hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体内時計を考慮した健康志向の食餌と運動処方のマウスモデル開発

研究成果の概要(和文):体内時計と食・栄養の関係(時間栄養学)と、体内時計と運動の関係(時間運動学)を組み合わせ、マウスの体内時計のリセット効果と、抗肥満効果について調べた。昼と夜の1日2食では体内時計の位相は自由摂餌の夜側から昼間側に引っ張れていくが、輪回し運動を同時に行うとこの作用がキャンセルされる。不規則な食餌による体内時計の乱れは運動で改善できた。食餌と運動の組み合わせでは、いずれの場合も食餌後の運動が抗肥満効果を示した。規則正しい食餌のリズムが体内時計をリセットし、ある位相に同調させる(例えは夜食だけ与えていると、夜に時計遺伝子発現がピークとなる位相に同調する)。将来の人の研究を想定して、マウスに3食を与えるとしても、規則正しい朝昼夕の3食を与えたとき、あるいは、夕夜朝の3食を与えたときでは、リセットの位相が真反対になる可能性がある。一方で、どちらの条件も、昼食と夕食は食べているので自由摂食のマウスに近い位相で同調しているという結果も予想される。あるいは昼食や夜食の量が問題で、この時間帯の食餌量を増やせば、位相が真反対になる可能性が考えられる。そこで、食餌の同調作用については、以下の実験を行った。本研究は、インビボイメージングを用いて行った。まず、インビボイメージングによる肝臓、腎臓、唾液腺での体内時計遺伝子発現変化を調べた。Per2::luciferaseのノックインマウスを用いて、4時間おきに、1日6回の計測を行い、リズムの位相、振幅を測定した。まず、本研究方法の妥当性について調べた。すなわち、麻酔薬による体温の低下、ルシフェリンの血液体内動態などを調べた。その結果、肝臓、腎臓、唾液腺のPer2時計遺伝子の働きによる生物発光リズムの振動現象は、このような要因では影響を受けず、ルシフェリンの生物発光リズムは体内時計の遺伝子発現を表現していることが分かった。本研究方法は論文に発表した。本方法を用いて、まずは1日4食、5食、6食の分食の、位相に及ぼす影響を調べた。その結果、食事間隔を一定にし、一定量の餌を分食して与えた場合、臓器すべての体内時計の位柏は影響を受けなかった。すなわち、このような食パターンは体内時計を動かせないことが分かった。本年度は、時間栄養学と時間運動学の接点の研究を拡大していくことにした。まず、45%脂肪の高脂肪食を負荷した状態で、(1)自由に輪回し運動にアクセスできる状態、(2)アクセスできる時間を1日4時とし、マウスにとっての朝、昼、夕に設定する。このときどの時間帯の運動が一番抗肥満効果が見いだせるかを調べた。その結果、夕運動が体重増加を抑制した。夕運動群を詳細に調べると、朝に摂食行動が盛んであることが分かった。すなわち朝から昼に食事をし、夕方運動することで、肥満用が起こることが分かった。一般的に、マウスの食パターンは夜間の最初に大きく、明け方は少なめの摂食活動を示す。このような食事パターンが、運動負荷によりどのように変化するか否かを調べた。つまり、朝運動+夕食事、あるいは、朝食事+夕運動などの組みあわせが出来る可能性があり、運動と食事のタイミングの組み合わせが、肥満予防に良い可能性が考えられる。実際、朝食事+夕運動は抗肥満効果を示した。次に食事と運動の順番効果を明らかにすべく、運動時間を昼間に固定し、餌を運動の前に与えるか、あるいは運動後に与えるかの2つのグループを用意した。この場合は餌は4時間の時間制限を設定することにより、運動と食欲との関係も調べることが可能となる。朝食後昼間の運動群は、逆の昼間に運動後夕食群より、顕著な抗肥満効果が見いだせた。運動と食事パターンの組み合わせ状態で、代謝ケージによりエネルギー代謝や呼吸商も計測し、これらのリズム性発現に対する影響についても調べた。その結果、夜遅い食事は、呼吸商の低下が起こらず、脂肪の燃焼が弱いことが分かった。すなわち、運動と食事の組み合わせは重要であり、食事後の運動は、摂取したエネルギーの消費に有用であり、特に夕方の運動は効果的であることが分かった。この研究成果は、人へ十分に応用可能である。前年度にインビボイメージングによる肝臓、腎臓、唾液腺での体内時計遺伝子発現変化を調べる方法を確立した。末梢の体内時計の位相が、食事時間に同調することが分かっているので、まずは1日4食、5食、6食の分食の、位相に及ぼす影響を調べた。その結果、食餌間隔を一定にし、一定量の餌を分食して与えた場合、臓器すべての体内時計の位相は影響を受けなかった。

すなわち、このような食パターンは体内時計を動かせないことが分かった。次に、ヒトの食パターンを模倣するモデルとして、1日3食を与えた。朝、昼、夕と与える群と、夕、夜中、朝と与える群を用意した。つまり、3食のうち1食を昼にとるかあるいは夜中にとるかの違いによる影響を調べた結果、夜中にとる群は、末梢臓器の時計の位相が大きく後退することがわかった。次に1日3食にし、夕食の時間のみ遅らせるプロトコールで実験を行った。これは、ヒトの食生活で夕食が遅くなるモデルである。その結果、夕食を午後7時から、午後10時や11時と遅らせていくと、末梢時計の位相は大きく遅れることが分かった。そこで、午後11時に半分の餌を、午後7時に残りを与える分食を行ったところ、位相の遅れが改善した。以上の結果から、1日3食のスケジュールでも、食べ方により、末梢時計の位相は変わること、夜遅い食事は体内時計を夜型に変えることが分かり、分食により改善することから、夕食が遅い人に直ちに応用出来る研究成果であった。本年度に、基礎的研究が終わり、体内時計の変化をインビボイメージングで調べる方法が確立できた。25年度が最終年度であるため、記入しない。まず世界に先駆けて、インビボイメージングにより末梢時計のリズムを可視化できたことは、大きな研究成果である。この方法は、容易にかつ安価にできるという特徴を有するため、汎用性が広いと考えられる。また、食事性のリズム形成が、ヒトの食事パターンを類する方法で再現できたことは、非常に画期的な研究である。この成果はそれぞれ、学術論文発表し、かつ、一般新聞の紙面に取り上げられるなど、社会的発信も充分行うことができた。このような視点から、本研究は順調に進んでいると判断して良いと考えている。本年度は、1日3食にし、かつ給餌時間を暗期に集中させるあるいは、明期に与えるなどおこない、実際の人の食パターンに類似した実験系を立ち上げる。さらに、体内時計が乱れる食パターンが見られた場合には、それを少しでも改善する食パターンを提案する。さらにこのような食パターンの見られが、エネルギー代謝や肥満に及ぼす影響についても調べる.時間運動学に閣しては、トレッドミル運動を与える時間を変化させ、どの運動時刻が、筋肉へのグルコースの取り込みが盛んになるか、あるいは、筋で使われる脂肪酸のβ酸化が盛んになるか、糖の酸化が盛んになるかを調べる。最終年度は、時間栄養学と時間運動学の接点の研究を拡大していく予定である。まず、45%脂肪の高脂肪食を負荷した状態で輪回し運動にアクセスできる時間を時に1日を6等分した4時とした時に、どの時間帯の運動が一番抗肥満効果が見いだせるかを調べる。すなわち朝、昼、夕のいずれの運動が効果的か否かを調べる。一般的に、マウスの食パターンは夜間の最初に大きく、明け方は少なめの摂食活動を示す。このような食事パターンが、運動負荷によりどのように変化するか否かを調べる。つまり、朝運動+夕食事、あるいは、朝食事+夕運動などの組みあわせが出来る可能性があり、運動と食事のタイミングの組み合わせが、肥満予防に良い可能性が考えられる。次に、運動時間を例えば昼間に固定し、餌を運動の前に与えるか、あるいは運動後に与えるかの2つのグループを用意する。この場合、餌は一定量与える場合と、4時間の時間制限を設定する場合2通りを用意することにより、運動と食欲との関係も調べることが可能となる。
非線形振動回路のネットワークを用いた時系列データの分析と予測

本研究では、実回路を基にしたネットワーク型の発振器を用いた、時系列データの予測を行うシステムを提案する。これらの回路は、van der Pol発振器をインダクタで3x3の格子状に結合し構築する。また、van der Pol発振器を数個と共振器を相互インダクタンスで結合して構築する。3x3に結合したシステムから得られた回路方程式を正規化し,Runge-Kutta法を用いてシミュレートを行い,カオス時系列データと気温の予測を行う。Pspiceを用いたシミュレーション実験でも、現実に実現可能な回路素子の大きさで構成したシステムで予測を行う。本研究は、様々な時系列データを、非線形振動回路である非線形発振器を結合して作成したネットワーク型発振器を用いて、過去のデータから未来のデータを予測するシステムを構築することを目的としている。(1)ハードでの構築を考慮するため、実際の回路を基本としたシステムの構築を模索する。予測に用いる時系列データに、自然界の非線形性が高い複雑なデータに近いと考えられるカオス時系列データと自然のデータである気温のデータなどを用い、考案したシステムの実証を行う。これら実証では、システムの回路方程式を計算が容易に行えるように正規化した手法と、実際の回路上に発生する様々な問題を考慮した手法を用いることとする。(2)考案したシステム自体の特性や性質、システム自体に発生する特異な現象などについても解析をすすめる。(3)物体の動きを時系列データとして取得できるシステムを上記で考案するシステムを利用し構築する。本研究では、自然界に見られる、複雑で多種多様な時系列データを非線形発振器などで構成されたネットワークを用いて予測を行うことが最終的な目的である。スパイラルインダクタを用いたコルピッツ発振器をスパイラルインダクタ間に発生する相互インダクタンスで結合したシステムにおいて、スパイラルインダクタ間の距離や重なる角度を変化させるなどにより、比較的非線形性の高い波形の合成を行った。さらに、実際に回路を作成しやすいと考えられるファン・デル・ポール発振器をインダクタで格子状に結合したネットワークを用いて任意の波形を合成し、予測を行った。すなわち、まだ精度面や学習方式などで問題を多く含むが、動的なシステムで時系列データを合成し、予測するシステムの開発に成功したと言える。さらに、本システムに発生する新たな性質や現象の確認もできた。特に、後者のネットワークを用いた任意の波形を合成する手法は、過去の波形から未来の波形を予測する手法である。簡単に説明すると以下のようになる。例えば、02Tの時間が過去であるとし、2T3Tの未来を予測したいとする。まず、0Tの時系列データを入力するとT2Tの時系列データが出力されるように各パラメータを学習し、T2Tの時系列データを入力することによって、2T3Tの未来を予測する。本手法では、個々の発振器が安定して発振する必要はなく、ネットワーク全体で発振すれば良いため、各パラメータをほぼ自由に選択することが可能となり、学習時の制限が少なくなる。すなわち、学習に時間はかかるが任意の波形を合成しやすくなると考えられる。試験データに、合成及び予測がしやすく自然に存在する時系列データに近いと考えられる、正弦波に近いシングルスクロールアトラクタを持つカオス時系列データを適用して、短い時間ではあるが、元のカオス波形に近い波形を合成することに成功し、予測を行うことができた。本年度は,昨年度正弦波に近いカオス時系列データの予測に成功したファン・デル・ポール発振器をインダクタで格子状に結合した回路を用い,より複雑で,より自然現象に近いと考えられるダブルスクロールアトラクタを持つカオス時系列データの合成と予測を行い成功した。また,ハード化を考慮した実験として,回路方程式を正規化して用いるのではなく,そのままspiceでシミュレートし,正弦波に近いカオス時系列データの予測を行ない成功した。spiceを用いる際は,全部で65のパラメータと9の初期値を調整する必要があるが,これを手動ではあるが比較的効率良く操作できる手法についても開発を行なった。この成功により,複雑な波形でなければ,本システムであっても実際の回路による予測が可能である可能性がより一層高くなったと考えられる。本手法では,問題点が未だ数多くある。特に昨年度は,厳密な計算ではなく人間の目視により誤差を考慮していた。本年度は,正規化した式を利用する手法において,自動的に合成データを時間で区切って重みをかけて誤差を求めるなど,ある程度自動的に最適解を求めるシステムへの改良を行なった。この結果,手動である部分が多く,人間のみに比べ予測精度もわずかに落ちるが,現在の手法であっても, 1パラメータ程度であれば自動化が可能であると考えられる。さらに,これらの手法で用いる回路において発生する現象の解析を進め,規模を大きくした同様の回路において,特殊な現象が発生することを明らかにした。

特に,定常状態でも位相差の波が存在し続ける特殊な現象を発見した。また,スパイラルインダクタを複数用いた加速度や動き検出,また,位置検出などが可能な,動く物体の時系列データを採取することができるシステムの開発を行なった。この手法は相互インダクタンスの変化を用いており,この過程で様々な歪んだ波形が観測されており,時系列データ合成への転用も考えられる。本研究では、自然界に見られる複雑で多種多様な時系列データを非線形発振器などで構成されたネットワークを用いて予測を行うことが最終的な目的である。昨年度、カオス時系列データの予測に成功したvan der Pol発振器をインダクタで格子状に結合したシステムを用いて、今年度は、広島市の気温データの予測を行なった。このシステムでは、上記発振器のネットワークから求められる回路方程式を正規化した連立微分方程式を用いる。この方程式をRunge-Kutta法を用いてシミュレートし、1年間を複数の期間に分割して予測を行なった。多少のずれが生じた期間もあるが、概ね近い値となり、成功したと言える。以上より、自然現象などの時系列データも、我々の開発したシステムで予測できる可能性があることを示せたと言える。また、より現実の回路に近い形で予測を行なうため、spiceを用いてダブルスクロールを持つ複雑なカオス時系列データの予測を行なっている。以上の予測を行うのに用いている発振器のネットワークを拡大し、そのシステムに見られる現象について解析を進め、定常状態でみられる特殊な波動現象の存在を確認した。この波動現象の性質は、ネットワーク上を伝搬するだけでなく、波同士が衝突する際、反射や消滅などを起こすことを発見し、そのメカニズムも明らかにした。さらに、これらのネットワークにおける、同相同期や逆相同期への初期値からの引き込みの強さなどについても調査解析を行った。以上の方式以外の方式として、spiral inductorを用いたvan der Pol発振器2つと、spiral inductorとキャパシタで構成した共振器を1つ作成し、2つの発振器の間をspiral inductor間の相互インダクタンスと共振器で結合したネットワークを開発した。このネットワークを用いて、予測に利用が可能と考えられる複雑な波形を合成することに成功した。本研究では,ネットワーク型発振器を用いて,時系列データの予測を行うことが目的である。昨年度までに,van der Pol発振器を3x3の格子状に結合したネットワーク型発振器で,過去のデータを入力することにより,未来のデータが出力される一種のフィルタを構築し,回路方程式を正規化してルンゲ・クッタ法を用いて数値解析を行い,時系列データの予測を行ってきた。このシステムはパラメータ数が多く,手動による調整部分も多かった。今年度は,自動化のためのパラメータ調整手法を開発し,1度目の予測以外はほぼ完全に自動で予測を行うプログラムの開発に成功した。また,実回路においてこのシステムが構築可能なことをより明らかにするため,昨年度から引き続き行っているspiceを用いての,ダブルスクロールアトラクタを持つカオス時系列データの予測を行い成功させた。
非圧縮性粘性流体方程式の自由境界値問題

本年度は次の2つの研究成果が得られた.1.Navier-Stokes方程式に対する層領域型の自由境界値問題を,表面張力・重力が働かない場合について考察し,時間Lp空間Lq枠において小さな初期値に対する時間大域的適切性を証明した.さらに,解の指数減衰を示した.証明のポイントは,自由境界値問題をLagrange変換を用いて固定領域上の非線形問題に帰着させ,その線形化問題に対する指数安定な最大Lp-Lq正則性定理を示すことである.表面張力や重力が働く場合には,レゾルベント問題を考察したときに原点が連続スペクトルになるが,それらが働かない場合には原点がレゾルベント集合に属することがAbels (2006)により示されている.これにより(表面張力・重力が働かない場合は)指数安定な解析半群を構成することができ,昨年度得られた層領域における一般化Stokes問題に対する最大Lp-Lq正則性定理と組み合わせることで,線形化問題に対する指数安定な最大Lp-Lq正則性定理を証明した.2.一般化ニュートン流体と呼ばれる非ニュートン流体のクラスの非圧縮性二相流を考察し,任意の時間区間(0,T)を与えたとき,それに応じて小さな初期値を選ぶことで,(0,T)上の強解の一意存在定理を示した.本研究で考察した一般化ニュートン流体とは,接線応力τがτ=μ(|D(v)|^2)D(v)(μは[0,∞)上の実数値関数,D(v)は変形速度テンソル)で与えられるものであり,特にμを定数関数とすればニュートン流体に対する接線応力と一致する.本研究では,C^3かつμ(0)>0なるμに対して上記の結果を得た.証明のポイントは,方程式をニュートン流体の場合からの摂動と見なすことであり,Pruss-Simonett (2010, 2011)で得られている最大Lp正則性定理を用いることで摂動項を上手く処理することができた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度は3つの研究成果が得られた.1.層領域においてNeumann-Dirichlet境界条件の一般化Stokesレゾルベント問題の解作用素の族のR-有界性を証明した.本結果の重要な点は, Σ_<ε, δ>={λ∈c||argλ|≦π-ε, |λ|≧δ}(0<ε<π/2, δ>0)上の解作用素の族のR-有界性を証明したことである.一般的な放物型理論では, δ>0は0<ε<π/2に依存する十分大きな数を選ばなければならないが,本結果ではδ>0を任意に選べるということが重要である.また,解作用素の族のR-有界性の応用として,対応するStokes問題に対する最大正則性定理も証明した.2.半空間において表面張力と重力を伴うStokes問題の解のLq-Lr減衰評価を証明した.Shibata-Shimizuにより本問題に対する最大正則性定理が示されていたが,解の減衰評価に関する結果は知られていなかった.Shibata-Shimizuの解表示に現れるLopatinskij行列式の根を求め, Cauchyの積分定理を用いて解析半群の積分路を左半平面に移動し,根に対して留数定理を用いることで減衰評価が得られた.また,指数q, rに対して1≦r<2<q≦∞なる制限が付くことが本結果の特色である.この制限は,圧縮性粘性流体方程式の解の減衰評価を導くときに現れることが知られており,放物ー双曲型方程式系の解の特徴と見なすことができる.本問題の場合は,自由界面の運動を記述する方程式が双曲型方程式なので,この制限が現れると考えられる.3.ある非有界領域におけるNavier-Stokes方程式に対する自由境界値問題の時間大域的適切性をLp-Lq枠で証明し,解の漸近挙動も明らかにした.本研究では, [a1] : 2<q<4, [a2] : (2/p)+(3/q)<1なる仮定が重要である. [a1]は(2)のLq-Lr減衰評価をr=q/2として用いるためである. p=qとすると[a1], [a2]が同時に成立しないことが容易に分かるため,本研究ではp≠qなるLp-Lq枠で考察することが本質的である.このように, Lp-Lq枠の有用性を明らかにしたのは本結果が初めてであり非常に重要な結果と言える.本年度は次の2つの研究成果が得られた.1.Navier-Stokes方程式に対する層領域型の自由境界値問題を,表面張力・重力が働かない場合について考察し,時間Lp空間Lq枠において小さな初期値に対する時間大域的適切性を証明した.さらに,解の指数減衰を示した.証明のポイントは,自由境界値問題をLagrange変換を用いて固定領域上の非線形問題に帰着させ,その線形化問題に対する指数安定な最大Lp-Lq正則性定理を示すことである.表面張力や重力が働く場合には,レゾルベント問題を考察したときに原点が連続スペクトルになるが,それらが働かない場合には原点がレゾルベント集合に属することがAbels (2006)により示されている.これにより(表面張力・重力が働かない場合は)指数安定な解析半群を構成することができ,昨年度得られた層領域における一般化

Stokes問題に対する最大Lp-Lq正則性定理と組み合わせることで,線形化問題に対する指数安定な最大Lp-Lq正則性定理を証明した.2.一般化ニュートン流体と呼ばれる非ニュートン流体のクラスの非圧縮性二相流を考察し,任意の時間区間(0,T)を与えたとき,それに応じて小さな初期値を選ぶことで,(0,T)上の強解の一意存在定理を示した.本研究で考察した一般化ニュートン流体とは,接線応力τがτ=μ(|D(v)|^2)D(v)(μは[0,∞)上の実数値関数,D(v)は変形速度テンソル)で与えられるものであり,特にμを定数関数とすればニュートン流体に対する接線応力と一致する.本研究では,C^3かつμ(0)>0なるμに対して上記の結果を得た.証明のポイントは,方程式をニュートン流体の場合からの摂動と見なすことであり,Pruss-Simonett (2010, 2011)で得られている最大Lp正則性定理を用いることで摂動項を上手く処理することができた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。線形化問題の解析において層領域の場合は計算が複雑なので,まずは半空間の場合に表面張力および重力付きの問題を考察し,それに対応する非線形問題も扱った。半空間の問題を通して得られたことは,線形化問題の解の減衰評価の導き方や,非線形問題の新しい解析手法を確立できたことである.これらは,層領域の場合にも応用可能であると思われる.一方で,半空間の問題を考察したことで時間が掛かってしまい,当初の研究計画より少し遅れてしまった.今後の研究の推進方策は次の2点を証明することである.(1)層領域の場合に表面張力および重力付きの問題を考察し,線形化問題の解の減衰評価を導く.(2)上記(1)の結果を用いて対応する非線形問題の時間大域解の一意存在および解の漸近挙動を明らかにする.今年度は半空間の問題に関して(1), (2)を証明することができた.同様の解析手法が層領域の場合に応用可能であると思われるので,スムーズに次年度の研究計画((1), (2)のこと)を遂行できると考えている.
高血糖による血管リモデリング修飾機構におけるアルドース還元酵素の関与

ヒト子宮動脈16標本についてcyclic GMP基礎産生量を測定したところ、2.0-16.1 pmol/mg proteinの高値を示す8例(第1群)と0-1.0 pmol/mg proteinの低値を示す8例(第2群)とに分類出来た。この二群について以下の3つのパラメーターを比較した。すなわち、アセチルコリン刺激時の正味cyclic GMP産生量は第1群において有意に多く、内皮細胞中NOS阻害物質(L-NMMA+ADMA)濃度ならびに血管壁エンドセリン-1含量はいずれも第2群において有意に高かった。第1群の全ての標本が組織学的にほぼ正常であったのに対して、第2群の標本では中等度から高度の内膜肥厚が観察された。追加した19標本を含む35標本について解析した結果、内膜肥厚の程度と内皮細胞中NOS阻害物質濃度との間、内皮細胞中NOS阻害物質濃度と血管壁エンドセリン-1含量との間、血管壁エンドセリン-1含量と内膜肥厚の程度との間にはそれぞれ正相関が認められた。すなわち、内皮細胞中NOS阻害物質濃度および/または血管壁エンドセリン-1含量の増加につれて内膜肥厚が増悪することが示された。内皮細胞中にNOS阻害物質が蓄積するとNO産生は低下し、血管壁エンドセリン-1含量の増加を招き、そのために内膜肥厚が発症・進展することが示唆された。アロキサン(100mg/kg)一回静注12週後の高血糖ウサギと同容量の生食のみを静注した週齢の一致した対照ウサギとを用い、一側総頸動脈に内皮剥離術を施行した。4週経過後にウサギを屠殺し、以下の実験に供した。なお、アルドース還元酵素の選択的阻害剤であるフィダレスタットの影響を観察する場合には内皮剥離術施行1週前から4週後にわたる5週間、飲料水に混ぜて投与した(3mg/kg/220ml//day)。内皮剥離術施行4週後には明らかな内膜肥厚が観察され、この内膜肥厚は高血糖によって有意に増悪した。この増悪は再生内皮細胞中NOS阻害因子の蓄積促進、再生内皮細胞によるNO産生低下亢進ならびに血管壁エンドセリンの蓄積促進を伴っていた。また、腹部大動脈内皮細胞中ソルビトール含量は高血糖群において著明に増加していた。これら高血糖に伴う変化は何れもアルドース還元酵素の選択的阻害剤であるフィダレスタットによって抑制された。以上の事実から、アロキサン誘発高血糖ウサギでの内膜肥厚増悪にポリオール経路活性化の関与が示唆された。糖尿病によって、内因性NOS阻害物質(L-NMMAおよびADMA)の内皮細胞内濃度の上昇とL-arginine濃度の低下を来し、NO産生減少、ひいては血管壁endothelin-

1含量増加を招き肥厚性血管病変を増悪するが、これらの変化とaldose reductaseとの関わりについて本年度は検討した。10週齢の日本白色在来種雄性ウサギを以下に示す4群に分け各種実験に供した。第1群:正常血糖群+生理食塩水第3群:Alloxan誘発高血糖群+生理食塩水Alloxanまたは生理食塩水1回静注11週後にARIを飲料水として投与を開始した。1週後、右頸動脈の内皮細胞剥離術を施行した。さらに、4週経過後、全動物を屠殺し、以下に示すparametersについて4群間で比較した。(1)内膜肥厚の程度(Intima/Meda ratio)、(2)頸動脈における内皮依存性cGMP産生、(3)頸動脈内皮細胞中L-arginine/(L-NMMA+ADMA)ratio、(4)頸動脈壁endothelin-1含量、(5)腹部大動脈内皮細胞中AR活性ならびにsorbitol含量。その結果、以下のことが明らかにされた。(1)内皮細胞剥離後惹起される内膜肥厚は高血糖によって増悪したが、ARIによって著明に抑制された。(2)肥厚血管での内皮依存性cGMP産生減少が高血糖によって促進されたが、ARIはこの促進を阻止する傾向を示した。(3)肥厚血管内皮細胞中L-arginine/(L-NMMA+ADMA)ratioの低下は高血糖によって促進され、ARIはこの促進を阻止した。(4)肥厚血管壁中endothelin-1含量蓄積は高血糖によって促進されたが、ARIはこの促進に対して抑制傾向を示した。(5)腹部大動脈内皮細胞中sorbitol含量は高血糖によって著明に増加したが、ARIによって正常値以下に低下していた。一方、AR活性には4群間で差はなかった。アロキサン(100mg/kg)一回静注12週後の高血糖ウサギと同容量の生食のみを静注した週齢の一致した対照ウサギとを用い、一側総頸動脈に内皮剥離術を施行した。4週経過後にウサギを屠殺し、以下の実験に供した。なお、アルドース還元酵素の選択的阻害剤であるフィダレスタットの影響を観察する場合には内皮剥離術施行1週前から4週後にわたる5週間、飲料水に混ぜて投与した(3mg/kg/220ml//day)。内皮剥離術施行4週後には明らかな内膜肥厚が観察され、この内膜肥厚は高血糖によって有意に増悪した。この増悪は再生内皮細胞中NOS阻害因子の蓄積促進、再生内皮細胞によるNO産生低下亢進ならびに血管壁エンドセリンの蓄積促進を伴っていた。また、腹部大動脈内皮細胞中ソルビトール含量は高血糖群において著明に増加していた。これら高血糖に伴う変化は何れもアルドース還元酵素の選択的阻害剤であるフィダレスタットによって抑制された。以上の事実から、アロキサン誘発高血糖ウサギでの内膜肥厚増悪にポリオール経路活性化の関与が示唆された。
TGF-βファミリーシグナル系による血管内皮細胞活性化制御機構の解明

血管内皮細胞は、HLHタンパク質であるId1またはHerp2により血管新生の指標となる細胞遊走能をそれぞれ促進または抑制することをすでに見出していた。そこで、酵母two hybrid法により、Id1またはHerp2に結合し、Id1またはHerp2の機能制御を行うタンパク質の単離を試みた。その結果、約20個の陽性コロニーを得た。得られた約20個の遺伝子の全長を用いてCOS細胞でId1またはHerp2と結合する分子を選択したところ、E2-2、Id2、CGI-128、FHL2、FLJ13861がId1またはHerp2と結合することを認めた。そこで、まずE2-2に着目し、これまで私達が血管新生を制御している転写因子群として注目していたId1、Herp2、LMO2、SCL、E2Aに対する結合能の違いをCOS細胞で検討したところ、E2-2は、Id1、SCL及びE2Aとヘテロ複合体を形成すること、さらにE2-2自身ホモ二量体を形成することを明らかとした。また、E2-2によって活性化されるプロモーターを用いて、E2-2に対するId1とSCLの影響を調べてところ、Id1及びSCLは共に、E2-2で活性化されるプロモーター活性を抑制することを明らかにした。Id1のパートナーとして単離したE2-2が血管内皮細胞活性化作用を持つId1と異なり血管内皮細胞の活性化を抑制していることを血管内皮細胞の増殖アッセイや管腔形成法により、認めている。このE2-2の作用機序として、血管内皮細胞活性化時に発現が上昇することの知られているVEGFRの発現を転写レベル抑制し、Id1がそれに拮抗して働いていることをルシフェラーゼレポーターを用いたアッセイにより明らかにした。TGF-βI型常用体(ALK5)の点変異導入ノックインマウスの作製を試みた。このマウスは、TGF-β/ALK5/Smad2,3シグナル伝達系が全く伝達されず、TGF-β/ALK1/Smad1,5,8シグナル系のみが伝達されることにより、胎仔期での血管形成がALK5ノックアウトより改善されると期待された。得られた、ALK5ノックインマウスは、胎生10.5日頃に死んでしまうことがわかった。ALK5ノックインマウスの胎仔羊膜上に血管形成が全く起こっておらず、そのため血液が胎仔内に流れず、致死に至ると考えられた。この表現系は、ALK5ノックアウトマウスと類似していた。一方、胎盤におけるラビリンス形成において、ALK5ノックインマウスは、野生型マウスと同様に血管形成が行われていたが、ALK5ノックアウトマウスの胎盤では、ラビリンス形成異常が認められた。血管内皮細胞は、HLHタンパク質であるId

1またはHerp2により血管新生の指標となる細胞遊走能をそれぞれ促進または抑制することをすでに見出していた。そこで、酵母two hybrid法により、Id1またはHerp2に結合し、Id1またはHerp2の機能制御を行うタンパク質の単離を試みた。その結果、約20個の陽性コロニーを得た。それぞれの陽性コロニーからcDNAを同定さらには、全長をRT-PCR法により単離した。得られた約20個の遺伝子の全長を用いてCOS細胞でId1またはHerp2と結合する分子を選択したところ、E2-2、Id2、CGI-128、FHL2、FLJ12361がId1またはHerp2と結合することを認めた。そこで、まずE2-2に着目し、これまで私達が血管新生を制御している転写因子群として注目していたId1、Herp2、LMO2、SCL、E2Aに対する結合能の違いをCOS細胞で検討したところ、E2-2は、Id1、SCL及びE2Aとヘテロ複合体を形成すること、さらにE2-2自身ホモ二量体を形成することを明らかとした。また、E2-2によって活性化されるプロモーターを用いて、E2-2に対するId1とSCLの影響を調べてところ、Id1及びSCLは共に、E2-2で活性化されるプロモーター活性を抑制することを明らかにした。現在、E2-2の血管内皮細胞での機能を検討する目的で、アデノウイルスベクターにE2-2やそのパートナーの遺伝子を組み込み、及びウイルスの増幅を行っている。TGF-βI型常用体(ALK5)の点変異導入ノックインマウスの作製を試みた。このマウスは、TGF-β/ALK5/Smad2,3シグナル伝達系が全く伝達されず、TGF-β/ALK1/Smad1,5,8シグナル系のみが伝達されることにより、胎仔期での血管形成がALK5ノックアウトより改善されると期待された。得られた、ALK5ノックインマウスは、胎生10.5日頃に死んでしまうことがわかった。ALK5ノックインマウスの胎仔羊膜上に血管形成が全く起こっておらず、そのため血液が胎仔内に流れず、致死に至ると考えられた。この表現系は、ALK5ノックアウトマウスと類似していた。一方、胎盤におけるラビリンス形成において、ALK5ノックインマウスは、野生型マウスと同様に血管形成が行われていたが、ALK5ノックアウトマウスの胎盤では、ラビリンス形成異常が認められた。現在、この形成異常に関して、詳細な検討を行っている。血管内皮細胞の活性化は、Id1やHerp2等のhelix-loop-helix(HLH)型転写因子によって調節されていることを申請者は、明らかにしてきた。しかしながら、Id1やHerp2が他のどのような分子と相互作用して、血管内皮細胞活性化を制御しているかについては、未だ不明であった。申請者は、Id1のパートナーとして単離したE2-2が血管内皮細胞活性化作用を持つIdlと異なり血管内皮細胞の活性化を抑制していることを血管内皮細胞の増殖アッセイや管腔形成法により、認めている。このE2-2の作用機序として、血管内皮細胞活性化時に発現が上昇することの知られているVEGFRの発現を転写レベル抑制し、Idlがそれに拮抗して働いていることをルシフェラーゼレポーターを用いたアッセイにより明らかにした。さらにHerp2と結合する因子としてyeast two hybrid法により単離した機能未知のCGI-128が、培養細胞を用いた研究により、Id1やE2-2に強く結合することを見出した。
分子進化情報を活用した耐性化の可能性が低い新たな感染制御法の確立

現在、薬剤耐性菌の増加などにより、感染症治療の選択肢が狭まっている。本研究では、細菌の進化過程を解析し、それを活用した、薬剤標的の新たな探索手法の確立を目指す。まず、病原細菌のゲノム情報から進化上で変異が制限された分子を統計的に同定する。次に当該遺伝子群の欠失株を作製し、マウス感染モデルにて病原性への影響を評価する。感染モデルにおいては、病原性とともに、宿主と病原体それぞれについて、遺伝子応答とサイトカイン応答を網羅的に解析する。得られた結果から、阻害剤やRNAi技術を用いた、感染による過剰な炎症応答の制御法を検討する。
酸化還元酵素の立体構造に基づく触媒機構の網羅的解析及び分類法の開発

酸化還元反応は、他の反応に比べて解析が難しい。非酸化還元反応である加水分解反応、転移反応、異性化反応などは、活性部位の共有結合の立体化学の変化などから推定可能である。しかしながら、電子の動き、酸化還元電位は、立体構造情報だけでは観ることが出来ないからである。従って、立体構造情報のみでは、反応を比較、分類することが極めて難しい。分光学的な知見(ラマン、IR、EPRなど)や理論計算(量子化学計算)などの結果、議論なども重要な要素となると考えられる。本研究課題では、酸化還元反応を下記のように、場合分けすることによって、関連酵素の立体構造や反応の解析・分類を進めた。1.電子伝達反応(Electron transfer)、2.ヒドリド移動反応(Hydride transfer):電子伝達反応にプロトン移動が伴う反応で、NAD等のニコチンアミドを持つ化合物やFAD等のフラビン化合物が関与している。3.酸素化反応(Oxygenation):O2などが関与している。4.水素活性化反応(Hydrogen-activation):H2が生成する反応、もしくはその逆反応である。本研究課題では、特に電子伝達反応に重点を置いて解析を進め、電子伝達反応に関与する電子伝達蛋白質の解析・分類も行った。酸化還元反応の種類とその反応に関与する補因子とに相関性が観られると考えられる。今後、更にこの相関性に注目して解析を進める必要があると考えられる。また、多くの酸化還元酵素の反応は複数の酸化還元反応が混在しており、更に、非酸化還元反応も含まれていることもあるので、それらの複合的反応を分割して解析する必要があることも判明した。酸化還元酵素が触媒する反応は、電子移動反応(Electron transfer)、水素化物イオン移動反応(Hydride transfer)、酸素化反応(Oxygenation)等に大別できる。平成17年度は、酸化還元酵素の大部分を占める水素化物イオン移動反応の触媒機構について、文献情報や蛋白質立体構造等のデータベースに基づき、系統的な解析を行った。水素化物イオン移動反応を触媒する酵素では、基質と酵素側でのプロトンの移動を伴うことが多い。また、水素化物イオン移動反応により酸化される基質はCH-XH(-XH:-OH,-CH,-NH)などが含まれる。水素化物イオン移動反応では、反応機構について、次のように分類できた:(A)プロトン移動と共役しない反応;(1)触媒残基共有結合型、(2)電荷リレー型、(3)プロトンポンプ型、(B)プロトン移動と共役した反応;(1)酸塩基触媒型、(2)プロトン・リレー型多くの反応では、基質と補酵素間のエネルギー差だけでなく、プロトン移動による配向の変化が重要であることが示唆された。プロトン移動に共役した反応では酸塩基の役割をするチロシン、ヒスチジン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システインなどプロトン・リレーの役割をする触媒残基、または亜鉛などの金属イオン(ルイス酸)が酵素に共通して存在することが判明した。他方で、プロトン移動と共役しない反応では、共有結合に関与する残基、電荷リレーの働きをする残基、またはプロトン・ポンプのような構造変化により酵素反応が触媒されることが判明した。量子化学手法との融合のために、(1)立体構造データをフラグメント分子軌道法プログラム(FMO)の入力データへ変換し、(2)FMO計算出力データから任意の情報を抽出し、(3)得られた情報を統合し、複数の蛋白質間の活性部位での電子状態を網羅的に比較・解析するシステムを開発した。平成18年度は、電子移動反応(Electron transfer)の触媒機構について、文献情報や蛋白質立体構造等のデータベースに基づき、系統的な解析・分類を行った。

電子移動反応を触媒する酵素では、電子の受け渡しをする補酵素を複数持つ場合が多い。これらの補酵素の種類を解析すると、鉄、銅などの無機系の補酵素、炭素・窒素原子を含む有機化合物で構成される補酵素(FAD、FMN等)、無機物と有機物の両方で構成される補酵素(ヘム等)など、3種類に大別できる。電子移動反応では、反応機構は次のように大別できた。(A)共有結合を形成せず、蛋白質・補酵素を媒体として電子が移動する;主に、無機系の補酵素が関与(B)システイン残基のジスルフィド基のように、共有結合を介し電子が移動する;有機系の補酵素やシステインが関与加水分解・転移反応の場合、触媒残基・補酵素とそれらの標的となる因子を同定することにより、複雑な触媒機構を記述・比較できることを研究代表者・長野は見出している(Proteins,66,147-159(2007))。(B)の場合、加水分解・転移反応と同様に、求核基や塩基などが存在するので、こうした触媒因子を同定する必要があることが判明した。それに対し、(A)の場合は、媒体となるアミノ酸残基や補酵素の原子種等を記述すれば良いことが判明した。これまでの解析結果では、親水性アミノ酸残基よりも疎水性アミノ酸残基が頻繁に媒体となっていることが判明した。電子移動反応のデータは下記のサイトで公開を開始している。酸化還元酵素は、電子伝達(Electron transfer)、ヒドリド転移反応(Hydride transfer)、酸素化反応(Oxygenation)、水素化反応(Hydrogenation)など、様々な酸化還元反応を担う酵素である。特に、電子伝達反応を担う酸化還元酵素の場合、シトクロム系蛋白質など、電子伝達蛋白質を基質・産物として、相互作用し、電子伝達反応を担っている。こうした電子伝達蛋白質には、活性中心に電子の授受をする補酵素やアミノ酸残基が存在している。フェレドキシンの場合、鉄硫黄系の補酵素を結合し、フラボドキシンの場合は、FMNのようなフラビン化合物を結合している。チオレドキシンの場合は、2個のシステイン残基が近接しており、酸化状態では、ジスルフィド結合を形成する。ヘムを結合する電子伝達蛋白質としては、所謂、シトクロム系の蛋白質がある。シトクロム系の蛋白質は、現在のように立体構造データが解かれる以前に、結合しているヘム化合物の種類や分光学的な手法で分類がなされており、シトクロムa、シトクロムb、シトクロムcというように、大別されていた。しかしながら、近年、こうした蛋白質の立体構造が解かれると共に、同じシトクロム群の蛋白質でも、様々なスーパーファミリー、フォールドに属しており、ドメイン構成が異なることも分かってきた。そこで、平成19年度では、こうした電子伝達蛋白質を活性中心の種類や立体構造の観点から系統的に解析・分類を行った。更に、電子伝達蛋白質と酸化還元酵素との相互作用の様式についても解析を行った。
石油系炭化水素化合物の陰イオン界面活性剤による可溶化モデルの構築

^<14>Cでラベルしたphenanthrene(ph)を用い、2種類の炭化水素化合物の溶解試験を行った結果、anthratheneがphの溶解度に影響することが明かとなった。それ以外の組み合わせでは、phは溶解したnaphtallene、pyrene(py)、benzo-pyreneによっては影響を受けなかった。非常に親水性の高い1-naphtholを含む系では、phとpyの溶解性が高められることも明らかとなった。疎水性が非常に高い4種類の炭化水素(fluorene(fl)、ph、fluoranthene(ft)、py)のミセル内部での溶解に関して、それぞれの炭化水素化合物間でどのような相互作用が見られるかについて詳細な実験研究を行った。唯一、flはphを含む場合に競合作用によって大きな影響を受けた。phについては、溶解に与える阻害効果はflを含む場合にのみ観察された。これらの結果は、これら二つの炭化水素化合物はミセル中の同様な場所で競合することを示している。しかしながら、ftとpyは、競合する影響をいずれも比較的受け難った。両者は類似した特性を有しているにも係わらず、お互いには競合しなかった。疎水性の高い炭化水素化合物の溶解性に関する応答は、4つのクラスターに分類できた。最初のクラスターはpy、ft、py+ftのグループで、溶解性が競合によって低下する。第二のクラスターは、phを共通して含むもの、第三のクラスターはflを共通して含むものである。これらのクラスターでは、第一のクラスターのように、競合によって溶解性が影響をあまり受けなかった。第四のクラスターは、phとflの両方を含む場合である。phとflは、py、ftよりも溶解度の決定に大きな影響を及ぼす。炭化水素化合物の種類が増加すると、溶解する炭化水素の全重量や容量も増加する。この傾向はLangumurian patternにより表現できた。実際の多種類の炭化水素化合物に汚染された土壌の浄化において、得られた知見は炭化水化合物の溶解性を予測する上で重要となる。陰イオン界面活性剤溶液中におけるPhenanthreneの溶解能の定量化の為の研究方法が開発された。放射表示されたPhenanthreneを使い、界面活性剤C16-DPDSの濃度上昇に伴う水に溶けにくい炭化水素の水への溶解度の増加を効果的に測定した。安定状態は主として46日間の継続した振蕩によって不変の反応から決定された。この方法によりモル溶解比(MSR)は0.0983、またミセル-水間の分配係数(logKm)は5.94と決定された-これは論文に示す。放射表示されたPhenanthreneのみを使うことにより、他の炭化水素によるPhenanthreneの反応への影響を研究することができた。3つの非常に疎水性の高い炭化水素(Anthracene,Pyrene,Benzo(a)Pyrene)はPhenanthreneの溶解性に大きな効果をもたらさなかった。今回の結果より。早過ぎるかもしれないが、界面活性剤ミセルは比較的高いモル溶解性があり、個々の炭化水素構成要素はお互いに影響しないだろうということが示された。研究は放射表示されたPhenanthreneと複合的に組み合わせた炭化水素と、適度に疎水性の炭化水素であるNaphthaleneを使用して続けられる。次の研究は従来の(放射表示されていない)方法で(HPLCを用いて)決まった界面活性剤濃度における炭化水素のそれぞれの構成要素を定量化により1つの典型モデルを作ることを必要とする。

モデル開発に必要な統合データベース開発の為同様の個々の構成要素システムを作ることが要求される。疎水性が非常に高い4種類の炭化水素(fluorene(fl)、phenanthrene(ph)、fluoranthene(ft)、pyrene(py))のミセル内部での溶解に関して、それぞれの炭化水素化合物間でどのような相互作用が見られるかについて詳細な実験研究を行った。唯一、flはphを含む場合に競合作用によって大きな影響を受けた。phについては、溶解に与える阻害効果はflを含む場合にのみ観察された。これらの結果は、これら二つの炭化水素化合物はミセル中の同様な場所で競合することを示している。しかしながら、ftとpyは、競合する影響をいずれも比較的受け難った。両者は類似した特性を有しているにも係わらず、お互いには競合しなかった。疎水性の高い炭化水素化合物の溶解性に関する応答は、4つのクラスターに分類できた。最初のクラスターはpy、ft、py+ftのグループで、溶解性が競合によって低下する。第二のクラスターは、phを共通して含むもの、第三のクラスターはflを共通して含むものである。これらのクラスターでは、第一のクラスターのように、競合によって溶解性が影響をあまり受けなかった。第四のクラスターは、phとflの両方を含む場合である。phとflは、py、ftよりも溶解度の決定に大きな影響を及ぼす。炭化水素化合物の種類が増加すると、溶解する炭化水素の全重量や容量も増加する。この傾向はLangumurian patternにより表現できた。実際の多種類の炭化水素化合物に汚染された土壌の浄化において、得られた知見は炭化水素化合物の溶解性を予測する上で重要となる。
新しい作用機序を有する新規抗血小板薬の開発を目指した研究

心筋梗塞及び脳梗塞を代表とする虚血性循環障害には血栓形成が関与しており、その治療及び予防には抗血小板薬が用いられている。しかし、それら薬物の効果は十分であるとは言い難いため、私はコラーゲンと血小板に着目し、新たな作用機序を有する薬物の開発を試みている。昨年度までに、コラーゲン受容体GPVIを介した血小板活性化をピペロングミンが抑制すること、またピペロングミンはイノシトールリン脂質水解反応の上流に作用して血小板凝集を抑制することを明らかにした。そこで今年度は、ピペロングミンの抑制作用メカニズムを詳細に検討した。GPVIを介したイノシトールリン脂質水解反応は、SykによるホスホリパーゼCγ_2のリン酸化によって惹起されるため、その作用に対するピペロングミンの作用を検討した結果、ピペロングミンはGPVIアゴニストCRP誘発性のSykリン酸化を濃度依存的に抑制した。Sykの活性化はマイクロドメインである脂質ラフトを足場にして行われるため、脂質ラフト形成に対するピペロングミンの作用を検討した結果、ピペロングミンは脂質ラフトには影響を与えなかった。GPVIを介したSykリン酸化にはSrcキナーゼファミリーが重要な役割を担っていることから、Srcキナーゼ阻害薬PP2とピペロングミンの比較検討を行った。その結果、ピペロングミンの作用はPP2によるSrc阻害とも異なる可能性が示唆された。ピペロングミンのGPVIに対する直接の作用を受容体結合実験で検討するため、GPVIを認識する標識体CRPの作製を試みた。ペプチドであるCRPに蛍光物質であるFAM及びビオチンを用いて標識体CRPの作製を試みたが、いずれの標識体CRPも作製することができなかった。今後は、ラジオアイソトープを用いるなどして、標識体CRPを作製し、受容体結合実験を行いたいと考えている。心筋梗塞及び脳梗塞を代表とする虚血性循環障害には血栓形成が関与しており、その治療及び予防には抗血小板薬などが用いられているが、それら薬物の効果が十分であるとは言い難い。そこで私はコラーゲンと血小板に着目し、新たな作用機序を有する薬物の開発を試みている。ピペロングミンがコラーゲン誘発性血小板凝集を抑制することが示唆されているため、現在、その抑制作用機序の解明を目的に検討を行っている。今年度、コラーゲン誘発性血小板凝集の経路に特異的な分子であるcPLA_2及びPLC_<γ2>に対するピペロングミンの作用をウサギ洗浄血小板を用いて検討した。その結果、ピペロングミンはコラーゲン誘発性のcPLA_2活性化及びイノシトールリン脂質水解反応を抑制することが明らかになった。また、コラーゲンの受容体Glycoprotein VI(GPVI)の選択的なアゴニストConvulxin(Cvx)を用いて、Cvx誘発性血小板凝集に対するピペロングミンの作用を検討した結果、Cvx刺激によって惹起された血小板凝集をコラーゲン誘発性血小板凝集と同程度にピペロングミンは抑制することが明らかになった。また、Cvx誘発性イノシトールリン脂質水解反応に対するピペロングミンの作用も検討した結果、ピペロングミンはそれも濃度依存的に抑制することが明らかになった。従って、ピペロングミンはGPVIを介した情報伝達経路のイノシトールリン脂質水解反応の上流に作用して血小板凝集を抑制することが示唆された。さらに、ピペロングミンの有効性を評価するために、ヒト洗浄血小板に対する作用を検討した。その結果、ピペロングミンはコラーゲン及びCvx誘発性のヒト洗浄血小板凝集を濃度依存的に抑制することが明らかになった。本研究成果は、ピペロングミンをリードとした新規抗血小板薬の開発、虚血性循環障害の新たな治療及び予防に繋がると考えられる。
中国における義務教育段階の「公立学校間協力」改革に関する実証的研究

本研究は中国における義務教育段階の「公立学校間協力」改革の社会的意味、その改革の変遷、そして異なった地区間でいかなる多様性が見られるかについて、都市部および農村部の政策と事例を踏まえて実証的に明らかにすることを目指した社会学的研究である。また、改革の背後に存在する複雑な社会関係を明らかにすることを通じて、欧米の事例とは異なる文脈から、「学校間協力」の可能性に対して新たな視点を加える。それらの成果を踏まえ、人口減少と格差拡大に直面する日本の公教育においても、より効果的な「質の高い学校づくり」を検討するうえで参照し得る示唆を提示する。
PSDとスパインの構造・機能連関

興奮性シナプスはシナプス後部側の細胞質構造として、樹状突起スパインとシナプス後肥厚部(PSD)を持つ。この二つの構造は興奮性シナプスの機能発現において重要である。生体内でのシナプス発達過程においてスパインとPSDがどのように形成され、また両者の形成過程にどのような関連があるのか、その詳細は明らかになっていない。本研究ではフィロポディアの形成、スパインの発達とPSDの動態を同時に個体内で観察することを目的とした。まず子宮内電気穿孔法を利用して蛍光蛋白質標識されたPSD分子を大脳皮質錐体細胞に発現させる系について検討し、PSD-95に比較して単一PSDからの蛍光シグナルが強いGFP-Homerlcをin vivo観察用の蛍光プローブとして選択した。GFP-Homer1cは培養細胞での分布と同様に細胞体と樹状突起に局在しクラスターを形成した。さらに成熟したマウス個体の大脳皮質ではGFP-Homer1cはスパインの頭部に局在した。以上の分布様式から、GFP-Homer1cはPSDの存在部位を示す蛍光プローブとして利用できることを確認した。次にGFP-Homer1c分子の大脳皮質錐体細胞の発達過程における変化を解析する目的で、GFP-Homer1c分子とDsRed分子を大脳皮質で発現させた幼弱なマウス(生後1-2週間)を対象として、両者の蛍光の同時励起を二光子顕微鏡により行った。大脳皮質浅層の6時間程度のタイムラプス画像を取得し、樹状突起から形成されるフィロポディア・スパイン構造を同定し、このような新規のフィロポディア・スパインにほぼ同時にGFP-Homer1c分子が集積することを確認した。PSDの集積のダイナミクスに関する結果は、我々が以前分散培養系で観察したスパインシナプス形成の時系列データに一致するものであり、個体レベルでもフィロポディアの樹状突起からの伸長が興奮性シナプス形成の初期段階であることが示された。興奮性シナプスはシナプス後部側の細胞質構造として、樹状突起スパインとシナプス後肥厚部(postsynaptic density : PSD)を持つ。PSDはシナプス後部膜への受容体の集積に必須の構造であり、スパインはその構造の変化がシナプス可塑性の制御に重要と考えられている。フィロポディア・スパインの形成とPSD構造の発達の間には、少なくとも培養細胞系では時間的な関連性があり、このような関連性を生体内で検証することが極めて重要である。本研究ではフィロポディアの形成、スパインの発達とPSDの動態を同時に個体内で観察することを目的として以下の実験を行った。1.子宮内電気穿孔法を利用して蛍光蛋白質標識されたPSD分子を大脳皮質錐体細胞に発現させた。GFPで標識されたHomerlc分子は分散培養系およびスライス培養系において、シナプス後部構造に対する信頼性の高い蛍光プローブとして機能することは確認済みである。GFP-Homerlcを発現する幼弱な神経細胞は正常に皮質内を移動して大脳皮質2-3層に達し、そこで正常に分化して樹状突起を形成した。2.上記のGFP-Homerlcを大脳皮質錐体細胞で発現するマウス個体を利用して、二光子顕微鏡によるin vivo imagingを行った。トランスジェニックマウスでGFPを錐体細胞に発現させた場合と比較して、子宮内電気穿孔法を利用した遺伝子発現ではイメージングの際の解像度が低下し、個々のスパインの形態が観察しにくいという問題点があることが明らかとなった。観察可能なスパインについて、その内部へのGFP-Homerlcの蓄積量を測定し、またin vivoで蛍光消退法(FRAP法)を用いて局所での蛋白分子のターンオーバーの速さを検討した。

大脳皮質浅層の6時間程度のタイムラプス画像を取得し、樹状突起から形成されるフィロポディア・スパイン構造を同定し、このような新規のフィロポディア・スパインにほぼ同時にGFP-Homer1c分子が集積することを確認した。PSDの集積のダイナミクスに関する結果は、我々が以前分散培養系で観察したスパインシナプス形成の時系列データに一致するものであり、個体レベルでもフィロポディアの樹状突起からの伸長が興奮性シナプス形成の初期段階であることが示された。