hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクティブメンブレンの創製と有機無機ハイブリッド積層膜構築への展開

近年,脂質二分子膜の機能を活用したあらたな機能材料の開発検討が盛んに行われている.本課題では,脂質二分子膜の主構成成分であるリン脂質に着目し,光・電場応答性サーモトロピック液晶にリン脂質部位を導入し,外場によるアクティブな組織構造変化・ダイナミックな応答性を示す人工リン脂質を創製することを目的とした.さらには外場の印加により大面積均一配向リオトロピック液晶場を形成させ,ナノ粒子を“その場合成"することで外場応答性有機無機ハイブリッド多層積層膜を構築する手法開発に繋げることを目的とした.その結果,電場・光応答性部位を導入することで,外場による液晶構造のダイナミックな制御を行う手法を確立した.近年,脂質二分子膜の機能を活用したあらたな機能材料の開発検討が盛んに行われている.こうした試みは,脂質二分子膜に少量の機能性分子を導入することに主眼が置かれ,二分子膜自身に機能性を付与するというよりむしろ,脂質二分子膜は単に機能性分子固定用の土台として用いられている.そこで本申請課題では,脂質二分子膜の主構成成分であるリン脂質に着目し,光・電場応答性サーモトロピック液晶にリン脂質部位を導入し,外場によるアクティブな組織構造変化・ダイナミックな応答性を示す人工リン脂質を創製することを目的とする.さらには外場の印加により大面積均一配向リオトロピック液晶場を形成させ,ナノ粒子の“その場合成"を行うことで外場応答性有機無機ハイブリッド多層積層膜を構築する手法を開発することを最終的な目標として研究開発を行っている.具体的には,アクティブメンブレンとして有機無機ハイブリッド積層膜を構築するため,水酸基を有する有機液晶を原料としてリン脂質誘導体を合成した.この際,逆相カラムを用いて十分に精製操作を行った.得られたリン脂質誘導体の組織構造や液晶性を各種分析により評価した.更に,外部刺激,具体的には電場・光による液晶組織構造の均一配向処理のための条件を探索した.この際,SPring-8での放射光小角散乱測定により自己組織構造の解析を行った.その結果,電場・光応答性部位を導入することで,外場による液晶構造のダイナミックな制御を行う手法を確立することができた.得られたリオトロピック液晶場を用いて,今後,酸化ガドリニウム平盤ナノ粒子を“その場"合成することにより,有機無機ハイブリッド積層膜を作成する予定である.近年,脂質二分子膜の機能を活用したあらたな機能材料の開発検討が盛んに行われている.本課題では,脂質二分子膜の主構成成分であるリン脂質に着目し,光・電場応答性サーモトロピック液晶にリン脂質部位を導入し,外場によるアクティブな組織構造変化・ダイナミックな応答性を示す人工リン脂質を創製することを目的とした.さらには外場の印加により大面積均一配向リオトロピック液晶場を形成させ,ナノ粒子を“その場合成"することで外場応答性有機無機ハイブリッド多層積層膜を構築する手法開発に繋げることを目的とした.その結果,電場・光応答性部位を導入することで,外場による液晶構造のダイナミックな制御を行う手法を確立した.近年,脂質二分子膜の機能を活用したあらたな機能材料の開発検討が盛んに行われている.こうした試みは,脂質二分子膜に少量の機能性分子を導入することに主眼が置かれ,二分子膜自身に機能性を付与するというよりむしろ,脂質二分子膜は単に機能性分子固定用の土台として用いられている.そこで本申請課題では,脂質二分子膜の主構成成分であるリン脂質に着目し,光・電場応答性サーモトロピック液晶にリン脂質部位を導入し,外場によるアクティブな組織構造変化・ダイナミックな応答性を示す人工リン脂質を創製することを目的とする.さらには外場の印加により大面積均一配向リオトロピック液晶場を形成させ,ナノ粒子の“その場合成"を行うことで外場応答性有機無機ハイブリッド多層積層膜を構築する手法を開発することを最終的な目標として研究開発を行っている.具体的には,アクティブメンブレンとして有機無機ハイブリッド積層膜を構築するため,水酸基を有する有機液晶を原料としてリン脂質誘導体を合成する.この際,逆相カラムを用いて十分に精製操作を行った.得られたリン脂質誘導体の組織構造や液晶性を各種分析およびUniversity of SheffieldのG. Ungar教授との共同研究体制により評価した.更に,外部刺激,具体的には電場・光による液晶組織構造の均一配向処理のための条件を探索する.この際,京都大学高西陽一准教授と共にSPring-8での時間分解放射光小角散乱測定により自己組織構造の解析を行った.得られた均一配向リオトロピック液晶場を用いて,今後,酸化ガドリニウム平盤ナノ粒子を“その場"合成することにより,有機無機ハイブリッド積層膜を作成する予定である.この際,リン脂質部位を有する側鎖型高分子液晶を用いて積層膜を構築することで,安定な有機無機ハイブリッド積層膜を調製する技術を確立することとしている.本申請課題では,脂質二分子膜,特にリン脂質に着目し,リン脂質部位をサーモトロピック液晶に有機合成的に導入することで,光・電場・温度などの外部刺激に対してアクティブな組織構造変化・応答性を示す人工リン脂質,すなわち“アクティブメンブレン"を創製することを目的としている.本年度は主に,電場・光応答性メソゲン部位を有するリン脂質を合成し,十分に精製したと共に,得られた外場応答性リン脂質から得られる“アクティブメンブレン"の自己組織構造を偏光顕微鏡観察,小角X線散乱,小角ほう砂光散乱法などを駆使して解析し,今後の有機無機ハイブリッド積層膜構築に向けた重要な知見を得ることができた.

一方で,合成した人工リン脂質は,希薄水溶液の状態で,ジャイアントベシクル構造を形成する事を新たに見出し,このような自己組織構造は,今後,有機無機ハイブリッドを調製する上で極めて有益な知見となった.平成24年度の研究遂行により見出した高温安定リオトロピックスメクチック液晶場を用いて平盤状無機ナノ粒子のその場析出を行うことで有機無機ハイブリッド多層積層膜の調製を検討する.この際,用いる無機ナノ粒子としては,X線吸収力が最大の酸化ガドリニウム(Gd2O3)に着目する.Gd2O3は常磁性を示すことからも興味深い材料である.原料として酢酸ガドリニウム等を用い,親水性リン脂質系リオトロピック液晶場において均一な液晶相を形成させるための条件を見出した後,高温加熱することで平盤状の形態として粒子析出させることで有機無機ハイブリッド多層積層膜を得るために条件探索を行う.申請者は既に特定のサーモトロピック液晶場を用いた場合に平盤状Gd2O3が得られることを見出しており,この知見を元に積層膜調製の実現を図る.一方で,光応答性メソゲン部位を有するリン脂質は,光照射により複雑な相転移を起こすことが見出された.形成される自己組織構造を,SPring-8における時間分解放射光測定により解析し,今後の有機無機ハイブリッド積層膜構築のための知見を得ることとする.本研究課題の基礎は有機合成による材料合成である.主な消耗品費はその合成のための有機合成反応剤購入費や精製費に充当する.物性評価には各サンプル数グラム程度の合成が必要である.通常のラボスケールでの有機合成としては比較的スケールが大きくなるため,有機合成反応剤購入費として平成25年度は20万円程度必要となると見込まれる.また,平成25年度は液晶場におけるナノ粒子合成を主に検討するため,その原料費として20万円を計上する.また,合成用ガラス器具購入費,各種分析装置セル購入費,電子顕微鏡用消耗品購入費として10万円計上する.また,本研究では,SPring-8での実験および英国University of SheffieldのGoran Ungar教授との打ち合わせ旅費として,30万円を計上する.
遺伝子変異動物を用いた心血管リモデリングの分子機構に関する多施設共同研究

我々は、血液を送り出すポンプあるいは血液を通すパイプと考えられていた心臓や血管が、種々の生理活性物質を生合成、分泌していることを明らかにし、心臓血管内分泌学という概念を打ち出した。すなわち、強力な血管平滑筋弛緩作用を有するナトリウム利尿ペプチドファミリーのうちANP、BNPは心臓から分泌され、一方CNPが血管内皮細胞から分泌されることを明らかにした。また、血管内皮から強力な血管平滑筋収縮作用を有するエンドセリンやアンジオテンシンIIが産生、分泌されることも明らかになった。また、我々はエンドセリン受容体に関し、血管平滑筋細胞に発現し、血管収縮に関与するETA受容体及び血管内皮細胞に発現し、血管弛緩に関与するETB受容体の双方の遺伝子構造の決定に成功した。また我々の研究協力者により、2種類存在する膜型グアニル酸シクラーゼそのものであるナトリウム利尿ペプチド受容体(GC-A及びGC-B)の構造決定がなされた。このように、我々はいち早く分子生物学的手法を導入し、心臓及び血管そのものから合成分泌される新しい血管作動性物質及びその受容体の同定とその作用機構を明らかにしてきた。近年心臓血管病変の病態生理は「心血管リモデリング」という新しい概念で理解されるようになってきた。本研究は、心血管リモデリングにおける血管作動性物質の意義に焦点を合わせ、分子生物学的手法及び発生工学的手法を駆使し、遺伝子変異動物(遺伝子過剰発現トランスジェニックマウス及び遺伝子欠損ノックアウトマウス)を作成する。更に、それら動物を交配し種々の条件下で解析することでin vivoの心血管リモデリングにおける心臓血管ホルモンの生理的意義を解明することをその目的とするものである。本研究課題によって以下の研究成果を得た。(1)本研究課題により、我々及び研究協力者によりBNPトランスジェニックマウス(Tg)、GC-Aノックアウトマウス(K/O)、AT1受容体、AT2受容体K/O、AT1受容体Tg、ET-A受容体、ET-B受容体K/Oに加えBNP及びCNP K/Oを作製した。(2)BNP K/Oにおいて心筋の著しい線維化が認められた。また、ANP、アンジオテンシン変換酵素(ACE)、TGF-β3、コラーゲンII遺伝子の発現亢進が認められた。(3)BNP K/Oに対しaorticbandingを施行し、心筋に対する圧負荷を行ったところ、BNP K/Oの心筋線維化は更に増強された。以上より、BNPが心臓局所ホルモンとして心筋の線維化に対して抑制的に作用していることが証明された。(4)テキサス大Garbersの開発したGC-A(ANP、BNPの受容体)K/Oは、血圧上昇及び心筋肥大を認める。GarbersよりGC-A K/Oの供与を受け、我々が既に保有しているBNPトランスジェニックマウス(Tg)と交配した。BNP-Tgにおいては、内軟骨骨化の活性化による骨格の伸長を認める。得られたBNP-Tg/GC-A K/Oにおいて血圧及び心筋肥大のフェノタイプは変化しなかったが、長管骨の伸長を認めた。この結果は、BNPが組織により異なった受容体を介して作用する可能性を示唆するものである。(5)BNP Tgを用いて、5/6腎摘による腎臓障害モデルを作成したところ、コントロールマウスに比べBNP Tgでは、TGF-βの発現の抑制に伴う糸球体硬化の抑制が認められ、BNPが腎保護的に作用することが明らかとなった。(6)CNP K/OはBNP Tgとは対照的に内軟骨骨化の障害、低身長を認め、更に早期死亡を認めた。(7)コラーゲンIIプロモーターにCNP遺伝子を連結し、これをトランスジーンとして骨特異的CNP過剰発現Tgを作成した(CNP-bone Tg)。CNP TgはBNP Tgと同様に長管骨の伸長を認め、CNP K/OはCNP-boneTgとの交配により正常の発育が得られ、早期死亡は認められなくなった。このCNP-boneTg/CNP K/Oを用い、現在心血管リモデリングにおけるCNPの意義を解析中である。

更に、それら動物を交配し種々の条件下で解析することでin vivoの心血管リモデリングにおける心臓血管ホルモンの生理的意義を解明することをその目的とするものである。本研究課題によって以下の研究成果を得た。(1)本研究課題により、我々及び研究協力者によりBNPトランスジェニックマウス(Tg)、GC-Aノックアウトマウス(K/O)、AT1受容体、AT2受容体K/O、AT1受容体Tg、ET-A受容体、ET-B受容体K/Oに加えBNP及びCNP K/Oを作製した。(2)BNP K/Oにおいて心筋の著しい線維化が認められた。また、ANP、アンジオテンシン変換酵素(ACE)、TGF-β3、コラーゲンII遺伝子の発現亢進が認められた。(3)BNP K/Oに対しaorticbandingを施行し、心筋に対する圧負荷を行ったところ、BNP K/Oの心筋線維化は更に増強された。以上より、BNPが心臓局所ホルモンとして心筋の線維化に対して抑制的に作用していることが証明された。(4)テキサス大Garbersの開発したGC-A(ANP、BNPの受容体)K/Oは、血圧上昇及び心筋肥大を認める。GarbersよりGC-A K/Oの供与を受け、我々が既に保有しているBNPトランスジェニックマウス(Tg)と交配した。BNP-Tgにおいては、内軟骨骨化の活性化による骨格の伸長を認める。得られたBNP-Tg/GC-A K/Oにおいて血圧及び心筋肥大のフェノタイプは変化しなかったが、長管骨の伸長を認めた。この結果は、BNPが組織により異なった受容体を介して作用する可能性を示唆するものである。(5)BNP Tgを用いて、5/6腎摘による腎臓障害モデルを作成したところ、コントロールマウスに比べBNP Tgでは、TGF-βの発現の抑制に伴う糸球体硬化の抑制が認められ、BNPが腎保護的に作用することが明らかとなった。(6)CNP K/OはBNP Tgとは対照的に内軟骨骨化の障害、低身長を認め、更に早期死亡を認めた。(7)コラーゲンIIプロモーターにCNP遺伝子を連結し、これをトランスジーンとして骨特異的CNP過剰発現Tgを作成した(CNP-bone Tg)。CNP TgはBNP Tgと同様に長管骨の伸長を認め、CNP K/OはCNP-boneTgとの交配により正常の発育が得られ、早期死亡は認められなくなった。このCNP-boneTg/CNP K/Oを用い、現在心血管リモデリングにおけるCNPの意義を解析中である。我々は、血液を送り出すポンプであり管と考えられていた心臓や血管が、種々の生理活性物質を生合成、分泌していることを明らかにし、心臓血管内分泌学という概念を打ち出した。すなわち、強力な血管平滑筋弛緩作用を有するナトリウム利尿ペプチドファミリーのうちANP、BNPは心臓から分泌され、一方CNPが血管内皮細胞から分泌されることを明らかにした。また、血管内皮から強力な血管平滑筋収縮作用を有するエンドセリンやアンジオテンシンIIが産生、分泌されることも明らかになった。また、我々はエンドセリン受容体に関し、血管平滑筋細胞に発現し、血管収縮に関与するETA受容体及び血管内皮細胞に発現し、血管弛緩に関与するETB受容体の双方の遺伝子構造の決定に成功した。
より臨床知見を反映した新しい統合失調症動物モデルの作製

統合失調症の発症仮説として注目されている発達段階における要因の複合化は、タンパク質発現変化を伴い、単独要因よりも行動障害を悪化させる。また、教育的に恵まれた環境を模した飼育は、エピジェネティック変化を伴い、要因による行動障害の発現を抑制する。このように要因の組合せにより、より臨床知見を反映した包括的な統合失調症モデルの構築をすることができた。精神疾患は、発達過程における環境要因(母体のウイルス感染などの物理化学的因子と養育環境などの心理社会的因子)と生得的に持っていた脆弱性因子(遺伝要因)が相互的に作用して発症に至ると考えられている。すなわち、周産期において遺伝要因を含めた何らかの原因による脳発達障害により精神障害に対する脆弱性が形成され、思春期以降における薬物摂取や社会的なストレスにより精神疾患を発症するもので、Two-hit仮説と呼ばれる。二本鎖RNAアナログのpolyriboinosinic acid-polyribocytidylic acid(Poly I:C)を新生児期のマウスに投与することで、発達期のウイルス感染が若年期に精神異常発現薬のフェンシクリジン(PCP)による情動・認知障害に脆弱性を与えるか検討を行った。PCP(10 mg/kg s.c.)の14日間連続投後に認められる運動過多、断崖回避試験における衝動性の亢進、社会性行動試験における社会性行動の低下および新奇物体認識試験における物体認識記憶の低下は7日間のPCP連続投与では認められなかった。しかし、新生仔期にPoly I:Cを投与しておくと、PCPの7日間連続投与後の各種精神機能行動は、PCPの14日間連続投与のそれらと同程度まで障害されていた。新生仔期にPoly I:C、若年期にPCPを投与した群の前頭前皮質において、グルタミン酸トランスポーター(GLAST)のタンパク発現の増強が認められ、前頭前皮質にその阻害剤(DL-TBOA)を投与すると、認知機能障害は緩解された。以上の結果から、新生仔期のPolyI:C処置は若年期でのPCP連続投与による行動異常を増強させたことから、新生仔期の免疫異常は若年期まで遷延し、精神異常発現薬に対して脆弱化させ、そのような行動障害は前頭前皮質におけるGLASTの過剰発現が関与していることが示唆された。臨床知見に基づく統合失調症動物モデルを作製し、統合失調症の発症機序の解明および、それに基づいた予防法および治療法の開発を目的とし、本年度は以下の成果を得ることができた。統合失調症の病態仮説にグルタミン酸仮説がある。グルタミン酸作動性神経系の主要な受容体であるNMDA受容体に対する拮抗薬であるフェンサイクリジンの慢性投与は統合失調症様の行動障害を惹き起す。そこで、フェンサイクリジンによる統合失調様の行動障害における遺伝要因の関与について、マウス間での系統差から検討した。ddY, C57BL6JおよびC57BL6N,ICRマウスの順に障害に対して脆弱であることを明らかにし、その変化にはNMDA受容体シグナルに関連していることを明らかにした。また、教育的に恵まれた環境下で成長すると統合失調症の発症が抑制されるかどうかについて、オブジェクトやトンネル等を配置した豊かな環境下での飼育はフェンサイクリジンによる統合失調様の行動障害の発現について検討した。豊かな環境下での飼育はフェンサイクリジンによる統合失調様の行動障害の発現を抑制すること、その効果はヒストンのアセチル化の亢進と関連していることを明らかにした。また、神経の発達障害が統合失調症を惹き起すという神経発達障害仮説が提唱されている。そこで、発達段階である胎生期におけるフェンサイクリジンの影響について検討した。胎生期のフェンサイクリジンの投与は前頭皮質のグルタミン酸作動性神経系の増殖を抑制するとともに成体期の学習障害を惹き起すことを明らかにした。本年度はフェンサイクリジンによる統合失調症様の行動障害における遺伝要因・環境要因の関与を明らかにするとともに、発達段階へのフェンサイクリジンの投与による神経発達障害仮説に基づいた動物モデルの作成に成功した。本申請の目標は臨床知見に基づく統合失調症動物モデルを作製し、統合失調症の発症機序の解明および、それに基づいた予防法および治療法の開発であり、その目標を達するために4つの課題のうち2つを達成した1.要因のモデル化ならびに単一要因の影響3.発症予防となる環境要因の影響1について、統合失調症様の行動障害を惹き起すフェンサイクリジンの投与によるマウス間の系統差を検討した。薬理学的統合失調症モデルであるフェンサイクリジン投与マウスとして汎用されている系統であるddYおよびICRマウス、遺伝子学的統合失調症モデルとして汎用されている系統であるC57BL6JおよびC57BL6Nマウスで比較した。本成果はフェンサイクリジン投与マウスにおける遺伝的要因を明らかにすると共に、薬理学的および遺伝子学的動物モデルを比較するにうえに重要な成果を達成することができた。また、発達段階である胎生期におけるフェンサイクリジンの影響について検討した。胎生期のフェンサイクリジンの投与は前頭皮質のグルタミン酸

作動性神経系の増殖を抑制するとともに成体期の学習障害を惹き起すことを明らかにし、フェンサイクリジンを用いた神経発達障害モデルを作成することを達成することができた。3について、教育的に恵まれた環境下で成長すると統合失調症の発症が抑制されるかどうかについて、オブジェクトやトンネル等を配置した豊かな環境下での飼育はフェンサイクリジンによる統合失調様の行動障害の発現について検討した。豊かな環境下での飼育はフェンサイクリジンによる統合失調様の行動障害の発現を抑制することから、統合失調症の発症予防として豊かな環境下での教育が環境要因として重要であることを明らかにすることができた。本申請の目標は臨床知見に基づく統合失調症動物モデルを作製し、統合失調症の発症機序の解明および、それに基づいた予防法および治療法の開発であり、その目標を達するために残り二つの課題を中心に行う。2. Two-hit仮説に基づく要因の複合化による発症・重篤化4.単一および複合的な遺伝要因・環境要因が与える周産期・思春期の遺伝子発現への影響2について、Two-hit仮説に基づき、周産期に遺伝要因・環境要因を負荷した動物に、思春期に環境要因をさらに負荷する事により、成体期における精神機能に異常が認められるか、もしくは単一の要因で認められた精神機能異常が重篤化するかどうかを明かにする。具体的には遺伝要因として変異DISC1遺伝子過剰発現マウスを用い、環境要因として冬季出産リスクを模した環境を胎生期に暴露、出産感染リスクをポリイノシトール-シトシンによる免疫応答を惹起、発症リスクである環境要因であるストレスを隔離飼育により再現する。4について、単一および複合的な遺伝要因・環境要因が与える周産期・思春期の遺伝子発現への影響について検討を行い、統合失調症に対する脆弱性・発症に関わるリスク遺伝子の同定、それを標的とした新規予防・治療薬の開発を行う。次年度は申請者が名古屋大学から名城大学に移動したため、名城大学にて培養システムを立ち上げるため、次年度へ繰越した研究費は倒立顕微鏡の購入に充てる。また、本年度はマウス、環境要因に負荷時に使用する装置・試薬、また遺伝子ならびにタンパク発現を解析する試薬の購入に研究費を主に使用する予定である。
2つの独立したプラズマ発生源による炭化水素系プラズマ中のラジカル反応制御

プラズマCVDでは混合気体を用いて生膜することが多いが、ガスの混合比によってプラズマ自体の状態が変化することが考えられる。本研究では、異種のモノマーガスを独立に励起した後に混合する方法(独立励起)を用いて有機薄膜を作製し、プラズマからの発光特性や生成膜のIRスペクトルに関してモノマーの混合ガスを励起して成膜する場合(混合励起)と比較した。装置は半球状のガラスベルジャーに2本の枝管部を持ち、それぞれにRF電力によるキャリアカス励起部を持つ。この励起部で生成したキャリアガスのフローイングアフターグロー中にモノマーガスをそれぞれ導入し、ベルジャー内で反応させて成膜を行った。混合励起の場合には、1本の枝管部を持つ半球状ガラスベルジャーを用いて、キャリアガスのアフターグロー中にモノマーガスの混合ガスを導入した。モノマーガスにはエチレンとアリルアミンを、キャリアガスにはアルゴンを用いた。ライトガイドによって半球状ガラスベルジャーの頂部から10mm下の部分を狙って採光し、発光分光分析を行った。生成膜の分析はKBr単結晶板上に膜を堆積させてFT-IRによって行った。発光分光分析によって測定したNHラジカルの発光強度をCHラジカルの発光強度で規格化した。この比を混合励起・独立励起のそれぞれについて求めた。また、それぞれの放電条件において生成した膜のFT-IRスペクトルを求め、3000cm^<-1>付近のC-H振動と、3300cm^<-1>付近のN-H振動の吸収ピークを比較した。その結果生成した膜中におけるC-H結合とN-H結合の量的な関係は発光分光分析におけるNHラジカルの発光とCHラジカルの発光の比と正の相関を有することが確かめられた。このことを利用して、膜中への窒素導入量をモニターすることが可能であると思われる。
新しい分子生物学的手法を用いたリンパ節転移診断の研究開発

頭頸部扁平上皮がんの頸部リンパ節転移診断においてOSNA法の有用性を検証し、臨床応用の可能性も踏まえて、研究を進めた。原発巣CK19染色陽性のリンパ節において、HE染色に対するOSNA法の感度は85.7%、特異度は100%、Fisherの直接法で、p<0.0001と有意であった。原発巣CK19陰性のリンパ節において、H.E.染色に対するOSNA分析の感度は50%、特異度は96.7%であった。本研究により、原発巣CK19免染陽性の症例では、頸部リンパ節の転移診断において、OSNA法が病理診断と同等な診断結果をもつ可能性があることが示された。リンパ節の採取が少なかったため、以前に採取したものを含め54個のリンパ節から病理組織用の検体とOSNA用の検体を作成し検討した。その結果、HE染色では、9個リンパ節に転移を認め、45個のリンパ節に転移は認めていなかった。また、OSNA法の結果は、CK19mRNAのコピー数が、131 copies/μl以上を転移陽性とした場合、8個のリンパ節が陽性であり46個のリンパ節が陰性であった。HE染色の病理診断に対するOSNA法の感度は78%、特異度は98%であった。病理用の検体に対し、CK19抗体による免疫染色を行った。リンパ節に関して、CK19の免疫染色の結果が陽性であったものが6個、陰性が48個であった。また、HE染色では、陽性が9個、陰性が45個であり、OSNA法では陽性が8個、陰性が46個であった。全体のリンパ節におけるCK19免疫染色の結果とOSNA法の結果を検討した。免疫染色が陽性であった6個のリンパ節は、OSNA法でもすべて陽性であった。同様に、免疫染色が陰性であった48個のリンパ節のうち、OSNA法が陽性であったのが2個で、陰性が46個であり免疫染色に対するOSNA法の感度は100%特異度は96%であり、これらは有意な関連を認めており、リンパ節においてCK19蛋白の発現とCK19mRNAの存在には、有意に関連がある結果であった。原発巣に対しても免疫染色を行い、CK19の免染が陽性が9例、陰性が12例であり、原発巣でCK19陽性率が42.9% (21例中9例のみ)と半数以下であった。評価方法として、免疫染色に関しては、原発巣、リンパ節とも乳がんでの評価方法であるJスコア法により全腫瘍細胞中1%以上染色された腫瘍細胞が存在すれば陽性とした。OSNA法は、以前に当教室の松塚が発表した報告に基づきmRNAのコピー数が131コピー/μl以上であった場合を転移陽性をした。リンパ節の免疫染色だけでなく、原発巣の免疫染色も行うことが可能であったためリンパ節の採取が少なかったため、以前に採取したものを含め54個のリンパ節から病理組織用の検体とOSNA用の検体を作成し検討した。免疫染色が陽性であった6個のリンパ節はOSNA法でもすべて陽性であった。同様に免疫染色が陰性であった48個のリンパ節のうちOSNA法が陽性であったのは2個で陰性が46個であり、免疫染色に対するOSNA法の感度は100%、特異度は96%でありこれらは有意な関連を認めており、リンパ節においてCK19蛋白の発現とCK19mRNAの存在には、有意な関連がある結果であった。原発巣に対しても免疫染色を行い、CK19の免染陽性が9例、陰性が12例であり、原発巣でCK19陽性率が42.9%と半数以下であった。原発巣CK19免染により54個のリンパ節を2群に分けたところ、原発巣CK19免染陽性群9例の22個のリンパ節において、HE染色に対するOSNA法の感度は85.7%、特異度は100%、p<0.0001と有意であった。原発巣CK19免染陰性群12例の32個のリンパ節において、HE染色に対するOSNA分析の感度は50%、特異度は96.7%であった。当初の予定していた検討項目の解析が順調にすすんでいるため本研究により、頭頸部扁平上皮癌において、原発巣のCK19免染陽性例では、頸部リンパ節の転移診断に関し、OSNA法が病理診断と同等な診断結果を持つ可能性があることが示された。更に我々は、血液中の腫瘍マーカー(CYFRA21ー1)と原発巣のCK19免染との関連を調査した。

その結果、原発巣のCK19免染,陰性例におけるCYFRA21ー1の平均値は1.87ng/ml,陽性例のおける平均値は1.6ng/mlであった。Fisher's直接法では、感度0%、特異度89%であり、有意な関連は認めていなかった。頭頸部扁平上皮がんの頸部リンパ節転移診断においてOSNA法の有用性を検証し、臨床応用の可能性も踏まえて、研究を進めた。原発巣CK19染色陽性のリンパ節において、HE染色に対するOSNA法の感度は85.7%、特異度は100%、Fisherの直接法で、p<0.0001と有意であった。原発巣CK19陰性のリンパ節において、H.E.染色に対するOSNA分析の感度は50%、特異度は96.7%であった。本研究により、原発巣CK19免染陽性の症例では、頸部リンパ節の転移診断において、OSNA法が病理診断と同等な診断結果をもつ可能性があることが示された。リンパ節の検体数が確保できており、その結果、病理学的な診断や、OSNA法による解析も順調に進んでいたため原発巣のCK19免疫染色の結果に基づいて、原発巣の免疫染色陽性例と免疫染色陰性例でのOSNA法のリンパ節転移診断への有用性に関して、得られたデータから検証していく。追加の検討項目として原発巣のCK19免疫染色の結果と患者の血清中のCYFRA21-1の値との関連を調べていく。耳鼻咽喉科学病理用の検体に対し、CK19抗体による免疫染色を行い、その診断結果とOSNA法との診断結果を比較する。免疫染色とOSNA法の診断結果が同等であった場合には、CK19がリンパ節の転移診断に有用である可能性が高いことが示唆される。さらに原発巣のCK19抗体による免疫染色をおこないCK19が頭頸部扁平上皮癌のリンパ節転移診断に最適な遺伝子となりうるかを検証する。当初の予定より、物品費やその他の経費が少なくして研究を進めていくことが可能であったため当初予定していたより物品費の経費が少なかったため当初の予定より、物品費や人件費が少なくして研究を進めることが可能であったため消耗品の補充や、積極的に学会発表や論文作成の費用にあてていく。データの解析や整理、積極的に学会に参加しさらなる研究テーマの探求のために使用する予定です。消耗品の補充や研究に協力していただける人員を積極的に雇うことを人件費にあてていく。
植物スフィンゴ脂質の分子機能解明と代謝改変技術の確立

植物は動物や菌類とは異なる独自のスフィンゴ脂質構造を有しており、それらは植物固有の機能を担っていることが推測される。本研究では、多様な植物スフィンゴ脂質分子種を網羅する理論ライブラリーを構築し、その全分子種を標的とした一斉定量分析システムを開発した。本技術を用いることで、植物細胞膜上のマイクロドメインの形成と特定のタンパク質の局在化において、植物特有のスフィンゴ脂質分子構造が重要な役割を果たすことを明らかにした。さらに分析技術のハイスループット性と網羅性を生かし、機能未知糖転移酵素変異体の中から、植物型スフィンゴ脂質糖鎖の多様性の根幹を形成する新規糖転移酵素を同定することに成功した。1.シロイヌナズナやタバコ等の双子葉植物に加え、イネやコムギ等の単子葉植物のスフィンゴ脂質分子構造を同定し、それらをLC-MS/MSにより一斉定量解析するスフィンゴリピドミクスの手法を確立した。これにより、イネ組織間のスフィンゴ脂質分子組成の多様性や、極長鎖脂肪酸合成異常によりシュート形成不全を示すonion変異体における脂質代謝変動を網羅的に捉えることに成功し、本手法の実用性を実証した(論文投稿中)。本手法の活用により、植物スフィンゴ脂質の多様性とその生物学的意義が明らかになることが期待できる。2.スフィンゴリピドミクス解析により、細胞死抑制因子Bax inhibitor-1が植物スフィンゴリピドームに及ぼす影響を明らかにした。さらにスフィンゴ脂質が集積する細胞膜マイクロドメインのプロテオーム解析を行い、ストレス誘導性細胞死において重要な役割を果たす新規因子を同定した。本成果はPlant Physiol誌に発表した。3.スフィンゴ脂質セラミド骨格および糖鎖構造を形成する代謝酵素群について、シロイヌナズナやイネを用いて欠損変異体、発現抑制体、過剰発現体等の作出を進めた。特に長鎖塩基不飽和構造を人為的に改変したシロイヌナズナおよびイネにおいて、酸性ストレスやアルミニウムストレス耐性の変化が示唆された。4.長鎖塩基不飽和化酵素をもたない出芽酵母を用いて、様々な植物種由来の不飽和化酵素や人為的にアミノ酸やドメイン構造を置換したキメラ型酵素の特性を簡便に解析する手法を確立した。さらに産物である不飽和型スフィンゴ脂質の生理学的解析として、アルミニウム耐性試験が有用であることを見出した。本実験系を用いることで、生理学的・生化学的機能を有するスフィンゴ脂質分子構造とその代謝酵素を迅速にスクリーニングすることが可能である。スフィンゴリピドミクス手法の確立は順調に進み、本手法を活用したイネスフィンゴ脂質の網羅的プロファイリングや微量膜脂質の定量など、これまでの手法では困難であった分析データを得ることができた。この成果は既に学術論文として1報を報告、さらに関連した3報が現在査読リバイズ中であり、手法の確立と活用、成果発表の点では当初の計画を大きく上回る進展となった。また代謝改変植物の作出や酵母発現系の構築は概ね計画通りに進行中であるが、年度後半にLC-MS/MS分析装置の不具合が長引いた影響により、予定していた代謝酵素改変植物や多様な単子葉植物群の大規模なスフィンゴリピドミクス解析を進めることができなかった。1.これまでに研究実績のあるシロイヌナズナやタバコ等の双子葉植物に加え、本研究ではスフィンゴ脂質構造が不明であったイネやコムギ等の単子葉植物において、スフィンゴ脂質分子構造を迅速に同定しLC-MS/MSにより一斉定量するスフィンゴリピドミクスの解析手法を確立した。これにより、イネ組織間のスフィンゴ脂質分子組成の多様性や、極長鎖脂肪酸合成異常によりシュート形成不全を示すonion変異体における脂質代謝変動を網羅的に捉えることに成功し、本手法の実用性を実証した。本成果はPlant J.誌に発表した(88, 681-693, 2016)。さらに脂質サンプル調製法や分析システムの改善をすすめ、従来の手法に比べ迅速・簡易かつ低コストな一連の実験手法を整備した。本手法の活用により、植物スフィンゴ脂質の多様性とその生物学的意義の解明が今後さらに加速することが期待できる。2.スフィンゴリピドミクスの活用により、これまで不明であった植物固有のスフィンゴ脂質特異的糖鎖構造を形成する一連の糖転移酵素ファミリーを初めて同定することに成功した。特にシロイヌナズナで主要なヘキソース特異的タイプと、イネで主要なN-アセチルヘキソサミン特異的タイプの2種の酵素機能の違いを発見し、これらの酵素遺伝子を利用することによりそれぞれの植物が有する特徴的なスフィンゴ脂質糖鎖構造を人為的に改変することに成功した。これまでにこれらの糖鎖構造が細胞壁との相互作用とその構造形成への寄与、さらに細胞膜機能として病原応答やストレス馴化に関与することを見出した。この成果は学術誌として一報を発表し、さらに続報を現在投稿準備中である(Fang et al. Plant Cell, in press)。今後の遺伝学的解析により植物スフィンゴ脂質糖鎖構造の生物学的機能の解明とその育種利用への展開がひらけることが期待される。

本技術を用いることで、植物細胞膜上のマイクロドメインの形成と特定のタンパク質の局在化において、植物特有のスフィンゴ脂質分子構造が重要な役割を果たすことを明らかにした。さらに分析技術のハイスループット性と網羅性を生かし、機能未知糖転移酵素変異体の中から、植物型スフィンゴ脂質糖鎖の多様性の根幹を形成する新規糖転移酵素を同定することに成功した。まずは計画から遅れているスフィンゴリピドミクス解析を早急に進める。特に初年度に作出を進めてきた代謝改変植物系統のスクリーニングを重点的に行い、成長評価やストレス耐性試験等の生理学的解析を進めるための系統確立を第一に遂行する。予備解析において、一部の系統では低pHやアルミニウムイオンなど、酸性土壌におけるストレス種へ応答性の変化が示唆されており、これらのストレス耐性を中心に解析を進める。また植物を用いた解析に加え、酵母発現系を用いた迅速な代謝改変・機能解析系を確立できたため、これにより植物型スフィンゴ脂質に特徴的な分子構造が形成される分子機構を解析し、生理活性をもつ脂質構造を効率よく産生させるための遺伝学的ストラテジーの提案やアミノ酸人工改変による高機能性酵素の開発を目指す。植物生理生化学年度後半にLC-MS/MS分析装置に原因不明の不具合が生じ、復旧に約5ヶ月要した。このため、予定していた大規模脂質分析や分析手法のさらなる改良等に用いるためのLC-MS/MS関連試薬類、ガラス器具及び消耗品については、大半が未購入である。また、形質転換植物の作出は順調に進んだものの、脂質分析によるスクリーニングが進まなかった関係で、予定していた物品費、謝金等の一部の使用を延期した。新年度に入りLC-MS/MS装置の不具合が解消し、分析可能な状態に復旧したため上述の延期していた研究に取り掛かる。これらは2年目の使用額として申請したものとは独立して必要な経費であり、それぞれの研究内容を並行しながら遂行する。
再生可能な天然由来水素源と水素の常温常圧水中での相互変換

化石燃料代替の方策として、再生可能な持続性資源を用いた小規模分散型電力供給網が期待されている。その燃料電池の燃料に用いられる高純度水素の貯蔵・供給源として、1つの触媒で可逆的に水素の貯蔵と発生を行うことが可能な有機金属錯体触媒系の開発を行った。水素貯蔵媒体としては、再生可能な天然由来の水素源を用い、その酸化体と還元体との可逆的変換に伴う水素化・脱水素化反応により、常温常圧水中で水素の貯蔵と発生を可能にした。触媒系は、水素化・脱水素化を担う遷移金属錯体と、光エネルギーにより電子伝達を促進する光増感剤、水素発生を担う金属錯体やナノ微粒子などで構成し、水素の活性化や脱水素化分子機構の解明を行った。分散型電力供給網の燃料電池の燃料に用いられる高純度水素の貯蔵・供給源として、1つの触媒で可逆的に水素の貯蔵と発生を行うことが可能な有機金属錯体触媒系の開発を行った。水素貯蔵媒体としては、再生可能な天然由来の水素源を用い、その酸化体と還元体との可逆的変換に伴う水素化・脱水素化反応により、常温常圧水中で水素の貯蔵と発生を可能にすることを目的とした。触媒系は、水素化・脱水素化を担う遷移金属錯体と、光エネルギーにより電子伝達を促進する光増感剤、水素の一時的貯蔵を担う金属錯体や金属ナノ微粒子、天然由来酸化還元補酵素などを単独、もしくは、組み合わせて構築した。常温常圧水中で、水素分子と反応することで金属ヒドリド種や低原子価金属種が生成可能な有機金属錯体の合成を行った。シクロペンタジエニル配位子を有する有機金属ハロゲン化物の水中脱ハロゲン化によりトリアクア錯体へと変換し、これと、別途合成した配位子(L)を水中で反応させて、各種有機金属単核アクア錯体を得た。Lとしては、ギ酸と水素の相互変換反応の触媒として機能した5員環ー6員環直結[C,N]シクロメタル化配位子を用いた。常温で水素分子により金属中心が還元される錯体を見い出し、その還元型錯体と天然由来補酵素が反応して還元型補酵素が生成することがわかった。pHに応じて中間体ヒドリド種がプロトンと反応すると水素が発生し、補酵素類縁体と反応した場合にはその還元体が生成することから、活性中間体の金属中心の還元状態とpHが反応性の鍵を握ることがわかった。得られた再生可能な天然由来の各種水素源(天然由来酸化還元補酵素)と酸素との反応を行い、酸素の選択的還元反応条件についても検討した。得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行った。触媒系は、水素化・脱水素化を担う遷移金属錯体と、光エネルギーにより電子伝達を促進する光増感剤、水素発生を担う金属錯体や金属ナノ微粒子などで構築した。常温で水素分子により金属中心が還元される錯体を見い出した。ギ酸と水素の相互変換反応では、pHに応じて中間体ヒドリド種がプロトンと反応すると水素が発生し、二酸化炭素(重炭酸イオン)と反応した場合にはギ酸が生成することから、活性中間体の金属中心の還元状態とpHが反応性の鍵を握ることがわかった。合成した各種アクア錯体と再生可能な天然由来の各種水素源(脂肪族アルコール類)との反応を行い、ヒドリド錯体や低原子価金属錯体の生成条件について検討した。

水素貯蔵媒体としては、再生可能な天然由来の水素源を用い、その酸化体と還元体との可逆的変換に伴う水素化・脱水素化反応により、常温常圧水中で水素の貯蔵と発生を可能にすることを目的とした。触媒系は、水素化・脱水素化を担う遷移金属錯体と、光エネルギーにより電子伝達を促進する光増感剤、水素発生を担う金属錯体や金属ナノ微粒子などで構築した。常温常圧水中で、水素分子と反応することで金属ヒドリド種や低原子価金属種が生成可能な有機金属錯体の合成を行った。シクロペンタジエニル配位子を有する有機金属ハロゲン化物の水中脱ハロゲン化によりトリアクア錯体へと変換し、これと、別途合成した配位子(L)を水中で反応させて、各種有機金属単核アクア錯体を得た。常温で水素分子により金属中心が還元される錯体を見い出し、その還元型錯体と天然由来補酵素が反応して還元型補酵素が生成することがわかった。pHに応じて中間体ヒドリド種がプロトンと反応すると水素が発生し、補酵素類縁体と反応した場合にはその還元体が生成することから、反応経路は錯体の金属中心の還元状態とpHが鍵を握ることがわかった。得られた再生可能な天然由来の各種水素源(天然由来酸化還元補酵素)により、酸素の選択的還元を試みた。再生可能な天然由来の水素源(ギ酸)と酸素との反応において、ギ酸をによる酸素の選択的還元反応にも成功した。ギ酸は腐食性であるため、その除去方法としても有効である。また、常温常圧において固体状で安定な水素キャリアーとしてパラホルムアルデヒドが有望視されているが、本研究では、常温常圧水中で水素を効率よく発生させる手法を初めて見いだした。得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行った。錯体化学、光化学、光機能材料これまでに、常温で水素分子により二酸化炭素分子を還元し、再生可能な天然由来水素源であるギ酸として、触媒的に二酸化炭素固定を行い、逆にギ酸を分解して水素を取り出すことが可能となる金属錯体触媒系を構築した。また、他の再生可能な天然由来の水素源として新たに過酸化水素に着目し、有機金属錯体と天然の酸化還元補酵素であるフラビンを触媒として組み合わせて用いて、Angew. Chem. (2013) (Impact Factor 13.46)に報告した。この成果は国際的にも認知され、選出されて本誌の表紙を飾るに至った。本研究を推進する途上で、水の酸化触媒共存下、太陽光で水を光分解して得た電子で酸素を還元して過酸化水素を選択的に得る触媒反応系を見出した。Energy Environ. Sci. (2013) (Impact Factor 9.61)に発表すると同時にJSTによる国際特許の各国移行の支援も取り付けた。この研究の独自性は、分子触媒系を組み合わせて用いる全く新しいコンセプトの人工光合成光触媒系にあり、今後、より高効率触媒系を開発する際の指針となり、特筆すべき成果である。常温で水素分子により二酸化炭素分子を還元し、再生可能な天然由来水素源であるギ酸として、触媒的に二酸化炭素固定を行い、逆にギ酸を分解して水素を取り出すことが可能となる金属錯体触媒系を構築し、本研究の主目的の1つを既に達成してEnergy & Environmental Science (2012), 5, 7360 (Impact Factor 9.61)に報告できた。また、他の再生可能な天然由来の水素源と水素との相互変換については、天然由来の脂肪族アルコールを水素源として有機金属アクア錯体を還元してヒドリド錯体に変換できることを見出し、pHを変化させるだけで温和な条件で水素を取り出せることを見出してJournal of the American Chemical Society (2012), 134, 9417 (Impact Factor 9.91)に報告した。
大腸癌術後に前向きに経過観察された大腸腺腫の発生・増大に関わる遺伝子異常の検索

大腸癌術後患者の術後サーベイランス内視鏡において、、6mm以下の大腸ポリープ500病変が軽・中等度異型腺腫と内視鏡診断され、経過観察された。このうち412病変で内視鏡が実施され、腫瘍径・形態の経時的変化が評価された。腫瘍径の変化は、不変71%、増大15%、縮小3%、再発見不可11%であり、明らかな形態を示したものもほとんどなかった。1997年4月以降、大腸癌術後患者を対象に実施している大腸内視鏡患者において、発見された5mm以下の大腸ポリープのうち経過観察が可能と判断されたものに対して、引き続き経過観察を行った。この際、全ポリープにおいてメジャー鉗子でポリープ径を計測し、拡大観察を行うことにより、腺腫であることを確認した。腺腫ではなく、非腫瘍性ポリープと判断されたものは、切除した。癌化例は一例も認められなかった。経過観察された腺腫のうち腫瘍径が7mm以上に増大したものが1病変あり、これは内視鏡的に切除を行った。腫瘍径の変化がない腺腫のうち、患者の希望により内視鏡切除を行った腺腫が6病変あった。以上の7病変は、全患者から遺伝子学的検索に関する研究協力承諾書をいただき、現在、凍結保存中である。以上の行程は、冨樫一智が中心となって実施した。最終的には、"増大した腺腫"と"腫瘍径に変化のない腺腫"からmRNAを取り出し、マイクロアレイ法により比較検討することを目的としているが、本年度は、癌を有しない8例の患者において正常粘膜の生検標本を採取し、このような微細な検体からmRNAが抽出できることの確認作業を行った。以上は、高田理が中心となって実施した。1997年4月以降、大腸癌術後患者を対象に実施している大腸内視鏡患者において、発見された6mm以下の大腸ポリープのうち経過観察が可能と判断された500病変があり、367病変で再度内視鏡検査が実施された。現在までに平均3.6±2.2年の観察期間中に3.6±1.6回の大腸内視鏡検査が実施された。ポリープ径の変化は、不変294病変、縮小12病変、増大61病変であった。増大の程度は、2mm:35病変、3mm:16病変、4mm:5病変、5mm:3病変、6mm:1病変、11mm:1病変であり、11mm増大した病変は身体的事情により7年8ヶ月の間、大腸内視鏡検査が実施できなかった例であった。この病変は、内視鏡的に切除され、病理組織学的には中等度異型腺腫であることが確認されている。増大したポリープ61病変のうち内視鏡治療が行われた病変は36病変あったが、病理組織学的には軽・中等度異型腺腫32病変、過形成性ポリープ4病変であった。今年度は、経過観察された腺腫7病変あった。この7病変を含めて14病変において、全患者から遺伝子学的検索に関する研究協力承諾書をいただき、現在、凍結保存中である。以上の行程は、冨樫一智が中心となって実施し、この研究成果は平成19年度の米国大腸直腸外科学会(ASCRS)において口演発表が予定されている。"増大した腺腫"と"腫瘍径に変化のない腺腫"からmRNAを取り出し、マイクロアレイ法により比較検討することを目的としているが、本年度は、14病変からmRNAを抽出した。この検索は、現在遂行中である、以上は、本年度から宮倉安幸が中心となって実施した。これまでに経過観察が可能と判断された6mm以下の大腸ポリープ500病変があり,このうち412病変で再度内視鏡検査が実施された。ポリープ径の変化は,不変71%,増大15%,縮小3%,再発見不可11%であった。しかし,癌化例は一例も認められなかった。上記の臨床データは,平成19年6月にセントルイスで開催された米国大腸直腸外科学会(ASCRS)において冨樫一智が口演発表を行い,同時に,Diseases of the Colon&Rectum誌(impact factor2,442)の52巻2号において発表した。この研究の意義は,拡大内視鏡観察により選別された多くの大腸腺腫が増大し癌化のpotentialを有するわけではないことを実証したことにあり,小ポリープの取扱い方針に一石を投じたものと考えられる。遺伝子異常の検討については,これまでに採取した14病変に新たに採取した4病変加えた18病変において,検体を採取し,現在,凍結保存中である。最終的に,"増大した腺腫"と"腫瘍径に変化のない腺腫"からmRNAを取り出し,マイクロアレイ法により比較検討することを目的としているが,現在,予備実験の段階にある。

以上に加えて,経過観察後に切除されたポリープのブロック標本を用いて,病理学的異型度の再評価・MIB-1による増殖能の評価に着手した。さらに,"増大した腺腫"と"腫瘍径に変化のない腺腫"を内視鏡的特徴から鑑別する目的に,ピットパターンを含めた内視鏡所見についても検討を開始した。大腸癌術後のサーベーランス大腸内視鏡検査で経過観察が可能と判断された6mm以下の大腸ポリープ500病変を研究対象として、本研究は開始された。このうち、412病変で再度の大腸内視鏡検査が実施された。ポリープ径の変化については、不変71%、増大15%、縮小3%、再発見不可11%であった。この臨床データの詳細については、昨年度にDiseases of the Colon&Rectum誌において発表した。遺伝子異常の検討については、これまでに採取した18病変においてマイクロアレイ法により比較検討することを試みてきた。しかしながら、mRNAを抽出することが技術的に困難であり、内外の研究者にコンサルトするなどを行ってきたが、マイクロアレイ法による比較検討は断念せざるを得なかった。このため、本年度は昨年度から引き続いて、経過観察後に切除されたポリープのブロック標本を用いて、病理学的異型度の再評価・MIB-1による増殖能の評価を行った。しかし、残念ながら、公表すべき目立った研究成果は得られていない。さらに、“増大した腺腫"と“腫瘍径に変化のない腺腫"を内視鏡的特徴から鑑別する目的に、ピットパターンを含めた内視鏡所見について検討を行ってきたが、現在進行中であり、これも目立った成果が得られていない状況である。本年度で科学研究費補助金を得ての本研究は終了となるが、これまでの研究成果・経験を土台にして、今後も本研究を継続していく予定である。
MHC結合性ペプチドモチーフを応用した自己免疫病の解析

本研究はMHC-ペプチド親和性をより迅速、簡便、かつ正確に決定する方法の開発し、これを用いてHLA-DR9分子に結合ペプチドの構造モチーフを同定し、β2-Glycoprotein I(β2-GPI)蛋白中にT細胞エピトープを推定することを目的とした。そのためにまず、15アミノ酸残基のランダムペチドを発現するファージ(fUSE5)ライブラリーの中から、精製DR9分子に結合性の高いファージ粒子を選択し、そのインサートのアミノ酸配列を同定した。そのペプチド上の各アミノ酸残基を一箇所置換したアナログペプチドとDR9分子との結合性を定量し、DR9分子に結合するために重要なペプチド上の残基(アンカー)の位置を決定した。さらにELISA法を応用して、精度や簡便さにおいて従来のアッセイ法に勝る方法を樹立し、これを用いて各アンカーに許容されるアミノ酸残基(モチーフ)を決定した。同定されたDR9結合モチーフはTrpxxSer(xは任意のペプチド)であり、第1アンカーにはTrpの他に、Tyr,Met,Phe,Ile,Leu,Valなどの疎水性アミノ酸残基とCysが、第2アンカーには、Serの他にThr,Gly,Ala,Val,Ile,Pheなどの弱い疎水性または中性親水性のアミノ酸残基とHisが許容された。1)第1アンカーにCysが許容される点、2)第2アンカーにSerのような小型中性アミノ酸残基が許容される点、3)第3、4、5アンカーにアミノ酸残基の制約がない点において、DR9結合モチーフは他のDR結合モチーフと異なっていた。さらに、1)に対応して、Cys残基が豊富なβ2-GPI蛋白中には、41箇所ものDR9結合モチーフを有するアミノ酸配列が存在することを明らかにした。今後、DR9結合モチーフを有するβ2-GPI合成ペプチドに自己反応性を示すT細胞が患者の末梢血中に存在するか否かを検討することは重要な課題である。