hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
一分子計測と電荷制御によるクロマチン構造変化の研究

17年度の研究により、スペルミジン(3+)により凝縮した一分子DNAの伸張-緩和サイクルで力学応答に速度に依存した履歴が現れることを見出した。18年度は履歴の要因を明らかにするためのデータを増やすとともに理論的考察を行い、以下の二つの要因から履歴が生じるという結論を得た。(1)緩和過程における凝縮の核生成(2)伸張過程における速度に依存したエネルギー散逸(1)については、核生成率の速度依存性に関する理論曲線を導出し測定結果と比較することで、緩和過程に現れる張力の急激な増加が核生成に起因していることを明らかにした。(2)については、測定で得られた摩擦係数(10^<-7>kg/sec)に対し、溶媒の粘性抵抗及びDNA鎖近傍のスペルミジン分子の不均一性は無視できることを示し、散逸が凝縮DNA内部で生じていることを明らかにした。さらに凝縮DNA伸張時の散逸がKramers的ダイナミクスで説明可能であり、その機構にDNAの曲げ弾性(semiflexibility)が強く影響していることを示した。これらの結果は現在論文投稿中である。荷電ナノ粒子を用いた測定では、粒径や電荷量変化に対し力学応答に顕著な違いを見るには至らなかったが、可視化が容易なことからDNA鎖上を動く分子(蛋白質)のモデルとして有効なことが分かった。本研究では静電相互作用を介し凝縮したDNAに対し、一分子レベルのダイナミクスに関する定量的知見を得ることができた。これらの結果は、荷電高分子鎖のダイナミクスについて新たな知見をもたらすとともに、生体内のクロマチン構造変化における静電相互作用の影響を評価する上で極めて重要な意味を持つと期待される。本研究の目的は、"静電相互作用の調節による遺伝子発現制御"という新たな概念の物理的根拠を明らかにすることにある。そのためにはDNAの負電荷と相互作用する物質の電荷量を制御し、静電相互作用の変化がDNA鎖の凝縮、非凝縮状態へ及ぼす影響を定量的に評価する必要がある。本年度は、正電荷を持つナノ粒子(ポリリジンコートされた直径10-100nmのシリカビーズ)を用いて、DNAの一分子力学測定を実施した。2005年に吉川等(京都大学)により、DNAがナノ粒子に巻き付いたヌクレオソーム構造に酷似した構造が観測されたが、本研究で現在までのところ、この構造を特徴付ける張力応答は観測できていない。一分子測定系では、観測している一本のDNAとナノ粒子が相互作用しない限り変化を見ることは出来ないため、バルク系とは異なるナノ粒子濃度と観測時間(数時間の長時間測定)が必要であることが分かった。反応チャンバー及び測定システムの改良により、これらの困難はすでに克服したため次年度において新たな知見が得られると期待される。また、スペルミジン(3+)による凝縮転移下において、凝縮状態のDNAの張力応答が伸張/緩和速度により変化することが分かった。広い伸張距離範囲で力一定の応答を示すスペルミジン濃度において伸張/緩和速度を変化させると、伸張/緩和サイクルで生じる不可逆仕事の量が速度に対し線形に増加する結果が得られた。さらに、凝縮開始を特徴付ける伸張距離が存在することを示唆するデータが得られ、凝縮、非凝縮状態の決定に、"静電相互作用の強さ-DNA鎖の広がり"及び"凝縮時間-DNA鎖の緩和時間"が密接に関係していることが分かった。これらの結果は、生体内のDNA凝縮機構のみならず、非平衡下における荷電高分子鎖のダイナミクスの観点からも非常に興味深く、次年度に向けてさらに研究を進める予定である。
妊娠高血圧症候群の発症予知と治療法の開発

喫煙妊婦と非喫煙妊婦の検討で、喫煙群で妊娠初期絨毛のVEGFA発現は非喫煙者と比較して有意に高かった。喫煙妊婦の妊娠初期の喫煙がVEGFA発現を増強させることが、妊娠高血圧症候群のリスク低下につながる可能性を示した。次に、妊娠初期からの抗酸化剤投与が抗酸化力が低下した女性の妊娠高血圧症候群発症を抑制できるかについて検討した。妊娠高血圧腎症を発症率は投与群2.0%、非投与群14.5%であった(p=0.034)。遺伝子発現レベルでは、FLT-1、endoglin、PGFに有意な発現変化を認めた。このように、妊娠初期からの抗酸化剤投与が妊娠高血圧症候群の発症予防につながる可能性を示した。妊娠高血圧症候群の病態が妊娠初期の胎盤形成期にあることはよく知られている。一方、妊娠中の喫煙に妊娠高血圧症候群の発症率低減効果あることはよく知られている。今年度、妊娠初期絨毛を用いて喫煙が血管増殖関連因子や抗酸化因子の遺伝子発現に及ぼす影響について検討を行った。具体的には、まず、非喫煙妊婦で妊娠初期に胎児心拍を認めた後に人工妊娠中絶を行った妊婦から絨毛組織を採取し、その遺伝子発現を定量し、妊娠経過に伴う変化と比較した。その結果、抗血管増殖因子であるFlt-1やENGはその発現量が増加する傾向を認めた。その上で、喫煙者と非喫煙者の識別のため、血中コチニン濃度を測定し、検出する妊婦を喫煙群、検出しない群を非喫煙群として比較したところ、妊娠10-11週の妊婦末梢血中cell-free RNA発現では、VEGFA発現が喫煙群で有意な高値を、また、PlGF発現は高値傾向を示した。Flt-1やENGには変化を認めなかった。同様に、妊娠6-8週での検討でも有意な変化を示す遺伝子はなかった。この結果は、喫煙により絨毛のVEGFA発現が亢進し、絨毛浸潤や血管形成に促進的に働くことが、妊娠高血圧症候群の発症に抑制的効果を示すメカニズムであることを示唆している。妊娠高血圧腎症は胎盤における血管発生や酸化ストレスの異常と関連しているといわれている一方、母体喫煙が妊娠高血圧症侯群のリスク低減に関連している。また、胎盤形成期の低酸素が絨毛の発育に重要な役割を担っていることが知られており、その形成過程の変化が、後の妊娠高血圧腎症や胎児発育不全などの病態形成に大きく関与していると考えられる。そこで、胎盤形成期の絨毛における血管発生や酸化ストレスに関連する遺伝子発現への喫煙の影響を評価する目的で検討を行った。妊娠6-7週、妊娠10-11週で胎児心拍が確認された後に妊娠中断を選択した妊婦に対し、手術後の絨毛の提供を倫理委員会承認の上で妊婦に説明し、研究への参加に同意した妊婦から、手術直後に絨毛細胞を採取した。対象は31件であった。組織は、RNAlaterに漬けて核酸を安定化し、その上でRNA抽出を行い、RT-PCRで定量化した。定量した遺伝子発現はVEGFA, Flt-1, sEng, PlGF, HMOX-1, SODである。母体の喫煙状況は血清中コチニン濃度で評価した。喫煙群で絨毛のVEGFA発現は妊娠10-11週に、非喫煙者と比較して有意に高かったが、6-7週の絨毛においては有意差はなかった。他の遺伝子には喫煙状態による遺伝子発現変化はなかった。絨毛のVEGFA発現は妊娠10-11週に、喫煙群で非喫煙者と比較して有意に高かった。喫煙妊婦の妊娠初期の喫煙がVEGFA発現を増強させることが、妊娠高血圧症候群のリスク低下につながるのかもしれない。今年度、血管増殖関連因子や抗酸化因子に限らず、より妊娠高血圧症候群の本質に近い病態変化をとらえて本症の病態解明を目指して研究に取り組んだ。具体的には、妊娠11週の絨毛検査(CVS)で得られた余剰絨毛細胞を用いて、その後に妊娠高血圧症候群を発症した症例(n=5)と発症しなかった症例(n=30)で、マイクロアレイを用いて47000遺伝子の発現変化を網羅的に分析して、比較した.その結果、118遺伝子に有意な遺伝子発現変化が見られ、その中で変化の大きかった5遺伝子について実際の妊娠高血圧症候群患者の母体血中cellular RNAを用いて遺伝子発現を調べたところ、これらの遺伝子発現はすべて有意に増加していることが確認された。現在、これらの遺伝子の病態形成への関与についての解析を行うことで、病態発生の初期段階に関与する遺伝子の発見を目指している。

さらに、妊娠初期に人工妊娠中絶を行った妊婦から絨毛組織を採取し、その遺伝子発現を定量し、その妊娠週数に伴う変化と比較している。その結果、抗血管増殖因子であるFlt-1やENGはその発現量が増加する傾向を認めた。これらの変化が、胎盤形成期の絨毛細胞のエピジェネティックな変化に制御されたものかを現在検討開始している。また、これらの遺伝子発現の違いが、母体の抗酸化能の影響を受けていないかについても検討し、絨毛のFlt-1およびENG発現が、母体血中ビタミンC濃度と逆相関の関係にあることを見出し、そのメカニズムの解明を行っている。研究成果が確実に出ている。発症予知に向けた血液検体採取のプロスペクティブな検討の準備は、日本人での妊娠初期の血液採取は1600例(妊婦数;検体数3800)以上になっている。現在、採血した妊婦の予後の調査を行っており、その結果を踏まえ、次年度の測定を開始したい。日本人での妊娠初期の血液採取は1500例以上になっているが、その中から妊娠高血圧症候群の患者発症が僅かであり、その解析につながっていない。日本人の妊婦1600人から、妊娠初期、中期、後期、分娩時、産じょく期の採血を行い、検体採取を行っており、日本人の検体採取は、ほぼ終了している。妊婦の予後の調査の結果を待って、検体測定を行い、妊娠高血圧症候群発症予知の精度を明らかにしたい。解析する遺伝子は、血管増殖因子関連遺伝子、抗酸化関連遺伝子などである。日本人の検体採取は、24年度中盤で終了とし、その解析による妊娠高血圧症候群発症予知の研究に取り組む。また、ビタミン剤の抗酸化作用に注目した研究を中心に24年度は取り組んでいく。日本人の妊婦1600人から、妊娠初期、中期、後期、分娩時、産じょく期の採血を行い、検体採取を行っている。妊娠予後の確認を行ったのち、このサンプルのcell-free RNA解析を行い、発症予知の可能性を日本人で確認する予定である。検体数が多いため、RNA抽出キットやPCR試薬などに多くの出費を予定している。また、研究成果を世界出生前診断会議で発表予定しており、関連分野の研究者との意見交換を含め、海外出張を予定している。次年度は絨毛細胞の培養を行い、低酸素負荷や抗酸化剤の添加による酸化ストレスの軽減効果などについて検討を行い、抗酸化剤の影響・効用について明らかにすることが新規課題である。その培養系の確立のための消耗品は新規の支出である。その他、前年同様の母体血からのRNA定量、抗酸化物質の定量などに利用する。
Lin7C-CASK-βcateninネットワーク制御による癌転移・浸潤抑制法

本研究は、癌の浸潤・転移に重要な役割を果たすLin7C-CASK-βcateninネットワークを制御し、臨床的に応用可能な固形癌の転移と浸潤の抑制法を開発することを目的とする。口腔扁平上皮癌細胞株においてLin7Cを強制発現させると、Lin7Cとネットワークを形成する各遺伝子が、連動した発現動態を示すことを確認した。また、本ネットワークの上流に位置するHTR2C(5HT2C)の阻害剤がLin7Cを介した癌の転移・浸潤のメカニズムに深く関与していることが分かり、今後の癌転移・浸潤の抑制治療への有用性が明らかになった。本研究は、細胞接着因子であるβcateninの発現量を増強させ、癌の浸潤転移を抑制するために、Lin7C-CASK-βcateninネットワークを制御する可能性のある候補遺伝子と候補薬物を検索し、臨床的に応用可能な固形癌の転移と浸潤の抑制法を開発することを目的とする。本研究は、Lin7C-CASK-βcateninネットワークを制御して細胞接着因子βcateninを発現増強させ、臨床的に応用可能な固形癌の転移と浸潤の抑制法を開発することを目的とする。
ハンズフリー音声認識のためのロバストな音響モデルの開発

1)ハンズフリー音声認識のための頑健な音響パラメータの検討ハンズフリー音声認識では,話者とマイクロホン間の相対位置の変動と残響のため認識性能が著しく劣化する.このような変動に対する頑健性を改善するため,本研究では,一般化対数スケール上のフォワードマスキングに基づく新しい特徴パラメータ,「一般化動的ケプストラム(DyMFGC)」,を検討した.始めに,提案するフォワードマスキングをメルフィルタバンクスペクトルに適用した.更に,このフォワードマスキングをメルLPCスペクトルに適用した.これはメル周波数軸上の全極モデルで、簡単で効率のよい時間領域の手法で推定される.比較的静かな小さいオフィス環境下で、話者とマイクロホン間の距離が20200cmで変動するの数字音声を用いて検討した結果,無雑音HMMによる認識では,比較的SNRの良い白色雑音環境において,対数スケール上のダイナミックケプストラムやCMS付きMFCCよりも高い認識精度を与え,音源から100cm以下であれば9095%の認識精度を維持できることが分かった.2)ハンズフリー音声へのHMMの適応の検討また本研究では、SVD法とランク推定に基づくMLLR手法を開発した.この方法はMLLRを任意サイズの回帰クラスに適用すること及び2次の重回帰へと拡張することを可能にするものである.話者適応による予備実験の結果,SVDによるMLLRは,大語彙音声認識において通常のMLLRよりも高い認識精度を達成できることがわかった.更に,2次の重回帰により、雑音付加音声に対して認識精度を改善できることを示した.もう一つの検討として,付加雑音と残響の影響を受けた音声に適応させるため,パラレルモデル結合(PMC)法をセグメント単位入力HMMに拡張した.この方法は,通常のPMC法に比べ,付加雑音に対しては良い認識性能を得たが,残響に対してはあまり有効ではなかった.1)ハンズフリー音声認識のための頑健な音響パラメータの検討ハンズフリー音声認識では,話者とマイクロホン間の相対位置の変動と残響のため認識性能が著しく劣化する.このような変動に対する頑健性を改善するため,本研究では,一般化対数スケール上のフォワードマスキングに基づく新しい特徴パラメータ,「一般化動的ケプストラム(DyMFGC)」,を検討した.始めに,提案するフォワードマスキングをメルフィルタバンクスペクトルに適用した.更に,このフォワードマスキングをメルLPCスペクトルに適用した.これはメル周波数軸上の全極モデルで、簡単で効率のよい時間領域の手法で推定される.比較的静かな小さいオフィス環境下で、話者とマイクロホン間の距離が20200cmで変動するの数字音声を用いて検討した結果,無雑音HMMによる認識では,比較的SNRの良い白色雑音環境において,対数スケール上のダイナミックケプストラムやCMS付きMFCCよりも高い認識精度を与え,音源から100cm以下であれば9095%の認識精度を維持できることが分かった.2)ハンズフリー音声へのHMMの適応の検討また本研究では、SVD法とランク推定に基づくMLLR手法を開発した.この方法はMLLRを任意サイズの回帰クラスに適用すること及び2次の重回帰へと拡張することを可能にするものである.話者適応による予備実験の結果,SVDによるMLLRは,大語彙音声認識において通常のMLLRよりも高い認識精度を達成できることがわかった.更に,2次の重回帰により、雑音付加音声に対して認識精度を改善できることを示した.もう一つの検討として,付加雑音と残響の影響を受けた音声に適応させるため,パラレルモデル結合(PMC)法をセグメント単位入力HMMに拡張した.この方法は,通常のPMC法に比べ,付加雑音に対しては良い認識性能を得たが,残響に対してはあまり有効ではなかった.(1)付加雑音と伝送歪みに頑健な音響パラメータの検討:ハンズフリー音声認識では,話者とマイクロホン間の相対位置が変動するため,直接音と環境雑音及び残響音の比が変動する.このような変動に頑健な音響モデルを構築するするため,加法性及び乗法性歪みに頑健なパラメータとして,線形振幅と対数振幅の中間的な振幅スペクトル領域でのフォワードマスキングに基づく動的一般化ケプストラムを検討した.その結果、一般化対数の巾数を0.1に設定することにより,伝送歪みと加法性雑音の両方の影響を低減できることを明らかにした.更に,話者とマイクロホン間の距離が20200cmで変動する音声を用いて検討した結果,無雑音HMMによる認識では,比較的SNRの良い白色雑音環境において従来法よりも高い認識精度を与え,100cm以下であれば9095%の認識精度を維持できることが分かった.(2)セグメント単位HMMとその雑音及び残響特性の補償の検討:環境雑音にロバストなHMMを実現するため、セグメントを単位とするHMMにおいて,正規分布の平均と共分散を逆KL展開を用いてフレーム単位のパラメータに変換することによりPMC法を適用する方法を検討し,通常のHMMより耐雑音性が向上することを確かめた.更に,分布の平均ベクトルに空間伝送特性のケプストラムを付加する方法を検討したところ,実際の残響付加音声で学習したHMMには及ばないことがわかった.これは,空間伝送特性のインパルス応答が分析窓長より遥かに長いことによるもので,この問題にどのように対処するかが今後の大きな課題である.(1)メルLPC分析による雑音と伝送歪みに頑健な音響パラメータの検討:ハンズフリー音声認識で問題となる残響とSNRの変動に対するため、周波数分解能に優れたメル線形予測分析で得られるスペクトルに対して,各種の聴覚特性の導入を検討した.先ず、6次のIIRフィルタで等

ラウドネス特性を付加した後、メルLPC分析を行い、予測係数から直接一般化ケプストラム係数及び動的ケプストラムを求める方法を開発した.認識実験の結果,等ラウドネス特性とメルLPC分析を組み合わせることで,無雑音及び雑音環境下において、従来のLPCケプストラムやMFCCに比べ数%高い認識率が得られることを明らかにした.また、一般化対数の巾数が0.10.3の範囲で認識精度を維持できることから,前方マスキングを導入することで、加法性雑音と部屋の伝送特性のような乗算性歪の両方の影響を低減できる見込みを得た.(2)2次項を含む重回帰による雑音及び伝送特性へのHMMの適応:環境雑音にロバストなHMMを実現するためのもう一つの方法として,2次項を含む重回帰写像により、HMMに含まれるガウス分布の平均ベクトルを少量の学習データで適応する方法を検討した.本方法では,説明変数に2次項を含めることで正規方程式の次元数が増大し,病的状況に陥る場合があるため、SVD法を用いた解法と固有値計算をせずに事前に方程式のランクを推定する方法を開発した.その結果、低周波域に大きなエネルギーを持つ雑音に対しては,従来のMLLR法に比べ適応精度が向上することを示した.残響を含む音声に対する有効性を検討することが今後の課題である.
菌体外マトリックスを標的とした成熟バイオフィルム制御のための多角的アプローチ

口腔バイオフィルムは他の生体バイオフィルムと違い、生体の切除を伴わず機械的に除去できるため、ブラッシングを主体とした機械的コントロールを原則としている。洗口液に代表される化学的コントロールは、清掃器具が届かない部位のバイオフィルムを殺菌するために有効な手段であるが、バイオフィルムは厚みの増加とともに、殺菌成分が浸透しにくくなっており短時間で有効な効果が得られにくい。本研究は、口腔健康維持のための簡便かつ効果的な新しいバイオフィルムコントロール法を開発するためにバイオフィルムの特性に注目した多方面アプローチを試みた。その結果、化学的コントロールが具備すべきいくつかの要件を見い出した。本研究は強力な殺菌作用によるバイオフィルムコントロールから、マトリックスを標的とした制御戦略への方向性転換の必要性を提言するとともに、成熟バイオフィルムに対する新たな化学的制御戦略の確立を目的としている。バイオフィルムへの抗菌成分の浸透には、抗菌成分の分子量、親水性、電荷、作用時間、作用回数が影響が受けるとともに、物質の可溶化し浸透性を高めると考えられていたアルコールには浸透促進効果がないことを明らかにした。その一例として、Streptococcus mutans ATCC株をカラスベースディッシュを用いた静置系もしくはガラスキャピラリーを用いたフローセル系にてバイオフィルム形成後に、酵素活性により蛍光発現するCalcein-AMにて生菌染色を施した。試料を共焦点レーザー顕微鏡の観察ステージに固定し、0.12%アルコール含有/非含有グルコン酸クロルヘキシジン溶液もしくはアルコール含有/非含有リステリンを還流しながら、タイムラプス解析をおこなったところ、バイオフィルムからの蛍光消失は同等の挙動を示し、蛍光量の減少率および浸透速度に有意な差は認められなかった。また、頻用されているLive/Dead染色像においても同様の結果であった。さらに、Plate Count法を用いた30秒作用後の生菌数も有意な差は認められなかった。さらに、いずれの群も迅速な殺菌効果を示したが、バイオフィルム構造の剥離効果は認められなかった。強力な抗菌物質を用いてバイオフィルム中の細菌を殺菌しても、付着界面に残存した構造は新たなバイオフィルム形成の起点となることが考えられるため、殺菌ではなくマトリックスに直接作用し分散作用が期待できる物質を効果的にバイオフィルム内部に送り込むこと必要があることが示唆された。(1)人工バイオフィルム死菌構造体への再付着これまで、口腔バイオフィルムの成熟とともに抗菌物質の浸透率が低下し深層部では有効殺菌濃度に到達しないこと、またバイオフィルムの殺菌処理後に付着界面にバイオフィルム構造物が残存することを報告した。そこで、残存したバイオフィルム構造が与える影響についてin vitroフローセル培養系を用いて検討した。その結果、殺菌処理したバイオフィルム構造体へ浮遊細菌の二次付着が有意に起こり、バイオフィルム再形成の足場となることを明らかにした。(2)低濃度抗菌剤によるマトリックス形成亢進バイオフィルム対策として抗菌成分を用いた場合、バイオフィルムへの抗菌成分の浸透率低下にともない、深層部では有効殺菌濃度以下となる可能性が考えられる。そこで、最小発育阻止濃度(MIC)以下の低濃度グルコン酸クロルヘキシジン(CHX)作用後のS. mutansバイオフィルムの形成量を検討した。1/8, 1/16,および1/32のCHX存在下もしくはCHX非存在下(対照)において、ガラス試験管壁に24時間培養することにより形成したS. mutansバイオフィルム中の生菌数をプレートカウント法により算定した。また、バイオフィルム量をクリスタルバイオレット法およびフェノール硫酸法を用いて測定した。その結果、バイオフィルム量は1/32MICのCHX存在下で対照群と比較して有意に増加した。このことから、S. mutansバイオフィルムでは有効殺菌濃度未満のCHXとの接触時にバイオフィルム形成が促進される可能性が示唆された。成熟バイオフィルムは菌体外マトリックスに覆われ物質の輸送を制限し各種免疫機構に抵抗性を示すため、強力な抗菌剤を用いても十分な効果が得られないことがわかっている。そのため、成熟バイオフィルムの制御法は細菌自体ではなく菌体外マトリックスを標的として構築する必要がある。研究実施にあたり、三つの制御理論(1.浸透性能の高い抗菌成分;2.粘着性結合の分散;3.バイオフィルムの剥離)による異なるアプローチを予定していた。しかし、下記の研究成果から、「1.浸透性能の高い抗菌成分を用いた制御戦略」は、殺菌されてもなお付着界面にバイオフィルム構造が残存するため、常在菌が存在し絶えず外界と交通する特殊な器官である口腔の場合、効果的な方法ではないことが明らかとなった。今後は、2および3による制御戦略の構築が必要である。(研究成果

1)S. mutans人工バイオフィルムモデルに対する各種洗口液の浸透性および剥離効果をCLSMを用いてリアルタイムに観察・解析したところ、洗口液30秒の作用では、深層部の細菌へ十分な殺菌効果が及ばず大多数の細菌の増殖能が維持された。洗口液30秒の作用によるバイオフィルム剥離効果は微弱であった。(研究成果2)フローセルを用いて作製したS. mutans人工バイオフィルムを70%イソプロピルアルコールに90分浸漬し殺菌したのち、再度RDR中で106/mlに調整したStreptococcus mutans培養液を4時間灌流させたところ、殺菌処理後に残存するバイオフィルム構造に、新たな浮遊細菌の付着が生じることが認められた。一方、バイオフィルム構造が存在しない界面では新たに付着した生菌の厚さは小さい傾向にあった。残存バイオフィルム構造が新たなバイオフィルム形成の起点となることが示唆された。本研究は、異なるアプローチによる成熟バイオフィルム制御法の開発を最終目的としている。そのアプローチとして(1)浸透・核酸性能に優れた抗菌成分の口腔内長期間保持及び持続的徐放(2)マトリックス結合の分散(3)マトリックスの剥離を想定しているが、(1)の取り組みについて、その物質の浸透性に影響を与える因子を明らかにしつつあるが、(2)および(3)の具体的な物質の選定までには至っていない。菌種に非特異的に作用する物質の探索が引き続き必要となっている。具体的な制御物質の選定までは達成していないが、従来の抗菌成分による殺菌に頼ったバイオフィルム制御の既成概念転換の必要性が立証できた点で、新規知見であり、意義がある。バイオフィルムを構成する菌種が産生するマトリックス成分に非特異的に作用する分散・剥離物質を探索を行う。同時に、バイオフィルム深層部に効果的に物質効果が及ぶデリバリー法を開発する。現時点で想定される方法として、温度感受性材料やイオン結合によるゲル化を考えている。また、細菌からマトリックスをターゲットとしたバイオフィルム制御戦略の必要性を提示するため、抗菌物質作用後のバイオフィルム内部の遺伝子発現解析も同時進行する。1.バイオフィルムの分散剥離に焦点を当てた制御法の探索本年度の研究計画の継続課題である。抗菌成分に頼らず、バイオフィルム構造を分散剥離する方法を検討する。例えば、化学的コントロールのみではその効果が微弱であっても、超音波のような機械的応力と併用することで相乗効果が得られる界面活性剤、発泡剤を検討中である。2.マイクロダイセクションによるバイオフィルム各層の菌体外DNA量およびmRNAの解析本年度において、口腔内は絶えず常在菌が存在する特殊な環境であることから、たとえバイオフィルム中の細菌をすべて殺菌しても、構造が残存した場合にはその構造を足がかりとしてバイオフィルム再形成が起こりやすいことを立証した。
ネットワーク問題のモデル化とアルゴリズムの研究

グラフは接続関係を表現する抽象モデルとして有用であり,古くから盛んに研究されている数学的対象である.本特定領域研究では,ネットワークや計算機上での問題をグラフ問題としてモデル化し,そのアルゴリズム開発の研究を行った.その結果、密な部分グラフ発見問題,供給点配置問題,頂点被覆問題,巡回セールスマン問題,自己安定化問題,安定マッチング問題などの様々な実用的問題について,効率的なアルゴリズムを得ることができた.グラフは接続関係を表現する抽象モデルとして有用であり,古くから盛んに研究されている数学的対象である.本特定領域研究では,ネットワークや計算機上での問題をグラフ問題としてモデル化し,そのアルゴリズム開発の研究を行った.その結果、密な部分グラフ発見問題,供給点配置問題,頂点被覆問題,巡回セールスマン問題,自己安定化問題,安定マッチング問題などの様々な実用的問題について,効率的なアルゴリズムを得ることができた.グラフは接続関係を表現する数学モデルとして古くから盛んに研究されている。特に近年では、計算機やネットワーク上の問題をグラフ問題として定式化して解くという応用が盛んになっている。本研究では、このような問題に対する入力を現実的なものに絞ることにより、より効率の良いアルゴリズムを設計することを目的としている。本年度の主な結果は、以下の通りである。(1)ネットワーク上の孤立した部分グラフを見つけることは、関連したWEBページ群を見つけることに関連する。本研究では、この問題に対して効率の良いアルゴリズムを開発した。また、その実証実験を行い、有用性を確認した。(2)限られた個数のサーバをネットワーク上に配置し、出来るだけ多くのクライアントがサーバに対する経路を持てるようにする、最大被覆供給点配置問題を取り扱った。一般の場合にこの問題がNP困難となることを示し、入力を現実的なものに限定した場合の多項式時間アルゴリズムを構築した。(3)ルーティング経路長の増大を抑えながら、ルータに格納されたルーティングテーブルのサイズを削減するコンパクトルーティング問題を取り扱った。平坦なネットワークに対しては、一般の場合に比べて経路長の増大が大幅に削減できることを示した。(4)与えられたネットワークにリンクを追加することにより、任意の2点間の最短距離を縮める、伸張度削減問題を取り扱った。一般のグラフに対しては、伸張度を最小化する問題がNP困難であることを示した。また、入力がリンググラフの場合と格子グラフの場合に対して、最適なアルゴリズムを与えた。(5)並列計算を行う際にタスクをプロセッサに割り当てるタスクスケジューリング問題に対して、通信に遅延があるという現実的なモデルを考えた。効率的な割り当てが存在することを示し、その発見アルゴリズムの有効性をシミュレーションによって示した。グラフは接続関係を表現する数学モデルとして古くから盛んに研究されている。(1)ネットワーク上の物理的な閉路はルーティングテーブルを作成する上で障害となるが、閉路の存在しないスパニングツリーを経路とすることでこの問題を回避できる。その性能評価の指標となる平均ストレッチを取り扱い、いくつかのグラフについて上限が定数となる構成法を示した。(2)ネットワーク上の孤立した2部クリークを見つけることは、関連したWEBページ群を見つけることに関連する。本研究では、この問題を線形時間で解くアルゴリズムを開発した。(3)単位円盤グラフは平面上で大きさの等しい円盤よってできる交差グラフであり、通信可能領域が等しい無線端末で構成されるネットワークと対応がある。単位円盤グラフ上の最大独立集合問題を取り扱い、多項式時間近似スキーム(PTAS)を示した。(4)限られた個数のサーバをネットワーク上に配置し、出来るだけ多くのクライアントをサーバが耐故障性の意味においてカバーする、最大被覆供給点配置問題を取り扱った。入力を現実的なものに限定した場合の多項式時間アルゴリズムを構築した。また、本問題を一般化した2つの問題がNP完全であることを示した。(5)自己安定アルゴリズムとは、任意のネットワーク状況から開始したとしても与えられた状況に到達するアルゴリズムである。木ネットワーク中の各プロセスに負荷が与えられたときに局所情報のみで任意のプロセス間の負荷の差が高々1になる自己安定アルゴリズムを提案した。(1)グラフ上にサーバを複数配置して冗長性を持たせる場合、どのような配置が最も効率が良いかを計算する問題(最大被覆供給点配置問題)に対して、冗長度により問題が多項式時間で解ける場合やNP完全となる場合があることを示した。(2)点集合と制約が与えられた上で最適なクラスタリングを求める問題(合意最大化問題)に対して、既存のアルゴリズムを改良してより良い禁じアルゴリズムを開発した。(3)与えられたグラフがある性質を持つか否かを判定する問題に対して、低い確率で誤りを許すことにより、計算時間を劇的に改善する手法(プロパティテスティング)が近年注目されている。本研究では、有効グラフがk-連結であるか否かを判定するアルゴリズムを提案した。

(4)各人の希望に基づいて、安定なマッチングを求める問題(安定マッチング問題)は研修医の病院配属などに使われる実用性の高い問題であるが、自然な条件緩和の下でNP困難になることがあることが知られている。本研究では、本問題に対する近似アルゴリズムを開発し、このアルゴリズムが既存のものよりも格段に良い近似度を実現することを示した。(5)グラフの彩色問題を利用した、無線ネットワークにおける帯域利用効率の高いTDMAスケジューリングアルゴリズムを開発した。また、提案手法が既存手法に比べてよい性能を発揮することをシミュレーションにより確認した。グラフは接続関係を表現する数学モデルとして古くから盛んに研究されている。特に近年では、計算機やネットワーク上の問題をグラフ問題として定式化して解くという応用が盛んになっている。本研究では、このような問題に対する入力を現実的なものに絞ることにより、より効率の良いアルゴリズムを設計することを目的としている。本年度の主な結果は、以下の通りである。(1)表計算ソフトで表を作成する際に、表の可読性を高めるため罫線が利用される。本研究では、罫線を描画する際に最小回数で描画することを目的として問題を定義し、問題のNP困難性と、効率的に解けるための罫線のレイアウトとスタイル集合の条件を示した。(2)与えられたグラフがある性質を持つか否かを判定する問題に対して、低い確率で誤りを許すことにより、計算時間を劇的に改善する手法(プロパティテスティング)が近年注目されている。本研究では、次数に上限のある有向グラフがk枝連結であるか否かを判定するアルゴリズムを提案した。(3)各人の希望に基づいて、安定なマッチングを求める問題(安定マッチング問題)は研修医の病院配属などに使われる実用性の高い問題である。本研究では、安定マッチングの良さの指標として平等性に着目し、これらの指標の近似アルゴリズムと困難性を示した。(4)P2Pネットワークにおける耐故障設計として、マルチパス,ワイドパスなどの経路の多重化法が提案されている。マルチパスはコストの点で、ワイドパスは耐故障性で優れている。本研究では、これらの手法を組合わせた手法を提案し、既存の手法と同程度の耐故障性を低コストで実現できることを解析とシミュレーションで検証した。
ホルモン依存性癌の増殖メカニズムの解明-下垂体腫瘍をモデルとして

ラット下垂体腫瘍のエストロゲン依存性増殖に関わる遺伝子発現について明らかにする目的で、平成10年度にエストロゲン応答性増殖をする下垂体細胞株MtT/E-2を樹立し解析した。さらに平成11年度は、原発性下垂体腫瘍を材料にPTTG遺伝子の発現解析を特にラット系統差によるエストロゲン応答性の違いに着目して検討した。成果:A.エストロゲンに非依存性の下垂体細胞株MtT/Eから、10^<-13>-10^<-9>Mのエストロゲンに応答して細胞増殖をするサブラインMtT/E-2が樹立された。この細胞は下垂体組織と同様にa型のエストロゲン受容体を発現していた。近年発見された下垂体腫瘍遺伝子であるPTTGのmRNAは、RT-PCRによる解析で、ラットの正常下垂体では検出されず、MtT/E-2細胞においてのみ発現していた。エストロゲン投与後、c-myc、cyclinDの上昇がみられたが、そのときPTTG発現の増加は観察されず、エストロゲン反応性との関わりは低いと考えられた。この細胞株は親株がホルモン産生性がないのに対し、GH産生能を有していた。興味深いことに、その産生調節は甲状腺ホルモンよりもレチノイン酸やデキサメサゾンに依存的であり、より胎生期下垂体細胞に近い性質を示した。また、この細胞のラットに移植実験により、in vivoにおいてもエストロゲン応答性の腫瘍形成能があることが確認された。B.下垂体腫瘍に高発現するがん遺伝子として見いだされたPTTGmRNAの発現を、エストロゲンによって誘発された原発性下垂体腫瘍において解析し腫瘍化への関与を検討した。1)ラット下垂体においてPTTGの発現がエストロゲンにより調節されていることが明らかになった。2)ラット下垂体のエストロゲンに対する応答性はラットの系統により異なるが、PTTG発現様式にも系統差がみられ、それらが相関していた。3)PTTGのエストロゲン応答性発現機構を解析するため、PTTG遺伝子プロモーターをクローニングし発現レポーター実験を行った結果、エストロゲンによる弱い調節が観察された。これらの結果より、PTTGはエストロゲンにより発現調節され、その発現が下垂体腫瘍化に関与していることが示唆された。ラット下垂体腫瘍を材料に、エストロゲン依存性増殖に関わる遺伝子発現について明らかにする目的で、1)ラット下垂体腫瘍細胞のエストロゲン応答性サブラインMtT/E-2の樹立および、2)原発性下垂体腫瘍を誘発してそれらの解析を行った。

エストロゲン投与後、c-myc、cyclin Dの上昇がみられたが、そのときPTTG発現の増加は観察されず、エストロゲン反応性との関わりは低いと考えられた。この細胞株は親株がホルモン産生性がないのに対し、GH産生能を有していた。興味深いことに、その産生調節は甲状腺ホルモンよりもレチノイン酸やデキサメサゾンに依存的であり、より胎生期下垂体細胞に近い性質を示した。また、この細胞のラットに移植実験により、in vivoにおいてもエストロゲン応答性の腫瘍形成能があることが確認された。B.原発性のエストロゲン応答下垂体腫瘍およびエストロゲン非処理、処理のMtT/E-2細胞株のDifferentialdisplayによる解析を開始した。新たなホルモン依存性増殖関連遺伝子の単離解析が現在進行中である。ラット下垂体腫瘍のエストロゲン依存性増殖に関わる遺伝子発現について明らかにする目的で、平成10年度にエストロゲン応答性増殖をする下垂体細胞株MtT/E-2を樹立し解析した。本年度は、A)原発性下垂体腫瘍を材料にPTTG遺伝子の発現解析および、B)樹立細胞株MtT/E-2と正常下垂体の間のdifferential displayによる解析を行った。成果:A.下垂体腫瘍に高発現するがん遺伝子として見いだされたPTTGmRNAの発現を、エストロゲンによって誘発された原発性下垂体腫瘍において解析し腫瘍化への関与を検討した。1)ラット下垂体においてPTTGの発現がエストロゲンにより調節されていることが明らかになった。2)ラット下垂体のエストロゲンに対する応答性はラットの系統により異なるが、PTTG発現様式にも系統差がみられ、それらが相関していた。3)PTTGのエストロゲン応答性発現機構を解析するため、PTTG遺伝子プロモーターをクローニングし発現レポーター実験を行った結果、エストロゲンによる弱い調節が観察された。これらの結果より、PTTGはエストロゲンにより発現調節され、その発現が下垂体腫瘍化に関与していることが示唆された。B.エストロゲン処理した樹立細胞株MtT/E-2、原発性下垂体腫瘍組織および正常下垂体組織それぞれのtotal RNAのdifferential displayによる比較解析をおこない、12個のエストロゲン応答性でかつ腫瘍特異的と考えられるmRNAフラグメントを検出した。
RiプラスミドrolC遺伝子による花芽誘導の解析と育種への利用

毛根病の病原因子であるRiプラスミドT-DNA上に存在するrol遺伝子、特に、植物体の矮化や花芽の早期分化を促すrolC遺伝子の生理機能を解明するため、強力なプロモーターであるCaMV35SプロモーターにrolC構造遺伝子を連結したキメラ遺伝子を構築し、ベラドンナに導入した。その結果、形質転換ベラドンナは矮化し、早期に花芽を分化した。このような形質転換ベラドンナの自家受粉後代植物について二世代に渡り、P1隔離温室で自然条件下で栽培を行い、その形態的・生理的特性について調査した。後代植物では、非形質転換体とほぼ同じ形質を示すもの(タイプ1)、形質転換当代と同様に矮化して発芽後早い時期から花芽分化するもの(タイプ2)、タイプ2よりもさらに植物体が小型化して成長が抑制され、花芽分化も見られないもの(タイプ3)に分離した。タイプ1、2、3の分離比は、ほぼ1:2:1となり、導入したrolCキメラ遺伝子が単一の優性遺伝子として機能し、また、ホモ個体となってrolC遺伝子が過剰に働くと成長が抑制されることも明らかとなった。この結果は、rolC遺伝子を品種改良に利用する際には発現量の制御について考慮する必要があることを示している。一方、rolCキメラ遺伝子を導入した形質転換ベラドンナについて、タイプ1及びタイプ2の個体を用い、生体内植物ホルモンの定性・定量分析を行った。その結果、茎葉部では、アブシジン酸、サイトカイニン、ジベレリンの含量が形質転換個体ではわずかに増加していたが、根部では差が見られなかった。また、タイプ1及び2について各種植物成長調節剤で処理したが、形質転換個体に特徴的な性質である花芽の早期分化については促進も抑制も見られなかった。この結果は、rolC遺伝子の機能として従来報告されてきた結果(サイトカイニングルコシダーゼ)とは一致せず、rolC遺伝子の真の生理機能については今後新たに考える必要があろう。CaMV35Sプロモータを結合したrolC遺伝子を導入したトランスジェニックベラドンナを実験室内で栽培し、自家受粉によって後代種子を得た。この種子をP1隔離温室に播種したところ、種子が休眠しており、かなり時間が経ってから除々に発芽した。この発芽個体では、矮化型と正常型に分離し、その分離比は約3:1となった。また、この発芽個体のうち矮化型は、発芽当初より矮化性を示し、成葉が3-4枚になると全ての個体で花芽が分化した。このような個体で自家受粉を行ったところ、果実が正常に肥大し、種子が得られた。この種子は、次年度には再度P1隔離温室で栽培試験を行う予定である。トランスジェニックベラドンナ及び非形質転換ベラドンナについて、果実を取った残りの植物体の根及び茎葉部を凍結保存し、常法に従ってジベレリン、サイトカイニン、アブシジン酸(ABA)の定性・定量分析を行った。その結果、ABA含量は形質転換体で約2倍高かった。一方、サイトカイニン含量はかなり低く、ELISA法の検出限界に近いところでの分析となったが、形質転換体ではゼアチンで約3倍、リボシルゼアチンで約6倍と高くなっていた。また、ジベレリンについては、GA_1では差がなく、GA_4では形質転換体で約2-3倍高かった。しかし、このような変化は、形質転換体では多数の花が咲いていたことに起因するものである可能性も高く、次年度はさらに詳細に検討する予定である。

非形質転換ベラドンナにサイトカイニン、サイトカイニングルコシド、及びジベレリンを処理したが、形質転換体のような性質は見られなかった。また、典型的な短日植物であるアサガオ及び典型的な長日植物であるルドベキアについては、現在、形質転換効率を高めるための再分化法を検討中である。CaMV35Sプロモーターを連結したrolC遺伝子を作成し、このキメラ遺伝子を導入したベラドンナについて自家受粉後代植物をP1隔離温室で自然条件下で栽培し、その形態や生理特性について検討した。その結果、形態的に明白な違いのある三種に分類できた。第1のタイプは、正常(非形質転換)体とほぼ同じ形態及び花芽分化を示した。第2のタイプは、形質転換当代植物と同様に、節間がつまり、全体として小型となり、さらに、本葉が出始めるとすぐに花芽を分化した。第3のタイプは、第2のタイプよりさらに全体が小型化し、成長が著しく抑制され、花芽が分化しなかった。このような3タイプの分離比は、タイプ1:タイプ2:タイプ3が1:2:1となり、導入したrolC遺伝子が単一の優性遺伝子としてメンデル遺伝をしていること、及び、ホモ接合体ではrolC遺伝子が強く働きすぎて植物の成長そのものに悪影響が出ることを示している。この結果は、rolC遺伝子を育種に利用する場合、強いプロモーターを使うとホモ系統として固定することで問題が生じる危険性を示している。一方、タイプ1及びタイプ2の個体についてその内生植物ホルモンの定性・定量分析を機器分析あるいはモノクローナル抗体を用いたELISA法で行った。その結果、茎葉部では、アブシジン酸、サイトカイニン、ジベレリンの含量がタイプ2でわずかに増加していたものの、根部では差が見られなかった。また、タイプ1及びタイプ2の個体をサイトカイニン、抗サイトカイニンあるいはジベレリン等で処理したところ、形質転換体に固有の性質である花芽の早期分化の誘導あるいは抑制が認められなかった。このことは、rolC遺伝子の機能は、これまでに報告されていた糖結合型サイトカイニンからサイトカイニンを遊離させる酵素である可能性はほとんど無く、これまでにない全く新しい生理機能を考えなければならないことを示している。
改正介護保険における介護予防プログラムの有効性

本研究の結果から、特定高齢者に対するハイリスクアプローチとして介護予防プログラムを期限付きで行う場合、その効果は極めて限局的になることが示唆された。一方、介護予防施策で中核的な役割を担う地域包括支援センターに求められているものは、総合相談機能であった。すなわち、日頃から地域住民と信頼関係を結び、地域で生活する高齢者の要支援・要介護化のリスクを早期に発見することが必要であると考えられた。また、地域住民が主体的に参加し、継続して進めていくことができる介護予防施策は、楽しみの要素を取り入れた体操やゲームといった活動を、特定高齢者だけでなく、住民ボランティアの力を活用し地域住民自身が展開する地域福祉的アプローチであることが示された。平成19年度の研究実績の概要は以下の通りである。本研究は改正介護保険における介護予防プログラムの有効性を検証するものである。そこで19年度は(1)介護保険改定で示された介護予防について、高齢化先進地である宮崎県内の各サービス事業者はどのように捉え、また、サービス提供の仕方が変化したことで介護予防の有効性をどのように評価しているのかを検証するためにアンケート調査を実施した。その規模は居宅介護支援事業所、訪問介護事業所、通所介護事業所、地域デイサービス、養護老人ホーム、特別養護老人ホーム、介護老人保健施設、地域包括支援センターへ計736通を発送しその回収率は36.2%であった。詳しい分析は20年度に行う予定であるがその中で顕著であったのが平成19年度のWAMNETから抽出した訪問介護事業所に発送した165事業所のうち16事業所が1年以内に廃業していた。今回の改正が在宅介護サービス事業者にかなりな経済的影響を与えている事が理解できた。(2)特定高齢者への介護予防事業への取組について地域包括支援センターへの聞き取り調査を行ったが顕著な効果は明らかにされなかった。(3)介護予防に関して独自の取組をしている地域にてその具体的方法について行政や専門的指導者への聞き取り調査及び参加者へのアンケート調査を行った。その結果介護予防には特定高齢者に限定した期間限定の介入ではなく地域を挙げた不特定多数の参加者の中に特定高齢者を含む地域参加型の活動の有効性や専門的プログラムを開発、指導できる専門家の必要性、地域で活動を支える地域リーダーの存在の必要性が示唆された。20年度研究実績の概要研究課題(1)今回の介護保険制度の改正が介護予防において、有効な施策であったかをサービス提供者からの評価として明らかにする。(2)地域包括支援センターのケアマネジメントにおいて、介護予防の効果の視点から研究を行う。(3)地方自治体が有効な介護予防サービスをどのように提供しているか、その実態を調査する。研究結果(1)宮崎県内で行ったアンケート調査から特別養護老人ホーム、居宅介護支援事業所は「評価している」のは約3割に過ぎない。(2)宮崎県内の地域包括支援センター(以下センター)へのアンケートにより、介護予防に関する意識と実態調査を行ない明らかになったことは、(1)「介護予防に力を入れることが介護保険制度維持に効果的」と考えるのは、3分の1に過ぎず半分は効果に疑問を持っている。(2)介護予防プランの事例をみると、総合相談の段階から度重なる訪問により、信頼関係を築き、必要が生じた時に介護予防プランを提案することで、対象者に受け入れてもらえることが理解できた。よって、日ごろの総合相談の重要性が明らかとなった。そのことは「センターが今後最も力を入れていくべき」と考えている業務が「総合相談である」と答えたセンターが55%に上ることからも証明された。(3)宮崎県K町の取り組みを事例とし研究した。結果、参加者を介護予防対象者に限定せず、町民の健康促進活動の一環として認知症や脳疾患後遺症のある住民も一緒になって活動すること、地域ボランティアを育成し、地域福祉的取り組みをしていること、及び優れたプログラムや実行力を持つ指導者の必要性が明らかとなった。意義と重要性介護保険の健全な存続の方法が模索されているなかで2006年改正で提案された介護予防施策のうち真に介護予防として有効なものが明らかとなった。本研究は介護保険存続のために必要な介護予防の新たな方向性を提案することが出来た。
強酸性炭素酸を鍵構造とする新しい有機分子触媒の設計と利用

本研究では,ビス(ペルフルオロアルキルスルホニル)メチル基が有機分子触媒を開発する際の新たな酸性官能基となることを提案した。こうした炭素酸では,触媒候補分子の構造的多様性を確保し,触媒作用のファインチューニングすることも期待できるためである。我々が開発した炭素酸は分子構造中に三つのTf2CH基を有する三価炭素酸であり,DMSO中のpKaは2.0であった。高分子合成の分野では,alpha,beta-不飽和エステルに少量のケテンシリルアセタールを反応させる方法が,不飽和エステルの優れた重合法(グループトランファー重合)として知られている。本年度,我々は炭素酸触媒の特性を考慮し,異なった二種類のMichael受容体を段階的に作用させる逐次的Mukaiyama-Michael反応を開発したした。一連の検討において,グループトランスファー重合などの意図しない副反応による系の複雑化は全くみられなかった点に特長がある。強酸性炭素酸の共役塩基は,単離できるほどに安定化されたカルボアニオンである。我々は有機溶媒への溶解度が良好な分子内塩の触媒作用を探求した。その結果、1,3-ジケトンのモノケタールに対する双性イオン触媒反応を検討していたところ,溶媒効果に基づく位置選択性の逆転が起こることを見いだした。最近開発した新たな炭素酸合成試薬であるピリジニウム型双性イオンについても研究を進め,本試薬を用いることでTf2CH型炭素酸のみならず,広く(RfSO2)CH型炭素酸(Rf=ペルフルオロアルキル基)が合成できることを明らかにした。さらに合成した一連の炭素酸の酸性度測定を行い,NfCHR(Nf=n-C4F9SO2)>Tf2CHR[(CF2)3SO2]CHRの順に酸性度が小さくなることを明らかにした。また、高度に分極したpush-pullアルケンに関する研究を進め、その触媒作用を検討した。27年度が最終年度であるため、記入しない。我々は,強酸性炭素酸の合成手法を開拓すると共に,合成した化合物の触媒作用を評価している。本年度得られた成果を次に示す。[1]強酸性炭素酸を用いた新しい合成反応我々の炭素酸触媒を用いたMukaiyamaアルドール反応では,求電子種のみが強く活性化され,求核種の活性化は事実上ないと考えられる。そこで,反応系内に共存する極安定カルボアニオン(炭素酸の共役塩基)の際立って低い求核性を活用した新しい合成反応を着想した。検討の結果,炭素酸存在下にクマリンに対してケテンシリルアセタールを作用させ,次いでクロモンを加えると,逐次的なMukaiyama-Michael反応が進行することを見いだした。[2]極安定カルボアニオン構造を備えた酸性アンモニウムの触媒作用炭素酸よりも温和な酸でありながら触媒作用を示す双性イオンについてもユニークな利用法を見いだした。すなわち,このイオン性化合物は酸触媒として作用しながらも,アセタールを損なうこと無しにカルボニル基を化学選択的に活性化した。また,適切な基質の設計から類例の乏しいアセタール選択的なMukaiyamaアルドール反応を開発した。[3]ピリジニウム型双性イオンの動的構造変化と利用法2-フルオロピリジニウム型双性イオンは,結晶中では双性イオン形として存在するが,ひとたび溶液とすると,即座に解離して2-フルオロピリジンおよびTf2C=CH2との平衡混合物となる。温度可変NMRによる詳細な動的構造の結果,この平衡反応はミリ秒オーダーの極めて速い化学プロセスであることを見いだした。また,幾つかの求核種との反応を行い,新たな炭素酸合成試薬としての有用性を示すことができた。さらに特筆すべきことに,この双性イオンは,分子構造中に酸性官能基を持たないにもかかわらず,触媒作用を示すことを見いだした。

さらに合成した一連の炭素酸の酸性度測定を行い,NfCHR(Nf=n-C4F9SO2)>Tf2CHR[(CF2)3SO2]CHRの順に酸性度が小さくなることを明らかにした。また、高度に分極したpush-pullアルケンに関する研究を進め、その触媒作用を検討した。強酸性炭素酸および双性イオンに関する研究は,当初の想定を超える進捗があり,順調である。一方で,構造的に異なる炭素酸構造をもつ触媒の研究については,鋭意進めているところだが,有望な有機触媒を見いだすには至っていない。従って,総合的に判断すれば,研究は「おおむね順調に進展している」ものと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。硫酸に匹敵する強酸性炭素酸の合成や,より酸性度の大きな炭素酸の合成については,一定の目処がついており,更なる検討を通じて,その利用法を深く探求していく予定である。一方で,達成度の項に示したとおり,構造的に異なる炭素酸の触媒作用については際立った成果が得られておらず,様々な炭素酸の合成と触媒作用の評価をスピードアップさせる必要がある。
歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導の試み

1.歯髄細胞の採取及びサブカルチャー:体重200グラム前後のWistar系ラットから無菌的に取り出した切歯歯髄を、2本のメスを使ってスライス状に薄切した後プラスチックディシュに付着させ、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM培養液中にて培養した。組織片からアウトグロウスしてきた細胞をトリプシン-EDTA処理して回収し、別のプラスチックディシュに播種した。コンフルエントになったら、同様にトリプシン-EDTA処理して継代培養し、適当な細胞数が確保できた時点で、細胞凍結剤と共に凍結保存した。2.歯髄細胞を導入した多孔性セラミクスの皮下移植: 1.の方法により得られた歯髄細胞懸濁液(5×10^6個/ml)に予めフィブロネクチンをコートした多孔性セラミクスを浸漬し、陰圧にして細孔内に細胞を導入した。これを37°Cの炭酸ガス培養器で1時間インキュベート後、同系ラットの皮下に移植した。細胞感作因子としては、歯胚形成に重要な因子として最近注目を集めているヒト肝細胞増殖因子(HGF)を選び、感作の方法としては細胞培養の際にHGFを添加する方法と、HGFを直接皮下に投与する方法及び親和性を有するセラミクスに予めHGFをコートする方法をそれぞれ試みた。3.皮下移植したセラミクスの組織像解析: 2.の方法により皮下移植したセラミクスを4週後および6週後に取り出し、常法に従い固定脱灰し、薄折切片を組織染色した。購入したデジタルカメラ(ミノルタ、RD-175)を用いてこの染色組織切片を写真撮影し、画像を整理保存した。