hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アカネズミを生物指標として用いたダイオキシン汚染の影響評価

レセプターは、転写活性領域に存在するCAGリピート数が他の齧歯類に比べ極端に多く、この現象が特異的な蛋白質構造を形成している可能性が示唆される。さらに特記すべき点として、今回クローニングを行ったサンプル数は1個体であったが、10塩基とCAGリピート数の異なる2通りの配列が同定された。10塩基のうち4塩基は3つのアミノ酸の置換に関与しており、CAGリピート数の違いはグルタミン数の違いを反映している。これらの結果はアカネズミAhレセプターに多型が存在することを示唆するものであるが、種特異的に起こった遺伝子重複による可能性もあり、今後さらにサンプル数を増加させ、検証していく必要がある。日本の森林に広く生息する小型齧歯類アカネズミ(Apodemus speciosus)は、生体内ダイオキシン類蓄積量が食物連鎖を構成する一部の高次捕食者よりも高い値を示し、ダイオキシン類汚染における生物指標としての有効性が注目されている。本研究では、ダイオキシンの毒性発現に重要な役割を担い、アミノ酸置換によって異なるダイオキシン感受性を示すことが報告されている受容体型転写因子AhR(Aryl hydrocarbon Receptor)を、ダイオキシン抵抗性に関して個体群内の構成変化を追跡する有効な因子として着目し、アカネズミAhRにおけるアミノ酸配列の多型解析と機能評価を行った。63個体のアカネズミAhRを解析した結果、850アミノ酸のAhR内に26ヶ所のアミノ酸置換が確認され、50通りの多型があることが明らかになった。変異が起こる部位は2ヶ所に集中していた。1つはN末端側に位置し、タンパク質とダイマー形成を行うPAS(Per-AhR/Arnt-simhomology)ドメイン内のPAS-A、B領域の間で、もう1つはC末端側に位置し、転写活性を行うTAD(Transactivation domain)である。また、アカネズミAhRの特徴として、TAD内にマウスやヒトと比べて非常に長いQリピート(817リピート)が存在していた。検出されたAhRについて機能評価を行ったところ、PASドメイン内での変異はAhRの機能に影響は無かった。一方、TAD内で検出された変異の一部は、わずかではあるがタンパク質の機能に差があることが明らかになった。
衝突力測定法による高速水噴流の特性評価

ウォータージェットは細い噴流であるが、単位面積当たりの加工エネルギーが極めて大きいことから、固体材料の加工などへの応用研究が活発である。様々な基礎・応用研究の進展に伴い材料の切削機構も次第に明らかになりつつあるが、定量的には未解明な点が多く残されている。ウォータージェット技術をより高度なものにするためには、ウォータージェットやアブレシブジェットの衝突による固体の衝撃的破壊のメカニズムの解明が基本的に重要であり、固体表面に実際に入射する噴流の構造の定量化が緊急の課題となっている。本研究は、衝突力測定による噴流構造の定量化法を確立するとともに、それらをウォータージェットおよびアブレシブジェットの分析に適用し、ウォータージェットの入射速度とみかけ密度の評価、壊食の噴流速度依存性、送り切削のモデリング、およびアブレシブジェットの流動測定と壊食作用について検討した。得られた結果を要約すると以下のようである。1)円筒連続水噴流を平滑なターゲットの表面に垂直に衝突させた場合の衝突力を分析し、その時間平均から運動量の法則に従って入射速度を算出すれば、噴流速度に対する飛翔距離の影響および空中衝撃波発生の影響などの検出が可能となる。2)表面近くの壊食速度はウォータージェットの入射速度の6乗則にに従うことを明らかにした。3)岩質材料の送り切削深さの予想計算式を、ノズルの口径、吐出圧力、ノズルの送り速度、よどみ圧の減衰特性値および材料定数としての基準壊食圧力の関数として求めた。4)研磨材添加水噴流の衝突による表面壊食速度は研磨材と被衝突物の破壊機構に強く依存していること明らかにした。ウォータージェット技術をより高度なもとするためには、ウォータージェットやアブレシブジェットの衝突による固体の衝撃破壊のメカニズムの解明が基本的に重要であり、固体表面に実際に入射する噴流の構造の定量化が緊急な課題である。本研究では、ウォータージェットを人工的な平底円筒孔に入射させた場合の衝突力から噴流特性を測定する方法を開発し、時間平均衝突力から噴流の平均速度とみかけ密度を評価する方法の実用性と問題点を明らかにした。得られた結果を以下に示す。1)円筒連続水噴流を平滑なターゲットの表面に垂直に衝突させた場合の衝突力を分析し、その時間平均値から運動量保存の法則に従って入射速度を算定すれば、噴流速度に対する飛翔距離の影響ならびに空中衝撃波発生の影響などの検出が可能となることを明らかにした。2)ターゲットの壊食に伴う衝突力の変化を実験と解析によって分析し、表面が窪むと時間平均衝突力は一旦増加するが、中央部に壊食孔が生じると漸減することを明らかにした。また、壊食孔の深さが増すと衝突力は入射噴流と壊食孔の断面積比に依存することを明らかにした。3)衝突力の精密測定は噴流を構成する水粒子の平均速度の評価だけでなく、噴流のみかけの密度の推定にも応用できることを示し、噴流構造の巨視的な評価法として有望であることを明らかにした。今年度は、本研究の最終年度にあたり、入射噴流の巨視的な分析法として衝突力測定法を用い、その高速水噴流への適用性について検討した。

1)円筒連続水噴流を平滑なターゲットの表面に垂直に衝突させた場合の衝突力を分析し、その時間平均から運動量の法則に従って入射速度を算出すれば、噴流速度に対する飛翔距離の影響および空中衝撃波発生の影響などの検出が可能となる。2)被衝突物質の壊食に伴う衝突力の変化を実験と解析によって分析し、表面が窪むと時間平均衝突力は一旦増加するが、中央部に壊食孔が生じる。3)壊食孔の深さが増すと衝突力は入射噴流と壊食孔の断面積比に依存する。4)衝突力の精密測定は噴流を構成する水の平均速度の評価だけでなく、噴流の見かけ密度の推定にも応用できる。
噴門部胃癌の発癌特異性:粘膜リモデリングと間質細胞における遺伝子異常の関与の証明

噴門部胃癌は増加しているが、その原因は不明である。粘膜下浸潤胃癌504例をreviewし、領域別(噴門部、中部、下部)に検討したところ、噴門部胃癌は、1.男性に多く、2.喫煙指数が高値で、3.分化型癌が多く、4. Submucosal cystの合併頻度が高く、5.粘膜筋板が肥厚し、6.腸上皮化生が強い、といった特徴が得られた。よって噴門部胃癌では、高度の粘膜remodelingが存在し、上皮のみならず間質にも強い傷害が生じており、間質細胞の遺伝子不安定性・異常があるととが疑われる。以上の背景から噴門部胃発癌は、上皮・間質、特に間質細胞の遺伝子異常が関与し、背景に粘膜remodeliagが影響していることを証明すべく研究を行った。1.臨床病理学的特徴:胃癌間の比較では、上記のような特徴が得られていたが、さらに噴門部胃癌の臨床病理学的特徴を明らかにする為に、非胃癌症例(胃粘膜下腫瘍)をコントロールとして生活歴の比較を行った。結果として胃上部胃癌では、喫煙指数以外に有意にアルコール摂取量が高値であった(P<0.05)。叉、現在までに240例の予後検索をした。5年生存率は90%以上で、領域別差異は見られなかった。2. H. pylori感染:噴門部胃癌におけるH. pylori感染率は63%であった。3.遺伝子異常の検索:噴門部胃癌9例と中部胃癌10例の癌部・非癌部におけるMSI・LOHをNCI推奨マイクロサテライトマーカーと17番染色体マイクロサテライトマーカーを用いて検索した。噴門部胃癌9例中、癌部上皮にてMSIを2例(22%)、LOHを1例(11%)、癌部間質にてMSIを1例(11%)確認した。中部癌10例中、癌部上皮にてMSIを2例(20%)、LOHを2例(20%)、癌部間質にてMSIをO例(o%)確認した。現在までの検討では両群に差異は見られなかった。近年、噴門部胃癌の発生率は増加しており、本施設でも増加傾向を認める。原因は不明であるが、食道と近接する特殊な環境であることより、飲酒や胆汁酸逆流等による持続的胃粘膜刺激が発癌に関与する可能性が高い。そこで粘膜下浸潤胃癌504例をreviewし、領域別(噴門部、中部、下部)に検討したところ、噴門部胃癌では、1.男性に多く、2.喫煙指数が高値で、3.分化型癌が多く、4.SMC : Submucosal cystの合併頻度が高く、5.粘膜筋板が肥厚し、6.腸上皮化生が強い、といった特徴が得られた。この結果から噴門部胃癌では、高度の粘膜remodelingが存在し、上皮のみならず間質にも強い傷害が生じており、間質細胞の遺伝子不安定性・異常があることが強く疑われる。また、remodelingの一過程であるSMCにも遺伝子不安定性・異常があることが推測される。以上の背景から噴門部胃発癌は、上皮・間質、特に間質細胞の遺伝子異常が関与し、背景に粘膜remodelingが影響していることを証明すべく研究を行った。1.対象:粘膜下浸潤癌504例中、噴門部胃癌19例、中部胃癌30例、下部胃癌30例を無作為に抽出。2.DNA抽出:噴門部胃癌10例の癌部・非癌部における、腺管上皮と近接した間質細胞をMicrodissection法にて分離・採取し、DNAを抽出した。4.結果:噴門部胃癌10例中、癌部上皮にてMSIを2例(20%),:LOH:を1例(10%)、癌部間質にてMSIを1例(10%)確認した。

3.遺伝子異常の検索:噴門部胃癌9例と中部胃癌10例の癌部・非癌部におけるMSI・LOHをNCI推奨マイクロサテライトマーカーと17番染色体マイクロサテライトマーカーを用いて検索した。噴門部胃癌9例中、癌部上皮にてMSIを2例(22%)、LOHを1例(11%)、癌部間質にてMSIを1例(11%)確認した。中部癌10例中、癌部上皮にてMSIを2例(20%)、LOHを2例(20%)、癌部間質にてMSIをO例(o%)確認した。現在までの検討では両群に差異は見られなかった。
近世から現代までの東南アジア山地民の移動が国家にもたらした影響に関する研究

本研究は,近世現代の東南アジア山地民の地域間移動が,関係諸国家に与えた影響を明らかにすることを目的とする。従来,山地民は国家に対して受動的あるいは周縁的存在と見られてきた。しかし彼らの越境移動は,関係諸国の国境管理や住民把握に大きな影響を与えており,特に近代以降,移民問題など国家の重要政策課題として立ち現われ,移動の範囲も世界規模となり影響範囲が拡大している。本研究はこの点に注目し,山地民の移動の世界史的インパクトを,史料分析を重視する歴史学的アプローチとオーラルヒストリーによる社会の内面理解を重視する人類学的アプローチを統合する手法により,近世から現代という長期的視野で考察する。
腰痛予防・改善を目的とした体幹後傾運動が腰部血流動態変化に及ぼす影響

近年,体幹前傾保持に起因する姿勢性腰痛に対する予防,治療として立位での体幹後傾運動(後傾運動)が髄核移動の点から推奨される。研究代表者らは多裂筋部の血流動態が体幹前傾位保持で減少,後傾運動で増加することから,血流動態改善も後傾運動の効果に関与する可能性を報告した。しかし,反復した後傾運動は椎間関節を刺激,その結果,不必要な多裂筋活動を引き起こし,阻血状態となる可能性が解剖学的知見から考えられる。本研究の目的は,後傾運動の適切な反復回数と適応を,近赤外線分光法,筋電図,そして筋弾性の検討に普及し始めた超音波せん断波イメージング技術を用いて血流動態の視点から検証し,姿勢性腰痛を予防,改善する筋生理学的根拠を確立することである。今年度は,昨年度課題となっていた反復した後傾運動が腰部血流動態に及ぼす影響を検証した結果,2回目までに血流動態の改善を認めることが明らかとなり,その研究成果を国際論文として投稿するに至った。また,健常者に腰部筋に筋疲労性腰痛を仮想した持久的筋疲労を与えた後の後傾運動の効果をエラストグラフィで検証した結果,後傾運動後では多裂筋弾性率の減少がみられたことから,疲労性腰痛に対する筋弛緩性の疼痛軽減が期待できる可能性が示唆された。その研究成果の中でも後傾運動の有無で比較した内容を国内学会,それらに加えて持久的筋疲労の有無で比較した内容を国際学会にエントリーし採択された。健常者並びに筋疲労性腰痛を仮想した持久的筋疲労に対する後傾運動による血流動態の改善は近赤外線分光法とエラストグラフィによって明らかとなったことから,今後は腰痛を有するものを対象とした検証を行なっていく。所属先が変更となり,その所属機関での業務,実験機材の利用手続きになれるのに時間を有したため.腰痛を有するものを対象とした研究を実施していく.近年、体幹前傾保持に起因する姿勢性腰痛に対する予防、治療として立位での体幹後傾運動(後傾運動)が髄核移動の点から推奨される。研究代表者らは多裂筋部の血流動態が体幹前傾位保持で減少、後傾運動で増加することから、血流動態改善も後傾運動の効果に関与する可能性を報告した。しかし、反復した後傾運動は椎間関節を刺激、その結果、不必要な多裂筋活動を引き起こし、阻血状態となる可能性が解剖学的知見から考えられる。本研究の目的は、後傾運動の適切な反復回数と適応を、近赤外線分光法、筋電図、そして筋弾性の検討に普及し始めた超音波せん断波イメージング技術を用いて血流動態の視点から検証し、姿勢性腰痛を予防、改善する筋生理学的根拠を確立することである。今年度は、超音波せん断波イメージング技術を用いたshear wave elastrography(SWE)による多裂筋部の組織弾性率測定の再現性を検証した。結果、SWEでの多裂筋部の弾性率の測定は体幹角度の違いに関わらず、良好な再現性を示すことが確認された。しかし多裂筋の深層部では体幹屈曲位と体幹伸展位の測定値においては体幹中間位と比較して対象者の個体差の影響が生じうる可能性があるため、体幹中間位での測定が望ましいことが示された。また、体幹伸展運動の反復回数の妥当性については、近赤外線分光法と筋電図を用いた検証を継続実施中であり、今後SWEも用いた検証を行なっていく。従来報告が少ない測定姿勢の違いによるSWEの測定値の再現性を担保するために、測定手法の確立にやや時間がかかったため。

所属先が変更となり,その所属機関での業務,実験機材の利用手続きになれるのに時間を有したため.測定の再現性の確認を終え、また研究代表者は測定機器が全て揃っている研究施設に異動となったため、昨年度以上に研究推進が可能となっている。腰痛を有するものを対象とした研究を実施していく.測定値の再現性の検証に時間がかかったため、その後の測定に必要な経費が次年度使用額として生じた。次年度からは使用機器が全て揃っている施設に異動となったため、当初予定の測定を推進していく予定である。今年度は被験者が近隣在住のため交通費の軽減ができたが,次年度は遠方者を対象とするため翌年度分として使用する..
転写共役修復開始反応の分子機能解析（遺伝性光線過敏症の分子基盤）

28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的を達成するために、以下の3つの課題に取り組んでいる。1)RNA polIIoのユビキチン化におけるUVSSAの役割及び作用機序の検討。2)UVSSAによって誘導される機能的なユビキチン化修飾と、DNA損傷後のTC-NER進行との関連性の解析。3)プロテオミクス解析によるUVSSAと関連する新規NER調節因子及びE3ライゲースの探索。初年度は、課題1)in vitro再構成ユビキチン化反応系の構築と、課題2)RNA polIIoをリビングセルで経時的に観察するシステムの確立(蛍光融合したRNA polIIoの安定発現細胞株の樹立、FRAP(fluorescence recovery after photobleaching)法によるRNA polIIoの損傷箇所での滞留時間測定法の確立等)に取り組んだ。TC-NERのin vitro再構成実験系を確立する事は、本研究の目的を達成するための要となる部分である。再構成系を確立するためには、純度の高いTC-NER関連因子の精製が重要である。現在までに、TC-NER開始反応に必要なTC-NER関連蛋白質(UVSSA, CSA/CSB複合体等)とRNA polII複合体の精製に成功した。試験管内で、リン酸化RNA polII、ユビキチンリガーゼE1/E2/E3、ユビキチン、UVSSA、CSA/CSB複合体等を加えることで、RNA polIIのユビキチン化反応が進行することを確認している。また、GFP融合したRNA polIIoを細胞イメージング技術や生化学的技術を用いて調査した結果、DNA損傷後のRNA polIIoの損傷箇所での滞留時間が、正常細胞、CS細胞、UVSS細胞において異なることが示された。この結果、UVSS患者細胞とCS患者細胞でのRNA polIIoの停止期間の長さの違い、つまり正常な転写が阻害される期間の違いが、TC-NER欠損という共通の細胞応答を示すにも関わらず、臨床症状が大きく異なる(CS:重篤な精神神経症状や早老症等;UVSS:軽微な日光過敏症及び色素沈着)原因であるという仮説の証明に近づいた。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
長鎖シークエンス技術を用いた肝癌の転写異常の包括的解析

肝癌は、世界の癌死の第3位に挙げられる予後不良の癌である。肝癌の発症機序解明や治療ターゲットの発見のために、多くのゲノム研究、転写産物の研究が行われてきた。しかしながら、それらの多くの研究は、読み取り長が短い(短鎖)の第2世代シークエンサーを用いて行われてきた。短鎖シークエンス技術には、短鎖であるが故の原理的限界があり、変異や転写産物の全貌を明らかにすることができない。本研究では、長鎖シークエンス技術を用いて、肝癌の転写異常や変異の全貌を包括的に明らかにし、肝癌発症のメカニズムの解明、治療標的の探索を行う。シークエンスには、Oxford nanoporeシークエンサーを用いることにした。ライブラリ構築手法の検討を行い、最適なライブラリ構築法を決定した。条件検討のため、細胞株から抽出したRNAからcDNAを作成し、シークエンスを行った。短鎖法と比較した結果、発現量はよく一致していた。また、融合遺伝子や新規スプライシングバリアント、エクソン長の変化を検出する手法を開発し、実験的検証を行った。以上の研究により、実験手法およびデータ解析手法をほぼ確立できたと考えている。臨床サンプルの解析に着手しており、融合遺伝子や新規スプライシングバリアント、エクソン長の変化が検出されている。実験的検証を行った結果、精度よく転写異常が検出されていることが示唆されていた。2019年度は、症例数を増やし、発がんやがんの進展に意義のある転写因子の検出を目指す。実験手法の最適化およびデータ解析手法の確立がほぼ終了している。今後症例数を増やす準備が整ったと考えられ、予定通りの進展が見られたと考えている。今後は、症例数を増やして解析を行う。症例数を増やした結果、現在の解析の問題が発見されることも予想され、試行錯誤が必要になると考えられる。また、機能的意義がある発見が見られた場合、分子生物学的解析にも着手する。
人工生命体の研究

ここでいう人工生命体とは、昆虫程度以下の単純さをもつ生物の、システムとしての機能を人工的に実現したもので、たとえば、蟻、蜂、・・・ゾウリムシ、大腸菌・・・・にいたるまで多様な生物を対象としたものが考えられる。これらの行動や運動は人間に比べて単純であるとみなされがちであるが、思いのほか複雑な行動もとる。行動の決定機構が単純であるからといって発現する行動も単純であるとは限らない点が興味あるところである。また、神経の細部についてはかなりいろいろなことが分かってきたが、システムとしての機能については、まだ解明できていない。本研究では、必要といわれながら、あまり本格的には行なわれていなかった工学と生物学との交流を上記のような問題意識を持ちながら推し進めていこうとしたものであった。生物学を専門とする研究分担者が、カイコガの行動の発現について詳しい報告を行ない、制御システム、学習システムを専門とする研究分担者が、そのような発現を促すようなシミュレータを構成して行く、というような形で共同研究が進められた。人工生命体に深くかかわりがあると考えられているカオスやフラクタルについても報告があり、興味深い議論が行なわれた。一方、化学反応における結晶成長や生物における細胞融合など良く似た現象として、自動組立システムが考えられるが、それを実際に行なうためにマイクロ技術(シリコンプロセス等)を用いるという試みについても議論され、今後のこの分野の進方向が少しづつ明らかになった。
上咽頭癌におけるMMP-1の発現および好酸球浸潤と生物学的悪性度に関する研究

1980年から1994年までの15年間に当科にて一次治療を行ない,かつ治療経過が検索可能であった上咽頭癌症例73例を対象とした。73例の5年生存率は58.1%,10年生存率は48.8%であった。ルナ染色にて好酸球浸潤が認められたのは40例で,全体の54.8%であった。その内訳はTATE(Tumor Associated Tissue Eosinophilia)grade1:20例,grade2:9例,grade3:7例,grade4:4例であった。好酸球浸潤のみられた40例の5年生存率は73.5%であり,浸潤のみられなかった33例の46.6%と比較し,良好であった。in situ hybridizationにてMMP(Matrix metalloproteinase)-1 mRNAの発現が認められたのは21例で全体の28.8%であった。発現は分化度の高い扁平上皮癌に求められる傾向があったが,TNM分類や5年生存率との相関はみられなかった。MMP-1mRNAの発現とTATE gradeの関係を検討するとMMP-1mRNAが認められてのはTATEgrade4で2例(50.0%),TATEgrade3で5例(71.4%),TATEgrade2で5例(55.5%),TATEgrade1で4例(20.0%),TATEgrade0で5例(15.2%)とTATEgradeの高い群に多く認められた。また確定診断より2年以上の経過観察が可能で,かつ局所再発,遠隔転移を認めない症例を予後良好例確定診断より2年以内に局所再発もしくは遠隔転移を認めた症例を予後不良例とすると,TATEgradeが4もしくは3のhigh gradeで,かつMMP-1mRNAの発現が認められた7例はすべて予後良好例であった。以上より上咽頭癌における好酸球浸潤およびMMP-1mRNAの発現は予後因子となる可能性が示唆された。今後は症例数を増やすとともに,in vitro,in vivoでの基礎的検討を行なう予定である。
前立腺癌抗原提示能を確立させる樹状細胞内分子機構の解明と創薬への展開

前立腺癌抗原-サイトカイン融合タンパク質を担癌マウスモデルに投与することによる抗癌作用に、液性免疫が関与している可能性が示唆された。抗癌サイトカイン様機能を持つREICタンパク質についても、各種の動物実験系を用いて、またアデノウイルスベクター等による強制発現系を用いた研究を展開し成果を得た。従来、抗癌免疫の確立には、生体内における各種細胞でのMHCクラス1およびクラス2タンパク質の発現と細胞内動態が重要であるとされる。本研究の実施により、これらのMHC分子のエンドサイトーシスと細胞内動態を癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築と一体化して解析する研究系が確立されつつある。本研究では、独自に開発した融合タンパク質群および担癌マウスモデルを用いて、樹状細胞分化の際のどのような細胞内シグナルが癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築に関与するかを明らかにし、樹状細胞の癌抗原提示能を確立させる分子基盤を解明する。さらに、樹状細胞分化・癌抗原提示能獲得の最適化の観点から、難治性前立腺癌に対する新規の癌ワクチン創薬につなげることを目的としている。すなわち、本研究は、「樹状細胞が持つ癌抗原クロスプレゼンテーション機構がどのように構築されるのかを解明」するin vitro研究と、「樹状細胞の癌抗原提示能を確立させる分子基盤の解明と最適化」に関するin vivo研究から成る。この二つの結果を有機的にリンクさせることにより、in vivoでの担癌マウスモデル治療実験でのCTL機能アッセイの結果に基づき、in vitro研究で樹状細胞分化の際のどのような細胞内サイトカイン(様)シグナルや分子のどういった動態が、癌抗原クロスプレゼンテーション機構の確立・活性化(≒癌抗原提示能の増強)に強く関与するかを明らかにすることが可能となる。さらに、クロスプレゼンテーション機構そのもののどのKey分子が、より強く癌抗原提示能を決定するのかを明らかにすることにより、癌抗原提示能を確立させる分子基盤を解明し、樹状細胞分化の最適化の観点から難治性前立腺癌に対する新規の癌ワクチン創薬に展開する為の基盤を確立する。本年度の研究により、マウス生体内に癌抗原ーサイトカイン融合タンパク質を投与することによって、当該抗原に対する抗体の著名な上昇を確認した。癌抗原クロスプレゼンテーション機構を解析する為のマウスモデルが確立されつつある。癌抗原クロスプレゼンテーション機構を解析する為のマウスモデルが確立されつつあり、研究は順調に進展している。本研究は、独自に開発した融合タンパク質群および担癌マウスモデルを用いて、樹状細胞分化の際のどのような細胞内シグナルが癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築に関与するかを明らかにし、樹状細胞の癌抗原提示能を確立させる分子基盤を解明するものである。また、樹状細胞分化・癌抗原提示能獲得の最適化の観点から、難治性前立腺癌に対する新規の癌ワクチン創薬につなげる事を目的としている。本年度は、REICタンパク質のサイトカイン様機能をより深く理解する為に、独自に開発した前立腺癌抗原に対する抗癌免疫活性化治療薬としての癌抗原-cytokine融合タンパク質群を用いた研究を行った。特に、抗癌免疫の主体となる樹状細胞の分化過程で、どのように癌抗原提示能が確立されていくのか、その分子機構をin vivoで解析する為の担癌マウス治療モデルを確立した。さらに当該癌抗原の免疫原生の観点から、投与後の血中抗体を定量測定する方法を確立し、当該抗体量と抗腫瘍効果との正の関連性を明らかにした。4種類のサイトカインをそれぞれ融合させた癌抗原-cytokine融合タンパク質を、それぞれマウスモデルに投与することにより、当該前立腺癌抗原に対する特異抗体の産生量に大きな違いがあることが明らかとなった。また、当該モデルにおいてマウス及び対応するヒト前立腺癌抗原の癌抗原-cytokine融合タンパク質を用いることにより、癌抗原として機能する可能性が高い癌抗原領域を同定した。癌抗原クロスプレゼンテーション機構を解析する為の樹状細胞を獲得する手法が確立されつつあり、研究は順調に進展している。我々は、独自に開発した融合タンパク質群および担癌マウスモデルを用いて、樹状細胞分化の際のどのような細胞内シグナルが癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築に関与するかを明らかにし、樹状細胞の癌抗原提示能を確立させる分子基盤を解明する為の基盤研究を実施してきた。癌抗原としては前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、前立腺特異抗原(PSA)、Prostate specific membrane antigen(PSMA)、Melanoma associatedantigen-A4(MAGEA4)、Extracellular matrix metalloproteinase inducer(EMMPRIN)等のタンパク質に焦点を当てて、これらの前立腺癌抗原を含む融合タンパク質を用いて研究を進めてきた。今回の研究により、サイトカイン(GM-CSFやIL-4等)をそれぞれ融合させた癌抗原-cytokine融合タンパク質を担癌マウスモデルに投与することにより、当該前立腺癌抗原に対する特異抗体の産生量に大きな違いがあることが明らかとなった。研究を進める過程で、当該マウスモデルにおける抗癌作用が液性免疫主体なのか、細胞性免疫主体なのかを明らかにすることができた。抗癌免疫の確立には、生体内における各種細胞でのMHCクラス1およびクラス2タンパク質の発現と細胞内動態が極めて重要である。

今回の研究により、癌抗原の免疫原性の成立が、癌細胞内での抗原タンパク質消化・ペプチド化プロセスと密接に関わっている可能性が改めて示唆された。引き続き研究を継続し、樹状細胞分化・癌抗原提示能獲得の最適化の観点から、難治性前立腺癌に対する新規の癌ワクチン創薬につなげていく予定である。前立腺癌抗原-サイトカイン融合タンパク質を担癌マウスモデルに投与することによる抗癌作用に、液性免疫が関与している可能性が示唆された。抗癌サイトカイン様機能を持つREICタンパク質についても、各種の動物実験系を用いて、またアデノウイルスベクター等による強制発現系を用いた研究を展開し成果を得た。従来、抗癌免疫の確立には、生体内における各種細胞でのMHCクラス1およびクラス2タンパク質の発現と細胞内動態が重要であるとされる。本研究の実施により、これらのMHC分子のエンドサイトーシスと細胞内動態を癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築と一体化して解析する研究系が確立されつつある。本年度に引き続き、樹状細胞が持つ癌抗原クロスプレゼンテーション機構がどのように構築されるのかを解明する。樹状細胞(DC)において癌抗原提示能を確立させる分子基盤を解明する為に、癌抗原提示能の本態である癌抗原を細胞内で抗原ペプチド化し提示する癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築に焦点を合わせる。本年度までの研究にてin vivo条件で癌抗原能を有する前立腺癌抗原の一つを同定した。来年度は当該抗原について樹状細胞分化の際のどのような細胞内シグナルや分子が癌抗原クロスプレゼンテーション機構の確立に強く関与するかを解析する。平成28年度に確立した担癌マウス治療モデルより分離した免疫担当細胞を用いて、樹状細胞分化の際のどのような細胞内シグナルが癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築に関与するかに焦点を当てる。すなわち、それぞれの癌抗原-cytokine融合タンパク質を組み合わせてマウスに投与することにより、分離した樹状細胞の細胞分化シグナルの動態を解析する。これまでに癌抗原クロスプレゼンテーション機構の構築に関与が報告されている分子についても動態を解析する。また、樹状細胞分化・癌抗原に対する提示能獲得の最適化の観点から、難治性前立腺癌に対する新規の癌ワクチン創薬につなげたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。泌尿器科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
中国の経済発展・体制移行と都市-農村格差:世帯・小地域パネルデータによる分析

国際共同研究チームによる世帯・村落データにもとづいて, 2000年代の中国における都市-農村格差を,(1)中国全体の所得分布における都市-農村格差の比重,(2)資産所有における都市-農村格差,(3)地域経済成長率格差の規定要因,(4)地域的公共財供給における農村内・都市-農村格差,(5)社会保障における都市-農村格差,(6)都市-農村の制度的障壁,労働市場における政治・社会関係資本の役割および幸福感などの視角から多面的に分析した。本研究の目的は、1980年代末から2010年前後にわたる世帯・小地域(行政村)のデータベースを構築し、中国の経済発展・体制移行過程における都市-農村格差の変動とその背景要因を分析したうえで、中国政府が近年強化しつつある農村公共政策の意義と問題点を明らかにすることにある。平成21年度には、就業・所得構造とりわけ地域間労働移動の状況(世帯の農業経営状況、世帯員の労働時間配分と非農業活動の状況、外地就業者の就業チャネル・就業地点・職種・収入および仕送りなど)に重点をおく農村世帯調査を実施し、データベース化を開始した。またこれまでに整備済みのデータベースを活用して、農村小地域(行政村)間における世帯所得の成長率の格差に影響する経済的要因と非経済的要因を分析した論文2本(「中国農村的収入増長」、"Growth of Villages")、農村世帯が外的ショック(自然災害)に起因する所得減少に対処するうえで、農村地域社会における社会関係資本(social capital)がどの程度機能しているかを分析した論文1本(「市場化進程中社会資本」)、人的資本・政治的資本(political capital)・社会関係資本が世帯所得形成に及ぼす効果の、時系列的・産業横断的な比較分析を行った論文2本(「誰進入了高収入行業」、"Power as a Driving Force of Inequality in China")を学術誌に発表した。また、平成21年5月には北京師範大学で開かれた国際会議"Workshop on Income Inequality in China"に出席し、本研究の目的と研究枠組み、および作業仮説について報告を行い、参加者から今後の研究に資するコメントを受けるとともに、海外共同研究者と調査計画と研究成果の取りまとめに関する協議を行った。本研究の目的は、1980年代末から2000年代をカバーする世帯・小地域データベースを構築し、中国の経済発展・体制移行過程における都市-農村格差の変動とその背景要因を分析し、格差是正のための公共政策の意義と問題点を明らがにすることにある。平成22年度においては、まず第1に、就業・所得糟造とりわけ地域間労働移動の状況に重点をおく農村世帯調査を継続して行い、データベースの作成を進めた。第2に、社会保障制度の変化が家計の貯蓄に与える影響が世代により異なることを都市居住世帯のケースで明らかにした論文("Public Pension and Household Saving")を国際学術誌に発表した(印刷中、電子版に掲載済み)。この結果は、社会保障政策の導入が農村居住世帯に与える効果を分析するための参照枠組みとなる。また第3に、最も重要な家計資産である住宅を取り上げて、2000年代を通じた農村・都市における住宅資産格差の変動を比較すると共に、住宅資産の決定要因が農村と都市でどのように異なるか、また農村における所得・就業構造の変化や地域間労働移動の進展が住宅資産保有にどのような影響を与えているかを分析する研究を進めた。その中間的成果は、海外共同研究者により、平成23年3月に開かれたAssociation of Asian Studiesの年次総会で発表された。さらに本研究課題による貢献を含む中国家計の長期ミクロデータ構築に関する国際ワークショップ"Workshop on Income Inequality in China 2010"(平成22年5月、北京師範大学)に参加し、長期ミクロデータベースを活用した所得分配と都市-農村格差に関する研究の方向性について、海外共同研究者を含む中国内外の研究者と議論した。本研究では、国際共同研究チームによる世帯・村落データにもとづいて、2000年代の中国における都市-農村格差を、(1)中国全体の所得分布における都市-農村格差の比重、(2)資産所有における都市-農村格差、(3)地域経済成長率格差の規定要因、(4)地域的公共財供給における農村内・都市-農村格差、(5)社会保障における都市-農村格差、(6)都市-農村の制度的障壁、労働市場における政治・社会関係資本の役割および幸福感などの視角から、多面的に分析した。研究の結果、(1)2000年代を通じて都市・農村ともに1人当たり実質所得水準の向上と所得格差の緩やかな拡大が進んだこと、(2)タイル指数などを用いて世帯所得格差を都市・農村内不平等,都市-農村間格差に分解すると、都市の住宅私有化などを反映して2000年代を通じて都市-農村間格差の比重が上昇していること、

(3)農村における絶対的貧困は着実に減少したが、国際比較可能な貧困線(1人1日1.25ドル水準)を用いて推計すると2007年時点で農村人口の13-14%程度がなお貧困層であること、(4)2000年代初めから導入された社会保障制度、就業政策、所得再分配政策など一連の公共政策は、住宅私有化、国有企業優遇、労働移動規制など所得分布を悪化させる要因に一定の歯止めをかけたと考えられるが、農村における公共政策はなお脆弱であること、などが明らかとなった。最終年度である平成23年度においては、データ整備を継続すると共に、研究成果の公表に主眼を置いた。国際学会等で研究発表を4回行い、また印刷中のものを含め国際学術誌へ3本の査読付き論文を発表した。さらに研究成果を一般向けに伝えるために、4回の講演・セミナーを実施した。
交通まちづくりとしての放置自転車対策に関する研究

地球環境問題への対応や健康志向から自転車利用は増加傾向にあり,放置自転車も増加している.これに対して大規模駐輪場の整備と放置自転車の撤去とマナーキャンペーンという従来からの方策では限界がある.本研究では自転車利用の利用実態の把握などから,利用実態に即した駐輪システムの整備,駅を中心としたレンタサイクルシステムの導入が効果的であることを確認した.また,我が国の現状から,まだ本格稼働はしていないが欧州を中心に世界中で拡大しているコミュニティサイクルシステムの動向についても注視する必要がある.地球環境問題への対応や健康志向から自転車利用は増加傾向にあり,放置自転車も増加している.これに対して大規模駐輪場の整備と放置自転車の撤去とマナーキャンペーンという従来からの方策では限界がある.本研究では自転車利用の利用実態の把握などから,利用実態に即した駐輪システムの整備,駅を中心としたレンタサイクルシステムの導入が効果的であることを確認した.また,我が国の現状から,まだ本格稼働はしていないが欧州を中心に世界中で拡大しているコミュニティサイクルシステムの動向についても注視する必要がある.放置自転車「対策」から,魅力あるまちづくりを進めるための自転車「政策」に転換するために,次のような研究を行い実績をあげた.1.放置自転車の駐輪時間把握を行う調査の実施堺市において,自転車カゴに時間毎に色の異なるティッシュを配布し,時間単位で残存量をカウントした.簡易に放置時間の観測ができることを確認でき,他の地域での展開も可能であることを確認した.2.放置自転車台数を削減するためのコミュニティサイクルシステム(以下,CCSと略)調査欧州を中心に近年,導入が進んでいるCCSの実態について,(1)利用対象者を住民に限定しているのか,それ以外の人達も対象としているのか,(2)CCSの導入主体が行政なのか,民間なのかの視点から,パリなど複数の都市へ行き,現地調査とヒアリングを行った.この結果,各都市の導入目的,都市構造,住宅構造などで異なるシステムの導入が行われていることが明確となった.3.自転車の交通行動を把握するためのパーソントリップ調査データの集計解析多様な交通手段の交通行動を把握できるパーソントリップ調査のデータを自転車に注目して集計解析することで,目的別の利用時間分布の差や駅ごとに利用形態の違いを把握することができた.以上の研究結果は,研究協力者の神戸大学冨田安夫准教授及び同大学院生芥川善典の修士論文「堺市における放置自転車対策の事後調査とコミュニティサイクルシステム導入の可能性」にまとめられている.なお,上記2.については,2010年度発行予定の神戸国際大学「経済経営論集第30巻第1号」に掲載予定である.従来から行われている放置自転車の撤去とマナーキャンペーンだけでは,放置自転車を大きく減少させることには限界がある.そこで自転車利用の実態に即した駐輪場,他の手段への転換可能性の把握,コミュニティサイクルなど方策を地域の状況に合わせて組み合わせる総合的な政策が必要である.本研究では,こうした考え方にもとづき,自転車利用の実態をパーソントリップ調査のデータ分析などを用いて確認し,他の交通手段への転換可能性などの検討を行った.パーソントリップ調査は自転車の利用目的と移動の把握や駐輪場所を把握することが出来る特徴がある.堺市を事例として分析を行ったが,駐輪時間分布に応じた柔軟な駐輪場施策を実施することが期待できることが明らかとなった.また,昨年度実施した欧州におけるコミュニティサイクルの実態調査や我が国におけるレンタサイクル事業などから,導入にあたっては地域の自転車利用特性を十分に把握する必要があることが認識できたIT技術を用いて,短時間駐輪と長時間のものについて課金を変更する駐輪システム(長時間のものを多く課金する)の利用実態調査を行った.その結果,駐輪場の利用者の回転率が上がり,放置自転車の削減に繋がることを把握した.また,こうしたシステムの利用者からも,柔軟な課金システムについては好感を持って認知され,放置自転車の減少につながることが明らかとなった.平成23年度は本研究の最終年度にあたり,過去2年間に取り組んできた成果を取りまとめるとともに,諸外国での導入が進み,我が国ではまだ実験段階にあるコミュニティサイクルについて京都市内での導入後における利用状況調査を行った.さらに,この2年間の研究成果をもとに,平成23年11月には多数の専門家や行政担当者と研究成果の共有を行い放置自転車政策の取り組みの進展を図るためにシンポジウムを開催した.3年間の研究で明らかになったことは,(1)放置自転車「対策」だけでは問題に対応できない.自転車利用特性に応じた政策が必要である(2)地域の人たち相互の顔が見える関係だと放置自転車が少ない(3)駅前広場の地下などに大規模な駐輪場整備を行うより,数台十数台規模でも良いので多様の駐輪施設配置を行うことで放置が少なくなる(4)駐輪場の課金は,地域の駐輪の実態に合わせて柔軟に変えることで利用が増加する(放置が減る)(5)コミュニティサイクルは,我が国の都市においては,駅を中心に朝夕の自転車利用を支える「駅りんクン」型が,諸外国のように都市内にステーションを分散配置するものよりも当面は利用性が高い(6)諸外国型のコミュニティサイクルについて一般市民の認知はまだ少なく,我が国での実用化には,まだ時間が必要であると考えられる(7)電動アシスト自転車と通常の自転車では,トリップの長さや坂道での利用が多いなど挙動が異なる.今後は高齢者だけでなく利用が増加すると考えられるので,その対応を考えることが課題となる(8)放置はマナー問題ではなく,ルール違反という認識を共有することが望まれる(9)自転車走行の車道・歩道問題が近年大きな課題となっている.
長期抑制制御分子と小脳シナプス形成機構に関する分子神経解剖学的研究

小脳長期抑制は、登上線維/プルキンエ細胞間シナプスおよび平行線維/プルキンエ細胞巻シナプスにおける神経伝達活動に依存して生ずるシナプス可塑性現象で、運動学習の基盤と考えられている。本研究では、小脳長期抑制に関与している1)イオンチャネル型グルタミン酸受容体δ2サブユニット、2)代謝型グルタミン酸受容体mGluR1、3)蛋白リン酸化酵素PKCγの3種の機能分子に注目して、プルキンエ細胞におけるこれらの分子の発現局在と分子欠損に伴うシナプス形成異常を分子神経解剖学的観点から解析を行った。その結果、δ2サブユニットは胎生期から成熟期に至るまで小脳プルキンエに特異的に発現する分子であることが判明した。その遺伝子ノックアウトは、平行線維シナプスの著明な減少をもたらし、登上線維の成熟が阻害され、小脳長期抑制現象が消失し、運動学習に障害が生じた。これに対して、プルキンエ細胞に高濃度に発現することが知られているmGluR1およびRKCγの分子欠損は、平行線維シナプスの形成には影響を及ぼさなかったが、登上線維シナプスの成熟が著しく阻害され、長期抑制現象が消失し、運動学習に障害が生じた。これらの事実は、イオンチャネル型のグルタミン酸と代謝型グルタミン酸カスケードがシナプスの成熟と可塑性に対して重要な役割を果たしているが、シナプス形成に対する寄与という点ではそれぞれの分子機構が異なる役割を担っていることを示唆している。
自家骨髄幹細胞を利用した歯周組織再生療法

平成14年度は,平成13年度に引き続いて骨髄間葉系幹細胞の分離,培養,増幅と,その細胞移植による歯周組織再生に関しての動物実験を行った。ビーグル犬の腸骨から骨髄液を約1ml採取し,骨髄間葉系幹細胞の分離・培養・増幅を試みた。採取した骨髄液を10%FBS(fetal bovine serum)および1% antibiotics(0.05 units/ml penicillin&0.05 units/ml streptomycin)含有DMEMにて一回washしたあとで上記のmediumにて100mm dishで培養をおこなった。その後34日ごとにmedium changeを三回くり返すことで浮遊細胞を除去し、引き続いて上記のDMEMにbFGF(10ng/ml)を添加して、接着した紡錘形の細胞を間葉系幹細胞として分離した。その後、同様のmediumにて必要量の細胞が得られるまで(約3代)培養および継代をくりかえした。次に,この細胞の歯周組織再生に及ぼす影響を検討するため,担体とともに実験的歯周組織欠損モデルに移植し,組織観察した。ビーグル犬に3級根分岐部病変モデルを作成し,コラーゲンゲルとともに移植した。術後1カ月の組織標本を作製し,組織計測,形態観察を行った。細胞移植群では,歯槽骨再生と共に,セメント質再生と一定の幅をもった歯周靭帯組織が観察された。骨性癒着像は認められず,適切な歯周組織の回復が確認された。再生歯周靭帯組織のコラーゲン線維は,アザン染色で歯根面に挿入されている像として観察された。また,再生セメント質はトルイジンブルーで濃染する像として認められた。組織計測では,移植細胞濃度2×10^6cells/100μlで最も顕著な歯槽骨再生が認められ,この濃度をピークとしていた。セメント質再生に関しては,移植群と対照群ではその再生量に差が認められ,2×10^6cells/100μlで最高値を得た。これらの結果から,歯周組織欠損部への骨髄間葉系間細胞移植は歯周組織再生に関して有効であり,これまでの再生療法と異なり,セメント質再生に有効に働くことが示された。平成13年度は,骨髄間葉系幹細胞の分離・培養・増殖と,その細胞移植による歯周組織再生の動物実験を行った。術後1ヵ月の組織標本を作製し,組織計測を行った。その結果,歯槽骨再生率は,移植細胞濃度2×10^6cells/100μlで担体のみのコントロールと比較し,有意に高い値を示した。また,セメント質再生率は移植細胞濃度2×10^5cells/100μlでコントロールと比較し有意に高い値を示した。これらの結果から,歯周組織欠損部への骨髄間葉系間細胞移植は歯周組織再生に関して有効であることが示された。

ビーグル犬の腸骨から骨髄液を約1ml採取し,骨髄間葉系幹細胞の分離・培養・増幅を試みた。採取した骨髄液を10%FBS(fetal bovine serum)および1%antibiotics(0.05units/ml penicillin&0.05units/ml streptomycin)含有DMEMにて一回washしたあとで上記のmediumにて100mm dishで培養をおこなった。その後34日ごとにmedium changeを三回くり返すことで浮遊細胞を除去し、引き続いて上記のDMEMにbFGF(10mg/ml)を添加して、接着した紡錘形の細胞を間葉系幹細胞として分離した。その後、同様のmediumにて必要量の細胞が得られるまで(約3代)培養および継代をくりかえした。次に,この細胞の歯周組織再生に及ぼす影響を検討するため,担体とともに実験的歯周組織欠損モデルに移植し,組織観察した。ビーグル犬に3級根分岐部病変モデルを作成し,コラーゲンゲルとともに移植した。術後1ヵ月の組織標本を作製し,組織計測,形態観察を行った。細胞移植群では,歯槽骨再生と共に,セメント質再生と一定の幅をもった歯周靭帯組織が観察された。骨性癒着像は認められず,適切な歯周組織の回復が確認された。再生歯周靭帯組織のコラーゲン線維は,アザン染色で歯根面に挿入されている像として観察された。また,再生セメント質はトルイジンブルーで濃染する像として認められた。組織計測では,移植細胞濃度2×10^6cells/100μl最も顕著な歯槽骨再生が認められ,この濃度をピークとしていた。セメント質再生に関しては,移植群と対照群ではその再生量に差が認められ,2×10^6cells/100μlで最高値を得た。これらの結果から,歯周組織欠損部への骨髄間葉系間細胞移植は歯周組織再生に関して有効であり,これまでの再生療法と異なり,セメント質再生に有効に働くことが示された。
骨細胞由来の未知の破骨細胞形成抑制液性因子の同定とその作用機構の解明

本研究は、骨細胞由来の未知の破骨細胞形成抑制因子を同定し、その分子による破骨細胞形成抑制機構を明らかにすることを目的としている。未知の因子を明らかにする方法として、10%濃度の血清を含む株化骨細胞MLO-Y4細胞の培養上清(10%FBS-αMEM-Y4-CM)からタンパク質を分離精製し、目的タンパク質を同定し、タンパク質のアミノ酸配列に対応する遺伝子を明らかにすることが必要であると考え、平成27年度から研究を行ってきたが、平成28年度から平成29年度の間に研究代表者が休業したことに関連して、研究の進歩状況が当初の計画よりも遅れた。平成30年度はまず、回収し貯蔵した10%FBS-αMEM-Y4-CMを3000から100000の間のnominal molecular weight limit (NMWL)のfilterででタンパク質を分画し、5群または10群に分け、破骨細胞形成系に作用させ、どの分子量群の培養上清に破骨細胞形成抑制効果がみられるか実験を行った。しかし、群間の比較で分子量の範囲を特定する結果は得られず、これには、10%FBS(タンパク質)を添加していることが影響している可能性が考えられた。しかし、10%のFBS濃度は、それまでの実験系維持とMLO-Y4細胞の培養維持の両者ために決定した濃度であり、濃度を下げるまたは無くすことはできなかった。そのため、本年度は最終年度であり、可及的速やかに目的に近付くための対処として別の方法を検討した。そして、初代骨細胞を骨基質に埋入したまま培養し(単純に培養した群や、とある薬剤を添加して培養した群を準備した)、そこから回収したRNAに関して、マイクロアレイ解析を行った。解析の結果、本研究目的タンパク質の同定に向けて、検討を進めたい遺伝子が数種類確認できた。強靭な骨の大部分は、骨吸収静止状態にあると考えられ、骨吸収静止状態に制御する機構として、骨格中に張り巡らされた骨細胞ネットワークによる監視・統制つまり骨の内部からの、骨細胞による負の破骨細胞制御機構が考えられる。本研究代表者は、骨細胞由来の破骨細胞形成抑制因子のひとつとしてinterferon (IFN) -βを見出し、その過程で、骨細胞由来の未知の破骨細胞形成抑制因子が他にも存在すると示唆された。本研究では、その未知の因子を明らかにすることを目的としている。IFN-βを同定した研究での株化骨細胞MLO-Y4細胞の培養上清(MLO-Y4-CM)は、10%FBS-αMEMを用いたMLO-Y4-CM(10%FBS-αMEM-Y4-CM)だったが、今回、タンパク質精製実験を行う過程での血清の影響を除去するために、まず無血清のαMEMを用いようと試みた。しかし、無血清では2日の培養期間にMLO-Y4細胞が死滅していくことが確認された。そのため、1.0%FBS-αMEMを用いたMLO-Y4-CMを回収し、このCMに破骨細胞形成抑制作用があるか否か、また、このCMを用いることでIFN-β以外の破骨細胞形成抑制因子を同定していく研究が成立しそうか否か、まず検討することとなった。その結果、1.0%FBS-αMEM-MLO-Y4-CMの破骨細胞形成抑制効果は確認された。しかし、10%FBS-αMEM-Y4-CMと比較して、IFN-β以外の破骨細胞形成抑制因子が存在すると考えられる傾向が、顕著には認められなかった。そのため、タンパク質精製作業は複雑困難にはなるが、10%FBS-αMEM-Y4-CMを用いて目的タンパク質を同定するための実験を進めていくことに決定した。平成27年度の計画目標は、株化骨細胞MLO-Y4細胞の培養上清を計50 L回収しタンパク質を分離精製し、目的タンパク質を同定し、タンパク質のアミノ酸配列に対応する遺伝子を明らかにすることであった。しかし、IFN-β以外の破骨細胞形成抑制因子を、タンパク質精製によって同定するための、MLO-Y4細胞の培養条件の決定に、予期せぬ困難が生じたため、当初の計画よりも進行が遅れた。さらに、本研究は、研究代表者のみで行う研究であるが、タンパク質精製のための低温室での実験が研究代表者の体調において危険有害業務と判断されるため、実験が進められないという事態が重なり、当初の計画よりも遅れている。強靱な骨の大部分は、骨吸収静止状態にあると考えられ、骨吸収静止状態に制御する機構として、骨格中に張り巡らされた骨細胞ネットワークによる監視・統制、つまり骨の内部からの骨細胞による負の破骨細胞制御機構が考えられる。本研究代表者は、骨細胞由来の破骨細胞形成抑制因子のひとつとしてinterferon (IFN)-βを見出したが、その過程で、骨細胞由来の未知の破骨細胞形成抑制因子が他にも存在すると示唆された。