hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キラルな二置換オルトキシリレン誘導体を活用する高選択的不斉触媒反応の開発

不斉触媒反応は、生命科学、材料科学の分野で重要な光学活性化合物の効率よい合成法であり、活発な研究が行われている。本課題では、不斉合成にほとんど用いられていなかった二置換o-キシリレン骨格に着目し、キラルな1,4-ジオールの合成法を確立した。さらに、得られた1,4-ジオールを種々のキラルな二置換o-キシリレン誘導体に変換し、不斉触媒反応を検討した。新しく合成したキラルな1,4-アミノアルコール触媒、二座含窒素複素環式カルベン配位子を用いることにより高い光学純度のキラルな光学活性第二級アルコールや光学活性カルボン酸誘導体が得られ、二置換o-キシリレン骨格の不斉源としての有効性が明らかとなった。平成24年度において、o-フタルアルデヒドから得られる1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンに各種光学分割法を適用し、(1S,1'S)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンおよび(1R,1'R)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンを比較的容易に入手する方法を確立した。一方、キラルなアミノアルコールは種々の不斉反応の優れた反応剤、触媒となることが知られている。そこで、(1R,1'R)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンから(R)-1-(2-((S)-1-(ジメチルアミノ)プロピル)フェニル)プロパン-1-オール、および(1S,1'S)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンから(S)-1-(2-((S)-1-(ジメチルアミノ)プロピル)フェニル)プロパン-1-オールへの立体選択的誘導について検討し、それぞれ7段階、9段階で誘導できることを明らかにした。得られたキラルな1,4-アミノアルコールを触媒として用いたジエチル亜鉛のベンズアルデヒドへの不斉付加反応を行ったところ、(R)-1-(2-((S)-1-(ジメチルアミノ)プロピル)フェニル)プロパン-1-オールを用いた場合も、(S)-1-(2-((S)-1-(ジメチルアミノ)プロピル)フェニル)プロパン-1-オールを用いた場合も、高い光学純度でいずれも(R)-1-フェニルプロパノールが得られた。上記で得られた知見を元に、より簡便にベンジル位炭素にキラリティを導入できるキラルアミナール構造を持つ1,4ーアミノアルコールを設計、合成し、ジエチル亜鉛あるいはアルキニル亜鉛試薬とベンズアルデヒドの反応を行い、興味ある知見を得た。以上、o-キシリレン骨格をもつキラルな1,4-アミノアルコールの不斉触媒としての有用性を明らかにした。われわれはすでに(1S,1'S)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンが有効な不斉源であることを報告しているが、ジエチル亜鉛のアルデヒドへの触媒的不斉付加反応を2回行うなど合成経路が比較的長く、また種々のキラルジオールの合成に適用することは必ずしも容易ではなかった。そこで、o-フタルアルデヒドを出発物質として、種々の置換基をもつラセミ体の1,2-ビス(1-ヒドロキシアルキル)ベンゼンの合成と、得られたラセミ体1,2-ビス(1-ヒドロキシアルキル)ベンゼンの光学分割を検討した。その結果、市販の光学分割剤(S)-5-アリル-2-オキサビシクロ[3.3.0]オクタ-1(8)-エン((S)-ALBO-V)によりジアステレオマーに変換後、クロマトグラフィーにより分離し加水分解する方法、あるいは(+)-ベンゾテトラミソールを触媒とするエナンチオ選択的アシル化反応により、種々のキラルジオールを簡便に入手できる方法を確立した。得られた各種(1S,1'S)-1,2-ビス(1-ヒドロキシアルキル)ベンゼンとo-フタルアルデヒドから対応するモノアセタールを合成し、グリニヤール試薬、有機リチウム試薬のカルボニル基へのジアステレオ選択的付加反応およびキラル3-置換フタリドの不斉合成を検討した。その結果、キラルジオール上の置換基が有機金属試薬の付加反応のジアステレオ選択性に大きな影響を与えることが分かった。また、上記のキラルジオールを合成するためのより基礎的な反応である非対称ケトンの不斉ボラン還元、アルデヒドのジアルキル亜鉛による不斉アルキル化について検討を行ったところ、不斉ボラン還元には(S)-2-(アニリノジフェニルメチル)ピロリジンが、アルデヒドの不斉アルキル化には(S)-1-アルキル-2-(アリールアミノメチル)ピロリジンが優れた触媒となることを明らかにした。不斉合成反応は有機合成化学の分野における中心的研究課題の一つである。

平成24年度、平成25年度において、キラルなジオール、1,2-ビス(1-ヒドロキシアルキル)ベンゼン、およびキラルなジオールから誘導されるキラルなアミノアルコール類の合成法を確立し、それらを不斉反応剤あるいは不斉触媒として活用することにより、キラルな二置換オルトキシリレン骨格が不斉誘起に有効であることを明らかにした。一方、遷移金属錯体を用いる触媒反応は活発な研究が行われており、近年含窒素複素環式カルベン(NHC)配位子が注目されている。キラルなNHC配位子を用いた不斉触媒反応も報告されているが、キラルな二座カルベンを用いた例は少ない。そこで、(S,S)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンから、対応するキラルジアミンを経て6段階でキラルなビスイミダゾリウム塩、1,1'-(1R,1'R)-1,1'-(1,2-フェニレン)ビス(プロパン-1,1-ジイル)ビス(3-ベンジル-1H-ベンゾ[d]イミダゾリウム-3-イウム)としたのち、反応系内でビスカルベンを発生させPd錯体を調製した。得られたPd触媒存在下、酢酸(E)-1,3-ジフェニルアリルとマロン酸ジメチルの反応を行ったところ、(E)-2-(1,3-ジフェニルアリル)マロン酸ジメチルが96%、81%eeで得られ、キラルなNHC配位子が有効であることが分かった。また、ジベンゾ[b,d]フラン-4,6-ジカルバルデヒドを出発物質として、上記と同様の手法を用いることにより、対応するキラルジオール、ジアミンを合成し、キラルな反応試薬としての活用について検討を行った。その結果、(1R,1'R)-1,1'-(ジベンゾ[b,d]フラン-4,6-ジイル)ジプロパン-1-アミン誘導体がNMRのキラルシフト試薬として有効であることが分かった。有機合成化学(1R,1'R)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼン、(1S,1'S)-1,2-ビス(1-ヒドロキシプロピル)ベンゼンを、それぞれ(R)-1-(2-((S)-1-(ジメチルアミノ)プロピル)フェニル)プロパン-1-オール、(S)-1-(2-((S)-1-(ジメチルアミノ)プロピル)フェニル)プロパン-1-オールに立体選択的に誘導する方法を確立した。また、得られたキラルな1,4-アミノアルコールは、いずれもジエチル亜鉛とベンズアルデヒドの反応において96%ee以上で(R)-1-フェニルプロパノールを与えることが分かった。従来、同様の反応で高い選択性を与えるキラルな1,4-アミノアルコールは報告例も少なく、o-キシリレン骨格は不斉触媒として有効な骨格であることを明らかにすることができた。また、従来アミノアルコールにおいてヒドロキシ基の結合した炭素原子ならびにアミノ基の結合した炭素原子がいずれもキラルである場合、ヒドロキシ基の結合した炭素原子のキラリティの方が反応の選択性に大きく関与するとされていたが、本研究ではヒドロキシ基の結合した炭素原子のキラリティは反応の選択性に関与せず、アミノ基の結合した炭素原子のキラリティが反応の選択性を決定していると言う、興味ある結果が得られた。この知見を元に、簡便にアミノ基が結合する炭素原子にキラリティを導入する方法として、アルデヒドからのアミナール構造の生成に着目し、種々のキラルアミナール構造を持つ1,3-アミノアルコール、1,4ーアミノアルコール合成し、ジエチル亜鉛とベンズアルデヒドの反応を行った。その結果、触媒の構造のわずかな違いにより、選択性が低下したり、逆転すると言う結果が得られた。以上、o-キシリレン骨格をもつキラルな1,4-アミノアルコールの不斉触媒としての有用性が明らかとなり、研究計画は概ね順調に進展している。
血管新生におけるCUL3システムネットワークの解明

血管新生は、組織損傷時の修復過程や固形腫瘍増殖、さらには臓器再生に必須であり、その制御は血管内皮細胞の増殖促進と抑制のバランス制御で成立している。申請者らは、これまでに血管新生のバランスを制御する分子を探索し、その中心的役割を担うと考えられる分子機構として、CUL3型ユビキチンリガーゼ複合体を見出した。昨年度までに同定した血管新生を制御する4種のCUL3パートナーBTBP(基質受容体)とその基質候補分子から、平成30年度ではCUL3-KCTD10軸の候補基質の評価、ならびにそれらの機能解析を進めた。培養血管内皮細胞でのCUL3及びKCTD10ノックダウンにより出現する2つの表現系(血管内皮細胞間のバリアー不安定化と細胞伸展抑制)と、基質候補分子の強制発現によって同一の表現系を示す基質候補分子として2つのGTP-結合タンパク質、RhoBとRnd2を同定した。ちなみにRhoBの強制発現は内皮細胞間のバリアーを不安定化し、Rnd2の強制発現は血管内皮細胞の伸展を抑制した。さらにCUL3-KCTD10によるRhoBのユビキチン化を解析した結果、RhoBタンパク質のLys161及びLys181をK63ポリユビキチン化することでライソゾームでの分解を誘導することを明らかにした。また、このRhoBの分解誘導は血管のバリアー形成において極めて重要であることを明らかにした。一方、Rnd2は血管内皮細胞のcortical actinの形成を誘導し、細胞のラウンド化を誘導するが、CUL3-KCTD10によるRnd2の負の制御は血管新生時における血管内皮細胞の進展とネットワーク形成に必須であることを明らかにした。現在、さらにCUL3-KCTD10によるRnd2のポリユビキチン化と分解、機能制御の分子機構に関して詳細な解析を進めているところである。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者らは、これまでに血管新生のバランスを制御する分子を探索し、その中心的役割を担うと考えられる分子機構として、CUL3型ユビキチンリガーゼを見出した。本研究では、このCUL3システムを血管新生バランス制御の本体と位置づけし、その制御ネットワークを解明するため、以下の事項を解析し、結果を得た。1、CUL3パートナーBTBP(基質受容体)の探索・同定:まず、血管内皮細胞に発現が認められる60種のBTBPをビオチンタグで、CUL3をFLAGタグで標識したリコンビナントタンパク質を、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて試験管内合成した。これを用いて、タンパク質試験管内相互作用解析法(アルファスクリーン法)によりCUL3と60種のBTBPとの結合を定性解析し、約40種のBTBPがCUL3と結合しうることを確認した。2、CUL3パートナーBTBPの血管新生制御解析:同定した約40種のBTBPに対するsiRNAを作成し、これを用いた遺伝子ノックダウン法により血管内皮細胞のインビトロ血管形成能を評価することで、血管新生を制御する4種のBTBPを同定した。この中の1つSPOPが血管内皮細胞増殖因子VEGFの受容体であるVEGFR2の遺伝子発現を制御することを明らかにした。さらに、CUL3-SPOPの基質探索を行い、その候補の1つとしてDAXXを同定した。CUL3-SPOP-DAXX軸の解析からVEGFR2の遺伝子発現をエピゲノムレベルで制御することを明らかにした。また、CUL3-SPOP-DAXX軸は、VEGFR2のみならず、Notch、Dll4、NRP1などの重要な血管新生因子遺伝子をも制御することを明らかにした。28年度の当初予定は、血管内皮細胞で作動しているCUL3ーBTBP軸の見積もりと血管新生を制御するCUL3ーBTBP軸の同定を主とした。当初予定通り、まずCUL3パートナーBTBPの探索・同定に向け、血管内皮細胞に発現が認められる60種のBTBPをビオチンタグで、CUL3をFLAGタグで標識したリコンビナントタンパク質を試験管内合成し、これを用いて、アルファスクリーンシステムによりタンパク質相互作用解析を行なった。その結果、極めて高いSN比を示す解析結果と良好な再現性を得て、早期に約40種のBTBPを抽出することができた。また、この約40種のBTBPに対するsiRNAを用いた遺伝子ノックダウン法により血管内皮細胞のインビトロ血管形成能を評価することで、血管新生を制御する4種のBTBPを同定し、血管新生に重要な4種のCUL3ーBTBP軸を同定できた。28年度の計画ではここまでを想定していたが、4種のCUL3ーBTBP軸の中の1つであるCUL3-SPOP軸の標的基質同定、ならびに機能解析にまで至り、29年度予定の一部を前倒しに遂行することができた。その要因として、当研究センターに、試験管内タンパク質合成やアルファスクリーンシステム構築、並びに機能解析(エピゲノム解析)に精通する研究者のお力添えを得ることができたことが挙げられる。血管新生は、組織損傷時の修復過程や固形腫瘍増殖、さらには臓器再生に必須であり、その制御は、血管内皮細胞の増殖促進と抑制のバランス制御で成立している。

申請者らは、これまでに血管新生のバランスを制御する分子を探索し、その中心的役割を担うと考えられる分子機構として、CUL3型ユビキチンリガーゼを見出した。平成28年度に同定した血管新生を制御する4種のCUL3パートナーBTBP(基質受容体)のうち、平成29年度はIntegrin beta1輸送を制御するBTBPとして同定したANKFY1、およびアクチンダイナミクスを制御するBTBPとして同定したKCTD10に焦点を絞って解析した。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECでのANKFY1ノックダウンでは、integrin beta1の細胞膜表面での局在が減少し、integrin beta1が細胞内に内在化すること、integrin beta1のリサイクリングが抑制されることでエンドゾーム内に蓄積することを明らかにした。このことは、CUL3-ANKFY1軸がintegrin beta1の細胞膜輸送系を制御している可能性を強く示唆しており、CUL3-ANKFY1軸が新たな血管新生制御の標的分子になりうることを示唆してくれる。一方、HUVECにおけるKCTD10ノックダウンでは、CUL3ノックダウン時に観察される細胞伸展や管腔形成の顕著な抑制、ならびにアクチン繊維形成の増大が観察された。さらに、このCUL3-KCTD10軸の基質探索を、ヒト20Kプロテインアレイを用いてBiotin-KCTD10をプローブとしてAlphaScreenで行なった。その結果、複数の基質候補分子を検出することに成功した。また、ある特定の基質候補分子の強制発現が、CUL3またはKCTD10のノックダウンと同等の表現型を示すことを確認した。平成28年度に血管内皮細胞で作動しているCUL3-BTBP軸の見積もりと血管新生を制御するCUL3-BTBP軸の同定し、平成29年度でその標的基質同定、ならびに機能解析にまで至り、平成30年度予定の一部を前倒しに遂行することができた。その要因として、当研究センターにおける試験管内タンパク質合成やアルファスクリーンシステム構築、世界に類を見ないヒト2万タンパク質アレイを用いた基質スクリーニングが、予想以上に良好に作動したことが挙げられる。血管新生は、組織損傷時の修復過程や固形腫瘍増殖、さらには臓器再生に必須であり、その制御は血管内皮細胞の増殖促進と抑制のバランス制御で成立している。申請者らは、これまでに血管新生のバランスを制御する分子を探索し、その中心的役割を担うと考えられる分子機構として、CUL3型ユビキチンリガーゼ複合体を見出した。昨年度までに同定した血管新生を制御する4種のCUL3パートナーBTBP(基質受容体)とその基質候補分子から、平成30年度ではCUL3-KCTD10軸の候補基質の評価、ならびにそれらの機能解析を進めた。培養血管内皮細胞でのCUL3及びKCTD10ノックダウンにより出現する2つの表現系(血管内皮細胞間のバリアー不安定化と細胞伸展抑制)と、基質候補分子の強制発現によって同一の表現系を示す基質候補分子として2つのGTP-結合タンパク質、RhoBとRnd2を同定した。ちなみにRhoBの強制発現は内皮細胞間のバリアーを不安定化し、Rnd2の強制発現は血管内皮細胞の伸展を抑制した。さらにCUL3-KCTD
ヒト腸腺癌細胞が細胞間接着を維持しつつ集団として遊走する機序の解析

(1)細胞間接着を維持しつつ集団として遊走する分子機構の解析HGF/SFによって惹起されるヒト大腸癌細胞下部のCMが、正常線維芽細胞(ヒト大腸由来CCD18)の共存により増強されることを明らかにした。これは癌細胞由来の未知の液性因子により、線維芽細胞からのTGF-β1分泌が亢進し、これが細胞運動を促進することで知られるEDA部分を含むfibronectin(EDA+FN)の産生を増加させるという機序によるものであった。癌細胞のCMも癌細胞と線維芽細胞間の相互作用により影響されることを示したものである。(詳細は10年度報告書を参照)(1)細胞間接着を維持しつつ集団として遊走する分子機構の解析HGF/SFによって惹起されるヒト大腸癌細胞下部のCMが、正常線維芽細胞(ヒト大腸由来CCD18)の共存により増強されることを明らかにした。(詳細は10年度報告書を参照)(1)細胞間接着を維持しつつ集団として遊走する分子機構の解析ヒト大腸由来CCD18線維芽細胞は細胞密度依存性に、HGF/SFによって惹起されるヒト大腸癌細胞株のCMを増強し、その作用はCCD18の単独培養上清中には認められず、CCD18と癌細胞との共培養上清中に認められた。腫瘍細胞に対して遊走惹起活性を持つ増殖因子の中で、TGF-β1のみがHGF/SFによる癌細胞のCMを相乗的に増強した。CCD18細胞からのTGF-β1分泌は癌細胞の培養上清により刺激され、両細胞共存下でTGF-β1は増加しており、CCD18細胞によるCMの増強効果は抗TGF-β1抗体にて抑制された。またこのTGF-β1刺激により、癌細胞ではfibronectin(FN)、特に細胞運動を促進することで知られるEDA部分を含むFN(EDA+FN)の産生が亢進し、抗FN抗体によりTGF-β1による増強効果は強く抑制された。HGF/SFによる癌細胞の遊走の惹起において、TGF-β1と未知のその分泌促進因子を介して癌細胞と線維芽細胞間の相互作用が関与していることが示された。(1)細胞間接着を維持しつつ集団として遊走する分子機構の解析ヒト大腸癌細胞株Lー10においてはmRNAレベル、蛋白レベル共にgelatinase A(GelA),membrane type-1 matrix metalloproteinase(MT1-MMP)の発現を認めた。免疫細胞化学的に両プロテアーゼは、非刺激時の細胞島においては主として細胞膜に分布するが、HGF/SFにてcohort migrationを誘導すると、遊走細胞シートの先端のみに(先頭細胞の先導葉を主として)特異的に強く発現し、後続の細胞集団にはほとんど認められなかった。この先頭細胞特異的な発現パターンは、(抗カドヘリン抗体+HGF/SF)にて誘導される細胞分散(scattering)時には認められず、分散する個々の細胞に発現していた。従って先の発現パターンは遊走細胞シートにおける細胞間接着により主として制御されていると考えられる。この遊走細胞集団の先頭に発現するGelA、MT1-MMPによりgelatin matrix(GM)は分解を受けたが、それは先導葉部分に整然と放射状に認められ、GMを細胞遊走に適した形へとrearrangeしたものと考えられた。また、このMMP活性をその阻害剤BB94にて抑制すると、遊走は顕著に阻害されたので、この先頭に発現するMMPによるGMのrearrangentはcohort migrationにおいて非常に重要な役割を担っていると考えられる。
喀淡中pre-rRNAの解析による肺炎患者に対する抗生物質の早期効果判定法の構築

本研究は感染症患者の検体中に存在する原因微生物由来のpre-rRNAを抗生物質曝露の前後で比較することで、迅速かつ精度の高い抗生物質の効果判定を可能にすることを目的として、以下の研究実施計画をもって申請をした。院内肺炎患者への抗生物質投与前の喀痰検体とその培養サンプルから原因微生物のRNAを抽出し、逆転写反応によりDNAへ変換後にリアルタイムPCR法により原因微生物由来のpre-rRNAを定量する。院内肺炎患者の喀痰検体の培養前後のpre-rRNA値の変化と患者のバイタルサインや炎症マーカー、細菌培養結果などの臨床データを比較することで抗生物質の効果との関連性を評価する。本年の進捗として、緑膿菌を用いて細菌増殖とpre-rRNAの関係について詳細な検討を行った結果、細菌増殖とより関連が強いものは一細菌あたりのpre-rRNA値であり、この値が菌の培養開始とともに上昇し、それに遅れて生菌数の増加がみられることが明らかとなった。この一細菌あたりのpre-rRNA値は、細菌増殖23時間後に最大値を示すことから、我々はこの23時間値をマーカーとして使用し、緑膿菌に対するメロペネム曝露実験ではその上昇が抑制されることを見出した。この差異を測定することで、喀痰サンプル中の肺炎起因菌の抗菌薬感受性は判定可能となった。一方で、メロペネム以外にシプロフロキサシンとトブラマイシンを用いた検討を行った結果、pre-rRNAのプロファイルに薬剤間の違いがみられた。これは各抗菌薬の作用機序の違いによるものと考えられる。現在、pre-rRNA値の変化を定量的に表せる仮説理論の構築を目的に、種々の抗菌薬の曝露実験データを収集している。基礎理論が固まり次第、患者サンプルにおいて効果判定が可能か検討する。得られた結果については学会発表、論文発表の形で公表する。
ラブロック重力理論に基づく宇宙論的研究

ラブロック重力理論は、アインシュタインのラグランジアンに高次の曲率項を付加したもので、この研究は重力の非線形効果や量子効果を明らかにすることを目的とする。この観点から今年度の成果は2つに分けられる。1.重力と結合したスカラ-場のドメイン・ウォ-ル構造の研究高次曲率項を持つ重力理論はスカラ-場の自由度を持ったアインシュタイン理論と同じ性質を持ち得る。スカラ-場の対称性の破れによって生成されるドメイン・ウォ-ルの時空構造を調べた。静的なドメイン・ウォ-ル解が存在するためのスカラ-場のポテンシャルに対する制限が得られた。また、ドメイン・ウォ-ル近傍には斥力と引力を交互に及ぼすような微細構造があることが明らかになった。このドメイン・ウォ-ルは非ガウス的な密度ゆらぎの種として興味深い。1.ウォ-ムホ-ルの量子力学宇宙の量子論では確率解釈の可能な波動関数を導入することが困難である。これはハミルトニアンがゼロになってしまうことに根ざしている。そこで、全ハミルトニアンがゼロでない値を持つ漸近的平坦な時空としてウォ-ルホ-ルを考えその量子論を考えた。ウォ-ムホ-ルは2つのシュバルツシルト時空の貼合わせであり貼り合わせの自由度を量子化することによって、質量が整数の平方根に比例することが解った。これは、ホ-キング幅射の温度が質量に反比例することやエントロピ-の面積則を説明する。また、時空の因果構造が量子効果で変更されたり、時空の特異点が除去される可能性が示唆された。貼合わせの量子論を一般化するとそのラグンジアンはラプロック重力と似た形になり興味深い。
看護の教育的機能向上のための『看護実践モデル』の検証および患者教育の体系化

研究目的は、「患者教育のための看護実践モデル」の構成要素および構成要素間の関係を事例への適応性を含めて詳細に分析することである。研究方法は、患者教育事例162を研究者・臨床看護師集団が帰納的・演繹的に分析した。1回の分析には、最少5名最多20名、平均13名の研究者があたった。分析の結果、モデルの構成要素「とっかかり/手がかり言動とその直感的解釈」の定義は、患者が発している言語的・非言語的な信号・合図・情報を看護者が心で直ちに感じ、看護者側から理解したこととした。「生活者に関する知識・技術」では、看護がとらえる生活者とは、その人の生きてきた個の歴史の中で培われた生活習慣や生活信条を持ちながら生きている人であるとし、看護職者は、対象者との相互作用の中で『その人の生活そのものの事実』と『その人にとっての意味』を健康との関連からとらえるとした。「教育方法に関する知識・技術」の範囲は大きく拡大し、対象者と接する時の技法からアプローチの方法を選択するまでの探索的な技法までも含めた。第I段階は行動変容を促すための基盤作り、第II段階療養上の困難事解決法の探索、第III段階療養上の困難事を解決するための支援、第IV段階意欲と行動を維持・習慣化するための支援とした。「Professional Learning Climate」は、態度や姿勢という患者教育に対する構えで、定義は、専門的な知識と経験に裏付けられ、効果的な患者教育の成果を導く、専門家に身についている態度あるいは雰囲気とした。この一連の分析により、「患者教育のための看護実践モデル」はモデルver.1、ver.2、ver.3と改良が加えられ、モデルの構成要素の定義、構成要素間の関係が明確にされた。看護実践モデルは改良されたが、ver.3ではProfessional Learning Climateの二次元性を十分に示せていない。今年度は、効果的な患者教育のための看護実践モデル(第2版)について検討し、特にモデルの「C : professional learning climate」および「生活に関する知識・技術」の定義および範囲を検討した。モデルの構成概念は「とっかかり/手がかり言動とその直感的解釈」、「病気・治療に関する知識・技術」、「生活者に関する知識・技術」、「教育方法に関する知識・技術」、教育者の「Professional learning climate」である。Cに関しての事例による帰納的な検討では、積極的傾聴、non-verbalな動き、心理サイズによる雰囲気、相手の話を物語のようにして聴く姿勢(narrative in medicine)などの概念が抽出された。前提として、相手(患者)の力を信じその限界性を一緒に見つけていくこと、また患者自身の意思決定でなくては、患者の行動は変化しないということ、それらは患者のストーリーの中に入っていくタイミングの基本であることなどの意見が出された。Cの定義については、看護婦・患者の関係性における共有可能なもの、ただの感覚的な共感と違うこと、価値観、関心に沿った生活をとらえることなどが出された。「生活、生活者の視点」の定義付け、明確化に関しては、看護科学学会での「生活」の定義、社会学からの定義などが提示されたものの、看護学領域内では共通認識としての「生活」が定義されていない。社会学の生活の3重構造やその人の生活という視点から検討され、看護婦は健康面を入口として生活を見るということ、また目に見えている生活(習慣など)の部分とその人の価値観、アイデンティティや生活信条のようなものが考えられるのではないか、すなわち、生活は見えている生活と生活の意味するものの2つの側面がある。

健康関連QOLという視点だけでなく、本人の価値観がどこにあるのかが大切であり、健康面を糸口として関連の情報を取り入れ判断しているなどが出された。看護師による患者教育事例を看護研究者・臨床看護師7名から20名で帰納的・演繹的にの両方の方法で分析された。患者教育のための看護実践モデルVersion 2を検討し、「療養に関する知識・技術」は生活者の要素の部分を除外することから、「病気と治療に関する知識・技術」と修正した。モデルでは「とっかかり/手がかり言動とその直感的解釈」を最初に置き、それを支持する知識・技術として「生活者に関する知識・技術」を中心とし、「病気と治療に関する知識・技術」と「教育方法に関する知識・技術」を置いた。Professional Learning Climateは、「専門的な知識と経験に裏付けられ、効果的な患者教育の成果を導く、専門家に身についている態度あるいは雰囲気である」であると定義づけられた。現在の検討段階では、Professional Learning Climateの10の要素として、【心配を示す】【尊重する】【信じる】【謙虚な態度である】【リラックスできる空間を創造する】【聴く姿勢を示す】【個人的な気持ちを話す】【共に歩む姿勢を見せる】【熱意を示す】【ユーモアとウィット】が抽出されている。モデルの構成要素の定義がほぼ出揃ったため、モデルやその構成要素を事例にて検討した結果、何れの要素も事例での適応は良好であった。患者教育のための「看護実践モデル」開発の試みとして、看護師によるとっかかり/手がかり言動とその直感的解釈、生活と生活者の視点、教育の理論と技法、そしてProfessional Learning climateの5つの構成要素を持つモデルを開発し、要素の定義、要素間の関係を明示したものを雑誌「看護研究」に5論文発表した。「患者が自己管理に向かって行動変容した」、そのきっかけとなった熟練看護師の患者教育事例を記述、分析する中で、効果的な患者教育の要素が抽出され、モデルが開発された。看護師による152件の患者教育事例を看護研究者・臨床看護師延べ49名、現在の研究参加者21名、1回の分析に集まる研究者数最少5名、最多20名、平均11名で分析した。研究期間は8年半(1994年7月-2003年4月)である。当初、帰納的に行われた分析は、分析討議の中で、研究者・臨床看護師自身の臨床経験、教育事例や先行研究、学習理論等による分析が行われ、帰納的分析と演繹的分析の両方を行き来しながら行われた。その結果、効果的な患者教育の要素として、とっかかり/手がかり言動とその直感的解釈、「生活者に関する知識・技術」、「病気と治療に関する知識・技術」、「教育方法に関する知識・技術」、「Professional Learning Climate第2版」が抽出され、要素間の関係を検討する中で、患者教育のための「看護実践モデル」が開発された。このモデルを使った患者教育事例はモデルの適応程度がよく、有用であると判断された。今年度は、特に「とっかかり/手がかり言動とその直感的解釈」について詳細な分析を行なった。
覚せい剤メタンフェタミンの胎盤通過性に関する研究

近年、覚せい剤乱用者の女性に占める割合は増加傾向にあり、女性は妊娠するということを考えると、女性の覚せい剤乱用は次世代へ与える影響が極めて大きいという重大な問題を秘めている。我々は、ヒトス妊産婦による覚せい剤乱用が胎児に与える影響を理解するための基礎実験として、実験動物を用いた覚せい胎盤通過に関する実験を企図した。平成12年度は妊娠周期の相違による覚せい剤の胎盤通過性について検討した。すなわち、妊娠20、40および50日目の妊娠モルモットにメタンフェタミン(MAMP)を各々20mg/k接種し、0.5、4および8時間後の母体および胎仔の諸臓器内MAMPおよびその代謝産物であるアンフェタミン(AMP)濃度をGCおよびGC/MSを用いて分析した。また、免疫染色による覚せい剤の組織学的局在についても併せて検討した。その結果、妊娠初期(妊娠20日目)では胎盤および胎仔におけるAMP濃度が経時的に増加していたが、妊娠中期以降(妊娠40および50日目)では胎盤および胎仔におけるAMP濃度が接種4時間後が最も高い値を示し、8時間後では減少していた。妊娠初期には胎仔の解毒機構が備わっていないため、いったん胎仔に入った覚せい剤は胎仔に蓄積され、妊娠中期以降では解毒機構が発達しはじめるため胎仔自身により代謝、排泄されたものと考えられる。しかし、妊娠周期がすすむにつれて胎盤での物質通過が上昇するため、胎仔に移行する覚せい剤量も増加しており、胎仔の解毒機構も未熟である。また、胎盤重量1g当りの覚せい剤濃度は妊娠中期であっても一定濃度以上を示さなかったことから、妊娠中期以降であっても覚せい剤の胎盤通過による胎仔への影響が危惧された。また、妊娠初期は胎仔の器官原基の段階であるため、奇形因子への感受性が高い。さらに、その組織学的局在を見ても特定部位への局在ではなくほぼ均一であることから、器官形成への異常の可能性を示唆した。我々は、ヒト妊産婦による覚せい剤乱用が胎児に与える影響を理解するための基礎実験として、覚せい剤の胎盤通過に着目し、覚せい剤の一種であるメタンフェタミン(MAMP)の母獣における代謝およびこれらの薬物の胎盤通過についてMAMPの光学異性体別に検討した。すなわち、妊娠後期の妊娠モルモットに光学活性の明らかなMAMPを各々20mg/kg接種し、0.5、4および8時間後の母体および胎仔の諸臓器内MAMPおよびその代謝産物であるアンフェタミン(AMP)およびp-ヒドロキシメタンフェタミン(p-OH-MAMP)濃度をGCおよびGC/MSを用いて分析した。その結果、母体へ接種したMAMPは、接種0.5時間以内に未変化体のまま、またはその代謝産物であるAMPとなり、胎仔体内へ移行することが明らかになった。また、MAMPの光学活性の相違による胎仔内MAMPおよびAMPの経時的変化は異なっており、d-MAMP接種個体はMAMPおよびAMPともに接種0.5時間後に胎仔から検出されたのに対し、l-MAMP接種個体は接種0.5時間後では胎仔個体内でMAMPが若干検出された臓器もあったが、AMPはすべての臓器で検出限界以下であった。d-体は接種後血中でl-体に比べ遊離型の状態ものが多いため代謝を受けやすく、速やかに脱メチル化を受けAMPとなって胎仔側へ移行したことが示唆された。したがって、母体から胎仔へのMAMPの胎盤通過は、胎盤で選択が成されているというより母体での薬物の状態によることが示唆された。

また、胎盤重量1g当りの覚せい剤濃度は妊娠中期であっても一定濃度以上を示さなかったことから、妊娠中期以降であっても覚せい剤の胎盤通過による胎仔への影響が危惧された。また、妊娠初期は胎仔の器官原基の段階であるため、奇形因子への感受性が高い。さらに、その組織学的局在を見ても特定部位への局在ではなくほぼ均一であることから、器官形成への異常の可能性を示唆した。
大腸癌セツキシマブ耐性克服の治療ツールとしてのmiR-7の意義

本研究の目的はセツキシマブ抵抗性克服の治療ツールとなることが期待されているmiR-7に意義をin vivo実験で明らかにすることである。大腸癌の再発症例に対しては化学療法だけでなく分子標的治療、とくに抗EGFR抗体を併用することにより生存期間の延長が期待できる。しかし化学療法、分子標的治療薬に抵抗性を示す症例の予後は依然として厳しく薬剤抵抗性メカニズムの解明、克服が切望されている。我々はEGFRを標的とする際にmicroRNA(miR)に注目した。miRは1825塩基長の一本鎖RNAで、messenger RNAの3'UTRに結合することでタンパク翻訳を抑制することで遺伝子発現を負に調節している。同様に遺伝子発現を抑制するsmall RNAとしてsiRNAがよく知られているが、RNA創薬の観点ではmiRはもともと体内にあり投与しても過剰な反応は起こしにくいこと、また1つのmiRが多数のタンパク発現を抑制する機能を有しており耐性化の起こりずらいことが期待される。本研究ではEGFR、RAF1を抑制ターゲットとすることが以前報告されているmiR-7の大腸癌における機能に注目している。これまでの検討で大腸癌部miR-7低発現症例は有意に予後不良であること、miR-7投与されたKRAS変異大腸癌細胞株はEGFR抗体であるセツキシマブへの感受性が亢進することを明らかにしてきた。また、そのメカニズムはEGFRだけの抑制ではなくRAF1抑制、Aktシグナル抑制が誘導されたことが原因と考えられた。これまでのデータからmiR-7そのものがEGFR抗体への耐性を克服する治療ツールとなることが期待されるが、これまでの検討はin vitroでの検討のみでマウス実験での薬効評価、セツキシマブ感受性に与える影響に関しては検討が不十分であり、今後の研究課題と考えている。
発生・生体維持における膜蛋白質メルトリンβ/ADAM19のリガンド産生機構の解明

メルトリンβは、受精や発生、様々な疾病への関与が知られるADAMファミリーに属するプロテアーゼである。申請者は、膜型グリア増殖因子の切断制御におけるメルトリンβの役割に関して以下の研究を行った。メルトリンβは初代培養神経細胞において、ゴルジ装置とその周辺に局在した。そこで蛍光相関分光法を利用し、メルトリンβが基質であるグリア増殖因子をゴルジ装置で切断することを、生きた細胞で捉えることを試みた。COS7細胞にメルトリンβとグリア増殖因子を共発現させ蛍光相関分光測定を行うと、ゴルジ装置でのグリア増殖因子の切断が観察され、それに対しプロテアーゼ活性を失った点変異体(EQ変異体)では、ゴルジ装置における切断が抑制される結果を得た。この結果は細胞内の逆行性膜輸送阻害薬(Bafilomycin A1)を用いても確認された。さらに、神経芽細胞およびCOS7細胞にメルトリンβとグリア増殖因子を共発現させ、密度勾配超遠心法によってゴルジ及び小胞体画分の成分の分離を行うと、確かにゴルジ画分にて基質が切断され、EQ変異体ではゴルジ画分における切断が抑制された。グリア増殖因子を切断するもう一つのプロテアーゼADAM17の欠損細胞でもメルトリンβによる基質切断はゴルジ画分で見られ、さらにADAM17はメルトリンβよりも軽い膜画分で基質を切断することが示唆された。以上から、メルトリンβはADAM17と時間的空間的に異なるリガンド産生制御に関与すると考えられた。癌細胞や再生過程では種々の膜型増殖因子の過剰発現や活性化が知られており、医療に繋がる有用な知見が得られたと考えられるメルトリンβは特に発生段階の後根神経節や脊髄に発現し、膜蛋白質であるグリア増殖因子を切断しErb Bの可溶性リガンドとして産生することが分かっている。また、中枢神経、末梢神経系ではグリア増殖因子はグリア細胞の生存、増殖、分化に必要であると分っている。本研究では、メルトリンβによる基質グリア増殖因子の認識、切断、その可溶性リガンドの放出される一連の過程の時空間的な解析をライブイメージングにより行い、リガンド産生の制御機構を解明する。まず、グリア増殖因子の認識、切断、その可溶性リガンド産生の一連の過程の解析のため、グリア増殖因子のN末端、C末端の片方もしくは、両方に蛍光蛋白質をつないだ融合蛋白質の作成および最適化を行った。また、融合蛋白質に付けるシグナル配列についても最適化を行った。さらに、グリア増殖因子の切断過程を詳細に解析するために、蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy ; FCS)を用いた測定を行った。蛍光相関分光法とは、目的分子の運動を蛍光顕微鏡を用いて解析することで、その分子が解離や、他の分子と相互作用をしているかを生きた細胞で測定することのできる手法である。つまり、グリア増殖因子の切断が、より詳細に、より定量的に、よりオルガネラ特異的に観察ができる。上記、蛍光相関分光法を使うためにも、検討を行い最適化した。その結果、メルトリンβによる、グリア増殖因子の切断をライブで観察するには、融合蛋白質をN末端から書いていくとすると、Venus-グリア増殖因子-ECFPが最適であることが分かった。また、蛍光相関分光法による観察には、GFP-グリア増殖因子が最適であることが分かった。現在、上記融合蛋白質を用いて、培養細胞下で、グリア増殖因子がメルトリンβによってどのような制御の元、切断が行われているかを詳細に解析している。今年度は、まず、グリア増殖因子の認識、切断、その可溶性リガンド産生の一連の過程の解析のため、グリア増殖因子のN末端、C末端の片方もしくは、両方に蛍光蛋白質をつないだ融合蛋白質の作成および最適化を行い、グリア増殖因子の細胞内での分布を観察した。さらにグリア増殖因子の切断過程を詳細に解析するために、蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy ; FCS)を用いた測定を行った。上記、蛍光相関分光法を使うために、融合蛋白質の最適化、薬剤や温度ブロックという手法による目的分子の局在のコントロールの検討を行い最適化を行った。結果、グリア増殖因子が従来の定説である細胞表面ではなく、ゴルジ体にて切断をされている可能性が示唆された。今後は、さらに、最適化した融合蛋白質の部位特異的、時期特異的な発現をさせるために、Cre-loxPシステムを用いたトランスジェニックマウスの作成を行う予定である。COS7細胞にメルトリンβとグリア増殖因子を共

発現させ蛍光相関分光測定を行うと、ゴルジ装置でのグリア増殖因子の切断が観察され、それに対しプロテアーゼ活性を失った点変異体(EQ変異体)では、ゴルジ装置における切断が抑制される結果を得た。この結果は細胞内の逆行性膜輸送阻害薬(Bafilomycin A1)を用いても確認された。さらに、神経芽細胞およびCOS7細胞にメルトリンβとグリア増殖因子を共発現させ、密度勾配超遠心法によってゴルジ及び小胞体画分の成分の分離を行うと、確かにゴルジ画分にて基質が切断され、EQ変異体ではゴルジ画分における切断が抑制された。グリア増殖因子を切断するもう一つのプロテアーゼADAM17の欠損細胞でもメルトリンβによる基質切断はゴルジ画分で見られ、さらにADAM17はメルトリンβよりも軽い膜画分で基質を切断することが示唆された。以上から、メルトリンβはADAM17と時間的空間的に異なるリガンド産生制御に関与すると考えられた。癌細胞や再生過程では種々の膜型増殖因子の過剰発現や活性化が知られており、医療に繋がる有用な知見が得られたと考えられる
細胞ダイニン軽鎖Tctex-1によるGタンパク質共役型受容体制御機構の解明

副甲状腺ホルモン(PTH)は血中Ca^<2+>濃度の制御に関わっており、骨リモデリングを促すことから骨粗鬆症治療薬として注目を集めている。我々は以前、PTH受容体のカルボキシル末端に会合するタンパク質として細胞質ダイニン軽鎖の一種であるt-complex tesds expressed-l(Tctex-l)を見出し、Tctex-lがPTH受容体の細胞内内在化に関与することを示した。そこで本研究では,Tctex-lのPTH受容体シグナル伝達に対する影響を詳細に検討した。Tctex-l会合タンパク質は、酵母ツーハイブリッド系を用いて探索した。Tctex-lとMVPとの細胞内結合は、免疫沈降法により検討した。細胞表面PTH受容体量は細胞表面ビオチン化法にて、また、extracellular signal-regulated kinase1/2(ERK1/2)のリン酸化は、Western blottingにてそれぞれ検討した。酵母ツーハイブリッド系の結果、Tctex-l結合タンパク質としてmajor vault protein(MVP)を見出した。さらに、Tctex-lはMVPと細胞内で会合し、その会合には特にMVPのcoiled-coil domainが関与することが示された。野生型PTH受容体(PTHR-WT)発現細胞では、PTH刺激によるERK1/2リン酸化はMVPの過剰発現によって抑制されたが,Tctex-1との会合を欠損したPTH受容体変異体(PTHR-KRVS)発現細胞では抑制されなかった。また、どちらの細胞においてもEGF誘導性ERK1/2リン酸化はMVP過剰発現によって抑制されなかった。以上のことから、PTH受容体のシグナル伝達は、Tctex-lがMVPと複合体を形成することによって抑制される可能性が示唆された。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)のシグナル伝達は,主に三量体Gタンパク質の活性化を通じて行われる.しかし近年,GPCRのカルボキシル(C)末端に会合する細胞内タンパク質によって,GPCR活性が調節されることが報告されてきている.これまで私は,副甲状腺ホルモン(PTH)受容体やトロンボキサンA_2(TXA_2)受容体βアイソフォーム(TPβ)のC末端に会合する細胞内タンパク質とし,Tctex-1(t-complex testis expressed-1)がそれぞれの受容体に会合することを見出している.Tctex-1は微小管に沿った物質輸送に関わる細胞質ダイニン複合体の一種であり,これまでに私は,PTH受容体の細胞内内在化に関与することを報告している.そこで本研究では,Tctex-1がPTH受容体およびTXA_2受容体のシグナル伝達に与える影響について検討した.私は既に,Tctex-1と会合することの出来ないPTH受容体変異体(PTHR-KRVS)を作製している,HEK293細胞に野生型PTH受容体(PTHR-WT)およびPTHR-KRVSを発現させ,extracellular signal-regulated kinase(ERK)1/2リン酸化の時間依存性を検討したが,顕著な差異は見出されていない.なお,HEK293細胞にはTctex-1が発現していることを,RT-PCR法およびウェスタン・プロッティングによって見出している.一方,TXA_2受容体のシグナル伝達に対するTctex-1の影響を検討するため,まず,TPβともう一つのTXA_2受容体アイソフォームであるTPαとをそれぞれ安定に発現したCHO細胞を作製した.そして,TPαとTPβを介するERK1/2リン酸化の時間依存性を比較検討した,その結果,短時間刺激時にTPβの方が急速なERK1/2リン酸化を引き起こすことが示された.またTPαおよびTPβのERK1/2リン酸化に対し,受容体の細胞内内在化を阻害するmonodansylcadaverineを前処理したところ,TPβを介するERK1/2リン酸化のみ顕著に抑制された.副甲状腺ホルモン(PTH)は血中Ca^<2+>濃度の制御に関わっており、骨リモデリングを促すことから骨粗鬆症治療薬として注目を集めている。
直観主義の哲学-論争史の検証と再評価の試み-

平成16年度には、ブラウワーの一次文献の翻訳・消化に努めるとともに、直感主義の認識論的側面について哲学的な評価を行うことを中心に研究を進めた。従来、ブラウワーの数学的認識論は、独我論的であり、また心理主義、主観主義に陥っていると批判されてきた。そうした批判は、ブラウワーのテキストに即して見た場合、誇張されているきらいがある。また、言語論的転回以降試みられている直観主義の脱「心理主義」化の企ての中には、却って直感主義の重要な哲学的示唆を棄てることにつながるような仕事がある(ダメットの意味論的アプローチなど)。直観主義の核は行為(心の中の操作も含めて)の図式の組み合わせとして数学的対象の世界を見る点にあるのであり、そのように見たときに初めて、人間と数学の関係を全体的に捉えるような認識論的問いかけとしての意義を持ってくるのである。以上の点を明らかにした。他方では、数学の根底にある人間の諸実践を認識論の対象とする場合、内面の働きへの着目だけでは十分でないことも確かである。本研究は、オスカー・ベッカーやブランシュヴィックの仕事をヒントとしながら、空間内での人間の身体の移動や、社会の中での交換といった現案的な諸活動と数学的対象を関連づけることを試み、そうしたテーマが成り立ちうることの確信を得た。とりわけ、人間存在の間主観性を基盤とし、またそれを促進するものとして数学の諸体系を見てゆくことが重要であり、可能であることを見出した。平成15年度には、直観主義に関するブラウワーの一次文献の翻訳と消化、20世紀初頭の科学哲学におけるカント主義の位置についての歴史的研究、そして、数学基礎論や解析学をめぐって数学史家との対話を行った。以下、各々の点について具体的に述べる。直観主義の一次文献の消化は、まだ作業途中であるが、その過程ですでに見えてきたことは、この思想が数学基礎論において一つの技術的な選択肢をなしていたのではなく、独自の認識論を提示する性質のものだったという点である。それは、数学的対象をイデア的なものとも単なる記号とも異なったもの、人間の行為についてのある種の真理と見る思想であり、フランス系の直観主義の言葉を借りれば、精神が世界を征服していく力を予め素描したものとして数学を見る見方である。20世紀初頭におけるカント主義の評価というテーマは、前述のような認識論、つまり精神や理性の自己認識をもくろむ認識論が、20世紀の半ば以降廃れてしまった理由を探るという意味で、必要であった。本年度は、論理実証主義者におけるカント主義と非カント主義の混在に焦点を当てて研究を進め、パリ第4大学アンジェル教授の私的セミナーにてその一端を報告し、別の一端を埼玉大学紀要に報告した。数学史家との対話では、19世紀以後の解析学や数学基礎論が「無矛盾性」の追求をもっぱらとしていたのに対して、解析、あるいは一般的に数学的対象の「意味」を考える認識論的な作業がそれとは別に成り立ち得るということを確認することができた。
脳血管障害におけるゲノム創薬科学解析法の開発

本研究の目的は、世界的に発展されつつあるゲノム創薬科学的アプローチを活用し、ゲノム上の治療関連遺伝子の探索研究戦略を確立することである。具体的には、脳血管攣縮病態および脳血管攣縮の致命的合併症である脳虚血病態における治療関連遺伝子クラスター解析から、新しい創薬ターゲットを探索し、ターゲットバリデーションを確立することである。そこで、我々は、脳虚血病態モデルにおける虚血脳および正常脳からDNAチップを作成した。脳虚血病態の進展、すなわち、脳虚血モデルにおける血管結紮の程度脳血管攣縮モデルにおける自家動脈血注大量を変えることで様々な重症度のモデルを作製し、その後の時間経過等に伴う脳血管、脳を回収した。これらのサンプルからDNAチップに対する各種ターゲットを作成した。虚血脳におけるDNAチップに遺伝子発現変化の検討では、脳虚血病態(重症度、時間経過)に依存した優位な遺伝子発現変化が認められ、脳虚血関連遺伝子を明らかすることができた。脳血管攣縮モデルにおける攣縮脳血管では、新しい治療関連遺伝子としてHeme Oxygenase-1(HO-1)を見出した。一方、臨床的に抗脳血管攣縮作用が確立している治療薬の一部にHO-1の誘導作用を見出した。この作用機序を検討し、cGMP/COの関与が示唆された。さらに、脳血管攣縮に対する新しい創薬ターゲットとして、Heat Shock Protein72(HSP72)を見出した。アンチセンスによるHPS72の特異的な抑制により、脳血管攣縮の増悪を見出した。このことからHSP72が脳血管攣縮における抗攣縮分子であることか示唆された。今後、脳虚血病態に対する治療関連遺伝子に焦点をあてた創薬ターゲットの探索研究戦略により、さらに、新しい創薬ターゲットを見出すことが可能であると考えられる。
DDS技術を利用した新規作用機作を有する脳アミロイドーシス治療薬の開発

認知症の患者は毎年増大し、2050年には1億3,200万人に達するといわれているが、現在、アルツハイマー病(AD)を根治させる薬物療法は存在せず、新規作用機作を有する治療薬の開発が望まれている。本研究では、ADの原因として知られるアミロイド線維形成・蓄積および脳内脂質代謝異常を同時に制御可能なシクロデキストリン/デンドリマー(CDE)結合体(申請者らが物質特許を有する)に、脳移行性リガンドを付与した脳移行性CDE(BT-CDE)結合体を新たに構築し、AD治療薬としての可能性について検討した。脳移行リガンドとしてラクトースを修飾したBT-CDEはCDEに比べて、BBBモデルであるhCMEC/D3細胞単層膜において、細胞取込および膜透過性を有意に増大させた。また、BT-CDEはin vitroにおいて、CDEに比べてAβアミロイド繊維形成を著しく抑制するとともに繊維溶解作用を示した。U18666Aを処理したSH-SY5Y細胞において、BT-CDEは、CDEに比べて、Aβおよびコレステロール値を有意に減少させた。マウスに静脈内投与後のBT-CDEはCDEと同様に主に肝臓および腎臓に移行したが、前者は後者に比べて高い脳移行性を示した。また、これらの効果にCDEへのラクトース修飾量が関係することが示された。BT-CDEをマウスに静脈内単回投与後の血液生化学検査値に異常値は認められなかった。以上のことから、BT-CDEはマウスに静脈内投与後、CDEに比べて高い脳移行性を示し、アミロイド線維形成・蓄積および脳内コレステロールレベルを制御可能なことおよび血液毒性を示さないことが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、コレステロール低下作用およびアミロイド繊維形成抑制能を有するシクロデキストリン(CyD)/デンドリマー(CDE)結合体に脳移行性リガンドを付与した新規脳移行性CDE結合体(BT-CDEs)を構築し、新規アルツハイマー病(AD)治療薬としての可能性を明らかにすることである。平成29年度の研究実績を次に示す。1)BT-CDEsの前駆物質として新規に構築したインスリンとCyDとの結合体(I-CyD)をマウスに静脈内投与後の脳移行性をIVISで測定した結果、血糖値および血液生化学検査値に影響を与えずに、脳移行性を示すことが確認された。2)しかし、I-CyDとデンドリマーとの結合体(I-BT-CDE)を新規に構築し、前項と同様な検討を行った結果、優れた脳移行性は認められなかった。3)それ故、新規BT-CDEsの構築を行い、脳移行性に関する検討を行った結果、これまで脳移行性の報告のない糖分子をBTリガンドとして結合したSBT-CDEが、in vitroの取込み実験において、hCMEC/CD3細胞に取り込まれること、また、本細胞およびSH-SY5Y細胞の共培養系を用いたBBB透過実験においても、取込み実験の場合と同様に濃度依存的に単層膜を透過し、また単層膜下層に存在するSH-SY5Y細胞にも取り込まれることが示された。4)前項の実験条件下、SBT-CDEは、hCMEC/D3単層膜の電気抵抗値ならびに細胞生存率に影響を与えないことが示された。5)SBT-CDEはin vitroにおいて、Aβのアミロイド繊維形成を抑制することが示された。これらの結果より、SBT-CDEは、in vitroにおいて、BBBを透過した後、神経細胞に取り込まれること、またAβの繊維形成を抑制することが示された。