hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エピジェネティック機構の破綻が顎顔面発生過程に与える影響

質的変化がダイナミックに生じる発生過程ではエピジェネティックな変化が頻繁に起きており、エピジェネティックな破綻が与える生命への影響は多大である。我々は、ヒストンメチル化酵素の一つであるSetdb1の顎顔面発生過程への影響を調べるため、神経堤細胞特的にノックダウンさせたマウス(Setdb1 CKO)を作製した。メッケル軟骨は通常発生過程が進行するにつれて消失していくが、Setdb1 CKOでは軟骨細胞の肥大化を伴うメッケル軟骨の増大を認めた。Setdb1 CKOのメッケル軟骨での増殖能は有意に亢進していた。Setdb1 CKOのメッケル軟骨においてはSMAD依存性のBMPシグナルが有意に増加した。以上のことより、Setdb1によるエピジェネティクス機構がメッケル軟骨の発生に必須である可能性が示された。また、Setdb1 CKOに認められる口蓋裂は、形態的特徴から鑑みると増殖能もしくは細胞死に何らかの影響があると考えられたため、BrdUの取り込み能、TUNEL解析を行ったところ、明らかな増殖能の低下がみられた。これは、メッケル軟骨とは異なる結果であり、Setdb1の組織特異的な作用が疑われる。平成30年度は、網羅的にSetdb1のターゲット遺伝子を解析するため、Setdb1 CKOの口蓋よりmRNAを採取する方法を検討した。増殖能が低下しているSetdb1 CKOは小さく、マイクロアレイを行うのに十分量のmRNAが採取できなかった。そのため、野生型のマウス口蓋から細胞を採取し、培養、その後、micro RNAを用いSetdb1をノックダウンさせ、その影響を検討中である。以上より、同じ神経堤細胞由来の組織においてもSetdb1の役割が異なる可能性が示唆され、今後は、どのように各組織においてSetdb1が遺伝子発現の制御を行っているのかを検討する予定にしている。我々は、エピジェネティクス機構を司るヒストンメチル化酵素の一つであるESETの顎顔面発生過程への影響を調べるため、神経堤細胞特的にノックダウンさせたマウス(ESET CKO)を作製したところ、口蓋、歯胚、メッケル軟骨、前頭骨の形成に異常を認めた。中でも平成28年度はメッケル軟骨におけるESETの役割について詳細に検討した。メッケル軟骨は通常発生過程が進行するにつれて消失していくが、ESET CKOでは軟骨細胞の肥大化を伴うメッケル軟骨の増大を認めた。さらに胎生16.5日と18.5日ではメッケル軟骨の軟骨膜の一部が消失し、胎生18.5日においてはメッケル軟骨の一部に野生型では生じることない石灰化物の沈着が認められた。ESET CKOのメッケル軟骨での増殖能を検討した所、有意に亢進していた。これは、siRNAによりESETをノックダウンさせたマウス前軟骨芽細胞ATDC5においても同様な結果が得られた。ESETをノックダウンさせたATDC5では、軟骨分化マーカーであるSox9, Mmp13, Collagen II, Aggrecanが有意に減少した。また、過剰なBMPシグナルがメッケル軟骨を肥大化することが報告されている。ESET CKOにおいても同様な現象が生じているのではないかと推察されたため解析を行った所、SMAD依存性のBMPシグナルはSetdb1 CKOのメッケル軟骨、siSetdb1 ATDC5においてともに有意に増加した。以上のことより、ESETによるエピジェネティクス機構がメッケル軟骨の発生に必須である可能性が示された。今後は、他の顎顔面組織でのESETの役割を解明することとする。計画目標の一つである時空間での表現型・形態解析は概ね終了し、表現型が認められるステージが確立された。中でもメッケル軟骨に関しては、その表現型が稀有であるため詳細に解析を行った。また、細胞増殖能およびアポトーシスについても表現型が生じている部分に対し行った。部位によって増殖能への反応が異なっていた。当初、ESET CKOから細胞を採取し網羅的に標的遺伝子を検索する予定であったが、部位によって細胞増殖が異なっていることよりも、組織間によってESETの役割が異なっていると考えられたため、予定を一時保留にした。現在は、各組織から十分量のRNAが抽出できるかの検討を行っている。また、並行して未分化なESETノックダウン細胞の確立を行い、その細胞に対し分化誘導をかけ、検討を行う予定である。本年は、表現型が稀有であるメッケル軟骨に着目し、その発症理由にBMPシグナルの関与があることを示すことができた。この内容はすでに掲載済みである。我々は、エピジェネティクス機構を司るヒストンメチル化酵素の一つであるSetdb1の顎顔面発生過程への影響を調べるため、神経堤細胞特的にノックダウンさせたマウス(Setdb1 CKO)を作製したところ、口蓋、歯胚、メッケル軟骨、前頭骨の形成に異常を認めた。平成28年度はメッケル軟骨におけるESETの役割について詳細に検討した。

Setdb1 CKOのメッケル軟骨での増殖能は有意に亢進していた。過剰なBMPシグナルがメッケル軟骨を肥大化することが報告されていおり、Setdb1 CKOのメッケル軟骨においてもSMAD依存性のBMPシグナルが有意に増加した。以上のことより、Setdb1によるエピジェネティクス機構がメッケル軟骨の発生に必須である可能性が示された。平成29年度は、主に口蓋部でのSetdb1の役割を検討した。Setdb1 CKOは口蓋裂を発症する事がわかった。形態的特徴から鑑みると増殖能もしくは細胞死に何らかの影響があると考えられたため、BrdUの取り込み能、TUNEL解析を行ったところ、明らかな増殖能の低下がみられた。現在は、マイクロアレイ解析、qPCRのためRNAの抽出条件を検討している。マイクロアレイ解析およびqPCR用のRNA抽出の条件検討に時間がかかっている。その理由としてSetdb1 CKOの口蓋は増殖能の低下が生じており、野生群と比較し、その口蓋は小さく十分なRNA量の抽出が困難である。採取したRNAの増殖等を考慮している。質的変化がダイナミックに生じる発生過程ではエピジェネティックな変化が頻繁に起きており、エピジェネティックな破綻が与える生命への影響は多大である。我々は、ヒストンメチル化酵素の一つであるSetdb1の顎顔面発生過程への影響を調べるため、神経堤細胞特的にノックダウンさせたマウス(Setdb1 CKO)を作製した。メッケル軟骨は通常発生過程が進行するにつれて消失していくが、Setdb1 CKOでは軟骨細胞の肥大化を伴うメッケル軟骨の増大を認めた。Setdb1 CKOのメッケル軟骨においてはSMAD依存性のBMPシグナルが有意に増加した。また、Setdb1 CKOに認められる口蓋裂は、形態的特徴から鑑みると増殖能もしくは細胞死に何らかの影響があると考えられたため、BrdUの取り込み能、TUNEL解析を行ったところ、明らかな増殖能の低下がみられた。これは、メッケル軟骨とは異なる結果であり、Setdb1の組織特異的な作用が疑われる。平成30年度は、網羅的にSetdb1のターゲット遺伝子を解析するため、Setdb1 CKOの口蓋よりmRNAを採取する方法を検討した。増殖能が低下しているSetdb1 CKOは小さく、マイクロアレイを行うのに十分量のmRNAが採取できなかった。そのため、野生型のマウス口蓋から細胞を採取し、培養、その後、micro RNAを用いSetdb1をノックダウンさせ、その影響を検討中である。以上より、同じ神経堤細胞由来の組織においてもSetdb1の役割が異なる可能性が示唆され、今後は、どのように各組織においてSetdb1が遺伝子発現の制御を行っているのかを検討する予定にしている。
低酸素応答制御による網膜疾患へのアプローチ

近年、低酸素誘導因子(HIF)が様々な疾患の病態生理に関与していることが明らかにされつつある。そこで網膜疾患の病態形成におけるHIFの役割を解明するためにHIFやその制御因子VHLを標的としたコンディショナルノックアウトマウスを作製し解析を行った。HIFを欠損させても成体網膜に異常をきたさず、HIFの異所的な安定は網膜変性を誘導することが明らかとなり、網膜疾患における新たな治療標的となることを見出した。さらに、網膜変性モデルに対する既知HIF阻害剤の投与実験を行い、その治療的抑制効果を確認した。これらの結果から、HIF阻害は網膜疾患治療のみならず発症予防にも寄与する可能性がある。加齢黄斑変性(AMD)は先進国における55歳以上の主要な失明原因である。しかしその根本的な病態メカニズムはわかっていない。近年、低酸素誘導因子(hypoxia-inducible factor; HIF)が様々な疾患の病態生理に関与していることが明らかにされつつある。そこでAMDの病態形成におけるHIFの役割を解明するために、Cre/Loxp技術を利用しHIFやその制御因子であるVHL(von Hippel Lindau protein)を標的とした成体誘導網膜色素上皮(RPE)細胞特異的コンディショナルノックアウトマウスを作製し解析を行った。その中で、HIFの異所的な安定は網膜変性を誘導することが明らかとなり、AMDにおける新たな治療標的となることを見出した。治療法の確立されていないAMDの新規治療法の開発は多くの患者にとって非常に有用なことである。また網膜変性疾患により一度視細胞が障害されてしまうとその視機能は取り戻すことができないため、疾患初期から介入の可能性があるHIF阻害の意義は大きいと考える。当初の計画通りAMDの病態形成におけるHIFの役割を明らかとしつつある。作製したRPE細胞特異的HIFおよびVHLコンディショナルノックアウトマウスの表現型を解析することで、RPEにおけるHIFの過剰発現が、網膜変性を誘導することを見出した。また、網膜切片の組織学的な検証や代謝変化を検証することにより、HIFの過剰な発現がグルコースや脂質の代謝に影響を与え、その結果網膜変性が引き起こされることを明らかにし、HIFを阻害することによるAMDへの新たな治療の可能性を見出し、論文報告した(Kurihara T, et al. eLife 2016)。さらに、網膜変性モデルに対する既知HIF阻害剤であるトポテカンの投与実験を行い、その治療的抑制効果を確認した(三輪、栗原ら.第120回日本眼科学会総会)。また、網膜切片の組織学的な検証や代謝変化を検証することにより、HIFの過剰な発現がグルコースや脂質の代謝に影響を与え、その結果網膜変性が引き起こされることを明らかにし、HIFを阻害することによるAMDへの新たな治療の可能性を見出し、論文報告した(Kurihara T, et al. eLife 2016, Kurihara T. Prog Brain Res 2017)。さらに、既知HIF阻害剤であるトポテカンの投与実験を行い、網膜萎縮性変性モデル(Miwa Y, Kurihara T etal. ARVO Annual Meeting 2016)および網膜血管新生性変性モデルに対するその治療的抑制効果を確認した(三輪、栗原ら.第121回日本眼科学会総会)。さらに新規HIF阻害剤の開発を目指し天然物や低分子化合物のライブラリーを用いたドラッグスクリーニングを行い、いくつかの候補物質を同定特許出願した(2016年11月14日出願)。

その中で、HIFの異所的な安定は網膜変性を誘導することが明らかとなり、AMDにおける新たな治療標的となることを見出した。治療法の確立されていないAMDの新規治療法の開発は多くの患者にとって非常に有用なことである。また網膜変性疾患により一度視細胞が障害されてしまうとその視機能は取り戻すことができないため、疾患初期から介入の可能性があるHIF阻害の意義は大きいと考える。近年、低酸素誘導因子(HIF)が様々な疾患の病態生理に関与していることが明らかにされつつある。そこで網膜疾患の病態形成におけるHIFの役割を解明するためにHIFやその制御因子VHLを標的としたコンディショナルノックアウトマウスを作製し解析を行った。HIFを欠損させても成体網膜に異常をきたさず、HIFの異所的な安定は網膜変性を誘導することが明らかとなり、網膜疾患における新たな治療標的となることを見出した。さらに、網膜変性モデルに対する既知HIF阻害剤の投与実験を行い、その治療的抑制効果を確認した。これらの結果から、HIF阻害は網膜疾患治療のみならず発症予防にも寄与する可能性がある。引き続きHIF、VHLさらにVEGFなどのRPE特異的コンディショナルノックアウトマウスを作成および解析を進めることでAMD病態形成における低酸素応答遺伝子群のさらなる役割の解明を目指す。またHIFの細胞内代謝へ与える影響を分子生物学的な手法を用いて検証を行っていく。さらにHIFを阻害することによるAMDへの治療的介入の可能性を検討するために、AMDモデルマウスへの既知のHIF阻害剤の投与実験を行う。また既知HIF阻害剤の多くは細胞毒性が強くそのままでは臨床応用が困難であるため、新規HIF阻害剤の開発が必要である。そこで新規HIF阻害剤の開発を目指し天然物や低分子化合物のライブラリーを用いたドラッグスクリーニングを行い、得られた候補物質をAMDモデルマウスへ投与しその効果を確認する。作成したRPE特異的コンディショナルノックアウトマウスの解析を進めることでAMD病態形成における低酸素応答遺伝子群のさらなる役割の解明を目指す。さらに既知のHIF阻害剤によるモデルマウスへの治療的効果を確認できたため、今後はスクリーニングで得られた新規HIF阻害剤をAMDモデルマウスへ投与しその効果を確認する。眼科学少額であり、研究消耗品の購入に充てられなかった為来年度分と合わせて研究用消耗品の購入費に充てる予定
北陸産貝化石・ケイソウ土を原料とした有機複合体の開発利用に関する試験研究

1)貝化石・ケイソウ土耐火レンガ粉末両試料と有機物を混合する方法について100l容ポリバケツを用い,有機物の原料としておから残渣と圧砕もみがらを培地とする人工培養キノコ残渣に対する各種の混合割合と常温における複合体生成物の性状を比較検討した。原料の有機物に対して重量で貝化石5,10,20%,ケイソウ土5,10,15%,貝化石+ケイソウ土各々10%,ケイフン20%,同10%,ケイフン10%+ケイソウ土10%,ケイフン+貝化石各々10%,ケイフン10%+貝化石5%,ケイフン300%+貝化石50%および対照の14試験区を設け約100日間の反応結果を比較したところ貝化石入りのものが有機質肥料として理化学性がややまさる傾向が分った。2)約70トン容量の槽を用いて4種類の複合体(貝化石10%処理,貝化石5%+ケイソウ土5%混合処理,ケイソウ土10%処理および対照)をを初年度の成果を参考として製造し,現地の畑地などにおいて施用効果を通じて、その性質を比較検討した。貝化石処理のものは一般にやや生育がまさる例が見られた。しかし貝化石+ケイソウ土混合処理の複合体は長野県菅平(火山灰土壌畑)の大根栽培において,施用時農業者の目からは他の3種に比べ窒素が多いと判断され,実際の施用によっても生育・収穫が45日遅れると観察された。製品の熟度により効果がかわるように考察された。製造法と品質の改良がさらに必要とされる。3)トマト,ホウレンソウ,野沢菜,タバコ,白菜,ダイコン,長芋,ブドウ(巨峰),桃,リンゴ(ふじ),キュウリなどの作物,果樹およびイネ(苗),コシヒカリ栽培などに施用された現地の農家圃場における複合体・堆肥の効果は貝化石混合処理のものにやや多く見られたが,土壌改良に効果がはっきり現われるものの反面品質や生育には明暸に反晄されない場合もあり,さらに施肥法などに留意が必要とみられた。1)貝化石・ケイソウ土耐火レンガ粉末両試料と有機物を混合する方法について100l容ポリバケツを用い、有機物の原料としておから残渣と圧砕もみがらを培地とする人工培養キノコ残渣に対する各種混合割合と常温における複合体生成物の性状を比較検討した。原料有機物重量に対して貝化石5、10、20%、ケイソウ土5、10、15%、貝化石+ケイソウ土各々10%、ケイフン20%、同10%、ケイフン10%+ケイソウ土10%、ケイフン+貝化石各々10%、ケイフン10%+貝化石5%、ケイフン300%+貝化石50%および対照の14試験区を設け7月から10月にかけ約100日間比較したところ、貝化石入りのものが有機質肥料としてすぐれたものとなった。

2)原料量を多くして、詳細に比較検討するため、1ロット当たり約3トンとなるようにして、貝化石10%、ケイソウ土耐火レンガ粉末10%、貝化石+ケイソウ土各々5%および対照の4処理区について冬期12ー3月に約100日間、複合体の変化を比較したところ、相対的に貝化石処理区は早く熟成し、ケイソウ土区はこれに続いた。3)複合体の汁の部分とケイソウ土耐火レンガ粉末より粒状品を試作し、これの溶解性などを比較した。4)有機複合体の性質を実際的肥効を通じてみるために露地トマト、水稲、大麦について畑、ポット、プランター試験により炭カル、ケイカルおよび市販の有機物等施用のものと生育、養分吸収および土壌養分量などを比較した。試作複合体は適量使用により肥効のあることが推定された。複合体のイネへの施用によって土壌中の可給態ケイ酸量は増えるが効率よくイネへ吸収させる方法については研究の余地がある。5)長野県内須坂地域の専業農家圃場20ケ所(野菜畑16、果樹4)について複合体施用適量算出のために土壌肥沃度について分析した。1.前年度の試験により試作された4種類の複合体(貝化石10%処理、貝化石5%+ケイソウ土5%混合処理、ケイソウ土10%処理および対照)を長野県菅平の黒色火山灰畑地において、施用量10a当たり200kg条件で試験使用し比較した。2.白菜(品種理想)では区間差がみられず、畑地の表面排水の方向、土壌水分の影響が大きく、これによる根コブ病の発生、被害をみた。しかし根コブ病に強い品種(空海)では区間による差は概してみられず、根コブの被害もほとんどみられなかった。この畑では降雨後の相対的に湿った状態時にうね立てがなされたために、土壌砕土や通気性が不充分となり、試験区間の差よりも土壌物理性の要因の差がやや強く出る面がみられた。3.大根(品種北海青首耐病総太)ではケイソウ土10%処理区が他のものに比べて栽培上、生育がややよいように観察された。貝化石+ケイソウ土混合処理の複合体は施用時、農業者の目からは窒素が多いように見られ、また実際に使用してみると大根の生育が他のものに比ベて45日遅れると観察された。この原因の1つとして堆肥の分解が緩効的が否かの検討が必要である。4.沖積土壌の畑地において主に有機質肥料+貝化石施用区と主に無機質肥料+貝化石施用区に複合体を併用した場合の露地トマト(桃太郎)果実中の主要無機成分含有率の果房段別推移を比較したが、著しい区間の特徴はみられなかった。1.試作有機複合体(改良おからもみがら推肥製品)について畑苗(イネ)の生育とカルシウム,ケイ酸などの養分吸収について検討したところ,重量で貝化石10%,ケイソウ土10%,ケイソウ土5%貝化石5%(混合)をそれぞれ添加処理した製品は無添加のものに比べて著しい差は見られなかった。しかし貝化石入りのものが若干まさる傾向がみられた。更にケイ酸等の吸収量の相違について研究の全地がある。2.同じように試作有機複合体について,砂状ケイカル,貝化石単体,グアノリン鉱粉末,硫酸処理ケイフンほかとの育苗土壌への相対的な施用効果を比べたが,供試複合体は製品の熟度に配慮が必要であることが分かった。3貝化石単体を砂壌土の畑苗(イネ)育苗に使用するには0.5%添加が好適とみられた。4長野県下における観察では供試有機複合体を施用した場合,トマト,長芋,野澤菜,白菜,大根などにおいて適量使用で効果がみられ,障害軽減に寄与する例もあった。ただし多量施用の場合には留意が必要。5またリンゴ,ブドウ(巨峰)においては甘さなどの品質向上に供試品の施用が寄与する例がみられた。6洪積酸性畑(能登半島)のタバコ作においては適量の使用が上質葉の収量増に貢献した。もみがら堆肥のみを施用したコシヒカリ栽培田においては慣行の化学肥料田のものより米の食味がやや優子傾向にあった。8良質な有機複合体の安定な製造法と現地の施用に際した技術的留意点などについて,さらに研究を継続する必要があると考察した。
肝臓型グリコーゲンホスホリラーゼの選択的阻害剤の探索

グリコーゲンホスホリラーゼ(GP)は数種類のリガンド結合部位を有するアロステリック酵素であることから、その触媒活性の阻害方法として複数の候補が挙げられる。これらのリガンド結合部位の性質を調べた結果、貯蔵部位は触媒活性部位の働きに直接的な影響を及ぼさないことを明らかにすることができた。また、GPの触媒活性部位において、触媒活性の発現に対して特に重要な役割を担っていると考えられるサブサイトが2つ存在することを示すことができた。しかし、肝臓型GPを選択的に阻害する化合物を見つけ出すには至らなかった。グリコーゲンホスホリラーゼに対して阻害剤が直接作用する部位としては、活性部位のほか、インドール結合部位、グリコーゲン貯蔵部位、AMP結合部位などが知られている。まず、前年度に調製したインドール誘導体について、グリコーゲンホスホリラーゼ活性阻害能の一次評価を行った。この一次評価は、前年度に調製したピリジルアミノ化マルトヘキサオースを基質として用い、グリコーゲン合成方向で行った。その結果、グリコーゲンホスホリラーゼ活性の阻害作用は確認できたものの、肝臓型グリコーゲンホスホリラーゼに対する選択的な阻害作用を示すものは存在しなかった。そこで、インドール結合部位とは異なる部位に作用する化合物についても、阻害能の一次評価を開始した。今回注目したのは、グリコーゲン貯蔵部位に作用する化合物である。従来、環状オリゴ糖類はこの部位に作用することでグリコーゲンホスホリラーゼ活性への阻害作用を示すとされてきた。しかし、ピリジルアミノ化マルトヘキサオースを基質として阻害メカニズムを詳細に検討したところ、環状オリゴ糖類はグリコーゲン貯蔵部位に作用するものの、活性部位の働きに直接的な阻害作用を及ぼすわけではないことが明らかになった。さらに、前年度に引き続いて、阻害能の二次評価に適したグリコーゲン分解方向での評価方法の検討も行った。その結果、陰イオン交換クロマトグラフィーと示差屈折率検出器を用いることでグルコース-1-リン酸を直接的に分離・定量する新たな手法を開発することができた。前年度に開発したグルコース-1-リン酸を直接的に分離・定量する手法を用いて、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤の評価を行っていたところ、二つの発見があった。一つ目は、グリコーゲンホスホリラーゼの働きにはイオン強度依存性があることである。このことは研究開始当初に予想しておらず、この原因を解明しなければ、電荷を有する化合物がもつ阻害能を正しく評価することができなかった。さまざまな実験を行った結果、この原因の解明には成功を収めることができた。二つ目は、グリコーゲンの分子サイズがグリコーゲンホスホリラーゼの働きに影響することである。既知のグリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤について阻害定数を確認していたところ、文献値と本研究での実測値との間に大きな差があり、原因を調べたところ、この発見につながった。グリコーゲンは天然物であり、同じ種に由来するグリコーゲンであっても、メーカーやロットによって化学構造に大きな違いがある。このため、均質なグリコーゲンをどのようにして安定的に入手するかで、たいへん苦労することになった。グリコーゲンホスホリラーゼの働きにイオン強度依存性とグリコーゲンサイズ依存性があることが明らかとなり、過去の文献に記載されている阻害定数と本研究での実測値、さらには異なる文献間での阻害定数をいかに比較するかという問題にも直面することになったが、解決には至っていない。また、グリコーゲンホスホリラーゼの活性を阻害する化合物は見つかっているものの、肝臓型グリコーゲンホスホリラーゼを選択的に阻害する化合物に関しては、未だ発見には至っていない。グリコーゲンホスホリラーゼには肝臓型・筋肉型・脳型という3種類のアイソザイム(アミノ酸配列が部分的に異なる酵素)が存在する。先ず、グリコーゲンホスホリラーゼの構造に関するこれまでの報告を調査し、肝臓型の構造が筋肉型や脳型の構造とは異なっている部位を確認した。そして、その情報を基に、阻害能を評価する化合物としてインドール誘導体の調製から始めることにした。これまでに12種類のインドール誘導体を調製することができた。また、グリコーゲンホスホリラーゼの高感度活性測定を行う際の基質となるピリジルアミノ化マルトヘキサオースの大量調製を行った。そして、この基質を用いて一次評価(予備試験)を行う際の反応条件の検討を行った。なお、この蛍光性基質を用いる高感度活性測定法は、グリコーゲン合成方向において活性を調べるものである[Makino, Y., & Omichi, K. (2009) J. Biochem. 146, 71-76]。グリコーゲンホスホリラーゼは可逆酵素であるが、生体内においてはもっぱらグリコーゲン分解方向に働いていることから、阻害剤の探索にはグリコーゲン分解方向で評価する方が望ましいと言える。そこで、グリコーゲン分解方向での簡便な活性測定法の開発にも取り組んだ。その結果、イオン交換クロマトグラフィーと電気伝導度検出器を利用する新たな活性測定法を開発することができた。

ただし、蛍光性基質を用いる活性測定法と比較すると、感度の面では劣ることになった。また、精製度の低い酵素(粗酵素)の利用は難しいことが分かった。グリコーゲンホスホリラーゼには、触媒活性部位のほか、インドール結合部位やグリコーゲン貯蔵部位などのリガンド結合部位が存在する。インドール結合部位とグリコーゲン貯蔵部位を標的とした肝臓型グリコーゲンホスホリラーゼ選択的阻害剤を見つけ出すことができなかったことから、今年度は触媒活性部位を標的とした阻害剤の探索を行った。まず、グリコーゲン貯蔵部位にオリゴ糖が結合しても、触媒活性部位の働きへは影響が及ばないことを証明した。その結果、オリゴ糖基質への反応性を調べることで、触媒活性部位の基質特異性を直接議論できるようになった。グリコーゲンホスホリラーゼの触媒活性部位には、グルコース残基1つを認識するサブサイトが5つ(SG1SG5)と、リン酸を認識するサブサイトが1つ(SP)存在すると考えられている。そして、これらのサブサイトが全て基質で満たされた場合に、グリコーゲンホスホリラーゼは完全な活性を示すと考えられている。私は、サブサイトSG1SG5には基質特異性に差があり、触媒活性の発現に対して特に重要なサブサイトが存在するのではないかという仮説を立てた。そして、この仮説を検証するため、構造が部分的に異なるマルトペンタオース誘導体へのグリコーゲンホスホリラーゼの反応性を比較した。その結果、サブサイトSG2とSG3でのグルコース残基の認識が活性の発現に重要であることが判明した。よって、サブサイトSG2またはSG3を標的とした阻害剤が有望と考えられるが、肝臓型アイソザイムを選択的に阻害する構造を発見するには至らなかった。生体分子科学東日本大震災の影響で、平成23年度に研究の立ち上げ作業が遅れてしまった。また、インドール結合部位に作用する化合物とグリコーゲン貯蔵部位に作用する化合物について阻害能の一次評価を行っているものの、肝臓型グリコーゲンホスホリラーゼに対して選択的な阻害作用を示す化合物を見つけるには至っていない。このことから、達成度はやや遅れていると言える。東日本大震災の影響で、平成23年度に研究の立ち上げ作業が遅れてしまった。また、グリコーゲンホスホリラーゼの働きにイオン強度依存性やグリコーゲンサイズ依存性があることを予想していなかったこともあり、肝臓型グリコーゲンホスホリラーゼに対して選択的な阻害作用を示す化合物を見つけるには至っていない。目標がかなり高いということもあるが、達成度はやや遅れていると言える。東日本大震災の影響で研究費が減額される可能性があったため、薬品等の購入を見合わせた時期があった。このため、グリコーゲンホスホリラーゼ活性測定用の蛍光性基質の調製については計画通り達成したものの、阻害剤の調製についてはやや遅れてしまうこととなった。なお、研究費が確定してからの研究は、おおむね順調に進展している。前年度に引き続き、グリコーゲンホスホリラーゼ活性阻害能を評価すべき化合物の調製を行う。
S化1本鎖DNAによるDNA-PK活性阻害と新しい放射線増感剤の可能性

放射線によりDNAには様々な損傷が生じるが、細胞の生死にとって重要なのはDNA2本鎖切断であることがわかっている。DNA2本鎖切断は人間の細胞では主に非相同的末端結合機構により修復が行われることが報告されている。我々は、非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の活性がPI3-キナーゼ阻害剤の1つwortmanninにより阻害され、放射線感受性が高められることを報告した。さらに、我々は培養食道癌細胞の放射線感受性とDNA-PK活性の間に相関関係が認められることを明らかにした。これらのことより、DNA-PK活性阻害により放射線抵抗性癌細胞を選択的に放射線増感できる可能性が示唆される。我々は、直鎖状のS化1本鎖DNA(phosphorothioate oligonucleotides)がDNA-PK活性を強力に抑制することを見出した。S化1本鎖DNAは50nMの濃度でDNA-PK活性をほぼ完全に抑制した。この現象に塩基配列特異性は認められないため、アンチセンスDNAとして作用しているのではないと考えられた。さらに、直鎖状DNA類似物質がDNA-PK活性を抑制することを見出した。直鎖状DNA類似物質が細胞レベルでDNA-PK活性を抑制するかどうかを検討した結果、細胞上清中に加えた場合にもDNA-PK活性が抑制されることが明らかになった。さらに放射線によるDNA2本鎖切断の修復を抑制するかどうかを、パルスフィールドジェルを用いて検討した結果、2本鎖切断の修復は有意に抑制された。直鎖状DNA類似物質は、培養細胞の放射線感受性を高めたが、紫外線感受性を高めることはなかった。また、SCIDマウス由来線維芽細胞の放射線感受性は高めたが、Control細胞の放射線感受性を高めることはなかった。DNA2本鎖切断は非相同的末端結合機構と相同的組換えにより修復される。このうち、人間の細胞では主に非相同的末端結合機構により修復が行われることが報告されている。我々は、非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の活性がPI3-キナーゼ阻害剤の1つwortmanninにより阻害され、放射線感受性が高められることを報告した(Hosoi et al.,Int.J.Cancer 1998)。さらに、我々は培養食道癌細胞の放射線感受性とDNA-PK活性の間に相関関係が認められることを明らかにした(Zhao et al.,Clin.Cancer Res.2000)。しかし、PI3-キナーゼ阻害剤はDNA-PK活性を阻害するが選択的阻害剤ではなく、副作用が大きく臨床適応は難しい。DNA-PK活性の選択的阻害剤の開発が臨床応用のために必要である。我々は、直鎖状のS化1本鎖DNA(phosphorothioate oligonucleotides)がDNA-PK活性を強力に抑制することを見出した(投稿中)。

我々は、非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の活性がP13-キナーゼ阻害剤の1つwortmanninにより阻害され、放射線感受性が高められることを報告した(Hosoi et al., Int. J.Cancer 1998)。さらに、我々は培養食道癌細胞の放射線感受性とDNA-PK活性の間に相関関係が認められることを明らかにした(Zhao et al., Clin. Cancer Res.2000)。これらのことより、DNA-PK活性阻害により放射線抵抗性癌細胞を選択的に放射線増感できる可能性が示唆される。我々は、直鎖状のS化1本鎖DNA(phosphorothioate oligonucleotides)がDNA-PK活性を強力に抑制することを見出した(Hosoi et al., Brit. J.Cancer in press)。S化1本鎖DNAは50nMの濃度でDNA-PK活性をほぼ完全に抑制した。この現象に塩基配列特異性は認められないため、アンチセンスDNAとして作用しているのではないと考えられた。さらに、直鎖状DNA類似物質がDNA-PK活性を抑制することを見出した。直鎖状DNA類似物質が細胞レベルでDNA-PK活性を抑制するかどうかを検討した結果、細胞上清中に加えた場合にもDNA-PK活性が抑制されることが明らかになった。さらに放射線によるDNA2本鎖切断の修復を抑制するかどうかを、パルスフィールドジェルを用いて検討した結果、2本鎖切断の修復は有意に抑制された。放射線によりDNAには様々な損傷が生じるが、細胞の生死にとって重要なのはDNA2本鎖切断であることがわかっている。DNA2本鎖切断は人間の細胞では主に非相同的末端結合機構により修復が行われることが報告されている。我々は、非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の活性がPI3-キナーゼ阻害剤の1つwortmanninにより阻害され、放射線感受性が高められることを報告した。さらに、我々は培養食道癌細胞の放射線感受性とDNA-PK活性の間に相関関係が認められることを明らかにした。我々は、直鎖状のS化1本鎖DNA (phosphorothioate oligonucleotides)がDNA-PK活性を強力に抑制することを見出した。
ラットフッ素症歯琺瑯質に出現する異常結晶の高分解能電子顕微鏡的研究

本研究に用いた材料は、200ppmのフッ素を含む飲料水を10週間自由に摂取させて形成したラットフッ素症歯である。まずラットに全身潅流固定を施して上下顎の切歯を採取し、非脱灰もしくは脱灰試料として、前者は光学顕微鏡、偏光顕微鏡、顕微X線観察の後、高分解能透過型電子顕微鏡観察に、また後者は光学顕微鏡および通常の透過型電子顕微鏡観察に供した。なお、観察部位は基質形成期から切端に至るまでの琺瑯質と琺瑯芽細胞であるが、詳細は研究成果報告書に記載することとし、ここでは琺瑯質の所見につきその概要のみを述べる。フッ素症歯琺瑯質の表層は透明かつ高度に石灰化した層として、その直下は不透明かつ低石灰化層として識別された。高石灰化層には、c軸断で扁平六角形を示す過成長した大型の結晶間に正六角形を示す小型の結晶が少数混在し、全体的にはそれらが極めて密に配列していた。それぞれの結晶の格子間隔は8.17Åと8.12Åで、前者がhydroxyapatite、後者がfluorapatiteと同定され、これまで推測の域を出なかったfluorapatiteの出現時期が萌出以前であることを本実験が確定した。低石灰化層の結晶は、対照よりやや小さい扁平六角形の断面を示すものが疎に分布し、時に微小な未石灰化領域を含んでいた。これらのことは、表層に結晶間隙がほとんど存在しないため、直下への無機イオンの供給が抑制された状態で萌出してくることを物語っていた。この他、格子間隔が8.13Å以上で8.17Å未満の結晶や、結晶中央にoctacalium phosphateの存在を示唆するものも観察された。特に前者の結晶はfluoridated-hydroxyapatiteであると想像して、これを検討し、in vitro実験ではあるが、その可能性が大であることを示した。また、後者の結晶については、健常な琺瑯質に最初に出現する結晶がこれであることをつきとめ、フッ素症歯琺瑯質を結晶形態学的立場からに明らかにした。本研究を遂行するにあたって、ラットに0.044%フッ化ナトリウム(200ppm)水溶液を飲料水として10週間与え、まずフッ素症歯を形成した。次いで、2.5%グルタールアルデヒド・2.0%パラホルムアルデヒド混合液で潅流固定を施した後、上下顎切歯(試料)を採取した。採取した切歯は非脱灰のままポリエステル樹脂に包埋の後、厚さ50μmの研磨標本としてそのマイクロラジオグラム(CMR)を作製し、研磨標本とCMRの両者を光学顕微鏡で比較観察した。その結果、成熟期の初期から切端にいたるまでの琺瑯質は、その表層側1/3に幅広い高石灰化層が形成され、その下方に低石灰化層を伴っていた。これら光学顕微鏡的所見は、これまでに本研究代表者らが行ってきたヒトフッ素症歯琺瑯質と同様の所見を示すところから、これがフッ素中毒に陥っている(フッ素症歯となっている)ことを裏付けた。

なお、石灰化度の相違を示すこのような変化は、特に萌出直前の部分に顕著で、萌出後はその程度差を減じていくものの、切端に至っても、表層直下の琺瑯質は低石灰化層として明瞭に識別される。以上の観察を終えてから、研磨標本を二分して、一方をX線元素分析ならびにX線回析用試料とし、他方をサンドイッチ法によりエポキシ樹脂に再包理の後、結晶c軸を横断する超薄切片として高分解能電子顕微鏡で観察した。本年度は個々の結晶解析のための指標となるfluoridated hudroxyapatiteのデータ獲得を主として為、それ以上は予備的観察の域を出なかったが、その概要を以下の述べる。まず、表層の高石灰化層であるが、この部分の結晶は対照のそれより幅、厚さともに大きく、また結晶間際も狭いが、低石灰化層では、逆に結晶が小さく、かつ微小な未石灰化領域も所々に観察された。本年度の研究に供した試料は昨年度に報告したものと全く同様にしてラット上下顎切歯に形成した実験的フッ素症歯である。これを通法に従って、ポリエステル樹脂包埋研磨切片としてそのマイクロラジオグラムを作製し、昨年度の結果と同じ所見が得られることを確認の後、研磨切片をエポキシ樹脂に再包埋して超薄切片とし高分解能透過型電子顕微鏡により個々の結晶を検索した。その結果、成熟期初期の琺瑯質表層に見られた高石灰化層の結晶は、結晶c軸断で扁平六角形の外形を示す大型結晶とそれらの間に介在する正六角形の小型結晶とからなっていた。大型結晶の外観は対照と同様であるが、厚み方向への成長が著しく、時にその辺縁に小型結晶を融合しているものも認められた。大型結晶の示す格子間隔はhydroxyapatiteであることを示す8.2Åのものが多いが、時に、octacalcium phosphateを示唆する9.4Å間隔の格子を結晶中央部に認めるものもあった。なお、小型結晶の格子間隔は8.1Åを示すものが多かったところからfluorapatiteもしくはfluoridated-hydroxypatiteである可能性が強い。これに対し、低石灰化層の結晶は対照のそれより小さいものが多く、同等の大きさもしくは過成長した結晶はほとんど認められなかった。ところで、琺瑯質における石灰化度の上昇は表層と深層から始まり、中層がやや遅れる。結晶の成長に必要な無機質の供給は結晶間隙を介して行われており、健常な状態で形成される琺瑯質の表層では、萌出直前に至ってもなおかなりの結晶間隙が残されていることが電子顕微鏡で確認されている。本実験における表層琺瑯質では、結晶の過成長に伴って結晶間隙が著しく狭窄しており、これがその後の結晶成長に影響を与え、延ては低石灰層成立の要因となっていることが強く示唆される。本年度も、前年および前々年と同様、ラット上下顎切歯に形成した実験的フッ素症歯を通法に従って超薄切片として高分解能透過型電子顕微鏡により個々の結晶を検索し、これまでの結果が偶然得られたものではないことの確認を行い、さらに、実験途上で問題となったfluoridated-hydroxyapatiteの検討を開始した。フッ素症歯琺瑯質の表層は高度に石灰化し、その直下に低石灰化層を伴っていた。高石灰化層には、結晶格子の間隔が8.17Åを示しhydroxyapatiteと同定される大型の結晶と、それが8.12Åでfluorapatiteと同定される小型の結晶が混在していた。大型のものは対照と比較すると明らかに過成長したものであり、しかもそれらが密に配列していた。また、認められた小型結晶の数はヒトのそれと比べると格段に少なかった。本研究者らがかつて行った実験的ブタフッ素症歯の検索で、fluorapatiteが形成中の琺瑯質に出現する可能性を示唆したが、今回の結果は、この所見を確実なものとし、萌出以前にfluorapatiteが琺瑯質中に出現していることを確定した。
家禽globule leucocyteにおける食菌作用の検出

本研究では,哺乳綱のナチュラルキラ-(NK)細胞が選択的に食菌するとされるStaphylococcus aureus Cowan I(SA)に対して、ニワトリglobule leucocyte(GL)が貧食作用を有するのか否かを明らかにし、報告者が従来明らかにしてきたGLのT細胞系列での分化過程をより明確にすることを目的として実験をおこなった。ニワトリの血液より、GLを含むバッフィ-コ-ト分画を分取し、この分離細胞浮遊液にグラム陽性菌(SA)ないし対照としてグラム陰性菌2種を加えて培養し、経時的に固定して光学および電子顕微鏡下で精査した。また補体の有無についての条件下でも同様に検討するとともに、合わせて血液中における同細胞のクリアランスの過程についても観察した。得られた知見は下記の通りである。1.GLには、SAとの混合培養により、II型果粒の増加や細胞突起の伸張等の細胞活性化の兆候が観察されるとともに、GLと思われる細胞による食菌作用が極く稀にではあるが認められた。2.SAに対する食菌作用を培養直後から示す細胞は、栓球および偽好酸球であり、これらの細胞がSA除去の主体をなすとともに、単球による食菌作用はやや遅れることが明らかとなった。また、その超微形態学的な詳細についても明らかになった。3.SAに対する食菌作用への補体の影響は認められなかった。以上の結果から、ニワトリGLも哺乳綱のNK細胞と同様にT細胞系列ら属しながら、ミエロイド幹細胞に極めて近い分化過程をとることが示唆されるとともに、ニワトリ血液におけるSAのクリアランスの様式が明らかとなった。これらの成果は近日中にまとめて公表する予定である。
人文科学における異種データの統合的表示についての研究

平成4年度の研究をもとに、本年度は、ハウサ語資料、アラビア語資料、およびトルコ語方言資料を対象に、コンピュータによるデータ処理や表示・プレゼンテーションの技法、さらに、その分析への利用について研究を進めた。まず、ハウサ語資料では、テキスト・データの表示を変え、より分析に利用しやすい形に加工する技法を検討した。その結果、基本的には通常のテキスト・データを用いながらも、データの配列・構成を変えることにより、これまでデータの上で明示的に示されていなかった語彙構造が、直接把握できるようになった。次に、テキスト・データではあるが、現在コンピュータで扱うことが困難な非ローマン系アルファベットであるアラビア語資料の抱える諸問題を研究した。これまで、コンピュータにおけるアラビア語処理の問題は、ややもすると、アラビア文字をコンピュータ上で表示できればよしとする傾向があったが、本研究では、アラビア語資料のデータ・ベース化を視野に入れながら、コンピュータにおけるアラビア語処理の問題を検討しした。最後に、トルコ語Bolu方言の調査データを用いて、方言の分布図を作成する方法を研究した。当初Macintosh上で動くHyperCardをプラットフォームとして、グラフィックやデータ・ベースのためのアプリケーションを統合する計画を立てたが、近日中にHyperCardがv2.2にバージョン・アップし、大幅に変更される可能性が生じたため、とりあえずアプリケーションの統合は行わず、それぞれを単体で用いて、方言分布図を作成し、言語地理学的研究に応用した。当初に予定していた作業のうち、トルコ語方言資料関係(共同研究者・林担当)は試験的なハイパーテキスト・スタックが数点完成し、現在試用・評価中です。このうちでも、動詞活用表示のためのスタックは、トルコ語のみならず、複雑な活用をみせる動詞体系の言語にも、すべて適応可能だと思われます。コンピューター支援言語教育にとって、将来有用なテクニックへと発展するはずです。アラビヤ文字を使用する言語関係の作業(共同研究者・西尾担当)では、現在入手可能なソフトウェアを最大限利用した基本システムについて、研究者むけの解説を刊行する予定です。これをもとにして、アラビヤ語動詞パラダイム生成のためのスタックが、現在編成中です。これまで、コンピュータにおけるアラビア語処理の問題は、ややもすると、アラビア文字をコンピュータ上で表示できればよしとする傾向があったが、本研究では、アラビア語資料のデータ・ベース化を視野に入れながら、コンピュータにおけるアラビア語処理の問題を検討した。当初Macintosh上で動くHyperCardをプラットフォームとして、グラフィックやデータ・ベースのためのアプリケーションを統合する計画を立てたが、近日中にHyperCardがv2.2にバージョン・アップし、大幅に変更される可能性が生じたため、とりあえずアプリケーションの統合は行わず、それぞれ単体で用いて、方言分布図を作成し、言語地理学的研究に応用した。
プラズマ酸化反応の原子レベルでの制御法の開発研究

本研究は,近年注目される医療応用を念頭に置いて,プラズマを使って効率的に酸化させる方法を確立させるものである。生体分子やアモルファスカーボン膜など炭素で構成される膜の酸化について,多重内部反射赤外吸収分光法(MIR-IRAS)のその場・実時間計測を用いて調べてきた。昨年度はエーテル(C-O-C)を原料として用いたプラズマCVDの研究で,C-OHの形成よりC=Oが優先されると考察した。エーテル構造につながるアルキル基の種類をエチル基,プロピル基,ブチル基へかえて実験を行った。その結果,ノルマル基(直鎖上の構造)の場合にはC=Oが形成されやすいが,第2級以上ではC=Oの形成とともに,OH基が形成されることが分かった。アモルファス炭素膜上にC=Oが形成されると,膜と純水の接触角が90度から60度へと減少し,膜の親水性自体は向上する。一方,膜上にC=Oに加えOH基が形成された場合,膜と純水の接触角が90度から30度へと激減し,膜の親水性が格段に向上することが分かった。第2級以上の炭素原子とそれにつながる酸素原子は,ノルマルの炭素原子の場合と比べ,切断されやすくなるため,プラズマ中でO原子が原料分子から放出され,これが酸化に寄与していることが分かった。プラズマ中でのO原子の生成がやはり酸化に寄与しているといえるものである。分子の構造をかえると,酸化を制御できることが分かる。有効な酸化手段として,酸素原子を放出されやすい構造の分子を用いるなどにより酸素原子の生成が有効であるといえる。一方で,プラズマ中で酸素が分子から解離して成膜された場合,炭素膜中のダングリングボンド密度が増大している可能性があり,この影響で酸素原子と結びつく炭素化水素の密度が高かった可能性もある。今後,この点も解明していく予定である。プラズマ酸化は現在に至るまで,物質合成・表面処理には重要なプロセスである。本研究は有機分子などのプラズマ酸化過程を系統的に調べ,効率的なプラズマ酸化に貢献しようとするものである。OHやOなど,プラズマで生成される活性酸素の種類ごとに,C=CやC-Cなど異なる結合状態を持った炭素群や様々な官能基に引き起こす酸化反応について,詳細に調べることを予定し,実際に,計画に基づき研究を進めている。具体的には,様々な結合状態を持った生体分子や酸化物の有機材料を膜化する。その膜に活性酸素をそれらの膜に照射し,膜中の化学結合状態の変化をその場・実時間の赤外分光計測により調べている。この結果から,活性酸素がどのような反応をしているのかを明らかにしていこうというものである。特に,本実験では,酸素プラズマによる酸素ラジカルの効果,酸素と水素の混合ガスによるプラズマによるOHラジカルの効果を水素プラズマによる水素ラジカルの効果と比較しながら,検証している。その場・実時間計測にこだわるのは,反応が終わってからではプラズマの反応以外にも酸化される可能性があり,これを排して,反応過程そのものを計測するためである。この研究から,酸化させやすい活性酸素の種類の特定も期待できると考えられる。このように,本研究は,様々な炭素群や様々な官能基と活性酸素の統一的な反応モデルの構築を目指し,プラズマ酸化の反応を原子レベルで制御できるようにするものである。この結果に基づいて,化学気相堆積法に使われる原料分子や細菌などの滅菌・殺菌などを実際に使われているプラズマ酸化処理の理論的根拠を引き出せるようにする研究を進めていてきた。アルツハイマー型認知症の患者には,脳内にアミロイドベータたんぱくが蓄積することが知られている。このタンパクは非常に安定であり,分解されにくいことから,このタンパクが病気の原因とも考えられている。この物質をプラズマ酸化により,分解することを試みた。酸素プラズマを照射し,その反応について,多重内部反射型赤外分光法を用いたその場・実時間での計測を行った。同時に,水素プラズマ,酸素・水素の混合ガスのプラズマを用いた実験を試みた。その結果,酸素プラズマによるアミロイドベータたんぱく質の分解量は,水素プラズマによる分解量と変わらない。一方,酸素・水素の混合ガスのプラズマによる分解量は,酸素プラズマ,水素プラズマ,それぞれ単体のプラズマの照射による分解量に比べ,大きいということが分かった。酸素・水素の混合ガスのプラズマを発光分光で解析すると,酸素プラズマ,水素プラズマの場合に計測された発光種に加え,OHラジカルによる発光種が計測された。本結果は,OHラジカルによる酸化・分解反応が大きいことを示唆していると考えられる。生体分子やアモルファスカーボン膜など炭素で構成される膜の酸化は,膜中にC-OHが形成されるとともに,C=Oが形成される。そこで,どちらが形成されやすいのか,明らかにするためにも,酸素を含みOH基を持っていないC-O-Cの構造をもつエーテルに注目した。ジイソプロピルエーテル((C3H7)2O)を原料分子として,プラズマ化学気相堆積法により,膜堆積を行い,その反応過程を調べ,その中でも酸化の進行について調べた。調べた方法は,これまで開発を進めてきた多重内部反射赤外吸収分光法(MIR-IRAS)であり,長崎大学より佐世保高専に移設し,稼働させることができた。膜表面では分子中のC-O基は切断され,膜中でC=O基が形成されていることが分かった。もちろん,有機分子なので,単結合の炭素原子に水素と結合したCXHY基が形成される。

ただし,膜中に炭化水素(CXHY)が形成された後,膜中のC=Oが形成されていくことが分かった。すなわち,CXHY基を酸化させてC=O基が形成されていると考えられる。この膜中にはOH基が形成されていないと考えられ,OH基が形成されるよりもC=Oの方が形成されやすいということも明らかになってきた。次に,C-C結合,炭化水素分子をOHで有効に分解できるのなら,過酸化水素水中でプラズマを生成しOHを生成すれば効率的に分解できるはずである。そこで,テトラエトキシシランと過酸化水素水の混合溶液中でプラズマ生成し,発生したOHによりテトラエトキシシランの分解を試みたが,分解は非常に難しかった。ここから,酸素原子,OHとの反応以上に,電子衝突や紫外線なども分解に寄与していことを示していると考えられる。さらに,モリブデンのプラズマ酸化によるモリブデン三酸化物の合成の実験を始めた。所属機関の変更もあり,真空装置,多重内部反射型赤外分光装置の移設,それらの立ち上げにより時間がとられ,研究の進展が危ぶまれたが,装置も順調に立ち上がり,ひとまずは安心できた。そればかりか,新たな結果も出てきた。OHによる酸化は強いことは知られているが,テトラエトキシシランはOHだけでは効率的な酸化はできないことが分かってきた。プラズマ酸化には, OやOHなどの酸化源とともに,紫外光や電子の衝突が重要であることがわかってきた。また,炭化水素の酸化によりOHが生成されることが知られていたが,C=Oの形成が優先される可能性も見出した。さらに,プラズマ酸化によるモリブデンからモリブデン三酸化物の合成の実験を始めた。プラズマ酸化という現象を幅広くとらえ,研究計画以上に,研究を広く展開することができた。本研究は,近年注目される医療応用を念頭に置いて,プラズマを使って効率的に酸化させる方法を確立させるものである。生体分子やアモルファスカーボン膜など炭素で構成される膜の酸化について,多重内部反射赤外吸収分光法(MIR-IRAS)のその場・実時間計測を用いて調べてきた。昨年度はエーテル(C-O-C)を原料として用いたプラズマCVDの研究で,C-OHの形成よりC=Oが優先されると考察した。エーテル構造につながるアルキル基の種類をエチル基,プロピル基,ブチル基へかえて実験を行った。その結果,ノルマル基(直鎖上の構造)の場合にはC=Oが形成されやすいが,第2級以上ではC=Oの形成とともに,OH基が形成されることが分かった。アモルファス炭素膜上にC=Oが形成されると,膜と純水の接触角が90度から60度へと減少し,膜の親水性自体は向上する。一方,膜上にC=Oに加えOH基が形成された場合,膜と純水の接触角が90度から30度へと激減し,膜の親水性が格段に向上することが分かった。第2級以上の炭素原子とそれにつながる酸素原子は,ノルマルの炭素原子の場合と比べ,切断されやすくなるため,プラズマ中でO原子が原料分子から放出され,これが酸化に寄与していることが分かった。プラズマ中でのO原子の生成がやはり酸化に寄与しているといえるものである。分子の構造をかえると,酸化を制御できることが分かる。有効な酸化手段として,酸素原子を放出されやすい構造の分子を用いるなどにより酸素原子の生成が有効であるといえる。