hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チタニアのケモアフィニティーを利用する生体内リン酸化解析システムの構築

1.材料の調製(1)高性能チタニア粒子の製造と物性測定:ゾル-ゲル法によりチタニア並びにハイブリッド型チタニア(チタニアーシリカ等)を合成した。後者はリン酸化合物に対し、構成する金属酸化物単独にはない新しい保持特性を示した。(2)リン酸化ペプチド、タンパク質のin vitro合成と精製:KemptideやMalantideを酵素的にリン酸化し、標品を得た。2.リン酸関連化合物の吸着・脱着・分離・検出条件の検討(1)リン酸化合物のチタニアカラムへの吸着・溶離条件:リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、ヌクレオチドでは、0.015%トリフルオロ酢酸(TFA)で吸着させ、LiC1を含む50mMホウ酸塩緩衝液(pH8.0)(溶離液A)で溶離する条件が、リン脂質ではクロロホルムで吸着し、クロロホルム-イソプロパノールーリン酸(7:14:5)で回収する条件が最適であった。(2)陰イオン交換HPLCによるリン酸関連化合物の分離条件の検討:有機リン酸化合物をAsahipak NH2P-50カラムを用いてグラジエント溶離後、リンモリブデン酸反応で検出する系を確立し、ラット心筋中リン酸化合物の分析に応用した。3.リン酸化タンパク質解析ソフトの開発(1)リン酸化タンパク質の酵素加水分解による断片化:ウサギホスホリラーゼaのトリプシン消化により、リン酸化ペプチドの生成が確認できた。(2)チタニアカラムにるリン酸化ペプチドの選択的捕集:0.015%TFAで吸着させ、溶離液Aで溶出する条件下、リン酸化Kemptideの回収率は80%以上であった。(3)陰イオン交換HPLCによるリン酸化ペプチドの単離:AsahipakNH2P-50カラムと移動相Aの組合せが適当であった。4.リン酸化タンパク質解析システムの構築UV検出またはUV検出とポストカラム蛍光検出(OPA)の二重検出装置を組込んだ、チタニアカラムと陰イオン交換カラムからなるカラムスイッチングHPLCシステムを構築し、微量リン酸化ペプチドの選択的検出または単離を可能とした。1.材料の調製(1)高性能チタニア粒子の製造と物性測定:ゾル-ゲル法によりチタニア粒子ならびに各種混合比のハイブリッド型チタニアゲル(チタニアーシリカ、チタニアーゲルマニア)を合成し、高速液体クロマトグラフィー用充填剤として評価した。その結果、ハイブリッド型ゲルについてはこれを構成する金属酸化物単独にはない新しい保持特性が現れることを見いだした。(2)リン酸化ペプチド・タンパク質のin vitro合成と精製:標記化合物は殆ど市販されていないため、Kemptide(Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly)とMalantide(Arg-Thr-Lys-Arg-Ser-Gly-Ser-Val-Tyr-Glu-Pro-Leu-Lys-Ile)はC-キナーゼで、またホスホリラーゼbはc-AMP依存性キナーゼでそれぞれリン酸化し、陰イオン交換HPLCで精製することにより標品を得た。2.リン酸関連化合物の吸着・脱着・分離・検出条件の検討(1)リン酸化合物のチタニアカラムへの吸着・溶離条件:リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン脂質などの有機リン酸化合物をチタニアカラムで選択的に捕集・回収する条件を検討した結果、前二者については0.015%トリフルオロ酢酸で吸着させ、900mm NaClを含む50mMリン酸塩緩衝液(pH8.0)で溶離・回収する条件が、またリン脂質についてはクロロホルム-メタノール(8:2)混液で吸着・洗浄し、クロロホルム-イソプロパノールーリン酸(7:14:5)で回収する条件がそれぞれ最適であった。(2)陰イオン交換HPLCによるリン酸関連化合物の分離条件の検討:リン酸化クレアチン、無機リン酸、グルコース-6ーリン酸、AMP、ADP、ATPなどをAsahipak NH2P-50カラムを用いて一斉にグラジエント溶離後、リンモリブデン酸反応で検出する系を確立した。本法は、ラット心筋中のリン酸化合物の分析に適用できた。

3.リン酸化タンパク質解析ソフトの開発(1)リン酸化タンパク質の酵素加水分解による断片化:ウサギホスホリラーゼaのトリプシン消化により、リン酸化ペプチドの生成が確認できた。(2)チタニアカラムにるリン酸化ペプチドの選択的捕集:0.015%TFAで吸着させ、溶離液Aで溶出する条件下、リン酸化Kemptideの回収率は80%以上であった。(3)陰イオン交換HPLCによるリン酸化ペプチドの単離:AsahipakNH2P-50カラムと移動相Aの組合せが適当であった。4.リン酸化タンパク質解析システムの構築UV検出またはUV検出とポストカラム蛍光検出(OPA)の二重検出装置を組込んだ、チタニアカラムと陰イオン交換カラムからなるカラムスイッチングHPLCシステムを構築し、微量リン酸化ペプチドの選択的検出または単離を可能とした。1.リン酸化タンパク質解析ソフトの開発(1)リン酸化タンパク質の酵素加水分解による断片化:ウサギホスフォリラーゼaはアミノ酸841残基からなり、N末端から14残基目のセリンのみがリン酸化されている。そこで、これをCaCl_2を含む酢酸塩緩衝液(pH5.4)で調製したトリプシンと37°C、3時間インキュベートしてペプチド断片化した。本操作により、究極的には1種類のリン酸化ペプチド(Gln-Ile-Ser(P)-Val-Arg)が生成すると思われる。そこで、上記トリプシン消化物をアルカリホスファターゼで処理し、その逆相HPLCパターンを無処理のものと比較したところ、保持時間15分付近のピークが酵素処理によって消失することが判明した。このことから、保持時間15分付近のピークがリン酸化ペプチドであることが確認できた。(2)チタニアカラムによるリン酸化ペプチドの選択的捕集:Kemptide(Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly)をATPの存在下にc-Kinaseとインキュベートし、生成したリン酸化Kemptideを用いて捕集条件を検討した。その結果、0.015%トルフルオロ酢酸(TFA)に溶かしたリン酸化ペプチドを東邦チタニウム社製のチタニアミニカラム(4.6mm i.d.x1015mm)に導入し、引き続いてTFAを0.5ml/minで2分間流し、LiClを含む0.05Mホウ酸塩緩衝液(pH8.0)(溶離液A)で溶離する条件で80%以上の回収率が得られた。(3)陰イオン交換HPLCによるリン酸化ペプチドの単離:AsahipakNH2P-50-4Eカラム(4.6mm i.d.x250mm)と溶離液Aの組合せが適当であった。2.リン酸化タンパク質解析システムの構築(1)上記のチタニアミニカラムと陰イオン交換カラムでカラムスイッチングHPLC分離システムを構成し、吸光度検出とポストカラム蛍光検出(オルトフタルアルデヒド反応)の二重検出システムと組み合わせることにより、微量のリン酸化ペプチドを選択的に検出又は単離することができた。
先天性心疾患とともに成長する子どものレジリエンスを育むアセスメントツールの開発

「レジリエンス」という人の内面の強さを示す心理的特性に着目し、継続的に生じる問題をかかえながら成人期へ移行していく先天性心疾患をもつ学童期・思春期・青年期の子ども(人)を対象とし「レジリエンス」を育むためのアセスメントツールを開発した。本研究は、次の3つの調査により構成されている。(1)レジリエンス構成要素の探求、(2)『レジリエンスを育むアセスメントツール』の作成、(3)『レジリエンスを育むアセスメントツール』の有効性の検証。先天性心疾患は、生命に直結した疾患、生まれながらの疾患という特徴より、患者は幼少期から特有の危機状況に遭遇し、そこから立ち直り、乗り越えてきた。当該研究の目的は、「レジリエンス」という人の内面の強さを示す心理的特性に着目し、継続的に生じる問題をかかえながら成人期へ移行していく先天性心疾患をもつ学童期・思春期・青年期の子ども(人)の「レジリエンス」を育むためのアセスメントツールを開発し、実践に適用することである。研究期間中に、次の3つの目的を達成することを目指している。(1)レジリエンス構成要素を明らかにする。(2)『レジリエンスを育むアセスメントツール/発達段階別』を作成する。(3)レジリエンスを育むための『レジリエンスを育むアセスメントツール/発達段階別』の有効性を検証する。当該年度は、まず、子どものレジリエンス、先天性心疾患をもつ子どもの心理的特性に関する国内外の文献を検討した。次に、先天性心疾患をもつ学童期・思春期・青年期の子ども(人)のレジリエンス構成要素を明らかにすることを目的として、全国心臓病の子どもを守る会、心臓病者友の会の協力を得て、フォーカス・グループインタビューを実施した(合計21名)。また、面接調査と同時に、集団特性の判定に用いるため、信頼性が検証されている既存のレジリエンス尺度を使用してレジリエンスを測定した。今後は、逐語化した面接調査のデータを「レジリエンス」の視点で質的に分析を行い、レジリエンス尺度のデータは統計的に分析を行う。平成23年度は上記(2)に取り組んだ。まず、前年度に取り組んだ(1)、先天性心疾患をもつ学童期、思春期、青年期の子ども(人)の思いを調査したフォーカス・グループインタビュー(対象者21名)のデータを「レジリエンス」の視点で分析した。次に、その分析結果および先行研究を参考に、連携研究者2名と検討し、『レジリエンスを育むアセスメントツール/発達段階別(試案)』を作成するための調査項目を抽出した。その後、抽出した項目で作成した尺度を用いて、社団法人全国心臓病の子どもを守る会の協力を得て、学童期、思春期、青年期の子ども(人)500名を対象とした質問紙調査を実施し、現在、データ分析中である。平成23年度までに、先天性心疾患をもつ学童期、思春期、青年期の人を対象としてグループインタビューを実施し(対象者21名)、「レジリエンス」の視点で分析した。この結果に基づき、学童期、思春期、青年期、各期175名、合計525名を対象とした質問紙調査を実施した。平成24年度は、このアンケート調査のデータを分析し、結果を基に、レジリエンスを育むアセスメントツール(試案)』を作成した。

そして、全国心臓病の子どもを守る会の協力を得て、学童期、思春期、青年期の当事者(13名)、親(22名)、先天性心疾患患者の看護を専門とする看護師(11名)を対象として、『レジリエンスを育むアセスメントツール(試案)』の妥当性を検証する目的で、グループインタビューを実施した。そして、検証結果を分析し『レジリエンスを育むアセスメントツール』を完成させた。『アセスメントツール』は[自分の病気のことがわかる]、[親ではなく自分で医師と話をする]、[親が体調の管理を任せてくれる]、[将来の生活に希望を持っている]他、全20項目から成る。調査はおおむね順調に進展してる。しかし、学会発表や論文投稿については、現時点で学会発表1回のみであり、遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
大腸菌走化性における受容体超分子クラスターを介したシグナル伝達制御機構の解析

大腸菌走化性はシグナル伝達の研究分野におけるモテルシステムである.中でも,中心的な課題となっているのが走化性シグナルの増幅および増幅率(ダイン)制御機構の解明である.走化性受容体は菌体の極で巨大なクラスターを形成する.クラスター内での受容体タイマー間相互作用を介して隣接する受容体ダイマーへとシグナルが伝わり,シグナル増幅が起こるとされているが,その詳細は不明である.特に,極クラスターが巨大な膜タンパク質複合体であることによる扱いの困難さから,受容体間相互作用の分子基盤についてはこれまで詳細な解析が行われてこなかった.私は,これまでの実験で単独の受容体を発現させ,ダイマー間相互作用変化を検出することでゲイン制御機構の解明に寄与してきたが,この状況下では全ての受容体に誘引物質が結合可能であり,クラスター内で隣接する受容体ダイマー間をシグナルが伝達したかどうかを判断するのは困難であった.そこで,大腸菌が4種類の走化性受容体をもつことに着目した.これらの受容体は混合クラスターを形成すると考えられているので,2種類の受容体(アスパラギン酸受容体Tar,セリン受容体Tsr)の共発現系を用いれば上記の課題をクリアできる.ダイマー間相互作用の検出はin vivoでのS-S架橋形成を利用した.はじめに,Tar架橋形成がTsr存在下で阻害されることから,混合クラスター形成を確認した.続いて,Tar-Tsrダイマー間で架橋したヘテロダイマーを検出し,異種受容体間相互作用が存在することを示唆した.Tar特異的な誘引物質であるメチルアスパラギン酸の添加によって,Tar-Tar架橋だけでなく,Tar-Tsr架橋,Tsr-Tsr架橋にも影響がみられたことから,クラスター内における膜に水平な方向へのシグナル伝達が示唆された.このシグナル伝達方式が走化性シグナルの増幅機構に関与していると考えられる.大腸菌走化性はシグナル伝達の研究分野におけるモデルシステムである.中でも,中心的な課題となっているのが走化性シグナルの増幅および増幅率(ゲイン)制御機構の解明である.走化性受容体は菌体の極で巨大なクラスターを形成する。クラスター内での受容体ダイマー間相互作用を介して隣接する受容体ダイマーへとシグナルが伝わりシグナル増幅が起こるとされているが,その詳細は不明である.特に,極クラスターが巨大な膜タンパク質複合体であることによる扱いの困難さから,受容体間相互作用の分子基盤についてはこれまで詳細な解析が行われてこなかった.私は,これまでの実験で単独の受容体を発現させて,ダイマー間相互作用変化を検出してきたが,この状況下では全ての受容体に誘引物質が結合可能であり,クラスター内で隣接する受容体ダイマー間をシグナルが伝達したかどうかを判断するのは困難である.そこで,大腸菌が4種類の走化性受容体をもつことに着目した.これらの受容体は混合クラスターを形成すると考えられているので,2種類の受容体(アスパラギン酸受容体Tar,セリン受容体Tsr)の共発現系を用いれば上記の課題をクリアできる.ダイマー間相互作用の検出はinvivoでのS-S架橋形成を利用した.はじめに,Tar架橋形成がTsr存在下で阻害されることから,混合クラスター形成を確認した.続いて,Tar-Tsrダイマー間で架橋したヘテロダイマーを検出し,異種受容体間相互作用が存在することを示唆する結果を得た.Tar特異的な誘引物質であるアスパラギン酸の添加によって,Tar-Tar架橋だけでなく,Tar-Tsr架橋,Tsr-Tsr架橋にも影響がみられたことから,クラスター内における膜に水平な方向へのシグナル伝達が示唆された.このシグナル伝達方式が走化性シグナルの増幅機構に関与していると考えられる.大腸菌走化性はシグナル伝達の研究分野におけるモテルシステムである.中でも,中心的な課題となっているのが走化性シグナルの増幅および増幅率(ダイン)制御機構の解明である.走化性受容体は菌体の極で巨大なクラスターを形成する.クラスター内での受容体タイマー間相互作用を介して隣接する受容体ダイマーへとシグナルが伝わり,シグナル増幅が起こるとされているが,その詳細は不明である.特に,極クラスターが巨大な膜タンパク質複合体であることによる扱いの困難さから,受容体間相互作用の分子基盤についてはこれまで詳細な解析が行われてこなかった.私は,これまでの実験で単独の受容体を発現させ,ダイマー間相互作用変化を検出することでゲイン制御機構の解明に寄与してきたが,この状況下では全ての受容体に誘引物質が結合可能であり,クラスター内で隣接する受容体ダイマー間をシグナルが伝達したかどうかを判断するのは困難であった.そこで,大腸菌が4種類の走化性受容体をもつことに着目した.これらの受容体は混合クラスターを形成すると考えられているので,2種類の受容体(アスパラギン酸受容体Tar,セリン受容体Tsr)の共発現系を用いれば上記の課題をクリアできる.ダイマー間相互作用の検出はin vivoでのS-S架橋形成を利用した.はじめに,Tar架橋形成がTsr存在下で阻害されることから,混合クラスター形成を確認した.続いて,Tar-Tsrダイマー間で架橋したヘテロダイマーを検出し,異種受容体間相互作用が存在することを示唆した.Tar特異的な誘引物質であるメチルアスパラギン酸の添加によって,Tar-Tar架橋だけでなく,Tar-Tsr架橋,Tsr-Tsr架橋にも影響がみられたことから,クラスター内における膜に水平な方向へのシグナル伝達が示唆された.このシグナル伝達方式が走化性シグナルの増幅機構に関与していると考えられる.
動物細胞小胞輸送変異株とセミインタクト細胞を用いたサイトーシスの分子機構の解明

エンドサイトーシス後期過程に異常のあるCHO変異株群を樹立し、解析を進めている。本年度は、変異株のひとつ、LEX2株で、コレステロール生合成の後期過程に関わる酵素のひとつに異常があることにより、細胞内遊離コレステロールレベルが低下し、後期エンドソームでの分子選別に異常が生じていることを突き止めた。そして、(1)後期エンドソーム多胞体からのゴルジ方向への分子選別にコレステロールが必須であること、(2)この分子選別過程に、多胞体構造の再構築が重要な役割をもつと考えられること、を示した。また、エキソサイトーシス経路の分子メカニズム解明を目的とし、「GFP可視化技術」と形質膜を一部透過性にした「セミインタクト細胞系」をカップルさせた顕微測光アッセイシステム確立した。本年度は、本システムを用い光学顕微鏡下の単一細胞内でGFP融合タンパク質の輸送及びGFP標識オルガネラのダイナミクスを定量的に解析し、かつ生化学的に関連因子を探索し次の結果を得た。(1)細胞分裂期(M期)におけるCHO細胞のゴルジ体、小胞体(ER)の形態変化と両オルガネラ間の小胞輸送ダイナミクスが密接に関係していることを発見した。(2)M期初期では、ER→ゴルジ体間の順行輸送がcdc2キナーゼ依存的に停止するが、逆行輸送はむしろ活性化されることが判った。(3)この原因の一つとしてtransitional ER(tER : ERからゴルジ体へ向かう輸送小胞が出芽するプラットフォーム)の形成がcdc2キナーゼ依存的に破壊されることを生細胞、セミインタクト細胞系を用いて明らかにした。M期において、このtERの形成が阻害されることによって、順行輸送は停止し、逆行輸送は活性化される結果、M期初期にゴルジ体の一部がERへ吸収されM期ゴルジ体が消失することを明らかにした。細胞内エンドサイトーシス経路の分子メカニズムを明らかにするために、以前開発した蛍光励起セルソーターを用いる方法でこの経路に異常を持つ変異CHO細胞の単離をすすめた。LDLの分解が遅い新たな複数の変異株を得ることに成功し、それらの表現型について詳細な解析を行った。変異株群は少なくとも4つの異なる表現型を持つクラスに分類できた。そのうちのひとつは、以前詳細な解析を加えたLEX1株と類似しているが必ずしも同じでない表現型を、他の3つのクラスはLEX1株とは明らかに異なる表現型を示した。得られた結果は、新たに得られた変異株群が、エンドサイトーシス細胞内経路のいくつか異なった過程に変異を持ち、この経路の解析においてこれらの変異細胞群が有用であることを示している。細胞内のエキソサイトーシス経路の分子メカニズムを明らかにするため、セミインタクト細胞を用いた新規な細胞内小胞輸送アッセイ系を確立した。まず、緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質をプローブとすることにより、共焦点レーザー蛍光顕微鏡・超高感度ビデオ付き蛍光顕微鏡、エバネセント蛍光顕微鏡下で、「単一」のインタクト細胞内での蛍光性膜蛋白質の小胞輸送過程を経時的に追跡でき、かつ、フォトンカウントシステムを用い、小胞体→ゴルジ体間の輸送のキネティックスを「定量的」に解析するシステムを確立した。次に、ストレプトリシンO(SLO)を用いて形質膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞内で、この輸送過程を、ATP再生系とL5178Y細胞の細胞質を用い再構成することに成功した。セミインタクト細胞内での輸送過程を上記顕微鏡システムを用いて追跡・解析した結果、小胞体からゴルジ体への輸送過程をATP一依存的な過程、ATP-細胞質-依存的な過程の、少なくとも2つの素過程にdissectionすることができた。

この再構成システムを用いることにより、それぞれの過程に関与する細胞質因子や、輸送中間体(小胞)のダイナミクスを制御する因子の検索が可能となった。(1)フローサイトメトリーにより表現型をダイレクトに解析し、それにもとづいて変異株を分離する方法を開発し、これを活用してエンドサイトーシス後期過程に体細胞遺伝学的アプローチを加えた。それにしたがって変異株の分離を進め、表現型の異なった後期エンドソーム課程に変異を持つ複数のCHO株を得た。そして、優性試験および相補性試験を行った結果、これらの変異株が、すべて劣性の変異を持ち、また複数の相補群に分類されることを示した。特にこれらのうちの異なる相補群に属する2つの変異細胞株、LEX1とLEX2について詳細な解析を進めた。その結果、エンドソーム後期過程はこれら二つの相補群の変異遺伝子によって規定される二段階の独立過程に分けられることをしめした。(2)インタクト・セミインタクト細胞内で生起するGFP標識オルガネラのダイナミクスを、超高感度ビデオカメラ付き蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡下で「単一細胞」を観察しながら追跡・定量的に解析する「一細胞計測法」を確立した。それを駆使し、次のオルガネラダイナミクスを再構成し、キネティックスの解析、必要な細胞質因子の検証を行った。(i)BFAによぐゴルジ体膜のdisasssembly過程の全過程を再構成し、チューブ形成過程とチューブとERとの融合過程に必要な因子(NSF,β-COPなど)を検証した。(ii)M期におけるゴジル体のfragmentationをセミインタクトMDCK細胞にカエル卵M期細胞質を添加することにより再構成した。MEK(MAP kinasekinase)、cdc2が段階的に関与し反応を進行させることを明らかにし、かつ小胞化したゴジル体がERへ吸収されることを世界で初めて明らかにした。(iii)ER-ゴルジ体間の小胞輸送を定量的にアッセイする系を確立し、そのキネティクスを解析することにより輸送に必要ないくつかの因子を明らかにした。以上3つの再構成系の確率により、今後それらの現象に必要な細胞質因子のスクリーニングシステムを確立できた。エンドサイトーシス経路の分子メカニズムを解明するために、低密度リポタンパク質のリソゾームでの分解が遅いCHO変異株群をセルソータを駆使した独自の方法で得、それらの解析を行っている。本年度は(i)蛍光観察により輸送系を定量的に解析する方法、(ii)レトロウイルスベクターを介した発現クローニング法を確立し、、エンドソーム後期過程は遺伝子の変異によって規定される複数の独立膜動過程に分けられること、そして、これらの後期エンドソーム膜動輪送の特定の進行過程における、コレステロールホメオスタシスの重要性を明らかにした。また、エキソサイトーシス経路の分子メカニズム解明を目的とし、「GFP可視化技術」と形質膜を一部透過性にした「セミインタクト細胞系」をカップルさせた顕微測光アッセイシステム確立した。本システムを用い、光学顕微鏡下の単一細胞内でGFP融合タンパク質の輸送及びGFP標識オルガネラのダイナミクスを定量的に解析し、かつ生化学的に関連因子を探索し次の結果を得た。
大都市におけるカトリック教会と市行政-19世紀のパリの事例-

本研究は、工業化と人口流入により大規模な社会変動を経験していた19世紀のパリにおいて、カトリック教会がそれにどのように対応したのかを、市行政との関連に注目しつつ調査したものである。この19世紀という時期は政教協約期(1801-1905年)にほぼ相当するが、こうした制度的背景から、教会は多くの点で市行政と協同せざるを得ない状況にあった。研究に際して具体的に取り上げた主題は、(1)教区の設置・再編、(2)郊外での聖堂・礼拝堂建設運動であった。本年度は研究の最終年度にあたるため、過年度の成果を踏まえて研究の総括をおこなった。都市化に対するカトリック教会の対応は、概して不十分だったといえる。19世紀初頭からはじまる人口流入に対して教区増設が試みられたが、既存教区間での利害対立があったほか、司教区自体も積極性を欠いていたため、わずかな増設にとどまった。また、その際に考慮されたのは、たんなる人口や聖堂までの距離であり、教区の社会・経済的特徴ではなかった。いっぽうで、教区増設以外に目立った対策がとられなかったという点でも、教会の姿勢の限界を指摘できる。20世紀後半から現在にかけて、教区という枠組みを打破しようとする運動が信徒のなかで目立っていることを考えると、当時の教会の姿勢は「後衛」的だったというべきだろう。たしかに第三共和政期にはパリ市は教会と敵対的であったが、都市化への対応が不十分だった根本的原因は教会の側にあると思われる。本研究は、大規模な社会変動を経験していた19世紀のフランス・パリにおいて、カトリック教会がそれにいかに対応したのかを、市行政との関連に注目しつつ明らかにするものである。扱う時期は政教協約期の1801年から1905年で、地理的範囲はセーヌ県とする。本年度は、研究課題のうち、教区の設置・再編の研究に主として取り組んだ。まず、平成14年夏に1ヶ月間の現地調査をおこない、パリ市歴史図書館やフランス国立図書館に所蔵されている当時の地図を閲覧して、教区の設置・再編の様子を明らかにした。つづいて、それを当該地区の人口、産業構造、社会階層などと照らし合わせて、それらが教区のあり方の変化とどうかかわっているのかを検討した。カトリック教会は、19世紀末までは宗教生活の基盤を教区という空間単位に求めており、都市化や人口増加には主に教区の分割・新設で対応しようとした。それが、20世紀になると、都市を多様な社会として認識しはじめ、教区という空間単位の活動よりも目的別の活動を重視するに至ったようである。今後は、教会関係者、市議会、住民などの意識をさまざまな史料を通して分析し、脱=空間化ともいえる上記の変化をより正確に検証する必要がある。また、既存の研究がなされている他都市との比較も重要であろう。本研究は、大規模な社会変動を経験していた19世紀のパリにおいて、カトリック教会がそれにどのように対応したのかを、市行政との関連に注目しつつ明らかにするものである。本年度は、急速に都市化が進展する市内周縁部および郊外におけるカトリック教会の認識と活動とを主に研究した。具体的には、歴史学、社会学、宗教社会学などの関連分野の研究書をもとに研究動向や周辺的事象を調査し、その上で、収集済みの資料を利用して研究をおこなった。研究成果の中間報告を、「都市化とカトリシズム」と題して、大阪大学イギリス史研究会で6月8日におこなった。本年度の研究成果の概要は、以下の通りである。パリでは、19世紀前半に、都市化への対応として周縁部で教区の増設が試みられた。だが、司教区としての支援の欠如と既存の教区からの抵抗のため、増設は困難を極めた。他方、増設にあたり考慮されたのは人口や聖堂までの距離であり、社会集団を考慮に入れるべきだという意見は全面には出なかった。あたかも、都市が社会的に均質な空間だという認識が優越していたかのように思える。それ以上に、教区については増設以外に目立った対策がとられなかったし、教区という枠組みが都市社会に適しているかどうかも問われなかった。20世紀、政教分離法の成立とともに、「枢機卿の建設運動」とよばれる聖堂建設事業がはじまった。事業は、聖堂建設にはある程度は有効だったが、教会の活動を刷新するにはいたらなかった。現在では、交通手段の発達と都市社会の複雑化・多様化とにより、教区という枠組みが形骸化し、信者たちの活動は教区を超え、また目的別におこなわれるようになっている。この点での教会の対応は迅速ではなかったと言うべきであろう。

また、その際に考慮されたのは、たんなる人口や聖堂までの距離であり、教区の社会・経済的特徴ではなかった。いっぽうで、教区増設以外に目立った対策がとられなかったという点でも、教会の姿勢の限界を指摘できる。20世紀後半から現在にかけて、教区という枠組みを打破しようとする運動が信徒のなかで目立っていることを考えると、当時の教会の姿勢は「後衛」的だったというべきだろう。たしかに第三共和政期にはパリ市は教会と敵対的であったが、都市化への対応が不十分だった根本的原因は教会の側にあると思われる。
広帯域音声が有する豊かな質感の音声内起源およびその知覚機構の解明

本年度は、実験動物の音声に対する認知の確からしさを動物の行動から定量的に評価するための実験プロトコル及び解析手法の確立を目指して動物実験を行った。実験にはモルモットを用い、動物の行動を引き起こすための音声としては、ヒトに対する心理実験で用いた音声の帯域とほぼ同等の帯域(500 Hz±0.25オクターブ、13.5 kHz±0.25オクターブ)の帯域雑音を用いた。既存の古典的条件付やオペラント条件付では、動物の認知の確からしさを評価しても高い確からしさが得られないことが見積もられたことから、本研究では、適応的条件付パラメータという考え方を新しく導入し、動物が提示された音声に対して正確な時間に行動させることを目標に実験及びプロトコルの改善を進めていったところ、動物の行動から算出される認知の不確かさが5%未満であることを数学的に保証する手法を確立した。動物は言葉で実験者に認知の結果を伝えることが困難なので、動物の認知は、その行動からしか客観的に評価することができない。脳で行われている音声周波数統合と、その統合によって引き起こされた認知を行動から評価することは、その仕組みを解明する上では欠かせないものであると言える。今年度の研究によって、実験動物の音声に対する認知の確からしさを客観的かつ定量的に評価する実験手法が確立されたことは、次年度の研究のみならず、動物モデルを用いた認知に関する実験全体への貢献につながると考えられる。平成30年度以降に計画されていた動物実験では、動物の脳で行われている音声認知の客観的な評価が重要な要素の一つとなっている。その重要な要素の一つが実現可能なものとなり、次年度以降の研究を進める上での基礎が完成した。動物の認知を統計学的に評価するためには、十分なオペラント条件付がなされた動物の数が必要になり、電極の埋め込みなどの侵襲性が高い実験を推進していくためには、より多くの数が必要になると考えられる。オペラント条件付のさらなるプロトコルの改善を行い、現状の2ヶ月程度の条件付期間を更に短縮し、1ヶ月程度の条件付期間で、認知の確からしさを動物の行動から定量的に評価できるようにすることを目指す。本年度は、ヒトの音声等の自然な広帯域音声内で見られるミリ秒程度の帯域間時間差が、ヒトにおいて知覚的な変化を生み出すか否かの検討を行った。この検討のために、まず、不要な雑音が発生しないファンレスのタブレット端末を用意し、最高で20 kHzの高さの音まで忠実に音をプレイバック可能なソフトウェアを作成した。その作成した装置を用いて、研究計画の通り、テスト音としては8 kHz±0.25オクターブと500 Hz±0.25オクターブの音を組み合わせた音で、帯域間時間差を与えないもの(参照音)、帯域間時間差を与えたもの(時間差音)をランダムにテスト音として被験者に提示した。被験者は、テスト音(参照音も含む)が参照音と等しいか否かを画面操作により答えた。9名の被験者の結果から相互情報量を計算したところ、4ミリ秒の帯域間時間差に対して0.052ビットながらもランダムな応答と比べて有意に大きい情報量となっていた。期待通り、時間差が大きくなるにつれて相互情報量は大きくなり、64ミリ秒の帯域間時間差に対しては、0.65ビットの情報量となっていた。この実験及び解析結果から、ヒトの聴覚は4ミリ秒以上の帯域間時間差に対して有意な感度があり、ミリ秒程度の帯域間時間差はヒトにおいて知覚的な変化を引き起こすことが明らかになった。我々の音声(例えば[su]の音)では、10ミリ秒以上の帯域間時間差が見られるが、その時間差の大小が感覚の違い(わずかに感じるよく感じる)を生む可能性が強く示唆された。平成29年度に計画されていた心理実験及び解析が完了し、動物実験で示唆されていた、帯域間時間差に対する聴覚的感度がヒトにおいても見られた。

研究計画通り、人工的な聴覚刺激を用いて帯域間時間差の知覚への影響をモルモットを用いて検討する。知覚の評価に用いるオペラント条件付けは自由行動下の動物で行うため、刺激用電極の固定が懸案となっているが、今のところ、1ヶ月程度であれば電極保護具の固定が可能であると確認できているため、保護具とスリップリングを活用し、自由行動下の動物に対して電気刺激を行えるようになると見込んでいる。動物の認知を統計学的に評価するためには、十分なオペラント条件付がなされた動物の数が必要になり、電極の埋め込みなどの侵襲性が高い実験を推進していくためには、より多くの数が必要になると考えられる。オペラント条件付のさらなるプロトコルの改善を行い、現状の2ヶ月程度の条件付期間を更に短縮し、1ヶ月程度の条件付期間で、認知の確からしさを動物の行動から定量的に評価できるようにすることを目指す。当初計画していた防音室の購入を行うと研究費が不足するため、別の予算で防音室を購入した。その結果、設備備品費が大きく抑制されたため、平成30年度以降に必要となる動物実験関連装置の作成等のための物品費(消耗品費)として使用した。平成30年度以降は、慢性実験のための各種装置に大きな費用がかかると見込まれるため、平成30年度分と合わせて助成金を使用する計画である。新規に確立した実験手法に関する論文の執筆に時間を要し、出版費の支払いが次年度になり、使用する動物の数も当初の予定より少なくなったため。
ファジィコントロ-ルの振動制御問題への応用に関する基礎的研究

本研究は、主として地震時の構造物の振動を制御するシステムを、ファジィコントロ-ルの概念を用いて構築することを目標としている。従来の振動制御の大部分は微分方程式を解くことによって行われているが、この方法では時として収束性の悪さを示し、早い変化に対応できない場合がある。これに対し、本研究では、仙台市の地下鉄あるいはクレ-ンやエレベ-タ等の多くの制御問題で成功を収めているファジィコントロ-ルの手法を適用し、より簡単でしかもレスポンスがよく、ロバストネスを持つ振動制御システムを作るための基礎的な研究を行った。数値シミュレ-ションの結果、非常に簡単なファジィ制御ル-ルを用いることにより、地震時の振幅を約半分程度に抑えることが可能となった。特に、1自由度構造系や2自由度構造系等の簡単な構造モデルでは、速度に関するル-ルのみで十分であることが分かった。また、2自由度系モデルの1層と2層を独立と考え、1自由度系モデルのためのファジィ制御ル-ルを別々に適用した結果、かなり良好な制御結果が得られた。ファジィ制御を用いると、多自由度系の振動特性(例えば振動モ-ドなど)を直接考慮しなくても、かなりの制振効果を上げることができる。ファジィ制御ル-ルのメンバシップ関数の設定には、対象モデルの構造特性がかなり影響を及ぼし、最適なメンバ-シップ関数の同定はそれほど容易ではない。さらに、これらの結果は簡単な模型実験によって確かめられた。今後の課題として、本研究で開発したファジィ振動制御法により、従来の最適制御と比較してもかなりよい結がを得られたが、さらに最適制御で用いられている制振に関わる知識をファジィ制御ル-ルの形で取り入れることができるならば、さらに効率的な振動制御システムを開発できると思われる。これと同時に、さらに大規模な実験を行い、実用化に関わる諸問題を行解明することが必要である。本研究の目的は、主として地震時の構造物の振動を制御するシステムをファジィコントロ-ルの概念を用いて構築することである。そのために本年度は、ファジィコントロ-ラと構造物の振動制御に関する既往の研究を調査し、構造物の振動制御に最も適したファジィコントロ-ルの方法を見いだすことを試みた。この結果、もちろん今後シミュレ-ション等を通じて検討しなければ明確なことは言えないが、予見ファジィコントロ-ル等が構造物の振動制御に良いのではないかという感触を得た。この検討と同時に、従来よく使われている簡単な構造をしたファジィコントロ-ラのプロトタイプの試作を行った。現在、数値シミュレ-ション等を通じプログラムのデバッギングを行っている段階である。前述したように、本研究の主目的は地震に対する振動制御であるが、その前に風に対する振動制御について検討をした。これは、風に対する制御の方がその定常性の強さから、地震に比べて振動制御が容易であると考えたからである。その後、構造物の地震時の応答解析と地震動の予測に関する研究を行い、入力地震波の検討を行い、まずエルセントロ地震波を初期のサンプルデ-タとすることにした。振動制御方式に関しては、TMD、TLD、パルス制御等について調査研究を行った。その結果、まず模型実験に対しては非常に簡単なパルス制御方式を取ることにし、実際の制御力はステップモ-タによって与えることにした。現在、簡単な一層ラ-メン構造に対する振動実験が行えるようになった。

今後、ファジィコントロ-ラを組み合わせることと、模型を多層の多自由度のものにして振動モ-ドの影響を調べることを行う予定である。本研究は、主として地震時の構造物の振動を制御するシステムを、ファジィコントロ-ルの概念を用いて構築することを目標としている。従来の振動制御の大部分は微分方程式を解くことによって行われているが、この方法では時として収束性の悪さを示し、早い変化に対応できない場合がある。これに対し、本研究では、仙台市の地下鉄あるいはクレ-ンやエレベ-タ等の多くの制御問題で成功を収めているファジィコントロ-ルの手法を適用し、より簡単でしかもレスポンスがよく、ロバストネスを持つ振動制御システムを作るための基礎的な研究を行った。数値シミュレ-ションの結果、非常に簡単なファジィ制御ル-ルを用いることにより、地震時の振幅を約半分程度に抑えることが可能となった。特に、1自由果構造系や2自由度構造系等の簡単な構造モデルでは、速度に関するル-ルのみで十分であることが分かった。また、2自由度系モデルの1層と2層を独立と考え、1自由度系モデルのためのファジィ制御ル-ルを別々に適用した結果、かなり良好な制御結果が得られた。ファジィ制御を用いると、多自由度系の振動特性(例えば振動モ-ドなど)を直接考慮しなくても、かなりの制振効果を上げることができる。ファジィ制御ル-ルのメンバシッブ関数の設定には、対象モデルの構造特性がかなり影響を及ぼし、最適なメンバ-シップ関数の同定はそれほど容易ではない。さらに、これらの結果は簡単な模型実験によって確かめられた。今後の課題として、本研究で開発したファジィ振動制御法により、従来の最適制御と比較してもかなりよい結果が得られたが、さらに最適制御で用いられている制振に関わる知識をファジィ制御ル-ルの形で取り入れることができるならば、さらに効率的な振動制御システムを開発できると思われる。これと同時に、さらに大規模な実験を行い、実用化に関わる諸問題を解明することが必要である。
医療契約の成文化（法典化）

医師と患者との間に契約関係が存在すると想定し、(解釈における)典型的な医療契約類型からさらにその成文化(法典化)へと、理論的接合をはかる研究を行った。中心的な研究成果は、現在わが国に立法例の存在しない医療契約法について、比較の好条件を備えた直近の立法例であるドイツの医療契約法を立法学上の視点から分析し、有意な示唆を獲得したことである。さらに周辺的な成果として、国内の他の非対称な契約の法典化(消費者契約法、労働契約法)を同一視点から分析し、本研究内容の相対化・客観化をはかった。本研究は、新民法の制定を待って、最終的なわが国の医療契約法(案)の提案に向かうものである。1本研究は、医師と患者の契約関係について、その実体的な内容の解明、(解釈論上の)典型的な医療契約類型の定立から「さらに」、その成文化(法典化)へと、理論的接合をはかることを目的とする。そのために、2013年に民法典の契約法に医療契約を組み込む立法が行われたドイツ法を主な素材として、比較法研究を行うものである。本年度は以下の作業を行った。2まず、本研究の全体像をあきらかにする作業を行った。具体的には、(1)立法における価値判断という本研究の問題意識、(2)2つの法分野から1つの法現象を捉えるという本研究の分析視角、(3)患者の権利法の概括的考察(歴史的経緯、立法の目的、立法の構造)、(4)ドイツ民法典改正の体系的考察(改正前の役務提供型契約の編成、新しい医療契約の体系的地位等)、(5)新しい医療契約の法定のあり方(定義規定630a条、定義規定以外の当事者の権利義務規定630c条630 g条、立証分配の特則630h条)である。そして、現時点で得られる示唆点をあきらかにした。以上の内容を著書においてまとめて公表している。初年度の段階で研究の全体的道すじが明確に見通せたこと、そして、民法改正が注目される中で関連する外国法情報を一般国民に発信できたことは、重要な意義がある。3 2と並行して、ドイツ2013年患者の権利法について、わが国の患者の権利法の立法運動と比較しながら、考察する作業を行った。具体的には、ドイツの患者の権利法を、わが国における患者の権利の法制化を考えるにおいて有意な3つの視点から分析し、示唆を得た。医療契約の法典化の背景事情として存在する立法論議をあきらかにすることは重要である。この内容に関して、患者の権利宣言30周年記念シンポジウムで講演を行ったことは、社会的意義を有する。以上の研究成果は紀要論文で公表している。2まず、昨年度実施の基本的・全体的研究(昨年度報告書参照)の成果を、日本医事法学会で個別報告した。報告論文を学会誌で公表予定である。また、この成果を含む著書(前年度報告書参照)に基づき、早稲田大学に学位請求し、博士(法学)の学位を取得した。以上と並行して、引き続き、ドイツの医療契約法についての情報資料のアップデイトと個別論点(特に医療水準や経済的情報提供義務)の深化に努めた。3また、国内の周辺法領域の立法に視野を拡げ、消費者契約法と労働契約法の立法の共通性をあきらかにする作業を行った。その結論は以下のとおりである。(1)外在的要因ないし背景事情として規制緩和や自由化の要求が存在したこと、(2)内在的要因として、弱者の人間像において自立へ向かう、あるいは向けられる動きがみとめられること、(3)市民法原理とともに、それぞれの法領域で発展した原理ないし手法を有していること、(4)市民法原理の発展形、あるいは市民法原理の部分的導入の装置として、契約法という法形式での立法が選択されたこと、(5)規制内容において、弱者の自己決定を実質化することと、契約内容そのものを規制することをともに含み、そのなかから当事者にインセンティブを与える規律を条文化していること、またはそうあるべきこと、(6)当該法領域における他法との協働、である。以上は紀要論文で公表予定である。2は研究の基本的部分の強化・公表・評価、3は2の補強と学術交流の点で重要な意義を持つ。ドイツの医療契約法に関する資料の収集、通読、執筆、発表に加えて、周辺法領域の立法例にも視点を転じて、研究の質・量ともに充実させることができた。ドイツ法の新しい資料が予想よりも充実した内容でなかったことが「おおむね」と評価する理由である。1本研究は、医師と患者の契約関係について、その実体的な内容の解明、(解釈論上の)典型的な医療契約類型の定立から「さらに」、その成文化(典型化)へと、理論的接合をはかることを目的とする。

最終年度にあたる本年度は、特に以下2、3の作業を行った。2本課題と並行して行ってきた医療基本法に関する研究の最終考察を行い、本課題の考察と結びつける分析を行った。すなわち、ドイツの患者の権利法を、政策論とは区別された法的視点から分析した。本成果は、医療基本法研究の最終成果として、これまでの翻訳資料と合わせる形で、論文の形で公表を計画している。本研究は本課題の研究と並走し、本課題の研究の視野を拡げ、質を高めるために重要な意義を有する。3他方、とくに美容医療に関して、医療契約論および医療契約法の特徴的な展開を研究した。具体的には、医療水準から逸脱する合意の有効性、医師の経済的情報提供義務について研究した。本成果を自身が研究会長を務める日本賠償科学会第68回研究会で報告し、報告論文を学会誌で公表予定である。さらにそれを深化させた研究を、21世紀不法行為法研究会で発表し、書籍で公表予定である。本研究は、本課題の重要な個別的論点の深化と位置づけることができる。そして、次の研究課題の立案に繋がっていった。4補助事業期間全体を通じての研究成果として、最終的に、わが国における医療契約法の成文化(法典化)に関し、1社会的・経済的事情および患者の人間像、2保護目的・規制原理・介入根拠、3法の形、4条文選択基準、5全法体系ならびに周辺法領域の立法との整合性という視点から構想するに至った。今後、新民法典と関連づけながら、確定した医療契約法構想として学会誌等で公表することを計画している。医師と患者との間に契約関係が存在すると想定し、(解釈における)典型的な医療契約類型からさらにその成文化(法典化)へと、理論的接合をはかる研究を行った。中心的な研究成果は、現在わが国に立法例の存在しない医療契約法について、比較の好条件を備えた直近の立法例であるドイツの医療契約法を立法学上の視点から分析し、有意な示唆を獲得したことである。さらに周辺的な成果として、国内の他の非対称な契約の法典化(消費者契約法、労働契約法)を同一視点から分析し、本研究内容の相対化・客観化をはかった。本研究は、新民法の制定を待って、最終的なわが国の医療契約法(案)の提案に向かうものである。資料の読み込み、執筆、発表、いずれも順調に行うことができた。研究の全体像をあきらかにする作業を先行させた関係で、個別的テーマの詳細な検討について課題が残った点が、「おおむね」と評価する理由である。当初研究計画よりも視野を拡げ、消費者契約法と労働契約法についての研究を行った成果を活用したい。ドイツ法研究のわが国への適合的移植につき、全法体系の中での位置づけや、相対化という意味で、当初の研究計画よりも精度の高い研究を行う。注目すべき個別的論点の解明にもいっそう力を入れる。研究会長をつとめる日本賠償科学会とのバッティングにより比較法学会報告ができなくなった点に対しては、本年度の日本医事法学会報告での個別報告に加え、比較法学会の学会誌に最終結果を投稿することで対応したいと考えている。民法、医事法全体像があきらかになったことをふまえ、今後は個別的テーマごとの詳細な研究にいっそう力を入れる。その際、全体像をふまえた効率的な作業につとめる。それとともに、周辺法領域や他分野にも視野を拡げ、研究の質の向上につとめる。購入を想定していた洋書が図書館で借りることで対応できる内容であったため、書籍購入費が思っていたよりはかからなかったことによる。
インドール環4位への窒素原子導入酵素の触媒機構の解析と応用

本研究代表者らは,発がんプロモーター・テレオシジンの基本骨格であるインドラクタム-V(IL-V)を大量に産生する特異な放線菌(Streptomyces blastmyceticus NA34-17株)を用いて,IL-Vの4位セコ体であるN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolが,IL-Vの生合成前駆体であることを明らかにした.またIL-V前駆体は,非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)によって合成されることが予想されている.昨年,本菌株におけるテレオシジン生合成遺伝子群は,NRPSをコードするtcnA,IL-Vへのモノテルペン側鎖導入酵素をコードするtcnD,機能未同定のMbtHをコードするtcnB,さらにcytochrome P450oxidaseをコードするtcnCからなることを明らかにした.本年度は,TcnB及びTcnCをHis-tag融合タンパク質として大腸菌で大量発現させた.TcnB及びTcnCは,それぞれ8.6及び44.7kDの可溶性タンパク質として調製できた.TenCは,ポルフィリン環に起因する極大吸収が410nm付近に認められ,P450であることが示唆された.そこでTenC及びTenBを用いて,ホウレンソウ由来ferredoxinやferredoxin reductaseなどのP450還元再生系タンパク存在下でN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolのIL-Vへの閉環を試みたが,IL-Vの生成を確認できなかった.TcnCがホウレンソウ由来の還元再生系では活性化していない可能性があり,TcnC特異的な還元再生系が必要なのかも知れない.今後in vivoでの閉環反応の検出も視野に入れて,放線菌(Streptomyces lividans TK-24)での発現を試みる必要がある.本研究は,インドール環4位への窒素原子導入反応を触媒する酵素を,本研究代表者らが保有する特異な放線菌(Streptomyces blastmyceticum NA34-17)の生合成遺伝子を用いて大量に調製するとともに,その触媒機構を明らかにすることを目的としている.S.blastmyceticumが生産するteleocidinは,強力な発がんプロモーターであり,indolactam-V (IL-V)を基本骨格としている.IL-VはN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolがインドール環4位に直接閉環した構造を有しているが,この閉環反応は有機合成化学的には極めて困難である.IL-V前駆体は,非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)によって合成されることが知られている.そこで,本菌株がもつNRPSのN-メチル化ドメインの保存領域を基にプライマーを設計し,クローニングを行なった.その結果,teleocidin生合成遺伝子群は,NRPSをコードするtcnA,IL-Vの7位へのモノテルペン側鎖導入酵素をコードするtcnD,機能未同定のMbtHをコードするtcnB,さらにcytochrome P450oxidaseをコードするtcnCからなることが判明した.これまでに本研究代表者らによって明らかにされたIL-Vの生合成経路からTcnBおよびTcnCがIL-Vへの閉環反応を触媒していることが予想された.そこでまず,大腸菌においてtcnB, tcnCを大量発現させることを試みた.TcnB及びTcnCと思われるタンパク質の発現に成功したが,N-methyl-L-valyl-L-tryptophanolをIL-Vに閉環させる条件を確立することはできなかった.今後,放線菌での発現ならびにco-factorを検討する必要がある.本研究代表者らは,発がんプロモーター・テレオシジンの基本骨格であるインドラクタム-V(IL-V)を大量に産生する特異な放線菌(Streptomyces blastmyceticus NA34-17株)を用いて,IL-Vの4位セコ体であるN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolが,IL-Vの生合成前駆体であることを明らかにした.またIL-V前駆体は,非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)によって合成されることが予想されている.昨年,本菌株におけるテレオシジン生合成遺伝子群は,NRPSをコードするtcnA,IL-Vへのモノテルペン側鎖導入酵素をコードするtcnD,機能未同定のMbtHをコードするtcnB,さらにcytochrome P450oxidaseをコードするtcnCからなることを明らかにした.本年度は,TcnB及びTcnCをHis-tag融合タンパク質として大腸菌で大量発現させた.TcnB及びTcnCは,それぞれ8.6及び44.7kDの可溶性タンパク質として調製できた.TenCは,ポルフィリン環に起因する極大吸収が410nm付近に認められ,P450であることが示唆された.そこでTenC及びTenBを用いて,ホウレンソウ由来ferredoxinやferredoxin reductaseなどのP450還元再生系タンパク存在下でN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolのIL-Vへの閉環を試みたが,IL-Vの生成を確認できなかった.TcnCがホウレンソウ由来の還元再生系では活性化していない可能性があり,TcnC特異的な還元再生系が必要なのかも知れない.今後in vivoでの閉環反応の検出も視野に入れて,放線菌(Streptomyces lividans TK-24)での発現を試みる必要がある.