hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イソキノリンアルカロイド生合成系における転写因子ネットワークの解析

今後、これらの株を用いたCjbHLH1のin vivoにおける機能解析やクロマチン免疫沈降実験などを予定している。また、ハナビシソウの2つのcjbHLH1ホモログ、EcbHLH1-1、EcbHLH1-2について、EcbHLH1-1特異的、EcbHLH1-2特異的、EcbHLH1-1,EcbHLH1-2に共通のRNAiベクター、EcbHLH1-1、EcbHLH1-2それぞれにSRDX配列を付加したキメラリプレッサー(EcbHLH1-1-SRDX、EcbHLH1-2-SRDX)を導入したハナビシソウ培養細胞株も確立した。なお、ハナビシソウ植物体の各組織におけるEcbHLH1-1、EcbHLH1-2の発現パターンの解析から、両者の発現パターンが異なることが明らかとなった。また、EcbHLH1-1、EcbHLH1-2はともにMeJAに対して応答することを確認した。1.ベルベリン生合成系の新規遺伝子発現調節因子、新規転写因子の探索のために、GFP抗体を用いた共免疫沈降(Co-IP)、ならびにLC-MS/MS解析により転写因子の相互作用因子の同定を試みた。その結果、調節因子や転写因子のようなタンパク質は同定されなかったが、CjbHLH1,CjWRKY1ともに翻訳後修飾による制御を受けている可能性が示唆された。一方、ESTの再アノテーションとce11 1ine間での発現比較、さらに二本鎖RNAを用いた一過的RNAiスクリーニングを行ったが、新たな転写因子を得るにはいたらなかった。2.sGFP-CjbHLH1を導入したハナビシソウ培養細胞株を複数ライン確立し、ゲノムPCRやqRT-PCR解析、および抗CjbHLH1抗体を用いたウェスタン解析を行い、形質転換体におけるsGFP-CjbHLH1の発現を確認した。一方、サンギナリン生合成に関わる酵素遺伝子の発現量は、コントロールとの間に差は見られず、単独での過剰発現ではほとんど生合成系に影響が見られない可能性が示唆された。また、ハナビシソウCjbHLH1ホモログ、EcbHLH1の37bpRNAi発現抑制株も複数ライン確立し、抑制の強い株の選抜を進めている。3.ジャスモン酸シグナル伝達系に関わるMYC2ホモログやJAZがベルベリン生合成系の制御に関わるかどうかを調べるために、オウレン、ハナビシソウからそれぞれMYC2遺伝子を、さらにオウレンから2つのJAZ遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現がMeJAに対して応答することを確認した。また、ce11 1ine間でのCjMYC2遺伝子の発現比較やハナビシソウ植物体におけるEcMYC2の組織別発現解析を行ったが、生合成酵素遺伝子の発現との相関は見られなかった。さらに、一過的RNAiによるCjMYC2の発現抑制の影響は一部の生合成酵素遺伝子に限定されており、その抑制効果もCjbHLH1に比べると低かった。また、CjbHLH1やCjwRKY1の発現量には全く影響が見られず、これらの因子は独立に制御を受けている可能性が示唆された。一方、CjJAZについては一過的過剰発現により生合成酵素遺伝子の発現量が減少していたことから、リプレッサーとして機能していることが示唆された。ベルベリン生合成系における新規遺伝子発現調節因子・転写因子の探索では、まだ新しい因子を得るまでには至っていないが、MALDI-TOF-MSを用いた解析やESTの情報整備等、必要な解析のための準備は順調に進んでいる。
有用微生物を用いた牛乳腺の分子免疫学的修飾と感染制御に関する研究

本研究は牛乳房炎の薬物治療に代わりうる治療法の開発を目標に食品規格の乳酸菌(LAB:B. breve)を乳房炎分房に注入し、乳腺の細胞および免疫学的な反応性を明らかにするとともに、乳房炎分房にLABの注入を実施してその治癒効果を評価した。乳房炎分房へのLAB注入により乳腺の防御に重要な役割を担う自然免疫が有意に誘導されることを明らかにした。乳酸菌を用いた乳房炎の治療に選択的な有用性が示された。ホルスタイン種泌乳牛において分房乳中の体細胞数30万/ml以上を示す乳房炎分房7頭8分房に対して有用微生物(B.breve,1x109/ml,3 ml)を搾乳後に乳腺内に注入し(1回/日:2回)、注入に伴う分房乳の物理化学的指標、微生物学性状を検索するとともに免疫学的指標として主要なサイトカイン遺伝子(mRNA)の発現を調べた。潜在性乳房炎罹患分房へのB.breve注入により乳の理化学的ならびに微生物学的性状が正常に復した分房(4頭5分房:治癒分房)と非治癒分房(3頭3分房)に分類して比較した。乳汁の非特異的防御因子(ラクトフェリンLf,免疫グロブリンIgG濃度)は治癒分房において、またIgGは非治癒分房において注入(1日)により顕著な増高が確認された。乳汁の化学発光反応は注入により有意な増高が認められた。非治癒分房では注入14日後においてもやや増高した反応が認められた。B.breve注入によるサイトカインmRNA発現において、IL-1β、TNF-αは注入1日後でその前後に比較して増高が認められた。IL8は治癒分房の注入1日で正常分房のそれに比較し有意に高値であった。NF-κBは非治癒分房の注入前で高値を示す傾向が認められた。LfーmRNAは治癒分房の注入1日後で増高する傾向が認められた。乳房炎分房へのB.breve注入にともない体細胞誘導と共に自然免疫の誘導反応が確認されるとともに治癒および非治癒分房乳において上記の指標に機能的な相違が存在することが認められた。乳牛の潜在性乳房炎分房への有用微生物を用いた免疫賦活による感染微生物の排除を意図し継続してデータの集積を目的として野外研究を展開した。乳牛において、乳房炎分房(体細胞数30万/ml以上)10頭14分房に対して有用微生物(B.breve,3x109cfu)に加えて抗菌活性を有するラクトフェリン分解産物(LFH)を乳腺内に注入し、注入分房乳の生理活性を検索するとともに免疫学的応答の評価としてサイトカイン関連遺伝子発現とその蛋白レベルを測定した。B.breve+LFH注入により回復した治癒分房(4頭7分房)と非治癒分房(3頭7分房:S.aureus)に分類し反応性を検討した。乳汁の防御因子(Lf)は注入3日後に治癒分房において著増し21日後に有意に減少した。化学発光反応は注入1日後に有意な増高が認められた。B.breve+LFH注入によるサイトカインmRNA発現において、IL-1β、IL-8, TNF-αおよびNF-κBは注入1、3日後に、IL-6は注入7日後に発現増高が認められ乳LF濃度との関連が示唆された。乳中のサイトカイン産生量において、IL-6,TNF-αは両群ともに注入1日後の最高値を示した。治癒群ではIL-8,IgGは注入後3日後に最低値を示し漸次減少した。非治癒群ではIL-1β,IL-12で注入1日目に最高値を示した後減少した。乳房炎分房へのB.breve+LFH注入にともなう自然免疫の誘導反応において治癒および非治癒分房乳に機能的な相違が存在することが認められた。S.aureusを除いた原因菌(CNS,OS,菌陰性も含む)による乳房炎に治療効果が認められた。ウシの乳腺感染に対して抗生剤の使用に代替可能な有用微生物を用いた乳腺の感染防御能を賦活することによるウシの乳房炎の制御を意図し研究を展開してきた。本研究は、実験に使用可能な搾乳牛の選定(乳房炎、原因菌、乳期、乳量、治療、薬物)があり、実験による乳の廃棄を伴うためその実施は研究者の計画のみでは遂行できず農場管理者の協力を努力して得てきた。研究は供試牛の有用微生物調整液を搾乳後の分房への注入により分房乳の反応(生理・免疫反応)を把握しており概ね「研究計画」に準じて行い成果をえてきている。問題点としては、他人の財産としての乳牛を使用させていただいており実験感染を行えず、あくまでも自然感染牛を使用させていただいて展開しているものであり、要因として原因菌の種類、炎症程度、乳期、乳量など個体の影響が反映されており、実態を反映した成果がえられている。治癒牛・非治癒牛の統計学的比較のために個体数の増加が望ましい。乳牛の乳腺感染に対して有用微生物(Bifidobacterium breve)を用いた乳腺の自然免疫を賦活することによる牛乳腺感染の制御およびその免疫学的特性を検討した。

農場において自然感染により発生した牛乳房炎(体細胞数30万/ml以上、潜在性乳房炎)6頭7分房に対して有用微生物(B.breve,3x109cfu)を乳腺内に注入し、注入前後にわたり継時的に治癒および非治癒分房における分房乳の生理活性の検索および免疫学的応答の指標としてサイトカイン関連遺伝子を評価した。B.breve注入により乳房炎が治癒した分房(3頭6分房)と非治癒分房(3頭6分房:S.aureus)に分類しそれらの反応性を検討した。乳汁中の微生物に対する非特異的発育阻止蛋白(Lf)は注入2日で増加し、4,5日に有意に増高した後に減少した。乳汁中の化学発光反応は注入1日後に有意な増高が認められた。B.breve注入によるサイトカインmRNA発現において、TNF-αは注入後2日および4日の治癒分房で増高する傾向が認められた。IL-6は注入後4日の治癒分房において非治癒のそれに比較して明らかな増高が認められた。非治癒群ではTNF-α,IL-6およびIL-8の反応性は治癒分房のそれらに比較して著しく低値であった。牛乳房炎分房へのB.breve注入に伴いLfやIgGなどの自然免疫の誘導反応が惹起されることが認められたが、感染分房のその反応性において、治癒および非治癒分房の両者には免疫学的に機能的な差異が存在することが示された。有用微生物B.breveの乳腺内注入により治癒に至る感染分房(CNS,OS,E.coliなどの起炎菌)では自然免疫の誘導とくにTNF-αおよびIL6の活性との関連性が示唆された。本研究は牛乳房炎の薬物治療に代わりうる治療法の開発を目標に食品規格の乳酸菌(LAB:B. breve)を乳房炎分房に注入し、乳腺の細胞および免疫学的な反応性を明らかにするとともに、乳房炎分房にLABの注入を実施してその治癒効果を評価した。乳房炎分房へのLAB注入により乳腺の防御に重要な役割を担う自然免疫が有意に誘導されることを明らかにした。乳酸菌を用いた乳房炎の治療に選択的な有用性が示された。初年度の研究計画として野外の農場での乳房炎罹患牛のスクリーニングを前提として研究を展開するものであるが、供試可能な罹患牛ならびに分房の選定の上から供試分房数にやや問題を残したが、研究全体で調整が可能と考えられる。研究推進:これまでの研究で本研究の目的にそった効果が有効と確認される条件が確認されてきたので、要因を絞りその有効な条件を備えた対象(注入対象牛および対象分房)についてその反応性をさらに明確にしたい。実用性の検討:これまでの有用微生物を用いた乳腺の感染制御についての基礎研究を基に共同研究者・飼養者の協力を得て野外の乳房炎乳牛を対象とした拡大試験(北海道・四国・中国地方:酪農場)を実施する。対象牛(選別)へ有用微生物調整液の注入による効果を注入前・後で比較し施用による臨床的有用性を評価する。管轄診療獣医師の協力の下で実施される。農学野外の乳房炎罹患牛を対象に供試可能な分房を選択し、有用微生物とともに非特異的感染制御因子であるラクトフェリシンとの併用条件下での乳腺の理学的ならびに免疫学的な指標動態について検討する。乳酸菌注入による主要サイトカインの定量を試みる。B.breveの注入により乳房炎治癒に至ったものと非治癒のそれらについての相違を明らかにしていきたい。乳腺の感染防御における「微生物クリアランス」の概念を提示するとともに、新しい乳腺感染制御法の提示を試みる。研究の過程で消耗品(試薬)費が計画よりも安価で入荷し利用できた。ほぼ計画通りに予算執行されたが、消耗品費が若干継続された2016年度の消耗品費・試薬・消耗器具費としての活用を計画する。消耗器具に充当される
不活化ウイルス粒子による脳腫瘍幹細胞を標的とした新規核酸医薬療法の開発

HVJ-E(HVJ envelope)はセンダイウイルス(HVJ:hemagglutinating virus of Japan)のゲノムRNAを破壊し複製能力を失わせた不活化粒子である。HVJ-Eはグリオーマ腫瘍幹細胞に対しても非常に強力な融合能を有しており、治療分子としての核酸を高効率で導入することが可能である。microRNAのうち腫瘍幹細胞性維持に関連するmiR-218およびmiR-34aを、HVJ-Eをベクターとしてグリオーマ腫瘍幹細胞に導入することは、悪性グリオーマに対する新規核酸医薬療法となる可能性がある。臨床検体から樹立した脳腫瘍幹細胞株を用いた細胞実験を行った。まずこの腫瘍幹細胞に対するHVJ-Eの膜融合能および核酸分子導入効率の評価を行った。臨床検体由来腫瘍幹細胞に対して、蛍光標識したHVJ-Eは高率に膜融合を生じ、また蛍光標識核酸分子の細胞内導入も高率に認められた。この結果から、HVJ-Eの腫瘍幹細胞への治療核酸分子導入能が確認され、この腫瘍幹細胞株を用いて本実験を行うこととした。複数の悪性神経膠腫細胞株と腫瘍幹細胞においてtotal RNAを回収し、両者でmicro RNA発現の差異を検討した。腫瘍幹細胞の増殖能、血管新生能、自己複製能等に機能することが予測される複数の候補microRNAを中心に解析を行ったところ、自己複製能等の幹細胞性維持に関与するポリコーム蛋白発現に抑制的に機能するmiR-218の発現において両細胞間に著明な差異が存在することを見出した。複数の悪性神経膠腫細胞株では候補microRNAのなかでmiR-218の発現が著明に亢進しており、一方腫瘍幹細胞ではmir-218発現は他のmicroRNA同等に抑えられている。このことは腫瘍幹細胞においては、mir-218発現抑制を通じてその標的分子である幹細胞性維持能を有するBMI1の発現を高めている可能性がある。現在HVJ-Eを用いてmir-218を腫瘍幹細胞へ導入することによる治療効果検討に先立って、microRNA至適投与量の検討を行っている。腫瘍幹細胞と非幹細胞腫瘍細胞で発現に差異のみられる分子同定のための解析を繰り返し重点的に行う必要があり、再現性の得られる結果が得られるまでに時間を要した。前年度同様に、悪性神経膠腫における腫瘍幹細胞に対して、幹細胞性の維持に関わる分子を標的とするmicroRNAを不活化ウイルス粒子であるHVJ-Eを用いて導入することによる治療効果を検討する研究を行った。悪性神経膠腫臨床検体から樹立した腫瘍幹細胞株を用いた細胞実験を継続して行った。同腫瘍幹細胞株においては、幹細胞性を有さない悪性神経膠腫細胞株で発現が亢進しているmiR-218の発現が抑制されていることから、腫瘍幹細胞へのHVJ-Eを用いたmir-218導入による細胞増殖能評価および自己複製能評価を行った。臨床検体から樹立した腫瘍幹細胞株は増殖速度が遅く、再現性を確認するために多くの時間を費やしている。そのため、増殖速度の速い人工腫瘍幹細胞を用いた細胞実験も並行して開始した。人工腫瘍幹細胞に対しても、HVJ-Eは膜融合能を有しており、また蛍光標識核酸分子を細胞内に高率に導入できることを確認した。人工腫瘍幹細胞におけるmicroRNA発現を網羅的に解析しており、その結果をふまえてmir-218導入に加えて他のmicroRNA導入実験も予定している。HVJ-Eの治療分子導入効率に関しては、臨床検体から樹立した腫瘍幹細胞株と人工腫瘍幹細胞でほぼ同等であることから、検討済であるmicroRNA至適量を用いた実験をすすめていく。すでに人工腫瘍幹細胞を用いた脳腫瘍モデルも樹立できており、細胞実験と並行して動物実験も行う予定である。悪性神経膠腫臨床検体から樹立した腫瘍幹細胞株のみでは再現実験に非常に時間を要することから、人工腫瘍幹細胞を用いた細胞実験も同時に行っている。臨床検体から樹立した腫瘍幹細胞株は増殖速度が遅く、治療効果検討に多大な時間を要していることから、増殖速度の速い人工腫瘍幹細胞を用いた実験を主に行うこととした。人工腫瘍幹細胞におけるmicroRNA発現パターンと人工腫瘍幹細胞を分化誘導した細胞におけるmicroRNA発現パターンとを網羅的に比較解析したところ、人工腫瘍幹細胞は臨床検体から樹立した腫瘍幹細胞株とほぼ同様の発現パターンを示していることが明らかとなった。分化誘導前の人工腫瘍幹細胞ではmiR-218の発現が最も抑制されており、次いでmiR-128aの発現が抑制されていた。これらのmicroRNAはともに幹細胞性維持に関与するポリコーム蛋白BMI発現を抑制することが報告されている。その他、miR-34aの発現が人工腫瘍幹細胞では抑制されており、NOTCH pathwayの発現亢進を通じて幹細胞性を維持している可能性が示唆された。HVJ-Eを用いてmiR-34aを導入したところ、人工腫瘍幹細胞自体のPD-L1発現抑制が誘導された。このことからmiR-34aを治療分子として用いることにより、幹細胞性維持抑制のみならず免疫チェックポイント阻害にも寄与する可能性が示唆された。すでに人工腫瘍幹細胞移植モデルに対するHVJ-E投与タイミング・回数、microRNA至適封入量に関する検討を終えており、皮下腫瘍モデルと脳腫瘍モデルを用いた治療実験を行い、効果の解析中である。

HVJ-E(HVJ envelope)はセンダイウイルス(HVJ:hemagglutinating virus of Japan)のゲノムRNAを破壊し複製能力を失わせた不活化粒子である。HVJ-Eはグリオーマ腫瘍幹細胞に対しても非常に強力な融合能を有しており、治療分子としての核酸を高効率で導入することが可能である。microRNAのうち腫瘍幹細胞性維持に関連するmiR-218およびmiR-34aを、HVJ-Eをベクターとしてグリオーマ腫瘍幹細胞に導入することは、悪性グリオーマに対する新規核酸医薬療法となる可能性がある。治療核酸分子候補が選定されたため、至適封入量確定に続いて幹細胞性変化を含めた治療効果解析をすすめていく。臨床検体由来腫瘍幹細胞と人工腫瘍幹細胞の両者を用いて、細胞実験および動物実験を並行してすすめていく。今後の臨床応用を念頭において、治療条件を確立していく予定である。脳神経外科学次年度購入予定の試薬費に充てるために残存させている。物品費(試薬費)としての使用を予定している。
超高速応答型感圧塗料による微小変動圧力場計測法の確立

物体表面の圧力を測るための感圧塗料(PSP)に関して,本研究では,微小振幅の圧力変動を計測するための高速応答型PSP,及び,それを用いた計測法の技術開発を進めた.その結果,任意の材質,形状の物体に「塗れる」高速応答型PSPの開発に成功し,また,感温塗料との併用による温度,圧力の同時計測にも成功した.さらに,高速風洞による実証試験から,本PSPを用いることで,物体表面における数kHzの圧力変動を1kPa程度の精度でとらえられることが分かった.物体表面の圧力を測るための感圧塗料(PSP)に関して,本研究では,微小振幅の圧力変動を計測するための高速応答型PSP,及び,それを用いた計測法の技術開発を進めた.その結果,任意の材質,形状の物体に「塗れる」高速応答型PSPの開発に成功し,また,感温塗料との併用による温度,圧力の同時計測にも成功した.さらに,高速風洞による実証試験から,本PSPを用いることで,物体表面における数kHzの圧力変動を1kPa程度の精度でとらえられることが分かった.微小圧力変動の空間分布を計測するための感圧塗料(PSP)技術開発を進めた.陸上輸送機器の主要速度域である0(10m/s)の変動圧画像計測法を確立し,風洞実験のコスト低減,詳細な数値予測のための基礎データの提供を実現することを目的として,本年度は,(1)任意の材質,形状の物体に「塗れる」高速応答型感圧塗料,および,(3)風洞中に置かれた物体周りの微小非定常圧力場計測を行った.(1)については,ナノメートルサイズのセラミック微粒子と色素を用いた新しいPSPの開発に成功した.この技術については,現在本学より特許を出願すべく準備が進んでいる.本PSPは,従来の高速応答型PSPに比べて,圧力感度,時間応答性は同等,発光強度はより高い,スプレーによる塗装が可能,という優れた特性を有し,種々の実験への応用が格段に進む可能性を有する.ただし,性能試験を通じて,発光強度に対する温度依存性が非常に大きい,という問題があることわかった.(2)については,遷音速風洞によるデルタ翼面上の非定常圧力分布の計測,および,超音速風洞における擬似衝撃波の振動現象の画像計測を進め,それぞれ良好な結果を得た.いずれも高速度ビデオカメラを用いた流し撮りによる時間分解計測であり,簡便な装置構成,測定方法により,従来の(半導体圧力センサを用いた)点計測に匹敵する定量的な圧力データが得られる見通しが得られたことが特筆される.なお,以上の成果は,本年8月に行われるアメリカ航空宇宙学会応用空気力学会議において,2件の口頭発表として公表される予定である.微小圧力変動の空間分布を計測するための感圧塗料(PSP)技術開発を進めた.陸上輸送機器の主要速度域である0(10m/s)の変動圧画像計測法を確立し,風洞実験のコスト低減,詳細な数値予測のための基礎データの提供を実現することを目的とした.流れの動圧レベル(100Pa)の計測を実現するために,(1)任意の材質,形状の物体に「塗れる」高速応答型感圧塗料,および,(2)感温塗料(TSP)とPSPの重ね塗りによる圧力・温度同時計測法,の開発を進めた.開発したPSP計測法に基づき,(3)多様な風洞実験による非定常圧力場計測を行った.(1)では,超微粒子セラミックを用いた多孔質PSPを開発し,特許出願を果たした.(2)では,PSPの下地として塗布した感温塗料から得られる温度データを用いてPSPの温度補償を行う方法を検討し,温度,圧力ともに単体計測に匹敵する精度が得られる見通しを得た.(3)では,擬似衝撃波をともなう超音速ダクト表面,低速(20m/s)流用ファン表面,および,遷音速デルタ翼表面の圧力計測を行った.いずれも,流体機械,航空機応用を強く意識したものである.ダクト計測では光学的アクセス法としてボアスコープを用い,100Hz程度の変動を1kPa以内の精度でとらえることに成功した.低速流ファンでは,ファン回転と同期したレーザダイオードによる間欠露光を試み,1kPa程度の変動をとらえることに成功した.デルタ翼表面圧力計測では,1kHzの変動を1kPa程度の精度でとらえることに成功しており,より精度を高めるためのPSP/TSP画像データの処理法を検討し,PSPデータの温度補償法の改善が必要であることを見出した.微小圧力変動の空間分布を計測するための感圧塗料(PSP)技術開発を進めた.陸上輸送機器の主要速度域であるO(10m/s)の変動圧画像計測法を確立し,風洞実験のコスト低減,詳細な数値予測のための基礎データの提供を実現することを目的とした.流れの動圧レベル(100Pa)の計測を実現するために,(1)任意の材質,形状の物体に「塗れる」高速応答型感圧塗料(PSP)と感温塗料(TSP)の重ね塗りによる圧力・温度同時計測法の開発,(2)開発したPSP計測法に基づく多様な風洞実験による非定常圧力場計測を行った.(1)では,PSPの下地として塗布した感温塗料から得られる温度データを用いてPSPの温度補償を行う方法を検討し,圧力,温度ともに単体計測に匹敵する精度が得られる見通しを得た.ただし,重ね塗りにより,単体に比べてTSP発光強度が低下する,PSPの圧力感度が若干悪くなる,という問題が新たに生じ,更なる改善が必要であることも明らかとなった.(2)では,擬似衝撃波をともなう

超音速ダクト表面,および,遷音速デルタ翼表面の圧力計測を行った.いずれも,流体機械,航空機応用を強く意識したものである.超音速ダクトでは,1kHz程度の変動をともなう擬似衝撃波の振動現象をPSPと同時にシュリーレン撮影によりとらえ,両者の画像をあわせて用いることにより,単体計測では知ることの難しい流れ場構造の詳細をとらえることに成功した.
廃水中の汚染有機物質の酸化分解

廃水中の汚染有機物質の化学的処理プロセスの確立をめざし、各分担者ごとに、以下の研究が行われた。1.触媒湿式酸化反応による汚染物質の酸化分解(井上) 27種の有機化合物の酸化分解反応を、酸化コバルト触媒共存下の水溶液系で行い、酸化分解による炭酸ガス生成速度と中間生成物の定量とが行われた。酸化分解速度測定より、種々の有機物の分解の容易さの順序を明らかにした。又中間生成物として、酢酸が、反応経路決定の上からも、汚染物質除去の実際的な観点からも重要であることを示し、有機物酸化分解反応の経路を明らかにした。さらに、各段階の酸化反応の速度定数を定めたシミュレーションによって多くの有機物の酸化分解過程を定量的に模擬するとともに、広く直鎖有機化合物酸化分解除去速度の推算を可能とした。2.有機汚染物質の生物分解の効率化(川端)湿式酸化反応で処理した廃液は通常、生物処理されるが、その処理時間の短縮・効率化をめざし、橋かけポリビニルピリジンを素材とした菌体担持材料の生物処理槽への添加効果を調べた。COD負荷の高い廃水処理において、この材料の添加が、生物処理速度増大に顕著な効果を示した。又橋かけポリビニルピリジニウムハライドのビーズの添加も、COD除去速度を増大させることがわかった。3.高活性触媒を用いた廃液の低温常圧処理(御園生)低温・水溶液中での酸化分解反応の高活性触媒探索のため、1-ブタノールをモデル被酸化物として、種々の触媒添加の効果を調べ、白金が高活性触媒として、最も有効であることを示し、その反応経路を推定した。担体としては、活性炭が完全酸化選択性の高いことを見出した。又、二元金属触媒系での反応において、銀の添加が、炭酸ガス生成反応の選択性を向上させ、低温湿式酸化の触媒として、可能性の高いことを明らかにした。
非線形超音波共鳴法の開発

固体材料の共鳴周波数を計測・逆解析することで、その材料の持つ二次弾性定数を決定する方法を超音波共鳴法という。本研究では、超音波共鳴法の基礎理論を非線形弾性体へ拡張するとともに、Ritz法に基づく数値解析を行った。その結果、非線形弾性体の共鳴振動が従来の点群・既約表現ではなく、カラー対称性を備えた磁性点群によって記述されることを明らかとした。また本理論を応用すれば、共鳴周波数の圧力依存性の実験計測とその逆解析によって、原理的にはほぼ全ての独立な三次弾性定数が決定できることを明らかとした。これらの成果は、本研究の主目的である非線形超音波共鳴法の基礎理論の完成を意味している。本年度は、一次元非線形弾性体について本研究で構築した理論の数値解析による検証を行った.その結果,非線形性に起因して生じる以下の現象とその特徴を明らかにすることができた:作用汎関数の停留条件を満足する非線形弾性体の運動は時間周期解である,非線形弾性体の共鳴周波数は振動振幅の増加に伴い単調減少する,共鳴周波数の振動振幅依存性は弾性体の持つ非線形性と密接な関係を持つ,非線形効果により励起される高次振動は対称性に応じて特定の振動モードが選択的に励起される.また関連課題として,二次元線形弾性体の共鳴振動問題について,エアリーの応力関数を用いた解析法を新たに考案した.以上の結果は,英文誌へ投稿し掲載されている(一部は印刷中).また,従来の超音波共鳴法を用いてランガサイト,リチウムタンタレイト,リチウムナイオベイト単結晶に対する低温域の弾性定数・圧電定数係数を行ったため,それらの成果を英文誌へ投稿した.これらの論文も既に掲載されている(一部は印刷中).これらの研究と並行して,本研究の主目的である二次元非線形弾性体に対する共鳴振動理論の構築を進めた.ここで,理論構築の対象はサブナン・キルヒホッフ型の超弾性体とした.この結果,基礎理論の主要な部分はほぼ完成させることができたが,その形式が未だ煩雑であるため,数値計算に十分適し形には整理しきれていない.そのため,現在はこの基礎理論の推敲を進めている.また,数値計算用に大型計算機を導入したため,これを用いた数値解析用のプログラムを作成している.昨年度は,二次元非線形超弾性体に対する共鳴振動理論の構築に成功した.その結果,共鳴振動振幅の増加に伴って生じる非線形現象を理論的に解析することが可能となった.こうして得られた理論予測結果を検証するため,本年度はその実験検証を行った.具体的には,弾性体に入力する超音波の振幅を増加させ,それに伴う共鳴周波数の変化を計測した.計測にはAl,Cu,およびSiの各単結晶試料を用い,ここへ入力する超音波の振動振幅を変化させながら共鳴スペクトルを計測.同時に各試料の振動波形解析も行った.その結果,共鳴周波数は振動振幅の増加に伴って単調に減少し,共鳴時のスペクトルには高調和振動項が確認された.これらの結果は理論予測の結果と定性的に一致しており,本理論の正当性を支持している.しかしながら大きな問題も浮上した.既存の研究設備では入力超音波の振動振幅が小さいためにその定量評価は容易でなく,また非線形効果による共鳴周波数の変化が予想よりも小さかったことから,当初の研究目的であった高次弾性定数の決定が困難であることが明らかとなった.そこで本年度では研究方法を修正し,高圧環境下における共鳴周波数の変化から,高次弾性定数を決定する方式へと切り替えた.この際に共鳴周波数の圧力依存性を計算する新しい非線形共鳴理論が必要となるが,これは昨年度の理論を応用することで完成させることができた.また高圧実験研究も並行して行い,高圧下での共鳴スペクトルの計測に成功した.本研究は,固体材料の共鳴周波数を計測し,その逆解析から材料の二次と三次の弾性定数を同時に決定する非線形超音波共鳴法の開発を目的としている.研究の初年度となる昨年度は,一次元超弾性体に対する基礎理論の構築に終始したが,二年目の本年度は,基礎理論を二次元へと拡張することに成功した.また,得られた理論に基づいて数値解析を行った結果,非線形超弾性体の共鳴振動にはカラー対称性と呼ばれる,これまで知られていなかった新しい対称性が埋め込まれていることを発見した.これと並行して,解析に材料の熱膨張を利用する新しい理論を考案し,その着想に基づいてより簡便な理論を構築することに成功した.

その結果,三次元の超弾性体に対する二次・三次の弾性定数計測に必要な基礎理論はほぼ全て完成させることができた.研究の三年目となる次年度は,得られた基礎理論を用いていくつかの試料に対する実計測を行う予定である.なお,本研究に関連して,今年度は2件の学術論文発表,1件の国際会議発表,5件の国内会議発表を行った.研究の最終年度となる本年度は、準線形共鳴振動理論の構築に取り組んだ。この理論は、弾性体の形状、密度、および二次と三次の弾性定数を与えると、その弾性体が持つ共鳴周波数とその圧力依存性を計算するものである。数値計算時のコストを削減するため、この理論では、当該研究によって昨年度までに得られた成果の一つである磁性点群と、物性物理学で多用されている準調和近似理論を併用している。ここで磁性点群とは、非線形共鳴振動内に見つかった新しい共鳴振動対称性(カラー対称性)を一つの対称操作と見た際に、その集合が作る群の構造を指している。準線形共鳴振動理論を用いて、これまでに二次および三次の弾性定数がともに計測されている様々な金属元素について解析モデルを構築し、その共鳴周波数と圧力依存性を理論的に計算した。更に、熱力学関係式を用いてこの圧力依存性から元素の持つ非調和性(非線形性)の指標であるグリューナイゼン定数を算出した。その結果、グリューナイゼン定数は共鳴振動モードによって大きく値が変化するものの、高周波数領域では一定値へ収束する傾向が伺えた。そこでこの収束値を元素ごとに算出し、得られた結果を既存のグリューナイゼン定数の報告値と比較した結果、両者は定量的に極めて良く一致することが明らかとなった。この結果は、準調和近似理論を用いて計算された共鳴周波数の圧力依存性が定量的に正しいことを示す、一つの客観的な検証結果を与えている。これらの結果から、準線形共鳴振動理論は完成したと考えることができ、さらにこの理論を用いることで、固体材料の共鳴周波数とその圧力依存性の計測とその逆解析から、原理的には全ての弾性定数と、ほぼ全ての三次弾性定数を決定することが可能となった。これは、本研究における当初の研究目的がほぼ達成されたことを意味している。26年度が最終年度であるため、記入しない。弾性理論、固体力学、材料科学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は二次元弾性体の基礎理論を完成させる予定であったが,理論の煩雑性のため予定以上に数値計算に時間がかかり,その完成には至っていない.当初は共鳴周波数の振動振幅依存性から高次弾性定数を計測することを目的としていた.このための理論は構築し,またその検証実験も行ったが,既存の設備ではこの方式での計測が困難であることが判明した.そこで急遽,計測方式を高圧計測に切り替えたが,そのための基礎理論は完成させることができ,また試験実験も成功させることができた.これは,ほぼ当初の計画と同程度の達成度と考えてよい.申請段階では,本研究の実施には4年間の研究期間を設け,前半の二年間は主に基礎理論の構築を,後半の二年間は構築した理論を用いた実計測を予定していた.前半の最終年度となる今年度は,予定通りに基礎理論を作成することができた.この基礎理論は,当初の計画とは異なる着想によるものであるが,より簡便で十分な精度を持った,実解析に耐えうる極めて現実的な理論である.この理論が完成したため,三年目となる次年度からは実計測を行うことができる.本研究は当初の予定通り,順調に進展していると考えることができる.本研究成果を含むこれまでの研究成果が認められ,研究代表者は平成27年度の文部科学大臣表彰(若手科学者賞)を受賞した.
近世の小規模領有関係錯綜地域における領主ネットワークと地域社会に関する研究

南信州(主に飯田・下伊那)地域における領主たちの動向について、飯田藩や交代寄合信濃衆に関する基礎的事実の解明・分析を中心を明らかにした。そうして得られた事実により、飯田藩をはじめとした領主権力の在り方と地域社会の構造や動向、中央政局の展開などとの関連についても明らかにすることが出来、京都をはじめとした領外の都市との関係についても論じることが出来た。そうした成果によって、この南信州(特に飯田・下伊那)という地域が、領有関係の錯綜や中央の政治状況等によって、領主権力とともにそのあり方を大きく規定されていることが明らかとなり、畿内や駿遠地域等との比較検討も行うことが出来た。史料の調査については、研究計画に従って飯田藩および下伊那に知行地を有した交代寄合に関する史料の調査および収集を行い、史料の翻刻および史料分析を進めた。飯田藩に関係する史料に関しては、飯田市歴史研究所が所蔵する写真帳に加え、東北大学附属図書館、東京大学史料編纂所、国立国会図書館などにおいて収集した。これらの作業により、概ね史料の所在を確認でき、主要な部分については収集・調査を行うことができた。これによって基礎的な事実の確定が可能となり、研究が大きく前進した。なおこれらの研究成果の一部については、東京大学近世史研究会、日本古文書学会などにおいて研究報告を行っており、そこでの議論は今後研究を進めていく上で大変参考になった。加えて飯田・下伊那に領地を有する他の領主については、交代寄合信濃衆、特に小笠原氏(小笠原資料館蔵小笠原家文書)、座光寺氏(高森町歴史民俗資料館蔵片桐家文書)に関する史料を中心に収集・分析を進めた。概ね史料の状況を把握することができ、今後の研究活動を行う上での足固めをすることができた。こうした成果については、今後所々の学会、研究会等において、報告を行う予定である。また上記の作業に加え、これまで行ってきた加賀藩や土浦藩などに関する研究も進め、飯田藩等との比較検討を行うための準備を進めた。これらについては、第53回近世史サマーセミナーなどにおいて報告を行ったものもある。これらは飯田藩とは性格を異にする諸藩であり、今後、比較検討を行う上で重要な視点を得ることが出来た。上記に加え、飯田藩および交代寄合信濃衆などについて、関連する史料の存在をいくつか確認することが出来た。具体的には、高木家文書(名古屋大学附属図書館)、松平太郎左衛門家文書(豊田市郷土資料館)などである。これらについては今後調査を進め、飯田藩等に関連する史料が存在するのか、調査する予定である。平成27年度においては、飯田藩および交代寄合信濃衆に関する史料の調査・収集に加え、昨年度に調査・収集を行った同史料に関する分析の成果を公表することが出来た。具体的には小笠原資料館や高森町歴史民俗資料館、東京大学史料編纂所等での研究資料の調査・収集を行った。研究成果の公表については、飯田市歴史研究所における定例研究会および名古屋大学近世史研究会において、「宝暦-天明期から寛政期における交代寄合信濃衆」と題する報告を行った。また飯田市歴史研究所において、コメンテーターとして静岡大学の今村直樹氏を招請し、「飯田・下伊那の領主たちと地域社会」と題するワークショップを開催し、「17世紀後半における飯田藩と信濃衆」題して報告を行った。上述の成果により、これまで解明されてこなかった飯田・下伊那における領主たちの動向が明らかになりつつあり、近世の地域社会において領主たちの動向がどのような意味を持ったのか、という点について明らかにする上で基礎となる事実や論点を見出すことが出来た点に大きな成果があったといえよう。またワークショップにおいては、今村氏による熊本藩や駿遠地域との比較等を念頭においたコメントを踏まえた議論により、本研究の意味や方向性を再確認するとともに、新たな視点を得ることが出来たという点で非常に有意義であった。また27年度は、飯田・下伊那の領主に関する史料以外にも、その比較対象として他地域における領主に関する史料を収集することも出来た。具体的には名古屋大学附属図書館や名古屋市蓬左文庫における高木西家および高木東家による史料の調査である。これらの調査によって、飯田・下伊那の領主を検討する上で、その比較対象となる領主の史料を収集することが出来た点で大きな成果があったといえる。総じて昨年度以来の研究成果を公表でき、新たな史料を収集し、研究を次の段階へ進める上での準備が出来た。昨年度までの研究成果を公表出来た点は大変重要な成果であり、またワークショップの開催により、今後の研究に必要な事例や論点を見出すことが出来た点は大変有意義であった。また史料の収集・調査についても、飯田藩や交代寄合信濃衆をはじめとして進展が見られ、他地域における領主の史料についても、調査を進めることが出来た点も重要な成果であったといえる。ただし、飯田・下伊那地域における領主については、飯田藩や交代寄合信濃衆に関する史料の調査や研究成果の公表を行うことが出来た一方で、それ以外の領主については調査・研究を十分に行うことが出来なかった点が課題として残った。しかしながら、飯田藩や交代寄合信濃衆に関する調査や史料の分析が進展したことで、これら以外の領主の問題についても論点や事例を見出すことが出来たこと、他地域へも調査・研究の範囲を広げることが出来たことは、重要な成果と言える。上述のことから、一定度の課題は残ったものの、概ね従来の計画にそった形で研究を進めることが出来たと考えており、比較的順調に研究が進展していると判断した。平成28年度は各所でこれまでの研究成果を公表することが出来た。

具体的には第32回平安京・京都研究集会において「近世大名家の京都における活動と京都屋敷」と題して、日本史研究会2017年1月例会において「近世武家社会における「両敬」」と題して、それぞれ飯田藩堀家を事例とした研究報告を行った。また飯田市が主催する第14回地域史研究集会において「近世後期の飯田藩政-その展開と課題」と題する報告を行った(『年報15号に掲載)。加えて飯田市歴史研究所において、京都精華大学の齊藤紘子氏を招請し、「飯田・下伊那の領主たちと地域社会II」と題するワークショップを開催し、「生類憐みの令をめぐる飯田藩と村々」題して報告を行った。これらの成果により、南信州(主に飯田・下伊那)における領主たちの動向が明らかになり、近世の地域社会において領主たちの動向がどのような意味を持ったのか、領外地域において領主たちはどのような活動を行っていたのか、という点について明らかにすることが出来た点に大きな成果があったといえよう。ワークショップにおいては、齊藤氏による伯太藩をはじめとする畿内との比較等を念頭においたコメントを踏まえた議論により、本研究の意味や方向性を再確認するとともに、当該地域における飯田藩の動向とその特質について明らかにすることが出来た。また28年度は、飯田・下伊那の領主に関する史料以外にも、その比較対象として他地域における領主に関する史料を収集し、比較検討を行うことも出来た。具体的には名古屋大学附属図書館や名古屋市蓬左文庫における高木西家および高木東家による史料の調査等である。これらの調査によって、飯田・下伊那の領主を検討する上で、その比較対象となる領主の史料を収集し、分析することが出来た点で大きな成果があった。総じて昨年度以来の研究成果を公表でき、一定の成果を得ることができたといえる。南信州(主に飯田・下伊那)地域における領主たちの動向について、飯田藩や交代寄合信濃衆に関する基礎的事実の解明・分析を中心を明らかにした。そうして得られた事実により、飯田藩をはじめとした領主権力の在り方と地域社会の構造や動向、中央政局の展開などとの関連についても明らかにすることが出来、京都をはじめとした領外の都市との関係についても論じることが出来た。そうした成果によって、この南信州(特に飯田・下伊那)という地域が、領有関係の錯綜や中央の政治状況等によって、領主権力とともにそのあり方を大きく規定されていることが明らかとなり、畿内や駿遠地域等との比較検討も行うことが出来た。初年度は飯田藩やその周辺に領地を有する領主に関する史料の収集と分析を主な活動として計画していたが、飯田藩や交代寄合信濃衆などについては、概ね主要な史料の所在を把握し、それを収集するとともに、そのについては、翻刻と分析を行うことができた。これに加え、収集・調査まで至らなかったが、所在を確認できた史料も複数あった。これらについては二年目以降の研究推進において、重要になっていくと考えられる。またその成果の一部、および科研申請以前に行った調査活動の成果については、研究報告等の形で報告・公表することができた。
RC及びPC柱・梁接合部のせん断耐力に関する有限要素法解析とせん断設計法の開発

本研究では、RC及びPC柱・梁接合部のせん断耐力を把握するために、2次元非線形FEM解析を行い、コンクリート強度、接合部横補強筋、柱軸力、梁主筋付着、プレストレス力、プレストレス材の付着などをパラメータとした解析結果から得られる接合部の変形、ひずみ状況や内部応力状態の詳細な考察から、接合部せん断抵抗機構に基づいたせん断耐力モデルやせん断耐力式を検討し、RC及びpc柱・梁接合部の合理的な耐震設計法の開発に寄与することを目的とした。上記目的を達成するために、今年度は、平成9年度に実施したRC及びPC柱・梁接合部のFEM解析結果(以下参照)を用いて、詳細なせん断抵抗機構の検討、並びにPC接合部に関するプレストレス力、プレストレス付着のFEMパラメータ解析を行った。RC柱・梁接合部: RC接合部のせん断耐力に影響を与えるコンクリート強度、横補強筋、柱軸カ、梁主筋付着をパラメータとしたFEM解析結果を用いて、RC接合部のせん断抵抗機構に与える各因子の影響について評価を行った。PC柱・梁接合部:(1)プレストレス力(PS=00.2Fc)と(2)プレストレス材の付着(ボンドとアンボンド)を主な実験変数とした、PC接合部のせん断破壊実験試験体4体を解析対象としてFEM解析を実施し、PC接合部実験試験体の履歴特性、破壊状況、コンクリートや鉄筋のひずみ状況の比較・検討を行った。更に、RC及びPC構造を区別することなく、共通の視点に立ったRC及びPC柱・梁接合部のせん断抵抗機構の理解に基づいたせん断耐力モデルやせん断耐力式の検討を行った。本研究では、RCおよびPC柱・梁接合部のせん断耐力を把握するために、コンクリート強度、接合部横補強筋、柱軸力、梁主筋付着、プレストレス力、プレストレス材の付着などをパラメータとした2次元非線形FEM解析を行い、解析結果から得られる接合部の変形、ひずみ状況や内部応力状態の詳細な検討から、接合部せん断抵抗機構に基づいたせん断耐力モデルやせん断耐力式を提案し、RCおよびPC柱・梁接合部の合理的な耐震設計法の開発に寄与することを目的とする。上記目的を達成するために、本年度は接合部せん断破壊が顕著なRCおよびPC柱・梁接合部実験試験体を対象としたFEM解析を行い、解析モデルの検証、ならびにせん断抵抗機構の検討を行った。具体的には、以下の2項目について研究を実施した。RC柱・梁接合部:RC接合部のせん断耐力に影響を与えるコンクリート強度、横補強筋、柱軸力、梁主筋付着をパラメータとしたFEM解析結果を用いて、RC接合部のせん断抵抗機構に与える各因子の影響を評価した。PC柱・梁接合部:プレストレス力(PS=00.2Fc、Fc :コンクリート圧縮強度)とプレストレス材の付着(ボンドとアンボンド)を主なパラメータとした、PC接合部のせん断破壊実験試験体4体を解析対象としてFEM解析を実施し、PC接合部実験試験体の履歴特性、破壊状況、接合部応力伝達機構の比較・検討を行った。尚、PC接合部の精度良いFEM解析を実施するために、グラウト材の付着-すべり関係を実験データから求め、より実状に近いプレストレス導入モデルの開発を行った。
転写モーターの1分子可視化実時間計測法による解明

T7RPaseを蛍光顕微鏡で可視化するために、蛍光物質TRITCを10分子導入したAvidinタンパク質を、あらかじめ複数のBiotin残基を導入したT7RPaseへに結合させることによって、観察に十分な量の蛍光強度をT7RPaseに付与した。DNAにはT7RPaseに対するプロモーターを持つT7ΔD111DNAを用意した。DNA分子をフローティングポテンシャル電極の電極間で誘電力により伸長させてDNA末端を電極端に固定させた。この伸長固定化DNAは、T7RPase分子やRNA基質の溶液の注入および吸引が容易になるように工夫したフローチャンバー内に配置した。転写時におけるT7RPaseの挙動を観察すると、DNA上で静止する分子と、運動する分子が観察された。この運動は1)溶液の流れによって流れ去る「ドリフト」、2)電極付近でゆらぎ運動する「テザード」、3)溶液の流れと垂直なDNAの伸長方向に振動様に運動する「マーチング」の3つのモードに分類された。マーチングはRNA基質が存在しない場合には観察されなかったことから、転写に伴った運動であると考えられる。これはDNAから解離したT7RPase分子が、近傍に密に配置されたDNA分子と再度結合し、そこで転写を繰りかえしたためだと考えられる。一方、転写運動をする様子が見られない分子は、moribund complexやslippage complexを形成した分子、あるいは転写が進行することによって転写進行方向のDNAの螺旋密度が増加し前進することができなくなった分子、だと考えられる。
甘果オウトウの花器官形成遺伝子の単離とその多雌ずい形成への関与の解明

本研究では、甘果オウトウの花器官形成遺伝子を単離するとともに、異なる温度や品種間でこれらの遺伝子の発現量と多雌ずい形成、胚珠発育との関係を調べた。クラスB遺伝子としてPaTM6、PaPI遺伝子を、クラスC遺伝子としてPaAGとPaSHP遺伝子を、クラスD遺伝子としてPaSTK遺伝子を単離し、花の各部位での発現を確認した。温度処理や品種間比較において、各遺伝子の発現量の全てに一貫した傾向は得られなかったものの、高温による多雌ずい形成にはPaAGの増加が関与している可能性が高いことが示された。一方、ジベレリンによる胚珠の退化にはPaSTKの減少の関与が示唆された。前年に単離に成功した甘果オウトウの花器官形成遺伝子{クラスB遺伝子(PIとAP3)、クラスC遺伝子(AG)}について、異なる温度条件下における発現量の差異を分析した。花芽分化期後半に、鉢植え樹を異なる温度(2035°C)の人工気象室に搬入し、花芽を採取した。花芽の分化段階を調査するとともに、多雌ずい花の発生率を記録した。また、花芽から鱗片を除いて花芽原基を取り出し、RNAを採取し、cDNAを合成して、リアルタイムPCRによりクラスB遺伝子(PaPI, PaAP3)と、クラスC遺伝子(PaAG, PaSHP)の発現量を分析した。花芽分化は、温度が高いほど遅れる傾向が認められた。多雌ずい花の発生率は温度が高いほど大きかった。高温により、PaTM6とPaSHP遺伝子は減少、PaPIとPaAG遺伝子は増加する傾向が認められた。多雌ずい形成や雄ずいの雌ずい化現象の原因として予想されたクラスB遺伝子の減少、クラスC遺伝子の増加と一致したのは、PaTM6とPaAG遺伝子であった。一方、クラスD遺伝子(STK)について、異なる温度条件下における発現量の差異を分析した。開花期前後に2品種の鉢植え樹を異なる温度(15、25°C)の人工気象室に搬入し、開花時に花を採取した。子房のPaSTK遺伝子の発現量は、`佐藤錦'では低温区で大きかったが、`紅秀峰'では高温区で大きかった。温度とPaSTK遺伝子の発現量について一貫した傾向が認められなかった。イネではクラスA遺伝子(AP2)の発現量の変化によって、雄ずい数の減少と雌ずい数の増加が生じることが報告されており、甘果オウトウについても、まずクラスA遺伝子(PaAP2)の単離を試み、成功した。今後はこの遺伝子の温度による発現量の比較が必要である。最終年度には、再度、甘果オウトウの花器官形成遺伝子{クラスB遺伝子(PaPIとPaTM6)、クラスC遺伝子(PaAGとPaSHP)}について、人工気象室による異なる温度条件下における発現量を比較した。`佐藤錦'では、高温によりPaPIとPaSHP遺伝子は減少、PaTM6とPaAG遺伝子は増加する傾向が認められた。`紅秀峰'では、いずれの遺伝子も高温により減少した。いずれの品種も高温により多雌ずい花発生率は増加した。次に、露地栽培において品種間で花器官形成遺伝子の発現量と多雌ずい花発生頻度を比較したところ、クラスB,C遺伝子ともに`佐藤錦'で`高砂'や`ナポレオン'よりも発現量が大きかった。多雌ずい花発生率は、ナポレオン'で`佐藤錦'や`高砂'よりも高く、多雌ずい花発生率と花器官形成遺伝子の発現量に品種間での一定の傾向は認められなかった。他に、花芽の発育段階による花器官形成遺伝子の発現量を調べたところ、分化初期の6月下旬にはいずれの発現量も少なく、がく片分化期の7月上旬にはクラスB遺伝子が急増し、花弁分花期の7月下旬にはクラスC遺伝子も急増していた。一方、クラスD遺伝子(PaSTK)について、開花前にジベレリン(GA)処理を行ったところ、PaSTK遺伝子の発現量は著しく減少し、退化した胚珠の割合が増加したことから、GAによる胚珠の早期退化にクラスD遺伝子が関与している可能性が示唆された。研究期間全体を通じて、甘果オウトウの花器官形成遺伝子(クラスB,C,D遺伝子)を単離するとともに、異なる温度や品種間での発現量と多雌ずい形成、胚珠発育との関係を調査した。全てに一貫した傾向は得られなかったものの、多雌ずい形成にはクラスB,C遺伝子が関与している可能性が示された。一方、胚珠の発育にはクラスD遺伝子の関与が示唆された。甘果オウトウの多雌ずい形成に関与していると推測される花器官形成遺伝子について、まず単離を試みた。雄ずいや雌ずいの原基が形成されている時期の花芽を採取し、鱗片を剥皮した後、RNAを抽出した。

雄ずいや雌ずいの分化に関わるクラスB遺伝子(PISTILLATA (PI)遺伝子とAPETALA3 (AP3)遺伝子)、クラスC遺伝子(AGAMOUS (AG)遺伝子)、クラスD遺伝子( SEEDSTICK (STK)遺伝子)について、同じバラ科植物のリンゴやバラ、モモのクラスB,C,D遺伝子に特徴的な配列をもとにジェネレートプライマーを作成した。前述のRNAを鋳型として、このプライマーによりRT-PCRを行い増幅産物TAクローニングし、塩基配列を決定した。この配列をもとに、3'-RACE、5'-RACE用のプライマーを作成し、3'-RACE法と5'-RACE法により全長の塩基配列を決定した。得られたオウトウのクラスB(PaTM6、PaPI)、C(PaAg、PaSHP)、D(PaSTK)遺伝子は、いずれもそれぞれのファミリーに特異的な配列を有していた。得られた塩基配列をもとに各遺伝子に特異的プライマーを作成し、開花時に花の各部位から抽出したRNAのRT-PCR分析を行った。PaTM6、PaPI遺伝子が花弁と雄ずいでのみ、PaAg、PaSHP遺伝子が雄ずいと雌ずいでのみ、PaSTK遺伝子が雌ずいでのみ発現していたことから、得られた遺伝子がそれぞれ目的の遺伝子である可能性が示唆された。得られた成果は、今後の多雌ずい形成へのクラスB,C,D遺伝子を関わりを研究するための基礎データとして非常に有用である。人工気象室を用いて温度処理を行って、各遺伝子の発現量を比較することができ、実験がおおむね順調に進展した。しかしながら、花芽原基の採取の方法で課題が残ったことから、来年度は植物ホルモン処理や品種間比較、クラスA遺伝子の実験に加えて、今年度の反復試験も改善したやり方で行う必要がある。ジェネレートプライマーをいろいろなものを試しながら進めた結果、クローニングが成功し、実験がおおむね順調に進展した。しかしながら、研究費を2/3までしか使えない状況が長く続いたため、一部分析ができなかったものもあった。今回、凍結保存した花芽から鱗片を剥いて原基を取り出すときに融解した可能性があるので、次年度はこの点を改善したうえで同様の反復実験を行う予定である。これにより、高温による多雌ずい形成とクラスB、C遺伝子の発現量との関係がより明確になるものと期待される。また、新たに単離したクラスA遺伝子の発現量についても、温度環境との関係を探る予定である。他に、多雌ずい化発生頻度の異なる品種間でもクラスA,B,C遺伝子の発現量を比較し、多雌ずい形成へのこれらの遺伝子の関与を探る予定である。胚珠の発育については、温度とクラスD遺伝子の発現量の関係について、同様の実験を行ってデータの信頼性を高める予定である。また、ジベレリン処理を行って胚珠の発育を抑制したときのクラスD遺伝子の発現量を調べることで、胚珠の発育へのこの遺伝子の関与を探る予定である。単離した遺伝子の多雌ずい形成への関与を明らかにするために、温度処理、植物ホルモン処理を行って多雌ずい発生頻度の異なる条件を生み出し、クラスB,C,D遺伝子の発現量を比較することで、多雌ずい形成へのこれら遺伝子の関与を探る。多雌ずい化発生頻度の異なる品種間でもこれらの遺伝子の発現量を比較し、多雌ずい形成への関与を探る。また、多雌ずい形成の発生しない品種について、これらの遺伝子を解析し、多発生品種との相違を調べる。特に、上流の発現調節領域の遺伝子も解析して、相違が見つかれば、その塩基配列の違いをもとに、分子マーカーの作出を試みる。