hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜血管新生におけるSIRT1の役割の解明及びSIRT1活性化経路の解析

Mrp4KOマウス及びコントロールマウス(野生型)に対してOIR負荷を行い、生後28日時点での網膜血管構造変化について解析を行った。野生型の網膜展開標本では、OIRモデルで生後17日目に確認された血管異常は改善され、通常の網膜血管構造を認めた。一方、Mrp4KOマウスにおいては、病的新生血管の退縮を認めたが網膜展開標本の後極側における血管構造の回復遅延が示唆された。さらに数を増やす必要があるが、生理的な血管形成についてMRP4が促進的な作用を有する可能性が推測された。また以前に我々はcAMP負荷によりMrp4KOマウスではペリサイトが脱落することを報告しており、本研究についてもペリサイトの評価を合わせて行う予定である。以上の結果をもって論文投稿予定としている。本研究ではcAMPを介するSIRT1活性化の解析と、病的血管新生と加齢変化におけるSIRT1及びcAMP輸送体であるMRP4の機能解析を行うことを目的とした。まずin vitro実験においてcAMPの上昇に伴いSIRT1が上昇することが示された。さらにMrp4ノックアウト(KO)マウスの高酸素負荷モデルを用いたところ、P17のKOマウスにおいて病的新生血管や虚血はより重症であった。P28でもKOマウスの血管形成は正常化に至っていない印象であった。一方、加齢に伴う網膜組織の変化は少ないものと考えられた。Mrp4はcAMPやSIRT1を介して血管新生において重要な役割を担う可能性が示唆された。購入したHRECの継代が順調にすすまないトラブルを抱え、初年度の実験計画に遅れが生じた。一方、マウスOIRモデルを用いた実験が初年度に始めることができており、2年目に計画していたin vivo実験は前倒しで進んでいる。ヒト網膜血管内皮細胞(HREC)を用いたin vitro実験においてcAMPとSIRT1の関連及びも膜血管新生に与える影響をより詳細に明らかにするため、HRECに対しレスべラトロール投与や、SIRT1ノックダウン誘導を行い、血管新生に係わる特性の評価やcAMPを介するSIRT1活性化経路の解析を行う。さらに現段階でMrp4KOマウスを用いたin vivo実験がすすんでおり、FSK投与や酸素負荷、加齢性変化などに対するSirt1の発現を確認し、レスベラトロールの投与時のSirt1発現変化や表現型変化を観察する。眼科学まずはHRECを用いたin vivo実験にて、cAMPを介するSIRT1活性化経路の解析を進めていく。一方で、本年に予定していたC57BL6/Jマウスの病的新生血管モデルを用いたSirt1の解析実験の準備は整っており、可能な限り同時並行ですすめていく予定である。in vivo実験及びin vitro実験の遂行において一部当初の計画から異なったため、本年度の研究経費に未使用分が生じた。既述の理由により研究計画の遅れが生じたため、本年度の研究経費に未使用分が生じた。研究費は主に動物の飼育料、免疫染色用抗体、リアルタイムPCR用プローブ・プライマーなどの実験試薬に使用する。また、研究成果発表のための学会旅費、論文投稿料などにも使用する計画である。。
グラフト共重合体の界面での配向の制御による分離機能設計

グラフト共重合体、櫛型ポリマ-などのマクロ、あるいは、ミクロな界面でのポリマ-の制御された配向を利用して、より高性能な分離機能材料を開発する原理を確立することを目的とした。マクロな界面を形成するブレンド膜では、表面修飾膜として、その界面を利用するのが有効であり、透過性、透過選択性の両立が可能であることを示した。このような界面でのグラフト共重合体の挙動に基本的な検討を加えるために、両親媒性グラフト共重合体の気-水界面での展開挙動を検討した。親水性の幹をもち、ポリスチレンやポリジメチルシロキサンを枝とするグラフト共重合体は、枝をコイル状として(ポリスチレン)、あるいは、水面上に広げて(ポリジメチルシロキサン)界面に存在していることがわかった。ポリマ-主鎖の軟さ、疎水性などが水面上での展開挙動、ひいては、界面での挙動を支配しているという知見を得た。一方、マクロには、相分離していないと考えられる。櫛型ポリマ-でも、ミクロナな意味では、主鎖側鎖の界面などが存在すると考えられる。このような系では、主鎖-側鎖間の相互作用が重要である。固体NMRの飽和より、この点について検討した。気体透過係数と、ピ-クの半値幅との間の定量的関係を確立することができた。気体の透過係数は、従来から言われていたポリマ-のガラス転移温度とは、必ずしも対応つけられるのではなく、特にガラス転移温度の低いポリマ-では、主鎖、側鎖セグメントの運動性が重要な因子であることを明確にすることができた。いずれにしても、これらの値は、ポリマ-のフリ-ボリュ-ムと密接に関連しており、ガラス転移温度炉を考慮した。動的な意味でのフリ-ボリュ-ムの定量化が必要であり、今後の検討課題である。なお購入した液体クロマトグラフは、ポリマ-の同定に有効に使用している。
相対論的効果を考慮した核磁気共鳴スペクトルパラメーターの理論計算

Dirac方程式の解である1電子波動関数は、4行1列の列ベクトルの形をもち、4成分スピノールと呼ばれる。上の2成分を大成分、下の2成分を小成分と呼ぶ。小成分を大成分と演算子を用いて消去して方程式を解く方法を2成分法、4成分を同時に求める解き方を4成分法という。本研究では両方の方法でDirac方程式を解き、NMRパラメーターの相対論的効果を計算した。NMRは、ある特定の原子核の共鳴線の位置(化学シフト)と分裂状態(スピン結合)を調べることによって、その原子核のまわりの電子構造を解明する分光装置である。今日、NMRの応用は、多岐にわたっており、使用される原子核も、従来の^1H,^<13>C核の他に、種々の核種におよんでいる。しかし、とくに重い原子核を含む系では、実験スペクトルのみで化学シフトやスピン結合定数などのNMR定数を決定することは容易ではない。このような系では、類似した化合物でもNMR定数が大きく異なっており、経験則が適用できないからである。そこで、NMR定数を量子力学に基づいて正確に計算し、測定したスペクトルと比較することが必要となる。原子番号が30以上の重い原子を含む分子では、化学シフトやスピン結合定数に相対論的効果が現れる。そこで、相対論的効果を含んだN定数の量子化学計算を行うことが必要になる。本研究の目的は、NMR定数の相対論的効果を計算することである。Dirac方程式の解である1電子波動関数は、4つの成分をもち、4成分スピノールと呼ばれる。4つの成分のうち、最初の2成分を大成分、残りの2成分を小成分という。小成分を求めるためには、大成分を求める場合と比較して、約2倍の展開関数(基底関数という)を必要とし、計算は容易ではない。そこで、本研究では、小成分を何らかの方法によって消去し、あらわには大成分のみを求める2成分スピノール方程式を用いて、NMRの磁気遮蔽テンソルの計算を行った。重原子を含む分子のNMR遮蔽テンソルには、相対論的効果の寄与が大きいことが知られている。Dirac方程式を2成分方程式に書き換える方法には、大きく分けて、次の2通りの方法がある。1.Dirac方程式をユニタリ変換して、1電子波動関数が大成分か小成分のいずれか一方の成分のみをもつようにする。これをデカップリングと呼んでいる。光の速度が無限大になった極限では、Dirac方程式はSchrodinger方程式になり、1電子波動関数は大成分のみをもつようになる。そこで、1電子波動関数が大成分のみをもつような2成分方程式(電子方程式という)を求める。2.小成分を(演算子)×(大成分)の形で表すことによって、小成分を消去する方法で、小成分消去法と呼ばれる。本研究では、2.の小成分消去法に基づき、3編の論文をアメリカ物理学雑誌J.Chem.Phys.に発表した。1番目の論文は、新しい小成分消去法の提案である。2番目と3番目の論文はその改良であり、とくに2番目の論文では、従来考慮されていなかった2電子間スピン軌道相互作用を理論に加えて磁気遮蔽テンソルの計算を行った。現在、1.のユニタリ変換の方法に基づいた論文1編をJ.Chem.Physに投稿中である。この論文では、従来の不完全なデカップリングを完全なデカップリングにするよう理論の改良を行った。そこで、本研究では、小成分を何らかの方法によって消去し、あらわには大成分のみを求める2成分方程式を用いて、NMRの核磁気遮蔽テンソルの計算を行った。1.Dirac方程式をユニタリ変換して、1電子波動関数が大成分か小成分のいずれか一方のみをもつようにする。非相対論的極限では、大成分はSchrodinger方程式の解になるので、大成分方程式のみが必要になる。2.小成分を(演算子)×(大成分)の形で表すことによって小成分を消去する方法で、小成分消去法(NESC法)と呼ばれる。本研究では、1及び2の方法に基づき、2編の論文をアメリカ物理学雑誌J.Chem.Phys.に発表した。1番目の論文は、新しいNESC法の提案であり、2番目の論文は、ユニタリ変換の方法(DKH法)に基づいた新しい理論の提案である。

小成分を求めるためには、大成分を求める場合と比較して、より複雑な計算を必要とする。そこで、本研究では、小成分を消去し、大成分のみを求める2成分方程式を用いて、NMRの核磁気遮蔽テンソルの計算を行った。重原子を含む分子のNMR遮蔽テンソルには、相対論的効果の寄与が大きいことが知られている。本研究では、小成分を(演算子)×(大成分)の形で表すことによって小成分を消去する小成分消去法(NESC法))を用いた。通常のc^<-4>オーダー(cは光の速度)の相対論的効果を無視する方法では、計算値は不十分なものとなった。そこで、c^<-4>のオーダーの相対論的効果を加えたところ、発散的な項が現れ、計算値は非現実的な値となった。原子核を点電荷ではなく広がりをもった有限核と考えて、c^<-4>オーダーの相対論的効果を含めた計算を行ったところ、計算値は著しく改善された。結果はアメリカ物理学会誌J. Chem. Phys.に掲載された。Dirac方程式の解である1電子波動関数は、4つの成分をもち、4成分スビフールと呼ばれる。4つの成分のうち、最初の2成分を大成分、残りの2成分を小成分という。小成分を求めるためには、大成分を求める場合と比較して、より多くの基底関数が必要であり、計算は困難である。そこで、2008年度までは、小成分を消去して大成分のみをおめる2成分法を用いて、NMRの核磁気遮蔽テンソルの計算を行ってきた。即ち、小成分を(演算子)×(大成分)の形で表すことによって小成分を消去する小成分消去法(NESC法)を用いて計算を行ってきた。このとき、c^<-4>のオーダー(cは光の速度)の相対論的効果を無視する通常の計算方法では、計算値は小さくなり過ぎ、はなはだ不十分な結果となった。そこで、c^<-4>のオーダーの相対論的効果を摂動論的に加えたところ、発散的な項が現れて計算値は大きくなり過ぎ、非現実的な値となった。原子核を点電荷ではなく広がりをもった有限核と考えて、c^<-4>オーダーの相対論的効果を含めた計算を行ったところ、計算値は著しく改善されたが、計算値にはなお発散的傾向が残った。そこで、2009年度は、4成分を独立に計算する4成分法を用いて計算を行った。その際、NMRの核磁気遮蔽テンソルを計算するためには、通常のkinetic balance (KB)法では不十分なので、小成分を展開する基底関数に磁場効果を含めるmagnetic balance (MB)法を用いて計算を行った。その結果、よい計算値が得られた。結果はBull.Chem.Soc.Japanの本年6月号に掲載される予定である。
葉緑体リボソームの蛋白質構成と光環境への応答

【目的】オオムギのプラスチドリボソームの構造、とりわけその蛋白質構成を調べるとともにそれらリボソーム蛋白質が光環境に応答してどのように変化するかを調べた。【結果】(A)プラスチドリボソームの蛋白質構成単離した無傷プラスチドのストロマ画分をショ糖密度勾配遠心にかけ、70S画分から粗リボソームを調製し、これにより50Sと30Sサブユニットを単離し、その蛋白質構成を調べた。その結果、30Sサブユニットと50Sサブユニットにはそれぞれ23,36種の蛋白質が同定された。このなかには15種の中性酸性蛋白質が含まれており、大腸菌の6種と比べきわだって多かった。また、14種のリボソーム蛋白質のN末アミノ酸配列を調べたところ、そのなかの5種はプラスチド特異的リボソーム蛋白質であった。また、最も酸性を示すリボソーム蛋白質のcDNAを単離し、蛋白質の全アミノ酸配列を調べたところ、大腸菌のL31と相同な蛋白質であった。しかし、プラスチドリボソーム蛋白質の場合、C末に酸性アミノ酸を多く持っており、特徴的な構造をしていた。(B)光に応答するリボソーム蛋白質の検索緑化プラスチドよりリボソームを単離し、その蛋白質構成を比較した。その結果、弱酸性領域に光によって誘導されるリボソーム蛋白質がひとつ見い出された。この蛋白質のN末アミノ酸配列を調べたところ、データーベース中には相同する蛋白質は見つからなかった。
Wnt/sFRPファミリー制御機構を組み込んだ新規骨再生医療の開発

近年、Wntシグナルが間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を調節していることが明らかになってきた。研究者らはこの点に着目し、WntのアンタアゴニストであるsFRP-3(secreted Frizzled Related Protein-3)の骨芽細胞分化に与える影響をin vitroおよびin vivoで検討し、sFRP-3添加が早期の骨芽細胞分化を誘導し、かつ動物実験では早期の骨形成能を示すことを明らかにした。このことはsFRP-3を利用した新規骨再生医療の可能性を示唆する結果となった。本研究では骨再生医療の効率化を達成するためにWnt/sFRPファミリーに着目した。すなわち間葉系幹細胞の細胞増殖過程および骨分化過程においてWntシグナルを調節することにより、増殖速度を速め、骨分化を効率的に行おうとするもので、患者のQOL向上に大きく寄与する医療となりえる。まずWntシグナルを賦活し細胞増殖能を高めることを検討した。リチウムイオンはWnt賦活因子の一つであるが、骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)の増殖能を高め、BrdU陽性細胞数を増加させた。逆にWnt阻害因子sFRP-3を加えて培養したところMSCsの増殖能は低下した。またリチウムを添加して培養したMSCsは骨分化誘導培地にて問題なく骨分化を行うことが示された。つぎに骨分化過程においてsFRP-3を添加してMSCsを培養したところ骨分化誘導7、14日目においてアリザリンレッドに染色性を示す石灰化物が非添加群にくらべ増大した。RT-PCRにおいてもI型コラーゲン、アルカリフォスファターゼ、Runx2などの発現が亢進し、定量的リアルタイムRT-PCRにてもアルカリフォスファターゼの有意な上昇を認めた。以上のことよりMS Csの増殖過程にWntシグナルを賦活し、骨分化誘導時に阻害することにより、より効率的に細胞を増殖させ、骨芽細胞様細胞へ分化させる培養システムが構築された。また乳歯および永久歯歯髄幹細胞とMSCsの比較を行った。MS Csに比べBrdU陽性細胞数が多く、かつ骨分化誘導能を有することよりMSCsに代わる新たな細胞源として有用であることも分かった。乳歯歯髄幹細胞ではMSCsでは発現していないいWnt3などのいくつかのWnt関連遺伝子の発現が亢進していることがRT-PCRにより明らかになった。このことは高い細胞増殖能を得るためにWnt3遺伝子などの遺伝子が関連している可能性を示唆するものであった。本研究ではヒト間葉系幹細胞(hMSC)の骨分化過程におけるWntシグナルおよびその阻害剤であるsFRP-3に着目し、hMSCの培養過程においてsFRP-3を用いて骨分化誘導を行った場合、早期の骨再生が可能となり、その結果増殖因子を用いることなく効率的な骨再生医療が可能になると考え実験を行った。まず、hMSCの培養過程においてsFRP-3を添加し骨分化誘導を行った場合、非添加群に比べ、分化誘導開始7日目において石灰化の亢進を認め、さらにリアルタイムRT-PCRを用いて骨形成関連遺伝子の発現の検討においてもアルカリフォスファターゼ、1型コラーゲン、オステオカルシン、Runx2の発現の上昇を認めた。さらにラット頭蓋骨骨欠損モデルへの移植実験において移植後にμCTおよび組織学的評価を行ったところ、移植後2週という早期より非添加群に比べsFRP-3添加群における骨造成量の上昇を認め、組織学的にも新生骨の造成が確認された。これらの結果は現在臨床応用が進められているヒトMSCを用いた骨再生医療において、従来考慮されていなかったWntシグナルの作用を利用することにより、より早期かつ効果的に骨分化誘導を行うことが可能であることを示唆するものである。このことは細胞培養にまつわる時間およびコストの軽減にもつながる可能性があり、さらに増殖因子などを利用せずして短時間でより良質な骨再生を実現しうる可能性を示した点で、本研究は一定の成果を得たものと考える。
増幅DNAを用いた残存白血病細胞検出の基礎的研究

小児急性リンパ性白血症のうち細胞形態、細胞表面マ-カ-、染色体検査がなされ、経時的にDNAの抽出が行なわれている15症例を対象とした。初診時のDNAについて免疫グルブリン遺伝子(JH,Cκ,Cλ)とT細胞レセプタ-遺伝子(TCRα,TCRβ,TCRγ)の再構成をサザンブロット法で検討した。表面抗原検査よりB細胞起源の症例はすべて免疫グロブリン遺伝子の再構成が認められたため、個々の症例について免疫グロブリン重鎖の可変領域(V_H)と結合領域(J_H)のDNAをプライマ-として白血病細胞特異的CDRIII遺伝子のDNA塩基配列の決定を試みた。しかし、PCRを用いた白血病細胞特異的CDRIII遺伝子の塩基配列の決定はPCRの感度によるものか、かなりの夾雑物のために1例のみCDRIIIの塩基配列が決定出来た。本症例において初診時より保存されたDNAを用いたPCR法での残存白血病細胞の有無を1年の経過で検討した。形態学的、染色体検査では完全寛解を維持しているものの、PCRでは絶えず陽性を示していた。本方法の有用性については今後の臨床的経過との関係を詳細に検討しなければならないが,個々の症例におけるCDRIIIの申基配列の困難さはB細胞系ALLの残存白血病細胞の検出には限界があるものと思われた。一方、T細胞起源のALL6例ではT細胞レセプタ-遺伝子の再構成が5例で認められた。近年、TーALLよりtalー1遺伝子がクロ-ニングされ、小児TーALLでは約25%に再構成がみられる。talー1遺伝子の塩基配列は決定されているので、これをもとにプライマ-の作製を行なった。我々のTーALL症例でもtalー1遺伝子の再構成の認められる症例ではこのプライマ-を用いてPCR法での残存白血病細胞の検出が可能と考え、現在あわせて検討を継続している。
妊娠中毒症の病態成立機序とその発症予知に関する免疫学的研究

我々は,妊娠維持免疫反応発動に重要な役割を演じていると期待されているHLA-G抗原と妊娠中毒症発症機序の関連性を中心に研究を進めた。第一に、妊娠中毒症において認められるHLA-G発現異常が、はたして妊娠初期からすでに起こっているか検討するために、水溶性HLA-Gタンパクを測定するためのenzyme linked immunosorbentassay (ELISA)を確立した。第二に、妊娠中毒症患者の胎盤で報告されている異常なIL-2の発現とHLA-G発現の低下について、HLA-G発現が低下しているとIL-2で賦活化された脱落膜リンパ球の作用で絨毛細胞の増殖が低下し、胎盤形成が障害されて妊娠中毒症が発生する可能性を示した。第三に,末梢血中のリンパ球は膜結合型HLA-Gを認識すると、Th1サイトカインの分泌を減少させTh2サイトカインの分泌を増加させるが、脱落膜中のリンパ球は、Th1サイトカインの分泌を減少させるもののTh2サイトカインの分泌は変化させないことを示した。第四に,妊娠中毒症同様,妊娠維持免疫反応の異常が原因として重要と考えられている習慣流産に対し,HLA-Gの意義、および夫単核球を用いた免疫療法の作用機序に関して検討した。その結果、習慣流産夫婦におけるHLA-G多型は正常経産夫婦と差がないことがわかった。また、習慣流産に対する免疫療法の効果は、患者リンパ球のナチュラルキラー受容体の変化によらない機序で発揮されていることがわかった。第五に、習慣流産、中でもTh2優位の自己免疫異常による習慣流産に対して古くから用いられ、経験的に有効とされてきた柴苓湯と当帰芍薬散がともにTh1/Th2サイトカインバランスをTh1優位に移動させ、サイトカインバランスを正常化させることにより、流産を防止していることを示した。平成10年度においては、まず第一に、妊娠中毒症におけるHLA-G発現異常が、妊娠初期からすでに起こっているか検討するために、抗HLA-Gモノクローナル抗体`87G'及び抗β2-ミクログロブリン抗体を用いて、水溶性HLA-Gタンパクを測定するためのenzyme linked immunosorbent assay(ELISA)を確立した。このELISAの感度は150ng/ml以上であり、妊娠中期の羊水中HLA-G濃度を測定したところ、平均275ng/mlであった。このELISAをさらに改良して、現在妊婦血清中のHLA-G濃度が測定可能となるよう研究中である。第二に、妊娠中毒症患者の胎盤で報告されている異常なIL-2の発現とHLA-G発現の低下が、どのようにして妊娠中毒症病態の成立に関与しているか検討した。HLA-Gを自然発現している絨毛癌細胞株JEG-3及びBeWoとHLA-Gを発現していない絨毛癌細胞株JAR、さらにJARにHLA-Gをトランスフェクトした細胞を用いて、こうした細胞の増殖にIL-2がどのような影響を与えるか検討した。絨毛癌細胞株において、HLA-G発現細胞株(JAR-G1、JEG-3、BeWo)ではIL-2添加、非添加培養液間で生存細胞数に差はなかったのに対して、HLA-G非発現細胞株(JAR)では、IL-2添加培養液における生存細胞数がIL-2非添加培養液における生存細胞数に比べて有意に減少していた。すなわち、HLA-Gは胎盤における異常なIL-2の発現があっても胎盤トロフォブラストの増殖が影響されないよう防御する働きをしているが、妊娠中毒症胎盤ではHLA-Gの発現が低下しているために、IL-2により胎盤トロフォブラストの増殖が低下していると考えられた。

このことは、胎盤形成の障害につながり、妊娠中毒症の発生を誘起すると考えられた。平成11年度においては、まず、妊娠中毒症の発症に関係があると考えられる胎盤繊毛上のHLA-G抗原に対し、末梢血液中のリンパ球と、妊娠局所である脱落膜中のリンパ球がどのように反応するのか検討した。脱落膜リンパ球は末梢血液中のリンパ球とその組成が異なっており、大部分は形態学的に大顆粒を細胞質内に有し、CD56陽性の細胞である。また、近年、リンパ球が出すサイトカンが、細胞性免疫を賦活化するTh1サイトカンと液性免疫を賦活化するTh2サイトカンとに分類できることがわかっているが、妊娠は胎児寛容の免疫学的機序としてTh2優位の現象である。今回の研究で、末梢血中のリンパ球はHLA-Gを認識すると、Th1サイトカインの分泌を減少させ、Th2サイトカインの分泌を増加させることがわかった。一方、脱落膜中のリンパ球は、Th1サイトカインの分泌を減少させるものの、Th2サイトカインの分泌は変化させないことがわかった。妊娠において、遮断抗体等の妊娠を維持させる働きがある抗体は末梢血液中のB細胞から分泌され、脱落膜中にはB細胞がほとんど存在しないことから、両リンパ球がHLA-Gを認識した際のサイトカイン分泌の変化が異なることは理解可能である。我々は次の段階として、妊娠中毒症患者において、末梢血液中リンパ球および脱落膜中リンパ球がHLA-Gを認識した際のサイトカイン分泌がどうなっているのか検討予定である。平成12年においては,妊娠中毒症同様,妊娠維持免疫反応の異常が原因として重要と考えられている習慣流産に対し,特にその治療法の免疫学的作用機序に関して検討した。まず、ナチュラルキラー受容体の発現をRT-PCR-SSCP法にて検討したところ、習慣流産に対する免疫療法の前後で患者リンパ球のナチュラルキラー受容体レパートリーは、治療後妊娠の転帰に関わらず変化していないことがわかった。すなわち、夫リンパ球を用いた免疫療法の臨床的治療効果は、患者リンパ球のナチュラルキラー受容体のレパートリー変化によらない機序で発揮されていることがわかった。また、習慣流産に対し、経験的に有効とされている漢方薬の作用機序を,HLA-G発現細胞に対するリンパ球のサイトカイン分泌の点から検討した。その結果、習慣流産、中でも自己免疫異常による習慣流産に対して古くから用いられ、経験的に有効とされてきた柴苓湯と当帰芍薬散がともにTh1/Th2サイトカインバランスをTh1優位に移動させることを見出した。自己免疫異常による習慣流産患者においてはTh1/Th2サイトカインバランスが過度にTh2に移動していることが知られており、これらの漢方薬はこのサイトカインバランスを正常化させることにより、流産を防止していることがわかった。妊娠中毒症の中には、抗リン脂質抗体症候群のような自己免疫異常と関連したものが多く含まれており、こうした漢方薬が妊娠中毒症の予防にも有効であると期待できることがわかった。
難聴者、高齢者のカテゴリー知覚を用いた語音弁別能低下の解析

人間が連続的に変化する音声を聞くとき、音声知覚は連続的でなく2つのカテゴリーに分けられた2音としてのみ聞き分けている。これをカテゴリー知覚といい、この現象をまず正常聴力のコントロール群に対しての実験で検証した。具体的には、正常聴力の成人に対して300msのホワイトノイズの中に0から70msまで5ms毎にランダムに変化させた無音部分を挿入した擬似的な音声を聞かせた。このノイズの中の無音部分を検知できた最小閾値は40msであった。つまり無音部分が35ms以下の短さでは無音部分を人間は検知できず1音として認識していた。それ以上では人間は2音のノイズとして検知していた。さらにこの1音と2音を区別する閾値は個人差が少なく、重複も少なくカテゴライズされていることがわかった。つまり音声のカテゴリー知覚の形となっていた。この正常聴力のコントロールのGap検知による語音認識度を数値化することができた。語音知覚、時間分解能の程度を定量化することができた。さらに今年度は具体的な音声である閉鎖子音+母音を用いて同様の実験を用いるため、音声を作成した。具体的には子音産出のための上下口唇閉鎖の開放から声帯振動開始までの時間を変化させたBa→Pa音節を作成した。これにより今年度行ったGap検知の実験より更に現実の音声を用いて音声知覚を定量化することができるようになるため極めて今後の実験に重要である。今後コントロール群はもちろんのこと難聴者に対しデータを蓄積することがすぐにでも行える状態となった。人間が連続的に変化する音声を聞くとき、音声知覚としては、連続的ではなく、2つのカテゴリーにわけられた2音としてのみ、聞き分け、間の音としては認識しない。これをカテゴリー知覚といい、この音声認識のカテゴリー知覚を用いて、難聴者の語音認識低下に時間分解能低下が関与していることを、定量的、難聴者の聴力像別に解明することを目的とした。被検者に300msのホワイトノイズをきかせ、そのノイズの中に5から70msの無音部分をいれ、どの時間以上のgapを検知できるか、また/ba/や/pa/などの閉鎖子音+母音を用い、子音産出のための上下口唇閉鎖の開放から声帯振動開始までの時間をに0から70msまで5ms毎に変化させた/ba/-/pa/音節をランダムに一定の音量で被検者に聞かせ、bもしくはp音のいずれかに聞こえるかという認識率を確認することで、語音認識度を測定しようとした。この手法により、語音知覚、時間分解能の程度を定量化する計画を立てた。今年度は上記音声の作成、実験系構築のため実験機器を購入した。現在音声作成を行い、被験者の反応を集計、分析方法について検討を加えている。今後このコントロール群として健常正常聴力者の上記音声認識率のデータ蓄積の予定である。今年度は上記音声の作成、実験系構築のため実験機器のセットアップを行った。

これにより今年度行ったGap検知の実験より更に現実の音声を用いて音声知覚を定量化することができるようになるため極めて今後の実験に重要である。今後コントロール群はもちろんのこと難聴者に対しデータを蓄積することがすぐにでも行える状態となった。
電子テキスト化による刊本蘭日辞書の研究とその訳語の研究

2018年9月までに『波留麻和解』の入力を一通り終了したが、参照した影印本には印刷不鮮明による判読不能箇所が多く存在したため、同月に東京大学総合図書館に赴き『波留麻和解』の全丁撮影を行った。また、それとほぼ同時期に家蔵本ハルマ蘭仏辞典第2版についても撮影し、両者の画像データを用いて『波留麻和解』の入力チェックを行い、2019年1月にその作業を終了した。2019年2月から3月上旬にかけて『訳鍵』の入力再チェックを行い、同年3月中旬からは『増補改正訳鍵』の入力再チェックを開始したが、年度内に全ての作業を終わらせる見通しが立たなかったので、補助事業期間を一年間延長することにした。具体的な実績は上記作業の進捗に限られるが、その過程で新たに発見されたこともあった。例えば『波留麻和解』は、ともに「江戸版」と呼ばれている東大本と早大本でも蘭語木活字部分において異同が存在することが報告されているが(杉本つとむ1978『江戸時代蘭語学の成立とその展開III』(早稲田大学出版部)p.588)、その異同について全冊調査したところ、蘭語活字部分が別版となっているのはAの部の冒頭二十丁までに限られ、それ以降は全くの同版であることが確認された。また、その異同のある範囲内では収録する蘭語もいくらか異なり、早大本では、底本であるハルマ蘭仏辞典第2版に記されているカラ見出し(「zie.」で始まる参照見出し)を多く入れる傾向が見られた。『訳鍵』についても新たな書誌的異同が発見された。『訳鍵』は整版による版本であるが、国会本と早大本とを見比べてみると、41丁・44丁・45丁・131丁はそれぞれ別の板木を用いて印刷されていることが新たに分かった。また、家蔵本と比べてみると、50丁・51丁については国会本と早大本とで同じ板木を用いて印刷しているが、家蔵本はそれらと異なる板木を用いて印刷していることも確認された。2017年度は入力アルバイトの人員確保が十分にできず、作業に遅れが出たが、2018年度の作業においてもその遅れが大きく影響した。また、『波留麻和解』影印本の不鮮明箇所が予想以上に多く、原本を撮影した画像により最初から点検を行ったことにより作業時間が大幅に増え、最終年度内に全ての作業を終わらせることができなかった。2019年度中には全ての電子テキスト化作業を終えるとともに、解題や論文の執筆を行う予定である。平成26年度は、当初の計画通り『増補改正訳鍵』の電子テキスト化に取り組んだ。一部は研究代表者が入力したが、大半は学生アルバイトを雇用して入力させた。その際、疑義のある箇所や判読困難な箇所については研究代表者が直接指導し、編纂時に利用された蘭日辞書の『訳鍵』や『和蘭字彙』、その他の諸辞書を参照しつつ、可能な限り正確に入力してもらうよう努めた。『増補改正訳鍵』は和装・整版・美濃本袋綴5冊、本文396丁の蘭日辞書である。平成26年度はこのうちの第3冊目まで、オランダ語・日本語の両方について計画通りに入力を終えた。まだ全体についての入力作業を終えておらず、詳細な分析も行っていないので正確なことは言えないが、上記作業を行う過程で以下のような印象を得た。先行研究でも指摘されている通り、『増補改正訳鍵』は『訳鍵』に対して『和蘭字彙』を用いて増補したものであると見て間違いなく、ほとんどの場合、『訳鍵』または『和蘭字彙』のいずれかを参照すれば『増補改正訳鍵』所収のオランダ語や訳語を見出せるようであった。これを逆に言えば、その両書以外から増補されたと見られる箇所はほとんど見当たらなかったということである。ただし、『増補改正訳鍵』の全てのオランダ語と日本語について『訳鍵』や『和蘭字彙』と対象させたわけではなく、電子テキスト化した箇所もまだ全体の6割程度に過ぎないので、以上のことは入力時の経験による推測に過ぎない。また、『訳鍵』から『増補改正訳鍵』に取られなかった訳語もある程度存在するものと見られるが、その実態についてもまだ判然としていない。これについては、平成28年度に『訳鍵』の電子テキスト化を実施し、『訳鍵』と『増補改正訳鍵』の対照表を作成することによって判明するものと考えられる。平成27年度も当初の計画通り『増補改正訳鍵』の電子テキスト化に取り組み、一通り完成させた。平成26年度と同様、一部を研究代表者が入力し、残りは学生アルバイトを雇用して入力させた。全巻を入力し終えてもやはり、『増補改正訳鍵』の記述は『訳鍵』および『和蘭字彙』の記述の範囲を出るものではないように感じられ、独自にオランダ語や訳語を増補したとみられる箇所は見当たらなかった。対照表を作成しなければ正確なことは言えないが、上記の印象が正しいとすると、『英和対訳袖珍辞書』の編纂に『増補改正訳鍵』が用いられたか否かを判じるのは甚だ困難になるものと予想される。一方、その作業と並行して、『和蘭字彙』の使用漢字についての分析も同時に進めた。その成果の一部を、論文「近世楷書体文献の電子テキスト化における漢字字体処理についてー『和蘭字彙』を例にー」(『国語と国文学』

93-5)にまとめ、『和蘭字彙』の電子テキスト化における漢字字体処理の基本方針を定めた。これにより、『波留麻和解』『訳鍵』『増補改正訳鍵』といった一連の蘭日辞書の漢字入力方針も定まったことになる。その入力方針とは概ね以下のようなものである。1.Microsoft Wordの「あいまい検索」で相互にヒットする範囲内で、なるべく原本の漢字字体に近いJIS第1・第2水準の漢字を用い、JIS第1・第2水準内に異体字が無い字は第3水準以下の字を用いる。2.「譌字(訛字)」と「同形異字」という概念を導入し、漢字学における厳密な異体字判断基準によるのではなく、近世期の異体字意識を酌み取りつつ現代の楷書規範に沿った漢字字体で翻字する。3.誤字や通用字、現代一般の表記とは異なる表記がなされている語などについては、《》内に現代一般の表記を併記する「別表記挿入」を行う。当初の計画通り、『増補改正訳鍵』全5冊の電子テキスト化を終えたので、概ね順調に進展していると言える。全体の入力チェックはまだ途中であるが、入力方針が固まって来たので、次年度中には終了する予定である。平成28年度は当初の計画通り『訳鍵』の電子テキスト化に取り組み、一通り完成させた。平成26・27年度と同様、一部を研究代表者が入力し、残りは学生アルバイトを雇用して入力させた。また、昨年度までに入力を終えた『増補改正訳鍵』の入力チェックも行った。先行研究でも言われている通り、『訳鍵』は『波留麻和解』の単なる抄録ではなく、独自の記述が見られることが改めて確認された。また、本文異同ではないものの、伝本により上巻(乾)の丁付けがアルファベットの部ごとにつけられている本と、全丁通しで付けられている本のあることが明らかとなった。下巻(坤)はいずれの伝本も全丁通しで丁付けが付けられているので、アルファベットの部ごとに付けられている本が初印本、全丁通しで付けられている本が後印本と推測される。これについては、表紙・題簽等の異同とともに、現存諸本の書誌調査をすることで明らかにする必要がある。一方、昨年度に続いて『和蘭字彙』の異体字分析も行った。電子テキスト化する上で問題となる字の組み合わせを、「本来異体字ではないものがほぼ異体字として用いられている例(例えば砲・炮・鉋)」「書き分けがなされておらず異体字の関係であるかのように見える例(例えば斑・班)」「通用が多く異体字のようにも見えるが一部に書き分けが存在する例(例えば惣・摠・總・総)」に大別し、それぞれ用字の分布を分析した上で、具体的な処理方法について考察した。この成果は平成29年度中に論文化して公表する予定である。当初の計画通り、『訳鍵』の電子テキスト化を終えたので、概ね順調に進展していると言える。また、昨年度までに入力し終えた『増補改正訳鍵』の入力チェックも一通り終えた。平成29年度は当初の計画通り『波留麻和解』の後半の電子テキスト化に取り組んだが、『波留麻和解』は分量が多いことに加え、雇用できるアルバイトの人数が少なかったこともあり、目標の約7割程度しか入力が進まなかった。一方、平成28年度までに入力を終えた『増補改正訳鍵』と『訳鍵』の入力チェック及び表記の統一作業も同時に行ったが、こちらは概ね完了した。平成28年度において、『訳鍵』の伝本には上巻(乾)の丁付けがアルファベットの部ごとに付けられている本と、全丁通しで付けられている本のあることが確認されたが、平成29年度における『訳鍵』の入力チェックの過程においても、本文の一部の板木が別板で印刷されていたり、板木に修正が加えられていたりといった異同が新たに確認された。
強皮症モデルマウスにおける皮膚硬化に対する硫化水素による抗酸化療法の検討

近年全身性強皮症の病態に酸化ストレスが関与していることが示されている。そして抗酸化療法が有望視されている。硫化水素は高濃度では毒性を呈するが、低濃度では抗酸化作用を持つ。全身性強皮症モデルマウスであるTSKマウスに硫化水素の供与体である硫化水素ナトリウム(NaHS)を投与すると皮膚効果の改善、抗ss-DNA抗体の減少を認めた。また抗酸化酵素であるヘムオキシゲナーゼIの発現増加、一酸化窒素産生酵素であるeNOSの発現を低下させた。さらに培養TSKマウス皮膚線維芽細胞にNaHS処理を行うとI型コラーゲン遺伝子の発現が阻害された。これらの事から硫化水素は全身性強皮症の治療薬として有望であると考えた。全身性強皮症モデルマウスであるTSKマウスに硫化水素(H_2S)の供与体である硫化水素ナトリウム(NaHS;100μmol/kg)を連日4週間、腹腔内投与した。光学顕微鏡下に厚さを測定し、組織学的に皮下結合組織の菲薄化を認め、皮膚硬化の改善が確認できた。また皮膚においてコラーゲン量を反映するハイドロキシプロリン量も減少していた。自己抗体産生に及ぼす影響についてはNaHSの投与によりIgM型抗ss-DNA抗体量は減少したが、抗トポイソメラーゼI抗体、抗セントロメア抗体、抗ds-DNA抗体量に変化は認められなかった。また血清中のIgG,A,M量も変化していなかった。皮膚における抗酸化酵素ヘムオキシゲナーゼー1(HO-1)のmRNA発現量を検討した。TSKマウスにおいてHO-1mRNAが減少していたが、NaHS投与により野生型マウスと同程度まで発現が回復した。しかしながら、コラーゲンの産生を抑制するサイトカインであるIFN-・,IL-12、膠原線維の産生を増強するサイトカインであるIL-4,6,13のmRNA発現はNaHS投与により変化をきたさなかった。さらにTSKマウス皮膚から培養した線維芽細胞をNaHSで刺激したところ、I型コラーゲンmRNAの発現低下が認められた。以上の結果から、H_2Sは全身性強皮症の治療薬となりうる可能性が示唆された。その機序としてNaHSが抗酸化酵素HO-1の発現増強を介して線維化を阻害している可能性、NaHSによる直接的なコラーゲン合成の阻害を考えた。光学顕微鏡下に厚さを測定し、組織学的に皮下結合組織の菲薄化を認め、皮膚硬化の改善を確認した。マウス背部皮膚において、皮膚に浸潤した炎症細胞の種類について免疫組織学的解析を行った。F4/80、抗CD4抗体(RM4-5)、抗CD8抗体(53-6.7)陽性細胞数はNaHS投与により変化しなかった。また背部皮膚における細胞成長因子のmRNA発現をreal-time PCR法で測定した。皮膚線維化に深く関与する細胞成長因子であるbasic FGF,PDGF,TGF-βのmRNA発現はNaHS投与による変化を呈さなかった。また細胞障害性を持つ一酸化窒素(NO)を産生する酵素であるeNOS、iNOS、nNOSのmRNA発現についても検討を行った。NaHS投与によりeNOSの発現は有意に減少したが、iNOS、nNOSの発現については変化を認めなかった。その機序としてeNOSの発現低下による細胞障害性を持つNOの産生減少が考えられた。しかしNaHS投与により浸潤する炎症細胞の種類の変化は無く、また細胞成長因子の発現も変化無かったことから両者の関与は見いだせなかった。これらの結果は昨年度の結果と合わせてリウマチ・膠原病分野の英文雑誌に現在投稿中である。
がん患者の最適身体活動量の維持をめざす多機能携帯電話利用看護支援システムの検証

乳癌化学療法(以下、化療)中の患者で筋肉量が少なく抑うつ状態にある者は身体活動量が低かった。化療中の発熱性好中球減少症(FN)の発症予測は患者の身体活動性や生活の質の維持のために重要である。そこで肺癌、乳癌、大腸癌の化療患者の病歴調査よりFNのリスク因子を抽出した。続いて化療中で在宅期の患者がTablet PCを用いて体温、倦怠感等の身体状況を自己モニタリングし、これらのデータを送信しFN発症のリスクが高まった場合にはアラートを発信するシステムを開発した。過去の化療で敗血症既往があり、G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)の投与歴がある者はFN発症リスクが有意に高かった。本研究は外来化学療法患者の重症有害事象の発症予測式を作成し、この予測式を搭載したTablet型PCによる通信システムを構築する。システム利用により対象者は自己観察した身体状況データを送信し、重症な有害事象発症の予測時には医療者が受診勧告や有害事象発症予防の徹底などの注意を促すメッセージを発信する相互通信システムを構築し、この効果を評価する。効果指標には有害事象発症率の低下と低活動生活様式の改善や骨格筋肉量低下等の代謝障害予防効果を評価する。初年度の本年は「重篤有害事象の特定とその関連要因の先行調査」「代謝障害であるインスリン抵抗性の増大と身体活動量の関連に関するパイロット研究」「有害事象発症予防通信システムに関する英国との情報交換」を計画し、下記のような実績であった。1.有害事象の特定と関連要因の決定:外来癌化学療法では発熱性好中球減少症(FN)が致死的有害事象であり、この発症予測式をretrospectiveデータ解析により作成する。肺・大腸・乳癌の化学療法患者の病歴調査実施にあたり倫理審査承認を得、FN発症の有無、発症関連予測要因のデータ収集を完了した。次年度はこれらより予測式の作成と通信システムの構築を推進する。2.乳癌化学療法中患者の身体活動量とインスリン抵抗性の関連:乳癌化学療法中の患者14名の活動強度別身体活動量、平均歩数、身体組成、下肢筋力とインスリン抵抗性(HOMA-R)の関連性を検証し、低活動様式や体脂肪率高値がインスリン抵抗性の高さと関連することが示唆され、論文投稿予定である。3.英国の関連研究領域の情報収集:Southampton大学、関連病院を訪問し、化学療法患者での有害事象発症時の重症度判定(トリアージ)システム、通信デバイスを活用した身体情報(バイタルサイン、経皮的動脈血酸素分圧等)の送信システムに関する情報収集を行った。本研究は外来化学療法(以下、化療)患者の重症有害事象の発症予測式を作成し、予測式を搭載したTablet型PCでの通信システムを構築する。本システムは化療後の対象者から連日、身体状況、身体活動量データが送信され、このデータと予測式による重症有害事象発症リスクが高まった場合、医療者からアラートを発信するものである。システム利用が有害事象発症率低下、対象者の身体機能維持への効果を評価する。研究2年目の本年度は、「有害事象発症予測式作成のためretrospectiveデータに基づく解析」、予備調査として「乳がん化療患者の身体活動量と身体組成、インスリン抵抗性との関連」及び「肺がん化療患者の身体活動量と身体組成、筋力との関連」以上の関連検証調査、さらに「英国、ポーランドでがん患者セルフケア支援方法の情報収集」を行い、以下の実績であった。1.有害事象発症予測式のための解析:国立国際医療研究センター病院で肺がん、大腸がん、乳がんで過去3年間の化療患者約340人、一人あたり平均4回分のデータを収集し、背景因子とVital Sign、血液・生化学値、治療内容、感染症等のデータ連結作業が進行中であり、今後、発熱性好中球減少症の発症予測式を作成する。2.化療患者の身体活動量と身体組成等の関連性評価:肺がん患者は病期が進行しており、身体活動性は乳がん患者に比べて有意に低い。身体組成は両疾患とも筋力・筋肉量低下のサルコペニア状態の者が存在し、身体活動性との関連検証中である。先行研究ではサルコペニア状態での化療実施は有害事象発症率が高く、予後不良との報告もあり、有害事象発症予測の重要要因と考えられ本予備調査を進展させる。3.英国、ポーランドでがん患者のセルフケア支援方法に関する情報収集:両国とも情報通信機器を使用したセルフケア支援開発を進めており、今後も情報交換を進める。本研究は外来化学療法(以下、化療)患者の重症有害事象の予測式を作成すること、さらに対象患者にTablet PCを配布し、患者はprospectiveに身体状況のデータを送信し、予測式から推計される発熱性好中球発症(以下、FN)リスク度判定と合算して、発症の危険性が高まった場合にはアラートを発する通信システムを構築することを目的としている。研究3年目の本年度の研究実績は下記の内容であった。1.有害事象発症予測式のための解析:国立国際医療研究センター病院で肺がん、大腸がん、乳がんで過去3年間に骨髄抑制が有害事象として起こる危険性のある抗がん剤を含むレジメンを規定投与量の60%以上投与された化療患者194例について、抗がん剤投与日から21日間に、FNの定義に該当、あるいは白血球数、好中球はFNの判定値以上であったが37.5°C以上の発熱者等について、影響因子を探索した。

2.相互通信システムの開発:患者にTabletPCを配布し、このTabletPC上のWebブラウザを介してサーバPCにアクセスし、ここで送信された日々の身体状況と患者個々のリスク度を合算し、必要時には受診勧告などのアラートを発するシステム開発。3.英国研究チームとの交流:化療患者の身体活動の促進と療養生活のモニタリングを行うシステムを開発中のKing's College of London (KCL)Florence Nightingale School of Nursing and Midwiferyの研究チームとの意見交換で、対象者は治療開始前、体調の変化が懸念される場合は医療者への早期連絡を指導されているが、どの程度の状況をいつ相談すべきなのかの判断がつかないという問題を抱えており、通信システムは患者の心理的な負担感や不安の軽減効果があることを、確認しあった。推計式作成に必要とするデータについて、調査施設の電子カルテより施設が作成したデータ収集ソフトを活用して収集した。これらのデータを処理可能な形式に連結する作業に予測以上の時間を要した。現在、この作業は完了し、推定式の精度を高める作業中であり、今後は在宅患者に通信機器を配布して在宅療養中のprospectiveなデータを通信するシステムを構築していく。本年度は、第1に癌化学療法患者の病歴データから発熱性好中球減少症(febrile neutropenia: FN)の発症予測因子を特定すること、第2に通信端末装置を利用した在宅中の化学療法患者の身体徴候のモニタリングシステムを開発し、倫理審査承認後の調査を計画した。過去3年間の病歴調査の結果、レジメン規定量の60%以上投与された肺・大腸・乳癌の合計193例について解析した結果、FN発生が12例と少なく発症リスクの特定はできなかった。そこで37.5°C以上発熱、抗菌剤投与となる感染症リスク、好中球数が1,000/μL以下のリスクを解析した結果、G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)投与歴有り、敗血症既往歴有り、ステロイド投与歴有りが因子として抽出され、この結果は10月の第4回看護理工学会で報告した。さらにprospectiveにFN発症関与因子を特定することを目的に、携帯端末装置より肺癌化学療法中患者が連日、体温、脈拍、体調自己評価結果を送信し、37.5°C以上発熱で予防的に処方のLevofloxacinの内服後病院へ相談する、息切れや強い悪寒が急速悪化の場合も病院への電話相談を促すアラートを発する通信システムを開発し、予備調査を実施した。対象は5例、調査期間の送信率はほぼ100%で、うち1例では好中球数の減少はないが38°C以上の発熱を呈した。対象者はアラート文により病院に電話相談し、その結果受診が促され、感染症が消退した。対象者は過去にG-CSF投与歴、敗血症既往歴があった。また全対象者よりモニタリングや送信に関する負担感や困難感の訴えはなく、安心感があると好評であった。今後の課題は送信データを医療スタッフと情報共有をするため状況把握が容易な送信結果閲覧画面の開発、対象患者にモニタリングと有害事象への対応など自己管理に関する事前指導が重要であることの示唆を得た。乳癌化学療法(以下、化療)中の患者で筋肉量が少なく抑うつ状態にある者は身体活動量が低かった。化療中の発熱性好中球減少症(FN)の発症予測は患者の身体活動性や生活の質の維持のために重要である。そこで肺癌、乳癌、大腸癌の化
脳形成・神経機能に関わる新しい機能ドメイン“ポストリン酸糖鎖”の確立

脳の形成に重要な役割を担う糖タンパク質のジストログリカンには、“ポストリン酸糖鎖"というユニークな機能ドメインが修飾されている。ポストリン酸糖鎖は、基底膜成分やシナプス分子といったリガンドと結合するために必要だが、ポストリン酸糖鎖の不全が、脳奇形(II型滑脳症)や精神発達遅滞など、中枢神経障害の原因になることが明らかになってきた。ポストリン酸糖鎖が、新しい機能ドメインとして、神経系で重要な役割を担っていることは明白であるものの、その構造・修飾機序・生理機能について、不明な点は多く残されている。本研究では、ポストリン酸糖鎖の構造、大脳皮質層構造の形成に重要な糖鎖シグナルや、ポストリン酸糖鎖が関与する神経機能を明らかにし、ポストリン酸糖鎖不全症における中枢神経病態を解き明かすことを目的とした。本年度は、昨年度に引き続き、ポストリン酸糖鎖に異常を認めるフクチン欠損マウスを用いて、組織病変の解析を行い、脳発生過程におけるポストリン酸糖鎖の時空間的な重要性を確立した。また、神経生理的解析としてフクチン欠損マウスのLTP測定を開始した。27年度が最終年度であるため、記入しない。そこで本研究では、ポストリン酸糖鎖の構造と修飾機序の全容を明らかにし、また、ポストリン酸糖鎖不全の疾患モデルを用いて、ポストリン酸糖鎖不全症における中枢神経病態を理解することを目的とする。本年度は、ポストリン酸糖鎖が高度に修飾された独自のジストログリカン組み換え体を作出し、質量分析法と糖質化学的手法による構造解析をすすめ、ポストリン酸糖鎖の全容解明を可能にする情報が得られた。また、ポストリン酸糖鎖の形成に関わる修飾分子の同定のため、修飾酵素活性測定系の樹立を行った。更に、中枢神経に特異的なポストリン酸糖鎖不全症のモデルを開発し、その組織病態解析を行い、組織病変の重篤度と、発生過程におけるポストリン酸糖鎖不全の程度に相関があることを見出した。以上の結果は、ポストリン酸糖鎖修飾の分子機序、および中枢神経病態の解明に重要な基盤となる。ポストリン酸糖鎖の構造と修飾機序の解明に必要な研究基盤を樹立することができた。また、ポストリン酸糖鎖不全症のモデルマウスを開発し、組織病態解析を行った。研究目的の達成にむけて計画通り順調な成果が得られている。本年度樹立した実験系を基盤に、ポストリン酸糖鎖の構造と修飾機序の解析をすすめ、その全貌を明らかにする。また、ポストリン酸糖鎖不全症のモデルを用いて、病態の解明およびそれに基づいた治療の可能性を明らかにする。
血小板由来成長因子β-受容体遺伝子の血管平滑筋特異的発現調節

血小板由来成長因子(PDGF)は血管平滑筋細胞(VSMC)の強力な細胞増殖因子の1つであるが、PDGFの生理作用はその特異的な受容体を介して発現される。また、動脈硬化巣や糖尿病性血管病変などでPDGFβ-受容体(PDGFRβ)が過剰発現されることも知られているが、そのVSMC特異的な遺伝子発現調節を規定している因子は不明である。そこで、独自に単離した約1.7-kbの5′-上流域を含むPDGFRβ遺伝子を用い、VSMCおよび肝細胞(HTC)におけるプロモータ活性を比較することで、VSMC特異的転写に関与する因子を解析した。その結果、PDGFRβの基本的転写活性には、-67-61に存在するCCAATボックス(以下、C67)が重要であり、この領域にはCCAAT結合因子の1つであるNF-Yファミリーが結合して転写を活性化することを明らかにした。ゲルシフトならびにスーパーシフト解析の結果、NF-YはVSMCおよびHTCの両細胞で発現を認め、組織特異的転写調節に関与しない、基本的な転写活性化因子であることが明らかになった。一方、その上流に存在する-150-121(以下、R30)はC67と協調して遺伝子転写を活性化する必須の配列であることが示された。さらに、R-30をプローブとしたゲルシフト解析の結果、この領域に結合するHTCにのみ特異的なDNA結合タンパクの存在を同定した。このことは、R30-結合タンパクのうちでHTCにのみ認められたタンパクは、内因性PDGFRβ遺伝子発現を認めないHTCにおいて組織特異的に発現し、PDGFRβ遺伝子発現に対して負の転写制御を行う因子であると考えられた。この因子を明らかにすることで、動脈硬化巣あるいは血管再狭窄病変に過剰発現されるPDGFRβ発現を遺伝子レベルで抑制する方法を開発できるものと考えられる。そこで、独自に単離した約1.7-kbの5^1-上流域を含むPDGFRβ遺伝子を用い、VSMCおよび肝細胞(HTC)におけるプロモータ活性を比較することで、VSMC特異的転写に関与する因子を解析した。その結果、PDGFβRの基本的転写活性には、-67-61に存在するCCAATボックス(以下、C67)が重要であり、この領域にはCCAAT結合因子の1つであるNF-Yが結合して転写を活性化することを明らかにした。さらに、この領域に対するゲルシフトならびにスーパーシフト解析の結果、この因子はVSMCおよびHTCの両細胞で発現を認め、組織特異的な転写調節に関与しない、基本的な転写活性化因子であることが明らかになった。一方、その上流に存在する-150-121(以下、R30)はC67と協調して転写を活性化する必須の配列であることが示され、この領域に結合する転写因子によってVSMC特異的な転写調節が行われていることが明らかになった。本年度までの研究により、内因性PDGFRβ遺伝子発現を認めないHTCでは、R30は負の転写調節配列(negative regulatoryelement;NRE)として