hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳内侵潤Ｔ細胞の免疫学的解析に基づくフラビウイルス脳炎の病態形成機序の解明

感染後体重が減少するマウスと体重が減少しないマウスが存在したが、感染後13日までに25%以上体重が減少したマウスは、21日目までにすべて死亡した(死亡群)。一方、13日目までに体重の減少が10%以下であったものはすべて生存した(生存群)。これらの死亡群、生存群から5頭ずつ選び、脳内のウイルス学的、免疫学的解析を行った。まず、脳のウイルス量は両軍とも感染ウイルス価、RNAレベルいずれにおいても差は認められなかった。このことは、感染マウスの生死が脳内ウイルス量によって決定されるのではないことを示している。脳内におけるCD3、CD4、CD8、CD25及びCD69の発現量においても差はなかった。従って、死亡群と生存群の脳内におけるT,B細胞の数等の差が生死を決定しているのではないと考えられた。一方、IFN gamma、TNF alpha (Th1型サイトカイン)とIL4、IL5 (Th2型サイトカイン)の比は、生存群に比べ死亡群において高い値を示した。さらに、脳内侵潤T細胞のT細胞レセプターの解析を行った。得られたPCR産物を全TCRα鎖可変部(TCRAV)及びTCRβ鎖可変部(TCRBV)ファミリーにそれぞれ相補的なオリゴDNAを固相化したマイクロプレートに播種してハイブリダイズさせた後、酵素反応を用いて発色させ吸光度を測定した。得られた吸光度から各TCRVファミリーの存在率を算出することにより、mRNAレベルにおける脳内浸潤T細胞のTCRVファミリーの偏在性を検討した。VA8-1、VA10-1あるいはVB2-1を発現しているT細胞は死亡群、生存群いずれにおいても増加していた。しかし、これらのT細胞レセプターのCDR3部位のアミノ酸配列を比較すると、両軍間には相違がみられた。従って、本モデルにおいては脳内浸潤T細胞の質的な違いが、日本脳炎ウイルス感染後の生死を決定していることが示唆された。本年度の研究により、日本脳炎ウイルス感染マウス脳内侵潤T細胞において選択的に使用されているT細胞レセプターが明らかとなった。非感染マウスにおいて、抗体等によってこれらのTCRV発現T細胞を選択的に削除する。その後、このマウスに日本脳炎ウイルスを感染させ、感染後のウイルス動態、脳炎発症の有無を解析する。仮に上記方法によって明確な結果が得られない場合は、正常マウス末梢血リンパ球を採取し、T細胞レセプターの各Vセグメントに対する抗体を吸着させたmagnetic beadsを利用し、特定されたT細胞レセプター発現リンパ球を除去後のリンパ球をSCIDマウスに移入し、日本脳炎ウイルス特異的T細胞レセプターを保有するT細胞を欠落したマウス作成し、ウイルスを接種して症状を観察し、同定されたT細胞レセプター保有T細胞の日本脳炎ウイルス感染病態に果たす役割を明らかにする。脳炎を発症したマウスから、脳内浸潤T細胞クローンを樹立する。ウイルス感染により特異的T細胞の出現が推測されるが、T細胞レセプターの各Vセグメントに対する抗体吸着マグネチックビーズを利用し、特定されたTCRV遺伝子発現を有するT細胞を抽出することも考慮する。樹立した各T細胞クローンのTCRAV及びTCRBVを同定し、高発現頻度のTCR発現型を有するクローンを選択樹立する。T細胞クローンは、in vivo解析としてJEV感染マウスに移入し脳炎の症状が改善/増悪を免疫学的及び病理組織学的所見と合わせて評価する。
高電荷密度イオン性高分子の創成と新奇機能性ゲルの開発

高吸収性機能性ゲルの材料ポリマーとして期待されるポリフマル酸(PFA)を合成するのに必要となるポリフマル酸ジ-tert-ブチル(PDtBF)について,テトラヒドロフラン(THF)中30°Cにおいて,静的光散乱により重量平均分子量Mw,平均二乗回転半径〈S2〉,第二ビリアル係数A2を決定した.同じ溶媒条件において,粘度測定により固有粘度[η]を,動的光散乱測定により流体力学的半径RHを決定した.これらの結果をみみず鎖モデルに基づいて解析し,PDtBFに対する剛直性パラメーターλ^<-1>の値を375Åと決定した.これは,ポリフマル酸ジイソプロピル(PDiPF)に対するλ^<-1>の値113Åに比べてはるかに大きい.このことより,PDiPFやPDtBFを含むポリフマル酸ジアルキルでは,側鎖置換基にメチル基が1つ増えることによって,鎖の剛直性が劇的に増加することが明らかになった.高吸収性機能性ゲルの材料ポリマーとして期待されるポリフマル酸(PFA)を合成するのに必要となるポリフマル酸ジ-tert-ブチル(PDtBF)について,テトラヒドロフラン(THF)中30°Cにおいて,静的光散乱により重量平均分子量Mw,平均二乗回転半径〈S2〉,第二ビリアル係数A2を決定した.同じ溶媒条件において,粘度測定により固有粘度[η]を,動的光散乱測定により流体力学的半径RHを決定した.これらの結果をみみず鎖モデルに基づいて解析し,PDtBFに対する剛直性パラメーターλ^<-1>の値を375Åと決定した.これは,ポリフマル酸ジイソプロピル(PDiPF)に対するλ^<-1>の値113Åに比べてはるかに大きい.このことより,PDiPFやPDtBFを含むポリフマル酸ジアルキルでは,側鎖置換基にメチル基が1つ増えることによって,鎖の剛直性が劇的に増加することが明らかになった.まず、大津らの方法によってポリフマル酸ジイソプロピル(PDiPF)をラジカル重合により合成し、分別沈殿法によって分別精製した試料を準備した。塩酸または水酸化ナトリウムを使ってPDiPF側鎖のイソプロピルエステル基を加水分解し、高電荷密度イオン性高分子であるポリフマル酸(PFA)を得ることを試みたが、残念ながら加水分解は進行せずPFAは得られなかった。PDiPFの側鎖エステル結合をカルボキシ基に変換させるために、PDiPFを求核試薬であるtrimethylsilyl iodldeやpotassium trimethylsilanolateと反応させる方法も試みたが、いずれの方法でもPFAは得られなかった。そこで、同じく大津らの方法によってポリフマル酸ジ-tert-ブチル(PDtBF)を合成し、それを分別精製した試料を準備した。PDtBF試料を180°Cで2時間加熱し、側鎖のtert-ブチルエステル基をカルボキシ基に変換させることにより、PFAを得ることに成功した。PFAの生成は^1H NMR測定によって確認した。PFAの研究を進める上で必要となるPDtBFの分子物性に関する情報を得るために、分別精製したPDtBF試料について良溶媒であるテトラヒドロフラン(THF)中30°Cにおいて、静的光散乱測定および粘度測定を行い、重量平均分子量、第二ビリアル係数、固有粘度を決定した。その結果を、以前に報告したPDiPFに対する結果と比較したところ、PDtBFはPDiPFと同様に、剛直な高分子であることを明らかにした。さらに、PDtBFはPDiPFに比べて側鎖置換基の嵩高さが高いために、剛直性がより大きくなっていることおよびTHFとの親和性が若干低くなっていることを示した。まず、大津らの方法によってポリフマル酸ジイソプロピル(PDiPF)をラジカル重合により合成し、分別沈殿法によって分別精製した試料を準備した。PDiPFの側鎖エステル結合をカルボキシ基に変換させるために、PDiPFを求核試薬であるtrimethylsilyl iodideやpotassium trimethylsilanolateと反応させる方法も試みたが、いずれの方法でもPFAは得られなかった。

PFAのゲル化のための予備的実験として、ポリアクリル酸市販試料のglycerol diglycidyl etherまたはpoly (ethylene glycol) diglycidyl etherを用いた架橋反応によるゲル化を試行し、PFAのゲル化のために必要な情報の蓄積を行った。大津らの方法によってポリフマル酸ジ-tert-ブチル(PDtBF)を合成し、それを分別精製した試料を準備した。PDtBF試料を180°Cで2時間加熱し、側鎖のtert-ブチルエステル基をカルボキシ基に変換させることにより、PFAを得ることに成功した。PFAの生成は1H NMR測定によって確認した。PFAの研究を進める上で必要となるPDtBFの分子物性に関する情報を得るために、分別精製したPDtBF試料について良溶媒であるテトラヒドロフラン(THF)中30°Cにおいて、静的および動的光散乱測定、粘度測定を行い、重量平均分子量、第二ビリアル係数、固有粘度、並進拡散係数を決定した。その結果を、以前に報告したPDiPFに対する結果と比較するとともに、みみず鎖モデルに基づいて解析し、PDtBFの剛直性パラメータおよび流体力学的な鎖の太さに関するパラメータの値を決定した。PDtBFはPDiPFに比べて、はるかに剛直な高分子であることを示した。PDtBFはPDiPFに比べて側鎖置換基がメチル基1個分だけ嵩高く、そのメチル基1個分の違いが高分子鎖の剛直性に大きな影響を及ぼしていることを明らかにした。PFAのゲル化のための予備的実験として、ポリアクリル酸市販試料のglycerol diglycidyl etherまたはpoly(ethylene glycol)diglycidyl etherを用いた架橋反応によるゲル化を試行し、PFAのゲル化のために必要な情報の蓄積を行った。今後、PFAを吸収性ポリマーとして応用する研究に発展することが期待される。機能性ゲルの材料となるポリフマル酸(PEA)およびPEAの前駆体ポリマーであるポリフマル酸ジ-tert-ブチル(PDtBF)の調製方法は確立している。したがって、PDtBFの特性解析とPEAのゲル化実験を進める段階に来ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。ポリフマル酸ジ-tert-ブチル(PDtBF)の特性解析およびポリフマル酸(PFA)のゲル化実験を推進する。PFAのゲル化実験では、まずポリアクリル酸市販試料を用いたゲル化の予備実験の経験を十分に蓄積した後に、PEAの最も有効なゲル化に取り掛かる予定である。
変異に対して頑強なゲノムの進化的構築

本研究の目的は、変異の有害作用を防ぐ原理を発見するため、高変異性大腸菌を植え継ぎ実験によって、増殖能力を低下させ、変異に対して頑強なゲノムの形成過程を明らかとすることである。変異の多くは生物の生存に有害な作用を及ぼすことがこれまでの研究で明らかとなっている。しかしながら、変異に対する対抗手段については未知な部分が多い。変異に対して頑強なゲノム配列の特徴や設計指針を理解できれば、有害な作用を防ぐことが可能になると期待される。そのために、本研究では、増殖速度に対して強い選択が掛かる環境下でかつ高い変異率で大腸菌を培養し、そのゲノムの進化を追跡することを確認した。増殖速度に対して選択が掛かりにくい環境下で継代培養した大腸菌に比べ、数千個の変異が蓄積しても増殖速度が低下しないことが分かった。得られた変異を解析した結果、複数の独立進化系列において、変異が集中して蓄積する遺伝子群を同定した。これらの遺伝子群はストレス応答に関わるものであり、変異に対する頑強性に密接に寄与する可能性が高いことが分かった。また、有害変異の蓄積によってもたらされる増殖低下だけでなく、変異率が高くなることに付随するなんらかの作用にって、増殖低下が引き起こされることを突き止めた。後者に対する耐性は、長期間の継代を経てもほとんど進化しないことが分かった。以上の実験証拠から、変異に対して頑強なゲノムの設計には、少なくとも二つの異なる有害作用に対するメンテナンスが必要になると推察された。さらに変異を解析した結果、変異は与えられた任意の塩基配列に完全にランダムに生じるのではなく、少なくとも23塩基で構成される特定の塩基配列のモチーフに変異が生じやすいことが分かった。これらの発見は、生じた変異に頑強なだけでなく、変異そのものが生じにくいゲノムを設計する上で重要な基礎的知見であると考えられる。本研究の目的は、変異の有害作用を防ぐ原理を発見するため、この高変異性大腸菌を植え継ぎ実験によって適応進化させ、変異に対して頑強なゲノム配列の形成過程を明らかとすることである。変異の多くは、生物の生存に有害な作用を及ぼしている。従って、変異に対して頑強なゲノム配列の特徴や設計指針を理解できれば、有害な作用を防ぐことが可能になると期待される。そのために、本研究では、高変異性大腸菌を構築し、植え継ぐ過程で発生する目的変異体(高い変異率でも増殖能力が落ちにくい変異体)を進化実験によって取得し、その頑強性のメカニズムを解明する。本年度は、大腸菌の変異修復遺伝子を欠損させて様々な高変異性大腸菌の構築を試みた。その結果、野生型の1000倍も高い変異率を持つ高変異性株の取得に成功した。さらにこの株は、その高い変異性ゆえに増殖速度が野生株よりも著しく遅いことを実験によって確かめた。この株を用いて、試験的に進化実験を行った。その際、様々な培養条件で培養し、変異率と変異スペクトルが培養条件にどの程度依存するかを確認し、ゲノム上での変異箇所を解明する解析技術を確立した。これらは、本格的に実施する進化実験(および得られる変異体の解析)に必要な技術である。予定した実験材料(高変異性大腸菌)と実験条件を予定していた期間内に構築できたため。また、追加の解析や、実験材料の不備の修繕も最小限に抑えることができたため。本研究の目的は、変異の有害作用を防ぐ原理を発見するため、高変異性大腸菌を植え継ぎ実験によって、増殖能力を適応進化させ、変異に対して頑強なゲノム配列の形成過程を明らかとすることである。従って、変異に対して頑強なゲノム配列の特徴や設計指針を理解できれば、有害な作用を防ぐことが可能になると機内される。そのために、本研究では、高変異性大腸菌を構築し、植え継ぐ過程で発生する目的変異体(高い変異率でも増殖速度が落ちにくい変異体)を進化実験によって取得し、その頑強性のメカニズムを解明する。昨年度までに、高変異性大腸菌の構築に成功し、野生型の1000倍も高い変異率を持つことを確認した。今年度は、この高変異性大腸菌の変異率が植え継ぎ中に、元の低い変異率に戻らないようにする工夫として、紫外線照射による変異誘導実験を行った。その結果、仮に進化の過程で変異率が低くなったとしても、野生株の数百倍程度の高い変異率は紫外線照射によって維持できることが分かった。また、紫外線照射の変異スペクトルや、変異発生部位をゲノムシーケンスによって調べ、高変異性大腸菌のそれとかけ離れた性質でないことを確認できた。この条件で進化実験を開始し、得られた変異体についてゲノム変異を同定し、遺伝子の不活化変異の発生速度が意図したとおりに高速化できていることを確認した。進化実験を安定に進めるための条件および、ゲノムシーケンシングの解析パイプラインが期間内に整ったため。

増殖速度に対して選択が掛かりにくい環境下で継代培養した大腸菌に比べ、数千個の変異が蓄積しても増殖速度が低下しないことが分かった。得られた変異を解析した結果、複数の独立進化系列において、変異が集中して蓄積する遺伝子群を同定した。これらの遺伝子群はストレス応答に関わるものであり、変異に対する頑強性に密接に寄与する可能性が高いことが分かった。また、有害変異の蓄積によってもたらされる増殖低下だけでなく、変異率が高くなることに付随するなんらかの作用にって、増殖低下が引き起こされることを突き止めた。後者に対する耐性は、長期間の継代を経てもほとんど進化しないことが分かった。以上の実験証拠から、変異に対して頑強なゲノムの設計には、複数の二つの異なる有害作用に対するメンテナンスが必要になると推察された。高い変異率でゲノム上に変異を蓄積させる実験装置を用いることで、ゲノム上に数千個の変異を蓄積させることができた。この値は当初目標に比較的近い値であり、目標としていた統計解析を実施できたため。本研究の目的は、変異の有害作用を防ぐ原理を発見するため、高変異性大腸菌を植え継ぎ実験によって、増殖能力を低下させ、変異に対して頑強なゲノムの形成過程を明らかとすることである。変異の多くは生物の生存に有害な作用を及ぼすことがこれまでの研究で明らかとなっている。しかしながら、変異に対する対抗手段については未知な部分が多い。変異に対して頑強なゲノム配列の特徴や設計指針を理解できれば、有害な作用を防ぐことが可能になると期待される。そのために、本研究では、増殖速度に対して強い選択が掛かる環境下でかつ高い変異率で大腸菌を培養し、そのゲノムの進化を追跡することを確認した。以上の実験証拠から、変異に対して頑強なゲノムの設計には、少なくとも二つの異なる有害作用に対するメンテナンスが必要になると推察された。さらに変異を解析した結果、変異は与えられた任意の塩基配列に完全にランダムに生じるのではなく、少なくとも23塩基で構成される特定の塩基配列のモチーフに変異が生じやすいことが分かった。これらの発見は、生じた変異に頑強なだけでなく、変異そのものが生じにくいゲノムを設計する上で重要な基礎的知見であると考えられる。今後は、取得した高変異性大腸菌を継代培養し、早い増殖速度をもつ変異体を選択していく。逐次得られる進化株について、高変異率状態での増殖速度と低変異率状態(変異修復遺伝子を再導入することで得られる)での増殖速度を比較する。
日英ニュースディスコースの比較分析-異文化理解の視点より

この研究は日英のメディア、特に、新聞記事の比較を、捕鯨というテーマを中心に、最近特に注目されている批判的談話分析(CDA)と異文化比較・コミュニケーションの視点を踏まえながら分析し、異文化理解における教育的示唆を検討したものである。まず研究報告書第1章では研究概要を説明し、第2章でニュースデイスコースを分析する上での理論的背景・枠組みとしてのCDAの可能性を異文化理解の視点を取り入れながら批判的に考察した。次に3章ではCDAの視点を取り入れてのテキスト比較分析の例を2種類挙げた。まず3章1項では日英の捕鯨に関する新聞論説を比較分析し、それぞれの論説が一般的にステレオタイプ化されているものとは異なる方略を用い、それぞれの立場を推進していることを明らかにし、2項では英国における捕鯨と北洋のたら漁業の記事を比較し、地域経済や文化に深く関わっている問題と直接影響がない問題ではそのデイスコースが異なることを明らかにした。第4章では、読者が実際にいかに記事を解釈するかを民俗誌学的に調査するために実施した2種類のアンケート結果を紹介した。1回目のアンケートは日英読者の捕鯨に対する意見と、捕鯨に関する記事を読んだ時の受け止め方の関係を、英国の新聞論説を用い調査し、読者の意見、文化的前提・背景知識と論説の受け止め方の関係を明らかにした(4.1)。第2回目では更に詳細に文化的前提と背景知識が読者の記事の解釈にいかに影響するかを調査し、テキストの解釈にこれらの要素が深く関わり、読者が必ずしも記者の意図した解釈をしないことを明らかにした(4.2)。第5章では3章で紹介したテキスト分析と4章で説明したアンケート調査の結果をもとに、ニュースデイスコースが異文化理解に果たす役割、重要性について文化的な背景を考慮しながら統合的に考察し、第6章では本研究の残された課題について言及した。平成15年度前半は、主として、捕鯨のデイスコースに関する第一次アンケート結果の分析・考察を行うと同時に、その結果をまとめ、一部を11月下旬にニュージーランドのワイカト大学で開催された国際会議で口頭発表した。この調査結果に関する論文は、現在、国際学術雑誌に投稿中である。15年度秋から夏にかけては、2度目の読解アンケートの実施、分析を行った。イギリスでのアンケート実施にあたっては、当初から予定していたロンドン大学の2つのコレッジとリーズメトロポリタン大学の研究者に協力を頂くと同時に、ニュージーランドのワイカト大学の学生とロンドンのクロイドンコレッジに学ぶEFLの生徒にも新たにアンケート実施に協力して頂いた。この2回目のアンケート結果については、データの入力が終了し、現在分析中である。15年度は読解アンケートの実施、分析と同時に、既に収集した捕鯨に関する記事に加え、更に新しい新聞記事の収集・分析も続けた。特にガーデイアン紙の過去の記事、新たにタイムズ紙の記事も比較・分析の対象に入れて、収集・分析にあたった。英国側の資料の調査・収集にあたっては主としてウェストミンスター参考文献図書館を利用し,ここやその他の図書館等で調べ、収集したデータの読み込み、分析、整理作業をスキャナー等を利用し、続けると同時に、科研費で購入したCD-ROM版の英国の新聞3紙(インデペンデント、ガーデアン、タイムズ2001-2年版)を用い、捕鯨関連記事に関するコーパスを構築する作業を続けている。また、上記資料の収集・分析と並行して、常に進展を続ける批判的談話分析の分野での新しい研究・理論の発展を取り入れるための文献調査も引き続き行った。その一環として、現在メディアデイスコースに関する書籍の書評を国際学術誌掲載のために執筆中である。

平成16年度には、まず15年度までに行った読解テスト式アンケートの分析を引き続き行い、その結果の集大成の一部を11月初旬に韓国、ソウルで開催されたAsia TEFL国際英語教育学会で発表すると同時に、論文にもまとめ、現在、国際学術雑誌に投稿準備中である。また、平成16年度も、既に収集した捕鯨に関する記事に加え、更に新しい記事の収集・分析を続けた。特に今年度は従来のインデペンデント、ガーデアン両紙に加え、タイムズ紙の記事のデータ構築を比較・分析の対象として更に充実させた。英国側の資料の調査・収集にあたっては、ウェストミンスター参考文献図書館、大英図書館のコリンデール新聞図書館などを利用し、資料収集に当たると同時に、収集したデータの読み込み、分析、整理作業を続けた。また、CD-ROM化した英国の新聞3紙(インデペンデント、ガーデアン、タイムズ)を用い、捕鯨関連記事に関するコーパスの構築も引き続き行った。また、British National CorpusやBank of Englishなどの既存の大規模な一般コーパスのデータとの比較分析も引き続き行っており、現在、このように資料収集、コーパスの構築を続けながら、既に構築されたコーパスをもとに、捕鯨の記事の多角的視点からの分析をいくつかの論文としてまとめるべく準備中である。また、研究結果の応用としては、近い将来上記の結果を踏まえて、この研究を最近特に注目されている批判的談話分析(CDA)と異文化比較・コミュニケーションの視点を踏まえながらの異文化理解を論じる本、教材としてまとめることを検討している。第1回目のアンケート調査に基づく研究成果の一部は国際学術雑誌に掲載された。また、批判的談話分析と密接な関係があるメデイアデイスコースの分野の書評が2005年度中にも国際学術雑誌に掲載される予定である。
高密度の形状記憶合金アクチュエータアレイによる生物の動きの表現の研究

■研究目的本研究は、独自に開発した形状記憶合金アクチュエータを高密度に配置し、多数のアクチュエータの動きの集合による生物の動き「ざわめき、うごめき」の表現を研究するものである。既存のディスプレイ装置にはない生物的な表現を利用して訴求力の高いディスプレイ装置を実現することを目的としている。■研究方法本研究では、形状記憶合金を用いて3軸方向へ駆動するアクチュエータ、形状記憶合金の熱を制御するための電子回路、制御用ソフトウェアを開発する。そしてプロトタイプとして、これらを組み合わせた実体型ディスプレイ装置を製作する。■研究成果特注のシリコンチューブと形状記憶合金線材を用いて3軸方向駆動可能なアクチュエータを開発した。駆動系となる3つの形状記憶合金にそれぞれ独立した電圧を与えて、電圧の変化を調整することでアクチュエータの周方向に360度回転する動きを実現することができた。これにより、複雑な動きを単純な機構によって制御することを可能にした。このアクチュエータの制御技術については特許出願を行い、その審査請求を行った。また、制御用電子回路とソフトウェアの開発を行い、プロトタイプとなる実体型ディスプレイ装置「plant」と「Tentacles」を開発した。「plant」は、鑑賞者の手に反応して葉がざわめく。「Tentacles」は、イソギンチャクの触手のように鑑賞者の手に反応して触手がうごめく。「plant」と「Tentacles」では予算の関係で小規模のディスプレイ装置となったが、今後はさらにサイズの大きな装置を開発し、解像度を高くして文字情報や図形が提示可能な装置を開発したい。
喉頭組織と男性ホルモン,その特異受容体と関連遺伝子発現

人正常喉頭上皮及び喉頭癌標本を対象とし:形態的に喉頭の基底膜に近い上皮細胞の核への男性ホルモン(T)の移行があることを組織培養及び3^H標識Tを用いて証明した。紀元前来予想の域を抜け出ないままであった人の声の性分化、Tの喉頭への関与を始めて実験的に証明しえたものである。また喉頭癌細胞でも同様であり、全ての細胞ではないがTの細胞核への取り込みを示し、癌細胞の生理作用への関与を裏付けるものである。これは喉頭癌発生の高い男性優位性(F : M=1:10<)を示す疫学調査結果の理解に一つの根拠を与えるものである。人喉頭癌培養細胞を対象とし:喉頭癌細胞(HEp-2)は、T及びエストロジェン(E)感受性を持ち、AR遺伝子転写活性能を必須とするが後の翻訳を欠きAR蛋白発現を必要としない。このことは古典的な男性ホルモンの作用機構では説明できない他のNongenomicなTによる活性の存在を示唆するものである。さらに10^<-6>M以上のTとEはこの癌細胞の死を誘導すること、報告が皆無な喉頭上皮細胞のT代謝を含め以下を証明した。1.アロマターゼ及びE受容体II型の遺伝子転写能を有する。3.この細部死現象は、p53に依存し、Caspase-3には非依存性である。実験動物(C_3H系マウスの担癌モデル使用)を対象とし:1.ホルモン調節機構破綻こよる発癌、副腎皮質(癌腫16例、他の4例も片測、両測性の血腫、水腫又は膿胞何れか発生)、唾液腺(2例)、乳腺(2例)、肝臓(2例)であり100%の個体に癌病変が確認された。2.T処置による癌細胞死誘導現象をin vivoで証明。3.T処置により健康の向上と60%完全治癒、40%延命(平均106日)を確認。(未処置群では移殖後、死亡率100%、平均寿命43日)人正常喉頭上皮及び喉頭癌標本を対象とし:形態的に喉頭の基底膜に近い上皮細胞の核への男性ホルモン(T)の移行があることを組織培養及び3^H標識Tを用いて証明した。(未処置群では移殖後、死亡率100%、平均寿命43日)男性ホルモンの性差誘導に音声の性分化も含まれ、喉頭癌発生が男性優位であることからもその声帯上皮は男性ホルモンの生理作用の下にあり、成長も含め喉頭組織を構成する筋、骨と共に影響を受ける。男性ホルモンはその標的組織で活性化の高い物質へと代謝されるが、声帯上皮における男性ホルモン活性型またその代謝が不明であった。今回この点を検討した。方法:今回、喉頭癌細胞(HEp-2)をコンフル95%状態まで培養RNA抽出保存し、プライマーを男性ホルモン代謝系酵素等に対しそれぞれ約200bpに設計しRT-PCR法に用いた。さらに産物をサイクル又はダイレクトシークエンス法にて塩基配列を調べ再確認した。スライド上に細胞培養、各種ホルモンの影響を調べた。結果及び結論:喉頭上皮細胞(癌細胞株)においては前立腺、外性器での活性型男性ホルモンである5α-Dihydrotestosteroneへの代謝能はない。さらにこの細胞はアロマターゼ酵素とエストロジェン受容体II転写能を有する。この株は男性ホルモン感受性であり10-6M以上の濃度で癌細胞死が誘導され、またEstradiol-17βによっても起こる。

このことからも、材料が癌細胞というバイアスがかかるもののEstradiol-17β受容体RNA発現のみならず翻訳もおこり、実際の喉頭組織上皮の生理活性に、性ホルモンTestosteroneのみならずEstradiol-17βが働いていることを示唆するものである。(研究内容は第101回日本耳鼻咽喉科総会、弟8回日本ステロイドホルモン学会にて口頭発表、「ステロイドホルモン研究の進歩2001」へ掲載予定)一方、男性ホルモン細胞死誘導のin vitroでの結果をin vivoで検討するため、内分泌平衡破綻による男性ホルモン感受性癌株作成(乳癌pectoral-1,Inguinal-5)、肝癌、副腎皮質腫瘍)継代株への可能性実験観察中。第9回ステロイドホルモン学会で報告予定。男性ホルモンが誘導する癌細胞死現象そして担癌生体(モデル)の延命・完全緩解の生命現象が存在する。培養咽頭癌細胞が男性ホルモン(10^<-6>M>)により細胞死が誘導される。この細胞死現象は男性ホルモン受容体転写及び翻訳を抑制する特異アンチセンスオリゴの前処理によりこの細胞は死から免れる。このことから男性ホルモン誘導癌細胞死には男性ホルモン受容体遺伝子転写が必須であることを示す。この細胞は男性ホルモン受容体遺伝子に欠損遺伝子変異が存在した。(ホルモンと臨床:ステロイドホルモン研究の進歩,p150-154.1999)またこの細胞はアロマーゼ及びエストロゲン受容体遺伝子の転写能を有しエストロジェンへの代謝産物でも癌細胞死が誘導される(ホルモンと臨床19増刊号p181-191.2001)以上はin vitro系の研究であるためin vivoでの同様の検討の必要性から動物実験(C3H系マウス)を行った。副腎皮質腫瘍株において男性ホルモン誘導癌細胞死を見出された。男性ホルモン投与により癌細胞の縮小とともに担癌生体自体の活動減少が抑制され17例中15例に延命効果が、そのうち9例に完全緩解が認められた。さらに普遍性を高める目的からホルモン分泌調節機構破綻により生じるステロイド関連腫瘍をマウス(C3H)において作成し(顎下腺癌1、耳下腺癌1、乳癌1、肝癌1、副腎皮質腫瘍9例)、同系去勢マウスに移植後各癌細胞のステロイド感受性を検討した。(2001年度日本ステロイドホルモン学界で報告)、また現在進行中である。この研究目的は、一つに性ホルモン受容体遺伝子を分子標的としたEBMに基づく新しい癌治療への一助として、そして遺伝子変異又は関連遺伝子を解明によりステロイド感受性癌の中から細胞死誘導が可能な検体を模索し治療指針の一助なる事を希望を含め見出すことにある。喉頭癌細胞は、アンドロゲン(T)、エストロジェン(E)、コルチゾン(C)により細胞死誘導が起こる。喉頭上皮では、前立腺に代表される男性ホルモンの活性型への変換、5α還元によるTから5α-Dihydrotestosteroneへの代謝はない。喉頭癌細胞株はアロマターゼ及びE受容体βの転写能を有し、Eにより細胞死が誘導される。喉頭上皮細胞では、TはEに代謝される。T喉頭癌細胞死の際、Tの核内での局在、またAR遺伝子転写抑制により細胞死が阻止され、Tも喉頭上皮生理における活性型となる。T誘導喉頭癌細胞死は、Bax及びBcl-2いずれも発現しその均衡の破綻による細胞死である。ステロイドの癌細胞への関与をin vivoで検証する必要性がある。今回、ホルモン調節機構破綻による発癌とTその他ステロイド感受性を検討、病変が確認された臓器は、副腎皮質(癌腫16例、他の4例も片測、両測性の血腫、水腫又は膿胞何れか発生)、唾液腺(2例)、乳腺(2例)、肝臓(2例)であり100%の個体に癌病変が確認された。一継代株副腎皮質腫瘍移植
FGF18の骨・軟骨、肺形成における役割とその分子メカニズムの解明

本研究により、内軟骨性骨化においてFgf18は軟骨膜に発現し、増殖軟骨細胞に発現するFgfr3cを介して増殖軟骨細胞の増殖と肥大化軟骨細胞への分化を抑制することに加え、肥大化軟骨細胞・最終分化肥大化軟骨細胞に発現するFgfr1cを介して軟骨細胞の最終分化肥大化過程を促進すること、また、前駆骨芽細胞に発現するFgfr2cを介して骨芽細胞の成熟を促進することで骨化過程を促進することが新たに明らかとなった。さらに、マウス胚より長管骨を調製し、in vitroの器官培養系でFGF18を作用させ、FGF18の分化促進に関与する細胞内シグナル伝達系をタンパク質のリン酸化や各種阻害を用いて調べた。その結果、Fgf18は主として、MAP経路を介してその作用を発現していることが明らかになった。一方、Fgf18欠損マウスの肺の形態学的観察から、肺葉の形成、気管支の分枝はあまり異常がないことが明らかになった。さらに、気管支の上皮細胞の分化マーカーの発現を調べ、その発現にも異常がないことも明らかになった。また、胎生後期のFgf18欠損マウスの肺を調べたところ、その肺胞壁の肥厚化と肺胞空間の狭隆化が観察された。さらに、電子顕微鏡で肺の切片を観察したところ、FGF18欠損マウスの肺胞の毛細血管が肺胞壁に埋もれ、肺の機能不全が観察された。さらに、肺胞上皮細胞の細胞増殖活性を調べ、Fgf18はFgfr2cを介して、肺胞原基形成期における細胞増殖を一過性に促進することが明らかになった。従って、肺胞原基形成期のFgf18による適正な細胞増殖の制御によって、肺胞原基の形成が開始し、Fgf18が肺胞原基の細胞の配置や上皮細胞の分化にも関与していると考えられた。我々は、FGF18遺伝子欠損マウスの表現形質の解析から、FGF18が肺、骨・軟骨形成因子として重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。四肢の骨を始めとする全身の主要な骨は、内軟骨性骨化過程により形成される。その過程において、FGF18は、増殖軟骨細胞の増殖と、増殖軟骨細胞から前肥大化軟骨細胞への分化の両者を抑制していた。一方、近年、肥大化軟骨細胞から最終分化肥大化軟骨細胞への分化も、内軟骨性骨化過程に重要であり、またその分化過程をFGFシグナリングが促進している可能性が報告された。従って平成17年度では、FGF18の最終分化過程に対する役割を検討した。FGF18遺伝子欠損マウス胎生15.0日胚、15.5日胚の脛骨を対象に、最終分化肥大化軟骨細胞のマーカーであるosteopontinの発現をin situ hybridizationにより検討したところ、最終分化肥大化軟骨細胞層領域の減少が確認された。従って、FGF18は肥大化軟骨細胞からの最終分化過程に重要な役割を果たすことが示された。さらに、FGF18の骨細胞分化における役割を検討した。胎生18.5日齢FGF18遺伝子欠損マウスの脛骨を対象に、骨芽細胞マーカーであるosteopontinの発現をin situ hybridizationにより検討したところ、発現の減少が確認された。従って、FGF18は骨芽細胞の成熟を促進し、骨化を正に制御していることが示された。以上の結果より、FGF18は、個体の骨形成過程において、増殖軟骨細胞の増殖と前肥大化軟骨細胞への分化を抑制するだけではなく、肥大化軟骨細胞から最終分化肥大化軟骨細胞への分化と、骨芽細胞の成熟を促進していることが明らかとなった。

本研究の成果は、骨・軟骨形成機構や軟骨疾患成因の解明の一助となることが期待される。本研究により、内軟骨性骨化においてFgf181ま軟骨膜に発現し、増殖軟骨恕胞に発現するFgfr3cを介して増殖軟骨細胞の増殖と肥大化軟骨細胞への分化を抑制することに加え、肥大化軟骨細胞・最終分化肥大化名骨細胞に発現するFgfr1cを介して軟骨細胞の撮終分化肥大化過程を促進すること、また、前駆骨芽細胞に発現するFgfr2cを介して骨芽細胞の成熟を促進することで骨化過程を促進することが新たに明らかとなった。さらに、マウス胚より長管骨を調製し、in vitroの器官培養系でFGF18を作用させ、FGF18の分化促進こ関与する細胞内シグナル伝達系をタンパク質のリン酸化や各種阻害を用いて調べた。その結果、Fgf18は主として、MAP経路を介してその作用を発現していることが明らかになった。一方、Fgf18欠損マウスの肺の形態学的観察から、肺葉の形成、気管支の分枝はあまり異常がないことが明らかになった。さらに、気管支の上皮細胞の分化マーカーの発現を調べ、その発現にも異常がないことも明らがになった。また、胎生後期のFgf18欠損マウスの肺を調べたところ、その肺胞壁の肥厚化と肺胞空間の狭隘化が観察された。さらに、電子顕微鏡で肺の切片を観察したところ、FGF18欠損マウスの肺胞の毛細血管が肺胞壁こ埋もれ.肺の機能不全が観察された。さらに、肺肺胞上皮細胞の細胞増殖活性を調べ、Fgf18はFgfr2cを介して、肺胞原基形成期における細胞増殖を一過性に促進することが明らかになった。従って、肺胞原基形成期のFgf18による適正な細泡噌殖の抑制こよって、肺泡原基の形成が開始し、Fgf18が肺胞原基の細胞の配置や上皮細胞の分化にも関与していると考えられた。
CD25,B7分子発現調節HCVTgマウスを用いた免疫学的肝細胞障害機構の解析

本研究はCHCの免疫学的病態を明らかにすることを目的に、自己反応性T細胞の活性化抑制に関与するCD25陽性細胞欠損CD25ノックアウトマウス(CD25KO)にHCV遺伝子を導入し、CD25KO/HCVTgマウスの作製を試み肝細胞障害が生じるか検討した。Willerfordらが作製したCD25KOマウスの供与を受け、MUPプロモーター、アルブミンプロモーターを用い肝細胞にHCV core、E1、E2タンパクを発現するCD25KO/HCVTgマウスの作製を試みたが、現在までのところ作製に成功していない。MUPプロモーターを用いた系ではいずれのHCV関連タンパクも肝細胞に発現させることが出来なかった。一方、アルブミンプロモーターを用いると肝細胞にHCVcoreタンパクを発現させることが出来るが、E1、E2タンパクを発現させることは出来なかった。同マウスでは肝内にわずかに単核球浸潤を認めたが、血中肝酵素の上昇は認められず、肝障害は誘導できなかった。HCVトランスジェニックマウスに、補助分子および免疫学的寛容に関与する分子を遺伝子導入し、免疫学的修飾を加え、慢性C型肝炎モデルを作成し、その免疫学的病態を明らかにすることが、本研究の目的である。本年度は基礎研究として、HCVトランスジェニックマウスの肝細胞における補助分子の発現動態、末梢血リンパ球のHCV関連タンパク反応性、HCV特異的CTL活性の解析を行い、以下の結果を得た。1.MUPプロモーター、アルブミンプロモーターを用いて作成した肝細胞特異的HCV core、E1、E2タンパク発現トランスジェニックマウスにおいては、ICAM-1の発現は認められるものの、CD80、CD86、CD40の発現はほとんど認められないことが、免疫組織化学的検討により明らかになった。2.同マウスの末梢血リンパ球にリコンビナントHCV core、E1、E2タンパクを添加培養したところ、各タンパクに対する反応性を認めたが、coreタンパクに対する反応性が最も高値であった。また、coreタンパク刺激により、IFN-γ産生を認めたがIL-10産生は認めなかった。また、CTL活性は認めなかった。今後、当初の計画に添い、同トランスジェニックマウスに補助分子遺伝子導入を行い、免疫動態がいかに変化し、慢性肝炎モデルが作成可能か検討を行う予定である。
遺伝情報維持の制御機構

内海は、液体保持回復を担う物質の同定を試み、それがMW1000以下の小さな物質である事をみつけた。また、カフェイン添加でX線の生存率が増加する放射線感受性変異細胞を分離した。そして、DNAインターストランド架橋による細胞死をカフェインが特異的に蘇生させていることを見いだした。石崎は、p53欠損マウスの繊維芽細胞ではUVやX線に対する感受性は正常であるが、UVによる姉妹染色分体交換(SCE)の頻度が有意に高く、UV照射によるS期の抑制が小さい事を明らかにした。葛西は、活性酸素による酸化的DNA障害8-ハイドロオキシグアニンの修復酵素活性が酸化ストレスにより高まる事を見いだした。また、他の種々な酸化的DNA障害として、2-ハイドロキシアデニン、グリオキサールが生じる事を見いだし、新しい突然変異の機横が予想された。実際、2-ハイドロキシアデニンは、TまたはCと塩基対を形成する事により、AT→GC変異とCG→TA変異を起こす可能性を示唆した。松影は、ショウジョウバエのDNApolαやPCNA遺伝子など多数の複製関連遺伝子の転写を制御する共通の配列DREを見い出し、DREFのcDNAと遺伝子のクローニングを成功させた。更に、成体眼原基でDREFを特所的に発現する遺伝子導入ハエを作成したところ、分化が抑制され、異常なDNA複製が誘導されることを見いだした。このことは、DREFが細胞増殖における中心的な制御因子であることを示唆している。二階堂は、ヒト細胞抽出液中からUV損傷DNA結合蛋白質を分離同定し、それがウラシルDNAグリコシラーゼと高い相同性を持つ事をみつけた。宮越は、p53遺伝子を欠失したヒト由来骨肉腫細胞に正常p53遺伝子を導入し、放射線感受性化されることを示した。山本は、活性酸素損傷の中にGC→CGトランスバ-ジョンの原因となる未知の損傷のある事を示した。三谷は、魚類細胞でピリミジンダイマーおよび(6-4)光産物を修復する光回復が、UVA、可視光、過酸化水素により転写レベルあるいは転写後のレベルで誘導される事を明らかにした。河野は、ショウジョウバエXPA蛋白の発現を特異的抗体を用いた免疫組織科学的手法により調べ、特に中枢神経系や筋肉で強く発現している事を示した。池島はヒトMutSホモログの一つであるhMSH3遺伝子の発現が一部の造血器腫瘍で顕著に減少していることを見い出し、この遺伝子が発がんに関与している可能性を示した。また、hMSH3遺伝子のゲノム構造を明らかにし変異解析を可能にした。藤原はD群XP患者の変異について解析した。内田は、PARP遺伝子欠損ショウジョウバエを樹立し、それが致死性になる事を明かにした。村上は、DNAポリメラーゼαがチェックポイントセンサーの働きをし、cdsl+はこれと相互作用し、DNA合成中のM期への進入を阻止している事を示唆した。

藤原はD群XP患者の変異について解析した。内田は、PARP遺伝子欠損ショウジョウバエを樹立し、それが致死性になる事を明かにした。村上は、DNAポリメラーゼαがチェックポイントセンサーの働きをし、cdsl+はこれと相互作用し、DNA合成中のM期への進入を阻止している事を示唆した。真核生物においてDNA損傷を中心とする遺伝情報の変化がもたらす細胞内のシグナル伝達機構や、DNA修復酵素系の働きを制御する仕組みを、細胞レベルで解明することを目的としている1 HeLa細胞から8-ヒドロキシグアニン(oh^8Gua)の修復酵素の部分精製をした。哺乳類のN-メチルプリンDNAグリコシラーゼははoh^8Guaを除去修復することを見いだした(葛西)。2 p53遺伝子をノックアウトしたトランスジェニックマウスより線維芽細胞を分離培養し、p53遺伝子欠損のDNA修復能への影響を調べた。p53欠損細胞では生存率に変化がなかったがSCEの頻度が増加した(石崎)。3 DNA修復と関係するPCNAとXPACタンパク質との相互作用を解析し、D-サイクリンが結合することが知られているN-端(2-64)及びC-端(197-228)の2箇所に独立した結合することが見いだされた(松影)。4ゲルシフト法等を用いて、ヒトDNA損傷結合因子を解析して、XPE細胞に欠損する因子を見いだした。既に報告されているXPE-BFより分子量が小さいことから、異なる因子か検討中である(松永)。5 XP患者の皮膚腫瘍よりDNAを抽出し、PCR-SSCP法により約50%にp53遺伝子の突然変異を見いだした。14の変異の内13は塩基置換変異であり、in vitroで見られる紫外線突然変異と傾向が同じであった(八木)6活性酵素によるDNA損傷を修復する大腸菌のmutMを相補するヒトやマウスの遺伝子を検索した。メチルプリングリコシラーゼがmutMのmutator活性を下げることを見いだした(山本)。7「多数細胞で条件付けられた培養液」からDNA修復を促進する活性物質は、分子量が1000以下で、酸性に弱く、活性炭にも吸着しなかったが、現在約100倍ほどに濃縮された。更なる精製を試みている(内海)。最近の分子生物学的手法の進歩により,生命の遺伝情報維持機構を司る酵素系の遺伝子が次々と同定されて、生物の他の基本的機能である遺伝情報の複製や転写の機構と密接な関係を保ち、機構間のクロストークが行われていることが理解され始めてきた。DNA損傷は、転写を止め転写修復結合因子と呼ばれる蛋白質を使って修復系を動員すると考えられるようになった。遺伝情報維持機構としてここに取り上げるのは、DNA損傷を中心とする遺伝情報の変化がもたらす細胞内のシグナル伝達を解明し、DNA修復酵素系の働きを制御する仕組みを、主にヒトを中心とする真核生物において、細胞レベルで解明することを目的としている。活性酸素による主要DNA損傷である8-ヒドロキシグアニン(8-OH-Gua)は、放射線のみならず環境中の多くの化学発癌物質によっても生じ、また生体内の酸素代謝により絶えず生じていると考えられる。大腸菌からは8-OH-Gua修復酵素が既に精製されているが、哺乳動物細胞については不明な点が多い。
拡張現実使用時に起こる変化の見落とし問題を解決する方法の提案

近年広まりつつある拡張現実(Augmented reality: AR)には、情報が見やすくなるという利点がある反面,現実世界の物体が見えづらくなるという欠点も指摘されている。ARが提示されることで、同時に現実世界で起こる出来事を見逃す「変化の見落とし」という現象が発生することが知られている。このようなことが実際に発生すれば、交通事故など、重大な事態を招く可能性がある。そこで、本研究ではAR使用時の変化の見落としにどのような要因が影響を与えるのかを検討する。また、それにより、変化の見落としが起こらないような情報提示方法を提案することを目的とする。
腸管出血性大腸菌O157に関する総合的研究-疫学、病原性、診断、治療

腸管出血性大腸菌(EHEC)とその感染症に関して、疫学、病原性、診断、治療の各方面から総合的に研究を展開した。疫学;岡山県の成牛40頭のうち、8頭がVero toxin (VT)用PCR陽性で、1頭からO157が分離された。また、静岡市および浜松市衛生試験所で1987-1996に分離したEHECについて検出状況を集計した。さらに生化学てき性状、薬剤感受性、遺伝子学的解析をおこなった。ヒト、家畜のO157に対するLPS抗体価測定、食品、環境等のEHEC汚染状況調査をおこなった。ウシ糞便10/1115,牛枝肉4/1048が陽性であった以外はいずれも陰性であった。1996年、国内で起こった集団発生事例に対してアンケートによる実態調査をおこなった。病原生;VTによる腎障害の動物実験モデルとしてラットの片腎動脈内へのVT投与を試みた結果、腎障害モデルとしての有用性示された。ウサギを使った動物モデルでVTの中枢神経障害作用のメカニズムの解析をおこなった。VTをウサギ耳静脈投与として血液脳関門同様、髄液脳関門の破壊も見られ、VTの中枢神経への直接的な作用が示唆された。幼若ウサギの動物モデルとしての可能性を検討する目的で、幼若ウサギにVTを耳静脈投与後、体重、神経症状、下痢症状、血液像、BUN、臓器重量の変化を観察した結果、ヒトでの症状に類似した傾向が観察され、モデルとしての有用性が示唆された。マウス腎臓の病理組織学的観察により、VTによる障害部位の特定を試みた結果、尿細管がVTに強い感受性を有していることを明らかにした。診断;迅速で正確なVTファミリー遺伝子検出法としてミックスプライマーを用いたPCR法を開発した。VT遺伝子の簡易・迅速・安価検出法トシテ酵素標識オリゴヌクレオチドプローブを開発した。トロンボモジュリンは血管内皮細胞の障害で遊離されるため、患者検体について調べたところ、血清中トロンボモジュリンが溶血性尿毒症症候群(HUS)の検査指標の一つになりうると考えられる結果を得た。EHEC感染による血便中には好中球の増加が見られないという特徴があるため、好中給の指標であるラクトフェリンを測定したところ、迅速・簡易にEHEC感染か否かの判定ができる方法として有用性が示された。糞便中のVTおよびO157を検出するELISAキットの評価をおこなった。治療;ウサギ耳静脈VT投与実験において、髄空内に抗VT抗体を投与することで中枢神経障害の出現を予防できた。抗菌剤投与の功罪を検討する一方法として、抗菌剤のVT産生に及ぼす影響を調べた結果、最も多く投与されたフォスフォマイシンは、VT1の産生および培地中への放出を促進するということを明らかにした。疫学;岡山県の成牛40頭のうち、8頭がVero toxin(TV)用PCR陽性で、1頭からO157が分離された。さらに生化学的性状、薬剤感受性、遺伝子学的解析をおこなった。病原性;VTによる腎障害の動物実験モデルとしてラットの片腎動脈内へのVT投与を試みた結果、腎障害モデルとしての有用性が示された。VTをウサギ耳静脈投与して血液脳関門同様、髄液脳関門の破壊も見られ、VTの中枢神経への直接的な作用が示唆された。VT遺伝子の簡易・迅速・安価検出法として酵素標識オリゴヌクレオチドプローブを開発した。EHEC感染による血便中には好中球の増加が見られないという特徴があるため、好中球の指標であるラクトフェリンを測定したところ、迅速・簡易にEHEC感染か否かの判定ができる方法として有用性が示された。治療;ウサギ耳静脈TV投与実験において、髄空内に抗VT抗体を投与することで中枢神経障害の出現を予防できた。

抗菌剤投与の功罪を検討する一方法として、抗菌剤のVT産生に及ぼす影響を調べた結果、最も多く投与されたフォスフォマイシンは、VT1の産生および培地中への放出を促進するということを明らかにした。腸管出血性大腸菌(EHEC)とその感染症に関して、疫学、病原性、診断、治療の各方面から総合的に研究を展開した。疫学;岡山県の成牛40頭のうち、8頭がVero toxin (VT)用PCR陽性で、1頭からO157が分離された。また、静岡市および浜松市衛生試験所で1987-1996に分離したEHECについて検出状況を集計した。さらに生化学てき性状、薬剤感受性、遺伝子学的解析をおこなった。ヒト、家畜のO157に対するLPS抗体価測定、食品、環境等のEHEC汚染状況調査をおこなった。ウシ糞便10/1115,牛枝肉4/1048が陽性であった以外はいずれも陰性であった。1996年、国内で起こった集団発生事例に対してアンケートによる実態調査をおこなった。病原生;VTによる腎障害の動物実験モデルとしてラットの片腎動脈内へのVT投与を試みた結果、腎障害モデルとしての有用性示された。ウサギを使った動物モデルでVTの中枢神経障害作用のメカニズムの解析をおこなった。VTをウサギ耳静脈投与として血液脳関門同様、髄液脳関門の破壊も見られ、VTの中枢神経への直接的な作用が示唆された。幼若ウサギの動物モデルとしての可能性を検討する目的で、幼若ウサギにVTを耳静脈投与後、体重、神経症状、下痢症状、血液像、BUN、臓器重量の変化を観察した結果、ヒトでの症状に類似した傾向が観察され、モデルとしての有用性が示唆された。マウス腎臓の病理組織学的観察により、VTによる障害部位の特定を試みた結果、尿細管がVTに強い感受性を有していることを明らかにした。診断;迅速で正確なVTファミリー遺伝子検出法としてミックスプライマーを用いたPCR法を開発した。VT遺伝子の簡易・迅速・安価検出法トシテ酵素標識オリゴヌクレオチドプローブを開発した。トロンボモジュリンは血管内皮細胞の障害で遊離されるため、患者検体について調べたところ、血清中トロンボモジュリンが溶血性尿毒症症候群(HUS)の検査指標の一つになりうると考えられる結果を得た。EHEC感染による血便中には好中球の増加が見られないという特徴があるため、好中給の指標であるラクトフェリンを測定したところ、迅速・簡易にEHEC感染か否かの判定ができる方法として有用性が示された。糞便中のVTおよびO157を検出するELISAキットの評価をおこなった。治療;ウサギ耳静脈VT投与実験において、髄空内に抗VT抗体を投与することで中枢神経障害の出現を予防できた。