hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シバヤギを実験モデルとした泌乳性無発情成立機序の解明

本研究では、乳仔による吸乳刺激がGnRH分泌に与える影響を解析することを目的として、長期間の連続測定が可能である視床下部基底部の多ニューロン発射活動を分娩後のシバヤギにおいてモニターし、吸乳刺激により同神経の活動が抑制されるかどうかを明らかにしようとした。シバヤギを分娩予定日1カ月まえから、8L:16Dの短日条件下で飼育し、分娩後1週に脳定位装置を用いて、頭蓋骨上部を切除し、生体内電極(6チャンネル)の視床下部基底部への留置手術を行った。手術が成功し、術後の経過が良好であった5頭の多ニューロン発射活動について、各個体の6チャンネル全てについてモニターしたが、多ニューロン発射活動が記録できたのは、2個体について各1チャンネルのみであった。これらの個体では、多ニューロン発射活動の個々のvolleyの振幅が小さく、また、基底値の変動が大きかったため、volleyと基底値の分離が極めて困難であった。従って、他の個体において多ニューロン発射活動が明瞭に記録できなかった原因として、分娩後のシバヤギにおいてはVolleyの振幅が、これまでに調べてきた通常の性周期の場合よりもかなり低いことが考えられた。このことは、分娩後のシバヤギにおいては、視床下部基底部におけるGnRH生産細胞の活動自体が通常よりも弱いことを示唆するものであり、今後、volley検出精度の向上や分娩前のチャンネル記録能力の検索に加え、下垂体から放出されるLHの生物活性についても検討する必要であるものと考えられた。申請者はシバヤギをモデルとして本テーマに取り組んできたが、これまでに、分娩後のシバヤギにおいては、1)吸乳刺激由来の性周期抑制が同じ反芻家畜であるヒツジにくらべて明確であること、2)吸乳刺激由来のLHのパルス状分泌抑制は明瞭ではないこと、3)吸乳刺激由来の高プロラクチン血症によりLHサージ中枢のエストロジェンに対する感受性が抑制されること、などを示してきた。しかし、2)についてはこれまでに行ってきた血液中のホルモンを分析する方法では、採血時間および期間の制限のために捉えられない変化が存在する可能性が未解決のまま残った。したがって、LH分泌のモニターでは捉えることができない長期間にわたるLH分泌パターンを連続的に解析する必要があると考え、本実験では長期間の連続測定が可能である視床下部基底部の多ニューロン発射活動(GnRHパルスジェネレータの活動)を分娩後のシバヤギで解析することができるかどうかを検討する。本年度は、分娩予後のシバヤギ4頭の多ニューロン発射活動を初回性周期の回復日まで連続記録するために、まず、雌シバヤギの視床下部基底部に生体内電極を移植し、全ての個体を雄と交配させた。その結果、手術成功例は4頭のうち、全てが妊娠したことが確認された。分娩後の(来年度)視床下部基底部活動の解析については、これらの個体を用いて、正常分娩後の個体哺乳期間および離乳後の多ニューロン発射活動およびこれに同調するLH分泌について検討する。
高齢期の妻や親を介護する男性介護者世帯に対する災害時の健康管理と共助に関する研究

高齢期の親や妻を介護する男性介護者は、女性に比べて、仕事中心の生活を送ってきたため地域との関りが少なく、ソーシャル・キャピタルが乏しい。また、男性介護者は自己完結しやすいため、男性介護者世帯は孤立しやすく、災害時には支援が遅れる可能性がある。さらに、被介護者と共に介護者も健康状態に不安を抱え、災害時は共倒れの危険があり、家族単位で支援する必要がある。本研究の目的は、男性介護者世帯に対する災害時に向けた健康と危機管理、防災に対する準備状態を1男性介護者(当事者)自身、2保健・医療・介護領域の専門職支援者、3地域住民の3側面から量的・質的に把握し、男性介護者との共助の在り方を検討することである。
鉄系超伝導体の高品質薄膜成長機構の解明と高性能化技術の創製

4種類の励起波長を採用したパルスレーザー堆積法を用いて、BaFe2A2:Coの高品質薄膜が得られる条件を検討し、レーザーの波長が異なった場合であっても、最適な成長速度はすべて同じ0.3 nm/secで一定であることを明らかにした。さらに高い臨界温度が期待できるBaFe2As2:Pにその最適プロセスを適用し、本研究課題の目標値である臨界電流密度(Jc)10 MA/cm2にほぼ匹敵する7 MA/cm2にまでの高性能化に成功した。さらに、実際に応用に使われている金属テープ基板にも適用し、15 Tの強磁場下において最大で0.1 MA/cm2の実用レベルのJcを達成した。4種類のパルスレーザー励起波長(193, 248, 532, 1064 nm)を採用したパルスレーザー堆積法を用いて、鉄系超伝導体BaFe2A2:Coの高品質薄膜が得られる条件を検討した。まず、各レーザー波長ーパルスエネルギー薄膜成長速度の関係を調査したところ、レーザーの波長が長くなる(=光子エネルギーが小さくなる)に伴って、同じパルスエネルギーを照射した場合の成長速度が速くなることがわかった。そして、X線回折のout-of-planeおよびin-planeのロッキングカーブ測定から、各レーザー波長における最適なパルスエネルギーを評価したところ、そのパルスエネルギーはレーザー波長が短くなるに伴って大きくなることが明らかとなった。以上の結果と、各レーザーにおける光学定数を考慮したところ、レーザーの波長が異なった場合であっても、最適な成長速度はすべて同じ0.3nm/secでほぼ一定であることが明らかとなった。すなわち、成長レートが最適であることがもっとも重要であった。それでは、なぜ他の研究グループがこのような結果に至っていないのかを考えてみると、短い波長(たとえば248nm)のパルスレーザーを用いた場合に本研究ほどのパルスエネルギーを入れられるセットアップになっていないことと、薄膜成長時の基板ーターゲット間距離は、本研究は鉄系超伝導体に最適なように30mmにしてあるのに対して、50mm前後としているグループが多いことが原因である可能性があるのではないかと考えられた。以上で見いだした各波長における最適パルスエネルギーで成長させた鉄系超伝導体BaFe2A2:Co薄膜は、励起波長に依存することなく、どの試料においても自己磁場中で1MA/cm2を越える性能を示し、確かに成長速度の最適化が最も重要なファクターであることを実証した。昨年度末、4種類のパルスレーザー励起波長(193, 248, 532, 1064 nm)を採用したパルスレーザー堆積法を用いて、鉄系超伝導体BaFe2A2:Coの高品質薄膜が得られる条件を検討した。そして、レーザーの波長が異なった場合であっても、最適な成長速度はすべて同じ0.3nm/secでほぼ一定であることが明らかとなった。以上で見いだした各波長における最適パルスエネルギーで成長させた鉄系超伝導体薄膜は波長に依存することなく、どの試料においても自己磁場中で1MA/cm2を越える臨界電流密度(Jc)を示し、確かに成長速度の最適化が最も重要なファクターであることを実証した。この得られた知見をもとに今年度では、さらに高い臨界温度が期待できるP添加BaFe2As2に最適プロセスを適用し、さらなる高性能化を目指した。そして、P添加系では、これまでよりも遙かに高い成長温度が必要であることを見いだし、その実現のためのシステムの立ち上げから行った。そして、高い磁場中(9T)では最高の1MA/cm2を越える性能を示す薄膜の作製に成功した。さらに、そのJc特性の磁場中の異方性を調査したところ、膜の成長方向(c軸方向)に沿った効果的な磁束ピン止め中心が自然に成長していることがわかり、応用上重要となる等方的な特性を有することを明らかにした。さらに、本研究課題の目標値である臨界電流密度10MA/cm2にほぼ匹敵する7MA/cm2にまでの高性能化に成功した。昨年度末までに、4種類のパルスレーザー励起波長を採用したパルスレーザー堆積法を用いて、鉄系超伝導体BaFe2A2:Coの高品質薄膜が得られる条件を検討した。この得知見をもとに、さらに高い臨界温度が期待できるP添加BaFe2As2に対してその最適プロセスを適用し、さらなる高性能化を目指した。そして、このP添加系では、これまでよりも遙かに高い成長温度が必要であることを見いだし、その実現のためのシステムの立ち上げから行った。そして、高い磁場中(9T)では鉄系超伝導体では最高の1MA/cm2を越える性能を示す薄膜の作製に成功した。さらに、その臨界電流密度(Jc)特性の磁場中の異方性を調査したところ、膜の成長方向(c軸方向)に沿った効果的な磁束ピン止め中心が自然に成長していることがわかり、応用上重要となる等方的な特性を有することを明らかにした。そして、本研究課題の目標値である臨界電流密度10MA/cm2にほぼ匹敵する7MA/cm2にまでの高性能化に成功した。

そこで、膜成長する基板をMgOからLSATに変更してその効果を検討したところ、LSAT基板上に製膜したP添加BaFe2As2は、MgO基板上の膜に比べて悪い結晶性(Δω= 1.1度, Δφ; = 1.5度)を示した。走査型透過電子顕微鏡による断面観察から、この起源は、LSATー膜界面における反応層の形成によって生じる多数のドメイン境界によるものと結論付けた。これまでの目標であったエピタキシャル成長機構の解明、および磁束ピン止め中心の効果的な導入にまで達した。さらに、本研究課題の最終目標値である臨界電流密度10MA/cm2にほぼ匹敵する7MA/cm2にまでの高性能化に成功し、数ある単結晶基板の中でもMgOが最適であることを見いだした。これまで4種類のパルスレーザー励起波長を採用したパルスレーザー堆積法を用いて、鉄系超伝導体BaFe2A2:Coの高品質薄膜が得られる条件を検討してきた。そして、レーザーの波長が異なった場合であっても、最適な成長速度はすべて同じ0.3nm/secでほぼ一定であることが明らかとなった。この得知見をもとに、さらに高い臨界温度が期待できるP添加BaFe2As2に最適プロセスを適用し、さらなる高性能化を目指した。そして、P添加系では、これまでよりも遙かに高い成長温度が必要であることを見いだし、その実現のためのシステムの立ち上げから行った。そして、高い磁場中(9T)では最高の1MA/cm2を越える性能を示す薄膜の作製に成功した。さらに、その臨界電流密度(Jc)特性の磁場中の異方性を調査したところ、膜の成長方向(c軸方向)に沿った効果的な磁束ピン止め中心が自然に成長していることがわかり、応用上重要となる等方的な特性を有することを明らかにした。そして、本研究課題の目標値である臨界電流密度10MA/cm2にほぼ匹敵する7MA/cm2にまでの高性能化に成功した。そこで、膜成長する基板をMgOからLSATに変更してその効果を検討したところ、LSAT基板上に製膜したP添加BaFe2As2は、MgO基板上の膜に比べて悪い結晶性(Δω= 1.1度, ΔPhi = 1.5度)を示した。見いだしたこれらの試料作製条件を、実際に応用に使われている金属テープ基板に適用し、15Tの強磁場下において最大で0.1MA/cm2の実用レベルのJcを達成した。4種類の励起波長を採用したパルスレーザー堆積法を用いて、BaFe2A2:Coの高品質薄膜が得られる条件を検討し、レーザーの波長が異なった場合であっても、最適な成長速度はすべて同じ0.3 nm/secで一定であることを明らかにした。さらに高い臨界温度が期待できるBaFe2As2:Pにその最適プロセスを適用し、本研究課題の目標値である臨界電流密度(Jc)10 MA/cm2にほぼ匹敵する7 MA/cm2にまでの高性能化に成功した。さらに、実際に応用に使われている金属テープ基板にも適用し、15 Tの強磁場下において最大で0.1 MA/cm2の実用レベルのJcを達成した。初年度および次年度の目標であったエピタキシャル成長機構の解明、および磁束ピン止め中心の効果的な導入にまで達した。さらに、本研究課題の最終目標値である臨界電流密度10MA/cm2にほぼ匹敵する7MA/cm2にまでの高性能化に成功した。
ナノ粒子導入単分散球状メソ多孔体を用いての複合集積構造体の合成

単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に光学特性あるいは磁気特性を有するナノ粒子又は有機化合物を導入し,それらの集積構造体を合成することを目的に検討を行ってきた.その結果,下記の知見が得られた.1.単分散球状メソ多孔体シリカの合成有機官能基を含有するシリカ源を共縮合することにより,単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に有機官能基を導入することに成功した.また,単分散球状メソ多孔体シリカを合成後,長鎖界面活性剤あるいは,膨潤剤の存在下,アルコール/水の混合溶媒中で熱処理することにより,粒子径の単分散性を保持したまま,細孔径が拡大することを見出した.条件を最適化することにより,細孔径は約2倍以上に拡大し,酵素,強磁性ナノ粒子等の導入が可能になった.さらに,粒子の内側と外側で細孔の化学特性の異なるコアシェル型単分散球状メソ多孔体シリカの合成に初めて成功した.1つの粒子の内側と外側に異なる特性を有するナノ粒子,または,色素を導入することが可能になった.2.ナノ粒子導入法フェロセン鉄カルバルデヒドを前駆体として用いることにより,1回の操作で大量の酸化鉄ナノ粒子を単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に選択的に導入する方法を見出した.一般的に行われている鉄のイオン結晶溶液を細孔内に含浸させる方法では,酸化鉄の導入量を増やすことが難しい,また,主として細孔外に酸化鉄が生成してしまうという2つの大きな問題点があった.本方法により,これらの問題点を一度に解決することができた.さらに,メルカプト基を有する単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に金のナノ粒子を導入することに成功した.処理条件の最適化により,金のナノ粒子の細孔外での析出を防ぐことができた.3.集積構造体の特性有機色素を導入した単分散球状メソ多孔体シリカからコロイド結晶を作製することに成功した.色素の導入量に応じて,コロイド結晶の反射波長が変化することが分かった.これらは,新規材料合成において基礎・応用の面から重要な知見であり,10報の論文としてまとめられた.単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に光学特性あるいは磁気特性を有するナノ粒子又は有機化合物を導入し,それらの集積構造体を合成することを目的に検討を行ってきた.その結果,下記の知見が得られた.1.単分散球状メソ多孔体シリカの合成有機官能基を含有するシリカ源を共縮合することにより,単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に有機官能基を導入することに成功した.また,単分散球状メソ多孔体シリカを合成後,長鎖界面活性剤あるいは,膨潤剤の存在下,アルコール/水の混合溶媒中で熱処理することにより,粒子径の単分散性を保持したまま,細孔径が拡大することを見出した.条件を最適化することにより,細孔径は約2倍以上に拡大し,酵素,強磁性ナノ粒子等の導入が可能になった.さらに,粒子の内側と外側で細孔の化学特性の異なるコアシェル型単分散球状メソ多孔体シリカの合成に初めて成功した.1つの粒子の内側と外側に異なる特性を有するナノ粒子,または,色素を導入することが可能になった.2.ナノ粒子導入法フェロセン鉄カルバルデヒドを前駆体として用いることにより,1回の操作で大量の酸化鉄ナノ粒子を単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に選択的に導入する方法を見出した.一般的に行われている鉄のイオン結晶溶液を細孔内に含浸させる方法では,酸化鉄の導入量を増やすことが難しい,また,主として細孔外に酸化鉄が生成してしまうという2つの大きな問題点があった.本方法により,これらの問題点を一度に解決することができた.さらに,メルカプト基を有する単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内に金のナノ粒子を導入することに成功した.処理条件の最適化により,金のナノ粒子の細孔外での析出を防ぐことができた.3.集積構造体の特性有機色素を導入した単分散球状メソ多孔体シリカからコロイド結晶を作製することに成功した.色素の導入量に応じて,コロイド結晶の反射波長が変化することが分かった.これらは,新規材料合成において基礎・応用の面から重要な知見であり,10報の論文としてまとめられた.本年度の研究実施計画に基づき検討を行った結果を以下にまとめる.1.ナノ粒子の種類,導入方法の検討フェロセン鉄カルバルデヒドを前駆体として用いることにより,1回の操作で大量の酸化鉄ナノ粒子を球状メソ多孔体シリカの細孔内に選択的に導入する方法を見出した.一般的に行われている鉄のイオン結晶溶液を細孔内に含浸させる方法では,酸化鉄の導入量を増やすことが難しい,また,主として細孔外に酸化鉄が生成してしまうという2つの大きな問題点があった.本方法により,これらの問題点を一度に解決することができた.2.単分散球状メソ多孔体シリカへの官能基の導入シリカ源であるテトラメトキシシランに種々の有機官能基を有するトリメトキシシランを共重合する検討を行った結果,有機官能基の種類により共重合可能な組成比の上限は異なるが,多くの種類の有機官能基を細孔内に導入可能であることが明らかになった.特に,貴金属原子との反応性が高いメルカプト基を有するメルカプトプロピルトリメトキシシランを用いた場合は,全ての組成比においてテトラメトキシシランが共重合した球状メソ多孔体シリカが合成可能であることが分かった.

また,金属原子との親和性が高いアミノ基を有するアミノプロピルトリメトキシシランも,20モル%までは共重合可能であることが分かった.3.ナノ粒子の特性の最適化1項で述べたフェロセン鉄カルバルデヒドを前駆体として用いて合成した酸化鉄/球状メソ多孔体シリカコンポジットの熱処理温度の影響を調べた結果,1000°Cまではγ相が,1100°C以上ではε相の酸化鉄ナノ粒子が生成することが分かった.通常観察されるα相は全く生成せず,メソ細孔内に拘束された状態ではγ相が安定化されることが明らかになった.また,ε相は準安定相であるが,約2nmのγ型酸化鉄が高温での加熱により凝集することにより,30-50nmのサイズに成長したものである.これらのコンポジットは,ナノ粒子に特有の超常磁性を示した.本年度の研究実施計画に基づき検討を行った結果を以下にまとめる.1.光学特性ナノ粒子の種類,導入方法の検討昨年度の検討で合成したメルカプト基を有する球状メソ多孔体シリカの細孔内に金のナノ粒子を導入することに成功した.処理条件の最適化により,金のナノ粒子の細孔外での析出を防ぐことができた.このコンポジットから作製したコロイド結晶は,ストップバンドを示すだけではなく,、金のプラズモン吸収も有していることから,全く新規な特性を有する材料として期待できる.また,テンプレートイオン交換法により,Cd, Znイオンを導入し,H2Sガスで処理することにより,硫化物半導体ナノ粒子(CdS, ZnS)を球状メソ多孔体シリカの細孔内に導入することにも成功した.2.大細孔径単分散球状メソ多孔体シリカの合成球状メソ多孔体シリカを合成後,長鎖界面活性剤あるいは,エキスパンダーの存在下で水熱処理することにより,粒子径の単分散性を保持したまま,細孔径が拡大できることを見出した.条件を最適化することにより,細孔径は約2倍以上に拡大し,酵素,強磁性ナノ粒子等の導入が可能になった.メカニズムについても解析を行い,長鎖のアルキル基を有する界面活性剤が,細孔内の界面活性剤と完全に入れ替わることを確認した.また,エキスパンダーの場合は,界面活性剤との強い疎水性相互作用により細孔内に導入されることを確認した.3.強磁性ナノ粒子の球状メソ多孔体シリカへの導入2項で述べた大細孔径単分散球状メソ多孔体シリカの細孔内にFePtを導入した結果,強磁性を有することが明らかになった.拡大した細孔径がFePtの強磁性限界粒子径を超えたために強磁性コンポジットの合成が可能になった.4.コアシェル型球状メソ多孔体シリカの合成粒子の内側と外側で細孔の化学特性の異なるコアシェル型単分散球状シリカ多孔体の合成に初めて成功した.1つの粒子の内側と外側に異なる特性を有するナノ粒子,または,色素を導入できる可能性がでてきた.本年度の研究実施計画に基づき検討を行った結果を以下にまとめる1.大細孔径単分散球状メソ多孔体シリカの合成昨年度までの検討で,球状メソ多孔体シリカを合成後,膨潤剤の存在下で水熱処理することにより,粒子径の単分散性を保持したまま,細孔径が拡大できることを見出している.そこで,種々の膨潤剤を用いて細孔径拡大検討を行い,トリメチルベンゼンが最も有効であることを見出した.細孔径を2.5nmから5.5nmまで拡大することができた.2.強磁性ナノ粒子の球状メソ多孔体シリカへの導入細孔径の異なる球状メソ多孔体シリカの細孔内にFePtナノ粒子を導入したコンポジットを作製し,細孔径がコンポジットの磁性に及ぼす影響を調べた.その結果,細孔径が大きい方が,保磁力が高くなることが分かった.ただ,超常磁性成分の影響で,磁化率は細孔径が小さい方が若干高くなった.
ジベレリンシグナル抑制因子の分解機構の解明

本研究は、ジベレリン(GA)のシグナル伝達機構を解明することを目的とする。*(1)GID1とSLR1の相互作用の解析ジベレリン非感受性極矮性変異体イネgid1の原因遺伝子は、リパーゼとよく似たタンパク質をコードしていた。GID1タンパク質はジベレリンと結合し、様々な性質からGID1がジベレリンの核内受容体であると結論した。さらに、イーストハイブリッドアッセイにより、GID1がジベレリンと結合すると、抑制因子であるSLR1と特異的に結合することを証明した。次に、in vitroにおけるGID1-GA-SLR1複合体の形成をゲルろ過法により解析した。His-tagをつけた全長のGID1タンパク質に対して、SLR1タンパク質(M1からH327の領域)をジベレリン存在下または非存在下でインキュベーションした後、ゲルろ過を行ったところジベレリン依存的に結合した。さらに、このSLR1を基にして、様々なSLR1のデリーションコンストラクトを作成したところ、N末のDELLA、TVHYNPドメインのどちらかが欠損するとGID1と結合できなくなった。これらのことから、この2つの領域がGID1との結合に必要であることが明らかとなった。ジベレリン依存的にGID1と結合したSLR1は、Fボックスタンパク質であるGID2と特異的に結合すると考えられる。そこで、yeast three hybrid法によりGID1,SLR1,GID2 3者の結合様式を調べた。その結果、GID2は、ジベレリン、GID1が存在している時のみSLR1と結合することが明らかとなった。(2)SLR1とGID2との相互作用の解析ジベレリン依存的にGID1と結合したSLR1は、Fボックスタンパク質であるGID2と特異的に結合すると考えられる。(1)GAシグナル伝達因子のGA結合能の解析今までに、単離、解析してきたDELLAタンパク質(SLR1),GID1,GID2の内いずれかが、GAの受容体である可能性について解析した。1)in vitroにおけるGA結合活性を調べた結果、GID1のみがGAに結合し、SLR1,GID2は、結合しなかった。2)活性型GAの一つであるジヒドロGA_4に対するK_d値は、約、10^<-6>Mであり、in vivoでの反応性とほぼ同等であった。3)活性型GAには高い親和性を示し、不活性型GAには低い親和性を示した。4)変位型アリルに対応する変異型GIDタンパク質は、GAと結合しなかった。5)GID1過剰発現体形質転換イネは、GAを過剰に与えたような徒長型の形質を示した。(2)GID1タンパク質とSLR1タンパク質との相互作用GA存在下でのイースト・ツーハイブリッドを行い、GID1とSLR1が、GA依存的に相互作用することを明らかにした。GID1,SLR1タンパク質を大腸菌で多量に合成し、現在結晶化の予備実験をほぼ終了した。(1)、(2)の結果より、GID1が、GAの細胞内受容体であると結論した。また、GAのシグナル伝達は、1)細胞内受容体であるGID1にGAが結合することが引き金になって、GID1がSLR1に結合し、安定的なGID1-GA-SLP1複合体を形成する、2)その複合体が、特異的にSCF^<GID2>のターゲットとなり、ユビキチン依存的に分解され、ジベレリン応答がおこる、の2段階からなることが推定された。昨年度までの結果として、ジベレリンの受容体であるGID1がジベレリンと結合すると、抑制因子であるSLR1と特異的に結合することを、yeast two hybrid assayの系で証明した。本年度は、in vitroにおけるGID1-GA-SLR1複合体の形成をゲルろ過法により解析した。His-

tagをつけた全長のGID1タンパク質に対して、SLR1タンパク質(M1からH327の領域)をジベレリン存在下または非存在下でインキュベーションした後、ゲルろ過を行ったところジベレリン依存的に結合した。さらに、このSLR1を基にして、様々なSLR1のデリーションコンストラクトを作成したところ、N未のDELLA、TVHYNPドメインのどちらかが欠損するとGID1と結合できなくなった。これらのことから、この2つの領域がGID1との結合k必要であることが明らかとなった。(2)SLR1とGID2との相互作用の解析ジベレリン依存的にGID1と結合したSLR1は、Fボックスタンパク質であるGID2と特異的に結合すると考えちれる。そこで、yeast three hybrid法によりGID1,SLR1,GID2 3者の結合様式を調べた。その結果、GID2は、ジベレリン、GID1が存在している時のみSLR1と結合することが明らかとなった。これらのタンパク質のX線構造解析を行う目的でGID1の結晶化を行ったが、解析に耐えうるような結晶は得られなかった。これは、タンパク質の構造の不安定性に依るものと考えられたので、タグの位置、タグを切るプロテアーゼの種類などの検討を行った。
Dent病発症の分子メカニズムと腎障害進行機序の解析

Cl輸送体CLC5の変異は小分子蛋白尿、くる病、進行性の腎障害などの近位尿細管機能障害を特徴とするDent病を生じるが、その発症機序には不明の点が多い。特に、2Cl/H交換輸送体であるCLC5の変異によりエンドサイトーシス異常を引き起こすメカニズム及びH-ATPaseとの相互作用の生理的意義などは解決されていない。CLC5のゲーティング部位の変異E211Qが初めて典型的なDent病症例から同定されたので、人為的変異体E211Aと比較しつつ機能解析を行った。アフリカツメカエル卵母細胞発現系で野生型CLC5は陽性電位域でのみ強い外向き整流性を示す電流を発現させた。これに対して、E211AおよびE211Q変異体は全電位域に渡り直線的な電流を呈した。まさらにpH感受性微小電極を用いて細胞膜近傍のpH測定実験を行ったところ、E211Q変異体はE211Aと同様にCl/H交換輸送体ではなく、Clチャネルとして機能することが確認された。一方、HEK293培養細胞では、全てのCLC5コンストラクトの遺伝子導入はH-ATPase活性を増強したが、その増強作用は野生型が最大であった。またマウスから単離し培養した近位尿細管にCLC5に対するsiRNAを導入したところ、H-ATPase活性は著明に抑制された。以上よりE211Q変異はCLC5のCl/H交換機能を喪失させることが確認され、その結果近位尿細管エンドソーム及び細胞膜上のH-ATPaseの最大活性の発現が障害されることが示唆された。Dent病はCl輸送体CLC5またはOCRL1遺伝子の変異により小分子蛋白尿、くる病、進行性の腎障害などの近位尿細管機能障害を呈するが、その発症機序には不明の点が多い。特に、2Cl/H交換輸送体であるCLC5の変異がエンドサイトーシス異常を引き起こすメカニズムは解決されていない。今回典型的なDent病症例からCLC5のゲーティング部位の変異E211Qが初めて同定されたので、人為的変異体E211Aと比較しつつ機能解析を行った。また細胞外溶液のpHを低下させると野生型CLC5の電流は有意に抑制されたが、E211AおよびE211Q電流は変化しなかった。さらにpH感受性微小電極を用いて細胞膜近傍のpH測定実験を行ったところ、野生型CLC5を発現した卵母細胞では脱分極刺激パルスにより細胞外局所pHが大きく低下した。しかし、E211AおよびE211Q変異体を発現した卵母細胞では同様のpH変化を全く認めなかった。一方、HEK293培養細胞に野生型および変異CLC5を発現させ細胞内酸負荷からのNa非依存性の細胞内pH回復過程を比較検討した。全てのCLC5コンストラクトの遺伝子導入はH-ATPase活性を増強したが、その増強作用は野生型が最大であった。以上よりE211Q変異はCLC5のCl/H交換機能を喪失させることが確認され、その結果近位尿細管H-ATPaseの最大活性の発現が障害されることが示唆された。CLC5のゲーティング部位の変異E211QがCLC5のCl/H交換機能を喪失させることが確認でき、またH-ATPaseに対する作用もある程度明らかにできたため。達成度は良好と考える。野生型および変異型CLC5遺伝子によるH-ATPase活性増強のメカニズムについて、蛋白発現や細胞内局在の変化などが関与するか、検討する予定である。

また野生型および変異型CLC5によるエンドゾーム内pHの変化についても詳細に検討し、E211Q変異によるDent病発症機序を明らかにする予定である。物品の経費が予想より少なく済んだため物品および旅費、その他の経費に使用する予定
窒化物半導体ステップフリーヘテロ構造の研究

我々の独自技術である窒化物半導体のステップフリー面[1分子層のステップも存在しないデバイスサイズ(16ミクロン以上)の大きさの完全平滑面]の形成技術を用いて、理想的なヘテロ界面を有するステップフリーInN量子井戸を作製した。ステップフリーInN量子井戸は、厚さが1分子層であり、紫色の極めて鋭い(スペクトルの幅が狭い)発光を示した。今後、量子井戸の厚さを制御することにより緑色や赤色の高効率発光が理論的に期待される。従来の窒化物半導体は、SiやGaAs等と比較して、転位が多く、また、平坦性が悪いため、量子井戸における量子準位の揺らぎや発光効率の低下が問題であった。そのため、無転位で完全に平坦(ステップフリー)な窒化物半導体のヘテロ界面が望まれていた。本研究では、無転位で1分子層のステップもない理想的なヘテロ界面を有するInN極薄量子井戸を作製し、窒化物半導体を用いた赤色や通信波長帯の発光ダイオードやレーザダイオードの実現を目指す。さらに、学術的な貢献として、窒化物半導体の成長機構の解明、ステップフリーヘテロ界面を有するGaN/InN量子井戸や規則混晶(GaN)m(InN)nの作製と光学物性の評価を行う。今年度は、GaNの成長機構の解明について重点的に研究を進めるとともに、量子井戸や規則混晶の光学物性評価を行うための測定系の構築を行った。GaN基板を用いて有機金属気相成長法(MOCVD)により選択成長を行った。螺旋転位や混合転位のない選択成長領域では2次元核成長がおこり、GaNステップフリー面が形成される一方で、これらの転位がある成長領域では螺旋成長が起こり、GaN表面には成長螺旋が観察された。これはすなわち、純粋な2次元核成長と螺旋成長を1回の成長で同一基板上に実現できたことになり、同じ条件下での両成長モードの機構解明が本研究により可能になったことを意味する。2次元核成長や螺旋成長速度の過飽和度依存性について英文論文誌や国際会議で発表した。また螺旋成長速度の温度依存性から、GaNの基礎物性値である蒸発エネルギーを算出し、国内会議で発表した。さらに、GaNステップフリー面の形成や成長機構解明について国際会議で招待講演を行った。GaNやInNのバンド端発光観察に対応できる波長範囲(3502200nm)のフォトルミネッセンス測定装置を立ち上げ、バンド端発光の測定が出来ることを確認した。従来の窒化物半導体は、SiやGaAs等と比較して結晶欠陥(転位)が多く、また、平坦性が悪いため、量子井戸における量子準位の揺らぎや発光効率の低下が問題であった。昨年度は、転位密度の低いGaN基板を用いて選択成長を行って、GaNのステップフリー面を形成したり、らせん成長や核成長機構を検討したりした。今年度は、ステップフリーヘテロ界面を有するGaN/InN量子井戸の作製について主に検討した。有機金属気相エピタキシ装置を用いて、大きさが16ミクロンのGaNステップフリー面の表面上へInNを短時間成長し、InNの核形成の様子を原子間力顕微鏡やオージェ電子分光装置等により検証した。次に、GaNステップフリー面上のInN層にGaN層をさらに成長することにより、GaN/InN量子井戸構造を作製した。さらに、GaN/InN量子井戸の発光特性を顕微フォトルミネッセンス装置を用いて検証した。日本結晶成長学会誌に論文が掲載された。第3回窒化物半導体結晶成長講演会において、表面過飽和度制御によるGaNステップフリー面の形成について招待講演を行った。また、国際会議2件、および、国内会議1件の口頭発表を行った。従来の窒化物半導体は、SiやGaAs等と比較して結晶欠陥(転位)が多く平坦性が悪いため、量子井戸における量子準位の揺らぎや発光効率の低下が問題であった。本研究では、無転位で1分子層のステップもない理想的なヘテロ界面を有するInN極薄量子井戸を作製し、窒化物半導体を用いた赤色や通信波長帯の発光素子実現を目指す。さらに、学術的な貢献として、窒化物半導体の成長機構の解明、ステップフリーヘテロ界面を有するInN量子井戸の作製と光学物性の評価を行う。昨年度までに、1転位密度の低いGaN基板を用いた選択成長を行って

GaNステップフリー面を形成、2GaNのらせん成長や核成長機構を検討、3GaNをバリア層とするInN単一量子井戸の作製、これらの項目を達成した。今年度は、作製したInN単一量子井戸の構造や光学物性に関して詳細に検討を行った。高分解走査透過型電子顕微鏡により、InN量子井戸が均一な1分子層の厚みを持ち、GaNバリア層との界面がステップフリー面であることを明らかにした。また、このInN単一量子井戸層から、波長が約400nmのシャープな光励起発光を得た。同じ波長で発光する従来の窒化物半導体(InGaN)量子井戸に比べて、発光スペクトル幅が1/7程度と非常にシャープであった。これらの検討から、ステップフリーInN単一量子井戸が持つ、界面の急峻さや混晶組成の揺らぎのなさというメリットを実験的に証明した。インパクトファクターの高い(IF=13.877)Advanced Materials誌を含め、査読付外国論文誌に2件論文が掲載された。また、国際会議の招待講演を2件行った。他に、国際会議2件、および、国内会議4件の口頭発表を行った。これまでに、低転位密度GaN基板を用いた選択成長法により、GaNおよびInNの2次元成長機構の解明を行った。さらに、InR/GaN量子井戸を作製し、その発光特性を顕微フォトルミネッセンス装置で評価した。これらは、当初の研究計画調書においても平成23年度までの計画として予定されていた内容であり、おおむね計画どおりに遂行することができたと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまで順調に研究が進展しており、また、研究を遂行する上での問題点は特に存在しない。今後は、具体的には次のように研究を進める予定である。まず、InN/GaN量子井戸の成長条件を最適化することにより、InN量子井戸層の厚さ(分子層数)を変化させ、量子サイズ効果による発光波長の制御を行う。この時、InN井戸層とGaNバリア層の間をステップフリー界面とすることにより、InN井戸に形成される量子準位のエネルギー分布をシャープにし、単色性の高い発光を目指す。さらに、GaN層の成長時にシランガスや有機マグネシウム原料などを導入してドーピング制御を行う。そして、InN/GaN量子井戸を活性層とする発光ダイオードの作製を行い、電流注入発光を狙う。
顎関節滑膜表層細胞と破骨細胞の細胞学的相同性の解明をめざして

顎関節における炎症性疾患の病態の主体となる滑膜表層細胞と破骨細胞にはcaveolin-3が発現する。両細胞に共通したイオンチャネルや受容体の存在を検索することを目的として、成獣ラット顎関節において特異抗体を用いた免疫組織学的検索を行った。破骨細胞ではT型、L型、N型電位依存性カルシウムイオンチャネルやENaCが、滑膜表層細ではT型チャネルやENaCが発現しており、これらはカルシウムシグナリングやイオン濃度変化に対する恒常性の維持に関与することが示唆された。高い反応性と分化増殖活性をもつ破骨細胞にはイオンチャネルを介する細胞制御機構があることが知られるが,滑膜表層細胞におけるイオンチャネルの研究はほとんどない.本研究では,顎関節滑膜表層細胞におけるイオンチャネルの発現を免疫組織化学的,微細構造学的および分子生物学的に検討し,破骨細胞と共通したイオンチャネルの存在を検討した.試料として8週齢ラットを用いて,顎関節部と脛骨を含む膝関節部の凍結切片,パラフィン切片および樹脂包埋切片を作成した.神経筋接合部や神経終末など活発な情報伝達が必要な組織で重要な役割を果たす電位依存性カルシウムチャネル(Cav)やグルタミン酸輸送体(GLAST, GLT-1),細胞外カルシウム濃度受容体の一種であるカルシウム作動性受容体(CaSR)に着目して,それぞれの特異抗体を用いた免疫組織化学的手法にて検討した.破骨細胞において,L-typeチャネルCav1.2陽性反応が細胞質内全体に,シナプスに特異的と言われるN-typeチャネルCav2.2陽性反応が吸収窩に沿って観察された.Cav1.2はカベオリン3同様にすべての破骨細胞が免疫陽性を示したが,Cav2.2は骨稜に接する破骨細胞のみに陽性反応が確認された.また,神経伝達物質の一種であるグルタミン酸の取り込みに関与する細胞膜局在性GLT-1が,主に骨軟骨移行部の破骨細胞に強発現していた.小胞性VGLT-1の破骨細胞における発現も考慮すると,破骨細胞の骨吸収の制御には,神経伝達物質や骨基質から遊離するカルシウムイオンの関与が示唆される.高い反応性と分化増殖活性をもつ破骨細胞にはイオンチャネルを介する細胞制御機構があることが知られるが,滑膜表層細胞におけるイオンチャネルの研究はほとんどない.本研究では,顎関節滑膜表層細胞におけるイオンチャネルの発現を免疫組織化学的,微細構造学的に検討し,破骨細胞と共通したイオンチャネルの存在を検討した.試料として8週齢ラットを用いて,顎関節部と脛骨を含む膝関節部の凍結切片,パラフィン切片および樹脂包埋切片を作成した.神経筋接合部や神経終末など活発な情報伝達が必要な組織で重要な役割を果たす電位依存性カルシウムチャネル(Cav)やグルタミン酸輸送体(GLAST,GLT-1),細胞外カルシウム濃度受容体の一種であるカルシウム作動性受容体(CaSR)に着目して,それぞれの特異抗体を用いた免疫組織化学的手法にて検討した.破骨細胞において,L-typeチャネルCav1.2陽性反応が細胞質内全体に,シナプスに特異的と言われるN-typeチャネルCav2.2陽性反応が吸収窩に沿って観察された.Cav1.2はカベオリン3同様にすべての破骨細胞が免疫陽性を示したが,Cav2.2は骨稜に接する破骨細胞のみに陽性反応が確認された.また神経終末において痛みの伝達物質であるグルタミン酸の細胞膜局在性輸送体GLT-1が,主に骨軟骨移行部の破骨細胞に強発現していた.小胞局在性のVGLT-1の破骨細胞における発現も考慮すると,破骨細胞の骨吸収の制御には,神経伝達物質や細胞周囲のカルシウムイオンの濃度変化の関与が示唆される.
好気性真核生物から嫌気性真核生物への進化におけるスナップショットと多様性の解明

本研究では、好気でも嫌気でも生育可能な真核微生物を用いて、真核生物における好気から嫌気への適応進化の初期段階の解明を目的として研究を行った。ミトコンドリアに局在するタンパク質はトランスクリプトーム解析と細胞内局在解析から網羅的に同定し、好気環境と嫌気環境下では、エネルギー合成に関与する遺伝子が大きく異なることが判明した。分子系統解析から、嫌気エネルギー合成遺伝子は水平移動によって獲得したと考えられる。本研究から、好気から嫌気へのミトコンドリア適応進化に重要な初期イベントとして、嫌気用エネルギー合成遺伝子の獲得と、好気・嫌気における遺伝子発現制御が重要であると考えられる。酸素の有無にかかわらず生育可能な真核生物について、好気培地と嫌気培地でそれぞれ培養し、トランスクリプトーム解析を行った。それぞれの条件から得られた転写産物配列には、ミトコンドリアゲノム由来の転写産物断片や、ミトコンドリアゲノムの複製、転写などに関わるタンパク質をコードした転写産物が含まれていた。これらの配列は、本種にミトコンドリアゲノムが存在していることを示している。そこでミトコンドリアゲノムの全長解読を行った結果、約30 kbほどの環状ミトコンドリアゲノムの全配列の決定ができた。本ゲノムには電子伝達系複合体Iを構成するタンパク質であるNADH dehydrogenaseや複合体IIIで機能するCytochromeb、複合体IVで働くCytochrome coxidaseなどの遺伝子が同定された。しかし近縁種の完全好気性種のミトコンドリアゲノムと比較すると、遺伝子数の減少やゲノムサイズの縮退が観察された。このことは、嫌気環境への適応進化により、ミトコンドリアでの酸素を用いたエネルギー生産への依存度が低くなっていることを示唆している。さらに、トランスクリプトームデータを探索すると、好気的エネルギー生産に必要な核遺伝子はほぼそろっていることが判明した。さらに、絶対嫌気性真核生物がもつとされる嫌気的なエネルギー生産に関わる遺伝子も同定された。これらの転写産物は、好気培養と嫌気培養によって転写産物量が変化することが定量的比較トランスクリプトーム解析によって判明した。本種は酸素濃度によってその生存戦略を適切にコントロールしていることが強く示唆される。これまでに、あらたに嫌気環境に適応した真核生物を新たに2株確立・維持している。今後、これらの種の同定を詳細に行っていく。当初の予定通り、トランスクリプトームデータとミトコンドリアゲノムデータをそろえることに成功した。また予定通り、新たな嫌気性真核生物の株を確立した。昨年度に得られたトランスクリプトーム解析に加え、さらに再現性をとるために同様のトランスクリプトーム解析を嫌気および好気培養細胞を用いて行った。嫌気2サンプル、好気2サンプルの計4サンプルすべてのデータを用いてアッセンブルを行い、コンティグを得た。コンティグに対し、リードを再マッピングし、嫌気でより発現している遺伝子および嫌気では発現が抑えられている遺伝子を同定した。さらに、このように酸素の有無で発現量が異なる遺伝子がコードするタンパク質データセットから、ミトコンドリア標的配列を検出した。今回の解析ではピルビン酸:フェレドキシン酸化還元酵素やピルビン酸:ギ酸リアーゼなどが嫌気条件でより発現し、ミトコンドリアで機能するタンパク質として同定された。これらのうち、いくつかのタンパク質配列におけるN末端配列をGFPのN末端へ結合させたリコンビナントタンパク質を酵母細胞内で発現させた。その結果、ミトコンドリア局在を示し、同定された嫌気条件特異的タンパク質がミトコンドリア内で機能していることが示唆された。現在、これらの遺伝子が関与する代謝経路の全体像を把握するため、トランスクリプトームデータの精査と遺伝子探索を行っている。また、昨年度単離した嫌気性真核生物2種から抽出したRNAを用いてトランスクリプトーム解析を行った。現在、本種における嫌気環境でのエネルギー生産機構の推定をトランスクリプトームベースで行っている。予定通り、再現性のあるトランスクリプトームデータから定量的な比較解析ができた。また、予定通りミトコンドリア局在タンパク質の推定ができている。これまでに得られたトランスクリプトームデータから検出した発現変動のある核コード遺伝子群の機能アノテーションを行った。その結果、ピルビン酸の代謝、アミノ酸代謝、ギ酸の代謝に関して嫌気環境下で発現が上がることが分かった。逆に嫌気環境下で顕著に発現が下がる核コードの機能は今回の解析では見いだせなかった。ピルビン酸の代謝、アミノ酸代謝、ギ酸の代謝に関して、それらに関与するタンパク質の局在解析を行ったところ、多くのタンパク質はミトコンドリアで機能すると予想された。すなわち、嫌気環境下でミトコンドリアのプロテオームおよび機能のリモデリングが起こると考えられる。機能およびミトコンドリア局在シグナルの存在からミトコンドリアに局在するタンパク質の網羅的な同定を行ったところ、500種近いタンパク質が同定された。この数はこれまでに研究されている好気環境に生育する真核生物のミトコンドリアプロテオームと比較すると非常に少なく、嫌気環境に適応する進化過程でタンパク質数や機能が縮退したことを示唆している。ミトコンドリアゲノムにコードされている遺伝子の定量逆転写PCRを行ったところ、好気条件と比較して、嫌気条件では転写産物量が有意に低下していた。トランスクリプトーム解析によるデータと総合して考えると、好気条件では電子伝達系によるエネルギー生産を行い、嫌気条件ではピルビン酸・アミノ酸・ギ酸の代謝を介したエネルギー生産を主に行っていることが強く示唆される。

本研究では、好気でも嫌気でも生育可能な真核微生物を用いて、真核生物における好気から嫌気への適応進化の初期段階の解明を目的として研究を行った。ミトコンドリアに局在するタンパク質はトランスクリプトーム解析と細胞内局在解析から網羅的に同定し、好気環境と嫌気環境下では、エネルギー合成に関与する遺伝子が大きく異なることが判明した。分子系統解析から、嫌気エネルギー合成遺伝子は水平移動によって獲得したと考えられる。本研究から、好気から嫌気へのミトコンドリア適応進化に重要な初期イベントとして、嫌気用エネルギー合成遺伝子の獲得と、好気・嫌気における遺伝子発現制御が重要であると考えられる。これまでも研究計画通り進んでいる。大幅な計画変更は必要ないと考えられるため、今後も研究計画通り実験を進めていく。研究計画通りに進展しているため、大幅な変更は必要ない。今後も研究計画通りに進めていく。真核微生物とそれらがもつオルガネラの進化・多様性
新たな血栓症の予防・治療法確立を目指した巨核球造血・血小板機能における系統的解析

巨核球は、造血幹細胞から巨核球系特異的サイトカイン,トロンボポエチン(TPO)の作用を受け分化・成熟し、分化の最終段階で胞体突起を形成するが、そのメカニズムや血小板活性化制御機構については以前不明な点が多い。本研究では、巨核球胞体突起形成,血小板凝集能などについて野生型巨核球及び血小板とdnam-1ノックアウト(KO), calpastatin KOで差が認められた。以上の結果から、DNAM-1, calpain-calpastatin系が巨核球造血,血小板機能に重要であることが示唆された。また、人工髄液に含まれる重炭酸塩が血小板機能を増強することを明らかにした。申請者はこれまで巨核球造血及び血小板機能のメカニズムの解明を主たる研究分野として研究に取り組んできた。その過程で巨核球・血小板と骨髄間質細胞・血管内皮細胞の接着を制御する可能性のある分子としてcalpain, p38MAPKなどいくつか見出した。そこで、これらノックアウト(KO)マウスを用いて巨核球造血及び血小板機能における役割を検討した。まず野生型(WT)マウスより精製した巨核球にcalpain阻害剤ALLNを添加し培養したところ、巨核球胞体突起形成(prpplatelet formation:PPF)が濃度依存性に抑制された。そこで、calpainの内在性阻害タンパクであるcalpastatinのKOマウスを用いて検討を行ったところ、WTとKO巨核球でPPFに差は認められなかった。次に、5-FUを投与し、造血幹細胞から巨核球への分化及び血小板産生能を評価したところ、血小板回復期の巨核球ploidyはWTと比較してKOで未熟巨核球が増加し、骨髄内巨核球の割合もKOで増加していた。これらの結果から、calpastatinは巨核球造血を制御する分子である可能性が示唆された。次に、血栓症の予防及び治療法の確立をめざし、血小板機能を制御する分子を探索した。なかでも近年脳外科手術において洗浄液として用いられる人工髄液を使用する際、生理食塩水を使用した場合と比較して止血が速やかに行われることが報告されている。そこで、人工髄液の成分をもとに血小板機能を制御する分子を探索したところ、sodium bicarbonateが血小板凝集能を増強するが凝固には影響しないことを見出した。またflow cytometryを用いた解析により血小板膜タンパクであるGPIIbIIIaの活性化やPS Exposure陽性血小板の割合や血小板あたりのP-selectinの発現をsodium bicarbonateは増加させ、出血時間を短縮することを見出した。また、この活性化の増強は、血小板内のSrc-PLCgIIの活性化を増強することによって行われていることも明らかにした。本来当該年度は申請者のこれまでの検討から巨核球造血及び血小板機能を制御する可能性が示唆されているDNAM-1についてKOマウスを用いて検討を行う予定であった。平成26年度に増殖したマウスの遺伝子型を検討したところ、繁殖したほとんどのマウスがヘテロマウスであり、研究を遂行するのに十分なKOマウスを準備できなかった。そこで、該当年は、得られたDNAM-1 KOマウスを用いた予備検討を行いながら、他のターゲットであるcalpastatinについてKOマウスを用いて巨核球造血における役割について検討した。その結果、5-FU投与後の血小板回復期において未熟巨核球が増殖し、さらには骨髄内巨核球がWTと比較してKOで増加していることが明らかとなり、calpastatinが巨核球造血を制御する分子である可能性が明らかとなった。そこで、現在もcalpastatin KOマウスを用いて巨核球造血、特に巨核球への分化におけるcalpastatinの役割を継続して解析中である。また、DNAM-1 KOマウスについても繁殖率の高いペアよりKOマウスを得て、繁殖を進めるなど次年度に向けて準備を進めている。また、血栓症の予防及び治療法の確立をめざし、血小板機能を制御する分子を探索したところ、sodium bicarbonateが血小板機能を増強させる分子であることを明らかにした。そこで、現在も、sodium bicarbonateの血小板機能への役割や応用について検討中である。血小板の母細胞である巨核球は、造血幹細胞から核の多倍化・胞体の成熟を伴いながら分化・成熟し、分化の最終段階で胞体突起を形成する。この胞体の先端が断裂することにより血小板は産生されるが、そのメカニズムは十分には解明されていない。また、産生された血小板活性化メカニズムについても不明な点が多く存在する。これまでの研究成果から、巨核球からの血小板産生過程にapoptosisは関与しないこと、造血幹細胞から巨核球への初期分化にcaspase活性化が関与することを明らかにしてきた。しかしながら、巨核球より産生された血小板におけるapoptosisの関与は未だ解明されていない。そこで本研究では、apoptosisに強い抵抗性を示すvav-bcl-2トランスジェニック(Tg)マウスを用いて血小板活性化におけるapoptosisの関与を検討した。まず、caspase阻害剤, z-VAD-fmkを血小板に添加したが、PS exposureやMP formationに影響を与えなかった。また、野生型(WT)マウス血小板とTg血小板の間においても差は認められなかった。

さらに血小板凝集能においてもWTとTg血小板の間で差は認められなかった。また、western blotなどにより血小板活性化時におけるcaspase-3活性化を測定したが、活性化していなかった。一方、37°Cで数日保存した血小板ではcaspase-3活性化が認められた。そこで血小板寿命を測定したところ、WTと比較してTgで有意に寿命が延長していた。以上の結果から、caspase活性化を含むapoptosisは血小板活性化には関与しないが、血小板寿命を制御する可能性が示唆された。巨核球は、造血幹細胞から巨核球系特異的サイトカイン,トロンボポエチン(TPO)の作用を受け分化・成熟し、分化の最終段階で胞体突起を形成するが、そのメカニズムや血小板活性化制御機構については以前不明な点が多い。本研究では、巨核球胞体突起形成,血小板凝集能などについて野生型巨核球及び血小板とdnam-1ノックアウト(KO), calpastatin KOで差が認められた。以上の結果から、DNAM-1, calpain-calpastatin系が巨核球造血,血小板機能に重要であることが示唆された。また、人工髄液に含まれる重炭酸塩が血小板機能を増強することを明らかにした。本来、平成26年度は、CD226の血小板機能及び巨核球造血における役割を明らかにするために、CD226 KOマウスを用いた検討を行う予定であった。しかしながら、CD226 KOマウスの繁殖効率が悪く、研究を遂行するには不十分なマウスしか準備できなかった。そこで、該当年はCD226 KOマウスを用いた血小板機能及び巨核球造血に関する解析を行わず、CD226 KOマウスの繁殖を中心に行った。従って、平成26年度は、検討するマウスは当初とは異なるものの、研究計画では平成27年度以降に行う研究対象であり、かつ繁殖が順調で研究に十分なマウスが確保できた別のKOマウス(血小板機能におけるcalpain-calpastatin系の役割を検討するために導入したcalpastatin KOマウス)の解析を先に行うこととした。その結果、calpastatin KOマウスとWTマウスで活性化GPIIbIIIa陽性率やmicroparticle放出量、CD62Pの発現など血小板機能に差が認められる血小板活性化マーカーが明らかとなってきた。しかしながら、いかにしてそのような差が認められるのか、その原因や血小板内情報伝達系の詳しい解析まで行うことはできなかった。そこで、現在もcalpastatin KOマウス血小板を用いて血小板内情報伝達系を中心に解析を継続中である。巨核球造血におけるcalpain-calpastatin系の役割を明らかにするためには、calpastatin KOマウスを用いてcalpastatin KO造血幹細胞または巨核球のさらなる解析が必須であると考えており、今後は骨髄内に少数かつ脆弱である巨核球を採取し、calpain-calpastatin系を中心にどのようなシグナル情報伝達系により巨核球造血が制御されているかを免疫細胞染色やflow cytometryを用いて検討する予定である。DNAM-1の役割についても、現在殖率の高いペアよりKOマウスを得て、繁殖を進めており、研究を遂行するのに十分なKOマウスを準備中である。