hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液型不適合及び異種移植におけるCD1d分子を介した糖鎖抗原認識機構の解明と制御

血液型不適合移植では臓器血管内皮に存在する、A/B血液型糖鎖抗原が、また異種移植ではGalα1-3Galb1-4GlcNAc(Gal)糖鎖抗原やN-glycolylneuramhic acid(NeuGc)糖鎖抗原が標的となり抗体性拒絶反応により移植臓器が廃絶される。我々は、A/B血液型抗原、Gal抗原あるいはNeuGc抗原に反応性を示すB細胞を特異的に制御しうる方法の確立を目指し研究を推進してきた。本研究で、これらの移植関連糖鎖抗原反応性B細胞の分化に関わるnatural killer T(NKT)細胞の役割を解析した。野生コントロールマウスでは、ヒトA型赤血球による免疫、α-galactosylceramide(α-GalCer)(CDld上に提示され、NKT細胞を活性化することが認められている唯一の糖鎖抗原)併用投与により、抗A型IgM,IgG抗体産生と促進が認められるのに対し、CDld(NKT細胞固有のVα14T細胞レセプターに対する〓igand)-ノックアウト(KO)マウス(NKT細胞欠損マウス)では、抗A型IgM抗体産生は有意に抑制され、IgG型抗体へのクラススイッチを認めなかった。同種異型マウスMHCに対する抗体産生はCDld-KOマウス、野生マウスで有意な差はなく、クラススイッチも正常に認められた。この結果より、NKT細胞と血液型抗原反応性B細胞の細胞間相互作用を制御することで血液型不適合移植における抗体性拒絶を回避し得る可能性が示された。また、NKT細胞を制御することではMHC反応性B細胞の機能、抗体産生制御は不可能なことが示された。今後異種抗原反応性B細胞の分化増殖に関わるNKT細胞の役割を解析する目的で、Gal糖鎖-KOマウスやNeuGc糖鎖-KOマウスとCDld-KOマウスを交配し、ダブルーKOマウスを作出した。本年度の研究では、これらの移植関連糖鎖抗原反応性B細胞の分化増殖に関わるnatural killer T(NKT)細胞の役割を解析した。CD1d-ノックアウト(KO)マウスとVα14-KOマウス(NKT-deficient)あるいは野生コントロールマウスをヒトA型赤血球で免疫した後に、血清中抗A型糖鎖抗体を測定した。野生コントロールマウスでは、α-galactosylceramide(α-GalCer)(CD1d上に提示されNKT細胞上のinvariant TCRによって認識される)の併用投与により、抗A型赤血球抗体産生の著明な促進が認められた。しかし、CD1d-KOマウスとVα14-KOマウスでは、抗A型赤血球抗体産生は有意に抑制され、α-GalCerの投与効果も認められなかった。また、CD1d-KOマウスに野生マウス由来のNKT細胞を移入したところ、抗A型赤血球抗体の産生が促進した。この結果より、NKT細胞と血液型A抗原反応性B細胞の間には細胞間相互作用が存在し、これを制御することで血液型不適合移植における抗体性拒絶反応を回避し得る可能性が示された。さらに異種抗原反応性B細胞の分化増殖に関わるNKT細胞の役割を解析する目的で、Gal糖鎖-KOマウスやNeuGc糖鎖-KOマウスとCD1d-KOマウスを交配し、ダブル-KOマウスを作出した本年度の研究では、これらの移植関連糖鎖抗原反応性B細胞の分化増殖に関わるnatural killer T (NKT)細胞の役割を解析した。また、通常のペプチド抗原、主に主要適合抗原(MHC)に対する抗体産生に対するNKT細胞の関与を解析した。

CDld(NKT細胞が使用するVα14-T細胞レセプターに対するligand)-ノックアウト(KO)マウス(NKT細胞機能欠損マウス)とVα14-KOマウス(NKT細胞欠損マウス)あるいは野生コントロールマウスをヒトA型赤血球で免疫した後に、血清中抗A型糖鎖抗体を測定した。野生コントロールマウスでは、α-galactosylceramide(α-GalCer)(CDld上に提示されNKT細胞上のinvariant TCRによって認識される)の併用投与により、抗A型赤血球IgM,IgG抗体産生の促進が認められた。しかし、CDld-KOマウスとVα14-KOマウスでは、免疫後の抗A型IgM抗体産生は有意に抑制され、IgG型抗体へのクラススイッチを認めなかった。また、CDld-KOマウスに野生マウス由来のNKT細胞含む肝内在リンパ球を移入したところ、抗A型赤血球抗体の産生が促進された。また、CDld-KOマウス、野生コントロールマウスでMHCに対する抗体産生には有意な差はなく、CDld-KOマウスにおいてもクラススイッチは正常に認められた。この結果より、NKT細胞と血液型A抗原反応性B細胞の間には細胞間相互作用が存在し、これを制御することで血液型不適合移植における抗体性拒絶反応を回避し得る可能性が示された。また、NKT細胞の機能を抑制することではMHCに対する抗体産生は抑制することはできず、あわせて外来抗原などペプチド抗原に対する抗体産生能を侵害しないことが明らかとなった。さらに異種抗原反応性B細胞の分化増殖に関わるNKT細胞の役割を解析する目的で、Gal糖鎖-KOマウスやNeuGc糖鎖-KOマウスとCDld-KOマウスを交配し、ダブル-KOマウスを作出した。
次世代Cu/low-k材料間の極薄バリヤを用いた安定な界面形成のための基礎的検討

本研究では、Si一ULSIにおけるCu多層配線部分での極薄バリヤの導入において、その信頼性の鍵となる界面層のない理想的な界面形成について検討を行った。まず、できるだけ低温で安定な窒化物バリヤを成膜するために、スパッタ法とWワイヤによるラジカル窒化を組み合わせた新たな手法を提案し、その有用性と問題点について検討した。この新規成膜手法で作製したTiNバリヤは、基板加熱しなくとも安定でかつほぼ1:1のTiN化合物が得られ、3nmまで極薄化しても500°Cの熱処理に耐え得る優れたバリヤ特性を示すことが明らかとなった。その要因は、バリヤ自身が安定な化合物として、かつ低温で作製できたこと、さらにはその構造が熱処理によって顕著に変化しないことと等の様々な要因が相まって、通常の界面に生起する界面層が存在しない界面を実現できたことによるものと推察された。一方、我々は極薄バリヤとして新たな材料の適用を検討し、ZrB_2という化合物でありながら極めて低抵抗な材料を従来報告されている温度よりも低温で作製することにより、Cu配線プロセスへの導入を検討した。その結果、ZrB2膜は室温から500°Cまでの堆積温度で成膜でき、かつ得られた膜は700°Cで1時間の熱処理後においても、顕著な構造変化も見られず、優れた安定性を持った材料であることが明らかとなった。さらに、Cu/Si02間に拡散バリヤとして適用した結果、700°Cの熱処理後においても、新たな反応生成物等も見られず、優れた熱的安定性を示すことがわかった。したがって、本研究により、極薄バリヤを用いた際に従来から問題となっていた界面層を効果的に抑制することが可能となり、その結果、3nm程度の極めて薄いバリヤを適用した高信頼Cu配線を実現できる見通しが得られたものと思われる。Si-ULSIにおけるCu配線は,さらなる微細化を続ける中で,ゲートの信号速度よりも配線部分の信号遅延が顕在化してきた。その対策として,層間絶縁膜を従来のSiO2からより低誘電率材料であるlow-k材料に置き換えることと,Cu配線のバリヤが高抵抗であることからより極薄化を図ることで,信号遅延の要因である配線抵抗と配線の寄生容量であるRC時定数を低減することが求められている。しかし,単純にバリヤ膜を極薄化するとCu配線の拡散を抑制できず,ULSI全体の性能の劣化が生じたり,あるいは異種材料が接する界面ではintermixingによる層が得られるが,その膜厚がバリヤ膜と同程度のオーダーである数10nm程度となることが新たな問題となってきた。そこで本研究では,数nm程度の極薄ナノバリヤを形成するにあたり,その界面で生起するintermixing layerの形成を抑制し,かつ極薄化しても優れたバリヤ特性が得られるのかをバリヤ材料の固有の性質(反応性,拡散性,化学的安定性,構造的安定性等)を考慮して検討を行った。その結果,VNあるいはZrN等の低抵抗な材料を用い,510nm程度の極薄膜とした場合のCu/low-k材料間のバリヤ特性を検討し,500°Cまでの熱処理によっても界面でintermixing layer等も見られない理想的な界面を形成することが可能であり,優れたバリヤ特性を示すことを実証した。従来,バリヤとして用いられているTa系のバリヤ

材料は,その界面に数10nm程度のintermixing layerが存在することが知られており,そのため10nm程度以下までバリヤを薄くすることは困難である一方,次世代65nmノードでは7nm,次の45nmノードでは5nmがバリヤの目標膜厚である。その中で本研究では,ナノクリスタルバリヤ膜とすることで,界面にintermixing layerの存在しない界面を実現することが可能とであり,それらの膜の抵抗率も,従来のバリヤの1/4程度であることから,RC時定数の低減にも十分に寄与できる。現在,界面制御のメカニズムの検討を行うと同時に,バリヤ膜の新たな形成手法についても検討を行っている。Si-ULSIにおけるCu配線技術の中で、最も解決を要する問題の一つとして極薄バリヤ膜の実現があげられる。極薄バリヤは単に数nmの連続で均一な膜を作製すること自体が、極めて困難である。さらに、近年の配線部分での信号遅延が回路全体の性能を律速するという状況をなんとか軽減するために、バリヤ材料は従来の高抵抗なTa系材料から、低抵抗な材料への移行が余儀なくされている。さらに、バリヤが極薄化したことで、従来から異種材料が接する界面ではよく知られたintermixing layerの存在が新たな問題として浮上した。そこで本研究では、まず35nmの極薄膜を作製する手法も含めて検討を行っている。その結果、メタルを成膜した後、ラジカル反応により窒化物バリヤを作製するという新たな成膜手法により、数nmの極薄膜を作製することが可能であることを見いだし、かつその新たな手法で作製した膜は、従来の反応性スパッタ法で作製したバリヤ膜とほぼ同等の特性が得られることを実証した。さらに、前年度に界面層のない理想的な界面を形成するために、バリヤ材料の固有の性質(反応性、拡散性、化学的安定性、構造的安定性等)を考慮して選定したTiN, ZrN等の材料を我々が提案する新たな成膜手法により作製し、Cu/SiO2間、あるいはCu/low-k材料間の拡散バリヤとしての特性を検討したところ、35nmの連続で均一なバリヤ膜を作製でき、かつ500700°Cの熱処理後まで安定な系を得ることが可能な優れたバリヤ特性が得られることが明らかとなった。さらに、その界面に着目すると、従来見られるintermixing layerは全く存在しない界面を実現できることが実証された。したがって、材料の固有の性質に着目して界面設計を行った結果、物理的な成膜手法の範疇では、成膜手法によらず理想的な界面を形成できることが知られた。さらに、我々が今回提案した新たな成膜手法は、今後の極薄膜の作製法の一つとして極めて有用であることが明らかとなった。さらに、今後ALD法等の化学的な成膜手法についても検討を行い、物理的な成膜手法により作製したバリヤのみならず、化学的な手法により作製したバリヤ膜においても同様の界面設計が成り立つかどうかを検証する予定である。次世代Cu/low-k材料間の拡散バリヤとして要求されているバリヤ膜厚は数nm程度であり、かつ多層配線部分の信号遅延を低減するために、できるだけ低抵抗な材料が望まれている。そこで本研究では、そのような低抵抗な材料を極薄膜として成膜する手法として、スパッタ法にラジカルによる窒化を組み合わせた新たな手法を提案し、従来からの反応性スパッタ法等で得られたバリヤ膜と新規成膜手法により得られたバリヤ膜の特性について検討を行ってきた。その結果、反応性スパッタ法においても、スパッタ条件を工夫することで、界面に従来から問題となっていた界面層を形成することなく極薄バリヤ膜を形成できることを実証するとともに、新規成膜手法では、反応性スパッタ法とほぼ同等の良好なバリヤ膜を基板加熱なしで得られ、かつ界面層等も存在しない理想的な界面を形成することが可能であることを見出した。さらに、Cu配線の次世代バリヤ
哺乳類嗅球を構成する神経前駆細胞の移動機構を探る

脊椎動物の終脳先端部に形成される嗅球は、嗅覚系の一次中枢として極めて重要な役割を担っている。興味深いことに転写因子であるPax6の遺伝子異常ラット胚(rSey^2/rSey^2)は、嗅球の位置異常という表現系を示す。そこで本研究では、このrSey^2/rSey^2胚を材料として嗅球発生におけるPax6遺伝子の機能解析を行い、嗅球発生の分子機構の解明を目指した。1)分子実験発生学的手法によるrSey^2/rSey^2胚の嗅球位置異常の解析哺乳類全胚培養系と終脳器官培養系を用いて、神経上皮細胞の標識、嗅球神経前駆細胞の移植、嗅上皮の除去、並びに外来性Pax6遺伝子の強制発現といった実験を行った。その結果、a)rSey^2/rSey^2胚の嗅球位置異常は、嗅球神経前駆細胞(僧帽細胞前駆細胞)の移動パターンの異常によってひき起こされている。b)この細胞移動パターンの異常は細胞非自律的な異常であり、rSey^2/rSey^2胚の終脳組織におけるPax6遺伝子の機能が失われたことに起因することを明らかにした。2)発生期の終脳において嗅球発生を制御する遺伝子の探索発生期の終脳に発現しており、rSey^2/rSey^2胚においてその発現パターンが変化している遺伝子を探索した結果、fgf-receptorであるfgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4の発現レベルがいずれもrSey^2/rSey^2胚終脳で減少していることを見い出した。今後、fgfシグナルと嗅球の形態形成との関連の解析が必要である。
英語所有格形の統語構造と意味論および語用論に関する共時的・通時的研究

一般的に言われているのとは異なり、Abney(1987)で提唱されたDP分析だけでは英語の所有格形を扱うことはできず、Taylor(1996)等で提案された複合語分析も必要であることには疑いの余地がない。しかも、歴史的に見るならば、複合語分析を必要とする所有格形表現の数は増加傾向にあり、平成17年度以降のアメリカ、カナダ、オーストラリア、イギリスにおけるアンケート調査の数値はその事実を見事に裏付けている。もう1つの興味深い変化は有生性条件にあり、ジャーナリズム英語を中心にこの条件は消滅の方向に向かっている。この傾向はジャーナリズム英語以外にも現れ始めており、そうした有生性条件に違反した表現の多くはDP分析よりも複合語分析を要求している。この有生性条件と複合語分析との相互関係を実証的に証明したのは本研究が初めてであり、そういう意味でも共時的研究と通時的研究の自然な融合は極めて重要である。有生性条件は語用論的条件であり、その条件の変化が統語構造にも影響を及ぼしていると考えられる。この点はまだ十分に立証されたとは言いがたいが、可能性は非常に高い。他方では限定詞という範疇が現代英語で強化されつつあることも事実で、bothとallは前位限定詞から限定詞に変化しており、限定詞という統語範疇が現代英語で大きな理論的地位を獲得しつつあり、DP分析の重要性を示している。こうした結論に至ることができたのは、平成17年度以降継続的に海外アンケート調査をしてきたためである。ある程度満足できるデータを蓄積することができたことも大きな成果であった。今後もこれを継続していきたい。現代英語の'sによって標示される属格形については、先行研究において、Abney(1987)のDP分析(DP analysis)が可能な例と、Taylor(1996)の複合語分析(compound analysis)が可能な例と少なくとも2種類があることが知られている。本年度は英語の属格の統語構造に関する理論的研究を進めると同時に、平成17年7月にオーストラリアにおいてアンケート調査を実施した。その結果、暫定的に次の結論に至っている。(1)DP分析や複合語分析がなされる属格表現の他に、Dの右側に付加される後位限定詞の一種として分析される時間・場所名詞属格と、形容詞修飾語としてN'に付加される度量名詞属格とが現代英語には存在する。イディオム属格と価値や量の属格も複合語の一種として分析することができる。(2)現代英語の属格名詞は主要部名詞の広い意味での修飾語が現れる位置とほぼ合致しており、属格名詞は恣意的にあちこちの位置に現れているのではない。現代英語には前位限定詞として分類される属格は存在しないが、その候補となる可能性があるのは後期中英語から初期近代英語にかけて現れたhis属格である。こうした結論に至ることができたのは、平成17年度だけでなく、本科学研究費補助金を得る以前から海外アンケート調査をしてきたためであるが、まだデータが不足しており、上記2つの主張を十分に裏付けるところまではきていない。来年度以降さらに調査を継続し、この2つだけでなく他の論点にもかかわるデータを蓄積していきたい。所有格表現と深い関係があるのが限定詞であり、所有格の研究は限定詞システムの研究なくして語ることはできない。それは共時的研究でも通時的研究でも同じであり、さらには統語的研究でも意味的研究でも同じである。本年度アメリカとオーストラリアで実施したアンケート調査で明らかになったのは、限定詞前位詞(predeterminer)と呼ばれる項目が限定詞、限定詞後位詞(postdeterminer)、修飾語の位置に移動しつつあるということであった。これは所有格表現の統語構造の研究にとって大きな意味を持っている。

なぜならば、これまで限定詞の位置にのみ現れると考えられてきた所有格表現が限定詞後位詞や修飾語の位置にも現れる可能性があり、現代英語の限定詞システムを従来とは全く異なる視点から見る必要が出てきたからである。しかも、この結果は所有格表現が現れる位置が変化しつつあるという昨年度のアンケート結果とも一致しており、昨年度の調査結果を分析する手掛かりを得たと言うことができる。統語的位置に多様性があるのであれば、その意味に多様性があるのも当然であり、意味論的研究にも大きな意味合いをもっている。所有格表現は指示詞的な意味を表すこともあれば、限定形容詞的な意味を表すこともあり、同じことが数量詞についても知られている。したがって、現代英語の所有格表現、限定詞前位詞、数量詞の少なくとも3種類の語彙項目が統語的も意味的にも並行的な特性を持つという結果になる。この結果はこうした項目の歴史的変化の分析にも影響を与えると予想され、来年度の課題の1つとしたい。平成19年度は本研究の最終年度になるので、英語所有格の共時的・通時的特徴を総合的にまとめる方向で研究を進めてきた。一般的に言われているのとは異なり、Abney(1987)で提唱されたDP分析だけでは英語の所有格形を扱うことはできず、Taylor(1996)等で提案された複合語分析も必要であることには疑いの余地がない。しかも、歴史的に見るならば、複合語分析を必要とする所有格形表現の数は増加傾向にあり、平成17年度以降のアメリカ、カナダ、オーストラリア、イギリスにおけるアンケート調査の数値はその事実を見事に裏付けている。もう1つの興味深い変化は有生性条件にあり、ジャーナリズム英語を中心にこの条件は消滅の方向に向かっている。この傾向はジャーナリズム英語以外にも現れ始めており、そうした有生性条件に違反した表現の多くはDP分析よりも複合語分析を要求している。この有生性条件と複合語分析との相互関係を実証的に証明したのは本研究が初めてであり、そういう意味でも共時的研究と通時的研究の自然な融合は極めて重要である。有生性条件は語用論的条件であり、その条件の変化が統語構造にも影響を及ぼしていると考えられる。この点はまだ十分に立証されたとは言いがたいが、可能性は非常に高い。他方では限定詞という範疇が現代英語で強化されつつあることも事実で、bothとallは前位限定詞から限定詞に変化しており、限定詞という統語範疇が現代英語で大きな理論的地位を獲得しつつあり、DP分析の重要性を示している。
好塩基球の膜蛋白CD203cの発現量を指標としたカルボプラチン過敏症の予測系構築

カルボプラチン投与中に発症するアナフィラキシーは、予測困難であり、時に呼吸器症状や循環器症状を伴う重篤なケースもみられることから、臨床上問題となっている。これまでに皮内反応テストの有用性が報告されているが、抗がん剤の被曝防止の観点から臨床応用が困難であり、予測性の高い安全な検出法の開発が切望されている。これまでの研究結果より、カルボプラチンの過敏症患者では、好塩基球の型酵素であるCD203cの発現量が未発症者に比べ有意に高く、さらに、少数例の検討(n=5)では、カルボプラチン投与前の血液検体からグレード2以上の過敏症が予測可能であった。本研究では、症例数を追加し、CD203cを指標としたカルボプラチン過敏症のin vitro予測系を検証し、実用化に向けた検討を行った。これまでに過敏症未発症者10名をエントリーし、そのうち8名について経時的にCD203cの発現量を測定した。過敏症を発症していない9名の22検体については、いずれの測定結果もCD203cの活性化率>6.0%、ΔMFI>10であり好塩基球の活性化はみられなかった。また、経過観察中にグレード1のアナフィラキシーを発症した1名(2検体)についても同様に陰性の結果であった。グレード4のアナフィラキシーの既往を持つ患者については、CD203cの活性化率が19.9%、ΔMFIが17.4と顕著に上昇しており、好塩基球の活性化が確認された。さらに、この患者のサンプルを用いて、PI3-Kの阻害剤であるWortmanninによる効果を検討したところ、CD203cの活性化がほぼ消失したことから、この1名については、カルボプラチンの過敏症はIgEを介する免疫機序が関わることが示唆された。以上より、これまでのデータの再現性が確認され、さらに発症機序についてもIgEを介した免疫機序の関連性を示唆する有益な情報が得られた。
認知症高齢者のその人らしさを保証するコンフォートケアモデルの開発

介護老人保健施設に適用できる認知症ケアガイドラインを開発した。この認知症ケアガイドラインにそったケアスタッフの実践は、入所者の在宅復帰率を高くし、ケアスタッフの仕事満足度を高くすることを実証した。入浴時におけるローズ水を用いた芳香療法は、認知症高齢者の感情を穏やかにすることを明らかにしたが、入浴ケアを行うスタッフのストレス軽減効果について統計学的に実証することはできなかった。また、写真を用いた回想法は認知症高齢者の認知機能の維持・改善の可能性があることが示唆され、回想法に関わった介護士の認知症高齢者ケアに対する認識の変化の様相を提示した。研究課題1「認知症高齢者のその人らしさを保証するコンフォートケアガイドラインの開発」に取り組み、ケアスタッフの認知症ケア実践と施設のアウトカム(在宅復帰率・平均在所日数)との関連についても検討した。平成23年度に実施した質問紙調査によるデータを分析し、「安心を高める環境づくり」「生活の継続性への支援」「その人の潜在能力を引き出す支援」「安全に社会とのつながりをもてる暮らしへの支援」「家族との協働を含めた一貫したケア」「家庭での療養への移行に向けた支援」の6因子・29項目で構成した介護老人保健施設に適用できる認知症ケアガイドラインを開発した。この認知症ケアガイドラインにそったケアスタッフの実践は、平均在所日数とは関連しないが、在宅復帰率を高くすることが示唆された。次に、研究課題2「認知症高齢者に対するケアリングの方法に則った介入がコンフォートの増進を導き、健康探索行動(認知レベルの改善等)が強化されるというモデルを設定し、その実証的な検討を行う」に取り組んだ。介護老人保健施設入所中の認知症高齢者の入浴行動過程においてローズ水を用いた芳香療法(ケアリングの方法に則った介入)を行い、感情の安定性を検討した。10名を対象とし、芳香を用いない入浴(A1)1回の後に、芳香を用いた入浴(B)を1回、その後に芳香を用いない入浴(A2)を1回設けた。脱衣室と浴室における一連の入浴行動過程を2分毎に観察し、認知症高齢者の感情を「happy」「neutral」「unhappy」に分類し、「happy」数と「unhappy」数の差を「穏やかさスコア」とした。(A1)と(B)、そして(A2)において分散分析・多重比較を行った結果、(A1)と(B)の間、(A2)と(B)の間で有意差が認められ、ローズ水を用いた芳香療法は、認知症高齢者の入浴時の感情を穏やかにする効果があることが示唆された。研究課題2「認知症高齢者に対するケアリングの方法に則った介入がコンフォートの増進を導き、健康探索行動(認知レベルの改善等)が強化されるというモデルを設定し、その実証的な検討を行う」に取り組んだ。介護老人保健施設入所中の認知症高齢者を対象に写真を用いた回想法(グループ及び個人)を実施し、(1)参加高齢者の認知機能に及ぼす影響、(2)個人回想法に関わった介護士の認知症高齢者ケアに対する認識の変化、について検討した。(1)回想法の前後にTDASプログラムで認知機能を評価した結果、回想法の前後でTDAS得点に有意差は認められなかったが、個別の点数変化をみると、点数が低下(認知機能が改善)した人は3名で、1名はほぼ横ばいであった。このことから、写真を提示しながら行う回想法を、グループ回想法と個人回想法を組み合わせて実施していくことは、認知機能の維持・改善の可能性があることが示唆された。(2)個人回想法を行った介護士に、回想法の前後において、参加高齢者をどのように捉え、関わっているかについて半構成的面接を実施し、介護士の認識の変化をあらわしている特徴的な発言を抽出し、分類整理した。その結果、介護職員の認知症高齢者ケアに対する認識の変化として15の内容が見出され、“その人がよく分かる"“その人への関心が高まる"“日常のコミュニケーションが円滑になる"“関わることの喜び・楽しさを実感する"という4つのカテゴリーに分類された。また、写真を用いた回想法を実施する際に、高齢者と介護者が共同でライフストーリーを生成するにあたって、そのきっかけとなる人生のキーワードを抽出するシステムの開発と、そのシステムを活用して蓄積された会話データ・写真提示履歴・キーワードリストから簡易ライフストーリーブックを作成することにも取り組んだ。介護老人保健施設に適用できる認知症高齢者のコンフォートを増進するケアモデルを開発するために,研究課題1「認知症高齢者のその人らしさを保証するコンフォートケアガイドラインの開発」に取り組んだ.原らの先行研究(原他,2009;Hara,et al.,2011),「認知症高齢者への環境支援のための指針(PEAP日本版3)」,認知症ケアに関する基本文献を参考に,認知症ケアの専門家らによる討議を行い,その人らしさを保証する(コンフォートを増進する)質の高い認知症ケアの仮説的な条件設定についての十分な検討を通して,介護老人保健施設の看護・介護職員における認知症ケアの要素29項目を抽出した.さらに,抽出された各項目について,ケアの焦点は何かという視点に基づいてカテゴリー化を行い,6領域に集約した.

具体的には,「安心を高める環境づくり」の領域に6項目,「生活の継続性への支援」の領域に4項目,「その人の潜在能力を引き出す支援」の領域に6項目,「安全に社会とのつながりをもてる暮らしへの支援」の領域に4項目,「家族との協働を含めた一貫したケア」の領域に6項目,「家庭での療養への移行に向けた支援」の領域に3項目である.上記の29項目(6領域)を「認知症ケアガイドライン」とし,その構成概念妥当性ならびに信頼性について検討することを目的に,質問紙調査を実施した.全国から無作為抽出した介護老人保健施設のうち14施設の調査協力を得て,常勤の看護・介護職員594名に調査票を配布し,396通を回収(回収率66.7%)した.有効回答数は380通(有効回答率64.0%)である.調査内容は,認知症ケアの実践頻度(考案した「認知症ケアガイドライン」で測定),看護・介護職員のコンフォート(仕事満足度),施設のアウトカム(在宅復帰率,平均在所日数)である.ライフストーリー・アプローチ(写真を用いた回想法)において試作した、認知症高齢者がライフストーリーを生成するきっかけとなるキーワードを自動抽出するシステムと、システム活用によって作成される簡易ライフストーリーブックについて、有用性の評価を行った。その結果、1ケア担当者(回想法の聴き手)を対象とした音声認識により効果的に人生のキーワードを抽出できる可能性があり、本システムは認知症高齢者のライフストーリー生成にかかわる介護士がキーワードを共有・再利用するために有用であること、2自分が写っている写真を見て自分だと認識できる高齢者との会話には本システムは有効であり、ケア担当者の使い勝手も良好であること、が示された。認知症高齢者を対象に実施したライフストーリー・アプローチ(写真を用いた回想法)の認知機能への影響について検討した。回想法に参加した高齢者4名の参加前後の認知機能をTDASプログラムで評価し、回想法前後におけるTDASの点数の差をWilcoxonの符号付き順位検定による解析を行った結果、回想法前後での差は認められなかった。しかし、個別の点数の変化をみると、4名中3名に認知機能の改善傾向が示され、1名はほぼ横ばいであり、認知機能の維持・改善の可能性があることが示唆された。また、ライフストーリー・アプローチ(写真を用いた回想法)において試作した、認知症高齢者がライフストーリーを生成するきっかけとなるキーワードを自動抽出するシステムを活用した際のライフストーリー導出プロセスを解析した。本システムを用いて実施した会話のトランスクリプトを修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチを用いて分析した結果、17の概念、7つの<カテゴリー>を生成した。個人回想法において、ケア担当者は<本システムによる写真提示>を行い、それをきっかけとして<問いかけ>、または<高齢者の反応を観察>し、ライフストーリー導出が可能であるか困難であるか<高齢者の反応に基づく判断>をする。ライフストーリー導出が可能である場合、さらに<問いかけ>、または<内容の繰り返し・推測>を行い、<ライフストーリーを共有>する。関連するさらなるライフストーリーを引き出すため<話題転換>を行うこともある。ライフストーリー導出が困難である場合、<問いかけ>の仕方を変えて再び<高齢者の反応を観察>し、反応に変化がなければ<話題転換>を行い、別のライフストーリー導出を試みる。話題を変える場合、ケア担当者は選択画面にある写真を見て、高齢者が反応を示しそうな写真を選択し、<本システムによる写真提示>を行う、というプロセスを見出した。介護老人保健施設に適用できる認知症ケアガイドラインを開発した。
霊長類における攻撃交渉時の行動調整とスマトラ産ほ乳類26種の保全

本研究は、ニホンザルの攻撃行動時に周囲の状況を見分けて適切な行動がとれるようになる能力がどのように発達してくるかを明らかにすることを目的にしている。これまでニホンザルの出生時から継続して観察を行い、当初の年齢層はすでに7才になった。ニホンザルが青年期に達して以降も、さまざまな行動の発達的変化が認められており、その観察を継続した。その中でマウンティングと呼ばれるオス同士で馬乗りをする行動が、オトナオスの第3者がいるときにより頻発することを見いだして、その結果を分析している。また母親の順位が変わると、すぐコザルの順位に反映されて順位が変化するが、その時の第3者の関与に関するデータを基に、分析を行っている。同じテーマで、京都府嵐山の野生群でも観察を行い、比較検討を行った。この結果は現在国際誌に投稿中である。スマトラ産ほ乳類の分布変遷については、生息地のさまざまな情報とあわせて分布変遷の分析を行っている。分析が終了次第、論文を投稿する予定である。また京都で開催された国際霊長類学会、およびヨーロッパ行動生物学会で成果の一部を発表した。平成21年11月に来日し、博士課程において観察していた霊長類研究所内のニホンザル飼育群の観察を継続しつつ、野生群である京都府嵐山群での観察を行った。これまで行ってきた飼育群とに比較対象として、香川県小豆島群、大分県嵐山群、宮崎県幸島群をも検討したが、種々の理由からこれまで観察を続けてきた飼育群を中心に、ニホンザルの成長を追跡しながら、嵐山の群れについて適宜比較対象としてのデータをとることになった。かっての観察対象個体はすでに34才になり、継時的な資料を蓄積している。またスマトラ産哺乳類分布の調査結果のまとめについては、GISソフトを用いた分析を取り入れるべく、作業を開始している。これまでニホンザルの出生時から継続して観察を行い、当初の年齢層はすでに6才になった。彼らは生後1年ですでに同年齢個体間ではっきりした順位関係が認められるが、その時期の行動の特徴について英文論文を発表した。観察を継続しており、すでにワカモノとなった個体の行動変化を追跡している。その中でマウンティングと呼ばれるオス同士で馬乗りをする行動が、オトナオスの第3者がいるときにより頻発することを見いだして、現在分析を進めている。また母親の順位関係が変わった時に、すぐコザルの順位に反映されて順位変動が起こるが、その時の第3者を含めた社会関係についてのデータを集め、分析している。その観察を野生群である京都府嵐山の群れでも行い、比較検討を加えている。スマトラのほ乳類の分布状況については、GISを用いた分析を行っており、生息地のさまざまな情報とあわせて分布変遷を見直している。
新たに見出した脂肪細胞の新機能と生活習慣病態との連関の解明ならびに制御剤の開発

本研究において、3T3-L1脂肪細胞系を用いた実験により、酸化LDL(OxLDL)と糖化後期生成物(AGE)リガンドが成熟脂肪細胞に取り込まれると、ROS産生を介してレプチンの産生量が減少することを初めて見出した。加えて、OxLDLが異なる酸化変性脂質を介し、かつ異なる分子機序により、悪玉アディポサイトカインであるPAI-1とレジスチンの発現増大を誘導することを見出した。すなわち、これら酸化ストレス産物(OxLDL,AGE-BSA)は、肥満と類似のアディポサイトカイン類の産生異常を誘発することを明らかにした。さらに、レジスチン発現増大において、細胞生物学的に興味深い「過酸化脂質成分が翻訳活性化を引き起こす」という現象を見出した。近年、アディポサイトカイン分泌異常に脂肪組織の酸化ストレス・炎症反応が関与しているとの報告が相次いでいる。本研究の成果により、酸化ストレスとアディポサイトカイン産生異常を関連づける上でのメディエーター候補としてOxLDLやAGE産物が浮上してきた。今後、in vivoにおいて、これらの産生が起こっているかの検証を待たねばならないが、脂肪細胞のアディポサイトカイン産生に対する酸化変性脂質、およびAGEリガンドの影響は、顕著である。よって、これらのリガンドのアディポサイトカイン産生誘導の分子機構解明は、メタボリックシンドロームの予防・治療のための創薬標的として有望である。申請者らは,脂肪細胞がスカベンジャー受容体CD36を介して酸化LDLやAGEを貪食するという新しい機能を見いだした。本年度は、酸化LDLや糖尿病患者に頻見される糖化反応後期生成物(AGE)の取込みによって,マウス3T3-L1脂肪細胞から放出される各種アディポカイン類(レジスチン、PAH、レプチン)の量が変化することを見出し、どのような分子メカニズムによるのか生化学的手法により詳しく解析した。1.酸化LDLの取込みとレジスチンおよびPAI-I放出促進メカニズムの解析1)レジスチンは、酸化LDL添加後、すみやかに分泌が増大した。この際、mRNA量の増大は起こらなかった。ポリゾーム解析を行ったところ、タンパク質への翻訳過程が亢進していることが判明した。2)PAI-1の分泌量増大は、mRNA量の増大に対応した。かつ、過酸化水素等によっても産生量が上昇したことより、酸化LDLより産生される活性酸素種(ROS)による各種酸化ストレス応答の結果ということが分かった。酸化LDLとAGEの取り込みによって、レプチンの産生量が減少した。mRNA量も低下していた。この低下した原因は、ROS産生に由来することが分かった。本現象は、マウス初代培養系でも確認された。以上の結果より、酸化LDLの取り込みによって肥満や生活習慣病と関連の深いアディポカインの産生量が変化することが立証された。そのメカニズムについても、PAI-1とレプチンについては、酸化LDLが発生するROSを介していることが分かった。一方、レジスチンについては、これらとは全く異なるメカニズムによることが明らかとなった。次年度は、後者の分泌促進機序を明らかにすると共に、その制御剤の探索を行う。申請者らは、酸化LDLやAGEの取り込みによって悪玉アディポカインであるplasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)やレジスチンの分泌量が増大し、逆に抗肥満因子であるレプチンの産生量が減少することを明らかにしてきた。本年度は、酸化LDLによるPAI-1とレジスチンの産生促進の分子機構を、転写・翻訳段階に着目して調べ、分泌量増大を引き起こす酸化LDL成分を探索した。(1)リゾホスファチジルコリン(Lyso-PC)によるPAI-1分泌促進機序の解明酸化LDLはPAI-1の転写活性化を促進することを見いだした。酸化LDL中のどの成分がこれを活性化しているか調べたところ、酸化生成物リゾホスファチジルコリンであることを明らかにした。この作用にはMAPキナーゼシグナルが関与していた。現在、創薬標的となりうるLyso-PCが作用する分子の探索を行っている。(2)酸化LDLの取込みによるレジスチン翻訳活性化と分泌促進作用の解析

酸化LDLはレジスチンの転写レベルを変化させずに、その分泌量を増大させる。ポリゾーム解析と翻訳阻害剤を用いた実験により、酸化LDLは翻訳レベルを活性化することでレジスチン発現を増大させることが分かった。また、この翻訳調節にはレジスチンmRNA上の3'-UTR側が重要であることをルシフェレーゼアッセイにより明らかにした。さらに、酸化LDL中の翻訳促進因子について探索を行ったが、既存の過酸化脂質成分ではなかった。酸化LDLによるアディポカイン産生促進機序が次第に明らかになってきた。次年度はこれまでの結果を踏まえ代謝症候群の予防と治療に結びつく創薬標的分子を明確にし、治療候補薬のスクリーニングを行う。申請者らは、酸化LDLやAGEの取り込みによって悪玉アディポカインであるPlasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)やレジスチンの分泌量が増大し、逆に抗肥満因子であるレプチンの産生量が減少することを明らかにしてきた。本年度は、PAI-1とレジスチンの産生増大を引き起こす酸化LDL中の活性成分を探索した。1)リゾホスファチジルコリン(LPC)によるPAI-1分泌促進機序の解明PAI-1の転写活性化を促進する酸化LDLの成分が、リゾホスファチジルコリン(LPC)であることを明らかにした。LPCは、活性酸素種(ROS)の産生を促し、このROSがPAI-1の転写活性化を起こすことを明らかにした。さらに、LPCはIL-6、MCP-1の発現をも増大させ、アディポネクチンの産生を減少さるという病態生理学的に興味深い知見が得られた。2)レジスチン翻訳活性化を誘導する酸化変性脂質成分の分離酸化LDLは翻訳レベルを活性化することでレジスチン発現を増大させることが分かった。さらに、酸化LDL中の翻訳促進因子についてHPLCによる探索を行い、脂質成分中に活性画分を得た。今後、化学構造の同定を行なう。酸化LDLによるアディポカイン産生促進の分子機序の解析を行ない、異なる脂質成分が、異なる分子機序でアディポサイトカイン産生に影響を引き起こすことを明らかにした。今後は、in vivoでの検証と、酸化変性脂質を標的とした治療候補薬のスクリーニングを行う。
CCR5を標的とした新規の抗HIV剤の基礎的研究と開発

本研究では既存の薬剤と異なる作用点を持つ抗HIV剤の開発を目的にケモカインレセプター(CCR5)阻害剤の開発・研究を展開した。新規のCCR5阻害剤:AK602/ON04128は我々が見いだしたプロトタイプの化合物:E913(Maeda, Miyakawa & Mitsuya, JBC.276:35194-35200,2001)より強力な抗HIV活性と優れた薬物動態を示した。更に複数のAIDS治療薬に対して高い耐性を獲得した変異株を含めたR5 HIVの感染・増殖を試験管内で強力に抑制し、動物モデル(NOD-SCIDマウス)の系でも強力な抗ウイルス活性を発揮、HIVウイルス血症を約2log抑制することを示した。更に放射線ラベル化(^3H)化合物を用いた検討でAK602は強力なCCR5に対する結合親和性K_D値:2.9nM)を持ち、さらにレコンビナントgp120とCCRとの結合を強力に阻害した。その一方でAK602はケモカイン、特にRANTESの生理的作用にはわずかしか影響を与えない結合様式をとっていることが分かった。更にCCR5阻害剤と種々の組み換え型CCR5を用いてAK602が既存のCCR5阻害剤の結合部位と異なる部位に結合、その中でもextracellular loop2の両端に位置するアミノ酸(G163とK191)が結合に重要であることを示した。AK602/ONO4128は米国での健常者での初期安全性試験(Phase1)が終了、現在、臨床第2相試験が行われている。本研究の意義としては、新規のCCR5阻害剤:AK602のin vitro/in vivoの評価を進め、臨床試験段階まで進めたことと共に、CCR5阻害剤とケモカインの相互作用、CCR5との結合様式といった基礎的な知見も多く得られたことが挙げられる。
下歯槽神経血管束の構成と自律神経線維の存在について

下歯槽神経血管束の構成を検討する目的にて、HRP法を適用すると共に、交感神経に関してはアミン蛍光法を、副交感神経に関してはコリンの間接的な証明としてアセチルコリンエステラーゼ(AChE)染色を、また、知覚神経繊維に関連して、Calcitonin gene related peptide(CGRP)抗体を用いた免疫組織化学を応用した。さらに、神経節切除実験を行い、各染色所見を比較検討した。SD系ラットにてHRP法の下歯槽神経への適用により三叉神経節、耳神経節にHRPの取り込みを確認し得たが、上けい神経節への取り込みは確認し得なかった。また、AcidGA法での検討では、下歯槽動脈周囲にアミン蛍光所見を認めたが、下歯槽神経束内に明らかな陽性所見はみられなかった。AChE染色では、下歯槽動脈周囲に陽性所見を確認すると共に、下歯槽神経束内にも散在性にAChE陽性所見を確認し得、同反応所見は歯根膜、下唇粘膜部の血管周囲にも認められた。CGRP染色では、三叉神経節、下歯槽神経に陽性所見を認めた。下唇部では粘膜直下の自由神経終末並びに一部血管にも陽性所見を認めた。上けい神経節切除で、動脈周囲のアミン蛍光所見の消失を確認し、耳神経切除により上記AChE陽性所見の消失を確認した。また、上けい神経節の切除・耳神経節の切除により、CGRP様反応所見にはなんら変化はみられなかった。以上の結果よりラット下歯槽神経血管束では、CGRP含有知覚神経繊維はもとより、上けい神経節由来の交感神経繊維は動脈周囲を主体として、耳神経節由来の副交感神経繊維は動脈周囲並びに神経束内に含まれるものと結論した。一方、ラットでは、AChE反応は動脈周囲ではラビットと同様の所見を呈していたが、下歯槽神経束内では同様の散在性反応のほか、より強い反応が偏在して確認された。
大気微小（エアロゾル・PM）粒子の高精度推定：多波長並びに偏光情報の活用

多波長・偏光衛星データを基盤情報とした大気エアロゾル特性導出手法を考案し,実効システムを作成した.3年間の成果・達成度・今後の発展計画をまとめる:1効率的なエアロゾルモデルの提案.2偏光・非偏光両放射場に柔軟に対応可能な放射伝達システム作成.3近紫外並びに紫バンドデータ比で定義する吸収性エアロゾル識別指標(AAI)を提案.4大気汚染やPM粒子解析,地域気象影響評価等に応用.5衛星データ検証ツールをNASA/AERONETデータを基に作成.6本成果は2017年12月に打ち上げのJAXA/GCOM-C(しきさい衛星)搭載SGLIセンサデータに適用予定.大気エアロゾルは,衛星並びに地上からの観測を駆使して情報収集解析が実施されているにもかかわらず,深刻な大気汚染,雲との相互作用,森林や農作物などの生態系や人間の健康に与える影響等,未だに取り組むべき課題は山積みで不確定性も大きい.本年度は次の3点に焦点を当てて取り組んだ.1.甚大な大気汚染の解明,2.多波長・偏光衛星データ解析アルゴリズムの効率化,3.気象衛星ひまわり8号データのエアロゾル(PM2.5を含む)解析システムの開発.項目1に関しては、主として東南アジアにおける焼き畑や山火事に起因する炭素性(バイオマスバーニングエアロゾル:BBA)粒子による大気汚染解析を実施した.項目2は新たに統計手法を取り入れ,エアロゾルモデルの簡潔表現並びに,最終導出過程において最適推定を組み込み,精度向上と効率化を進めた.項目3は高頻度かつ高解像という気象衛星の利点を生かし,地上観測値との精密検証及びPM2.5分布の推定システム開発に取り組んでいる.来年(2017年)1月打ち上げJAXAから予定の地球観測衛星・気候変動観測ミッション(GCOM-C)データの解析を当面の具体的な目標として,その実効性を検証中であるため.昨年度に引き続き,衛星並びに地上からの観測データや数値シミュレーションを駆使して大気エアロゾルの特性解析システムの改良に取り組んでいる.大きくは,1.効率的な全球分布の導出アルゴリズムの考案並びにシステム開発と2.深刻な大気汚染粒子の解明に焦点を当てて研究を進めた.項目1に関しては,赤波長670と近赤外波長865 nmの偏光輝度値と,短波長の443 nm放射強度を用いて,エアロゾルの光学的厚さ,サイズ分布,複素屈折率,一回散乱アルビドの全球分布導出システムを作成稼動し,得られた結果は地上観測データや数値シミュレーションにより検証した.項目2に関しては,近紫外波長380並びに412nmデータの活用により,森林火災や焼畑に起因する炭素性(バイオマス・バーニングエアロゾル: BBA )粒子による大気汚染解析を精度と効率の両面から改善し,検知ー解析ー検証という一連の流れを確立し全球規模解析を可能にした。衛星データから甚大な大気汚染域を含む大気粒子の全球解析システムを開発した.更に改良を加え,様々な衛星データを対象として実効性を検証中である。時空間を動きまわる希少で微小な大気エアロゾル粒子の実体(量,大きさ,組成,形)把握は難しい.エアロゾルが健康・環境・社会に与える影響の大きさが認識され,衛星および地上計測・実験・理論・モデルを駆使した研究調査が始まった.特に越境大気汚染(黄砂粒子・PM2.5)問題を抱える我が国では大気エアロゾル解析は緊急課題である.しかし大気エアロゾル特性の高精度把握や雲との相互作用を含めた放射収支に与える不確定性は未解決のままである.本研究は衛星で取得される多波長・偏光データを基盤情報として地上計測データやシミュレーション情報を複合活用した精密で効率的な大気エアロゾル・リトリーバル手法を開発し,実効的なシステムを構築する事を目的とした.次に,3年間の成果・達成度・今後の発展計画をまとめる:1効率的なエアロゾルモデル表記を提案し,広くMODISやADEOS-2/GLIデータに適用し,計算効率だけではなく精度面でも十分な結果が得られる事を実証した.2偏光放射伝達モデルの実用化精度向上に努めた.更に,偏光・非偏光両放射場に柔軟に対応可能なシステムへの移行に着手した.3近紫外並びに紫バンドデータ比で定義する指標(AAI: Absorption Aerosol Index)を提案,この指標を用いてエアロゾルを鉱物粒子,植物燃焼粒子,硫酸粒子,雲に大別できる事をADEOS-2/GLI全球データを用いて示した.4大気汚染やPM粒子解析,地域気象影響評価等に応用した.5衛星データ検証ツールをNASA/AERONETデータを基に作成した.4つの選定ルールを提案し,各項目に3段階評価を付して目的に応じた衛星プロダクツ検証に非常に有用である事を示した.6本研究成果は,2014年10月に打ち上げられたひまわり8号やJAXA/GCOM-C(しきさい)搭載SGLIセンサデータ解析に活用予定である.多波長・偏光衛星データを基盤情報とした大気エアロゾル特性導出手法を考案し,実効システムを作成した.3年間の成果・達成度・今後の発展計画をまとめる:1効率的なエアロゾルモデルの提案.2偏光・非偏光両放射場に柔軟に対応可能な放射伝達システム作成.3近紫外並びに紫バンドデータ比で定義する吸収性エアロゾル識別指標(AAI)を提案.4大気汚染やPM粒子解析,地域気象影響評価等に応用.5衛星データ検証ツールをNASA/AERONETデータを基に作成.6本成果は2017年12月に打ち上げのJAXA/GCOM-C(しきさい衛星)搭載SGLIセンサデータに適用予定.

上記で述べたJAXA/GCOM-Cデータ解析に限らず,地球大気における偏光データ解析には,「地表面反射の偏光特性」「非球形粒子の導入」が不可欠である.地表面反射モデルは,完全自由底面→ランベルト反射→Ross & Liモデルを代表とする双方向反射(BRDF)モデル→フランスPOLDERグループによる偏光を考慮した(BPDF)モデルへと進化している.ここでは,更にBRDFとBPDFの物理過程を統一したBRMの計算コードの作成と実用化に取り組む.エアロゾル形状を従来の球形で近似できる限界を,先ず地上PMサンプラー計測値から探る.PMサンプリングデータのX線電子顕微鏡写真の解析から大気粒子の大きさ・形状分類,組成分析を行っている.大粒子ほど不規則形状が無視できないのは当然であるが,粒径だけではなく,粒子の種類(組成)による形状の変化も無視できない.原則として粒子の大小にかかわらず,大気粒子の光散乱問題の解析において,不規則形状の考慮は不可欠である.粒子の形状は,放射強度以上に偏光に大きな影響を及ぼすため,非球形粒子による光散乱パターンの定式化,実用化は避けられない.A衛星データ解析には、「地表面反射光特性」「非球形粒子の導入」が不可欠である。地表面双方向反射モデルは,BRDFとBPDFの物理過程を統一したBRMの計算コードの作成と実用化に取り組む。エアロゾル形状を従来の球形で近似できる限界を探り,粒径だけではなく,粒子の種類(組成)による形状の変化を考慮する。特に大気粒子の偏光光散乱解析において,粒子形状の考慮は不可欠である。粒子形状を考慮する事により,念願の課題である「エアロゾルと雲分離」並びに「雲の上のエアロゾルの識別」に取り組む。更に,もう一つの課題である「大気汚染の生態への影響」についても歩を進めたい。環境動態解析27年度に未使用金が生じた主要な原因は、以下の通りである。本研究課題の初年度のため、研究補助依頼が9月以降開始となった。6月末に負傷(骨折)したため、参加予定であった国際学会への出席を取りやめたため。28年度に国際学会での発表を予定しているため、参加旅費として使用予定。最終年度につき,地球観測データベースおよび検索システム構築等研究補助要員の雇用(謝金)に使用予定。
酵素反応と細胞内輸送が共役する真菌細胞壁β－１，６－グルカン合成機構の解明

β-1,6-グルカンは酵母の生存に必須な細胞壁の構成成分だが、その生合成機構は未だに明らかでない。β-1,6-グルカン合成に最も重要なタンパク質は、小胞体にあるKeg1, Kre5、小胞体から細胞表層まで輸送されるKre6とそのホモログSkn1、Kre9とホモログKnh1である。これらのタンパク質間の正常な相互作用によりKre6が細胞膜へ輸送されることがβ-1,6-グルカン合成に必須であることを示し、生合成プロセスの新しいモデルを提唱した。未だに機構が明らかでないβ-1,6-グルカン合成には、小胞体の可溶性タンパク質Kre5と膜タンパク質Keg1、小胞体と出芽部位の細胞質膜に存在する膜タンパク質Kre6、細胞膜局在が予想されるGPI-アンカー型タンパク質Kre1、分泌シグナルを持つKre9が重要な働きをしており、各々について詳細な解析を進めている。タグで標識していない内在タンパク質を検出する抗体作製を試みてきたが、既に取得済みのKre6以外の抗原調製は難航していた。今年度前半はピキア酵母発現系を様々な形で試みたが、成功しなかった。やむをえず、Kre9については大腸菌の封入体タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルで分画して切り出したものを、Kre5については酵母細胞質中に生産させたものを精製して抗原とし、ウサギを免疫した。できた抗血清は力価と特異性が十分でないので、今後、アフィニティ精製して使用する予定である。昨年度作製に成功した、機能を保持したC末端HAタグ標識Kre9は、間接免疫蛍光染色により主に小胞体様の像として認められた。今年度は、蔗糖密度勾配遠心分画で小胞体への局在を確認するとともに、出芽中の芽にも著量存在していることを見出した。芽への局在は、Kre6でその機能に必須なことを明らかにしていたので、Kre9とKre6の関係について調べた。Triton X-100により可溶化した酵母溶菌液からの免疫沈降で、Kre9-3HAとKre6は相互作用していることが明らかになった。Kre6にはリン酸化修飾を受けたものと受けていないものが存在するが、Kre9-3HAと免疫吸着で一緒に回収されるのは、非リン酸化型が大部分であった。β-1,6-グルカンがほとんど作られなくなるkre9破壊株を調べると、Kre6のリン酸化はほとんど起きておらず、また免疫染色像では出芽した芽におけるシグナルが認められなくなっていた。β-1,6-グルカン合成には、小胞体に存在する可溶性タンパク質Kre5と膜タンパク質Keg1、小胞体と細胞質膜をリサイクルするKre6、細胞質で小胞輸送に関与するKre11、細胞膜の外側に局在するGPI-アンカー型のKre1、ペリプラズムに分泌されるKre9が重要な働きをしている野生型タンパク質を検出する抗体を調製するため、既に抗体取得済みのKre6以外を大腸菌で発現させ、安定に大量調製する構築を多種試みたがいずれも難航した。終盤からは真核細胞の宿主・発現系の使用に計画変更して再検討している。生化学的機能がまったく不明で分泌タンパク質と予想されているKre9について、N末端の予想シグナル配列の直後とC末端にそれぞれHAタグ標識した細胞を作製した。いずれの細胞もK1キラー毒素感受性ではβ-1,6-グルカンは正常で、標識タンパク質は機能的である。間接蛍光染色でN末端標識体は細胞内ドット状、C末端標識体は主に小胞体様の像として認められた。C末端近傍にゴルジ体のKex2プロテアーゼ認識配列KRの存在に気付き、KAへのアミノ酸置換体およびΔkex2遺伝子破壊株での検討の結果、実際にここで切断プロセシングが起ることを明らかにした。今後生化学的解析が重要になると予想しているKre5とKre6について、活性測定などで野生株と詳細な比較ができる温度感受性変異株の作製を試みた。Kre5については、先行研究で報告された温度感受性株のアミノ酸置換体を再構築したが温度感受性を示さず、独自にerror-prone PCRで2株を取得し、アミノ酸置換部位を同定した。Kre6は先行研究がないので最初からKre5と同じ方法で、3変異体の取得に成功した。これらは複数のアミノ酸置換を起こしていたが、野生型とのキメラの解析によって、ルーメン側にあるアミノ酸置換のみで温度感受性を示すことを明らかにした。未だ具体的な生合成機構が不明なβ-1,6-グルカンは、小胞体(ER)の可溶性タンパク質Kre5と膜タンパク質Keg1、ERと出芽生長領域の細胞質膜にある膜タンパク質Kre6、分泌シグナルを持つが局在部位が確実には分っていないKre9が関与して作られている。