hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
渓流環境への適応をモデルとした植物の適応進化機構のゲノムレベルでの解明

本年度は、屋久島の渓流沿い植物ホソバハグマとその近縁種で林床に生育するキッコウハグマ(キク科モミジバグマ属の多年生草本)を用いて、両者の雑種を含めた集団の遺伝構造、ハビタット分化、形態分化を総合的に解析した。その結果、これらの2種は自然集団で交雑を起こしているにもかかわらず、対照的な渓流帯・林床環境の自然選択圧によって、顕著な形態的・遺伝的分化が維持されているという、「生態的な生殖隔離」の存在を明らかにした。この内容は、生物の進化に関する重要な知見であると評価され、当該分野において著名な国際誌であるEvolution誌に掲載された。続いて、渓流種と林床種の生態的分化の過程を、集団遺伝学の集団分化モデルを用いて解析した。屋久島固有の渓流種ホソバハグマとその姉妹種キッコウハグマ、さらに、沖縄島固有の渓流種ナガバハグマとその姉妹種オキナワバグマにおける分岐年代と遺伝子流動を推定し、渓流種が最終氷期あるいは後氷期に、隣接する林床種から適応的に進化した可能性を示した。本研究は、結果的に当初の目標であった適応進化のゲノム基盤を解明するまでには至らなかったが、本研究の成果は渓流-林床というような環境勾配の中で、植物が生態的要因によって急速に種分化を起こす可能性を示すものであるとして高く評価された。一連の成果は全て関連学会で発表し、投稿論文として受理まなは掲載される見込みである。新しい種が形成され、生物多様性が生み出される主要な原動力は、さまざまな環境への適応と進化であると考えられる。本研究では、林床環境から隣接する渓流帯への植物の適応進化プロセスに着目している。この実験系を用いるメリットは、まず適応形態(葉の細長さ、厚さ等)と、それをもたらす自然選択(水流、光強度等)が非常に明瞭であることが挙げられる。さちに、ごく近縁種間、または種内で適応的な表現型の変異が見られるため、妥当な比較生態、遺伝学的解析が可能である。本年度は、屋久島に分布するキク科のホソバハグマ(渓流型)、キッコウハグヤ(林床型)、さらに両種の自然雑種を用いて、それらの生態的・遺伝的分化を解析した。具体的には、まず生存率に大きな影響を与える形態(葉の構造)と、生理特性(光環境への応答として光合成効率)を比較解析し、種間での有意な形態的、生理的分化と、種間雑種の中間的な形質を明らかにした(第8回日本植物学会口頭発表)。さらに、個体レベルで遺伝子タイプ決定を可能とするマイクロサテライトDNAマーカーを開発し(Mitsui et al.2008)、自然集団の交雑帯における遺伝的構成を解析した。その結果、ホソバハグマとキッコウハグマは定期的に種間交雑を起こし、雑種が形成されているが、雑種はF1またはF2世代がほとんどであることが分かった。生態的、遺伝的解析によって、中間的な形質の雑種は、渓流帯、林床の自然選択によって淘汰されてしまうことで、種間の遺伝子浸透が制限され、顕著な分化がもたらされていることが示唆された。以上の内容をまとめ、第8回日本植物分類学会で口頭発表した。現在、進化生物学の著名な学術雑誌であるEvolutionへの投稿準備を進めている。本年度の研究成果は大きく3つの内容にまとめられ、学会で発表するか、または論文として投稿し掲載された。(1)屋久島の渓流沿い植物ホソバハグマとその近縁種で林床に生育するキッコウハグマ(キク科モミジハグマ属の多年生草本)を用いて、両者の雑種を含めた集団の遺伝構造、ハビタット分化、形態分化を総合的に解析した。この研究成果を2009年8月にイタリアのトリノで行われた第12回ヨーロッパ進化生物学会で発表した。またこの内容を投稿論文としてまとめ現在Evolution誌にて査読中である。(2)前年度までに投稿論文としてまとめていた、屋久島の渓流沿い植物ホソバハグマの集団遺伝構造に関する研究が、2010年にAmerican Journal of Botany誌に掲載された。この研究は、洪水を伴う過酷な環境に生育する渓流沿い植物の、集団形成・維持機構について、分子遺伝マーカーを用いて詳細に調べた研究として高く評価された。(3)生物の多様な姿形・生態の進化は、様々な環境への適応によって非常に短期間のうちに起こる可能性がある。我々は最新の集団遺伝学的手法を用いて、複数の核遺伝子領域を分子マーカーに用いて、琉球列島で多様化を遂げているモミジバグマ属近縁種における系統進化の歴史的なプロセスを推定した。その結果、形態・生態的に全く異なる4つの近縁種は、驚くべきことに非常に最近(数万年前)に分化した可能性が示唆され、おそらく琉球列島の湿潤な気候によって形成された渓流環境への適応進化が、このような急速な種分化をもたらしていると考えられた。この研究の結果を2010年3月に行われた第9回日本植物分類学会(愛知)で口頭発表し、非常に先駆的な研究として高く評価され、学会発表で大会発表賞を受賞した。

本年度は、屋久島の渓流沿い植物ホソバハグマとその近縁種で林床に生育するキッコウハグマ(キク科モミジバグマ属の多年生草本)を用いて、両者の雑種を含めた集団の遺伝構造、ハビタット分化、形態分化を総合的に解析した。その結果、これらの2種は自然集団で交雑を起こしているにもかかわらず、対照的な渓流帯・林床環境の自然選択圧によって、顕著な形態的・遺伝的分化が維持されているという、「生態的な生殖隔離」の存在を明らかにした。この内容は、生物の進化に関する重要な知見であると評価され、当該分野において著名な国際誌であるEvolution誌に掲載された。続いて、渓流種と林床種の生態的分化の過程を、集団遺伝学の集団分化モデルを用いて解析した。屋久島固有の渓流種ホソバハグマとその姉妹種キッコウハグマ、さらに、沖縄島固有の渓流種ナガバハグマとその姉妹種オキナワバグマにおける分岐年代と遺伝子流動を推定し、渓流種が最終氷期あるいは後氷期に、隣接する林床種から適応的に進化した可能性を示した。本研究は、結果的に当初の目標であった適応進化のゲノム基盤を解明するまでには至らなかったが、本研究の成果は渓流-林床というような環境勾配の中で、植物が生態的要因によって急速に種分化を起こす可能性を示すものであるとして高く評価された。一連の成果は全て関連学会で発表し、投稿論文として受理まなは掲載される見込みである。
スーパーコンピューターによる「分子レバレッジ」仮説の検証

血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIaの細胞外ドメインを分子動力学計算の対象とした。細胞内ドメインのわずかな構造変化が細胞外ドメインの大きな構造を惹起する「分枝レバレッジ仮説」の妥当性検証のために、GPIIb/IIIaの細胞外ドメインの活性型構造と非活性型構造の遷移の可能性を検証した。分子動力学計算には本予算にて施設内に購入したXeon Pfiおよび学外高性能コンピューターとしてOakforest-PACSを用いた。GPIIb/IIIaの活性型構造に、リガンドとしてフィブリノーゲンのドデカペプチドが結合した構造を初期構造とした。リガンドが結合した条件では2フェムト秒毎に分子動力学計算を行い安定した構造も活性型構造に近似した。「分子レバレッジ」仮説の前提となる細胞外ドメインの複数のエネルギー的安定構造を明らかにするために、ドデカペプチドを外して2フェムト秒毎の分子動力学計算を10,00,000ステップ施行した。計算の継続とともに、細胞外ドメインは、中央付近にて折れ曲り、非活性型構造に近似した形態へと変化した。2年間の研究により、GPIIb/IIIaの細胞外ドメインは、GPIbalphaとは異なり、エネルギー的に安定した構造が複数存在すること、そのエネルギー安定構造の一部は活性型構造に、一部は非活性型構造に類似していること、お互いのエネルギー的安定構造間の遷移を惹起するためのエネルギー障壁は高くないことを確認した。細胞膜を支点、細胞内ドメインを力点、細胞外ドメインを作動点とした「分子レバレッジ」とするために、細胞膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの構造を、過去に公開されたNMR解析と矛盾しない構造として自作した。「分子レバレッジ」における力点、支点、作用点となるアミノ酸を明確にするための予備的研究にも成功した。生命体は、わずかなエネルギーにより、外界の変化に速やかに対応して動的平衡を維持するメカニズムとして、細胞内環境のわずかな変化により細胞外ドメインの大きな構造変化を起こす蛋白質として血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIaに注目した。GPIIb/IIIaは細胞膜貫通蛋白である。細胞膜貫通部位を支点、細胞内ドメインを力点、細胞外ドメインを作用点とする分子レバレッジにより、細胞内ドメインのわずかな構造変化が細胞外ドメインの大きな構造変化を惹起するモデルを考案した。GPIIb/IIIaの細胞膜貫通ドメインを実際に細胞膜に配置し、細胞外ドメイン、細胞内ドメインを配置した。細胞外ドメインの初期構造には過去のX線構造解析の結果を用いた。細胞内ドメイン、膜貫通ドメインの初期構造としてはNMR解析結果を用いた。活性化を惹起する細胞内ドメインの構造変化としてリン酸化Talinとの結合を過程した。巨大分子であるTalinのうち、GPIIb/IIIaの細胞内ドメインと結合するF3ドメインを用いる。蛋白質の静的構造の指標となるX線構造解析と異なり、活性化構造と非活性化構造の間を動的に遷移するGPIIb/IIIaの3次元構造を動的に分子動力学計算するための基盤モデルの作成に成功した。活性型構造にてフィブリノーゲンのドデカペプチドと結合したGPIIb/IIIaの動的構造を2x10-15秒ごとに解くことにより、50ピコ秒程度までの計算により非活性型構造に遷移することを本年度の計算にて確認した。「分子レバレッジ」の存在を確認するまでには至っていないが、GPIIb/IIIa分子が動的に高次構造変化すること、その時の細胞外ドメインの構造変化に比較すると細胞内ドメインの構造変化は小さいことは確認できた。分子レバレッジ仮説の検証のために、細胞膜を支点、細胞外ドメインを作用点、細胞内ドメインを力点としてGPIIb/IIIa分子を「てこ」の配置にする必要がある。過去に報告されたX線構造解析、NNR解析などの結果を参考にして基盤モデルを作成した。基盤モデルを構成する原子を初期配置し、CHARMM力場を用いた分子動力学計算を可能とした。細胞膜としては脂質二重膜のモデルを用いた。脂質二重膜は硬いので、膜に厚みがあっても支点として作用できる。細胞内ドメインは細胞外ドメインに比較して小さいので力点として作用し得ることを確認した。計算のための基盤モデルの作成に成功したこと、学内のXeon Phiの整備に成功したこと、実際にXeon Phiを用いてGPIIb/IIIaの動的3次元構造遷移の計算に成功したことから、本研究は概ね順調に進行していると判断した。分子レバレッジは仮説であるが、仮説を完全に否定できない場合に、本研究の終末をどの時点に設定するかの判断は難しいことがわかった。

計算の継続とともに、細胞外ドメインは、中央付近にて折れ曲り、非活性型構造に近似した形態へと変化した。2年間の研究により、GPIIb/IIIaの細胞外ドメインは、GPIbalphaとは異なり、エネルギー的に安定した構造が複数存在すること、そのエネルギー安定構造の一部は活性型構造に、一部は非活性型構造に類似していること、お互いのエネルギー的安定構造間の遷移を惹起するためのエネルギー障壁は高くないことを確認した。細胞膜を支点、細胞内ドメインを力点、細胞外ドメインを作動点とした「分子レバレッジ」とするために、細胞膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの構造を、過去に公開されたNMR解析と矛盾しない構造として自作した。「分子レバレッジ」における力点、支点、作用点となるアミノ酸を明確にするための予備的研究にも成功した。本年度学内コンピューターとしてXeon phiを整備した。Xeon phiには46GBのメインメモリーの他に32GBのMCDRAMという高速メモリーが搭載されている。本研究の大規模計算に用いる大きなサイズのデータを用いる場合,メモリーからCPUへのデータの転送が高速計算施行のためのボトルネックとなり、CPUの計算力を十分に発揮できない.学内に整備したXeon phiにて十分な計算効率を発揮するために、メインメモリーの使用を避け、高速なメモリーであるMCDRAMからのCPUへのデータ転送を効率的に利用する必要がある。脂質二重膜を含むGPIIb/IIIaの構造は大きすぎてXeon PhiのMCDRAMに入りきらない。分子レバレッジ仮説の証明のためには脂質二重膜を含むGPIIb/IIIaの細胞内外ドメインの一括計算が直感的ではあるが、細胞膜貫通ドメインの構造揺らぎは小さいので、細胞外ドメインと細胞内ドメインを分割計算することも可能である。Xeon Phiを用いて計算するときには、GPIIb/IIIaの構造計算を各々がMCDRAMに入る4つのプロセスに分割し、各々別個に計算する方法を工夫した。本法により、各プロセスがMCDRAMに収まるので計算は効率化可能である。各ノードで64コアをフルに活用することにより計算の効率化を図る。さらに本研究を加速化させる計算結果を保存するハードディスクなどの消耗品の価格が技術の進歩とともに安価になったため差額が生じた。2018年度には計算が本格化するのでさらに消耗品が必要となるのでそこで使用する。
正常人における炎症マーカーCRP高値を規定する炎症関連遺伝子多型に関する研究

高感度CRP測定法が導入され、健常人であっても血清CRPレベルに高低があることが判明してきた。疫学調査は、血清CRP値が高値の集団は低値の集団より心筋梗塞のリスクが高いことを示している。しかし、その背景に潜む分子機序に関しては未だ十分解明されていない。本研究では、「炎症応答の良い遺伝子多型の個体は健常時の血清CRP値が高く、動脈硬化を促進する環境因子への炎症応答も高いため心筋梗塞のリスクも高い」という仮説を立て、炎症応答に関連すると考えられるプロ炎症性サイトカイン遺伝子、調節性ないし抑制性サイトカイン遺伝子、酸化ストレス調節遺伝子の一塩基多型(SNPs)と血清CRPの相関を年齢、性、白血球数、貧血、糖尿病(HbAlc)を調節しながら検討した。対象集団は、1999年10月から2001年1月の期間に受診した成人健康調査コホート集団のうち、急性炎症、慢性肝疾患、腎不全、自己免疫疾患、癌の既往がない1000名である。血清CRP値が高値上位149名、低値下位から151名を選び検討した。蛍光共鳴エネルギー移転(FRET)-PCR法によりSNPsを測定した。リンホトキシンα(LTA)のA252G多型は、有意に血清CRPと相関した(修飾因子未調整オッズ比=1.90、p=0.007、調整後オッズ比=1.93、p=0.014)。LTA遺伝子252Gアリールは、近隣のNFKBIL1遺伝子の-62AアリールおよびBAT1遺伝子-22Cアリールと連鎖不平衡にあり、いずれのアリールも炎症を増強する方向に働くと推測されている。Ozakiらは、LTA252Gアリールが心筋梗塞のリスク要因であることを報告している。我々の研究結果は、環境要因に対して高炎症応答性の個体ほど血清CRP値が高く、そのことが心筋梗塞のリスク要因になっていることを示唆している。本研究は、遺伝子型が前臨床状態の検査測定値へ及ぼす影響を検討する事を目的とする。動脈硬化の一原因と考えられるClamidia pneumoniae感染に対する炎症応答の高低を高感度CRPで評価し、遺伝子多型とのassociationを検討する。放射線影響研究所が1958年から臨床追跡調査している成人健康調査コホートの中から、1999年より2000年に高感度CRP検査を受けた約1700名の対象者の中から、膠原病、橋本病、慢性肝炎、糖尿病、癌の現症ないし既往を有さない対象者で、CRP高値トップ151名、CRP低値ボトム150名を選んだ。常在感染症の一つであるClamidia pneumoniae感染をIgG抗体価およびIgA抗体価で評価した。全対象者より、3省ガイドラインに基づき、書面のインフォームドコンセントを取得した。
上部尿路結石形成機序における分子生物学的検討

尿路結石症患者や結石モデルラットの腎にオステオポンチン(OPN)が強く発現していること、動脈硬化症ではマクロファージがOPNを発現し石灰化を起こすことは報告した。これまでに私たちは、腎結石を持ったヒトの腎尿細管細胞と実験的シュウ酸結石形成ラットの腎尿細管細胞において遺伝子レベルでもOPNとCPTの強い発現を認めており、ヒトのカルシウム含有結石のマトリックスにOPNとCPTの存在を証明した。また、腎結石を持ったヒトの腎だけでなく実験的シュウ酸結石形成ラットの腎においてもマクロファージが尿細管細胞の周囲の間質に遊走してきており、それは、結石の形成やOPNの発現が増強するよりも早期に遊走していた。そして、ヒトの腎と結石形成ラットの腎においては、炎症性サイトカインである1L-1、1L-6、TNFα、TGFβの発現が認められ、結石ラットではマクロファージの出現よりも早期に炎症性サイトカインの発現を認めている。また、細胞接着分子のICAM-1の発現もサイトカインと同時点で認められた。以上の結果から、OPN、CPT、MGP、マクロファージ、サイトカインが結石形成の初期の段階から重要な役割を果たしていることが示唆された。臨床的に尿路結石症の原因の一つに骨代謝異常が示唆されている。骨粗鬆症の治療薬として臨床応用が始まりつつあるビスフォスフォネートとエルカトニンに着目し、実験的高カルシウム血症ラットにビスフォスフォネートを同時に投与したところ遺伝子レベル、蛋白質レベルでOPNの発現を抑制することを見いだした。さらに、その機序は、プロトオンコジーンc-srcの発現物質であり細胞内のsignal transductionにあずかるSrcチロシンキナーゼの活性を抑制することでOPNの発現を遺伝子レベル、蛋白質レベルで抑制することが示唆された。
質量分析イメージングによるホヤ神経ペプチドの3次元脳内マッピング

本研究ではカタユウレイボヤの脳におけるペプチドミクスデータに基づき、イメージングMSを用いて多種神経ペプチドの分布を明らかにした。本研究ではさらに、神経細胞で蛍光タンパクを発現するトランスジェニックホヤの脳切片と情報処理的操作を併用した高解像度イメージングMS解析法を新たに開発し、通常の組織学では難しい4つの神経ペプチドの多重検出を細胞レベルの解像度で達成した。さらに高解像度イメージングMSの結果は、神経ペプチドの特異的抗体による免疫染色と類似する結果となったことから、この方法により高精度でペプチドの分布を解析できることが示唆され、脳内マッピングのための基盤が形成された。本年度はホヤの神経複合体組織上で、質量分析によりペプチドを検出するために最適なマトリックスを検討した。その結果、高エネルギーのレーザーを組織に照射してペプチドを検出するという質量分析イメージングの実験条件では、2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)が安定的にペプチドピークを検出することができたことから、最も最適なマトリックスはDHBであると決定した。また、ペプチドのイオン化を阻害する夾雑物の除去について検討した結果、ノルマルヘキサンを多く含有する石油エーテルにより切片を20秒間洗うことで、脂質等の夾雑物を除き、ペプチドが効率よくイオン化することを見出した。MS/MS分析を行った結果、少数のフラグメントピークは得られたものの、ピーク強度が低かったことから、薄切片上に存在するペプチド濃度が想定以上に低く、MS/MS分析を行うにはペプチドのイオン化効率などを改善する必要があることが示唆された。本年度はマトリックスを溶解する溶媒や塗布法を検討し最適化することにより、再現性良くイメージング結果を得ることができた。また10-20マイクロメートルの空間分解能を達成した。その他に質量分析装置の調整、最適化等を行い、イメージングデータの精度や信頼性を向上させた。この方法を踏まえて、ホヤ脳神経複合体の組織切片を分析した結果、脳神経複合体を形成する脳神経節と神経腺のそれぞれの組織に特異的な神経ペプチドや低分子化合物を検出することができた。それぞれのイメージング結果を比較し、マージ等をすることにより神経ペプチドや低分子化合物の二次元分布や共存情報を画像化することができた。本年度は1高分解能と高再現性を可能にするマトリックス塗布法の最適化と2質量分析イメージングによるホヤ神経ペプチド分布の2次元画像化を達成目標として研究を行い、以下のような成果を得た。1マトリックス溶媒や塗布法を最適化した結果、再現性良くイメージングデータを得ることができた。2ホヤ脳神経節複合体の組織切片の分析結果から組織特異的な神経ペプチドや低分子化合物の分布を2次元化することができた。いずれの項目についても概ね計画通り進んだため(2)の評価とした。本年度はイメージングMS像の3次元化を目指したが、イメージングMS像の空間解像度が低いため3次元化した際に鮮明な像を得ることが難しいという問題が生じた。そこで本年度はイメージングMS像の高解像度化に取り組んだ。神経細胞で蛍光タンパクを発現するトランスジェニックホヤの脳切片において、蛍光顕微鏡により細胞の分布像を得ると同時に同一切片でイメージングMS像を得た。独自に開発した画像処理プログラムを用いて、細胞の分布像にイメージングMS像を融合させることで、通常のイメージングMSでは不可能な細胞レベルの解像度を持つイメージングMS像の取得に成功した。この方法により4つの神経ペプチドの分布を同一の切片において視覚化することに成功した。さらに代表的な神経ペプチド(Ci-TK-I)について、特異的抗体を用いた免疫染色と高解像度イメージングMS像を比較した結果、類似の分布パターンを示したことから、高解像度イメージングMSの信頼性を検証することができた。また、イメージングMSによって明らかにした神経ペプチドと末梢器官との相関性を明らかにする基盤構築を目的として、神経系で蛍光タンパクを発現するトランスジェニックホヤにおいて、蛍光を指標として神経線維の投射や神経細胞の分布を解析した。その結果、脳から入出水口、輸精管、輸卵管、直腸、卵巣等への神経投射パターンと、脳から卵巣まで続く神経細胞の集合体である背索叢について、ホールマウント観察による詳細な形態を明らかにした。本年度は1組織上でのペプチド分析に最適なマトリックスの探索2ペプチド以外の夾雑物を除去する切片処理法の確立3MS/MS分析によるペプチドピークの検証の3つの項目を達成目標として研究を行ない、以下のような成果が得られた。1組織上でのペプチド分析には2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DBH)が最も適切であることを決定した。2切片処理として、石油エーテルにより切片を洗うことにでペプチド以外の夾雑物を効果的に除くことができた。3切片上でMS/MS分析を行った結果、少数のフラグメントピークが得られた。

切片上に存在するペプチド濃度が想定以上に低く、MS/MS分析を行うにはペプチドのイオン化効率を改善するなどの必要があることが示唆された。いずれの項目についても概ね計画通りに進んだため、(2)の評価とした。平成28年度は計画通り、質量分析イメージングの3次元構築を目指してホヤ脳神経複合体の組織切片の全データを統合する。3次元構築を達成したのち多変量解析を行い、ホヤの脳部位ごとに多く発現しているペプチドや、同時局在しているペプチドといった発現パターンを把握し、ホヤ神経ペプチドの脳内における空間分布を特徴づける。神経内分泌平成27年度は予定通り空間分解能を上げるためのマトリックス塗布法の最適化と、イメージングによる神経ペプチド分布の2次元画像化・共存情報の分析を行う。本年度行なったMS/MS分析において、得られたピーク強度が低かったため、ペプチドのイオン化効率を上げるための誘導体化試薬の使用を検討している。また、免疫染色との対比も有効であると考えられるため、ペプチド抗体の作製を検討している。
西田幾多郎-不二の探求

平成15年度は、西田哲学における不一不二元論についての研究を続けて、刷新的な解釈を発展させ、学会発表をおこない、裏面に記載した諸論文を公刊しました。最近は、西田哲学の注釈に取り組んでいますが、その際、基本的な解釈として考えられるのは二つだけです。西谷啓治と上田閑照に従う学者は西田哲学に於ける「絶対矛盾的自己同一」という概念を哲学の問題の解決と述べていますし、批判者は西田哲学を非哲学的であるとかたづけています。支持者も批判者も西田哲学を同一哲学として解釈していますが、そういう解釈は西田の哲学を誤解することになると思います。それに反して、私は同一と差異を含める解釈方法を導入します。殊に、西田哲学に従う西谷啓治と上田閑照だけではなく、同一の哲学を支える務台理作と同時に、それを批判する田辺元と高橋里美の立場から見ると、西田哲学を不一不二元論としで理解すればいいと思います。そうすると、西田哲学は仏教における思想を解明し、現代哲学に適用されることによって、哲学に刷新的な貢献をすることになると言えます。現在も引き続き、コンピュータの製品、殊に、外付けドライブ、スキャナー、及びOCRソフトを購入したり、自分が所有している西田全集の半分以上をスキャンしたり、CDで録画したりしています。この作業によって、キーワード検索や、結果の印刷ができるようになります。私のアシスタントにスキャンしてもらいました。また、京都学派に関する引用や定義などコンピュータのデータベースも作成しています。それから、西谷啓治と上田閑照等についての図書を買ったり、講義、又は研究会に出席するために京都に行ったりしました。研究費によって研究を大変援助していただき、有難うございました。近年、西田哲学について多くの論文や書物が著わされていますが、そこでの基本的な解釈は二つだけです。一方は西田哲学における「絶対矛盾的自己同一」という概念を哲学の問題の解決と述べていますし、他方は西田哲学を非哲学的であると片付けています。私は西田哲学を不二元論として紹介してみたいと考えています。詳しく言えば、西田哲学を京都学派の中の様々な見解と比べたり、西田哲学から不二元論を展開したり、ポストモダンのアイデンティティの政治論に適用しようと考えております。補助金を利用して、コンピューター本体、スキャナー、プリンター等のコンピューター関連の物品を購入し、西田全集をスキャンし、CDに記録するという作業を始めました。これによりキーワード検索とその結果のプリント・アウトが可能となりました。現在は、アシスタントの方にスキャンしてもらっています。また、彼は、私が指定する引用や定義などをデータベースに入力してくれています。これらの作業の結果、キーワード、年月日、論文名等から特定の引用や記述の検索が可能となり、私の研究にとって大きな支えとなります。さらに、彼は私の日本語の論文を校正してくれています。最後に、私が在籍する南山宗教文化研究所にはなく、私の研究には不可欠である京都学派の比較的マイナーな哲学者の書物を購入しました。現在までに、西田幾多郎全集と最近出版された西田哲学についての研究書を一覧し、執筆中の本のアウトラインを決定した上で、私の方法を西田と高橋の論争から展開いたしました。西田哲学の解釈は、一般に新カント派や現象学との関わりで行われることが多いのですが、私はそれに反して、西田哲学における弁証法と高橋の包弁証法との対比という観点から、西田解釈を行いたいと考えております。
危険な自殺手段制限のための基礎的研究

本研究では、以下の3点に関する検討を行った。1)2003から2013年の日本で急増した練炭自殺の地理的影響を解析した。2)1950から1975年の自殺率の変動におけるそれぞれの自殺手段の占める割合を解析した。3)1968から1994年のガス自殺の推移を解析した。解析結果は、以下のようであった。1)僻地部で練炭自殺の増加が著しく、男性では練炭自殺の急増により自殺率の地域差が拡大していた。2)若い世代では服毒自殺が最も多かった。3)家庭用ガスに含まれる一酸化炭素が70年代に減少したが、これに伴いガス自殺が減少した。平成27年度は、「練炭自殺の地理的分布」、「手段的自殺の長期的推移」に関する検討を実施した。「練炭自殺の地理的分布」では、1999年から2013年までの男女別、都道府県別、自殺手段別(ICD-10コード)の自殺死亡者数のデータを人口動態統計から抽出した。練炭自殺とは、密閉した空間において練炭などの燃焼により一酸化炭素を発生させ、それによって中毒死を図るという自殺手段である。ICD-10コードでは、練炭自殺を特異的に示すコードはなく、このタイプの自殺手段は、X67(その他のガス及び蒸気による中毒及び曝露に基づく自傷及び自殺)に含まれている。X67には、この自殺手段の他に、乗用車の排気ガスによる自殺、家庭ガスによる自殺も含んでいる。我々の推計では、2007年におけるX67コードの中で、約80%が練炭自殺によると考えられるため、本研究ではX67を練炭自殺によるものとして解析を行った。都道府県は人口密度により4群にし、小さい順から、most rural、second most rural、second most urban、most urbanとした。我が国では、近年、most ruralにおいて最も高い自殺率が観察されている。解析の結果、2000年代始めに練炭自殺が急増したが、most ruralに顕著であった。特に男性で、この時期に自殺率の地域間格差の拡大が観察された。「手段的自殺の長期的推移」では、人口動態統計における男女別、年齢階級別、自殺手段別(ICD-2から10)の自殺死亡者数のデータを使用するが、これらはまだほとんど電子化されていないものであるため、紙媒体のものを表計算ソフトのスプレッドシートに入力した。平成27年度中にデータ入力作業は終了し、その後データ解析作業を開始した。「練炭自殺の地理的分布」の成果は、すでに学術論文として、報告している。「手段的自殺の長期的推移」に関しても、データ入力はすでに終了し、平成28年度中に学術論文として、報告する予定である。平成28年度は、「手段的自殺の長期的推移」に関する検討を実施した。日本では、1950年代から1960年代にかけて、特に若い世代において自殺率が激しく変動している。すなわち1950年代には自殺率は急増し、1960年代には減少している。そこで今回、使用された自殺手段に着目し、この変動時期にそれぞれの自殺手段の推移はどのようであったかを記述疫学的に明らかにすることを目的に調査を実施した。使用したデータは、1950年から1975年にかけての日本における男女別、年齢階級別、自殺手段別の自殺死亡者数を人口動態統計から入手した。年齢階級は、15から29歳、30から49歳、50歳以上の3区分とした。人口動態統計では死因はICDコードに基づき、分類されている。この時期に使用されたICDコードは、ICD-6(1950-1957)、ICD-7(1958-1967)、ICD-8(1968-1975)である。自殺手段も、ICDコードに基づき、服毒、縊首、溺死、その他(ガス、飛び降りなど)に分類した。さらに1958年から1967年にかけての期間のみ、服毒自殺で使用された物質のデータも入手できた。解析の結果、この時期、女性より男性、年齢の高い世代より低い世代で自殺率が激しく変動していた。手段別では、若い世代では服毒自殺が圧倒的に変動しており、これに比べるとその他の手段は変動幅が小さかった。年齢の高い世代では、この時期縊首が最も多かった。1950年代後半に服毒自殺者数がピークとなっていたが、この時期に使用された物質に関しては、若い世代では臭化物(鎮静剤)が最も多く、ついでその他の鎮静剤(バルビツール系は含まず)であった。年齢の高い世代に関しては、農薬が最も多かった。平成28年度中に、「手段的自殺の長期的推移」に関する成果を2編、学術論文として報告する予定であったが、1編だけしかできていない。残りの1編は、解析は終了しており、平成29年度の早い段階で学術論文として報告する予定である。このため、「自殺手段別の地理的分布の検討」および「若い世代の服毒自殺に関する研究」に関するデータ入力はまだ終了していない。平成29年度は「手段的自殺の長期的推移」に関する検討を実施した。20世紀に入り、家庭用ガスや自動車が一般に普及するに伴い、家庭用ガスや排気ガスを使用した自殺者数が増加した。その後、英国や米国などからの報告によると、家庭用ガスや車の排気ガスに含まれる一酸化炭素濃度の減少に伴い、これらのガスを使用した自殺者数が低下していた。

日本でも、1970年代以降これらのガスに含まれる一酸化炭素濃度は低減されているが、それによる自殺への影響はまだ明らかではない。そこで本研究では、1968年から1994年の期間における日本のガスによる自殺の性別年齢階級別の推移を解析した。家庭用ガスによる自殺率は、性年齢に関わらず、1970年代初めまで増加し、1970年代中頃にピークとなり、以降急速に減少している。1970年代初めから、徐々に日本の都市ガスは低毒性のガスに置換されており、これにより家庭用ガスによる自殺率は急速に低下したと考えられる。一方、排気ガスによる自殺率の推移は、性年齢によりかなり異なっていた。男性15-24歳におけるこの自殺率のピークは1970年代中頃であり、男性25-44歳および45-64歳のピークは1980年代初めであった。男性の65歳以上及び女性の全年齢階級では、排気ガスによる自殺率は低い水準にとどまっていた。日本の排気ガス規制は1970年代中頃に強化され、欧米とほぼ同様の水準であった。しかしながら、1980年代中頃まで排気ガスによる成人男性の自殺者数が増加しており、これは日本では排気ガス規制の自殺者数への影響は限定的であったことを示唆している。平成27から29年度にかけて実施した一連の研究により、日本においても諸外国と同様に、毒性の高い薬物やガスなどを比較的簡単に入手し利用できることが、自殺者数を増加させた可能性があるということを示した、と考えている。本研究では、以下の3点に関する検討を行った。1)2003から2013年の日本で急増した練炭自殺の地理的影響を解析した。2)1950から1975年の自殺率の変動におけるそれぞれの自殺手段の占める割合を解析した。3)1968から1994年のガス自殺の推移を解析した。解析結果は、以下のようであった。1)僻地部で練炭自殺の増加が著しく、男性では練炭自殺の急増により自殺率の地域差が拡大していた。2)若い世代では服毒自殺が最も多かった。3)家庭用ガスに含まれる一酸化炭素が70年代に減少したが、これに伴いガス自殺が減少した。平成28年度以降も、基本的には当初の実施計画にしたがって、研究を進めて行く予定である。平成29年度は、まず「手段的自殺の長期的推移」の2編目の成果を学術論文として報告する予定である。そして、「自殺手段別の地理的分布の検討」および「若い世代の服毒自殺に関する研究」に関するデータの構築、解析を実施する予定である。疫学2015年1月から10月まで、休職をし、ハーバード大学公衆衛生大学院の客員研究員として、米国ボストンに滞在した。このため、研究の進め方を若干変更し、当研究費において次年度使用額が生じた。しかしながら、幸い、研究の進捗には大きな影響は見られていない。平成28年度に発表を予定していた論文のうち1編が完成しなかった。そして、平成29年度に解析を予定していたデータの入力がまだなかったため、当研究費において次年度使用額が生じた。平成27年度の予定の一部は、平成28年度の前半に実施することを予定している。平成28年度に実施できなかったものは、平成29年度前半に実施することを予定している。
土地に刻まれた歴史からみた佐賀干拓平野の開発・居住システムに関する研究

有明海沿岸部の佐賀干拓平野では、年々広がる干潟の自然陸化や干拓などによって、常に土地形成が進められるとともに居住地が形成されている。本研究ではそれらが如何にして干潟などといった、造成される以前の土地条件を活用し、依拠しているかを明らかにすることで、日本の都市空間の重要な特質である自然の取り込み方や、その形成手法に関する知見を得ようとするものである。1.土地改良事業に関わる従前地形図の広域的収集と整理現在個々に散在的に保管されている圃場整備等の従前地形図(千分の1地形図など約600枚)を佐賀平野沿岸部を中心に地域ごとに整理し、画像データとしてCD-ROMに記録した。2.低平地の居住空間システムに関する研究調査分析から、特にホリ(水路)などが縦横に張り巡らされる低平地において、(1)集住地の居住域は、周辺の農地部分と対比して、よりホリが密に掘りこまれた、わずかに高められた土地であること。(2)居住域は、複数の屋敷地からなるホリに囲まれた島状の土地が単位となって構成していること。(3)個々の屋敷地には、カド(主に作業用空地)を中心とした空間構成パターンがあること。(4)さらに、島状の土地相互は橋(ミチ)によって、屋敷地相互はカドとカドを結ぶミチなどによって、個々の空間が繋がれていること、などを認めることができた。3.集住地の神社からみた佐賀低平地の集住に関する研究新たにつくられた土地での集住について、すでに出来上がっている集住観念が示されていると考えられる集住地の神社に着目し、山麓から低平地の比較分析を行った。その結果、一つには「山とのかかわり」、いま一つには「集住生活とのかかわり」といった特徴的な2つの性質を認めることができ、低平地においては前者が形式的に、後者がより強く表現され、このような集住地の神社を使うことで集住をすすめていると考えることができた。1:かつての土地形態を把握するために、ほ場整備事業前の従前地形図の収集と整理を行った。対象は主に有明海の湾奥部一帯(佐賀市、川副町,東与賀町、千代田町など)であり、主に1,000分の1地形図を約450枚収集し、画像のデジタルデータ化を行った。それらの整理の結果、かつての土地形態は土地形成の痕跡を示していると考えられ、ほ場整備事業によって大きく土地形態は改変しているが、その改変はかつての土地のまとまり毎に行われていること、などがわかった。2:居住地の空間的・社会的条件として、集住地の核である神社についての調査分析を行った。調査は、山麓から海岸までの佐賀市、川副町、東与賀町の形態の明確な集住地240を取り上げ、(1)集住地の神社の抽出、集住地形態の類型、その立地分布について、(2)それぞれの神社を対象に、集住地における位置、神社の向き(遙拝の向き)、要素からみた神社の空間構成、について行った。集住地の神社は多様な様相を呈しているが、今回の調査分析の結果から、一つには神社が集住地の北端(山側)に立地し、北向きにあり、鎮守の森を持ち、神社境内には神社に関わる要素のみが見られるもの。いま一つには、神社が集住地の中央部に位置し、森を持たず、公民館や公園などの集住地施設があるもの、といった特微的な2つの特質を見いだすことができた。そして、前者は山側に、後者は海側に多いと言える傾向を示しており、多様な神社の様相はこれら2つの特質のバランスによって成り立っているのではないかと考えることができた。

その結果、一つには「山とのかかわり」、いま一つには「集住生活とのかかわり」といった特徴的な2つの性質を認めることができ、低平地においては前者が形式的に、後者がより強く表現され、このような集住地の神社を使うことで集住をすすめていると考えることができた。
人と家畜との関係の向上を目指した家畜介在教育の可能性

近年「食育」の重要性が指摘されるようになり、全国各地で乳幼児から高齢者まで様々な年齢層を対象とした食育が試みられている。米作り、イモ掘り、野菜の栽培など、農業体験を通して子ども達に食生産の大切さを学ばせる試みは以前から行われており、小中高の学校教育に「総合的な学習の時間」が取り入れられたことで再び脚光を浴びているが、これらは一過性の体験に留まっており、体系的な教育とはなっていないのが現状である。また、子ども達が生きた家畜に触れたり、見たりする機会は大幅に減少している。広島大学附属農場では、遠足や社会見学など地域の幼児及び児童を広く受け入れているが、家畜に触りたがったり、餌をやりたがったりする子どもがいる一方で、触りたいけれども恐くて手が出せなかったり、牛の大きさに驚いて泣き出してしまったり、畜舎に入ろうとしない子どもなど、家畜を見る体験が初めてという行動を取る園児がほとんどであり、「農」や「家畜」との分離を目の当たりにしている。本研究は、食材から食事までを扱う「食育」に加え、家畜を介在した教育を効果的に組み合わせることで、幼児に「食」「食材」「食を支える家畜」の関係性を認識させることを目的とし、そのための基礎的データを収集した。その結果、幼児に対する家畜を介在させた食農教育(家畜介在型食農教育プログラム)を実践することで、一般社会の食農リテラシーを高めることが可能となり、人と家畜との関係性も向上することが示唆された。今後は、様々な教育機関で実践可能な家畜介在型食農教育プログラムを開発することで、人及び家畜の福祉の向上、食の安全性の向上につながるものと考えられた。近年、農業高校では、農業に関する専門教育とともに、農業の役割をより幅広く捉えたフィールド教育にも積極的に取り組みつつある。その中でも特に畜産科では、生徒が家畜の飼育管理を行い、家畜に触れながら様々な体験をするという、家畜による動物介在教育を実践している。本調査では、農業高校の教育的効果について、畜産科とその他の学科とを比較することを試みた。調査対象は、広島県立西条農業高等学校の畜産科、生物工学科に所属する1年生から3年生までの生徒とした。生物工学科の生徒は高校附属農場の家畜に触れるという経験をほとんど持っていなかった。調査はマークシートによる選択式アンケートとした。質問は全部で100問とし、生徒の主体性に関する質問群、自尊心に関する質問群、自然観に関する質問群、動物観に関する質問群、農業・畜産観に関する質問群から構成した。動物観及び自尊心の質問群にはそれぞれPAS尺度とRosenberg尺度を参考にした。畜産科の生徒は、農業に対する知識や農業・畜産観、動物観について、生物工学科の生徒と異なる傾向を示した。また、アンケート結果には、学年間においても差が認められた。今後さらに畜産科の生徒に焦点をあて、農場における実習内容を詳細に調査し、教育効果との関連性を明らかにすることが必要であると考えられた。しかし、米作り、イモ掘り、野菜の栽培など、農業体験を通して子ども達に食生産の大切さを学ばせる試みは以前から行われており、小中高の学校教育に「総合的な学習の時間」が取り入れられたことで再び脚光を浴びているが、これらは一過性の体験に留まっており、体系的な教育とはなっていないのが現状である。

広島大学附属農場では、遠足や社会見学など地域の幼児及び児童を広く受け入れているが、家畜に触りたがったり、餌をやりたがったりする子どもがいる一方で、触りたいけれども恐くて手が出せなかったり、牛の大きさに驚いて泣き出してしまったり、畜舎に入ろうとしない子どもなど、家畜を見る体験が初めてという行動を取る園児がほとんどであり、「農」や「家畜」との分離を目の当たりにしている。本研究は、食材から食事までを扱う「食育」に加え、家畜を介在した教育を効果的に組み合わせることで、幼児に「食」「食材」「食を支える家畜」の関係性を認識させることを目的とし、そのための基礎的データを収集した。その結果、幼稚園児の畜産加工食品に対する嗜好性は非常に高いが、家畜に関する知識は乏しく、畜産加工食品と家畜との関連について意識することも少ないことが明らかとなった。幼稚園において動物を飼育することや蔵書絵本の内容を吟味することなどが、家畜に対する園児の意識に大きく影響することが示唆されたことから、今後さらに、幼稚園における飼育動物の実態を調査するとともに、絵本に登場する動物が物語の中で果たす役割や位置付けを動物種ごとに調査するなど、園児を取り囲む環境について調査を進め、家畜を含む生き物教育の充実と体系化をはかることが必要であると考えられた。本研究は、「食育」「食農教育」に焦点を当て、食農教育プログラムの開発の一環として、幼児が「食」「食材」「食を支える家畜」をどのように捉えているのかを明らかにすることを目的とした。広島県内にある6つの幼稚園の年長児153名を対象として個別面接調査を行った。3園の幼児は調査前に、乳牛、肉牛、豚、羊を飼養している広島大学附属農場を見学していた。調査項目は、「日常生活における動物及び食べ物との関わり」「家畜に対する認知度」「牛乳、卵と家畜との関連性」「料理と食肉、家畜との関連性」とし、各幼児に様々な家畜、料理、食材の写真を見せながら質問した。約6割の幼児が、家で食事をするよりも外出して食事をすることを好んでいた。その理由として「楽しい」「家よりもおいしい」「家よりも種類がたくさんある」が挙げられた。保護者の作る料理の中で、幼児はカレーライスとハンバーグを最も好んでいた。牛、豚、羊、鶏の写真を見せて家畜の種類を尋ねると、羊以外の家畜については9割以上の幼児が正答したが、羊については、15.0%の幼児が「ヤギ」と回答し、12.4%がわからなかった。また、3本、4本の脚を持つ鶏の写真を本当の鶏として選択した幼児が3割以上いた。大学附属農場を訪れた幼児の方が、牛、豚、鶏を有意に「好き」であると回答する傾向が見られたことから、幼児は農場見学をしなくても知識として家畜の種類をほぼ正しく答えることができるが、実際に家畜を見たり触れたりすることによって無意識に親近感や好ましい印象を持つようになることが示唆された。9割以上の幼児が牛乳・卵を生産している家畜を正しく選択したが、中には、牛乳が鶏や豚から、卵が植物や牛から生産されると認識している幼児もいた。料理と食肉との関連性についてはある程度認識していても、食肉とそれを生産する家畜とのつながりについての知識は希薄であった。
興奮性及び抑制性神経伝達物質によるシナプス小胞再充填機構の比較解析

脳にはグルタミン酸作動性とGABA作動性の神経細胞が存在する。持続的神経伝達のためには、それぞれの伝達物質がシナプス小胞内に再充填されなければならないが、その機構は十分には分かっていない。本研究では、これらの伝達物質の再充填機構を知るために、培養海馬細胞でグルタミン酸シナプスとGABAシナプスを区別して小胞内pHをモニターした。シナプス小胞内腔に適したpHセンサータンパク質を用いることで、両者で有意なpHの違いがあることが分かった。またGABAの取込みの有無によるpH動態の違いから、GABAとH+の対向輸送が示された。またGABAの取込みの時定数はグルタミン酸に比べ数倍遅いことも分かった。哺乳類中枢神経系では、グルタミン酸が興奮性シナプス伝達を、GABAが抑制性シナプス伝達を担っている。いずれの神経伝達物質も、シナプス小胞膜上にある液胞性H+-ATPase(V-ATPase)によって形成されたH+の電気化学的勾配を駆動力にして小胞内に充填される。小胞内の伝達物質量がシナプス伝達の最小構成単位になることから、グルタミン酸とGABAの小胞充填機構の違いは、脳の興奮性・抑制性を左右する最も基礎的な要素として関心を集めてきた。しかしながら、グルタミン酸・GABAいずれの充填機構についても十分なコンセンサスが得られるには至っていない。特に、小胞充填に伴うH+とCl-の挙動について、複数の説が提唱されている。この要因の一つとして、これまでの研究が、精製した小胞等、生理的環境にない標本を対象にしてきたことがあげられる。そこで私は、培養神経細胞の機能的シナプスにおいて、小胞内H+動態及びCl-動態の定量的解析に取り組んでいる。これまでに、グルタミン酸シナプス小胞へのH+の蓄積がグルタミン酸の取込みの速度と類似していることを明らかにし論文として報告している。本研究課題の初年度では、小胞内のpH動態をグルタミン酸小胞とGABA小胞で比較解析を行い、二つのシナプス小胞でpH動態が大きく異なることを示した。さらにその違いの原因を詳細に解析することで、GABAとH+の対向輸送が生じていることを支持する結果が得られた。今年度はこの研究結果を論文として報告した。本研究課題では、グルタミン酸を充填する興奮性シナプス小胞とGABAを充填する抑制性シナプス小胞の小胞内pH及びCl-動態を比較解析することで、それぞれの神経伝達物質の小胞内輸送メカニズムについて理解することを目指している。初年度では、小胞内のpH動態について比較解析を行うことを計画しており、実際に二つのシナプス小胞で定常状態のpHとそこに到達するまでのpH動態が大きく異なることを明らかにした。特に重要な知見として、GABA性シナプス小胞のpH動態が、酸性化の相とアルカリ化の相を合わせ持つ二相性の変化を示すことがわかった。この特徴的なpH動態とGABAの小胞充填メカニズムの関連を調べるために、vesicular GABAtransporterのコンディショナルノックアウト動物から作成した培養神経細胞を用いた解析を行った。その結果、GABAの小胞充填にはH+の対向輸送が共役していることを強く支持する結果が得られ、これは大変重要な知見であるため、論文として報告するにいたった。以上の研究経過は当初の計画・目標を十分に達成していると考える。一方で残された課題は、興奮性シナプス小胞では、グルタミン酸の輸送に伴うH+の移動が存在するかどうかである。この点については、vesicular glutamatetransporter (VGLUT)の欠損動物を利用した実験を行う必要がある。神経伝達はシナプス小胞内に貯蔵された伝達物質の放出を介して起こる。古典的神経伝達物質の小胞内輸送はH+の勾配を利用した2次輸送であることが知られているが、その詳細についてはいまだ議論が続いている。本課題では興奮性伝達物質であるグルタミン酸と抑制性伝達物質であるGABAがシナプス小胞内に充填される機構について、それぞれの小胞内pHをイメージングにより比較解析することで明らかにしようと試みた。代表者の過去の研究により、グルタミン酸を取り込むシナプス小胞へのH+の流入はグルタミン酸の流入と同程度の速度で起きていることが分かっている(Egashira et al., J Neurosci 2015)。この事実は、グルタミン酸の取込みとH+の動きが時間的に共役していることを示唆しており、伝達物質ごとに充填機構に違いがあれば小胞内pHイメージングによりそれを明らかに出来る可能性を示している。そこで抑制性神経細胞特異的に蛍光タンパク質を発現する遺伝子改変マウスから培養神経細胞を作成し、興奮性及び抑制性シナプスで小胞内pH動態の比較を行った。その結果、両者で大きな違いがあること、またその違いの原因としてGABAの取込みには小胞内の強いアルカリ化が伴うことが判明した(Egashira et al., PNAS 2016)。今年度はグルタミン酸充填と小胞内pHの共役様式の解明に取り組んだ。ここで問題となったのが、上記の遺伝子改変動物に依存せずに、いかに興奮性シナプスと抑制性シナプスを区別するかである。そこで新規の研究ツールとして興奮性神経細胞特異的に遺伝子発現を起こすウイルスプロモーターの探索を行った。

いくつかの遺伝子について検討した結果、VGLUT1のプロモーターが実用可能なレベルで興奮性細胞への強い特異性を示した(Egashira et al., in revision)。脳にはグルタミン酸作動性とGABA作動性の神経細胞が存在する。持続的神経伝達のためには、それぞれの伝達物質がシナプス小胞内に再充填されなければならないが、その機構は十分には分かっていない。本研究では、これらの伝達物質の再充填機構を知るために、培養海馬細胞でグルタミン酸シナプスとGABAシナプスを区別して小胞内pHをモニターした。シナプス小胞内腔に適したpHセンサータンパク質を用いることで、両者で有意なpHの違いがあることが分かった。またGABAの取込みの有無によるpH動態の違いから、GABAとH+の対向輸送が示された。またGABAの取込みの時定数はグルタミン酸に比べ数倍遅いことも分かった。初年度は、シナプス小胞内のpH動態について、グルタミン酸性シナプスとGABA性シナプスとの比較解析を行うとともに、GABAの取込みを欠損したGABA性シナプスでの解析も行った。これによりGABAの小胞充填メカニズムについての理解が得られたように、グルタミン酸の取込みを欠損した興奮性シナプス小胞について同様の解析を行うことで、グルタミン酸の小胞充填メカニズムについての知見が得られると期待される。そこで、次の課題としてVGLUT1ノックアウトマウスを利用した実験を計画している。しかし、そのためには解決が望まれる問題がいくつか存在する。その一つに、初年度にVGAT Venusトランスジェニックマウスを用いて示したように、GABA性シナプス小胞とグルタミン酸性シナプス小胞とではpH動態が大きくことなるため、できるかぎりGABA性シナプスを解析から除外しなければならないことがある。この問題の解決法としては、VGAT VenusトランスジェニックマウスとVGLUT1ノックアウトマウスを掛け合わせてダブルトランスジェニックマウスを作成することがあるが、これは研究の効率を大きく制約するだけでなく、汎用性の観点からも望ましくない。そこで現在検討を行っているのが、より興奮性神経細胞への選択性の高い遺伝子発現プロモーターの探索である。現在までに従来のプロモーターよりも34倍程度選択性の高い配列を同定している。この配列を組み込んだウイルスベクターの実用化によって、VGLUT1欠損細胞でのpH測定がより正確かつ効率的に進展すると期待される。また当初の計画にある小胞内のCl-動態の定量に着手するためにも、この技術の確立は重要である。神経生理学