hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エクソソーム内包タンパク活性化機構に着目した胆道がん併用療法の確立

本研究は、新薬開発が容易でない胆道がんの予後に貢献できる併用療法の可能性について、細胞から分泌される分画であるエクソソームに着目して探索することを特徴とする。エクソソームの薬剤耐性機序を解明するためには、培養胆道がん細胞から分泌されるエクソソームのmTOR活性化機構を解析するとともに、他のエクソソーム蛋白の活性化についても検討する。さらに臨床応用の可能性が高い胆道がんの併用薬による治療法を探るため、。抗がん剤で活性化されるエクソソーム内部蛋白を制御できる医薬品による併用療法の実用性を検証する。
堆積物を運んだ水の起源情報としての鉄マンガン酸化物のポテンシャル評価

河川の堆積物粒子の付着成分,ケイ酸塩成分のSr-Nd同位体比と,河川水のSr-Nd同位体比を比較し,水由来のSr-Ndが多く含まれる成分を確かめる実験を行なった.三陸地方で太平洋に注ぐ大小の12河川(奥入瀬川,久慈川,北上川,名取川,阿武隈川など)より採取した懸濁物について,酢酸,塩酸ハイドロキシルアミン酢酸(HH)溶液による溶出実験を行い,交換体及び炭酸塩,鉄マンガン酸化物と想定される成分を抽出した.さらにその残渣を砕屑性ケイ酸塩成分と想定し,フッ酸・硝酸・過塩素酸を用いて完全に分解した.各成分についてSrとNdの同位体測定を行い,河川水のSr-Nd同位体比と比較した.Nd同位体比は,各成分とも河川水の値とよく一致することが確認された.鉄マンガン酸化物にはNdを含む鉱物はモナザイトや褐簾石など,岩石や堆積物中において主要でない鉱物に限定して含まれることから,岩石から水に溶存したNd同位体比と,溶存せず砕屑物粒子に残存するNd同位体比との間に大きな分別が起こらないことが推定される.一方,Sr同位体比は炭酸塩成分では河川水溶存成分と良く一致するが,他の成分は河川水とは大きくずれることが確認された.値がずれるのは,Srは斜長石を始め多くの主要鉱物に含まれることから,鉱物の溶解度の違いによって水と残渣である堆積物との間に同位体比の差が生じるためと解釈できる.炭酸塩成分のSrと河川水溶存Srの同位体比が一致することは,炭酸塩成分が水から析出したものであることを支持する.しかし同じく水から析出したと想定される鉄マンガン酸化物のSr同位体比は水よりもケイ酸塩成分の方に近かった.このことは,鉄マンガン酸化物中のSr含有量が少ないためと考えられる.Sr含有量の少ない鉄マンガン酸化物を抽出する過程で使用したHH溶液の反応性が高すぎて,ケイ酸塩成分の一部も溶かしてしまった可能性がある.河川懸濁物の鉄マンガン酸化物に含まれるNd同位体比が河川水の値と概ね一致することが確認できた.この結果は,鉄マンガン酸化物が堆積作用に関与した水の情報を提供するという本研究の理論的基盤が間違っていないことを示すものであり,本研究を次のステップに進めることが可能となった点で大きい.しかし一方で,溶出実験に用いたHH溶液の侵食性が想定以上に高くケイ酸塩の一部を溶出した可能性も示唆され,技術的な部分を少し改善する必要がある点で,想定以上に進展しているとまでは言えない.仙台湾で採取された海水の懸濁物について,河川懸濁物と同様に溶出実験を行い,海水溶存成分とNd同位体比を比較する.仙台湾の海水のNd同位体比は,外洋水との混合により,名取川や阿武隈川といった流入河川水よりも低いことを,他の研究ですでに明らかにしている.仙台湾の懸濁物はこれらの河川に由来すると考えられるが,それらに吸着する鉄マンガン酸化物が河川のNdを保持する程度を河口からの距離や深度との関係から考察する.一方で,2011年東北太平洋沖地震による津波による陸上の堆積物を対象に海水のシグナルを検出する研究に着手する.福島県北部沿岸平野部で採取された津波堆積物試料及び津波の影響を受けていない堆積物試料について炭酸塩成分,鉄マンガン酸化物成分,ケイ酸塩成分それぞれのSr-Nd同位体比を測定する.周辺河川水及び沿岸海水を採取し,それらと堆積物各成分とでSr-Nd同位体比を比較し,津波海水の痕跡の検出を試みる.それらと並行して,HH溶液の濃度や作用時間を調整することで,ケイ酸塩の溶出を出来るだけ抑えつつ鉄マンガン酸化物を最大限抽出できる条件を求めるための実験や,堆積物埋積後の鉄マンガン酸化物中のSr-Nd同位体比の安定性を検証するための実験を逐次行って行く予定である.河川の堆積物粒子の付着成分,ケイ酸塩成分のSr-Nd同位体比と,河川水のSr-Nd同位体比を比較し,水由来のSr-Ndが多く含まれる成分を確かめる実験を行なった.三陸地方で太平洋に注ぐ大小の12河川(奥入瀬川,久慈川,北上川,名取川,阿武隈川など)より採取した懸濁物について,酢酸,塩酸ハイドロキシルアミン酢酸(HH)溶液による溶出実験を行い,交換体及び炭酸塩,鉄マンガン酸化物と想定される成分を抽出した.さらにその残渣を砕屑性ケイ酸塩成分と想定し,フッ酸・硝酸・過塩素酸を用いて完全に分解した.

各成分についてSrとNdの同位体測定を行い,河川水のSr-Nd同位体比と比較した.Nd同位体比は,各成分とも河川水の値とよく一致することが確認された.鉄マンガン酸化物にはNdを含む鉱物はモナザイトや褐簾石など,岩石や堆積物中において主要でない鉱物に限定して含まれることから,岩石から水に溶存したNd同位体比と,溶存せず砕屑物粒子に残存するNd同位体比との間に大きな分別が起こらないことが推定される.一方,Sr同位体比は炭酸塩成分では河川水溶存成分と良く一致するが,他の成分は河川水とは大きくずれることが確認された.値がずれるのは,Srは斜長石を始め多くの主要鉱物に含まれることから,鉱物の溶解度の違いによって水と残渣である堆積物との間に同位体比の差が生じるためと解釈できる.炭酸塩成分のSrと河川水溶存Srの同位体比が一致することは,炭酸塩成分が水から析出したものであることを支持する.しかし同じく水から析出したと想定される鉄マンガン酸化物のSr同位体比は水よりもケイ酸塩成分の方に近かった.このことは,鉄マンガン酸化物中のSr含有量が少ないためと考えられる.Sr含有量の少ない鉄マンガン酸化物を抽出する過程で使用したHH溶液の反応性が高すぎて,ケイ酸塩成分の一部も溶かしてしまった可能性がある.河川懸濁物の鉄マンガン酸化物に含まれるNd同位体比が河川水の値と概ね一致することが確認できた.この結果は,鉄マンガン酸化物が堆積作用に関与した水の情報を提供するという本研究の理論的基盤が間違っていないことを示すものであり,本研究を次のステップに進めることが可能となった点で大きい.しかし一方で,溶出実験に用いたHH溶液の侵食性が想定以上に高くケイ酸塩の一部を溶出した可能性も示唆され,技術的な部分を少し改善する必要がある点で,想定以上に進展しているとまでは言えない.仙台湾で採取された海水の懸濁物について,河川懸濁物と同様に溶出実験を行い,海水溶存成分とNd同位体比を比較する.仙台湾の海水のNd同位体比は,外洋水との混合により,名取川や阿武隈川といった流入河川水よりも低いことを,他の研究ですでに明らかにしている.仙台湾の懸濁物はこれらの河川に由来すると考えられるが,それらに吸着する鉄マンガン酸化物が河川のNdを保持する程度を河口からの距離や深度との関係から考察する.一方で,2011年東北太平洋沖地震による津波による陸上の堆積物を対象に海水のシグナルを検出する研究に着手する.福島県北部沿岸平野部で採取された津波堆積物試料及び津波の影響を受けていない堆積物試料について炭酸塩成分,鉄マンガン酸化物成分,ケイ酸塩成分それぞれのSr-Nd同位体比を測定する.周辺河川水及び沿岸海水を採取し,それらと堆積物各成分とでSr-Nd同位体比を比較し,津波海水の痕跡の検出を試みる.それらと並行して,HH溶液の濃度や作用時間を調整することで,ケイ酸塩の溶出を出来るだけ抑えつつ鉄マンガン酸化物を最大限抽出できる条件を求めるための実験や,堆積物埋積後の鉄マンガン酸化物中のSr-Nd同位体比の安定性を検証するための実験を逐次行って行く予定である.同位体分析に用いる装置が共同利用機器であるため,予約が取れずに分析できなかった試料があり,その分,処理に用いる薬品代,機器利用費に余剰が生じた.翌年度以降,未分析の試料の測定に用いる消耗品及び機器利用費として使用する予定である.
レーザーの生体組織に対する細胞生物学的な影響を探る

本年度は最終年度に当たるため、研究代表者が行った研究の総括内容を報告する。炭酸ガスレーザーはいままで骨組織に対して使用不可とされてきた。しかしながら我々は骨組織に対して低出力で照射することにより、メカニカルフォースとしてレーザーを骨増殖に応用で切ることを見い出した。さらに本研究により、その照射条件を検討し、より歯科臨床に応用することを前提に検討し、そのメカニズムの一端を明らかにすることができた。結果は以下の通りである。ラットの頸骨に体表面から照射し、骨膜表面ならびに骨髄での変化を形態学的に検索した。照射総エネルギー密度は1.1KJ/cm^2で照射後7日目に脛骨を摘出し、中性ホルマリンで固定し樹脂包埋し、非脱灰片を作製した。これらの切片をALP染色、およびカルセイン投与による骨形態計測を行った。ラットの骨膜ならびに骨髄中には類骨が形成され、そこにはALP陽性の骨芽細胞が多数確認でき、骨形成が促進していることが確認された。また、骨形態学的計測により石灰化速度が非照射骨に比較して有意に増加していた。これらの所見は炭酸ガスレーザー照射の刺激が、骨膜および骨髄中に存在する未分化な間葉系の細胞に作用し、骨芽細胞への分化を促進させ、骨形成を誘導したことを示している。これらの所見は炭酸ガスレーザー照射がもつLLLT作用であり、組織の上からでも骨表面のみならず、骨髄中にも作用して骨を誘導できることを意味している。炭酸ガスレーザーは骨再生療法へ応用できることが十分に可能であることがわかった。本研究の最大の目的は歯科における再生療法へmechanical forceとしてレーザー治療を応用するために、in vivo, in vitroならびに多種のレーザーを利用した基礎実験のデータを集約し、今後のレーザー治療の新たな方向性を導きだすことである。これらの目的のために現在10人の研究分担者が歯随組織、筋肉組織、骨組織、歯根膜組織、を対象に炭酸ガスレーザーとEr.YAGレーザーを用いて細胞レベルでの影響を解析している。平成14年度は各研究者が実験系の確立ならびに準備期間とし、現在研究が進行中である。平成14年度に研究代表者に提出された研究成果は片山直、横瀬敏志(明海大学)および吉羽邦彦(新潟大学)であり、以下のとおりである。1.ラットの骨格筋に炭酸ガスレーザーを照射し、その後の組織反応をMAPKのリン酸化の状態を組織化学的に検出した。その結果、細胞増殖時に増加するといわれているMAPKのリン酸化はレーザー照射することにより強く誘導されることが分かった。これは炭酸ガスレーザーの組織治癒促進効果のメカニズムの一つであることが分かった。2.Er.YAGレーザーによる窩洞形成後の歯随細胞におこる変化を組織化学的に検索した。その結果、象牙芽細胞とcell-free zone, cell-rich zoneに存在する細胞にALP活性とDNAの断片化が経時的に確認された。これらの変化は歯科用タービンで形成した時とほぼ同じ変化であった。これらの結果は、Er.YAGレーザーが歯随細胞へ及ぼす影響を細胞レベルで示したものであり、齲蝕除去に十分適用できることを示唆している。本年度の斑会議において(2003年6月5日)各研究分担者に対して、炭酸ガスレーザーの骨組織に対する影響を調べることを研究代表者の片山から依頼した。本年度は主にin vivoにおいて炭酸ガスレーザーの骨組織に対する研究結果がえられた。炭酸ガスレーザーの骨組織に対する影響:SDラットの卵巣を摘出(OVXラット)し、オステオポローシスのモデル動物を作製した。そしてこの動物の大腿骨に炭酸ガスレーザーをデフォーカスで60J/cm^2のエネルギー密度で照射した。その後、経時的にカルセインで骨組織をラベルして骨形成作用に対する炭酸ガスレーザーの影響を骨形態計測法にて調べた。また、あわせてDEXAにて骨塩量を測定した。(結果と考察)

炭酸ガスレーザーを照射した骨組織は、照射後3日目から骨髄内の内骨膜に類骨の盛んな形成がみられた。その後7日目には石灰化を伴った成熟骨組織が確認された。また、カルセインの標識結果から、石灰化速度はレーザー照射しないOVXラットに比較して約3倍に達していた。これらの結果を反映して、DEXAの結果もレーザー照射したOVXラットの骨組織では照射していないOVXラットに比較して骨塩量の増加が確認された。これらの結果は、骨塩量が急激に減少するオステオポローシスのモデルであるOVXラットの骨組織に対して、炭酸ガスレーザーが骨の増加と骨塩量減少の阻止に有効であることを示している。すなわちメカニカルフォースとして骨組織の機能保持に利用できることを示唆している。今後さらに骨増加のメカニズムを分子生物学的に探索したい。本年度は最終年度に当たるため、各研究分担者の研究の総括した内容を報告する。レーザーが持つ細胞生物学的な作用を、in vivoとin vitroに分けて研究を行い以下のような結果が得られた。1)炭酸ガスレーザーをラットの頸骨に体表面から照射し、骨膜表面ならびに骨髄での変化を形態学的に検索した。照射総エネルギー密度は1.1KJ/cm^2で照射後7日目に切片を作製した。ラットの骨膜ならびに骨髄中には類骨が形成され、骨形成が促進していることが骨形態学的計測により確認できた。これらの所見は炭酸ガスレーザーが骨再生療法へ応用できることを示唆している。2)炭酸ガスレーザーをラットの臼歯に照射し、その後の歯髄の変化を光顕ならびに電顕レベルで観察し、炭酸ガスレーザーの硬組織への応用の可能性を調べた。0.7W,5秒の照射後1,3,5,7日目に試料とした。照射後、5日までは歯髄の細胞緻密層に炎症性変化がみられるが、7日目では象牙質の増生と神経の再生が確認できた。これらの所見により炭酸ガスレーザーが硬組織庇の応用が可能であることが示唆された。1)炭酸ガスレーザーと半導体レーザーを培養骨髄細胞へ低出力で照射し、骨芽細胞への分化と機能への作用を調べた。各ガスレーザーを2.6Wで照射したところ、骨芽細胞への分化への影響には変化がなかったが、骨芽細胞が石灰化する機能を亢進することが明かとなった。これらの結果は、炭酸ガスレーザーと半導体レーザーが骨再生へ応用可能であることを示唆している。2)象牙質片の下で線維芽細胞を培養し、そこに炭酸ガスレーザーを照射し、温度変化と培養細胞の生存率を調べた。16,32Jの出力で照射したところ、温度変化が7°C以下であれば、細胞の生存率は90%以上を示した。これらの所見は炭酸ガスレーザーを根管内へ照射した時、殺菌作用を示す出力においても、歯根膜細胞へは影響しないことを示しており、炭酸ガスレーザーが根管治療に有用であることを示唆している。
思春期の骨量を増大させる具体的な生活習慣の解明：前向きコホート研究

思春期は生涯の骨の健康状態を左右する骨強度(最大骨量)を獲得する重要な時期であり、この時期の生活習慣は骨粗鬆症の予防に強く影響する。本研究では、思春期の骨強度増大(最大骨量の増大)に寄与する具体的な生活習慣を解明することを目的として、小中学生の骨強度測定、及び生活習慣調査を実施した。本研究により、思春期の骨強度増大には運動が強く寄与しており、週に7時間以上(1日約60分以上)の運動を継続して実施することが骨強度(最大骨量)の増大に効果的である可能性が示唆された。今後は客観的な評価法を用いて、年齢ごとに分析を行うなど、より妥当性の高い調査法に基づく更なる検討が必要である。平成24年度は、23年度からの1年間の骨量変化について縦断的に検討を行った。平成23年度と同様に、小学4年生から中学3年生までの児童・生徒、約700人を対象に骨強度測定,および身体活動、カルシウム摂取、睡眠、骨折歴、(女子のみ初潮の有無)に関する自記式質問紙調査を実施した。また、各学校において、学校保健簿より身長、体重等の身体データを抽出した。調査の結果、有意な差はみられなかったものの、1週間あたりの運動時間が4時間以上の群はそれ未満の群と比較して1年後のSOS、およびBUAの増加率が高値を示した(SOS変化率(%):1.08 vs 0.85, p=0.08, BUA変化率(%):2.67 vs -0.68, p=0.09)。カルシウム摂取、睡眠に関しては有意な関連は示されなかった。今後は対象者数を拡大した検討が必要であると考えられる。また、身体活動、睡眠に関する質問紙の妥当性・信頼性を評価するため、小学4年生6年生を対象に加速度計および睡眠・覚醒判別ソフトを用いて、身体活動、および睡眠の評価を行った。身体活動に関する質問項目については、女子において加速度計と質問紙で評価した身体活動量に有意な正の相関関係が示され(Spearmanの相関係数,r = 0.61,p=0.002)、その妥当性が確認された。男子については、加速度計の装着を遵守させるなど、今後更なる検討をしていく必要がある。再検査法による信頼性の評価については、男女共に高い級内相関係数が得られ、信頼性が確認された。睡眠に関する質問項目については、質問紙から得た平日の基本的な睡眠項目と睡眠・覚醒判別ソフトで評価した睡眠項目との間に高い相関が得られ、本質問項目の妥当性が示された。また、再検査法による信頼性の検討においては、男女ともに、平日、休日のすべての項目において、高い信頼性が確認された。本研究は思春期の骨量増大に寄与する要因を明らかにすることを目的としている。平成25年度は、平成23年度、平成24年度と同様に小学4年生から中学3年生までの児童・生徒966名を対象に骨強度測定、および身体活動、カルシウム摂取、睡眠、骨折歴、(女子のみ初潮の有無)に関する自記式質問紙調査を実施した。1週間当たりの運動時間を3分位に分け(低位群(=2時間未満,46名),中位群(=2-6時間,67名),高位群(=6時間以上,49名))、各群の1年間の骨量変化率の平均値を比較した。各群のStiffness値の変化率はそれぞれ3.9 ±1.6 % (mean±SE)、5.9 ±1.3 %、8.5 ±1.6 %であり、各群間に有意な差は示されなかったものの、Stiffness値の変化率は運動時間の増加に伴って段階的に高値を示し、Stiffness値の変化率と運動時間の間に有意な正の用量反応関係が示された(トレンド検定,p=0.047)。小学4年生から6年生の女子における1年間の骨量変化は、運動時間の増加に伴って段階的に増大する傾向が示された。また、3年間の蓄積データを用いて小学5年生における1日60分以上の運動実施日数について検討を行ったところ、男子で週に4-5日実施しているものは、0-1日、2-3日のものと比較して有意に高い骨量値を示した。6-7日実施しているものとの間に有意な差は示されなかった。女子では統計的に有意ではないものの、男子同様4-5日で高い骨量値が観察された。このことより、1日1時間以上の運動を週に4-5日程度実施することが小学生高学年の骨量増大に効果的である可能性が示唆された。

本研究は、現在進行中の小中学生を対象としたコホートについて前向き追跡調査を行い、運動・栄養だけではなく、休養(睡眠)と骨量との関連を縦断的に検討し、思春期の骨強度増大に寄与する適切かつ具体的な生活習慣(睡眠内容、運動内容、食事内容)を解明することを目的として実施している。平成23年度は、小学4年生から中学3年生までの児童・生徒、約600人を対象に骨強度測定を実施した。骨強度測定には放射線被曝がない超音波測定装置(Achilles A-1000 InSight,GE Healthcare)を用いた。各学校において、学校保健簿より身長、体重等の身体データを抽出するとともに、身体活動、カルシウム摂取、睡眠、骨折歴、(女子のみ初潮の有無)に関する自記式質問紙調査を実施した。また、身体活動、睡眠に関する質問紙の妥当性・信頼性を評価するため、小学4年生6年生71名を対象に、活動量評価機器および睡眠・覚醒プログラムを用いて、身体活動強度、時間、頻度、睡眠時間、就寝・起床時刻の評価を行った。思春期は生涯の骨の健康状態を左右する骨強度を獲得する時期であり、この時期の生活習慣は骨粗鬆症の予防に大きく影響する。本研究では、思春期の骨強度増大に寄与する具体的な生活習慣を解明することを目的として、小中学生の骨強度測定、及び生活習慣調査を実施した。初年度に山梨県A市の小学4年生から中学3年生を対象にベースラインの骨強度測定、及び生活習慣調査を行った。2年目以降も同様の調査を実施し、生活習慣と骨強度との関連を横断的、及び縦断的に検討した。今年度は、本研究の成果をまとめたポスターを作成し、各小中学校への配布を行った。横断的な検討においては、男女ともに、1週間当たりの運動時間が短くなると(7時間、4-6時間、2-3時間、1時間未満の比較)、骨強度も段階的に低くなる傾向が示された。男子では、1週間当たりの運動時間が1時間未満の児童生徒は、7時間以上の児童生徒と比較して、有意に低い骨強度を示した。カルシウム摂取量、睡眠時間については、有意な関連は示されなかったが、それらの生活習慣の組み合わせと骨強度との関連を検討したところ、不適切な生活習慣(1週間当たりの運動時間が7時間未満、1日のカルシウム摂取量が400mg未満、就寝時刻が10時30分以降)の個数が多いほど、骨強度は段階的に低くなる傾向が示された。2年間の骨強度変化を観察した縦断的な検討においては、女子において、2年間を通して週に7時間以上の運動を実施していた者、2年後に7時間未満になった者、2年後に7時間以上になった者、2年間を通して7時間未満であった者の順に骨強度の増加率が段階的に小さくなることが示された。今後、より妥当性の高い調査法に基づく更なる検証が必要であるが、本研究により、週に7時間以上(1日約60分以上)の運動を小学生から継続して実施することが最大骨量の増大に効果的である可能性が示唆された。研究成果を各小中学校の児童生徒に身近に知ってもらうため、骨量を増大させるための情報、及び本研究の成果をまとめたポスターを作成し、各学校に配布した。応用健康科学、疫学・公衆衛生学当初の目的、研究計画どおり、1年間の縦断調査を実施し、その評価ができているため。当初の計画通り、骨量測定及び質問紙調査は実施できているが、最終年度に予定していた各学校へ配布する冊子の作成について、信頼性のある結果を掲載するための論文公表が遅れているため。当初の目的、研究計画どおり、ベースライン調査を実施し、平成24年度に実施する分析データの整理ができているため。平成23年度、24年度と同様に骨強度測定、および生活習慣質問紙調査を実施する。平成23年度からのデータより、骨強度変化に影響を及ぼす生活習慣要因を縦断的に検討する。
LPA-βカテニン経路を介した肺移植後閉塞性細気管支炎の発症機序の解析とその制御

本研究の目的は肺移植後閉塞性細気管支炎(BO)の発症メカニズムをLPA-βカテニン経路を中心に遺伝子コントロールが可能なマウスにおいて明確し,その臨床応用を目指すことである.BOの病態であるグラフトにおける末梢気道のfibrotic remodelingを引き起こす原因は,未だ十分に解明されていないが,LPA (Lysophosphatidic Acid) -βカテニン経路に着目し,BOにおける関与をin vivoで明らかにするとともに,LPA1の拮抗薬がBO発症を抑制する可能性があることを確認することが,本研究の狙いである同所性マウス肺移植モデル(以下OLTモデルとする)を利用した慢性拒絶反応モデルを,再現性の高いモデルとして確立した. B6D2F1/J (H2b/d)をト&#12441;ナー,DBA/2J (H2d)をレシピエントとした組み合わせにて肺移植を行い,Day7, 14, 21,28,40にそれぞれ犠牲死させ,高いpenetrance rateと再現性をもった末梢肺の線維化を確認した.さらにOLTモデルを利用した慢性拒絶反応モデルを用いて,Allograftにおけるドナー肺のATX (Autotaxin)蛋白発現をWestern blotにて確認をした.またLPA1の拮抗薬であるAM095を経口的にDay14よりDay28まで投与した.Day 40に犠牲死させ,線維化の程度を確認したところ,プラセボに比べて有意に線維化が抑えられていることが確認できた.またβカテニンのdirect reporterであるAxin2LacZ mouseを用いたOLTモデルを使用することにより,BO発症の間のβカテニンの転写活性について調査した.その結果Allograftにおいて気管支周囲のLacZ発現が線維化領域と一致しており,AM095の投与にてその発現が現象することより,BOの発症にLPA-βカテニン経路が関与していることが示唆された.このことは今後のBOの治療法に繋がると期待される.本研究の目的は肺移植後閉塞性細気管支炎(BO)の発症メカニズムをLPA-βカテニン経路を中心に遺伝子コントロールが可能なマウスにおいて明確し,その臨床応用を目指すことである.BOの病態であるグラフトにおける末梢気道のfibrotic remodelingを引き起こす原因は,未だ十分に解明されていないが,以前の研究にて,リン脂質誘導体であるLysophosphatidic Acid(LPA)が,BO発症患者のヒト肺胞洗浄液内の間葉系細胞の遊走の決定要因であることを報告した.LPAはAutotaxin (ATX)により,Lysophosphatidylchloine (LPC)から加水分解され生成され,Gタンパク質共役受容体(LPA1, LPA2, LPA3)を活性化する.このうちLPA1へのLPAの連結が,グラフト由来の間葉系細胞におけるβカテニンの活性化を導く.このβカテニンが,間葉系細胞活性化の調節因子として存在していると考える.LPA-βカテニン経路に着目し,BOにおける関与をin vivoで明らかにするとともに,LPA1の拮抗薬がBO発症を抑制する可能性があることを確認することが,本研究の狙いである平成28年度は同所性マウス肺移植モデルを利用した慢性拒絶反応モデルを,再現性の高いモデルとして確立した.具体的にはB6D2F1/J (H2b/d)をドナー,DBA/2J (H2d)をレシピエントとした組み合わせにて肺移植を行い,Day7, 14, 21,28,40にそれぞれ犠牲死させ,高いpenetrance rateと再現性をもった末梢肺の線維化を確認した.マウス肺移植モデルはかなり難易度の高い手技であり,評価し得るドナー肺を獲得することに難渋した.本研究の目的は肺移植後閉塞性細気管支炎(BO)の発症メカニズムをLPA-βカテニン経路を中心に遺伝子コントロールが可能なマウスにおいて明確し,その臨床応用を目指すことである.BOの病態であるグラフトにおける末梢気道のfibrotic remodelingを引き起こす原因は,未だ十分に解明されていないが,以前の研究にて,リン脂質誘導体であるLysophosphatidic Acid(LPA)が,BO発症患者のヒト肺胞洗浄液内の間葉系細胞の遊走の決定要因であることを報告した.LPAはAutotaxin (ATX)により,Lysophosphatidylchloine (LPC)から加水分解され生成され,Gタンパク質共役受容体(LPA1, LPA2, LPA3)を活性化する.このうちLPA1へのLPAの連結が,グラフト由来の間葉系細胞におけるβカテニンの活性化を導く.このβカテニンが,間葉系細胞活性化の調節因子として存在していると考える.LPA-βカテニン経路に着目し,BOにおける関与をin vivoで明らかにするとともに,LPA1の拮抗薬がBO発症を抑制する可能性があることを確認することが,本研究の狙いである平成29年度は同所性マウス肺移植モデルを利用した慢性拒絶反応モデルを用いて,Allograftにおけるドナー肺のATX蛋白発現をWestern blotにて確認をした.またLPA1の拮抗薬であるAM095を経口的にDay14よりDay28まで投与した.Day 40に犠牲死させ,線維化の程度を確認したところ,プラセボに比べて有意に線維化が抑えられていることが確認できた.

かなり困難なマウス肺移植モデルではあるが,LPA1の拮抗薬であるAM095の投与をうまく行うことができたため.本研究の目的は肺移植後閉塞性細気管支炎(BO)の発症メカニズムをLPA-βカテニン経路を中心に遺伝子コントロールが可能なマウスにおいて明確し,その臨床応用を目指すことである.BOの病態であるグラフトにおける末梢気道のfibrotic remodelingを引き起こす原因は,未だ十分に解明されていないが,LPA (Lysophosphatidic Acid) -βカテニン経路に着目し,BOにおける関与をin vivoで明らかにするとともに,LPA1の拮抗薬がBO発症を抑制する可能性があることを確認することが,本研究の狙いである同所性マウス肺移植モデル(以下OLTモデルとする)を利用した慢性拒絶反応モデルを,再現性の高いモデルとして確立した. B6D2F1/J (H2b/d)をト&#12441;ナー,DBA/2J (H2d)をレシピエントとした組み合わせにて肺移植を行い,Day7, 14, 21,28,40にそれぞれ犠牲死させ,高いpenetrance rateと再現性をもった末梢肺の線維化を確認した.さらにOLTモデルを利用した慢性拒絶反応モデルを用いて,Allograftにおけるドナー肺のATX (Autotaxin)蛋白発現をWestern blotにて確認をした.またLPA1の拮抗薬であるAM095を経口的にDay14よりDay28まで投与した.Day 40に犠牲死させ,線維化の程度を確認したところ,プラセボに比べて有意に線維化が抑えられていることが確認できた.またβカテニンのdirect reporterであるAxin2LacZ mouseを用いたOLTモデルを使用することにより,BO発症の間のβカテニンの転写活性について調査した.その結果Allograftにおいて気管支周囲のLacZ発現が線維化領域と一致しており,AM095の投与にてその発現が現象することより,BOの発症にLPA-βカテニン経路が関与していることが示唆された.このことは今後のBOの治療法に繋がると期待される.摘出したドナー肺のATX mRNAとタンパク発現をreal time PCRとWestern blotで定量し,ATX活性を確認する.さらにβカテニンのdirect reporterであるAxin2LacZ mouseを用いて同所性マウス肺移植モデルの使用することにより,BO発症の間のβカテニンの転写活性について調査すし,その後, LPA1に対する拮抗薬であるAM095の投与を,移植されたレシピエントマウスに行う.以上により,肺移植後BO発症における,LPA-βカテニン経路の役割を明らかにする.今後はβカテニンのdirect reporterであるAxin2LacZ mouseを用いた同所性マウス肺移植モデルを使用することにより,BO発症の間のβカテニンの転写活性について調査する.以上により,肺移植後BO発症における,LPA-βカテニン経路の役割を明らかにする.研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なった.研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なった.研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく.研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
実行機能課題と小型センサを用いた転倒スクリーニングデバイス開発に関する基礎研究

健康寿命の延伸の為,効果的な介護予防事業が期待される.その為,認知症や転倒に関する的確なスクリーニングが重要である.近年,認知機能の1つである実行機能は,歩行調節や転倒と深く関与すると報告されている.しかし,現存する転倒予測指標には,認知機能の要素が含まず,転倒スクリーニングとして十分ではない.本研究の目的は,1)臨床応用可能な小型モーションセンサと実行機能課題を用いて立位姿勢制御の定量的評価と戦略を検討すること2)実行機能課題中の立位姿勢制御の測定値について転倒予測指標の有用性を検証し,高齢者の実行機能の評価要素を取り入れた転倒スクリーニングデバイス開発の基礎研究を遂行していく事である.健康寿命の延伸の為,効果的な介護予防事業が期待される.その為,認知症や転倒に関する的確なスクリーニングが重要である.近年,認知機能の1つである実行機能は,歩行調節や転倒と深く関与すると報告されている.しかし,現存する転倒予測指標には,認知機能の要素が含まず,転倒スクリーニングとして十分ではない.本研究の目的は,1)臨床応用可能な小型モーションセンサと実行機能課題を用いて立位姿勢制御の定量的評価と戦略を検討すること2)実行機能課題中の立位姿勢制御の測定値について転倒予測指標の有用性を検証し,高齢者の実行機能の評価要素を取り入れた転倒スクリーニングデバイス開発の基礎研究を遂行していく事である.
パスウェイバーデン解析に基づく多発性硬化症リスク遺伝子の疾患多様性への寄与の解明

本研究では、多発性硬化症(multiple sclerosis; MS)における疾患感受性遺伝子の多様性と疾患表現型の多様性と関連性を明らかにすることを目的とした。これまでの研究によりMSの病態への寄与が示唆され、本研究で注目する遺伝子機能分類(gene ontology)12個を決定し、MS患者それぞれに対し、各gene ontologyについてどの程度遺伝的負荷を有しているかを示す、MSパスウェイバーデン(MSPB)を算出した。どのような役割を持つ遺伝子群が発症年齢や重症度といった各疾患表現型の多様性に寄与しているのかを解明するため、各MSPBと疾患表現型との相関について統計学的に解析した。米国カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)における630例のMS症例コホートデータと、最新の国際MS遺伝子解析コンソーシアムの研究において同定されたMSリスク関連一塩基多型(SNP)200個を基に、12個のMSPBを算出した。それぞれについて、MSPBの凝集度と臨床的パラメーターやMRI画像における各解剖学的容積との関連を解析した。結果、加齢に関わるMSPBが高い程、MSの発症が早く、NFkBシグナリングに関わるMSPBが高い程、頭部MRIにおける皮質下灰白質容積が小さいことが、統計学的有意差を持って示された。これにより、加齢に関わる遺伝的要因が発症時期に寄与し、NFkBシグナリングの遺伝的負荷量が大脳の特定の領域における萎縮度に関与していることが示唆された。得られた成果について、国内外の学会で発表を行った。29年度が最終年度であるため、記入しない。
運動のプログラムと制御に関与する大脳基底核の後割

背景と目的:木村らは大脳基底核の線条体のニューロンの示す感覚応答や身体運動に関連する活動は,感覚刺激のもつ物理的な性質や運動のパラメーターとの関係は弱く、刺激や運動などの事象がどのような状況で起こるかに強く依存することを報告してきた(文献1,2,3).例えば,サルに3つの押しボタンを順番に手で抑える運動を,感覚刺激誘導モードで,自己始動モードそして記憶依存モードで行わせ,線条体の被殻・尾状核のニューロンの活動を調べると,3つの運動モードのいずれでも活動するのではなく,いずれかのモードでは営動するが他のモードでは活動しないという特徴が明らかになった(文献1).本年度の重点研究の目的には上記3つのモードの運動を行っているサルの被殻と尾状核の機能を一時的に遮断することによって,被殻と尾状核の運動の機序における役割を知ることである.方法と結果:GABA agonistであるMuscimolの局所注入によって被殻と尾状核の機能を一時的に遮断した結果,学習した3つの輸動課題に選択的に障害が現れた.すなわち,記憶誘導モードでは輸動反応時間が延長して記憶に依存した予測的な運動が不可能となり,運動の軌道の乱れが増大し,運動の順序を間違った試行が多く現れた.これに対して視覚誘導モードでは反応時間に変化はなく,自己始動モードにも共通して軌道の乱れも少なかった.考察:得られた結果は「大脳基底核は運動のパラメーター制御やスキルの向上等に関与するのではなく,記憶に依存して予測的な運動を行うなど,習得している運動レパートリーの中から特定の運動せ活性化し,他を抑制する」という仮説せ支持する.これは線条体のニューロン活動が強い状況依存生を持つことと良く合致する.背景と目的:木村らは大脳基底核の線条体のニューロンの示す感覚応答や身体運動に関連する活動は,感覚刺激のもつ物理的な性質や運動のパラメーターとの関係は弱く、刺激や運動などの事象がどのような状況で起こるかに強く依存することを報告してきた(文献1,2,3).例えば,サルに3つの押しボタンを順番に手で抑える運動を,感覚刺激誘導モードで,自己始動モードそして記憶依存モードで行わせ,線条体の被殻・尾状核のニューロンの活動を調べると,3つの運動モードのいずれでも活動するのではなく,いずれかのモードでは営動するが他のモードでは活動しないという特徴が明らかになった(文献1).本年度の重点研究の目的には上記3つのモードの運動を行っているサルの被殻と尾状核の機能を一時的に遮断することによって,被殻と尾状核の運動の機序における役割を知ることである.方法と結果:GABA agonistであるMuscimolの局所注入によって被殻と尾状核の機能を一時的に遮断した結果,学習した3つの輸動課題に選択的に障害が現れた.すなわち,記憶誘導モードでは輸動反応時間が延長して記憶に依存した予測的な運動が不可能となり,運動の軌道の乱れが増大し,運動の順序を間違った試行が多く現れた.これに対して視覚誘導モードでは反応時間に変化はなく,自己始動モードにも共通して軌道の乱れも少なかった.考察:得られた結果は「大脳基底核は運動のパラメーター制御やスキルの向上等に関与するのではなく,記憶に依存して予測的な運動を行うなど,習得している運動レパートリーの中から特定の運動せ活性化し,他を抑制する」という仮説せ支持する.これは線条体のニューロン活動が強い状況依存生を持つことと良く合致する.
新規に同定したＥＲＫ基質群のリン酸化による制御メカニズムの包括的解明

真核生物に普遍的に存在するERK/MAPキナーゼは、様々な基質をリン酸化することによって細胞内で多彩かつ重要な役割を果たしている。本研究では、独自のリン酸化プロテオーム解析法によって研究代表者らが新たに同定した複数のERK基質について、ERKによるリン酸化部位を同定した後、リン酸化による機能制御を生化学的に検討した。さらにERKによる細胞機能の制御における、それぞれのERK基質の役割を明らかにした。本研究では、研究代表者らが開発したリン酸化プロテオーム解析法によって新たに同定したERK/MAPキナーゼの標的基質群について、リン酸化による生理機能の制御メカニズムを包括的・体系的に解明することを目標としている。昨年度までに細胞間接着部位に局在するPHドメインタンパク質であるFam129b/Minervaと細胞質ダイニンの中間鎖Dync1i2に対し、ERK活性に依存した細胞内でのリン酸化の変動を自作した抗リン酸化抗体を用いて時間空間的に詳細に検出した。本年度はまず、Phos-tagウェスタンブロット法によってFam129bとDync1i2だけでなく、EPLIN、Nup50、Rpt5、Dync1li1、SGTなどの他の複数の新規ERK基質についてもERKによるstoichiometricな細胞内でのリン酸化を検出した。またマウス繊維芽細胞においてFam129bおよびDync1i2をsiRNAによってノックダウンしたところ、いずれもwound healingアッセイにおいて細胞運動能が低下することを見出した。さらにDync1i2とGSTとの融合タンパク質をビーズに固相化した後、ERKによるリン酸化反応を行った場合と行わなかった場合で培養細胞抽出液からプルダウンされるタンパク質の電気泳動パターンに変化があるか検討した。現在Dync1i2のリン酸化によって相互作用が抑制されるタンパク質バンドを検出しており、今後質量分析法による同定を行う予定である。本研究では、研究代表者らが独自に開発したリン酸化プロテオーム解析法によって新たに同定したERK/MAPキナーゼの標的基質群について、リン酸化による生理・病理機能の制御メカニズムを包括的・体系的に明らかにすることを目標としている。本年度は、1)アクチン架橋タンパク質の一つであり、がんの悪性化に伴って発現が低下するEPLIN (epithelial protein lost in neoplasm)、2)細胞間接着部位に局在し、がん細胞の浸潤を制御するPHドメインタンパク質であるFam129b/Minerva、3)細胞質ダイニンの中間鎖Dync1i2、の3つのERK基質について以下の知見を得た。まずEPLINが腎臓糸球体内のメサンギウム細胞に高発現しており、ヒト初代培養メサンギウム細胞において接着斑に局在するpaxillinと細胞辺縁部で相互作用することをin situ PLA (proximity ligation assay)法によって明らかにした。そしてこのEPLINとpaxillinの相互作用はMEK/ERK経路の活性化によって抑制されることを示した。またFam129b/Minervaと細胞質ダイニンの中間鎖Dync1i2をGSTまたはHaloタグとの融合タンパク質として調製後、ビーズに固相化し、全細胞抽出液とインキュベートして結合因子群を検索した。そしてERKによるFam129bやDync1i2のリン酸化によって親和性が変化する結合因子に注目して質量分析法による同定を行った。真核生物に普遍的に存在するERK/MAPキナーゼは、細胞内で多彩かつ重要な役割を果たしているが、その複雑なシグナル伝達ネットワークの調節と機能の仕組みは未だ十分に明らかにされていない。研究代表者らは最近、独自のリン酸化プロテオーム解析法を開発することによってERKの新たな標的基質の候補を多数同定した。本研究ではこれらの新規ERK基質群について、増殖・癌化・運動などの種々の細胞機能のリン酸化による制御機構を包括的に解明することを目標としている。本年度は細胞間接着や癌の浸潤およびアポトーシスの抑制に関与するFam129b/Minervaと微小管モーター分子の一つである細胞質ダイニンの中間鎖Dync1i2を中心に解析し、以下の知見を得た。まずマウスFam129bを特異的に認識する抗体とERKによる複数のリン酸化部位の中の一カ所に対する抗リン酸化抗体を作製し、ウェスタンブロットと免疫細胞染色により、ERKの活性化に依存した時間空間的な内在性Fam129bのリン酸化の変動を詳細に検出した。またDync1i2に対する市販抗体と自作した抗リン酸化抗体を用いて同様に解析したところ、Dync1i2はERKのみならず複数のプロリン指向性キナーゼによって同一部位でリン酸化されることを明らかにした。さらに運動中の繊維芽細胞の進行方向の先導部に位置するleadingedgeにリン酸化型Dync1i2が集積することを見出した。今後は細胞運動を中心に種々の細胞機能における上記のリン酸化の生理機能を検討する予定である。真核生物に普遍的に存在するERK/MAPキナーゼは、細胞内で多彩かつ重要な役割を果たしており、これまでに転写因子などの多数の基質が報告されている。

本研究では、研究代表者らが開発したリン酸化プロテオーム解析法によって新たに同定したERK基質群について、リン酸化による機能制御を包括的に解明することを目標としている。本年度はマウス腎髄質内層集合管細胞mIMCD-3にHaloタグを付加したFam129bと細胞質ダイニンの中間鎖Dync1i2を発現させ、細胞運動・管腔形成・3Dスフェロイド形成における生細胞イメージングを行った。さらにこれらの発現細胞からHaloタグリガンド固定化レジンを用いてFam129bやDync1i2との結合タンパク質をプルダウンし、質量分析計によってタンパク質の同定を行った。Dync1i2との結合タンパク質として同定されたp150Gluedは、Dync1i2がERKによってリン酸化されると結合のカイネティクスが変化することをBLI(バイオレイヤー干渉法)を用いた定量解析によって明らかにした。本研究によって、研究代表者がERK基質として同定したEPLIN、Fam129bおよびDync1i2が細胞運動や細胞接着などに関与することが明らかになった。また、Phos-tagウェスタンブロット法、質量分析計を用いたリン酸化部位の同定と定量、Haloタグを用いたイメージングと相互作用解析など、タンパク質のリン酸化による制御機構の解明において重要な解析技術を確立した。生物学Fam129bとDync1i2などが生理的なERK基質であることは抗リン酸化抗体やPhos-tagウェスタンブロット法によって確認することができた。またFam129bとDync1i2が細胞運動に関与することもRNAiノックダウン細胞のタイムラプス観察によって予定通り調べることができた。しかしながらHaloタグタンパク質を付加したFam129bとDync1i2を発現するプラスミドの細胞内でのトランスフェクション効率が低く、生細胞イメージングに難航している。またGSTプルダウン法による相互作用タンパク質の検索については、Fam129bでは候補となるタンパク質バンドを検出できておらず、Dync1i2では候補タンパク質の質量分析法による同定に未だ成功していない。ERK基質であるFam129bとDyncli2にHaloタグを付加し、細胞間接着装置の発達したマウス上皮細胞に発現させて生細胞イメージングと結合タンパク質の探索を行う予定であった。しかしながらAmerican Type Culture CollectionよりBiosafetylevel 2に該当するmIMCD-3細胞を入手するための手続きに想定以上の時間を必要としたため、研究に遅延が生じた。Fam129bとDync1i2のERKによるリン酸化は予定通り詳細に検出することができた。しかし本年度はプロテアソームの制御サブユニットの一つであり、AAAファミリータンパク質に属するRpt5/Psmc3にも注目し、ERKによるリン酸化とRpt5のSUMO化修飾との関連性も調べる予定であった。
悪性黒色腫の放射線抵抗性機序の解明-メラニン合成能とエルカインド回復の関係

放射線抵抗性癌の代表である悪性黒色腫におけるメラニン合成と放射線抵抗性の関係を検討した。基礎実験において、メラニン合成能と放射線抵抗性には正の相関があることが分かっており、また、DNAに損傷をきたす紫外線、抗癌剤に対する抵抗性にTRP-2が関与しているという報告から、TRP-2に焦点を当て放射線抵抗性に及ぼす影響を解析した。Ihara細胞(ヒト黒色腫細胞)と同細胞にTRP-2遺伝子(pCMVDTS)をエレクトロポレーション法により導入樹立した細胞株IDT-10とにおいて比較検討した。両細胞で遺伝子導入による細胞増殖には特に影響はなかった。TRP-2の発現量は蛋白レベルでIDT-10細胞がIhara細胞の約2.8倍であり、X線照射後のコロニーアッセイ法による生存率曲線で、IDT-10の生存率上昇が認められた。この生存率の上昇は、放射線生物学で言う「エルカインド回復(SLDR)」の差であり、細胞自体の放射線感受性には両者に差は認めなかった。細胞の生存に影響するMAPKであるERKをX線照射後の両細胞で比較したところ、pERK発現量はIDT-10細胞で増加していた。また、X線照射後の細胞周期の分布をフローサイトメトリーを用い経時的に測定したところ、照射直後から64時間後の間にIDT-10細胞ではSG2期へ細胞が有意に集積していた。すなわち、TRP-2による放射線抵抗性の増加は、ERKを活性化することによる細胞周期のG2期での停止と、late SG2期における相同組換え修復によるDNA二重鎖切断の修復であることが推測され、相同組換え修復の中心的役割を演じるRAD51familyとの関連が示唆された。今回、放射線抵抗性癌の代表である悪性黒色腫に的を絞り、メラニン合成能と放射線抵抗性の関係を検討した。基礎実験において、メラニン合成能と放射線抵抗性には正の相関関係がある事がわかっており、また、DNAに損傷をきたす紫外線、抗癌剤に対する抵抗性にTRP-2が関与しているという報告から、TRP-2に焦点を当て放射線抵抗性に及ぼす影響を解析した。Ihara細胞(ヒト黒色腫細胞)と同細胞にTRP-2遺伝子(pCMVDTS)をエレクトロポレーション法により導入し樹立した細胞株IDT-10とにおいて比較検討した。TRP-2の発現量は蛋白レベルでIDT-10細胞がIhara細胞の約2.8倍、メラニン含量は約1.5倍であり、X線照射後のコロニーアッセイ法による生存率曲線で、IDT-10の生存率上昇が認められた。また、X線8Gy照射後の細胞周期の分布を経時的に測定したところ、照射直後からIDT-10細胞ではSG2期に集積する傾向がみられ、64時間後もIhara細胞と比較して有意に高い集積率であった。すなわち、TRP-2による放射線抵抗性の増加は、細胞周期のlate SG2期における相同組換え修復であることが推測され、サイクリンをはじめとした細胞周期調節系あるいは相同組換え修復の中心的役割を演じるRAD 51 familyとの関連が示唆された。

両細胞で遺伝子導入による細胞増殖には特に影響はなかった。TRP-2の発現量は蛋白レベルでIDT-10細胞がIhara細胞の約2.8倍であり、X線照射後のコロニーアッセイ法による生存率曲線で、IDT-10の生存率上昇が認められた。この生存率の上昇は、放射線生物学で言う「エルカインド回復(SLDR)」の差であり、細胞自体の放射線感受性には両者に差は認めなかった。細胞の生存に影響するMAPKであるERKをX線照射後の両細胞で比較したところ、pERK発現量はIDT-10細胞で増加していた。また、X線照射後の細胞周期の分布をフローサイトメトリーを用い経時的に測定したところ、照射直後から64時間後の間にIDT-10細胞ではSG2期へ細胞が有意に集積していた。すなわち、TRP-2による放射線抵抗性の増加は、ERKを活性化することによる細胞周期のG2期での停止と、late SG2期における相同組換え修復によるDNA二重鎖切断の修復であることが推測され、相同組換え修復の中心的役割を演じるRAD51familyとの関連が示唆された。
地球環境汚染のタイムカプセルによる汚染監視に関する研究

環境汚染のタイムカプセル樹木入皮研究のため、西暦2000年12月日光中宮祠で採取した樹齢250年のミズナラ(Querus crispula)について、その年輪、入皮、着生コケ植物に含まれる鉛の量と鉛の安定同位体比をICP-MS質量分析計を用いて測定した。その結果、5年間隔で採取した年輪に含まれている鉛の濃度は0.01-0.1mg kg^<-1>の範囲で変動し、過去250年間から今日に至るまでの一定の増加傾向は認められなかった。これに対し、入皮に含まれる鉛の量は0.1-10mg kg^<-1>の範囲を示し、1875年以降増加する傾向が見られた。また、外樹皮上に分布していた着生コケ植物の茎葉体中の鉛の濃度は17mg kg^<-1>を示していた。更に、入皮に含まれる鉛の安定同位体比(^<206>Pb/^<207>Pb)は1964年以降1.18から1.16へと減少し、鉛汚染のもととなる鉛の起源が変化していることを示していた。また、着生コケ植物に含まれる鉛の安定同位体比と同じ値(1.16)を示していた。以上の結果は、入皮が明治開国以降の日本の産業化に伴う鉛汚染をよく反映しており、大気起源の鉛汚染のモニタリングに有効な環境試料であることを示していた。しかし、年輪の有効性は汚染物質の化学種によって異なるようで、鉛については汚染の時系列変化を反映しなかったが、ヒ素の汚染に関しては入皮に含まれるヒ素の時系列変化と年輪に含まれるヒ素の時系列変化は極めてよく一致していた。我が国(国立環境研究所ならびに中央大学理工学部)と英国シェフィールド大学環境分析化学研究室ならびにノルウェーエネルギー研究所Pollution Technology研究室を中心とする国際共同研究を開始した。シェフィールド大学との研究では郊外のナショナルトラストの管理するブナ林の病害のため伐採された樹齢約150年のブナに含まれる連続入皮に注目し、過去90年にわたる環境汚染の歴史をレーザーアブレーションICP-MS法を用いて解明した。その結果、重金属等による汚染が過去90年間引続いており、特に第二次世界大戦中の汚染が最もはなはだしいことが明らかとなった.このような樹木入皮を用いた環境汚染のモニタリングは英国では高い評価を受け、1999年には英国Royal Societyが全サイエンスの分野から選ぶ約20の研究のひとつ(New frontiers in science)に選ばれ、"A century of air pollution-recorded in tree barkpockets"というタイトルのもとRoyal Societyで発表を行なった。その内容についてはTimes、BBC、New Scientist等の取材を受けNew Scientist誌には"The Smog of War"として紹介された。この他英国との共同研究では、英国西南部のシリ-諸島においてバックグラウンド測定用の樹皮のサンプリングを行なった。ノルウェーエネルギー研究所との共同研究ではノルウェー中部スウェーデンとの国境に近くのロロス鉱山(この鉱山は19世紀以降ノルウェーの軍需産業の発展と共に採掘、精錬が拡大し、このため周囲の山林が大被害を受けたことで知られる)に出かけ、ロロス市及び製材所の協力を得て樹齢約100年の松より入皮のサンプリングを行った。この試料については、ノルウェーエネルギー研究所において凍結保存し、次年度佐竹が同国を訪れ、高精度質量分析装置及び中性子放射化分析用の試料として調整し分析を行なう予定となっている。またノルウェーでは森林研究所において樹木入皮についての講演を行ったところ、全くオリジナルなアイディアに基づく興味深い研究として注目を集め、試料の収集、前処理等について協力が得られることとなった。大気中に放出されて来た環境汚染物質のうち、本年度は特にウラニウム、銅等の汚染元素に注目して、その汚染の現状、その汚染の歴史的変遷について調査を進めた。