hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単一細胞解析による骨芽細胞の運命制御機構の解明と新規骨形成促進剤の標的分子探索

骨芽細胞は骨形成を終えると,大半はアポトーシスにより死滅するが,一部は骨細胞へと分化するほか,骨表面にとどまり休止期骨芽細胞へと分化する。また,加齢による骨量減少は,骨髄の脂肪化を伴うことが多く,その要因の一つに,骨芽細胞の脂肪細胞への分化転換が示唆されている。このように骨芽細胞は多様な運命を辿るが,その詳細な分子機構は不明な点が多い。本研究では,2.3-kb Col1a1プロモーター制御下で蛍光タンパク質Venusを発現するレポーターマウスの頭蓋冠からVenus陽性細胞を単離し,遺伝子発現をシングルセルRNA-seqにより網羅的に解析した。計285個のVenus陽性細胞について解析が終了し,リード数の少ない細胞を除いた計283細胞の遺伝子発現プロファイルを得た。骨芽細胞マーカーの発現プロファイルから,解析したVenus陽性細胞は全て骨芽細胞と断定された。教師なしクラスタリング解析により,骨芽細胞は大きく2つのクラスターに分類された。1つはCd34, Cxcl12など骨前駆細胞マーカーを高発現するクラスター,もう1つは成熟骨芽細胞マーカーであるIbsp,Spp1,Bglapなどを高発現するクラスターである。また,一部の骨芽細胞はPpargやCebpaなど,脂肪細胞のマスター転写因子を含む脂肪細胞関連遺伝子を発現していることが見出された。そこで,高脂肪食とロジグリタゾン(PPARγアゴニスト)を与えたVenusレポーターマウス(4週齢)の大腿骨について,組織学的検討を行った。結果,骨髄にVenus陽性かつ脂肪細胞マーカーPLIN1陽性の細胞が散見され,in vivoにおける骨芽細胞の脂肪細胞への分化転換が示された。以上の結果は,骨髄脂肪化による骨量減少の病態解析に貢献するものと期待される。所属の異動により,実験環境が十分に整備されておらず,一部実験系の確立が滞っている。しかし,次年度には,実験環境がほぼ整う予定であり,当初の計画通りに進めることが出来ると考えている。シングルセルRNA-seqの解析から得られた骨芽細胞の遺伝子発現プロファイルをもとに,今後は複数の機械学習アルゴリズムを駆使し,さらにバイオインフォマティクスを駆使し,骨芽細胞の分化方向性の決定に働く遺伝子ネットワークの解明を目指す。近年,シングルセルの遺伝子発現プロファイルを解析するための機械学習アルゴリズムが活発に開発されている。中でも,MonocleやSCUBAなど,遺伝子発現情報を用いて擬似的な時間軸を作り出し,細胞系譜を予測するアルゴリズムを活用する。骨芽細胞の分化時間軸(分化の流れ)を予測し,分化方向性を制御する分子機構の理解を試みる。分化の鍵となりうる候補分子について,骨組織,特に,成長,加齢,および場合によっては骨疾患に伴う時空間的分布動態を解析し,骨組織における機能を推測する。また,培養骨芽細胞を分化モデルとしたウイルスベクターを用いた過剰発現,siRNAあるいはCRISPR-Cas9を用いた発現抑制を行い,骨芽細胞の分化に与える影響をin vitroにて検討する。骨芽細胞は骨形成を担った後,アポトーシスにより死滅するほか,骨表面にとどまり休止期骨芽細胞となる,あるいは骨基質に埋もれて骨細胞へと最終分化する。また,加齢や病態に伴い,骨芽細胞が脂肪細胞へと分化転換する例も報告されている。このように骨芽細胞は多様な運命(分化の方向性)を辿るが,その運命がどのような分子機構により決定されているのかは不明な点が多い。本研究では,「骨芽細胞の運命決定」を標的として,骨代謝を改善するゲノム創薬や分子標的療法に向けた分子基盤の形成を目指す。これまでに骨関連細胞の単離を目的として,I型コラーゲンプロモーター制御下で蛍光タンパク質Venusを発現するレポーターマウスの樹立に成功している。同マウスの頭蓋冠をコラゲナーゼ等で処理し,得られた頭蓋冠由来細胞(骨原生細胞)について,細胞1個あたりの遺伝子発現をシングルセルRNA-seqにより網羅的に解析した。前年度までに計96個の骨芽細胞について解析が終了している。しかし,個々の細胞の遺伝子ネットワークから分化の時間軸および細胞動態を解明するためには,より多くの細胞数を解析する必要がある。そこで,本年度はこれまでの96細胞に加え,192個の骨芽細胞の網羅的遺伝子発現解析を次世代シーケンスにより行った。今後,バイオインフォマティクスによる包括的・網羅的発現プロファイル解析から,骨芽細胞の分化方向性を制御する分子機構を理解し,骨形成の促進へとつながる候補分子を見出す。所属の異動により,トランスジェニックマウスの飼育が難しい状況になり,一部実験系の確立が滞ってしまった。しかし,次年度には,マウスの飼育も可能となる予定であり,当初の計画通りに進めることが出来ると考えている。

計285個のVenus陽性細胞について解析が終了し,リード数の少ない細胞を除いた計283細胞の遺伝子発現プロファイルを得た。骨芽細胞マーカーの発現プロファイルから,解析したVenus陽性細胞は全て骨芽細胞と断定された。教師なしクラスタリング解析により,骨芽細胞は大きく2つのクラスターに分類された。1つはCd34, Cxcl12など骨前駆細胞マーカーを高発現するクラスター,もう1つは成熟骨芽細胞マーカーであるIbsp,Spp1,Bglapなどを高発現するクラスターである。また,一部の骨芽細胞はPpargやCebpaなど,脂肪細胞のマスター転写因子を含む脂肪細胞関連遺伝子を発現していることが見出された。そこで,高脂肪食とロジグリタゾン(PPARγアゴニスト)を与えたVenusレポーターマウス(4週齢)の大腿骨について,組織学的検討を行った。結果,骨髄にVenus陽性かつ脂肪細胞マーカーPLIN1陽性の細胞が散見され,in vivoにおける骨芽細胞の脂肪細胞への分化転換が示された。以上の結果は,骨髄脂肪化による骨量減少の病態解析に貢献するものと期待される。所属の異動により,実験環境が十分に整備されておらず,一部実験系の確立が滞っている。しかし,次年度には,実験環境がほぼ整う予定であり,当初の計画通りに進めることが出来ると考えている。今後は分化過程の時間軸に沿った詳細な遺伝子ネットワークの動態解明を目標に,休止期骨芽細胞および骨細胞の網羅的シングルセル遺伝子発現解析を目指す。まず,休止期骨芽細胞および骨細胞の分離手法を確立し,フローサイトメトリー(FACS)解析の条件を検討した上で,ソーティングによる各細胞の単離を試みる。その後,C1システム(フリューダイム社)を用いた1細胞ごとのRNA-seqライブラリーを作製し,次世代シーケンスにより解析する。本年度の解析から得られた骨芽細胞の遺伝子発現プロファイルと統合し,Weighed Gene Co-expression NetworkAnalysisなどのバイオインフォマティクスにより,遺伝子間のネットワーク(遺伝子モジュール)の抽出,遺伝子モジュールの情報(臨床情報,変異情報,オントロジーなど)解析を行い,骨芽細胞の分化方向性を制御する分子機構の理解とともに骨形成の促進へとつながる候補分子を見出す。得られた候補分子について,骨組織,特に,成長,加齢,および場合によっては骨疾患に伴う時空間的分布動態を解析し,骨組織における機能を推測する。また,培養骨芽細胞を分化モデルとしたウイルスベクターを用いた過剰発現,siRNAあるいはCRISPR-Cas9を用いた発現抑制を行い,骨芽細胞の分化に与える影響をin vitroにて検討する。さらに可能であれば,マウス骨損傷モデルなどを用いて,in vivoにおける骨再生能力を検討し,骨形成の促進に働く分子を見出す。シングルセルRNA-seqの解析から得られた骨芽細胞の遺伝子発現プロファイルをもとに,今後は複数の機械学習アルゴリズムを駆使し,さらにバイオインフォマティクスを駆使し,骨芽細胞の分化方向性の決定に働く遺伝子ネットワークの解明を目指す。近年,シングルセルの遺伝子発現プロファイルを解析するための機械学習アルゴリズムが活発に開発されている。
qアナログ理論の研究

qアナログ理論においてしばしば現れる無限和と無限積を結びつける等式の解釈には、組み合せ的、表現論的、楕円関数論を使ったもの、リ-環論に結びつけるものなど種々の考え方がある。本研究では代表者たちは、この種の等式の中で特に有名なRogersーRamanujan恒等式を対角線方向に幾何級数的に減少する成分を持つ三対角的無限次行列の相異った3種類の行列式計算により解釈することを試みた。ここで特に大切な無限次積表現の部分をacyclicなネックレスを添字として持つfactorの無限個の積となることを示した。そしてそれぞれはある種のヤング図形の周期的同値のもとでのます目の数の計算という組み合せ論的問題に帰着されることがわかった。そして得られたアルゴリズムを持ちいることにより1≦k≦9に対する約6000個のfactorを計算することができ、それを検討することによりモデュラスがqの1乗という形のfactorに整頓されることが解明した。この問題の進展はいくつかの予想が立てられているが現在はここまでである。他の方向の考察としては代数的ト-ラス上でq差分方程式を考え、それに付随して現れるbー関数のqアナログを用たドラ-ム複体およびドラ-ムコホモロジ-の問題がある。これは古典的なバ-ンズ表現に添った基本超幾何関数のジャクソン積分を用いた新しい定式化になっている。この差分形は有限次のホロノミック系になっており、最高次のコホモロジ-は解の漸近的ふるまいを調べることにより次元が具体的に計算できた。この研究課程でト-ラス埋め込みの方法が有効に用いられ、代数的ト-ラスのコンパクティフィケイションが重要であることがわかった。また凸体の組み合せ論的な問題とも関連しているので今後この方面の研究を続けるつもりである。
第二次世界大戦期の在タイ邦人経営日刊新聞三紙(和、タイ、華文紙)に視る日タイ関係

本課題の成果報告書は次の3章より構成されている。即ち、第1章、戦前のタイ国における日本論第2章、矢田部保吉公使のタイ研究および留学生事業-今日への遺産第3章、1943年後半の日タイ関係と大東亜会議以下各章毎に、その概要を記す。第1章はタイ側から見た日タイ関係論であり、タイ近代政治史上の重要な転換期において、タイ政治指導者によって日本がいかに比較され、議論されたかをタイ政治史の文脈のなかで明らかにしようと試みた。日本とタイとの間に政治経済文化面で密接な交流が行われ、「日本化」とも称された現象が現れたのは、1930年代になってからであるが、本章はそれ以前の時期においてもタイに対して日本が与えた精神的影響力は大きなものがあったこと実証した。1932年の立憲革命ののちタイ側に強い日本ブームが生じ、タイ人の日本訪問が増大した。第1章末尾に付した日本に関する単行本リストから、1930年代になって出版点数が急増したことが判るが、これはこの時期に生じた日本ブームの大きさを示している。第2章は、矢田部保吉駐タイ公使(19281936の7年半在勤)時代の日タイ関係の深まりを、日本人のタイ研究およびタイからの留学生受け入れ体制の整備の二つの面から明らかにした。第2章末尾には、矢田部保吉著作リストを付した。第3章は、太平洋戦争時の日タイ関係の転換点である1943年後半の時期に焦点を当てている。本章は次の点を実証した。即ち、日本の対共栄圏政策の転換により、43年7月に東條首相が訪タイし、タイの領土獲得を承認したが、その効果は短期間のうちに消滅したこと、ピブーン首相と親日派のルアン・ウィチット外相との間には対日政策に関し溝が生じたこと、および43年11月の大東亜会議時にピブーン首相の答礼訪日を求める日本側に、ピブーン首相が応じなかったことでピブーン首相の日本離れは明白化し、これを契機に日タイ関係は一挙に悪化したこと、である。本研究は次のことを課題としている。即ち、(1)本報告者が過去10年以上に亘って収集した、第2次世界大戦期の日タイ関係に関する日本語、タイ語、中国語、英語の諸文献や一次資料および(2)本研究助成によって調査収集する第2次大戦期に出版された在タイ邦人経営の3新聞(タイ語紙の『カーオパープ』、中国語紙の『中原報』、日本語紙の『バンコク日報』)を資料として、1930年代後半から1945年における日タイ関係を政治、軍事、経済、金融、文化面などについて詳細に明らかにすることである。初年度においては、主として次の調査を実施した。即ち、タイ国立図書館での『カーオ・パープ』及び『中原報』の閲覧である。このため平成12年度の夏および年度末の2回に分けて、合計4週間タイ国に出張し調査を実施した。同図書館は両紙の閲覧は許可していたが、紙質の劣化が激しいので複写は禁止しており、また当面同図書館にはマイクロ化をはかる予定もなかったので、必要な部分を筆写する以外にはなかった。『中原報』については1941年から1943年部分を閲覧筆写し、『カーオ・パープ』については1941年部分を中心に筆写し、相当の成果を挙げることができた。

一方、現在までのところ公的な図書館での所在が確認されていない『バンコク日報』についても、古本屋等を通じて発見に努めたが、所在を確認するところまでには至らなかった。また、日本では本報告者が従来までに収集した資料に上記二新聞からの資料を加えて、1941年10-12月時における日タイ関係の実態および1943年11月における大東亜会議時のタイの態度について論文を作成した。これらの論文は未だ発表できる段階には至っていないが、次年度における調査の成果と併せて発表する予定である。本研究は次のことを課題としている。即ち、(1)本報告者が過去10年以上に亘って収集した、第2次世界大戦期の日タイ関係に関する日本語、タイ語、中国語、英語の諸文献や一次資料および(2)本研究助成によって調査収集する第2次大戦期に出版された在タイ邦人経営の3新聞(タイ語紙の『カーオパープ』、中国語紙の『中原報』、日本語紙の『バンコク日報』)を資料として、1930年代後半から1945年における日タイ関係を政治、軍事、経済、金融、文化面などについて詳細に明らかにすることである。両年に亘って、主として次の調査を実施した。一つは、タイ国立図書館での『カーオ・パープ』及び『中原報』の閲覧である。このため平成12年度の夏および年度末、平成13年の夏に、合計7週間タイ国に出張し調査を実施した。同図書館は両紙の閲覧は許可していたが、紙質の劣化が激しいので複写は禁止しており、また当面同図書館にはマイクロ化をはかる予定もなかったので、必要な部分を筆写する以外にはなかった。『中原報』については1941年から1945年部分を閲覧筆写し、『カーオ・パープ』については1941年部分を中心に筆写し、相当の成果を挙げることができた。また調査の第二として、現在までのところ公的な図書館での所在が確認されていない『バンコク日報』についても、古本屋等を通じて発見に努めたが、所在を確認するところまでには至らなかった。研究成果としては、本報告者が従来までに収集した資料に上記新聞からの資料を加えて、「タイ国の立憲革命期における文化とナショナリズム」、「タイにおける共産主義運動と中国革命」、「タイにおける華僑・華人問題」の三論文(詳細は研究発表の項参照)を執筆、発表した。
有害相の動的析出機構解明に基づく耐熱材料の高信頼化

高効率石炭火力発電プラントの配管は、配管内を流れる高温・高圧の蒸気に数十年の間、耐える必要がある。しかし、数年間の使用中に配管材料の金属組織中に有害析出相が生成し、材質が変質することが問題となっている。そこで、この有害析出相の数や大きさが使用中に変化する様子を調査し、有害性が顕在化する時期を明らかにした。さらに、高温・高圧の蒸気によって配管材料に負荷される力が大きい場合、有害析出相が多量に生成することを明らかにした。先進高効率火力発電プラントの高温部材として使用されている改良9Cr-1Mo鋼(ASME Gr.91)について、長時間クリープ変形(約10万時間相当)に伴う転位組織および析出相変化について調査し、実機において問題となっている長時間クリープ強度低下との関連を検討した。クリープ中断試験片平行部の硬さは、約3万時間程度まであまり変化せず、それ以降急激に硬さが低下した。マルテンサイトラス組織におけるサブグレイン径およびサブグレイン内の転位密度は、クリープ変形の進行に伴い約7万時間程度までそれぞれ緩やかに増加および減少したが、7万時間以降急激に変化した。サブグレイン径と転位密度の変化は、クリープひずみ量と良く相関していることが知られているが、実際、クリープ曲線から約7万時間まではクリープひずみ量が小さく、それ以降急激にひずみ量が増加することが確認された。また、約5万時間中断材では、旧γ粒界近傍のサブグレイン径は、粒内のそれに比べて大きい傾向が認められたが、破断後は観察視野全面においてサブグレイン径が増加し、回復していた。有害相と考えられているZ相は、約1万時間中断材において観察され、クリープ変形の進行に伴いそのサイズが大きくなり、数密度も増加した。Z相の析出に伴い、強化因子であるMX炭窒化物が消失し、クリープ破断後のMXの析出数密度は、クリープ変形前に比べて約一桁低下した。破断後のZ相の析出数密度も甑のそれとほぼ同程度で、MXとZ相を合わせても数密度はクリープ変形前の1/8程度であり、Z相析出とMX消失により、析出強化の程度が著しく低下していることが分かった。従来、クロム量の少ない改良9Cr-1Mo鋼では、12Cr鋼などと比べてZ相の析出は問題とされてこなかったが、本研究結果より、改良9Cr-1Mo鋼においてもZ相の析出によるクリープ強度低下が無視できないことが明らかとなった。平成23年度は,高強度フェライト耐熱鋼のうち,改良9Cr-1Mo鋼(ASME Gr.91)のクリープ中断試験片(600°C)ねじ部の組織調査を実施し,組織変化に及ぼす応力あるいはひずみの効果を検討した。併せて高温硬さによる材質劣化評価の可能性についても検討した。クリープ中断材ねじ部(応力無負荷部)では,クリープ時間の増加に伴いZ相の析出数密度は増加したが,約3万時間以降では,その増加は極僅かであった。前年度に調査したクリープ中断材平行部(応力負荷部)ではZ相の数密度がクリープ時間の増加に伴い単調に増加したことから,応力あるいはひずみがZ相の析出を促進することが分かった。(実際,約8万時間で,ねじ部におけるZ相数密度は,平行部の約1/3程度であった)MXの数密度は,平行部では約3万時間以降,ねじ部では約5万時間以降でクリープ時間の増加に伴い減少し始めた。約8万時間では,平行部におけるMX数密度は,ねじ部に比べて約1/7に低下していた。このことは,応力あるいはひずみによりZ相の析出が促進した結果,MXの消費が促進されたことを意味する。実機プラントにおける部材では,負荷される応力レベルが部位によって異なるが,応力が高い部位ほどZ相の析出およびMXの消失が促進される可能性が高いため,応力が高い部位では材質劣化評価の指標としてZ相析出の数密度が使用できる可能性がある。クリープ中断材ねじ部を利用して,600°Cにおける硬さ試験を実施したところ,高温硬さはクリープ時間の増加に伴い単調に減少し,約5万時間以降はあまり変化しなかった。ねじ部において,強化相であるMXの数密度は長時間域で低下するため,高温硬さの変化とは対応していない。高温硬さには,析出物以外の転位組織も影響を及ぼすため,今後詳細な検討をする必要がある。
グラフマイナー理論と局所変形を用いた曲面上のグラフの多面体的実現についての研究

曲面上に与えられたグラフが、3次元ユークリッド空間に多面体として実現可能か(多面体的実現可能か)という問題の歴史は古く、最も古い研究は1922年のSteinitzの定理にさかのぼるだろう。1960年代にGrumbaumが「任意の向き付け可能な閉曲面の三角形分割は多面体的実現可能である」ことを予想したが、Steinitzの球面上の定理が証明されて以来、それは長い間未解決であった。しかし、2006年、Bokowskiたちは種数6の曲面に反例を見つけ、2007年にはArchdeaconたちがトーラス上ではこの予想が正しいことを証明した。本研究では、それらの研究の流れを汲み、向き付け不可能な種数1の閉曲面(射影平面)上の三角形分割から1つの面を取り除いて得られるメビウスの帯の三角形分割の多面体的実現の研究を行った。特に、射影平面の任意の三角形分割は、ある1つの面を取り除くと、多面体的実現を持つことを証明し、さらに、任意の1つの面を取り除くことにより多面体的実現を持つ三角形分割を特徴付けた。上記の研究テーマで平成18年度より3年間,科学研究費補助金の援助を受けた.今年度はその初年度である.研究計画立案直前に,射影平面上の任意の三角形分割は,ある1つの面の内部を取り除くことにより,多面体的実現を持つという事実を証明することができた.そして,研究計画には,今後の3年間で,どの1つの面を取り除いても,多面体的実現を持つ射影平面の三角形分割の特徴付けを目指すと述べた.その初年度である平成18年度は,それを少し緩めた結果,すなわち「射影平面の5-連結三角形分割は,どの1つの面を取り除いても多面体的実現ができる」ことを証明することができた.その証明手法は,射影平面の5-連結三角形分割Gの任意の頂点xに対して,xの絡み閉路を境界とするメビウスの帯の三角形分割G-xが多面体的実現可能であることを証明した.その証明では,幾何学的議論の進化はほとんどされていないが,極めて巧妙なグラフ理論的手法が用いられている.(これには最新のグラフマイナー理論の研究成果が生かされている.)この研究内容を全体的に評価すると,とりあえず,当初に掲げた研究計画の第一段階はクリアさせることができたと言える.研究計画に掲げた目標を実善するためには,今後,幾何学的議論の詳細を詰める必要があると思われる.新年度では,そのためにさまざまな情報収集から始め,幾何学的議論を深めるためのコンピュータを利用したツールの開発や多面体的実現モデルの具体例の設計などが課題となる.それを繰り返すことにより,来年度以降の目標の達成を目指すつもりである.曲面Fが与えられたとき、F上のどんな三角形分割が多面体として実現できるかどうか(多面体的実現可能か)という問題を考える。Steinitzの定理により、任意の3-連結平面グラフは多面体的実現可能であることが示されている。近年、トーラス上の任意の三角形分割も多面体的実現可能であることが証明されたが、その他の閉曲面に関してはそのような研究はあまり進んでいない。そのような問題意識を基にして,本研究では、与えられた向き付け不可能な閉曲面の三角形分割が、ある1つの面を取り除いくことにより、多面体的実現可能かどうかを考える。すでに、射影平面に関してはそのような事実を証明することができたが、今年度は、クラインの壷の5-連結三角形分割に対して、同様の事実が成立することを証明することができた.連結度に関して、これを拡張するには射影平面の三角形分割の性質に関する詳細な記述が必要であると考えられ、来年度に向けて、その研究を開始したところである。2007年, Archdeaconたちは,トーラスの任意の三角形分割は多面体的実現を持つことを証明した.これは,剛体幾何の問題に位相幾何学的手法を取り入れる画期的な研究であり,それまで停滞気味であった曲面地図の多面体的実現の研究を大きく進展させた.私たちは,その手法を取り入れることにより,向き付け不可能な閉曲面の三角形分割から, 1つの面を取り除くき,その多面体的実現を構成するという問題に取り組み始めた.前年度までの研究により,射影平面の三角形分割からある面を取り除いて,多面体的実現が構成できること,さらに,射影平面5-連結三角形分割から任意の1面を取り除いて,多面体的実現が構成できることが明らかになっていた.

ところが,これらはメビウスの帯の三角形分割の多面体的実現性については,それほど強い事実を保証するものではない.ゆえに,私たちは平成18年度から20年度までの科学研究費補助金による研究の最終年に,多面体的実現可能なメビウスの帯を,ただ1つの禁止構造を用いて,特徴付けることに成功した.得られた定理は以下のものである:「メビウスの帯の三角形分割Mが多面体的実現を持つための必要十分条件は, Mがメビウスの帯の境界にホモトピックな2つの3-閉路を持たないことである」これにより,射影平面とメビウスの帯の三角形分割の多面体的実現についての一連の問題をすべて解決することができた.
ハイパーメディア・アプリケーション・システムのためのマルチメディア・データ構造

本研究は、筆者らが構築した、UNIXワークステーション上のマルチメディア・ユーザインタフェース管理機構(MMUIMS)のプラットフォームであるMUMINシステムを基に、その設計指針となった概念モデル(ペリフェラル・モデル)を拡張する試みである。MUMINシステムの設計時に考察されたのは、アプリケーション本体とそのユーザインタフェースを分離して、それぞれを動的に変更できるような枠組を与えるオブジェクト指向モデルであるが、これをマルチメディア・システムとそこで実行(再生または記録)されるマルチメディア・シナリオとの関係に敷衍したマルチメディア・ペリフェラル・モデルを本研究では提唱している。このモデルでは、マルチメディアの諸相に対応したMMUIMSサービスを提供するため、三層の抽象度からなるインタフェース・レベルを設けている。最下層レベルは、デバイスレベルであり、デバイスオブジェクトとグループマネージャにより、アナログのデータとデバイスの適合と排他制御を行う。また、仮想実行により、アプリケーションの開発時と実行時の差異を吸収させる。中間層は、データレベルであり、データオブジェクトと同期オブジェクトにより、マルチメディアシナリオを1群の複合オブジェクトとしてアプリケーションに提示する。並列実行と順次実行の2つの基本的な同期構造に加え、終了時イベントの発行と再帰的な伝播による動的な同期機構により、インタラクティブなシナリオを簡単な木構造で表現する。また、抽象実行過程のダンプとリストアにより、実行の一時中断や動的合成などをモデル化する。以上の二層については、オブジェクトクラスの体系および各オブジェクトの内部変数と基本的なメソッドを定義した。最上層は、システムレベルであり、コアとペリフェラルの階層的な積み重ねに相当するが、具体的なオブジェクト設計には至らず、今後の研究課題とする。
熱パルスによる心疾患治療デバイスの基盤技術の開発

本研究において申請者らは、マウスin vivo左心室心筋細胞におけるサルコメア長と細胞内Ca濃度の同時イメージングを可能にする高時間(100 fps)・空間(20 nm)共焦点顕微鏡システムの構築を行った。イメージング中は、心電図、左心室内圧および左心室の圧容積関係などのマクロパラメーターも同時に計測した。この顕微システムを用い、細胞膜染色試薬を用いて心筋細胞のT管を染色した心臓に赤外レーザーのパルス照射を行うと、心筋細胞の動的特性が亢進した。本研究の結果は、赤外レーザーのパルス照射がin vivoにおける心筋の収縮性を促進させる上で有用であることを示している。平成27年度は、in vivoにおけるサルコメア長とCa2+同時イメージングを可能にするために必要な装置の開発と資料の作成を行った。2.並行して、熱パルス照射と同時にサルコメア長(SL)およびCa2+の高速ライブイメージングを行うため顕微鏡システムの改良を行った。具体的にはこれまでに構築したin vivoライブイメージング用共焦点顕微鏡に、Cameleon-nanoが持つ2つの発色団(CFP・YFP)の2色を同時にイメージング可能な2光路系を導入するため、顕微鏡メーカー(Olympus)の協力を得て特注部品の開発を行っている。3.今後使用予定の拡張型心筋症モデルマウス(DCMマウス)の繁殖を行い、実験条件に適合する週齢の検討を行った。4.成果発表に関しては、in vivo顕微鏡系を用いた生きたマウスの心臓におけるサルコメアイメージングについての論文を発表した(Kobirumaki-Shimozawa et al., 2016)。さらにα-actinin-cameleon-nanoによるサルコメア長とCa2+イオン動態の同時計測については論文を投稿中である。上記2つの成果に関して、第60回米国生物物理学会および第93回日本生理学会大会において発表を行った。組換え遺伝子発現用のアデノウイルスベクターが完成し増幅段階に入ったことで、実験の前段階で最も時間のかかる2つの過程のうちの1つがクリアされた。もう一方は顕微鏡の改良であるが、こちらはメーカーとのやりとりでやや遅れが出ているものの、近日中に部品の開発が終了するものと考えている。また、今後使用する予定の拡張性心筋症モデルマウスも順調に繁殖を行っており、全体として問題なく進展している。本年度中、産前産後の休暇および育児休業の取得により研究を一時中断した。休業中は休暇取得以前に取得した動画データの解析を行い、論文の作成を行った。今後は、当初の予定に従い、以下の3つを柱に研究を遂行する予定である。1)心機能に関するマクロレベル・ミクロレベル情報の統合解析法の確立:野生型マウスのin vivoライブイメージングを引き続き行うとともに、得られたデータの解析手法を構築する。ここでは、心筋細胞内カルシウムイオンの微細な心筋組織内伝播動態とサルコメア長動態を心電図や心内圧(および、さらに多くの情報を得られる圧-容積(PーV)ループ)と統合して解析する方法を確立していく。2)パラメータ変化および拡張型心筋症(DCM)マウス心臓への応用:野生型マウスのデータの集積完了後は、まず野生型に対する物理刺激(大動脈クランプによる血圧低下)や薬剤投与(アドレナリン投与等)の影響を分子レベルで検出する。次に同様の実験をDCMモデルマウスを用いて行い、病態マウスにおけるサルコメア動態、カルシウム動態の差異を抽出に挑む。3)局所熱パルスを用いた心臓内の心筋加熱による収縮法の確立:マウス成体から摘出した心臓を大動脈から逆行性に灌流し、赤外光レーザを照射することによって心臓という臓器レベルにおいて心筋細胞の収縮を誘発できるか否かを検証する。さらに、申請者が独自に開発したサルコメア長・カルシウム同時イメージング法により、熱パルスに対する心筋細胞の応答を分子レベルで定量的に評価・解析し、そのメカニズムの解明を試みる。産前産後休暇と育児休業の取得により、実験を主体とする作業には遅れが出ている。データの解析および論文の作成はほぼ予定通りに進んでいる。本研究では、従来にない全く新しい心機能改善法として「局所熱パルス照射」による心筋収縮力増強を提案し、マウスのin vivo局所に赤外レーザーを照射することによって心筋収縮構造(サルコメア)の収縮・弛緩を直接的に制御し、効率的でかつ安全性の高い次世代新疾患治療デバイスの基盤技術の開発に挑戦した。In vivoにおけるサルコメア長とCa2+濃度やその他の要素との同時計測を可能にするため、2光路系を備えたスピニングディスク型高速共焦点顕微鏡系の構築を行った。また、心室圧容積曲線(p-vループ)との同時計測を可能にするカテーテル機器をin vivo顕微鏡システムに導入し、サルコメア長やCa2+濃度などの分子動態と心機能との関係を解析すると同時に生きた心臓に熱パルスを同時照射可能なシステムを構築した。膜染色試薬を用いてT管を染色した心臓において、T管をイメージングしつつ局所熱パルス照射を行った結果、生きた心臓においても熱パルス照射部位の心筋収縮を惹起できることを確認した。この結果は以前に単離心筋細胞で確認されたのと同様であり、本研究によって熱パルスによる心筋細胞制御の可能性が確認された。また熱パルス照射が心筋細胞にどのような影響を与えるか詳細に調べるため、in vivoサルコメア・Ca2+同時イメージングの前段階として、摘出心臓でのCa2+イメージング系を確立し、Ca2+ウェーブ発生初期の詳細な解析手法を開発して論文を発表した。

またサルコメアイメージングに適した細胞内構造の蛍光標識手法を確立し、それらをまとめた論文を投稿中である。さらに拡張型心筋症モデルマウスのサルコメアおよびT管のin vivoイメージングを行い、野生型と病態マウスとの違いを解析中であり、今後は熱パルス照射によって病態マウスの心機能を改善することができるかをさらに調査していく予定である。本研究において申請者らは、マウスin vivo左心室心筋細胞におけるサルコメア長と細胞内Ca濃度の同時イメージングを可能にする高時間(100 fps)・空間(20 nm)共焦点顕微鏡システムの構築を行った。イメージング中は、心電図、左心室内圧および左心室の圧容積関係などのマクロパラメーターも同時に計測した。この顕微システムを用い、細胞膜染色試薬を用いて心筋細胞のT管を染色した心臓に赤外レーザーのパルス照射を行うと、心筋細胞の動的特性が亢進した。本研究の結果は、赤外レーザーのパルス照射がin vivoにおける心筋の収縮性を促進させる上で有用であることを示している。平成28年度以降は以下の3つを柱に研究を遂行する予定である。1.心機能に関するマクロレベル・ミクロレベル情報の統合解析法の確立:野生型マウスのin vivoライブイメージングを引き続き行うとともに、得られたデータの解析手法を構築する。ここでは、心筋細胞内カルシウムイオンの微細な心筋組織内伝播動態とSL動態を心電図や心内圧(および、さらに多くの情報を得られる圧-容積(P-V)ループ)と統合して解析する方法を確立していく。2.DCMマウス心臓への応用:野生型マウスのデータの集積の完了後は、まず野生型に対する物理的刺激(大動脈クランプによる血圧低下)や薬剤投与(アドレナリン投与等)の影響を分子レベルで検出する。3.局所熱パルスによる心臓内の心筋加熱収縮:マウス成体から摘出した心臓を大動脈から逆行性に灌流し、赤外光レーザーを照射することによって心臓という臓器レベルにおいて心筋細胞の収縮を誘発できるか否かを検証する。さらに、申請者が独自に開発したサルコメア長・Ca2+イメージング法により、熱パルスに対する心筋細胞の応答を分子レベルで定量的に評価・解析することにより、そのメカニズム解明を試みる。平成29年度以降は、当初の予定に従い、以下の3つを柱に研究を遂行する予定である。1)心機能に関するマクロレベル・ミクロレベル情報の統合解析法の確立:野生型マウスのin vivoライブイメージングを引き続き行うとともに、得られたデータの解析手法を構築する。ここでは、心筋細胞内カルシウムイオンの微細な心筋組織内伝播動態とサルコメア長動態を心電図や心内圧(および、さらに多くの情報を得られる圧-容積(PーV)ループ)と統合して解析する方法を確立していく。2)パラメータ変化および拡張型心筋症(DCM)マウス心臓への応用:野生型マウスのデータの集積完了後は、まず野生型に対する物理刺激(大動脈クランプによる血圧低下)や薬剤投与(アドレナリン投与等)の影響を分子レベルで検出する。次に同様の実験をDCMモデルマウスを用いて行い、病態マウスにおけるサルコメア動態、カルシウム動態の差異を抽出に挑む。
アルドステロン産生腺腫における18オキソコルチゾール分泌の病態生理と臨床応用

健康寿命延伸および医療費削減の目的において、高血圧症およびそれに伴う臓器障害の予防は喫緊の課題である。原発性アルドステロン症(PA)は、二次性高血圧症のうち約10%と最たる原因であり、上記理由から早期診断・早期治療が求められる。しかし、複数回の負荷試験、副腎静脈サンプリングを用いた現行の診断手法は、月単位での時間を要し、また、一連のプロセスは専門施設でのみ実施可能であることから、適切な診療を受けることのできないアンメットニーズが存在する。我々は、PAにおいて極めて産生が亢進する18-オキソコルチゾール(18oxoF)に着目し、18oxoFのPA存在診断、そして、局在診断の新規バイオマーカーとしての末梢血18oxoF測定の臨床応用を目的に、本研究を進めている。平成30年度では、PAのうち、手術治療の適応となるアルドステロン産生腺腫(APA)症例において、18oxoF産生亢進機序に関する病理組織学的解析を行った。結果、APA 48症例の解析を行った時点で、末梢血18oxoF濃度はAPAの腫瘍径およびアルドステロン合成酵素を中心とするステロイド合成酵素発現、そして、正常副腎では観察されないアルドステロン合成酵素とコルチゾール合成酵素である11β-hydroxylaseの共発現細胞数と統計学的有意差をもって正相関しており、これらの特徴的腫瘍内環境が18oxoF産生亢進の原因であることが示唆された。さらに、本邦で報告が最多であるKCNJ5体細胞変異がdriverであることが示され、PA診療での末梢血18oxoF測定の臨床応用の可能性が再確認できた。現在は、KCNJ5以外の体細胞性変異を有する症例を中心とした追加検討、薬物治療の対象となる特発性アルドステロン症症例との比較検討を進めている。本研究により、非侵襲的かつ普遍的に実施可能な末梢血18oxoF測定の臨床応用が進むものと期待される。本研究申請時点で予定していた、アルドステロン産生腺腫におけるステロイド合成酵素発現およびCYP11B1/CYP11B2共発現細胞の解析を実施した。予定した症例数より少数での解析であったが、約半数の症例検討で一定の結果を得ており、本研究は概ね予定通り進展していると判断している。平成30年度の検討により、アルドステロン産生腺腫内の体細胞性変異が重要であることが確認されたため、今後は本邦で比較的少数とされる種類の体細胞性変異を有するアルドステロン産生腺腫症例の選定および解析、そして、特発性アルドステロン症症例との比較検討を進める予定である。
鰓原器内パラニュ-ロンの発生と機能に関する形態学的ならびに生理化学的研究

甲状腺、上皮小体、胸腺、口蓋扁桃および鰓後体は発生学的に鰓嚢に由来し、鰓原器と総称されているが、このうち特に甲状腺のC細胞、上皮小体の主細胞はパラニュ-ロンとよばれる特殊な内分泌細胞の一種でそれぞれカルシトニン(CT)およびパラスルモン(PTH)を分泌し、カルシウム(Ca)代謝に関係するといわれている。本研究ではこれら鰓原器内パラニュ-ロンの発生と機能を形態学的、生理化学的に解明することを目的として免疫組織化学、画像解析、ラジオイムノアッセイなどの手法を用い、各種哺乳動物において個体発生、妊娠とビタミンD(VD)投与との関係、妊娠と低Ca、低VD飼料との関係、低ビタミンA(VA)飼料が下垂体-甲状腺系、下垂体-性腺系に及ぼす影響、下垂体前葉細胞の加齢、妊娠、冬眠における変化などについて検索を行なった。まず画像解析法ではトスピックス(東芝製)を用いた新しいプログラムを開発し、形態学的試料を数値化して統計的に処理することを可能にした。この画像解析法は本件給では各種実験における甲状腺、上皮小体の体積、甲状腺C細胞の総体積、下垂体前葉の各種内分泌細胞の面積比の計測などに応用され、低Ca、低VD飼料で飼育したラットでは上皮小体の体積が著しく増加すること、VA欠乏ラットで下垂体前葉のTSH細胞の面積比が有意に増加すること、冬眠期にユビナガコウモリの下垂体前葉のTSH細胞の面積比が有意に低下することなどを統計学的に明らかにした。またゴ-ルデン・ハムスタ-を用いた個体発生学的研究では甲状腺、鰓後体は胎齢9日、上皮小体は胎齢10.25日に出現するが、鰓後体は胎齢12日に甲状腺と癒合し、CT免疫陽性細胞は鰓後体由来甲状腺組織内に出現することなどを証明した。以上より、本研究によって鰓原器内パラニュ-ロンの発生学的詳細と、そのCa代謝における役割の一部を形態学的、生理化学的に明らかにすることができた。甲状腺,上皮小体,胸腺などは発生学的に鰓嚢に由来し,鰓原器と総称されているが,このうち特に甲状腺のC細胞,上皮小体の主細胞はパラニューロンとよばれる特殊な内分泌細胞の一種で,それぞれカルシトニン(CT)およびパラソルモン(PTH)を分泌し,カルシウム(Ca)代謝に関係するといわれている.本研究ではこれらパラニューロンの発生と機能を形態学的,生理化学的に解明することを目的としているが,本年度は研究計画の初年度に当たるため,まず画像解析装置を有効に使用するための新しいプログラムを開発し,それを利用することによって形態学的研究の成果を統計的に解析することを可能にした.その結果,甲状腺,上皮小体の体積, C細胞の総体積, C細胞の甲状腺に対する体積比は,ラットではそれぞれ平均4.12mm^3, 0.14mm^3, 0.13mm^3, 3.2%であり, C細胞は甲状腺内で後方3分の2に主に分布することなどを明らかにした.またCa代謝との関係では, CaおよびビタミンD_3(VD)欠乏飼料を給与したラットで上皮小体の体積が2.53倍に増加することも明らかにした.さらに発生学的にはC細胞が胎生末期に上皮小体に近い部位から甲状腺内に進入することを明らかにし, C細胞の鰓嚢由来説を免疫組織化学的に裏付けた.以上の形態学的検討の他に,本年度はさらにラットの血中Ca, PTH濃度を生化学的に測定し,それぞれ平均9.7mg/dl, 770pg/dlであることを明らかにすることによって今後の研究のための基礎資料を得ることができた.また臨床的に泌乳牛にVDを投与して乳熱の予防を試み,血中Ca濃度が対照群に対して有意に上昇することを認めた.甲状腺、上皮小体、胸腺、口蓋扁桃および鰓後体は発生学的に鰓嚢に由来し、鰓原器と総称されているが、このうち特に甲状腺のC細胞、上皮小体の主細胞はパラニュ-ロンとよばれる特殊な内分泌細胞の一種でそれぞれカルシトニン(CT)およびパラスルモン(PTH)を分泌し、カルシウム(Ca)代謝に関係するといわれている。

またゴ-ルデン・ハムスタ-を用いた個体発生学的研究では甲状腺、鰓後体は胎齢9日、上皮小体は胎齢10.25日に出現するが、鰓後体は胎齢12日に甲状腺と癒合し、CT免疫陽性細胞は鰓後体由来甲状腺組織内に出現することなどを証明した。以上より、本研究によって鰓原器内パラニュ-ロンの発生学的詳細と、そのCa代謝における役割の一部を形態学的、生理化学的に明らかにすることができた。甲状腺、上皮小体、胸腺、口蓋扁桃および鰓後体は発生学的に鰓〓に由来し、鰓原器と総称されているが、このうち特に甲状腺のC細胞、上皮小体の主細胞はパラニューロンと呼ばれる特殊な内分泌細胞の一種でそれぞれカルシトニン(CT)およびパラソルモンを分泌し、カルシウム代謝に関係するといわれている。本研究はこれらパラニューロンの発生と機能を形態学的、生理化学的に解明することを目的としているが、本年度は研究計画の第2年度に当たっており、前年度に開発した、画像解析装置を有効に使用するための新しいプログラムを用いて種々の形態計測学的研究を行った。まずラットをビタミンA(VA)欠乏飼料で飼育してその下垂体TSH細胞、甲状腺濾胞上皮細胞、CT分泌細胞の変化を免疫細胞化学的ならびに形態計測学的に分析したところ、下垂体前葉のTSH細胞はVA欠乏によって著しく増数肥大し、単位面積当たりのTSH細胞の面積は対照群では12.70%であるのに対しVA欠乏群では16.71%と有意に増加した。また甲状腺における濾胞腔の面積は対照群が27.24%であるのに対しVA欠乏が甲状腺の機能減衰をもたらし、そのネガティブ・フィードバックによって下垂体前葉のTSH細胞が増加したことを示唆する。一方、甲状腺のCT細胞の面積は対照群が15.92%であるのにVA欠乏群では17.30%と有意に増加したが、その原因は不明であった。次に、ユビナガコウモリの下垂体前葉におけるTSH細胞の増減を妊娠、泌乳および冬眠との関連においてやはり免疫細胞化学的ならびに形態計測学的に分析した結果、TSH細胞が冬眠器で正常状態に比べて有意に増加することが明らかになった。このことは冬眠期に甲状腺の機能が低下し、そのネガティブ・フィードバックによって下垂体前葉のTSH細胞が増加したことを示唆するものと思われた。甲状腺、上皮小体、胸腺、口蓋扁桃および鰓後体は発生学的に鰓嚢に由来し、鰓原器と総称されているが、このうち特に甲状腺のC細胞、上皮小体の主細胞はパラニュ-ロンとよばれる特殊な内分泌細胞の一種でそれぞれカルシトニン(CT)およびパラソルモン(PTH)を分泌しカルシウム代謝に関係するといわれている。本研究はこれら鰓原器内パラニュ-ロンの発生と機能を形態学的、生理化学的に解明することを目的として行なってきたが、本年度は本研究計画の最終年度に当たっているため、前年度までの研究成果を踏まえてその応用的または補足的実験を行ない、最終的まとめとした。まずゴ-ルデン・ハムスタ-を用いて甲状腺、上皮小体、鰓後体の発生を免疫組織化学的に検索したところ、甲状線、鰓後体は胎齢9日、上皮小体は胎齢10.25日に生じ、胎齢12日には鰓後体は甲状腺と癒合した。サイログロブリン陽性反応は胎齢10.5日に甲状腺の濾胞上皮細胞に出現し、その後増強したが、濾胞腔内には初生仔で初めて陽性反応が出現した。CT陽性反応は胎齢14日に鰓後体由来の甲状腺組織内に出現し、その後増強した。PTH陽性反応は胎齢15日に初めて上皮小体内に出現した。またラットを対照群、低Ca低ビタミンD(VD)群、低VD群に分け、それぞれの飼料で4週間飼育後交配し妊娠20日で屠殺して甲状腺、上皮小体を採取して甲状腺、上皮小体の体積、甲状腺C細胞の総体積などを画像解析法によって計測したところ、C細胞の総体積は低Ca低VD群で大きい傾向にあり、上皮小体の体積は低Ca低VD群で著しく大きく、他群の2倍以上となった。
腋芽の休眠機構に関与する因子の解析

無傷の植物では、頂芽が優先的に成長し腋芽の成長は抑制されている。この現象は頂芽優勢と言われ植物生理学では最も古くから知られている現象の一つである。頂芽が損傷して成長することが不可能になると、休眠中の腋芽は頂芽に代わって直ちに成長を始める。頂端分裂組織から分化・成長していた腋芽が休眠に至る仕組みを理解することは頂芽優勢の分子機構を理解する上で重要かつ不可欠であると考え、腋芽の休眠過程に関わる遺伝子群を単離・同定することにより、腋芽の「休眠への移行段階」において遺伝子レベルで何が起きているかを明らかにしようとした。これまでの定量的PCR法を用いた解析により、休眠過程に特異的に発現する遺伝子、PsAD4、を同定していた。PsAD4遺伝子の発現解析をin situ hybridization法を用いて行った結果、PsAD4遣伝子は休眠中の腋芽及び頂芽切除によって成長を開始した腋芽では発現が見られなかった。一方、休眠を開始した腋芽全体に発現が見られた。この結果は、PsAD4遺伝子が腋芽全体に作用していることを示している。また興味深いことに、休眠過程の腋芽と主茎とをつなぐ維管束にも強い発現が見られた。この結果は、PsAD4遺伝子の発現様式が維管束を通して制御されている可能性を示している。腋芽を含む地上部形態は茎頂分裂組織から作られる。植物の地上部形態構築には小分子RNAを介した遺伝子発現制御が必須であることが、近年、明らかになってきた。そこで、多様な小分子RNAがどのように下流の遺伝子発現制御を行っているのかを明らかにすることで、腋芽形成の分子機構を明らかにしようと試みた。その結果、植物種ごとに小分子RNAを介した遺伝子発現制御が多様であることを示唆する研究結果が得られた。(抄録なし)無傷の植物では、頂芽が優先的に成長し腋芽の成長は抑制されている。腋芽の休眠過程に関わる遺伝子群を単離・同定することにより、腋芽の「休眠への移行段階」において遺伝子レベルで何が起きているかを明らかにしようとした。本特別研究員による平成23年度以前の解析により、休眠過程の腋芽特異的に発現する遺伝子PsAD4が同定されていた。そこで、平成23年度ではPsAD4遺伝子の機能解析を行った。<1>PsAD4遺伝子の系統樹解析の結果、アスコルビン酸生合成の最終段階を触媒する酵素と相同性が高かった。そこで、アスコルビン酸量と腋芽の休眠・成長段階との相関関係について調べた。その結果、PsAD4遺伝子はアスコルビン酸の生合成には関わっていないことが推測された。<2>様々な条件検討を行いながらPsAD4遺伝子の発現を抑制したエンドウの作出を試みた。<3>エンドウPsAD4遺伝子の相同遺伝子はシロイヌナズナでは7つあることがわかった。そこで、7つの遺伝子のそれぞれが破壊されたシロイヌナズナを入手し表現型を観察したところ、目立った表現型は観察されなかった。<4>エンドウPsAD4遺伝子の相同遺伝子はイネでは3つであることがわかった。そこで、3つの遺伝子のそれぞれが破壊されたイネの種を入手した。一方、イネlax panicle2(lax2変異株は、腋芽の形成に異常が見られ、腋芽の数が減少する表現型を示す。これまでに、lax1変異株が報告されており、lax2はlax1と表現型が類似していた。lax2変異株の原因遺伝子の単離の結果、LAX2遺伝子は新規な核タンパク質をコードしていた。酵母two-hybrid assay、及びin vitro binding assayにより、LAX2タンパク質はLAX1タンパク質と直接相互作用することが明らかになった。これらの結果から、LAX2タンパク質はLAX1タンパク質と共に働き、腋芽の形成に関わっていることが明らかになった。何らかの傷害により頂芽が損傷して成長することが不可能になると、休眠中の腋芽は頂芽に代わって直ちに成長を始める。そこで、腋芽の休眠過程に関わる遺伝子群を単離・同定することにより、腋芽の「休眠への移行段階」において遺伝子レベルで何が起きているかを明らかにしようとした。これまでの解析により、腋芽の休眠移行時期に特異的に発現するエンドウPsAD4遺伝子を同定した。PsAD4遺伝子は、植物特異的FAD-binding domain containing-proteinをコードしており、細胞内物質の酸化還元反応に関わっていることが推測された。エンドウPsAD4遺伝子と相同遺伝子はイネでは3つあった。そこでそれぞれの遺伝子破壊株の表現型を観察したが、特に目立った表現型を示さなかった。従って、それぞれの遺伝子がお互い相補しながら働いている可能性が考えられた。分化・成長を行っている腋芽が休眠へ移行するには、腋芽のメリステム活性の活動期→休止期への相転移が起こっていると考えられる。メリステム活性の維持にはホメオボックス遺伝子といわれる転写因子群が関わっていることが知られている。ホメオボックス遺伝子群の機能解析が腋芽メリステムの活動・休止の分子機構の解明に必要であると考えた。そこで、その中の一つであるWUSCHEL-relatedhomeobox gene,NAL2/3遺伝子の機能解析を行った。

イネ,NAL2/3遺伝子の破壊株は葉が細く、電子顕微鏡による観察結果により葉の端の構造が欠損していることが分かった。その一方、NAL2/3遺伝子を過剰発現させたイネの形質転換体は葉が太くなる表現型を示した。in situ hybridization法による解析によりNAL2/3遺伝子は葉の端で発現していた。以上の結果を考え合わせると、NAL2/3遺伝子は葉の端の構造形成に関わっていることが明らかになった。この研究成果は学術雑誌Plant Cell Physiologyに発表した。無傷の植物では、頂芽が優先的に成長し腋芽の成長は抑制されている。この現象は頂芽優勢と言われ植物生理学では最も古くから知られている現象の一つである。頂芽が損傷して成長することが不可能になると、休眠中の腋芽は頂芽に代わって直ちに成長を始める。頂端分裂組織から分化・成長していた腋芽が休眠に至る仕組みを理解することは頂芽優勢の分子機構を理解する上で重要かつ不可欠であると考え、腋芽の休眠過程に関わる遺伝子群を単離・同定することにより、腋芽の「休眠への移行段階」において遺伝子レベルで何が起きているかを明らかにしようとした。これまでの定量的PCR法を用いた解析により、休眠過程に特異的に発現する遺伝子、PsAD4、を同定していた。PsAD4遺伝子の発現解析をin situ hybridization法を用いて行った結果、PsAD4遣伝子は休眠中の腋芽及び頂芽切除によって成長を開始した腋芽では発現が見られなかった。一方、休眠を開始した腋芽全体に発現が見られた。この結果は、PsAD4遺伝子が腋芽全体に作用していることを示している。また興味深いことに、休眠過程の腋芽と主茎とをつなぐ維管束にも強い発現が見られた。この結果は、PsAD4遺伝子の発現様式が維管束を通して制御されている可能性を示している。腋芽を含む地上部形態は茎頂分裂組織から作られる。植物の地上部形態構築には小分子RNAを介した遺伝子発現制御が必須であることが、近年、明らかになってきた。そこで、多様な小分子RNAがどのように下流の遺伝子発現制御を行っているのかを明らかにすることで、腋芽形成の分子機構を明らかにしようと試みた。その結果、植物種ごとに小分子RNAを介した遺伝子発現制御が多様であることを示唆する研究結果が得られた。交付申請書の年次計画にほぼ従った研究の進み具合であることと、本研究成果の一部を査読付き学術雑誌に発表することができたので、おおむね順調に進展していると判断した。研究の進展状況が交付申請書の年次計画にほぼ従っている点。さらに、本研究成果の一部を査読付き学術雑誌に発表することが出来た点。平成23年度では、本研究代表者により既に得られていた腋芽の休眠過程に関与するPsAD4遺伝子の機能解析を行った。平成24年度では、PsAD4遺伝子以外の腋芽の休眠過程に関与する新奇な遺伝子の単離・同定を行う予定である。研究課題申請書に記載した研究計画では、subtracted cDNAライブラリー法により候補遺伝子群を単離する予定であった。しかしその後、他の研究者との意見交換や学術雑誌に掲載されている情報から、マイクロアレイ法の方が得られる結果がより高度なものになることが期待できた。