hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地中熱利用技術開発のための多孔質媒体中の水・熱輸送モデルの高度化に関する研究

多様化する地中熱利用技術の普及・発展のためには、地下浅層のような不飽和状態の土壌中の流体流動・熱輸送プロセスを表現できる数値シミュレーションモデルが必要である。本研究では、特に高透水性多孔質媒体を対象とした流体流動・熱輸送モデルの開発を目的とした室内での浸透実験および数値モデルの開発を行った。その結果、高透水性多孔質体中の流体流動であっても多相流モデルを適用し再現することができた。また、固・液(水)・気相それぞれの温度を個別に追跡できる数値モデルを提案した。提案した数値モデルを用いることで実験結果を概ね再現することができた。多様化する浅層の地中熱利用システムの技術開発のためには、様々な地盤の粒径に対し地下水流動やそれに伴う熱輸送の変化を表現できる数値モデルが必要である。本研究では、地盤・土壌を対象とした多孔質体中の流体流動・熱輸送について、特に、高透水性媒体を対象とした実験装置の製作および実験を実施した。また、実験結果を元にシミュレーションモデルによる数値計算を実施した。製作した実験装置は内部に温度センサーを12個設置できる鉛直円筒カラムであり、カラム装置の下部の電子天秤により排水量変化を測定することで流量・流速を推定した。本研究では特に高透水性多孔質体を対象としているため、主に直径3mmのガラスビーズを用いて実験を行った。変水位試験の原理による絶対浸透率の測定では、約3×10^-9m^2であった。不飽和状態から温水(基準温度+2030°C)約500mlを繰り返し注入し、温水の浸透に伴う多孔質体中および排水温度の測定と、同様の温水を連続的に滴下させる実験を実施した。その結果、注入方法の違いによりカラム内部および排水の温度変化が異なる結果が得られた。また、繰り返し注水を行う実験ではカラム内の空気挙動が影響していると考えられる排水変化を測定することができた。また、数値モデルについてはこれまで申請者が構築した多相流の流体流動・熱輸送シミュレーション・コード(吉岡・登坂、2010)を元に計算を行った。本研究による実験結果を元にモデルの拡張を試みた。特に相対浸透率曲線については高透水性の多孔質体を対象とした曲線を得ることができ、これは多相流モデルの適用範囲を拡張するものであると考えられる。本研究課題の1つであった固液気相熱輸送の簡易モデルの確立までは達成されなかったが、本研究による実験結果および将来的には野外実験における測定結果を元に計算条件に応じて適用できる簡易モデルの構築を行う予定である。再生可能エネルギーである地中熱利用の分野において、効率向上システムの開発に向けて地盤と熱交換器との熱交換率の増強に関する研究開発が進められている。その中には、砂利等の比較的透水性の高い多孔質媒体を活用する技術も進展しており、多様化する浅層の地中熱利用システムの技術開発のためには、様々な地盤の粒径に対し地下水流動やそれに伴う熱輸送の変化を表現できる数値モデルが必要である。本研究では、まず、地盤・土壌での流体流動と熱変化に関する論文についてレビューを行った。不飽和の多孔質体中の流体流動のメカニズムについては古くから研究がなされているが、温度測定を行っているものは少ないことが明らかになった。その中で佐倉(1984)は、圃場やカラムを利用して、砂などの媒体中の水の動きと温度変化を測定しているが、流体流動と温度変化のメカニズムについては明らかになっておらず、さらなる実験の必要性が確認された。次に、室内実験用のカラム装置の設計を行った。直径が15cm、長さが40cmのカラムに4つの温度センサー挿入口を取り付けた。このカラムを最大で3つまで連結できるスタンドを制作し、スタンドの下部には開閉型のコックを取り付け、その下には水受けと電子天秤を設置し、排水速度から流出量を測定可能である。温度センサーには熱電対を利用し、1ms以下の高速度で温度を測定できるデータロガー(HIOKI社製)を用意した。カラム内部にはガラスビーズ(現在3mmを主に使用)を充填させ、内部に水や温水(恒温水槽により生成)を流入させることが可能である。現在、本装置を用い、流出速度の測定を行っており、近いうちには不飽和状態での温度測定に着する予定である。また、数値モデルについては、これまで申請者が構築したコード(吉岡・登坂、2010)の整理および改良を実施すると共に、実験データを再現するためのデータセットの準備を進めている。交付申請時における計画案では、実験の大半を平成24年度中に完了する予定であったが、現在、完了には至っていないため、やや遅れているものと考える。その理由として、主に実験に使用するカラム装置の設計がやや遅れたことが挙げられる。

本研究では、一般的な浸透カラム実験に使用される粒径よりも大きな多孔質体を対象としているため、カラムのサイズや重量、設置の最適化を検討したためである。それにより、安全に配慮した比較的フレキシブルな装置を計画よりも低価格で作成することができた一方、やや計画に遅れが生じたものと考える。今後は、まず、8月頃を目安に現在行っている室内カラム実験を進展させる。本研究で特に着目している高透水性多孔質媒体では、これまでのDarcy型の透水実験よりも粒径が大きいため装置の規模が大きく設計や扱いに困難なところがあったが、実験自体は浸透速度が速いため比較的短時間で終了する。そのため、短期間であっても繰り返し実験を行うことができ、精度のよいデータを獲得することができると考える。次に、得られたデータを用い、現在コードの精査を行っている数値モデルの改良・パラメータに対する感度解析を実施する。本作業により、本研究のコアとなるシミュレーションモデルを完成させる。一方、様々な粒径に対しても構築したモデルが適用できるのか、またその場合のパラメータはどの程度なのかを把握するため、細粒(粒径1mm以下)のものについても実験を実施する予定である。細粒多孔質体における実験にはある程度時間がかかるが、数値モデルの改良や上記の基礎的なカラム実験結果とのフィッティングと共に実施することで、時間を節約できるものと考えている。また、実験データの不足が懸念される場合には、これまで申請者が設計したカラム装置の直径を小さくしたものを追加で発注する。上記3.で述べたように、カラム設計時の最適化により、やや研究計画に遅れが生じたが、予算に多少の余裕があり、カラムを含めた実験システムの追加発注を行うことができる。作製期間についてもすでに設計も行われているため、製作期間も前回よりも短期間で納品が可能である。これらを同時並行で使用することで、同時に数種類のデータを得ることができ、時間の短縮になると考える。最終目標である多孔質体中の流体流動・熱輸送モデルの簡易化については、基礎となる改良型数値モデルを整備した後(夏以降を想定)、実施する予定である。実験を加速させるため、実験装置の追加等の設備費へ約60万円、測定・解析用の計算機として40万円、消耗品として解析に必要なソフトウェアを含め30万円、国内外の学会発表への参加するための旅費として45万円を計画している。詳細は以下の通りである。まず、設備費については、現在使用している実験装置の高度化のために約20万円を、同種類のカラム実験装置の製作費および周辺機器の購入のため約40万円を予定している。現在すでに使用している測定器等に追加して測定できる項目もあり、初年度の設備購入額よりも少額で実験システムを追加することが可能である。また、計測用および解析用として計算機購入費として40万円を予定している。消耗品としては、ガラスビーズ等実験に必要な備品および申請時からの予定である可視化ソフトウェアの購入を含め30万円を計画している。さらに、本研究で得られた結果を国内外で発表するための旅費および参加費として、45万円を計画している(国内の学会に2回、国際学会を1回を予定)。
減圧雰囲気中プラズマ溶射による急冷凝固形状記憶合金材料の作製とその評価

1.目的:一般に合金を液体状態から急速凝固させると組成が均一になる。このことはTiNi合金のように形状記憶の作動温度が合金組成に大きく依存する材料では実用上重要である。また、急速凝固によって結晶粒を極めて微細にするとマルテンサイト変態温度が低下することが知られており、これを利用すると形状記憶合金の作動温度を正確に制御することが可能となる。本研究では、特別な固化プロセスを経ずに直接バルクの急速凝固材を作製することができる減圧プラズマ溶射法を用いて、TiNi合金粉末から急速凝固材を作製し、その組織とマルテンサイト変態を調べた。2.方法:溶射に用いた合金粉末は2種類である。粉末AはNi粉末をTi粉末をボ-ルミルにかけて作った複合粉末であり、Ni相とTi相が非常に幅のせまい層状構造をなしている。粉末Bはディスク法で作った合金粉である。これらの粉末を減圧チャンバ-内で基板上にプラズマ溶射した。基板は、粉末Aの場合には裏面を水冷した鉄板であるが、粉末Bの場合には、このほかに冷却能の異なるいくつかの基板も用いた。3.結果と考察(1)粉末Aの場合:溶射によってNi相とTi相が溶融・反応し、TiNi相が生成する事が期待されたがこれは生成せず、Ni_3Ti相とNiTi_2相が形成された。これは各粉末粒子中でNiとTiの割合が必ずしもモル比で1:1となっていないこと、あるいは溶射での短い飛行時間ではNiとTiの反応が完了しなかったことによると考えられる。(2)粉末Bの場合:asーsprayed皮膜はTiNi母相とマルテンサイト相からなっている。マルテンサイト変態に伴う皮膜の発熱量は冷却能の大きな基板を用いたときほど大きい。いずれの基板の場合にも、発熱量は粉末のそれよりも小さい。これらの結果は、急速凝固による結晶粒の微細化と規則度の変化によると考えられる。目的:種々の形状記憶合金のなかでも、TiーNi合金は強度、耐久性、信頼性の点で現在のところ最も優れており、機能材料としてさまざまな面に応用されている。本研究では、減圧プラズマ溶射法によって微細な結晶粒から成るTiーNi合金の急速凝固皮膜を作製し、その変態温度や熱処理の効果を特に結晶粒径との関連で調べることを目的とする。方法と結果:TiおよびNi粉末を等原子比に混合したのち、遊星ボ-ルミルにかけTiーNi複合粉末を作製した。この粉末粒子内ではTiとNiが非常に幅の狭い交互の層状構造をなしている。減圧チャンバ-内で、この粉末と厚さ3mmの鉄製基板上にAr+H_2を作動ガスとしてプラズマ溶射し、急速凝固させた。その際、TiがH_2を吸収する恐れがあることを考慮してH_2量をできるだけ少なくした上で、皮膜が緻密で、かつ溶射中に皮膜の温度があまり上昇しないような溶射条件を決定し、続いてこの条件で溶射を行なった。プラズマフレ-ム内で粉末粒子が溶融すると、層状構造をなしたTiとNiが急速に反応して金属間化合物相を形成する。この反応をできるだけ進ませるように溶射距離を長くしたが、得られた皮膜のX線回折から、皮膜の構成相は大部分がTi_2Ni相であり、そのほかNi_3Ti相、TiNi相およびNi相が含まれていることがわかった。

これはNiとTiの間の反応が十分に進行するための時間がなかったためと考えられる。溶射に適した清浄なTiNipre-alloy粉末の製造が現在のところは困難であることから、pre-alloyTiNi線材を溶射材とし、減圧雰囲気中でこれを溶射して急速凝固材を作製することが適当であると考えられる。減圧プラズマ溶射によるTiNi形状記憶合金の急速凝固を目的として、今年度は以下のような実験を行った。1.方法:急速凝固させるための溶射粉末には回転ディスク法で作製したTiNi合金を用いた。粉末の粒径は90μm以下であり、Ni含有量は49.05at%である。この粉末を減圧雰囲気中で回転基板上へプラズマ溶射して急速凝固させた。急速凝固時の冷却速度および自己焼鈍の程度を変えるために、次のような冷却能の異なる4種類の基板を使用した。これらは、(1)裏面を水冷した銅基板、(2)裏面を水冷した鉄基板、(3)水冷しない鉄基板、および(4)冷水しないアルミナ基板である。得られた皮膜の組織を光学顕微鏡とSEMおよびTEMで、構成相をX線回折で、またマルテンサイト変態温度と変態熱量をDSCで調べた。2.結果と考察:溶射粉末の主な構成相はマルテンサイトであり、このほかにTiNi母相がある。一方、溶射による急速凝固皮膜は基板の種類にかかわらずTiNi母相とマルテンサイトから成るが、溶射粉末に比べるとマルテンサイトの量は著しく少ない。マルテンサイト変態および逆変態に伴う発熱及び吸熱量は、溶射粉末に比べて皮膜ではかなり少ない。また、基板の冷却能が小さいほど皮膜の変態熱量は少ない。溶射皮膜中には1μmよりもかなり小さな粒径の結晶からなる領域がある。結晶粒が極めて微細になるとマルテンサイト変態が抑制されることが知られている。また、TiNi合金においても温度によって規則度が変化するとの報告があり、さらに銅基形状記憶合金においてではあるが、規則度がマルテンサイト変態に影響すると言われている。粉末と皮膜の間での、および冷却能の異なる基板上に形成された皮膜間での変態熱量の相違は、結晶粒径や規則度の観点から説明される。
リボソーム生合成系と細胞膜合成系のクロストーク

リボソーム生合成は、細胞内外の環境変化に応答して厳密に調節されている。その制御の一つとして、出芽酵母において、分泌経路が遮断されるとリボソーム生合成が転写レベルで抑制される。分泌経路の遮断はWsc蛋白質によって細胞膜ストレスとして感知され、そのシグナルがPkc1を介して伝達されると考えられているが、その他の因子に関する知見は乏しい。これまでに、分泌経路遮断によってTORC1下流エフェクターSch9およびSfp1の活性に必要なTORC1依存的なリン酸化が減少することが報告されている。これらのことから、分泌経路遮断によるリボソーム生合成抑制に、TORC1を介した経路が関与することが考えられた。前年度において、分泌経路遮断によるリボソーム生合成抑制においてTORC1-Sch9経路の活性が必要であることが示唆された。本年度は、TORC1と機能的に異なるTORキナーゼであるTORC2およびTORC2下流で制御されるスフィンゴ脂質の分泌経路遮断によるリボソーム生合成調節機構への関与について検討した。TORC2構成因子変異株を用いて、分泌経路遮断によるリボソーム蛋白質遺伝子の転写への影響を解析した結果、TORC2は分泌経路遮断時のシグナル伝達に関与しないことが示唆された。また、スフィンゴ脂質合成の各ステップに関与する酵素の遺伝子変異株を用いて同様の解析を行った結果、分泌経路遮断時のシグナル伝達にスフィンゴイド塩基が必要であることが示唆された。スフィンゴイド塩基はキナーゼであるPkh1/2の活性を制御することから、Pkh1/2の遺伝子変異株を用いて同様の解析を行った結果、Pkh1/2が分泌経路遮断時のシグナル伝達に関与することが示唆された。以上の結果から、分泌経路遮断によるリボソーム生合成の抑制において、スフィンゴイド塩基-Pkh1/2経路が必要であることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。出芽酵母において、分泌経路が遮断されるとリボソーム生合成が転写レベルで抑制される。分泌経路の遮断はWsc蛋白質によって細胞膜ストレスとして感知され、そのシグナルがPkc1を介して核内へと伝達されるが、その他の因子に関する知見は乏しい。本研究では、分泌経路遮断時のリボソーム生合成抑制機構におけるTOR (Target Of Rapamycin)経路の関与の有無について検討した。TOR複合体には、構成因子と機能の異なる2つの複合体TORC1とTORC2が存在する。本年度は、分泌経路遮断によって誘導されるリボソーム生合成抑制機構におけるTORC1の関与について解析した。TORC1はリボソーム生合成調節に関与することが報告されている。TORC1機能欠損株を用いて、分泌経路遮断時のリボソーム蛋白質遺伝子の転写への影響を解析した結果、分泌経路遮断時のリボソーム蛋白質遺伝子の転写抑制は部分的に解除されていた。さらに、TORC1下流エフェクターSch9の欠損株も、分泌経路遮断時のリボソーム蛋白質遺伝子の転写抑制に欠陥を示した。そこで、Sch9欠失株に恒常的活性化型あるいは恒常的不活性化型のSch9を発現させ、分泌経路遮断時のリボソーム蛋白質遺伝子の転写への影響を解析した。その結果、恒常的活性化型を発現させてもリボソーム蛋白質遺伝子の転写抑制に影響を及ぼさなかったが、恒常的不活性化型を発現させると、分泌経路遮断時のリボソーム蛋白質遺伝子の転写抑制が部分的に解除された。以上の結果から、分泌経路遮断時のリボソーム生合成抑制機構にはTORC1-Sch9経路の活性が必要であることが示唆された。TORC1経路とリボソーム生合成抑制機構との関係について、実施計画をほぼ完了している。分泌経路遮断時におけるTORC1経路の活性については継続して研究を行う必要があるが、研究を行う準備はすでに整えている。また、平成28年度に計画していた内容について、一部解析を進めている。再現性をとる必要があるが、TORC2機能欠損株および脂質合成酵素変異株を用いて、分泌経路遮断時のリボソーム蛋白質遺伝子の転写への影響を解析した。

また、スフィンゴ脂質合成の各ステップに関与する酵素の遺伝子変異株を用いて同様の解析を行った結果、分泌経路遮断時のシグナル伝達にスフィンゴイド塩基が必要であることが示唆された。スフィンゴイド塩基はキナーゼであるPkh1/2の活性を制御することから、Pkh1/2の遺伝子変異株を用いて同様の解析を行った結果、Pkh1/2が分泌経路遮断時のシグナル伝達に関与することが示唆された。以上の結果から、分泌経路遮断によるリボソーム生合成の抑制において、スフィンゴイド塩基-Pkh1/2経路が必要であることが示唆された。今後は、分泌経路遮断時におけるリボソーム生合成調節機構におけるTORC2の関与および膜脂質の機能について解析を行う。TORC2構成因子欠失株および下流エフェクターの変異株を用いて分泌経路遮断時のリボソーム蛋白質遺伝子の転写への影響を解析する。膜脂質合成酵素の欠失株についても同様の解析を行う。これらの研究を行うために必要な遺伝子変異株はすでに準備が整っている。28年度が最終年度であるため、記入しない。
家兎大腿直筋再灌流モデルにおける抗IL-8中和投作

下肢再灌流障害は、四肢の切断後などの外傷後の血行再建術後などに認められ、四肢機能にたいして重篤な障害を与える原因となっている。近年再灌流障害において好中球の役割が注目されている。また好中球に対して走化能をもつサイトカインとしてIL-8が注目されており、再灌流障害においてもIL-8が重要な役割をもつと考えられるようになった。今回家兎再灌流障害を兎の大腿直筋モデルを用いて筋組織への好中球浸潤とIL-8の役割について検討した。兎の大腿直筋を3.5時間虚血後24時間再灌流をおこなったところ、大腿直筋の広汎な壊死と組織間の浮腫を著しくみとめた。浸潤細胞は大半が好中球であった。好中球の浸潤は、再灌流後6時間ぐらいから増加し、24時間後には最大となりその後は減少した。再灌流後48時間では、浸潤細胞は大半が単核球となり、好中球はほとんどみとめなかった。虚血時間を4時間にした場合90%以上の筋細胞の壊死を生じた。抗IL-8抗体で再灌流後24時間の筋組織を免疫染色したが、IL-8の産生は不明確であった。IL-8の再灌流後の好中球浸潤に与える影響を検討するため抗IL-8中和抗体を投与した。抗IL-8抗体10mgを再灌流前に投与した場合、再灌流後の筋組織への好中球浸潤は抑制される傾向にあった。IL-8の局在については不明確であったが、再灌流ごの筋組織への好中球浸潤にはIL-8が重要な役割をもっていると考えられた家兎大腿直筋再灌流モデルを作成し、虚血時間を3.5時間に設定し、再灌流時間を6時間、12時間、24時間、72時間、96時間に設定し再灌流後の大腿直筋に与える影響を組織学的に検討した。再灌流傷害により筋肉細胞は変性、壊死をびまん性に認めた。その後時間の経過とともに筋肉細胞の再生、線維細胞の増殖をみとめ傷害は軽減した。再灌流後早期には好中球を主体とする炎症性細胞の浸潤を認めた。また筋肉、筋間組織には著しい浮腫を認めた。筋肉の浮腫及び好中球の浸潤は24時間が最大であった。その後は、浮腫の改善がみられた。浸潤細胞は再灌流時間の経過とともに好中球から単核細胞へと変化していた。再灌流後24時間では好中球浸潤が増加しているが、以前より我々は好中球の遊走および活性化因子であるインターロイキン8が再灌流後の組織への好中球浸潤に重要な役割を担っていると考えており、今回の再灌流モデルにおいて抗IL-8中和抗体を投与し、筋肉組織に与える影響を検討した。組織学的判断であるが、抗IL-8中和抗体を虚血後再灌流前に10mg投与した群では再灌流後24時間における筋肉及び間質への好中球浸潤は、減少している傾向を認めた。IL-8の局在については不明確であったが、再灌流ごの筋組織への好中球浸潤にはIL-8が重要な役割をもっていると考えられた
トランスグルタミナーゼによる食品タンパク質と酵素類の機能改変

1.トランスグルタミナーゼの取得:ウシ血液凝固XIII因子(チモーゲン型トランスグルタミナーゼ、a_2b_2)の非触媒性サブユニット(b)にたいする単クローン抗体を産生するハイブリドーマクローンを樹立した。この単クローン抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、触媒性サブユニット(a)をウシ血漿よりワンステップで効率よく単離することが可能になった。2.モルモット肝トランスグルタミナーゼのcDNAクローニングと全一次構造の解析:cDNAの塩基配列から本酵素の全一次構造が解析され、分子量は76,620と算定された。決定した一次構造を基にして、活性中心配列の構造的特徴やカルシウム結合部位について考察することができた。肝トランスグルタミナーゼと血液凝固XIII因子の一次構造ホモロジー解析は、両者における相同領域を明確にし、本酵素の触媒機能に重要と思われる一次構造部位を示唆した。3.モルモット肝トランスグルタミナーゼのN末端プロセッシング:本酵素のNおよびC末端部ペプチドを単離して構造を解析した。その結果、本酵素はN末端プロセッシング(翻訳開始メチオニンの除去と隣接アラニンのアセチル化)を受けていることが判明した。4.動物トランスグルタミナーゼの大腸菌中での発現:モルモット肝トランスグルタミナーゼの全コード領域を含むcDNAを発現ベクターpKK233ー2のNcoI/PstI部位に組入れることにより、非融合型の本酵素蛋白質を合成するようにデザインした発現プラスミドpKTG1を構築した。pKTG1でトランスフォームした大腸菌は、天然型トランスグルタミナーゼと同じ触媒能をもつ組換え型酵素を産生した。本年度は交付申請書に記載した研究計画のうち,以下の2項目について成果をあげることができた.1.トランスグルタミナーゼ(以下TGaseと略す)の迅速精製:モノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーにより,モルモット肝抽出液からTGaseをワンステップで効率よく精製する方法を確立した.この場合,特異的に吸着した酵素の溶出条件(炭酸緩衝液, pH10.3/2MKcl)の選定が最大のポイントであった.更にウシ血液凝固XIII因子(チモーゲン型TGase,a_2b_2)に対するモノクローナル抗体も取得し,本因子の触媒性サブユニット(a_2)をウシ血漿から直接に分離精製するアフィニティークロマトグラフィーの確立にも成功した.これらの成果により,精製操作が煩雑なTGaseの迅速精製が可能となった.2.TGase cDNAクローニング:モルモット肝TGaseの部分重複cDNAクローン4個を取得し, mRNAの全長サイズ(3.73.8kg)に匹敵するcDNA配列(3695塩基)を決定した.翻訳領域のアミノ酸組成から,本酵素の分子量は76,620と算定された.解析したTGaseの一次構造を基にして,活性中心配列の構造的特徴(チオールプロテアーゼ類との類似性,疎水性領域に隣接することなど)やCa^<2+>結合部位(E-Fハンド構造よりもグルタミン残基富領域がそれに関与するのではないか)について考察することができた.肝TGaseと血液凝固XIII因子の一次構造ホモロジー解析は,両者における相同領域を明確にし, TGaseの活性と構造の相関関係を理解するうえでの貴重な情報をもたらした.次のステップとしては, TGaseの菌体内発現系を確立し,本酵素機能を蛋白質工学的に改変し,その活用領域の拡大を図かる.本年度は交付申請書に記載した研究計画のうち、動物トランスグルタミナーゼの微生物による生産について研究を行い、以下のような成果をあげることができた。既に取得しているモルモット肝トランスグルタミナーゼの部分cDNAクローンのうちpLTG16とpLTG21を用いて、本酵素の全コード領域をカバーする発現プラスミドの構築を行った。

発現ベクターpKK233ー2のNcoI/PstI部位に翻訳開始コドンから始まるcDNA断片を組み入れることにより、非融合型の酵素蛋白質が合成されるようにデザインした。構築したトランスグルタミナーゼ発現用プラスミドpKTG1でトランスフォームした大腸菌が本酵素を合成することを、イムノブロッティング解析や活性測定により確認した。大腸菌でつくられた組換え型モルモット肝トランスグルタミナーゼを、菌体抽出液から単クローン抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーにより単離した。組換え型酵素は、分子量、アミノ酸組成、NおよびC末端配列などにおいて天然型酵素と同じであったが、N末端アラニンがアセチル化されていない点が天然型と異なっていた。比活性、基質類にたいするKm値やVmax値、Ca^<2+>の活性化にたいする感受性などにおいて、組換え型と天然型の酵素間に差は無かった。このことは、天然型モルモット肝トランスグルタミナーゼのN末端アセチル基は、触媒機能の発現において特別な役割をもたないことを示している。大腸菌での組換え型酵素の生産量は1リットル培養で約3mgであった。蛋白質工学的手法による本酵素の構造活性相関の解析やそれに基づく酵素分子機能の改変が次の課題である。
骨誘導因子(BMP)による筋細胞の分化と抑制と骨芽細胞への分化誘導機構の解析

我々は、これまでの研究から、筋芽細胞(C2C12細胞)をBMP-2で処理すると、筋細胞への分化が完全に抑制され、骨芽細胞への分化が強力に誘導されることを見いだした。そこで本研究では、BMP-2による筋細胞への分化の抑制と骨芽細胞への分化誘導の相互作用を解析した。まず、筋細胞の分化を促進する転写調節因子(MyoDとMyogenin)を線維芽細胞に導入し、恒常的にMyoDやmyogenin mRNAを発現する細胞株を樹立した。これらの細胞の筋細胞や骨芽細胞への分化に対するBMP-2の作用を検討した結果、BMP-2は筋芽細胞の場合と同様に、これらの細胞でも筋細胞への分化を抑制し骨芽細胞への分化を誘導した。次に、BMP-2で骨芽細胞への分化が誘導されない線維芽細胞にMyoDを導入したところ、この細胞でもBMP-2は筋細胞への分化を抑制することが明らかとなった。さらに、免疫染色およびゲルシフトアッセイの結果より、BMP-2処理群でも、MyoDやmyogeninはDNA結合能を保持したまま核内に存在していることが判明した。以上の結果は、BMP-2による筋細胞への分化の抑制には骨芽細胞への分化誘導が必須ではないこと、BMP-2はMyoDやmyogeninタンパク質の活性を阻害していることを示している。さらに、BMP-2処理群でもMyoDやmyogeninのDNA結合能が阻害されなかったことから、BMP-2はMyoDやmyogeninによる転写の活性化に必要な他の因子を阻害する可能性が示唆された。
「メディアミックス」としての公害資料館の意味

本研究は、公害資料館を「メディアミックス」実践の場と捉え、様々なメディアが何をどのように伝えているのか、それらがどういった相乗効果を生みだしているのかを検証するものである。2018年度は資料館と公害マンガの二つのメディアが組み合わさることでいかなる力が発揮されうるのかに焦点をあてた。これまでのところ、資料館に何らかの形でこのマンガが展示される機会はなかったが、本というメディアに収録されたことで四日市市内の公共および学校の図書館におかれ、多くの市民の目に触れることになった。とくに、定期的に資料館見学を実施し、語り部の講話に参加したり、解説員の展示説明を聞いたりしている教育の現場でのこの二つのメディアが果たす役割は大きいと考え、公害を伝えるための教育実践を行っている学校の取り組みを中心に検証・考察を行った。具体的には、四日市市の小学校で公害教育に取り組むある教諭の授業実践の分析を試みた。同時に、福岡県太宰府市の小学校で公害マンガを使って四日市公害を学ぶ授業実践の事例との比較も行った。資料館という場がない状況でのマンガを使った公害学習の事例では、社会科の授業であるにもかかわらず、まるで国語の読解の授業のようになってしまったという担当教諭の言葉からわかったのは、より重層的な学びを引き出す役割を資料館が担っているということだった。ここまでの研究成果は論文としてまとめ、発表した。また、前述の二人の小学校教諭と資料館の語り部/解説員を交えての意見交換の場をシンポジウムという形で行った。研究代表者の本務校がある福岡市およびその近隣の小中学校の教員への参加を促したため、このシンポジウムは本研究の一般への成果発表を兼ねたものとなった。マンガを使った公害学習の模擬授業に参加し、その授業の分析を行った。分析結果の一部を論文としてまとめ、日本コミュニケーション学会九州支部大会で発表した。また、その論文をさらに発展させた形の論考にまとめ、研究代表者が編集に携わった『グローバル社会における異文化コミュニケーション』のなかにそれを掲載した。したがって、メディアミックスという観点から資料館とマンガがどのような相乗効果を発揮しうるのかについては、当初の予定通り研究が進み、成果もあがっているといえる。研究実績の概要でふれたシンポジウムでは、四日市の小学校での模擬授業と、四日市市と太宰府市の二つの小学校での実践報告がなされた。それに加え、語り部の講話や解説員の展示解説を含めた資料館をメディアと捉え、そこが公害を伝える場としてどのように機能しているのかも報告・議論された。公害資料館のみならず教育の現場でのマンガの使用を含めた、複数のメディアが重なり合うことの効果を考察するうえで、有益な意見交換がなされたといえる。そのシンポジウムの報告書を年度内にまとめるべく準備を進めたが、わかりやすくかつ充実した内容にするのに当初の予定よりも時間がかかったため、年度をまたぐことになった。以上の経過に照らし合わせて考えると、公害資料館を「メディアミックス」実践の場として捉え、様々なメディアを分析していくという研究における成果は順調にあがってはいるものの、シンポジウム報告書が完成できなかったことを考慮して、現在までの達成度を「やや遅れている」と評価した。シンポジウムの報告書のまとめが2018年度内に終えられず、補助事業期間の延長を申請し許可された経緯を考えると、まず報告書をまとめることに力を注ぐ。その報告書をシンポジウムにかかわった人たちや、それ以外にも公害学習に携わる現場の教員に配布し、何らかの形でフィードバックをもらう予定である。そのためにも、報告書の周知を図る機会や、報告書をもとにさらなる議論を重ねる場を設ける予定である。「語り部」や解説員の多くが元教員であることに鑑み、この報告書が公害教育において学校現場と資料館の連携をつくりだすきっかけとなれば、公害を伝えるためのすそ野が徐々に広がっていくのではないだろうか。また、広島平和記念資料館の伝承者との比較を通しての「語り部」や「ボランティア解説員」のメディアとしての役割について、今年度も継続して研究を行っていく。2018年度から始まった被爆体験伝承者等派遣事業の実態の聞き取り調査も行い、ここでも教育現場と資料館の連携の可能性について探っていく。平和教育と公害教育の類似点や相違点についても考えたい。これらの研究成果は論文としてまとめ、日本コミュニケーション学会九州支部ジャーナルで論文として発表する予定である。本研究の目的は、公害資料館を「メディアミックス」実践の場と捉え、さまざまなメディアが何をどのように伝えているのか、それらが相互にどのような影響を与えあうのかを四日市公害の資料館である「四日市公害と環境未来館」を例に取り上げて検証することである。2016年度は、四日市公害マンガ『ソラノイトー少女をおそった灰色の空』の四日市での受容を中心に研究を進めていった。資料館でのマンガの展示は実現しなかったものの、このマンガを収録した書籍『空の青さはひとつだけーマンガがつなぐ四日市公害』を研究代表者が編集・出版したことで、資料館売店や、資料館および四日市市内の図書館に置かれることになった。そのため、資料館を訪れる多数の小中学生の目に触れることとなり、夏休みの自由研究で引用されたりした。例えば「第36回三泗小中学校社会科作品展」では、四日市公害を扱ったものが31あり、7つの研究でこの本が参考文献に引用されていた。また、小学5年生の社会科の授業で四日市公害のことを教える教師2名がこのマンガを使って授業を行っていることも、フィールド・ワークのなかで明らかになった。

マンガが若い世代に公害のことを伝えるメディアとしての可能性を秘めていること、それが小学校の授業内容の検証から実証されたことを水俣市で行われた第12回水俣病事件研究交流集会で成果として発表した。四日市市内の生徒が野外実習で資料館の見学に出かけていることに鑑み、今後もマンガと資料館という二つのメディアの関係についてみていく必要があると考える。また、四日市の公害資料館は博物館と一体化しているという特徴に着目し、二つの異なる性質のミュージアムがどのような相互作用をもたらしているかについても検証した。こうした二つのメディアがあることで、戦争と公害の連続性を来館者に伝えうることが明らかになった。当初の予定通り、四日市公害マンガ『ソラノイトー少女をおそった灰色の空』の公害を伝えるメディアとしての可能性については順調に研究が進んでいる。マンガそのものの資料館での展示は実現しなかったものの、資料館の売店や図書館にはこのマンガが収録された本が置いてあり、本と資料館という二つのメディアの相互作用を分析するには不足のない状況だと思う。ただし、このマンガの英訳と、英語版が資料館の来館者に与えるインパクトについては次年度以降の課題となった。資料館の展示の分析と考察は、概ね予定通り推移しており、成果も上がっている。また、語り部と解説員に関するフィールド・ワークと面接調査も、初年度としては、ほぼ順調に進んでいるといえる。本研究は、公害資料館を「メディアミックス」実践の場と捉え、様々なメディアが何をどのように伝えているのかを検証することを目的とし、メディアどうしがどのような相乗効果を生み出す/出さないかを考察していこうとするもので、事例として取り上げるのは「四日市公害と環境未来館」である。2017年度は、資料館において公害を伝える重要な役割を担う「語り部」と「ボランティア解説員」に焦点をあて、彼女/彼らがメディアとしてどのようなコミュニケーションの場をつくり出しているのかを明らかにしようとした。特に両方を兼務している二人の人物の活動からみえてきたのは、公的な場である資料館において「語れない者」を生み出す力の存在であり、その力の作動に加担しているのは「語れる者」を固定的なイメージで捉えている私たちの先入観なのではないかということだ。こうした研究に多くの示唆を与えてくれたのが水俣病を伝える活動との比較であり、そのためのシンポジウムを四日市で開催した。また、広島平和記念資料館の伝承者の講話への参与観察および面接調査により、彼女/彼らがおかれている立場の特殊性がみえてきた。これらからわかってきたのは、当事者・家族であったとしても、公的な場で「語れる者」はそれぞれの場で恣意的に決められているということだった。また、メディアの一つであるマンガについては、1970年代に多くのマンガで公害が取り上げられたことの意味を考察し、論考としてまとめた。展示の分析については、昨年度から継続している公害と戦争とのつながりについての論考に加え、今年度は「病」が展示の場でどのように表象されているのかについても検証結果をまとめた。「語り部」と「ボランティア解説員」に関するフィールド・ワークと面接調査の結果は、発表論文としてまとめ、日本コミュニケーション学会九州支部大会で報告した。
赤痢菌の上皮細胞感染におけるオートファジー阻害機構の解析

本研究課題の研究成果より赤痢菌のiscB遺伝子欠損株(ΔicsB)は上皮細胞に侵入後オートファゴソームによる貪食を高頻度に受けることが明らかになった。さらに、オートファゴソームの「種(たね)」であるGFP-Atg5を発現させたBHK細胞にΔicsBを感染させたところ、菌体の一極へのAtg5の局在が観察されたことから、赤痢菌の一極に局在することが報告されているVirGとAtg5の結合性の解析を行った。その結果、VirGとAtg5の結合が認められ、さらにIcsBがVirGとAtg5の結合を競合的に阻害することが明らかになった。VirGによるオートファジー誘導能を検討するために、virG遺伝子変異株(ΔvirG)をMDCK細胞に感染させた結果ΔvirGではオートファジーが完全に抑制されることが明らかになった。これらの結果から、赤痢菌感染において観察されるオートファジーは赤痢菌の細胞内でのアクチンコメットの形成に必須であるVirGが宿主細胞のオートファジーに必須のタンパク質であるAtg5により認識されることにより誘導され、これはIcsBによって競合的に阻害されることが明らかになった。これらの研究成果をふまえAtg5に結合する宿主タンパク質の検索をyeast two-hybrid法により行った結果、Atg5と相互作用する5種類の候補タンパク質を得た。各々の候補タンパク質についてin vitroおよびin vivoでのAtg5との結合性、および赤痢菌感染によって観察されるオートファゴソームとの局在性の検討をおこなった。その結果4種類の候補タンパク質がin vitroにおいてAtg5と結合性を示し、最終的に1種類の候補タンパク質(AfpIと命名)が赤痢菌感染時に観察されるオートファゴソームと共局在することが明らかになった。IcsBは赤痢菌のIII型分泌機構から分泌される新規病原因子である。透過型電子顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡による観察により、icsB欠損株(ΔicsB)は上皮細胞に侵入後オートファゴソームによる貪食を高頻度に受けることを我々は報告している。オートファゴゾーム形成に関与するapg遺伝子群は同定されているが、その認識機構に関してはほとんど報告がなされていない。そこで我々は赤痢菌感染におけるオートファジーによる菌体の認識およびその阻害機構の解明に焦点を絞って解析を行った。赤痢菌感染におけるオートファジーの解析をさらに詳細に行うためにatg5 KO mouse由来のMEFにΔicsBを感染させた結果、オートファジーは完全に阻害された。さらにイムノゴールド法によりΔicsBの周囲を取り囲んでいる多層の構造物にLC3が局在することが明らかになった。GFP-Atg5を発現させたBHK細胞にΔicsBを感染させたところ、菌体の一極へのAtg5の局在が観察されたことから、赤痢菌の一極に局在することが報告されているVirGとAtg5の結合性の解析を行った。VirGによるオートファジー誘導能を検討するために、VirG変異株(ΔvirG)をMDCK細胞に感染させた結果ΔvirGではオートファジーが完全に抑制されることが明らかになった。これらの結果から、赤痢菌感染において観察されるオートファジーはVirGがAtg5により認識されることにより誘導され、これはIcsBによって競合的に阻害されることが明らかになった。
不全心筋の分子レベル動的特性の非侵襲的評価のための超音波組織性状診断システムの開発

近年、実験用小動物、特に心不全を自然発症するBio53.58あるいは肥大期を経て心不全に至るBio14.6などのハムスターが、心不全における病的心筋の分子生物学的機序解明に大きく貢献している。しかし、このような心筋細胞レベルの病変が、心臓の構造と機能とにどのよう反映されるかについては不明の点が多い。心不全における心筋細胞レベルの病的変化と心構造や心機能との間の相互連関を知ることは、心不全の機序解明、その病態診断、さらにはその治療と予防に大きく貢献するものと考えられる。この目的のために、我々は、超音波法を中心とした心機能および心筋組織診断システムを作成し、これを用いて基礎的検討を行った。(1)最近開発されたハイフレームレート型超音波装置を中心に非侵襲的小動物実験系を作成した。これにより、極めて小さく心拍数の速いハムスター心の心機能評価が可能となった。Bio53.58では、既にその5週齢から明瞭な左室収縮不全を呈し、その後進行性に増悪すること、またBio14.6では510週齢で左室拡張不全を、20週齢では収縮不全を呈することがわかった。(2)前述の超音波装置からRF信号を取り出し、A-D変換後にコンピュータ解析するため、装置改造しシステム作成を行い、病理組織標本などにつき基礎的検討を行った。小動物を含む生体心筋組織診断のためのソフトウエアー作成は現在最終段階にある。(3)心筋症ハムスターにおけるCa++動態をFura-2レベルで解析した結果、Bio53.58では対照F1BやBio14.6に比し、5週齢から20週齢にかけて、α1リセプター刺激が筋小胞体機能低下に基づくCa++過負荷をきたすことが示唆された。このような細胞内Ca++動態は、超音波法で評価したハムスター心の構造、機能異常とよく対応した。
Stog Palace写本とTokyo写本を用いたチベット典籍の史的系統調査

昨年度より引き続き,チベット大蔵経のうち西の系統に属するStogPalace写本とTokyo写本を,東の系統に属するPeking版,Narthang版,及び漢訳を参照しつつ,複数の典籍に渡って比較対照調査した結果,以下のことが明らかとなった.(1)従来報告されていた通り,StogPalace写本とTokyo写本との読みが一致して,東系統とは異るという一般的傾向が顕著に現れている.対象典籍を拡張しても,この傾向は変わらなかった.(2) StogPalace写本とTokyo写本の読みが異る箇所では,従来はStog PaIace写本の方が東系統に一致するという報告がされていたが,昨年度の調査ではそのような傾向は見られず,今年度も同様であった.従来の写本系統研究についての再考が必要となろう.(3) StogPalace写本はTokyo写本と比較して,安易な誤写・誤記が多い.このことはTokyo写本の方が複数のソースを参照して誤写・誤記を防いでいたことの傍証となりうる.(4) StogPalace写本の読みが他のどの版本・写本とも異り,唯一漢訳のみと一致する箇所が存在する.漢訳の歴史性とチベット訳の忠実性に鑑みたとき,Stog Palace写本の読みこそ「本来の正しい文」であると考えられる.ただし残念ながら,このような貴重な事例は一典籍当たり数ヶ所に止まる.(まとめ)従来のようにStog PaIace等の写本を用いない研究では,「本来の正しい文」を見失ってしまうおそれのあることが2ヶ年に及ぶ本研究を通じて明らかとなった.今後もチベット写本の研究を継続し,注意を喚起していきたい.チベット大蔵経のうち西の系統に属するStogPalace写本とTokyo写本を,東の系統に属するPeking版,Narthang版,及び漢訳を参照しつつ,複数の典籍に渡って比較対照調査した結果,以下のことが明らかとなった.(1)従来報告されていた通り、StogPlace写本とTokyo写本との読みが一致して,東系統とは異なるという一般的傾向が顕著に現れている.(2)StogPalace写本とTokyo写本の読みが異る箇所では,従来はStog Palace写本の方が東系統に一致するという報告がされていたが,今後の調査ではそのような傾向は見られなかった.(3)StogPalace写本とTokyo写本と比較して,安易な誤写・誤記が多い.このことはTokyo写本の方が複数のソースを参照して誤写・誤記を防いだことの傍証となりうる.(4)StogPalace写本の読みが他のどの版本・写本とも異り,唯一漢訳のみと一致する箇所が存在する.漢訳の歴史性とチベット訳の忠実性に鑑みたとき,Stog Palace写本の読みこそ「本来の正しい文」であると考えられる.従来,チベット訳はサンスクリット原典の直訳,漢訳は意訳と言われてきた.そのため,チベット文と漢文が相違する場合,チベット文をもって「本来の正しい文」と定める気風が学会には根強い.しかしその判定は,信用できるチベット版本・写本の全てにあたってみた上でなければ下せないはずである.従来のようにStog Palace等の写本を用いない研究では,「本来の正しい文」を見失ってしまうおそれのあることが本研究を通じて明らかとなった.今後もチベット写本の研究を継続し,注意を喚起していきたい.昨年度より引き続き,チベット大蔵経のうち西の系統に属するStogPalace写本とTokyo写本を,東の系統に属するPeking版,Narthang版,及び漢訳を参照しつつ,複数の典籍に渡って比較対照調査した結果,以下のことが明らかとなった.(1)従来報告されていた通り,StogPalace写本とTokyo写本との読みが一致して,東系統とは異るという一般的傾向が顕著に現れている.対象典籍を拡張しても,この傾向は変わらなかった.(2) StogPalace写本とTokyo写本の読みが異る箇所では,従来はStog PaIace写本の方が東系統に一致するという報告がされていたが,昨年度の調査ではそのような傾向は見られず,今年度も同様であった.従来の写本系統研究についての再考が必要となろう.(3) StogPalace写本はTokyo写本と比較して,安易な誤写・誤記が多い.このことはTokyo写本の方が複数のソースを参照して誤写・誤記を防いでいたことの傍証となりうる.(4) StogPalace写本の読みが他のどの版本・写本とも異り,唯一漢訳のみと一致する箇所が存在する.漢訳の歴史性とチベット訳の忠実性に鑑みたとき,Stog Palace写本の読みこそ「本来の正しい文」であると考えられる.ただし残念ながら,このような貴重な事例は一典籍当たり数ヶ所に止まる.(まとめ)従来のようにStog PaIace等の写本を用いない研究では,「本来の正しい文」を見失ってしまうおそれのあることが2ヶ年に及ぶ本研究を通じて明らかとなった.今後もチベット写本の研究を継続し,注意を喚起していきたい.
古代、中世、近代日本人の変形性股関節症有病率

過去の世界における変形性関節症(OA)の有病率を調べ、現代と対比させることによりOA発症に関与する因子を推測する目的で本研究を行った。古代より近世に至る考古発掘成人人骨、日本人402体、中国人394体、フランス人413体、計1209体を調査した。上下肢大関節の各部位を観察記録し、象牙化がある場合にOAとした。この結果、つぎの点が判明した。1)現代では極めてポピュラーな疾患である脛骨大腿関節の変形性膝関節症は、比較的最近までは稀な疾患であった。2)過去の世界では変形性膝関節症は白人よりアジア人に多かった。3)人類社会が狩猟漁労より農耕へと変化したとき、肘関節、膝蓋大腿関節OAは減少した。4)現代日本人の変形性股関節症有病率は低いが、過去の世界においても低い。これらの結果よりつぎの点が推測される。1)変形性膝関節症は比較的近い過去に人類に急増した疾患であり、現代人のライフスタイルの中にその発症因子がある。2)日本人は遺伝的に変形性股関節症発症の防御因子を有している。本邦縄文時代発掘成人人骨、江戸時代成人人骨、近世アイヌ成人人骨、各310体、69体、69体の古病理学調査を行った。各人骨について性、年齢鑑定を行なった。また、1象牙化2骨棘3関節面陥凹4関節変形のうち、1または24のうち2項目を満たすものを変形性関節症とした。現在までの調査結果では、変形性股関節症の粗有病率は縄文、江戸、アイヌの順に各0.6、0.0、0.0%であった。縄文時代を標準人工として、性、年齢で補正した訂正有病率は各0.6、0.0、0.0%であった。これを我々が調査している中国古人骨と比較すると、本邦古人骨における変形性股関節症有病率は低いと考えられる。1)変形性股関節症は比較的近い過去に人類に急増した疾患であり、現代人のライフスタイルの中にその発症因子がある。
セルソーターによる有用微生物のスクリーニング

特定の機能を持つ微生物をフローサイトメトリーを利用してスクリーニング(選別、取得)し、探索することを目的として、実証実験をおこなった。モデル系を用い、変異処理により著量生成株を誘導して、検出、選別し、分取することとした。アスタキサンチン(ASX)は微細藻類Heamatococcus pluvialisがシスト化するときに生成する自家蛍光物質である。シストをサイトメトリー解析し、ASXの含量が高いシストを分取して、細胞が大きいことを観察した。パン酵母はチアミン(B1)を生成する。B1は簡単な反応で蛍光物質チオクロームに導いて定量できるが、サイトメトリー測定には不充分で、パン酵母の細胞は死ぬ。多数の生細胞を得るために、細胞を懸濁してある融解寒天をガラス薄膜フィルターを通して油相に分散させ、マイクロゲルビーズ化した。これを培養してB1を生成させ、チオクローム法によりサイトメトリーで定量した。反応の条件を検討し、標準3分の処理時間を0.5分以内にすれば、3%NaOHの条件で、サイトメトリー解析が可能で、しかも、生細胞を回収できた。乳酸菌Acetobacter aceti,Gluconobacter oxidansは補酵素ピロロキノリンキノン(PQQ)のを活性化補酵素などの形で生成する。PQQは378nmに励起極大、482nmに蛍光極大を持つ。乳酸菌を培養し、紫外線レーザー(325nm)を用いてサイトメトリー解析した。培地の種類、培養時間によって明らかにサイトグラムの形が異なっていたが、これと菌体から抽出してHPLC、および酵素法で求めた含有量との間には明確な相関性は見られなかった。特定の機能を持つ微生物を、フローサイトメトリーを利用してスクリーニングすることを目的として、モデル系として(1)astaxanthinをシスト内に生成する微細藻類Haematococcus pluvialisと(2)thiamineを生成するパン酵母を用い、変異処理により著量生成株を誘導して、処理した細胞の中から特定の性質を持つものをフローサイトメトリーを利用して検出、選別する実験を行った。1個の酵母細胞の中に生成するthiamineの量は今のところ(thiochromeとして)測光するのには充分でないので、1個の細胞から短時間の培養により増殖させて蛍光プローブを生成させるマイクロコロニー法を採った。マイクロゲルビーズ化のためには、水相である細胞を懸濁してある融解寒天を、w/o型エマルションにしてから冷却し、固化させる方法を用いた。この技術は新素材である多孔質ガラス膜フィルターを用いる新技術であるので、寒天を用いる新しい応用として適用するため、操作方法、各種反応条件を中心にして検討した(続行中)。微水滴の表面に膜を形成させてマイクロカプセル化する方式も利用するために、市販の様々な製剤を用いる方法も検討した(続行中)。これまでに得られた細胞はH.pluvialisとパン酵母のastaxanthine、thiamineの著量生産株は、(a)継代して培養し、生成能の安定性を検討したが、すぐに形質を欠失した。また、(b)選別と培養(生産量の測定)を繰り返した場合にも、格段に形質が向上した菌株が得られる訳でもなかった。選別された変異株の形質の不安定性についての検討は、引き続き次年度にわたって検討する予定である。Haematococcuspluvialisの変異処理によって著量生産株を取得を続行して試みた。アスタキサンチン(ASX)の含量がより高いと思われる、より強い蛍光を発するシストを分取し、培養してシスト化させ、再びサイトメトリー解析したが、いままでのところ、親株のものと異なるサイトグラムパターンを示す株は取得できていない。つまり、継代培養すると著量生産性が徐々に失われる。パン酵母が生成するチアミン(B1)をサイトメトリーで定量した。

酵母細胞をガラス薄膜フィルターを用いるマイクロゲルビーズ法でマイクロコロニーとし、これを培養してB1を生成させ、チオクローム反応法により定量するが、反応の条件を検討し、標準3分の処理時間を0.5分以内にすれば、3%NaOHの条件で、サイトメトリー解析が可能で、しかも、生細胞を回収できた。しかしながら、変異処理による著量生産株の分取については、取得した株を継代培養すると著量生産性が徐々に失われて、いまのところ、安定した株は得られていない。補酵素ピロロキノリンキノン(PQQ)を活性化補酵素などの形で生成する乳酸菌Acetobacter aceti, Gluconobacter oxidansを新たなモデル系として追加した。PQQは378nmに励起極大、482nmに蛍光極大を持つ。乳酸菌を培養し、紫外線レーザー(325nm)を用いてサイトメトリー解析した。培地の種類、培養時間によって明らかにサイトグラムの形が異なっていたが、これと菌体から抽出してHPLC、および酵素法で求めた含有量との間には明確な相関性は見られなかった。