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鉄(VI)酸カリウムによる消毒ならびに新規化学物貭の処理技術の開発

6価の鉄の酸素酸塩である鉄酸カリウムを用い、水の殺菌・消毒剤としての検討ならびに、微生物分解しにくい新規化学物貭の酸化処理剤としての検討を行った。殺菌・消毒剤としては、大腸菌を対象とした実験の他、ウイルス指標としてバクテリオファージを用いた検討を行った。バクテリオファージは微量の鉄酸カリウムにより不活化され、大腸菌に対する濃度より更に低い濃度でも十分な効果が得られたことから、鉄酸カリウムは特にウイルス不活化剤として効果的に使用できると考えられた。またこのウイルス不活化に及ぼす種々の水貭因子の影響の検討から、ウイルス不活化のメカニズムに関する考察も行った。鉄酸カリウムは鉄酸イオンが不活化効果を示すのではなく、その分解過種で生じる中間体が強い不活化効果を示すと考えることが出来、水中の緩衝能は、この中間体の生成にはマイナスに作用するが、一方生成された微量の中間体の存在時間を長く保つ効果も持ち合せいてることなどが推察された。新規化学物貭の酸化剤としての検討を試みた。数種の塩素化フェノールを対象とし、酸化実験を行ったところ、鉄酸カリウムによりこれらの化合物そのものの濃度は減少したが、脱塩素は必らずしも生じている訳ではないことも明らかとなった。酸化剤としての特性は不明な点も多く今後はより基本的な研究を行うことが、結果として工学的な応用に際し有効な指摘を行えると思われる。従来使用されている多くの酸化剤との比較により、鉄酸カリウムの特性が明らかになるはずであるが、本年度はそこまで実験を行う時間的なゆとりはなかった。このように、酸化剤としての特性の把握は十分ではなかったが、ウイルス不活化剤として非常に効果的であることが明らかとなったのは大きな収穫である。水貭によっては塩素よりはるかに効果的であろう。
タキサンジテルペノイドの合成研究

イチイ科植物に含まれるタキサンジテルペノイドは、多数の酸素官能基が歪んだ三環性骨格(ABC環)上に密集した合成化学的に極めて興味深い天然物である。昨年度までに(1)[6+2]型付加環化反応によるBC環構築、(2)エポキシニトリルの分子内環化反応によるA環構築、(3)シアノ基の還元的除去に伴う橋頭位二重結合導入法、を鍵工程として、タキサン骨格を有するモデル化合物の合成に成功した。本年度ではこの戦略に基づき天然物タキシンBの全合成研究を行った。タキシンBの全合成研究にあたり課題となったのが、モデル化合物とは全く異なるBC環の両核間位の構築であった。まずこれを解決するべく[6+2]型付加環化反応の基質を再度検討した。その結果、o-クレゾールより導かれる6員環エノールシリルエーテルとアセチレンジコバルト錯体との付加環化反応によって核間位メチル基が導入されたビシクロケトンが高収率で得られた。もう一方の核間位については三級水酸基の還元的な除去が必要であった。まず既存の反応による還元を試みたが、立体選択性に乏しい結果となった。そこでジアゼン(H-N=N-R)と呼ばれる化学種の特性に着目し、アリルアミン誘導体のジアゼンを経由した立体特異的な分子内還元反応を新たに開発した。これによりトランス縮環部位を備えたBC環セグメントの構築に成功した。その後、シアノ基を有するアルキル側鎖の導入と8員環上オレフィンのエポキシ化によって環化前駆体を合成した。モデル化合物とは異なりこのエポキシニトリルの分子内環化反応は困難であったが、キシレン溶媒の加熱還流下にKHMDSを滴下する方法によりA環部6員環の構築に成功した。A環部の橋頭位二重結合は、モデル化合物で見出した方法と同様にβ, γ-エポキシニトリルのLDBB還元によって導入した。以上により、高度に歪んだタキシンBの基本骨格を構築することに成功した。(抄録なし)本年度において実施されたタキサンジテルペノイドの合成研究について報告する。本研究ではまず、タキサン類の共通構造である三環性骨格(A-B-C環)を有するモデル化合物の合成を行った。始めにタキサン骨格のBC環部の構築を検討した。これには当研究室で開発された[6+2]型付加環化反応による8員環構築法を応用した。すなわちルイス酸存在下、アセチレンジコバルト錯体を6員環エノールシリルエーテルと反応させると、8員環と6員環がトランスに縮環したビシクロケトンを立体選択的に得た。続いて環化体のカルボニル炭素に対し、4-ブテニルリチウムを作用させ、末端オレフィンを有するアルキル側鎖を導入した。この末端オレフィン部位をマルコフニコフ型のヒドロシアノ化反応条件に付し、シアノ基を導入した。また、[6+2]型付加環化反応で利用したコバルト錯体部はアルケンへの変換を経て、エポキシドに導いた。このエポキシニトリルに塩基を作用させα-シアノカルバニオンを調整すると、エポキシドへの6-エキソ型の分子内環化反応が進行し、A環部6員環が形成された。タキサン骨格に特徴的な歪んだ橋頭位二重結合は、以下の方法により導入された。まず、エポキシドの開環により生じたアルコールを脱水反応条件でアルケンとした。次にこのアルケンを、過酸で処理しβ,γ-エポキシニトリルへと変換した。このものをリチウムジターシャリーブチルビフェニリド(LiDBB)で処理してシアノ基の還元的除去とエポキシドの開環を一挙に行い、タキサン骨格を有するモデル化合物の合成に成功した。現在、本戦略に基づく天然物タキシンBの合成を検討中である。

モデル化合物とは異なりこのエポキシニトリルの分子内環化反応は困難であったが、キシレン溶媒の加熱還流下にKHMDSを滴下する方法によりA環部6員環の構築に成功した。A環部の橋頭位二重結合は、モデル化合物で見出した方法と同様にβ, γ-エポキシニトリルのLDBB還元によって導入した。以上により、高度に歪んだタキシンBの基本骨格を構築することに成功した。当初の計画で掲げた、タキサン骨格を有するモデル化合物の合成を滞り無く達成することができた。本合成ルートは15工程と極めて短工程であり、[6+2]型付加環化反応の有用性を実証できたと思われる。現在、本研究の論文を執筆中である。タキサン類天然物に導くために、官能基を導入した6員環エノールシリルエーテル(C環部に対応)を用いて[6+2]型付加環化反応を検討する。核間位のシロキシ基は立体保持で水素原子に置き換える必要があるが、これはジアゼンのヒドリドシフトを利用することで実現可能と思われる。ここで得られた二環性化合物にモデル化合物と同様の戦略でA環を構築し、官能基を整えて天然物Taxine Bの全合成を目指す。(抄録なし)
哺乳類の性分化機構とその進化に関わる細胞特異的エピジェネティック修飾の解明

性分化異常の発症原因となる性分化機構の検討を行った.性分化異常系統のマウスで同一遺伝背景から異なる表現型が生じる原因が,性分化関連因子の時空間特異的な性的二型性発現の破綻であることが示された.ターナーモザイク患者では,性分化関連遺伝子の発現が必ずしも左右で同じで無く,モザイク比率やタンパク質局在と一致しない遺伝子が存在した.加えて,培養条件下でのセルトリ細胞の特性維持には三次元構造および細胞接着の両方が必須で有ること,さらに発生中のニワトリ生殖腺ではGATA4がDMRT1の発現調節を行う事,DMRT1がミュラー管の退縮および生殖細胞の発生促進と減数分裂開始に関与することが明らかとなった.性逆転症系統遺伝子組換え動物における真性半陰陽個体における性分化関連因子の発現解析を行い,雄性化の実行因子であるSox9の発現量の差が性決定因子Sryの発現量の左右差に由来することを推測させる結果を得た.その発現は雄性生殖腺の形成程度と相関し,雌性生殖腺を有する個体では殆ど認められなかった.加えて出生後の性腺における性分化関連遺伝子発現も同結果を裏付けていた(発表1).この結果は,雄性生殖腺型性へのSox9発現の関与からすると妥当な結果であり,同一遺伝子型を有する個体よりこれらの差が生じた事から,本研究が目的としているエピジェネティック修飾による性分化制御が行われていることが強く示唆され,本研究の重要性が再認識された.雄性化を惹起するSertoli細胞におけるSOX9発現制御について培養条件下で検討した結果,Sox9発現は細胞形態により制御される事が明らかとなった.しかしながらSertoli細胞の成熟ならびに性腺の性決定の実行を担う下流因子の発現制御には細胞接着を介する制御が関与することが明らかとなった(発表2).Sry発現が遅延した場合,Sox9の発現が維持されないことが報告されており,本研究が目的とする同一遺伝子型内の雄性生殖腺の形成程度とSox9発現制御が関連する可能性が推測された.哺乳類における性分化不全の例として,ヒトの性分化疾患症例の一つであるターナー症候群由来組織における性腺分化の破綻機構解析を行った.その結果,雄性化因子であるSOX9,GATA4や雌性化因子であるWNT4の発現に左右差を認めるとともに,健常人個体との間に発現量の差を認めた.この結果は組織像より判断される生殖腺の形成程度とも関連しており,胎子期における性分化関連因子の発現が性腺形成に影響したことが推察された(発表3).これらの遺伝子の胎子期での発現変化については,実験動物で検証中である.性逆転症系統遺伝子組換え動物における真性半陰陽個体における性分化関連因子の発現解析を行い,雄性化の実行因子であるSox9の発現量の差が性決定因子Sryの発現量の左右差に由来することを推測させる結果を得ている.その発現は雄性生殖腺の形成程度と相関し,雌性生殖腺を有する個体では殆ど認められなかった.野性型個体におけるSox9の性腺内における発現を解析すると,発生段階の一部においてその分布にわずかな左右差がみとめられた.同結果より雄性生殖腺の雄性化を撹乱する可能性が想定されたので,Sox9発現の制御に関与するFgf9発現を解析したが,個体差が大きく想定を裏付けるまでには至らなかった.一方,真性半陰陽個体において雄性化側が逆転する個体が得られ,単なる体軸型性因子による制御に寄らないことが示唆された.雄性化を惹起するSertoli細胞におけるSOX9発現制御について培養条件下で検討した結果,Sox9発現は細胞形態により制御される事が明らかとなった.加えて,Sertoli細胞の成熟ならびに性腺の性決定の実行を担う下流因子の発現制御には細胞接着を介する制御が関与することが明らかとなった(発表1,2,3).同一遺伝子型内の雄性生殖腺の形成程度とSox9発現制御が関連する可能性が推測された.哺乳類における性分化不全とくに左右において異なる表現形を示す機構を解明するため,同じ脊椎動物で特に雌において左右で性腺の発達が異なるある鳥類の性分化機構との比較を行った.その結果,哺乳類の雄性生殖腺の維持に関与するDMRT1がミュラー管の退縮に関与することが明らかとなった.加えて,雄性生殖腺の皮質部におけるDMRT1発現は左右で異なっており,未分化性腺は発生段階の特定時期においては等価で無いことが示唆された(論文1,発表4).加えて,未分化性腺の分化においては周辺臓器からの液性因子の関与も想定された.性分化異常の発症原因となる性分化機構の検討を行った.性分化異常系統のマウスで同一遺伝背景から異なる表現型が生じる原因が,性分化関連因子の時空間特異的な性的二型性発現の破綻であることが示された.ターナーモザイク患者では,性分化関連遺伝子の発現が必ずしも左右で同じで無く,モザイク比率やタンパク質局在と一致しない遺伝子が存在した.加えて,培養条件下でのセルトリ細胞の特性維持には三次元構造および細胞接着の両方が必須で有ること,さらに発生中のニワトリ生殖腺ではGATA4がDMRT1の発現調節を行う事,DMRT1がミュラー管の退縮および生殖細胞の発生促進と減数分裂開始に関与することが明らかとなった.性逆転症系統遺伝子組換え動物を用いて,真性半陰陽個体における性分化関連因子の発現解析を行った.その結果,タンパク質レベルで胎子期における雄性化の実行因子であるSox9の発現量の差が認められた.

その発現は雄性生殖腺の形成程度と比例しており,雌性生殖腺を有する個体では殆ど認められなかった.この結果は,雄性生殖腺型性へのSox9発現の関与からすると妥当な結果であるが,同一遺伝子型を有する個体よりこれらの差が生じた事から,本研究が目的としているエピジェネティック修飾による性分化制御が行われていることが強く示唆され,本研究の重要性が再認識された.しかしながら,同個体群より摘出した生殖腺を用いた遺伝子発現量の解析においては,Sox9発現に有意な差は認めることが出来なかった.この結果は微小な胎子性腺を材料として用いたことにより有意差が隠されたためであり,遺伝子発現量においてもSox9に差が生じていると申請者は考えている.すなわち,同一遺伝子型内の雄性生殖腺の形成程度とSox9の調節機構を精査することにより,性分化の過程に対するエピジェネティック修飾の影響を明らかにすることが可能である.発現解析が難しい点についてはすでに検討済みで,次項の達成度で示す対応を行う.加えて,哺乳類における性分化不全の例として,ヒトの性分化疾患症例の一つであるターナー症候群由来の組織を解析し,成人性腺由来の培養細胞においてGATA4,SOX9,WNT4などの発現に左右差を認めた.この結果は組織像より判断される生殖腺の形成程度とも関連しており,胎子期における性分化関連因子の発現が性腺形成に影響したことが推察された.今後,健常ヒト個体における同遺伝子の発現量との差を示した上で報告予定である.これらの遺伝子の胎子期における発現変化の可能性については,実験動物による検証を行う.研究の遂行は予定よりやや遅れているが,その原因は次に示すように試料として用いる遺伝子組換え動物に由来しており,以下の記載の対策より取り戻すことが可能と考えている.研究に用いる真性半陰陽個体となる遺伝子型の動物の出生頻度ならびに出現割合が低く,十分量の実験個体を得る事が出来ていない.また,胎子の両側の性腺における発現量を比較しているため,材料として得られる遺伝子量は極めて少ない.加えて同一遺伝子型より真性半陰陽,半陰陽,雄性,雌性と表現型の異なる個体が得られる実験動物であるが,胎子の段階では将来どの表現型となるのか判別が付かない.これらの点については,昨年度の段階で判明済みの問題点については既に改良を行い,繁殖効率など改善がされている.しかしながら,研究を行う中で目的とする遺伝子発現制御が当初想定よりも細かい時空間的制御に支配されていることが明らかとなり,解析群数の増加を余儀なくされた事が遅延の原因となっている.この点については,野生型の動物を用いた解析を先行させ,解析を行う群数ならびに関連遺伝子の減少を行っている.加えて,Sox9標識動物を用いることで,雄性化実行因子の解析については代替して結果を得ている.ヒト性分化異常症の症例については,当初計画の通り知見が増えている.性逆転症系統遺伝子組換え動物を用いて,真性半陰陽個体における性分化関連因子の発現解析を行った.その結果,切片上において胎子期における雄性化の実行因子であるSox9の発現量の差が認められた.その発現は雄性生殖腺の形成程度と比例しており,雌性生殖腺を有する個体では殆ど認められなかった.
中枢神経伝導路の再構築

小脳遠心投射の再生過程と個体発生過程の関連を明かにするために,胎児から成体に至るいろいろな日齢のラットを用いて小脳遠心投射の個体発生過程を発生の初期から調べ、また、これと並行して、新生ラットの全小脳あるいは半側小脳を切除したのち,摘出した胎児ラットの全小脳あるいは半側小脳を相同部位に移植し,その移植小脳の神経結合を調べた。用いた方法はWGAーHRPと蛍光色素(Fluorogold)をトレ-サ-とする順行性・逆行性標識法である。結果は以下の通りである.小脳遠心投射の個体発生過程:小脳遠心投射はE17にまとまった線維束として脳幹に入り,速やかに成長しE18には視床の最吻側に達し,その間に脳幹と視床の諸核,とりわけ対側の赤核と視床前腹側核ー外側腹側核群に密な終末を与える.この線維の走行と終止の様式は成体におけるものとおおむね同じであったが,異なる点もあった.すなわち、一過性の投射の存在であり、それは以前に我々が仔ネコの小脳遠心投射の再生過程で生ずる異所性投射として報告したものと同じであった。このことは再生が個体発生の繰り返しであることを示している。移植小脳の神経結合:移植小脳に注入したWGAーHRPにより、小脳核からでる小脳遠心投射は終末にいたるまで順行性に標識され,小脳前核のニュ-ロンが逆行性に標識された.このようにして標識された線維の経路、終止部位、終末の密度、あるいは逆行性に標識されたニュ-ロンの分布はいずれも正常ラットにおけるものと区別することはできなかった.このことから移植された小脳にも正常な入出力のできていることが判明した.以上の結果は哺乳動物の脳であっても,その中枢神経回路網をシステムとして再構築することが可能であることを示している.小脳遠心投射の再生過程と個体発生過程の関連を明かにするために,胎児から成体に至るいろいろな日齢のラットを用いて小脳遠心投射の個体発生過程を発生の初期から調べ、また、これと並行して、新生ラットの全小脳あるいは半側小脳を切除したのち,摘出した胎児ラットの全小脳あるいは半側小脳を相同部位に移植し,その移植小脳の神経結合を調べた。移植小脳の神経結合:移植小脳に注入したWGAーHRPにより、小脳核からでる小脳遠心投射は終末にいたるまで順行性に標識され,小脳前核のニュ-ロンが逆行性に標識された.このようにして標識された線維の経路、終止部位、終末の密度、あるいは逆行性に標識されたニュ-ロンの分布はいずれも正常ラットにおけるものと区別することはできなかった.このことから移植された小脳にも正常な入出力のできていることが判明した.以上の結果は哺乳動物の脳であっても,その中枢神経回路網をシステムとして再構築することが可能であることを示している.
キラルナノゲルと強磁性ナノ粒子のハイブリッド化による新規キラル分離剤の開発

これまでに無機基材表面への有機化合物の導入に関して評価を行ってきた。本年度は無機基材の種類をカーボンナノチューブ、フラーレン、ナノ磁性粒子と脂質化合物を組み合わされることによって、脂質化合物のナノゲル形成における自己組織可能を利用して、これらの無機材料を一次元に配向させることを試みた。臨界会合濃度以上でかつゲルを形成しない濃度条件で分子内に極性を有する脂質の透過型電子顕微鏡観察を行ったところ、3次元に発達した繊維状ネットワークが観察された。その条件下で強磁性ナノ磁性粒子を混合し、同様に透過型電子顕微鏡を行ったところ、わずかではあるがナノ磁性粒子が一次元に配向した様子が確認された。しかしながらその一次元配向体がどのような条件、調整法で再現できるかなど、不明な点が多く更なる実験が必要であると考えられる。またそのほかの無機材料について同様の実験を行ったが、脂質による繊維状会合体は確認されたものの無機物質の一次元配向体は確認できなかった。今後脂質の種類や、無機物との混合比を変化させて調査を行っていく予定である。また、オルガノゲルの基本構造およびそのプロパティについて知見を深めるために、米国Georgeteon UniversityのR.G.Weiss教授の訪問を実施した。その結果、光学的な分析手法のほかに、XRDを用いた評価法を学ぶとともに、様々なオルガノゲル化剤について知見を深めることができた。また特別研究員の期間終了後は、同教授の下で博士研究員を内定しており、今後更なる研究の発展が期待できる。シリカ被覆強磁性ナノ粒子は,粒子表面に様々な械能をもった分子を就職することが可能であり,新しいインテリジェントな分離材料として期待されている。今回の研究では,この粒子の表面キラル認識能を有するナノゲルを導入しキラル分子認識能をもつ分離剤の開発を試みた。ナノ磁性粒子の低分散性のために,粒子表面の評価が非常に難しいという問題から,今回は金属吸着能を有するポリ(ビニルイミダゾール)を不斉ナノゲルの代わりに用い,シリコン基板表面に坦持させるととも,その表面の物性をIR, XPS,接触角などを用いて調査した。ポリ(ビニルイミダゾール)の導入後,基板最高の接触角が増加や,XPSによるイミダゾリル基特有のピークが確認されたことから,基板表面にポリ(ビニルイミダゾール)の層が形成されていることが示唆された。また,磁性粒子に坦持するナノゲルの有機溶媒中における分子会合挙動を調査するために,L-グルタミン酸誘導体脂質の頭部に光機能部位を有するピレニル脂質を導入した脂質を作製しTEM, UV, CD,蛍光スペクトルから脂質の会合挙動を調査した。その結果,有機溶媒中において繊維状分子会合体によるネットワーク形成が確認され,この時のCDスペクトルがピレニル基部分において誘起CDを示したことから,この脂質は不斉を誘起した分子会合体構造をことが示された。今後この脂質の不斉識別能について検討するとともに,シリコン基板あるいはナノ磁性粒子への導入を試みる。
マルチメタリックサイトを有する遷移金属錯体の合成と応用

前年度までに、ピリタジン環に二つのジフェニルホスフィノ基を導入した窒素-リンハイブリット四座配位子の合成を行っており、さらにその配位子に二つのパイアリルパラジウム錯体を配位させ二核錯体の合成にも成功している。本年度は二核錯体の触媒的合成反応への応用を検討した。まず、パイアリルパラジウム二核錯体を触媒として用い、アリル位アルキル化反応、スチレンのビニル化反応、エチレンのポリメリゼーション等について検討した。しかしながらこの錯体はいずれの反応においても、単核錯体とは異なる二核錯体に特徴的な反応性は示さず、逆に触媒活性は単核錯体に比べ低いものであった。そこで次に、四座配位子とロジウム錯体二当量から系内で二核錯体を発生させサフロールのヒドロホルミル化によるへリオフロール合成における触媒能について調査した。その結果、生成物の位置選択性に関しては単核錯体と顕著な差異は見られなかったが、触媒活性が向上し単核錯体に比べ低圧、低温の比較的穏和な条件でヒドロホルミル化体が高収率で得られた。サフロールのヒドロホルミル化では一部の単核錯体を用いたときにフリーデルクラフツ反応によりテトラヒドロナフタレンが副生するが、本二核錯体を用いた穏和な反応条件では副生生物は全く得られなかった。この触媒活性の増大が二つのロジウムの共働作用によるものかどうか、また、二つのロジウムがどのように働いているかについては現在調査中である。また、四座配位子に対しロジウム一当量と他の遷移金属錯体一当量を加えることにより二つの金属が四座配位子上で協奏的に働くことを期待し、種々の金属との組み合わせも検討した。しかしながら、サフロールのヒドロホルミル化反応においては多くの金属がロジウムそのものの触媒活性を低下させてしまい、ロジウムのみを触媒として用いた反応と比べ収率や位置選択性の面での劇的な向上は見られなかった。空間的に近接した二つの金属中心を有する金属錯体の配位子として、同一平面に二つの窒素原子を有するピリダジン環に二つのジフェニルホスフィノメチル基を導入した窒素-リンハイブリッド四座配位子の合成を行った。まず、ピリダジンジエステルを水素化ホウ素ナトリウムにより還元しジ(ヒドロキシメチル)ピリダジンに誘導した。続いて水酸化カリウムとトシルクロライドによりトシレートとした後、リチウムジフェニルホスフィドと低温にて反応させることにより目的の四座配位子が得られた。また、ナフチリジン環を中心骨格とする窒素-リンハイブリッド四座配位子の合成も同様の手法を用いることにより成功している。続いて、前者のハイブリッド四座配位子を用い二核遷移金属錯体の合成を行った。種々の後周期遷移金属前駆錯体との反応を行った結果、パイアリルパラジウム錯体を用いたときに相当する二核錯体が高収率で得られた。この錯体に関してはx線結晶構造解析にも成功しており、二つのパラジウムがねじれて配位しているC2対称を持つ錯体であることが確認された。また、アリル部位のプロトンNMRのピークは既知のパイアリル錯体とは大きく異なり、触媒反応において特異な反応性を示すことが期待できる。現在、この二核錯体を触媒として用いた有機合成反応について検討中である、その他、二つの異なる遷移金属を有するヘテロ二核錯体の合成についても検討を行ったが、期待される二核錯体は得られなかった。
幹細胞を利用した新歯内治療法の確立

1.マウス歯胚由来幹細胞の分取我々が所存しているマウス由来の歯髄細胞株中に歯髄幹細胞が存在することをHoechst33342を用いてFACS cell sorter機器を使用して確認し、幹細胞分取に成功した。また、幹細胞の培養を行い、再びFACS cell sorter機器を用いて測定したところ、多くの幹細胞の存在を確認できた。2.幹細胞のキャラクタリゼーション:多分化能の詳細な証明幹細胞の性質である多分化能の詳細な確認を行った。石灰化誘導実験において、誘導可能な培地の下で培養後、ALP活性およびvon Kossa染色にて判定を行った結果、幹細胞群はALP活性の促進およびvon Kossa染色に対して強い陽性反応を示した。また、培養終了後total RNAを分離し、cDNA合成を行い、骨芽細胞分化マーカーであるOsteocalcin、Osteonectin、Runx2の発現をReal-time PCRにて定量した結果、それぞれ多い発現量を示した。次に、脂肪誘導実験を行い、Oil Red O染色にて判定および培養終了後のtotal RNAより合成したcDNAを用いて、PPARγをReal-time PCRにて定量比較した。その結果、幹細胞が脂肪滴を含んだ脂肪細胞へ変化し、Oil Red O染色に対しても陽性反応を示し、PPARγの発現も強く現れた。神経誘導実験では、培養後、ニューロンおよびグリア細胞様の形成を実体顕微鏡にて確認した。また培養後、タンパク質を分取し、Neurofilamentの発現をWestern blot法にて解析した結果、Neurofilamentタンパクの発現が確認できた。次にBMP2およびBMP4を含んだ培地で培養後、象牙芽細胞分化マーカーであるDmp1、Dsppなどの発現を半定量的PCR法かつReal-time PCRにて比較した結果、幹細胞群において強い発現が確認された。
Heparanaseによる癌浸潤転移機構の解明とその制御法の確立

本研究はheparanaseの発現をコントロールすることにより癌浸潤転移機構を解明し、更にその制御法の確立を目的とし、モデルシステムの確立、癌浸潤転移にかかわる因子の評価を行ってきた。動物実験、in vitroの実験を行い以下の結果を得た。1)ラット肝癌肺転移モデルの確立とその癌転移メカニズムの解析ラット肝癌由来細胞株を同系ラットの肝臓に移植することにより、肝細胞癌が肝内で増殖し、更に高率に肺転移を発症するモデルを開発し、確立した。このモデルについて担癌肝臓を摘出し同種肝移植を施行しても、肺転移は成立した。しかしこの肺転移はRock inhibitor投与により完全に抑制された。このことにより本モデルでは癌細胞の原発巣からの離脱と基底膜を越えての血管内への浸潤は、肝癌移植後1ヶ月から既に始まっており、遠隔部位へのホーミング、増殖による転移巣の形成はRock inhibitorによって阻害できることを証明した。2)ラット肝癌細胞浸潤能、遊走能にかかわる因子の評価免疫抑制剤投与で肝癌細胞株の浸潤遊走能は著明に亢進し、その効果はRock inhibitor投与で有意に抑制された。更にRock標的因子であるMLCのリン酸化レベルは免疫抑制剤投与で亢進し、Rock inhibitor投与で抑制された。しかしこれらの効果は肝癌細胞株の増殖能}ご対してはなんら影響を与えなかった。すなわち、本実験系における肝癌細胞株の転移巣形成はRockを介した浸潤遊走能亢進によることが証明された。3)Heparanase遺伝子発現による、in vivoでの癌転移形態の解析ラット肝癌細脚株移植モデルにおいて肝癌細胞株にheparanase遺伝子を導入し、heparanase発現を調節することにより、転移巣形成に変化があるか検討中であるが、導入効率など更なる改善が必要である。1)ラット肝癌肺転移モデルの確立とその癌転移メカニズムの解析ラット肝癌由来細胞株(Morris)を同系ラットの肝臓に移植することにより、1ヶ月後に肝細胞癌が肝内で増殖し、更に約4ヶ月後に高率に肺転移を発症するモデルを開発し、確立した。このモデルについて肝癌移植後1ヶ月で担癌肝臓を摘出し同種肝移植を施行しても、肺転移は成立した。次にほ乳類細胞発現ベクター(pTet-on&pTet-off)にラットheparanase cDNAを組み込んだベクターを作成した。まずHeLa細胞株に遺伝子導入し、安定に発現する細胞株を樹立した。培養細胞系でtetracycline存在下でのheparanaseの発現をreal-time PCR、ウェスタンブロットで確認した。更に培養上清中のheparanase活性を測定し、このシステムで機能的な酵素が産生されることを証明した。In vivoで本システムが機能するか否か、ラットを用いて検討中である。本研究はheparanaseの発現をコントロールすることにより癌浸潤転移機構を解明し、更にその制御法の確立を目的とする。ラット肝癌細胞浸潤能、遊走能にかかわる因子の評価Morris肝癌細胞株の浸潤能はトランスウエルチャンバーを用いて定量的に評価し、遊走能はLPA刺激下に遊走細胞数を測定した。LPA投与でMorris肝癌細胞株の浸潤遊走能は著明に亢進し、その効果はRock inhibitor投与で有意に抑制された。

さらにこの現象はLPAのかわりに免疫抑制剤を投与することでも確認され、免疫抑制剤投与によって亢進した浸潤遊走能がRock inhibitor投与で抑制された。更にRock標的因子であるMLCのリン酸化レベルは免疫抑制剤投与で亢進し、Rock inhibitor投与で抑制された。しかしこれらの効果はMTTを用いて測定したMorris肝癌細胞株の増殖に対してはなんら影響を与えず、更にMAPキナーゼリン酸化も変化しなかった。すなわち、本実験系におけるMorris肝癌細胞株のin vivoにおける転移巣形成はRockを介した浸潤遊走能亢進によることが証明された。Heparanase遺伝子発現による、in vivoでの癌転移形態の解析Morrisラット肝癌細胞株を同系ラットの肝臓に移植することにより、高率に肺転移を発症する。更に肝癌移植後の担癌肝臓を摘出し、免疫抑制剤使用下での同種肝移植を施行しても、やはり肺転移が成立し、この肺転移はRock inhibitor投与により完全に抑制された。本モデルにおいてMorrisラット肝癌細胞株にheparanase cDNAを組み込んだほ乳類細胞発現ベクター(pTet-on&pTet-off)を導入し、heparanase発現を調節することにより、転移巣形成に変化があるか検討中であるが、導入効率など更なる改善が必要である。
顕在的注意を喚起する視覚情報とサッカードの大きさに依存した機能分化の解明

本研究ではマーモセットにおける皮質眼領野を決定するためfMRI実験を実施した。マーモセットは9.4TMRIの中で反復眼球運動課題を実施した。前頭前野では、A8aVにてサッカード関連活動が確認された。また、頭頂葉、後頭葉にもサッカード関連活動が観察された。本研究により、眼球運動制御に関わるマーモセットの皮質領野を特定することができた。マーモセットにおける眼球運動はマカクやヒトなどと異なり、可動範囲がかなり狭い範囲に限定されることが行動学的に知られているが、眼球運動制御に関わる皮質領野の局在について基本的な特性が真猿類間で保存されていることが示された。霊長類は視覚的な情報を選択的に取得・処理する。高速な眼球運動(サッカード)を用いて特定の興味の対象を効率よく注視する一方で、周辺視野では次のサッカード先を決定する。これを顕在的注意の制御と呼ぶ。日常生活では、同種個体の顔など重要な情報には小さなサッカードを用いて精査して、突発的な外界の変化には大きなサッカードを用いて対応するということが考えうる。このような顕在的注意の制御にはどのようなメカニズムが機能しているのだろうか。本研究では、自然画像の自由観察課題とfMRI、拡散強調MRIを組み合わせることで、サッカードの大きさに応じた神経メカニズムの機能分化の様相を明らかにすることを目指す。本年度は、各種実験セットアップの確立を行った。マーモセットの眼球運動を測定するためのシステムを開発した。非訓練動物における自動キャリブレーションシステムと自由観察課題を開発した。これにより自然画像観察時の視線探索分布を調べることができる。視覚誘導性眼球運動課題をマーモセットに訓練することに成功し、これにより眼球運動測定が視野角一度未満の精度で計測できていることが確認された。また、覚醒下でfMRIを行うためにシステム開発を行った。MRIに適合するヘッドポストおよび8チャンネルコイルシステムを開発した。さらにこれらに適合した視覚提示装置を開発した。視野角で最大40度ほどの刺激を超高磁場MRIにおいて呈示できるようになった。これらの装置により覚醒マーモセットから視覚刺激呈示中の機能画像を取得できるようになり、視覚刺激による頑健なBOLD信号変化を捉えることに成功した。本研究での重要な実験系の構築が概ね完了した。本課題において一つもっとも難しい問題は超高磁場環境にて眼球運動を計測を行いながら、ノイズの少ない機能画像を取得することである。この点において、縮小光学系を用いた眼球運動計測カメラ、同じく縮小光学系を用いた背面投射の画像呈示システム、動物固定のための高次場適合ヘッドポスト、これらに対応した8チャンネルサーフェスコイルの開発により実験の要求を満たすレベルで計測可能となった。本年度において覚醒マーモセットから視覚刺激提示中の機能画像を取得できるようになり、また視覚刺激による頑健なBOLD信号変化を捉えることに成功した。これは顕在的注意の制御と呼ばれる。このような顕在的注意の制御にはどのようなメカニズムが機能しているのか、本研究では自然画像の自由観察課題とfMRI、拡散強調MRIを組み合わせることでサッカードの大きさに応じた神経メカニズムの機能分化の様相を明らかにすることを目指す。前年度までに開発したマーモセットを対象とした覚醒下fMRI実験系により、眼球運動制御に関連の強い領野の決定を試みた。マーモセットに視覚誘導性連続サッカード課題を訓練した。この課題は、「画面にターゲット刺激が呈示され、そこに素早くサッカードを行う」という一連の動作を繰り返し実行するという課題である。大きなサッカードが必要となる周辺視野サッカード条件、小さなサッカードのみの中心視野サッカード条件、固視条件の3条件のブロックデザインとしてfMRI計測を実施した。その結果、特に顕著な活動として、前頭前野の一部に中心視野サッカードおよび固視条件にて強く反応する領域、また頭頂葉の一部にて周辺視野サッカード条件にて強く活動する領域がそれぞれ見いだされた。このようにサッカードの大きさに依存した機能分化の存在が示唆された。研究実施の順序は当初とは異なる順序で進むこととはなっているが、本研究課題の主要な問いである「サッカードの大きさに依存した機能分化の解明」という点について重要な示唆を得ることが既にできている。賦活領域の領野推定においては、Hashikawa-atlasへの非剛体変換にて推定した。実験では周辺視野間へ大きくサッカードするLarge Saccade条件、中心窩近傍でサッカードをするSmall Saccade条件、一点で固視するFixation条件を行った。Small-saccadeとFixationでは条件間で顕著な賦活コントラストは得られなかった。一方でLarge SaccadeとFixation条件において複数の皮質領野でサッカード関連活動が確認された。この領野は解剖学的な知見からもマーモセットにおける前頭眼野と推定されており、本研究における機能解析とも一致する。

また、頭頂葉、後頭葉にもサッカードにより賦活する領野が認められた。賦活はMT野のちょうど背側後端と、腹側前端分に位置していた。マカクザルの研究では頭頂葉ではLIPという領野がサッカードの制御に重要と考えられている。マーモセットにおいて解剖学的にLIPとされている領野において、本研究でも顕著な活動が認められた。ただそのBOLD反応パターンは他の皮質眼野とは著しく異なるものであった。さらに背側後頭葉に位置するV6,V6a,V3aにおいてもサッカード関連の活動を確認した。本研究により、眼球運動制御に関わるマーモセットの皮質領野を特定することができた。マーモセットにおける眼球運動はマカクやヒトなどと異なりかなり狭い範囲に限定されることが行動学的に知られているが、眼球運動制御に関わる皮質領野の局在について基本的な特徴が真猿類間で保存されていることが示された。本研究ではマーモセットにおける皮質眼領野を決定するためfMRI実験を実施した。マーモセットは9.4TMRIの中で反復眼球運動課題を実施した。前頭前野では、A8aVにてサッカード関連活動が確認された。また、頭頂葉、後頭葉にもサッカード関連活動が観察された。マーモセットにおける眼球運動はマカクやヒトなどと異なり、可動範囲がかなり狭い範囲に限定されることが行動学的に知られているが、眼球運動制御に関わる皮質領野の局在について基本的な特性が真猿類間で保存されていることが示された。開発した装置を用いて実験を進めていく。被験個体に自然画像を呈示して自由に観察させる。この時の注視パターンをアイトラッカーで記録する。次に刺激画像の特徴量を定量的に評価する。この特徴量マップをもとに、各サッカードがサッカード先のどのような特徴量によって喚起されるのか、またサッカードの大きさと体系的な変化があるのかを調べる。続いてブロックデザインを用いた単純なサッカード課題を行う。サッカードの振幅に対して前頭眼野の活動に機能的局在があるか調べる。それが観察された場合、各サッケード振幅で賦活するエリアをROIとして、その他領野での活動の相関を計算する。これにより各サッカード振幅に応じたそれぞれの機能ネットワークを調べる。恣意的な課題場面で見いだされたサッカードの大きさに依存した機能分化あるいは領域特化が、自然な視線行動においてどのような役割を果たすのか解明を目指す。自然画像を用いた自由観察課題をマーモセットに実施して、特徴的な視線行動、それを惹起する視覚刺激、そしてfMRIによる脳活動の関連性を明らかにする。神経科学必要な物品の一部を研究所内のリサイクルで取得したため。動物の認知実験課題へのモチベーションのコントールが、他の動物種に比べ繊細であることが判明したため、普段の給水量のモニタ・制限の自動化システムを調達する。
大西洋往還知識人ネットワークの形成とスペイン語圏文化地図の変化についての研究

東京大学文学部現代文芸論研究室の紀要『れにくさ』に以下の論文を発表した。「コスモポリタンな欲望ーブエノスアイレスーパリーブエノスアイレス」『れにくさ』第9号、2019、pp.145-156.これは2018年9月21日、立命館大学衣笠キャンパスで開かれた第9回世界文学・語圏横断ネットワーク研究集会での口頭発表を基に文章化したものである。また、2019年2月27日から3月5日にかけてはアルゼンチン、ブエノスアイレスにおいてアーカイヴ調査および文献収集を行った。今回の出張は学事との兼ね合いで日程が十分に取れなかったので、現地の研究者や作家らとの意見交換の場を持つことはできなかったものの、1930年代当時の言論空間の調査としてはまずまずの結果を得た。時間の関係からごくわずかなものとならざるを得なかったが、上記論文の仕上げに際しては参考になった。2018年9月26日から28日にかけては、所属する東京大学の主催によるJapan Latin America Academic Forum(於・日光)というのに参加した。ここでの発表や司会した分科会の内容は直接には本研究とは関係ないが、メキシコやチリの研究者と有意義な意見交換ができた。当初出版を予定していた著書の出版が遅れている。ただし、これは版元となる東京外国語大学出版会、およびその書籍のはいるシリーズの他の著者の仕事の進捗状況との関係によるものである。そうした問題も決着しつつあるので、2019年度にはその成果を世に問うことができそうである。その著書のうち数章は、本研究の成果と見なしうるものであり、その部分の執筆は終えている。版元の作業が待たれるところである。また、本研究の成果として毎年発表してきた論文および、これから発表する予定の翻訳などは、報告のとおりであり、おおむね順調と言って良い。遅れ気味である著書の出版に関しては、ひとつは、上記のごとく、版元の問題であるので、解決され次第、進める予定。予定していた他の著書に関しても、着実に進めているところである。また、これまで研究成果として発表した論文等を編纂し直し、著書などにまとめることを検討している。今後は研究の焦点をフランス生まれのスペイン語作家マックス・アウブと、彼が亡命先のメキシコで親好を結び、その生涯を小説化したスペイン人映画監督ルイス・ブニュエルの関係に絞るつもりであり、アウブの『小説ブニュエル』の翻訳と研究なども行う予定。アウブの記念館がスペイン、バレンシア地方にあるので、今年度は、そこを訪問する予定。今年度はまず、立石博高編著『概説スペイン文化史18世紀から現代まで』(ミネルヴァ書房、2015)に、以下の3本の論文を寄稿した。「第8章国民文学と地方文学」(182-205ページ)、「第13章映画の世界」(291-305ページ)、「第15章「国技」としての闘牛」(320-330ページ)。これらは近代スペインの文化史をめぐる概説ではあるが、20世紀に入り、スペイン文化がスペイン語圏ラテンアメリカと取り持つ関係にも配慮したものであり、私の研究の基礎をなすものと位置づけられる。また、私の所属する東京大学大学院人文社会系研究科の現代文芸論研究室が発行する雑誌『れにくさ』第16号(2016年3月)に研究ノート「突き出した指はどこから来て、どこへ行くのかスペイン内戦のポスターとソヴィエト、そしてメキシコ」(91-99ページ)を発表した。これはソヴィエトとスペインのポスター芸術の影響関係、および、それらとメキシコ壁画運動のかかわりについてのある予測を示したものであり、以後、私の研究のひとつの極を形成すると思われる。この研究ノート執筆直後にはメキシコ合衆国への調査旅行を行い、スペイン内戦を機にメキシコを訪れたヨーロッパ知識人たちについての調査を行った。また、以下の翻訳単行本を出版した。いずれも大西洋をまたいでスペインとラテンアメリカで活動する作家たちの作品だ。エドゥアルド・メンドサ『グルブ消息不明』東宣出版、2015、232ページ。セサル・アイラ『文学会議』新潮社、2015、192ページ。フアン・ガブリエル・バスケス『物が落ちる音』松籟社、2016年、314ページ。翻訳などの注文仕事もあったため、自身の研究を活字化する作業に期待したほどの進展がないのが悔やまれるところだが、準備は怠っておらず、このまま展開すれば計画どおりに進捗するものと思われる。今年度は以下の2冊の翻訳書を出した。1アルフォンソ・レイェス『アナワクの眺め(一五一九)/Vision de Anahuac (1519)』ヌエボレオン州立大学、モンテレイ、メキシコ、2016年、78ページ(対訳版。アドルフォ・カスタニョンによる序文の翻訳も含む)。2ロベルト・ボラーニョ『第三帝国』白水社、2016、404ページ。いずれも私の研究に深くかかわる作家たちである。くわえて、以下の招待講演を行った。「世界文学の時代ーラテンアメリカ文学のひとつの首都パリ」日本フランス語教育学会2016年度秋季大会、2016年10月15日(於:金沢大学)。この講演はスペイン語圏の作家たちがパリを媒介にして築いたネットワークを描き出す試みの一環である。従来、ラテンアメリカ文学の枠組みで語られていた20世紀スペイン語圏の文学の新しい潮流の胚胎を、世界文学の視点から捉え直すと同時に、作家たちの有機的ネットワークという基礎の上に成り立つことを説いたもの。

この原稿はいずれ出版される予定の研究成果に組み込まれる。また、当初、計画ではスペイン、バルセローナへの研究旅行を予定していたが、情勢を鑑み、キューバへのそれに変えた。作家カルペンティエールの記念館等で文献探索にあたり、当地の研究者と意見交換した。調査旅行の対象は変更したが、内容的にはおおむね目標を達成している。ただし、論文や書籍などの形での発表がいささか遅れている。引き続き努力したい。2017年度は別紙に示したとおり、論文「劇場と祭のトポス&#8212;&#8212;カルペンティエールの場合」を『れにくさ』8号に発表した。これは以前(2014年)、学会で口頭発表したものを活字化したものだが、活字化に際し、昨年度行ったキューバへの研究旅行の成果も盛り込んだ。キューバの小説家アレホ・カルペンティエールが、キューバからベネズエラに移住した時期の活動も論文には盛り込んだが、その時期には、前者から後者へは大挙してラジオ関係者・音楽関係者が移動したのであり、カルペンティエールがそうした移民のひとりだったことを資料的に跡付けたうえで示すことによって、大西洋の一部であるカリブ海の沿岸地域の間の沿岸地域の人の移動に焦点を当てることができた。加えて2017年度はメキシコへの研究旅行を行った。スペインからメキシコに渡った作家マックス・アウブおよび映画監督ルイス・ブニュエルについての調査をした。スペインからメキシコへと渡り、生涯をメキシコで終えたこのふたりの知識人の関係については、作家が映画監督についての書いていた小説が未完ながら数年前に刊行されたこともあり、これから大いに考察を展開したい。申請時に計画していた書籍の刊行の準備も着実に進んでいる。2017年度中の刊行はならなかったものの、年度末に原稿を書き上げ、また、上記研究旅行中に資料や写真の不備を補うことができた。2018年度の研究実績としては報告することができそうである。研究計画では広く多くの知識人を対象とすると書いたが、より具体化し成果を実現していくために対象を絞ることにした結果、その対象となる作家たちについての研究は進捗している東京大学文学部現代文芸論研究室の紀要『れにくさ』に以下の論文を発表した。「コスモポリタンな欲望ーブエノスアイレスーパリーブエノスアイレス」『れにくさ』第9号、2019、pp.145-156.これは2018年9月21日、立命館大学衣笠キャンパスで開かれた第9回世界文学・語圏横断ネットワーク研究集会での口頭発表を基に文章化したものである。また、2019年2月27日から3月5日にかけてはアルゼンチン、ブエノスアイレスにおいてアーカイヴ調査および文献収集を行った。今回の出張は学事との兼ね合いで日程が十分に取れなかったので、現地の研究者や作家らとの意見交換の場を持つことはできなかったものの、1930年代当時の言論空間の調査としてはまずまずの結果を得た。時間の関係からごくわずかなものとならざるを得なかったが、上記論文の仕上げに際しては参考になった。
強直性脊椎骨増殖症とレチノイドとの関係に関する研究

強直性脊椎骨増殖症の成因解明の一環として,レチノイドの本症に関する研究を行い,次の成果をえた.1.レチノイドを連続投与したラットの脊柱には散発的に靭帯骨化と類似の所見が得られたが,ビタミンAの血中濃度や投与量あるいは投与期間に依存して一定の傾向で靭帯骨化は証明できなかった.ビタミンA総投与量が増加するにしたがって骨塩量は減っていく傾向を示し,高頻度に骨吸収像が認められた.2.ビタミンA強制経口投与により,ラットにビタミンA過剰症を起こしたが,推定実測生存率からビタミンA濃度が上昇するほど生存期間は短くなっていた.靭帯骨化の形成のためには長期間のビタミンA過剰状態が必須であることが推測されるので,長期間継続できるビタミンA投与方法について検討の余地があると考えられた.3.ビタミンA過剰ラットにおける肝では,ビタミンA投与用量にしたがってビタミンAが貯蔵されていることが判明したが,アキレス腱部にはビタミンA貯蔵細胞はみられなかった.靭帯骨格系には,ビタミンAを貯蔵するための細胞が少ないことと,ビタミンAの標的細胞としての機能が備っていないことが判明した.4.器官培養骨に対するビタミンAの影響を調べたが,鶏胎児の大腿骨、脛骨の成長抑制が明らかになった。これは軟骨細胞に対するビタミンAの濃度勾配に依存する抑制作用を示唆していた.5.軟骨のRBPの局在を調べるために,各種の軟骨組織をもちい免疫組織学的に検索した.RBPは,胎児軟骨の細胞や成長軟骨の周囲や,関節軟骨,変性した関節軟骨,椎間板において認められた.6.強直性脊椎骨増殖症患者および対照例について,血清ビタミンA濃度を測定したが,強直性脊椎骨増殖症と血清ビタミンA濃度との関連を証明することが出来なかった.強直性脊椎骨増殖症の成因解明の一環として,レチノイドの本症に関する研究を行い,次の成果をえた.1.レチノイドを連続投与したラットの脊柱には散発的に靭帯骨化と類似の所見が得られたが,ビタミンAの血中濃度や投与量あるいは投与期間に依存して一定の傾向で靭帯骨化は証明できなかった.ビタミンA総投与量が増加するにしたがって骨塩量は減っていく傾向を示し,高頻度に骨吸収像が認められた.2.ビタミンA強制経口投与により,ラットにビタミンA過剰症を起こしたが,推定実測生存率からビタミンA濃度が上昇するほど生存期間は短くなっていた.靭帯骨化の形成のためには長期間のビタミンA過剰状態が必須であることが推測されるので,長期間継続できるビタミンA投与方法について検討の余地があると考えられた.3.ビタミンA過剰ラットにおける肝では,ビタミンA投与用量にしたがってビタミンAが貯蔵されていることが判明したが,アキレス腱部にはビタミンA貯蔵細胞はみられなかった.靭帯骨格系には,ビタミンAを貯蔵するための細胞が少ないことと,ビタミンAの標的細胞としての機能が備っていないことが判明した.4.器官培養骨に対するビタミンAの影響を調べたが,鶏胎児の大腿骨、脛骨の成長抑制が明らかになった。これは軟骨細胞に対するビタミンAの濃度勾配に依存する抑制作用を示唆していた.5.軟骨のRBPの局在を調べるために,各種の軟骨組織をもちい免疫組織学的に検索した.RBPは,胎児軟骨の細胞や成長軟骨の周囲や,関節軟骨,変性した関節軟骨,椎間板において認められた.6.強直性脊椎骨増殖症患者および対照例について,血清ビタミンA濃度を測定したが,強直性脊椎骨増殖症と血清ビタミンA濃度との関連を証明することが出来なかった.Fisherラット雄160匹を生後12ヵ月令(60匹)と3ヵ月令(100匹)の2群にして、コントロ-ルはピ-ナッツ油を、ビタミンA過剰ラットには、パルミチン酸レチノ-ルをピ-ナッツ油に溶解して、5000U/kg/day、25000U/kg/day、100000U/kg/dayになるように週2回強制径口投与した。径口投与後3ヵ月では、12ヵ月令においては体重減少がみられたものの、3ヵ月令では、ビタミンA投与量に差がなく50gほどの増加があった。それぞれの群における骨関節変化を軟X線で検討した。12ヵ月令25000U/kg/day以上の投与群では、すべて後肢屈筋群付着部の腱に、骨化像が認められた。膝蓋腱着部、脊髄(特に胸推部)、足根骨部にも骨棘に似た変化が見られたが、ばらつきがあった。3ヵ月令5000U/kg/day投与したものでは、脊髄を除いた骨関節部に、moth-eaton様の骨粗髪が認められ、また後肢屈筋腱付着部には、骨新生像がみられた。25000U/kg/day以上の投与群においては、12ヵ月令にみられたような背柱の変化は明らかではなかった。今後は、血中ビタミンA濃度と骨関節の形態学的変化との関係についてさらに検討を加えていく予定である。強直性脊髄骨増殖症の患者とコントロ-ルとの、血中ビタミンA濃度を各6名につき計測したが、平均56550ng/mlと平均5000ng/mlであった。骨塩量との相関関係はいまのところみられていない。ラットの脛骨骨折後の化骨細胞の培養では、オ-ルトランスレチノ-ル20ug/mにおいては、培養細胞は死滅した。

それ以下の濃度ではH^3チミジンの取込がみられたが、それが骨増生能を直接証明しているのかさらに検討を要するものと考えている。Fisherラット雄186匹を12カ月令,3カ月令にわけて,対照群,ビタミンA過剰群として、骨関節変化が生じるか検討した.ビタミンA過剰症になったかについては、高速液体クロマトグラフィ-にて血中のレチノ-ルパルミチン酸レチノ-ルを定期的に測定した、パルミチン酸レチノ-ル強制経口投与群では対照群と比べて、レチノ-ル、パルミチン酸レチノ-ルともに血中濃度が上昇しており、パルミチン酸レチノ-ル総投与量が多ければ多い程血中濃度が高くなっていた。定期的に屠殺したラットの軟X線像においては、明らかな骨変化、造骨所見をしめすものはみられなかった.アキレス腱付着部に骨化巣はみられたものの、対照群、ビタミンA過剰群との間に、量的質的な差はなかった。摘出したラットの肝では,レチノ-ル貯臓細胞が鍍金染色で、パルミチン酸レチノ-ル投与量に相関して多数認められたが、アキレス腱付着部、脊椎血四肢骨にはレチノ-ル貯臓細胞を証明することはできなかった。またレチノ-ル結合蛋白をもちいた免疫染色でも,鍍金染色と同様の所見であった対照群・ビタミンA過剰群ともに、第1尾椎の骨塩量をDigital Image Processing法を用いて測定したが,ΣGS/Dは平均0.55と両群に差はなく、投与期間の時間的差異についても明らかではなかった。しかし、ビタミンA過剰群には数少ないが骨粗鬆がおきたものがみられた。ビタミンAの培養組織に対する影響に関しては、鶏卵からの大腿骨と脛骨に対してオ-ルトランスレチノ-ルを加えて骨の成長について検討した。ビタミンA濃度が100μM以上になると骨成長に悪影響を及ぼすことが判明した。ヒトにおける強直性脊椎骨増殖症患者と対照群との血中レチノ-ル濃度については、それぞれ20名づつ調査したが、有意差はなかった。
ダイズの菌根菌接種による生育応答を決定する地下部形質の解明と関連QTLの同定

リン施肥量削減に向け、ダイズのAM菌接種による生育応答(MGR)の高い品種の育成が求められている。MGRは根系形態とAM菌の菌糸長により決定すると考えられているが、両者を詳細に定量化できる技術は存在せず、どちらがMGRを決定しているのかは未だ不明である。本研究では、根箱法の改良により菌糸も同様に定量化し、ダイズミニコアコレクションのMGRを決定する地下部形質を解明する。また、ゲノムワイドアソシエーション解析(GWAS)によりそのQTLを同定する。さらに、圃場でも、この地下部形質によってMGRが決定するのか検証する。これらにより、MGRの高い品種の育成に貢献する。