hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンデムロータ型インテリジェント風力発電機の研究開発:風車ロータの好適化

本風力発電機は,(1)低風速下では前後段風車ロータが互いに逆方向に回転し,(2)後段風車ロータの最高回転速度付近で定格運転に達し,(3)その後は雨風車ロータが同方向に回転して出力一定運転となる.これを実現させるため,二重回転電機子方式二重巻線形誘導発電機を試作して特性を把握するとともに,風洞と数値実験により,風車ロータ形状の好適化を図った.1.発電機風車ロータとの連携運転が可能なことを確認し,同期回転速度以上では入力側からも出力が取り出せることを明らかにした.2.好適な前後段風車ロータ径比前段ブレードの形状によらずD=(後段径/前段径)=1までは後段風車ロータ径の増加とともに出力は増大するが,D=0.84以下では相対回転速度が遅い領域で後段風車ロータが前段風車ロータと同方向に回転する能力があるのに対し,D=0.84以上になると前段風車ロータが後段風車ロータと同方向に回転する.本着想に沿いかつ高出力が得られる直径比はD=0.84付近となる.3.前後段風車ロータの好適な軸間距離前後段ブレード形状によって出力と回転トルクに違いはあるものの,前後段風車ロータの軸間距離が近いほど高出力が得られる.4.風車ロータ周りの流れ軸方向速度成分は風車ロータを通過する毎に遅くなるが,前後段風車ロータが同方向に回転すると後段風車ロータのハブ側で上流側に向かう流れが生じ,前段風車ロータの過回転を抑制する.5.好適ブレード形状の提案後段風車ロータに流入する流れを考慮し,前段風車ロータ径の50%内側では,前段風車ロータに流入する流れをそのまま後段風車ロータに流すため,無作用翼素の採用を提案した.6.空力騒音の把握単段風車ロータのみの場合に比べてタンデム風車ロータの等価騒音レベルは高く,相反回転時のほうが同方向回転時より高い.しかし,後段風車ロータ径が小さいと騒音が低くなることは喜ばしい.本風力発電機は,(1)低風速下では前後段風車ロータが互いに逆方向に回転し,(2)後段風車ロータの最高回転速度付近で定格運転に達し,(3)その後は雨風車ロータが同方向に回転して出力一定運転となる.これを実現させるため,二重回転電機子方式二重巻線形誘導発電機を試作して特性を把握するとともに,風洞と数値実験により,風車ロータ形状の好適化を図った.1.発電機風車ロータとの連携運転が可能なことを確認し,同期回転速度以上では入力側からも出力が取り出せることを明らかにした.2.好適な前後段風車ロータ径比前段ブレードの形状によらずD=(後段径/前段径)=1までは後段風車ロータ径の増加とともに出力は増大するが,D=0.84以下では相対回転速度が遅い領域で後段風車ロータが前段風車ロータと同方向に回転する能力があるのに対し,D=0.84以上になると前段風車ロータが後段風車ロータと同方向に回転する.本着想に沿いかつ高出力が得られる直径比はD=0.84付近となる.3.前後段風車ロータの好適な軸間距離前後段ブレード形状によって出力と回転トルクに違いはあるものの,前後段風車ロータの軸間距離が近いほど高出力が得られる.4.風車ロータ周りの流れ軸方向速度成分は風車ロータを通過する毎に遅くなるが,前後段風車ロータが同方向に回転すると後段風車ロータのハブ側で上流側に向かう流れが生じ,前段風車ロータの過回転を抑制する.5.好適ブレード形状の提案後段風車ロータに流入する流れを考慮し,前段風車ロータ径の50%内側では,前段風車ロータに流入する流れをそのまま後段風車ロータに流すため,無作用翼素の採用を提案した.6.空力騒音の把握単段風車ロータのみの場合に比べてタンデム風車ロータの等価騒音レベルは高く,相反回転時のほうが同方向回転時より高い.しかし,後段風車ロータ径が小さいと騒音が低くなることは喜ばしい.本風力発電機は,(1)低風速下では前段風車ロータの通り抜け流れを逆方向に回転する後段風車ロータに効率よく与え,(2)後段風車ロータの最高回転速度付近で定格運転に達し,(3)その後は出力一定運転となる.これを実現させるため,風洞実験と数値実験を併用し,反りをもつブレードを用いて次のような成果をえた.1.前後段風車ロータの好適軸間距離:軸間距離が短いほど出力は高くなる.しかし,軸間距離を短くするには限界があり,ブレードの材料や形状によるたわみを考慮して最適な軸間距離を設定する必要がある.また,軸間距離が短くなるほど前段風車ロータに対して後段風車ロータが大きな抵抗となるため,前段風車ロータの周速比は遅くなる傾向がある.2.好適前後段風車ロータ径比:風車ロータ径比(後段径/前段径)D=1付近で最高出力となるが,本風力発電機の着想である後段

風車ロータの正逆転混在能力を有しながら高出力が望める風車ロータ経比はD=0.84である.3.空力騒音の把握:単段風車ロータのみの場合に比べてタンデム風車ロータの等価騒音レベルは高く,相反回転時のほうが同方向回転時より高い.このとき,風車ロータ間距離が長くなれば騒音は低下するが,出力に着目した上述の結果と相反する.しかし,後段風車ロータ径が小さいほど騒音が低くなることは喜ばしい.4.数値シミュレーションによる設計:汎用ソフトCFX-5によるシミュレーション結果と実験結果が比較的よく一致することを確認し,前後段風車ロータ回転直径2000mm,1330mm,前後段ブレード枚数3,5,前後段軸間距離160mm,定格運転開始風速ν=10m/sとして,前後段風車ロータを設計した.5.研究成果発表:以上の成果をとりまとめ,国際会議で3件,日本機械学会講演会で3件発表した.前段風車ロータには二次元およびそりとひねりを有しハブからティップにかけて弦長を一定の割合で減少させた2種類のブレード,後段風車ロータには二次元ブレードを準備して得られた主な成果は次の通りである.1.好適前後風車ロータ径比前段風車ロータにそりとひねりのあるブレードを用いると,半径によらず迎え角が好適となるので出力が飛躍的に増加する.また,前段ブレードの形状によらずD=(後段径/前段径)=1までは後段風車ロータ径の増加とともに出力は増大するが,D=0.84までは相対回転速度が小さい領域において,後段風車ロータが前段風車ロータと同方向に回転する能力があるのに対し,それ以上のDになると前段風車ロータが後段風車ロータと同方向に回転する.これは,後段風車ロータで得られる回転トルクが前段風車ロータより大きくなるためであり,この回転挙動は本着想から逸脱する.着想に沿いかつ高出力が得られる直径比Dは前段ブレード形状によらずD=0.84付近となる.2.好適軸間距離前後段ブレード形状によって出力と回転トルクに違いはあるものの,軸間距離が近いほど高出力が得られる.3.風車ロータ周りの流れ前段風車ロータに入る流れは既に半径方向速度成分を持ち,前後段風車ロータが相反回転する場合,ロータを通過した後も速度成分はほとんど同じとなる.このため,軸方向速度成分は風車ロータを通過する毎にハブ側で顕著に遅くなる.本風力発電機の特徴の一つ,前後段風車ロータが同方向回転すると,後段風車ロータ出口のハブ側で内側に向かう流れが生じ(後送風作用に近い働き),前段風車ロータの過回転を抑制する.4.好適ブレード形状の提案今までの研究成果を踏まえて,後段風車ロータに流入する流れを考慮し,前段風車ロータ径の50%内側では前段に流入する流れをそのまま後段風車ロータに流すため,無作用翼素の採用を提案した.
筋萎縮性側索硬化症におけるタンパク質凝集機構の解明

ポリグルタミン病やアルツハイマー病、パーキンソン病で認められる異常タンパク質のミスフォールディングや凝集体形成は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)においても見られることより、それぞれの疾患に特有な発症機構に加え、神経変性疾患に共通した発症機構も存在するのではないかと考えられる。transglutaminaseはタンパク質中のグルタミン残基とリジン残基をカルシウム依存的に架橋する酵素である。神経変性疾患の原因タンパク質といわれるhuntingtin, tau, amiloyd βA4, α-synucleinなどはtransglutaminaseの基質となることが確認されている。家族性ALS(FALS)の変異型Cu, Zn-superoxide dismutase(SOD1)がtransglutaminaseの基質となることを、精製酵素を用いて確認した。さらに、数種類のFALS変異型SOD1やtransglutaminaseを培養細胞に強制発現させ、凝集体の形成を検討した。またtransglutaminaseの阻害剤が凝集体形成を阻害するかどうかも検討した。凝集体の検出方法としては、Blue native PAGE(BN-PAGE)を用い、より生理的な状態でのSOD1の解析ができるようになった。またゲル内酵素活性測定法をBN-PAGEの改良法であるClear native PAGE(CN-PAGE)を用いて開発し、凝集体を形成したSOD1の酵素活性の有無も確認できるようになった。筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患では、異常タンパク質のミスフォールディングや凝集体形成がみられ、病因と密接に関与していると考えられている。凝集体構成タンパク質の中には分子シャペロンやユビキチン-プロテアソーム系のタンパク質も検出されており、コンフォメーションの変化に対して分子シャペロンが作用するが、最終的にはプロテアソームによる分解処理が完了せずに凝集体が蓄積するのではないかと考えられている。封入体は細胞内のミスフォールドしたタンパク質を無毒化する為に細胞が防御反応として形成していると考えられ、不溶性凝集体の前駆体である可溶性オリゴマーの方が強い毒性を持つことも報告されている。凝集体検出法として簡便な電気泳動法は頻用されているが、可溶性オリゴマーSOD1を検出するためには、水素結合や疎水結合を保持した方法でなければならず、SDS-PAGEは適さない。従来のNative PAGEの泳動度は、等電点や荷電による影響を受けるため、オリゴマーSOD1の分子量による分離には適さない。これらの問題点を克服したBlue Native PAGEは、charge-shift moleculeとしてCoomassie G250色素を用いるためnitroblue tetrazolium染色によるin gel SOD activity assayに適さない。そこで色素を用いない改良型であるhigh resolution clear native PAGEを用いて家族性ALS変異型SOD1の凝集体形成を検討した結果、モノマー、ダイマー、オリゴマーSOD1や、アポ型、ホロ型SOD1を識別することができた。さらにin gel activity assayへ応用し、SOD1はオリゴマーを形成してもSOD活性を保持しているという新たな知見を得た。
ストック住宅の耐震性能向上による長寿命化と保存・再生に関する研究

建設分野では既存建物の長寿命化に対する構造的技術の開発が求められており、既存木造住宅を長寿命化させるには、経年劣化を最小限に抑えること、地震による損傷を軽微とすることが最も重要である。本研究では、地震による損傷を定量的に判断するための基礎データを静的加力実験などによって蓄積することを目的に研究を実施した。我が国に建つ既存建物を長寿命化させ、住宅建て替えサイクルの長期化を図るためには建物の生物劣化を防ぐこと、地震など自然災害による建物の被害を軽減することが重要である。本研究では、既存建物棟数で最も多い軸組構法の既存木造建物を対象に、地震によって大きな被害を受けた建物の修復可能性を簡便に判断できる写真データの蓄積を目的とした静的加力実験を実施した。試験体は、2007年能登半島地震、2007年新潟県中越沖地震の被災調査から、築年数が比較的古い建物に用いられることが多い、土塗り壁、下見板を持つ試験体を選定し、大きな層間変形角となった時の荷重-変形角関係・被害写真に着目した。本年度の実験を以下にとりまとめる。・下見板、土壁、下見板付き土壁の静的加力実験を実施し、変形角毎の試験体の被害写真データ、荷重-変形角関係を把握した。・下見板試験体の最大荷重は土塗り壁試験体などと比較して、それほど高くないが大きな変形角となっても急激な耐力の低下は見られなかった。・下見板付き土壁試験体における土壁の被害は、下見板によって見えにくくなり、外観からの目視調査によって被害を適切に評価することは困難である。・下見板付き土壁試験体では、柱脚の引き抜けによる損傷が発生した。このように、それぞれの試験体には破壊モードに違いが有り、破壊モードの違いは試験体の被害写真、荷重-変形角関係に大きな影響を与えることが確認された。・土塗り壁にひび割れが発生した後でも荷重が高くなる場合が見られ、被害写真にひび割れが見えるだけで被害が大きいと判断することは出来ない。本研究では、地震による損傷を定量的に判断するための基礎データを蓄積することを目的とした。地震により被災した木造住宅では、壁のひび割れや脱落の状態から建物が修復不能な状態であると目視で判断し、新築住宅に建て替える場合が多い。木造住宅に多い軸組構法の場合、柱・梁などの主要な軸組に大きな損傷が発生しなかった場合は、壁のみの補修によって被災前の最大耐力と同程度まで耐力が回復することが近年の研究より明らかとなった。本年度の研究は、昨年度実施した地震被災後の耐震改修・建て替えの判断基準となる写真データの蓄積を引き続き行い、被災住宅の中から構造的に修復が難しい住宅を適切かつ容易に分類するデータを得た。具体的には、昨年度実施した古い木造住宅に対して、本年度は在来構法の木造住宅を対象とした実験を実施した。木造住宅における各層間変形角の損傷を、非構造部材をも含めて明らかとするため、サッシ、窓ガラスを持つ壁面の静加力実験を行った。実験では、大きな変形角においても窓ガラスが破壊することは無かったが、2枚の窓ガラスを固定するクレセントの変形や破壊、サッシの変形が見られた。また、非構造部材が耐力・剛性に与える影響も調査し、初期剛性、最大耐力はサッシ、窓ガラスの有無により大きな違いが見られることを確認した。
一軸配向ポーラス高分子超薄膜の空孔内壁面での自在官能基変換

本研究の全体構想は、一軸配向型ナノポーラス高分子薄膜の作成とその空孔内部への規則的な官能基配列と機能性分子修飾を行い、デバイスや様々な分子の分離膜へと展開することである。本申請課題は、デバイスや分離材料への展開を目的として、空孔内壁面に規則的に配列している高い反応性を有する官能基をポーラス材料を作製と、発生した官能基を利用した空孔内壁面の変換反応による機能性高分子薄膜への展開を目指す。その課題達成のための空孔内壁面に規則的に配列したスルホン酸やチオール残基を有するポーラス高分子薄膜を作製し、イオン結合や共有結合による空孔内壁面の極性変換や機能性分子の集積化されたポーラス高分子薄膜の作製を目的とする。昨年度、PEOスルホン酸エステル型の液晶性ブロック共重合体からの熱解裂空孔化において、イオン性分子であるスルホン酸を発生する過程で、PEOの熱による解重合による機構が示唆された。この熱解裂と熱分解反応は、この系に限らずすべてのPEOをシリンダー成分とする高分子に適用できる機構になり得る。本年度は、様々な分子量のPEO-液晶高分子とマクロ開始剤を合成し、PEOの熱分解の分子量依存性・分解成分の同定などを行った。その結果、PEOの分子量5000の高分子では10%の熱分解は起こることがTG/DTAより確認された。PEOの分子量を12000にするとその分解挙動は、減少した。薄膜をNaCl水溶液で洗浄し、分解したPEOを除去した後、イオン性の異なる色素による表面残基の定量を行った。その結果、計算から見積もられる最大スルホン酸残基の数の50%が表面に存在することが明らかにした。その課題達成のための空孔内壁面に規則的に配列したスルホン酸やチオール残基を有するポーラス高分子薄膜を作製し、イオン結合や共有結合による空孔内壁面の極性変換や機能性分子の集積化されたポーラス高分子薄膜の作製を目的としている。本年度は、PEOスルホン酸エステル型の液晶性ブロック共重合体からの薄膜中での一軸配向化された状態での熱解裂空孔化において、イオン性分子であるスルホン酸を発生する過程で、PEOの熱による解重合による機構が示唆された。現在この分解機構と分解の詳細な挙動は検討中である。発生したスルホン酸に対して種々のイオン性の異なる色素をの吸着実験を行った。その結果、スルホン酸と塩基対を形成するカチオン性の色素のみが選択的に吸着した。スルホン酸の発生数は、膜厚と面積から算出した理論値の50%であることが明らかになった。
産業保健現場におけるHIV感染者およびエイズ患者の対応の実態調査

血友病以外の6名は、いずれもエイズを発症している。職業は、退職または自営業等である。最近抗HIV剤の有効性が確認され、職場でのエイズ対策はますます重要になると考え、産業医および健診機関医705名に対しエイズ対策に関するアンケート調査を実施し、有効回答率は46.5%である。事業場の種類では、製造業が62.5%で、規模では1000人以上が61.8%と最も多い。海外派遣者は65.4%、海外からの従業員は42.3%の事業場に存在する。健康管理部門は91%にあり、そのうち産業医は281、保健婦は174、看護婦は221、カウンセラ-は58事業場にいる。61.8%が1000人以上の大規模事業場であることを考えると、カウンセラ-は他の職種に比較しても少ない。124事業場で講演会、パフレット配布、ビデオ鑑賞、研修会等のエイズ対策を実施しているが、毎年実施は70事業場である。さらに、エイズ対策委員会の設置は26事業場、エイズ対策マニュアル作成は39事業場、エイズ抗体検査の実施は207事業場である。HIV感染者の経験は5事業場(すべて従業員1000人以上の製造業)のみである。その際、プライバシーが十分に守られているのは4事業業であり、1事業場はわからない。採血等HIV感染者/エイズ患者に接した経験は製造業で3件、健診機関で1件ある。HIV感染事故の相談窓口は137事業場にある。HIV発症予防剤の常備は医療関係・製造業の8事業場である。以上、エイズ対策については、一部の事業場を除き、具体的対応の詳細は明らかでない。特に、中小規模事業場でのエイズ対策が送れており、今後もHIV感染者/エイズ患者の増加が予想されることから、HIV感染者の早期治療、カウンセラ-の育成などエイズ対策が積極的に推進されることが望まれる。事業場のみで対応困難な場合、専門医等との連携を日頃から構築しておくことも重要と考える。平成8年度は、産業医科大学・血友病包括外来を受診した患者および非血友病患者のhiv感染者およびエイズ患者の15名に対し職場および家庭環境を問診による詳細な調査を実施した。血友病患者は事業主にその診断名を知らせていないため、関節障害があるにもかかわらず健常者と同様の仕事をしており、事業主は職場の改善等の対策ができていない。HIVの問題以後、従来にもまして血友病患者は病名を隠して就職する傾向にあると思われる。また、中小企業の多くは産業医、保健婦等がいないため、職場での不都合は患者本人が解決しなければならない。就職を控えた血友病患者の多くは、就職先として公務員または中小企業を考えており、全員大企業は希望していない。従来、一部の患者および両親にあきらめや甘えの構造があり、勉学や就職に影響していたと考えられる。最近は、第8因子製剤の家庭注射が普及したことにより関節障害等が最小限に予防できることから、患者や家族の血友病に対する考え方が変わり、大学への進学や就職先等が改善されると期待できる。非血友病患者は、すべての事業主また一部は家族にも秘密にしているため、2名を除いて全員エイズを発症して当院を受診した。全員HIVキャリアの時期に発症予防の投薬を受けていない。

エイズ発症後自分から辞職し、自営業を手伝うか、無職となり生活保護または医療保護を受けるなど問題が多い。事業主および従業員のHIVに対する偏見をなくする方策を職場に広め、早急に仕事をしながら発症予防薬を内服できる環境を整備しなければならない。現在、これらの結果を踏まえ事業場の産業医、保健婦および衛生管理者等に対し、HIV感染者およびエイズ患者に対する具体的対応策についてアンケートを中心した検討を実施している。血友病以外の6名は、いずれもエイズを発症している。職業は、退職または自営業等である。最近抗HIV剤の有効性が確認され、職場でのエイズ対策はますます重要になると考え、産業医および健診機関医705名に対しエイズ対策に関するアンケート調査を実施し、有効回答率は46.5%である。事業場の種類では、製造業が62.5%で、規模では1000人以上が61.8%と最も多い。海外派遣者は65.4%、海外からの従業員は42.3%の事業場に存在する。健康管理部門は91%にあり、そのうち産業医は281、保健婦は174、看護婦は221、カウンセラ-は58事業場にいる。61.8%が1000人以上の大規模事業場であることを考えると、カウンセラ-は他の職種に比較しても少ない。124事業場で講演会、パフレット配布、ビデオ鑑賞、研修会等のエイズ対策を実施しているが、毎年実施は70事業場である。さらに、エイズ対策委員会の設置は26事業場、エイズ対策マニュアル作成は39事業場、エイズ抗体検査の実施は207事業場である。HIV感染者の経験は5事業場(すべて従業員1000人以上の製造業)のみである。その際、プライバシーが十分に守られているのは4事業業であり、1事業場はわからない。採血等HIV感染者/エイズ患者に接した経験は製造業で3件、健診機関で1件ある。HIV感染事故の相談窓口は137事業場にある。HIV発症予防剤の常備は医療関係・製造業の8事業場である。以上、エイズ対策については、一部の事業場を除き、具体的対応の詳細は明らかでない。特に、中小規模事業場でのエイズ対策が送れており、今後もHIV感染者/エイズ患者の増加が予想されていることから、HIV感染者の早期治療、カウンセラ-の育成などエイズ対策が積極的に推進されることが望まれる。事業場のみで対応困難な場合、専門医等との連携を日頃から構築しておくことも重要と考える。
２管球型デュアルエナジーＣＴを用いた肺腺癌浸潤巣検出能の放射線学的病理学的相関

本研究においてはCT上すりガラス状に描出される非浸潤成分の中に充実性成分(非浸潤・浸潤成分)が存在する原発性肺腺癌に対し2管球型CTのデュアルエナジーモードをもちいた造影CTを施行し,各成分の増強所見を検討したうえで,両者識別の可能性につき評価したまず,ファントーム実験により,すりガラス状成分を有する病変の増強効果を定量的に評価可能であることがしめされた,さらに肺癌臨床例においても実施可能であることを確認し,これまで困難であった,CTを用いたすりガラス状病変の増強効果の定量的評価を可能とした内部の充実成分内の組織差の検出能は現時点で不明であり,今後の検討課題となった.平成24年度の研究では、平成21-23年度の基盤研究Cにて明らかにした、旧型Definition `Liver VNC'プログラムを用いて作成したcontrast mapping image (CMI)が、アガロースゲルと造影剤によるファントームにおいてヨード濃度を反映し、すりガラス吸収値領域でも適正に評価可能と言う成果を、最新型シーメンス社製デュアルソースCT(Somatom Definition Flash)に対して応用し、ファントームにて適性撮影条件の設定を試みた。デュアルエナジーモード(140kVp,100kVp)を用いた、すりガラス吸収値(-500から-700HU程度)病変造影効果の評価はファントームを、2050μm程度の中空樹脂を含む市販の樹脂粘土(Shin Nihon Zoukei, Ltd, Tokyo, Japan)により作成し、安定性を確認した(-632.6 -617.2 HU,SD:4.7 HU)上で、CMIのROI値と実際のヨード造影剤濃度との関係を、デンプンにヨードを吸着、粘土と混和し4段階のヨード濃度のファントームを作成し評価した.ファントームの容器は10 mLのテルモ社製プラスティックシリンジを使用し、100から150HU程度の造影過大評価を、Liver VNCのパラメータを過大評価0となるように設定しすりガラス吸収値病変に対する信頼性を担保した。人体型ファントーム京都科学社:胸部ファントームN-1ラングマンに装着したところ-9.9過補正され,補正を要することが示された。以上につき、第153回日本医学放射線学会中部地方会平成25年2月2ー3日(藤田保健衛生大学,豊明市)において口演発表を行った。平成25年度においてはこれらの撮影条件をルーチン検査の被曝線量を越えない条件で臨床応用し、肺癌術前患者に応用し、目標症例20例を蓄積した。本研究においてはCT上すりガラス状に描出される非浸潤成分の中に充実性成分(非浸潤・浸潤成分)が存在する原発性肺腺癌に対し2管球型CTのデュアルエナジーモードをもちいた造影CTを施行し,各成分の増強所見を検討したうえで,両者識別の可能性につき評価したまず,ファントーム実験により,すりガラス状成分を有する病変の増強効果を定量的に評価可能であることがしめされた,さらに肺癌臨床例においても実施可能であることを確認し,これまで困難であった,CTを用いたすりガラス状病変の増強効果の定量的評価を可能とした内部の充実成分内の組織差の検出能は現時点で不明であり,今後の検討課題となった.シーメンス社製デュアルソースCT(Somatom Definition Flash)におけるデュアルエナジーモード(140kVp,100kVp)を用いた,すりガラス吸収値(-500から-700HU程度)病変造影効果の評価の可否を検討するため,すりガラス吸収値病変ファントームを作成の上,適正撮影・解析条件を検討することを平成24年度の検討課題とした.平成21-23年度の基盤研究(C)にて,旧型DefinitionではSyngo Dual Energyの`Liver VNC'プログラムを用いて作成されたcontrast mapping image (CMI)は,アガロースゲルと造影剤によるファントーム実験でヨード濃度をよく反映し,すりガラス吸収値領域でも適正に補正できることを示した.今回も同様の手法を適応した.すりガラス吸収値病変ファントームを,2050μm程度の中空樹脂を含む市販の樹脂粘土(Shin Nihon Zoukei, Ltd, Tokyo, Japan)を使用して作成し安定性を確認した(-632.6 -617.2 HU,SD:4.7 HU).CMIのROI値と実際のヨード造影剤濃度との関係を,デンプンにヨードを吸着,粘土と混和し4段階のヨード濃度のファントムを作成し評価した.ファントムの容器は10 mLのテルモ社製プラスティックシリンジを使用した.100から150HU程度の造影過大評価を,Liver VNCのパラメータを過大評価0となるように設定しすりガラス吸収値病変に対する信頼性を担保した.人体型ファントーム京都科学社:胸部ファントムN-1ラングマンに装着したところ-9.9過補正され,補正を要することが示された.以上につき,第153回日本医学放射線学会中部地方会平成25年2月2ー3日(藤田保健衛生大学,豊明市)において口演発表を行った.放射線医学平成24年度の研究実施計画において達成されたファントーム実験により明らかとなった適正撮影条件による臨床応用を開始した。肺癌術前患者に対し、通常のルーチン撮影に用いられているプロトコールである、単純、造影早期、造影後期3相撮影の被曝線量と同等の撮影条件を設定した。

実験ファントームを人体型ファントームに搭載した撮影実験では、ー9.9と若干の過補正状態となり、さらに,直線の傾きの誤差も考慮した。現在順調に症例を蓄積しており、目標の20症例を達成している。これに加えて、従来装置である、Somatom Definitionにおいて蓄積されていた臨床症例を集積し、肺野すりガラス状病変における造影効果測定について、その精度を臨床的異議について、英文論文を作成し、現在投稿準備中である。平成24年度の研究実施計画において予定されていた当施設への新型デュアルソースCT装置の導入は,予定通り平成24年8月に完了し,ファントーム実験を開始することが可能となった.これまでの旧型装置で得られていた研究成果を応用することにより,ファントーム撮影に於いて十分な精度を有する事を立証することができたため国内での学会にて発表した.デュアルエナジーモードと造影早期,遅延相とをすりガラス状吸収値において再現した造影像ファントームの作成,至適デュアルエネルギー,必要な曝射線量,再構成厚,再構成FOV,至適造影剤濃度など適正撮影条件も明らかとなり,1mm厚においても十分計算に耐えうることが示されたため,5mm程度の小病変に対しても本方法が適応可能であることが示唆された.一方,人体型ファントームに実験ファントームを搭載し同様の撮影実験を試行したところ,ー9.9と若干の過補正状態となり,さらに,直線の傾きにも誤差が認められたため,臨床応用時には若干の追加補正が必要であることが判明した.本法の応用を臨床症例に対しての開始し、症例を蓄積中であるが、平成26年度前半にさらに評価に十分な症例数まで蓄積を継続する。ヨードアレルギー患者、喘息患者といったヨード造影剤禁忌患者は除外したうえで、当院にて手術予定の有所見精査症例、および本院に受診した良悪性肺縦隔疾患未確診例中、本研究への参加に同意が得られた症例を対象としている。対照データとしては、これまでに得られている同様の症例のデータを使用する。症例蓄積目標は,18ヶ月にて限局性すりガラス状吸収値病変30症例とする。当院では年間100症例を越える肺癌手術件数があり、十分に収集可能な件数と考えられる。画像データと、手術所見、病理所見とをあわせて、放射線学的病理学的相関について検討を行う。現在投稿準備中の従来法の画像所見と統計学的有意差がえられるか否かを評価する。得られた成果に付き、国内外の学会にて発表し、最終報告を英文論文として投稿する。平成24年度に得られたデータに基づき,人体ファントーム搭載時の過補正と傾きの誤差について適正な補正式を算出したうえで,臨床症例に対しての本法の応用を開始する.ヨードアレルギー患者,喘息患者など,ヨード造影剤禁忌患者は除外したうえで,当院にて手術予定の有所見精査症例,および本院に受診した良悪性肺縦隔疾患未確診例中,本研究への参加に同意が得られた症例を対象とする.対照データとしては,これまでに得られている同様の症例のデータを使用する.症例蓄積目標は,18ヶ月にて限局性すりガラス状吸収値病変30症例とする.当院では年間100症例の肺癌手術件数があり,十分に収集可能な件数と思われる.平成25年度では20症例を目標とする.画像データと,手術所見,病理所見とをあわせて,放射線学的病理学的相関について検討を行う.従来法の画像所見と統計学的有意差が得られるか否か評価する.得られた成果に付き,preliminaryデータとして国内学会にて発表する.
新しい腫瘍関連抗原TSP-1の遺伝子及び蛋白レベルでの発現解析

Thrombospondin-1(TSP-1)はもともと血小板α顆粒より産生される分子量約450kDaの糖蛋白として報告されたが,現在では繊維芽細胞,血管内皮細胞など種々の細胞での産生が知られている.最近TSP-1に対して数種のモノクローナル抗体が作製され組織免疫染色などに用いられているが,その特異性など不明な点が多い.そこで我々はまずTSP-1に対する新たなモノクローナル抗体の作製を試みた.TSP-1を精製したあとBALB/cマウスを免疫し,細胞融合によりハイブリドーマを作製した.最終的にIgM抗体6種,IgG1抗体4種,およびIgG3抗体3種が得られた.エピトープを解析した結果,いくつかの特異性の違うモノクローナル抗体が確認され,癌患者血清中のTSP-1レベルを測定できるものと癌の組織検索に有用であるものとを碓認した.一方, TSP-1は細胞外マトリックス(ECM)に分類され,炎症や傷害部位では大量に放出されて多彩な接着部位を持つため多くの物質に結合する.またTSP-1はTGF-βの主な生体内活性化物質である.これらのことからTSP-1の免疫系に与える影響に興味が持たれる.そこで我々はTSP-1の抗原提示細胞(APC)およびAPCとT細胞の反応系に対する影響を,分泌されるサイトカインを指標にして調べた.その結果,可溶型のTSP-1はPHAで刺激された系でT細胞の増殖を抑制し,またAPCによるインターロイキン-10(I1-10)の産生を亢進させ,炎症反応や免疫反応の場において,反応の終息に重要な役割を担っていること世界で初めて証明した.以上の結果は,TSP-1がある種の癌で腫瘍マーカーになる可能性を示唆するとともに,生体におけるTSP-1の機能の一つを証明するものである.Thrombospondin-1(TSP-1)はもともと血小板α顆粒より産生される分子量約450kDaの糖蛋白として報告されたが,現在では繊維芽細胞,血管内皮細胞など種々の細胞での産生が知られている.最近TSP-1に対して数種のモノクローナル抗体が作製され組織免疫染色などに用いられているが,その特異性など不明な点が多い.そこで我々はまずTSP-1に対する新たなモノクローナル抗体の作製を試みた.TSP-1を精製したあとBALB/cマウスを免疫し,細胞融合によりハイブリドーマを作製した.最終的にIgM抗体6種,IgG1抗体4種,およびIgG3抗体3種が得られた.エピトープを解析した結果,いくつかの特異性の違うモノクローナル抗体が確認され,癌患者血清中のTSP-1レベルを測定できるものと癌の組織検索に有用であるものとを碓認した.一方, TSP-1は細胞外マトリックス(ECM)に分類され,炎症や傷害部位では大量に放出されて多彩な接着部位を持つため多くの物質に結合する.またTSP-1はTGF-βの主な生体内活性化物質である.これらのことからTSP-1の免疫系に与える影響に興味が持たれる.そこで我々はTSP-1の抗原提示細胞(APC)およびAPCとT細胞の反応系に対する影響を,分泌されるサイトカインを指標にして調べた.その結果,可溶型のTSP-1はPHAで刺激された系でT細胞の増殖を抑制し,またAPCによるインターロイキン-10(I1-10)の産生を亢進させ,炎症反応や免疫反応の場において,反応の終息に重要な役割を担っていること世界で初めて証明した.以上の結果は,TSP-1がある種の癌で腫瘍マーカーになる可能性を示唆するとともに,生体におけるTSP-1の機能の一つを証明するものである.Thrombospondin-1(TSP-1)はもともと血小板α顆粒より産生される分子量約450kDaの糖蛋白として報告されたが,現在では繊維芽細胞,血管内皮細胞など種々の細胞での産生が知られている.またその細胞接着作用や細胞増殖活性により癌の浸潤や転移との関連が指摘されるとともに,いくつかの癌腫瘍マーカーとしての意義も報告されている.最近TSP-1に対して数種のモノクローナル抗体が作製され組織免疫染色などに用いられているが,その特異性など不明な点も多い.そこで我々はまずTSP-1に対する新たなモノクローナル抗体の作製を試みた.ヒト血小板を洗浄後,カルシウムイオノフォア刺激で放出されたTSP-1をフィブリノーゲンおよびヘパリンのアフィニテイクロマトグラフィーで精製した.精製TSP-1 20μgでBALB/cマウス2匹に免疫を行った.5週後追加免疫を行い,その3日後マウスの脾臓を採取した.モノクローナル抗体作製キットを用いて免疫マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞SP2/0の細胞融合によりハイブリドーマを作製しクローニングした.2回の細胞融合で1,600個のハイブリドーマが得られ,すべてのクローンの培養上清を検索した.ヤギ抗ヒトTSP-1抗体を96-ウェル・プレートに固相化し,精製したTSP-1を反応させてTSP-1固相プレートとした.TSP-1固相プレートにハイブリドーマの培養上清を反応させ,ビオチン化抗マウスIgGまたはIgM抗体でスクリーニングした結果,最終的にIgM抗体6種,IgG1抗体4種,およびIgG3抗体3種が得られた.これらの抗体とTSP-1との反応をウエスタン・ブロティングにて確認したところ.

分子最約45万のTSP-1との反応が確認され,腫瘍マーカーとしてのTSP-1の解析に有用であることが証明された.引き続き,TSP-1の癌患者血清中のレベルをチェックするとともに,各種癌組織での発現レベルを免疫染色およびインサイチュ・ハイブリダイゼーションで検索中である.Thrombospondin-1(TSP-1)はもともと血小板α顆粒より産生される分子量約450kDaの糖蛋白として報告されたが,現在では繊維芽細胞,血管内皮細胞など種々の細胞での産生が知られている.最近TSP-1に対して数種のモノクローナル抗体が作製され組織免疫染色などに用いられているが,その特異性など不明な点が多い.そこで我々はまずTSP-1に対する新たなモノクローナル抗体の作製を試みた.TSP-1を精製したあとBALB/cにマウスを免疫し,細胞融合によりハイブリドーマを作製した.最終的にIgM抗体6種,IgG1抗体4種,およびIgG3抗体3種が得られた.エピトープを解析した結果,いくつかの特異性の違うモノクローナル抗体が確認され,癌患者血清中のTSP-1レベルを測定できるものと癌の組織検索に有用であるものとが確認された.一方,TSP-1は細胞外マトリックス(ECM)に分類され,炎症や傷害部位では大量に放出されて多彩な接着部位を持つため多くの物質に結合する.またTSP-1はTGF-Pの主な生体内活性化物質である.これらのことからTSP-1の免疫系に与える影響に興味が持たれる.そこで我々はTSP-1の抗原提示細胞(APC)およびAPCとT細胞の反応系に対する影響を,分泌されるサイトカインを指標にして調べた.その結果,可溶型のTSP-1はPHAで刺激された系でT細胞の増殖を抑制し,またAPCによるインターロイキン-10(I1-10)の産生を亢進させ,炎症反応や免疫反応の場において,反応の終息に重要な役割を担っていること世界で初めて証明した.以上の結果は,TSP-1がある種の癌で腫瘍マーカーになる可能性を示唆するとともに,生体におけるTSP-1の機能の一つを証明する極めて重要な所見である.
TRPチャネルとアノクタミン１の相互作用を介した疼痛メカニズム

カプサイシン受容体であるTRPV1は、皮膚において痛み刺激を受容する重要なイオンチャネルである。長年、TRPV1のみが灼熱痛の主体を成すと考えられてきたが、本研究ではアノクタミン1という別のイオンチャネルがTRPV1による痛み信号を増強していることを解明した。また、カプサイシンによる痛みがアノクタミン1阻害薬により減弱することが判明した。このことから、アノクタミン1を標的とした鎮痛薬はより良い治療戦略になるものと期待される。また、アノクタミン1阻害効果を持つ新規化合物を発見し、これは鎮痛薬開発における新たなシーズとなることが期待される。カルシウム透過性カチオンチャネルであるTRPチャネルと細胞内のカルシウム濃度上昇によって活性化するクロライドチャネルであるアノクタミン1(ANO1)は相互作用の関係にあり、TRPチャネルの活性化に伴ってANO1も活性化する。本研究においては、灼熱痛に関わるカプサイシン受容体型イオンチャネル、TRPV1とANO1の関係についてその生理的意義を検討した。TRPV1とANO1が一次感覚神経において共発現することはすでに知られていたので、疼痛に関わると考えて検討を進めた結果、以下のことが明らかとなった。1)TRPV1活性化に伴って細胞内へ流入するカルシウムはANO1を活性化させる、2)TRPV1とANO1はタンパクータンパク結合をする、3)感覚神経におけるTRPV1とANO1の相互作用によってカプサイシン投与による活動電位発生が亢進する、4)マウスにおいてカプサイシン投与によって引き起こされる痛み関連行動はANO1選択的阻害剤の同時投与により減弱する。これらの結果から、TRPV1とANO1の相互作用は疼痛を増強する分子メカニズムとなっていることが判明した。これまではカプサイシンの痛みにはTRPV1のみが関わると考えられていたが、それに加えてANO1もその疼痛に関わることが示された。また、本研究はANO1を鎮痛薬開発のターゲットとすることの重要性も示すことができた。初年度に予定していたTRPV1とANO1の相互作用については計画通り研究をまとめることができた。当初の予定よりもやや早く進んだため、2年目に計画していたTRPA1-ANO1相互作用についても検討を開始している。HEK293T細胞においてTRPA1活性化に伴うANO1電流の解析を行ったところ、相互作用を示す明確な電流増大を観察した。このことから、TRPA1もTRPV1と同じようにANO1と感覚神経において共発現していればTRPA1関連疼痛についてもANO1による増強メカニズムが存在することとなり、TRPA1関連疼痛の緩和にANO1阻害が重要であることが示されるものと考えられる。マウスの一次感覚神経において、TRPV1とアノクタミン1の相互作用により疼痛感覚が増幅される新規メカニズムを解明した。また、アノクタミン1の阻害がTRPV1関連疼痛を抑える有効な手段であることを明らかとした。これらのことから、TRPV1と同じように一次感覚神経に発現するTRPA1もアノクタミン1と相互作用することにより疼痛を増幅していると推察していた。事実、HEK293T細胞においてTRPA1とアノクタミン1が機能的に相互作用することを見出していた。しかしながら、マウスを用いた行動薬理学的検討において、TRPA1アゴニストであるアリルイソチオシアネートにより引き起こされた疼痛関連行動(足舐め行動)はアノクタミン1の選択的阻害薬であるT16Ainh-A01の同時投与によって減弱しなかった。このことから、単一細胞においてTRPA1とアノクタミン1が共発現していたとしても個体レベルではそれぞれ独立して急性疼痛に関わっていることが示唆された。すなわち、アノクタミン1阻害はTRPV1関連疼痛を抑えることに重要であると考えられる。以上のことから、本研究課題であったTRPチャネルとアノクタミン1の相互作用を介した疼痛メカニズムの検討において、TRPV1ーアノクタミン1相互作用に基づく急性疼痛の分子機構が解明された。また、本研究の過程においてTRPM8のアゴニストであるメントールがアノクタミン1を強く阻害することを発見した。さらに、メントール類似体の比較検討からメントールの一部を構成しているイソプロピルシクロヘキサンがアノクタミン1を阻害するのに重要な化学構造であることが判明した。これは、新たな創薬シーズの発見であり、鎮痛薬開発における今後の発展が期待される。今後は、計画通りTRPA1とANO1の相互作用についてその生理的意義も含めて検討を進める。HEK293T細胞における機能的相互作用はすでに観察しているので、生化学的手法によりタンパクータンパク間結合を検討する。すでに抗TRPA1抗体を用いて免疫沈降実験を試みたが、現存の抗体ではTRPA1の検出が難しかったため、今後はGFPタグなどを用いたプルダウンアッセイにより物理的相互作用の有無を検討する予定である。

また現在、蛍光2重in situハイブリダイゼーションの実験系を立ち上げておりTRPA1-ANO1の共発現をマウス後根神経節において検討する。また、マウスにおいて電気生理学的、行動薬理学的にTRPA1-ANO1相互作用の有無と生理的意義について解析を進めていく。神経生理学想定よりも使用動物数や検体検査の外部発注の件数が少なくなったことによって生じた。来年度も引き続き、動物実験および外部発注による分子の網羅的探索などを行うので差額分はそれらの経費に充てる予定である。
ゴルジ体からの小胞形成,積み荷選別の分子機構の解明―ライブイメージングからの展開

本年度はゴルジ体からの小胞形成で機能する分子装置と積荷タンパク質を高速・高感度で可視化しin vivoの動態を明らかにするため,以下の実験を行った.まず,ゴルジ体後期(トランス,TGN)コンパートメント,輸送小胞に局在する一連のタンパク質の機能を保持するGFP, mRFP融合タンパク質を作成し,4次元(3次元+時間)レベルで観察を行う準備を整えた.また,これまでに確立した,Sec7p, Ypt31p/Ypt32p(Rab11ホモログ)に注目しTGNダイナミクスを可視化する系をもとに,制御因子を同定する試みを行った.その結果,TGN動態の正常な制御には,Ypt31p/Ypt32p, Arf1p,アクチンが少なくとも必要であることが明らかになった.今後はより多くの変異株を用いて新たな制御因子を同定してゆく.積荷タンパク質については,ゴルジ体からprevacuolar compartmentへと選択的に輸送されるVps10pのDronpa融合タンパク質を可視化する系を構築した.Dronpaは,紫外光によってシグナル強度が急激に増加するため,ゴルジ体上に存在するVps10を局所的に可視化し,その挙動を追うことができる.一方,TGN動態を更に詳細に解析するため,紫外光により緑から赤に変化するDendra融合TGNマーカーの開発を行った.この系を用いれば,TGNを局所的に緑から赤に変化させ、個々のTGNの挙動を追うことができる.今後はこの系を用い,個々のTGNの構成要素が入れ替わる速度を変異体や様々な条件下の細胞で定量し,TGNのダイナミクスの制御様式を明らかにしてゆく.本年度はゴルジ体からの小胞形成で機能する分子装置と積荷タンパク質を高速・高感度で可視化しin vivoの動態を明らかにするため,以下の実験を行った.まず,ゴルジ体後期(トランス,TGN)コンパートメント,輸送小胞に局在する一連のタンパク質の機能を保持するGFP, mRFP融合タンパク質を作成し,4次元(3次元+時間)レベルで観察を行う準備を整えた.また,これまでに確立した,Sec7p, Ypt31p/Ypt32p(Rab11ホモログ)に注目しTGNダイナミクスを可視化する系をもとに,制御因子を同定する試みを行った.その結果,TGN動態の正常な制御には,Ypt31p/Ypt32p, Arf1p,アクチンが少なくとも必要であることが明らかになった.今後はより多くの変異株を用いて新たな制御因子を同定してゆく.積荷タンパク質については,ゴルジ体からprevacuolar compartmentへと選択的に輸送されるVps10pのDronpa融合タンパク質を可視化する系を構築した.Dronpaは,紫外光によってシグナル強度が急激に増加するため,ゴルジ体上に存在するVps10を局所的に可視化し,その挙動を追うことができる.一方,TGN動態を更に詳細に解析するため,紫外光により緑から赤に変化するDendra融合TGNマーカーの開発を行った.この系を用いれば,TGNを局所的に緑から赤に変化させ、個々のTGNの挙動を追うことができる.今後はこの系を用い,個々のTGNの構成要素が入れ替わる速度を変異体や様々な条件下の細胞で定量し,TGNのダイナミクスの制御様式を明らかにしてゆく.
アデノ随伴ウイルスの特定な染色体上への部位特異的な挿入機構についての解析

現在のAAVベクターは野性型の持つ部位特異的な染色体への挿入能力を持たない。そこで、AAVベクターにこの能力を付加する事を目標とした。AAV蛋白質Rep78遺伝子を大腸菌内でmaltose binding proteinとのfusion proteinとして発現させ、これを抗原とした抗-Rep78ウサギ・ポリクローナル抗血清を作成した。この抗血清は市販のAAV Rep proteinモノクローナル抗体(PROGEN;226.7)と同一のwestern blotのバンドを認識し、fusion proteinとして発現させた蛋白質がRep78蛋白質であることを確認した。次に、このRep78蛋白質をヒト培養細胞(293細胞)へ直接導入することにより、AAVベクター遺伝子が部位特異的に挿入出来るか検討した。amylose resinにて精製したRep78蛋白質とネオマイシン耐性遺伝子を持つAAVベクタープラスミドとをliposomeを用いて293細胞へ導入後、G418にてセレクションし、DNAを分離した。前年度において確立した部位特異的挿入の同定法、即ち、AAVベクター遺伝子の両端末部分(ITR)と細胞ゲノムの第19染色体の長腕(q13.4-ter)に存在するAAV挿入部位(AAVS1:既知配列)とをプライマーとするNested-PCR、AAVS1配列のオリゴをプローブに用いたサザン分析により、AAVベクター遺伝子の部位特異的挿入を確認した。Direct-sequenceによりAAVベクター遺伝子の挿入部位およびAAVS1内の挿入部位をそれぞれ検討したところ、既報の野性型AAVの挿入部位と非常に類似していた。以上の結果は、ITR配列とRep78/68蛋白質が同時に存在することがヒト・ゲノムへ目的遺伝子を部位特異的に挿入するための必要・充分条件であることを示している。現在のAAVベクターは野生型の持つ部位特異的な染色体への挿入能力を持たない。そこで、AAVベクターにこの能力を付加する事を最終目標とし、その第1のステップとして、部位特異的に挿入された野生型AAVの検出方法を確立した。野生型AAVがクローニングされているpsub201プラスミドを用いて野生型AAVを作成し、HeLa細胞およびマウス由来の3T3細胞へ感染後、継代培養を続けて野生型AAV感染細胞株を作成した。これらより常法に従ってゲノムDNAを分離した。AAV挿入部位(AAVS1)とAAVのITR部分内にプライマー作成して、部位特異的挿入の同定をnested-PCR法によって行ったところ、対照の3T3細胞及びAAV非感染HeLaには認めないバンドを検出できた。これらのバンドは、用いたプライマーセットの内側のオリゴヌクレオチドをプローブをしたSouthern Blotでも検出され、更に塩基配列を検討したところ、AAVS1上のAAV-ITRの挿入を確認した。従って、上述の方法を行えば部位特異的挿入を検出できると考える。次に、AAV蛋白質Rep78遺伝子を大腸菌用融合蛋白質発現ベクターに組込み、大腸菌内でmaltose binding proteinとのfusion proteinとして発現する系を確立し、これを抗原とした抗-Rep78ウサギ・ポリクローナル抗血清を作成した。この抗血清は市販のAAV Rep proteinモノクローナル抗体(PROGEN;226.7)と同一のwestern blotのバンドを認識した。また、誘導型プロモーターとして、Dexamethasone(DX)の存在により活性化されるマウス乳癌ウイルスのLTRプロモーターの下流に、Rep78(AAV No.263-2233nt)のcDNAを繋ぎ込んだ発現プラスミドを構築し、ヒト由来HeLa細胞へリポフェクション後、10uMDXの有無によるRep78蛋白質の発現をNorthern Blotしたところ、DX依存性の発現を認めず、細胞毒性の高いRep蛋白質がDXの有無に拘わらずに発現していた。このため、AAVベクターを用いたRep蛋白質の存在の有無による部位

特異的挿入能の評価は不可能になった。そこで、他の誘導型プロモタ-を検討中である。現在のAAVベクターは野生型の持つ部位特異的な染色体への挿入能力を持たない。そこで、AAVベクターにこの能力を付加する事を目標とした。AAV蛋白質Rep78遺伝子を大腸菌内でmaltose binding proteinとのfusion proteinとして発現させ、これを抗原とした抗-Rep78ウサギ・ポリクローナル抗血清を作成した。この抗血清は市販のAAV Rep proteinモノクローナル抗体(PROGEN;226.7)と同一のwestern blotのバンドを認識し、fusion proteinとして発現させた蛋白質がRep78蛋白質であることを確認した。次に、このRep78蛋白質をヒト培養細胞(293細胞)へ直接導入することにより、AAVベクター遺伝子が部位特異的に挿入出来るか検討した。amylose resinにて精製したRep78蛋白質とネオマイシン耐性遺伝子を持つAAVベクタープラスミドとをliposomeを用いて293細胞へ導入後、G418にてセレクションし、DNAを分離した。前年度において確立した部位特異的挿入の同定法、即ち、AAVベクター遺伝子の両端末部分(ITR)と細胞ゲノムの第19染色体の長腕(q13.4-ter)に存在するAAV挿入部位(AAVS1:既知配列)とをプライマーとするNested-PCR、AAVS1配列のオリゴをプローブに用いたサザン分析により、AAVベクター遺伝子の部位特異的挿入を確認した。Direct-sequenceによりAAVベクター遺伝子の挿入部位およびAAVS1内の挿入部位をそれぞれ検討したところ、既報の野生型AAVの挿入部位と非常に類似していた。以上の結果は、ITR配列とRep78/68蛋白質が同時に存在することがヒト・ゲノムへ目的遺伝子を部位特異的に挿入するための必要・充分条件であることを示している。