hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子導入・培養半月板移植による半月板損傷の修復促進と半月板再生

膝関節内のクッションとしてはたらく半月板は、断裂などの損傷をきたすと自然に治癒しにくい。その理由としては、血管が存在しないエリアが半月板に存在すること、半月板細胞の特徴が軟骨細胞に似ていること、日常生活における歩行や膝の曲げ伸ばしなどで常に過剰なストレスにさらされていることなどが挙げられる。今回の研究では、適切なストレスが半月板細胞の治癒能力を増加させることが判明した。これらの成果は、半月板損傷に対する手術方法や手術後のリハビリテーションを最適化し、治療成績を向上させる可能性を秘めている。半月板inner領域損傷が、outer領域損傷に比較し治療成績が不良である原因として、inner領域は非血行領域であり、軟骨組織に類似した細胞外器質(ECM)が関与していると考えられる。今年度は、軟骨組織特異的に発現するとされるSOX9・CCN2・II型コラーゲンの局在とその役割について検討した。また、細胞骨格を制御するsmall GTPaseROCKの関与を検討した。半月板inner細胞にROCK阻害剤(ROCKi)を添加し培養することで、SOX9・COL2A1の発現が上昇した。また、ROCKiの添加により、半月板inner細胞におけるSOX9・Smad2/3の核内への集積が増加していた。Western blotによる解析で、ROCKi添加により核内に存在するSOX9は1.3倍、Smad2/3は4.8倍に増加していた。本研究により、ROCK阻害は半月板inner細胞におけるSOX9・Smad2/3の核内移行を促進し、COL2A1の発現を増強することが明らかとなった。これらの結果から、ROCK阻害はSOX9-Smad2/3転写複合体の形成を誘導することで、半月板inner細胞の軟骨細胞様形質を維持している可能性が示唆された。半月板inner領域損傷が、outer領域損傷に比較し治療成績が不良である原因として、inner領域は非血行領域であり、endostatinなどの血管新生抑制因子が関与していると考えられる。今年度は、軟骨組織特異的に発現するとされる血管新生抑制因子ChM-Iの半月板における局在とその役割について検討した。人工膝関節置換術時に、変性の少ない外側半月板を採取し、ChM-Iの局在を免疫組織学的に検討した。半月板をinner領域・outer領域に半割し、I/II/III型コラーゲン・ChM-I・endostatinの発現をRT-PCRにて評価した。培養液中へのChM-I分泌量をELISAにより定量した。ChM-Iを含む半月板培養上清(C-CM)と免疫沈降によりChM-Iを除去した培養上清(IP-CM)を用い、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVECs)の増殖活性に対する影響を検討した。免疫染色によるChM-I染色強度は、inner領域においてouter領域有意に強かった。C-CMのChM-I濃度は、inner・outer領域器官培養上清でそれぞれ7.5・3.7 ng/mlであった。COL2A1の発現は、inner領域で検出されたが、outer領域では認めなかった。ChM-Iの遺伝子発現はinner領域、および無血清培養下のinner細胞で観察された。また、C-CMではHUVECsの細胞増殖活性が阻害されたものの、IP-CMではその抑制効果が減弱された。ChM-I発現は、半月板inner領域および無血清培養下inner細胞において特徴的であった。また、培養上清中のChM-Iが、血管内皮細胞の増殖を抑制していることが明らかとなった。半月板inner領域にはChM-Iが豊富に存在するため、半月板損傷時の血管侵入が阻害され、inner領域損傷の治癒を妨げている可能性が示唆された。線維軟骨組織である半月板は、その特徴的な細胞外基質構成のため、断裂等の損傷をきたすと自然治癒が期待しにくいとされる。特に半月板inner領域損傷においては、自己修復能力が低いとされ、本研究では半月板細胞を賦活化することにより、組織修復を活性化するとともに、半月板の再生医療に直結する技術開発を目的としてきた。これまでの研究から、ROCK阻害や生理的なメカニカルストレスが半月板細胞を活性化することを明らかにしており、半月板inner領域に特徴的に発現するII型コラーゲンの産生を効率よく誘導するためには、転写因子SOX9と細胞内シグナルSmad3の相互作用を増強させ、II型コラーゲンプロモーター上での転写複合体活性を賦活化する必要があることを証明した。これらの研究成果は複数の学会で報告するとともに、国際英文誌に掲載された。整形外科学(膝関節・スポーツ医学)ROCK阻害により細胞形態を変化させると、SOX9-Smad2/3転写複合体の形成を誘導することで、半月板inner細胞の軟骨細胞様形質が賦活化される可能性が示唆された。つまり、inner領域損傷は軟骨損傷に対する治療と同様、inner細胞の軟骨細胞様形質を生理的メカニカルストレスやROCK阻害により活性化させる必要があると考えられる。血管新生抑制因子

ChM-Iの発現は、inner細胞特異的に発現する転写因子であるSOX9に制御されている可能性があり、半月板細胞へのSOX9遺伝子導入で、ChM-I発現も増幅される可能性がある。今回の結果から、半月板inner領域損傷に対して、SOX9を遺伝子導入したinner細胞を利用する場合、outer領域からの血管侵入がさらに期待できない状況が予想される。つまり、新生血管網の構築を目的とした治療法には限界があると考えられ、inner領域損傷は軟骨損傷に対する治療と同様、inner細胞の軟骨細胞様形質をいかに活性化させるかがポイントとなる。半月板inner領域に特徴的なECM構造を再構築することが、非血行領域における半月板修復促進と半月板再生の鍵になるものと推測される。半月板にパンチ孔を作製し、器官培養後の修復状態を、それぞれの条件で検討する。「3次元培養半月板の作製」ーSox9遺伝子導入と伸張刺激負荷ー半月板inner領域は非血行領域であり、特殊な線維軟骨様ECM構造をもつとされる。しかし、outer領域におけるECM構造を含め、動物種間で大きな違いが存在することが確認されている8)。申請者も、ヒト半月板においてII型コラーゲンの沈着がinner領域に特徴的であることを確認しており業績3)(図5)、inner領域に特徴的なECM構造を再構築することが、非血行領域における半月板修復促進と半月板再生の鍵になるものと推測される。半月板inner細胞を生体吸収性ペプチドゲルに包埋し、3次元培養する(2週間)。Sox9導入と伸張刺激負荷(4時間/日)により、II型コラーゲンをはじめとするECM構成成分の産生が増強するものと予想される。伸張刺激後のSox9・ECM構成成分の発現変化を、real-time PCR・Western blot・免疫染色により解析する。平成25年度の研究計画が順調に進行したため、消耗品における研究費の使用量が見積もりよりも少なかった。そのため残額を平成26年度に繰り越すが、抗体等の消耗品購入費に割り当てたい。その他、培養細胞・PCR関連試薬として平成26年度の研究費を使用予定である。平成24年度の研究計画が順調に進行したため、消耗品における研究費の使用量が見積もりよりも少なかった。そのため残額を、平成25年度に繰り越すが、生体吸収性ペプチドゲル等の消耗品購入費に割り当てたい。その他、培養細胞・PCR関連試薬として平成25年度の研究費を使用予定である。
職業性心理的ストレスの過去・慢性暴露と不眠の関連を明らかにする疫学研究

不眠の維持・新規発症に関連する職業性心理的ストレスを明らかにするため、前向きコホート研究を実施した。上司・同僚からの乏しい支援や仕事に費やす努力に比して報酬が低いことが不眠の維持の危険因子となること、および、仕事の裁量度に比して要求度が高い状態や過度に仕事に傾注する状態は不眠の新規発症の危険因子となることが示された。また、並行して行った実験的研究からは、不眠の自己評価の信頼性・妥当性が比較的良好なこともわかった。1.職業性心理的ストレスと不眠の関連を調べる前向きコホート研究研究代表者は中高年(4065歳)労働者1,600名余を対象にした前向きコホート研究を行ってきた。本研究は、このデータを用い、職業性心理的ストレスへの曝露と不眠の関連を縦断的に明らかにすることを目的とした。職業性心理的ストレスと不眠の関連を調べた先行研究のほとんどは横断研究であり、因果関係の究明に限界がある。本研究は前向きコホート研究を行うことでこの2者の因果関係の解明に寄与する。本年度は研究データを整備し、順次解析を実施した。仕事への過度の傾注(overcommitment to work)と不眠の関連、および、不眠の有症者は過去にも不眠を訴えている者が多いことについて学会発表を行った。来年度以降も分析を進め、誌上および学会発表を行う予定である。2.質問紙による不眠の判定の信頼性・妥当性の評価大規模な疫学研究では不眠を質問紙にて評価することが多い。しかし、質問紙による不眠の評価の信頼性・妥当性は十分に検証されているとは言いがたい。本研究は、短期間に複数回行った不眠症状に関する自己申告内容の一致度、および、不眠の自覚・他覚所見の一致度を調べることで、質問紙による不眠の評価の信頼性・妥当性を明らかにすることを目的としている。本年度は研究計画の作成、研究体制の整備、ならびにデータ収集を行った。研究計画は倫理審査にて承認された。睡眠解析ロガー(Mini-Mitter社製アクティウォッチ、アクティウェア解析ソフトウェア、アクティリーダー)等の必要な実験機材の購入も行った。現在まで10名余のデータを得ているが、引き続き対象者の募集を行い、次年度までに総計30名のデータ収集を行う計画としている。次年度はデータの分析および紙上・学会発表を行う予定である。(1)職業性心理的ストレスと不眠の維持・新規発症:コホート研究:中高年労働者1,022人を2年間観察したコホート研究で、Karasekの要求度-コントロールモデルとSiegristの努力-報酬不均衡モデルを用いて評価した職業性心理的ストレスと不眠の関連を調べた。不眠は過去1ヶ月間に入眠困難、中途覚醒、早朝覚醒、熟眠感の欠如の1つ以上を週に3晩以上自覚することとした。ベースライン時に不眠のあった292人ではベースライン時のeffort-reward imbalance(有病率73%対55%、性・年齢等調整済みオッズ比(95%信頼区間) : 2.40(1.18, 5.10))とlow social support(61%対50%、2.00(1.18, 3.40))が、ベースライン時に不眠のなかった730人ではベースライン時のovercommitment to work(25%対15%、1.75(1.16, 2.66))とhigh job strain(16%対22%、1.72(1.06, 2.79))が2年後の不眠と関連した。不眠の維持・新規発症に関連する職業性心理的ストレスに違いがあることが示された。(2)不眠のスクリーニングとしての自己評価の信頼性・妥当性:(1)で利用した不眠の自己評価の信頼性と妥当性を33人の労働者を対象に検討した。1ヶ月の間隔で行なった2回の自己評価の一致度は中程度(カッパ係数0.463)で一定の信頼性を認めた。妥当性は、アクティウォッチで評価した客観的不眠所見(連続した3晩のうち1晩以上で30分以上の入眠潜時、10分以上・2回以上の中途覚醒、90分以上の離床潜時、80%未満の睡眠効率のいずれかを認める)をスタンダードにした自己評価の感度、特異度、正確度を調べた。それぞれ0.33、0.83、0.70で、自己評価は感度が低い可能性が示された。
燃料電池自動車用高容量高耐久性V系プロチウム貯蔵合金の創生

水素社会の実現には体積効率が高く、耐久性の高い水素貯蔵手段の開発が必要不可欠である。水素吸蔵合金は体積効率が高いものの、低温特性、耐久性に課題がある。本研究はV系プロチウム合金の耐久性、低温特性向上を目指すものである。成果として-30°Cの平衡放出圧0. 2MPa以上、有効水素量2mass%程度、200サイクル時の水素容量維持率99%以上の世界最高水準のプロチウム吸蔵合金の開発に成功した。水素吸蔵合金は体積貯蔵率が高く、燃料電池自動車用水素貯蔵手段として注目されている。重要課題は極低温始動性と耐久性向上であり、実用化には、-20-30°Cにおいても水素放出可能な合金へと改良が必要である。本研究は、体積効率の高いV-Ti-Cr系水素吸蔵合金を基に、1、極低温における水素放出特性の向上、2、高耐久性合金の開発を目指すものであり、2010年度は以下の知見、成果を得た。1、V-Ti-Cr合金の高耐久性化、高作動圧化V含有量の耐久性への影響について調査を行い、高耐久性の75at%V合金を見いだした(200サイクル時、初期水素容量の99%を維持)。また、V含有量と高作動圧化(箒低温作動化)の限界について調査を行い、良好な関係を見いだした。一方更なる低温作動性向上(ex.-20°C)には置換元素の導入が不可欠であることも判明した。低温作動性向上のため、湖を導入、想含有量と作動圧の関係について調査を行い、Al量増加にほぼ比例して、低温作動性の向上がなされた。Al導入合金はV-Ti-Cr合金と比較して高圧化限界が大きく改善され、Alの新しい役割を見いだし、-30°Cにおいても水素放出の容易な75at%V-Ti-Cr-3at%Al合金の開発に成功、(1)と併せて第18回国際水素会議にて報告した(WHEC2010)。他の第四元素導入による高圧化も期待され、75at%V-Ti-Cr-Moおよび75at%V-Cr-W合金において、MoまたはW導入量と高圧化の関係について調査を行い、MoおよびWを導入することにより低温特性の向上がなされ、-30°Cにおいても水素放出が容易な合金を見いだし、日本金属学会秋期大会にて報告した。2010年度末期(2011年13月)に多数の試料作製、水素吸蔵放出測定を終えていたものの、データ解析が行われていなかった。3月に被災後、6月以降測定済みデータをサルベージ、解析を行い、以下の知見をまとめることが出来た。前年に良好な低温特性を有することが確認された75at%V-Ti-Cr-Al合金を中心に合金中のAl量を1,2,,3,および5at%としCr量を変化させた場合の平衡圧力マップを作成した(Al量を一定とすれば平衡圧力の対数値はCr量に比例することが確認された)。また、水素吸放出温度を変化させて、平衡動作圧のVan't Hoff plotを求め、作動熱量も求め、合金組成から動作圧力を予測することが可能となった。同様にV含有量を70at%および80at%としてAl量(15at%)としてCr量を変化させて平衡圧力について求めたところ、Cr量に対して平衡圧力の対数値が比例すること、およびV含有量の影響についてもある種の直線関係が得られ、前年度の解析結果と併せてV-Ti-Cr-Al系合金(V量6085at%,Al量05at%)において合金組成から動作圧力を予測することが可能となった。3.V-Ti-Cr-M系(M=Al,MoおよびW)合金における合金組成と格子状数、平衡水素圧の関係の算出一般に水素吸蔵合金の格子状数と平衡水素圧は密接な関係を有し、置換元素の添加量と格子状数、平衡圧の関係について整理を行った。Al添加系では特に置換による格子状数の増加と平衡圧の上昇が確認され、BCC系固溶体合金におけるAlの特別な効果が確認された。*一方、保管されていた試料、原料については、震災後回収し、再測定を試みたものの、酸化のため新規データを得ることは叶わなかった。
ソバにおける自家不和合性の遺伝的基盤の解明

ソバ(Fagopyrum esculentum)は自家不和合性として知られる栽培上の欠点を持つ。このため他の自殖性の主要穀物と比較して、その収量は低く、不安定である。本研究では次世代シークエンスによるmRNAの配列比較をはじめとする複数の分子遺伝学的な手法を利用し、ソバの自家不和合性遺伝子と考えられる新規の遺伝子、S-LOCUS EARLY FLOWEING 3(S-ELF3)の同定に成功した。本研究成果は自殖性ソバ品種の開発につながると考えられる。C.Darwinの著書「Different formsof flowers」に掲載されているように、多くの植物において花の形態多型と自家不和合性とが密接に関係した二花柱型自家不和合性が見られる。しかしながら、その分子遺伝学的な機構は全く解明されていない。本研究の目的は世界に先駆けてソバの二花柱型自家不和合性を司る遺伝子(S遺伝子)を同定し、C.Darwinの時代からの謎であった花の形態多型と自家不和合性の関連を分子レベルで解明することにある。本年度は以下の研究成果を得ることができた。1.短柱花および長柱花の雌蕊よりmRNAを抽出し、次世代シークエンサーによる塩基配列決定を行った。2.次世代シークエンスの結果を比較し、短柱花の雌蕊特異的に発現する8個の遺伝子を見いだした。3.上記の2で見つかった配列をもとにPCRプライマーを作成し、世界各地から採集されたソバのコレクションを対象としたアソシエーション解析を行った。その結果、2つの遺伝子が短柱花個体に特異的に存在することが分かった。4. 1400個体からなるマッピング集団において上述の2遺伝子と花柱性間の組み換えをみたところ、まったく組換え体はみられなかった。これらの結果から2つの遺伝子はソバの二花柱性を支配する遺伝子と同座性を示し、短柱花でのみ発現することが分かった。2遺伝子のうちの1つは他の生物の転写因子と相同性があり、多面発現を行っている可能性が示唆された。これら2遺伝子(特に転写因子)はソバの二花柱型自家不和合性において重要な働きをしていると考えられる。本年度は非常に貴重な知見を得ることができた。次年度以降は2つの候補遺伝子の分子遺伝学的解析および進化学的解析に着手する予定である。その結果、短柱花のゲノム中に特異的に存在する2つの遺伝子(SSG2およびSSG3)を発見した。またこれら2遺伝子はS遺伝子座に座上していることが分かった。2.BBLASTXによる相同性解析の結果、SSG2と相同性の高い遺伝子は見つからなかった。二花柱型自家不和合性を有するソバ個体においてSSG2に大きな欠失がみられたことから、SSG2は二花柱型自家木和合性には関与していないことが分かった。3.SSG3は転写因子であるEARLY FLOWERING 3 (ELF3)と相同性が高いため、本遺伝子をS LOCUS EARLY FLOWERING 3 (S-ELF3)と命名した。二花柱型自家不和合性を有するソバ個体において、S-ELF3に大きな構造変化は見られなかった。また二花柱型自家不和合性を有するソバの近縁野生種においては、やはり短柱花個体のゲノム中にのみS-ELF3が存在した。さらに二花柱型自家不和合性が崩壊した自殖性野生種ではS-ELF3にフレームシフトを伴う大きな構造変化が見られた。転写解析の結果、S-ELF3は花器官で特異的に発現している、ことも示された。これらの結果からS-ELF3は短柱花形質を制御している転写因子であることが分かった。4.重イオンビームを用いることによりS遺伝子座周辺を欠失した突然変異個体を得ることができた。本突然変異個体は今後の重要な材料となる。本研究の目的は世界に先駆けてソバの二花柱型自家不和合性を司る遺伝子(S遺伝子)を同定し、C. Darwinの時代からの謎であった花の形態多型と自家不和合性の関連を分子レベルで解明することにある。前年度までにソバの二花柱型自家不和合性の雌蕊側形質を制御すると考えられる遺伝子、S-LOCUS EARLY FLOWERING 3 (S-ELF3)の同定に成功した。

S-ELF3は転写因子と考えられ、ソバの二花柱型自家不和合性機構を解明するためには実働遺伝子群の同定が必須となる。我々はChIP-Seqを利用し、実働遺伝子群を一網打尽にクローニングするため、リファレンスとなるソバゲノム配列の決定を行った。現在、100倍程度のカベレージでソバゲノムを解読しており、現在、メイトペア解析を行うことにより、長コンティグの作成を試みている。ソバゲノム解析結果とChIP-Seq解析結果は近年中に公表可能である。本年度は雄側因子の同定のため、重イオンビーム照射種子を育成・採種し、M2世代において雄蕊形質に関わる変異体のスクリーニングを行った。その結果、雄蕊の形態が短柱花形質から長柱花形質へ転換した変異体を発見した。これまでに20個体程度の後代を確認しているが、変異体の表現型は完全にS遺伝子座と連鎖している。今後、詳細な連鎖解析を行うためにはマッピング集団の構築が必要なると考えられる。また同時に変異体の自家不和合性形質の確認を行い、変異体の雄(花粉)側の自家不和合性能力を検定する必要があると考えられる。さらに次世代シークエンシングを利用し、変異個所を同定することにより、ソバの二花柱型自家不和合性の雄側因子を同定することが可能となるだろう。現在、マッピング集団の構築、自家不和合性能力を検定するための変異体の育成、リファレンスゲノム配列の構築を行っており、近年中に雄側因子が同定されると考えている。世界に先駆けて二花柱型自家不和合性に関与する遺伝子(S-ELF3)を同定することができた。ソバ属内での進化的解析を終え、S-ELF3の崩壊と自家不和合性の崩壊に密接な関係があることが分かった。さらに重イオンビームを用いてこれまでに存在しなかったS遺伝子座周辺を完全に失った突然変異個体を得ることもできた。突然変異個体の獲得は予想を大きく上回る成果であり、今後の二花柱型自家不和合性の分子機構の解明において、重要な材料となるものである。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後変異個体のゲノム解析を行い、欠失領域を岡定する。手法はBACライブラリーを用いたゲノミックウォーキングおよび次世代シークエンサーを用いたゲノム配列の解析となる。ゲノム配列の解析に関しては資金的に無理はあるが、ゲノム支援を受けることにより、達成可能である。これらの研究によりS遺伝子座に座上するすべての遺伝子が明らかになると考えられる。
自閉スペクトラム症児における「他者との同期」現象の定量化

近年、自閉スペクトラム症(ASD)の本態を「他者との同期の困難さ」とする説(生体機能リズム障害説)が注目されている。そこで本研究では、実際のコミュニケーション場面でASD児が対話者と「目が合わないこと」や「息が合わないこと」について定量的に捉える。さらに、場面によって同期の困難さが異なることを示すことで、ASD児にとって同期しやすいコミュニケーション環境を考える。
感情判断における文脈情報の役割:表情表出者の国籍と状況の効果

本研究は,表情を通した感情判断において,感情喚起刺激,状況,表出者の国籍(文化)のような文脈情報がどのように寄与しているかを実験的に検討することを目的として計画した。特に,先行研究において取り上げられることのなかった表出者の国籍の要因を操作し,表情をはじめとした情報源の相対的重要性,および相対的重要性に及ぼす表出者の国籍,状況の影響を検討した。研究は表情刺激の収集・選択,情報の定義、感情判断実験の3つの段階に分かれる。昨年度は第1,2段階として,日米表出者の表情を収集し、実験刺激として適当な表情と感情喚起刺激を選ぶために,被験者に表情と喚起刺激を単独で提示し,幸福,悲しみ,怒り,恐れ,嫌悪、驚き,快-不快,強度の各尺度へ7段階で評定してもらう作業を進め,アメリカ人表出者について作業を終えた。本年度は,日本人表出者について実験刺激として適当な表情を選ぶための作業を行い,実験で使用する刺激を選んだ。これらの刺激を用いて,本研究の主目的である表情と喚起刺激の相対的重要性を検討するため,文脈情報とともに表情と喚起刺激を組み合わせて提示して感情判断を行う実験を実施した。その結果,アメリカ人表出者の表情を用いた場合と同様に,日本人表出者の場合でも表情が感情喚起刺激に対して相対的に重要な情報源であることがわかった。また,表情が生起した状況の公私の差には有意な効果は見られなかった。これらの結果から,表情はその表出者の国籍に関わらず,感情判断に際して安定して重要な情報源となっていることが示された。本研究は,表情を通した感情判断において,感情喚起刺激,状況,表出者の国籍(文化)のような文脈情報がどのように寄与しているかを実験的に検討することを目的とする。特に,先行研究において取り上げられることのなかった表出者の国籍の要因を操作し,表情をはじめとした情報源の相対的重要性,および相対的重要性に及ぼす表出者の国籍,状況の影響を検討する。研究は表情刺激の収集・選択,情報の定義、感情判断実験の3つの段階に分かれるが,本年度はまず第1段階として,日米表出者の表情を収集した。さらに、実験刺激として適当な表情と感情喚起刺激を選ぶために,被験者に表情と喚起刺激を単独で提示し,幸福,悲しみ,怒り,恐れ,嫌悪、驚き,快-不快,強度の各尺度へ7段階で評定してもらう作業を進め,アメリカ人表出者については作業を終えた。この評定の平均値を表情と喚起刺激から得られる情報の質と量と見なし,選択された刺激を用いて表情と喚起刺激の相対的重要性を検討するため,文脈情報とともに表情と喚起刺激を組み合わせて提示して感情判断を行う実験を,アメリカ人表出者の表情を用いて実施した。その結果,表情が安定して重要な情報源であることがわかった。来年度は,日本人表出者を刺激とした実験を実施し,国籍の効果について検討を進める。感情表出と国籍に関連して,中国人大学生を対象に調査を行う機会を得たので,状況や対人関係についての情報が感情表出にどのような影響を及ぼすかを調査し,日中比較を行った。予想では中国人大学生のほうが表出的であると考えたが,結果では総じて日本人大学生の方が表出的であった。また,中国の男子学生が特異的な表出パターンを示していた。
網羅的発現解析が明らかにした眼特異的転写産物は角膜再生の新規キープレーヤーか？

Gillespie症候群は無虹彩症と運動失調を特徴とする稀な遺伝病であり、ITPR1の変異で発症する。眼特異的な新規Itpr1アイソフォームが存在すること、新たに作製したItpr1ノックアウトマウスでは神経堤細胞由来の前眼部組織(角膜内皮・実質など)が消失することから、このアイソフォームが「神経堤細胞から前眼部組織の分化に関わるキープレーヤー」であると仮説を立てた。本研究では、新規アイソフォームの眼特異的な発現調節機構、前眼部組織の形成過程における経時的なRNA発現の変化、結合タンパク質から予測される機能解明から、角膜形成過程の分子メカニズムを明らかにし、角膜再生医療の基盤研究とする。
高等学校におけるボランティア活動の単位認定の実施状況に関する実証的研究

全国の高等学校に対して質問紙調査を実施したところ,ボランティア活動の単位認定を行っている学校は平成18年度以降増加する傾向にあったが,「認定している」学校の割合は全体の1割に満たないことがわかった。また,単位認定制度がある学校でも,生徒への周知が不十分で,実際に単位認定されるのは「19人」が約3割,「0人」も約3割であった。高等学校におけるボランティア活動の単位認定の全国的な実施状況を明らかにするために,全国5322校の高等学校を対象とした郵送調査法による質問紙調査を, 2008年7月から2008年9月にかけて実施した。その結果, 1538校(回収率28.9%)から回答を得た。具体的な内容に関しては,生徒が学校外で行っているボランティア活動について,「単位認定している」8.1%,「単位認定していない」91.9%であった。「単位認定している」と回答した学校で,単位認定を始めた時期は,「平成18年」192%,「平成19年」17.5%,「平成16年」10.8%,「平成15年」10.0%,「平成17年」10.0%が比較的多かった。平成19年度に単位認定した生徒数は,「0人」31.9%,「19人」31.1%,「1019人」10.9%,「2029人」6.7%,「3039人」5.9%,「4099人」5.9%,「100199人」2.5%,「200299人」3,4%,「300人以上」1.7%であった。単位認定の基準となる学修・活動時間は,「35時間」73.5%,「134時間」15.4%,「36時間以上」11.1%であった。生徒一人について認定した単位数の下限は,「1単位」85.8%,「2単位」12.3%,「3単位」1.9%であった。他方,上限は,「2単位」57.9%,「3単位」31.6%,「5単位以上」10.5%であった。生徒が活動した場所(複数回答)は,「高齢者施設」55.2%,「保育所」34.4%,「障害者施設」34.4%,「幼稚園」24.8%,「社会福祉協議会」24.8%,「特別支援学校」21.6%が比較的多かった。生徒のボランティア活動の単位認定について,「認定していない」と回答した学校で,今後の単位認定の予定に関して,「ある」1.9%,「ない」98.1%であった。高等学校におけるボランティア活動の単位認定を含めた具体的な実践状況を明らかにするために,11校の高等学校を対象とした面接法による聞き取り調査を2009年8月から9月にかけて実施した。その結果,ボランティア活動の単位認定について,制度としては導入されているが,実際に認定される生徒数は多くないことが明らかになった。また,制度導入を特色ある学校づくりの一環として位置づけたこと,あるいは,ボランティア活動が盛んであった地域性などを背景に,特に賛否等の議論がなされることなく導入に至るケースがあったこともわかった。単位認定も含めたボランティア活動促進関連業務について,校務分掌に明示されることは少なく,生徒指導関連部署や特別活動関連部署の担当者,あるいは,ボランティア活動関連部活動の顧問などがその役割を担うケースが多かった。それに関連して,ボランティア活動関連情報の収集・整理,外部との連絡・調整,生徒に対する事前・事後指導など,特定の少数の教員に過剰な負担がかかっている現状も垣間見られた。ボランティア活動の具体的な実践に関して,地域に根差したボランティア活動に着目すると,学校の所在する地域の文化や伝統に関連した活動に取り組むことが多かった。また,地域社会を知るという意味で,教科で地域を素材とした学習が行われるケースがあり,そうした学校では,地域に密着した活動が行われやすいこともわかった。なお,非都市部では,高校生の存在自体が貴重な地域資源で,地域社会の活性化の視点からも,高校生のボランティア活動が看過できない状況にあるところも散見された。高等学校におけるボランティア活動の単位認定の現状と課題を明らかにするために,平成20年度に約5300校に対して行った質問紙調査と平成21年度に高等学校11校・教育委員会3機関に対して行った聞き取り調査の詳細な分析・考察を行った。単位認定に関して,制度としては確立されていても,生徒への周知等が不十分で機能していないこと(制度を利用する生徒がいない,活動していても手続きを取らない生徒がいるなど),また,それに伴い単位認定される生徒数も少ないことが明らかになった。制度の位置づけとしては,私立の学校や総合学科を有する学校において,学校の特色を打ち出す一環として着目しており,学校設定教科・科目で単位認定に対応するなど具体的な方策が採られていることもわかった。ボランティア活動そのものについて,地域性に着目すると,学校の所在地の環境・教育資源等を効果的に活用していることがうかがえた。

都市部では交通の利便性を活かして,広範囲に渡って活動を展開していること,非都市部の活動では,地元の伝統や文化に根差した地域密着型の取り組みを行っていた。ただ,いずれの場合も,生徒の安全確保に十分な配慮をしている一方で,そのために教師に過度の負担がかかることを懸念している側面があることも浮き彫りになった。今後ボランティア活動の単位認定を定着・促進させるにはどうすべきか,また,新学習指導要領下でどのように高校生のボランティア活動を活性化・活発化させるのか,その方向性を提示できたことは有意義であるといえる。
流動層反応器への組込みを想定した水素透過能を有する金属薄膜の調製

CVD法により無機多孔質体の細孔内へのパラジウムを選択的に担持したパラジウム/多孔質アルミナ複合膜の調製法および水素透過性能について検討した。平均細孔径200nmの多孔質アルミナ管を用いたとき、パラジウムで細孔を埋め、水素のみ選択的に透過するためには、24時間の析出が必要であった。なお、このようにして得られた複合膜の同一条件下における窒素に対する水素の透過流束比は、ガスクロマトグラフによる窒素の検出限界を考慮して求めた結果、少なくとも500であった。得られた複合膜は、膜厚4.5μmの無電解めっき複合膜に比べ、673 Kで1.6倍の高い透過流束を与えた。この結果から、CVD法で作製した複合膜でのパラジウム担持量は、2.8μm程度の平滑なパラジウム複合膜の析出量に相当していることがわかった。また、水素透過流束は水素分圧の平方根の差に比例していたことから、透過の律速段階は原子状に解離した水素のパラジウム内の拡散にあることが明らかとなった。SEMおよびEPMAにより得られた、多孔質アルミナ管内の表面有効層(最表面から約5μm:平均細孔径、200nm)におけるパラジウム分布から、パラジウムは主として表面有効層の細孔内および表面付近に担持されていることが確認された。以上のことから、CVD法で作製した複合膜が優れた水素透過能を示すのは、パラジウムが細孔内に担持され機械的強度を失うことなく薄膜化が可能となったためと考えられた。
新規骨質評価法を用いたin vivoにおけるステロイド性骨粗鬆症骨質に関する研究

ステロイド性骨粗鬆症(GIO)は、長期ステロイド治療を受けている患者に発症し、骨折のリスクを高めると報告されている。その一方で、骨強度に影響を及ぼすGIOの骨質に関する研究報告は極めて少ない。本研究では、GIOモデルマウスを作製し、赤外分光法とマイクロCTを駆使してin vivoにおける骨質の化学的・構造学的な解析を行い、同一検体で行う力学特性評価で得られた骨強度との関わり合いを検討することを目的としていた。これまでの研究から、GIOモデルは作製に時間を要し、個体差が大きく、in vivoにおける力学特性と骨質の関わり合いを短期間に検討するのは難しいと判断し、動物をマウスからより骨質を特徴付けやすいラットに変更し、安楽死させたGIOモデルラットから摘出した骨の評価を行うことにした。また、当初の目的がin vivoの計測であったことから、新鮮骨の薄切片と一般的に用いられている樹脂包埋による薄切片を評価し、その違いを明らかにする。本年度は、凍結切片法で作製した大腿骨薄切片の保存方法について検討し、その内容の一部を国際学会(KJF-ICOMEP 2018,及び、CIF19th)で報告した。また、樹脂包埋した大腿骨については、その連続切片を作製し、赤外イメージングによる3次元の骨質解析を行った。この成果の一部は、国際学会(CIF19th)、第31回北海道骨粗鬆症研究会学術集会、第53回高分子学会北海道支部研究発表会で発表した。更に、樹脂包埋による薄切片についてはコラーゲン線維と骨アパタイトの配向性評価も行い、その研究成果は、第53回高分子学会北海道支部研究発表会で報告している。研究は下記の理由でやや遅延している。1.モデル動物をマウスからラットに変更した。2.ステロイド性骨粗鬆症モデルラットを作製するにあたり、申請から承認までに時間を要した。3.近赤外イメージング装置の干渉計が故障し、装置の修理に時間を要した。4. 13の理由により、研究の内容を一部変更した。5.胆振東部地震のため赤外イメージング装置が故障し、その修理に時間を要した。今後の研究の推進方策は下記に示す。1.ステロイド性骨粗鬆症ラット大腿骨と腰椎における、コラーゲン線維および骨アパタイトの配向性を検討し、これまで解析した骨質データとの相関を調べる。2.凍結切片法と樹脂包埋法で作製した薄切片から得られた骨質の比較検討を行う。3.これまで得た骨質データと力学特性の相関を詳細に解析する。4.学会や論文などで成果を発表する。ステロイド性骨粗鬆症(GIO)は、副腎皮質コルチコイド(GC:グルチコルチコイド)による治療で発症する副作用の一つで、長期ステロイド治療を受けている患者では、その3050%に骨折が起こると報告されている。GCは炎症を起こす疾患の治療に広く用いられ、膠原病、リュウマチ、ぜんそく、甲状腺の障害治療など、慢性病にも使用されていることから、GIO患者の年齢層は幅広く、性別に依らない。日本では約120万人以上がGCを3ヶ月以上使用している。GIOの特徴は、GC使用開始後すぐの骨量減少が812%と高く、その後は数パーセントずつ減少する傾向にある(GIOの管理と治療のガイドライン:2014改訂版)。また、他の骨粗鬆症と比べ、骨密度に対してより骨強度が低下する傾向にある。そのためGIOによる骨強度の低下は、骨質による影響が大きいと考えられている。GIO発症の機序については、GCによる骨芽細胞や骨細胞のアポトーシスの誘発、破骨細胞寿命の延長、二次性副甲状腺機能亢進症を介する骨密度の減少や微細構造破壊などが報告されている。その一方で、GIO患者の骨質に関する報告は極めて少ない。骨質の評価は、摘出した骨を計測・解析するのが一般的で、GIO以外の病態についてもin vivoによる骨質評価は殆ど行われていない。本研究では、骨質を制御する骨代謝をモニタしながら、in vivoにおける骨質の化学的な情報、構造学的な情報、力学特性を評価し、骨質と骨強度の関わり合いについて検討することを目的としている。具体的には、GIOモデルマウスを作製し、赤外分光法とマイクロCTを用いてin vivoにおける骨質の化学的・構造学的な解析を行い、同一検体で行うin vivoの力学特性評価で得られた骨強度との関わり合いを検討する。力学特性評価に使用する装置の購入が遅れた。また、納品された装置の治具に問題が発生し、その改善に時間を要した。その結果、検体の固定治具の開発が遅れた。ステロイド性骨粗鬆症(GIO)は、長期ステロイド治療を受けている患者に発症し、骨折のリスクを高めることが報告されている。

これまでの研究から、GIOモデルは作製に時間を要し、個体差が大きく、in vivoにおける力学特性と骨質の関わり合いを短期間に検討するのは難しいと判断し、動物をマウスからより骨質を特徴付けやすいラットに変更し、本研究の第一段階として、安楽死させたGIOモデルラットから摘出した骨の評価を行うことにした。これまで赤外分光法によるGIOの詳細な骨質解析の報告がないため、この研究を遂行すれば初のGIOの詳細な骨質データとなる。本研究ではよりin vivoの状態に近づくように、計測は新鮮骨で行うことにした。また、GIOと他の骨粗鬆症の骨質を比較検討するために従来法である樹脂包埋法による試料調整も行うことにした。一方、GIOモデルラット作製の承認に時間を要したことから、平成29年度は前年度に引き続き、中・近赤外分光法による骨質評価の検討、新鮮骨の評価法の確立、力学測定法の条件検討を中心に行った。中・近赤外分光法による骨質評価において、水分と血液の及ぼす影響については、その一部を国際学会(KJF-ICOMEP 2017,及び、CIF18th)で報告した。また、赤外分光法で得られる骨質の特徴についても論文(J Oral Biosci)で報告した。新鮮骨の骨質評価法の一部については、国際学会(ASBMR 2017 Annual Meeting)や論文(PlosOne)で報告した。ステロイド性骨粗鬆症モデルラットを作製するにあたり、申請から承認までに時間を要した。また、近赤外イメージング装置の干渉計が故障し、装置の修理に時間を要した。ステロイド性骨粗鬆症(GIO)は、長期ステロイド治療を受けている患者に発症し、骨折のリスクを高めると報告されている。その一方で、骨強度に影響を及ぼすGIOの骨質に関する研究報告は極めて少ない。本研究では、GIOモデルマウスを作製し、赤外分光法とマイクロCTを駆使してin vivoにおける骨質の化学的・構造学的な解析を行い、同一検体で行う力学特性評価で得られた骨強度との関わり合いを検討することを目的としていた。これまでの研究から、GIOモデルは作製に時間を要し、個体差が大きく、in vivoにおける力学特性と骨質の関わり合いを短期間に検討するのは難しいと判断し、動物をマウスからより骨質を特徴付けやすいラットに変更し、安楽死させたGIOモデルラットから摘出した骨の評価を行うことにした。また、当初の目的がin vivoの計測であったことから、新鮮骨の薄切片と一般的に用いられている樹脂包埋による薄切片を評価し、その違いを明らかにする。本年度は、凍結切片法で作製した大腿骨薄切片の保存方法について検討し、その内容の一部を国際学会(KJF-ICOMEP 2018,及び、CIF19th)で報告した。また、樹脂包埋した大腿骨については、その連続切片を作製し、赤外イメージングによる3次元の骨質解析を行った。この成果の一部は、国際学会(CIF19th)、第31回北海道骨粗鬆症研究会学術集会、第53回高分子学会北海道支部研究発表会で発表した。更に、樹脂包埋による薄切片についてはコラーゲン線維と骨アパタイトの配向性評価も行い、その研究成果は、第53回高分子学会北海道支部研究発表会で報告している。研究は下記の理由でやや遅延している。1.モデル動物をマウスからラットに変更した。2.ステロイド性骨粗鬆症モデルラットを作製するにあたり、申請から承認までに時間を要した。3.近赤外イメージング装置の干渉計が故障し、装置の修理に時間を要した。4. 13の理由により、研究の内容を一部変更した。5.胆振東部地震のため赤外イメージング装置が故障し、その修理に時間を要した。1.ステロイド性骨粗鬆症GIOモデルマウス作製と飼育、骨代謝マーカー検査、生化学検査、カルセイン投与を行う。
新規HPVワクチン関連神経免疫異常症候群モデルマウスを用いた病態発症機構の解析

ヒトパピローマウィルス(HPV)感染を病因とする子宮頸がんに対して開発されたHPVワクチンは感染予防に効果を示す一方で、多くの有害な副反応が世界中で報告され問題となっており病因・病態の解明が急務とされている。その症状は疼痛、運動障害、高次機能障害、内分泌異常など多岐にわたり、我々はHPVワクチン関連神経免疫異常症候群(HANS)と名付けた。HANSの病因・病態を明らかにするためHPVワクチンを用いてHANSモデルマウスを作製し、運動機能および脳の組織学的異常を示すマウスが得ている。本研究ではHANS発症メカニズムの解明および安全性の高いワクチンの開発を目指して、HANSモデルマウスを用いたワクチン作用機序の解析および宿主反応メカニズムの解析を行っている。同モデルマウスの脳の組織学的解析よりHANS患者で報告されているIL-17の増加が示唆されていた。さらに宿主反応メカニズムを明らかにするためにHPVワクチンおよび百日咳毒素処理を行い、HANSモデルマウスを作製しモデルマウスの病態である運動機能の低下がみられることを確認した。モデルマウスより視床下部を採取、脾臓より末梢リンパ球、血漿の採取をおこなった。それぞれの組織よりタンパク質、RNAを精製、また分離した末梢リンパ球の分画を行った。定量的PCR、アレイ、ウェスタンブロットによりサイトカインなどの発現を現在解析中である。上述したように、さらにHANSモデルマウスを作製し個体数を増やして免疫細胞分画および視床下部から組織を採取した。RNAおよびタンパク質を調整し発現因子の解析を行っている。この結果を基にモデルマウスに適応し、病態発症における宿主因子の応答機構の解明につなげる。HANS発症においてワクチンを接種した体内において何らかの過剰な免疫応答が起きていると考えられため、どの免疫経路が病態に関与しているか、マウスに移植し病態を再現できるかどうか検討する。ワクチンおよび百日咳毒素を投与し現在のHANSモデルマウスから調整した血液分画を、放射線照射による免疫不全マウスに移植しおよびPtx処理を行い、病態(運動機能、行動、組織、シグナル伝達、アポトーシス)について検討する。現在検討中のモデルマウスにおいて発現が変化していた因子に関して、病態発症に関与する細胞と同因子のシグナル伝達経路の関連について解析を行う。さらにワクチン中のHANS発症成分の同定に関しては、各成分(HPVワクチン、L1タンパク質もしくはAl塩)を免疫、Ptxを腹腔投与したマウスの行動学的解析、組織学的解析をさらに進める。本研究ではHANS発症メカニズムの解明および安全性の高いワクチンの開発を目指して、HANSモデルマウスを用いたワクチン作用機序の解析および宿主反応メカニズムの解析を行う。まず宿主反応メカニズムを明らかにするために野生型メスマウスにHPVワクチンおよび百日咳毒素処理を行いHANSモデルマウスを作製し、運動機能の低下がみられる個体を確認した。マウスより血液、脾臓などの免疫細胞および脳の組織を採取し、サイトカインなどの発現を測定し宿主の応答メカニズムを解析した。脳の組織切片を採取し自己免疫に深く関与するサイトカインIL-17の発現を免疫染色にて発現を調べたところワクチン+百日咳毒素投与群ではコントロール群と比較してIL-17を発現する細胞の増加が示唆された。ワクチン投与患者の髄液でIL-17の増加が示唆されており本モデルマウスとの共通性が示唆された。現在、脾臓より免疫細胞を単離し検討を行っている。上述したように、HANSモデルマウスの免疫細胞分画および解析を行い、個体数を増やして検討する必要があるがHANS患者にみられる病態と共通する結果を得ることができた。これをもとに宿主因子の応答の解明につなげる。

上述したように、さらにHANSモデルマウスを作製し個体数を増やして免疫細胞分画および視床下部から組織を採取した。RNAおよびタンパク質を調整し発現因子の解析を行っている。この結果を基にモデルマウスに適応し、病態発症における宿主因子の応答機構の解明につなげる。HANS発症においてワクチンを接種した体内において何らかの過剰な免疫応答が起きていると考えられるため、どの免疫経路が病態に関与しているか、マウスに移植し病態を再現できるかどうか検討する。ワクチンおよび百日咳毒素を投与し現在のHANSモデルマウスを作製し、平成29年度検討したように血液および胸腺から密度分離法、表面マーカービーズを用いて1)血漿、2) B細胞、3) T細胞、4)その他の白血球細胞成分に分離する。各成分を放射線照射による免疫不全マウスに移植しおよびPtx処理を行い、病態(運動機能、行動、組織、シグナル伝達、アポトーシス)について検討する。病態が検出できた群はさらに詳細に分離し検討する。ワクチン中のHANS発症成分の同定に関しては、各成分(HPVワクチン、L1タンパク質もしくはAl塩)を免疫、Ptxを腹腔投与したマウスの行動学的解析、組織学的解析をさらに進める。HANS発症においてワクチンを接種した体内において何らかの過剰な免疫応答が起きていると考えられため、どの免疫経路が病態に関与しているか、マウスに移植し病態を再現できるかどうか検討する。ワクチンおよび百日咳毒素を投与し現在のHANSモデルマウスから調整した血液分画を、放射線照射による免疫不全マウスに移植しおよびPtx処理を行い、病態(運動機能、行動、組織、シグナル伝達、アポトーシス)について検討する。現在検討中のモデルマウスにおいて発現が変化していた因子に関して、病態発症に関与する細胞と同因子のシグナル伝達経路の関連について解析を行う。さらにワクチン中のHANS発症成分の同定に関しては、各成分(HPVワクチン、L1タンパク質もしくはAl塩)を免疫、Ptxを腹腔投与したマウスの行動学的解析、組織学的解析をさらに進める。試薬購入にあたり金額が不足したため、翌年度予算と合算して支払い予定である
成人における疑似コレラ下痢症から分離されたロタウイルスの遺伝子レベルでの解析

ロタウイルスは小児下痢症の主要病因であることが明らかにされているが、成人の下痢症患者よりロタウイルスが分離されたという報告はわが国では皆無である。われわれは最近重症の脱水・下痢症のため疑似コレラの診断のもとに隔離・治療された成人患者から本邦で初めてロタウイルスを分離した。これまでロタウイルスによる成人の重症下痢症例は免疫力の低下した老人においてのみ報告されているが、本症例には免疫不全などの重症感染症に至る要因は見当たらなかった。われわれは本症例ように免疫があると考えられる成人に重症の下痢症を引き起こしたロタウイスル株がこれまで報告されている株とは異なる特殊な株なのか、また小児間で流行しているロタウイスル株とは異なるのかという点について遺伝子レベルで検討を行なった。すなわち、患者の便中より分離されたロタウイスル株のエレクトロフェロタイプ、VP7血清型、さらにRNA-RNAハイブリダイゼーションによりゲノグループを決定し、従来報告されている株および同時期に小児間で流行していた株と比較した。その結果、分離されたロタウイルスは、エレクトロフェロタイプ、RNA-RNAハイブリダイゼーションより、従来から報告されているDS-1ゲノグループに属することが明らかにされ、またPCR法により決定されたVP7血清型もG2であり、DS-1ゲノグループ株として矛盾しなかった。さらに同時期に小児間で流行していたロタウイルス株を検討したところ、小児数例より本患者と同一の株が認められた。すなわち本研究は、小児間でのロタウイルス流行株が成人にも重症下痢症を引き起こしうることを遺伝子レベルで初めて証明し、この結果は消化器内科の分野において極めて意義深い結果をもたらすものと考えられた。
ミオシン速度改変による植物特異的細胞内交通機構と高次機能の解析

原形質流動の主な駆動力として知られるシロイヌナズナミオシンXIに,速度の異なる他種ミオシンのモータードメインを融合することで,速度改変型キメラミオシンXIを開発した。高速・低速型ミオシンXIの発現により原形質流動が高速化・低速化し,植物が大型化・小型化した。植物サイズとミオシン速度のリニアな相関から,原形質流動速度が植物サイズを規定している支配因子の一つであることを世界ではじめて明らかにした。本研究では,植物ミオシンに速度レベルの異なる他種ミオシンのモータードメインを融合し植物体で発現させ,細胞内交通や植物高次機能への影響を解析する。これまでにない全く新しい試みから,ノックアウト等の一般的方法論では得られない知見を抽出する。高速型(High-speed)作製には生物界最速であるシャジクモミオシンXIのモータードメイン,低速型(Low-speed)作製には動物ミオシンVbのモータードメインを用いた。1.定量化。原形質流動の主な駆動力とされるミオシンXI-2の速度改変型キメラを植物で発現させた。結果,高速型では植物体が大型化し,逆に低速型では植物体が小型化することが明らかとなった。H24年度では,詳細な定量解析を行った。結果,植物の大型化と小型化は,それぞれ細胞サイズの大型化と小型化に起因することが明らかとなった。2.原形質流動に関与するミオシンメンバーの速度改変。原形質流動の駆動力として機能する他のミオシンXIメンバー(XI-1, XI-K)にシャジクモミオシンモータードメインを融合し高速化を施した。それぞれのシングルノックアウト株にアグロバクテリウムを介して形質転換し,T3ホモラインを確立した。表現型解析を行ったところ,高速型XI-1の発現は植物のサイズに影響を及ぼさなかったが,高速型XI-Kの発現は植物を大型化する傾向が見られた。影響の違いは,それぞれの発現レベルや原形質流動へ寄与と一致することが示唆された。3.原形質流動以外のミオシンXIメンバーの速度改変。原形質流動に関与する4メンバー以外にも,多数のミオシンXIメンバーが存在し,それぞれの機能に関してはほとんど明らかになっていない。H24年度は,これらミオシンXIメンバー全てに高速化・低速化を施した。1,原形質流動の駆動力として機能する他のミオシンXIメンバー(XI-1, XI-B, XI-K)にシャジクモミオシンXIあるいは,ヒトミオシンVのモータードメインを融合し,高速型および低速型ミオシンXI-1, B, Kを作製した。2,それぞれのシングルノックアウト株(xi-1, B, k)に形質転換し,T3ホモラインを確立した。3,表現型解析の結果,高速型XI-1,Bの発現は植物のサイズに影響を及ぼさないことが明らかとなった。4,高速型XI-Kの発現は植物を大型化した。しかしながら高速型XI-Kによる大型化は,高速型XI-2と時期や組織において違いがあることが明らかとなった。高速型XI-2は植物成長における前期(栄養成長期)に効果が大きく,高速型XI-Kは植物成長における後期(生殖成長期)に効果が大きい傾向が見られた。葉柄の長さにほぼ変化はなかったが,葉面積および乾燥重量は高速型で約30%増大していた。また単位重量あたりのクロロフィル含量は,高速型でも野生株と変化が見られなかった。高速型ミオシンXI-Kによる大型化は,細胞の品質を保持したまま,マスとして増大していると考えられる。5,Promoter GUS解析により,XI-Kの発現が,葉柄で特異的に抑制されていることが明らかとなった。大型化や発現に特徴的な違いが見られた葉柄表皮細胞の原形質流動における速度改変型ミオシンXI-Kの影響を見た。XI-Kノックアウト株に,高速型・低速型ミオシンXI-Kを発現させたが,原形質流動速度は高速化・低速化せず,ほぼXI-Kノックアウトと同じレベルであった。XI-Kノックアウト株に,野生型ミオシンXI-Kを発現させてはじめて,原形質流動速度は,野生株レベルまで回復した。以上の結果より,シロイヌナズナは,組織や発達段階に応じて,原形質流動のミオシンモーターを使い分けていることが示唆された。植物では、原形質流動に代表されるようにアクチンーミオシンシ系による特異的な細胞内輸送システムが発達している。本研究では、植物ミオシンに速度レベルの異なる他種ミオシンのモータードメインを融合することで、速度改変型キメラミオシンを開発する。速度改変型キメラミオシンを培養細胞や植物体に発現させ、細胞内交通や植物高次機能への影響を解析するという全く新しい試みから、ノックアウト等の一般的方法論では得られない知見を抽出する。本年度は、原形質流動の駆動力として知られるシロイヌナズナミオシンXI-2のモータードメインを他種ミオシンと置換することによって、速度改変型キメラミオシンを開発した。高速型(Hyper active)作製には生物界最速であるシャジクモミオシンXIのモータードメインを用いた。