hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞接着分子ネクチンとアファディンによるシナプス形成機構

ネクチン・アファディン系とともにZO-1による神経細胞の形態形成機構の検討を行った。これまで神経細胞において機能が不明だったZO-1は、ネクチン・アファディンとともに樹状突起フィロポーディアどうしが接触する部位に局在し、また樹状突起フィロポーディア自身の形成にも関与していた。さらにZO-1は樹状突起フィロポーディア間の接着を制御することで、樹状突起の形態形成を制御していることをも明らかにした。シナプスは神経伝達の行われる部位であり、記憶に密接に関連して可塑的な変化の起こる接着構造である。申請者はシナプス形成における細胞接着分子カドヘリンの重要性を世界に先駆けて示し、さらに軸索・樹状突起間の識別に細胞接着分子ネクチンがカドヘリンとともに必須であることを解明した。ネクチンの裏打ち分子であるアファディンのノックアウトマウスを作製したところ、シナプス形成が顕著に減少していた。しかし、アファディンがシナプスの形成と維持、さらに記憶の形成にどのように関わるのかはいまだ不明である。そこで本年度は、シナプス形成時におけるアファディンによる細胞間接着の制御機構と、シナプスの維持や記憶の形成に果たすアファディンの役割と作用機序を明らかにする目的で、アファディンの遺伝子改変マウスより海馬初代培養細胞を作製した。これらの神経細胞では軸索と樹状突起間の接触が減少し、正常なシナプスが形成されなかった。また、形成された多くのシナプスでは形態の異常を示した。そこで、アファディンが軸索と樹状突起の認識および接着制御にどのように関与しているのかを明らかにする目的で、アファディンをノックアウトした培養神経細胞をGFP等の蛍光タンパクで標識し、顕微鏡下で経時的に観察したところ、アファディンをノックアウトした細胞では軸索と樹状突起が出会っても互いにすれ違うか、成長円錐と樹状突起が接触したまま軸索伸長が停止しているものが多数見られ、軸索が樹状突起に沿って走行する例が極端に減少していた。これらの実験結果は、ネクチン-アファディン系は軸索と樹状突起を認識し、神経突起間の適切な相互作用を保ちながら軸索の伸長と誘導を行うために必須であることを示している。海馬では歯状回より伸びた苔状線維がCA3領域の錐体細胞に対してシナプスを形成する。ネクチンの裏打ち分子であるアファディンのノックアウトマウスを作製したところ、このノックアウトマウスの海馬ではシナプス形成が顕著に減少していた。苔状線維内のシナプス小胞の構成分子、またCA3錐体細胞の受容体集積に関わるPSD-95等の足場分子の集積が低下していた。しかし、アファディンがシナプスの形成においてどのようにこれらの分子の集積に関わるのかは不明である。これまでに、アファディンの遺伝子改変マウスより海馬初代培養細胞を作製したところ、これらの神経細胞では軸索と樹状突起間の接触が減少し正常なシナプスが形成されなかった。アファディンがノックアウトされた培養神経細胞では細胞間接着に関与する分子について発現と局在の低下がそれぞれ見られた。現在、アファディンとこれら分子の相互作用について検討を行っている。アファディンノックアウトによって変化が見られた分子については培養神経細胞を用いて過剰発現とノックダウンの実験を行い、アファディンとどのような協調的な機構によってシナプス形成に関与しているのかを検討している。また、ネクチン・アファディンの機能を解析する中で、異なるネクチンを発現する二種類の細胞がモザイク様の細胞選別に関わることを見出し、論文として公表した。神経細胞は軸索と樹状突起を伸長させて、他の神経細胞とシナプスを介して結合することで機能的な神経回路網を形成する。樹状突起の形態は軸索からの入力の受容野と関わることから、神経細胞の情報処理とも密接に関係している。このような樹状突起形態形成には接着分子が関与することが示されているが、いまだ詳しい分子機構については明らかにされていないことも多い。これまでにマウス海馬CA3領域における海馬歯状回からの苔状線維と錐体細胞の間の接着構造にはMAGUKファミリーに属するアクチン結合分子のZO-1が存在することが示されている。ZO-1は上皮細胞などにおいてはタイトジャンクションの形成などに必須であることが示されているが、ZO-1が神経細胞の形態形成にどのように関わるのかはいまだ不明である。そこで、樹状突起の形態形成におけるZO-1の機能に着目して検討を行った。培養海馬神経細胞においてZO-1は樹状突起フィロポーディア間に強い局在が見られたが、このような構造は一過的であり、神経細胞が成熟するに従い消失した。そこでZO-1の過剰発現を行ったところ、ZO-1は樹状突起フィロポーディア間に強い局在を示し、樹状突起どうしの異常な接触が誘導された。

このような樹状突起フィロポーディアの接触部位には、ネクチンやカドヘリンなどの接着分子が濃縮していた。一方、培養海馬神経細胞においてZO-1のノックダウンを行ったところ、これらの神経細胞では樹状突起の本数や長さには変化がなかったが、偏った方向に複数本の樹状突起が束になって伸長しており、樹状突起フィロポーディアが減少していた。これらの実験結果は、ZO-1は樹状突起フィロポーディア間の接着を制御することで、樹状突起の形態を制御していることを示している。アファディンによるシナプス形成の機構が順調に理解されるのと同時に、シナプス形成においてアファディンと協調的に機能する分子が多数明らかにされつつあり、細胞間接着とシナプス形成の分子機構について当初の計画以上に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。アファディンをノックアウトした培養神経細胞では正常なシナプス形成が減少していた。そこで、シナラス形成における細胞間接着の働きを明らかにする目的で、神経細胞をGFP等の蛍光タンパクで標識し、シナプス形成過程を顕微鏡下で経時的に観察を行う。また、細胞接着分子等のGFP融合分子を神経細胞に発現させ、同様の実験を行うことにより、シナプス分子と接着分子の機能を明らかにする。
新しい不斉合成反応の開発

1.キレート生成を経由する不斉アルキル化反応キレート生成による反応中間体のコンホメーションの固定を用いた不斉アルキル化反応の展開を行なった。その結果、この手法が不斉マイケル反応に有効に応用できる事を見出した。すなわち、L-バリンエステルとβ-ケトエステルから得られるエナミンをリチオ化し、メチレンマロン酸ジエステルと反応させると、用いる溶媒や添加物によって、対応するマイケル付加体の両対掌体を高い光学純度で得た。本反応はエナンチオ選択的な反応にも応用できる。2.光学活性ブチロラクトン,ブチロラクタムを用いる不斉アルキル化光学活性γ-ヒドロキシメチル-γ-ブチロラクトンの両対掌体を、安価なL-グルタミン酸から大量に合成するルートを拓き、これらを用いて抗腫瘍性天然物であるメガフォン、スパトールのはじめての不斉全合成を完成した。本合成反応の結果から、対応するブチロラクタムの不斉試薬としての有用性を明らかにし、これを用いる不斉アルキル化による光学活性β-置換カルボン酸の新しい不斉合成法を開発した。3.不斉ルイス酸、不斉塩基を用いるエナンチオ選択的不斉合成光学活性アルコキシアルミニウムジクロリドをルイス酸触媒とするエナンチオ選択的ディールス・アルダー反応の一般性を見出した。また、光学活性リチウムアミド型強塩基を用い、対称面を有するプロキラルなカルボニル化合物(たとえば4-置換シクロヘキサノン)の不斉脱プロトン化反応によるエナンチオ選択的なエノールエーテルの不斉合成法を開発した。エノールエーテルはエノレートアニオン等価体であるから、この不斉反応は種々の光学活性化合物の不斉合成子として広く応用できることが期待される。本不斉反応の機構の推定も行なった。効率的かつ実用的な不斉合成法の開発を目的として、以下の検討を行なった。1.キレート生成を経由する不斉アルキル化反応β-ケトエステル(【1!】)から得られるエナミン(【2!】)とリチオ化後マイケル反応を行なうことにより、対応する付加体(【3!】)を高い不斉収率で得る事に成功した。反応系を選択する事により、【3!】の両対掌体を作り分ける方法も見出した。2.光学活性ブチロラクタムを用いる不斉アルキル化反応α,β-不飽和カルボン酸(【4!】)を対応するイミド(【5!】)とし、グリニヤール試薬と反応させる事によるβ,β-ジ置換カルボン酸を不斉合成する一般法を確立した。3.不斉塩基を用いるエナンチオ選択的不斉脱プロトン化反応不斉塩基(たとえば【9!】)を用いることにより、4-置換シクロヘキサノンの不斉脱プロトン化によるシリルエノールエーテル(【8!】)の不斉合成法を見出した。
電子波共鳴を用いた有機金属気相成長ヘテロ界面の原子オーダーの評価と平坦化の研究

本研究では、InP/GaInAs共鳴トンネルダイオードを有機金属気相成長法により作製し、結晶成長条件とヘテロ界面の原子オーダとの関係を明らかにした。結晶表面の原子オーダでの平坦化は、成長条件を基板傾斜方向と角度で定まるテラス及び単原子層ステップを形成する成長モード(ステップフローモード)に制御することにより実現される。そこで、成長した結晶表面形状を原子間力顕微鏡で観測し、その結果を成長条件にフィードバックし以下の知見を得た。(1)ラフな元基板表面の7分間の熱処理では、平坦領域は生じるがステップの形成には到らない。(2)(1)のようなラフ(凹凸が1原子層以上)なInP基板表面には、10nm程度の初期成長と30秒の成長中断を施すことにより、テラス幅250nmの単原子層ステップが初めて実現した。(3)ステップフロモードは(2)の表面形成後に得られ、InP表面では成長温度600°C、成長速度0.43ML/s以下で、GaInAs表面では650°C、0.35ML/s以下で原子オーダでの平坦化が実現した。(4)結晶成長機構を理論解析し、今回の実験結果より、InP/GaInAsのステップフロー、2次元核成長の遷移領域を温度、成長速度等のパラメータ空間で同定した。更に、以上の知見を共鳴トンネルダイオードのヘテロ界面制御に応用した。共鳴トンネルダイオードを2次元核成長、単原子層ステップ成長のそれぞれで成長し、4Kにおける電流電圧特性の2階微分を実測し、共鳴準位幅を評価した。共鳴準位幅は2次元核成長が44meVステップフロー成長が18meVとなり、ヘテロ界面の平坦化成長により、共鳴特性が改善された。以上のことから、有機金属気相成長法によりGaInAs/InPヘテロ界面の平坦化を実現し、平坦化が電子の共鳴特性改善に反映することを明らかにした。
アイコンタクト型対話ロボットの研究

対話における視線の役割を、対話を妨害しない形で調べるため、アイコンタクト型対話装置を開発、それを用いて対話を収録、視線の使われ方を分析した。また、人がどの程度の視線方向の検出を行っているのか、アイコンタクトの状態をどのようにして認識しているのかを調べるために、「にらめっこ実験」を行い、アイコンタクトの認識がこれまで考えられてきたような、物理的現象ではなく、心理的現象であることを明らかにした。アイコンタクトロボットの製作に関しては、ハードウェアとしては人の視線制御の速度に近い速度で動作可能なロボットヘッドが完成した.ロボットヘッドはシリアルポートを介してPCと接続されており、PC上の制御ソフトウェアを書き換えることで、様々な実験が可能である。研究は発達の研究への利用を小嶋が、また視線を用いた対話の実現を伊藤が行っている.前者については、本ロボツトを用いて、発達の現場での利用、人との共有注意の実現などの試みが始められている。後者については、視線検出の実時間処理の実現に時間を要し、現在やっと人の視線を自動追跡できるようになった段階である.現在、これを用いて人とロボットの対話実験を行っている段階であるが、予備的実験では視線を用いることでの人の振る舞いに興味深い結果が観測されている。本研究は、この3年で終了するのではなく、研究環境が整備された段階であり、対話への利用はこれからその結果を出していかねばならないし、またそれが可能であると考えている。なお、以上の研究と平行して、心を読むアルゴリズムの研究、心を持ったロボットのアーキテクチャなどの検討、シミュレーションなどを行ってきた。これらのモデル、結果は本実験の背景思想となるものであり、それらの成果も、本研究の中で得られた成果である。1.アイ・コンタクトの可能な遠隔対話装置を開発し,これを用いて自由な対話を収録した.収録データは,対話者の音声データ,それぞれ単独での顔映像,2画面ビデオを用いた顔映像である.これにより,対面対話と同じ状況で行われて対話者の正面映像が,対話と併せて収録される.現在,収録データから対話における視線の使われ方の分析を行っている.2.人が対面でどのくらいの精度で視線の向きを推定できるかの実験を行い,視線の向きで±4°程度のずれ(1mの距離で7cmに相当)を検出できるのは7,8割であること,上下のずれの検出はさらに困難なことがわかった.これは,対話者がアイ・コンタクトが成立しているかどうかを,純粋に視線方向だけからでは,正確に推定できないことを意味する.3.アイ・コンタクト型対話装置で取得した映像から,顔の向き,視線方向を実時間で抽出するシステムを開発した.処理時間の制約から主としてヒストグラム処理で対処しているが,顔の向きはそれなりの(±4°以下の誤差)性能であるが視線の向きは光線や人によりかなり困難な場合がある.現在,視線を含めて人並みの性能が得られるよう改良中である.4.広い視野の中から人の顔を探してその方向に視線を向けることのできるロボットを制作した.また,ソフトウェアとして肌色抽出とテンプレートマッチを組み合わせた,実時間の顔領域抽出プログラムを開発し,ロボットに実装した.現在,3で開発した視線方向検出プログラムとあわせることで,人とロボットでのアイ・コンタクトを実現し,アイ・コンタクトの対話における意味を認知科学的立場から調査する準備を進めている.1.アイ・コンタクト型対話ロボットの制作人とのアイ・コンタクトを目指したアイ・コンタクト型ロボットを制作した。ロボットは人の頭部とほぼ同一に作られており、首(上下、左右)、目(上下、左右、左右は両眼独立動作)口(上唇、下唇)の7自由度である。本体はPC(Linux)に接続されており、画像処理、ロボットのモータ制御を行う。視線方向で言えば、数百ミリ秒で目的物に視線を向けることができる。

目には、望遠、広角、2種類のカメラが搭載されており、人の高速ズームに代わる注視機能を実現している。2.顔方向、視線方向の抽出の実時間処アイ・コンタクト型対話ロボットを用いて以下のような機能の開発を行っている。1)ロボットに搭載のCCDカメラを用いて取得した広角画像から顔領域を抽出する。2)顔画像が正面にくるようにロボットの顔、視線方向を制御する。3)望遠画像から顔領域、目領域を切り出し、顔の傾き、黒目の位置から視線方向を推定する。4)人の注視対象の方向に自分の視線を戻し、人の注視対象物を同定することを目指す。現在、1-3までの開発が進んでおり、ほぼ実時間(百ミリ秒程度)で顔のトラッキング、視線方向の推定を行っている。これらの処理には複数のPCを用いた並列処理を行っている。3.人とロボットの対話実験開発中アイ・コンタクト型対話ロボットの用いて、人とロボットの対話実験を開始した。現在は音声認識機能は実現されていないので、人が応答を行う。出力は合成音声を用いる。実験の目的は、このような対話において人の視線の使い方、ロボットの視線制御に対する人の反応、などを実験状況を記録したビデオから解析することである。1)人の顔、視線方向を検出し、自己の視線を制御して対話する対話ロボットを開発した。本ロボットは、首の上下、回転、上下唇の開閉、眼球のパン、チルトが可能な頭部ロボットである。眼球部には広角、望遠2種のカメラを装備し、PCにより画像処理を行う。また、音声認識、音声合成用マイク、スピーカを備えている。2)広角レンズでで取り込まれた画像から、視野内の顔を抽出し、顔にロボットの視線を向けることができる。顔の追跡に要する時間は500msec程度であり、それほど早くない動きであれば実時間で追随できる。そのとき望遠カメラは顔を大きく捕らえており、やはり画像処理で、顔画像の中から相手の顔の向き、視線の向きを実時間で抽出できる。また、この情報を元に、相手の視線の動きに合わせて自己の視線を動かすことができる。3)本ロボットを用いて、人と対話を行う実験を行った。実験は、被験者にものの名前をロボットに教えさせるというものである。このとき、視線の制御の仕方を、視線固定、視線ランダム動作、および動物体への注視と、発話時の相手の顔への視線の移動、という三つのモードで実験を行い、人の反応の変化を調べた。まだ定量的な分析にはいたっていないが、個々の実験の結果は人がロボットの視線の動きに敏感に反応していることを示している。1)ー3)の結果は、情報処理学会第65回全国大会で発表した。4)人が視線をどのようにして感じるかを調べた「にらめつこ実験」の結果を取りまとめた。重な発見は、人が視線を「感じる」のには、心理的要因が大きく影響するということである。この結果は、Roman2002国際会議で発表した。
思春期広汎性発達障害児者の性行動の理解と支援体制の構築

広汎性発達障害(以下、PDD)が思春期をどのように体験しているのか、本人たちの経験世界を基盤に性意識の芽生えや二次性徴による自己変容の受止め方をまとめた。出発点においては精神病理学的手法も用いた。また年代による意識変化を明らかにした。PDDの性行動の実態を調査し、その結果から性行動を査定するアセスメントツールを作成した。また、保護者への調査などから年齢(学年)や性別に応じた社会的に要求される性行動と、PDDらの性行動のズレを明らかした。PDDの障害特性に特化した性に関する支援プログラム(当事者向けのワークブック、家族・支援者向けのマニュアルを作成)の開発を行い、実践後その効果測定を行った。最終的に、PDDの支援者を対象とした様々な研修会を通して、研究成果を社会に還元した。本科学研究費が採択されたのを受け、大学院生の協力のもとに、2009年4月17日(金)、4月19日(日)、6月7日(日)、6月26日(金)、6月30日(火)、7月6日(月)7月7日(火)、7月13日(月)、7月15日(水)、8月28日(金)、8月31日(月)、9月25日(金)、10月10日(土)、10月18日(日)、10月30日(金)、2010年1月20日(水)に、愛知県内の広汎性発達障害小中学校や医療少年院、知的障害者の入所施設などの男子向けの性教育をおこなってきた。また、彼らをサポートする教員や支援者(両親など)にも指導を行い、現場の声を聞き取ってきた。こうしたフィールドワークのなかで、彼らがどのような性的に問題となる傾向(具体的には、相手の気持ちを理解せずに好きな異性に近づいてしまう、など)を持っているのかを分析した。さらに、研究分担者で定期的に集まって、研究分担者の経験した広汎性発達障害のケースと併せて、精神医学的、精神病理的、精神分析的観点などから議論やケース検討を重ねた。また海外から性知識や性行動の質問紙(Sexual Knowledge, Experience and Needs Scale SEX KEN 1994-Fourth Edition Marita P.McCabe)を使用許可を得た上で取り寄せ、研究分担者で分担して翻訳して、その翻訳とフィールドワークの知見を総合して我々の独自の質問紙を作成しはじめたところである。平成22年度は、広汎性発達障害の子どもを対象とする独自の性教育のプログラムを開発し、完成した質問紙を対象者に行い、効果を測定する予定である。昨年度に引き続き、以下の目的で「広汎性発達障害児の性行動の調査と、性教育プログラムの開発」を行った。1) PDDが思春期をどのように体験しているのか、本人たちの経験世界を基盤に性意識め芽生えや二次性徴による自己変容の受止め方をまとめる。また年代による意識変化を明らかにする。2) PDDの性行動の実態を調査し、その結果から性行動を査定するアセスメントツールを作成する。3)保護者への調査などから年齢(学年)や性別に応じた社会的に要求される性行動と、PDDらの性行動のズレを明らかする。4) PDDの障害特性に特化した性に関する支援プログラム(当事者向けのワークブック、家族・支援者向けのマニュアルを作成)の開発を行い、実践後その効果測定を行う。平成22年度に具体的に行った研究内容は以下の通りである。・思春期PDD(広汎性発達障害)に性意識のインタビューを行い、その内容を年代による変化の分析を継続した。・思春期PDDの性行動の実態調査(アンケート、インタビュー)を継続した。・PDDの家族や支援者に調査(アンケート、インタビュー)を行い、PDDらの外部から見た性行動の実態調査を引き続きおこなった(「岐阜発達障害者支援センターのぞみ」「なごや職業開拓校」「宮川医療少年院」「日間賀島」など)。・PDDの臨床的実態について平成22年7月にポルトガルの国際精神分析学会で発表を行い、この学会では、父親が発達障害であるために、幼児期からのトラウマの蓄積がスキゾイドパーソナリティーをもたらしたケースを検討した。・実態調査をもとに、PDDらが自己変容に伴い適切な社会行動がとれているかを評価するアセスメントツールの開発を引き続きおこなった。・性に関する周囲が求める適切な行動の習得(社会適応)のために、PDDらに見合った手法での「性に関する支援プログラム」の開発をおこない、その効果測定を引き続きおこなった。

1)PDDが思春期をどのように体験しているのか、本人たちの経験世界を基盤に性意職の芽生えや二次性徴による自己変容の受止め方をまとめる。また年代による意識変化を明らかにする。2)PDDの性行動の実態を調査し、その結果から性行動を査定するアセスメントツールを作成する。3)保護者への調査などから年齢(学年)や性別に応じた社会的に要求される性行動と、PDDらの性行動のズレを明らかする。4)PDDの障害特性に特化した性に関する支援プログラム(当事者向けのワークブック、家族・支援者向けのマニュアルを作成)の開発を行い、実践後その効果測定を行う。平成23年度は3)4)を主に行った。具体的に行った研究内容は以下の通りである。自閉症スペクトラム障害を持つ思春期のこどもたちに対し、性に関する内容の指導を含めた社会での適切なふるまい方を指導した。また保護者や支援者に対しても、子どもたちをどう支援したらよいかを説明した。一連の調査研究をもとに最終的な目的である支援プログラムの開発を行い、以下のように研究成果を社会に還元した。講演・研修会等(旅費については予算の都合上私費によるものがある)5/22大阪LD親の会おたふく会子ども向けセミナー7/1愛知教育大学附属養護学校保護者向け研修会7/27、8/3岐阜県発達障害者支援センターのぞみ「かっこいい男性になるためのプログラム」7/28、8/10下呂市「かっこいい男性になるためのプログラム」8/168/20日間賀島同上10/1ゆいネット発達障害研修会10/18生蘭高等専修学校教員向け研修会11/30東海中央病院子育て・教育相談センター支援者・保護者向け研修会12/7なごや職業開拓校利用者向け講話「かっこいい男性/女性になるために」2/5お口とコミュニケーション研究会発達障害研修
滑らかな曲面を有する物体による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証

本研究では、研究課題『滑らかな曲面を有する物体による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証』を、(1)誘電体で覆われた導体円柱による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、及び(2)開放円筒導体曲面による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、の2つの研究細目に分けて研究を進めた。研究細目(1)および(2)において提案を行う周波数領域(frequency-domain: FD)及び時間領域(time-domain: TD)における散乱電磁界に対する新たな近似解は、(ア)厳密解(あるいは参照解)及び実験結果と良く一致すること、及び(イ)散乱現象を物理的に解釈する上で有効であること、の2点を明らかにすることを研究目的とした。各研究細目の研究目標を達成するため、下記の(a)(e)の5段階に分けて研究を遂行するよう計画した。(a)FD及びTDの厳密解(参照解)の導出とプログラムの作成、(b)FD及びTDの各近似解の導出、(c)近似解の有効性・解釈法の検討、(d)電波暗室における測定実験、及び(e)近似解と厳密解(参照解)と実験結果の比較。最終年度(平成30年度)では、上記の(b)と(c)について実施した。研究細目(1)では、周波数領域および時間領域における新たな近似解を導出し、近似解は厳密解(あるいは参照解)と良く一致すること、及び近似解は誘電体で覆われた導体円柱による散乱現象を詳細に解明する上で有効であることを明らかにした。研究細目(2)では、周波数領域および時間領域における新たな近似解を導出し、近似解は厳密解(あるいは参照解)及び実験結果と良く一致すること、及び近似解は開放円筒導体曲面による散乱現象を詳細に解明する上で有効であることを明らかにした。本研究では、研究課題『滑らかな曲面を有する物体による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証』を(1)誘電体で覆われた導体円柱による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、及び(2)開放円筒導体曲面による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、の2つの研究細目に分けて研究を進めた。研究細目(1)および(2)において提案を行う周波数領域(frequency-domain: FD)及び時間領域(time-domain: TD)における散乱電磁界に対する新たな近似解は、(ア)厳密解(あるいは参照解)及び実験結果と良く一致すること、及び(イ)散乱現象を物理的に解釈する上で有効であること、の2点を明らかにすることを目的として研究を行った。当該年度計画では、(a)研究細目(1)及び(2)の厳密解(あるいは参照解)のプログラムの作成、(b)研究細目(1)及び(2)の周波数領域(frequency domain: FD)および(time domain: TD)の近似解析を行い一部の近似解の導出、(c)(b)で導出した近似解の有効性及びその解釈法、(d)電波暗室における測定実験の準備を行った。研究成果は、1電磁界理論研究会で4件(千代田区、釧路市、宮崎市、神戸市)、2電子情報通信学会総合大会で1件(福岡市)、3URSI-JRSM 2015で1件(Tokyo)、4ICEAA 2015で2件(Torino)の発表を行い、研究の有効性について確認を行った。また、新規性・独創性の高い研究内容について、5電子情報通信学会(IEICE)のTransactionおよび6IEICEのElectronics Expressで、それぞれ1件の論文発表を行った。本研究成果は、(ア)および(イ)において述べた「研究目的」の達成に直接関係する重要な研究成果であると考えている。本研究では、研究課題『滑らかな曲面を有する物体による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証』を、(1)誘電体で覆われた導体円柱による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、及び(2)開放円筒導体曲面による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、の2つの研究細目に分けて研究を進めている。研究細目(1)および(2)において提案を行う周波数領域(frequency-domain: FD)及び時間領域(time-domain: TD)における散乱電磁界に対する新たな近似解は、(ア)厳密解(あるいは参照解)及び実験結果と良く一致すること、及び(イ)散乱現象を物理的に解釈する上で有効であること、の2点を明らかにすることを研究目的としている。各研究細目の研究目標を達成するため、下記の(a)(e)の5段階に分けて研究を遂行するよう計画している。平成27年度(初年度)では(a)を達成し、(b)(e)の一部について実施した。現在までの「研究目的」の達成度は、40%程度であると考えている。研究細目

(1)および(2)において提案を行う周波数領域(frequency-domain: FD)及び時間領域(time-domain: TD)における散乱電磁界に対する新たな近似解は、(ア)厳密解(あるいは参照解)及び実験結果と良く一致すること、及び(イ)散乱現象を物理的に解釈する上で有効であること、の2点を明らかにすることを目的として研究を行った。当該年度計画では、(a)研究細目(1)及び(2)の時間領域(TD)の近似解析を行い一部の近似解の導出、(b)(a)で導出した近似解の有効性及びその解釈法、(c)電波暗室における測定実験の準備を行った。研究成果は、1電磁界理論研究会で3件(千代田区、網走市、和歌山県西牟婁郡)、2電子情報通信学会総合大会で1件(名古屋市)、32016 IEEE AP-Sで1件(Puerto Rico)、42016 URSI AP-RASCで1件(Seoul)、5ICEAA 2016で2件(Cairns)、6ICCEM 2017で2件(Kumamoto)の発表を行い、研究の有効性について確認を行った。また、新規性・独創性の高い研究内容については、7電子情報通信学会(IEICE)のElectronics Expressで1件の論文発表を行った。本研究成果は、(ア)および(イ)において述べた「研究目的」の達成に直接関係する重要な研究成果であると考えている。本研究では、研究課題『滑らかな曲面を有する物体による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証』を、(1)誘電体で覆われた導体円柱による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、及び(2)開放円筒導体曲面による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、の2つの研究細目に分けて研究を進めている。研究細目(1)および(2)において提案を行う周波数領域(frequency-domain: FD)及び時間領域(time-domain: TD)における散乱電磁界に対する新たな近似解は、(ア)厳密解(あるいは参照解)及び実験結果と良く一致すること、及び(イ)散乱現象を物理的に解釈する上で有効であること、の2点を明らかにすることを研究目的としている。各研究細目の研究目標を達成するため、下記の(a)(e)の5段階に分けて研究を遂行するよう計画している。(a)FD及びTDの厳密解(参照解)の導出とプログラムの作成、(b)FD及びTDの各近似解の導出、(c)近似解の有効性・解釈法の検討、(d)電波暗室における測定実験、及び(e)近似解と厳密解(参照解)と実験結果の比較。平成28年度までの2か年間に(a)を達成し、(b)(e)の一部について実施した。現在までの「研究目的」の達成度は、60%程度であると考えている。本研究では、研究課題『滑らかな曲面を有する物体による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証』を(1)誘電体で覆われた導体円柱による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、及び(2)開放円筒導体曲面による散乱電磁界の新たな近似解と実験による検証、の2つの研究細目に分けて研究を進めている。研究細目(1)および(2)において提案を行う周波数領域(frequency-domain: FD)及び時間領域(time-domain: TD)における散乱電磁界に対する新たな近似解は、(ア)厳密解(あるいは参照解)及び実験結果と良く一致すること、及び(イ)散乱現象を物理的に解釈する上で有効であること、の2点を明らかにすることを目的として研究を行っている。当該年度計画では、(a)研究細目(1)の時間領域(TD)の近似解析を行い一部の近似解の導出、(b)(a)で導出した近似解の有効性及びその解釈法を行った。
反応性アフィニティータグを用いた蛋白質標識・精製・検出法の開発

本研究では生物活性化合物の標的蛋白質とその結合部位同定を目指して、標識官能基・アフィニティー精製タグ・検出官能基の3つの機能を併せ持つ「反応性アフィニティータグ」の開発を目指した。その結果、βーケトアミドおよびO-ニトロベンゾキサジアゾール(NBD)ユニットに関して、新たに1つの機能を付与させることに成功した。最終的に反応性アフィニティータグを開発し、生物活性化合物の結合蛋白質の蛍光標識化および標識化されたペプチド断片を精製・同定することを達成した。ケミカルバイオロジー分野において、生物活性化合物の結合タンパク質の同定、さらにその結合部位の同定は、その作用機序解明のためには非常に重要な情報を与える。そのためには、生物活性化合物の活性を損なうことなく導入可能なタグが必要である。本研究では蛋白質標識官能基・アフィニティー精製タグ・検出官能基の3つの機能を一つのタグで併せ持つ「反応性アフィニティータグ」を開発することで、本命題の解決を目指す。これまでの研究で3つの特性のうち2つの特性を併せ持つ官能基の開発に成功している。そこで本年度はこの官能基に3つ目の機能を付加すること、さらにこれに加えて新しいタグとなる官能基を見出すことを目指し、研究を展開した。本年度はこれまでに開発した官能基の中で標識官能基と検出官能基の機能を併せ持つ蛍光標識化タグに関して、その蛍光標識化体をペプチドに導入したものを調製し、これをモデルペプチドとしてその精製法を検討した。その結果いまだ効率は低いものの、モデルペプチドを精製する条件を見出すことに成功した。さらに、特定の金属錯体に対して錯体形成能を持つ官能基に着目し、アフィニティー精製のタグとすると同時にその反応性を利用して種々の標識官能基と反応させることを検討した。その結果、固相担持された金属錯体を用いることで、タグを有するモデルペプチドの精製に成功した。さらに蛍光団を有する標識性官能基と反応させることにも成功し、アフィニティー精製に加えて蛍光標識化も可能であることを示した。ケミカルバイオロジー分野において、生物活性化合物の結合タンパク質の同定、さらにその結合部位の同定は、その作用機序解明のために重要な情報を与える。そのため、生物活性化合物の活性を損なうことなく導入可能なタグが必要である。昨年度は標識官能基と検出官能基の機能を併せ持つ蛍光標識化タグに関して、その精製システムの検討を行い、モデルペプチドでの検討ではあるが蛍光標識化されたペプチドを精製することに成功している。そこで本年度は本システムを結合部位が未知の生物活性化合物へと適用し、その結合部位同定を試みた。その結果、更なる検証が必要ではあるが、結合部位候補の同定に成功した。さらに、昨年度見出すことができた特定の金属錯体に対して錯体形成能を持つ官能基に関して、既知の酵素阻害剤へと組み込んだプローブを設計・合成し、その標的となる酵素に反応させた後に、その結合部位ペプチドをアフィニティー精製できるかどうかを検討した。その結果、固相担持された金属錯体を用いることで、結合部位ペプチドの効率的な精製に成功し、その結合部位が酵素の触媒中心に相当することを検証することができた。この結果は、本官能基が新しいアフィニティー精製タグとして使用可能であることを示唆している。本年度はモデルペプチドを用いた実験系と同時に実際の結合タンパク質を使用し、これまでに開発してきたタグが実際に結合部位同定に使えるかどうかを検討した。その結果、蛍光標識化タグに関しては未知の結合部位の同定に成功し、金属錯体を利用したアフィニティー精製法でも予想される結合部位が確かに精製されることがわかった。以上の結果は、昨年度までペプチドを中心にして検討してきたものがタンパク質へと適用可能であることを示唆しており、最終年度に向けて計画通りに進んでいると考えられる。昨年度の検討で標識官能基と検出官能基の機能を併せ持つ蛍光標識化タグに対して、蛍光標識されたペプチドを精製するシステムを構築することに成功した。そこで本年度は本手法をより複雑な系で適用することを目指し、さらなる精製条件の最適化を試みた。その結果、複雑なタンパク質混合物中で生物活性化合物の結合タンパク質を蛍光標識化し、さらにそのサンプル中から蛍光標識部位を同定することに成功した。さらに、昨年度見出した金属錯体に対して錯体形成能を持つ官能基に関しては、酵素阻害剤へと組み込んだプローブを用い、複雑なタンパク質混合物中で酵素の標識化とその結合部位ペプチドをアフィニティー精製できるかどうかを検討した。まず細胞抽出液を調製し、これに精製酵素を加えて化合物による酵素のラベリング、結合部位ペプチドの同定を試みた。その結果、非特異的に結合するペプチドが多くいまだ検討の余地はあるものの、精製されたペプチドの中から、酵素の触媒中心に阻害剤が結合したペプチドを同定することに成功した。

本研究では生物活性化合物の標的蛋白質とその結合部位同定を目指して、標識官能基・アフィニティー精製タグ・検出官能基の3つの機能を併せ持つ「反応性アフィニティータグ」の開発を目指した。その結果、βーケトアミドおよびO-ニトロベンゾキサジアゾール(NBD)ユニットに関して、新たに1つの機能を付与させることに成功した。最終的に反応性アフィニティータグを開発し、生物活性化合物の結合蛋白質の蛍光標識化および標識化されたペプチド断片を精製・同定することを達成した。本年度はモデルペプチドを用いた実験系を中心に検討し、目的とする3つの機能のうち2つに関しては達成することができた。蛍光標識化タグに関しては3つ目の機能を付加することまで成功したことから、本研究のコンセプト実証の第一歩を踏み出すことができたと考えられる。また今後タンパク質へと展開するにあたって、本年度のペプチドでの検討は様々な知見を与えており、来年度に向けて全体として計画通りに進んだと考えているこれまでの検討結果をもとに、最終目的として細胞から生物活性化合物の結合タンパク質の同定、結合部位の同定まで挑戦する。その際には、まずは数種の精製タンパク質を混合したものに対して条件検討を行い、様々な問題点を洗い出した上で、実際の細胞の系へと進める。また生細胞に対して結合タンパク質の同定を進める場合にも、状況に応じて細胞抽出物を使うなどして、実験系の複雑さをコントロールしながら条件検討を進める。化学反応を利用した生物活性化合物の結合分子同定法の開発蛍光標識化タグ、金属錯体を利用したタグ、いずれの場合もその精製効率が不十分であった。そこで次年度では精製効率を高めるべく、精製に用いる担体や精製条件のチューニングを中心にして検討を行う。その上で、蛍光標識化タグはタンパク質を用いた実験系へ進めることを目指す。また、金属錯体を利用したタグに関しては、続く蛍光標識化の反応効率向上を検討する。モデルタンパク質に研究室がすでに保有する精製タンパク質が使用できることがわかり、その購入費用を節約することができたため。モデルとなるペプチドに導入するユニットを既に研究室が保有する試薬を利用して合成することが可能であったため、新たな試薬の購入を抑えることができた。次年度は細胞からの結合タンパク質の同定を進めるために非常に高価な担体の購入ないしは受託による合成が必要となる。次年度使用額を合算使用することで、この費用に充てたい。次年度は精製条件の検討を中心に行う予定であり、そのためには非常に高価な担体の購入ないしは受託による合成が必要となる。
潜在的ウイルス糖尿病を背景とした非アルコール性脂肪肝炎の病態の解析

1型糖尿病は様々な発症機序が想定されており、Tyrosine Kinase2(TYK2)遺伝子プロモーター多型とウイルス感染による1型糖尿病発症との関連を我々は報告してきた。さらに非肥満の2型糖尿病においてもTYK2PV変異型が高率であることを見出した。TYK2PV変異型の2型糖尿病では野生型の2型糖尿病と比較し、膵β細胞の障害に伴うインスリン分泌能が早期に低下すると想定される。本研究は主にin vivoモデルの開発と臨床研究部分に分かれるが、本年度は主に臨床研究を中心に遂行した。インスリン製剤を使用していない2型糖尿病患者80名を対象にTYK2PVとインスリン分泌能及び非アルコール性脂肪性肝炎(NAFLD)病態との関連性を検討した。血液検体から患者DNAを採取し、TYK2PVをダイレクトシーケンス法で解析した。TYK2PV野生型と変異型で、空腹時インスリンやHOMA-β等のインスリン分泌能を含む臨床背景を比較検討した。またNAFLDの肝硬度やFIB4インデックスとの関連を検討した。2型糖尿病患者80名のうち6名(7.5%)がTYK2PV変異型を有していた。野生型(74名)と変異型(6名)では年齢、罹病期間で有意差を認めなかった。TYK2PV変異型はBMIが低く、HbA1cは高い傾向を示した。またインスリン分泌能について、IRIおよびHOMA-βは野生型と比較して変異型でそれぞれ低値であった。またNAFLDにおけるFIB4インデックスとHOMA-βは負の相関を呈し、TYK2変異型はFIB4インデックスが高い傾向を認めた。以上の結果から非肥満2型糖尿病の病態にTYK2PV変異が関連している可能性が示唆された。変異型ではインスリン分泌能が低い傾向にあり、早期からのβ細胞保護やインスリン療法の導入タイミングなど通常の2型糖尿病とは異なる治療戦略が求められる可能性がある。更に同病型はNAFLDの肝線維化進展に関与している可能性が示唆された。今後多施設共同研究で、より多数例での検討を予定している。研究計画は当初の計画通り順調に進行している。TYK2 KOマウスを用いてin vivoモデルの作成を開始する。マウス繁殖に要する時間を考慮し十分に余裕を持ったタイムフレームでの実験計画とする。我々は非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の疫学的研究で、肝線維化進展とインスリン分泌不全が相関し、インスリン分泌不全を来している症例は過去、現在において肥満傾向が乏しいことを突き止めた。一方でインターフェロンシグナル分子であるTyrosine kinase 2 (Tyk2)遺伝子の変異がウイルス誘発糖尿病の原因であり、更に一型糖尿病や非肥満2型糖尿病においてTYK2遺伝子多型が関連していることを報告した。これらの知見から非肥満におけるインスリン分泌不全とTYK2遺伝子多型の関与が予想され、今回、非アルコール性脂肪性肝疾患および脂肪肝炎(NAFLD、NASH)の発症および線維化進展様式に与える膵β細胞のインスリン分泌能とTyrosine kinase 2 (Tyk2)遺伝子の自然変異の影響を明らかにする事を目的として研究を開始した。2型糖尿病患者におけるNAFLD患者、また非糖尿病のNAFLD患者を対象にTYK2 promotor variantの検索を約70例で行った。TYK2 promotor variantを伴う症例においてインスリン分泌能の低下や肝線維化の進展などの傾向を認め、今後更に症例を蓄積していく。また糖尿病患者でNAFLDを有する症例と有さない症例を比較したところTYK2 promotor variantの頻度はNAFLD症例で多い傾向があった。これらの結果からTYK2 promotor variantはインスリン分泌の低下を介してNAFLDの成因や病態進展に影響を及ぼしていると考えられた。またTYK2 KOマウスは九州大学から分与を受け、現在繁殖を行っている。2018年度前半にこのマウスを用いたNASHモデルの作成を開始する。具体的には同KOマウスに対して高脂肪食負荷およびコリン欠乏食負荷を行い、野生型と比較してNASH病態の進展を検討する。研究計画に沿って概ね順調に遂行できている。今後はKOマウスを用いた実験が開始されるため遅れに注意し計画を遂行する。

TYK2PV変異型はBMIが低く、HbA1cは高い傾向を示した。またインスリン分泌能について、IRIおよびHOMA-βは野生型と比較して変異型でそれぞれ低値であった。またNAFLDにおけるFIB4インデックスとHOMA-βは負の相関を呈し、TYK2変異型はFIB4インデックスが高い傾向を認めた。以上の結果から非肥満2型糖尿病の病態にTYK2PV変異が関連している可能性が示唆された。変異型ではインスリン分泌能が低い傾向にあり、早期からのβ細胞保護やインスリン療法の導入タイミングなど通常の2型糖尿病とは異なる治療戦略が求められる可能性がある。更に同病型はNAFLDの肝線維化進展に関与している可能性が示唆された。今後多施設共同研究で、より多数例での検討を予定している。研究計画は当初の計画通り順調に進行している。実験計画に余裕をもって、マウスの繁殖を行い、特に食事負荷モデルに関しては早めの条件検討を行い期間内での計画遂行に努める。TYK2 KOマウスを用いてin vivoモデルの作成を開始する。マウス繁殖に要する時間を考慮し十分に余裕を持ったタイムフレームでの実験計画とする。
神経病理学的診断を行っていると、通常の組織標本、つまり2次元平面に薄切した標本の観察では、脳病変を正しく評価できないのではないか、と思うことがある。脳は、つくりが複雑で機能単位がことさら立体的だからである。本研究では、ヒト脳組織透明化・3Dイメージング技術を用いて、ヒト脳における神経細胞やグリア細胞の配列やネットワーク、更には微小血管の分布を3次元で鮮明に捉え、`立体的機能ユニット'における正常と異常を明らかにする。つまり定量的なデジタル3D神経病理学を創成し、ブレインサイエンスにおける形態学的イノベーションを開拓する。
従来の病理学的手法で検索不能であった微小リンパ節転移に関する食道癌での検討

食道癌手術55例について,主病巣およびリンパ節からのDNAの抽出を行った.リンパ節に関してはこのうち21例でDNA抽出ができた.まず主病巣に関して,p53の遺伝子異常を検討した.p53のエクソン5,6,7,8に関してPCR-SSCP法で検討し,25例で異常が認められた.これらの症例で,PCR産物のdirect sequencingを試みたが,この手法では塩基配列の決定ができなかった.そのためPCR産物をゲルから切り出し,ベクターに組み込んでサブクローニングを行い,塩基配列を決定した.15症例でp53の塩基配列の異常を確認した.そのうち1例で食道の多発癌症例があり,同一症例の2病巣でp53の異なる変異を検出できた.その症例のリンパ節転移巣のp53の変異のタイプから,一方の主病巣からの転移であることが判明し,興味深い知見が得られた.p16遺伝子については27例で検索し,そのうち14例で突然変異を確認した.8例がフレイムシフトであり6例がミスセンス変異であった.MASA法による検討では,p53およびp16の突然変異の部分の塩基配列を3'の末端に置きプライマーを作製し,PCRを行った.PCR条件により非特異的バンドが出現し判定が困難であった.食道癌手術55例について,主病巣およびリンパ節からのDNAの抽出を行った.リンパ節に関してはこのうち21例でDNA抽出ができた.まず主病巣に関して,p53の遺伝子異常を検討した.p53のエクソン5,6,7,8に関してPCR-SSCP法で検討し,25例で異常が認められた.これらの症例で,PCR産物のdirect sequencingを試みたが,この手法では塩基配列の決定ができなかった.そのためPCR産物をゲルから切り出し,ベクターに組み込んでサブクローニングを行い,塩基配列を決定した.15症例でp53の塩基配列の異常を確認した.そのうち1例で食道の多発癌症例があり,同一症例の2病巣でp53の異なる変異を検出できた.その症例のリンパ節転移巣のp53の変異のタイプから,一方の主病巣からの転移であることが判明し,興味深い知見が得られた.p16遺伝子については27例で検索し,そのうち14例で突然変異を確認した.8例がフレイムシフトであり6例がミスセンス変異であった.MASA法による検討では,p53およびp16の突然変異の部分の塩基配列を3'の末端に置きプライマーを作製し,PCRを行った.PCR条件により非特異的バンドが出現し判定が困難であった.本研究では、食道癌の臨床例で、原発巣とリンパ節からDNAを精製し、まず原発巣に関して癌抑制遺伝子p53およびp16の遺伝子異常を解析し、ついでmutant allele-specific amplication (MASA)法によってリンパ節での微量な遺伝子異常を解析することにより、微小リンパ節転移を検出することを目的とする。現在まで食道手術例32例に関して、主病巣およびリンパ節からのDNAの抽出をおこなった。リンパ節に関してはこのうち4例のみでしか採取できなかった。まず主病巣に関して、p53の遺伝子異常を検討した。p53のエクソン5、6、7、8に関してPCR-SSCP法で検討し、現在まで8例で異常が認められた。これらの症例で、PCR産物のdirect sequencingを試みたが、きれいにバンドを出すことが困難であった。そのためPCR産物をゲルから切り出し、ベクターに組み込んでサブクローニングを行い、塩基配列を決定した。現在2例に関して、p53の遺伝子異常を確認したところである。1例目では1個所、2例目では2個所の遺伝子変異が確認された。p16に関してはエクソン2の異常を検討すべく、種々のプライマーを設計し、PCRの条件を検討するのを開始したところである。MASA法による検討に関しては、ようやく原発巣での異常が確認できたので、これから着手することになるという段階である。まずp53の突然変異の部分の塩基配列を3'の末端に置くようにしてプライマーを作製し、PCRの条件の検討をはじめたところである。今後はp53の検討を全ての症例に関して行い、MASA法による微小リンパ節転移に関する検討を進めていく予定である。またp16に関しても検討を行い、食道癌における微小リンパ節転移の有無、臨床的意義について研究を進めたいと思っている。本研究では,食道癌の臨床例で,原発巣とリンパ節からDNAを精製し,まず原発巣に関して癌抑制遺伝子p53およびp16の遺伝子異常を解析し,ついでmutantallele-specific amplification (MASA)法によってリンパ節での微量な遺伝子異常を解析することにより,微小リンパ節転移を検出することを目的とする.現在までに食道癌手術例55例について,主病巣およびリンパ節からのDNAの抽出を行った.リンパ節に関してはこのうち21例でDNA抽出ができた.まず主病巣に関して,p53の遺伝子異常を検討した.p53のエクソン5, 6, 7, 8に関してPCR-SSCP法で検討し,現在までに25例で異常が認められた.これらの症例で,PCR産物のdirect sequencingを試みたが,この手法では塩基配列の決定ができなかった.そのためPCR産物をゲルから切り出し,ベクターに組み込んでサブクローニングを行い,塩基配列を決定した.15症例でp53の塩基配列の異常を確認した.そのうち1例で食道の多発癌症例があり,同一症例の2病巣でp53の異なる変異を検出できた.その症例のリンパ節転移巣のp

53の変異のタイプから,一方の主病巣からの転移であることが判明し,興味深い知見が得られた.p16遺伝子については27例で検索し,そのうち14例で突然変異を確認した.8例がフレイムシフトであり6例がミスセンス変異であった.MASA法による検討では,p53およびp16の突然変異の部分の塩基配列を3'の末端に置きプライマーを作製し,PCRを行った.PCR条件により非特異的バンドが出現し判定が困難であった.この点については,今後もう少し検討が必要である.p53, p16の遺伝子異常と臨床病理学的因子との間には,特に相関するものはなかった.また,臨床的予後とも特に相関を認めなかった.
中心体過剰複製と染色体倍数性異常の発がんにおける役割の研究

私達は、サイクリンEやp27^<Kip1>のユビキチン依存性をつかさどるユビキチンリガーゼのコンポーネントSkp2をクローニングし、そのノックアウトマウス作製した。Skp2ノックアウトマウスにおいてはユビキチン化の障害の結果1)サイクリンEとp27^<Kip1>の異常な蓄積、2)染色体多倍体化や中心体過剰複製などの異常が観察されたが、個体としての発癌は認められなかった。さらに次の段階として、Skp2ノックアウトマウスを以前に作製したp27^<Kip1>ノックアウトマウスと交配することによってSkp2/p27ダブルノックアウトマウスを作製し、過剰なサイクリンEの蓄積とp27^<Kip1>の消失という癌細胞にしばしば認められる生化学的な異常を再現したが、この個体もやはり発癌は認めなかった。驚いたことに、このSkp2/p27ダブルノックアウトマウスでは、染色体多倍数体化や中心体過剰複製などSkp2ノックアウトマウスでみられた表現型は消失した。このようにSkp2ノックアウトマウスとSkp2/p27ダブルノックアウトマウスは、細胞周期関連蛋白の生化学的特徴は非常に癌細胞と類似しているものの、個体レベルでの発癌はみられず、癌誘発のためにはさらなる異常が必要であることが判明した。また、Skp2ノックアウトマウスより調製されたリンパ球細胞及び胎仔線維芽細胞では、細胞周期のG0期からG1期ではp27は野生型細胞と同様に分解されることが判明した。これによって、p27^<Kip1>タンパク質の量的な調節はSkp2だけではなく、他の因子によっても調節されていることが判明した。