hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
損傷脊髄の修復における境界膜の分子シグナル解析

23年度に計画した個体レベルの解析に加え、24年度に計画している培養細胞を用いた解析の予備実験も行った。マウスモデルの作製方法に対して改良を行い、より精度の高い解析が可能となった。改良には研究の遅れを伴ったものの、今後の計画を進めるうえで重要な成果である。24年度の成果を踏まえ、計画を進める。23年度の成果を踏まえ、計画を進める。当初、24年度にはインテグリンのシグナルの解析についても計画していたが、発現細胞に関する解析を行う必要性が生じたため、シグナルの解析には遅れが生じた。しかし、このことは発現細胞の同定がシグナル解析の基礎となるため有意義であったと考えている。25年度には当初の計画に加え、シグナルの解析を行う予定である。繰り越した研究費とともに25年度配分の研究費を使用する計画である。モデルの作製の改良という必要性が生じたため、マウスを用いた個体レベルの解析に遅れが生じた。マウスのモデルの解析は次年度も引き続き行う必要があり、24年度の当初の研究計画に加えて行う。繰り越した研究費とともに24年度配分の研究費を使用する計画である。
白血病に選択性を有する分子標的治療法ならびにその評価法の開発

白血病に対する有効で安全性の高い標的治療の開発のため、1)白血病に特異的な分子病態と標的分子の同定を行い、変異FLT3や変異KIT、さらにキメラ転写因子PML-RARAにリクルートされるN-CoR/HDAC3/TBLR1複合体が新たな標的分子となり得ることを明らかにした。2)標的のための阻害剤開発を行い、FLT3阻害剤としてFI-700、KW-2449、KIT阻害剤としてKI-328を開発した。N-CoR/HDAC3/TBLR1複合体に対してはデコイペプチドの開発を行った。3)チロシンキナーゼ阻害剤の評価系として、p-FLT3あるいはp-STAT5に対する抗体によるFACSおよび血漿バイオアッセイ系を確立した。本研究では、白血病治療における新たな標的、標的方法、評価方法を明らかにすることを目的とし、(1)新しい変異遺伝子ならびに活性化シグナル伝達、(2)白血病キメラ転写物と結合する転写抑制複合体、(3)免疫不全マウスへの異種移植系、の3点について、研究を進めた。1)当初予定したキナーゼの発現クローニング法は、キナーゼの種類によっては大腸菌の増殖に影響を与えるため、発現ベクターを変えて施行中であるプロテインアレイを用いたリン酸化プロフィールの検索では、白血病ではそれぞれユニークな活性化パターンを認め、活性化シグナルによる白血病の層別化、原因遺伝子の探索に向けた基礎データが得られた。2)急性前骨髄球性白血病(APL)に発現が認められるキメラ転写因子PML-RARaに結合して、標的遺伝子発現を直接抑制する因子の同定を試み、N-CoR/HDAC3複合体がリガンド非存在下においてPML-RARaと結合し、標的遺伝子発現抑制に重要であることを確認した。HDAC3のsiRNAノックダウン実験からこのN-CoR-HDAC3複合体が、治療標的となりうることが示唆された。3)NOGマウスへヒト白血病細胞を移植し、我々の知る限り、初めて継代可能な移植が高率に可能となった。移植早期には骨端部にある骨内膜に接してホーミングし、同部より内腔に向かって増殖することや、治療後の残存にも関わることから、白血病ニッシェの一端が明らかになった。現在、分子間相互作用についても解析中である。この系は、新規開発FLT3キナーゼ阻害剤の有用性・特異性を見るために有用であった。急性骨髄性白血病におけるFLT3変異は、シグナル伝達径路MAPKやSTAT5を恒常的に活性化し、IL3依存的細胞株をトランスフォームするが、野生型FDT3ではリガンド刺激によってもSTAT5は活性化されずまたトランスフォームもしない。STAT5恒常的活性化はトランスフォームに必要かつ十分である。そこで変異FLT3とSTAT5をつなぐシグナル伝達径路が白血病に特異的かつ重要と考え、この径路を明らかにし治療標的とすることを第一の目的とした。本年度、FLT3/ITDはSrcファミリーチロシンキナーゼLynと変異特異的に結合し、これに伴ってLynがリン酸化された。Lynを標的としたsiRNAあるいはLyn阻害剤PP2によって、STAT5リン酸化はLynに依存していることを明らかにし、マウスモデルでLyn標的治療の有用性を確認した。急性前骨髄球性白血病におけるキメラ転写因子PML-RARαはドミナントネガティブにレチノイン酸(RA)応答遺伝子群の転写を抑制し、分化抑制に働くとされている。しかしどのような転写抑制複合体がリクルートされ転写制御に働くのか明らかではないので、この径路を明らかにし治療標的とすることを第二の目的とした。本年度の研究により、N-CoR-HDAC3ヒストン脱アセチル化酵素複合体が、APLに発現するPML-RARαキメラ転写因子を介して標的遺伝子プロモーター部位にリガンド非存在下でリクルートされ、遺伝子発現を抑制することを確認した。この複合体はリガンド存在下でPML-RARαから解離する。さらにHDAC3の機能を阻害することにより、標的遺伝子発現の抑制が解除されることを確認した。この結果、N-CoR-HDAC3複合体がAPLにおける新規治療標的分子となる可能性が強く示唆された。急性骨髄性白血病におけるFLT3変異は、AMLの約30%に認められる活性化変異である。我々は小分子化合物ライブリーの中から、FLT3に高い特異性を有する新規構造物FI-700を発見した。nMレベルでの阻害活性と下流シグナルの抑制、細胞周期ではG1停止を引き起こした。免疫不全マウス(NOGマウス)での継代が可能なFLT3変異を有するヒト白血病細胞を用いて、FLT3キナーゼ阻害剤による治療を行ったところ、本キナーゼ阻害剤は、正常造血への阻害作用が少なく、白血病細胞が駆逐されるのとほぼ同期して正常造血が回復する可能性が示唆された。

一方、化学療法剤であるシタラビンを投与した場合には正常の造血細胞が破壊された中に、骨芽細胞あるいは血管内皮細胞に接着して白血病細胞が残存していた。ヒト白血病細胞株と一部の症例について市販のリン酸化受容体型チロシンキナーゼ(RTK)アレイを用いて、キナーゼプロファイルについての解析を行なった。その結果、FLT3の活性化を認める細胞株を4種類確認した。この中でFLT3のみにリン酸化を示した細胞はFLT3阻害剤に高感受性を示したが、他のRTKの活性化も併存した細胞株は、FLT3阻害剤に対する感受性は低下し下流のSTAT5も抑制されなかった。この細胞株に対しては、併存するリン酸化RTKに対する阻害剤が併用効果を示した。活性化RTKアレイで陽性となったRTKはキナーゼ阻害剤による治療の標的となり、個々のRTK阻害剤の併用が有効である可能性が示唆された。急性骨髄性白血病におけるFLT3変異は、AMLの約30%に認められる活性化変異である。我々は小分子化合物ライブリーの中から、FLT3に高い特異性を有する新規構造物FI-700(昨年度報告)に加えて、KW-2449を発見した。この化合物はvitroではFLT3の他、Aurora、ABLキナーゼを阻害した。nMレベルでの阻害活性と下流シグナルの抑制、細胞周期ではG1停止を引き起こした。免疫不全マウス(NOGマウス)での継代が可能なFLT3変異を有するヒト白血病細胞を用いて、FLT3キナーゼ阻害剤による治療を行ったところ、本キナーゼ阻害剤は、正常造血への阻害作用が少なく、白血病細胞が駆逐されるのとほぼ同期して正常造血が回復する可能性が示唆された。マウスへのFLT3変異腫瘍移植モデルでの有効性を確認した。ヒト白血病細胞に対してもFLT3の阻害、STAT5のリン酸化阻害、アポトーシスの誘導を起こした。FLT3を抑制する10倍の濃度ではAuroraBおよび数倍の濃度でT315Iを含むABLキナーゼも阻害した。一方、キナーゼ阻害剤での有効性を検証するために、NOGマウスへのヒト白血病モデルを作成し、キナーゼ阻害剤での残存・耐性メカニズムについても検討した。この結果、コントロール群あるいはイマチニブ投与群では、マウス末梢血中のBCR/ABL mRNAコピー数が25倍増加するのに比べ、KW-2449投与群では逆に1/2-1/3に減少し、骨髄中のヒト白血病比率も減少した。このことはKW-2449がヒト耐性細胞に対しても生体内で有効であることを示唆する。急性骨髄性白血病におけるKIT変異は、FLT3変異に次いで多く認められ、特にt(8;21)やinv(16)を有する、いわゆるCBF白血病では高率に認められる活性化変異である。我々は小分子化合物ライブリーの中から、受容体型チロシンキナーゼに選択性の高いリード化合物からのスクリーニングによって、FLT3に高い特異性を有するFI-700をすでに報告している(clin Cancer Res 2007)。今回、FI-700の元となったリード化合物をあらたに構造展開することによって、KIT選択性の高いKI-328を得た。
シャンカラナンダナの刹那滅論研究－7世紀以降のインド仏教思想史の再構築に向けて－

前年度(平成23年度)は、シャンカラナンダナ(ca.920-980/940-1020)の著作『ダルマ・アランカーラ』第3章「刹那滅性に対する論駁はないことの証明」の章のサンスクリット原典写本のディプロマティック・エディション(写本を書写されたその通りにローマ字に起こしたもの)を作成した。今年度は、アメリカ合衆国-ハーヴァード大学・教養学部・南アジア学科(受入: Parimal G.Pati1教授)に約11カ月間研究滞在し、前年度の研究成果をもとに、同著作のサンスクリット校訂テキスト、並びに、その暫定的な翻訳を作成した。その文献学的基礎研究の成果として、シャンカラナンダナが対論者としていたと推測される、正統派バラモン教哲学学派に属する幾人かの思想家クマーリラやウッドヨータカラなどを同定することが出来たほか、『ダルマ・アランカーラ』第3章の章の構成、成り立ちについて、幾つかの興味深い知見を得ることができた。また本年度は、昨年度に引き続き、『ダルマ・アランカーラ』第3章に対する文献学的基礎研究と並行して、7世紀以降の刹那滅論を中心としたインド仏教思想史を再構築するべく、ダルモーッタラ(ca.740-800)の刹那滅論に関する研究を更に推し進めた。この研究では、刹那滅論証で使用される論証因「存在性」の成立をめぐるダルモーッタラの理論を明らかにし、また、その理論が、後代の思想家ジュニャーナシュリーミトラ(ca-980-1030)にある程度の影響を与えたことを実証した。ダルモーッタラやシャンカラナンダナなど、カシュミール系の思想家たちが、ジュニャーナシュリーミトラなど、いわゆるヴィクラマシラー系の思想家たちの思想形成に与えた影響を具体的な事例のレヴェルで明らかにして行くことは、7世紀以降のインド仏教思想史を再構築する上で、極めて重要な作業と言える。平成23年度は、中国チベット学研究センターからオーストリア科学アカデミー・アジア文化・思想史研究所(IKGA)に学術提供された学界未見のサンスクリット原典写本を使用し、シャンカラナンダナ(ca.920-980/940-1020)の著作『ダルマ・アランカーラ』第3章「刹那滅性に対する論駁はないことの証明」の章のサンスクリット原典写本のディプロマティック・エディション(写本を書写されたその通りにローマ字に起こしたもの)を作成した。ディプロマティック・エディションの作成に当たっては、同著作第2章「無我の証明」の章を担当するVincent Eltschinger博士(IKGA専任研究員)との共同作業が必要不可欠であったため、4月下旬よりIKGAを訪問し、同博士の協力を得て作業を進めた。次年度では、本年度に作成したディプロマティック・エディションをもとに、『ダルマ・アランカーラ』第3章のサンスクリット校訂テキストの作成に取り組む予定である。また本年度では、『ダルマ・アランカーラ』第3章に関する文献学的研究と並行して、7世紀以降の刹那滅論を中心としたインド仏教思想史を再構築するために、ダルマキールティ(ca.600-660)、ダルモーッタラ(ca.740-800)、そしてプラジュニャーカラグプタ(ca.750-810)の3人の思想家を主に取り上げ、彼らの刹那滅論に関する研究発表を国内外の学会で行い、また、彼らの刹那滅論を論じた幾つかの論文を発表した。なかでも、6月に台湾で開催された国際学術会議では、刹那滅論における「存在」と「消滅」の関係について、ダルモーッタラとプラジュニャーカラグプタの両者にはダルマキールティには見られない新たな問題意識が見出せることを論じた。

ダルモーッタラやシャンカラナンダナなど、カシュミール系の思想家たちが、ジュニャーナシュリーミトラなど、いわゆるヴィクラマシラー系の思想家たちの思想形成に与えた影響を具体的な事例のレヴェルで明らかにして行くことは、7世紀以降のインド仏教思想史を再構築する上で、極めて重要な作業と言える。本年度は、当初からの研究目標であった、『ダルマ・アランカーラ』第3章のサンスクリット原典写本のディプロマティック・エディションの作成を達成できた。それゆえ、研究は現在のところおおむね順調に進展している。サンスクリット原典写本のディプロマティック・エディションの作成を進める中で、サンスクリット原典写本それ自体が多くの誤写を含むことが明らかになった。『ダルマ・アランカーラ』には現存するサンスクリット原典写本が一本のみで、また本作にはチベット語訳テキストが存在しないため、サンスクリット原典写本の校訂には困難が予想される。対応策としては、より多くの一次文献を参照し、本テキストが成立するに至った思想史上の背景、周辺状況をおさえることが肝要となると思われる。
ヒト摘出肝からの肝progenitor cellの分離・保存と細胞移殖

肝移植の代替手段として期待されている肝細胞移植も肝移植と同様に、肝細胞供給不足の問題を解決できていない。そこで肝内の多分化能を有するprogenitor cellの利用を考え、研究を行なってきた。前年度は生体肝移植摘出肝の中でのprogenitor cellの染色を行ない、病変別にその多寡、局在を検討した。本年度は生体肝移植を施行した摘出末期病的肝より肝細胞分離を行い、その可能性の検討と、培養可能であったprogenitor like cellの動態を観察した。(対象と方法)対象は当科にて生体肝移植を施行した58例中8症例。原疾患はHBV2例(HCC合併2例)、HCV4例(HCC合併2例)、PBC1例、アルコール性肝不全1例であった。細胞分離の方法は、摘出肝を一部切除し、門脈内にコラゲナーゼを注入した。肝細胞濾過液にDMEMを加え、600rpm、3分間遠心を計3回行った。均一な肝実質細胞を得た後、細胞数、trypan blue testにてViabilityを計測し、ディッシュに播種し、培養を開始した。さらに初回遠心後の上清を3000rpm、3分3回遠心し、得られたProgenitor cellを混じていると考えられる非実質細胞分画(小型肝細胞、非実質細胞)の細胞数、Viability計測し、培養を行った。(結果)使用した肝湿重量は21±14.1gであった。その組織より肝実質細胞を2.3×10^7±2.1×10^7個分離可能であったが、viabilityは36.1±29.7%であった。また、非実質細胞は2.0×10^7±1.5×10^7個でviabilityは51.3±36.2%であった。肝摘出から分離開始までの時間は374±132.3分で、viabilityと相関があった。長期間培養できたのは1例のみであった。(結語)末期肝疾患からの細胞分離はviabilityは低いものの、可能であった。対象疾患が肝硬変や肝不全といった肝移植での肝細胞分離は困難であるが、本法の改良によって、細胞移植のみならず、再生医療を含めた今後の治療に寄与するものと考える。現在、画像処理PCカスタマイズを用い、長期培養例の細胞増殖の経時的変化を観察し、画像処理している。肝細胞から肝幹細胞であるprogenitor細胞は自律増殖するため肝細胞の移植としては絶好のツールである。本年度はこの細胞を分離・保存する研究より着手した。対象となるヒト切除肝は充分な説明による同意の得られた転移性肝癌3例である。これらの肝組織片をUW (University of Wisconsin)液に浸漬保存し、2-4時間後に肝細胞分離を施行した。分離方法)37°C加温乳酸加リンゲル液でUW液の排出と組織加温しEDTA/Collagenase法で分離した。復温操作がない場合分離細胞収量は減少し未消化部分が残ったため酵素活性が低温下で不十分であったと考えられる。実質細胞分画と非実質細胞分画に分けEGF、ビタミンC、血清を主体とする培地で培養した。細胞形態)実質細胞分画の培養では石垣状に増殖配列していったが、培養後3-4日目よりこれら細胞の脱落部周辺に小形の各を有する細胞集団が確認された。非実質細胞分画の培養では線維芽細胞が増殖しており、これらを抑制するためDMSO1-2%を添加すると小形の核を有する小細胞の集塊が認められるようになりこの塊は増大していった。約3-4週で一部重層化傾向を認めた。培養1ヶ月で凍結保存して半年後を目安に解凍予定である。対照とすべく分離した正常肝細胞を肝臓に放射線障害を与えたラット脾臓へ移植したところ培養で認められた小肝細胞が脾・肝内に散見され分離時に実質分画に存在したprogenitor細胞と推定された。今後の展開)非実質分画の細胞培養後1ヶ月でのマーカーによる判別を計画している。またこの細胞を一旦はがし移植予定である。本年度は、(実験1)これらの細胞が肝移植を受けた末期肝疾患の患者の摘出全肝内に存在する頻度を病態別に検討した。(実験2)また、新規移植症例で全摘肝からの肝細胞分離をおこなった。(方法)2003年12月までに当科にて行われた肝移植症例27症例を対象にprogehitor cell marker(c-kit、CD34)にて染色を行った。(結果と考察)実験1:劇症肝炎ではc-kit(2/8:25%)、CD34(2/8:25%)、胆道閉鎖症ではc-kit(1/8:14.2%)、CD34(1/7:14.2%)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)ではc-kit(2/4:50%)、CD34(3/4:75%)、ウイルス性肝硬変ではc-kit(4/7:57.1%)、CD34(2/7:28.6%)であった。PBC症例では肝硬変症例と同等に中等度の大きさの胆管に発現が認められた。一方、劇症肝炎の中でも長期経過をとった症例ではstem cell markerの発現が高度であった。

このことから比較的強い再生刺激を一定期間うける状況でstem/progenitor cellの集積が期待されると思われる。実験2:肝硬変症例から分離した非実質細胞分画からprogenitor cell様細胞が認められ、急性肝障害に比べて、慢性に進行していく硬変肝で肝前駆細胞の存在が示唆された。そのような硬変肝から分離された小型の肝細胞が増殖し、集塊を形成し、40日以上の間培養可能であった。摘出肝の分離肝細胞に対する解析により、不全肝の再生予備能力の評価、人工肝臓、肝細胞移植の細胞源となる可能性が示唆された。肝移植の代替手段として期待されている肝細胞移植も肝移植と同様に、肝細胞供給不足の問題を解決できていない。そこで肝内の多分化能を有するprogenitor cellの利用を考え、研究を行なってきた。前年度は生体肝移植摘出肝の中でのprogenitor cellの染色を行ない、病変別にその多寡、局在を検討した。本年度は生体肝移植を施行した摘出末期病的肝より肝細胞分離を行い、その可能性の検討と、培養可能であったprogenitor like cellの動態を観察した。(対象と方法)対象は当科にて生体肝移植を施行した58例中8症例。原疾患はHBV2例(HCC合併2例)、HCV4例(HCC合併2例)、PBC1例、アルコール性肝不全1例であった。細胞分離の方法は、摘出肝を一部切除し、門脈内にコラゲナーゼを注入した。肝細胞濾過液にDMEMを加え、600rpm、3分間遠心を計3回行った。均一な肝実質細胞を得た後、細胞数、trypan blue testにてViabilityを計測し、ディッシュに播種し、培養を開始した。さらに初回遠心後の上清を3000rpm、3分3回遠心し、得られたProgenitor cellを混じていると考えられる非実質細胞分画(小型肝細胞、非実質細胞)の細胞数、Viability計測し、培養を行った。(結果)使用した肝湿重量は21±14.1gであった。その組織より肝実質細胞を2.3×10^7±2.1×10^7個分離可能であったが、viabilityは36.1±29.7%であった。また、非実質細胞は2.0×10^7±1.5×10^7個でviabilityは51.3±36.2%であった。肝摘出から分離開始までの時間は374±132.3分で、viabilityと相関があった。長期間培養できたのは1例のみであった。(結語)末期肝疾患からの細胞分離はviabilityは低いものの、可能であった。対象疾患が肝硬変や肝不全といった肝移植での肝細胞分離は困難であるが、本法の改良によって、細胞移植のみならず、再生医療を含めた今後の治療に寄与するものと考える。現在、画像処理PCカスタマイズを用い、長期培養例の細胞増殖の経時的変化を観察し、画像処理している。
高効率スピン軌道トルクを目指した反強磁性結合金属人工格子の創製

反強磁性体は外的擾乱に強く、デバイスの高集積化に適した材料として、スピントロニクス分野で注目を集めている。非磁性中間層を介して隣り合う強磁性層が反強磁性的に結合した金属人工格子は、反強磁性の周期や結合の強さを人工的に制御できるモデル物質となる。本研究では、非磁性中間層をスピン流源とするスピン軌道トルクが最も効率的に強磁性層に作用する反強磁性結合金属人工格子の創製を行うことを目的とした。平成30年度は、(1)強い反強磁性結合と大きなスピン軌道トルクを両立させる物質の探索、および(2)スピン軌道トルクに対する界面でのスピン軌道相互作用の役割の解明、という研究項目から着手した。薄膜試料の作製には、超高真空対応スパッタ装置を用い、反射高速電子線回折および原子間力顕微鏡を用いて表面形態を調べ、X線回折法により周期構造と結晶構造を同定した。また、振動試料型磁力計とSQUID磁束計を用いて磁気特性を評価し、反強磁性結合の強さや界面磁気異方性を算出した。(1)についてはCo/Cu/Coのエピタキシャル薄膜を研究対象とし、層間交換結合により反強磁性的な磁気構造が形成できることを確認した。また、Cu中間層にIrを添加したときの磁気特性の変化を明らかにした。(2)については、Pt/Co/Pdの三層構造を基本として各々の膜厚を系統的に変化させた試料を作製し、それらの磁気特性を調べた。界面磁気異方性や誘導磁気モーメントの膜厚依存性を明らかにし、Co/Pt界面およいCo/Pd界面それぞれの役割を議論することに成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
糖鎖のパターン状固定化による細胞機能制御

ヒアルロン酸に硫酸基を導入することによりヘパリン類似の抗凝血活性を付与することに成功したので、これをポリスチレンやポリエチレンテレフタレート膜のような汎用合成高分子上に光固定化する方法を開発した。そして、半導体工業などで用いられる光リソグラフィ法を応用し、硫酸化ヒアルロン酸をマイクロパターン状に固定化し、血液成分との相互作用を調べた。光固定化のために、硫酸化ヒアルロン酸に光反応性の官能基であるフェニルアジド基を結合した。カップリング反応は、硫酸化ヒアルロン酸とアジドアニリンを混合して、縮合剤として水溶性カルボジイミドを加えることにより行った。フェニルアジド基を導入しても抗凝血活性が低下しないことを血液テストにより確認した。得られたフェニルアジド基導入硫酸化ヒアルロン酸を水に溶解し、ポリスチレンやポリエチレンテレフタレート膜の上にキャストした。空気中で乾燥した後、一定のマイクロパターン(今回は線幅100μmの縞状パターン)にクロムメッキした石英ガラスの光マスクで覆い、紫外線を照射した。光の当たった領域でのみ、フェニルアジド基の分解が起き、ナイトレシラジカルが形成され、これが分子内・分子間で反応し、固定化された。水で洗うことにより、未固定の硫酸化ヒアルロシ酸は除かれた。パターン状に固定化が行われたことはカチオン性の染料で染色して顕微鏡で観察することにより確認した。このように硫酸化ヒアルロン酸マイクロパターン状に固定化された膜に血小板を作用させると、非固定化領域でのみ血小板が粘着し、固定化領域には全く血小板の粘着しないことが顕微鏡の一視野で観測された。このような光固定化法は、特別な官能基を表面に有しない有機材料の修飾法として優れている上に、マイクロパターン状に固定化して生体成分との相互作用を調べやすく、有用な方法であることが示された。
長期生態系プロットによる森林生態系の解明

森林の動態を解明するためには、比較的面積の大きい固定プロットの設置と一定間隔の調査が必要不可欠である。東京大学の3つの演習林に設置された既存の長期観測プロットに加えて今回新たに4つの演習林について長期生態系プロットを設置した。各プロット内に生育する胸高直径45cm以上の樹木について樹種と胸高直径を測定した。また、いくつかのプロットでは樹高と樹木位置等を測定した。調査対象林分の特徴とプロットの面積は北からそれぞれ、1.北海道中央部に位置する北海道演習林のトドマツ・エゾマツ・シナノキを主体とする針広混交天然林林36.25ha、2.埼玉県西部に位置する秩父演習林のイヌブナ・ブナ・ツガを主体とする山地帯天然林6ha、3.東京都田無市にある田無試験地のアカマツ・コナラからなる二次林にヒノキ・シラカシを植栽した林分0.42ha、4.山梨県山中湖畔に位置する富士演習林の数多くの落葉広葉樹の混交する約75年生のカラマツ人工林0.25ha、5.房総半島清澄川周辺に位置する千葉演習林のモミ・ツガ・コナラなどからなる天然林1.845ha、6.愛知県瀬戸市東部に位置する愛知演習林のアカマツとコナラ、ホオノキ、ヤブツバキ、アカガシなどの落葉・常緑広葉樹の混交する針広混交二次林の2.76ha、伊豆半島南端に位置する樹芸研究所の皆伐後43年経過し、現在スダジイが優占し、ヒサカキ、イヌガシ等の常緑広葉樹からなる二次林1.0haである。これらの7つの地域のプロットのうち、千葉演習林、北海道演習林と秩父演習林においては、プロット設置後24回の調査が実施されており、各調査林分の組成構造の変化を分析する上での貴重な資料が得られた。これらの異なる森林帯に設置した長期観測プロットの定期的観測結果とその分析によって、森林生態系の取り扱いや保全にとって重要な基礎資料を提供することが可能となった。東京大学農学部附属の全7地方演習林(研究所・試験地を含む)において、長期生態系森林プロットを設置し、枯木を含む樹木の計測を行い、森林動態の長期モニタリングを開始した。北海道および秩父演習林では、既存の大面積プロットでの調査を発展させ、残る5演習林・研究所・試験地では新規プロットにおいて、同じ調査法により胸高直径4cm以上の樹木の胸高直径と樹高の測定と、一部では位置図の作成を行った。北海道演習林では、トドマツ、エゾマツ、シナノキ、ダケカシバなどからなる面積36.25haの前山プロットにおいて、第2回目の測定を行った。5年間の変化は、わずかであった。秩父演習林では、イヌブナ・ブナ・コメツガなどからなる面積16.5haの赤沢プロットにおいて、樹木調査区域を約7haまで拡張し、胸高直径と樹幹長を測定するとともに位置図を作成した。千葉演習林は暖帯林の面積2haの楢ノ木台プロットを再設定し、胸高直径を測定し、昭和15年の間伐等施業後の位置図と現状の対照作業に入っている。同演習林では、シカの生息密度が高く、シカ防御柵を設置してシカの森林植生への影響評価も行う。愛知演習林はアカマツ・コナラ・ヒノキ等からなる面積0.5haの暖温帯都市近郊林に赤津プロットを、南北の谷に分けて新設した。

富士演習林はカラマツ植林の上木下に再生するミズキ、ウリハダカエデ、ミツバウツギ等からなる冷温帯林にまず0.25haのプロットを新設し、胸高直径と樹高の測定および樹木位置図の作成を開始した。また、小型温度ロガーによる、林内微気象の観測を始めた。樹芸研究所は、スダジイ、クスノキ、サクラ、ハゼノキ等からなる旧薪炭林の暖帯二次林に面積1haの青野プロットを新設し、胸高直径と樹高測定、位置図の作成を完了し、林内の気温測定も開始した。田無試験地は、アカマツ、コナラ、クヌギ等からなる暖温帯都市林に面積0.41haのプロットを新設し、樹木調査を終えた。森林の動態を解明するためには、比較的面積の大きい固定プロットの設置と一定間隔の調査が必要不可欠である。東京大学の3つの演習林に設置された既存の長期観測プロットに加えて今回新たに4つの演習林に長期生態系プロットを設置した。各プロット内に生育する胸高直径45cm以上の樹木について樹種と胸高直径を測定した。また、いくつかのプロットでは樹高と樹木位置等を測定した。調査対象林分の特徴とプロットの面積は北からそれぞれ、1.北海道中央部に位置する北海道演習林のトドマツ・エゾマツ・シナノキを主体とする針広混交天然林林36.25ha、2.埼玉県西部に位置する秩父演習林のイヌブナ・ブナ・ツガを主体とする山地帯天然林6ha、3.東京都田無市にある田無試験地のアカマツ・コナラからなる二次林にヒノキ・シラカシを植栽した林分0.42ha、4.山梨県山中湖畔に位置する富士演習林の数多くの落葉広葉樹の混交する約75年生のカラマツ人工林0.25ha、5.房総半島清澄山周辺に位置する千葉演習林のモミ・ツガ・コナラなどからなる天然林1.845ha、6.愛知県瀬戸市東部に位置する愛知演習林のアカマツとコナラ、ホウノキ、ヤブツバキ、アカガシなどの落葉・常緑広葉樹の混交する針広混交二次林の2.76ha、伊豆半島南端に位置する樹芸研究所の皆伐後43年経過し、現在スダジイが優占し、ヒサカキ、イヌガシ等の常緑広葉樹からなる二次林1.0haである。これらの7つの地域のプロットのうち、千葉演習林、北海道演習林と秩父演習林においては、プロット設置後24回の調査が実施されており、各調査林分の組成構造の変化を分析する上での貴重な資料が得られた。これらの異なる森林帯に設置した長期観測プロットの定期的観測結果とその分析によって、森林生態系の取り扱いや保全にとって重要な基礎資料を提供することが可能となった。
円口類Otx遺伝子群の発現調節の解析

日本産ヤツメウナギ(Lethenteron japonicum)より得られた3つのOtx関連遺伝子(OtxA,OtxB, OtxC)の全長cDNA配列を決定し、これまで明らかになっていなかった初期胚内での発現パターンをwhole mount in situハイブリダイゼーション法により記載した。明らかになった発現パターンを与える発現調節領域の同定を行う為にヤツメウナギBAC(大腸菌人工染色体)ライブラリーより、各遺伝子を含むBACクローンの単離を試み、OtxA遺伝子座を含むクローンの単離に成功し、ショットガンシーケンス法によりドラフト配列を得る事に成功した。有顎脊椎動物の頭部発生に於いて重要な働きを持つOtx遺伝子群が、有顎脊椎動物の姉妹群である顎を持だない円口類の頭部発生に於いて、どのような発現パターンを示すのか、また、その発現を司る転写調節領域を特定する為に、1、日本産ヤツメウナギからOtxA,OtxB,OtxC遺伝子cDNAの完全長cDNAを得た。この結果、無顎類も有顎脊椎動物同様に3つのOtx関連遺伝子を持つ事を明らかにした。これら3つの遺伝子の胚発生に於ける時空間的な発現パターンをwhole mout In situハイブリダイゼーション法により解析した。特に、新規にクローニングしたOtxC遺伝子については全発生ステージに渡って解析をおこなった。合わせてOtxA,OtxB遺伝子でこれまで解析されていなかった胞胚期原腸胚期についても解析を行い、いずれの遺伝子も原口背側部のオーガナイザーと思われる領域に発現している事、OtxCに関しては後期発生において北米産のヤツメウナギで報告されているパターンと類似する発現を示す事を明らかにした。2、1項に述べた発現を与える転写調節領域を同定する為にヤツメウナギBAC(大腸菌人口染色体)ライブラリーより、各遺伝子を含むゲノム断片のスクリーニングを行った結果、OtxA,OtxCを含むクローンの単離に成功した。現在,OtxA遺伝子座を含むBACクローンのショットガンライブラリーを作成し、その塩基配列の決定を行っている。今後、決定された塩基配列を、他のゲノムが明らかになっている有顎脊椎動物のOtx遺伝子座と比較し、非翻訳領域の保存性について検討を行う予定である。有顎脊椎動物の頭部発生に於いて重要な働きを持つOtx遺伝子群が、有顎脊椎動物の姉妹群である顎を持たない円口類の頭部発生に於いて、どのような発現パターンを示し,その発現を司る転写調節領域を特定する為に、1、日本産ヤツメウナギから得られたOtxA,OtxB,OtxC遺伝子の胚発生に於ける時空間的な発現パターンをwholm。mout In situハイブリダイゼーション法により解析した。新規にクローニングしたOtxC遺伝子については全発生ステージに渡って解析した。合わせてOtxA,OtxB遺伝子でこれまで解析されていなかった胞胚期一原腸胚期についても解析を行い、いずれの遺伝子も原口背側部のオーガナイザーと思われる領域に発現している事、OtxCに関しては後期発生において北米産のヤツメウナギで報告されているパターンと類似する発現を示す事を明らかにした。2、1項に述べた発現を与える転写調節領域を同定する為にヤツメウナギBAC(大腸菌人口染色体)ライブラリーより、各遺伝子を含むゲノム断片のスクリーニングを行った結果、OtxA,OtxCを含むクローンの単離に成功し、OtxA遺伝子座を含むBACクローンの塩基配列決定を行うた。得られた配列と、有顎脊椎動物Otx2遺伝子の転写調節領域と配列の保存性を検討したが、有為に保存性を示す領域は認められず、転写調節領域の候補領域を塩基配列の保存性から見いだすことはできなかった。今後はOtxA遺伝子の転写調節を司る領域を特定する為に、得られたBACクローンよリレポーター遺伝子を作成し、トランスジェニック技術を用いて解析を行う予定である。
ケモカインを介した腎発生ならびに再静機序とその制御

1)IP-10ならびCXCR3はマウス胎児期において腎組織内に発現がみられることが判明した.一旦,マウス腎が成熟する生後1週以降ではほとんど発現がみられなくなった.一方,虚血再環流障害モデルを作成したところ,IP-10ならびにCXCR3ともに間質浸潤細胞ならびに尿細管上皮細胞に発現を認めた.この新たに発現がみられるIP-10/CXCR3の役割を検討する目的で,虚血再環流障害モデル作成時に抗IP-10中和抗体投与を行った.その結果,抗IP-10中和抗体投与群において,対照群と比較して再環流後4日で尿細管上皮細胞の再生が増加することが判明した.さらにこの虚血再環流モデルにおいて,尿細管上皮細胞増殖の亢進がKi67陽性細胞数増加より示された.さらに培養マウス尿細管上皮細胞を用いてwound healingtestを施行した.その結果,抗IP-10中和抗体投与によりwound healingが促進することが示された.さらに,抗IP-10中和抗体共培養によりKi67陽性細胞で示される細胞増殖が促進された.2)進行性腎線維化モデルにおける意義を検討した.抗IP-10中和抗体投与群において4日,7日目に腎間質線維化率の増加を確認した.さらに組織コラーゲン含有をあらわすハイドロキシプロリン量も増加した.加えて,TGF-β_1蛋白ならびにmRNAの腎での発現は増加した.この発現は,抗IP-10中和抗体投与によりさらに亢進した.一方,線維化抑制効果を示すと考えられているHGF mRNA発現も同様に増加した.抗IP-10中和抗体はこのHGF mRNA発現を抑制した.培養マウス尿細管上皮細胞においてH_2O_2存在下のTGF-β_1 mRNA発現はリコンビナントIP-10添加により減少し,抗IP-10中和抗体により増加した.以上の結果より,抗IP-10中和抗体投与により腎線維化促進効果がみられ,この機序として尿細管上皮細胞でのTGFβ_1発現亢進ならびにHGF発現低下を介していることが推測された.以上より,IP-10/CXCR3は腎発生ならびに腎線維化に至る修復機構に深く関与する因子であることが推測される.1)IP-10ならびCXCR3はマウス胎児期において腎組織内に発現がみられることが判明した.一旦,マウス腎が成熟する生後1週以降ではほとんど発現がみられなくなった.一方,虚血再環流障害モデルを作成したところ,IP-10ならびにCXCR3ともに間質浸潤細胞ならびに尿細管上皮細胞に発現を認めた.この新たに発現がみられるIP-10/CXCR3の役割を検討する目的で,虚血再環流障害モデル作成時に抗IP-10中和抗体投与を行った.その結果,抗IP-10中和抗体投与群において,対照群と比較して再環流後4日で尿細管上皮細胞の再生が増加することが判明した.さらにこの虚血再環流モデルにおいて,尿細管上皮細胞増殖の亢進がKi67陽性細胞数増加より示された.さらに培養マウス尿細管上皮細胞を用いてwound healingtestを施行した.その結果,抗IP-10中和抗体投与によりwound healingが促進することが示された.さらに,抗IP-10中和抗体共培養によりKi67陽性細胞で示される細胞増殖が促進された.2)進行性腎線維化モデルにおける意義を検討した.抗IP-10中和抗体投与群において4日,7日目に腎間質線維化率の増加を確認した.さらに組織コラーゲン含有をあらわすハイドロキシプロリン量も増加した.加えて,TGF-β_1蛋白ならびにmRNAの腎での発現は増加した.この発現は,抗IP-10中和抗体投与によりさらに亢進した.一方,線維化抑制効果を示すと考えられているHGF mRNA発現も同様に増加した.抗IP-10中和抗体はこのHGF mRNA発現を抑制した.培養マウス尿細管上皮細胞においてH_2O_2存在下のTGF-β_1 mRNA発現はリコンビナントIP-10添加により減少し,抗IP-10中和抗体により増加した.以上の結果より,抗IP-10中和抗体投与により腎線維化促進効果がみられ,この機序として尿細管上皮細胞でのTGFβ_1発現亢進ならびにHGF発現低下を介していることが推測された.以上より,IP-10/CXCR3は腎発生ならびに腎線維化に至る修復機構に深く関与する因子であることが推測される.Interferon-inducible protein-10(IP-10)/CXCL10およびその受容体CXCR3を介する再生/修復機構の解析とその制御を検討する目的で,進行性腎線維化モデルにおける意義を検討した.IP-10は正常腎においてはほとんど発現がみられないが,尿管結紮により間質浸潤細胞ならびに尿細管上皮細胞に発現を認めた.一方,CXCR3は,間質線維化進行過程において尿細管上皮細胞ならびに浸潤細胞に発現を認めた.抗IP-10中和抗体投与群においてCXCR3陽性細胞数の増加を認めた.実際,培養マウス尿細管上皮細胞において,H_2O_2ならびにIFN_<-γ>存在下でIP-10/CXCR3mRNA発現は経時的に増加した.この進行性腎線維化モデルにおいて4日,7日目に腎間質線維化率の増加を確認した.

さらに組織コラーゲン含有をあらわすハイドロキシプロリン量も増加した.この線維化は抗IP-10中和抗体を用いたIP-10機能阻害により促進された.加えて,TGF_<-β_1>蛋白ならびにmRNAの腎での発現は増加した.この発現は,抗IP-10中和抗体投与によりさらに亢進した.一方,線維化抑制効果を示すと考えられているHGFmRNA発現も同様に増加した.抗IP-10中和抗体はこのHGFmRNA発現を抑制した.培養マウス尿細管上皮細胞においてH_2O_2存在下のTGF_<-β_1>mRNA発現はリコンビナントIP-10添加により減少し,抗IP-10中和抗体により増加した.以上の結果より,抗IP-10中和抗体投与により腎線維化促進効果がみられ,この機序として尿細管上皮細胞でのTGF_<-β_1>発現亢進ならびにHGF発現低下を介していることが推測された.以上より,IP-10は腎予後に関連する腎間質線維化に対して進展抑制効果を有することが示唆され,腎間質の修復機構への関与が推測された.IP-10ならびCXCR3はマウス胎児期において腎組織内に発現がみられることが判明した.一旦,マウス腎が成熟する生後1週以降ではほとんど発現がみられなくなった.一方,虚血再環流障害モデルを作成したところ,IP-10ならびにCXCR3ともに間質浸潤細胞ならびに尿細管上皮細胞に発現を認めた.この新たに発現がみられるIP-10/CXCR3の役割を検討する目的で,虚血再環流障害モデル作成時に抗IP-10中和抗体投与を行った.その結果,抗IP-10中和抗体投与群において,対照群と比較して再環流後4日で尿細管上皮細胞の再生が増加することが判明した.さらにこの虚血再環流モデルにおいて,尿細管上皮細胞増殖の亢進がKi67陽性細胞数増加より示された.一方,このモデルの特徴である尿細管壊死は抗IP-10中和抗体投与による差異はみられなかった.このIP-10/CXCR3の腎障害時の役割をさらに検討する目的で,培養マウス尿細管上皮細胞を用いてwound healing testを施行した.その結果,抗IP-10中和抗体投与によりwound healingが促進することが示された.さらに,抗IP-10中和抗体共培養によりKi67陽性細胞で示される細胞増殖が促進された.これらの結果より,抗IP-10中和抗体投与により腎尿細管上皮細胞の再生ならびに増殖亢進がin vivoならびにin vitroで確認された.以上より,IP-10/CXCR3は腎発生に関与することに加えて,腎障害時に発現が亢進するIP-10/CXCR3は腎尿細管上皮細胞の再生や増殖に関与することが推測された.
地中レーダーを用いた地震性バリアーシステムの堆積様式の解明

風蓮湖北東縁に位置する走古丹バリアースピットには,5帯の浜堤列が認識される.我々の掘削により, 7層の完新世テフラが見いだされ,千年オーダーでの地形発達史を解読した.現在のシステムが成立したのは5500年前であり,BR1は17世紀以降,BR2は17世紀,BR3は1213世紀,BR4は910世紀に離水した浜堤と推定される.千島海溝沿岸域では500年間隔で発生した巨大地震の存在が明確になり,特にこの地の地盤は17世紀巨大地震後には12m隆起し,その後現在まで8.5mm/年の速さで沈降し続けていることがわかっている.ゆえに,各分岐砂嘴の出現には,地震性地殻変動が関わっていたのであろう.風蓮湖バリアーシステムは,オホーツク海の根室海峡に沿って西別川河口からもたらされた沿岸漂砂系によって成立している.このうち別海町側に位置する走古丹バリアースピットは西別川河口から南東方向に延びる12.5kmの分岐砂嘴をなしており,5列の浜堤(BR1-BR5)が明瞭に認識できる.我々の研究グループは,2010年以来,走古丹バリアースピットにおいて測量調査とハンドボーリング調査およびボーリング試料を用いたAMS14C年代およびテフラ年代の検討を実施してきた.特に浜堤間低地の掘削により,泥炭層中に樽前山,北海道駒ヶ岳や摩周起源の完新世テフラが多数見いだされ,概ねの地形発達史を以下のように読むことが出来た.バリアーシステムが現在の位置に成立したのは泥炭層基底の年代から5500年前と推定されるが,最初のバリアーは現在浸食されて存在しない.その後,5200年前と4000年前に大規模な海進・海退があり,その都度,一時的に干潟環境が広がった.一方,最も若い分岐砂嘴であるBR1は17世紀以降に出現し,現在活動的なバリアーである.BR2は17世紀にあった巨大地震によって離水した浜堤である可能性が被覆するテフラから理解される.BR3およびBR4の離水年代は明確ではないが,それぞれ12-13世紀と9世紀に出現したものと考えている.2003年以降,南千島海溝沿岸域では500年間隔で発生した巨大地震(Mw8.5)の存在が明確になり,特にこの地の地盤は,17世紀の巨大地震時(もしくはその後)には12m隆起し,逆に地震以降現在まで8.5mm/年の速さで沈降してきたことがわかっている.ゆえに,現在のバリアーシステムが地形的に明瞭であるのは,17世紀の巨大地震以降の急激な地震性沈降による影響が大きく,さらにそれぞれの分岐砂嘴の出現は500年間隔地震の地殻変動に規制されていた可能性がある.北海道東部,風蓮湖北東縁にある走古丹バリアースピット(HBS)は,総延長12.5kmの明瞭な分岐砂嘴である.写真判読によって5列の浜堤が認識され,それらの分岐関係によって地形発達史が解読できる.我々は,2010年以降,浜堤を横断する5本の測線(H0, H1, H3, H4, H6)を設定し,地形学的・堆積学的研究を実施してきている.これまでの成果として,各浜堤間低地の掘削により,上位から7層の完新世テフラ,Ta-a(1739年),Ko-c2(1694年), B-Tm(929年)およびMa-b(10世紀), Ta-c(2.5ka), Ma-d(4.0ka),Ma-e(5.2ka)が見いだされ,これらを時間面として,約1000年オーダーでの地形発達史を解読することが出来た.即ち,HBSが現在の位置に成立したのは,泥炭層基底の年代から5500年前と推定されるが,その下位の海進期バリアーは現在浸食されて地形としては存在しない.5200年前と4000年前に大規模な海進が繰り返し起こり,その都度,広域に干潟環境が広がった.一方,最も若い浜堤であるBR1は17世紀以降に過去のバリアースピットの根元を浸食するように最も外洋側に出現し,西別川河口から岬の先端まで明確に連続する現在活動的な浜堤である.BR2はハルタモシリ付近からBR1と分岐し西別川河口まで連続する,この浜堤は17世紀に離水した可能性が高い.BR4の発生年代は910世紀と推定できる.走古丹の集落が立地するBR3の発生年代はおそらく1213世紀と予測される.南千島海溝沿岸域では500年間隔で発生した巨大地震(Mw8.5)の存在が明確になり,特にこの地の地盤は17世紀巨大地震時(もしくはその後)には12m隆起し,逆に地震以降現在まで8.5mm/年の速さで沈降し続けてきたことがわかっている.ゆえに,少なくともBR5よりも若い分岐砂嘴の出現には,南千島海溝の地震性地殻変動が関わっていた可能性がある.風蓮湖北東縁に位置する走古丹バリアースピットには,5帯の浜堤列が認識される.我々の掘削により, 7層の完新世テフラが見いだされ,千年オーダーでの地形発達史を解読した.現在のシステムが成立したのは5500年前であり,BR1は17世紀以降,BR2は17世紀,BR3は1213世紀,BR4は910世紀に離水した浜堤と推定される.

千島海溝沿岸域では500年間隔で発生した巨大地震の存在が明確になり,特にこの地の地盤は17世紀巨大地震後には12m隆起し,その後現在まで8.5mm/年の速さで沈降し続けていることがわかっている.ゆえに,各分岐砂嘴の出現には,地震性地殻変動が関わっていたのであろう.オホーツク海に面した風蓮湖周辺には,海進期に特徴的な春国岱バリアー島,走古潭バリアースピットおよび風蓮湖ラグーンの構成する完新世バリアーシステムが認められる.しかし,この地域の海面変動に関する研究は滞っている.その一方で,2003年以降,釧路根室沿岸域では500年間隔で発生した巨大地震の存在が明確になり,巨大地震時(もしくはその後)には12m隆起し,逆に現在は8.5mm/年の速さで沈降してきたことがわかっている.一般に海進期バリアーシステムが作る堆積シークエンスは,海面上昇に伴うバリアー(島)の海→陸方向への単純な移動によって特徴づけられ,バリアー(島)の接近にともなって外洋側からの粗粒堆積物の供給が増加し上方粗粒化浅海化シークエンスを示すことになる.しかし現在の風蓮湖を見た場合,バリアーが周期的に外洋側にシフトしているように見え,単純な海退モデルの当てはめだけでは説明できない.平成23年度,初年度研究として衛星写真判読と現地踏査による地形学的検討を行った.春国岱は根室海峡に沿って北西方向から運ばれた沿岸漂砂が根室半島に遮断され堆積して出来た我が国唯一のバリアー島である.島の両端に2箇所の潮流口があり,風蓮湖ラグーンと外洋間で海水の交換があり,この潮流によって上げ潮および下げ潮三角州が生じている.春国岱は3列の浜堤列から構成され,陸側ほどその標高は12m程高く樹木に覆われて生成年代も古いと推測されていた.メインの潮流口を隔てて対岸に位置する走古潭は西別川河口から分岐砂嘴をなしており,春国岱の3列の浜堤の北方延長部を含む5列の浜堤が認識できる.風蓮湖周辺では過去に掘削調査が行われた事例が少なく,主に浜堤間低地の30地点で掘削調査を行った結果,道南や道東の火山灰層が多数発見され,繰越金を使ってAMS14C年代測定とあわせて分析を行う予定である.当初,根室市の春国岱をメインフィールドとして考えていたが,地籍の問題が発覚し,掘削調査を予定通り調査することが出来なかった.一方,別海町の走古丹は,別海町の管理する土地での調査を歓迎していただいたこともあり,予定以上の成果をあげることができた.特に昨年度は泥炭層のAMS年代測定には失敗したが,摩周火山起源の完新世テフラを記載することが出来た.これによって,走古丹湿原の地形発達史が1000年オーダーで解明できた点は大きい.2011年3月11日東日本大震災によって,産業技術総合研究所つくば研究センターも大きな被害を被り,未だ復興途中にある.科研費の採択報告も6月にずれ込んだため,道立公園内の調査申請のため根室市,別海町および北海道根室振興局の話し合いが遅れ,調査時期が大幅に遅れた.但し,10月下旬の地形や掘削調査では様々な新規発見があり,特に道南や道東起源の未知の火山灰層が複数発見された.今年度は3ヶ年計画の最終年度にあたるため,過去2年間の成果を補足し,論文発表に必要なデータセットを補填したいと考えている.今年度の現地調査は,関係者と調整の上,夏秋に1週間程度実施予定であり,野付風蓮道立自然公園内での調査許可申請を北海道根室振興局に送付済みである.また,今年度も地元の別海町郷土資料館の石渡一人学芸員や北海道教育大学釧路校の池田保夫教授と共同で,科研費研究成果の一部を別海町の町民にお知らせする報告会を行いたいと考えている.平成24年度は夏に風蓮湖の湖底掘削調査と秋に春国岱・走古丹での地中レーダー探査を行う予定である.残りの2年間で,千島海溝の地震テクトニクスによって規定され発達してきたであろう風蓮湖バリアシステムの地形学的研究を当初の予定通り行っていく所存である.昨年度実施した泥炭層のAMS14C年代測定年代測定は全て想定された年代より,若い数字が得られている.
父性発現インプリンティング遺伝子Ｐｅｇ１０の機能解明

Peg10の詳細な機能解析の目的でCRISPR/Cas9システムを用いて受精卵にDSBを導入し、変異マウスの作製を行った。その結果、およそ30%の個体で、レトロトランスポゾンなどの配列がDSB導入部位に挿入されることを発見した。他には、内在性の遺伝子配列のスプライス後の配列、すなわち、mRNAの逆転写産物が挿入していた。これらの結果より、申請者はマウス受精卵には豊富なレトロトランスポゾンの逆転写活性により多量のcDNAが存在する状態であり、受精卵におけるDSB修復の際にmicrohomologyを介して鋳型として働くことでDSB部位に挿入されることを明らかにした。研究代表者は、マウス6番染色体近位部に位置する新規父性発現インプリンティング遺伝子Peg10を報告している。驚くべきことに、Peg10はORF1およびORF1が-1フレームシフトをして翻訳されるORF1-2融合タンパクを持ち、それぞれがフグのSushi-ichiレトロトランスポゾンのGagタンパクおよびPolタンパクに高い相同性を示すレトロトランスポゾン由来の遺伝子であった。Peg10の機能解析を行うために、既に研究代表者はPeg10 KOマウスを作製し、Peg10が胎盤形成に必須な機能を持つことを明らかにしている。しかしながら、レトロトランスポゾンのGag, Polタンパクに由来するPeg10 ORF1およびORF1-2融合タンパクの機能については不明である。そこで本研究課題において、ORF1およびORF1-2融合タンパクの詳細な機能解析を行い、ORF1およびORF1-2融合タンパクに機能的差異があるのか、また、それぞれORFに存在する機能ドメインの解析を行うことを目的としている。Peg10-ORF1マウスに関しては、ORF1およびORF1-2融合タンパクを認識する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、研究代表者の予想通りにORF1だけが翻訳されているマウスであることが確認できた。申請者は、新規父性発現インプリンティング遺伝子Peg10 (Paternally Expressed Gene 10)が哺乳類で高度に保存されているレトロトランスポゾン由来の遺伝子であり、哺乳類に特異的臓器である胎盤の形成に必須な機能を持っていることを明らかにした(Fig.1;Nature Genetics 38(1):101-6 2006)。これは、レトロトランスポゾンが哺乳類の進化の過程で、哺乳類の胎盤形成に必須な機能を獲得しことを実証した初めての報告である。本研究では、レトロトランスポゾンであったPeg10がどのようなメカニズムで哺乳類の生存に必須な機能をしているのか、胎盤以外の臓器におけるPeg10の機能を解明することを目的としている。本研究成果により、レトロトランスポゾンが哺乳類の進化にいかに貢献してきたかを明らかにできる。より詳細なPeg10の機能を明らかにするために、マウス受精卵においてCRISPR/Cas9システムを用いて変異マウスを作製した際に、DNA二重鎖切断部位にレトロトランスポゾンが挿入される個体がいることを発見した。挿入されていたのは、レトロトランスポゾンの他に内在性遺伝子の逆転写産物もあったことから、マウス受精卵において、活発に遺伝子発現されるレトロトランスポゾンの逆転写活性が、DNA二重鎖切断修復に関与するという新たな機能の発見に至った。今後は、レトロトランスポゾンの挿入を伴うDNA二重鎖切断修復のメカニズムを明らかにしていく。解析に用いる遺伝子組み換えマウスの作製が終了した。申請者は、新規父性発現インプリンティング遺伝子Peg10 (Paternally Expressed Gene 10)が哺乳類で高度に保存されているレトロトランスポゾン由来の遺伝子であり、哺乳類に特異的臓器である胎盤の形成に必須な機能を持っていることを明らかにしている。本研究では、レトロトランスポゾンであったPeg10がどのようなメカニズムで哺乳類の生存に必須な機能をしているのか、胎盤以外の臓器におけるPeg10の機能を解明することを目的とし、より詳細なPeg10の機能を明らかにするために、マウス受精卵においてCRISPR/Cas9システムを用いて変異マウスを作製した。その際に、DNA二重鎖切断部位にレトロトランスポゾンが挿入される個体がいることを発見した。申請者は、CRISPR/Cas9システムを用いて変異を導入したマウス受精卵より作成したマウス個体、およびCRISPR/Cas9システムを用いて変異を導入したマウス3T3細胞のゲノムを抽出し、CRISPR/Cas9システムによるDNA二重鎖切断部位を、次世代シーケンサーを用いたアンプリコンシーケンスを行い、網羅的に解析することで、レトロトランスポゾン、マウス内在性遺伝子のmRNAおよび、使用したベクターDNA配列の断片挿入の頻度を明らかにした。また、多くの場合は、数ベースのmicrohomologyを介したdeletionであることも明らかにしている。これらの解析結果は、CRISPR/Cas9システムには、非意図配列の挿入リスクがあることを示しており、現在、論文投稿準備中である。