hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エピジェネティック制御におけるヒストンバリアントＨ２Ａ．Ｚアセチル化の機能解析

クロマチン構造の変換には、通常のヒストンに代わってヌクレオソーム中に導入されるヒストンバリアントが重要な枠割を果たすことが知られている。ヒストンバリアントH2A.Zは酵母からヒトにまで進化的に高度に保存されたヒストンバリアントであり、生物学的に重要な機能を持つと考えられている。これまでの研究により、H2A.ZのN末端ヒストンテールはアセチル化修飾を受けることが報告されていたが、その機能は不明であった。本研究室ではこれまでに、遺伝子破壊細胞の樹立が可能な培養細胞ニワトリDT40細胞を用いることによって、H2A.Z遺伝子破壊(H2A.Z KO)細胞を樹立した。昨年度の研究によって、H2A.Z KO細胞に対して外来生H2A.Z遺伝子を安定発現させることで、H2A.Z KO細胞の表現型を相補することを利用した「遺伝学的機能相補系」を樹立し、H2A.Zへのアセチル化修飾は転写制御特異的に寄与することを示した。本年度はこの細胞生物学的解析を用いて、H2A.Zアセチル化修飾の転写制御への寄与をさらに詳細に解析した。具体的には、野生型H2A.Z (wtH2A.Z)、アセチル化修飾の起こらないH2A.Z (5KR-H2A.Z)を安定発現するH2A.Z KO細胞を樹立し、細胞外刺激によって転写が誘導されるEGR1遺伝子に着目して解析を行った。クロマチン免疫沈降解析によりEGR1遺伝子領域のアセチル化H2A.Zの存在量を比較したところ、細胞外刺激後にアセチル化H2A.Zの存在量が増加することが示された。重要なことに、EGR1遺伝子の転写誘導はwtH2A.Z発現細胞では観察されたが、5KR-H2A.Z発現細胞では観察されなかった。これらの結果より、H2A.Zアセチル化修飾は転写誘導において重要な機能を持つことが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。真核生物のゲノムDNAは核内タンパク質ヒストンと結合してクロマチン構造を形成し、クロマチン構造の動的変換によって多様なゲノム機能が制御されている。このようなクロマチン構造の変換には、通常のヒストンに代わってクロマチンに導入されるヒストンバリアントが重要な役割を担っている。特にヒストンバリアントH2A.Zは酵母からヒトにまで進化的に高度に保存されており、生物学的に重要な機能を持つと考えられているが、その機能は多くの点が不明である。本研究は、遺伝子破壊細胞の樹立が容易なニワトリDT40細胞により樹立されたH2A.Z遺伝子破壊(H2A.Z KO)細胞を用いて、ゲノム機能制御におけるH2A.Zの機能解明を目指した。まず、H2A.Zのゲノム機能制御への寄与を検証するため、H2A.Z KO細胞に対してマイクロアレイ転写解析・顕微鏡観察を行い、H2A.Z KO細胞の表現型を解析した。この結果、H2A.Zは染色体分配と転写制御の両面において重要な機能を持つことが示された。次に、H2A.Zの機能ドメインとして、アセチル化修飾を受けるN末端テール領域に着目した解析を行った。具体的には、野生型H2A.Z(wtH2A.Z)、アセチル化修飾の起らない変異型H2A.Z(5KR-H2A.Z)、テールをH2A型に置換したキメラ型H2A.Z (H2A-H2A.Z)をH2A.Z KO細胞に安定発現させ機能相補性を検証した。樹立した安定発現株の表現型を比較した結果、いずれの細胞株でも染色体分配異常を相補可能であった。しかし一方、変異型H2A.Zを発現する細胞株では、wtH2A.Z発現細胞と比べて遺伝子発現に異常が生じていた。これらの結果は、H2A.Z N末端テールが転写制御に特異的に寄与することを示しており、H2A.Z N末端テールのゲノム機能制御における機能を明らかにすることが出来た。ゲノム機能制御におけるH2A.Zの機能を解析するため、(1)H2A.Z KO細胞を用いた表現型解析、(2)H2A.Z KO細胞に対して外来性H2A.Zを安定発現する機能相補実験系、二つの実験系を組み合わせることで、H2A.Z N末端テールの機能性について解析することが出来た。H2A.Z N末端テールはアセチル化修飾が重要な機能を持つことが知られていたが、配列特異性が転写制御において機能を持つことを示したのは、本研究が初の報告である。さらに、H2A.Z KO細胞を用いた機能相補実験系は、H2A.Z N末端テールのみでなく、H2A.Zのその他の機能ドメインの解析に対しても応用可能なものである。このような新規の知見、新しい実験系の樹立は当初の計画を上回っており、本年度は計画以上に研究が進展したと考えられる。

本研究室ではこれまでに、遺伝子破壊細胞の樹立が可能な培養細胞ニワトリDT40細胞を用いることによって、H2A.Z遺伝子破壊(H2A.Z KO)細胞を樹立した。昨年度の研究によって、H2A.Z KO細胞に対して外来生H2A.Z遺伝子を安定発現させることで、H2A.Z KO細胞の表現型を相補することを利用した「遺伝学的機能相補系」を樹立し、H2A.Zへのアセチル化修飾は転写制御特異的に寄与することを示した。本年度はこの細胞生物学的解析を用いて、H2A.Zアセチル化修飾の転写制御への寄与をさらに詳細に解析した。具体的には、野生型H2A.Z (wtH2A.Z)、アセチル化修飾の起こらないH2A.Z (5KR-H2A.Z)を安定発現するH2A.Z KO細胞を樹立し、細胞外刺激によって転写が誘導されるEGR1遺伝子に着目して解析を行った。クロマチン免疫沈降解析によりEGR1遺伝子領域のアセチル化H2A.Zの存在量を比較したところ、細胞外刺激後にアセチル化H2A.Zの存在量が増加することが示された。重要なことに、EGR1遺伝子の転写誘導はwtH2A.Z発現細胞では観察されたが、5KR-H2A.Z発現細胞では観察されなかった。これらの結果より、H2A.Zアセチル化修飾は転写誘導において重要な機能を持つことが示唆された。本年度の研究によって樹立された変異型H2A.Z発現細胞を用いて、H2A.Zアセチル化による転写制御機構の解析を行う。これまでの研究によって、H2A.Zアセチル化ががん原遺伝子JUN, FOSの転写誘導に寄与することを示唆する結果が得られているので、この2遺伝子をモデル遺伝子としてクロマチン免疫沈降法、ヌクレアーゼ処理を用いたクロマチン構造解析を行う。また、H2A.Zアセチル化修飾はDNA損傷修復に寄与することも示唆されている。そこで並行して、N末端テール変異型H2A.Z発現細胞を用いて、DNA損傷修復におけるH2A.Zアセチル化修飾の機能についても検証を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
重力レンズ現象から探る始原ミニハローの起源

4重像をもつ重力レンズを用いて、レンズ銀河内のサブハロー(小質量のハロー)もしくは視線方向のダークマターの構造によるレンズ効果を理論および観測的に求めた。その結果、以下の事が判明した。1)観測データはコールドダークマター(CDM)に基づく宇宙モデルと矛盾しない。2)ウォームダークマター(WDM)から成る宇宙モデルでは、観測データを説明することが難しく、粒子の質量は電子の質量の約400分の1より大きくなければならない。これらの結果から、原始銀河の母体であると考えられる始原ミニハローの起源はCDMである可能性が高まった。一方で、近傍矮小銀河の観測データはCDMモデルの予言と矛盾することが分かった。(1) N体シミュレーションを用いたミニハローの理論計算(井上、高橋)・1024の3乗個の粒子を用いて得られたN体シミュレーションのデータを用いて、一辺10Mpc/hのボックスに対しレイトレーシングシミュレーションを実行した。そして、点光源をもつ中間赤外クエーサー-銀河四重像レンズに対し、視線方向に存在するミニハローやミニボイドによる弱い重力レンズ効果を調べた。その結果、これまでに得られたパワースペクトルのみを用いる計算と同様、フラックス比異常の原因は視線方向に存在するミニハローやミニボイドによって充分説明可能であることが判明した(Takahashi R. and Inoue K.T. MNRAS 2014)。(2)中間赤外光源であるクエーサーの内部構造の理解(峰崎)・重力レンズクエーサーの観測から摂動体の質量に制限を与えるためには、光源であるクエーサーの内部構造の理解、とくに各波長に対応する放射領域の幾何学的な大きさが重要である。変光スペクトルの研究から標準降着円盤モデルに多少の変更あるいは他の放射源を加える必要があることが判明した(Kokubo et al. 2014)。またダストトーラス内縁については、その放射機構に妥当なモデルを採用することで可視赤外線変光遅延データから標準的なハッブル定数の値を導くことができた。これはダストトーラス内縁についてこれまでの理解が妥当であることを示している(Yoshii et al. 2014)。今年度の主な研究成果は以下の通りである。(1)我々は四重像QSOレンズを用いて温かいダークマターの質量に下限を付けた(Inoue, Takahashi, Takahashi, Ishiyama 2015, MNRAS 448, 2704)。赤方偏移0<z<3の領域において、「カスプ問題」や「行方不明の矮小銀河」問題を解決する可能性をもつ温かいダークマターモデルにとって否定的な結果となった。言い換えると、視線方向に太陽質量の一億倍程度以上の質量をもつ構造がなければ、フラックス比異常を説明することは困難であるということになる。今後は、今回我々が仮定した重力レンズ銀河の中心付近の密度分布の性質や、視線方向の射影重力ポテンシャルの統計的性質について詳細に調べる必要がある。また、バリオンの重力的影響も考慮していく必要がある。(2)我々は四重像QSOレンズMG0414+0534にみられるフラックス比異常がレンズ銀河内のサブハローだけでなく、視線方向に存在するボイドやフィラメントによっても説明可能であることを初めて示した(Inoue 2015, MNRAS 447, 1452)。今後は、MG0414+0534において視線方向の射影重力ポテンシャルの性質を観測的に明らかにし、本当にボイドやフィラメントによってフラックス比が変化しているのか否か確認する必要がある。そのためにはALMAを用いたサブミリ波観測が不可欠である。アタカマサブミリ波ミリ波電波干渉計(ALMA)によって観測されたサブミリ波銀河SDP.81の4重重力レンズ像を用いて、以下のことが判明した(Inoue, Minezaki, Matsushita, Chiba 2016, MNRAS 457, 2936)。1)拡がった光源に対する「フラックス比異常」を発見した。特にその内、パリティ(像の表裏)が正であるレンズ像が系統的に暗くなっていることを発見した。2)1)の効果は銀河間空間において局所的に密度が低いボイド領域を考えれば自然に説明できる。また、その表面質量密度は1秒角の2乗あたり太陽質量の10の8乗倍程度である。3)一酸化炭素の輝線から背景となる主レンズに対し、0.01秒角のオーダーのレンズ像の位置のずれ(アストロメトリックシフト)が観測された。これを視線方向の非線形構造による重力レンズ効果と解釈しても矛盾は生じない。銀河系とアンドロメダ銀河に付随する矮小楕円体銀河の恒星系に対して、それらの視線速度分布から、背景にあるホストハローに付随するサブハローの密度分布を求めた(Hayashi and Chiba 2015, ApJ, 810, 22)。その結果、以下のことが判明した。1)中心部のダークマターの分布は、カスプ状およびコアの2種類に分類される。2)これらのサブハローは大きく扁平な形状をしていることが示唆され、CDMに基づく数値シミュレーションの結果と食い違う。さらに、サブハローの質量分布をその回りの円軌道を想定した際の回転速度で表現する際、回転速度が最大となる半径以内に含まれるダークマターの面密度が、どれも1パーセク平方あたりおおよそ太陽質量の20倍となり、しかも、どの大きさのハローでも一定のユニバーサルな値であることを発見した(Hayashi & Chiba 2015, ApJ, 803, L11)。

4重像をもつ重力レンズを用いて、レンズ銀河内のサブハロー(小質量のハロー)もしくは視線方向のダークマターの構造によるレンズ効果を理論および観測的に求めた。その結果、以下の事が判明した。1)観測データはコールドダークマター(CDM)に基づく宇宙モデルと矛盾しない。2)ウォームダークマター(WDM)から成る宇宙モデルでは、観測データを説明することが難しく、粒子の質量は電子の質量の約400分の1より大きくなければならない。これらの結果から、原始銀河の母体であると考えられる始原ミニハローの起源はCDMである可能性が高まった。一方で、近傍矮小銀河の観測データはCDMモデルの予言と矛盾することが分かった。拡がった光源に対する視線方向の構造による弱い重力レンズ効果の解析が遅れているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。宇宙論ALMAによる観測を実行し、フラックス比異常の原因を探ること。また、既に観測されている中間赤外フラックスのデータを用いて、比較的低赤方偏移のソースをもつ4重像レンズにフラックス比異常がみられるか否か調べること。当初の予定では2048の3乗個の粒子のシミュレーションを行う予定であったが、計算時間の関係で1028の3乗個になってしまったため。ALMAやSMAによるサブミリ波観測プロポーザルは提出済みである。予定よりALMAの観測日程が遅れており、必要な研究打ち合わせが出来なかったため。N体シミュレーションの粒子数を増やし、これまでの数値計算との整合性を評価する。ALMAの観測が終了後、そのデータ解析に関して研究打ち合わせを行う。そのための旅費に使用する。数値計算機などの物品費が想定より安くなったため。剰余分は次年度ワークステーションの購入などに充当する。
木材腐朽菌のフェニルアラニンアンモニアリアーゼのリグニン分解過程での役割

前年度に引き続き、木材腐朽菌Phenerochaetechrysosporiumの二次代謝産物Veratryl alcohol(VA)の蓄積が、培地へのフェニルアラニン添加により阻害される機構を明らかにするために、フェニルアラニン、又、アンモニウムイオンの添加がアンモニア同化酵素(L-Glutamate:NADP^+ oxidoreductase,EC1.4.1.4(GDH),L-Glutamate:ammonia ligase,EC6.3.1.2(GS))活性に与える影響を検討した。まず、培地に添加したアンモニウムイオン、又、フェニルアラニンは、添加後5日、又、7日で代謝され培地より消失した事を見出した。フェニルアラニンの減少と、誘導されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性(PAL)は同期していたため、菌体は、PAL活性が高い時期に、フェニルアラニンからの窒素を獲得できたと考えられた。しかし、フェニルアラニン、又、アンモニウムイオン添加数時間後のGS,GDH活性には変動が観察されなかった。その点に関し、菌体内の窒素代謝の様相を解明するには、本研究のように酵素活性の変動の検討だけでは限界があると考えられた。その間、米国のTowersらが^<15>N標識したアミノ酸を用い、木材腐朽菌Lentinus lepideusにおいて、フェニルアラニンアンモニアリアーゼを中心とした窒素のリサイクル機構を、^<15>N-NMRを用い報告した。この^<15>N標識化合物を用いる方法は、本研究で行っている酵素活性の変動から考察する方法に比べ、菌体に対するアンモニウムイオン、フェニルアラニン添加の影響を検討する点においては適当な方法ではないかもしれないが、リサイクルの証明には最も強力な方法と考えられた。しかしながら、助成を受ける間には、実験を進めることはかなわなかった。現在、これまでの結果を取りまとめているところである。木材腐朽菌Phanerochaetechrysosporiumの二次代謝産物Veratryl alcohol(VA)の蓄積が、培地へのフェニルアラニン(Phe)添加により阻害される機構を明らかにするために、Phe、またNH_4Clを窒素制限培地に添加し、アンモニア同化酵素(L-Glutamate:NADP+oxidoreductase,EC1.4.1.4,(GDH)とL-Glutamate:ammonia ligase,EC6.3.1.2、(GS))、の活性変動の違いを明らかにした。Pheの添加は、アンモニア同化酵素(GDH,GS)の活性を無添加の場合に比べやや減少させた。即ち、Phe無添加の培養で、GSは培養5日目から7日目にかけて、1.3nkat/mg proteinから3.53nkat/mg proteinに増加した。Phe添加の系に於いても、培養7日目に2.9nkat/mg proteinに達した。しかし、NH_4+を添加した系では、GSの活性レベルは添加後3日間は変わらなかったが、培養5日目から7日目にかけて1.1nkat/mg proteinから0.3nkat/mg proteinに減少した。一方、GDHにおいても、無添加の系では、培養5日目まで減少し0.35nkat/mg proteinになったが、そこから培養7日目にかけて、1.8nkat/mg proteinまで増大した。1.2mMPhe添加の場合でも同様に減少し、培養7日目で増大した。しかし、NH_4Cl添加の系では、GDHの活性は減少し、培養7日目で0.67nkat/mg proteinに減少した。以上の結果から、同菌では、二次代謝と同期してGS,GDHの活性が増加することが解った。さらに、Phe、NH_4+はGS,GDH活性の増大を阻害することにより、VA蓄積が阻害されることが示唆された。しかし、Phe、NH_4+添加が二次代謝時に、GS,GDHの活性を下げる機構に関しては今後の検討が必要である。
鉄道施設の地震リスク解析とリスク転嫁策の研究

鉄道施設のような線状構造施設の地震リスク解析法を構築し,地震時システムリスク解析を実施した.このため,各種構造物(高架橋、地下構造物など)の地震損傷関数の算定法を考察し,高精度地震ハザード曲線を導入した.・鉄道会社を対象としたリスク転嫁策(地震保険,地震デリバティブ)を調査/検討した.・鉄道モデル路線による地震リスク解析とリスクファイナンスの有効性を検討した.鉄道施設のような線状構造施設の地震リスク解析法を構築し,地震時システムリスク解析を実施した.このため,各種構造物(高架橋、地下構造物など)の地震損傷関数の算定法を考察し,高精度地震ハザード曲線を導入した.・鉄道会社を対象としたリスク転嫁策(地震保険,地震デリバティブ)を調査/検討した.・鉄道モデル路線による地震リスク解析とリスクファイナンスの有効性を検討した.本研究は,道路施設/鉄道路線のような線状に構成される社会基盤施設を対象とするもので、本年度は、「Phase I :線状構造物の地震リスク解析の確立」を実施した.このPhase Iは、リスク解析の要素技術を取扱うもので,下記の3点に要約される。1:路線を構成する構造物の地震損傷関数を算定する.地震損傷関数は,地震動規模に対する地震損失率(損失金額,営業損失),信頼性理論を援用して表すもので,さらには、損傷期待値(NEL)と予想最大損失(PML)を算出する.RC橋脚に対してモデル化し、数値シミュレーションを実施した。2:中域地震ハザード曲線の設定:路線サイトにおける地震の確率分布(超過確率)を表す中域地震ハザード曲線の設定を行った.本研究では,研究計画のとおり、研究協力者によって開発された高精度強震動シミュレータによる解析値の提供、および高精度の商用ソフトを用いた。3:線状構造物の地震リスク解析の統合化とシミュレーション:上記の検討を踏まえ,路線全体のNEL,PML,および地震リスク曲線(SRC)を算定する基本式を整理した。特に、延長2km程度の東京都内にある私鉄路線をモデル化し、数値シミュレーションを実施した。ここでは、駅舎、切土、橋梁、高架橋によって構成され、各々の施設をイベントツリーによってモデル化して、路線全体の物的損失と停止日数を指標とするリスク解析を実施した。これらの技術は,地震リスク解析における最も重要な要素技術であり,次年度の地震リスク解析とリスクファイナンスの研究に応用される.本研究は,道路施設/鉄道路線のような社会基盤施設を対象とするもので、本21年度は、「Phase I:線状構造物の地震リスク解析」を継続するとともに,当初の計画である「Phase II:リスクファイナンス(リスク転嫁策)の適用性の検討」を実施した.1.Phase I(線状構造物の地震リスク解析)の継続:以下の3点について研究を行うとともに,関連学会に投稿した(査読中).・都市内鉄道路線の機能停止期間に関する地震時システムリスク解析(土木学会論文集)・ラダー系システムを用いた高速道路の地震時車両通行機能性評価(土木学会論文集)・供給量に着目したサプライチェーンの地震時業務停止期間に関するリスク評価(地域安全学会研究発表会)2.PhaseII:地震リスクファイナンス(リスク転嫁策)の調査検討土木構造物を対象とした損害保険とキャタストロフィーボンドの現状と適用例に関する調査を行った.特に,鉄道施設の地震リスク転嫁に適用する場合,地震リスクファイナンス手法として,リスク移転を目的とするもの,および手元流動性の確保を目的とするものに大別され,それぞれの手法について調査を行った.・リスク移転を目的とするもの:地震保険、地震デリバティブ、キャタストロフィーボンド、コンティンジェント・エクイティ、・手元流動性の確保を目的とするもの:コンティンジェント・コミットメントライン、グループ内に保険会社を設立するキャプティブこれらの地震リスクファイナンスはそれぞれの特徴を有するが,被災時の支払い要件,ベーシスリスク,支払いの即時性,対象が物損のみか(利益損害も含むか),などが論点となる.また,我国での前例のないもの,前例の少ないものは,金融機関のノウハウと積極姿勢,制度設計上の問題点,海外資本への依存,再保険の引き受け手などが,検討課題として挙げられる.本研究は,鉄道施設を対象とした地震リスク解析とリスク転嫁を主題とするもので、本年度は,PhaseIとPhaseIIの継続,および「PhaseIII:モデル路線による試算」,を実施した.1.Phase I(線状構造物の地震リスク解析),Phase II(地震リスクファイナンス)の成果発表として,主要学会に投稿した.・製造装置の余剰性能を考慮した生産施設の地震時復旧曲線(第蓋3回日本地震工学シンポジウム)・地震リスク解析を用いた浄水場配管の最適投資額の算定(第13回日本地震工学シンポジウム)・首都圏における鉄道施設の地震リスクとリスクファイナンス(地域安全学会梗概集)これらは,線状施設の地震リスク解析事例,およびリスクファイナンスへの適用手法として,地震リスクの定量評価の意義を具体的に提示できたことが重要な研究成果である.さらに,当初の研究主題である'鉄道施設'から,製造施設,浄水場,サプライチェーンに拡張したことは,提案するシステムリスクの柔軟性と一般性を示唆するものとして強調したい.2.Phase III(モデル路線による試算)として,以下のような研究とシミュレーションを実施した.・JR東日本のキャタストロフィーボンドの調査(地震デリバティブによる南関東の地震リスクの転嫁)

・鉄道業者による地震リスクファイナンスとして,震災前後の貸借対照表による資産評価(借入金または地震保険の適用)・関東圏にて営業する鉄道業者を3業者想定して,リスクファイナンスの検討(地震保険,地震デリバティブ,CATボンド).(当初計画にある,広域連合キャプティブの検討については,必ずしも現実的ではなく,代替研究項目として上記のような成果を得た)、このような研究成果に基づき,下記に投稿し,現在審査中である.・リスクファイナンスのための線状施設の地震リスク評価(土木学会論文集)・鉄道会社の地震リスクマネジメント(Jcossar2011)
妊娠期の化学物質曝露による孫世代での体細胞突然変異の増加を誘導するエピ変異の探索

C3Hマウス雌(F0)の妊娠期に無機ヒ素を投与すると、F1雄を介してF2雄の成長後に肝腫瘍が増加する。その原因として、ヒ素によるF1雄生殖系細胞のエピ変異がF2肝臓に伝えられ体細胞突然変異を増加させて後発的に腫瘍を増加させるという仮説を設定し、エピ変異の解析を行った。対照群とヒ素群F2の正常肝臓および腫瘍組織のゲノムワイドなDNAメチル化状態を次世代シークエンスを用いたRRBS法によって一塩基単位で明らかにし、腫瘍増加に関与する領域やヒ素曝露特異的に変化する領域を同定した。またヒ素曝露特異的に変化し腫瘍と関連するmicroRNAを同定した。1)実験に用いているC3Hマウスの腫瘍の一部では、突然変異によって癌遺伝子Ha-rasが活性化型になっている。妊娠期ヒ素曝露によるF2雄(ヒ素群F2雄)の腫瘍増加の原因としてHa-ras突然変異の増加が関与するかどうかを、Pyrosequence法によるHa-ras変異測定によって検討した。その結果Ha-ras変異率は対照群とヒ素群F2雄の腫瘍で差がなく、Ha-ras変異率はヒ素群F2雄の腫瘍増加の原因とはならないことが示された。2)対照群およびヒ素群F2雄の肝腫瘍においてDNAメチル化変化を検出するために、網羅的解析法であるReduced representation bisulfite sequencing (RRBS)法を実施し、次世代シークエンス解析を行った。結果についてバイオインフォマティクスを用いて解析を開始した。3)対照群およびヒ素群F2雄肝臓の正常組織および腫瘍組織のmiRNAの発現変化について、マイクロアレイ法による網羅的解析を行い、ヒ素群F2雄肝臓腫瘍増加に関与する可能性のあるmiRNAを抽出した。C3Hマウスは雄が高齢期に一定の割合で肝腫瘍を自然発症する系統である。これまでの研究によって、妊娠中のC3Hマウス(F0)に無機ヒ素を投与することによって、子世代(F1)雄、および孫世代(F2)雄においても肝腫瘍が増加し、その増加に体細胞突然変異の増加が関与することが示唆された。そこで本研究では、F2肝臓での体細胞突然変異や肝腫瘍増加に関与するエピ変異の探索を目的とした。1)妊娠期ヒ素曝露群F2肝臓のDNAメチル化変化:対照群、ヒ素曝露群F2の肝腫瘍組織および正常肝組織のゲノムDNAについて、Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS)法によってゲノムワイドなDNAメチル化解析を行った。取得された次世代シークエンスデータについて、統計ソフトのR上でmethylkitパッケージおよびedmrパッケージを用い、妊娠期ヒ素曝露によってF2でメチル化が変化したシトシン(DMC)および領域(DMR)を検出した。その中でも特に遺伝子発現の制御に重要と考えられる転写開始点±2000bpの領域をLinux上でbed tools closestを用いて検出した。その結果、ヒ素曝露群F2の肝腫瘍で対照群肝腫瘍組織と比較して有意にメチル化が変化する領域を同定した。2)妊娠期ヒ素曝露群F2肝臓のmiRNA解析:昨年度のマイクロアレイの解析の結果、対照群正常肝組織と比較してヒ素曝露群F2正常肝組織でlet-7b, miR-29a, miR-122が増加していたためqPCRで確認をおこなったところ、miR-29aの増加が確認された。またターゲットの可能性が示唆されているG6pcの発現が減少していることがわかった。研究協力者:鈴木武博、岡村和幸、松下隼也(国立環境研究所)、中林一彦(国立成育医療研究センター)、森田純代、堀居拓郎(群馬大学)計画した次世代シークエンス解析やmiRNAの発現解析が予定通り進行した。1)昨年度行ったRRBS法によるDNAメチル化解析のデータを用いて、まずC3Hマウスの肝腫瘍特異的なDNAメチル化変化を解析した。特に遺伝子発現の制御に重要な転写開始点(TSS)±2000 bpに正常肝組織と比較して腫瘍組織でDNAメチル化の程度が異なる領域(promoter differentially methylated region, promoter DMR)を明らかにした。メチル化変化30%以上のDMRをもち癌との関連が報告されている遺伝子のうち2つの遺伝子について、細胞株での実験でDNAメチル化と遺伝子発現変化との対応を確認し、さらにそれらの遺伝子下流で腫瘍増加につながる可能性のあるシグナル経路を明らかにした。次に対照群と妊娠期ヒ素曝露群F2の腫瘍間でpromoter DMRを明らかにした。正常組織と腫瘍組織間のpromoter DMRと、対照群とヒ素曝露群F2の腫瘍間のpromoter DMRは重複しておらず、妊娠期ヒ素曝露は新たなDNAメチル化変化を介して腫瘍増加に関与することが示唆された。2)対照群と比較して妊娠期ヒ素曝露群F2の肝臓で増加するmiR-29aの標的をmicroRNA.orgで検索した結果、ヒトとマウスでG6pcが予想された。G6pcの減少が肝がん発症に関与することが報告されていることから、Control miRNAとmiR-29aをA549細胞に導入しG6pcの発現をqPCRで定量した。その結果、miR-29aの導入により有意なG6pcの発現の低下を認め、G6pcはmiR-29aの標的となると結論された。以上より、妊娠期ヒ素曝露によるF2肝腫瘍増加に関与するエピ変異に関して、メカニズム解明の一端となる新たな知見を得た。

連携研究者:鈴木武博、岡村和幸(国立環境研究所)、中林一彦(国立成育医療研究センター)、森田純代、堀居拓郎(群馬大学)C3Hマウス雌(F0)の妊娠期に無機ヒ素を投与すると、F1雄を介してF2雄の成長後に肝腫瘍が増加する。その原因として、ヒ素によるF1雄生殖系細胞のエピ変異がF2肝臓に伝えられ体細胞突然変異を増加させて後発的に腫瘍を増加させるという仮説を設定し、エピ変異の解析を行った。対照群とヒ素群F2の正常肝臓および腫瘍組織のゲノムワイドなDNAメチル化状態を次世代シークエンスを用いたRRBS法によって一塩基単位で明らかにし、腫瘍増加に関与する領域やヒ素曝露特異的に変化する領域を同定した。またヒ素曝露特異的に変化し腫瘍と関連するmicroRNAを同定した。計画したHa-ras突然変異解析、RRBSライブラリーの作製、次世代シークエンス、miRNAの網羅的解析はすべて予定通り進行した。RRBS次世代シークエンスについては、予定より早くバイオインフォマティクスを用いた解析に入っている。1)妊娠期ヒ素曝露群F2肝臓のDNAメチル化変化:妊娠期ヒ素曝露群F2の正常肝組織および腫瘍組織で、対照群と比較してTSS近傍等でDNAメチル化が変化し、それに対応した遺伝子発現変化がみられる領域(DMR)を明らかにする。遺伝子発現変化とDMRのメチル化変化との対応をマウス肝がん細胞株の5aza-dC処理等により検討し、遺伝子発現変化と対応するDMRについては体細胞突然変異の増加や肝腫瘍増加との関係について、文献検索や細胞株での実験で検討する。2)妊娠期ヒ素曝露群F2肝臓のmiRNA解析: G6apcの減少が肝がんの発症に関係しているという報告を鑑み、G6apcがmiR-29aのターゲットである可能性を検証する。方法としては以下の2つを用いる。1)肝臓の培養細胞にmiR-29を導入し、G6apcの発現を定量する。2) G6apcの3'UTRをレポーターにつなげたplasmidとmiR-29を細胞に導入してレポーター活性に影響するかを検討する。以上の研究によって、ヒ素曝露群F2肝臓の体細胞突然変異や肝腫瘍増加の関与するDNAメチル化やmiRNAを明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子毒性学計画通り、以下の研究を行う。1Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS)法によるDNAメチル化解析、および次世代シークエンスデータの解析: 26年度、27年度に次世代シークエンサー解析で得られるデータについて、各種バイオインフォマティクスの手法を用いて解析を行い、妊娠期ヒ素曝露によってF2で変化したゲノム領域やシトシンを明らかにする。2妊娠期ヒ素曝露によってF2ゲノムで転写開始点付近にDNAメチル化変化が検出された遺伝子を中心に、文献的に発癌との関連が深いものを探す。遺伝子発現を測定し、DNAメチル化変化と遺伝子発現変化の関係を明らかにする。3昨年度のmiRNAマイクロアレイ解析で、正常肝臓および肝癌組織について対照群とヒ素曝露群F2の間で発現変化が見られたmiRNAについて、各個体での発現量をreal-time PCRで測定し、アレイの結果のvalidationを行う。
被虐待児童における心理社会的問題に関する基礎的研究-特にネグレクトを中心とした検討-

本研究の目的は,被虐待児童-特に保護の怠慢および放棄を受けている,いわゆるネグレクトの症例について,その心理社会的行動特性について明らかにすることであった。ネグレクトは,主として児童福祉機関において取り扱われるため,本年度は首都圏の当該機関に依頼,症例の蓄積に努めてきた。その結果,本研究の範疇に入ると考えうる症例はおよそ30例あり,準ネグレクトと判断して良いと思われる例がおよそ40例あった。これまでのところ,ネグレクトの行動特性としては,過剰行動,衝動統制の未成熟などが認められており,従来虐待児童の特性として指摘されていた行動および情緒表出の抑制傾向とは対極をなす結果となっている。
上咽頭癌の頸部転移機構に関する分子生物学的解析

上咽頭癌の頸部転移機序を分子生物学的に解明し、それを予防する治療法を開発する目的でEBウイルスの唯一の発癌遺伝子といわれるLMP1発現と相関する転移関連遺伝子群のスクリーニングをおこなった。その結果、細胞外基質破壊、細胞接着、血管新生、細胞運動能亢進に関与する転移関連遺伝子群が明らかになった。次いでLMP1によるMMP9の発現誘導をI-κBが阻害することを明らかにした。つまり、NF-κBシグナルを抑制することでLMP1によるMMP9の転写が抑制されることを証明した。しかしLMP1遺伝子発現の直接制御は難しく、LMP1下流のシグナル伝達経路を遮断することで癌の浸潤・転移を抑制する分子標的治療の可能性について検討を加えることにした。最初に、I-κBキナーゼ(IKK)を不活化し、NF-κBの活性を抑制することが知られているアスピリン及びその関連物質であるサリチル酸ナトリウムについて検討した。その結果、アスピリンはLMP1導入後のMMP9の発現を抑制することをゼラチンザイモグラフィーで観察した。ゲルシフトアッセイの実験から、アスピリンはLMP1によるNF-κB, AP-1の活性を抑制したことから、MMP9の発現抑制はLMP1下流シグナル伝達経路の抑制によるものであると考えられた。また、MMP9の転写に関するプロモーターの活性を調べたCATアッセイでも、アスピリンによる抑制が証明されたので、ヌードマウスを用いて、臨床応用への可能性を検討した。形質転換した子宮頚痛由来C33A上皮系細胞とLMP1発現C33A細胞を作成し、それぞれの細胞をヌードマウス背部へ皮下注射により移植した。次いで腫瘍形成ヌードマウスヘアスピリンを3日間、皮下注射した。この移植腫瘍からウェスタンブロット用及びゼラチンザイモグラフィー用細胞抽出液を採取し、それぞれの材料においてLMP1及びMMP9の誘導を確認した後、アスピリン投与有無での両者の発現の差を比較検討した。結果は期待どおりアスピリンはそれらの発現を有意に抑制し、上咽頭癌の頸部転移抑制のための分子標的療法の可能性が証明できた。今回の研究目的は、上咽頭がんにおける頸部転移機序を分子生物学的に解明し、LMP1の発現を抑制する方策を見いだすことである。本年度はEBウイルスの唯一の発癌遺伝子といわれるLMP1発現と相関する転移関連遺伝子群をすべてスクリーニングすることに努めた。その結果、LMP1の発現は、1)上咽頭がん頸部リンパ節転移と相関すること、2)細胞接着性を低下させること、3)基底膜破壊のkey enzymeであるマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)9などを誘導して間質分解を促進すること、4)転写因子ets-1を活性化し、さらにHepatocyte Growth Factor(HCG)受容体c-Metの発現を誘導し、細胞の運動性を亢進させること、5)インターロイキン8(IL-8)やvascular endothelial growth factor(VEGF)を活性化し血管新生を誘導すること、6)細胞内シグナル伝達物質としては、NF-kB, AP-1が重要であること、など転移に必要と考えられている各ステップにおいて転移を促進する方向に作用することを検証した。特に今回、血管新生因子と腫瘍内微小血管数との関係を免疫組織化学的に調べたところ微小血管数とbasic fibroblast growth

factor(bFGD), VEGF, transforming growthfactor (TGF)-α、IL-8およびLMP1の発現との間に有意な相関を認めた。上咽頭がんの頸部転移機序を分子生物学的に解明する目的でこれまでにEBウィルスの唯一の発癌遺伝子といわれるLMP1発現と相関する転移関連遺伝子群のスクリーニングをおこなった。その結果、細胞外基質破壊、細胞接着、血管新生、細胞運動能亢進に関与する転移関連遺伝子群が明らかにされた。そこで、昨年度はLMP1の発現抑制のための方略を検討した。その結果、LMP1によるMMP9の発現誘導をI-κBが阻害することを明らかにした。つまり、NF-κBシグナルを抑制することでLMP1によるMMP9の転写が抑制されることを証明した。しかしLMP1遺伝子発現の制御は難しく困難と考え、LMP1下流のシグナル伝達経路を遮断することによって、癌の浸潤・転移を抑制する分子標的治療の可能性について検討を加えることにした。まず最初に、I-κBキナーゼ(IKK)を不活化し、NF-κBの活性を抑制することが知られているアスピリン及びその関連物質であるサリチル酸ナトリウムについて検討した。その結果、アスピリンはLMP1導入後のMMP9の発現を抑制することをゼラチンザイモグラフィーで観察した。ゲルシフトアッセィの実験から、アスピリンはLMP1によるNF-κB、AP-1の活性を抑制したことから、MMP9の発現抑制はLMP1下流シグナル伝達経路の抑制によるものであると考えられた。また、MMP9の転写に関するプロモーターの活性を調べたCATアッセイでも、アスピリンによる抑制が証明された。今後は、ヌードマウスを用いたin vivoの系での実験を勧め、臨床応用への可能性を検討する予定である。上咽頭癌の頸部転移機序を分子生物学的に解明し、それを予防する治療法を開発する目的でEBウイルスの唯一の発癌遺伝子といわれるLMP1発現と相関する転移関連遺伝子群のスクリーニングをおこなった。その結果、細胞外基質破壊、細胞接着、血管新生、細胞運動能亢進に関与する転移関連遺伝子群が明らかになった。次いでLMP1によるMMP9の発現誘導をI-_κBが阻害することを明らかにした。つまり、NF-_κBシグナルを抑制することでLMP1によるMMP9の転写が抑制されることを証明した。しかしLMP1遺伝子発現の直接制御は難しく、LMP1下流のシグナル伝達経路を遮断することで癌の浸潤・転移を抑制する分子標的治療の可能性について検討を加えることにした。最初に、I-_κBキナ-ゼ(IKK)を不活化し、NF-_κBの活性を抑制することが知られているアスピリン及びその関連物質であるサリチル酸ナトリウムについて検討した。ゲルシフトアッセイの実験から、アスピリンはLMP1によるNF-_κB、AP-1の活性を抑制したことから、MMP9の発現抑制はLMP1下流シグナル伝達経路の抑制によるものであると考えられた。また、MMP9の転写に関するプロモーターの活性を調べたCATアッセイでも、アスピリンによる抑制が証明されたので、ヌードマウスを用いて、臨床応用への可能性を検討した。
非鉛系強誘電体二チタン酸バリウムの元素置換および配向制御による誘電圧電特性向上

本研究では、アーク溶解法によりBaTi_2O_5多結晶体および希土類元素を添加したBaTi_2O_5多結晶体を合成し、誘電特性に及ぼす希土類元素添加の影響を調べた。0-2.5mol%La_2O_3を添加したBaTi_2O_5のa軸長は1.69074から1.68938nmに減少し、c軸長は0.94141から0.94052nmに減少したが、その後ほとんど変化しなかった。また、b軸長とβ角はLa_2O_3の添加によりほとんど変化しなかった。従って、La_2O_3の固溶限は2.5mol%であった。La_2O_3添加したBaTi_2O_5はいずれも(020)面に強く配向した。BaTi_2O_5の誘電率の極大値はLa_2O_3添加量の増加に伴い減少し、またブロードになった。誘電率の極大値を示したキュリー温度はLa_2O_3添加量の増加に伴い750Kから380Kまで連続的に低下した。0.5mol%La_2O_3の添加により、BaTiO_3ではキュリー温度が24K低下したが、BaTi_2O_5では38Kであった。BaTi_2O_5の電気伝導度は、La_2O_3添加量の増加につれて0.5mol%まで約1桁増大したが、それ以上のLa_2O_3を添加してもほとんど変化しなかった。希土類元素のイオン半径はLa^<3+>、Ce^<4+>、Nd^<3+>、Eu^<3+>、Y^<3+>の順で小さくなる。BaTi_2O_5のa軸長とc軸長は、希土類元素のイオン半径が小さくなるにつれて大きく減少した。3mol%La_2O_3を添加したBaTi_2O_5の誘電率が最も高い値であり、キュリー温度が最も低かったY_2O_3を添加したBaTi_2O_5の誘電率が最も低く、キュリー温度が最も高かった。BaTi_2O_5の誘電率は希土類元素のイオン半径が小さいほど減少し、キュリー温度が大きいことがわかった。BaTi_2O_5のキュリー温度は,希土類元素添加量の増加に伴って低下した。各元素の添加量が1mol%まではキュリー温度の低下量はほぼ同様であったが、その後イオン半径の大きいLaが最もキュリー温度を低下させ、最も小さいYがキュリー点をそれほど低下させないことがわかった。特に添加量が増加するとその傾向は強くなっている。本研究者らは、浮遊帯域溶融法(FZ)により作製したBaTi_2O_5単結晶が高いキュリー温度(743K)と大きな誘電率(約20000)を有する強誘電体であることを世界で初めて報告した。BaTi_2O_5はb軸方向にのみ強誘電性を示すことから、実用的にはb軸配向した多結晶体の作製が求められる。また、BaTi_2O_3では、BaサイトをLaやNd等の希土類元素の固溶置換によって優れた誘電特性を広温度域で持たせることが報告されているが、BaTi_2O_5については報告例がない。そこで、本研究では、アーク溶解法によりBaTi_2O_5多結晶体および希土類元素を添加したBaTi_2O_5多結晶体を合成し、誘電特性に及ぼす希土類元素添加の影響を調ペた。BaCO_3、TiO_2、La_2O_3粉末を用い、(Ba+La):Ti=1:2(mol%)の割合で混合・成形した。Ar雰囲気中でアーク溶解し、凝固体を得た。希土類元素を添加したBaTi_2O_5を(020)面と平行に切り出し、1123Kの空気中で96h熱処理した。X線回折により相同定し、格子定数を測定した。交流インピーダンス法により誘電率(ε)および電気伝導度(σ)を測定した。測定温度を室温から1073K、測定周波数(f)を100Hzから10MHzとした。BaTi_2O_5が変位型の強誘電体であるため、イオン半径の小さいLaの添加により単位格子が小さくなり、TiO_6八面体中のTiの変位量が小さくなることは、La_2O_3添加に伴う誘電率の極大値が減少する原因と考えられる。

0.5mol%La_2O_3の添加により、BaTi_2O_3ではキュリー温度が24K低下したが、BaTi_2O_5では38Kであった。BaTi_2O_5の電気伝導度は、La_2O_3添加量の増加につれて0.5mol%まで約1桁増大したが、それ以上のLa_2O_3を添加してもほとんど変化しなかった。本研究では、アーク溶解法によりBaTi_2O_5多結晶体および希土類元素を添加したBaTi_2O_5多結晶体を合成し、誘電特性に及ぼす希土類元素添加の影響を調べた。0-2.5mol%La_2O_3を添加したBaTi_2O_5のa軸長は1.69074から1.68938nmに減少し、c軸長は0.94141から0.94052nmに減少したが、その後ほとんど変化しなかった。また、b軸長とβ角はLa_2O_3の添加によりほとんど変化しなかった。従って、La_2O_3の固溶限は2.5mol%であった。La_2O_3添加したBaTi_2O_5はいずれも(020)面に強く配向した。BaTi_2O_5の誘電率の極大値はLa_2O_3添加量の増加に伴い減少し、またブロードになった。誘電率の極大値を示したキュリー温度はLa_2O_3添加量の増加に伴い750Kから380Kまで連続的に低下した。0.5mol%La_2O_3の添加により、BaTiO_3ではキュリー温度が24K低下したが、BaTi_2O_5では38Kであった。希土類元素のイオン半径はLa^<3+>、Ce^<4+>、Nd^<3+>、Eu^<3+>、Y^<3+>の順で小さくなる。BaTi_2O_5のa軸長とc軸長は、希土類元素のイオン半径が小さくなるにつれて大きく減少した。3mol%La_2O_3を添加したBaTi_2O_5の誘電率が最も高い値であり、キュリー温度が最も低かったY_2O_3を添加したBaTi_2O_5の誘電率が最も低く、キュリー温度が最も高かった。BaTi_2O_5の誘電率は希土類元素のイオン半径が小さいほど減少し、キュリー温度が大きいことがわかった。BaTi_2O_5のキュリー温度は,希土類元素添加量の増加に伴って低下した。各元素の添加量が1mol%まではキュリー温度の低下量はほぼ同様であったが、その後イオン半径の大きいLaが最もキュリー温度を低下させ、最も小さいYがキュリー点をそれほど低下させないことがわかった。特に添加量が増加するとその傾向は強くなっている。
樹状細胞前駆細胞の包括的理解と治療応用技術基盤

転写因子E2-2は形質細胞様樹状細胞(pDC)の分化・生存に必須であるが、従来型樹状細胞(cDC)分化には影響しない。本研究では、E2-2レポーターマウスを作製し、共通DC前駆細胞(CDP)中のE2-2高発現分画がpDCにのみ分化することを見出した。これとは対照的に、小腸では、同E2-2高発現CDPが、小腸に豊富に存在するIL-3, IL-5, GM-CSF依存性に、CD103陽性cDCに分化転換した。同CD103陽性cDCは、ex vivoにおいてFoxp3陽性Tregを誘導した。E2-2高発現CDPは可塑性を有し、小腸における免疫寛容の成立に貢献していることが示唆された。樹状細胞(DC)は、抗原提示能に優れた従来型DC(cDC)と、核酸を認識して大量のI型インターフェロンを産生する形質細胞様DC(pDC)に大別される。平成26年度は、cDCあるいはpDCのみを生み出すDC前駆細胞(CDP)の同定、CDPニッチの実態解明を目的とした。当初の計画通り転写因子IRF8のレポーターマウスIRF8-Venusを作製した。同マウス骨髄中に存在するcDCの前駆細胞(pre-cDC)をIRF8の発現の有無を指標に2分画して、各々のDC分化能を検討したところ、IRF8+pre-cDCからはCD8+cDCのみが出現した。また、作製済みE2-2-KuOrangeと交配してIRF8/E2-2ダブルレポータマウスを作製した。現在、同マウス骨髄中のCDPを、IRF8/E2-2の発現を指標に4分画し、各々の分画のex vivo, in vivoにおけるDC分化能を検討している。次に、E2-2-KuOrangeマウス骨髄からE2-2を高発現するCDP分画を単離、レシーピエントマウスに移植してin vivoにおける分化能を検討した。既存のex vivoの結果(未発表)と同様に、in vivo二次リンパ組織においてもE2-2を高発現するCDP分画は大部分がpDCに分化した。対照的に、腸粘膜関連リンパ組織では約4割がcDCに分化した。この結果は、E2-2を高発現するCDPは本来pDCへ分化する細胞であるが、腸の微小環境下では当該分画のpDCへの分化の方向性が変化してcDCに分化したことを示している。現在、詳細なメカニズムを検討している。さらにCDPニッチの実態解明を試みた。E2-2レポーターマウスを用いてCDPの一部を可視化、血管内皮細胞を抗VE-カドヘリン抗体、CAR細胞を抗PDGFRbeta抗体で染色したところ、CDPがCAR細胞と共局在することを示唆する結果が得られた。樹状細胞(dendritic cell, DC)は、抗原提示脳に優れた従来型DC(cDC)と、核酸を認識して大量のI型インターフェロンを産生する形質細胞様DC(pDC)に分類される。昨年度までに、各々のDCサブセットだけを生み出すDC前駆細胞(common DC progenitor, CDP)を同定する目的で、pDCの分化・生存に必須の転写因子E2-2のレポーターマウス(E2-2-KuOrange)、pDC及びCD8+cDCの分化に重要な転写因子IRF8のレポーターマウス(IRF8-Venus)を作製して解析を進めてきた。その結果、E2-2hi CDPは末梢二次リンパ組織においては大部分がcDCに分化するものの、腸粘膜関連リンパ組織では約4割が本来のpDCではなくcDCに分化することを見出した。本年度は、腸粘膜関連リンパ組織でDC分化の方向性が変化する分子基盤の解明を目指した。IL-3, IL-5, GM-CSFに共通な受容体beta鎖(bc)を欠損するE2-2レポーターマウスを作製し同様の実験を行ったところ、bc-/-E2-2hi CDPは末梢二次リンパ組織でだけでなく腸粘膜関連リンパ組織でも大部分がpDCに分化する傾向を示した。また腸粘膜関連リンパ組織にはbc関連サイトカインの発現が高いこと、さらにbc関連サイトカイン刺激によってE2-2の発現が低下することを確認した。これらの結果は、腸粘膜関連リンパ組織に高発現するbc関連サイトカインの影響を受けて、CDPあるいはpreDCでのE2-2発現が低下し、cDCへの分化が誘導されたことを示唆していた。現在、この現象の免疫学的的意義を追求しており、腸粘膜関連リンパ組織で分化転換したcDCにはレチノイン酸合成酵素が誘導されており、高い免疫寛容レベルが求められる同所における合目的転換である可能性が提示されている。当初の予定通り、末梢二次リンパ組織においてはpDCあるいはCD8+cDCにのみ分化するCDPを同定することに成功した。一方、当初の予想に反して、腸粘膜関連リンパ組織では、pDCへ分化の方向性が決定しているはずのE2-2hi CDPが部分的にcDCへ分化することが観察された。そのため、この現象の誘導メカニズムと生物学的意義を追求する必要性が生じた。これらの理由により、当初予定していた他の研究計画はやや遅れているが、その分1つの計画を深く探求することができている。組織特有のサイトカイン環境を含む微小環境によってマクロファージがエピジェネティックな機能修飾を受ける現象は最近のトピックスであり、DCの分化の方向性や機能が組織の微小環境によって就職される現象の解明も、その免疫学的意義を含め重要である。

現時点では生理的な組織の微小環境に焦点を当てているが、今後、感染や炎症病態によるDCの分化/機能転換を考える際の重要な基礎データになることが期待される。これらの観点から、概ね順調に進展している、と判断した。DCは、抗原提示能に優れたcDCと、核酸を認識して大量のI型インターフェロンを産生するpDCに分類される。昨年度までに、各々のDCサブセットだけを生み出すDC前駆細胞(common DC progenitor, CDP)を同定する目的で、pDCの分化・生存に必須な転写因子E2-2のレポーターマウス、pDC及びCD8+cDCの分化に重要な転写因子IRF8のレポーターマウスを作製解析してきた。今年度は、さらにはE2-2/IRF8ダブルレポーターマウスを作製して解析を進めたが、CDPにおいてはIRF8を明確に発現する亜集団の存在を確認することができなかった。この結果を踏まえ、E2-2レポーターマウスを用いてさらに解析を進めた。昨年度までに、E2-2hi CDPは末梢二次リンパ組織においてはpDCのみに分化するものの、腸粘膜関連リンパ組織では約40%がcDCに分化転換すること、同分化転換にはIL-3, IL-5, GM-CSFに共通のbeta鎖(bc)受容体シグナルが重要なこと、腸粘膜関連リンパ組織にはbc依存性サイトカインが高発現していることを示した。今年度は、この現象の免疫学的的意義を追求した。E2-2hi CDPをFlt3LとGM-CSFの存在下で培養し、cDCへの分化転換とaldehyde dehydrogenase (ALDH)の発現を確認した。さらに重要なことに、当該cDCとナイーブT細胞の共培養によって、ALDH依存性にTregが誘導された。尚、E2-2hi CDPをFlt3L単独で培養してもpDCのみが誘導されTregも誘導されなかった。これらの結果は、食物抗原や常在菌に晒されている腸の微小環境では、免疫寛容の構築・維持が重要であり、免疫寛容に中心的役割を担うTregを効率よく誘導するため、本来pDCになる細胞がALDH+cDCに分化転換したことを示唆していた。転写因子E2-2は形質細胞様樹状細胞(pDC)の分化・生存に必須であるが、従来型樹状細胞(cDC)分化には影響しない。本研究では、E2-2レポーターマウスを作製し、共通DC前駆細胞(CDP)中のE2-2高発現分画がpDCにのみ分化することを見出した。これとは対照的に、小腸では、同E2-2高発現CDPが、小腸に豊富に存在するIL-3, IL-5, GM-CSF依存性に、CD103陽性cDCに分化転換した。同CD103陽性cDCは、ex vivoにおいてFoxp3陽性Tregを誘導した。E2-2高発現CDPは可塑性を有し、小腸における免疫寛容の成立に貢献していることが示唆された。平成26年度は、主にcDCあるいはpDCのみを生み出すCDPを同定すること、骨髄内のCDP局在の場(CDPニッチ)の実態を解明することを目的とした。既に研究概要の実績で述べたように、当該目的を達成するために必要なマウスの作製・交配・実験実施は順調に遂行している。現在、作製したレポーターマウスの骨髄から、転写因子の発現に基づいて細分化したCDPを用いてcDC/pDC分化能を検討しており、cDCあるいはpDCのみを生み出すCDPの同定に関する結果が近々得られる予定である。