hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト細胞における紫外線によるDNA損傷修復機構の解析

HeLa細胞よりC群色素性乾皮症細胞に欠損しているDNA修復因子(C因子)の単離を試み、以下のような特長を明らかにすることができた。C因子は核に存在し、Kcl濃度を0.4M以上に上げないと溶出してこない。トリプシン処理で失活し、陽イオン交換体に結合することから、塩基性の核タン白であると考えられる。Sephacryl S-300によるゲル濾過により、その分子量は約55万であった。このC活性を有する分画には、A,F,G群のxp細胞を相補する活性は検出されなかったが、B群を相補する活性(B因子)が検出された。しかしこの分画を更にDNAセルロースで分画するとB因子とC因子は異なる分画に検出されることから、両者の間に強い相互作用は存在しないものと考えられる。次にC因子のC群xp細胞内での安定性をその残存活性量の測定から調べてみた。C活性は細胞質へ注射後約4時間で最高値に達し以下少くとも24時間内に活性の減少は認められなかった。また粗核抽出液の状態でC因子は極めて安定で4°Cで少くとも2ケ月は活性の減少は認められなかった。またC因子の細胞当りの総量は紫外線照射の前後で変化しないことから、前核細胞における修復因子のような誘導性のものではない。C活性はヒト以外の動物からも検出され、ウシ及びマウス細胞より調製した抽出液中のC因子のクロマト上での挙動、分子量共ヒト由来のC因子と同一で、C因子は種を越えてかなり共通した構造を持っていることが推定される。現在マウス腹水ガン細胞よりC因子の精製を試みており、陽イオン交換,ゲル濾過,DNAセルロース等のクロマトを組み合わせてその比活性を数百倍上げる段階まで精製を進めることが可能となったため、この標品を用いてDNA修復に関与すると考えられるいくつかの酵素活性の有無を調べている。
津波石を用いた古津波規模の地質・水理学的推定方法の確立

本研究では,琉球列島の礁原上に分布する巨礫群のサイズ・空間分布の調査を行ない,津波・台風の高波起源の巨礫群の識別方法と,津波起源の巨礫を用いた古津波規模の推定方法を検討した.その結果,津波・台風の高波起源の巨礫群は,サイズ・空間分布が明瞭に異なり両者を識別可能であること,津波石移動モデルを用いて数値検討を行なうことで,古津波の規模を推定できる可能性があることがわかった.本研究では,琉球列島の礁原上に分布する巨礫群のサイズ・空間分布の調査を行ない,津波・台風の高波起源の巨礫群の識別方法と,津波起源の巨礫を用いた古津波規模の推定方法を検討した.その結果,津波・台風の高波起源の巨礫群は,サイズ・空間分布が明瞭に異なり両者を識別可能であること,津波石移動モデルを用いて数値検討を行なうことで,古津波の規模を推定できる可能性があることがわかった.本研究では沿岸域の巨礫から津波によって運ばれたものを抽出する手法を確立し,さらにそれらの巨礫を用いて古津波の規模の推定を行うことを主目的としている。そのためには,津波で運ばれた巨礫群と,台風の高波で運ばれた巨礫群の特徴の違いをまず明らかにする必要がある.そこで,本年度は沖縄県久高島および石垣島沿岸域に分布する巨礫群の位置とサイズの測定を行った。久高島では, 210個の巨礫群を測定した.その結果,(1)巨礫群は礁縁から275m以内の範囲にのみ分布すること,(2)礁縁から内陸に向けて,指数関数的にサイズが小さくなること,(3) 2007年7月に台風に伴い発生した既往最大の有義波によって,現在の分布が説明できることがわかった.そこで,この分布と2007年7月の有義波との関連付けを行い,任意の高波による巨礫運搬距離を明らかにする方法を考案した.一方,石垣島では,礁縁から11.5km離れた高潮線付近に数百トンもの巨礫が密集している様子が観察された.これらの巨礫は,久高島に分布する巨礫群から推定される,高波による巨礫移動限界をはるかに超え,かつ重量が極めて重いという特徴がある.そのため,水理学的に考えて,これらの巨礫群は台風の高波では説明がつかず,より周期の長い津波により運搬されたものと考えられる.石垣島の巨礫群は, 1771年明和津波により運搬された可能性が,古文書の研究や年代測定から示唆されており,本研究の結果は,水理学的検証により,これらの先行研究を支持するものである.本研究では,沿岸域の巨礫から津波によって運ばれたものを抽出する手法を確立し,さらにそれらの巨礫を用いて古津波の規模の推定を行うことを主目的としている.本年度は,津波と台風の高波により運搬された巨礫の違いをさらに明らかにするため,沖縄諸島および奄美諸島における巨礫群調査を実施した.これまで沖縄県・久高島で調査を行い,台風の高波で運搬された巨礫群は,礁縁から指数関数的にサイズが減少すること,礁縁から約300mの範囲内の礁原上に分布することが確認できた.今年度はさらに,巨礫が点在する久高島周辺の他島(津堅島)や,波浪条件が異なる島(奄美諸島)では,台風の高波に伴う巨礫がどのような分布傾向を示すのか調査した.その結果,津堅島,奄美大島のいずれでも,久高島と同様の巨礫分布を示すことが明らかになった.これは,沖縄諸島,奄美諸島において,台風の高波の強さはほぼ同規模であることを意味している.通常,過去に発生した高波の波高は統計的手法に頼らざるを得ないが,リーフ上に存在する巨礫群の分布を用いれば,過去の高波の規模を推定できる可能性があることがわかった.言い換えれば,琉球列島において台風起源の巨礫群は明確に識別でき,その基準を上回る重量,位置に存在する巨礫は,津波起源と考えられる.そして,津波起源の巨礫群は,宮古-八重山諸島にのみ集中的に存在することがわかった.津波により運搬された巨礫群を数値モデルを使って解析すれば,巨礫を運搬しうる津波の波高・周期を推定できると期待される.本研究では,沿岸域の巨礫から津波によって運ばれたものを抽出する手法を確立し,さらにそれらの巨礫を用いて古津波の規模の推定を行うことを主目的としている.本年度は,沖縄諸島や宮古-八重山諸島のリーフ上において,巨礫分布に関する現地調査を行なった.具体的には,巨礫のサイズ,空間分布および長軸の方向や密度の測定を行った.その結果,沖縄諸島においては台風起源と考えられる巨礫しか存在しないものの,宮古-八重山諸島においては,津波起源および台風起源の巨礫の両方が存在することがわかった.沖縄諸島においては,既往最大の台風の高波の外力を推定できる可能性があるのに対し,宮古-八重山諸島では,台風の高波の外力のみならず,津波外力を推定できる可能性がある。そこで,巨礫のサイズや移動距離のみから,津波のどのような水理量が推定できるのか調べた.その結果,巨礫の空間・サイズ分布から,津波の波高と周期の組み合わせを推定できることが明らかになった.また,1771年明和津波を対象として,波源モデルの推定を行なった.

その結果,海溝型巨大地震よりも,内陸寄りの海底断層とそれに付随する海底地すべりを仮定することにより,古文書・地質記録から推定された宮古-八重山諸島の遡上高分布を制度よく再現できることが明らかになった.このモデルを用いて,石垣島や水納島などの巨礫の移動過程を解析したところ,推定される初期位置からほぼ現在位置まで移動することがわかり,波源モデルの妥当性を示すことができた。
ディープラーニング・ニューラルネットワーク教育用実験ツールキット

研究の目的:近年、ディープラーニング・ニューラルネットワーク(以下DNNとする)を使用したシステムの台頭が著しい。DNNはGoogle社の自動運転車などに使用されて話題となっている。DNNを手軽に利用できる教育用実験用ツールキットが望まれている。平成28年度、「ステレオ・カメラや超音波距離センサーを使用したロボットカー教育用実験キットの開発」で白線追従走行ができるロボットカー教育用実験キットを開発した。このロボットカー教育用実験キットを参考にしてディープラーニング・ニューラルネットワーク教育用実験用ツールキットを開発する。研究方法:1.白線に見立てた白ビニールテープを28cmの間隔で2本平行に床に貼り、その間にミニ・ロボットカーを置いて白線の写真を数十枚撮影した。なお、白線は直進路、角度を変えたカーブ2種類を作成した。2.写真を加工し、コントラスト変更やぼかし付加、ノイズ付加などにより、千枚程度に増やした。更に、その写真をずらして切り取ることにより数万枚規模に増やした。3.数万枚の写真を使用して畳み込みニューラルネットワーク(以下CNN)を学習した。4.学習したCNNを量子化し、精度を確認した。5. C言語で記述し高位合成ツールを使用してIP化を行った。6. FPGAにCNNを実装して、その結果によりミニ・ロボットカーが白線間を走行することを確認した。7.更に、FPGAにCNNを最適化して、6.に示したよりも速度が20倍に向上し、結果を得るまでの時間が1.9ms程度から90us程度に向上することを高位合成ツールにより確認した。研究成果:白線間を走行するためのCNNをFPGAに実装して、実際にミニ・ロボットカーが白線間を走行することが確認できた。「実機の写真によるCNNを学習」、「推論の量子化によるCNNのFPGA実装」、「ミニ・ロボットカーにより白線間を走行」という一連の手順を実行できるので、教育用の実習キットとして最適である。
アニオン交換膜水電解におけるイオン置換メカニズムの解明

アニオン交換膜(AEM)を用いた水電解装置は,低コストで高性能な水素製造装置として期待されている.しかしアニオン交換膜は大気中の二酸化炭素(CO2)を容易に吸収し,膜中水酸化物イオン(OHー)が炭酸イオン種(CO32ー/HCO3ー)に置換されてしまい,膜のイオン導電率の低下を招くという問題がある.一方で水電解運転によって炭酸イオン種が水酸化物イオンに再置換される可能性が示唆されている.本研究ではこのイオン置換および再置換のメカニズム解明することを主要な課題としている.昨年度は,電解中のイオン置換を把握するために必須となる安定した電解運転を行うことが可能な電極構造の選定を行った.その結果,アノード(水素発生極)はアイオノマを結着剤として触媒を直接膜上に塗工する構造(CCM構造)とし,カソード(酸素発生極)は化学的に安定なPTFEを結着剤として触媒を給集電体上に塗工し焼成して担持する構造(CCS構造)とすることが適当であるとの結論に至った.今年度は,このアノードーCCM/カソードーCCSから成る電極層を適用したセルを駆使して,AEM中イオン置換に大きな影響を及ぼす電解液について実験的研究を行った.その結果,1)純水を電解液に用いた水電解は可能ではあるが,セル抵抗が著しく大きくなり,水電解装置としての実用上の運転は困難,2)アルカリ溶液の場合,水酸化カリウム(KOH)溶液よりも炭酸カリウム(K2CO3)を用いた時に膜抵抗が低く維持でき,より優れた電解性能を発揮できることが明らかになった.この膜抵抗の電解液依存性から,膜内イオン種は電解液イオン種と同一ではなく,膜界面でのイオン交換が膜内イオン種組成に大きく影響することが明らかになった.本研究で主要な課題とする「イオン置換および再置換のメカニズム解明」について,電解液イオン種が電解に及ぼす影響を定量的に評価することによって,膜内イオン種の支配因子が膜界面でのイオン交換にあることを特定した.また生成水素の露点を測定することにより,膜内イオン種が膜内水分量へはさほど影響を及ぼさないという知見を得た.水電解セルを用いた水電解運転に伴うイオン置換の挙動を解析すると共に,膜内イオン種の同定を行うため,セル運転中の電解液を抽出し,イオンクロマトなどの分析装置を駆使してセルから排出されるイオン種の分析を行う.またアニオン交換膜について水電解に供する前後のサンプルをフーリエ変換赤外分光光度計測(FT-IR),ラマン分光計側,小角X線散乱法(SAXS)等を適宜駆使して分析を行い,膜構造とイオン種の相関関係の解析を進める.アニオン交換膜(AEM)を用いた水電解装置は,低コストで高性能な水素製造装置として期待されている.しかしアニオン交換膜は大気中の二酸化炭素(CO2)を容易に吸収し,膜中水酸化物イオン(OHー)が炭酸イオン種(CO32ー/HCO3ー)に置換されてしまい,膜のイオン導電率の低下を招くという問題がある.一方で水電解運転によって炭酸イオン種が水酸化物イオンに再置換される可能性が示唆されている.本研究ではこのイオン置換および再置換のメカニズム解明することを主要な課題としている.このイオン導電率の変化は主にセル抵抗の形で測定されるが,幅広い電流範囲で繰り返しセル抵抗を測定するためには,安定して優れた電解性能を発揮できる電極触媒層の存在が不可欠である.電極触媒層は,セルのアノードにおいては酸素を,カソードに置いては水素を発生させる触媒を担持した層であり,アニオン交換膜に接着した構造を有する.今年度は,触媒層の性能改善を図るため,触媒層の担持方法や塗工方法について,様々な手段を駆使して,その最適化を行った.数多くの種類の触媒層とそれらを用いた電解実験を行うことで,下記のことが明らかになった.1)カソード(水素発生極)触媒は比較的安価なニッケルを用いることが可能であるが,白金を用いることで,その性能は飛躍的に向上する,2)カソードは運転中ほぼドライの状態を維持できるので,アニオン交換膜上にアイオノマを結着剤として触媒を直接塗工する構造が適当である,3)アノード(酸素発生極)は電解液に直接触れるため,化学的安定性が求められるため,アイノマでは触媒を保持できず,PTFEを結着剤に用いて高温で焼結させた構造とする必要がある.このような構造の電極触媒層を用いることによって,1A/cm2までの電流で少なくとも数日間は安定した電解を行えることが分かった.本研究で主要な課題とする「イオン置換および再置換のメカニズム解明」には安定して優れた性能を発揮する電極触媒層の開発が不可欠である.そのために今年度は触媒層の高性能化に注力した研究開発を行った.その結果予想を超える性能を発揮できる触媒材料と構造を特定できた.次年度以降は,この電極触媒層を駆使することで効率的な研究進捗を図ることが可能になった.アニオン交換膜(AEM)を用いた水電解装置は,低コストで高性能な水素製造装置として期待されている.しかしアニオン交換膜は大気中の二酸化炭素(CO2)を容易に吸収し,膜中水酸化物イオン(OHー)が炭酸イオン種(CO32ー/HCO3ー)に置換されてしまい,膜のイオン導電率の低下を招くという問題がある.一方で水電解運転によって炭酸イオン種が水酸化物イオンに再置換される可能性が示唆されている.本研究ではこのイオン置換および再置換のメカニズム解明することを主要な課題としている.

昨年度は,電解中のイオン置換を把握するために必須となる安定した電解運転を行うことが可能な電極構造の選定を行った.その結果,アノード(水素発生極)はアイオノマを結着剤として触媒を直接膜上に塗工する構造(CCM構造)とし,カソード(酸素発生極)は化学的に安定なPTFEを結着剤として触媒を給集電体上に塗工し焼成して担持する構造(CCS構造)とすることが適当であるとの結論に至った.今年度は,このアノードーCCM/カソードーCCSから成る電極層を適用したセルを駆使して,AEM中イオン置換に大きな影響を及ぼす電解液について実験的研究を行った.その結果,1)純水を電解液に用いた水電解は可能ではあるが,セル抵抗が著しく大きくなり,水電解装置としての実用上の運転は困難,2)アルカリ溶液の場合,水酸化カリウム(KOH)溶液よりも炭酸カリウム(K2CO3)を用いた時に膜抵抗が低く維持でき,より優れた電解性能を発揮できることが明らかになった.この膜抵抗の電解液依存性から,膜内イオン種は電解液イオン種と同一ではなく,膜界面でのイオン交換が膜内イオン種組成に大きく影響することが明らかになった.本研究で主要な課題とする「イオン置換および再置換のメカニズム解明」について,電解液イオン種が電解に及ぼす影響を定量的に評価することによって,膜内イオン種の支配因子が膜界面でのイオン交換にあることを特定した.また生成水素の露点を測定することにより,膜内イオン種が膜内水分量へはさほど影響を及ぼさないという知見を得た.今後は,特殊構造のセルを組み上げ,本研究で主要な課題とする「イオン置換および再置換のメカニズム解明」に本格的に取り組む.アニオン交換膜(AEM)水電解セルの構成部材と配置はプロトン交換膜(PEM)燃料電池やPEM水電解装置に倣っており,触媒層を接合したAEMを多孔性給集電体(ガス拡散層),流路付の複極板(セパレータ)で挟み込む.ただし従来のセルでは電解質膜の外周部がわずかに大気に接していた.この部分についても完全に大気と遮断するため,新たなセルを製作し,実験に供する.H30年度はこのセルを設計・作製し,気密試験を行った後,従来のセルと同等な電解性能を発揮できることを確認する.初期アニオン種を設定するため,そのセルに所定のアルカリ溶液を流し込んだ後,保持する.その後そのアルカリ溶液を排出して電解を開始する.AEM中イオン再置換の影響については,最初に導入するアルカリ溶液と電解液のアニオン種を変えることで特定できる.この場合,セル抵抗値の電解液導入からの時間経過依存性を調べることで,イオン置換の速度論的解析が可能になる.水電解セルを用いた水電解運転に伴うイオン置換の挙動を解析すると共に,膜内イオン種の同定を行うため,セル運転中の電解液を抽出し,イオンクロマトなどの分析装置を駆使してセルから排出されるイオン種の分析を行う.またアニオン交換膜について水電解に供する前後のサンプルをフーリエ変換赤外分光光度計測(FT-IR),ラマン分光計側,小角X線散乱法(SAXS)等を適宜駆使して分析を行い,膜構造とイオン種の相関関係の解析を進める.
ワイヤレス電解剥離法によるグラフェンの合成と構造制御

本研究では,グラファイト粉末に対して直接導通を取らずに電解処理を施し,グラフェンを効率的に得る手法(ワイヤレス電解剥離法)を確立することを最終的な目的としている。これを実現するためには,インターカレーション反応,アノード酸化,バイポーラ電気化学,交流電解を組み合わせ最適な電解条件を確立する必要がある。2年目は,初年度に得られたグラファイトを有線直流電解におけるグラファイト箔の剥離に関する基礎データを参考にして,グラファイト板または粒子に対して,直流ワイヤレスで電解処理を施した。直流ワイヤレスでグラファイト試料を剥離するために,まずは実験セットアップを検討した。駆動電極として白金電極を用いて,駆動電極間にグラファイト試料を配置し,電解を行うことで,剥離が進行するかを確認した。駆動電極間距離および試料の保持方法は実験の再現性を確保するために,非常に重要なパラメータであるため,電極の固定方法と試料の保持方法を検討した。プラスチック棒を用いて自作の電極固定冶具を作製したところ,電解において高い再現性を確保することができた。また,板はクリップを用いて,粒子は絶縁性フィルターバックを用いて試料を駆動電極間に保持した。電解液濃度,時間,電圧などの諸パラメータを最適化することで,グラファイト板および粒子径約1 mmのグラファイト試料を直流ワイヤレスで処理することが可能となった。得られたグラフェンの構造解析も順調に進行している。当初の予定通り,直流ワイヤレス電解においてグラファイト板およびグラファイト粒子を剥離することが可能であることを見出した。また剥離物の詳細な構造解析も行った。そのため,研究は概ね順調に進展していると判断される。当初の予定通り,直流ワイヤレス電解においてグラファイトを剥離することが可能であることを見出したので,本年度以降も計画通りに研究を推進する。直流ワイヤレス電解において,粒子径1 mm以下の粉末に対して処理を行い,本手法の有効性を確認する。更に交流電解を組み合わせる前に,直接の交流電解においてグラファイトの剥離に及ぼす電解因子の影響を明らかにする。具体的には,波形,周波数,アノード,カソードのバランスなど,諸パラメータを検討し,剥離物の構造を解析する。交流の結果をワイヤレス電解に適用し,効率よくグラフェンを合成できる条件を検討する。得られたグラフェンの構造解析を詳細に行うとともに電気化学デバイスとしての特性評価も行う。
プロトンチャネルノックアウトマウスを用いた摂食中枢機構の維持とその破綻の理解

昨年度に引き続き、野生型とVSOP/Hv1遺伝子欠損マウスの間で、NADPH oxidaseの局在に違いが認められるかを検証した。NADPHoxidase complexにおける細胞質サブユニットであるp67抗体を用いた免疫細胞化学を行った結果、野生型ミクログリアにおいてはp67とF-actinの局在に強い相関が見られたのに対し、VSOP/Hv1遺伝子欠損ミクログリアにおいてはそれが見られなかった。以上からVSOP/Hv1遺伝子欠損ミクログリアにおいてはF-actinの重合・脱重合異常によってNADPHoxidaseの細胞質ユニットの局在に変化が生じ、活性酸素産生の違いを生じていることが示唆された。更にこのようなin vitroでのVSOP/Hv1による活性酸素産生調節機構が、in vivoにどのように反映されているかを明らかにするため、週齢の異なる野生型マウス及びVSOP/Hv1遺伝子欠損マウスについて酸化ストレスマーカーの発現量を調べた。その結果、生後1日、5日、3週間齢のVSOP/Hv1遺伝子欠損マウスでは酸化ストレスマーカーの発現量が低下していたのに対し、6か月齢では逆にこれが増大していることが明らかとなった。以上から、VSOP/Hv1による活性酸素産生機構はin vivoにおいては加齢依存的であることが示唆された。また本年度の解析では、C57BL6/JのマウスからC57BL6/Nにバッククロスするにつれ肥満の表現型が小さくなっていたため、バックグランドによる影響が考えられた。しかしC57BL6/Nの4か月齢のマウスにおいてもVSOP/Hv1遺伝子欠損によって血中レプチン濃度が減少している傾向が認められ、摂食中枢の調節に関わっている可能性が考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、我々が見出している「6ヶ月齢程からの加齢と共に雌マウスで肥満が生じる」という特徴を持つ、VSOP/Hv1欠損マウスに着目し、老化に伴う肥満形成が生じるメカニズムについて、新たな知見をみいだすことを目的とした。VSOP/Hv1は脳内ではミクログリア特異的に発現するため、VSOP/Hv1のミクログリアにおける機能を詳細に解析した。初代培養ミクログリアにおいてsuperoxide anionの産生をPMA刺激により誘導し、Diogeneにより定量したところ、先行論文での知見とは逆に、VSOP/Hv1ノックアウトマウスでは優位に産生量が増えることが示された。好中球やマクロファージなどでのVSOP/Hv1の機構とは異なる機構により制御されている可能性が示唆された。またミクログリアでのVSOP/Hv1の細胞内局在を詳細に検討した結果、細胞膜の周辺部、とくに接着部位に多く分布することが示された。ミクログリアにおけるHv1の活性酸素産生制御機構について、先行論文での知見とは異なる結果が得られ、あらたなプロトンチャネルの生理機能が見いだされる可能性が生じたため。このようなミクログリアでのVSOP/Hv1による活性酸素産生機構について、アクチン形成との関係を明らかにし、VSOP/Hv1による活性酸素産生の抑制機構と週齢に伴う酸化ストレスとの関係を調べる計画である。
社会的存在としての遠隔操作型アンドロイドの研究

人と関わるロボットの自律動作と遠隔操作の機能を統合することで,人間やロボットが存在する社会的で現実的な場面において,発話やジェスチャーなどの社会的振る舞いを行い,社会に参加できるロボットシステムの実現を目指すとともに,社会的な対話の認知心理学的な理解とモデリングに取り組んだ.今年度は,以上の取り組みを開始したところであったが,本提案をさらに発展させた,人間に酷似したロボットであるアンドロイドの機構の改良やBMIの導入を含む基盤研究S "人のような存在感を持つ半自律遠隔操作型アンドロイドの研究"が採択されたため,5月31日をもって,本研究課題を廃止し,基盤研究Sの一部として研究を推進している.本研究課題実施時の具体的な研究内容としては, 1.対人状況における注意制御機能と遠隔操作機能の統合の一部として,学習アルゴリズムに基づくロボットの自律制御に関する研究,及び, 2.社会的状況における対話の認知科学的モデル化の研究の一部として,ロボット演劇中のロボットが人にアプローチするシーンの演出データからの社会的振る舞いの抽出に取り組んだ.現在,基盤研究Sとして,物理的なインタラクションをも自然にするための電磁リニアアクチュエータを用いたアンドロイドの開発,複数人による雑談などの具体的な社会的状況における対話とそれに伴う行動の記録と分析に基づく対話モデルの構築や,遠隔操作の記録を基にしたアンドロイドの自律化に取り組んでおり,今後,行う予定のブレインマシンインターフェースによる遠隔制御の導入などとともに,人との多様な相互作用を行うアンドロイドの開発,社会的存在としての機能の実現,現実社会におけるアンドロイドの社会参加の実現に取り組む.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子制御ネットワークに着目した超好熱菌からの有用遺伝子探索

好熱菌が産生するタンパク質は、化学反応が加速される高温環境で機能することから、産業応用に適したバイオマテリアルの供給源として期待されている。本研究では超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisの転写制御ネットワークに着目して、機能未知遺伝子の機能解析を行った。その結果、マルトオリゴ糖に対して加水分解活性を示す、新規糖質加水分解酵素を発見した。本年度はTgr regulonに存在する機能未知遺伝子であるTK1743に着目し、その機能解明を進めた。TK1743は糖質添加時およびTgr遺伝子破壊株でその転写量が増大すること、およびTK1743遺伝子産物はGH57 familyに属する新規タンパク質であることから、糖質代謝との関連が期待された。TK1743組換タンパク質を大腸菌を用いて調製し、熱処理および各種クロマトグラフィーを用いて、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製を行った。精製後の組換えタンパク質を用いて、各種の糖基質を用いて活性測定を行った。その結果、TK1743タンパク質はマルトトリオース以上のマルトオリゴ糖を基質として、その非還元末端より2糖単位で加水分解反応を行う、βアミラーゼ活性を有することが判明した。本酵素は特にマルトトリオースに対して、非常に高い活性を有することが明らかとなった。2.ペントース代謝関連regulonの転写制御因子の同定T.kodakarensisのAMP再利用経路に属する酵素RubisCOの遺伝子発現制御に関わる転写制御因子の同定を進めている。本年度はその準備段階として、ゲノム情報よりT.kodakarensisの転写制御因子と考えられる約80種の遺伝子を選択し、これらの全遺伝子産物を大腸菌を用いた無細胞翻訳系で合成した転写制御因子ライブラリーを構築した。既存の糖質関連酵素との相同性をもたないT.kodakarensisの機能未知タンパク質であるTK1136の機能同定を目指した。大腸菌で組換えタンパク質を調製し、精製後、酵素活性の検出を試みた。基質としてマルトオリゴ糖(G1-G7),マルトデキストリン、アミロース、可溶性デンプンなどを用い、高温(70-80°C)でインキュベーション後に、α多糖加水分解活性を確認したが、現在までに有意な活性の検出には至っていない。T.kodakarensisの転写制御因子ライブラリーを用いて、高温発現型chaperonin遺伝子(TK2303)のプロモーター領域を用いたPhr非依存性の熱ショック応答転写制御に関与する転写制御因子の同定を目指した。しかしながら、これまでに有力な候補は見出されていない。このことはPhr非依存性の熱ショック応答転写制御機構が、特定の転写制御因子を介さないシステムである可能性を示唆している。精製したTK1136タンパク質に対して、様々なα多糖やp-Nitrophenyl基等の吸光基で修飾された糖基質など、総計40種類の基質と反応させ、その糖加水分解活性・糖転移活性をTLC解析で観察した。しかしながら、これまでに明確な活性を確認するには至っていない。続いてTK1136遺伝子破壊株を作製した。作成した遺伝子破壊ベクターを用いて、T. kodakarensis KUW1株を形質転換し、ウラシル非要求性を指標として、シングルクロスオーバー相同組換株を単離した。その後、5ーフルオロオロチン酸耐性を指標とした単離により、pyrFマーカー脱離して本ORFのみがゲノムより除去された遺伝子破壊株を得た。この遺伝子破壊株の生育が培地中に含まれる炭素源により異なるかを調べるために、基本培地(人工海水塩に酵母エキスとトリプトンを添加)にピルビン酸ナトリウムを添加した培地と、基本培地にマルトデキストリンを添加した培地でそれぞれ生育測定を行った。その結果、TK1136破壊株はどちらの条件でもホスト株と同様に生育し、明確な差は観察されなかった。新型耐熱性α多糖加水分解酵素の候補であるTK1136タンパク質の調製が完了した。ペントース代謝関連regulonの転写制御因子の候補が複数同定された。Phr非依存性の熱ショック応答転写制御に関しては、特定の転写制御因子に支配されない可能性が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。新型耐熱性α多糖加水分解酵素の候補であるTK1136タンパク質の活性同定を継続する。この際、加水分解活性のみならず、糖転移活性の有無についても確認を行う。また様々なPNP糖基質を用いた呈色反応による活性測定系を構築し、活性検出を容易する。これにより、1つの基質に対してより多くの反応条件(温度、pH、塩濃度など)で活性測定を行う。
LASER光照射による電子捕獲率増幅を利用した標準模型を超える物理の探索

本年度は二つの研究を主として行いました。一つはレーザー光を原子に照射した際の、束縛電子の原子核による捕獲率の増加に対する時間依存性の解析です。もう一つとしては、標準模型を超える物理の候補として余剰空間模型に注目し、その構築と解析を行いました。捕獲率の増幅の時間発展については、レーザー光の時間依存性を取り入れ、原子とレーザー光の系に対するDirac方程式を数値解析することで調べます。具体的にはレーザー光下での波動関数をレーザー光のない場合の波動関数、すなわち水素型原子波動関数を用いて展開し、時間に依存する展開係数の時間発展を解析します。これまでの研究により、展開する際の水素型原子波動関数は束縛状態だけでは不十分であり、連続状態も必要であることを明らかにしました。この研究は、我々が先行研究で適用したレーザーの時間依存性を落とした近似計算の適用限界とその妥当性を明らかにできるという点から、非常に重要です。一方で、標準模型を超える物理の候補となる余剰空間模型としては、Universal Extra Dimensional(UED)模型に注目しました。UED模型ではコンパクトな余剰空間を考え、その上を標準模型の粒子が伝搬できると考えます。そのため、各粒子に対して余剰空間方向の運動量を持った励起状態-Kaluza Klein(KK)モード-が存在し、それらは4次元時空においては重い粒子として振る舞います。その内、最も軽い粒子は安定になり暗黒物質の候補を与えるため注目されています。我々は新たに二次元球面を用いた模型構築に取り組みました。二次元球面を用いた結果として、KKモードの質量は球面上の角運動量によって特徴づけられるということを明らかにしました。さらに、この模型におけるKKモードのグルーオン融合を介したヒッグス生成率への影響を調べ、標準模型の場合と比べて30%程度の生成率の増幅が得られることを示しました。本年度は研究目的の一つである、レーザー光を原子に照射した際に束縛電子が原子核に捕獲される確率が増幅されるメカニズムの詳細な解析の研究を行った。具体的にはレーザー光の時間依存性を取り入れて、原子とレーザー光による系を記述するDirac方程式を数値計算により解析することを試みた。これまでの解析により、正しく捕獲率の増幅メカニズムを記述するためには十分な精度が必要であることがわかったので、さらに数値計算のアルゴリズムを改良している。この研究は我々の先行研究で用いた、レーザーの時間依存性を落とした近似計算の適用限界とその妥当性を明らかにするという意義がある。さらに、この研究で行う詳細な捕獲率の増幅メカニズムの解析により、捕獲率増幅に必要なレーザー光の強度や波長等をより詳しく決定することができると期待される。また、電子捕獲率の増幅メカニズムを実際の実験に適用することを考える上で、時間依存性を取り入れた詳細な解析は重要である。また、平行して標準模型を超える物理の候補を模索する研究も行った。特に、標準模型を超える物理を記述する模型の候補として、時空にcoset spaceという特殊なタイプの空間を導入した素粒子模型に着目した。本研究ではcoset spaceの次元として10次元の場合に注目し、標準模型を超える物理を記述する模型として適したcoset spaceや系が持ちうる対称性を分類した。この研究は研究課題であるレーザー光を用いた標準模型を超える物理の探索において、どのような物理を調べるべきかという指針を与えうるという意義がある。本年度は標準模型を超える物理の候補を模索する研究を重点的に行いました。特に、素粒子標準模型を超える物理を記述する模型の候補として、時空に商余空間という特殊なタイプの余剰空間を導入した高次元時空におけるゲージ理論に基づいた素粒子模型に着目しました。商余空間の次元として10,6,4次元の場合に注目し、標準模型を超える物理を記述する模型として適した商余空間や系が持ちうる対称性を分類しました。また、同じく商余空間の構造を持った2次元球面を余剰空間とした模型についての解析を行い、ある条件の下では素粒子標準模型に近い構造を導くことを示しました。これらの研究は本研究課題であるレーザー光を用いた標準模型を超える物理の探索において、どのような物理を調べるべきかという指針を与えうるという意義があります。また、並行してレーザー光を原子に照射した際に束縛電子が原子核に捕獲される確率が増幅されるメカニズムの詳細な解析の研究を行っています。具体的にはレーザー光の時間依存性を取り入れて、原子とレーザー光による系を記述するDirac方程式を数値計算により解析することを試みています。最近の進展として、Dirac方程式の数値解析において、レーザー光のない場合のエネルギー固有関数で波動関数を展開する際には離散状態だけではなく連続状態を含めて解析する必要があるこがわかりました。このことにより、正確な数値解析が可能になります。この研究は我々の先行研究で用いた、レーザーの時間依存性を落とした近似計算の適用限界とその妥当性を明らかにするという意義があります。

この研究は、我々が先行研究で適用したレーザーの時間依存性を落とした近似計算の適用限界とその妥当性を明らかにできるという点から、非常に重要です。一方で、標準模型を超える物理の候補となる余剰空間模型としては、Universal Extra Dimensional(UED)模型に注目しました。UED模型ではコンパクトな余剰空間を考え、その上を標準模型の粒子が伝搬できると考えます。そのため、各粒子に対して余剰空間方向の運動量を持った励起状態-Kaluza Klein(KK)モード-が存在し、それらは4次元時空においては重い粒子として振る舞います。その内、最も軽い粒子は安定になり暗黒物質の候補を与えるため注目されています。我々は新たに二次元球面を用いた模型構築に取り組みました。二次元球面を用いた結果として、KKモードの質量は球面上の角運動量によって特徴づけられるということを明らかにしました。さらに、この模型におけるKKモードのグルーオン融合を介したヒッグス生成率への影響を調べ、標準模型の場合と比べて30%程度の生成率の増幅が得られることを示しました。
モティリティシステムにおけるマイクロ・ナノ流動の巨視的運動制御機構の解明

微小生物システムにおけるモティリティはナノ・マイクロ流動と関連している。本研究では,微小生物の巨視的な運動に関連しているナノ・マイクロ流動の流動メカニズムを究明し,マイクロ流動の発現原理を利用したデバイスへの開発を目的に研究を進めた。その結果,ハマトビムシの遊泳肢の微細な折り畳み構造と能動的振動運動が低レイノルズ数領域で効果的な推進力を生成すること,トビムシは跳躍肢の空洞構造を巧みに操り気体高圧を生成して体長の数十倍から百倍以上もの距離を瞬時に移動すること,頭花運動が花弁細胞間の流体流動によってなされていることを解明し,その仕組みを制御する微小振動に倣うマイクロ流動生成デバイスを開発した。微小な節足動物や雑草などは,これらの生命を脅かすような危機的状況下におかれた場合に特異な運動性(モティリティ)を示す。平成27年度では,潮間帯に生息する体長が8mm程度のハマトビムシを取り上げ,各体節に付属する運動器官としての遊泳肢の微視的観点からの形態構造と機能の関係を明らかにした。すなわち,これまでに知られていなかった遊泳肢の折り畳み構造と能動的肢運動が明らかとなった。さらに,遊泳の際に重要となる抗力生成のための細毛構造の規則性についても明らかになった。前述のハマトビムシに続く次の段階として,さらに体長が小さく(2mm以下),水面と陸上を行き来している粘管目トビムシを取り上げ,陸上における跳躍および水上における跳躍が体長の数十倍から百倍程度の距離を瞬時に移動する能力を有することを解析によって明らかにし,さらに高さ情報の得られるレーザ顕微鏡によって,跳躍器の微細な構造を明らかにし,形態構造と運動機能の関連性を明らかにした。さらに,その微細構造が,流体力学的特性を最大限に発揮することをつきとめた。タンポポの頭花がモティリティを示すことから,頭花を構成する花弁表面細胞のレーザ顕微鏡による微視的その場観察を行い,花弁細胞内の微小な流体流動が頭花運動を引き起こすことを明らかにし,定量的に細胞形状の開花時および閉花時における時間変化を計測し,植物流体力学的な考察を行った。微小な節足動物の特異なモティリティおよびタンポポの頭花に観察されるモティリティの解析によって得られた成果を,人工物で効果的に再現する目的で,磁場に応答する磁性流体の微少量と比較的強さの弱い交流磁場を利用してマイクロアクチュエータを幾つか試作した。平成27年度の研究実施計画であげた3項目,すなわち(1)微小な節足動物の遊泳・跳躍・飛行解析および運動器官のレーザ顕微鏡計測,(2)モティリティ頭花を構成する花弁表面細胞形状計測と細胞内ナノ流動の単位時間あたりの流量産出,(3)微小な節足動物の運動器官使用時におけるマイクロ流動場の計測,のそれぞれの項目に関して,当初目標通りに研究計画を遂行した。その結果,研究実績の概要に記述したように,潮間帯に生息する陸生のハマトビムシの水中での遊泳挙動解析から,遊泳肢の微視的計測による力学的細毛構造の抗力増大・抗力減少のための周期的運動と細毛構造の規則性,および遊泳における身体全体の抗力低減姿勢と遊泳メカニズムとの関連性を明らかにした(項目1に関連)。特に,ハマトビムシに関しては,遊泳肢に関してこれまで全く不明であった形態構造や二叉部分の動きに関する新しい発見があった。また,開閉運動を行うタンポポの頭花のその場観察による表面細胞形状計測とその工学的解析を行い,時系列での細胞体積の変化と表面形状変化を明らかにした(項目2に関連)。さらに,微小な水上性トビムシの水面上での跳躍解析と陸上での跳躍解析の比較を行い,跳躍器の形態構造の機能を明瞭にした(項目3に関連)。以上のような計画遂行から,危機的状況下で示す小さな節足動物や日本のどこにでも生えている植物の特異な運動性(モティリティ)が定量的に明らかになったことから,それらの微小振動に基づくメカニズムをマイクロアクチュエータに応用し,その試作にまで計画を進めた。平成28年度は,頭花が開閉運動を示す花弁の表面細胞の形状の時間変化の精密測定,微細な繊毛の生えた遊泳脚を有する海洋性水棲生物の遊泳逃避挙動などに関連して,流体力学的な観点からモティリティ(運動性)の発現メカニズムを解明する目的で研究を遂行し,さらに,それらのメカニズムに基づくデバイスを試作・駆動し,以下のような成果が得られた。開閉運動を呈するいくつかの植物の花を取り上げ,水を供給して生きた状態にあるアサガオおよびタンポポの花弁表面細胞を,高さ情報の得られるレーザ顕微鏡によって時間経過に従って,細胞間の流体ナノ流動によるサイズ変化を計測し,植物に内在するサーカディアン・リズムを通して,定量的な細胞形状の時系列分析を行い,モティリティ特性を明らかにした。また,植物本体が吸い上げた水の蒸散を制御する気孔に関して,アサガオの花弁に最も近い葉を採取し,生きたままその場観察を行い,気孔の精密測定を行いその形状がタンポポの気孔と異なる形状であることを明らかにした。さらに,微細な繊毛の生えた遊泳脚を有する小さな水棲生物の遊泳に関して,遊泳脚を剛体と仮定し,円柱状の軸に直交して生える円柱列で模擬したモデルを構築し,円柱列の間隔を変えたシミュレーションを行い,円柱列間隔が推進力および周囲の流れ場に与える影響を数値的に解析して,繊毛遊泳脚各部からの境界層の厚さが推進力に与える影響を明らかにした。

次に,水と混じり合わない微少量の磁性流体と針状の1対の永久磁石を用いて微小な磁性流体液橋を水中に構成し,外部から磁気的信号を印加し,磁性流体界面に微小振幅の液体振動を誘起し,水中にマイクロ流動を生成するシステムを構築し,その流動特性を明らかにした。また,SAWデバイスと微小スチレン粒子を用いた液滴の霧化システムの特性を明らかにした。平成28年度の研究実施計画であげた項目は,(1)細胞壁を有する細胞内のナノ流動モデルの構築とその数値解析による究明,(2)ナノ・マイクロ流動によるモティリティ原理を利用したマイクロデバイスの試作および開発であり,当初目標通りに研究計画を遂行した。その結果,アサガオの開花時における花弁表面の各細胞は半球形の突構造をとり,その高さが20μm30μmで,閉花に伴って高さを減少させることを明らかにした。また,タンポポの花弁表面細胞は,高さが5μm15μm,先端方向に長さ55μm140μm,幅13μm21μm程度の縦長構造をとり,開花時に高さを増大していくことを明らかにした。さらに,繊毛遊泳脚を有する小さな海洋性水棲動物は,繊毛遊泳脚にかかる流体抗力によって推進し,繊毛遊泳脚は限られたサイズ,重量の中で効率的に推進力を得る形状を有していることが明らかとなった。マイクロ流動を生成するデバイスに関しても,直径1.5mm,長さ8mmの円柱状磁石を3.6mmの間隔で一直線に配置し,10μlの量の磁性流体液橋を磁石間に構成し,90Hzの振動数の交流磁場によって磁性流体界面に微小振動を誘起し,液橋と直交する方向に水のマイクロ振動流を生成した。デバイスは非接触エネルギー供給方式で流動を生成・制御でき,その流動特性を明らかにした。また,SAW素子とスチレン微粒子を利用した液滴の微粒化システムにおいて,微粒子の個数を変えることによって微粒化時間を制御できることを明らかにした。平成29年度は、当該研究課題の遂行によって得られた成果に基づいて、ナノ・マイクロ流動のワイヤレス制御の開発を目的として、微小な永久磁石と磁性流体から構成されるデバイス要素の特性を調べ、また、MHzオーダーの高周波で駆動するSAW(表面弾性波)デバイスを作成し、SAWを利用してマイクロ液滴の表面に毛細表面波動を誘起し、毛細波の生成過程および液体表面崩壊のメカニズムを調べ、以下のような成果を得た。針状の2本の微小永久磁石間に磁性流体の液橋(液体の体積はマイクロリットルオーダー)を形成し、外部から比較的弱い交流磁場(数ミリテスラ以下)を印加することによって比較的高周波数で応答する液体振動を非接触で生成できることを検証し、続いて、磁石ー磁性流体素子の周りの磁場分布を精密に測定することによって、永久磁石の磁場方向と外部磁場の方向が対抗する時に液橋の中心部が細くなり、外部磁場の方向が並行な場合に液橋が太くなると液橋振動と磁場の関係を定量的に明らかにした。また、外部磁場の方向の効果についても明らかにした。さらに、液橋が崩壊する条件や液面崩壊過程についても詳細に明らかにし、磁石ー磁性流体素子で構成されるデバイスの特性を求めた。次に、3.17MHzの周波数で駆動するSAWデバイスを製作し、マイクロ液滴をMHzの高周波数で加振し、マイクロ液滴の液体自由表面に発生する毛細波動、液体表面の崩壊、液面からの超微細な液滴の放出、霧状微粒化などを高精密時間分解能で解析し、表面毛細波が生成する過程での液滴の高さ上昇が、縦波放射による過渡的な圧力によるものであること、その後の液滴伸長がSAWによって液滴内に生成されたマイクロ流動によることなどを明らかにした。
微生物の環状アミド代謝を利用した機能付加型物質生産プロセスの開発

微生物の環状アミド代謝を物質生産に応用する研究に関して、環状アミド代謝中間体フマル酸からのピルビン酸生産について検討した。500mMのフマル酸から約290mMのピルビン酸を生産しうるPseudomonas putida s52株を親株とし、NTG処理によるピルビン酸高生産変異株の取得を試みた。高生産菌の選抜に有効なアナログの探索を試み、TCAサイクルの阻害剤を中心にフマル酸からのピルビン酸生産を特異的に阻害する化合物を探索した。その結果、Bromopyruvateを見いだした。2%Bromopyruvateを含む栄養培地にて生育可能なBromopyruvate耐性変異株を取得し、フマル酸からのピルビン酸生産能を評価した。約2500株のBromopyruvate耐性変異株について検討を行った結果、ピルビン酸生産性が顕著に上昇した変異株15160株を得た。15160株は、1000mMのフマル酸から38時間の反応にて560mMのピルビン酸を生産した。また、含硫環状アミド化合物代謝を利用する光学活性α-メルカプト酸の生産について検討した。S体の光学活性α-メルカプト酸は、医薬品原料として近年注目を集めている。含硫環状アミド化合物である5-ベンジル-2,4-チアゾリジンジオン(BTH)の不斉加水分解による3-フェニル-2-メルカプトプロピオン酸(PMPA)の生成反応を微生物に探索した結果、Brevibacterium linens C-1株に目的の活性を見いだした。本菌は2日間の反応において10mMのラセミ体BTHより約7mMのS-PMPAを光学純度80.1%e.e.にて生成した。本反応を触媒する酵素を単離精製し諸性質を検討した。微生物の環状アミド代謝を物質生産に応用する研究に関して、本年度は環状アミド代謝中間体フマル酸からのピルビン酸生産について以下に示す成果を得た。高生産菌の選抜に有効なアナログの探索を試み、種々の化合物、特にTCAサイクルの阻害剤を中心に、フマル酸からのピルビン酸生産を特異的に阻害する化合物を探索した。その結果、Malic enzymeの阻害剤であるBromopyruvateが、フマル酸からのピルビン酸生産を特異的に阻害し、代謝中間体であるL-リンゴ酸の蓄積をもたらすことを見いだした。s52株の生育に対するBromopyruvateの影響を検討したところ、Bromopyruvate濃度0.5%以上でs52株の生育が顕著に阻害されることが判明した。これらの結果をもとに、2% Bromopyruvateを含む栄養培地にて生育可能なBromopyruvate耐性変異株を取得し、フマル酸からのピルビン酸生産能を評価することとした。15160株は、親株s52株では生産性が低下する高いフマル酸濃度においても良好なピルビン酸生産性を示し、1000mMのフマル酸から38時間の反応にて560mMのピルビン酸を生産した。また、良好な生産性を得るには、反応時のpHを中性(pH7.5付近)に維持すること、および、通気量を高く保つことが効果的であった。微生物の環状アミド代謝を物質生産に応用する研究に関して、含硫環状アミド化合物代謝を利用する光学活性α-メルカプト酸の生産について研究を行った。

S体の光学活性α-メルカプト酸は、医薬品原料として近年注目を集めている。生産するα-メルカプト酸に3-フェニル-2-メルカプトプロピオン酸(PMPA)を選択し、対応する含硫環状アミド化合物である5-ベンジル-2,4-チアゾリジンジオン(BTH)の不斉加水分解によるS-PMPAの生成反応を微生物に探索した結果、Brevibacterium linens C-1株に目的の活性を見いだした。本菌は2日間の反応において10mMのラセミ体BTHより約7mMのS-PMPAを光学純度80.1%e.e.にて生成した。本反応を触媒する酵素を単離精製し諸性質を検討した結果、本酵素はBTH、5-メチル-2,4-チアゾリジンジオン、2,4-チアゾリジンジオン以外にアラントインに良好に作用し、本来プリン塩基代謝にて機能する1酵素であることが予想された。さらに、本酵素をコードする遺伝子をクローニングし塩基配列の解析を行った結果、936bp、312アミノ酸から成る配列が決定された。本酵素.はアラントイナーゼ活性を示すが、既知アラントイナーゼとの配列上の相同性は見られなかった。また、この遺伝子を大腸菌に導入し、本酵素を大量発現する形質転換大腸菌を構築した。本大腸菌はラセミ体BTHより光学純度81.2%e.e.にてS-PMPAを生成した。一方、本酵素が核酸塩基代謝に関連したものであったことから、ピリミジン塩基の微生物代謝について検討を加え、その酸化的分解代謝系の詳細を初めて明らかにした。特に、環状アミド化合物であるバルビツール酸の加水分解酵素バルビチュラーゼについて諸性質を明らかにした。
実験的脊髄損傷後の脊髄細胞のアポトーシスに関する研究

Wister Rat(生後1416週,375423g,雄)を用い,全麻下に第810胸椎の椎弓切除を行った。Blackらの方法に準じて,120gの重錘にて2分間第9胸髄を硬膜上より圧迫し、脊髄完全損傷モデルを作成した。これらのモデルを損傷後,何ら処置を加えなかった対照群と興奮性アミノ酸の拮抗剤(MK-801)を投与したMK801群にわけ,損傷30分後、6時間後、12時間後,24時間後,72時間後,7日後,14日後に,全麻下にホルマリンにて灌流固定を行った後、断頭瀉血した。損傷脊髄を含めた胸髄を一塊として摘出した後,パラフィンにて包埋した。損傷中心部と頭側10mmの部位をHematoxylin-Eosine(以下HE)染色,Nissl染色及びapoptosisの特異的観察法であるNick-end-label法にて染色した。また,損傷3日後の脊髄を電顕にて観察した。脊損6時間後のHE染色標本では,損傷中心部は、神経細胞の核及び細胞体とも崩壊する著明なnecrosisの所見が認められた。この損傷中心部にみられたnecrosisの所見は時間の経過とともに進行していった。損傷中心部より頭側に10mmの部位では損傷6時間後まで神経細胞死はわずかしか観察されなかったが,損傷12時間後にはnecrosisとは明らかに異なる,Nissl小体が比較的保たれ,核が一様に濃染する神経細胞死の所見が散見された。この所見は損傷14日まで継続していた。Nick-end-label法標本では,損傷6時間後までいずれの部位にても神経細胞の核は染色されなかったが,脊損後12時間後には神経細胞の核は発色していた。この所見は損傷後3日に最も顕著にみられ,損傷14日まで継続してみられた。また,電顕にて神経細胞とグリアにアポトーシスの所見が確認された。MK-801群では,Nick-end-label法にて陽性の細胞数は、損傷24時間後と損傷3日後に有意に減少していた。本研究により,損傷12時間後より14日後まで損傷脊髄内のapoptosisによる細胞死が生じること,及びapoptosisの形成に興奮性アミノ酸が関与することが明らかにされた。Wister rat(生後1416週,375423g,雄)を用い,全麻下に第810胸椎の椎弓切除を行った。Blackらの方法に準じて,120gの重錘にて2分間第9胸髄を硬膜上より圧迫し,脊髄不全損傷モデルを作成した。損傷3時間後,6時間後,12時間後,24時間後,48時間後,72時間後,7日後に,それぞれ2匹ずつ全麻下にホルマリンにて灌流固定を行った後,断頭瀉血した。損傷脊髄を含めた胸髄を一塊として摘出した後,水洗し,パラフィンにて包理した。

HEにて神経細胞死の形態学的特徴を,Nick-end-label法にてその生化学的特徴を検討し,損傷部および周辺脊髄組織におけるapoptosisの有無を観察した。脊損3時間後のHE染色標本では,損傷中心部は,神経細胞の核及び細胞体とも崩壊する著明なnecrosisの所見が認められた。この損傷中心部にみられたnecrosisの所見は時間の経過とともに進行していった。損傷中心部より頭側に12mmの部位では損傷3時間後から6時間後まで神経細胞死は観察されなかったが,損傷12時間後にはnecrosisとは明らかに異なる,Nissl小体が比較的保たれ,核が一様に濃染する神経細胞死の所見が散見された。しかし,脊損72時間後には,細胞の核の境界が不鮮明となり脊損後12時間後より認められた所見は消失していた。Nick-end-label法標本では,損傷6時間後までいずれの部位にても神経細胞の核は染色されなかった。脊損後12時間後には損傷中心部では染色されなかったが,中心部より頭側に12mmの部位にて神経細胞の核は発色し,HE染色標本の所見と合わせてapoptosisが示唆された。Wister Rat(生後1416週,375423g,雄)を用い、全麻下に第810胸椎の椎弓切除を行った。Blackらの方法に準じて、120gの重錘にて2分間第9胸髄を硬膜上より圧迫し,脊髄不全損傷モデルを作成した。損傷6時間後,12時間後,24時間後,72時間後,7日後に,それぞれ2匹ずつ全麻下にホルマリンにて灌流固定を行った後,断頭瀉血した。損傷脊髄を含めた胸髄を一塊として摘出した後,パラフィンにて包埋した。脊損6時間後のHE染色標本では,損傷中心部は,神経細胞の核及び細胞体とも崩壊する著明なnecrosisの所見が認められた。損傷中心部より頭側に10mmの部位では損傷6時間後まで神経細胞死はわずかしか観察されなかったが,損傷12時間後にはnecrosisとは明らかに異なる,Nissl小体が比較的保たれ,核が一様に濃染する神経細胞死の所見が散見された。この所見は損傷7日まで継続していた。Nick-end-label法標本では,損傷6時間後までいずれの部位にても神経細胞の核は染色されなかったが,脊損後12時間後には神経細胞の核は発色していた。この所見は損傷後3日に最も顕著にみられ,損傷7日まで継続してみられた。Nick-end-label法標本とHE染色標本の所見より損傷12時間後より7日まで損傷脊髄内の神経細胞死にapoptosisが関与することが示唆された。Wister Rat(生後1416週,375423g,雄)を用い,全麻下に第810胸椎の椎弓切除を行った。Blackらの方法に準じて,120gの重錘にて2分間第9胸髄を硬膜上より圧迫し,脊髄完全損傷モデルを作成した。これらのモデルを損傷後,何ら処置を加えなかった対照群と興奮性アミノ酸の拮抗剤(MK801)を投与したMK801群にわけ,損傷30分後,6時間後,12時間後,24時間後,72時間後,7日後,14日後に,全麻下にホルマリンにて潅流固定を行った後,断頭瀉血した。損傷中心部と頭側10mmの部位をHema toxylin-Eosine(以下HE)染色,Nissl染色及びapoptosisの特異的観察法であるNick-end-label法にて染色した。