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血管内皮細胞増殖因子(VEGF)発現と肝類洞内皮細胞再生に関する研究

肝臓は旺盛な再生力を持ち、例えばラット肝臓を70%部分切除しても5日後にはほぼ元の大きさに戻るが、肝実質細胞とともに非実質細胞の再生が機能回復に重要である。この再生に関与する血管内皮細胞増殖因子(VEGF-A・VEGF-B・basicFGF)の発現について調べたところ、肝臓ではVECF-Aの発現が肝再生過程に伴って増加した。bFGFは微増したがVEGF-Bの発現は変化しなかった。VEGF-A発現の多い肺や心臓では変動は見られたが、増加することはなかった。脾臓では肝切除後12時間から増加する傾向がみられ、48時間目まで増加した。小腸では減少し、腎臓では術後24時間目に2倍程度に増加した。肺や脾臓のVEGF-Aには血中に移行しうるVEGF-Aのアイソフォームがみられた。VEGF-Bの発現は肝臓と腎臓において変化はなかった。しかし、肺臓、心臓、脾臓、小腸の各組織においては、VEGF-Bは肝切除群で増大した。以上の結果より、肝非実質細胞の再生に肝臓でのVEGF-AとbFGFの発現に加え、肺や脾臓由来のVEGF-Aが関与することが示唆された。また、肺臓、心臓、脾臓、小腸においてはVEGF-Bの産生が著しく増加しており、他の報告からウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターやプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター-1の発現や活性を調節して肝非実質細胞の再生に寄与する可能性が示された。これらの血管内皮細胞増殖因子の発現機構はまだ明らかではないが、褐色脂肪組織でのVEGF-AおよびbFGFの発現は交感神経の活性化を介して行われていることを明らかにした。肝再生時に交感神経系が活性化されることが知られており、肝再生中の血管内皮細胞増殖因子の発現が褐色脂肪組織同様に調節されていると考えられた。肝臓は旺盛な再生力を持ち、例えばラット肝臓を70%部分切除しても5日後にはほぼ元の大きさに戻る。このとき肝実質細胞のみならず非実質細胞が再生することが肝機能回復に重要である。本研究では、特に類洞内皮細胞の再生に必須と考えられる血管内皮細胞増殖因子(VEGF-AおよびVEGF-B)の肝臓および他の臓器での発現と肝再生時の変動についてノーザンブロッティング法で調べた。VEGF-Aの発現は再生肝において類洞内皮細胞の増殖(術後96時間がピーク)に先立って72時間目より増加した。しかし、VEGF-Aの発現は偽手術群において手術後、直に増加し、その発現量はコントロールの34倍に達し、術後168時間まで高いレベルを維持した。肝臓でのVEGF-Bの発現は肝切除群、偽手術群で変化は見られなかった。一方、他の臓器について調べたところ、VEGF-Aの発現は肝切除後24時間で脾臓と腎臓で2倍程度に増加し、正常状態で発現量の多い肺や心臓と小腸では変化は見られなかった。VEGF-Bの発現は肝切除群では心臓、肺、小腸、脾臓、腎臓と試した全ての臓器で増加が見られた。このうち肺のVEGF-Bの変動は偽手術群でも見られたが、他の臓器の変動は肝切除群に特有であり、その変動のピークは術後624時間であった。

以上の結果より、肝再生時の類洞内皮細胞の増殖には肝臓由来のVEGF-Aに加え、脾臓と腎臓で産生されるVEGF-Aおよび肝臓以外のの臓器で産生されるVEGF-Bが関与する可能性が示唆された。また、偽手術群の肝臓でVEGF-Aの発現が増加することはVEGF-Aが急性相蛋白として機能する可能性が見いだされた。肝臓は旺盛な再生力を持ち、例えばラット肝臓を70%部分切除しても5日後にはほぼ元の大きさに戻る。このとき肝実質細胞のみならず非実質細胞が再生することが肝機能回復に重要である。これまでにVEGF-AおよびVEGF-Bの肝臓および他の臓器での発現と肝再生時の変動についてノーザンブロッティング法で調べた。その結果、肝臓のVEGF-Aの発現は偽手術群においても認められ、再生肝に特有の現象では無いことが明かとなった。VEGF-Aと相乗作用を示すbasicfibroblast growthfactor(bFGF)の発現についてノーザンブロッティング法およびRT-PCRで調べたところ、肝切除群3よび偽手術詳のいずれの肝臓においでもbFGFの発現もほとんど変化しなかった。次に、肝臓以外の臓器で発現するVEGF-AおよびVEGF-Bのスプライシングバリアントについて検討した。VEGF-Bのスプライシングバリアントは調べた全ての組織で変化は無かった。VEGF-Aのスプライシングバリアントも手術による影響は見られず、心臓では主に189bpのバンドが検出され、肺および脾臓では少なくとも189,165,121bpの三つのバンドが検出された。これらの結果より、非実質細胞が再生にはbFGFの関与は少なく、肝臓でのVEGF-Aの発現と他の臓器、特に血中に放出しうるl21bpのVEGF-Aを産生する肺や脾臓の関与が示唆された。しかしながら、これらも肝切除群と偽手術群においても同様に認められることから、別の非実質細胞再生の機構が存在すると考えられる。
不揮発性トランジスタ開発のための半導体へのスピン偏極電子注入

電子のスピン自由度を利用して不揮発的に情報を記憶するスピントランジスタは、その導入によりあらゆるIT機器の消費電力の劇的な削減につながるため、世界的に熾烈な開発競争の只中にある。スピントランジスタを実現するためには、半導体中へのスピン注入技術を確立する必要がある。Geは次世代のMOS-FETのチャネル材料の有力候補とされており、スピン注入技術の確立が期待される。高効率のスピン注入のためには、高品位の強磁性体/Ge接合を可能とする材料・成長技術が必要であると考えられるため、新障壁層材料や強磁性体を用いたトンネル接合技術を開発する必要がある。今年度達成した主な成果を以下に説明する。(GaMn)Asは極めて高いスピン偏極状態を有し、かつ、Geと格子定数がほぼ等しくエピタキシャル成長が期待されるため、Geへののスピン注入源として注目されるべき物質である。しかしながら、これまでスピン注入実験はおろか、Ge基板上の結晶成長すら報告はなされていなかった。本研究では分子線エピタキシー法による成長条件を最適化することにより、世界で初めてGe上の単結晶(Ga, Mn)As膜の作製に成功した。(2)障壁層フリーのスピン注入源の作製とスピン注入の実証トンネル障壁層を必要としない高品位スピン注入源の開発は、作製プロセスを簡略化できるため応上用有利である。しかしながらFe等の通常の強磁性体をGeと直接接合させると、接合界面での磁性が失われてしまうという問題があり、これまで実現は困難であった。そこで、Mn5Ge3というGeを構成要素とする強磁性体に注目しGeへの結晶成長とスピン注入に取り組んだところ、期待通りにスピン注入を実証するに至った。(抄録なし)電子のスピン自由度を利用して不揮発的に情報を記憶するトランジスタ(スピントランジスタ)は、その導入によりあらゆるIT機器の消費電力の劇的な削減につながるため、世界的に熾烈な開発競争の只中にある。スピン注入とは、強磁性体からスピン偏極電子を半導体へ注入し、そのスピン情報をトランジスタのベース層幅程度(数十百nm)を伝搬させる技術である。IV属半導体であるGeは半導体技術の将来指針を与えるITRSロードマップでも次世代のMOS-FETのチャネル材料の有力候補とされており、スピン注入技術の確立が期待される。高効率のスピン注入のためには、高品位の強磁性体/Ge接合を可能とする材料・成長技術が必要であると考えられるため、新規障壁層材料や強磁性体を用いたトンネル接合技術を開発する必要がある。本研究では将来のGe基不揮発性トランジスタの実現のために必要である、Geへの高効率のスピン注入技術のための高品位接合の開発を行う。具体的に、本年度はGe基板上の磁性半導体(Ga,Mn)As単結晶膜作製技術の確立を目指した。ここで、(Ga,Mn)Asは極めて高いスピン偏極状態を有する物質として知られており、かつ、Geと格子定数がほぼ等しくエピタキシャル成長が期待されるため、高性能のスピン注入源としての利用できる可能性が指摘されている物質である。その結果、分子線エピタキシー法による成長条件を最適化することにより、世界で初めてGe上の単結晶(Ga,Mn)As膜の作製に成功した。これは、Geへの高効率スピン注入の実現に繋がる成果である。電子のスピン自由度を利用して不揮発的に情報を記憶するトランジスタ(スピントランジスタ)は、世界的に熾烈な開発競争の只中にある。このデバイスを実現するためには、半導体中へのスピン注入技術を確立する必要がある。ここで、Geは次世代MOSFETのチャネル材料の有力候補とされており、スピン注入技術の確立が期待される。高効串のスピン注入のためには、高品位の強磁性体/Ge接合を可能とする材料・成長技術が必要であると考えられるため、新規障壁層材料や強磁性体を用いたトンネル接合技術を開発する必要がある。本研究では将来のGe着不揮発性トランジスタの実現のために必要である、Geへの富効率のスピン注入技術のための高品位接合の開発を行う。本年度は、主に新障壁層材料GeO2を用いたGe中へのスピン注入を行った。GeO2はGeに対して高品位の鼻面を形成できるためゲート酸化膜として用いられているが、トンネル障壁材斜としての報告例はなかった。そこで、不純ガスの少ないバルク状GeO2蒸着源の開発を行い、これを用いた高品位Fe/GeO2強磁性トンネル接合を実現することにより、スピン注入に必要な臨界電流密度を従障壁層MgOと比較して約3桁に達する劇的な削減に成功した(A. Spiesser et al. Jpn. J. Appl. Phys.(2013))。この成果は、Geを用いたスピントランジスタの低消費動作に極めて重要であり、グリーンITの発展へ大きく貢献できると期待される。さらに、異方性トンネル磁気抵抗効果という現象をSi基デバイスにおいて初めて観測する等、当初予想していなかった成果を挙げることができた。

電子のスピン自由度を利用して不揮発的に情報を記憶するスピントランジスタは、その導入によりあらゆるIT機器の消費電力の劇的な削減につながるため、世界的に熾烈な開発競争の只中にある。スピントランジスタを実現するためには、半導体中へのスピン注入技術を確立する必要がある。Geは次世代のMOS-FETのチャネル材料の有力候補とされており、スピン注入技術の確立が期待される。高効率のスピン注入のためには、高品位の強磁性体/Ge接合を可能とする材料・成長技術が必要であると考えられるため、新障壁層材料や強磁性体を用いたトンネル接合技術を開発する必要がある。今年度達成した主な成果を以下に説明する。(GaMn)Asは極めて高いスピン偏極状態を有し、かつ、Geと格子定数がほぼ等しくエピタキシャル成長が期待されるため、Geへののスピン注入源として注目されるべき物質である。しかしながら、これまでスピン注入実験はおろか、Ge基板上の結晶成長すら報告はなされていなかった。本研究では分子線エピタキシー法による成長条件を最適化することにより、世界で初めてGe上の単結晶(Ga, Mn)As膜の作製に成功した。(2)障壁層フリーのスピン注入源の作製とスピン注入の実証トンネル障壁層を必要としない高品位スピン注入源の開発は、作製プロセスを簡略化できるため応上用有利である。しかしながらFe等の通常の強磁性体をGeと直接接合させると、接合界面での磁性が失われてしまうという問題があり、これまで実現は困難であった。そこで、Mn5Ge3というGeを構成要素とする強磁性体に注目しGeへの結晶成長とスピン注入に取り組んだところ、期待通りにスピン注入を実証するに至った。トンネル障壁層を用いたスピン注入実験に関して、新障壁層材料GeO2を用いたGeへの高効率スピン注入に成功し、さらに異方性トンネル磁気抵抗効果という新親象を見出すなど、予想を上回る成果を挙げた。一方で、磁性半導体GaMnAsや新磁性材料MnGeを用いたトンネル障壁層を用いないGeへのスピン注入は、接合抵抗が非常に高くなってしまうという問題が生じており、これまで確認できていない。実際に、(Ga,Mn)AsからGeへのスピン注入に挑む。さらに、通常の強磁性金属を用いた高品位金属/Ge接合の実現を探る。MnGeおよびGaMnAsを用いたGeへのスピン注入を目指す。これまでの研究により、半導体への効率的なスピン注入のためには強磁性トンネル接合抵抗をできるだけ低くすることが有効であることがわかっている。そこで、より高ドープGe基板、もしくはデルタドープ等の手法を用いて接合抵抗の低減を図り、スピン注入を実現する。(抄録なし)
新規脳分子による新しい生殖制御機構の解明

我々は新規脳ホルモンである生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモン(gonadotropin-inhibitory hormone;GnIH)を鳥類から発見した。本研究では、GnIHはヒトなどの霊長類から無顎類に至る全ての脊椎動物に存在することを明らかにした。さらに、GnIHは生殖腺刺激ホルモンの合成と放出を抑制して生殖腺の発達と機能を抑える働きがあることを明らかにした。本研究により、この新規脳分子による新しい生殖制御機構の大略が解明された。動物の生殖を制御する脳機構の新しい理解には、重要な新規脳分子を同定して、それらの生理作用、作用機構、発現制御機構などを明らかにする必要がある。1970年代始めにノーベル賞受賞者であるシャリーとギルマンにより哺乳類の脳から生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)が発見されたが、生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制する脳ホルモンの存在は長く不明であった。2000年に我々は生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制する新規の脳ホルモンを鳥類のウズラの脳から発見して、生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモン(GnIH)と名付けた。GnIHの発見は従来の常識を覆すものである。本研究は、ヒトなどの霊長類から無脊椎動物にまで広く存在すると考えられるGnIH同族ペプチドを同定し、これらの新規脳分子による生殖制御機構の解明を目的に実施した。すでに、ヒトなどの霊長類からヌタウナギなどの無顎類に至る全ての脊椎動物からGnIH同族ペプチドの同定に成功しており、新規脳ホルモンであるGnIHとGnIH同族ペプチドによる新しい生殖制御機構の解明が期待される。動物の生殖を制御する脳機構の新しい理解には、まず重要な新規脳分子を同定し、新規脳分子の作用を分子、細胞、個体の各レベルから解析することが不可欠である。2000年に我々は生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制する新規の視床下部ホルモンを鳥類から発見して、生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモン(GnIH)と名付けた。その後の研究により、GnIHと構造の類似する同族ペプチドが他の脊椎動物にも存在していることが示唆された。本研究は、(1)ヒトなどの高等哺乳類から無脊椎動物にまで広く存在すると考えられるGnIH同族ペプチドを同定してGnIHとGnIH同族ペプチドの起源と構造の分子進化を明らかにすること、さらに(2)これらの新規脳分子による新しい生殖制御機構の解明などを目的として実施した。本年度は、霊長類のヒト、哺乳類のハムスター、両生類のカエルとイモリなどの脳からGnIH同族ペプチドを同定して構造を明らかにした。次に、ヒトとハムスターから同定したGnIH同族ペプチドの生理作用を解析した結果、これらのGnIH同属ペプチドは生殖を制御する生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制することが見いだされた。一方、カエルとイモリから同定したGnIH同属ペプチドは生殖を制御する別のホルモンであるプロラクチンの放出を促進することが見いだされた。次に、これらのGnIH同属ペプチドの受容体を同定して、GnIH同属ペプチドの作用機構を解析した。その結果、GnIH同属ペプチド受容体は脳下垂体に発現していることから、GnIH同属ペプチドは脳下垂体に作用して生殖腺刺激ホルモンとプロラクチンの放出を制御することが明らかになった。さらに、新たに同定したGnIH同族ペプチドの発現制御機構を解析したところ、メラトニンがGnIH同族ペプチドの発現を誘導していることが示唆された。GnIHと構造の類似する同族ペプチドが他の脊椎動物にも存在している可能性がある。本研究はヒトなどの霊長類から無脊椎動物にまで広く存在すると考えられるGnIH同族ペプチドを同定し、これらの新規脳分子による新しい生殖制御機構の解明を目的としている。本年度は、GnIH同族ペプチドを霊長類のヒトとサル、哺乳類のラット、ハムスターとヒツジなどの脳から同定して構造を明らかにした。GnIH同族ペプチドはGnIHと同様にC-末端側の配列がいずれも共通のLeu-Pro-Xaa-Arg-Phe-NH2(Xaa=Leu or GIn)(LPXRFa)構造を持つという特徴があった。同定した霊長類と哺乳類のGnIH同属ペプチドの生理作用を解析したところ、鳥類のGnIHと同様に生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制する作用があることがわかった。鳥類のGnIHと霊長類と哺乳類のGnIH同族ペプチドの受容体を同定して作用機構を解析した結果、これらの新規脳分子は脳下垂体の生殖腺刺激ホルモン産生細胞と視床下部の生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンに存在する7つの膜貫通領域を持つ新規のGタンパク共役型受容体を介して生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制することが明らかになった。GnIHとGnIH同族ペプチドの発現制御機構を解析したところ、メラトニンがこれらの新規脳分子の発現を制御していることが見いだされた。

本年度はさらに、GnIHとGnIH同族ペプチドの起源と構造の分子進化を明らかにするために、爬虫類のミドリガメ、両生類のカエルとイモリ、魚類のキンギョ、無顎類のヌタウナギなどからGnIH同族ペプチドを同定して、構造の普遍性と多様性を明らかにした。我々は生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制する新規視床下部ペプチドを鳥類から同定して生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモン(gonadotropin-inhibitory hormone; GnlH)と名付けた。昨年度までの研究により、GnlH同族ペプチドを霊長類、哺乳類、爬虫類、両生類、魚類、無顎類などから同定して、GnlHとGnlH同族ペプチドの起源と構造の分子進化の大略を明らかにした。GnlHとGnlH同族ペプチドはC-末端側の配列がいずれも共通のLeu-Pro-Xaa-Arg-Phe-NH2(Xaa=Leu or GIn)(LPXRFa)構造を持つという特徴があり、GnlHとGnlH同族ペプチドの起源は少なくとも無顎類に遡ることがわかった。本年度は、GnlHとGnlH同族ペプチドの生殖腺の発達と機能における生理作用と作用機構を主に哺乳類や鳥類などの高等脊椎動物を用いて解析した。その結果、GnlHとGnlH同族ペプチドは下垂体に存在する新規のGタンパク共役型受容体を介して生殖腺刺激ホルモンの合成と放出を抑制して、生殖腺の発達と機能を抑えることが明らかになった。また、GnlHとGnlH同族ペプチドの受容体は生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(gonadotropin-reIeasing hormone; GnRH)ニューロンにも存在しており、GnlHとGnlH同族ペプチドはGnRHニューロンに作用して生殖腺刺激ホルモンの合成と放出を抑制することが見いだされた。さらに、GnlHとGnlH同族ペプチドは生殖腺にも発現しており、GnlHとGnlH同族ペプチドの局所作用により、配偶子形成が抑制されることが示唆された。GnlHとGnlH同族ペプチドの発現制御機構を解析したところ、メラトニンがGnlHとGnlH同族ペプチドの発現を誘導して生殖を抑制することが明らかになった。鳥類から発見した新規脳分子である生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモン(gonadotropin-inhibitory hormone : GnIH)による新しい生殖制御機構の解明には、他の脊椎動物からGnIH同族ペプチドを同定して、GnIHとGnIH同族ペプチドの生理作用、作用機構、発現制御機構を明らかにする必要がある。本年度は、次の重要な成果を得た。(1)霊長類(ヒトとサル)、哺乳類(ヒツジなど)、鳥類(ムクドリなど)、両生類(イモリ)、魚類(キンギョなど)、無顎類(ヌタウナギ)の脳からGnIH同族ペプチドを同定して、新規脳分子であるGnIHの起源は無顎類に遡ることを明らかにした。さらに、GnIHの起源と分子進化を明らかにするために、原索動物(ホヤ、ナメクジウオ)と無脊椎動物(タコ)の脳からGnIH同族ペプチドの同定を試みた。(2)霊長類、哺乳類、鳥類では、GnIHとGnIH同族ペプチドは脳下垂体の生殖腺刺激ホルモン産生細胞と視床下部のGnRHニューロンに作用して生殖腺刺激ホルモンの放出と合成を抑制することを明らかにした。
低酸素イメージングを中心とした複合的な脳腫瘍診断法・治療法の確立

原発性脳腫瘍の臨床において、手術を行わずに非侵襲的な方法で腫瘍の性質を明らかにする画像診断の果たす役割は大きい。本研究では、MRI等の既存の診断法に加えて、低酸素イメージング製剤F-18 fluoromisonidazole(FMISO)を用いたポジトロン断層撮影法(PET)を用いることで、神経膠腫の非侵襲的な鑑別診断法の確立を目指すことを目的とした。神経膠腫23症例に対して、FMISOPETを行い、その画像所見を術後病理所見と比較した。23例中14例が病理学的にWHO grade IVの神経膠芽腫であったが、これらはすべてFMISO集積亢進を示した。また残りの9例はgrade IIまたはIIIの神経膠腫であったが、これらはすべてFMISO集積陰性であった。この結果からFMISO PETによってgrade IVか、grade III以下かを鑑別することができると考えられた。さらに、神経膠芽腫のうち10例に、高分解能半導体PETでのFMISO PETおよび糖代謝を反映するFDG PETを行った。半導体PETの高い空間分解能を利用して腫瘍内の局所的な集積強弱を評価することによって、腫瘍内の分布のFMISOとFDGの分布がよく一致する症例(N=4)と、乖離する症例(N=6)が存在することを見出した。前者は嫌気性糖代謝が中心で、後者は好気性糖代謝が中心と考えられ、神経膠芽腫の中にも好気性のものと嫌気性のものが存在することがわかった。両者の治療反応性や予後の差異について今後研究を進める予定である。また、本研究に関連して、脳腫瘍の診断に用いられるメチオニンPETが、非腫瘍性の脳炎の診断にも有用であることを見出したので、これを報告した。
炭酸ガス高固定樹種の検索と遺伝育種学的向上に関する研究

九州地方に生育する樹木の中から炭酸ガス固定能力の高い樹種としてセンダンを選抜した。センダンの優良個体を得る目的で、九州の5地域に生育するセンダンから種子を採取し、産地試験を実施した。これらの遺伝変異をRAPD分析により明らかにするとともに、成長特性を明らかにした。加えて、組織培養を用いたセンダンの大量増殖法を確立した。一方、育種的手法により変異体を作成するための予備試験として、ニセアカシアを材料としたカルス選抜による方法を試みた。以上の結果、以下のことが明らかにされた。1.産地試験の結果、センダンの成長は地域差、個体差が大きいことが明らかになった。産地試験の中から成長の良好な個体を優良個体として選抜し、組織培養による大量増殖のための材料とした。2.RAPD分析の結果、離れた地域間ほど遺伝距離が離れ、特に屋久島と種子島の個体と九州本島との遺伝距離が離れていた。3.センダンの成長特性として、陽性の樹種であることと、養分要求量の大きな樹種であることが明らかにされた。4.センダンは組織培養による増殖が可能であったが、クローンにより増殖率に差がみられた。5.ニセアカシアのカルスから植物体を再生するための培養系を確立した6.ニセアカシアのカルスに塩処理を行い、形質変化を蛋白組成から判断するための方法を確立した。7.塩処理カルスから再生した個体の遺伝変異を蛋白組成から明らかにした。1.成長量の検索九州地方に生育する落葉広葉樹53種の中から成長の優れた樹種で、しかも優良広葉樹として利用価値の高い雑種としてセンダン(Melia azedarach)を選抜した。2.遺伝子の収集センダンの自生地は河川沿いに多く見られることから、九州内の5河川(緑川、大淀川、川内川、多々良川、筑後川)を対象として種子の採集を行った。採取母樹は各河川とも40個体とし、全域で200母樹から採取した。3.炭酸ガス固定能、成長量の把握成長量の検索に用いた落葉広葉樹の中から30種を選定し、単歯の光合成速度と成長量との関係を解析した。その結果、成長量の大きなセンダンの光合成速度は大きい値を示すことが明らかにされた。4.遺伝的解析センダイの頂芽を用いてプライマーの検索、DNA増殖の条件設定などの予備検索を行った。この結果をもとに採取の終了した200母樹の遺伝子解析を行う。5.組織培養の可能性の検討センダン成木の腋芽からの無菌苗の作出を試みた。MS基本培地に1ppmのBAPを添加した培地でシュートが形成された。これらのシュートを支持材としたMS培地に置くと発根が見られた。発根した無菌苗は順化の後、野外への植栽が可能であった。1.炭酸ガス固定能,成長量の把握九州の5河川と屋久島から収集したセンダンの実生の成長を比較した。その結果、緑川で採取された種子の中に成長の良好な個体が多いことが明らかにされた。さらに、各採取地の遺伝変異をRAPD法によって解析した結果、屋久島のセンダンが、他の地域のセンダンと隔離されていることが判明した。2.組織培養による培養系の確立対象樹種としてセンダンとニセアカシアを選定し、組織培養による増殖法について検討した。センダンは外植体として腋芽を用い、MS倍地にBAPの1ppmの添加で増殖できることが確認された。ニセアカシアは芽生えの胚軸から誘導されたカルスを経由して不定芽を誘導する培養系が確立された。3.育種センダンは、発芽種子を無菌的にコルヒチン処理することによって4培体を作成できた。この4培体植物を順化・生育させ、交配育種によって3培体を作出することが可能となった。

ニセアカシアはカルス選抜による変異体を作出する目的で、継体培養されたカルスに塩処理を行い、生き残ったカルスを経由して植物体を再生させるための培養系を確立した。塩処理されたカルスより分化したシュートは正常なカルスから分化したシュートと比較して形態的に異なっていることが確認された。炭酸ガスの固定機能などの特性については、これらのシュートから植物体を再生させた後、比較が可能となる。九州の5河川流域から採取されたセンダン種子群の中から初期成長の優れた7個体を優良樹として選抜した。さらに、これらの7個体を材料として、組織培養による大量増殖法の確立を試みた。切断された幹を室内に搬入し、萌芽法によって得られた腋芽を、無菌的に試験管内で増殖した。1/2MS培地にBAPを1ppm添加した培地で増殖が可能であった。しかし、個体によって増殖率に差が認められ、遺伝的な違いがあることが確認された。発根は1/2MS培地にIBAを1ppm添加した発根培地で良好に発根することが確認された。苗の順化は大型ポットで良好な結果が得られた。以上の研究によって、センダンの大量増殖法が確立された。カルス選抜による効果を蛋白組成を用いて評価するために、SDSゲル電気泳動法について検討した。耐乾性、耐塩性に優れ、成長速度の大きいニセアカシアのカルスを材料とし、試料の調整方法、ゲルの作成方法、電気泳動法等について検討した。試料の調整には、蛋白質の分解、変性修飾の抑制および不可溶性蛋白質の可溶化のために最終濃度0.375mMのDDTと8Mの尿素の添加が必要であった。濃度勾配(7.5-15%)分離ゲルの作成には過硫酸アンモニウムとTEMEDの最終濃度が0.025%が適していた。さらに、電気泳動の電圧と時間のスケジュールを明らかにした。
末梢動脈瘤に対する仙台ステントグラフトの基礎的研究

(1)生体におけるcoveredSENDAI stentの有用性の検討【方法】Nitinol製の自己拡張型ステント:SENDAI stent(径56mm、長さ20mm)を多孔性のSPU filmで被覆した。SPU filmの厚さは15μm、孔径は100μm、孔間隔は250μmとした。新生内膜肥厚抑制のため、SPU filmの外面に免疫抑制剤であるFK506を塗布した。雌ビーグル成犬(体重1012kg)の外腸骨動脈にFK506を塗布したcovered stent (n=6)、何も塗布しないcovered stent (n=6)およびbare stent (n=6)を留置した。4週間後に血管撮影し、外腸骨動脈を摘出し、内膜肥厚の程度、内皮化の有無を検討した。【結果】いずれも留置4週後の外腸骨動脈に有意狭窄や血栓閉塞は認めず、cover filmの内面には均一な内皮化を認めた。新生内膜肥厚の面積は(bare stent群)<(FK506を塗布したcovered stent群)<(何も塗布しないcovered stent群)の順て、各群間に有意差を認め、FK506塗布の効果が示唆された。(2)末梢動脈瘤モデル作成法の検討【方法】計8匹の雌ビーグル成犬(体重1012kg)を使用。外腸骨動脈に留置したダブルバルーンの閉鎖空間にエラスターゼ2mlを注入し、1時間放置した。1ケ月後に血管造影と組織学的に動脈瘤の有無を検討した。【結果】以下のことが明らかとなった。(1)ダブルバルーンの閉鎖空間にエラスターゼ2ml注入1ケ月後に外腸骨動脈に動脈瘤が生じた。(2)動脈瘤を生じるには、エラスターゼ注入前にバルーン拡張が必要であった。(3)径8mmバルーンカテーテルで6気圧までの拡張まで外腸骨動脈は破裂しなかった。(1)生体におけるcovered SENDAIstentの有用性の検討【方法】Nitinol製の自己拡張型ステント:SENDAI stent(径56mm、長さ20mm)を多孔性のSPU filmで被覆した。(1)生体におけるcovered SENDAIstentの安全性の検討【結果】いずれも留置4週後の外腸骨動脈に有意狭窄や血栓閉塞は認めず、cover filmの内面には均一な内皮化を認めた。新生内膜肥厚の面積は(bare stent群)<(FK506を塗布したcovered stent群)<(何も塗布しないcovered stent群)の順で、FK506塗布の効果が示唆された。(2)末梢動脈瘤モデル作成法の検討【方法】計3匹の雌ビーグル成犬(体重1012kg)を使用。5.5Fのダブルバルーンカテーテルを右外腸骨動脈に留置。ダブルバルーンを拡張させて、閉鎖空間にエラスターゼ2ml(206U)を注入し、1時間放置した。コントロールとして、左外腸骨動脈に留置したダブルバルーンを拡張させて、閉鎖空間に生食2mlを注入し、1時間放置した。4ヶ月後に血管撮影し、外腸骨動脈を摘出し、動脈瘤の有無を検討した。【結果】3例ともエラスターゼを注入した右外腸骨動脈に動脈瘤が生じており、左外腸骨動脈には動脈瘤を認めなかった。今後、さらに動脈瘤モデルの作成法を検討していく。まず、動脈瘤モデルが必要であるため、以下のような動脈瘤モデル作成実験に1年間を費やした。【方法】

計8匹の雌ビーグル犬を使用。外腸骨動脈に留置したダブルバルーンの閉鎖空間にエラスターゼ2mlを注入し、1時間放置した。1ケ月後に血管造影と組織学的に動脈瘤の有無を検討した。<No.1>右外腸骨動脈の閉鎖空間にエラスターゼを注入。【結果】右外腸骨動脈に動脈瘤が生じた。<No.2>・右外腸骨動脈の閉鎖空間にエラスターゼ注入。・バルーンで左外腸骨動脈を拡張後、注入。【結果】左外腸骨動脈に動脈瘤が生じ、右外腸骨動脈には軽度の動脈瘤が生じた。<No.3>・Cutting Balloonで右外腸骨動脈を拡張後、エラスターゼを注入。・Fogartyカテーテルで左外腸骨動脈を擦過後、注入。【結果】両側外腸骨動脈に動脈瘤が生じた。<No.4>・ダブルバルーンを用いずに、総頚動脈と右大腿動脈からバルーンを挿入し、閉鎖空間にエラスターゼ注入。・左深大腿動脈を金属コイルで塞栓し、注入。【結果】右外陽骨動脈が破裂し、急性期死亡となった。<No.5>・Fogrartyカテーテルで擦過後、右外腸骨動脈の閉鎖空間にエラスターゼを注入。・左外腸骨動脈の閉鎖空間にエラスターゼを注入。【結果】右外腸骨動脈に過剰な血栓が付着し、瘤化は認めなかった。左外腸骨動脈に瘤化を認めた。<No.6>・バルーンカテーテルにて右外腸骨動脈を拡張後、閉鎖空間にエラスターゼを注入。・Fogrartyカテーテルにて左外腸骨動脈を擦過後、注入。【結果】右外腸骨動脈が破裂して、急性期死亡となった。<No.7>・右外腸骨動脈の閉鎖空間にエラスターゼを1回注入。・左外腸骨動脈の閉鎖空間にエラスターゼを6回注入、【結果】両側外腸骨動脈の動脈瘤に差は認めなかった。<No.8>(破裂実験)外腸骨動脈を径6mm→7mm→8mmバルーンにて拡張した。【結果】φ8mm、6気圧まで破裂しなかったが、径8mm、8気圧で破裂した。【結論】以上の実験から、有効な動脈瘤モデル作成法として、以下のことが明らかとなった。(1)ダブルバルーンの閉鎖空間にエラスターゼ2ml注入1ケ月後に外腸骨動脈に動脈瘤が生じる。(2)動脈瘤を生じるには、エラスターゼ注入前にバルーン拡張が必要である。(3)径8mmバルーンカテーテルで6気圧までの拡張では破裂しない。(4)Cutting Ba11oonやFogartyカテーテルは動脈破裂や過剰な血栓を生じ、動脈瘤作成に適さない。
病原細菌，Mollicutes綱における3種の運動メカニ ズム

高等動植物に寄生することで特殊な進化を達成した病原細菌,Mollicutes綱(モリクテス綱)は,小さなグループであるにもかかわらず,3種類ものユニークな運動メカニズムを有している.私たちはこれまでの独自の研究で,Mycoplasma mobile(以下,モービレと略)の滑走運動メカニズムのアウトラインを明らかにし,Mycoplasma pneumoniae(以下,ニューモニエと略)などの滑走運動とSpiroplasma eriocheiris(以下,スピロプラズマと略)などの遊泳運動のメカニズムの理解に大きく貢献してきた.本研究では,これら3種の運動メカニズム全てを,構造,反応,進化の面から徹底的に究明する.昨年度までにモービレとスピロプラズマの力発生装置の中核部分と,ニューモニエのあしの主なタンパク質の構造を,電子顕微鏡を用いることで高分解能で明らかにした.今後はこれらの研究を完成させると同時に,運動メカニズムを解明するために必須ではあるが,まだ明らかにしていない構造に取り組む.また,これらの構造に関する新しい知見を基に,蛍光顕微鏡,光ピンセット,高速原子間力顕微鏡,急速凍結レプリカ電子顕微鏡法などを駆使した実験を行い,化学反応とのカップリングや力の発生と伝達についても明らかにする.昨年度に成功した,合成細菌syn3Bにおけるスピロプラズマ遊泳運動の再構築系を最大限に活用し,タンパク質改変に基づいた解析と細胞観察と生化学の間を埋める実験系を確立し,この系を他の二つの運動メカニズムにも応用する.さらにこの系をメカニズム解明のみではなく,運動能獲得の進化の解明にも活用する.【モービレの滑走運動】滑走装置の内部構造を単離し,クライオ電子顕微鏡による観察と,コンピューターによる像の計算を行うことで,6.7オングストロームの分解能で構造を明らかにすること,その構造に5つの構成タンパク質のうち3つを割り当てることに成功した.その結果,モービレの滑走装置がATP合成酵素と,解糖系においてATPを合成しているホスホグリセリン酸キナーゼから進化したことが示された.また,この内部構造の動きを,菌体の高速原子間力顕微鏡観察によりとらえることに成功した.さらに,あしのタンパク質の受容体ドメインの特定に成功した.【ニューモニエの滑走運動】滑走のためのあしを形成する重要なタンパク質,P1アドヘジンの構造の溶液X線散乱によるモデリングに成功し,さらにクライオ電子顕微鏡による解析を行うことで分解能3.1オングストロームで構造を明らかにした.また,菌体膜を界面活性剤で透過化したモデル,滑走ゴーストの確立に成功し,直接のエネルギー源がATPであると結論づけた.【スピロプラズマの遊泳運動】スピロプラズマに共通して存在するFibrilタンパク質から構成される,遊泳装置の中核となるリボン構造を単離し,その構造とバリエーションを従来型の電子顕微鏡で解析した. 20オングストロームの分解能で構造を明らかにすることに成功し,スピロプラズマの遊泳メカニズムがリボン構造のねじれで説明できることを明らかにした.さらにこのタンパク質と,真核生物のアクチンとよく似たタンパク質であるMreBタンパク質5種類を,合成細菌syn3Bにて発現することにより遊泳運動を再現することに成功した.syn3Bは,ゲノム操作で知られるクレイグベンター研究所で2016年に開発された,人工ゲノムを持つ合成生命で,小さな球状の細菌で運動能はない.また,これら遊泳に関与すると考えられる5種類のMreBタンパク質それぞれを合成,精製して,生化学的な特徴づけを行った.【モービレの滑走運動】構成タンパク質の構造を,結晶化あるいは配列を基にした予想を行うことで,クライオ電子顕微鏡で得られた構造の全てに構成タンパク質を割り当てる.内部構造以外の部分については,単離したタンパク質の構造のみが明らかになっているため,複合体の単離と構造解析を行う.高速原子間力顕微鏡については,観察中に菌体が基板から外れることが問題となっているため,観察対象を菌体から滑走装置断片に変更し,ATP添加による動きの解析を行う.これまでに固形物表面にはりつけた菌のあしに光ピンセットで操作したビーズをつけてその動きと力を調べることに成功しているため,今後はこの方法を用いてあし1本の挙動を解明する.滑走に必要と考えられる約14のタンパク質をsyn3Bの系に発現し,装置と機能の構築を調べる.【ニューモニエの滑走運動】P1アドヘジンには,モノクローナル抗体による阻害,株間によるアミノ酸配列の違い,抗原性変化を起こす部位,などの数多くの研究者による興味深いデータが蓄積しているため,昨年度に得られた構造にアミノ酸配列を当てはめることでそれぞれの部位の機能を明らかにする.私たちは,以前に滑走装置の内部構造をクライオ電子顕微鏡で可視化したが,本年度はさらに高分解能での解析を行う.滑走に必要と考えられる約15のタンパク質をsyn3Bの系に発現し,装置と機能の構築を調べる.【スピロプラズマの遊泳運動】Fibrilタンパク質の構造をクライオ電子顕微鏡法で解析することで,分解能3オングストロームでの解明を行う.5種類のMreBタンパク質の生化学的な特徴づけを完成することと並行して,細胞膜やFibrilタンパク質との結合,重合・脱重合などのダイナミクスを単離した画分とsyn3Bの双方の系を用いて,光学顕微鏡により明らかにする.5種類のMreBの機能と遊泳における役割をsyn3Bの系を用いて明らかにする.高等動植物に寄生することで特殊な進化を達成した病原細菌,Mollicutes綱(モリクテス綱)は,小さなグループであるにもかかわらず,3種類ものユニークな運動メカニズムを有している.私たちはこれまでの独自の研究で,Mycoplasma mobile

(以下,モービレと略)の滑走運動メカニズムのアウトラインを明らかにし,Mycoplasma pneumoniae(以下,ニューモニエと略)などの滑走運動とSpiroplasma eriocheiris(以下,スピロプラズマと略)などの遊泳運動のメカニズムの理解に大きく貢献してきた.本研究では,これら3種の運動メカニズム全てを,構造,反応,進化の面から徹底的に究明する.昨年度までにモービレとスピロプラズマの力発生装置の中核部分と,ニューモニエのあしの主なタンパク質の構造を,電子顕微鏡を用いることで高分解能で明らかにした.今後はこれらの研究を完成させると同時に,運動メカニズムを解明するために必須ではあるが,まだ明らかにしていない構造に取り組む.また,これらの構造に関する新しい知見を基に,蛍光顕微鏡,光ピンセット,高速原子間力顕微鏡,急速凍結レプリカ電子顕微鏡法などを駆使した実験を行い,化学反応とのカップリングや力の発生と伝達についても明らかにする.昨年度に成功した,合成細菌syn3Bにおけるスピロプラズマ遊泳運動の再構築系を最大限に活用し,タンパク質改変に基づいた解析と細胞観察と生化学の間を埋める実験系を確立し,この系を他の二つの運動メカニズムにも応用する.さらにこの系をメカニズム解明のみではなく,運動能獲得の進化の解明にも活用する.【モービレの滑走運動】滑走装置の内部構造を単離し,クライオ電子顕微鏡による観察と,コンピューターによる像の計算を行うことで,6.7オングストロームの分解能で構造を明らかにすること,その構造に5つの構成タンパク質のうち3つを割り当てることに成功した.その結果,モービレの滑走装置がATP合成酵素と,解糖系においてATPを合成しているホスホグリセリン酸キナーゼから進化したことが示された.また,この内部構造の動きを,菌体の高速原子間力顕微鏡観察によりとらえることに成功した.さらに,あしのタンパク質の受容体ドメインの特定に成功した.【ニューモニエの滑走運動】滑走のためのあしを形成する重要なタンパク質,P1アドヘジンの構造の溶液X線散乱によるモデリングに成功し,さらにクライオ電子顕微鏡による解析を行うことで分解能3.1オングストロームで構造を明らかにした.また,菌体膜を界面活性剤で透過化したモデル,滑走ゴーストの確立に成功し,直接のエネルギー源がATPであると結論づけた.【スピロプラズマの遊泳運動】スピロプラズマに共通して存在するFibrilタンパク質から構成される,遊泳装置の中核となるリボン構造を単離し,その構造とバリエーションを従来型の電子顕微鏡で解析した. 20オングストロームの分解能で構造を明らかにすることに成功し,スピロプラズマの遊泳メカニズムがリボン構造のねじれで説明できることを明らかにした.
ステロイドホルモンレセプターの神経系細胞内における動態の解析

GFPおよびそのspectral variantであるCFP、YFPなどと種々のステロイドホルモンレセプター(本研究課題においては主としてグルココルチコイドレセプター(GR)、ミネラルコルチコイドレセプター(MR))あるいは核-細胞質間輸送蛋白のimportin αやimportin βとのキメラ遺伝子を作成した。これらをCV-1,COS-1細胞、初代海馬培養神経細胞、初代培養グリア細胞などにリポフェション法によりトランスフェクションし、レセプターや共役転写因子がリガンドの添加や細胞外環境の変化に対してどのような挙動を示すのかを、落射型蛍光顕微鏡と冷却CCDカメラの組合せまたは共焦点レーザー顕微鏡を用い、リアルタイムに追跡した。その結果、GRはリガンドの非存在下では主として細胞質に局在し、MRは細胞質と核の両者に分布することが認められ、リガンドの添加によりGRおよびMRともに速やかに核内へ移行することが、また核内移行に際して微小管などの関与は認められないことなどが明らかにされた。さらに、GRおよびMRを各々CFPおよびYFPで二重標識して同一細胞内に共発現させた実験において、核内移行速度は内因性のレセプターをもたないCOS細胞ではリガンドに対する親和性の差を反映していたが、内因性のGRおよびMRが共発現する海馬の神経細胞ではリガンドに対する親和性を反映した核移行速度の差は認められず、異なる核輸送の機構が存在する可能性が示唆された。また、hsp90の特異的阻害剤であるgeldanamycin投与によりCOS細胞においてGRおよびMRの核移行が阻害され、これらレセプターの核移行にhsp90が重要な役割を担っていることが示唆された。さらにGRやMRの核移行シグナル(NLS)を認識するimportin αをCOS細胞に発現させると、細胞質、核の療法に存在する細胞が多く認められたが、細胞質有意、核有意に存在するものも認めた。外からの刺激なしでも核内への移行が観察されたが、GRやMRと共発現させた場合は、リガンドの添加によって細胞質に存在するimportin αの核内への強い集積を認め、輸送蛋白が核内レセプターとともに動く像をリアルタイムに可視化し、捉えることができた。今後はFRETなどの手法を加えて、時空間特異的にこれらレセプターと輸送蛋白との相互作用を追跡していきたいと考えている。われわれの研究室では種々のステロイドホルモンレセプターとgreen fluorescent protein(GFP)あるいはそのspectral variant(CFP,YFP,RFP)などとの融合蛋白を用いて、その生細胞内局在をリアルタイムに追跡する系を確立し、研究をすすめてきた。本研究課題では、細胞内局在の変化、とくにGR,MRの細胞質-核間輸送に焦点をおいて、細胞骨格蛋白、他の細胞内小器官、核内輸送因子、核膜複合体蛋白などのステロイドホルモンレセプターの細胞内局在変化に及ぼす影響を解析することを目的とする。コルヒチン処理により細胞骨格蛋白を破壊しても核移行には影響しないことが明らかになった。またhsp90の特異的阻害剤であるgeldanamycin投与によりCOS細胞においてはGRおよびMRの核移行が阻害され、hsp90がこれらレセプターの核移行に重要な役割を担っていることが示唆された。

一方、初代海馬培養神経細胞においてはgeldanamycinで同様に処理しても、核移行には有意な変化は認められず、細胞種におけるhsp90の作用機序に相違があることが示唆された。さらに、GR-CFPおよびYFP-MRを同一細胞に共発現させ、共通のリガンドであるcorticosteroneの影響を調べたところ1μM投与では両レセプターの核移行速度に有意差は認められなかったが、1nMでは親和性の高いMRの方が高い核移行速度を示した。13年度は、importin α,βなどの核内輸送因子の影響を同様な共発現の系で解析するとともに、fluorescence resonance energy transfer(FRET)を用いて核内輸送因子や核膜複合体蛋白とステロイドホルモンレセプターとの蛋白-蛋白相互作用の解析もすすめていく予定である。申請者らはGFPとの融合により、ステロイドホルモンレセプターの生細胞内における局在をリアルタイムで解析する実験系を確立し、研究を進めてきた。GFPおよびそのspectral variantであるCFP、YFPなどと種々のステロイドホルモンレセプター(本研究課題においては主としてグルココルチコイドレセプター(GR)、ミネラルコルチコイドレセプター(MR))あるいは核-細胞質間輸送蛋白のimportinαやimportinβとのキメラ遺伝子を作成した。これらをCV-1,COS-1細胞、初代海馬培養神経細胞、初代培養グリア細胞などにリポフェション法によりトランスフェクションし、レセプターや共役転写因子がリガンドの添加や細胞外環境の変化に対してどのような挙動を示すのかを、落射型蛍光顕微鏡と冷却CCDカメラの組合せまたは共焦点レーザー顕微鏡を用い、リアルタイムに追跡した。その結果、GRはリガンドの非存在下では主として細胞質に局在し、MRは細胞質と核の両者に分布することが認められ、リガンドの添加によりGRおよびMRともに速やかに核内へ移行することが、また核内移行に際して微小管などの関与は認められないことなどが明らかにされた。さらに、GRおよびMRを各々CFPおよびYFPで二重標識して同一細胞内に共発現させた実験において、核内移行速度は内因性のレセプターをもたないCOS細胞ではリガンドに対する親和性の差を反映していたが、内因性のGRおよびMRが共発現する海馬の神経細胞ではリガンドに対する親和性を反映した核移行速度の差は認められず、異なる核輸送の機構が存在する可能性が示唆された。また、hsp90の特異的阻害剤であるgeldanamycin投与によりCOS細胞においてGRおよびMRの核移行が阻害され、これらレセプターの核移行にhsp90が重要な役割を担っていることが示唆された。さらにGRやMRの核移行シグナル(NLS)を認識するimportinαをCOS細胞に発現させると、細胞質、核の両方に存在する細胞が多く認められたが、細胞質有意、核有意に存在するものも認めた。外からの刺激なしでも核内への移行が観察されたが、GRやMRと共発現させた場合は、リガンドの添加によって細胞質に存在するimportinαの核内への強い集積を認め、輸送蛋白が核内レセプターとともに動く像をリアルタイムに可視化し、捉えることができた。
薄膜混合潤滑におけるナノ表面構造の働き

ナノメートルオーダーの粗さをもつ摺動面の,薄膜混合潤滑状態での潤滑膜形成について多角的に検討し,ナノ粗さによる潤滑膜形成への影響と,その潤滑剤分子構造による違いを示唆する以下の成果を得た.1.スパッタリングによるガラス円板への2層膜コーティングにおいて,スパッタパワー,基板温度,雰囲気圧力などの条件を変えることにより,表面粗さの大小だけでなく異なる粗さ構造を任意に作成することを可能にした.また,分子付着による表面成長モデルの数値シミュレーションを行い,この成膜条件と粗さとの関係を説明した.2.超薄膜光干渉法による潤滑膜厚測定装置を設計製作し,滑り及び転がり接触下のナノ潤滑膜厚の測定を測定精度2nmにて行った.3.上記実験により,厚さ十数ナノメートル以下の潤滑膜の形成は,液体分子の大きさと構造によって異なることを見出した.極性分子では粗さが小さい表面において多層吸着膜を形成しやすく,非極性分子では摺動面の粗さが大きいほどナノ薄膜が形成されやすい.前者は吸着膜形成から流体膜形成へ移行の機構が,後者は潤滑部上流での流体の供給が関連する.4.蛍光法によるナノメートルオーダーの膜厚測定における問題点を検討し,その改善策を考案した.5.等加速度条件下のEHL膜厚に関する検討から,厚さ数十ナノメートル以下の潤滑膜は,潤滑部のかなり上流での流体の供給の良否に左右されることを示した.6.表面の濡れ性に関する測定を行い,シリカ表面での液膜の拡がり速度は,表面粗さと液体分子の構造によって異なることを見出した.極性分子は粗さが小さい表面で拡がりやすく,非極性分子は粗さが大きい表面で拡がりやすい.7.分子動力学法による単純化したシミュレーションにより,液膜の拡がりにおいて微細粗さが流体分子の流れに影響を及ぼすことを示唆する結果を得た.ナノメートルオーダーの粗さをもつ摺動面の,薄膜混合潤滑状態での潤滑膜形成について多角的に検討し,ナノ粗さによる潤滑膜形成への影響と,その潤滑剤分子構造による違いを示唆する以下の成果を得た.1.スパッタリングによるガラス円板への2層膜コーティングにおいて,スパッタパワー,基板温度,雰囲気圧力などの条件を変えることにより,表面粗さの大小だけでなく異なる粗さ構造を任意に作成することを可能にした.また,分子付着による表面成長モデルの数値シミュレーションを行い,この成膜条件と粗さとの関係を説明した.2.超薄膜光干渉法による潤滑膜厚測定装置を設計製作し,滑り及び転がり接触下のナノ潤滑膜厚の測定を測定精度2nmにて行った.3.上記実験により,厚さ十数ナノメートル以下の潤滑膜の形成は,液体分子の大きさと構造によって異なることを見出した.極性分子では粗さが小さい表面において多層吸着膜を形成しやすく,非極性分子では摺動面の粗さが大きいほどナノ薄膜が形成されやすい.前者は吸着膜形成から流体膜形成へ移行の機構が,後者は潤滑部上流での流体の供給が関連する.4.蛍光法によるナノメートルオーダーの膜厚測定における問題点を検討し,その改善策を考案した.5.等加速度条件下のEHL膜厚に関する検討から,厚さ数十ナノメートル以下の潤滑膜は,潤滑部のかなり上流での流体の供給の良否に左右されることを示した.6.表面の濡れ性に関する測定を行い,シリカ表面での液膜の拡がり速度は,表面粗さと液体分子の構造によって異なることを見出した.極性分子は粗さが小さい表面で拡がりやすく,非極性分子は粗さが大きい表面で拡がりやすい.7.分子動力学法による単純化したシミュレーションにより,液膜の拡がりにおいて微細粗さが流体分子の流れに影響を及ぼすことを示唆する結果を得た.本研究は,混合潤滑状態における潤滑膜分子と表面のナノ粗さ構造の相互作用を解明することを目的としており,初年度は超薄膜光干渉法による実験の準備段階として以下を実施した.第一に,バッチ式スパッタリング装置を用いて,ガラス円板試験片(基板)に2層スパッタ膜を形成する方法の検討を行った.主としてクロムと二酸化ケイ素について検討を行った結果,放電電圧,基板温度,ガス圧力,スパッタ時間,逆スパッタ条件,基板の表面仕上げ及び洗浄条件などの成膜条件によって,膜厚ならびに膜の強度,密着強度が異なることがわかった.膜の強度は,既存の往復動試験機を用いて基板と鋼球を摺動させることにより調べた.また,触針式粗さ計及び原子間力顕微鏡を用いて表面粗さを測定し,粗さのフラクタル構造を調べた.基礎的なスパッタ特性を把握するために時間を要したため,当初の目標であった成膜条件とナノスケールの粗さ構造との関係を整理するまでには至っていない.第二に,超薄膜光干渉実験装置の設計と製作を行い,膜厚測定の部分をほぼ完成させた.プログラム開発において,上で作成した2層膜付き基板を用いた静的点接触実験を行った.第三に,種々の鉱油と合成潤滑油について,鋼同士の往復動滑り実験を行い,混合潤滑状態においては油の分子構造の違いにより潤滑状態が著しく異なることを明らかにした.粘度圧力係数αで整理すると,摩擦係数はαが高いほど高くなる傾向があるが,潤滑膜形成状態は必ずしもαと相関がなく,αが低い油では分子の極性による吸着膜の効果が見られ,αが高い油では高圧での固化膜が作用していることが予想された.