hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遅発性小脳失調モデル動物を用いた軸索変性機序の解明

神経特異的RNA結合タンパク質HuCのノックアウト(KO)マウスは正常に発育するが生後7ヶ月になると歩行障害などの運動失調症状を呈する。このマウスの小脳では神経回路が正常に形成されたのちに遅発性にシナプス脱落を伴ったプルキンエ細胞の軸索変性が起こるが、プルキンエ細胞は細胞死に至らない。HuC KOマウス小脳における詳細な電子顕微鏡解析を行った結果、プルキンエ細胞の軸索膨大部に様々な細胞内小器官が蓄積し、細胞質の構成成分が軸索へと流出している所見が観察された。このことから、HuC KOマウスのプルキンエ細胞では軸索輸送の障害に加え、細胞体から軸索に細胞内小器官等の異常流出が生じている可能性が考えられた。通常、ニューロンでは細胞体と軸索の間に拡散障壁(AIS)が形成されており、軸索へ移行できる細胞内小器官やタンパク質は制限されている。HuC KOマウス小脳では、AISの最も重要な構成因子の1つであるAnkyrin-Gの発現量および選択的スプライシングのパターンが有意に変化していた。野生型に比べHuC KO小脳ではexon 34を有するAnkyrin-Gのバリアントが増加しおり、ZU5ドメイン中にexon 34が挿入されることによりSpectrinとの結合親和性に変化が起こっていることが示された。同バリアントは胎生期に多く発現するものの成体脳では極めて少ないため、HuC KO小脳では異時性に"胎仔型Ankyrin-G"が出現していると言える。我々はこれまでにHITS-CLIP法を用いた標的探索によりAnkyrin-GがHuによる選択的スプライシング制御を受けることを明らかにしており(Ince-Dunn G, Okano HJ et al. Neuron 2012)、Huタンパク質の欠失によりAIS機能の低下が起こっている可能性が強く示唆される。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経特異的RNA結合タンパク質HuCのノックアウト(KO)マウスの小脳では神経回路が正常に形成されたのちに遅発性にシナプス脱落を伴ったプルキンエ細胞の軸索変性が起こるが、プルキンエ細胞は細胞死には至らない。電子顕微鏡による詳細な形態解析を行ったところ、球状に膨大した軸索においてミトコンドリアや滑面小胞体等の膜組織の蓄積が観察されたため軸索輸送の障害が疑われた。また、リボソームや核など細胞質に局在し軸索輸送されないはずの小器官が軸索膨大部に混入する所見が見られたことから、HuC KOでは軸索起始部(AIS)における細胞質・軸索間拡散障壁の機能不全が起こっていると予測された。そこで、以前に実施したRIP-CHIP法およびHITS-CLIP法により同定されたHuCの標的RNAのうち軸索輸送(KIF3A、KIF3C)、細胞質・軸索間拡散障壁(Ankyrin-G)に関与する可能性のある因子について解析を行った。HuC KOマウスのプルキンエ細胞ではKIF3A、3Cの発現が野生型に比べて有意に低下しており、培養細胞におけるKIF3A、3Cの強制発現実験により軸索変性を一部是正できることが示された。一方、HITS-CLIP法の結果(Ince-Dunn G, Okano HJ et al. Neuron. 2012)から、Huタンパク質はAnkyrin-G hnRNAのイントロン配列に特異的に結合してエクソン34の選択的スプライシングを調節することが示されている。KOマウス小脳RNAを用いたRT-PCRを実施したところ、野生型と比較してKOではエクソン34(11アミノ酸)を含有したバリアントが増加していることが示された。さらに抗Ankyrin-G抗体を用いた免疫組織染色により、KO特異的なAnkyrin-Gの細胞内局在異常が見られた。今後、Ankyrin-Gと結合するナトリウムチャネル(Nav1.6)およびスペクトリンのKOマウスプルキンエ細胞における局在を詳細に調べることによりAISの機能異常を示す知見が得られるものと期待している。

同バリアントは胎生期に多く発現するものの成体脳では極めて少ないため、HuC KO小脳では異時性に"胎仔型Ankyrin-G"が出現していると言える。我々はこれまでにHITS-CLIP法を用いた標的探索によりAnkyrin-GがHuによる選択的スプライシング制御を受けることを明らかにしており(Ince-Dunn G, Okano HJ et al. Neuron 2012)、Huタンパク質の欠失によりAIS機能の低下が起こっている可能性が強く示唆される。本研究は順調に進展しており、1年目の研究目的をほぼ達成した26年度の研究結果では、7ヶ月齢,12ヶ月齢HuC KOマウス小脳の電子顕微鏡解析によりプルキンエ細胞の軸索膨大部において多くの細胞質小器官の蓄積が観察されたため、当初は軸索輸送障害を疑っていたが、細胞質・軸索拡散障壁の障害との関連性をも疑わせる知見が得られた。本研究は新たな段階に進んだといえ、当初の計画以上に進展している。これらのデータをもとに、27年度の研究計画では大きな発展が期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。軸索変性と軸索起始部(AIS)における拡散障壁機能障害との関連性を明らかにするために、1HuC KOマウスプルキンエ細胞におけるAnkyrin-G、ナトリウムチャネル(Nav1.6)およびスペクトリンの細胞内局在を詳細に調べる。2生化学的手法によりAnkyrin-G(エクソン34有りおよび無し)とナトリウムチャネル、スペクトリンとのタンパク質間相互作用を検討する。3Ankyrin-G(エクソン34有り、無し)を、HuC KOおよび野生型マウスプルキンエ細胞において強制発現させ軸索変性の消失、出現を検討する。
大腸菌感作ウサギ関節炎における関節炎発症機序に関する研究

大腸菌感作により家兎に関節炎を発症せしめその病態を解析してきた。NZW(ニュ-ジ-ランドホワイト)純系家兎雌の背部筋肉内に大腸菌0:14株100°C、2時間加熱死菌2mg/2mlをFreundの不完全アジュバントと等量混和した抗原液を月1回の割合で投与し経時的に観察した。膝関節滑膜における組織学的変化では、短期感作(4カ月)で滑膜表層細胞の多層化は62.5%(20/32膝)、表層細胞下の浮腫は50.0%(16/32膝)、滑膜表層におけるフィブリノイドの沈着は59.4%(19/32膝)、滑膜へのリンパ球浸潤は31.3%(10/32膝)に認められた。長期感作(810カ月)では表層細胞の多層化は80.6%(29/36膝)、浮腫は75.0%(27/36膝)、フィブリノイド沈着は61.1%(22/36膝)に認められた。滑膜へのリンパ球浸潤は61.1%(22/36膝)と短期感作家兎に比べ有意(P<0.05)に高い出現率を示した。膝関節軟骨および関節半月の変化は、短期感作(14カ月)で軟骨表層の変化は0%、パンヌス様織の侵入は17.6%(6/34膝)に認められた。一方長期感作(810カ月)では軟骨表層の変性は22.2%(8/36膝)、パンヌス様組織の侵入は27.8%(10/36膝)に認められた。血清中リウマチ因子様物質は感作開始後3週より出現し始め、15週では90.9%(20/22羽)に認められた。血清中リウマチ因子様物質が8週以前の早期に出現した家兎では滑膜へのリンパ球浸潤は81.2%(9/11羽)で、8週以後の後期に出現した家兎の18.2%(2/11羽)に比べ有意(0.05>に高い出現率を示した。また長期感作例では、滑膜表層にIgG沈着が36膝中20膝(55.6%)、滑膜でのIgG陽性形質細胞浸潤は36膝中9膝(25.0%)に見られた。以上大腸菌感作家兎関節炎の経時的病態変化が明らかとなった。本関節炎は慢性関節リウマチに類似しており有用な疾患モデルである。慢性関節リウマチの動物モデルとして大腸菌O:14株加熱死菌を家兎に感作し,慢性関節炎を発症せしめた.大関節である膝には4ヵ月で組織学的に潰瘍表層細胞の多層化,表層下の浮腫,表層へのフィブリノイド沈着が認られた.

感作10ヵ月では滑膜へのリンパ球浸潤がこれらに加わり,免疫組織学的に表層のフィブリノイド沈着部で1gGやフィブリノーゲンの局在が観察された.また局所での形質細胞によるIgG産生所見も認められRA類似の滑膜等が形成された.一方血清中には感作後3週よりリウマドイド因子様物質(以下RFLS)が出現しはじめ,感作4ヵ月では90.9%に陽性となった.これは家兎変性IgGで感作したヒツジ赤血球を凝集せしめるものでヒトRAにおけるリウマトイド因子と同様な活性を示したと言える.以上の結果を踏まえて,今後はRFLSの関節炎発症における役割をさらに詳細に検討すべく, 1.関節内におけるRFLSの動態の把握, 2.RFLS性状分析等を行っていく予定である.具体的に延べると1.免疫組織化学的に滑膜におけるRFLS活性物質の局在を検索する.大腸菌感作後血清RFLSが出現した時点において膝関節に薬剤注入や関節内処置を加えて血管透過性を高めRFLSを関節内に誘導し,その動態を観察する.2.酵素抗体法(ELISA法)を用いてRFLSの各種IgGへの反応態度の分析および免疫グロブリンとしてのサブクラスを決定する,などを次年度研究の予定とする.大腸菌感作により家兎に関節炎が発症することを報告してきた。NZW家兎雌の背部筋肉内に大腸菌0:14株100°C、2時間加熱死菌2mg/2mlを月1回の割合で投与し、4カ月の短期感作および810カ月の長期感作を行った。家兎膝関節に対して、HE染色および螢光抗体法を用いたIgG、fibrinogenの染色を行った。短期感作(4カ月)で滑膜表層下の浮腫が50%(16/32膝)、リンパ球浸潤が31.3%(10/32膝)、パンヌス形成が16.7%(6/34膝)に認められた。長期感作(810カ月)では表層へのIgG沈着が55.6%(20/36膝)、fibrinogenの沈着が58.8%(10/17膝)に生じた。一方リンパ球浸潤は61.1%(22/36膝)に認められ短期感作より有為(p<0.05)に高率であった。血清中には感作後3週よりリウマチ因子様物質(以下RFLS)が出現し始め、感作4カ月では90.9%に陽性となった。感作開始後8週以前の早期に陽性となる群(RFLS早期陽性群)と8週以後に陽性となる群(RFLS後期陽性群)とに分けると、膝関節滑膜におけるリンパ球浸潤の陽性率はRFLS早期陽性群では81.2%(9/11羽)と、RFLS後期陽性群の18.2%(2/11羽)に比し有意(p<0.05)に高かった。以上の結果より大腸菌感作家兎は、何らかの機序をもって滑漠の血管透過性の亢進が生じ急性関節炎を繰返し、長期感作を経てリンパ球浸潤を得、慢性関節炎を形成するものと推察された。さらに本関節炎発症の一条件としてRFLSの長期にわたる血清中での存在が重要であると考えられ、さらにRFLSを大腸菌の感作早期より産生せしめうる未知の固体的素因も本関節炎発症に深い関係があるものと推察された。大腸菌感体期間が長期(810ヶ月)の家兎において、蛍光抗体法および酵素抗体法により滑膜表層におけるIgGの沈着が36膝中20膝(55.6%)、滑膜へのIgG陽性の形質細胞浸潤が36膝中9膝(25.0%)に認められた。さらに軟骨にパンヌス様組織が36膝中10膝(27.8%)に認められ、このうち10膝にはIgGの局在が観察された。また軟骨の表層変性が36膝中8膝(22.2%)ありこのうち5膝にIgGの局在が認められた。以上長期感作を行った家兎の屠殺時の血清リウマチ因子様物質(RFLS)の陽性率は88.9%(16/18羽)であった。これらの事実より滑膜および軟骨表層へのIgG沈着は血清因子としてのIgG-RFLS免疫複合体の可能性が示唆され、さらに一部局所滑膜にて産生されたIgGもこれに加わり慢性炎症巣を形成するものと考えられる。慢性関節リウマチ(RA)においては、軟骨組織内にリウマチ因子および抗コラ-ゲン抗体の局在が認めれており、これらが関節内に長期間とどまることによってRAの自己再燃性および慢性化が生じるとする説がある。さらにこれらの抗体および免疫複合体が局所での軟骨破壊に一定の役割を果たしている可能性も考えられる。したがって本関節炎においても軟骨表層に局在するIgGの抗原特異性を特定することが大切である。
胃腺粘液糖鎖αGlcNAcの消失による胃がん悪性化の制御機構

がんは、本邦で死因の第1位である。胃がんは、早期に発見・切除すれば5年生存率は90%以上であるが、がん死の原因としては第2位であり致死人口が高い。従って胃がんの早期診断法・治療法ならびに予防法の確立は急務である。本研究グループではこれまでに、マウスの個体レベルならびにヒト胃がん患者の病理学的解析の結果から、胃腺粘液特異的糖鎖αGlcNAc産生量の低下が、分化型胃がんの発症および悪性度と密接に相関していることを報告してきた。本年度は、1)病理学的手法で示されたαGlcNAcの消失が胃がんの悪性化に関与している可能性を培養細胞レベルで証明できるか否か、2)できるとすればどのような分子機構で関与しているのか、を調べるため、中分化型胃がん細胞株AGSを用いて解析を行った。本研究課題では、最終的に、培養細胞を用いた研究から得られた結果を基に、早期胃がん診断法、新規治療法の開発へと繋げる基礎的知見を得ることを目標としている。胃がん細胞株でのαGlcNAc産生量と、がん細胞の悪性形質の関係について解析するため、αGlcNAcの産生が認められない中分化型胃がん細胞株AGSでTet-Onシステムを用いてαGlcNAcの産生量を調節し、その形質について解析を行った。その結果、αGlcNAcの産生によりin vitro細胞増殖能のわずかな低下、マトリゲル浸潤能の低下、細胞外基質への接着能のわずかな上昇を認めた。さらに、この分子メカニズムを解析するため、AGS細胞内でαGlcNAcが結合しているタンパク質の同定を試みたところ、膜結合型ムチンであるMUC-1にαGlcNAcが結合していることを見出した。以上の結果は、αGlcNAc産生量の変化が胃がんの悪性度を制御している可能性を示唆している。本年度は、胃がん細胞株でのαGlcNAc産生量と、がん細胞の悪性形質との関係について解析するため、αGlcNAcの産生が認められない中分化型胃がん細胞株AGSにαGlcNAc生合成に必須な酵素α4GnTをTet-Onシステムを用いて発現させることによりαGlcNAcの産生を調節し、その形質について解析を行った。Tet-Onシステムによるα4GnT発現AGS細胞の構築はレトロウイルスベクターを用いて行い、ドキシサイクリン(Dox)添加後の細胞表層でのαGlcNAcの産生を指標として、磁気ビーズを用いて細胞を選択した。初めに、得られた細胞へのDox添加の有無による、がん細胞の形質への影響について解析した。その結果、αGlcNAcの産生によりin vitro細胞増殖能はわずかに低下した。次に、トランスウェルを用いて細胞の運動能とマトリゲル浸潤能について解析を行ったところ、αGlcNAcの産生により運動能には差を認めなかったが、αGlcNAc陽性細胞は陰性細胞と比べてマトリゲル浸潤能が有意に低下した。さらに、種々の細胞外基質への接着能について解析したところ、αGlcNAcの産生により、細胞外基質への接着能のわずかな上昇を認めた。次に、この分子メカニズムを解析するため、AGS細胞内でαGlcNAcが結合しているタンパク質の同定を試みた。その結果、Doxの添加により、膜結合型ムチンであるMUC-1にαGlcNAcが結合していることを見出した。MUC-1は、がん細胞の悪性形質を制御する分子として知られており、MUC-1へのαGlcNAcの結合が、AGS細胞での形質変化に関与している可能性が示唆された。以上より、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。本年度は、当初予定に比べ、in vitroでの細胞レベルの解析が中心となった。これまでの解析から、AGS細胞内でαGlcNAcが結合しているタンパク質はMUC-1のみではなく、未知のタンパク質も存在することが明らかになっているため、次年度は、これらのαGlcNAc結合タンパク質の同定も試みる。また、細胞内シグナル伝達変化や遺伝子発現量変化について解析を行い、本年度に得られた形質変化の分子メカニズムを明らかにする。さらに、AGS細胞のみならず、他の細胞株でも同様の実験を行い、がん細胞の分化度の違いとαGlcNAc産生量の違いによる形質変化の関係について考察する。in vivoでの造腫瘍能については現在条件検討中であり、次年度はこの解析を進める予定である。このことにより、αGlcNAcのがん細胞での産生量とin vivoでの造腫瘍能との関係について考察する。

本年度は、1)病理学的手法で示されたαGlcNAcの消失が胃がんの悪性化に関与している可能性を培養細胞レベルで証明できるか否か、2)できるとすればどのような分子機構で関与しているのか、を調べるため、中分化型胃がん細胞株AGSを用いて解析を行った。本研究課題では、最終的に、培養細胞を用いた研究から得られた結果を基に、早期胃がん診断法、新規治療法の開発へと繋げる基礎的知見を得ることを目標としている。胃がん細胞株でのαGlcNAc産生量と、がん細胞の悪性形質の関係について解析するため、αGlcNAcの産生が認められない中分化型胃がん細胞株AGSでTet-Onシステムを用いてαGlcNAcの産生量を調節し、その形質について解析を行った。その結果、αGlcNAcの産生によりin vitro細胞増殖能のわずかな低下、マトリゲル浸潤能の低下、細胞外基質への接着能のわずかな上昇を認めた。さらに、この分子メカニズムを解析するため、AGS細胞内でαGlcNAcが結合しているタンパク質の同定を試みたところ、膜結合型ムチンであるMUC-1にαGlcNAcが結合していることを見出した。以上の結果は、αGlcNAc産生量の変化が胃がんの悪性度を制御している可能性を示唆している。本年度は、胃がん細胞株でのαGlcNAc産生量と、がん細胞の悪性形質との関係について解析するため、αGlcNAcの産生が認められない中分化型胃がん細胞株AGSにαGlcNAc生合成に必須な酵素α4GnTをTet-Onシステムを用いて発現させることによりαGlcNAcの産生を調節し、その形質について解析を行った。Tet-Onシステムによるα4GnT発現AGS細胞の構築はレトロウイルスベクターを用いて行い、ドキシサイクリン(Dox)添加後の細胞表層でのαGlcNAcの産生を指標として、磁気ビーズを用いて細胞を選択した。初めに、得られた細胞へのDox添加の有無による、がん細胞の形質への影響について解析した。その結果、αGlcNAcの産生によりin vitro細胞増殖能はわずかに低下した。次に、トランスウェルを用いて細胞の運動能とマトリゲル浸潤能について解析を行ったところ、αGlcNAcの産生により運動能には差を認めなかったが、αGlcNAc陽性細胞は陰性細胞と比べてマトリゲル浸潤能が有意に低下した。さらに、種々の細胞外基質への接着能について解析したところ、αGlcNAcの産生により、細胞外基質への接着能のわずかな上昇を認めた。次に、この分子メカニズムを解析するため、AGS細胞内でαGlcNAcが結合しているタンパク質の同定を試みた。その結果、Doxの添加により、膜結合型ムチンであるMUC-1にαGlcNAcが結合していることを見出した。MUC-1は、がん細胞の悪性形質を制御する分子として知られており、MUC-1へのαGlcNAcの結合が、AGS細胞での形質変化に関与している可能性が示唆された。以上より、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。本年度は、当初予定に比べ、in vitroでの細胞レベルの解析が中心となった。これまでの解析から、AGS細胞内でαGlcNAcが結合しているタンパク質はMUC-1のみではなく、未知のタンパク質も存在することが明らかになっているため、次年度は、これらのαGlcNAc結合タンパク質の同定も試みる。また、細胞内シグナル伝達変化や遺伝子発現量変化について解析を行い、本年度に得られた形質変化の分子メカニズムを明らかにする。さらに、AGS細胞のみならず、他の細胞株でも同様の実験を行い、がん細胞の分化度の違いとαGlcNAc産生量の違いによる形質変化の関係について考察する。
持続可能な生物多様性農村社会共創のための経済システム設計

本研究の目的は、自発的・持続的に稀少性生物を育み、生物多様性農村社会を共創する経済システムの設計を理論・実験室実験・エージェントシミュレーション・フィールド調査・社会実験の相互フィードバックから検証することである。稀少性生物の保護を含め、生物多様性を維持するための農業は国家的補助政策を過度な拠り所とし、それを農村社会が自発的かつ持続的に内包し、農村の主幹産業と共生させるために必要なプラットフォームが未だ整っていない。この課題解決のために、本研究では、稀少性生物の代表例たる朱鷺を育む農村である佐渡とその主幹産業である稲作をモデルケースとし、(1)消費者の生物多様性保全への価値を計測し、(2)不確実性下での生物多様性保全に対する生産者努力を動学的に検証し、(3)持続可能な生物多様性農村社会共創のための経済システムを提言する。本年度は課題1の実験結果の頑健性(仮想バイアス)を検証するため、同内容を全国規模のインターネット調査によって検証した。また、課題2では初年度の理論モデルと課題3のフィールド調査の結果を踏まえて生産関数などをリファイメントし、理論モデルの帰結を被験者実験によって検証し、シミュレーションした。課題3では、課題2の実験システムを基盤として、社会的に最適な生物の数へと近づけるための経済システムを検証した。インターネット調査からは食味や色や外見などよりも生産のために使われているエネルギーが重要であることが分かった。また、消費者は有機栽培に価値を置くことが分かった。さらに、生産関数としてエネルギーを投入要素として入れ込んだコブダグラス型の生産関数をもち、エネルギーの消費選好を反映したマルチエージェントの相互作用から、バイオマスの普及率が太陽光よりも上がる場合に、生物多様性が最大となる、効用関数が存在することを示した。当初の計画通りに実験が進んでいるため課題3に関するマルチエージェントシミュレーションと社会実験を実施し、3年間の成果をまとめる。まず、実験結果を定性的にサポートするために先に開発したシミュレーションに被験者の行動パタンーンを反映させて、シミュレーションを行い、結果を比較・検証する。次に、社会実験では各システムが需要に与える影響を検証することに主眼を置き、フィールド実験を行う。実験因子として制御する制度は課題2の4つの情報制御因子を基礎とし、次のように現実的整合性を担保する。1第三者認証では、朱鷺との共生認証マークと有機栽培のオーガニックラベルを組み合わせる。2生産者の自主規制では、生産者が朱鷺のために行っている努力をパンフレットで紹介する。3消費者同士の情報交換制度では、佐渡米に対する情報交換を可能なSNSや店頭掲示板を立ち上げる。4生産者による生産過程を公開する制度では、佐渡米の製造過程を写真、ビデオに収め、生産者から消費者に向けてメッセージを送ってもらい、それを店頭で流す。以上の制御因子下で販売する米の容量を1kgとして、情報公開制度と販売利益の関係を検証する。フィールド実験からPOSデータを取得し、データはパネル分析し、Difference-in-Difference推定からトリートメント効果を検証する。課題1「消費者の生物多様性保全の価値評価」では消費者に対する選択行動実験のプレテストを完了させ、消費者の属性による行動の違いを検証できた。課題2「生産者の生物多様性の保全努力の検証」では、若手Bで開発した同時手番のナッシュ均衡を前提とした消費者と生産者の安全確保努力モデルを不確実情報下の逐次手番のモデルへと拡張した。課題3「農村社会共創のための経済システム設計」では、朱鷺以外の国内外の事例をサーベイし、制度としての共通点や長短をまとめた。代表者の所属機関変更による資金移管のため、代表者を主体とする課題の実施に支障を来たす可能性が発生したため、分担者による実行である程度代替し、かつ費用が比較的発生しない課題の遂行を前倒しにした。これにより、全体の計画の遂行はおおむね計画通りである。

さらに、生産関数としてエネルギーを投入要素として入れ込んだコブダグラス型の生産関数をもち、エネルギーの消費選好を反映したマルチエージェントの相互作用から、バイオマスの普及率が太陽光よりも上がる場合に、生物多様性が最大となる、効用関数が存在することを示した。当初の計画通りに実験が進んでいるため今後は、代表者の所属機関変更により遂行順位を変更した課題の遂行に努める。課題3に関するマルチエージェントシミュレーションと社会実験を実施し、3年間の成果をまとめる。まず、実験結果を定性的にサポートするために先に開発したシミュレーションに被験者の行動パタンーンを反映させて、シミュレーションを行い、結果を比較・検証する。次に、社会実験では各システムが需要に与える影響を検証することに主眼を置き、フィールド実験を行う。実験因子として制御する制度は課題2の4つの情報制御因子を基礎とし、次のように現実的整合性を担保する。1第三者認証では、朱鷺との共生認証マークと有機栽培のオーガニックラベルを組み合わせる。2生産者の自主規制では、生産者が朱鷺のために行っている努力をパンフレットで紹介する。3消費者同士の情報交換制度では、佐渡米に対する情報交換を可能なSNSや店頭掲示板を立ち上げる。4生産者による生産過程を公開する制度では、佐渡米の製造過程を写真、ビデオに収め、生産者から消費者に向けてメッセージを送ってもらい、それを店頭で流す。以上の制御因子下で販売する米の容量を1kgとして、情報公開制度と販売利益の関係を検証する。フィールド実験からPOSデータを取得し、データはパネル分析し、Difference-in-Difference推定からトリートメント効果を検証する。代表者の所属機関変更による資金移管のため、研究に科研費を利用できない期間が生じた。このため、研究がストップした。来年度のフィールド実験のために本年度はマルチエージェントシミュレーションにおいて基礎設計のみに特化したため、来年度に実験費用を回すから。
有機バイオサイドと銅による相乗的な毒性作用メカニズムの理解

1、新規防汚剤トラロピリル(TLP)の水中での安定性を評価した。水中のTLPとその主要な分解産物CLを分離定量する方法を、蛍光検出器付HPLCを用いて開発した。人工海水中のTLPの半減期は高水温および高pH条件下でより短く、酸性下では分解しなかった。太陽光近紫外線(UVA)は海水中のTLPの分解に影響しなかったが、天然淡水中でのTLPの分解を促進した。TLPは分解に伴ってCLを生成し、CLはUVA照射によって分解した。2、水生生物に対してTLPおよび防汚剤の亜鉛ピリチオン(ZnPT)は強い阻害を示したが、TLPの分解産物による阻害は極めて弱かった。藻類増殖に対するTLPの有害性は経時的に減少したことから、TLPは暴露初期に迅速に分解したと考えられた。カキの幼生に対してTLPは強い影響を及ぼした。1時間暴露でのウニ受精率に対するTLPのEC50は、ZnPTに比較して8倍程度であり、48時間暴露後の発生に対するTLPのEC50は、ZnPTの5倍程度であった。このようにウニの受精・発生に対しては、TLPよりもZnPTの方が強い影響を示した。3、防汚剤の銅ピリチオン(CuPT)の分解産物であるHPTは、銅イオンが存在すると容易にCuPTを生成した。有機物フリーで塩分濃度が高い海水中では、CuPTは塩水性甲殻類に対して強い急性致死影響を示した。CuPTの毒性は供試海水中の有機物濃度、塩分濃度だけでなく、塩類組成によっても有意に影響を受けることを明らかにした。TLPおよびZnPTがそれぞれ銅と共存した場合のウニの受精・発生に対する影響を評価した。1時間暴露でのウニ受精率に対するTLPの毒性に対して、銅は有意な影響を及ぼさなかった。一方、ZnPTの毒性は銅が共存した場合には10倍程度増強し、銅イオンがZnPTと反応してより毒性の強いCuPTを生成したと考えた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。新規防汚剤を対象として、環境残留、生物蓄積性、生態毒性について文献調査を実施した。本研究で研究対象とする防汚剤を銅ピリチオンとトラロピリル(Tralopyril:TLP)に絞り込んだ。1銅ピリチオン:ピリチオンと銅をそれぞれ人工海水に添加し、塩水性甲殻類への致死影響を評価した。単独で存在する時、両化合物は共に3uM以下で致死影響を及ぼさなかったが、この濃度で両化合物を共存させると致死率は最大80%程度となった。両化合物を共存させた海水中では、化学量論的に銅ピリチオンが生成していたので、本物質が致死影響をおよぼす原因物質と考えた。この反応を天然海水中で評価したところ、人工海水で観察した結果とは異なり、天然海水中の溶存有機物濃度と主要カチオンの濃度バランスによって銅ピリチオンの致死影響が大きく影響を受けた。2トラロピリル(TLP): TLPと主要な分解産物(CL)を入手し、蛍光分光光度計により三次元蛍光スペクトルを得た。セミミクロHPLCを用いた両化合物の最適な分離方法と検出方法を検討し、10分間で完了できる分析方法を開発した。この方法では、TLPとCLの装置の定量限界濃度(IQL)をそれぞれ算出した。淡水産藻類に対する増殖阻害試験を行ったところ、72時間の50%影響濃度(72h-EC50)を設定濃度から求めると5070 ug/lであった。最高濃度100 ug/lでは、試験開始後15時間にはTLPは完全分解してほぼ全量がCLに変換されており、24時間で完全な増殖阻害が観察された。このように分解性が極めて高いことから、実測濃度を用いて72h-EC50を求めることが困難であった。そこで、有害性を短期で評価できる試験方法で評価することが必要である。人工海水中での銅とピリチオンの甲殻類の致死に対する相乗作用について実験を行い、致死影響を生じる原因物質を銅ピリチオンと同定した。天然海水を用いた実験では異なる結果が示されたことから、実環境中での両化合物の化学反応及び生物への有害性を理解するには、実環境中のパラメータの理解が必要であることが示された。新規防汚剤TLP及びその主要な分解産物CLを入手でき、両化合物の迅速な分析方法を確立できた。今後、水中での安定性を評価し、さらに環境生物への影響を定量的に評価するためにこの分析方法を用いる。防汚剤であるトラロピリル(TLP)およびTLPの分解産物、ジンクピリチオン(ZnPT)、銅を供試し、イワガキおよびウニの胚の初期発生に対する影響を評価した。夏、秋、冬に成熟したウニ(それぞれタコノマクラ、アカウニ、バフンウニ)を供試して、精子を1時間暴露した後に受精させる試験(受精試験)、受精卵を48から72時間暴露する試験(初期発生試験)を行った。受精試験では受精率を、初期発生試験では発生の遅れ、形態異常個体、プルテウスの成長を指標として評価した。受精率に対する影響は、初期発生に対する影響に比べて感受性が低かった。

3種類の防汚剤は、単独でいずれも有意な影響を示し、例えば、TLP(1100 ug/l)は25 ug/l以上では発生が極端に遅れ、異なる発生段階の胚が観察され、正常なプルテウス幼生は認められなかった。一方、TLPの分解産物(100 ug/l)は、ウニの精子に対しても初期発生に対しても有意な影響を示さなかった。供試した3種類のウニに対する毒性試験結果には顕著な差はなかった。タコノマクラの初期発生に影響しない銅の濃度(5ug/l)を供試し、TLP(1.6100 ug/l)と銅を混合した場合、およびZnPT(0.130 ug/l)と銅を混合した場合の毒性影響を評価した。銅はTLPの有害性に顕著な影響を及ぼさなかったが、ZnPTの有害性を顕著に増大させた。この現象は、銅とZnPTから生成した銅ピリチオンがより強い有害性を示したと考えられた。毒性試験の結果を実測濃度で解析するために、TLPおよび分解産物の濃度を蛍光検出器を装着したLCを用いて定量する方法を開発し、加水分解曲線を作成した。このモデルを元にして、短時間で加水分解するTLPの濃度を推定し、毒性試験から得られる影響濃度を算出した。ウニを用いた試験法を導入して、公的試験法に準じた試験法をほぼ完成させた。一方、カキを用いた試験では受精率が極端に低く、試験法を確立できなかった。ウニ試験は簡便で感受性が高いので、この試験を用いて有機防汚剤と銅の相互作用を評価し、設定濃度を元に毒性試験結果を評価できた。毒性試験の結果は、防汚剤の(あるいは活性物質の)実測濃度を元に解析することが一般的であるが、TLPは極めて迅速に加水分解することと、親化合物の分解量と分解産物の生成量が化学量論的に合わなかった。この分析技術上の困難さから、本年度に予定していた水中での安定性評価(加水分解性、光分解性)の解析は次年度に行うこととしたい。1、新規防汚剤トラロピリル(TLP)の水中での安定性を評価した。水中のTLPとその主要な分解産物CLを分離定量する方法を、蛍光検出器付HPLCを用いて開発した。人工海水中のTLPの半減期は高水温および高pH条件下でより短く、酸性下では分解しなかった。太陽光近紫外線(UVA)は海水中のTLPの分解に影響しなかったが、天然淡水中でのTLPの分解を促進した。TLPは分解に伴ってCLを生成し、CLはUVA照射によって分解した。2、水生生物に対してTLPおよび防汚剤の亜鉛ピリチオン(ZnPT)は強い阻害を示したが、TLPの分解産物による阻害は極めて弱かった。藻類増殖に対するTLPの有害性は経時的に減少したことから、TLPは暴露初期に迅速に分解したと考えられた。カキの幼生に対してTLPは強い影響を及ぼした。1時間暴露でのウニ受精率に対するTLPのEC50は、ZnPTに比較して8倍程度であり、48時間暴露後の発生に対するTLPのEC50は、ZnPTの5倍程度であった。このようにウニの受精・発生に対しては、TLPよりもZnPTの方が強い影響を示した。3、防汚剤の銅ピリチオン(CuPT)の分解産物であるHPTは、銅イオンが存在すると容易にCuPTを生成した。有機物フリーで塩分濃度が高い海水中では、CuPTは塩水性甲殻類に対して強い急性致死影響を示した。CuPTの毒性は供試海水中の有機物濃度、塩分濃度だけでなく、塩類組成によっても有意に影響を受けることを明らかにした。TLPおよびZnPTがそれぞれ銅と共存した場合のウニの受精・発生に対する影響を評価した。1時間暴露でのウニ受精率に対するTLPの毒性に対して、銅は有意な影響を及ぼさなかった。一方、ZnPTの毒性は銅が共存した場合には10倍程度増強し、銅イオンがZnPTと反応してより毒性の強いCuPTを生成したと考えた。
局所ナノパルス電界場における酵母細胞の動態変化および遺伝子発現の検証

本研究は、マイクロリアクタ内に精密配置した酵母細胞にナノパルス電界を印加して、その動態変化を計測するとともに、細胞モデル解析及び増幅遺伝子評価から局所瞬時電界と遺伝子発現の相関を検証するものである。主要な成果として、波形の精密制御が可能なパルス電源の開発に成功した。また、標準粒子を用いて分散配列条件やパルス幅の可変限界を特定した。ストレス変化による膜損傷状態及び呼吸活性を核酸染色応答によって分類した。さらに細胞数値モデルを用いて、膜変性による電気特性の変動を定量化し、PCR法による主要因遺伝子を検証した。本研究の目的は、マイクロリアクタ内に精密配置した酵母細胞にナノパルス電界を印加して、その動態変化を計測するとともに、細胞モデル解析及び増幅遺伝子評価から局所瞬時電界と遺伝子発現の相関を検証するものである。要素技術の確立から、動態変動の制御に至る研究を、【課題1パルス電源製作】(ナノパルス電源装置の設計・製作)、【課題2印加試験・動態計測】(酵母細胞に対するパルス電界印加試験及び細胞動態変化の染色計数計測)及び【課題3モデル解析・発現評価】(細胞数値モデルの構築、電界照射量の数値解析及び遺伝子発現のPCR評価)における諸項目の達成と連携によって推進した。本年度(平成24年度)は、昨年度に得られた基本的知見と試作したナノパルス印加装置を用いて、パルス印加による細胞動態変化の実証試験と特性評価を遂行するため、(1)リアクタ端子間と結合した一体型電源への改造、(2)標準粒子に対する泳動配列及びパルス印加試験と装置の性能評価、(3)パルス印加条件に対する染色酵母細胞の動態観察、(4)遺伝子解析と数値解析の比較による局所瞬時電界と遺伝子発現の相関検証、を行った。(1)に関しては、ブスバー構造を有するリアクタを用いて負荷変動を低減し、パルス印加試験の再現性を向上させた。(2)に関しては、(1)で試作した電源系において、ポリスチレン蛍光粒子やコロイド状金属ナノ粒子などを用い,誘電泳動のよる分散配列条件を精査した。また、パルス幅の可変限界を特定した。(3)に関しては、ストレス変化による膜損傷状態及び呼吸活性を核酸染色応答によって分類した。(4)に関しては、細胞数値モデルを用いて、膜変性による電気特性の変動を定量化し、PCR法による主要因遺伝子を検証した。以上、2年間の研究活動を通して、本研究費を効果的に活用し、当初設定した研究計画をほぼ遂行することができたと言える。要素技術の確立から、ナノパルス実験での検証に至る一連の研究に対して、【課題1パルス電源製作】(ナノパルス電源装置の設計・製作)、【課題2印加試験・動態計測】(酵母細胞に対するパルス電界印加試験及び細胞動態変化の染色計数計測)及び【課題3モデル解析・発現評価】(細胞数値モデルの構築、電界照射量の数値解析及び遺伝子発現のPCR評価)における各目標を達成するとともに、課題間の密接な連携によって研究全体を推進する計画である。本年度(平成23年度)は要素技術の確立を主目的として、(1)回路パラメータ計測とナノパルス発生回路の設計、(2)半導体ナノパルス電源の試作評価、(3)マイクロリアクタの設計・試作及び印加試験、(4)細胞数値モデルの構築及び細胞電気定数の導出を行った。(1)に関しては、模擬負荷におけるインピーダンス及び位相角を確認し、論理回路ゲートアレイを利用したナノパルス発生回路を設計した。(2)に関しては、(1)で得られたデータを元に、波形の精密制御が可能なパルス電源(最大電圧振幅100 V、最小パルス幅80 ns)の開発に成功した。(3)に関しては、ギャップ0.2 mmの耐圧処理リアクタを新たに作成し、印加試験を実施した。(4)に関しては、大腸菌及び酵母に対する細胞数値モデルを構築し、電圧振幅に対応した定常静電界分布を導出した。また、交流インピーダンス計測を行い、パルス幅に対する動態変化とインピーダンスの相関を定量的に示した。【課題1パルス電源製作】において、設計試作した波形可変パルス電源は当初予定していた最小パルス幅に迫る出力が実現されている。最大電圧振幅については、十分な値であるとは言えないが、リアクタ一体型電源の設計を最適化することにより、更なる改善が可能であると考えている。なお、本研究成果の一部は、新規性・有用性の観点から学術的価値があり、電気学会論文誌D(産業応用部門誌)に掲載されている(13.研究発表の項を参照)。【課題2印加試験・動態計測】に関しては、蒸着・エッチング工程による電極作成ではなく、より簡易な組み立て式を採用し、細胞処理に適したマイクロリアクタを設計試作した。

さらに、課題1で作成した波形可変パルス電源と接続して、実際にパルス印加実験を行い、パルス幅に対する代謝活性(主に生殖活性)の変化を核酸染色により確認することができた。本結果の詳細は国際会議(International Union of Microbiological Societies 2011 Congress)および国内会議(電気学会パルスパワー・放電研究会)にて発表している(13.研究発表の項を参照)。【課題3モデル解析・発現評価】については、当初予定していた多層膜の細胞数値モデルの構築は完了できた。実験的検証として、インピーダンス変化との整合性も確認されたため、構築した細胞モデルの妥当性が示されたと言える。定常時のリアクタおよび細胞内の電界分布については、静電界解析から導出できた。ただし、時間変化を伴う解析への対応には課題が残っており、次年度も引き続き検討を進めて行く予定である。以上より、本年度の研究においては当基金を有効に活用し、到達目標を概ね達成できていると言える。次年度(平成24年度)は、本年度に得られた基本的知見とナノパルス印加試作機を用いて、ナノパルス印加による細胞動態変化の実証試験を遂行するため、各設定課題に対して以下の取り組みを行う。【課題1パルス電源製作】電源とマイクロリアクタ間の配線インダクタンスを低減するため、リアクタ端子間と結合した一体型波形可変電源に改造する。さらに前処理として誘電泳動操作による酵母の精密配列を行うため、一体型電源に交流電圧(電圧振幅5 V、周波数100 kHz)との波形交替機能を持つ半導体スイッチ回路を実装する。【課題2印加試験・動態計測】上記課題にて、製作した波形交替型マイクロリアクターナノパルス電源を用い、ポリスチレン標準粒子(粒径2ミクロン)に対する泳動配列及びパルス印加操作の試験を行い、泳動状況やパルス波形のひずみから装置性能を評価する。更に電圧振幅、パルス幅やパルス数などのパルス印加条件に対する染色酵母細胞の動態変化(膜損傷・不活性化)をフローサイトメーターにより連続的に計数計測する。【課題3モデル解析・発現評価】本年度に構築した細胞数値モデル及び誘導電界計算コードを用いて実験条件における数値解析を実施し、細胞内に誘導される電界の時間発展及び空間分布を把握する。また、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により得られる発現遺伝子の情報を上述の数値解析結果と比較し、局所瞬時電界と遺伝子発現の相関を検証する。上記で示した研究の推進方策に基づいて、ナノパルス印加による細胞動態変化の実証試験を遂行するため、次年度の研究費を以下の項目で使用する予定である。<消耗品費>菌体用試薬(培地、アルコール等)・容器(シャーレ、遠沈管、ピペットチップ等):酵母の培養・調整・保管に使用する。リアクタ材料(ガラス板、Ag及びNi粒、銅端子等):リアクタの構成部品として購入する。半導体素子・制御部品(MOSFET、FPGA、スイッチング素子、電子基板、抵抗、電界コンデンサ等):ナノパルス電源の構成部品として購入する。PCR用試薬キッド: PCR計測における酵母の遺伝子同定に用いる。フローサイト用試薬:フローサイト計測における酵母染色剤として選定したものを購入する。<国内・外国旅費>
Modeling the Habitat Suitability of Adelie penguins across Antarctica

本研究は環境変動下における南極のペンギン類の一年を通じた生態的ニッチを明らかにする目的で実施した。国際共同研究によりバイオロギング手法によるペンギンの行動追跡を複数地点で実施した。その結果、まず一年を通じたアデリーペンギンの渡り行動・潜水行動の記録を得て、海氷密接度、日長時間などの環境要因が行動の季節変化に強く影響することを明らかにした。次に、アデリーペンギンがクラゲを食べるという新しい行動を発見し、この行動が南半球に生息する4種7集団のペンギンで見られることを報告した。これらはペンギンの生態的ニッチの可変性に関する新規性の高い知見で、ペンギンの環境変動への応答を予測する上で重要である。
極低温・超電導技術の電力機器への応用

(1)超電導同期機の動特性に関する基礎研究20kVA超電導発電機を模擬送電線を介して、商用電源に連係した系統において、系統急変時の過渡特性実験を行い、併せてシミュレーションを行った。また、エネルギー転送回路を用いた超電導発電機励磁電源を設計・製作した。一方、電力系統に事故が発生したとき、超電導界磁巻線に過渡磁界が生じる。この過渡磁界による交流損失、電磁力などを計算し、超電導界磁巻線に与える系統のじょう乱の影響を検討した。(2)極低温および超電導ケーブルの設計と冷却システムに関する基礎研究試作した20m長の押出しポリエチレン絶縁超電導ケーブルの冷却・通電試験を行った。LHeによるケーブル全体の4.2Kへの冷却試験を2回実施し、ケーブルの熱絶縁および端末部からの侵入熱を評価することができた。通電試験は、電源容量の不足をLN2冷却変圧器とコンデンサによる共振回路で補うことにより、2.5kAまでの通電に成功した。また、LH2冷却ケーブルの実現に備えて、LH2のもつ大きな絶縁耐力と小さい誘電正接などの要因を明らかにするために、光電流の注入効率を各種極低温液体中で観測し、その結果をもとにLH2の電気的性質に関する特徴的な点を他の液体と比較しながら検討した。(3)エネルギー貯蔵用超電導マグネットの特性と電力系統における応用超電導エネルギー貯蔵装置により電力系統の安定化を実現するために必要なSMESの電力貯蔵量および交直変換器の容量について考察を行った。発電機を含めた模擬系統において受動型フィルターの効果を実験的に検討すると共に、能動型フィルターの製作および簡単な予備試験を行った。また大電力貯蔵のための大型超電導マグネットの保護法に関して、小型モデルコイルを3分割し、強制的にクエンチさせ、内部電圧の過渡現象を把握し、その保護方法確立の予備的実験を行った。
SーS結合欠損リゾチ-ム分子の折りたたみ構造単位の研究

蛋白質の立体構造は、いくつかの部分構造があらかじめ正しく折りたたまれた後、それをさらに折りたたんで最終的な立体構造にたどり着くと考えられている。リゾチ-ムは4本のSーS結合を持つ安定な蛋白質であるが、そのSーS結合を失うとその立体構造を保つことが出来ない。しかし、そのようなコイル状態においても、短いペプチド鎖の範囲内で働く短距離相互作用によって決る局所的にとりやすい部分構造が形成されていると期待される。そのような局所秩序構造を見いだし、その部分構造の位置を同定することが出来れば、蛋白質の折りたたみ反応の機構を考察する上で貴重な情報となるであろう。我々は、Sー3ートリメチルアミノプロピル化リゾチ-ム(TMAPーリゾチ-ムと呼ぶ)を用いて実験を行った。TMAPーリゾチ-ムの190ー260nm領域の円二色性スペクトルを塩酸グアニジンやソルビト-ルを含む水溶液中で測定した。その結果、塩酸グアニジンはTMAPーリゾチ-ムの構造をさらにランダムコイルに近付け、ソルビト-ルは逆に部分的な2次構造を増加させることが見出された。TMAPーリゾチ-ムの局所秩序構造を考察する目的で、トリプシンによるその限定加水分解反応を行った。すべての分解反応最終生成物をアミノ酸組成分析によって同定し、逆相液体クロマトグラフ上のピ-クとの対応関係を決定した。次に、ピ-クの面積を反応時間に対してプロットして、最終生成物の生成反応のキネティックスを観測した。また、限定分解反応の途中、8つの中間生成物が現れることを見いだし、その中間生成物の組成を全て明らかにすることが出来た。また、中間生成物の生成と分解反応のキネティックスも観測した。これらの実験結果から、TMAPーリゾチ-ムの全ての分解反応部位における反応の速度定数が決定された。その結果、トリプシンに対して抵抗性の高い分解部位はTMAPーリゾチ-ムのN末端側の半分に集中しており、逆にC末端側はトリプシン感受性の高いことが明らかになった。S-S結合欠損リゾチーム(天然リゾチームのS-S結合を還元後、トリメチルアミノプロピル基でSH基をブロックしたもの)を用いて、この分子の部分秩序構造形成の有無について研究した。この分子の溶液の温度を2°Cに保って、トリプシンによる限定分解反応を行い、分解生成物のHPLC(高速液体クロマト)による逆相クロマトグラフィ(ペプチドマップ)を測定し、トリプシン分解時間によるマップの変化を調べた。まずトリプシンによる最終分解生成物のマップをとって、大阪大学・蛋白質研究所の相本三郎博士のところでアミノ酸分析をしていただき、ペプチドマップのそれぞれのピークがリゾチーム分子のどのペプチド断片鎖に相当するかを決定した。つぎに分解反応の中間生成物をペプチドマップ上で同定し、それを分離・精製して、トリプシンによる再分解反応を行い、最終生成物と比較することによって、中間生成物がどのペプチド断片鎖から構成されているのか知ることが出来る。このような実験から、リゾチーム分子のArg5とArg68残基のC端側ペプチド結合の加水分解反応速度が他に比べ著しく遅いことを、またArg14、Arg73残基のそれが速いという事実を見出した。また、予備的な実験結果は限定分解反応の中間生成物が残基15から残基73までのペプチド断片鎖であることを示唆している。さらに詳しい実験を必要とするが興味深い実験結果である。さらに低温の領域で、同様のペプチドマップを調べている。本研究費の交付決定が昨年の11月であったため、円偏光2色性(CD)の測定による十分な研究成果はまだないが、天然リゾチームとS-S結合欠損リゾチームのCDスペクトルを測定した。後者のスペクトルはランダムコイル鎖のスペクトルに近い。現在、温度変化、溶媒添加物変化をしてCDスペクトルを測定している。今後はトリプシン限定分解生成物のCDスペクトルも測定していく予定である。

また、限定分解反応の途中、8つの中間生成物が現れることを見いだし、その中間生成物の組成を全て明らかにすることが出来た。また、中間生成物の生成と分解反応のキネティックスも観測した。これらの実験結果から、TMAPーリゾチ-ムの全ての分解反応部位における反応の速度定数が決定された。その結果、トリプシンに対して抵抗性の高い分解部位はTMAPーリゾチ-ムのN末端側の半分に集中しており、逆にC末端側はトリプシン感受性の高いことが明らかになった。SーS結合欠損リゾチ-ム(還元Sートリメチルアミノプロピル化リゾチ-ム)をトリプシン消化し、最終生成物をペプチドマップして、各ピ-クがどのアミノ酸配列部分に対応するのかを完全に同定した。トリプシンによる限定分解の途中、ペプチドマップ上にI1からI8までの中間生成物が現れる。それを分画し、集めて再びトリプシンによって完全に分解した後、同じくペプチドマップし、その中間生成物がどんな最終生成物から構成されていたのか完全に同定した。また、最終生成物、および中間生成物のペプチドマップ上のピ-クの面積をトリプシンとの反応時間に対してプロットし、それらの生成、分解反応のキネティックスを測定した。それらの結果をミカエリス・メンテン機構に従って、反応速度定数を計算した。全ての分解可能部位の分解速度定数の一覧表を作成し、トリプシンに対する感受性の高い部位と低い部位をアミノ酸配列上の位置と照合した。その結果、リゾチ-ムのN末端側の半分のアミノ酸配列領域に、トリプシン抵抗性の高い分解部位が集中していることが明らかになった。次に、SーS結合欠損リゾチ-ムを30%のグリセロ-ル溶液中で、同様のトリプシン限定分解反応を行い、全く同様にペプチドマップから分解生成物の出現反応のキネティックスを測定した。その結果、水溶液中で、急速に加水分解されて出現してくるT11とT17T18という最終生成物の出現速度はほとんど変わらないが、トリプシン抵抗力の高い分解部位がグリセロ-ル中でさらに3倍程度分解速度が遅くなることが分かった。また、ペプチド断片鎖として、SーS結合欠損リゾチ-ムのトリプシン分解反応から得られる最終、あるいは、中間生成物を集め、その円2色性スペクトルを測定した。溶媒中のTFE(トリフロロエタノ-ル)の濃度を上げると、それらのペプチド断片鎖の2次構造の割合が増加する。アミノ酸配列上の断片鎖の場所によって、TFEの濃度が低くても2次構造が出現しやすい断片鎖と、2次構造をとりにくい断片鎖があることが分かった。