hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフト&ウェットな眼球ロボットの創成

本研究では、進展の著しい高強度・高機能性ゲルの技術によってものづくりに変革をもたらすことを最終目的として、眼球の画期的な治療につながる世界初のソフト&ウェットな眼球ロボットを開発する。眼球は光を操る生体ゲルであり、ゲルでできたロボットであると捉えることができる。本研究は、これまでの申請者の研究成果に立脚し、(1)高強度ゲルの技術を活かして水晶体の治療に適用可能な焦点調節可能な眼内レンズを開発し、(2)次に材料化学的なアプローチで眼内レンズ用ゲル材料の屈折率や作動温度を最適化し、(3)ゲルの構造解析と物性評価の技術や機械工学的なアプローチを駆使して新しい眼内レンズを組み込んだ、実物大のソフト&ウェットな模型眼システムを開発することを最終目標とした。平成27年度は下記を実施した。5)屈折率可変ゲルの開発:屈折率の異なるゲルの開発に成功した。6)温度制御ゲルの開発:温度によって力学物性が変化するゲルの開発を行い、転移温度を060°Cの範囲で変化させられることが示された。7)レンズの温度制御:温度制御可能なゲルでレンズを作製し、レンズに送液する液体の温度を可変させることで、形状を保持したり、元の形に戻ったりするレンズ系を開発した。8)ゲルレンズ評価用模型眼の開発:7)で示した温度で変化するゲルが模型眼の中で戻る様子を確認した。9)ゲルレンズを組み込んだ模型眼の外部制御:変形するレンズを作成し、外部制御によりレンズの焦点距離を変えられることを示すことに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、これまでの申請者の研究成果に立脚し、高強度ゲルの技術を活かして水晶体の治療に適用可能な焦点調節可能な眼内レンズを開発し、次に材料化学的なアプローチで眼内レンズ用ゲル材料の屈折率や作動温度を最適化し、ゲルの構造解析と物性評価の技術や機械工学的なアプローチを駆使して新しい眼内レンズを組み込んだ、実物大のソフト&ウェットな模型眼システムを開発する。平成25年度は下記を実施した。1.焦点調整型レンズの設計2.レンズ用ゲルの開発3.焦点調整系の開発4.変形するゲル水晶体による焦点可変実験本研究では、進展の著しい高強度・高機能性ゲルの技術によってものづくりに変革をもたらすことを最終目的として、眼球の画期的な治療につながる世界初のソフト&ウェットな眼球ロボットを開発する。研究実績の概要の各項に関して、下記の事項を達成した。1.焦点調整型レンズの設計:透明で柔軟なゲル材料をレンズとして用いることを想定して、ヒトの水晶体のサイズに近い、焦点調整型の小型レンズを設計した。2.レンズ用ゲルの開発:屈折率が高くなると予想されるモノマーを選び、屈折率が1.4以上のレンズの材料として利用可能なゲルを開発した。3.焦点調整系の開発:1.の設計に基づき、レンズを装着するためのパーツを作製した。アクリル板の削り出しでレンズホルダーを作製し、液体の排出と吸入で、レンズの厚みを可逆的に変化できるようにした。4.変形するゲル水晶体による焦点可変実験:上記の1.3.の成果に基づき、実際に変形するレンズを組み立て、焦点が可変し、遠近を見ることができるかどうかを評価した。具体的にはレーザー光の屈折の確認を行った。この間、雑誌論文(査読付論文)3件、招待講演1件、国際学会発表4件、国内学会発表8件を行い、外部に成果を公表した。5.屈折率可変ゲルの開発水中で高い屈折率を持つゲルが、水中で働く変形レンズには必須の材料ではあるが、実際に精密に焦点調整等を行うことを想定すれば異なる屈折率をもつバラエティに富んだ透明ゲル材料が必要である。

そこで昨年度に開発した高屈折率ゲルについて、屈折率を徐々に小さくする方法を検討する。6.温度制御ゲルの開発前項5.が上手く行き始めたら、今度は温度によって力学物性が変化するゲルの開発に着手する。これまでの研究成果から、透明な形状記憶ゲル(SMG)を開発できることがわかっており、このSMGをレンズ材料に直接適用することを検討する。通常、われわれは60°C近傍で内部構造の転移が生じ、やわらかさが変化するSMGを用いているが、組成によってこの転移温度を060°Cの範囲で変化させられると予想している。7.レンズの温度制御6.が上手く行ったら、温度制御可能なゲルでレンズを作製し、レンズに送液する液体の温度を可変させることで、形状を保持したり、元の形に戻ったりするレンズ系を開発する。これが成功すれば、ある種の眼球ロボットの原型が開発される。8.ゲルレンズ評価用模型眼の開発本研究で開発した焦点可変レンズを眼内レンズに用いるためには、ヒトの眼の水晶体手術に相当するモデルシステムを構築し、そのシステムの中に眼内レンズを装着し、変形動作が可能かどうかを検証する必要がある。この検証のための模型眼を設計し開発を進める。9.ゲルレンズを組み込んだ模型眼の外部制御7.と8.が上手く行ったら、温度制御可能なレンズを模型眼の内部に組み入れることで、「動く模型眼」=「眼球ロボット」と考えて、眼球ロボットの性能評価を行う。
ユダヤ民衆の言語・文化が中部ヨーロッパ社会に与えた影響

昨年度の資料収集とその分析を通して、近世のドイツ人犯罪者集団は、同じ階層に属するユダヤ人たちとの接触を通じて、後者に独特のヘブライ語表現を広範囲に吸収していることを確認した。またそれらのヘブライ語表現は、当時の一般のユダヤ人民衆の間における意味・用法とはかなり異なる。独自のものであることも確認できた。今年度は、こうした言語内容の変容が、ドイツ人犯罪者層の間でようやく生じたものなのか、あるいは彼らにヘブライ語表現が伝えられる以前すでに独自性が付与されていたのかについて確認を試みた。そのため、これらヘブライ語起源の隠語表現を、その意味ごとに整理分析した。この結果、例えばヘブライ語の数字「28」が犯罪者集団の間では「暴力」を意味するようになるなど、独自の意味内容の変容をささえる論理は、ユダヤ教独自の文化的民俗学的思考様式であることが明らかになった。すなわちこの変容は、ユダヤ教文化に育ったユダヤ人によってのみ可能なのである。これは本研究による新しい発見であると言える。ドイツ人犯罪者集団の間で隠語が成立するには、当時中欧において多くのユダヤ人が彼らの共同体から離脱し、その外部の世界で犯罪者集団を形成後、独自の言語文化を発展させたことが背景となっているのである。こうした下層ユダヤ人の独自の言語文化は、その後東欧で発展したイディッシュ語へ影響を与えるとともに、東欧系ユダヤ人の北米大陸への移住によって、現代英語にも紛れ込むようになった。OEDにイディッシュ語語源として収録されている語彙が、実はイディッシュ語そのものではなく、イディッシュ語を話すユダヤ人犯罪者の「隠語的表現」であることを確認できたことも、本研究による新しい知見であると考える。今年度は、近世のドイツ系犯罪者集団の言語を伝える警察資料や史書を中心に、ユダヤ人たちの日常語に由来すると思われる表現、すなわちヘブライ語やイディッシュ語が語源と考えられる単語、慣用的表現を拾い集めた。またれらの言葉が、一部の犯罪者集団から、一般のヨーロッパ人たちへと伝わっていった経路を中世から近世のヨーロッパ社会史、またユダヤ史資料を基に再構築を試みた。ただしこの問題については、さらに多くの資料の比較検討が必要と思われる。一方こうしたユダヤ人の言葉から形成された犯罪者集団の隠語の多くは、その本来の語源的な意味、あるいは借用もとであるユダヤ人の日常語における用法からもかなり異なっていることが確認できた。この点は、これまで欧米の研究者の間でも見過ごされてきた事実である。従ってこの事実の発見は、当研究による新しい知見であると認識している。また本研究では、こうした意味や語法の変遷、その変化の担い手についても、関連するヘブライ語やイディッシュ語の歴史的研究、さらにドイツ語方言やジプシー語資料、社会言語学文献などと比較対照することによって、ある程度明らかにする事ができたと考える。ただし、収集、また比較した資料は限られており、今回の成果を一般化し、理論としてまとめるには至っていない。ただし現時点での成果はすでに論文としてまとめてあり、適当と思われる学術雑誌に投稿する予定である。次年度以降は、すでに収集した言語資料の整理、またさらなる拡充を中心に作業を進めるとともに、社会史や社会言語学の手法による分析を継続していく予定である。
IoT社会を支えるフィジカルコンピューティング教育の教材開発と拡充に関する研究

最初に、Arduinoを用いた高専向けフィジカル・コンピューティング教育システムの最終的な拡張を行い、後期の授業「情報処理基礎」(1学年・必修)において実践・評価した。この結果、教材としては十分な内容を持ち、教育効果も更に上がったことが確認でき、このシステムの完成と判断した。4学年(後期)の選択科目「フィジカル・コンピューティング」については、前年度の研究成果を加味して同様の総合実習を行ったが、3Dプリンタの活用やAI関連テーマの採用など、飛躍的な教育効果が見られた。更に、科研研究テーマの一部拡張として、高専専攻科で活用可能な教育システムの構築を目的として、低価格マイコンを複数台利用した、並列プログラミング教育システムを製作した。もう一つの科研研究テーマの一部拡張として、フィジカルコンピューティングを実際の社会に活用するためのシステム構築を行う必要性に迫られ、農園(圃場)における各種気象データ等の収集・管理・制御システムの設計を行った。これは、これまでに研究してきたArduinoやRaspberry Piを総合的に連携することで、非常にローコストで高性能なものが構築可能であるため、次年度での研究継続を行うこととしたい。次に、前年度構築を開始したmicro:bitを用いた小学校向けフィジカルコンピューティング教育システムについて、カリキュラムと教材を整備し、実際に地域での小学生向けのプログラミング講座において、講習実践と評価を行い、予想以上の良好な結果が得られた。当初の研究実施計画にあったフォグサーバとクラウドサーバの開発の代わりに小学校でのプログラミング教育のための教材開発という新たなテーマを設定して研究を行ってきたが、教材作成と講習会での実施ができた。しかし、これらの評価作業が遅れているため、次年度への課題としたい。また、科研費課題に関連した新たな拡充テーマを設定して研究を行ってきた。これらは、大学や高専専攻科でのフィジカルコンピューティング教育システムの構築と、農園IoT制御システムであるが、次年度も継続して研究を行っていきたい。学会発表に関しては、前年度同様、国内学会での発表(3件)は行ったが国際学会レベルでの発表は未実施のため、次年度に発表を行いたい。進捗状況の項目にも記したように、大学や高専専攻科でのフィジカルコンピューティング教育システムと農園IoT制御システムの2つのシステム開発を新たな研究テーマとして拡充して研究を継続して行きたい。更に、AI(人工知能)に関連する教育システムについても社会的な要請が強まっていることもあり、その開発も次年度での目標としたい。最初に、前回科研費にて開発してきた、Arduinoを用いた高専向けフィジカル・コンピューティング教育システムの拡張を行った。これを後期の授業「情報処理基礎」(1学年・必修)において実践・評価した。次に、4学年(後期)の選択科目「フィジカル・コンピューティング」のカリキュラム編成とRaspberryPiを用いた総合実習のための教材作成を行った。そして実際に授業実践と評価を行い、良好な結果が得られた。さらに、この総合実習のテーマ設定に参考となるデモ教材の開発・製作を二点行った。一つは「2つのサーボモータによるルービックキューブ求解・実技ロボット」であり、ArduinoとRaspberryPiの2台のマイコン連携と画像認識の教育を目的とする。もう一点は,「RasPi Zeroを用いた問題画像入力カメラ付き数独求解・表示システム」であり、画像認識とクラウド連携が目的である。以上により、これまで6年間に渡って行ってきた高専向けのフィジカル・コンピューティング教育システムに関しては、Arduinoによる基礎教育システム(低学年向け)とRaspberryPiによる応用教育システム(高学年向け)の双方を完成できた。次に、今回の科研費の研究目的である、IoT社会に立脚したネットワーク教育システムの開発に移行し、最初の研究実施計画事項である、IoTデバイスの選定を行った。市販のIoTデバイスを数点購入し、教育のしやすさ、教育効果、コストパフォーマンスなどの観点から比較を行った。結果的に英BBCのmicro:bitを選定して、小中学校向けのカリキュラムや教材作成を開始した。さらに、2020年度に予定されている、小学校でのプログラミング教育の必修化に着目し、このために開発されている製品を展示会等で比較評価した。研究実施計画は4つの計画を行っていたが、そのうち半分程度しか進行できていないため。前半の計画であるArduinoによる教材の見直しは行ったが、小学生向けの教材作成については進行中である。後半の計画では、IoTデバイスの評価・選定とノード基板の製作であったが、選定までが完了した。ただ、その後に新しいデバイスが登場したため、評価を行った結果これが最適であることがわかり、選定結果の修正を行った。学会発表に関しては、国内学会での発表は行ったが国際学会レベルでの発表は今年度以降としたい。

もう一つの科研研究テーマの一部拡張として、フィジカルコンピューティングを実際の社会に活用するためのシステム構築を行う必要性に迫られ、農園(圃場)における各種気象データ等の収集・管理・制御システムの設計を行った。これは、これまでに研究してきたArduinoやRaspberry Piを総合的に連携することで、非常にローコストで高性能なものが構築可能であるため、次年度での研究継続を行うこととしたい。次に、前年度構築を開始したmicro:bitを用いた小学校向けフィジカルコンピューティング教育システムについて、カリキュラムと教材を整備し、実際に地域での小学生向けのプログラミング講座において、講習実践と評価を行い、予想以上の良好な結果が得られた。当初の研究実施計画にあったフォグサーバとクラウドサーバの開発の代わりに小学校でのプログラミング教育のための教材開発という新たなテーマを設定して研究を行ってきたが、教材作成と講習会での実施ができた。しかし、これらの評価作業が遅れているため、次年度への課題としたい。また、科研費課題に関連した新たな拡充テーマを設定して研究を行ってきた。これらは、大学や高専専攻科でのフィジカルコンピューティング教育システムの構築と、農園IoT制御システムであるが、次年度も継続して研究を行っていきたい。学会発表に関しては、前年度同様、国内学会での発表(3件)は行ったが国際学会レベルでの発表は未実施のため、次年度に発表を行いたい。今年度の計画では、フォグサーバとクラウドサーバの開発を盛り込んでいた。しかし、2020年度に予定されている小学校でのプログラミング教育の必修化という、新たな大きな流れが発生し、これは本研究に大きな影響を及ぼすこととなった。このような状況に鑑み、今年度は小学校でのプログラミング教育に関わる教材開発を優先して行うこととしたい。さらにAI(人工知能)というキーワードに大きな注目が集まっており、この教育に関しても国を挙げて対策を講じ始めた状況も見逃せない。このために、これまで開発してきたフィジカル・コンピューティング教育教材の中にAI教材を取り込んで行くことも大きな社会的要請と考えられる。この点については最終年度での実施を目指したい。進捗状況の項目にも記したように、大学や高専専攻科でのフィジカルコンピューティング教育システムと農園IoT制御システムの2つのシステム開発を新たな研究テーマとして拡充して研究を継続して行きたい。更に、AI(人工知能)に関連する教育システムについても社会的な要請が強まっていることもあり、その開発も次年度での目標としたい。計画段階での、IoT基板の試作と発注、国際レベルの学会への出張などが次年度に持ち越されたために、次年度使用額が生じた。研究途上のため、申請時の請求内容を基に課題内容の一部改変を考慮して、次年度使用額のほぼ満額を支出予定である。
創傷治癒過程における瘢痕形成分子メカニズムに関する解析

創傷治癒における組織再生および瘢痕形成メカニズムを分子レベルで解明するために以下の実験を行った。まず、創傷治癒組織において変動する遺伝子を網羅的に検索する目的で、7週齢の雌性C57BL/6マウスの皮膚に直径5.0mmの創傷を作製し、その治癒過程8日後の組織と傷付けを行っていない皮膚からRNAを抽出し、約4,000の既知遺伝子を含むDNA micro arrayによって創傷治癒時に変動する遺伝子のプロファイリングを行った。その結果、spot intensityの比率が2以上(傷付けによって発現が2倍以上上昇、あるいは減少)変動があった遺伝子の中で発現上昇を示した遺伝子が62、減少を示した遺伝子が17であった。注目すべき結果として、成長因子であるCCN(Connective tissue growth factor, Cyr61,NOV)ファミリーのメンバーであるWnt-1-induced secreted protein 1(WISP-1)の発現上昇が挙げられた。DNA micro arrayにおける結果の再現性を検討する目的で、マウス皮膚における創傷治癒0日、2日後、8日後の組織からRNAを抽出し、WISP-1の発現をNorthern blottingにて再確認したところ、創傷治癒8日後(増殖期)に明らかな発現上昇が認められ、WISP-1の創傷治癒組織における発現上昇の再現性が確認された。マウス胎児線維芽細胞(MEF)、肺および腎臓組織においてWISP-1の発現が確認できたためマウスのWISP-1のクローニングをMEFから行った。FLAGで標識されたWISP-1遺伝子を発現ベクター(pcDNA3)へサブクローニングし、WISP-1-FLAG発現ベクターを構築した。WISP-1は分泌タンパクであるため、WISP-1を過剰発現した293細胞の培養上清を回収し、MEFをその培養液下で培養したところ、有意な細胞増殖が認められた。WISP-1はWnt/βカテニン経路によって誘導され、創傷治癒における線維芽細胞の増殖にβカテニンが関与する報告があることから、WISP-1が創傷治癒組織において線維芽細胞の増殖に関与する可能性が示唆された。創傷治癒組織において変動する遺伝子を検索する目的で、7週齢の雌性C57BL/6マウスの皮膚に直径5.0mmの創傷を作製し、その治癒過程8日後の組織と傷付けを行っていない皮膚からRNAを抽出し、約4,000の既知遺伝子を含むDNA micro arrayによって創傷治癒時に変動する遺伝子のプロファイリングを行った。注目すべき結果として、成長因子であるCCN (Connective tissue growth factor, Cyr61,NOV)ファミリーのメンバーであるWnt-1-induced secreted protein 1 (WISP-1)の発現上昇が挙げられた。平成16年度実験計画においてDNA micro arrayにおける結果の再現性を検討する目的で、マウス皮膚における創傷治癒0日、2日後、8日後の組織からRNAを抽出し、WISP-1の発現をNorthern blottingにて再確認したところ、創傷治癒8日後(増殖期)に明らかな発現上昇が認められた。WISP-1の創傷治癒組織における発現上昇の再現性が確認されたため、WISP-1のクローニング、発現ベクター(pcDNA3)へのサブクローニングを行なった。現在、テトラサイクリンによるWISP-1の発現制御が可能なベクターへのサブクローニングを行なうとともに、上皮細胞と線維芽細胞との三次元再構成培養実験系の確立を行なっている。今後、マウス線維芽細胞にテトラサイクリンで発現誘導可能なベクターを導入し、stable発現細胞株を樹立後、上皮細胞と線維芽細胞との三次元再構成培養実験系においてWISP-1を発現した場合における細胞応答について検討する予定である。一方、マウス口蓋粘膜創傷治癒実験におけるWISP-1の役割に関しても検討している。マウス口蓋粘膜創傷治癒実験はマウス口蓋に幅1.5mmの創傷を作製し、創傷治癒5日後、8日後の切片を作製した。今後、WISP-1のin-situ hybridizationを行ない、マウス口蓋粘膜におけるWISP-1の発現様相を検討する予定である。

マウス胎児線維芽細胞(MEF)、肺および腎臓組織においてWISP-1の発現が確認できたためマウスのWISP-1のクローニングをMEFから行った。FLAGで標識されたWISP-1遺伝子を発現ベクター(pcDNA3)へサブクローニングし、WISP-1-FLAG発現ベクターを構築した。WISP-1は分泌タンパクであるため、WISP-1を過剰発現した293細胞の培養上清を回収し、MEFをその培養液下で培養したところ、有意な細胞増殖が認められた。WISP-1はWnt/βカテニン経路によって誘導され、創傷治癒における線維芽細胞の増殖にβカテニンが関与する報告があることから、WISP-1が創傷治癒組織において線維芽細胞の増殖に関与する可能性が示唆された。
ゼニゴケの重力応答シグナリング因子の単離・解析

シロイヌナズナの重力応答に関わる遺伝子のゼニゴケオルソログの解析を行った。その結果、発現時期やパターンを同定でき、過剰発現体ではオーキシン生合成遺伝子の過剰発現体と類似した表現型が見られた。重力応答はオーキシンの偏差分布に起因する成長反応なので、この遺伝子が種を超えてオーキシンのシグナリングに関与している可能性が示唆された。また、ゼニゴケの重力応答に関わる遺伝子の変異体スクリーニングについて、仮根や生殖器の重力応答性を検討したが、同一個体でも一様な応答が見られないこと、定量化が難しいことがわかった。そこで条件検討を行い、重力に依存した明確に定量化が可能な表現型を見出すことができた。本研究では、ゼニゴケを用いて重力応答シグナルの分子メカニズムを解析することを目的としている。そのため、まず初めにゼニゴケを生育するための環境を整備する必要があった。今年度はゼニゴケが問題なく生育する条件を確立し、ゼニゴケの重力応答を解析するための条件検討を行った。青色光受容体photの変異株Mpphot変異体をコントロールに用い、光や培地の位置を変化させることによりゼニゴケ葉状体における屈性を調べると、水屈性はあまり見られず、光、重力の影響を大きく受けることが明らかとなった。さらに、我々の研究室で扱っているシロイヌナズナの重力関連遺伝子RLDの機能理解を深めるため、ゼニゴケのRLDオルソログMpRLD遺伝子のノックアウト変異体を作成した。CRISPR-CAS9のシステムを利用し、MpRLD遺伝子の2か所をターゲットにして遺伝子破壊を試みた。それぞれ20系統の選抜個体を調べた結果、1つの個所では全く塩基配列の異常は生じておらず、もう1つの方でも3系統のみ塩基に変化が生じていた。現在これら3つの系統について、発現解析および重力応答性を調べているところである。発現および重力応答が低下している個体においてはさらに相補実験を進める予定である。現在相補用のコンストラクトを作成しているところである。MpRLDの発現部位はゼニゴケの重力応答を解析する際に重要な情報であるためMpRLD promoter::GUSのコンストラクトを作製、ゼニゴケに遺伝子導入し、形質転換体を得た。このG1植物では葉状体の中央部、および連結部、仮根においてGUS活性が見られた。仮根は重力応答を示す部位であることが知られているが、葉状体では周縁部が重力屈性を生じるため予想外の結果であった。まずゼニゴケがシロイヌナズナとほぼ同じ植物実験施設で生育できることを確認した。また、形質転換には多量の胞子が必要となるが、ゼニゴケの生殖誘導には遠赤色光が必要である。遠赤色光設置により生殖器の誘導まで成功したが、胞子形成には至っていない。CRISPR-CAS9のシステムを利用しゼニゴケのRLDオルソログMpRLD遺伝子のノックアウト変異体を作成した。この結果、目的の部位で塩基配列に変化が見られたものは3系統あった。系統2では21アミノ酸の挿入、系統9では12アミノ酸欠損、1アミノ酸改変、系統8ではフレームシフトになり、stopコドンが生じると予測された。現在相補用のコンストラクトを作成しているが、これはMpRLD promoter::MpRLDCDS-Citrinの構造を持つ遺伝子であり、相補と同時にMpRLDの組織及び細胞内局在も調べることができる。また、MpRLDの発現部位をMpRLD promoter::GUS遺伝子を導入した形質転換植物で解析を行った。1週間おきにGUS染色を行い、7週間調べた。G1植物では葉状体の中央部、および連結部、仮根においてGUS活性が見られた。また若い植物体の方がGUS活性は高いことが明らかとなった。若い杯状体から取り出したばかりの無性芽ではGUS活性はなく、背腹も決定されていない。そこで、今後は無性芽において重力刺激を与えて何時間後にGUS活性が見られるか、背腹決定は何時間後に決まるのかを調べる予定である。この結果は今後の変異体スクリーニングの条件検討にも必要な情報である。以上、ゼニゴケRLD遺伝子機能解析、および変異体スクリーニングに向けて解析が進んでいる。ゼニゴケは進化上最も初期に誕生した陸上植物であり、仮根を地下へ、葉状体や生殖器を光合成や生殖に有利な上方へ成長させるという重力応答性を持つことが示唆されており、遺伝子の冗長性が低いという利点がある。一方、高等植物シロイヌナズナを用いた解析によって重力屈性に関わる遺伝子がいくつか明らかになっている。このような遺伝子群(AtRLD1-AtRLD4)のゼニゴケオルソログ遺伝子は1つで、このMpRLDをCRISPR-CAS9のシステムを利用して破壊株を作製したが、野性株と異なる表現型を持つものは得られなかった。現在はより大規模な欠損を生じる変異を導入しているところである。一方、AtRLD2の部分配列(AtRLD2_BRX)を重力感受細胞で発現させると根が上方に向かい、重力応答が逆になることが我々の研究によって明らかとなっているが、MpRLD_BRXをゼニゴケで過剰発現させるといくつかの葉状体が重なりあった表現型を示した。この表現型はオーキシン応答に関わるMpARF1の過剰発現体の形質と類似していた。さらにMpRLD全長の過剰発現体はオーキシン生合成遺伝子YUC1の過剰発現体と類似した表現型を示した。

これらの結果からMpRLD遺伝子がオーキシンの合成またはシグナル伝達に関わる可能性が示唆された。Atrld14の4重変異体はオーキシンの輸送に関わる変異体と表現型が類似しており、RLD遺伝子のオーキシンシグナリングへの関わりは種を超えて保存されていると考えられた。また、ゼニゴケの重力応答に関わる遺伝子の変異体スクリーニングについて、仮根や生殖器の重力応答性を検討したが、同一個体でも一様な応答が見られないこと、定量化が難しいことがわかった。そこで条件検討を行い、重力に依存した明確に定量化が可能な表現型を見出すことができた。シロイヌナズナの重力応答に関わる遺伝子のゼニゴケオルソログの解析を行った。その結果、発現時期やパターンを同定でき、過剰発現体ではオーキシン生合成遺伝子の過剰発現体と類似した表現型が見られた。重力応答はオーキシンの偏差分布に起因する成長反応なので、この遺伝子が種を超えてオーキシンのシグナリングに関与している可能性が示唆された。重力応答と光応答は競合する応答であり、重力応答を解析する際には光応答を排除しなければならない。しかし、そのために暗闇にするとゼニゴケは全く成長できず、光をあらゆる方向から均一にあてることは難しいという問題があった。共同研究者との議論の中で、ゼニゴケにおいて青色光は光屈性を引き起こすが、赤色光は光屈性を引き起こすことなく光合成を誘導できるという情報を得ることができた。そこで、これまで使用していた白色光の代わりに赤色LEDを使用して重力応答を調べる予定である。これが利用可能ならば、遺伝子背景がMpphot変異体でなくても光屈性の影響を排除できるので、変異体スクリーニングにも赤色光を使用すればよく、変異体単離後にMpphot遺伝子の相補をして表現型を再検討するなど複雑な過程を省略することができる。また我々の研究室では重力応答関連因子としてシロイヌナズナのDLLsおよびRLDを単離しており、これらはそれぞれCDL, BRXと呼ばれる短い配列において相互作用する。さらにCDLまたはBRXの過剰発現は重力屈性の正負を逆転させる効果があることを突き止めている。ゼニゴケにはDLLsおよびCDLと類似した配列は検出されていないが、もしシロイヌナズナのCDL配列の過剰発現がゼニゴケでも重力応答に影響すれば、ゼニゴケにも高等植物と共通の重力応答メカニズムが存在し、高等植物では重力応答に関わる因子を増加させていった可能性が考えられる。そこで、ゼニゴケにおいてCDL配列の過剰発現体を作成し、表現型を観察する。また、BRX配列の過剰発現体の表現型も解析する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子生理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
侵襲期低栄養患者に関するリスク評価及び病態解析

【視察】低栄養の病態解析のためトレーサーや間接熱量計などを用いた先進的な臨床研究を行っているUniversity of Texas Medical Branch (UTMB)に訪問・視察した。UTMBでは、臨床研究のための独自の病棟をもっており、医師・看護師などの医療スタッフなどの人的配置のみならず、食事を作るキッチンはもとより、間接熱量計、筋生検、動静脈採血などの手技ができる設備面でも、臨床研究の登録から実施までの手続きも整った体制になっている。研究テーマとして、高齢化と栄養に焦点をあてており、同化を促すための遺伝子発現や治療法の開発に非常に熱心に取り組みを行っていた。このような実践的、臨床的な栄養の研究体制は日本では見当たらず、隔世の感があった。視察だけでなく、日本でのアミノ酸、脂肪、代謝におけるテーマについて日本側からも講演、質疑応答を行い情報交換を行った。【研究】昨年に引き続き後向きの低栄養患者の解析のため、当院の栄養管理計画書を調査した。データの抽出可能であった約7000人の患者のうち、低栄養状態から心停止にいたる可能性があるリフィーディング症候群の基準のひとつであるBMI 16kg/m^2以下の患者は、約3%に認められた。このデータを元に、入院患者全体に対して新たな低栄養への予防対策を講ずることが可能である。【学会】第27回日本静脈経腸栄養学会では、ICUの栄養管理についてのシンポジウム「リフィーディング症候群の早期発見・早期対応心合併症を伴う症例から」と題して講演及び意見交換を行った。以上の訪問・視察と現在の当院での状況を基に、病院全体のスクリーニング体制や多職種によるかかわりのさらなる整備を検討している。データの抽出可能であった約7000人の患者のうち、低栄養状態から心停止にいたる可能性があるリフィーディング症候群の基準のひとつであるBMI16kg/m^2以下の患者は、約3%に認められた。間接熱量計に関しても、高度救命救急センターを中心に重症病態への使用を開始している。今後、されにデータを蓄積して、栄養の観点から病態を解析していく。【学会】第5回日本アミノ酸学会学術集会では、急性期での血中アミノ酸分析から病態への解析と次なる治療へ提言を行うとともに、意見交換を行った。
等輝度ガボール変調正弦格子を用いた2光法による視覚系の時空間統合特性に関する研究

この研究では、等輝度事態で空間的時間的にガボール変調した正弦格子刺激を用いた心理物理学的実験を行うことを計画した。前年度は主に実験環境の整備に主眼が置かれた。実験プログラム開発及びそれを用いた予備実験が行われ、実験装置群の妥当性や精度の点検を行った。今年度は上記の環境をもちいて、組織的な実験データの収集に主点が置かれた。まず飽和度を変調した等輝度の正弦格子を用いて、空間的なコントラスト感度を測定した。その結果、コントラスト曲線は平均色度に依存して変化することが分かった。平均色度が白色に近い場合、たとえば淡いピンク色のように色順応があまり進んでいない条件では、コントラスト曲線は低帯域通過型であり、全体の感度は非常に高い。一方平均色度を増やし色順応を進めると、コントラスト曲線は、感度が低下すると同時に、形状がやや帯域通過型になり、ピークの空間周波数がやや高い周波数にシフトする。この傾向は主観的な飽和度の高い主波長を用いた場合の方が顕著であった。つまり黄色や黄緑色よりも赤や青において顕著であった。ほぼ同様の実験事態を用いて時間的なコントラスト感度曲線も測定した。時間的コントラスト感度は空間的コントラスト感度と同様、平均色度の上昇に伴い減少した。しかし曲線の形状変化は明確には見られなかった。これは測定した時間周波数条件が装置の都合上少なかったことも影響しているようである。ただ補助的に行われた視覚的持続の実験データを見ると、色度に比例して視覚的持続が短くなっており、この傾向から少なくとも時間的コントラスト関数のカットオフ値は高空間周波数側にシフトする可能性がある。したがって色度が時間的コントラスト曲線の形状に及ぼす影響については、周波数条件を増やしてさらに検討する必要がある。この研究では、等輝度事態で空間的時間的にガボール変調した正弦格子刺激を用いて、2光法による時空間統合の実験を行うことを計画した。本年度は主に実験環境の整備に主眼が置かれた。申請者が提案した環境で刺激を提示するには、特殊な拡張ボ-トを搭載したPCとCRTで提示される刺激の時空間強度分布を厳密に制御することと、順応刺激を呈示するための簡易型マックスウエル光学系を構成することが必要である。今年度は主に前者のシステムの導入と実験プログラム開発及びそれを用いた予備実験が行われた。実験で用いる刺激は、輝度および色度変調が時空間的にガボール関数で重みづけされた正弦格子を用いる。したがって刺激は時間的、空間的に複雑な輝度および色度布置を持つ。ここではディスプレイの走査周波数と刺激提示時間を考慮し、実験プログラム作成の際に、フレームバッファへの刺激の書き込みと消去をディスプレイの画面更新と適切に同期させ、ハードの進歩を効率良く利用できるような入出力部の基本ソフトを試作した。画像処理専用のCPUを使うことで、刺激の書き込みと消去がより迅速になった。またビデオサブシステムを使い、画像データの入出力を高速高精度で行う。オシロスコープで確認したところ、5ms単位での書き換えが可能である。次に現有のCRTを使い、4原色の飽和度変調ガボール正弦格子を提示し、現有の色彩輝度計を用い測色した。本実験では多数の色を正確に測定する必要があるため、コンピュータによる自動制御で行われた。また収差を取り除くため、口径の小さい人口瞳孔を用いた。最後に上で述べた装置群を用い、10種類の空間周波数に対するコントラスト感度を測定し、実験装置群の妥当性や精度の点検を行った。
温熱療法の分子基盤の解明-熱ショック誘導性新規蛋白質の解析を通して

FAM107ファミリー分子は進化の上で保存された分子であり、哺乳類はFAM107AとFAM107Bの2つのサプタイプが存在し、FAM107Aは癌抑制遺伝子の候補として多くの報告がなされている。我々は機能が知られていなかったFAM107Bについて、癌細胞で共通して発現が低下する熱ショック蛋白質の一種であることを証明し、HITSと命名した。HITSは腫瘍の増殖抑制効果を持つ事から癌抑制遺伝子の候補と考えられ、他の熱ショック蛋白質が癌遺伝子であるのと対照的な、ユニークな機能を持った分子である事を明らかにした。本研究は、温熱療法の分子基盤の解明のため新規熱ショック蛋白質(HITSと命名)に焦点を当てて機能解析を行い、その生体での働きを解明することが主たる目標である。まず哺乳動物の実験系で、生化学的・病理学的解析を行い、癌をはじめとする疾患とどのような相関があるのか分子レベルで解析することとした。初めにヒト/マウス/ラットに共通なHITSに対する抗体を作製し、組織学的/病理学的検討を行った。その結果、HITSは消化管や肺の腺上皮細胞の核で発現が高く、胃癌・大腸癌組織では正常組織と比べて発現が極端に低下している事が判明した。また、HITSの発現パターンは、胃癌・大腸癌の分化度と組織型によって異なる事も明らかとなった。生化学的解析では、HITSは細胞増殖のシグナル伝達系物質数種と相互作用し、HITSの発現によってがん細胞の増殖が抑制されることも判明した。一方、ショウジョウバエを用いた実験系では、個体レベルでの遺伝子操作をすることによって、発生や疾患の発症とどのような相関があるのか検討することとした。GAL4-UASの系で発現が調節されるコンストラクトを作製し、それをショウジョウバエの胚にインジェクションすることで、HITSの遺伝子改変体の強制発現系(トランスジェニック)と発現抑制系(ノックダウン)をそれぞれ数系統ずつ樹立した。作製した遺伝子改変体で、全身で発現をコントロールすることのできるtubulin-GAL4系を使った実験では、HITSの強制発現は胎生致死となり器官形成に異常が起こる事が判明した。一方、tubulin-GAL4系によるHITSのノックダウンは成虫とはなるものの、各種ストレスに対する耐性が著しく低下している事もわかった。現在、器官形成の異常やストレス耐性のメカニズムを分子レベルで検討している。がん温熱療法は化学療法や放射線療法との併用で抗腫瘍効果を増強させることから、補助療法の一つとして位置づけられているが、その分子機構には謎が多い。一方、熱に対する生体の応答は熱ショック蛋白質(HSP)を中心として研究・理解されていて、HSP70やHSP90は癌細胞で発現が上昇し、その発現によって各種治療に抵抗性となる。HSP27の発現は前立腺がんの予後不良のマーカーである。したがってHSPは癌原遺伝子であり、実臨床(温熱療法)と基礎医学(HSP)との間に理論上大きな矛盾が存在する。これを解決すべく白血病細胞に熱ショックを与えてDNAマイクロアレイを行い、新規熱ショック蛋白質(HITSと命名)を発見、その生体での働きを解明することがこの研究の主たる目標である。ヒト/マウス/ラットに共通なHITSに対する抗体を作製し、組織学的/病理学的検討を行った。その結果、HITSは消化管や肺の腺上皮細胞の核で発現が高く、大腸癌の進展に伴って発現が低下し、胃癌では腸上皮化生や萎縮粘膜から発生するintestinal typeで発現が低下する事がわかった。また、HITSを強制発現すると腫瘍細胞の増殖因子に対する反応が低下する事から、癌抑制遺伝子と推定された。さらにラットに癌温熱療法を旅行するとHITSの発現が上昇する事も証明し、新規熱ショック誘導性がん抑制遺伝子候補として論文を投稿し、特許の申請を準備している。一方、ショウジョウバエを用いた実験系では、GAL4-UASの系で発現が調節されるHITSの遺伝子改変体の強制発現系(トランスジェニック)と発現抑制系(ノックダウン)をそれぞれ数系統ずつ樹立し、癌や神経変性疾患モデルと交配した。その結果、HITSとRas-MAPKシグナル、ユビキチン-プロテアゾーム系との遺伝学的相互作用が認められた。

これを解決すべく白血病細胞に熱ショックを与えてDNAマイクロアレイを行い、新規熱ショック蛋白質(HITSと命名)を発見、その生体での働きを解明することがこの研究の主たる目標である。ヒト/マウス/ラットに共通なHITSに対する抗体を作製し、組織学的/病理学的検討を行った。HITSは核に局在する蛋白であり、広汎な組織に発現し、消化管組織においては、大腸癌への多段階進展過程(正常粘膜→腺腫→癌)の経過に伴ってHITSの発現量が段階的に低下し、また、胃癌をその主要な組織型別に解析したところ、腸型癌ではHITSの発現量が顕著に低下しているのに対して、びまん型癌では低下していないことが判明した。組織アレイを用いて大規模スクリーニングを行った結果、癌化に伴った田TSの発現低下が、消化管以外に甲状腺・乳腺・肺・子宮頚部・精巣など複数の臓器で見られた。Tet-ONシステムによる誘導発現系を用いた実験で、癌細胞にHITSをin vitroで強制発現させると増殖因子に対する応答性が低下して細胞増殖の抑制が見られ、また、in vivoでHITSを誘導発現させても腫瘍の増殖抑制効果が確認された。
バイオマーカーを用いた肝細胞癌の新規画像診断システムの構築と治療への応用的展開

肝細胞癌(HCC)の最も有効な治療法は外科的切除であるが、術後の高頻度な再発が臨床的な課題となっている。この課題の克服には、高感度な診断法や有効性の高い術後治療法の開発が必要である。我々は、蛍光物質インドシアニングリーン(ICG)がHCC組織に長期間蓄積することを明らかにした。この性質を利用して、手術中にICGの蛍光発光を探索し、目視や既存の画像診断では検出できなかった新たなHCCを検出する術中診断技術を確立した。一方、ICGが蓄積したHCC組織に対して近赤外光を照射することにより、HCC細胞のみを死滅させる光線力学療法を開発した。これらの技術は、HCCの再発の抑止に貢献できると期待される。当該年度の研究計画では、種々のバイオマーカーをターゲットとして癌組織あるいは癌の影響を受けた病変部位を検出可能なツールとして、これまでに肝細胞癌(HCC)の血清マーカーとして臨床利用されている異常プロトロンビン(DCP)が有用であるかを検討した。肝硬変を併発したHCC患者組織におけるDCPの発現を免疫組織化学的解析により検出したところ、癌部組織だけでなく周辺の非癌部組織においても発現が認められた。また、DCPの発現性と患者の病態との関連性を検討した結果、癌部組織及び非癌部組織の双方で発現が認められた症例群において術後の生存率が低下した。以上の結果から、HCC患者組織におけるDCPの発現性は、病態が悪化した病変部位の検出に有用であることが示唆される。さらに、モデル動物を用いたin vivo実験による有効性の評価を行うための解析系の構築を目的として、皮下に肝癌細胞を移植して腫瘍組織を形成させたBALB/c-nuヌードマウスに対して肝癌組織に集積することが知られているインドシアニングリーン(ICG)を静脈投与し、腫瘍組織を検出できるかを検討した。ヒト肝細胞癌細胞HuH-7由来の腫瘍組織を形成させたマウスにICGを投与したところ、24時間後にICG由来の蛍光が腫瘍組織において検出された。また、この発行は腫瘍組織全体で検出された上、周囲の他の組織では検出されなかった。一方、ヒト肝癌細胞HepG2由来の腫瘍組織を形成させたマウスに対して同様にICGを投与したところ、24時間後の蛍光発光はHuH-7と比較して非常に微弱なものであった。マウス皮下移植癌組織におけるICGに由来する蛍光発光は、移植する癌細胞種によって異なることが示された。以上の結果は、マウス皮下移植癌モデルを用いた腫瘍組織の検出及びICGの癌組織特異性を検討する解析系が構築されたことを示唆する。当該年度の研究では、モデル動物を用いたin vivo解析系が蛍光発光を基盤とした治療技術の評価に応用可能であるかを検討した。前年度までに、肝細胞癌細胞の一種であるHuH-7を皮下移植したモデルに対してインドシアニングリーン(ICG)を投与すると、24時間後に腫瘍組織に集積するICGの蛍光像を描出することに成功した。ICGは、近赤外光を吸収して発熱する性質を有することから、光線力学的治療法に有用であることが期待された。そこで、ICGを集積させたHuH-7由来の腫瘍組織に対して近赤外光を照射したところ、近赤外光を照射していない群やICGを投与せずに近赤外光を照射した群と比べて腫瘍組織の生育が有意に抑制された。近赤外光照射後36時間の腫瘍組織を採取して細胞の形態を観察したところ、近赤外光を照射した部分において顕著な細胞の形態変化や死細胞の存在がみとめられた。従って、ICGを取り込んで蛍光発光した腫瘍には、近赤外光照射による光線力学的治療が有効であることが示唆された。また、本モデルは静脈投与した蛍光物質による腫瘍組織の描出や光線力学的治療法の評価に有用であると示されたことから、標識化抗体などの投与によって腫瘍組織を描出できれば、バイオマーカーの発現に基づいた蛍光検出技術や治療法の確立への応用が期待される。癌組織あるいは癌の影響を受けた病変部位を検出可能なツールとして肝細胞癌(HCC)の血清マーカーとして臨床利用されている異常プロトロンビン(DCP)が有用であることをこれまでに示唆してきたが、小規模な研究にとどまっていた。当該年度においては、153例のHCC患者由来癌組織を用いてDCPの発現性を免疫組織化学的に解析し、臨床病理学的意義を検討した。その結果、97例(63.4%)のHCC患者において癌部組織でDCPの高発現が検出された。一方、癌部組織周辺の非癌部組織においてDCPの高発現が検出された症例数は20例(13.1%)のみであった。また、我々の研究グループでは、細胞外に分泌されたDCPがc-Metを高発現するHCC細胞の増殖を亢進させることをin vitroの解析で示唆したが、実際のHCC症例でのDCPとc-Metの連関性は不明であった。そこで、HCC症例由来組織中のDCPとc-Metの発現性を比較検討した。その結果、78例の癌部組織において、DCPの高発現とc-Metの高発現が同時に検出され、統計学的にも有意に高頻度であることがみとめられた。従って、過去にin vitroで示されたDCPとc-Metの連関性が、HCC患者組織においても検出されることが示唆された。これまでの研究で、DCP及びc-Metの高発現が癌患者の予後の悪化と相関することが見出されている。

これらの抗原を標的として癌組織を高感度に検出できれば、病態が進行した癌組織を検出する技術に繋がると考えられる。当該年度における研究では、前年度までに確立されたインドシアニングリーン(ICG)をモデルとしたin vivo解析系を用いて、蛍光発光と近赤外光の組み合わせによる新規肝細胞癌治療技術の創出を検討した。マウスに肝細胞癌細胞HuH-7細胞を皮下移植して腫瘍を形成させ、ICGを静注後に腫瘍に対して近赤外光を照射すると腫瘍の生育を抑制させることには成功していたが、実際に肝臓に形成された腫瘍に対して治療を施行できるかは不明であった。そこで、細胞を経脾臓で移植して肝臓に転移させるモデルを構築し、そのモデルマウスに対してICGを投与することにより腫瘍の描出を達成できるかを検討した。その結果、HuH-7細胞を脾臓移植し、56週間後にICGを投与して肝臓を蛍光検出装置で観察すると、HuH-7細胞由来の腫瘍が明瞭に蛍光発光にて描出された。以上の結果から、癌細胞の脾臓移植という方法を介した肝腫瘍形成モデルが、ICGの肝腫瘍特異的な発光を検出するのに有用であると示唆され、近赤外光照射の治療を評価するモデルとして期待される。一方、当該年度の研究においても、腫瘍組織の蛍光発光を達成するための癌細胞上の標的の探索を引き続き実施した。その成果として、HGFの受容体であるc-Met、肝機能のマーカータンパク質として臨床で用いられているgammaGTPが、病態の悪化した肝細胞癌患者において発現上昇することを見出した。これらのタンパク質を標的とした抗体を肝細胞癌組織に作用させて蛍光発光させることができれば、バイオマーカーの発現に基づく診断法や治療法の開発につながると考えられる。当該年度における研究では、肝細胞癌の病態との関連性が報告されているバイオマーカーであるGlypican-3を標的として、ICG標識化した抗体での好感度検出法の構築を試みた。まず、in vitro解析において、種々の肝細胞がん培養細胞に対してICG標識化抗Glypican-3抗体を作用させ、蛍光顕微鏡を用いて蛍光強度を評価した。その結果、HuH-7細胞及びHepG2細胞において、ICG由来の蛍光発光を検出した。従って、当該ICG結合型抗体は、Glypican-3を発現した細胞をICGの蛍光発光を介して検出するのに有効であることが示唆された。そこで、HuH-7細胞を皮下に移植した癌モデルマウスに対してICG結合型抗体を投与して、腫瘍組織が蛍光発光により描出されるか否かを検討した。その結果、ICG由来の蛍光発光がHuH-7細胞由来の腫瘍組織からみとめられたが、極めて微弱なものであった。ICG結合型抗体は、生体内においてもGlypican-3を発現した腫瘍組織を検出することは可能であると考えられる。しかし、高感度な描出を達成するためには、更なる抗体種の変更や増感法のin vivoでの検討が必要である。一方、ICGが近赤外光を吸収して発熱する性質を利用した光線力学的治療法の構築に関する研究を進めた。昨年度までにヒト肝細胞癌細胞由来の移植癌を形成させたモデルマウスに対してICGを投与し、ICGが集積した腫瘍組織に対して近赤外光を照射すると腫瘍の拡大が抑制されることを明らかにした。加えて、今年度の研究では近赤外光の照射回数を増加させると、腫瘍が縮小することが示された。従って、近赤外光照射はICGを介した肝腫瘍に対する光線力学的治療として有用であると示唆される。
発光遺伝子導入マウスを用いた急性腎不全と腎症回復における骨髄幹細胞の役割の解明

KHNEICC発光遺伝子導入Tgマウスの子孫に尿細管特異的にHcRed1が発現するか、podocyte特異的にEGFPが発現するかを、腎臓での青色、緑色、赤色発光を、解析した。糸球体及び尿細管はCAG promoterの制御下、ECFPを発現するが、Ksp-cad promoter制御下のHcRed1の発現は尿細管に限定されたようである。また、nephrin promoter制御下のEGFPの発現は、podocyteに限定されている。しかし、遺伝子発現の詳細な解析を行ったところHcRed1の発現は認められなかった。KHNEICCプラスミッドの塩基配列調査ではKsp-cad promoter領域とHcRed1の接続部分に新たな翻訳開始コドンが出来ていて、さらにinsulatorとCAG promoterの間に大きな挿入がある事が発見された。放射線照射後immunotoxin注射によるpodocyte障害モデルTgマウスにKHNEICC Tgマウスの骨髄細胞を移植し、2,4,6,8週後にrecipientマウスの腎臓を採取し、蛍光顕微鏡学的、組織学的(H-E染色、PAS染色)にて観察した。移植後4週目には、骨髄細胞移植による腎障害の組織学的な改善は観られたものの、蛍光顕微鏡下では糸球体内には発光細胞が認められなかった。自家発光と見られる発光細胞が尿細管に数多くあった。EGFPの波長はECFPの波長に近いため蛍光顕微鏡学的にその二つの発光は区別しにくい。波長の離れた発光遺伝子を組直し、骨髄細胞に導入して同様の解析、および移植実験を行った。B6C3F1マウスから骨髄細胞を採取し、間葉系幹細胞を選択的に培養した。それら間葉系幹細胞にEGFP由来の緑色発光(CAG promoterにより制御)遺伝子とDsRed2由来の赤色発光(Ksp-cadherin promoterにより制御)遺伝子をElectroporation法にて共遺伝子導入した。遺伝子導入後EGFP発光を蛍光顕微鏡、免疫染色などで確認した後Cisplatin投与による急性腎不全マウスに移植した。移植後2,4,6,8週後にrecipientマウスの腎臓を採取し、蛍光顕微鏡学的、組織学的、免疫学的解析を行った。移植後2週目には、尿細管にEGFPあるいはKsp-cadherinとDsRed2、両方染まった細胞が観察され、移植後4週目以後には両方染まった細胞数が徐々に増加する傾向が見られた。しかし、自家発光や抗体の交差反応の可能性は除外できず、In situ hybridizationや遺伝子学的解析を行っている。尿細管にHcRed1の特異的安定な発現は期待し難いため、podocyteにEGFPの特異的な発現を利用し、骨髄細胞移植実験を行った。

放射線照射後immunotoxin注射によるpodocyte障害モデルTgマウスにKHNEICC Tgマウスの骨髄細胞を移植し、2、4、6、8週後にrecipientマウスの腎臓を採取し、蛍光顕微鏡学的、組織学的(H-E染色、PAS染色)にて観察した。移植後4週目には、骨髄細胞移植による腎障害の組織学的な改善は観られたものの、蛍光顕微鏡下では糸球体内には発光細胞が認められなかった。自家発光と見られる発光細胞が尿細管に数多くあった。EGFPの波長はECFPの波長に近いため蛍光顕微鏡学的にその二つの発光は区別しにくい。波長の離れた発光遺伝子を組直し、骨髄細胞に導入して同様の解析、および移植実験を行っている。B6C3F1マウス(♂)の大腿骨、脛骨から骨髄細胞を採取し、間葉系幹細胞を選択的に培養した。それら間葉系幹細胞にEGFP由来の緑色発光(CAG promoterにより制御)遺伝子とDsRed2由来の赤色発光(Ksp-cadherin promoterにより制御)遺伝子をNucleofector【○!R】IIを用いてElectroporation法にて共遺伝子導入した。遺伝子導入後、G418存在下に細胞を選別し、EGFP発光を蛍光顕徴鏡、免疫染色などで確認した後、培養に付し、1-2週間ほど増殖させた。マウス由来遺伝子導入骨髄間葉系幹細胞を受け入れるrecipientとして、成体B6C3F1マウス(♀)を用いた。これらマウスにCisplatin(12.7mg/kg ip)腹腔内投与し、急性腎不全モデルマウスを実験的に作製した。因みに、この腎疾患モデルマウスは、一時的に特有の腎病態を示すが、時間の経過に伴い、正常な状態へ回復する。その回復過程で腎構成細胞の前駆細胞から修復が行われるのか、血中の骨髄間葉系幹細胞が腎構成細胞へ分化し、修復が行われるのか、いずれか、あるいは双方と予想される。急性腎不全マウスに共遺伝子導入骨髄細胞を移植し、2、4、0、8週後にrecipientマウスの腎臓を採取し、蛍光顕徴鏡学的、組織学的(H-E染色、PAS染色)免疫学的(EGFP、DsRed2、尿細管細胞のマーカーであるKsp-cadherin抗体による免疫化学的染色)な解析を行った。移植後2週目には、骨髄細胞移植による腎障害の組織学的な改善は観られ、尿細管にはEGFPあるいはKsp-cadherinとDsRed2、両方染まった細胞が幾つか観察され、移植後4週目以後には両方染まった細胞数が徐々に増加する傾向が見られた。しかし、自家発光や抗体の交差反応の可能性は除外できず、In situ hybridizationや遺伝子学的解析を行っている。