hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新組成リンパ指向性超音波造影剤の開発によるリンパ節転移の術中超音波迅速診断

1.転移性リンパ節および炎症性リンパ節モデルの作成ウサギのリンパ節を用いて炎症腫脹モデル5例,転移モデル19例を作成し,病理組織学的に検討した結果,炎症性腫脹モデルではリンパ瀘胞の反応性腫大や好酸球の増加などの所見を認めたが,辺縁洞と髄洞は保たれており,ヒトの正常リンパ節と構造上の大きな違いはないことを確認した。また,ウサギのリンパ節転移モデルをヒトの乳癌腋窩リンパ節転移と病理組織学的に比較した結果,両者とも,辺縁洞と髄洞のリンパ洞より中心性に癌細胞が増殖しており,転移形態はよく近似していることを確認した。2.新しいリンパ指向性超音波造影剤による転移性リンパ節と炎症性腫脹リンパ節の超音波造影効果の比較造影剤は注入部より速やかにリンパ管に沿って腫大リンパ節へ流入する様子が黒色色素により肉眼的に,さらに高解像カメラでも動的状態としてVTRで観察できた。造影剤注入後,リンパ節のエコー輝度を5分間連続的に観察した結果,リンパ節炎症性腫脹モデルでは,造影前に比べて,造影開始30秒後から有意なエコー輝度の上昇を認めた。一方,リンパ節転移モデルでは,その転移の程度によりエコー輝度の上昇はさまざまであったが,造影開始30秒後から有意なエコー輝度の上昇を認めた。1.中性脂肪粗乳化エマルションのリンパ指向性に着目し,エマルションの粒子径を調整することでマイクロバブルによらない新しい超音波造影剤を開発し,その作製条件に対する製剤学的検討を行った.2.ウサギを用い,リンパ節炎症性腫脹モデルおよびリンパ節転移モデルを作成し,作製した造影剤をそのリンパ節の近傍に局所注入し,造影剤のリンパ節内での局在を病理組織学的に検討するとともに,所属リンパ節の超音波造影パターンを解析し,リンパ節転移術中迅速診断の臨床応用の可能性について検討した.その結果,1.リンパ指向性超音波造影剤を作製するには,超音波乳化出力を120W,脂質配合比を10%にするとエコー輝度が最も高くなることが判明した.この新組成超音波造影剤は,マイクロバブルと違い,作製後1週間室温保存してもエコー輝度の低下は全く認めず保存性は良好であった.2.炎症性腫脹モデルでは,造影剤はリンパ洞内に僅かに認めるのみでほとんど残っていなかったが,リンパ節転移モデルでは,造影剤は辺縁洞および髄洞の保たれている部分に流入を認め,また,腫瘍に置き換わっていない髄索内にのみ存在していたことを確認した.3.この造影剤によるリンパ節の超音波診断は,造影開始30秒後からエコー輝度の上昇を認め,1分1分30秒後をピークとして5分間以上持続することから,術中の迅速診断としての条件を満たしていることが確認できた.4.その造影パターンは,炎症性腫脹ではほとんどhomogeneous enhancementであり,リンパ節転移は,spotty, linear, radialまたはring-shaped enhancementと多彩なパターンを示すが,homogeneous enhancementはないことから,良悪性の鑑別が可能であることを明らかにした.1.転移性リンパ節および炎症性リンパ節モデルの作成ウサギのリンパ節を用いて炎症腫脹モデル5例,転移モデル19例を作成し,病理組織学的に検討した結果,炎症性腫脹モデルではリンパ瀘胞の反応性腫大や好酸球の増加などの所見を認めたが,辺縁洞と髄洞は保たれており,ヒトの正常リンパ節と構造上の大きな違いはないことを確認した。
パルミトイルサイクルによるG蛋白質の動態制御機構

GTP結合蛋白質の多くはパルミトイル化脂質修飾を受けることにより、特定の膜マイクロドメインに局在し分子スイッチとして機能する。例えば三量体G蛋白質Gαや低分子量G蛋白質H-Rasなどがパルミトイル化修飾を受ける。しかし、パルミトイル化酵素が不明であったためパルミトイル化修飾によるG蛋白質の動態制御機構に関しては不明であった。昨年度までに、私どもは23種類のパルミトイル化酵素の中から、Gαをパルミトイル化する酵素としてDHHC3/7を同定した。今年度は1)DHHC3/7によるG蛋白質動態制御機構の解明、および2)パルミトイル化酵素ファミリーの多様な活性制御機構の解明を目指した。今年度の研究実績は以下のとおりである。GFP融合型Gαqを用いたFRAP/FLIP法、および光変換蛍光蛋白質Dendra2との融合型Gαqを用いたphotoconversion法を用いて細胞内Gαqの動態を解析した。その結果、細胞膜に存在するパルミトイル化Gαqは脱パルミトイル化を受けた後速やかにDHHC3/7が存在するゴルジ装置に移行し、DHHC3/7により再パルミトイル化され再び細胞膜に輸送されることを見出した(堤らMol. Cell. Biol. 2009)。また、神経細胞のような極性化した細胞においては、細胞体のゴルジ装置においてDHHC3がGαqやPSD-95など多くの基質を恒常的にパルミトイル化するが、樹状突起上のポストシナプスにおいては別のサブファミリーに属するDHHC2が、神経活動感受的にPSD-95をパルミトイル化することが分かった(則竹らJ. Cell BioL. 2009)。これらの成果は世界的にも高く評価され、総説(深田らNature Rev. Neuroscience, 2010)にまとめられた。このように今年度の研究計画は達成できたと考えている。GTP結合蛋白質の多くは特定の膜マイクロドメインに局在することにより分子スイッチとして細胞内情報伝達の要として機能する。パルミトイル化脂質修飾は翻訳後脂質修飾の一つであり、三量体G蛋白質のGα(Gs, Gi, Gqなど)、低分子量G蛋白質(H/N-Rasなど)に見られ、これら分子の局在、機能を外界刺激依存性に制御している。これまでに、我々はパルミトイル化反応の責任酵素群をゲノムワイドに同定し(Fukata M, et.al, Neuron 2004)、本特定研究(平成18-19年度)においてGαをパルミトイル化する酵素DHHC3/7を同定した。本研究では1)DHHC3/7によるG蛋白質動態制御機構の解明、2)脱パルミトイル化酵素の同定により、Gサイクルにおける時間的・空間的制御機構をパルミトイル化修飾という観点から明らかにする。DHHC3/7によるパルミトイル化がGαの細胞内動態に与える影響を生細胞イメージングにて検討した。GFP融合型Gαを用いたFRAP法、FLIP法、ならびに紫外線により蛍光波長が変化する蛍光蛋白質Dendra2との融合型Gαを用いたphotoconversion(光変換)法を用いて細胞内Gα_qの動態を解析した。その結果、パルミトイル化を介したGα_qの細胞膜-ゴルジ装置間双方向性輸送という興味深い現象を発見した。細胞膜に存在するGα_qは脱パルミトイル化を受け細胞質に移行し、その後ゴルジ装置においてDHHC3/7により再パルミトイル化され小胞輸送により細胞膜に再び輸送されると考えられる(堤らMol. Cell. Biol., 2009)。現在、脱パルミトイル化酵素の精製、同定を試みている。

また、神経細胞のような極性化した細胞においては、細胞体のゴルジ装置においてDHHC3がGαqやPSD-95など多くの基質を恒常的にパルミトイル化するが、樹状突起上のポストシナプスにおいては別のサブファミリーに属するDHHC2が、神経活動感受的にPSD-95をパルミトイル化することが分かった(則竹らJ. Cell BioL. 2009)。これらの成果は世界的にも高く評価され、総説(深田らNature Rev. Neuroscience, 2010)にまとめられた。このように今年度の研究計画は達成できたと考えている。
大腸菌主要酸性リン脂質の細胞増殖における役割の分子遺伝学的解析

酸性リン脂質欠損で増殖するlpp変異株のサプレッション機構:Lpp前駆体のプロセシングは酸性リン脂質完全欠損細胞では膜にどのような不都合を生じるのかを、Lppの構造遺伝子(lpp,)の発現誘導系により検討しlpp欠損変異によるサプレッションの機構を明らかにした。LppのC末端のリジンを欠失させることで架橋ができない変異Lpp(LppΔK)を発現するプラスミドを構築し、主要酸性リン脂質欠損細胞(pgsA30::kan, lpp-2)でその発現を誘導すると、野生型のLppを発現したときに見られる顕著な溶菌は、予想どおり起こさなくなった。野生型のLppの発現により溶菌をおこす細胞の膜は、外膜と内膜が分離できない。これはホスファチジルグリセロールが欠損するとLppの前駆体はプロセスできなくなるので、このため内膜に蓄積したLpp前駆体が、内膜に蓄積したままペプチドグリカンに架橋するため、外膜と内膜が分離できなくなることを明らかにした。Lpp前駆体とペプチドグリカンとの架橋は架橋によって生ずる分子の存在を質量分析によって同定することからも証明した。酸性リン脂質を必須とする細胞機能に関与する遺伝子の検索:高温感受性を抑圧するサプレッサー変異株をminiTn10(cat)トランスポゾンの挿入による遺伝子破壊により48株分離し、配列決定とPCRによる挿入変異の確認、野生型遺伝子による相補性テストにより、変異部位を同定した。夾膜多糖合成遺伝子オペロン(cps)の転写を制御するリン酸リレー制御系rcsC, rcsB, yojNと活性化因子rcsF, rcsA、およびlgtに変異が起こることにより高温感受性が抑圧されることが確認された。これらの結果は、cpsオペロンの転写発現が酸性リン脂質欠損変異株で昂進しており、この昂進が高温感受性をもたらす主原因であり、rcsリン酸リレー系の遮断により高温感受性がサプレスされることを明らかにした。平成12年度は以下のように2つの研究計画を併行して実施した。(1)酸性リン脂質完全欠損で増殖するlpp欠損変異株のサプレッション機構の解明lpp欠損変異株では、酸性リン脂質が全く欠損した状態でも増殖しうることを発見している。lpp遺伝子を発現誘導可能なaraBADプロモーターに連結し、発現誘導により生産されるプロリポ蛋白質が、どのようにして酸性リン脂質が欠損した細胞を致死に導くかを、プロリポ蛋白質の内膜への蓄積に注目して蔗糖密度勾配遠心により解析した。その結果、プロリポ蛋白質C末端のリジン残基を欠き、このためペプチドグリカンとの結合が出来ないもの(外膜・内膜の分画が適切におこり)の発現誘導では、致死性が著しく低下していることを見出した。即ち、酸性リン脂質欠損による致死性の主原因は、ホスファチジルグリセロールによる修飾(プロセシングに必要)が出来ない為に内膜に留まっているプロリポ蛋白質が、内膜に在るままペプチドグリカンと誤まって結合することにより生じるenvelopeの損傷による毒性であると判断できる結果を得た。(2)酸性リン脂質を必須とする細胞機能に関与する遺伝子の検索酸性リン脂質の欠損による増殖阻害を抑圧するサプレッサー変異株を分離解析する実験計画において、酸性リン脂質完全欠損による高温感受性を、mini Tn10(CM^r)のトランスポゾンの挿入による遺伝子破壊により抑圧する変異株を多数分離し、これらサプレッザー変異の変異部位の塩基配列解析を行ってきた。これまでの解析で明らかにされたものは、すべてRcs制御系にかかわるものであった。

即ち、rcsC,rcsB,rcsF,yojNの挿入失活変異であり、このほかに温度感受性にはかかわらないが、rcsA変異も容易に起ることを見出した。現段階で変異部位が未解析の株は3株のみとなった。Rcs系の標的オペロンである、cpsの転写発現をlacZオペロン融合と、ドットブロットによるmRNAの定量により検討している。平成13年度は以下のように2つの研究計画を併行して実施した。(1)酸性リン脂質完全欠損で増殖する1pp欠損変異株のサプレッション機構の解明1pp遺伝子の発現誘導により生産されるプロリポ蛋白質が、どのようにして酸性リン脂質が欠損した細胞を致死に導くかを解析した結果、酸性リン脂質欠損による致死性の主原因は、ホスファチジルグリセロールによる修飾(プロセシングに必要)が出来ない為に内膜に留まっているプロリポ蛋白質が、ペプチドグリカンと結合することにより生じるenvelopeの損傷による毒性であると結論された。ペプチドグリカンと結合できない変異プロリポ蛋白質を発現させた場合の、酸性のリン脂質生合成中間体(ホスアチジン酸とCDP-ジアシルグリセロール)の消耗量を検討し、これらが修飾に代用されうること、また、代用により酸性の生合成中間体の減少が、増殖の停止をもたらすことを示唆する結果を得た。更に、脂質修飾を不能とするプロリポ蛋白質の変異蛋白質を作成し、これを発現に用いて、酸性のリン脂質量の減少と増殖停止との関係を検討した。(2)酸性リン脂質を必須とする細胞機能に関与する遺伝子の検索酸性リン脂質の欠損による増殖阻害を抑圧するサプレッサー変異株の解析計画において、酸性リン脂質完全欠損による高温感受性を抑圧する変異株を多数分離し、変異部位の解析を行ってきた。これまでにrcsC,rcsB,rcsF,yojNの失活変異が明らかになり、すべてRcs制御系にかかわるものであった。更にまた、研究室で用いてきた主要酸性リン脂質完全欠損変異株にはrcsA変異がはいっていたことを見出し、rcsAを野生型とした株を構築して、その特性を検討した。野生型のrcsAをもつ株は増殖速度が遅く、高温にはより感受性であり、SDSに高感受性であり、この株の培養では、rcsAの挿入破壊変異株が容易に蓄積した。ドットブロット解析により、Rcs制御系の標的であるcpsオペロンのmRNA量がこの株において顕著に増加していることを見出した。
光電気化学エッチングによる酸化チタンナノロッドの創製

光電気化学エッチング法を,近年,光機能材料として注目されている酸化チタンに施し,そのエッチングサイト選択性を調べるとともに光電気化学特性に及ぼす効果について検討した。酸化チタン焼結体に対して光電気化学エッチング処理を行ったところ,エッチングの進行とともにナノメートルスケールのエッチピット形成が見られ、その壁面が特定の結晶面(ルチル型酸化チタンの(100)面)から構成されることから、高結晶性かつ大比表面積を持つナノポーラス構造を持つ表面が得られることを見出した。エッチピットサイズは、電極のキャリア密度やエッチング速度によって変化し、キャリア密度が高いほど、また、エッチング速度が速いほどピット密度は高くなることがわかった。また、エッチピットを構成する壁の厚さは、酸化チタン/電解液界面に形成される空間電荷層幅に依存し、キャリア密度が高いほど薄くなり、またエッチング時の電極電位によっても変化することがわかった。また、エッチング量を増加させると、そのようなナノポーラス構造から、径が数十ナノメートルで長さが数マイクロメートルの棒状酸化チタンからなるナノロッド構造に変化することを見出した。以上のような表面は,ナノメートルスケールの微細な構造から構成され,大きな比表面積を持つとともに,特定の結晶面からなる単結晶的な性質を持っているため,その光触媒能の向上,反応選択性の発現などが期待できる。また、それらの結果をもとに光電気化学的に活性な酸化チタン表面を得るための、光電気化学エッチング条件について考察した。以上の結果について、現在、投稿準備中である。
分子生物学的手法によるウシと細菌のチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ機構の研究

我々が開発したHeLa細胞を宿主とするウシ・ヒト雑種酵素発現系を利用して、ウシ心筋チトクロム酸化酵素で提案されているH+輸送経路の一つD-pathwayの変異体解析を行った。細菌酵素のこれに対応した経路の変異体解析が支持するH^+能動輸送機能は否定された。振動分光法を用いたH^+輸送機構の研究に必須である部位特異的同位体標識のために無細胞系によるタンパク質発現を試みた。大腸菌を利用してサブユニット数が少ない細菌酵素の機能発現系は確立した。チトクロムc酸化酵素のプロトン(H^+)輸送経路として提案されている3つの経路(D-, K-, H-pathway)のひとつD-pathwayは、細菌酵素のX線結晶構造解析と変異体解析により、水形成用とポンプ用のH^+を輸送すると提唱されている。この経路は、細菌とウシの酵素間で酷似し、しかも機能に必須のアミノ酸残基が保存されている。したがって、ウシ酵素のD-pathwayも同じ機能をもつと示唆されている。一方、ウシ酵素のX線構造と変異体解析によりH-pathway H^+ポンプ機構が示唆され、対立している。本年度、D-pathway H^+ポンブ説を支持する解析結果を与える細菌酵素での変異部位に対応した全ての変異をウシ酵素で検討し終えた。細菌酵素では酸素還元活性を阻害しないでポンプ活性を失活させるが、ウシ酵素では、いずれの変異も、ポンプ活性に影響を与えなかった。したがって、D-pathway H^+ポンプ説は支持されなかった。この結果は、D-pathwayの機能がウシと細菌とで異なることを示唆する。構造によって機能が決定されるとの構造生物学の前提への桃戦である。H^+ポンプ機構に於けるアミノ酸残基の役割を直接検討する手段に振動分光法がある。この解析には部位特異的同位体標識化チトクロムc酸化酵素標品が必須であるため、これを可能にする無細胞タンパク質合成系で細菌の酵素を発現する系を開発している。本酵素を大腸菌無細胞系で合成し、大腸菌の膜画分に機能発現させることに成功した。精製酵素標品は、正常なSoret/visスペクトルを示し、ヘム当りのチトクロムcからの電子伝逹活性は142±15sec^<-1> (n=6)であり、野生型酵素の浩活性値236±21sec^<-1> (n=6)にほぼ匹敵した。無細胞で確実に正常酵素標品を得る事ができ、収量は、合成されたタンパク質の約0.1%であった。ウシ心筋と細菌のチトクロムc酸化酵素のプロトン(H^+)輸送経路としてそれぞれ3つの経路(D-, K-, H-pathway)が提案されている。D-pathwayは水形成用とポンプ用のH^+を輸送すると提唱され、細菌酵素の変異体解析が支持している。この経路は、細菌とウシの間で酷似し、しかも機能に必須のアミノ酸残基が保存されている。したがって、ウシ酵素のD-pathwayも同じ機能をもつと推測され、我々のウシ酵素H-pathway H^+ポンプ説と対立している。昨年度、細菌によるD-pathway H^+ポンプに必須のアミノ酸残基に対応したウシ酵素部位を変異体(Asn98Asp, Asn163Asp)解析した。いずれの変異も機能に影響を与えず、D-pathway H^+ポンプ説を支持しない。ウシ酵素は、ミトコンドリア由来の3つのサブユニット(SI-III)と核由来の10個のサブユニットにより構成される。我々はHeLa細胞を宿主とするウシ(SI)/ヒト雑種酵素発現系を開発し、変異体を作製している。上述した細菌酵素の結果との不一致に対して、変異雑種酵素が宿主内で新たな変異を起こし野生型に戻った可能性を考えた。そこで各サブユニット遺伝子の塩基配列を本年度決定した。一方、細菌D-pathwayの水形成用H^+輸送機能に必須のアミノ酸残基に対応したウシ酵素部位を変異(Glu242GlnとAsp91Asn)させ解析している。予備的な結果ではあるが、水形成用H^+輸送機能を支持する。大腸菌無細胞系で、細菌酵素のSI-IIIを合成し、野生型と遜色がない標品を得た。低い機能発現効率の向上を図るために、本来の宿主であるParacoccus denitrificansの無細胞系の構築を始めた。本年度、各サブユニット発現ベクター、GFPのコントロールベクターを構築し、またtRNAs調製法を確立した。ウシ心筋と細菌のチトクロムc酸化酵素のプロトン(H^+)輸送経路として、互いに相同である3つの経路(D-,K-,H-pathway)が提案されている。D-pathwayは水形成用とポンプ用のH^+を輸送すると提唱され、細菌酵素の変異体解析により支持されている。

D-pathway H^+ポンプ説を支持する細菌酵素での変異に対応したウシ酵素部位を変異(Asn98Asp,Asn163Asp)させたが、いずれも機能に影響がなく、細菌酵素の結果と一致しなかった。この結果は予想外である、そこで発現系宿主内でのback-mutationを考慮し、変異体を含む酵素のサブユニット遺伝子およびサブユニットmRNAの全塩基配列を本年度決定し終えた。新たな変異はなかった。また、細菌D-pathwayの水形成用H^+輸送機能に必須のアミノ酸残基に対応したウシ酵素部位を変異(Glu242GlnとAsp91Asn)させた。この変異体発現細胞は、死に易く培養が難しかったものの、活性酸素除去作用をもつN-acetylcysteineを培地に添加することにより、細胞死が抑制された。これら変異は酸素還元活性を失活させた。以上の変異体解析の結果、ウシ酵素D-pathwayは、水形成用H^+を輸送するものの、ポンプ用H^+は輸送しない、ことが強く示唆された。既に報告したように、我々が提案しているH-pathwayの変異体解析は、ポンプ用H^+の輸送を強く示唆する。大腸菌無細胞タンパク質合成系で、細菌酵素のSI-IIIを合成し、野生型と遜色のない標品を得ている。しかし、機能化効率が低い。この効率の向上を図るために、本来の宿主であるParacoccus denitrificansの無細胞系を構築した。正常なGFPまたP450camを合成することに成功した。この系により細菌酵素のサブユニットI-IIIを合成できた。
咬合曲面構築法を用いた咬合面ラミネートベニア製作用CAD/CAMシステムの開発

CAD/CAMにより咬合面ラミネートベニアを作製するために、正常咬合者と不正咬合者の高速歯列模型計測装置を用いて計測および分析を行った。その結果、歯列弓形態を多項式により表し、数値的に比較することにより、その形態的差異を定量的に評価することが可能となった。さらに咬合面ラミネートベニアによる治療を行う際、咬合面の設定が不可欠となる。そのため非接触型3次元形状計測装置を用い、顔面と歯列の3次元計測データの統合に関する実験を行い、0.3mm程度の誤差で統合することができた。この方法により、顔面と歯列の位置関係を定量的に分析することが可能となり、ラミネートベニアの設計に関して有用なデータを得ることが可能となった。材料的には、有限要素法によりメタルフリークラウンの加重分析を行い、ラミネートベニアの強度解析に関する基礎的データを得ることができた。前歯部不正咬合を治療する際,歯列模型分析による病態の把握が必要となる.模型分析から得られる情報の中でも,歯列弓や咬合彎曲などの歯列形態は,顎口腔機能と関連しているため,不正咬合の形態と機能との関わりを明らかにする上で重要な手がかりとなる.近年では模型分析に用いる3次元計測装置が開発されているが,計測に長時間を要するため,臨床応用は困難であった.そこで,本研究では,最初に,歯列模型の3次元計測を高精度で短時間に行うため,ラインレーザおよびCCDカメラを用いた3次元計測装置を開発し,その性能を評価した.次いで,対照群として正常咬合群,前歯部不正咬合群として開咬群,過蓋咬合群,上顎前突群,反対咬合群の被験模型を選択し,開発した装置により3次元計測した.そして,前歯部不正咬合における歯列模型分析の指標を得るために,得られたデータから歯列弓や咬合彎曲を多項式により近似し,各前歯部不正咬合の形態的な特徴を定量的に分析した.その結果,新しく開発した装置は,臨床に十分実用できる時間,精度で歯列模型を計測できた.そして,本装置を用いた歯列模型分析により,典型的な前歯部不正咬合の歯列弓および前後的咬合彎曲の特徴が客観的に明らかとなった.以上,本研究結果は,歯列形態の定量的な評価を可能とするものであり,前歯部不正咬合を有する患者の診査,診断および治療において有用であることが示唆された.前歯部不正咬合のもたらす審美性や顎口腔機能に関する問題を補綴的な治療によって解決する指標を得るために、高速3次元形状計測装置を用い、前歯部不正咬合の歯列模型の分析を行った。正常咬合および典型的な前歯部不正咬合である開咬、過蓋咬合、上顎前突、反対咬合の歯列模型を計測した。そして、計測データから取得した咬頭頂をはじめとする特徴点の3次元座標を用い、歯列形態を反映する歯列弓や咬合湾曲を多項式により近似し、各前歯部不正咬合の形態的特徴を定量的に分析した。前歯不正咬合の歯列形態1)開口:歯列弓は上下顎とも特徴的な形態が認められなかった。前後的咬合湾曲は上顎で強く、下顎で弱かった。2)過蓋咬合:歯列弓は上下顎共に特徴的な形態が認められなかった。前後的咬合湾曲は下顎で強かった。3)上顎前突:歯列弓は上顎で尖形を示したが、下顎では特徴的な形態はみとめられなかった。前後的咬合湾曲は上下顎ともに強かった。4)反対咬合:歯列弓は上顎で方形を示したが、下顎では特徴的な形態が認められなかった。前後的咬合湾曲は、下顎で弱かった。CAD/CAMにより咬合面ラミネートベニアを作製するために、正常咬合者と不正咬合者の高速歯列模型計測装置を用い計測および分析を行った。さらに咬合面ラミネートベニアによる治療を行う際、咬合平面の設定が不可欠となる。そのため、非接触型3次元形状計測装置を用い、顔面と歯列の3次元計測データの統合に関する実験を行い、0.3mm程度の誤差で統合することができた。
博物館・美術館の展示プレゼンテーション用の専用ネットワークシステムの開発

本研究の目的は、博物館の展示における実用的なLANの構築を目指じた様々なプロトコルの研究開発である。特別展など短期間で展示用のシステムを立ち上げる必要がある博物館のLANにおいて特に求められることは、アドレスや名前設定などネットワークの各種設定をできるだけ自動化する自動設定の技術と、動画や音声といったリアルタイムデータを扱うためのリアルタイムネットワークの機能である。自動設定の研究の焦点は二つある。一つはネットワーク層におけるルーティング・アドレスの自動設定のためのプロトコルACRP(Auto-Configurated Routing Protoco1)の開発である。この研究ではルーティング・アドレスというルータを越えたアドレスが自動設定可能になったことが新たなる進展である。もう一つは、さらに上位層において自動設定に対応した名前、アドレスの管理システムの構築である。博物館LANにおいては、大きなノードと、小さなノードが混在している。大きなノードは動画や音声が保存されており、いろいろな指令に従ってネットワークヘデータを出力する。小さなノードはそれらリアルタイムデータを出力するためのノードであったり、また、観客からの様々な指令をネットワークを通じて大きなノードヘ伝える役割を持ったものである。博物館LANにおいては小さなノードが圧倒的に多いという特徴をうまく生かし、ネットワークのリアルタイム性を最大限に引き出すことのできる物理ネットワークRCL(Realtime ControI LAN)の研究を行った。1999年度では、ACRPの実装を行うと同時に、RCLのためのコントロール回路のプロトタイプを開発した。RCLの動作は確認されたが、来年度はさらに詳しい評価を行いつつ、本格的なドライバーチップのLSI化を企業との共同研究で試みたいと考えている。本研究の目的は、博物館の展示における実用的なLANの構築を目指した様々なプロトコルの研究開発である。一つはネットワーク層におけるルーティング・アドレスの自動設定のためのプロトコルNIP(Network Information Protocol)の開発である。大きなノードは動画や音声が保存されており、いろいろな指令に従ってネットワークへデータを出力する。小さなノードはそれらリアルタイムデータを出力するためのノードであったり、また、観客からの様々な指令をネットワークを通じて大きなノードへ伝える役割を持ったものである。博物館LANにおいては小さなノードが圧倒的に多いという特徴をうまく生かし、ネットワークのリアルタイム性を最大限に引き出すことのできる物理ネットワークRCL(Realtime Control LAN)の研究を行った。1998年度では、NIPの開発を行い、シミュレータ上で動作確認を行った。また、シミュレーションにより、2,000物理ネットワーク400,000ノード規模のネットワークでも問題なく動作することを示した。一方、RCLに基づいたネットワークを搭載したハードウエアの設計、実装を終えた段階である。来年度は実装された各種ノードに、開発したNIPを実装する予定である。
大動脈解離の病態解明による革新的な薬物療法の開発

マウス大動脈解離モデルはピオグリタゾン投与により病変長が増悪した。ナトリウム摂取過剰が炎症性サイトカインであるIL-17を介して大動脈解離を増悪させたことから、ピオグリタゾンの副作用であるナトリウム貯留作用が大動脈解離を増悪させた可能性が示唆された。またDNAマイクロアレイの結果から解離増悪のメカニズムとして細胞外マトリックスが重要な鍵を握っていることを明らかになった。ナトリウム摂取制限は実臨床での応用につながりやすいことから、今後もその分子メカニズム解明に向けて研究を継続する。大動脈解離は大動脈中膜が突然断裂する致死的疾患であるが、その病態は殆ど解明されておらず、発症や進展に関わる因子も不明である。申請者独自の大動脈解離マウスモデル及び人解離組織を用いてチアゾリジン系薬物の効果と分子機序を明らかにすることを目的として研究を進めた。まず、大動脈解離マウスモデルの組織学的検討を行った。野生型マウスを用いて塩化カルシウム処置、アンギオテンシン負荷を行うことで、腹腔動脈、上腸間膜動脈分枝部にエラスチン破壊、炎症反応浸潤が起こり、それが経過とともに治癒機転が働くことが明らかになった。このモデルを使用し、ピオグリタゾン投与を行ったところ、大動脈解離病変の増悪を認めた。仮説とは逆の所見であり、今後組織学的検討(HE、EVG、ピクロシリウスレッド染色、アデリポネクチン免疫染色等)やアディポネクチン関連分子の動態についてウエスタンブロットによる評価を行っていく。大動脈解離は大動脈中膜が突然断裂する致死的疾患であるが、その病態はほとんど解明されておらず、発症や進展に関わる因子も不明である。申請者独自の大動脈解離モデルマウス及びヒト解離組織をチアゾリジン系薬物(ピオグリタゾン)の効果と分子機序を明らかにすることを目的として研究を進めた。野生型マウスを用いて塩化カルシウム処置、アンジオテンシンII負荷を行うことで、腹腔動脈、上腸間膜動脈分子部にエラスチン破壊、炎症反応浸潤が起こり、それが経過とともに治癒機転が働くことが明らかになった。さらにDNAマイクロアレイ解析から、発症前の大動脈組織では炎症関連遺伝子の発現亢進とECM関連遺伝子の抑制が起こっていた。この遺伝子発現変動は、過去に報告されたヒト大動脈解離組織での発現変動と極めて類似していた。このモデルを使用しピオグリタゾン投与を行ったところ、予想に反して大動脈解離病変の増悪を認めた。そこでピオグリタゾンが抗炎症作用の他にNa貯留作用を有することに着目した。Na過剰は心血管イベントの危険因子であり、炎症応答の中心的役割を果たすIL-17を活性化させることが報告されている。そこでNaCl過剰が大動脈解離を増悪させる可能性を検証した。NaCl過剰状態で解離モデルを作成したところ、IL-17依存性に大動脈解離が増悪することを発見した。さらにDNAマイクロアレイ解析により、IL-17がECM代謝を抑制していることが明らかになった。以上のことから、大動脈解離増悪にIL-17経路とECM代謝が関与している可能性が示唆された。これまでピオグリタゾンとIL-17の関与については報告がなく、ピオグリタゾン投与による大動脈解離増悪のメカニズムにおけるIL-17とECM代謝の関与を検討すべく研究を継続している。血管外科、分子血管病態学申請者が独自に開発した大動脈解離モデルマウスにおける組織学検討行い、マウスにおいて解離発症後に治癒過程が働くことが確認できた。またこの大動脈解離マウスモデルを用いてピオグリタゾン投与することで、増悪することが判明した。今後そのメカニズム解明にむけて研究を進める。ピオグリタゾン投与で大動脈解離が増悪するメカニズム解明のため、アディポネクチンに関するシグナルを中心に免疫染色、ウエスタンブロットによる解析を、またバイオマーカー探索のための遺伝子学的解析を行う。次に解離増悪のメカニズムとしてピオグリタゾンの副作用でもある体液貯留が悪影響を及ぼしている可能性も疑われたため、塩分負荷により体液貯留を図り、大動脈解離への影響を検討する。さらにヒト解離組織における病理学的解析、組織培養によるピオグリタゾンの影響を確認し、大動脈解離症例へのピオグリタゾン投与の危険性の有無を検討する。ピオグリタゾン投与による大動脈解離への影響が予想より少ない実験数で確認することができ、マウス購入費、実験試薬、消耗品が予定より節約することができた。前述の今後の研究推進方策を進めるにあたり、マウスの購入やマウス実験試薬、消耗品、組織関連試薬や生化学実験消耗品の費用及び成果発表における費用として使用する。また遺伝子学的解析も行う。これにより、当初の計画以上の成果を上げることを目指す。
抗ピシウムタンパク遺伝子導入による赤腐れ病耐性ノリ種苗の作出に関する研究

本研究では、赤腐れ病耐性ノリ種苗を作出する目的で、ノリ赤腐れ病起因真菌Pythium porpohyraeに対する抗真菌タンパクを探索し、有明海より採取した水試料からP.Porphyrae細胞壁分解細菌13株を分離した。最もP.porphyrae細胞壁分解活性が強かったPseudomonas sp. PE2は、キチン分解酵素、β-1,3;1,4-グルカン分解酵素およびβ-1,3-グルカン分解酵素を産生していることが明らかとなり、これら酵素遺伝子について発現クローニングを行った。クローニングした遺伝子の解析を行ったところ、これらの酵素は、多様な多糖結合能を有する機能領域を有しており、試験した数種の多糖に対して特異的な結合活性を示した。中でも、β-1,3(4)-グルカナーゼAは最も重要な酵素であることが明らかとなった。また、P.poryphyraeに対して抗真菌活性を有する分離海洋細菌Streptomyces sp. AP77の培養上清から抗P.poryphyraeタンパク(SAP)を精製し、SAPの性状について解析を行い、SAPが、3つのサブユニットにより構成されていること、各サブユニットは既知のタンパクとそれぞれホモロジーを有することを明らかにし、SAPの抗P.porphyrae活性の作用機序は、P.porphyrae細胞膜の透過性に関与する可能性を示唆した。以上、本研究により、上記抗P.porphyrae酵素並びに抗真菌タンパクの有用性が示唆され、これらタンパクの遺伝子導入による耐病性ノリ種苗の確立が期待された。有明海は、ノリや貝類を始めとする海産物が豊富にとれ、中でも養殖ノリは、毎年全国1,2位の生産高を誇り、佐賀県の基幹産業の一つとなっているが、養殖現場においては毎年養殖ノリの病害、赤腐れ病が発生し、時にはノリ養殖業の健全経営に支障をきたすこともあり問題となっている。そこで、我々はノリ赤腐れ病を引き起こす真菌ピシウム菌に対する抗真菌性遺伝子を導入した耐病性ノリ種苗を確立することを目的に、高等植物では陸上植物以外に成功例のない耐病性組換え作物を、ノリを用いて試みたところ、まずノリ養殖域より分離した海洋細菌Pseudomonas sp. ND137株のノリ細胞壁分解酵素の大量生産およびプロトプラストの作出した結果、プロトプラスト作出組換え体酵素により、大量にかつ効率的にノリプロトプラストを獲得することができた。また、耐病性ノリ葉状体を食品として応用することを鑑み、その安全性確保のための基礎的研究として、Streptomyces sp. AP77、Bacillus sp. BE1およびFE1、Pseudomonas sp. PE1およびPE2株が生産する抗ピシウムタンパクの性状と作用機序について検討し、本タンパクのpH安定性、温度安定性、金属イオンの効果、基質特異性、N末端アミノ酸配列等を明らかにすることができた。さらに、作用機序の検討としてピシウム細胞壁構成成分に対する分解活性、ピシウム代謝阻害作用等を検討したところ、Streptomyces sp. AP77株が産生する抗ピシウムタンパクの作用機序は、サイトックスグリーン蛍光染色法により、抗ピシウムタンパクはピシウムの細胞膜の透過性を変調させることによりピシウムを溶解することが明らかになった。そこで、我々はノリ赤腐れ病を引き起こす真菌ピシウム菌に対する抗真菌性遺伝子を導入した耐病性ノリ種苗を確立することを目的に、高等植物では陸上植物以外に成功例のない耐病性組換え作物を、ノリを用いて試みている。

まず、佐賀県有明海および筑後川より採取した水試料よりP. porphyrae細胞壁分解細菌13株を分離した。各採取地点で得た分離細菌の中から、最もP. porphyrae細胞壁分解活性の強かったBacillus sp. BE1,Bacillus sp.FE1、Pseudomonas sp.PE1およびPseudomonas sp. PE2の粗酵素についてP. porphyrae細胞壁に対する最終分解産物を検討したところ、BE1、FE1およびPE2株でN-アセチルグルコサミンとグルコースが、PE1株ではグルコースだけが検出された。さらに、これら海洋細菌4株すべての粗酵素にβ1,3;1,4-およびβ1,3-グルカン分解活性が確認され、PE1株以外にはキチン分解活性も観察された。そこで、Pseudomonas sp. PE2株が生産するピシウム細胞壁構成酵素の遺伝子のクローニングと解析を行ったところ、これらの酵素は、多様な多糖結合能を有する機能領域を有しており、試験した数種の多糖に対して特異的な結合活性を示した。特にキチナーゼAは糖質結合領域ファミリー6を有していることを初めて明らかにした。また、Pseudomonas sp. PE2のβ-1,3-グルカナーゼBはタンパク質-多糖間の相互作用に関連しているpolycystic kidney disease (PKD)領域を有しており、この領域を有した微生物由来のβ-1,3-グルカナーゼも初めて明らかにすることができた。有明海は、ノリや貝類を始めとする海産物が豊富にとれ、中でも養殖ノリは、毎年全国1,2位の生産高を誇り、佐賀県の基幹産業の一つとなっているが、養殖現場においては毎年養殖ノリの病害、赤腐れ病が発生し、時にはノリ養殖業の健全経営に支障をきたすこともあり問題となっている。我々はノリ赤腐れ病を引き起こす真菌ピシウム菌に対する抗真菌性遺伝子を導入した耐病性ノリ種苗を確立することを目的に、高等植物では陸上植物以外に成功例のない耐病性組換え作物を、ノリを用いて試みている。そこで本年度の研究では、抗ピシウムタンパク、SAPの抗P.porphyrae活性の作用機序として、P.porphyrae細胞壁構成成分分解活性およびP.porphyrae細胞膜透過性について検討したところ、P.porphyrae細胞壁構成多糖およびタンパクに対する分解活性は観察されなかった。しかしながら、MTTアッセイ法では、50μg/mlのSAPの処理によってP.porphyrae菌糸の抑制が観察され、作用1時間目から原形質の漏出に続き、菌糸の膨張および崩壊が観察された。なお、SAPはP.porphyrae細胞膜の透過性に影響を与え、その影響性は、濃度依存的に増加することが観察された。膜の脱分極剤、CCCPを添加した場合、SAPの膜透過性影響は減少した。一方、K^+を添加した場合、高濃度のSAPの膜透過性への影響は増加し、Mg^<++>添加ではわずかながらSAPの膜透過性への影響は減少した。また蛍光顕微鏡観察においても、経時的にSAPの膜透過性への影響が観察され、これらの結果より、SAPの抗P.porphyrae活性の作用機序は、P.porphyrae細胞膜の透過性に関与している可能性が示唆された。
ゼロ制御パワー現象を基調とした開空間音響場のグローカル能動騒音制御

本研究課題では,能動騒音制御によって開空間の音響パワーを最小化した際に制御音源のパワーがゼロになる現象に着目し,制御点周辺の情報のみからグローバルな騒音抑制を可能とする手法を提案する.ただし,ゼロ制御パワー現象は全音響パワー最小化の必要条件に過ぎないので,当該現象と何らかの評価関数(ダミー評価関数)をセットにすることで,必要十分条件を構築する.また,複数制御音源によるゼロ制御パワー現象の発現条件を解明し,当該現象とダミー評価関数の最小化を両立する制御手法を確立する.最終的には,低周波発生装置を騒音源とするフィールド実験を行うことで,その有用性を実証する.本研究課題では,能動騒音制御によって開空間の音響パワーを最小化した際に制御音源のパワーがゼロになる現象に着目し,制御点周辺の情報のみからグローバルな騒音抑制を可能とする手法を提案する.ただし,ゼロ制御パワー現象は全音響パワー最小化の必要条件に過ぎないので,当該現象と何らかの評価関数(ダミー評価関数)をセットにすることで,必要十分条件を構築する.また,複数制御音源によるゼロ制御パワー現象の発現条件を解明し,当該現象とダミー評価関数の最小化を両立する制御手法を確立する.最終的には,低周波発生装置を騒音源とするフィールド実験を行うことで,その有用性を実証する.
角膜上皮幹細胞ニッシエとしての細胞外マトリックス・テネイシンの機能解析

SJS等の角膜上皮幹細胞疲弊症に対する眼表面再建術の際に摘出した組織から新鮮凍結組織切片を作成し、免疫組織学的にTNC分子の発現を検討した結果、TNCタンパクが結膜下に多量に沈着していることが判明した。TNC遺伝子のプロモーター解析のために、レポーターコンストラクトを作成して、角膜上皮を用いて遺伝子発現を検討したところ、創傷作成、機械的ストレスでTNC遺伝子の誘導がかかることが判明した。TNCはFNコートの培養に加えた場合、細胞の形態に変化を生じる(Focal adhesion kinaseの発現の低下)が、細胞増殖能には変化がないことが、判明した。また、角膜上皮テネイシンノックアウトマウスの角膜上皮、コンジェニックマウスの角膜上皮から初代培養細胞を作成し、羊膜上に培養することで、形態学的な差異およびβカテニンタンパクの発現を免疫組織染色で検討したところ、テネイシンノックアウトマウスから作成した上皮細胞にはβカテニンの局在に極性が見られなかったのに対し、コンジェニックなワイルドタイプマウスでは上皮下にTNCタンパクの沈着が見られるとともにβカテニンが基底膜側に偏在して発現がみられ、細胞極性の形成に貢献していることが示唆された。以上の結果から、角膜上皮に強いストレスがかかった際のレスキュー分子としてTNCが発現し、TNC分子自体は上皮細胞の極性形成を通じて、上皮細胞の恒常性維持に貢献していると考えられた。ヒト角膜上皮(HCE)細胞をテネイシン(TNC)コートしたディッシュ上で培養し、フィプロネクチン(FN)等、他のコート剤上で培養した細胞と比較検討したところ、TNC上で培養したHCE細胞におけるβカテニンタンパク量が増加していた。一方、βカテニンmRNA量の増大は認められなかったため、TNCを介したHCE細胞におけるβカテニン量の増加はタンパク分解機構の抑制によるものと考えられた。細胞染色の結果、TNCコート上で培養したHCE細胞においては、細胞質のβカテニン陽性染色が著明であり、上記の結果を裏づける所見を得た。また、βカテニンタンパクの細胞核移動により活性化される、Tcf経路のシグナル量をTOPFLASHベクターによるルシフェラーゼアッセイにて検討したところ、TNCコートによるβカテニン量の増加にはTcf経路の活性化を伴わないことが判明した。すなわち、TNCコートによるβカテニン安定化作用はβカテニンの核内移行によるシグナル経路の活性化を伴わないことが判明した。一方、TNCコート上で培養した細胞の増殖能を細胞増殖マーカーであるki67染色像で検討したところ、TNCコート上ではFNコートと比較してHCE細胞の増殖能は低かった。TNCコート上で培養したHCE細胞が形態的に糸状突起を多く有することから、同細胞におけるSmall GTPaseの発現を検討したところRaclタンパク陽性、Rhoおよびcdc42タンパクは陰性との結果を得た。

以上の結果から、角膜上皮に強いストレスがかかった際のレスキュー分子としてTNCが発現し、TNC分子自体は上皮細胞の極性形成を通じて、上皮細胞の恒常性維持に貢献していると考えられた。
遺伝性疾患における発現変異タンパク質の分子動力学シミュレーションによる評価

構造生物学を分子遺伝学に応用し、遺伝性疾患の発症機構を解明することを目指ざした。国内外の遺伝学研究室によって遺伝性疾患の原因として新たに同定された遺伝子変異がタンパク質構造に与える影響について、ホモロジーモデリングによる分子モデル構築や自由エネルギー計算などの静的な解析に加え、分子動力学計算(MD)による動的な解析により調べた。その結果、静的な解析だけでは捉えることができなかった、NUP107遺伝子の変異による分子構造への影響について、MDを併用することで明らかにし、遺伝学研究におけるMDの有用性を示した。遺伝性疾患の原因として新たに同定されたアミノ酸置変異について、分子動力学計算(MD)を用いて分子構造に与える影響をシミュレートし、分子機能に与える影響の予測を試みた。具体的には、野生型および変異型タンパク質について、新たに導入したワークステーションを用いて、GROMACSおよびOPLS-(AAL)/L力場による30 nsecのMDシミュレーションを行った。その結果、新規に同定されたアミノ酸変異が、分子構造上、変異部位とは離れた領域の分子の揺らぎを増大させることが予想された。揺らぎの増大が認められた分子領域は、他の分子との相互作用領域を含んでいた。このことから、新規に同定されたアミノ酸変異は、遠隔からその分子間相互作用を弱めている可能性が示唆された。そこで、共同研究により、小麦胚芽を用いたタンパク質合成系を用いて、野生型、変異型タンパク質および相互作用するタンパク質分子を合成し、プルダウンアッセイにより相互作用を調べたところ、変異型タンパク質において相互作用タンパク質との結合活性が低下していた(投稿中)。今回見出されたアミノ酸置換変異が遠隔の分子領域の構造に与える影響は、単にアミノ酸変異を結晶構造上にプロットしただけでは見出すことは極めて難しいものであり、MD解析を行ってはじめて同定することが可能であった。MDによって予測されたアミノ酸変異の影響は、機能実験によっても実証されたため、疾患を引き起こす変異の分子構造への影響を調べる手段として、MDの有用性が示されたといえる。遺伝性疾患を引き起こすアミノ酸変異について、分子構造の観点から分子機能に与える影響を予測した。具体的には、横浜市立大学大学院医学研究科遺伝学教室をはじめとした共同研究機関により同定された、early-childhood-onset steroid-resistant nephrotic syndromeを引き起こすNup107のアミノ酸変異、Spinal Extradural Arachnoid Cystを引き起こすHOXD4遺伝子のアミノ酸変異、encephalopathy with infantile-onset epilepsyを引き起こすGRIN1遺伝子のアミノ酸変異、focal cortical dysplasia type Iibを引き起こすMTOR遺伝子のアミノ酸変異、glycine encephalopathyを引き起こすLIAS遺伝子のアミノ酸変異、epileptic encephalopathyを引き起こすDNM1のアミノ酸変異などの解析を行った。これらのアミノ酸変異を分子構造上にプロットするとともに、in silicoで変異を導入し、野生型と変異型タンパク質との間の自由エネルギー差計算や、分子動力学シミュレーションを行った。タンパク質構造が実験的に明らかにされていない場合には、ホモロジーモデリングにより構造予測を行い、得られた構造にアミノ酸変異をプロットした。機能解析の結果と比較しながら、アミノ酸変異によるタンパク質の機能破綻のメカニズムを多面的に考察し報告した。遺伝性疾患の原因として同定されたアミノ酸変異によるタンパク質機能への影響を分子動力学法によって評価するシステムを構築し、ウェットな実験による検証を完了した。この成果はすでに論文報告をしており、概ね順調に進展している。国内外から依頼されるアミノ酸変異の解析に対して、構築した分子動力学シミュレーションによる解析システムを実際に運用し、複数の論文報告を行った。一方、アミノ酸置換変異の構造解析の依頼数は非常に多くなってきており、分子シミュレーションの結果をNMRによって実験的に検証するまでには至っていない。遺伝性疾患の原因として共同研究先により新たに見出された分子変異について、ホモロジーモデリングによる分子モデル構築、自由エネルギー計算、および分子動力学計算(MD)を組み合わせた解析システムを用いて、分子構造の観点から解析を行った。ただし、分子動力学計算については、解析対象分子の構造がX線結晶構造解析によって実験的に決定され、蛋白質構造データバンク(PDB)に登録されている場合にのみ行った。具体的には、以下の症状を呈する家族性疾患の原因として同定された遺伝子変異産物を対象に解析を行った。巨大血小板性血小板減少症の原因となるGrowth Factor Independent 1B Transcriptional Repressor分子のジンクフィンガードメインの遺伝子変異産物、神経変性疾患の原因となるTarget Of EGR1Protein 1分子の遺伝子変異産物、幼児期からの発育遅延とてんかんの発症に関与するProlyl-TRNA Synthetase分子の遺伝子変異産物、ネマリンミオパチーの原因となるミオパラジン分子の遺伝子変異産物、遠位関節拘縮症の原因となるTroponin I, Fast Skeletal Muscle分子の遺伝子変異産物、てんかんや精神遅滞を伴う家族性疾患の原因となるAsparagine Synthetase分子の遺伝子変異産物、および精神遅滞や筋力低下、呼吸不全を伴うびまん性の脳萎縮症の原因となるtubulinfolding co-factor D分子の遺伝子変異産物について、遺伝子変異がタンパク質機能にもたらす影響について分子構造の観点から解析し、共同研究成果として論文報告した。これらの解析例の多くでは、遺伝子変異によってタンパク質の機能不全が引き起こされる機序を分子構造の観点から説明することが可能であった。

国内外の遺伝学研究室によって遺伝性疾患の原因として新たに同定された遺伝子変異がタンパク質構造に与える影響について、ホモロジーモデリングによる分子モデル構築や自由エネルギー計算などの静的な解析に加え、分子動力学計算(MD)による動的な解析により調べた。その結果、静的な解析だけでは捉えることができなかった、NUP107遺伝子の変異による分子構造への影響について、MDを併用することで明らかにし、遺伝学研究におけるMDの有用性を示した。本研究の最大の目的は、疾患発症性のアミノ酸変異によるタンパク質機能への影響を、MDによって評価するシステムを構築し、そしてその有用性について、実験的に検証することである。本年度までに、変異型タンパク質のMDを施行するためのコンピューター環境と構造モデルの構築手法の整備が完了し、さらに、MDによる予測をウェットな実験によって検証することができた。この成果はすでに投稿中であり、概ね順調な進展と評価した。これまでに、遺伝性疾患の発症に関与するアミノ酸置換変異の分子構造への影響を解析する手法を整備してきた。具体的には、ホモロジー構造モデルの構築手法を整備し、分子動力学シミュレーションによる解析を行うためのコンピューター環境を整備などが含まれる。疾患変異を引き起こすアミノ酸置換変異の解析依頼がますます増えているので、今後は、構築した分子動力学シミュレーションによる解析システムを実際の解析に広く適用し、有用性の検証を進めるとともに、解析パイプラインをさらに洗練させていく。また、アミノ酸置換変異だけではなく、欠失などの変異に対しても構築した解析パイプラインの適用を試みる。生化学、構造生物学現在までのところ、想定を超える新規変異の解析依頼があるため、分子モデリングや、MDによる変異のシミュレーション解析にスピードが求められている。疾患関連アミノ酸変異の同定は世界的に競争が激しいため、変異による影響を実験的に検証することに時間を掛けることは難しく、当初予定していたNMR実験を検証に用いることは時間的に無理があることが分かった。そこで、分子モデリングやMDなどを実験的に検証する方法として、タンパク質間相互作用や酵素活性などへの変異による影響の解析など、NMRよりも解析スピードのより早い実験手法を併用していく予定である。