hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遊離腸管移植による食道再建法と術後機能の研究

下咽頭食道重複癌や、胃切後食道癌、一次再建に失敗した食道の二次再建などは、これまで結腸による再建にほとんど限られ、結腸に病変をもつものや腹部手術の既往例で癒着の高度なものは再建がきわめて困難であった。微小血管吻合術の進歩とともに遊離腸管移植が安全に行われるようになり、再建は新たな時代に入ったと思われる。これまで下咽頭頚部食道を遊離腸管で再建することは技術的にもほぼ確立され、当施設でも多くの症例を経験した。しかし、先に述べたような長い距離を遊離腸管で再建するには2カ所の血管吻合が必要となるかといった問題や、腸管の虚血時間の限界、腸管の食物輸送器官としての運動能など多くの解決しなければならない問題がある。これらはモデル実験で技術的に十分可能と思われた。臨床例の到来を3年間待ったが、機会がなかった。しかし、一般的な遊離空腸移植症例は50例を越え確立された術式と認められるに至った。安全性のみならず、術後の嚥下機能に関しても十分に検討を行い、学会発表、学会誌発表を行った。遊離空腸植移による下咽頭および食道再建法は、生体に対する侵襲が少なく安全に実施できるだけでなく、胃や結腸といった、重要臓器を犠牲にしないため、術後の機能面からも大変優れた術式との結論に達した。また遊離組織移植として、遊離皮弁を用いた口腔再建も同様に試み30例以上を実施した。これらの術後のモニタ-としてレ-ザ-血流計を用いたが、非侵襲的できわめて有用であった。術後の嚥下機能に関する検討も多く行い、学会発表、学会誌発表を行った。以上の遊離組織移植の臨床における手術をビデオに記録し、学会発表を繰り返しただけでなく、多くの臨床家の賛同を得られほかの施設で実際に試みられていることは喜ばしいことである。下喉頭から胃までの長い距離を遊離腸管移植によって一期的に再建する技術面の完成を目標に、成犬を用いて基礎実験を行ってきたが、成犬は人間と異なり小腸の腸間膜が短いために長い距離の小腸茎を作成するとル-プを描き、食物の通過には不利になることがわかった。従って結腸を用いた遊離移植に変更するか、或いは機能面は犠牲にして腸管の生着のみを追求するかは難しいところである。両面からのアプロ-チが必要と思われる。さらに長い距離の遊離腸管移植においては、移植床となる血管の選択が限られるため、腸管膜血管との吻合が難しくなる。この問題を解決するには細小径の人工血管の開発にかかっているが、それまでの間自家静脈移植や、大血管との端側吻合法などに頼らざるを得ない。細小血管におけるこれらの吻合は、開存率を100%近くに保つには技術的に解決しなければならない問題がいくつかある。顕微鏡下に微小血管吻合法の技術を用いてラットにおいて血管吻合の様々な型による開存率の違いを実験的に確かめ、最適な方法を開発する予定である。また臨床面においての応用であるが、これまでの間適応となる症例に恵まれなかった。現在考えられる適応として下喉頭食道重複癌、胃切除食道癌、食道の一次再建失敗例における二次再建などが挙げられる。臨床において実施するにあたり、食物の通過に対する機能や逆流の有無と言った生理学的検討が必要となる。

これから成犬およびラットの実験系の中に、生理機能面からのアプロ-チを可能とすべく、内圧、pH、組織酸素分圧、レ-ザ-ドップラ-を用いた循環面の検討などを行うべき項目は多い。できる限りの範囲でこれらの問題を1つ1つ解決していく所存である。下咽頭から胃までの長い距離を遊離空腸によって一期的に再建しようというのがこの研究の出発であった。平成2成度までに成犬を用いたモデルでの完成を目指してまたが、当初の予定であった空腸は成犬においてはその血管系が短かいため不可能であることが判明し結腸に変更せざるを得なかった。結腸でほぼ目処がついたがまだ臨床で応用する機会に恵まれていない。その間に通常の遊離空腸移植による下咽頭頚部食道の再建は症例を重ね、術後の機能面からの検討と合わせて学会発表および誌上発表を行ってきた。下咽頭食道癌は高齢者に多く、侵龍が小さくかつ術後の嚥下機能からみても優れている遊離空腸移植による再建は理想的なものと言える。これまで65歳以上の高齢者18例に対して遊離空腸移植を施行したが、80歳以上の超高齢者も3例含まれており、全例で満足すべき成績をあげた。特に術後バリウムによる造影をVTRに記録し解析することや内圧測定、さらにはアンケ-ト調査などから術後の機能面の研究を行ったが十分に評価に耐えうるものであり、高齢者に対する外科治療として明るい希望をもたせる結果が得られた。また最近では遊離移植の1つとして遊離皮弁や遊離節皮弁さらには血管柄付骨移植にまで手を広げ、頭頚部悪性腫瘍切除後の再建に応用している。これらの遊離組織移植後のモニタ-として、レ-ザ-ドップラ-血流計を用いそのviabilityの判定に役立てている。いずれ次年度でその成果を発表する予定である。下咽頭食道重複癌や胃切除後食道癌、一次再建に失敗した食道の二次再建などは、これまで結腸による再建に殆んど限られ、結腸に病変をもつものや腹部手術の既応例で癒着の高度なものは再建が極めて困難であった。微小血管吻合術の進歩とともに遊離腸管移植が安全に行われるようになり、再建は新たな時代に入ったと思われる。これまで下咽頭頚部食道を遊離腸管で再建することは技術的にもほぼ確立され、当施設でも多くの症例を経験した。しかし先に述べたような長い距離を遊離腸管で再建するには2カ所の血管吻合が必要となるかといった大問題や、腸管の虚血時間の限界、腸管の食物輸送器官としての運動能など多くの解決しなければならない問題がある。これらはモデル実験で技術的に十分可能と思われた。臨床例の到来を3年間待ったが機会がなかった。しかし一般的な遊離空腸移植症例は50例を越え、確立された能式として認められるに至った。安全性のみならず術後の嚥下機能に関しても十分に検討を行い、学会発表、学会誌発表を行った。遊離空腸移植による下咽頭および食道再建法は、生体に対する侵襲が少なく安全に実施できるだけでなく、胃や結腸といった重要臓器を犠牲にしないため術後の機能面からも大変優れた形式との結論に達した。また遊離組織移植として、遊離皮弁を用いた口腔再建も同様に試み30例以上を実施した。これらの術後のモニタ-としてレ-ザ-血流計を用いたが、非侵襲的できわめて有用であった。術後の嚥下機能に関する検討も多く行い、学会発表、学会誌発表を行った。以上の遊離組織移植の臨床における手術をビデオに記録し学会発表を繰り返したが、多くの臨床家の賛同を得られほかの施設で実際に試みられていることは喜ばしいことである。
新規ヒストンシャペロンGRWD1によるPuraを介した転写制御機構の解明

GRWD1はDNA複製開始だけでなく、細胞周期を統合的に制御していると考えられる新規ヒストンシャペロンである。このGRWD1の結合候補因子として、転写因子Puraを同定した。PuraとGRWD1との関連を明らかにすることが本研究の目的である。解析の結果、PuraとGRWD1は腫瘍抑制因子p53と複合体を形成し、協調してp53の転写活性化能を負に制御していることが示唆された。GRWD1ががんで過剰発現していることから、GRWD1およびPuraを介したp53制御機構の解明により、新たな染色体不安定性の誘導や発がんの分子機構の理解につながると考えられる。我々は、複製開始だけでなく、細胞周期を統合的に制御していると考えられるGRWD1の結合因子候補として転写因子Puraをマススペクトロメトリーで同定した。このPuraとGRWD1との関連を明らかにすることが本研究の目的である。本年度は、まずヒト細胞の細胞周期におけるPuraレベルの変化を調べるため、HeLa細胞をヒドロキシウレアを用いて同調させたのちリリースし、Puraタンパク質レベルの変化を調べた。その結果、G1/S期S期は、そのタンパク質量は低く、S期後期から徐々に蓄積し始め、M期にその量は最大となった。一方、Puraはp53と結合し、その転写活性化能を抑制制御している可能性が報告されている。そこで、免疫沈降法を用いてこれらの結合を調べた。その結果、GRWD1、Puraおよびp53が複合体形成していることが認められた。直接結合かどうか等の結合様式の詳細は不明である。また、PuraやGRWD1によるp53転写活性への影響を調べるため、p53の下流因子であるp21遺伝子のプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子上流に組み込み、p53存在下でPuraやGRWD1の発現量を過剰あるいは抑制させたときの発現の変化をルシフェラーゼアッセイにて測定した。その結果、GRWD1あるいはPuraの過剰発現により、p21プロモーターにおけるp53の転写活性が抑制された。GRWD1とPuraを共過剰発現させたときも同様の結果が得られた。一方、GRWD1の酸性ドメインを欠失させた変異体では、その抑制活性が見られなかった。さらに、PuraやGRWD1を発現抑制させ、ブレオマイシンで処理しDSBを誘導した細胞において、p53標的因子の発現量が変化するのかをイムノブロッティングおよびRT-qPCRによって調べたところ、p21レベルの増加が認められた。以上から、GRWD1はPuraと協調してp53の転写活性化能を制御していると考えられ、更に検討を行っている。我々は、DNA複製開始だけでなく、細胞周期を統合的に制御していると考えられるGRWD1の結合候補因子として、マススペクトロメトリーにより転写因子Purαを同定した。このPurαとGRWD1との関連を明らかにすることが本研究の目的である。昨年までのデータから、GRWD1はPurαと協調して、がん抑制因子p53の転写活性化を制御していると考えられたため、更なる解析を進めた。昨年度はGRWD1-Purα-p53のin vivo interactionを明らかにした。そこで、本年度は各因子の精製組換えタンパク質を作成し、in vitroにおける結合試験を行った。その結果、Purα-p53の直接結合は見られたものの、GRWD1-PurαおよびGRWD1-p53のin vitroにおける直接的相互作用は見られなかった。これらの結果から、GRWD1-Purα-p53結合には何らかの因子が必要だと考えられる。今後、以前行ったGRWD1結合候補因子の探索の結果を元に、GRWD1-Purα-p53複合体の他のサブユニットを同定したい。また、作成した抗Purα抗体を用いたChIP assayにより、Purαはp53標的因子の一つであるp21プロモーターおよびその周辺領域に結合していることがわかった。In vitroにおける結合試験の結果と併せて考えると、Purαはp53依存的にp21プロモーターおよびその周辺領域にリクルートされている可能性が示唆される。今後は、その可能性について、p53 siRNA処理細胞やブレオマイシン処理によりp53を活性化させた細胞を用いて調べたい。さらに、GRWD1の同領域への結合もChIP assayで調べたい。分子生物学当初の研究計画では、平成25年度には、(1) GRWD1とPuraの結合様式の解析、(2) Pura機能の生物学的意義の解析、そして(3) GRWD1のPura転写活性化能あるいは転写抑制能への関与の解析、を予定していた。(1)については、まずPuraに対する特異的抗体を作製し、これを用いて免疫沈降を行った。その結果、前項で記載した通り、細胞内で複合体を形成しているとの知見を得た。

in vitroにおける直接結合の有無については確認中である。また、結合に必要なドメインを探るためのtruncated mutantの作製を進めているところであり、提出した研究計画に相当する達成度におおむね至っている。(2)については、いくつかの細胞種を用いて、Puraの過剰発現あるいは発現抑制の細胞増殖への影響を調べているところである。(3)は本研究において重要度の高い検討内容である。前項で記載した通り、p21プロモーターにおけるp53の転写活性化能制御にGRWD1およびPuraが関与することが示された。以上より、いくつかの課題はあるものの、ある程度十分な知見は得られたことから、現在までの達成度は当初の研究計画に比べ、おおむね順調に進展しているものと判断した。まず、GRWD1ーPuraーp53結合様式についてさらに詳細に調べたい。一方昨年度は、p53反応性のp21プロモーターをモデルとして、そこでのGRWD1やPuraの関与を解析した。p21以外のp53標的プロモーターへの影響については現在調査中である。また、Puraの転写制御能を、融合蛋白質を用いた人工プロモーター系を用いて解析することも行っている。すなわち、LacI-Pura発現ベクターおよびLacIの結合配列であるLacO配列を上流に持つルシフェラーゼレポーターベクターを用いた解析を行っている。一方今年度は、作製した抗体を用いてChIP (クロマチン免疫沈降)-qPCRを行い、p21プロモーター領域にPuraおよびGRWD1が結合するのかを調べる。また、それらの結合のp53依存性を調べる。さらに、seq法(次世代シークエンス法)を用いたゲノムワイド解析を行い、GRWD1と共役したPuraによる転写・染色体制御の普遍像を得ることを試みたい。抗GRWD1抗体を用いたChIP-seqの結果は既に得ている。そこで、PuraのChIP-seqデータを得た後、プロモーター候補領域を中心にそれらの分布を解析する。Puraはどのようなプロモーターに結合しているのか(例えばp53反応性プロモーター)?それらのうち、GRWD1が共結合しているのはどの程度なのか?などを調べる予定である。さらに、クロマチンopennessを見るFAIRE (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)-seqも行い、Puraのクロマチン構造への影響を調べたい。これはsiRNAによってPuraを抑制した細胞を用いて調べる。FAIRE-seqによるGRWD1のクロマチン構造への影響のデータは既に得ているため、この結果および上述したPuraとGRWD1の結合部位のデータと組み合わせて解析していく。
歯牙保存における氷温領域の応用

低温における歯牙保存の成功には温度、保存液等の保存条件の検討のほかに、抜歯操作により損傷した歯根膜組織の再生力を何らかの方法で増強することも有効と考えられた。そこでplatelet-derived growthfactor(PDGF)が歯の再植時に歯根膜損傷部の組織反応に与える影響を検討する目的で実験を行った。前歯と第一前臼歯(計48本)を抜去し、根中央部の歯根膜線維を3ミリ幅で根全周にわたり除去し、境界部にノッチを付与した。PDGF群は5μgPDGF含有アテロコラーゲン50μl塗布し、AC群はアテロコラーゲンのみを50μl塗布し、対照群は何も塗布せずに再植した。再植2週間後に根管処置を行い、2、4、8週後に病理組織観察と組織計測を行った。その結果、骨性癒着量は、PDGF群が全期間で3群中最も少なく、AC群は再植4週後に増加した後8週後に減少し、対照群は全期間で3群中最も多く、統計学的には再植4週後のPDGF群とAC群、PDGF群と対照群、再植8週後のPDGF群と対照群の間で有意差が認められた。根面の残存セメント質は全群で経時的に吸収が進み8週後にほとんど消失した。新生セメント質の形成は、PDGF群が3群中最も多く、再植4週後のPDGF群と対照群、8週後のPDGF群と対照群、AC群と対照群の間に有意差が認められた。以上の結果から、PDGFは再植時の歯根膜損傷部の骨性癒着を抑制し、歯根膜とセメント質を再生する上で有効性が高いことがし示唆された。方法)ウイスター系ラットの上下顎切歯を抜去、歯根部分を取り出し、矢状面で割断、歯髄組織を除去したもの実験材料とした。作成したものを以下の条件で保存した後ラット頭部皮下に埋入し、4週後に屠殺、組織切片を作成し光顕的観察を行った。保存条件)1.コントロール群として抜去後即時埋入を行う。2.実験群としては抜去後氷温条件下で2日間保存したものを用いる。実験群はさらに現在組織保存液として用いられている生理食塩水、MEMにそれぞれ保存して比較した。結果)実験群、コントロール群ともに様々な程度の歯根吸収が観察され、有意差は認められなかったが、コントロール群の方が歯根吸収の程度が軽度な傾向にあった。考察)今回実験群、コントロール群とも有意差が認められなかったことにより歯牙の氷温保存の可能性が示唆された。しかしコントロール群においても様々な程度の歯根吸収が観察されたことから、試料作成の際の歯根膜の損傷があるものと考えられる。ラット切歯歯根部の歯根膜組織は大型の実験動物に比べルーズに付着しており、実験操作中に剥離しやすい傾向にある。そのため歯根吸収が歯根膜細胞の氷温保存の問題か試料作成上の問題か判別しにくいため実験材料を再考する必要があると考えられる。また氷温条件の設定においても±0.1°Cの変動に制御する必要があると考えられるが、今回実験に使用した低温インキュベータ-は庫内温度が一定せず、保存する場所によって温度差を生じている可能性があり、現在検討中である。
積雪寒冷型硝子被覆空間(アトリウム)の可能性に関する研究

本研究では都市・建築計画学、建築環境学、寒冷地工学、建築構法学の各分野から積雪寒冷型硝子被覆空間の可能性について検討した。(1)都市計画の分野では、自治体や設計事務所を対象に北海道のアトリウムの設計・計画の実態をアンケート調査から探った。設計事務所の80%が計画の経験ありの申告。しかし、その実現率は低く、計画の1/4にとどまっているのが現状であった。(2)建築計画の分野では、廉売市場を積雪寒冷型のアトリウムの原型とみなし、旭川市を対象にその実態調査を行った。対象建物が築後40年から50年も経過しているところから、それらを商業地域の再構築に利用するには、後継者の不足と建物が老朽化し過ぎていることが指摘された。(3)建築環境学の分野では、1月、2月の厳寒期に硝子被覆空間の利用実態を、晴天時と降雪時、外気温の低温時と高温時、昼と夜に分けて調査した。利用頻度は外気温が高い降雪時に上昇する傾向が現れた。(4)環境工学の分野では、大小2種類の模型を対象に、トレーサーガス法を用いて熱対流型換気量を推定した。換気量に関する近似相似則を導くと共に、開口位置によって換気経路に差の現れるごとを確認した。(5)寒冷地工学の分野では、硝子天蓋に用いられる硝子と雪氷体との凍着性状及び摩擦抵抗性状に付いて低温実験室で検討した。また、積雪寒冷地で用いられている屋根葺き材の諸性状との比較検討も行った。(6)建築構法学の分野では、アトリウム空間の維持管理の検討に欠くことのできない事例研究をスウェーデン国立研究所で発行されたガイドブックの翻訳作業を通じて行った。積雪寒冷型硝子被覆空間(アトリウム)の可能性に関する本研究は大きく分けて(1)建築環境学、(2)都市計画学、(3)建築構法学、(4)建築計画学、(5)寒冷地工学の五つの方向からアプロウチしている。(1)建築環境学からの取り組みは「上方開放による熱環境調整」である。小型模型空間を用いて水平に張った細線にパラフィン油を塗布、通電後の白煙の移動をビデオカメラで撮影し、気流の移動をビジアルな方法からの把握を試みた。(2)都市計画学からの取り組みは「積雪寒冷都市の生活活動と空間利用」である。冬期の外気温の低い北海道の都心部空間では、四季を通じて滞留利用が可能な通年型の公開空地を創り出すことが有効であることが見いだされた。(3)建築構法学からの取り組みは「アトリウムの活用法、戦略」についてである。集合住宅、学校、老人施設等にアトリウム手法を取り入れた北欧の事例研究を行った。特にアトリウム空間に欠かすことのできない維持管理などはスウ-デン国立研究所の調査報告の翻訳検討から多くの知見を得た。(4)建築計画学からの取り組みは「地域性とエネルギ-の有効利用」についてである。建築専門雑誌への発表作品を対象とした最近5年間のアトリウムの国内における事例調査を行うと共に、旭川市内に建つ観葉植物用温室の盛夏、秋、厳寒期にわたる温度測定を行った。(5)寒冷地工学からの取り組みは「硝子屋根の雪処理」についてである。屋外に設置した実大の硝子屋根を用いて、融雪滑雪の実験を実施した。その結果、融雪滑雪の特性には硝子を押さえるサッシュ縁(ガスケット)の形状が大きく影響していることが明かとなった。本研究では都市計画学、建築計画学、環境工学、寒冷地工学、建築構法学の各分野から積雪寒冷型硝子被覆空間を総合的に検討した。(1)都市計画の分野では、自治体や設計事務所を対象に行ったアンケート調査から北海道のアトリウムの設計・計画の実態を探った。

設計事務所の80%は計画の経験ありと申告。しかし、その実現率は低く、計画行為の1/4にとどまっているのが現状である。(2)建築計画の分野では、積雪寒冷型のアトリウムの1原型として廉売市場を対象に立地の分布や利用実態等の調査を行った。対象建物の大部分は築後40年から50年を経過。それらを商業地域の再構築に利用するには、後継者の不足と建物が老朽化し過ぎていることが指摘された。(3)建築環境学の分野では、厳寒期の硝子被覆空間の利用実態を晴天時と降雪時、外気温の低温時と高温時、昼と夜に分けて調査した。利用頻度は外気温が高い降雪時に上昇する傾向が認められた。(4)環境工学の分野では、大小2種の模型空間を用い、その熱対流型換気量をトレーサーガス法にて算定した。換気量推定のための近似相似則を明らかにすると共に開口位置で換気経路に差の現れることを確認した。(5)寒冷地工学の分野では、硝子天蓋に用いられる硝子と雪氷体との凍着性状及び摩擦抵抗性状に付いて低温実験室で検討した。また、積雪寒冷地で用いられている屋根葺き材の諸性状との比較検討も行った。(6)建築構法学の分野では、アトリウム空間の維持管理の調査に欠くことのできない事例研究をスウェーデン国立研究所で発行されたガイドブックの翻訳作業を通じて行った。
熱帯熱マラリア病態解析実験モデルとしてのリスザルの特徴付けとその系統化

(1)リスザルMHCclassII遺伝子のクローニング2頭のリスザル脾細胞より抽出したmRNAを鋳型としてcDNAライブラリーを作製し,それらについてMHCclassIIβ2ドメイン内のシスティン残基周辺の配列をプローブとしてスクリーニングを行い,8個のcDNAクローンを得た.それらの塩基配列を解析し,アミノ酸レベルにおけるヒトおよび既知の各種サルMHCclassII遺伝子との比較したところ,3クローンはDPと高い相同性を示し,2クローンはDRとの相同性が高かった.これらの蛋白翻訳領域は,メチオニンおよび非常に類似したシグナルペプチド配列より始まり,いずれのクローンも完全長の蛋白翻訳領域を含むと予想された.(2)抗リスザルIg抗体の作製およびそれを用いたELISA法によるリスザル抗体測定系の開発リスザル血清より精製・濃縮したリスザルIgを免疫したBALB/cマウスの脾細胞から3種のハイブリドーマを作製した.これらが産生する抗体のサブクラスはそれぞれIgG2a,IgG1,IgMであった.この抗体のヒト及び各種サル血清に対する反応性を,ELISA法,ウェスタンブロット法および免疫沈降法により検討した結果,新世界ザルのうちオマキザル科に属するリスザル,ヨザル,フサオマキザル,クモザルの血清と反応したのに対し,科の異なるマ-モセットおよびヒトの血清とは反応しなかった.さらにこの抗体を用いてリスザル血清中の抗体価を測定するELISAの系を確立した。リスザルの原産地ではない本邦に於いて,しかも南米原産地からの入手に様々な制約を伴う現在,リスザルコロニーを個々の原産地に由来する系統ごとに維持することは大変困難であり,多くの繁殖コロニーでは系統差を考慮せずに繁殖が行われる傾向にあったが,本研究の予算により,東大医科研奄美病害動物実験施設においてリスザルの系統別繁殖コロニーを樹立した.(1)リスザルMHCclassII遺伝子のクローニング2頭のリスザル脾細胞より抽出したmRNAを鋳型としてcDNAライブラリーを作製し,それらについてMHCclassIIβ2ドメイン内のシスティン残基周辺の配列をプローブとしてスクリーニングを行い,8個のcDNAクローンを得た.それらの塩基配列を解析し,アミノ酸レベルにおけるヒトおよび既知の各種サルMHCclassII遺伝子との比較したところ,3クローンはDPと高い相同性を示し,2クローンはDRとの相同性が高かった.これらの蛋白翻訳領域は,メチオニンおよび非常に類似したシグナルペプチド配列より始まり,いずれのクローンも完全長の蛋白翻訳領域を含むと予想された.(2)抗リスザルIg抗体の作製およびそれを用いたELISA法によるリスザル抗体測定系の開発リスザル血清より精製・濃縮したリスザルIgを免疫したBALB/cマウスの脾細胞から3種のハイブリドーマを作製した.これらが産生する抗体のサブクラスはそれぞれIgG2a,IgG1,IgMであった.この抗体のヒト及び各種サル血清に対する反応性を,ELISA法,ウェスタンブロット法および免疫沈降法により検討した結果,新世界ザルのうちオマキザル科に属するリスザル,ヨザル,フサオマキザル,クモザルの血清と反応したのに対し,科の異なるマ-モセットおよびヒトの血清とは反応しなかった.さらにこの抗体を用いてリスザル血清中の抗体価を測定するELISAの系を確立した。リスザルの原産地ではない本邦に於いて,しかも南米原産地からの入手に様々な制約を伴う現在,リスザルコロニーを個々の原産地に由来する系統ごとに維持することは大変困難であり,多くの繁殖コロニーでは系統差を考慮せずに繁殖が行われる傾向にあったが,本研究の予算により,東大医科研奄美病害動物実験施設においてリスザルの系統別繁殖コロニーを樹立した.
顎顔面を形成する転写因子のクロストーキングの遺伝子発現

マウス顎顔面におけるCBFA-1およびBMP-4の局在と遺伝子発現を免疫組織化学的方法を用いて比較検討した。CBFA-1の反応は前頭部および鼻骨を形成する部位の間葉細胞に強い免疫反応がみられ,この反応は胎生12日に較べて胎生13日では頭蓋底や頭頂方向へ広範囲にみられる傾向を示した。胎生14日,15日および16日では,下顎では免疫反応は骨梁に沿う骨芽細胞に強かった。顎顔面では前頭骨と鼻骨の縫合部および頭蓋底で極めて強い反応がみられた。CBFA-1の免疫反応は胎生期12日および13日では,Meckel軟骨は軟骨周囲の軟骨芽細胞に最も弱く,増殖期軟骨細胞の反応は休止期よりも強く,それ以後では肥大期軟骨細胞に最も強い反応がみられた。歯胚における局在は雷状期では,歯蕾中央部および歯胚周囲の歯槽骨を形成する部位の間葉細胞に強かった。帽状期では,免疫反応はエナメル器やprimary enamel knotの上皮細胞に強い。鐘状期では,反応は歯堤の上皮細胞と歯乳頭、歯小嚢の細胞およびsecondary enamel knotの上皮細胞に強い。また,きわめて強い免疫反応が咬合面の厚いエナメル質が形成される部位の分泌期エナメル芽細胞にみられた。生後の歯胚では,反応は咬頭付近のエナメル芽細胞,象牙芽細胞に見られた。歯根形成期ではHertwig上皮鞘付近でエナメル芽細胞およびセメント芽細胞にみられた。BMP-4の免疫反応は歯胚においてはCBFA-1の局在と一致していた。骨芽細胞に分化すると考えられた間葉細胞や軟骨芽細胞に強い反応がみられた。BMP-4はおもに骨芽細胞の初期分化にCBFA-1はこれらの細胞の初期分化から成熟にいたる過程で重要な役割を果たしているものと考えられた。また歯の形成過程では,CBFA-1はBMP-4とともに上皮・間葉シグナル伝達物質として作用しているものと考えられた。顎顔面や顎関節の形成を理解することは補綴学的に極めて重要な研究テーマである。近年,器官再生の組織工学的な技術が発展を遂げているが,顎関節の再生に関する技術は全く開発されていないのが現状である。補綴治療を行う際にも顎関節の再生を試みることは重要であると考えられる。近年,顎顔面の形成を調節している成長因子や転写因子の研究は進展し、頭蓋骨の形態形成には鎖骨頭蓋異骨症の原因とされている転写因子Core Binding Factor A-1(CBFA-1)を欠如している個体では,顎関節が形成されていないことが報告され,CBFA-1は顎関節の形成に不可欠であることが証明された。さらに,in vitroの実験では骨誘導タンパク(BMP)がCBFA4の遺伝子発現を増殖することが示され,BMPはCBFA-1の上流にあることが証明された。このように顎顔面や顎関節の形成は,様々な成長因子や転写因子が骨や軟骨を形成する幹細胞の分化増殖や細胞外マトリックスの合成の促進および抑制を行うことによって制御されている。本研究の目的は顎顔面や顎関節の形態形成を制御する因子の遺伝子発現の以下に示したクロストーキングをin situ hybridizationを用いて解析することである。

歯胚の形成においてはCBA-1とBMP-4の局在は一致しており,CBFA-1の遺伝子発現はBMP-4の発現と密接な関係を持ち,歯の形態形成初期から歯根形成期にいたるまで上皮・間葉のsignal伝達物質として作用しているものと考えられた。また,CBFA-1は顎顔面の骨形成において前骨芽細胞から成熟骨芽細胞にいたるまで局在がみられ,骨形成初期から成熟にいたるまでの骨芽細胞の分化に関与すると考えられた。これに対して,BMP-4は前骨芽細胞に強い反応がみられ,おもに骨芽細胞の初期分化に深く関与することが示唆された。さらに,CBFA-1はMeckel軟骨で増殖期や肥大期の軟骨細胞にみられたことから,軟骨細胞の成熟にも関与していることが示唆された。顎顔面や顎関節の形成は,様々な成長因子や転写因子が骨や軟骨を形成する幹細胞の分化増殖や細胞外マトリックスの合成の促進および抑制を行うことによって制御されている。昨年度の研究においては、顎顔面の形態形成を制御する因子であるCBFA-1の遺伝子発現のをin situ hybridizationを用いてに解析をおこなった。平成15年度においては、破骨細胞および骨芽細胞の分化および成熟を調節する成長因子であるOPG(破骨細胞の分化を抑制する成長因子)およぴRANKL(破骨細胞の分化を促進する成長因子)の発現を免疫組織化学を用いて検索した。材料および方法胎生期718日のDDY系マウス胎児を用いる。4% paraformaldehyde溶液で6時間浸漬固定を行う。組織をEDTAで脱灰し,パラフィンに包埋後切片にした。結果顎顔面の成長過程において、RANKLおよぴOPGは将来に骨を形成すると考えられる間葉細胞および骨芽細胞に強く局在した。破骨細胞においては、RANKLのみが強く発現した。歯胚の形成においてはエナメル器のsecondary enamel knotに強く反応がみられた。また、RANKLおよびOPGの免疫反応ははMeckel軟骨で増殖期や肥大期の軟骨細胞にみられた。以上のことから、骨芽細胞の分化にはRNAKLおよびOGFが関係しており、破骨細胞の成熟に関してはRANKLが中心的な役割をしているものと考えられた。また,RNAKLおよびOGF軟骨細胞の成熟にも関与していることが示唆された。
学習方略の物語化と相対化に着目したピアノ演奏支援システムに関する研究

(1)評価実験に向けた実験システムの改良:ピアノ演奏練習を撮影したビデオ上で手指悪癖の出現箇所を半自動アノテーションするため,畳み込みニューラルネットワークの一種であるVGGNetを用いて,悪癖クラス認識器を実装し,正答率78%を達成した.多くの楽器演奏の練習支援システムでは,その実現のために,与えられた課題曲の楽曲構造をあらかじめ解析する機能を必要としている.次の3つの楽曲分析の基本機能の完成度を高めた:タイムスパン・セグメンテーションのより正確な抽出,個々のフレーズ抽出(その応用としてメドレー中の原曲断片識別),より動的に頑健な調性同定.(2)改良システムを用いての評価実験:悪癖発見ツールを実現するため,従来の動画プレイヤに,悪癖発見を効率化することが期待される機能を追加した(複数ビデオ同期再生機能,音単位再生機能,演奏情報表示機能,上述の悪癖出現箇所自動アノテーション機能).ピアノ経験者12人に対して,従来の動画プレイヤのみを使った場合と,悪癖発見ツールを使った場合で,悪癖発見率を比較し,悪癖発見ツールが0.52,動画プレイヤが0.42であった.遠隔ピアノレッスン環境におけるカメラ自動切り替え方式を評価した.課題曲(子犬のワルツ)の演奏で生じる典型的なミス5シーンを抽出し,FFNNとルールによる提案手法と,2つの比較手法(背景差分により最も動きの大きいカメラ画像を選択する方式,7視点画像のタイリングによる同時視聴の方式)とを比較した.手指の細かな動きを指摘する場合,引き直し箇所を同定する場合において提案手法の有効性が確認できた.(3)分析:前年度の成果を踏まえて,初心者と経験者で,各チャンクの数,各チャンクの大きさの変化を観察し,初心者と経験者の間に有意差が認められた.学習に必要な技能を5種類に分けたガニエの5分類との対応からも本研究成果の正しさが支持された.研究計画・方法に記載した項目ごとに述べる:(1)差分検出機構のプロトタイピングとして,まず,正しく打鍵できた回数,打鍵ミス回数,演奏滞留度などのパラメータをヒートマップと折れ線グラフにより表示する機能を実装した.特に,折れ線グラフは練習開始からN分後の各パラメータの推移を表示しており,学習者は自身の練習進捗度を直感的に把握できる.学習者は希望するN分後の折れ線グラフを選択的に表示できるので,学習者自身が差分を吟味することが可能である.練習中のグラフ表示は,連続的な練習の妨げにならないように,30秒間表示すると自然に消えることとした.(2)アノテーション作成・付与ツールのプロトタイピングとして,譜面の一部(例えば,1つの音符,旋律の一かたまり,和音など)および譜面全体に対し,学習者が練習中に何か気付いた瞬間に任意の文章を入力できる機能を実装した.また,練習中のアノテーション入力時間をできる限り短縮するため,任意の場所で文章入力しそれをアノテーションを付与したい箇所にドラッグアンドドロップできるようにした.さらに,研究計画・方法では予定されていなかったが,日本を代表するジャズ音楽家2名の協力を得て,即興演奏における熟達に関する実験を実施し,データを収集した.ジャズでは集団演奏でのプレイヤ同士の即興的な相互行為が中心的な表現方法であるが,その即興能力がどのように身に付き,どのように高度化していくメカニズムの大部分は未解明であり,即興能力を養成する方法論の体系化も不十分である.上述(1)(2)のような与えられた譜面通りに,しかし感情を込めて演奏する技能の熟達と,即興演奏に関する技能の熟達の対比は,楽器演奏における熟達の解明に何らかの示唆を与えるものと思われる.実装した差分検出機構とアノテーション作成・付与ツールに関して,14名の被験者,モーツァルト作曲トルコ行進曲冒頭17小節を課題曲とする確認テストを実施した.評価パラメーとして,1練習セッションあたりの打鍵時間,キューポイントの操作回数,模範演奏の再生回数,差分検出機構の利用回数,付与したアノテーション個数などを用いた.本システム利用者の方が有意に効率的な練習を行っていることが示された.(1)練習支援ツールのプロトタイピング:視線を利用したピアノ演奏追跡機能を実現した.鍵盤を押下する情報のみによるピアノ演奏追跡に対して,演奏者の視線情報も利用すると,演奏追跡精度が13ポイント向上し,速度も40%向上した.ピアノ演奏者の手指悪癖を効率的に発見するために,打鍵時間間隔および打鍵強度の可視化,手指のそれぞれの関節の動きの可視化,検索のための譜面上演奏箇所とビデオ再生箇所の自動対応付けをプロトタイピングした.遠隔ピアノレッスン環境向けに,練習演奏時に効率的かつ正確に遠隔地の教師が注目したい点に注目できるよう複数のカメラを自動切り替えする仕組みをプロトタイピングした.ニューラルネットワークによる学習機能を取り入れることで,注目点の動的な変化にも柔軟に対応できる.(2)プロトタイプシステムを用いた予備実験:ピアノ初心者に対して,鍵盤上に演奏や練習に有益な情報をプロジェクションマッピングすることで,熟達がどのような影響を受けるかを観察し,練習者の学習方略を大きく3タイプに分類できることを発見した.意図的にバイオリン練習者に誤情報を提示することで,練習システムからの自然な離脱を実現できることを確認した.(3)実験結果分析:

上記(2)で作成したプロトタイプシステムを利用して,ピアノ演奏が熟達するにつれて練習者の認知がどのように変容するかを,練習者が意識するチャンクの変化から読み取れることを確認した.グラウンディッド・セオリー・アプローチを用いた結果,視覚情報が支配的な譜面チャンク,聴覚情報が支配的な演奏チャンク,知識の運用が支配的な音楽知識チャンクに分類できることが分かった.研究計画・方法で述べた3項目のいずれにおいても,当初の計画以上に進展している.(1)練習支援ツールのプロトタイピングにおいては,昨年度より継続的に作成しているアノテーション付与ツールをさらに高度化するための演奏追跡機能を実装した.練習状況をより詳細に記録しユーザにフィードバックするために,手指動作に着目する機能を実装した.自分や他学習者との比較を行うため,遠隔地で練習している状況を円滑に共有する機能を実装した.(2)プロトタイプシステムを用いた予備実験においては,ピアノ演奏に加え,バイオリン演奏に関しても実験を実施し,振り返りについて多角的に考察を深めることができた.(3)実験結果分析においては,単に分析するだけでなく,チャンクを利用すれば効果的な振り返りができる可能性および熟達モデル構築へ向けたマイルストーンを見出した.次年度の最終実験に向けてより高い目標を立てることができる.(1)評価実験に向けた実験システムの改良:ピアノ演奏練習を撮影したビデオ上で手指悪癖の出現箇所を半自動アノテーションするため,畳み込みニューラルネットワークの一種であるVGGNetを用いて,悪癖クラス認識器を実装し,正答率78%を達成した.多くの楽器演奏の練習支援システムでは,その実現のために,与えられた課題曲の楽曲構造をあらかじめ解析する機能を必要としている.次の3つの楽曲分析の基本機能の完成度を高めた:タイムスパン・セグメンテーションのより正確な抽出,個々のフレーズ抽出(その応用としてメドレー中の原曲断片識別),より動的に頑健な調性同定.(2)改良システムを用いての評価実験:悪癖発見ツールを実現するため,従来の動画プレイヤに,悪癖発見を効率化することが期待される機能を追加した(複数ビデオ同期再生機能,音単位再生機能,演奏情報表示機能,上述の悪癖出現箇所自動アノテーション機能).ピアノ経験者12人に対して,従来の動画プレイヤのみを使った場合と,悪癖発見ツールを使った場合で,悪癖発見率を比較し,悪癖発見ツールが0.52,動画プレイヤが0.42であった.遠隔ピアノレッスン環境におけるカメラ自動切り替え方式を評価した.課題曲(子犬のワルツ)の演奏で生じる典型的なミス5シーンを抽出し,FFNNとルールによる提案手法と,2つの比較手法(背景差分により最も動きの大きいカメラ画像を選択する方式,7視点画像のタイリングによる同時視聴の方式)とを比較した.手指の細かな動きを指摘する場合,引き直し箇所を同定する場合において提案手法の有効性が確認できた.(3)分析:前年度の成果を踏まえて,初心者と経験者で,各チャンクの数,各チャンクの大きさの変化を観察し,初心者と経験者の間に有意差が認められた.学習に必要な技能を5種類に分けたガニエの5分類との対応からも本研究成果の正しさが支持された.予定通り,差分検出機構とアノテーション作成・付与ツールの高機能化,UX向上を継続する.また,当該プロトタイプシステムを用い,ある程度長期間の予備実験を実施する.ピアノ学習方略における物語化と相対化の有用性実証を意識しつつ,ピアノを演奏していない時間をどのように使うと演奏技能が向上するのか,効率的な練習の振り返り法とはどのようなものか,他練習者との有意義な社会的相互作用とは何かを検討する.基本的に予定通り進める.
農業における集団行動に関する比較制度分析

本研究は、次の3つの課題に分けて実施された。1)わが国の農業水利システムについて構造的な分析を進め、利用者の行動様式も含めた内部組織論的かつ比較制度学的な理論的、実証的研究を行った。その結果から明らかになったことは、わが国の水利システムは、戦後に設立された土地改良区をベースに構築されているが、その第一の機能は水利権の実質的な受け皿として管理主体となっていること、第二の機能は水利施設の維持管理活動の仲介者として関係者のコーディネーション主体になっていることである。また制度的特徴として、土地改良区が戦前の耕地整理組合または普通水利組合等の組織体と機能を継承していて、組織運営のルールに歴史的に定まった自律的規範や共同体的規律を内在させていることを指摘した。2)農業基盤整備の実施過程、農家、農協、土地改良区、行政機関の行動と相互関係、および基盤整備が農業活動に与えた影響について、現地調査に基づき評価を行った。その結果、農業基盤整備、生産調整、マーケティング事業の相互間に制度的補完性が観察された。農業基盤整備事業の成果を向上させるためには、この補完性に配慮した制度設計と運営とが重要であることを明らかした。3)海外の事例分析として、中国雲南省の山岳地域の一行政村で実態調査を実施した。調査地の村はまだ経済発展の初期段階にある。1970年代の土地制度改革によって土地利用権が再配分されて経営請負責任制へ移行したことが、この地域の農業活動の行動様式と土地資源管理の行動原理をどのように変化させたかを詳細に調べて比較制度的な観点から評価を行った。農業用水は土地改良区による組織管理が一般的であることに注目して、なぜ市場機構を利用できないのかについて、まず理論的に検討した。そこには上下流の利用調整問題とシステムとしての維持管理問題とが資源分配上の重大な問題として存在していて、わが国ではその解決のために互恵主義とよばれる平等性原則に依拠した方式で対処しているのではないかという暫定的な結論を導いた。このことを確かめるために、具体的な取り組みについての事例を収集する現地調査を行った。河川灌漑のシステムについては、(1)愛媛県の道前道後土地改良区および(2)香川用水土地改良区、ため池による灌漑システムについては、(3)香川県満濃池土地、改良区、(4)奈良県大和平野土地改良区を代表例として、実態調査を行った。(1)の地区は隣接する地域でありながら賦課金の方式が異なっていることに注目して、そこには自己水源賦存量の格差が制度の違いを生み出したことを明らかにした。(2)の地域では県を超える流域変更の歴史を検討して、政治経済的プロセスを分析した。(3)の地域では、いわゆる「親池」と「子池」の関係について共同体的視点から考察した。(4)の地域では、ため池用水の「あと使い」問題を観察した上で、ため池用水が河川灌漑用水と連結した結果保険的な性格を持つようになったことを農村共同体の変化と関連させながら分析を進めた。またこれ以外に別途生産調整方式について現地調査を行っているが、集落と生産調整の合意形成との関連について、最近の動向をしている段階である。なお農村資源の共同体的管理が多面的機能を生み出すプロセスについても着目し、追加的な課題として、分析を進めている。本年度の研究は、次の3つの課題に分けて実施された。わが国の水利システムは、戦後に設立された土地改良区をベースに構築されているが、その第一の機能は水利権の実質的な受け皿として管理主体となっていること、第二の機能は水利施設の維持管理活動の仲介者として関係者のコーディネーション主体になっていることである。

そこで特に注目した制度的特徴は、土地改良区が戦前の耕地整理組合または普通水利組合等の組織体と機能を継承していて、組織運営のルールに歴史的に定まった自律的規範や共同体的規律を内在させていることである。2)わが国の稲作生産調整政策の実施過程、その中での農家、農協、行政機関、中央政府の行動と相互関係、生産調整制度が農業活動の成果に与えた影響について評価を行った。その結果、生産調整制度は農業活動を制約する阻害要因として作用することが改めて確認されたが、一方でその問題に対処するため、関係者間の相互交渉によって制度の枠組みや運用方法が、現地の事情に応じて、実質様々に手直しされていることも判明した。生産調整制度は、土地改良事業などとの制度的補完性も観察されることから、制度設計・運用のあり方によっては経済成果を向上させる可能性もあることも明らかにされた。あわせて生産調整制度の改革に関する議論も加えた。3)海外の事例分析として、中国雲南省弥勒郡の山岳地域の一行政村で実態調査を実施した。調査地の村はまだ経済発展の初期段階にある。1970年代の土地制度改革によって土地利用権が再配分されて経営請負責任制へ移行したことが、この地域の農業活動の行動様式と土地資源管理の行動原理をどのように変化させたかを詳細に調べて比較制度的な観点から評価を行った。
患者神経幹・前駆細胞由来ミニブレインによる脳形成異常の病態解明と治療分子標的探索

1. NSPCsによるミニブレイン作製我々が胎児前脳から樹立したヒト疾患由来神経幹・前駆細胞(以後NSPCs)をin vitro三次元(3D)増殖・分化培養系に供することで、胎児期脳発生過程の一部を模倣する細胞モデル・疾患モデルである脳オルガノイド(ミニブレイン)の作製を試みた。NSPCsのうち、正常胎児由来NSPCs(n=2)、FGFR3遺伝子異常を有するタナトフォリック骨異形成症(TD)由来NSPCs(n=3)を用いて、ミニブレインを形成した。増殖メディウムで単一ニューロスフェアを形成、次にオリジナルメディウム(1)で7日間、オリジナルメディウム(2)で、ガス交換可能な遠沈管型振盪培養を用いた特殊微小環境下で14-28日間培養した。FGFR3遺伝子異常症例では、ミニブレイン表面に瘤状隆起が多数形成され、in vivoの脳形成異常に類似した表現型が再現された。組織学的に、瘤状隆起は分裂終了直後の未熟な神経細胞胞巣よりなり、ミニブレイン深部にGFAP(+),ビメンチン(+)の放射状グリア胞巣が形成され、ラミニン、テネイシン等の細胞外基質の沈着がみとめられた。In vitroの系で、in vivoの脳に類似したモデルが形成されたと判断した。今後、神経細胞・グリア細胞への分化、遊走、層形成、神経突起伸長、シナプス形成などを時空間的に解析する。2. NSPCsの亜株の樹立遺伝背景に関連した個体差やNSPCs樹立時期の違いなどが実験結果に影響することを懸念し、正常由来NSPCsにエピソーマルベクターを利用して、Human C-MYC、野生型FGFR3遺伝子、FGFR3遺伝子点変異体を安定発現する亜株の樹立に着手した。次年度以降、これら亜株を用いて上述の3D増殖・分化培養系でのミニブレインの形態変化の再現性を確認し、異常部位の細胞組成・細胞特性を細胞レベル・分子レベルで解析する。ヒト由来NSPCsを材料として胎児期脳形成過程の一部をin vitroで模倣するミニブレインの樹立には、培地組成や培養容器・装置などの培養条件の指摘化が最も重要である。今年度では、正常NSPCsと遺伝子異常を有するNSPCsとの比較で、構造や細胞組成に違いが生じるかどうかを一つの指標にして試行錯誤してきた。装置の容量や培養コストの問題に加え、1回の試行に2ヶ月を要するため生産性は低いが、少なからず再現性のある現象は捉えられている。ヒト由来NSPCsの問題点である患者間の個体差やサンプル数の制限を解消すべく、遺伝子導入を施した亜株の作製に着手しており、実験的に比較可能な群の取得や責任遺伝子産物の蛋白動態・シグナリング解析を可能にする。1. NSPCsの2D・3Dでの機能解析:脳形成異常責任遺伝子を導入したNSPCs亜株群を早期に樹立し、3D培養系での検証実験に供することで、遺伝子型と表現型の関連を明らかにする。関連が認められた表現型を対象に細胞レベル・分子レベルでの検討を加えることで、表現型の基盤となる分子機序・シグナル伝達経路を顕在化させる。入手可能な関連経路阻害剤・賦活化剤や分子標的薬が存在する場合は、表現型に及ぼす効果を3D培養系にて検証する。我々が樹立しつつあるNSPCs亜株群にはタグ付加された責任遺伝子が導入されているため、これまで困難であった責任遺伝子産物の細胞内動態解析が可能になる。3D培養と2D培養を併用することで研究を推進させる。2. NSPCsの一次繊毛の制御機構:TDの骨形成異常に軟骨芽細胞の一次繊毛異常が関与するという報告がなされている。そこで、Human C-MYC、野生型FGFR3遺伝子あるいはFGFR3遺伝子点変異体を安定発現する亜株細胞を用いて、一次繊毛とFGFシグナルパスウェイの相違を形態学的、生化学的、分子生物学的に比較検討する。FGFシグナル伝達阻害剤(NVP-BGJ398)等をFGFR3遺伝子点変異体導入NSPCsに作用させることで、一次繊毛や細胞の表現系が正常化するかを検討する。以上の結果を基にして、ヒト脳に発生する大脳形成異常の分子メカニズムに迫る。

今後、神経細胞・グリア細胞への分化、遊走、層形成、神経突起伸長、シナプス形成などを時空間的に解析する。2. NSPCsの亜株の樹立遺伝背景に関連した個体差やNSPCs樹立時期の違いなどが実験結果に影響することを懸念し、正常由来NSPCsにエピソーマルベクターを利用して、Human C-MYC、野生型FGFR3遺伝子、FGFR3遺伝子点変異体を安定発現する亜株の樹立に着手した。次年度以降、これら亜株を用いて上述の3D増殖・分化培養系でのミニブレインの形態変化の再現性を確認し、異常部位の細胞組成・細胞特性を細胞レベル・分子レベルで解析する。ヒト由来NSPCsを材料として胎児期脳形成過程の一部をin vitroで模倣するミニブレインの樹立には、培地組成や培養容器・装置などの培養条件の指摘化が最も重要である。今年度では、正常NSPCsと遺伝子異常を有するNSPCsとの比較で、構造や細胞組成に違いが生じるかどうかを一つの指標にして試行錯誤してきた。装置の容量や培養コストの問題に加え、1回の試行に2ヶ月を要するため生産性は低いが、少なからず再現性のある現象は捉えられている。ヒト由来NSPCsの問題点である患者間の個体差やサンプル数の制限を解消すべく、遺伝子導入を施した亜株の作製に着手しており、実験的に比較可能な群の取得や責任遺伝子産物の蛋白動態・シグナリング解析を可能にする。1. NSPCsの2D・3Dでの機能解析:脳形成異常責任遺伝子を導入したNSPCs亜株群を早期に樹立し、3D培養系での検証実験に供することで、遺伝子型と表現型の関連を明らかにする。関連が認められた表現型を対象に細胞レベル・分子レベルでの検討を加えることで、表現型の基盤となる分子機序・シグナル伝達経路を顕在化させる。入手可能な関連経路阻害剤・賦活化剤や分子標的薬が存在する場合は、表現型に及ぼす効果を3D培養系にて検証する。我々が樹立しつつあるNSPCs亜株群にはタグ付加された責任遺伝子が導入されているため、これまで困難であった責任遺伝子産物の細胞内動態解析が可能になる。3D培養と2D培養を併用することで研究を推進させる。2. NSPCsの一次繊毛の制御機構:TDの骨形成異常に軟骨芽細胞の一次繊毛異常が関与するという報告がなされている。そこで、Human C-MYC、野生型FGFR3遺伝子あるいはFGFR3遺伝子点変異体を安定発現する亜株細胞を用いて、一次繊毛とFGFシグナルパスウェイの相違を形態学的、生化学的、分子生物学的に比較検討する。FGFシグナル伝達阻害剤(NVP-BGJ398)等をFGFR3遺伝子点変異体導入NSPCsに作用させることで、一次繊毛や細胞の表現系が正常化するかを検討する。以上の結果を基にして、ヒト脳に発生する大脳形成異常の分子メカニズムに迫る。
仰臥位片肺分離換気中の低酸素性肺血管攣縮と肺血管内皮機能について

近年胸部動脈瘤や肺腫瘍を含む胸部外科症例の増加により術中に片肺分離換気を必要とする症例が増加している。しかしながら、これまでの研究において重力などが片肺分離換気中の肺血流調節機構に関与することは示しているが、その直接の肺血流調節機構については推論の域を出ない。我々はアセチルコリン(Ach)負荷による肺血管内皮機能を評価し、片肺換気中の発生する低酸素性肺血管攣縮(HPVC)に対する肺血管内皮機能の影響について検討を行った。【対象】久留米大学倫理委員会より承認を得た(研究番号2023)。肺外科手術予定患者10名とした(平均年齢63歳、身長160cm、体重56kg)。胸部硬膜外チュービング後、全身麻酔を導入した。ダブルルーメンチューブを挿管後、右内頚静脈より肺動脈カテーテルを挿入した。測定項目は動脈圧、肺動脈圧(PAP)、PCWP、中心静脈圧、動脈血酸素分圧、混合静脈血酸素分圧、ヘモグロビン値、心拍出量とし、肺血管抵抗とシャント率を算出した。肺血管内皮機能検査としてAchを中心静脈路から10(-4)mol/L心拍出量で5分間持続投与した。側臥位両肺換気時、Ach投与直後、片肺換気時において測定した。【結果】肺動脈Ach負荷時体血圧の変動は無かった。Achの投与により平均PAPは低下し、PaO2/FIo2の値の低下とシャント率の上昇を認めた。平均PAPの低下値とPaO2/FIo2の値に相関関係を認めた(r=0.785、p<0.001)。さらに、両肺換気時Ach負荷時のPAPの低下と片肺換気中のPaO2/FIo2の値にも相関関係を認めた(r=0.849、p<0.016)。【考察・結語】PAPの低下とシャント率の上昇より、Achによる血管拡張は換気を有する肺胞に接している肺血管拡張よりも、HPVCにより収縮しているシャント血管である可能性が高い。また、Ach負荷時のPAP低下の程度(拡張機構)と片肺換気中の酸素化能(収縮機構)との間に負の相関を認めるため、肺血流調節機構上、相反する調節機構として存在することを示唆する。Ach負荷試験はこの調節機構の不均衡を検出する臨床的に有意義な検査であると考えられる。肺血管内皮障害が存在すると低酸素性肺血管攣縮の機能障害が起こり、片肺換気中に重症な低酸素血症を引き起こす可能性がある。今回、我々は肺外科手術に片肺換気が必要な症例において肺血管内皮機能検査と片肺換気中の肺ガス交換能について検討している。(久留米大学倫理委員会、研究番号2023、平成12年10月10日承認)全身麻酔導入後、体血圧測定と動脈血液ガス分析のために橈骨動脈にカテーテル留置し、また右内頚静脈より肺動脈カテーテルを挿入し、肺動脈圧、中心静脈圧を経時的に測定している。仰臥位両肺換気時に血行動態および動脈血ガス分析のコントロール値を測定している。次に側臥位、両肺換気時に同様な測定と肺血管内皮機能検査を施行している。肺血管内皮機能検査は肺動脈カテーテルからアセチルコリンを投与し、肺動脈圧・体動脈圧変化を記録している。その後、側臥位、開胸片肺換気後20分経過時における血行動態、動脈血酸素分圧を測定している。現在、アセチルコリンによる最大反応を求めるための至適ボーラス投与量と持続投与量を検討中である。また、経食道心臓超音波検査による肺動脈血管径と血流速度を測定記録するために、ディジタル記録器および画像処理のためのディジタル変換機を購入し、肺血流評価機器を構築した。来年度には、血行動態、血液ガス分析とともに肺血管血流画像を記録し総合的な評価をしたい。

平均PAPの低下値とPaO2/FIo2の値に相関関係を認めた(r=0.785、p<0.001)。さらに、両肺換気時Ach負荷時のPAPの低下と片肺換気中のPaO2/FIo2の値にも相関関係を認めた(r=0.849、p<0.016)。【考察・結語】PAPの低下とシャント率の上昇より、Achによる血管拡張は換気を有する肺胞に接している肺血管拡張よりも、HPVCにより収縮しているシャント血管である可能性が高い。また、Ach負荷時のPAP低下の程度(拡張機構)と片肺換気中の酸素化能(収縮機構)との間に負の相関を認めるため、肺血流調節機構上、相反する調節機構として存在することを示唆する。Ach負荷試験はこの調節機構の不均衡を検出する臨床的に有意義な検査であると考えられる。