hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネにおける開花制御因子の分子生物学的解析

本年度は以下の研究を行った。1.台中65号背景の遅咲き変異体の解析遅咲き変異体を短日条件で生育させ、発達段階を追って開花関連因子の遺伝子発現を解析した。野生型である台中65号はHd1遺伝子とEhd1遺伝子の機能を持たない品種であるため、短日条件でOsGIの発現は認められるが、Hd1・Hd3aの発現は非常に少ないことが報告されている。その結果の再現性を確認し、同様の結果を得ることが出来た。また、遅咲き変異体からも同様の結果が得られたことから、OsGI→Hd1→Hd3aの経路は遅咲き変異体でも野生型同様に機能しており、この経路のシグナル伝達に異常がないことが明らかになった。この変異体は染色体断片の大きな欠失が認められることから、この欠失した断片部分の候補遺伝子の遺伝子発現を葉において確認したところ、発現が認められないことが明らかになった。この候補遺伝子の絞り込みを現在行っている。また、同様に遅咲きの表現型を示す変異体を日本晴品種の背景からも得ており、変異体の遺伝子発現を上記の候補遺伝子について調査したところ、変異体では候補遺伝子の発現が野生型の日本晴と比較して減少していることを明らかにした。2.新規な遅咲き変異体の解析上記の遅咲き変異体以外の台中65号背景の新規な遅咲き変異体を6系統入手し、これらの品種のホモ化を行った。今後、これらの品種を生育させ、開花関連因子と上記候補遺伝子の遺伝子発現を発達段階を追って確認する予定である。植物の日長感受性の分子機構を明らかにすることを目的に研究を行っている。1.開花制御遺伝子のタンパク質複合体の単離と同定イネの開花制御遺伝子であるOsGI, Hd1, Hd3aのそれぞれにTAPタグを付加したコンストラクトを導入した形質転換植物と培養細胞を作出した。OsGI : TAPの培養細胞から複合体を単離し、タンパク質を同定した。2.コアコレクションを用いた開花制御因子の解析イネコアコレクション64品種において、短日条件下で開花時期とHd3aの遺伝子発現量を解析した。その結果、開花時期の早い品種はGd3aの発現量が高く、Hd3aの遺伝子発現量と開花時期の間には相関が認められた。同時にこれら全ての品種に光中断処理を行い、翌日にHd3aの発現量を調査したところ、64品種中の58品種で光中断によるHd3a遺伝子の発現抑制が認められた。以上のことから、イネではHd3a遺伝子の発現量が開花の主たる原因であること、殆どのイネ栽培種では光中断の分子メカニズムが保存されていることを明らかにした。3.長日条件下での開花促進因子OsMADS50/OsSOC1の解析自然条件下で遅咲きになる変異体の解析からOsMADS50/OsSOC1が自然条件下で開花を促進する因子であることを以前に見いだしている。この変異体を制御された日長条件で生育したところ、長日条件下では野生型に比べて遅咲きになるが、短日条件下では変異体は野生型と同時期に開花するという新しい表現型を見いだした。また、OsMADS50/OsSOC1の信号伝達はOsGI, Hd1, Hd3aとは独立して長日条件下で開花を促進する因子であることも発現解析から見いだした。
細胞直接リプログラミングに共通するエピジェネティック制御機構の解明

これまでの研究により、心筋特異的転写因子を導入することでマウス及びヒトの線維芽細胞から心筋細胞の直接誘導を可能とした。また、筋特異的microRNAであるmiR-133により誘導効率が改善すること、そのメカニズムとして上皮間葉移行のマスター因子であるSnai1を直接抑制することで線維芽細胞の特性が消去され、心筋誘導が促進することを明らかとしたこれらによりジェネティックな障壁の一部が明らかとなったが、エピジェネティクスを含めた分子基盤に関しては未だ不明な点が多く、誘導効率も依然十分とは言えない。そこで、注目したのが低分子化合物である。低分子化合物はコスト、安全面、簡便さから臨床応用に向け優れた選択肢といえる。本研究ではエピジェネティック制御因子も含めた化合物ライブラリーの中から心筋誘導を促進するものを探索した。心筋特異的蛋白であるα-Myosin Heavy Chain (αMHC)を蛍光標識したαMHC-Cre/Loxp-tdTomato (tdT)遺伝子改変マウスの線維芽細胞を用いて、心筋特異的転写因子に加えて各種化合物を導入することで誘導されるtdT陽性細胞数及び割合をcell image analyzerにより評価し、tdT陽性細胞の誘導を促進する化合物の絞り込みに成功した。その中で、心筋直接誘導を強く促進する新規子化合物として、化合物Aを同定した。化合物Aは心筋誘導因子に加えることでcTnT陽性細胞を強く促進することをflow cytometerで確認した。また、グローバルな遺伝子発現の変化をマイクロアレイで確認したところ、化合物Aを加えることで、心筋の発生・機能に関わる遺伝子群が顕著に上昇していた。今後は化合物Aによる心筋直接リプログラミング促進のメカニズムを解明していく。29年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究により心筋特異的転写因子であるGata4/Mef2cTbx5(GMT)またはGMT/Msep1/Myocdを導入することでマウスのin vitro、in vivo、さらにはヒト細胞で線維芽細胞からの心筋直接リプログラミングを可能とした。また、筋特異的マイクロRNAであるmiR-133により心筋誘導効率が改善すること、そのメカニズムとして上皮間葉移行のマスター因子であるSnai1を直接抑制することで線維芽細胞の特性が消去され、心筋誘導が促進することを明らかとした。これらによりジェネティックな障壁の一部が明らかとなったが、エピジェネティクスを含めた分子基盤に関しては未だ不明な点が多く、リプログラミング効率も依然十分とは言えない。低分子化合物は安全面、簡便さ、コスト面等から臨床応用に向け優れた選択肢といえる。本研究ではエピジェネティック制御因子も含めた化合物ライブラリーの中から心筋誘導を促進するものを探索することとした。心筋特異的蛋白であるα-Myosin Heavy Chain (αMHC)を蛍光標識したαMHC-Cre/Loxp-tdTomato (tdT)遺伝子改変マウスの尾部線維芽細胞を用いて、GMTに加えて各種低分子化合物の導入することで誘導されるtdT陽性細胞数及び割合をcell image analyzerにより評価し、high troughputscreeningを行った。これまでに、化合物ライブラリーに対して上記のスクリーニングを行い、tdT陽性細胞の誘導を促進する化合物の絞り込みに成功している。心筋特異的蛋白であるα-Myosin Heavy Chain (αMHC)を蛍光標識したαMHC-Cre/Loxp-tdTomato (tdT)遺伝子改変マウスの尾部線維芽細胞を用いて、心筋直接リプログラミングを促進する低分子化合物のスクリーニングの系を確立した。これまでの研究により心筋特異的転写因子を導入することでマウス、さらにはヒトで線維芽細胞からの心筋直接リプログラミングを可能とした。これらによりジェネティックな障壁が明らかとなったが、エピジェネティクスを含めた分子基盤に関しては不明な点が多く、リプログラミング効率も依然十分ではない。コスト、安全面、簡便さから臨床応用に向け優れている。心筋特異的蛋白であるαMHCを蛍光標識したαMHC-Cre/Loxp-tdTomato (tdT)遺伝子改変マウスの尾部線維芽細胞を用いて、心筋リプログラミング因子に加えて各種低分子化合物の導入することで誘導されるtdT陽性細胞数及び割合をcell image analyzerにより評価し、high-troughputscreeningを行い、tdT陽性細胞の誘導を促進する化合物の絞り込みに成功した。その中で、心筋直接リプログラミングを強く促進する新規子化合物として、化合物Aを同定した。化合物Aは心筋リプログラミング因子に加えることでcTnT陽性細胞を強く促進することをflow cytometerで確認した。これまでに心筋誘導促進化合物のスクリーニングの系を確立し、誘導を促進する化合物を同定している。

さらには、化合物による誘導促進のメカニズムをすでに一部解明しており、順調に研究が進展していると考える。これまでの研究により、心筋特異的転写因子を導入することでマウス及びヒトの線維芽細胞から心筋細胞の直接誘導を可能とした。また、筋特異的microRNAであるmiR-133により誘導効率が改善すること、そのメカニズムとして上皮間葉移行のマスター因子であるSnai1を直接抑制することで線維芽細胞の特性が消去され、心筋誘導が促進することを明らかとしたこれらによりジェネティックな障壁の一部が明らかとなったが、エピジェネティクスを含めた分子基盤に関しては未だ不明な点が多く、誘導効率も依然十分とは言えない。そこで、注目したのが低分子化合物である。低分子化合物はコスト、安全面、簡便さから臨床応用に向け優れた選択肢といえる。本研究ではエピジェネティック制御因子も含めた化合物ライブラリーの中から心筋誘導を促進するものを探索した。心筋特異的蛋白であるα-Myosin Heavy Chain (αMHC)を蛍光標識したαMHC-Cre/Loxp-tdTomato (tdT)遺伝子改変マウスの線維芽細胞を用いて、心筋特異的転写因子に加えて各種化合物を導入することで誘導されるtdT陽性細胞数及び割合をcell image analyzerにより評価し、tdT陽性細胞の誘導を促進する化合物の絞り込みに成功した。その中で、心筋直接誘導を強く促進する新規子化合物として、化合物Aを同定した。化合物Aは心筋誘導因子に加えることでcTnT陽性細胞を強く促進することをflow cytometerで確認した。また、グローバルな遺伝子発現の変化をマイクロアレイで確認したところ、化合物Aを加えることで、心筋の発生・機能に関わる遺伝子群が顕著に上昇していた。今後は化合物Aによる心筋直接リプログラミング促進のメカニズムを解明していく。今後は絞り込まれた候補化合物の中から顕著な新規心筋誘導促進因子を同定し、その薬理活性を明らかとすることで、心筋直接リプログラミングのエピジェネティック、ジェネティックな障壁の解明を目指す。今後は同定された化合物に関して、その標的因子を同定し、心筋直接誘導促進のメカニズム解明を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
von Willebrand(vW)病のvW因子機能ドメインの研究

vWfの血小板膜GPIbへの結合を抑制する2種のモノクロ-ナル抗体(MAb)の性状を研究し,in vitroでvWfのGPIb結合を惹起する2つのモジュレ-タ-,リストセチンおよびボトロセチンの作用機序を検討し,この両者の違いを明らかにした。次にこのvWfと血小板膜GPIbの結合に関与するとされるAurin Tricarboxylic Acid(ATA)の作用機序をGPIb結合に関与するvWfの2種のMAbを用い研究し,ATAはvWfとGPIbとの結合に特異的に作用し,既に報告したリストセチンを介するvWfの血小板膜GPIbの結合よりボトロセチンを介する結合をより特異的に抑制し(未発表)さらに血液還流実験でATAはvWf作用のより生理的な条件,すなわち血小板と損傷血管壁の間でhigh shear stress(高ずり応力)下での結合を特異的に抑制することを明らかにした。このことはvWfを介する血小板の損傷血管内皮下組織への粘着を抑制する新たな抗血栓剤開発に大きく寄与するものと考えられる。また,この2種のMAbを用いて各種von Willebrand病(vWd)の血漿vWfの構造解析を行ったいる。2.vWfのコラゲン線維結合能に関する研究.vWfのコラゲン線維への結合様式およびそのvWfのエピト-プについてはフランスおよび教室のMAbを用いて明らかにした。すなわち,その結合はCaイオンに関係せず,容易に混和するだけで結合し,vWf側の結合エピト-プはvWfの最小構成単位(サブユニット)のアミノ酸残基911ー1365の間に存在することを示した。またvWd各種病型でのvWfのコラゲン線維との結合を研究し,そのなかでvWfサブユニットのより重合した高分子vWfがよりコラゲン結合能を示し,vWdでは重合障害がみられるtypeIIA,IICで結合能の低下がみられた。さらに,同程度の重合を示す正常クリオ上清より結合能の低下がみられたことから,これら疾患での異常部位がコラゲン結合部位の近傍かvWf構造変化に伴いコラゲン結合部位の異常をもたらしたものと推定された。3.vWdのサブユニット構造の解析.vWdのvWfのコラゲン線維の結合能を解析する中で,vWdのvWfサブユニット解析を検討した。従来,vWfのサブユニット解析は血漿vWfを部分純化する必要があり,数mlー数十mlと大量に血漿を必要とした。しかし,還元vWfと反応する抗体の作成によりわずか30μlで分析が可能となった。さらに,従来,報告されていたvWfのサブバンドより,より多くのバンドの分析を可能にした。またこの分析法にてvWd typeI,IIA例でのバンド異常を明らかにした(未発表)。von Willebrand病(vWd)のvon Willebrand因子(vWf)の構造および機能の解析にまず既に作成した5種のmonoclonal antibodies(MoAbs)のepitope分析およびそのvWf機能への影響について検索した。以下、便宜上NMC/vW1-5と省略。エピト-プ分析には精製vWfおよびその酵素(SP-V8,trypsin)処理fragmentsを作成および純化した。それらは、各々SPIII(vWfsubunitのアミノ酸1-1365までのhomo-dimer)、SPII(アミノ酸1366からC-terminal2050のhomo-dimer)、SPI(アミノ酸911-1365)のmonomer,vWfのN末fragment(アミノ酸1-278)である。vWf機能へのMoAbの影響については凝固因子第VIII因子への結合能、血小板GPIbへの結合能(ristocetin,botrocetin)、GPIIb/IIIa(thrombin刺激血小板)への結合能、collagenへの結合能およびヘパリンへの結合能について検索した。結果;MoAbsのepitopeの局在はNMC/vW1,3,4,5はSPIII上に、NMC/vW2はSPII上に、NMC/vW1,3,5はSPI上に存在した。また、NMC/vW4はvWfのristocetinおよびbotrocetin誘導血小板GPIbへの結合およびヘパリンへの結合能を完全に抑制した。NMC/vW3はvWfとhuman type III collagenとの結合を抑制した。しかし、他のSPI上にepitopeを有する2種のMoAb(NMC/vW1および5)は抑制しなかった。次にvWdの血漿中vWfのcollagenへの結合能を検索した。方法は血漿vWfと予め調整したfibrillar collagenをpolystylen tube内で反応させ、結合しなかった残存vWf量をcontrolとして用いた熱処理変性collgenとの結合能と比較し算出した。また、上述のMoAbsの影響およびheparin,Caイオンの影響をみた。結果、血漿vWfはspecificおよびsaturableに、またheparinおよびCaイオンの影響を受けずに結合することが明かとなった。また、次に各種vWfの変異病型の血漿vWfのcollagen結合能を測定した。その結果、変異病型でcollgenとの結合能の低下を認め、特にtypeIIA,IICでは有意に低下していることが明かとなった。1.vW病のコラゲン結合ドメイン:vW病患者血漿vW因子の人胎盤由来typeIIIコラゲン

繊維への結合能を測定した。本測定から、患者血漿vW因子はコラゲン繊維へdoseーdependent様式で結合し、この結合にはCaイオン,ヘパリンの影響は認めなかった。又、vW因子のコラゲン結合ドメインを確認するモノクロ-ナル抗体(NMC,vW/3)で完全に抑制された。次にvW病各種病型の患者vW因子のコラゲン結合能を測定した。結果は、高分子重合障害のみられる異型vW病でコラゲン結合能の低下を認めた。2.vW病のGPIb結合ドメイン:vW因子と血小板膜糖蛋白GPIbの結合をmodulateするものに抗生剤の一種リストセチン及び蛇青の成分ボトロセチンが存在する。一方、このvW因子のGPIb結合ドメインを認識するモノクロ-ナル抗体(NMC.vW/4,322)の特性について報告されているが、今回、更にこの2種のmodulatarsと2種のモノクロ-ナル抗体との関係を分抗し、2種のmodulatorsのvW因子の作用機序の違いを明らかにすると共に、合成ペプタイドを用いた研究からvW因子のGPIb結合ドメインの解析をおし進めた。又、この2種のモノクロ-ナル抗体のvW病患者vW因子への結合様式の違いを見い出しているが、まだ結論を得るには至っていない。3.vW病のvW因子糖鎖分析:vW因子糖鎖結合にはN・O両グリコシド結合の存在が明らかにされている。又、Nグリコシド結合糖鎖構造の解析も報告されている。しかし、vW因子の糖鎖と機能との関係は不明な点が多い。そこでvW病の血漿vW因子糖鎖分析法を考案した。現在、定量性、特異性を確認し、検体を測定中で、近く発表予定である。1.von Willebrand因子(vWf)の血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)への結合に関する研究.vWfの血小板膜GPIbへの結合を抑制する2種のモノクロ-ナル抗体(MAb)の性状を研究し,in vitroでvWfのGPIb結合を惹起する2つのモジュレ-タ-,リストセチンおよびボトロセチンの作用機序を検討し,この両者の違いを明らかにした。次にこのvWfと血小板膜GPIbの結合に関与するとされるAurin Tricarboxylic Acid(ATA)の作用機序をGPIb結合に関与するvWfの2種のMAbを用い研究し,ATAはvWfとGPIbとの結合に特異的に作用し,既に報告したリストセチンを介するvWfの血小板膜GPIbの結合よりボトロセチンを介する結合をより特異的に抑制し(未発表)さらに血液還流実験でATAはvWf作用のより生理的な条件,すなわち血小板と損傷血管壁の間でhigh shear stress(高ずり応力)下での結合を特異的に抑制することを明らかにした。このことはvWfを介する血小板の損傷血管内皮下組織への粘着を抑制する新たな抗血栓剤開発に大きく寄与するものと考えられる。また,この2種のMAbを用いて各種von Willebrand病(vWd)の血漿vWfの構造解析を行ったいる。2.vWfのコラゲン線維結合能に関する研究.vWfのコラゲン線維への結合様式およびそのvWfのエピト-プについてはフランスおよび教室のMAbを用いて明らかにした。すなわち,その結合はCaイオンに関係せず,容易に混和するだけで結合し,vWf側の結合エピト-プはvWfの最小構成単位(サブユニット)のアミノ酸残基911ー1365の間に存在することを示した。
片側パターン電極を用いた電気粘性流体援用研磨

電場で粘性が制御可能な流体を電気粘性流体(ER流体)と言う.このER流体に研磨砥粒を混合したスラリー(ERスラリーと呼ぶ)を用い,電場を印可しながら研磨を行なうと研磨効果に差が見られることが先行研究で知られていた.本研究では,片側電極パターンを用い,電場印可を片面にて行なうことで絶縁物への適応も可能なER流体援用研磨法に関する研究を行なった.具体的には,まず,砥粒を混合していない状態のER流体に対して片側電極を用いた場合の粘性特性に関して調査を行なった.高分子液晶系ER流体に対する片側電極上での粘性特性は先行研究で知られていたが,本研究では新たに低分子液晶に関しても同等の実験を行い,低分子液晶の電気粘性特性が片側パターン電極上でも発現すること,その特性が電極パターンに依存すること,非常に低速領域では電場の有無による粘性変化率が大きいことを初めて確認した.これらの成果は,今回の研磨を目的とした用途以外にも潤滑制御にも適用できる可能性があることを見出した.また,砥粒の種類(粒径,材質)や充填率によるERスラリーの粘性特性に関しても調査を行なった.砥粒の種類としては主にダイヤモンド砥粒とWA砥粒を用いた.ダイヤモンド砥粒(粒径3-8μm)を用いた実験では,充填率が10wt%,20wt%の場合においてはER流体の粘性変化特性に大きく影響を与えず,研磨制御用スラリーに適応可能であることを確認した.また,30wt%以上の場合には粘性変化効果が減少することも確認された.WA砥粒(#500から#8000)に関しては一様に充填率10wt%の場合はER効果への影響がないが,20wt%以上になると電流の急激な上昇が起こり,研磨への適用が困難であることがわかった.これらの成果で作製されたERスラリーを用いて研磨実験を行い,電場を印可した場合に研磨効率が上昇することが確認された.本研究課題は,電気粘性流体(ER流体)を用いた研磨加工に関する研究である.電場援用型の複合研磨手法として捉えることができる.特に片側パターン電極を用いた新規の研磨手法を開発することを目的としており,この点において従来の電場援用型研磨手法とは異なる.本研究で得られた結果は以下のとおりである.1.高分子液晶系ER流体を研磨液として用いることにより,そのER効果を利用することによって研磨加工の加工効率制御が可能であることを確認した.2.使用する片側電極のパターン形状によって,加工性能に変化があることを表面粗さ計およびAFM観察によって確認した.3.片側パターン電極上でのER流体の粘度特性を評価し,そのER効果がパターン形状によって変化することが確認された.このER効果の変化が上記2の加工効率に影響していることが推測される.また,低分子液晶においてもパターン形状によるER効果が確認された.4.ER流体と研磨砥粒の混合スラリーにおいても,上記3と同様のER効果を確認した.5.上記3の原因を解明するため電場解析を行い,ER流体の配向方向が電場分布によって決定されると仮定した場合,パターン電極の形状によってその粘度特性が異なることが確認された.6.ER流体の粘度変化モデルを構築し,数値解析的手法によってその正当性を評価した.適応範囲を限定すれば,本モデルを用いることによって流動特性の予測が可能であることが確認された.電場で粘性が制御可能な流体を電気粘性流体(ER流体)と言う.このER流体に研磨砥粒を混合したスラリー(ERスラリーと呼ぶ)を用い,電場を印可しながら研磨を行なうと研磨効果に差が見られることが先行研究で知られていた.本研究では,片側電極パターンを用い,電場印可を片面にて行なうことで絶縁物への適応も可能なER流体援用研磨法に関する研究を行なった.具体的には,まず,砥粒を混合していない状態のER流体に対して片側電極を用いた場合の粘性特性に関して調査を行なった.高分子液晶系ER流体に対する片側電極上での粘性特性は先行研究で知られていたが,本研究では新たに低分子液晶に関しても同等の実験を行い,低分子液晶の電気粘性特性が片側パターン電極上でも発現すること,その特性が電極パターンに依存すること,非常に低速領域では電場の有無による粘性変化率が大きいことを初めて確認した.これらの成果は,今回の研磨を目的とした用途以外にも潤滑制御にも適用できる可能性があることを見出した.また,砥粒の種類(粒径,材質)や充填率によるERスラリーの粘性特性に関しても調査を行なった.砥粒の種類としては主にダイヤモンド砥粒とWA砥粒を用いた.ダイヤモンド砥粒(粒径3-8μm)を用いた実験では,充填率が10wt%,20wt%の場合においてはER流体の粘性変化特性に大きく影響を与えず,研磨制御用スラリーに適応可能であることを確認した.また,30wt%以上の場合には粘性変化効果が減少することも確認された.WA砥粒(#500から#8000)に関しては一様に充填率10wt%の場合はER効果への影響がないが,20wt%以上になると電流の急激な上昇が起こり,研磨への適用が困難であることがわかった.これらの成果で作製されたERスラリーを用いて研磨実験を行い,電場を印可した場合に研磨効率が上昇することが確認された.
新規手法を用いたショウジョウバエ母性胚性遷移におけるマイクロRNA経路の機能解析

動物発生における母性-胚性遷移(maternao-to-zygotic transition; MZT)は、卵内の母性情報を消去し、胚ゲノムの情報に従った発生プログラムへと移行する過程であり、動物種をこえた普遍的現象である。本研究では、ショウジョウバエMZTにおけるmiRNA経路の機能について解析を試みた。具体的には、miRNA経路因子であるDcr-1, Ago1, GwについてGFPノックイン系統を作成した。そして、GFP融合タンパク質を分解に導くdeGradFPシステムを初期胚で活性化させた。その結果、Gwをノックダウンすると約50%の胚においてMZTが起きる胚発生初期に致死となった。動物発生における母性-胚性遷移(maternal-to-zygotic transition: MZT)は、卵内の母性因子を消去し、胚ゲノムの情報にしたがった発生プログラムへと移行する過程であり、動物種をこえた普遍的現象である。脊椎動物のMZTにおける母性RNAの分解には、miRNA経路が中心的役割を果たす。一方、ショウジョウバエでは、miRNA経路の因子の突然変異は卵形成不全となることから、MZT実行経路の詳細は不明のままである。本研究では、ゲノム編集と新規技術を確立する事により、MZTにおけるmiRNA経路の機能について解析を試みている。具体的には、CRISPR-Cas9を利用した遺伝子ノックイン手法を用いて、miRNA経路因子にGFPをノックインした。次にGFP融合タンパク質を特異的にユビキチン化して分解に導くNSlmb-vhhGFP4を卵形成過程から転写させつつ、排卵後に翻訳させることの出来るsmaug (smg)遺伝子のプロモーターと3 'UTRに連結したトランスジェニック系統(smg-NSlmb-vhhGFP4)を作製した。そして、両者を掛け合わせることにより、標的遺伝子の機能を卵形成過程ではGFP融合タンパク質の状態で維持しつつ、排卵後の胚性遺伝子の活性化が始まる前に分解誘導するシステムを構築した。現在までに、miRNA経路の遺伝子のうち、Dicer-1 (Dcr-1)とGw182 (Gawky)についてGFPノックイン系統の作製に成功した。これらGFP系統とsmg-NSlmb-vhhGFP4系統との掛け合わせた。その結果、Gw182をノックダウンすると胞胚期前に胚発生が停止することから、Gw182は胚発生初期に必須の機能を持つことが判明した。一方、Dcr-1については、今のところノックダウンによる異常は見られていない。本年度は、smg-NSlmb-vhhGFP4が実際に、卵形成過程ではGFP融合タンパク質を分解誘導することなしに、初期胚の胞胚期までに分解を引き起こすことが出来ることを確認した。次に、GFPノックイン系統の作製については、Dcr-1とGawkyについてはN末端側にGFPがノックインされた系統の作製に成功した。一方、Ago1については、複数の転写・翻訳開始点が存在することから、当初、C末端側にGFPをノックインすることを計画して実験を進めてきた。しかし、既に公表されていたX線構造解析を詳細に検討したところ、C末端のカルボキシ基が、miRNAの認識に必須であり、C末端側配列の付加はAgo1の機能を喪失させることが判明した。このように当初計画していた3つのmiRNA経路因子の内、2つについて作成が完了しているが、Ago1のノックイン系統については、いまだ完了していない。動物発生における母性-胚性遷移(maternal-to-ztgotic transition: MZT)は、卵内の母性因子を消去し,胚ゲノムの情報に従った発生プログラムへと移行する過程であり、動物種をこえた普遍的な現象である。脊椎動物のMZTにおける母性RNAの分解には、miRNA経路が中心的な役割を果たす。一方、ショウジョウバエでは、miRNA経路因子の突然変異体は卵形成不全となることから、MZTにおけるmiRNA経路経路の機能について、詳細は不明のままである。そこで、本研究ではゲノム編集技術を用いて、miRNA経路の主要因子であるDcr-1, Ago1, Gwについて、GFPをノックインした系統を作出した。さらに、GFPをデグロンとして認識して特異的にユビキチン化して分解に導くNSlmb-vhhGFP4を、初期胚で特異的に翻訳させることにより、miRNA経路因子の機能を卵形成過程ではGFP融合タンパク質として維持しつつ、排卵後に特異的に分解誘導する実験系を構築した。このような実験系を用いて、miRNA経路因子のMZTにおける役割を解析することを試みた。現在までに、Dcr-1, Ago1, GwのGFPノックイン系統を作出した。また、NSlmb-vhhGFP4を卵形成過程から転写させつつ、排卵後に翻訳させるトランスジェニック系統の作出も成功した。しかし、Dcr-1とAgo1に関して、排卵後にノックダウンした胚は正常に発生した。これら因子は基底状態の発現レベル自体が低く、効率的にノックダウンされていないと考えられた。一方、Gwに関しては、母性・胚性の両遺伝子を初期胚でノックダウンすることにより、高頻度で胚発生異常が観察された。今後、Gwノックダウン胚における母性RNAの動態を検討するためRNA-seq解析を進める。

具体的には、miRNA経路因子であるDcr-1, Ago1, GwについてGFPノックイン系統を作成した。そして、GFP融合タンパク質を分解に導くdeGradFPシステムを初期胚で活性化させた。その結果、Gwをノックダウンすると約50%の胚においてMZTが起きる胚発生初期に致死となった。前述のようにAgo1には複数の翻訳開始点が存在することから、GFPを複数部位に挿入するか、アイソフォーム間で共通する配列中に挿入する必要がある。構造を詳細に検討することにより、どちらのストラテジーを選択するのかを決定する予定にしている。また、Dcr-1については、NSlmb-vhhGFP4によるノックダウンでは,初期胚発生における異常が観察されていない。Dcr-1はmiRNAの成熟に必須の機能を持つことを考えると、初期胚でのノックダウンによって異常が生じることが期待される。従って、NSlmb-vhhGFP4が効率的にはDcr-1を分解誘導できていない可能性が考えられる。そこで、NSlmb-vhhGFP4とは別のGFP表面と結合するようなユビキチン化因子を作製することを計画したい。具体的には、vhhGFP4途は別にGFPと特異的に結合することの出来るペプチド配列として、GBP4と3G86.32を選択した。これらをNSlmbと融合させた遺伝子をsmg制御配列化に挿入したトランスジェニック系統を作成する予定である。発生生物学
酸化ストレス感知とレドックス細胞制御機構の解析

細胞内外で発生する活性酸素種は、過剰な場合は細胞にダメージを与えたり細胞死を誘導したりするため、様々な病気の発症への寄与が考えられている。一方で少量の活性酸素種は細胞増殖を促進する。では、細胞死と細胞増殖という異なった方向性(細胞の運命)はどのように決定されているのであろうか?本研究では、これまで抗酸化蛋白質と考えられてきたペルオキシレドキシンが活性酸素種の受容体として働き、酸化ストレスに応答した糖代謝や蛋白質合成の制御を行うことを初めて明らかにした。(PRDX5依存的Bag1のレドックス制御によるeIF2alfaのリン酸化制御機構)小胞体ストレスやウイルス感染を防御するために、哺乳動物細胞は一過的にグローバルなタンパク質合成を阻害する。これは翻訳に必須な翻訳開始因子eIF2alfaのリン酸化を介して起こることが知られている。このeIF2alfaのリン酸化は酸化ストレスによっても誘導されることが知られているがそのメカニズムは明らかにされていない。本研究からヒトペルオキシレドキシンV(PRDX5)によるBag1のレドックス制御がeIF2alfaのリン酸化の制御に寄与していることが示唆された。これまでPARK、PKRやHRI等のeIF2alfaキナーゼが酸化ストレスに活性化に寄与することが報告されているが、我々が得た知見はこれを覆す可能性がある。すなわちPRDX5依存的なBag1のレドックス制御がeIF2alfa脱リン酸化酵素を制御するというものである。(Pyk1のレドックス制御とジスルフィド結合に寄与するシステイン残基の同定)Pyk1は糖代謝の過程でホスホエノールピルビン酸(PEP)よりビルビン酸合成をおこなう唯一の酵素である。グルコースが枯渇した条件ではエタノールや酢酸を材料として糖新生を行い核酸等の代謝産物を得る必要があるが、その際にはPyk1の活性が抑制されなければならない。すなわち合成されたPEPが残存したPyk1の活性により再びピルビン酸に変換され効率の良い糖新生が行われない状況が想定される。本研究では、酵母ペルオキシレドキシンTsa1によるレドックス制御されると考えられるシステイン残基を同定した。さらに、Pyk1が酸化されるとピルビン酸合成活性が低下することが判明した。これらの結果は、Pyk1がレドックス抑制制御されることを強く示唆しており、糖代謝のレドックス制御の可能性を示すものである。"(PRDX5依存的Bag1のレドックス制御によるeIF2alfaのリン酸化制御機構)小胞体ストレスやウイルス感染を防御するために、哺乳動物細胞は一過的にグローバルなタンパク質合成を阻害する。本研究からヒトペルオキシレドキシンV(PRDX5)によるBag1のレドックス制御がeIF2alfaのリン酸化の制御に寄与していることが明らかにされた。(Pyk1のレドックス制御とジスルフィド結合に寄与するシステイン残基の同定)ピルビン酸キナーゼPyk1は糖代謝の過程でホスホエノールピルビン酸(PEP)よりビルビン酸合成をおこなう唯一の酵素である。すなわちPyk1活性が残存すると合成されたPEPが再びピルビン酸に変換され糖新生効率が低下することが考えられる。本研究によりPyk1が酵母ペルオキシレドキシンTsa1依存的にレドックス抑制制御されることが示唆された。これは、環境変化に適応するため細胞は過酸化水素をシグナル分子としてエネルギー代謝をレドックス制御するという新たな機構の可能性を初めて示すものである。1、ヒトペルオキシレドキシンVによる酸化ストレス依存的eIF2alfaのリン酸化を制御真核生物は、ストレスに適応するための選択的な因子の蛋白質合成の誘導機構を備えている。グローバルな蛋白質合成抑制と抗ストレス因子の蛋白質合成のみを特異的に誘導する翻訳のリプログラミング機構である。この制御に中心的に機能しているのが翻訳開始因子eIF2alfaのリン酸化を介した機構である。eIF2alfaのリン酸化は、小胞体ストレスではPERKが、ウイルス感染ではPKRといったeIF2alfaキナーゼの活性化に起因する。

しかし、これらのキナーゼは酸化ストレスによって活性化されない。本研究により、ヒトペルオキシレドキシンV(PRDX5)が過酸化水素存在下でBag1を酸化し、その結果、eIF2alfaの脱リン酸化酵素GADD34-PP1の活性が抑制されることを見出した。すなわち、構成的なeIF2alfaキナーゼ活性によるリン酸化eIF2alfaのレベルは、通常GADD34-PP1活性により抑えられているが、酸化型Bag1とGADD34-PP1が結合することでこの脱リン酸化が抑制される。新たな翻訳リプログラミング機構が酸化ストレス応答においては役割を果たす。2.酵母ピルビン酸キナーゼのレドックス制御はグルコース枯渇時の酸化ストレス応答に必須であるピルビン酸キナーゼPyk1は糖代謝の過程でホスホエノールピルビン酸(PEP)よりビルビン酸合成をおこなう唯一の経路を担う酵素である。グルコースが枯渇した条件では核酸等の代謝産物を得るために糖新生を行うが、そのためには糖新生過程で合成されたPEPを消費するPyk1の活性は抑制される必要があるがその機構は不明であった。本研究によりPyk1が酵母ペルオキシレドキシンTsa1に依存的にレドックス抑制制御されることが明らかになった。また、この制御がグルコース枯渇下の酸化ストレス応答に必須であることを明らかにした。これらの知見は、グルコース枯渇下の定常期の酵母細胞の酸化ストレス応答には糖新生によるNADPHの誘導合成が必要であり、Pyk1のレドックス抑制制御は糖新生の誘導機構である可能性を示している。
運動のがん予防効果に関する研究

平成16年度、ラットに、2種類の強度の習慣的な水泳運動を課し、その後、腎に酸化ストレスを誘発し腎がんを発生させる鉄ニトリロ三酢酸(Fe-NTA)を投与し、腎・横隔膜等の臓器を採取・保存した。今年度は、それらの臓器の酸化的DNA損傷(8-oxo-guanine、8-oxo-G)、抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性、8-oxo-Gの修復酵素であるオキソグアニン・グリコシラーゼ(OGG1)のタンパク量を測定し、習慣的運動が酸化損傷を誘発するか、習慣的運動が発がん、特に酸化ストレスによる発がんイニシエーションに影響を与えるかを解析した。その結果、習慣的運動は腎の8-oxo-Gを増加させなかった。Fe-NTA投与により酸化ストレスを誘発したところ、運動群、非運動群とも腎の8-oxo-Gは有意に増加した。しかし、運動群が非運動群より8-oxo-Gは有意に低く、さらに運動強度の高い群ほど、8-oxo-Gは低かった。なぜ運動が酸化ストレスを軽減したかを明らかにするため、SOD活性並びにOGG1タンパク量を測定した。運動群では腎並びに横隔膜のSOD活性が有意に上昇していた。一方腎のOGG1タンパク量は運動群で有意に低下していた。これらのことから、今回の強度の習慣的運動は酸化的DNA損傷を誘発せず、習慣的運動は酸化ストレス耐性を増加させ、過大な酸化ストレスを軽減し、発がんイニシエーションを抑制することが示唆された。次にラットにトレッドミル運動を40週間負荷し、習慣的運動が、Fe-NTAが誘発する腎がんに影響を与えるかを検討した。その結果、習慣的運動は腎がんの発生率を有意に抑制した。しかし、がんの大きさは習慣的運動群で増大していた。腎がん発生率の抑制は運動によるイニシエーションの抑制と考えている。がんが増大した機序について、細胞増殖、アポトーシス、血管増生の面から検討中である。我々は、酸化ストレス耐性が習慣的な運動で強化されることを明らかにしている。そして習慣的な運動が、発がんイニシエーションを抑制することを明らかにした。本実験では、習慣的な運動が、イニシエーションの抑制にとどまらず、活性酸素によるがんの発生を抑制するかを検討している。発がん実験は長い実験期間を要するため、現在実験中である。ラットを運動群、非運動群に分け、運動群にはトレッドミルによる運動を15分間、週3回負荷し、両群に活性酸素を発生し腎がんを誘発する鉄ニトリロ三酢酸(Fe-NTA)を、週3回12週間腹腔内に投与した。Fe-NTA投与終了後は、運動群の運動時間を30分間、運動頻度を週5回にして、運動を継続し、実験開始1年6ヶ月後にラットをと殺し、腎がんの発生におよぼす、運動の影響を検討する。現在、Fe-NTA投与群では体重増加が少ないこと、運動群では非運動群に比べ体重増加が少ないことを認めている。発がんには摂取カロリーが影響を及ぼすため、運動群ラットの摂食量を測定し、非運動群には運動群と同じ食餌量を与えている。また習慣的な運動を行うことにより、活性酸素に対する耐性がどのように変動するかを検討する目的で、習慣的な運動が、抗酸化酵素活性や酸化的DNA損傷レベルのみでなく、酸化的DNA損傷の修復能に与える影響も検討する予定である。そのため、酸化的DNA損傷の代表的な指標である8ヒドロキシグアニン(8OHG)修復活性の測定法を開発している。8OHGは専らOGG1により修復されるが、ヒトOGG1を用い、その活性を測定するために、基質の種類、基質濃度、反応時間の検討を行っており、OGG1が0.05u以下でも測定できるアッセイ法を開発した。今後、このアッセイ法を用い、培養細胞やヒト血球中のOGG1が測定可能であるかを検討するとともに、約1年後に採取する運動群並びに非運動群の臓器におけるOGG1活性を測定する予定である。

次にラットにトレッドミル運動を40週間負荷し、習慣的運動が、Fe-NTAが誘発する腎がんに影響を与えるかを検討した。その結果、習慣的運動は腎がんの発生率を有意に抑制した。しかし、がんの大きさは習慣的運動群で増大していた。腎がん発生率の抑制は運動によるイニシエーションの抑制と考えている。がんが増大した機序について、細胞増殖、アポトーシス、血管増生の面から検討中である。
自然免疫の鍵物質の構造と機能に関する化学的研究

バクテリアに特有の細胞表層化学成分が、動物の免疫力を強化するという現象は古くから知られていた。本研究ではわれわれのグループが以前に合成的にそれぞれの活性本体であることを証明したペプチドグリカンの成分・ムラミルジペプチド(MDP)とリポ多糖の糖脂質部・リピドAについて、その活性発現の機構を精密な構造に基づいて理解するために行ったものである。初年度に引き続いて以下のような成果をあげた。MDPの活性確認以来、われわれを含む多くの研究者によって求められてきたその受容体が、動物細胞内にミシガン大学の猪原らによって見だされた蛋白質NOD2であること、四糖、八糖を含むMDPよりも分子量の大きいペプチドグリカン部分構造もこのNOD2を介して活性を発現することが、合成化合物を用いて証明できた。さらに同じく細胞内に存在するNOD1がグラム陰性菌に特有のジアミノピメリン酸を含むペプチドに対する受容体であることも明らかにできた。一方、動物細胞表層の受容体TLR2が、疎水性に修飾したペプチドグリカン部分構造を認識することから、これまで不明であったペプチドグリカンそのものの活性発現機構解明の鍵が得られた。リポ多糖や、その活性本体リピドAの受容体が動物細胞表層のTLR4であることはすでに明らかになっているが、その機能発現に関わる蛋白質MD2の役割を東京大学・三宅らと協力して明らかにした。またリポ多糖の内毒素作用を抑制するある種のリピドA誘導体のアンタゴニスト活性について、種々の関連化合物を合成して内毒素活性とアンタゴニスト活性を分ける構造要因を安定配座計算の手法と活性試験によって追求した。さらにその結果に基づいて配座を固定した誘導体の合成を進めた。自然免疫を始動する代表的な化合物・リポ多糖の活性部位リピドAについて、まずアフィニティー精製を活用した効率的な合成法を開発し、多数の類縁体を合成して、アシル基の分布や鎖長が活性に与える影響を解明する道を拓き、さらに計算化学的な手法によるアシル基の疎水的親和力と分子のかたちが活性に与える影響を解析した。リピドAの受容体であることを昨年明らかにした膜蛋白質TLR4とリピドA分子の相互作用を実証するためにリピドAの蛍光標識体の合成を検討し、広く複合糖質の標識に応用できる手法を考案して、生物活性を保持した蛍光標識リピドA合成に成功した。合成標識体はすでに受容体との相互作用解析研究に使用されている。大腸菌リピドAとは異なる活性パターンを示すHericobacter pylori菌のリピドAとその誘導体を合成して、このリピドAの活性の特徴を化学構造に基づいて解析した。リポ多糖と並んで古くから免疫増強活性を有することが知られているペプチドグリカン(PGN)については、その受容体がまだ明確に証明されていない。本研究では過去にPGNの受容体候補であると示唆された膜蛋白質TLR2が、合成されたPGNの明確な部分構造によって活性化されることを確認するために、ムラミルジペプチドの構造を基礎に、より長い糖鎖構造、それに種々のペプチド鎖の結合した化合物などを化学的に合成した。ミシガン大・猪原らとの協同研究の結果、予期に反して八糖程度までの構造はTLR2ではなく、細胞内に存在するNOD2と呼ばれる新しい受容体を介して免疫系細胞を活性化することが明らかになり、高等動物が多重の監視機構によってバクテリアから身を譲る複雑かつ周到な自然免疫の機構の一つがまた明らかになった。糖鎖合成の効率化と選択性向上を図るためにマイクロ波を用いる手法や固相合成法など新たな展開を検討して成果を挙げた。バクテリアに特有の細胞表層

化学成分が、動物の免疫力を強化するという現象は古くから知られていた。本研究ではわれわれのグループが以前に合成的にそれぞれの活性本体であることを証明したペプチドグリカンの成分・ムラミルジペプチド(MDP)とリポ多糖の糖脂質部・リピドAについて、その活性発現の機構を精密な構造に基づいて理解するために行ったものである。初年度に引き続いて以下のような成果をあげた。MDPの活性確認以来、われわれを含む多くの研究者によって求められてきたその受容体が、動物細胞内にミシガン大学の猪原らによって見だされた蛋白質NOD2であること、四糖、八糖を含むMDPよりも分子量の大きいペプチドグリカン部分構造もこのNOD2を介して活性を発現することが、合成化合物を用いて証明できた。さらに同じく細胞内に存在するNOD1がグラム陰性菌に特有のジアミノピメリン酸を含むペプチドに対する受容体であることも明らかにできた。一方、動物細胞表層の受容体TLR2が、疎水性に修飾したペプチドグリカン部分構造を認識することから、これまで不明であったペプチドグリカンそのものの活性発現機構解明の鍵が得られた。リポ多糖や、その活性本体リピドAの受容体が動物細胞表層のTLR4であることはすでに明らかになっているが、その機能発現に関わる蛋白質MD2の役割を東京大学・三宅らと協力して明らかにした。またリポ多糖の内毒素作用を抑制するある種のリピドA誘導体のアンタゴニスト活性について、種々の関連化合物を合成して内毒素活性とアンタゴニスト活性を分ける構造要因を安定配座計算の手法と活性試験によって追求した。さらにその結果に基づいて配座を固定した誘導体の合成を進めた。
布の湿り感を錯覚的に再現する手法の検討

主な研究実績としては、なぞり動作時の布の湿り感知覚特性に関する知見を得たことである。当該年度は、1件の国内学会発表および1件の査読有り国際学会発表(1st 1件)を行った。当初の計画では、当該年度は布をなぞって触れながら湿り感を提示するための、振動刺激の効果を検討することを目標としていた。しかしながら、2017年度、温冷刺激の効果を検討した結果、なぞり動作時でも布の冷たさのみから湿り感を錯覚する可能性が示唆された。そこで、当該年度は摩擦の影響を考慮し触動作の条件を追加して、改めて冷たさのみによる湿り感錯覚について、なぞり動作時にも適用でき得るのかを検討した。触動作として、これまで錯覚が生じると証明されてきた静的な接触と、なぞり動作を比較した。さらに、触れる際の押下圧にも注目し、摩擦の大小について比較した。その結果、湿り感の錯覚に押下圧の影響は見られず、触り方(静的接触・なぞり動作)によって湿り感錯覚の生じやすさが異なっていた。具体的には、なぞり動作時、冷却した乾燥布からは湿り感を錯覚しなかった。ただし、この結果は個人差が大きかったため、クラスタ分析により全被験者を3つのグループに分けた。1つ目のグループは触り方に依らず、「冷感」を重要視して湿り感を判断するグループ、2つ目のグループは触り方に依らず、「機械刺激の感覚(柔らかさ・摩擦等)」を重要視して湿り感を判断するグループ、3つ目のグループは触り方によって、湿り感を判断するためのキーファクターを変えるグループ、であるとわかった。この研究から、より多くの人を対象としてなぞり動作で湿り感錯覚を生起させるためには、冷たさに加え摩擦などの機械刺激の感覚を追加して提示する必要があるということがわかり、布の湿り感提示装置の開発指針を明確にした。現在までの進捗は、当初の計画とは異なるが、なぞり動作時における湿り感提示に必要な物理刺激を把握することできたため、おおむね順調といえる。当初の計画では、2017年度になぞり動作時の湿り感知覚における冷刺激の効果を検討し、2018年度に湿り感の知覚における振動刺激の効果を検討し、2019年度に冷刺激と振動刺激を組み合わせて湿り感提示手法を検討する、としていた。当該年度は2017年度に引き続き、なぞり動作時の布の冷たさによる湿り感錯覚を調査し、なぞり動作時に湿り感錯覚が生じる条件を調査した。その結果、湿り感知覚における個々人の戦略の違いが示唆され、手掌でなぞって布に触れるときは「冷感」に加え「機械刺激の感覚」の提示の必要性を明らかにした。現在までに、布をなぞって触れるとき、冷たさだけでは湿り感を錯覚しにくいことがわかった。この結果を踏まえ、今後、なぞり動作時に湿り感を提示するため、冷感に加えて機械刺激の感覚(摩擦感・滑らかさ感)を追加する手法を検討する。そのために、「疑似力覚(pseud-haptics)」に注目する。疑似力覚とは視覚情報が「触覚」の知覚を促すことで、たとえばマウスカーソルを使って画面を操作するときカーソルの移動量がマウスの移動量よりも小さいとき、あたかもマウスが重くなったかのように感じる現象のことである。この現象を利用して、なぞり時の湿り感錯覚を生起させられるかを検討する。映像を見ながら冷乾燥布をなぞると、Pseud-hapticsを生じると想定される条件(映像の変化速度が実際よりも遅い)では、乾燥した布をなぞっていながらも水分を含んだ布のような「摩擦感」を錯覚するのではないかと仮定する。この仮説を検証するために、2019年度は、Pseud-hapticsを利用しながら、なぞり時の湿り感を評価する実験を行う。主な研究実績としては、なぞり動作時の布の湿り感特性に関する知見を得たことである。さらに、布以外の物体における湿り感についても評価した。当該年度は、査読付き国内学会論文誌1件(1st 1件)、国内学会発表9件(1st 3件)、査読付き国際学会発表1件(1st 1件)の発表を行った。また、オランダに留学して研究を進め、この内容は査読付き国際学会にて平成30年6月に発表予定(採択率24%)である。当初の計画では、指の両脇部に温度刺激を提示することによって指腹部に温冷感を錯覚する装置を利用し、布に触れるとき湿り感を提示するために適切な温度刺激の制御手法を検討することと申請した。これは修士時代までに得た、布の温度制御による湿り感錯覚の手法を基に、皮膚の冷却から対象物体に温冷感を知覚させる手法によって湿り感を提示するというアイディアである。その前に、既存手法である布の温度制御によって、布をなぞったときの湿り感を評価した。乾燥した布の表面温度を冷却するという温度制御によって、知覚される湿り感の強度を心理物理的に評価した。その結果、なぞり動作時でも冷却した乾燥布から湿り感を錯覚することがわかった。この知見はなぞって触れる際の湿り感の再現手法の確立、また湿り感の知覚特性の解明において、重要な知見となる。

また、布以外を対象とした湿り感の評価については、物体を冷却することで湿り感を錯覚する現象は生じる物理的特徴を知るため、布を含めた数種類の素材を冷却し、湿り感を比較して評価する心理実験を行った。その結果、湿り感を強く感じる因子として、皮膚温度の低下と滑らかさが重要だと示唆された。この結果は、多様な物体における湿り感提示手法の方向性を示し、湿り感の知覚特性を解明する手がかりとなる。以上のように、当該年度は当初の計画とは異なるが、計画以上の成果を得た。現在までの進捗は、当初の計画とは異なるが、なぞり動作時・布以外の物体における湿り感提示に必要な物理刺激を推測することできたため、おおむね順調といえる。当初の計画では、29年度になぞり動作時の湿り感知覚における冷刺激の効果を検討し、30年度に湿り感の知覚における振動刺激の効果を検討し、31年度に冷刺激と振動刺激を組み合わせて湿り感提示手法を検討する、としていた。だが当該年度に、振動による粗さ・摩擦感を提示せずとも、布に冷刺激を加えるだけで、実際に水分を含んだ布と同程度まで湿り感を提示させられる可能性が示唆された。もし、なぞり動作時も冷刺激のみで湿り感を提示できるなら、湿り感の再現をより簡素な機構で実現でき、湿り感知覚における「冷感」と「粗さ・摩擦感」という手がかりの優先度合いを推測できる。また、布以外を対象とした湿り感の評価も進めた。冷却した物体を静的に触れるとき湿り感を錯覚する現象は、どのような物体の物理的特徴から起因するのかについて知るため、布を含めた数種類の素材を冷却し、湿り感を評価する心理実験を行った。その結果、アルミやアクリルのような物体が湿り感の評価が高く、「皮膚温度の低下」と「滑らかさ」が重要な因子だと示唆された。以上より、当該年度は冷却した布をなぞるときの湿り感を評価し、静的な触れ方のときと同様に湿り感を錯覚することを示唆した。また、布以外の物体についても湿り感錯覚を検討し、皮膚温度を大きく低下させる、あるいは滑らかな物体が湿り感錯覚を生じやすいことを明らかにした。主な研究実績としては、なぞり動作時の布の湿り感知覚特性に関する知見を得たことである。当該年度は、1件の国内学会発表および1件の査読有り国際学会発表(1st 1件)を行った。当初の計画では、当該年度は布をなぞって触れながら湿り感を提示するための、振動刺激の効果を検討することを目標としていた。しかしながら、2017年度、温冷刺激の効果を検討した結果、なぞり動作時でも布の冷たさのみから湿り感を錯覚する可能性が示唆された。そこで、当該年度は摩擦の影響を考慮し触動作の条件を追加して、改めて冷たさのみによる湿り感錯覚について、なぞり動作時にも適用でき得るのかを検討した。触動作として、これまで錯覚が生じると証明されてきた静的な接触と、なぞり動作を比較した。さらに、触れる際の押下圧にも注目し、摩擦の大小について比較した。その結果、湿り感の錯覚に押下圧の影響は見られず、触り方(静的接触・なぞり動作)によって湿り感錯覚の生じやすさが異なっていた。具体的には、なぞり動作時、冷却した乾燥布からは湿り感を錯覚しなかった。ただし、この結果は個人差が大きかったため、クラスタ分析により全被験者を3つのグループに分けた。1つ目のグループは触り方に依らず、「冷感」を重要視して湿り感を判断するグループ、2つ目のグループは触り方に依らず、「機械刺激の感覚(柔らかさ・摩擦等)」を重要視して湿り感を判断するグループ、3つ目のグループは触り方によって、湿り感を判断するためのキーファクターを変えるグループ、であるとわかった。この研究から、より多くの人を対象としてなぞり動作で湿り感錯覚を生起させるためには、冷たさに加え摩擦などの機械刺激の感覚を追加して提示する必要があるということがわかり、布の湿り感提示装置の開発指針を明確にした。