hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
可燃性混合気の着火と火炎伝ぱ

可燃性混合気の着火と火炎伝ぱにおける安全工学および燃焼学の基礎研究の進展を目的とし、東京大学およびポーランド工科大学が協力して研究をおこなってきた。研究は、研究者を相互に派遣し知識および技術の情報意見交換をおこなうことにより進められた。本科学研究費補助金の基に4名の研究者が渡航した。知識および技術の情報意見交換は、可燃性固体微粒子群の燃焼機構に関する研究に重点が置かれた。この研究に関する多くのデータが、双方の大学の研究者から提供された。東大側:可燃性固体粉じん雲中(Stearic acid、1-octadecanolおよび金属粉じん)を伝ぱする火炎の構造、伝ぱ機構に関するデータ。ワルシャワ工大側:可燃性固体粉じん雲(主に1-octadecanol粉じん)の着火現象および火炎構造に関するデータ。結果として、以下の点が明らかになった。・可燃性粉じん雲中を伝ぱする火炎の構造(火炎構造、予熱領域の厚さ、反応領域の厚さ)・可燃性粉じん雲中を伝ぱする火炎の伝ぱ機構(熱伝達機構、火炎伝ぱ速度)これらの結果より、可燃性固体粉じん雲中を伝ぱする不均質系火炎は、均質な可燃性混合気中を伝ぱする火炎と比較して火炎帯が厚く、その分伝ぱ速度が小さくなるなどの特徴があることがわかった。これらの知見は、不均質系火炎の構造、伝ぱ機構を理解する上で大変重要であり、この共同研究により不均質系火炎の研究の大きなレベルアップ、ならびに日本、ポーランド間の学術交流の進展がはかれた。安全工学および燃焼学の進展に資する新しい知見を得ることを目的とし、東京大学およびポーランド工科大学が協力して研究をおこなっている。平成9年度の実績の概要を以下に記す。8月に、東京大学側から2名の研究者(土橋、鈴木)を、ワルシャワ工科大学に派遣した。初めに、これまでの双方の研究実績についての情報意見交換をおこなった(東大側:揮発性の低い可燃性液滴群中および可燃性個体粉じん雲中を伝ぱする火炎の構造、伝ぱ機構に関する研究結果。熱拡散、熱泳動現象に関する石ワルシャワ工大側:粉じん爆発の基礎研究としての燃焼限界および着火エネルギーの測定結果等)。続いて、不均質系火炎について実験をおこなった。東京大学側でしばしば用いている1-oictadecanol粉じん雲中を伝ぱする火炎挙動を、ワルシャワ工科大学側が有する測定装置(シュリーレンシステムと干渉計)で測定した。その後、ワルシャワ工科大学側の研究者により、さらに詳細なデータ収集がおこなわれた。11月に、ワルシャワ工科大学側から博士課程学生(B.SZATAN)が東京大学を訪問し、この1-octadecanolを用いた実験解析結果について報告した。議論の結果、揮発性の低い可燃性固体粉じん雲中を伝ぱする火炎は、均質な可燃性混合気中を伝ぱする火炎と比較して火炎帯が厚いなど構造に差異があることが確認された。1月に、ワルシャワ工科大学側からprof.P.WOLANSKIが東京大学を訪問した。これまでの結果をもとに、可燃性固体粉じん雲中に形成される不均質系火炎の構造について議論した。また、火炎伝ぱ機構についてもいくつかの仮説を出し合い、今後協力して検討してゆくこととした。さらに、揮発性の非常に小さい可燃性金属粉じん雲中を伝ぱする火炎の構造、伝ぱ機構についても議論した。安全工学および燃焼学の進展に資する新しい知見を得ることを目的とし、東京大学およびポーランド工科大学が協力して研究をおこなってきた。平成10年度の実績の概要を以下に記す。平成10年9月から10月にかけて、東京大学側から1名の研究者(平野)を、ワルシャワ工科大学に派遣した。初めに、双方の最近の研究実績についての情報意見交換をおこない、研究の進め方について話し合った。東大側:可燃性固体粉じん雲中(1-octadecanolおよび金属粉じん)を伝ぱする火炎の構造、伝ぱ機構に関する研究結果。

特に粒子直径の変化、イオン電流の火炎各部での分布。ワルシャワ工大側:粉じん爆発の基礎研究としての燃焼限界および着火エネルギーを垂直型燃焼チューブを用いて測定した結果。シュリーレン法、干渉計および直接撮影による火炎構造の詳細検討結果(主にl-octadecanol粉じん)。平成11年1月に、ワルシャワ工科大学側から1名の研究者(Prof.P.WOLANSKI)が東京大学を訪問し、最新の研究結果について報告し、共同研究の最終まとめについて議論をおこなった。結果として、以下の点が明らかになった。・1-octadecanolなどの可燃性粉じん雲中を伝ぱする火炎の構造に関する点火炎構造、予熱領域の厚さ、反応領域の厚さ、・1-octadecanolなどの可燃性粉じん雲中を伝ぱする火炎の伝ぱ機構に関する点火炎伝ぱ速度、熱伝達機構これらの結果より、可燃性固体粉じん雲中を伝ぱする不均質系火炎は、均質な可燃性混合気中を伝ぱする火炎と比較して火炎帯が厚く、その分伝ぱ速度が小さくなるなどの特徴があることがわかった。これらの知見は、不均質系火炎の構造、伝ぱ機構を理解する上で大変重要であり、この共同研究により不均質系火炎の研究の大きなレベルアップがはかれた。
セメント水和物のケイ酸構造を指標としたコンクリートの最適材料設計手法

セメントと産業廃棄物を利用した材料を組み合わせたコンクリートの材料設計では,コンクリート中の微細組織構造の物理・化学的特性の時間変化から材料特性を把握することが必要不可欠になる。本研究は,セメント水和物の大半を占めるケイ酸カルシウム水和物のケイ酸鎖の重合度と強度発現特性との関係を明らかにした。その結果,ケイ酸カルシウム水和物のケイ酸鎖の平均重合度構成比の変化率と圧縮強度に強い相関関係が認められた。したがって,ケイ酸カルシウム水和物のケイ酸鎖の平均重合度構成比がコンクリートの最適な材料設計においては重要な指標になることを明らかにした。今年度は,シリカフューム(SF)とセメントの水和反応に(I)シリカフュームの品質,(II)水結合材比,(III)加熱養生履歴が与える影響について検討した。結果は以下の通りである。(I)シリカフーム(SF)の品質指標であるSiO2量,比表面積(BET値),湿分量が異なるSFを使用したW/B=22%のセメント硬化体についてSiO2量,BET値,湿分量が圧縮強度と水和物に与える影響についてSFおよびセメント鉱物の反応率の観点から検討した。その結果,圧縮強度はSiO2量,BET値の影響が殆ど無く,湿分量の影響が認められた。SFの反応率は,SiO2量90%未満でBET値の高いSFが増加し,90%以上でBET値の影響が少なかった。C2Sの反応率は,SFのSiO2量が90%以上の場合に初期材齢の反応率が高くなった。(II)水結合材比(W/B)が水和反応およびケイ酸構造へ与える影響について圧縮強度,XRD/リートベルト法による水和反応解析,SFの反応率,トリメチルシリル(TMS)誘導体化法によるC-S-Hのシロキシサン鎖の鎖長分布の観点から検討した。その結果,W/B=15%配合の水和反応は,W/B=30%,W/B=22%配合と比較してSFおよびセメントの水和反応,C-S-Hの生成,C-S-Hのシロキシサン鎖の鎖長が減少することを確認した。(III)熱養生履歴がシリカフューム(SF)を添加したセメント硬化体において,水和反応およびケイ酸構造へ与える影響について圧縮強度,(XRD)/リートベルト法による水和反応解析,SFの反応率,TMS誘導体化法によるC-S-Hのシロキシサン鎖の鎖長分布の観点から考察した。W/B=15%配合の水和反応は,最高温度90°C養生を行った場合,SFおよびセメントの水和反応が材齢91日の20°C封緘養生と比較して促進し,C-S-Hのシロキシサン鎖の鎖長が減少する事を確認した。フライアッシュ(FA)を混和したセメントを蒸気養生した場合の養生工程における前置時間,昇温時間,最高温度継続時間,降温時間が圧縮強度と水和反応およびケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)とC-S-Hのケイ酸鎖の重合度に及ぼす影響について検証した。C3SとC2SおよびFAの水和反応率とC-S-H生成量は,前置時間,昇温時間,最高温度継続時間,降温時間の各々を短縮では減少しなかった。C2S反応率は,最高温度継続時間,降温時間の短縮では材齢7日以降に増進し,C-S-H生成量は,最高温度継続時間と降温時間の短縮で材齢28日以降,若干増加した。C-S-Hのケイ酸鎖の重合度は,昇温速度の増加で進行し,最高温度継続時間と降温時間の短縮で遅延することが認められた。圧縮強度とC-S-Hのケイ酸鎖の平均重合度構成比の変化率には,強い相関関係が認められた。シリカフューム(SF)を混和したセメントにおいて,水結合材比(W/B)およびSFの添加量が圧縮強度,セメントおよびシリカフュームの水和反応の進行,C-S-Hのケイ酸鎖長分布に与える影響を検証した。その結果,圧縮強度は,W/Bの低下により増加し,さらに,SFの添加により増加する。SFの添加効果はW/Bが小さく材齢が長期になるほど大きくなった。C2S,SFの水和反応は,W/B=22%,30%では,材齢365日まで反応が進行したが,W/B=15%では材齢91日以降反応が停滞した。C-S-Hの生成量は,材齢365日ではW/Bの影響,SFの添加量の影響は小さく,C2Sの反応率の影響が大きかった。C-S-Hのケイ酸鎖の平均重合度構成比の変化率は,SFの添加,W/Bの上昇に伴い増加した。

産業廃棄物を利用したコンクリートの材料設計では,コンクリート中の微細組織構造の物理・化学的特性の時間変化から材料特性を把握する性能照査型設計法の構築が必要不可欠になる。この設計法の構築に寄与するため本研究は,セメント水和物の大半を占める非結晶質のケイ酸カルシウム水和物とセメント硬化体の強度発現特性等を関連付ける指標となるケイ酸鎖の構造との関係を解明することを目的している。本年度は,石炭火力発電所から発生するフライアッシュとセメントの水和反応から溶出する水酸化カルシウムCa(OH)2とのポゾラン反応を解明するため,フライアッシュと水酸化カルシウムの単純配合系における水和反応と生成されるケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)の構造変化(シロキシサン鎖の鎖長分布)の分析を行った。また,セメント水和反応の促進のため蒸気養生を用いるケースが多いことから,シロキシサン鎖の鎖長分布に及ぼす加熱温度履歴の影響についても検討した。その結果,ポゾラン反応によりフライアシュからmonomerタイプのケイ酸イオンが供給され,シロキシサン鎖の鎖長分布は短鎖長側にシフトする傾向が確認され,常温20°Cでは材齢14日以降で確認された。一方,80°C,60°C,40°Cぞれぞれの温度で連続的に加熱すると,温度が高いほどフライアッシュのポゾラン反応は活性化され,C-S-Hの生成量が増加される。また,早期にmonomerが供給される結果,鎖長分布はより速く短鎖長にシフトする傾向にあった。内部標準物質を用いたXRD定量分析からフライアッシュに含有するquartzのような結晶性シリカ成分はポゾラン反応を受けずに未反応フライアッシュに残存することが推察された。加熱養生はAFm相の生成を促進させるが,80°C以上ではAFmおよびAFt相が消失することが確認された。今年度は,昨年度の研究の内,フライアッシュとセメントとの水和で生成したC-S-Hのシロキシサン鎖の鎖長分布の分析を継続実施し完了した。今年度申請した研究内容は、シリカフュームのセメントとの水和反応とセメントの水和反応およびシリカフュームのポゾラン反応から生成されるケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)の構造変化を明らかにすることである。具体的には,セメントとSFの水和反応に与えるシリカフュームの品質,水結合材比,プレキャストコンクリートへの適用も考慮した加熱養生履歴が与える影響について検討した。当初計画した実験は終了することができ,概ね順調に進展していると判断できる。今年度当初申請した研究内容は,フライアッシュのセメントとの水和反応過程において,水和初期におけるフライアッシュ粒子表面から溶出するケイ酸の構造を明らかにするとともに,セメントとの水和反応の解析と特にセメントから溶出する水酸化カルシウムCa(OH)2とのポゾラン反応の解析を実施し,生成されるケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)の構造変化を明らかにすることであった。フライアッシュのポゾラン反応解析のためにフライアッシュと水酸化カルシウムCa(OH)2との単純配合ペーストの水和反応解析とC-S-Hのシロキシサン鎖の鎖長分布の分析は予定通り実施しデータを得ることができた。また,フライアッシュとセメントの水和反応解析のために混合配合ペーストを作製し加熱温度履歴を変えた試験体について水和反応解析を実施した。このフライアッシュならびセメントの主要鉱物であるC3SならびにC2Sの反応分析は実施できたが,生成したC-S-Hのシロキシサン鎖の鎖長分布の分析は継続中であり,すべての分析が完了するまで3カ月を要する予定である。しかし,次年度予定しているシリカフュームのセメントとの水和反応解析を前倒して一部実施し始めていることから,概ね順調に進展していると判断できる。
頸筋反応時間を用いた下顎運動時の頸部筋活動様式に関する研究

下顎運動および頭頸部運動時の頸部筋筋電図反応時間の計測方法を確立し、下顎運動における頸部筋群活動の意義究明を目的として本研究を計画した。まず、各種被験運動(頭頸部運動および下顎運動)時の被験者の頭・頸部の動きを加速度トランスデューサーを用い検出を試みたが、加速度トランスデューサー単独のデータやこれらを積分処理して得られるデータだけでは変位を十分に捕らえることができず、実際の頭頸部の動きを正確に把握するのが非常に困難であった。そのため使用するセンサーの見直しを行い電気的角度計の併用を検討したところ、より正確な頭頸部動態の把握が可能となった。一方、頸部筋が主動筋となる頭頸部自体の運動の場合と比較し下顎運動時の頸部筋活動は小さく、また動きによる筋活動記録への影響もみられたため、これらを考慮したデータの記録・処理方法に関しても対策を考慮した。さらに当初用いた音刺激装置では刺激の立ち上がりの不安定を認めた。これらのことを改善した上で頭頸部急速前屈および後屈運動、下顎急速開口および閉口運動などの各種被験運動を被験者に行わせ頭・頸部の動きの記録を行った。その結果、指定した運動とは別の運動と思われる動きが各被験運動開始直前に観察された。波形分析装置を用いて加速度トランスデューサーおよび角度計のデータからこの動きを検討したところ指定した運動に対する準備運動ではないかと推測された。今後は筋電図反応時間データの計測方法を確立し、被験運動と当該運動直前に観察された運動に対する頸部筋活動との関連性に関しさらに詳細に調査を進めて、下顎運動時の頸部筋活動の意義を明らかにしていく予定である。
木質バイオマスを原料としたCu/ZnO担持炭素調製における金属粒子形態制御

目的:針葉樹に金属化合物を担持して炭化すると,粒子径と形状が揃った金属微粒子を担持した多孔質炭素が得られる。このような金属微粒子担持炭素は,針葉樹を構成する仮道管の微小な内部空間にバイオマス熱分解ガスが充満し,金属塩の熱分解生成物と反応するため生成すると考えている。本研究では触媒としての利用を考え,銅と亜鉛,二種類の金属化合物の混合溶液を含浸した木質バイオマスを原料に銅・亜鉛担持炭化物を調製した。銅と亜鉛の混合比,および金属化合物のアニオンが炭化物上の金属粒子形状におよぼす影響を確認し,金属粒子形成過程を明らかにすることを目的とした。実験方法:木質バイオマスとしてヒノキを,担持する銅および亜鉛の原料として塩化物および硝酸塩を用いた。濃度を0.1mol/1に調製した銅・亜鉛混合溶液にヒノキチップを添加して含浸処理を行い,濾別後に乾燥し銅・亜鉛担持ヒノキとした。炭化処理は熱天秤(島津TGA-50)に高純度窒素を20ml/min通気し,処理温度500-700°C,昇温速度10°C/minの温度条件で行った。炭化物中の金属微粒子形態をSEMにより観察し, EDSを用いて組成分析を試みた。実験結果:調製した金属粒子担持炭化物をSEMおよびEDSで観察した結果, 1塩化物担持試料:銅および亜鉛を単独で担持した時に見られた結晶状粒子の生成は見られず,歪な形状の粒子が生成した。また銅と亜鉛の混合状態は悪く,それぞれ独立した組成の粒子の形成が確認できた。2硝酸塩担持試料: 500°Cまでに直径数十nmの半球形微粒子が炭化物表面に多数形成される。生成した粒子の組成は担持処理に用いた銅・亜鉛混合溶液組成にほぼ等しいことがわかった。また炭化温度の上昇や炭化設定温度下で保持することで,半球形粒子からウイスカー状粒子に変化し,銅・亜鉛の組成分布に偏りが生じた。半球形粒子中の融点の低い成分がウイスカーに成長するためと考える。目的とした触媒用途には,銅・亜鉛混在ナノ粒子を多数生成する,硝酸塩担持ヒノキを原料に炭化温度500°Cで調製した炭化物が最適と考える。
没入型映像システムにおける立体映像知覚の基礎研究

本研究は,没入型映像システム(CAVE型ディスプレイ)の特徴である周辺映像が,立体感や立体像の見やすさに関係するかを調べることを目的とした.研究期間内の実験からは,没入型映像表示システムでは被験者の手に届くような範囲の映像呈示で,立体像の位置やサイズ知覚の正確度が高まり,臨場感が向上すること,疲労感については従来型ディスプレイと差はないことがわかった.これらから,周辺視野にも映像呈示された没入型映像表示システムでは大きな視差を持った立体映像を比較的安全に呈示可能であるといえる.本研究は,没入型映像表示システム(CAVE型ディスプレイ)で提示された二眼式立体映像に対する観察者の立体視特性を実験的に調査して,立体映像表現の実用に役立てることを目的としている.前年度は,主に視野サイズの影響について調べた.当該年度は,ディスプレイの種類での比較を中心に研究を進めた.具体的には,(1) CAVE型ディスプレイでの立体映像の位置,大きさ知覚および疲労感について調べる実験を行い,従来のディスプレイに対する研究結果と比較した.また,(2)ビル高所から眼下を望む立体映像を用いて,高さ方向の立体知覚についてCAVE型ディスプレイとHMD型ディスプレイとで比較を行った.実験結果として,(1)CAVE型ディスプレイではスクリーンから大きく飛び出すような映像でも立体視が可能であり,また立体像(CGモデル)の立体位置やサイズに関しては被験者の手の届くような範囲の映像呈示で正確度が高まることがわかった.一方,疲労感については従来型ディスプレイと比較した場合の明確な差は見られなかった.没入型映像表示システムでは比較的大きな視差を持った立体映像呈示が可能なことがわかったが,その理由の解明にはいたらなかった.(2)高さ方向の立体感については,CAVE型の方がHMD型よりも高さ知覚の正確度が高い傾向にあることがわかった.原因としては,周辺映像の影響が示唆された.実験内容(1),(2)ともに知見は得られたが,原因や要因に関する考察は十分とはいえず,さらなる検討が必要である.なお,前年度からの課題である(3)周辺視野映像の図柄が立体感に及ぼす効果・影響について予備実験を実施したが,明確な傾向が現段階では得られておらず,今後さらに検討することとした.本研究は,没入型映像システム(CAVE型ディスプレイ)の特徴である周辺映像が,立体感や立体像の見やすさに関係するかを調べることを目的とした.研究期間内の実験からは,没入型映像表示システムでは被験者の手に届くような範囲の映像呈示で,立体像の位置やサイズ知覚の正確度が高まり,臨場感が向上すること,疲労感については従来型ディスプレイと差はないことがわかった.これらから,周辺視野にも映像呈示された没入型映像表示システムでは大きな視差を持った立体映像を比較的安全に呈示可能であるといえる.本研究は,没入型映像表示システムで提示される二眼式立体映像に対する観察者の立体視特性を実験的に調査して,立体視における周辺映像や背景映像の役割を明確にして,実用に役立てることが目的である.研究において,没入型映像表示システムとして既存設備である箱型4面立体スクリーンシステム(通称CAVE型ディスプレイ)を用いた.当該年度は,映像から受ける立体感が,(1)視野サイズや(2)画枠により,どのように影響を受けるかを調べる主観評価実験を中心に研究を実施した.まず実験に用いるための,これら条件パラメータを変化できる映像コンテンツを作成した.映像としては正方形,円形などの2次元図形や立方体,球などの3次元モデルを視野内の任意の位置に,任意の奥行きで提示できるものである.また,任意の大きさの四角枠の画像(画枠)を重畳提示可能なものである.実験結果としては,映像が提示される視野を広くしていくと立体感が得られる奥行き範囲が広がること,ただし立体感の大きさはやや減少傾向を示すことが示唆された.また,立体視への画枠の影響は大きいことがわかり,画枠が大きいと立体感が得られる奥行き範囲が広がった.現段階では周辺視野と立体視の関係の定性的な関係の一部が分かってきた段階であり,映像の立体視に影響する周辺視野範囲や枠の影響を明確にするためには定量的な検討が今後必要である.なお,研究実施計画では,(3)周辺視野映像の図柄が立体感に及ぼす効果・影響についても実験を行う予定であった.予備実験を複数実施したが,明確な傾向が現段階では得られていない.原因として,図柄モデルの奥行き位置や奥行き形状なども関係していることが示唆され,今後さらに検討することとした.本研究は,没入型ディスプレイの特徴である周辺映像が立体感や立体像の見やすさに関係するか,また同ディスプレイで起きる描画視点と観察者視点のずれの問題が立体視に影響するかを調べることを目的とした.最終年度は,観察者の手元付近に提示される立体像に対する視覚負担をCAVE型とHDTV型のディスプレイで比較した.実験結果からはディスプレイ間での有意な差は見られなかった.昨年度までの実験結果と総合するとCAVE型ディスプレイでは比較的大きな視差を持った立体映像呈示で臨場感などの立体効果は増すが,視覚負担は従来型ディスプレイと同じ程度であることがわかった.また,没入型映像表示システムでの描画視点と観察者視点のずれについての実験からは,視点の一致した映像と比較して立体感や疲労感の評価に違いは見られなかった.

本研究期間内の実験からは,没入型映像表示システムでは被験者の手に届くような範囲の映像呈示で,立体像の位置やサイズ知覚の正確度が高まり,臨場感が向上すること,疲労感については従来型ディスプレイと差がないことがわかった.これらから,周辺視野にも映像呈示された没入型映像表示システムでは大きな視差を持った立体映像を比較的安全に呈示可能であるといえる.また,高さ方向の立体知覚については,没入型映像表示システムでもCAVE型の方がHMD型よりも高さ知覚の正確度が高い傾向にあった.原因としては,CAVE型では観察者自身の身体(主に足)が周辺視野に見えることとの関係が示唆された.研究期間内の実験を通して,没入型ディスプレイが立体映像に適していて,その理由のひとつが周辺映像であるとの知見は得られたが,原因や要因に関する考察は十分とはいえず,さらなる検討が必要である.立体映像のヒューマンファクタ当初の計画では,平成25年度以降は,主に描画視点と観察視点のズレと立体視との関係を解明する実験を行う計画であった.そこで平成25年度は,実験用CAVE型ディスプレイにおいて,描画視点と観察視点の同期をとるヘッドトラッキング機能を整備した.また,比較実験用としてのHMD用実験映像を制作した.これらを用いて,立体映像のサイズ感,距離感に関する実験を実施できた.この面での研究はほぼ予定通りに進捗していると考えている.引き続き平成26年度は,描画視点と観察視点のズレと立体視との関係を調べる実験を行う計画である.一方,当初の計画では,周辺視野映像の図柄や背景映像の影響に関する実験を平成24年度に実施予定であったが予備実験の段階で明確な傾向が見られず本実験に至らなかった.平成25年度に引き続き検討を行い,背景映像の影響についてはある程度の方向性は見えてきたが周辺視野映像の図柄に関しては引き続き検討が必要となった.これまでのところ,おおよそ計画通りに進めているが,一部では遅れや当初計画通りに進んでいない部分もあり,全体として計画はやや遅れ気味と考える.当初の計画では,初年度に今後の実験に用いる,(a)映像コンテンツ(没入型映像表示システム表示用)の基本部分の作成と(b)立体像の知覚位置を調べるための3次元位置センサ(購入装置)の整備を予定していた.(a)については制作を行い,テストを経て実験に用いている.(b)についてはデータ取得プログラムを準備したが,十分なテストには至っていない.この点で実験準備部分の遅れがややでている.また,立体視実験として,(1)視野サイズと立体感,(2)立体感への画枠の効果・影響,(3)周辺視野映像の図柄と立体感,の3種類の実験を実施する計画であった.実験としては3種類とも実施をしたが,(1),(2)については次年度以降につながる結果を得られたが,(3)については明確な結果が得られなかった.また,いずれも実験での被験者数が不十分であった.これまでのところ,おおよそ計画通りに進めているが,一部では遅れや当初計画通りに進んでいない部分もあり,全体として計画はやや遅れていると考える.これまでの実験結果をふまえて,周辺視野の図形や背景映像に関する予備実験を繰り返して,定性的,定量的な検討が可能な本実験を行う.このために実験補助者を増やすなどで進めていく予定である.平成26年度は,主に描画視点と観察視点のズレと立体視との関係を解明する実験を行う計画であるが,平成24年度に購入・整備した
アトピー皮膚炎患者末梢血単球、T細胞培養上清刺激が皮膚ケラチノサイトに及ぼす影響

アトピー性皮膚炎(AD)の発症、重症化、難治化には様々な要因がかかわると推測され、特にバリア機能低下、感染防御能低下などの皮膚固有の機能の障害に代表される生理学的異常と外来抗原に対する抗原提示能の亢進、血中IgE上昇や末梢血T細胞の活性化などの免疫学的異常が、その要因として複雑にからみあうと考えられている。今回の研究ではその両面からアトピー性皮膚炎の病態を解明しようと試みた。(1)生理学的異常に対する検索:皮膚表面及び粘膜表面のsIgA量を測定し、AD患者の易感染性について検討した。いずれもAD患者では有意に低下していた。従って、AD患者では感染防御の第一線となるsIgAが減少し易感染性のひとつの要因であると推測した。(2)免疫学的異常に対する検索:まずAD患者の単球についてその表面マーカー第XIIIa因子についてADと健常人を比較すると、末梢血中の単球では両者の陽性率に有意差はみられなかった。真皮内で比較すると本症の紅斑型の病変部は健常人皮膚と比較して陽性細胞の増加はなかったが、ダニパッチテスト陽性部位では著明に増加していた。また痒疹型の病変部では陽性細胞が増加していた。以上の事はAD患者ではIgE上昇に伴ってI型アレルギーが優位な群とIV型アレルギーが優位な群、両者とも上昇している群に分別されるという以前の結果の傍証となる考えた。次に、免疫学的異常の観点でT細胞のサイトカイン産生能が検討した結果、IL-1の産生能がAD患者では上昇していた。また正常皮膚ケラチノサイトをADT細胞培養上清で刺激するとケラチノサイトの増殖が促進され、IL-1産生が増加した。しかしIL-6産生は増加しなかった。現在はサイトカイン産生についてmRNAレベルで検討中である。
培養巨核球細胞に於けるチロシン・リン酸化蛋白の発現と,その情報伝達的意義について

マウス骨髄細胞から巨核球系細胞への分化・増殖及び成熟に対する基礎条件をPooke Weed Mitogen刺激脾細胞培養上清添加液体培地系で確立した後,ガングリオシドGDlaが巨核球の増殖と成熟を共に促進することを見い出した。更にモノシアロ体GM1はGD1aより強く巨核球の未端細胞である血小板の生成過程を促進した。血小板の刺激剤トロンビンやPMA(ホルボ-ルエステル)は培養骨髄細胞の分化・増殖に効果を示さなかったが,インスリンやPDGFでは骨髄細胞の増殖は強く促進された。この促進作用は蛋白質燐酸化の阻害剤スタウロスポリン(STS)により強く阻害されたが,GD1aにより促進した骨髄球細胞の成熟過程には微弱な阻害作用を示したのみであったことから増殖と成熟過程への蛋白質燐酸化反応の関与の差異が示唆された。他方,血小板をPMAで刺激するとセリン/スレオニン残基燐酸化以外にチロシン残基燐酸化の促進が認められるが,従来報告してきた48Kol蛋白以外の標的として刺激により形成される血小板膜糖蛋白GPIIb・IIIの複合体のうち抗IIIa学クロ-ン抗体(ヒト血小板膜抗原)が家兎血小板のGpIIIaのエピト-プを共通的に認識することを見いだし,対照血小板のGpIIIaは66kolであるのに対し,PMA刺激ではSDSによる解離度に抵抗性が生じて95kolと少量の66Kolとなる燐酸化蛋白であって,我々の作成した抗フオスフォチロシン単クロ-ン抗体陽性の“95Kol"バンドと対応しGpIIIaのチロシン残基燐酸化の可能性は高く,Goldenら(J.B.C.111,3117ー3127,1990)の提唱と矛盾しない。すなわち,トロンビンやPMAなどのアゴニスト類による刺激によって形成されたフィブリノ-ゲンレセプタ-としてのGpIIb・IIIの複合体のうち,90Kalsのチロシン残基燐酸化が血小板の凝集反応に於ける情報伝達機構に関与するものと考えられる。マウス骨髄細胞をPoke Weed Mitogen刺激脾細胞培養上清添加液体培地により培養し、巨核球の分化、増殖及び成熟に対する各種薬物の作用を検討した結果、トロンビンやホルボールミリステートアセテート(PMA)は無効であったが、インスリン、PDGF、トランスフェリン等は増殖を、またGanglioside GDlaは成熟を促進することが明らかとなった。Staurosporine(STS)により増殖は強く阻害されたが、成熟に対する阻害は比較的弱く、蛋くリン酸化機構が分化成熟に伴って変化することが示唆された。他方、骨髄巨核球を母細胞とする血小板をPMAで刺激すると、刺激の極めて早期から48K蛋白がチロシンキナーゼ(TPK)の標的となることは、先に報告した。このPMAの刺激の前後にSTS処理をすると、何れの場合にもPMA単独刺激による血小板形態変化、血小板凝集をμgオーダーで阻害した。48K蛋白のリン酸化も抑制されたが、僅かに残存するリン酸化蛋白の存在を認めた。STSは、CーKinaseの特異的な阻害剤であるがSTSでは抑制されないリン酸化を認めており、この時全血小板中の32pーtyrosine含量は、増大していた。STS前処理PMA刺激

血小板は、円盤状形態を保持することから血小板のmarginal bundles ofmicrotubulesを単離し、金コロイド法による免疫電顕及び電気泳動法で正常血小板のそれと比較したところ、正常血小板より強固なmarginal bundlesの形成を認め、SDS処理では解離しないTubulindimerと低分子MAPより形成されていることが判明した。以上のことは、微小管形成とチロシン残基リン酸化の相関を示唆した。骨髄巨核球の末端細胞である血小板の刺激剤であるトロンビン(T)やホルボ-ルエステル(P)は、血小板蛋白燐酸化反応を促進するが、培養骨髄細胞の分化及び増殖には効果が無かった。蛋白質燐酸化酵素の阻害剤であるStdurosporine(STS)によりインスリンやPDGFで促進した骨髄球細胞の増殖は強く阻害された。しかしガングリオシドGD1aにより促進した骨髄球細胞の成熟に対しSTSの阻害効果は弱かった。STSの骨髄球細胞の増殖と成熟過程に対する阻害効果の相反性は、蛋白質燐酸化反応の同過程への関与の差異を示唆した。TやP刺激後の血小板蛋白燐酸化反応に対しSTSは10^<-6>M以上の濃度で阻害作用を示した。同一条件下P凝集はSTSによりほぼ完全に阻害されたが、T凝集は殆ど阻害されなかった。免疫電顕法による形態的検討からアクチンフィラメントや微小管などの細胞骨格構造蛋白の脱重合作用を有するPにSTSを添加すると微小管関連蛋白(MAP)と共に微小管を安定化させることが示唆され、STSの微小管安定化作用によりP刺激後の細胞骨格構造蛋白関連物質を介した情報伝達が阻害される可能性が考えられた。T刺激により形成される凝集塊中には微小管が存在し、血小板膜直下に存在して円盤状形態を維持する微小管はSTS処理により更に安定化するが、方向性を持って安定化した微小管がT刺激により失われて形成された凝集塊中には長い微小管断片として認められ、結果としてSTSはT凝集を阻害しなかった。以上の結果から骨髄球細胞で認めたSTSの増殖に対する阻害作用は、増殖時の微小管脱重合のSTSによる阻害に依ることが示唆された。又、成熟期にはSTSが有効でないことから一端安定化した微小管により形態が維持されている成熟骨髄球細胞に対してSTSが消極的役割しか演じないことが示唆された。これらの現象は、血小板に対する上記2種の刺激剤による凝集反応に及ぼすSTS作用の差異と矛盾しない。マウス骨髄細胞から巨核球系細胞への分化・増殖及び成熟に対する基礎的条件をPooke Weed Mitogen刺激脾細胞培養上清添加液体培地系で確立した後、ガングリオシドGD1aが巨核球の増殖と成熟を共に促進することを見い出した。更にモノシアロ体GD1aより強く巨核球の末端細胞である血小板の生成過程を促進した。血小板の刺激剤トロンビンやPMA(ホルボ-ルエステル)は培養骨髄細胞の分化・増殖に効果を示さなかったが、インスリンやPDGFでは骨髄細胞の増殖は強く促進された。この促進作用は蛋白質燐酸化の阻害剤スタウロスポリン(STS)により強く阻害されたが、GD1aにより促進した骨髄球細胞の成熟過程には微弱な阻害作用を示したのみであったことから増殖と成熟過程への蛋白質燐酸化反応の関与の差異が示唆された。他方、血小板をPMAで刺激するとセリン/スレオニン残基燐酸化以外にチロシン残基燐酸化の促進が認められるが、従来報告してきた48Kd蛋白以外の標的として刺激により形成される血小板膜糖蛋白GPIIb・IIIa
肺癌の高頻度染色体欠失領域における新規癌関連遺伝子の同定

肺癌で高頻度染色体欠失が認められる8p11領域について外科手術症例80例を用いて解析した。D8S1180マーカーにて検討し38%の症例でアリル欠失を認めた。この領域に存在するSFRP1遺伝子の発現解析を行い、48%の非小細胞肺癌で発現低下を認めた。SFRP1遺伝子発現ベクターを細胞株に導入したところ、コロニー形成の低下が認められ、SFRP1は肺癌における腫瘍抑制遺伝子であることが強く示唆された。3p21.3領域の共通ホモザイガス欠失領域に存在する、3つの腫瘍抑制遺伝子(RASSF1A,BLU,SEMA3B)の不活化機構を検討した。138例の外科手術症例にてRASSFIAは32%,BLUは30%,SEMA3Bは47%においてプロモーター領域の高メチル化が認められた。3つの遺伝子の高メチル化は比較的同時に生じていた。3p21.3アリル欠失をD3S1568およびD3S1621マーカーを用いて検討した。138症例の外科手術標本で解析しアリル欠失は58%の症例で認められた。RASSF1Aの下流遺伝子のSM22及びSPARC遺伝子発現がRASSF1Aメチル化症例では有意に低下していた。肺癌細胞株NCI-H2882における2p24ホモザイガス欠失領域が約3.7MBであることを明らかにした。128症例の外科手術標本にてD2S2150マーカーを用いて検討し40%の症例でアリル欠失を認めた。この領域内に存在するRhoB遺伝子の発現を、ノーザンブロット法を用い肺癌細胞株20例にて、免疫組織学染色にて外科手術症例112例にて検討したところ、高頻度にRhoB遺伝子に発現低下を検出した。特に、腺癌より扁平上皮癌において発現低下が高頻度に生じていることを明らかにした。肺癌を含む多くのヒト悪性腫瘍において高頻度の染色体欠失が報告されている染色体8p11領域に関して、肺癌臨床検体80例を用い、マイクロダイセクション法を用いてマイクロサテライトマーカーD8S1150によるLoss of heterozygosity(LOH)検索を行ったところ、LOHは38%(40 informative症例中)に認められた。該当する8p11領域で他の固形がんで腫瘍抑制遺伝子候補遺伝子であると示唆されているSFRP1遺伝子の発現解析を行ったところ、36%の肺癌検体に発現低下が認められた。SFRP1遺伝子の発現ベクターを構築し、非小細胞肺癌細胞株NCl-H460およびH2009に遺伝子導入したところ、コロニー形成の低下が認められた。これらの結果からSFRP1は肺癌において同様に腫瘍抑制遺伝子であることが強く示唆された。非小細胞肺癌細胞株NCl-H28822における染色体2p23-24のホモザイガス欠失領域を探索し、その欠失領域は約3MBであることを明らかにした。さらに非小細胞肺癌細胞株NCl-H2887における染色体18q11-12におけるホモザイガス欠失領域を同様に探索し、欠失領域は約4.8Mbであることを明らかにした。現在、ホモザイガス欠失領域の両切断点を10kb以下に限定し、その切断点のクローニングを行っている。欠失領域内にある遺伝子は約15個であることを明らかにし、その発現の変化をRT-PCR法で検討している。

発現低下の同定された遺伝子に対し、点突然変異等の変異検索およびプロモーター領域のepigeneticな変化の解析を行い、腫瘍抑制遺伝子の候補遺伝子を明らかにする予定である。肺癌細胞株で同定された染色体3p21.3領域の共通ホモザイガス欠失領域に存在する、3つの腫瘍抑制遺伝子(RASSF1A, BLU, SEMA3B)が不活化される機構について検討した。138例の外科手術症例にてRASSF1Aは32%,BLUは30%,SEMA3Bは47%においてプロモーター領域の高メチル化を認めた。これらの遺伝子の高メチル化は比較的同時に生じていた。3p21.3アリル欠失をD3S1568およびD3S1621マーカーを用いてGeneScan法にて検討した。マイクロダイセクション法にて138症例の外科手術標本スライドから腫瘍細胞のみを抽出し解析しアリル欠失は93例のインフォーマティブな症例のうち54例(58%)で認めた。さらにRASSF1A下流遺伝子のSM22およびSPARC遺伝子発現をノーザンブロット法で検討したところ、RASSF1A高メチル化症例では有意に発現低下が認められた。肺癌細胞株NCI-H2882における染色体2p24ホモザイガス欠失領域について解析した。132症例の外科手術標本に関してD2S2150マーカーを用いてアリル欠失を検討した。64例のインフォーマティブな症例のうち26例(41%)に欠失を認めた。この欠失領域に存在するRhoB遺伝子について遺伝子変異解析を行ったが、体細胞突然変異は認められなかった。一方、ノーザンブロット法にてRhoB遺伝子発現を肺癌細胞株25例で検討したところ、RhoBの発現低下を高頻度に検出し、腫瘍抑制遺伝子候補遺伝子であることが示唆された。免疫組織学的解析にて118例の外科手術症例を検討し、扁平上皮癌では74%、腺癌では14%の発現低下が認められ発現低下は組織型の差にも関与していることが示唆された。
小児期急性脳症の発症初期に生ずる血液脳関門破綻メカニズムの解明

インフルエンザ脳症をはじめとするウイルス性脳症の病態を理解し、特にジクロフェナックナトリウムにより増悪メカニズムを解明するために本研究を企画した。培養アストロサイトおよびミクログリアを、IL-1β、TNF-α、IFN-γにて刺激すると、アストロサイトでは、iNOS、AQP4が発現上昇し、NOの産生も高まった。ミクログリアでも、iNOSが誘導され、NOの産生が高まると共に、貪食作用も高まった。サイトカインによるこれらの誘導は、DCF存在下で強くなることから、これらの誘導が、脳症増悪メカニズムの一端を担っている可能性が示唆された。昨年度に引き続き、インフルエンザ脳症で高値を示すIL-6, IL-8, MCP-1などをはじめとするサイトカイン、ケモカイン(他に、IL-1beta、IFN-gamma、TNF-alphaなど)が、血液脳関門を構成する細胞である、脳血管内皮細胞およびアストロサイトに与える影響について検討を行った。さらに、中枢神経における炎症に深く関わっているミクログリアについても検討を加えた。アストロサイトについては、申請者らが樹立したラット不死化細胞株に加え、ラット胎仔・新生仔からの初代培養細胞も用いた。また、ミクログリアについてもラット新生仔からの初代培養細胞を用いた。血管内皮細胞については、昨年度に引き続き、マウス脳血管内皮細胞の不死化細胞株を用いた。アストロサイトの足突起は、血管内皮細胞に接し血液脳関門の機能の一部を担っていると考えられているが、その足突起に集積し、中枢神経系の水移動調節に関わっているアクアポリン4(AQP4)の発現が、サイトカインによってどのような影響を受けるか検討を行った。アストロサイトをIL-1beta、IFN-gamma、TNF-alphaで刺激し、その後のAQP4の発現変化をmRNA (RT-PCR)、タンパク(Western blot、免疫組織染色)レベルで調べたところ、これらサイトカインの刺激により、発現増加が見られること、さらに、小児急性脳症を増悪させるといわれているジクロフェナックナトリウム(以下DCF)を同時に作用させると、さらに発現上昇することが判明した。一方、ミクログリアについては、サイトカインの刺激による実験系が確立し、各種指標を用いて、その活性化状態の検討を行っている。ミクログリアについては、サイトカインの刺激による実験系が確立し、各種指標を用いて、その活性化状態の検討を行なった。DCF存在下で、IL-1beta、IFN-gamma、TNF-alphaで刺激すると、iNOSが強く誘導され、NOの産生が高まると共に、貪食作用も高まることが判明した。インフルエンザ脳症で高値を示すIL-6、IL-8、MCP-1などを始めとするサイトカイン、ケモカイン(他にIL-1beta、IFN-γ、TNF-αなど)が、血液脳関門を構成する細胞である、脳血管内皮細胞およびアストロサイトに与える影響について検討を行った。アストロサイトについては、ラット新生仔大脳皮質から初代培養したアストロサイトと、申請者らが、平成20年度に採択された科学研究費による研究において樹立したラットアストロサイトの不死化細胞株を用いた。一方、血管内皮細胞については、マウス脳血管内皮細胞の不死化細胞株を用いた。今年度は、これら細胞に、IL-1beta、IFN-γ、TNF-αを混合投与し作用させ、血液脳関門の透過性を変化させると報告のあるNOおよびその合成酵素であるiNOSの発現を中心に検討を加えた。

アストロサイトにIL-1beta、IFN-γ、TNF-αを混合投与すると、mRNAおよびタンパクレベルで強力にiNOSの誘導が生じ、NOの産生も高まることが判明し、さらに、産生されたNOによりアストロサイトの細胞傷害が生じることも明らかになった。また、アストロサイトの細胞内シグナルの解析も阻害剤等を用い検討を加えている。一方、血管内皮細胞については、これらサイトカインの影響について、年度内に十分な結果を得ることが出来なかったため、引き続き実験を行っている。一方、ラットアストロサイト不死化細胞株とマウス脳血管内皮細胞不死化細胞株を用いた血液脳関門を想定した共培養系については、コーティングを初めとした最適な培養条件の決定に手間取り、当初の予定通りの進捗が得られなかった。1,平成24年度においては、アストロサイトの不死化細胞および初代培養細胞を用いた研究については、ほぼ予定通り研究を進めることが出来た。また、ミクログリアについても、培養系が安定し、十分な結果を得るまでには至らなかったが、研究を進めることが出来ている。2,血管内皮細胞については、培養条件の設定が進んでおらず、当初予定していた、血管内皮細胞とアストロサイトの共培養系を用いた実験の進行が遅れている。1,平成23年度では、ラットアストロサイト初代培養細胞を用い検討については、順調に研究を進めることが出来たが、血管内皮細胞を用いた研究については、年度内に予定していた内容まで検討を進めることが出来なかった。2,加えて、ラットアストロサイト不死化細胞株とマウス脳血管内皮細胞不死化細胞株を用いた血液脳関門を想定した共培養系を用い、そこにサイトカイン、ケモカインを作用させ、血管内皮細胞とアストロサイトの共存下における遺伝子発現変化、蛋白発現変化を検索することを目標としていたが、とりわけ血管内皮細胞の培養条件の決定に手間取り、これについても、予定通りの結果が得られなかった。1,平成25年度においては、24年度に引き続き、アストロサイト、ミクログリアにおいて、サイトカインやケモカインを作用させたときの遺伝子変化の検索を引き続き進める。とくに、血液脳関門の傷害につながるMatrix metalloproteinaseの発現に注目し、研究を進める予定である。2,血液脳関門の形成状況をモニタリングするために、蛍光タンパクを融合させたAQP4を発現したアストロサイト細胞株を作成し、脳血管内皮細胞との共培養系にて利用することを計画している。ただし、AQP4のN末またはC末には、それぞれ機能があり、従来の融合タンパクのようにAQP4のN末またはC末に融合させることが出来ないため、途中に挿入する必要があり、工夫が必要となる。1,平成24年度においては、血管内皮単独培養系にサイトカイン、ケモカインを作用させた時の遺伝子発現変化、蛋白発現変化の検索を引き続き進める。2,ラットアストロサイト不死化細胞株とマウス脳血管内皮細胞不死化細胞株を用いた血液脳関門を想定した共培養系が安定してきているので、この培養系を用いて、当初の研究スケジュールにキャッチアップ出来るよう研究を推進する。
歩行対称性指標の妥当性およびその正常標準値の検討

健康な若年者を対象に平面上又はトレッドミルでの歩行を行わせ,歩行中の腰背部および両膝での加速度測定を行う。この加速度波形の自己相関関数から歩行の対称性,定常性指標を算出する。これらの指標の標準値,正常範囲を得ること,また歩行速度や距離,疲労との関係を検討する。
外来遺伝子高発現オルソブニヤウイルス作出技術の確立に関する研究

本研究目的は、外来遺伝子高発現オルソブニヤウイルス作出技術の確立である。外来遺伝子として容易に検出できるGFPを用いて、これを効果的に発現するアカバネウイルス(AKAV)の作出を試みる。5′UTRを欠損させたことによるアンチゲノムからの転写プロモーター活性の変化を調べるために感染細胞を用いてリアルタイムPCRを行なったところ、eGFP-AKAV/38は親株に比べてアンチゲノムから転写されるGFP mRNA量が増えていた。またノーザンブロッティングの結果から、アンチゲノムからゲノムへの複製が増強されていることが分かった。これまでに、同じオルソブニヤウイルスのブニヤンベラウイルスで、S分節の5′UTRを削ると転写・複製効率が下がるというミニゲノムアッセイの報告があるが、本研究結果では転写・複製効率が上がるという逆の結果となっており、感染性ウイルスでは異なることが示唆された。これはオルソブニヤウイルスのUTRに関する新たな知見である。平成30年度の計画は、回収できた改変型組換えAKAVのin vitroでの性状解析をすることであった。1.増殖性について: eGFP-AKAV/42とeGFP-AKAV/38、および親株と野生株ウイルスを用いて感染細胞で増殖曲線、プラックの大きさを調べた。2.蛍光発現時期の解析:eGFP-AKAV/42、eGFP-AKAV/38、親株、野生株をmoi=0.01でHmLu-1細胞に感染させ、感染24時間後および48時間後の蛍光を観察した。また、蛍光免疫染色でAKAV感染領域における蛍光発現率を調べた。3.安定性について:eGFP-AKAV/42、eGFP-AKAV/38および親株を10代まで継代し、蛍光検出できたプラック率を継代数ごとに比較して、挿入遺伝子が安定して発現しているかを調べた。4.培養細胞でのゲノムの転写能の検討:蛍光発現時期の違いについて、その原因解明のためにGFP mRNA量をノーザンブロッティングで調べる予定であったが、GFP mRNAの発現量が少なく検出不能あったため、リアルタイムPCRを行った。反応産物がGFPゲノムではなくmRNAであることは、反応液を電気泳動し検出したバンドの長さで確認した。その結果、eGFP-AKAV/38は親株に比べて外来遺伝子の転写が増強していることが分かった。以上、1.4.の前年度に計画した実験は全て網羅しており、本研究は当初の計画通りに順調に進捗している。eGFP-AKAV/38を用いてin vivoでの詳細な解析を行い、動物体内でのAKAVの可視化(in vivoイメージング)としての有用性を検討する。最終年度に当たる平成31年度は、作出したウイルスのin vivoでの性状を動物実験を行い解析する。蛍光を最も効果的に発現するeGFP-AKAV/38をマウスに感染させ、親株および野生株との病原性を比較する。新生子マウスに腹腔内接種し、一日一回以上症状と生死を観察し生存曲線を描く。マウスに致死性を示した場合、瀕死期に開腹し臓器(腹腔内臓器、胸腔内臓器、脊髄、脳など)を蛍光実体顕微鏡で観察する。致死性を示さない場合でも、感染後、継時的に解剖し、同じく蛍光実体顕微鏡で蛍光検出を試みる。これまでに、蛍光発現AKAV(eGFP-AKAV)のS分節5′UTRの3′側領域をstop signalまで削ったウイルス(eGFP-AKAV/42)が作製されており、このウイルスは、培養細胞でeGFP-AKAVよりも蛍光発現時期が早いことが確認できている。今年度は新たに、eGFP-AKAV/42のS分節からさらに1塩基ずつ削っていった9種類の5′UTR欠損S分節プラスミドを作製した。これら各プラスミドとLおよびM RNA発現プラスミドをT7ポリメラーゼ恒常発現BHK-T7/9細胞に遺伝子導入することで、8種類のウイルスが回収できた。回収できたウイルスのRNAを抽出しシーケンス解析で塩基配列を確認したところ、欠損領域の多い4種類のウイルスでS分節に変異が入っていた。変異の入っていなかった4種類のウイルスはそれぞれ、5′UTRのうち8083塩基を欠損させたものであり、感染性ウイルスの産生に必須である5′UTR領域を突き止めることができた。作製した蛍光AKAVは全て、CPE発現の前に蛍光を検出できており、改変前のeGFP-AKAVよりも蛍光発現時期が早かった。5′UTRを欠損させたことで、アンチゲノムからの転写プロモーター活性が増強し、GFP遺伝子の発現が上昇した可能性がある。これまでに、同じオルソブニヤウイルスのブニヤンベラウイルス(BUNV)で、S分節の5′UTRを削ると転写・複製効率が下がるというミニゲノムアッセイの報告があるが、本研究結果から感染性ウイルスでは異なることが示唆された。平成29年度の計画は、eGFP-AKAVの5′UTR欠損S分節プラスミドライブラリーを作製し、5′UTR欠損AKAVライブラリーを作製することであった。eGFP-AKAVのS分節5′UTRを79塩基欠損させて作出した、eGFP-AKAV/42のS分節をもとに、さらに1塩基ずつ欠損させた9種類の5′UTR欠損S

分節プラスミドを作製した。これらを用いてウイルスレスキューを試みたところ、変異の入っていない4種類のウイルスが回収できた。これらのウイルスはそれぞれ、5′UTRのうち80から83塩基を欠損したもので、感染細胞で蛍光が検出できている。また感染細胞の観察で、従来の蛍光AKAVよりも蛍光発現時期が早いことが確認できている。以上より、本研究は当初の計画通りに順調に進捗している。本研究目的は、外来遺伝子高発現オルソブニヤウイルス作出技術の確立である。外来遺伝子として容易に検出できるGFPを用いて、これを効果的に発現するアカバネウイルス(AKAV)の作出を試みる。5′UTRを欠損させたことによるアンチゲノムからの転写プロモーター活性の変化を調べるために感染細胞を用いてリアルタイムPCRを行なったところ、eGFP-AKAV/38は親株に比べてアンチゲノムから転写されるGFP mRNA量が増えていた。またノーザンブロッティングの結果から、アンチゲノムからゲノムへの複製が増強されていることが分かった。これまでに、同じオルソブニヤウイルスのブニヤンベラウイルスで、S分節の5′UTRを削ると転写・複製効率が下がるというミニゲノムアッセイの報告があるが、本研究結果では転写・複製効率が上がるという逆の結果となっており、感染性ウイルスでは異なることが示唆された。これはオルソブニヤウイルスのUTRに関する新たな知見である。平成30年度の計画は、回収できた改変型組換えAKAVのin vitroでの性状解析をすることであった。1.増殖性について: eGFP-AKAV/42とeGFP-AKAV/38、および親株と野生株ウイルスを用いて感染細胞で増殖曲線、プラックの大きさを調べた。2.蛍光発現時期の解析:eGFP-AKAV/42、eGFP-AKAV/38、親株、野生株をmoi=0.01でHmLu-1細胞に感染させ、感染24時間後および48時間後の蛍光を観察した。また、蛍光免疫染色でAKAV感染領域における蛍光発現率を調べた。3.安定性について:eGFP-AKAV/42、eGFP-AKAV/38および親株を10代まで継代し、蛍光検出できたプラック率を継代数ごとに比較して、挿入遺伝子が安定して発現しているかを調べた。4.培養細胞でのゲノムの転写能の検討:蛍光発現時期の違いについて、その原因解明のためにGFP mRNA量をノーザンブロッティングで調べる予定であったが、GFP mRNAの発現量が少なく検出不能あったため、リアルタイムPCRを行った。反応産物がGFPゲノムではなくmRNAであることは、反応液を電気泳動し検出したバンドの長さで確認した。その結果、eGFP-AKAV/38は親株に比べて外来遺伝子の転写が増強していることが分かった。以上、1.4.の前年度に計画した実験は全て網羅しており、本研究は当初の計画通りに順調に進捗している。作出したウイルスについて、in vitroおよびin vivoの詳細な解析を行っていくことで、蛍光を最も効果的に発現するウイルスを見つける。平成30年度は、作出したウイルスのin vitroでの性状を解析する。5′UTR欠損部位の多い組換えAKAVを用いて、eGFP-AKAV/42および改変前のeGFP-AKAVと以下の項目について比較する。