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高ヒ素含有銅鉱石ミネラルプロセシングのイノベーション

その結果、アルカリ条件下では最初にMg(OH)2の沈殿、その次に主にCaCO3の沈殿生成が起こり粒子表面を親水化すること、輝水鉛鉱のような層状構造を持つ鉱物の場合、エッジ部分が先に親水化されることが分かった。これら沈殿物はアルカリ領域で正のゼータ電位を示すことから、負の電位を持つ鉱物に付着し正に帯電させること、付着物量の差を利用し選択浮選の可能性があることが分かった。電気炉による加熱酸化・磁力選別による各種硫化鉱の新規分離方法の検討を行った。黄銅鉱の磁性は、約400°C以上で増大するがそれ以外の鉱物の磁性はあまり増大しないことが明らかとなった。また、シングルモード導波管を用いたマイクロ波処理実験では、一部の鉱物を除きほとんどの鉱物は電界成分で加熱されることがわかった。含砒素精鉱の加熱処理・磁力選別により黄銅鉱とヒ素鉱物の分離が可能であることが明らかになった。硫酸イオンがバイオスコロダイト生成に及ぼす影響およびバイオスコロダイト生成機構について考察を行うための一連の実験を行った。FTIR/TG-DTA/XAFS分析により、黄褐色の非晶質前駆体が2種類の沈殿により構成されることが示された。まず、1段階目のAs濃度減少では、jarosite型水酸化硫酸第二鉄(MFex(SO4)y(OH)z)および非晶質ferric arsenateが生成し、数日に渡って溶解・再結晶が行われた。その後、水酸化硫酸第二鉄の溶解およびferric arsenateの粗大化が進行し、結晶性バイオスコロダイトの生成が進んだ。水酸化硫酸第二鉄を含む前駆体の生成がバイオスコロダイト生成に大きく寄与していることが示された。鉱物表面の酸化を利用して浮選で銅鉱石と高ヒ素含有銅鉱石、輝水鉛鉱等を分離回収可能であることを明らかにした。また、浮選分離が困難な高ヒ素含有銅鉱石(主に黄銅鉱と含ヒ素硫化鉱物)については、新規に見出した加熱処理・磁力選別法により分離が可能であることを示した。加熱法としてはマイクロ波加熱も有効であった。さらに、高ヒ素含有銅鉱物をバイオ・ケミカルリーチングによりCu回収し、Asをスコロダイト化する機構を明らかにした。石炭改質液を利用した酸性鉱山廃水抑制のための硫化鉱物の安価なマイクロカプセレーション化処理法を提案し効果的であることを示した。これらの結果から最適処理フローを示した。難処理硫化鉱の新しい分離方法を見出してきていることから、今後はこれらの分離方法の実用化も含め研究を行っていく予定である。難処理硫化鉱の新しい分離法等のメカニズムを明らかにできたことから、より効率的な分離方法、条件などについて明らかにし、実用化の可能性も含めて研究を行っていく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。資源処理工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒノキ科植物由来花粉-食物アレルギー症候群原因抗原ペプチドBP14の解析

ヒノキ科植物の花粉症の原因抗原として新規に同定されたGRPファミリーペプチドBP14を対象とし、その分子レベルでのアレルギー誘発機構、特に、花粉症が原因となって誘発される花粉-食物アレルギー症候群(PFAS)との関連を明らかにすることを目的とする。BP14遺伝子のクローニング、遺伝子組換えペプチドの大量発現、抗BP14抗体の作製、BP14の立体構造解析、抗体との相互作用解析およびエピトープの同定など、蛋白質科学的手法用いて、植物界に広く存在するBP14およびそのホモログであるGRPファミリーペプチドのアレルゲンとしての振る舞いを分子レベルで明らかにする。本研究で得られるBP14に関する知見は、新規診断技術の開発や花粉症治療薬への応用にもつながる基礎研究となることが大きく期待される。本年度の研究として、イトスギ花粉のRNA-SeqによるBP14およびそのホモログの遺伝子同定、同定遺伝子の組換えタンパク質の調製の検討を進めた。その結果、植物界では初めての発見となる極めて特徴的な配列を有するイトスギ由来の新規BP14ホモログ遺伝子の同定に成功した。また、BP14およびGRPファミリーのIgE反応性と臨床的関連の検討として、モモ等、各種GRPファミリーの遺伝子組換え発現、精製を進め、その患者血清に対する反応性の検討を行った。特に、配列の異なる各種GRPファミリー組換えペプチドを活用し、患者好塩基球へのBP14刺激によるマーカー活性化の評価を行うことで、そのエピトープに関する重要な知見を得ることに成功した。イトスギ花粉のRNA-SeqによるBP14およびそのホモログの遺伝子同定の研究の成果として、植物界では初めての発見となるヒスチジンーグリシンの繰り返し配列を有する遺伝子の同定に成功した。植物界以外では、このリピート配列を持つタンパク質の存在は広く知られているが、植物界の遺伝子では初めての発見である。GRPファミリーホモログでありながら、極めて特徴的な配列を有する、この遺伝子の発見は重要な成果といえる。引き続きBP14遺伝子の探索を進めるとともに、他のGRPホモログに関して、遺伝子組換えペプチドの発現、精製、分子レベルでのキャラクタリゼーションをすすめる。本年度得られたエピトープに関する知見をもとに、変異体解析等を進める。研究の進捗に応じて研究費配分行ったためで、翌年度以降の進捗に応じて使用する計画である。
高エネルギー白色SR平行マイクロビームの細束化と素子局所スペクトル分布像の可視化

高い輝度の放射光5□mΦのマイクロビーム微小構造スペクトロスコピーを伴う結晶内部の状態を高分解能可視化する散乱トポグラフ観察が可能となる状態を達成していたが、ルーチン的にこの実験配置を再現性よく作ることは高度の熟練を要した。研究初期においてこの改善をまず行った。まず最初に、マイクロホールコリメーター(MHC)によってビームの微細化を達成し、種々のケースの計算機シミュレーションを行い、その予測を立てた。このシミレーションをもとに、マイクロビームの形成実験を成功裏に達成した。さらに、結晶評価の新たなツールと成り得るマイクロビームを用いた結晶内部のペンデルビート現象の測定の試みにより、マイクロビームから動力学的回折が生じ、波長変化に対応した積分強度のペンデルビート現象が明瞭に観察された。また散乱トポグラフィーで試料を観察した範囲において測定箇所を変えてエネルギーペンデルビート測定を行い、原子散乱因子の計測をした。次に歪を有する不完全結晶の二次構造の可視化に成功した。このような歪を有する不完全な結晶の「無歪イメージング」とその画像の統計的動力学回折理論による解釈を初めて成功した。新しい構造評価を行うことができた。この応用としてGaAs基盤上にN+イオン分子線エビ成長させたGaN膜の観察を行った。4軸ゴニオによるマッピングによる逆格子平均構造を調べた上で、マイクロビーム走査による構造イメージングを行い、GaNウルツァイトエピ膜とGaNウルツァイトージンクブレンド混晶は異なる成長をしていることが判明した。結晶の格子傾き(方位分布)と格子間隔(残留応力分布)の構造分布の可視化も成功した。観察対象としての電子素子に加えて生体の可視化に適用して、重要な成果(研究成果報告書)を得た。高い輝度の放射光の特性を利用した5μmΦのマイクロビームにより微小構造スペクトロスコピーを伴い、結晶内部の状態を高分解能可視化する散乱トポグラフ観察が可能となった。今年度は、3カ年計画初年度で、<マイクロホールコリメーター(MHC)のシミレーション>、<マイクロホールコリメーターの製作>、<SPring-8実験(SP-8-BL28ハッチにおいて、研究室で設計した21軸マルチチャンネルイメージンゴニオメータおよび関係の付属装置一式を使用)>、および、<単結晶素子の育成>を実施した。まず最初に、MHCによってビームの微細化を達成できるか、種々のケースの計算機シミュレーションを行い、その予測を立てた。さらに、結晶評価の新たなツールと成り得るマイクロビームを用いた結晶内部のペンデルビート現象の測定の試みを行った。動力学的回折理論によって導出される理論式より、試料の厚さを一定とし波長を変化させることで理論式中のWaller積分項が変化しペンデルビートを与える。これは白色SRマイクロビームを用い平板結晶と半導体検出器の位置関係を、それぞれブラッグ回折角θBとその二倍の2θBの状態のまま連続的に変化させることで測定できた。測定の結果、直径5μmのマイクロビームから動力学的回折が生じ、波長変化に対応した積分強度のペンデルビート現象が明瞭に観察された。ついで、ペンデルビートの各測定値を比較した結果、結晶の観察範囲において結晶構造の乱れの少ない状態であることを見出した。本研究では、結晶中の動力学回折共鳴現象をエネルギー分散測定を行い、完全結晶による原子散乱因子の測定ならびに不完全結晶の二次構造の可視化を行う。結晶中の波動場の干渉によるエネルギーペンデルビート法の開発と不可視情報の可視化技術の開発を目的とした。

可視化はマイクロビーム走査スペクトロ散乱イメージングに基づく。X線の回折条件を満たす条件に置くと、その結晶中で、干渉の結果、波動場が形成されペンデルビート現象が起こる。これは波動場の干渉であるため、結晶中の歪場に非常に敏感であることが考えられ、結晶性の評価として用いることができる。また、結晶の完全性が高い場合にはペンデルビートから原子散乱因子の測定が可能である。回折ピークの積分強度を波長軸にプロットしエネルギーペンデルビートを得る。この局所スペクトルのマイクロビーム走査によりエネルギー分散の散乱トポグラフを取得する。完全結晶のケースでは、測定位置を変えて得られたペンデルビートの比較の結果、極大極小における波長のずれが0.1%程度以内であったことから散乱トポグラフとペンデルビートの両面から結晶性が良いととが確認できた。測定したペンデルビートの極大極小位置の波長を理論式に代入して構造因子を求め、原子散乱因子を計算した結果、8.548±0.031となった。銅拡散した試料のケースでは、結晶中に局所変異が統計的に分布していると仮定して展開された統計的動力学回折理論を導入した。その結果、二次消衰によるエネルギーペンデルビートの傾向と一致した。以上の通り、我々が独自の開発をしたHEWPMマイクロビームを用いて、動力学的回折理論に基づいたエネルギーペンデルビート現象を確認し、原子散乱因子を算出することができた。また、欠陥近傍の高分解能エネルギーペンデルビート法により、通常のX線トポグラフィではこれまで得られなかった構造評価を行うことができた。本科研費研究の今年度の研究では、白色多波長マイクロビームの形成とその局所スペクトロスコピーおよび局所ディフラクトメトリから得られる構造分布情報の可視化を第一の目的としている。更にこれまで可視化が行われていなかった格子定数-格子結晶方位の分布の分布構造を、上記の方法の発展的手法によって観察をすることも主要なねらいとしている。第一の観察対象としての電子素子に加えて生体の可視化に適用して、重要な成果(研究成果報告書)を得た。第一の研究はGaAs基盤上にN+イオン分子線エピタクシャル(以下、エピ)成長させたGaN膜の観察を行った。4軸ゴニオによるマッピングによる逆格子平均構造を調べた上で、マイクロビーム走査による構造イメージング(散乱トポグラフィ)を行い、次の結果を得た;GaNウルツァイトエピ膜は[-1-11]方向に成長し、GaNウルツァイトージンクブレンド混晶は表面法線方向に収縮、表面内に伸張する。その程度はウルツァイトの方がジンクブレンドより大きいことも判明した。マイクロビームにより構造分布可視化では、ウルツァイトとジンクブレンドの分布は大きく異なること、それぞれの分布は成長条件に依存することがわかった。第二の研究は、結晶の格子傾き(方位分布)と格子間隔(残留応力分布)の構造分布の可視化である。この研究ではテスティングマテリアルとしてSi-Fe単結晶を用いた。
ゲノムに潜む鎮痛ペプチド・エンドモルフィンは酸化ストレスのRNA編集で誕生する

エンドモルフィンは、アミノ酸4つからなる神経ペプチドである。モルヒネを凌ぐ強力な鎮痛作用があり、痒みとの関連も非常に注目されている。しかし、未だにエンドモルフィン遺伝子は不明のままなのである。近年では、ゲノムから短いペプチドを見出す難しさが認識され、ペプチドを網羅的に質量分析するペプチドーム解析にも注目が集まりつつある。こうしたなか、次世代シークエンサーを用いた網羅的解析とRNA編集を考慮した情報処理技術の両面からの探索を試みた。結果としてエンドモルフィン遺伝子単離には至らなかった。しかし、エンドモルフィン様ペプチド遺伝子を見出し、これに基づいた合成ペプチドはオピオイド受容体と弱く結合した。1997年にエンドモルフィンという神経ペプチドが脳から単離された。これには強力な鎮痛作用があり、最近では、アトピー患者を苦しめる痒(かゆ)みとの関連も非常に注目されている。しかし、意外なことに、未だにエンドモルフィン遺伝子は不明のままなのである。こうしたなか、申請者は最近、エンドモルフィン類似の前駆体遺伝子の存在に気がついた。これより「ゲノム中に遺伝子が見つからないのは、酸化ストレスなど特殊条件の下で、mRNAが転写後の修飾、すなわちRNA編集を受けてエンドモルフィン遺伝子が完成するからだ」と思い至った。そこでこの証明に挑戦している。さらに、神経ペプチド遺伝子の特徴として未同定の神経ペプチドも同時にコードされる可能性が非常に高く、本研究の新規鎮痛薬および抗痒薬開発に対する影響は計り知れない。本年度は、採択後すぐに次世代シークエンサーを用いた網羅的塩基配列解析のために、申請計画通りに「ゲノム支援」の「大規模ゲノム情報生産及び研究リソース構築支援活動」に応募した。この研究支援活動には、科研費の採択が応募条件になっている。応募の結果、無事に採択された。そこで、マウス新生仔の全脳よりmRNAを抽出し、網羅的RNAシークエンスに供出した。また、エンドモルフィン様ペプチドをコードしていると考えられた遺伝子の断片をPCRにより増幅しクローンの取得に成功した。このペプチドを化学合成し、オピオイド受容体に対する結合試験を実施した。このペプチドは結合能が低いものの、オピオイド受容体に結合することが確認された。遺伝子構造の全容を解明するために、RACE法によりこのペプチド遺伝子のクローニングも試みた。現在のところ、RACE法によるクローンの取得には至っていない。現在、引き続きRACE法による全長のクローニングを実施中である。強力な鎮痛作用がある神経ペプチド・エンドモルフィンが脳から単離された。これは今からおよそ20年も遡る1997年のことであった。最近では、エンドモルフィンとアトピー患者を苦しめる痒(かゆ)みとの関連も非常に注目されている。しかし、意外なことに、ペプチドが単離されたにもかかわらず、未だにエンドモルフィン遺伝子は不明のままなのである。こうしたなか、申請者は「ゲノム中に遺伝子が見つからないのは、酸化ストレスなど特殊条件の下で、mRNAが転写後の修飾、すなわちRNA編集を受けてエンドモルフィン遺伝子が完成するからだ」と思い至った。第二年度(最終年度)となる本年度は、採択後すぐに申請した次世代シークエンサーを用いた網羅的塩基配列解析「ゲノム支援」の「大規模ゲノム情報生産及び研究リソース構築支援活動」で採択された、網羅的RNAシークエンスについて実験試料のシークエンス結果を送付頂き、解析した。現在のところ、標的配列をもつ神経ペプチド遺伝子の発見には至っていない。しかし、初年度より継続していたエンドモルフィン様ペプチドをコードしていると考えられた遺伝子の断片をPCRにより増幅し、クローンの取得に成功した。このペプチドの配列はエンドモルフィンとは異なるものであった。だが、クローンの取得には至らなかった。一方で、このペプチドを化学合成し、オピオイド受容体に対する結合試験を実施した。このペプチドは結合能が低いものの、初年度同様にオピオイド受容体に結合することが確認された。2年計画の初年度である本課題研究は、概ね計画通り順調に進展している。今年度は次世代シークエンサーを用いた網羅的塩基配列解析のために、申請計画通りに「ゲノム支援」の「大規模ゲノム情報生産及び研究リソース構築支援活動」に応募した。これは、文部科学省科学研究費新学術領域研究(研究領域提案型)『生命科学系3分野支援活動』が終了後、科学技術学術審議会で継続した活動が認められている研究支援活動で、科研費の採択が応募条件になっている。そこで早速応募した結果、無事に採択された。計画ではラット脳を用いる予定であったが、実験の簡便性からマウス新生仔の全脳をシークエンスに用いた。

これに関しては現在データの送付を待っている状況である。また、培養細胞を用いた酸化ストレス暴露で起こるRNA編集の解析を予定していた。これについては培養細胞をラット脳神経細胞PC12を用いる予定であったが、神経幹細胞分化のモデル系としてよく知られているヒト多能性胎生期癌NTERA-2 clone D1も用いることにし、現在、その培養など準備を行っている。また、エンドモルフィン様ペプチドをコードしていると考えられた遺伝子の断片をPCRにより増幅しクローンの取得に成功した。このペプチドを化学合成し、オピオイド受容体に対する結合試験を実施した。このペプチドは結合能が低いものの、オピオイド受容体に結合することが確認された。遺伝子構造の全容を解明するために、RACE法によりこのペプチド遺伝子のクローニングも試みた。現在のところ、RACE法によるクローンの取得には至っていない。このように本研究は順調に推移しており、現在のところ特に問題点はない。生物化学今後は、まず平成26年度にシークエンスが終了した塩基配列解析結果のゲノム上へのマッピングを行う。また、解析の際には神経ペプチドの前駆体に特有の、シグナル配列を持つか否かに留意する。こうした解析により、得られた配列が神経ペプチドに由来するかを同定する。これらを通じて、最終的にエンドモルフィン前駆体遺伝子であるか否かを同定する。エンドモルフィンをはじめとするペプチドは、一つの前駆体上に複数コードされている可能性がある。これにも留意し、新規ペプチドがあるかを念頭に入れて解析を進める。また、RACE法をもちいて全長の配列を3'-RACEおよび5'-RACE法により確定する。これまでの経験に基づき、完全長cDNAを取得しやすいGeneRacer法(invitrogen)を用いる。mRNAの5'側に存在するキャップ構造を利用した、アダプターの付加を実施する。こうして得られた新規ペプチド遺伝子にコードされる神経ペプチドを化学合成し、オピオイド受容体に対する結合試験および活性化試験を実施する。塩基配列の解析結果のゲノム上へのマッピングを継続すると共に、前年度に得られたゲノム上のマッピングに基づき、神経ペプチドの存在パターンを類別化し、新規な神経ペプチド予測法の開発を行う。さらに、得られたアルゴリズムで、他の神経ペプチドが予測できるか精査する。さらに、平成26年度に購入したト多能性胎生期癌NTERA-2 clone D1を用いて、ストレスの暴露を受けてから転写翻訳系への影響が速いRNA酸化損傷などの影響が起きるかを解析する。こうして、最終的には今なお、発見されていないエンドモルフィン遺伝子の発見に迫る。本研究は順調に計画通りに進んだ。
肺レセプターイメージングの薬物投与設計への応用(動物用ポジトロンCTを用いた基礎的検討)

ラジオアイソトープを用いた肺レセプタイメージングの手法を開発し、喘息病態の解明や薬剤投与設計が可能な情報が得られる画像解析法を研究することを目的とし、以下の実験を行い成果を得た。1.放射性トレーサの肺摂取率の定量的解析に関する実験交感神経機能分布を反映する放射性ヨードMIBGの肺内摂取を定量する手法について、モルモットを用いた採血法による定量を行い、MIBGの肺内摂取率が約30%であり、かつ容量依存性であることを確認した。さらに家兎を対象としてシンチグラフィ法により採血を行わないで摂取率を求めるコンピュータ解析ソフトを開発した。その結果もMIBGの肺内摂取率は約30%であり、本法が臨床的に使用できる可能性が示唆された。2.放射性トレーサのエアロゾル吸入法による研究放射性ヨードMIBGをエアロゾル吸入し、シンチグラフィ法による肺内薬物動態を解析した。その結果、薬物の投与経路により薬剤に反応するレセプタの局在が異なる可能性が示唆された。3.動物用ポジトロンCTによる研究ヒスタミンレセプタのリガンドであるC-11ピリラミンの標識合成を行い、そのエアロゾル吸入後の肺気道系イメージングを行った。標識リガンドの品質管理が今後の課題として残された。モルモットを対象として、交感神経分布のイメージングが行える^<131>I MIBGと血管内トレーサである^<99m>Tc HSAと同時に静脈内投与し、各々の動脈中の放射能からMIBG肺摂取率を算出する実験系を作成した。平均肺摂取率は約20-30%であった。このMIBG肺摂率は、投与するMIBGの容量依存性があることが確認された。また、ウサギを対象にして、^<123>I MIBGと^<99m>Tc HSAの同時投与を行い、採血せずにガンマカメラで撮像した肺イメージデータのみから、デコンボリューション法を基礎とした数値解析的手法でMIBG肺摂取率を測定するソフトを構築した。この手法で求めたMIBG肺摂取率も約30%前後であり、比較的採血法に近い結果が得られた。さらに経気道投与の薬剤分布をもとめるため、モルモットに気管内挿管して動物用超音波ネブライザで作成したエアロゾルを吸入し、イメージングを行う手法を確立した。ポジトロン標識リガンドは基礎的検討の結果、H1レセプタである^<11>Cピララミンを選択し、コールドの標識実験を行った。
沈み込み帯の不均質構造を考慮した精密地震解析環境の構築と応用

1)遠地実体波波形計算プログラムTakenaka & Kennet(1996)による2.5次元平面波問題の新しい効率的な定式化を用いて、彼らと共同で遠地実体波波形を計算するプログラムを開発した。従来の方法に比べて計算時間を大幅に(数十分の1)短縮でき、本研究だけではなく様々な分野への応用が期待できる。2)近地地震波波形計算プログラム境界条件(流体・弾性体境界)を満足する格子点配置やその精度に関する問題を一つ一つ検証し、それらを解決したプログラムを開発して、実際の観測波形をよく再現して実用性を実証した。3)近地地震波モーメントテンソルインバージョン相反定理に基づく波形計算方法を導入した。この方法は、多数の震源に対する応答を一度に計算できる、震源の発震機構も任意に与えることができる、などの特徴があるため今後の地震解析では標準的なアプローチになると考えられる。本研究では、このアプローチの実用性を実証するために、日本海溝で発生した浅い地震の試験的なモーメントテンソルインバージョンを行ない、ほぼ妥当な解を得ることができた。4)遠地実体波解析プログラム発震機構・震源位置解析プログラムと地震モーメント分布推定をするプログラムを作成した。後者では、未知数である断層面上のモーメント分布が負にならないような非線形の逆問題を新たに定式化した。応用例として、津波波形からは非常に浅い場所に断層運動が集中していたと推定されている1992年ニカラグア津波地震を解析したところ、地震波で調べると深い場所にもかなりの断層運動があったことが示唆された。5)並列計算機環境の構築マルチプロセッサ計算機を導入して、UNIX OSの標準的なプロセス間通信機構を用いた並列化を近地地震波計算のプログラムに施した。CPUが2個の場合にCPUが1個の場合よりも1.5倍ほど高速化できた。まだ充分な高速化(並列化)には至っておらず、今後の課題である。今年度の主なテーマは、地震波波形計算プログラムの開発・地震波解析プログラムの開発であった。・遠地実体波理論波形計算プログラムの開発本年度は、大きな前進を見ることができた。Takenaka & Kennet(1996)によって、2次元媒質に3次元的な平面波が入射する問題を波数積分を用いずに時間・空間領域で計算する定式化が提唱され、本年度は彼らと共同で遠地実体波波形を計算する新たな実際のプログラムの開発に着手し、ほぼ完成させることができた。これは、波数積分を必要としないために従来の数十分の一の計算量で遠地実体波波形を計算することができる画期的なプログラムであると言える。・近地地震波形計算プログラムの開発この問題では点震源を扱うため2.5次元の問題であっても波動場が単一の平面波だけでは表現できない。そのため波数積分が必要となる。本研究では、代表者が開発した反射・透過行列法による波形計算の結果と、差分法による結果とを比較することにより、差分法における境界条件(流体・弾性体境界)を満足する格子点配置やその精度に関する問題を解決できた。そして、2.5次元の地震波伝播を数値計算する差分法プログラムをほぼ完成できた。このプログラムを用いたシミュレーションによって、日本海溝で発生した実際の浅い地震による観測地震波形(周期10秒-200秒、震央距離約200km)を非常によく再現することができ、本研究で開発したプログラムの実用性を実証することができた。・地震波解析プログラムの開発

新たに開発した遠地実体波波形計算プログラムに合わせて、解析プログラムの変更作業にも着手した。遠地実体波波形による発振機構・震源位置解析プログラムは基本的な変更をほぼ終えたが、震源関数の表現方法などにまだ拡張を必要とする点が残っており、その他のプログラムと共に引続き開発を続ける。・計算機環境の構築今年度は、既存の計算機を、部品の更新によって512MBytesという大容量の記憶領域を持つマルチプロセッサ計算機にアップグレードし、マルチプロセッサ用OSの導入作業やプログラム開発環境の構築、性能評価等を行なった。また、もう一つのテーマであった構造データの設定までには至らず、継続して研究を行なう予定である。今年度は、地震解析用プログラムとして、(1)近地地震波計算・モーメントテンソルインバージョンプログラム、(2)遠地実体波計算・断層運動解析プログラムの作成と実際のデータによる解析を試みた。(1)については、前年度に作成した近地地震波計算プログラムを更に発展させ、相反定理に基づく波形計算方法を導入した。この方法では、観測点に実体力を与え、震源での歪み場を計算し、この歪み場を相反関係によって観測点での変位波形に変換する。この定式化では、多数の震源に対する応答を一度に計算できる。また、震源の発震機構も任意に与えることができる。震源に等価な力を与えて計算する順計算ではただ1つの震源に対する応答しか計算できない。通常、地震は様々な場所で発生し発震機構も一定ではないので、この方法は地震解析の上で有用である。本研究では、海水層などの沈み込み帯の不均質構造があっても安定かつ良い精度で相反定理にもとづく波形計算が可能であることを示し、日本海溝で発生した浅い地震のモーメントテンソルインバージョンを行なってほぼ妥当な解が得られることを見出した。これらは沈み込み帯の地震の解析や即時発震機構決定などに役立つと期待される。(2)では、前年度に作成した新しい効率的な計算方法に基づいて断層運動(地震モーメント解放量分布)推定をするプログラムなどを作成した。応用例として1992年ニカラグア津波地震の解析を行った。津波波形からは非常に浅い場所に断層運動が集中していたことが推定されているが、本方法では深い場所にもかなりの断層運動があったことが示唆された。しかし、まだ検討すべき点が残されており、余震分布の再決定などの方法を試みて解析を継続する予定である。なお、これらの結果は国際会議(American Geophysical Union)や国内の学会などで発表した。
軟骨内骨化における肝細胞増殖因子の生理的役割の解明

肝細胞増殖因子[HGF]は、種々の上皮細胞や血管内皮細胞、血液幹細胞などの間葉系細胞の増殖および分化に関わっている。これまで我々は、(1)HGF遺伝子がマウス胚芽において軟骨形成部位周辺に発現すること、(2)HGFが培養関節軟骨細胞の増殖、運動性、プロテオグリカン合成を促進することを見いだした。これらの知見は、骨格形成機構におけるHGFの重要性を強く示唆している。そこで本研究では、軟骨内骨化におけるHGFの生理的役割の解明するために、(1)4週齢のウサギ肋軟骨成長より成長軟骨細胞を分離して、成長軟骨細胞の増殖、成熟、肥大化および石灰化の各分化段階におけるHGFの作用、ならびに(2)in vivoの軟骨組織におけるHGF及びHGF受容体の発現を調べた。HGFは、成長軟骨細胞の増殖および基質合成を若干促進した。一方、軟骨細胞の肥大化(最終分化)を抑制した。このことは、形態的にも、肥大軟骨細胞のマーカーであるtype X coll agenおよびアルカリフォスファターゼ発現抑制としても観察された。さらに、成長軟骨細胞の石灰化誘導を抑制した。しかし、この抑制効果は一過性で、HGF存在下でも成長軟骨細胞は、ゆるやかに最終分化した。また、すでに肥大化した軟骨細胞に対してHGFは、細胞の分化形質に影響を与えず、その後の石灰化も抑制しなかった。In situ hybridizationおよび免疫組織学的検索よりHGFは肥大軟骨細胞層に局在することが判明した。以上の結果よりHGFは、肥大軟骨細胞で産生されて成熟軟骨細胞に作用する、成長軟骨細胞の最終分化制御因子であることが示唆された。軟骨内骨化は、多様な因子群によって複雑な制御を受けており、その制御機構の全容は、いまだ不明である。本研究は、いままで知られていなかった、軟骨内骨化におけるHGFの生理的役割を明らかにするために、in vitroおよびin vivoの両面からHGFに反応する軟骨細胞の存在部位、その分化段階および特定の場でのHGFの作用機序の解明を試みた。ラット胎仔(胎生17-20日)の四肢の筋組織より未分化間葉系細胞を分離して、単層高密度培養および軟寒天培養を行なった。一部の培養系にHGFを添加して軟骨形成に対する作用を検討したところ、HGFはBMP-2比べてに弱いものの軟骨形成誘導作用を持つことが判明した。また、成長軟骨細胞の高密度培養系にHGFを添加して軟骨細胞の分化機能に及ぼす作用を検討したところ、HGFは成長軟骨細胞の増殖および基質合成にはあまり著明な作用を示さなかったが、アルカリフォスファターゼ、X型コラーゲンなどの最終分化マーカーの発現を強力に抑制することがわかった。一方、4週齢ラット肋軟骨、徑骨骨端の凍結切片を作成して抗ラットHGF抗体を用いて免疫組織化学的検索を行ったところ、HGFは肥大軟骨細胞層に多量に存在することがわかった。以上の知見の一部は、平成7年度日本骨代謝学会において発表した。これまで我々は、(1)HGF遺伝子がマウス肢芽において軟骨形成部位周辺に発現すること、(2)HGFが培養関節軟骨細胞の増殖、運動性、プロテオグリカン合成を促進することを見いだした。そこで本研究では、軟骨内骨化におけるHGFの生理的役割の解明するために、(1)4週齢のウサギ肋軟骨成長板より成長軟骨細胞を分離して、成長軟骨細胞の増殖、成熟、肥大化および石灰化の各分化階段におけるHGFの作用、ならびに(2)in vivoの軟骨組織におけるHGF及びHGF受容体の発現を調べた。

このことは、形態的にも、肥大軟骨細胞のマーカーであるtype X collagenおよびアルカリフォスファターゼ発現抑制としても観察された。さらに、成長軟骨細胞の石灰化誘導を抑制した。しかし、この抑制効果は一過性で、HGF存在下でも成長軟骨細胞は、ゆるやかに最終分化した。また、すでに肥大化した軟骨細胞に対してHGFは、細胞の分化形質に影響を与えず、その後の石灰化も抑制しなかった。In situ hybridizationおよび免疫組織学的検索よりHGFは肥大軟骨細胞層に局在することが判明した。以上の結果よりHGFは、肥大軟骨細胞で産生されて成熟軟骨細胞に作用する、成長軟骨細胞の最終分化制御因子であることが示唆された。
シェーグレン症候群発症の分子機構と制御

シェーグレン症候群(SS)発症の分子機構を明らかにし、分子をターゲットとした新規治療戦略を開発する事を目的とした。本研究では、唾液分泌に重要な機能を有するムスカリン作働性アセチルコリン受容体3(M3R)を分子標的として、以下の研究成果を明らかにした。1)SSの約50%においてM3Rに対する自己抗体とT細胞が存在した。2)M3RのB細胞エピトープは複数あった。3)細胞外第二ドメインに対する抗M3R抗体は機能抑制する病因抗体であった。4)SS様の唾液腺炎(M3Rimmunized sialadnitis, MIS)を樹立した。5)MISの発症にはIFN-γおよびIL-17産生CD3+T細胞が必須である。6)MISの主要T細胞エピトープはM3R細胞外第一ドメインであり、単独免疫によりMISを誘導できた。シェーグレン症候群(SS)は原因不明の自己免疫疾患である。本研究では、その発症の分子機構を明らかにし、分子をターゲットとした新規治療戦略を開発する事を目的とする。具体的には、唾液腺特異的に発現し唾液分泌に重要な機能を有するムスカリン作働性アセチルコリン受容体3(M3R)に焦点をしぼり、1)SS患者におけるM3Rに対する免疫応答解析、2)抗M3R抗体の対応B細胞エピトープ解析、3)抗M3R抗体のB細胞エピトープと機能との関連解析、4)M3R免疫唾液腺炎モデルマウスの作成、5)M3RのT細胞エピトープおよびアナログペプチド(APL)の選定、6)4)で樹立したモデルマウスにおいてAPLを用いた唾液腺炎の抗原特異的な治療戦略の確立、などをめざした。結果として、1)M3R分子のN領域、細胞外第一、第二、第三ドメインに対する自己抗体がSSの約50%に検出された。2)M3R分子上の複数のB細胞エピトープが存在すること、一症例において1個4個のB細胞エピトープを認識する抗M3R抗体が存在することを明らかにした。3)細胞外第二ドメインに対する抗M3R抗体はCa influxを抑制した。一方、N領域や細胞外第一ドメインに対する抗体はCa influxを促進することが判明した。4)M3Rペプチドを免疫したM3R-/-マウスの脾細胞をRag1-/-マウスに細胞移入することにより自己免疫性唾液腺炎の発症を誘導することができた。唾液腺炎発症にはCD3+T細胞が必須であることも明らかにした。以上の研究成果から、平成22年度は、in vitroにおいてM3RのAPLの選定、さらにin vivoにおいてAPLを用いたM3R免疫唾液腺炎の抗原特異的制御戦略の確立を目指す。シェーグレン症候群(SS)患者血清中にムスカリン作働性アセチルコリン受容体3(M3R)に対する自己抗体が存在すること、末梢血単核球にM3R反応性CD4+T細胞が存在することを明らかにしてきた。本研究では、M3R分子に対する免疫応答が自己免疫性唾液腺炎発症を誘導するか否かを検討する事を目的とした。方法として、M3R-/-マウスにM3Rペプチドを免疫しその脾細胞をRag-1-/-マウスに経静脈的に細胞移入した。さらに、T細胞にRORγt分子を過剰発現するRORγtトランスジェニックマウスを用いて、唾液腺炎発症機構について解析した。その結果、以下の事実を明らかにしてきた。1)M3R-/-→Rag-1-/-マウスにおいて唾液腺炎が認められた。2)H3R反応性T細胞により唾液腺炎が誘導された。3)唾液腺にINF-γおよびIL-17発現が認められ、M3R反応性T細胞からIFN-γおよびIL-17が有意に産生された。4)M3R-/-xIFN-γ-/-→Rag-1-/-マウスでは唾液腺炎スコアが有意に低下していた。一方、M3R反応性T細胞からのIL-17は有意に増加していた。5)RORγtトランスジェニックマウスにおいて、唾液腺炎と涙腺炎が自然発症し、IL-17産生M3R反応性T細胞、抗M3R抗体が検出された。以上の研究成果から、M3Rを認識するT細胞がSS類似の自己免疫性唾液腺炎発症に重要であることが判明した。今後、M3RのT細胞エピトープを決定しアナログペプチドによる自己免疫性唾液腺炎の抗原特異的制御法を開発する。

その発症の分子機構を明らかにし、分子をターゲットとした新規治療戦略を開発する事を目的とする。具体的には、唾液腺特異的に発現し唾液分泌に重要な機能を有するムスカリン作働性アセチルコリン受容体3(M3R)を自己抗原候補として以下の研究成果を明らかにしてきた。2種類のマウスモノクローナル抗M3R細胞外第二ドメイン抗体について、HSG唾液腺上皮細胞株を用いたin vitroで機能解析を行った。その結果、細胞内Ca influx濃度の有意な低下を誘導した。このことから、抗M3R細胞外第二ドメイン抗体が唾液分泌を抑制する病因抗体であることが明らかにされた。3.MISマウスにおける抗原特異的治療法の確立M3RのN領域、細胞外第一ドメイン、第二ドメイン、第三ドメインを構成する部位に対する合成ペプチドを作成し、M3R反応性T細胞のT細胞エピトープをin vitroで解析した。その結果、M3R細胞外第一ドメインが主要なT細胞エピトープであることが判明した。さらに、細胞外第一ドメイン単独でM3RKOマウスに免疫することによりMISの誘導に成功した。以上より、MIS発症におけるT細胞エピトープはM3R細胞外第一ドメインであることが判明した。現在、APLの選定を進めている。
MXRを過剰発現する多剤耐性ヒト癌細胞における耐性機構の解析

(1)MXRのアミノ酸配列をもとに15塩基の合成オリゴペプチドを作成,これを免疫原としてウサギ抗血清を調整した。MXRを発現しているdoxorubicin耐性ヒト乳癌細胞株(MCF-7 AdVp3000)とその親細胞株(MCF-7)についてイムノブロット法により解析したところ,MCF-7 AdVp3000において約70kDaのバンドが認められ,MXRを認識していると考えられた。免疫染色ではMCF-7 AdVp3000細胞において,主に細胞膜が染色された。MXRは細胞膜に存在して,何らかの輸送機構に関与していると考えられた。(2)20例の腎細胞癌組織におけるMXRの発現をPCR法により調べた。発現レベルは低かったが,正常腎組織より発現が亢進しており,腎細胞癌における薬剤耐性への関与が示唆された。(3)Flow cytometryによる解析で,MCF-7 AdVp3000細胞においてP-gpの基質であるrhodamine 123のATP依存性の細胞外排出を認めた。しかし,P-gp阻害剤であるPSC833はこの排出を阻害しなかった。また,MRPの基質であるcalceinの排出は認められなかった。MXRはP-gpやMRPとは異なる輸送スペクトルを有すると考えられた。(4)MCF-7 AdVp3000細胞から調整した膜小胞はATP依存性にleukotrien C4(LTC4)を小胞内に取り込んだ。この取り込みはMXRの阻害剤と考えられているnovobiocinにより阻害された。MRPの基質であるestradiol-17-β-D-glucuronideの取り込みは認められず,また,GS-platinumはLTC4の取り込みを阻害しなかった。MXRはMRPやCDDP耐性細胞に発現するGS-Xポンプとは異なる基質特異性をもったGS-Xポンプである可能性が示唆された。MXRを発現しているdoxorubicin耐性ヒト乳癌細胞株(MCF7 AdVp3000)とその親細胞株(MCF7)についてイムノブロット法により解析したところ,MCF7 AdVp3000において約70kDaのバンドが認められ,MXRを認識していると考えられた。免疫染色ではMCF 7AdVp3000細胞において,主に細胞膜が染色された。MXRは細胞膜に存在して,何らかの輸送機構に関与している可能性が考えられた。今後,腎癌,移行上皮癌,前立腺癌などの臨床検体についてMXRの発現を解析し,病態,治療抵抗性との関連を検討していく。(2)Flow cytometryによる解析で,MCF7 AdVp3000細胞においてATP依存性のrhodamine123の細胞外排出を認めた。Rhodamine123はP糖蛋白質の基質であるが,P糖蛋白質阻害剤であるPSC833はrhodamine123の排出を阻害しなかった。また,MRPの基質であるcalceinの排出は認められなかったことから,MXRはP糖蛋白質やMRPとは異なる輸送スペクトルを有すると考えられた。(3)MCF7 AdVp3000細胞から膜小胞を調整し,小胞内への薬剤輸送について解析したところ,ATP依存性のleukotrien C4の取り込みがみられた。しかし,MRPの基質であるestradiol-17-β-D-glucuronideの取り込みは認められなかった。

また,GS-platinumはleukotrien C4の取り込みを阻害しなかったことから,MXRはMRPやCDDP耐性細胞に発現するGS-Xポンプとは異なる基質特異性をもったGS-Xポンプである可能性が示唆された。今後,(2),(3)の手法を用いてMXRの薬剤輸送を阻害する方法を開発していく。(1)MXRのアミノ酸配列をもとに15塩基の合成オリゴペプチドを作成,これを免疫原としてウサギ抗血清を調整した。MXRを発現しているdoxorubicin耐性ヒト乳癌細胞株(MCF7 AdVp3000)とその親細胞株(MCF7)についてイムノブロット法により解析したところ,MCF7 AdVp3000において約70kDaのバンドが認められ,MXRを認識していると考えられた。免疫染色ではMCF7 AdVp3000細胞において,主に細胞膜が染色された。MXRは細胞膜に存在して,何らかの輸送機構に関与していると考えられた。(2)20例の腎細胞癌組織におけるMXRの発現をPCR法により調べた。発現レベルは低かったが,正常腎組織より発現が亢進しており,腎細胞癌における薬剤耐性への関与が示唆された。(3)Flow cytometryによる解析で,MCF7 Advp3600細胞においてP-gpの基質であるrhodamine 123のATP依存性の細胞外排出を認めた。しかし,P-gp阻害剤であるPSC833はこの排出を阻害しなかった。また,MRPの基質であるcalceinの排出は認められなかった。MXRはP-gpやMRPとは異なる輸送スペクトルを有すると考えられた。(4)MCF7 AdVp3000細胞から調整した膜小胞はATP依存性にleukotrien C4(LTC4)を小胞内に取り込んだ。この取り込みはMXRの阻害剤と考えられているnovobiocinにより阻害された。MRPの基質であるestradiol-17-β-D-glucuronideの取り込みは認められず,また,GS-platinumはLTC4の取り込みを阻害しなかった。MXRはMRPやCDDP耐性細胞に発現するGS-Xポンプとは異なる基質特異性をもったGS-Xポンプである可能性が示唆された。
油性造影剤の比重変化が塞栓術時の生体内における造影剤分布に与える影響に関する研究

生体外研究の結果、血液と等比重となるように調整された油性造影剤で作成した懸濁液は、高比重な油性造影剤で作成した懸濁液と比較して粘性度が低く、肝動脈塞栓術や動脈内化学療法において有効な素材となりえる可能性が示唆された。また生体内研究の結果、等比重油性造影剤は、従来の高比重油性造影剤と比較して、動脈内に注入されたのちの組織分布が重力の影響を受けにくく、より均一に分布する可能性が示唆された。まず基準となる油性造影剤の粘性度データをとるため、血液と等比重となるように調整した油性造影剤と血液より低比重となるように調整した油性造影剤を作成し、それぞれ外気温を模した24度、体内温度を模した37度に設定した際の粘性度を測定した。また肝動脈化学塞栓術で使用する方法と同様の条件になるよう、抗癌剤(エピルビシン)を水溶性造影剤と生理食塩水の混合液に溶解し、作成した各油性造影剤と同じ比重となるように調整し、油性造影剤と抗癌剤水溶液との懸濁液を作成。油性造影剤と抗癌剤水溶液との混合比率を様々に変化させた際、また油性造影剤を等、低、高比重に変化させた際の粘性度の変化、懸濁液の安定性、X線視認性をそれぞれ評価した。この結果により、今回新たに作成した等比重、低比重油性造影剤の持つ特徴、また抗癌剤水溶液との間で作成した懸濁液の持つ流体力学的性質、放射線透過性に関する貴重な所見を得ることができた。続いて作成した特殊な油性造影剤の性質を評価するため、ブタの肝動脈を用いた実験を行った。来年度以降に複数のブタを使用した本格的な動物実験を行う予定であり、そのための準備として油性造影剤の組織内分布を正しく評価するための実験系の摸索を行った。具体的にはブタ肝動脈起始部にカテーテルを留置し、造影Cone-Bean CTを撮影して肝臓内の腹側亜区域・背側亜区域へ分岐する等しい太さの動脈分岐を二ヶ所同定した後、片方から高比重な懸濁液を、もう片方から等比重の懸濁液を多段階に分けて少量ずつ注入し、CTを撮影して油性造影剤の分布を確認した。また液状塞栓物質であるn-butyl 2-cyanoacrylate (NBCA)との混合溶液を低比重なものと高比重なものの二種類作成し、左右の腎動脈にそれぞれ別に注入してCTを撮影し、塞栓分布の評価を行った。いずれも良好な結果が得られ、来年度以降の実験の有効材料となった。油性造影剤(リピオドール)の比重変化が組織内薬剤分布に与える影響を調べる目的で、循環ポンプシステムと鉛直方向、水平方向、斜め方向への分岐による簡易的なin vitroの実験モデルを作成し、低・高流速の2種類の流速下でリピオドールを投与した際の挙動について実験を行った。解析にはCT画像を用い、分岐後に採取された2つの試料をCTで撮影し、高比重リピオドールではCT値2000、低比重リピオドールではCT値250をカットオフに設定して体積の自動解析を行った。その結果、高比重リピオドールでは鉛直上向き分岐に対して下向き分岐の方がより多くの集積がみられ、より低流速である方が比重の影響が強く生じる結果となった。一方、低比重リピオドールでは45度斜め上向き分岐の方が45度斜め下向きよりも多くの集積が得られたが、鉛直方向実験では得られた画像からのCT値自動解析という方法による偽陰性率が高く、評価に値する体積が得られなかった。この実験により油性造影剤の比重変化は流体力学的に集積結果に影響を及ぼすことが示唆されたが、解析方法に課題を残す結果となった。次に生体内に投与したリピオドールの分布を調べる目的で、全身麻酔下のブタin vivoモデルを用いて比重の異なる2種類のリピオドールを肝動脈から動注し、分布の相違を調べる実験を行った。方法としては、まず右総大腿動脈にシースを留置し、カテーテルを用いて総肝動脈から血管造影とCone-beam CTを撮影し、腹側と背側に分岐する血管を同定した。その後マイクロカテーテルを分岐直前まで進め、2種類のリピオドール、右葉・左葉に分けて4日間合計8個のデータを採取した。現在結果の解析を進めている段階だが、実験を行うことでいくつかの問題点が明らかとなってきた。来年度はこの問題点の改善に取り組みたいと考えている。本年度はin vitro, in vivoの実験を行うことができたため、概ね順調に伸展していると考える。ただし、in vivoの実験ではいくつか実験系・解析方法に問題点が浮き彫りになってきており、次年度はその改善が必要と考えている。油性造影剤の比重変化が組織内分布に与える影響を調べる目的で、比重の異なるリピオドールをブタ肝動脈から動注し、Cone-beam CT(CBCT)を用いて肝臓内分布を評価した。血液より比重の高い「高比重リピオドール:HL」と、血液と同程度に調整された「等比重リピオドール:IL」を用意した。ブタ総肝動脈から造影CBCTを行い、腹・背側に分岐する血管を同定した。分岐直前から水溶性造影剤によるCBCTを撮影したのち、HLないしILの一方を分岐直前から段階的(2、3、4mlの3段階)に注入し、CBCTを撮影した。

同様の実験を肝両葉、1日2頭4日間、合計16例施行した。解析ソフトウェアを用いて集積されたリピオドールを計測した。注入領域の体積差の影響を除外するため、腹・背側領域の体積を計測し、リピオドール集積率/体積(%)を算出した。データはWilcoxon順位和検定で比較し、p値0.05未満で統計学的有意差と判断した。手技は全例成功したが、2例でデータ再構成障害による欠損が生じた。14例中7例にHLを、7例にILを注入した。2ml、3ml注入の結果、HLは背側に有意に多く分布し、ILは腹側に有意に多く分布した。(p < 0.01) 4ml注入の結果、HLは全例背側に分布したのに対し、ILは分布に有意差がみられなかった。(p = 0.277)リピオドール注入時のX線視認性はHLと比べ、ILで視認性が低下した。CBCTにおいてもILはCT値が低く、検出が困難であった。HLは少量投与時から背側に多く集積され、注入量を増やしてもその傾向に変化はみられなかった。一方、ILは少量投与時には腹側に多く集積され、注入量増加後は腹側・背側両者に均一に分布するように集積した。この結果より、油性造影剤の比重を血液と同程度に調整することで、動脈から注入した際に、より均一な組織内分布を得られるとわかった。比重に関する実験は予定通り終了したが、解析方法において信頼性のおける解析方法にたどり着くのに時間を要した。また平行して行っていた粘性度実験では粘性度低下を期待したシリコンオイルと油性造影剤との混合溶液は分離が早く実験に不適切であり、再考を要した。前年度までは油性造影剤(リピオドール)を腫瘍に対する動注療法で使用する上で、比重変化が生体内分布に与える影響を調べる目的でブタを使用し、比重の異なる2種類のリピオドールを肝動脈から動注し、Cone-beam CT(CBCT)を用いて肝臓内の分布を評価した。最終年度にはリピオドールのもう一つの臨床的使用方法である塞栓物質として使用する上で、n-butyl-2-cianoacrylate (NBCA)と混合したリピオドールの比重変化が生体内分布に当たる影響について調べた。ブタを使用し、比重の異なる2種類のリピオドールとNBCAを混合した液状塞栓物質を作成し、バルーン閉塞下に注入した際の腎臓内の分布をCBCTで評価した。10例のデータを採取し、解析用ソフトウェアを用いて、ブタ腎腹側および背側領域それぞれに集積されたリピオドールと、腹側および背側領域の造影される腎体積を計測し、リピオドール集積率/体積値を算出した。得られた2群のデータはWilcoxon順位和検定を用いて統計学的に比較し、p値は0.05未満で有意と判断した。結果、高比重リピオドール/NBCAおよび低比重リピオドール/NBCAはいずれも5例中3例が腹側に多く集積し、分布に有意差がみられなかった。前年度までに行った実験では、高比重リピオドールと等比重リピオドールの動注後の肝臓内分布に相違がみられたのに対し、今回バルーンで血流を遮断した状態で行った液状塞栓物質を用いた実験では、両者の生体内分布に相違がみられなかった。これは血流遮断により塞栓物質が均一に注入されたことに起因したと考えられ、リピオドールを生体内で均一に注入する上で血流の影響は比重以上に大きなものであることが示唆された。ただし注入液が塞栓物質という性質上、血管に接触した時点でその場に留まり末梢まで到達しないことが本研究結果に対して影響を与えている可能性があった。生体外研究の結果、血液と等比重となるように調整された油性造影剤で作成した懸濁液は、高比重な油性造影剤で作成した懸濁液と比較して粘性度が低く、肝動脈塞栓術や動脈内化学療法において有効な素材となりえる可能性が示唆された。
新規軟骨由来血管新生因子(CTGF)に対する阻害剤の開発と血管新生病治療への応用

1)合成ヒトCTGFペプチド断片およびリコンビナントCTGF(rCTGF)をウサギに免疫して、ポリクロナール特異抗体を調製した。また、多数のモノクローナル抗体を作製した。2)鶏卵漿尿膜にrCTGFを投与するとbFGFに匹敵する著明な血管新生が見られた。また、マウス皮下に投与でも著明な血管新生がみられた。3)rCTGFは血管内皮細胞の接着、増殖、遊走を促進し、また、管腔形成を誘導し、これらの作用はすべてポリクローナル抗CTGF抗体により阻害された。4)血管内皮細胞にCTGF受容体が存在することをクロスリンク法により明らかにした。5)ヌードマウス移植腫瘍の血管新生が強い順に乳癌細胞株(MDA231)、線維肉腫細胞株(HT1080)、扁平上皮癌細胞株(A431)を選びそのCTGF産生能をin vitroならびにin vivoで調べるとこの順序で強かった。一方、従来から血管新生因子として知られているVEGFやbFGFの産生能とこれらの腫瘍細胞の血管新生活性との間に相関はみられなかった。6)鶏卵漿尿膜に上記の乳癌細胞を移植すると著明な血管新生がみられこの腫瘍による血管新生は抗CTGF抗体を同時投与することにより抑制された。7)血管新生病の一つである慢性関節リウマチ患者の関節液中にCTGFが出現することを明らかにした。また、実験的心筋梗塞の修復期にCTGF遺伝子の発現が亢進することを見出した。8)ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを用いてヒト型CTGF抗体を作製しこの抗体がヌードマウス骨転移モデルで骨転移を阻害することを明らかにした。以上の結果、CTGFが血管新生の全過程を促進する新規の血管新生因子であること、また、正常および病的な血管新生の両者に関与することが明らかになった。さらに、抗CTGF抗体がCTGF阻害剤として血管新生病の治療に応用できる可能性が示された。1)ヒトCTGFペプチド断片を合成あるいはリコンビナントCTGFを大量に調製し、これらを動物に免疫して、ポリクロナール特異抗体を調製した。さらに、マウスに免疫し多数のモノクローナル抗体を作製した。2)鶏卵漿尿膜に1-2ugのリコンビナントCTGFをグラスファイバーフィルターに滲み込ませて投与するとbFGFに匹敵する著明な血管新生が見られた。また、マウス皮下にCTGFをコラーゲンキャリアーとともに注射すると著明な血管新生がみられた。3) CTGFはin vitroで血管内皮細胞の接着、増殖、遊走を促進し、また、管腔形成を誘導した。すなわち、血管新生の全過程を促進することが判明した。特に管腔形成作用は強力でbFGRやVEGFと異なり、コラーゲン等でコートしていないプラスチックシャーレ上でもみられた。4)上記のポリクロナール抗体はCTGFの血管内皮細胞の接着、増殖、遊走すべてに対する促進作用を阻害した。5)鶏卵漿尿膜の実験系で上記のポリクロナール抗体を同時に投与するとCTGFによる血管新生が著明に阻害された。以上、抗CTGF抗体が血管新生阻害剤として極めて有望な物質であることが明らがとなった。6)一方、組み換えCTGFタンパクを^<125>Iで標識し、ヒト軟骨細胞様培養細胞株HCS-2/8への結合試験を行い、受容体を同定した。