hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
個人差を考慮した熱中症リスク評価指標の開発

個人差(心肺能力,暑熱順化)が生理量に及ぼす影響を既往の研究データと被験者実験により検討した。暑熱環境における直腸温を,作業強度起因の直腸温と暑さ起因の直腸温の増分として定義し,個人の心肺能力(最大酸素摂取量)を考慮することを可能にした。次に暑熱順化が発汗量および着衣のぬれに及ぼす影響について検討し,平均皮膚温36°Cを境に暑熱順化前後の発汗量と着衣のぬれの特性に差が見られた。本研究では,心肺能力や暑熱順化といった個人特性が人体生理状態に及ぼす影響を文献調査と被験者実験により明らかにし,個人差を考慮した人体生理量予測モデルを開発することを目的としている。平成20年度は,まず個人の心肺能力と暑さの影響を考慮した深部体温の予測式を提案した。深部体温を作業強度起因の深部体温と暑さ起因の深部体温の和として定義した。心配能力の指標として最大酸素摂取量VO_<2max>、を採用し,作業強度起因の深部体温を相対的作業強度である%VO_<2max>の関数で表すことにより,心肺能力の個人差を考慮することを可能にした。暑さ起因の深部体温の増加は,平均皮膚温と深部体温が上昇し始める臨界平均皮膚温の差の2次関数として定義した。2次関数の傾き並びに臨界平均皮膚温は, 20代青年男子の自転車エルゴメーターによる被験者実験データと文献データから算出した。定常時の平均皮膚温が36°C程度までの環境において,定常に達する時間は1時間程度であるので,導かれた深部体温の予測式は作業時間13時間の暑熱環境評価に有効に利用できると考えられる。しかし定常時の平均皮膚温が36°Cを超えるような温域では,定常に達する時間が数時間に及ぶので非定常状態の予測式が必要である。そこで被験者実験データを基に,暑熱環境における相対的作業強度35%VO_<2max>の非定常状態の平均皮膚温と深部体温の関係を分析することにより,非定常状態の平均皮膚温と深部体温の予測式を導いた。定常時の平均皮膚温が36°Cを超える温域では,作業開始後70分以降,深部体温と皮膚温の差がほぼ一定値を示したことから,非定常時の深部体温の予測式は平均皮膚温の1次関数として定義した。非定常状態の実測データを用いて予測式の有効性を検証したところ,予測値と実測値はおおむね一致した。本研究では,心肺能力や暑熱順化等の個人特性が人体生理状態に及ぼす影響を文献調査と被験者実験により明らかにし,個人差を考慮した人体生理量予測モデルを開発することを目的としている。平成21年度は,暑熱馴化の有無が温熱性発汗及び心拍数,体内温度上昇に与える影響を,筆者らが開発した平均皮膚温予測モデル式を用いることにより定量的に検証することを目的とした。既往の諸実験データとして,実験時間が40分以上のものを選定し,暑熱馴化後は室温35°C以上の高温環境で6日以上馴化を行ったものを選定した。暑熱馴化後の特性を,横軸を平均皮膚温,縦軸を蒸発熱流密度とした図(椅座時,3met時)より比較した。いずれも暑熱馴化後は平均皮膚温が体内温上昇の臨界皮膚温3536°Cを超える辺りから蒸発熱流密度が急上昇し,平均皮膚温予測モデル式で適用している平均的な発汗能に対し約2倍の発汗能を有することが読み取れた。次に,暑熱馴化が着衣のぬれに及ぼす影響を把握するために,温熱環境試験室にて被験者実験を行った。成年男性3名の被験者に代謝量3.96met,外部仕事0.83metの自転車エルゴメーター運動を90分間行わせた。室温は2035°C,相対湿度は約45%とした。また35°C,60%の環境で自転車エルゴメーター運動を6日間(1時間/日)行い,暑熱馴化させた。実験の結果,直腸温,心拍数どちらも暑熱馴化後に減少していることから,暑熱馴化トレーニング前後に有意な差が存在すると考えられた。発汗量は暑熱順化トレーニング前後に差は見られなかった。全発汗量に対する着衣重量の増加量の割合は暑熱馴化前後で顕著な差はみられず,無効発汗の約56%が着衣に残る結果となった。この結果から着衣のぬれに伴い残りの44%が体温調節に寄与する有効発汗として蒸発したものと仮定し有効発汗増加率0.44として予測モデルに導入した。平均皮膚温モデル式の予測値と実測値を比較した結果,良く一致することが示された。
新規ワンステップ接着システムによる機能性根面齲蝕修復材の開発に関する研究

根面齲蝕の治療には,清掃あるいは局所の防湿が困難であるので,所要時間が短くてすむことが必須条件である。しかし,現行の修復システムでは,いずれもステップ数が多く,臨床面では改良が望まれている。そこで,コンディショナー,プライマーおよびボンディング材の機能を併せ持つ,完全なワンステップ接着材で,さらに抗齲蝕能を有する修復システムを開発することを企画した。すなわち,フッ素徐放性を有するpre-reacted polyalkenoi, c glass fillerを用いた機能性材料を用いてワンステップ接着システムを試作し,その基本的接着性能について検討を加えた。また,本システムを臨床使用するにあたってその接着耐久性を含めた評価を行い,ワンステップ修復システムの臨床使用にあたっての示唆が得られた。さらに,新規修復システムのテクニックセンシティブ因子の影響を評価するとともに,臨床での短期間における経過観察を行っている。すなわち,接着試片は,ウシ下顎前歯の唇面を被着歯面として用い,これを試作ワンステップ接着材で処理する。次いで,レジンペーストを填塞,照射させ接着試片とする。この際,ボンディング材の塗布時間,厚さあるいは照射強度などの因子について変更して製作する。接着試片は試片製作直後から,24時間37°C精製水に保管した後,インストロン万能試験機を用いてその剪断接着強さの測定を行う。また,接着破断面の観察を行い,破壊形式を判定してその評価資料とする。また,同意を得た患者に対して本修復材を使用して短期間の経過観察をUSPHSの評価基準に従って評価を加える。光重合型レジンの歯質接着システムは,チェアタイムの短縮という臨床的要求から操作ステップを簡素化する傾向にあり,現在では2ステップシステムが主流として市販されている。申請者らは,操作時間のさらなる短縮を目指したワンステップ接着システムとして,pre-reacted glass polyalkenoate filler(以後,PRGフィラー)を配合することによってフッ素徐放能を有する試作接着システムを製作し,その基礎的接着性能について検討を加えた。その結果,1.新規ワンステップ接着システムのエナメル質および象牙質接着強さは,それぞれ11.8MPaおよび13.9MPaであり,対照としたコンポマーの値とほぼ同等であった。一方,接着安定性は,コンポマーよりも良好であった。2.本接着システムの接着試験後の破壊形式は,エナメル質,象牙質ともに光重合型レジンの2ステップ製品と同様にアドヒーシブの凝集破壊および象牙質の凝集破壊が多い傾向があった。3.アドヒーシブの作用時間は,本接着システムの歯質接着性に大きな影響をおよぼさなかった。4.本接着システムのエナメル質および象牙質作用面のSEM像では,いずれの作用面においてもその表層が脱灰された像を呈し,エナメル質では粗造な小柱構造が,象牙質ではスミア層が除去され,象牙細管の開口がそれぞれ認められた。5.本接着システムの歯質接合界面のSEM観察では,エナメル質および象牙質のいずれにおいても間隙のない良好な接着層が形成されていた。1年目にはフッ素徐放性を有するpre-reacted polyalkenoic glass fillerを用いた機能性材料を用いてワンステップ接着システムを試作し,その基本的接着性能について検討を加えた。そこで,1年目の成果を踏まえ,本システムを臨床使用するにあたってその初期ならびに長期接着耐久性を含めた評価を行い,ワンステップ修復システムの臨床使用にあたっての示唆を得ることを目的として本年度の研究を進めた。その結果,以下のような知見が得られた。

3.ワンステップ歯質接着システムの象牙質処理面は,いずれもスミア層が除去され,一部にコラーゲン線維様構造物の露出が観察された。4.ワンステップ歯質接着システムの接合界面は,いずれも良好な接合界面を示し,界面付近には1μmに満たない薄い樹脂含浸層様の構造が観察された。根面齲蝕の治療には,清掃あるいは局所の防湿が困難であるので,所要時間が短くてすむことが必須条件である。しかし,現行の修復システムでは,いずれもステップ数が多く,臨床面では改良が望まれている。そこで,コンディショナー,プライマーおよびボンディング材の機能を併せ持つ,完全なワンステップ接着材で,さらに抗齲蝕能を有する修復システムを開発することを企画した。1年目にはフッ素徐放性を有するpre-reacted polyalkenoi,c glass fillerを用いた機能性材料を用いてワンステップ接着システムを試作し,その基本的接着性能について検討を加えた。そこで,1年目の成果を踏まえ,本システムを臨床使用するにあたってその接着耐久性を含めた評価を行い,ワンステップ修復システムの臨床使用にあたっての示唆を得ることを目的とする。新規修復システムのテクニックセンシティブ因子の影響を評価するとともに,臨床での短期間における経過観察を行う。すなわち,接着試片は,ウシ下顎前歯の唇面を被着歯面として用い,これを試作ワンステップ接着材で処理する。次いで,レジンペーストを填塞,照射させ接着試片とする。この際,ボンディング材の塗布時間,厚さあるいは照射強度などの因子について変更して製作する。接着試片は試片製作直後から,24時間37°C精製水に保管した後,インストロン万能試験機を用いてその剪断接着強さの測定を行う。また,接着破断面の観察を行い,破壊形式を判定してその評価資料とする。また,同意を得た患者に対して本修復材を使用して短期間の経過観察をUSPHSの評価基準に従って評価を加える。
メダカES細胞の相同組換えによる遺伝子導入

すでに樹立されていたES様細胞株OLES1に続き、OLES2を胞胚期胚盤葉細胞の培養によって樹立した。この細胞株を用いて、相同組換えによる遺伝子の導入法の開発を以下に1)2)述べる点について試みた。1)細胞に遺伝子を導入するための実験条件を、エレクトロポレーションとリポフェクションについて調べた。エレクトロポレーションについては、メダカβ-アクチンプロモーターにGFP遺伝子をつないだDNA断片をマーカーとして電圧の条件を0450Vの範囲で変えて遺伝子導入の効率を調べた。その結果、電圧が高くなるにつれて、細胞の生存率は低下し、遺伝子の導入率は上昇することがわかった。電圧が最高の450Vでの生存率は12.8%、導入率は0.77%であった。リポフェクションについてはリポフェクタミン40μlとDNA18μg/ml培養液で20時間処理の条件で遺伝子導入を行ったところ、0.5%の細胞がGFPを発現した。GFP発現細胞を単離して培養し、GFP発現クローンを得た。2)相同組換え体の選別を行うために用いる選択薬剤G418とGANCに対する細胞の感受性を調べた。G418の濃度が0600μg/mlの範囲で調べたところ、300μg/ml以上の濃度で感受性を示し、600μg/mlではすべての細胞が5日以内に死滅した。ネオマイシン耐性遺伝子DNAをエレクトロポレーションによって細胞に導入したところ、G418の濃度が600μg/mlでも耐性を示す細胞集団が得られた。また、フィーダー細胞にも遺伝子を導入し、ネオマイシン耐性フィーダー細胞株を樹立した。GANCの細胞毒性を00.5μMの範囲の濃度で調べたところ、0.1μMでは明らかな毒性は見られなかったが、0.2μM以上の濃度では濃度依存的に毒性が見られた。メダカES様細胞株OLES2を用いて、相同組換えによって細胞に遺伝子を導入するための実験条件を以下のように検討した。1)エレクトロポレーションによる遺伝子導入の条件の検討エレクトロポレーションにおけるパルス強度と細胞の生存率、および遺伝子の導入率をしらべた。レポーター遺伝子として、メダカβ-アクチンプロモーター・GFP融合遺伝子(OBA-GFP)を用い、遺伝子を導入した細胞におけるGFPの発現による蛍光を観察した。0から450Vの範囲では、電圧が上昇するにつれて細胞の生存率は低下する一方、GFPの発現は上昇した。450Vでの生存率は12.8%、処理細胞あたりのGFP発現率は0.8%であった。2)ポジティブ・ネガティブセレクションのための条件の検討300600μg/mlの濃度のネオマイシン類似体G418存在下では、9日以内にほとんどすべての細胞は死滅した。MC1プロモーターにつないだneo耐性遺伝子(MC1-neo^r)を細胞に導入したところ、300μg/mlのG418存在中で活発に増殖する細胞集団が得られた。次にGANCの細胞に対する毒性を調べたところ、0.2μM以上では毒性があることがわかった。MC1-tk-MC1-neo^rを細胞に導入した後、600μg/mlの濃度のG418存在下で1カ月培養して、G418耐性の細胞集団を得た。現在、この集団から8クローンを単離して増殖させている。この細胞株を用いて、相同組換えによる遺伝子の導入法の開発を以下に1)4)述べる点について試みた。

1)細胞に遺伝子を導入するための実験条件を、エレクトロポレーションとリポフェクションについて調べた。エレクトロポレーションについては、メダカβ-アクチンプロモーターにGFP遺伝子をつないだDNA断片をマーカーとして電圧の条件を0450Vの範囲で変えて遺伝子導入の効率を調べた。その結果、電圧が高くなるにつれて、細胞の生存率は低下し、遺伝子の導入率は上昇することがわかった。電圧が最高の450Vでの生存率は12.8%、導入率は0.77%であった。リポフェクションについてはリポフェクタミン40μlとDNA18μg/ml培養液で20時間処理の条件で遺伝子導入を行ったところ、0.5%の細胞がGFPを発現した。GFP発現細胞を単離して培養し、GFP発現クローンを得た。2)相同組換え体の選別を行うために用いる選択薬剤G418とGANCに対する細胞の感受性を調べた。G418の濃度が0600μg/mlの範囲で調べたところ、300μg/ml以上の濃度で感受性を示し、600μg/mlではすべての細胞が5日以内に死滅した。ネオマイシン耐性遺伝子DNAをエレクトロポレーションによって細胞に導入したところ、G418の濃度が600μg/mlでも耐性を示す細胞集団が得られた。また、フィーダー細胞にも遺伝子を導入し、ネオマイシン耐性フィーダー細胞株を樹立した。GANCの細胞毒性を00.5μMの範囲の濃度で調べたところ、0.1μMでは明らかな毒性は見られなかったが、0.2μM以上の濃度では濃度依存的に毒性が見られた。
口腔扁平上皮癌新規治療法の確立～サイトケラチン１７発現機序の検索～

申請者らは口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞がCK17を高頻度に発現し、また臨床的には原発巣と末梢血中では癌細胞に発現するCKに差がある可能性を見い出した。そこで本研究では、OSCC患者から末梢血を経時的(術前、術後)に採取し検索した。OSCC患者20名の術前に末梢血を採取しCKの発現頻度を検討したところ、CK17は20/20例(100%)、CK19は15/20例(75%)、CK20は12/20例(60%)であった。さらに予後良好症例および予後不良症例において、術後、予後良好症例では減少しているのに対して、予後不良症例では増加していた。以上より術後の末梢血中のCK17予後因子の可能性が示唆された。今年度は、主に口腔扁平上皮癌(OSCC)患者から血液を採取し末梢血単核球からサイトケラチン(CK)17、19、20の検出の有無を検索した。検出方法はreal-time PCR法を用いた。結果はlate T2症例において末梢血を検索するとCK17が最も発現しており、OSCCの診断に用いることが可能であることが示唆された。また、CK19も75%発現しており従来の報告の様に診断因子として利用可能である事が考えられた。OSCC症例全体を経時的に観察すると、末梢血中のCK17発現量は、放射線化学療法を行うことで減少し、術前と比較すると術後のCK17発現量も減少することが分かった。術後1ヶ月の末梢血CK17発現量は、初診時のCK17発現量と比較すると予後良好症例では減少していたが、一方の予後不良症例では増加していたことから、CK17が予後の判定に利用できることが示唆された。今年度の研究では、従来の研究同様CK19が予後の判定に利用可能であることが示唆された。しかし、以前のわれわれの研究ではOSCCにおいて最も発現量が多いのはCK17であり、OSCCの診断や予後因子として利用可能であることを報告した。術前の末梢血単核球中CK17発現量と比較し、術後に末梢血単核球中のCK17発現量が減った症例は、増えた症例よりoverall survivalの確率が有意に高かった。したがって、末梢血中のCK17はOSCC由来である可能性が高く、予後不良例では術後発現量が上がっているためOSCCの予後因子としてCK17は非常に有用であることが示唆された。サイトケラチン(Cytokeratin; CK)は細胞骨格を形成する蛋白である。申請者らは高分化型口腔扁平上皮癌(Oral squamous cell carcinoma; OSCC)細胞がCK17を高頻度に発現し、正常細胞がCK17を発現せずCK13を発現することを見出した。このことから、CK17は、正常組織が癌化する際に発現し、OSCCにおいて特異的であることが考えられる。そこで本研究の目的は、まず遺伝子レベルでのCK17の発現機序を検索しOSCC発生のメカニズムをin vitroにおいて解明することである。次に、OSCCに特異的なCK17と上皮幹細胞のマーカーであるΔNp63を用いて癌幹細胞(Cancer stem cell; CSC)の同定を行うことである。まず、OSCC原発巣にCK17が高発現していることから末梢血中にCK17が発現してないか検索した。当院の患者19名から末梢血を採取したところ、全員の末梢血からCK17が発現していることが分かった。さらに、予後良好群と予後不良群に分けて術前、術後のCK17発現量を比較すると、予後不良群の方が有意に術後のCK17発現量が増加していた。以上から術前、術後のCK17の増減を検索する事で予後が分かり、CK17を予後因子として使用できる可能性があることが明らかとなった。さらに、症例を増やす事でCK17を腫瘍マーカーとして使用できる可能性も考えられた。以上の結果は論文作成し投稿予定である。サイトケラチン(Cytokeratin:CK)は細胞骨格を形成するタンパク質である。申請者らは高分化型口腔扁平上皮癌(Oral squamous cell carcinoma:OSCC)細胞がCK17を高頻度に発現し、正常細胞がCK17を発現せずCK13を発現する事を見出した。この事からCK17は、正常細胞が癌化する際に発現し、OSCCにおいて特異的である事が考えられる。そこで本研究の目的は、まず遺伝子レベルでのCK17の発現機序を検索しOSCCの発生メカニズムをin vitroにおいて検索する事である。次にOSCCに特異的なCK17と上皮間葉系のマーカーであるΔNp63を用いて癌幹細胞(Cancer stem cell:CSC)を同定する事である。まず、OSCC原発巣にCK17が高発現していることから末梢血中にCK17が発現しているか検索した。さらに予後不良群と予後良好群に分けて術前、術後のCK17発現量を比較すると、予後不良群の方が有意に術後のCK17発現量が増加していた。以上から術前、術後のCK17発現量を検索する事で予後が分かり、CK17を予後マーカーとして使用できる可能性がある事が考えられた。

さらに症例を増やし結果を報告する予定である。研究結果は順調に出ており論文作成は終了し、今後投稿する予定である。申請者らは高分化型口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞がCK17を高頻度に発現し、低分化型OSCC細胞がCK20を高頻度に発現する可能性、また臨床的には原発巣と末梢血中では癌細胞に発現するCKに差がある可能性を見い出した。そこで本研究ではCKがOSCCの新規予後因子として有用であるかを解明することを目的として、OSCC患者から末梢血を経時的(術前、術中、術後、定期的な経過観察時)に採取し、末梢血中のCK陽性癌細胞とその分化度との関連を検索している。OSCC患者20名の術前に末梢血を採取しCKの発現頻度を検討したところ、CK17は20/20例(100%)、CK19は15/20例(75%)、CK20は12/20例(60%)であった。またそれぞれのCKの発現頻度を経時的に検索すると、CK17は術前、術前治療終了時、経過観察時(術後1か月)における相対比は1:0.73:0.87、CK19は1:1.14:1.36、CK20は1:1.17:1.80であった。さらに予後良好症例および予後不良症例において、CK17の発現は術前は両方の群で同じであったが、術後、予後良好症例では相対比が0.69に減少しているのに対して、予後不良症例では1.38に増加していた。CK19の発現は術後、予後良好症例では相対比が1.02とほぼ変化なく、予後不良症例では1.82に増加していた。CK20の発現は術後、予後良好症例では相対比が5.48に増加しており、予後不良症例では0.09に減少していた。以上より、術後1ヶ月の末梢血中のCK17は、初診時と比較すると予後良好症例では減少していたが、予後不良症例では増加していたことから、CK17が予後因子の可能性が示唆された。また経時的観察の結果より、末梢血中のCK17は、術前放射線化学療法により減少し、術前と比較すると術後のCK17発現量も減少することが分かった。申請者らは口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞がCK17を高頻度に発現し、また臨床的には原発巣と末梢血中では癌細胞に発現するCKに差がある可能性を見い出した。そこで本研究では、OSCC患者から末梢血を経時的(術前、術後)に採取し検索した。さらに予後良好症例および予後不良症例において、術後、予後良好症例では減少しているのに対して、予後不良症例では増加していた。以上より術後の末梢血中のCK17予後因子の可能性が示唆された。in vitroでの研究はやや遅れているが、in vivoでの研究は結果が出ており一部論文が完成している。近々投稿できるためおおむね順調に進展していると考えられる。英語論文を作成する。可能な限り学会報告を行う。口腔外科一部結果がでていることから、論文や学会発表を行なう。交通費、論文投稿等で予算が使用されるため計画的に発表し、実験用具が不足しないよう注意する。OSCC患者からのサンプル採取が順調に行なわれており、実験もその都度行なっている。今の所当初考えていた結果と近いものが出ており研究自体順調である。しかし、in vitroでの実験が準備段階で滞っており計画以上の進展はしていないのが現状である。今年度準備していた実験をすぐに行なえるよう計画して行く。学会出張が減少し旅費の使用が少なかったため。
フェナレノキシル型安定中性ラジカルの開発

ガルビノキシルなどの安定中性ラジカルの電子構造特性を分子設計の原型として,新分子性強磁性体の実現を目指す研究を行っている.本年度はジアザフェナレン類に各種の置換基を導入した新規誘導体を合成し,その電荷移動錯体を合成し,種々の物性を調べた.これらの誘導体を酸化して中性ラジカルを合成することを現在検討している.さらに,この研究の新しい展開をはかるためジアザフェナレン類の種々の基本的性質を調べた.先ず,ジアザフェナレン類はメタノール溶液での電子スペクトルの測定から,430nm付近及び450nm前後に吸収を有することが分かった.次にこれらのジアザフェナレン類を電子ドナー分子として用いた電荷移動錯体の合成を検討し,TCNQと混合することにより暗緑色黒色の粉末錯体が得た.これらの錯体は,赤外吸収及スペクトルにおけるTCNQのニトリル伸縮振動の波数の解析及び電子スペクトルが赤外吸収領域の低エネルギーに存在することから,部分電荷移動状態にあることが推定される.得られた錯体の粉末加圧成型ペレットでの四端子法による電導度測定の結果,いずれの錯体も室温での比抵抗の値から半導体であったが,非常に小さい活性化エネルギーを持つという特徴を示した.今後の課題は単結晶を作製し,結晶構造解析,電気伝導度測定などを行い,電子構造を明らかにすることである.ガルビノキシルなどの安定中性ラジカルの電子構造特性を分子設計の原型として,新分子性強磁性体の実現を目指す研究を行っている.本年度はジアザフェナレン類に各種の置換基を導入した新規誘導体を合成し,その電荷移動錯体を合成し,種々の物性を調べた.これらの誘導体を酸化して中性ラジカルを合成することを現在検討している.さらに,この研究の新しい展開をはかるためジアザフェナレン類の種々の基本的性質を調べた.先ず,ジアザフェナレン類はメタノール溶液での電子スペクトルの測定から,430nm付近及び450nm前後に吸収を有することが分かった.次にこれらのジアザフェナレン類を電子ドナー分子として用いた電荷移動錯体の合成を検討し,TCNQと混合することにより暗緑色黒色の粉末錯体が得た.これらの錯体は,赤外吸収及スペクトルにおけるTCNQのニトリル伸縮振動の波数の解析及び電子スペクトルが赤外吸収領域の低エネルギーに存在することから,部分電荷移動状態にあることが推定される.得られた錯体の粉末加圧成型ペレットでの四端子法による電導度測定の結果,いずれの錯体も室温での比抵抗の値から半導体であったが,非常に小さい活性化エネルギーを持つという特徴を示した.今後の課題は単結晶を作製し,結晶構造解析,電気伝導度測定などを行い,電子構造を明らかにすることである.
佐渡金銀山絵巻群の史料学的研究

新発見の佐渡金銀山絵巻を用いて、これまで未解明であった絵巻群の作者や制作年代、制作事情を検討し、絵巻群の構造の一端を明らかにした。また、佐渡金銀山絵巻に附属的に描かれる銅の選鉱・製錬部分の描写についても銅山経営体制や技術の変化が反映されていることを具体的に明らかにした。佐渡金銀山絵巻の法量・顔料の変遷についても検討を加え、佐渡金銀山絵巻データベースの構築を進めた。平成24年度に引き続き、未調査の佐渡金銀山絵巻の調査・撮影を行い、データベースの構築を進めた。併せて、鉱山技術書などの文献史料をもとに、それらの描写年代や絵師などについて分析を行い、佐渡金銀山絵巻群全体のなかでの位置付けを検討した。佐渡金銀山絵巻は、佐渡奉行所の絵図師(山尾氏)が佐渡奉行交代の度ごとなどに制作し、17301860年代までの約130年間に100点以上制作したと考えられている。しかし、現存する100点以上の絵巻の大半が、全国各地においてさまざまな理由で転写されたものであることがわかってきた。とりわけ幕末期には山尾氏以外の絵師による多様な絵巻が制作される事例が多いことを確認した。このような多数の写本の存在は、国内最大の金銀山だった佐渡金銀山そのものの重要性や、人々の関心の高さを反映すると考えられる。そして、このような絵巻のなかには江戸で出版された浮世絵の種本となった可能性があるものも認められるなど、その文化的影響力の一端についても明らかにした。また、佐渡金銀山絵巻に付属的に描かれる銅の選鉱・製錬部分の描写についても、その仕法や技術の変化が反映されていることが明らかになった。佐渡金銀山絵巻の料紙・法量・顔料の変遷解明については、より科学的な分析を進める必要があるが、19世紀前期以降の絵巻に使用される青色顔料が、18世紀のものとは明確に異なる傾向にあることを確認できた。これまで未調査の佐渡金銀山絵巻の調査・撮影を行い、データベースの構築を進めた。併せて、それらの描写年代や絵師などについて分析を行い、佐渡金銀山絵巻群全体のなかでの位置付けを検討した。佐渡金銀山絵巻は、佐渡奉行所の絵図師が佐渡奉行交代の度ごとに制作し、1730年代1860年代までの約130年間に100点以上制作されたと考えられている。しかし、現存する約100点の絵巻は、奉行所の絵図師が制作したことが明らかなものはわずかで(散逸したと思われる)、大半が全国各地においてさまざまな理由で転写されたものであることがわかってきた。このような多数の写本の存在は、国内最大の金銀山だった佐渡金銀山そのものの重要性や人々の関心の高さを反映する、という見通しを立てた。また、小判製造場面の描写と変遷についての分析を進め、現存する佐渡小判の金属組成分析データも採取しながら、描写内容の妥当性を検討した。佐渡金銀山絵巻群の料紙・法量・顔料の変遷解明については、その分析素材となる1750年代の絵巻断簡を入手し、検討を進めた。法量については、1730年代の最初期の絵巻のみが紙幅40cm程度で、それ以降の絵巻は2728cm程度となる見通しを立てることができた。さらに、海外の鉱山史研究者と検討会をもち、欧米における佐渡金銀山絵巻の所在や概要についての情報を得、佐渡金銀山絵巻群の全体像の視野を大きく広げることができた。平成24・25年度に引き続き、未調査の佐渡金銀山絵巻の調査・撮影を行い、データベースの構築を進めた。とりわけ、金銀山絵巻に付属的に描かれる銅の選鉱・製錬部分の描写についても仕法や技術の変化が反映されており、その分析から描写年代が判明することを具体的に明らかにした。佐渡金銀山絵巻は、佐渡奉行所の絵図師(山尾氏)が3代にわたって佐渡奉行交代の度ごとに制作し、17301860年代までの約130年間に100点以上制作したと考えられている。制作年代や絵師の記載のある絵巻は稀だが、これまでの比較調査で山尾氏初代・2代・3代それぞれの作品のいくつかが特定できた。しかし一方で、現存する100点以上の絵巻の多くが、全国各地においてさまざまな理由で転写されたものであることがわかってきた。佐渡金銀山絵巻の料紙・法量・顔料の変遷解明については、より科学的な分析が必要であるが、紙幅は最初期40cm程度であったものが、その後27cm程度に変化することや19世紀前半以降の絵巻に使用される青色顔料が、18世紀のものとは明確に異なる傾向にあることを確認できた。日本近世史佐渡

金銀山絵巻の撮影およびデータベース構築の作業が順調に進んでおり、調査の過程で新たな絵巻の所在も発見されている。また、絵巻制作年代の重要な検討史料となる鉱山関係技術書の分析の深化により、絵巻の制作年代や分類の指標作りの検討作業が進んでいる。絵巻の絵師についても、佐渡奉行所絵図師(山尾氏)3代にわたる作風が明らかになりつつあり、それ以外の写本との見分けができつつある。以上により、絵巻群の全体像と個々の絵巻の位置付けの解明が進みつつある。なお、佐渡金銀山絵巻の料紙・法量・顔料の変遷解明については、より科学的な分析を進める必要がある。佐渡金銀山絵巻のデータベース構築の作業が進み、佐渡金銀山絵巻群の全体像と個々の絵巻の位置付けの解明が進みつつある。絵巻各場面の描写内容、とりわけ描かれた鉱山技術・道具の分析から、絵巻の制作年代や分類の指標作りの検討作業が進んだ。また、絵巻の絵師についても、佐渡奉行所絵図師の作風が明らかになりつつあり、それ以外の模写本との見分けができつつある。なお、佐渡金銀山絵巻群の料紙・法量・顔料の変遷解明のためには、より科学的な分析を進める必要がある。平成24年度・25年度に引き続き、未調査絵巻の調査・撮影を行い、データベースの構築を進める。時間のかかる史料撮影については、研究協力者に依頼するか、業者委託を行い、作業の効率化をはかる。併せて、絵巻各場面の描写内容、とりわけ描かれた鉱山技術・道具の分析による制作年代の検討を文献史料とも対比させながら行い、絵巻の分類指標の作成を充実させる。また、各絵巻の絵師についても引き続き分析を進めるとともに、絵巻の料紙や顔料などの変遷の解明についても分析を深める。必要に応じて研究協力者との検討会も行いながら研究成果のまとめを行う予定である。平成24年度に引き続き、未調査の佐渡金銀山絵巻の調査・撮影を行い、データベースの構築を進める。時間のかかる撮影については、研究協力者に依頼するか、業者委託を行い、作業の効率化をはかる。併せて、絵巻各場面の描写内容、とりわけ描かれた鉱山技術・道具の分析による制作年代の検討を文献史料とも対比させながら行い、絵巻の分類指標の作成をより充実させる。また、各絵巻の絵師についても引き続き分析を進めるとともに、絵巻の料紙や顔料などの変遷の解明についても分析を深める予定である。予定していた絵巻史料の撮影が都合により不許可となった箇所があり、撮影委託費分の残金が生じた。これまでの調査で新たに発見された複数の絵巻の撮影委託費として有効に使用する。未調査絵巻の調査・撮影のための旅費および撮影委託費を中心とする。絵師の分析については、美術史の立場からも検討を深めることが重要と考えられる。また、絵巻の料紙や顔料の分析については、保存科学の立場からも検討する必要があると考えられる。このため、上記に関する研究協力者招聘の旅費や分析委託に関する経費としても有効に使用したい。
心筋における興奮の発生と伝導の分子機構とその制御

心筋における興奮の発生と伝導の機構は今や分子レベルで解明されるべき時期に来ている.一方,社会の近代化に伴い突然死が増し,社会的関心事となっているが,突然死の主因は心臓死であり,その根低にあるものは心臓のポンプ機能を喪失せしめる重篤な不成脈であり,その治療は緊急の課題となっている.かつる学問的現状と社会的要請に鑑み,この領域の研究を重点領域研究に発展させる準備のため本研究を計画したが,昭和62年9月11日の班会議,昭和62年10月15日の長崎における本研究名の公開シンポジウム,研究代表者と研究分担者間の個別的な情報交換を通し,昭和64年度発足の重点領域研究の申請準備を行い,昭和63年3月3日に申請書を提出することができた.研究代表者を昭和大学教授春見建一とし,申請重点領域研究名を「心臓異常電気活動の分子機構とその制御に関する研究」とした.本研究の計画の段階で立てた5項目の主要研究目的に沿い,重点領域研究申請書においても1.心筋イオンチャンネルの構造と機能,2.心筋異常興奮発生のメカニズム,3.心筋異常興奮伝導のメカニズム,4.心筋興奮・伝導の制御機構,5.心筋細胞興奮・伝導のシミュレーションを主要研究項目とし,各項目に89名の研究者を配して計画研究とした.心筋興奮の素子であるイオンチャンネルの構造決定というミクロのレベルの研究から,ヒトの心臓全体の電気現象のコンピュータシミュレーションというマクロのレベルの研究までを拒否し,重篤な不整脈の治療という社会的要請にも応えようとするものであるが,イオンチャンネル蛋白の構造の決定,再構成,再構成チャンネルの電気生理学特性の解析,チャンネル機能修飾物質による修飾の分子機構の解明など分子レベル,サブセルラーレベルの研究に力点を置いて計画した.このようなミクロレベルの研究成果のマクロレベルの研究への還元は大きな研究成果を約束するものと考えられる.心筋における興奮の発生と伝導の機構は今や分子レベルで解明されるべき時期に来ている.一方,社会の近代化に伴い突然死が増し,社会的関心事となっているが,突然死の主因は心臓死であり,その根低にあるものは心臓のポンプ機能を喪失せしめる重篤な不成脈であり,その治療は緊急の課題となっている.かつる学問的現状と社会的要請に鑑み,この領域の研究を重点領域研究に発展させる準備のため本研究を計画したが,昭和62年9月11日の班会議,昭和62年10月15日の長崎における本研究名の公開シンポジウム,研究代表者と研究分担者間の個別的な情報交換を通し,昭和64年度発足の重点領域研究の申請準備を行い,昭和63年3月3日に申請書を提出することができた.研究代表者を昭和大学教授春見建一とし,申請重点領域研究名を「心臓異常電気活動の分子機構とその制御に関する研究」とした.本研究の計画の段階で立てた5項目の主要研究目的に沿い,重点領域研究申請書においても1.心筋イオンチャンネルの構造と機能,2.心筋異常興奮発生のメカニズム,3.心筋異常興奮伝導のメカニズム,4.心筋興奮・伝導の制御機構,5.心筋細胞興奮・伝導のシミュレーションを主要研究項目とし,各項目に89名の研究者を配して計画研究とした.心筋興奮の素子であるイオンチャンネルの構造決定というミクロのレベルの研究から,ヒトの心臓全体の電気現象のコンピュータシミュレーションというマクロのレベルの研究までを拒否し,重篤な不整脈の治療という社会的要請にも応えようとするものであるが,イオンチャンネル蛋白の構造の決定,再構成,再構成チャンネルの電気生理学特性の解析,チャンネル機能修飾物質による修飾の分子機構の解明など分子レベル,サブセルラーレベルの研究に力点を置いて計画した.このようなミクロレベルの研究成果のマクロレベルの研究への還元は大きな研究成果を約束するものと考えられる.
粒子径制御された超微粒子の固体へのin situ分散固定化法の開発

本研究では,油中水滴型マイクロエマルション中で金属化合物超微粒子を合成し,その微粒子が分散した溶液中で金属アルコキシドから担体を作製し,同時に金属化合物超微粒子を担体に固定化するという新規固定化法に関する研究を行った.まず,本法における界面活性剤の親水基長さ,疎水基長さ,溶媒種を変えることによって,Rh ́SiO_2触媒のRh粒子径を1.89nmの広い範囲で制御することができた.また,本法で調製した触媒のRh粒子は,その一部が担体内に埋没してその部分が触媒として有効に機能していないことがわかった.そこで,固定化条件がRhの表面露出率に及ぼす影響について調べた結果,アルコキシドの加水分解時間を短くし,かつその時の含水率を大きくすることによって,Rhの表面露出率を80%近くまで高くすることができた.同様に,Pd/ZrO_2触媒においても,加水分解時の含水率を高くすることによってPd微粒子固定化後のPd露出率を向上させることができた.また,金属露出率を高くするためには,マイクロエマルション中の金属微粒子を固定化するのではなく,金属錯体超微粒子を固定化する方が好ましいことがわかった.本法によって,金属粒子径がCO水素化反応に適した大ささの金属微粒子を担体に露出率が高い状態で固定化することによって,従来法触媒よりも数倍も活性の高い触媒を調製することができた.また,金属の露出率が活性点当たりの反応速度に及ぼす影響を明らかにすることもできた.本研究では,油中水滴型マイクロエマルション中で金属化合物超微粒子を合成し,その微粒子が分散した溶液中で金属アルコキシドから担体を作製し,同時に金属化合物超微粒子を担体に固定化するという新規固定化法に関する研究を行った.まず,本法における界面活性剤の親水基長さ,疎水基長さ,溶媒種を変えることによって,Rh ́SiO_2触媒のRh粒子径を1.89nmの広い範囲で制御することができた.また,本法で調製した触媒のRh粒子は,その一部が担体内に埋没してその部分が触媒として有効に機能していないことがわかった.そこで,固定化条件がRhの表面露出率に及ぼす影響について調べた結果,アルコキシドの加水分解時間を短くし,かつその時の含水率を大きくすることによって,Rhの表面露出率を80%近くまで高くすることができた.同様に,Pd/ZrO_2触媒においても,加水分解時の含水率を高くすることによってPd微粒子固定化後のPd露出率を向上させることができた.また,金属露出率を高くするためには,マイクロエマルション中の金属微粒子を固定化するのではなく,金属錯体超微粒子を固定化する方が好ましいことがわかった.本法によって,金属粒子径がCO水素化反応に適した大ささの金属微粒子を担体に露出率が高い状態で固定化することによって,従来法触媒よりも数倍も活性の高い触媒を調製することができた.また,金属の露出率が活性点当たりの反応速度に及ぼす影響を明らかにすることもできた.本研究の目的は,金属超微粒子の大きさをナノスケールオーダーで制御しつつ,それらの微粒子を凝集させることなく固体上に均一に固定化する方法の開発とその固定化過程の解明を図ることである.そのために本研究では,Rh超微粒子のシリカ担体への固定化をとりあげて,マイクロエマルション中で粒子径を制御しつつRh超微粒子を調製し,Rh超微粒子が分散したその溶液中でケイサンエチルの加水分解を行うという新規な方法について検討した.まず,界面活性剤のイオン性を変えた場合の固定化状態の相違を調べたところ,この方法ではいずれの界面活性剤においてもRh超微粒子をシリカに均一に固定化できることがわかった.また,非イオン性界面活性剤を用いるよりも,イオン性界面活性剤を用いた方が,Rh超微粒子がシリカ担体の表面近傍に固定化されやすいことがわかった.触媒など超微粒子の工学的利用を考えると,超微粒子は担体の表面近傍に固定化される方が望ましい.そこで,カチオン性界面活性剤をとりあげて,その固定化過程について検討した.ここでは,固定化過程における経時変化,及びpH,含水率,アルコキシド濃度が固定化状態に与える影響を調べた.その結果,Rh超微粒子は加水分解のごく初期に生成したシリカ担体にすべて固定化されて,その後に生成してくるシリカが超微粒子の上に成長することがわかった.したがって,加水分解時間を短くすることによって,Rh超微粒子を担体の表面近傍に固定化できることがわかった.さらに,加水分解速度を促進するような条件(pHを上げる,含水率の増加,およびアルコキシド濃度の増加)に調整することによって,シリカの核発生数が多くなり,超微粒子が表面に担持されやすくなることがわかった.

このようにして,Rh超微粒子を凝集することなく担体の表面近傍(露出割合80%)に均一に固定化することに成功した.本研究では,油中水滴型マイクロエマルション中で金属化合物超微粒子を合成し,その微粒子が分散した溶液中で金属アルコキシドから担体を作製し,同時に金属化合物超微粒子を担体に固定化するという新規固定化法に関する研究を行った.昨年度のRh/SiO_2の検討に続き,本年度はPd/ZrO_2触媒のPd露出率について検討した.Rh/SiO_2と同じ条件で調製したPd/ZrO_2のPd露出率はRhのそれに比べて著しく低かった.また,Al_2O_3担体についても検討を行ったが,その場合の金属露出率はRh/SiO_2の場合と変わらなかった.したがって,Pd/ZrO_2のPd露出率が低かったのは,担体の種類による相違ではなく,固定化する超微粒子の種類に起因することが示唆された.つまり,金属微粒子の露出率を向上させるには,Pdの場合のような金属超微粒子を固定化するのではなく,Rhの場合のように錯体超微粒子を固定化することが重要であることが示唆された.さらに,Pd/ZrO_2のPd微粒子固定化条件がPd露出率に及ぼす影響を調べたところ,Rh/SiO_2の場合と同様に固定化時の含水率を増加させることなどが,Pdの露出率向上に効果的であることがわかった.このようなPd露出率の向上によって,触媒活性は著しく向上した.また,金属の露出率が活性点当たりの反応速度に及ぼす影響について,Rh/SiO_2上のCO水素化反応を例にとって調べた.その結果,Rhの露出率が30%以上の範囲では,Rh露出率はRh1原子当たりの活性には影響せず触媒全体の活性に影響するだけであるが,Rh露出率が30%以下になるとRh露出率が低くなるほどRh1原子当たりの活性が高くなることがわかった.これは,Rhの露出割合が非常に低いところではRh粒子のある特定の結晶面だけが露出したためと考えられた.
多環芳香族化合物分解菌による細胞増殖抑制物質の生産とその応用

クマリン(coumarin)類は抗菌性や酵素阻害活性など様々な生物活性を持つことが報告されており、クマリン類のなかにはガン細胞の増殖抑制を行うものも確認されている。多環芳香族炭化水素(PAHs)のモデル化合物の1つであるphenanthrene(PHN)を資化する細菌Sphingobium sp. P2株は、PHNの分解過程において2種類のベンゾクマリンと1種類のクマリンを生産する[Pinyakong et al. (2000) FEMS Microbiol. Lett., 191,115-121]。これまでの知見では、水酸化されたクマリン類に特に高いガン細胞に対する増殖抑制活性があるため、これら3種のクマリン類に水酸化することを試みた。昨年度、P2株のPHN代謝系酵素遺伝子を解析している過程で発見された3種の酸化酵素について機能解析を行ったが、二環以上の芳香族化合物に対する活性はなく、全てsalicylate 1-hydroxylaseであることが示された[Pinyakong et al. (2003)Biochem. Biophys. Res. Commun., 301,350-357]。そこで本年度は、二環以上の芳香族化合物に二水酸化が可能な酵素遺伝子を、やはりPAHsのモデル化合物であるacenaphtheneを資化する細菌Sphingomonas sp. A4株から単離することとした。既にP2株で単離されたferredoxin及びreductase componentをコードする遺伝子を導入した大腸菌を用い、A4株の全DNAのショットガンクローニングを行ったところ、naphthalene、PHNなど二環以上のPAHsに酸化反応を行う新規dioxygenaseをコードする遺伝子の単離に成功した。現在、本酸化酵素のクマリン類に対する水酸化活性を調べている。同様にPAHsのモデル化合物であるfluorene(FN)を資化する細菌Terrabacter sp. DBF63株については、昨年度の研究により、FNの分解過程において8-hydroxy-3, 4-benzocoumarin(HBC)を生産することが示されていた。本年度は、HBC生産に関与すると推測された2種類のdehydrogenase様酵素(FlnB, FlnC)について機能解析を行い、FlnBが9-fluorenoneのangular dioxygenation産物からHBCを生産する酵素であることを明らかにした。
植物由来の新規糖転移酵素の特性の解明とヒスタミン遊離抑制剤の創製への応用

糖質誘導体は、医薬品への応用が期待されている。特に、糖質誘導体の中でも、ヒスタミン遊離抑制剤として有用な物質が知られている。植物培養細胞が行う反応には酵素が関与しており、有機化学合成のような過激な反応条件を必要としない。このため、副生成物が少なくグリーンケミストリーに適している。今回、植物培養細胞とその糖転移酵素を利用して、植物培養細胞に含まれない外来物質に対して、メチル化、および、糖転移などの変換を行った。なかでも、糖転移反応は植物の特徴であり、カプサイシン、スチルベノイドなどが植物培養細胞および糖転移酵素によって効率的に糖転移された。研究の対象とする植物由来の酵素は、申請者らが発見し、単離したものを用いた。植物培養細胞は、常法によりカルス誘導し、培養を行い、液体培地により均一のサスペンジョン状態にしたのち、酵素精製を行った。培養細胞を摩砕したのち、遠心分画を行い、得られた粗酵素各分をゲル濾過クロマトグラフィーで脱塩し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを順次行うことにより、HPLCを用いるアッセイにより、目的の変換を行う酵素を単離した。植物由来酵素のcDNAをpQE30プラスミドベクターにクローンした後、大腸菌M15細胞の形質転換を行った。アンピシリンを含む培地で培養した大腸菌細胞から、目的の酵素は、集菌の後、超音波処理することにより溶菌を行い、遠心処理により粗酵素画分を得、His-acceptカラムクロマトグフラフィーにより、単離精製を行った。精製した酵素を使用して、ピーナッツの皮などに含まれる生理活性化合物である、ビニフェリンの変換反応を行い、親水性の高いビニフェリン誘導体を得た。ビニフェリン誘導体と、ビニフェリンの、ラットの肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制試験を行ったところ、ビニフェリン誘導体が、compound 48/80刺激に対するラット肥満細胞からのヒスタミン放出を強く阻害することがわかった。このことから、今回合成したビニフェリン誘導体が、高いヒスタミン遊離抑制活性を持つ事が明らかになった。酵素を利用した新規な抗ヒスタミン薬の創製に成功しており、当初の計画通りに研究が進展しているといえる。ラットの肥満細胞に、compound48/80を作用させると、ヒスタミンの遊離が誘導されるが、このラット肥満細胞からのヒスタミンの遊離を抑制させる、抗ヒスタミン作用を持つ物質の合成を目指し、本年度は、我々の研究室において、すでに有用物質の合成に有効であることが確立されている、植物培養細胞等の培養細胞へ、外来の基質として投与した物質を有用な物質へ変換する、植物培養細胞を生体触媒として使用するバイオトランスフォーメーションにより、抗ヒスタミン作用を有する有用な化合物の合成を行った。抗ヒスタミン性を有する化合物の生産に関与する酵素類は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの、カラムクロマトグラフィーにより精製を行っている。植物培養細胞を生体触媒として使用するバイオトランスフォーメーションにおいては、植物培養細胞を3日間、前培養を行い、外来の基質をDMSOで懸濁して可溶化した溶液を投与し、反応を2日間行った。植物培養細胞と培養溶液を、フィルターを使用して濾過する事により分離した。培養溶液は、酢酸エチルおよびブタノールにより分配抽出を行うことにより、生成物を得た。植物培養細胞は、ホモジナイズの後、メタノールにより、12時間浸漬する事により生成物の抽出を行った。このメタノール抽出物を濃縮後、水と酢酸エチルにより、分配抽出を行った。水層はさらに、ブタノールにより抽出する事により、ブタノール抽出画分を得た。生成物の確認は、LC/MSおよび、核磁気共鳴法により、化合物の化学構造を決定した。その結果、植物培養細胞の酢酸エチル抽出画分に、生成物が抽出されていることが分かった。本研究の目的は、ヒスタミンの遊離を抑制させる、抗ヒスタミン作用を持つ物質の合成を行うことであり、本年度は、生体触媒を使用するバイオトランスフォーメーションならびに、反応に関与する酵素の検討を行っており、当初の目的通りに、おおむね順調に進展しているといえる。本年度は、植物培養細胞由来の糖転移酵素を用いた、スチルベン骨格を有する化合物や、フラボン骨格を有する化合物を基質として変換反応に供し、生成物を液体クロマトグラフィーにより精製を行い、変換生成物の構造決定を行った。抽出過程においては、酢酸エチルおよびブタノールにより分配抽出を行うことにより、粗抽出物を得た。その結果、レスベラトロールを基質として用いた場合には、3位と4'位のフェノール性水酸基に位置選択的に糖転移反応が生起し、それぞれのモノグルコシドを生成物として与えた。一方、クエルセチンを基質として使用した場合には、位置選択的な糖転移反応が生起する事が明らかになった。植物培養細胞を使用したバイオトランスフォーメーションの結果では、糖転移酵素による反応により、3位のフェノール性水酸基に位置選択的に糖転移が生起して、モノグルコシドを生成し、さらに、3'位のフェノール性水酸基に位置選択的にメチル化が生起して、イソラムネチンのモノグルコシドを生成物として与えた。本年度は、さらに、植物培養細胞由来の糖転移酵素について、大腸菌を使用した発現を行った。すなわち、大腸菌を用いて植物培養細胞由来の糖転移酵素を大量発現し、各種クロマトグラフィーによって精製をおこなった。

精製酵素を用いて、アクセプター分子であるレスベラトロールおよびドナー分子アナログであるUDP-2F-グルコースとの複合体の結晶化条件を探索した。ポリエチレングリコールを沈殿剤とする条件で良質な結晶が得られたので、大型放射光施設SPring-8 BL44XUにてX線回折強度データを収集した。既知の糖転移酵素の構造をモデルとした分子置換法により位相決定をおこない、2.6Å分解能での構造決定に成功した。糖質誘導体は、医薬品への応用が期待されている。特に、糖質誘導体の中でも、ヒスタミン遊離抑制剤として有用な物質が知られている。植物培養細胞が行う反応には酵素が関与しており、有機化学合成のような過激な反応条件を必要としない。このため、副生成物が少なくグリーンケミストリーに適している。今回、植物培養細胞とその糖転移酵素を利用して、植物培養細胞に含まれない外来物質に対して、メチル化、および、糖転移などの変換を行った。なかでも、糖転移反応は植物の特徴であり、カプサイシン、スチルベノイドなどが植物培養細胞および糖転移酵素によって効率的に糖転移された。さらに、他の基質を使用する酵素変換を行い、酵素の基質特異性を明らかにする。また、酵素変換により得られる生成物について、抗ヒスタミン活性の評価を行う。申請者が発見した新規酵素のネイティブ状態での四時構造の情報について、MALDI-TOFMSなど機器を使用する測定により、検討を加える。今後は、抗ヒスタミン作用を持つ広範な、より活性の高い化合物の合成を行う。それに際し、まず、当研究室が保有する植物培養細胞である、ニチニチソウ植物培養細胞、タバコ植物培養細胞、ヨウシュヤマゴボウ植物培養細胞、イモ植物培養細胞、キョウチクトウ植物培養細胞、ユーカリ植物培養細胞を使用して、外来の化合物の変換反応を行い、最もヒスタミンの遊離を抑制させる、高い抗ヒスタミン作用を持つ物質の合成を行うため、所有する植物培養細胞のスクリーニングを行う。特に、これまでの当研究室の研究により、他の反応において高い変換活性を示しているニチニチソウ植物培養細胞、ヨウシュヤマゴボウ植物培養細胞、ユーカリ植物培養細胞についてはバイオトランスフォーメーションにおける反応条件として、光照射の有無、反応温度、反応時間を検討するためのタイムコース実験などの検討を加え、高い変換活性を得られる反応条件を検証する。高い変換活性を有することが確認された植物培養細胞については、さらに反応に関与する酵素を、植物培養細胞から抽出を行い、精製を行う。反応に関与する酵素は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの、カラムクロマトグラフィーにより精製を行い、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一バンドとして酵素を得る。得られた酵素は、可溶化した基質溶液と反応に必要な補因子とともに12時間のインキュベーションを行うことで反応を行い、得られる生成物を、LC/MSおよび、核磁気共鳴法による各種のスペクトル解析により化学構造を決定する。酵素化学その他の生理活性化合物の誘導体の合成、及び、その生理機能の解明を、次年度に行うことにしたため、次年度使用額が生じた。