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びまん性大細胞型B細胞リンパ腫におけるJAK-STAT経路活性化の意義

びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)におけるSTAT3活性化状態および臨床病理学的所見との具体的な関連性を解析した。pSTAT3は279例中122例(44%)に陽性を示した。pSTAT3発現はnon-GCB型、MYD88L265P変異例、EBV陽性例、STAT3変異例において有意に高頻度に認められたが、L265P以外のMYD88変異例はpSTAT3発現に関連性を認めなかった。STAT3変異を有する症例は予後良好、EBV感染例は有意に予後不良であった(P=0.01)。以上のようにDLBCLにおけるJSAK-STAT経路活性化の多様性およびその臨床的意義を解明することができた。DLBCL検体の収集に関しては研究協力施設の倫理審査委員会の承認を得て逐次開始しており、すでに100症例近くを収集した。また、変異解析について、MYD88、SOCS1、STAT3、STAT6に関しては直接シークエンス法の条件を、細胞株より抽出された良質なDNAを用いて決定した。本実験に使用される検体の多くはホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)標本であり、これらの標本においてどれくらいの割合の症例が解析可能かを検討することが2年目の課題になる。免疫染色については、STAT3、リン酸化STAT3に関しては実験条件が決定し、やはりFFPEを中心とした実際の標本での解析に取り掛かる段階である。機能解析に必要な各種細胞株については他研究機関からの受け入れがほぼ終了し、10種の株について申請者のラボで管理している。これらの株は多様なJAK-STAT経路関連遺伝子の異常を示すが、それぞれにおけるJAK-STAT経路活性化の状態をウェスタンブロット法を用いて解析できる状態にしている。JAK-STATの各阻害剤、遺伝子導入に伴う細胞環境の変化について解析していくことが2年目の課題である。臨床情報についても収集を開始しており、上記遺伝子異常や蛋白発現、JAL-STAT活性化状態と臨床病理学的所見との関連性を解析していく予定である。上記のように、実験の条件と材料が揃いつつあり、おおむね順調と考える。DLBCL検体の収集に関しては研究協力施設の倫理審査委員会の承認はほぼ終了し、すでに100症例以上を収集した。また、変異解析について、MYD88、SOCS1、STAT3、STAT6に関して、FFPEサンプルを用いて直接シークエンス法および次世代シークエンス法で解析する系を立ち上げ、すでに50例以上で解析が進んでいる。免疫染色については、STAT3、STAT5、STAT6および各リン酸化物質に関して、100例のFFPEサンプルで解析を行った。機能解析に関しては、JAK-STAT経路にさまざまな異常を有する10種の細胞株について、それぞれにおけるJAK-STAT経路活性化の状態およびJAK-STAT阻害剤導入後の変化を解析している。臨床情報についても約140例でデータ蓄積がなされている。29年度は上記遺伝子異常や蛋白発現、JAL-STAT活性化状態と臨床病理学的所見との関連性の解析を行う。STAT3の変異頻度が予想よりも低かったため、解析に耐えうる規模にするため、さらなる追加症例の収集と解析を行う予定である。上記のように、実験の系は確立され、おおむね順調と考える。ただし、変異頻度が予想よりも低かったために、さらなる検体の収集が必要となった。2003年から2017年において新規に診断されたDLBCL症例のFFPE検体および臨床情報を収集した。HE染色において生検組織中に腫瘍細胞が50%以上含まれる298症例を抽出し、リン酸化STAT3(pSTAT3)を含む免疫染色およびEBER in situ hybridizationを行った。本年度において、予定していたゲノム解析は全て終了し、全298症例中、GCB型148例、non-GCB型131例の合計279例における遺伝子変異を調べることができた。このうち、臨床情報も確認出来た症例は262例であった。pSTAT3は122例(43.7%)に陽性を示した。pSTAT3発現はnon-GCB型に有意に多く認められた(P<0.001)。MYD88 L265P変異はnon-GCB型に多く(P<0.001)、これらはpSTAT3発現を示した(P<0.001)。一方で、L265P以外のMYD88変異例はGCB型に多く(10/14; 71.4%)、pSTAT3発現に関連性を認めなかった(P=0.96)。STAT3変異を有する症例は15例(5.4%)あり、これらはpSTAT3発現と有意に相関した(P=0.02)。EBER陽性例はpSTAT3発現を示しやすかった(P<0.001)。一方、SOCS1のナンセンスあるいはフレームシフト変異は23例(8.2%)存在し、興味深いことにこれらはpSTAT3発現を示しにくい傾向にあった(P=0.08)。GCB型とnon-GCB型間(P=0.24)や、pSTAT3発現の有無による予後の差は認めなかった(P=0.80)。STAT

3変異を有する症例は予後が良い傾向を示した(P=0.09)のに対して、EBV感染例は有意に予後不良であった(P=0.01)。In vitro実験においてMYD88 L265P変異を有する細胞株はpSTAT3発現が陽性でJAK阻害剤に有効だったが、SOCS1変異株はpSTAT3を発現しておらず、JAK阻害剤に対して抵抗性を示した。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)におけるSTAT3活性化状態および臨床病理学的所見との具体的な関連性を解析した。pSTAT3は279例中122例(44%)に陽性を示した。pSTAT3発現はnon-GCB型、MYD88L265P変異例、EBV陽性例、STAT3変異例において有意に高頻度に認められたが、L265P以外のMYD88変異例はpSTAT3発現に関連性を認めなかった。STAT3変異を有する症例は予後良好、EBV感染例は有意に予後不良であった(P=0.01)。以上のようにDLBCLにおけるJSAK-STAT経路活性化の多様性およびその臨床的意義を解明することができた。実績の概要でも述べたように、(1)実際の検体のFFPE標本を用いた変異解析および免疫染色の開始、(2)各種細胞株を用いた機能実験、(3)臨床情報の収集と解析、を柱にして研究を引き続き進めていく。実績の概要でも述べたように、(1)検体のさらなる収集、(2)遺伝子異常、蛋白発現と臨床病理学的所見との関連性の解析を柱にして研究を引き続き進めていく。血液病理学
連続光方式近赤外分光法における脳酸素動態の生理的多型性を考慮した標準化指標の確立

本研究で、認知課題遂行中の、脳内酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、および総ヘモグロビン濃度について、絶対値計測が可能な時間分解近赤外分光法によって得られたデータを詳細に検討した結果、連続光方式近赤外分光法を用いた計測において、脳酸素動態数値計算モデルを構築すること、および標準化指標を見いだすことは極めて妥当であると考えられた。従って、数値計算モデル構築のための、安定的標準化指標としては、連続光方式近赤外分光法に基づいて我々が提唱する酸素化ヘモグロビン濃度と脱酸素化ヘモグロビン濃度の各変化分の比が有用であることが確立できたと考えられた。本研究では、ヒトの高次脳機能を生理的多型性の面から解明するための基礎を築くために、多チャンネル化が容易な連続光方式近赤外分光法を用いた脳酸素動態計測において、チャンネル間、実験間および被験者間の比較を可能とする標準化指標を見出すことを目的としている。このため、本年度においては、まず、連続光方式との比較のために、脳酸素動態の絶対値計測が可能な時間分解分光法を用いて18名の非喫煙者を対象として、認知課題遂行中の脳内酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、および総ヘモグロビン濃度変化を計測した。その結果、酸素化ヘモグロビン濃度および脱酸素化ヘモグロビン濃度の増減における個体差は、連続光方式を用いた我々の先行研究で得られた結果と全く同様に観察されることが確認された。この結果、連続光方式近赤外分光法を用いた計測において、脳酸素動態数値計算モデルを構築すること、および標準化指標を見いだすことの妥当性を確立できたと考えられた。次いで、数値計算モデルの構築のために、低濃度酸素吸入実験における脳内酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、および総ヘモグロビン濃度変化のデータに基づいて、安定的指標を見いだそうと試みた。この結果、安定的指標としては、酸素化ヘモグロビン濃度を脱酸素化ヘモグロビン濃度で除した変数が有用であることが示唆された。また、脳酸素動態の解析において、高次脳機能の賦活化および高精度解析が必要となる。このため、我々が開発・使用してきた認知課題(Stroop色-語課題)反応提示・計測システムを大幅に改良することを試みた。その結果、反応時間計測の精度を一桁向上させ1ミリ秒とすることができ、高次脳機能を高精度で解析する手段を開発することができた。本研究は、ヒトの高次脳機能を生理的多型性の面から解明するための基礎を築くために、多チャンネル化が容易な連続光方式近赤外分光法を用いた脳酸素動態計測において、チャンネル間、実験間および被験者間の比較を可能とする標準化指標を見出すことを目的とした。本年度においては、18名の非喫煙者を対象とした認知課題遂行中の、脳内酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、および総ヘモグロビン濃度について、絶対値計測が可能な時間分解分光法によって得られたデータを詳細に検討した。その結果、酸素化ヘモグロビン濃度および脱酸素化ヘモグロビン濃度について、安静閉眼値は、標準偏差/平均値が0.11程度であることから、個体差は小さいといえることがわかり、また、再現性が非常に高いこともわかった。一方で、課題遂行中の増減については、例えば酸素化ヘモグロビン濃度については、約-2.7μM約+4.0μMと、個体差が非常に大きいことが明らかとなった。これらの知見は、連続光方式を用いた我々の先行研究で得られた結果と矛盾しないことがわかり、連続光方式を用いて得られた結果から導かれる結論には妥当性があるという考えを支持する重要な資料となった。更に、これらの結果から、連続光方式近赤外分光法を用いた計測において、脳酸素動態数値計算モデルを構築すること、および標準化指標を見いだすことは極めて妥当であると考えられた。従って、数値計算モデルの構築のための、安定的指標としては、我々が提唱した酸素化ヘモグロビン濃度を脱酸素化ヘモグロビン濃度で除した変数が有用であることが確立できたと考えられた。
アークプラズマCVD法によるタンタル超微粉末の新製造プロセスの開発

現在、Ta粉末はNa還元法によって製造されているが、粉末は凝集し易く、微粉末化されず、高密度化しがたいと言われている。そこで、新たなタンタル粉末製造プロセスを構築する必要がある。平成11年度にCVD法により次ぎの反応によって高純度のTa微粉末を生成したが、(TaCl_5(g)+(5/2)H_2(g)=Ta(s)+5HCl(g))この反応によるTa粉末合成では、気相一気相反応であるため、反応率が悪く、研究が進行し難かった。そこで、平成12年度からは、新しいTa粉末製造プロセスとして、五酸化タンタルを原料とし、金属Mgを還元剤に用いた次式の反応により、(Ta_2O_5(s)+(5Mg(g)=2Ta(s)+5MgO(s))によって、比表面積の大きい高純度のTa粉末製造法について研究を行った。平成12年度は、温度依存性、時間依存性について調査した結果、高温ほど反応はし易いが、粉末の細孔が低下し、粉末特性の向上には低温還元が必要であることが判明した。そこで、本年度は650°C、700°C、750°Cの低温で還元実験を行い、合成Ta粉末の温度依存性を調べ、SEM観察、粒度分布、比表面積、化学分析などの特性評価を行った。650°Cの還元では還元反応が充分に進行せす、700°C以上で還元する必要が分かった。またSEM観察および粒度分布測定によれば、粒子直径1μm5μm程度のTa粉末が合成されていることが判明した。化学分析の結果によれば、従来のNa還元によるTa粉末と同程度の純度のものが製造可能であった。今後は、タンタル微粉末の大量製造プロセスの開発を行う予定である。タンタルの陽極酸化皮膜は極めて安定であり、また、その高い比誘電率等により電解コンデンサーの好適な特殊金属として使用されている。タンタル粉末を焼結したタンタル焼結コンデンサーの容量は陽極素子の表面積に比例するため、高容量のコンデンサーには比表面積の大きい粉末が必要である。タンタル粉末はNa還元法によって製造されているが、粉末は凝集しており、微粉末化されず、また高密度化しがたいと言われている。一方、CVD法によると(1)の反応によって高純度のTa微粉末を生成することは可能である。TaCl_5(g) + (5/2)H_2(g)=Ta(s)+5HCl(g)(1)本研究では、アークプラズマとCVD法とを組み合わせ、(1)式の反応による直径1μm以下の粒径のタンタル粉末の製造を指向し、これを原料とする高容量コンデンサー素子の開発を目的とした。本年度はCVD装置の試作、試作した装置の基礎実験およびタンタル粉末の合成実験を行った。その結果、原料である塩化タンタルの昇華には350400°Cの温度を必要とし、還元剤であるH_2ガスは最低でも500ml/min以上必要であることが分かった。また、SiC、Si、Niの各基板を使用して(1)式によるCVD実験を行った結果、還元温度800°Cの場合に少量のタンタル粉末の合成に成功した。今後は基板の種類を替え、タンタル微粉末の大量製造プロセスの開発を行う予定である。Ta粉末を焼結したタンタル焼結コンデンサー容量は陽極素子の表面積に比例するため、比表面積の大きい粉末が必要である。

現在、Ta粉末はK_2Ta_5F_7(l)+Na(g)=Ta(s)+2KF(l)+5NaF(l)の化学反応によるNa還元法により製造されているが、粉末は凝集しており、また高密度化しがたいと言われている。そこで、新しいプロセスによる高純度のTa微粉末製造法の構築を企画した。本年度はMg熱還元装置の試作し、タンタル粉末の合成実験を行った。その結果、原料である酸化タンタルのMg還元反応は800°Cの温度で進行し、90°C以上ではほぼ完全にタンタル粉末の製造が可能であった。そこで、合成Ta粉末の温度依存性、触媒添加依存性について、SEM観察、粒度分布、比表面積などの粒子特性の評価を行った結果、低い温度で還元したTa粒子および触媒添加のTa粒子内に多く細孔が存在することが分かった。また、SEM観察および粒度分布測定の結果、粒径1μm5μm程度のTa粉末が合成されていることが判明した。合成Ta粉末の比表面積は2m^2/g3m^2/gであった。この比表面積の値は従来のNa還元によって製造されるTa粉末の比表面積1.3m^2/gよりも2倍程度大きかった。今後、本法により合成したTa粉末を用いてコンデンサー素子を作成し、その特性を評価する予定である。現在、Ta粉末はNa還元法によって製造されているが、粉末は凝集し易く、微粉末化されず、高密度化しがたいと言われている。そこで、新たなタンタル粉末製造プロセスを構築する必要がある。平成11年度にCVD法により次ぎの反応によって高純度のTa微粉末を生成したが、(TaCl_5(g)+(5/2)H_2(g)=Ta(s)+5HCl(g))この反応によるTa粉末合成では、気相ー気相反応であるため、反応率が悪く、研究が進行し難かった。そこで、平成12年度からは、新しいTa粉末製造プロセスとして、五酸化タンタルを原料とし、金属Mgを還元剤に用いた次式の反応により、(Ta_2O_5(s)+(5Mg(g)=2Ta(s)+5MgO(s))によって、比表面積の大きい高純度のTa粉末製造法について研究を行った。平成12年度は、温度依存性、時間依存性について調査した結果、高温ほど反応はし易いが、粉末の細孔が低下し、粉末特性の向上には低温還元が必要であることが判明した。そこで、本年度は650°C、700°C、750°Cの低温で還元実験を行い、合成Ta粉末の温度依存性を調べ、SEM観察、粒度分布、比表面積、化学分析などの特性評価を行った。650°Cの還元では還元反応が充分に進行せず、700°C以上で還元する必要が分かった。またSEM観察および粒度分布測定によれば、粒子直径1μm5μm程度のTa粉末が合成されていることが判明した。化学分析の結果によれば、従来のNa還元によるTa粉末と同程度の純度のものが製造可能であった。今後は、タンタル微粉末の大量製造プロセスの開発を行う予定である。
腺様嚢胞癌の神経周囲浸潤における膜貫通型MMP(MT‐MMPs)の役割

腺様嚢胞癌の臨床的特徴である神経周囲浸潤は耳下腺癌において顔面神経の温存を左右する重要な因子であり、神経合併切除を余儀無くされた患者において整容面で大きな問題を生じることになる。神経周囲浸潤を規定すう因子が特定できれば、その阻害剤の開発などの将来の新しい治療につながる可能性がある。一方膜貫通型MMP(MT-MMPs)は癌細胞膜周囲のマトリックス分解に関与することから神経周囲浸潤等の癌細胞周囲の微少環境のリモデリングに関与することが予想される。唾液腺癌において粘表皮癌に比べ腺様嚢胞癌ではTIMP-2の過剰産生によりMT1-MMPによるMMP-2の活性化が抑制されていた(平成13-l4年度科研費J Pathol 202: 403-411,2004)。平成l6年度から継続して唾液腺癌の組織ホモジネートからRNAを抽出し、RT-PCRによりMT-MMPs(MT1,2,3,4,5-MMP)について検討した。これらのうち腺様嚢胞癌で高発現であったのはMT3-MMPだけでその他のMT-MMPsに差をみとめなかった。唾液腺癌組織ホモジネートに対して抗MT3-MMP抗体によるイムノブロッテイングを行なったところ腺様嚢胞癌においてはコントロールの非癌部唾液腺や粘表皮癌に比べ高発現であった。抗MT3-MMP抗体による免疫組織化学法を行なったところ、MT3-MMPの局在は腺様嚢胞癌細胞に認めるものの神経周囲に特異的に観察されるものではなく腫瘍周辺部でび漫性に観察された。本研究では脳神経組織に高発現すると報告されているMT3-MMPがRNAレベルでも蛋白レベルでも腺様嚢胞癌に高発現していたものの、神経周囲浸潤に対する機能的重要性については示されなかった。今後症例数を増やして、腺様嚢胞癌におけるMT3-MMPの機能を他の臨床病理学的因子と検討していく予定である。唾液腺癌では、粘表皮癌において組織学的悪性度や頸部リンパ節転移にMTI-MMPによるMMP-2の活性化が相関するが、腺様嚢胞癌と腺癌ではMTI-MMPの産生量は粘表皮癌と同レベルだがTIMP-2の高発現によってMMP-2の活性化が抑制きれた特殊な癌であることを明らかにしてきた(平成13年度、14年度科研費Kayano, Shimada et al. J Pathol 202:403-411,2004)。腺様嚢胞癌は遠隔転移や神経周囲浸潤、遅い増殖などの特徴的な臨床像を持つ。特に腺様嚢胞癌の神経周囲浸潤は摘出手術時に顔面神経の温存の可否を大きく左右する因子である。特に膜貫通MMP(MT-MMPs)は癌細胞膜上あるいは細胞膜周囲の細胞外マトリックスの分解を通して腺様嚢胞癌細胞の神経周囲浸潤の関与していることが予想される。本年度は組織破砕によるホモジネートからtotal RNAを抽出し、RT-PCR法によりMT1,2,3-MMPについて検討したところ、MT3-MMPが腺様嚢胞癌において粘表皮癌より有意に高率に検出されたが、MT1,2-MMPの検出率は腺様嚢胞癌と粘表皮癌で差がなかった。また特異的抗体を用いた免疫組織化学法では、神経周囲にMT3-MMPの局在を認めるものの、MT1,2-MMPとの明確な差は現在のところ観察されていない。今後は脳での発現が報告されているMT5-MMPに付いても検討していく必要性が有ると思われる。
新たな血管収縮薬投与法の確立を目指した心肺停止状態におけるRAA系動態の解明

日本蘇生協議会による心肺蘇生ガイドライン2015では、心肺停止(CPA)症例に投与する血管収縮薬として標準用量のエピネフリン投与が提案されているが、その有益性に関しては未だcontroversialで、CPA症例におけるカテコラミン血中濃度とその予後に関しても不明である。そこで、CPA症例における病院到着時の血中カテコラミン濃度と病院搬送後の自己心拍再開(ROSC)との関連について臨床的に検討した。本研究は前向き観察研究で、実施にあたり本院倫理委員会から承諾を得た。2014年7月2017年7月までに当院救急外来へ搬送されたCPA症例に対し病院到着直後に採血し血中カテコラミン(エピネフリン:Ep、ノルアドレナリン:NEp、ドーパミン:DOA)を測定した。このうち、Ep投与前に採血可能であった102例から末期悪性腫瘍3症例を除いた99例に関して、ROSCの有無で2群に分け、来院時の血中カテコラミン濃度に関して比較検討した{結果はMedian (Q1, Q3)で表記}。結果として、ROSC(+)群:36例、ROSC(-)群:63例であった。来院時、Ep投与前の血中EpおよびNEp濃度は、ROSC(-)群に比較してROSC(+)群で有意に低値であった{Ep;ROSC(+)群:0.59 (0.12, 2.35) pg/ml、ROSC(-)群:2.28 (0.65, 7.28) pg/ml、p=0.017、NEp;ROSC(+)群:1.06 (0.23, 2.18) pg/ml、ROSC(-)群:1.68 (0.77, 4.80) pg/ml、p=0.045}。これに対し、DOAは2群間で有意差はなかった。【結語】CPA症例において、Ep投与による血中カテコラミン濃度上昇はROSC獲得と関連しない可能性がある。心肺停止症例に投与する血管収縮薬として、現状では標準用量のエピネフリン投与が提案されているが、我々の研究結果では、心肺停止症例に対し、蘇生中のエピネフリン投与によるエピネフリン血中濃度上昇は自己心拍再開に結びつかない可能性が示唆された。これまで心肺蘇生におけるエピネフリンの有効性に疑問を呈する報告は散見されるが、本研究の如くカテコラミン血中濃度からの観点でエピネフリンの有効性を検討した報告はほとんど見られず、有益な研究結果が得られたと考えている。当初の目的である心肺蘇生における新たな血管収縮薬の探索のための研究を行う。搬送された心肺停止症例に対し来院直後に血液採取を行い、カテコラミン(エピネフリン、ノルアドレナリン、ドーパミン)、バゾプレシンおよびレニン、アルドステロン、アンギオテンシンIIの測定を行い、それらの心肺蘇生中の血中動態とそれぞれの関連を検討する。また、その結果を踏まえ、動物実験を行い、新たな血管収縮物質投与の確立を目指す。

これまで心肺蘇生におけるエピネフリンの有効性に疑問を呈する報告は散見されるが、本研究の如くカテコラミン血中濃度からの観点でエピネフリンの有効性を検討した報告はほとんど見られず、有益な研究結果が得られたと考えている。当初の目的である心肺蘇生における新たな血管収縮薬の探索のための研究を行う。搬送された心肺停止症例に対し来院直後に血液採取を行い、カテコラミン(エピネフリン、ノルアドレナリン、ドーパミン)、バゾプレシンおよびレニン、アルドステロン、アンギオテンシンIIの測定を行い、それらの心肺蘇生中の血中動態とそれぞれの関連を検討する。また、その結果を踏まえ、動物実験を行い、新たな血管収縮物質投与の確立を目指す。研究の進行が順調であり予定額よりも低値で研究遂行が可能であった。検体測定や得られた結果の更なる発表等を行うことで、研究費使用を推進していく所存である。
がん治療用・陽子線回転ガントリーの基礎研究

陽子線によるがん治療はめざましい成果を挙げ近年欧米でがん治療の専用施設の建設が進んでいる。そこでは陽子線の線量分布の良さを最大限に生かすために回転ガントリーが導入され或いは検討されている。本研究は我が国における来たるべきがん治療専用の陽子線照射施設に設置すべき陽子線回転ガントリーについて検討したものである。ここでは今までの研究成果を検討し、深部臓器がんが主な対象になる我が国におけるがん治療施設に組み込むのに適した回転ガントリーを設計し提案した。回転ガントリーに組み込む照射野形成法として2重リング第2散乱体を用いた2重散乱体法により短い距離で従来の方法より効率良く平坦な照射野を得る手法を見い出し理論的にも実験的にもその有用性を実証した。この方式によりガントリーの大きさを小さくするとともに時間的に安定な照射野を得ることができる。米国ではコークスクリュー型のアイソセントリックガントリーを採用しているがここでは現場での患者の位置決めが可能で治療方向の柔軟性を確保し将来のConformal Radiotherapyに発展ができるように治療台周辺のスペースを大きくとれる標準型のアイソセントリック回転ガントリーを設計した。また新しい照射野形成法として8重極、12重極磁場を使ったビーム光学的照射野形成法についても検討した。この方法は散乱体を使わないため照射野の側方の切れが良くビームの利用効率も高い。この手法を回転ガントリーに組み込む際の問題点を検討し6重極磁場補正が必要なことを示し、1次元方向はビーム光学的に平坦化し他方向は高速スキャニングで照射野を得る方法を提案した。さらに将来的には究極の照射野形成法とも言えるスキャニング法による3次元照射野形成法の技術的問題点についても検討を加えた。
ペプチド性神経伝達物質の遊離機構ならびに遊離制御システムの解明

サブスタンスP(SP)は、侵害情報を伝達するペプチド性神経伝達物質であり、末梢の疼痛刺激により、一次知覚神経終末部から遊離される。本研究では、SPの遊離機構解明の目的で一次知覚神経に着目し、成熟ラットから脊髄後根神経節(DRG)初代培養細胞を作成し、次の知見を得た。1.作成した培養DRG細胞の性質を観察した。1)培養DRG細胞はニューロトロフィン非存在下でも生存可能であったが、細胞中のSP含量およびSP前駆体プレプロタキキニンmRNA量は神経成長因子に依存的であった。2)培養DRG細胞中のSPは、高濃度カリウムあるいはカプサイシンによって、カルシウム依存的に遊離した。従ってこの培養DRG細胞は生理的ベプチド遊離を観察できる標本であると考えられた。2.炎症時に起こる痛覚過敏を考慮し、インターロイキン-1β(IL-1β)の作用を検討した。1) IL-1βは、培養DRG細胞からSPの遊離を誘発し、その後転写の促進によりSP生合成量を増加した。IL-1βによるSP遊離は、カルシウム依存的であり、IL-1受容体を介した作用であった。2) IL-1βの効果はシクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤で抑制され、また、IL-1βによりCOX-2mRNAが増加した。従ってIL-1βによるSP遊離はCOX-2を介した作用であることがわかった。3.以上得られた結果は、IL-1βによる痛覚過敏のメカニズムの一部を説明しうる直接的作用と考えられ、現在投稿中である。今後、IL-1βを薬理学的ツールとし、関連すると思われるプロスタグランジン類の作用メカニズムの解明および痛覚伝達機構との関連へと発展させていく。サブスタンスP(SP)は、侵害情報を伝達するペプチド性神経伝達物質であり、末梢の疼痛刺激により、脊髄後角において一次知覚神経終末部から放出される。伝達物質の遊離はその神経の出力を示すものである。従って、SP遊離機構を解明することは一次知覚神経の活動度を調節する機構を解明するものであり、痛覚伝達を制御しうる機構を見い出すものである。本研究では、SPの遊離機構解明の目的で、一次知覚神経に着目し脊髄後根神経節(DRG)細胞の初代培養を行った。成熟ラットからDRGを単離し、酵素処理することにより分散させ、初代培養細胞を作成することに成功した。インターロイキン-1β(IL-1β)は炎症に関わるサイトカインである。炎症時に痛覚過敏が起こることから、培養DRG細胞SPに及ぼすIL-1βの影響について検討した。その結果、培養DRG細胞SP量はIL-1β処置1日後に減少し、7日間処置により増加した。培養DRG細胞からRNAを抽出しSP前駆体(PPT)mRNA解析を行った結果、IL-1β7日間処置によりPPTmRNAの有意な増加が観察された。IL-1βの培養DRG細胞内SP量増加はIL-1受容体アンタゴニストで抑制された。IL-1β1日処置によるSP量減少についてSPの遊離を推測し、培養液中のSP量を測定した。IL-1β処置細胞の培養液中には対照に比較してより高濃度のSPが存在していた。従ってIL-1βは、培養DRG細胞からSPの遊離を誘発し、その後転写の促進によるSP生合成量増加を引き起こすことがわかった。これはIL-1受容体を介した作用であることが示唆され、IL-1βによる痛覚過敏のメカニズムの一部を説明しうる作用と考えられる。

本研究ではペプチドの遊離機構を解明する目的で、侵害情報を伝達するペプチド性神経伝達物質であり、末梢の疼痛刺激により一次知覚神経終末部から遊離されるサブスタンスP(SP)と一次知覚神経に着目した。脊髄後根神経節(DRG)には一次知覚神経の細胞体が存在する。成熟ラットからDRGを単離し初代培養細胞を作成し、SP生合成について培養DRG細胞の性質をすでに観察した。平成10年度には、SP遊離に対するインターロイキン-1β(IL-1β)の作用を観察し、以下の知見を得た。1.炎症にかかわるサイトカインであるIL-1βは、培養DRG細胞に添加すると、3時間でSPの遊離を誘発し、その後数日でSP前駆体(プレプロタキキニン、PPT)mRNA転写促進によりSP生合成量を増加した。IL-1βによるSP遊離は、EGTA添加により抑制され、IL-1受容体アンタゴニスト添加により抑制されたことから、カルシウム依存的であり、IL-1受容体を介した作用であることがわかった。2. IL-1βの効果はシクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤(アスピリン、インドメタシン)で抑制された。COXには2つのアイソフォームがある(COX-1、COX-2)。IL-1βの効果は、COX-2選択的阻害剤であるNS-398で完全に抑制され、また、IL-1βによりCOX-2mRNAが増加した。従ってIL-1βによるSP遊離はCOX-2を介した作用であることがわかった。3.以上得られた結果は、IL-1βによる痛覚過敏のメカニズムの一部を説明しうる直接的作用と考えられ、現在投稿中である。今後、IL-1βのSP遊離作用に関連するプロスタグランジン類の作用および痛覚伝達調節機構との関連を解明する予定である。
ブラジル北東部の“干魃多角形地帯"における住民 の生業活動と地域生態系への影響

ブラジル北東部の内陸部は、熱帯乾燥・半乾燥の干魃常習地域である。ブラジル政府は、ここに“干魃多角形地帯"を設定し重点的に干魃対策を実施している。本研究は、この“干魃多角形地帯"における住民の生業活動の特質をあきらかにし、それらが砂漠化する本地域の生態系にいかなる影響を及ぼしているのかを考察した。その結果、以下の諸点が明らかとなった。1.ブラジル北東部では、史料的制約の多い1617世紀にも8年、18世紀には30年、19世紀には18年、20世紀(1983年まで)には18年の計74年に及ぶ干魃年が記録されており、このうち約20年は北東部全域を襲う大干魃であったことがブラジル内務省のデータより明らかとなった。また、1936年に画定された干魃多角形地帯は、1946年・1951年・1965年の法令とともに漸次その面積を拡大し、1983年現在その面積は936,993Km^2にも及んでいる。2.本地域で多発する干魃の背後には、大土地所有制下での住民の粗放的かつ収奪的な経済活動や生活様式の変化に起因するカ-チンガ植生への人為的ストレスの増大とその多様化といった原因がある。現地住民の生業活動がカ-チンガ植生に及ぼす人為的インパクトは、カ-チンガ資源の利用と破壊(改良牧野の造成や鉱山開発による掘削)に大別される。カ-チンガ資源の利用は、さらに植物資源と動物資源の利用に細分できるが、とりわけ植物資源の過度な利用が砂漠化と密接な関わりをもっている。本地域では、家畜の飼料源・牧柵資材・燃料源・薬用樹木・建築材・植物繊維・食糧源などとしてカ-チンガ植生が日常的に利用されているが、特に牧柵や燃料源(レンガやパンを焼くための薪の採集や木炭生産)としての樹木伐採が植生に過度なストレスを与えており、干魃を誘発する重大な要因となっていることが解明された。
ヘム-核酸複合体の創製と機能制御

四重鎖DNAのG-カルテットの平面性とその大きさは、ヘムのポルフィリン環の認識に適している。G-カルテットを形成する4つのグアニンのπ電子系は、ヘムのポルフィリン環のπ電子系とπ-πスタッキングして、安定な複合体を形成することが期待されるからである。さらに、アデニンやグアニンのプリン環のN7窒素原子は金属との反応性が高いことから、ヘムのポルフィリン環の中心金属と配位結合を形成することも期待できる。私共は、ヘムとG-カルテットをもつ四重鎖DNAから安定なヘム-核酸複合体が生成することを明らかにしている。ヘムと塩基配列TTAGGGにより形成される平行型四重鎖DNAから、結合定数10^6M^<-1>で1:1のヘム-核酸複合体が生成することを見いだした。各種分光学的手法によるヘム-核酸複合体の構造解析から、ヘムはDNA塩基対にスタッキングしていること、ヘム鉄の軸配位子としてDNA塩基が結合していること、複合体を形成してもDNAの立体構造にはほとんど影響を受けないことなどを明らかにした。溶液NMRにより複合体の立体構造解析を進めているが、ヘム鉄の常磁性がNMRスペクトルに与える影響が予想以上に大きく、ヘム近傍の構造解析の分解能を向上させるためには更なる工夫が必要である。そこで、私共は、ヘムのモデルとして、ポルフィリン環のメソ位にN-メチルピリジンをもつポルフィリン誘導体と平行型四重鎖DNAとの複合体の立体構造をNMRにより決定した。その結果、ポルフィリン環は予想通りG-カルテットにスタッキングしていることが示された。したがって、ヘム-核酸複合体中のヘムも同様な様式で平行型四重鎖DNAに結合していると考えられる。このように、本研究では、四重鎖DNAを利用してヘム-核酸複合体を創製するための有用な知見を得ることができた。ヘムを補欠分子族としてもつタンパク質であるヘムタンパク質が生体系において遍在するのに対して、タンパク質同様に重要な生体高分子であるDNA、RNAなど核酸にヘムが組込まれた`ヘム核酸'と呼ぶべき複合体は生体系ではまだ発見されていない。最近、私共はヘムと平行四重鎖DNAとの錯形成反応によりヘム核酸が生成することを発見した。驚くべきことに、生成したヘム核酸の各種分光スペクトルは、ヘムタンパク質での対応するスペクトルに酷似していた。これらの知見に基づいて、本研究では、核酸が形成する各種高次構造とヘムの複合体形成反応における分子認識の解明、ヘム核酸の熱力学的安定性の解析、およびヘム核酸の機能制御を行い、ヘム核酸の化学を開拓する。ヘムのポルフィリン環とG-カルテットのπ-πスタッキングがヘム核酸形成における特異性と安定性に大きな寄与を果たすことを複合体のNMRによる詳細な立体構造解析により実証した。ポルフィリン環は四重鎖DNAで形成されるG-カルテットとπ-πスタッキングによる相互作用に都合の良い平面性とサイズをもっていることから、この結果はあらかじめ予想されたことである。そこで、四重鎖DNAにもう一つのヘム結合部位を分子設計して追加した結果、四重鎖DNA1分子に対してヘム2分子が結合する1:2複合体が生成することを初めて見いだした。さらに、イミダゾール誘導体などヘム鉄に対して中程度の配位子場をもつ外部配位子との結合反応の解析から、親和性は配位子の塩基性、立体障害などにより著しい影響を受けることを見いだした。今後は、ヘム核酸におけるヘム周囲の核酸塩基の立体配置を工夫して、ヘム鉄の反応性の調節を試みる予定である。
ヌクレオチド結合部位の動的構造の解析

1)UDPGピロホスホリラーゼ:ジャガイモ酵素について、硫酸アンモニウムを用いる微量透析法により良好な結晶を得ることができ、重原子誘導体結晶で2.72.8A分解能まで回折強度データを集めた。得られた電子密度図から主鎖構造をトレースした結果、本酵素は3つのドメインからなることが明らかになった。現在、活性部位を含む詳細な分子モデルを作成中である。また、ウシ肝臓と大腸菌から本酵素をコードするDNAをクローニングして、ヌクレオチド配列を決定すると共に、それら酵素の発現系を作成して組換え酵素を精製することに成功した。2)アデニル酸キナーゼ:本酵素はリン酸基受容体であるAMPに対して非常に高い特異性をもつ。本年度では、基質特異性の異なるUMP、CMPキナーゼをコードするcDNAをクローニングして、そのヌクレオチド配列を決定することにより、アデニル酸キナーゼとの構造比較を行った。その結果から、アデニル酸キナーゼにおいてAMP結合に与るアミノ酸残基を推定し、それらの残基についてランダム変異による機能解析を行った。さらに、これら残基に部位特異的変異導入を行うことにより、AMPに対する活性を低下させながらUMP、CMPに対する活性を上げることに成功した。3)グリコーゲン合成酵素:哺乳動物、高等植物、細菌を起源とする本酵素には、糖ヌクレオチド結合領域に存在するLys-X-Gly-Glyというコンセンサス配列が保存されている。本年度では、この配列の機能的役割を明らかにするために、大腸菌酵素の配列中に含まれるLysとGlyに変異導入を行い、得られた変異酵素について反応速度論的解析を行った。その結果、このLysは基質ADP-グルコースとのイオン結合に関与していることが明らかになった。さらに、このLysに近い方のGlyを他のアミノ酸に置換すると、触媒活性が1/1000以下に低下することが明らかになった。
CDDP併用放射線療法による膀胱癌の治療効果とマイクロサテライト領域の関連

インフォームドコンセントして承諾を得ている膀胱癌症例を対象とした。治療前に膀胱癌標本を採取してからCDDP併用放射線療法を施行した。1)治療の終了した45例の膀胱癌組織(治療前のパラフィン標本)と患者末梢血のそれぞれからDNAを抽出した。3)膀胱癌DNAと同一患者末梢血DNAを用いて,2-4個のマーカーを1セットとして,multiplex-PCRを行った。得られたPCR productにsize standardを混ぜて4%ポリアクリアルアミドゲル電気泳動を施行した(蛍光DNA sequencer ABI377を使用)。4)各マーカーごとに膀胱癌DNAと患者末梢血DNAの2つのalleleのピーク領域(GeneScan)を計算した。癌DNAの減少した側のalleleのピーク領域が,末梢血DNAの同側alleleのピーク領域に比較して,50%以下となるマーカーを共通欠失領域(lossof heterozygosity;LOH)とした。5)現在35膀胱癌症例について検討中である。D9S259 locusではLOHが7例中6例に認められた。D9S942 locusではLOHが12例中5例に認められた。まだ実験中であるが,15マーカーのうち,12マーカーにおいて1症例以上でLOHが観察された。今後さらにLOH解析を続けて,各マイクロサテライト領域でのLOHの発現とCDDP併用放射線療法の治療効果との相関を検討する予定である。
体内埋込み型医療機器用電源のための非酵素型燃料電池の開発

今年度は、はじめに生理条件下でグルコースを酸化することが可能な高活性ニトロキシルラジカル触媒の獲得のため、ニトロキシルラジカル触媒のスクリーニングを行った。すなわち、立体的要因と電子的要因の両観点から最適構造を同定した。その際、立体的要因を検証するために嵩高さを微調整した種々のビシクロ、トリシクロ骨格を有する触媒を合成した。嵩高さを軽減すると触媒骨格の歪みが増すために触媒が不安定になり、最もバランスの良い高活性の触媒を同定した。また、電子的要因として、分子骨格上に電子求引基を導入した触媒を種々合成した。ここで電子求引性基の導入により活性種であるオキソアンモニウムの求電子性が増すために活性が向上したが、同時に酸化電位が高電位側にシフトし好ましくなかったため、最もバランスの良い触媒を同定した。以上の結果から、ノルトロピン型ニトロキシルラジカルが生理条件下で最もグルコースを酸化するのに最もバランスの良いニトロキシルラジカル触媒であることが分かった。次に、燃料電池として広く普及するためには触媒の電極上への固相化が必須であることから、ニトロキシルラジカル触媒のスクリーニングにより得られた最もバランスの良いニトロキシルラジカル触媒の電極への固定化を行った。その際、触媒の活性(反応速度)のみならず、その安定性が鍵となることから、ニトロキシルラジカル触媒のスクリーニングにより得られた知見をもとに、電解重合法、SAM法、交互累積膜法において修飾電極を作製し評価したところ、ピロール置換ノルトロピン型ニトロキシルラジカルを電解共重合することにより、ニトロキシルラジカル触媒を安定かつ効率的に電極上に固定化することができた。さらに、このニトロキシルラジカル触媒修飾電極を用いて、生理条件下でグルコースの電解触媒酸化反応を効率的に行えることを明らかにした。本研究は2年間の研究課題で、(1)生理条件下でグルコースを酸化することが可能なニトロキシルラジカル化合物の創製、(2)ニトロキシル化合物の効率的な電極上への固定化法の開発、(3)ニトロキシル化合物修飾電極を用いた体内埋込み型医療機器用燃料電池の開発から構成されている。1年目に(1)および(2)に関する研究成果を順調にあげることができた。すなわち、ニトロキシルラジカル触媒のスクリーニングにより最もバランスの良いニトロキシルラジカル触媒としてノルトロピン型ニトロキシルラジカルを見つけ出し、ピロール置換ノルトロピン型ニトロキシルラジカルを電解共重合することにより、ニトロキシルラジカル触媒を安定かつ効率的に電極上に固定化することができ、生理条件下でグルコースの電解触媒酸化反応を効率的に行えることを明らかにすることが出来たからである。2年目は本研究課題の根幹をなす(3)ニトロキシル化合物修飾電極を用いた体内埋込み型医療機器用燃料電池の開発を達成する必要がある。燃料電池は酸化反応が起こる負極側と還元反応が起こる正極側から成り立っており、最もバランスの良いニトロキシルラジカル触媒としてノルトロピン型ニトロキシルラジカルを創製し、さらにピロール置換ノルトロピン型ニトロキシルラジカルを電解共重合することにより、ニトロキシルラジカル触媒を安定かつ効率的に電極上に固定化することが出来たことから負極側の作製は終了した。よって、今後の研究は正極の条件検討が中心となる。すなわち、正極では溶液中の溶存酸素の水への還元反応を効率的に進行させることが可能な反応条件を詳細に検討を行う。また、ニトロキシルラジカルはグルコースなどの糖以外にもアルコール類、アミン類の酸化反応も進行することから、これらの基質存在下での電解触媒酸化反応による燃料電池の可能性についても合わせて検討を行う。

本研究は2年間の研究課題で、(1)生理条件下でグルコースを酸化することが可能なニトロキシルラジカル化合物の創製、(2)ニトロキシル化合物の効率的な電極上への固定化法の開発、(3)ニトロキシル化合物修飾電極を用いた体内埋込み型医療機器用燃料電池の開発から構成されている。1年目に(1)および(2)に関する研究成果を順調にあげることができた。すなわち、ニトロキシルラジカル触媒のスクリーニングにより最もバランスの良いニトロキシルラジカル触媒としてノルトロピン型ニトロキシルラジカルを見つけ出し、ピロール置換ノルトロピン型ニトロキシルラジカルを電解共重合することにより、ニトロキシルラジカル触媒を安定かつ効率的に電極上に固定化することができ、生理条件下でグルコースの電解触媒酸化反応を効率的に行えることを明らかにすることが出来たからである。2年目は本研究課題の根幹をなす(3)ニトロキシル化合物修飾電極を用いた体内埋込み型医療機器用燃料電池の開発を達成する必要がある。燃料電池は酸化反応が起こる負極側と還元反応が起こる正極側から成り立っており、最もバランスの良いニトロキシルラジカル触媒としてノルトロピン型ニトロキシルラジカルを創製し、さらにピロール置換ノルトロピン型ニトロキシルラジカルを電解共重合することにより、ニトロキシルラジカル触媒を安定かつ効率的に電極上に固定化することが出来たことから負極側の作製は終了した。よって、今後の研究は正極の条件検討が中心となる。すなわち、正極では溶液中の溶存酸素の水への還元反応を効率的に進行させることが可能な反応条件を詳細に検討を行う。また、ニトロキシルラジカルはグルコースなどの糖以外にもアルコール類、アミン類の酸化反応も進行することから、これらの基質存在下での電解触媒酸化反応による燃料電池の可能性についても合わせて検討を行う。当初購入予定だった電極作製用のCO2レーザープラーを業者に依頼しデモンストレーションを行ったところ、体内埋込み型医療機器用電源のための燃料電池用微小電極を作製するのには十分な性能を有していないことが判明した。そこで自家製の電極作製用のCO2レーザープラーを作製するための備品、消耗品購入等に費用を当てたために、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、自家製の電極作製用のCO2レーザープラーの性能向上のための消耗品が必要なため、翌年度分消耗品費(130万円)に次年度使用額(約40万円)を加えて翌年度消耗品費を170万円として使用する計画である。
自動車排ガス浄化およびVOC燃焼における酸化物担持貴金属触媒の活性とナノ構造制御

自動車などから排出される一酸化炭素は人体に有害であるため、固体触媒により完全酸化除去されることが望ましい。本研究課題では、強い相互作用により特異な触媒性能を示す白金-酸化スズ系触媒に着目し、酸素貯蔵能(OSC)を有するセリア上に担持することで新たな環境浄化触媒を開発することを目的とした。触媒担体として600C焼成済みのCeO2 (参照触媒, JRC-CEO-3)を使用し、含浸法によりPt-Sn/CeO2触媒を調製した。400度で水素還元処理を行ったPt-Sn/CeO2触媒を用いてCO酸化活性試験を行った結果、Snの含有量が増加するにつれて触媒性能が低下した。触媒の表面状態を調査した結果、Snの含有量が増加するとPtナノ粒子の分散性が低下することや、水素還元処理による金属間化合物の生成が示唆され、CO酸化活性をより低温で達成するには、金属状態のPtナノ粒子を高分散状態で維持することが重要であると考えられる。次に前処理条件の影響を調べるために、100度, 200度, 400度で水素還元処理を行ったPt-Sn/CeO2触媒を用いてCO酸化活性試験を行った結果、未処理の触媒と比較して活性が向上することが分かった。特に100度や200度で還元処理を施したときに高い活性を示した。また、各試料のCO吸着量をCOパルス法により測定した結果、100度や200度で還元した触媒は400度で還元した場合よりも大きなCO吸着量を示した。したがって、400度で還元処理を行うと、COの吸着サイトが減少するため、低温で還元したときよりも活性が低いことが明らかになった。以上のように、PtとSnの含有量や前処理条件などを変化させることで触媒性能を制御できることが明らかになった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
腋芽の休眠・成長に関わるプラスチドの機能獲得に関する研究

頂芽切除前後のエンドウの茎からプラスチドを調製し、両プラスチドに含まれるタンパク質で量が変動するものを、iTRAQ法を用いた質量分析比較プロテオーム解析により検索した。2,000以上のペプチドについて増減を解析した結果、ほとんどのタンパク質は頂芽切除前後で2倍程度の増減しかしていなかった。頂芽切除後3倍以上増加するペプチドは15本、また1/3以下に減少するものは6本見いだされた。これらの中には、Cu-Zn-superoxide dismutaseがあり、茎が切り取られたことによる傷害によって誘導された可能性が考えられる。また、いくつかのタンパク質はある画分に核が混入したことにより増減が変化したように見えたものもあった。同様に緑化の進んだ茎から調製した画分からは、RuBisCOが増減するタンパク質として検出されることもあり、試料調製の重要性が再確認された。検出できたトリプシン消化ペプチドは2,000以上であるが、想定されるペプチド数から考えると10-20%程度と思われる。これらのペプチドを解析した結果、増減が検出できたものは比較的量の多いものしか検出できていないように思われた。これまでの解析から、当初予想していた以上に頂芽切除前後の茎プラスチドで変動のあるタンパク質が検出できていない。問題は、本当に変動のあるタンパク質が少ないのか、あるいは変動のあるタンパク質はあるが、存在量が少なくて検出できていないのか、この点を明らかにする必要がある。本来、ポジティブコントロールとなるべきIPTタンパク質の変動を、MS解析でモニターできるようにすることが、必須である。実験系を確認する意味で、オーキシン処理したDR5 promoter : : GUSシロイヌナズナのGUSタンパク質の増加をiTRAQ法で検出すると、ウエスタンブロット法の検出感度よりもやや劣る程度の感度であった。頂芽切除前後のエンドウの茎からプラスチドを調製し、両プラスチドに含まれるタンパク質で量が変動するものを、質量分析法を用いた比較プロテオーム解析により検索した。昨年度の反省に立ち、今年度は比較プロテオーム解析の手法としてiTRAQ法を用いて、頂芽切除0,6,12,24時間後の茎から調製したプラスチドを解析対象とした。各タンパク質画分をトリプシンでペプチドに消化後、0,6,12,24時間後の画分をそれぞれiTRAQ 114,115,116,117の修飾試薬で標識した。その後、これらを一つにまとめ、pHを3以下に調整後、Mini Sカラムで6つの画分に分画した。続いてこれらの画分を逆相クロマトグラフィーによって60の画分に分画した。これら360画分をMALDI-plateにスポットして質量分析計4700を用いてMS解析、引き続きMS/MS解析を行った。結果として約2,000のペプチドについて増減を解析した。ほとんどのタンパク質は頂芽切除前後で2倍程度の増減しかしていなかった。これらのペプチドをMS/MSスペクトルから配列を推測し検索した結果、そのうちの一つはCu-Zn-superoxide dismutaseであり、茎が切り取られたことによる傷害によって誘導されたと思われた。
菌根の拡大・生長の光学的手法による高精度計測とそれによる大気汚染影響評価

本研究においては、研究代表者らが独自に開発した超高密度非接触変位計測法である「統計干渉法」による植物のナノメータレベルの動きの計測を行い、同時にすでに従来技術であるデジタル画像相関法の応用として、植物の動きの3次元解析を新たに提案した。統計干渉法による実験では、これまで誰も見たことがない新規な現象として「ナノメータゆらぎ」を発見した。さらに、この現象が環境負荷に対して敏感に応答するという新しい知見を得た。以下にこれらの成果を要約する。1)植物の茎および根が成長過程で回線運動をすることは古くから知られているが、本研究においては、デジタル画像相関法により、3次元的な運動をサブミリメータレベルの精度で定量解析した。2)植物の成長を「統計干渉法」によって秒レベルのサンプリング間隔でナノメータレベルの分解能で計測したところ、健康な植物においては、不規則な伸縮を繰り返す「ナノメータゆらぎ」現象が新規に確認された。3)植物の大気環境ストレス応答実験として、オゾンシロイヌナズナへのオゾン暴露実験をおこなったところ、ナノメータゆらぎが短時間に減衰し、注意報レベルのオゾン濃度で十分敏感に反応することが確認された。4)アカマツの根のナノメータレベルの動きは、菌根との共生に大きく依存することが、統計干渉法による計測の結果から確認された。以上、統計干渉法によって観察される「植物のナノメータゆらぎ」は、植物学の分野にこれまでにない全く新しい計測手段を提供し、また環境センシングという意味においても、新しい指標となる可能性を秘めており、新しい研究分野の萌芽として、今後の研究の進展を予感させる興味深い成果が得られた。緑色植物の生長と環境負荷の関係を実時間的に直接計測した例はこれまでにない。本研究では申請者らが独自に開発した2つの光学的手法である統計干渉法および動的スペックル干渉法(DESPI)を用いることにより、植物の生長を秒以下の短い時間でサンプリングし、ナノメータレベルの精度で計測することを試みた。ヤブランの葉の生長計測の実験では、毎秒数ナノメータ、伸び率にして毎秒10^<-6>のオーダの局所ひずみ値の時間変化を得ることに成功した。興味ある現象として、これらの計測により植物の生長は一定速度で進展するのではなく、なゆらぎ現象を伴いながら生長することが明かされ、さらにそれらが環境負荷、具体的には大気中のオキシダント濃度に敏感に反応することが確かめられた。多くの緑色植物は菌根菌との共生関係によって光合成活動等を効率的に行うことが知られている。本研究では、アカマツの実生苗の根および葉の生長を統計干渉法およびDESPIで計測することを試みた。従来の乾燥重量計測法などから、菌根菌に感染していない実生苗は感染した実生苗に比べて生長が著しく悪いことが知られている。本研究では統計干渉によるアカマツの根の生長計測を、菌根菌に感染した実生苗と非感染の実生苗について実施したところ、生長速度に明らかな差異が見られ、従来の計測結果を秒レベルの短い時間域で確かめられた。これらの実験から、統計干渉法による秒レベルのサンプリングレートによる植物の生長計測を可能にする実験法であることが確認された。次年度以降は、統計干渉法と並行してDESPIによる2次元視野における生長分布の計測を行う予定である。さらに、菌根菌の有無、その種類によって生長がどのように変わるか、環境負荷の影響がどのように現れるかを詳細に検討する。光合成活動との関係を明らかにするために、光合成量の直接計測および、レーザ誘起蛍光法などすでに確立した計測を行い、統計干渉法およびDESPIによる計測結果との比較検討を行う予定である。昨年度は申請者らが独自に開発したサブナノメータの変形計測分解能をもつ統計的干渉法による菌根菌の拡大・生長計測において一定の成果を挙げた。本年度は、引き続いて統計的干渉法による植物の動態の環境影響を定量的に詳細に行うと同時に、より基本的な植物の生長および運動計測を、植物学的知見も導入し、モデル植物として知られているシロイヌナズナについて、ビデオ観察およびデジタル相関法による定量解析を行った。植物の動きをマクロなスケールからミクロさらにはナノメータスケールの分解能で計測する手法を確立すると同時に、分光反射率や蛍光法による計測との相関関係を明らかにするための準備実験がなされた。それらの結果および研究の進捗は以下の5点に要約される。(1)統計的干渉法により、ヤブランの生長過程を秒単位で、サブナノメータ精度で計測を行い、独特の揺らぎ現象の存在を確認した。また揺らぎ現象が大気汚染に敏感に応答することを見出した。(2)植物学の分野でモデル植物として実験研究に用いられているシロイヌナズナの回旋運動をビデオ観察し、またデジタル相関法による定量解析を行い、光照射条件の違いによる回旋運動の変化を確認した。(3)上述の実験は、動的ESPIによるより高精度な計測法を導入し、偏差生長の局在性を見出すべく実験を行っている。(4)レーザ誘起蛍光画像法の計画は、準備段階である。並行して植物の加齢に伴う色変化を分光反射率計測データをもとに解析する手法をあらたに導入し、水生植物の環境浄化作用との関係を準定量的に評価することができた。