hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線維柱帯の圧感受性と房水流出調節機構およびその緑内障病態との関連に関する研究

圧感受性に関わる因子を探索するために、線維柱帯細胞の3次元培養における加圧モデルを構築した。具体的には、コラーゲンと培地と細胞を混合した後にpHを変えることでゲル化させ、細胞をコラーゲン培地の中で3次元的に遊走・増殖させた後、このコラーゲン培地に重りを乗せることで全体を加圧し、細胞の変化を免疫染色にて観察した。共焦点顕微鏡を用いた観察によって、重合アクチンが減少することがみとめられた。アクチン重合阻害剤であるROCK阻害剤がヒトの眼圧を下降させることを考えると、この反応はROCK阻害剤の作用と同一のメカニズムをもって眼圧のホメオスターシスに寄与していると推測された。しかしながら3次元培養の細胞はタンパク質解析が困難であったため、我々は圧ストレスと酸化ストレスとに共通の細胞内反応が生じるのではないかという推測のもと、酸化ストレスを加えた後の線維柱帯細胞の反応を調べた。その結果、Akt-PI3Kシグナルやp38シグナルが活性化されることが分かった。さらにこれらのシグナルを阻害することで、酸化ストレスによる細胞死が促進されることを見出した。これらの結果はこれまでに報告されていない知見であり、圧に対応した線維柱帯細胞の生理的な房水流出調節機構の解明にむけて重要な手掛かりを得た。申請者がDuke大学で用いていた定圧灌流型のGrant perfusionsystem (Ellingsen and Grant. Invest Ophthalmol 1971)を元に、新たに電子天秤を組み込んだモデルを並列して2眼の房水流出量の測定が同時に可能となる装置を構築した。この装置は摘出ブタ眼の前房をボトルからのバッファで灌流し、ボトルの重量変化を計測することで房水流出量を算定する装置で、効果を検証するため既知の房水流出促進薬剤であるROCK阻害剤を用いたところ、コントロールと比較して30-40%の安定した房水流出促進効果を定量できた。したがって、今年度の実験で房水流出量を定量する装置を確立できたと考えられ、今後圧感受性に関わるメカニズムの探索に応用可能となった。また圧感受性に関わる因子を探索するために、線維柱帯細胞の3次元培養における加圧モデルを構築した。具体的には、コラーゲンと培地と細胞を混合した後にpHを変えることでゲル化させる。細胞はコラーゲン培地の中で3次元的に遊走・増殖するが、このコラーゲン培地に重りを乗せることで全体を加圧し、細胞の変化を観察する。骨髄線維芽細胞においては加圧によってアクチン細胞骨格の脱重合化が起こることがわかっているが、線維柱帯細胞においても蛍光標識ファロイディンを用いてアクチンを染色したところ、アクチンの脱重合化がみとめられた。この結果は圧感受性メカニズムの解明に向けて有望な知見であるが、いまだ定量化には至っておらず、今後更なる検討が必要である。

今後さらに探索を進め、そのメカニズムを理解することができれば、その意義は眼生理学的なものに留まらず、眼圧調節メカニズムの破綻による高眼圧緑内障モデルの理解にも繋がると考えられる。またそのメカニズムに関わる因子を明らかにすることで、その因子をターゲットにした眼圧下降薬開発といった創薬に応用できる可能性があり、臨床医学にも貢献することが可能であると推測される。
病態における細胞外プロテオグリカンの役割：細胞挙動制御と組織構築機構

本研究の目的は、細胞外マトリックスの主要なプロテオグリカン、Vcanの病態における役割を明らかにすることである。Vcanの局所発現を欠失させる遺伝子改変マウス実験系や機能回復実験を通じて、腫瘍間質に発現するVcanが腫瘍増殖抑制効果を有すること、その機能ドメインがG1とG3に存在することがわかった。Vcan沈着量と腫瘍間質のコラーゲン線維ならびに線維芽細胞数が正の相関を示すことが確認できた。また別のVcan遺伝子改変マウスの解析からVcanが胎生期の真皮形成に重要な役割を果たすことを明らかにした。本研究の目的は、細胞外マトリックスの主要なプロテオグリカン、バーシカン(Versican,以下Vcan)の生体内機能とその作用機構を解明することである。胎生期の器官形成・組織発生におけるVcanの役割を明らかにしてきた申請者は、近年病態の発症と進展における同分子の役割を研究し、同分子の欠失によって創傷治癒が遅延することを見出した。これを端緒に、トランスジェニックマウスによる機能回復実験を行い、Vcanの病態制御機構の解明と機能ドメインの同定を目指すことと当初の目的とした。Cre酵素発現アデノウイルス(Ad-Cre)を用いた部位特異的Vcan発現欠失マウス系は確立済みであったが、真皮内局所注入は手技的に難しく、マウス実験群を増やした際に相当なバラツキが出た。この問題を解決すべくPrx1-Cre、Ve-cadherin-Cre、S100a4-Cre等、様々なcreマウスとVcan<flox/flox>系、さらには上記Creマウス群とVcan<flox/->系を交配させコンディショナルノックアウト(cKO)マウスを調製し、同様の皮膚創傷治癒実験を行ったが統計学的有意差は認められていない。我々はB6系マウスに生着する腫瘍細胞株を皮下に注入する系を確立していたが、腫瘍細胞をAd-Creを局所注入する系をさらに確立し、宿主Vcan発現の腫瘍細胞に対する影響を検討することとした。同実験系で宿主Vcan発現を欠失させた場合、腫瘍細胞増殖が亢進することがわかった。胎生期の器官形成・組織発生におけるVcanの役割を明らかにしてきた申請者は、近年病態の発症と進展における同分子の役割を研究してきた。本研究では種々の病態を同遺伝子改変マウスに作出してその進展・治癒過程を観察し、さらにトランスジェニックマウスによる機能回復実験を行い、Vcanの病態制御機構の解明と機能ドメインの同定を目指すこと目的とした。B6系マウスに生着し、かつVcanを発現しない腫瘍細胞株QRsP11をCre酵素発現アデノウイルス(Ad-Cre)と共に皮下に局所注入して宿主Vcan発現の腫瘍細胞に対する影響を検討した。その結果、宿主Vcan発現を欠失させた場合、腫瘍細胞増殖が亢進すること、この亢進作用の背景にヒアルロン酸とCD44を介したシグナル伝達ならびにTGFβシグナル伝達の亢進が関与すること、宿主線維芽細胞とコラーゲン線維が減少することがわかった。現在、Vcanと他の細胞外マトリックス分子との相互作用、炎症細胞の関与等を検討中である。Ad-Cre注入の困難な系に関しては、Prx1-Cre、Ve-cadherin-Cre、S100a4-Cre等、様々なcreマウスとVcan<flox/flox>系、さらには上記Creマウス群とVcan<flox/->系を交配させコンディショナルノックアウト(cKO)マウスを調製し、種々の病態を検討中である。またVcanのV3バリアントをCre発現によって時空間的制御下で発現させるトランスジェニックマウス系(Tg-hV3)を樹立し同マウスの局所にCre酵素を発現して表現型を検討する準備を進めている。本研究の目的は、細胞外マトリックスの主要なプロテオグリカンとして知られるバーシカン(Versican,以下Vcan)の生体内機能とその作用機構を解明することである。胎生期の器官形成・組織発生におけるVcanの役割を明らかにしてきた申請者は近年、病態の発症と進展における同分子の役割を研究してきた。その結果、宿主Vcan発現を欠失させた場合、腫瘍細胞増殖が亢進すること、この亢進作用の背景にヒアルロン酸とCD44を介したシグナル伝達ならびにTGFβシグナル伝達の亢進が関与すること、宿主線維芽細胞とコラーゲン線維が減少する一方炎症細胞浸潤の程度と炎症細胞の種類に差はないことがわかった。これらの変化はG1-G3ドメインから成るVcan V3バリアントの局所発現によって全て回復したためVcanのよる腫瘍増殖抑制効果はG1-G3ドメインに存在すると考えられた。さらに血管内皮細胞のVcan発現が欠失したVECad-Vcan系に同様の腫瘍移植実験を行ったが対照群と比較して腫瘍塊の大きさに差はなかったため血管内皮細胞が発現するVcanは腫瘍微小環境の形成に関与しないと思われ、恐らく線維芽

細胞が腫瘍増殖抑制効果を発揮する中心的細胞と考えられた。B16F10細胞株で同様の実験を行ったところ統計学的有意差は得られなかったが宿主間質Vcan発現の欠失により若干の腫瘍増生促進が観察された。Vcan<flox>系マウスにCre発現アデノウイルスを局所注射することによって宿主Vcan発現を局所的に欠失させる系が問題なく樹立でき、種々の実験系が進むようになった。特に腫瘍皮下移植実験では腫瘍微小環境の形成・維持におけるVcanの役割をin vivoにて明確にすることができた。研究概要に記載していないが創傷治癒実験、熱傷作出実験、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発腸炎実験等、様々な動物実験系を用いてVcanの機能を検討しており、本研究は概ね順調に進行しているといってよい。本研究の目的は、細胞外マトリックスの主要なプロテオグリカンとして知られるバーシカン(Versican,以下Vcan)の各種病態における役割を、種々の同遺伝子改変マウスの病態モデルを用いて明らかにすることである。B6系マウスに生着し、かつVcanを発現しない腫瘍細胞株QRsP11をCre酵素発現アデノウイルス(Ad-Cre)と共に皮下に局所注入して宿主Vcan発現の腫瘍細胞に対する影響を検討した結果を昨年度に報告した(Fanhchaksai K, et al., Int J Cancer, 2016)。当該の報告では、宿主間質細胞のVcan発現が腫瘍細胞増殖を抑制すること、同抑制作用にヒアルロン酸とCD44を介したシグナル伝達ならびにTGFβシグナル伝達が関与すること、宿主線維芽細胞とコラーゲン線維の維持に間質Vcanがきよす必要なこと、これらのVcan機能はG1-G3ドメインによることを明らかにした。本年度は当該機能を発揮するVcanを合成分泌する細胞を明らかにするため、マクロファージ系細胞のVcan発現が欠失するLyz2-Vcanマウス、筋線維芽細胞/腫瘍随伴線維芽細胞にのVcan発現が欠失するActa2-Vcanマウス、線維芽細胞特異的タンパク質として当初報告されたS100a4細胞にてVcan発現が欠失するS100a4-Vcan細胞にQRsP11、細胞を移植したところ、Lyz2-Vcanマウスのみで腫瘍塊の増生が観察された。腫瘍塊内と周囲の結合組織に浸潤するマクロファージの数と性状を現在解析中である。本研究の目的は、細胞外マトリックスの主要なプロテオグリカン、Vcanの病態における役割を明らかにすることである。Vcanの局所発現を欠失させる遺伝子改変マウス実験系や機能回復実験を通じて、腫瘍間質に発現するVcanが腫瘍増殖抑制効果を有すること、その機能ドメインがG1とG3に存在することがわかった。Vcan沈着量と腫瘍間質のコラーゲン線維ならびに線維芽細胞数が正の相関を示すことが確認できた。また別のVcan遺伝子改変マウスの解析からVcanが胎生期の真皮形成に重要な役割を果たすことを明らかにした。種々の遺伝子改変マウスはほぼ予定通りに作出できたといってよい。細胞生物学的、生化学的、分子生物学的解析技術はほぼ全て揃っており、病理組織学的解析に関しては実験補助員の欠員のため数ヶ月遅れたが、新たに実験補助員を雇用する等して挽回できた。
トマス・アクィナスにおける新プラトン主義の影響……新プラトン主義の影響史の研究……

通説ではトマス・アクィナスはアリストテレス主義者として知られているが、一層深くは新プラトン主義の影響を受けている。トマスが接した新プラトン主義の第一はプロクロス哲学である。「II.研究発表の雑誌論文」の第一において、トマスが新プラトン主義文書『原因論』とディオニシウス文書を介して「第一原因」の理解をプロクロス哲学から大きく受けていることをテクストに即して明らかにした。第二論文では、『原因論』の命題2のesse superiusの三つの段階をトマスは自分の体系の「神」「分離実体」「魂」の三つの段階に対応するものと解釈していることを明らかにした。第三論文では、これを受けて上の諸段階はプロクロスの第2段階の三一..存在・生命・知性のTriade..に対応することを明らかにした。ここから『原因論』とトマスはプロクロスの「善の優位性」の哲学を「存在の優位性」の思想系譜にいわば座標変換していることが判明する。第四論文は新プラトン主義の善一者の思想源泉をプラトンの『パルメニデス篇』の第一の仮定に求めた試行的論攷。「II.研究発表の図書」の第一では過去約十年間の新プラトン主義とトマス・アクィナスに関する研究を纏めた。ジルソン流に万有の根源を「善」と捉えるかそれとも「存在者」と捉えるかで西洋哲学史全体を「善の優位性の思想」(古代哲学)と「存在の優位性の思想」(中世以降の哲学)の2系譜に区別し、この中でプロクロス、トマス・アクィナス、『原因論』を考察して、プロクロスは「善の優位性」の思想系譜にトマスと『原因論』は「存在の優位性」の思想系譜に属していることを明らかにし、最後に万有の根源は善であるのかそれとも存在者であるのか、また知性であるのかないのか、という古い問題を再提起した。第二書は上掲書で提出した哲学史観を8人で協力して西洋哲学史全体に適用した試論書である。
Claudin を利用した非侵襲性投与ワクチンの開発

感染症対策は少子高齢化が顕著に進んでいる我が国にとって最重要課題である。現在汎用されている注射型ワクチンは全身免疫は賦活できるものの、粘膜免疫賦活化に乏しく、侵襲性投与であることが問題である。一方で、粘膜ワクチンは全身・粘膜免疫の双方を誘導可能であり、非侵襲性投与が可能であることからも、理想的な感染症対策であると期待されている。しかしながら、抗原を単に粘膜面に投与するだけでは免疫が誘導されず、多くの免疫担当細胞が集積する粘膜免疫組織へ効率よく抗原を送達する必要がある。申請者は抗原送達に関して粘膜免疫組織に高発現するclaudin-4(CL-4)に着目し、その結合分子として知られるウエルシュ菌毒素C末断片(C-CPE)を用いた粘膜ワクチン開発が可能であることを明らかにした。これまでの検証は抗原性の高いモデル抗原:卵白アルブミンを用いてのものであるため、本年度では感染症に対する粘膜ワクチン効果に焦点を絞り検証を行った。感染症関連抗原としてはすべての肺炎球菌に共通して発現しているPspA(Pneumococcal surface protein A)に着目し、CL-4を標的とした感染症粘膜ワクチン開発を目指し、検証を行った。まず、PspAとC-CPEの融合タンパク質を作製し、CL発現バキュロウィルスを用いたELISAによりそのCL-4結合性を検証した。その結果、PspA-C-CPEはCL-4指向性を有していた。続いて、PspA-C-CPEによる免疫賦活化効果を検証するために、マウスにPspA-C-CPEを経鼻投与することによりPspA特異的抗体が得られるか検証した。その結果、PspA単独群に比してPspA-C-CPEでは有意に高い血清IgGおよび粘膜IgAの誘導が認められた。以上の知見はC-CPEを利用し、粘膜免疫組織に高発現しているCL-4を標的とした感染症粘膜ワクチン開発の可能性を示している。今後は感染症モデルマウスを用い、PspA-C-CPEによる肺炎球菌感染予防効果を中心に検証を行い、CL-4を標的とした非侵襲性投与ワクチン開発を目指していく。粘膜ワクチンは全身面・粘膜面で免疫誘導可能であり、非侵襲性投与が可能であることから理想的な感染症対策として期待されている。パイエル板などの粘膜免疫組織ではclaudin-4(CL4)が高発現しており、これまでに申請者はCL4結合分子であるウエルシュ菌毒素C末断片であり、消化酵素耐性であるC-CPEを用いた薬物輸送研究を推進した。C-CPEを付加することによりタンパク質、リポソームにCL4指向性を付与できることを見出し、CL4を標的とした粘膜ワクチンのproof of conceptを確立した。また、経口ワクチン開発に向けて抗原をC-CPEで修飾したリポソームに封入し、消化管内での安定化を図ったが、抗体価の上昇は認められなかった。一般に経口ワクチンでは経鼻ワクチンに比べて10倍以上の抗原送達が必要であることから、CL4指向性に優れた結合分子獲得が必要となる。このような背景のもとこれまでにC-CPEに比して10倍近いCL4指向性を有するC-CPE変異体の獲得に成功している。当該申請課題はこれら独自のCL研究の成果を基にCL4を標的とした経口ワクチン開発を目指すものである。本年度ではC-CPE変異体とモデル抗原OVAとの融合タンパク質を作製し、経鼻投与することにより抗原送達率の上昇が可能かどうか評価した。その結果、マウスに週1回、計3回経鼻投与することにより、OVA-C-CPE変異体はOVA-C-CPEに比して有意なOVA特異的IgGおよびIgAの上昇が観察された。さらに、IgGサブクラスであるIgG1、IgG2a抗体価の上昇およびTh1系サイトカインIFN-γ、Th2系サイトカインIL-13の産生も認められた。また、OVA-C-CPE変異体によるワクチン活性に関してOVA発現癌細胞を移植したマウスにおける抗腫瘍効果の観点から検証した結果、OVA-C-CPE変異体投与群はOVA-C-CPE投与群に比して有意な腫瘍増殖抑制効果を発揮した。以上の結果からCL4指向性に優れるC-CPE変異体は免疫誘導能に優れていることを明らかにした。今後、本成果を基にC-CPE変異体と感染症関連抗原の融合タンパク質を用いたワクチン効果の解析を行う予定である。

感染症関連抗原としてはすべての肺炎球菌に共通して発現しているPspA(Pneumococcal surface protein A)に着目し、CL-4を標的とした感染症粘膜ワクチン開発を目指し、検証を行った。まず、PspAとC-CPEの融合タンパク質を作製し、CL発現バキュロウィルスを用いたELISAによりそのCL-4結合性を検証した。その結果、PspA-C-CPEはCL-4指向性を有していた。続いて、PspA-C-CPEによる免疫賦活化効果を検証するために、マウスにPspA-C-CPEを経鼻投与することによりPspA特異的抗体が得られるか検証した。その結果、PspA単独群に比してPspA-C-CPEでは有意に高い血清IgGおよび粘膜IgAの誘導が認められた。以上の知見はC-CPEを利用し、粘膜免疫組織に高発現しているCL-4を標的とした感染症粘膜ワクチン開発の可能性を示している。今後は感染症モデルマウスを用い、PspA-C-CPEによる肺炎球菌感染予防効果を中心に検証を行い、CL-4を標的とした非侵襲性投与ワクチン開発を目指していく。本年度は経口ワクチン開発問題点である効率の良い抗原輸送法の開発に焦点を置き研究を行った。抗体と同程度の親和性を有するCL4結合分子であるC-CPEに比して10倍近く指向性に優れるC-CPE変異体を用い免疫誘導能に関して検証を行った。その結果、従来のC-CPEに比して有意な免疫誘導活性が認められ、本CL4結合分子が抗原送達に優れていることを明らかにした。このように経口ワクチン開発の問題点の解決の糸口を見出したことからも本年度はおおむね順調に研究進展したと考えている。本年度は経口ワクチン開発の問題点であるCL4への抗原送達に関して焦点を置き、従来のCL4結合分子であるC-CPEに比して10倍近く指向性に優れるC-CPE変異体を用い、その抗原送達に関して評価を行った。その結果、C-CPE変異体により有意な免疫誘導が観察された。感染症関連抗原を用いたワクチン活性も評価すべきと多方面からご意見をいただいていることから、今後は感染症関連抗原との融合タンパク質を用いた粘膜ワクチン活性の解析を行う予定である。また、CL4を標的とした経口ワクチン開発に向けて、CL4 binderを修飾したリポソームによるワクチン開発を目指していく。
現代農村地域社会におけるまちづくり活動の機能重視型アソシエーション化に関する研究

我が国をはじめアジア諸国における21世紀成熟社会の農村地域においては、都市的な多機能性・多様性を享受しつつも、自然と共生する生活やスローライフを可能とする魅力的な地域計画が求められる時代にある。これまでの近隣都市の動態や従来の都市住民的な思考に左右される地域活性化ではなく、独自の地域アイデンティティを創出し、地域づくり活動に住民が主体的に着手する時期にきているといえる。それは、従来の農村コミュニティが維持してきた伝統的な村落社会を基盤とする地域活性化方策(全イエ出席義務型,総体運営型)から、「機能重視型アソシエーション化」による方策(機能分化型,有志参加型,参加圏域拡大型)に変化していくことをも意味する。本研究ではこれらの背景をふまえ、成熟型農村地域(日本・中国・韓国)を対象に調査・比較分析を行うことにより、今後のアジア型農村地域社会のあり方を予測、提示していくことを目標とした。2005年度は、国内農村地域調査、及び、中国上海市郊、韓国ソウル市郊外における海外農村地域調査を行い、地域施設計画・社会学・文化人類学的視点から、基礎文献・基礎データの収集を行いつつ分析を行った。まちづくり組織のアソシエーション化については、斎尾他「農村地域における地域運営型まちづくり組織の特性と役割」農村計画学会農村計画論文集(2005)に、組織化する『範域』に関する議論は、栗原・斎尾他「農村計画における『範域』の捉え方」農村計画学会誌(2005)にまとめるに至った。2006年度は、農村計画に関する政策の現地調査を実施すると共に、農村地域社会研究に携わる3力国の研究者・実務者へのアンケート調査を行い、比較分析を進めていった。調査の一部は斎尾・栗原「日韓・農村計画研究者による「農村(計画)」アンケート調査」結果報告」農村計画学会誌(2006)に、2力年の研究成果は本科研報告書にまとめている。農村地域において、これまでの近隣都市の動態や従来の都市住民的な思考に左右される地域活性化ではなく、独自の地域アイデンティティを創出し、ユニークな地域づくり活動に、住民が主体的に着手する時期にきているといえる。本研究ではこれらの農村地域における住民主体による地域活性化の動きの中で、成熟型農村地域を対象に調査・分析を行うことにより、従来の農村地域社会が培ってきた、伝統文化と折り合いをつけながらの共生方策、新たな「伝統の創出」あるいは「伝統の塗り替え」方策等、地域特性ごとの具体策を提案し、今後のアジア型農村地域社会のあり方を予測、提示していくことを目的としている。初年度である2005年度は、国内農村地域調査と中国上海市郊外における海外農村地域調査を行い、地域施設計画・地域社会学・文化人類学的視点から、基礎文献・基礎データの収集を行い、主に国内の状況について分析を行った。我が国における、まちづくり組織のアソシエーション化については、斎尾他「農村地域における地域運営型まちづくり組織の特性と役割」農村計画学会農村計画論文集,217-222,2005に、組織化する『範域』に関する議論は、栗原・斎尾他「農村計画における『範域』の捉え方」農村計画学会誌,24巻1号,24-35,2005にまとめるに至った。

調査の一部は斎尾・栗原「日韓・農村計画研究者による「農村(計画)」アンケート調査」結果報告」農村計画学会誌(2006)に、2力年の研究成果は本科研報告書にまとめている。
チーム共有認識発達メカニズムにおけるリーダーのビジョン提示効果の検証

2018年度の実績は以下になる。組織やチームをまとめるために何が必要かを探るため、文献レビュー、インタビュー、アンケート調査を行った。特に、インタビュー調査から研究の糸口を発見した。ある企業の複数の幹部とインタビューをしている際に、企業の目指すべきゴールや課題の認識に統一性がないことが分かった。幹部ごと違うゴールや課題を重要視していて、お互いの認識にズレがあったのだ。このズレをどのように概念化したらよいか考えるため、過去の文献を探ったが今一つ正しい概念は見つからなかった。そのため、まずは「認識のズレ」を概念化するために、分析をまとめ、尺度開発に乗り出した。心理学、経営学、社会学、ネットワーク科学の様々な文献をあたり、組織の幹部層が組織を動かすうえでどのようなことを意識しなければならないかを探索した。その中で、組織を取り巻く環境をどのように認識しているかが、組織を動かすうえでは重要とわかり、過去の研究は「マネージャーの環境に対する認識」をどのように測定しているか、想定方法をまとめた。結果、あまり良い測定方法が見当たらなかったため、インタビュー調査から尺度を開発に乗り出した。インタビューでは、新しいプロジェクトを立ち上げた経験と他の部署のマネージャーと連携を行ったことがある40代以上のマネージャーを中心にインタビューを行った。インタビューを通じて、マネージャーが顧客・マーケット・他社などをどのように考え、どのような部分で他部署のマネージャーと認識にズレがあるかを調査した。そしてインタビューの結果から、質問票を作成した。2019年7月にポルトガルで行われる国際学会にも、本研究に基づく報告が採択された。2019年7月の国際学会での発表や、「認識のズレ」を測定する尺度も完成しつつあり、おおむね良好に研究は進んでいる。加えて、2019年度中に本格的なデータ収集を行える目途が立ったため、研究報告のみでなく、今後は論文発表も高い確率で見込まれている。2019年度では、2018年度に作成した尺度が妥当であるかどうかを検討する。「認識のズレ」尺度は、現時点では残点的な質問項目を含み、また概念を測定するために十分妥当な尺度かはわかっていない。そのため、まずは調査会社に依頼して一般的な企業で働く人からデータ収集を行い、妥当性を検証する。一度目の妥当性の検証を行った後、再度質問項目の検討を行う。場合によっては、第二回目のインタビュー調査を交え、別の質問項目を作成するかどうかも検討する。尺度の妥当性を担保後に、特定の企業に調査依頼し、認識のズレがチームワークや業績に対して影響を及ぼすかを検証する。現時点では、国内の企業に依頼をすでに行い、承諾を取り付けている。また、2019年7月にポルトガルで学会発表を行う。この学会には世界中から第一線で活躍する研究者が集うため、彼らからフィードバックを行い、尺度作成と今後の研究に反映させる。

現時点では、国内の企業に依頼をすでに行い、承諾を取り付けている。また、2019年7月にポルトガルで学会発表を行う。この学会には世界中から第一線で活躍する研究者が集うため、彼らからフィードバックを行い、尺度作成と今後の研究に反映させる。研究環境整備費として、追加で研究費が支給された。この研究環境整備費は3年間の間に消費すればよいと指示されたため、2018年内で使い切らず、2019年と2020年度に必要な機材を購入することにしたため、差額が生じた。
幼若期ストレスにより誘発する成熟期情動行動異常の分子基盤解析

本年度は本補助事業を基課題とする国際共同研究加速基金による課題(幼若期ストレスによって変容する薬物依存性と共感性行動の脳内分子メカニズム解析)について、アメリカ国立衛生研究所に1年間滞在し研究に従事したため、本補助事業期間の延長申請を行った。一方、本補助事業の計画実験を高精度に追究できる新規の実験手法ならびに研究材料を得られたことから、次年度は本補助事業の目的をより精密に達成するため以下の研究を計画している。マウスの脳定位固定による標的脳部位への逆行性標識物質およびアデノ随伴ウィルスの局所注入技術を習得したことにより、(1)幼若期ストレスによる内側前頭前皮質背側部(dmPFC)に出力する扁桃体基底部(BA)ニューロンの電気生理学的特徴の変化とセロトニンによる同ニューロンの活動変化の解析(2)光刺激によってBA内のセロトニン放出を調節することによる条件付恐怖行動の変化(3)オキシトシン作働性ニューロンおよびその投射部位とオキシトシン受容体発現ニューロンの分布解析(4)オキシトシン作働性神経終末の光刺激抑制による恐怖学習行動の変化と幼若期ストレスによる影響以上の内容について解析することにより、幼若期ストレスによる情動機能変容の神経回路と関連分子について追究できると考える。本補助事業を基課題とする国際共同研究加速基金による課題に1年間海外にて従事したため。本補助事業を基課題とする国際共同研究加速基金の課題に取組んだことにより、本研究課題の計画実験を高精度に追究できる新規の実験手法ならびに研究材料を得られたことから、今後の研究をより精密に達成すべくウイルスベクターや特異抗体を用いた研究を推進する。不安障害や気分障害は脳内のセロトニンなどのモノアミン系神経伝達物質の低下が原因とする仮説が提唱されているが、このような精神疾患を有する思春・青年期層にはSSRIなどの抗うつ薬に反応しない患者が一定数存在する。このため、これらの精神疾患の「モノアミン仮説」の範疇を超え、かつ生後発達過程に応じたメカニズム解明が必要である。本研究では、モノアミン/コリン作動性神経系に加えアミノ酸類および神経ペプチド類に着目し、情動機能調節に重要な脳部位である扁桃体における神経伝達修飾メカニズムを電気生理学的、神経化学的ならびに行動学的に検討する。思春/青年期のストレス障害の発症機序ならびに神経精神基盤の成熟に与える影響について新規の分子・神経回路・行動メカニズムを見出すことを目的として研究を行なっている。幼若期(生後3週齢)と壮年期(生後10週齢)のそれぞれのマウス扁桃体神経細胞におけるセロトニン、神経ペプチドおよびカンナビノイド受容体感受性について電気生理学的に解析することを計画した。幼若期にストレスを負荷されたマウスの壮年期(生後10週齢)における情動機能の行動学的解析と扁桃体神経細胞の活動電位に対するセロトニンの効果について以下のような結果を得た。幼若期ストレスによって成熟期の扁桃体錐体細胞の活動電位の発生頻度が対照群に比較し有意に増大していた。また、対照群で認められるセロトニン濃度依存的な活動電位発生頻度の増大が幼若期ストレス負荷マウスでは認められず、セロトニンの感受性に差が見られた。以下の2つの新知見1)および2)を得たとともに、計画にはなかった新たな知見として3)を得たため。1)幼若期ストレスによって成熟期の扁桃体錐体細胞の活動電位の発生頻度が対照群に比較し有意に増大していた。2)対照群で認められるセロトニン濃度依存的な活動電位発生頻度の増大が幼若期ストレス負荷マウスでは認められず、セロトニンの感受性に差が見られた。3)幼若期ストレスを受けたラットが成熟期にうつ様行動を示すことを確認し、この症状に対してケタミンの単回投与によって急性に回復効果を発揮した。幼若期マウスのモノアミン/コリンの投射パターンを同様に解析するモノアミン/コリン作動性神経系の扁桃体における投射パターンを検証したところ、扁桃体基底外側核の中でも基底核(BA)にセロトニン、ドーパミンおよびアセチルコリン神経系の密な神経投射があることを確認した。また予備的検討として、同じげっ歯類であるラットにおいて、幼若期ストレスによって扁桃体におけるコリントランスポーターの発現レベルが50%程度に半減していることを確認していることから、マウスでも検討したが条件検討に留まった。また、電気化学検出器付高速液体クロマトグラフィーを用いた脳内微小灌流法による神経化学的定量によって、扁桃体におけるモノアミン/コリン遊離量が幼若期ストレスの有無によって変化している可能性を検討することを計画していたが、こちらも条件検討に留まり、結果を出せなかった。そのため計画を変更して平成30年度計画分の以下の研究を前倒しで行った。幼若期ストレスと成熟期ストレスにおける情動機能変容の差異についてマウスを用いた恐怖・不安レベルの評価系を用いて行動学的に解析することを試み、今年度は幼若期ストレスにおける解析を行った。幼若期ストレスモデルマウスは本能的な高所/新奇環境不安レベルの低下、経験依存的な恐怖記憶消去の過剰亢進ならびに社会性不安レベルの低下が認められる可能性を見出している。さらにこの幼若期ストレスモデルマウスの扁桃体では神経細胞(錐体細胞)の活動電位の発生頻度が亢進している結果を得た。平成29年度は幼若期ストレスマウスを実験モデル動物として用いて、電気化学検出器付高速液体クロマトグラフィーを用いた脳内微小灌流法による神経化学的定量する予定であったが、条件検討に留まり、結果を出せなかったため。

本年度は本補助事業を基課題とする国際共同研究加速基金による課題(幼若期ストレスによって変容する薬物依存性と共感性行動の脳内分子メカニズム解析)について、アメリカ国立衛生研究所に1年間滞在し研究に従事したため、本補助事業期間の延長申請を行った。一方、本補助事業の計画実験を高精度に追究できる新規の実験手法ならびに研究材料を得られたことから、次年度は本補助事業の目的をより精密に達成するため以下の研究を計画している。マウスの脳定位固定による標的脳部位への逆行性標識物質およびアデノ随伴ウィルスの局所注入技術を習得したことにより、(1)幼若期ストレスによる内側前頭前皮質背側部(dmPFC)に出力する扁桃体基底部(BA)ニューロンの電気生理学的特徴の変化とセロトニンによる同ニューロンの活動変化の解析(2)光刺激によってBA内のセロトニン放出を調節することによる条件付恐怖行動の変化(3)オキシトシン作働性ニューロンおよびその投射部位とオキシトシン受容体発現ニューロンの分布解析(4)オキシトシン作働性神経終末の光刺激抑制による恐怖学習行動の変化と幼若期ストレスによる影響以上の内容について解析することにより、幼若期ストレスによる情動機能変容の神経回路と関連分子について追究できると考える。本補助事業を基課題とする国際共同研究加速基金による課題に1年間海外にて従事したため。幼若期ストレスによって神経細胞の活動電位の発生頻度およびセロトニン感受性に差が見られたことから、今後は興奮性および抑制性シナプス入力強度や棘突起密度や形態変化について解析するとともに、どのようなセロトニン受容体が変容しているのかサブタイプを追求する。また、幼若期ストレスによるうつ様行動に対してケタミンが効果的であることを踏まえ、ケタミンの作用機序についても検討する。平成29年度の当初の計画内容を一部遂行できなかったが、平成30年度に予定していた計画を前倒しで行えたため、来年度は本年度の計画をもう一度精査して再び取り組む。本補助事業を基課題とする国際共同研究加速基金の課題に取組んだことにより、本研究課題の計画実験を高精度に追究できる新規の実験手法ならびに研究材料を得られたことから、今後の研究をより精密に達成すべくウイルスベクターや特異抗体を用いた研究を推進する。オーダーメイド型の試薬を海外企業に発注を検討したが、納期に数カ月を要する事が年度末に判明し、年度内に購入できなかったため。企業委託作製によるウイルスベクターを使用した実験を計画していたが、予備検討においてウイルス設計の変更に迫られた。年度内納品が困難になり次年度に繰り越したため、次年度使用額が生じた。2018年度は本補助事業を基課題とする国際共同研究加速基金による課題(幼若期ストレスによって変容する薬物依存性と共感性行動の脳内分子メカニズム解析)について、アメリカ国立衛生研究所に1年間滞在し、研究に従事したことから、本補助事業期間を延長したため。次年度は本年度の目的をより精密に達成するため免疫組織化学的解析用の特異抗体の購入に使用する。オーダーメイド型の試薬を海外企業に発注する。
多因子発現系を用いた迅速分化誘導法の開発

ES/iPS細胞などの多能性幹細胞を用いて、様々な細胞(神経幹細胞NSCなど)への分化方法開発が進んでいるが、そのどれもが長い時間(数週間)を要し、これが実験上のばらつきを生み、分化条件の至適化が進まない原因になっている。最近の知見から、細胞の分化は転写因子の組み合わせによって決定されるとわかってきている。ES細胞では、分化に重要な遺伝子は発現を抑制されていると同時に、すぐにでも発現できるエピジェネティクス状態にある(ヒストン修飾の抑制型と活性化型が混在するbivalentなクロマチン状態)。つまり、適切な転写因子を与えれば、目的の細胞を規定する下流遺伝子群は発現すると考えられる。本研究では、ES細胞において同時に多数の転写因子を強制発現し、短期間に目的細胞を得ることを試みた。ひとたび「分化時間は短縮できる」ことがわかれば、その後は他の研究者の流入も手伝って様々な他の細胞へも応用され、分化条件が至適化されるだろう。多因子発現系は翻訳量の至適化が必要なことがわかったため、様々な翻訳効率を上昇させる配列をコード領域5'側に挿入したところ、IRESが一番翻訳効率が高いことがわかった。別の発現系を用いて、ES細胞へNSCの重要転写因子群を導入したところ、通常より短い日数でNSC様の細胞が得られた。また、もう一つの解析例として、肝幹細胞(HPC)の重要転写因子群をES細胞に導入したところ、やはり通常より短い日数でHPC様の細胞が得られた。これらの結果は、分化時間が短縮可能なことを示唆する。
交感神経を介した骨組織への運動刺激効果

交感神経活動亢進状態にある自然発症高血圧ラットにおいては、対照ラットに比べて骨組織構造や骨量が低値を示すことを明らかにした。類骨の分析により骨形成が低下していることを示唆した。また自然発症高血圧ラットに対する薬剤(β遮断薬;プロプラノロール)や運動効果についても検討し、骨量維持改善効果を認めた。骨に対する形成促進効果はメカニカルストレスや液性因子に加え、神経性にもアプローチしうる可能性を有した。骨強度は骨の量、質、構造の3つの要因に規定されており、骨梁構造はそれに影響する一要因である。骨梁のネットワーク構造は不活動や交感神経活動の影響を受けて劇的に変化する。末梢神経の骨量への影響を検討するために、坐骨神経の切除及び凍結麻、交感神経活動によって下肢を不活動にした脛骨骨梁の形態的特徴について、骨梁の狭小化や断片化に着目してその経時的変化を検討した。坐骨神経切除(不動化)による組織レベルでの形態的変化は7-10日目頃から始まり、それ以降、骨強度にも負の影響を及ぼしているものと推察された。また、骨梁骨の吸収過程において狭小化と断片化の進行程度は段階的に進行し、縦断横断構造の変化過程にも時間的ずれが生じるものと考えられた。さらに、骨と骨格筋の萎縮進行程度は量的時間的に一致せず、両組織間に量的時間的ずれが存在することが示唆された。また坐骨神経凍結法により一過性に不活動となった下肢における脛骨の骨萎縮は1-2週間で急激に進行した。二次海綿骨の骨梁構造は狭小化ならびに断片化するようになるが、その進行は直線的ではなく段階的に進行することが認められた。骨梁構造の断片化率が50%、狭小化率50%の段階までにおいては回復効果が認められ、構造に関しても狭小化の改善に効果があることが示唆された。交感神経活動の亢進が見られる高血圧症ラットにおいて、対象群と比較して骨量の減少が見られた。以上の結果より、術後初期の骨量減少程度は、神経凍結の場合、神経切除と比較して反応性は低いものと思われる。不活動による骨量低下のうち、除神経では吸収系の異常亢進、suspensionでは形成系の異常抑制が強いと言われており、SNはNFよりも吸収系の亢進が強く、骨量減少に影響したのではないかと考えられる。またNFによる再神経支配による骨量回復過程の観察では、骨量の回復増加と一致して骨梁幅が増加し、長さに変化がなかったことから、4週目以降の骨量回復に骨量幅の増大が貢献していることが明らかとなった。不活動からの回復過程において、骨梁幅における構造的可塑性が示唆された。また交感神経活動の過剰亢進は骨量維持に負の影響を及ぼすことが示唆された。骨梁のネットワーク構造は不活動や交感神経活動の影響を受けて劇的に変化するため、本研究では交感神経を含む末梢神経の骨量への影響を検討するために、坐骨神経の切除及び凍結麻痺によって下肢を不活動にした脛骨骨梁の形態的特徴について、骨梁の狭小化や断片化に着目してその経時的変化を検討した。片側の坐骨神経を凍結麻痺させた一過性の不活動モデルラットを用いて、除神経に続く再神経支配の骨梁構造に対する影響を検討した。11週齢のFischer-344雄性ラットの片下肢を不活動状態にするため、偽手術とともに坐骨神経の切除(SN)もしくは液体窒素で冷凍したステンレス製ロッドを用いて凍結麻痺(NF)を行った。術後0,1,2,3,4及び5週目に脛骨を採取し、骨幹端近位二次海綿骨断面の組織形態学的分析を行った。SN及びNFともに術後約2週目までに骨梁が顕著に喪失した。骨梁面積率は術後3週目まで低下し、NFでは増加して、術後5週目には術前の55%レベルまで回復した。骨梁の幅及び長さは除神経により有意に低下した。NF後5週目の骨梁幅は、NF後3週目のときやSN後5週目のときと比べて有意に大きく回復したが、骨梁の長さは5週目までの期間において変化がなかった。これらの結果より、1)坐骨神経の凍結麻痺では術後2週目までに骨梁の著しい喪失がみられ、2)一過性の除神経とそれに続く回復過程では、骨梁幅においては骨梁構造の回復が見られることが示唆された。肥満症や高血圧、高脂血症並びに糖尿病など生活習慣病においては、交感神経の活動亢進が認められる。特に高血圧症では、筋や骨代謝にも影響を及ぼすことが報告されているが、骨組織構造との関係を検討した報告は希少であり、本研究では自然発症高血圧ラットを用いて、骨組織構造の違いや量的構造の変化について観察し、薬剤や運動効果についても検討した。

自然発症高血圧ラット(SHR)及び対照ラットを4044週齢時に心拍数並びに血圧をラット・マウス用非観血式血圧計を用いて計測した結果、対象群と比較してSHRラットでは心拍数、血圧が有意に高く高血圧を発症しており、フラクレット解析により交感神経亢進状態の傾向を有した。骨梁面積、類骨幅、骨量面積当たりの類骨面積は有意に小さいことが観察された。類骨並びに骨芽細胞について光学顕微鏡にて観察したところ、SHR群における骨芽細胞はCont群に比べて小さく偏平なものが多く、その活性度が低いものと推察された。自然発症高血圧は骨量低下を引き起こすことが示唆され、骨梁構造や骨形成に負の影響があることが推察された。またこれらのSHRラットにβ遮断薬(プロプラノロール)を投与もしくはモデレートな運動(自発走)を実施することで骨量は高値を示した。特に類骨面積が改善され、骨芽細胞による骨基質形成促進を示唆するものであった。以上のことから交感神経を介した骨量の調節機序があるものと示唆され、適度な運動の骨量維持改善に対する効果は、メカニカルレストレスや液性因子に加え、神経性にもアプローチしうる可能性を有した。
シャクヤクの花芽分化と促成栽培に関する研究

予備冷蔵(以下予冷)と冷蔵期間並びにGA処理が促成シャクヤクの花芽の発育と開花に及ぼす影響について調査した。[花芽の発育]野生タイプシャクヤクの花芽の発育について,6月下旬から12月中旬まで10日ごとに調査した。調査開始時の6月20日から9月下旬までは葉数の増加のみ認められた。10月中旬には花弁が,11月中旬には雄しべが,また下旬には雌しべの分化がそれぞれ観察された。`サラ・ベルナール'の冷蔵(4°C)開始時(10月上旬)における花芽の状態については,数枚の花弁が観察され,`サラ・ベルナール'の花芽分化は野生タイプよりやや早い傾向を示した。15°Cで予冷されたシャクヤクは花芽の発育が促進された。30日70日冷蔵中における花芽の発育については,冷蔵期間が長くなるほど花芽の長さは長くなる傾向を示したが,花芽の直径や花弁数については一定の傾向を示さなかった。[促成]植え付け日が早いほど発芽日や開花日は早くなった。植え付けから開花までの到花日数は冷蔵期間が長くなるほど短縮された。発芽から開花までの積算温度は,冷蔵期間の長短にかかわらずほぼ一定であった。一年生株において,開花率は30日冷蔵が67%で最も高かったが,実用限界の80%には及ばなかった。冷蔵期間の長短による切り花形質の差は少なかった。予冷により開花期が促進した。予冷とGA処理の組み合わせにより,開花率は向上し,切り花品質も優れた。GA処理は出芽直後の1回処理が開花率向上に最も効果的であった。GA処理により,切り花の花色は薄くなる傾向があった。シャクヤクにおける花芽の発芽並びに冷蔵期間が促成栽培に及ぼす影響について調査した。[発芽の発育]野生タイプシャクヤクの花芽の発育について,6月下旬から12月中旬まで10日ごとに調査した。開花率は30日冷蔵が67%で最も高かったが,実用限界の80%には及ばなかった。また切り花形質は全区ともまずまずであった。予備冷蔵(以下予冷)とGA処理が促成シャクヤクの開花や花色に及ぼす影響について調査した。2週間の予冷処理が花芽の発育に及ぼす影響について調査した結果,15°Cの予冷処理によって内芽の直径や長さが大きくなる傾向を示し,9月15日の処理終了時において15°C予冷区で苞葉やがくの形成が観察された。しかし8°C予冷区では花芽の発育促進効果がほとんど認められなかった。

予備冷蔵の有無とGA処理が出芽や出蕾並びに開花に及ぼす影響について調査した結果,出芽日や出蕾日は処理によって異なり,44日本冷蔵区や8°C予冷区が出芽,出蕾とも早く,対照区が最も遅れた。開花日は8°C予冷区(12月31日)が最も早く,対照区(1月11日)と11日間の差が生じた。開花率は15°C予冷のGA処理区(62.5%)が最も高くなった。GA未処理区ではほとんど開花しなかった。開花時の切り花形質は区間に大きな差が生じなかった。8°Cと15°Cの予冷温度では,出芽や開花期の促進には8°Cがやや効果的ではあるが,花芽の発育促進と開花率の向上には15°Cが優れた。15°C10日間の予冷処理でも花芽の発育に効果的であった。断根育苗された株に対し,予冷処理すると出芽や出蕾および開花期が促進し,またGA処理により開花率が80%を越えた。さらに植え付け株当たりの切り花数も増加した。予冷処理とGA処理により切り花形質が向上した。GA処理時期は出芽直後が開花率向上に効果的で,処理時期が遅れたり,2回処理を行うと,処理効果が薄れる傾向が見られた。切り花の花弁の色は,GA処理によって薄くなる傾向が認められた。
免疫不全症への遺伝子治療における白血病の発症機序の解明と安全性の評価法の確立

レトロウイルス(RV)ベクターによる遺伝子治療での挿入発がん変異の機序について、マウスの骨髄細胞を用いたin vitro immortalization assayアッセイにより解析を行った。挿入コピー数と不死化頻度は相関しており、また、VSV-GによるRVベクターはエコトロピック(Eco)エンベロープに比べて低コピーで不死化を認めた。不死化した細胞集団におけるベクター挿入部位解析では両者に違いはなく、また両エンベロープともベクター挿入によるMECOM遺伝子の発現上昇が不死化の原因と考えられた。VSV-Gが低コピーで不死化を呈する(がん原遺伝子に挿入しやすい)原因を探索中である、B6マウスの骨髄より、Lineage negative細胞(Lin- BM)を分離し、サイトカインにて刺激を行った後に、レトロウイルス(RV)ベクターによって遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の骨髄細胞を2週間培養し、その後10-100細胞/ウェルにて96ウェルプレートに播種し、2週間後に不死化クローンが認められたウェル数からreplating frequencyを算出した(In vitro immortalization assay: IVIMアッセイ)。ウイルスはエコトロピックエンベロープおよびVSV-Gによる2種類のエンベロープで作製し解析をおこなった。両エンベロープとも、replating前のベクターコピー数(VCN)とIVIMクローンの出現に相関が認められ、ベクターコピー数の上昇とともに、不死化の頻度が上昇した。一方で、VSV-Gでは2-3コピーのベクター挿入で不死化が起こるのに対し、エコトロピックエンベロープでは8-12コピーのベクター挿入が不死化に必要であった(2-3コピーの挿入では不死化が起こらず)。遺伝子治療における白血病発症や、その指標としてのIVIMアッセイでの不死化クローンの出現には、ベクターの構造(エンハンサーによる交叉活性の有無)や、ベクターコピー数(多い程がん原遺伝子近傍への挿入頻度が増加する)が関係すると考えられている。しかし、今回の研究では、エンベロープの違い自体によって、不死化の頻度が大きく左右される結果となった。不死化が起こる機序としては、がん原遺伝子近傍へのベクター挿入とその活性化が分かっており、VSV-Gでは低コピー数でもがん源遺伝子近傍への挿入が起こりやすいのかなど、エンベロープの違いによるベクターの染色体挿入パターンに違いの有無を、次世代シーケンサーにより解析する予定である。マウス骨髄でのIVIMアッセイはほぼ確立できている。ヒトCD34陽性細胞を利用したIVIMアッセイでは、不死化クローンの出現が同様に認められたが、培養中に線維芽細胞に分化してしまった細胞(長期生存が可能となってしまった)の混入の影響を排除できず、in vitro(培養系)での評価は難しいとの結論に至った。しかし、幼弱な血球細胞形態を取るクローンも存在していることから、CD34陽性細胞での不死化自体は起こっていると考えられ、今後NOGマウスへの移植により白血病もしくはその前病変の評価の可能性を検討している。原発性免疫不全症に対するレトロウイルス(RV)ベクターによる遺伝子治療では、ベクターの挿入部位近傍のがん原遺伝子の活性化に起因する発がんが報告されている。本研究では、遺伝子治療の実施に向けた発がん挿入変異のリスク評価とそのメカニズムに関して解析を行った。B6マウスの骨髄から、lineage negative (Lin-BM)を分離し、サイトカインにて刺激を行ない、レトロウイルス(RV)ベクターによって遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の骨髄細胞にてreplating assayを行い、不死化の頻度を測定した。VSV-G及びエコトロピックエンベロープ(Eco)の2種類のエンベロープでウイルスを作製し、解析をおこなったところ、不死化クローンにおけるコピー数の違いが認められた(VSV-G: 2-3コピー、Eco: 8-10コピー)。ベクターの挿入部位が異なる可能性を考え、次世代シーケンサーによる解析を行った結果、VSV-GとEcoともベクター挿入の大部分は共通の遺伝子近傍にあることがわかった。このことは、EcoRVによる遺伝子導入ではより多くのベクターコピー数が導入されるものの、挿入される遺伝子部位は、エンベロープの違いに関わらず一定の傾向があること、また不死化に関わる遺伝子挿入も同じであることを意味すると考えられた。さらにマイクロアレイによる発現解析を行ったところ、不死化クローンではVSV-G、Ecoとも同様の遺伝子発現変化が認められ、中でもMECOM遺伝子の発現が大きく上昇していた。遺伝子治療における骨髄球系の白血病の発症と一致して、MECOM遺伝子への挿入及び発現上昇が不死化に関与すると考えられた。VSV-Gが低コピーで不死化を呈する(がん原遺伝子に挿入しやすい)原因を探索中である、本年度の研究から、エンベロープの違いによる不死化への直接的な影響に関して解析を進める。不死化には、がん原遺伝子へのベクター挿入が起こるかが重要とされており、VSV-Gおよびエコトロピックエンベロープで不死化を起こしたIVIMクローンにおいてベクターの挿入パターンの詳細な解析を行う。次世代シーケンサーによる解析の他、マイクロアレイによる内因性の遺伝子発現の変化などを解析し、なぜVSVーGによるRVベクターが低コピーでも、より発がんへの変化を起こしやすいのか解析を行う。

また、ヒトCD34陽性細胞にRVベクターにて遺伝子導入し、その後NOGマウスへ導入することで、実際の遺伝子治療における白血病発症のモデルの作製を試みる。白血病および類縁病変を示した際には、核型分析や次世代シーケンサー、マイクロアレイによって、ウイルスベクターの挿入部位解析、遺伝子発現パターンの変化、染色体の不安定性に関して評価を行う。ベクターの挿入による発がんへのクラスI遺伝子変異、クラスII遺伝子変異など経時的な発がんへの変化の有無を解析する。以上によって、遺伝子治療における白血病発症の詳細な機序の把握を試みる。血液、悪性腫瘍、遺伝子治療本年度の研究において、ほぼ当初の計画通りに進行することができたが、ヒトCD34陽性細胞による不死化アッセイのみ結果が得られなかった。報告書にも記載した通り、ベクターの挿入による血球細胞の不死化による長期生存と、一部の線維芽細胞への分化による長期生存の判別が困難であることから、in vitroでのヒトCD34陽性細胞を利用した不死化実験を中断することになった。そのため当該実験に対する使用予定額が、次年度使用額となった。ヒトCD34陽性細胞のin vitroでの不死化実験は困難であることから、次年度は、当初の研究計画通りにNOGマウスを用いたin vivoでの白血病発症モデルの作製を通して、白血病発症の機序を解明する。次年度使用額は、従来の助成額とともに、NOGマウスによる実験における費用(NOGマウスの購入、飼育、免疫磁気ビーズの購入、フローサイトメトリー解析用の抗体の購入)に使用する予定である。
サッカードディストラクター課題を用いた動機付け、誤差信号、報酬による学習の解析

本研究では、誤差信号や報酬という外的信号と動物の内的状態(動機付けや空間的注意)が運動学習にどのように関わるのか脳幹-大脳基底核系を中心に解析している。眼前のいくつかの場所に光点を呈示すると、ヒトやサルは光点から光点に向かってサッカードとよばれる非常に速い眼球運動で視転移動を行う。視野に標的が現れてからサッカードが起きるまでの反応時間は空間的注意や動機付けと関係していることが良く知られているが、被験者が「どの点に向かって」、「どのような軌道で」あるいは「いつサッカードを開始するのか」ということは誤差信号や報酬による学習によって系統的に修正され得るものと思われる。このような学習には外部から与えちれる誤差信号、行動の結果、与えられた報酬と被験者の内的状態(報酬や誤差信号の履歴による被験者の動機付けや空間的注意など)が重要な要素となるはずであるが、これら要素の相互関係、各要素を関連付ける神経機構はこれまで明らかにされていなかった。本研究では標的となる光点を複数種類それぞれ違った場所に呈示し、実験者が定めたルールに従い、複数呈示された光点のうちある1種類の標的にむかってサッカードを行わせる課題(distractor課題)をサルに課し、課題学習前、課題学習中、課題学習後の黒質-脚橋被蓋核系のニューロン活動を記録解析している。実験中にDistractorと標的との位置関係やタイミングを系統的に操作することにより誤差信号、引き起こされる運動を操作しさらに、ターゲット呈示位置の空間的確からしさ、ターゲットに対する報酬の期待値等を系統的に制御することにより動機付けや空間的注意を操作し、強化学習に対する誤差信号、空間的注意、動機付けの関係を行動学的に解析している。