hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スパース学習に基づく情報統合型多変量統計手法の研究

データ間の構造学習と得られた構造に基づく予測を同時に可能とする,情報統合型統計的モデリング手法の理論・方法論の開発研究に取り組んだ.特に,主成分分析モデルと回帰モデルを統合した1段階法による主成分回帰モデルを軸として研究を進め,スパースモデリングやオンライン学習に基づくデータ解析手法を提案するとともに,スパースモデルに含まれる調整パラメータの選択方法を情報量およびベイズ理論の観点から開発することができた.開発したモデリング手法は,コンソミック系統マウスデータを含む様々な実データに応用した.本年度においては,まず,連続変数および離散変数を扱うことが可能なスパース主成分回帰モデルの研究に取り組んだ.連続変数に対しては,2乗損失関数と主成分損失関数に基づきモデルを構成し,その損失関数にスパース正則化を課すことにより,変数選択ならびにパラメータの一意性を保証したモデリング手法を提案した.数値シミュレーションや実データへの適用を通してその有用性を検証した.次に,離散変数に対しては,多項ロジスティックモデルに着目し,そのモデルから自然に導入される尤度ベースの損失関数と主成分損失関数およびスパース正則化項を用いることにより,離散変数に対する主成分回帰モデリング手法を提案した.実データへの適用を通して,提案手法の有効性を検証した.これらの研究成果は,研究論文として発表するとともに,国内外の学会や国際会議で発表した.また,様々な損失関数に対するスパースモデリングに関する研究,ならびにベイジアンアプローチによるスパース推定の研究についても取り組んだ.順序付きカテゴリカルデータを扱うことが可能な連続比ロジットモデルに着目し,平行性仮定と説明変数の自動選択を目的として,スパース推定に基づく順序ロジットモデリング手法を提案した.オンライン学習アルゴリズムの一つであるadaptive regularization of weight vectors (AROW)に着目し,特徴選択を有したスパースAROWを提案した.ベイジアンlassoに含まれるハイパーパラメータの値を客観的に選択するために,ベイズ型予測分布に基づいた情報量規準を提案するとともに,効率的にパラメータを選択するための最適化アルゴリズムも提案した.得られた成果は学会・シンポジウム等で発表し,研究論文としてまとめて学術雑誌に発表した.当初計画していたスパース主成分回帰モデリングに関する研究のみならず,様々な損失関数に対するスパースモデリングおよびベイジアンスパースモデリングに関する研究についても取り組むことができた.ただ、成果の多くはまだ研究論文として出版されていないため,区分は「おおむね順調に進展している」とした.昨年度より引き続きスパース主成分回帰モデルの研究に取り組んだ.離散変数を取り扱うことが可能な損失関数を一般化線形モデルの枠組みまで拡張し,新たな損失関数を導出した.拡張された損失関数と主成分損失関数により最小化問題ベースでモデルを定式化し,スパース正則化を課すことによりモデル選択とモデルの一意性を保証したモデリング手法を提案した.モンテカルロ・シミュレーションや実データ解析を通して提案手法の有効性を検証した.本研究成果は,原著論文としてまとめられ現在投稿中である.また,様々な損失関数に対するスパースモデリングに関する研究,およびスパースモデルに含まれる正則化パラメータの選択方法に関する研究についても取り組んだ.順序付きカテゴリカルデータを目的変数とするスパース順序ロジットモデリング手法に対し,さらなる理論的・数値的検証を行った.オンライン学習手法adaptive regularization of weight vectors (AROW)にスパース学習を組み込んだスパースAROWについても,様々な観点から捉え直すことを試み,多くの数値的検証を行った.決定木のオンライン学習はこれまでミニバッチ学習の枠組みでしか研究されてこなかったが,カルバック-ライブラー情報量に基づいた損失関数を導出し,逐次的に得られるデータのみでモデルの更新が可能なオンライン決定木学習手法を提案した.スパース推定により得られる推定量の漸近分布を考えることにより,スパース推定された一般化線形モデルの評価基準を導出した.得られたモデル評価基準の有効性を,シミュレーションや実データへ適用することにより評価した.提案した評価基準を計算するソフトウェアを,統計分析ソフトRのパッケージsAICとして作成し,一般に公開した.得られた成果は研究論文として発表するとともに,学会・研究集会等で発表した.スパース順序ロジットモデリングおよびスパースAROWに関する研究成果を学術雑誌に掲載することができ,スパース主成分回帰モデルに関する研究も原著論文としてまとめ上げ現在投稿中である.ただ,その他のデータ形式に対するスパース主成分回帰モデルの研究については取り組むことができなかったため,区分は「おおむね順調に進展している」とした.本研究は,様々なデータ形式から有効な情報を抽出するための多変量統計手法およびそのスパースモデリングを開発することを目的としている.平成27年度および平成28年度においては,指数型分布族に属するデータを扱うことが可能なスパース主成分回帰モデリング,順序付きデータに対するスパース順序ロジットモデリング,逐次的にデータが得られることを想定したオンラインスパースモデリング,スパースモデルに含まれる調整パラメータの選択方法をそれぞれ提案し,得られた成果を国内学会・国際会議で発表するとともに,学術論文として発表してきた.以下は平成29年度に得た研究成果である.1.昨年度より取り組んでいるスパース主成分回帰モデリングにおいて,モンテカルロ・シミュレーションおよび実データへの適用を通して,提案手法の更なる検証を行った.具体的には,提案手法と様々な種類のスパース主成分分析手法や一般化線形モデルに対する部分最小二乗回帰モデルを数値的に比較することにより,提案手法の有効性を多角的に検証した.提案手法を計算するソフトウェアを,統計解析ソフトウェアRのパッケージspcrとして作成し,一般に公開した.2.スパース推定を可能とするNEG分布(normal exponential gamma distribution)を事前分布に持つベイズモデリングについて研究を行った.具体的には,fused lassoに対するNEG事前分布を提案し,その事前分布に基づくベイズモデルを提案した.本モデリングの有効性をシミュレーションや実データ解析を通して評価した.本研究成果は,現在原著論文としてまとめて投稿中である.

3.スパース推定で用いられる計算アルゴリズムをまとめ,数値実験を通してそれぞれのアルゴリズムの特性について考察を行った.本研究内容は総合報告として発表した.データ間の構造学習と得られた構造に基づく予測を同時に可能とする,情報統合型統計的モデリング手法の理論・方法論の開発研究に取り組んだ.特に,主成分分析モデルと回帰モデルを統合した1段階法による主成分回帰モデルを軸として研究を進め,スパースモデリングやオンライン学習に基づくデータ解析手法を提案するとともに,スパースモデルに含まれる調整パラメータの選択方法を情報量およびベイズ理論の観点から開発することができた.開発したモデリング手法は,コンソミック系統マウスデータを含む様々な実データに応用した.スパース主成分回帰モデルが扱うことが可能な離散変数としては,現段階では多項ロジスティックモデルにより記述されるもののみであるため,この手法をカウントデータや生存時間データを扱うことが可能なモデルまで拡張する.さらに,これまで提案してきた手法とともに統一的に扱うために,一般化線形モデルの枠組みまで拡張する.加えて,データ形式が関数,行列,テンソルに対する情報統合型モデルの損失関数についての研究に着手する.また,オンラインスパースモデリングやベイジアンスパースモデリングについても引き続き研究を進め,情報統合型モデル構築のための足場を固める.一般化線形モデルから導出される損失関数に基づくスパース主成分回帰モデルは,多くの計算時間を必要とする.このため,計算アルゴリズムの高速化について検討を行う.高速化の方法は多種考えられるが,座標降下法の共分散更新を中心に検討する.また,これまで主成分分析を行う損失関数は連続変数のみを扱うものであったが,カテゴリカルデータなどの離散変数も扱うことが可能な損失関数まで拡張する.現在関連研究を調査しており,研究に必要なエッセンスは掴みつつある.統計科学スーパーコンピューターの利用費を計上していたが,年度途中で他の研究費が採択され,利用費の支出をそちらの研究費に変更したため.RパッケージsAIC
SPM、PM2.5中微生物濃度とエンドトキシン量に基づく曝露リスクの推定

2018年度は、前年度に検討した総粉じん、SPM10、PM2.5をろ過捕集したフィルターから細菌菌数濃度(cells/m3)とエンドトキシン(ET)濃度(EU/m3)それぞれを測定するために決定したプロトコルに基づき、当初計画した3か所(会議室、実習室、屋外)において2018年4月から2019年3月に隔週で定期測定を実施した。さらに、粒径別に生菌の捕集ができるアンダーセンサンプラーを用いて、ろ過捕集中に浮遊細菌生菌数濃度(cfu/m3)も測定し、浮遊細菌の菌数濃度および生菌数濃度と気中ET濃度の変動と関連性について調べた。屋外のET濃度は、総粉じん、SPM10、PM2.5ともにほぼ測定できたが、室内においては、SPM10やPM2.5中のET濃度が定量下限濃度(0.003 EU/mL)を下回ることや、ブランク(未使用の滅菌フィルター)と同様、検出されないことが多かった。室内外濃度比(I/O比)は、浮遊細菌では両室内のPM2.5中菌数濃度が1を超えることが複数回あったが、ET濃度はどの粒子中でもほとんど1を超えなかった。浮遊細菌菌数濃度とET濃度について、1年間の全データを用いて解析すると、いずれの粒子、いずれの測定場所においても両者の間の相関性が低い傾向となり、黄砂などの季節的な影響が見えにくくなった。そこで、気温が高く黄砂の影響を受けることが多い4月9月と気温が低くなる10月3月に分けて解析を行った。その結果、両室内のPM2.5中細菌菌数濃度とET濃度とに4月9月は正の相関性が認められたが、10月3月はなかった。屋外では4月9月の総粉じんとSPM10で菌数濃度とET濃度に正の相関傾向が見られたが、10月3月ではSPM10のみに正の相関傾向が見られた。このように時期により相関傾向が異なったことから、浮遊細菌の構成が年間で変化していることが示唆された。前年度の検討により決定した、フィルターより回収した同一の試料から菌数濃度とエンドトキシン(ET)濃度を測定するプロトコルについて、実際に捕集した試料を測定しながら回収液量と菌数濃度測定のための臭化エチジウム染色に使用する液量を修正した。この修正プロトコルに従い、総粉じん、SPM10、PM2.5回収液中のET濃度と細菌菌数濃度を同じ試料で概ね測定することができている。室内のSPM10やPM2.5中のET濃度が定量下限濃度(0.003 EU/mL)未満の場合もあるが、プロトコルを統一しているため、一定の条件下での結果として比較はできている。その結果、総粉じん、SPM10、PM2.5中の浮遊細菌濃度とET濃度については、測定場所別に見た両者の相関性やそれぞれの濃度の経時変化、発生源を推察するためのI/O比の算出など、解析は進んでいる。さらに、ET濃度(EU/mL)を標準ETであるLPS濃度(ng/mL)に換算する検量線も作成できたため、文献においてLPS濃度で記載されているデータとも比較できるようになった。一方、当初の計画では、浮遊細菌濃度とET濃度に加え、浮遊真菌濃度測定およびデジタル粉じん計による浮遊粉じん濃度測定を実施し、経時変化とともに浮遊細菌濃度やET濃度との関連性などを見る予定であった。浮遊真菌濃度は、2018年4月2019年3月に細菌濃度やET濃度とともに測定しておりデータは得られている。浮遊粉じん濃度については、2018年8月下旬よりサンプリング時にデジタル粉じん計での測定を実施しており、PM2.5については近隣の江川観測局のデータを得ている。しかし、これらについてはまだ解析ができていないため、2019年度も継続する。2018年度の隔週捕集により、各粒子別の浮遊細菌菌数濃度とET濃度の大まかな傾向がつかめたため、2019年度は捕集頻度を4週間に1回とし、2018年度に得られた経時的変化等の傾向を追試する。また2018年度のデータから、黄砂が飛来した時には屋外の総粉じん中ET濃度が高くなることが認められたことから、2019年度でも黄砂の飛来が予測される時には、できるだけ捕集を実施する予定である。これまでにデータを採取した各粒子中の真菌菌数濃度(cells/m3)やデジタル粉じん計で測定した浮遊粉じん濃度のデータ、江川観測局のPM2.5濃度(μg/m3)データについても、ET濃度(EU/m3)との関連性を検討する。また、測定キットで得られるエンドトキシン(ET)濃度(EU/mL)と標準ET濃度(LPS濃度;ng/mL)間の検量線を用いて、各粒子中のET濃度(EU/m3)をLPS濃度(ng/m3)に換算し、文献調査により得られた動物実験データや室内環境測定データとの比較を行う。さらに、ET曝露による健康影響についての文献を検索し、これらを参考にしながら、本室内におけるET曝露に対する健康へのリスクを考察する計画である。浮遊細菌濃度や各粒子中のET濃度の測定、ET曝露の可能性等についてのこれらの結果は、日本建築学会や室内環境学会、日本産業衛生学会等で発表し、論文としてもまとめ、公表していく予定である。平成29年度は、総粉じん、PM2.5、SPM中の微生物濃度とエンドトキシン(ET)濃度を、1つの試料で測定するための回収条件とETの測定条件を検討した。

浮遊微生物の捕集に使用する滅菌メンブランフィルター3種からの低ETのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)への回収液は、測定時間120分の間にはゲル化せず、また回収液に添加した既知量ETも回収されたため、各フィルターからのET値への影響はないことが認められた。次に、捕集フィルターからの微生物回収に使用するポリプロピレン(PP)チューブ、ポリスチレン(PS)チューブでET標準試料の希釈系列を調整しET濃度を測定したところ、ETに対する感度はPPよりPSの方が高く、調整濃度に対しPPは24.5±5.1%、PSは62.3±7.2%の濃度となった。これより、試薬添付の検量線は使えず、使用する素材ごとの検量線が必要であることがわかった。また、微生物回収液を冷蔵あるいは冷凍保存したところ、いずれの素材も3日後にはET濃度の低下が見られ、ET濃度は微生物回収当日に測定すべきということがわかった。予定した3か所(会議室、実習室、屋外)で捕集した総粉じん、PM2.5、SPMから、PBSに微生物を回収しET濃度を測定する条件を検討した。捕集は毎月行い、総粉じんとPM2.5について、従来行ってきたPBS 10 mL中に微生物を回収する条件でET濃度を測定したが、11月以降にET濃度が低下する傾向がみられ、特にPM2.5中のET濃度は測定時間120分では測定できなくなってきた。そのため、浮遊微生物濃度算出に必要な回収液量を考慮しながらPBS量を見直し、添加するPBS量は、総粉じん10 mL、PM2.5 5 mL、SPM 8 mLとし、浮遊微生物濃度測定にはそれぞれ2 mL、4 mL、6 mLを使用し、残りをET測定に使用するプロトコールを決定した。平成29年度の目標は、総粉じん、PM2.5、SPM中の微生物濃度とエンドトキシン(ET)濃度を、1つの試料で測定するための捕集条件や回収条件、ETの測定条件を検討することであった。そのためには、予定したET測定装置(トキシノメーターET-mini)の購入時期が問題であったが、5月中旬に購入できた。これにより、研究期間の早期から、浮遊微生物の捕集やET濃度の測定に使用する器具がET値にもたらす影響を調べ、対応策を検討することができた。その結果、浮遊微生物捕集用フィルターからのET値への影響はなく、また実験設備や実験の性格上メーカーが推奨するガラス器具の使用が難しいことから、ポリプロピレン(PP)やポリスチレン(PS)製のディスポ製品を使用せざるを得なかったが、これらの使用時に生じる問題点や、その解決策などを検討する時間を比較的十分にとることができた。また、ET濃度測定については、不明な点はその都度メーカーの担当者に問い合わせ確認しながら行うことができた。本研究ではガラス器具の使用ができないため、ET測定試薬に付属する検量線は使えず、素材ごとの検量線が必要であることがわかり、この問題への対応も比較的順当にできた。使用するディスポ製品素材については、ETへの感度はPP製よりPS製の方がよく、またどちらの素材においても微生物回収液の保存はET値を低下させるため行うべきでないということが、実験により判明した。また微生物濃度とET濃度を同時に測定するために必要十分なPBS量の決定が大きな問題となったが、実試料による検討で微生物回収のために添加するPBS量と浮遊微生物濃度測定に使用するPBS量を決定でき、初年度中に粒径別浮遊微生物捕集からET測定までのプロトコールを決定することができたことが、今年度の一番の成果であった。2018年度は、前年度に検討した総粉じん、SPM10、PM2.5をろ過捕集したフィルターから細菌菌数濃度(cells/m3)とエンドトキシン(ET)濃度(EU/m3)
口腔癌と周囲組織におけるMnSODおよびCuZnSODのmRNA発現の比較検討

近年、ある種の抗癌剤が活性酸素を産生し、その活性酸素が抗腫瘍作用として働くことが示唆されている。また、悪性腫瘍に対する治療法の一つである放射線療法も活性酸素が関与していることが示唆されている。そこで、我々は以前に好中球の活性酸素産生におよぼすブレオマイシンの効果(日口外誌34 : 1852-1856, 1988)とブレオマイシンによる好中球の活性酸素産生2対するサイトカインの効果(日口外誌、38 : 1498-15071992)を報告し、ブレオマイシンにより産生された活性酸素が抗腫瘍性に働く可能性を示唆した。また、腫瘍細胞の放射線感受性はその細胞のもつCuZnSOD活性と負の相関があることを報告した(FreeRadicalBiology&Medicine, Vol. 17, No5 389-395, 1994)。一方、化学療法や放射線療法において、その使用を繰り返すことにより、臨床上しばしば抗癌剤や放射線に対する腫瘍の感受性の低下を経験することがある。そこで、今回我々はPT-PCR法を用いて、当教室で樹立されたヒト舌扁平上皮癌細胞株NAをxantine-xantine oxidase系により産生した活性酸素に暴露した際の活性酸素に対するscavengerのmRNAの発現を検討した。結果は、NAに活性酸素を暴露した際、20分という比較的短時間にCuZnSOD、catalase, GSH-pxといったscavengerのmRNAが誘導された。また、ミトコンドリアに主に存在し活性酸素を消去するMnSODについてはすべての条件、時間でmRNAは誘導されなかった。今後は、活性酸素産生するような抗癌剤に対しても、NAのscavengerの遺伝子発現について検討する予定である。
急性肺損傷の新規治療法の開発;PARの役割と治療への応用

急性肺損傷(ALI)および急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は重篤な呼吸不全であり,未だ有効な治療法が無く,その死亡率は依然として非常に高い,この疾患の病態には,肺胞上皮細胞の傷害とそれによって引き起こされるアポトーシスが大きくかかわっている,この肺胞上皮細胞のアポトーシスを,好中球エラスターゼがproteinase activated receptor(PAR)-1を介して惹起することを我々は報告した(Am J Respir Cell Mol Biol 2005;33:231-247)。また,それとは反対にPAR-2刺激が好中球の肺への遊走を抑制することを発見した,以上のことより,PAR-1/PAR-2のバランスが,急性肺損傷時の肺の病態に大きくかかわっていることが示唆された.そこで,急性肺損傷におけるPARの役割について,以下の3方向より研究を進めた.1.臨床検体(急性肺損傷,間質性肺炎急性増悪症例)における検討PAR-2のCleavedされるN末のpeptideに対する抗体を作成した.そしてこの抗体を用い,症例の気管支肺胞洗浄液中のPAR-2断片濃度を測定した.その結果,急性肺損傷時にPAR-2断片濃度が変化することを発見した.このことは,臨床の急性肺損傷においてもPARがその病態に関与していることを示している.現在,予後など臨床病態との関連を調べている.BEAS-2B細胞を,PAR-2 Activating peptideで刺激することにより,細胞増殖が促進されることを明らかにした.このことは,PAR-2の肺上皮細胞保護作用を示している.また,肺傷害後の組織修復にPAR-2が関与することも示唆する.我々が開発した急性肺損傷後の組織修復のモデルで,好中球エラスターゼの関与を検討した.このモデルでは,組織修復が正常に行われず,肺コンプライアンスの低下をもたらすことを明らかにした.しかし,この変化は好中球エラスターゼを阻害することにより抑制され,PARを介した肺組織修復の修飾が示唆された.このことより,PAR-1/PAR-2のバランスをコントロールすることによる肺組織修復の促進が期待でき,急性肺損傷の新規治療法開発に向け,研究を進めている.急性肺損傷(ALI)および急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は重篤な呼吸不全であり,未だ有効な治療法が無く,その死亡率は依然として非常に高い,この疾患の病態には,肺胞上皮細胞の傷害とそれによって引き起こされるアポトーシスが大きくかかわっている,この肺胞上皮細胞のアポトーシスを,好中球エラスターゼがproteinase activated receptor(PAR)-1を介して惹起することを我々は報告した(Am J Respir Cell Mol Biol 2005;33:231-247)。また,それとは反対にPAR-2刺激が好中球の肺への遊走を抑制することを発見した,以上のことより,PAR-1/PAR-2のバランスが,急性肺損傷時の肺の病態に大きくかかわっていることが示唆された.そこで,急性肺損傷におけるPARの役割について,以下の3方向より研究を進めた.1.臨床検体(急性肺損傷,間質性肺炎急性増悪症例)における検討PAR-2のCleavedされるN末のpeptideに対する抗体を作成した.そしてこの抗体を用い,症例の気管支肺胞洗浄液中のPAR-2断片濃度を測定した.その結果,急性肺損傷時にPAR-2断片濃度が変化することを発見した.このことは,臨床の急性肺損傷においてもPARがその病態に関与していることを示している.現在,予後など臨床病態との関連を調べている.BEAS-2B細胞を,PAR-2 Activating peptideで刺激することにより,細胞増殖が促進されることを明らかにした.このことは,PAR-2の肺上皮細胞保護作用を示している.また,肺傷害後の組織修復にPAR-2が関与することも示唆する.我々が開発した急性肺損傷後の組織修復のモデルで,好中球エラスターゼの関与を検討した.このモデルでは,組織修復が正常に行われず,肺コンプライアンスの低下をもたらすことを明らかにした.しかし,この変化は好中球エラスターゼを阻害することにより抑制され,PARを介した肺組織修復の修飾が示唆された.このことより,PAR-1/PAR-2のバランスをコントロールすることによる肺組織修復の促進が期待でき,急性肺損傷の新規治療法開発に向け,研究を進めている.
骨巨細胞腫での破骨細胞様多核巨細胞形成における接着分子の病理学的研究

骨巨細胞腫瘍とは骨に発生する良性腫瘍の一種で、組織学的には、単核のstromal cellと多核のgiant cellという2種類の細胞成分より腫瘍が構成されているという特徴を持つ。本研究では、骨巨細胞腫瘍のgiant cellがstromal cellの癒合によって発生する事を明かとする目的で、これらの細胞に発現している接着分子の発現をmRNAおよび蛋白質のレベルで検討した。また、GCT培養細胞を抗原としてモノクローナル抗体を作製し、骨巨細胞腫瘍に発現されている抗原と共通の抗原の分布を正常組織を用いて免疫組織化学的に検索した。まず、E-カドヘリン及びOB-カドヘリン、CD44の発現について検討を行った。RT-PCR法の結果、CD44Hの発現が全ての検体で認められた。酵素抗体法の結果、CD44Hは単核及び多核の腫瘍細胞の細胞膜に陽性であった。また、OB-カドヘリンは外科切除材料では正常型が優位に発現していた。E-カドヘリンの発現は認められなかった。破骨細胞の形質であるCD44Hを共に発現していることから、骨巨細胞腫の破骨細胞様多核腫瘍細胞と単核の細胞は共に破骨細胞への分化を示すと考えられる。CD44が破骨細胞の多核化に必要であるという報告もみられるため、骨巨細胞腫においても同様の機構が存在する可能性がある。GCTに対する2種類の単クローン抗体を作成し、1D8と3C8と命名した。これらの抗体はGCTのstromal cellとgiant cellの両者に陽性であった。正常組織を免疫組織化学的に検討したところ、この両者の抗体を同時に発現している細胞は破骨細胞だけであり、GCTのstromal cellとgiant cellは、破骨細胞と免疫組織化学的に共通の特徴を示しており、両者とも破骨細胞系に属す事が示唆された。骨巨細胞腫瘍とは骨に発生する良性腫瘍の一種で、組織学的に、単核のstromal cellと多核のgiant cellという2種類の細胞成分より腫瘍が構成されているというユニークな特徴を持つ。giant cellと破骨細胞の類似性に関してはいくつかの報告があり、少なくともgiant cellは破骨細胞へ分化した細胞と考えられるが、stromal cellも破骨細胞系に属す細胞か、またgiant cellがstromal cellから発生するのかに関しては、明確な結論は得られていない。我々は既に骨巨細胞腫瘍培養細胞を抗原とするモノクローナル抗体を作製し、これらの認識する抗原の正常組織での分布を免疫組織化学的に検討し、骨巨細胞腫瘍は破骨細胞系と共通する抗原を発現していることを見いだした。本研究では、これらのモノクローナル抗体の認識する抗原を抽出し、アミノ酸分析を行い、既知の物質との異同について検索し、骨巨細胞腫瘍のstromal cellとgiant cellの相互関係、また、これらの細胞と正常な破骨細胞系との関連性を調べることを企図した。本年度は、骨巨細胞腫瘍の培養細胞を用いて、単核細胞から多核細胞が生じるかどうかを検討した。骨巨細胞腫瘍細胞を緑色と赤色の二種類の蛍光色素で別々にラベルし、その後に混合して培養した。二週間後、蛍光顕微鏡により観察し、黄色に染色された多核巨細胞が出現することを観察した。このことから、giant cellがstromal cellの細胞融合によって出現する可能性が示唆された。骨巨細胞腫瘍培養細胞から我々の作製したモノクローナル抗体の認識する抗原を抽出し、アミノ酸配列を分析することも試みているが、今年度は結果を得るには至らなかった。来年度以降、さらに実験を係属する予定である。今回、破骨細胞の多核化及び機能の発現に関与していると考えられているE-

カドヘリン及びOB-カドヘリン、CD44の骨巨細胞腫における破骨細胞様多核巨細胞形成への関与を明らかにするために、外科切除材料及び初代培養細胞株におけるこれらの分子の発現について、RT-PCR法及びNorthern blot法により検討を行った。また、E-カドヘリン及びCD44については、酵素抗体法によりその詳細な組織内の局在を検討した。3細胞株及び21検体を用いたRT-PCR法の結果、CD44H(standard form)の発現が全ての検体で認められたが、スプライシングバリアントは確認できなかった。酵素抗体法の結果、CD44Hは単核反び多核の腫瘍細胞の細胞膜に陽性であった。また、OB-カドヘリンは細胞株では発現が認められなかったが、外科切除材料では正常型及びバリアント型ともに発現がみられ、正常型の発現が優位であった。E-カドヘリンの発現は骨巨細胞腫では認められなかった。破骨細胞の表面形質であるCD44Hを共に発現していることから、骨巨細胞腫の破骨細胞様多核腫瘍細胞と単核の細胞は共に破骨細胞への分化を示すと考えられる。しかしながら、破骨細胞では血管側細胞膜でのみその発現がみられることから、破骨細胞様多核腫瘍細胞は少なくとも機能的には最終的な分化段階には至っていないと思われる。CD44が破骨細胞の多角化に必要であるという報告もみられるため、骨巨細胞腫においても同様の機構が存在する可能性がある。また、骨巨細胞腫では、破骨細胞で発現がみられているE-カドヘリンではなく、OB-カドヘリンが発現しており、このことが骨巨細胞腫の腫瘍発生に関与している可能性が示唆された。骨巨細胞腫瘍とは骨に発生する良性腫瘍の一種で、組織学的には、単核のstromal cellと多核のgiantcellという2種類の細胞成分より腫瘍が構成されているという特徴を持つ。本研究では、骨巨細胞腫瘍のgiant cellがstromal cellの癒合によって発生する事を明かとする目的で、これらの細胞に発現している接着分子の発現をmRNAおよび蛋白質のレベルで検討した。また、GCT培養細胞を抗原としてモノクローナル抗体を作製し、骨巨細胞腫瘍に発現されている抗原と共通の抗原の分布を正常組織を用いて免疫組織化学的に検索してきた。今年度は、作成したモノクローナル抗体のうち、1D8と命名した抗体の認識する抗原について解析した。免疫沈降法、Western blotting法では、この抗体の認識する抗原は、分子量が43kDであった。この抗原を精製し、内部アミノ酸配列の解析を行ったところhuman argininosuccinate synthasc(AS)と100%一致した。従って、1D8はASを認識する抗体であり、ASは免疫組織化学的検討では、骨巨細胞腫瘍の単核細胞・多核巨細胞、正常破骨細胞や骨細胞に局在する事が判明した。ASは本来、肝臓の尿素サイクルを構成する酵素であるが、近年では、肝臓以外ではシトルリン-NOサイクルを構成する酵素として知られており、NO合成に関与する酵素である。
頭頸部腫瘍放射線治療時の口腔内急性および慢性障害を防止するための装具の開発

歯牙が頬粘膜に接している状態を想定し、2、5、10mm厚の歯科鋳造用金銀パラジウム合金、タフウォータ板、GAFChromicfilmを様々な条件で積層し4MVのX線を10-20Gy照射し線量の測定を24回行った。1回の例外を除くと、モンテカルロ法による計算値は実測値の2.4%以内の差異であった。1回の例外はファントムを水中で照射した際にタフウォータ板が照射中に若干浮遊したものと考えその後は空気中での照射実験に変更した。抜歯歯牙(10の健常歯牙および14の金属充填歯牙)を用いて線量の測定を行った。健常歯牙およびインレーの直下ではビルドアップ効果により線量が増大したのに比べ、ブリッジ・クラウンでは線量は低下した。健常歯牙・インレーでは後方散乱は認められなかったが、ブリッジ・クラウンでは、後方散乱により線量の増大が認められた。大きな金属充填歯牙が照射野内に存在するとき、後方の線量の減衰による腫瘍線量の低下、および後方散乱によって生じる線量増大による口内炎重症化が問題になると考えられた。人体近似の口腔ファントムを用いた線量測定の結果、歯牙に5mmを超える金属が存在する場合後方散乱による線量の有意な増大(15%程度)を認め、歯肉炎・頬粘膜炎の増悪が予測された。この場合アクリル製の3mmのスペーサーを用いるとその影響は認められなかった。歯牙の後方に腫瘍が存在する場合、5mmを越える金属では線量の減衰により腫瘍線量の低下が認められた。そのような条件下では金属充填物の除去あるいは照射方向の再検討が余儀なくされる。ファントムをCTで撮影し線量計算を行ったが金属近傍の線量予測はかなり困難を極めた。培養皿で培養細胞の近傍に金属片を配置しての照射実験を行ない、金属片周囲で散乱線によるものと思われる影響は認められているが、3次元でのシミュレーションとならず今後の検討課題である。歯牙が頬粘膜に接している状態を想定し、数個の正常歯牙および金属充填歯牙、歯科鋳造用金銀パラジウム合金、タフウォータ板、GAFChromic filmを積層に重ね4MVのX線を20Gy照射し線量を測定した。モンテカルロ法によるシミュレーションで実験と同様の条件で線量の計算を行い実測データと比較した。歯牙の側から照射した場合は、健常歯牙の直下ではbuild up効果により線量が大きく増大した。金属充填歯牙では減衰により健常歯牙よりも線量は低下した。また5mm後方での線量はインレーでは健常歯牙と同様であったが、ブリッジ・クラウンでは減少していた。頬粘膜側から照射した場合、後方散乱によりブリッジ・クラウンの手前では線量の増大が認められたが、このとき金属の厚みによる違いはなかった。インレー・健常歯牙では後方散乱による影響は認められなかった。歯牙より手前の部位では後方散乱による線量の増加は認められなかった。モンテカルロ法による線量の計算結果は実測データとほぼ一致していた。ブリッジ・クラウンのような大きな金属充填歯牙が照射野内に存在するとき、金属の後方に腫瘍が存在する場合は線量の減衰が懸念され、照射方法の変更・金属の除去が必要と考えられた。後方散乱によって生じる線量増大による口内炎重症化の一部は数mmの吸収体の配置で防止できる可能性が示唆された。線量の予測にモンテカルロ法によるシミュレーションが有用であると考えられた。この結果を元にさらに実験を進め、平成18年度は物理学的測定と同時に生物学的反応が一致するかを判定するために、培養細胞を用いた実験を施行する予定である。散乱線の強度による放射線治療関連遺伝子の発現の測定も考慮している。

培養皿で培養細胞の近傍に金属片を配置しての照射実験を行ない、金属片周囲で散乱線によるものと思われる影響は認められているが、3次元でのシミュレーションとならず今後の検討課題である。
古生代大量絶滅の原因解明：グローバル寒冷化と地球外フラックス

カンブリア紀以降の古生代で3回の大量絶滅(オルドビス紀末、デボン紀後期、およびペルム紀末)がおきた。どれもグローバル寒冷化期に起きたが、その原因は未特定である。オルドビス紀末には大気CO2分圧が現世の10倍あったにもかかわらず大規模寒冷化がおきた。一方ペルム紀末絶滅時に地球外起源3Heが大量流入したことから、大量の星間塵の集中落下で寒冷化と絶滅がおきた可能性が指摘されている。本計画は、古生代の3回の大量絶滅と寒冷化との因果関係の解明を目的とし、過去の深海堆積物中の絶滅境界層から3He同位体異常などの地球外起源物質流入の定量的検出を試みる。主要絶滅事件に関する新たな統一的説明を目指す。古生代に起こった3回の生物の大量絶滅を引き起こしたと考えられている地球規模の寒冷化が、巨大隕石の衝突によるものではなく、地球外からの星間塵が集中的に地球に落下することによって日射が遮蔽されて生じたとする仮説を、絶滅が発生した地層付近における岩相・化石および地球化学層序の地質調査から確認しようとする研究である。古生代の大量絶滅の原因としては、巨大隕石衝突や異常火山噴火などが議論されてきたが、本研究では研究代表者らが新たな証拠に基づいて提唱してきた星間塵の集中落下という仮説を検証することにより、過去に複数回起きている生物の大量絶滅の原因や、地球外物質の流入による大規模な気候変動機構に関して理解を深めることができると期待される。
ショウジョウバエ胚における背腹極性形成情報伝達系の分子メカニズムの解体

1.Tube抗体及びPelle抗体の調製Tube遺伝子の全長を大腸菌中で大量発現、精製し高原を調製。得られた抗血清はショウジョウバエ初期胚抽出液中のTube以外の3個の蛋白質と強くクロス反応した。アフィニティー精製によってもこれらのクロス反応は全く除けなかった。現在、Tube全長ではなくその一部を抗原として、より特異性の高い抗体をとることを計画中である。Pelleについては、グルタチオントランスフェラーゼとの融合蛋白質を用いて抗血清を調製した。大腸菌アセトンパウダーによる吸収により、ほぼPelle特異的抗体が得られた。2.SS架橋法による複合体検出:調整した抗体を用いてTube及びPelleの複合体の検出を試みた。Tubeに関しては、クロス反応する蛋白質によるノイズと、これらの蛋白質の複合体によるノイズのために、Tube複合体は検出できなかった。Pelle複合体に関してもバックグラウンドのノイズが高く、微量の複合体が検出できるだけのS/N比が得られなかった。そこで、より特異性が高くハイアフィニティーの抗体の再調製を進めると共に、SS架橋法の検出方法の改良を試みた。3.より高分解能の解析法の開発:これまでは架橋された複合体をSDS-PAGEで一次元的にフラクショネートしていたのでバンドが混みあい、少しでもクロス反応があると複合体の検出が妨げられた。複合体の2次元面状に展開できればシグナル同志が重なり合う確立は遙かに低くできると考え、架橋処理後、細胞抽出液を2次元電気泳動でフラクショネートする方法の開発を試みた。材料として集めやすい培養細胞系を用い、cAMPシグナル伝達系に関与する転写因子CREBP1の複合体の検出をモデル実験として、種々の条件設定を行い、一般的な方法として確立できたので、現在、Tube及びPelle複合体検出への適用を開始しているところである。
プロトクロ-ナル変異の発生メカニズムの解明と優良形貭の探索

多年性の他殖性マメ科牧草バ-ズフット・トレフォイル(Lotus corniculatus L.)の品種vikingの種子由来の集団(以下S集団と記す)と一個のプロトプラスト由来のプロトクロ-ン集団(以下P集団と記す)を育成し、諸形質について比較検討した。草丈、茎の太さ等の収量形貭についてはP集団がS集団より有意に小さかった。しかし全ての形貭でプロトプラストを単離した親より大きな値を示す個体があり、このような変異を育種に利用可能なことを示唆した。家蓄に有害なHCN含量についても低含量のものが得られた。またP集団の減数分裂を調査したところ、第1分裂中期に一価染色体,第1および第2分裂後期に遅滞染色染色体橋が観察され、逆位などを含む染色体の構造的変異が起っており、花粉稔性の低下の一因と考えられた。これらの結果はひとつのプロトプラストに由来した集団に見られる変異であり、外殖片に存在していたものではない。またS集団より2個体およびP集団より5個の葉のmtDNAをサザン・ブロッティングによって調査したところ、制限酵素とプロ-ブ48組合せ中、種子由来2個体間で約13%の違いが見られ多型性を示した。プロトクロ-ン5個体間では約4%の違いが見られ,DNAレベルの変異が起きていることが明らかになった。また興味のあることは,この変異DNA断片が種子由来個体のものと一致し,変異を起こしやすい部分、あるいは変異の仕方に一定の方向性があることを示唆した。またプロトクロ-ンの核遺伝子についてはRubisco小サブユニットrbc3Aー1,phenylalanine ammonia lyaseおよびリボゾ-マルRNAの遺伝子を持つpRR217をプロ-ブとしてサザン・ブロッティングしたところDNA断片パタ-ンには相違が全く見られなかった。従って調査された核遺伝子およびその周辺のDNAは非常に安定していると考えられる。今後は葉緑体DNAの調査をすることも望まれる。多年生他殖性のマメ科牧草バ-ズフット・トレフォイル(Lotus corniculatus L.)の品種Vikingの種子由来の集団(以下S集団と記す)と一個のプロトプラスト由来のプロトクロ-ン集団(以下P集団と記す)を育成し、収量形質,花粉稔性,家畜に有害なHCN含量及び染色体変異について比較検討した。プロトプラスト単離のためのカルスはHCN以外の形質に関してS集団の平均値に近い個体より誘導した。プロトクロ-ン60個体中倍数体及び24ー48の混数体がそれぞれ1個体づつ出現した。収量形質である草丈,最大節間長、茎の太さ,葉身長,葉巾長の平均値はP集団はS集団より有意に小さかった。しかし全ての形質でプロトプラストを単離した親より大きな値を示す個体があり、このような変異を育種に利用可能であることを示唆した。HCN含量については最低と最高濃度間を5段階に分け,個体の含量を分類した。その結果S集団は最低から最高含量までの変異が見られた。一方P集団は最高含量の個体を親としているが,変異が小さく安定的であった。しかし低含量の個体も出現しているので,育種への応用の可能性があるものと考えられる。

またプロトプラスト由来の個体の減数分裂を調査したところ、第1分裂中期に一価染色体,第1および第2分裂後期に遅滞染色体や染色体橋が多く観察されたことから,逆位などを含む染色体の構造的変異が起っており、花粉稔性の低下の一因と考えられた。光学顕微鏡下での体細胞染色体の観察では染色体構造異常を検出することができなかったことから,減数分裂の異常によって推定される染色体構造異常は小規模のものと推定された。したがって収量形質の変異においてもpolygenicな突然変異だけでなく染色体突然変異も関与していると思われる。これらの結果はひとつのプロトプラストより由来したカルスから再生したプロトクロ-ン集団に見られる変異であり,外植片に存在していたものではない。Lotus corniculatus L.の8個体より誘導したカルス8系統について,抽出したDNAをEcoRIで処理し,3つのミトコンドリア遺伝子をプロ-ブとしてハイブリダイゼ-ションしたところ,多くの異なる断片パタ-ンが見られた。これは培養中に生じたmtDNAの塩基レベルのソマクロ-ナル変異も含まれると推定されるが、それ以外に他殖性かつ合成品種である親集団の多型の存在をも示唆する。また種子集団より2個体及びプロトクロ-ン集団より5個体の葉のDNAについて調査した結果、種子由来2個体について制限酵素とプロ-ブの48組合せの中で,異なる断片パタ-ンを示したものが約13%存在した。プロトクロ-ン5系統は48組合せ中、種子由来個体Sー3とほとんど一致し、同一のmtDNAを持つと推定されたが,EcoRIとcoxI及びSalIとcoxIにおいてSー3と異なる断片が見出され,その頻度は約4%であった。しかし興味あることは,この変異断片が種子由来の他の1個体oー61の断片サイズと一致することであった。このことはmtDNAは変異を起こしやすい部分が存在するか、あるいは変異の仕方に一定の方向性があることを示唆しているものと思われる。またプロトクロ-ン11個体について核遺伝子であるRubisco小サブユニットrbc3Aー1,phenylalanine ammonia lyase(PAL),及び5.8S,17S,25Sリボゾ-マルRNAの遺伝子を持つプラスミドpRR217をプロ-ブとしてサザン・ブロッティングを行ったところ,2種類の制限酵素と2種類のプロ-ブ4組合せでDNA断片パタ-ンには相違が全く見られなかった。従って調査された核遺伝子及びその周辺のDNAは安定していると考えられるが,他の核遺伝子についても実験を重ねる必要があろう。また種子由来の親集団のミトコンドリアDNAのように,核DNAについても多型現象が見られるか,検討する必要がある。
自己組織化機構の発現に及ぼす制限要因の特定:社会性昆虫を例に

社会性昆虫のコロニー内では局所的相互作用によって生じる自己組織化機構によって様々な集団行動が創発されている。本課題ではこれまで考慮されてこなかった自己組織化機構創発に関与する生態要因を推定するために、トゲオオハリアリのメンバー間の情報伝達メカニズムに注目した。その結果、情報伝達に関わるパトロール行動にはコストが存在し、パトロール行動が増加するほど産卵数が低下した。また、個体の運動特性にはリズムが見られ、これが個体間の相互作用によって影響をうけることが明らかになった。このように、情報伝達に関わる自己組織化機構には様々な生態要因がその帰結に影響を及ぼすことが明らかになった。本研究では社会性昆虫を用いて、システムとしては存在する自己組織化機構が何故機能しないのかという問いに、下位構成要素の行動発現に及ぼす制限要因から適応的な答えを導き出すことを目的とした。非平衡-開放系の動的秩序の一つである自己組織化の概念は、熱力学則によって規定される化学過程に由来する為、システムの最適性・安定性を前提にした理論、実証研究が行われてきた。.しかしながら、熱力学則に加え自然選択も働く生物の自己組織化機構では、様々な選択圧が働くためシステムの最適性、安定性が常に担保されるとは限らない。本研究課題ではトゲオオハリアリを用いて、コロニーサイズ依存的な自己組織化発現パターンの適応的意義について、下位要素の行動発現に関わる選択圧から検討する。さらに、種問比較から、自己組織化機構によるワーカー産卵制御方法の適応進化について考察ことを目的とした。23年度は、女王物質の情報伝達に関わるコストの推定と、種間比較対象種のサンプリング、生態調査を行った。本種では女王物質の伝達が、女王によるパトロール行動(巣内俳徊)に大きく依存し、パトロール行動が卵巣発達ワーカーの存在によって促進されることが先行研究から明らかになっている。そこで、人為的にコロニー内の卵巣発達ワーカー比率を変えて、女王のパトロール時間、頻度の増減と産卵数の関係を調査した。その結果、女王のパトロール時間、頻度の増加とともに、産卵数が減少することが示された。このことは、情報伝達自体にコストが伴い、これが自己組織化機構の発現を制限している可能性示唆された。また、自己組織化機構の機能を考察するためには、類似の情報伝達システムを持つと予測されるツシマハリアリの生態調査を行った。長崎県対馬市で調査を行った結果、コロニーは森林内の石下に分布しており、コロニーサイズは50150とトゲオオハリアリと近い値を示すことが明らかになった。社会性昆虫にみられるコロニーサイズ認識に関わる自己組織化機構を明らかにするために、以下の2つの実験を行った。まず始めに、コロニーサイズ認識の前提となるこれまでコロニーサイズ依存的行動の有無を実験的に検証した。これまで、多数の種で性比や活動性、敵対行動レベルに関してコロニーサイズ依存的変化が報告されているが、いずれもコロニーサイズの異なる複数のコロニーを用いた相関関係にすぎず、実際にコロニーサイズをコントロールして得られた結果ではない。そこで、トゲオオハリアリのコロニーを10コロニー野外から採集し、コロニーサイズを17525まで変化させ、女王のパトロール行動頻度とワーカー間の順位行動頻度との関係性を調査した。その結果、パトロール行動、順位行動頻度ともにコロニーサイズと正の相関がみられた。しかしながら、増加パターンはこれまで報告されているような単純な増加パターンを示さず、コロニーサイズ125付近を閾値としたシグモイド型となった。これは、ワーカーポリシング強度や繁殖虫の生産されるコロニーサイズと近く、特定の集団サイズで社会を制御するメカニズムが離散的に変化し、それにともない様々なコロニーレベルの表現型が影響をうけることを示唆している。次に、繁殖ワーカーの存在が女王のパトロール行動に影響を及ぼすのかどうか調査した。コロニーを分割し人為的に繁殖ワーカーを作り出し、それを0,25,50%の比率で元のコロニーに導入し、女王のパトロール行動の変化を観察した。その結果、コロニー内の繁殖ワーカー数が増えるほどパトロール行動の頻度も増加した。このことは、繁殖ワーカーの存在が女王のパトロール行動を促す刺激となっていることを示している。調査自体に大幅なお遅れはみられず、順調に進展にしていると考えている。ただ、種間比較対象種のサンプリングが不十分な点があり、これが若干の不安材料となっているが、24年度に早期に調査を開始することによって充分補えるものと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。自己組織化機構の適応進化を考察する際、種間比較により各生態要因との関連性を検討する必要がある。社会性昆虫では自己組織化機構は複数報告されているものの、同形質を複数種にまたがり調査、比較した研究はほとんどない。そのため、特定種のシステムとしての記載にとどまり、システムの機能にまで言及した研究が少ない、今後は、さらに詳細な種間比較を行い、生物の自己組織化機構の一般性について明らかにしていきたい。
炎症性骨破壊における歯周病菌由来酵素ジンジパインの作用機序解明

歯周病はPorphyromonas gingivalis等の感染による慢性炎症性疾患で、歯槽骨の吸収を特徴とする。同菌が産生するリシン特異的ジンジパイン(Kgp)の骨破壊における役割を解析した。KgpはTNF-αとIL-1βによる破骨細胞分化を促進した.これらのサイトカインは、破骨細胞分化抑制因子であるOPGに比べ、Kgpによる分解に対して安定だった。KgpによるOPGの分解断片はRANKL結合能を失っており、そのN末アミノ酸配列解析から、death domain類似領域を優先的に分解されることが明らかとなった。今回の結果は、タンパク質分解が破骨細胞分化を制御することを示している。我々は、Porphyromonas gingivalisが産生する一群のシステインプロテアーゼであるジンジパインの中でもリシン特異的ジンジパイン(Kgp)が破骨細胞分化抑制因子であるオステオプロテゲリン(OPG)を分解することで、生理的骨吸収のひとつである活性型ビタミンDやLPSなどの菌体成分、TNF-αやIL-1βなどの炎症性サイトカインによる破骨細胞分化誘導を促進することを報告してきた。昨年度までに、TNF-αおよびIL-1βもKgpの基質となるが、これらのサイトカインがOPGに比べKgp分解に対して抵抗性を示すことを見出している。さらに、KgpによるOPGの分解開始部位が、N末側のRANKL結合領域ではなく、C末側のデスドメイン類似領域にあることを明らかにしている。本年度は、Kgpにより上記切断部位で分解されたOPGが骨芽細胞の細胞膜表面に発現するRANKLに結合する能力を失っている事を、N末蛍光標識したOPGを用いて明らかにした。さらに、KgpによるOPGの分解が、破骨細胞分化誘導培養系でも起こることを確認した。さらに、Kgpによる破骨細胞分化促進作用の発現におけるOPG分解の重要性を確認するために、Opg遺伝子欠損マウスから採取した骨芽細胞および骨髄細胞の共存培養系を用いてKgpの効果を解析した。その結果、炎症性サイトカインによる破骨細胞分化のKgpによる促進効果が見られなくなった。我々は、Porphyromonas gingivalisが産生するリシン特異的ジンジパイン(Kgp)が破骨細胞分化抑制因子であるOPGを分解することで、LPSなどの菌体成分やTNF-α、IL-1βによる破骨細胞分化を促進することを見出し、その分子機序を解明することを目的として本研究を開始した。本年度はまず、破骨細胞分化を正に制御するサイトカインとして、TNF-α、IL-1βおよびIL-17A、負に制御するOPGのKgpによる分解をWestern blot法で定量的に比較した。TNF-αとIL-1βはOPGに比べKgpによる分解に安定であるのに対し、IL-17AはOPGと同様にKgpによって容易に分解されることが明らかとなった。KgpがTNF-αあるいはIL-1βによる破骨細胞分化を促進し、IL-17Aによるそれを抑制することは、Kgpによる安定性で説明できると考えられた。KgpによるOPGの主要な分解部位は、主要な分解断片の分子量とN末アミノ酸配列から、デスドメイン類似領域内であることが示唆された。分解部位のLys残基を特定するために、pCAGGSに組込んだOPG cDNAからLys-258あるいはLys-262をAlaに置換した変異OPG cDNAをinverse PCR法で作製し、CHO細胞で変異OPGを産生させた。これらの変異OPGは野生型OPGと同様、Kgpで分解されたことから、これらのLysはKgpによる分解部位ではないか、野生型OPGでは分解部位であるものの、Alaに変異しているため、付近のLysを分解する可能性が考えられた。したがって、分解部位のLysの同定には至っていない。歯周病は,Porphyromonas gingivalisを始めとする歯周病原菌の感染を原因とする慢性炎症性疾患で、歯槽骨の吸収を特徴とする。しかし、P. gingivalis感染と歯槽骨破壊の関係は必ずしも明らかではなかった。歯槽骨破壊は破骨細胞によって引き起こされる。我々は、P. gingivalisによって産生されるタンパク分解酵素であるジンジパイン、特にリシン特異的ジンジパイン(Kgp)が、破骨細胞分化阻害因子であるオステオプロテゲリン(OPG)を分解することで、生理的骨吸収因子である活性型ビタミンDや細菌由来のLPSによって誘導される破骨細胞分化を促進することを見出した。本研究では、歯周病で産生が亢進する炎症性サイトカインによる破骨細胞分化に対するKgpの効果を解析した。

その結果、Kgpは、TNF-α、IL-1β、IL-17Aといった破骨細胞分化誘導能を持つサイトカインを分解したが、TNF-αおよびIL-1βによる破骨細胞分化を促進する一方、IL-17Aによるそれを阻害した。TNF-αとIL-1βはOPGに比べ,Kgpによる分解を受けにくく、IL-17AはOPG以上に分解され易いことを見出した。Kgpによって分解されたOPG断片はRANKL結合能を失っていた。OPGの分解断片のN末アミノ酸配列解析から、KgpはOPGのRANKL結合領域よりC末側のdeath domain類似領域を優先的に分解することが明らかとなった。一方、細胞膜結合タンパク質であるRANKLとその受容体RANKはKgpによる分解効率が低かった。この知見は、破骨細胞分化が、これまで言われて来たRANKL/OPGの遺伝子発現比の他に、これらのタンパク質の分解によって制御されることを示すものである。生化学本年度の研究から、Kgpにより分解されたOPGがRANKL結合能を消失していることを実験的に示すことができた。さらに、Opg遺伝子欠損マウスから採取した骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系では、Kgpによる破骨細胞分化促進作用が消失することを確認した。これらの成果は、KgpによるOPGの分解がRANKLとRANKの相互作用を促進することで破骨細胞分化を促進するという我々の仮説を裏付けるものである。本年度の研究から、破骨細胞分化を負に制御するOPGの分解が、Kgpによる破骨細胞分化の促進に極めて重要であることが、明らかとなった。OPGの分解が歯周病性骨破壊に重要なステップであるとの当初の仮説の正しさが裏付けられる形となったと考えている。今年度得られた知見は、研究協力者の大学院生によって学会あるいは研究会で発表され、高く評価され、海外の研究会に国内の代表として派遣されるなどの経験をした。また、米国生化学会の機関誌に投稿し、現在、指示により訂正を行っている。当初の予定では、Kgpによる分解に耐性の変異OPGの調製にある程度の目途が立っている予定であったが、今年度中に調製したLys258AlaおよびLys262Ala組換えOPGは、野生型OPGと比較し、変異OPGを含む培養上清を用いた予備的解析では、有意な分解安定性の向上は認められなかった。この部分に関しては、解析が完了しておらず、十分な達成度を得たとは言えないが、次年度以降も引き続き、Kgp耐性OPGの調製の試みを続けるためには、重要な情報となる可能性がある。Kgpのin vitroにおける破骨細胞分化促進作用にOPGの分解が重要な役割を果たすことを明らかにしてきた。今後は、in vivo骨破壊におけるジンジパインの役割を解析するよていである。具体的には、野生型、rgpA/B遺伝子欠損およびkgp遺伝子欠損P. gingivalisをマウス頭部皮下に接種し、菌の定着、炎症細胞の浸潤、破骨細胞形成をはじめとする骨代謝を組織化学的に解析する予定である。Kgp耐性組換えOPGの調製を引き続き試みる。上記変異OPGを精製し、Kgpによる分解を野生型OPGのそれとの比較で詳細に解析したい。これらの変異OPGにKgp耐性が認められた場合は、同変異体のRANKL結合性および破骨細胞分化抑制活性を調べる予定である。