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微生物を利用した再生骨材の製造とその品質に関する研究

本研究は,バクテリアリーチングにおいて利用されてきた方法を基本とし,微生物を利用して再生骨材を製造し,その品質を明らかにすることで,再生骨材の製造に微生物を利用することの有用性を示そうとするものである.本研究において,多種多様な微生物の中から硫黄酸化細菌と鉄酸化細菌に着目した基礎実験を行った.すなわち,細菌の有無,骨材の有無,コンクリート塊の大きさ,炭酸化の有無がペースト及びモルタルの劣化度に及ぼす影響を実験的に明らかにした.得られた知見を以下に列挙する.・硫黄酸化細菌及び鉄酸化細菌が増加すると培地のPHを低下させ,モルタルをよく剥離させ,カルシウムイオンを溶脱させる.・硫黄酸化細菌と鉄酸化細菌の活動は,コンクリート塊のサイズが5-20mmの範囲の方が,5mm以下の範囲よりも活発化した.これは塊のサイズが小さいと培地に溶け出すアルカリ量が多くなるためである.それゆえ,微生物を摂取する前に炭酸化させた方が良い.・硫黄酸化細菌と鉄酸化細菌が骨材に及ぼす影響は工学的に無視できる.・酸性硫黄温泉水を培地として利用した場合,効率よくカルシウムイオンを遊離させることができる.しかし,コンクリート塊の表面に生成される腐食性生物が硫酸イオンの浸透を阻止する為,反応速度が著しく低下する.本研究は,バクテリアリーチングにおいて利用されてきた方法を基本とし,微生物を利用した再生骨材を製造し,その品質を明らかにすることで,再生骨材の製造に微生物を利用することの有用性を示そうとするものである.本年度は,多種多様な微生物の中から硫黄酸化細菌に着目した基礎実験を行った.すなわち,細菌の有無,骨材の有無,コンクリート塊の大きさ,炭酸化の有無がペースト及びモルタルの劣化度に及ぼす影響を実験的に明らかにした.得られた知見を以下に列挙する.・硫黄酸化細菌が増加すると培地のPHを低下させ,モルタルをよく剥離させ,カルシウムイオンを溶脱させる.・硫黄酸化細菌の活動は,コンクリート塊のサイズが5-20mmの範囲の方が,5mm以下の範囲よりも活発化した.これは塊のサイズが小さいと培地に溶け出すアルカリ量が多くなるためである.それゆえ,微生物を摂取する前に炭酸化させた方が良い.・硫黄酸化細菌が骨材に及ぼす影響は工学的に無視できる.本研究は,バクテリアリーチングにおいて利用されてきた方法を基本とし,微生物を利用して再生骨材を製造し,その品質を明らかにすることで,再生骨材の製造に微生物を利用することの有用性を示そうとするものである.本研究において,多種多様な微生物の中から硫黄酸化細菌と鉄酸化細菌に着目した基礎実験を行った.すなわち,細菌の有無,骨材の有無,コンクリート塊の大きさ,炭酸化の有無がペースト及びモルタルの劣化度に及ぼす影響を実験的に明らかにした.得られた知見を以下に列挙する.・硫黄酸化細菌及び鉄酸化細菌が増加すると培地のPHを低下させ,モルタルをよく剥離させ,カルシウムイオンを溶脱させる.・硫黄酸化細菌と鉄酸化細菌の活動は,コンクリート塊のサイズが5-20mmの範囲の方が,5mm以下の範囲よりも活発化した.これは塊のサイズが小さいと培地に溶け出すアルカリ量が多くなるためである.それゆえ,微生物を摂取する前に炭酸化させた方が良い.・硫黄酸化細菌と鉄酸化細菌が骨材に及ぼす影響は工学的に無視できる.・酸性硫黄温泉水を培地として利用した場合,効率よくカルシウムイオンを遊離させることができる.しかし,コンクリート塊の表面に生成される腐食性生物が硫酸イオンの浸透を阻止する為,反応速度が著しく低下する.
抗癌剤耐性化機構を標的とした高分子キャリアＤＤＳに関する基礎的研究

リポソーム製剤のキャリア成分の細胞内動態、細胞外排出に焦点を当て、抗癌剤耐性化の主要因であるP糖タンパク質(P-gp)からのドキソルビシン排出阻害特性を評価した。ドキソルビシン内包リポソームのin vitro細胞毒性におけるPEG修飾リン脂質の関与が示唆されたとともに、in vitro細胞毒性がリポソーム構成脂質のPEG修飾の有無や電荷等に大きく影響を受けることが明らかとなった。本年度は、リポソーム構成脂質として汎用されるリン脂質及びコレステロール、またポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質やカチオン性リン脂質等の細胞内動態評価を行い、各種リポソーム構成成分の細胞内動態特性を明らかにした。いずれのリポソーム構成脂質もリポソームとしてエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれた。その後、リン脂質及びカチオン性リン脂質は小胞体-ゴルジ体輸送を受け、ゴルジ体との共局在が認められた一方で、PEG修飾リン脂質ではゴルジ体との共局在が認められないことが示された。また、カチオン性リン脂質はミトコンドリアへの輸送特性を有する可能性が示唆された。さらに、リン脂質及びカチオン性リン脂質は主としてABCG1を介して細胞外排出される一方、PEG修飾リン脂質はABCB1を介して細胞外排出されることが示された。以上のように、PEG修飾の有無や電荷等によってリン脂質の細胞内動態が大きく影響を受けることを明らかにした。本年度は、細胞内取込後の各種高分子キャリアによるP-糖タンパク質(P-gp)に対する影響を評価することを目指した。P-gp膜透過評価系を用いて蛍光標識リポソーム添加一定時間後におけるP-gp介在性膜透過特性を評価した結果、リポソーム構成脂質にP-gp介在性膜透過が認められた。各種リポソーム構成脂質が、P-gp基質として知られているドキソルビシンの膜透過に及ぼす影響を評価した結果、リポソームの主構成成分として汎用されるリン脂質やコレステロールと比較して、ポリエチレングリコール(PEG)修飾を施したリン脂質が極めて高いドキソルビシン膜透過の抑制作用を示すことも明らかとなった。次に、培養液中ドキソルビシン濃度を段階的に増加することでP-gpを発現誘導したドキソルビシン耐性ヒト子宮頸癌由来HeLa細胞株(HeLa/DXR)を樹立し、HeLa/DXRのドキソルビシンに対するIC50値が感受性株と比較して約50倍程度増大することを確認した。その後、各種リポソーム製剤の脂質組成がHeLa/DXR細胞からのドキソルビシン放出挙動に及ぼす影響を評価した結果、PEG修飾リン脂質をリポソーム構成脂質として含有させることで、HeLa/DXR細胞からのドキソルビシン排出量が減少し、長期的に細胞内にドキソルビシンが集積することを明らかとした。一般的に、PEG修飾リポソームは細胞内取込効率が低く、内封薬物であるドキソルビシンによるin-vitro殺細胞効果が未修飾リポソームと比較して低いことが知られている。一方で、同濃度のリポソーム製剤が細胞内に取り込まれた場合には、PEG修飾リン脂質によるドキソルビシンの細胞外排出抑制作用により、ドキソルビシンによる細胞毒性効果が増強されることを本結果は示唆している。さらに、本年度は各種リポソーム構成成分と細胞、血液成分との相互作用についても検討を行った。各種リポソーム構成脂質が、P糖たんぱく質(P-gp)の基質として知られているドキソルビシンの膜透過に及ぼす影響を評価した結果、リポソームの主構成成分として汎用されるリン脂質やコレステロールと比較して、ポリエチレングリコール(PEG)修飾を施したリン脂質が極めて高いドキソルビシン膜透過の抑制作用を示すことが明らかとなった。また、同濃度のリポソーム製剤が細胞内に取り込まれる条件下においては、PEG修飾リン脂質をリポソーム構成脂質としてドキソルビシンを内包させた場合は、PEG修飾リン脂質を含まないリポソームより、ドキソルビシンによる細胞毒性効果が増強された。そこで、リポソーム製剤の脂質組成と細胞毒性・薬物放出性との関連性について調べた。PEG修飾リポソームについて、リン脂質組成やPEG鎖長の異なる複数のリポソームにドキソルビシンを内包させ、HeLa細胞に対する細胞毒性を調べたところ、カチオン性リン脂質を有するリポソームで細胞毒性が高かった。この傾向は、細胞内へのドキソルビシン取り込み量と相関していた。一方、PEG鎖長の違い(平均分子量2000及び5000)は、細胞内へのドキソルビシン取り込み量やリポソームからのドキソルビシンの放出量に影響を与えなかった。以上、本研究によりドキソルビシン内包リポソームのin vitro細胞毒性におけるPEG修飾リン脂質の関与が示唆されたとともに、リポソーム構成脂質のPEG修飾の有無や電荷等がin vitro細胞毒性に大きな影響を与えることが明らかとなった。医薬品評価科学平成25年度は、リポソーム構成脂質として汎用されるリン脂質及びコレステロール、またポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質やカチオン性リン脂質等の細胞内動態評価を行い、各種リポソーム構成成分の細胞内

動態特性を計画通りに解析することができた。さらに、各種高分子キャリア構成成分による、ドキソルビシン等の抗癌剤を内包したリポソーム製剤の放出特性や薬理活性増強との関連性に関する研究も進んでいる。平成24年度は、まず細胞内に導入された各種高分子キャリア(リポソーム、高分子ミセル等)構成成分のP-糖タンパク質(P-gp)に対する親和性特性を評価する系を計画通りに構築することができた。また、培養液中に添加するドキソルビシン(DXR)量を段階的に増加することでP-gpが高発現したDXR耐性を有する癌細胞株を作製し、構築した抗癌剤耐性癌細胞を用いて、各種高分子キャリアの影響をin-vitro条件下において評価することも可能であった。各種高分子キャリア構成成分の細胞内動態に着目して、細胞内取込からP-gpを介した細胞外排出に至る過程の研究も進んでいる。内封薬物としてドキソルビシンを封入した際に、ドキソルビシンの薬理活性に及ぼす各種リポソーム構成脂質の影響について評価する。得られた各種脂質成分の細胞内動態に関する知見、特に細胞内動態特性や薬剤排出トランスポーターとの相互作用特性を基盤として、内封薬物の薬理活性向上や、抗癌剤耐性克服を可能にし得るキャリア設計を目指す。具体的には、組成や構成比率、表面電荷、並びにキャリアの構造安定化法として汎用されるPEG鎖導入等が、ドキソルビシン等の抗癌剤を内包したリポソーム製剤の放出特性や薬理活性増強に及ぼす影響を解析する。リポソーム構成脂質として汎用されるリン脂質及びコレステロール、またポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質やカチオン性リン脂質等の細胞内動態評価を行い、各種リポソーム構成成分の細胞内動態特性を明らかにする。また、内封薬物としてドキソルビシンを封入した際に、ドキソルビシンの薬理活性に及ぼす各種リポソーム構成脂質の影響について評価する。具体的には、組成や構成比率、粒子径や表面電荷、並びにキャリアの構造安定化法として汎用されるPEG鎖導入等が、ドキソルビシン等のP-糖タンパク質により細胞外排出される抗癌剤の薬理活性増強に及ぼす影響を解析する。また、これまでに行った各種リポソーム構成脂質の細胞内動態特性評価は、主にヒト子宮頸癌由来HeLa細胞株を対象として検討を行ってきた。一方、細胞内発現タンパク質は細胞の種類によって大きく異なることが知られている。そこで、これまでに得られたリポソーム構成脂質の細胞内動態機構が他の細胞種においても普遍的に認められる現象であるか否かを評価すべく、複数の細胞株を用いて各種リポソーム構成脂質の細胞内動態特性を評価する。平成25年度は平成24年度に使用していた細胞株やキャリア成分、さらに研究室で有していた試薬等を使用してきたため、次年度に使用する研究費が生じた。次年度は、新たな細胞やキャリア成分等に当該研究費を使用する予定である。
膵β細胞分化誘導因子ベータセルリンによる分化シグナル伝達機構の解明

本研究において、AR42J細胞を用い、EGF familyに属するβ細胞分化誘導因子ベータセルリン(Betacelluin、以下BTC)による分化シグナル伝達経路、「アロキサン膵部分灌流糖尿病マウス」におけるβ細胞新生過程の分析と外因性BTCの及ぼす効果について検討を行った。膵外分泌由来AR42J細胞はBTCによる刺激によりインスリン免疫活性を有するようになるとともに、超微形態学的にβ果粒に類似した分泌果粒の形成が認められ、BTCは本細胞を調節性分泌能を有する細胞にまで分化誘導し得る活性をもつものと考えられた。BTCはEGF receptor、erbB4と結合するが、receptorのチロシン燐酸化は直接結合能を有しないerbB2に強く認められ、分化シグナルはerbB2を介することが推測された。さらに、erbB2のmutantを用いdominant negative型細胞の作製を試みたが、cloningは困難であった。BTC特異的receptorの存在は否定的で、分化刺激は既知のerbB familyを介することが想定された。BTCは膵組織に発現し、導管細胞およびα細胞で産生される。アロキサン膵部分灌流糖尿病マウスでは、β細胞が破壊された部分でのみβ細胞の分化・新生像が観察され、同部位でBTCの発現が増強していることも見い出した。新生膵島(islet-like cell cluster;ICC)に密接する導管細胞にはインスリン転写因子PDX-1の発現がみられ、ICC内の細胞にはインスリンを含む膵ホルモン二重陽性細胞が出現しており、β細胞の分化・新生には導管細胞が重要であることが確認された。以上の結果に基づき、同糖尿病モデルにヒトBTCを投与したところ、膵全体でICCの増加、さらに耐糖能の改善が認められ、BTCはin vivoにおいてもβ細胞の分化因子として作用しうるものと考えられた。EGF familyに属するベータセルリン(Betacellulin、以下BTD)には、膵外分泌由来のcell line(AR42J)からインスリン分泌細胞への分化誘導作用がみられ、すでに共同研究者らとともに報告したが、BTCによる膵β細胞の新生や分化機構をさらに解明するため、in vitroおよびin vivo(動物モデル)の実験系を用いた検討を行い、以下の成績を得た。AR42J細胞におけるEGF receptor familyの発現を検討したところ、少なくともErbB1(EGF receptor)、ErbB2、ErbB4が発現しており、BTCによるreceptor tyrosineの燐酸化は三者とも起こるが特にErbB2を介する燐酸化が強く、また、持続的に起こる(120分以上)ことを明らかにした。さらに、超微形態的検討にて分泌果粒形成も観察され、BTCは本細胞を調節性分泌機能を有するインスリン分泌細胞にまで分化誘導する能力を有するものと考えられた。また、BTCはヒトおよびマウスの胎児膵組織の導管様細胞で強い発現がみられ、その生理作用としてβ細胞(膵内分泌)の分化関わっている可能性が示唆された(投稿中)。そこで、β細胞の増殖と新生の両者を区別して観察可能な糖尿病モデル(アロキサン膵部分灌流糖尿病マウス)を開発し、糖尿病における膵β細胞新生機構を検討するとともに、本モデルに合成ヒトBTCを投与し、β細胞新生誘導作用につき検討した。本モデルでは、β細胞破壊部でのみ導管細胞からβ細胞の新生(分化)が認められ、同部位の導管細胞においてBTCの免疫組織活性の上昇がみられ、BTCとβ細胞分化現象はin vivoでも密接な関連を有している可能性が示唆された(投稿中)。また、本モデルに、BTCを連日投与(1μg/g)したところ、導管細胞からのβ細胞新生像が高頻度に観察された。

従って、BTCはin vivoにおいてもβ細胞分化誘導作用を持つものと推測され、結果の一部を報告した。本研究において、AR42J細胞を用い、EGFfamllyに属するβ細胞分化誘導因子ベータセルリン(Betacelluin、以下BTC)による分化シグナル伝達経路、「アロキサン膵部分灌流糖尿病マウス」におけるβ細胞新生過程の分析と外因性BTCの及ぼす効果について検討を行った.膵外分泌由来AR42J細胞はBTCによる刺激によりインスリン免疫活性を有するようになるとともに、超微形態学的にβ果粒に類似した分泌果粒の形成が認められ、BTCは本細胞を調節性分泌能を有する細胞にまで分化誘導し得る活性をもつものと考えられた。BTCはEGFreceptor、erbB4と結合するが、receptorのチロシン燐酸化は直接結合能を有しないerbB2に強く認められ、分化シグナルはerbB2を介することが推測された。さらに、erbB2のmutantを用いdominantnegative型細胞の作製を試みたが、cloningは困難であった.BTC特異的receptorの存在は否定的で、分化刺激は既知のerbBfamllyを介することが想定された。BTCは膵組織に発現し、導管細胞およびα細胞で産生される。アロキサン膵部分灌流糖尿病マウスでは、β細胞が破壊された部分でのみβ細胞の分化・新生像が観察され,同部位でBTCの発現が増強していることも見い出した。新生膵島(lslet-likecellcluster;ICC)に密接する導管細胞にはインスリン転写因子PDX-1の発現がみられ、ICC内の細胞にはインスリンを含む膵ホルモン二重陽性細胞が出現しており、β細胞の分化・新生には導管細胞が重要であることが確認された。以上の結果に基づき、同糖尿病モデルにヒトBTCを投与したところ、膵全体でICCの増加、さらに耐糖能の改善が認められ、BTCはinvivoにおいてもβ細胞の分化因子として作用しうるものと考えられた。
日本の古生代ペルム紀単体サンゴの研究

1.北上、阿武隈、飛騨、中国山地のペルム系より単体サンゴ化石を採集した。産出相は殆んど石灰岩で、石灰質砂岩、〓岩がこれに次ぐ。非石灰質の岩相からの産出は極めて稀である。産出の頻度は一般に散点的であって、密集した化石層の例は少ない。2.産出層準はペルム紀最前期からペルム紀後期に及ぶ。しかし、岩相上の制約とも関連して、ペルム系を三分した場合の上部からの産出は少ない。北上山地の標準層序に照らしてみると、坂本沢、叶倉両層よりの産出が多く、登米層には極めて少ない。同山地ではその頃、陸棚相より斜面相への転換があったとみられ、サンゴ化石の産出はこれに支配された。他地域でも上部ないし最上部ペルム系の発達は極限されており、サンゴ化石は得られなかった。従って日本列島におけるTerminal Permianのサンゴ化石相を明らかにすることはできなかった。4.泡沫組織を有する単体サンゴによってみると、坂本沢層下部の堆積期まではTethys,Boreal両タイプの混在が認められる。それ以後叶倉層の堆積期一パイはTethys型のみが産する。泡沫組織の無い“Cyathayonia"faunaについては、余りこの地域性は顕著ではないが、Verbeekiella,Duplocariniaなどチモール原産属はTethys型とみられ、他はコスモポリタンである。5.多数の良好な個体が得られたVerbeekiellaについては一新種を含む二種が検出された。個体発生の検討の結果、かなり初期から主、対両セプタの〓化が認められ、系統分類上ユニークな一群をなすものとみられる。Plerophyllid類は少なく、検討できていない。南部北上山地、阿武隈山地においてペルム系坂本沢層、叶倉層、登米層とその相当層から単体サンコ化石を採集した。しかし産出状況は甚だ断片的で、個体数も限られる。ことに最上部ペルム系からの産出は極めてまれである。これは、北上、阿武隈のテレ-ンが、ペルム系の後半にはスロ-プ相へと移化したことに関連しているものとみられる。単体のサンゴ化石がもっとも豊富に産したのは、阿武隈山地の高倉山層であった。これは北上山地の叶倉層に相当する。ただ化石は固い砂質マトリックスに埋もれていて抽出はできない。薄片によって研究中である。軸柱のあるVerbeekiella,Lophophyllidium,Cyathaxoniaなどが優勢である。参考のため琉球て現生単体サンゴについて調べたが、寄生動物によって軸柱の形態に変化の生ずることをスミソニアン研究所のグライガ-氏より教示され有益であった。矢部と早坂が1915年当時研究した標本は東北大学に保管されているが、この中に当時は未記載だったVerbeekiella Japonicumが含まれていた。Axophylloides nom.nud.属は、今日のSakamotosawanellaに相当するものらしい。矢部・早坂コレクションには、東亜のデボン紀、石炭紀、ペルム紀サンゴ化石の重要なタイプ標本が含まれており、ペルム紀単体サンゴ以外にも、将来徹底した再研究が望まれる。引き続き西南日本でも採集につとめ、遅れている形態学的、分類的、系統的な研究を完成させたいと考えている。1.北上、阿武隈、飛騨、中国山地のペルム系より單体サンゴ化石を採集した。産出相は殆んど石灰岩で、石灰質砂岩,負岩がこれに次く。

産出の頻度は一般に散点的であって、密集した化石層の例は少ない。2.産出層準はペルム紀最前期からペルム紀後期に及ぶ。しかし,岩相上の制約とも関連して,ペルム系を三分した場合の上部からの産出は少ない。北上山地の標準層序に照らしてみると、坂本沢,叶倉兩層よりの産出が多く,登米層には極めて少ない。同山地ではその頃,陸棚相より斜面相への転換があったとみられ、サンゴ化石の産出はこれに支配された。他地域でも上部ないし最上部ペルム系の発達は極限されており,サンゴ化石は得られなかった。従って日本列島におけるTermiral Permiarのサンゴ化石相を明らかにすることはできなかった。4.泡沫組織を有する單体サンゴによってみると,坂本沢層下部の堆積期まではTethys,Boreal兩タイプの混在が認められる。それ以後叶倉層の堆積期ーパイはTethys型のみが産する。泡沫組織の無い“Cyathaxonin"faunaについては、余りこの地域性は顕著ではないがVerbeekiella,Duplocarininなどチモ-ル原産層はTethys型とみられ,他はコスモポリタンである。5.多数の良好な個体が得られたVerbeekiellaについてはー新種を含む二種が検出された。個体発生の検討の結果,かなり初期から主,対兩セプタの短化が認れられ,系統分類上ユニ-クな一群となすものとみられる。Dleroohyllid類は少なく,検討できていない。
アミノペプチダーゼN認識ヒト型モノクローナル抗体の肺癌患者への臨床応用

細胞運動を抑制するマウスモノクローナル抗体を作製し、その遺伝子クローニングすることで、Aminopeptidase N(APN)を同定した。APNはメタロプロテアーゼに属し、ペプチドの加水分解の最終段階で重要な役割を果たしている。現在までに我々は、APNが細胞外マトリックスへの浸潤と基底膜の破壊をきたし、癌細胞運動および血管新生の過程で、癌の転移形成、進展に関わっていることを明らかにした。更に、APN強発現の肺癌・膵癌・大腸癌患者は予後不良となることを明らかにした。以上のことからAPNを抑制することは、癌患者の予後を改善できる可能性があると考えた。マウス抗体では臨床応用すると様々な副作用を生じるため、数種のヒト型モノクローナル抗APN抗体を作製した。その中でもヒト型MT95-4抗体とヒト型MT19-12抗体は強いAPN活性抑制効果を示した。MT95-4抗体をヌードマウス血行転移モデルで投与し、肺転移を著明に抑制できることを明らかにした。更にヌードマウスの左肺に、APN強発現の肺癌細胞株を同所移植することで、縦隔リンパ節転移を生じる実験モデルを作製し、抗APN抗体のMT95-4抗体を投与すると、縦隔リンパ節転移は著明に抑制された。他の抗APN抗体は、APN活性抑制効果著明ではなかった。その効果の相違は、修飾糖鎖構造にあることが判明している。APNの転写活性部位および作用機序は未だ不明な点が残っているが、少なくとも血管新生に関してはこの糖鎖構造の役割は大きいと考えられる。細胞運動を抑制するマウスモノクローナル抗体を作製し、その道伝子クローニングすることで、Aminopeptidase N(APN)を同定した。マウスモノクローナル抗体での実験で、マウス転移モデルで抗体を投与すると肺転移を有意に抑制できた。しかし、マウス抗体では臨床応用すると様々な副作用を生じることが報告されていたため、数種のヒト型モノクローナル抗APN抗体を作製した。その中でもヒト型MT95-4抗体は強いAPN活性抑制効果を示した。その抗ヒト型APN抗体のMT95-4抗体をヌードマウス血行転移モデルで投与し、肺転移を著明に抑制できることを明らかにした。更にヌードマウスの左肺に、APN強発現の肺癌細胞株を同所移植することで、縦隔リンパ節転移を生じる実験モデルを作製した。このモデルを使用し、ヒト型モノクローナル抗APN抗体のMT95-4抗体を投与すると、縦隔リンパ節転移は著明に抑制された。しかし、腫瘍抑制効果は有意ではなかった。その機序はいまだ解明できていない点があり、本年継続して検討する予定である。

マウス抗体では臨床応用すると様々な副作用を生じるため、数種のヒト型モノクローナル抗APN抗体を作製した。その中でもヒト型MT95-4抗体とヒト型MT19・12抗体は強いAPN活性抑制効果を示した。MT95-4抗体をヌードマウス血行転移モデルで投与し、肺転移を著明に抑制できることを明らかにした。更にヌードマウスの左肺に、APN強発現の肺癌細胞株を同所移植することで、縦隔リンパ節転移を生じる実験モデルを作製し、抗APN抗体のMT95-4抗体を投与すると、縦隔リンパ節転移は著明に抑制された。他の抗APN抗体は、APN活性抑制効果著明ではなかった。その効果の相違は、修飾糖鎖構造にあることが判明している。APNの転写活性部位および作用機序は未だ不明な点が残っているが、少なくとも血管新生に関してはこの糖鎖構造の役割は大きいと考えられる。
１８～１９世紀ドイツの鍵盤楽器教授に見る鍵盤楽器奏者の多様性とその史的展開

近代ドイツでの鍵盤楽器音楽、奏者、教授は、時代が下るにつれ超絶技巧化していく方向で見られていた。確かにそのような側面がある一方で、当時の超絶技巧ピアニストがかならずしもその範疇では収まらない(例えばオルガニスト)活動をしていることに注目し、より豊かな鍵盤楽器奏者及び教授の諸相があったと考え調査を進めた。そのために、これまでに研究資料の対象となっていた教則本ではなく、教授に使われた手書きの資料、教員養成学校における音楽教授資料および教会音楽家に関する一次資料、雑誌・新聞記事、音楽を教授する学校の資料を調査し、従来とは異なる多様な鍵盤楽器奏者や教授のあり方を明らかにできた。今年度は2度ドイツの渡航調査を行った。前年度に調査先の都合でできなかった教則本の調査(主にライプツィヒ、ベルリン、ドレスデン)および、当初から今年度に予定されていた18世紀19世紀ドイツにおける音楽教育機関の音楽教授記録の調査を実施した。具体的には、ライプツィヒのトーマス教会付属学校(Thomasschule)における記録、ドレスデンの教員養成所(Lehrerseminar)における音楽教授、デッサウにおける音楽教授所(Musikschule)における記録を調査・収集できた。目下これらの資料の分析を進めているところであるが、デッサウのものについては、すでに日本とドイツの音楽教授との関係を論じた論考の中で公表できた。また、教則本の調査ではピアノ、オルガン、また通奏低音の教則本を中心に収集を進めた。この調査の一環で『バイエルピアノ教則本(Vorschule im Klavierspiel)』の初版に近い資料を発見した。この史料を用いて、以前より当教則本の初版研究を行っている研究者と共同発表を行い、計画当初の予定にない成果を出すことができた。18世紀19世紀の鍵盤楽器教則本を用いて、手のポジション移動を行わない「静かな手Steillstehende Hand」に焦点を当て、鍵盤楽器教授における難易度の考え方の変遷と確立について考察し公表した。前述したが、オルガン教授を中心にドイツと日本における鍵盤楽器の教授関係に関する論考を行った。これは昨年からすでに行っている島崎赤太郎を中心とした研究であるが、本年度の調査で収集した資料により、洋楽導入期(明治期)におけるドイツと日本の音楽教育上の関係をより細かく考察し公表することができた。今年度の課題は鍵盤楽器教本の現地調査と分析・分類であった。これは、本研究開始時までに行っていた鍵盤楽器教本類の収集をさらに補完すること、Hoffmeister Katalogをもとに19世紀に出版された鍵盤楽器教本ならびにそれに類するものについて、すべてピックアップし電子カタログ化を遂行することであった。教本類の電子カタログ化に関しては、協力者を得てほぼ完遂した。これらにより、鍵盤楽器教本類の全貌が一応に明らかとなった。これを公開したいと考えているが、その方法については検討中である。このカタログに基づき、現地調査やデジタル化されたものの検索などを含め教本類の収集を行った。その結果、カタログ情報だけでは明らかにならなかった各教本の内容が明らかとなっている。一部の教本については、研究論文等で公開した。また次年度以降の調査を先行して行い、ドイツにおけるバロック以来のオルガン教授と、明治期の日本におけるオルガン教授との連続的関連性の解明を試みた。これについても学会発表を行い、論文として公刊を予定している。本年度の研究実績として、研究結果や途中経過の公表並びに海外調査の成果があげられる。研究結果や途中経過の公表に関しては、昨年度の調査にて発見したアルテンブルク州立資料館で発見した手書きの鍵盤楽器の教則本(18世紀19世紀初頭)や、また同時期に家庭で使用されたと思われる楽譜集について、その史料的価値や特徴について学会発表を行った。このことから、従来出版された楽譜でのみ研究がなされ、その陰にあるはずの膨大な量の手書き教本史料の存在の一片が明らかにできた。この研究成果については、今年度中に学会誌や紀要などに掲載する予定である。また、安田寛奈良教育大学名誉教授と共に共著で、音楽之友社のサイトにて、バイエル教則本の連載を始めている。本研究はバイエル教則本に限るものではないが、安田氏のバイエル教則本研究とわたくしのこれまでの3年間の研究調査成果が合流することにより、バイエルの西洋音楽史上の位置づけや、従来陰に隠れていた西洋音楽史や音楽教育史の一端が明らかになりつつある。ドイツへの現地調査については、2回を予定していたが本務との都合もあり、少し予定よりも長めに滞在することで1回に抑えた。今年度は研究方策を微修正するところから始めたがその流れで、旧プロイセンの教員養成所並びに国民学校での鍵盤楽器を中心とした音楽教授や、ヴァイマール地域の手書きによる教則本や家庭で使用された手書きの楽譜史料などの収集分析ができた。その研究結果の公表は次年度行う予定である。本研究は、ドイツにおける主に18世紀後半から19世紀前半にかけての鍵盤楽器奏者及び鍵盤楽器教授の多様性を明らかにすることが目的であった。そのために、鍵盤楽器教本の収集、鍵盤楽器教授が行われた教育施設、新聞記事を主要な着眼点として研究を進めることとしていた。鍵盤楽器教本の収集については、印刷公刊されたものに加えて従来着目されてこなかった教授内容を含む手稿譜の収集に重点を置いた。このような手稿譜は、印刷された教本と違って実際の教授活動の経過が如実に反映されており、その実態を知るのに貴重な資料である。

そこからは鍵盤楽器教授単体で行われるというよりも、多種多様な教授が同時的に行われ、鍵盤楽器教授はその中の一つに過ぎないことが明らかになった。また、この一環で『バイエルピアノ教則本』の自筆譜およびその出版後の経過を示す資料を発見し、研究計画当初にない大きな副産物となった。教育施設での鍵盤楽器教授については、とりわけ当時の教員養成所に焦点を当てて各地の文書館にて資料を調査した。初等学校教員を養成するこの施設では、各楽器に専門技能に特化してゆく当時の大方の鍵盤楽器教授の方向性とは異なり、18世紀までのいわゆる教会音楽家型の総合的な教授が、専門性の高さはともかくも、残存してゆく状況を見ることができた。つまり、ピアノだけではなくオルガン、通奏低音、弦楽器、場合によっては即興演奏などの総合的かつ多様な教授内容である。新聞記事の調査については、鍵盤楽器を含む幅広い音楽教授の記事についての調査を行った。特に19世紀は雑誌の発行が盛んになり、大量の音楽教授に関する記事が書かれている。その中には、単純に奏法・技法に関するものもあるが、一般教育の中での音楽教育の意義、特に若者に与える影響などが議論されており、鍵盤楽器教授がいわゆる専門教育のみならず、多様に受容されていることが示唆された。近代ドイツでの鍵盤楽器音楽、奏者、教授は、時代が下るにつれ超絶技巧化していく方向で見られていた。確かにそのような側面がある一方で、当時の超絶技巧ピアニストがかならずしもその範疇では収まらない(例えばオルガニスト)活動をしていることに注目し、より豊かな鍵盤楽器奏者及び教授の諸相があったと考え調査を進めた。そのために、これまでに研究資料の対象となっていた教則本ではなく、教授に使われた手書きの資料、教員養成学校における音楽教授資料および教会音楽家に関する一次資料、雑誌・新聞記事、音楽を教授する学校の資料を調査し、従来とは異なる多様な鍵盤楽器奏者や教授のあり方を明らかにできた。手書きの教則本や、家庭で教育的な目的で使用された楽譜を発掘し、その分析を行うことで、従来の出版された楽譜を中心に行われてきたこの種の研究に対し、さらなる鍵盤楽器教授の多様性をつまびらかにしつつある。その点では、内容的に今年度より軌道修正を行ったものの、当初の研究目的である鍵盤楽器教授の多様性の発見は達成されつつあると考える。また、前述したとおり昨年度より、バイエル研究との融合がおこなわれ、2年目となった今年度もさらなる発展があった。この点は、研究開始時の計画を超える研究成果である。また、日本とドイツとの関係も研究計画の一つに入っており、今年度はリードオルガンの教本を軸に調査を進める予定であったが、時間の都合でできなかった。この点より完全に順調とはいえないと判断する。音楽学、音楽教育学今年度の研究方策を引き継ぎ、教員養成所や手書きの教則本類の発掘に努め、あらたな音楽教授像を歴史的に解明してゆきたい。なお、調査地域を中部ドイツに絞るとしていたが、今年度の調査で広く調査を行う方が研究上の意義も高いことが分かったので、この限定は若干解除したい。また安田氏とのバイエル研究も積極的に推進し、当初に予測していた以上の成果を出せるよう努める次第である。
細胞膜融合におけるカルシウムプロテア-ゼの役割

カルシウム依存性中性プロテア-ゼ(カルパイン,CANP)はカルシウムイオンで活性化される主要な細胞内プロテア-ゼであるが、その生理的機能は不明である。そこで,カルパインの細胞膜タンパク質への作用に焦点を絞り,カルシウムイオンが必須といわれている細胞膜融合への関与を検討した。先ず,カルシウムイオンとフリ-ゲンであるA_2Cで赤血球を処理し,赤血球の融合系を確立した。赤血球の融合速度は生物種により異なり,カルパインとその内在性インヒビタ-であるカルパスタチンの量比の高いものほど速く,カルパインの関与を示唆した。また,赤血球の融合は赤血球内カルパインが自己消化的に活性化される時期と時間的に一致して起った。さらに,カルシウムイオンフォアであるA23187を加えると融合は促進され,細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が必須な過程であることを示している。これらの結果から,A_2CやA23187により細胞内カルシウムイオン濃度が上昇してカルパインが活性化され,恐らく膜裏打ちタンパク質を分解することにより膜の対称性を低下させ,さらにA_2Cにより膜の流動性が高まることにより赤血球間の融合が誘起されるものと考えられる。このことを確認するために、我々の開発したカルパイン阻害剤(CbzーLeuーLeuーLeuーal膜透過性を有し赤血球内カルパインを阻害することができる)を共存させると,カルパインの活性化と赤血球の融合はともに阻害された。以上の結果から、カルパインの機能の一つとして細胞膜融合への関与が明らかになった。
線虫におけるD-アミノ酸酸化酵素の時空系分布の解析とD-アミノ酸含量の分析

モデル生物である線虫には、D-アミノ酸を酸化的に分解する酵素の遺伝子が4つ存在する。1つは、中性と塩基性D-アミノ酸を分解するするD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)で、他の3つは酸性D-アミノ酸を基質とするD-アスパラギン酸オキシダーゼ13(DDO-1DDO-3)である。そこで、これらの遺伝子を欠失した変異株を取得して野生株と比較した。まず、各生育段階にある線虫変異株体内に存在するD-アミノ酸をHPLCを用いて分離定量し、野生株と比較した。また、各変異株の表現形質と行動について調べ、野生株との違いを解析した。我々は,既に、モデル生物である線虫に、D-アミノ酸酸化酵素の4つの遺伝子を同定している。1つは、中性と塩基性D-アミノ酸を基質にするD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)であり、他の3つは、酸性D-アミノ酸を基質とするD-アスパラギン酸オキシダーゼ13(DDO-1DDO-3)である。これらは、互いに活性の強さや基質特異性が異なっている。一個体に複数のDDO遺伝子が同定されたのは線虫が初めてである。本年度は,これらのD-アミノ酸酸化分解酵素について、線虫体内での時空系分布を解析した。上記の4種の酵素遺伝子の、ATGコドンを含めたプロモーター領域(約23kb)を、green fluorescent protein(GFP)をコードするレポータープラスミドpPD95.67にクローニングした。これらのプラスミドを、形質転換体の選択マーカーであるro1-6と同時に、雌雄同体のyoung adultの生殖腺にマイクロインジェクションした。形質転換体を選別し,さらにF2、F3の安定な形質転換体を選別し、蛍光実体顕微鏡を用いて,成長過程の各ステージにおけるGFPの発現を観察した。DAO、DDO-1およびDDO-2はembryoからadultに至る全ての発生段階において腸で観察された。DDO-1は頭部神経でも観察され、上皮ではadultでのみ観察された。また、DDO-2は頭部神経、咽頭および体壁筋でも観察された。一方、DDO-3は腸では発現しておらず、頭部神経での発現がL3幼虫から観察された。さらに、陰門、生殖腺および上皮での発現が観察された。以上のように、これらの酵素が神経系、消化系、骨格系および生殖系といった様々な組織で成長時期特異的に発現していることが明らかになった。ヒトを含めた生体内には、D型アミノ酸を機能分子とする新規なバイオシステムが存在する。我々は、その分子論的解析を行うため、遺伝学的・分子生物学的解析がしやすいモデル生物である線虫を用いて研究を行っている。線虫のゲノムデータベースにおけるD-アミノ酸関連酵素の遺伝子探索を行ない、特に、D-アミノ酸を立体特異的に分解する酵素(D-アミノ酸酸化分解酵素)には4つの機能的遺伝子が存在することを同定した。すなわち、中性と塩基性D-アミノ酸を基質にするD-アミノ酸オキシダーゼ1種類(DAO)と、酸性D-アミノ酸を基質とするD-アスパラギン酸オキシダーゼ3種類(DDO-1-3)である。昨年度は、これらの酸化分解酵素の線虫体内における時空系分布を解析した。また我々は,さまざまなD-アミノ酸を分離分析するHPLCシステムを2種類開発し、ヒトの試料をはじめ、げっ歯類、水棲動物から植物にいたるまで、さまざまな生物中のD-アミノ酸の分析を行ってきた。今年度は、これらのシステムを用いて、各生育ステージの線虫体内に存在するD-アミノ酸の網羅的な分離定量を行った。線虫は、生育を同調させることで、ライフサイクルの各生育ステージの材料を容易にかつ多量に集めることができる。採集した線虫を超音波により破砕し、TCAによる除タンパクをした後、遊離のアミノ酸を抽出し蛍光誘導体化して高感度定量を行った。その結果、解析したすべての発生段階でD-Ser、D-Asp、D-AlaおよびD-Gluが検出された。また、これらのD-アミノ酸含量が成長に伴って増加していることが明らかになった。一方、DAO、DDO-1、DDO-2またはDDO-3遺伝子に欠失のある変異株体内のD-アミノ酸を定量したところ、DDO-2変異株では野性株との違いは認められなかったが、DAO、DDO-1およびDDO-3変異株では、それぞれD-Ala、D-AspおよびD-Gluの量が野生株と比較して有意に増加していることが明らかになった。ヒトを含めた生体内に、D型アミノ酸を機能分子とする新規なバイオシステムが存在するが、機能発現の分子論的解析は未だ十分とは言えない。我々は,実験的解析が容易なモデル生物である線虫を用いて、D型アミノ酸の機能解析を進めている。

すなわち、D型アミノ酸を立体特異的に分解する酵素の欠損変異体を取得し、その形質の解析を行うことでD型アミノ酸の機能を明らかにしようとするものである。これまでの我々の解析結果から明らかになったように、線虫は、中性および塩基性D-アミノ酸を分解する1種類の酵素DAOと酸性D-アミノ酸を分解する3種類の酵素DDO(DDO-13)を有している。平成23年度は、DAOおよびDDO-13遺伝子に欠失のある4種類の変異株を用いて、線虫の基礎的形質と行動について解析を行った。以下にその結果をまとめた。1)DDO-3変異株は成長速度が遅れており、結果として寿命の延長が生じていた。2)25°Cの培養においてすべての変異株で産卵数と孵化率の低下が認められ、その原因として、DAOおよびDDO-3変異株では卵子の数の減少、DDO-1およびDDO-2変異株では卵子の数と質の低下が示唆された。さらに野生株との交配実験で、DDO-13の変異株から卵子が提供された場合に艀化率が低下したことから、DDO-13が卵子を提供する母体、あるいは卵子で発現していることが重要であると考えられた。一方、DAO変異株と野生株との交配実験では孵化率に影響が見られなかったことから、DAOは受精後の胚で発現していることが重要であると考えられた。3)DDO-1変異株では排泄の周期が有意に延長していた。また、一定時間あたりに身体を屈曲させる回数(運動量)は、DDO-3変異株で有意に上昇していたことから、神経伝達に影響が生じていることが示唆された。
small talkを中心とした小学校英語科の授業改善と評価指標の開発・共有

栃木県那須烏山市の小学校外国語科の授業における小学校教員の不安を軽減し、教員(ALT)及び児童との豊かな英語のやり取り(small talk)のある授業作りを支えるとともに、タブレットを活用してやり取りを行う児童の反応を記録し、授業後に視聴することで、児童のよりよい反応を引き出す授業について考察する。研究の最終段階では、small talk中の望まれる児童の反応を指標(シンプトム)化し、コミュニケーションへの関心・意欲・態度の評価に生かせるようにする。
米に対する湿熱処理の多角的効果を取り入れた米加工食品の開発

本研究では,これまでに主に高アミロース米で得られている湿熱処理のメリットを様々な品種の米に対して応用するため,玄米に対して湿熱処理が与える種々の影響を明らかにする.30年度は,29年度の結果において,湿熱処理の効果がより顕著であった高アミロース米品種の越のかおりと,比較対照として中アミロース品種のこしいぶきについて,生理機能性成分の保持と,湿熱処理米の粉砕処理の影響を検討した.まず,玄米における糠層,および胚芽中の機能性成分として,総ポリフェノール量,抗酸化能値(DPPH,ORAC)の湿熱処理条件による増減を測定した結果,今回実施した湿熱処理条件(0.1 MPa0.3 MPa,10分間)の範囲では,各測定値はわずかな減少を示したものの大きな影響は見られないことが明らかとなった.また,物理的性質に対する湿熱処理の有無の影響に関しては,デンプン損傷度,粒度分布,糊化度,吸水率を調べた結果,デンプン損傷度は,湿熱処理によって損傷度の値が8%程度増加したが,圧力条件のちがいによる大きな差は見られなかった.一方糊化度については,湿熱処理によって428%の増加が見られ,圧力条件が高くなるほど値が増加した.湿熱処理後に粉砕した玄米粉の粒度分布については,おおよそ10100μmの幅広い粒径にわたって分布していることが分かった.また,湿熱処理米の調理加工特性として吸水率を調べた結果,もっとも高い圧力条件0.3 MPaの湿熱処理玄米は,2時間の浸漬において,未処理玄米と比較して15°Cでは1.2倍程度,25°Cでは1.4倍程度の吸水率改善が達成されることが分かった.したがって,今回の結果より,玄米の機能性成分は湿熱処理によって大きく失われることはなく,多少デンプンが糊化するデメリットはあるが,粉砕して粉にしない場合には,炊飯調理前の吸水率を改善できるメリットもあることが明らかとなった.現在までに湿熱処理による米のアミロース含量と難消化性デンプン増加,生理機能性向上との関係,糠層・胚芽中の機能性成分の保持への影響,湿熱処理米の米粉への粉砕処理の影響,加工調理に対する適用性の一部について,試験実施が終了している.糠層の生理機能性成分について,これまでに調べた抗酸化成分だけでなく,その他の成分についても湿熱処理の影響を検討する.また,生理機能性成分の胚乳への移行の可能性についても調べる.湿熱処理による米粒の形状変化についても観察し,加工,調理への適用性としては調理,食味評価を実施する.本研究では,これまでに主に高アミロース米で得られている湿熱処理のメリットを様々な品種の米に対して応用するため,玄米に対して湿熱処理が与える種々の影響を明らかにする.29年度は,米のアミロース含量と湿熱処理による難消化性デンプンの増加,それにともなう生理機能向上の関係を複数品種の玄米について調べた.まず,アミロース含量の異なる中アミロース品種(こしいぶき)および高アミロース品種(越のかおり)の玄米について,成分分析を行い比較した結果,水分,灰分,タンパク質,脂肪に関しては,大きな相違が認められなかった.それに対して,難消化性デンプン量は,高アミロース米である越のかおりの方が大きな値を示し,湿熱処理をすることによって,両品種ともに値が増加することが認められた.次に,湿熱処理玄米による生理機能性を評価するため,こしいぶきの未処理白米と玄米,湿熱処理玄米(0.1MPa,10分間),および越のかおりの未処理玄米,湿熱処理玄米(0.3MPa,10分間)の計5種をそれぞれ炊飯・乾燥・粉砕した米粉飼料を調製し,ラットの成長や脂質代謝への影響を検討した.ラード10%添加の高脂肪改変AIN-76混合飼料のコーンスターチを上記の各米粉と置換し,5週齢Wistar系ラットに自由摂食で50日間投与した.その結果,飼育期間中の体重増加は各試験群共に恒常的に増加し,終体重にはアミロース含量の違いによる差は認められなかったが,両品種ともに,湿熱処理によって終体重が未処理玄米より少なく,特に越のかおりで顕著であった.また,内臓脂肪である後腹壁脂肪量と,解剖時の血清コレステロールは,湿熱処理によって未処理玄米よりも減少することが両品種ともに確認され,特に越のかおりで顕著であった.以上の結果より,玄米の湿熱処理はラットの脂質代謝に影響を与え,特に高アミロース米で顕著であることが分かった.米のアミロース含量と湿熱処理による難消化性デンプン増加,生理機能向上の関係についての全般的な検証は完了したが,玄米特有の生理機能に対する効果を調べるためのラットを用いた動物実験における盲腸内容物中のLC-MS/MSメタボローム一斉解析が終了していない。本研究では,これまでに主に高アミロース米で得られている湿熱処理のメリットを様々な品種の米に対して応用するため,玄米に対して湿熱処理が与える種々の影響を明らかにする.30年度は,29年度の結果において,湿熱処理の効果がより顕著であった高アミロース米品種の越のかおりと,比較対照として中アミロース品種のこしいぶきについて,生理機能性成分の保持と,湿熱処理米の粉砕処理の影響を検討した.まず,玄米における糠層,および胚芽中の機能性成分として,総ポリフェノール量,抗酸化能値(DPPH,ORAC)の湿熱処理条件による増減を測定した結果,今回実施した湿熱処理条件(0.1 MPa0.3 MPa,10分間)の範囲では,各測定値はわずかな減少を示したものの大きな影響は見られないことが明らかとなった.

また,物理的性質に対する湿熱処理の有無の影響に関しては,デンプン損傷度,粒度分布,糊化度,吸水率を調べた結果,デンプン損傷度は,湿熱処理によって損傷度の値が8%程度増加したが,圧力条件のちがいによる大きな差は見られなかった.一方糊化度については,湿熱処理によって428%の増加が見られ,圧力条件が高くなるほど値が増加した.湿熱処理後に粉砕した玄米粉の粒度分布については,おおよそ10100μmの幅広い粒径にわたって分布していることが分かった.また,湿熱処理米の調理加工特性として吸水率を調べた結果,もっとも高い圧力条件0.3 MPaの湿熱処理玄米は,2時間の浸漬において,未処理玄米と比較して15°Cでは1.2倍程度,25°Cでは1.4倍程度の吸水率改善が達成されることが分かった.したがって,今回の結果より,玄米の機能性成分は湿熱処理によって大きく失われることはなく,多少デンプンが糊化するデメリットはあるが,粉砕して粉にしない場合には,炊飯調理前の吸水率を改善できるメリットもあることが明らかとなった.現在までに湿熱処理による米のアミロース含量と難消化性デンプン増加,生理機能性向上との関係,糠層・胚芽中の機能性成分の保持への影響,湿熱処理米の米粉への粉砕処理の影響,加工調理に対する適用性の一部について,試験実施が終了している.測定の終了していない盲腸内容物中のLC-MS/MSメタボローム一斉解析を継続して行い,その他は,平成30年度以降の実施計画に沿って行う.糠層の生理機能性成分について,これまでに調べた抗酸化成分だけでなく,その他の成分についても湿熱処理の影響を検討する.また,生理機能性成分の胚乳への移行の可能性についても調べる.湿熱処理による米粒の形状変化についても観察し,加工,調理への適用性としては調理,食味評価を実施する.年度内に測定が終了しなかった,玄米特有の生理機能に対する効果を調べるためのラットを用いた動物実験における盲腸内容物中のLC-MS/MSメタボローム一斉解析に必要な試薬類,装置の消耗部品費を次年度に繰り越すことになった.平成30年度は,終了していないLC-MS/MSメタボローム一斉解析にまず取り組み,その他は,平成30年度以降の実施計画に沿って研究を継続する.今年度,当初の実施計画に沿って糠層・胚芽中の機能成分保持をメタボローム一斉分析によって調べたが,その結果,ある特定の数種類の化合物は湿熱処理によって顕著な量変化を示すことが分かった.この結果は,当初の計画では予測していなかった興味深い結果であり,理由や原因についてより詳細に調べる必要性があると考え,次年度に取り組むこととした.
π-アリル金属活性種の構造と物性

π-アリル金属錯体は遷移金属触媒反応,合成反応の鍵中間体の一つである.しかしながらアリルー金属間結合の本質やπ-アリル錯体の物性に関する基礎研究は,その応用面の華やかさに比較してかなり遅れているように思われる.より高効率,高選択性を持つ合成反応の設計には,上記の基礎知見の集積が不可欠であると信ずる.本研究は,最近特に重要度が増しつつあるπ-アリルパラジウムおよびニッケル錯体を経由する炭素-炭素結合生成反応の中間活性種に焦点を当てて,この活性種の還元脱離に関する構造-反応性相関を解明することを目的として行ったものである.まず手始めに,中間活性種モデルとして, σ-有機基とホスフィンを配位子として同時に持つπ-アリルパラジウムおよびπ-アリルニッケル錯体を合成するとともに,これらの還元脱離反応におよぼす添加ホスフィン(単座性,二座配位性)の促進効果を検討した.次に配位子としてオレフィン分子を用いると,パラジウム錯体の還元脱離が異常に大きく促進されることが判明した.そこでこの反応を分子軌道計算で解明するための基礎として,類似の白金のπ-アリル(オレフィン)錯体を単離するとともに, X線構造解析で固体状態の構造を決定することができた.同時にこのオレフィン配位の特異性(幾何構造と溶液安定性)がはじめて明らかになった.これらの反応性と構造解析を基に, πアリルパラジウム錯体の還元脱離過程を,拡張ヒュッケル法分子軌道計算でシミュレートすることができた.この計算は, πアリル錯体の反応を取り扱ったものとしては稀有の例の一つであり, πアリル基と金属との相互作用の特徴を理解するのに大きな貢献をなすものと考えられる.π-アリル金属錯体は遷移金属触媒反応,合成反応の鍵中間体の一つである.しかしながらアリルー金属間結合の本質やπ-アリル錯体の物性に関する基礎研究は,その応用面の華やかさに比較してかなり遅れているように思われる.より高効率,高選択性を持つ合成反応の設計には,上記の基礎知見の集積が不可欠であると信ずる.本研究は,最近特に重要度が増しつつあるπ-アリルパラジウムおよびニッケル錯体を経由する炭素-炭素結合生成反応の中間活性種に焦点を当てて,この活性種の還元脱離に関する構造-反応性相関を解明することを目的として行ったものである.まず手始めに,中間活性種モデルとして, σ-有機基とホスフィンを配位子として同時に持つπ-アリルパラジウムおよびπ-アリルニッケル錯体を合成するとともに,これらの還元脱離反応におよぼす添加ホスフィン(単座性,二座配位性)の促進効果を検討した.次に配位子としてオレフィン分子を用いると,パラジウム錯体の還元脱離が異常に大きく促進されることが判明した.そこでこの反応を分子軌道計算で解明するための基礎として,類似の白金のπ-アリル(オレフィン)錯体を単離するとともに, X線構造解析で固体状態の構造を決定することができた.同時にこのオレフィン配位の特異性(幾何構造と溶液安定性)がはじめて明らかになった.これらの反応性と構造解析を基に, πアリルパラジウム錯体の還元脱離過程を,拡張ヒュッケル法分子軌道計算でシミュレートすることができた.この計算は, πアリル錯体の反応を取り扱ったものとしては稀有の例の一つであり, πアリル基と金属との相互作用の特徴を理解するのに大きな貢献をなすものと考えられる.