hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
品質機能展開法(QFD)を用いたクォリティ・オブ・ライフの評価指標講築

また米国の自動車産業が採用するQS9000では、部品製造企業に品質管理システムとして導入が義務付けられており、世界中で顧客ニーズを的確に反映した合理的な製品開発の計画および品質管理手法として広く採用されている。本研究では最初に顧客志向評価モデルであるECR法を用いて札幌市の除雪事業の現状分析を行い、冬期業務交通問題点の順位を求めた。その結果、「冬期遅れ時間」が一番重要視されたことから、都市除雪事業のアウトカム指標として「冬期遅れ時間」を設定した。また、冬期遅れ時間に対する満足度・不満足度調査から、二つの顧客不満足(アンサティスファクションとディスサティスファクション)を用いた目標サービスレベルの設定を行った。QFD法を札幌市の除雪事業に適用したことにより、市民が要望する除雪サービスと各種工法への予算配分との比較分析を行うことができた。その結果に基づき除雪事業の改善方向性を示し、効率的な除雪を実現するためにボトルネックとなっている技術の特定と、同じ予算額で市民の便益を最大化する除雪工法を提案した。今後の課題として、QFD法による除雪サービスの改善が利用者の満足度をどれだけ向上させたかの検証、他の行政サービスへのQFD法の適用可能性、ならびに他の品質管理モデルの行政への適用可能性などのあることを示した。
人間の画像記憶における色情報の処理に関する実験心理学的研究

本研究は,画像の記憶において色情報がどのような効果をもつのかを検討した。主要な知見は,以下の通りである。1.画像刺激として,同一風景のカラー写真,白黒写真,線画が用いられた。刺激の提示時間(記銘時間)は,250msec,500msec,1sec,5sec,10secの5種類であった。同一被験者に直後再認テストと1週間後再認テストが課された。その結果,直後再認テストでは,とりわけ250msecと500msecの提示時間では,カラー写真がもっともよく,次いで白黒写真がよく,線画の再認成績はもっとも悪かった。一方,提示時間が10secの場合には,3者の再認成績はほぼ同じになった。この結果は,色情報が画像のコード化の初期で大きな促進効果をもつことを示唆する。色は,画像(写真)の中の個々の対象の認知を容易にし,その結果,コード化を促進するのだろうと考えられる。1週間後再認テストでは,再認成績は全体的に低かったが,カラー写真とほかの2つの画像刺激(白黒写真と線画)の間の成績の差は顕著であった。2.上記の実験で再認のよかったカラー写真を選び,これらの写真を被験者に記銘してもらったあと,これらの写真の一部分を白黒に変えたテスト刺激を用いて,色の再生テストを行なった。記銘時の提示時間は,250msec,1sec,10secであった。これに先立って,別の被験者にテスト刺激のみを提示して,色を推定させる実験を行なった。この結果と本実験の結果とを比較したところ,両者にほとんど差は見られなかった。すなわち,色そのものの記憶はよくなかった。このことは,上記1の実験で見られたように色は確かに効果をもつが,色そのものはかなり自動的に(被験者があまり意識することなく)処理されていることを示唆する。
フォトニック結晶特性の作製後チューニング技術に関する研究

(1)2次元ピラー構造の電子線照射による制御およびレーザ発振GaAs/AlGaAs多層構造をドライエッチングすることにより2次元ピラー型のフォトニック結晶を作製した。この構造に電子線を照射すると、それまで規則配列していた格子点が移動し部分的にバンチングする。これを、電子線照射によるクーロン引力と斥力の釣り合いから解析した。その結果、直径0.3μm長さ1μm程度のピラーに充分に塑性変形を与えうることが明らかになった。さらに、このような半導体ピラー構造でフォトニック結晶構造を反映したレーザ発振が可能であるか試みた。その結果、チタンサファイヤレーザを励起光源として、フォトニック結晶に照射しその入出力特性から100mW近傍に閾値を有するレーザー発振特性を確認した。さらに、その発振波長が、計算されたフォトニックバンドギャップの高エネルギー側エッジ近傍に有ることを示した。発振モードは2次元DFBモードであり、半導体(GaAs)の利得帯域とフォトニックバンドギャップの帯域がオーバーラップ領域での発振と結論付けた。(2)半導体利得構造とフォトニック結晶の複合化。半導体フォトニック結晶自体にチューニング機能を持たせたピラー構造は、空気/半導体の大きな屈折率差が利用できる点で有利であるが、光学利得の大きな犠牲を伴う。これを回避するために、誘電体系フォトニック結晶と半導体光学利得構造の複合化を試みた。半導体MQW活性層を光励起し、そのルミネッセンス光をエッジ(導波方向)および基板垂直方向から観測しフォトニック結晶の効果を検証した。色素充填によりレーザ発振を確認しているアルミナホールアレイを基板としてSiO2/Si、SiO2/TiO2系3D-PhCをオートクローニング法により積層し光学的評価を行った。ピッチが200nm程度では3D-PhCがホール部分を埋めて積層されるので新しい光機能素子として期待できる。(3)フォトニック結晶ファイバー(PhCF)を用いたスーパーコンティニューム(SC)光の発生波長制御の観点から広帯域スペクトルを発生しこれから任意の波長を切り出すことを狙いとした。PhCFのクラッド部の不均一性に由来する擬似的微小コアに注目し、Tiサファイヤレーザ(810nm,<1ps)励起により広帯域SC光(450-1400nm)を得た。擬似的コアではゼロ分散波長が短波長化し結果的に大きな異常分散が得られるためである。変換効率が極めて高いため短尺PhCFでもSC光が得られ、9mm長で550-850nmのSC光を得た。ファイバーの保持限界である2mmでも観測され、世界最短長のPhCFによるSC光発生を実現した。さらに、石英系平面光波回路をフォトリソグラフィーにより加工し35μm長でも十分なSC光が得られることを確認し、光集積回路でSC光を発生し制御する新しいデバイスへの展開を示した。

ファイバーの保持限界である2mmでも観測され、世界最短長のPhCFによるSC光発生を実現した。さらに、石英系平面光波回路をフォトリソグラフィーにより加工し35μm長でも十分なSC光が得られることを確認し、光集積回路でSC光を発生し制御する新しいデバイスへの展開を示した。(1)2次元ピラー構造でのレーザ発振の詳細評価。チタンサファイヤレーザを励起光源として、フォトニック結晶に照射しその入出力特性から100mW近傍に閾値を有するレーザ発振特性を確認した。さらに、その発振波長が計算されるフォトニックバンドギャップの高エネルギー側エッジ近傍に有ることを示した。発振モードは2次元DFBモードであり、半導体(GaAs)の利得帯域とフォトニックバンドギャップの帯域がオーバーラップ領域での発振と結論付けた。閾値が比較的高い理由はピラーに対して軸方向励起であって励起効率が低いこと並びに、ピラー構造表面のドライエッチングダメージによる非発光再結合に求められる。(2)半導体利得構造とフォトニック結晶の複合化。半導体フォトニック結晶自体にチューニング機能を持たせたピラー構造は、空気/半導体の大きな屈折率差が利用できる点で有利であるが、光学利得の大きな犠牲を伴う。これを回避するために、誘電体系フォトニック結晶と半導体光学利得構造の複合化を試みた。半導体レーザ用の多重量子井戸構造を有するダブルヘテロ構造上に2次元パターンを2重露光法により作製しこれを基板として用いてSiO2/アモルファスSiの3次元フォトニック結晶構造を作製した。多重量子井戸構造活性層を光励起し、そのルミネッセンス光をエッジ(導波方向)および基板垂直方向から観測しフォトニック結晶の効果を検証した。積層したSiO2/アモルファスSi構造が単純多層構造の場合と3次元フォトニック結晶構造の場合ではスペクトルに明らかな違いが見られ、後者の場合には2次元のフィードバック効果に依ると思われる新たなピークが出現することを見いだした。励起方法の改善などにより、この新たなピークを増大させ、作製後チューナブルナなレーザ発振へと展開できるものと考えられる。1.フォトニック結晶(PhC)と利得媒質の複合化H14年度の研究により半導体ピラー構造でレーザ発振が確認されPhC機能デバイスの波長制御に道を拓いた。課題であったドライエッチングダメージを解決するために、利得媒質と3次元フォトニック結晶(3D-PhC)の複合化を試みた。具体的には表面に2次元格子を形成した多重量子井戸構造あるいは陽極酸化アルミナホールアレイを基板としてSiO2/Si、SiO2/TiO2系3D-PhCをオートクローニング法により積層し光学的評価を行った。前者の複合構造ではPhC層が有効に光閉じ込め層として機能し、さらに、積層面内方向の周期性を反映した新発光ピークが観測され2次元DFBレーザ発振の可能を示した。色素充填によりレーザ発振を確認しているアルミナホールアレイとの複合構造ではピッチが200nm程度では3D-PhCがホール部分を埋めて積層されるので新しい光機能素子として期待できる。2.フォトニック結晶ファイバー(PhCF)を用いたスーパーコンティニューム(SC)光の発生波長制御の観点から広帯域スペクトルを発生しこれから任意の波長を切り出すことを狙いとした。
低転位バルクGaN単結晶実現に向けた新規気相成長技術の研究

酸化ガリウム(Ga2O)をGa源としたGaN結晶成長法(OVPE法)は,排気系を詰まらせる副生成物が生成しないため原理的に長時間の連続成長が期待できる方法である.長時間成長に向けた課題は,ノズル部,および基板ホルダー部における多結晶生成の抑制であるが,H28年度の成果より,ノズル部においてはシールドガスの導入により多結晶生成が抑制された.そこでH29年度は(1)基板ホルダー部の多結晶生成を抑制するため,各種ガス条件を検討したので報告する.加えて,新たに多結晶生成の原因となる(2)H2Oを低減できる炭素吸着法を開発した.(1)については,基板上での核発生を抑制することが重要であるが,核発生頻度を決めるパラメータである過飽和比(σ=(Ga2O供給分圧P0)/(Ga2O平衡分圧Pe))に着目した.従来の過飽和比(σ=140)に対し低過飽和比(σ<10)の条件で結晶育成を実施したところ,成長膜上に堆積する多結晶密度が大幅に減少し,5時間の成長においても成長速度の低下,および結晶性の低下は起こらなかった.(2)について,OVPE法では,原料部で副生するH2Oも多結晶生成要因の一つであるが,H29年度は,H2O分圧を低減する手法として,新たに炭素吸湿法を開発した.本手法では,炭素,もしくはメタンガスを導入することで,H2O分圧の低減が可能であり,それにより5時間以上の長時間成長においても多結晶化が大幅に抑制されることが明らかになった.以上の結果より,低過飽和比条件と,炭素吸湿法を組み合わせることで,多結晶生成を抑制しながら約400μm61549;mの厚膜GaN成長(10時間)に成功した.現状では,設備的な制約で成長時間が最長10時間に限定されているが,本年度の成果によれば,更なる長時間成長により1mm厚のGaN成長が期待される.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。Oxide Vapor-Phase Epitaxy法は,固体の副生成物が原理的に発生せず,高温成長による高品質化が見込めるため,高品質バルクGaN結晶の成長手法として有用である.H28年度は,GaN種結晶上OVPE成長において,新たな転位発生のない成長開始表面の実現に向けて,昇温中の雰囲気ガス分圧を調整し,種結晶表面荒れの最も少ない昇温プロセスを検討した.まず,窒素ガスフロー環境下でGaN種基板を昇温したところ, 1200°CではRMS値が133nmであり昇温前の種結晶表面(RMS値:数nm)と比較して平坦性が悪化した.この表面上にOVPE法により約50μmのGaN層を成長させたところ,成長層のGaN(002)X線ロッキングカーブ半値幅(FWHM)は212arcsecと,種基板(FWHM=70arcsec)と比較して結晶性が悪化した.昇温中の表面平坦性の悪化は,種基板であるGaN基板表面の熱分解によるものと推察される,そこで,昇温中に原料ガスであるGa2Oガス,およびNH3ガスを供給する成長初期表面制御法を考案し,GaN種基板表面の分解抑制を試みた.その結果,600°C到達後にNH3ガスのフローを開始し,1200°C到達後に40PaのGa2Oガスを供給した条件で,育成前種結晶表面のRMS値が47nmと,平坦性の高い表面が得られた.この昇温プログラムを用いて,1250°Cの高温GaN成長を実施したところ,膜厚53μm,GaN(0002)FWHMが75arcsecと,種結晶と比べて結晶性の劣化がほぼないOVPE成長を実現した.平成28年度は,上記に加えて,原料ノズル付近に発生する多結晶(ノズルデポ)抑制(H29年度予定)にも取り組み,新たにシールドガスを導入することで,ノズルデポを大幅に低減することに成功し,長時間成長(8時間)により,約240μmの厚膜GaN成長にも成功した.H28年度は,OVPE法を用いた高温GaN成長に向けて,新たな転位発生のない成長開始表面の実現,を目指して,新たに成長初期表面制御法を開発した.これにより,高温成長で従来から問題となっていた成長開始前の種結晶表面荒れ,それに起因する成長層の結晶性劣化,成長界面における転位の導入の解決の見通しを得た.実際に,成長初期表面制御法を用いて1250°Cの高温成長を実施したところ,成長前の種結晶表面を平坦に維持することが可能となり,種結晶の結晶性とほぼ同等のGaN成長に成功した.以上の課題が解決したことで,最終目標である,1mm厚GaN結晶作製に向けた長時間成長の取り組みを始めた.本取り組みは,当初,平成29年度の計画であったが,上記課題が解決したため,平成28年度に一部前倒しで実施した.長時間成長における問題は,成長時間の増加にともない,原料ノズル付近や反応管内壁,及び基板ホルダー上に多結晶が発生し,それらの多結晶が飛散し,種基板上に付着すると,転位発生の原因になり,時間とともに結晶品質が低下する,ということである.本年度はこの問題のうち,原料ノズル付近に発生する多結晶(ノズルデポ)の抑制に取り組んだ.具体的には,Ga源とN源の供給ノズルの間にシールドガスと呼ばれる分離ガスを導入することで,ノズル付近での各種原料ガスの混合を抑制し,ノズルデポを抑制した.

その結果,8時間の長時間成長で,最大240μmの厚膜成長に成功した.以上のように,平成28年度は,計画していた成長開始前表面の制御方法を確立し,加えて,平成29年度に予定していた多結晶発生の抑制について,一部の課題が解決され,当初の計画以上に進展した.酸化ガリウム(Ga2O)をGa源としたGaN結晶成長法(OVPE法)は,排気系を詰まらせる副生成物が生成しないため原理的に長時間の連続成長が期待できる方法である.長時間成長に向けた課題は,ノズル部,および基板ホルダー部における多結晶生成の抑制であるが,H28年度の成果より,ノズル部においてはシールドガスの導入により多結晶生成が抑制された.そこでH29年度は(1)基板ホルダー部の多結晶生成を抑制するため,各種ガス条件を検討したので報告する.加えて,新たに多結晶生成の原因となる(2)H2Oを低減できる炭素吸着法を開発した.(1)については,基板上での核発生を抑制することが重要であるが,核発生頻度を決めるパラメータである過飽和比(σ=(Ga2O供給分圧P0)/(Ga2O平衡分圧Pe))に着目した.従来の過飽和比(σ=140)に対し低過飽和比(σ<10)の条件で結晶育成を実施したところ,成長膜上に堆積する多結晶密度が大幅に減少し,5時間の成長においても成長速度の低下,および結晶性の低下は起こらなかった.(2)について,OVPE法では,原料部で副生するH2Oも多結晶生成要因の一つであるが,H29年度は,H2O分圧を低減する手法として,新たに炭素吸湿法を開発した.本手法では,炭素,もしくはメタンガスを導入することで,H2O分圧の低減が可能であり,それにより5時間以上の長時間成長においても多結晶化が大幅に抑制されることが明らかになった.以上の結果より,低過飽和比条件と,炭素吸湿法を組み合わせることで,多結晶生成を抑制しながら約400μm61549;mの厚膜GaN成長(10時間)に成功した.現状では,設備的な制約で成長時間が最長10時間に限定されているが,本年度の成果によれば,更なる長時間成長により1mm厚のGaN成長が期待される.H29年度は,長時間成長による1mm厚のGaN結晶の実現に向けて,炉内の多結晶発生を完全に抑制することを目標とする.具体的には,まず熱力学解析によるGaN生成条件の予測,及び流体シミュレーションによる反応管内の各種ガス流速・分布分布計算を実施する.例えば,GaN生成が起こる温度,各種ガス(Ga2O,NH3,H2,N2,H2O)分圧を熱力学解析により明らかにする.その結果から種結晶外でのGaN生成を抑制し,種結晶表面近傍でのみGaN生成反応が起こるような反応管内環境(温度分布,各種ガス流速・分圧分布)を予測し,流体シミュレーションを用いて,上記環境を実現するためのノズル・ホルダー形状・配置,各種ガス流速を決定する.現状の反応管内の流体シミュレーション結果より,原料ノズル付近,種結晶ホルダー付近で循環流と呼ばれる原料ガスのよどみが生じており,こうした箇所で多結晶の発生が確認されている.そこで,各種ガス流量,ノズル配置を変えて循環流を抑制したパターン等,様々な条件(ノズル形状・配置,各種ガス流量・分圧)における多結晶発生抑制効果を検証する.期間内に種結晶外で発生する多結晶を抑制し,10時間以上の長時間成長(1mm厚さ)を目指す.熱力学解析については,HVPE法の熱力学解析の第一人者である東京農工大学の村上准教授(研究協力者)に協力を仰ぐ.流体シミュレーションについてはSTR社製のVirtial Reactorを用い,STR-Japanの塚田氏に協力を仰ぐ.ノズル形状設計・製作は,HVPE法の反応管設計経験を有するエピクエストの梅宮氏から協力を仰ぐ.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
メタルCMPの研磨作用とスラリーの開発

半導体デバイスの集積度は、日進月歩で指数関数的に増大し来た。これ発展を支えている製造技術の1つが、CMP(化学的・機械的研磨法)である。しかし、CMPはいわゆるプロセストライボロジの領域であることから経験とノウハウに頼らなければならない極めて現場的技術である。そのため、この技術の科学的究明が斯界の懸案になっている。加えて、CMPの加工対象が従来のSi酸化膜(SiO_2)からメタル(銅など)へ展開されようとしている現在、CMPのメカニズムの解明が急がれる。以上のような背景の下、本研究はこの2年間、次のようなプロセスでこの懸案に取り組み、その研究成果を得た。(1)ゾル-ゲル法によるCMPスラリー製造技術の開発粒子径分布幅の狭い微粒(数十nm)のスラリー粒子を、ゾル-ゲル法により安定して製造するための合成技術の追究し、その制御因子をかなり明らかにすることができた。ここで試作したスラリーはその組成が明瞭なことから、以下の本CMP実験に供することで、CMPメカニズムの解明に大きく貢献した。(2)SiO_2を対象としたCMPの基礎実験を体系的に実施して、CMPの作用メカニズムをかなり具体的に想定することができるようになった。すなわち、CMPを左右する主要因として機械的因子と化学的因子に大別し、この両者の作用を定量的に比較することに注力した。その結果、CMPといえども、機械的作用因子が十分大き名影響因子となっていることを指摘できた。そして、機械的因子として具体的に、(1)加重、(2)パッドと加工面との接触点密度、(3)粒子直径と粒子濃度、が抽出された。また、「(1)加重」の効果は、PRESTONの関係式の妥当性を検証すると共に、その成立のメカニズムが、パッドーワーク接触点密度に拠ることの可能性を指摘した。(3)上記(1)、(2)の成果を踏まえ、銅を対象としたメタルCMPの実験を行った。当然ながら、まず化学作用の検討にpH因子を取上げて行った。結果は極めて複雑なCMP特性を示し、断定するのは難しいものの、少なくとも予想された化学的作用効果は現われ難いことを突き止めることができた。その結果浮上したのが、上記(2)で示した機械的作用の重要性である。可能性として、メタルCMP現象が、平均粒子間隔と接触点密度の関数として理解できることを示すことができたと考えている。本年度はゾルゲル法によりシリカSiO_2研磨材すらリーを試作し,その研磨特性を実験的に検討した。そして,この結果より、シリカによるCMPメカニズムの化学的(C),機械的(M)研磨(P)作用を定量的に分析し,その研磨メカニズムモデルを構築した.これにより,メタルCMP用スラリー開発の方針を得ることができた.本年殿成果を要約すると以下のとおりである.CMP研磨機構をできるだけ単純化させることを目的とし,素性の明らかなスラリーを試作し,市販のスラリー(種々の不明な添加物を含む)と対比させながら,系統的なCMP実験を行った.すなわち;(1)CMPにおけるpHの効果・・・化学的作用の検討

(2)砥粒径,濃度,個数密度の効果・・・機械的作用の検討(3)添加剤の効果...物理,化学的効果の検討以上,主として3つの視点からCMPのメカニズムを追究した.本実験から次の所見を得た.(1)添加剤は研磨作用そのものに直接関わっておらず,2次凝集の防止や研磨後の後処理を行うための補助的なものである.(2)表面へのシリカの堆積は,砥粒がワーク表面に2次凝集した結果である.(3)砥粒粒径が大きくなるほど,研磨量は増大する.(4)パッドと加工面の接点(研磨作用点)数が増大するほど,研磨量が増加する.(5)CMP作用は,砥粒-砥粒間の結合力,砥粒-工作物材質間の結合力,砥粒-パッド材質間の結合力,この3者の強度関係で決定する.従来のCMPは酸化膜(SiO2)をその研磨の対象としてきた。しかし昨今注目されるデュアルダマシン方式では、メタル(Cuなど)CMPに期待がかけられている。このメタルCMPは歴史が浅く、これまで体系的なデータの蓄積がなされていないのが実情であり、いまだ現場の経験と試行錯誤に頼らざるを得ない状況である。したがって、メタルCMP特性の本質(メカニズム)の解明なしには、この技術の普及は望み得ないと考えた。本研究では昨年度は、この目的のために設計したCMP実験装置により体系的基礎データを集積し、メタルCMPの本質を探ることができた。残された課題は、CMPにおけるパッドの作用機構であり、本年度はこの解明を目指した。研磨機構の原点は、パッドとワーク表面の接点にある。そして、この接点数とこの接点にどれだけ確実に作用砥粒粒子を供給できるかが、CMP研磨特性の支配因子になるはずである。この仮説を実証できれば、パッドの機能、スラリーの濃度、粒子径の因果関係が定量的に体系化できることになる。本年度の研究の目標は、実験によりこの仮説の妥当性を検討する事にあった。そこで本年度は、研磨作用点の数がCMP特性にどのように関わっているかを実験的に追究した。すなわち、実験パラメータはスラリー濃度、粒度、およびこの両者から決定される平均砥粒間隔、そしてパッドとワークの接触作用点数を左右する研磨圧力である。そこで得られた所見は以下のとおりである:(1)粒度あるいはスラリー濃度が一定の下での研磨量は、研磨圧力と完全な比例関係を示す。すなわち、Prestonの定理が成立することを確認できた。この直線の勾配は、粒径が大きいほど、またスラリー濃度の高いほど大きく、これらの特性から、Preston定理のメカニズムは、CMP研磨量はパッドとワークの接触点数に依存していると結論される。(2)本研究で想定した仮説にしたがえば、同一の研磨圧力下では、スラリーの平均砥粒間隔と研磨量との間には比例関係が成立することが期待された。しかし、実験結果は、この両者の間には、下に凸の放物線状の特性曲線が成立することが実験データによって明らかにされた。このことはCMP研磨作用に、スラリーの平均砥粒間隔の他に、砥粒粒径が大きな作用因子であることを示唆している。恐らく、パッドとワークの間に存在する液膜厚さとスラリー粒径の関わりが重要であると結論される。
注射器操作技術に関する研究-注射器内筒への手指接触について-

看護基礎教育機関では、アンプルから薬液を吸い上げる際、注射器内筒への手指接触およびアンプル切り口への注射針接触を不可としている。しかし、臨床ではいずれも接触させている人が多い。また、これまでの研究から、経験者と初学者では薬液吸い上げ時の注射器内圧や所要時間に差が見られており、手技が影響していると考える。そこで、無菌操作の必要性について検証するとともに、無菌操作の有無による技術習得への影響を検証した。1.微生物学的検討手洗いしない手指で通常の手技で、看護師51人にバイアル内のTS液状培地を5回ピストン操作してもらい、合計306本のバイアルについて菌の検出状況を確認した。2人(2本)から合計3種の菌が検出された。さらに、看護師14人、学生および教員29人に、手洗いしない手で故意に注射器内筒を強く握り込む方法で同様の操作をしてもらい、合計215本のバイアルについて実施した。5人(5本)から3種の菌が検出された。通常の手技での菌の検出率0.5%に対して故意に内筒を握り込むと2.3%であり、内筒の握り込みにより菌が薬液に移行する可能性が高くなることが実証された。しかし、検出された菌はいずれも病原微生物ではなく、表皮や環境に広く存在する菌であるため、衛生学的手洗いまたは消毒を厳守することで、手指接触が原因による薬液汚染を低減できると考える。2.人間工学的検討看護師72人、学生38人の手技をデジタルカメラで撮影し、構え、バイアルの保持方法、注射器の保持方法から5タイプの手技に分類された。また、医療・看護に無関係な学生11人を対象に、厳密な無菌操作または無菌操作を意識せずにアンプル入り薬液の吸い上げを行ってもらい、注射器内圧の最大値、所要時間、波形を比較した。その結果、厳密な無菌操作による方法は効率性が低いこと、無菌操作を厳守しない方法は比較的容易に習得できることがわかった。無菌的にアンプルの薬液を吸い上げるため、教育機関では注射器内筒への手指接触とアンプルカット面への注射針の接触を不可としているが、臨床では厳守されていない。そこで、これらの無菌操作の必要性を検証する。まず、内筒への内筒への手指接触による薬液汚染の有無を調べるため、病院勤務している看護師51名と臨床検査技師の学生・教員39名に手洗いをしない手指で普段実施している方法でバイアル内のTS液状培地を5回ピストン操作してもらった。1人36本の10ml注射器各を使用し合計423バイアル実施した。37°Cで10日間培養し経時観察した。2名(2バイアル)で細菌の増殖が確認された。分離培養の結果1つのバイアル(1名)からは3種類のコロニーが検出された。コロニー性状は異なったが、2種は表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)と同定された。1種は表皮ブドウ球菌の類似菌(Staphylococcus capltis)であった。もう1つのバイアルからは1種類のコロニーが検出され、同定の結果、Brevibacterium spp.(Coryneform)と確定された。

細菌の増殖が認められた被験者の注射器把持方法に特異性はなく、多くの被験者は内筒に手指を接触させていた。検出された細菌はいずれも皮膚常在菌であり、検出率はひじょうに少なく病原性は低いと思われるが、内筒の付着細菌が薬液内に移行する可能性は否定できない。注射器操作をする前に衛生学的手洗いまたは消毒を厳守することで、手指接触が原因による薬液汚染を低減することができると考える。次に、アンプルの切り口の汚染の有無を検証するため、梱包された状態のアンプル5箱から各10管合計50管(20管は個別包装)を選び、アンプル頚部の外壁を無菌生理食塩水に浸した滅菌綿棒で拭き取り、綿棒をTS半流動培地で培養した。ガラスアンプル2管、プラスチックアンプル1管から、各1種類のグラム陽性球菌が確認された。同定の結果、コロニーは3種ともMicrococcus spp.であった。個別包装されたプラスチックアンプル20管は全て陰性であった。検出された細菌は生活環境に広く存在しており、アンプルを使用する直前にアルコール綿で頚部を消毒することにより除去することが可能である。特にプラスチックアンプルは構造上、頚部の消毒が困難であり、切断面のプラスチック繊維の不定形な突出が見られるため、消毒方法や保管方法の工夫が必要と考える。1.微生物学的検討アンプル入り薬液を吸い上げる場合、教育機関では注射器内筒への手指接触とアンプルカット面への注射針の接触を不可としているが、臨床では接触させている人が多い。そこで、これらの無菌操作の必要性を検証するため、手洗いしない手で故意に注射器内筒を強く握り込み、菌の検出状況を確認した。看護師14人、学生および教員29人にバイアル内のTS液状培地を5回ピストン操作してもらった。1人5本の10ml注射器各を使用し合計215バイアル実施した。37°Cで10日間培養し経時観察した。5名(5バイアル)で細菌の増殖が確認され、分離培養の結果1バイアルから各1種類、全体では3種類のコロニーが検出された。検出された菌は表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、広く環境に存在するバシラス属(Staphylococcus Bacillus)、外耳道の常在菌(Staphylococcus auriclaris)であった。検出率は2.3%であり、普通の手つきによる検出率0.5%と結果と比較すると高い。いずれも病原微生物ではないため、衛生学的手洗いまたは消毒を厳守することで、手指接触が原因による薬液汚染を低減できると考える。2.人間工学的検討(1)看護師75人、学生38人の手技をデジタルカメラで撮影し、構え、バイアルの保持方法、注射器の保持方法から5タイプの手技に分類された。(2)医療・看護に無関係な学生11人を対象に、厳密な無菌操作によるアンプル入り薬液の吸い上げを行った場合と無菌操作を意識せずに行った場合について、注射器内圧の最大値、所要時間、波形を比較した。それぞれ100回練習してもらい、練習10回ごとに測定した。その結果、厳密な無菌操作は効率性が低いことがわかった。また、無菌操作を厳守しない方法は比較的容易に習得できることがわかった。
イネにおける有用遺伝子の起源に関する研究

イネの「緑の革命」で広範囲で利用された半矮性遺伝子(sd1)座の変異遺伝子の地理的分布から、「変異遺伝子は野生イネに保持され、在来品種形成過程で利用された」ものと「在来品種形成の過程で突然変異を人為的に選抜して利用された」ものの両者が存在することが分った。環境適応に対するsd1座の役割を検討するため、インド産野生系統(W107)とA58(北海道栽培系統)のRILsを用いて、適応的形質変異がsd1座近傍に検出されるかどうかを調査した。その結果、野生系統はA58よりも長稈に作用するQTLを保持しているにも関わらず、ヒエなどの水田主要雑草に対する強い競争力を支配するQTLがA58に発見された。さらに、長稈に作用するQTLを詳細にマップしたところ、sd1座を含む複数のQTLが密接に連鎖していることが判明した。遺伝子多様度の比較から、この領域は日印品種間で明瞭に分化しており、両者間には浸透交雑の形跡が殆ど見られないと考えられた。したがって、この領域は地理的分布に関わる適応的分化が隣接する微少なQTLの組合わせによって成立しており、環境適応を考える上で興味ある領域であると結論出来た。一方、第6染色体のモチ遺伝子の遺伝子多様度を品種分化との関連で比較したところ、日印品種間で浸透交雑の形跡が認められ、頻度は低いものの日本型特異な領域が印度型特異な領域に挿入された在来品種を見い出すことに始めて成功した。このことは、自然界に見られる多様性が集団内の遺伝的組換えにより創出され、人為選抜されたことを意味している。以上の結果から、有用遺伝子の多様化には、遺伝子によって異なる歴史的変遷を経てきたことが伺われる。この事実は、育種形質の多様化を考慮する上で、貴重な示唆を与えると期待される。イネの有用形質である半矮性遺伝子(sd1)とモチ遺伝子(wx)に関し、遺伝子の分布および遺伝子系統を明らかにして、有用遺伝子が品種に利用される経路と自然界における保持機構を明らかにすることが本研究の目的である。本年度は、まず、低脚烏尖(DGWG型)由来と十石(JKK型)由来のsd1遺伝子を識別するプライマーを用いて、野生・栽培259系統について変異アレーレの分布を調査した。その結果、中国産の野生2系統と台湾産在来1系統から新たにDGWG型変異遺伝子を見い出した。中国産およびインド産野生2系統と北海道産系統(A58)との間で組換え自殖系統を育成し、第1染色体のsd1近傍領域の分子マーカーを用いて、QTL解析を行ったところ、中国産系統では、明瞭にsd1の矮性効果が認められた。インド産1年生系統は典型的なr戦略を示し低い草型をもつが、sd1領域には予想に反して長稈作用を持つQTLが検出された。現在、この領域の詳細な比較を行っている。また、有用遺伝子の遺伝的経路を厳密に比較するために、sd1とWx遺伝子について64系統の塩基配列を決定した。両遺伝子とも日本型系統では、野生・インド型系統と比較して塩基多様度(π)が著しく減少しており、異なる染色体における類似の傾向は日本型イネの成立にボトルネック効果の存在することを強く示唆した。Wx遺伝子については、異なる対立遺伝子間で酵素活性を調査したところ、Wx^aとWx^bでは差異はないが、Wx^<in>では遺伝子産物の酵素活性が減じていることが判明した。現在、ネットワーク解析により分化経路を調査している。

緑の革命に利用されたイネ半矮性遺伝子(sd1)には低脚烏尖(DGWG型)と十石(JKK型)由来の変異遺伝子が知られる。10種256系統の調査から、DGWG型は台湾在来品種1系統と中国産O.rufipogon2系統で見出された。アジア栽培および野生イネ62系統の塩基配列から遺伝子系譜を解析した結果、2つの変異体は異なる系譜上で起源したことが分った。さらに、DGWG型変異体は元来野生イネに保持され、栽培法の近代化後、緑の革命に利用されたと推定された。DGWG型変異体をもつ野生イネは、他の遺伝子の存在により半矮性の効果を示さないため自然集団中で維持されてきたものと考えられた。また、sd1座には、野生イネ・印度型・日本型の間で複対立遺伝子が分化していることが同質遺伝子系統の比較から判明した。sd1座近傍には、栽培と野生イネの間で最も顕著な脱粒性のQTLが存在するので、品種分化との関連をさらに解析する必要が示唆された。1年生野生系統は低い草型をもつが、sd1領域には長桿に作用するQTLを持ち、従来報告のなかった短桿に作用するQTLが第7染色体に検出された。両領域におけるインド型・日本型品種・野生系統間において遺伝分化が生じているか、精密マッピングによって調査を進めている。インド型・日本型品種における複対立遺伝子の分化については、既にWx遺伝子座が詳細に調査されている。Wx座は澱粉合成酵素(GBSS)をコードしており、その複対立遺伝子は胚乳の酵素(GBSS)量とアミロース含量から見出された。各複対立遺伝子のタンパク質当たりの酵素活性を比較したところ、Wxa,Wxb,Wxin間では酵素活性に差は無いが、Wxopでは低下し、wxでは酵素活性が消失していた。遺伝子系統樹の解析は、これらの各複対立遺伝子が品種群特異的に生じたことを示唆した。イネの「緑の革命」で広範囲で利用された半矮性遺伝子(sd1)座の変異遺伝子の地理的分布から、「変異遺伝子は野生イネに保持され、在来品種形成過程で利用された」ものと「在来品種形成の過程で突然変異を人為的に選抜して利用された」ものの両者が存在することが分った。環境適応に対するsd1座の役割を検討するため、インド産野生系統(W107)とA58(北海道栽培系統)のRILsを用いて、適応的形質変異がsd1座近傍に検出されるかどうかを調査した。その結果、野生系統はA58よりも長稈に作用するQTLを保持しているにも関わらず、ヒエなどの水田主要雑草に対する強い競争力を支配するQTLがA58に発見された。さらに、長稈に作用するQTLを詳細にマップしたところ、sd1座を含む複数のQTLが密接に連鎖していることが判明した。遺伝子多様度の比較から、この領域は日印品種間で明瞭に分化しており、両者間には浸透交雑の形跡が殆ど見られないと考えられた。したがって、この領域は地理的分布に関わる適応的分化が隣接する微少なQTLの組合わせによって成立しており、環境適応を考える上で興味ある領域であると結論出来た。一方、第6染色体のモチ遺伝子の遺伝子多様度を品種分化との関連で比較したところ、日印品種間で浸透交雑の形跡が認められ、頻度は低いものの日本型特異な領域が印度型特異な領域に挿入された在来品種を見い出すことに始めて成功した。このことは、自然界に見られる多様性が集団内の遺伝的組換えにより創出され、人為選抜されたことを意味している。以上の結果から、有用遺伝子の多様化には、遺伝子によって異なる歴史的変遷を経てきたことが伺われる。
ナノ・マイクロレベルの革新的熱物性センシングとその応用

ナノ・マイクロレベルの熱・物質・運動量輸送性質を非接触かつ高速にセンシングすることが可能となれば、ナノテクノロジー研究の材料開発における戦略的基盤情報を提供するばかりでなく、全く新しい概念に基づいたデバイス創成の道が拓ける。本研究では、超高時空間分解能を有する熱物性センシング技術を原理の段階から開発し、多様な応用実証により包括的なマルチプロパティセンシングに関する研究基盤体系を確立するに至った。ナノ・マイクロレベルの熱物性値(特に熱・物質輸送性質)の計測技術は、次世代熱工学の基盤としてのみならず、あらゆる分野を横断する最先端研究開発の基盤技術として極めて重要である。例えば情報通信分野では、半導体デバイス内部の微細領域での放熱問題やHD-DVDのような高密度記録メディア内部の多層薄膜のナノ秒オーダーの熱伝導や相変化問題、ライフサイエンス分野ではDNA等の拡散や分離問題、またエネルギー・環境分野では、燃料電池用ポリマー薄膜内部の物質拡散問題等、枚挙にいとまがない。また学術的には、これら最先端の技術的課題を包括的に取り扱うためのナノ・マイクロレベル輸送現象に関する横断的な学問体系を構築する必要があり、熱物性センシング技術はその未知基本現象を定量的に解明する重要なツールとして不可欠である。しかしながら、従来の古典的な熱物性計測技術では、定常的な温度勾配や濃度勾配をmmcmオーダーで生成する必要があり、測定対象がナノ・マイクロレベルで極短時間に変動し、さらに空間分布しているような場合には原理的に適用が不可能であった。本研究の目的は、ナノ・マイクロレベルの熱・物質・運動量輸送性質(熱伝導率、温度伝導率、相互拡散係数、ソーレー係数、粘性係数、表面張力、表面粘弾性質)を(1)非侵襲かつin situ、(2)高空間分解能、(3)高時間分解能、(4)極微量サンプル、(5)異方性・2次元分布、がセンシング可能な全く新しい計測手法体系を基本原理から独自に開発し、熱物性センシングの新たな応用を世界に先駆けて提案することである。平成19年度は以下に挙げる要素技術の開発を行い、具体的な成果を得た。1.近接場蛍光熱顕微鏡の開発:試料にナノレベルで分子修飾あるいは分散させた蛍光粒子を近接場プローブで励起検出することで温度分布を光の回折限界を超えた高い空間分解能で測定する要素技術を構築した。(1)安定化CWレーザーを用いた微弱な近接場蛍光を高感度に検出するシステムを構築し、近接場領域の蛍光寿命を測定する技術を構築した。ナノ蛍光粒子の蛍光寿命-温度依存性を明らかにした。(2)ナノスケール温度分布の計測ツールとして、近接場光学顕微鏡プローブを用いた蛍光相関分光法の開発に着手した。100200nmの開口プローブにて十分なSN比を確保し、直径20100nmの蛍光ビーズを用いたデモ測定に成功した。また通常の光学顕微鏡ベースの蛍光相関分光法の応用として、加熱金粒子近傍の温度分布マッピングを試みた。2.フォトサーマル赤外検知法の開発:試料を高速に周期加熱することによって、ナノ・マイクロレベルの固-固界面における温度波干渉を直接観察し、ナノ機能性材料の熱伝導率、温度伝導率、界面熱抵抗をセンシングする要素技術を構築した。(1)高速周期変調レーザーを用いた周期加熱システムを構築し、薄膜の熱物性測定が可能となった。(2)SWNT-PMMA複合材料およびBi2Te3の測定を行い、システムの妥当性を確認した。3.リプロン表面光散乱法の開発:気-液界面に存在する分子の熱揺らぎに起因した微細な表面波(リプロン)を高感度に測定することで、表面粘弾性質を高精度に測定可能な分子振動センシング技術を構築した。(1)高出力レーザーと高精度スキャンシステムによるリプロン波長スイープ技術を構築し、3500μmの広範なリプロン波長を選択することが可能となった。(2)混合状態変化および分子吸着による表面粘弾性質変化を検出することに成功した。平成20年度は前年度に開発した要素技術の更なる高度化を目指し、以下に挙げる具体的な研究実績を得るに至った。1.近接場光学熱物性顕微鏡の開発:液中のナノ蛍光粒子および固体試料表面の近接場光学応答を非常に高い感度かつ高い空間分解能で検出し、試料の熱物性情報を抽出可能なナノレベルのセンシング技術を構築した。(1)開口径100500nmの近接場プローブを用い、溶液中の蛍光ビーズに対して蛍光相関分光をおこなった。ビーズのサイズ比を厳密に反映した相関時間の比を得たが、相関時間の絶対値は理論的予測値から大きく乖離しており、プローブ先端におけるビーズの異常な拡散を反映している可能性が高いと結論付けた。(2)相変化材料に対し、フェムト秒パルス照射による構造変化を誘起した。電子顕微鏡観察により溶融を経由しない構造変化である可能性が高いこと、またパルス幅・フルエンス依存性から、瞬間的な電子励起が構造変化に本質的であることを確認した。

2.レーザー誘起表面波法の開発:振幅がナノメートルオーダー、波長がマイクロメートルオーダーの人工的な表面波を誘起する革新的計測技術を構築し、液体試料の粘性率、表面張力を高精度に測定するシステムを構築した。(1)光ファイバ融着接続機を用いたファイバーシステムの構築により非常に高いSIN比を達成した。(2)血液などの非ニュートン流体への適用性について理論的・実験的に明らかにした。3.ソーレー強制レイリー散乱法の開発:液体中にレーザー励起温度格子を生成し、縞状温度変化に誘起された正弦波状の濃度勾配(ソーレー効果)の減衰時定数を検出することで、液体の拡散係数を高速かつ高精度に測定可能なシステムを構築した。(1)2位相DSPロックインアンプとハイパワーベンチトップタイプレーザーシステムを用いた高感度検出システムを構築した。(2)3成分ポリマー溶液の交差拡散現象を初めて観察することに成功した。平成21年度は前年度に開発した要素技術の更なる高度化を目指し、以下に挙げる具体的な研究実績を得るに至った。1)近接場光学熱物性顕微鏡の開発(1)ナノスケール固液界面における拡散現象を観測する手段として,近接場光学プローブを用いた蛍光相関分光法を開発した。界面近傍での拡散の異方性を含め,実験状況を忠実に再現した計算機シミュレーション(FDTD法+モンテカルロ法)と対比することにより,界面相互作用に起因する信号成分を測定データから抽出することに成功した。また,ナノ粒子の回転拡散運動に着目し,粒子形状や局所粘性を高速に測定する単一ナノ粒子偏光分光法,ならびにフォトサーマル効果と偏光検出を組み合わせた高感度ナノ粒子検出法を開発した。(2)近接場光を用いた自己組織化単分子膜(SAM)のナノスケール熱的パターニング技術を先駆けて開発し,非接触に大面積かつ加工中のSAM汚染が無い光学的ナノ構造制御基盤技術を確立した。2)フォトサーマル赤外検知法の開発(1)イットリウム系超伝導体(YBCO)を用いた薄膜線材におけるクエンチの3次元モデル解析において必要不可欠な熱伝導率および温度伝導率の測定を行い,YBCOの薄膜化に伴うフォノン散乱が熱伝導率ならびに温度伝導率の低下の原因になる可能性があることを示した。3)レーザー誘起表面波法(1)微細加工技術を用いた革新的マイクロ拡散センサーの開発に成功した。数mm角のチップ内に,数μm程度の干渉縞間隔で濃度分布を励起するシステムを集積化し,高速な拡散係数モニタリング技術を開発することに成功した。4)リプロン表面光散乱法(1)加圧溶解法によって発生させた酸素ナノバブルの表面物性値の経時変化を測定することに初めて成功した。酸素ナノバブル含有水は,ナノバブル発生前と比較して時間経過に伴い表面張力の減少ならびに粘性率の増加傾向を示すことを明らかにした。平成22年度は最終年度(平成23年度)に計画している「センシング技術の統合による応用実証」を目指し、以下に挙げるセンシング技術の高度化を達成した。(1)フォトサーマル赤外検知法の適用温度範囲の拡大:超伝導材料への適用を目指し極低温(1.5K)強磁場(7T)での測定が可能なシステムを構築した。(2)近接場光学熱顕微鏡の高度化:近接場光学熱物性顕微鏡に適用可能な高感度近接場ファイバーの設計を行った。
ABCトランスポーター能動輸送のポンプ収縮弛緩と逆止弁メカニズム

温泉に棲む好熱性真核生物Cyanidioschyzon merolae由来のP糖タンパク質であるCmABCB1の優れた結晶化能を利用して、同一分子の内向型と外向型の両立体配座の構造を初めて結晶化することに成功した。この結晶化によって、ヌクレオチドと結合した外向型構造がABCトランスポーターとしては最良の分解能である1.9オングストロームで明らかとなった。用いた変異型CmABCB1は、野生型とよく似た基質輸送活性とATP加水分解活性を示したことから、変異導入による構造への影響はほとんどないものと推定された。ポンプ機能に関わるアミノ酸残基として、新たにTrp400が見つかった。Trp400をTyrに置換すると輸送基質ローダミンに対する排出活性が著しく低下したが、他の輸送基質に対しては影響がなく、ローダミン特異的な何らかの機能を有するアミノ残残基であることが明らかとなった。また、NMRによる解析の標的であるTrp残基の構造状態を蛍光スペクトルによって分析する手法を確立した。そこで、基質輸送の経路となっている部位を結晶構造解析の結果から予測して、新たにTrp残基を導入したところ、基質結合に伴い、蛍光強度の大幅な消光が観測されたことから、基質結合を蛍光分析によって観測することが可能となった。新たに立体構造が明らかになった変異型CmABCB1を用いて分子動力学計算による立体構造変化のシミュレーションを行った。また、多種類の基質を用いた場合の輸送過程についてもシミュレーションを行った。その結果、Trp蛍光分析によって明らかとなったアミノ酸残基がその経路上に位置することが判明した。さらに、前年度合成に成功したローダミン誘導体RT-17との複合体の結晶化に成功した。得られた結晶をX線解析に供した結果、CmABCB1の膜貫通領域の中央の内腔にRT-17と思われる電子密度を観測することができた。本研究では、方法論の異なる5つの研究手法を協奏的に用いてABCトランスポーターメカニズムに迫ろうとする点が革新的であり、また、前例のない成果が得られつつある。特に、Nature Communicationに発表した同一分子における異なる2つの立体配座の高分解能での結晶構造決定の成果は、ABCトランスポーターのメカニズムの基盤でとなる交互アクセスモデルを構成する2つの状態すなわち内向型と外向型状態の立体構造であり、研究コミュニティが長らく待ち焦がれたそれぞれの立体構造と詳細な構造変化の情報を提供したものとなった。一方、NMR解析においては、15Nラベル化体の供給に問題が生じTrp残基の構造変化を指標とする動的構造解析が遅れている。しかし、Trp残基の蛍光特性を生かし、蛍光スペクトル分析に変更したところ、基質結合部位を検出することに成功した。また、この結果は、独立に行ってきた分子動力学計算を用いたシミュレーションの結果とも整合したことから、新たな成果に結びつきつつある。さらに、合成した新規阻害剤との複合体の結晶も得られたことから、今後さらなる大きな成果が期待されることとなった。阻害剤との複合体のX線結晶解析、変異体の機能解析と、結晶解析用の大量試料の調製、MD計算、有機合成は、当初の計画通り順調に進んでおり、今後とも順調に進むものと考えられる。一方、NMR解析においては、試料調製の再現性に問題が生じたが、培地の再検討と菌株の培地への順応を達成することにより新たな培養方法が見つかり、15Nラベル化体を安定供給することが可能となった。さらに、NMRの実験を補完目的で行った蛍光スペクトルを用いた立体構造変化の補足実験から、基質結合を検出できる新たな計測系を確立することができている。今後は、これら成果を活用して当初の目的だったポンプ収縮弛緩と逆止弁メカニズムの解明を達成できるものと思われるだけでなく、基質排出ゲートの開閉制御のメカニズムの解明についても期待できる状況が生じている。マグネシウムイオンとATPアナログ複合体をABCトランスポーターとしては前例のない高分解能(2.0オングストローム)で構造決定した。その結果、ヌクレオチド結合ドメイン(NBD)の二量体を安定化する新たな機能モチーフを発見した。また、基質アナログ複合体とCmABCB1複合体を初めて結晶化することができた。ついで、ポンプ機能に関わるアミノ酸残基として、Phe138、Phe384、Tyr358、Gln398、Pro400、Tyr233、Lys237、Ala240の改変がポンプ機能を著しく低下させることを確認した。これらは、膜貫通ヘリックスのTM3とTM6に局在することから、この2本のヘリックスが基質輸送メカニズムに関わることが機能解析によって確かめられた。これまでに確立したPichia pastorisの培養方法では、15N標識の標識効率が安定せず、NMR測定に必要な試料を安定に供給することが困難であることが判明した。そこで、原因を探るために、質量分析(MALDI-TOF)を用いて試料タンパク質の標識効率を計測する実験系を確立した。これにより、精製したCmABCB1を用いて15Nラベル体と14Nラベル体の分子量の計測が可能になった。これまでに立体構造を決定した内向型および外向型CmABCB1の結晶構造を最初と最後の構造として、それらをつなぐ動的なコンフォーメーションの構造を分子動力学計算により求めた。その結果、ATPおよびMgイオンの結合によってNBDが二量体化を起こし、その構造変化がトランスメンブレンドメインに伝わり基質排出ゲートが開く様子をシミュレーションすることができた。

ローダミン誘導体RT-17を合成したところ、ATP加水分解酵素活性のKm値および阻害定数Ki値がいずれもローダミンと比較して小さく、CmABCB1との特異性が向上した化合物であることが判明した。本研究では、方法論の異なる5つの研究手法を協奏的に用いてABCトランスポーターメカニズムに迫ろうとする点が革新的であり、また、前例のない成果に結び付くものと考えられる。それら5つのうち、基質及び阻害剤との複合体のX線結晶解析、変異体の機能解析と大量試料の調製、MD計算、有機合成は当初の計画通りか、それを超える成果が得られていると言える。すなわち、ヌクレオチドとマグネシウムイオンの結合した結晶構造では、ABCトランスポーターとして、前例のない高分解能での構造決定に成功し、外向型構造の安定化に寄与する新規モチーフ構造を発見した。さらに、従来は主鎖の構造変化のみが議論されてきた輸送メカニズムと立体構造変化において、主要な残基の側鎖の役割が明らかとなった。従来は部位特異的変異と機能における必要性が議論されていただけであったものが、それぞれのアミノ酸残基の具体的な役割が立体構造変化に基づいて解明されつつある。一方、NMR解析においては、当初は順調に進んでいたが、途中から試料調製の再現性に問題が生じ、15Nラベル化体を安定供給することが困難となった。そこで、その原因を定量的に探るため、15Nラベル体を定量する手法の開発を行い、巨大な膜タンパク質を直接MALDI-TOFによる質量分析によって計測できる実験系を確立した。この方法により、培養条件に問題があることが判明したことから、その問題解決を図れば、当初計画の実現に至る見込みがあることが明らかとなった。温泉に棲む好熱性真核生物Cyanidioschyzon merolae由来のP糖タンパク質であるCmABCB1の優れた結晶化能を利用して、同一分子の内向型と外向型の両立体配座の構造を初めて結晶化することに成功した。この結晶化によって、ヌクレオチドと結合した外向型構造がABCトランスポーターとしては最良の分解能である1.9オングストロームで明らかとなった。用いた変異型CmABCB1は、野生型とよく似た基質輸送活性とATP加水分解活性を示したことから、変異導入による構造への影響はほとんどないものと推定された。ポンプ機能に関わるアミノ酸残基として、新たにTrp400が見つかった。Trp400をTyrに置換すると輸送基質ローダミンに対する排出活性が著しく低下したが、他の輸送基質に対しては影響がなく、ローダミン特異的な何らかの機能を有するアミノ残残基であることが明らかとなった。また、NMRによる解析の標的であるTrp残基の構造状態を蛍光スペクトルによって分析する手法を確立した。そこで、基質輸送の経路となっている部位を結晶構造解析の結果から予測して、新たにTrp残基を導入したところ、基質結合に伴い、蛍光強度の大幅な消光が観測されたことから、基質結合を蛍光分析によって観測することが可能となった。新たに立体構造が明らかになった変異型CmABCB1を用いて分子動力学計算による立体構造変化のシミュレーションを行った。また、多種類の基質を用いた場合の輸送過程についてもシミュレーションを行った。