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球状ビーズの血管内動態と最適化に関する検討：血管塞栓術のパラダイムシフトに向けて

球状ビーズの血管内流動挙動の把握が可能な直径1mm未満の血管塞栓用ファントムはない.本年度は科研費申請時の計画に沿って,ビーズの流動挙動解析用ファントムの作成を行った.1本のテーパー状の模擬血管をもつ単純型模擬血管モデルと2分岐をもつ分岐型模擬血管モデルの2種類のファントムをバイオメディカル社と共同開発を行った.材質はアクリル材で作成し,入口部と出口部を設け,出口に近づくと内径0.5mmになるように設計した.これにより,流体中を流れる直径φ1mm程度の球状ビーズの塞栓挙動の実験が可能となる.流速可変型模擬血流システムは,オーバーフロータンクの高さを変更することにより,ファントム中を流れる流速の変更が任意に可能となるようシステムを構築した.システムはオーバーフロータンク,顕微鏡,対物レンズ,高速CCDカメラ(高感度高速ビデオカメラもしくはUSB式CCDカメラ,低倍率レンズ,模擬血管ファントムからなる.フロータンクの高さと模擬ファントム手前での流量との関係は良好な直線関係となった.構築したシステムを用いて,球状ビーズの塞栓実験のパイロットスタディを行った.使用した球状ビーズはTG-MS(Embosphere)900-1200μm, APVA-MS(BeadBlock)900-1200μm, PP-PMMA-MS(Embozene)900μmの3種類を用いた.いずれも,ファントム内で程度は異なるものの,その形状を変形させ,出口方向へ進んでいくのが観察された.又,顕微鏡下の観察では,球状ビーズの種類により形状の描出が乏しいものもあった.さらには,推定したよりも初期到達点から最終到達点にいたるまでの制動距離が長く,初期到達点と最終到達点の両方を同時に同じ画面上に記録することは困難と考えられた.この点については次年度にシステムの再構築により解決を試みるものとする.従って、球状ビーズの血管内挙動を病理学的に良好な状態で観察するためには、中枢側の血管内でビーズが凝集することなく、個々のビーズが十分血管末梢レベルに到達する必要がある。実際にはビーズの粒子径、浮遊液の希釈倍率、及び浮遊液の注入速度などによりビーズの血管内の末梢到達性は影響を受けるため、これらの注入条件設定に試行錯誤を要している。球状塞栓物質のサイズはφ1mm以下である.そのため,実験システムを構築するのにも時間がかかる.球状塞栓物質を使用した流動実験となると,球状塞栓物質のサイズが小さいため,球状塞栓物質の取扱が難しく,時間がかかるのが現状である.予備実験で調整したビーズの注入条件に基づいて、イヌ腎動脈モデルにおいて規定量の各種ビーズを注入後に動脈を結紮、腎臓を摘出し、病理学的に各時相における各ビーズの塞栓深度と粒子径・変形の程度を観測する。ビーズ周囲に惹起される血管壁及び周囲組織の反応についても病理学的に評価し、材質・表面積などとの関連を検証する。また、各ビーズについて、腎動脈区域枝レベルを異なるエンドポイントで塞栓を行い、十分な梗塞率を示す最小限のエンドポイントを至適エンドポイントとして探索する。一方、そのような至適エンドポイントにより肝動脈を塞栓した際に、胆管壊死や肝梗塞などの肝障害を惹起しないか、肝のビーズ塞栓術に対する忍容性を検証する。現在の血管ファントム実験の問題点を洗い出し,手順等についても再検討を行う。その上で,適切なファントム実験システムの再構築を行う予定である.再構築ができた後に,球状塞栓物質の塞栓挙動の流動実験を行う.具体的には球状ビーズの血管内挙動の動態解析として、一定血流下にファントム内にビーズを注入し、顕微鏡下・CCDカメラ下で動態記録を行い、ビーズの経時的な塞栓深度の変化から時間塞栓深度曲線を作成し、注入開始から初期到達点及び最終到達点に至る時間を推定する。次年度は、動物実験に移行していく予定で,現在実験開始に向けて,システム環境整備及びプロトコールについて検討を行っている.
再発癌症例に対するポルフィマーナトリウムを用いた超音波力学的治療法の臨床応用

ポルフィリン類はレーザー光を用いた光線力学的治療法(PDT)として癌治療の研究と臨床に利用されている。その理論は、癌組織中に活性酸素を生成させ壊死させるものである。この活性酸素の生成は、超音波にても惹起される。レーザー光は組織内到達距離が浅いが、超音波は組織深部まで到達することより、超音波を用いた治療法(超音波力学的治療法,sonodynamic therapy : SDT)の基礎的研究がなされてきた。今回の研究は、このSDTを臨床応用することを目的に行った。対象症例:本研究費を使用しSDTを施行した症例は、深在癌である消化器癌局所再発の1症例であった.SDTを行うにあたり使用した超音波は、0.9MHzの超音波発信装置を用いることでボルフイーナトリウムの励起を行える超音波特性を有するものを準備した.この超音波発生装置を用いて十なインフォームド・コンセントのもとに直腸癌局所再発例の1症例に臨床応用を行った.実施方法:超音波力学的治療法に使用するボルフイマーナトリウムは、体重あたり2mg/kgを静脈投与した.このボルフイマーナトリウム1パイアルは75mg/kgであり、患者には2パイルが必要であった。ボルフイマ←ナトリウムは光感受性薬剤であるため、静注後よ50ルクス以下暗室個室に収容し、静注後48時間から72時間の間に重畳波超音波を同一部位に2回照した.照射後1週間300ルクス以下の暗室個室管理を行い、光過敏反応(手背を太陽光に5分間曝し、発赤の有無を見る方法)をみて2週間後に退院した。効果判定:副作用、自覚症状、画像静断(CTと超音波検査)、腫瘍マーカー測定などを行った。結果は、副作用については何ら認めず、自覚症状は治療前の下腹部痺痛の軽減が認められた.画像診は治療直後であり、超音波検査のみの結果であるが、腫瘍内部の構造変化が認められた。小括:超音波力学的治療法の副作用は認められず、安全に施行しえた。効果に関しては単回の治療であり、劇的な効果の確認はできなかった。今後、反復投与とその症例集積が必要と思われた。起音波力学的治療法の対象となる症例は、深在癌である消化器癌局所再発症例を対象とした。超音波力学的治療法を行うにあたり使用する超音波は、0.9MHzの超音波発信装置を用いることでポルフィマーナトリウムの励起を行える超音波特性を有するものを準備した。この超音波発生装置を用いて十分なインフォームド・コンセントのもとに直腸癌局所再発例の1症例に臨床応用を行った。臨床検討:超音波力学的治療法に使用するポルフィマーナトリウムは、体重あたり2mg/kgを経静脈投与した。このポルフィマーナトリウム1バイアルは75mg/kgであり、患者には2バイアルが必要であった。ポルフィマーナトリウムは光感受性薬剤であるため、静注後より50ルクス以下の暗室個室に収容し、静注後48時間から72時間の間に重畳波超音波を同一部位に10分間づつ2回照射した.照射後1週間300

ルクス以下の暗室個室管理を行い、光過敏反応(太陽光に5分間手背をさらし、発赤の有無を見る方法)をみて2週間後に退院した。効果判定:副作用、自覚症状、画像診断(CTと超音波検査)、腫瘍マーカー測定などを行う。結果は、副作用については何ら認めず、自覚症状は治療前の下腹部疼痛の軽減が認められた。画像診断は治療直後であり、超音波検査のみの結果であるが、腫瘍内部の構造変化が認められた。小括:超音波力学的治療法は副作用は認められなかった。効果に関しては治療終了直後でありその判定については、長期的観察が必要とである。目的:我々はポルフィマーナトリウムと超音波による超音波力学的治療法(Sonodynamic therapy : SDT)の癌治療への応用について、基礎的研究を行い、SDTの殺細胞効果について報告してきた。しかし、SDTの系統だった臨床応用についての研究はなされていないのが現状である。今回、消化器癌症例を対象としてSDTの臨床応用を検討し、更に超音波発振装置の改良を行った。対象と方法:装置は、1MHz以下の周波数の超音波にその1/2波長の超音波を重畳させる超音波発信装置を使用し、ポルフィマーナトリウムの励起を効果的に行えるような超音波発信装置を作製した。消化器癌再発症例1例を対象としインフォームド・コンセントのもと臨床応用を行った。方法は、ボルフイマーナトリウムの使用量は2mg/kgを静脈投与した.ボルフイマ←ナトリウムは光感受性薬剤であるため、静注後よ50ルクス以下の個室に収容し、静注後4872時間の間に超音波を同一部位に10分間づつ2回照射した。照射後1週間300ルクス以下の個室管理を行い、光過敏反応(手背を太陽光に5分間曝し、発赤の有無を見る方法)をみて2週間後に退院した。結果:SDTの効果判定は、副作用、自覚症状、画像診断、腫瘍マーカー測定をもとに行った。第1に副作用は認めなかった。自覚症状は治療前下腹部痛の軽減を認めた.超音波検査では腫瘍内部の明瞭な構造変化が認められた。腫瘍マーカーは一時的な減少が見られたが、その後上昇した。超音波発振装置の改良:平成16年度に作製した超音波発生装置は、所有していた0.9MHzの超音波発生装置に科研費購入のAG1006(T&C Co. USA)の超音波発生装置を組み合わせ作製した。しかし、今回の臨床経験から精度の高い重畳波超音波発生装置の作製が必要と考えられ、更に超音波発生装置AG1006を購入し、オシロスコープ観察下にAG1006の2台による重畳波作成を行った。小括:超音波力学的治療法の臨床応用において副作用は認められなかった。今回の症例数は少なく抗腫瘍効果の判断はできなかった。今後、改良装置の使用による症例集積が必要と考えられた。
未利用資源からのキシロースなど単糖の生産および希少糖への変換

昨年度は、種々の廃棄物の糖質の組成などを調べた。本年度は、廃棄物を種々に組み合わせた酵素剤を用いて効率よく分解させて単糖を得る系を検討した。また、Aspergillus aculeatusとSaccharomyces cerevisiaeを用いて、米のアルコール発酵を参考にしてエタノールを得、さらに、酵母を用いて糖アルコールに変換した。後者の微生物を用いた変換は比較的容易と考えられたが、エネルギー的ロスが大きく、ほとんどアルコール発酵ができないという結果で酵母を用いたアルコールから糖アルコールであるD-アラビトールヘの変換系の開発には成功した。そこで前者の酵素を用いて分解することに重点をおいて検討した。昨年度新たに発見したAspergillus aculeatusのセルラーゼであるCBHI-2の解析を進め遺伝子のクローニングに成功した。また、本菌の生産する酵素についてプロテオーム解析を行い、どんな基質にどのように作用する酵素が存在するかをプロファイリングするための基礎を検討し様々な知見を得た。このようにして、酵素反応での分解率の向上を目指し、より収率よく単糖を得る系について引き続き検討している。次に、単糖から希少糖への変換については、モデルバイオリアクタを構築し、グルコースやフルクトースから希少糖への変換を検討した。D-グルコースから架橋D-キシロースイソメラーゼ、生産物のD-フルクトースからD-タガトース3-エピメラーゼ、希少糖生産物のD-プシコースからL-ラムノースイソメラーゼでの希少糖D-アロースまでの連続生産系が確立できた。未利用資源の多くを占める植物バイオマスの主成分はセルロース・キシランなどの不溶性多糖類であり、潜在的に有効利用可能であるとともにごみの減量化にも注目されている。Aspergillus aculeatusは単糖生成力の強い糸状菌として分離した。本菌の産生する多糖分解酵素群は糖転移活性を全く持たない特徴があり、最終産物は単糖である。また、本菌由来の酵素剤はイナワラやみかんの皮を80%以上単糖まで加水分解した。本研究では、農産廃棄物を中心とした未利用資源の糖源としての有用性を検証し、さらに、新たに発見した酵素剤の成分であるセルラーゼの性質を調べた。試料として、もみがら、ゴマ搾油カス、たまねぎ皮など数種類の糖組成を調べた。糖組成が単純なイナワラやもみがらはキシロースが主成分であり、利用性が高いと判断した。みかん皮やたまねぎ皮はガラクツロン酸やグルコース、フルクトースが多く、容易に利用可能と判断した。不溶性多糖のセルロースからグルコースを得るにはセルラーゼが必要である。作用機作の異なるほとんどのセルラーゼは既知である一方、本菌より新たに発見したセルラーゼ、アビセラーゼ3は分類学上新規の酵素であり、役割解明がセルロースを効率よく分解するために重要である。本酵素遺伝子をクローニングし、Saccharomyces cerevisiaeで分泌発現させた。生産した酵素を精製し、諸性質を調べた。精製は結晶セルロースに吸着させセロビオースで溶出させるアフィニティー法で行った。精製酵素のN末端アミノ酸配列は元菌の酵素と一致した。分子量は120,000、糖含量は約40%で、pH、温度に対する性質は、pH2.06.0の酸性側で安定であり、至適pHは3.0であった。また60°C以下で安定であり、至適温度は30°Cだった。基質特異性を調べたところ、カルボキシメチルセルロースナトリウムに最も強く作用し、結晶セルロースに対しては10%の相対活性であった。不溶性セロオリゴ糖に対する分解機作は、鎖を大きくランダムに切断し、最終産物はセロトリオースとセロビオースであった。本報告の新規酵素を含め一連のセルラーゼ群を作用させることにより、未利用資源から効率よくグルコースを取り出せると思われる。
アミロイド前駆体タンパク質細胞内輸送に対する脂質代謝の関与メカニズムの解明

アルツハイマー病における老人斑の主要構成成分であるアミロイドβ(Aβ)は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)から産生される。本研究ではコレステロールの脳特異的酸化物である24S-酸化ステロールで細胞を処理すると、APPの細胞内輸送が阻害され、小胞体に留まることを見出した。またAβ産生量が減少することも見出した。さらに24S-酸化ステロール存在時にAPPとの結合が増加するタンパク質を複数同定した。本年度はアミロイド前駆体タンパク質(amyloid precursor protein、APP)の細胞内輸送について、小胞体からゴルジ体までのin vitrovesicle transport assayの構築を目的として、条件検討を行った。その結果、ヒトAPPが安定的に発現しているCHO細胞株をジギトニンで処理し、細胞膜に穴のあいた状態にしたセミインタクト細胞を用いて小胞輸送の再構成を行ったところ、良好な結果が得られた。すなわち、セミインタクト細胞にラット肝細胞質やATP再構成系/GTPなどを加え、37°Cでインキュベートし、反応後、超遠心により出芽した小胞を回収し、Immunoblot法により評価した。その結果、COP-IIによって輸送されることが知られているERGIC-53やsec22bは、時間依存的に小胞画分に回収されていた。一方で、小胞体局在膜タンパク質であるRibophorin Iは小胞画分には観察されず、反応中に小胞体の分解は起きていないことを確認した。この結果から、本条件下において小胞体からのCOP-II小胞の出芽が再構成されていることが確認された。この条件下でAPPの小胞への移行を解析したところ、小胞体に存在していたと考えられる未成熟なAPPが時間依存的に小胞画分に回収されることが確認された。またAPPやERGIC-53、sec22bを含む小胞の出芽はATPおよび細胞質に含まれる可溶性タンパク質依存的であった。以上の結果から、セミインタクト細胞を用いたin vitro assayによりAPPの細胞内輸送の再構成系の構築に成功した。今後はオキシステロールがAPPの細胞内輸送に与える作用メカニズムについて解析を進めていく予定である。アミロイド前駆体タンパク質(amyloid precursor protein、APP)の細胞内輸送におけるオキシステロールの影響について、昨年度構築したin vitro vesicle transport assayを用いて検討した。その結果、脳特異的オキシステロールである24S-hydroxycholesterol(24S-OHC)を細胞に24時間処理すると、濃度依存的にCOP-II小胞へのAPPの移行を阻害した。また別のオキシステロールである25-OHCや27-OHCでも同様の阻害効果が確認されたが、LXR合成リガンドであるT0901317は阻害しなかった。そこでELISA法により24S-OHC処理後の培地中のAβ量を測定したところ、濃度依存的にAβ産生量が減少することが確認された。また25-OHCや27-OHC処理でもAβは減少していたが、T0901317では減少していなかった。一方、全長APPは24S-OHC濃度依存的に増加していた。以上の結果から24S-OHCがCOP-II小胞を介したAPPの初期輸送を阻害した結果、Aβ産生酵素が存在するオルガネラにAPPが到達せず、Aβ産生量が減少する可能性が示唆された。また、その効果は24S-OHCが持つLXRリガンドとしての作用以外の効果によると考えられた。そこで24S-OHC処理時にAPPと直接結合する、または結合が外れるタンパク質を同定することを目的として、抗APP抗体を用いた免疫沈降法を行った。24S-OHCで24時間処理した細胞からNP-40を含む溶解液により全タンパク質画分を調製し、抗APP抗体と共沈したタンパク質をLC-MS質量分析法により同定した。その結果24S-OHC存在下でAPPとの結合が増加するタンパク質を複数同定した。今後これらの候補タンパク質について解析を進めていく予定である。
植物における線虫抵抗性メカニズムの解明

本研究課題での研究目的は植物寄生性線虫に対する抵抗性誘導物質を植物から抽出することである。植物ホルモンの1種であるジャスモン酸を植物に処理すると、線虫の根への侵入が有意に低下することが自分の研究より明らかとなっているため、ジャスモン酸を処理した植物根から抵抗性物質が放出されているであろうという仮説のもと、物質の抽出を行っている。平成26年度は植物に含まれる線虫感染抑制物質の単離を進め、植物体内で産生される直鎖状テルペノイド化合物の1種を検出することに成功した。この物資を処理した植物では線虫の根への侵入数が有意に低下した。物質処理をした植物の根における反応を遺伝子発現から解析すると、植物ホルモンの1種であるエチレンをシグナル伝達物質とする経路の一部が活性化することを明らかにし、エチレン経路が線虫感染に関わることが判明した。事実、エチレンの生合成や蓄積がみられないシロイヌナズナ変異体を用いて、線虫の侵入を評価したところ、物質処理によって線虫の侵入数に差はみられず、この結果からも単離物質の植物体内での反応にエチレン経路が関与することが示唆された。さらに、単離物質を介して生産される2次代謝物質の中にも植物に処理することで、線虫感染抑制効果を示すことを明らかにした。上記の結果をまとめ、平成27年度以降に学会誌への投稿を行う予定である。また、上記成果は知財化(特許化)が見込まれることから、平成27年度中に出願を行う予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。研究代表者は植物寄生性線虫の抵抗性に関与する植物遺伝子の選抜と植物由来物質の抽出を行うことを目的としている。平成25年度は既存の病害抵抗性誘導物質に含まれていない、植物体内で産生されるテルペン化合物の1種、スクラレオールを候補物質の1種として単離することに成功した。スクラレオールはもともとある特定の菌種に対する抗菌活性を持つことが知られている物質であるが、スクラレオールを外部施与した植物において、植物寄生性線虫の侵入数が有意に低下することを明らかとした。スクラレオール処理をした植物の根における反応を遺伝子発現から解析すると、根の木化を誘導する物質であるリグニンの生合成に関与する遺伝子経路の発現がみられた。事実、スクラレオールを処理した植物の根内部ではリグニンの蓄積が観察された。リグニンの蓄積が起きないシロイヌナズナ変異体を用いて検証したところ、スクラレオール処理によるリグニン蓄積は観察されず、線虫の侵入も抑制されることはなかった。以上の結果から、線虫抵抗性誘導物質候補の1種であるスクラレオールは、植物に処理すると、根の硬化を誘導し、線虫の侵入を妨げることが示唆された。また、スクラレオールを処理した植物の根より物質抽出を行ったところ、特異的に放出量が変化している物質を数種類単離することに成功した、これらの物質をそれぞれ植物に処理したところ、線虫の侵入数が有意に低下する物質の存在が明らかとなった。平成26年度以降はそのメカニズムについて解析を進める予定である。・線虫抵抗性を誘導する物質(スクラレオール)の単離に成功したこと・スクラレオール処理による植物体内での線虫抵抗性誘導メカニズムの解明に成功したこと・スクラレオール処理によって植物体内で放出量の変化する物質を複数単離することに成功するとともに、そのなかに線虫抵抗性誘導物質が含まれていることを明らかにしたこと。平成25年度の結果より、スクラレオールを処理した植物の根において、特異的に放出量が変化している複数種類の物質を単離することに成功した、これらの物質の中には線虫の侵入数を有意に低下させる物質が含まれていた。
創薬を指向したメダカを利用するin vivoスクリーニング法の構築

魚類メダカを使用して、生体内でも有効性が期待できる医薬リードを選択する手法の確立に成功した。具体的には、血管およびリンパ管の形成過程を間接的に反映する尾ひれの再生に着目して、これを促進または抑制する活性天然物のスクリーニング系を構築した。また構築した評価系を利用して、底生海洋生物の抽出エキスや海洋由来微生物の培養抽出物ライブラリーを探索した結果、インドネシア産海綿のメタノール抽出エキスから、尾ひれの再生を阻害する化合物としてmanzamine Aを単離・同定した。これまでの医薬シーズの探索では、酵素、微生物、培養細胞などを利用するin vitroでのスクリーニング後、見出した活性物質をマウスなどでの動物実験で評価し、有望な化合物を医薬シーズとして利用してきた。このため、動物実験の段階で効果を示さない化合物や毒性の高い化合物が選択される場合も多くあった。このことから、直接in vivoでも有効な活性物質を見出すことができる評価系は、医薬シーズの探索時間を短縮し、コストの削減にも繋がると考えられる。本研究では、飼育や個体の供給が容易であり、形質転換や形質導入技術が確立されている魚類メダカを利用し、in vivoでも有効な活性物質を直接見出すことができる評価系の構築に挑戦するものである。今年度は実験計画に従い、メダカの尾ヒレ再生に着目し、これを阻害する化合物(血管新生阻害物質やリンパ管新生阻害物質)または促進する化合物(骨、血管やリンパ管の形成を促進する再生医療に有用な化合物)を探索するための評価系の構築を行った。そして、使用するメダカの種類、週令、飼育条件、活性定量方法などの基礎検討を行い、多検体の評価が可能なスクリーニング系を確立した。さらに確立した評価系を使用して、メダカの尾ヒレ再生に影響を与えると予想される既知化合物の活性評価を行った。その結果、細胞の分化誘導活性が知られているall-trans retinoic acid、研究代表者がマウスの血管新生を阻害する作用を見出しているbastadin 6に、メダカの尾ヒレ再生を阻害する作用が確認された。現在、研究代表者が保有する海洋生物の抽出物ライブラリーを対象とするスクリーニングを開始している。今年度は、メダカの尾ヒレ再生に着目し、これを阻害する化合物(血管新生阻害物質やリンパ管新生阻害物質)または促進する化合物(骨、血管やリンパ管の形成を促進する再生医療に有用な化合物)を探索することを目的に、昨年度、多検体の活性評価が可能なように最適化を行い確立した評価系を利用して、研究代表者が保有する底生海洋生物の抽出エキスおよび海洋微生物の培養物ライブラリーを対象とする探索を行った。そして、2種類の海綿のメタノール抽出エキスにメダカの尾ひれ再生を阻害する活性を見出し、1種類の海綿のメタノール抽出エキスに尾ひれ再生を促進する活性を見出した。さらに尾ひれの再生阻害活性を示した海綿の抽出エキスについて、活性試験の結果を指標に分画・精製を進めた結果、メダカに対して毒性を示さない濃度で尾ひれの再生を阻害するアルカロイド成分を単離した。そして現在、本化合物についてリンパ管または血管を可視化したトランスジェニックメダカを用いて、高次での活性評価を進めている。
社会保障法の「事業化」の諸相と規律

今年度は、多様な事業が組み合わされている生活困窮者自立支援制度や介護保険の地域支援事業を中心に、事業の法的仕組みや行政上の規律等について検討を行った。生活困窮者自立支援制度の自立相談支援事業では、法的な外延が必ずしも明瞭ではない対象者に対して、事実行為の連鎖により相談支援が展開され、法的把握が極めて難しい仕組みとなっていることが明らかになった。他方で、介護保険の地域支援事業では、保険給付(予防給付)から移された訪問介護・通所介護のように、保険給付との類似性が見られる仕組みもあり、事業の法的組み立てにおける多様性が見いだされた。行政行為に分節化できない仕組みを持つ事業においては、いかなる法的組み立てで当事者の権利・利益を確保することができるのかという課題が明らかになった。損害賠償といったミクロの視点とともに、事業全体の統制というマクロの視点の重要性についても検討を行い、両視点の限界を相互に補い合うことの可能性について検討を行った。また、今年度は、社会保障の事業化を要請する背景としての社会的排除の状況や高齢者の貧困についても検討を行った。とりわけ、高齢者の貧困に関しては、必要な介護や医療へのアクセスを保障するため、医療機関等も含めた多様な支援のチャネルの必要性が認められ、社会保険などの「大きな制度」ではない、より身近な仕組みを提供する基盤として、各種事業の意義が見いだされた。さらに、世代間衡平の観点から社会保障制度をより持続可能な仕組みとするために、国や地方自治体のみが支える仕組みから、地域の多様な主体を取り込んだ仕組みへの移行の意義が見いだされ、そうした多様な主体の連携を推進する仕組みとしての事業の機能にも着目した。今年度は、当初の予定通り、社会保障法で進展している各種の事業の具体的な仕組みを分析することができた。特に事業化が顕著である生活困窮者自立支援制度について具体的にその仕組みを分析したとともに、当該仕組みが抱える課題についても明らかにすることができた。また、社会福祉の領域において、給付本体の仕組みとともに近年重要性を増している事業の例として、介護保険の地域支援事業をめぐる政策的動きに関しても検討することができた。また、単に社会保障法制における各種事業の仕組みを解明するだけでなく、事業化が求められる社会的背景についても視野を広げることができた。特に、社会的排除や貧困の深刻化といった、従来型の社会保険制度では対応できない問題が認識されるようになったことや、社会保険といった大きな仕組みのみでは持続性が揺らいでいる社会保障において、多様な関係機関の連携の重要性が注目され、それとともに事業化が推進してきたことが明らかとなった。2019年度には、2018年度に把握した具体的事業について、引き続き文献・資料を参照しながら、従来の権利義務アプローチの有効性と限界を検討する。特に2018年度におこなった研究で明らかになったように、生活困窮者自立支援制度の法的分析を中心に検討し、学会報告を行う予定である。また、こうした検討は、当然のことながら行政法や民法の研究への参照を必要とするため、関係する法領域の文献を渉猟しながら実施する予定である。また、本研究が比較対象とするフランスに関する研究も、2019年度には力を入れる。相談支援などの検討において参考となる契約化(Contractualisation)の動きー対象者と行政とが契約を締結して社会参入のための取組みを行う、国と社会保険金庫が契約を締結して目標管理を行う等ーを中心に、文献調査・現地調査等を踏まえながら実施する予定である。2020年度には、本研究の総括として、さらに文献・資料を渉猟しながら、フランス法への参照も行いつつ、権利義務アプローチによる分析が困難であった「事業」について、新たなアプローチを模索する。とりわけ、事業実施主体とそれによる支援を受ける者との関係が、従来型の行政行為を介した垂直的な関係と相違する点に着目しながら法的規律の方法を検討する。

特に事業化が顕著である生活困窮者自立支援制度について具体的にその仕組みを分析したとともに、当該仕組みが抱える課題についても明らかにすることができた。また、社会福祉の領域において、給付本体の仕組みとともに近年重要性を増している事業の例として、介護保険の地域支援事業をめぐる政策的動きに関しても検討することができた。また、単に社会保障法制における各種事業の仕組みを解明するだけでなく、事業化が求められる社会的背景についても視野を広げることができた。特に、社会的排除や貧困の深刻化といった、従来型の社会保険制度では対応できない問題が認識されるようになったことや、社会保険といった大きな仕組みのみでは持続性が揺らいでいる社会保障において、多様な関係機関の連携の重要性が注目され、それとともに事業化が推進してきたことが明らかとなった。2019年度には、2018年度に把握した具体的事業について、引き続き文献・資料を参照しながら、従来の権利義務アプローチの有効性と限界を検討する。特に2018年度におこなった研究で明らかになったように、生活困窮者自立支援制度の法的分析を中心に検討し、学会報告を行う予定である。また、こうした検討は、当然のことながら行政法や民法の研究への参照を必要とするため、関係する法領域の文献を渉猟しながら実施する予定である。また、本研究が比較対象とするフランスに関する研究も、2019年度には力を入れる。相談支援などの検討において参考となる契約化(Contractualisation)の動きー対象者と行政とが契約を締結して社会参入のための取組みを行う、国と社会保険金庫が契約を締結して目標管理を行う等ーを中心に、文献調査・現地調査等を踏まえながら実施する予定である。2020年度には、本研究の総括として、さらに文献・資料を渉猟しながら、フランス法への参照も行いつつ、権利義務アプローチによる分析が困難であった「事業」について、新たなアプローチを模索する。とりわけ、事業実施主体とそれによる支援を受ける者との関係が、従来型の行政行為を介した垂直的な関係と相違する点に着目しながら法的規律の方法を検討する。次年度使用額が生じたのは、2018年度に使用しきれない端数が残ったためである。次年度はこの端数を含め、次年度配分額とともに、主に物品費・旅費に使用する予定である。
メンタルヘルス不調者の復職支援要請システムの開発と評価

メンタルヘルス不調により休業した労働者が復職後に安定した就労を再確立する過程で職場上司からの支援は不可欠である。しかし上司は復職者への支援に困難感を抱き,必要な支援が適切に提供されていないと報告されている。本研究ではまず復職過程で有効な上司からの支援内容をインタビュー調査により解明する。そして復職者が医療者と共に「いま必要な支援」を考え,自ら上司に支援要請する「復職支援要請システム」を開発し評価する。それにより上司は復職者の状態や具体的な支援内容を容易に把握でき,復職者は自らの状態を客観的に評価する力や支援の要請力などの社会的スキルを育むことができ,継続的な再休職予防として効果が期待できる。
高倍率の接触型内視鏡開発による間欠跛行を伴う腰部脊柱管狭窄症の病態の解明

接触型拡大視内視鏡は25-150倍拡大視が可能で顕微鏡と同じ拡大になり明るい解像力が獲得される。手術の際に神経性間欠性跛行の神経根上の血行動態を評価することが有用な手技であったので報告する。その記録はDVDに記録し後にIPlaboのソフトを関発し解析をした。間歇性跛行は神経根上の血流障害が注目されており今回の研究でプロスタグランヂンの末梢血管からの注入や末梢神経の電気刺激でも血流量(流速、血管径)の増化がみられた。以上接触型拡大視内視鏡は神経根上の血行動態を容易に生理的に測定が可能で他の関節の滑膜病変を観察することに応用されると思われる。29例の間欠性跛行を伴った腰部脊柱管狭窄症の馬尾神経根の微小循環動態を接触型拡大視内視鏡を用いて生理的に近い状態で観察し、腰椎椎体間固定術する際の神経根上の微小循環の血管径や赤血球の流速の変化と定性的変化について評価する。その目的は腰部脊柱管狭窄症患者の神経根の微小循環を観察し、後方腰椎椎体間固定術(posterior lumbar interbody fusion ; PLIF)の際に神経根を内側に展関する前後の神経根上の微小循環の変化を検討することである。対象は腰部脊柱管狭窄症患者でPLIFの手術的治療となった29例(男性15女性14;平均年齢56才)を対象とした。検索した傷害神経根はL5が26例、S1が3例である。傷害神経根上の微小循環を測定し次に神経根をretractしてlumbar interbody fusion施行後に再度同じ部位で測定する。接触型内視鏡を用いた解析はビデオフレームメモリから血球を自動的に認識して流速と血管径を自動的に測定するシステムを作成した。血管内径が100μm以下の細動静脈と100μm以上の15ヶ所で血管径と赤血球の流速度の解析を行った。また定性的変化について評価した。神経根の臨床上の変化はMacnab's criteriaに従って評価した。150倍のcontact endoscopesは29例全例が約20μまでの血管内の血球の動態観察が可能であった。血球と血漿が分離して流れる血漿分離流(plasma skimming)は展開前29例中3例に観察され展開後に8例〔27.6%〕に増えた〔全例血管径100μ以下〕。赤血球の荷電状態の変化により赤血球が一塊となって血漿中を流れる現象のIEA(intravascular erythrocyte agglutination)は展関後100μ以上の血管で3例に認められた。神経根展開前後で血管径100μ以上の血管で赤血球の流速が平均26%〔p<0.005〕減少し、血管径は5%の上昇がみられたが統計学的に有意差は見られない。血管径が100μ以下では血流速度は5%遅れ、血管径は2%の拡大がみられたが統計的有意差は無かった。接触型拡大視内視鏡(contact endoscope)を用いて観察しえた展開前後の神経根の微小循環動態では血管径の大きさに関らず赤血球の流速の低下が認められた。

また定性的変化について評価した。神経根の臨床上の変化はMacnab's criteriaに従って評価した。150倍のcontact endoscopesは29例全例が約20μまでの血管内の血球の動態観察が可能であった。血球と血漿が分離して流れる血漿分離流(plasma skimming)は展開前29例中3例に観察され展開後に8例〔27.6%〕に増えた〔全例血管径100μ以下〕。赤血球の荷電状態の変化により赤血球が一塊となって血漿中を流れる現象のIEA(intravascular erythrocyte agglutination)は展関後100μ以上の血管で3例に認められた。神経根展開前後で血管径100μ以上の血管で赤血球の流速が平均26%〔p<0.005〕減少し、血管径は5%の上昇がみられたが統計学的に有意差は見られない。血管径が100μ以下では血流速度は5%遅れ、血管径は2%の拡大がみられたが統計的有意差は無かった。接触型拡大視内視鏡(contact endoscope)を用いて観察しえた展開前後の神経根の微小循環動態では血管径の大きさに関らず赤血球の流速の低下が認められた。微少循環の研究は生体のホメオスターシスの維持、薬剤の作用機序、生体の非器質的障害の解明に重要である。これまでは微小循環の血流速度流量の測定の多くは顕微鏡レベルであるために様々な物理的な制約が多かった。微小血管の局所的な変化と時間的な変化を同時に計測することは循環調節の詳細な解析に有用と思われる。手技は接触型内視鏡を用いて解析はビデオフレームメモリとIPIaboのcomputorを用いて血球を自動的に認識して流速と血管径を自動的に測定するシステムを開発した。そのために生体の人間で数ヵ所を経時的に血流測定することが可能となった。方法は撮影した画面をビデオフレームメモリで512×512〈256階調〉の画素にデジタル化してデジタルビデオレコダーに記録しテレビ画面上で血球を1つクリックすることによりその流速が測定できる装置である。血管内径が50-100umの細動静脈を中心に複数の場所と時間的経過で多元的解析を行った。接触型拡大視内視鏡(contact endoscope)は神経根上の血行動態を容易かつ生理的に測定可能で神経性間欠性跛行の詳細な病態観察に有用な手技になりえた。また血行の動態変化を観察する為にレオロジーを評価可能なソフトを開発した。そして薬剤投与や下肢の電気刺激後や術中の神経根の物理的圧排の変化前後のそれぞれの血球のベクトル変化と粘性の変化を解析した。本方法は明るい視野で拡大視され、従来の動物を対象とした手技から人間の生理的病態を観察することが可能とした飛躍した手技といえる。接触型拡大視内視鏡は25-150倍拡大視が可能で顕微鏡と同じ拡大になり明るい解像力が獲得される。手術の際に神経性間欠性跛行の神経根上の血行動態を評価することが有用な手技であったので報告する。その記録はDVDに記録し後にIPlaboのソフトを開発し解析をした。間歇性性跛行は神径根上の血流障害が注目されており今回の研究でプロスタグランヂンの末梢血管からの注入や末梢神経の電気刺激でも血流旦(流速、血管径)の増化がみられた。以上接触型拡大視内視鏡は神経根上の血行動態を容易に生理的に測定が可能で他の関節の滑膜病変を観察することに応用されると思われる。29例の間欠性跛行を伴った腰部脊柱管狭窄症の馬尾神経根の徴小循環動態を接触型拡大視内視鏡を用いて生理的に近い状態で観察し、腰椎推体間固定術する際の神経根上の微小循環の血管径や赤血球の流速の変化と定性的変化について評価する。
子ども期の被ばくにおける低線量率放射線誘発腫瘍の特異性に関する研究

低線量率の放射線に長期間被ばくした場合の発がん影響について、そのリスクを明らかにすることは喫緊の課題である。特に、子どもは放射線に高感受性であるが、低線量率放射線による発がん影響については不明である。本研究では、放射線感受性発がんモデル動物を用い、子供における低線量率放射線の影響について、その照射時年齢依存性、低線量率放射線の低減係数を病理学的解析により明らかにすることを目的とした。ヒト家族性大腸腺腫症(FAP)のモデルであり、消化管腫瘍の自然発生が低く、放射線被ばくにより高頻度に消化管腫瘍が誘発されるC3B6F1 Min (ApcMin/+)マウスを用いた。高線量率(約0.5Gy/min)のガンマ線2.0Gyを生後2週齢、あるいは7週齢に照射した。また、低線量率(約0.1mGy/min)のガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢から2週間かけて総線量が2.0Gyになるように照射した。照射後30週齢時に、照射群および対照群における消化管腫瘍の数とサイズを計測し、その発生率を調べた。また組織切片標本を作成し病理学的に解析した。消化管(小腸)の総ポリープ数は、2週齢時における2Gy一回照射群において対照群に比べておよそ1.5倍に増加した。しかし、7週齢時における2Gy一回照射群では増加は認められなかった。24週齢時における2Gy低線量率照射群においては、その発生率は対照群に比べて増加する傾向を示したが、一回照射群に比べて低くなった。また誘発率の増加に伴い悪性度も増加する傾向が観察された。本年度は血清中のコレステロールを測定し、悪性度とコレステロール値に相関があることがわかった。以上の結果より、Minマウスにおける放射線による消化管腫瘍の誘発と悪性化は照射時年齢に依存しており、また子ども期の照射によるそれは線量率に依存していることがわかった。特に、子どもは放射線に対する感受性が高いことが知られているが、低線量率放射線による発がん影響については不明である。そこで、本研究では、放射線感受性発がんモデル動物を用い、子供における低線量率放射線の影響について、その照射時年齢依存性、低線量率放射線の低減係数、放射線誘発消化管腫瘍の発生機序を病理学的及び分子生物学的解析により明らかにすることを目的として行うこととした。本年度は凍結保存してある受精卵の融解胚移植によりSPF個体を作製し、ガンマ線の連続照射施設のあるSPF実験動物管理区域内へ搬入して実験を開始した。照射用の雌雄C3B6F1 ApcMin/+マウスについては、系統維持をしているC57BL/6J ApcMin/+雄マウスとCH3雌マウスを交配し、PCR法によりの遺伝タイプを判定することにより用意した。まずC3B6F1 ApcMin/+マウスの放射線感受性確認のための予備実験を行った。すなわち、一群10匹(雌雄各5匹)として、高線量率ガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢において0.1Gyあるいは2.0Gy照射した。また、低線量率のガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢から2週間かけて総線量が2.0Gyになるように照射した。30および50週齢に達した時点で打ち切り、照射群および対照群における消化管腫瘍の発生率と病理組織の解析を行った。その結果、50週齢では自然誘発腫瘍が多くなり、照射の効果を検出しにくくなることから、解剖週齢を30週齢に設定することにした。また、後大静脈より血液を採取し、血清を分離した後その中の総脂質量等を測定するため凍結保存した。予備実験で得られた腫瘍組織試料を用いて、分子生物学的解析の条件設定のための実験を開始した。凍結保存してある受精卵の融解胚移植によりSPF個体を作製し、ガンマ線の連続照射施設のあるSPF実験動物管理区域内へ搬入を終えた。C3B6F1 ApcMin/+マウスの放射線感受性確認のための予備実験について、高線量率ガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢において0.1Gyあるいは2.0Gy照射し、30週齢および50週齢での解剖を終えた。また、低線量率のガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢から2週間かけて総線量が2.0Gyになるように照射し、30週齢および50週齢での解剖を終えた。照射群および対照群における消化管腫瘍の発生率の解析をおこなった。なお、当初予定にあった15週齢での照射については、この週齢では既に自然発生の消化管腫瘍が発現しており、さらに照射をしても放射線の影響をよく観察することができないことから、この週齢での照射は行わないことにした。予備実験の解剖は既に終わり、病理解析と血清成分の測定準備に移行している。よって計画はおおむね順調に進展しているといえる。低線量率放射線に長期間被ばくした場合の発がん影響について、そのリスクを明らかにすることは喫緊の課題である。

そこで本研究では、放射線に感受性を示すとされる消化管腫瘍モデル動物を用いて、子ども期における低線量率放射線の影響について、その線量率および照射時年齢依存性を病理学的解析により明らかにすることを目的として行った。本年度は、ヒト家族性大腸腺腫症(FAP)のモデルであり、消化管腫瘍の自然発生が低く、放射線被ばくにより高頻度に消化管腫瘍が誘発されるC3B6F1 Min (ApcMin/+)マウスを用いて本実験を行った。すなわち高線量率(約0.5Gy/min)のガンマ線2.0Gyを生後2週齢、あるいは7週齢に照射した。また、低線量率(約0.1mGy/min)のガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢から2週間かけて総線量が2.0Gyになるように照射した。予備実験の結果に基づき照射後30週齢時に消化管を採取し、実体顕微鏡下で照射群および対照群における消化管腫瘍の数とサイズを計測し、その発生率を調べた。消化管(小腸)の総ポリープ数は、2週齢時における2Gy一回照射群において対照群に比べておよそ1.5倍に増加した。しかし、7週齢時における2Gy一回照射群では増加は認められなかった。24週齢時における2Gy低線量率照射群においては、その発生率は対照群に比べて増加する傾向を示したが、一回照射群に比べて低くなった。また79週齢時における低線量率照射では、腫瘍発生率は対照群と変わらなかった。以上の結果より、Minマウスにおける放射線による消化管腫瘍の誘発は照射時年齢に依存しており、また子ども期の照射による腫瘍の誘発は線量率に依存している可能性が示された。今年度内に本実験の照射、飼育および解剖を終了した。すなわち一群10匹(雌雄各5匹)として、高線量率ガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢において0.1Gy、0.5Gyおよび2.0Gy照射した。また、低線量率のガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢から2週間かけて総線量が0.1Gy、0.5Gyおよび2.0Gyになるように照射した(総数190匹、コントロール34匹を含む)。30週齢に達した時点で解剖し、血清を採取保存した。照射群および対照群において発生した消化管腫瘍の数を実体顕微鏡下で計数し、それらの線量効果、線量率効果および照射時年齢依存性について評価した。また腫瘍をホルマリン固定・パラフィン包埋して病理組織標本の作製を終え、デジタルスキャナーでの画像取り込みを行った。低線量率放射線に長期間被ばくした場合の発がん影響について、そのリスクを明らかにすることは喫緊の課題である。特に、子どもは放射線に対する感受性が高いことが知られているが、低線量率放射線による発がん影響については不明である。ヒト家族性大腸腺腫症(FAP)のモデルであり、消化管腫瘍の自然発生が低く、放射線被ばくにより高頻度に消化管腫瘍が誘発されるC3B6F1 Min (ApcMin/+)マウスをSPF飼育条件下で、高線量率ガンマ線を生後2週齢、あるいは7週齢において0.1Gy、0.5Gyおよび2.0Gy照射した。本年度は、30週齢時に剖検を行い消化管腫瘍の数とサイズを測定して線量依存性について評価し、さらに病理組織標本を作製して腫瘍の病理組織学的解析による進行度の評価も行った。
協同的結合と選択的化学反応の複合によるDNA塩基配列の精密認識

ペプチド二量体の安定性および二量体形成が平衡反応であることが二量体ペプチドのDNA塩基配列認識にどのような影響を及ぼすかを解析した。ペプチド二量体の熱力学的安定性を変化させるために、ゲスト分子の種類の異なる5種類のプチド二量体を合成した。DNA結合ドメインとして転写因子GCN4のDNA結合領域由来の24残基のペプチドを共通に用い、そのC末端のシステインの側鎖にCd、そしてアダマンタン(Ad)などの各種ゲスト分子を導入した。これらのペプチド二量体を用いて、GCN4が特異的に認識するDNA配列に対する結合をゲルシフトアッセイにより定量的に評価したところ、二量体の安定性とぺプチド二量体-DNA複合体の安定性は直線関係にはなく、安定なペプチド二量体-DNA複合体形成にはある値以上の二量体安定性が必要であることがわかった。次に、二量体形成が平衡反応であることが、ペプチド二量体のDNA塩基配列認識能にどのような影響を与えるかを検討した。このために、同一のDNA結合ペプチドを用いて、共有結合および非共有結合により二量体を形成する3種類のペプチド二量体を合成した。共有結合二量体ペプチドとして、ジヒドロフェナンスレン誘導体を介してGCN4のDNA結合領域由来のペプチドを二量化したペプチドを用い、非共有結合二量体ペプチドとして、CdペプチドおよびAdペプチドからなる二量体ペプチドと同一ペプチド内にCdおよびAdを有するAdCdペプチド2分子からなる二量体ペプチドを用いた。これらの二量体ペプチドの塩基配列選択性をゲルシフトアッセイによって定量的に比較することで、ペプチドニ量体のDNA認識へのペプチド二量体の解離平衡の影響を解析したところ、二量体形成を非共有結合にすることで塩基配列認識の選択性が向上することが確認された。天然のb-ZIPタンパク質GCN4の中のLeucine Zipper部分をβ-シクロデキストリンとアダマンタンという、1:1のホストーゲスト錯体を形成する分子に置き換えることによりえられるG23AdとG23Cdペプチドは、ホモダイマーを形成して、天然のGCN4のDNA塩基配列であるCREを認識する。また、ホスト分子とゲスト分子に、異なったペプチドを組み合わせることにより、選択的にヘテロダイマーを形成することができる。本年度の研究では、ペプチドにDNA切断分子としてp-ベンゾイルフェニルアラニン(Bpa)を導入し、非回文配列に結合した状態でのペプチドヘテロダイマーが配向を明らかにした。N末端での位置の異なるBpa-G22とBpa-G21にアダマンタンを導入したG23ペプチドと、C23にシクロデキストリンを導入したペプチドとのヘテロダイマーが、非回文配列のCE/CRに結合することを、ゲルシフトアッセイにより確認した。切断反応はBpa-G21AdあるいはBpa-G22AdとC23Cdの2つのペプチド存在下で、0°Cで302nmの紫外線を1時間あるいは2時間照射したあとで、中性の条件下で90°C、15分処理し、その後90°C、30分ピペリジンで処理した。切断の位置は非回文配列CE/CRの、CR側内のTに相当することがわかった。即ち、紫外線照射により、Bpaのベンゾフェノンが励起してチミンと反応し、ピペリジンで処理することにより、DNAの切断が起きたと考えられる。また、Bpaの位置の異なるペプチドでDNAの切断に差が生じたことは、DNAに対するBpaの位置が重要であると考えられる。DNAの切断に用いたBpaは、フェニルアラニンの誘導体であるので、ペプチド内に導入することができる。よって、DNAと結合したペプチドの位置を知るための分子として、またそのペプチド内のアミノ酸残基とDNAとの位置関係を知るための分子として、今後利用できることがわかった。

本年度はペプチド二量体の安定性および二量体形成が平衡反応であることが二量体ペプチドのDNA塩基配列認識にどのような影響を及ぼすかを解析した。ペプチド二量体の熱力学的安定性を変化させるために、ゲスト分子の種類の異なる5種類のプチド二量体を合成した。DNA結合ドメインとして転写因子GCN4のDNA結合領域由来の24残基のペプチドを共通に用い、そのC末端のシステインの側鎖にCd、そしてアダマンタン(Ad)などの各種ゲスト分子を導入した。これらのペプチド二量体を用いて、GCN4が特異的に認識するDNA配列に対する結合をゲルシフトアッセイにより定量的に評価したところ、二量体の安定性とペプチド二量体-DNA複合体の安定性は直線関係にはなく、安定なペプチド二量体-DNA複合体形成にはある値以上の二量体安定性が必要であることがわかった。次に、二量体形成が平衡反応であることが、ペプチド二量体のDNA塩基配列認識能にどのような影響を与えるかを検討した。このために、同一のDNA結合ペプチドを用いて、共有結合および非共有結合により二量体を形成する3種類のペプチド二量体を合成した。共有結合二量体ペプチドとして,ジヒドロフェナンスレン誘導体を介してGCN4のDNA結合領域由来のペプチドを二量化したペプチドを用い、非共有結合二量体ペプチドとして、CdペプチドおよびAdペプチドからなる二量体ペプチドと同一ペプチド内にCdおよびAdを有するAdCdペプチド2分子からなる二量体ペプチドを用いた。これらの二量体ペプチドの塩基配列選択性をゲルシフトアッセイによって定量的に比較することで、ペプチド二量体のDNA認識へのペプチド二量体の解離平衡の影響を解析したところ、二量体形成を非共有結合にすることで塩基配列認識の選択性が向上することが確認された。