hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Nanofluidic法を用いた肺炎症例の肺炎球菌血清型サーベイランスの構築

肺炎球菌は、髄膜炎や肺炎において最も重要な起炎菌の一つである。肺炎球菌は表面抗原によって約100種類に分類(血清型)される。現在国内では肺炎球菌ワクチンは2種類あるが、一部の血清型(約100種類のうち13種類と23種類)のみカバーするため、血清型の疫学は2種類のワクチンの効果を推定するためにも重要である。この研究ではnanofluidicテクノロジーを用いたPCRという技術によって、一度に50検体から50の血清型の遺伝子を検出できる方法を開発し、その有効性を試した。ベトナムの子供の咽頭に定着した肺炎球菌や日本における成人肺炎球菌性肺炎の起炎菌の血清型分布を検討し、非常に有用であった。H25年は、システムの有用性の確認と、収集サンプルの処理に時間を費やした。ベトナムの小児コホートで得られた小児のレントゲンで確認した肺炎の52検体(咽頭拭い液)から、LytA陽性のサンプルをnanofluidic技術を用いて血清型を解析し研究協力者が論文として出版した。この研究によって、この技術の正確性と再現性を確認することができた。(Journal of Medical Microbiology 2014;63:528)これにより、本格的に成人肺炎コホートへの利用が可能である段階に至った。現在、保存された成人肺炎コホートの喀痰サンプルのDNA抽出と、一般細菌(肺炎球菌、インフルエンザ菌、モラキセラ)および非定型菌(マイコプラズマ、クラミドフィラ、レジオネラ)のスクリーニングPCRを推進している。現在は一年目(合計約1600検体)のサンプルの処理を続行しており、サンプルは二年分を収集している(合計3000検体程度)。DNA抽出が済んだものから、nanofluidic技術を用いたPCRで血清型を同定しているが、この中で、一人の患者の検体から複数の血清型が分離されるケースが、これまで考えられていたよりも多い事が明らかとなった。このことは今後のワクチン政策を考慮する上で重要である。また、培養陽性の保存菌株の従来法(菌の膨化反応)による血清型分類も同時に進行しており、この結果とnanofluidic技術を用いた結果との整合性を確認するに至った。これまでの成果から、研究方針を分離菌の本技術と従来法の二法による血清型決定、喀痰から直接抽出したDNAを用いての本技術での血清型決定を行うこととした。引き続き、全国成人肺炎研究で得られた検体の解析を行った。その内訳は、1喀痰から直接DNA抽出を行い、PCRでLytAを検出してのち血清型用マルチプレックスPCRにかける、2分離菌株を培養して胆汁溶解試験やオプトヒン試験で確認、その後DNAを抽出してLytAのPCRを行いマルチプレックスPCRにかける、3継代に失敗した保存株のビーズを生食に溶解してDNA抽出を行ってPCRを試みた。これによりほとんどのデータを得るに至ったが、一部、通常方法による肺炎球菌のPCR結果と一致しないものがあり、ともに再検を行っている。得られた結果については、臨床情報(喀痰培養の結果やグラム染色所見、抗生物質の効果など)をあわせて解析を行い、複数血清型の検出もあわせて血清型との関連を解析している。また、従来法である莢膜膨化反応による血清型同定との一致率を検討して、血清型分布をより正確なデータとして求め、以前の他の報告から得られた10年前の血清型分布と比較して蛋白結合型肺炎球菌ワクチン導入後の血清型置換の有無を検討する予定である。nano-fluidic multiplex PCRによる肺炎球菌の血清型の決定法を確立し、ベトナムの小児で鼻咽頭ぬぐい液への定着を検討し、その有用性を確認した。これをもとに、国内における成人の肺炎のコホート研究のサンプルを使用し、成人における肺炎球菌性肺炎の血清型分布を検討した。喀痰を二年間約2600収集し、これからまず呼吸器病原細菌とウイルスのマルチプレックスPCRを行い、一年目のデータを論文として報告した。ここで抽出したDNAを用いて、あらためてlytA遺伝子の有無をPCRで検出し、さらにnano-fluidic multiplex PCRを用いて肺炎球菌の血清型を決定した。協力施設の1つでは、尿中抗原により血清型を決定できる方法と分離株の膨化反応と本法による結果を比較して、それぞれの検査特性を明らかにした。また、PCRによる肺炎球菌の検出の有用性を明らかにすることができたため、ワクチンの効果を検証するデータ解析にも用いた。最後に、二年分の肺炎球菌性肺炎の血清型分布を従来法とあわせて集約して、論文として報告する予定である。検査法の確立と、これを成人の肺炎における疫学調査には十分に生かすことができた。来年度中にデータを論文として報告する予定である。一方、計画していた薬剤耐性遺伝子を検出するためのPCRの開発には至らなかった。これは、薬剤耐性遺伝子の解析のためフルゲノムシークエンスを用いた他の研究を行っていたが、これが計画より遅れたため、PCRによる検出方法の開発まで行うことができなかった。nano-fluidic multiplex PCRを用いた肺炎球菌の血清型決定法を確立し、ベトナムの小児における咽頭ぬぐい液をもちいて有用性を確認した。これをもとに、国内における成人肺炎の前向きサーベイランスの喀痰検体を用いて、成人における肺炎球菌性肺炎の血清型を検討した。

喀痰は二年間で約2600検体収集し、ニューモリジン遺伝子のスクリーニングPCRで陽性となった検体のみを対象とした。この検体をもちいて、血清型を検討した。スクリーニングPCRの陽性率は17.2%21.5%であり、若干施設間で差がみられたが有意なものではなかった。年齢別では70%が65歳以上であり、62%が男性であった。この技術を用いた研究の特徴的な実績としてあげられるのが複数血清型の検出である。従来の培養法では1種類の菌株しか釣菌していなかったのでわからなかったことだが、本法により一人の患者から複数の肺炎球菌の血清型が検出されることがわかった。スクリーニング陽性516検体のうち複数血清型が検出されたのは205検体であり、その頻度は39.7%であった。DNA量を検討したところ、一番目の菌と二番目の菌は有意差をもって多かったが、二番目、三番目、四番目では有意差がなかった。これまでに知られていない「肺炎球菌複数血清型が原因と思われる肺炎」の実態を把握することができた。測定したDNA量の、臨床的意義やワクチン効果に対する考えかたを含めて考察し、論文として発表する準備を行った。肺炎球菌は、髄膜炎や肺炎において最も重要な起炎菌の一つである。肺炎球菌は表面抗原によって約100種類に分類(血清型)される。現在国内では肺炎球菌ワクチンは2種類あるが、一部の血清型(約100種類のうち13種類と23種類)のみカバーするため、血清型の疫学は2種類のワクチンの効果を推定するためにも重要である。この研究ではnanofluidicテクノロジーを用いたPCRという技術によって、一度に50検体から50の血清型の遺伝子を検出できる方法を開発し、その有効性を試した。ベトナムの子供の咽頭に定着した肺炎球菌や日本における成人肺炎球菌性肺炎の起炎菌の血清型分布を検討し、非常に有用であった。システムの開発、ベトナムの検体の処理、国内成人肺炎の検体の処理と順調に進んでいるから。今後は、これまで集積したデータを公開することを第一に行う。全国成人肺炎疫学研究で収集した約3200症例の肺炎から採取された検体を用いて、成人肺炎球菌性肺炎の血清型分布を明らかにして発表する。また、本法と従来法、尿中抗原で血清型を決定する方法の有用性について、それぞれ比較した成果をも解析して論文として発表する。薬剤耐性遺伝子の解析の推移をみつつ、マルチプレックスPCRで検出する方法の構築を検討する。感染症内科学これまでのデータの確認作業と、整理、解析を行い、論文とする。一方で遺伝子型によるタイピング(MLST)も別の研究として進めており、得られたデータを照合して肺炎球菌の分子疫学に貢献する成果を目指す。ベトナム小児の解析が順調に進み、また、成人肺炎のサンプル収集と解析作業には時間を要するが、滞りなく遂行している。尿中抗原とnano-fluidic PCRと培養結果との間に、PCRでは複数血清型が検出されるなどの新しい解釈の必要な事態が発生した。これについて、検証作業を行い、また論文として発表するための時間、費用を見込んで一年間延長した。これまでのデータをもとに、臨床情報を検証し、複数血清型の意義について解析を加え、論文として作成し、発表する。ひきつづき、計画通り収集されたサンプルを処理して、データ化していく。おおむね予定通り使用したが、試薬の購入が予定よりも少なかった。
生体機能分子を中心とする欧米諸国との国際共同研究によるバイオサイエンスの総合化

蛋白質や核酸などの生体機能分子に関する研究を軸として、欧米諸国との国際共同研究を実施するための方策について協議を行った。第1回目の会議は5月21日に日本学術会議内において行い、国際共同研究のこれまでの経緯について説明した後、今後の国際共同研究の進め方について大枠の決定をした。その結果、動物・植物・微生物・バイオセンサ-の4分野について英米独仏との国際共同研究を行うことが決定され、その方策を探ることとした。第2回目の会議は8月23日に開催され、先に決定した4分野の国際的な研究動向が各研究分担者から説明された。第3回目の会議は12月3日4日にかけて開催され、上述の4分野における国際共同研究の素案を作成した。今後の国際共同研究に際しては、日本と英米独仏の各国との合同会議を特定のテ-マについて適宜開催するとともに、若手研究者を中期派遣することで実質的な共同研究が可能となると考えられ、科学研究費の申請を活発に行うこととなった。このような共同会議のテ-マについても上述の4分野の研究実状に合わせて具体的な提案がなされた。1月には外国人研究者の受け入れを活発に行うことで国際共同研究を実施している農林水産省熱帯農業研究所を訪問し、その具体的な実施方法と問題点について現地調査した。また、平成3年度までに研究代表者や研究分担者が関与して実施してきた欧米諸国との国際共同研究の実施例やその時の相手側研究者との打ち合わせについても協議を行い、英米独仏の4ケ国は政府レベルでの対応が決定されており、日本側も今後は国際共同研究に対応する特定の組織が必要であるとの結論に達した。今後は本研究の研究代表者あるいは研究分担者を中心に科学研究費(国際共同研究)を申請しつつ、実質的な国際共同研究を行う予定である。
真核生物組換え蛋白質の機能解析

遺伝的組換えは真核生物で減数分裂期組換え、抗体遺伝子の再編成、細胞周期の制御に関わり、生物の多様性、遺伝子発言制御に重要な役割を担っている。平成7年度の共同研究では、組換え反応に直接関与し、しかも、構造が大腸菌RecAと類似のRad51とDmcl蛋白と組換えを行う蛋白質複合体の形成を促進するRad52蛋白、減数分裂期組換え開始機構について主に解析した。1組換え遺伝子産物の発現磁気と減数分裂期の染色体上での分布を免疫学的手法で解析し、その動的挙動をユリ、マウスで解析した。ユリを用いて、Rad51、Lim15(Dmcl homolog)が染色体の対合に共同して働くこと、マウスを用いて、その後、Rad51がシナトネマ複合体の構成成分になり、更にキアズマ形成に関与し染色体交換反応を行うこと、Lim15蛋白はパキテン期からダイキネシスの間染色体の両端に存在し、テロメアの組換え、あるいは、染色体分配に関与することを示した(小川智子)。3 Rad52,Rad51とRPA(ssDNA結合蛋白)蛋白を精製し、RPAとRad52が直接相互作用すること、そこへRad51が結合して安定なヌクレオプロテインフィラメントを形成することを見つけ、Rad52蛋白がリコンビノソーム形成の開始を促進することを提唱した。(篠原)4酵母Dmcl蛋白質を精製し生化学的活性の検出を行った。また、これらの二重変異株のDNA鎖切断の修復と組換え、染色体構造の変化の関係を解析し、減数分裂期組換えでこれら類似蛋白質の役割分担を明かにした(Bishop)。5組換え開始にMRE11、RAD50、XR2遺伝子が複合体を形成して二重鎖切断を行うこと、RNA結合蛋白であるMre2とMre1がMre2RNAのSplicingを行って、減数分裂期組換えの開始を制御していること等を明らかにした(小川英行)。6組換え中間体のホリデ-構造の解離に関わるRuvB蛋白とDNAが結合した電子顕微鏡写真のイメージでRuvB蛋白の立体構造を解析した。RuvBとDnaBはどちらもヘリケース活性を示すが、全く異なったアミ酸配列を持つ蛋白質でありながら、電子顕微鏡による観察では両者がほぼ同じ構造を持つことを示し、蛋白質の3次構造が機能に反映されることをしめした(Egelman)。7 Rad52蛋白質構造解析を行いRad52が6量体でリング状の構造を形成すること、この構造体のDNA結合性、Rad51またはRPAとの相互作用の仕方を電子顕微鏡観察で明かにしようと試みている(篠原、小川智子、Egelman)。遺伝的組換えは真核生物で、減数分裂期組換え、抗体遺伝子の再編成、細胞周期の制御に関わり、生物の多様性、遺伝子発現制御に重要な役割を担っている。

平成6年度の共同研究では、減数分裂期組換えに直接関与し、しかも、構造が大腸菌RecAと類似のRad51とDmc1蛋白と組換え開始機構について主に解析した。1組換え遺伝子産物の発現時期と減数分裂期の染色体上での分布を免疫学的手法で解析し、その動的挙動をユリ、酵母、マウスで解析した。特に染色体構造で減数分裂期の進行が明確にできるユリを用いて、Rad51、Lim15(Dmc1 homolog)がレプトテン期で同じ位置に存在し、パキテン期ではRad51が異なった様式で染色体上にあることを示した(小川智子)。2酵母ではRad51がDmc1の染色体への結合に必要であることを示した(Bishop)。3 Rad51とDmc1蛋白の精製、生化学的活性の検出を行った。また、これらの二重変異株のDNA鎖切断の修復と組換え、染色体構造の変化の関係を解析し、減数分裂期組換えでこれら類似蛋白質の役割分担の解明に迫った(篠原、Bishop)。4組換え開始にMRE11、RAD50、XR2遺伝子が複合体を形成して二重鎖切断を行うこと、RNA結合蛋白であるMre2とMerlがMer2RNAのSplicingを行って、減数分裂期組換えの開始を制御していること等を明らかにした(小川英行)。5組換え中間体のホリデイ構造の解離に関わるRuvB蛋白とDNAが結合した電子顕微鏡写真のイメージでRuvB蛋白の立体構造を解析した(Egelman)。6大腸菌での組換え開始の研究を精力的に行っているKowalzckowski博士(米国)が特別研究協力者として来日し、組換え開始機構の一般性について討議した。
音楽の進化心理学：事象関連電位研究

"No music, no life"などいう言葉があるが、言語や他の高次脳機能と異なり明らかな適応的意義の見当たらない音楽が、何故どのように進化したのかは不明である。本研究は、霊長類における音楽の進化を調べるために、頭皮上誘発電位(ERP)記録というこの研究分野において新しい方法論を導入し有用性を検討した。様々な音刺激に対するERPをヒトとサルで比較したところ、聴覚野においける音処理の時間スケールがヒトにおいて延長していることを示唆する結果が得られた。言語や他の高次脳機能と異なり、明らかな適応的意義の見当たらない音楽は、何故どのように進化したのだろうか。本研究は、従来の行動指標の代わりに事象関連電位を用いて、音楽の系統発生を探る試みである。すなわち、和音やメロディーなどの様々な音楽刺激に対する事象関連電位を種間比較することにより、これらの音楽刺激の脳処理の進化を明らかにすることを目的とする。3年実験計画の初年度にあたる本年度は、マカクザルを対象に、無麻酔で頭皮上から聴覚事象関連電位を記録するための方法論を確立することを目指した。無麻酔・無侵襲で脳波記録を行うため、チェアを用いて必要最低限の保定をしたことと頭部を剃毛した以外は、ヒト脳波記録と全く同じ方法で、頭皮上の9箇所(F3, F4, C3, C4, P3, P4, Fz, Cz, Pz)、左右の耳朶、左眼窩左下に、ヒト用のコロジオン電極を設置した。その上で、スピーカーから提示した和音や純音刺激に対して、聴覚事象関連電位が安定して再現性よく記録できることを確認した。次に、1頭のアカゲザルを対象に、刺激間時間間隔を様々に変えた周波数弁別オドボール課題でミスマッチ陰性電位を記録するなど、いくつかの探索的な実験を行った。結果、ヒトとサルでは、聴覚処理の時間幅(temporal window of integration)が異なることが示唆されるなど、いくつかの興味深い知見が得られた。言語や他の高次脳機能と異なり、明らかな適応的意義の見当たらない音楽は、なぜどのように進化したのだろか。本研究は、従来この研究領域において広く用いられてきた行動指標の代わりに、事象関連電位を用いることによって音楽の系統発生を探る、新しい試みである。すなわち、和音やメロディーを始めとする様々な音楽刺激に対する事象関連電位をヒトを含む様々な霊長類で種間比較する事により、これらの聴覚刺激の脳処理の進化を明らかにする事を目的とする。3年実験計画の2年目にあたる本年度は、無麻酔のアカゲザルの頭皮上から、最大で21チャンネルの脳波を無侵襲で記録するための方法論を独自に確立した。そのうえで、アカゲザル3頭を対象とした実験で聴覚事象関連電位の外因性皮質成分(mP1, mN1, mP2, mN2, mSP)を世界で初めて同定して命名した(英文査読誌投稿中)。さらに、12頭のアカゲザルを対象とした予備的実験をいくつか行い、純音や和音刺激の提示条件(主にstimulus onset asynchrony)を変える事による聴覚事象関連電位成分の振幅の変化を評価し、ヒトとの違いに着目して解析した。結果、ヒトとマカクザルでは、聴覚処理の時間幅が(temporal window of integration)が大きく異なる事が、明らかになってきた。明らかな適応的意義の見当たらない音楽は、何故どのように進化したのだろうか。本研究は、従来の行動指標の代わりに事象関連電位(ERP)や誘発電位(EP)を用いて、音楽の系統発生を探る試みである。昨年度までの研究で、マカクザルを対象に、無麻酔かつ無侵襲で頭皮上からERP/EPを記録するための方法論を確立した(Itoh et al., 2015)。この方法により、頭皮上の最大19チャンネルから、純音刺激に対する聴覚EPの後期成分を記録し、mP1, mN1, mP2, mN2, mSPの各成分を世界で初めて同定・命名することに成功した。本年度は、これらのEP成分が、純音刺激提示の時間特性(刺激持続時間、刺激間無音間隔)にどのように影響を受けるか検討した。結果、特にN1(mN1)以降の成分について、刺激持続時間や刺激間無音間隔の変化がEP振幅に与える影響には、ヒトとマカクザルの間に顕著な種差があることが分かった。脳の進化に伴い、ヒトで聴覚処理の時間窓が延長していることを示すと解釈できる結果であり、成果をまとめている(Itoh et al., in preparation)。最終年度となる予定であった本年度は、マカクザルの脳波記録と並行して、マーモセットの対象とした無侵襲の脳波記録の方法の新規開発に挑戦した。しかし、ヒトでの方法論をほぼそのまま適応できたマカクザルとは異なり、動物の保定法や脳波記録電極などにつきゼロベースで検討する必要があるため、準備と試行錯誤に想定以上の時間を要している。事業期間の延長によって、これを達成したい。最終年度である本年の成果は大きく2つにまとめられる。(1)マククザルを対象とした実験では、前年度までに行ってきた各実験につき、対象個体数を増やすことによって、結果の信頼性を向上させた。従来の文献では、通常2頭程度のみからしか記録をしていない。しかし、本研究を通じて、サルの事象関連電位にも、ヒト事象関連電位と同程度の個体差があることが分かった。そこで、本研究では各実験につき4ー6頭の標本数を確保した。結果は海外や国内の学会で発表し、論文にまとめている。

(2)マーモセットを対象とした実験では、頭皮上からの無侵襲の聴覚誘発電位の記録に、世界で初めて成功した。電極や保定法を工夫するなどして、2頭から記録を行い、結果の再現性を確認した。"No music, no life"などいう言葉があるが、言語や他の高次脳機能と異なり明らかな適応的意義の見当たらない音楽が、何故どのように進化したのかは不明である。本研究は、霊長類における音楽の進化を調べるために、頭皮上誘発電位(ERP)記録というこの研究分野において新しい方法論を導入し有用性を検討した。様々な音刺激に対するERPをヒトとサルで比較したところ、聴覚野においける音処理の時間スケールがヒトにおいて延長していることを示唆する結果が得られた。世界的にも前例がほとんどない試みであったにも関わらず、予期された技術的な問題は全てクリアされ、実施する全ての実験で確実に成果が得られている。前年度までの成果を受けて、以下2点を進める。(1)マカクザルで得られた結果につき、英文原著論文を作成する。(2)マーモセットを対象として、無侵襲の頭皮上脳波記録の方法論を確立する。脳科学平成25ー26年度の研究により、マカクザルにおける無麻酔・無侵襲での頭皮上脳波記録の方法論が、完全に確立された。平成27年度は、前年度までに行ってきたマカクザル事象関連電位実験の対象個体数を増やして結果の再現性を確認したうえで、成果としてまとめる。また、次へつながる新しい試みとして、マーモセットを対象とした無麻酔・無侵襲の頭皮上脳波記録の方法論の開発に取り組む。初年度の研究により、マカクザルについて、無麻酔・無侵襲での頭皮上脳波記録の方法論を確立した。世界的にも前例がほとんどない試みであり、いくつかの実践上の困難に直面したが、独自の保定法を工夫するなどして解決した。これにより、次年度以降に様々な刺激条件での聴覚事象関連電位を記録する基盤が整備された。主としてマーモセットの実験が予定通りに進展しなかったことから生じた。実験装置の作成や環境の整備が、想定よりも少ない予算で完了した。主としてマーモセットの実験のために用いる。平成26年度の研究により、マカクザルについて、無麻酔・無侵襲での頭皮上脳波記録の方法論を確立し、1頭のアカゲザルを対象とした探索的実験にて、興味深い知見を得た。平成27年度以降は、他のマカクザルで結果の再現性を検討するとともに、さらに様々な刺激条件でマカクザルの事象関連電位を記録し、ヒトの知見と比較検討していく。並行して、マーモセットにおける無麻酔・無侵襲での脳波記録の方法論の確立にも、あらたに着手する。この方法論が整備されれば、ヒト、マカク(旧世界ザル)、マーモセット(新世界ザル)という真猿類の大きな系統分類学上の区分をそれぞれ代表する種からの事象関連電位データの取得が可能になり、研究の視野が大きく広がる。マーモセットを対象とした、新しい実験のための装置の作成や環境の整備に利用する。日程上の都合により出張を延期しために生じた。また、一部のサル用実験機器について、共同研究先の機器を利用することにより、経費を削減することができた。延期した分の出張に用いるほか、次年度以降に行うマーモセットの脳波記録のための実験機器購入・開発費に充当する。
骨延長部に適用したインプラントの咬合と周囲組織のリモデリングに関する研究

顎骨に骨延長を施した領域に埋入されたデンタルインプラントの周囲組織における,咬合機能圧によるメカニカルストレスに対するリモデリングについて形態学的検討を加えた。実験動物としてイヌを用いた.まず,下顎臼歯の抜歯を行い3ヵ月経過したものに対して、顎骨の水平方向への骨延長を行った。骨延長装置は水平的歯槽骨延長装置であるアルベオワイダー^<【○!R】>(オカダ医材)を用いた。骨延長を終了し、待機期間を経た後、同部へチタン合金製のインプラントフィクスチャーを埋入した。用いたインプラントはリプレイスセレクトテーパード(ノーベルバイオケア社製)で頂部の直径3.5mm、長さ10mmであった。インプラントを植立して3ヵ月経過した後、アバットメントとクラウンを装着した。コントロールとしてクラウンを装着しない群、また、過大な咬合負荷状態のモデルとして咬合の高いクラウンを装着した群を設定した。インプラントとその周囲組織を一塊として摘出し、脱灰薄切切片ならびに非脱灰切片を作成し光学顕微鏡にて病理組織学的に観察を行った。その結果、いずれの群においても顎骨の水平的骨延長を行った領域に埋入されたインプラントにおいて,組織学的にオッセオインテグレイションが得られていた.ペリオテスト^<【○!R】>を用いてクラウンを装着したインプラントの動揺度を測定したところ顕著な動揺は認められなかった.また,クラウンを装着しなかった群に比べてクラウンを装着した群ではインプラント周囲の骨形成が良好であった.顎骨に骨延長を施した領域に埋入されたデンタルインプラントの周囲組織における,咬合機能圧によるメカニカルストレスに対するリモデリングについて形態学的検討を加えた。その結果、いずれの群においても顎骨の水平的骨延長を行った領域に埋入されたインプラントにおいて,組織学的にオッセオインテグレイションが得られていた.ペリオテスト^<【○!R】>を用いてクラウンを装着したインプラントの動揺度を測定したところ顕著な動揺は認められなかった.また,クラウンを装着しなかった群に比べてクラウンを装着した群ではインプラント周囲の骨形成が良好であった.骨延長を行った顎骨に埋入されたインプラントの周囲組織について、メカニカルストレスに対するリモデリングについて、形態学的検討を加えた。実験動物としてイヌを用い、まず下顎臼歯の抜歯を行い3ヵ月経過したものに対して、顎骨の水平方向への骨延長を行った。骨延長装置は既に市販されているアルベオワイダー^<【○!R】>を用いた。骨延長を終了し、待機期間を経た後、同部ヘチタン合金製のインプラントフィクスチャーを埋入した。用いたインプラントはリプレイスセレクトテーパード(ノーベルバイオケア社製)で頂部の直径3.5mm、長さ10mmである。インプラントを植立して3ヵ月経過した後、クラウンを装着した。コンートロールとしてクラウンを装着しない群、また、過大な負荷状態のモデルとして咬合の高いクラウンを装着した群を設定した。その結果、いずれにおいても顎骨の水平的骨延長を行った領域に埋入されたインプラント周囲には骨形成が認められた。骨延長を行った顎骨に埋入されたインプラントの周囲組織について、メカニカルストレスに対するリモデリングについて、形態学的検討を加えた。実験動物としてイヌを用い、まず下顎臼歯の抜歯を行い3ヶ月経過したものに対して、骨延長器アルベオワイダー^<【○!R】>(オカダ医材)を用いて顎骨の水平方向への骨延長を行った。骨延長終了後,一定の待機期間を経た後、同部へスクリュータイプのチタン合金製のインプラントフィクスチャーを埋入した。インプラントを植立して3ヶ月経過した後、アバットメントおよびクラウン装着した。コントロールしてクラウンを装着しない群、また、過大な負荷状態のモデルとして咬合の高いクラウンを装着した群を設定した。

その結果、いずれにおいても顎骨の水平的骨延長を行った領域に埋入されたインプラント周囲には骨形成が認められた。インプラント周囲に形成された新生骨の接触率はクラウン装着群でコントロール群に比べて有意に高かった。また、過大な咬合負荷状態を付与した咬合の高いクラウン装着群においては正常な咬合接触を付与したクラウン装着群とほぼ同程度であった。
悪臭センサの開発と官能評価の定量法の確立

近年、窒素酸化物や硫黄酸化物に代表される酸化性ガスによる、地球規模に及ぶ環境汚染が深刻な問題となってきた。これら酸化性ガスは人体の呼吸器に対して有害であるばかりでなく、大気中に拡散することによって酸性雨を生成させる原因ともなる。環境管理を行う際には、発生した酸化性ガスの存在を確実に検知する必要が有り、ガスセンサの開発が叫ばれるようになった。フタロシアニンはp型半導体の性質を有するが故に、酸化性ガスが吸着若しくは接近すると電子を奪われて正孔の数が増加し、電気抵抗値が減少する。この現象を利用したガスセンサの開発が数十年来に亘って続けられてきたが、材料本来の電気抵抗値が大きく測定が困難である、経時変化によって劣化してしまう、等の様々な問題が有り、未だ実用化には至っていない。コバルトフタロシアニン錯体電解析出膜を用いたガスセンサを作製し、ガス検知特性を評価した。2種のセンサ共に、1ppm程度の低濃度のNO_2及びSO_2の存在を検知可能であることが確認された。硫化水素は下水道から発せられる悪臭源であり、人体にとって有毒なガスである。メルカプタン類は都市ガス中の付臭剤として用いられており、臭いを嗅ぐことによってガス漏れの有無を検知することができる。しかしながら、ガスが人体の呼吸器中に入り込むことは好ましくなく、センサデバイスによる検知が望ましい。ペリレン誘導体はn型半導体の性質を有するため、硫化水素やメルカプタン類のような還元性ガスが吸着若しくは接近すると電子が与えられて電気抵抗値が減少する。本研究に於いては、この原理に基づいて硫化水素若しくはメルカプタン類の存在を検知するガスセンサの作製を試みた。3種のセンサのいずれも、1ppm程度の濃度のH_2S及び数+ppb程度の濃度のCH_3SHの存在を検知可能であることが確認された。本年度は、生体酸化酵素モデルとなる高分子金属錯体を合成し得られた高分子金属錯体の持つ悪臭分子分解能について検討を行った。金属錯体として金属フタロシアニン錯体を用い、錯体周辺へのカチオン基の導入による触媒活性の向上及びポリエステル内への金属フタロシアニン錯体の導入による不均一触媒の調整とこれを用いたチオールの酸化分解反応について研究を行った。これらの高分子金属錯体は悪臭分解能を持つことが明らかとなり、さらに悪臭に対するセンシング能も持ち合わせていることから、新規な悪臭センサ用センシング材料への応用が考えられる。これらの成果はJournal of Porphyrins and Phthalocyanines (1,309 (1997),2,31 (1998))に発表した。さらに、センシング能を持つ共役高分子を合成し、金属塩存在化での配位子置換反応を利用した悪臭センサーの開発を行った。共役高分子は、それ自身強い蛍光を持ちこの高分子内にセンシング部を導入することによって目的とする物質の結合による蛍光強度が観測された。これに関しては、Advanced Materials(掲載予定)に発表を行った。

この現象を利用したガスセンサの開発が数十年来に亘って続けられてきたが、材料本来の電気抵抗値が大きく測定が困難である、経時変化によって劣化してしまう、等の様々な問題が有り、未だ実用化には至っていない。コバルトフタロシアニン錯体電解析出膜を用いたガスセンサを作製し、ガス検知特性を評価した。2種のセンサ共に、1ppm程度の低濃度のNO_2及びSO_2の存在を検知可能であることが確認された。硫化水素は下水道から発せられる悪臭源であり、人体にとって有毒なガスである。メルカプタン類は都市ガス中の付臭剤として用いられており、臭いを嗅ぐことによってガス漏れの有無を検知することができる。しかしながら、ガスが人体の呼吸器中に入り込むことは好ましくなく、センサデバイスによる検知が望ましい。ペリレン誘導体はn型半導体の性質を有するため、硫化水素やメルカプタン類のような還元性ガスが吸着若しくは接近すると電子が与えられて電気抵抗値が減少する。本研究に於いては、この原理に基づいて硫化水素若しくはメルカプタン類の存在を検知するガスセンサの作製を試みた。3種のセンサのいずれも、1ppm程度の濃度のH_2S及び数十ppb程度の濃度のCH_3SHの存在を検知可能であることが確認された。
泌乳ラットの性腺刺激ホルモン分泌及び卵巣機能調節における副賢の役割

本研究では,泌乳ラットでの性腺刺激ホルモン分泌調節及び卵巣機能調節機構を解明する一端として,薬理学的及び免疫学的方法を用いて副賢皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)・副賢皮質刺激ホルモン(ACTH)系を活性化させ,黄体形成ホルモン(LH)及び卵胞刺激ホルモン(FSH)分泌並びに卵巣機能に及ぼす影響について検討した。1.薬理学的副賢皮質摘出法による検討Corticosteroneの生合成酵素抑制剤であるMetyraponeを投与して副賢皮質からのCorticosterone分泌を抑制した泌乳ラットを用いて検討した。即ち,泌乳15日のラットの卵巣を摘出し,Metyraponeを投与して泌乳17日に乳子による吸乳刺激実験を行った。その結果、ACTH分泌が促進され,逆に血中LHとFSH濃度が対昭群に比べて著しく低下した。2.免疫学的副賢皮質摘出法による検討抗Corticosterone抗体を投与して内因性Corticosteroneを中和した泌乳ラットを用いて検討した。即ち,泌乳15,17,19日の3回抗Corticosterone血清を投与し,泌乳20日に人絨毛性性腺刺激ホルモン投与による排卵試験法により卵胞発育を調べた結果,抗Corticosterone投与群では,明らかな卵胞発育の抑制が観察された。以上の成績から,泌乳ラットの副賢皮質から分泌されるCorticosteroneの分泌を抑制すると視床下部からCRHが大量に分泌され,そのCRHが黄体形成ホルモン放出ホルモンの分泌を抑制し,下垂体からのLHとFSHの分泌が低下することにより,結果として卵巣での卵胞発育が抑制されたものと推察された。
抗腫瘍性マクロライド抗生物質生合成マシナリーのリデザイン

本研究では、抗腫瘍性マクロライド抗生物質FD-891のポリケチド合成酵素(PKS)の触媒ドメイン間の相互作用機構を解明し、その知見を生かしたPKS遺伝子改変によりスターター部位の異なる類縁体を生合成することを目指した。本研究期間では、スターター部位の生合成に関わるローディングPKSのアシルキャリアープロテイン(ACP)ドメインとアシル基転移酵素(AT)ドメイン、ACPドメインとβ-ケトアシルACP合成酵素(KS)ドメインの相互作用機構を解明するために、分子プローブを用いてクロスリンク反応させた複合体を精製して結晶化を検討した。また、ACPドメインを単独発現させて、単独発現させたATドメインとKSドメインとのクロスリンク反応による複合体化と結晶化を検討した。いずれの条件においても結晶構造解析に供することのできる結晶は得られていないが、クロスリンク反応の効率が複合体サンプルの純度に大きな影響を与えることがわかった。遺伝子改変による類縁体創製に関しては、FD-891のローディングPKSのATドメインを、前年度に生合成遺伝子クラスターを決定したビルストマイシン生合成に関わるPKSの基質特異性の異なるATドメインと入れ換えた。相同性のある酵素構造情報を基に境目を決定して入れ換えた結果、一炭素増炭した類縁体と二炭素増炭した類縁体を生合成させることに成功した。一方、メトキシ基を導入した類縁体の生合成も検討したが、期待した化合物を得ることができなかった。入れ換えたATドメインがACPドメインと相互作用できない可能性、KSドメインがメトキシ基を導入した中間体を認識できなかった可能性などが考えられる。今後はうまくできなかった原因を明らかにして、それを解消すべき遺伝子改変を行い新たな類縁体を生合成する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、抗腫瘍性マクロライド抗生物質FD-891のポリケチド合成酵素(PKS)の触媒ドメイン間の相互作用機構を解明し、その知見を生かしたPKS遺伝子改変によりスターター部位の異なる類縁体を生合成することを目指している。まず、スターター部位の生合成に関わるローディングPKSのアシルキャリアープロテイン(ACP)ドメインとアシル基転移酵素(AT)ドメイン、ACPドメインとβ-ケトアシルACP合成酵素(KS)ドメインの相互作用機構を解明するために、分子プローブを用いたクロスリンク反応を検討することにした。クロスリンク反応は、化学合成した6種類のパンテテインミミック、補酵素A合成酵素とホスホパンテテイニル基転移酵素を用いてACPドメインを化学修飾して検討した。結果として、ACP-ATとACP-KSの組み合わせによりクロスリンク反応の条件が異なることを見いだした。酵素遺伝子改変による類縁体創製に関しては、ローディングPKSのATドメインを基質特異性の異なるATドメインと入れ換えることを計画した。現在のところ、KSドメインとATドメイン間、ATドメインとACPドメイン間の明確な境目に関する情報は得られていないため、相同性のある酵素構造情報から境目を推定して入れ換えを検討した。今年度はまず、ローディングPKSのAT遺伝子に耐性遺伝子を挿入してFD-891非生産株を構築した。今後は、この破壊株のAT遺伝子部分を入れ換えて類縁体創製することを検討する。さらに今年度は入れ換えるためのATドメイン配列情報を蓄積するためにFD-891生産菌のゲノム解読を行い、同生産菌が生産する他のマクロライド抗生物質の生合成に関わるPKS遺伝子を特定した。ローディングPKSの触媒ドメイン間の相互作用解析に関しては、ACPドメインと触媒ドメインをクロスリンクさせるための分子プローブを見いだすことができたため、クロスリンク化された複合体精製と結晶化検討に向けて目処が立った。また、研究対象としている約110 kDaの酵素タンパク質は比較的安定で、結晶化検討に向けての不安定性の懸念が払拭された。本研究で計画しているATドメインの入れ換えに関しては、標的とするATドメイン遺伝子破壊が容易に行えたため、生産菌の形質転換を再現よく行えることを確認することができた。また、入れ換えるためのAT遺伝子の情報を蓄積することができた。FD-891の生物活性発現には、PKSにより構築されるポリケチド骨格(FD-892)がさらにシトクロムP450酸化酵素GfsFによりエポキシ化される必要がある。いくつかのFD-892類縁体を用いてGfsFの基質特異性を解析した結果、FD-892のスターター部位の含むアルキル側鎖部位の有無はエポキシ化反応にはそれほど影響しないことが明らかになった。したがって、本研究で創製することを計画しているマクロライド骨格のエポキシ化反応も進行することが予想された。

いずれの条件においても結晶構造解析に供することのできる結晶は得られていないが、クロスリンク反応の効率が複合体サンプルの純度に大きな影響を与えることがわかった。遺伝子改変による類縁体創製に関しては、FD-891のローディングPKSのATドメインを、前年度に生合成遺伝子クラスターを決定したビルストマイシン生合成に関わるPKSの基質特異性の異なるATドメインと入れ換えた。相同性のある酵素構造情報を基に境目を決定して入れ換えた結果、一炭素増炭した類縁体と二炭素増炭した類縁体を生合成させることに成功した。一方、メトキシ基を導入した類縁体の生合成も検討したが、期待した化合物を得ることができなかった。入れ換えたATドメインがACPドメインと相互作用できない可能性、KSドメインがメトキシ基を導入した中間体を認識できなかった可能性などが考えられる。今後はうまくできなかった原因を明らかにして、それを解消すべき遺伝子改変を行い新たな類縁体を生合成する予定である。ローディングPKSの触媒ドメイン間の相互作用解析に関しては、ACP-AT間, ACP-KS間のクロスリンク反応条件の最適化を図り結晶化検討に耐えうる量の複合体を精製する。また得られる複合体の結晶化を集中して行い構造解析を試みる。これによりPKS触媒ドメイン間における相互作用に関わるアミノ酸残基を特定し、合理的なPKSエンジニアリング手法を提案したい。酵素遺伝子改変による類縁体創製に関しては、上記の構造解析を待つことなくいくつかの境目での遺伝子組換えを検討してFD-891類縁体を生合成する。また上記の構造解析の知見を活かした合理的なATドメインの入れ換えを検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
サービス評価をするために連続数理表現を導入したサービス設計支援システム

サービスを工学的に捉え,工業製品と同様に工学的に設計する対象として,その設計支援システムを構築することを目的とした.「場面遷移ネット(Scene Transition Nets)」を拡張・導入することにより,離散・連続混在システムとしてのサービスをシミュレーションにより評価可能とするサービス評価支援ツールを開発し,レンタルDVDビジネスなどを事例としてサービス設計の有用性を示すことができた.サービスを工学的に捉え,工業製品と同様に工学的に設計する対象として,その設計支援システムを構築することを目的とした.「場面遷移ネット(Scene Transition Nets)」を拡張・導入することにより,離散・連続混在システムとしてのサービスをシミュレーションにより評価可能とするサービス評価支援ツールを開発し,レンタルDVDビジネスなどを事例としてサービス設計の有用性を示すことができた.1.場面遷移ネットとサービス工学との関連に関する研究成果サービスのモデル化手法によって得られた設計事例や知識を蓄積し,新たな設計を行なう際の支援環境として,サービスCADシステムを構築している.これまでにサービス設計を支援するソフトウェアであるService Explorer νが開発されている.Service Explorer νではサービス成立判定の可否を離散事象のモデル化ツールであるペトリネットをベースとしたCPNtoolsを用いていた.CPNtoolsでは連続事象のモデル化が困難であるため,連続・離散混合のモデル化ツールである場面遷移ネットを用いたサービスフロー・シミュレータを開発した.これによって,時間概念などの連続事象もシミュレータで取り扱えるようになった.次に,サービスの提供者と受給者の相互作用が生み出される場概念であるサービス・エンカウンターに着目し,エージェント同士が関わるサービス全体の流れを離散・連続の混合システムのモデル化手法である場面遷移ネットを用いて表現し,サービス・エンカウンターにおける場の影響を考慮した評価を可能とする手法を提案し,その有効性を検証した.2.価値表現に関する研究成果顧客の価値重要度概念と価値の分類を行い,その決定プロセスを価値重要度決定プロセスと呼び,この価値重要度決定プロセスを用いて,レシーバが製品・サービスを受ける際の価値概念のモデル化とシミュレーション可能なシステムを構築した.本シミュレーションにより,製品・サービスを受領後のレシーバの将来的な価値概念の構造化ができるようになった.このことから,構造化された顧客価値概念から将来的に要求される潜在的な価値の予測ができるようにするために新たに価値重要度変化モデルを提案した.今後このような変化を場面遷移ネットの数理モデルで表現できるように検討を進める.3.ライフサイクルデザインと関連する研究成果環境問題解決に向けたライフサイクル設計には,脱物質化や製品・サービスシステムといった考え方を内包している点でサービス工学と共通的な課題が多い.例えば,価値向上と環境問題解決という時に相矛盾する関係を解決しなければならないという点はサービス工学における価値と広義のコストのバランス問題と読み替えることも可能である.ライフサイクル設計の立場から,ライフサイクル設計とサービス工学の共通点と相違を整理しながら,今後,協調して解くべき課題について考察した.また,環境ビジネス事例を分析し,上記1.で評価すべき環境ビジネスアイディア創成支援手法を検討した.1.場面遷移ネット(STN)とサービス工学との関連に関する研究成果STNは、生産システムなどの複雑なハイブリッドシステムや、近年はサービス工学におけるサービスのフローのシミュレーションツールとしての利用が期待されている。モデリングの対象となるシステムによっては、従来のSTNの定義を拡張する必要がある。例えば、サービスフローにおけるレジに並ぶ顧客を表現する場合などである。今年度の研究では、シーンのキャスティングにキャパシティ(容量)の概念を追加することにより、個々のシーンに同時に遷移可能なアクタの数を指定可能とすることを提案し、その機能をSTN GUI Simulatorに実装した。また、確率的な状態遷移の分岐や、正規分布に従って決定される変数のモデルのシミュレータ上での記述方法についても提案した。2.サービス工学における顧客価値に関する研究成果顧客価値については、サービス受給品質に基づく顧客価値モデルの開発や、サービスの実現構造の類似性に基づくサービス間距離を可視化する手法などを開発した。さらに、サービス受給品質について検討し、サービス体験における顧客の満足と評価モデルについて一定の成果を得た。3.サービス問題のシナリオ作成に関する研究成果エコビジネス・アイディア生成支援システムを開発した。また、CD,DVDレンタルビジネスについてその構造を調査し、サービス問題のシナリオを作成する基礎データを開発した。1.サービス設計と場面遷移ネット導入に関する研究成果まず既存のサービスの開発事例を調査分析することにより、「サービスを工学的に捉え、工業製品と同様に工学的に設計するためには、どのようにサービスを見るのか」という視野・視点に関する情報を含む形でのサービスの表現を可能とする統合的なサービスのモデル化手法を提案した。具体的には、サービスをレシーバの状態変化として捕らえた関数関係を場面遷移ネットにおける時間変化システムとして数理的に記述する方法を提案し、さらに本モデルに基づく基本的なオブジェクトをシミュレータ開発用コンピュータ上に実装し、離散・連続混在システムとしてのサービスをシミュレーションにより評価可能とするサービス評価支援ツールの開発を実現した。次に開発したサービス評価支援ツールを実際のサービス設計に適用することにより、その有効性を検証した。まず、サービスの具体的な実行シナリオを設計した後、同シナリオをサービス評価支援ツール上のモデルとして記述し、レシーバの状態変化を場面遷移ネットにおける時間変化として確認可能であること、加えて、モデル上の設計パラメータの変更が同レシーバの状態変化に及ぼす影響を視覚的に把握可能であることを確認した。2.サービス問題のシナリオ作成に関する研究成果CD、DVDレンタルビジネスについてその構造を調査し、今年度はWebアンケートサービスを用いてアンケートを実施し、問題のシナリオを作成する基礎データならびにシミュレーション実験に用いるデータを整備した。そしてサービス設計の有効性について事例を用いて検証した。

さらに、バネモデルに基づく可視化分析手法を提案し、機内サービスとレンタルDVD及び動画配信について性別、年代別での顧客満足を満たすための機能構造を可視化した結果を示した。実験結果では、性別、年代による、顧客価値に関係する機能構造と特徴を可視化することができた。さらに、提案手法を用いることにより、サービスの改善・設計へと反映できる可能性を示した。
コンディショナル遺伝子改変マウスを用いた記憶における海馬ＣＡ２領域の機能解析

近年まで海馬CA2領域はその機能がほとんど未知であった。本研究の目的はCA2神経細胞の記憶に果たす役割の解明である。そこで、CA2選択的遺伝子改変のためCacng5、Rgs14、AbatなどCA2領域に強く発現することが知られている遺伝子を標的として翻訳開始点にDNA組換え酵素Creまたはテトラサイクリントランスアクチベーターを挿入したノックインマウスや、Cre活性またはテトラサイクリン誘導により神経細胞死を誘導できるマウスを作製した。本研究課題により作製された多数の遺伝子改変マウス系統は、今後、海馬と記憶の研究に極めて有用なツールとなることが期待される。海馬は記憶学習に不可欠な脳部位であるが、ごく最近までCA2領域についてはその機能がほとんど未知であった。本研究の目的は、Cre/loxP組換え系およびテトラサイクリン(Tc)誘導系を利用したCA2選択的遺伝子改変マウスの作製、解析によるCA2の神経生理学的特性と、記憶学習を担う神経回路に果たす役割の解明である。まず計画(1)(2)として、CA2選択的な神経細胞死の誘導または神経伝達の阻害をできるマウスや、神経伝達と可塑性に重要な分子のCA2選択的ノックアウト(KO)マウスの作製を試みた。研究開始当初にドライバーマウスとして用いる予定であったRgs14-iCreノックイン(KI)マウスはCA2神経細胞以外にも広く活性が認められため、その他の候補遺伝子(Cacng5、S100b、Abat等)を用いることで、より選択性の高いtTA発現マウスを現在も作製している。最初に樹立したRgs14-iCre/Cacng5-rtTA KIマウスについてはレポーター系統を交配して解析を行ったが、CA2選択的なTc誘導には成功しなかった。Cacng5-iCre KIマウスやRgs14-iCre KIマウスはCreの発現領域選択性が低かったため、CA2選択的GluN1 KOマウス作製は保留したが、Cre依存的/Tc誘導型ジフテリア毒素受容体発現マウスを樹立し、さらにTc誘導型破傷風毒素軽鎖発現マウスを入手できたので、作製した各KIマウスと交配することでCA2選択的神経細胞死誘導または神経伝達遮断が可能になると思われる。計画(3)として、ウイルスベクター等を用いてトレーサー物質をCre活性またはTc誘導によりCA2に限局して発現させ、CA2を介する神経回路網を可視化して明確にする予定であったが、より高い発現領域選択性を持つドライバーマウスを作製中であるため、現在その系統を用いる実験を立案中である。海馬は記憶学習に不可欠な脳部位であるが、海馬CA2についてはその機能がほとんど未知の領域であった。本研究においては、Cre-loxP組換え系およびテトラサイクリン(Tc)誘導系を利用し、CA2選択的遺伝子改変マウスを作製、解析することでCA2の神経生理学的特性と、記憶学習を担う神経回路に果たす役割を解明する。計画(1) CA2のシナプス伝達の阻害や神経細胞死を誘導できるマウスを作製し解析を行う。成果:ドライバーマウスであるRgs14-iCreノックイン(KI)マウスを作製しCreの発現様式を検証した結果、CA2神経細胞に加え、皮質、視床、歯状回等にも活性が認められた。Cacng5-rtTA,tTS KIマウスも樹立し、レポーター系統、FLPドライバー系統との交配を開始した。さらにRgs14-tTA KIマウスもキメラを作製することができた。また、ジフテリア毒素受容体発現マウスについては作製済みであり、破傷風毒素軽鎖発現マウスについては理研バイオリソースに供託されている系統の搬入準備を進めている。計画(2)シナプス伝達、可塑性に重要な分子を標的としてCA2選択的ノックアウト(KO)マウスを作製する。成果:Rgs14-iCre KIマウスを用いてNMDA受容体GluN1サブユニットのCA2選択的KOマウスを作製した。しかし上述の通り、このKIマウスはCreの発現領域選択性が低かったため、解析については保留した。現在は、より選択性の高いS100b-iCre KIマウスを用い、GluN1 KOマウスを作製中である。計画(3)ウイルスベクター等を用いてトレーサー物質をCre活性またはTc誘導によりCA2に限局して発現させることで、CA2を介する神経回路網を可視化して明確にする。成果:より高い発現領域選択性を持つドライバーマウスを樹立した。現在その系統を用いる実験を立案中である。本研究の目的は、シナプス伝達、可塑性を担う分子を主な標的とした海馬CA2選択的遺伝子改変マウスを作製、解析することでCA2の神経生理学的特性と、記憶学習を担う神経回路に果たす役割を解明することである。

この目的を達成するため、計画(1)においては、Cre活性およびTc誘導によりCA2領域のシナプス伝達を阻害する破傷風毒素軽鎖や細胞死の誘導するジフテリア毒素受容体を発現するマウスを作製し、電気生理学的解析、行動学的解析を行うことで、CA2神経細胞の神経生理学的特性や、記憶学習及び社会性行動における役割を明らかにすることを目指した。本研究に用いるマウスのうち、Rgs14-iCre KIマウスは予想以上にCre発現領域選択性が低かったためそのままドライバーマウスとしては使用しなかったが、その他のドライバー系統の作製は極めて順調である。これらの系統と交配させるジフテリア毒素受容体発現マウスは作製済み、破傷風毒素軽鎖発現マウスは入手可能であり、近々にCA2選択的遺伝子改変マウスの作製を可能とした。計画(2)においても、より発現領域選択性の高いS100b-iCre KIマウスを作製したことで、CA2選択的GluN1 KOマウスを作製を可能とした。計画(3)においては上記のS100b-iCre KIマウスに加え、数系統のドライバーマウスを作製したことで、ウイルスベクター等を用いて順行性及び逆行性トレーサー物質(小麦胚芽レクチン及び破傷風毒素c断片)をCre活性またはTc誘導によりCA2に限局して発現させることを可能とした。以上のことから、研究は概ね順調に進展していると評価する。計画(1)(3)から得られた結果をさらに発展させ、CA2の神経生理学的特性と記憶学習の神経回路基盤を明らかにする。計画(1)(2)で作製されたマウスを用いて、CA2領域の機能的役割を明確にする解析を行う。具体的には、記憶の獲得、想起、記銘におけるCA2の機能や、DG, CA3の担うパターンセパレーション、パターンコンプリーションへの影響を検証する行動学的解析を中心に行う。一方で、さらに関連分子のKOマウスを作製し、解析を行う。特にシナプス可塑性に重要なリン酸化酵素や脱リン酸化酵素を標的とする予定である。計画(3)ではウイルスベクター等を用いてトレーサー物質をCre活性またはTc誘導によりCA2領域に限局して発現させることで、CA2を介する神経回路網を可視化して明確にする。明らかとなったCA2と連絡する神経細胞のコンディショナル遺伝子改変マウスの作製を試みる。主に破傷風毒素軽鎖発現マウスを用いて、CA2との神経伝達を遮断することで変化する表現型を行動学的解析により検索する。特にCA2へ投射していると考えられる乳頭体上核を標的として、Cre発現またはrtTA, tTS発現ウイルスベクターのインジェクションにより神経細胞死誘導またはシナプス伝達遮断実験を先行して、海馬のシータ波および空間学習能力への影響を評価する予定である。計画(3)の、ウィルスベクターについては当該年度に作製しなかったため、次年度に使用する研究費にて作製を行う。次年度に請求する研究費については当初の計画通り主に遺伝子改変マウスの作製、繁殖、解析に使用する。