hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗癌剤の薬効評価のための癌微小環境を模倣した擬似癌組織の構築

抗体の配向制御のための化学修飾法や固体化された抗体を安定化させる因子の特定に関する基礎的検証は終了しており、特許出願を検討する段階にまで研究は進展している。また、関連する研究として、細胞分離の検証の際に必要となる細胞膜の蛍光色素によるラベリングを簡便に行えるマイクロ流路チップを開発し、論文を執筆することができた(現在投稿中)。2浮遊細胞を基板上に固定化する技術に関しては、我々がこれまで行ってきたアルブミンフィルムを用いた細胞パターニング技術の知見の蓄積もあり、迅速に当初の目標である固体化法の確立を達成することができ、積極的に学会発表を行うことができた。3擬似癌組織の構築に関しては、当初H25年度に実施することを計画していた株化細胞を用いたモデル実験を前倒しで行い、癌細胞と間質細胞から擬似癌組織を構築するための培養デザインや抗癌剤の薬効を評価する方法を確立することができた。4in vivo試験に関しては、本研究目的に適合する癌モデル動物の作製に関する情報収集を行うことができた。また、抗癌剤感性試験のキットを販売している企業との接触にも成功し、複数回の意見交換の場を持つことができた。現場のニーズを反映しつつ、実用的なin vitro抗癌剤評価法の確立を目指す体制を構築できた点において大きな意義がある。本年度は、昨年度の研究成果をもとに以下の研究を実施する。1細胞分離法の確立:癌組織を細胞レベルにまで分解した後、組織中の癌細胞と間質細胞を分離する手法を確立する。分離効率の向上を目指し、抗体の固定化法を工夫することで抗体の配向を制御し、更に昨年度見出したタンパク質安定化剤を添加することで固定化した抗体の安定化を促す。線維芽細胞やマクロファージを認識する抗体を固定化し、異なる蛍光色素で細胞膜を染色した癌細胞、癌間質線維芽細胞、マクロファージなどを用いて、細胞の分離効率を算出する。2擬似癌組織の構築と抗癌剤の薬効評価:抗癌剤の薬効評価に適した擬似癌組織を作製し、同組織を用いて抗癌剤評価を行う。癌細胞をコラーゲンゲルに包埋後、細胞接着性を制御できるアルブミンフィルムや昨年度確立した浮遊細胞の固定化法を利用して、癌細胞の周囲に癌間質線維芽細胞や血液細胞を配置することで擬似癌組織を構築する。擬似組織のデザインに関しては、昨年度の基礎的検証で既に確定している。この組織を用いて抗癌剤や抗癌剤のプロドラッグの薬効を評価する。また、アルブミンフィルムを利用して、細胞が接着できる領域を調整し、癌細胞の周囲に配置する線維芽細胞や血液細胞の位置や細胞数を変化させ、比較検討することでこれら癌組織の構成成分が癌細胞や抗癌剤の薬効に及ぼす影響を明らかにする。3癌モデル動物を用いた本抗癌剤感受性試験法の有効性の検証:癌モデル動物を作製、または、購入し、本抗癌剤感受性試験法(in vitro試験)とin vivo試験の抗癌剤評価の結果を比較することで、in vitro試験の的中率を算出し、本試験法の有効性を検証する。H24年度の予算に関して、消耗品費や外国出張旅費に関して当初の予想額を下回ったため、本年度への繰り越しとなった。経費の主要な用途は消耗品費であり、細胞培養に必要とされるピペットや培養皿などの物品、抗体やアルブミンなどのタンパク質、細胞膜に親和性を有する試薬や架橋剤などの化学試薬、実験用動物の購入のために使用する。また、研究成果を発表するための経費(国内旅費、海外旅費、学会参加費、英語論文の校閲費)や研究を円滑に進めるための実験補助員の人件費を計上している。
医療・介護・保健・年金の分野における情報化・市場化による改革の理論・実証分析

本研究では、今後の高齢化社会に向けて、医療・介護・保健・年金といった分野において、効率的な制度は如何にあるべきか、理論と実証から分析した。まず、現行制度の実証的分析を医療と介護を中心に行った。今後高齢者の医療費を引き下げると期待されているITを用いる在宅健康管理システムを取り上げ、これがどれだけの金額の経済効果を生むか推計した。実地調査を行った事例は、福島県西会津町・葛尾村、山口県三隅町、岩手県釜石市・胆沢町、兵庫県五色町などである。分析手法としてCVMを用い、在宅健康管理システムに対する需要曲線を、質問したWTPの金額と回答人数から推計し、得られた需要曲線から所望のWTPを求めた。それは、例えば、釜石市では住民一人4,519円、葛尾村では住民一人1,640円と推計された。さらに費用便益分析を用いて、上記のWTPと事業コストを比較したが、B/C比率は前者では1.07、後者では0.54となった。その他の自治体では、0.5程度であり、収益事業としては成り立っていない。さらに回帰分析により、在宅健康管理システムの費用負担のあり方が分析できた。釜石市の場合では、WTP4,519に対する自己負担は3,961円、保険(公費)負担は558円となった。現在、在宅健康管理システムの運用について介護保険の適用を求める要望が強いが、釜石市の事例では、保険から1人当たり558円を支給してもよいことになる。医療費の削減効果をもつ在宅健康管理システムは、現在は自治体によって補助金により運営されているが、得られた費用便益比率は1より小さく、その便益は費用によって回収できず、現行制度のもとでは、サービスを市場メカニズムよって供給することに関して否定的な結論が得られた。医療・保健・介護といったサービスは、今後、自治体、NPO、ボランティアといった地域での共助のシステムが必要である。医療・介護・保健・年金の分野での情報化・市場化にあたって問題となる点について基礎的分析およびデータの収集を行った。まず、これらの分野での情報化・市場化を推進するにあたって発生するとする危惧されているデジタル・デバイドについて、その容認論と是正論の両面について理論的分析を行った。同時に、識者についてのアンケート調査により、デジタル・デバイドの発生はさらなる所得格差の拡大を招く可能性が高く、市情報化・市場化の推進に平行して情報弱者に向けた政策的是正処置が必須との結論を得た。ついで、上記の分野での情報化の現状と市場化の可能性について、在宅ケアを取り上げた。地方自治体が行っている具体的な事例について実地調査を行い、事業に関わるコスト情報を収集し、同時にその事業がどれだけの経済効果を生んでいるのか、ユーザーにWTP(willingness to pay)を聞き取るアンケートから推計した。調査した岩手県釜石市や福島県葛尾村の事業では、便益がコストを上回っていることが示され、情報化の有用性と市場化の条件が満たされていることが証明された。上記の分野では、市場化による効率化を図ると同時に、NPOやボランティアといった地域住民、団体との協同(共助)が不可欠である。地域内での関係する主体間を結びつけるネットワークの構築は極めて重要である。このような分析に必要な非営利団体に関する基礎的概念の定義とそのデータ収集を行った。さらに、非営利活動の行動原理を理論的に分析し、この分野でのNPOやボランティア団体の参加を推進する必要性とその政策について分析した。昨年に引き続き、医療・介護・保健・年金の分野での情報化・市場化に当たって問題となる点について基礎的分析およびデータの収集を行った。

まず、奈良県十津川町、野迫川町において地域医療・保健の実態調査を行った。ここでは地域住民の健康増進について、病院等の施設を建設した方がよいのか、あるいは道路等の拠点の医療機関へのアクセスを改善した方がよいのか、これを分析するための基礎的データを収集した。現在そのデータを解析中である。ついで、在宅健康管理システムの経済評価を、WTP(willingness to pay)の調査を中心に行った。地方自治体が行っている具体的な事例について実地調査を行い、事業に関わるコスト情報を収集し、同時にその事業がどれだけの経済効果を生んでいるのか、アンケートから推計した。調査した岩手県釜石市、福島県西会津町、葛尾村、香川県寒川町(現さぬき市)事業について、具体的に便益とコストを計測し、B/C比率を求めた。この比較では、釜石市のB/Cが1を上回っていたが、その他の3つでは、ほぼ0.5の水準であり、事業としては採算がとれていないことが示され、事業の市場化には解決すべき課題が多いことがわかった。一連の研究成果を国際学会で発表したが、その際欧州のドイツ、英国、イタリアをはじめとする何カ国で日本と同じ在宅健康管理システムを用いて、心臓病患者の治療に応用していることが分かった。今後は、このような事業について、国際比較分析を行うことの重要性を認識した。本研究では、IT(情報技術)を用いた在宅健康管理システムを取り上げ、これがどれだけの金額の経済効果を生むか推計した。分析した事例は、(1)釜石市における在宅健康管理システム、(2)福島県葛尾村での在宅健康管理システム、(3)京都府久美浜町国保久美浜病院における遠隔放射線診療、これらの三つを取り上げた。(1)および(2)においては、在宅健康管理システムに対する需要曲線を、質問したWTPの金額と回答人数から推計し、得られた需要曲線から所望の消費者余剰を求めた。それは釜石市では住民一人4,519円、葛尾村では住民一人1,640円と推計された。(3)久美浜病院での遠隔放射線診療の経済効果については、代替法を援用し、現行の遠隔放射線診療システムの運用費用と、導入以前のシステムとの費用格差を便益として算定した。両者の差額は1,283,449円となり、これがシステムの純便益となる。さらに(1)の回帰分析を応用することにより、在宅健康管理システムの費用負担のあり方が分析できた。分析の結果、WTP4,519に対する自己負担は3,961円、保険(公費)負担は558円となった。現在、在宅健康管理システムの運用について介護保険の適用を求める要望が強いが、せいてつ記念病院の事例では、保険から1人当たり558円を支給してもよいことになる。このように、医療費の削減効果をもつ在宅健康管理システムは、現在は自治体によって補助金により運営されているが、得られた費用便益比率は1より小さく、その便益は費用によって回収できないことが分かった。これらのサービスを市場メカニズムよって供給することに関して否定的な結論が得られた。
光合成の光阻害反応における光化学系Iと光化学系IIの相互調節

光エネルギーは植物の光合成反応の原動力であり、植物の生存に必要不可欠である。しかし、過剰な光は逆に光合成反応を阻害し、光合成器官の酸化的な破壊を引き起こす、従来からおびただしい研究例のある系IIの光阻害と、申請者らの発見した系Iの光阻害は、当初、全く独立した現象であるかに思えたが、最近になって系IIの光阻害からの回復に系Iの光化学活性が必要であるとの報告がなされ、さらに我々は系Iの光阻害には系IIからの電子伝達反応が必要であることを見いだした。このことは、系Iと系IIが、光阻害とそこからの回復という過程においても、協調して光合成反応を進行させるために、その阻害や回復を相互に制御している可能性を示唆する。本研究では、光阻害とそこからの回復過程における系Iと系IIのこのようなクロストークの実体を明らかにすることを目的とすして実験を行った。材料としては、すでに切り葉で光化学系Iが阻害されることが確かめられているキュウリおよびインゲンマメを用いた。これらは、どちらも低温感受性植物であることが知られている。1)回復過程を日単位で追うためには、低温/光処理を、従来の切り葉ではなく、植物体についたままの生葉で行うことが必要である。そこでまず、生葉での処理条件を検討した。その結果、インゲンにおいては生葉においても切り葉の場合と同様の系Iの阻害が見られた。2)系I活性は阻害から7日後までほとんど回復が見られなかった。3)これに対して同時に見られる系II活性の若干の失活は7日後までにほとんど回復した。これらの結果より系IIの阻害が代謝回転の一部であるのに対して系Iの阻害は不可能的な阻害であることが明らかになった。
農村空間の商品化からみた日本の余暇・観光振興の地域差に関する実証的研究

本研究は農村空間の商品化という視点から、日本における余暇・観光地域の再編と発展の可能性、その地域差と地域構造を明らかにした。特に、日本を象徴する首都圏とその周辺における農村空間の商品化による観光振興とその地域差に焦点をあてた。大都市域を象徴する散策、都市郊外の市民農園、平坦農業地域の農産物直売所、盆地の果樹地域の観光農園、丘陵でのハイキング、山間盆地の農林業体験、高原リゾート地の避暑、積雪山岳のスキー、高山の登山、沿岸・島嶼のマリーン・レジャーという、東京都心部を中心とした同心円状のパターンが検出できた。そして、各類型の事例調査を実施し、農村空間の商品化による観光振興の特徴をまとめた。本研究は農村空間の商品化という視点から、日本における余暇・観光地域の再編と発展の可能性を探り、さらにこの側面から日本の地域差と地域構造を解明することを目的とした。まず、農村空間の商品化によるレクリエーションや観光の振興の諸類型を把握し、日本全体でどの地域にそのような現象がみられるかを整理し、地図化した。結果として、大都市の周辺と大都市圏外縁、そして全国の山地や海岸の既存の観光地域とその周辺、さらにはポテンシャルであるが北海道から沖縄までの広大な山地、などにおいて農村空間を活用したレクリエーション・観光振興がみられた。農村空間を消費する人々が集中しているのは大都市であるので、大都市との距離によって、地域差が生じていることがわかった。この研究では、東京を念頭において、大都市近郊、大都市周辺、大都市圏外縁、そして遠隔地という地域的枠組みで事例地域を選択し、フィールドワークに基づく調査を行っている。大都市圏外縁を中心に研究を進めた昨年度に引き続き、本年度は遠隔地である富山県黒部川扇状地において、研究協力者とともに現地調査を実施した。黒部川扇状地では農村の景観や産業、生活様式、伝統文化の価値を地元住民が発見して、それを保存・活用しようとする活動を地元民が行っているが、近年ではこれらに関心をもつ都市住民が増加している。また、漁村では水産物の直売と漁村景観や湧水を生かした観光に力を入れ、それによって地域振興を図っている。甲府盆地でも調査を行い、ワインなどの産物や渓谷美を生かした観光、扇状地や丘陵、山地を生かしたルートでの散策やマラソン、サイクリングなどの観光が進められていた。また、大都市近郊の東京都練馬区での直売と市民農園、さらには大都市周辺にあたる埼玉県北部の道の駅を中心とした観光化と地域振興についても現地調査を行い、関連資料を収集した。本年度には日本を象徴する首都圏とその周辺の15都県における農村空間の商品化による観光振興の地域差を、関係都県の観光と農業の担当者からの聞き取り、既存の文献や統計の検討、フィールドワークなどから明らかにした。また、都心部、熱海や箱根などの既存の観光地を中心とした事例調査を行った。結果として、散策はいずれの地域でもみられるが、特に大都市域を象徴するものであった。同様に市民農園は都市郊外、農産物直売所は平坦農業地域、観光農園は主として盆地の果樹地域に、ハイキングは丘陵や低山性山地、農林体験・農山村生活体験は山間の盆地などに、避暑は高原リゾート地、スキーは積雪山岳、登山は標高の高い山岳、そしてマリーン・レジャーは沿岸部や島嶼部といった具合である。農村空間の商品化による観光振興の地域差は、自然環境や農林水産業の内容、既存の著名な観光地、そして都市からの近接性によって影響を受けており、基本的には東京都心部を中心として同心円状のパターンをしていることがわかった。研究の集大成として、研究協力者とともにここ3年間の研究期間に実施した事例研究を、上記の地域差に対応するように配列して『地域振興としての農村空間の商品化』という題名の単行本の原稿を作成して、平成26年度科学研究費補助金研究成果公開促進費(学術図書)を申請し、交付内定を受けた。そこでは「農村空間の商品化の概念」、「首都圏とその周辺の地域差」に続いて、「市民農園や農産物直売所」、「農村景観の商品化や農業サポーター」、「既存の観光地域における農村空間の商品化によるさらなる観光振興の可能性」、「水産物や漁村文化の商品化による地域振興」など10の事例研究を収録することができた。まず、日本における余暇・観光の変遷過程を既存の文献で整理した結果、近年の大きな特徴の一つとして、市民農園や農産物直売所、農村での散策やハイキング、農業体験やクラインガルテン、農家レストランなど、農村空間の商品化による観光振興が盛んになっていることがわかった。

また、観光のみならず、農産物供給や都市住民の農村居住、そして景観や環境の保存といった、農村空間の商品化全体の日本における傾向をまとめた。さらに東京の周辺農村、房総半島、三浦半島、北関東、山形県から宮城県にかけての地域において、概括的な調査と資料収集を行った。この研究では、東京を念頭において、大都市近郊、大都市周辺、大都市圏外縁、遠隔地という地域敵枠組みで事例地域を選択して調査をしているが、そのうち本年度は大都市圏外縁の茨城県日立市下深荻地区の観光農園、山形県朝日町のエコミュージアム活動と観光振興を取り上げ、研究協力者とともに詳細な現地調査を実施した。日立市下深荻地区では、1970年代中頃から1980年代初めにかけてリンゴとブドウの観光農園が開設されたが、現在は農業経営者の高齢化が進んでいる。これを補い観光農園を持続させているのは、他出の息子や娘のほかに、退職者を中心とした都市住民による農業ボランティアであることがわかった。山形県朝日町では、エコミュージアム活動の理念が実質的に地元住民に浸透しており、集落を単位として、自発的な地域資源の活用・維持・管理活動が活発に行われていた。それらの中で、山や湖沼、河川、神社仏閣、棚田、リンゴやワインなどの地場産品などの活用によって、近年観光客を引きつけるようになったものも多くあった。観光・余暇に関する既存の研究や研究代表者らのこれまでの調査・研究によって、日本全体の農村空間の商品化によるレクリエーション・観光振興が著しい地域を地図化することができ、さらにそれらの地域差を把握することができた。その成果を論文および著書にまとめた。また、東京近郊と首都圏、北陸地方において現地調査を行ったが、特に富山県黒部川扇状地の農村と漁村における現地調査の結果を論文にまとめることができた。まず、観光・余暇に関する既存の研究や農村空間の商品化に関する研究の検討によって、全体の傾向をおおまかに捉えることができた。そして、東京周辺と関東地方、東北地方を概括的に調査し、全体のイメージをつかむことができた。さらに、大都市圏外縁と遠隔地の2つの事例地域において現地調査を実施し、その成果を論文としてまとめることができた。また、日本全体の農村空間の商品化についてまとめて、日本地理学会春季学術大会において特別発表(日本地理学会会長講演として45分間)ができた。これらのことから、初期の目的を達したと考えることができる。平成25年度は最終年度であるので、これまで実施してきた現地調査の結果をまとめ、それに基づいて日本における余暇・観光からみた地域差と地域構造の解明につとめる。大都市圏外縁と遠隔地の事例調査については、すでに論文として発表することができたので、東京近郊の市民農園や農家レストランと東京周辺の農産物直売所を中心とした観光化の事例地域の補足調査を行い、これらの結果を論文にまとめる。現地での補足調査は67月を中心に集中的に実施する。また、関東地方と東北地方南部、中部地方の都県庁等の観光や農業関係の部署において、聞き取りと資料収集を行い、首都圏およびその周辺における農村空間の商品化による観光の一般的傾向と地域差を整理する。
多環系モノマーを用いた床用レジンの開発

本研究では,分子の環構造上に重合反応性の二重結合を有する多環系モノマーを単独,もしくはMMAと共重合させ,これにより得られるレジンの義歯床用材料としての可能性を検討した.本研究により得られる高分子の特徴は,環構造上の二重結合を重合反応に用いることにより,ポリマーの主鎖に環状構造が組み込まれ,ポリマーの主鎖の運動が束縛され,従来の義歯床用材料よりも高い靭性を有する硬いレジンが得られると期待される.本研究では次の結果を得た.インドールのように,ベンゼン環に五員環が結合した構造をとる多環系モノマーはMMAに対して高い溶解性を示す.高い溶解性を示すモノマーでも,側鎖に-OH基,-COOH基,-OCH_3基,-NH_2基,-SH基のような親水性の基を有する多環系モノマーは,MMAに対し不溶性を示す.インデン,インダゾール,マレイミドのように,環構造内に電子の分布が不均一な二重結合を有する多環系モノマーはMMAに対して共重合する性質を示すことが分かった.MMAと多環系モノマーの混合物より加熱重合法で得られた重合体の重合収縮率(体収縮)および機械的強度から,義歯床用材料としての物性を検討した.MMAに対して溶解性および共重合性を示す多環系モノマーを添加したアクリルレジンは,いずれも重合収縮が有意に減少するのが認められた.機械強度については,ほとんどの多環系モノマーの添加においてアクリルレジンの物性は低下したが,インドール-3-カルボン酸メチルおよびマレイミドをMMAにそれぞれ4wt%および10wt%添加して得られた共重合体の機械的強度は有意に向上した.MMAにマレイミドを10wt%添加したアクリルレジンの圧縮強さは有意に向上した.マレイミドの環状構造がポリマー分子中に導入されたことに起因する立体障害によりアクリルレジンの機械強度が向上したと考えられる.本研究では,分子の環構造上に重合反応性の二重結合を有する多環系モノマーを単独,もしくはMMAと共重合させ,これにより得られるレジンの義歯床用材料としての可能性を検討した.本研究により得られる高分子の特徴は,環構造上の二重結合を重合反応に用いることにより,ポリマーの主鎖に環状構造が組み込まれ,ポリマーの主鎖の運動が束縛され,従来の義歯床用材料よりも高い靭性を有する硬いレジンが得られると期待される.本研究では次の結果を得た.インドールのように,ベンゼン環に五員環が結合した構造をとる多環系モノマーはMMAに対して高い溶解性を示す.高い溶解性を示すモノマーでも,側鎖に-OH基,-COOH基,-OCH_3基,-NH_2基,-SH基のような親水性の基を有する多環系モノマーは,MMAに対し不溶性を示す.インデン,インダゾール,マレイミドのように,環構造内に電子の分布が不均一な二重結合を有する多環系モノマーはMMAに対して共重合する性質を示すことが分かった.MMAと多環系モノマーの混合物より加熱重合法で得られた重合体の重合収縮率(体収縮)および機械的強度から,義歯床用材料としての物性を検討した.MMAに対して溶解性および共重合性を示す多環系モノマーを添加したアクリルレジンは,いずれも重合収縮が有意に減少するのが認められた.機械強度については,ほとんどの多環系モノマーの添加においてアクリルレジンの物性は低下したが,インドール-3-カルボン酸メチルおよびマレイミドをMMAにそれぞれ4wt%および10wt%添加して得られた共重合体の機械的強度は有意に向上した.MMAにマレイミドを10wt%添加したアクリルレジンの圧縮強さは有意に向上した.マレイミドの環状構造がポリマー分子中に導入されたことに起因する立体障害によりアクリルレジンの機械強度が向上したと考えられる.分子の環構造上に重合反応性の二重結合を有すると思われる多環系モノマーをMMAに添加し,これにより得られるレジンの義歯床用材料としての可能性を検討するため,今回は多環系モノマーを添加したMMAを加熱重合することで得られたレジンの重合収縮率(体収縮)を比重法により評価した.このうち常温で固体として存在するモノマー,すなわちインダゾール,2-メチルインドール,3-メチルインドール,インドール-3-カルボン酸メチルの4種類のモノマーに関しては,MMAに対する溶解性に限界があるため,MMAに数mass%溶解し飽和させた程度の添加率では,MMAの重合収縮を有意に抑制する効果はみとめられなかった.ただし,MMAに対して5mass%の溶解性を示したPa型ベンゾオキサジンと,MMAに3040mass%溶解したクマリンおよび7-メチルインドールを添加した試料は,100°Cに加熱しても重合反応を示さなかった.また,同様に常温で固体のInosine,3-イソブチル-1-メチルキサンチン,2',3'-o-Isopropylideneadenosine, Kinetine, MAVT,メラトニン,メトキサレン,6-METHOXYPURINEの8種類のモノマーは,MMAに対して1mass%以下の溶解性であった.これに対して,常温で液体のモノマーはMMAに任意の割合で溶解することができ,MMAの重合収縮を有効に抑制するものと考えられた.

そこでインデン,クマロン,N-メチルインドールの3種類のモノマーを選び同様の実験を行ったところ,MMA:インデン=50:50の重量比で混合した場合,重合収縮率は18.63±0.76%となり,MMA単独で重合させた時(21.30±0.23%)に比べて有意に減少した.一方,後者2種類のモノマーを添加したMMAは,100°Cに加熱しても重合反応を示さなかった.機械的性質に優れ,重合収縮の少ない歯科用レジンを得るために,分子の環構造上に重合反応性の二重結合を有する多環系モノマーをMMAに添加し,加熱重合法で得られた重合体の重合収縮率(体収縮)および機械的強度から,義歯床用材料としての可能性を検討した。常温において液体で存在するシクロヘキセンあるいはシクロペンテンをそれぞれMMAに対して10wt%添加した共重合体は,MMA単独重合時の体積収縮を有意に抑制する効果が認められたが,機械的強度は著しく低下した.その他1,3-シクロヘキサジエン,1,4-シクロヘキサジエンについても同様の検討を行ったが,これらの化合物は,B.P.O.を開始剤とする100°Cまでの本実験条件では重合反応を示さなかった.また,常温では固体として存在するマレイミドをMMAに10wt%添加した共重合体の圧縮強さは,MMA単独重合時と比較して有意に向上するのが認められた.一方,分子内に環構造を持たないが,重合後,大きな側鎖の立体障害により剛直なポリマー分子鎖を与えると考えた重合性二重結合を有するモノマーとして,フマル酸ジイソプロピル,フマル酸ジイソブチル,フマル酸ジ-n-ブチルおよびフマル酸ジオクチルの4種類の物質を選び,同様の検討を行った.いずれの物質とも,MMAに添加することによりその重合収縮を有意に抑制する効果がみとめられたが,得られた重合体の機械的強度は著しく低下した.p-メチルスチレン,p-クロロスチレンについては,それぞれ50wt%添加することによりMMAの重合収縮を有意に抑制する効果が認められたが,やはり機械的強度は著しく低下した.その他α-クロロスチレンについても同様の検討を行ったが,同物質は,B.P.O.を開始剤とする100°Cまでの本実験条件では重合反応を示さなかった.本研究では,分子の環構造上に重合反応性の二重結合を有する多環系モノマーを単独,もしくはMMAと共重合させ,これにより得られるレジンの義歯床用材料としての可能性を検討した.本研究により得られる高分子の特徴は,環構造上の二重結合を重合反応に用いることにより,ポリマーの主鎖に環状構造が組み込まれ,ポリマーの主鎖の運動が束縛され,従来の義歯床用材料よりも高い靭性を有する硬いレジンが得られると期待される.本研究では次の結果を得た.インドールのように,ベンゼン環に五員環が結合した構造をとる多環系モノマーはMMAに対して高い溶解性を示す.高い溶解性を示すモノマーでも、側鎖に-OH基,-COOH基,-OCH_3基,-NH_2基,-SH基のような親水性の基を有する多環系モノマーは,MMAに対し不溶性を示す。インデン,インダゾール,マレイミドのように,環構造内に電子の分布が不均一な二重結合を有する多環系モノマーはMMAに対して共重合する性質を示すことが分かった.MMAと多環系モノマーの混合物より加熱重合法で得られた重合体の重合収縮率(体収縮)および機械的強度から,義歯床用材料としての物性を検討した.MMAに対して溶解性および共重合性を示す多環系モノマーを添加したアクリルレジンは,いずれも重合収縮が有意に減少するのが認められた.機械強度については,ほとんどの多環系モノマーの添加においてアクリルレジンの物性は低下したが,インドール-3-カルボン酸メチルおよびマレイミドをMMAにそれぞれ4wt%および10wt%添加して得られた共重合体の機械的強度は有意に向上した.MMAにマレイミドを10wt%添加したアクリルレジンの圧縮強さは有意に向上した.
金ナノロッドを用いた光照射による薬物コントロールリリース

本年度は、DA部位を持つPEGを修飾した金ナノロッドを用いた近赤外光によるPEGのコントロールリリースの評価と、薬物としてドキソルビシン(Dox)を修飾した金ナノロッドの作製を評価した。DA部位を持つPEGを修飾した金ナノロッドの作製と、近赤外光照射による金ナノロッドの凝集の評価は前年度に報告した。本年度は、近赤外光照射による金ナノロッドの凝集が、戦略通りフォトサーマル効果の熱に誘起された逆Diels-Alder反応によってPEGが放出されたためか、放出されたPEG鎖を定量することで評価した。結果として近赤外光の照射強度、照射時間に依存したPEG鎖の放出が確認できた。これらの結果は、本システムが狙い通り働いていることを示し、金ナノロッドを用いたコントロールリリースシステムの有用性を示すことができたと考えている。さらに本年度では、薬物修飾金ナノロッドの作製も行った。薬物としてはドキソルビシン(Dox)を用いた。片末端にDoxを修飾したPEGをDA部位を介して金ナノロッドに修飾した。しかし、金ナノロッドへのDoxの修飾量が低く、末端にDoxがあるため金ナノロッドの分散安定性が低下してしまった。そこで、PEGの末端にオリゴグルタミン酸ペプチドを結合させ、オリゴグルタミン酸ペプチド部分にDoxをグラフトさせることで、Doxの修飾量向上と金ナノロッドの分散安定性の向上を試みた。結果として、Doxの修飾量は実験で十分評価できるほど向上し、金ナノロッドの分散安定性は数日間放置しても凝集しないほど向上した。本年度の計画では、薬物修飾金ナノロッドを用いた動物実験まで行う予定であった。しかし、今回の報告は薬物担持量の向上と、金ナノロッドの分散安定性の向上が達成できたことから、今後の動物実験で問題になると考えられた薬物担持量と分散安定性の問題のブレイクスルーとなる結果を報告できたことから、時間をかけるに値する重要な研究結果であったと考えている。Dox修飾金ナノロッドの作製が遅れたためである。申請した研究方針の戦略の金ナノロッドでは1粒子辺りのDoxの担持量の向上に限界があった。そこで、Doxの修飾量を向上させるため、新しい設計と金ナノロッドの作製を行ったことが、遅れた原因と考えられる。しかし、新しい設計ではDoxの担持量の向上が確認できたので、今後の研究の足がかりになると期待できる。本年度までに、Doxの担持量と分散安定性の向上が達成できた。そのため、今後は、新しく設計、作製したDox修飾金ナノロッドを用いた細胞実験、動物実験を実施できると考えている。しかし、それと同時に、Doxの金ナノロッドから放出される時間の短縮も課題の一つとなる。本研究におけるDiels-Alder環化物の組み合わせはフランとマレイミドであった。しかし、この組み合わせでは逆Diels-Alder反応が起こる温度が90°Cと高い。本研究では、金ナノロッド近傍にDiels-Alder環化物が存在できる分子設計のため、より低温側かつ短い時間での逆Diels-Alder反応を期待したが、反応温度は80°C前後で、有意な変化が確認できた反応時間は近赤外光照射から5分後であった。そのため、本システムにより好ましいDiels-Alder環化物の組み合わせの探索が必要になってくると考えられる。その探索法としては、いくつかのジエン、求ジエン体を候補として選び、NMRを用いてDiels-Alder反応の進行をモニタリングしていく手法が考えられる。本研究の研究対象である金ナノロッドは、近赤外光と呼ばれる生体成分を透過する光を吸収し、熱に変換する特性(フォトサーマル効果)を有する。そのため、生体内に金ナノロッド投与しても、近赤外光のオン、オフで加熱をコントロールする事ができる。本研究の目的は、2つある。一つは、金ナノロッドを使用して薬物を標的とする癌(腫瘍)により効果的に送達することである。もう一つが、薬物送達後、金ナノロッドのフォトサーマル効果を利用して、残りの癌を治療することである。その方法として、熱に応答する反応であるDiels-Alder反応(DA)部位を介して、薬物と、血中滞留性を向上させるためのPEGを金ナノロッドに修飾させ、近赤外光で薬物放出とフォトサーマル効果方法を考案した。本年度の報告では、DA部位を持つPEGを修飾した金ナノロッドの作製、近赤外光によるPEGのコントロールリリースと、PEG放出による金ナノロッドの凝集を評価した。DA部位を持つPEGは、チオール基を持つフランと末端マレイミドPEGの間でDiels-Alder反応させ合成した。合成したDA部位を持つPEGを金ナノロッドと撹拌し、DA部位を持つPEG修飾金ナノロッドを作製した。作製は、吸収スペクトル、TEM、ζ電位測定で確認した。次に、作製したDA部位を持つPEG修飾金ナノロッドに近赤外光を照射した。近赤外光照射(500mW,920nm連続波レーザー)で、時間に応じてPEG鎖が金ナノロッドから放出され、PEG鎖放出による金ナノロッドの凝集が確認された。比較対象として、DA部位を持たないPEGで同様の実験を行ったが、有意なPEG鎖の放出と金ナノロッドの凝集は確認されなかった。この事から、DA部位がフォトサーマル効果で反応した結果、PEGが放出されたと考えられる。本年度は薬物修飾金ナノロッドも作製する計画であった。

しかし、今回の報告は、近赤外光照射による薬物コントロールリリースシステムという本研究戦略の実現性を示すものであり、時間をかけるに値する重要な研究結果であったと考えている。本年度は、DA部位を持つPEGを修飾した金ナノロッドを用いた近赤外光によるPEGのコントロールリリースの評価と、薬物としてドキソルビシン(Dox)を修飾した金ナノロッドの作製を評価した。DA部位を持つPEGを修飾した金ナノロッドの作製と、近赤外光照射による金ナノロッドの凝集の評価は前年度に報告した。本年度は、近赤外光照射による金ナノロッドの凝集が、戦略通りフォトサーマル効果の熱に誘起された逆Diels-Alder反応によってPEGが放出されたためか、放出されたPEG鎖を定量することで評価した。結果として近赤外光の照射強度、照射時間に依存したPEG鎖の放出が確認できた。これらの結果は、本システムが狙い通り働いていることを示し、金ナノロッドを用いたコントロールリリースシステムの有用性を示すことができたと考えている。さらに本年度では、薬物修飾金ナノロッドの作製も行った。薬物としてはドキソルビシン(Dox)を用いた。片末端にDoxを修飾したPEGをDA部位を介して金ナノロッドに修飾した。しかし、金ナノロッドへのDoxの修飾量が低く、末端にDoxがあるため金ナノロッドの分散安定性が低下してしまった。そこで、PEGの末端にオリゴグルタミン酸ペプチドを結合させ、オリゴグルタミン酸ペプチド部分にDoxをグラフトさせることで、Doxの修飾量向上と金ナノロッドの分散安定性の向上を試みた。結果として、Doxの修飾量は実験で十分評価できるほど向上し、金ナノロッドの分散安定性は数日間放置しても凝集しないほど向上した。本年度の計画では、薬物修飾金ナノロッドを用いた動物実験まで行う予定であった。しかし、今回の報告は薬物担持量の向上と、金ナノロッドの分散安定性の向上が達成できたことから、今後の動物実験で問題になると考えられた薬物担持量と分散安定性の問題のブレイクスルーとなる結果を報告できたことから、時間をかけるに値する重要な研究結果であったと考えている。Dox修飾金ナノロッドの作製が遅れたためである。申請した研究方針の戦略の金ナノロッドでは1粒子辺りのDoxの担持量の向上に限界があった。そこで、Doxの修飾量を向上させるため、新しい設計と金ナノロッドの作製を行ったことが、遅れた原因と考えられる。しかし、新しい設計ではDoxの担持量の向上が確認できたので、今後の研究の足がかりになると期待できる。本年度までに、Doxの担持量と分散安定性の向上が達成できた。そのため、今後は、新しく設計、作製したDox修飾金ナノロッドを用いた細胞実験、動物実験を実施できると考えている。しかし、それと同時に、Doxの金ナノロッドから放出される時間の短縮も課題の一つとなる。本研究におけるDiels-Alder環化物の組み合わせはフランとマレイミドであった。しかし、この組み合わせでは逆Diels-Alder反応が起こる温度が90°Cと高い。
インスリン受容体基質と相互作用するRNAの網羅的同定とその機能解析の試み

インスリン様成長因子(IGF)/インスリン(INS)のシグナル伝達に重要な受容体チロシンキナーゼ基質の一つ、インスリン受容体基質(IRS)-1が、RNA代謝に関与する多数のタンパク質と複合体を形成しており、同時に、この複合体にはRNAが含まれることを発見した。IRS-1と相互作用するRNAを同定し、その機能を検討した結果、IRS-1は、翻訳マシナリーの足場として機能する、リボソーム生合成のマシナリーの成熟を促進する、スプライシングや翻訳を制御しているなど、これまでに報告のない機構でIGF/INS活性を調節している可能性が示された。インスリン様成長因子(IGF)/インスリン(INS)は、特定の遺伝子の転写、タンパク質の翻訳を誘導し、動物の成長や発達などを発現することが知られている。最近、申請者らはIGF/INSシグナル伝達に重要な受容体チロシンキナーゼ基質の一つ、インスリン受容体基質(IRS)-1が、RNA代謝に関与する多数のタンパク質と複合体を形成しており、IRS複合体にRNAが含まれることを発見した。本研究では、IRS複合体に含まれるRNAを同定し、当該RNAの代謝制御・機能制御にIRS-1複合体が果たす役割を調べ、「IGF/INSが、IRSを介した全く新しい分子機構で標的RNAの代謝・機能を調節し、インスリン様活性を発現している」ことを証明する。本年度は、まず、これまでの研究でPABPC1がIRS-1と相互作用するタンパク質として同定されていることから、IRS-1複合体にはmRNAが構成因子として含まれ、これを介して翻訳開始因子も存在している可能性を検討した。その結果、IRS-1は、増殖刺激の有無に関わらずmRNA-protein complex (mRNP)と相互作用しているが、増殖刺激に応答して起こる翻訳活性化状態では翻訳マシナリーの足場として機能し、翻訳促進に新しい機構で関与していることが明らかとなった。一方、IRS-1は既知のRNA結合ドメインは有していないが、RNAと直接結合する可能性も考えられる。そこで、in vivo UV-crosslinking and immunoprecipitation(CLIP)法によりIRS-1と直接相互作用するRNAの同定を試みた。CLIP法により同定されたRNAには、mRNAの他、non-coding RNAやrRNAも含まれていた。申請者らはインスリン様成長因子(IGF)/インスリン(INS)シグナル伝達に重要な受容体チロシンキナーゼ基質の一つ、インスリン受容体基質(IRS)-1が、RNA代謝に関与する多数のタンパク質と複合体を形成しており、IRS複合体にRNAが含まれることを発見した。IRS-1は既知のRNA結合ドメインは有していないが、RNAと直接結合する可能性も考えられたので、in vivo UV-crosslinking and immunoprecipitation(CLIP)法によりIRS-1と直接相互作用するRNAの同定を試みた。CLIP法により同定されたnon-coding RNAの中で核小体小分子RNA(snoRNA)の一つ、U96A snoRNA(U96A)に注目して研究を進めた。U96Aは、Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1)遺伝子のintron2内にコードされているが、RACK1のスプライシングと共役して産生された後、部位特異的転写された5.8S rRNAにメチル化修飾を引き起こす酵素をガイドする。まずIRSとU96Aの相互作用をゲルシフト法や免疫沈降法により検討したところ、IRSがU96Aと直接相互作用することが明らかとなった。更に、免疫沈降法によりU96AはRACK1のintron 2のみがスプライシングされずに残ったpre-mRNAや切り出されたintron 2とも相互作用することを見出した。この結果は、U96AがRACK1のイントロンから切り出され、核小体で機能するまでの過程に、IRS-1が何らかの機能を果たしている可能性を示している。更に、IRS-1ノックアウトマウスの胎児から調製した線維芽細胞(MEF)でU96A量を解析したところ、野生型MEFと比較して、その量が有意に減少していることも見出した。これらの一連の結果は、IRSが、rRNAの転写後メチル化修飾および成熟に必要なsnoRNAの産生を正に制御し、リボソーム生合成のマシナリーの成熟を促進する結果、全タンパク質合成活性が上昇するという新規機構の存在を示していた。その他、IRSが選択的スプライシングに機能していることも明らかにした。畜産学・獣医学応用動物科学IRS-1に相互作用するタンパク質により翻訳やリボソーム生合成が制御されることを初めて明らかにすることができ、さらにIRSと相互作用する他のRNAの同定やその機構の解析を行うことができた。このように研究の進捗状況は順調と言える。次年度は、研究計画を更に進め、IRSやIRSと相互作用することが明らかとなったスプライスソーム調節タンパク質であるPRMT5などをノックアウトした細胞で、RNAの代謝やインスリン様活性が変動しないかについて検討を加える。
RNA二次構造の大域的性質の集団遺伝解析

細胞内のRNA分子は、遺伝子に書き込まれた情報がタンパク質になり生理的な機能を発揮する上で非常に重要な役割を持つ。RNA分子の立体構造は、ステムと呼ばれる局所的二重らせん構造(二次構造)の3次元的な配置としてよく理解されることが知られており、二次構造の性質を解明することは、RNAの機能を理解する上で重要である。本研究において、我々は、メッセンジャーRNAや長鎖非コードRNAと呼ばれる長大なRNA分子に対して、その二次構造的性質を正確に計算することができるアルゴリズムの開発に世界で初めて成功した。また、RNA結合タンパク質の結合領域周辺がどのような二次構造的特徴をもつかを計算する手法も開発した。本年度は以下の様な研究を行った。1.RNA配列が与えられたとき、配列が任意の塩基置換、挿入、欠失を起こした場合の塩基対確率、アクセシビリティ、ステム確率の変化を網羅的に計算するプログラムRadiamを実装した。このプログラムを用いてRNAの変異を調べることにより、RNAの二次構造に働く、進化的な選択圧を精密に検出することが可能になった。2.Radiamを用いて、Rfamデータベースに登録されているtRNA配列およびrRNA配列の変異解析を行い、実際に起こっている変異による二次構造の変化をバックグラウンドの変化と比較することにより、非コードRNAの二次構造に働く進化的な選択圧を検出することができた。3.2.の手法をヒトゲノム上のmRNA配列に対して適用し、配列の各領域に働く、構造的な選択圧の検出を試みた。その結果によるとUTR領域においては、構造を保とうとする選択圧が強く働いていることが示された。またアミノ酸コード領域においては、コードするアミノ酸を変化させない同義置換では、進化的な選択圧が検出されたが、アミノ酸を変化させる非同義置換においては選択圧が検出されなかった。4.ゲノムスケールの配列に対して、二次構造的な特徴量を網羅的に計算することができるプログラムParasorを開発した。このプログラムにより、ヒトゲノムのあらゆる領域の二次構造的な性質を調べることができるようになった。特にヒトゲノムに存在する長大なイントロン領域に働く二次構造的な選択圧を精密に検出することができるようになった。本研究では、RNAの二次構造配列解析と、集団遺伝学の合祖理論を融合させたRNA進化シミュレーション法を開発することを第一の目標としている。また、これを用いて、RNA制御因子結合部位の露出度やイントロンの端点間距離といった、遺伝子の発現・制御の効率に影響する因子の進化的形態を明らかにすることも目標としている。平成26年度は、ゲノムスケールでRNAの二次構造的な特徴を計算するアルゴリズムの開発を行った。従来の二次構造計算は、長い入力配列に対しては、数値誤差が大きくなるため、pre-mRNAや長鎖非コードのRNAの二次構造を計算することが難しかった。そこで本研究では、計算過程で互いに打ち消し合う大きな量について、その差分のみをダイレクトに計算する手法を考案した。また、長い配列をたくさんの部分配列に分割し、それらのつながりの関係を失うことなく、多数の計算機で同時並行的に計算する並列計算アルゴリズムも開発した。これらにより、ゲノムスケールでのRNA配列解析の技術的基盤を構築することができた。開発したソフトウェアを用いてヒトのRNA遺伝子の構造的性質を網羅的に調べたところ、転写領域は非転写領域に比べ、強い構造を取る領域が多いこと、イントロンは強い構造を多くとること、タンパク質コード領域の二次構造的性質は、その塩基組成により良く説明できること、スプライシングの後にエキソン領域はよりアクセシブルになることなど、二次構造に起因する様々な進化的制約がゲノム上に働いていることを明らかにできた。平成27年度は、前年度までに開発したRNA二次構造を大域的に計算するアルゴリズム(論文投稿中)を利用して、非コードRNAの一つであるNEAT1の二次構造的な進化保存性を調べた。NEAT1は核内構造体の一種であるパラスペックルを構成する主要なRNA分子であるが、その働きはよく分かっておらず、活発な研究が進められている分子である。我々はヒトのNEAT1配列に相同な配列を脊椎動物に渡って検索した。これより一般にNEAT1の配列の保存性は非常に低いことが分かったが、200ー500塩基の位置の保存性のみ非常に保存していることが明らかになった。この部分の二次構造もよく保存されていることを明らかにすることができた。この他、RNAの塩基変化に応じて二次構造がどのように変化するかを網羅的に計算するアルゴリズムの開発や、RNA結合タンパク質結合サイト周辺に頻出する配列・構造モチーフを推定するアルゴリズムの開発などを行った。これらのアルゴリズムは今後精度評価を行い、生物学的に発見につなげていく予定である。塩基置換によるRNA二次構造の変化を網羅的に計算するアルゴリズムの開発は早い段階で行ったが、計算速度が遅く実用的でなかったため、並列計算を利用して高速に二次構造を計算する新たなアルゴリズムの開発を行う必要性が生じた。このため当初の予定よりもRNA二次構造の進化保存性を研究する期間が後ろへずれ込むことになった。

但し、二次構造の並列計算アルゴリズム自体は新規性の高いアルゴリズムであり、当初の目的とは少し外れた部分ではあるが、十分な研究成果が出ていると考えている。本研究は、RNAの二次構造配列解析と、集団遺伝学の合祖理論を融合させたRNA進化シミュレーション法を開発することが主目的であった。期間内の研究においては、初期の目的のRNA進化シミュレーション法の開発を達成することはできなかった。しかし、その代わりに初期の構想以上の価値をもつ2つの成果を出すことができた。一つ目は、RNA結合タンパク質(RBP)結合領域周辺の二次構造的な特徴を計算するCapRアルゴリズムの開発及び実装である。一般にRBPは、DNAに結合する転写因子などと違い、一次配列的な特徴が弱いことが多いが、これは、RBPが、結合領域周辺の二次構造などの特徴も認識することで結合特異性を高めているからだと考えられている。我々は、RNA二次構造アルゴリズムを用いて、RNA配列の各位置がどのような二次構造的文脈にあるかを計算する手法を開発・実装した。これをCLIP-seqデータから得られるRBP結合領域に適用し、各RBPがもつ二次構造的特異性を計算することに成功した。二つ目は、長大なRNAの二次構造的性質をアルゴリズムの開発及び実装である。従来の二次構造計算アルゴリズムは、主にtRNA等の短い構造RNAの二次構造計算を想定しており、mRNA、長鎖非コードRNAなど長い配列の二次構造を計算しようとすると計算時間の面などで困難があった。我々は、クラスタマシンで並列に計算するアルゴリズムを開発・実装し、長いRNAの二次構造計算を初めて可能にした。またこれを用いて、ヒトゲノムのイントロン領域に働く強い二次構造的な拘束を検出することができた。細胞内のRNA分子は、遺伝子に書き込まれた情報がタンパク質になり生理的な機能を発揮する上で非常に重要な役割を持つ。RNA分子の立体構造は、ステムと呼ばれる局所的二重らせん構造(二次構造)の3次元的な配置としてよく理解されることが知られており、二次構造の性質を解明することは、RNAの機能を理解する上で重要である。本研究において、我々は、メッセンジャーRNAや長鎖非コードRNAと呼ばれる長大なRNA分子に対して、その二次構造的性質を正確に計算することができるアルゴリズムの開発に世界で初めて成功した。また、RNA結合タンパク質の結合領域周辺がどのような二次構造的特徴をもつかを計算する手法も開発した。従来の二次構造アルゴリズムは、数値誤差や、計算量の面から、ゲノムスケールの大規模解析に使うことが難しかった。本研究で開発したアルゴリズムは、このような問題点に完全な解決法を与えるものであり、今後のRNA二次構造研究を飛躍的に発展させるブレイクスルーとなる成果であると考えている。このアルゴリズムを用いてヒトゲノムの転写領域を網羅的に計算した結果、UTR、タンパク質コード領域、イントロンなどそれぞれの機能領域が、特有の進化形態を持つことを示すことができたが、これもゲノム進化研究において非常に意義深いものであると考えている。本研究で考える二次構造変化は、DNA配列の個人差から生じるもののみを考えていた。
免疫制御を可能とする紫外線波長特性の解析―あらたな深紫外光LED光線治療の開発

遅延型過敏反応(DTH)のマウスモデルでは、290320nm中で、310nmに遅延型過敏反応の抑制とTregの誘導が見られ、Tregの誘導のみならず、TH17細胞の誘導を抑えていることが明らかとなった。抗原の投与していないマウス皮膚にリンパ節・脾臓でCD4+CD25+Foxp3+Neuropilin-1+細胞(nTreg)が、290300nmで誘導が見られた。7日後で明らかに皮膚とリンパ節でTregが増加、Neuropilin1陽性のnTregであり、Treg関連の遺伝子におけるメチル化を調べたところ、脱メチル化がみられ、安定した抑制機能のあるTregが誘導されることを明らかとなった。乾癬患者において、Tregの抑制能の低下は、PUVAバス療法後においてほぼ正常へ回復し、PUVAバスによるTregの機能回復が示した。照射開始(PUVAバス)から5回ごとに、3つの分画を調べたところ、aTregが、明らかに上昇することが明らかとなった。マウス皮膚で、Tregが誘導されたことから、ヒトでも同様のTregの誘導がわかるかどうかを確かめるため、皮疹血として採取したわずかな全血から、細胞解析ができるかどうかの検討を行った。マルチカラーでのFACS解析、さらに高速セルソーターで、CD4/ CD8を分離することも成功した。末梢血に比べ、皮疹血では、CD4およびCD8のpopulationに差があり、現在、CyTOFやT細胞レパトア解析を行っている。昨年度につづき、制御性T細胞(Treg)による免疫寛容誘導する波長探索を行い、乾癬患者において、ナローバンドUVB・308nmエキシマライト・PUVAバスによる末梢血でのTreg誘導解析などの解析は進めることができた。今年度、乾癬および皮膚T細胞性リンパ腫の皮疹部分から、皮疹血として採取したわずかな全血から、細胞解析ができること、さらには、高速セルソーターで分離することにも成功した。疹血として採取したわずかな全血から、細胞解析ができること、さらには、高速セルソーターで分離することにも成功したため、光線療法後の皮膚に浸潤する細胞群をセルソーターで分離し、RNAシークエンス、Treg関連遺伝子のエピジェネティック解析(次世代シークエンサー)で行う予定である。乾癬以外の皮膚T細胞性リンパ腫においても、同様に解析を行い、Tregの誘導に関して解析を行う。Treg数、DysfunctionalTregの機能回復、aTreg、RNAシークエンス、Treg関連遺伝子のエピジェネティック解析を行う予定である。これらの解析から、誘導されるTregの詳細なタンパク・遺伝子発現・エピジェネティックプロファイルが明らかとなり、より詳細な波長ごとの特性を明らかにすることができる。これらの結果から、さらに、どのような光生物学的メカニズムによって、波長ごとの特性がえられるか、検討を進める予定である。現在もすすめているが、制御性T細胞を誘導する樹状細胞を誘導する波長特性解析を行う。iTreg(誘導性制御性T細胞)を誘導する波長解析遅延型過敏反応(DTH)のマウスモデルを用いた実験では、290320nm中で、310nmに遅延型過敏反応の抑制とTregの誘導が見られた。リンパ節細胞でIL-10を誘導、IL-17の抑制、IL-23の抑制などが明らかとなり、Tregの誘導のみならず、TH17細胞の誘導を抑えていることが明らかとなった。nTreg(内在性制御性T細胞)の誘導波長解析抗原の投与していないマウス皮膚にリンパ節・脾臓でCD4+CD25+Foxp3+Neuropilin-1+細胞(nTreg)が、290300nmで誘導が見られた。ブロードバンドUVBの照射で、7日後で明らかに皮膚とリンパ節でTregが増加、Neuropilin1陽性のnTregであり、Treg関連の遺伝子におけるメチル化を調べたところ、脱メチル化がみられ、安定した抑制機能のあるTregが誘導されることを明らかとなった。臨床レベルでのTreg誘導解析乾癬では、Treg数の減少はなく機能不全であることが報告されている。健常人Treg存在下ではCD4+CD25-Tcellsの分裂増殖がほぼ完全に抑制された(94.4%)のに対して、乾癬患者Tregでは完全に抑制できず(70.3%)、抑制能の有意な低下を認めた。乾癬患者のTregの抑制能の低下は、PUVAバス療法後においてほぼ正常へ回復したことから、PUVAバスによるTregの機能回復が示した。照射開始(PUVAバス)から5回ごとに、3つの分画を調べたところ、aTreg (CD4+CD25+Foxp3highCD45RA-)が、明らかに上昇することが明らかとなった。比較的早期にaTregが上昇し、rTregも同様に誘導され、非抑制性Tregの減少もみられた。予定していた制御性T細胞(Treg)による免疫寛容誘導する波長探索、臨床レベルでのTreg誘導解析ナローバンドUVB・308nmエキシマライト・PUVAバス照射患者におけるTreg誘導解析)などの解析は進めることができ、同時に、皮疹部分から浸潤している細胞を高速セルソーターで分離する方法をセットアップをおこなうことができた。抗原の投与していないマウス皮膚にリンパ節・脾臓でCD