hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食道扁平上皮癌の新規癌抑制遺伝子としてのEMP3の同定と発現制御機構の解明

本研究により、EMP3遺伝子が食道癌における新規癌抑制遺伝子である可能性を示した。特異性の高いEMP3抗体の策定を行い、同時にマイクロアレイによる遺伝子プロファイリング解析により、EMP3の新たな関連遺伝子候補を抽出した。さらに、EMP3発現制御機構解明のために必要な材料として、同遺伝子のプロモーター領域における複数のDeletion mutant(欠失変異体)を構築した。1)特異性の高いEMP3抗体の策定と臨床検体の集積:既存するEMP3に対する一次抗体(Anti-EMP3 monoclonal antibody (MO1)、clone 3D4、Abnova Corporation)に関しては、免疫組織化学染色での十分な情報が得られていなかった。そこで、臨床検体組織を用いた同抗体の適切な免疫組織化学染色の条件設定を行った。また、同時に多数のホルマリン固定食道癌臨床検体及びその臨床情報の集積を行った。2) EMP3による食道癌細胞増殖抑制に関わる分子機構の解明:既に樹立している細胞増殖能の低下を来たした複数のEMP3強制発現クローンと細胞増殖能に変化のないコントロールベクター導入クローンを用い、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子プロファイリング解析を行った。この結果をGeneSpring GX11にて解析し、新規関連遺伝子の候補の抽出に至った。1)食道癌臨床検体における高特異性EMP3抗体による免疫組織化学染色:既存するEMP3に対する一次抗体(Anti-EMP3 monoclonal antibody (MO1)、clone 3D4、Abnova Corporation)に関しては、免疫組織化学染色での十分な情報が得られていなかったことから、昨年度に引き続き、臨床検体組織を用いた同抗体の適切な免疫組織化学染色の条件設定を行った。同時に、集積し得た食道癌臨床検体の免疫組織化学染色を行った。2)EMP3発現に関連する新規関連遺伝子の同定:(1)食道癌臨床検体における高特異性EMP3抗体による免疫組織化学染色:既存するEMP3に対する一次抗体に関しては、免疫組織化学染色での十分な情報が得られていない。昨年度に引き続き、臨床検体組織を用いた同抗体の適切な免疫組織化学染色の条件設定を行った。(2)EMP3発現制御機構の解明:EMP3発現制御機構としてプロモーター領域のメチル化が関連しているという報告がある一方で、メチル化が少ないにも関わらずその発現が低下している食道癌細胞株が存在すること、さらにTSA処理した食道癌細胞(HEEC-1)のろならず、食道癌以外の細胞株(SV-11、TF-1)においても処理したTSAの濃度依存的にEMP3の発現が抑制されることを報告した(Shoichi Fumoto, Tsuyoshi Noguchi, et al.Cancer letters,, 274 ; 25-32, 2009)。このことは、プロモーター領域のメチル化以外の発現制御機構の存在を示唆している。そこで、プロモーター領域における発現制御因子の作用部位の塩基配列からそのレプレッサーを策定することを目的にプロモーター領域(転写開始点から約2000塩基上流まで)における複数のDeletion mutantを樹立し得た。
高血圧から循環器合併症に至る遺伝的危険因子の解明

本態性高血圧症は社会的負担の大きい各種循環器合併症の主要因であり、本症の遺伝因子を同定することは、疾患の早期診断に役立つだけでなく、薬剤の選択や、生活指導にも貢献することが期待される。しかし、これまでの症例・対照研究では、集団の選択バイアスにより、1因子の影響の小さいとされる高血圧感受性遺伝子の同定は困難であった。本研究では、欧米に比肩しうる住民ベースの大規模コホート研究とコアパネルを用いたDNA解析を行うことにより、高血圧疾患感受性遺伝子の同定、および合併症への進展を規定する因子の検討を行った対象集団として、10年以上にわたって24時間自由行動下血圧および家庭血圧の測定を行ってきた0研究および大阪大学のDNA検体を使用した。研究計画書は3省庁合同の倫理指針に基づき作成され、大阪大学および東北大学倫理委員会の承認を受け、遺伝子解析はインフォームドコンセントの得られた者のみついて実施した。東北地方農村部における大規模前向き研究(0研究)では、家庭血圧と24時間血圧測定が数千人規模で実施され、血圧に関する豊富な表現型が把握されている。高血圧感受性遺伝子同定のための新しいケース・コントロール研究の実施により、αアデュシン遺伝子多型が低レニン性高血圧リスクとなることを示したほか、キマーゼ遺伝子多型が血圧とは関連しないが末梢からのHDLコレステロール輸送に関連すること、0研究ではACE/DDの影響は小さいことなども報告した。また、都市部一般住民における大規模前向き研究(S研究)では、アルツハイマー病や動脈硬化リスクとされるアポリポ蛋白Eのε4アリルが、若年者では高血圧に抑制的に働くことを示した。本研究では、欧米に比肩しうる住民べースの大規模コホート研究とコアパネルを用いたDNA解析を行うことにより、高血圧疾患感受性遺伝子の同定、および合併症への進展を規定する因子の検討を行った対象集団として、10年以上にわたって24時間自由行動下血圧および家庭血圧の測定を行ってきたO研究および大阪大学のDNA検体を使用した。研究計画書は大阪大学および東北大学倫理委員会の承認を受け、遺伝子解析はインフォームドコンセントの得られた者のみついて実施した。阪大研究では、高齢者における肺炎発症に、アンジオテンシン変換酵素遺伝子のDD型がリスクとなる(オッズ比=2.9倍,vs ID+II)ことや、レニン遺伝子多型は関連がないことが示された。O研究では、エンドセリン1遺伝子多型が肥満者のみで高血圧のリスクとなることや、アルドステロン合成酵素や24時間ABPMや夜間降圧に関与することが示された。これらの結果は、重篤な循環器合併症の予防に、これら遺伝子多型情報に基づく個別の生活指導を利用できる可能性を示すものと考える。
ナノアモルファスコンポジット材料によるイオンセンシング

本研究では、電気化学手法によるリンの迅速・高感度・高精度な分析技術の開発を目指して、アモルファス相中にナノ粒子を分散したナノアモルファスコンポジット材料の合成とそのイオンセンシング特性を研究する。本研究はイオンセンシングにおける革新的材料の創成につながるとともに、イオンセンシングが実現できていない分野を開拓する上での研究指針を示すものとなる。
星間分子探査に備えた分子・分子イオンのテラヘルツ域回転遷移周波数の精密測定

国際的な星間分子観測プロジェクト(ALMA, SOFIA, Herschelなど)における遠赤外域のスペクトル研究を地上の実験室で支えるために、世界で唯一6テラヘルツまで調べられる富山大学の遠赤外分光計を用いて、分子や分子イオンの回転遷移の周波数を数十kHzの精度で精密に測定した。D2H+, 15NH3 , HCO+ (同位体分子を含む)などの測定を行った。とくにD2H+の測定値はこのイオンの分子定数改良に貢献した。近年の電波天文学はテラヘルツ(遠赤外)領域へと進展しつつあり、ALMAをはじめとする国際観測プロジェクトがいくつも稼動している。これを支える実験室の高精度分光研究の役割は大きい。そこで、本研究では世界唯一の波長可変コヒーレント光源型遠赤外分光計を用いて、主に星間分子として重要な分子・分子イオンについて、それらの回線遷移周波数を数十kHzの高精度で測定する。26年度は以下の2つの目標に向かって進めた。(1)イオン生成のための圧力微調整機構の改良とCH+イオンの測定。星間イオンとして大事なCH+イオンを実験室で分光するためには、負グロー拡張型のイオンセル中に微量なメタンガスを注入する技術が必要である。これまで手持ちの流量コントローラーでは微量なコントロールができないため、あらたにこれを可能とするマスフローコントローラーを導入した。今年度はイオンの測定までは行かなかったが、測定系の改造まで進展した。次年度、HCO+の分光が終わってからCH+の測定に取り掛かる。(2)HCO+イオンとその同位体イオンの分光。HCO+イオンも星間イオンとして重要であり、その回転遷移周波数の精密測定が必要である。すでに前年度までに何本かを測定してあったが、今年度本格的に測定をおこなった。これまでにほぼ予定通りの進展で、炭素12、水素(H,D)のH12CO+,D12CO+、さらに炭素13、水素(H,D)のH13CO+,D13CO+について測定が進み、分子定数などを改良できた。これらは国際会議でも発表している。進展が順調であるので、このまま酸素18の同位体についても測定を拡張することにした。27年度は以下の2つのテーマについて成果があった。(1)HCO+イオンとその同位体イオンの分光測定を一通り終えた。HCO+イオンは星間イオンとして重要であり、その回転遷移周波数の精密測定が必要である。すでに前年度までに、炭素12、水素(H,D)のHl2CO+,Dl2CO+、さらに炭素13、水素(H,D)のH13CO+,Dl3CO+について測定が進んでいたが、今年度は残りの酸素18、水素(H,D)のHC18O+,DC18O+について測定を進めた。これによりHCO+の分子イオンについてはひととおり測定がでそろったので、分子定数などを各同位体ごとに改善しまとめることができた。成果については国際会議や国内の会議で発表し、また、論文を起草中である。(2)D2H+イオン分子の回転遷移周波数測定。当初予定していたCH+イオンの測定に先立って、米国JPL研究所の要請で至急にD2H+イオン分子の回転スペクトルを試すことになった。負グロー域拡張型の試料放電セルを使った実験により、2本のスペクトル線について確認できた。このうちの1本は今回新たに測定できた線であり、早速その測定周波数値を用いた解析がJPLでおこなわれた。このあと検出器が故障して年度の残りの期間を修理に費やしたので、予定していたCH+イオンの測定は最終年度へ持ち越すことになった。また、今回測定したD2H+のデータを取り入れた論文がJPLのグループによってまとめられつつある。予定していたHCO+の分光測定が完了したこと、および、これまでなかなか検出できないで長年の懸案事項であったD2H+イオンの測定ができたことで、まずは成果があったと判定している。ただし、11月後半になって、これまで30年近く動作していた遠赤外検出器がこわれたことから、その状況調査、修理などに時間を費やし、年度末まで測定が中断したのは不測の事態であった。最悪の場合検出器が直らなければ今後の計画が中絶するところであったが、幸い検出器は科研費からの出費で無事直ったので、D2H+イオンの継続とCH+イオンの測定は最終年度へ持ち越すことにした。(1)D2H+イオンの成果公表:前年度の後半に最も重要な構成機器である遠赤外検出器(シリコンコンポジットボロメーター)が故障した。30年近く大切に使用してきたものであるが,幸い検出素子ではなく周辺の半導体素子の故障であることが判明し、修理ができた。この故障のため前年度測定していたD2H+イオンの測定が前年度末まで中断した。HD+イオンの測定は米国JPL研究所のグループとタイアップして行っていたものであり、論文公表が急がれたので、とりあえずそれまでに図られていたスペクトル線1本の周波数測定結果と、それを含めて行われた解析結果が公表された。

D2H+イオンは星間分子のうちでも最も基本的な分子イオンの一つであり、星間科学の進展への寄与が大きいものと期待される。(2)15NH3分子の分光:修理後の検出器のノイズが以前よりも大きめであったため、本来の予定であったD2H+イオンの継続測定を変更し、検出器の状態をチェックするために試料サンプルの状態が把握しやすい中性分子の分光に切り替えた。ちょうど星間分子研究で著名なケルン大学からアンモニアの窒素15同位体の測定データがほしいという要請があり、この分子の回転遷移を系統的に測定した。また、アンモニアでは禁制遷移としてほとんど測定されていない線で、量子数KがΔK=3で変わる遷移があるが、これについて測定データが得られれば、分子定数の決定に大きな効果が期待される。そこで、吸収セルの改良の後ΔK=3の線について試行を重ね、ようやく1本について検出することが出来た。(3)残る課題への対処:最終年度までに終えるつもりであった課題には、CH+の分光、HCO+の成果公表、D2H+の測定継続などがあり、上記の機器不調などにより達成ができなかったが、補助事業期間を終えた来年度(申請者の在職最終年度)計画を続行し達成したいと思っている。国際的な星間分子観測プロジェクト(ALMA, SOFIA, Herschelなど)における遠赤外域のスペクトル研究を地上の実験室で支えるために、世界で唯一6テラヘルツまで調べられる富山大学の遠赤外分光計を用いて、分子や分子イオンの回転遷移の周波数を数十kHzの精度で精密に測定した。D2H+, 15NH3 , HCO+ (同位体分子を含む)などの測定を行った。とくにD2H+の測定値はこのイオンの分子定数改良に貢献した。年度前半は病気療養のため実験をひかえていたが、年度後半から予定の分子イオンCHO+(炭素13同位体と重水素同位体も含む)の測定を進め、一応予定の測定をおこなうことができた。結果が順調であるので、次年度の予定に加え、酸素18同位体の測定へも拡張することにした。CH+イオンの測定に備えて微量流量コントローラーを導入し、そのための実験系を改造しつつある。当初の予定では実際の測定にかかる予定であったが、測定は次年度に繰り入れることにした。28年度は本研究の最終年度であるとともに、定年を控えた申請者の研究生活の最終段階でもある。これまで、懸案になっていたCH+などの基本的な星間分子イオンを中心に、できるだけこれまでの研究が完結するように測定を進めてゆく。さらに、本研究の分光装置は、世界でも富山大学にしかない遠赤外域の高精度な分光測定器であることから、継続して研究がなされるよう、後継の人材に対しても教育指導をしてゆきたい。数物系科学炭素13と通常の水素からなるHCO+イオンについて、求めた分子定数の誤差がまだ十分に小さくなっていないので、この原因を探り、必要なら、再測定をおこなう。その後、酸素18と水素・重水素のHCO+同位体について測定をおこなう。さらに、これまで信号が見えていないCH+イオンについて、昨年度調達できた微量流量コントローラーを用いた測定系に改装して信号検出を試みる。これらイオンの測定をおこないつつ、当初予定のD2H+イオンと、H3O+イオンの測定をおのなう。検出器故障修理が年度の終盤までかかり、残額が不確定であったこと、および残金があったとしても小額であったので、次年度の物品購入にあわせて使うようにした。
低融点合金を治具とする機械加工技術の開発

(1)低融点合金の特性を知り(2)材種毎の加工物との相性を探り(3)実際の機械加工用いる事、を目的として本研究を行った。まず(1)について、当該合金の特性を知る為にアルミ丸棒に穴開けを行い、当該合金を充填し→旋削→穴あけ→タップ立てをした。加工性は良くタップも問題なく立てられた。また母材ともしっかりと固着しており当該合金と治具との間に滑りもなかった。これにより当該合金は治具として充分に耐えられる可能性を得た。切削で出た当該合金の切り屑を集め再度溶融してみたが、それらが再利用できるような結合は得られなかった。次に(2)についてステンレス、アルミニウム、銅、真鍮、ポリアセタール樹脂と当該合金との相性を探った。特に、加工終了後に母材から低融点合金が剥がれない場合は治具として不適であることから取り外し性について探った。結果として銅、真鍮は母材表面に低融点合金がなじみ、張り付いてしまう事例が発生した。そのため、これらの対処法を検討したところ、当該合金を充填する前にテフロン系潤滑材を母材表面に塗布することによって、張り付きを軽減できる結果を得られた。今回は5種の材料であるが、どんな材料に対しても使える可能性を示す事が出来た意義は大きいと感じる。最後に(3)について、実際の部品作成の際に用いて検証を行った。一つ目の加工事例とし、薄肉加工を行った。これまでは入れ子と呼ばれる治具を作り、隙間を埋めて薄肉の加工を行ったが当該合金を流し込むだけで、これまでと同等の加工性能を得られた。二つ目の加工事例としてアルミニウム板の薄肉異形状加工した。従来、異形状加工の場合は上記に示した入れ子の準備に手間とコストがかかったが、流し込むだけで切削加工に必要な強度が得られ、従来と同等の加工性能を得られた。これらより本研究では低融点合金が治具として有効に利用できる事を評価できた。また、低融点合金は切り屑にならない限りは簡単に再利用ができ、加工時間の短縮と環境負荷の低減にも役立つ治具であるという結果を得られた。
看護師間コミュニケーションの定量化と可視化に基づく離職防止対策と教育的課題

本研究では、日立ハイテック社製のビジネス顕微鏡を使用し、看護師間や看護学生の集団内コミュニケーションの量的把握を行う。会話内容は測定せずにコミュニケーションの量や構造を可視化し、(a)対面時間、(b)密度、(c)集中度、(d)相互性により実態を明らかにする。さらに対面時間とチームワーク測定尺度や職務満足度尺度の下位尺度との順位偏相関係数を算出し、その関連性を分析する。コミュニケーション構造については、測定期間内の組織ネットワーク図を表示し、ネットワークの密度や位置関係からその特徴を考察する。それらに基づき、就業につながる教育的支援と早期離職防止のための具体的対策や提案を目指す。
超高エネルギ-ハドロンコライダ-(SSC)実験におけるミュ-粒子測定とそのトリガ-の研究

素粒子物理学における標準理論を越える新しい物理学を切り開くものと期待され、現在すでに建設が開始されている次世代の加速器、超高エネルギ-ハドロンコライダ-(SSC)ではヒッグス粒子、超対称性粒子など新しい粒子の発見が期待されている。これら新粒子の発見にはミュ-粒子の測定は非常に重要な役割を担うが、これまでの加速器における実験とは異なり、陽子・陽子反応頻度が高く、反応により生成される二次粒子の数も多い。また、測定すべき高エネルギ-のミュ-粒子にはしばしば付属粒子を伴い、ミュ-粒子の測定を邪魔する。従って、上記目的のためにはこれらを正しく評価し適切な測定器を開発することが重要である。高エネルギ-ミュ-粒子を良い運動量分解能で測定し、かつ、ミュ-粒子とそれに近接する付属粒子を良く区別できる測定器として、単一セル内の信号線の数が3本と極端に少ないジェット・チェンバ-の開発を開始した。信号線の長さが長いこと、また、その本数が多いことを考慮して、信号線切断事故の場合にあっても被害が当該セルの外部に及ばないように各セルは閉じられた構造とする。また、死角を最小限にすること、および、ミュ-粒子トリガ-を容易ならしめるため、チェンバ-は2層構造、かつ、それぞれの層は互いに半セルずらせた上同一セル内の3本の信号線は常に陽子・陽子反応点を向く配置とする。以上の基本設計に従いシュミレ-ション・プログラムを開発してミュ-粒子測定システムの性能評価を行った。トリガ-は半セルずれた上下のセルでミ-ンタイマ-を通し、シンチレ-ション・カウンタ-との間で3重同時計測を行う。トリガ-の頻度は、重粒子生成によるもの、ハドロンの崩壊によるもの、吸収材突き抜けによるもの、宇宙線によるものとわけて検討された。その結果、トロイド磁石の偏向方向のみでなくそれに直行する方向にも1層チェンバ-を設置し宇宙線によるトリガ-を減らせる必要があることが判明した。このチェンバ-追加によりミュ-粒子測定システムは「しきいち」10ないし20GeVで十分動作可能であることが確信された。しかも、このトリガ-回路ではデジタイザ-の情報を使用することなく各セル内の位置が1mm以内の精度で判明し、高レベル・トリガ-に有効に使用されることも分かった。次に、米国フェルミ国立加速器研究所の高エネルギ-・ビ-ムを使って高エネルギ-・ミュ-粒子測定のためのビ-ム・テストを行った。テスト・チェンバ-は日本グル-プ提案のものに極近いチェンバ-を米国チ-ムが製作し、日本チ-ムはデ-タ収集とその解析を行った。その結果、高エネルギ-・ミュ-粒子はそのエネルギ-によって異なるが(50-550GeV)17-30%の確率で付属粒子を伴うことが確認された。また、この種のチェンバ-は100ミクロン以下の位置精度が容易に得られることも確認された。これらのデ-タはシュミレ-ション・プログラムの調整にも大いに利用され、ビ-ム・テストでは調べられなかった条件下での評価にも大いに役立った。その一部は添付資料に掲載されているが、世界的にもめずらしく、今後この種の実験計画作成に重宝するものと確信する。一方国内にあっては、この種チェンバ-の基本性能確認のため小型テスト・チェンバ-を製作、宇宙線を用いてガス・ゲイン、位置精度の確認、電場配置の最適化など概念設計に必要な基礎デ-タの蓄積を行った。また、実用段階での諸問題を検討するため、8mX3mの大型プロトタイプ・チェンバ-を製作して主として製作および使用にかかわる機械的問題点の検討を行った。その結果、小型チェンバ-では設計計算通りの性能がでることが確認されたが、大型チェンバ-では陰極板の材質およびその支持方法に工学的検討がなお必要であることが判明し、現在改良中である。トリガ-は半セルずれた上下のセルでミ-

ンタイマ-を通し、シンチレ-ション・カウンタ-との間で3重同時計測を行う。トリガ-の頻度は、重粒子生成によるもの、ハドロンの崩壊によるもの、吸収材突き抜けによるもの、宇宙線によるものとわけて検討された。その結果、トロイド磁石の偏向方向のみでなくそれに直行する方向にも1層チェンバ-を設置し宇宙線によるトリガ-を減らせる必要があることが判明した。このチェンバ-追加によりミュ-粒子測定システムは「しきいち」10ないし20GeVで十分動作可能であることが確信された。しかも、このトリガ-回路ではデジタイザ-の情報を使用することなく各セル内の位置が1mm以内の精度で判明し、高レベル・トリガ-に有効に使用されることも分かった。次に、米国フェルミ国立加速器研究所の高エネルギ-・ビ-ムを使って高エネルギ-・ミュ-粒子測定のためのビ-ム・テストを行った。テスト・チェンバ-は日本グル-プ提案のものに極近いチェンバ-を米国チ-ムが製作し、日本チ-ムはデ-タ収集とその解析を行った。その結果、高エネルギ-・ミュ-粒子はそのエネルギ-によって異なるが(50-550GeV)17-30%の確率で付属粒子を伴うことが確認された。また、この種のチェンバ-は100ミクロン以下の位置精度が容易に得られることも確認された。これらのデ-タはシュミレ-ション・プログラムの調整にも大いに利用され、ビ-ム・テストでは調べられなかった条件下での評価にも大いに役立った。その一部は添付資料に掲載されているが、世界的にもめずらしく、今後この種の実験計画作成に重宝するものと確信する。一方国内にあっては、この種チェンバ-の基本性能確認のため小型テスト・チェンバ-を製作、宇宙線を用いてガス・ゲイン、位置精度の確認、電場配置の最適化など概念設計に必要な基礎デ-タの蓄積を行った。また、実用段階での諸問題を検討するため、8mX3mの大型プロトタイプ・チェンバ-を製作して主として製作および使用にかかわる機械的問題点の検討を行った。その結果、小型チェンバ-では設計計算通りの性能がでることが確認されたが、大型チェンバ-では陰極板の材質およびその支持方法に工学的検討がなお必要であることが判明し、現在改良中である。
急性腎不全モデルにおけるα-MSHによる病態改善メカニズムの検討

阻血・再還流手術前後の体温管理を厳重に行うことにより、阻血性腎不全は安定して発現するようになった。安定した阻血性急性腎不全モデルが作成されるようになったので、Sham手術、阻血後0,1,2,4時間で腎臓を摘出し、RNAを抽出した。以前からの蓄積されたデータを利用して、これらのサンプルが同様の変化を生じているかを確かめた結果CYR61やHBEGFの上昇が確認された。以前からの予備的な実験で、CYR61の重要性を発見していたため、その発現の時間的な変化と部位的な点、尿中での検出について以前からの共同研究者たちと検討し、阻血性急性腎障害モデルでのCRY61を報告した。CYR61のmRNAは正常やSham手術の腎臓ではノーザンブロット法では検出されないが、阻血後の再還流2時間の腎で強く発現した。障害のない他の臓器には検出されず、障害臓器に特異的であった。CYR61蛋白は障害の後424時間強い発現が持続しており、またヘパリンビーズを利用して尿中に排泄された蛋白を検出することができた。このような特性からCYR61の上昇は阻血による一連の腎の変化の引き金の一つとなりうると思われ、また診断の補助としての利用が期待された。α-MSH投与によってどのような変化を生じるかについては、現在まだ検討中である。そのほかの阻血性腎障害の病態に関係する蛋白についてはHBEGFのmRNAが阻血後約8時間でおよそ100倍以上に増加していることが確認された。ただα-MSHによる腎保護作用の直接の担い手は発見できていない。以前からの動物実験の経過から、マウスにおける阻血性急性腎不全モデルを作成する上で、マウスの体温コントロールが極めて重要であり、それによって初めて安定した腎障害が得られるようになる。そのため恒温プレートを購入し、全体を39°Cに保った状態で腎の阻血を行い、組織障害を生じさせた。この操作によって比較的安定した腎障害を呈するようになったため、阻血35分後の再還流時系列での腎臓組織を作成した。以前からの蓄積されたデータを利用して、これらのサンプルが同様の変化を生じているかを確かめてみた。その結果CYR61やHBEGFの上昇が確認され、動物実験系を利用可能になった。α-MSHの効果についてはまだ、安定した結果が得られていない。これはα-MSHが13個のアミノ酸からなるペプチドであり、突気中の水分の存在ですぐに失活してしまうためと思われた。どの会社の試薬が最良か、どのような保存方法が一番安定しているかを早急に検討する必要が生じている。手術前後の体温管理を厳重に行うことにより、阻血性腎不全は安定して発現するようになった。以前からの蓄積されたデータを利用して、これらのサンプルが同様の変化を生じているかを確かめた結果CYR61やHBECFの上昇が確認された。

障害のない他の臓器には検出されず、障害臓器に特異的であった。CYR61蛋白は障害の後424時間強い発現が持続しており、またヘパリンビーズを利用して尿中に排泄された蛋白を検出することができた。このような特性からCYR61の上昇は阻血による一連の腎の変化の引き金の一つとなりうると思われ、また診断の補助としての利用が期待された。α-MSH投与によってどのような変化を生じるかについては、現在まだ検討中である。そのほかの阻血生腎障害の病態に関係する蛋白についてはHBECFのmRNAが阻血後約8時間でおよそ100倍以上に増加していることが確認された。ただα-MSHによる腎保護作用の直接の担い手は発見できていない。
STJ検出器による高効率極端紫外線望遠鏡のための多層膜光学素子の開発

本年度は、最終年度であるが、Mg2Si多層膜光学素子の設計・作製を中心に行った。多層膜光学素子の試作と最適化では、平成12年度に理化学研究所内に導入された多層膜成膜装置を用いて試作をする予定であったが、他の研究プロジェクトとの装置のシェアリングの関係で、Mg2SiではなくNi/Tiを用いた多層膜の製作を主に行い、本目的の曲面多層膜を作製するための装置の制御技術の習得を行った。Ni/Tiを用いた成膜精度は、当研究室が保有しているX線装置で評価し、本研究の多層膜が成膜する能力を十分に持つことを確認した。Mg2Siを用いた多層膜の作成を、別途、研究室で保有している通電過熱蒸着装置で試みたが、多層膜として機能させるにいたらなかった。層間の膜が相互拡散した等の原因を考えている。また、Mg2Siを成膜する為には、それに適した成膜装置が必要であることが解った。本予算はこれで、終了してしまうが、引き続き成膜の可能性を模索したい。光学系の設計に関しては、保有する超伝導接合素子(STJ)冷却用クライオスタットに取り付く小型望遠鏡の基本設計を完了させた。2回反射を利用したカセグレン型望遠鏡となっており、クライオスタット真空内の常温部に設置する構造とした。STJを0.3Kという極低温に保った状態で、集光した光を照射できるように熱シールド構造が十分にとれる設計を行った。本研究により、極端紫外線用の低温検出器を用いた望遠鏡の構築が十分に出来ることを確認したが、Mg2Siを用いた多層膜の製作という課題が残った。平成13年度は、(1)多層膜成膜装置の成膜プログラムの開発、(2)EUV光源システムの構築、(3)光学系の設計を行った。平成12年度末に理化学研究所内に導入された多層膜成膜装置を用いた成膜シーケンスのソフト開発を行った。このプログラムにより、20ペアのNi/Ti多層膜の試作に成功している。また、X線での反射率を測定し、作製素子の基本性能を調べる目的で、平成12年度末に理化学研究所内に導入されたX線多層膜構造解析装置の制御ソフトの開発も完了し、試作した多層膜の評価を開始している。これと平行して、EUV光をモノクロメータを介して単色光を素子に入射するシステムの構築も行い上記のX線多層膜構造解析装置の測定ステージ部に光を導入できるシステムを構築し、EUVでの反射率評価を行える体制が整いつつある。光学系の設計に関しては、理研が保有している業界リーダーの光学シミュレーションソフトのCodeVとASAPをもちい収差補正、迷光評価等の光学系の最適化を行う準備が整い、初期的な結果を用いて2件の国内特許(内1件は、国際特許)を申請・取得している。次年度は、目的の物質組み合わせであるMoとMg2Siの多層膜の作製評価を行い、曲面に精度良く成膜する技術の探索を行う。また、当研究室で開発している極端紫外線用超伝導トンネル接合素子検出器と反射鏡を組み合わせて試験的な小型望遠鏡の設計を行う。可能であれば、実際の製作も行いたい。本年度は、(1)多層膜光学素子の設計・作製、(2)EUV光源システムの構築、(3)光学系の設計を行った。多層膜光学素子の試作と最適化では、平成12年度に理化学研究所内に導入された多層膜成膜装置を用いて試作をする予定であったが、他の研究プロジェクトとの装置のシェアリングの関係で、Mg2SiではなくNi/Tiを用いた多層膜の製作を行い、本目的の曲面多層膜を作製するための装置の制御技術の習得を行った。また、作製した多層膜は、平成12年度に理化学研究所内に導入されたX線多層膜構造解析装置を利用してX線での反射率を測定し、十分な反射特性を有することを確認した。EUV光源システムの構築では、モノクロメータを介して単色光を素子に入射するシステムを構築および改善を継続中である。EUVでの反射率評価試験では、まずHeII(304Å)に対する特性を確認する。その結果を素子作製に反映させていく。なお、本試験は平成14年度にも継続して行う。光学系の設計では、理研が保有している業界リーダーの光学シミュレーションソフトのCodeVとASAPをもちい収差補正、迷光評価等の光学系の最適化を継続中で、直入射光学系として、カセグレンタイプ、斜入射光学系としては、従来の多重型Wolter-II型の設計を進めている。また、Wolter-IIのタイプ4は、従来の多重型Wolter-II型に比較して、有効径を向上させることを確認した。来年度は、上記の基礎実験、計算を利用して、光学系のプロトタイプの構築を行いたいと思っている。

Ni/Tiを用いた成膜精度は、当研究室が保有しているX線装置で評価し、本研究の多層膜が成膜する能力を十分に持つことを確認した。Mg2Siを用いた多層膜の作成を、別途、研究室で保有している通電過熱蒸着装置で試みたが、多層膜として機能させるにいたらなかった。層間の膜が相互拡散した等の原因を考えている。また、Mg2Siを成膜する為には、それに適した成膜装置が必要であることが解った。本予算はこれで、終了してしまうが、引き続き成膜の可能性を模索したい。光学系の設計に関しては、保有する超伝導接合素子(STJ)冷却用クライオスタットに取り付く小型望遠鏡の基本設計を完了させた。2回反射を利用したカセグレン型望遠鏡となっており、クライオスタット真空内の常温部に設置する構造とした。STJを0.3Kという極低温に保った状態で、集光した光を照射できるように熱シールド構造が十分にとれる設計を行った。本研究により、極端紫外線用の低温検出器を用いた望遠鏡の構築が十分に出来ることを確認したが、Mg2Siを用いた多層膜の製作という課題が残った。
精神障害者をもつ家族への援助技術の開発

〈研究目的〉看護職の専門的援助技術として,精神障害者をもつ家族への有効な援助技術を明らかにすることを目的とした。〈結果および考察〉今年度は,地域精神保健看護の観点から,保健婦の行う精神分裂病患者の家族への援助内容と特徴について質的な分析により,以下のように明らかにした。保健婦の援助は「家族のもつケア能力の向上」に向けて行われており,特に援助導入時は「家族との信頼関係の構築」が中心であった。1,援助内容としては,1)家族自身に向けての援助:(1)家族が相談できる人,家族を脅かさない存在として出会う。(2)家族の健康度を高める。(1)不安や焦りなど,家族の心的負担を緩和する。(2)家族自身の健康についてのセルフケア能力を高める。2)本人と家族との関係に向けての援助:(1)具体的な場面を通して本人と家族との関係を確認する。(2)保健婦自身を本人と家族が良好な関係を作るための道具として活用する。例えば,家族に対して本人とのコミュニケーションの取り方のモデルを示す等。(3)本人と家族間のコミュニケーションの介在者として機能する。(4)家族が本人への理解を深め,本人に対応できるよう助ける。3)家族と社会とをつなぐ援助:(1)家族を支える関係機関のネットワークや社会資源の強化を図る。(2)社会からの刺激として家族に接する。2,援助の特徴として,1)家族に相談できる人と認知してもらうために,保健婦との出会い方の工夫や同行受診等により,家族と一緒にいる場面を多く共有しながら家族との信頼関係を築くことに主眼がおかれていた。2)家族の焦りや不安などの心的負担を,家族と一緒に行動する・本人への対応方法を場面を通して提示するといった具体的な援助を行いながら緩和していた。〈研究目的〉看護職の専門的援助技術として,精神障害者をもつ家族への有効な援助技術を明らかにすることである。〈結果および考察〉今年度は,研究目的に従って主に次の2点を実施し,以下の知見を得た。1,精神分裂病患者をもつ家族と看護婦(士)と退院時面接の参加観察を行うことで,家族援助の実際を把握した。その結果,看護婦(士)は患者の現在の病状や生活状況といった状態を把握しながらも,家族の介護条件をアセスメントし,家族のニーズをふまえた上での援助を行っていた。具体的には,1)家族の訴え(不満)を受けとめる,2)家族状況を考慮して退院時期の決定する(例;柔軟性をもった日程の調整),3)家族の訴え・状況を把握した上で,退院後の患者の生活を再構築する(生活リズム・人とのつきあい),4)患者と家族の関係性の調整であった。さらに,患者の退院後の生活を再構築していくために,5)家族への教育的な援助を行っている傾向にあった。2,家族への個人・およびグループを対象とした半構成面接をおこなった。その結果,現時点で,家族は,1)看護職に特定した援助ニーズと,2)看護職に限定しない医療職への援助ニーズがあることが明らかになってきた。1)看護婦(士)に特定した援助ニーズ;(1)情緒的ニーズ;患者および家族に対して優しく対応する・声をかける・話を聞く。2)看護職に限定しない医療職への援助ニーズ;(1)再発時・症状増悪時の精神科救急対応の充実(家族の負担軽減)(2)病状や病気の見通しなど,病気に対する正しい知識伝達の充実さらに,本研究は来年度も継続する予定である。その内容としては,家族の援助ニーズのさらなる把握,および看護援助の実際の把握を中心とする。なお,上記と比較する意味で,思春期問題をもつ親への援助についても検討した。
高蛋白質給与ならびにバイパスアミノ酸投与がめん羊の骨成長に及ぼす影響

本研究は高蛋白質飼料給与ならびに小腸上部に直接到達させたアミノ酸がカルシウム、骨代謝、骨成長にどのような影響を与えるかについて調べたものである。めん羊に高蛋白質飼料を給与すると、見かけのカルシウム吸収は促進され、体内カルシウム保有量は有意に増加した。尿中カルシウム排泄量も高蛋白質飼料摂取により増加したが、これは腎臓における糸球体ろ過量が増加し、尿細管以降でのカルシウム再吸収量に変化がなかったことによるものと考えられた。また高蛋白質飼料給与により、血漿中カルシウム濃度はわずかながら低下し、骨吸収の指標とされている血漿中遊離ハイドロキシプロリンならびに血漿中副甲状腺ホルモン濃度は上昇した。したがって、全体的に言えば高蛋白質飼料給与はカルシウムおよび骨代謝を活発にしていると考えられた。めん羊に対するEDTA注入時の骨からのカルシウム動員量は高蛋白質飼料給与により増加したが、この試験結果も高蛋白質飼料摂取は骨代謝を活性化することが示唆された。めん羊の第四胃へのカゼイン注入によって、血漿中ソマトメジンC濃度は増加する傾向にあり、血漿中インスリン濃度は明らかに増加した。しかし、骨形成の指標であるオステオカルシン濃度には変化が認められず、第四胃以降への良質な蛋白質の流入は骨成長の促進に働くことが推察されたが、動物の成長段階によって反応に違いのあることも示唆された。また第四胃へのアラニンとアスパラギン酸注入は血漿中インスリン濃度を上昇させたが、ソマトメジンC濃度を減少させた。したがって十二指腸に到達するアミノ酸の種類、量により、骨代謝・成長に関連するホルモンの反応に違いが生じる可能性のあることが考えられた。高蛋白質飼料給与がめん羊カルシウム(Ca)および骨代謝に与える影響を調べるために、2つの試験を行った。第1試験では4頭の、第2試験では6頭の去勢めん羊を用いて試験を行った。同一エルネギ-摂取条件下では高蛋白質飼料摂取により見かけのCa吸収は促進され、体内Ca保有量は統計的に有意に増加した。一方、尿中Ca排泄量も高蛋白質飼料摂取により増加したが、これは腎臓における系球体ろ過Ca量が増加し、尿細管以降でのCa再吸収量に変化がなかったことによるものと考えられた。また高蛋白質飼料を給与すると、血漿中Ca濃度はわずかではあるが低下し、骨吸収の指標と考えられる血漿中遊離ハイドロキシプリン濃度ならびに血漿中副甲状腺ホルモン濃度は上昇した。したがって全体的に言えば高蛋白質飼料給与はめん羊のCaおよび骨代謝を活発にしていると考えられた。めん羊を用いてEDTA負荷試験を行ったが、EDTA注入時の骨からのCa動員量は高蛋白質飼料給与区の方が対照区よりも多く、この試験結果も高蛋白質飼料給与はめん羊の骨代謝を活性化することを示唆していた。ラットの筋肉内に脱灰骨基質を埋没して、埋没物が骨化していく様相を観察する方法を用いて、高蛋白質飼料給与が骨形成に与える影響について検討した。対照食区では移植14日後では骨基質を分泌している骨芽細胞、骨細胞と多核の破骨細胞の存在が観察されたが、高蛋白質食区では骨芽細胞、破骨細胞はほとんど見られず、軟骨細胞が優勢な状態であった。これは高蛋白質飼料摂取によってラットの骨化が遅延あるいは抑制されたか、または軟骨の増殖が促進された結果によると推察されるが、その詳細については今後の検討が必要である。第4胃にカテ-テルを装着した4頭のめん羊用い,第4胃へのカゼイン投与が窒素(N)出納,血液中カルシウム(Ca)濃度,骨代謝指標に与える影響について調べた。対照区に比べて,カゼイン投与区では,Nの採取量は2倍近くに増加し,Nの体内保有量,血漿中の尿素態N濃度はそれぞれ約3倍に増加した。

血液中のCa濃度はカゼイン投与により低下の傾向があり,尿中ハイドロオキブロリン排泄量は増加の傾向が見られたことから,骨吸収は盛んになっていることが示唆された。上記の試験と同時に,6ケ月間もの長期間にわたり,高蛋白質飼料でラットを飼育してミネラル出納と骨中ミネラル含量を調べた試験では,Ca吸収はすべての時期において高蛋白質飼料投与により増加するが,骨中のCa含量は飼育末期では低下することが認められた。したがって,カゼインを多く含む高蛋白質飼料の投与はCaのみかけの吸収を増加さすが,尿中Ca排泄量も増加させ,血液中のCa濃度の低下を引き起こすと考えられた。さらに血液中のCa濃度の低下は骨吸収の増加を導き,若い動物では骨代謝の活性化を引き起こすが老齢の動物では骨中Ca含量の減少を導くと思われた。一方,カゼインの部分分解物であるカゼインプロフォスフェイト(CPP)投与が骨代謝に及ぼす影響を脱灰骨基質(DBM)埋没法を用いて調べた。飼料中0.5%のCPP投与は血液中Ca濃度を有意に上昇させ,Ca含量を有意に増加させた。また,DBM中のAlpーaseに変化は見られなかったがAcpーaseは有意に減少していた。したがって,CPPは骨吸収を減少させ,骨中のCa濃度を上昇させる働きがあると考えられた。めん羊に微細に粉砕しためん羊骨を埋没して骨吸収を調べる方法(非脱灰骨埋没法)を用いて蛋白質欠乏が骨吸収に与える影響について調べた試験では低蛋白質飼料給与は破骨細胞の増殖を抑え,骨吸収の低下を導くことを見出している。当該年度は2つの実験のまとめとなる。1番目の試験は、第四胃内へのカゼイン注入がめん羊の血漿中ソマトメジンC濃度および骨代謝に及ぼす影響に関する研究である。第四胃内へのカゼイン注入により、血漿中ソマトメジンC濃度およびインスリン濃度は増加する傾向にあった。また、尿中ハイドロキシプロリン排泄量はカゼイン注入によって増加した。したがって、第四胃内へのカゼイン注入は骨成長に促進的に作用するとともに骨吸収も活性化することが考えられた。一方、骨形成の指標である血漿中オステオカルシン濃度にはカゼイン注入の影響は認められなかった。この結果はソマトメジンC濃度の増加が骨形成の促進に結びつかなかったことを示唆している。本試験で用いた動物は成熟しためん羊であったことおよびカゼイン注入が13日間と短かったことが骨形成の促進に至らなかった原因であるのかもしれない。2番目の試験は、第四胃内へのアラニンおよびアスパラギン酸注入がめん羊の骨代謝および血漿中骨成長促進ホルモン濃度に及ぼす影響についての研究である。アラニン、アスパラギン酸注入とも血漿中インスリン濃度を上昇させ、血漿中グルコース濃度を減少させた。また両アミノ酸注入は血漿中ソマトメジンC濃度および骨形成の指標となるオステオカルシン濃度を減少させた。一方、尿中ハイドロキシプロリン排泄量はアラニン、アスパラギン酸注入によって増加した。本試験の結果から、アラニン、アスパラギン酸の第四胃内注入は骨形成を抑制し、骨吸収を促進することが推察された。今後はさらに十二指腸に到達するアミノ酸の種類と量を変えて検討する必要があると考えられた。なお、反芻胃の発達する以前の幼家畜に対するカゼインの部分分解産物であるカゼインフォスフォペプチド給与は骨中カルシウム含量を増加させる働きのあることが、ラットを用いた試験結果から示唆された。
ユビキチン-プロテアソーム系制御による廃用性筋萎縮抑制法の開発

本研究はユビキチン-プロテアソーム系制御による廃用性筋萎縮の治療法開発を目的としている。これまで、ユビキチンリガーゼCbl-bによるIGF-1シグナルの減弱が廃用性筋萎縮の原因であることを見出し、筋萎縮抑制を目的としてCbl-bを競合阻害する抗ユビキチン化ペプチドを作製した。本Cbl-b阻害ペプチドの投与実験により個体レベルでの筋萎縮抑制効果を検討し、本ペプチドによる廃用性筋萎縮に対する新規治療法の確立を目指す。本年度は、本ペプチドを静脈内投与により安定して作用部位まで送達するための投与条件を決定することを目的とし以下の研究を行った。7週齢のC57BL/6野生型雄性マウスを使用し、ペプチドにFITCを付与したアテロコラーゲン複合体の投与実験を行った。ペプチド/アテロコラーゲン複合体を眼窩静脈叢から投与を行い24時間後に前頚骨筋を摘出し、蛍光顕微鏡により検索を行ったが筋肉中に抗ユビキチン化ペプチドを確認することができなかった。さらに同条件にて摘出した前頚骨筋を抗FITC抗体により免疫組織化学染色を行ったが、筋肉中にペプチドを検出することができなかった。本年度での結果からは眼窩静脈叢からの静脈内投与によりペプチドを筋まで送達することは困難であると考えられた。そのため次年度は、尾静脈からの投与を試みるなど再度投与条件の検討を行う。初年度の目標は本ペプチドを静脈内投与により安定して作用部位まで送達するための投与条件を決定することである。そのため、デリバリー担体としてアテロコラーゲンを使用し、ペプチド/アテロコラーゲン複合体として眼窩静脈叢から投与を行った。しかし、後肢の筋においてペプチドは検出されず、眼窩静脈叢からの静脈内投与によりペプチドを筋まで送達するに至らなかった。今後は投与部位の他、投与するペプチド量およびペプチドとアテロコラーゲン比率の検討を行う必要がある。次年度は、本ペプチドを尾静脈から投与し再度投与条件の検討を行う。その際、複数のペプチドとアテロコラーゲンの比率を使用し最適な投与条件の確立を目指す。投与条件の確立が行えた後、7週齢のC57BL/6野生型雄性マウスを用いて対照群、投与群、非投与群を設定し、筋萎縮モデルとして投与群と非投与群に座骨神経切除術を行う。投与群にはペプチド/アテロコラーゲン複合体の投与を行い、手術9日後に前頚骨筋を摘出し本ペプチドによる抗筋萎縮効果について検討を行う。初年度は、抗ユビキチン化ペプチドによるIGF-1シグナル伝達阻害の改善効果と投与条件の検討のため、萎縮条件下での筋細胞に本ペプチドを添加し生化学的解析を行うことを目的とし以下の結果を得た。マウス筋芽細胞由来C2C12細胞を分化誘導培地にて3日間培養した後、機能性ペプチドとアテロコラーゲンを培地に添加し、筋萎縮刺激として培地にDexamethasoneを添加した。Dexamethasoneの添加により筋管細胞は萎縮したもののペプチドの添加により萎縮が抑制されていた。その後、細胞を回収しCbl-bおよびIRS-1の蛋白質変動、AKTの細胞内修飾をウエスタンブロット法により検討したところ、Dexamethasone添加により萎縮した筋管ではCbl-bの発現が増加し、IRS-1の減少とAKTのリン酸化の減少を認めたが、ペプチドの添加によりこれらが抑制された。これまでの結果をもとに、次年度は実験動物に本ペプチドを投与し、抗ユビキチン化ペプチド全身投与法の確立を目指す。初年度の目標は筋管細胞を用いて萎縮刺激に対する萎縮抑制のための機能性ペプチドの添加条件を明らかにすることである。抗萎縮効果をもたらすのに有効なアテロコラーゲンとペプチドの比率を決定できたため、本目標は達成することができた。

本年度での結果からは眼窩静脈叢からの静脈内投与によりペプチドを筋まで送達することは困難であると考えられた。そのため次年度は、尾静脈からの投与を試みるなど再度投与条件の検討を行う。初年度の目標は本ペプチドを静脈内投与により安定して作用部位まで送達するための投与条件を決定することである。そのため、デリバリー担体としてアテロコラーゲンを使用し、ペプチド/アテロコラーゲン複合体として眼窩静脈叢から投与を行った。しかし、後肢の筋においてペプチドは検出されず、眼窩静脈叢からの静脈内投与によりペプチドを筋まで送達するに至らなかった。今後は投与部位の他、投与するペプチド量およびペプチドとアテロコラーゲン比率の検討を行う必要がある。次年度は、7週齢のC57BL/6野生型雄性マウスを使用し、ペプチドにFITCを付与したアテロコラーゲン複合体の投与実験を行う。投与24、48および72時間後に前頚骨筋を摘出し蛍光顕微鏡により筋肉中の抗ユビキチン化ペプチドを検索し、適切なペプチド投与量および投与間隔を決定する。次年度は、本ペプチドを尾静脈から投与し再度投与条件の検討を行う。その際、複数のペプチドとアテロコラーゲンの比率を使用し最適な投与条件の確立を目指す。投与条件の確立が行えた後、7週齢のC57BL/6野生型雄性マウスを用いて対照群、投与群、非投与群を設定し、筋萎縮モデルとして投与群と非投与群に座骨神経切除術を行う。投与群にはペプチド/アテロコラーゲン複合体の投与を行い、手術9日後に前頚骨筋を摘出し本ペプチドによる抗筋萎縮効果について検討を行う。本年度の目標は達成できたため、執行する必要がなかった。繰越金は次年度の物品費として抗体などの試薬の購入に使用する予定である。
骨芽細胞様細胞への圧縮力により誘導されるHsp25の機能解析

マウス骨芽細様細胞MC3T3-E1細胞に対して持続的圧縮力を加えることにより、Hsp25のmRNA、タンパクの発現量が増加した。圧縮力により誘導されたHsp25は、caspase3の活性を抑制し、骨芽細胞のアポトーシスを抑制していることが示された。またカルシウムイオンチャンネルも圧縮力を感知する機構のひとつであることが示唆された。我々は以前より、マウス骨芽細胞様細胞株( MC3T3-E1 )にガラスシリンダーを用いてメカニカルストレス(持続的圧縮力)を加える実験系を用い、持続的圧縮力特異的にCox-2 (cyclooxygenase2)、およびHsp25 (heat shock protein 25)のmRNA、およびタンパクが細胞外マトリクスであるインテグリン、MapkinaseのERKの系を介して、発現誘導されることを示した。今回、発現誘導されたHsp25の機能を明らかにするために、siRNAによりHsp25のノックダウンを行ったMC3T3-E1細胞に圧縮力を加え、caspase3の活性と、cell counting kitを用いて、細胞数を計測、さらにTunnel染色を行い、アポトーシス反応の検出を行った。その結果、コントロール群はcaspase3の活性が見られたのに対し、siRNAによりHsp25をノックダウンした骨芽細胞は、圧縮力によるcaspase3の活性化が抑制されており、生存している細胞数の減少がみられた。また、Tunnel染色により、アポトーシス反応を示す細胞が認められた。こレらの結果より、siRNAでHsp25をノックダウンすると、圧縮力によるアポトーシス反応が促進されることが示された。以上より、圧縮力により発現誘導されたHsp25は、圧縮力をうけた細胞のアポトーシスを抑制していることが示された。今後は、ラットに純チタン棒を埋入し、in vivoでも周辺骨にHsp25が発現しているかどうか、アポトーシス反応が誘導されるかを実験していく予定である。骨には力学的負荷(メカニカルストレス)を感知する機構を有していると考えられている。以前我々は、骨芽細胞(MC3T3-E1)に圧縮力を加えた時に,インテグリンが圧縮力を感知して特異的に発現量が上昇する遺伝子として, Cox-2,およびHsp25を見出した。しかし発現誘導されたHsp25の機能は明らかではない。そこで本研究では発現誘導されたHsp25の機能をsiRNAを用い、Hsp25をノックダウンし、ウェスタンブロッティングを用いて検討した。また、インテグリンのほかにメカニカルストレスを感知する機構として, SAチャンネル(stretch activated calciumion channel)が知られているが, SAチャンネルにより, Hsp25の発現量が変化するかは分かっていない。圧縮力によるHsp25の発現上昇がSAチャンネルを介しているかどうか調べた。siRNAによりHsp25をノックダウンした細胞に圧縮力を加えることにより、caspase 3の活性化が認められた。また、cell counting kitにより細胞の生死を判定すると、圧縮力を加えた細胞はアポトーシスをおこしていた。これらのことから、圧縮力により発現誘導されたHsp25は骨芽細胞のアポトーシスを抑制しているということが考えられた。また、SAチャンネルの阻害剤であるGdCl 3を培地中に添加し、細胞外カルシウムの流入を阻害すると、Hsp25の遺伝子およびタンパクの発現量は減少傾向を示した。これらのことからSAチャンネルもインテグリンと同様に圧縮力を感知する機構であると考えられた。
B細胞膜型分子CD72を介した自己免疫制御機構の解明

B細胞膜型タンパクCD72は自己免疫発症との相関が示されているがCD72の細胞外領域のCタイプレクチン様領域(CTLD)のレクチン活性の有無とその糖鎖リガンドについては明らかになっていない。本研究では、CD72の精製組換えタンパクを用いてCD72糖鎖リガンドの網羅的な探索を糖鎖アレイにより行い、ある種の硫酸化糖鎖とCD72が相互作用することを明らかにした。いくつかのCD72リガンドは自己免疫疾患関連抗原であった。またほとんど全てのB細胞がニトロフェニル基(NP)に反応性のQM(quasi-monoclonal)マウスとQM/CD72欠失マウス由来のプライマリーB細胞とを用いて、NP架橋したCD72リガンドとNP架橋した非CD72リガンドでB細胞抗原受容体刺激を加えた場合の細胞内カルシウム濃度を解析し、CD72リガンドによってCD72を介したBCRシグナルの抑制が起きる事を示した。さらにCD72の欠損によってCD72リガンドに対する抗体産生が増加するかをCD72欠失マウスと野生型マウスで解析を行い、CD72リガンドに対するIgMクラスの血清中の抗体量がCD72欠失マウスで増加していることを明らかにした。これらの結果はB細胞表面上のCD72が、そのリガンドに対するB細胞の活性化を抑制することでそのリガンドに対する抗体産生、免疫応答を抑制していることを示唆するものであり、まだ明らかになっていないB細胞による自己と非自己の新たな識別機構を示すものである。このような自己と非自己の識別機構の解明は、自己免疫疾患の発症機構の新たな理解につながるものである。本研究では、まずCD72の精製組換えタンパクを用いてCD72糖鎖リガンドの網羅的な探索を糖鎖アレイにより行い、ある種の硫酸化糖鎖とCD72が相互作用することを明らかにした。次にCD72とCD72リガンドの相互作用がB細胞抗原受容体シグナルにどのような影響を与えるか調べるため、ほとんど全てのB細胞がニトロフェニル基(NP)に反応性のQM (quasi-monoclonal)マウスとQM/CD72欠失マウス由来のプライマリーB細胞とを用いて、NP架橋したCD72リガンドとNP架橋した非CD72リガンドでB細胞抗原受容体刺激を加えた場合の細胞内カルシウム濃度を解析し、CD72リガンドによってCD72を介したBCRシグナルの抑制が起きる事を示した。本年度はさらにCD72の欠損によってCD72リガンドに対する抗体産生が増加するかをCD72欠失マウスと野生型マウスで解析を行い、CD72リガンドに対するIgMクラスの血清中の抗体量がCD72欠失マウスで増加していることを明らかにした。またB細胞表面上のタンパクが直接そのリガンドに対する抗体産生を抑制することで自己免疫応答への障壁として機能しているという概念を提唱するものである。主にBリンパ球(B細胞)に発現する膜型タンパクCD72の精製組換えタンパクを用いてCD72糖鎖リガンドの網羅的な探索を糖鎖アレイで行った。探索の結果得られたリガンド候補についてCD72と相互作用するかどうかを、CD72タンパクと糖鎖リガンドを用いたレクチンELISAで調べることで相互作用の解析を行った。