hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
走行時の脚のリズムと心拍動リズムの相関

走運動などでは脚のリズムと心拍動リズムの間になんらかの相互関係があるのではないかという仮説の検証と脚運動と心拍動とが同期する現象(カップリング)の発生機序の解明を目的とした。実験Iでは、走行時の脚のピッチを一定にし、軽い運動から始めて負荷を漸増したときの心拍数とピッチを連続的に計測した。その結果、トレッドミル走においてもカップリングは一般的に起こる現象であることが確認された。実験IIでは、走行時の着地の心周期内タイミングとその時点における心周期との関係を明らかにするために、ピッチを固定し、心拍数がそれより低い値で一定を保つようなトレッドミル走を行なった。その結果、駆出期に着地すると心周期は短縮し拡張期の初期に着地すると心周期は延長する傾向があり、両者の間には微弱ながら正弦波状の関係があることを明らかにした。実験IIIでは、高さ30cmの台から種々な心周期内タイミングで落下させる実験を行い、吸気時に駆出期に着地すると心周期は顕著に短縮し、次の心周期は代償的に延長するが、呼気時に落下しても心周期は変化しないことを明らかにした。以上の結果と先行研究の結果に基づいて考察し、着地のタイミングと心周期の間に認められた正弦波状特性は、圧反射によって起こる心臓迷走神経中枢の興奮が着地に伴う感覚刺激によって打ち消されることによるものと推論した。またこの正弦波状特性の存在が心拍動を脚のリズムに同期させるようなフィードバックを形成し、これがカップリング発生の基本的メカニズムになっているものと考えられる。本年度に計画していた実験はすべて終了し、現在結果の解析と考察を行なっている。陸上競技中・長距離選手のべ24人を対象にして、トレッドミル上で走行させ、心電図およびペドグラムを記録し、コンピューターを用いて足の着地のタイミング(着地の瞬間と先行するR波との間隔=R-St)とRRを連続的に計測した。R-Stを横軸に瞬時RRを縦軸にとると、R-Stが約100msのきRR間隔は最小になり、R-Stが約200msのときRR間隔は最大になる傾向があり、両者の間に正弦波状の関係が認められた。走行時のRR間隔の平均値は約400msであったことから、この所見は、駆出期に着地するとRR間隔は短縮し、拡張期に着地するとRR間隔は延長することを意味していると考えられる。このような現象の起こるメカニズムについて現在検討中であるが、これまでのところ、(1)着地に伴う感覚的刺激によって心臓抑制中枢が影響されるために起こる、(2)着地に伴う機会的刺激によって血圧が変化し、圧反射を介して心周期が影響を受けるために起こる、などの可能性が考えられている。また脚のリズムを160歩/分に固定し、スピードあるいは勾配を漸増することによって心拍数を漸増させた場合についても実験を行なった。負荷の増加に伴って心拍数は顕著に増加するがピッチは固定されているため、軽い運動からはじめると、初め心拍数はピッチより低いが、次第にピッチに近付き、やがてそれを凌駕するようになる。その際両者が一致したままの状態を保ちいわゆるカップリング現象が起こるが、条件によってそれが起こったり起こらなかったりする。カップリングの起こる条件および発生機構について現在検討している。走運動などでは脚のリズムと心拍動リズムの間になんらかの相互関係があるのではないかという仮説の検証と、脚運動と心拍動とが同期する現象(カップリング)の発生機序の解明を目的とした。

その結果、駆出期に着地すると心周期は短縮し拡張期の初期に着地すると心周期は延長する傾向があり、両者の間には微弱ながら正弦波状の関係があることを明らかにした。実験IIIでは、高さ30cmの台から種々な心周期内タイミングで落下させる実験を行い、吸気時に駆出期に着地すると心周期は顕著に短縮し、次の心周期は代償的に延長するが、呼気時に落下しても心周期は変化しないことを明らかにした。以上の結果と先行研究の結果に基づいて考察し、着地のタイミングと心周期の間に認められた正弦波状特性は、圧反射によって起こる心臓迷走神経中枢の興奮が着地に伴う感覚刺激によって打ち消されることによるものと推論した。またこの正弦波状特性の存在が心拍動を脚のリズムに同期させるようなフィードバックを形成し、これがカップリング発生の基本的メカニズムになっているものと考えられる。
フェーズフィールドモデルによる3次元相変化パターンの解析

平成18年度の研究実績・成果の概要は以下の通りである。(1)過年度までに開発した相変化現象に対する数理モデルは、各相の自由エネルギーと、相を分離する効果をもたらす自由エネルギー障壁を組み合わせた自由エネルギーポテンシャルを構成し、その緩和過程を表現する勾配系偏微分方程式モデルである。今年度はこのモデルを拡張し、各相の自由エネルギーに重力ポテンシャルに起因する項を組み込むことで、相変化の重力の影響を表現した。その結果、特に保存系の自由エネルギー緩和によるモデルに基づく計算機シミュレーションでは、密度の小さい相が泡状に分離し浮遊する相分離パターンを再現することができた。これは重力場が影響する各種の相変化現象に広く応用できるものと考えられる。またこの種のモデリング手法は重力場だけではなく応力場や電磁場の影響下での相変化モデルを構築する際にそのまま利用できるものである。(2)相変化現象のモデルとして、セルオートマトンモデルならびにモンテカルロシミュレーションモデルとの比較を試みた。後者のモデルでは、相分離パターンや多成分モデルにおけるミセル組織の形成などが再現できたが、フェーズフィールドモデルとの対応についての厳密な解析は今後の課題として残った。ただし、3次元シミュレーションを簡易に実行するにはフェーズフィールドモデルを始めとする偏微分方程式モデルと比較して優れていることが実証されたことから、本研究での成果を今後も発展させる計画である(3)3次元の相変化現象の計算機シミュレーションの基礎モデルとしては分子動力学法によるものも有効であるため、本研究との関連でシミュレーションの実行や理論的な解析を試みた。しかし、これについては非平衡統計力学の理論がまだ整備されていない現状では十分な成果を得ることができなかった。平成16年度の研究成果の概要は以下の通りである。1.相変化現象に伴う典型的なパターンである共晶(共析)組織の形成に対し、安定相への状態変化の速度と相分離速度のバランスを可変にし、数値計算を行った。2次元の計算機シミュレーションにおいては、相分離速度を相対的に小さくすると、共晶(共析)組織は同心円状のパターンから層状のパターンに変化することを確認した。また、プログラムコードを3次元化し、表面拡散、バルクの拡散および相分離速度を比較しながら相変化現象(2成分系)の計算機シミュレーションができる環境を構築した。2.上記の共晶(共析)組織形成に対する計算機シミュレーションにおいて、相変化現象の離散モデルであるセルダイナミクスシステムの手法を応用して計算スキームを開発し、従来の数値計算手法の結果とパターンの周波数特性評価などの観点から比較した。この結果、本研究における計算手法は十分利用可能であることが確認され、2次元で100×100メッシュ程度の計算サイズであれば、汎用のノートパソコン程度でもリアルタイムの計算機シミュレーションが行えるようになった。3.フェーズフィールドモデルを導出する際の基礎となる自由エネルギー汎関数に現れる界面張力項に異方性の効果を付与し、相界面が平坦なファセットを形成するように既存の数理モデルを拡張した。4.異方性を付与した上記の相変化モデルと組み合わせる目的で、3相が関与する相変化モデルに潜熱の発生と界面での光エネルギーの吸収効果を取り入れた数理モデルを開発した。これは、合金系と並んで相変化現象の数理モデルの重要な対象である水と氷によるある種のパターン形成を記述する数理モデルである。併せて、2次元および3次元の計算機シミュレーションを行う準備が整った。平成17年度の研究実績、成果の概要は以下の通りである。(1)平成16年度までに構築した数理モデルに基づき、相変化現象、特に相分離と相転移のカップリング現象に対するコンピュータシミュレータを構築し、拡散効果と相転移速度のバランスに関する考察を行った。成分拡散(相分離効果)の大小によって異なる相がなすパターンは層状から同心円状または螺旋状へと変化することを計算機シミュレーションによって示した。(2)3次元相変化パターンの解析、計算機シミュレーションの実現を目指し従来の偏微分方程式モデルとの比較も視野に入れて、離散モデルであるセルオートマトンモデルに基づく数値計算を行った。これはD.Youngの反応拡散セルオートマトンモデルを応用したものであり、偏微分方程式モデルに基づく数値計算と比較してかなりの効率化が図れることが確認された。特に汎用のノートパソコン程度の性能の計算機であっても短時間で複雑な系の相変化現象がシミュレートできることが確かめられた。ただし、従来法との定性、定量比較は次年度の課題として残った。(3)過年度において、多成分、多相が関与する系に対して拡張したフェーズフィールドモデルを提案していたが、このモデルを金属間化合物の生成過程に適用した研究を国際研究集会(11.研究発表欄に詳細)において発表した。(4)3次元弾性体方程式とフェーズフィールドモデルのカップリングに関して、系の自由エネルギー汎関数に弾性エネルギーを付与することで新たな数理モデルを構築した。計算機シミュレーション、数学解析によるモデルの正当性の確認は継続して研究中である。

またこの種のモデリング手法は重力場だけではなく応力場や電磁場の影響下での相変化モデルを構築する際にそのまま利用できるものである。(2)相変化現象のモデルとして、セルオートマトンモデルならびにモンテカルロシミュレーションモデルとの比較を試みた。後者のモデルでは、相分離パターンや多成分モデルにおけるミセル組織の形成などが再現できたが、フェーズフィールドモデルとの対応についての厳密な解析は今後の課題として残った。ただし、3次元シミュレーションを簡易に実行するにはフェーズフィールドモデルを始めとする偏微分方程式モデルと比較して優れていることが実証されたことから、本研究での成果を今後も発展させる計画である(3)3次元の相変化現象の計算機シミュレーションの基礎モデルとしては分子動力学法によるものも有効であるため、本研究との関連でシミュレーションの実行や理論的な解析を試みた。しかし、これについては非平衡統計力学の理論がまだ整備されていない現状では十分な成果を得ることができなかった。
アメリカ連邦制と三権分立制の相互作用：抑制均衡を担保する州政府の台頭

近年、大統領による実質的な既存法の書き換えを伴う政策変更に対して、連邦議会でも裁判所でもなく、州政府が、それを抑制する主体として重要な地位を占めるようになった。本研究では、一次資料の歴史分析により、近年、大統領の三権分立制を脅かすような行為を阻止する主体として州政府が台頭してきていることを指摘し、またその台頭の要因の解明を目的としている。本研究課題の初年度である本年度は、当初の予定通り、初めて州政府らが協力して、三権分立制を脅かすような大統領の行動を提訴して勝訴した事例、すなわち、ジョージ・W.ブッシュ政権による環境保護関連法の不執行に対して12の州政府らが訴え、訴えが認められた事例について、一次資料を収集、分析した。資料収集に際しては、ブッシュ大統領図書館は利用せず、ワシントンDCにて州政府側の史料を収集した。ブッシュ大統領図書館にて資料を収集しなかったのは、渡航前の計画段階で、ブッシュ政権側の資料ではなく州政府側の資料が本研究課題にとって重要だということが明らかになったためである。それから、関連する二次文献も渉猟した。特筆すべきは、本研究課題が当初想定していた以上に広がりがあったため、新たに、連邦政府から州政府への規制政策に関する権限委譲についての二次文献も収集し、整理を進めている点である。以上の結果、ロナルド・レーガン政権期の権限委譲が州政府の訴訟戦略の台頭の要因の一つとして浮上した。この時期、「小さな政府」を目指すべく、環境規制を含む多くの政策分野の規制権限が州政府へと委譲され、連邦法執行に関して州政府の果たす役割が増大した。こうした変化により、州政府が連邦法執行に関して口を挟む余地が生まれ、大統領と意見が対立する際には訴訟に持ち込むようになった可能性がある。本年度は、ブッシュ大統領図書館は利用せず、ワシントンDCにて州政府側の史料を収集した。ブッシュ大統領図書館にて資料を収集しなかったのは、渡航前の計画段階で、二次文献を整理している中で、ブッシュ政権側の資料ではなく州政府側の資料が本研究課題にとって重要だということが明らかになったためである。具体的には、当初想定していなかった連邦規制政策の権限委譲という大きな変化が重要な役割を果たしているかもしれないことに気づき、その点についての文献を整理する中で、注目すべきは、連邦規制政策について大きな役割を果たすようになった州政府側だと認識するに至ったためである。そのため、当初の予定とは異なるものの、想定以上の収穫もあり、研究も着実に進展しているため、上記の区分とした。引き続き、レーガン政権期における連邦規制政策の権限委譲が、本研究課題にとってどれほど大きな意味を持っているのかについて、一次資料と二次文献を用いて精査していく。また、本年度の調査により、州政府たちが、レーガン政権期に初めて、既存法の変更を伴うような大統領の政策変更を阻止するために、協力して訴訟を提起するようになっていたことが明らかにできたので、レーガン政権期にまで本研究課題の分析の射程を伸ばすことも検討している。

引き続き、レーガン政権期における連邦規制政策の権限委譲が、本研究課題にとってどれほど大きな意味を持っているのかについて、一次資料と二次文献を用いて精査していく。また、本年度の調査により、州政府たちが、レーガン政権期に初めて、既存法の変更を伴うような大統領の政策変更を阻止するために、協力して訴訟を提起するようになっていたことが明らかにできたので、レーガン政権期にまで本研究課題の分析の射程を伸ばすことも検討している。当初の予定よりも資料収集の回数が少なくなったため、次年度使用額が生じた。次年度予算に組み込み、適切に利用する。
小学校理科6年土地のつくりと変化で,マルチメディア教材を用いた野外観察法の開発

1研究目的小学校理科6年土地のつくりと変化で,マルチメディア教材を用いた野外観察法を開発する。(1)地層の野外観察に必要なデジタル教材を作成する。(2)授業実践でマルチメディア教材を用いて野外観察を行い,その効果を分析する。2研究方法(1)鹿児島県大島郡龍郷町の地形図や地質図,観察地域の露頭写真等をマルチメディアに対応できるようにデジタル化し,教育の専門家と改善の意見交換を行い,教材化した。(2)小学校第6学年を対象に,マルチメディア教材を用いて野外観察を行い,その効果を児童の記録(映像記録,ノート,質問紙調査)から分析し,成果と課題をまとめ,教材とともにDVDにまとめ公開した。3研究成果(1)専門書をわかりやすい言葉に変えた教材は効果的であった。まずは,教師の教材研究と児童が地層の野外観察を行う際に,露頭を観察する視点として地層の構成物に関する情報(岩石の種類,生成した時代,広がり)が必要とされる情報であり,そのため,地質図と粒度の違いによる岩石の種類を主たる情報として教材を構成することが,地質に関する地域教材を開発する上で重要である。(2)理科を専門としない小学校の教員が活用することを主眼に研究を進め,このような地域教材は小学校の授業に有効であることがわかった。研究成果について町内の研究会で発表した際に,中学校の授業でも地層の野外観察が進んでいないことが明らかになった。その原因は,小学校と同じく「地層のどこに着目させたらよいかわからない。」「教科書と実際に観察可能な地層が違うので困る。」等の指導への困難性であった。本教材を中学校1年の地層の学習でも活用ができるよう改良を加え,教師の教材研究をサポートしていくことが必要である。
卵母細胞処理口腔扁平上皮癌細胞のエピジェネティックなリプログラミングの検討

当研究室で樹立した口腔扁平上皮癌株ZA(無血清培養下で培養)における癌抑制遺伝子(プロモーターの高メチル化が報告されている。E-cadherin、p16、MGMT、DAP-K、MLH1)の発現をRT-PCRを用いて検討を行った。その結果、MGMT、DAP-K、MLH1では、その発現が消失していたため、フリカツメガエル卵母細胞および未受精卵抽出液をZA細胞5,000個対して1μlの量で無血清培地中に添加し、21°Cで無血清培養を行い、培養3、6、9時間後に各癌細胞よりRNAを抽出し、RT-PCRで上記の癌抑制遺伝子の発現上昇の有無の検討および、適切な培養時間の検討を行ったが、有意差は認めなかった。両生類の卵母細胞抽出液はDNAメチル化とヒストン修飾異常を修復する能力を有していることが報告されており、両生類の卵母細胞抽出液にて処理された肺癌細胞株では、脱腫瘍化(リプログラミング)生じたことが報告されている。本研究は、口腔扁平上皮癌細胞株に対して、アフリカツメガエル卵母細胞および卵細胞抽出液を処理するで、、腫瘍細胞のリプログラミングが可能性の検討を行い、口腔扁平上皮癌細胞の癌化のメカニズムを解明、さらに特定遺伝子・分子を標的とした口腔癌の診断・治療法の確立を目的とした。まず、アフリカツメガエルの卵母細胞および未授精卵からの抽出液をHutchisonらの方法に準じて抽出を行った。次に、当研究室で樹立した口腔扁平上皮癌株NA、KN、ZA、KO、Ca9-22(無血清培養下で培養した細胞株)における癌抑制遺伝子(プロモーターの高メチル化が報告されている。その結果、すべての遺伝子の発現低下もしくは、発現消失を認める細胞株は認めなかったが、ZAにおいて、MGMT、DAP-K、MLH1においては、その発現が消失していたため今後の研究に使用することとした。lberioらの報告(Exp Cell Res,307,131-141,2005)に従い、細胞の透過性を高進させた口腔扁平上皮癌細胞株ZA(2×106個)に対し、先に用意した、アフリカツメガエル卵母細胞および未受精卵抽出液を細胞5,000個対して1μlの量で無血清培地中に添加し、21°Cで無血清培養を行う。培養3時間、6時間、9時間後に抽出液未処理および抽出液処理癌細胞よりそれぞれRNAを抽出し、RT-PCRで上記の癌抑制遺伝子の発現上昇の有無の検討および、適切な培養時間の検討を行ったが、有意差は認めなかった。本研究は、口腔扁平上皮癌細胞株に対して、アフリカツメガエル卵母細胞および卵細胞抽出液を処理することによって、腫瘍細胞のリプログラミングが可能か否かに関して検討を行い、口腔扁平上皮癌細胞の癌化のメカニズムを解明するし、さらに特定遺伝子・分子を標的とした口腔癌の診断・治療法の確立を目的とした。まず、アフリカツメガエルの卵母細胞および未授精卵からの抽出液をHutchisonらの方法に準じて抽出を行い、以下の実験に用いるよう準備した。次に、当研究室で樹立した口腔扁平上皮癌株KO,UE,KN(無血清培養下で培養した細胞株)における癌抑制遺伝子(プロモーターの高メチル化が報告されている。p15、p16、MGMT、DAP-K、RAR )の発現をRT-PCRを用いて検討を行い、これらの癌抑制遺伝子の著しい発現低下もしくは発現消失を認める細胞株を続く研究に用いる予定であったが、いずれの細胞株にも上記のがん抑制遺伝子の発現を認め、いずれの細胞も本研究への適応は困難であった。そこで、現在、他の細胞株の使用ならびに口腔癌に発現を認める、癌抑制遺伝子p16INK4A、E-cadherin、MLH1の発現を検討中である。使用を予定していた細胞株に癌抑制遺伝子が発現していたことより、研究材料(細胞株)を大きく見直す必要があったため。他の細胞株を使用、他の癌抑制遺伝子の解析を検討している。また、適当な細胞株や癌抑制遺伝子が見つかり次第、卵母細胞および未受精卵抽出液処理による口腔扁平上皮癌細胞株の癌抑制遺伝子発現の検討、抽出液処理による癌抑制遺伝子のCpG領域の脱メチル化の検討を行う予定である。主に消耗品、細胞培養や遺伝子解析に必要な試薬等を購入予定である。
小児悪性腫瘍におけるSPINDLE CHECKPOINT異常と予後との関連性

研究開始から現在まで当院小児科に10名の新規悪性腫瘍患児が入院した。全例に検体検査の同意を得て腫瘍組織の染色体検査をおこない、うち2例に染色体異常(Hyperdiploid)が認められた。この2例は体細胞染色体に異常が認められなかったため、腫瘍特異的異常であった。全例の腫瘍組織に対して各種抗癌剤投与におけるアポトーシスの誘導をMTT assayにて測定したがploidyと抗癌感受性とは明らかな相関を認めなかった。次に腫瘍組織におけるMAD1、MAD2遺伝子の発現を検討した。予備実験として細胞株HeLa細胞のMAD1、MAD2蛋白の発現を細胞周期別にWestern blottingで解析した。これによりMAD1とMAD2蛋白は全細胞周期にほぼ偏りなく発現していることが判明した。さらに細胞質蛋白と核内蛋白とを分離調整しそれぞれの発現を解析したところ、MAD1は主に核内に存在しMAD2は核内・細胞質ともに存在することが示された。さらに生細胞におけるこれらの蛋白の細胞局在を解析するために免疫染色をおこなった。結果としてWestern blottingの解析結果と同様の現症が得られた。次にMAD2の機能を研究するためにMAD2のDeletion mutantsを作製し、その細胞内局在を調べたところ、C末端の9アミノ酸を欠失した変異MAD2は正常MAD2と異なり細胞質のみに局在した。また免疫沈降法によってMAD1とMAD2の結合を解析したところMAD1とMAD2は結合するものの、MAD1と変異MAD2は結合することができなかった。これよりMAD2蛋白はC末端部にMAD1との結合ドメインを持つことが示された。得られたがん組織から蛋白を抽出し、MAD1、MAD2の蛋白発現を調べたところ、2例にMAD2の発現低下が認められた。さらに1例にMAD1とMAD2との結合抑制が認められ、MAD1のmutationが示唆された。このように臨床の検体でもMAD1とMAD2の相互作用の異常が認められ、癌細胞の特異性に関与していることが示唆された。研究開始から現在まで当院小児科に8名の新規悪性腫瘍患児が入院した。全例の腫瘍組織に対して各種抗癌剤投与におけるアポトーシスの誘導をMTT assayにて測定した。現時点ではploidyと抗癌感受性とは明らかな相関を見ていない。これは症例数の問題と悪性腫瘍の種類の多彩性によると思われ、さらなる症例の蓄積、特に同一疾患における染色体正常腫瘍と異常腫瘍の蓄積が望まれる。次に腫瘍組織におけるMAD1、MAD2遺伝子の発現を検討中である。MAD2の発現低下はspindle checkpointを抑制することがすでに判明している。MAD2の変異はPloidyの変化ひいては癌化と密接に関係していると思われ、各腫瘍組織におけるMAD1、MAD2の解析をおこなっていく。

また免疫沈降法によってMAD1とMAD2の結合を解析したところMAD1とMAD2は結合するものの、MAD1と変異MAD2は結合することができなかった。これよりMAD2蛋白はC末端部にMAD1との結合ドメインを持つことが示された。得られたがん組織から蛋白を抽出し、MAD1、MAD2の蛋白発現を調べたところ、2例にMAD2の発現低下が認められた。さらに1例にMAD1とMAD2との結合抑制が認められ、MAD1のmutationが示唆された。このように臨床の検体でもMAD1とMAD2の相互作用の異常が認められ、癌細胞の特異性に関与していることが示唆された。
ヒト唾液特異ムチン糖蛋白のコア蛋白構造の解明

ムチン糖蛋白は巨大分子で取扱が困難であるが、近年遺伝子手法を使った研究によりムチンの全体像がかなり明らかになりつつある。加えて、生体内でのムチンはそれぞれに特異性を有することが認められている。既に、ヒト唾液ムチンに特異性を示すモノクロナル抗体(P4-5C)が木村章彦等によって開発されているが、P4-5Cに対するエピトープは明確ではない。ABO血液型活性を担うヒト唾液ムチンにP4-5Cが特異的あることから、今回、血液型を担うコア蛋白部分の解明と、P4-5Cのエピトープの解明を試み、以下のような成果を得た。P4-5Cの免疫原調製法に従って、煮沸唾液上清のエタノール沈殿物を出発物質とした。これは、シアリダーゼ消化、還元、カルボキシルメチル化によってもP4-5Cとの反応性に変化を認めなかった。唾液の主要成分であるアミラーゼ分泌型IgAの完全除去のため、2M尿素中でトリプシン消化し、消化物をSuperose6カラム(FPLC装置、6M塩酸グァニジン溶液を使用)で分画した。素通り分画(T-1)は、P4-5Cに陽性、クマシ-青蛋白染色に陰性、アルシアン青糖染色に陽性であり、ムチン糖蛋白と考えられた。T-1を過ヨード酸々化した後、β-脱離反応による脱糖処理を行っても、P4-5Cに対する反応性に変化を認めなかった。更にTFMSを用い0°C、4時間で可及的に脱糖した場合(DG)、P4-5Cとの反応性は消失した。DGはSDS・PAGE(10%ゲル)で、クマシ-青染色性の分子量13万・7万と推定されるバンドとして検出された。P4-5Cのエピトープは糖鎖が大いに関与しており、ペプチド部分は抗原性に直接関与していないことを確認した。DGは血液型を担うヒト唾液ムチンコア蛋白部分と考えられるので、これをSuperose12カラムで精製し、更にペプシン消化を行い、N末端アミノ酸配列分析に供し得るフラグメントの分離・精製を試みた。ペプシン消化フラグメントのアミノ酸組成は、DGと同じ様にThr,Ser,Pro,Alaが全体の60%以上を占めるというムチンの特徴を示した。HPLCによって単一のピークとして捕えたフラグメントから、明確な単一のアミノ酸配列を決定することは出来なかった。今回得た成績を報告されている2種のヒト唾液ムチン糖蛋白、MG1,MG2に照合して考えると、まだアミノ酸配列は報告されていない高分子で、血液型活性を示すMGIのコア蛋白部分の一部をDGとして捕えていることが予想された。糖結合部位が連なる分子中央部に相当すると予想されるDGは、ムチン自身が変異を持っている可能性に加えてThr,Serに糖鎖の結合の有無、又はThr,Ser結合糖鎖の脱糖の変異に基づく変異があることが考えられる。DGから単一のN末端を有するフラグメントの分離は非常な難事と考えられた。この分野での研究には、遺伝子手法の応用が必要不可欠であろうと思われる。

今回得た成績を報告されている2種のヒト唾液ムチン糖蛋白、MG1,MG2に照合して考えると、まだアミノ酸配列は報告されていない高分子で、血液型活性を示すMGIのコア蛋白部分の一部をDGとして捕えていることが予想された。糖結合部位が連なる分子中央部に相当すると予想されるDGは、ムチン自身が変異を持っている可能性に加えてThr,Serに糖鎖の結合の有無、又はThr,Ser結合糖鎖の脱糖の変異に基づく変異があることが考えられる。DGから単一のN末端を有するフラグメントの分離は非常な難事と考えられた。この分野での研究には、遺伝子手法の応用が必要不可欠であろうと思われる。ヒト唾液からP4-5Cモノクローナル抗体(ヒト唾液ムチンに特異性を示す)に反応するムチン糖蛋白の分離精製を行った。30分間煮沸した唾液の遠心上清に2倍量のエタノールを加えて得られた沈殿を出発物質とした。これをシアリダーゼで消化した後、常法に従って還元・カルボキシメチル化した。次いで、2M尿素中でトリプシン消化を行い消化物をSuperose6カラム(FPLC装置、6M-塩酸グァニジン溶液を使用)で分画した。素通りして溶出される分画をムチン糖蛋白(B-T-1)として集めた。B-T-1のSDS-PAGE(10%ゲル)像は、P4-5Cに陽性、クマシ-青蛋白染色には陰性であり、且つアルシアン青糖染色には陽性を示した。このことからB-T-1は今回の目的に叶う高分子ムチン糖蛋白であると判定した。B-T-1の糖鎖及びコア蛋白部分とP4-5Cとの反応性、ムチンコア蛋白構造の解明を目的に、B-T-1の脱糖を試みた。脱糖処理条件を検討した結果、TFMSを用い0°C、4時間の反応、必要に応じて再度TFMSを作用させる事でほぼ脱糖していると考えられる成績を得た。脱糖処理B-T-1(DG-ムチン)はSDS・PAGE(10%ゲル)で明かにクマシ-青に染色する分子量13万、7万と推定される蛋白を保有していることを認めた。しかし、両蛋白バンドは、非還元状態でのSDS・PAGEでは様子を異にすることも認めている。DG-ムチンの精製をSuperose6カラム、6M-塩酸グアニジン溶液中で試みたが、分離・収量いずれも満足な結果が得られなかった。DG-ムチンはムチン糖蛋白のコア部分と考えて差し支えないと判断できるので、DG-ムチンを酵素的に又は科学的に切断し、その断片を分離・分析して、構造の解明をしたいと考慮中である。ABO血液型活性を示すヒト唾液ムチンに特異性を示すモノクローナル抗体P4-5Cが木村章彦等によって開発されている。P4-5Cに特異性を示すヒト唾液ムチンを分離・精製し、P4-5Cのエピトープ、並びにムチン糖蛋白のコア蛋白部分の解明を試みた。P4-5Cの免疫原調製方法に従って、30分間煮沸した唾液の遠心上清に、エタノール(2倍量)を加えて沈殿する分画を得た。これをシアリダーゼ消化、還元・カルボキシメチル化後2M尿素中でトリプシン消化した。消化物をSuperose 6カラム(FPLC装置、6M塩酸グァニジン溶液を使用)で分画した。素通りして溶出される分画(T-1)は、P4-5Cに陽性であり、クマシ-青蛋白染色に陰性、アルシアン青糖染色に陽性であった。この分画は高分子ムチン糖蛋白と考えて差し支えない。P4-5Cに対する糖鎖の関与を検討したところ、T-1を過ヨード酸々化し、続いてβ-脱離反応によって脱糖してもP4-5Cに陽性であった。
スピン自由度を持った素励起の量子力学的スピン輸送現象・ホール効果の研究

昨年度に引き続き、極性構造を持つ半導体BiTeIおよび磁性絶縁体(ZnxFe1-x)2Mo3O8における輸送現象の研究に取り組んだ。BiTeIの圧力効果について昨年度に得られていた知見を論文としてまとめると同時に、様々なキャリア数を持つ試料での熱電効果測定を進め、熱電効果の磁場依存性や量子振動の位相がフェルミ面のトポロジーを反映してバルクディラック点上下で定性的に変化することを明らかにし、特に3次元的なラシュバ型バンド構造の状態密度変化によってその起源を説明することに成功した。本研究で考案した量子振動の解析手法や熱電効果を用いたフェルミ面トポロジーのプローブ方法は、一般の空間反転対称性の破れた系におけるトポロジカル相研究にも有用である。また、(ZnxFe1-x)2Mo3O8において観測されていた巨大な熱ホール効果について実験・議論を進め、磁性絶縁体における新しいメカニズムのホール効果の解明に取り組んだ。低温でのヒステリシス効果の観測に成功すると共に、比熱測定を行うことにより、スピンに加えて格子の熱輸送が本質的であることを明らかにした。スピン・格子相互作用を考えることにより、熱ホール効果と電気磁気効果を関連付けると同時に、反対称性の破れた磁性絶縁体において巨大な熱ホール応答を得るための新しい機構の可能性を示し、スピンカロリトロニクス研究における重要な学理を構築した。さらに、同物質とPtとの界面抵抗が二つの反強磁性ドメインによって異なる磁場依存性を示すことを発見した。これは反強磁性/Pt界面での新規スピン輸送存在の可能性を示唆している。異なる反強磁性ドメインの新規観測手法を確立したとも言え、今後、界面における非相反スピン輸送現象や外場によるドメイン制御と新規界面磁気抵抗効果による観測等、研究の飛躍的進展が期待できる。26年度が最終年度であるため、記入しない。極性半導体BiTeIの圧力効果・熱電効果の研究を行った。圧力効果においては、スピン分裂したバンド構造に起因する二種類の周期を持つShubnikov-de Haas (SdH)振動の圧力効果を初めて観測し、振動周期の圧力依存性からトポロジカル相転移に関する情報を得た。輸送現象によって圧力誘起トポロジカル相転移の知見を得たのは本研究が初めてである。熱電効果に関しては、本物質の熱電効果のキャリア数・圧力依存性を系統的に研究し、ラシュバ型バンド構造のディラック点についての情報を得た。特にフェルミ面がディラック点上下に位置する試料においてネルンスト効果の符号が反転する様子が観測され、ネルンスト効果がラシュバ型バンド構造のディラック点に非常に敏感であり、フェルミ準位の位置を判断する良い指標となる可能性を示した。さらに、熱電効果における量子振動を初めて観測し、量子振動の位相を検討することにより、スピン分裂した内側・外側のフェルミ面起源の量子振動が異なる起源を有する可能性があることを明らかにした。これらBiTeIに関する成果は、極性半導体の輸送現象における新しい解釈を含むものであり、今後の半導体輸送現象研究における有用な手法となる可能性がある。また、極性結晶構造を持つ磁性絶縁体(Zn_xFe_<1-x>)_2Mo_3O_8のスピン輸送現象を研究した。特に熱ホール効果測定を通して、本物質がフェリ磁性相及びメタ磁性相において巨大な熱ホール効果応答を示すことを明らかにした。強磁性絶縁体以外でのマグノンホール効果観測の初めての例であり、研究者が過去に研究したマグノンホール効果が磁性絶縁体において広く起こりうる可能性を示す重要な結果であると同時に、観測された熱ホール応答がこれまでに見つかっているいずれの物質よりも大きいことから、巨視的に結晶の対称性が破れていることとの関連性等、今後巨大なスピン輸送応答を得る指針が得られる可能性が期待される。

異なる反強磁性ドメインの新規観測手法を確立したとも言え、今後、界面における非相反スピン輸送現象や外場によるドメイン制御と新規界面磁気抵抗効果による観測等、研究の飛躍的進展が期待できる。26年度が最終年度であるため、記入しない。ラシュバ系におけるスピン分裂したバンドを起源とする輸送現象に関して、トポロジカル相転移やバルクディラック点に関して、新しい視点からの理解が深く進んだ。また、マグノンホール効果が強磁性絶縁体に限らず磁性体で広く一般に起こる可能性を示し、巨大なスピン輸送現象観測に成功すると同時に、その機構解明に向けた指針を示した。極性半導体BiTeIの圧力効果・熱電効果に関して、結果をそれぞれ論文としてまとめ、投稿する。また、極性結晶構造を持つ磁性絶縁体(Zn_xFe_<1-x>)_2Mo_3O_8に関しては、引き続き研究を推進し、この物質における新規スピン輸送現象の研究・メカニズムの解明に取り組んでいく。さらに、他の様々な磁性秩序を示す絶縁体においても、非自明なスピン輸送現象観測を試みる。
マラリア原虫感染における原虫および宿主の熱ショック蛋白質の機能

マウスマラリア原虫Plasmodium falciparumを用いた感染モデルで、以下について検討した。(1)感染抵抗性における宿主HSP65の関与マウスにP.yoeliiの強毒株(L株)を感染させると、全てが速やかに死亡する。弱毒株(NL株)を感染させた場合には一過性に感染は憎悪するが全てのマウスで治癒する。これらのマウスの脾臓のマクロファージにおけるHSP65の発現は、強毒株感染マウスでは見られなかったが、弱毒株感染マウスでは強く見られた。さらに、弱毒株に対しても抵抗性を獲得することができない免疫不全マウスでは弱毒株感染時にさえ、マクロファージにはHSP65の発現が見られなかった。また、マクロファージを除去したマウスに弱毒株を感染させると、抵抗性が無くなった。以上のことから、マラリアに対する感染抵抗性にはHSP65を発現したマクロファージが重要な役割をしていることが明らかとなった。(2)原虫の病原性におけるマラリアHSP90の関与上記の強毒、弱毒株を用いて各種HSPの発現を観察したところ、HSP65,70は両株で発現に差はなかったが、HSP90の発現は強毒株で強く、弱毒株で見られた。HSP90を発現するはずの強毒株を免疫不全マウスに感染させると、原虫内にHSP90は発現されなくなった。これらの結果から、強毒株原虫は宿主の排除機構に応答してHSP90を発現し、病原性を発揮していることが示唆された。また、この発現は免疫電顕法によっても確認されており、強毒株の分裂体にHSP90が多く見られた。
超高性能鉛カルコゲナイド系バルク体熱電材料の創製

鉛カルコゲナイド(PbX(X:S, Se, Te))系熱電材料において、結晶構造(原子配置)から、ナノ構造、マイクロ構造、ミリ構造までの各階層の形態を制御することで、熱電特性の改善と熱電変換モジュールの開発を実施した。PbX層とビスマス・カルコゲナイド(Bi2X3)層を基本構造としたPbX-Bi2X3において、層形態を結晶構造レベルで制御し、さらに焼結体組織の配向をマイクロレベルで制御して、熱電性能指数ZTの向上を実現した。さらに、ナノ構造を有するPbTe焼結体を用いたミリレベルの熱電変換モジュールにおいて、その高温発電動作を確認した。本研究では、鉛カルコゲナイド(PbX (X: S, Se, Te))系バルク体において、原子配置(結晶)、ナノ、マイクロ、ミリ構造の各階層の形態を制御(パナスコピック形態制御)することで、熱電特性の大幅改善と熱電発電モジュールの開発を目指している。本研究では、まず、PbX層とビスマス・カルコゲナイド(Bi2X3)層を基本構造とした自然積層構造を持つ層状カルコゲナイドにおいて、原子配置(結晶構造)の制御を実施した。二つの層を、折り重なるように積層させたり、ミラー対称を持つように積層させたり、有限長に断層させたりと、層形態を変化させた層状カルコゲナイド(それぞれの組成は、Pb5Bi6Se14、Pb3Bi2S6、PbBi2S4)を作製して、熱電材料に相応しい低い熱伝導率を実現した。次に、硫化ランタンと硫化クロムの層から成る(LaS)1.20CrS2において、ナノ構造の制御を実施した。LaSとCrS2の積み重ねに、ナノレベルで不規則(積層欠陥)を導入することに成功した。積層欠陥はキャリアを供給したり、逆にトラップしたりするために、積層欠陥を調整することで、熱電特性を向上させるために相応しいキャリア濃度を実現できる。マイクロ構造制御では、Pb5Bi6Se14と(LaS)1.20CrS2の両方で、層状構造を反映させ、それら焼結体の結晶粒を異方的に成長させることに成功した。結晶粒界での効果的なフォノン散乱を実現し、熱伝導率の更なる低減を達成した。最後に、ミリ構造制御として、PbTeバルク体熱電材料を用いて、熱電発電モジュールの試作を実施した。特性評価などの試験から、PbTeバルク体熱電材料との界面抵抗が低い電極材料を見出した。昨年度は、PbX層とビスマス・カルコゲナイド(Bi2X3)層を基本構造とした自然積層構造を持つ層状カルコゲナイドにおいて、結晶構造の制御を実施して、熱電材料に相応しい低い熱伝導率を実現した。三年計画の二年目にあたる本年度は、PbSe層とBi2Se3層が1:1の割合で、結晶軸c方向に積層した結晶構造を有するカニツァライトPb5Bi6Se14において、マイクロ構造の制御を実施した。合成したPb5Bi6Se14の粉末を、真空中で一軸方向から加圧しながら焼結することでPb5Bi6Se14の焼結体を作製した。X線回折法と走査型電子顕微鏡法により、加圧方向に対して平行方向に結晶軸cが配向していることを確認した。加圧焼結法を用いることで、マイクロオーダーの配向制御に成功した。この配向焼結体において、結晶軸cに垂直な面内方向に高い電荷キャリアの移動度を達成した。この面内方向の移動度は、結晶軸cに平行な面外方向と比較して3.5倍程度も高い。これは、面外方向では、PbX層とBi2X3層の界面にてキャリア散乱が引き起こされることに起因している。高い移動度の結果として、面内方向に優れた電気特性を実現した。昨年度に結晶構造の制御により達成した低い熱伝導率と、本年度にマイクロ構造の制御により達成した優れた電気特性により、Pb5Bi6Se14焼結体の面内方向に優れた熱電特性を実現した。最後に、ナノ・ミリ構造制御として、マグネシウム・テルライド(MgTe)のナノ構造を埋め込んだPbTeバルク体熱電材料を用いて、ミリオーダーの熱電発電モジュールを試作して、高効率動作を確認した。最終年度の本年度は、PbTeにおいてナノ構造とミリ構造の制御を実施した。さらに、毒性元素Pbを使用しない環境に調和した新規カルコゲナイド系熱電材料の開発も実施した。まず、n型のPbTeの開発を実施した。PbTeに、n型のドーパントとしてヨウ化鉛PbI2を添加した。作製したPbTe-0.2%PbI2の試料を、透過型電子顕微鏡を用いて観察したところ、Pbの欠陥が集合した5 nm程度のナノ構造の形成が明らかとなった。PbTe-

PbI2は熱電材料として相応しい低い格子熱伝導率を示すが、このナノ構造がフォノンを効果的に散乱していることがその要因の一つであると考えられる。熱電性能指数ZTは、750 Kで非常に高い値1.4に達した。続いて、n型には本研究で開発したPbTe-0.2%PbI2を、p型には従来材料のPbTe-2% Mg-4% Naを熱電材料として用いて、ミリレベルの熱電変換モジュールを作製した。本モジュールの特徴は、PbTe系熱電素子と銅電極の接合に、高温側には銀ペーストを、低温側では半田を用いたことである。これらの部材を用いることで、高温で安定的に発電することが期待される。実際に、低温283 K、高温873 Kの条件で、発電することを実証した。最後に、銅Cuと硫黄Sからなる低毒性熱電材料の開発を実施した。化学組成Cu26Ta2Sn6S32において、670 KでZT = 0.8を達成した。上記PbTe-0.2%PbI2のZT = 1.2には及ばないものの、Pbを使用しないで、このZT = 0.8を達成したことは評価に値する。鉛カルコゲナイド(PbX(X:S, Se, Te))系熱電材料において、結晶構造(原子配置)から、ナノ構造、マイクロ構造、ミリ構造までの各階層の形態を制御することで、熱電特性の改善と熱電変換モジュールの開発を実施した。PbX層とビスマス・カルコゲナイド(Bi2X3)層を基本構造としたPbX-Bi2X3において、層形態を結晶構造レベルで制御し、さらに焼結体組織の配向をマイクロレベルで制御して、熱電性能指数ZTの向上を実現した。さらに、ナノ構造を有するPbTe焼結体を用いたミリレベルの熱電変換モジュールにおいて、その高温発電動作を確認した。これまでの研究で、原子配置(結晶)、ナノ、マイクロ、ミリ構造の各階層の形態制御を、二つの鉛カルコゲナイド系材料、カニツァライトPb5Bi6Se14と鉛テルライドPbTeで実施してきた。Pb5Bi6Se14では、結晶構造とマイクロ構造の制御を実施して、焼結体の面内方向に優れた熱電特性を実現した。PbTeでは、ナノ構造とミリ構造の制御を実施して、熱電発電モジュールの高効率動作を確認した。Pb5Bi6Se14とPbTeで、共に満足いく成果を得ている。三年計画の二年目で、計画していたすべての研究、すなわち、各階層の形態制御のすべてに着手して成果を得ている。後述する通り、研究発表も精力的に実施することができ、自己評価として「当初の計画以上に進展している。」とした。材料工学、金属物性・材料、熱電変換これまでの研究では、各階層の形態制御を、二つの鉛カルコゲナイド系材料、カニツァライトPb5Bi6Se14と鉛テルライドPbTeで実施してきた。最終年度となる平成27年度の研究では、ここで得た知見を利用して、一つの材料系において、すべての形態制御を実施する。二年間の研究で、異なる材料系で一つ一つの形態制御を独立に実施するだけでも、熱電特性を向上できるという成果を得ている。すなわち、すべての形態制御を一つの材料で統合的に実施することができれば、熱電性能指数を大きく改善できると期待される。もちろん、各形態制御は互いに相関を持っているので、異なる材料系での独立制御に比べて難易度は向上する。昨年度(平成25年度)と本年度(平成26年度)の研究で得た知見と手法を利用することで、この壁を乗り越えて、すべての形態制御を一つの材料で実現する。これまでの研究で、原子配置(結晶)、ナノ、マイクロ、ミリ構造の各階層の形態制御を、それぞれ異なる材料で独立的に実施してきた。
糖尿病合併症としての認知症に関する診断指標の開発と予防戦略への発展

糖尿病合併症としての認知症は、糖尿病の予後を悪化させる大きな原因となっている。このため、認知機能の低下をいかに早期に発見して治療を開始するかが、重要な課題である。本研究では、プロテオミクス及びグライコミクスを用いて、長期縦断コホートに参加した同一対象者の認知機能低下前と低下後を比較し、糖尿病による認知機能の低下を初期の段階で発見する診断指標を開発する。さらに、認知症の合併に伴って変化するタンパク質や糖鎖及び糖タンパク質の発症機序への関与を分子レベルで明らかにし、認知症合併を予防する予防戦略の開発につなげることを目的とする。今年度は、大規模長期縦断コホート(SONIC)の中から抽出した解析対象者(HbA1c: 6.5%以上かつMoCA-Jスコア: 6年間連続低下)の初回調査及び3回目調査(6年後)の検体について、血漿タンパク質の蛍光標識二次元ディファレンシャルゲル電気泳動法(2D-DIGE)を用いたプロテオーム解析を行った。まず、血漿からアルブミンとイムノグロブリンを除き、タンパク質定量を行った後、すべての検体を等量混合して標準検体を作成した。標準検体と個別の検体についてそれぞれタンパク質の蛍光標識を行った(標準検体:IC3-OSu、個別検体:IC5-OSu)。標準検体と個別検体を等量混合し、等電点電気泳動(pH4-7)とSDS-PAGE (%T=7.5, %C=3.0)による二次元電気泳動を行った。電気泳動後、IC3とIC5の二次元電気泳動画像をそれぞれ別々にスキャンし、Progenesis SameSpots (TotalLab)を用いて、画像解析を行った。検出したそれぞれのタンパク質スポットについて、標準検体の強度に対する相対強度を求め、同一対象者の認知機能の低下前と低下後の比較を行った。現在、コホートより抽出した全解析対象者の検体について解析を行っている。本研究では、プロテオミクス及びグライコミクスを用いて、糖尿病による認知機能の低下を初期の段階で発見する診断指標を開発する。本年度は、70代の大規模長期縦断コホート(SONIC)コホート中から、解析対象者を抽出した。SONIC調査は、初回調査(1 wave)、3年後に追跡調査(2 wave)、6年後に追跡調査(3 wave)が行われている。そこで、1 wave参加者1,000人の中から、2 waveと3 waveにも参加し、糖尿病マーカー(HbA1c)と認知機能検査(MoCA-J)のデータを取得しているグループを抽出した(約500人)。そしてその中から、1, 2, 3 waveともに糖尿病及び糖尿病予備軍と考えられ(HbA1c (NGSP) 6.5%以上)、かつMoCA-Jのスコアが3年後、6年後と連続して低下した認知機能低下群(1 wave > 2 wave > 3 wave)を解析対象とした。さらに、対照群として1, 2, 3 waveともに糖尿病及び糖尿病予備軍と考えられるが(HbA1c (NGSP) 6.5%以上)、MoCA-Jのスコアは1, 2, 3 waveともにカットオフ値以上で認知機能の低下が認められない群(コントロール1)、1, 2, 3 waveともに正常(HbA1c (NGSP) < 6.5%)で認知機能の低下も認められない群(コントロール2)を、教育歴、性別を考慮して抽出した。本年度は解析対象者の抽出に留まり、血漿サンプルの取得には至らなかったため、プロテオミクス解析及びグライコミクス解析は、来年度に行う。

電気泳動後、IC3とIC5の二次元電気泳動画像をそれぞれ別々にスキャンし、Progenesis SameSpots (TotalLab)を用いて、画像解析を行った。検出したそれぞれのタンパク質スポットについて、標準検体の強度に対する相対強度を求め、同一対象者の認知機能の低下前と低下後の比較を行った。現在、コホートより抽出した全解析対象者の検体について解析を行っている。抽出した解析対象群、及びコントロール群の血漿サンプルを取得し、プロテオミクス解析、グライコミクス解析をおこなって、糖尿病性認知機能障害のバイオマーカーを探索する。今年度は、血漿サンプルの取得には至らなかったため、プロテオミクス解析及びグライコミクス解析は、来年度に行う。予算は、プロテオミクス・グライコミクス解析に使用する。
機械的刺激による骨形成促進に関与するWnt/βカテニンシグナルネットワークの解明

ネズミ頭蓋骨縫合部(骨と骨のつぎ目)に引張り力を加えると、骨が急速に沢山作られる。その過程で変化する骨の細胞活性に関係する因子の遺伝子発現について、とくにWnt/βカテニン関連因子群について検討した。その結果、Wnt/βカテニン関連因子群のみならず、その他の骨形成関連因子も含めて時間的・量的変化が明らかとなり、それらの因子間の重要性の度合いについて解明を進めることができた。【研究の目的】機械的刺激による骨形成促進機構へのWnt/βカテニンシグナルの関与について解明を進めることで、骨粗鬆症などの骨量減少疾患の治療の開発や、矯正治療の改善などに貢献することを目的とする。【平成22年度の研究実施計画と成果】(1)反復的伸展刺激装置の開発→反復刺激装置を北村先生の協力を得て作成し、縫合部に反復的伸展刺激を加え、RNAを抽出した。しかし、採取したRNA量が解析にはまだ不十分な量しか採れていない段階で、装置が故障し、修理を行っている段階である。刺激の頻度、伸展力の強さなどの検討がまだこれからなされなければならない。しかし、反復的に伸展することはできそうな手応えを得ている。(2)反復的あるいは持続的伸展刺激による頭頂骨縫合部細胞におけるβカテニンの経時的局在変化の検索。→GFP標識したβカテニンを発現させるアデノウィルスベクターを作成し、縫合部組織に一部発現させることに成功した。しかしながら、発現頻度がまだとても少なく、伸展刺激による変化を観察できる段階には至っていない。(3)インテグリンの阻害実験:RGD蛋白によってインテグリンからのシグナルをブロックする。→交付が10月末からであったため、上記の実験までで本実験には至っていない。【平成22年度の成果の意義と今後】発表にいたる成果は上げられなかったが、反復刺激装置の開発や、組織内でのβカテニン遺伝子の強制発現など、本研究の基礎的な方法の開発に挑戦したという意義がある。実際に実験してみたことで、新たな課題や可能性が見えてきた。今後、装置については開発をすすめ、反復刺激を安定して与えられる実験系を確立したい。組織内での遺伝子強制発現は、以下に高濃度のアデノウィスルベクターを作成し、深部まで感染させるかという点が大きな課題として残されている。(1)縫合部組織からのmRN氏抽出・3、6時間、0.2gの機械的張力刺激を与えた縫合部組織ならびに、刺激を与えずに同時間培養した組織から、網羅的遺伝子発現解析に用いるためのmRNAを、一般的プロトコールに従って抽出した。GeneChipによる解析に使用可能な品質と認められたRNAを、各群、500ng以上採取することができた。・網羅的遺伝子解析の多くは培養細胞を用いて行われており、組織から採取したRNAをもちいることは、一般的に困難であるため数が少ない。しかし、in vivoに近い状況下での遺伝子発現変化をとらえることは、より現実に起こっていることを反映していると考えられ、意義は大きい。骨縫合部という比較的単純な組織を用いるごとが、本研究での特色となる。・解析は、研究分担者である田淵によって遂行された。その結果、3時間で45個、6時間で43個程度の骨形成に関連ずる可能性のある因子が認められた。それらの中にはWnt/βカテニンシグナル関連因子のみならず、今まで機械的刺激による骨形成へに関与についての報告のほとんどない因子も含まれていた。・これらのデータから、数多く存在するWnt/βカテニンシグナル関連因子の内で、in vivoで実際に重要な役割をしているものが浮かびあがるとともに、混在した組織の中での細胞間相互作用に関連する因子を新たに提示できる可能性があり、機械的刺激による骨形成促進メカニズムの解明に寄与できると考えられる。本研究の目的は、機械的刺激による骨形成促進機構へのWnt/βカテニンシグナルの関与について解明を進めることで、骨粗鬆症などの骨量減少疾患の治療の開発や、矯正治療の改善などに貢献することである。本年度は、機械的刺激を加えたマウス頭頂骨縫合部組織からRNAを抽出し、前年度のGeneChipの結果から変化が認められた遺伝子について、再度GeneChipで変化を確認した。さらに、変化した遺伝子の中で興味あるものについてリアルタイムPCRによって発現変化を確認し、いくつかの骨形成関連因子について興味深い変化を捉えることができた。すなわち、伸展刺激を与えて3時間では、骨形成促進に関与すると考えられる増殖や骨芽細胞分化促進に関わる局所因子・サイトカイン(BMPファミリー関連因子、EGFファミリー関連因子)の発現増加が確認され、刺激後6時間ではそれらに加えてWntファミリーの変化も明確になった。従って、機械的刺激による骨形成促進機構におけるWntシグナルの関与は比較的後半期に重要になり、それ以前に細胞増殖を促進する因子として、EGFファミリーの貢献が大きい可能性が示された。

さらに、我々は機械的刺激によりBMP4遺伝子の発現が3時間から促進されることを以前明らかにしているが、今回の結果からBMP受容体の発現も影響を受けることが明らかとなり、BMPファミリーは早期から骨形成促進において重要な因子として働いていると考えられた。以上から、機械的刺激による骨形成促進機構に関連すると考えられるWntをはじめとする局所因子・サイトカインの、組織内での時間的・量的変化が明らかとなり、それらの因子間の重要性の度合いに関する考察を得ることができた。組織から抽出したRNAを用いるため、予想した以上にばらつきがあり、網羅的遺伝子解析を行った結果について、さらに慎重に解析をする必要がでてきた。そのため複数回の実験から得られたRNAを用いて、GeneChipを繰り返すとともに、主要な因子についてはリアルタイムPCRによる確認を行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。データの正確性を増すため、リアルタイムPCRによる解析をより慎重に行う。そのうえで、有意な変化を認める因子についてネットワーク解析を進めるとともに、検出可能で意義があると思われる因子について、in situ hybridizationによる組織内局在変化を検討する。