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松果体におけるグルタミン酸作動性原理によるメラトニンの分泌制御機構

約24時間の周期を持つ生物リズムはサーカディアンリズム(概日リズム)とも呼ばれ、動物はもとより植物や単細胞生物に至るまで広く見られる現象である.噛乳類の場合、概日リズムの中枢は視交叉上核と呼ばれる神経細胞集団にあり、この活動シグナルが交感神経を通じて松果体に伝えられる.松果体はこのシグナルをメラトニンという液性情報に変えて血中に放出する.放出されたメラトニンは受容体を介して時間情報を細胞に伝達する.従って、松果体は時間情報の変換器とも考えられ、メラトニンの合成・分泌機構を明らかにすることは概日リズムを理解するために極めて重要な課題である.我々は、松果体におけるメラトニンの合成・分泌が交感神経により正の制御を受ける他に、負に制御する機構を内在していることを見いだした.すなわち、松果体細胞は神経の化学伝達と類似した機構により興奮性アミノ酸であるグルタミン酸を蓄積し、分泌している.これが隣接する松果体細胞に伝達され、メラトニンの分泌が抑制される.本班研究において、我々はこの新規な内分泌制御機構の全貌を解明することを目的とし、以下の成果を修めた.(1)メラトニンの合成・分泌を抑制するシグナル伝達系を解析した.クラスII型の代謝型受容体(mGluR3)が松果体細胞に発現しており、抑制性cAMPカスケードによりメラトニン合成酵素活性が抑制されることを見いだした.(文献1)これは分泌細胞で代謝型グルタミン酸受容体が機能していることを示した初めての例である.(2)グルタミン酸を濃縮する顆粒・マイクロベジクルの構成蛋白に関する研究を推し進め、マイクロベジクルにsynaptivvesicle protein 2Bが発現していることを見いだした.(文献2)(3)松果体細胞がグルタミン酸を開口放出させるin vivoにおける刺激につき探求した.アセチルコリンがニコチン性受容体を介してマイクロベジクルの開口放出をトリガーすることを見いだした.(文献3)これは、グルタミン酸によるメラトニン合成分泌阻害がさらに上位中枢により副交感神経を介して行われていることを示唆する結果である.(4)松果体細胞は哺乳類の細胞としては最も高濃度のDアスパラギン酸を含んでいる.松果物におけるDアスパラギン酸の生理作用と由来につき研究した.その結果、Dアスパラギン酸はLグルタミン酸よりも強いメラトニン合成抑制作用を示すことが判明した.その作用機構はLグルタミン酸のそれと少なくとも一部共通であった.(文献5)さらに、このDアスパラギン酸が細胞内で生合成されている証拠を見いだした.これは動物におけるDアスパラギン酸合成酵素活性の初めての検出例である.PC12細胞にも同様の合成酵素活性が存在することを見いだした.(文献4)約24時間の周期を持つ生物リズムはサーカディアンリズム(概日リズム)とも呼ばれ、動物はもとより植物や単細胞生物に至るまで広く見られる現象である.噛乳類の場合、概日リズムの中枢は視交叉上核と呼ばれる神経細胞集団にあり、この活動シグナルが交感神経を通じて松果体に伝えられる.松果体はこのシグナルをメラトニンという液性情報に変えて血中に放出する.放出されたメラトニンは受容体を介して時間情報を細胞に伝達する.従って、松果体は時間情報の変換器とも考えられ、メラトニンの合成・分泌機構を明らかにすることは概日リズムを理解するために極めて重要な課題である.我々は、松果体におけるメラトニンの合成・分泌が交感神経により正の制御を受ける他に、負に制御する機構を内在していることを見いだした.すなわち、松果体細胞は神経の化学伝達と類似した機構により興奮性アミノ酸であるグルタミン酸を蓄積し、分泌している.これが隣接する松果体細胞に伝達され、メラトニンの分泌が抑制される.本班研究において、我々はこの新規な内分泌制御機構の全貌を解明することを目的とし、以下の成果を修めた.(1)メラトニンの合成・分泌を抑制するシグナル伝達系を解析した.クラスII型の代謝型受容体(mGluR3)が松果体細胞に発現しており、抑制性cAMPカスケードによりメラトニン合成酵素活性が抑制されることを見いだした.(文献1)これは分泌細胞で代謝型グルタミン酸受容体が機能していることを示した初めての例である.(2)グルタミン酸を濃縮する顆粒・マイクロベジクルの構成蛋白に関する研究を推し進め、マイクロベジクルにsynaptivvesicle protein 2Bが発現していることを見いだした.(文献2)(3)松果体細胞がグルタミン酸を開口放出させるin vivoにおける刺激につき探求した.アセチルコリンがニコチン性受容体を介してマイクロベジクルの開口放出をトリガーすることを見いだした.(文献3)これは、グルタミン酸によるメラトニン合成分泌阻害がさらに上位中枢により副交感神経を介して行われていることを示唆する結果である.(4)松果体細胞は哺乳類の細胞としては最も高濃度のDアスパラギン酸を含んでいる.松果物におけるDアスパラギン酸の生理作用と由来につき研究した.その結果、Dアスパラギン酸はLグルタミン酸よりも強いメラトニン合成抑制作用を示すことが判明した.その作用機構はLグルタミン酸のそれと少なくとも一部共通であった.(文献5)さらに、このDアスパラギン酸が細胞内で生合成されている証拠を見いだした.

これは動物におけるDアスパラギン酸合成酵素活性の初めての検出例である.PC12細胞にも同様の合成酵素活性が存在することを見いだした.(文献4)哺乳類の概日リズムの中枢は「視交叉上核」と呼ばれる神経細胞集団にあり、この活動シグナルが交感神経を通じて松果体に伝えられる。松果体はこのシグナルをメラトニンという液性情報に変えて血中に放出する。放出されたメラトニンは受容体を介して時間情報を細胞に伝達する。従って、松果体は時間情報の変換器であり、メラトニンの合成・分泌機構は概日リズムを理解するために極めて重要な課題である。我々は、(1)松果体細胞がグルタミン酸作動性の神経内分泌細胞であること、(2)松果体細胞はグルタミン酸をメラトニン合成の負の制御因子として用いていること、を明らかにしてきた。ホルモンの合成・分泌が神経と類似の機構で制御されていることは全く新しい概念であり、その制御機構の解明は、松果体の内分泌制御のみならず、細胞間情報伝達における普遍性のある有用な知見を提供するものと考えられる。以上の観点に立ち、本年度は以下の項目の研究を行い成果を得た。(1)マイクロベジクルの構成蛋白につき、SV2AではなくSV2Bが存在することを見いだした。(2)マイクロベジクル内にはLグルタミン酸以外にLアスパラギン酸が含まれており、エキソサイトーシスされる。このアミノ酸も強力なメラトニン合成阻害効果を示す。(3)一方、松果体細胞の細胞質にはDアスパアラギン酸が高濃度含まれており、エキサイトーシスとは別経路で細胞外に放出され、メラトニン合成を強く阻害する。この阻害機構も解明した。これは哺乳類においてDアスパラギン酸の生理作用とその機構がわかった初めての例である。(4)エキソサイトーシスされたグルタミン酸やアスパラギン酸は急速に再吸収される。この反応はNa^+-dependent glutamatetransporter(GLT-1 type)が司っている。(5)メラトニン合成を抑制する受容体を特定しその細胞内シグナル伝達系路を決定した。約24時間の周期を持つ生物リズムはサーカディアンリズム(概日リズム)とも呼ばれ、動物はもとより植物や単細胞生物に至るまで広く見られる現象である。哺乳類の場合、概日リズムの中枢は視交叉上核と呼ばれる神経細胞集団にあり、この活動シグナルが交感神経を通じて松果体に伝えられる。従って、松果体は時間情報の変換器とも考えられ、メラトニンの合成・分泌機構を明らかにすることは概日リズムを理解するために極めて重要な課題である。我々は、松果体におけるメラトニンの合成・分泌が交感神経により正の制御を受ける他に、負に制御する機構を内在していることを見いだした。すなわち、松果体細胞は神経の化学伝達と類似した機構により興奮性アミノ酸であるグルタミン酸を蓄積し、分泌している。これが隣接する松果体細胞に伝達され、メラトニンの分泌が抑制される。本班研究において、我々はこの新規な内分泌制御機構の全貌を解明することを目的とする。本年度は以下の成果を修めた。(1)メラトニンの合成・分泌を抑制するシグナル伝達系を解析した。クラスII型の代謝型受容体(mGluR3)が松果体細胞に発現しており、抑制性cAMPカスケードによりメラトニン合成酵素活性が抑制されることを見いだした。
中東和平を阻害する聖地問題とその解決策：エルサレムにおける宗教共存の前望的研究

今年度は、博士論文の執筆に多くの時間を費やし、それをより精緻化するための学会報告や現地での追加調査などを行った。まず、日本中東学会では、博士論文の2節分をまとめ報告を行った。ヨルダン王政によるエルサレム問題への関わりを軸に、和平交渉なども含む公的政治のレベルを重点的に取り上げた。報告では、ヨルダン以外の中東諸国を専門とした政治研究者からも建設的なコメントを得ることができ、今後の研究の拡がりを考える上でも有意義な報告となった。続く二つの報告では、博士論文の概要を約めた構想発表をベースとして研究発表を行った。両報告では、エルサレムとヘブロンの二聖都を取り上げ、それらの政治状況の異なりを認識しつつも、その共通性をより重点的に論究した。これまでの研究では、そうした類似性が指摘されるに留まっており、本格的な複数事例研究としては分析がなされてこなかった。いずれの報告においても、二つの事例を同時に取り上げ、共通の枠組みのなかで議論する意欲が評価された。その一方で、歴史的な政治活動の発展径路や、エルサレムという存在の重みといった課題もやはり指摘された。これらの報告は、両者の事例間の関係を改めて考え直す契機となり、博士論文の構想報告として実り多きものとなった。また、平成30年2月、3月には、約1ヶ月の間、エルサレムを中心に博士論文の予備調査を実施した。昨年度までの渡航では、文献資料の収集やその解析を優先的に行ってきたが、今回の渡航では、宗教指導者などを中心に、エルサレムの聖地における信仰実践やその社会生活との結びつきなどに関して聞き取り調査を行った。本渡航による調査で得た情報は博士論文の修正に大いに役立ち、次回以降の調査にも繋がる人的ネットワークの拡張にも成功したと思われる。29年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、研究対象地域におけるフィールド調査および研究成果の発信を行った。研究対象地域におけるフィールド調査は、平成28年9月1日から12月1日までの期間に、ヨルダンおよびイスラエル(パレスチナ自治区)で行い、以下のような成果が得られた。1アラビア語資料の収集:エルサレムのイスラエル国立図書館、ヘブライ大学図書館、その他書店などで、イスラエル領内のパレスチナ人組織が発行した新聞や、エルサレム、聖地をめぐる紛争に関わる書籍を多数入手した。エルサレムのパレスチナ人による政治活動の歴史的展開や運動の指導者が持つ構想などを解明する上での貴重な資料を得ることが出来た。2エルサレムでのインタビュー調査:1967年以降イスラエルが占領支配する東エルサレム地区において、特に聖地が密集する旧市街やその周囲の村落部を中心に、地域密着型の慈善組織を訪問し、組織の活動内容や共同体が直面する課題について聞き取りを行った。政治組織とは一線を画した民衆組織による取り組みの実相が明らかとなり、上記の文献資料を補完する知見を得た。また、研究成果の発信としては、第一に、フィールド調査で得られた一次資料を活かした個別具体的な実証研究を行い、『イスラーム世界研究』への論文投稿などを行った。第二に、こうした具体例の分析と同時に、それらを俯瞰し、広く政治的展開を眺望する視座から分析を進め、同内容の論文を『国際政治』へ投稿した。これらの研究発信は、これまでエルサレムをめぐる紛争の研究で乖離してきた、社会的次元と公的次元における政治の動態を結び付ける作業であり、聖地問題を中心とするエルサレムにおける宗教・政治対立の実相をより体系的に理解する上で大幅な進展があったと言える。平成28年度は、研究対象地域におけるフィールド調査および研究成果の発信を中心に研究活動を進めた。フィールド調査は、平成28年9月12月に、ヨルダン、イスラエル(パレスチナ自治区)において行った。図書館や書店におけるアラビア語資料の収集や、研究対象とするエルサレムでのパレスチナ民衆運動へのインタビュー調査などを通じ、研究上極めて有益な知見を得ることが出来た。全体として、前年度までの渡航で構築された研究のネットワークを活用し、円滑に調査を遂行できたと考えている。研究成果の発表としては、学会誌2誌への投稿とともに3度の学会発表を遂行した。原典資料を用いた個別具体的な実証研究と、マクロな枠組みを意識した理論的分析の両面において成果を発表することが出来た。フィールド調査、研究成果報告のいずれも順調に進行しており、来年度に予定されている博士論文の提出に向けて大幅な前進が見られた。

これらの報告は、両者の事例間の関係を改めて考え直す契機となり、博士論文の構想報告として実り多きものとなった。また、平成30年2月、3月には、約1ヶ月の間、エルサレムを中心に博士論文の予備調査を実施した。昨年度までの渡航では、文献資料の収集やその解析を優先的に行ってきたが、今回の渡航では、宗教指導者などを中心に、エルサレムの聖地における信仰実践やその社会生活との結びつきなどに関して聞き取り調査を行った。本渡航による調査で得た情報は博士論文の修正に大いに役立ち、次回以降の調査にも繋がる人的ネットワークの拡張にも成功したと思われる。平静29年度は同年度11月の博士論文の提出に向け、これまでのフィールド調査で得られた資料の分析・読解に精力的に取り組み、論文の形にまとめることが主たる目的である。論文の完成に向けては、年度前半を中心に博士論文の構想に関する口頭発表を国内外で行い、そこでのコメントなどを論文に反映させ、より完成度の高い論文の執筆に努める。29年度が最終年度であるため、記入しない。
高校における数学学習に支援が必要な生徒の困難性の体系化と指導モデルの開発

高校にも特別な支援が必要な生徒が少なからず在籍し年々増加傾向にある。しかし,彼らへの数学指導での支援は必ずしも効果的に行われておらず十分に成果を上げているとは言い難い状況である。そこで,本研究では彼らの困難性を明らかにし指導モデルを開発する。今年度は以下の研究を行った。(1)高校数学における学習困難等に関する先行研究及び文献を調査し,数学学習に支援が必要な生徒の困難性と支援の現状と課題を明らかにするための質問紙調査,テスト調査及び訪問調査の内容と調査対象校を検討する資料とした。(2)(1)の結果をもとに質問紙調査及びテスト調査を作成し,それらの調査を行う高校等を選定した。選定した高校等で質問紙調査及びテスト調査を行い,それらの結果を分析した。その結果をもとに高校における数学学習に支援が必要な生徒の困難性と支援の現状と課題の一端を明らかにするとともに訪問調査校を選定するための基礎的な資料とした。(3)(2)の結果をもとに,数学学習に支援が必要な生徒への数学指導に意欲的かつ効果的に実践に取り組んでいると考えられる高校等を訪問調査校に選定した。高校における数学学習に支援が必要な生徒の困難性と支援の現状と課題を学校現場の現状分析を通してさらに詳細に明らかにするためにそれらの高校等に訪問調査を行った。訪問調査では,1生徒の困難性の状態,2教師の支援の内容と方法,3実態把握の方法,4評価方法,5ICT活用の状況,6その他の観点でデータ収集を行った。その結果,実際の授業のどの指導場面(学習場面)でどのような困難性があり,それに対してどのような支援が行われているかを指導者と学習者から直接知ることができ,数学学習に支援が必要な生徒の困難性を同定するための基礎的な資料を得ることができた。(4)訪問調査で取集したデータをもとに,数学学習に支援が必要な生徒の困難性を同定し,それらの体系化を図った。先行研究及び文献の調査結果をもとに,調査対象とする高校等を設定し,質問紙調査,テスト調査及び訪問調査をそれぞれ行うことができた。また,それらの結果を分析することで,数学学習に支援が必要な生徒の困難性を同定するための基礎的な資料を得ることができた。さらに,それらをもとに,数学学習に支援が必要な生徒の困難性を同定し,体系化を図った。次年度は,数学学習に支援が必要な生徒の困難性とその体系を精緻化及び構造化するとともに,同定した数学学習に支援が必要な生徒の困難性を改善するための指導モデルを開発する。1年目の研究において,同定することができた高校における数学学習に支援が必要な生徒の困難性を精緻化するとともに構造化を図る。さらに,高校における数学学習に支援が必要な生徒の困難性を改善するための指導モデルをPDCAサイクルで開発する。そのために,指導モデルを開発するための研究協力校を選定し,研究協力を依頼する。開発する指導モデルは,1困難性の実態把握の方法,2困難性の体系化をもとに,各困難性の関連を考慮した支援,3多層指導モデルを参考にした,多数の生徒に見られる困難性(第1層),少数の生徒に見られる困難性(第2層),特定の生徒に見られる困難性(第3層)に対する多層的な支援,4指導の評価の方法,5ICTの活用の5点を検討し開発を行う。また,数学に関する側面(数学的な意味や概念,数学的な見方や考え方,数学的活動など)と学習者に関する側面(認知特性の分析,方略の選択的採用,動機づけ,メタ認知など)にも留意し,指導モデルの開発を行う。

先行研究及び文献の調査結果をもとに,調査対象とする高校等を設定し,質問紙調査,テスト調査及び訪問調査をそれぞれ行うことができた。また,それらの結果を分析することで,数学学習に支援が必要な生徒の困難性を同定するための基礎的な資料を得ることができた。さらに,それらをもとに,数学学習に支援が必要な生徒の困難性を同定し,体系化を図った。次年度は,数学学習に支援が必要な生徒の困難性とその体系を精緻化及び構造化するとともに,同定した数学学習に支援が必要な生徒の困難性を改善するための指導モデルを開発する。1年目の研究において,同定することができた高校における数学学習に支援が必要な生徒の困難性を精緻化するとともに構造化を図る。さらに,高校における数学学習に支援が必要な生徒の困難性を改善するための指導モデルをPDCAサイクルで開発する。そのために,指導モデルを開発するための研究協力校を選定し,研究協力を依頼する。開発する指導モデルは,1困難性の実態把握の方法,2困難性の体系化をもとに,各困難性の関連を考慮した支援,3多層指導モデルを参考にした,多数の生徒に見られる困難性(第1層),少数の生徒に見られる困難性(第2層),特定の生徒に見られる困難性(第3層)に対する多層的な支援,4指導の評価の方法,5ICTの活用の5点を検討し開発を行う。また,数学に関する側面(数学的な意味や概念,数学的な見方や考え方,数学的活動など)と学習者に関する側面(認知特性の分析,方略の選択的採用,動機づけ,メタ認知など)にも留意し,指導モデルの開発を行う。
キンギョヘルペスウイルスに対する耐病性機構の解明による選抜育種バイオマーカー開発

キンギョヘルペスウイルス病耐性魚における耐病性機構の解明と選抜育種に利用可能なバイオマーカーの開発を目的とした。鰭由来初代培養細胞では、耐病性魚の感受性が有意に低いことが判明した。耐病性魚は、感染3日頃までは感受性魚と同様なウイルス増殖を示したが、その後ウイルス量は減少に転じた。宿主応答ではMHC class Iの遺伝子発現量が耐病性魚で感染前から高いことが判明した。この耐病形質はメンデルの優性遺伝を示し、さらに1対1交配群においてGBS解析を行ったところ、耐病形質と有意に相関するSNPが得られた。選抜バイオマーカーとしてMHC Iの定量PCR法とマーカーSNPを判別するHRM法を開発した。1)ウイルス感染・増殖促進する標的組織成分とその作用機序の特定:腎臓抽出液のウイルス増殖促進効果について、耐病系統と感受性系統で差違があるのか調べたるため、両系統魚の腎臓抽出液と尾鰭の培養細胞を作出した。感受性系統由来細胞の方が耐病系統由来細胞よりも10倍程度感受性が高かった。また、腎臓抽出液の添加効果をこの鰭細胞で調べたところ、いずれの組み合わせにおいても同程度のウイルス増殖促進効果が認められた。このことから、このウイルス増殖促進物質が直接的に耐病性と関わっている可能性は低いと判断された。2)トランスクリプトーム解析による発現遺伝子の解明:耐病系統と感受性系統を供試し、ウイルス浸漬感染後の魚体内ウイルス動態を定量PCR法により経時的に調べたところ、感受性魚では鰓や鰭という体表組織での一次増殖がまず起こり、ついで標的器官である腎臓などでの増殖が起こって死に至った。一方、耐病系魚ではこの一次増殖部位での増殖が少なく、標的臓器でもウイルスが増えないことが分かった。以上のことから、耐病系魚では、一次増殖部位での増殖が少なく、その結果、血流で標的細胞に運ばれるウイルス量も少ないことに加え、腎臓等の標的細胞の感受性が低いことから、相乗的にウイルスが魚体内で増殖することなく、耐病性を示すと考えられた。3)単離される耐病性候補遺伝子の耐病形質との相関性の解明:昨年度に作製した耐病成魚×感受性魚の交配稚魚(F1)を用いたF1×F1によるF2稚魚およびF1×感受性魚の戻し交配稚魚を作製しウイルス感染による死亡率を調べたところ、F2稚魚では約20%、戻し交配稚魚では約50%の死亡が認められた。このことから耐病形質は、メンデル遺伝し、優性形質を有することが判明した。また、♂耐病性魚×♀3倍体クローンギンブナとの4倍体雑種交配では、2交配群の作製に成功したがウイルス感染後の耐過魚は得られなかった。1)本課題では、標的である腎臓の抽出液中のウイルス増殖促進物質に注目していたが、耐病系と感受性系の魚から準備した抽出液と鰭由来細胞の組み合わせによる試験から、この物質が直接的に耐病性と関わっている可能性は低いことが判明した。当初の作業仮設が否定されたが、これによる課題進行の遅滞はなく、細胞の感受性の違いの方が大きいことが判明してきたので、今後、この解析に重点を置くこととする。2)耐病系統と感受性系統を供試し、浸漬法と注射法によるウイルス感染後の魚体内ウイルス動態を定量PCR法により経時的にウイルスDNAコピー数を計測したところ、耐病性形質の発揮においては、ウイルス感染直後の一次増殖が重要であり、加えて標的細胞の感受性が重要と推察され、次年度のトランスクリプトーム解析の時期と部位を絞り込むことができ、計画通り順調に進行している。3)計画通りF2稚魚と戻し交配稚魚での感染実験による形質の判定を実施でき、耐病形質は、メンデル遺伝し、優性形質を有することが判明し、予想以上にクリアーなデータが得られ、順調に耐病形質の解明進んでいる。また、♂耐病性魚×♀3倍体クローンギンブナとの4倍体雑種交配では、計画通り作出して感染実験を行ったが、全数死亡し、目的とする耐過魚が得られなかった。3倍体の染色体に1つの染色体を耐病魚から持ち込んだ交雑魚はすべて弱い可能性が濃厚であるが、その判定を下すには交配数が少ないことから、慎重を期して再度交配数を増やして確認する予定とするが、計画の遅滞にはならない。1)ウイルス感染・増殖促進する標的組織成分とその作用機序の特定:種々の臓器を用いてウイルス増殖促進物質をキンギョ由来細胞で測定すると、筋肉で若干低いもの腎臓、脾臓、肝膵臓、心臓でも4000倍程度まで希釈しても効果があることが判明した。また、コイ由来細胞を用いた場合でも効果があった。さらに、コイの体腎抽出液にも増殖促進効果があることが判明した。2)トランスクリプトーム解析による発現遺伝子の解明:耐病系魚では、体表や鰓での一次増殖部位での増殖が少なく、また標的細胞での増殖も少ないことが特徴であることが判明し、これらの部位に行ける免疫関連遺伝子等の発現を調べた。現在、データを解析中で、耐病系統に特異的な動態を示す遺伝子の抽出を行う。3)単離される耐病性候補遺伝子の耐病形質との相関性の解明:一昨年度に作製した耐病性魚×感受性魚の交配稚魚(F1)を用いたF1×感受性魚の戻し交配稚魚を4群作製し、この交配群をウイルス感染させたところ、予想通り死亡率が50%程度となった。

これら交配群の内、1群を用いてその死亡魚と生残魚に分け、Genotyping by sequencing(GBS)よるSNPの分離とQTL解析を実施した結果、一つの連鎖群で耐病・感受性に関わる有意なSNPが得られた。また、♂耐病性魚×♀3倍体クローンギンブナとの4倍体雑種交配を作製し、ウイルス攻撃したところ、21尾の生残魚が得られた。今後、これらを親魚に育成して、雌性発生させることにより4nクローン魚を得る。1)本課題では、標的である腎臓の抽出液中のウイルス増殖促進物質に注目しているが、計画に従って特性評価を行ったところ、キンギョの他の臓器、心臓や肝膵臓にも活性があることが分かり、また、ウイルス感染測定系としてコイの細胞を用いたときでも同様に効果が見られ、さらには、コイの腎臓抽出液中にも活性が認められることも判明した。耐病形質とは関連しそうもないが、ウイルスの感染・増殖という点で大変興味深い結果であり、今後、何かの機会にさらなる検討を進めることしたい。2)耐病系魚では、体表や鰓での一次増殖部位での増殖が少なく、また標的細胞での増殖も少ないことが特徴であることが判明し、これらの部位に行ける免疫関連遺伝子等の発現を調べた。現在、データを解析中であるが、計画通り順調に進行している。3)50%程度の死亡率となるF1×感受性魚の戻し交配稚魚を作製し、Genotyping by sequencing(GBS)よるSNPの分離とQTL解析を実施したところ、一つの連鎖群で耐病・感受性に関わる有意なSNPが得られた。メンデルの優性遺伝を示し、一遺伝子座が予想されていたことと合致しており、今後、このSNPマーカーを使ってさらに他の供試魚群についても確認していくとともに、近傍のDNA配列も取得していく。また、♂耐病性魚×♀3倍体クローンギンブナとの4倍体雑種交配では、今年度は感染生残魚が出たことから、これらについても計画通り子供の4nクローンを取って、耐病形質があるか、SNPマーカーが入っているかどうかも含めて検討を進める。この課題も大変興味深い成果が出ており、計画通り順調に進行している。2ー3)耐病系魚と感受性魚における発現遺伝子の解明耐病性アズマニシキ系統と感受性ワキンの感染後の免疫関連遺伝子の発現を調べたところ、耐病性魚では、臓器内ウイルスDNAコピー数が感染5日後に減少に転じ、このときにMHCクラスI遺伝子の発現が有意に高いことが判明した。さらに、感染前の状態でのこの遺伝子発現量は、耐病性アズマニシキ系統魚で感受性ワキンよりも数倍高いことも判明した。3ー3)単離される耐病性候補遺伝子の交配家系での耐病形質との相関性の解明昨年度、GBSによる(耐病性アズマニシキ×感受性クロデメキン)F1×感受性クロデメキンの戻し交配群における連鎖解析で得られたSNPは、ある遺伝子上にあることが判明した。このSNPのPCRプライマーの設計とHRM法での分析法を構築し、分析個体数を増やして検討を行った。その結果、F1を雄親とした交配群では平均して生残魚の95.4%が該当のSNPをヘテロ接合で持ち、死亡魚のうち平均97.9%は持たなかった。一方、F1を雌親とした交配群では平均して生残魚の67.5%が該当のSNPをヘテロ接合で持ち、死亡魚の平均72.9%は持たなかった。雄親の選抜の際にはこのSNPが耐病性の遺伝マーカー候補になりうると考えられた。4)耐病性選抜育種に利用可能なバイオマーカー開発耐病性アズマニシキを判別するSNPマーカーを分析するHRM法等が開発できた。
中世における医事的教養の研究-医事説話を中心に-

『医談抄』の注釈に関しては、先年度までの作業でおおまかな作業を終えていた本文・注釈の原稿に入念なチェックと最終的な加筆を行い、原稿を完成した。また、『医談抄』所収の説話と、原拠となった中国説話を収載する中国の医事書との関係、『医談抄』の筆者である惟宗具俊の周辺の医家の人々の活動、現存『医談抄』の筆者に関わった江戸後期の尾張藩医浅井氏周辺の人々の活動などについて調査して解説原稿を作成し、『伝承資料文学集成』の一冊として刊行するに至った。同書に於いて、『医談抄』の校訂を加えた本文と、『医談抄』の出典について網羅的に調査した注釈を載せる他、解説として、近世写四本の位置づけと書写相、丹波氏、和気氏、惟宗氏の人々の系譜と活動、『医説』『太平御覧』『太平広記』『証類本草』をはじめとする中国の医事書、類書、本草書と『医談抄』の関係などを論じることができた。また、『医談抄』の解釈ほかを通じて、医事説話の根幹をなす思考様式は、たとえば医術と霊異の関係について、霊異さえも物理的合理性の範疇において解釈し対処しようとすることに代表されるような、一種の合理主義であることなどが明らかになった。さらに、『医談抄』周辺の研究によって、鎌倉時代の宮廷医の実態についても触れることができた。『大同類聚方』『医家千字文注』など、平安から鎌倉期にかけての医術と密接に関係があり、医事説話研究に必須の資料となる諸作品については、各地に訪書を行い、写真ほかによって情報を収集した。また、「伝屍病」についてもいくつかの原本資料にあたることができた。これらについては、今のところ研究成果を活字化することはできていないが、いずれ資料の翻刻、論考などを学術雑誌に発表する予定である。鎌倉後期の宮廷医である惟宗具俊によって書かれた医事随筆である『医談抄』の本文ならびに内容についての調査研究を行なった。同書は中国の宋時代に新たな進展を見せた中国古典医学の影響を受けて書かれたものと思われる。とくに医術ではなくて宮廷医の心得ておかなければならない知識と教養への興味によって書かれたものである。著作の直接のきっかけを与えたものは宋時代の医事百科事典ないし医事随筆ともいえる張の著作『医説』であったらしい。それに刺激されて医術書ではない医事随筆ともいえる本書が書かれたことが推定される。本書はほとんど中国の古典医学書に記される知識と教養のモザイクのような内容である。そこで、その実態を明らかにすべく『医説』のほか『千金方』『諸病原候論』『証類本草』などを中心に中国古典医学書、『太平広記』『太平御覧』などの類書、さらに『史記』『漢書』『後漢書』などの史書などに典拠を求めた。また日本の医事書としては後代の規範となった大部の医学書である平安中期の丹波康頼著『医心方』また鎌倉後期の惟宗時俊著『医家千字文注』などからの影響関係も確かめている。これには大きく分けて二点の目的がある。第一は現存の『医談抄』の伝本が新しいもので、そのままでは学術的に本文を使用できないほどの誤りがある。それで学術的な使用にたえる本文を典拠との関係において確定すること、第二は鎌倉後期の宮廷医の知識と教養の幅を『医談抄』の典拠を明らかにすることを通して知ること、以上の二点を明らかにしつつある。

鎌倉時代後期に宮廷医の惟宗具俊が著した『医談抄』を、『伝承文学研究資料集成』(三弥井書店刊)の一冊として刊行すべく文献学的研究を続けてきた。彦根城博物館、竜谷大学図書館、京都大学図書館、杏雨書屋、尊経閣文庫、京都府立総合資料館そのほかの文庫・図書館を訪問し資料収集にあたった。また月例会および夏季休暇中の集中合宿において各自が分担してまとめた作業成果をもちより研究討議を行なった。その結果、今年1月末にあらあらの作業を終えて、3月末を脱稿の時期として鋭意、執筆にあたっている。ただ、執筆を続けるうちに気付いた不備不足を再調査によって補う必要があるため、脱稿の時期は5月にずれこむ可能性が高い。秋の中世文学会の時期までに刊行できることは間違いない。書物は、(1)出典調査によって得たところの出典および周辺の書物の詳細な注記そして出典本文との比較による本文の誤脱の注記を付した、研究者の使用に耐える『医談抄』の翻刻本文、(2)出典および周辺の書物の本文、(3)『医談抄』論、『医談抄』を中心に据えての医事説話論、中世の宮廷医の教養世界の概観、それらを内容とする解説、とからなる。中国宋時代の新しい中国医学とその刊行書が鎌倉時代に輸入されるなかで、従来の古典医学書と新渡の医学書(特に『医説』)からの説話的また医術的な知識がモザイクのように組み合わされて医事説話集としての『医談抄』は成っている。そこには、他の説話世界でほとんど姿を見せない『太平御覧』『太平広記』がしきりに利用されてもいる。われわれの研究書はその様相を逐一に示すことを通して、説話文学研究の分野でも医学史研究の分野でも面白い知見を提供することのできる書物になるはずである。『医談抄』の注釈に関しては、先年度までの作業でおおまかな作業を終えていた本文・注釈の原稿に入念なチェックを行い、最終的な加筆を行って原稿を完成した。また、『医談抄』所収の説話と、原拠となった中国説話を収載する中国の医事書との関係、『医談抄』の筆者である惟宗具俊の周辺の医家の人々の活動、現存『医談抄』の筆者に関わった江戸後期の尾張藩医浅井氏周辺の人々の活動などについて調査して解説原稿を作成し、『伝承文学資料集成』の一冊として刊行するに至った。同書に於いて、『医談抄』の校訂を加えた本文と、『医談抄』の出典について網羅的に調査した注釈を載せる他、解説として、近世写四本の位置づけと書写相、丹波氏、和気氏、惟宗氏の人々の系譜と活動、『医説』『太平御覧』『太平広記』『証類本草』をはじめとする中国の医事書、類書、本草書と『医談抄』の関係などを論じることができた。また、『医談抄』の解釈ほかを通じて、医事説話の根幹をなす思考様式は、たとえば医術と霊異の関係について、霊異さえも物理的合理性の範疇において解釈し対処しようとすることに代表されるような、一種の合理主義であることなどが明らかになった。さらに、『医談抄』周辺の研究によって、鎌倉時代の宮廷医の実態についても触れることができた。『大同類聚方』『医家千字文注』など、平安から鎌倉期にかけての医術と密接に関係があり、医事説話研究に必須の資料となる諸作品については、各地に訪書を行い、写真ほかによって情報を収集した。また、「伝屍病」についてもいくつかの原本資料にあたることができた。これらについては、今のところ研究成果を活字化することはできていないが、いずれ資料の翻刻、論考などを学術雑誌に発表する予定である。
咬合に起因するくさび状欠損の形成機序の三次元有限要素法による究明と対策法の検討

くさび状欠損の発生メカニズムの一つに咬合説(abfraction)が考えられており、有限要素法による応力解析法を用いて咬合力により歯に生じる応力が集中する部位とくさび状欠損の発生が認められる歯頚部と一致するという点から解釈する報告がこれまで多く行われている。しかし、今までの研究の多くは、二次元モデルを用いており、特有な歯の解剖学的形態や複雑な咬合形態(咬合圧や接触部位)などが三次元的にモデル化できないことから、二次元的に応力集中部位を示すのみの解析結果となっている。そこで、今回は、咬合面による荷重を負荷した後に生じた歯頸部の変形状態からくさび状欠損の発生を検討することにした。まず,ヒト歯のマイクロCTイメージから三次元有限要素(FE)モデルの構築を行い,数値モデルの妥当性を検討した.その後,口蓋側咬頭頂、近心辺縁隆線および遠心辺縁隆線の3箇所を荷重荷部位とし、荷重部位ごとの荷重の割合を変化させるとともに、負荷方向は歯軸方向(0度)、頬舌方向に15,、30、45度と傾斜させ、近心側から頬側をわたって遠心側までの歯頸部セメントエナメル境(CEJ)に沿ったエナメル質内に発生する主応力の分布を検討した。1)ヒト歯のマイクロCT像から特有な歯の解剖学的形態を有する三次元FEモデルを構築できた.2)構築モデルを用いた有限要素解析によるひずみの解析値とストレンゲージ実測値を比較することにより構築した数値FEモデルの妥当性を確認することができた。3)CEJに沿った歯頸部エナメル質に発生する最大主応力は負荷方向の傾斜の増加により引張応力が増大するが、負荷部位の増加や荷重割合の調整によって、歯頸部に発生する引張応力は軽減でき、くさび状欠損の形成につながる引張応力を抑制することが可能であることが示唆された。そこで、今回は、咬合による荷重を負荷した後に生じた変形状態からくさび状欠損の発生を検討することを目的に、ヒト歯のマイクロCTイメージから三次元有限要素(FE)モデルの構築を試みた。さらに歯のひずみをひずみゲージにより測定し、両者の結果を比較することで、構築したFEモデルの妥当性を検討した。(結果)CTスライス断面白黒濃淡画像から歯表面、象牙質、歯髄についてそれぞれ領域の2値化閾値を設定して2値化画像に変換し、それぞれの部位の三次元輪郭点群データの抽出を行った。この点郡データを点群処理ソフトに部位ごとに取り込み、点群データの間引き、点群編集、ポリゴン処理、サーフェス処理などを行い、三次元CADモデルを部位ごとに作成した。さらに、CADソフトに取り込み、エナメル質部位の抽出、ジメトリの修正などを手作業で順次行い、その後、全体の組み合わせを行い最終的にエナメル質、象牙質、歯髄の3閉空間からなる歯の三次元ソリッドモデルを作成した。構築したFEモデルの総要素数は20773、総節点数は30718であった。主弾性ひずみの解析値と実験値との相関係数は0.88であった。

以上の結果から、ヒト歯のマイクロCT像から三次元FEモデルを構築でき、ひずみの解析値と実測値を比較することによりFEモデルの妥当性を確認することができた。くさび状欠損の発生に関与する歯頸部の応力分布の解析に用いられている有限要素法解析モデルの多くは、二次元モデルであり、歯の特有な解剖学的形態や複雑な咬合負荷状態などが三次元的にモデル化されていない。また、咬合負荷は1点接触のみの研究がほとんどであり、複数の負荷部位による接触や異なる負荷度合いによって歯頸部に生じる応力の分布状態はまだ不明である。そこで、今回はヒト抜去上顎第二小臼歯のCT像を元に作成した三次元有限要素モデルを用いて、口蓋側咬頭頂、近心辺縁隆線および遠心辺縁隆線の3箇所を荷重の負荷部位とし、負荷部位ごとに荷重の割合を変化させるとともに、負荷方向は歯軸方向(0度)、頬舌方向に15、30、45度と傾斜させ、近心側から頬側をわたって遠心側までの歯頸部セメントエナメル境(CEJ)に沿ったエナメル質内に発生する主応力の分布を検討した。(1)口蓋側咬頭頂のみに荷重を加えた時、負荷角度の増加につれて、遠心-頬-近心側のCEJに現れる引張主応力は増大し、45度の時に最大値に達した。また、引張応力のピークは頬側歯頸部の中央より近遠心側に偏る両サイドに大きく現れた。(2)近心辺縁隆線または遠心辺縁隆線の部位に口蓋側咬頭頂と同時に負荷すると、45度の場合では応力の減少はみられるが、0度の場合ではむしろ増大した。しかし、3点に同時負荷では、負荷方向に関係なく、歯頸部の引張主応力は減少し、特に0度ではほとんど消失した。(3)3点負荷時の荷重割合を変化させると、引張応力も減少傾向になることが認められた。以上のことから、CEJに沿った歯頸部エナメル質に発生する最大主応力は負荷方向の傾斜の増加により引張応力が増大するが、負荷部位の増加や荷重割合の調整によって、歯頸部に発生する引張応力は軽減でき、くさび状欠損の形成につながる引張応力を抑制することが可能であることを示唆された。
骨格筋由来成体幹細胞からの褐色脂肪細胞創出による肥満の予防法開発

成人において抗肥満効果を持つ褐色脂肪細胞の創出を狙った基礎研究を行った。成体骨格筋に由来する間葉系幹細胞が高い褐色脂肪分化能を持つことを示し、新生褐色脂肪細胞の供給源として有力であることを明らかにした。また、この間葉系幹細胞がヒト成人においてほとんど消失してしまう褐色脂肪組織とは異なる発生学的起源を持つこと、そして、実際ヒト成人骨格筋にも存在していることを突き止めた。さらに、間葉系幹細胞の分化効率を向上させるための遺伝子導入系を確立した。本研究では、骨格筋組織に由来する成体幹細胞に褐色脂肪細胞の発生、分化に重要な転写因子を導入することにより、新生褐色脂肪細胞を誘導することを目的に以下の実験を実施した。骨格筋からフローサイトメーターを用いて2種類の幹細胞、筋衛星細胞と間葉系幹細胞を高純度に分取し、in vitro、in vivoで脂肪分化能を評価した。その結果、筋衛星細胞は脂肪細胞に全く分化しないが、間葉系幹細胞は非常に効率よく脂肪に分化することを見出し、その成果を論文報告した。次いで、筋衛星細胞と間葉系幹細胞からRNAを調整し、マイクロアレイにより網羅的遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現解析ソフトを用いて、筋衛星細胞に特異的に発現している17の内在性転写因子、間葉系幹細胞に特異的に発現している11の内在性転写因子を同定した。そのうちのいくつかに関してRT-PCRにより発現を確認した。その中でも、間葉系幹細胞特異的内在性転写因子に褐色脂肪細胞形成に関連する正の転写因子Foxc2が含まれていたことは非常に興味深い。さらに興味深いことには、間葉系幹細胞から分化させた脂肪細胞の遺伝子発現を解析したところ、褐色脂肪細胞分化に重要なPRDM16や褐色脂肪マーカーであるUCP-1の発現が確認された。これらの結果から、筋衛星細胞に比べ間葉系幹細胞は脂肪分化能が圧倒的に高く、遺伝子導入等の人工的操作を介さずに褐色脂肪細胞へと分化誘導可能であることが示された。これらの成果を受け、来年度以降は間葉系幹細胞にターゲットを絞り、効率のよい褐色脂肪細胞の分化法確立を目指す予定である。脂肪細胞にはエネルギーを脂肪として蓄える白色脂肪細胞と、熱産生によりエネルギーを消費する褐色脂肪細胞が存在する。褐色脂肪細胞はそのエネルギー消費特性から抗肥満作用が期待されている。研究代表者はこれまで、骨格筋組織内に高い脂肪分化能を有した間葉系前駆細胞の同定に成功しており、その間葉系前駆細胞が褐色脂肪への分化能も有していることを明らかにしている。間葉系前駆細胞の褐色脂肪細胞への誘導効率を高める目的で、誘導法の検討を行ってきた。これまでに、褐色脂肪細胞形成に重要な転写因子を導入するためのレンチウィルスの実験系を立ち上げ、間葉系前駆細胞への高効率な遺伝子導入に成功している。今回、導入遺伝子の発現をより厳密に制御する目的で、Tet-onシステムによる誘導型レンチウィルスを作製した。作製された誘導型レンチウィルスは間葉系前駆細胞への高い感染率を示し、また、導入遺伝子のDoxによる厳密な発現制御が可能であった。さらに、PRDM16をはじめとした褐色脂肪細胞形成を正に制御する転写因子をクローニングし、レンチウィルスベクターを作製した。これらを利用し、褐色脂肪細胞への誘導効率向上を検討していく予定である。最近、細胞系譜追跡実験により褐色脂肪組織は筋関連転写因子myf5を発現する系譜の細胞から発生することが明らかにされたが、我々が同定した間葉系前駆細胞はmyf5-CreマウスやMespl-Creマウスを用いた細胞系譜追跡実験により、myf5系譜や中胚葉由来ではないことが明らかになった。また、我々はヒト成人の骨格筋においても間葉系前駆細胞の同定に成功した。褐色脂肪組織はヒト成人においてほとんど消失してしまうため、間葉系前駆細胞がそれとは異なる発生学的起源を持ち、実際ヒト成人骨格筋に存在していたことの臨床的意義は大きい。最近の細胞系譜追跡実験により、褐色脂肪組織が骨格筋系譜細胞と同じ発生学的起源を持つことが示され(Seale et al., Nature, 2008)、褐色脂肪細胞と骨格筋系譜細胞の類似性が注目されている。しかし、成体における骨格筋系譜幹細胞である筋衛星細胞の脂肪分化能は、研究代表者が同定した間葉系前駆細胞に比べると著しく低く、間葉系前駆細胞が成体において褐色脂肪細胞の細胞源として有望であることを明らかにした。

このPDGFRα陽性前駆細胞の発生学的起源を調べるため、細胞系譜追跡実験を行ったところ、神経堤に由来することが明らかになった。褐色脂肪組織はヒト成人においてほとんど消失してしまうが、成体において褐色脂肪細胞を生み出すPDGFRα陽性前駆細胞がそれとは異なる発生学的起源を持つことを明らかにした本研究の臨床的意義は大きい。
超対称模型におけるフレーバーの物理の研究

超対称模型におけるフレーバーの問題を解決する模型として、ゲージ伝搬模型がある。我々は、超対称CPの問題も合わせて解決するminimal gauge mediation(MGM)模型に着目し、現在のフレーバーの物理の観測結果(ミューオンの異常磁気能率やb→sγなど)からこの模型に制限を与えた。その結果10の5乗GeV程度で超対称性の破れが生じる模型が観測とよく合うことがわかった。このことは今後の超対称性探索において重要な結果である。10の5乗GeV程度で超対称性の破れが生じる模型は宇宙論的な問題をうまない軽いグラビティーノを予言する。そういった模型を実現するアイデアの1つに準安定真空で超対称性の破れを実現することがある。我々は準安定真空の量子論的安定性から模型に制限を与え、宇宙論的に問題を生まない軽いグラビティーノを予言することからスカラークォークの質量に対して上限を与えた。クォークセクターにおいて、CP位相をもつフレーバー転換項は原理的にハドロンの異常電気双極子能率(EDM)に寄与を与えている。標準模型においては、CKM位相が唯一のCP位相であり、EDMへの寄与が小さいことがわかっている。よって、EDMは標準模型を超える理論に存在する拡張されたフレーバー構造に対して感度を持つことを意味する。我々は、超対称標準模型を仮定し、そこで存在しうるフレーバー数保存およびCP対称性両方を破るスクォークの質量項を起源とするハドロンのEDMの評価を行なった。特に、荷電ヒッグスボゾン交換によって2ループのダイアグラムで生じる寄与に注目した。この寄与は、超対称粒子の1ループで生じる寄与のように超対称粒子の質量を十分重くしても抑制されず、また標準的な超対称粒子がヒッグスボゾンと同程度の質量のときでも1ループに対して遜色ない寄与を与える。このことはハドロンのEDMの探索が、パラメータの広い範囲で超対称模型に存在するスクォークのフレーバー数非保存の質量項に対して感度があることを意味する。最も単純な超対称標準模型において、ゲージーノのマヨラナ質量やスカラー場の2点および3点結合といった超対称性の敗れに存在するCP位相は、ハドロンおよびレプトンの異常電気双極子能率に寄与を1ループで寄与与え、現象論的に問題があることが知られている。この問題は超対称CP問題と呼ばれている。この問題を最も単純な超対称標準模型において解決するためには、超対称粒子の質量が10TeVにあるか、もしくは何らかの理由にCP位相が小さいことが要請される。我々は超対称標準模型を拡張することでCP位相が自動的に小さくなる可能性を議論した。もし、ゲージーノがディラック質量をもち、マヨラナ質量が十分に小さい場合にはEDMが十分に小さくなることを示した。
光受容蛋白質ロドプシンに見るG蛋白質共役型受容体の活性化状態形成機構の最適化

VA/VALオプシンは分子系統樹上において、脊椎動物型視物質が多様化する前に分岐したと考えられる蛋白質であり、その性質を決定することで脊椎動物型視物質に共有される性質が、祖先型蛋白質が進化する過程のどの段階で獲得されたかについて情報を得られると考えた。これまでの知見として、脊椎動物型視物質と、無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンの性質を比較すると、脊椎動物型視物質の活性状態は紫外部に、無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンなどの活性状態は可視部に吸収極大があることが知られている。さらに無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンの活性状態に特有の性質として、直接全トランス型レチナールと結合しても形成されること、光があたると不活性な状態に戻ることが知られている。また、G蛋白質活性化効率を比較すると無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンの活性化効率は脊椎動物型ロドプシンの1/50から1/20程度であると言われている。アフリカツメガエルのVALオプシンの性質を調べた結果、全トランス型レチナールの直接結合能は極めて低く、活性状態は光に対して非感受性である一方でその吸収極大は可視波長にあり、且つそのG蛋白質活性化効率はウシロドプシンと比較しておよそ1/5程度であった。これらの結果はVALオプシンの活性状態はある部分において脊椎動物型視物質に近く、ある部分においてパラピノプシンや無脊椎動物型ロドプシンに近いことを示す。この結果から、無脊椎動物型ロドプシン様の活性化メカニズムを持つオプシンから脊椎動物型視物質様の活性化メカニズムを持つオプシンへの変遷は段階的に起こったものであり、その途上にある祖先型蛋白質からVALオプシンが分岐して現れた可能性が考えられる。さらに、活性状態の性質の変化に対応する重要なアミノ酸の置換が複数存在することが考えられる。ロドプシンはG蛋白共役型受容体(GPCR)の1種で、そのうちファミリー1と呼ばれるグループに属する。ファミリー1では細胞質側にD/ERYモチーフと呼ばれる3つのアミノ酸が保存されている。脊椎動物のロドプシンにおいてその最初のグルタミン酸に当たるE134はグルタミンに変異させることで構成的活性化能の上昇をもたらすことや、野生型で見られる外液からのプロトン取り込みが消失することが知られている。このE134がロドプシンの活性状態MetaIIとその前駆体MetaIの平衡のpH依存的な性質を制御する残基であると推定し、網羅的に変異体を作成した。そのMetaI/MetaIIの平衡のpH依存性を測定した結果、134番目の残基をグルタミン酸とアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換した場合、特徴的なpH依存性が消失することが判明した。このことから、MetaI/MetaIIのpH依存的な平衡は、134番目の位置にあるカルボキシル基が外液環境とプロトンをやりとりすることで制御されると考えられた。さらに、ロドプシンの近縁の蛋白質である錐体視物質錐体視物質の活性中間体のpH依存性を解析し、配列を比較することでロドプシンのMetaI/MetaIIの平衡を制御する残基を絞り込む事を試みた。試料としてニワトリ由来緑感受性視物質(ニワトリ緑)、ニワトリ青、ニワトリ紫、サル赤、そしてウシロドプシンを用いて解析を行った。結果、ニワトリ緑、ニワトリ青、ニワトリ紫においてウシロドプシンと同様に脱プロトン化シッフ塩基を持つ活性状態が低pHにおいて安定化されることが観測された。今後これらの蛋白質の配列に共通のアミノ酸を解析することでさらなる研究の進展が得られると考えられる。ロドプシンの活性状態が持つ特異なpH依存性をもたらすアミノ酸残基を特定するため、前年度に引き続き近縁のタンパク質である錐体視物質の活性中間体のpH依存性を解析した。前年度までにニワトリ由来緑感受性視物質(ニワトリ緑)、ニワトリ青、ニワトリ紫においてウシロドプシンと同様に脱プロトン化シップ塩基を持つ活性状態が低pHにおいて安定化されることが既に示されたため、今年度は、長波長感受性グループに属するサル緑について同様の解析を行った。このグループに属する視物質は発色団近傍に塩化物イオンが結合して波長制御することが知られており、イオン環境が中間体の性質にも影響を与えている可能性があるので、塩化物イオン結合型・硝酸イオン結合型のそれぞれについて解析した。結果、硝酸イオン結合型は他の錐体視物質と同様に脊椎動物ロドプシン型のpH依存性を示した。一方、塩化物イオン結合型においてはpH依存性が消失するという結果が得られた。つまり桿体・錐体問わず脊椎動物視物質は活性中間体は共通のpH依存性を示すが、サル緑が属するグループにおいては塩化物イオンの結合がその性質を消失させると考えられた。さらにこの結果に基づきアミノ酸配列を比較し、重要であると考えられたアミノ酸についてウシロドプシンの変異体を作製、解析を行った。結果、Trp126とPro180をそれぞれCysとLeuに置換した場合、pH依存性の消失及びGタンパク質活性化効率の低下が見られた。しかし一方で、無脊椎動物型の性質を示すことが知られるヤツメウナギパラピノプシンの対応する残基(Cys126、Leu180)をそれぞれTrp、Proに置換しても活性状態の性質やGタンパク質の活性化能に変化は見られなかったことから、この2つの残基はロドプシンの活性状態の性質を決定づけるのに必要な構成要素ではあるが、この2つだけでは十分でないと考えられた。

VA/VALオプシンは分子系統樹上において、脊椎動物型視物質が多様化する前に分岐したと考えられる蛋白質であり、その性質を決定することで脊椎動物型視物質に共有される性質が、祖先型蛋白質が進化する過程のどの段階で獲得されたかについて情報を得られると考えた。これまでの知見として、脊椎動物型視物質と、無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンの性質を比較すると、脊椎動物型視物質の活性状態は紫外部に、無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンなどの活性状態は可視部に吸収極大があることが知られている。さらに無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンの活性状態に特有の性質として、直接全トランス型レチナールと結合しても形成されること、光があたると不活性な状態に戻ることが知られている。また、G蛋白質活性化効率を比較すると無脊椎動物型ロドプシンやパラピノプシンの活性化効率は脊椎動物型ロドプシンの1/50から1/20程度であると言われている。アフリカツメガエルのVALオプシンの性質を調べた結果、全トランス型レチナールの直接結合能は極めて低く、活性状態は光に対して非感受性である一方でその吸収極大は可視波長にあり、且つそのG蛋白質活性化効率はウシロドプシンと比較しておよそ1/5程度であった。これらの結果はVALオプシンの活性状態はある部分において脊椎動物型視物質に近く、ある部分においてパラピノプシンや無脊椎動物型ロドプシンに近いことを示す。この結果から、無脊椎動物型ロドプシン様の活性化メカニズムを持つオプシンから脊椎動物型視物質様の活性化メカニズムを持つオプシンへの変遷は段階的に起こったものであり、その途上にある祖先型蛋白質からVALオプシンが分岐して現れた可能性が考えられる。さらに、活性状態の性質の変化に対応する重要なアミノ酸の置換が複数存在することが考えられる。