hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不安定核による(α、n)天体核反応の研究

1)主要測定装置であるガス検出器(GEM-MSTPC)の性能評価を行なった。我々の実験条件は、低圧(Heベースガス120 torr程度)であるため、これまで研究は少ない。CERN製50μmのGEM1段では増幅率が数10倍程度で足りない、又2段では数100倍得られるがafter pulseが現れる問題がある等の結果を得た。林栄精機製400μmのGEMを用いると、低圧(He+CO_2 120 torr)で安定に作動し10^3の増幅度が得られる事、他の基本性能も実験条件を十分に満たす事がわかった。これらに関して、国際会議1件、国内学会で3件の報告を行った。陽イオンのわずかなfeedbackでも10^6/secの入射ビームに対しては問題となるため、シールド用のGEMシートを増幅用GEMの直前に置き、ドリフト電場も強くし陽イオンのsweepを早くする。これらの条件でビームを用いて性能確認後、^<13>C(α,n)反応及び^8Li(α,n)反応の測定を行う。実験遂行上問題となる、中性子検出器系のbackground調査と対策を完了した。又、トリガーを少なく押さえるためのveto counterの設計と性能評価を行った。2)原研タンデム加速器を用いた天体核反応率の測定を引き続き行っており、^8Liによる荷電粒子放出反応で新たな実験結果を得ている。論文1編を投稿し、国際会議で4件の口頭発表を行った。これらは又、超新星爆発時のr過程ネットワーク計算に新たな入力情報を与えている。1)主要装置であるガス検出器(MSTPC)の改造を開始した。これまでは増幅機構に通常のアノードワイヤーを用い、gating gridを装備して有効トリガーのあった時のみ増幅を行い、40kHzまでは安定に作動させてきた。今回増幅機構にGEMを用い(GEM-MSTPC)、より高い計数率での測定を可能とし、又カソードを細分化することにより、より高い位置分解能を得る事を目的とする。設計は終了し、一部の制作を開始。現在GEMの性能評価を行っている。2)原研タンデム加速器を用いた天体核反応率の測定を引き続き行っている。今回は^8Li(d,t),(d,α)反応を、入射エネルギー4点の範囲ではあるが、測定することができた。現在解析中であるが、有意義な結果が得られそうで、今後多くの入射エネルギーと他の反応チャネルの測定を試みる。その他の核種生成実験も継続して行っている。3)新しいGEM-MSTPCとTRIAC加速装置を用いて、^8Li(α,n)反応を更に精度良く測定するためのsimulationを開始した。これまでの測定方法に比べ、エネルギー精度で数倍、統計精度で10倍の結果を得る見通しができた。1)主要装置であるガス検出器(MSTPC)の改造を行った。今回増幅機構にGEMを用い(GEM-MSTPC)、より高い計数率での測定を可能とし、又カソードを細分化することにより、より高い位置分解能を得る事を目的としている。検出器の製作は完了し、性能評価を行っている。He(90%)+CH4(10%)とHe(70%)+CO2(30%)の二種類のガスに対して印加電圧を変えながら増幅度を測定した結果、GEMは通常の3段は必要なく1段で充分な増幅度が得られることがわかった。今後、計数率による増幅度の変化や位置分解能を調べ、ビームを用いたテストを行っていく。2)原研タンデム加速器を用いた天体核反応率の測定を引き続き行っており、^8Liによる荷電粒子放出反応、及び^<12>B(α,n)反応を広い入射エネルギー範囲で測定した。特に、^8Li(d,t)反応の実験値は理論的予測に比べて約10倍、又^<12>B(α,n)反応は約2倍大きいことがわかり、超新星爆発時のr過程ネットワーク計算に新たな入力情報を与えた。3)新しいGEM-MSTPCと高エネルギー加速器研究機構のTRIAC加速装置を用いて、^8Li(α,n)反応を更に精度良く測定するための実験simulationを行った。これまでの測定方法に比べ、エネルギー精度で数倍、統計精度で10倍の結果を得る見通しができ、TRIACでの実験として提案し、実験評価委員会で採択された。実験は来年度から開始する。

陽イオンのわずかなfeedbackでも10^6/secの入射ビームに対しては問題となるため、シールド用のGEMシートを増幅用GEMの直前に置き、ドリフト電場も強くし陽イオンのsweepを早くする。これらの条件でビームを用いて性能確認後、^<13>C(α,n)反応及び^8Li(α,n)反応の測定を行う。実験遂行上問題となる、中性子検出器系のbackground調査と対策を完了した。又、トリガーを少なく押さえるためのveto counterの設計と性能評価を行った。2)原研タンデム加速器を用いた天体核反応率の測定を引き続き行っており、^8Liによる荷電粒子放出反応で新たな実験結果を得ている。論文1編を投稿し、国際会議で4件の口頭発表を行った。これらは又、超新星爆発時のr過程ネットワーク計算に新たな入力情報を与えている。
トウアズキ種子レクチンの構造と機能に関する研究

トウアズキ種子から単離した分子量が異なる2種のレクチンを対象としてその構造と機能の関係を解明することを目的として研究を進め、これまでに以下のような結果を得た。まず、分子量13万の細胞凝集素APAについて糖質との相互作用を紫外吸収差スペクトルおよび蛍光スペクトルにより解析し、その結果、。APAの糖結合部位にはトリプトファンが存在することおよびこのトリプトファン残基は糖質の結合により分子表面から分子内部へ移行することが明らかとなった。また、APAの糖結合部位にはガラクトピラノシド認識部位の外にオリゴ糖を収容しうるサブサイトが存在することが示唆された。さらに、N-ブロモスクシンイミド(NBS)によるトリプトファン残基の化学修飾の結果から、APAの2個の糖結合部位はいずれもトリプトファン2残基を含むが、そのうち1残基は直接糖質との結合に関与し、他の1残基は糖結合部位の構造保持に寄与することが判明した。一方、分子量6万4千のアブリンaに対する糖質の結合を平衡透析法、紫外吸収差スペクトルおよび蛍光スペクトルにより検討し、アブリンaのB鎖上には糖質に対する親和性を異にする高親和性部位と低親和性部位の2つの糖結合部位が存在することおよびそれぞれの部位はトリプトファン残基を含むことを明らかにした。また、これら結合部位における糖結合能はpH5以下で著しく低下することを認めた。円二色性スペクトルによる測定結果から、酸性領域においてはアブリンa分子の主鎖構造に乱れを生じ、このことが酸性領域における糖結合能の低下をもたらす主たる要因であることが推定された。さらに、NBSによるトリプトファンの化学修飾の結果から、アブリンa分子中に存在する2つの糖結合部位のうち、いずれか一方の部位においてはトリプトファン1残基が糖質との結合に重要な寄与をしていることが示唆された。
学齢期障害児の放課後生活支援に関する実証的研究

本研究は、学齢期障害児の放課後生活の実態と支援の課題を明らかにするために、特別支援学校に通う児童の保護者を対象に放課後・休日支援の利用実態に関する質問紙調査を、また、学童保育の指導員を対象に障害児の受け入れ実態に関する質問紙調査を実施した。その結果、第1に、特別支援学校の児童が放課後利用できる社会資源の選択肢が乏しいことが示された。第2に、学童保育指導員が障害児をどう集団活動にさせるかに困り感を抱えていることが示された。本研究は、(1)鳥取県における学齢期障害児の放課後生活の実態について明らかにするとともに、(2)放課後の生活支援の拠点の一つとしての学童保育において、健常児と障害児が共に育ち合う保育実践のあり方について検討することを目的として、アンケート調査、インタビュー調査、及び縦断的事例研究を通して実証的に解明することを計画した。研究1年目の本年度は、全県調査の準備段階の予備調査として、特別支援学校(知的障害、病弱・肢体不自由)の児童の保護者を対象に、児童の放課後実態に関するアンケート調査を実施した。調査項目としては、津止ら(2004)を参考にしながら、鳥取県に特徴的な家族特性や地域性が明らかになるよう、(1)家族の特性や地域性にかかわる項目、(2)放課後・休日の過ごし方に関する項目、(3)放課後・休日に利用している制度・サービスについて、(4)放課後・休日にかかわる保護者の支援ニーズ、要望について、といった観点から作成した。結果としては、社会的資源の選択肢が限定されている鳥取県においては、放課後・休日支援における児童デイサービスの役割がきわめて大きいこと、また児童の介助程度による放課後・休日支援の利用実態、利用目的の違い等が明らかになった。支援の充実を図るために、児童デイサービスの活動内容のあり方については今後、検討すべき課題として残されている。もう1つの研究課題の柱である障害児を含む学童保育の事例的実践検討についても継続中である、今後、児童デイサービス、学童保育等の活動内容についても調査をすすめ、障害児の放課後生活支援のあり方について考察する予定である。研究期間2年目である本年度の研究成果として、1点目は、全県調査の準備段階の予備調査として、特別支援学校(知的障害、病弱・肢体不自由)の児童の保護者を対象に、児童の放課後実態に関するアンケート調査を実施した結果を論文にまとめた。主な結果としては、社会的資源の選択肢が限定されている鳥取県においては、放課後・休日支援における児童デイサービスの役割がきわめて大きいこと、また児童の介助程度による放課後・休日支援の利用実態、利用目的の違い等が明らかになった。研究成果の2点目は、学齢期障害児の放課後生活の実態の特徴をより明らかにするために、学齢期健常児の放課後生活実態との対比において捉えようと試みた。学齢期健常児の保護者に対して放課後実態に関する質問紙調査を実施した結果について国際会議(OMEP)で発表した。主な結果としては、今の日本においては、子どもの発達を保障するためには学齢期健常児にとっても放課後の学童保育のニーズが高いこと、特にそのニーズは、母親が就労していない家庭においてより高い傾向にあることが明らかになった。もう1つの研究課題の柱である障害児を含む学童保育の事例的実践検討については研究継続中である。本研究は、鳥取県における学齢期障害児の放課後生活の実態について明らかにするとともに、放課後の生活支援の拠点の一つとしての学童保育における障害児支援のあり方について、質問紙調査、インタビュー調査、及び縦断的事例研究を通して実証的に検討することを目的としている。そのために、(1)鳥取県における学齢期にある障害児の放課後生活の実態についての解明、(2)鳥取県の学童保育における障害児の受け入れ実態についての解明、(3)障害児を受け入れている学童保育における保育内容・方法の検討、の3点について研究を計画・遂行してきた。研究3年目の平成23年度は、目的(1)に関して、学齢期障害児の放課後生活支援にあたっては、学校、学童保育、児童デイサービスといった関係機関の連携が図られ、個別の教育支援計画が策定されることが求められると考えられるため、その実施実態について鳥取県の特別支援学校(知的障害、病弱・肢体不自由)児童の保護者を対象にアンケート調査を行った。その結果、子どもの放課後生活まで見通した生活全体を豊かに保障するための支援者会議の実施、個別の教育支援計画の策定及び活用については不十分な状況であった。目的(2)に関しては、鳥取県の学童保育における障害児の受け入れ実態について、学童保育の指導員を対象とした質問紙調査の内容を検討した。来年度、実施する計画をしている。目的(3)に関しては、これまで学童保育実践検討会を継続して行ってきており、統合学童保育における保育内容、保育方法のあり方について検討した。

今後、(2)の実態調査の結果とあわせて検討することにより、学齢期障害児の放課後生活支援の重要な一端を担っている学童保育のあり方について提言していけるものと考える。本研究は、鳥取県における学齢期障がい児の放課後生活の実態について明らかにするとともに、放課後の生活支援の拠点の一つとしての学童保育における障がい児支援のあり方について、アンケート調査、インタビュー調査、及び縦断的事例研究を通して実証的に検討することを目的とした。今年度は、学齢期障がい児の放課後生活と家族の就労を支援する拠点のひとつとして大きな役割を担っている学童保育(放課後児童クラブ)における障がい児の受け入れに関する調査を実施した。指導員へのインタビュー調査から得られた質的データを基に作成した質問紙を、県内の全学童保育所を対象に送付した。調査の観点の1つは、障がい児の受け入れ状況について(受け入れの判定基準、実施要綱や受け入れ定員の有無、実際にどのような障がい児を何人、何年生まで受け入れているか、障がい児保育を行う指導員の体制、保育を実践するうえでの指導員の具体的な困り感など)の実態を明らかにすることであった。また、もう1つの観点は、実態を踏まえ、今後、学童保育において障がい児保育を拡充するために指導員が必要と考えている方策や、障がい児にとって学童保育がどのような役割を果たしていると考えるかといった指導員の役割観等について明らかにすることであった。これらが、運営主体や職員体制、施設環境といった要因とどのように関連するかといった観点も含め、分析を進めているところである。また、縦断的事例検討からは、障がい児の放課後生活を支援してきた学童保育が、小学校から中学校への移行をどのようにサポートするかといった課題が明らかになった。当初計画していたアンケート調査の立案と実施、統合学童保育の実践検討会等を行ってきている。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究期間の最終年度である来年度は、今年度内容を検討した学童保育における障害児の受け入れ実態についての質問紙調査を遂行し、これまでの成果を報告書にまとめていく予定である。
子宮頸部悪性腺腫の遺伝子診断

子宮頚部悪性腺腫と診断され治療された症例のパラフィン包埋病理標本よりDNAの抽出が可能であった23症例と子宮頚部の腺癌・扁平上皮癌・良性頚管腺病変のDNAを用いて、これら子宮頚部におけるSTK11遺伝子のExon1-9における遺伝子変異を検索した。多施設より収集された23症例については病理組織診断を再検討し、腺癌・悪性腺腫(高・低悪性度)・胃底腺化生に分類した。病理標本からは実体顕微鏡もしくはLaser capture microdissectionを用いて腺病変部分のみを採取してDNAを抽出した。PCR-SSPC法にてスクリーニングし、変異バンドを検出した症例から変異遺伝子のクローニングを行い、悪性腺腫では7つの変異遺伝子が同定された。他の組織型では腺癌に分類されたPeutz-Jeghers症候群の1例に遺伝子変異を同定した。良性と考えられた胃底腺化生や頚管深部のnabothian cystには遺伝子変異は検出されなかった。変異を同定した症例の正常組織部分からもDNAを抽出し、Peutz-Jeghers症候群の1例ではgermline mutation,悪性腺腫ではsomatic mutationであることを確認した。いずれの検体もDNAの抽出から最低2回再検し、再現性のあることを確認した。変異はexon1・4・5およびintron7-exon8の境界にあり、7個中4つの変異がexon1に見出された。変異はPeutz-Jeghers症候群の症例も含めていずれもmissense mutationであり、Peutz-Jeghers症候群において多く報告されているnonsennse mutationはみられなかった。悪性腺腫の高悪性度4例中3例、低悪性度7例中3例に変異があったのに対し、粘液性腺癌19例(Peutz-Jeghers症候群のぞく)では1例の遺伝子変異症例を見るのみであり、有意に(p=0.0045、Fisher's test)組織型との関連があることが示された。悪性腺腫11例中変異を有す6症例と変異のない5症例の予後を追跡比較したところ、臨床病期には2群の差が無いにもかかわらず、変異群では6例中4例が2年以内に死亡したのに対し、変異の無い群では5例とも2年半以上生存していた(p=0.038,Logrank test)。なお、STK11遺伝子の存在する19番染色体短腕(19p13.3)におけるマイクロサテライトマーカーを用いた検索およびAndrogen receptorを用いたクロナリテイー解析については、悪性腺腫に関してパラフィン包埋切片から採取されうるDNA量に限りがあるため、再現性に乏しく判定は困難であり、診断法としてはSTK11遺伝子変異の検索が優った。子宮頸部悪性腺腫と診断され手術を施行した22症例を対象にパラフィン包埋病理標本より、実体顕微鏡下もしくはLaser capture microdissectionを用いて腺病変部分のみを採取し、DNAを採取した。うち2症例については腺腫部分が標本中に占める割合が少なく、充分なDNA量を得ることが出来なかったが、20症例の腺腫部分のDNAを用い、STK11遺伝子のExon1-9における遺伝子変異をPCR-SSCP法にてスクリーニングし、9症例に変異バンドを検出した。うち5症例についてさらに変異遺伝子のクローニングを行い、7つの変異遺伝子を同定した。同定された変異はPeutz-Jeghers症候群での報告が多いnonsense mutationは無く、missense mutationであった。また、STK遺伝子変異を有した症例は病理組織学診断上、子宮頸部悪性腺腫の典型例にみられた。変異はexon1,4,5,8に同定され、他の変異バンドを検出した症例についても解析中である。現在同一症例中2つのexonについて変異バンドを有したものについては、DNAを再度パラフィン標本より採取して確認実験を実施している。Peutz-Jeghers症候群におけるSTK遺伝子変異が多いのではないかとの報告のあるexon6については、現時点での検索では変異は見出されていない。婦人科疾患での異常の報告があるp53、K-rasの各癌関連遺伝子についても同様のPCR-SSCPを用いたスクリーニングを行ったが、p53癌抑制遺伝子に関しては1症例に変異バンドが検出され、missense mutationを同定した。K-rasについては変異バンドは検出されなかった。また、手術時に正常組織を採取し得た症例については、19番染色体短腕(19p13.3)にあるマイクロサテライトマーカーを用いてdeletion mapを作成中である。マーカーD19S216を用い現在14症例まで解析し、うち4症例にLOHと判定し得た。症例数の追加および、マイクロサテライトマーカーD19S565,D19S894を用いた検索も施行中である。

他の組織型では腺癌に分類されたPeutz-Jeghers症候群の1例に遺伝子変異を同定した。良性と考えられた胃底腺化生や頚管深部のnabothian cystには遺伝子変異は検出されなかった。変異を同定した症例の正常組織部分からもDNAを抽出し、Peutz-Jeghers症候群の1例ではgermline mutation,悪性腺腫ではsomatic mutationであることを確認した。いずれの検体もDNAの抽出から最低2回再検し、再現性のあることを確認した。変異はexon1・4・5およびintron7-exon8の境界にあり、7個中4つの変異がexon1に見出された。変異はPeutz-Jeghers症候群の症例も含めていずれもmissense mutationであり、Peutz-Jeghers症候群において多く報告されているnonsennse mutationはみられなかった。悪性腺腫の高悪性度4例中3例、低悪性度7例中3例に変異があったのに対し、粘液性腺癌19例(Peutz-Jeghers症候群のぞく)では1例の遺伝子変異症例を見るのみであり、有意に(p=0.0045、Fisher's test)組織型との関連があることが示された。悪性腺腫11例中変異を有す6症例と変異のない5症例の予後を追跡比較したところ、臨床病期には2群の差が無いにもかかわらず、変異群では6例中4例が2年以内に死亡したのに対し、変異の無い群では5例とも2年半以上生存していた(p=0.038,Logrank test)。なお、STK11遺伝子の存在する19番染色体短腕(19p13.3)におけるマイクロサテライトマーカーを用いた検索およびAndrogen receptorを用いたクロナリテイー解析については、悪性腺腫に関してパラフィン包埋切片から採取されうるDNA量に限りがあるため、再現性に乏しく判定は困難であり、診断法としてはSTK11遺伝子変異の検索が優った。
バングラデシュにおける貧困とサイクロン被害の因果関係に関する研究

2011年度は、バングラデシュにおける355世帯を対象とした質問紙調査をもとに、バングラデシュにおける貧困とサイクロン被害の因果関係に関する研究を実施した。具体的には、大型の熱帯低気圧による被害が甚大なバングラデシュ南部沿岸地域において、自然災害の被害と貧困の問題に焦点を当て、2007年にバングラデシュを襲ったサイクロン「シドル」の被災地における実証的研究をもとに、災害脆弱性と貧困の課題を分析した。本研究の目的は、地域の災害脆弱性を微視的視座明らかにし、被害抑止と被害軽減の視点から防災政策の課題を提起することを通じて、地域の災害脆弱性の克服と、防災力の向上を目指すことにある。具体的には、バングラデシュにおけるサイクロン災害とそれによって発生する被害を統計的に分析することにより外力への理解を図り、これまでの構造物による防災政策の課題を、被害軽減の要であるサイクロンシェルター支援を分析することにより考察した。また、バングラデシュ国ノアカリ県ハティア郡ハティア島における6地域355世帯を対象とした質問紙調査をもとに、(1)貧困に起因する「避難意思阻害要因」によって避難行動がとれないといった低い防災力が災害被害を拡大すること、(2)生活基盤の弱い貧困層が災害リスクの高い堤外地に移り住むことによって高まる地域の災害脆弱性、を微視的視座から実証的に明らかにした。これらの研究を通じて、貧困が災害被害に及ぼす影響を明らかにし、災害に対する配慮がなされた貧困削減政策が実践されなければ、貧困に起因する災害被害拡大要因に対処することは難しいことを指摘した。また、防災は、住民の日々の営みの中に位置づけられなければその効果を十分に発揮することはできず、他の開発課題同様、そこに暮らす人びとの参加を前提とした政策立案と、その効果を低減する可能性のある、貧困などの地域の固有要因への働きかけを同時に実施していく必要性を提起した。バングラデシュは洪水・干ばつ・サイクロンといった自然現象が、災害と呼ばれる規模で人びとを襲う災害リスクの高い国である。サイクロンだけをみても1970年に50万人、1991年には14万人の人びとがサイクロンによって命を奪われている。これらは20世紀以降に世界を襲ったサイクロンによる人的被害(台風・ハリケーンを含む)の上位2位を占めている。最近では、2007年11月15日午後18時半頃に南部沿岸部に上陸した観測史上最大級のサイクロン「シドル(SIDR)」によって、死者・行方不明者計4000人以上、被災者約900万人という大きな被害が発生した。本研究の目的はバングラデシュにおけるサイクロン被害と貧困の因果関係を明らかにし、今後の防災政策にむけた論点を抽出することにある。1、インタビューによる質的研究サイクロン「シドル」被災地10箇所を訪問し、被災者計100人に対してベンガル語による半構造的インタビュー調査を実施した。この調査から被災当日の住民の行動をグラウンデッド・セオリー・アプローチに基づいて分析したところ、サイクロンの襲来の事実を知りながらも、事前に避難行動に移ることのできない住民の存在が明らかになった。2、質問票をもちいた量的研究ノアカリ県ハティア島におけるサイクロン高度危険地域200世帯に対し、質問票を用いた家計調査、移住に関する調査、避難に対する意識調査を実施した。この調査結果を分析したところ、(1)家財の盗難(2)家畜の被害、(3)警報への不信、が住民の避難意思阻害要因として明らかとなった。また、堤外地の高度危険地域に最貧困層が土地を求めて移住する現象が特徴的にみられた。サイクロン高度危険地域である南部沿岸地域は、土壌侵食が激しいことから、移り住んだ土地がさらに浸食で失われるケースもあり、住民は複数回にわたって移住を繰り返している。住民はサイクロンと土壌侵食という二重の自然災害によって、生活がさらに困窮すると考えられる。

また、防災は、住民の日々の営みの中に位置づけられなければその効果を十分に発揮することはできず、他の開発課題同様、そこに暮らす人びとの参加を前提とした政策立案と、その効果を低減する可能性のある、貧困などの地域の固有要因への働きかけを同時に実施していく必要性を提起した。
逆生理学的研究手法を用いた反芻動物の脂質代謝調節因子の同定と機能解析

我々は脂肪組織で発現する新規アデイポカイン(Adipokine)としてマウスケメリン(Chemerin)とその受容体を報告している。平成20年度は、ウシケメリンとその受容体の遺伝子をクローニングし、塩基配列の解析を行った。GenomeNetを用いたBlastan解析を行ったところ、ウシケメリンとケメリン受容体と思われる遺伝子配列が得られた。これらの配列を基に、特異的プライマーを作成し、ウシケメリンとケメリン受容体全長を決定した。黒毛和種牛の組織からtotal RNAを抽出し、ウシケメリン遺伝子分離と遺伝子発現に供した。ウシケメリンcDNAは3個のExonからなり、ORFは489bpであった。得られた配列はヒトとマウスの塩基配列との相同性は、各々79%と69%であり、アミノ酸配列の相同性は、各々74%と60%であった。ケメリン受容体のORFは1089bpであり、ヒトとマウスの塩基配列と84%と79%の相同性を示した。各組織ごとにおけるケメリンの遺伝子発現量については、肝臓と脂肪組織で高い発現が見られたが、ケメリン受容体は脂肪組織で高い発現量を示したものの、各組織において差は見られなかった。ウシ分化脂肪細胞において、ケメリンとケメリン受容体の遺伝子発現量は脂肪細胞分化に伴い発現量は上昇した。また、分化脂肪細胞でのTNF-αの処理はケメリンとケメリン受容体の遺伝子発現量を増大させた。以上のことから、ウシ脂肪組織でも同様に脂肪細胞由来のアデイポカインが存在し、脂質代謝系に影響を与える可能性が示唆された。本研究では、脂肪蓄積に関連する新しい因子の探索法として、これらの公開されているDNAデータベースに着目し、様々な組織と比較して脂肪組織に高く、もしくは限局して発現する遺伝子の中で、脂肪蓄積との関連が未だ報告されていない未知および既知の分子について、脂肪細胞分化および脂質分解との関連について実験を行った。その候補遺伝子の中から、脂肪細胞分化と脂肪蓄積過程におけるChemerinとその受容体の役割について調査した。Chemerinは皮膚細胞においてRARβ、γ選択性レチノイドである、タザロテンにより誘導される遺伝子として同定された分泌タンパク質で、ChemerinはGiタンパク質と共役するオーファンGPCRであるGPCR-DEZ(Chemerin受容体)の内因性リガンドである。ChemerinとChemerin受容体はマウスの各組織での発現量を比較したところ、広い範囲での発現が見られたが、特に肝臓と脂肪組織で高く発現した。脂肪組織では血管間質細胞より脂肪細胞で高く発現した。また、普通食給餌マウスと比較して、高脂肪食給餌マウスの各脂肪組織においてその遺伝子発現は上向き調節された。3T3-L1脂肪細胞の分化過程において分化誘導後、ChemerinとChemerin受容体の遺伝子発現量は増加した。3T3-L1脂肪細胞へのtroglitazoneの処理によってこれらの遺伝子発現が上向き調節された。さらに、脂肪細胞へのChemerinの直接作用を調べるために、3T3-L1脂肪細胞にChemerinを処理した結果、ERK1/2のリン酸化を促進し、脂質分解が刺激された。以上の結果から、Chemerinは新規アディポカインとしてChemerin受容体を介して脂肪細胞分化および脂肪蓄積を調節する制御機構が存在することが示唆された。
真正細菌に存在する細胞内底分子RNA(scRNA)の機能解析

真正細菌SRP Rは、グラム陰性細菌と陽性細菌では大きく異なり、陰性細菌では100残基程度で2次構造は哺乳類のドメインIV領域に相当する部分のみからなる。これに対して、枯草菌やウェルシュ菌では、ドメインIVに加えて、度メインIやIIに相当する構造を持っていた。本研究においても枯草菌や大腸菌でのSRP RNA条件欠損株を作成したところ、いずれも強い増殖阻害がみられたことから、増殖に必須な遺伝子であることがわかった。さらに、SRP RNA中、特にドメインIV領域が機能上重要であることが判明した。真正細菌におけるSRP RNAの機能をさらに詳細に検討するため、放射ラベルした大腸菌SRP RNA(4.5S RNA)を用いてゲルシフト解析を行ったところ、大きさの異なる2種類のタンパク質を同定した。解析の結果、48kDaのタンパク質はすでに結合性が示されていた大腸菌Ffhタンパク質(SRP54の相同タンパク質)であった。約80kDaのタンパク質について、DEAE-S-ephadex A-50,Sephadex G-100を用いて精製を行い、アミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ、タンパク質伸長因子EF-Gであった。また、GDPの添加により、最大約2倍、結合性が上昇した。一方、真正細菌SRP RNAのドメインIV中に高く保存されている22残基についてDNAデーターベースを用いて解析したところ、22残基中連続した10残基の配列が23SリボソームRNA中の配列と一致した。23SrRNA上のこの10残基は、蛋白質伸長因子EF-Gのリボソームとの結合領域に含まれていた。以上の結果より、真正細菌SRP RNAは、蛋白質の膜透過に関与する一方、蛋白質の合成それ自身にも機能を持つ多機能分子であることが明らかとなった。さらに、この機能発現のために、SRP RNAは異なる2種類の蛋白質に対して結合能を有することがわかった。SRP RNAは、真正細菌からヒトにいたるまで広く生物界に保存されているRNAである。真核生物のSRP RNAは、シグナル認識粒子(SRP)の構成成分であり、大きさは、約300残基で、Alu反復配列に相同な部分とS挿入配列からなり、機能的には4ドメイン(I,II,III,IV)からなる。これに対し、大腸菌の4.5S RNAの大きさは100残基である。枯草菌のscRNAでは、ドメインI,II,IVに相当する約271残基からなる。真正細菌のSRP RNAの構造・機能相関に関するこれまでの実験から以下の知見が得られた。(1)大腸菌4.5S RNA結合蛋白質の検索と構造解析4.5S RNA結合蛋白質をゲルシフト法を用いて検索したところ、2種類の大きなの異なるバンドが得られた(complex1,2)。Ffh蛋白質が4.5S RNA結合能を持つことが明らかとなっているが、精製したFfh蛋白質を用いてゲルシフト実験を行ったところ、complex2と同じ移動度を示した。DEAE-Sephadex A-50,Sephadex G-100により、complex1形成に関わる蛋白質を精製したところ、78kDaの蛋白質(P78)が検出された。N末端のアミノ酸配列を解析し、ホモロジーサーチを行ったところ、P78は蛋白質合成伸長因子EF-Gであった。さらに、EF-Gの4.5S RNA結合活性はGDPの添加により約3倍増加した。以上の結果から、EF-Gが新規の4.5S RNA結合蛋白質として同定された。(2)枯草菌scRNAの生体内での局在とscRNPの精製.枯草菌のscRNAはFfh蛋白質(50kDa)とscRNPを形成している。ショ糖密度勾配遠心法によりscRNPは8.2Sの沈降係数を示した。scRNAとFfh蛋白質をマーカーにして、ω-アミノペンチル、DEAE-セファロースCL-6B、Ffh抗体カラムを用いてscRNPを精製したところ、scRNPには、Ffh蛋白質に加えて、24kDaの蛋白質が含まれていた。一方、精製Ffhを用いて、EDACによる化学架橋実験を行ったところ、Ffhは分泌蛋白質のシグナル配列と特異的に結合した。以上のことから、枯草菌のscRNPは真核生物のSRP様粒子の働きを持つことが示唆された真正細菌SRP Rは、グラム陰性細菌と陽性細菌では大きく異なり、陰性細菌では100残基程度で2次構造は哺乳類のドメインIV領域に相当する部分のみからなる。

また、GDPの添加により、最大約2倍、結合性が上昇した。一方、真正細菌SRP RNAのドメインIV中に高く保存されている22残基についてDNAデーターベースを用いて解析したところ、22残基中連続した10残基の配列が23SリボソームRNA中の配列と一致した。23SrRNA上のこの10残基は、蛋白質伸長因子EF-Gのリボソームとの結合領域に含まれていた。以上の結果より、真正細菌SRP RNAは、蛋白質の膜透過に関与する一方、蛋白質の合成それ自身にも機能を持つ多機能分子であることが明らかとなった。さらに、この機能発現のために、SRP RNAは異なる2種類の蛋白質に対して結合能を有することがわかった。平成8年度の研究結果として、まず、大腸菌4.5S RNAを放射能ラベルしたプローブを用いたゲルシフト法を確立し、大腸菌菌体内蛋白質について解析し、2種類の4.5S RNA結合蛋白質が存在することを明らかにした。ゲルシフト法を用いて4.5S RNA結合活性をモニターし、この2種類の蛋白質を精製したところ、すでに結合能が示されていたFfh蛋白質以外に、タンパク質伸長因子EF-Gが新たに同定された。大腸菌をはじめとする真正細菌のSRP RNAの機能としてタンパク質の分泌以外に翻訳過程における機能が示唆されていたが、我々の結果は翻訳過程における機能がEF-Gと深く関係することを示している。さらに、大腸菌4.5S RNAがもつ翻訳過程での機能について詳細に解析した。大腸菌4.5SRNAはショ糖密度勾配遠心法による解析から、その大部分がリボソームとは異なるそれよりも軽い画分に見出された。一方、大腸菌菌体をすでに翻訳過程における作用点が明らかになっている抗生物質で処理したところ、フシジン酸やバイオマイシンでのみ、4.5S RNAは70Sリボソーム分画に見出された。従って、4.5S RNAは、EF-Gによるトランスロケーション以前にリボソームと相互作用し、EF-Gのリボソームからの離脱までとどまっていることが示唆された。一方、4.5S RNAの欠損がEF-Gの局在性に与える影響について解析したところ、4.5S RNAの発現を押さえた場合、EF-Gは70Sリボソーム画分に検出された。この後、IPTGを添加し4.5S RNAの発現を再び、誘導すると、EF-Gはリボホームから解離した。一方、真正細菌SRP RNA中、22残基の高い保存領域についてデータベースとのホモロジーサーチを行ったところ23SrRNA上の+1069から10残基にわたって完全に一致していた。この10残基は、化学修飾法やUVクロスリンク法を用いた実験から、23SrRNA上のリボソーム結合領域の一つに含まれることがわかった。また、4.5S RNAの22残基を含む領域を化学合成し、EF-GとリボソームRNAと結合実験に添加したところ、競争的に阻害した。以上の結果により、4.5S RNAの翻訳における機能は、トランスロケーション後、加水分解したGDP型EF-Gと結合することにより、リボソーム(リボソームRNA)かたの解離を促進していると考えられる。この結果は、先に我々が明らかにしたEF-G-4.5S RNAの結合がGDPの添加により約3倍増強されることともよく一致する。
無季節環境下での個葉・シュート特性のトレードオフと植物生活形多様性

熱帯山地は、温度と乾燥のストレスもかかりにくい、植物にとってもっとも恒常的な環境であり、植物の生活形多様性が高い。そこでは、適応的分化を反映する明瞭な生理機能レベルのトレードオフが存在すると推測される。本研究では、個葉およびシュートモジュールレベルのトレードオフが、同じ地域の恒常的な環境下での多様化を促進しているという仮説に立って、葉およびシュートの生理機能の分化を解析した。本研究が主対象としたのは、西ジャワ州のハリムン山国立公園であり、対照として、屋久島の照葉樹林においてもセンサスも行なった。ハリムンでは、110種の葉寿命の観測を3年間にわたって行なった。葉の窒素利用効率は、葉の原形質成分と細胞壁成分に分けて分析し、葉の寿命と、葉の構造維持にかかわると想定される細胞壁成分の窒素分画の増加について分析を行なう。着生大型シダのオオタニワタリや、つる性ヤシ科のロタンなどでは、詳細な成長解析を実施した。種間で、当年葉展開時の水分配や、生活形によるシュート間の分配制御の違い、肥大成長とシュート伸長成長のあいだの分配を観測して、種間・生活形間の分化の適応をあきらかにした。屋久島では、116種の葉試料について、葉齢分布、LMA,C/Nの分析を行い、予測した1年葉以上の種での窒素含量と葉寿命の無相関を、生活形にまたがって検出した。照葉樹の葉配置に認められる疑似輪生配置と二列生配置の二系について、シュート形態と葉特性との対比が存在することもあきらかにした。三回のインドネシア現地調査と、国内での研究打ち合わせ、インドネシア熱帯林で展開するための国内での研究成果の整理を行った。現地では、おもにハリムン山国立公園の熱帯山地林を対象地域とした調査地設定を行った。100種ほどのさまざまな生活形の植物種各4個体を選定し(林床および林縁開所)、1シュートについて既存の葉をすべてマーキングし、毎月、新展開葉と脱落葉を追跡する観測システムを設定しつつある。また、林床近くで樹幹に着生するオオタニワタリの一種については、葉のターンオーバを追跡に加えて、株に落下するリターの除去実験もおこない、トラップ状に着生する植物の栄養塩供給に果たすリターの役割を、植物生長の点からあきらかにすべく観察している。さらにオオタニワタリの株腐食系に成育する昆虫群集を、土壌群集と比較する予備的な観察を開始した。植物葉の生理・形態カップリングについては、以下の整理をおこない、現地予備調査とつなげた。常緑広葉樹の葉において、貯蔵物質は葉肉組織の分裂と伸長、葉緑体の発達に貢献し、成長している葉自身の光合成産物は主に細胞壁の肥厚に貢献していることが示唆された。常緑樹葉の展開時の水分生理学的性質の変化を既存葉と比較したところ、常緑樹葉が展開時に、すでに成熟した葉は蒸散を盛んに行うために水ポテンシャルを下げる能力はもっているが、気孔を閉じ、枝が水分欠乏に陥らないようにしていた。落葉樹を用いて、葉量と枝断面積との比例関係で表現される樹形のパイプモデルのダイナミクスを明らかにするための操作実験を行った。枝の肥大成長には、葉による生産量(供給)と長枝率や葉量増加に依存した枝のgrowth activity(需要)のバランスが重要であることが明らかになった。これらの葉や枝レベルの研究をインドネシア産の樹種を用いて展開する際のポイントを検討した。本研究は,環境の恒常性の高い熱帯山地林を対象に,多様な生活形にまたがる葉・シュート特性の適応を観測・解析することを目的としている.本年度は,西ジャワの熱帯山地林を中心に,また屋久島の暖温帯林を比較対象として,以下の調査・測定をおこなった.1.ハリムン山の調査地において,マーキングによって葉の動態の追跡調査を引き続き実施した.

また,葉齢の既知の個葉についてサンプリングを行い,面積・湿重量・乾燥重量・窒素含量・クロロフィル含量の測定を実施した.2.全選定対象種について,さまざまなサイズ(地上高5mまで)の個体を採集し,アロメトリー解析を実施した.3.同調査地で,隔週間隔で2000年より継続されている落葉のトラップサンプルを,植物種ごとに分別し,栄養塩分析を実施した.土壌・樹皮表層と,オオタニワタリ類のような落葉集積型着生植物の基部腐植有機物について,栄養塩組成を分析するとともに,株内の土壌動物群集を調査した.なお,栄養塩の分析のために,共同研究者のRahajoe博士を1ヶ月半の間札幌に招へいした.4.暖温帯照葉樹林における比較のために,鹿児島県屋久島において,海岸林,中部照葉樹林,上部照葉樹林を対象に,常緑・落葉の樹木・低木・草本の個葉のサンプリングを行い,葉面積,葉面積重,葉の炭素・窒素含有量の測定をおこなった.5.インドネシアとの共同調査であるため,研究目的と個別課題の年度毎の打ち合わせを日本側研究代表者(甲山)とインドネシア側代表者(Herwint Simbolon)の間で実施した.そのためにSimbolon博士を短期招へいした.西ジャワ州ハリムン山国立公園の、山地林生態系において、以下の調査を実施した。(1)樹木稚樹、着生植物、林床草本、つる植物といったさまざまな生活形にまたがって120種を対象に、光合成器官である葉のターンオーバーと生理特性のセンサスを行なった。葉のターンオーバーは、マークした葉群を2年半の間追跡することによって明らかにできた。すでに採集した葉のSLAや窒素含量の測定を終え、さらに葉たんぱく質の組織分画による定量を進めている。(2)3樹種の稚樹と成木計11個体、50の枝系について、枝毎に光環境の測定を行い、各葉齢の葉のSLAおよび枝の直径の肥大成長を測定して、環境と成長、葉特性の間の関係を解析した。(3)草本種と木本種における地上部構造の形成過程について調査を行った。木本種の場合、主軸の成長が優先される結果、シュートの光環境と成長との関係におけるばらつきが草本種よりも大きかった。(4)葉の細胞の膨圧が、展開葉で乾燥する日中でも保たれるしくみを解明するために、一年枝の基部から当年枝の先端までについて、実際に枝に水を流し水分通導抵抗を測定した。その結果、水分通導抵抗は、シュートの全抵抗のなかで、85%以上が当年枝にあることを明らかにした。鹿児島県屋久島の照葉樹林において、ジャワの熱帯山地林と比較するために、以下の調査を行なった。(1)生活形にまたがる116種のシュート計測をした。私たちが作業仮説とする「一年葉以上では窒素含量は減少しない;場合によっては僅増する」傾向が確認できた。高窒素含量グループ(2.5%4%)は、おもに海岸群集の草本やツル植物、林縁性の落葉木本であった。(2)常緑樹の「横」方向の枝先では、葉の配置が(互生・対生葉序にかかわらず)疑似輪生か二列生かになる傾向がある。こうした伸長特性と、個葉特性との関係を明らかにする目的で、上から見た年枝茎に対する個葉の方向と葉の仰角を記録し、節間分布(葉痕も含めて)を記録した。二列生配置の種のほうがより連続成長的であり、簡単な裸芽を作る種もあった。疑似輪生配置では、成長が間欠的で、これは年内に何回か伸びる場合も,あるいは数年頂芽が休眠芽となる場合もあてはまった。
超低摩擦を実現する量子論に基づくマルチスケールトライボケミカルシミュレータの開発

現在、環境問題・エネルギー問題解決のためには低摩擦特性・高耐久性をもつ潤滑剤の迅速な開発が強く求められている。そのためには、マルチスケールで起こる様々な摩擦現象を明らかにすることで、低摩擦・高耐摩耗潤滑剤の設計指針を決定する必要がある。そこで本研究では、潤滑剤が低摩擦を実現するためのメカニズムを明らかにするため、化学反応を伴う摩擦現象を解明可能な量子論に基づくマルチスケールトライボケミカルシミュレータの開発に関する研究を行った。今年度は、Tight-Binding量子分子動力学法と第一原理計算を組み合わせ、水潤滑におけるDLC膜の摩擦プロセスを検討した。その結果、圧力の増加に従って摩擦係数が下がることを明らかにした。これは実験結果と一致しているが、境界潤滑における一般的なストライベック曲線では、圧力の増加に従って摩擦係数が上がっており、逆の傾向を示している。そこで、その原因を明らかにするため、高圧力条件における摩擦後のDLC膜表面構造を調べた結果、摩擦下の化学反応によってDLC表面にC-O-C結合が生成することを明らかにした。また、C-O-C結合の生成がDLC表面の構造に与える影響について検討するため、第一原理計算を用いて酸素原子を添加したダイヤモンド結晶の構造を調べた。その結果、酸素原子近くの六員環構造が五員環構造に変化し、表面のsp3炭素原子がsp2炭素原子に変化することで低摩擦化に寄与することを明らかにした。これが、圧力の増加に従って摩擦係数が上がるという、ストライベック曲線とは逆の傾向を示した原因であることを明らかにした。以上より、低摩擦機構を明らかにするためには、摩擦下の化学反応を考慮することが重要であることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。現在、環境問題・エネルギー問題解決のためには低摩擦特性・高耐久性をもつ潤滑剤の迅速な開発が強く求められています。そのためには低摩擦・高耐摩耗潤滑剤の設計指針を決定する必要があります。そして、マルチスケールで起こる様々な摩擦現象を明らかにする必要があります。そこで本研究では、超低摩擦技術を実現するための量子論に基づくマルチスケールトライボケミカルシミュレータの開発に関する研究を行いました。まずTight-Binding量子分子動力学法を用いたF終端ダイヤモンドライクカーボン(DLC)膜とH終端DLC膜同士の摩擦シミュレーションを行い、その低摩擦メカニズムを検討しました。最初に圧力1GPaの場合を検討しました。F-DLCとHLCの摩擦係数は0.07と0.04を示し、両方とも低い摩擦係数を示すことを明らかにしました。これは、膜表面に終端されたF原子とH原子によって摩擦界面における化学反応が抑制され、DLC膜が非常に滑らかな摩擦状態を示すためであると明らかにしました。次に、接触圧力が高い過酷な接触面を考え、圧力7GPaの場合を検討しました。その結果、F-DLCとH-DLCの摩擦係数は0.08と0.38を示しました。これは、F終端DLC膜はH終端DLC膜より、高い圧力条件でも低摩擦特性を維持し続けることを示しています。また、この違いが出る原因は、表面に終端されたF原子間の強い反発相互作用によるものと明らかにしました。また、DLCにSiを添加することで摩擦特性が向上するメカニズムを検討するため、Si添加によるダイヤモンド膜の構造変化を第一原理計算を用いて調べました。Si含有量を6.25%添加すると、表面のsp3のC原子が炭素膜の低摩擦化に寄与すると考えられるsp2のC原子に変化することを明らかにしました。低摩擦発現メカニズムを明らかにするため、原子・電子スケールにおける化学反応及び摩擦プロセスの解析を行いました。その結果、F終端DLC膜の極圧下における低摩擦メカニズムを解明しました。また、Si添加ダイヤモンド膜の構造変化プロセスを解明し、Si添加がDLC膜の摩擦特性に与える影響を検討しました。

以上より、研究はおおむね順調に進展していると思います。今年度は、量子論に基づくマルチスケールトライボケミカルシミュレータの開発を行うため、原子・電子スケールにおける化学反応及び摩擦プロセスの解析を行いました。来年度は、ナノメートルスケールにおけるガス雰囲気(水・アルコール)が、炭素膜の摩擦・磨耗プロセス及び膜の変質プロセスに与える影響を調べ、界面構造が変化した炭素材料の低摩擦発現条件を解明します。
歯科保存領域での効果的な細胞移植再生治療の新規開発に関する基礎的研究

今年度は関葉系幹細胞(MSC)をFGF添加のDMEM培地(FBS+、ペニスト+)で培養を行なった。また通常の維持培養に加え骨分化誘導培地にて培養を行った。通常の維持培地は60mm dishにDMEM4ml、FGF3ng/ml、100mm dishにDMEM9ml、FGF3ng/mlを添加し、コンフルになった幹細胞を骨形成誘導培地にて骨芽細胞への分化誘導に使用した。骨形成誘導培地は基本培地のDMEM(FBS+、ペニスト+)に3ng/mlFGF、10^<-7>Mデキサメタゾン、10mMグリセロリン酸、50μg/mlアスコルビン酸を添加した基本的な骨分化誘導培地に加え、基本維持培地にキトサンモノマー、キトサンオリゴマー、SK-2、キトサンポリマー、フィッシュコラーゲンをそれぞれ添加した培地を使用した。各群の最終濃度は0.005%、0.0005%、0.00005%で行なった。培養後10日、15日、20日にアリザリンレッド染色、Ca定量にて骨分化誘導を評価した。基本的な骨分化誘導培地においては10日でアリザリンレッド染色(±)15日(+)20日(+)であったがキトサンモノマー、オリゴマー、SK-2、ポリマー、フィッシュコラーゲン、においては10日、15日、20日いずれも陰性であった。またCa定量に関して基本的な骨分化誘導培地においては15日、20日で有意差が認められたが、その他の骨分化誘導培地において有意差は認められなかった。今回期待したキトサンによる間葉系幹細胞への積極的な骨芽細胞分化は証明できなかった。逆に、骨形成誘導培地にキトサンモノマーを添加しても、骨芽細胞への分化は阻害されないことも確認できた。したがって、生体材料としてのキトサンをスポンジ等に成形し、MSCの足場として応用することは可能と結論される。多潜能を有する幹細胞のうち、生命倫理に抵触しない間葉系幹細胞は歯科領域を含めて再生医学・医療へ応用価値が多い。今回、理化学研究所から購入可能となっている人骨髄由来の間葉系幹細胞を歯科保存領域へ活用する目的で、基礎的研究を開始した。はじめに、理化学研究所から購入のため必要となる、申請者の所属機関における倫理委員会から研究内容に関する承認を得た。間葉系幹細胞(MSC)は、線維芽細胞成長因子(FGF)添加DMEM培地で培養を行っている。現在の培養状況は以下のとおりである。60mm培養皿にDMEM4mL, FGF12μL、100mm培養皿にDMEM9mL, FGF27μLを添加している。60mm培養皿に1×10^5個播種してコンフルエントとなるのに約2週間、100mm培養皿に1×10^5個播種してコンフルエントとなるのに約3週間を要する。コンフルエントとなった細胞数は、60mm培養皿で4×10^5個程度、100mm培養皿で1.5×10^6個程度であった。MSC細胞の骨芽細胞への分化誘導実験には、35mm培養皿に1.5×10^5個播種し、通常の維持培地にインシュリン、デキサメサゾン、アスコツビン2リン酸、β-グリセロリン酸ナトリウムをさらに添加している。添加量は、DMEMにFGF1ng/mL,インシュリン10μg/mL,β-グリセロリン酸ナトリウム10mM,デキサメサゾン100nM,アスコツビン2リン酸50ng/mLである。現在、骨芽細胞への分化を確認する方法として、オステオカルシン抗体での免疫染色を検討している。間葉系幹細胞(MSC)の維持培養は60mm dishでDMEM4ml、FGF3ng/ml、100mm dishでDMEMgml、FGF3ng/mlを添加して行っている。培養皿に一杯となったMSCは骨形成誘導培地で骨芽細胞への分化誘導を行なっている。骨形成誘導培地は基本培地のDMEM(FBS+、ペニスト+)に3ng/mlFGF、10^<-7>Mデキサメタゾン、10mMグリセロリン酸Na、50μg/mlアスコルビン酸を添加されている。骨分化誘導のための実験培地として(1)上記の骨分化誘導培地(2)基本維持培地にキトサンモノマー0.005%添加培地(3)基本維持培地に酢酸0,04%添加の上記培地のコントロール培地(4)上記の骨分化誘導培地に0.005%キトサンを加えた培地を使用している。骨分化誘導培地への置換はMSCが培養皿で一杯になって行うと、骨分化誘導が促進される事が分かっている。このため幹細胞を48well dishに1wellあたり5000cells/cm^2で播種を行い、通常の維持培地にて5日程培養しMSCが一杯になった時点で骨分化誘導培地に置換している。骨分化誘導後の評価は骨分化誘導培地置換後、14日、21日、28日目に行っている。現在、評価方法はアリザリンレッド染色で行っている。(1)の骨分化誘導培地にて培養した幹細胞は14日、21日、28日共にアリザリンレッド染色に陽性であった。(2)(3)においては14日、21日、28日においてアリザリン染色陰性であった。

(4)の骨分化誘導培地に0.005%キトサンモノマーを添加した培地においては(1)と同様に14日、21日、28日においてアリザリンレッド染色陽性であったが(1)と比較して明確な差異は認められなかった。このため今後は添加するキトサンを分子量、脱アセチル化度を変化させ検討する予定である。今年度は関葉系幹細胞(MSC)をFGF添加のDMEM培地(FBS+、ペニスト+)で培養を行なった。また通常の維持培養に加え骨分化誘導培地にて培養を行った。通常の維持培地は60mm dishにDMEM4ml、FGF3ng/ml、100mm dishにDMEM9ml、FGF3ng/mlを添加し、コンフルになった幹細胞を骨形成誘導培地にて骨芽細胞への分化誘導に使用した。骨形成誘導培地は基本培地のDMEM(FBS+、ペニスト+)に3ng/mlFGF、10^<-7>Mデキサメタゾン、10mMグリセロリン酸、50μg/mlアスコルビン酸を添加した基本的な骨分化誘導培地に加え、基本維持培地にキトサンモノマー、キトサンオリゴマー、SK-2、キトサンポリマー、フィッシュコラーゲンをそれぞれ添加した培地を使用した。各群の最終濃度は0.005%、0.0005%、0.00005%で行なった。培養後10日、15日、20日にアリザリンレッド染色、Ca定量にて骨分化誘導を評価した。基本的な骨分化誘導培地においては10日でアリザリンレッド染色(±)15日(+)20日(+)であったがキトサンモノマー、オリゴマー、SK-2、ポリマー、フィッシュコラーゲン、においては10日、15日、20日いずれも陰性であった。またCa定量に関して基本的な骨分化誘導培地においては15日、20日で有意差が認められたが、その他の骨分化誘導培地において有意差は認められなかった。今回期待したキトサンによる間葉系幹細胞への積極的な骨芽細胞分化は証明できなかった。逆に、骨形成誘導培地にキトサンモノマーを添加しても、骨芽細胞への分化は阻害されないことも確認できた。したがって、生体材料としてのキトサンをスポンジ等に成形し、MSCの足場として応用することは可能と結論される。