hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動と積極的栄養摂取のコンビネーションによる筋萎縮対抗策の開発

本研究では、運動と栄養摂取を用いた筋萎縮対抗策の開発を目的とした。萎縮筋に対する一週間の運動は筋萎縮回復促進効果があり、筋線維あたりの筋核数が増えた。増殖核は筋細胞膜の外にあり、外来細胞の増殖が示唆された。また、運動と栄養の筋萎縮抑制メカニズム解明のため、骨格筋培養細胞を用い、電気刺激停止による廃用性筋萎縮モデルを作成した。この筋萎縮モデルで、筋収縮停止早期で、タンパク質合成と分解の両方が高まっており、タンパク質分解によるアミノ酸がタンパク質合成を高めている可能性があることがわかった。筋の萎縮に対する対抗策として代表的なものに、運動と栄養摂取がある。本研究では、運動と積極的な栄養摂取を用いた筋萎縮対抗策を開発する。今年度は、運動による筋萎縮回復過程とそのメカニズムを検討した。ICR雄性マウス(9週齢)を対象とし、1週間の尾部懸垂によって後肢筋を萎縮させた後、オペラント学習法を用いた立ち上がり運動を、1セット25回を4セット、1日1回行った。1週間の立ち上がり運動で、ヒラメ筋において筋萎縮回復促進効果が見られ、また、筋線維あたりの筋核数が同週令のマウスと比べ有意に多くなっていることがわかった。運動による萎縮筋筋核の増加時期を詳細に調べると、運動48時間で増加していた。また、増殖する核の局在を組織学的に調べたところ、増殖核は筋細胞膜の外にあることがわかり、外来の細胞核が増殖し、そのあと既存の筋細胞に融合することによって筋核の増加が起こっていることが示唆された。この研究により、筋萎縮に対する運動の回復効果のメカニズムの一端を示したと考えている。これらの成果から、萎縮筋に対する効果的な運動の条件(量、種類、時期、期間など)を検討する予定である。また、筋萎縮からの回復を機能的に評価するため、小動物用筋力測定装置を開発し、測定値の再現性が高いことを示した。この筋力測定装置の開発によって、筋萎縮からの回復を、組織的に評価するだけでなく、機能的な筋力で評価できるようになった。本研究では、運動と栄養摂取を用いた筋萎縮対抗策を開発することを目的とした。運動による筋萎縮回復過程とそのメカニズムを検討した。マウスを対象とし、尾部懸垂によって後肢筋を萎縮させた後、オペラント学習法を用いた立ち上がり運動を1週間行うと、ヒラメ筋において筋萎縮回復促進効果が見られ、筋線維あたりの筋核数が有意に多かった。さらに、運動による萎縮筋の筋核の増殖は、運動開始後48時間で増加しており、増殖核は筋細胞膜外にあることがわかった。運動すると、まず外来の細胞核が増殖し、そのあと既存の筋細胞に融合することによって筋核の増加が起こっていることが示唆された。また、筋萎縮からの回復を機能的に評価するための小動物用筋力測定装置を開発し、測定値の再現性が高いことを示した。この装置を用いて、萎縮筋において、運動強度(筋収縮強度)による筋損傷と筋力回復の関係を検討している。当初の計画では、動物実験で運動と栄養の筋萎縮抑制効果を検討する予定であったが、栄養摂取を制御するとトータルの食事量が減少し、筋萎縮からの回復が妨げられたので、計画を繰り上げて、運動と栄養の筋萎縮抑制メカニズム解明のための培養実験を行った。まず、骨格筋培養細胞を用い、電気刺激(筋収縮)停止による廃用性筋萎縮モデルを作成した。電気刺激停止48時間後、タンパク質の分解機構として知られているユビキチンプロテアソーム系とオートファジーリソソーム系が活性化していた。電気刺激停止1時間後では、タンパク質合成と分解の両方が高まっていることがわかり、タンパク質分解によるアミノ酸が、タンパク質合成を高めている可能性が示唆された。本研究では、筋萎縮への対抗策として、効果的な運動と栄養摂取のコンビネーションを明らかにし、運動と積極的な栄養摂取を用いた筋萎縮対抗策を開発する。まずは、運動による筋萎縮回復過程を検討した。ICR雄性マウス(9週齢)を対象とし、実験前に、オペラント学習法を用いて、立ち上がり運動を1週間練習した。この運動学習を行った後、1週間の尾部懸垂によって後肢筋を萎縮させ、その後、立ち上がり運動を、1セット25回を4セット、一日1回、1週間行った。立ち上がり運動後、ヒラメ筋を摘出し、組織学的評価として、筋線維断面積、筋核を測定した。その結果、後肢筋を一週間尾部懸垂によって萎縮させると、筋線維断面積、核数は減少するが、その後、一週間立ち上がり運動すると、運動せず普通に飼育した群と比べ、筋線維断面積が有意に大きく、運動による筋萎縮回復促進効果が見られ、また、筋線維あたりの筋核数が有意に多いことがわかった。

これは運動によって筋萎縮から回復していく際、筋核が増えることを示唆している。次に、これらの結果を踏まえて、異なった摂食タイミングが運動による萎縮回復効果を高めるかどうかを検討した。1回1時間、一日2回の食事に制限し、そのうち1回の食事を立ち上がり運動の前と4時間後に与え、筋萎縮からの回復を比べた。しかし、1回1時間、一日2回という食事制限をするためマウスの体重が増えず、筋萎縮からの回復に影響を与えることがわかり、来年度以降の検討課題となった。動物実験で、運動と食事のタイミングを示す予定であったが、計画した方法では食事量が減少するため、運動による筋萎縮の回復過程が見られない。萎縮筋に対する運動効果のメカニズムの一端は、示すことができた。また、筋萎縮からの機能的な回復効果を評価するため、小動物用足関節筋力測定装置を製作し、測定の信頼性(再現性)を確認した。食事を一日2回にして、そのうち1回の食事の時間を、運動時間に合わせて設定し、運動による筋萎縮からの回復過程に効果的な摂食タイミングを示す計画だったが、計画した方法だと、一日に食べる食事量が減少するため、運動による筋萎縮の回復効果が見られないことがわかった。動物実験で、運動と栄養の効果を検討する計画であったが、計画した方法では筋萎縮からの回復が認められない。運動と栄養のタイミングを調べるための動物実験がうまく進まないので、培養実験を立ち上げることにする。骨格筋培養細胞により廃用性筋萎縮モデルを作成し、筋収縮(運動)と栄養摂取の効果を検討する。筋蛋白質の合成経路に、アミノ酸が関与することが既に知られているので、筋萎縮からの回復におけるアミノ酸投与の関与を明らかにした後、筋収縮(運動)との関連、細胞内メカニズムの解明へと発展する予定である。培養系に移行することで、細胞内メカニズムを解明がより期待できる。運動による筋萎縮回復効果やそのメカニズムに関する研究に関しては、運動による萎縮筋の筋核増加現象を軸に、さらに進める予定である。摂食方法を変更する。代替え案として、通常の食餌を与えながら、分岐鎖アミノ酸を、経口ゾンデにて、運動前と4時間後に投与する方法を検討する。筋萎縮回復過程を評価するために、今後、マウスの底屈筋力を測定するシステムを構築する。23年度は、組織学的に筋線維断面積と筋核数を測定したが、筋力が測定できるようになると、筋萎縮からの機能的な回復が明らかになる。また、萎縮筋に対して一週間の運動を行うと、筋線維あたりの筋核数が有意に増大することがわかった。この運動による筋核の増加が、どのような機序で起こるのかを解明する。これが解明されると、萎縮筋に対する運動効果のメカニズムにつながる可能性がある。申請した計画を一部変更する。運動による萎縮筋の筋核増加のメカニズムや運動条件をさらに検討するとともに、骨格筋培養細胞で萎縮モデルを作成し、筋収縮(運動)とアミノ酸投与の関係を検討する予定である。そのため、試薬・抗体にかかる経費を増やす。具体的には、直接経費の総額約130万のうち、実験動物・動物飼育用飼料・床敷きで20万、試薬・抗体で80万、ガラス器具で15万、旅費10万、その他5万を予定している。申請した計画を少し変更する。摂食方法の変更、萎縮からの機能的な回復効果をみる評価方法の追加、萎縮筋への運動による筋核増加の機序解明などを行う。
肺高血圧におけるVIPの機能解明と遺伝子治療への応用

重症肺高血圧症には根本的な治療法がない。神経伝達物質VIP,PACAPは肺循環、呼吸機能に関与するとされるが、詳細な機能は不明である。実験的肺高血圧モデルの肺、心臓組織ではVIP,PACAPが減少する一方、その受容体VPAC1,VPAC2,PAC1の発現は亢進していた。VIP,PACAP補充により肺高血圧が改善すると推測し、生体内でVIP、PACAPを産生させるプラスミドベクターを作製した。静脈内、腹腔内投与等による治療効果を検証する。原発性、二次性肺高血圧症による不可逆的な肺血管損傷は肺移植以外に根治療法はない。VIP等が次世代治療薬と期待されているが、肺循環における詳細な機能は不明である。本研究では肺高血圧症におけるVIPの機能、治療法への応用の検討のため以下の実験を行った・ラット肺高血圧モデル;モノクロタリン60mg/kg投与により作成。4週間後に右室圧/血圧比、右室/左室重量比より肺高血圧、右室肥大を来たしていることを確認した。・Western blot analysis、免疫組織学的検討により肺高血圧ラット肺組織中のVIP受容体VPAC2発現量の有意な増加を認めたが、VPAC1は不変であった。またmRNA発現量も同様の結果であった。・VIPのmRNAはPCRによる半定量では肺高血圧ラット肺組織中では低下していた。従って肺高血圧の肺組織中においてVIP発現減少に対し代償的にVIP受容体VPAC2の発現が亢進していると推定された。この仮説を検証するためVIP補充により肺高血圧の治療効果の検討を行っている。・VIP発現プラスミドベクター作成;マウス、ラット脳組織からmRNAを抽出しcDNAを得、PCRによりVIPをクローニングし分泌型発現ベクターに組み込み作成している。今後in vivoでtransfectionさせ発現による効果を検討する原発性、二次性肺高血圧症による不可逆的な肺血管損傷は藤移植以外に根治療法はない。本研究では肺高血圧症におけるVIPの機能、治療法への応用の検討のため以下の実験を行った。・ラット肺高血圧モデル;モノクロタリン60mg/kg投与により作成。更に、PAC1受容体も不変であった。・VIP, PACAPのmRNAはreal-timePCRで定量した。肺高血圧ラット肺組織中では低下していた。肺高血圧の肺組織中においてVIP発現減少に対し代償的にVIP受容体VPAC2の発現が亢進していると推定された。VIP発現プラスミドベクター作成;マウス、ラット脳組織からmRNAを抽出しcDNAを得、PCRによりVIPをクローニングし分泌型発現ベクターに組み込み作成している。今後in vivoでtransfectionさせ発現による効果を検討する。
食道閉鎖モデルマウスにおける責任遺伝子発現様式の三次元的解析に関する研究

病因がいまだ確立されていない先天奇形であるVACTERassociation(以下本症)に対し、アドリアマイシン投与マウスモデルが知られており、関与する遺伝子は約10種類以上報告されているが、その遺伝子発現様式の三次元解析を行うに至っていないのが現状である。本研究は遺伝子発現異常の原因究明ならびにその三次元構築を行うことも目的とした。その結果、アドリアマイシン投与マウスにおけるVATER症候群に関与する前腸・後腸発生異常は脊索の異常分岐による各種遺伝子の発現異常によるものと推察され、さらにその三次元的解析により形態学的発現様式の解析が行われた。本研究の目的は食道閉鎖、気管食道瘻の動物モデルであるアドリアマイシン投与マウスを用い、その遺伝子発現様式を新たな手法(OPT)をもちいて三次元解析し発現異常部位を立体的に具現化することであり、最終的に本疾患の遺伝子治療への可能性を探求することである。このため、研究方法としてアドリアマイシン投与マウスをWhole Mount In Situ Hybridizationを用い本邦にて染色し、共同研究者であるIreland,Trinity College DublinのProfessor Paula MurphyとともにIrelandにてOptical Projection Tomography (OPT)を用い、その遺伝子発現の三次元構築を行うという手法をとった。実験初年度は、本邦においての実験を開始するべく実験器具の購入、実験施設の確保、本学における動物実験のライセンスの取得、動物管理施設の確保などに費やし、実際の実験は共同実験者であるアイルランド、Professor Paula Murphyの元にて共に三次元構築のみ行うこととなり、誌上発表に至った。昨年度は国内におけるアドレアマイシン投与マウスのWhole Mount In Situ Hybridizationに成功し、本来初年度実験予定であったShh,Foxfi,昨年度の対象であるHNF3-βを対象遺伝子とし、アイルランドにてOPTを用い三次元構築を行った。この実験結果は既知の結果のみであったが、付随して直腸肛門奇形に関与すると思われる結果を得、今年度誌上発表予定である。初年度、昨年度の実績を踏まえ、今年度はG1i2,G1i3などのさらなる遺伝子の発現様式をOPTにより三次元構築し、この三年間にての結果を総合的に評価し発表を行い、次年度以降のさらなる研究の礎とすることを目標とする。研究成果:CD1マウスを計画的に交配し、妊娠母体に妊娠7日、8日にアドリアマイシンを0.6mg/kg腹腔内投与し、食道閉鎖モデルマウスを計画的に作成した。またコントロールとして同量の生理食塩水を投与した群を比較対象として作成した。このモデルマウスを用い、マウスの食道・気管形成関与遺伝子であるShh, Foxf1の発現をWhole Mount In Situ Hybridisationにて染色を行った。引き続き、染色した胎仔をアイルランドに持参し、現地共同研究者と共にOptical Projection Tomographyを用いて遺伝子発現様式の三次元解析を行い、その発現異常は胎生期の脊索より発生するNotochordが腸管原基に異常分岐し接着することによって引き起こされるという新たな知見を得、誌上発表に至った。また同モデルマウスは直腸肛門奇形のモデルマウスとしても知られていることから、同実験において大腸並びに肛門の発生原基である後腸においても同遺伝子発現異常をきたしていることに注目し、同様の実験を行い、やはりNotochordの異常分岐・腸管原基への異常接着により遺伝子発現異常が引き起こされている可能性を示唆し、その結果を世界に先駆け学会発表・誌上発表し研究を発展させ得た。これら結果より、食道閉鎖並びに直腸肛門奇形を合併する奇形症候群であるVATER症候群はこれまでの多元的病因ではなく、Notochordの異常分岐という一元的病因にて説明しうる可能性を有し、本奇形症候群の概念を根底から変化させ将来的な遺伝子治療の可能性も見出しうるとの考えに至った。このため研究方法としてアドリアマイシン投与マウスをWhole Mount In Situ Hybridizationを用い本邦にて染色し、共同研究者であるIreland, Trinity College DublinのProfessor Paula MurphyとともにIrelandにてOptical Projection Tomography (OPT)を用いその遺伝子発現の3次元構築を行うという手法をとった。実験初年度である本年度は本邦においての実験を開始するべく実験器具の購入、実験施設の確保、本学における動物実験のライセンスの取得、動物管理施設の確保などを要したため、本邦における実験の部分は行うことができず実際の実験は共同実験者であるアイルランド、Professor Paula Murphyの元にて共に3次元構築のみ行うこととなった。

その結果アドリアマイシンマウスモデルにおけるNotochordの異常分岐を確認し、3次元構築することが可能でありこの異常分岐が食道閉鎖症、気管食道瘻を引き起こす責任病巣と考えられ、誌上発表にいたった。研究実施計画では本年度の実験計画として「アドリアマイシンモデルにおける食道、気管上皮の解剖学的位置関係を確認するため、上皮細胞成分に特異的に染色されるTTF-1, HNF3-βを対象としOPTによる発現様式の解剖学的構造を確認する。」としており、本年度の結果によりこの異常分岐部における遺伝子発現異常を研究目的とする次年度以降の実施計画における重要な試金石となりえた。本年度の目標として昨年度の目標として「アドリアマイシンモデルにおけるOPTによる遺伝子発現様式の解剖学的構造を確認する。」を掲げていた。本邦における実験を昨年度予定対象遺伝子に対し行うことができ、アイルランドの共同研究者とともに現地での実験を遂行することができた。また付随して新しい知見を得ることができ誌上発表するべく投稿中である。本年度の目標として「アドリアマイシンモデルにおけるOPTによる遺伝子発現様式の解剖学的構造を確認する。」を掲げていた。本邦における実験自体は環境の整備にとどまり進行しなかったものの、アイルランドの共同研究者とともに実験を遂行することにより当初掲げた本年度の目標を達成し、誌上発表するに至った。昨年度は、マウスの繁殖初年度であり、期せずして自然分娩となったマウスをさらに交配し使用することにより、経費の削減につなげたため次年度に使用する研究費が生じた。今後は実験に必要な環境が整備され、本邦において実験を行い、複数回にわたり3次元解析をアイルランドにて行う当初設定した到達目標を遂行する方策である。実験器具の購入、動物実験ライセンスの取得、動物管理施設の確保などに実験開始までの時間を要し、本年度はマウスを購入しての実験を行うことができず、共同実験者のいるアイルランドにおける実験の実施となったため、次年度に使用する研究費が生じた。今後は実験に必要な環境が整備されたため、本邦において実験を行い、3次元解析をアイルランドにて行う当初設定した到達目標を遂行する方策である。今年度は予定しているマウス、実験試薬など消耗品の購入予定に加え、対象遺伝子の増加に伴い複数回に及ぶ渡欧しての共同研究者との実験、学会発表などが見込まれ、昨年度の研究費を補てんする予定である。次年度は本来予定しているマウス、実験試薬など消耗品の購入予定に加え、本年度本邦にて購入、実行できなかった分のマウス並びに試薬を購入し、実験結果の追実験を行う必要があるため本年度の研究費を補てんする予定である。
近衞秀麿研究―作品・資料目録データベース作成と資料の分析を通して

近衞秀麿は、日本のオーケストラ史におけるパイオニア的存在で、新交響楽団(今日のNHK交響楽団)を創設し、わが国の西洋音楽の黎明期に、指揮者、作曲家、編曲家として日本の交響楽の普及、発展の基礎を確立した音楽家と位置付けられる。本研究では、これまで未整理のまま保管されてきた近衞家所蔵の近衞秀麿関連資料について、(1)所蔵資料の調査、(2)破損の激しい資料の補修・整備、(3)資料のデジタル化、(4)近衞秀麿作曲・編曲資料目録の作成、(5)主要作品の分析、評価を行い、近衞秀麿の歴史的な意義の考察の土台を提供した。本研究を通して、音楽に対する取り組みの姿勢および彼の音楽観を明らかにすることができた。本研究の目的は、わが国の西洋音楽の黎明期に指揮者、作曲家、編曲家として、日本の交響楽の普及・発展の基礎を確立した近衞秀麿の資料目録を作成し、近代日本音楽史における近衞秀麿の音楽活動の功績を明らかにすることである。当該年度の主な研究活動として、以下の6点が挙げられる。1.所蔵資料の調査の結果、新たにこれまで知られていなかったスコアやパート譜を状態の良い形で発見することができた。段ボール数箱分に及ぶかなりまとまった資料である。2.資料を一点ずつ保存袋や中性紙箱に入れて保護し、番号を付与した。これにより、資料の全体像の把握が可能となった。3.研究上の重要性および緊急性の高い資料13点を外部業者に委託し修復した。火災に遭うなど資料の状態が悪かったため修復作業が増え、結果的に作業量の増大に伴い修復に要する費用がかさんでしまった。そのため、予定より少ない点数の修復となった。4.目録データ項目を検討し入力を開始した。5.スキャンが可能な資料について、スキャンを行った。これは、資料の現状以上の劣化を防ぐために、内容の精査はデジタルデータを通して行うことを可能にするものである。現在、各資料をスキャンが完了したスキャンデータとリンクさせる作業が順調に進んでいる。6.人名入力作業を開始し、人名索引を作成した。7.ドイツ語、ロシア語の翻訳を専門家に依頼し、書簡や新聞記事の内容等から、近衞秀麿の欧米での評価や欧米の音楽家達との交流の実態を明らかにした。1平成27年度に見つかった未整理資料(楽譜)の整備を行った。2新たに1920年代のアルバムや写真、欧米での活動に関するスクラップブック、日記を遺構資料から発見した3ドイツ語による書簡について、原語および日本語訳によるデータ入力を進めた。4資料の破損やサイズの大きさのためにこれまでデジタル化できなかった資料について、オーバーヘッド読取方式のスキャナを導入し、デジタル画像化した。5上記を含む近衞秀麿に関する重要な資料、自筆譜について300点のデジタル画像化(一部表紙のみ、合計約600コマ)を実施した。5近衞秀麿にかかわる作品索引の作成が完了した。全楽譜資料について、作成済みの簡易目録に当てはめるためのデジタル画像化(一部表紙のみ)が完了し、次年度以降の資料の詳細情報の入力、作品研究のための基盤的調査が進んでいるため。本年度は下記の研究を実施した。1.楽譜データベースの作成。昨年度に引き続き楽譜資料(近衞秀麿作曲・編曲)を中心に入力・修正を行った。平成28年度の新規データ入力件数は74件、修正件数は635件であった。これに基づき、後述の報告書に楽譜一覧を掲載した。その他のデータ入力、修正件数などは以下の通り。人名データ:新規入力件数17件、修正件数30件曲名データ:新規入力件数55件、修正件数914件、画像データ:新規入力枚数2,657枚。2.書簡類の整理近衞家が所蔵する主な書簡についてリストを作成し、報告書に掲載した。1新響10周年記念(1935年)の祝辞23件、2秀麿宛書簡類83件、3秀麿の書いた書簡類19件、4その他の書簡類17件合計142件3.近衞秀麿が渡欧時に聴いた演奏会のリストの作成。1923年、1930年の2冊のスクラップブックに基づき一覧表を作成、報告書に掲載した。11923年が26件、21930が48件の合計74件である。4.資料の整理。近衞家に遺されている膨大な資料のうち、近衞秀麿に関連する資料を選別するべく、調査を続けた。現時点で、近衞秀麿関連資料として640件以上であり、引き続き整理を要する。また資料の修復についても、修復が実現した点数は限られており、この修復はなお今後の重要な案件として残されている。5.冊子体による研究報告書「近衞秀麿作曲・編曲資料目録」の発行。日本における西洋音楽受容と所蔵楽譜との関連について考察した。研究協力者らからの寄稿も含み、近衞秀麿作曲・編曲作品の資料について相当程度把握された。

本研究では、これまで未整理のまま保管されてきた近衞家所蔵の近衞秀麿関連資料について、(1)所蔵資料の調査、(2)破損の激しい資料の補修・整備、(3)資料のデジタル化、(4)近衞秀麿作曲・編曲資料目録の作成、(5)主要作品の分析、評価を行い、近衞秀麿の歴史的な意義の考察の土台を提供した。本研究を通して、音楽に対する取り組みの姿勢および彼の音楽観を明らかにすることができた。当初の計画通りに進展している。中間報告として所蔵資料の一部を紹介した著書(共著)の刊行を行い、一般への研究成果公開を行ったため。平成27年度に引き続き、資料情報の入力作業を継続する。平成27年度に資料の保管場所が変更されたため、これまで実施した整理資料の検証を行う。資料の状態、作品演奏、作品研究の重要度に応じて、必要に応じてデジタル化を行う。資料調査で得られた結果に基づき、近衞秀麿の音楽活動を、指揮者、作曲家、編曲家の3つの側面から分析する。近代日本音楽史作業は予定通り進展しており、資料の整理とデジタル化、目録の入力をすすめる。資料が新たに見つかる状況が続いており修復費を残しておきたいこと、旅費について当該年度は他から支給されたこと、謝金が必要な作業についてデータベースを構築したところ、一次資料に直接することができる申請者自身が行ったほうがよい作業が、初期の段階で多かったためである。目録入力のアルバイトは昨年度は一名であったが、入力項目・入力内容がほぼ確定したため、アルバイトの人員を増やしてマニュアルに則って入力をすすめる。
眼ウイルス感染症の病態におけるT細胞の役割について

ヒト角膜実質細胞・SV-40不死化ヒト角膜上皮細胞・ヒト好中球・Boiden dhamberを用いたin vitroの系で、HSV感染によって角膜上皮細胞・実質細胞よりIL-8が産生され、好中球に対してchemotaxisを生じることを見出した。2.HSV抗原刺激に対する角膜ヘルペス患者末梢血T細胞の反応性(1)ヒト末梢血単核球をT細胞と抗原提示細胞に分け、抗原提示細胞に紫外線不活化ウイルスをかけた後γ線照射したものをT細胞と再び共生培養することによってT細胞より産生されるサイトカインをELISAにて測定する系を確立した。(2)この系にて角膜ヘルペス患者T細胞はTh1サイトカインであるIFNγ・IL-2を産生したが、Th2サイトカインであるIL-10の産生はわずかであり、IL-4の産生は認められなかった。(3)角膜ヘルペスの病態とサイトカイン産生の関係について検索したところ過去1年間に実質型の再発を認める患者においては認めない患者と比較してTh1サイトカインが高値を示し、Th2サイトカインとの比(IFNγ/IL-10・IL-2/IL-10)が有意に高かった。3.マウス角膜ヘルペスモデルを用いたヘルペスワクチンの検討ヘルペスワクチンによる免疫療法の可能性をさぐるためHSV膜蛋白のglycoprotein D(gD)とヒトIL-2のキメラ蛋白を作製し、マウス角膜ヘルペス初感染モデルにて以下の結果を得た。(1)gD-IL2蛋白の全身・局所(結膜下)投与にて実質型角膜ヘルペスへの進展が阻止された。(2)gD-IL2DNA結膜下投与にてHSVに対する液性・細胞性免疫が惹起された。(4)gD-IL2DNA結膜下投与にて眼球・三叉神経節・脳でのウイルス増殖が抑制された。4.マウス角膜ヘルペスモデルにおけるサイトカインなどの免疫組織学的検討マウス角膜ヘルペス初感染モデルににて角膜・局所リンパ節における各種サイトカイン・接着分子・浸潤細胞・組織適合抗原の局在を免疫組織化学的に解析し、Th1サイトカインの反応・γδ-T細胞の浸潤などを確かめた。角膜ヘルペス患者末梢血T細胞のサイトカイン・プロフィール上記の実験系を用いて活動期・鎮静期の上皮型・実質型角膜ヘルペス患者の末梢血T細胞を採取・培養し、Th1サイトカインの代表であるIFN-γとTh2サイトカインの代表であるIL-4の培養上清中濃度を測定した。その結果、非感染のnon-rosetting cellで刺激した場合は2.21±1.94pg/mlのIFN-γ産生しか認めなかったが、MOI5で感染させたnon-rosetting cellで刺激した場合は129.3±108.9pg/mlのIFN-γ量を示し、有意の上昇を認めた。しかし、IL-4はHSV感染細胞刺激によっても培養液中にほとんど産生されてこなかった。以上の結果よりヒトの角膜ヘルペス患者ではHSVに対するT細胞の反応性がTh1細胞優位となっていることが示唆された。HSV抗原刺激に対するヒト

末梢血T細胞の反応性を感染ウイルスを用いて前年度施行し、結果を得ていたが、感染性ウイルスを使用した場合は抗原提示による特異的な刺激によらずこれが直接T細胞に作用し、非特異的にサイトカイン産生に影響する可能性や抗体陰性者ではウイルスがT細胞にダメージを与えるが,陽性者ではダメージが少なく,その差が結果的にサイトカイン産生能の差として現れる可能性が考えられた。そこで,このような要因を除くためUV不活化したウイルスを抗原提示細胞に接種し,これでT細胞を刺激する系に変えて検討したところ、UV不活化ウイルスではヘルペス抗体陰性者の末梢血T細胞も反応することが判明した。そこで,実験系の再確立のために種々の条件について検討し、以下の結果を得た。(1) uv不活化HSVを接種した抗原提示細胞からT細胞を直接刺激するサイトカインが産生されており,これが抗体陰性者のT細胞を非特異的に刺激してサイトカインが産生されることが判明した。(2)抗原提示細胞の抗原提示能を残し、サイトカイン産生能をなくすためにγ線照射を従来の25グレイから45グレイにしたところサイトカイン産生が抑制された。(3) UV不活化HSVをCHR3株からKOS株に変更すると抗体陰性者でのサイトカイン産生が抑制された。2.マウス角膜ヘルペスにおけるサイトカインヒト末梢血T細胞のサイトカイン検討と平行して,マウスの角膜ヘルペスモデルで組織化学的に角膜・リンパ節でのサイトカインの表現を検索したところTh1サイトカインが優位であることが判明した。また,IL-7とγδT細胞が関与していることも判明した。前年度確立したHSV抗原刺激に対するヒト末梢血T細胞の反応性を検索する系を用いて角膜へルペス患者の末梢血T細胞にて以下の結果を得た。(1)角膜へルペス患者T細胞は抗原提示細胞に提示させたUV不活化ウィルスの刺激によってTh1サイトカインであるIFNγ・IL-2を産生したが,Th2サイトカインであるIL-10の産生はわずかであり,IL-4の産生は認められなかった。(2)角膜ヘルペスの病態とサイトカイン産生の関係について検索したところ過去1年間に実質型の再発を認める患者においては認めない患者と比較してTh1サイトカインが高値を示し,Th2サイトカインとの比(IFNγ/IL一10・IL2/IL-10)が有意に高かった。(3)血清中和抗体価と再発の病態との間に関係は認められなかった。2.マウス角膜ヘルペスモデルを用いたヘルペスワクチンの検討上記のようにヒトの実質型角膜へルペスてばT細胞の反応性が角膜混濁を悪化させるが,逆に更に高い反応性が獲得されればウィルスが三叉神経節に封し込められた状態になりそもそも角膜へルペスを一切発症しなくなる可能性も期待できる。そこでへルペスワクチンによる免疫療法の可能性をさぐるためHSV膜蛋白のglycoprotein D(gD)とヒトIL-2のキメラ蛋白を作製し,マウス角膜へルペス初感染モデルにて以下の結果を得た。(1)gD-IL2蛋白の全身・局所(結膜下)投与にて実質型角膜ヘルペスヘの進展が阻止された。(2)gD-IL2DNlA結膜下投与にてHSVに対する液性・細胞性免疫が惹起された。(4)gD-lL2DNA結膜下投与にて眼球・三叉神経節・脳でのウイルス増殖が抑制された。
全球雲解像モデルによる降水日変化の研究

全球雲解像モデルNICAMによる熱帯地域の降水日変化についてTRMMによる衛星観測データと比較を行った。その結果、従来の全球モデルに比べて日変化の位相や振幅が大幅に改善されることが示された。また、日変化の解像度依存性やメソスケール循環との関係について新たな知見が得られた。本研究では,全球雲解像モデルによって降水の日変化を再現し,それを海陸別あるいは地域ごとなどの区分で統計的に解析し,人工衛星による観測プロダクトと比較することを目的としている.全球雲解像モデルでは従来の全球気候モデルでは困難とされてきた降水の日変化が適切に再現され,大気大循環を駆動する上で重要な熱帯の対流活動が精度よく表現できるととが期待される.20年度は,熱帯降雨観測衛星(TRMM)の降雨レーダによる降雨強度や複数チャンネルを用いた推定降水量と,全球雲解像モデルによって得られた日変化の特徴を世界で初めて示した.また,全球雲解像モデルの特徴を生かし,従来の観測データや気候モデルからでは調べる事が不可能な海洋上のコールドプールの全球分布やメソスケールの大気循環の日変化を示すことに成功した.また,海洋大陸上で見られる活発な対流活動の日変化のうち,海洋上で朝早くに発生する対流活動が同地域のコールドプールの発生パターンと非常によく対応する事が確認された.また,従来の高解像GCMやsuper parameterizationでは再現が困難とされる対流活動の遠方伝播についても,全球雲解像モデルで適切に再現されることを示した.得られた成果は国内外の学会で発表されたほか,学術論文として20年度に執筆を行い,アメリカ気象学会が発刊するJournal of Climateへ投稿中である.同分野の匿名研究者3名による査読の結果,3名全てが本研究成果を非常に重要な結果として高く評価しており,まもなく掲載が受理される見込みである.研究成果の概要(和文):本研究では、全球雲解像モデルNICAMによる実験結果を用いて、熱帯地域の降水日変化を全球スケールで解析し、その特徴を系統的にまとめたうえで、熱帯地域の日変化の再現性を向上するための提案や衛星観測データとモデルとの比較についての新たな示唆を与えた。まず始めに、調和解析によって熱帯全域を対象とした陸上・海上のそれぞれについて降水の日周期の位相と振幅を求め、TRMMによる観測データと比較を行った。その結果、3.5km格子間隔の実験では、陸上にみられる午後早い時間の極大を良く再現しているのに対し、格子間隔が粗くなるにつれて、日周期の位相が遅れ、振幅も過大になることを示した。このような特徴は、メソスケールモデルを用いた短時間の実験では示されていたことであるが、1ヶ月という長期間かつ熱帯全域にわたって示されたのは初めてである。さらに、このような解像度の違いによる日周期の遅れは、外洋では見られず、陸上と海上で日変化のメカニズムが異なることを示している。さらに、気温の時間変化を利用して冷気塊の形成を検出し、熱帯域のコールドプール形成場所と頻度を示すことに成功した。コールドプールは熱帯対流系の維持に重要な役割を果たしていると考えられているが、観測から広域的な分布を得ることは未だ困難である。全球雲解像モデルによる解析の結果は、ITCZやSPCZなど対流の活発な領域でコールドプールの発生頻度が高いことを示している。また海洋大陸周辺では、毎日決まった時刻にコールドプールが陸上から沿岸へ進出し、降水の日変化をもたらす要因となっていることを明瞭に示すことに成功した。
超新星元素合成とニュートリノ観測から見る超新星ニュートリノ自己相互作用の効果

本研究ではr-processやνp-processなど重元素合成に関するネットワークの拡張やニュートリノ駆動風におけるこれら重元素合成の計算を行い,r-processのベータ崩壊率に対する依存性や極超新星のニュートリノ駆動風におけるνp-processについて調べた.しかしニュートリノ自己相互作用については動径方向近似での計算は可能となったが角度依存性の導入や最終的な定式化には至らなかった.そのため今後も研究を継続していきたい.超新星元素合成についてはニュートリノ元素合成で作られるフッ素の銀河化学進化や超巨大質量星を起源とする極超新星における元素合成の特徴を明らかにした.ニュートリノ自己相互作用の計算を行うコード開発については、ニュートリノ放出の角度依存性を考慮した計算方法(multiangle計算)を試みているがまだ開発途中の段階である。自己相互作用のより基礎的なところからの定式化と拡張については主に連携研究者の高村明氏、研究協力者の木村恵一氏が相対論的量子力学を用いて進めている。1012太陽質量という大質量星の中では比較的軽い超金属欠乏星が進化した超新星の輻射He層におけるニュートリノ元素合成を原因とするr-processについて調べたが、この環境ではr-processは十分に進まないことが得られた。理由としては恒星進化の違いが考えられる。我々のモデルではHe shell燃焼において対流He層が形成されたが、r-processが進むとされる恒星進化モデルでは対流He層があまり形成されず輻射He層の半径が小さくなる。そのため,これらの星でのr-processの進行は現実的ではないと考えられる.非常に明るい超新星であるSN 2007biは3太陽質量以上の放射性核種56Niを生成したと考えられ、電子対生成型超新星の可能性が指摘されている。一方、この爆発は巨大質量星が進化した重力崩壊型超新星でも説明できる。そこで我々は巨大質量星が進化した重力崩壊型超新星における56Ni生成量をより詳細に調べた。我々は110、250太陽質量の星が進化した43、61太陽質量のウルフレイエ星について超新星爆発と爆発的元素合成の計算を行い、生成される56Niの量を調べた。その結果、球対称爆発では爆発エネルギーが2e+52 erg以上の爆発でSN 2007biで推定される56Niの量を説明できることが得られた。一方、非球対称爆発の場合には比較的球対称に近い爆発でないとSN 2007biで推定される56Niの量を説明できないことがわかった。本年度は鉛を超える重元素まで計算できるようにr-processの核反応ネットワークを拡張しニュートリノ駆動風におけるr-process元素合成の計算を行った.そしてN=126核種のベータ崩壊の値に対する重元素組成の影響を調べ,ベータ崩壊値を改良するとウランなどの長寿命核種の生成量が増加し得ることがわかった.また,巨大質量星が進化した極超新星が形成する原始中性子星からのニュートリノ駆動風におけるνp-processの元素合成についても調べた.昨年度,巨大質量星の進化した非球対称爆発の極超新星における56Niの生成量について調べ,超高輝度超新星であるSN 2007biの観測を再現する56Niの生成量を再現するのは難しいという結論を得た.しかし,本年度により現実的な超新星の初期条件を用いることで非球対称爆発の極超新星でもSN 2007biの観測を再現する56Niの生成量を得ることができた.また,重力崩壊型超新星となる下限に近い星の進化を重力崩壊直前まで計算することに成功した.本研究ではr-processやνp-processなど重元素合成に関するネットワークの拡張やニュートリノ駆動風におけるこれら重元素合成の計算を行い,r-processのベータ崩壊率に対する依存性や極超新星のニュートリノ駆動風におけるνp-processについて調べた.しかしニュートリノ自己相互作用については動径方向近似での計算は可能となったが角度依存性の導入や最終的な定式化には至らなかった.そのため今後も研究を継続していきたい.超新星元素合成についてはニュートリノ元素合成で作られるフッ素の銀河化学進化や超巨大質量星を起源とする極超新星における元素合成の特徴を明らかにした.本研究ではr-processやνp-processなど重元素合成に関するネットワークの拡張やニュートリノ駆動風におけるこれら重元素合成の計算を行い,r-processのベータ崩壊率に対する依存性や極超新星のニュートリノ駆動風におけるνp-processについて調べた.しかしニュートリノ自己相互作用については動径方向近似での計算は可能となったが角度依存性の導入や最終的な定式化には至らなかった.そのため今後も研究を継続していきたい.超新星元素合成についてはニュートリノ元素合成で作られるフッ素の銀河化学進化や超巨大質量星を起源とする極超新星における元素合成の特徴を明らかにした.我々は、まずニュートリノがマヨナラ粒子で磁気モーメントを持つ場合に起こるResonant spin-flavor (RSF)conversionによる超新星ニュートリノのフレーバー変換のニュートリノ振動パラメータ依存性を調べた。そして、100ktサイズの液体アルゴン検出器で超新星爆発のごく初期に出るニュートリノと超新星ニュートリノの総イベント数を検出した場合に、中性カレントイベントに対する電子ニュートリノ、反ニュートリノの荷電カレントイベントの比を調べることで、ニュートリノ振動パラメータとRSF conversionの効果に対して制限を与えることができることがわかった。ニュートリノ自己相互作用の研究については、現在ニュートリノ自己相互作用の新しい効果の可能性について議論を進めている。r-processに関する研究として、我々は中性子魔法数N=126の核種のベータ崩壊半減期をGamow-Teller遷移と第一禁止遷移を考慮した殻模型を用いて計算し、超新星爆発時のニュートリノ駆動風を想定したr-process元素合成への影響を調べた。

そして、新しい半減期を用いるとr-processにより重元素生成量分布の第3ピークの位置がやや重い方にずれることが明らかになった。我々はまた、超新星におけるニュートリノ元素合成(ν-process)によるフッ素の元素合成を考慮してフッ素存在度の銀河化学進化について調べた。その結果、ν-processを考慮してフッ素存在度の銀河化学進化を求めると金属欠乏星のフッ素存在度をよく再現することがわかった。そのため、銀河化学進化においてフッ素は主に超新星におけるν-processで生成されることが定量的に示された。これに関連して、超新星元素合成をより詳細に計算するため、大質量星進化コードおよび回転星の進化コードの開発を進めている。ニュートリノ自己相互作用のコード開発については残念ながらあまり進んでいない。ニュートリノ自己相互作用によるニュートリノフレーバー変換のコードを開発中であるが、より詳細に計算するためニュートリノ放出方向の角度依存性を考慮する点で開発が難航している。コード開発に対する時間を十分にとれず試行錯誤が十分できなかったことが原因として挙げられる。豊田工業高専の高村明氏、名古屋大学の木村恵一氏、東京大学の川越至桜氏とはニュートリノ自己相互作用の定式化と新しい効果についての議論を定期的に行っている。これについてはまだ結果をまとめるには至っていないものの、着実に進んでいる。昨年度、超金属欠乏星が進化した超新星でニュートリノ反応が起因するr-processが指摘された。そこで本年度は恒星進化計算、超新星爆発計算、r-processに対応した核反応ネットワークを用いた元素合成計算を行い、r-processがどの程度進行するかについて調べた。その結果、このニュートリノ過程ではr-processは十分に進行しないことが得られた。そのため、ある程度結果が得られたところでこの研究を終えることにした。恒星進化計算を詳細に調べたところ、この原因はr-processを十分に進行させるために必要なニュートリノfluxを出すにはr-processが進行する領域の半径が小さくなる必要があり、多くの星ではこの条件を満たすことができないためである。ニュートリノ元素合成の元データとなる恒星進化コードの開発については、広い質量、重金属量範囲で重力崩壊直前まで計算できるところまでコード開発が進んだ。超新星ニュートリノのニュートリノ自己相互作用によるフレーバー変換については、十分に進んでいるとはいえないのが現状である。r-processに対する影響についてはおおよその結果が得られていたが、アメリカの研究グループが同様の結果を出版してしまったことにより、ニュートリノ自己相互作用についてより詳細な計算をすることが必要になった。
マイクロ流体デバイスによる連続的密度勾配遠心分離の研究

本課題では、密度勾配遠心法を連続的かっ自動的に実行する流体デノミイスを開発した。遠心ディスク上に流路を形成し、この中で多層の流れを形成することに成功した。これを用いて、密度勾配遠心法を実施した結果、血液と密度媒体の界面に蛍光ビーズを選択的に濃縮しつつ、血球をこれらから分離して回収するできることが判った。この実験に於ける蛍光ビーズ除去率は100純であり、希少細胞抽出技術として有望な技術であると言える。本課題では、密度勾配遠心法を連続的、かつ自動的に実行する流体デバイスを開発した。まず、遠心ディスク上に流路を形成し、この中で多層の流れを形成する実験を実施した。この結果では、流れが顕著な2次流れを生じ層流の縞状パターンが撹拌される事を発見した。コリオリの力に由来することは、有限要素解析と実験により実証し、この成果をまとめた論文は採択されている。コリオリの力は流れの流速と、ディスクの回転数に比例する。このためこれらを抑制する事で安定な縞状パターンを得る事が出来た。また、これとは異なる方法に於いても2次流れが抑制出来る事を見いだし、本成果は特許出願中である。遠心中の細胞分離挙動の観察のためにストロボスコープを初年とに構築したが、より微細な挙動を観察するために、本年度は顕微鏡ユニットを取り付けた「顕微ストロボスコープ」を構築した。本装置は初年度構築したシステムのCCDに同軸落射顕微鏡鏡筒を取り付けることで、ストロボ光の集光と、顕微鏡観察を実現するものである。特に、ストロボ光のスペクトルが蛍光励起に適した波長を多く含む事に着目し、蛍光観察ができる仕様にしてある。これを活用する事で、血液中に懸濁した蛍光微粒子の共同を選択的に観察する等の新規な観察手法を構築する事ができた。これを用いて、密度勾配遠心法を実施した結果。血液と密度媒体の界面に蛍光ビーズを選択的に濃縮しつつ、血球をこれらから分離して回収するできることが判った。この実験に於ける蛍光ビーズ除去率は100%であり、希少細胞抽出技術として非常に有望な技術であると言える。当該年度では以下の事項に取り組んだ。1.ディスク上の現象を観察する為のシステムの構築。2.ディスク上の流れ挙動の理解。4.流れのシミュレーション法の構築3.気泡混入防止方法の確立。1.の項目については、予想以上に高度なシステムを構築できたと言える。ストロボスコープと顕微鏡を組み合わせる事で数100μmの流路内の挙動が可視化できることがわかった。本システムには同軸落射光学系の採用を初めて試みたが、これが功を奏し、高倍率な観察を安価なシステムで実現できる事がわかった。さらに、同軸落射光学系を採用した事で、ディスク上の蛍光粒子の挙動を観察する事も可能になっており、新たなフローサイトメーターの開発等につながる成果と言える。2.の項目については、粒子分離実験の事前実験で、ディスク上で多層流を形成する実験を試みた結果うまく行かないことがわかった。これは、流路内に形成した流れがねじれ現象(2次流れ)を生じるという物で、研究の進捗を大きく阻むものである。23年度で詳細に調べた結果、本現象はコリオリの力による物である事が判明した。これを抑制する方法論も確立できており、この成果に関しては論文化する予定である。3.の項目については、コリオリの力を体積力として流れ場を解くシミュレーション手法を確立して、実験結果との一致が得られている。これにより、流れの予測が容易となり、2次流れの予測が可能となった。これを利用して新たな原理による分離プロセスの検討等がかのうである。4.流れ内への気泡の混入を防ぐ為に、パッシブバルブ構造を形成することを検討したが、液体の注入方法を工夫すればより確実に気泡の混入は防止できる事がわかった。実験データーの信頼性が向上できたとともに、実験操作も確実で簡便になった。これを自動的に実行する方法を確立できれば、より簡単な装置の開発に役立つ。予期せぬ2次流れ挙動のため、時間を費やした。研究の進捗を阻む現象であった為、なんとしても解決する必要があり、時間を費やした。このため粒子分離実験に関しては3ヶ月ほどの遅れがあると言える。しかしながら、本現象は他のマイクロ流路では起こらないディスク型マイクロ流路内特有の現象であることから、非常に興味深く、あえてこだわって調査を行ったという実状もある。粒子分離に限定せずに、今後さらに応用範囲を広げて、引き続き検討して行きたいと考えている。可視化法の構築に関しては、これまでに実現していないレベルの技術を限られた予算の中で構築する必要があったため、当初はもっと時間がかかるものと考えていた。

しかし、本技術の構築においては、本学工作室の技術力が予想を遥かに上回る物であった事や、顕微鏡メーカーの技術者も非常に協力的であったため、当初の予定の4分の1くらいのコストで、予想よりも高性能なシステムを早期に構築できた。今後は研究の加速化が期待できる。以上、粒子分離実験では遅れがあるものの、可視化システムはかなり完成度の高いものが既に構築できている。これらの進捗を相殺するとおおむね順調に進展していると評価できる。可視化システムの完成度は高く、システムの大枠は完成したと言える。24年度は構成要素の交換などの簡単な変更により、システムをグレードアップして行く。このため、これに裂く時間はそれほどいらないと考える。23年度に構築した可視化システムをツールとして、粒子挙動の可視化に取り組む。蛍光観察が実現できたため、蛍光粒子を用いて実験を実施できる。蛍光光学系を改良し、より効率的に実験をすすむような工夫を行い研究を加速化する。また、シミュレーションを併用する事で、新規な流路構造の設計も合わせて実施したい。細胞変形性の評価に関しては、放射光を用いずにSU8を用いてもキャピラリーアレイ構造を作製できる事がわかっているため、これを用いて実施する。ストロボスコープを導入することで当初予定していた高感度CCDを使用せずに、目標としていたシステムの構築を実現できたため物品費を大幅に節約する事ができた。23年度の実績で予想よりも安く可視化システムを構築できたものの、24年度では、倍率と解像度を改良したいほか蛍光観察波長の多様化により、より詳細な挙動を観察可能になると考えられる。このために、いくつか購入したい物品がある。CCDや顕微鏡の光学系を交換したいため、物品・消耗品が必要である。また、成果発表においては、MicroTAS2012に現在2件投稿中であり、旅費・会議登録費として使用したい必要である。
象牙質基質由来ＭＭＰ活性を抑制する銀系バイオガラス含有レジン素材の開発

銀系バイオガラスを作製し、それらのMMP活性抑制効果およびRAW264に対する細胞毒性を調べた。銀系バイオガラス(酸化銀3%配合)は象牙質由来のMMP-2およびMMP-9活性を抑制した。しかし、細胞毒性の発現も認められた。これらの結果は、溶出した銀イオンの作用による。今後、ガラスの銀含有量およびイオン溶出量を調整することによって、MMP活性の抑制効果を増強し、さらに、細胞毒性を低下させたバイオガラスを作製する必要がある。銀系バイオガラス(SiO2-Na2O-CaO-P2O5-Ag2O)を電気炉にて作製し、粉砕してガラス粒子を作製する。レジンマトリックス(Bis-GMA, TEGDMA, HEMA系)を調整して、ガラス含有レジン複合体を作製する。それらを各種試験溶液に一定期間浸漬して、形成された石灰化物の解析、溶出イオン濃度の測定を行うとともにヒト象牙質粒を用いたMMP assayにより象牙質基質から放出されるMMP活性を抑制するガラス組成を模索した。試験試料を長期浸漬後、試料表面に形成された石灰化物の定量を行うとともに、形態観察(SEM, TEM)および分子構造の解析(EDX, MOLE, XRD, XPS)を行い。さらに試験溶液へ溶出したイオン濃度の測定(ICP)を行った。試験歯として抜去ヒト小臼歯を使用する。粉砕機を用いて歯冠・歯根象牙質から粒子径約50 μのDentin Powder(象牙質粒)を作製する。80 mg・Dentin Powderを180 μL・緩衝液で調整後、20 μLの蛍光色素によりラベルされたコラーゲン線維を用いて、各種条件で象牙質基質から放出されるMMP活性を比色計にて測定した。各種条件にて銀系バイオガラスを作製・調整して、象牙質基質由来のMMP活性の抑制効果を比較・評価した。銀系バイオガラスにより、有効にMMPを抑制することができた。さらにそれら生体安全性について研究を継続している。銀系バイオガラス(SiO2-Na2O-CaO-P2O5-Ag2O)を電気炉にて作製し、粉砕してガラス粒子を作製した。それらを各種試験溶液に一定期間浸漬して、形成された石灰化物の解析、溶出イオン濃度の測定を行い、さらに、ヒト象牙質粒を用いたMMP assayにより象牙質基質から放出されるMMP活性に対する抑制効果を評価した。石灰化物を形成するとともにMMP活性を有効に抑制する銀系バイオガラスの組成およびレジンモノマーの調整を行った。レジンマトリックス(Bis-GMA, TEGDMA, HEMA系)を調整して、ガラス含有レジン複合体を作製し、MMP活性に対する抑制効果を評価した。銀系バイオガラスを実験前に考えていたよりも有効にMMP活性を抑制した、また、レジンとの複合材料としても類似の機能を有した。しかし、銀イオンが細胞毒性を有することとが問題となり、これからの改善点であると考えられた。銀系バイオガラスバルクを高温電気炉にて作製した。粉砕してガラス粒子を作製した。それら粒子を元素分析およびXRDにより調べた結果、標準的なアモルファス・バイオガラスを問題なく作製できることがわかった。3 wt%の酸化銀を含むガラスを標準実験材料とした。それらを各種試験溶液(SBF)に一定期間浸漬して、形成された石灰化物をSEMにて観察、ICPにより溶出イオン濃度の測定を行った。その結果、各種イオンの溶出、とくに銀イオンの溶出が確認された。また、SBF浸漬試料の表面に再石灰化物の形成を確認した。ヒト象牙質粒を用いたMMP assayにより象牙質基質から放出されるMMP活性を抑制するガラス組成を模索した結果、3 wt%の標準ガラスにおいて有効にMMP活性を抑制することがわかった。さらにMMP-2およびMMP-9を使用して同様の実験を行った結果、銀系バイオガラスにより有効に両MMP活性は抑制された。さらに、ザイモグラフィー(電気泳動法)を用いて類似の実験を行った結果、やはりMMP活性は抑制された。銀系バイオガラスはMMP活性を抑制する事実が2種類の実験系から判明したが、銀イオンの細胞毒性は臨床上問題になるため、各種細胞(RAW264.7, MC3T3-E1など)を用いた細胞毒性試験(MTT assay, LDH)、細胞の形態観察(SEM, TEM)、遺伝子発現(RT-qPCR)などについて調査を行っているこれら、実験を総括し、最後に、石灰化物を形成するとともにMMP活性を有効に抑制する銀系バイオガラスの組成およびレジンモノマーを用いたコンポジット素材の調整などを行う予定である。ガラスそのもののMMP抑制については、良好な結果が得られた。しかし、レジンマトリックスの調整などについては不十分なところが多い。銀系バイオガラスは生体安全性についての検証が不十分であるため、それらについての研究に比較的多くの時間を費やした。銀ナノ粒子などの新規素材についても同様な実験を行い結果を得ている。

・標準的な銀系バイオガラス作製が可能であり、当初、予想していた機能を付与することができた。・試作したバイオガラスがMMP活性を抑制するこたを2種類の実験系から確認できた。・ガラスが有する細胞毒性の評価のための各種実験系を構築することができ、ガラスの組成を調節することにより細胞毒性を制御することが可能であることが判った。・新規材料の開発・臨床応用に一定のめどがついた。前年度に行った実験結果についての総括を行う。石灰化物を形成するとともにMMP活性を有効に抑制する銀系バイオガラスの組成およびレジンモノマーの調整を行う。Ag2OおよびP2O5の増量・再調整により銀イオン溶出を増加させる。さらにレジンマトリックスのモノマーを再度、調整(親水性化)することにより臨床応用可能な材料完成まで同様の上記実験を繰り返す。また、銀ナノ粒子などの新規素材についても同様な実験を行い、新規材料のスクリーニングを行う予定である。酸化銀の増量・再調整により銀イオン溶出を増加させる。また、酸化リンの含有量を増加させることによりガラス粒子の溶解性を調整し銀イオンの溶出量を調整する。さらにレジンマトリックスのモノマーを親水性化することにより銀イオンの溶出量を調整し、臨床応用可能な材料完成まで同様の上記実験を繰り返す。さらに他の歯科材料との性能比較などを行う予定である。ガラスと細胞の相互作用、特に細胞毒性の関係について精査する。さらに、それら調整された材料についての生体安全性について研究を行う。研究費の大部分を消耗品の購入に充てる予定である。バイオガラス作製のための白金るつぼ、細胞試験関連のピペット、シャーレ、フラスコ、培地(DMEN)、血清(FBS)、抗生剤、実験試薬(とくにPCR用試薬)、各種アッセイキット類(MMP, LDH, NOアッセイ)および電子顕微鏡用品(エポキシレジン、グリッド、ネガフィルム)などを購入する予定である。さらに、研究内容を総括し、学会発表のための旅費および論文掲載費などに使用する。