hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸癌肝転移高危険群選別を目的とした門脈系エクソソーム中RNA・タンパク質解析

本研究の目的は、大腸癌切除標本から低侵襲かつ高感度な大腸癌肝転移スクリーニング法を開発することである。exosomeは癌細胞を含むすべての細胞から分泌される小胞で、内部にタンパク質、RNA、DNAなどが格納されており、血液中のRNase、DNaseから守られている。転移・浸潤をはじめ様々な働きをすると考えられているが詳細はまだ判明していない。肝転移を予測する新たなマーカーを発見することは、術後治療選択の幅を広げ大腸癌の予後改善へと飛躍的に発展する契機となり、また大腸癌肝転移のメカニズムを解明する一助になると考えられる。まず切除標本から門脈系(上腸間膜静脈、回結腸静脈)血液を採取し同血液内からexosomeを抽出する。インテグリンタンパク質ファミリーをはじめ、RNA、DNAを網羅的に解析し、大腸癌肝転移ハイリスク群の新たな高感度バイオマーカーを明らかにすることである。今年度は昨年度に引き続き、門脈系血清のサンプル採取を行い、exsome抽出を行った。また膵液、十二指腸液からもexsome及び、exosomeに内包されていると想定されるmicroRNAを抽出した。本抽出法で得られたexosomeの検体量や質が、条件の悪い膵液サンプルでも今後の今後の研究に耐用可能であることを確認し、exosome中のmicroRNAレベルを測定、膵癌診断に有用なマーカーであることを論文報告した。サンプル採取に関しては終了している。現在、得られたexosomeからRNAやmicroRNA、タンパクを抽出しているところである。抽出と同時に、臨床病理学的データと照らし合わせ、その臨床的・分子生物学的意義について検討を進めているところである。タンパク解析を中心に行う。ELISA Kitを用いて門脈血及び末梢静脈血由来exosomeのインテグリン蛋白ファミリーの発現解析を行う。それに加えて予後調査を行いインテグリンタンパクファミリーの発現と予後の関係も詳細に検討し、肝転移ハイリスク群とインテグリンタンパク質の関連を明らかにする。最終的には、その結果をもとにプロスペクティブスタディを行うことを計画している。一方で多方面からの研究も進める。予後良好・不良症例の網羅的遺伝子解析や蛍光X線分析を用いた癌間質相互作用による抗癌剤耐性発現メカニズムの解析を推進し、最終的に大腸癌微小環境に関連する分子生物学的因子の解明を進める。まず門脈系血清のサンプル採取を行った。平成28年4月から大腸癌手術症例の摘出検体の下腸間膜静脈から血清を採取している。現時点で計41症例から採取しており、うち8例(25%)はStageIV症例である。さらに同門脈系血清からexosomeを、超遠心法、及び抽出キットを使用した方法で抽出し、抽出方法がexosome抽出量に影響を与えるかを調べた。大腸癌由来exosomeの表面マーカーといわれるCD9/CD147を測定し、門脈系exosomeに大腸癌由来exosomeが含まれていること、抽出方法はexosome抽出量に影響を与えないことを確認した。また手術前、手術後の末梢血採血も進めている。現在16症例から術前術後末梢血を採取しており、門脈血同様CD9/CD147を測定予定である。Exosomeが抽出されている確認として、ナノ粒子トラッキング解析(Nanosight)、及び電子顕微鏡での小胞確認、ウエスタンブロッティング法でのExosomal Markerの確認を行った。それぞれ良好な結果を得ており、exosomeは確実に抽出されていると思われる。現在、さらなるサンプル採取を継続している。Exosomeからまずは特に安定して存在するmicroRNAを抽出し測定した。多くの腫瘍で高発現が認められているmicroRNA21/microRNA155を測定し、癌症例で高発現であることが確認された。また多方面からの検討として他臓器由来体液からもexosomeを抽出した(膵液)。最終的にはインテグリンファミリーの解析を行う。将来的に肝転移を来しうる症例を識別し大腸癌肝転移ハイリスク群の早期診断のみならず、治療方針の決定・大腸癌の予後改善に飛躍的な進歩が期待できる。サンプル採取に関しては、大腸癌症例は収集が容易であるが、コントロールとして健常群(憩室炎、虚血性腸炎など)の収集はやや遅れている。採取不能な場合、内視鏡的粘膜切除(EMR)後で癌遺残が全くない症例などを代用する予定である。サンプルからのexosome抽出、及びmicroRNAは随時行っているが、microRNAの検討を優先したため、それ以外の抽出は遅れている。抽出法を検討した後、タンパクなどの抽出を行いたい。

また膵液、十二指腸液からもexsome及び、exosomeに内包されていると想定されるmicroRNAを抽出した。本抽出法で得られたexosomeの検体量や質が、条件の悪い膵液サンプルでも今後の今後の研究に耐用可能であることを確認し、exosome中のmicroRNAレベルを測定、膵癌診断に有用なマーカーであることを論文報告した。サンプル採取に関しては終了している。現在、得られたexosomeからRNAやmicroRNA、タンパクを抽出しているところである。抽出と同時に、臨床病理学的データと照らし合わせ、その臨床的・分子生物学的意義について検討を進めているところである。サンプル採取を継続し、得られたexosomeからRNAやmicroRNA、タンパクを抽出して臨床病理学的データと照らし合わせ、その臨床的・分子生物学的意義について検討を進める。特にStageIV大腸癌(肝転移)サンプルを中心に解析を行い、肝転移促進因子を発見する。現時点で新たに肝転移が出現した症例はないが、肝転移新規出現症例があった場合、初回手術時に採取されたサンプルを検討し、肝転移促進因子の発現を解析する。タンパク解析を中心に行う。ELISA Kitを用いて門脈血及び末梢静脈血由来exosomeのインテグリン蛋白ファミリーの発現解析を行う。それに加えて予後調査を行いインテグリンタンパクファミリーの発現と予後の関係も詳細に検討し、肝転移ハイリスク群とインテグリンタンパク質の関連を明らかにする。最終的には、その結果をもとにプロスペクティブスタディを行うことを計画している。一方で多方面からの研究も進める。予後良好・不良症例の網羅的遺伝子解析や蛍光X線分析を用いた癌間質相互作用による抗癌剤耐性発現メカニズムの解析を推進し、最終的に大腸癌微小環境に関連する分子生物学的因子の解明を進める。おおむね計画通りに使用できた。次年度は研究用試薬、器材、研究用キットなどの消耗品に使用する予定である。研究計画に遅れを生じているため。次年度は研究用試薬、器材、受託解析等に使用予定である。
HDLによる細胞コレステロール搬出系におけるカベオリンの意義

カベオリン-1はアミノ酸178個からなり、中央部の細胞膜結合ドメイン(アミノ酸102-134)を介して細胞膜に結合し、N末端及びC末端を細胞質側に向けたヘアピン状の構造をとると考えられている。機能ドメインとして、2つのへリックスドメイン(アミノ酸28-56、並びに57-75)、Ras蛋白結合ドメイン(アミノ酸82-101)、上述の細胞膜結合ドメイン、及びコレステロールセンシングドメイン(アミノ酸119-122)が言われているが、これら各ドメインの生細胞内での役割、特にコレステロール代謝平衡に関わる機能については、直接的な生化学的証明がない。本研究では、1.イヌカベオリン-1cDNAをクローニングし、c-Myc及び7つのヒスチジンかなるtagを付加した後、動物細胞系の発現ベクターpcDNA3に組み込み、カベオリン-1発現プラスミドを構築した。2. PfuDNAポリメラーゼによるPCRと、鋳型のメチル化DNAを特異的に断するDpnIを用いた部位特異的変異導入法によって、上記のヘワックスドメイン、Ras蛋白結合ドメイン、細胞膜結合ドメイン、及びコレステロールセンシングドメインを選択的に欠失さたカベオリン-1欠失変異体を作製した。3.これらの欠失変異体、並びにカベオリン-1全長をCOS-7細胞に一過性に過剰発現させる実験系を確立した。現在、アビジンによって細胞膜蛋白を標識した後、遠心法による細胞分画を行い、リコンビナントカベオリン-1の細胞内分布、並びに細胞膜遊離コレステロールの増減を検討中である。予備的検討の結果では、カベオリン-1の過剰発現は、細胞遊離コレステロールのefflux更にはinfluxに著明に影響し、特に一番目のへワックスドメインの欠失変異体は、ドミナントアクティブに機能することが示唆されている。
ブーメラン型多連続反応の高効率化と環境低負荷型電解法への応用

複雑な多環性骨格を持つ生理活性物質の合成を志向して、様々な連続反応を用いる骨格構築法の開発とその応用について研究を行い、新合成法の開発ならびに周辺の新事実を明らかにした。Michael-aldol反応の立体制御と触媒化新たなシクロブタン環の簡易構築法として以前開発した分子内Michael-aldol反応について、不斉化の検討を行った結果極めてよい光学収率で多環性化合物を得ることに成功した。また、ルイス酸触媒を活用することにより分子間反応への展開と触媒サイクルの構築に成功した。また、ある条件ではレトロ反応が進行すること、並びに中性のフッ素原子が触媒反応を活性化することを見出した。新規ラジカル反応の開発ビニルラジカルのamphiphilicityを積極的に活用した新規な分子内連続反応の開発について検討した結果、論理的に設計した基質を本ラジカル反応に付すことで、位置選択的に環化成績体を好収率で合成することに成功した。特に、基質の設計に少しの変化を加えるだけで、まったく異なる環化様式をもつ化合物をつくり分けることができ、ラジカル反応に固有な特徴を拡張できた。また、環境調和型の電解法によるラジカル反応にも応用した。生理活性物質合成への連続反応の応用分子内double Michael反応を鍵として抗カビ活性セスキテルペノイドであるクルモリン及びロンギボルネオールの効率的全合成を達成した。本合成法は、全収率・簡便性・工程数において従来法より優れたものであり、分子内double Michael反応が複雑な渡環化合物の合成法の極めて有効な手段になり得ることを証明できた。また、分子間azadouble Michael反応を新たに開発し、多彩な生理活性が期待できるインドールアルカロイドの合成に応用した。複雑な多環性骨格をもつ生理活性天然物の合成を指向して、様々な分子内連続反応を用いる骨格構築法の開発とその応用について研究を行い、いくつかの新たな事実を明らかにした。分子内Michael-aldol反応の立体制御キラル補助剤、または化学量論量の外部不斉源を用いて不斉分子内Michael-aldol反応について検討を行った。中程度極めて良い光学収率で多環性化合物を得ることに成功した。また、詳細な反応機構について検討を加えた。本連続反応の不斉触媒化についても研究を行い、現在進行中の課題である。新規ラジカル連続反応の開発ラジカル連続反応により望む目的物を与えるような基質(ビニルハライドを有するポリエン化合物)を論理的に設計した。本基質をラジカル条件で反応に付すことにより、目的の化合物が好収率で位置選択的に得られることを証明した。反応条件を最適化し、反応の選択性・収率を改善した。また、本反応の適用範囲を明らかにすることを検討した。環境低負荷型反応である電解法によるラジカル連続反応についても検討を行った。生理活性物質合成への連続反応の応用分子内double Michael反応を鍵反応として抗カビ活性セスキテルペノイドであるクルモリン及びロンギボルネオールの効率的合成を達成した。本合成法は、全収率・簡便性・行程数において従来法より優れていた。また、Michael-aldol反応を利用して低血糖症に効果のあるサウジンの短段階合成研究を行った。さらに、上記の連続反応を利用して種々の生理活性セスキテルペンの合成研究を行い、効率的骨格構築法を開発した。
安定期慢性閉塞性肺疾患患者における栄養教育プログラムの開発

安定期COPD患者3名に対し小集団栄養教育を行い、栄養状態と栄養摂取量の変化を評価した。その結果、栄養状態は、1名は体重を維持できたが2名は若干の減少がみられた。栄養摂取量では、3名の摂取エネルギー量はCOPD必要エネルギー量に近い値を摂取できていたが、PFC比はF比が低くC比が高い状況でCOPD患者に望ましい比率ではなかった。知識は獲得できたが、実際に食行動を変容させるまでには至らなかった。知識の伝達にとどまらず、食行動改善への態度、自信など認知的要因へのアプローチをふまえた個別教育の必要性が示唆された。安定期COPD患者の栄養障害予防に向けた介入のあり方を検討することを目的とし、平成26年2月から4月にかけて、月1回の栄養リハビリテーション教室を実施した。対象は外来通院中の慢性閉塞性疾患(COPD)患者とその家族とし告知したが、参加者のほとんどはCOPD以外の慢性呼吸器疾患患者であった。第1回(2月20日)「栄養障害のメカニズム」(医師)「栄養障害はなぜこわい?」(看護師)における参加者は男性5名女性4名であり、うちCOPD患者は3名であった。第2回(3月20日)「望ましい栄養とメニューの工夫ー食品モデルを使ってやってみようー」(栄養士)における参加者は男性2名女性4名であり、COPD患者は2名であった。第3回(4月17日)「食事と運動のバランス」(理学療法士)「食事時の症状と対処」(看護師)における参加者は男性3名女性3名であり、COPD患者は3名であった。3回の介入すべてに参加したCOPD患者2名は病期不明であり、2回に参加したCOPD患者は病期IIIであった。在宅酸素療法をしている患者の参加はなかった。介入の効果を評価するために、1回目と3回目に身体測定と栄養摂取量調査を実施した。COPD患者3名におけるBMIは、A氏16.5(初回)→16.3(3回目)、B氏20.9→21.1、C氏22.9→22.9と変化はほとんどみられなかった。栄養摂取量調査の結果、推定エネルギー必要量とエネルギー摂取量との差は、A氏ー240kcal(初回)→ー378kcal(3回目)、B氏ー593kcal→ー685kcal、C氏ー410kcal(初回のみ)であり、推定エネルギー必要量をいずれも下回っていた。協力の得られた8名のうち、COPD診断基準に合致した5名について分析した。男性4名女性1名、平均年齢は67.4(±5.4)歳、在宅酸素療法利用者は0であった。COPD病期分類ではI期(軽度)3名、III期(高度)2名、対標準1秒量(%FEV1)の平均は72.74(±25.67)であった。呼吸困難の程度を示すH-J分類ではII(坂、階段の昇降は健常者並みにできない)4名、IV(休みながらでなければ50m以上歩けない)1名であった。BMIの平均は21.88(±5.98)と標準ではあるが、各データをみると18.5以下のやせが2名、25.0以上の肥満が2名であった。%IBW(%標準体重)は中等度低下が2名、軽度低下が1名であった。食事に伴う症状についてはほとんど全員が「症状なし」であったが、%FEV1が42.2と最も低値であった対象のみ、食欲不振、満腹感、息切れ、腹満感が「時々ある」と回答した。COPDの療養指導および栄養指導を受けた経験のある者はいなかった。3日間の食事調査の結果、エネルギー摂取平均値は1553kcal、炭水化物摂取平均186.3g、タンパク質摂取平均69.3g、脂質摂取平均57.9gであり、日本人の食事摂取基準(2010)と比較すると推定エネルギー必要量において男性は下回り女性は同程度であった。先行研究(沓澤,2005)との比較では、本調査対象者はエネルギー、炭水化物、タンパク質摂取量において低かったが、ビタミンB1、B2、Cと脂質の摂取は多かった。5名と少数のデータからではあるが、安定期の患者はBMIからやせと肥満に二分化される可能性があること、食事における摂取エネルギーは同年代と比較し少ないこと、COPDに関する療養・栄養指導を受けた経験がないことが明らかになった。今後、さらにデータ収集を続け、栄養教育プログラム構築の基礎的資料とする。予備研究として、外来通院中の安定期慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者10名を対象に、栄養障害の程度や食生活の実態について明らかにすることを目的として調査を行った。

その結果、10名中6名に栄養障害があり、筋タンパク量の減少がみられたこと、栄養障害のある患者の半数は摂取総カロリーが必要エネルギー量を下回っていたこと、高度なやせのみられる患者のPFC比はC比が高くF比が低いことが明らかになった。栄養障害があっても食事に伴う症状のみられない患者は、COPD患者特有の食事についての知識は少なく、栄養指導を受けた経験もなかった。疾病早期から病態と栄養に関する知識を得て、栄養障害を防ぐための食生活へ行動変容できることを目指した患者教育の必要性が示された。予備研究の結果を元に、外来に通院中の慢性呼吸器疾患をもつ患者およびその家族を対象に多職種による小集団栄養教育を行った。月1回60分×3回で、医師、看護師、管理栄養士、理学療法士が実施した。安定期にあるCOPD患者以外にも肺がん(術後)や非結核性抗酸菌症の患者など、常時6名9名の参加があった。第1回実施前・第3回終了後・終了後3ヶ月後に、身体測定と食事調査、質問紙調査を行い評価した。日本人の推定エネルギー必要量は、70歳以上の男性で1,850kcal/日、女性で1,450kcal/日である(身体活動レベルI)。簡易型自記式食事歴法質問票(BDHQ)を用いた食事調査の結果、摂取エネルギー量が低下したF氏以外は必要量を満たしていた。栄養状態を示す%IBW(%標準体重)では、80≦%IBW<90で軽度栄養障害、70≦%IBW<80で中等度、%IBW<70で高度と評価する。6名のうち、A氏とE氏が軽度栄養障害と評価された。2名とも期間中に体重増加はみられなかったが、低下を防ぐことはできた。臨床看護学平成24年度は、外来通院中の安定期COPD患者を対象にした身体組成および食事の実態調査を実施し、栄養障害と食生活の実態を明らかにした。その結果、10名中6名に軽度重度の栄養障害がみられ、栄養障害がなくとも筋肉量が減少している患者の存在も明らかになった。食事調査では、多くの患者に必要エネルギー量の不足がみられ、かつ高エネルギー高タンパク食や脂質を効率的にとることなど、COPD患者に必要な栄養に関する知識をもっていないことも示された。これらの調査結果をもとに、平成25年26年度にかけて3回にわたる栄養リハビリテーション教室を実施した。研究対象が少なかったことから統計分析を実施できるデータは得られなかったが、栄養障害予防の介入を実施するにあたっての対象の焦点化(呼吸機能障害が重度である在宅酸素療法実施者に限定する)や介入方法(1食生活は個別性が大きく、COPD患者は高齢であり既往歴も多様であることから小集団教育より個別教育が望ましい、2在宅酸素療法患者が介入のために通院することは身体的負担が大きいため、定期受診に来院した際介入する、3高齢男性が多いため、家族への教育的介入のあり方を検討する)についての示唆が得られた。平成24年度の研究目的は、「安定期COPD患者の栄養状態とその関連要因を明らかにする」ことであった。計画が遅れている理由は主に2点である。1つは、外来通院中のCOPD患者を対象に食事・栄養の実態調査を開始にあたり、調査対象者の除外基準「運動障害をきたす疾患に罹患している者」「認知機能障害がある者」「抗精神病薬を内服している者」に「悪性腫瘍に罹患していない者」を加えたため、対象数が減少したことである。悪性腫瘍は栄養状態に大きな影響を及ぼすことから対象から除外した。しかしCOPD患者は高齢男性が多く、肺がんをはじめ食道がんや前立腺がんなど様々な悪性腫瘍に罹患している者が含まれており、調査対象が減少したことが遅れの理由である。あと1つは、食事分析を依頼した企業の都合により契約が遅れ、12月に契約の運びとなった。
座り過ぎの健康影響および決定要因の解明

本年度は、平成2629年度までの研究に引き続き、長時間の座位行動(座りすぎ)の健康影響と決定要因の解明ならびに健康障害を引き起こす座位行動パターンの特定、さらには座位行動の決定要因を解明するための縦断的調査・測定を継続実施するとともに、得られたデータを用いて分析を進めた。40歳以上の大学同窓生を対象にした大規模コホート研究参加者のうち、座位行動評価のための加速度計測定、質問紙調査(領域別座位行動等)、健康アウトカム評価のための血液検査(HD LおよびLDLコレステロール、中性脂肪、C反応性蛋白、空腹時インスリン濃度、HOMA-IR等)および体力・運動機能測定(握力、歩行速度、TUG、膝進展筋力、筋肉量(BIA法)、慢性疼痛等)に加えて、決定要因(人口統計学的要因、心理的要因、社会的要因、環境的要因等)の評価を行うためのweb調査データを用いて分析を行った。特に、建造環境については地理情報システム(GIS)やWalkscoreを用いた解析を行い、座位行動パターンとの関連について詳細な検討を行った。血液検査および一部の体力・運動能力測定については、対象者が可能な限り自宅に近い場所で検査・測定に参加できるように、これまで同様、全国規模で検診事業を展開している公益財団法人パブリックヘルスリサーチセンターの協力を得て実施した。5年間のまとめとして、座り過ぎの是正を促す効果的な取り組みを進めるための指針の作成に向けて、これまでの横断的・縦断的に検討した健康障害を引き起こす座位行動の特定および座位行動の決定要因について整理を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、長時間の座位行動(座り過ぎ)の健康影響および決定要因を、質の高い研究手法に基づいて網羅的に解明することを目的としている。初年度である平成26年度は、座位行動の健康影響および決定要因を解明する横断的研究のための調査を開始した。具体的には、平成25年度から進めている大学同窓生を対象にした大規模コホート研究参加者に対して募集し、本研究の調査への参加に同意した中高齢者を対象に、順次、調査および測定を開始した。加速度計と調査票を組み合わせた場面ごとの座位行動データを用いることで、各中間健康アウトカムに影響を及ぼす座位行動の時間やパターンだけでなく座位行動がどのような要因によって定常化するのかを解明する。そのため、以下の手続きにて対象者に対し、調査を実施している。座位行動評価のための加速度計測定は郵送調査にて実施し、質問紙調査(ドメイン別座位行動、GPAQ等、心理的要因、社会的要因、環境的要因、人口統計学的要因等)は、Webシステムにて調査を行った。来所調査では、中間健康アウトカム評価のための血液検査(HDLおよびLDLコレステロール、中性脂肪、C反応性蛋白、空腹時インスリン濃度、HOMA-IR等)および体力・運動機能測定(握力、歩行速度、椅子立ち座りテスト、開眼・閉眼片足立ちテスト、TUG、膝伸展筋力、筋肉量、ADL・IADL、腰痛、膝痛、頸部痛等)を行った。なお、本調査・測定は、平成27年度9月までを予定している。2年目である平成27年度は、26年度に引き続き大学同窓生を対象にした前向きコホート研究へ参加した中高齢者を対象に、順次、座位行動の健康影響および決定要因を解明するための調査や測定を実施した。具体的には、座位行動評価のための加速度計調査は郵送調査にて実施し、質問紙調査(ドメイン別座位行動、GPAQ等、心理的要因、社会的要因、環境的要因、人口統計学的要因等)はWebシステムにて行った。その上で、中間アウトカム評価のための血液検査(HDL/LDLコレステロール、中性脂肪、C反応性蛋白、空腹時インスリン濃度、HOMA-IR等)および体力・運動機能測定(握力、歩行速度、椅子立ち座りテスト、開眼・閉眼片足立ちテスト、TUG、膝伸展筋力、ADL・IADL、腰痛、膝痛、頸部痛等)を来所してもらい調査した。また、収集したデータを基に客観的・主観的に評価した座位行動の場面・時間・パターンと各中間健康アウトカム(生理・生化学的指標・心理行動的指標)の関連、各座位行動指標と人口統計学的要因、心理的要因、社会的要因、環境的要因との関連について検討を行っている。なお、網羅的に検討をするために、ロジスティック回帰分析を中心とした多変量解析(身体活動量等を調整)を用いて解析を進めている。なお、初回調査・測定への対象者に対しては、脱落を防ぐために、対象者が研究参加への動機付けを維持できるよう調査・測定データのフィードバックや、Webシステムによる健康に関するニュースレターを配信を行っている。当初の予定通り、対象者の募集および調査・測定、データ解析を行っている。3年目である平成28年度は、平成26・27年度に引き続き、大学同窓生を対象にした前向きコホート研究へ参加登録した中高齢者を対象に、順次座位行動の健康影響および決定要因を解明するための横断調査・測定を実施した。

具体的な調査・測定項目は、座位行動については加速度計にて郵送法により実施し、質問紙調査(ドメイン別座位行動、GPAQ等、心理的要因、社会的要因、環境的要因、人口統計学的要因等)はwebシステムにて行った。その上で、中間アウトカム評価のための血液検査(HDL/LDLコレステロール、中性脂肪、C反応性蛋白、空腹時インスリン濃度、HOMA-IR等)および体力・運動機能測定(握力、歩行速度、椅子立ち座りテスト、開眼・閉眼片足立ちテスト、TUG、膝伸展筋力、ADL/IADL、腰痛、膝痛、頚部痛等)を来所してもらい調査した。また、縦断的な検討として、初回調査・測定に参加した対象者に初回同様の内容による調査・測定を行った。横断的研究の解析として、座位行動と中間アウトカムおよび決定要因との関連をロジスティック解析を中心とした多変量解析(身体活動量等を調整)を用いることにより網羅的に解析を進めている。なお、初回調査・測定の対象者に対しては、脱落を防ぐために、対象者が研究参加への動機付けを維持できるよう調査・測定データのフィードバックやwebシステムによる健康に関するニューズレターの配信を行っている。当初の予定通り、対象者の募集および調査・測定、データ解析を行っている。本研究では、長時間の座位行動(座り過ぎ)の健康影響および決定要因を、質の高い研究手法に基づいて網羅的に解明することを目的としている。4年目である平成29年度は、長時間の座位行動(座り過ぎ)の健康影響と決定要因を解明するための横断的研究および健康障害を引き起こす座位行動パターンの特定およびその座位行動の決定要因を解明するための縦断的調査・測定を昨年度より引き続き実施した。まず、横断的研究に関しては平成25年度から参加している対象者のうち座位行動評価のための加速度計測定、質問紙調査(場面別座位行動等)、中間アウトカム評価のための血液検査(HDL/LDLコレステロール、中性脂肪、C反応性蛋白、空腹時インスリン濃度、HOMA-IR等)および体力・運動機能測定(握力、歩行速度、TUG、膝伸展筋力等)に加えて、決定要因(人口統計学的要因、心理的要因、社会的要因、環境的要因等)の評価を行うためのweb調査データを用いて解析を引き続き行った。特に、構築環境について地理情報システム(GIS)を用いた解析を行い、座位行動パターンとの関連について詳細な検討を進めている。また、縦断的研究については、引き続き初回調査・測定に参加した対象者に初回同様の内容による調査・測定を行った。具体的には、加速度計測定は郵送調査にて実施した。血液検査および一部の体力・運動能力測定については、可能な限り対象者の自宅に近い場所で検査・測定にて参加できるように、これまで同様、全国規模で検診事業を展開している公益財団法人パブリックヘルスリサーチセンターの協力を得て実施した。決定要因に関しては、従来度どおりweb調査により評価を行い、ロジスティック解析を中心とした多変量解析(身体活動量等を調整)を用いることにより網羅的に解析を進めている。本年度は、平成2629年度までの研究に引き続き、長時間の座位行動(座りすぎ)の健康影響と決定要因の解明ならびに健康障害を引き起こす座位行動パターンの特定、さらには座位行動の決定要因を解明するための縦断的調査・測定を継続実施するとともに、得られたデータを用いて分析を進めた。
末梢血への高線量照射後に誘発される接着性巨細胞を利用した放射線抵抗性の機構解析

X線照射した末梢血からリンパ球層を分離し、AIM-V/2%ヒト血清+r-IL2(100IU/ml)で2週間培養した。1.濃縮培養上清による放射線抵抗細胞の誘導作用:30Gy照射し前記条件で培養し、培養上清を20培濃縮した。0,10,20,30Gy照射リンパ球を4倍希釈濃縮培養液と前記培養液単独で培養し、接着性巨細胞の出現頻度を比較した。いずれの線量でも接着性細胞の誘導に有意差は認めなかった。2.BrdUを用いた細胞増殖測定:各照射線量のリンパ球を13日間培養後、BrdU 10mmol/lを加え24時間培養した。浮遊細胞と接着細胞を別のプレートに移し、それぞれ洗浄後0.5mmol/l HCl/70%エタノールで固定した。ヌクレアーゼ溶液を加え37°Cで30分保温し、ペルオキシダーゼ標識抗BrdU抗体(200mU/ml)で反応させた後、基質液(ABTS)を加え発色させた。リーダーにより吸光度を測定した(490nm対象で405nmを測定)。浮遊細胞の吸光度は非照射を基準にして10,20,30Gyでそれぞれ0.5±0.04,0.2±0.02,0.08±0.04であった。一方、接着性細胞では非照射及び照射群でも明らかな吸光度の変化は認めなかった。3.MTT法による蛋白合成能の測定:リンパ球を13日間培養した後にMTT溶液(5mg/ml)を加え4時間培養した。上清と浮遊細胞を除き、HCl(0.04N)/isopropanolで溶解させ、吸光度を測定した(630nm対象で570nmを測定)。非照射では明らかな吸光度の変化は認めず、10,20,30Gy照射群でも0.023±0.013,0.031±0.011,0.027±0.015で明らかな傾向は認めなかった。結論:接着性巨細胞は線量増加に従って増加するが、細胞数が少なく上記のBrdU法、およびMTT法で明らかな結果が得られなかった。放射線抵抗性を獲得した接着性巨細胞を分離し、細胞生物学的特徴を同定する。1.フローサイトメータによる細胞表面マーカーの解析:回収した細胞を24×10^6/mlに希釈した。分注した細胞にPE標識anti-CD3抗体(抗T),FTTC標識anti-CD13,14抗体(抗B),FITC標識anti-CD19抗体(抗単球/マクロファージ)を用いて蛍光染色してFACSで解析した。浮遊細胞は照射に伴いCD3陽性のT細胞が増加し、B細胞や単球/macrophageはほとんど認めなかったが、接着性細胞は逆に、CD3陽性細胞は減少し、単球/macrophageが増加した。B細胞は変化しなかった。2.光学顕微鏡による観察:培養後の浮遊細胞ならびに接着性巨細胞を別々に回収し、スメア標本を作製した。標本をanti-CD68抗体(抗ヒトマクロファージ)およびanti-LCA抗体(抗ヒトリンパ球共通抗原)を利用し、酵素抗体法で染色し、個々の細胞の由来を観察した。接着性巨細胞はanti-LCA抗体で染色されたが、anti-LCAでは染色されなかった。浮遊細胞は逆の結果であった。4.サイトカインの誘導:接着性巨細胞の誘導に対し、培養液中のIL-1β濃度を経時的に測定したが、検出限界以下であった。3.染色体解析:照射後に誘導された接着性巨細胞にカリクリンA(100 nmol)を加えた後、低張処理後に固定した。この処理で分裂能のあるリンパ球では染色体標本が得られるが、接着性巨細胞では染色体標本を得られなかった。以上より、高線量照射後に誘導された接着性巨細胞は単球/マクロファージ系であり、分裂能が極めて乏しいことが放射線抵抗性に関係していると考えられる。

3.MTT法による蛋白合成能の測定:リンパ球を13日間培養した後にMTT溶液(5mg/ml)を加え4時間培養した。上清と浮遊細胞を除き、HCl(0.04N)/isopropanolで溶解させ、吸光度を測定した(630nm対象で570nmを測定)。非照射では明らかな吸光度の変化は認めず、10,20,30Gy照射群でも0.023±0.013,0.031±0.011,0.027±0.015で明らかな傾向は認めなかった。結論:接着性巨細胞は線量増加に従って増加するが、細胞数が少なく上記のBrdU法、およびMTT法で明らかな結果が得られなかった。
腔腸動物ペプチドニューロンにおけるシナプス伝達の情報処理・貯蔵機構の解析

動物界で最も原始的な神経系を有すると考えられている腔腸動物のヒドラにおいてはコリン作動性ニューロンやアミン作動性ニューロンは見いだされず、すべてがペプチドニューロンであるという研究報告から、腔腸動物はペプチドニューロンの宝庫であり、また,ペプチドニューロンが脊椎動物脳内の各種ニューロンの起源である可能性もある。本研究計画では、このような特徴を持つ腔腸動物を材料として申請者らが用いてきた最先端技術を用い、ペプチドニューロンの根元的な機能について、特に、少数ニューロンからなる微小脳において情報処理・貯蔵の基礎過程を構成しているシナプス伝達とその可塑性に注目して解明することを目的とした。シナプス前後両部の同時記録及び分子生理学的手法の応用ができるクラゲの双方向性シナプスを用いて、特に、ニューロンの異なる部位において脊椎動物中枢神経系に見られるような速い神経伝達と、ペプチド分泌に見られるような遅い開口放出による神経修飾が使い分けられているかどうかに注目して、シナプス伝達メカニズムを電気生理学的・分子生理学的に解析するため,まず実験系を模索するところから開始した。最初に,日本産ユウレイクラゲ(Cyanea nozakii)およびミズクラゲ(Aurelia aurita)を用い,福岡女子大学小泉博士より提供された5種のヒドラ神経ペプチドに対する抗体を用いて免疫組織化学を行った。その結果,ヒドラのRFamide peptidefamilyに対する抗体RIV#2に対して免疫陽性なペプチドニューロンが両種において主にsubumbrellaの組織中に見いだされた。そこで,これらのニューロンからの電気生理学的記録を行うためのプレパレーションの開発を行った。上皮を取り除く処理をした標本を作製したところ何種かの神経細胞が露出できたので,それらからのパッチクランプ記録を行った。また,コラゲナーゼ処理により解離細胞を作成し,それらから神経回路網を再形成させて電気生理学的記録を行う試みも開始している。
高齢社会に対応したホームページのバリアフリー化に関する研究

高齢者特有の機能特性の変化、特に視覚機能の変容を考慮したホームページのデザインに関する実験の結果、文字サイズに関しては、輝度比がどんな場合であってもfont size=3(12pt)はほとんど読めるということが明らかになった。文字色と背景色の組み合わせに関しては、輝度比が4:1以上の陽画表示で背景色の明度が高く、文字色の明度が低い組み合わせが読みやすく、好ましいという結果を得た。また、陽画表示で輝度比3:1以下のもの、陰画表示のもの、背景色と文字色が同系色の組み合わせは望ましくないとの結果を得た。若年者層と比較をしたところ、読みやすさについては若年者層の方が「読みやすい」と答えており、その差が大きいものは輝度比が小さくなるにつれて多く見られた。好ましさについて差が大きいものを見た場合、陽画表示でコントラストの高い組み合わせにおいて若年者層より高齢者の評価が高いことより、高齢者はコントラストの影響をより多く受ける傾向が認められた。これらの結果より、全ての人にとって望ましい配色は、輝度比8:1以上の陽画表示で背景色がうすく文字色は紺か黒の組み合わせであること。逆に望ましくない組み合わせは輝度比8:1以下の陽画表示の組み合わせ、陰画表示、背景色と文字色が同系色のものであることが明らかになった。次に、アイコンデザインに関する分かりやすさの実験を行った。その結果、対象アイコンや状態アイコンは、年齢が高くなるにつれて正答率が低くなる傾向があった。特に年齢が高いほど、アイコンの意味をとらえることも難しくなる傾向が認められた。ISO(国際標準化機構)によるインタフェイスのユーザビリティからは6割以上の正答率の確保が要求されることを考えると、何らかの改善の必要性が認められた。高齢者を対象としたホームページのバリアフリー化に関わる基礎実験として,1)ホームページデザインにおけるフレーム構造と階層構造の問題、2)提示文字の大きさ,文字色と背景色との配色の問題を分析した.その結果,フレーム構造でないほうが高齢者には使いやすく,階層構造も画面あたりの項目数が極端に多くないのであれば極力階層を減らすほうが良く、64項目程度までなら2階層メニューがもっとも検索効率が良いとの結論を得た.文字色と背景色の組み合わせに関しては,公共のホームページ105サイトを調査し,その中で良く使われていた背景色と文字色,「Lalomia&Happ(1987)の研究で明かにされていた色の組み合わせを用いて予備実験を行い,好ましいと評価された65パターンを用いて実験を行った.その結果,「青,緑,水色系統の色を組み合わせて使用しない」「同系色の組み合わせは避ける」「陰画表示より陽画表示が望ましい」という結論を得た.又,文字サイズと画面の明るさ指標としての輝度比との関係を分析した結果,健常者が省略時の設定であるフォントサイズ3で問題なく読める場合であっても,背景と文字の輝度比が5対1より低い場合には,文字サイズをフォントサイズ6以上に設定したほうが望ましく、白内障視覚障害など高齢者特有の視覚障害がある場合には,日本工業規格にある輝度比3対1以上ではなく,5対1以上にし,文字サイズもフォントサイズ5以上にするほうが望ましいことが示された.高齢者を対象としたホームページのデザインに関する実験の結果、文字サイズに関しては、輝度比がどんな場合であってもfont size=3(12pt)はほとんど読めるということが明らかになった。また、陽画表示で輝度比3:1以下のもの、陰画表示のもの、背景色と文字色が同系色の組み合わせは、望ましくないようである。

若年者層と比較をしたところ、読みやすさについては若年者層の方が「読みやすい」と答えており、その差が大きいものは輝度比が小さくなるにつれて多く見られた。好ましさについて差が大きいものを見た場合、陽画表示でコントラストの高い組み合わせにおいて若年者層より高齢者の評価が高いことより、高齢者はコントラストの影響をより多く受ける傾向が認められた。これらの結果より、全ての人にとって望ましい配色は、輝度比8:1以上の陽画表示で背景色がうすく文字色は紺か黒の組み合わせであること。逆に望ましくない組み合わせは輝度比3:1以下の陽画表示の組み合わせ、陰画表示、背景色と文字色が同系色のものであることが明らかになった。次に、アイコンデザインに関する分かりやすさの実験を行った。その結果、対象アイコンや状態アイコンは、年齢が高くなるにつれて正答率が低くなる傾向があった。特に年齢が高いほど、アイコンの意味をとらえることも難しくなる傾向が認められた。ISO(国際標準化機構)によるインタフェイスのユーザビリティからは6割以上の正答率の確保が要求されることを考えると、何らかの改善の必要性が認められた。
感情病におけるナトリウム(Na)-カリウム(K)共輸送機構について

感情障害に於ける細胞膜異常仮設が言われており、申請者はその観点からヒト赤血球膜を使って、感情障害に於ける陽イオン輸送機構の一つであるナトリウム(Na)-カリウム(K)共輸送機構について検討した。慈恵医大外来及び入院中の感情障害者78例(単極性うつ病者44例、双極性うつ病者34例)、健常ボランティア44例、精神分裂病者26例、神経症者7例、計155例に、実験の目的ならびに方法を十分に説明し、同意を得た上で採血を行った。感情障害者のLPG値[実験にはリチウムを使い、リチウムがこのナトリウム(Na)-カリウム(K)共輸送機構によって輸送される量(ミリモルバリットルバアワ-:mM/Lhrで表す。)をLPC値とした。]では、0.097±0.009mM/Lhr(以下単位略)、そのうち単極性うつ病者では0.095±0.014、双極性うつ病者では0.101±0.008であった。一方、健常ボランティアでは0.130±0.010、精神分裂病者では0.118±0.010であった。単極性及び双極性うつ病者のLPC値は健常ボランティア、精神分裂病者、神経症者のいずれのLPC値に対しても有意に低値を示していた。一方、精神分裂病者及び神経症者のLPC値は健常ボランティアと有意な差はなかった。単極性及び双極性うつ病者に於ける病相関比較では、いずれの病相も健常ボランティアのLPC値に比し有意に低値を示した。また、健常ボランティアのLPC値は現在年齢、初発年齢、Hamiton's scoreとの相関は認められなかった。以上より、感情障害に於けるナトリウム(Na)-カリウム(K)共輸送機構の機能低下が推測された。しかし、男女間による問題が残されている。男性の単極性及び双極性うつ病者のLPC値は健常ボランティアに比し有意に低値を示したものの、女性に於いては有意な差はなかった。推測としてナトリウム周期と月経周期との関連性も考えられるが、今後男女間によるLPC値の差について検討していく必要がある。)をLPC値とした。
細胞老化を克服した軟骨細胞分化誘導／維持メカニズムの解析

主要細胞老化因子の1つのp53の2つのisoform(p53 βとΔ133p53)の間葉系幹細胞老化と軟骨細胞への分化制御機構を解明する目的で、ヒト間葉系幹細胞老化でのisoform発現パターンと軟骨細胞への分化誘導能の違い、若い幹細胞にp53 βを過剰発現または老化幹細胞にΔ133p53を過剰発現させ老化の誘導と阻害を引き起こすか、さらに軟骨細胞分化誘導能の分子機構を解析した結果、Δ133p53の発現は若い幹細胞で発現が高く老化すると発現減少が認められ、老化細胞にΔ133p53を過剰発現させると細胞寿命延長と軟骨細胞分化誘導能の亢進を認め、また特徴的な分子機構の存在を確認した。まず実験を開始するに当たり、研究用ヒト間葉系幹細胞を用いるため、京都大学3部合同倫理委員会への申請とヒト遺伝子解析実験の申請を行い、それぞれ承認を受けた。また、用いるヒト間葉系幹細胞のいくつかは、理化学研究所Cell Bankより供与を希望していたので、理化学研究所とのMTAの締結を行い、細胞を入手した。さらに、p53 isoformとp53のコンストラクト等の使用に関して、米国国立癌研究所とのMTA締結を行った。理研Cell Bankより入手した若年期、老年期それぞれの細胞提供者由来の間葉系幹細胞4種類(若年期2種類、老年期2種類)について、donor ageと細胞老化、p53、p53 isoformの発現プロファイルを解析するために培養を介さず細胞を保存した。また、一部は培養過程で生ずる細胞老化との関連性を見るため、7ヶ月間lifespan assayを行い、各time point毎に細胞を回収している。また、市販の研究用ヒト間葉系幹細胞2株(2株とも若年期細胞提供者からのもの)を入手、培養過程で生ずる細胞老化がヒト間葉系幹細胞でも観察されるか、p53 isoformsの発現プロファイルは見られるかを目的に、lifespan assayを行い、各time point毎に細胞を回収している。さらにヒト正常線維芽細胞で見られた細胞増殖、細胞老化関連の現象が認められるかを目的に、full-length p53、p53 isoforms (p53 beta、delta133p53)をヒト間葉系幹細胞に導入した。Delta133p53については、仮説どおりに細胞増殖の亢進が認められ、細胞老化への影響を現在解析中である。Full-length p53、p53 betaの過剰発現は、ヒト正常線維芽細胞での効果と異なる可能性が出てきており、これを詳細に解析する予定である。昨年度、理研Cell Bankより入手した若年期、老年期の健常者から提供された4種類のヒト骨髄由来間葉系幹細胞(若年期2種、老年期2種)間のdonor ageのp53、p53 isoforms (p53beta、delta133p53)の発現に与える影響を調べた。これまでのヒト正常T細胞で得られた結果と同様に、donor ageが高いサンプルではp53、p53betaのタンパク質発現が高く、delta133p53のタンパク質発現は低下していた。さらに、これらの4種の間葉系幹細胞を長期培養し、lifespan assayを行った。同じ細胞における培養開始時のサンプルと細胞老化に至ったサンプルとの比較では、これまでのヒト正常線維芽細胞における結果と同様に、delta133p53のタンパク質発現が細胞老化サンプルで非常に低下していた。しかし、ヒト正常線維芽細胞とは異なり、p53とp53betaの発現は細胞老化では上昇しておらず、変化無しあるいは低下していた。同様のlifespan assayをLONZA社から入手したヒト骨髄由来間葉系幹細胞2種においても行い、同様の結果を得た。またこの培養による細胞老化の誘導前後の間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導させたところ、老化間葉系幹細胞は軟骨細胞に分化しにくいことが軟骨細胞マーカーの発現チェックにより明らかになった、さらに間葉系幹細胞老化におけるp53、p53 isoformsの役割を明らかにするため、培養初期の細胞あるいは細胞老化に近い状態の細胞にp53、p53beta、delta133p53を過剰発現させた。ヒト正常線維芽細胞の結果と同様に、老化状態に近い細胞にdelta133p53を過剰発現させるとlifespanの延長が認められた。しかし、培養初期の初期の細胞にp53あるいはp53betaを過剰発現させると、ヒト正常線維芽細胞の場合と異なり細胞老化を引き起こさず、細胞死が誘導されることを認めた。また、これらのサンプルのメタボロムを網羅的に測定し、現在その解析を進めている。昨年度、培養初期の間葉系幹細胞にp53、p53betaを過剰発現すると、これまでの種々の体細胞で得られていた結果と異なり、細胞老化を引き起こさず細胞死を誘導することが判明した。そこで今年度からはdelta133p53に集中して解析することにした。培養開始間もなくの間葉系幹細胞、老化状態に近い間葉系幹細胞にdelta133p53を過剰発現させ、軟骨細胞に分化誘導し経時的にサンプリング後、軟骨細胞分化マーカーの発現をそれぞれのコントロール細胞と比較検討した。現在、これらのサンプルのRNA-Seqを計画中である。初年度のマテリアル入手のための申請等に時間がかかり、実際の実験開始がH26年度からになったため。継代培養を繰り返して細胞老化に近い(=senescent)ヒト間葉系幹細胞と培養回数が少ない(=young)

間葉系幹細胞をそれぞれ軟骨細胞に分化誘導し、その過程でサンプリングを行い、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現を解析した。同様に、senescent間葉系幹細胞にdelta133p53を過剰発現あるいはコントロールベクターを導入し、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現を解析したところ、コントロールベクターを導入細胞は、軟骨細胞にうまく分化できなく、マーカー遺伝子発現も認められなったが、delta133p53を過剰発現細胞は、young間葉系幹細胞と同様に軟骨細胞に分化し、軟骨細胞マーカー遺伝子発現も確認された。このことから、予想通りにdelta133p53を過剰発現すると細胞の若返りが起こり、軟骨細胞に分化することができると示唆される。さらに、young、senescent間葉系幹細胞、young間葉系幹細胞にp53 betaを過剰発現あるいはコントロールベクターを導入、senescent間葉系幹細胞にdelta133p53を過剰発現あるいはコントロールベクターを導入、のサンプルでメタボローム解析を行ったところ、p53 betaを過剰発現させたyoung細胞はsenescent細胞に近いこと、また、delta133p53過剰発現細胞は特異的なメタボロームの存在があることがわかった。また、これらのサンプルを用いてRNA-Seq解析を行い、現在詳細な解析を行っているところである。主要細胞老化因子の1つのp53の2つのisoform(p53 βとΔ133p53)の間葉系幹細胞老化と軟骨細胞への分化制御機構を解明する目的で、ヒト間葉系幹細胞老化でのisoform発現パターンと軟骨細胞への分化誘導能の違い、若い幹細胞にp53 βを過剰発現または老化幹細胞にΔ133p53を過剰発現させ老化の誘導と阻害を引き起こすか、さらに軟骨細胞分化誘導能の分子機構を解析した結果、Δ133p53の発現は若い幹細胞で発現が高く老化すると発現減少が認められ、老化細胞にΔ133p53を過剰発現させると細胞寿命延長と軟骨細胞分化誘導能の亢進を認め、また特徴的な分子機構の存在を確認した。昨年度のマテリアル入手のための申請に時間がかかったことから、実際の実験の開始が今年度からになったため。しかし、開始後は順調に進捗している。細胞老化状態に近い間葉系幹細胞にdelta133p53を過剰発現させた後、軟骨細胞に分化誘導させ経時的にサンプリングし、軟骨細胞分化マーカーの発現チェックをコントロールとの比較で行う。さらに、非老化間葉系幹細胞、老化幹細胞、それぞれにdelta133p53を過剰発現させた間葉系幹細胞、さらにそれらから各々分化誘導した軟骨細胞のRNA-Seqを行い、delta133p53、p53と軟骨分化誘導と細胞老化との関連性を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子細胞生物学p53とp53betaを間葉系幹細胞に過剰発現させると細胞死を引き起こすので、今後は1)細胞老化状態に近い細胞にdelta133p53過剰発現させ、老化幹細胞とdelta133p53による老化が緩和した細胞で、軟骨細胞分化誘導にどのような影響があるか、2)誘導発現型ベクターを用いて間葉系幹細胞から軟骨細胞分化誘導過程で、p53、p53 isoformsを発現させ、軟骨細胞分化過程での影響を軟骨細胞マーカー分子の発現を中心に解析する予定である。
糖類により多重修飾された層状粘土鉱物による不斉選択的触媒反応

1.研究目的本研究では、(1)光学不斉を持つアミノ糖ホスファイト誘導体を合成し、これを配位子として[Rh(COD)Cl]_2と反応させ、新規ロジウム-キトサン錯体(Rh-Chito)を合成する。(2)得られたRh-Chitoを粘土鉱物層間にインターカレートさせた無機・有機ホストーゲスト錯体(Rh-Chito^+/NaHT)を合成する。(3)さらに、層間固定化錯体を触媒として用いて不飽和化合物の水素化反応を行い、不斉選択性および官能基選択性などの分子認識機能を調べる。2.研究成果(1)アミノ糖ホスファイト誘導体およびRh錯体の合成合成:アミノ糖としてキトサン(分子量2.6-2.9x10^3)を用いた。これをフタルイミド化し、ClPPh_2と反応させキトサンホスファイト(Chito-OP)を合成し、さらにRh-Chitoを合成した。構造解析により、Rh錯体はグルコース単位当たり1分子が2個の-PPh_2基によりキレート配位していると結論した。(2)ヘクトライト(HT)層間固定化錯体の合成:Rh-ChitoのHT層間へのインターカレーションは、水/DMF混合溶媒を用いることにより成功した。坦持量が34.6meq/100g-HTのとき、HTの底面間隔(d_<001>)は、2.02nmとなり、キトサン分子鎖はHT層間で2/1らせん構造を取っているものと結論した。(3)イタコン酸ジメチルの不斉水素化反応:均一系のRh-Chitoと比べて、反応速度は80%程度に低下し、主生成物は(R)-メチルコハク酸ジメチルであった。不斉選択性は、反応溶媒に大きく依存しEtOH/DMF混合溶媒を用いた場合、DMFの割合を減少すると選択性が著しく向上した。すなわち、EtOH/DMF=1で7.7%e.e.がEtOH/DMF=30で16.7%e.e.となった。このように、ロジウム-キトサン錯体を層間に固定化することにより、錯体の立体構造を制御して選択性を向上させることに成功した。(5)シトロネラールの水素化:疎水性のホスフィン基を持つ[Rh(PPh_3)_2(COD)]PF_6とRh-Chitoとの反応挙動を比較したところ、Rh-ChitoはC=CよりC=Oをより優先的に水素化することを発見した。以上の成果より、層間で糖分子鎖の立体構造を制御し不斉選択性を向上させることができた。また、従来の疎水性ホスフィンとことなり、C=O水素化に活性があることから種々のケトンを基質に用いた不斉水素化反応に展開できると思われる。

また、従来の疎水性ホスフィンとことなり、C=O水素化に活性があることから種々のケトンを基質に用いた不斉水素化反応に展開できると思われる。1.研究目的本研究では,(1)光学不斉を持つホスフィン化糖誘導体を合成し,これを粘土鉱物層間にインターカレートさせた無機・有機ホストーゲスト化合物を合成する.(2)さらに金属イオンあるいは金属錯体を粘土鉱物層間にインターカレートすることにより,新規層間固定化糖錯体を合成する.(3)層間固定化糖錯体を用い,α,β-不飽和カルボン酸誘導体等の不斉水素化反応に対する触媒挙動を調べる.出発物質のキトサンは,(1)ルイス塩基のアミノ基を有するため,粘土鉱物層間にインターカレートし易いこと,(2)天然より安価に入手可能である,(3)不斉炭素を持ちヘリックスなどの高次構造も形成可能であるなどの理由から選択した.2.実験および結果(1)キトサンホスフィン誘導体の合成.キトキンの水酸基にNaPPh_2を直接反応させキトサンフォスファイト(chito-OP),有機溶媒に高溶解性のN-フタロイル化キトサンを合成し,水酸基をトシル化後,NaPPh_2で反応させたキトサンホスフィン(N-pht-chito-P)を合成した.(2)キトサン-ロジウム錯体の合成chito-OPにRh(COD)ClO_4を反応させて,キトサン-ロジウム錯体([Rh(chito-OP)(COD)]ClO_4)を合成した.元素分析,FT-IRで構造解析を行った.(3)層間固定化触媒の合成[Rh(chito-OP)(COD)]ClO_4をDMF/水混合溶媒中でNa^+-ヘクトライト(NaHT)と反応さ,カチオン交換法によりHT層間にインターカレートさせた([Rh(chito-OP)(COD)]^+/HT).XRD測定により,HTの底面間隔は2.02nmに拡大し,一分子層のRh錯体が層間に形成されていると考えられる.(4)層間固定化錯体を触媒として用い,イタコン酸ジブチルを室温,水素1気圧下,DMF中で反応させたところ,100%基質を消費したところで(R)-メチルコハク酸ジブチルが5-10%e.e.の選択率で得られた.さらに,種々の反応条件を検討して予定である.1.研究目的本研究では、(1)光学不斉を持つアミノ糖ホスファイト誘導体を合成し、これを配位子として[Rh(COD)C1]_2と反応させ、新規ロジウム-キトサン錯体(Rh-Chito)を合成する。(2)得られたRh-Chitoを粘土鉱物層間にインターカレートさせた無機・有機ホストーゲスト錯体(Rh-Chito^+/NaHT)を合成する。(3)さらに、層間固定化錯体を触媒として用いて不飽和化合物の水素化反応を行い、不斉選択性および官能基選択性などの分子認識機能を調べる。2.研究成果(1)アミノ糖ホスファイト誘導体およびRh錯体の合成合成:アミノ糖としてキトサン(分子量2.6-2.9x10^3)を用いた。これをフタルイミド化し、C1PPh_2と反応させキトサンホスファイト(Chito-OP)を合成し、さらにRh-Chitoを合成した。構造解析により、Rh錯体はグルコース単位当たり1分子が2個のPPh_2基によりキレート配位していると結論した。(2)ヘクトライト(HT)層間固定化錯体の合成:Rh-ChitoのHT層間へのインターカレーションは、水/DMF混合溶媒を用いることにより成功した。担持量が34.6meq/100g-HTのとき、HTの底面間隔(d_<001>)は、2.02nmとなり、キトサン分子鎖はHT層間で2/1らせん構造を取っているものと結論した。(3)イタコン酸ジメチルの不斉水素化反応:均一系のRh-Chitoと比べて、反応速度は80%程度に低下し、主生成物は(R)-メチルコハク酸ジメチルであった。