がある。28年度の研究によって、バナジン酸塩系およびホウ酸塩が有望な系であることを明らかにした。バナジン酸塩は融点が500650°Cで触媒反応温度域に適しており、多様な元素と複合化が可能で酸化還元作用および酸素吸収放出機能を発現することができた。特に三酸化硫黄分解のように基質が融体に溶解する反応に対しては効果的で、Ptなどの貴金属に匹敵する高い触媒性能を達成し、注目される。今後、詳細な反応機構の解明および長期的な安定性の評価が必要である。ホウ酸塩系は融点が400°C程度と低く、多様な元素との複合化にも適する。バナジン酸塩系に比べるとイオン性は低いがその分、炭化水素などの非極性分子の変換反応に有効であると期待される。今後、これら候補物質の担持ナノ液膜触媒の調製法を確立することで触媒材料としての可能性はさらに高まる。多孔質の細孔表面をナノスケールの厚みの液膜で被覆した触媒材料はこれまで開発された例が無く、本研究はきわめて独自性の高い成果を創出できる。硝酸塩、炭酸塩など多様な融体の触媒としての可能性、各融体に適した触媒反応系の開拓と合わせて研究をさらに活発に展開していきたい。低融点の溶融塩をナノスケールの液膜として多孔性物質の細孔壁に被覆した構造を有する、新規な「イオン性溶融ナノ液膜触媒」を開発することを目的として、1融体触媒のスクリーニング、2液膜触媒の設計および調製、3構造・物性解析、4触媒反応開発、および5反応機構解析の中で、昨年度に引き続き12さらには3について検討した。バナジン酸塩、ホウ酸塩および硝酸酸塩系の融体について、多孔質担体にナノスケールの液膜を担持した触媒を調製し、その構造、物性および反応性について調べた。1では、バナジン酸塩のうち最も低融点を示すアルカリ金属含有系を多孔質シリカ上に分散することで、550°Cでは担持融体触媒となることを確認した。SO3分解や酸素放出反応をモデル反応として、融体中の遷移金属元素とSO3分子との相互作用や酸化還元挙動を調べた。SO3分子の融体への溶解は酸塩基相互作用に依存しており、塩基性が最も高いCs-V系が貴金属に匹敵する高活性な触媒として有望であることを明らかにした。2では、バナジン酸塩系に加えてホウ酸塩および硝酸塩系の多孔質シリカへの分散担持法を確立した。バナジン酸塩系では550°C以上、ホウ酸塩系では450°C、硝酸塩系では230°Cでそれぞれ安定な融体が生成した。融体をナノ液膜化し,安定に担持するための多孔質担体として、三次元細孔構造を有するメソポーラスシリカが最も有望であった。
新規有機性汚泥溶解菌による下水余剰汚泥の減容化および溶解汚泥の資源化

下水汚泥の減量化および資源化に関する研究の展開で、高温で余剰汚泥を溶解する細菌および乳酸菌の新菌種と考えられる菌株を発見した。本課題では、60°C前後で下水余剰汚泥を溶解し、32°C以下では活動を休止する新規細菌株を用いて、下水余剰汚泥の減容化を図ろうとするものである。さらに、溶解した余剰汚泥から、乳酸菌による乳酸生産を行う。また、大腸菌による水素生産と酵母によるバイオエタノール生産について、その資源化の可能性を探ることも研究目的とし、本年度は次の成果を得た。1.新たに高温性汚泥溶解菌Geobacillus sp.B1株と、アルヵリ依存性汚泥溶解菌Bacillus sp.N1株を分離した(特許出願準備中)。両株の余剰汚泥減容化は、B1株では高温条件下(60°C)3日間で約45%の、N1株ではアルカリ条件下(NaOH,pH11)6目間で約45%の、汚泥減量率を示した。2.さらに両株のCOD処理能は、B1株では1日間で15%、N1株では6日間で12%であり、試作装置-減容系汚水処理システムーを用いて、応用・実用化への研究を展開中である。4.高温処理した余剰汚泥は、大腸菌高度水素生産株で1Lの上清から47mLの水素が生成できた。5.また、溶解汚泥のメタン発酵を検討したところ、3.01L/kg-dry/dayとなり、通常のメタン生成の1.3倍の速度向上が認められた。また、大腸菌による水素生産と酵母によるバイオエタノール生産について、その資源化の可能性を探ることも研究目的とし、次の成果を得た。1.分離した高温性汚泥溶解菌Anoxybacillus sp. MS8株とBrevibacillus sp. MH10株を用いて余剰汚泥の減容化を検討したところ、滅菌汚泥では約30%、未滅菌(生)汚泥では約35%の汚泥減量率を示した。2.これらの菌株では生汚泥の減量率が低いことから応用・実用化に向けて研究を展開できないと考えられるので、更なる高温性汚泥溶解菌の分離を行い、16株を取得した。さらにアルカリ耐(依存)性汚泥溶解菌の分離も行い、9株を取得した。3.次に、溶解した余剰汚泥にショ糖50mMを添加し、分離・同定したLactobacillus acidophilusで乳酸発酵を5日間行ったところ(確立した最適化条件)、対象と比較して約7.5倍の乳酸生産に成功した。4.また、溶解汚泥から分離した水素生成菌を用いて水素発酵を行い、対象と比較して約30倍の水素生成を確認した。
非定常温熱環境下における熱的快適性の定量評価法に関する基礎的研究

非定常温熱環境下における熱的快適性の定量評価の確立を目的として、環境温度が非定常に変動する空間での人間の生理学的特性と温冷感の相関を実験的に解明することを試みた。温冷感の過渡的挙動を精度良くトレースできる新たな温冷感申告方法を提案するとともに、環境温度変動によって引き起こされる皮膚表面温度および皮膚血流量の変化が温冷感の過渡的挙動に影響を及ぼしていることを明らかにした。本研究は非定常温熱環境下における熱的快適性の定量評価の確立を目的としているが、平成25年度は前年度に引き続き、環境温度が非定常に変動する空間での人間の生理学的特性(体温、血流量)と過渡温冷感(寒暖の感覚)の相関を実験的に解明することを試みた。被験者の温冷感については、前年度に提案した、温冷感の変化を感じた時点でその変化の度合いを+3からー3までの7段階スケール(0をニュートラルとして、プラス側が暖かく、マイナス側が寒く感じ、数字が大きいほどその度合いが大きい)で申告してもらう方法を採用した。生理学的特性については、手甲と首の皮膚表面温度、深部体温(鼓膜温度)および指先の血流量を測定した。室温をある温度から徐々に下げていき、設定温度に達した後に再び元の室温まで上昇させる実験を行ったところ、温冷感は環境温度の変化に追随するように変化するが、最終的な温冷感はもとの状態には戻らず、温冷感の積算値は多くの被験者において負の値となった。また、室温を上昇させた後に元の室温まで低下させる逆の実験でも最終的な温冷感が負となる傾向が見られた。すなわち、温度差と温度の時間変化が同じであっても、温度が上昇する場合と下降する場合では、後者のほうが温冷感の変化を強く感じることがわかった。また、前年度の結果と同様、環境温度変化と温冷感変化の間には優位な時間遅れは認められなかった。生理学的特性として、手甲と首の皮膚表面温度、深部体温(鼓膜温度)および指先の血流量を測定した結果、首部表面温度と深部体温は環境温度の変化に対してほぼ一定であったが、手甲表面温度と指先血流量については環境温度変化および温冷感変化と類似した挙動を示すことがわかった。本研究は,非定常温熱環境下における熱的快適性の定量評価法の確立を目的としているが,平成24年度はその基礎的研究として,環境温度が非定常変動する空間での人間の生理学的特性(体温,血流量など)と過渡温冷感挙動(寒暖の感覚)の相関を実験的に解明することを試みた.静岡大学工学部内に設置された温熱環境室において,室温を一定温度に保った状態から,任意の変化速度で室温を低下させ,目標温度に達した後に再び室温を初期温度まで上昇させるような温度制御を行い,その際,室内の被験者に温冷感の時間変化を申告してもらうとともに,皮膚表面温度を測定した.温冷感の申告方法として,1.決まった時刻(例えば1分おき)に,前回の申告時よりも暑く感じたら+1,寒く感じたらー1を申告してもらう方法,2.申告時間を設けず,直前の状態よりも暑く感じたら+1,寒く感じたらー1をその都度申告してもらう方法を用いたが,申告法1では時間に対する温冷感の解像度が低く,また申告法2では温冷感レベルの解像度が低く,室温変化速度の違いによる温冷感挙動の変化を捉えることができなかった.そこで,申告法2を改良し,従来のPMVスケールのように温冷感を+3からー3までの7段階で評価する新たな申告法を導入するにより,温冷感の非定常挙動を精度よくトレースできるようになった.新たな申告法で実験を行った結果,実験前と実験後では室温は同じにもかかわらず,温冷感レベルには違いが生じることがわかった.すなわち,多くの被験者において,実験前の温冷感レベルよりも実験後の温冷感レベルの方が低くなる傾向がみられた.また,従来,環境温度変化に対して,皮膚表面温度変化と温冷感変化との間には時間遅れが生じるという報告がなされていたが,本実験においては有意な時間遅れは認められなかった.平成24年度の目標であった,非定常温熱環境下における生理学的特性と過渡温冷感挙動に関する実験的検討については,被験者数は若干少ないものの,その定性的な傾向を把握することができ,概ね目的を達成できたと考える.また,非定常温熱環境下での温冷感の非定常挙動をより正確かつ高分解能でトレースできるよう,蓄積した実験データに基づき温冷感申告方法を改良したことにより,実験の精度も向上している.平成24年度に引き続き,非定常温熱環境下における生理学的特性と過渡温冷感挙動に関する実験および定量評価を行う.被験者数を増やし,過渡温冷感の非定常挙動の更なる解明に取り組む.実験と平行して,血流ならびに体温調整機能を考慮した生体伝熱モデルを構築し,環境温度の変動に伴う生理学的特性の挙動を高精度で予測する方法を確立する.

生体伝熱モデルは,従来広く用いられている全身分割モデルをベースに構築する.全身分割モデルとは,人体を複数の部位に分割して各部位同士を血管系で連結させるモデルであるが,従来のモデルでは動脈と静脈は周囲組織と熱交換をするためのヒートソースとしてのみ取り扱われており,血管中の血液の流れは考慮されていない.また,体温調整に重要な役割を果たす毛細血管網は単なる一本の血管として表現されているため,外気温度の変化に伴い皮膚表面近傍の毛細血管が収縮・膨張し,外部への放熱量が調整されることによって体温が保たれるという体温調節機構が正しく組み込まれてない.そこで,比較的直径の大きな動脈・静脈層をマクロスケール,血管径の小さい毛細血管・生体組織層を多孔質近似して局所体積平均を施した部分(以下,組織相)をミクロスケールとし,それぞれのスケールに対応した血流場の運動方程式とエネルギー方程式を連成することにより,血流の影響を考慮した生体伝熱モデルを構築する.環境温度変化に対する毛細血管の膨張・収縮については多孔質体の透過率の温度依存性として取り扱うことにより,複雑な体温調整機構を簡単かつ正確に表現することができ,体温および血流量の高精度な予測が可能となる.実験で得た生理学的特性と比較することにより,人体伝熱モデルの妥当性を評価する.該当なし
スピロピラン類縁体の新規固相フォトクロミック反応の開拓

スピロピラン類とその類縁体のフォトクロミズムは、溶液やポリマー中に限られ、固相では発現されないとされてきたが、申請者らは最近、固相でも低温ならばフォトクロミズムが発言することを見出した。さらに、類似の構造をもつクロメン類も、低温では固相フォトクロミズムを示すことを見出した。クロメン類の固相フォトクロミズムでは、安定な光着色体であるメロシアンニン体に加えて、不安定な光着色体の生成が定常状態拡散反射分光法によって確認され、それは非平面形配座であると推定した。スピロピラン類とその類縁体であるスピロオキサジンおよびクロメン類は,フォトクロミズムを示す代表的な化合物として知られ,反応機構に関する基礎的な研究から,調光レンズへの利用など商品開発に至るまで,非常に幅広く研究されている.これらのフォトクロミズムは,これまで,溶液やポリマー中に限られ,固相では発現しないとされてきたが,申請者らは最近,固相でも低温ならばフォトクロミズムが発現することを見出した.本研究は,これらの固相フォトクロミック反応の経路を解明し,固相ならではの反応性を生かした新規フォトクロミック材料の実現を目的としている.スピロピラン類,スピロオキサジン類,およびクロメン類のフォトクロミック反応は,いずれも,閉環体が6π電子環状反応によって開環したのち,異性化によってメロシアニン体と呼ばれる着色体を生成する.この反応は,反応前後での分子の形状が大きく変化する.一般に,固体中では分子が密に詰まっていて,分子の形状が大きく変化するような反応は進行しにくいと考えられる.それにもかかわらず,一連の化合物の固相中でフォトクロミック反応が進行したのは,それらの反応が,固体の表層付近でのみ進行しているためである可能性がある.その観点から,平成25年度は,反応の前後で分子の形状が著しく変化するような有機光反応として,アゾベンゼン類のcis-trans光異性化反応をとりあげ,その固相光反応を主に拡散反射スペクトルを用いて追跡した.その結果,アゾベンゼンおよびその置換体びcis-trans光異性化反応は,固相でも進行するが,その反応は固体の表層付近でのみ進行し,固体の内部では進行しないことを見出した.スピロピラン類とその類縁体であるスピロオキサジンおよびクロメン類は,フォトクロミズムを示す代表的な化合物として知られ,反応機構に関する基礎的な研究から,調光レンズへの利用など商品開発に至るまで,非常に幅広く研究されている.これらのフォトクロミズムは,これまで,溶液やポリマー中に限られ,固相では発現しないとされてきたが,申請者らは最近,固相でも低温ならばフォトクロミズムが発現することを見出した.本研究は,これらの固相フォトクロミック反応の経路を解明し,固相ならではの反応性を生かした新規フォトクロミック材料の実現を目的としている.そのために,スピロピラン類縁体について,固相固有の着色体の発生を確認し,その光反応性を調べ,それが主たる着色体となるような化合物の開発に取り組んだ.反応経路を解明するためには,固体中に生成する複数の着色体を区別して観測する必要がある.そのためには,可能な生成物の種類が少ない系を対象とする方が結果が分かりやすい.スピロピランおよびスピロオキサジンでは,開環体の2つの環外二重結合に幾何異性が生ずるのに対して,クロメンでは,開環体の末端オレフィン炭素の置換基が同一なので,幾何異性は一つの環外二重結合にのみ生ずる(式(3)).このため,クロメンのフォトクロミック反応で生じうる着色体の異性体の種類は,スピロピランおよびスピロオキサジンの半分となる.しかも,クロメンは,その誘導体が調光材料として実際に使用されており,フォトクロミック材料としての重要性が高い.そこで,平成24年度は,クロメン類の置換体をいくつか合成し,その固相光反応を調べた.その結果,いずれも,低温でフォトクロミズムが発現することが確認できた.スピロピラン類とその類縁体であるスピロオキサジンおよびクロメン類は、フォトクロミズムを示す代表的な化合物として知られ、反応機構に関する基礎的な研究から、調光レンズへの利用など商品開発に至るまで、さまざまな側面から多くの研究が行われている。それらのフォトクロミズムは、これまで、溶液やポリマー中に限られ、固相では発現しないとされてきたが、申請者らは最近、固相でも低温ならばフォトクロミズムを発現することを見出した。本研究は、これらの固相フォトクロミック反応の経路を解明し、固相ならではの反応性を生かした新規フォトクロミック材料の実現を目的としている。スピロピラン類、スピロオキサジン類、およびクロメン類のフォトクロミック反応は、いずれも、閉環体が6π電子環状反応によって開環したのり、異性化によってメロシアニン体と呼ばれる着色体を生成する。この反応は、反応前後での分子の形状が大きく変化する。一般に、固体中では分子が密に詰まっていて、分子の形状が大きく変化するような反応は進行しにくいとされてい。それにもかかわらず、一連の化合物について、固相中でフォトクロミック反応が進行したのは、それらの反応が、固体の表層でのみ進行しているためである可能性がある。その観点から、平成26年度は、代表的な光反応性分子であるが、固相では光反応が進行しないとされているスチルベン類の固相光反応を検討した。

その結果、固体試料に紫外光を照射すると、室温において、[2+2]付加環化反応とcis-trans異性化反応がわずかながら進行し、その反応率が温度の上昇とともに増大することを見出した。スピロピラン類とその類縁体であるスピロオキサジンおよびクロメン類は、フォトクロミズムを示す代表的な化合物として知られ、反応機構に関する基礎的な研究から、調光レンズへの利用など商品開発に至るまで、非常に幅広く研究が行われている。これらのフォトクロミズムは、従来、溶液やポリマー中でのみ発現し、固相では発現しないとされてきた。ところが、申請者らは最近、これらのフォトクロミズムが、固相においても、低温であれば発現することを見出した。本研究は、これらの固相フォトクロミック反応の経路を解明するとともに、固相ならではの反応性を生かした新たなフォロクロミック材料を創り出すことを目的としている。スピロピラン類、スピロオキサジン類、およびクロメン類のフォトクロミック反応は、いずれも、無色である閉環体から6π電子環状反応によって開環したのち、異性化によって、メロシアニン体とよばれる着色体を生成する。一般に、固体中では分子が密に詰まっているので、分子の形状が大きく変化するような反応は進行しにくいと考えられる。それにもかかわらず、一連の化合物の固相中でフォトクロミック反応が進行したのは、それらの反応が、固体の表層付近でのみ進行しているためである可能性がある。その観点から、最終年度は、反応の前後で分子の形状が著しく変化するような反応として、オレフィンのcis-trans光異性化反応をとりあげ、その固相光反応の進行を分光学的な方法で解析するとともに、光学顕微鏡で固相表面を観察したところ、化合物によっては、固相表面で融解が起こっていることが確認された。スピロピラン類とその類縁体のフォトクロミズムは、溶液やポリマー中に限られ、固相では発現されないとされてきたが、申請者らは最近、固相でも低温ならばフォトクロミズムが発言することを見出した。さらに、類似の構造をもつクロメン類も、低温では固相フォトクロミズムを示すことを見出した。クロメン類の固相フォトクロミズムでは、安定な光着色体であるメロシアンニン体に加えて、不安定な光着色体の生成が定常状態拡散反射分光法によって確認され、それは非平面形配座であると推定した。申請者らは、スピロピラン類、スピロオキサジン類、クロメン類のいずれも固相でフォトクロミズムを示すことを見出したが、これまでその反応が、固体の内部においても進行するのか、表層でのみ進行するのかについては、とくに区別をしてこなかった。しかし、その区別をすることは、固相光反応の理解にはもちろん、応用する場合においても、非常に重要である。この点を解明することは、当初は計画していなかった。より単純な系であるアゾベンゼンとその置換値について検討を行い、さらに、代表的な光反応性有機分子であるスチルベンとその置換体についても検討を行った。そのために、当初の予定と比べると、研究の進行はやや遅れているが、それを上回る重要な成果が得られたと考えている。有機物理化学、有機結晶化学固体の内部では進行できない光異性化反応が、固体の表層付近で進行できることが、アゾベンゼン類についてわかった。また、スチルベン類の場合には、固相光反応は進行しないとされていたにもかかわらず、固体試料への紫外光照射によって光反応が進行することを見出した。
離婚急増社会における夫婦の愛情関係の実証研究

本研究では、現代日本社会での夫婦関係のあり方を分析するために、離婚研究者に対するインタビュー調査、及び、30才から59才までを対象とする質問紙調査を東京と大阪で実施した。質問紙調査では、離婚対象者のみの質問を質問票に組み込むことによって、離婚対象者に対するランダムサンプリングデータを得た。分析による知見は、主に三つにまとめられる。一つは、日本の夫婦関係の現状に関してのものである。日本の夫婦関係において、40年前の調査結果と比較しても、一緒に出かけるなど共同行動は相変わらず低調である。これは、セクシュアリティーに関してもいえる。しかし、共同行動が少なく、セックスレスだからといって、夫婦の関係性が希薄だと結論づけることはできない。日常会話や困ったときに助け合うなど、愛情を直接表現し合うこととは別の形での愛情関係が維持されうることが分かった。次に、恋愛感情と結婚生活における愛情が分離している様相が観察された。意識において、恋愛感情と結婚を別立と意識している傾向が強まることが分かった。行動においても、カップルを壊すことなくカップル外の親密関係を作るケースが相当数いることがわかる。以上のように、近年の離婚急増を、「夫婦の愛情関係が変化した」という点に求めるという仮説は成り立たないように見える。むしろ、離婚や結婚をめぐる環境の変化によってもたらされた可能性が高い。データ分析を行うと、離婚経験者には、配偶者への愛情表現や経済力(女性のみ)への高い期待が見られた。つまり、相手が提供できうる能力以上のものを相手に求めることが離婚につながる大きな原因となっている。愛情表現に関しては、その基準が高まったという仮説も成り立ち、今後の検証にまたねばならない。一方、経済力に関しては、近年の男性の雇用の不安定化によって、男性の経済力が落ちている。離婚相手の経済力に不満があったという女性の割合が高いことによっても裏付けられる。近年の離婚急増の一因は、経済状況の変化によってもたらされたものであり、少子化の原因とも重なるものであると結論できる。本年度は、3年計画の第一年度として結婚問題の専門家からのヒアリング、離婚経験者からのインタビュー調査を中心に行った。専門家からのヒアリングに関しては、ここ10年の離婚急増に関する見解を伺った。落合恵美子京都大学助教授からは、江戸時代と比較した日本の離婚の傾向について伺った。評論家の石坂晴海氏からは、近年の夫婦関係から離婚の変化について、男女の意識の差の観点が話された。離婚経験者に関しては、地域差、男女差を考慮して、30-40歳前後の方を選定し、青森県2名、関西3名、東京3名(男性3名、女性5名)の方に結婚から離婚に至るまでの経緯についてインタビュー調査を行った。インタビューからは、次のような現代に特徴的な離婚の傾向が抽出された。(1)男性側からの離婚の申し出については、妻と妻の親との関係に関するものが特徴的であった。妻が自分の親との関係を優先し、夫婦関係を顧みないことによって夫の不満がつのり離婚に至るケース(2例)。(2)女性側からの離婚の申し出については、夫の経済力と暴力にかかわるものが特徴的であった。夫の事業の破綻、や失業によって、妻が夫に見切りをつけ、離婚に至るケース(2例)。そして、夫の暴力や、支配的言動が妻の不満をつのらせ、離婚に至るケースである。(3)更に、離婚のプロセスに、常に両方の親が関与、もしくは、援助する傾向がみてとれた。

次年度は、今年度の調査・研究結果を応用し、質問紙調査によって、現代日本の夫婦関係に生じている問題を抽出する計画である。本年は、三年研究の二年目として、一年目からの引き続きで離婚経験者へのインタビュー調査、及び、質問紙による夫婦関係に関する大量調査を行った。離婚経験者へのインタビュー調査としては、東京、神奈川、岡山にて4人を対象に、構造化面接法によって行った。結婚に対する期待が高まっている一方で、結婚相手が期待に応えられない事によって、夫婦関係が悪化し、離婚に至るケースが目立った。平成15年調査分と合わせて、離婚に関する言説の語られ方を、レトリック分析にかける予定である。質問紙調査を行うため、研究会を開いて、調査項目について、検討した。夫婦関係の変容を分析するために、家族に関する意識、特に、離婚に関する意識、夫婦関係の実態、婚外の関係、未婚者の結婚意識、離婚経験者に離婚経緯などを質問票に盛り込むことが決定された。実査は、中央調査社に依頼した。東京都区部、大阪府を対象地として選定し、各1120サンプルを層化無作為抽出し、東京503ケース、大阪538ケースを有効サンプルとして回収した。全体として、カップルの愛情関係に対する期待は高いが、その期待に応えられる層と、応えられない層で、夫婦の満足度が異なってくる傾向が見られた。特に、夫に比べ、妻の不満が高いことが明らかになった。離婚経験者は、90ケースの回答が得られた。夫の経済問題を離婚のきっかけにあげるものが多かった。なお、意識としては、離婚に対する拒否的意識は弱くなっていることが確認出来た。本年度は、研究の最終年度として、代表者、分担者、協力者が、前年までに集めたインタビュー・データ、質問紙調査のデータに基づき、各自、そして、共同で分析を進め、研究会を開いて相互の分析結果を検討した。分析による知見は、主に三つにまとめられる。一つは、日本の夫婦関係の現状に関してのものである。日本の夫婦関係において、40年前のデータとほとんど変わらず、共同行動は低調である。これは、セクシュアリティーに関してもいえる。しかし、共同行動が少なく、セックスレスだからといって、夫婦の関係性が希薄だと結論づけることはできない。信頼性や困ったときに助け合うなど、愛情を直接表現し合うこととは別の形での愛情関係が維持されうることが分かった。次に、恋愛感情と結婚生活における愛情が分離している様相が観察された。意識において、恋愛感情と結婚を別立と意識している傾向が強まることが分かった。行動においても、カップルを壊すことなくカップル外の親密関係を作ることが相当数いることがわかる。以上のように、近年の離婚急増を、「夫婦の愛情関係が変化した」という点に求めるという仮説は成り立たないように見える。むしろ、離婚や結婚をめぐる環境の変化によってもたらされた可能性が高い。データでみてみると、離婚経験者には、配偶者への愛情表現や経済力(女性のみ)への高い期待が見られた。つまり、相手の能力以上のものを。
隆起海棲生物殻化石を用いた南海トラフにおける海溝型巨大地震履歴の解明

本研究は,室戸岬に分布する石灰質生物殻化石を使って,南海トラフ付近で発生したすべての巨大地震の履歴について,5000年間以上にわたって切れ目無く復元することを目的としたものである.平成9・10年度は資料採取と堆積構造の分析と年代測定を中心に,研究を行った.平成11年度は,これまで得られた資料を基に化石群体の成長過程の分析を行った.標高9mと6.7mに分布する2つの化石群体において,化石群体の成長の等時間面を復元した.これによって,標高9m付近では45002700yrsbpにかけて,相対的に安定的な海水準の下で,化石群体が成長したことがわかった.標高6.7mに分布する化石群体は,27001750yrsBPくらいまで海水準が安定していたが,その後1300yrsBPにかけて,徐々に海水準が低下した傾向が読みとれた.これらのことから,室戸岬はインタープレート地震とイントラ-プレート地震の組み合わせで隆起しており,後者の方がより累積的隆起に貢献していることが確認された.また,1988年の論文で推定した6回のイントラプレート地震は,本研究では,3回程度にまとめられ,ほぼ2000年に1回の割合で発生していると推定された.イントラプレート地震の震源断層については,今後の課題として残された.また,コアの堆積構造の解析中,ヤッコカンザシ以外に,生息震度が異なる石灰藻やサンゴが多数含まれていることがわかった.しかし,生物の属種分析には専門的知識と時間が必要なため,このことに関する詳細な分析は本研究課題では結論を出すことができなかった.これらの詳細が判明すれば,インタープレート地震の復元についても展望を開くことができる可能性があるため,新たな研究課題として今後取り組む予定である.本研究は,室戸岬に分布する石灰質生物殻化石を使って,南海トラフ付近で発生したすべての巨大地震の履歴について,5000年間以上にわたって切れ目無く復元することを目的としたものである.平成9・10年度は資料採取と堆積構造の分析と年代測定を中心に,研究を行った.平成11年度は,これまで得られた資料を基に化石群体の成長過程の分析を行った.標高9mと6.7mに分布する2つの化石群体において,化石群体の成長の等時間面を復元した.これによって,標高9m付近では45002700yrsbpにかけて,相対的に安定的な海水準の下で,化石群体が成長したことがわかった.標高6.7mに分布する化石群体は,27001750yrsBPくらいまで海水準が安定していたが,その後1300yrsBPにかけて,徐々に海水準が低下した傾向が読みとれた.これらのことから,室戸岬はインタープレート地震とイントラ-プレート地震の組み合わせで隆起しており,後者の方がより累積的隆起に貢献していることが確認された.また,1988年の論文で推定した6回のイントラプレート地震は,本研究では,3回程度にまとめられ,ほぼ2000年に1回の割合で発生していると推定された.イントラプレート地震の震源断層については,今後の課題として残された.また,コアの堆積構造の解析中,ヤッコカンザシ以外に,生息震度が異なる石灰藻やサンゴが多数含まれていることがわかった.しかし,生物の属種分析には専門的知識と時間が必要なため,このことに関する詳細な分析は本研究課題では結論を出すことができなかった.これらの詳細が判明すれば,インタープレート地震の復元についても展望を開くことができる可能性があるため,新たな研究課題として今後取り組む予定である.本年度はまず現地で調査地点の選定行い、調査地が国定公園内であるため、関係諸機関や地権者の調査許可証を取得した。現地作業は9月中旬に室戸岬において、海抜09m前後にわたって岩礁に付着する海棲生物石灰質殻の化石群体より試料の採取を行った。試料の採取は、本研究費によって作成したジオアクト社製の小型エンジンドリルとダイヤモンドピット付き40cmシングルコアチューブを用いて、直径5cmの連続コアサンプリングを行った。試料は四ケ所で7本採取し、コアの総延長は約210cmであった。コアは肉眼による堆積構造の観察を行った後、X線によるより詳細な堆積構造の分析を行った。これは医療用CTスキャナーを利用してコアを1mm間隔で断面撮影し、映像をデジタル化してパソコンで三次元画像を合成する方法で、コアを破壊せずに任意の方向からコア内部の堆積構造を分析できる利点がある。現在データの解析中であるが、当初の予想通り長さ数十cmのコアはさらに数センチ程度の堆積ユニットに区分できることが数点の試料で確認された。次にコアの年代幅を碓認するため、コア最深部およぴ最浅部の^<14>C年代測定を16点行った。微量の試料で測定できるAMS法によって測定したため、標高9mで採取したコア最深部から、これまで知られていた最も古い年代よりさらに500年程度古い年代値が得られ、完新世地殻変動様式の詳細な復元に貢献できそうである。来年度はコアの堆積構造の解明を行った上で、各堆積ユニットの年代測定を行い、地震履歴を明らかにしていく。また、今年度採取できなかった標高の低い化石群体の試料採取も引き続き行う予定にしている。結果がある程度まとまった段階で学会などを通して成果を公表していきたい。

本年度も昨年度に引き続き,室戸岬において岩礁に付着する海棲生物石灰質殻の化石群体より試料の採取を行った。試料の採取は、本研究費によって作成したジオアクト社製の小型エンジンドリルとダイヤモンドビット付き40cmシングルコアチューブを用いて、直径5cmの連続コアサンプリングを行った。試料は昨年度高波で採取できなかった最下部の群体を中心に四ヵ所で8本採取し、コアの総延長は約175cmであった。昨年度はコアをX線断層撮影することにより堆積構造の分析を試みたが,解像度の限界で細かい部部分が分かりにくかったため,今年度は採取したコアを石膏で固定して,岩石カッターで縦方向に切断し,光学スキャナで読取った画像をパソコン上で拡大して堆積構造の分析を行った。その結果、長さ数十cmのコアはさらに数センチ程度の堆積ユニットに区分できることがはっきりと確認された。次に各ユニットの年代値を知るため,マイクログラインダーによって各ユニットから幅23mm程度で10点ほどサンプリングし,それぞれのユニットの年代値をAMS法によって測定した。その結果,各ユニットは100200年くらい年代差で,表面から深部にいくほど古くなる傾向が見られ,予想通リプレート間地震によって堆積間隙が形成された可能性が高まった。本年度は9月に日本地理学会において研究の途中経過を発表し,3月に予察的な報告として論文を発表した。来年度は補足調査と年代測定,研究の取りまとめを行う予定である。本研究は,室戸岬に分布する石灰質生物殻化石を使って,南海トラフ付近で発生したすべての巨大地震の履歴について,5000年間以上にわたって切れ目無く復元することを目的としたものである.平成9・10年度は資料採取と堆積構造の分析と年代測定を中心に,研究を行った.平成11年度は,これまで得られた資料を基に化石群体の成長過程の分析を行った.標高9mと6.7mに分布する2つの化石群体において,化石群体成長の等時間面を復元した.これによって,標高9m付近では45002700yrsBPにかけて,相対的に安定的な海水準の下で,化石群体が成長したことがわかった.標高6.7mに分布する化石群体は,27001750yrsBPくらいまで海水準が安定していたが,その後1300yrsBPにかけて,徐々に海水準が低下した傾向が読みとれた.これらのことから,室戸岬はインタープレート地震とイントラプレート地震の組み合わせで隆起しており,後者の方がより累積的隆起に貢献していることが確認された.また,1988年の論文で推定した6回のイントラプレート地震は,本研究では,3回程度にまとめられ,ほぼ2000年に1回の割合で発生していると推定された.イントラプレート地震の震源断層については,今後の課題として残された.また,コアの堆積構造の解析中,ヤッコカンザシ以外に,生息深度が異なる石灰藻やサンゴが多数含まれていることがわかった.しかし,生物の属種分析には専門的知識と時間が必要なため,このことに関する詳細な分析は本研究課題では結論を出すことができなかった.これらの詳細が判明すれば,インタープレート地震の復元についても展望を開くことができる可能性があるため,新たな研究課題として今後取り組む予定である.
維管束組織の構築における木部と師部の相互作用を担う分子機構の解析

維管束を構成する師部および木部組織は、どちらも前形成層/形成層細胞と呼ばれる維管束幹細胞の活動により成長する。この過程を制御する仕組みを明らかにするため、CLEファミリーに属す分泌性低分子ペプチドTDIFに着目した。これまで、TDIFペプチドリガンド-TDR受容体-WOX4標的転写因子のシグナル経路が存在することを明らかにした。このシグナルが前形成層細胞の増殖を促進すること、WOX4非依存的に木部分化を抑制する働きを持つことが分かり、維管束における幹細胞維持に必要であることが明らかとなった。今年度は得られたデータをまとめ、Plant Cell誌に論文として発表した。その他に以下の実験を行った。1)TDIFシグナル経路の新規因子の探索TDIF遺伝子を過剰発現する変異体背景で変異源処理を行い、表現型を抑圧する変異体を探索した。予備的なスクリーニングにより、約30個体の候補を見出した。2)胚軸二次成長における維管束成長様式の観察シロイヌナズナの胚軸二次成長過程を観察した結果、この成長過程がおそらく内鞘細胞を含む中心柱の細胞群の増殖によるものであることが示唆された。さらに詳しい観察を行うため、組織特異的なプロモーターGUSレポーターラインを野生型およびtdr等の各変異体背景で作成した。また、in situ hybridization法によっても発現パターンを確認したところ、TDR mRNAが前形成層に局在することが分かった。これらのマーカーは、二次成長の発生様式をより詳細に追うために利用できる。維管束を構成する師部と木部の細胞は、どちらも前形成層細胞と呼ばれる維管束幹細胞より生まれる。1、TDIFはシロイヌナズナ植物体に投与することで前形成層細胞から木部細胞への分化を抑制する効果を持つことが分かっていた。新たに胚軸の維管束切片を詳細に観察した結果、前形成層細胞の増殖が促進されていることが分かった。したがって、TDIFは維管束幹細胞である前形成層細胞に働きかけ、分裂の促進と木部細胞への分化抑制の二つの機能を果たすことが示唆された。同様の結果は、TDIFをコードするCLE41、CLE44遺伝子を強制発現させた形質転換体においても見られた。2、TDIFはロイシンリッチリピート受容体型キナーゼ(LRR-RK)によって受容されると予想されていた。また、1の結果から、前形成層細胞で発現するLRR-RKがその重要な候補となった。この情報を基に、収集したLRR-RK遺伝子変異体を用いてTDIF非感受性変異体のスクリーニングを行った。その結果、一つのLRR-RK遺伝子変体でTDIFへの感受性が失われており、この遺伝子TDIF RECEPTOR(TDR)がTDIFの受容体であると考えられた。TDRは最近報告されたPXYと同一の遺伝子である。tdr変異体では前形成層細胞が減少しており、内生のTDIFに対して感受性が低下していると考えられた。また、TDRはたしかに前形成層細胞で発現することも分かった。TDIFが主に師部より分泌されることから、前形成層細胞の運命決定において師部と木部の間にはTDIFとTDRを介したクロストークが存在すること、この仕組みが幹細胞集団の維持にも働くことが示唆された。1)WOX4遺伝子の機能解析wox4変異体の表現型を観察し、TDIFによる木部分化抑制シグナルの働きに関する新たな知見が得られた。tdr変異体では篩部に隣接した木部細胞分化が起こるのに対し、wox4変異体ではそのような異常が見られなかった。この表現型はCLE41遺伝子の変異体でも見られた。内在性のTDIF-TDRシグナル系は、篩部から生み出されるシグナルによって隣接する前形成層細胞の分化を阻害する働きを持っことが明らかとなった。2)TDIFシグナルによる幹細胞制御幹細胞は分化能と自己複製能をあわせ持つ細胞であるため、長期にわたって細胞を生み出し続ける。TDIFシグナルがこの幹細胞機能にどのような影響を与えるかを調べるため、維管束の二次成長について解析した。tdr変異体では一部の幹細胞機能が阻害され、リング状の維管束組織が途切れることが明らかとなった。詳細な観察により、篩部に隣接した木部細胞分化が、この異常の原因であることが分かった。TDIFシグナルは木部分化阻害によって幹細胞の維持に働くことが明らかとなった。これはwox4変異体では見られなかったが、tdr wox4二重変異体ではより強い異常が見られた。このことから、WOX4は幹細胞の増殖を促進することで、幹細胞維持に寄与することが示唆された。3)TDIFシグナル初期応答における新規因子の探索TDIFシグナル初期応答においてリン酸化レベルの変化するタンパク質を同定するため、ホスホプロテオーム解析を行った。シロイヌナズナ用植物体の胚軸に対してTDIFを投与したサンプルを用い、リン酸化タンパク質を精製、二次元電気泳動による分離と同定を試みた。いくつかのスポットに変化が見られた。

このシグナルが前形成層細胞の増殖を促進すること、WOX4非依存的に木部分化を抑制する働きを持つことが分かり、維管束における幹細胞維持に必要であることが明らかとなった。今年度は得られたデータをまとめ、Plant Cell誌に論文として発表した。その他に以下の実験を行った。1)TDIFシグナル経路の新規因子の探索TDIF遺伝子を過剰発現する変異体背景で変異源処理を行い、表現型を抑圧する変異体を探索した。予備的なスクリーニングにより、約30個体の候補を見出した。2)胚軸二次成長における維管束成長様式の観察シロイヌナズナの胚軸二次成長過程を観察した結果、この成長過程がおそらく内鞘細胞を含む中心柱の細胞群の増殖によるものであることが示唆された。さらに詳しい観察を行うため、組織特異的なプロモーターGUSレポーターラインを野生型およびtdr等の各変異体背景で作成した。また、in situ hybridization法によっても発現パターンを確認したところ、TDR mRNAが前形成層に局在することが分かった。これらのマーカーは、二次成長の発生様式をより詳細に追うために利用できる。
大気圧プラズマジェットを用いた細胞内への新規タンパク質導入法の確立

本研究課題の実現により、iPS細胞の作製や分化など、医療・バイオ分野への貢献が期待できる。以下に、本年度実施した研究実績の概要を記す。・大気圧プラズマジェット(PJ)の照射によるHeLa細胞内へのGFP-NLS導入:HeLa細胞にPJを照射し、GFP-NLSを細胞内に効率よく導入することを目的とした実験を行った。その結果、PJの照射により細胞死を引き起こすことなくHeLa細胞内にGFP-NLSを効率よく導入することができた。また、PJを照射してもGFP-NLSの主な機能である緑色蛍光性と核移行性が維持されることがわかった。・誘電体材質の違いによるPJへの影響:ガラス管とアルミナ管を用いてPJを生成し、各PJで生成される活性種の種類や量に違いが見られるか調査した。その結果、励起状態粒子の種類に違いは見られなかったが、アルミナ管を用いた方が全体的な発光強度が強く、励起状態粒子の生成量が多くなることがわかった。また、アルミナ管を用いた方が電界の時空間分布が大きくなることが示唆された。・PJへの水分添加による細胞への影響:乾燥PJ(DPJ)とミストPJ(MPJ)を細胞に照射し、細胞に異なる影響を与えるかどうかを調査した。その結果、MPJではOHラジカルやH2O2の生成量が増加することが示唆され、タンパク質導入研究において、照射時間の短縮などが期待できることが示唆された。また、PJは直接的に細胞死を引き起こすよりも、培地を介して二次的に細胞死を引き起こす可能性が高く、特に、MPJを照射した場合には培地を介した二次的な反応が細胞死を引き起こす主な要因となることがわかった。・PJへの水分添加による細胞培地への影響:DPJとMPJを照射した培地のpH、導電率、温度の変化を調査した。その結果、これら個々の影響による細胞死誘発の可能性は低いことがわかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は,これまで我々の研究室で調査してきた,大気圧プラズマジェット照射による細胞培養培地中のヒト子宮頸癌由来(HeLa)細胞内へのタンパク質導入ドメイン(Protein Transduction Domain : PTD)装飾緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein : GFP)の導入効率向上に向けた各種パラメータの最適化,及び,そのメカニズムの解明のための調査を目的としている.本課題の実現により,人工多能性幹(induced Pluripotent Stem : iPS)細胞作製はもとより,医療・創薬など様々な分野における応用が期待できる.また,安価な装置とニードル状プラズマによる細胞の選択性を上げることで,生物学者への広い普及も期待できる.以下に,本年度実施した研究内容の概要を記す.[1]タンパク質導入後の細胞生死確認,及び,タンパク質導入量の定量評価PTD装飾GFPの精製に着手し一定の収量が得られたが,所望の収量には未だ至っておらず,また,技術の習得に多大な時間を要したため,十分な実験及び評価を行うことができなかった.今後はより効率的な精製と収量の確保を目指し,来年度の上期を目標に当該実験を行う予定である.[2]プラズマジェットの物理特性評価誘電体にガラス管とアルミナ管を用いてプラズマジェットを生成し,プラズマ進展速度や発光強度の推移,生成種の評価などの比較を行った.その結果,同一電圧を印加した場合,進展速度に大差はないが,アルミナ管を用いた方が発光強度は強くなり, N_(2)^(+)などの高エネルギー粒子種の生成割合が高くなることが示された.また,プラズマ原料であるヘリウムガスへの含有水分量の違いによって, OHラジカルなどの生成される粒子種の割合に違いが見られた.[3]培地の物理特性変化の調査大気圧プラズマジェット照射前後において,培地の含有タンパク質成分, pH,導電率,紫外線透過率などの変化を調査した,その結果,これらの成分変化が細胞へ何らかの影響を及ぼすことが示唆された本研究課題の実現により、iPS細胞の作製や分化など、医療・バイオ分野への貢献が期待できる。