hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
若齢期の人工甘味料曝露によるレプチン抵抗性獲得機構の解明

若齢期における人工甘味料摂取が、視床下部小胞体(ER)ストレスを介して、成獣期の肥満感受性(レプチン抵抗性)を高める可能性が示唆された。分子シャペロンを人工甘味料と共投与することで、視床下部ERストレスが低下し、さらに成獣期以降、高脂肪食に対する嗜好性をも軽減することが確認された。マウスのembryoから摘出した全脳のprimary cultureにおいては、人工甘味料がERストレス関連遺伝子の発現をかなり亢進させた。これは人工甘味料が視床下部ERストレスにダイレクトに寄与することを示唆する所見である。人工甘味料アスパルテームが糖脂質代謝に及ぼす影響、そして視床下部におけるStat3シグナルを解析した。1.若齢マウス(C57BL/6Jオス)に高脂肪食(HFD)とともに、一定期間(47週齢)のみ人工甘味料アスパルテーム(Asp)を給餌することで、摂食量が増え、HFD単独に比べて有意な体重(内臓脂肪)増加を来たすことを見出したため、まず各群マウス22週齢における糖脂質代謝について検証した。Asp給餌群では、HFD単独群に比べて、糖負荷テスト(IPGTT)でのglucose AUCが有意に高値を示していた(1763±153 vs.1289±103)。さらにインスリン負荷テスト(ITT)でも、Asp給餌群はインスリン感受性の悪化が認められた。2.形態的に、各群マウス22週齢の膵島内インスリン分泌細胞の面積および重量についても検証したが、明らかな差は認められなかった。しかしAspを給餌したマウスの22週齢において、肉眼的な脂肪肝増悪所見が認められたため、異所性脂肪蓄積についても検証した。まず肝臓切片をoil red Oで解析をしたところ、Asp給餌群はHFD単独群と比較して有意に肝臓内脂肪が蓄積していた。同時に肝内中性脂肪含有量も有意に増加していた。現在、筋肉内における脂肪蓄積についても検証中である。3.若齢期マウスにおけるHFD&Asp同時給餌誘導性の高レプチン血症に関して、各群マウスの7週齢でレプチン脳室内投与(i.c.v.)にて視床下部のStat3シグナルを検証したところ、HFDとともにAspを同時給餌した群では、HFD単独群に比べて、Stat3シグナルが有意に低下していた。体重差の殆ど無い7週齢においても、Aspが視床下部レベルでレプチン抵抗性を強く惹起していることが考えられた。人工甘味料アスパルテームが視床下部ERストレスに及ぼす影響を解析した。1.若齢マウス(C57BL/6Jオス)に高脂肪食(HFD)とともに、一定期間(47週齢)のみ人工甘味料アスパルテーム(Asp)を給餌することで、摂食量が増え、HFD単独に比べて有意な体重(内臓脂肪)増加を来たすことを見出し、さらに視床下部のStat3シグナルを検証したところ、HFDとともにAspを同時給餌した群では、HFD単独群に比べて、Stat3シグナルが有意に低下していた。2.視床下部におけるStat3シグナルにつき、上記各群で視床下部ERストレス関連遺伝子(CHOP、XBP1、ERDj4)および蛋白(IRE1α、PERK)リン酸化を検証したところ、7週齢においてHFDとともにAspを同時給餌した群では、HFD単独群に比べて、これらのERストレス関連因子が全て有意に亢進していた。この時点(7週齢)で、内臓脂肪や肝臓におけるERストレス関連因子も調べたが、上記2群間で明らかな差は認められなかった。しかし、7週齢で有意差が認められた視床下部ERストレスは22週齢でその差が無くなり、対して内臓脂肪と肝臓におけるERストレス関連因子がHFDとともにAspを同時給餌した群で有意に亢進していた。3.食の嗜好性につき検証したところ、HFDとともにAspを同時給餌した群では、HFD単独群に比べて、HFDに対する強い嗜好性が認められた。4.続いて、ERストレスを強制的に解除する分子シャペロン4PBAをAsp投与期間中(47週齢)に腹腔内投与したところ、以後体重の有意な増加が抑えられ、成獣期(22週齢)における糖代謝の有意な増悪も抑えられた。また若齢期のHFDとAspを同時給餌することで獲得されたHFDに対する強い嗜好性が、若齢期の4PBA投与により解除された。

近年、生活習慣病に対する意識も高まり、“カロリー0"を銘打った甘味料の需要が急速に伸びているが、元より肥満者に対する効能については疑問視され(Obesity Fowler SP et al. 16: 1894, 2008)、マウスに摂取させるとむしろ摂食量と体重が増えたというパラドキシカルな結果も報告されている(Int J Obesity TL Davidson et al. 28: 933, 2004)。本研究では、肥満モデルC57BL/6J雄マウスにおいて、若齢期の一定期間(47週齢)、高脂肪食(HFD)と同時に人工甘味料アスパルテーム(Asp)を給餌することによって、HFD単独給餌群と比較して、成獣期以降もHFD対する嗜好性が有意に高まった。これらAsp給餌群においては、視床下部小胞体(ER)ストレス関連蛋白および遺伝子の惹起とともに高レプチン血症(レプチン抵抗性)が有意に亢進していた。ERストレス解除薬である分子シャペロン4-PBAの共投与は、成獣期における視床下部ERストレスおよび高脂肪食に傾いた嗜好性を通常食に回帰させた。Primaryneuronal cultureを使用した実験においては、Aspの添加がERストレス関連遺伝子(CHOP、XBP1、そしてERdj4)の発現増強を惹起し、それは4-PBAの前処置により抑制された。本研究では、天然甘味料ステビアでも同様の検証を施行したが、ステビアでは糖代謝および食嗜好性の変容は来さず、また血中レプチンや視床下部ERストレスにも有意な影響は認められなかった。視床下部におけるERストレスのみならず、内臓や肝臓におけるERストレスも検証できたこと、さらに同時採取した筋肉、皮下脂肪、そして腸管上皮細胞におけるERストレスの関与も検証中である。そしてERストレス解除薬である分子シャペロン4PBAを投与することで、ERストレスの解除のみならず、Aspの体重増加や糖脂質代謝、食の嗜好性に及ぼす悪影響を抑えられたことまで確認できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、Aspが視床下部ERストレスを惹起するメカニズム解明を進め、さらにマウスneuronal primary cultureに直接Aspを振りかけることで、実際ERストレスが有意に亢進するのか検証したい。
金属ソース・ドレイン型ゲルマニウムスピンMOSFETの創製

原子層レベルで急峻な界面を持つ高規則度L21ーCo2FeSi電極をスピン注入・検出電極に用いることで、従来電極(Fe/MgOトンネル接合電極など)よりも二桁近く高いGe中へのスピン生成効率(0.12)を実現し、その検出温度を100 K以上も上昇させることに成功した。また、硫化アンモニウム水溶液によるpーGe(111)基板の表面処理が、原子整合した体心立方構造金属/Ge(111)接合によるフェルミレベルピニングの影響の緩和効果を大幅に安定化させることを見出した。更に、金誘起層交換成長(GIC)法を改善して大粒径化させたGe結晶粒を用い、300°C以下という低温で薄膜トランジスタの作製に成功した。超高速かつ超低消費電力が期待されるGeスピンMOSFETの創製には,強磁性ソース・ドレイン電極を用いたGeチャネル中におけるスピン注入・伝導の検出が欠かせない.従来のFe/MgO/Ge電極を用いたGe中のスピン注入・伝導を示唆する4端子Hanle効果の観測は,このFe/MgO/Ge電極の低いスピン注入/検出効率ために100 K以下という極低温に留まっているのが現状である[Y. Zhou et al., Phys. Rev. B 84, 125323 (2011).].研究代表者は,これまでの金属チャネル(Cu)における実験で高いスピン注入/検出効率が報告されているCo2FeSi(CFS)を用いることで, Ge中へのスピン注入/検出効率の高効率化を図り,4端子非局所Hanle信号の観測温度の高温化を試みた.研究代表者は,これまでに原子層レベルで急峻な界面を有するCFS/Ge(111)接合の作製に成功しており[K. Kasahara et al., J. Appl. Phys. 107, 09B105 (2010).],本研究ではこの高品質CFS/Ge(111)接合を電子線リソグラフィー法及びAr+イオンミリング法を用いてサブμmオーダーの微細な4端子デバイスに加工し,スピン注入・伝導の検出法として一般的な4端子非局所Hanle効果測定を行った.150 Kで得られた4端子非局所Hanle信号を一次元拡散モデルにより解析したところ,研究代表者のCFS/Ge(111)電極は,従来のFe/MgO/Ge電極よりも二桁近く高いスピン注入/検出効率(0.12)を有していることがわかった.その結果,225 K以上でもGe中のスピン注入・伝導を示唆する4端子非局所Hanle信号を観測することに成功した.この成果は,GeスピンMOSFETの創製を飛躍的に推進させる成果である.集積回路の低消費電力化が期待されているGeスピンMOSFETの実現には、強磁性電極からGeチャネル中にスピンを電気的に注入し、そのスピンを電気的な手法により検出できなければならない。研究代表者は前年度までに、原子層レベルで急峻な界面を持つ高規則度L21-Co2FeSi/n+-Ge/n-Ge(111)構造をスピン注入・検出電極として用いることで、従来電極(Fe/MgO/Ge)よりも二桁近く高いスピン注入/検出効率を実現し、これまで150Kという極低温に留まっていた検出温度を100K以上も上昇させることに成功した。一方で、ほとんどの金属/pーGe接合はフェルミレベルピニング(FLP)と呼ばれる現象により正孔に対するショットキー障壁高さが極端に低くなる。そのため何の対策も講じなければ、金属ソース・ドレイン型GeスピンMOSFETはゲート電圧がOFFの状態でもリーク電流をほとんど抑制できず、トランジスタ動作ができないと考えられる。研究代表者はこれまでに、原子整合した体心立方構造(bccー)金属/Ge(111)接合を用いてFLPの緩和に成功しているが、この効果は試料間で大きくばらつき、安定性に欠けていた。本研究では、bccー金属堆積前に硫化アンモニウム水溶液でpーGe(111)基板表面を処理することにより、FLP緩和効果の安定性を大幅に向上させることに成功した。そして、金属/pーGe接合では初めてFLPの強さの指標となるSパラメータを取得した(S 0.12)。更に研究代表者は、超軽量かつ超低消費電力なディスプレイの創製を指向したプラスチック基板対応の低温(300°C以下)Ge結晶化技術の開発にも取り組んだ。従来技術の金誘起層交換成長法を独自技術により発展させ、300°C以下でGe結晶粒の大粒径化(> 600 μm)に成功し、その粒子を用いた薄膜トランジスタの動作にも成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。スピントロニクス26年度が最終年度であるため、記入しない。

高品質界面を有するCo2FeSi/Ge接合をスピン注入・検出電極として用いることで,従来の強磁性電極よりも約二桁も高いGe中でのスピン注入/検出効率を実現し,その結果としてGe中のスピン注入・伝導の検出温度を飛躍的に向上させることに成功した.しかしながら,このGe中のスピン注入・伝導の検出未だ低温に留まっているのが現状である.更に,GeスピンMOSFETの実現に向けて克服しなければならないもう1つの課題は,金属/Ge接合型ソース・ドレイン電極を用いたMOSFET構造におけるOFFリークの抑制,即ち,0.45 eV以上の金属/p-Ge接合のショットキー障壁高さ(ΦBp)を取得であるが,研究代表者が現在までに取得できているΦBpは,ΦBp = 0.18 eVであり,上述のOFFリークの抑制に必須となるΦBpに達していない.以上の2つの理由から,達成度は3とした.本年度は前期中に,申請者が保有しているbcc-FM/Ge接合の界面制御技術を応用レベルまで高度化し,室温でも十分にリーク電流が低いMOSFETを実現可能な高いショットキー障壁高さ(ΦBp ≧0.45 eV)の取得を目指す.『金属/極薄bcc-FM/Ge(111)』構造の作製し,高品質なbcc-FM/Ge(111)界面によるFLP抑制効果を維持したまま,「金属」層のΦmでΦBpの変調を試みる.極薄bcc-FM層には,昨年度,従来のFM電極より約二桁も高いスピン注入・検出効率を示したCo2FeSi(CFS)を用い,「金属」層には低Φmを持つ金属の中でも比較的蒸着し易いGdを用いた『Gd/CFS/Ge(111)』構造を作製し,高いスピン注入・検出効率とΦBpの両立を試みる.挿入した極薄CFS層の膜厚がΦBpに大きく影響すると予想されるため,極薄(膜厚< 1.0 nm)且つ平坦(凹凸< 0.1 nm)なCFS層の実現を目指す.申請者はこれまでに,別のbcc-FM材料であるFe3Siを用いて,高品質な界面を維持したまま極薄膜化(1.5 nm)することに成功しており,Fe原子の一部をCoに置換しただけのCFSでも極薄膜化は比較的容易に達成されると予想される.この『Gd/極薄CFS/Ge(111)』構造を縦型伝導素子に加工し,I-V特性からΦBpを算出することで,ΦBp ≧0.45 eVという特性を得る.これにより室温でn-Ge MOSFET動作を実証可能な「金属ソース・ドレイン」構造が完成する.この「金属ソース・ドレイン」構造に現有の原子層堆積装置を用い高品質なゲートスタック構造を加え,スピンMOSFETを試作する.ゲート電圧によるドレイン電流の制御と,ソース・ドレイン電極の磁化配置に応じた不揮発メモリ動作を実証することでショットキー型GeスピンMOSFETが創製される.
熱極性物質理論の実構造部材への適用

これまでに熱極性物質理論に基づきマイクロモードマテリアルなる概念を提案してきた.連続体の1点に直交関数展開したモードを与えることで,複雑な内部構造を有する物体の挙動を表現することができる.これまでモードベクトルを釣合い方程式に乗じてバイモーメントの概念を厳密に導入してきた.さらに実際の構造物にこの概念を適用することが本研究の目的である.マイクロモードマテリアル理論については,ほぼその全容を体系化することができた.特にモードベクトルなる中間的なスケールを有する位置ベクトルを乗ずる際に,項の数を適正に保つことが可能となった.今年度は力学的マイクロモードマテリアルの実構造部材の例に着目し,薄肉断面部材をとりあげた.そり拘束ねじりの連続体力学的な体系化を昨年度までに整えつつあったが,更に今年度は運動学および構成式に関する議論を行い,ほぼ全体の体系が完成した.特に2次そり関数についても定式化に織り込み,その効果を含む構成式を検討した.本理論においては,構成式がマイクロモードマテリアルなる物質に固有の値を定数として必要とするので,単に固体の素材に関する材料定数を適用することができない.材料定数の決定の問題は極性理論に共通する課題であり,本理論の弱点とも見えるが,逆に,有限要素法によってある境界条件の基での材料定数を定めることができる.断面形状の細かい曲率等の影響を厳密に考慮した定数を用いることで,この手法の有効性を確認することができた.これまでに熱極性物質理論に基づきマイクロモードマテリアルなる概念を提案してきた.連続体の1点に直交関数展開したモードを与えることで,複雑な内部構造を有する物体の挙動を表現することができる.これまでモードベクトルを釣合い方程式に乗じてバイモーメントの概念を厳密に導入してきた.さらに実際の構造物にこの概念を適用することが本研究の目的である.マイクロモードマテリアル理論については,ほぼその全容を体系化することができた.特にモードベクトルなる中間的なスケールを有する位置ベクトルを乗ずる際に,項の数を適正に保つことが可能となった.今年度は力学的マイクロモードマテリアルの実構造部材の例に着目し,薄肉断面部材をとりあげた.そり拘束ねじりの連続体力学的な体系化を昨年度までに整えつつあったが,更に今年度は運動学および構成式に関する議論を行い,ほぼ全体の体系が完成した.特に2次そり関数についても定式化に織り込み,その効果を含む構成式を検討した.本理論においては,構成式がマイクロモードマテリアルなる物質に固有の値を定数として必要とするので,単に固体の素材に関する材料定数を適用することができない.材料定数の決定の問題は極性理論に共通する課題であり,本理論の弱点とも見えるが,逆に,有限要素法によってある境界条件の基での材料定数を定めることができる.断面形状の細かい曲率等の影響を厳密に考慮した定数を用いることで,この手法の有効性を確認することができた.本研究の主題である熱極性物質の概念は,当研究室において提案されたものであるが,その基礎を原子の運動により確認したことが第一の成果である.本年度はさらにこれを拡張し熱的マイクロモードマテリアルなる概念を導入した.熱的マイクロモードマテリアルとは,熱極性物質を包含する概念であり,物質の内部の小領域dvに直線的な温度分布を設定するだけではなく,内部にある分布をもつ温度分布を許容する概念である.小領域内部を更にいくつかの領域に分割し,その分割に応じた数の固有モードを与えてこれを表現する.この考え方の下に,エネルギー方程式,熱モーメント方程式ならびに熱バイモーメント方程式を導出した.この過程で熱モーメントの概念が導出される.このモーメントは力学的モーメントとは異なり,単独で釣り合うことのできる量である.この点に関し熱的なSt.Venantの原理を新たに提唱した。熱モーメントに加え,熱バイモーメントなる量の存在も理論的に要請される.この概念はこれまで見出だされていないが,薄肉構造におけるバイモーメントの概念を熱的な概念に広げたものといえる.この量に関しても熱的St.Venantの原理が成立する.熱流束,熱モーメント流束あるいは熱バイモーメント流束に対応する構成式の一般形を導出し,そこに現われる材料定数につき検討を行なった.例として取り上げたモデルは一方向繊維で強化された複合材料あるいは,光ファイバーのような内部構造をもつ1次元材料に対応している.通常の有限要素法により,ある境界条件における熱伝導計算を行ない,マイクロモードマテリアルとみなした場合の材料定数を算出した.マイクロモードマテリアルなる概念によって,内部構造を有する1次元部材の熱的応答を,従来よりも厳密に表現できることを確認した.本研究の主題である熱極性物質の概念は,当研究室において提案されたものであるが,一昨年にはその基礎を原子の運動により確認し,さらにこれを拡張し熱的マイクロモードマテリアルなる概念を導入した.今年度はこれを実際の構造物に適用するため薄肉断面部材をとりあげ,これがマイクロモードマテリアルの好例となることを確認することができた.熱的マイクロモードマテリアルとは,熱極性物質を包含する概念であり,物質の内部の小領域dvに直線的な温度分布を設定するだけではなく,内部にある分布をもつ温度分布を許容する概念である.

小領域内部を更にいくつかの領域に分割し,その分割に応じた数の固有モードを与えてこれを表現する.今年度は実際の巨視的な薄肉断面部材にこれを適用するに際して,力学的な挙動のみに限定して検討を行った.はじめに独立な剛体回転を支配するモードアームを定義し,任意の一点で成立する力の釣合い式を積分平均することで,この概念の3次元モデルにおける巨視的な釣合い方程式の導出を行った.ここで新たに,各中間領域で積分平均された釣合い方程式に,更にモードアームをテンソル積することで,バイモーメントの釣合い方程式を導出している.この導入法はマイクロモードマテリアルの定式化において一般性を有しており,ここに本研究の特徴がある.この一般的なマイクロモードマテリアル概念を1次元化して棒材理論としての定式化を行い,釣合い方程式を導出した.巨視的な座標を部材軸方向にとり,微視的な座標を断面内でとることで薄肉部材をモデル化することができる.そり拘束ねじりにおいて,せん断中心から折板要素のそり零の点までをモードアームとし,折板要素ごとにモードを与えバイモーメントを自然な形で導入した.最終的には従来と類似した形式で釣合い方程式を得ることができた.ひずみエネルギー関数の導関数より構成式も得ており,さらに場の方程式を導出している.マイクロモードマテリアルなる新たな概念を導入することにより,厳密な一般化連続体としての薄肉構造理論を導くことができたといえる.これまでに熱極性物質理論に基づきマイクロモードマテリアルなる概念を提案してきた.連続体の1点に直交関数展開したモードを与えることで,複雑な内部構造を有する物体の挙動を表現することができる.これまでモードベクトルを釣合い方程式に乗じてバイモーメントの概念を厳密に導入してきた.さらに実際の構造物にこの概念を適用することが本研究の目的である.マイクロモードマテリアル理論については,ほぼその全容を体系化することができた.特にモードベクトルなる中間的なスケールを有する位置ベクトルを乗ずる際に,項の数を適正に保つことが可能となった.今年度は力学的マイクロモードマテリアルの実構造部材の例に着目し,薄肉断面部材をとりあげた.そり拘束ねじりの連続体力学的な体系化を昨年度までに整えつつあったが,更に今年度は運動学および構成式に関する議論を行い,ほぼ全体の体系が完成した.特に2次そり関数についても定式化に織り込み,その効果を含む構成式を検討した.本理論においては,構成式がマイクロモードマテリアルなる物質に固有の値を定数として必要とするので,単に固体の素材に関する材料定数を適用することができない.材料定数の決定の問題は極性理論に共通する課題であり,本理論の弱点とも見えるが,逆に,有限要素法によってある境界条件の基での材料定数を定めることができる.断面形状の細かい曲率等の影響を厳密に考慮した定数を用いることで,この手法の有効性を確認することができた.本理論は経路U*解析における極性効果に拡張することが可能であり,実際に広く構造物全体の検討に応用することができる.自動車の車体構造に適用する可能性を探るため,U*利用に関する一般的な検討も併せて行なった.
『日本書紀』の隼人像－古代天皇制におけるイデオロギー政策の一端

本研究においては、隼人を中心に対南島人・蝦夷政策との比較も含めて、古代天皇制に中国の政治思想がどのような影響を及ぼしているのか、その中で隼人はどのように位置付けられるのかについて考察を行った。『日本書紀』および同書編纂時にかかる『続日本紀』の隼人関係記事の語句/文章の語義や典拠を、各種工具書やデータベースを用いて調査し、仏書を含め中国文献との比較を行った。また、これらの成果をもとに中国文献/中国思想に基づき述作された『日本書紀』及び『続日本紀』の隼人関係記事の思想的分析、すなわち隼人のイデオロギー的位置付けについて、特にその時期的変遷の分析を、天皇制との関わりを注視し行った。その結果、以下の結論を得た。1隼人の名義について、特に「隼」の用字を中心として、これまで諸説あったが、漢籍に描かれた「隼」像には、「小人」あるいは「夷狄」として表象されたものもあり、このように漢籍にマイナスイメージで登場する「隼」像が隼人の名義のもととなっている可能性を指摘した。2『日本書紀』編纂時、すなわち天武朝から養老年間までの隼人関係記事を分析すると、隼人が中国的夷狄概念に関わる用語で形容されるのは、おおよそ養老年間までであることが判明した。3南島人および蝦夷と隼人の政策上の位置付けの差異を検討したところ、実際の政策上の隼人の位置付け、隼人のイデオロギー的な位置付け、そしておそらく隼人の法的位置付けは、微妙にズレを有し、必ずしも重なり合わないことが判明した。以上の研究について、本年度は2篇の論文を公表することができ、また、同様のテーマで1編が近く公開予定である。さらに、学術書専門出版社から単著公刊の依頼があったため、本研究の成果をもとにした単著を現在執筆中である。
解像型チェレンコフカメラ用集光器の開発

本研究ではオーストラリアで稼働中の3.8m鏡のカメラに取り付ける集光器を開発した。まず集光器の形状をシミュレーションによって決めた。今回は反射面を曲面状にすることは考えずに、全面が平らなものを設計した。反射面の反射率を90%と仮定して、いろいろな形状についてシミュレーションを行った結果、1.8倍の光量を得られることが判った。はじめ、金属を打ち出して成形し反射面にアルミ蒸着を施すことを考えたが、打ち出し用の型代が予算に収まらないため、ABS樹脂を成形して表面に金属メッキを施すことにした。クロムをメッキしたABS樹脂の平板の反射率を測定したところ86%であり、シミュレーションの仮定をほぼ満たしていた。メッキ金属はクロム、ニッケル、スズ・コバルト合金が考えられたが、集光率はどれもほぼ同じであったので、生産の歩留まりや耐久性からスズ・コバルト合金を採用した。3/8インチ光電子増倍管に集光器を取り付けて光量を測定したところ単体での集光率は1.5倍であった。この集光器を16×16のマトリックス状に組み上げてオーストラリアの3.8mCANGAROO望遠鏡に取り付け、95年11月、12月にCrabの観測を行なった。Crabについては93、94年の観測で、エネルギー閾値7TeVでガンマ線を検出している。今回取り付けた集光器で光量が増加していれば、エネルギー閾値が下がってガンマ線の計数率が増えているはずである。95年の観測は天候状態が不安定であったため、Crab方向に雲がかかっている時間帯を除いた解析によって集光器の総合的な性能評価を行なわねばならず、現在その解析を行なっているところである。
駅伝選手の強力トレーニングが非特殊免疫能に及ぼす影響

本実験は、某大学の陸上競技部に所属し、平成7年度の箱根駅伝メンバーとして選抜された選手を対象とした。夏期合宿は、北海道を中心として平成7年7月23日8月26日の約1ケ月間行われた。また、合宿期間中の走行距離は、通常の練習の約2倍程度であった。採血は、合宿前、合宿中、合宿後の計3回、早朝空腹時に肘正静脈より行った。好中球の分離は、合宿中に行った採血に関しても実験室まで運搬してから行った。したがって、この際の移動時間による好中球機能の変化を考慮し、事前に採血直後、6時間後さらに12時間後における好中球機能の変化を比較検討した。その結果から、採血後6時間経過してから分離を始めても、被験者間における好中球活性の相互比較が可能なことが確かめられたため、3測定とも6時間後に好中球分離を行うこととした。測定に関しては、好中球機能の指標として活性酸素産生を微弱光画像解析システム(ルミボックスH-1000、マイクロテック・ニチオン社)を用い、オプソニン化ザイモザンを刺激物質としてルシゲニンおよびルミノール依存性化学発光法にて行った。活性酸素産生能の評価方法は、活性酸素の最大産生量を示す最大発光量(Peak Height)、および異物認識から活性酸素の最大産生量に至るまでの平均時間とされる最大発光時間(Peak Time)を指標として行った。今回の結果から合宿中においてはPeak Heightが高く、またPeak Timeも早くなり、活性酸素産生能が活性化する傾向が認められた。しかしながら、合宿後においてはPeak Heightは合宿前の値より若干低値であったことから、更に合宿中の活性酸産生能の活性化の原因を検討する必要があると思われる。本研究において得られた他の数値については現在検討中であり、今後さらに分析を進め検討を行う予定である。
細胞内シグナル伝達ネットワークの情報論的解析

シグナル伝達系に着目し,情報理論の枠組みを適用することで,定量的にシグナル伝達系の情報伝達を評価した.実際の細胞のシグナル強度を1細胞レベルで計測した実データを用い,情報伝達を相互情報量によって測ることに成功している.PC12細胞の情報伝達を調べた結果,成長因子の種類によらず早期応答遺伝子へと伝達される情報量は約1ビット程度であったが,成長因子の種類によって,情報伝達に用いる主な経路は異なることがわかった.また,阻害剤を用いた薬理的摂動に対して,伝達される情報量は頑強に保たれる傾向があることがわかった.情報伝達が頑強である要因のひとつとして,相補性があることがわかった.PC12細胞に成長因子などによる刺激を与え,下流の早期応答遺伝子群を含むERKシグナルネットワークにおいて1細胞レベルでの応答の標本データを,定量的免疫染色法を用いて取得した.得られた標本データから応答の分布を推定するため,適応分割法を実装し,単純なヒストグラムを用いるより精度よく,応答の分布を推定することが可能となった.推定した分布より相互情報量を算出するコードを実装し,細胞内における情報伝達の解析が可能となった.ERKシグナルネットワークの各経路の相互情報量を算出し,解析を行った結果,成長因子による刺激から下流の早期応答遺伝子まで伝達される情報量は約1ビットであることがわかった.刺激に用いる成長因子の種類を変えても,同様に伝達される情報量は約1ビットであったが,情報伝達に用いる主な経路は異なることがわかった.さらに,経路の一部に薬理的阻害による摂動を与えても伝達される情報量は約1ビットに保たれており,情報伝達が摂動に対して頑健であることがわかった.情報伝達が頑健である理由のひとつに,摂動を受けた経路が伝達する情報量が減少しても,摂動を受けてない別の経路による情報伝達量が増える,一種の補償的仕組みがあることがわかった.また,情報伝達は成長因子の刺激によって生じる表現型である神経突起伸張に対しても摂動に対して頑健であることがわかった.細胞内シグナル伝達において,情報伝達に頑健性と補償性があることを情報量を用いて示したのは本研究が初めてである.細胞内シグナル伝達における情報伝達が堅牢であり,堅牢である要因のひとつに補償があることが2013年度に明らかとなったが,その仕組みについてはまだ不明な点が多い.2014年度は,トイモデルを用いて細胞が行っている情報伝達の堅牢性と補償の仕組みを解明することに注力した.最初は細胞内シグナルの情報伝達のトイモデルより,より簡単な非対称2元Z通信路に対する解析を行った.非対称2元Z通信路では,情報伝達において補償が起きて堅牢となる数学的条件を,解析的評価により明らかにできた.非対称Z通信路は,簡単化した細胞内シグナル伝達において通信路の分散が大きいときに対応するとみなすこともできる.これにより,情報伝達において堅牢性と補償が生じる仕組みについて理解が深まる取っ掛かりを得ることができた.その後,より実際の細胞内シグナル伝達に近いトイモデルを用いて,同様に,堅牢性を補償が生じる仕組みの解明について取り組んでいる.実際により近い細胞内シグナル伝達のトイモデルでは,解析的評価のみで堅牢性と補償が生じる条件を導出するのが簡単ではないため,数値計算を組み合わせた評価を行っている.細胞は環境変化や他の細胞からの信号を情報処理することにより,自らの制御を行っている.しかし,情報処理の仕組みは,未だ不明な部分が多い.特に,数理モデルを用いた定量的な観点からの研究は少ない.本研究では,細胞の情報処理において特に重要な役割を担うと考えられているシグナル伝達系の情報伝達に着目し,情報理論の枠組みを適用することで,定量的にシグナル伝達系の情報伝達を評価した.実際の細胞のシグナル強度を1細胞レベルで計測した実データを用い,情報伝達を相互情報量によって測ることに成功している.具体的には,ラットの副腎髄質由来の褐色細胞腫であるPC12細胞を用いて,NGF,PACAPなどの成長因子の刺激によってERK,CREBのシグナル伝達分子を経由してc-FOS, EGR1の早期応答遺伝子まで伝達する相互情報量を調べた.NGF, PACAPの刺激後にPC12細胞は神経細胞へと分化する傾向がみられ,NGF, PACAPは細胞分化を制御する情報を伝達していると考えられる.ただし,細胞が実際に生体内において取り得るNGFやPACAPの入力分布は不明であるため,相互情報量が最大となるような入力分布を用いて,相互情報量を算出している(通信路容量).PC12細胞の情報伝達を調べた結果,成長因子の種類によらず早期応答遺伝子へと伝達される情報量は約1ビット程度であったが,成長因子の種類によって,情報伝達に用いる主な経路は異なっていることがわかった.また,阻害剤を用いた薬理的摂動を与えるとシグナル強度は減少するが,伝達される情報量は頑強に保たれる傾向があることがわかった.情報伝達が頑強である要因のひとつとして,摂動によって損失があった経路の情報伝達が摂動を受けていない経路の情報伝達によって相補することがわかった.現在,相補性によって頑強な情報伝達が起きる仕組みの解明に取り組んでいる.シグナル伝達系に着目し,情報理論の枠組みを適用することで,定量的にシグナル伝達系の情報伝達を評価した.実際の細胞のシグナル強度を1細胞レベルで計測した実データを用い,情報伝達を相互情報量によって測ることに成功している.PC12細胞の情報伝達を調べた結果,成長因子の種類によらず早期応答遺伝子へと伝達される情報量は約1ビット程度であったが,成長因子の種類によって,情報伝達に用いる主な経路は異なることがわかった.

また,阻害剤を用いた薬理的摂動に対して,伝達される情報量は頑強に保たれる傾向があることがわかった.情報伝達が頑強である要因のひとつとして,相補性があることがわかった.ERK経路を中心とした解析は順調に進み,現在は,情報伝達の堅牢性や補償の仕組みについて焦点をあてた数理モデルによる解析を行っている.一方,AKT経路については膜局在などから画像処理に課題がある状況となっていて,サンプル取得は円滑には進んでいない.また,3分子種以上の同時染色については,定量性に問題がある状況である.また,2014年度から研究代表者の所属変更に伴い,ラボの立ち上げや実験環境の変化があり,2013年度と同様のペースでデータ取得を行うのは難しい状況である.情報科学情報伝達の堅牢性や補償の仕組みの解明を目指す.非対称2元Z通信路で得られた知見をもとに,より実際の細胞内シグナル伝達に近いモデルでの解析を行う.より実際に近いモデルでは,解析的評価のみでの解明は難しいので,数値計算を併用して仕組みの解明を行う.AKT経路や3分子種以上の組み合わせについては,所属変更による実験環境の変化も考慮し,情報伝達の堅牢性や補償の仕組みの解明を優先してひとまず保留とする.ERKシグナルネットワークにおいては,当初の計画よりも順調にデータが取得できたため,分布の推定や相互情報量を算出を早めて行い,解析を前倒しした.神経突起伸張の計測においても,画像解析の改善により,計測が可能となった.結果として,細胞内シグナル伝達において,情報量を通して定量的に調べることで,情報伝達に頑健性や補償性があることがわかり,収穫があった.一方,AKTシグナルネットワークのデータ取得は遅れている.原因のひとつは,AKTの活性は膜に局在するため,ERKシグナルネットワークで計測した分子種よりも画像解析による定量化が難しいことがある.ふたつめの原因は,先行研究で示されたようなERKとAKTによる相互作用によって神経突起伸張と細胞増殖の細胞運命が決定されることの再現が十分に取れず,AKTシグナルネットワークのデータを取得することの意味が薄くなっていることがある.再現がうまく行かない原因としては,AKTシグナルの活性の定量化が難しいために現象の抽出がうまくできていない可能性や,そもそも細胞株の違いによって現象が異なっている可能性がある.2014年度は,異動により所属が変わり,所属先のラボは今年度より発足した.そのため,年度の前半はラボの立ち上げに時間がかかり,実験が円滑に遂行できる状況ではなかったため,実験用消耗品の使用が大幅に減ったことが理由である.ERKシグナルネットワークの情報量の解析により,情報伝達に頑健性と補償性があることが実データによって本研究で示された.しかし,頑健性と補償性を生み出す仕組みは,まだ十分にわかっていない.よって,情報伝達が頑健になされる仕組み,および,補償性を持つ仕組みを明らかにする.仕組みをよく知るためには,数理モデルによる解析が適している.頑健性と補償性をよく表すような数理モデルを設計し,解析計算と計算機シミュレーションを併用して仕組みを解き明かす.AKTシグナルネットワークのデータ取得,および,解析は,AKT活性の定量化の改善を画像解析の点から試みる.
光印象法による口腔内形状直接計測と電子情報化

ラインレーザスキャン方式の3次元形状計測装置VIVID-910を用い,照射されたラインレーザをミラーを介し被験者の口腔内に導入する方法で光印象を行い,口腔内歯列および顎底の3次元形状を得ることが可能になった.しかし,測定精度を向上するためには,(1)歯の透明性によってレーザが透過する事を防ぐ方法,および(2)ミラーを介して計測する際に,患者によって光軸が変化するが,その調整が容易行える方法を開発する必要があった.そこで以下の検討を行った.(1)歯の透明性防止法:歯面から剥離しにくいマスキング材として,シェラック(乾燥透明白ラック,日本シェラック工業)と酸化チタン粉末(セレックパウダー,ジーシー)をエタノールで混和したものを用いた.このマスキング材は,唾液や粘膜の接触による剥離がなく,被験者の負担が大幅に改善された.また,計測後はアルコールガーゼで除去することができた.(2)ミラー調整および固定用ジグの開発:被験者の頭部をホルダーで固定でき,フリーアームによりミラーを口腔内で任意の位置・角度に調節および固定できるジグを開発した.この方法を用い直接計測した上顎咬合面の計測データと模型の計測データとのマッチングを検討した所,咬合面部分はおおよそ0.2mm以内の良好な精度で計測できていることが確認できた.ミラー固定用ジグを用いることにより,被験者の頭部,下顎の動揺が減少し,さらに計測装置と計測対象の距離やミラーの角度などの計測条件が調節しやすくなったため,精度の良好な計測が可能となったと考えられる.この方法の応用例として,印象材や模型材を用いない歯列の直接計測だけではなく,VIVIDで直接計測した前歯部を含む顔面データを用いて顔貌と歯列模型のデータを統合する事が可能になった.この方法は,患者の負担が少なく,今後矯正の診断や,CAD/CAMによる補綴物の作製などに応用できると思われる.本研究では、患者への負担がより少なく、また形状データの電子情報化が可能であるなどの利点を有する口腔内三次元形状光印象システムを開発することを目的として研究を進めている。そのため、(a)三次元デジタルカメラを応用し、口腔内写真を撮る要領で光印象する方法(b)レーザ光スキャン方式の三次元形状計測装置とミラーを用いて口腔内光印象を採得する方法の2種類のアプローチを試みた。a)の三次元デジタルカメラは交付申請書において、主要備品として申請したものであり、試供品を借用し検討した。その結果、極めて容易にカメラ撮影の感覚で三次元計測でき、精度としては我々が要求するものより低かったが、多方向からの合成も可能であった。ところが、この装置はその後、販売停止となり導入することが不可能となった。しかし、この種のカメラは現在工業界で高まっている三次元簡易計測の要求に対応するべく、他のメーカー等からも発売される可能性が高いので、今後の製品化に引き続き注目し、検討を続けたい。b)の超高速三次元形状計測装置(VIVID-700)を用いた口腔内光印象システムの開発については、実際に被験者の口腔内にステンレスミラーを導入し、光印象を行うことができた。この際、歯の透明性によってレーザの反射率が低下し計測精度が低下するので、歯列に歯科用CDA/CAMシステムのCERECが口腔内計測で用いている白色パウダを塗布することで改善することができた。しかし、この装置でも計測ピッチがまだ少しあらく、精度の点で検討の余地がある。最近、より精度の高いVIVID-900が発売されたので、次年度はこれを用いて光印象精度の向上を進める予定である。本研究では光印象法による口腔内の三次元形状計測法の開発を目指している。(1)直接印象法の開発昨年度の研究により、VIVID-700から照射されたラインレーザをミラーを介し被験者の口腔内に導入する方法で光印象できることが確認できた。しかし、この装置では計測ピッチが0.5mm程度と少しあらく、印象精度の点で検討の余地があった。所が、昨春データピッチが0.2mm程度と高分解能のVIVID-900が発売され、これを別途科研費で購入する事ができた。そこで今年度は、この装置を用いてまず前歯部の口腔内直接光印象を試みた。この際、歯の透明性によってレーザが透過し計測精度が低下するので、歯面の前処理を検討した。その結果、CAD/CAM法による歯科修復物製作システムCERECで用いられている白色パウダーを塗付すれば、透明感を抑え正確に計測できることがわかった。次に、臼歯部の印象法として、ミラーを用いてレーザーを口腔内に導入する方法を試みた。その結果、上顎では歯列咬合面だけでなく、口蓋を含めて計測することができた。このように、ミラーを用い複数計測したデータを合成することで、歯列全体の計測が行える可能性が示唆された。(2)光印象した歯列と顔面の三次元データの統合歯列の全形状を米印象するために、間接法も試みた。つまり、歯列模型をVIVIDで多方向から光印象し、そのデータを合成してアンダーカット部も含め全三次元形状を構築することができた。一方、顔面をVIVIDで3方向から直接光印象し、合成した。そして、バイトを口腔外に延長した先端にプレートを付けたインターフェースを作製し、これを上下模型と被験者の口腔内に保持した状態で計測し、両者のデータを共通として一致させることで、歯列と顔面三次元形状を統合することができた。ラインレーザ

スキャン方式の3次元形状計測装置VIVID-910を用い,照射されたラインレーザをミラーを介し被験者の口腔内に導入する方法で光印象を行い,口腔内歯列および顎底の3次元形状を得ることが可能になった.しかし,測定精度を向上するためには,(1)歯の透明性によってレーザが透過する事を防ぐ方法,および(2)ミラーを介して計測する際に,患者によって光軸が変化するが,その調整が容易行える方法を開発する必要があった.そこで以下の検討を行った.(1)歯の透明性防止法:歯面から剥離しにくいマスキング材として,シェラック(乾燥透明白ラック,日本シェラック工業)と酸化チタン粉末(セレックパウダー,ジーシー)をエタノールで混和したものを用いた.このマスキング材は,唾液や粘膜の接触による剥離がなく,被験者の負担が大幅に改善された.また,計測後はアルコールガーゼで除去することができた.(2)ミラー調整および固定用ジグの開発:被験者の頭部をホルダーで固定でき,フリーアームによりミラーを口腔内で任意の位置・角度に調節および固定できるジグを開発した.この方法を用い直接計測した上顎咬合面の計測データと模型の計測データとのマッチングを検討した所,咬合面部分はおおよそ0.2mm以内の良好な精度で計測できていることが確認できた.ミラー固定用ジグを用いることにより,被験者の頭部,下顎の動揺が減少し,さらに計測装置と計測対象の距離やミラーの角度などの計測条件が調節しやすくなったため,精度の良好な計測が可能となったと考えられる.この方法の応用例として,印象材や模型材を用いない歯列の直接計測だけではなく,VIVIDで直接計測した前歯部を含む顔面データを用いて顔貌と歯列模型のデータを統合する事が可能になった.この方法は,患者の負担が少なく,今後矯正の診断や,CAD/CAMによる補綴物の作製などに応用できると思われる.
移植医療に向けた、膵島細胞分化経路の解明

近年、糖尿病の治療に、膵臓または膵島の移植、遺伝子治療、人工膵臓などを定着させるためには、膵島細胞の分化・増殖を誘導する技術の確立が急務である。本研究で、まず膵島細胞の誘導に適した細胞を選択するために、膵島細胞の正確な分化経路の解明を試みた。その手段として、個々の細胞が前駆細胞の段階で、ある特定の遺伝子を発現したか否かを検定するために、新たにcre-loxP systemを応用し、マウスから単離した膵島細胞において、'前駆細胞遺伝子発現検定法を考案した。この検定法を用い、まずインスリン遺伝子の発現を指標として膵島細胞の分化経路を解析している。はじめにインスリン遺伝子のプロモーターを有するcre遺伝子の発現ベクターを構築し、トランスジェニックマウスを作製した。このマウスでは、cre遺伝子がインスリン産生細胞特異的に発現していることを、RT-PCRおよび抗cre抗体を用いた免疫組織化学染色により確認した。次に、動物細胞で普遍的に活性化するCAGプロモーターの直下にloxP配列で挟んだ転写終止カセットを挿入し、cre recombinaseの非存在下では発現しないよう制御されたEGFP遺伝子(レポーター)の発現ベクターを構築し、トランスジェニックマウスを作製した。この2つのマウスを交配し、ダブルトランスジェニックマウスを作製した。サザンブロット法を用い、このマウスの膵島において、loxP配列の組み換えが起こり転写終止カセットが切り出されていることを確認した。現在、このダブルトランスジェニックマウスの膵島において、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡等を用いてEGFPの発現を検定し、いかなる細胞が、インスリン陽性細胞から派生したかを解析している。今後、同様にグルカゴン、ソマトスタチン、PPについても解析し、膵島細胞の分化経路を解明して行く予定である。検定したい遺伝子のプロモーターで発現が制御されるよう構築されたCre recombinase遺伝子と、動物細胞で普遍的に活性化するプロモーターを持つものの、その直下に、両端にloxP配列を有する転写終止カセットが挿入され通常では発現しないよう制御されたレポーター遺伝子を持つダブルトランスジェニックマウスにおいて、検定したい遺伝子が発現した細胞では、Cre recombinaseが発現し、lokP配列の組み換えが起こり転写終止カセットが切り出されるため、レポーターが発現する。さらに、この細胞から派生した細胞にも、転写終止カセットが欠失したレポーター遺伝子が伝わるため、レポーターが発現する。即ち、ダブルトランスジェニックマウスから採取した細胞がレポーターを発現している場合、その細胞もしくはその前駆細胞において、検定に用いた遺伝子が発現していたことを示す。本研究では、上記の方法を用い、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、PP産生の各膵島細胞が、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、PPのうちどのホルモンを発現する前駆細胞に由来するのか、解析することを目的としている。初年度では、当初の実験計画に則り、インスリンプロモーター-Cre Tg mouseとレポーター(EGFP Tg mouseを交配しダブルトランスジェニックマウスの作製に成功している。グルカゴン、ソマトスゴチン、PP-Cre Tg miceも順次作製中である。次年度では、これらのダブルトランスジェニックマウスよりそれぞれ膵島組織切片を採取し、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡およびフローサイトメーターを用いてレポーターの発現を解析する予定である。本研究では、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、PPを産生する各膵島細胞が、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、PPのうちどのホルモンを発現する前駆細胞に由来するのか解析し、膵島細胞の分化経路を明らかにすることを目的としている。<方法

>検定したい遺伝子のプロモーターで発現が制御されるよう構築されたCre recombinase遺伝子と、動物細胞で普遍的に活性化するプロモーターを持つ遺伝子各々の直下に、両端にloxP配列を有する転写終止カセットが挿入され、通常では発現しないように制御されたレポーター遺伝子を持つダブルトランスジェニックマウスを作成する。このマウスにおいては検定したい遺伝子が発現した細胞では、Cre recombinaseが発現し、loxP配列の組み換えが起こり転写終止カセットが切り出されるため、レポーターが発現する。さらに、この細胞から派生した細胞にも、転写終止カセットが欠失したレポーター遺伝子が伝わるため、レポーターが発現する。即ち、ダブルトランスジェニックマウスから採取した細胞がレポーターを発現している場合、その細胞もしくはその前駆細胞において、検定に用いた遺伝子が発現していたことを示す。この方法を用い細胞の分化経路を解明する。<研究経過>当初の実験計画に則り、インスリンプロモーター-Cre Tg mouseとレポーター(EGFP) Tg mouseを交配しダブルトランスジェニックマウスを作製した。膵島組織切片を採取し、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡およびフローサイトメーターを用いてレポーターの発現を解析したが、充分なEGFPの発現を得られなかった。そのため、レポーター遺伝子をlacZに変更したダブルトランスジェニックマウスを作製した。現在このマウスを用いて解析を進めている。
神経発育因子による神経節再生と可塑性の研究

水棲カタツムリの培養中枢神経細胞を用いて、細胞体細胞体神経節を形成させた。神経発育因子を含まない培養液で細胞体細胞体神経節を作成した場合、細胞内カルシウムの局在化は認められなかった。この群では電気生理学的に生体内で形成される興奮性の神経節ではなく抑制性の神経節であった。一方、神経発育因子を含む培養液を用いた場合は50%に局在化を認めた。この神経節は興奮性であった。また最初発育因子を含まない培養液で培養を行ったあと、発育因子を含むもので培養を行うと興奮性神経節のみが観察された。神経節は修正されたと推定された。また細胞内カルシウムが局在化したもののみが興奮性神経節となり、神経節が修正される過程で細胞内カルシウムの局在化が必須であり、また修正過程において神経発育因子が必要であることがわかった。さらに細胞内カルシウムの局在化に必要な神経発育因子が、受容体チロシンキナーゼを介して作用するかを明らかになった。【目的】神経節の形成過程で神経発育因子が存在しないと正常な神経節が形成されない。また神経節の形成にカルシウムの局在化は重要である。カルシウムイメジングを用いて、神経発育因子が神経節の修正過程に細胞内カルシウムの局在化にどのような影響を与えるか検討する。【方法】Lymnaea stagnalisを5%アルコールで麻酔後、脳を摘出する。細胞を単離するために酵素処理を行う。外膜を剥離し、ガラスピペットをマイクロシリンジに装着し細胞を吸引採取する。細胞は呼吸のネットワークを形成するRPeD1とVD2またはVD3とする。この2つの単離細胞を培養皿に定着させ、インキュベーターで24時間培養を行う。神経発育因子を含まない状態の培養液(defined medium;DM)を用いた後、神経発育因子を含む培養液(conditioned medium;CM)に変更する。6時間後にFura-2を細胞内に導入する。同時にガラス電極を用いてシナプスを確認する。以下の2群に分けて研究を行う。1.DM群(神経発育因子を含まない培養液:n=8)2.CM群(神経発育因子を含まむ培養液:n=8)【結果】DM群では細胞内カルシウムの局在化は認められなかった。この群は電気生理学的に生体内で形成される興奮性の神経節ではなく抑制性の神経節であった。CM群では50%に局在化を認めた。【結論】シナプスが修正される過程で細胞内カルシウムの局在化は重要である。また局在化は神経発育因子が必要である。【目的】神経節が修正される過程で細胞内カルシウムの局在化は重要であり、神経発育因子が必要であることがわかった。神経発育因子の多くは受容体チロシンキナーゼ(TrK)に結合し作用を発現する。細胞内カルシウムの局在化に必要な神経発育因子が、TrKを介して作用するかを明らかにする。神経発育因子を含まない状態の培養液(defined medium ; DM)を用いた後、神経発育因子を含む培養液(conditioned medium ; CM)に変更する。12時間後にカルシウムイメージングを用いてカルシウムの局在化の有無を調べる。以下の群に分けて研究を行う。1.DM群(神経発育因子を含まない培養液)【結果】DM群では細胞内カルシウムの局在化は認められなかった。2-2.群では50%に局在化を認めたが、2-1.群では認めなかった。
免疫細胞の体内動態制御法の確立とその癌免疫療法への応用に関する研究

本研究は、腫瘍免疫において重要な機能を担っている樹状細胞(DC)や細胞傷害性T細胞(CTL)の生体内動態を制御しうる基盤テクノロジーを構築し、この"Cell Delivery System"ともいうべき概念を導入した新規癌免疫療法の開発を目的に遂行された。本年度は、一本鎖抗体(scFv)発現系を応用してCTLの体内動態(腫瘍集積性)を改善する方法論の確立とその癌免疫療法における有用性を解析し、以下の成果を得た。1.腫瘍新生血管に特異的かつ豊富に発現しているflk-1を標的分子として選択し、抗fik-1scFvと細胞膜貫通ドメインの融合蛋白質を発現するレトロウイルスベクターを作製した。本ベクターで遺伝子導入したCTLでは、細胞表面に機能的な抗fik-1 scFvを発現していることが確認され、担癌マウスに静脈内投与した際にはコントロールCTLと比較して腫瘍集積性が約3倍向上するとともに、抗腫瘍効果の大幅な増強が認められた。2.上記(i)の成果を踏まえて、抗fik-1 scFvにCD3分子とCD28分子の細胞内シグナル伝達ドメインを結合したキメラ抗原レセプターを発現するCTLを創製した。この改変CTLは、flk-1発現細胞を特異的に傷害する活性を有しており、担癌マウスに静脈内投与すると、腫瘍集積性が向上するのみならず腫瘍血管傷害による劇的な腫瘍退縮をも達成できることが明らかとなった。これらの成果により、抗flk-1 scFvを細胞表面に発現させるアプローチが、細胞医薬への腫瘍ターゲティング能の付与に極めて有用であり、さらにscFvに細胞内シグナル伝達ドメインを融合させたキメラレセプターの応用が、標的分子に応答した細胞医薬の機能制御をも可能にすることを実証できた。今後は、本研究での基盤技術を活かした新規癌免疫療法の確立に向けて、詳細な作用機構の解明や安全性の評価を図っていく予定である。本研究では、腫瘍免疫において重要な機能を担っている樹状細胞(DC)や細胞傷害性T細胞(CTL)の生体内動態を制御しうる基盤テクノロジーを構築し、この"Cell Delivery System"ともいうべきアプローチを導入した新規癌免疫療法の開発を目指す。本年度は、ケモカイン-ケモカインレセプター連関を利用して免疫細胞の体内動態(腫瘍集積性)を改善する方法論の確立とその癌免疫療法における有用性を解析し、以下の成果を得た。(i)広範な種類の腫瘍細胞に極めて効率よく遺伝子導入可能なRGDファイバー改変型アデノウイルスベクターを用いて、マウス皮内に生着させたMeth-A腫瘍(7-9mm)にケモカイン(CCL27)とサイトカイン(IL-12)の遺伝子を共導入したところ、各遺伝子を単独で導入した群と比較して強力な腫瘍退縮効果が発揮された。また、この抗腫瘍効果の増強が、CCL27によるCD8陽性CTLの腫瘍内動員と、IL-12によるこれら腫瘍内浸潤CTLの活性化が同時に促進された結果であることを明らかとした。(ii)腫瘍特異的なCTLを担癌マウスに移入する癌養子免疫療法モデルにおいて、移入CTLに高発現するケモカインレセプター(CCR7)に特異的なケモカイン(CCL19)の遺伝子を腫瘍組織に導入したところ、腫瘍増殖抑制効果に顕著な改善が認められた。また、CCL17遺伝子導入によって腫瘍組織に集積する移入CTL数が約2倍に増加することを明らかとした。これらの成果により、ケモカイン-ケモカインレセプター連関の応用が、生体内に存在する免疫細胞あるいは生体に細胞医薬として投与する免疫細胞の体内動態制御(Cell Delivery System)に有用であることを実証できた。