hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィトクロムによる植物光センシングと環境応答

フィトクロムは植物の生存に重要な光合成に有効な赤色光を受容し、遺伝子発現を調節する主要な光受容体であり、植物の生涯を通じて機能する。花成に着目したスクリーニングにより、フィトクロム相互作用因子VOZ1,VOZ2を単離同定した。シロイヌナズナでは重複して花成促進機能をもっていた。この因子はphyBの下流、FTの上流で機能した。フィトクロムはシグナル伝達時に細胞質から核へ移行し下流因子の発現を調節する。機能的なVOZ細胞内局在を明らかにするため、核移行/核搬出シグナルを融合したVOZをvoz1 voz2変異体に導入した。表現型解析の結果、核移行株でのみ、変異体の遅咲きが相補した。両株において導入遺伝子の発現解析を行ったところ、mRNAは両株共に検出されたのに対し、タンパク質蓄積は核移行株で著しく低下していた。プロテアソーム阻害剤を用いた解析から、核局在のVOZが積極的に分解されることが示唆された。VOZは核で機能し、シグナル伝達の過程で分解されると考えられる。次に、VOZの発現組織解析を行った。まず、野生株の維管束組織と葉肉細胞を分離し、VOZのmRNA発現量を解析した。その結果、VOZ1は維管束組織のみで、VOZ2は維管束組織を中心に葉肉細胞でも発現が見られた。voz1 voz2二重変異体背景で、GUS-VOZ融合タンパク質をVOZプロモーター制御下で発現する株を作成した。得られた形質転換体で遅咲きの表現型が相補されることを確認し、GUS染色により発現組織を解析した。いずれの成長段階でも、VOZ1は維管束組織において、VOZ2は植物体全体で蓄積していた。さらに、植物の切片の観察より、VOZ1タンパク質は維管束師部に蓄積が見られた。両者に共通する維管束師部でのVOZの発現が花成制御に重要であることが示唆された。光合成に生存を依存し固着生活を営む植物にとって、光は最も重要な環境因子である。フィトクロムは植物固有の受容体と考えられてきたが、細菌やシアノバクテリアではその祖先的な分子が二成分制御系として利用されていることが示された。しかしながら、植物型フィトクロムはキナーゼ活性ではなく、細胞内局在と構造の変化に基づくタンパク質相互作用による信号伝達経路をもつとされている。進化的な側面と作用メカニズムの点から解析している。今年度は主として作用メカニズムに焦点をあて、フィトクロム相互作用因子として単離され、花成制御に関与するVOZ(Vascular plant One-Zinc finger、シロイヌナズナにはVOZ1、VOZ2の2分子種が存在)を中心に研究を進めた。フィトクロムシグナルにおけるVOZの機能を解明するため、VOZの細胞内局在解析を行った。機能的な細胞内局在を明らかにするため、核移行シグナル(NLS)または核搬出シグナル(NES)をVOZに融合し、vozl voz2二重変異体に導入することで、表現型の相補実験を行った。その結果、核移行シグナル株でのみvozl voz2二重変異体の遅咲きを相補したことから、VOZが核内で機能することが示された。これらのコンストラクトにはGFPも融合させていたので、GFPによる蛍光観察を行った。その結果、NESを与えたGFP-VOZタンパク質は細胞質において容易に観察されるのに対して、NLSを与えた融合タンパク質は変異表現型を相補し機能的であるにも関わらず核内への蓄積が観察されなかった。更に、GFP融合VOZ2発現株を作出し、VOZの蓄積場所を解析した。大量にVOZを発現させると主に細胞質にタンパク質が蓄積することが観察され、観察可能な分子と機能的な局在が一致しないことがわかった。つまり、VOZの作用の解析には光による局在の変化や分解を考慮する必要があることがわかった。

得られた形質転換体で遅咲きの表現型が相補されることを確認し、GUS染色により発現組織を解析した。いずれの成長段階でも、VOZ1は維管束組織において、VOZ2は植物体全体で蓄積していた。さらに、植物の切片の観察より、VOZ1タンパク質は維管束師部に蓄積が見られた。両者に共通する維管束師部でのVOZの発現が花成制御に重要であることが示唆された。
次世代歯科用CAD/CAMシステム　－顎口腔機能情報の活用－

1.被験者の確保:本年度は、鶴見大学歯学部附属病院補綴科を受診した患者31名(低位咬合、開口、顎関節症などを含む)をあらたに被験者として確保し、延べ34回の顎運動測定を実施した。そのうち31回はCT撮影も行った。本年度までの被験者総数は76名、測定回数は延べ90回に達した。2.顎運動測定:昨年度、磁気ベクトル方式顎運動測定器(試作器)の高精度データ校正方法を開発しセンサ10mm移動時の絶対誤差は0.03mm、相対誤差0.3%を実現した。この結果をうけ、共同研究を実施している企業が商用試作器を製作した。商用試作器の性能評価を行った結果、従来の試作器と同等あるいはそれ以上の性能を有していることが確認できた。現在、新たに3台の試作器の製作を開始し、多施設での臨床応用試験に向けて準備を行っている。3.咬合高径の決定法の検討:昨年度に引き続き顎運動データを解析し、下顎回転運動範囲、すなわち下顎が主として回転運動する範囲での咬合高径を変化できる可能性について検討している。具体的には、習慣性閉口路で全運動軸点の顆路が咬頭嵌合位付近に分布する開口量を指標として咬合挙上量を決定しプロビショナルレストレーションの設計に利用している。また、全運動軸が算出できない症例では、蝶番軸を顎位決定のシミュレーションに用いる方法についても検討した。4.顎機能異常者の基準軸の検討:上記顎運動測定結果より補綴治療を必要とする31名すべての被験者で最小運動軸(Least Motion Axis; LMA)を算出することができた。LMAが算出できるが健常者とは異なる位置に分布する場合や運動範囲の差を認めた。現在はLMAが咬合高径、咬合平面の位置、咬合接触部位、咬合小面の向きと位置との関連に加えて術前術後の機能評価への応用について検討している。5.研究成果発表:上記研究成果を論文(和文1編、英文3編)および国内学会(9演題)にて報告した。当初の計画では研究期間内に50名以上の被験者を確保する予定であったが、3年目までで76名の被験者を確保できている。また、得られた機能情報である顎運動データとCTやスキャナの形態情報を統合し,実際の臨床において治療下顎位の妥当性の検討,顎機能評価,治療時期の決定や補綴装置設計に活用できている。また、現在研究に使用している顎運動測定器の実用化研究も試作器の性能評価の段階にあり、おおむね順調に進展している。本年度の研究成果を継続発展させ、顎運動データおよび3次元スキャナあるいはCTによる歯列、顎骨の形態データの蓄積を行い、機能情報から歯科医師や歯科技工士の経験や勘に頼っていた補綴装置の設計や咬合面形態の製作に必須の情報(咬合高径、咬合平面の位置、咬合面形態など)の数値化を目指す。また、現在研究に使用している顎運動測定器の実用化研究を進める。1.環境整備:1磁気ベクトル方式顎運動測定器の高精度データ校正方法の開発しセンサ10mm移動時の絶対誤差は0.05mm、相対誤差0.5%を実現した。2リアルタイプデータ収集ソフトウエアの開発依頼しデータのリアルタイム表示を実現した。2.顎運動測定:顎機能健常者2名、顎機能健常者14名(低位咬合、開口、顎関節症など)の被験者を確保し延べ20回の顎運動測定を実施した。そのうち9回CT撮影も行った。3.咬合高径の決定法の検討:顎運動データを解析し、下顎回転運動範囲、すなわち下顎が主として回転運動する範囲での咬合高径を変化できる可能性について検討している。4.顎機能異常者の基準軸の検討:上記顎運動測定結果より顎機能異常者14名すべての被験者で最小運動軸(Least Motion Axis; LMA)を算出することができた。現在はLMAが咬合高径、咬合平面の位置、咬合接触部位、咬合小面の向きと位置との関連について検討を行っている。低位咬合患者1名においてプロビショナルレストレーションで咬合挙上5ヶ月後に顎運動検査を行った結果LMA運動軸だけでなく全運動軸も算出できることが確認できた。5.研究成果発表上記研究成果を論文(和文2編、英文2編)および国内学会(5演題)にて報告した。平成28年4月1日付けで研究代表者が所属研究機関を変更したため、研究環境の整備(研究組織の再編、顎運動測定システムの構築、被験者確保など)に時間を要したことでやや遅れているが、実際の被験者の顎運動測定を行い、データの蓄積および解析を実施でき次年度以降の研究に繋がる成果をあげることができているためおおむね順調に進展している。1.被験者の確保:1磁気ベクトル方式顎運動測定器の高精度データ校正方法の開発しセンサ10mm移動時の絶対誤差は0.03mm、相対誤差0.3%を実現した。2顎運動データのリアルタイム表示にviewer機能を追加し歯列や頭蓋骨などの形態情報と顎運動情報を同一座標系での可視化を実現した。2.顎運動測定:本年度は、鶴見大学歯学部附属病院補綴科を受診した患者26名(低位咬合、開口、顎関節症などを含む)を被験者として確保し、延べ36回の顎運動測定を実施した。そのうち24回はCT撮影も行った。前年度からの被験者数は43名(延べ56回)に達した。

3.咬合高径の決定法の検討:顎運動データを解析し、下顎回転運動範囲、すなわち下顎が主として回転運動する範囲での咬合高径を変化できる可能性について検討している。具体的には、習慣性閉口路で全運動軸点の顆路が咬頭嵌合位付近に分布する開口量を指標として咬合挙上量を決定しプロビショナルレストレーションの設計に利用している。また、全運動軸が算出できない症例では、蝶番軸を顎位決定のシミュレーションに用いる方法についても検討した。4.顎機能異常者の基準軸の検討:上記顎運動測定結果より顎機能異常者26名すべての被験者で最小運動軸(Least Motion Axis; LMA)を算出することができた。少数例ではあるが、LMAが算出できるが健常者とは異なる位置に分布する場合を認めた。現在はLMAが咬合高径、咬合平面の位置、咬合接触部位、咬合小面の向きと位置との関連に加えて術前術後の機能評価への応用ついても検討している。5.研究成果発表:上記研究成果を論文4編(和文2編、英文2編)および国内学会(5演題)にて報告した。当初の計画では研究期間内に50名以上の被験者を確保する予定であったが、2年目で43名の被験者を確保できている。また、得られた機能情報である顎運動データとCTやスキャナの形態情報を統合し、実際の臨床において治療下顎位の妥当性の検討、顎機能評価、治療時期の決定や補綴装置設計に活用できているためおおむね順調に進展している。1.被験者の確保:本年度は、鶴見大学歯学部附属病院補綴科を受診した患者31名(低位咬合、開口、顎関節症などを含む)をあらたに被験者として確保し、延べ34回の顎運動測定を実施した。そのうち31回はCT撮影も行った。本年度までの被験者総数は76名、測定回数は延べ90回に達した。2.顎運動測定:昨年度、磁気ベクトル方式顎運動測定器(試作器)の高精度データ校正方法を開発しセンサ10mm移動時の絶対誤差は0.03mm、相対誤差0.3%を実現した。この結果をうけ、共同研究を実施している企業が商用試作器を製作した。商用試作器の性能評価を行った結果、従来の試作器と同等あるいはそれ以上の性能を有していることが確認できた。現在、新たに3台の試作器の製作を開始し、多施設での臨床応用試験に向けて準備を行っている。3.咬合高径の決定法の検討:昨年度に引き続き顎運動データを解析し、下顎回転運動範囲、すなわち下顎が主として回転運動する範囲での咬合高径を変化できる可能性について検討している。4.顎機能異常者の基準軸の検討:上記顎運動測定結果より補綴治療を必要とする31名すべての被験者で最小運動軸(Least Motion Axis; LMA)を算出することができた。LMAが算出できるが健常者とは異なる位置に分布する場合や運動範囲の差を認めた。現在はLMAが咬合高径、咬合平面の位置、咬合接触部位、咬合小面の向きと位置との関連に加えて術前術後の機能評価への応用について検討している。5.研究成果発表:上記研究成果を論文(和文1編、英文3編)および国内学会(9演題)にて報告した。当初の計画では研究期間内に50名以上の被験者を確保する予定であったが、3年目までで76名の被験者を確保できている。
myo-イノシトール含有新規スフィンゴリン糖脂質CJP2の立体選択的合成

無脊椎動物である練皮動物に局在するガングリオシドは、極微量しか単離できないことから生物活性評価サンプルの供給すら容易ではない。近年、イノシトールホスホセラミド(IPC)を構成単位とするCJP2が棘皮動物のニッポンウミシダから単離された。本化合物はホスファチジルイノシトールとスフィンゴミエリン、ガングリオシド等の重要な生理活性化合物の融合した極めて新奇な構造を特徴とする。本研究ではCJP2の特異な生理活性の解明に貢献するために、合成化学的なアプローチによりmyo-イノシトール、セラミド、シアル酸グリカールの各構成成分をすべてグルコースから合成する研究を行った。1myo-イノシトール誘導体の合成グルコース由来のアルデヒドと有機銅試薬の高ジアステレオ選択的1,2-付加、Wittig反応、閉環メタセシスを鍵反応とし、重要中間体となるconduritolB誘導体を合成した。本誘導体のアリル位水酸基上アシル基側からの四酸化オスミウム酸化が優先的に進行することを見出し、複数の異なる保護基を所望の位置に有するmyo-イノシトール誘導体を立体選択的に合成する方法論を確立した。2.セラミドの合成グルコースからの既知の合成法を改良し、より効率的に合成を行った。3.シアル酸グリコシルドナーの合成シアル酸と他の糖とのグリコシル化を考慮し、グルコースからWittig反応、Sharpless不斉エポキシ化反応、水酸基へのマロニル基の導入、Eschenmoser's saltを用いたオレフィンの構築、閉環メタセシス反応を経て直接的にシアル酸グリカール誘導体を合成した。ガングリオシドは細胞膜の構成成分として脳や神経系に多く存在し、基本的かつ動的な生命現象に深く関与する重要な生理活性生体成分であることから、その分子機能の解明が急がれている。この様なガングリオシドは哺乳類には広く存在しているが、近年無脊椎動物である棘皮動物よりこれまでにない新たなガングリオシドが単離された。その新規ガングリオシドの生物活性には非常に興味が持たれるが、微量成分であるためにその生物活性評価を行うことは難しい。そこで新たに単離されたイノシトールフォスフォセラミドを有するガングリオシド(CJP2)の生理活性機構の解明や創薬基礎研究に貢献することを目的とし、ガングリオシド(CJP2)をシアル酸、イノシトール、セラミドの3つのフラグメントに分けてその立体選択的全合成を行うことを計画した。1.ガングリオシドのイノシトール部位はD-グルコースを出発原料とし、アルデヒドへの有機銅試薬を用いた高ジアステレオ選択的な1,2-付加、1,7-ジエンの閉環メタセシス反応、アリル位水酸基へアシル基を導入したオレフィンへの高ジアステレオ選択的なオスミウム酸化を行うことで立体選択的に合成を行ない、CJP2のイノシトール部位の構築を完了した。2.シアル酸部位は直接的なシアル酸のグリコシルドナーの合成を行うべく現在D-グルコースからの合成が進行中であり、アリルアルコールへのSharplessの不斉エポキシ化反応を経由した1,7-ジエンの構築に成功し、現在閉環メタセシスによる6員環の形成反応を検討している。

そこで新たに単離されたイノシトールフォスフォセラミドを有するガングリオシド(CJP2)の生理活性機構の解明や創薬基礎研究に貢献することを目的とし、ガングリオシド(CJP2)をシアル酸、イノシトール、セラミドの3つのフラグメントに分けてその立体選択的全合成を行うことを計画した。1.ガングリオシドのイノシトール部位の合成はD-グルコースを出発原料とし、高ジアステレオ選択的1,2-付加、Wittig反応、閉環メタセシス、面選択的四酸化オスミウム酸化を経て、高ジアステレオ選択的かつ任意の位置に所望の保護基を有するイノシトール誘導体合成に成功した。2.シアル酸部位はWittig反応、Sharplessの不斉エポキシ化を経、Mitsunobu反応によるアミノ基の導入とα-ケト酸誘導体への変換を経て行い、現在最終段階の脱保護を検討中である。3.セラミド部分は既存の方法により供給可能であるため、今後イノシトール部位とシアル酸部位をグリコシル化により結合させ、その後アミダイト法によりセラミド部分と結合させてCJP2の全合成を行う。
複数アンテナを用いた超広帯域無線センサによる屋内侵入者の位置推定技術の研究

現在,ホームセキュリティセンサの関心が高くなっており,高信頼且つ安価な侵入者検知センサシステムの開発が望まれている.本研究では,従来のセンサでは困難であった見通し外の検知を可能とし,また侵入者の有無だけでなくその位置を推定することができる複数アンテナを用いた超広帯域無線センサによる侵入者検知センサシステムを実現するための各技術の開発とシステムの構築を行い,その有効性を計算機シミュレーションおよび実験により示した.平成27年度は超広帯域無線(UWB:Ultra-wideband)センサによる侵入者の位置推定手法の提案を行い,その基礎的な位置推定特性の検討を行った.従来のUWBセンサによる侵入者検知では侵入者の距離情報のみしか推定できず,形成可能な監視領域が同心円状となるため家屋や部屋の形状によってはセンサの所望する監視領域の他に,例えば屋内と屋外(あるいは室内と室外)が含まれる曖昧な領域が生じ,誤警報が発生することが課題であった.そこで,本研究では上記課題を解決するために侵入者の位置を推定する手法を提案した.研究成果としては以下の通りである.また,学術論文1件,国際会議論文1件,国内会議論文5件の成果を残した.(1)従来の無指向性送受信アンテナに加えて複数の無指向性受信アンテナを設置することで,侵入者の距離だけでなく位置を推定可能な手法を提案した.(2)提案手法の有効性を評価するために購入した電波伝搬解析ソフトウェア(RapLab-Pro)を用いて,特定の室内環境をモデル化し,当該室内環境内に侵入者を模擬した人体モデルを配置することで,侵入者に対する電波伝搬シミュレーション環境の構築を行った.(3)(2)において構築したシミュレーション環境により得られた侵入者に対する電波伝搬特性モデルを基に,(1)で提案した位置推定手法を適用し,提案手法による侵入者の位置推定精度について検討した.その結果,位置推定誤差が平均で18cmという他の位置推定センサシステムと比較しても高精度な結果が得られた.また,検討にあたって,センサの諸元(帯域幅やアンテナ配置など)についてもいくつか変化させながら検討し,これらの諸元に最適値が存在することは確認したが,最適化までは至らなかったため,次年度以降の課題としたい.本研究成果は上記研究課題の解決に直接関係する重要な研究成果であったといえる.当初の研究計画では,上記【研究実績の概要】において説明した提案手法のシミュレーションによる検討に加えて,所属研究機関が所有するベクトルネットワークアナライザ(VNA)による実験を予定していた.しかしながら,センサの諸元の最適化に至らなかったことから予定していた実験の実施をとりやめ,引き続きセンサの諸元の検討を実施したことで計画に対して2か月ほどの遅れが生じており,やや遅れていると判断した.しかし,VNAによる計測準備は整っているため,諸元の最適化が完了次第,着手する予定である.H28年度はH27年度に提案したマルチスタティック配置した超広帯域無線センサによる侵入者の位置推定法において,センサシステムの諸元(帯域幅やアンテナ配置など)が位置推定特性へ与える影響を明らかにし,システム諸元の最適化を検討した.また,実験システムの構築を行った.主な研究成果としては以下の通りである.また,国際会議論文1件,国内会議論文4件の成果を残しており,さらに現在,学術論文を3件投稿中である(2017年5月現在).(1)前年度に構築した電波伝搬解析ソフトウェア(RapLab-Pro)による侵入者に対する電波伝搬シミュレーション環境を改良し,受信機内雑音や送信信号帯域幅といったセンサシステム諸元が位置推定特性に与える影響を明らかにした.その結果,見通し内環境では帯域幅が1GHz,信号対雑音電力費が20dBの環境であっても位置推定結果の8割はその誤差が24cm以内となることを確認した(最大でも90cmの誤差).(2)本システムの将来の運用では,アンテナの配置位置は家屋の形状などにより様々な配置が考えられる.そこで,(1)と同様のシミュレーション環境において,アンテナ配置位置と侵入者の位置関係が位置推定特性に与える影響を明らかにした.その結果,センサの測距性能(距離分解能)に依存するが,各アンテナ間の配置間隔を距離分解能以上に離して配置することで位置推定特性への影響が小さいことを確認した.(3)年度末に納入された計測器(主にベクトル信号発生器とデジタルオシロスコープ)を組み合わせて,実験システムの構築とセンサ信号処理プログラムの開発を行った.ここでは,予定していた通り,高速AD変換器が不要なステップドFM方式により超広帯域化を実現した.本研究成果は上記研究課題の遂行および解決に直接関係する重要な研究成果であったといえる.当初の研究計画では,計測器材の関係から所属研究機関外において実験を実施する予定であったが,本校において計測器材が納入され,実験システムの構築まで完了した.そのため,本研究課題は本校においてすべて実施可能となったため,当初の計画以上に円滑に遂行できることが予想される.なお,H28年度に予定していた実験が器材の納入時期の関係から実施できていないが,上述の通り本校において研究をすべて実施可能となったため,H29年度初めより取り掛かる予定である.このような状況から,おおむね順調に進展していると判断した.H29年度はH28年度までに提案してきたマルチスタティック配置した超広帯域無線センサによる侵入者の位置推定法において,構築した実験システムを用いて,位置推定性能の実験的評価を実施した.主な研究成果としては以下の通りである.また,学術論文3件,国内学会発表2件の成果をあげた(2018年5月現在).

(1)前年度に構築した実験システムによる人体(侵入者)に対する位置推定実験を本校の実験室内(4m×5m)において実施し,その位置推定性能について検討した.その結果,帯域幅が3GHzを使用した場合,位置推定結果の8割はその誤差が25cm以内となることを確認した(最大でも約100cmの誤差).(2)本システムの将来の運用では,アンテナの配置位置は家屋の形状などにより様々な配置が考えられる.そこで,(1)と同様の実験環境において,アンテナ配置位置と侵入者の位置関係が位置推定特性に与える影響を明らかにした.その結果,センサの測距性能(距離分解能)に依存するが,各アンテナ間の配置間隔を距離分解能以上に離すという制約のもとであれば,間隔を近づけたとしても影響が小さく,例えば,帯域幅が3GHzを使用した場合は位置推定結果の8割はその誤差が30cm以内となることを確認した(3)高速AD変換器が不要なステップドFM方式により超広帯域化を実現した実験システムによる侵入者のリアルタイム検知特性について実験的に検討を実施した.その結果,従来型のセンサと同等以上の検知応答速度(2.5秒以下)で侵入者を検知できることを確認した.本研究成果は上記研究課題の遂行および解決に直接関係する重要な研究成果であったといえ,研究期間全体を通して提案手法による侵入者の位置推定の実現性が確認できたといえる.現在,ホームセキュリティセンサの関心が高くなっており,高信頼且つ安価な侵入者検知センサシステムの開発が望まれている.本研究では,従来のセンサでは困難であった見通し外の検知を可能とし,また侵入者の有無だけでなくその位置を推定することができる複数アンテナを用いた超広帯域無線センサによる侵入者検知センサシステムを実現するための各技術の開発とシステムの構築を行い,その有効性を計算機シミュレーションおよび実験により示した.上記の通り,当初の計画に対してやや遅れているため,計画を先送りしながら実施する.また,次年度は侵入者のリアルタイム位置推定実験を実施することを予定しており,計測器材の関係から所属研究機関外において実験等を実施する予定であったが,所属研究機関の研究費により計測器材の納入の目途がたったため,予定していた実験は本機関内にて実施する.そこで,以下の通り研究計画を変更することとする.(1)センサの諸元の最適化を行う.(2)(1)の結果を反映させ,提案手法の有効性についてVNAを用いて実験的に検討する.(3)提案する位置推定アルゴリズムを納入予定の計測器材へ実装し,侵入者のリアルタイム位置推定システムを構築する.次年度は以下の通り研究を推進する.(1)構築した実験システムを用いて侵入者の位置推定実験を実施し,その位置推定特性を前年度までのシミュレーション結果と比較しながら検討する.(2)侵入者の位置情報から得られる移動履歴をもとに早期に侵入警報する方法を提案し,その有効性を実験システムにより評価する.
皮膚感覚インターフェースデバイスの開発と皮膚感覚情報処理の解明

皮膚感覚の「センシング-伝送・記録-ディスプレイ」を可能とするシステムを実現し,皮膚感覚研究のプラットフォームを確立することを目標として研究を進めた.まず皮膚感覚を検出する基本デバイスとして、セルブリッジシステムという新規な通信方式を用いた人工皮膚を実現した。受容器は導電繊維を用いた層状サイトであり、セルブリッジという計測および通信素子がそれらのサイト境界に配置される。弾性体の非線形特性を利用して力の総和と接触面積を検出し、そのデータのパケットを、同様な導電性サイトを用いて連鎖伝達されていく。このような構成をとることにより、長い配線を含まない、柔軟な人工皮膚が実現できる。セルブリッジの機能を搭載したLSIの開発を行い、4つの受容器をもつデバイス試作に成功することができた。センシング、データ転送の特性は定量的に評価された。触覚ディスプレイとしては、強力超音波を収束して放射圧を発生させ、そのスポットを高速に2次元走査可能なデバイスの開発に成功した。試作に用いた3MHzの超音波の波長は0.5mmであり、1mm径のスポットに収束させることは容易である。またその周波数は触覚の帯域である1kHzより十分に高く、1ms以下の時定数で圧力分布を制御することができる。このように本研究で開発した触覚ディスプレイは、皮膚表面上の圧力パターンを時間的にも空間的にも高い解像度で正確に制御することができるデバイスである。さらに人工皮膚を実現するために考案された二次元通信の技術によって、筋電の2次元分布を検出するサポーター状のデバイスの開発を行った。柔軟な繊維に筋電計測電極を高密度配置することで、手指の動きを計測する。装着が容易なサポーター状デバイスとすることにより、新しいヒューマンインタフェースとして幅広い用途に応用できる。皮膚感覚の「センシング-伝送・記録-ディスプレイ」を可能とするシステムを実現し,皮膚感覚研究のプラットフォームを確立することを主な目標として研究を進めている.本年度の中心課題の一つは,二次元通信の技術を用いて多数の触覚素子から信号を読み出す人工皮膚を試作することであった.二次元通信とは,伸縮可能な膜状の伝達媒体を2次元的に伝播する電磁エネルギーによって,膜内の任意点間で信号を伝達する新しい技術である.二次元通信層に接続された素子間には個別配線は存在せず,各通信素子は有限の伝達距離をもつ信号を発信し,動的に確立した通信経路によってパケットを連鎖的に伝達する.個別配線が存在しないため,様々な形態の柔軟膜に多数の機能素子を容易に実装できる.無線通信に比べるとはるかに少ない消費電力で高速に通信できる.これまで民間企業との共同研究によって,100MHzクロックで動作する通信素子が開発され,通信経路を自動的に生成するプロトコルについても,オーバーヘッドが極めて小さいパケット伝送の体系を確立することができている.本年度はこれらの通信素子に触覚の機能を持たせ,センシングと信号伝送の両方が可能である触覚素子を試作した.またこれを伸縮可能な柔軟シートに埋め込み,信号伝送が可能であることを確認した.もう一つの課題が,皮膚に高忠実度触感を再現する技術の開発である.本年度は,超音波の放射圧を用いた触覚ディスプレイを試作し,人間の皮膚の知覚特性を検証する実験を行なった.試作に用いた3MHzの超音波の波長は0.5mmであり,1mm径のスポットに収束させることは容易である.またその周波数は触覚の帯域である1kHzより十分に高く,1ms以下の時定数で圧力分布を制御することができる.このように本研究で開発している触覚ディスプレイは,皮膚表面上の圧力パターンを時間的にも空間的にも高い解像度で正確に制御することができるデバイスである.現時点では2gfまでを連続的に発生でき,力のスポットを1次元的に走査可能な装置の試作が終了している.さらに発生力を強化し,2次元圧力分布を制御可能なデバイスの開発を継続中である.装置開発を進める一方で,試作した1次元走査型のデバイスを用いた皮膚感覚の心理物理実験も開始されている.従来のデバイスでは困難であった実験によって,定説を覆す結論が得られている.皮膚感覚の「センシング-伝送・記録-ディスプレイ」を可能とするシステムを実現し,皮膚感覚研究のプラットフォームを確立することを目標として研究を進めた.まず皮膚感覚を検出する基本デバイスとして、セルブリッジシステムという新規な通信方式を用いた人工皮膚を実現した。

柔軟な繊維に筋電計測電極を高密度配置することで、手指の動きを計測する。装着が容易なサポーター状デバイスとすることにより、新しいヒューマンインタフェースとして幅広い用途に応用できる。
美術作品の内容と表現に関する思考の発達を基礎とした鑑賞教育方法と教材の開発研究

本研究は,美術作品に対する鑑賞教育方法とその教材開発を目的に行う。教育方法や教材の開発は,小学校低学年から大学生までの鑑賞傾向についての年齢ごとの調査や各分野における発達段階を基に行う。また,教材は教育現場で誰もがその理論を理解して行える形にして示す。本研究の成果を鑑賞教育における教育現場の一助としたい。本研究は,小学生から大学生までの美術作品に対する鑑賞態度の傾向を基に,鑑賞指導方法とその教材の開発を目的に行うものである。本年度は,中学生の鑑賞傾向を明らかにし,中学生向けの鑑賞指導方法と教材の開発を行った。本研究では,美術作品の要素を内容と表現に分けそれぞれの感受を行い,最終的に作品全体の感受に統合する鑑賞方法を提案している。作品内容を感受するために,鑑賞者は作品世界に想像的・観念的自己を入り込ませる。想像的・観念的自己は作品世界で起こることを想像的・観念的に体験し作品内容を感受する。それに対して,作品の表現を感受するのは,作品をあくまでも「作られたもの」として認識する現実的自己である。現実的自己は作品に使われている色や形などを感受する。鑑賞者は自身を,想像的・観念的自己と現実的自己に分裂させて作品と向かい合い,最終的に統合させる。小学生を対象にこの方法で鑑賞実践を行ったところ,作品の内容を感受した後に表現を感受するという順番が自然であった。まずは想像的・観念的自己が作品と出会い,その後に現実的自己が向かい合うとも言える。しかし,この順番は,中学2年生以上の生徒にとっては鑑賞しにくいようであった。中学2年生以上の生徒は,表現を感受してから内容を感受する方がやりやすかった。これは,この年齢の生徒たちが,先に現実的自己が作品と出会い,それから想像的・観念的自己が作品と向かい合うことを示している。この中学2年生での変容は,他の研究分野にも見られることであった。本研究では,中学2年生での鑑賞傾向の変容に合わせた鑑賞教育方法と教材を作成して実践を行い,その有効性を確認した。この鑑賞方法論での調査を様々な年齢に対して行った。調査対象者はどの年齢であってもこの鑑賞方法論で作品感受ができた。よって,本研究で提案している鑑賞方法論は,多くの年齢において用いることができることを明らかにした。ただ,調査によって年齢によって作品と向き合い方が変容することも分かった。よって指導方法はそれに合わせて変えていく必要があることも明らかになった。現在までに,小学校3年生から中学生までの児童生徒を対象に調査を行い,年齢ごとの鑑賞態度の傾向を明らかにした。調査から,小学校4年生と中学校2年生あたりの時期に鑑賞態度の変容の時期があることが確認できた。小学校3年生から中学1年生あたりまでは作品内容を想像的・観念的自己が感受してから,作品表現を現実的自己が感受する。中学2・3年生は現実的自己が作品表現を感受してから作品内容を想像的・観念的自己が感受する。そして,どの年齢においても最終的に作品内容と作品表現から感受したことを統合し,作品全体の感受とする。このような各年齢の鑑賞態度の傾向に合わせ,鑑賞指導方法とその教材(ワークシート)の開発を行い,その有効性を確かめた。これらの研究は,美術科教育学会の学会誌に論文として掲載される予定である。また,現在の時点で,小学校1年生と大学生を対象にした鑑賞傾向の調査,大学生からは調査の他に鑑賞実践も行うことができている。今後は,小学校1年生と大学生を対象にした調査を基に,小学校1年生と大学生の鑑賞傾向の違いをつかむ。また,小学校1年生と大学生用の鑑賞指導方法と教材の開発も行う。そして,これまでに明らかにしてきた小学校3年生から中学校3年生の鑑賞傾向を合わせ,本研究での鑑賞方法における鑑賞発達段階を明らかにする。研究のまとめとして,本研究で明らかにした小学生から大学生までの鑑賞発達段階,鑑賞指導方法と教材(ワークシート)を冊子にまとめ,各学校等に配布し現場で役立てられるようにする。

小学生を対象にこの方法で鑑賞実践を行ったところ,作品の内容を感受した後に表現を感受するという順番が自然であった。まずは想像的・観念的自己が作品と出会い,その後に現実的自己が向かい合うとも言える。しかし,この順番は,中学2年生以上の生徒にとっては鑑賞しにくいようであった。中学2年生以上の生徒は,表現を感受してから内容を感受する方がやりやすかった。これは,この年齢の生徒たちが,先に現実的自己が作品と出会い,それから想像的・観念的自己が作品と向かい合うことを示している。この中学2年生での変容は,他の研究分野にも見られることであった。本研究では,中学2年生での鑑賞傾向の変容に合わせた鑑賞教育方法と教材を作成して実践を行い,その有効性を確認した。本研究では,美術作品の要素を内容と表現に分けそれぞれの感受を行い,最終的に作品全体の感受に統合する鑑賞方法を提案している。この鑑賞方法論での調査を様々な年齢に対して行った。調査対象者はどの年齢であってもこの鑑賞方法論で作品感受ができた。よって,本研究で提案している鑑賞方法論は,多くの年齢において用いることができることを明らかにした。ただ,調査によって年齢によって作品と向き合い方が変容することも分かった。よって指導方法はそれに合わせて変えていく必要があることも明らかになった。現在までに,小学校3年生から中学生までの児童生徒を対象に調査を行い,年齢ごとの鑑賞態度の傾向を明らかにした。調査から,小学校4年生と中学校2年生あたりの時期に鑑賞態度の変容の時期があることが確認できた。小学校3年生から中学1年生あたりまでは作品内容を想像的・観念的自己が感受してから,作品表現を現実的自己が感受する。中学2・3年生は現実的自己が作品表現を感受してから作品内容を想像的・観念的自己が感受する。そして,どの年齢においても最終的に作品内容と作品表現から感受したことを統合し,作品全体の感受とする。このような各年齢の鑑賞態度の傾向に合わせ,鑑賞指導方法とその教材(ワークシート)の開発を行い,その有効性を確かめた。これらの研究は,美術科教育学会の学会誌に論文として掲載される予定である。また,現在の時点で,小学校1年生と大学生を対象にした鑑賞傾向の調査,大学生からは調査の他に鑑賞実践も行うことができている。今後は,小学校1年生と大学生を対象にした調査を基に,小学校1年生と大学生の鑑賞傾向の違いをつかむ。また,小学校1年生と大学生用の鑑賞指導方法と教材の開発も行う。そして,これまでに明らかにしてきた小学校3年生から中学校3年生の鑑賞傾向を合わせ,本研究での鑑賞方法における鑑賞発達段階を明らかにする。研究のまとめとして,本研究で明らかにした小学生から大学生までの鑑賞発達段階,鑑賞指導方法と教材(ワークシート)を冊子にまとめ,各学校等に配布し現場で役立てられるようにする。
タイラーウイルスによる脱髄におけるL^*蛋白の役割

タイラーウイルス(TV)はマウスに急性致死性の灰白脳脊髄炎を起こす急性亜群(GDVII株)と、マウス脊髄に持続感染し、脱髄を引き起こす慢性亜群(DA株)に分けられる。我々はこれまでウイルスのリザーバーと考えられているマクロファージでは、持続感染・脱髄を起こす慢性亜群のみが増殖することを示した。さらにこの"亜群特異的宿主細胞依存性ウイルス増殖"には、慢性亜群でのみ合成されるL*という蛋白が重要であることを、L*蛋白欠失DA変異ウイルスを用いた"loss of function"の系で明らかにした(J.Virol.71:729-733,1997;J.Virol.72:4950-4955,1998;Microbio1.Immunol.43:885-892,1999)。そこで今回はL*蛋白翻訳領域を持続感染・脱髄を起こさないGDVII株に組み込んだリコンビナントウイルスを作製し、"gain of function"の系により、"亜群特異的宿主細胞依存性ウイルス増殖"におけるL*蛋白の関与を検討した。L*蛋白産生GDVIIリコンビナントウイルスはマクロファージ細胞J774-1における増殖能力を獲得した。さらに感染細胞内ではウイルスRNA量が増加しており、"亜群特異的宿主細胞依存性ウイルス増殖"はウイルスRNA複製の段階で制御されていることが推定された(J Virol74:4898-4901,2000)。またL*蛋白に対する特異的抗体を作製し感染細胞におけるL*蛋白の動向を検討した。L*蛋白は本来の読み枠から翻訳されるカプシド蛋白と同じ経時変化で合成されるが、その量ははるかに少なく、さらにウイルス粒子中には取り込まれず、微小管と結合して比較的安定した形で感染細胞内に留まることを明らかにした(Virology 289:95-102,2001)。タイラーウイルス(TV)・DA株はマウス脊髄に持続感染し、多発性硬化症類似の病理像を呈することからその動物モデルとして注目されている。近年、ウイルスポリ蛋白とは別個に翻訳されるl7kDaの小さな蛋白L*が持続感染・脱髄のキー蛋白として注目されている。従来L*蛋白の機能解析はL*蛋白開始コドンAUGをACGに変異させたL*蛋白欠失DA変異ウイルスを用いた"loss of function"の系で行われてきた。本研究では逆にL*蛋白産生GDVIIリコンビナントウイルスを作製し、"gain of function"の系により、L*蛋白の脱髄発症に果たす役割を検討した。本年度はウイルスの主たるリザーバーであると考えられているマクロファージにおけるウイルスゲノムの維持、すなわちウイルス増殖にL*蛋白が関与しているかどうかを検索した。TV・GDVII株は本来マクロファージでは増殖しないが、L*蛋白の翻訳領域を組み込んだL*蛋白産生GDVIIウイルスはマクロファージで増殖するようになり、L*蛋白がウイルスのリザーバーであるマクロファージにおけるウイルスゲノムの維持に関与していることが確かめられた。我々は既にL*蛋白欠失DA変異ウイルスを用いた"loss of function"の系でL*蛋白がマクロファージにおけるウイルスゲノム維持に重要な役割を果たしていることを報告している(J Virol 72:4950-4955,1998)ので、今回"gain of function"の系によりさらにこの事実を確認できたことになる(J Virol 74:4898-4901,2000)。タイラーウイルス(TMEV)の急性亜群はマウスに致死的な急性灰白脳脊髄炎を起こす。

一方、慢性亜群はその脊髄に持続感染し、炎症細胞浸潤を伴った一次性脱髄を引き起こす。その病理像は多発性硬化症に類似しており、このことからその動物モデルとして注目されている。近年、ウイルスポリ蛋白とは別個に翻訳される17kDaの小さな蛋白L^*が報告されている。このL^*蛋白は慢性亜群でのみ合成されることから、持続感染・脱髄のキー蛋白として注目されている。今までL^*蛋白の研究は、L^*蛋白開始コドンAUGをACGに変異させたL^*蛋白欠失DA変異ウイルスを用いた"loss of function"の系、およびL^*蛋白産生GDVIIリコンビナントウイルスを用いた"gain of function"の系により、L^*蛋白の機能解析にとどまっていた。しかし、L^*蛋白の性状解析は全く進んでいなかった。本研究ではL^*蛋白に対する特異抗体を作製し、この抗体を用いて、感染細胞におけるL^*蛋白の動向を検索した。L^*蛋白の70-88番目のアミノ酸残基に相当する合成ペプチドによりウサギを免疫し、ポリクローナル抗L^*蛋白抗体を得た。この抗体を用いてウイルス感染BHK-21細胞におけるL^*蛋白の性状を調べた。L^*蛋白はカプシド蛋白と同様な経時変化で合成され、ウイルス粒子には取り込まれなかった。すなわちL^*蛋白は合成後感染細胞質内に留まっており、細胞質内では微小管に結合して、比較的安定に存在していることが分かった。さらに持続感染の主要な場であるマクロファージにおいても、L^*蛋白と微小管の関わりが示唆された(Virology, 289:95-102, 2001)。
消化管におけるストレス応答とその食品因子による制御の分子基盤解析

各種ストレスで誘導される腸管の炎症反応を、腸管上皮細胞と免疫系細胞の相互作用という視点から、細胞培養実験系を用いて解析するとともに、腸管炎症を抑制する食品成分を探索した。活性化したマクロファージやマスト細胞は上皮細胞の傷害を引き起こし、逆に上皮細胞はマスト細胞の機能の活性化を誘導するなどの相互作用が観察された。また、細胞間相互作用を担う分子や抗炎症作用を示す食品因子を見出すことができた。(1)上皮細胞としてヒト腸管由来Caco-2を用い、各種ストレス因子が腸管上皮細胞に引き起こす炎症反応に対する食品因子の影響を調べた。炎症反応の誘導に関わるサイトカインIL-8の上皮細胞における産生に及ぼす食品因子の影響を調べた結果、有害微生物などによるToll様受容体(TLR)の刺激により誘導されるIL-8産生のうちTLRI,2,5を介したものがカルノシンのようなジペプチドによって、またTLR2,5,7を介したものが乳酸菌の代謝性産物である酪酸によって亢進すること、TLR3を介したものが両者によって抑制されることが見出され、菌体成分等のストレスに曝された腸管上皮における免疫応答を食品因子が制御することが示された。(2)IBDモデルとしてすでに構築した「腸管上皮細胞(Caco-2)とマクロファージ様細胞(THP-1)の複合培養系」において、Caco-2細胞側の遺伝子発現変動をDNAマイクロアレイによって解析した。免疫やアポトーシスに関与する遺伝子の発現の上昇が確認され、最も発現量変動の大きいものとしてIEX-1を見出した。複合培養時のIEX-1mRNA発現には少なくともTHP-1細胞の産生するTNF-αが関与していることが示された。(3)Caco-2細胞の培養上清を添加することで、マスト細胞RBL-2H3のTNF-α分泌量が変動することを示唆するデータが得られた。また、RBL-2H3細胞上の抗原抗体反応によって誘導されるTNF-αmRNA発現及び脱顆粒をnobiletin、hesperetin、tangeretinのようなメトキシフラボノイドが抑制するという結果を得た。腸管上皮下に存在するマスト細胞の炎症性サイトカィン発現や脱顆粒は上皮細胞や食品成分によって制御されていると考えられる。(1)腸管上皮細胞の刺激によるサイトカイン産生を指標に、ストレス応答を抑制する食品因子の解析を引き続きおこない、ポリフェノール、スフィンゴ脂質、アミノ酸などによる抑制機構の一端を明らかにした。(2)IBDのモデル系として構築した腸管上皮細胞(Caco-2)とマクロファージ様細胞(THP-1)の複合培養(共培養)系において、Caco-2細胞側で免疫やアポトーシスに関与する遺伝子の発現の上昇が確認された。最も早く応答し、かつ発現量変動の大きいものとして転写因子IEX-1が見出されたことから、IEX-1が腸管上皮の炎症反応の鍵分子である可能性について検討した。レンチウィルスの系を用いてIEX-1を高発現あるいはノックダウンさせたCaco-2細胞の特性を調べた結果、IEX-1は腸管上皮細胞のアポトーシス誘導を抑制する分子として、ストレス条件下での細胞保護に寄与することが示唆された。また、傷害の誘導にはTNF-α受容体の発現変化が関わる可能性が示された。(3)20年度にマスト細胞として用いたRBL-2H3の性質が安定しないことから、21年度はヒト由来細胞株HMC-1を用いた。HMC-1に適用できる培養条件を検討した後、Caco-2細胞と共培養した結果、48時間後にCaco-2細胞の顕著な傷害が起こっていることが見出された。またHMC-1細胞では、数時間の共培養によって脱顆粒が起こっていることが見出された。(4)HMC-1は共培養によって形態変化することが見出され、腸管上皮細胞からの何らかの因子により分化が亢進すると考えられた。腸管上皮細胞からの因子がマスト細胞を刺激し、マスト細胞の産生する因子が、腸管上皮細胞の傷害を誘導するという図式はIBSの発症においても認められると考えられることから、これらの因子の解析を進めている。本研究は、最近増加している過敏性腸症候群(IBS)のような疾病の原因と考えられる「腸管におけるストレス応答」を細胞・分子レベルで解析するために、新規なin vitro,in vivo実験系を構築し、それを用いてIBS等の予防や改善に役立つ食品因子を探索すること、さらにはその抗ストレス作用の分子メカニズムを解明することを目的としている。腸管における上皮細胞(IEC)と他の細胞(マクロファージ、マスト細胞、神経細胞)の相互作用、あるいは摂取した食品因子がIBSの成因に関わると考えられることから、本研究では複数細胞を同時に培養する複合培養系を用いて、腸管の炎症反応の誘導機構や、それに及ぼす各種食品成分の影響を調べた。

その結果、マクロファージ様細胞により誘導されるIECの炎症反応において、IEX-1のようなタンパク質が抑制的に関わること、IECの炎症誘導にはある種のフェノールカルボン酸が有用であることなどが見出された。さらに、マスト細胞とIECの間には複雑な相互作用があり、IECの産生する因子により、マスト細胞の分化が促進されるとともに、マスト細胞上でのインテグリンのような接着分子の発現が上昇し、マスト細胞の遊走接着能が増加すること、一方でマスト細胞の産生する因子によりIECの傷害が誘導されることなどが明らかになった。さらに、ある種の食品ポリフェノール類がIECの傷害を顕著に抑制することも見出された。このような知見は、マスト細胞の制御や食品の摂取によりIBSに伴う炎症を制御できることを示唆するものと考えられる。
方位制御SiCウィスカー砥石の開発

本研究は,研削砥石中の砥粒のかわりに微小のSiCウィスカを使用することを考え,ウィスカを研削面に垂直にそろえた砥石の開発を試みたものである.もともとSiCはGC砥粒として知られている上に,ウィスカはその機械的強度特性が極めて優れていると言われているので,研磨材として使用した場合,優れた研磨特性をもつことが期待される.また,ウィスカの直径は約1μm(砥粒で#8000相当)と極めて微細であるが,長さが40から50μmと長いため,もし方向をそろえた砥石を作れば研磨材としてのウィスカの保持面積が極めて大きいので,研磨中,研磨材が脱落しにくく,長寿命の砥石になる可能性がある。本年度は結合材としてフェノール樹脂を用いたレジノイドタイプの砥石について,SiCウィスカの方向制御方法と,そのセグメント砥石による正面研削によってどの程度の表面仕上げが可能かについて検討を行った.まず最初に,Sicウィスカと液状フェノール樹脂とを混ぜ合わせ粘土状にしたものを,一方向に100倍程度延ばすことにより,ほとんどのウィスカを一方向にそろえることができることを理論的,実験的に示すことができた.次に,SiCウィスカの方向を研削面に対して垂直にそろえたもの,平行にしたもの,そして方向をそろえないものの3種類の砥石について研削仕上げ面を比較したところ,垂直にそろえた砥石の場合が一番良い結果が得られることがわかった.最後に,本砥石でSKD11(HRC60)を研削したときの仕上げ面粗さにおいて,0.04μmRmax(0.004μmRa)を得ることができた.以上により,SiCウィスカ砥石の有効性を示すことができた.本研究は,研削砥石中の砥粒のかわりに微小のSiCウィスカを使用することを考え,ウィスカを研削面に垂直にそろえた砥石の開発を試みたものである.もともとSiCはGC砥粒として知られている上に,ウィスカはその機械的強度特性が極めて優れていると言われているので,研磨材として使用した場合,優れた研磨特性をもつことが期待される.また,ウィスカの直径は約1μm(砥粒で#8000相当)と極めて微細であるが,長さが40から50μmと長いため,もし方向をそろえた砥石を作れば研磨材としてのウィスカの保持面積が極めて大きいので,研磨中,研磨材が脱落しにくく,長寿命の砥石になる可能性がある。本年度は結合材としてフェノール樹脂を用いたレジノイドタイプの砥石について,SiCウィスカの方向制御方法と,そのセグメント砥石による正面研削によってどの程度の表面仕上げが可能かについて検討を行った.まず最初に,Sicウィスカと液状フェノール樹脂とを混ぜ合わせ粘土状にしたものを,一方向に100倍程度延ばすことにより,ほとんどのウィスカを一方向にそろえることができることを理論的,実験的に示すことができた.次に,SiCウィスカの方向を研削面に対して垂直にそろえたもの,平行にしたもの,そして方向をそろえないものの3種類の砥石について研削仕上げ面を比較したところ,垂直にそろえた砥石の場合が一番良い結果が得られることがわかった.最後に,本砥石でSKD11(HRC60)を研削したときの仕上げ面粗さにおいて,0.04μmRmax(0.004μmRa)を得ることができた.以上により,SiCウィスカ砥石の有効性を示すことができた.
アデノウイルスベクター及びCRISPRを用いた受精卵における遺伝子組換えの効率化

従来、ノックイン動物を用いる際はES細胞にターゲッティングベクターを導入し、ノックインされたことにより薬剤耐性になったものを選択することにより選別する方法が採用されてきた。しかし、ES細胞の性質の違いにより、この方法はマウス以外の動物では不可能であるため、CRISPRとドナーDNAを受精卵に導入する方法が採用されている。非ヒト霊長類モデル動物であるマーモセットは、得られる受精卵の数が他の動物と比べて非常に少なく、ノックイン効率を上昇させる必要性が高い。そこで、マーモセットES細胞を用いて組換えの頻度を上昇させる遺伝子の探索を行った。これまで生物学の分野、特に脳神経系機能を解析において、モデル動物としてマウスがしばしば用いられてきた。これは、マウスの身体が小さく飼育に適している、子をたくさん産むなど、モデル動物として適する条件を持っていること、また、遺伝子改変が容易に行なえることが理由としてあげられる。近年、ヒトと近縁であることからマーモセットなど非ヒト霊長類動物の解析がさかんに行なわれてきている。マーモセットは、マウス同様モデル動物に適した特性を持つが、これらのES/iPS細胞はnaive状態ではなくprimed状態であるため、マウスのようにES細胞を用いた遺伝子改変はできない。そのため、マーモセットにおいて遺伝子のノックインおよびノックアウトを行う場合、受精卵のゲノムに改変を行なう必要がある。しかしながら、マーモセットは、受精卵がマウスほどとれない上、遺伝子改変が行なわれていなくても処分することができない。よって、遺伝子改変を行なう際、組換え効率が問題となる。そこで、本研究では、ノックインベクターがゲノムに組換える効率を高める技術開発を行う。まず、マーモセットの受精卵で遺伝子ノックインを行なうためのドナーDNAおよびノックインする遺伝子座のゲノムを切断するCRISPR/Cas9の作製を行なう。さらに、これらをマーモセット受精卵に導入した際に、遺伝子が効率よくノックインされるようにするための薬剤や遺伝子などの探索を行なう。遺伝子ノックイン・マーモセットを作製するために、3種類のドナーDNAを作製した。また、それぞれの遺伝子座を標的とするCRISPRを3種類ずつ作製した。それぞれの活性は、サロゲートベクターを作製して確認した。サロゲートベクターとは、同一のプロモーター調節下に、赤色蛍光タンパク質(DsRed)と緑色蛍光タンパク質(GFP)が、CRISPRの標的配列を挟んでコードされており、そのままだとフレームがそろっていないのでDsRedしか発現しないが、CRISPRにより標的配列が切断され、そこに変異が入った場合のみGFPも発現する仕組みになっている。すなわち、サロゲートベクターとCRISPRを同一細胞にトランスフェクションし、そのCRISPRが標的配列を切断した場合(すなわちそのCRISPRに活性があった場合)GFPが発現する。このほかに、同じ遺伝子座について、ヒトとマウスについてもドナーDNAとCRISPRの作製を行った。これらを用いて、遺伝子組換えが効率よく行なわれるようにするための薬剤や遺伝子などの探索を行なう予定である。しかし、ES細胞の性質の違いにより、この方法はマウスでのみ可能であり、マウス以外の動物に用いることはできない。そこで、マウス以外の動物においてノックインを作成する場合、CRISPRとドナーDNAを受精卵に導入する方法が採用されている。CRISPRを用いてゲノム中の任意の場所を切断すると、DNA修復機構により、ドナーDNAがゲノムに相同組換えによりノックインされることが知られている。この方法により、哺乳動物においてラット、ブタなどでノックイン動物の作製が報告された。しかしながら、霊長類においてはまだ報告はない。そこで、霊長類に属するマーモセットにおいてノックイン動物の作製を試みるため、現在までに3つの遺伝子座についてCRISPRおよびドナーDNAを作製した。マーモセットにおいて遺伝子ノックインが成功していないのは、受精卵における相同組換えの頻度が低いためであると考え、現在マーモセットES細胞を用いて組換えの頻度を上昇させる遺伝子の探索を行っている。ドナーDNAをアデノウイルスベクターに搭載して、CRISRPと共に目的の細胞に導入することにより、効率よくドナーDNAがノックインされることが報告されている(Holkers et al., Nat Methods, 2014)。これは、アデノウイルスゲノムの構造、すなわち直鎖状2本鎖DNAの両端にタンパク質が共有結合しているもの、によりランダムインテグレーションが抑制されるためであると推測されている。そこで、ドナーDNAと共にCRISPRを搭載したアデノウイルスを受精卵に感染される計画を立てた。しかし、近年、CRISPR/Cas9の発現が遅いと、受精卵の発生が進んだ際、割球ごとにゲノム状態が異なるいわゆるキメラ胚が多く認められるという報告があり、Cas9はタンパク質の状態で受精卵に導入する方法が趨勢となってきている。そこで、方針を変更し、現在、アデノウイルスの中に相同組換えを促進する遺伝子が存在すると考え、アデノウイルスの遺伝子の発現ベクターを作製し、マーモセットES細胞にCRISPR、ドナーDNAと共に導入し、それらの遺伝子のスクリーニングを行っている。従来ノックイン動物の作製は、まずES細胞にターゲッティングベクターを導入し、外来遺伝子がノックインされたES細胞からキメラ動物を作製することにより行われてきた。