hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎児染色体異常症の脱落膜における母児間免疫応答と新生血管制御因子の関与

生殖遺伝学自然流産の絨毛・脱落膜の染色体分析では、絨毛と脱落膜の分離がしばしば困難であり、脱落膜での遺伝子解析をして、新生血管調節因子を調べることが難しく、染色体不分離に関与するSYCP3遺伝子と第XII因子46C/T遺伝子の多型解析を行った。凝固活性と遺伝子多型との関連は示すことができたが、他の因子を調べるため第V因子遺伝子多型解析を行っている。また、今年度からは施設内倫理委員会・ヒト遺伝子組み換え委員会の承認のもとでヒト絨毛脱落膜を採取して、細胞表面マーカー等を指標とし細胞分離法により分離することを始めている。胎児由来の脱落膜からフィーダー細胞となる線維芽細胞を樹立することを今後の目標とし、妊娠維持や母児間免疫応答について検討する。深部静脈血栓症と第V因子活性低下を認めた日本人患者から同定された第V因子Nara変異(FV W1920R)と、中国人患者から発見された第V因子Hong Kong変異(FV R306G)について、母児間免疫応答という観点から妊娠維持における新生血管調節因子として関与するかを調べる。原因不明反復流産患者群と出産歴があり流産歴のない対照群を研究の対象としている。凝固第V因子活性は、第V因子欠乏血漿とPT試薬を用いた凝固一段法で測定する。また、胎児染色体異常の有無を確認したうえで、染色体不分離に関与しているCOHESINおよびBUB1遺伝子において遺伝子変異について全エクソンを包括するようプライマーを設定しダイレクトシークエンス法にて解析する予定である。本年度は胎盤絨毛・脱落膜検体を用いて、絨毛細胞と脱落膜細胞を分離して細胞培養を行い、iPSを樹立できるかどうかを検討する。iPS細胞の培養には、アミノ酸や糖などの栄養源の他、細胞維持のための足場となるフィーダー細胞(胎児線維芽細胞)が必要であり、現在はマウスの胎児から取った線維芽細胞を使う方法が一般的となっている。しかし、臨床応用のためには、異種細胞であるのみならず未知病原体の感染等のおそれや品質管理の難しさなどが課題になっている。本研究では、母由来および胎児由来の両細胞成分を含むヒト胎盤組織から絨毛と脱落膜を細胞表面マーカー等を指標とし細胞分離法により分離することによって、1)胎児由来の脱落膜からフィーダー細胞となる線維芽細胞を樹立する。また、2)細胞バンクより入手可能なヒトiPS細胞との共培養により神経系細胞への分化誘導が可能かについて検討する。
オートファジーの誘導を標的とする新規抗腫瘍活性天然物の探索研究

オートファジーの誘導を標的とする新規抗腫瘍活性天然物の探索を目的に、ヒガンバナ科植物Lycoris albifloraの鱗茎、ハマビシ科Larrea tridentataの地上部、ビャクダン科Santalumalbumの材、ユリ科Fritillaria meleagrisの鱗茎、キンポウゲ科Adonisaestivalisの種子について、HL-60白血病細胞に対する細胞毒性を指標に成分探索を行った。その結果、L. albifloraの鱗茎より単離されたフェナンスリジン型アルカロイドのリコリシジノールがHL-60細胞およびHSC-2口腔がん細胞に対して、非常に低濃度(HL-60: IC500.018 mM; HSC-2: IC500.053 mM)でアポトーシス型の細胞死を誘導した。HSC-2細胞をリコリシジノールで処理すると、HSC-2細胞は一過性のオートファジーの発現を経てアポトーシスへと誘導されたが、このときオートファジー阻害剤を添加するとリコリシジノールのアポトーシス誘導活性は減弱した。したがって、リコリシジノールのHSC-2細胞に対する強力なアポトーシス型細胞死誘導活性に、培養の初期に観察される一過性のオートファジーの発現が寄与していることが示唆された。そのほかに、L. tridentataの地上部、S. albumの材、F. meleagrisの鱗茎、A. aestivalisの種子から、腫瘍細胞にアポトーシス型の細胞死を誘導する二次代謝産物が単離されたが、オートファジーの発現は確認されなかった。オートファジーの誘導を標的とする新規抗腫瘍活性天然物の探索を目的に、2種のヒガンバナ科植物Habranthus brachyandrusおよびLycoris albifloraの鱗茎のメタノール抽出エキスについて、HL-60ヒト急性前骨髄性白血病細胞に対する細胞毒性を指標に成分検索を行った。その結果、H.brachyandrusより、10種のフラバン類、1種の新規ヒドロキシ脂肪酸配糖体、2種のネオリグナン、1種のアセトフェノン誘導体、1種のジヒドロカルコン、3種のクリナン型アルカロイド、2種のピロロフェナンスリジン型アルカロイドを単離し、各種スペクトルデータの解析と化学変換によりそれらの構造を同定した。また、L.albifloraからは、2種のフラバン類、3種のリグナン類、1種のアセトフェノン誘導体、1種のクリナン型アルカロイド、1種のピロロフェナンスリジン型アルカロイド、2種のフェナンスリジン型アルカロイド、4種のリコラナン型アルカロイド、3種のガランサミン型アルカロイドを単離し、構造を同定した。これら2種のヒガンバナ科植物から単離された化合物について、HL-60細胞に対する細胞毒性活性試験を行ったところ、フェナンスリジン型アルカロイドの一種が非常に強い細胞毒性活性を示した(IC_<50>0.0056μg/mL)。この化合物は、HSC-2ヒト口腔扁平上皮がん細胞に対しても強い細胞毒性活性を示し、細胞死初期の段階において、オートファジー様の形態学的変化を認めた。次年度以降、オートファジー誘導に関する絶対的な確証を得るための実験を行うとともに、強い細胞毒性活性とオートファジー誘導の関連を明らかにする予定である。ヒガンバナ科Habranthus brachyandrusの鱗茎より単離されたフェナンスリジン型アルカロイドの1種が、HL-60ヒト急性前白血病細胞およびHSC-2口腔扁平上皮がん細胞に対して強力な細胞毒性を示したことから、その作用メカニズムを精査した。その結果、培養初期(3時間)において、オートファゴソームのマーカータンパクであるLC3タンパクの発現と集積を認めた。さらに、培養を続ける(24時間)とカスパーゼ依存型のアポトーシスへと誘導されることが明らかとなった。来年度以降、オートファジーとアポトーシスの関連を含めたさらに詳細な細胞死メカニズムの研究を進める予定である。

別に、ハマビシ科Larrea tirdentataの地上部のメタノール抽出エキスについて、細胞毒性を指標とした成分検索を行った。その結果、13種の新規化合物を含む、25種のトリテルペン配糖体を単離し、それらの化学構造を、NMRを中心としたスペクトル解析と化学変換によって明らかにした。単離されたトリテルペン配糖体のうち5種がHL-60細胞に対して細胞毒性を示し、そのうち2種はカスパーゼ依存型のアポトーシスを誘導したが、オートファジーの発現は確認されなかった。また、ビャクダン科ビャクダンSantalum albumの材のメタノール抽出エキスより1種の新規化合物を含む5種のリグナン類を単離し、それらの化学構造を、NMRを中心としたスペクトル解析と化学変換によって明らかにした。単離されたリグナン類のうち、アルデヒド基を有するネオリグナンの2種が、HL-60細胞とA-549肺腺がん細胞に対して有意な細胞毒性を示した。昨年度までの研究により、ヒガンバナ科Lycoris albifloraの鱗茎より単離されたフェナンスリジン型アルカロイド(FA-1と仮称)が、HL-60ヒト急性前白血病細胞およびHSC-2口腔扁平上皮がん細胞に対して強力な細胞毒性を示し、培養初期の段階においてオートファジーを誘導していることを明らかにした。そこで、透過型電子顕微鏡を用いて細胞内部を観察したところ、明らかなオートファゴゾームの形成は観察できなかったものの、ミトコンドリアの萎縮と黒変化が確認された。このような現象は、過去にモルヒノンがHL-60細胞に対してオートファジー型の細胞死を誘導する際にも確認されている。さらに、FA-1とオートファジー阻害剤である3-メチルアデニンを併用した場合、FA-1のHSC-2細胞に対する細胞毒性は有意に減弱した。これらの結果からFA-1の強力な細胞毒性は、培養初期に観察されるオートファジーの誘導が寄与していることが強く示唆された。別に、ハマビシ科Larrea tridentataの地上部のメタノール抽出エキスより、1種に既知リグナンとともに、2種の新規リグナン配糖体を単離し、それらの化学構造を、NMR中心としたスペクトル解析と化学変換によって明らかにした。配糖体としては細胞毒性を示さなかったが、そのアグリコン部分は中程度の細胞毒性を示した。また、ビャクダン科ビャクダンSantalum albumの材のメタノール抽出エキスより数種のセスキテルペン類を単離した。これらセスキテルペン類のなかには、HL-60細胞に対して既存の抗がん剤に匹敵する細胞毒性を示すものもあったが、オートファジーの誘導は確認されなかった。さらに、米国ハーバード大学との共同研究により、強力な抗腫瘍活性物質OSW-1の作用メカニズムの一端を明らかにした。昨年までの研究により、ヒガンバナ科Lycoris albifloraの鱗茎より単離されたフェナンスリジン型アルカロイド(FA-1)が、HSC-2口腔がん細胞に対して培養初期の段階においてオートファジーを発現させ、このオートファジーの発現がその後のアポトーシス誘導に深く関与していることを明らかにした。そこで、FA-1の類縁体の単離と化学誘導を試み、それらの細胞毒性を評価したところ、8位/9位のメチレンジオキシ基、7位水酸基、1位/10b位間の二重結合は、いずれもFA-1の強力な細胞毒性の発現に必須であることが明らかとなった。
多角形区間演算を用いたロバスト制御系のCADに関する研究

本研究で得られた成果は以下のようにまとめられる.1.完全分割可能な表現を持たない場合に対する高精度な値集合の推定法完全分解可能ではない表現が与えられる場合も含めて高精度な値集合の推定を行う方法について検討を行った.まず,分母分子が不確かさを持つ変数のアフィン関数であるような関数についてFuの結果を拡張した.次に,復素平面における多角形を定義域とする変数の正則関数については.値集合の境界は各多角形の境界(辺)を定義域とした場合の像に含まれることを明らかにした.さらに,これを用いて,不確かさを持つ変数の多重アフィン関数である関数に対してその値集合の境界を求める方法を提案した.2.制御系設計のためのCADシステムロバスト仕様を満たすPID制御器,位相進み・位相遅れ要素,2自由度PID制御器の設計を行うためのCADシステムの開発を行った.本システムは,多角形区間演算を用いて値集合の推定を行うことにより実パラメータの変動を取り扱えることと,多角形の演算(和集合,共通部分,差集合の計算)を用いることにより与えられた仕様を満たす制御器のパラメータの許容領域を計算できることに特長がある.許容領域自体を求めることができるので,常に大域的最適解をもとめることができ,これは,2自由度制御系の設計において特に有効である.3.非線形システムの安定解析従来ルーリェシステムの安定性は,非線形部分のみがセクター条件で与えられる不確かさを持つという設定で解析されてきたが,本研究では,線形部分にも不確かさを含む場合の安定解析を多角形区間演算を併用して行った.本研究で得られた成果は以下のようにまとめられる.1.完全分割可能な表現を持たない場合に対する高精度な値集合の推定法完全分解可能ではない表現が与えられる場合も含めて高精度な値集合の推定を行う方法について検討を行った.まず,分母分子が不確かさを持つ変数のアフィン関数であるような関数についてFuの結果を拡張した.次に,復素平面における多角形を定義域とする変数の正則関数については.値集合の境界は各多角形の境界(辺)を定義域とした場合の像に含まれることを明らかにした.さらに,これを用いて,不確かさを持つ変数の多重アフィン関数である関数に対してその値集合の境界を求める方法を提案した.2.制御系設計のためのCADシステムロバスト仕様を満たすPID制御器,位相進み・位相遅れ要素,2自由度PID制御器の設計を行うためのCADシステムの開発を行った.本システムは,多角形区間演算を用いて値集合の推定を行うことにより実パラメータの変動を取り扱えることと,多角形の演算(和集合,共通部分,差集合の計算)を用いることにより与えられた仕様を満たす制御器のパラメータの許容領域を計算できることに特長がある.許容領域自体を求めることができるので,常に大域的最適解をもとめることができ,これは,2自由度制御系の設計において特に有効である.3.非線形システムの安定解析従来ルーリェシステムの安定性は,非線形部分のみがセクター条件で与えられる不確かさを持つという設定で解析されてきたが,本研究では,線形部分にも不確かさを含む場合の安定解析を多角形区間演算を併用して行った.1)高精度な値集合の推定法に関する検討:多角形区間演算を用いると,不確かさのパラメータqを含む伝達関数G(s,q)がqに関して完全分割可能な表現(各q_iがGにおいて1回しか現れない表現)である場合には高精度な値集合の推定得ることが出来るが,そうでない場合には,値集合の推定は過大なものになる可能性がある.完全分割可能な表現が得られない場合でも,多くのシステムにおいて,G(s,q)は,幾つかの独立な不確かさのパラメータq^iの完全分解可能な表現p_i=G_i(s,q^i)を中に含み,p_iが,G^^<^>(s,p)=G(s,q)において複数回現れるという構造を持つ場合が多い.この場合,p_iは,多角形区間演算によって計算され,結局ある多角形を定義域とする変数と考えられる.このような問題設定において,多角形の内部の点は値集合の境界には写像されないことを証明でき,多角形の辺で値集合の境界へ写像されるものを探索すればよいという段階まで問題を絞り込むことができた.現在は,それを効率よく求める問題について検討している状況である.2)制御器のパラメータの許容領域の算出:ロバスト仕様を満たすPID制御器の許容パラメータの許容領域の算出に関しては,周波数帯によって計算方法を変える方法が非常に有効であった.しかし,この方法は位相進み・遅れ要素に関してはあまり有効ではないことが判明した.そこで,位相進み・遅れ要素G(s)=a_k(1+T_1s)/(1+T_2s)の2つのパラメータT_1,T_2を同時に管理するために,T_1-T_2平面の多角形の積集合の演算を用いることを検討し良好な結果を得た.また,これをPID制御器の許容パラメータの許容領域の算出にも適用し,以前の方法よりも効率良く計算できるようになった.さらに,これらの結果を利用して,2自由度制御系の設計のためのCADシステムの開発を行った.本研究で得られた成果は以下のようにまとめられる.1.完全分割可能な表現を持たない場合に対する高精度な値集合の推定法完全分解可能ではない表現が与えられる場合も含めて高精度な値集合の推定を行う方法について検討を行った.まず,分母分子が不確かさを持つ変数のアフィン関数であるような関数についてFuの結果を拡張した.

次に,複素平面における多角形を定義域とする変数の正則関数については,値集合の境界は各多角形の境界(辺)を定義域とした場合の像に含まれることを明らかにした.さらに,これを用いて,不確かさを持つ変数の多重アフィン関数である関数に対してその値集合の境界を求める方法を提案した.2.制御系設計のためのCADシステムロバスト仕様を満たすPID制御器,位相進み・位相遅れ要素,2自由度PID制御器の設計を行うためのCADシステムの開発を行った.本システムは,多角形区間演算を用いて値集合の推定を行うことにより実パラメータの変動を取り扱えることと,多角形の演算(和集合,共通部分,差集合の計算)を用いることにより与えられた仕様を満たす制御器のパラメータの許容領域を計算できることに特長がある.許容領域自体を求めることができるので,常に大域的最適解をもとめることができ,これは,2自由度制御系の設計において特に有効である.3.非線形システムの安定解析従来ルーリェムの安定性は,非線形部分のみがセクター条件で与えられる不確かさを持つという設定で解析されてきたが,本研究では,線形部分にも不確かさを含む場合の安定解析を多角形区間演算を併用して行った.
急性肺障害における活性酸素の関与および統発性肺線維症に関する研究

成人呼吸窮迫症候群(Adult Respiratory Distress Syndrome,ARDS)で死亡した患者の肺では肺構造の著明な破壊と線維化が観察される。その発症の機序として活性酸素が重要な役割を演ずると言われ、ARDSのモデルのひとつであるブレオマイシン(BLM)肺障害の発生にも関与すると考えられている。今回の研究ではBLMによる急性肺障害および肺線維症に対する抗酸化酵素の影響について検討した。ラットを用い前処置としてポリエチレングリコール結合型カタラーゼ(CAT)を気管内投与した群(CAT群)及び生理食塩水を投与した群(対照群)を設定した。上記投与15分後両群とも1単位のBLMを気管内へ投与し、BLM処置後1,3,7,14日に経時的に屠殺し、肺障害の指標として血液ガス、気管支肺胞洗浄(BAL)液成分の検討、肺組織中のヒドロキシフロリン(OIIーPr)含量などを測定した。CAT群では処置後1日目においてBAL液中のCAT活性が有意な高値を示し、動脈血酸素分圧も1および7日において対照群に比して高めであった。一方、組織過酸化の指標である過酸化脂質は両群とも7日まで増加傾向をみるものの、CAT群では以後の増加は抑制された。しかしながら、肺組織OII-Pr含量については両群間に有意差を認めなかったが、14日では対照群で高い傾向がみられた。BLM肺障害には活性酸素が関与していると言われるが、CAT群において血液ガスの悪化の防止、脂質過酸化の抑制、肺組織線維化の抑制傾向が観察されたことは、抗酸化酵素のBLM肺障害に対する軽減効果を示唆するものかも知れない。成人呼吸窮迫症候群の発生機序として活性酸素の関与が報告され,また肺障害が進行すると肺線維症へと発展することが知られている.これまで肺線維症のモデルとしてブレオマイシン(BLM)が用いられてきたが,BLMによる初期障害に活性酸素が関与する可能性を考え, 1.抗酸化酵素であるカタラーゼ(CAT)やスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)はBLMによる初期の肺障害を軽減ないし防止するか?2.さらに線維症の発展が修飾されるか?の2点を目的とした.本年度は主として1の点につき検討する予定であったが,当初予定していたリポゾーム包含抗酸化酵素の入手が困難となり,市販のポリエチレングリコール(PEG)結合型抗酸化酵素を購入せざるを得なくなった.PEGーSODに関しては未だ入手出来ていないため,これまでのところPEGーCATについてのみ検討してきた.1)PEGーCAT気管内注入による肺抗酸化酵素の変化:肺組織中のCAT活性は投与後1, 3, 7, 14, 28日においてそれぞれ平均35.0, 40.7, 20.1, 18.7, 14.8U/g肺であり,非投与動物における活性が15U/g肺前後であることより,投与後3日まで高い活性の保たれている事が明らかになった.2)急性期障害への影響:急性期死亡に関してはBLMのみおよびBLM+CAT両群に差を認めなかった.しかしながら,麻酔下でのPaO2をみると1ー3日ではCAT投与群においてのPaO2が67.4ー75.9torrに対し, BLMのみの群においては25.9ー60.8torr低値を示し, CATが肺障害の程度を軽減している可能性がうかがえた.しかしながら同時期におこなった気管支肺胞洗浄では上清中の蛋白濃度および細胞数において両群間に差を認めずCATが肺水腫を軽減したとは言い難い.肺線維化の指標としてのヒドロキシプロリンについては現在測定中である.ブレオマイシン(BLM)肺障害の発症機作として活性酸素の関与が報告されている。昭和62年度において、前もって抗酸化酵素であるカタラーゼ(CAT)を気管内に投与しておくとBLMによる血液ガスの悪化が軽減されることを観察してきた。

本年度は気管支肺胞洗浄(BAL)を行い、細胞成分およびBAL液蛋白濃度の変化(急性期炎症)、肺組織過酸化脂質含量(活性酸素による組織過酸化の指標)、肺内ハイドロオキシプロリン(OHーPr)含量の変化(線維化の指標)について検討してきた。当初、抗酸化酵素としてCATのほかスーパーオキシドジスムターゼの投与を考慮していたが、供給がうまく行かなかったため、CAT(ポリエチレングリコール結合型)のみの検討となった。BLM投与の影響は、PaO2の低下、BAL細胞数の著増(多形核白血球が有意)、BAL液蛋白濃度の上昇に見られたが、CAT前処置によってBAL所見には影響がみられなかったもののPaO2の低下は軽減された。CAT活性はBAL液において処置後1日で検出されたが、以後、CAT非投与ラットと同じくほとんど検出されなかった。また肺組織ホモゲネートにおいても投与、非投与両群間に差は認めなかった。しかしながら、BLMによる過酸化脂質の蓄積は14日目においてCATによって抑制され、肺OHーPr含量も少ない傾向にあった。CATの気管内前投与によりBLM肺障害が抑制される可能性を示唆したが、CAT活性の低下が早期に起こっているにも拘らず、これらの抑制効果が認められたことについてはさらに検討を要する。
アパタイトをナノセラミックエアロゾルで置換する新しい歯面コーティングの基礎的研究

本研究では、セラミックナノ粒子の常温衝撃固化現象を実用化したエアロゾルデポジション法に着目し、ハイドロキシアパタイト表面へセラミック薄膜コーティングを行うことで、歯面の耐酸性向上を目指すことを目的としている。エアロゾルデポジション法は、1997年に産業技術総合研究所で開発された技術である。エアロゾルデポジション法によって形成されたアルミナ膜は緻密で、強度的にも透明性にも優れ、他のコーティング法よりも厚い数ミクロンから数百ミクロンのコーティングが可能といった特徴がある。実験は企業の協力を得て行った。エアロゾルデポジション装置のチャンバー内に板状の人工ハイドロキシアパタイト試料を置き、さらにこの装置の別の部分でサブミクロンサイズのアルミナ微粒子に振動を与えて煙状のエアロゾルを発生させた。そしてこのエアロゾルをノズルから一定圧で噴射してターゲットのハイドロキシアパタイト試料表面に当てた。その結果全く加熱することなく、無色透明なアルミナ膜が試料表面に形成され、表面粗さ形状測定機で測定した膜厚は7-10ミクロンであった。また、マイクロビッカース硬度計を用いて、コーティングの前後で試料表面の硬度を測定した結果、コーティング前のハイドロキシアパタイト表面はHv724-784 (平均758)、一方アルミナコーティング後はHv817-849(平均827)であり、有意水準5%で両平均値間に有意差が認められ、エアロゾルデポジションによってハイドロキシアパタイトの表面が改質されていることが示された。交付申請書に記載したハイドロキシアパタイト表面へセラミック薄膜コーティングを行うという研究目的で、研究実施計画に沿ってエアロゾルデポジション法を用いた人工ハイドロキシアパタイト試料へのコーティング実験を行い、形成されたアルミナ膜の厚さや表面硬度を評価した結果、次年度の実験につながる知見が得られたから。交付申請書に記載した研究実施計画に基づき、人工ハイドロキシアパタイト上にコーティングされたアルミナ膜の走査型電子顕微鏡による形態学的観察を行う。さらに全研究期間に得られたデータをまとめて、本研究の総括を行う予定である。歯はハイドロキシアパタイトが主成分であり、酸に侵されやすく、従来の予防法だけではウ蝕の発生を完全には防ぐことができない。そこで本研究では、セラミックナノ粒子の常温衝撃固化現象を実用化したエアロゾルデポジション法に着目し、ハイドロキシアパタイト表面へセラミック薄膜コーティングを行うことで、歯面の耐酸性向上を目指すことを目的としている。エアロゾルデポジション法によって形成されたアルミナ膜は緻密で、強度的にも透明性にも優れ、他のコーティング法よりも厚い数ミクロンから数百ミクロンの製膜が可能といった特徴がある。歯質構成成分に対するセラミックコーティングは前例がなく、セラミックスを利用した新しい歯冠修復法開発の第一歩と位置づけられる。本研究では、コーティングするターゲットとして人工ハイドロキシアパタイト製の板状試験片を使用し、企業の協力を得て、アルミナ微粒子を使ったコーティングを試みた。エアロゾルデポジション専用の装置のチャンバー内にハイドロキシアパタイト試料を置き、一方でサブミクロンのアルミナ微粒子に振動を与えて煙状のエアロゾルを発生させ、このエアロゾルをノズルから一定圧で噴射してターゲットのハイドロキシアパタイト試料に当てた。その結果全く加熱することなく、無色透明なアルミナ膜を試料表面に形成できることがわかった。交付申請書に記載したハイドロキシアパタイト表面へセラミック薄膜コーティングを行うという研究目的で、研究実施計画に沿ってエアロゾルデポジション法を用いた人工ハイドロキシアパタイト試験片への製膜実験を行った結果、次年度のセラミック膜の評価研究につながる知見が得られたから。

交付申請書に記載した研究実施計画に基づいて、人工ハイドロキシアパタイト上にコーティングされたセラミック膜の硬度や耐酸性などを評価する。必要な場合は、ハイドロキシアパタイト表面へセラミック薄膜コーティングを行うことで、歯面の耐酸性向上を目指すという研究目的を逸脱しないよう配慮しつつ、確実に行える評価方法を優先的に行うなど実験方法を適宜修正して、今後の研究を推進する。交付申請書に記載した研究実施計画に基づき、人工ハイドロキシアパタイト上にコーティングされたアルミナ膜の走査型電子顕微鏡による形態学的観察を行う。さらに全研究期間に得られたデータをまとめて、本研究の総括を行う予定である。物品の値引きによって、次年度以降使用可能な金額が生じた。セラミックコーティングの実験に必要な器具や試薬の購入に充てる予定。セラミックコーティングの実験的評価に必要な器具や材料の購入に充てる予定。
神経膠腫におけるαB-クリスタリン発現の亢進の意義と癌遺伝子との関係

本研究は神経膠腫におけるαB-クリスタリンの発現亢進が腫瘍の生物学的特性とどのような関係があるかを検討し、種々の神経疾患におけるグリア細胞の反応機構と比較検討する事を目的としている。αB-クリスタリンは低分子量熱ショック蛋白質(HSP27)とアミノ酸配列の相同性が高く水晶体以外ではストレス蛋白質として働いている可能性がある。そこで、グリア系の培養細胞を用いて種々のストレス状態におけるαB-クリスタリンの発現調節を検索した。その結果グリア細胞においてαB-クリスタリンの発現が熱ショックや過酸化水素水を用いたoxidative stressによって誘導を受けることを見いだした。ついでαB-クリスタリン蛋白質の神経系における機能について検討するためにグリオーマ細胞に遺伝子導入を行ない、発現レベルの異なるモデルを作成してその機能解析を進めた。この実験では構成的に発現を変化させる目的で、ラウス肉腫ウイルスのプロモーターの下流にαB-クリスタリンのcDNAを正方向ないし逆方向に連結したものをグリオーマ細胞(C6,U-373MG)に導入し、αB-クリスタリンの高発現系および発現抑制系を作成した。αB-クリスタリンの発現を抑制すると細胞は小型で細長くなり、ストレスファイバーの減少ないし消失をきたし、細胞の基質への接着性が低下した。逆にαB-クリスタリンの増加はグリオーマ細胞に熱ショックへの耐性獲得に寄与することが分かった。以上の結果よりαB-クリスタリンはグリオーマにおいて細胞骨格構造の安定化に関与し、種々のストレス耐性の担い手となっていることが示唆された。最後にHSP27に対する抗体を用いた免疫染色にて、HSP27はグリオーマ細胞以外にも神経芽細胞腫株など、より広い種類の細胞に発現がみられ、ローゼンタール線維にもHSP27が含まれていた。本研究は神経膠腫におけるαB-クリスタリンの発現亢進が腫瘍の生物学特性とどのような関係があるかを検討し,種々の神経疾患におけるグリア細胞の反応機構と比較検討する事を目的としている。αB-クリスタリンの免疫組織化学染色で,脳腫瘍では主にグリオーマに発現がみられ,退形成が進んだものにその発現が亢進している細胞が多くみられた。αB-クリスタリンの機能面として,主に培養細胞を用いた実験から,この蛋白質が低分子量熱ショック蛋白質に属することを示す以下のデータを得た。1)C6グリオーマ細胞において,熱ショックや過酸化水素水を用いたoxidative stressによって発現が誘導された。2)αB-クリスタリン遺伝子の5^1上流に2箇所,熱ショック調節配列がみられた。3)αB-クリスタリンはHSP27と同様に熱ショック等により速やかに不溶性分画へと移行するものがみられた。4)通常の培養条件下ではびまん性に細胞質内に分布しているαB-クリスタリンが,ストレス状態下で急速に分布を変え,不均一に凝集していることを見い出した。5)v-mosをグリオーマ細胞に強制発現させるとαB-クリスタリンの発現が増大してくることがNarthern blottingによって示唆された。6)グリオーマ細胞株にαB-クリスタリン遺伝子を導入し,その発現量を変えた種々の細胞株を得た。C6グリオーマ細胞株を用いた実験でαB-クリスタリンの発現量が多い細胞株に熱ショックに対する耐性が増強している傾向がみられた。ついで,αB-クリスタリンと比較する目的でHSP27に対する抗体を作製し,これを用いた免疫染色で,以下の結果を得た。1)HSP27はグリオーマ細胞以外にも神経芽細胞腫株などより広い種類の細胞に発現がみられた。

3)ローゼンタール線維にはHSP27も含まれていた。私達はアストロサイトの細胞質内封入体であるローゼンタール線維の主要成分が水晶体蛋白質alphaB-クリスタリンであることを同定した。alphaB-クリスタリンは正常脳組織では発現量は少ないが、種々の疾患脳で反応性グリアや一部のニューロンに蓄積がみられ、アストロサイト由来の腫瘍細胞には高率に発現している。本研究は神経膠腫におけるalphaB-クリスタリンの発現亢進が腫瘍の生物学的特性とどのような関係があるかを検討し、種々の神経疾患におけるグリア細胞の反応機構と比較検討する事を目的としている。本年度はalphaB-クリスタリン蛋白質の神経系における機能について検討するためにグリオーマ細胞に遺伝子導入を行ない、発現レベルの異なるモデルを作成してその機能解析を進めた。この実験では構成的に発現を変化させる目的で、ラウス肉腫ウイルスのプロモーターの下流にalphaB-クリスタリンのcDNAを正方向ないし逆方向に連結したものをグリオーマ細胞(C6,U-373MG)に導入し、alphaB-クリスタリンの高発現系および発現抑制系を作成した。alphaB-クリスタリンの発現を抑制すると細胞は小型で細長くなり、ストレスファイバーの減少ないし消失をきたし、細胞の基質への接着性が低下した。逆にalphaB-クリスタリンの増加はグリオーマ細胞に熱ショックへの耐性獲得に寄与することが分かった。以上の結果よりalphaB-クリスタリンは、グリオーマにおいて細胞骨格構造の安定化に関与し、種々のストレス耐性の担い手となっていることが示唆された。
新規アポトーシス誘導因子を応用した悪性腫瘍に対する治療法の開発

白血病株細胞HL-60のPMA刺激下の培養上清20Lから、各クロマトグラフィーを用いて3種類の新規アポトーシス誘導因子を精製した。その中で、内皮細胞由来インターロイキン8は、単球由来インターロイキン8に活性がないことから、N末端の5ペプチドのみでもアポトーシス活性があることがわかった。マウスに担癌として白血病細胞移植ヌードマウスでも、細胞死を誘導し、抗腫瘍活性が認められた。悪性リンパ腫由来細胞株でも同様に活性を認めた。これはぺプチドでも同様に活性が認められた。またこの系の細胞死誘導系における耐性機序を検討したところ、N末端のペプチドを切断する酵素のひとつである、アミノペプチダーゼN(CD13)が、重要である事を示した。すなわち急性前骨髄球性白血病株細胞NB4では完全に耐性であった。CD13遺伝子を導入した白血病株細胞は、内皮細胞由来インターロイキン8による細胞死の誘導は耐性となった。またこの酵素の阻害剤であるubenimexを添加すると、この耐性は克服できる事が示された。次に精製した蛋白として、b2-ミクログロブリンがある。25ng/ml以上で、細胞死を誘導し、HLA分子との相互作用とは別の経路の細胞死があることを証明した。さらに3番目の蛋白として、補体ファクターBbフラグメントがある。これはCD11cという補体に対する受容体のひとつを介して細胞死となる経路を見い出した。白血病細胞の細胞死に少なくとも、Fas,TNF系以外に経路がある事を示した。現在ex vivo purgingとして、体外での腫瘍細胞除去への応用に向けて、基礎的検討を加えている。新規アポトーシス誘導因子である内皮細胞由来インターロイキン8(以下IL-8Eと略す)の作用機序について研究した。まずIL-8EがPDBuで分化誘導した白血病株細胞HL-60において誘導されることを抗体を用いて示した。また同様に血管内皮細胞においてもTNFα,IL-1,LPSによって、または白血病細胞と共培養することによって、IL-8Eの放出が誘導された。これによってアポトーシスが誘導されることがわかった。これはIL-8Eに対する抗体により阻止された。白血病胞だけでなく悪性リンパ腫由来細胞にもアポトーシスを誘導した。ヌードマウスに白血病株細K562を皮下または腹腔内に移植し、白血病モデルをまず作成し、これにIL-8Eを投与すると、アポトーシスを誘導するだけでなく、抗腫瘍効果を示した。単球由来IL-8(以下IL-8M)にはその作用を全く認めないことから、その違いはN末端5残基のアミノ酸配列が重要と考えられた。5残基のみのアミノ酸ペプチドを合成して、同様に投与したところ、アポトーシス誘導、抗腫瘍効果が認められた。現在5残基のうちのどこまで活性の保持に必要かを明らかにするために配列を変更して合成したもので検討中である。またYeast Two Hybrid Systemを用いて5残基ペプチド及びIL-8Eに結合する蛋白の遺伝子クローニングを試みている。これらの研究成果について発表した。(1)内皮細胞によるがん細胞のアポトーシスの機序活性化した血管内皮細胞が白血病細胞と共培養するとアポトーシスをきたすことを示した。またマウスにおいて担がん状態を作成し、腹腔内および皮下腫瘍に対してアポトーシス誘導による抗腫瘍効果を示した。これまでに報告されたTNF,Fasの系は介さずに生じることを示した。抗腫瘍化学療法剤エトポシドとの併用でも増強効果が認められた。血管内皮細胞において、内皮型インターロイキン8遺伝子の発現は、TNF,IL-1αによって調節されていることを示した。

インターロイキン8の分解については、アミノペプチダーゼのひとつであるCD13が関与しており、CD13遺伝子導入した白血病細胞を用いて、アポトーシスを検討したところ、酵素活性の増強によりアポトーシスは抑制された。またアミノペプチダーゼ阻害剤によって解除された。CD13が始めから強く発現している白血病細胞では内皮細胞由来インターロイキン8に抵抗性を示したが、アミノペプチダーゼ阻害剤によって解除され、細胞死が誘導できた。今後の治療に有用な所見である。(2)内皮型インターロイキン8の活性部分の同定N末端5ペプチドによってアポトーシス誘導及び抗腫瘍効果を担癌マウスでも示した。活性部分を同定するために合成ペプチドによる研究では、そのうち4残基があれば、アポトーシス誘導活性があることを示した。現在このペプチドの活性についての機構を解析するために結合蛋白の遺伝子クローニングを行っている。(3)b2-ミクログロブリンによるアポトーシスの解析2番目に精製した蛋白は、N末端のアミノ酸配列の結果b2-ミクログロブリンであった。HLA分子に対する抗体によって誘導される系が報告されていたが、この分子によってHLA非特異的に細胞死が誘導されることがわかった。現在マウスにおいて担癌状態を作成して抗腫瘍効果を検討中である。さらに結合蛋白の解析を行っている。(4)補体蛋白ファクターBbによるアポトーシス3番目に精製された蛋白は、ファクターBのフラグメントBbであった。この系では種々の補体受容体のうちCD11cが最も関係していると考えられた。現在これらの蛋白の発現及び白血病の型及び治療に対する反応を検討中である。白血病株細胞HL-60のPMA刺激下の培養上清20Lから、各クロマトグラフィーを用いて3種類の新規アポトーシス誘導因子を精製した。その中で、内皮細胞由来インターロイキン8は、単球由来インターロイキン8に活性がないことから、N末端の5ペプチドのみでもアポトーシス活性があることがわかった。マウスに担癌として白血病細胞移植ヌードマウスでも、細胞死を誘導し、抗腫瘍活性が認められた。悪性リンパ腫由来細胞株でも同様に活性を認めた。これはペプチドでも同様に活性が認められた。またこの系の細胞死誘導系における耐性機序を検討したところ、N末端のペプチドを切断する酵素のひとつである、アミノペプチダーゼN(CD13)が、重要である事を示した。すなわち急性前骨髄球性白血病株細胞NB4では完全に耐性であった。CD13遺伝子を導入した白血病株細胞は、内皮細胞由来インターロイキン8による細胞死の誘導は耐性となった。またこの酵素の阻害剤であるubenimexを添加すると、この耐性は克服できる事が示された。次に精製した蛋白として、b2-ミクログロブリンがある。25ng/ml以上で、細胞死を誘導し、HLA分子との相互作用とは別の経路の細胞死があることを証明した。さらに3番目の蛋白として、補体ファクターBbフラグメントがある。これはCD11cという補体に対する受容体のひとつを介して細胞死となる経路を見い出した。白血病細胞の細胞死に少なくとも、Fas,TNF系以外に経路がある事を示した。
膵β細胞増殖・分化における消化管ホルモンIBCAPの役割の解明

我々は新規消化管ホルモン因子Betagenin = IBCAPを同定し解析を行ってきた。今回、Betageninの分泌産物の構造解析を進め、得られた情報から合成ペプチドを作製し、その活性を評価した。その結果、Betagenin合成ペプチドにおいても膵β細胞増殖促進作用を持つ事を強く示唆する結果を得た。さらに、iPS細胞から膵β細胞への分化誘導の際にBetageninを添加すると効率を高めることから、Betageninは膵β細胞の分化、再生にも有用である可能性が強く示唆された。我々はこれまでに、未知の消化管ホルモンを探索し新規消化管特異的分泌タンパク遺伝子Betagenin = IBCAPを同定し、その解析を進めてきた。これまでにBetageninが膵β細胞の増殖刺激作用を持つこと、また、Tg/KOマウスの解析からBetageninが膵ラ氏島の量を決める重要な因子であることを明らかにしており、Betageninを標的とした創薬は糖尿病に対する根源的治療薬となる可能性が期待される。また、Betageninはこれまでに明らかにされている他の消化管ホルモンとは有意な相同性を持たない。本研究では、このBetageninによる膵β細胞増殖・分化誘導に関わる分子メカニズムを明らかにし、膵臓・膵β細胞再生医療への臨床応用へ向けた分子基盤の解明を目的とした。今回、Betageninの分泌産物の構造解析を進め、得られた情報から合成ペプチドを作成し、その活性を評価した。その結果、Betagenin合成ペプチドは、in vitroで膵β細胞に対する増殖刺激作用を持ち、さらにインスリン分泌能を促進する作用を併せ持つことが今回、明らかになった。また、iPS細胞にBetageninを添加すると膵β細胞への分化誘導効率を高めることを見出しており、Betageninは膵β細胞の分化、再生にも有用である可能性が強く示唆された。以上より、Betageninは膵β細胞増加作用、インスリン分泌促進作用および膵β細胞への分化促進作用と併せて糖尿病に対する根源的治療薬となる可能性が示唆された。今後さらなる検討が必要ではあるが、膵β細胞の移植や再生医療も含め、糖尿病治療への応用が期待される。まず、Betagenin遺伝子産物は切断されて分泌および活性化される可能性を示唆するデータを得たため、今回、Betageninの分泌産物の構造解析を進め、得られた情報から合成ペプチドを作製しその活性を評価した。その結果、Betageninの分泌産物であると考えられる合成ペプチドにおいても、in vivo、in vitroの両面で膵β細胞増殖促進作用を持つ事を強く示唆する結果を得た。さらに、iPS細胞から膵β細胞への分化誘導の際にBetagenin合成ペプチドを添加すると効率を高めることから、Betageninは膵β細胞の分化、再生にも有用である可能性が強く示唆された。Betageninはこれまでに明らかにされている他の消化管ホルモンとは有意な相同性を持たないため、今後更なる検討を加えることで、新しい糖尿病治療への応用が期待される。活性体ペプチドの解析に成功し、合成ペプチドの効果も期待される結果が出てきているため。代謝内分泌学H27年度は、この合成ペプチドを用いて、膵β細胞増殖メカニズムの解明を目指して解析を行う。また、iPS細胞から膵β細胞への分化誘導において、Betagenin合成ペプチドの効果や有用性を詳細に検討する。具体的には、iPS細胞あるいは膵前駆細胞からの膵β細胞への分化誘導において、Betageninペプチドをどのタイミングで添加する、あるいは、どのように用いれば最も効率化を図ることが出来るかについて、既存の方法と比較し検討する。
プロトプラスト再生系を用いたCandida細胞壁の電子顕微鏡学的解析

Candida albicansは日和見病原真菌として医学的に重要な位置を占める二形性真菌である。真菌細胞を覆う細胞壁は細胞形態を規定する骨格構造であると同時に、その成分は種々の生理活性を有し、宿主との免疫応答に重要な役割を果たしている。Candida細胞壁はβ-グルカン、キチンおよびマンナンからなる多糖が主成分であり、それが複雑に組み合わさって強固な構造を作り上げている。壁多糖に関する生化学的および血清学的解析は広く行われているが、多糖の局在性についての知見は少ない。我々はC.albicansプロトプラストの再生系を用いて、壁の再生過程を微細形態学的に検討し、さらにβ-1,3グルカン、キチンおよびマンナンの局在性を免疫およびレクチン電顕法で解析した。細胞壁の再生過程を観察すると、再生初期にプロトプラスト膜の一部から微細繊維が形成され、再生が進むと繊維は伸長、集合し網目構造を形成した。再生後期には網目構造の電子密度が増し、intact cellと同様の構造を示す厚い壁構造が形成された。壁多糖の分布をみると、マンナンはプロトプラスト膜にすでに存在し、また再生初期形成される繊維構造がβ-1,3グルカンおよびキチンから構成されていることが明らかになった。続くグルカンおよびキチン繊維の網目構造形成に伴い、マンナンが網目の間を埋めて高電子密度の壁構造が作られ、最終的にマンナンが細胞壁最外層を覆って、細胞壁の再生が完了することが明らかになった。真菌細胞を覆う細胞壁は細胞形態に規定する骨格構造であると同時に、その成分は種々の生理活性を有し、宿主との免疫応答に重要な役割を果している。細胞壁の構造解析は医学、生物学的に重要な研究課題の一つであると考えられる。しかし、C. albicansの細胞壁は複雑に構築れているためwhole cellを用いて壁多糖の局在性を調べるには限界があった。我々はC. albicansプロトプラストの完全再生糸を確立し、壁の再生過程を電子顕微鏡学的に明らかにした。本研究ではC. albicansプロトプラスト再生系を用いて、β-1, 3グルカンおよびキチンの分布を明らかにした。すなわち、β-1, 3グルカンの局在性はβ-1, 3グルカン構造を有する抗腫瘍剤Schizophyllanに対するモノクローナル抗体SPG1-HSと金コロイドを用いた免疫電顕法で、キチンの分布は金コロイドを標識した小麦胚芽凝集素(WGA)を用いるレクチン法で検討した。その結果、(1)調整したプロトプラストにはβ-1, 3グルカンおよびキチンの存在が認められなかった。(2)再生初期に形成されるmicrofibril構造に一致して免疫電顕、レクチン電顕法いずれでも金コロイドの標識が認められた。(3)再生後期に形成された高電子密度の壁構造には免疫電顕、レクチン電顕法いずれでも金コロイドの標識が認められなかった。以上の結果から、再生初期に形成されるmicrofibril構造はβ-1, 3グルカンおよびキチンのcomplexであること、また再生後期に形成された壁構造表面にはβ-1, 3グルカンおよびキチンは露出していない、すなわち他の成分、おそらくマンナンで覆われていることが示唆された。C.albicans細胞壁の主成分はβ-グルカン、キチンおよびマンナンであり、これらが複雑に組み合わさって強固な構造を作り上げている。細胞壁多糖に関する化学的および血清学的解析は広く行われているが、多糖の局在性についての知見は少ない。

我々はC.albicansプロトプラストの再生系を用いて、壁の再生過程を微細形態学的に解析してきた。本研究ではC.albicansプロトプラストの再生系を用いて、細胞壁主要多糖であるβ-1,3グルカン,キチンおよびマンナンの分布について、免疫細胞化学的手法を用いて、電顕レベルで解析することを目的とした。平成7年度には、プロトプラスト再生初期に形成される繊維構造がβ-1,3グルカンおよびキチンで構成されていることを明らかにした。平成8年度は、Rabbit Anti-Candida albicans mannanおよび金コロイドを用いた免疫電顕法で、再生プロトプラストのマンナンの局在性を検討した。その結果、プロトプラスト膜から細胞壁が再生される過程においては、まずグルカンおよびキチンの繊維が形成され、同時にマンナンが細胞膜の外側に堆積すること、続くグルカンおよびキチン繊維の網目構造形成に伴い、マンナンが網目の間を埋めて高電子密度の壁構造が作られ、最終的にマンナンが細胞壁最外層を覆って、細胞壁の再生が完了することが明らかになった。
多元的相互作用を有するジイミン白金錯体による有機-無機複合電子系の構築

1.多重相互作用系白金錯体における希薄な環境下での集積発光と集積状態の解明,制御.多重相互作用系錯体、ジシアノ(ビイソキノリン)白金(II)において,希薄な状態においても,錯体が集積して生じる特異な発光を観測した。集積挙動と集積発光状態を解明するために,対応するビピリジン錯体と比較しながら,詳細な分光学的検討を行った。2.複合スタック系の構築と選別集積機能開発.平面性のジイミン配位子と非平面型配位子のエチレンジアミンの両方を含む系白金錯体は,白金間の相互作用が不利になるかわりに,フリーのフェナントロリンを優先的に取り込んで1:1交互スタックを形成することを見出した。一連の複合結晶のX線構造解析の結果、フェナントレン骨格が、交互スタック形成にちょうどよいサイズであり,このことが選別集積が起こる最大の要因であることが結論づけられた。3.直鎖構造系ジイミン白金錯体におけるベイポクロミズム.ジシアノ(ビピリジン)白金(II)の赤色結晶は,白金直鎖構造を持ち,室温でも強い赤色の発光を示す。この結晶が空気中の水分子に鋭敏に感応して起こる赤色【double arrow】黄色の変化を観測し、X線構造解析と発光測定からベイポクロミズムのメカニズムを解明した。4.歪んだπ共役系を持つ(ジイミン)白金(II)錯体の発光変化.配位立体障害を持つ高歪み錯体、ジクロロビキノリン白金(II)やビス(ジイミン)白金(II)錯体を合成し、構造と発光特性について検討した。その結果、π共役配位子が異常に歪んだ特異な構造が見い出されるとともに、発光スペクトルの低エネルギー化を観測し、歪みの効果を明らかにした。1.有機-無機複合結晶のデザイン合成.芳香環が配位窒素原子側に張り出しているため,配位の際に必然的に立体障害を生じ,弱い配位結合や歪みの効果による発光状態のチューニングが期待できる2,2'-ビキノリン(biq)を用いて,新規白金錯体とその複合結晶の合成に成功した。X線結晶解析の結果,単離した結晶中では,二つの[PtCl_2(biq)]が非配位のtrans-biqをサンドイッチした2:1組成の複合体を形成していることが見いだされた。非配位のbiqは良い平面構造をとっているが,錯体中のbiqは大きく彎曲しており,配位の異常性を示している。グラス性溶液の発光測定の結果,非配位のbiqと錯体の両方からの発光が観測された。[PtCl_2(biq)]の発光は,対応する[PtCl_2(i-biq)](i-biq=3,3'-ビイソキノリン)の発光とくらべて2300cm^<-1>も低エネルギーに現れ,構造の歪みとの関連を引続き探究中である。2.分子選別取込み機能の評価.平面性のジイミン配位子と非平面型配位子のエチレンジアミン(en)の両方を含む系白金錯体,[Pt(en)(L)]^<2+>(L=phen,bpy)は,白金間の相互作用が不利になるかわりに,中性のフリーphenを優先的に取り込んで1:1交互スタックを形成することを見出した。選択的交互スタック形成に対するサイズやヘテロ原子の効果を調べる為に,種々の芳香属化合物を用いて有機-無機複合結晶形成能を調べた。その結果,約20種の複合結晶を得,そのうち10種の単結晶X線構造解析に成功した。

それらの構造の比較から,[Pt(en)(L)]^<2+>に対しては,フェナントレン骨格が,交互スタック形成にちょうどよいサイズであり,このことが選別集積が起こる最大の要因であることが結論づけられた。これらの複合結晶の発光挙動から,複合体の分子間で容易なエネルギー移動が起っていることが認められた。1.多重相互作用系の構築と発光状態のチューニング.ジシアノビピリジン白金(II)の赤色結晶(Red Form)は,白金直鎖構造を持ち,室温でも強い赤色の発光を示す。本研究で、この結晶が空気中の水分子に鋭敏に感応して起こる赤色【double arrow】黄色の変化、"vapochromism"を観測し、X線構造解析と発光測定からそのメカニズムを解明した。すなわち、Red Formは空気中の水分子を取り込んで黄色結晶(Yellow Form)に変化し、また、乾燥空気中や有機溶媒雰囲気下では、逆にYellow FormはRed Formに変化する。今回、新たに不安定なYellow Formの構造決定に成功した。その結果、Yellow Formのスタッキング構造は、はじめに予想されたような白金間距離が伸びた構造ではなく、横ずれをしたジクザク構造であることがわかった。空気中の水分子を取り込んで、CN^-と水素結合を形成することによりスタッキングの歪みが起こり、発光変化をもたらすことが明らかとなった。2.歪んだπ共役系を持つ(ジイミン)白金(II)錯体の発光変化.昨年合成に成功した配位立体障害を持つ錯体、ジクロロビキノリン白金(II)やビス(ジイミン)白金(II)錯体の構造と発光特性について引き続き検討した。その結果、[PtCl_2(biq)](PF_6)_2結晶の構造解析にも成功したが、やはりπ共役配位子が異常に歪んだ特異な構造が見い出された。対応する錯体より低エネルギーに現れる発光は歪みにより低エネルギー化したMLCT状態の影響を強く受けていると考えられる。
末梢神経損傷後の再生過程における発現分子の経時的変化の解析および導入〜再生修復時に発現誘導される既知,未知の分子定量および臨床応用の検討を中心に〜

本研究では、まず末梢神経損傷後の神経細胞における遺伝子発現状態について、RLCS法を用い経時的に観察した。ラット坐骨神経に厚挫損傷を加えた後、1,3,5,7日目の脊髄前角領域を採取しRLCSプロファイルを作製後、未処理ラット脊髄前角領域のRLCSプロファイルと比較検討した。全1991種の遺伝子に対し、37種の遺伝子が変動していた。変動率は1.9%であった。これら37種の遺伝子の経時的変動パターンは23種類に分類された。これらのパターンは、「持続性発現亢進パターン」「一過性発現亢進パターン」「発現低下パターン」の3種類に大別された。発現変動する遺伝子のうち約6割が一過性に発現誘導されるものであり、このことは末梢神経損傷後、神経細胞で神経再生分子機構が複雑に制御されることを反映するものと考えた。さらに発現変動する遺伝子のクローニングとその塩基配列の決定を試み、一過性に発現変動する遺伝子としてurideine kinase遺伝子ラットホモログを同定した。今回、末梢神経損傷後7日目にこの遺伝子の発現が誘導されることを初めて見いだした。本研究では,まず第1に末梢神経損傷時における神経栄養因子受容体の発現を経時的に検索した。ラットの坐骨神経を圧挫損傷し1,3,7,14日目に4%パラフォルムアルデヒドで固定した。坐骨神経,L4,5レベルの後根神経節,脊髄を摘出し,各神経栄養因子受容体の分布を免疫組織化学的染色法を用いて検討した。その結果NGF受容体であるTrk Aは損傷坐骨神経のシュワン細胞だけでなく脊髄神経の前角細胞周囲の神経膠細胞に発現しており,末梢神経損傷時における中枢神経系の重要性が明らかとなった。またBDNF受容体であるTrk Bは主に運動神経に分布し,損傷後3日目から7日目にかけて強く発現していることが確認できた。次に神経損傷前後での遺伝子発現の経時的変化を比較検討するために,同様にラット坐骨神経に圧挫損傷を加えた後,1,3,5,7日目のRLCSプロファイルを作製した。千数百の遺伝子に対しスクリーニングを行い,変動する遺伝子を検索した。その結果,変動する遺伝子は30個存在していた。またその数は,神経損傷後5日目に最も多い事が明らかとなった。変動していた遺伝子のうち4個の遺伝子のクローニングとその塩基配列を決定したところ,そのうち3個はcathepsin S,mithochondrial phosphate symporter,uridine monophosphate kinaseであった。これらの遺伝子と神経再生機構との関連についてこれまで報告はなく,新たな知見が得られた。また残りの1つは新規遺伝子であり,この遺伝子機能解析を実験計画に沿って進めていくと共に残りの発現変動する遺伝子のクローニングを行う予定である。以上のように本研究では末梢神経再生修復時に発現誘導される既知,未知の分子定量を行っている。ラット坐骨神経に圧挫損傷を加えた後、1,3,5,7日目の脊髄前角領域を採取しRLCSプロファイルを作製後、未処理ラット脊髄前角領域のRLCSプロファイルと比較検討した。発現変動する遺伝子のうち約6割が一過性に発動誘導されるものであり、このことは末梢神経損傷後、神経細胞で神経再生分子機構が複雑に制御されることを反映するものと考えた。さらに発現変動する遺伝子のクローニングとその塩基配列の決定を試み、一過性に発現変動する遺伝子としてuridine kinase遺伝子のラットホモログを同定した。