hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
質量分析法を用いた心不全の新規診断マーカーの同定

左室補助人工心臓(LVAD)は心不全患者装着され、一部の患者は心機能を回復し離脱するが、多くの患者が心臓移植待ちの状態となる。このLVAD装着により左室心筋の蛋白質にどのような変化が生じているかを網羅的に解析するために、液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて、心筋組織の蛋白質の相対定量を行った。各サンプルあたり1000以上の蛋白質が検出されたが、左室拡張期径や心駆出率の改善値と相関した蛋白質にはミトコンドリア関連蛋白が多くみられた。現在は、LVAD離脱群と心臓移植群との比較検討を進めている。心筋生検は心筋炎や心筋症の診断に必要な侵襲的検査であり,組織学的に炎症細胞浸潤の有無や線維化の程度,心筋細胞肥大や粗鬆化,沈着物の有無などを観察することができる.しかし,心筋生検は心内膜側の極小さな検体に過ぎず,心機能や心予後を予測することは現状困難である.我々は,液体クロマトグラフィー質量分析法を用いたこれまでの研究で,中間径フィラメントなどの心筋由来蛋白の定量解析や翻訳後修飾などについて興味深い結果を得ている.これらの経験を踏まえ,左室補助人工心臓装着前後の心筋組織に対し,液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて解析し,心不全の新規診断マーカーを同定し,臨床診断に応用できるシステム作りを目指すものである.【本研究の具体的な目的】1.心筋組織の蛋白質を液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて,経時的に解析し,心負荷の予後予測因子となりうる蛋白質を同定する.2.蛋白質の同定のみならず,その翻訳後修飾についても検討し,実際の臨床診断に応用できる病理診断システムを確立する.【本研究の流れ】1.移植時心摘出時と補助人工装着時の臨床データの構築,病理組織学的検討2.液体クロマトグラフィー法を用いた蛋白質の網羅的かつ定量的な質量解析3.免疫組織学的検討と質量分析法との比較検討4.日常の病理診断へ応用するためのシステム作り【本研究の実績】上記【本研究の流れ】の1,2.を終え,現在はデータ解析を行っている.既に興味深い蛋白質を多数見出しており,本年は学会発表や論文作製にとりかかっている.心筋組織の蛋白質を経時的に解析し,心負荷の予後予測因子となりうる蛋白質を同定するために,当院で左室補助人工心臓を挿入され,心臓移植を行った症例を28例抽出した.左室補助人工心臓の脱血管挿入部切除の心筋組織(A)と移植摘出心の左室自由壁の心筋組織(B)を回収,質量解析を行い,1000種類以上の蛋白質のB/A比データを入手した.左室補助人工心臓による蛋白質の変化をみるために,臨床データや画像解析を用いた心筋の線維化率との相関を統計鰐的に解析し,細胞外マトリックスに関する蛋白質やミトコンドリアに関する蛋白質で興味深い結果を得た.左室補助人工心臓(LVAD)は心不全患者に装着され、一部の患者は心機能を回復するが、多くの患者が心臓移植待ちの状態となる。このLVAD装着により心筋組織にどのような変化が生じているのかを網羅的に解析するために、LVAD装着時の心尖部切除心筋組織と心臓移植時の左室自由壁の心筋組織を28症例分、回収・前処理を行った。LVAD装着時と移植時、それぞれに重さの異なる同位体ラベルを付加し、液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて蛋白質の増減を分析した。各症例あたり1000以上の蛋白質が検出されたが、左室拡張期径や心駆出率、BNPの改善値などと相関する蛋白質を統計解析し有意な増減を呈する蛋白質を抽出したところミトコンドリアに関連する蛋白質が多く認められた。この後、さらに症例数を増やして再現実験を行うと同時に、左室補助人工装着時の心筋組織由来蛋白質の絶対定量も行い、左室補助人工心臓装着後に心機能が回復した症例群との比較を検討した。これらの結果については、現在は論文作成中であり、まだ、発表できる段階にはない。また本研究の前に行っていた、デスミン心筋症に関するイメージング質量分析法についての論文も発表した。現在は統計解析がほぼ終了し,論文作成中である.今年度は国際学会にも積極的に発表していく予定である.また,今回の研究結果を踏まえて新たな研究計画を立案中である.心臓血管病理、腎病理当該年度に予定していた国際学会への発表が次年度に持ち越されたため,次年度への繰り越し金が生じた.国際学会への発表を2回予定している.
ヒト体細胞遺伝子相同組み換え法による癌関連遺伝子の解析と新規薬剤探索法への応用

ヒト癌細胞(呼吸器・消化器癌等)の網羅的遺伝子・蛋白発現解析、癌関連治療標的分子の同定、およびその遺伝子組み換え細胞の機能解析を通じた抗癌化合物探索系構築の基礎的検討を行い、以下に示す研究成果を得た。1.網羅的な癌関連治療標的分子の同定と機能解析全ヒト遺伝子の90%以上を網羅するcDNAマイクロアレイを用いて、肺癌・食道癌細胞における遺伝子発現プロファイルを解析した。得られた発現情報と臨床病理学的情報を各種数理学的手法で比較した結果、肺癌・食道癌の発症・進展、リンパ節転移、遠隔転移、抗癌剤感受性を規定する癌関連分子群を同定した(雑誌論文9,11,12,14,19)。2.治療標的分子と相互作用する蛋白群の同定と癌発症機構の解明同定した癌関連分子群のRNA干渉法による遺伝子発現阻害実験と組織マイクロアレイ解析による臨床病理学的因子との相関解析により治療標的となる11種類の癌遺伝子を同定し、これらの分子経路を介した肺癌・食道癌の発症・進展に関わる多彩な分子機構を明らかにした(雑誌論文1-4,7,8,10,13,15,16,20)。また独自の新規体細胞遺伝子相同組み換え技術を開発し、各種癌関連遺伝子の癌化における機能を明らかにした(雑誌論文5,6,17,18,21,22)。3.新規薬剤候補化合物探索系の技術基盤の確立と創薬への応用同定した治療標的分子の機能活性阻害を指標にした創薬アッセイ系の基盤技術を確立した(雑誌論文1,3,7,8,13,16)。今後は網羅的発現情報解析により得られた癌の発症・進展機構に関わる癌関連分子の生物学的基盤データとこれまで構築してきた癌発症機構の迅速再現系を融合した新しい解析戦略を用いて、癌悪性化に関わる新規の分子経路の解明とそれを標的とした迅速な創薬展開を念頭に置いた解析を予定している。平成16年度は各種発現ベクターを用いた遺伝子安定発現細胞作製技術および体細胞遺伝子相同組み換え技術等の各種細胞株への適用を念頭においた検討と癌細胞の発生、増殖等にかかわる癌関連分子(標的分子)の探索を重点的に行った。1)癌細胞株(呼吸器・消化器癌中心)を用いた解析:・ヒト癌細胞株の収集、それらの細胞生物学的および遺伝学的backgroundの確認、各株での各種発現ベクターを用いた遺伝子導入条件の検討をおこなった。・各癌細胞株につき公的データベースおよび誌上発表された発現情報解析データの収集、検討を行った。・遺伝子変異解析、cDNAマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイル解析や各種プロテオミクス解析に必要な試料(DNA,RNA,蛋白)の抽出とプローブ作製をおこなった。2)高頻度に癌で異常を示し癌細胞増殖の促進あるいは抑制に関わる、すなわち新規薬剤同定法や治療法開発のためのモデルとなる標的分子の探索:・candidateapproachの一環として、癌抑制遺伝子DEC1およびp300につきその遺伝子発現と細胞表現型(増殖、細胞死、下流シグナルの誘導等)の関係につき検討した。DEC1遺伝子はリポフェクション法による食道癌細胞株への遺伝子導入実験によりその増殖を抑制することを確認した。p300遺伝子は試験的に作製した体細胞遺伝子相同組み換え株(大腸癌細胞株でp300の片アレルを欠損させることによりnull株を作製)において、DNAダメージによりアポトーシスが誘導されることを確認した。この機序の一部としてp300がp53とその下流遺伝子の機能を各種の蛋白修飾や発現制御で調節することを明らかにした。

平成17年度はこれまでの研究結果を踏まえて、癌細胞の発生、増殖等にかかわりヒト癌細胞内で新規薬剤等の治療標的となる癌関連分子(標的分子)の探索を重点的におこなうとともに、あわせて新規薬剤探索法開発のためのモデル実験系の構築に向けた予備検討と各種遺伝子導入、組み換え法を用いた遺伝子安定発現細胞作製技術の各種細胞株への適用を念頭においた検討をおこなった。1.高頻度に癌で機能異常を示し癌細胞増殖の促進等に関わる候補標的分子の探索:(1)候補標的分子の詳細なvalidationに必要な癌および正常臓器サンプル(細胞、組織、体液検体)の収集を継続しておこなった。(2)呼吸器・消化器癌細胞のcDNAマイクロアレイ等による遺伝子発現プロファイル解析および遺伝子変異解析にもとづいた候補標的分子群の抽出を試みた。(3)候補標的分子群の癌および正常臓器サンプルでのRNAの発現上昇・低下の確認をおこなった。(4)複数の候補標的分子について免疫組織染色等によるタンパク発現を検討した。2.新規薬剤・治療法開発のためのモデル実験系の構築に向けた検討:(1)複数の候補標的分子についてRNA干渉法による発現阻害、遺伝子導入実験を各種細胞株で施行し、その細胞増殖への関与を中心に検討した。(2)複数の候補標的分子について細胞内動態のモニタリングをおこなった。(3)候補標的分子機能のin vitro/in vivo再現系構築に必要となる移植細胞株を調査、検討した。平成18年度はこれまでの研究結果を踏まえて、癌細胞の発生・増殖等にかかわる癌関連分子(標的分子)の探索・同定を引き続き行い、これらの解析を通じて得られた複数の候補標的分子の分子経路につき体系的解明を試みた。また新規薬剤同定法や治療法開発に向けたモデルアッセイとなる候補標的分子の機能阻害化合物の探索系構築の可能性を検討した。1.高頻度に癌で機能異常を示し癌細胞増殖に関わる候補標的分子の探索と機能解析:(1)複数の候補標的分子の発現レベル・細胞増殖能の検証(癌・正常組織での発現確認とRNA干渉法による細胞増殖への関与の検討)。(2)各種発現ベクター、遺伝子組み換え技術で作製した候補標的分子の発現/欠損細胞を用いた細胞の形態、生理、生化学的表現型および標的分子の細胞内動態に関する解析。(3)マイクロアレイ法/質量分析法等により候補標的分子の量的変化と連動して発現量、活性レベルの変化する、もしくは標的分子と相互作用する遺伝子・蛋白群の同定。(4)複数の候補標的分子について免疫組織染色によるタンパク発現と癌の臨床病理学的因子との相関の検討。2.新規薬剤・治療法開発のためのモデル実験系の構築に向けた基礎的検討:(1)複数の候補標的分子につき、おもにその細胞増殖能、相互作用分子との結合能、下流遺伝子の発現誘導能を指標とした機能阻害化合物探索系(細胞アッセイ)を検討した。
民事手続における集合的権利保護の仕組み及びその必要性に関する理論的研究

本研究は、いわゆる集合的な権利保護の仕組み、特に金銭請求訴訟について、その理論的な基礎を探るものである。権利の行使が割に合わない事例に対応する手続の不存在は、現代社会において解決されるべき課題の一つである。これについて、近時、日本では、事業者の責任(共通義務)の確認と個別消費者の加入・救済を分ける2段階型の手続が創設されるに至った。画期的な手続ではあるが、第1段階における和解の可否などの点においてなお解明すべき点が存在している。本研究の目標は、日本と同様に先行的な確認訴訟制度を選択したドイツ・フランス法を参照し、上記手続の基礎を捉え直すことによって、より実効的な権利保護手続を示すことにある。
西黒沢期におけるマングローブ沼の分布と古環境

62年度は3年継続の本研究の最終年度に当る.すでに研究成果の一部は裏面に記したものを公表した.今年度は前半はこれまでの研究で残した地域の地質調査をし,そこで得た試料の花粉分析を行った.後半は本研究のとりまとめを行ったが,その成果は別途提出の冊子のごとくである.そこに記述されている研究実績の要点は以下のとおりである.1.西黒沢期とは中新世中期の暖温な気候であった時期と定義していたが,この時期の花粉化石の組成の特徴を日本海側の多くの地域の分析によって明らかにすることができた.2.西黒沢期の上限は,新潟県北部の黒川村のボーリングの試料の分析によっていつむことができた. (絶対年代の決定は今後の課題).他方下限は庄内地方の大山累層の下位にある可能性があり,この周辺の地層を詳細に検討すれば判明するという見通しをつけた.3.西黒沢期の地層のマングローブ化石の北限は今のところ佐渡である.今後より沿岸部の泥質な試料で分析を行えばさらに北方の地層からも見つかる可能性がある.しかし,富山のような良い条件の所は非常に少い.4.富山の黒瀬谷層の下位からはマングローブ植物の花粉が多産するが,とくに栃津川や神通川の流域からはExcoecariaやSonneratiaの花粉が高率に多することをつきとめた.これは当時この付近に,古神通川の河口のデルタをはさんで,その両側の海浜付近にマングーブ沼が形成されていたことを明らかにした.そこには海から陸側にかけてマングローブ林が群落の組成を変えながら成立していたことを具体的に推定された.こうしたマングローブ林の組成は現在のマングローブ林と比較すると少くとも西表島以南のものに対応すると考えられる.これは黒瀬谷層の貝類化石群集の組成とも調和するものである.62年度は3年継続の本研究の最終年度に当る.すでに研究成果の一部は裏面に記したものを公表した.今年度は前半はこれまでの研究で残した地域の地質調査をし,そこで得た試料の花粉分析を行った.後半は本研究のとりまとめを行ったが,その成果は別途提出の冊子のごとくである.そこに記述されている研究実績の要点は以下のとおりである.1.西黒沢期とは中新世中期の暖温な気候であった時期と定義していたが,この時期の花粉化石の組成の特徴を日本海側の多くの地域の分析によって明らかにすることができた.2.西黒沢期の上限は,新潟県北部の黒川村のボーリングの試料の分析によっていつむことができた. (絶対年代の決定は今後の課題).他方下限は庄内地方の大山累層の下位にある可能性があり,この周辺の地層を詳細に検討すれば判明するという見通しをつけた.3.西黒沢期の地層のマングローブ化石の北限は今のところ佐渡である.今後より沿岸部の泥質な試料で分析を行えばさらに北方の地層からも見つかる可能性がある.しかし,富山のような良い条件の所は非常に少い.4.富山の黒瀬谷層の下位からはマングローブ植物の花粉が多産するが,とくに栃津川や神通川の流域からはExcoecariaやSonneratiaの花粉が高率に多することをつきとめた.これは当時この付近に,古神通川の河口のデルタをはさんで,その両側の海浜付近にマングーブ沼が形成されていたことを明らかにした.そこには海から陸側にかけてマングローブ林が群落の組成を変えながら成立していたことを具体的に推定された.こうしたマングローブ林の組成は現在のマングローブ林と比較すると少くとも西表島以南のものに対応すると考えられる.これは黒瀬谷層の貝類化石群集の組成とも調和するものである.61年度は3年継続の本研究責の2年目に当る。60年度は富山県と北海道の西黒沢期(第三紀中新世中期)の地層の調査と試料の採取を行い、61年度はさらに青森県、秋田県、山形県、新潟県、富山県、石川県等の西黒期の層準の試料の採取を行った。これらの試料はすでに空内での処理を終え、一部はすでに検鏡も完了した。これらの結果に次年度の補足的な調査結果を加え、その総括を行うのは62年度末以降になるが、すでに本研究の中心地である富山県の黒瀬谷層の結果については分担者とともにこれまでに得られた成果をとりまとめ公表した。その要点は次のとおりである。1.黒瀬谷層の花粉組成は暖温な古期温を示すものであり、東北日本の新芽三系の花粉層序のうち、NP-2帯(1516Mc)に属するものである。2.黒瀬谷層の下位の層準からはマングローブ植物の花粉が多産するが、とくに栃津川流域や神通川流域の春日からはExcoecartaやSonneratiaの花粉が高率に産出する。3.当時の栃津川流域や春日付近には黒瀬谷期に存在していた古神通川の河口のデルタをはさんで、その両側の海浜付近に位置していたものと考えられる。このような場所はマングローブ沼が形成されるには好適であった。4.黒瀬谷層から産出するマングローブ植物花粉の組成は現在のマングローブ林と比較すると少なくとも西表島次西のものに対応する。これは黒瀬谷層の貝化石群集の組成とも調和するものである。

5.古神通川の河口付近に存在していたであろうマングローブ沼には、そこの海側から陸側にかけて、Sonneratia.Avicennia(砂泥質部)/Rhizoohora(泥質部)→Bruaiera(ときにCeriopus Sevpiphor Nvoaを交える)→Excoecariaと一連の群落がマングローブ林を構成していたものと推定することができる。
学士課程カリキュラムの共通性に関する実証分析

本研究課題が答えようとする学術的「問い」は,現代日本において学士課程カリキュラムの共通性はどの程度あるのか,である.この課題設定の独自性は,学士課程全体を視野に,専門分野を超えたカリキュラム分析を行う点にあり,また創造性は,分析手法の応用によって学士課程カリキュラムの歴史的,国際的な比較研究が可能となる点にある.分析の対象は,専門職養成を目的としない約2,500の学科である.対象学科について,必修の授業科目とその単位数を調査しデータセットを作る.その上で,共通性の指標として卒業要件単位数に占める必修の授業科目の単位数(必修単位率)と,複数学科で共通に見られる類型の授業科目の単位数(類型単位数)を算出する.4年の研究期間を通じて使用するデータセットの基本部分を作成できた.ただし必要な情報の捕捉率は,現時点で85.4%であり,引き続き調査を進めデータセットを充実を図る.今年度の調査で必修単位率が算出できた(必要な情報が入手できた)学位プログラムの割合は85.4%であった.次年度は,分野系統毎の分担者がさらに調査を進め捕捉率を高めるとともに,類型単位率の算出方法についても検討する.いずれの作業についても,9月中に実施する研究会において進捗状況を確認する.年度後半は,分野系統毎に担当者が分析を進め,2020年度内には,各分野について一度は研究発表ができるように研究を推進する.本研究課題が答えようとする学術的「問い」は,現代日本において学士課程カリキュラムの共通性はどの程度あるのか,である.この課題設定の独自性は,学士課程全体を視野に,専門分野を超えたカリキュラム分析を行う点にあり,また創造性は,分析手法の応用によって学士課程カリキュラムの歴史的,国際的な比較研究が可能となる点にある.分析の対象は,専門職養成を目的としない約2,500の学科である.対象学科について,必修の授業科目とその単位数を調査しデータセットを作る.その上で,共通性の指標として卒業要件単位数に占める必修の授業科目の単位数(必修単位率)と,複数学科で共通に見られる類型の授業科目の単位数(類型単位数)を算出する.4年の研究期間を通じて使用するデータセットの基本部分を作成できた.ただし必要な情報の捕捉率は,現時点で85.4%であり,引き続き調査を進めデータセットを充実を図る.今年度の調査で必修単位率が算出できた(必要な情報が入手できた)学位プログラムの割合は85.4%であった.次年度は,分野系統毎の分担者がさらに調査を進め捕捉率を高めるとともに,類型単位率の算出方法についても検討する.いずれの作業についても,9月中に実施する研究会において進捗状況を確認する.年度後半は,分野系統毎に担当者が分析を進め,2020年度内には,各分野について一度は研究発表ができるように研究を推進する.
細胞老化の不可逆性を規定する分子機構の解明

多細胞生物においては、単に、その構成細胞の分裂増殖を促進するだけでなく、発生段階、または状況に御応じて構成細胞の増殖を安定的に停止させることが生命維持にとって必須事項となっている。この安定的な増殖停止の1つとして、細胞老化が知られている。細胞老化は細胞周期の休止期(GO期)に見られるような一時的な増殖停止状態とは異なり、もはやいかなる増殖刺激を与えても細胞分裂を再開できない不可逆的な増殖停止状態である。細胞老化は、古くから癌抑制機構として機能していると考えられてきた。しかし、細胞老化を起こしても、細胞が死滅するわけではないので、老化細胞が生体内に長期間生存し続けることが予想される。このため、この増殖停止の不可逆性が細胞老化が癌抑制機構として働くための必須条件になっていると考えられる。我々は昨年度までに細胞老化の不可逆性を規定するメカニズムの一つとして、DNAダメージ応答によるDNA methyltransferase 1(DNMT1)の分解と、それに伴うヒストン3リジン9のジメチル化(H3K9me2)レベルの低下を見出していた。これらの研究成果を踏まえ、本年度では細胞老化で起こるDNMT1の分解機構の解明と、それによって引き起こされるH3K9me2レベルの低下に関するメカニズムの解明を試み以下の研究結果を得た。1.細胞老化を誘導するDNAダメージはユビキチンリガーゼとして知られるAPC/C-Cdh1を活性化することで、DMTIのポリユビキチン化とそれに伴うプロテアソーム依存的な蛋白質分解を引き起こすことを見出した。2.DNMT1の分解はDNAダメージシグナルを更に増強させることでAPC/C-Cdh1の活性を更に高める。このため、通常は基質になりえないH3K9のメチル化酵素であるG9a及びGLPのポリユビキチン化が起こり、G9a/GLPの蛋白質分解及び、それに伴うH3K9me2レベルの低下が起きることを明らかにした。当初目標としていた、細胞老化に伴うDNMT1の分解を引き起こすユビキチンリガーゼの同定に成功し、細胞老化の不可逆性を規定するエピジェネティックな制御機構の主要メカニズムの一つを明らかにすることが出来たため。今回同定したエピジェネティックな制御機構によって発現が調節される遺伝子群を同定し、細胞老化に伴う不可逆的増殖停止機構の詳細を解明することを目指す。また、今回我々が見出したエピジェネティックな制御機構がどのようにして破綻することで発癌が起こるのかについても解明を試みたいと考えている。我々はこれまでCDKインヒビターであるp16^<INK4a>が活性酸素種(ROS)を介して細胞老化の不可逆性を誘導していることを見出してきた。更に最近、ROSがDNA methyltransferase 1(DNMT1)の分解を促進する可能性を見出した。これらの研究成果を踏まえ、本研究では細胞老化で起こるエピジェネティックな遺伝子発現変化の分子機構とその役割を解明することで細胞老化の不可逆性とその生物学的意義を解明することを目的として研究を行い以下の研究結果を得た。1.細胞老化の誘導にはDNAダメージ応答経路が活性化されることによりDNMT1のユビキチン化が促進され、DMT1がプロテアソーム依存的に蛋白質分解を起こすことが必要である。2.老化細胞ではDNMTIの分解によりDNA及びヒストンのメチル化状態の両方が変化し、細胞周期の進行を阻害する様々な遺伝子の発現が安定的に上昇していることが細胞老化の不可逆を規定している可能性を見出した。

1.細胞老化を誘導するDNAダメージはユビキチンリガーゼとして知られるAPC/C-Cdh1を活性化することで、DMTIのポリユビキチン化とそれに伴うプロテアソーム依存的な蛋白質分解を引き起こすことを見出した。2.DNMT1の分解はDNAダメージシグナルを更に増強させることでAPC/C-Cdh1の活性を更に高める。このため、通常は基質になりえないH3K9のメチル化酵素であるG9a及びGLPのポリユビキチン化が起こり、G9a/GLPの蛋白質分解及び、それに伴うH3K9me2レベルの低下が起きることを明らかにした。当初目標としていた、細胞老化に伴うDNMT1の分解を引き起こすユビキチンリガーゼの同定に成功し、細胞老化の不可逆性を規定するエピジェネティックな制御機構の主要メカニズムの一つを明らかにすることが出来たため。今回同定したエピジェネティックな制御機構によって発現が調節される遺伝子群を同定し、細胞老化に伴う不可逆的増殖停止機構の詳細を解明することを目指す。また、今回我々が見出したエピジェネティックな制御機構がどのようにして破綻することで発癌が起こるのかについても解明を試みたいと考えている。
mRNAの化学合成を可能にするRNAライゲーション反応の開発

本研究ではmRNAなどに代表される長鎖オリゴ核酸の合成を可能にする核酸のケミカルライゲーション(化学的連結)反応の開発を行った。核酸医薬に用いるオリゴ核酸合成には高い分子均一性や非天然構造に対する許容性が求められるため化学合成が最適であるが、現状の固相合成法では合成可能な長さに上限がある。そのため固相合成したオリゴ核酸のフラグメント同士を化学反応で連結する手法が必要である。本研究では天然核酸に類似した連結構造を持つライゲーション体を与える核酸のケミカルライゲーション法の開発を行った。本研究では、メッセンジャーRNA(mRNA)などの長鎖核酸の化学合成を可能にする核酸のライゲーション反応の開発を目標とした。ライゲーション反応の形式として、末端にホスホロチオエート基を持つ核酸鎖を求電子剤で活性化し、生じた求電子種に対してアミノ基末端あるいはチオール基末端を有する核酸鎖を求核攻撃させる形式を設計し、検討を行った。この反応形式で生じる連結構造は、天然のホスホジエステル結合に近いホスホロアミデート結合あるいはホスホロチオレート結合であり、天然体に近い機能を持つことが期待される。アミノ基末端を有する基質の場合、以前の検討からホスホロチオエート基の活性化剤としてDNFB(2,4-ジニトロフルオロベンゼン)が最適な求電子剤であることを見出していた。反応条件を最適化することで、生成物が112塩基長などの長鎖のDNA合成にも適用することが可能であった。また、より実用性に優れた手法としてDNFBで活性化されたDNAを単離せずにライゲーションを進行させる反応条件も見出した。一方チオール基を有する基質では、DNFBでは反応は進行せず最適な活性化剤の探索が必要であった。様々な活性化剤を検討したところ、S-2-pyridyl-2,4,6-trimethyl benzothioateを用いることで、ホスホロチオエート基とのジスルフィド結合で連結されたライゲーション体が良好な収率で得られることを見出した。本反応はチオール基の高い求核性を反映し、短時間で完結する反応であり、細胞内での効率的な反応にも展開が見込まれる。またこれらのライゲーション反応とは別に、予備的な結果ではあるが、核酸鎖の求電子的な活性化のステップを必要としない新規のライゲーション反応系を見出している。複数の種類の核酸の連結反応条件を見出すことができているため。本研究では、長鎖核酸の化学合成を可能にする核酸のケミカルライゲーション反応(化学的連結反応)の開発を目標とした。前年度までにホスホロチオエート末端を持つオリゴ鎖とアミノ基末端を持つオリゴ鎖の連結反応の開発に成功した。本反応ではホスホロチオエート基を活性化剤で処理しホスホロチオエステル基に変換し、それに対しもう一方の核酸鎖のアミノ基が求核攻撃をすることで、ホスホロアミデート結合で連結された核酸鎖を与える。今年度は本ライゲーション反応を利用して、ホタルルシフェラーゼに対するsiRNAをコードするベクターの化学合成を行った。このベクターを構成する6断片の核酸(ホスホロチオエート基とアミノ基を含有)を核酸合成機で合成し連結反応を行った。得られた連結体をデュアルルシフェラーゼアッセイで評価を行ったところ、想定する遺伝子発現抑制効果を観測することが出来た。本結果は、開発したライゲーション反応が生理活性を有する機能性核酸の合成に有用であることを示すものである。今後、連結反応の最適化を行い、より高効率な合成法を開発する予定である。また、上記とは異なる新たな化学的連結反応の開発を行った。この反応はスルホンアミド基を有する核酸鎖とホスホロチオエート基末端を持つ核酸鎖との連結反応で、上記と同様にホスホロアミデート結合で連結された核酸鎖を与える。生成物の構造は上記と同じであるが、核酸鎖の活性化のステップを必要としないこと、およびアミノ基プロトン化による反応性の低下の問題を避けられることなどから、細胞内などの生体環境下での連結反応への応用に適している。反応検討の結果、in vitroにおいて良好な収率で連結体を与える条件を見出すことに成功した。今後は細胞内での連結反応による生理活性核酸の構築などに応用していく予定である。開発したライゲーション反応を基盤としてmRNAやベクターなどの機能性核酸分子の合成と、その機能評価を行う。また新規の反応形式によるライゲーション反応の開発にも取り組み、細胞内での機能性核酸構築を可能にする手法の開発も目指す。核酸化学
沈み込み帯における前弧ウェッジの短縮と海洋地殼の破壊現象

南千島海溝と南海トラフの付加体を調べ、海洋地殼が破壊される深度に相違があることが分かった。それは10ー15kmの深度を境として、それより浅い脆性的変形領域とそれより深い準延性的変形領域に区別された。10ー15kmより浅いところで海洋地殼が破壊される南海型の付加体では、破断面に多数の微小クラックが非定向に集中して破壊されることから余震域の拡大率が大きな値を示す。また、海洋地殼がこのように浅いところで付加体に下付けされると、組み込まれた付加体の密度は比躍的に増加することになり、このことが南海マイクロプレート(前弧スリバー)が九州にむかって沈み込んでおり、豊後水道が形成されている一つの原因となっていると考えた。室戸岬西方の安芸海底谷断層は土佐沈降帯と室戸隆起帯を分ける構造線であることが明らかとなった。これより西側では更新世中期以降の竜王層群が堆積しているが、東側では基盤岩類が北東ー南西の高角逆断層によって変位している。室戸隆起帯の東側の野根海底谷断層から安芸海底谷断層までの35kmの間は一連の構造単位であり、繰り返し発生した歴史地震の境界が室戸隆起帯を形成したのだと考えると、西南日本にみられる波曲構造は地震断層の境界が原因であるとして理解できる。興津隆起帯も土佐湾を分割する地震断層の境界であることが明らかになった。この東の土佐沈降帯にある竜王層群の堆積盆の位置は下位の土佐湾層群のに比べて約10°も反時計回りに移動していた。興津隆起帯の隆起軸も時間変化に伴う移動がみられた。これは、更新世中期後にフィリピン海プレートの沈み込みが、北西へ転移したために南海トラフに対して斜め沈み込み運動をしたことに伴う諸々の変動;南海マイクロプレートの形成、西国山脈の隆起、モラッセ性堆積物の広範な分布、そして土佐湾では竜王層群の新しい堆積盆形成などの一つと考えられる。著者は,南海トラフの沈み込み帯における前孤ウエッジの弾性波速度の分布からウエッジの短縮とか伸張が生じていることを報告した.ところで,ウエッジの短縮がそれを構成している地層の弾性波速度の増加に比例しておりまた短縮の著しい所こそ巨大地震の発生頻度が大きい所と一致することからこれらの現象は震源域の変形に由来するもの考えた.そこで,震源域が区分されている千島海溝と南海トラフのウエッジの速度分布断面に地震断層面を投影したところ,沈み込み海洋プレートの上面の海洋地殻は沈み込みの極めて初期において断層形成により破壊されて,ウエッジの底面に底付けされているいることが明らかとった.また,南千島の海溝付加帯では海洋地殻の破壊され始める深さは14kmと深いのに,南海トラフでは8ー10kmと浅くなっている.このような違いが生じた原因は,ほかにもあるかも知れないがここでは海洋地殻と陸側基盤の相対的強度に系統的な相違があるからであると考えた.このようにウエッジ基底についてはかなり明かとなったので,今回は四国沖の震源域について地震性小断層と段丘層との関係から,主地震断層から派生する高角逆断層モデルによって地表の地殻変動が説明されないか検討した.

足摺岬周辺には海成中位段丘が分布するが,その高度は足摺岬で60^+mあり北端の伊の岬では20^+mとなっている.伊の岬で観察した中位段丘をきる逆断層はN50°E, 60°NWを示し,加藤(1983)が南海道地震の地殻変動を説明するために提唱した伊の岬断層の実在を明らかにした.土佐清水の高位段丘をきるのは正断層でN50°ー80°Eの走行を示した.このことから足摺岬の中位段丘の成因に関しては宝永地震のような大規模な震源域を想定するか,または観察された正断層のような局地的な隆起運動を考慮することになる.本年度は四国沖の地震断層について調査し、そのうち特に海溝に沿って発生する巨大地震の地震断層の東西方向の境界について検討した。室戸岬西方にあって、南北に走る安芸海底谷断層は土佐沈降帯と室戸隆起帯を分ける構造線であることが明かとなった。これより西側では更新世中期以降の竜王層群が厚く堆積しているが、東側では基盤岩類が北東ー南西の高角逆断層によって変位している。室戸隆起帯の東側にも断層があって野根海底谷と呼ばれている。従来、南海道地震の震源域は野根海底谷付近に引かれていたので、室戸隆起帯が地震断層の境界とは誰もが考えなかった。しかし、野根海底谷断層から安芸海底谷断層までの35kmの間は一連の構造単位であり、繰り返し発生した歴史地震の境界が室戸隆起帯を形成したのだと考えると、西南日本にみられる波曲構造は理解できるのである。南海道地震は、たまたまこの境界の東端までに発生したものであると考える。興津隆起帯も土佐湾を分割する地震断層の境界であるとして今回明らかにした成果の一つである。この境界の西には中村沈降帯が、東には土佐沈降帯があって竜王層群が存在しているが、その竜王層群の堆積盆の沈降軸の位置は下位にくる土佐湾層群のそれに比べて約10°も反時計回りに移動していたのである。このことは興津隆起帯の隆起軸についても時間変化に伴う移動が同様に観察されたことから、更新世中期以降にフイリピン海プレートの沈み込み方向が、北から北西へ転移したために南海トラフにたいして斜め沈み込み運動をしたことに伴う諸々の変動;南海マイクロプレートの形成、四国山脈の隆起、モラッセ性堆積物の広範な分布、そして土佐湾では竜王層群の新しい堆積盆の形成の一つとして発現したものと考えている。
自分描画法に関する臨床基礎研究～思春期・青年期への取り組み

筆者は自分描画法(Self-Portrait Method;以下SPMと略す)研究において、子どもから大人へと成長するに従って落書きに変化が生じる点に着目した。本研究において落書きは人の思いを映し出していると仮定し、SPMを落書き行為とみなした。また筆者は思いの深まりの経過を説明する方法として、「思いの理論("OMOI"approach to psychotherapy);小山(2002)」を用いた。本研究結果、落書きには「今の自分のありよう」「今、自分が気になっていること」「心理的背景」「心の中に隠れているもの」の4つの要素が含まれ、これらが関わり合って人の思いが構成されることがわかった。2007年度は大学生40名に対してSPMを実施した。その結果、SPMは性差の影響をほとんど受けないこと、そしてSPMを用いると個人の思いを浮かび上がらせることが可能であることを確認した。2008年度は北海道立高校2校の協力を得て、総計219名にSPMを実施した。その結果、SPMを実施することで緊張緩和の効果が認められた。また「思い」という言葉から想起する色彩は男女とも「透明」と答える人が最も多く、そのあと赤、白、橙と続き、最後に紫と黒をあげる人が多かった。2009年度は中学生183名を対象にSPMを実施した。その結果、SPMを実施することで緊張が緩和されることがわかった。思春期にある人にはSPMは有効に働くことがわかった。「思い」という言葉に最も近い色を尋ねたところ、透明(22%)→白(18%)→赤(17%)→燈(14%)で71%を占めた。いずれも思春期の人が好む色だった。2010年度には、B高校からの依頼で、高校1年生と2年生合わせて総計320名に対してSPMを実施した。本研究目的は、SPMがスクリーニングテストとして活用できるかどうかを見定めることにあった。その結果、SPMはいくつかの留意点を踏まえた上で実施すると、スクリーニングテストとしての効果が見込まれることがわかった。以上、4年間にわたるSPM研究の結果、SPMは心理療法として活用できる可能性が充分にあることがわかった。本研究は自分描画法研究(SPM)の第2段階にあたり、質的分析に照準をあてる。研究目的は(1)思春期・青年期の"今の思い"を本法で把捉可能かどうかの検討、(2)自分描画時の対象者の描画行動をビデオで撮影し描画行動の分析を行い、実施後に行うPDI結果と照合する、(3)自分描画法実施時の教示内容の検討、(4)性格傾向との関連をみるため、バウムテストとK-SCTおよびTAT結果から分析考察する、(5)質的分析を補完するものとして、思いに関する独自の質問用紙への応答内容について統計を用いた量的分析を行う(SPSS16.0使用)、以上5点にある。このほかにも研究実施にあたって必要と思われる研究を追加しながら、自分描画法研究を展開中。研究目的は(1)思春期・青年期の"今の思い

"を本法で把捉可能かの検討、(2)自分描画時の対象者の描画行動をビデオで撮影し描画行動の分析を行い、実施後に行うPDI結果と照合する、(3)自分描画法実施時の教示内容の検討、(4)性格傾向との関連をみるため、バウムテストとK-SCT結果から分析考察する、(5)質的分析を補完するものとして、思いに関する独自の質問用紙への応答内容について統計を用いた量的分析を行う(SPSS15.0使用)、以上5点にある。2つの予備研究後、大学生男女各20名(総計41名)に対して、バウムテスト→思いに関する質問用紙への記入(前半)→自分描画法実施→自分描画法に関する質問用紙への記入→思いに関する独自の質問用紙への記入(後半)→PDI[自分描画の説明→イメージについて→自分描画に「自分の思い」がどの程度現れているかの確認→描画行為に関する実感の度合い→他に気づいたこと→K-SCTを実施。所要時間は約1時間程度であった。20歳の女性が描いた自分描画、「ドライブに出かけたら、迎えを待っている知らない人を見つけた。もうすぐ迎えが来るんだろうなと思ってその人の前を車で走り去った」という自分描画に隠れているものは「うきうきしたもの」。PDIでは「一瞬見ただけなのに、絶対にこの人は迎えを待っていると思う」と述べた。全員が自分描画に何かしらの思いを浮き上がらせた。描画中・後の対話は思いの確認定着のために必要であり、教示内容は小山(2008)で詳細に述べた。KSCTは個性的な自分描画理解を深めるためには有効だとわかった。性差の観点から有意な差異を認めたのは「物語の内容が実際に体験した内容か」の項目のみだった(0.048<0.05)。自分描画法は性差の影響をほとんど受けない。[対象]北海道内の2つの高校[A校(職業科)+B校(普通科)の協力を得て、総計219名(男106名、女113名)が対象となった。[手続き]予備研究と本研究に分かれる。前者はA校男女各2名に対して個別に実施し、質問項目内容の検討や手順の検討、対話による本法実施に関する感想等の聴取を行った。その結果、手順に特に問題はないことがわかった。研究実施にあたっては上質紙1枚(バウムテスト用)、実施前後の思いに関する質問表、描画用両用紙1枚、クレョン等の文具を事前に用意し実施前に個別に配布した。[結果と考察]統計解析にあたってはSPSS16.0およびJUSE:StatMasterを用いた。本研究結果の概要は以下のとおり。1.実施前後に実施したSTAIの状況不安項目の平均値比較結果、性別または全体比較でも、本法実施により、緊張・不安感の軽減がみられた(0.00<0.01 ; t値=3.243)。“慣れ"によるものか、本法実施の効果なのか等に関しては今後慎重に検討を深めたい。2.「思いが絵にどの程度現れたと思うか」と「描画実感」間には、やや弱い相関が認められた(r=0.485)。本結果は、思いが深くても絵に現れにくいこともあるし、逆に思いが浅くても絵になるという可能性を示唆している。3.思いの形容詞によるたとえについてはSDプロフィールより、男女とも「あたたかい、すき、たいせつな、つらい、重い」というイメージを抱いていることがわかった。4.「思い」から想起する色彩は、男(透明→赤→白→燈...紫→黒)と女(白→赤→透明→檀...紫→黒)は類似し、性差は橙の強調が女性に認められる程度であった。
血液培養陰性の血管内感染症に対する細菌遺伝子診断の有用性の検討

血管内感染症が疑われるが、抗菌薬投与後あるいは培養が困難な菌のために血液培養が陰性となる症例が存在する。血液培養陰性の感染症に対する血液PCRを用いた遺伝子診断の有用性について検討した。preliminaryなデータを含め、感染性心内膜炎21例(初回培養陰性6例、培養陽性15例)、培養陰性の感染性動脈瘤・人工血管感染4例を対象とした。培養陰性の感染性心内膜炎6例中5例において血液PCRにて細菌遺伝子を検出した(S.mitis, S.canis, Cardiobacterium sp., Porphyromonas sp.)。血液PCR陰性の1例も術中検体にて細菌遺伝子を検出した(S.salivarius)。この1例を含め手術が施行された5例中4例にて術中組織のPCRが陽性となり血液PCRと同一遺伝子を検出した。培養陰性の感染性動脈瘤・人工血管感染例はいずれも血液PCRが陽性となり、術中検体からも同一遺伝子を検出した(Enterobacter sp., E. cloacae. S. aureus, L. anisa)。血液培養にて起炎菌が確定している感染性心内膜炎15症例(自己弁12例、人工弁3例)を対象に抗菌薬開始3日目以降、血液培養が陰性化した時点で血液PCRを施行し、全例で細菌遺伝子を検出した(S.aureus 6例、CNS 1例、Streptococcus sp.7例、Enterococcus faecalis 1例)。人工弁感染に対する非手術例で血液PCR陽性(血液培養は陰性)が数ヶ月続く症例を認めた。持続的菌血症を特徴とする血管内感染症においては、培養が陰性化した後もしばらくの間、血液PCRにて細菌遺伝子を検出できることができた。細菌の遺伝子診断は薬剤感受性は分からないものの、起炎菌を推定することで、診断・治療に利用できると考えられた。
ダブルイオン注入法による強磁性ナノ微粒子分散型シリカガラスの製造と特性評価

イオン注入を利用して異なる注入イオン同士を選択的に反応できれば、マトリックス中に化合物が分散したニューコンポジットを合成できる。本研究では窒化鉄の磁気的性質を利用して、シリカガラス中にNとFeを連続してイオン注入した場合に、両者が選択的に反応するかどうかを検討した。シリカガラス(Corning 7940-excimer grade)に、室温、4μA・cm^<-2>の条件でイオン注入を行った。NとFeの深さ方向の分布が一致するように、TRIM89によってあらかじめシミュレーションし、N^+とFe^+注入エネマギ-をそれぞれ52keVと160keVに決定した。Fe注入量は6×10^<16>cm^<-2>で一定とし、N注入量を0から1.2×10^<17>cm^<-2>まで変化させた。Nの次にFeを注入した試料はN+Fe、その逆に注入した試料をFe+Nと記述する。強磁性共鳴(FMR)スペクトルの測定の結果、共鳴磁場H_s(θ)は、磁場の方向がイオン注入面の法線方向と水平である(θ=0°)方が垂直である(θ=90°)よりもおおきかった。化学組成N/Feに対してFMR吸収強度および角度依存性から計算した磁化を調べたところ、N/Fe0.2付近で極大を示すことが明らかにされた。このとき、両者の値は試料Fe+Nの方が試料N+Feよりも小さかった。窒化鉄の磁化はN/Fe組成比に依存して変化し、N/Fe0.125で極大を示す。したがって、FMRの結果は注入したNとFeの間に少なからず反応が起こることを示唆する。さらに、^<57>Feを用いて作製した試料の内部転換電子メスバウアー共鳴や上記の注入量を5倍にした試料のX線回折の結果から、この推論が正しいことが裏付けられた。
カプセル化した幹細胞の脳内移植による神経疾患の治療

パーキンソン病への移植療法を念頭に置き、ES細胞をドパミンニューロンに分化誘導してマイクロカプセル内に封入しin vitroで長期間安定してドパミンを産生することを確認した。パーキンソン病モデルラットに対する治療効果を3ケ月間行動学的評価で確認し、免疫組織学的にもドパミンの産生を確認した。カプセル化細胞の腫瘍形成は見られなかった。また、NT2細胞を我々の研究室で用いている中空糸内にカプセル化して脳梗塞モデルラットやパーキンソン病モデルラットに移植したところ、良好な治療効果が認められた。引き続きラット成体由来神経幹・前駆細胞を用いた研究に進み、未分化なままでも、神経系への分化誘導を行った後でも、1型コラーゲンと共にカプセル化すると、腫瘍形成せず生存することを確認した。成体サル脳室下帯・海馬からも神経幹細胞を分離培養した。増殖スピードはラットの細胞より遅く、移植に必要な量まで増幅させるのに1.5ケ月を要した。カプセル化には1型コラーゲンを要し、1ケ月間の生存率はラットを用いた研究と比較して遜色なかった。分化誘導を行わずにカプセル化を行うと、ニューロンへの分化を示すものはごく少数であり、グリア細胞への分化を示すものが多数であった。ドパミンニューロンへの分化を図った後にカプセル化した細胞からはドパミンの分泌がHPLCにより確認された。パーキンソン病モデルサルを作成し、亜急性期にカプセル化未分化サル神経幹・前駆細胞を移植すると、1ケ月間細胞は生存したが、有意な行動学的改善を示さなかった。それに対して、ドパミンニューロンに分化したカプセル化神経前駆細胞を移植すると、パーキンソン病モデルサルは行動学的改善を示した。パーキンソン病に対して、ドパミンニューロンに分化誘導したカプセル化細胞は治療効果を有し、腫瘍化という大きなハードルを越えることができるため、臨床応用が現実となる可能性を有すると思われる。まず最初に、ES細胞をカプセル化することをめざした。そのままのES細胞は増殖性が高いために簡単にカプセルが破壊してしまうので、ドパミンニューロンへの分化誘導法を用いて分化させたのちにカプセル化を行った。そのとき、現在当施設で使用している透析に利用される中空糸ではなく、アガロースを用いた球状の約500μmのマイクロカプセルを用いた。このカプセル内の細胞が、in vitroで約1ヶ月間持続的に壊れることなく、ドパミンやL-ドパを産生していることを確かめた。カプセル化ES細胞由来ドパミン細胞をパーキンソン病モデルラットの線条体内に移植した。行動学的評価として、アポモルフィン誘発回転運動を行い、コントロールカプセル群と比べて有意に行動学的改善を認めた。この効果は約1ヶ月間持続した。その後に取り出した脳から組織学的にドパミンが産生されていることを確認した。また、カプセルが壊れたり、脳内に腫瘍を形成することはなかった。現在、長期的効果を検討中である。次にES細胞を従来当施設で使用している透析に利用される中空糸にカプセル化することを検討した。細胞をそのままカプセル内に充填しても足場が十分でないためにカプセル内の細胞は長期間生存することができない。そこで、細胞外基質であるコラーゲン1型やラミニンを一緒にカプセル内に充填することにより細胞は生存することができた。現在は1ヶ月までは細胞が生存することを確認した。神経幹・前駆細胞や骨髄細胞などを用いて、カプセル化細胞の作製を検討中である。

従来当施設で使用している透析に利用される中空糸に、神経幹・前駆細胞株であるNT2細胞を細胞外基質であるコラーゲン1型と同時に封入し、カプセル化した。細胞はカプセル内で1ヶ月生存し、さまざまな神経栄養因子を産生していた。このカプセル化細胞を脳虚血モデルラットの線条体内に移植し、神経保護効果を検討した。移植後1週間にて屠殺しカプセルを取り出すとNT2細胞は生存していた。また、脳虚血巣の減少を示し、カプセル化神経幹・前駆細胞は脳虚血に対して神経保護効果があることを示した。この要因としてカプセル化細胞から産生される神経栄養因子のカクテルによる効果と考えられる。次に、前年の研究の続きであるカプセル化ES細胞の長期的効果の研究では、パーキンソン病モデルラットに対してカプセル化ES細胞移植を行い、3ヶ月間の効果を検討した。ES細胞由来ドパミン細胞はアガロースを用いた球状の約500μmのマイクロカプセルに封入した。カプセル化ES細胞移植は、アポモルフィン誘発回転運動をコントロールカプセル群と比べて有意に行動学的改善を認めた。この効果は約3ヶ月間持続した。次に初代培養された成体由来神経幹・前駆細胞を中空糸にカプセル化することができるかどうか検討した。細胞外基質であるコラーゲン1型と成体由来神経幹・前駆細胞を同時にカプセル内に封入することにより、その細胞は約1ヶ月間カプセル内に生存することができた。1カプセル内の細胞は増殖を示すことはなかったが、ニューロンヘの分化はわずかであった。ほとんどはグリアヘの分化を示し、今後分化誘導法を検討中である。パーキンソン病への移植療法を念頭に置き、ES細胞をドパミンニューロンに分化誘導してマイクロカプセル内に封入しin vitroで長期間安定してドパミンを産生することを確認した。パーキンソン病モデルラットに対する治療効果を3ヶ月間行動学的評価で確認し、免疫組織学的にもドパミンの産生を確認した。カプセル化細胞の腫瘍形成は見られなかった。また、NT2細胞を我々の研究室で用いている中空糸内にカプセル化して脳梗塞モデルラットやパーキンソン病モデルラットに移植したところ、良好な治療効果が認められた。引き続きラット成体由来神経幹・前駆細胞を用いた研究に進み、未分化なままでも、神経系への分化誘導を行った後でも、1型コラーゲンと共にカプセル化すると、腫瘍形成せず生存することを確認した。成体サル脳室下帯・海馬からも神経幹細胞を分離培養した。増殖スピードはラットの細胞より遅く、移植に必要な量まで増幅させるのに1.5ヶ月を要した。カプセル化には1型コラーゲンを要し、1ヶ月間の生存率はラットを用いた研究と比較して遜色なかった。分化誘導を行わずにカプセル化を行うと、ニューロンへの分化を示すものはごく少数であり、グリア細胞への分化を示すものが多数であった。ドパミンニューロンへの分化を図った後にカプセル化した細胞からはドパミンの分泌がHPLCにより確認された。パーキンソン病モデルサルを作成し、亜急性期にカプセル化未分化サル神経幹・前駆細胞を移植すると、1ヶ月間細胞は生存したが、有意な行動学的改善を示さなかった。それに対して、ドパミンニューロンに分化したカプセル化神経前駆細胞を移植すると、パーキンソン病モデルサルは行動学的改善を示した。
ニューロンの生死の制御機構に関する分子細胞生物学的研究

多量のNOは神経細胞死を引き起こすことが知られているが、その機序については不明な点が多い。いくつかの標的蛋白質が同定されており、その中でグリセロール-3ーリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)が知られている。本酵素は解糖系に存在し、エネルギー産生に関して重要な役割を担っている。近年、これ以外にもRNA結合活性や蛋白質合成にも関与していることが明らかにされている。そこで、NOによるニューロン死におけるGAPDHの関与について、NG108-15細胞を用いて検討し、以下の知見を得た。NOドナーであるSodium nitroprusside (SNP)はNG108-15細胞を死に至らしめるが、乳酸デヒドロゲナーゼ漏出、DNA断片化やクロマチン凝縮などがみられたことから、この細胞死はアポトーシス様であることが示唆された。このとき、SNPはGAPDH活性を濃度依存的に抑制していることを確認した。つぎに、GAPDHの特異的阻害薬であるkoningic acid (KA)をNG108-15細胞に処理すると、SNPと同様にGAPDH活性の抑制とともに細胞死が引き起こされた。この細胞死にもDNA断片化やクロマチン凝縮がみられたことから、アポトーシス様であることが示唆された。以上の結果より、NG108-15細胞においてNOはアポトーシス様の細胞死を惹起するが、この作用機構の一部にGAPDHが関与していることが示唆された。GAPDHはアルツハイマー病への関与が示唆されているamyloid precursor protein (APP)に結合する可能性が報告されており、エネルギー産生系ばかりでなく他の活性も細胞の生存あるいは死にとって重要であることが推定された。
Ras蛋白質によるターゲット活性化のメカニズム

Rasは互いに一次構造上相同性の見られない多くの因子と相互作用し,活性化する.そこで,それらのターゲット認識・活性化機構の間にどのような共通性や特異性があるのかを明らかにすることをめざした.Raf-1のRas-bindingドメイン(RBD)およびCys-richドメイン(CRD)を含む領域(以下,RBD-CRDと略す)については,大腸菌で大量発現を行い,結晶化を行った.その結果,小さいながらも結晶が得られた.また,脂質修飾を受けたRasについてもSf9細胞より調製し,結晶が得られている.RBD-CRDとGMPPNP結合型ファルネシル化Rasとの共結晶については,未だ結晶は得られていない.今後もひきつづき,検討を行っていきたい.全長のRaf-1については,大腸菌内において,GroELなどのシャペロンと共発現を行い,得られたものとHsp90/50と混合する,といった操作を行ってみたが,安定なタンパク質を得ることに成功していない.さらに,Hsp90/50や14-3-3を共存させた状態で大腸菌抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を用いた調製を試していきたい.また,Raf-1のRBDに特異的に結合するRNAアプタマーをin vitroセレクション法により人工的に単離した.そしてこのRNAアプタマーがGST-Raf-1 RBDとRasとの結合を阻害し,その一方,Rasの標的タンパク質であるRGLのRBDとRasとの結合に関しては阻害しないことを確認した.このアプタマーを用いてRaf-1活性化におけるRasの役割をさらに厳密に明らかにしていきたい.また,Rasのシグナル伝達経路の下流に位置する因子であるPOB1(partner of RalBP1)のEH(Eps15 homology)ドメインの水溶液中の立体構造についてNMR法により決定した.Rasは互いに一次構造上相同性の見られない多くの因子と相互作用し,活性化する.そこで,それらのターゲット認識・活性化機構の間にどのような共通性や特異性があるのかを明らかにすることをめざした.Raf-1のRas-bindingドメイン(RBD)およびCys-richドメイン(CRD)を含む領域(以下,RBD-CRDと略す)については,大腸菌で大量発現を行い,結晶化を行った.その結果,小さいながらも結晶が得られた.また,脂質修飾を受けたRasについてもSf9細胞より調製し,結晶が得られている.RBD-CRDとGMPPNP結合型ファルネシル化Rasとの共結晶については,未だ結晶は得られていない.今後もひきつづき,検討を行っていきたい.全長のRaf-1については,大腸菌内において,GroELなどのシャペロンと共発現を行い,得られたものとHsp90/50と混合する,といった操作を行ってみたが,安定なタンパク質を得ることに成功していない.さらに,Hsp90/50や14-3-3を共存させた状態で大腸菌抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を用いた調製を試していきたい.また,Raf-1のRBDに特異的に結合するRNAアプタマーをin vitroセレクション法により人工的に単離した.そしてこのRNAアプタマーがGST-Raf-1 RBDとRasとの結合を阻害し,その一方,Rasの標的タンパク質であるRGLのRBDとRasとの結合に関しては阻害しないことを確認した.このアプタマーを用いてRaf-1活性化におけるRasの役割をさらに厳密に明らかにしていきたい.また,Rasのシグナル伝達経路の下流に位置する因子であるPOB1(partner of RalBP1)のEH(Eps15 homology)ドメインの水溶液中の立体構造についてNMR法により決定した.