hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子宮体癌に特徴的な遺伝子変異に基づいた細胞死誘導機構の解明と癌遺伝子治療への応用

ヒト子宮体癌細胞株3株を場として(これら全ては、ORF-2に変異を持つ)、正常型ORF-1の再発現はHIF-1蛋白を消失させ、その下流であるVEGFなどの腫瘍増殖促進的に働く多くの遺伝子の活性を低下させることを見いだした。さらにORF-12によるHIF-1の抑制は最終的には、senescenceを誘導し癌細胞死を導くことも明らかとなった。これらの事実をふまえてHIF-1活性阻害剤であるYC-1と17AAGを癌細胞株に添加したところ同様な細胞死の誘導が観察された。ORF-12発現アデノウイルスベクターとともにこれらの薬剤の生体内投与について、特に難治例の肉腫を中心にして今後検討を行う。3)p21についてp21発現アデノウイルスベクターを作製した。これらの癌細胞への感染は、Rb,p16,p53の状態に依存せず低容量感染でsenescenceを、高容量でアポトーシスを誘導することを明らかにした。基礎的検討が終了したのでこれもヌードマウスを場として検討を進める。
不活性オレフィンの環境調和型活性化反応の開発と天然物合成への展開

著者は最近,不活性オレフィンの触媒的活性化法として,触媒的環化アルケニル化反応の開発に成功している。本法を利用すれば,同一分子内に存在する二つの不活性オレフィンをカップリングさせ,多様な環状化合物を一挙に合成できることが明らかになってきた。本研究では,触媒的環化アルケニル化反応のアフィディコリン合成への適用と,ビシクロ[3.3.0]オクタン化合物やビシクロ[4.3.0]ノナン化合物の簡易合成法への展開を検討した。(1)アフィディコリンの全合成触媒的環化アルケニル化反応を利用することにより,アフィディコリンのCD環部に相当するビシクロ[3.2.1]オクタンを一挙に合成後,この構造上の特徴を利用した立体選択的な官能基変換反応を組み合わせて抗腫瘍活性を持つアフィディコリンの全合成を達成した。(2)ビシクロ[3.3.0]オクタン骨格とビシクロ[4.3.0]ノナン骨格のワンポット合成触媒的環化アルケニル化反応のさらなる展開として,生理活性天然物の部分構造であるビシクロ[3.3.0]オクタン骨格とビシクロ[4.3.0]ノナン骨格の新しい合成法の開発に着手した。その結果,ビシクロ[3.3.0]オクタン化合物は,4565%の収率で得られることが分かった。また,ビシクロ[4.3.0]ノナン化合物は,シクロペンテン誘導体から4555%の収率で合成することが出来た。さらに興味深いことに,触媒的環化アルケニル化反応がシリルエノラートと芳香環とのカップリングに適用できることも明かとなった。末端オレフィンを有するアルキル側鎖を持つ環状シリルエノラートから,触媒反応条件下で双環性化合物をワンポットで構築する新たな合成手法の開発に着手した.標的分子として,生理活性天然物の部分構造であるビシクロ[3.3.0]オクタン(オクタヒドロペンタレン)骨格とビシクロ[4.3.0]ノナン(ヒドリンダン)骨格に着目した.前者は,セスキテルペンの部分構造を成し,後者はステロイドやビタビンDの骨格の一部である.その結果,β位に置換基を持つシクロ-2-ペンテン-1-オンにGrignard試薬を1,4-付加させてin situにシリル化することにより生成するシリルエノラートを,触媒量の酢酸パラジウムで処理することによりビシクロ[3.3.0]オクタン骨格が中程度の収率で得られることが明らかとなった.同様の方法論をシクロ-2-ヘキセン-1-オンに適用したところ,好収率で目的とするビシクロ[4.3.0]ノナン骨格が得られてくることを見出した.さらに本触媒的環化アルケニル化反応の汎用性の拡大を目指し,sp^2炭素同士のカップリング反応に適用した.その結果,シリルエノラートのsp^2炭素と芳香環のsp^2炭素が,緩和な反応条件下でカップリングすることが明らかとなった.これまでsp^2炭素同士のカップリング反応として、Heck反応などが知られている.基本的にHeck反応の使用は,ハロゲン化ビニルや芳香族ハロゲン化物と不飽和化合物とのカップリングに限られている.一方,著者が開発したシリルエノラートのsp^2炭素と芳香環のsp^2炭素とのカップリング反応は前例のない新しいタイプの反応であり,さらに中性条件下で容易に反応が進行することから,本反応のさらなる展開が期待される.不活性オレフィンの触媒的活性化は,近年最も注目を集めている研究テーマの一つである。本研究では,同一分子内に存在する二つの不活性オレフィンを同時に活性化してカップリングさせ,多様な環状化合物を一挙に合成する方法論を確立し,さらに天然物合成へ適用することを目指した。

その結果,基質の設計を精密に行い反応条件を詳細に検討したところ,310mol%の酢酸パラジウムを用いることにより,酸素雰囲気下(1気圧)に,ビシクロ[3.2.1]オクタン化合物,デカリン誘導体・さらにヒドリンダンが好収率で合成出来ることが明らかになった。また本法(触媒的環化アルケニル化反応)を芳香族化合物に適用したところ,同様に環化反応が進行し,芳香環が融合したインダン化合物が好収率で得られることが明らかになった。さらに,基質に光学活性体を使用すれば,生理活性天然物の不斉合成に利用可能なキラル合成素子が簡単に合成できることも分かった。次に,上記した触媒的環化アルケニル化反応を利用するアフィディコリン合成に着手した。アフィディコリンはDNAポリメラーゼαを選択的に阻害することから抗腫瘍剤として期待されている四環性のジテルペンである。これまで,多くの合成化学者による合成が報告されているが,D環部の側鎖の立体化学まで制御した合成例は殆ど知られていない。本合成により,今までの問題点が全て解決された。すなわち,アフィディコリンのCD環部の合成に触媒的環化アルケニル化反応を適用して,好収率で官能基されたビシクロ[3.2.1]オクタン環部を合成した。次に,この双環性化合物の構造上の特徴を利用してD環部の側鎖を導入すべくCorey-Chaykovsky反応を適用し,望むエポキシドを立体選択的に合成した。さらにエポキシドの加水分解を行いジオールとしアセトナイドで保護した。これよりジエン部ならびにジエノフィル部を構築後,分子内Diels-Alder反応によりAB環部を立体選択的に合成し,官能基変換を行い,アフィディコリンの全合成を達成した。
玄米有効成分を活用した脳内報酬系による食嗜好制御に関わるエピゲノム機構の解明

食生活の改善が肥満や糖尿病の予防・改善には不可欠であるが、高脂肪食依存から脱却することは至難である。我々はこれまでに玄米特有の成分であるγ-オリザノールが高脂肪食への依存状態を解除すること見出してきた。本研究では、玄米成分γ-オリザノールが高脂肪食に対する嗜好性を緩和する機序を検証し、実用化につなげることを目指した。その結果、次の2点が明らかとなった。(1) γ-オリザノールは高脂肪食の摂取による報酬系機能異常を改善する高脂肪食の摂取によりDNAメチル化を介して線条体におけるドーパミンD2受容体の発現レベルが低下していた。これが高脂肪食に対する依存形成の一因と考えられた。γ-オリザノールは高脂肪食の摂取によるドーパミンD2受容体のDNAメチル化とそれに伴う発現レベルの変化を改善し、高脂肪食に対する依存状態を緩和した。(2) γ-オリザノールをナノ粒子に封入することにより作用効率が格段に向上する生体吸収性高分子ポリマーであるPLGAで作製したナノ粒子中にγ-オリザノールを封入することで、従来の投与量の1/1000以下の量で有効な代謝改善効果を確認した。平成27年度は玄米成分γ-オリザノールの作用について、下記3点を主に検証した。1.受容体の探索と受容体を介さない作用機序の解明HEK293細胞を用いたルシフェラーゼアッセイにより、核内受容体やGタンパク質共役型受容体(GPCR)を対象にγ-オリザノールがアゴニストあるいはアンタゴニストとして働く可能性のある受容体を網羅的に探索した。その結果、ゲノム修飾に関わる酵素の発現を調節する核内受容体へ作用する可能性が示唆された。2.ドーパミン系構成遺伝子のエピゲノム修飾への効果高脂肪食に対する依存形成に重要な役割を担う線条体、恒常性維持機構の一つとして摂食調節を司る視床下部の2つの部位におけるドーパミン系構成遺伝子のエピゲノム修飾を次世代シークエンサーを用いたバイサルファアイトシークエンシングにより検証した。その結果、視床下部においては高脂肪食、γ-オリザノールいずれの介入においてもメチル化状態に変化を認めなかったが、線条体においては高脂肪食の摂取により増加したメチル化がγ-オリザノールの摂取により改善されることを確認した。γ-オリザノールが核内受容体への作用を介してゲノム修飾を変化させる可能性、線条体におけるドーパミン系構成遺伝子の発現調節を介して食嗜好を変化させる可能性について、英文論文を準備中である。臨床応用に向けてγ-オリザノールをナノ粒子化することによる体内動態の変化と効力の違いについて、肥満・糖尿病モデル動物を用いて検討する。吸収効率が改善することで通常のγ-オリザノールでは認めなかった効果、毒性を認める可能性も考えられることから、従来の標的臓器である脳や膵臓だけでなく、全身の表現型変化に注目して解析を進める。
ヒトに対する病原性細菌の感染モデルとしてのカイコ幼虫の有用性に関する研究

本研究では、黄色ブドウ球菌、ザントモナスなどの病原性細菌、及び、カンジダなどの病原性真菌について、ヒト臨床で治療薬として用いられている抗菌剤、抗真菌剤の治療効果を、カイコ幼虫を用いて定量的に判定する方法の確立を試みた。その結果、ヒト臨床で有効性が確立されている抗生物質は、例外なくカイコ幼虫の系で有効性を示した。さらに、カイコ幼虫で求めたED50値は、ほ乳動物で得られている値とよく一致していた。また、ヒトで経口では無効であることが知られているバンコマイシンやカナマイシンは、カイコ幼虫の系でも、血液内注射では有効であるが、餌に混ぜたり、腸管に注射した場合には無効であることが分かった。さらに、経口投与で有効であるクロラムフェニコールは、腸管注射後直ちに血液内に現れたが、バンコマイシンでは腸管内注射では血液濃度が保たれないことが示された。さらに、摘出腸管を用いた試験管内腸管透過アッセイにおいて、バンコマイシンは透過性を示さないことが分かった。これらの結果は、カイコ幼虫の系が抗生物質の治療効果の有無を評価する上に有効であることを示している。さらに本研究では、黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株の解析を行った。murB遺伝子をはじめとするペプチドグリカン合成系の酵素群について、変異株が生育阻害を示す高温で生細胞数が減少することが明らかになった。この結果は、これらの遺伝子産物を阻害剤等で失活させれば、殺菌されることを意味している。すなわち、これらのタンパク質は、殺菌効果をもたらす抗生物質の標的であることが強く示唆された。
N型糖鎖による神経細胞膜上AMPA型グルタミン酸受容体の側方移動制御機構の解析

記憶学習形成には、神経活動に伴った適切なスパイン強度の維持が要求される。その制御には、スパインでのAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)の数が重要となる。従って、AMPARが樹状突起からスパインへ向かって移動する側方移動と呼ばれる現象を理解することが、記憶学習形成メカニズム解明の上で必須となる。これまでに特定の糖鎖の欠失により、記憶学習形成の基盤となる長期増強が減弱することを見出してきたが、糖鎖によるAMPARの移動制御機構を明らかにした報告はない。本研究は、生細胞膜上の分子の動きを一分子ごとにリアルタイムに追跡できる高精度一分子イメージング法を駆使して、その解明を目指すものである。
消化器癌早期診断のためのエピジェネティックバイオマーカの開発

日本人の死因における第一位が癌になって久しいが、癌の中では大腸癌が今や第一位とならんとしており、大腸癌はまさに国民病といって過言ではない。大腸癌は切除可能な時期に診断されれば、治癒する可能性の非常に高い癌である。従って大腸癌の激減をめざそうとすれば、癌の早期診断に勝るものは無い。しかし、現行の大腸癌検診の受診率は18%にとどまり、要精検率は7%前後、要精検者のうち大腸癌が見つかったのは約2%にすぎない。我々は、簡便さを落とさず、癌由来のDNAを便中に検出するすぐれた方法を開発した。DNAプロモータのメチル化をバイオマーカーとする画期的な診断法の確立により、そうK診断のみならず、腫瘍の性格診断、治療効果の判定等への応用をすすめ、安価で実用的で最も効果的な診断法としての意義を確立することを目的とした。現在研究期間として1年経過した所である。検出方法としてはmethylation specific PCR (MSP)を改良し、internal controlをもうけたMSSP (methylation specific single PCR)法を用いる方法で0.01%までの検出感度を上げることができ、(PCT特許出願済み)ていた。しかし、擬陽性が出現すると検査自体の特異度が落ちる心配があるため、これを改良したHiSA (high sensitivity assay)法を完成させ、特異度を上げることができた。これは国内特許を申請した。便中のDNAプロモータのマーカー部位も、様々な検討を行った。同じプロモータ状の複数のメチル化部位を同時に検討することにより、より、癌形成過程の生物学的側面を反映させることが可能となった。つまり、前癌状態としての腺腫、早期大腸癌、進行大腸癌のどの段階にあるか等質的診断も加味できる可能性がでてきた。また、大腸にできるポリープ、癌以外の病態においてどのような便中のメチル化の変化が生じるか等の詳細な検討も加わり、よりこの検査法の適正さが検討できた。一方、胃癌に対してもこの検査法で検出可能であることが証明されたことも大きな成果であった。さらに、膵癌等に関しての検討を始めている。DNAプロモータのメチル化をバイオマーカーとする画期的な診断法の確立ができた。この診断法は、早期診断のみならず、腫瘍の性格診断、治療効果の判定等への応用が可能で、安価で実用的で最も効果的な診断法としての意義を確立することができた。検出方法としてはmethylation specific PCR (MSP)を改良し、internal controlを設けることにより、MSSP (methylation specific single PCR)法を用いる方法で0.01%までの検出感度を上げることができた(PCT特許出願済み)。しかし、擬陽性が出現すると検査自体の特異度が落ちる心配があるため、これを改良したHiSA (high sensitivity assay)法を完成させ、特異壌を上げることができた(国内特許を申請中)。同じプロモータ状の複数のメチル化部位を同時に検討することにより、より、癌形成過程の生物学的側面を反映させることが可能となり、前癌状態としての腺腫、早期大腸癌、進行大腸癌のどの段階にあるか等の質的診断も加味することが可能性となった。裏を返せば、今後需要の増えると思われるスクリーニング目的の大腸内視鏡検査を省略可能な人を選別できるということも、医療経済上からは最も重要かもしれない。胃癌に対してもこの検査法により検出可能であることが証明されたことも大きな成果であった。さらに、最も診断困難とされる膵癌等に関してもこの技術により診断できる可能性が高いことが解ったことも、今後きわめて重要である。
中学・高校の学校行事の発達的意義と活動の在り方に関する教育心理学的検討

本研究は,中学・高校における文化祭や体育祭などの学校行事が個人の発達に対して長期的な観点からみた際,具体的にいかなる影響を及ぼし得るのか,そして,その影響プロセスはいかなるものかを明らかにするため,仲間集団内での同化・差異化体験が長期の社会情緒性に影響を及ぼし得ることを提唱した集団社会化理論の視座に基づき,アンケートやインタビューといった複数の手法を用いた研究を行った。大学生を対象に,過去に関与してきた学校行事体験を振り返ってもらった結果,学校行事に没頭して関わっていた者,そして,仲間の中で差異化し自身の役割を見出していた者ほど,大学で所属する部活やアルバイトなど,課外活動の運営を円滑にする行動を行うことが示唆され,集団社会化理論が部分的に支持された。また教師対象の研究で,教師自身が生徒の頃に体験した学校行事が,いかに現在の実践に活かされているかを検討した結果,そこでもまた,生徒の頃に経験した学校行事で,同化や差異化を経験していた教師の方が,その当時の経験を現在の実践にもなお,活かしていることが示唆された。最後に,高校生を対象に,1年半の種々の学校行事の中で,いかに仲間集団での同化や差異化を経験しているかを縦断的に検討した結果,そこでの同化・差異化体験には発達の個人差がみられることが示唆され,今後いかなる体験がその個人差につながるのか,更なる研究が求められることが明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。日本の学校では,授業のみならず,文化祭や体育祭などの学校行事が,ごく当たり前に行われている。ところが,学校行事の実際の機能に関する実証的知見は乏しく,その実施方法もほとんど考究されていない。そこで,本研究では,中学・高校の学校行事体験が,その後の個人のいかなる社会情緒的発達に寄与するのか,そして,活動がいかなるプロセスを経て個人の社会情緒的発達に影響するのかを明らかにすることを目的とし検討を行った。本年度は,大学生,教員,高校生という3つの観点からデータ収集を行い,確かに学校行事体験は,その活動に夢中になった者については,高校卒業後の社会情緒性の発達に有用であると意味づけられること,そのプロセスにおいては,活動集団に熱心な風土があること,また自身がリーダーなど重要な役割についていることが重要であるという示唆が得られた。そのため,学校行事が個人の発達におよぼす長期的な影響を検討するにあたっては,集団社会化理論という理論が適用できることが示唆された。次に,教員の語りを検討した結果,教員自身の中学・高校の学校行事体験は,生徒に対する共感性や現在の学校行事観につながり,学校行事における効果的な指導に活かされ得ることが明らかになった。さらに,集団社会化理論で想定されるように,教員は生徒集団の風土や役割の獲得に関して多様な働きかけを行っていることが示唆された。最後に,高校生対象の研究では,文化祭体験を通じてクラスの中での差異化が深まり,クラスの風土や個人のスキルに変化がみられることが示唆された。ただし,その変化の仕方は生徒の元々のスキルの高さによって異なっていた。以上の研究成果は,国内外の様々な学会で発表を行い,上記の成果の一部に関しては2本の学術誌論文にまとめた。またここで得られた知見は,教育現場に対しても有用な実践的含意を有すると考えられたため,教員向けに成果の発表も行った。本研究は概ね当初計画していた予定通り,アンケート,インタビューともに着実にデータ収集を行っている。今年度は調査実施が困難であることが予想された高校において10か月にわたり定期的にデータ収集を行うことができ,貴重なデータを得ることができた。またその研究成果についても,国内外双方にて学会発表を行った。国内では日本教育心理学会,日本発達心理学会の2つの学会で,日本全国の研究者と最新の知見について議論を交わした。国外ではICAP(the International Congress of Applied Psychology)という国際学会で,世界各国の研究者に日本の学校行事という教育文化を知ってもらい,各国の教育状況に関する情報交換も行うことができた。

来年の国内外の学会に向けた研究知見の発表の準備も行っており,いくつかの要旨は既に受理されている。学術論文としても発達心理学研究ならびに東京大学大学院教育学研究科紀要と2本の研究成果が受理され発行された。発達心理学研究は査読付きの学術雑誌である。また,東京大学大学院教育学研究科紀要は,査読はついていないものの,インターネットに学術論文が掲載される性質を持つ学術論文で,今後,広く知見が発信されることが期待される。さらに,研究成果に関しては学術的な発信のみならず,高校の教員向けに発信する機会も設け,研究者はもちろん,実践現場の教員にも積極的に知見を発信している。以上より,現在の研究状況は「おおむね順調に進展している」と判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,学会にて発表した研究知見を学術論文としてまとめ,投稿することを目指す。また,今年度収集したアンケートおよびインタビューデータについては,その分析を進め,国内外の学会にて知見が発信できるよう準備を進める予定である。さらには,現在,既にデータを収集している高校での調査に関して,年度をまたいで引き続き定期的にデータを収集する予定であり,複数の学校行事をまたいだ経年変化および長期的な発達の変遷を分析する予定である。
血管内皮及び平滑筋細胞におけるアンジオテンシンIIとキニンの産生動態の解明

ウシ肺動脈由来内皮細胞(CPAE)、ラット大動脈由来平滑筋細胞(AIO)及び、ブタ大動脈より内皮細胞(PAEC;擦過法)と平滑筋細胞(PASMC;explan法)とを得てそのアンジオテンシン(ANG)II産生能、プラジキニン(BK)産生能について検討した。方法;各々の細胞を径35mmのwellに5万個ずつ播種し10%牛胎児血清を含む培養液(DMEM)で培養し、コンフルエントに到達後、無血清のDMEM(pH7.4)に置換した。基質(ANGI,トリデカペプチドレニン基質(13RS)、テトラデカペプチドレニン基質(14RS)、ウシ低分子キニノーゲン(KNG))を添加し37゚Cで1時間培養後、上清を取り逆相カラムで抽出後ラジオイムノアッセイで定量した。ANGII及びBK産生酵素の阻害薬としてカプトプリル(CAPT)、キモスタチン(CHYM)、アプロチニンを用いてそれぞれの産生経路についても検討した。結果;CPAE,PAECではANGIからIIへの変換能が高く、CAPTで90%以上抑制されたがCHYMでは抑制されなかった。CPAEでの13RSからのあANGII産生能はANGIからの産生能の約15%と低かったがCAPTの影響を受けずCHYMでやや抑制された。A10でのANGIからIIへの変換能はCPAEの場合の約1/10であったがやはりCAPTで抑制された。13RSからのANGII産生能はCPAEの場合よりも高く、この活性はCAPTの影響を受けずCHYMで有意に抑刷された。PASMCでのANGIからのANGII産生能はPAECとほぼ同程度と高い活性を示した。この細胞における14RSからのANGII産生はA10の場合と異なりCHYMに抵抗性を示した。またこの細胞にはKNGからのBK産生能も認められ、アプロチニンで抑制された。結論;ブタ大動脈由来の細胞においては内皮細胞、平滑筋細胞共にアンジオテンシン変換酵素活性を示した。これらの細胞において、14RSからのANGII産生はCHYMによって抑制されず、ラット大動脈やウシ肺動脈由来の細胞の場合と異なった。従ってANG変換酵素を介しないANGII産生に寄与する酵素は単独ではなく、それぞれの寄与度も種により異なることが考えられた。従来から用いてきたウシ肺動脈由来内皮細胞(CPAE)、ラット大動脈由来平滑筋細胞(A10)に加え、ブタ大動脈より内皮細胞(擦過法)と平滑筋細胞(explant法)とを得てそのアンジオテンシン(ANG)II産生能、ブラジキニン(BK)産生能について検討した。方法;各々の細胞を径35mmのwellに5万個ずつ播種し10%牛胎児血清を含む培養液で培養し、コンフルエントに達した後、培養液を燐酸緩衝液(pH7.4)に置換した。

基質(ANGI,トリデカペプチドレニン基質(13RS)、テトラデカペプチドレニン基質(14RS)、ウシ低分子キニノ-ゲン(KNG))を添加し37°Cで1時間培養後、上清を取り逆相カラムで抽出後ラジオイムノアッセイで定量した。ANGII及びBK産生酵素の阻害薬としてカプトプリル(CAPT)、キモスタチン(CHYM)、アプロチニンを用いてそれぞれの産生経路についても検討した。結果;CPAEではANGIからIIへの変換能が高く、CAPTで90%以上抑制されたがCHYMでは抑制されなかった。13RSからのANGII産生能はANGIからの産生能の約15%と低かったがCAPTの影響を受けずむしろCHYMでやや抑制された。A10ではANGIからIIへの変換能はCPAEの場合の約1/10であったがやはりCAPTで抑制された。13RSからのANGII産生能はCPAEの場合よりも高く、この活性はCAPTの影響を受けずCHYMで有意に抑制された。ブタ大動脈内皮細胞でもCPAEと同様ANGIからIIへの変換能が高くCAPTで90%以上抑制され、13RS、14RSからのANGII産生能も認めた。この細胞にはKNGからのBK産生能も認められ、アプロチニンで抑制させた。つまり、血管内皮細胞にはANG変換酵素に加え、基質からANGIを経ないで直接ANGIIを産生する酵素や、カリクレイン様のキニン産生酵素が存在することが確認された。ブタ大動脈平滑筋細胞については現在検討中である。ブタ大動脈より内皮細胞(擦過法)と平滑筋細胞(explant法)とを得てそのアンジオテンシン(ANG)II産生能について検討した。方法;各々の細胞を径35mmのwellに5万個ずつ播種し10%牛胎児血清を含む培養液(DMEM)で培養し、コンフルエントに達した後、培養液を無血清のDMEM(pH7.4)に置換した。基質としてANG1とブタに特異的配列を持つテトラデカペプチドレニン基質(14RS)、を添加し37°Cで1時間培養後、塩酸酸性として反応を停止し、上清を取り逆相カラムで抽出後ラジオイムノアッセイで定量した。ANGII産生酵素の阻害薬としてカプトプリル(CAPT)、キモスタチン(CHYM)、を用いてそれぞれの産生経路についても検討した。結果;ブタ大動脈内皮細胞(PAEC)ではANGIからIIへの変換能が高く、CAPTで90%以上抑制されたがCHYMでは抑制されなかった。CAPTによるIC_<50>は10^<-9>Mであった。14RSからのANGII産生はCAPTの影響を受けずまたCHYMでもほとんど抑制され無かった。ブタ大動脈平滑筋細胞(PASMC)でもPAECと同様ANGIからIIへの変換能が高くCAPTで濃度依存性に抑制された。14RSからのANGII産生はCAPTの影響を受けずまたPAECの場合と同様にCHYMでの抑制は軽度であった。結論;ブタ大動脈由来の細胞においては内皮細胞、平滑筋細胞共にアンジオテンシン変換酵素活性を示した。これらの細胞において、14RSからのANGII酸性はANG変換酵素阻害薬によって抑制されず、従来用いてきたラット大動脈やウシ肺動脈由来の細胞の場合と異なり、キモスタチンに対し抵抗性を示した。従ってANG変換酵素を介しないANGII産生に寄与する酵素については種により異なることが考えられた。
標準化戦略国際ダイナミズムの中でのビジネスモデル

本研究では、既存研究をベースに導き出した標準化戦略フレームを追試し精緻化した。従来インテグラル型のアーキテクチャを持ち日系企業が優位とされていた自動車産業やFA事業における事例研究では、デジタル化の進展の中で標準化をうまく取り入れ新興国で展開するプラットフォーム戦略が見いだされた。さらに、サービス業への適用可能性を探るべくITソフトウェア開発で行ったパイロットスタディでは、開発手法のモジュール化・標準化とインドIT産業の発展、欧米企業との協業関係が浮き彫りになった。1.研究の目的本研究の目的は、標準化に伴って製品アーキテクチャが変化することによって、従来の企業戦略やビジネスモデルにどのような影響を与えているのかを分析し、企業が標準化から収益を上げるためにはどのようなビジネスモデルを構築すべきかを考察することである。日本企業の多くは高い技術力を背景にグローバルに標準化を推進しながらも、その標準化から収益を上げることができないというジレンマに直面しており、これらの一連の研究は大きな関心のひとつとなっている。申請者は、これまでこのような研究に従事し標準化戦略としてまとめてきたが、本研究は、これらの研究をさらに進化させるものである。つまり、本研究は、これまで所与とされていた製品アーキテクチャの変化を定量的に捉えなおし、さらに、事例分析による追試を行うことで、標準化戦略フレームワークの精緻化することに力点を置いている。2.初年度(H21年度)の研究実績初年度は、まずスタートとして、既存の研究成果にさらに考察を加えて、本研究のベースとすべく論文としてまとめた。その作業を進めると同時に、(1)製品アーキテクチャの観点からデータ的にモジュール化を図る指標の抽出、(2)プロトコールの再確認、(3)事例収集を行った。(1)モジュール化進展の指標の抽出:当初計画の特許のIDPによる把握を試みた。しかし、研究の進展に伴い、グローバル標準での出口市場としてBRICSが機能していることが仮説として浮かび上がり、これらの諸国での特許出願状況にも注視する必要があることが認識された。また、モジュールの低価格化といったインパクトという点から図ることも重要であることの示唆を得た。(2)プロトコールの再確認:(1)で得た知見をプロトコールにも反映させるようにした再開発した。(3)事例収集:インテグラルなアーキテクチャを持ちながら、電子化とそれに関連する標準化によって、モジュール化の進展が進む可能性の高い産業として自動車産業を特定し、調査を開始した。2. 2年度目(H22年度)の研究実績2年度目は、初年度に開発したプロトコールに基づき、以下2つの事例について情報収集を行った。(1)自動車産業:インテグラルなアーキテクチャを持ちながら、電子化とそれに関連する組み込みソフトウェアの標準化によって、モジュール化の進展が進む可能性の高い産業として自動車産業を特定し、調査を開始した。調査対象は、欧州部品メーカーのボッシュである。同社は、組み込みソフトウェア規格であるAutosarを標準化して欧州規格とする動きの中で、中心的働きをしている。標準化の結果を展開するアウトプット市場として中国およびインドなどの新興国が位置づけられていたため、インドおよび中国でのボッシュ社の情報収集を行った。(2) FAネットワーク産業:同産業は端末機器がモジュールとして標準化したネットワークで結びつくという構成をとっている。その代表的な事例として、自社規格をオープン標準化した三菱電機にヒアリングを行った。(1)と同様に、同社のインドや中国での展開を調査した。1.本研究の目的本研究の目的は、標準化プロセスに関する事例をひろく収集し、標準化を成功裏にビジネスに結び付けるための戦略と標準化から収益を上げるビジネスモデルを導き出し、一般化することである。日本企業の多くは高い技術力を背景にグローバルに標準化を推進しながらも、その標準化から収益を上げることができなかった。これらの一連の研究は大きな関心のひとつとなっている。申請者は、本研究において製品アーキテクチャの変化を定量的に捉えなおし、さらに、事例分析による追試を行うことで、標準化戦略フレームワークの精緻化することに力点を置いた。

2.最終年度の研究実績3年間にわたる本研究では、最初の2年間で、(1)一般化にむけての理論的追試のためのケース収集、(2)標準化周辺企業の普及活動に関する調査を実施した。その成果は、立本・高梨(2010)、高梨・立本・小川(2011)として発信した。最終年度では、この2年間で残された課題の解決と、さらなる研究への足掛かりとしてサービス業への理論的追試に注力、以下を実施した。(1)モジュール化指標策定のための仮説の導出:モジュール化が進展している分野として事例収集してきた自動車にターゲットを絞り、In-depthなインタビューやデータを分析(2)サービス分野としてインドIT産業を調査:インドIT企業は、欧米企業の世界的なR&D拠点となっている。調査の結果、この背景には、ソフトウェア開発におけるモジュール化があり、印・欧米間のグローバルなビジネス・エコ・システム(新たなビジネスモデル)の形成が見えた。
ダイエット関連植物素材の安全性における主要栄養素の影響評価

フォルスコリンがc-AMPを蓄積して脂肪分解を促進することから、10%フォルスコリンを含むコレウス・フォルスコリエキス(CFE)が人気のダイエットハーブ素材となっている。マウスにCFEを摂取させると、肝臓重量の増加、肝臓シトクロームP450(CYP)の誘導、脂肪肝が惹起された。また、CFE投与は肝臓CYP2Cタイプの誘導を介して、ワルファリンの抗凝固作用やトルブタミドの血糖降下作用を減弱させた。それらのCFEの作用は、飼料中スターチ含有量が高い条件で増強された。CYP誘導や脂肪肝に関与するCFE中の成分は、フォルスコリンではなく、エーテル可溶性の複数の未同定の成分と推定された。ダイエット素材のコレウス・フォルスコリエキスをジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトンにより4分画し、コレウス・フォルスコリエキス中の肝薬物代謝酵素(特にシトクロームP450 (CYP))誘導成分をマウスのin vivo系で検索した。前年度の研究においてコレウス・フォルスコリエキスによるCYP誘導作用が高スターチ食条件で明確に検出できたことから、高スターチ食条件下で検討した。その結果、コレウス・フォルスコリエキス中のCYP誘導成分はエーテル画分に多く含まれ、酢酸エチル画分やアセトン画分ではその活性は低下し、残渣にはほとんど活性がなかった。以上より、コレウス・フォルスコリエキス中のCYP誘導成分はエーテル可溶で水に難溶の特性を有していると推定された。コレウス・フォルスコリエキスと医薬品との相互作用について、相互作用の影響が重篤になる抗凝固薬ワルファリンで検討した。その結果、マウスへのコレウス・フォルスコリエキス投与は、それだけでは血液凝固パラメータにほとんど影響しなかった。しかしならが、ヒトがサプリメントから摂取しているコレウス・フォルスコリエキス量から投与量依存的にワルファリンの代謝酵素であるCYP2Cを誘導し、それを介してワルファリンの抗凝固作用を減弱させた。さらに、ヒトならびにマウスのミクロソームを用いたin vitro系で、コレウス・フォルスコリエキスはCYP2C酵素と直接相互作用することが確認できた。ダイエット食品素材のコレウス・フォルスコリ(CFE)は、マウスにおいて低用量で肝薬物代謝酵素のシトクロームP450(CYP)(特に2B、2C、3Aタイプ)を強く誘導し、高用量では脂肪肝を惹起した。CFEの低用量で惹起される肝CYP誘導を指標として、主要栄養素の影響を検討したところ、スターチ含量の高い飼料条件で肝CYP誘導が著しかった。CFEによるCYPの誘導は肝臓だけでなく腸管でも認められ、腸管のCYP誘導はCFE摂取中止によって肝臓よりも速やかに回復した。in vivo実験において、CFEはマウスではワルファリン(抗凝固薬)、また、ラットではトルブタミド(経口血糖降下薬)の薬効を、肝CYP2Cの誘導を介して減弱させることが明らかとなった。CFEはin vivoではCYPを誘導するが、in vitroではCYPを阻害した。in vivoにおいてCYP誘導や脂肪肝を惹起するCFE中の成分は、ヘキサンと水には難溶でメタノールに容易にとける成分であった。CFE粗分画を逆相の分取HPLCによってさらに分画し、in vitroにおけるCYP阻害作用を検討したところ、複数のフラクションに阻害作用が検出された。また、別途、CFE粗分画をシリカゲルクロマトによって5つのフラクションに分画し、得られた試料をマウスに混餌投与して、in vivoにおける肝CYP誘導を測定したところ、この検討においても複数のフラクションにCYP誘導活性が認められた。CFE中の既知の主要成分であるフォルスコリンには、in vivoにおけるCYP誘導も脂肪肝の惹起も認められなかった。以上の結果より、CFE中に存在するCYP誘導や脂肪肝を惹起する成分は、フォルスコリン以外の複数の成分と推定された。ダイエット素材のコレウス・フォルスコリ(CFK)エキスは、ヒトがサプリメントから摂取している量で、マウス肝薬物代謝酵素系(特にシトクロームP450(CYP)の中のCYP2B、CYP2C、CYP3A)を強く誘導した。CFKエキスによる肝CYP誘導は、混餌投与と胃内投与の条件でも同様に認められ、混餌投与では市販非精製飼料よりもAIN93G組成の精製飼料で惹起されやすかった。CYPの誘導に対する主要栄養素の影響を検討したところ、AIN93G組成飼料中の炭水化物源として利用したスターチ含量の高い条件でCYP誘導が起こりやすく、飼料中の脂質やタンパク質含量はそれほど影響しなかった。CFKエキスで認められたin vivoにおける肝CYPの誘導は、肝臓重量の増加と極めて強い相関性を示した。また、CFKエキスはin vitroにおいてCYP活性を濃度依存的に阻害した。

これらの現象は、今後実施するCYP誘導物質の効率的な検索に有益な情報となった。マウスに対するCFKエキス投与は脂肪肝も惹起したが、その影響は肝CYP誘導を惹起する摂取量の約10倍で検出された。CFKエキスによるCYPの誘導は、医薬品との併用による相互作用の可能性を示した。コレウス・フォルスコリエキスはヒトでも肝CYP誘導を介して医薬品と相互作用する可能性をはじめて明らかにした。また、コレウス・フォルスコリエキス中の肝CYP誘導成分はエーテル可溶性の性質を有することを明確にすることができ、おおむね当初の目的が達成できた。CFKエキス投与が肝CYPを誘導し、医薬品と相互作用する可能性、ならびにCFKエキスによるCYP誘導と飼料条件の関連を明らかにできた。またCFKはCYP誘導だけでなく脂肪肝を惹起すること、その投与量との関係を明確にすることができ、概ね当初の目的が達成できた。コレウス・フォルスコリエキスをさらに分画し、誘導成分の検索を引き続き実施する。また、コレウス・フォルスコリエキス中にはcAMP濃度を上昇させるフォルスコリンが含まれていることから、その肝CYP誘導作用も併せて検討する。CFKエキスによる肝CYPの誘導は、併用医薬品の薬効を減弱させる可能性があることから、医薬品としてワルファリンを用い、そのCFKエキスとの併用による相互作用についてさらに詳細に検討する。また、前年度の結果を踏まえ、in vitro系におけるCYP活性の阻害ならびにin vivo系における肝重量の増加とCYP活性の増加という2つの指標の組み合わせにより、CFKエキス中に存在するCYP誘導物質の検索を予定通り実施する。当該年度末に分析機器(HPLC)の不具合がありその修理を行ったが、請求書が届いていないことから、現時点では支払いができていない。その部分の支払いが次年度に持越しとなったが、それ以外についてはほぼ当初の予定通り行う。薬物代謝酵素のin vitroにおけるスクリーニングキットが効率的な研究遂行に有益なことが判明した。その測定キットの利用に必要な機器が24年度に入手できることになった。そこでキットの購入等を予定していた一部の予算を24年度に持ち越すことにした。その他については当初の予定通りとする。機器等の購入の予定はない。
生体組織の力学的適応におけるコラーゲン分子間の力学的相互作用の解明

コラーゲン溶液から再構成した原線維とコンドロイチン硫酸Bの相互作用を水晶振動子マイクロバランス(QCM)を用いて解析した.その結果,コンドロイチン硫酸Bには,コラーゲン原線維同士を結合する作用があることが明らかになった.また,再構成コラーゲン原線維の引張試験と微視的構造観察を行った.その結果,再構成原線維は,腱を構成している原線維と同等の力学的性質と微細構造を有することが明らかになった.酸可溶性Type Iコラーゲン溶液から原線維を再生させ,この過程で起こるコラーゲン分子間の力学的相互作用をQCMを用いて解析するとともに,再生原線維の引張試験と微細構造観察を行った.温度37°Cに設定した恒温槽内に,水晶振動子を装着したウェル型セルを設置した.その後,コラーゲン溶液をセルのカップ部にマイクロピペットを用いて滴下した.次に,再構成用緩衝液を滴下して,コラーゲン原線維を再生させた.得られた周波数の変化量からコラーゲン原線維の再生量を算出した.次に,この水晶振動子を蒸留水で洗浄・乾燥させた後,コラーゲン溶液あるいはコンドロイチン硫酸Bをセルのカップ部に滴下し,水晶振動子上に形成された原線維に吸着する分子の吸着量を得られた周波数の変化量から算出した.さらに,水晶振動子上に再生された原線維の微細構造を原子間力顕微鏡(AFM)を用いて観察した.その結果,コンドロイチン硫酸Bにはコラーゲン原線維とコラーゲン原線維を結合する作用があることが明らかになった.再生原線維の力学的性質は独自に開発した引張試験システムを用いて調べた.その結果,本実験で得られた直径369±33nm(平均±標準誤差)の再生原線維の引張強度は75.0±40.7MPa,破断ひずみは42.2±10.5%,接線弾性係数は157±38MPaであった.現有するQCM装置は,溶液をカップ状の容器に滴下して反応させる方式であるので,溶液中のコラーゲン分子や再生された原線維に力学的刺激を与えることはできない.そこで,溶液に流れを与えながらコラーゲン原線維を再生させ,そのときに起こるコラーゲン原線維間や分子間の力学的相互作用を解析するためのQCM装置の開発を進めた.酸可溶性Type Iコラーゲン溶液から原線維を再構成させ,この過程で起こるコラーゲン分子間の力学的相互作用をQCMを用いて解析するとともに,再構成原線維の引張試験と微細構造観察を行った.溶液に流れを与えながらコラーゲン原線維を再構成させ,そのときに起こるコラーゲン原線維間や分子間の力学的相互作用を解析するためのQCM装置を開発した.希塩酸で濃度を調整したコラーゲン溶液を送液ポンプを使用して,温度37°Cのインキュベーター内に設置した水晶振動子を取り付けたフロー型セルに流し込んだ.次に,再構成用緩衝液を流してコラーゲン原線維を再構成させた.送液ポンプを制御して,流速や流れの方向を変化させて,コラーゲン分子に種々の力学的刺激を加えた.得られた周波数の変化量から原線維の再生量や原線維間の力学的相互作用について解析した.その結果,コラーゲン原線維の再構成において,流れを与えても吸着する原線維の配向に影響は現れなかったが,コラーゲン濃度が高いと長い原線維が多数再構成されることが明らかになった.再構成原線維の力学的性質は独自に開発した引張試験システムを用いて調べた.その結果,本実験で得られた直径367±24 nm(平均±標準誤差)の再構成原線維の引張強度は77.9±28.4 MPa,破断ひずみは38.7±7.6 %,接線弾性係数は188±37 MPaであった.これらの値とラット尾腱より摘出した原線維の力学的性質の間で有意差はなかった.以上の結果から,再構成された原線維は,生体内の腱を構成している原線維と同等の力学的性質を有することが明らかになった.溶液に流れを与えながらコラーゲン原線維を再構成させ,そのときに起こるコラーゲン原線維間や分子間の力学的相互作用を解析するためのQCM装置が完成し,流速や流れの方向を変化させて実験を行うことができた.有用なデータが得られており,当初の予定通り研究は順調に進んでいる.Type Iコラーゲン溶液から原線維を再構成させ,この過程で起こるコラーゲン分子間の力学的相互作用をQCMを用いて解析するとともに,再構成原線維の引張試験と微細構造観察を行った.水晶振動子を装着したウェル型セルのカップ部にコラーゲン溶液をマイクロピペットを用いて滴下した.その後,再構成用緩衝液を滴下して,コラーゲン原線維を再構成させた.次に,この水晶振動子を蒸留水で洗浄・乾燥させた後,コンドロイチン硫酸Bをセルのカップ部に滴下し,水晶振動子上に形成された原線維に吸着するコンドロイチン硫酸Bの吸着量を得られた周波数の変化量から算出した.その結果,コンドロイチン硫酸Bにはコラーゲン原線維同士を結合する作用があることが明らかになった.コラーゲン溶液と再構成用緩衝液を送液ポンプを使用して,水晶振動子を装着したフロー型セルに流し込み,流速や流れの方向を変化させて,コラーゲン分子に種々の力学的刺激を加えながら原線維を再構成させた.

その結果,流れを与えても吸着する原線維の配向に影響は現れなかったが,コラーゲン濃度が高いと長い原線維が多数再構成された.また,原線維を再構成させた後,蒸留水を流すと,吸着していた原線維の一部が脱離し,その脱離量は流れの向きにより変化することが明らかになった.再構成原線維の力学的性質は独自に開発した引張試験システムを用いて調べた.その結果,得られた再構成原線維の力学的性質と生体内の腱を構成している原線維の力学的性質の間で有意差はなかった.また,両末端にテロペプチドを持つ分子から再構成された原線維に比べて,テロペプチドを持たない分子から再構成された原線維の力学的強度は小さいことが明らかになった.コラーゲン溶液から再構成した原線維とコンドロイチン硫酸Bの相互作用を水晶振動子マイクロバランス(QCM)を用いて解析した.その結果,コンドロイチン硫酸Bには,コラーゲン原線維同士を結合する作用があることが明らかになった.また,再構成コラーゲン原線維の引張試験と微視的構造観察を行った.その結果,再構成原線維は,腱を構成している原線維と同等の力学的性質と微細構造を有することが明らかになった.酸可溶性Type Iコラーゲン溶液から原線維を再生させ,この過程で起こるコラーゲン分子間の力学的相互作用をQCMを用いて解析するとともに,再生原線維の引張試験と微細構造観察を行った.また,溶液に流れを与えながら原線維を再生させることができるQCM装置の開発も進めており,当初の予定通り研究は順調に進んでいる.平成27年度に実施した流れによる負荷下での原線維の再構成実験において,さらにコラーゲン溶液の流速や流れの方向などの種々のパラメータを変えて実験を行い,再構成過程で起こるコラーゲン原線維間や分子間の力学的相互作用を解析する.以上の実験より得られた分子レベルでの結果と,これまでに蓄積してきたミクロおよびマクロなレベルでの腱や靭帯の力学的反応に関するデータを比較・検討することによって,力学的環境の変化に対する生体組織の力学的適応のメカニズムを解明する.生体工学平成26年度に開始したQCM装置の開発を本格的に行い,完成させる.希塩酸で濃度を調整したコラーゲン溶液を送液ポンプを使用して,温度37°Cのインキュベーター内に設置した水晶振動子を取り付けたフロー型セルに流し込む.次に,再構成用緩衝液を流してコラーゲン原線維を再生させる.送液ポンプを制御して,流速や流れの方向を変化させて,コラーゲン分子に種々の力学的刺激を加える.得られた周波数の変化量から原線維の再生量や原線維間の力学的相互作用について解析する.当初予定していたよりも薬品等の消耗品費が必要なかった.また,成果発表のための国内旅費を大学の旅費で賄うことができた.溶液に流れを与えながらコラーゲン原線維を再生することが可能なQCM装置を開発するために,新たにQCM用発振コントロールモジュールと送液ポンプを購入する予定であったが,現有する装置でも使用に問題ないことがわかったので,新たに購入する必要がなくなった.原線維の再構成実験において,コラーゲン溶液の流速や流れの方向などの種々のパラメータの影響について検討するために,平成27年度よりも多くの実験を行い,薬品等の消耗品費として使用する.再生された原線維の微細構造を現有する原子間力顕微鏡(AFM)を用いて観察しているが,さらに詳細に調べるために走査型電子顕微鏡(卓上顕微鏡,Miniscope TM3030 Plus)をレンタルして,再生原線維の微細構造観察を行う.
マウスＥＳ細胞の維持に必須な遺伝子群の網羅的探索

ES細胞は、無限の自己複製能と、様々な細胞系譜へ分化するための多能性という、2つの特徴を有す。ES細胞を再生医療へ応用するには、この2つの特性を制御する遺伝子群についての詳細な解析が必要である。本研究では、近年報告されたハプロイドのマウスES細胞に対して、我々が長年に渡って用いて来た遺伝子トラップ法を適用し、ベクター挿入による遺伝子破壊株の単離の原理を証明した。本研究で樹立した実験条件を大規模化することで、ES細胞の自己複製と未分化維持に必須な遺伝子の網羅的スクリーニングが可能となり、表現型を元にした遺伝子機能解析に繋がると考えられる。ES細胞は、無限の自己複製能と、様々な細胞系譜へ分化するための未分化性という、2つの特徴を有す。本研究では、近年報告されたハプロイドのマウスES細胞に対して、我々が長年に渡って用いて来た遺伝子トラップ法を適用することで、ES細胞の自己複製と未分化性維持に必須な遺伝子の網羅的スクリーニング法の開発を試みた。(1)ハプロイドES細胞の培養条件:ハプロイドES細胞は培養過程で自然にディプロイド化するため、細胞を継代する過程で、FACS解析で核型をモニターしながら、定期的にハプロイド細胞をHoechst33342で染色し、ソーティングする必要がある。染色による細胞毒性を最小限に抑え、かつ、純度の高いハプロイドES細胞を回収するための条件を設定した。(2)遺伝子トラップベクターの開発:Cre依存的に遺伝子トラップのユニットが反転して遺伝子を破壊できるベクターを作製した。反転が十分になされるためのCreの活性化条件を設定した。遺伝子トラップベクターを効率的にゲノムへ挿入するためのトランスフェクションの条件も設定した。(3)FACSにより回収したハプロイドES細胞へ遺伝子トラップベクターを導入した。ベクター挿入部位を決定し、かつ、挿入部位の遺伝子型をPCRで解析することにより、野生型のアレルが消滅していることを証明した。(1)ハプロイドES細胞の培養条件ハプロイドES細胞は、培養過程で、自然にディプロイド化する。このため、細胞を継代する過程で、FACS解析で核型をモニターして、定期的にハプロイド細胞のみをソーティングする必要があった。また、ソーティング後には細胞の増殖が著しく低下する傾向も認めた。網羅的な遺伝子破壊を行うには、多数のハプロイドES細胞へ変異を導入する必要があるため、上記の問題点を解決することが重要と考え、ハプロイドES細胞の培養とソーティングの条件を検討した。具体的には、血清の添加の有無やフィーダー細胞の有無、ソーティング前のHoechst33342による染色条件、ソーティングにおけるgating等を検討した。(2)ベクターの導入法の検討網羅的に遺伝子を破壊するためには、ベクターの導入効率を高める必要がある。GFP発現ベクターを用いて導入のための条件を検討した上で、変異導入用ベクターを用いた実験を施行した。(3)ハプロイドES細胞におけるCre遺伝子の発現系の構築本実験では、ベクター内のlox配列を効率的にCreタンパクで反転させる必要がある。我々は以前に、ディプロイドES細胞において、遺伝子ターゲティング法を用いて、ゲノムの特定の場所へCre-ERT2融合タンパクの遺伝子をノックインすることで、効率的にCre-ERT2融合タンパクを発現させることに成功していた。しかし、同様の方法では、ハプロイドES細胞における遺伝子ターゲティングは効率が低かった。そこで、他の手法でのCre-ERT2融合タンパクの発現法を検討中である。24年度中に、Cre依存的な遺伝子破壊ベクターをES細胞へも網羅的に導入して、ハプロイドES細胞の網羅的遺伝子破壊を終える予定であった。しかし、網羅性の達成という観点からは、Creによる組換え効率と、ハプロイドES細胞へのベクターの導入効率が、未だ不十分であるため、実験条件の再検討を行うこととした。研究遂行上の問題点を浮き彫りにできた点では、今後につながる結果が得られたと考えている。Creによる組換え効率を高めるために、ベクターのlox配列の塩基配列を変える。Creによる組換え効率が高まらない場合は、Creによる変換が行われた細胞のみをベクター挿入部位の決定に用いるようにPCRプライマーをデザインする。当初予定していた網羅的な変異細胞ライブラリーの作製をとりやめたため、24年度の研究費に未使用額が生じたが、25年度に実験条件を改良の上でライブラリー作製に要す試薬を購入し、ES細胞における必須遺伝子同定の研究を実施する。
動物細胞rRNAの転写とプロセッシングの共役

1.マウスrRNAの転写開始因子。マウスFM3A細胞を定常期(12×16^6細胞/ml)まで培養し、それから調製したS100によるin vitrorDNA転写効率は、対数増殖期(5×10^5/ml)に比べ、8%程度にまで低下する。NAD^+をin vitrorDNA転写系に添加すると、定常期S100による転写効率が、NAD^+の濃度依存的に著しく上昇し、対数増殖期S100によるrDNA転写と同程度にまで回復した。このNAD^+の効果は、30°C、20-30分間の前処理が必要であり、チミジンおよびニコチンアミドにより阻害された。NTPの濃度変化のrDNA転写に対して、NAD^°Cは何ら影響を及ぼさないことから、単にNTPの安定化によるものではなく、転写因子またはRNAポリメラーゼIがポリまたはモノADPリボシル化の修飾を受け、rDNAの転写効率に影響を与えたことが示唆された。目下、何がADP-リボシル化を受けたためによる影響かを検討中である。2.プロセッシングシグナルと因子。マウスrRNAの転写スペーサー部分数ヵ所のエンド型切断部位近傍に、GGYUUGYCY=UorC)なる共通塩基配列があることを昨年報告した。この共通塩基配列を含む21merの合成ヌクレオチドTCGACCCCCGGTTTGTCCCCTを合成し、SP6プロモーターのRNA合成開始点26塩基下流に連結したプラスミドを構築した。50塩基長のrun-offRNAを合成し、マウスS100を用いて切断を受けるか否かを調べたところ、37および13塩基長のRNAが生じた。この結果は、上記共通塩基配列内で、エンド型切断が生じたこを物語るものであり、この配列がプロセッシングシグナルに関与する可能性を示唆した。また、この部位の切断に関与する蛋白性因子は、リン酸セルロースカラムでは0.1MKCL溶出分画に認められたが、ヘパリン-セファロースカラムでは、0.1Mおよび0.6MKCL溶出分画の2つの分画に分かれることが明らかとなった。