hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸管上皮を考慮した非アルコール性脂肪肝を予防する食物質探索評価系の構築及び解析

非アルコール性脂肪肝(NAFLD)は近年その患者数が世界的に増加している肝疾患であり、NAFLDは非アルコール性脂肪肝炎(NASH)、さらには肝硬変や肝細胞がんへと進行・悪化するリスクがある。本研究では昨年度に引き続き、in vitro NAFLDモデル系を構築・改良し、さらにNAFLDを予防する食品成分の探索・解析を進めた。前年度構築したin vitro NAFLDモデル系では、ヒト肝モデルHepG2細胞の培養状態によっては遊離脂肪酸による脂肪滴形成が明確に観察できない場合もみられたため、さらにモデル系の改良をおこなった。具体的にはHepG2細胞を播種後、無血清培地に変えずに通常培地のまま遊離脂肪酸のパルミチン酸(PA)、オレイン酸(OA)を4:1の比率に変えて添加し、24時間培養した。その後Oil Red O染色して脂肪滴蓄積を観察し、さらにその後の洗浄操作も改良してOil Red Oを溶出させ吸光度測定で定量化した。その結果、従来の方法に比べ顕著な脂肪滴蓄積が安定に観察された。改良したin vitro NAFLDモデル系を用いて脂肪滴蓄積を抑制する食品成分を新たに探索した結果、ある種の生薬抽出物が脂肪滴蓄積を抑制することが見出された。並行して、構築したin vitro NAFLDモデル系ではIL-8など炎症関連分子のmRNA発現が亢進されることを見出している。そこでNASHにも関与する炎症関連転写因子NFkappaBに注目し、NFkappaB転写活性を抑制する食品成分を探索した。その結果、クワ葉熱水抽出物中に含まれる1-deoxynojirimycin(1-DNJ)がTNFalpha刺激によるNFkappaB転写活性亢進並びにIL-8のmRNA発現亢進及び分泌亢進を有意に抑制した。また1-DNJは腸管上皮を透過し、肝細胞における炎症を抑制する可能性が示唆された。ヒト肝由来HepG2細胞を用いて、昨年度構築したin vitro NAFLD系をさらに改良し、遊離脂肪酸による脂肪滴蓄積をより明確に評価できるよう改善することができた。さらに改善したin vitro NAFLD評価系を用いて、ある種の生薬抽出物がNAFLD抑制作用を示す可能性を新たに見出している。並行して、NAFLD誘導時には炎症反応もみられることから炎症関連転写因子であるNFkappaBに注目して研究を進め、クワ葉に含まれる1-DNJがNFkappaB転写活性およびその標的遺伝子であるIL-8発現を抑制することも新たに見出した。一方でin vivoのNAFLDモデル系については、高脂肪食誘導や高フルクトース食誘導に加え、ガラクトサミン誘導肝炎モデルなども含めて様々な評価系について、予備検討をおこなっている。しかしながら、まだ評価系の確立には至っておらず、早急にin vivo評価系の構築を目指す。本年度新たに見出したNAFLD抑制が期待される生薬抽出物について、NAFLD抑制活性を有する成分の単離・同定を進める。また同定された成分あるいは生薬抽出物が脂肪滴蓄積を抑制する作用メカニズムについて、詳細に解析する。さらに、腸管上皮モデル細胞の管腔側から脂肪酸mixと共に食品成分を添加した際に、HepG2細胞にて抑制作用がみられるか検討する。また肝臓における炎症を抑制することが示唆された1-DNJについても、NFkappaB活性化抑制の作用機序を解析する。並行して、現在検討中であるin vivoのNAFLD/NASH評価系を構築し、さらにin vitro評価系で見出した食品成分がNAFLD/NASH症状を予防・改善しうるかどうか検討する。非アルコール性脂肪肝(NAFLD)は世界的に患者数が増加している肝疾患であり、NAFLDは非アルコール性脂肪肝炎へと進展し、さらに肝硬変や肝細胞がんへと悪化するリスクがある。またNAFLDは生活習慣病の発症とも関連があることから、本研究では肝疾患に加え生活習慣病をも予防する観点からNAFLDを予防する食品成分を探索することとし、食品成分の腸管吸収をも考慮したin vitro NAFLDモデル系を構築し解析することとした。ヒト肝由来HepG2細胞を用いてin vitroNAFLDモデル系を構築することとし、HepG2細胞を無血清培地に置き換え、さらに24時間後に無血清培地(control)、遊離脂肪酸のパルミチン酸(PA)、オレイン酸(OA)、2つの脂肪酸を両方加えたMixを添加した無血清培地で培養した。24時間後にOil Red O染色して脂肪滴蓄積を観察し、さらに定量化した。その結果、PA、OA、そのMixを添加したHepG2細胞では脂肪滴蓄積誘導が確認され、特にMix群で最も強く脂肪滴蓄積が観察された。さらに脂肪酸Mix添加後3時間で、IL-8やTNFalphaなど炎症関連分子のmRNA発現亢進が見出された。そこで脂肪酸Mix添加によるIL-8 mRNA発現亢進を抑制するフィトケミカルを探索した結果、クルクミンがIL-8mRNA発現亢進を有意に抑制し、また脂肪酸Mixによる脂肪滴蓄積も抑制する傾向がみられた。次に、透過性膜上に14日間培養し腸管上皮様に分化させたCaco-2細胞と12 well plateに培養したHepG2を用意した。Caco-2を培養した透過性膜インサートをHepG2を培養したplateにのせ、さらにCaco-2管腔側に脂肪酸Mixを加えて共培養を開始したところ、HepG2に脂肪滴の蓄積が観察された。ヒト肝由来HepG2細胞を用いて、無血清+5%

脂肪酸フリーBSA条件下でパルミチン酸およびオレイン酸の混合物を添加することによって、脂肪滴蓄積・IL-8のmRNA発現誘導を指標としたin vitro NAFLD系を構築することができた。また添加する脂肪酸の細胞毒性や、脂肪酸の混合比の最適化、IL-8mRNA発現亢進を評価する際のタイムコースなど、詳細な実験条件も検討をおこない、さらにある程度改善・最適化できたと考えられる。また構築した評価系を用いてスクリーニングを開始しており、いくつかNAFLDの予防が期待できる食品成分も見出しつつある。さらに、腸管上皮モデルCaco-2細胞とHepG2細胞の共培養系を構築し、各種共培養条件を改善した。そして腸管上皮モデルの管腔側から脂肪酸を添加した場合に、HepG2細胞における脂肪滴蓄積の誘導が観察され、腸管吸収を考慮したin vitro NAFLD系の構築できたと考えられる。一方で、マウスやラットを用いたin vivoのNAFLDモデル系についてはいまだ評価系の確立には至っておらず、さらに検討を進める予定である。非アルコール性脂肪肝(NAFLD)は近年その患者数が世界的に増加している肝疾患であり、NAFLDは非アルコール性脂肪肝炎(NASH)、さらには肝硬変や肝細胞がんへと進行・悪化するリスクがある。本研究では昨年度に引き続き、in vitro NAFLDモデル系を構築・改良し、さらにNAFLDを予防する食品成分の探索・解析を進めた。前年度構築したin vitro NAFLDモデル系では、ヒト肝モデルHepG2細胞の培養状態によっては遊離脂肪酸による脂肪滴形成が明確に観察できない場合もみられたため、さらにモデル系の改良をおこなった。具体的にはHepG2細胞を播種後、無血清培地に変えずに通常培地のまま遊離脂肪酸のパルミチン酸(PA)、オレイン酸(OA)を4:1の比率に変えて添加し、24時間培養した。その後Oil Red O染色して脂肪滴蓄積を観察し、さらにその後の洗浄操作も改良してOil Red Oを溶出させ吸光度測定で定量化した。その結果、従来の方法に比べ顕著な脂肪滴蓄積が安定に観察された。改良したin vitro NAFLDモデル系を用いて脂肪滴蓄積を抑制する食品成分を新たに探索した結果、ある種の生薬抽出物が脂肪滴蓄積を抑制することが見出された。並行して、構築したin vitro NAFLDモデル系ではIL-8など炎症関連分子のmRNA発現が亢進されることを見出している。そこでNASHにも関与する炎症関連転写因子NFkappaBに注目し、NFkappaB転写活性を抑制する食品成分を探索した。その結果、クワ葉熱水抽出物中に含まれる1-deoxynojirimycin(1-DNJ)がTNFalpha刺激によるNFkappaB転写活性亢進並びにIL-8のmRNA発現亢進及び分泌亢進を有意に抑制した。また1-DNJは腸管上皮を透過し、肝細胞における炎症を抑制する可能性が示唆された。ヒト肝由来HepG2細胞を用いて、昨年度構築したin vitro NAFLD系をさらに改良し、遊離脂肪酸による脂肪滴蓄積をより明確に評価できるよう改善することができた。
現代型訴訟の立法論的研究-少額訴訟・環境保護訴訟を中心として-

本年度の研究では、アメリカ合衆国・ドイツ連邦共和国における環境保護訴訟・消費者保護訴訟(少額訴訟)の実際の展開の軌跡を、可能な限り詳細にたどった。まず、アメリカ合衆国においては、消費者保護団体や環境保護団体に出訴権(原告適格)を認めた特別の法律は存在しない。しかしながら、一般的な訴訟要件としての原告適格を有すると認められれば訴訟追行権を有する。これら団体が行政庁の行為を訴訟の対象とする場合には連邦行政手続法10条(a)項の要件を満たすことが必要であるが、その判断は最終的には裁判所によって行われている。1980年代までのアメリカ連邦最高裁判所は、環境訴訟の当事者は、彼ら自身への不当な行為を正すことだけでなく、公衆の利益を守ることも求めるという認識を示していたため、環境問題に関する原告適格についても、広く環境保護団体にも認めていた。しかしながら、1990年代に入ると、Lujan v.Defenders of Widlife事件(112 S.Ct.2130(1992))などで、環境保護団体の当事者適格を否定する判決が下されるようになってきている。これに対し、ドイツ連邦共和国においては、個別の法律(自然保護法、不正競争防止法等)により団体に原告適格を認めているが、その団体は無制限ではなく、行政庁による承認手続きを経た団体のみに出訴権(原告適格)を付与している。しかし逆に、団体訴訟は自然保護法等によって明文の規定が定められない限り、裁判所の判例法や理論によって団体に原告適格が認められる可能性はきわめて乏しい。今後の研究の計画としては、これらアメリカ・ドイツ両国の紛争処理方式が、我が国の民事訴訟法及び民事訴訟法理論との関わりの中で、どのように評価されるべきかを検討する予定である。
海洋漂流重油の運命予測-変性解析と漂流ルート解析および環境影響解析-教授

重油の変成機構として、水分の混入による重油ー海水エマルジョンの形成,海水中塩分の凝集、揮発分の大気への揮発に着目した。ナホトカ号船首抜き取り重油および数地点で入手した漂流・漂着重油のムースの組成を測定した結果,Naが油層へ移行していることを明らかにした。そこで,国産C重油を用いて,海洋漂流中の油の変性実験を行った結果,油中に塩分が移行することにより重油ー淡水エマルジョンよりも水泡が微細となり、安定な油ー海水エマルジョンが生成されることを明らかにした。さらに,エマルジョンの形成により揮発性成分の拡散が抑制されることを示した。次に海洋漂流重油の揮発成分の揮散および溶出成分の溶出機構を移動現象論的にモデル化し,数学的な解析を行うことにより,実験結果および漂流漂着中に含まれていたナフタレンの挙動を表すことができた。最後に、漂流・漂着重油による環境影響として、海藻葉への取り込みおよび海浜植物葉への取り込みをモデル化するとともに、大気汚染を招いた重油中の揮発成分の植物への影響を調べるために,キョウチクトウ葉を用いたベンゼンの吸収実験を行った。その結果、ベンゼンは気孔をとおして細胞層に取り込まれ、約4時間程度でベンゼン濃度が最大となり,葉の溶解を招くことが明らかにした。海洋漂流重油の揮発成分および溶出成分の溶出機構を移動現象論的にモデル化し,数学的な解析を行うことにより,重油中のナフタレンの挙動を表すことができた。さらに,油中塩分濃度の測定方法を開発し,ナホトカ号流出重油および数地点で入手した漂着重油の油中塩分濃度を測定した結果,ナトリウム濃度が高いことを明らかにした。そこで,国産重油を用いて,海洋漂流中の油の変性実験を行った。その結果,重油と海水を混合することにより,短時間でエマルジョンが形成され粘度の上昇が認められること,油中に塩分が移行することにより油-海水エマルジョンが安定化することを明らかにした。さらに,エマルジョンの形成により揮発性成分の拡散が促進されることを示した。以上の結果から,塩分の移行によるエマルジョンの安定化と,エマルジョン化による揮発成分の揮散により,より粘度の高いエマルジョンとなると考えれらた。海洋に漂流した重油の変性について、国産C重油を用いて実験的に検討した。の結果,海水中のNaionが油層に移行することにより,重油-海水エマルジョンが安定化し,重油-海水エマルジョンよりも水泡が微細となり安定化して,高粘度のムースとなることを明らかにした。次に,揮発物質の大気中への揮散をモデル化し,ベンゼンを添加した重油-海水ムースからのベンゼンの揮散実験から,ベンゼンのムース内での拡散係数を求めた結果,高粘度の重油-海水ムースは,揮発成分の拡散係数が低下し,その揮散速度が低下することを示した。さらに,ナホトカ号重油流出事故の実データを用い,揮発分の変化を計算した結果、これらは海洋漂流中はほとんど大気中に放出されず,海浜に漂着し厚みが極端に低下したことにより,一気に大気中に揮散して大気汚染を招いたことを明らかにした。次に,大気汚染を招いた重油中の揮発成分の植物への影響を調べるために,キョウチクトウ葉を用いたベンゼンの吸収実験を行った。その結果,ベンゼンは,気孔をとおして細胞層に取り込まれ,約4時間程度でベンゼン濃度が最大となり,葉の溶解を招くことが明らかとなった。
MRSを用いた嚢胞性卵巣腫瘍の性状分析-特に漿液性腫瘍と粘液性腫瘍の鑑別の可能性

次に、手術により摘出された卵巣嚢胞性卵巣腫瘍の内容液を吸引し、PRESS法にて同様な条件で1H-MRSを測定したところ、3病巣中2病巣で明瞭なピークが観察された。このピークがどのような物質に基づくものかは同定できなかった。病理学的にはいずれも粘液性嚢胞腺腫であった。今回、内容液を用いた検討では明瞭なピークが同定できたことから、今後も卵巣嚢胞性腫瘍内容液の1H-MRS測定を重ねることで、ピークを構成する物質を特定し、漿液性嚢腫と粘液性嚢腫、あるいは良性と悪性の1H-MRSパターンの違いを認識しうる可能性が示唆された。また、ハードウエアの面でも、十分な水抑制と脂肪抑制を行う新たな方法の開発と、体内深部にある病巣の微弱な信号を受診ができるよう体表コイルを改良することで、病巣が体内にある状態でも1H-MRSの測定は可能と考えられた。
脳スライス培養系を用いた神経-細胞外マトリックス-グリア間相互作用に関する研究

神経細胞傷害時における神経-細胞外マトリックス(ECM)-グリア細胞間相互作用の役割を明らかにすることを目的として、大脳皮質および線条体領域から作製した脳スライス培養系を用いて、以下の検討を行った。平成18年度の研究から、NMDAによる神経細胞傷害時に、マトリックスメタロプロテアーゼの1つ、MMP-9の活性が上昇することが明らかとなっていることから、NMDAによるMCP-1産生に対するMMP-2/MMP-9阻害薬SB-3CTの効果を検討したが、SB-3CTはMCP-1産生に対して、影響を与えなかった。このことから、NMDAによる神経細胞傷害時におけるMCP-1産生へのMMP-2/MMP-9の関与は小さいことが示唆された。また、様々な刺激によって細胞内外で生成する過酸化水素(H_2O_2)が、脳内での細胞間あるいは細胞-ECM間の相互作用を担っている可能性について検討するため、脳スライス培養系を用いて、H_2O_2による細胞傷害およびケモカインMCP-1の産生について検討した。H_2O_2は濃度依存的に細胞傷害およびMCP-1の産生を惹起し、主なMCP-1産生細胞はアストロサイトであった。さらに、MAPキナーゼの関与を検討したところ、H_2O_2によるMCP-1産生は、部分的ではあるもののMEK阻害薬U0126によって有意に抑制されたことから、MEK-ERK系の関与が示唆された。本培養系での神経細胞傷害時におけるH_2O_2の生成量やそのタイムコースなどの詳細については、今後の検討課題である。本研究では、神経細胞傷害時における神経-細胞外マトリックス(ECM)-グリア間相互作用の役割とその分子機構の解明を目的としており、まず今年度は、その中でも神経-ECM間相互作用に着目し、神経細胞傷害時におけるECM発現変化に関して検討した。実験には、生後2-3日齢ラットの大脳皮質-線条体領域より作製したスライス培養系を用いた。免疫組織学的検討から、培養10日目の培養スライスにおいて、ラミニンに対する染色は、神経細胞のマーカーであるNeuNに対する染色や血管内皮細胞のマーカーであるvon Willebrand factorに対する染色との重なりを示した。また、フィブロネクチンについては、血管内皮細胞様染色がわずかに認められる程度であった。NMDA(50μM)による神経細胞傷害後、ラミニン免疫反応性は顕著に減少した。一方で、フィブロネクチンに関しては、NMDA処置後もその免疫反応性に変化は認められなかった。さらに、ECMの分解に関与する細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性変化を、ゼラチンザイモグラフイーを用いて検討した。その結果、NMDAによる神経細胞傷害によって、MMP-9活性はNMDA処置数時間後から一過性に上昇し、48時間後には元のレベルにまで戻ることが明らかとなった。これらのことから、脳スライス培養系では、神経細胞傷害後、神経-ECM間情報伝達を介してラミニンなどの細胞外マトリックス環境が変化すること、またそれらの分解に関与するMMP-9などの酵素活性も変化すること示された。
レジンモノマーの安全性を評価する先進的なセルベースアッセイ系の構築

これまでに、解毒の中心的な遺伝子発現応答である「ARE(Anti-oxidant Responsive Element)活性」を発光測定で定量する細胞株を樹立し、メチルメタクリレート(MMA)とジヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)のARE活性に対する作用の比較から、ARE活性を低濃度で上昇させるレジンモノマーは、相対的に毒性が高いことを示唆した。本課題では、歯科で頻用されるエチルメタクリレート(EMA)についてARE活性化における濃度依存性と細胞毒性の相関性を明らかにした。以上の結果より、レジンモノマーの細胞毒性が強いものほど低濃度でARE活性を上昇させることが実証された。歯科材料による細胞毒性関連遺伝子発現解析に、ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイを適用し、これまでに、解毒の中心的な遺伝子発現応答である「ARE(Anti-oxidant Responsive Element)活性」を発光測定で定量する細胞株を樹立した。その細胞株を用いて、メチルメタクリレート(MMA)とジヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)のARE活性に対する作用の比較から、ARE活性を低濃度で上昇させるレジンモノマーは、相対的に毒性が高いことを示唆した。しかしながら、MMAとHEMA以外のレジンモノマーによるARE活性化に関しては不明なままであった。そこで、レジンモノマーの濃度依存的なARE活性化能は、細胞毒性の強さを反映するかを検証するため、MMAとHEMAの他に、歯科で頻用されるエチルメタクリレート(EMA)のARE活性化能を調べ、細胞毒性との関係を検討した。EMAは、高濃度(10-30 mM)でARE活性を顕著に上昇させ、細胞毒性の指標となる細胞内グルタチオン濃度と細胞生存率の低下は30 mMにおいても起こらなかった。EMAのARE活性に対する作用は、MMAと類似しており、30 mMでもグルタチオン濃度が低下しなかったことから、EMAは、急性の細胞傷害性という観点からは、MMAと同様にある程度多量に使用できる材料であることが示唆された。このように、EMAについてARE活性化における濃度依存性と細胞毒性の相関性を明らかにし、その結果、ARE活性化の濃度依存性は、相対的にレジンモノマーの毒性の強さの指標となることが実証された。レジンモノマーの細胞毒性を低濃度から高感度に評価する手法として、細胞内の解毒代謝系である、「ARE(Anti-oxidant Responsive Element)活性」を発光測定で定量する細胞株、HepG2-AD13細胞を樹立し、生物発光を利用した細胞毒性試験法を構築している。これまで、HepG2-AD13細胞におけるレジンモノマーのARE活性化における濃度依存性と細胞毒性の相関性を中心に行ってきた。そこで、細胞毒性評価に標準的に用いられるマウス線維芽細胞株のL929や正常歯肉線維芽細胞由来のGin-1細胞における、レジンモノマー刺激によるARE活性、細胞毒性の評価指標として細胞内グルタチオン濃度、WST-8を用いた細胞生存率の測定を行なった。L929細胞や、Gin-1細胞においても、相対的に応答率は低いものの、MMAによるARE活性の上昇の起こることが示された。ヒト歯肉線維芽細胞でも解毒応答が起こることを示し、解毒能が弱いため、HEMAの毒性発現濃度が低濃度にシフトするが、MMAとHEMAはHepG2と類似の細胞毒性を示した。作出したHepG2-AD13細胞におけるレジンモノマーの毒性は、正常歯肉線維芽細胞においても、レジンモノマーの毒性を反映しており、HepG2-AD13細胞によるレジンモノマーの毒性評価が、正常歯肉線維芽細胞における細胞毒性の良い指標となると考えられた。HepG2-AD13細胞とGin-1細胞におけるMMAとHEMAの細胞毒性に関連した細胞応答の比較検討を中心に行ってきた。HepG2-AD13細胞におけるレジンモノマーの毒性は、Gin-1細胞においても反映しており、HepG2-AD13細胞によるレジンモノマーの毒性評価が、正常歯肉線維芽細胞における細胞毒性の良い指標となると支持する良好な研究結果が得られた。しかし、Gin-1細胞はHepG2細胞と比較してグルタチオン解毒機能が発達していないため、レジンモノマーに対するARE活性の応答率が低く、MMA低濃度(10 mM以下)の作用を比較するのは、困難であった。また、MMA高濃度側(10 mM以上)の作用は、レジンモノマーによる細胞に対するダメージのため、内部標準となるルシフェラーゼ活性が急激に低下し、正確に評価できなかった。そのため、Gin-1細胞では、レジンモノマーの濃度依存的なARE活性化能の違いで、レジンモノマーの毒性の強さを解析することは困難であることが明らかになった。アクリル系レジンは操作性に優れ、生体材料のひとつとして、歯科および医科領域で多用されているが、重合体に残留する未重合モノマーの生体為害性が懸念されている。レジンの安全な使用法を考える上で、レジンモノマーの毒性に対する解毒応答を調べることは重要と考えられる。これまでに、解毒の中心的な遺伝子発現応答である「ARE(Anti-oxidant Responsive Element)活性」を発光測定で定量する細胞株を樹立し、歯科、医科領域で汎用される既存のレジンモノマーを安全に使用し、新規歯科材料を開発していく上で有用と考えられるレジンモノマーの毒性評価系を構築した。

グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を含む第二相異物代謝遺伝子群の発現誘導においては、センサータンパク質Keap1が異物を感知し、Keap1システイン残基のスルフヒドリル(SH)基が異物による修飾を受け、Keap1による分解制御から逃れた転写因子Nrf2が核内に移行してAREを活性化する(Wakabayashi N, et al., PNAS. 2004)。これまでにHEMAが多くの異物と同様に、このKeap1-Nrf2経路でAREを活性化することを報告した(Orimoto A, et al., PLoS One, 2013)。そこで、次に、ARE活性制御タンパク質である、センサータンパク質Keap1と転写因子Nrf2強制発現により解析を行い、HEMAに加えてMMA,EMAがKeap1-Nrf2経路でARE活性を上昇させることを示し、レジンモノマーによるKeap1への直接作用が低濃度範囲でのARE活性化の分子機構であることを示唆した。これまでに、解毒の中心的な遺伝子発現応答である「ARE(Anti-oxidant Responsive Element)活性」を発光測定で定量する細胞株を樹立し、メチルメタクリレート(MMA)とジヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)のARE活性に対する作用の比較から、ARE活性を低濃度で上昇させるレジンモノマーは、相対的に毒性が高いことを示唆した。本課題では、歯科で頻用されるエチルメタクリレート(EMA)についてARE活性化における濃度依存性と細胞毒性の相関性を明らかにした。以上の結果より、レジンモノマーの細胞毒性が強いものほど低濃度でARE活性を上昇させることが実証された。これまでにMMAとHEMAの比較から、ARE活性を低濃度で上昇させるレジンモノマーは、相対的に毒性が高いことが示唆されていた。本年度はEMAのARE活性化能について調べ、細胞毒性との関係を明らかにしARE活性に対するレジンモノマーの濃度依存性が、毒性の強さの指標となることを支持する良好な研究結果が得られた。一方でトリエチレングリオールジメタクリレート(TEGDMA)、4-メタクリロキシエチルトリメリテート酸無水物(4-META)、ウレタンジメタクリレート(UDMA)といったアクリル系レジンモノマーに関しても同様の実験を試みたが、上記材料によるARE活性誘導はみられなかった。これら材料は、非水溶性材料であり培養液に添加したところ析出してしまい、物理的な細胞のダメージによりARE活性誘導がみられなかったと考えられる。これにより「ARE活性試験」では毒性を評価できない材料があることが明らかになった。次年度は、ARE活性の基盤となるKeap1によるレジンモノマー認識能の解析を進めたい。GSTを含む第二相異物代謝遺伝子群の発現誘導においては、センサータンパク質Keap1が異物を感知し、Keap1システイン残基のスルフヒドリル(SH)基が異物による修飾を受け、Keap1による分解制御から逃れた転写因子Nrf2が核内に移行してAREを活性化する(Wakabayashi N, et al., PNAS. 2004)。申請者は、これまでにHEMAが多くの異物と同様に、このKeap1-Nrf2経路でAREを活性化することを報告した(Orimoto A, et al., PLoS One, 2013)。
超高次元データの分類手法の導出とその理論的性質の解明および実データへの応用の研究

超高次元データにも適応可能な分類手法が近年求められている.そこで柔軟な判別境界を表現できて過学習となりにくいbagging型AdaBoostを提案した.また地球環境空間データの解析のため,空間依存性をマルコフ確率場でモデル化し,森林被覆率の判別問題や回帰問題,土地被覆割合の推定手法を考察した.なお統計モデル選択のための情報量基準についての専門書を出版した.近年の情報化や計測技術の発展により,従来得られなかった超高次元のデータが観測されるようになり,有効な解析手法手法が求められている.たとえば特徴変数の次元が10個前後のデータを念頭においた従来の統計解析手法をそのまま応用しても十分な解析性能は保証されない.ここでは判別分析,および関連する分野に重きを置いて次の研究を行う.(1)超高次元データの判別手法を提案し,実データでその性能を検証することを研究目的とする.また標本が複数のカテゴリに含まれている場合,そのカテゴリ比率を推定する問題:カテゴリ分解についても考察する.特に空間データの場合,空間相関をモデル化してカテゴリ分解の精度を向上させる手法について考察し,実データで検証する.(2)時系列データの統計解析,およびモデル探索・選択について考察する.(3)高次元データの統計解析やその環境問題への応用について考察する.超高次元データにも適応可能な分類手法が近年求められている.そこで柔軟な判別境界を表現できて過学習となりにくいbagging型AdaBoostを提案した.また地球環境空間データの解析のため,空間依存性をマルコフ確率場でモデル化し,森林被覆率の判別問題や回帰問題,土地被覆割合の推定手法を考察した.なお統計モデル選択のための情報量基準についての専門書を出版した.人工衛星や飛行機から地表面を観測したデータから各画素のカテゴリを推測することは、地球環境を知る上での重要な課題である。また遺伝子発現量を計測するマイクロアレイのデータから、特定疾患の特徴を把握することも高次元データの判別問題となる。ここでは、ランダムに生成した2分岐型の関数を基底関数とし、そのなかから指数ロスを小さくしていく弱判別機を結合していくアダブーストを提案した。また過学習を回避するため、教師データをランダムに判別機の生成用と評価用に分割し、判別機を生成・評価し、これを繰り返した判別機の多数決原理を用いて、安定した高性能の判別機を得ることに成功した。提案した手法は、各変数が判別にどの程度貢献するかを数値として評価できるため、変数選択に用いることもできる。実データでは、変数の重要度に応じて基底判別機を生成することにより、判別性能を改良することができた。提案手法はシミュレーションデータや実データでSVM、ANN等の高性能として知られる方法を常に上回る性能を示した。なお画像判別について、Nishii&Eguchi(2005)が提案した統計的学習理論に基づく判別手法SpatialBoostについて考察し、その適応範囲を広めた手法をレビューした。地表面の各観測メッシュが複数の土地被覆カテゴリで覆われている場合,その割合を推定する問題はunmixingと呼ばれる.この問題を混合ガウス分布およびマルコフ確率場に基づくアプローチで考察した(投稿中).また克服すべき課題も見つかった.また地表面のメッシュごとの森林被覆率を予測するため,人口密度および傾斜強度を説明変数とする非線形回帰モデルを考察した.まず森林被覆率を説明変数の階段関数で近似し,それによりスムースな非線形回帰モデルの候補を複数考え,AICで選択した.これにより誤差に空間相関を持つモデルが選ばれ,森林減少過程や地域差の考察が可能となった(掲載決定).また時間の経過にともなって高頻度で観測・測定されたデータや時空間データを,観測時点の不均一性や欠測,あるいは個体差や内在するノイズを考慮して関数化処理し,処理した関数集合に基づく非線形現象解明のためのモデリングと理論・方法論の研究に取り組んだ.さらにAICを研究の端緒とする統計モデル選択のための情報量基準について,この分野の研究の集大成的書籍を出版した.一方,高次元配列(テンソル)データの応用が画像解析、脳波解析,WEB解析など様々な分野で研究されている.テンソルデータ解析における基本的な問題には階数決定問題があり,これに対してのいくつかの結果を得た.また,比較的サイズの小さな3次元分割表に対して、時点tにおける条件つき推論のFRAMEから時点t+1における条件つき推論のFRAMEへの全射をアルゴリズム的に構成することができることを示した.なお,本科研費と科研基盤(A):統計科学における数理的方法の理論と応用(研究代表者:谷口正信)との共催で研究集会「高度情報抽出のための統計理論・方法論とその応用」(九大附属図書館視聴覚ホール2008/11/20-22)を開催した.本研究の分担者や研究協力者を含めた16件の研究発表があり,活発な討論が行われた.航空機搭載のセンサーから200次元以上の超高次元データが観測されるようになってきた.本年度は高次元の多重分光画像を観測したとき,各画素の土地被覆(カテゴリ)を推定する問題を考察した.画素を複数あるカテゴリの一つに分類する判別分析が一般的であるが,空間分解能が大きい場合,一つの画素が複数のカテゴリで被われていることが多い.そこで画素を被っているカテゴリの比率を推定するunmixingについて考察した.その場合,空間的に隣接している画素のカテゴリ比率ベクトルはお互いに近いものになっているはずである.この事前情報をマルコフ確率場としてモデル化した.また各カテゴリでの特徴ベクトルは正規分布に従い,複数のカテゴリで被われている場合は,正規混合分布で与えられると仮定した.このもとで局所事後密度の近似的最大化により被覆割合の推定方式を提案した.提案手法をシミュレーション

データや実データに適応したところ,十分な性能を有することが示された.その後局所事後密度の正確な最大化方式を導出できたため,200次元の実データに適応した.現在投稿中である.一方,リモートセンシングに関連する話題として,地表面を正方形状に区切った領域における森林の被覆率を,人口や土地の起伏量で説明する非線形回帰モデルを考察した.誤差が空間相関を持つ多くのモデルのなかからAICでモデル選択を行った.また東アジアの4領域で同様のモデル選択を行ったところ,同一モデルが選ばれた.なお共同研究者はそれぞれ高次元データを関数化したデータ解析手法の提案,多次元テンソルデータ解析における数学的問題である階数決定問題についで研究し,論文発表を行った.本年度は地球環境のリモートセンシングデータに関する判別問題を考察した.地表面をメッシュ状に区切った観測領域において,森林の被覆率を人口密度と土地の起伏量(最高標高-最低標高)で説明する非線形回帰モデルを考察した.まず観測領域の森林割合が1)森林が全くない,2)部分的に森林で被われている,3)完全に森林で被われている,の3つのケースについて,当該領域の人口密度および起伏量から判別するロジスティック型判別モデルを考察した.判別には周辺の観測領域の影響も取り込んだモデルが有効であること,説明変数の巾変換が有効であることを確認した.また森林が全く無くなる原因は周辺領域の影響によるものではなく当該領域で決定されること,逆に完全に森林で被われるのは周辺領域からの影響が大きいことが推定モデルからも説明できることが示された.一方,外生変数をもつ自己回帰モデルのモデル選択とモデル推定について,企業と共同研究を行い,現在特許出願のための書類を作成中であるその他の研究として,高次元データを関数化したデータによる動作の判別分析モデルや関数データのクラスタリングについて考察した.また高次元データの2種類のタイプである高次分割表の解析法とテンソルデータ解析法の数学的基礎理論を研究し、高次元分割表においては近傍理論を構築した.なお本研究費も部分的にサポートした研究会:32回Symposium on Remote Sensing for Environmental Sciencesを主催した.Prof.Benediktsson(アイスランド大)によりモルフォロジーを用いた画像判別の最近の発展の報告があり,有意義な研究交流ができた
高精度エアロゾル光学特性測定法の開発と実証観測

エアロゾルの光学特性を精度よく測定するために角度分解型ネフェロメーター(ポーラーネフェロメーター)とキャビティリングダウン分光(CRDS)装置の開発を行った。CRDS装置は、355, 532 nmの2波長で消散係数を計測できる。ポリスチレンラテックス(PSL)標準粒子を用いて性能評価を行ったところ、97%以上の確度で消散係数が測定可能であることが確認された。ポーラーネフェロメーターは、散乱角4176°までは4または10°毎に散乱光を測定する。性能評価のためPSL標準粒子と実大気の測定を行った。その結果、本装置単独で散乱係数が測定可能となった。本課題では、地球放射収支に影響を与えるエアロゾルの一次散乱特性の測定のため、角度分解型散乱係数計を開発し、既開発の全消散測定装置と合わせて新しい測定システムを構築する。気象研究所では、角度分解型散乱係数計を開発するため、システムの構成を決定後、フォーカサー及び検出器を選定し、散乱光が検出可能かどうか調べるために基礎実験を行った。波長は532nm(出力350mW、ビーム径2mm)で前方は4度まで、後方は176度まで測定できることが分かった。フォーカサーを使用することでS/Nが上がったが、側方散乱光の出力が小さいため装置の調整、改造を進めている。装置の開発と同時に従来型の散乱係数計のデータを吸収係数と併用して補正する方法を開発し、シミュレーションで精度調査を行った。名古屋大学では、355,532nmの2波長で消散係数を計測できるキャビティリングダウン分光(CRDS)装置を製作し、装置の性能評価を行った。単分散のポリスチレンラテックス標準粒子を発生させ、CRDS装置で消散係数を、CPCで粒子数密度の測定を行った。粒子数密度で規格化した消散係数の測定値のバラつきから測定精度を評価したところ、粒子数密度が100個/ccより大きく、消散係数が装置の検出限界よりも十分大きな環境下において、532,355nmともに約2%の精度で消散係数を測定できることが判明した。また、CRDSで測定した消散係数とCPCで測定した粒子数密度から得られた消散効率をMie散乱理論による計算値と比較することにより、装置の確度を評価した。その結果、実測値とMie散乱理論の計算値は、532nmでは平均0.4%(最大3%)、355nmでは平均1.2%(最大3%)の範囲で一致した。このことから、本CRDS装置が97%以上の確度で消散係数を計測できることが確認された。さらに、本装置を用いて、気象研究所(つくば市)で実大気観測を行い、現在、ネフェロメータなど他の地上計測装置や、MAX-DOAS法などリモートセンシングによる計測結果との比較のための解析を進めている。平成22年度に行った基礎実験に基づき作成した角度分解型散乱係数計(ポーラーネフェロメーター)を角度分解能を高めるために改造を行い、前方20度までを4度の角度分解能で、それ以外を10度の分解能で測定できるようにした。その後、開発したポーラーネフェロメーターの性能を評価するために、粒径および屈折率が既知のポリスチレンラテックス標準粒子の測定を実施した。測定では、ネブライザーにより発生させた粒子を拡散ドライヤーで乾燥させたあと、静電分級器およびエアロゾル質量分級装置に導入し、単分散粒子を得た。得られた単分散粒子(直径:200,300,500,700,900nm)の散乱の角度依存性をポーラーネフェロメーターで、消散係数をキャビティリングダウン分光法で、粒子数密度を凝縮式粒子計数器で計測した。散乱の角度分布から得られた散乱係数を、キャビティリングダウン分光法により得られた消散係数および、粒子数密度と粒径からミー散乱理論により計算される散乱係数と比較した。その結果、キャビティリングダウン分光法により得られた消散係数は、理論計算とよく一致していたが、ポーラーネフェロメーターの散乱光を積分して得た散乱係数は、系統的に小さな値であった。このため、散乱光の角度分布を調べたところ、散乱光の角度分布が前方散乱の領域(散乱角30度以下)で、角度力ま小さくなるほど理論値に比べ小さくなっていることが分かった。今後、問題点を明らかにし、装置及び校正法の改良を行い、実大気での測定を可能にする。

平成23年度に、開発したポーラーネフェロメーターの性能を評価するために、粒径および屈折率が既知のポリスチレンラテックス(PSL)標準粒子の測定をキャビティリングダウン(CRDS)装置と同時に測定し、CRDS装置による測定値とPSL標準粒子の散乱光の角度分布の理論計算値を基に校正した。平成24年度には、新たにCRDS装置を併用しないで、二酸化炭素とフィルターを通した空気を基準に校正する方法を試みた。その際、サンプリング体積の不確定さを除くため、測定インレット内をすべてサンプル空気で満たす方式でおこなった。PSL標準粒子の測定値と理論計算値を比較した結果、散乱パターンは、全体の傾向をよくとられており、前方散乱の角度分布に改善が見られ、散乱角40度くらいまでの範囲で両者の一致は非常に良くなった。しかし、散乱角40°以上では側方散乱のノイズが増加するため、側方から後方にかけての一致はそれほどよくなかった(散乱光の絶対値の差は小さい)。実大気で測定した散乱係数を、積分型のネフェロメーター(TSI model 3563)の550nmの値と比べると、系統的に数%10%程度大きかった。実大気の測定を行った日のTSIのネフェロメーターの前方を測定していないことによる補正は約4%、測定波長の違いによる差(オングストローム指数から見積もる)は6%程度あることを考慮すると、両者の系統的な差はなくなり非常に良く一致する。本課題で開発したポーラーネフェロメーターの測定により、散乱係数の角度分布が得られるようになったこと、測定値から測定できていない極前方(散乱角4度以下)と極後方(散乱角176度以上)を推定することで正確な散乱係数が測定可能であることが分かった。新たに追加した集光レンズ付きファイバーの性能にバラツキがあり、再調達に時間がかかったことと、非常に微弱な光を測るので、個々の検出器の感度調整に手間取ったこと、散乱光の検出領域が、サンプル空気より大きい可能性があり、校正方法を再検討する必要が生じたことのため、やや進捗が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。ポリスチレンラテックス標準粒子を用いて行った実験結果を再検討し、問題点を明らかにする。校正のための測定を簡単にできるように装置の改造を行い、再度、標準粒子による実験を行った後、実大気での実証観測を行う。
甲殻類におけるマイクロダイアリシス法による血中神経ホルモンのリアルタイム測定

甲殻類では、脳内物質のリアルタイム分析はおろか、血液中の物質変動の解析すら試みられていない。無拘束甲殻類でマイクロダイアリシス法により血液中のセロトニン、ドーパミンなどの生体アミン、グルタミン酸、GABAなどのアミノ酸の高感度HPLC分析を行った。アメリカザリガニとアメリカンロブスターを用い、氷麻酔下の個体および外的刺激による闘争ないし威嚇行動発現中の個体の各種神経ホルモン、伝達物質の血中濃度を分析し、行動との関係を解析した。アメリカザリガニでセロトニンが、アメリカンロブスターでドーパミンが、威嚇ないし闘争行動にともなって血中濃度が増大することが明らかになった。アメリカザリガニでは、セロトニンが氷麻酔時5.3±1.0、興奮時17.3±3.0、その代謝産物5-HIAAが氷麻酔時71.1±14.5、興奮時29.8±14.1であった(単位pg/10ul)。一方モノアミン、アミノ酸の血中濃度は麻酔時と興奮時で有意差が認められなかった。アメリカンロブスターでは、全個体で興奮時のドーパミン血中濃度が麻酔時のドーパミンより有意に増加した。セロトニンおよび5-HIAAは測定限界を下回った。従来の研究では、動物の行動、心理状態を考慮するどころか、in vivoでの神経伝達物質の血中濃度そのものが十分調べられていなかった。本研究では多くの神経ホルモン伝達物質について平均的な体内濃度を明らかにできたばかりでなく、行動にともなう物質変動を捉えることができた。アメリカザリガニではセロトニンレベルの上昇がセロトニン代謝産物の5-HIAAレベルの下降をともなった。一方アメリカンロブスターではドーパミンレベルの上昇が、ドーパミン代謝産物HVAの上昇をともなわなかった。今後これらの物質の放出器官や代謝経路の検討を含めて、薬理学的、組織化学的手法も取り入れて研究を進める。自由行動中の動物において神経伝達物質あるいはホルモンの濃度をリアルタイムで分析した研究はほとんどない。行動と体液中の神経伝達物質濃度とを連関させる研究のための萌芽的研究として、甲殻類の攻撃行動をモデルに血液中のアミノ酸神経伝達物質濃度、モノアミン神経伝達物質濃度のHPLC分析を試みた。アメリカザリガニ(Procambarus clarkii、12g-53g)が示す鋏を大きく開いて鋏脚をもちあげるという攻撃的な威嚇姿勢に注目した。1-2時間氷麻酔した動物および室温で威嚇姿勢をとっている動物から、一個体当たり0.5-1.0mlを採血した。各個体ごとにモノアミンおよびアミノ酸を個別にHPLC分析した。サンプルの調製法を確立するため、以下の4つの方法(1)通常の微量神経粗織のHPLC分析に用いる除蛋白法、すなわち、採血後ただちに0.1M過塩素酸を加え1時間除蛋白処理する方法、(2)採血後ただちに30分問冷却超遠心した上清に60%過塩素酸を加え(最終濃度が5%以下)、1時間除蛋白処理する方法、(3)あらかじめ0.5M EDTA 0.1mlを入れた注射器で採血し60%過塩素酸(最終濃度20%)で処理する方法、(4)EDTAを用いず採血し、5分間煮沸して除蛋白処理する方法、を検討した。甲殻類の代表的アミノ酸神経伝達物質(グルタミン酸とGABA)はどの個体の血液中からも、また、氷麻酔下でも室温条件下でも、安定した値で検出された。氷麻酔下の動物と室温で威嚇姿勢を見せている動物とでGABA濃度、グルタミン酸濃度はともにほぼ同じであった。
良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん病因遺伝子のポジショナルクローニング

1.疾患候補領域の同定すでに私は、BAFMEの疾患遺伝子候補領域を8番染色体長腕8q23.3-q24.11の約8cMの領域に定めている。しかし、8cMという領域は、原因疾患遺伝子の同定をおこなうには、困難な大きさである。そのため、すでに報告されているPCR用マイクロサテライトマーカーの情報に基づき、10ヶ所以上のマーカーについて、疾患家族構成員から採取したゲノムDNAでのPCR解析をおこなった。またその結果に基づき、疾患との連鎖解析を行った。2.疾患候補遺伝子アプローチ疾患候補領域の同定に併行して、領域近傍に存在するてんかんの病因となる可能性のある遺伝子やExpressed Sequenced Tags(ESTs)に対して、候補遺伝子アプローチを行った。今回は、ESTs群の中からカリウムチャネルサブユニットKv8.1に相同性の高いESTs群に着目し、今までヒトデの全配列や遺伝子構造の報告がされていなかった電位依存型カリウムチャネルサブユニットKv8.1のヒトでのcDNA配列を決定した。このcDNA配列は、500個のアミノ酸をコードする1500塩基からなるオープンリーディングフレームで構成されていた。この遺伝子はすでに報告されていたラット、ハムスターのアミノ酸配列と高い相同性を示し、脳で強く発現されていることを確認した。また、1.2kb,3.5kbの2つのイントロンにより3つのエクソンからなる遺伝子構造を明らかにした。この遺伝子について、BAFME患者と健常人の遺伝子で解析を行ったが、病因変異を発見することはできなかった。
知覚神経系と免疫系のクロストーク―免疫細胞に発現する痛み関連分子の役割

免疫細胞と知覚神経系の相互作用を解明するため、重要な侵害受容体であるTRPV1に注目して解析を行った。全身性の炎症および炎症性の腹痛が生じるLPS腹膜炎モデルにおいて、腹部の痛覚過敏は、TRPV1ノックアウトマウスで有意に低下しており、脊髄の免疫染色においても痛みに反応して活性化している神経細胞が少なかった。血清中の炎症性サイトカインにも差はなかったが、TRPV1ノックアウトマウスでは腹膜炎後に脾臓が腫大し、細胞数が増加していた。増加していた細胞は、骨髄系細胞およびCD4T細胞であった。以上から、LPS腹膜炎では痛みの違いが免疫系を制御するということが示された。免疫細胞における知覚神経系の痛み関連分子の役割を解明するため、当初、野生型マウスに放射線照射を行い、野生型マウスまたはTRPV1ノックアウトマウスの骨髄を移植し、骨髄キメラマウスを作製する予定であったが、マウスを大量に必要とし、また予想よりもマウスの繁殖数も少なかったため、まずは、CFA投与による炎症性痛モデルマウスを作成し、野生型マウスとTRPV1ノックアウトマウスでの比較を行うこととした。末梢においてTRPV1は、機械性痛覚には影響を及ぼさないが、炎症性熱性痛覚過敏に関与することが判明しており、免疫細胞の関与も考えられる。そこで、CFA投与による足底の浮腫の評価に加え、免疫組織学的評価の検討を開始した。炎症の局所には熱があり、冷やすことにより炎症は抑制される。また、TRPV1の閾値は通常43度であるが、炎症部位では活性化閾値が低下する可能性がある。よって、免疫細胞の活性化にTRPV1などの温度センサーが関わっている可能性もある。ex vivoにて培養し、野生型マウスとTRPV1ノックアウトマウスのマクロファージおよびT細胞について、培養温度を変化させることにより活性化に程度に変化がみられるかどうかについての検討も開始した。免疫細胞における知覚神経系の痛み関連分子の役割を解明するため、侵害刺激受容体として重要な役割を担っているTRPV1についての解析を行っている。前年度はCFA投与による炎症性痛モデルを作成し、野生型マウスとTRPV1ノックアウトマウスでの比較を開始した。CFAモデルでは、筋肉内、足底、いずれも浸潤細胞を分離すると、細胞数が少なく、解析に必要な細胞数が確保しにくいという問題があった。そのため、今年度はLPS腹膜炎モデルの作成を追加した。それと同時に、TRPV1の炎症細胞における発現変化をreal time PCRで経時的に解析した。その結果、ヒト炎症細胞では、TRPV1は恒常的に発現しているものの、マウスでは、恒常的には発現しておらず、また、刺激による発現上昇も認められなかった。また、マウスから脾臓細胞を採取したのち、LPS刺激をex vivoでおこなった。その結果、分離した脾臓細胞からのTNFa, IL-6, IL-10等のサイトカインおよびiNOSなどの産生に大きな差は生じないことが判明した。このため、マウスを用いた研究では、炎症細胞はTRPV1陽性神経を介してどのように修飾されるのか、について、の解析を進めることとした。CFAモデル、あるいはLPS腹膜炎モデルを作成し、炎症細胞の解析を進めるとともに、in vivoにおいて、炎症部位から、末梢神経・中枢神経への刺激の入力がどのように変化しているのかを検討するため、免疫組織染色を用いた解析も開始した。免疫細胞と知覚神経系の相互作用を解明するため、侵害刺激受容体として重要な役割を担っているTRPV1に注目して解析を行っている。ex vivoでの免疫細胞に対するLPS刺激では、野生型とTRPV1ノックアウトの間にサイトカイン産生に関して大きな差はなかった。マウスを用いたin vivoでのLPSによる腹膜炎モデルを用い、痛みに関する研究と免疫学的解析を同時に行っている。痛みに関する行動解析では、野生型とTRPV1ノックアウトマウスで、痛覚過敏に有意な差が生じていた。また、脊髄の免疫染色の結果から、TRPV1ノックアウトマウスの方が、痛みに反応して活性化している神経細胞が少ないことが分かった。この痛覚過敏が免疫細胞にどのような影響を与えているかの解析をし始めた。TRPV1ノックアウトマウスでは、LPS腹膜炎後に野生型と比較して有意に脾臓が腫大し、細胞数が増加していることが分かった。細胞の種類、数、期間の解析をすすめるために、フローサイトメトリーを用いての解析を進めている。また、LPS腹膜炎の経過中の血清中のサイトカインやストレスホルモンをELISAで測定する準備を進めている。脾臓での神経・免疫連関を解析するために、神経伝達物質の定量化や免疫染色をする準備や条件検討を行っている。マウスの繁殖数を確保しようとしているが、予定通りの数を確保できなかったことや、腹膜炎モデルでの条件検討・免疫染色の条件検討にも予想以上に時間がかかったことから、当初の予定より遅れている。exvivoでの免疫細胞に対するLPS刺激では、野生型マウスとTRPV1ノックアウトマウスの間にサイトカイン産生に関して大きな差はなかった。マウスを用いたin vivoでのLPSによる腹膜炎モデルを用い、痛みに関する研究と免疫学的解析を同時に行った。痛みに関する行動解析では、野生型とTRPV1ノックアウトマウスで痛覚過敏に有意な差が生じていた。

また、脊髄の免疫染色の結果から、TRPV1ノックアウトマウスの方が痛みに反応して活性化している神経細胞が少ないことが分かった。この痛覚過敏が免疫細胞にどのような影響を与えているかについて解析を行った。ELISAによる炎症性サイトカイン測定では、野生型とTRPV1ノックアウトマウスの間に差はなかった。しかし、TRPV1ノックアウトマウスでは、LPS腹膜炎後に野生型と比較して有意に脾臓が腫大し、細胞数が増加していることが分かった。この脾腫は7日目には野生型と同等となった。フローサイトメトリーによる解析では、骨髄系細胞、特に好中球の増加が著しことが分かった。この脾臓での細胞数の違いについて、痛みによるストレスとそれに伴う交感神経の活性化が関与していると考えられたため、薬物的に交感神経脱落を誘導させ、同様の研究を行った。その結果、野生型においても脾腫が生じ、TRPV1ノックアウトマウスの間にあった脾細胞数の差は消失した。以上から、LPS腹膜炎ではTRPV1を介した腹部の痛覚過敏が生じ、この結果交感神経系が活性化され脾臓に免疫抑制が生じていることが明確に示された。免疫細胞と知覚神経系の相互作用を解明するため、重要な侵害受容体であるTRPV1に注目して解析を行った。全身性の炎症および炎症性の腹痛が生じるLPS腹膜炎モデルにおいて、腹部の痛覚過敏は、TRPV1ノックアウトマウスで有意に低下しており、脊髄の免疫染色においても痛みに反応して活性化している神経細胞が少なかった。血清中の炎症性サイトカインにも差はなかったが、TRPV1ノックアウトマウスでは腹膜炎後に脾臓が腫大し、細胞数が増加していた。増加していた細胞は、骨髄系細胞およびCD4T細胞であった。以上から、LPS腹膜炎では痛みの違いが免疫系を制御するということが示された。マウスの繁殖数を確保しようとしているが、予定通りの数を確保できなかったことや、浸潤細胞の分離にフローサイトメトリーを使用しているが、レーザーの細胞毒性が予想より強く解析に使用できなかったことなどから、当初の予定より遅れている。当初よりも進行は遅れているが、フローサイトメトリーを中心とした研究結果が数多く蓄積しはじめた。研究条件と研究方針が絞られてきたことから、今後はELISAやreal time PCR、高速液体クロマトグラフィを用いた実験を中心として進めていく予定であり、これにより実験ペースもあがると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。麻酔科学当初よりも進行は遅れているが、実験条件などは改善されてきている。ベースの実験データが蓄積されてきていること、免疫染色などの手法も開始したことから、実験ペースがあがり、解析手法も広がると考える。骨髄キメラマウスの作製にはマウスを大量に必要とし、また予想よりもマウスの繁殖数も少なかったため、当初の予定を変更せざるを得なかった。免疫組織学的評価の条件検討や培養条件の検討について確定できていない。また、CFA投与による炎症局所の評価も浸潤細胞数が少なく、炎症細胞を採取し評価するのに時間がかかるため、予定よりは遅れていると考えざるを得ない。