hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
穏和な酸化およびラジカルカップリングに基づく新規な環境調和型の複素環合成法の開発

本年度は,当初計画の代替として、有機分子触媒を利用したキナゾリノン類縁体の新規環境調和型合成法の開発を重点的に探求した。4-キナゾリノンを骨格に持つ化合物は、多様な生物活性や催眠・鎮静作用を持ち、さらに癌の治療に対する利用も提案されている非常に有用な化合物であり、新規薬剤を開発する際の有力な候補化合物として注目されている。しかし従来、その骨格を形成する方法として、銅などの遷移金属を触媒に用いた反応や大過剰量の塩基を用いた反応が報告されているが、それらはグリーンケミストリーの観点から、反応段階が多い、低収率など問題点がある。さらに、N-1置換体の合成の報告例は少ないのが現状である。そこで本研究では、入手容易な基質から、安価で環境負荷が低い有機分子触媒を用いることにより、環境調和型C-Nカップリング反応を開発し、キナゾリノン類縁体の新規合成法の確立を目指した。まず種々の2-ハロゲン化ベンズアミド1と種々のイソシアネート誘導体2を縮合させ、新規化合物8種を含む12種類の基質となるウレア誘導体3を収率35%94%で得た。同時に、2-ブロモベンズアミド1aとフェニルイソシアネート2aより合成したウレア体3aをモデル基質として、分子内C-Nカップリング反応の最適化についての検討を行った。その結果、L-プロリン(40 mol%)を用い、KOt-Bu (2当量)の存在下、DMSO中85 °C、8時間反応させたところ、最も高い収率(92%)で期待したキナゾリノン類縁体4aが得られることを見出した。今後、アミノ酸および塩基、溶媒をいくつか検討し、有機分子触媒を触媒量に減少させるとともに、ウレア体3およびキナゾリノン類縁体4の誘導体を新規誘導体を含めて20種類程度合成し、それを生理活性評価するとともに、本反応のOne-Pot化ならびにグラムスケールでの合成を検討していく予定である。上述のように,ギナゾリン誘導体の塩基存在下,プロリンを触媒に用いたメタルフリー条件下,新規環境調和型合成法が軌道に乗りつつある。本反応は,従来の銅触媒を利用する反応などに比べ,簡便で誘導体合成も容易であり,ケミカルライブラリーの構築,スクリーニングへの利用等に遊離であり,発展が期待される。また,オキサゾールの超原子価ヨウ素試薬を用いる合成において,以前報告したエナミドを経由する段階的方法のワンポット化に成功した。また,本反応を利用して,オキサゾール系制癌剤中間体の合成にも成功している。一方で,ベンゾオキサゾール合成のベンゾチアゾール体への展開など,当初の計画通りに反応が進行しない例も見られた。またインドールや,キノキサリンの合成に関しては以上の反応の検討に手間取ったため着手出来ておらず,当初計画達成のため,研究期間の延長により遂行したい。以上の理由から、(2)おおむね順調に進展しているとした。まず,順調に進行しつつあるギナゾリン誘導体の合成に関しては、ベンズアミド由来の芳香環ならびに,ヒドラジンの置換基に関して,様々な原料を合成し環化反応を試み,基質一般性を検証する。また同時に,中間体を単離しないワンポット化も可能であるか試みる。また,当初の計画にもかかわらず着手出来ていない反応である,1キノキサリノンのメタルフリーフリー合成,すなわち,アニリンとアミノ酸から合成したアミドの,超原子ヨウ素試薬等の酸化剤による環化反応によるキノキサリノン誘導体の合成,22ーハロアニリンとβーケトエステルから合成したエナミンのプロリン触媒下,塩基によるラジカルカップリングによるインドールの合成,3ヒドラジンと,アレーンの超原子価ヨウ素試薬を用いた分子間CーNカップリング反応、4アニリンとヒドラゾンの付加反応で生成するアミドラゾンの分子内メタルフリーカップリングによる3ーアミノインダゾールの合成など,報告例のない未達成の新規な環境調和型合成反応を開発する。以上が達成されることにより,新規誘導体を含めた含窒素複素環化合物のケミカルライブラリーの構築が容易となり,創薬研究が加速されると共に,環境調和性が高く,永続的な有機合成反応の開発に貢献出来ると考えている。医薬品や農薬、生理活性物質、有機電子材料、機能性色素などとして有用性の高い、環内に窒素原子を含んだ含窒素複素環化合物を対象に、環境調和性と持続性を考慮した新規合成法の開発を行う。具体的には、遷移金属触媒や、強酸や強塩基などを用いるのではなく、ヨウ素やアミノ酸、アルカリ金属など資源的に豊富かつ再生可能であり、有害性の少ない安全性の高い反応剤に用い、温和な条件下で進行する合成法を開発する。有用な化合物の環境調和性の高い合成法が開発できれば合成コストの低下につながる。これは、医農薬等の低価格供給にもつながり、途上国等で問題となっている有毒で残留性があり、使用が禁止となっている農薬の違法使用の回避、薬価が高く十分に医薬品が行き渡らない貧困地域における、マラリア、エイズ等の感染症の撲滅に貢献できる。さらに穏和な条件下、低毒性で安全性の高い反応剤を用いる反応が開発できれば、物質生産現場における安全性の向上にもつながり、女性の当該分野における社会進出等にも貢献できるものと考えている。また、再生可能な資源の有効利用は、限られた資源の保護とともに、物質生産を通した人類の永続的繁栄にも寄与するものである。29年度は、オキサゾール合成法の基質適用限界の探究、ワンポット合成、医薬品合成の応用並びに、キノキサリン、インドール合成法の検討を開始する。

30年度は、オキサゾール合成法のチアゾール、イミダゾールへの展開、ライブラリー構築と生理活性評価、キノキサリン、インドール合成法の基質展開並びに合成法の応用、ヒドラジン、フタラジンのアリール化の検討を行う。31年度は、ヒドラジン、フタラジン合成法の基質展開、応用研究、各反応の反応機構を調べるためのコントロール実験、合成された誘導体の生理活性評価、オカラミンの全合成研究を行うとともに、次世代型環境調和合成法の探索を開始する。研究計画に基づき、オキサゾール合成法の基質適用限界の探究、ワンポット合成、医薬品合成の応用並びに、キノキサリン、インドール合成法の検討を開始した。まずオキサゾール合成法の基質適用限界に関して、2位の置換基については、芳香環(2ーメチル、2ーメトキシ、2ーブロモ、3ーシアノ、4ーニトロフェニル基、3ーピリジル基)ならびにアルキル基(メチル、トリフルオロメチル、n-ペンチル、シクロヘキシル、t-ブチル、)について、不安定なシアノ基、強い電子求引性基であるニトロ基、更には立体障害の大きいt-ブチル基についても許容性があることがわかった。5位の置換基は、アシル基、エステル基で可能である。ワンポット化については、ベンズアミドとアセチルアセトンを酸触媒下で縮合させエナミドを得た後、溶媒の留去、最適条件の適用により達成した(63%)。医薬品合成への応用は、抗がん活性物質の合成中間体を標的とした。(2-フルオロベンゾイル)酢酸エチルと酢酸アンモニウムを反応させてエナミンとした後、塩化アセチルにより環化前駆体を得た。環化反応は良好に進行し、84%の収率で目的体を獲た。以上の結果は、論文発表を行った(Tanimori, S. et al. Tetrahedron 2017, 73, 1247.)。2ーハロアニリンとアミノ酸のアミド縮合体の環化によるキノキサリン合成は、再考の末、従来のワンポット合成法に関してpriorityが見出せなかったことから検討しないことにした。代替反応として、2-ブロモチオシソシアネートとマロン酸エステル並びにシアノ酢酸エステル付加体の環化を検討した。その結果、Pd触媒を用いることにより目的の環化体が低収率(26ならびに40%)得られる新たな合成法を見出した。予定したエナミン体の環化によるインドール合成は、種々条件検討を行ったが、反応は進行しなかった。本年度は,当初計画の代替として、有機分子触媒を利用したキナゾリノン類縁体の新規環境調和型合成法の開発を重点的に探求した。4-キナゾリノンを骨格に持つ化合物は、多様な生物活性や催眠・鎮静作用を持ち、さらに癌の治療に対する利用も提案されている非常に有用な化合物であり、新規薬剤を開発する際の有力な候補化合物として注目されている。しかし従来、その骨格を形成する方法として、銅などの遷移金属を触媒に用いた反応や大過剰量の塩基を用いた反応が報告されているが、それらはグリーンケミストリーの観点から、反応段階が多い、低収率など問題点がある。さらに、N-1置換体の合成の報告例は少ないのが現状である。そこで本研究では、入手容易な基質から、安価で環境負荷が低い有機分子触媒を用いることにより、環境調和型C-Nカップリング反応を開発し、キナゾリノン類縁体の新規合成法の確立を目指した。
遺伝子組換え技術による未利用植物資源の活用

本研究は、遺伝子組換え技術により、これまで植物で利用されなかった部分に有用タンパク質の蓄積を図るものである。収穫時にも光合成活性、異化代謝活性が高い根菜の葉に着目し、具体的にはサツマイモ(Ipomoea batatas)の葉に有用タンパク質を大量蓄積させることを目指す。求められる要素技術はサツマイモの形質転換法に加え、サツマイモの塊根の生育・デンプン蓄積等に悪影響を与えずに外来タンパク質を葉に大量蓄積させるための特異的遺伝子発現系の確立である。特に、生育後期に人為的に目的遺伝子を誘導発現させることを念頭に制御系の開発を行った。1.西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子のサツマイモへの導入と発現大谷と島田らにより報告されたサツマイモ形質転換法を参考に有用遺伝子である西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ遺伝子prxC1a,prxC2をカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S RNA遺伝子プロモーターに連結し、同時に導入したハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を指標にサツマイモ形質転換体を選抜し、C1a,C2ペルオキシダーゼをサツマイモ植物体に蓄積させることに成功した。2.人為的遺伝子誘導発現系:熱誘導可能な制御系および放線菌由来の遺伝子発現制御系酵母・庖疹ウイルス・シロイヌナズナ由来の熱誘導可能な制御系の構築を試みた。タバコ培養細胞BY2のプロトプラストを用いた一過性発現実験を行った結果では、系の有効性が示されたが、BY2形質転換体を用いた解析では、残念ながら熱による系の動作は認められなかった。放線菌由来のVB(Virginiae butanolides)による遺伝子発現制御系をタバコ培養細胞へ移植し、系の動作確認を行った後、オペレーター配列のプロモーター領域に対する位置及び数について最適化を行い、実用化レベルでの人為的遺伝子発現制御系の完成に至った。植物バイオマスの多くは廃棄物である。これの有効利用を目的として、サツマイモ、高系14号の葉部に付加価値の高い西洋ワサビのペルオキシダーゼを蓄積させる。CaMV35Sプロモーターに連結したペルオキシダーゼ遺伝子、prxClaを組み込んだpBI101Hmを保持するアグロバクテリウムをサツマイモカルスに感染させ、ハイグロマイシン耐性の再生個体5系統を選んだ。サザン解析によりprxCla遺伝子のコピー数は1-3であった。ノザン解析で転写物を確誌し、酵素活性を測定した結果、宿主サツマイモの2-5倍に上昇していたつ等電点電気泳動で、宿主のべルオキシダーゼとは異るpI値の活性バンドが見られ、prxCla遺伝子産物の蓄積が確認された。実用的には遺伝子の導入・発現が本来の有用部分である塊根へ影響を与えないことが重要である。そこで発現時期を人為的に制御できる誘導型プロモーター(シロイヌナズナの熱ショックタンパク質遺伝子、HSP18.2のプロモーター)の利用を計画した。HSP18.2プロモーターのタバコでの解析では生育温度の28°Cから37°CへのシフトによりレポーターのGUS遺伝子の発現が約1,000倍に上昇したが、酵素の合成は精々数時間しか持続しなかった。長時間植物を高温に保持するには限界があるので、正の転写因子をHSP18.2プロモーターで数時間駆動し、温度を下げた後、転写因子が数日間安定であれば、それが作用する遺伝子の発現の持続が可能である。転写因子として、VP16をGal4DNA結合ドメインに融合させた。

標的遺伝子にはGa14結合配列を上流に持つCaMV35S最小プロモーター支配下のGUSを用いた。目下、タバコでその有効性を確認中である。21世紀の課題は環境保全と資源・エネルギーの高効率利用とリサイクルである。太陽エネルギーとCO2から生産される植物バイオマスの大部分は廃棄物として処理される。この有効利用の例として、サツマイモの未利用の葉部に遺伝子組換え技術により、有用タンパク質を大量蓄積させることを目的とする。すでにサツマイモに有用酵素のペルオキシダーゼ遺伝子を導入し発現させたが、そのための要素技術として、今年度は遺伝子発現制御系の開発研究を行った。1)熱誘導可能な制御系の構築シロイヌナズナの熱ショックタンパク質遺伝子、HSP18.2のプロモーターの機能解析の一貫として、これに作用する熱ショック転写因子のCDNAをタバコから2種類単離した。大腸菌で発現させた転写因子は、インビトロでプロモーター内の熱ショックエレメントに特異的に統合した。また転写因子のアンチセンスDNA導入タバコでは熱ショック応答に変動が見られた。これらの基礎知見は熱ショックプロモーターの実用遺伝子の発現の人為的制御法に情報を提供する。2)外来遺伝子の安定発現系通常、植物に導入された遺伝子は染色体上の位置により発現が大きく変動する(位置効果)。これを回避し安定に発現させる方策が模索されているが、タバコ細胞から単離したアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)遺伝子のプロモーターの上流には、安定発現の候補となる領域の存在が示唆された。そこで、ADH遺伝子の転写開始点の上流200bp断片をCaMV35Sプロモーター/GUSレポーターのセットの上流に付加し、タバコ培養細胞の染色体に導入した。独立に取得した数百の形質転換細胞全てがGUSを示し、これはプロモーターの強度、染色体の特定の場所への挿入でないことから、位置効果を回避できる配列であると結論した。今後、応用面で多いに期待される成果である。21世紀の人類の主課題は環境保全と資源/エネルギーの高効率利用とリサイクルである。太陽エネルギーとCO2から生産される植物バイオマスの大部分は現在では廃棄物として処理されるか、むしろ処理に難渋を来している。そこで年間我国で300万トン生産されているサツマイモの未利用の葉部に遺伝子組換え技術により、有用タンパク質を大量蓄積させることを目指す。しかし、サツマイモの生育、デンプン蓄積等に悪影響を与えないために、生育後期に人為的に目的遺伝子を誘導発現させる制御系の開発を目的とした。1、熱誘導可能な制御系の構築酵母の転写因子(Gal4)のDNA結合ドメインと疱疹ウイルスの転写因子(VP16)の転写活性化ドメインを融合させた遺伝子をシロイヌナズナの熱ショックタンパク質遺伝子(HSP18.2)のプロモーターで発現させるベクターと、Gal4の結合配列の下流にCaMV35S/GUSを置いたベクターを構築した。これらベクターをタバコ培養細胞BY2のプロトプラストへ導入し、一過性発現実験を行った結果では、系の有効性が示されたが、BY2形質転換体を用いた解析では、残念ながら熱による系の動作は認められなかった。2、新規プロモーターの取得と検証昨年度、放線菌由来のVB(Virginiae butanolides)による遺伝子発現制御系をタバコ培養細胞へ移入し、系の動作(約2倍の発現誘導)を報告した。
アクチナイド化合物のフェルミ面の研究

アクチナイド化合物の5f電子は、局在性の強い希土類化合物の4f電子と遍歴性を示す遷移金属化合物の3d電子との中間に位置し、その物理的性質の解明は未開拓の分野となっている。1988年度に発足した重点領域研究「アクチナイド化合物の物性」(代表者、糟谷忠雄)では、Uを中心としたアクチナイド化合物や、CeやYbの希土類化合物に特徴的に見られる重い電子状態の解明が主要課題の一つとして取り上げられた。藤村班では、ドハース・ファンアルフエン(dHVA)効果の測定により、重い電子のフェルミ面、有効質量等の情報をうることを研究目的としている。重い電子のdHVA効果の観測には、(1)純良単結晶の育成技術、(2)極低温・強磁場測定装置、(3)高感度測定技術、などの極限物性研究法の開発研究をおこなう必要がある。本研究班では主として、(2)および(3)の実験技術の開発に責任をもっている。極低温下でのdHVA効果の実験を目的とした大型希釈冷凍機の独自開発は、本計画研究の中心課題であり、東北大学・科学計測研究所・附属工場で設計製作をおこなっており、第一号機は完成した。現在は、室内配管等がおこなわれており、近々に最初のオペレーションがおこなわれる予定である。次年度以降も、本年度の製作経験に基づき、第2号機、第3号機の製作が予定されており、工作技術等の進歩も期待できる。また希釈冷凍機と結合させる大型超伝導磁石(14.5テスラ)も主要設備品としてオックスフォード社から購入した。帯磁率、超音波の高感度測定技術の開発も、本計画研究の推進の重要な鍵であり、クライオエレクトロニクスの開発がおこなわれている。単結晶試料については、試料作製班において研究が進められており、新物質の開発も含めて、重い電子系の研究の発展が期待できる。
自己駆動粒子系の映像解析によるデータ駆動型シミュレーション構築手法の研究

初年度の研究については、当初の研究計画調書の通りに実行した。まず研究代表者のグループでは、実験で取得した画像・映像データから時系列情報を取得するために、画像処理関連のライブラリの利用によるプログラム開発、及び、最近発達している深層学習を応用した方法について実装及び検討を行った。また、当初の計画には記述していないが、データを抽出と解析という形で2段階にするのではなく、映像データをそのまま処理して動的モード分解を行う処理手法についても、その実行可能性や有用性などを検討した。ここで検討した動的モード分解は時系列データ解析の手法の一つであるが、同様のアプローチがデータ駆動型のシミュレーション構築に応用できると考えられるため、ここでの検討結果は次年度以降に実施予定のシミュレーション構築の準備として有意義であったと考えている。これらの処理を実施するための設備として、6コアx4の計算機を導入し、並列計算も含めて大規模に利用できる形で整備を実施した。2名の研究分担者は研究計画調書に従って、大規模な非線形シミュレーションと自己駆動粒子系の実験から時系列を取得するための研究を実施し、実際に時系列データの形で研究代表者のもとに送付が完了している。今年度実施したこれらの研究に関する成果の公表については、それぞれの実施内容と分野などに応じて、物理学会、電気関連学会九州支部連合大会、その他の研究会等で個別に実施している。初年度の主な実施事項のうち、実験とシミュレーションによる時系列取得については2名の分担者がそれぞれ計画通りに実施していることと、研究代表者のグループでも画像解析手法の検討が進められており、研究計画調書中の研究実施計画の表に照らしてほぼ計画通りであると言える。初年度の実支出額についても、研究分担者に配分したものは計画的にほぼ使い切られており、問題がないことがわかる。研究代表者について、特に旅費についての未使用額が多くなっているが、これは主に導入した計算機が比較的安価に導入できたことが要因であって、研究の進展自体が遅れているわけではない。この未使用分に関しては、次年度に成果発表のための旅費として執行する予定であるため、計画実施自体には問題がないと考える。初年度は2名の研究分担者と協力して実施していたが、内1名がエフォート率を割けなくなったために分担者から外れることとなった。この担当部分であるシミュレーションによる時系列取得は研究代表者のグループに引き継いで担当することとなった。2年目の研究については、研究代表者と研究分担者1名の2グループで実施することなるが、分担内容の調整により大きな問題は生じないと考える。研究代表者のグループで導入した計算機が、当初予定の100万ではなく、同スペックの製品を50万程度で導入することができたため、旅費等で調整したものの残額が出てしまっている。この分に関しては、次年度に開催される国際会議への参加旅費として利用する予定である。
典型金属イオンを用いた集積型遷移金属錯体の機能制御

1)2つのエチレンジアミンユニットをアルキルスペーサーでつないだ配位子は四核銅錯体を与えた。この錯体は3,5-di-tert-butylcatechol(DTBC)の酸素酸化反応を大きく加速した。さらに、溶液中で四核構造を安定に保つために、4つのエチレンジアミンユニットをもつ八座の大環状配位子を合成した。この四核銅錯体は、低濃度でも反応速度を大きく向上させた。DTBCの酸素酸化反応について、二核錯体と比較すると四核錯体で30倍の加速効果がみられた。この四核銅錯体は、これまでのアルキルスペーサーを用いた四核銅錯体の結果と同様に酸素分子への2電子移動を加速した。2)Na^+、K^+、Mg^<2+>、Ca^<2+>などのアルカリおよびアルカリ土類金属イオンは、集積化して多様な機能を発現することはないが、構造因子として働き、タンパクの機能発現に不可欠な働きを持つことが知られている。従って、典型金属の構造因子としての機能を集積型金属錯体に導入することができれば、集積型金属錯体の機能制御の新たな手法として有用であると考えられる。この点について、本年度から、アルカリおよびアルカリ土類金属を用いた遷移金属イオンの集積化と機能制御を試みた。この研究の成果として、クラウンエーテルをもつトリピリジルメタン配位子(LO4,LO5)を合成した。これらの配位子の銅(I)錯体は酸素分子と反応して、μ-η^2;η^2-パーオキソ二核銅(II)錯体を生成した。この酸素錯体の安定性は、Na^+、K^+、Mg^<2+>、Ca^<2+>などのアルカリおよびアルカリ土類金属イオンを共存させる事によって、向上した。クラウン環に4つの酸素原子をもつLO4の錯体ではNa^+を用いたときに大きな安定化の効果が得られ、クラウン環に5つの酸素原子をもつLO5の錯体ではK^+を用いたときに大きな安定化の効果が得られた。
反転授業高次化のためのブレンド型授業モデルの基盤構築に関する研究

本研究では、反転授業の基盤となる授業デザインについての研究を目指すものである。反転授業の学習効果を明らかにし、学習の過程についての検討し、授業のデザインへ還元することを目指す。我々は、深い学習に着目した。深い学びは、浅い学びとの対比において生まれた概念であり、従来の知識伝達を中心にした学びと異なる学びの存在が浮き彫りになったものと言える。ただ、深い学びについての実態解明は、現在進行形であり、深い学びは研究の緒に就いたと言える。もちろん、深い学びについて様々な観点から考察が進んでいる。我々は、メタ認知を取り上げた。認知科学においてメタ認知は、高次の認知活動を指すものであり、アクティブラーニングで言われる深い学びと親和性が高いと考えた。メタ認知の評価に関する研究から、成人を対象にしたメタ認知尺度に着目し、これを利用することとした。本年度は、反転授業の実践において、このメタ認知尺度を用いた調査をおこなった。そこから、メタ認知の存在は明らかになった。アクティブラーニングにおいて、メタ認知の活動が進むことは分かった。一方で、授業を受けることによるメタ認知の変化について、定量的なデータを得ることが困難なことも明らかになった。何らかの変化が存在することは示唆されるものの、明確な結果を得ることはできなかった。メタ認知の活動は間接的な認知活動であり、指標を用いた調査が、メタ認知活動に関する活動を直接計測するものではないことによる。ただし、本研究からメタ認知の活動において、省察(Reflection)の重要性が示唆されることは分かった。このことから、我々は、アクティブラーニングの授業において、授業内の活動に省察を配置することを提案する。研究の成果については、大学教育学会、教育システム情報学会の年次大会や大学教育研究フォーラムにおいて公開し、内外の研究者らと意見交換を積極的におこなった。2010年以降、北米から始まった反転授業に注目が集まっている。反転授業は、ブレンド型と呼ばれる対面授業とオンライン型のe-ラーニングを組み合わせた学習形態である。国内の大学においても急速に、反転授業の実践が広がっている。反転授業が、学習において一定の効果があることは明らかになってきたが、詳細は明らかになっていない。反転授業が広がるのと時を同じくして、学習に対する理解が進み、学習を、浅い学習と深い学習に分けて考えるようになった。反転授業の研究においても、浅い学習と深い学習に対し、学習効果の検証をを模索することが顕著になっている。一方、反転授業は、ブレンド型の授業であるにも関わらず、教育システムからの研究は進んでいない。e-ラーニングのデザインが学習へどのように影響を与えているのかを明らかにすることは、今後の授業設計にとって重要である。本研究では、高等教育等の現場へ還元を目指し、反転授業の学習効果の検証や分析をおこない、汎用的な反転授業のデザインを構築することを目指している。研究の初年次である平成28年度では、反転授業の調査から始めた。反転授業の実践事例を収集し、分析をおこなった。協力者を募り、複数の事例を収集することが出来た。複数の授業から、アンケートを中心にデータを収集した。学習効果の検証に関しては、基本的な結果を得ることができた。つまり、浅い学習と呼ばれる、知識の伝達に関し、反転授業は効果が得られることが分かった。反転授業の授業形態は、オンライン学習の予習を必須とすることから、従来の対面式授業と比べ、学習時間が延びることが分かった。学習効果に対し、学習時間の延長の寄与が大きいと推測されるが、このことを、今後の反転授業のデザインに適切に組み入れることが重要であることが明らかになった。本研究は、e-ラーニングの研究という観点と、高等教育の実践研究の観点から、斑点授業の高度化を目指すものである。具体的には、反転授業の学習効果の検証と、反転授業のデザイン方法を明らかにすることを目指す。研究の初年次である平成28年度では、研究協力者を募り、反転授業の実践事例を集めた。斑点授業の調査をおこなった。平成28年度、複数の事例を収集することが出来た。複数の授業において、アンケートを中心にデータを収集することが出来た。学習効果の検証に関し、基本的な分析をおこなった。また、コンテンツ作成に関し、コンテンツ作成方法についての検討をおこなった。まず、学習効果の検証に関しては、基本的な結果を得ることができた。学習時間が延びることは、浅い学習に対して、大きな影響を与える。次に、コンテンツの作成に関し、実際の授業に用いるコンテンツの作成をおこなった。スタジオを用いたコンテンツ作成、簡易なコンテンツ作成をおこなった。また、作成したコンテンツを用いて、実際の授業をおこなった。コンテンツの作成方法の検討をおこなった。e-ラーニングの分類では、反転授業は対面授業とオンライン学習を組み合わせたブレンド型と呼ばれる学習形態である。一方で、反転授業はアクティブラーニングの一種としても受け入れられている。反転授業の普及が進む中、授業を実施する教員は、一定の効果を直観してきたが、学習効果の詳細は明らかになっていない。アクティブラーニングの研究において、学習に対する理解が進み、学習を、浅い学習と深い学習に分けて考えるようになった。

反転授業の研究においても、浅い学習と深い学習に対し、学習効果の検証をを模索することが顕著になっている。しかし、反転授業は、ブレンド型の授業であるにも関わらず、e-ラーニングの影響等を考慮した学習効果の研究は進んでいない。e-ラーニングのデザインが学習へどのように影響を与えているのかを明らかにすることは、今後の授業設計にとって重要である。本研究では、高等教育等の現場へ還元を目指し、反転授業の学習効果の検証や分析をおこない、汎用的な反転授業のデザインを構築することを目指している。本研究では、まず、研究協力者を募り、反転授業の実践事例の収集と、分析を目指した。結果として複数の実践事例に対する調査をおこなうことが出来た。質問紙の調査を中心にデータを収集した。1年目は、浅い学習と呼ばれる、知識の伝達に関する学習効果が得られることが分かった。2年目は、深い学習について効果が示唆されることが分かった。深い学習はメタ認知と呼ばれる活動の反映であると考えるに至った。そのため、深い学習の検証について、手法の検討が必要であることも明らかになった。3年目は検証方法を検討し、メタ認知と深い学習の関係を明らかにする。あわせて、ブレンド型授業としての反転授業のデザインについても検討する予定である。本研究は、e-ラーニングの研究という観点と、高等教育の実践研究の観点から、反転授業の高度化を目指すものである。具体的には、反転授業の学習効果の検証と、反転授業のデザイン方法を提案することを目指す。研究の初年次である平成28年度は、研究協力者を募り、反転授業の実践事例を集めた。アンケートを中心にデータを収集し、分析をおこなった。調査から、浅い学習と呼ばれる知識の伝達に関する学習について、反転授業は一定の効果が得られることが分かった。平成29年度も前年度に続き実践事例を募り、調査をおこなった。調査の結果から、深い学びについて、その効果が示唆されることが分かった。明確な指標を得るところまではいたらなかった。そこで、調査の方法を検討した結果、メタ認知の分析の手法を用いることとした。深い学びは、メタなレベルの認知と考えられる。直接、メタレベルの認知活動を測定することは困難であることが分かった。研究の成果については、内外の関連する学会等で発表をおこなった。例えば、京都大学高等教育研究開発センター主催の第24回大学教育研究フォーラム(2018年3月開催)において、企画セッションを開き内外の研究者らと議論を深めた。当該セッションでは指定討論者に大阪大学の三宮真智子教授を招き、アクティブラーニングにおける深い学びについて討論した。本研究では、反転授業の基盤となる授業デザインについての研究を目指すものである。反転授業の学習効果を明らかにし、学習の過程についての検討し、授業のデザインへ還元することを目指す。我々は、深い学習に着目した。
Ｔｏｌｌ様受容体とケモカインに着目した歯槽骨代謝機構の解明

Toll様受容体5リガンドであるフラジェリンを骨芽細胞様MC3T3-E1(E1)細胞に作用させたところ,ケモカインであるCX3CL1およびCXCL12 mRNAの発現が時間依存的に誘導された。また,フラジェリンとともにTNF-alphaやIL-1betaなどの炎症性サイトカインでE1細胞を刺激するとこれらケモカインの発現レベルはさらに上昇した。以上より,骨芽細胞はこれらケモカインを産生する主要な細胞の一つであることが示唆された。また,骨芽細胞は骨代謝に関係するだけではなく,局所における生体防御機構にも寄与しているものと考えられた。わが国では成人の多くが辺縁性歯周炎に罹患している。辺縁性歯周炎は進行すると歯槽骨の吸収を伴う疾患であり,それゆえ発生予防および進行抑制が重要となる。ケモカインは白血球遊走・活性化作用を有するサイトカインである。歯周疾患は慢性の経過をたどり,歯周組織には白血球の浸潤が認められる。それゆえ,ケモカインが歯周疾患の進行に関与していることが推測される。本研究では,これまではあまり注目されなかったものの歯周疾患の進行とともに増加する細菌であるTreponema denticolaが有するToll-like receptor5(TLR5)リガンドであるFlagellinに着目し,それらが誘導する種々のケモカインと骨芽細胞様MC3T3-E1(E1)細胞との関連を中心に据えた研究計画を設定した。今年度はこれまでの研究でFlagellinにより誘導することが示されたCCL2(MCP-1),CCL5(RANTES)以外にさらに他のケモカインの誘導が認められるか否かについて検討した。種々のケモカインmRNAのE1細胞における発現をreal-time PCR法にて確認したところ,CXCL12(SDF-1)およびCX3CL1(Fractalkine)mRNAの発現が認められた。さらにFlagellin(100 ng/ml)でE1細胞を124時間処理し,これらケモカインの発現に変化がみられるか確認した。その結果,CXCL12mRNAの発現については変化がみられなかったものの,CX3CL1mRNAは,処理後3時間をピークにその発現レベルが誘導され,その濃度依存性も確認された。また,E1細胞におけるCX3CL1の受容体であるCX3CR1mRNAの発現も確認できた。以上よりCX3CL1が歯周組織破壊を引き起こすサイトカインネットワークにおいて重要な役割を果たしていることが推測された。ケモカインは白血球遊走・活性化作用を有するサイトカインであり,歯周疾患の発症・進行に関与しているものと推測されている。本研究の目的は,歯周疾患の発生・進行に関与する細菌の一種であるTreponema denticolaが有するToll-like receptor 5リガンドであるFlagellinに着目し,それが誘導する種々のケモカインと骨芽細胞様MC3T3-E1( E1 )細胞との関連を明らかにすることである。昨年度の研究により, FlagellinがE1細胞においてCX3CL1の遺伝子誘導をもたらすことが示された。そこで,本年度は,まずそのタンパク発現についてELISA法を用いて研究を進めたが,その遺伝子発現から推測される状況とは異なる結果がもたらされた。そこで,その原因となっているものが何であるかをCX3CL1 mRNAの発現動態も含めて現在,検討しているところである。また,これまでの研究でFlagellinはE1細胞においてケモカインの一つであるCCL2を誘導することが明らかになっていたので,これに関する研究も並行して行った。FlagellinはE1細胞においてOPG mRNAの発現を抑制すること,およびCCL2の中和抗体を添加するとその抑制がさらに亢進されることがこれまでに示されていたので,今回はMCP-1によりE1細胞を刺激してOPG mRNAの発現についてreal time PCR法にて確認した。その結果,その発現は処理後3時間をピークに誘導されることが明らかになり,これまでの研究結果を裏付けるものとなった。研究の目的は、Treponema denticolaが有するフラジェリンに着目し、骨芽細胞に対する影響を明らかにすることである。昨年度に引き続き、本年度もフラジェリンが誘導するケモカインの発現動態についての研究を行った。最初にCX3CL1の動態について確認した。CX3CL1に関してはフラジェリンの添加がなくとも培地の交換等によりmRNAが経時的に変化し、これが昨年度の研究でもたらされたmRNA発現とタンパク発現の乖離につながったものと思われた。ただ、対照群と比較して有意差は認めなかったもののmRNA発現がフラジェリンにより上昇する傾向は認められたので、今年度も引き続きCX3CL1に関する研究を進めた。さらに、研究当初はmRNA発現の変化がわずかであったために着目しなかったCXCL12に関しても再度、研究を進めることとした。フラジェリンが誘導するこれらケモカイン発現に対する炎症性サイトカインの影響をみるためにTNF-alpha、IFN-gammaおよびIL-1betaで刺激しreal-time PCR法を用いて検討した。その結果、CX3CL1に関しては、いずれの炎症性サイトカインにおいてもmRNAの発現レベルが誘導され、中でもTNF-alphaおよびIL-1betaではその誘導が顕著であった。また、CXCL12に関してはIL-1betaで刺激したときのみ、そのmRNA発現レベルの上昇が認められた。歯周疾患の発生・進行を考える上では骨芽細胞を中心としたサイトカインネットワークを考慮することの意義が本研究から示唆された。

歯周疾患の進行抑制を実現するための方策を検討する上で今後はフラジェリンだけではなく、他のToll様受容体リガンドにも着目し、歯槽骨代謝に関する分子生物学的研究を継続していく必要があると思われた。Toll様受容体5リガンドであるフラジェリンを骨芽細胞様MC3T3-E1(E1)細胞に作用させたところ,ケモカインであるCX3CL1およびCXCL12 mRNAの発現が時間依存的に誘導された。また,フラジェリンとともにTNF-alphaやIL-1betaなどの炎症性サイトカインでE1細胞を刺激するとこれらケモカインの発現レベルはさらに上昇した。以上より,骨芽細胞はこれらケモカインを産生する主要な細胞の一つであることが示唆された。また,骨芽細胞は骨代謝に関係するだけではなく,局所における生体防御機構にも寄与しているものと考えられた。当初の予定では,CX3CL1の発現誘導に関して,情報伝達系の解析等を行う予定であったが,研究実績の概要で記載した通り,タンパク発現について予測した通りの結果が得られなかったたため,遺伝子発現についてもその結果が再現性のあるものかも含めて検討中であり,やや実験計画に遅れが生じている。ただし,CX3CL1 mRNAのFlagellinによる誘導自体は確認されているので,次年度以降ではすでに骨芽細胞の刺激を行っているCCL2とあわせてCX3CL1を用いた実験も遂行できるものと考えている。予防歯科学次年度はCCL2に関しては,MC3T3-E1細胞におけるOPG mRNAの発現が誘導されることは確認できたので,RANKLの発現に対して影響を及ぼすか否かをreal-time PCR法あるいはELISA法にて確認する。さらに,CX3CL1に関して,その発現動態がTNF-α,IFN-γ等の炎症性サイトカイン+Flagellinで刺激することにより変化がみられるかをreal-time PCR法等を用いて確認する。また,これまでに行う予定であったCX3CL1の発現誘導に関するメカニズムについてNF-κB,MAP kinase等に着目し,確認する予定である。また,Flagellin,CCL2,CX3CL1でE1細胞を長期間刺激し,石灰化が出現するか否かを検討する予定である。最終的には上述した研究結果をまとめ,CCL2,CX3CL1が骨代謝をめぐるサイトカインネットワークにおいていかに作用するのかを解析する予定である。今年度の研究の主目的は,次年度以降の研究において核となりうる未知のケモカインの同定であったが,概要に記載したようにCX3CL1がMC3T3-E1細胞において誘導されることがreal-time PCR法にて示すことが出来た。さらにその受容体もE1細胞に存在することが明らかとなった。よって,次年度以降はCCL2,CCL5に加えて,このCX3CL1をリガンドとして用いる各種実験が可能となり,今年度の終了時点として本研究はおおむね順調に進展しているものと考えられる。
免疫記憶の成立機構に関する転写因子レベルでの解析

獲得免疫成立の分化機構を転写因子(BCL6、BAZFやc-Fos遺伝子)のレベルで明らかにすることを目的とする。そのため胚工学技術を応用して、これらの遺伝子を欠損させたマウスや発現過剰にしたトランスジェニック(Tg)マウスを作製する。これらのマウスにワクチニアウイルスを感染させたときの脾臓やリンパ節におけるウイルス特異的リンパ球の分化異常を免疫学的に解析した。その結果、1)BCL6は抗原特異的メモリーCD8T細胞の分化維持機構を正に制御する。2)モリーT細胞は二次抗原刺激時に増殖能を主体とするcentral memory (TCM)と増殖せずにサイトカインを産生するeffector memory (TEM>の2種類に分画される。そこで、これら2種類のメモリーCD8T細胞の分化維持におけるBcl6の機能を、Bcl6-KOマウスや1ck-Bcl6トランスジェニック(Tg)マウスを抗原刺激することにより誘導されるメモリーCD8T細胞の種類やそれらを再刺激した後の細胞増殖能、サイトカイン産生能を調べることにより検討した。その結果、メモリーCD8T細胞をCD62L+とCD62L-に分画することにより、TCMとTEMに機能分画できることを明らかにした。また、これら両者のメモリーCD8T細胞におけるサイトカイン産生能には有意な差は認めなかった。3)免疫後のlck-Bcl6-Tgマウス由来メモリーCD8T細胞はCD62L+のTCMが主体をなしており、逆にBcl6-KO由来メモリーCD8T細胞は細胞増殖能が低いCD62L-のTEMが比較的多かった。
降水雲上部における氷晶粒子の成長過程と粒径分布の観測とモデル化

北海道東部内陸部に偏波ドップラーレーダを設置し、2011年2月から3月にかけて観測を実施した。同時に陸別町で雲粒子ゾンデを放球し、雲内部の粒子の観測を実施した。これにより低気圧と寒気の吹き出しに伴う降雪雲を観測した。MPレーダ観測からは降雪雲の力学的・雲物理学的構造を明らかにした。雲粒子ゾンデのデータから、雲内の氷晶粒子の大きさ、結晶タイプ、数濃度、粒径分布などの特性を明らかにした。これらの観測をもとに、粒径分布をモデル化した氷晶粒子の落下過程を雲解像モデルCReSSに導入した。1.北海道内陸部における観測計画観測:対流活動が弱く、雲頂高度の低い降雪雲を観測するために、北海道内陸部の陸別町と訓子府町にMPレーダーを設置し、2009年2月から3月にかけて観測を実施した。それと同時に陸別町では雲粒子ゾンデ・高層気象観測ゾンデを放球し、雲内部の粒子の観測を実施した。この観測期間に低気圧と寒気の吹き出しに伴う降雪雲を観測することができた。MPレーダー観測から、観測点を通過しつつ降雪をもたらした雪雲の時間変化と内部構造が調べられた。また、雲粒子観測から0度以下においても多くの雲粒子が存在し降水粒子の形成に寄与していることが示された。II.雲解像モデルを用いたシミュレーション:毎日の雲解像予報実験:MPレーダ観測期間中、雲解像モデルCReSSを用いた高解像度の毎日の気象予報実験を行った。このシミュレーションの結果を用いて、雲粒子ゾンデとMPレーダの観測をサポートした。雲粒子ゾンデ観測を行った事例のシミュレーション:雲粒子ゾンデで観測を行った雲について、さらに高解像度のシミュレーションを行い、雲粒子ゾンデの観測、およびMPレーダの観測との比較を行った。III.レーダ解析と雲粒子解析:MPレーダ観測からは、ドップラー速度、レーダ反射強度、および降水粒子についての様々なパラメータが得られた。対象とする背の低い降雪雲は、鉛直速度が小さいので、そのような雲について、2台のMPレーダのドップラー速度情報から、精度よく鉛直速度を求める方法を開発した。雲粒子を観測する接触型雲粒子ゾンデのデータから、氷晶粒子の大きさ、結晶タイプ、数濃度、粒径分布、および過冷却水滴の付着率が、観測された画像上でどのような特性を持っているのかを調べた。1.雲粒子ゾンデの解析厳冬期の北海道東部の内陸部で発生した降雪雲に対して放球した雲粒子ゾンデHYVISの観測した雲粒子画像を解析した。顕微鏡画像で観測された氷晶粒子を針状、板状、鼓状、その他の不明に分類し、高度毎の粒子の分布を明らかにした。このような粒子判別を自動的に行うための画像解析の方法を検討した。厳冬期の北海道東部の内陸部で昨年度実施した特別観測期間に、2台のマルチパラメータレーダーで観測された降雪システムについて、力学的構造と雲物理学的構造を調べた。なかでも特に4時間にわたって持続した降雪システムの詳細な解析を行った。2台のドップラー観測から、降雪システムの気流場を解析した。この降雪システムはエコー頂が3km程度で、高層観測から得られた湿度プロファイルに見られた高度3km付近の顕著な湿度の減少と対応していた。この高度より下はほぼ北風で、下層の弱い収束が降雪システムの前部と後部に見られた。この収束に対応して、降雪システムとしては非常に弱い上昇流(1ms^<-1>以下)が前部と後部に形成され、それによって降雪粒子が形成されていた。偏波パラメータの解析から、降雪システム内にはあられが存在しないことが示された。これは弱い上昇流と対応している。粒子情報に関するMPレーダパラメータから、上空では氷晶があり、下層では雪片が存在した。この降雪システムについて、雲解像モデルCReSSを用いてシミュレーションを行い、降雪システムの環境場を解析した。その結果、オホーツク海からの弱い北風内に降雪システムが形成されたことを裏付けた。昨年度に引き続いて、2011年2月8日28日に北海道東部の陸別町と訓子府町で実施したXバンド偏波レーダーと雲粒子ゾンデ観測の解析を行った。雲粒子ゾンデ観測では厳冬期にも関わらず、雲上部に大量の過冷却水滴が観測された。このような事例は3事例あり、それらに共通して雲頂付近に強い安定層が存在し、その直下に厚さ100200mの過冷却層が存在していた。この過冷却水滴の層は降水の形成だけでなく、雲頂部における放射過程に重要な役割を持つと考えられる。今後、この過冷却水滴層についての、放射伝達を計算し、これによる雲の冷却率を求める。上記の観測期間中、2011年2月27日に、観測点を弱い上昇流を持つ降雪バンドが通過した。

2台の偏波レーダーのドップラー機能から求めた上昇流は1m/s以下で、この弱い上昇流中における降雪粒子の形成過程を調べた。偏波レーダーを用いた雲内部の粒子判別から雲上部には扁平な氷晶が存在し、高度が下がるとともに雪片が存在する構造であることが推定された。これを雲内部に放球した雲粒子ゾンデの画像、及び地上における降水粒子の接写観測と比較し、偏波レーダーからの推定が妥当であることが確認された。これらのことから内陸部で形成された降雪バンドでは、あられが形成されず、氷晶と雪片による降雪機構であることが示された。雲解像モデルCReSSの氷晶過程について、氷晶粒子の落下のインパクトを調べた。その結果、氷晶粒子を落下させることで、雲頂高度の予報が改善され、降水量について少ないながらも増加がみられること、さらに雲内における降水形成過程が変化することが明らかにされた。また、放射過程を通して台風の強度に大きなインパクトがあることを示した。この結果を踏まえて、粒径分布をモデル化した氷晶粒子の落下過程を雲解像モデルCReSSに導入した。雲粒子ゾンデHYVISで得られる雲粒子の画像解析の方法を開発するにあたって、鮮明でない画像や、粒子を付着させるためのシリコンオイルのにじみや筋をどのように除去するかが問題である。また、解像度の限界にある粒子の判別が難しく、自動的に画像解析を行うことの障害となっている。これらの問題を解決する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。雲粒子の画像解析については、鮮明でノイズの少ないものについて、ある程度の自動判別を行い、これまで行ってきたように人の目での解析を組み合わせることで最終的な判別とすることを検討する。雲粒子ゾンデHYVISの解析については、粒子の粒径分布を調べるのは限定的にして、粒子の種類の分布に重点をおいて解析する。シミュレーションについては、より高解像度の実験を行い、その結果で粒子分布を観測と比較することに重点を置いて解析を行う。
疾病研究に資するポリADP-リボース高精度化学合成法の構築

本研究計画は、平成27年度のみの単年度研究であり、期間内に効率的なPAR化学合成工程を確立した。短期間なので、まずは直鎖状PARの合成に集中し、最適な反応条件を探索した。DNA固相合成法の一つであるホスホロアミダイト法に準拠して、PAR化学合成法を構築した。リボシルアデノシンは、連結予定部分の水酸基を弱い酸条件で加水分解可能なジメトキシトリチル基で保護し、その他の水酸基・アミノ基は担体からの切り出しの工程で同時に脱保護可能なベンゾイル基で保護した。他にも、スターターとしてのリボースとキャッピングとしてのアデノシンの保護体も用意した。PAR合成サイクルを経て、PAR二量体を得た。ポリADP-リボース(PAR)の化学合成工程を確立する。加えて、任意のサイズ・構造の合成PARに非天然修飾を付与し、これらを用いて、化学標識PARの創出やPAR認識タンパク質の捕捉へ研究を展開する。正しくPARの機能を理解するためには、正確な構造のPARを用いる必要がある。しかし、酵素を用いてPARを作製しようとする限り、様々な重合度を持つPARの混合物でしか得られず、1種類のPARを得ることはできない。任意の構造のPARを純品で用意するには、合成化学的な工程を経る必要がある。生物学的合成単位にこだわらないチャレンジングな基質設計をしPAR合成へのDNA化学合成系の転用によって斬新なPAR入手法を提案する。DNA固相合成法の一つであるホスホロアミダイト法に準拠して、効率的なPAR化学合成法を構築した。PARのピロリン酸部分が単量体合成段階における反応条件や精製条件に脆弱であるため、本来のPARの単量体であるNAD+単位を単量体とせず、ピロリン酸部位の前後で順次結合を作った。リボシルアデノシンと二亜リン酸は、連結予定部分の水酸基を弱い酸条件で加水分解可能なジメトキシトリチル基で保護し、その他の水酸基・アミノ基は担体からの切り出しの工程で同時に脱保護可能なベンゾイル基で保護した。PAR合成サイクルを経て、ADP-リボース2量体までを得ることができた。生物有機化学
内分泌撹乱物質の評価システムの構築

動物個体に対する内分泌撹乱物質の影響を評価するには,その作用メカニズムの解明が必要である。従って,本研究では生殖腺の分化を支える分子メカニズムに付いて検討した。性分化の分子メカニズムを解明するために,主に未分化生殖腺から性分化時期の生殖腺に発現する転写因子に焦点を当て,その機能と発現調節機構を明らかにすることを目的に行なわれた。我々は既にAd4BP/SF-1と相互作用する因子を酵母two-hybrid screeningによって単離してきた。これらの因子の中で胎仔生殖腺に特異的に発現するもののうち,構造上転写因子であることが期待される因子に付いて検討を行なった。そのうちの一つがPaired type homeo boxを有するaristalessと類似のArxであった。本因子は生殖腺の性分化時期には間質細胞に発現し,後に間質細胞の他にperitubular cell,血管内皮細胞などに発現するが,ライディッヒ細胞にはその発現は認められなかった。Arx遺伝子破壊マウスの生殖腺を調べたところ,野生型マウスに比べ小型で,間質に形態上の異常が観察された。また,各種マーカー遺伝子の発現から,セルトリ細胞は正常に分化しているが,ライディッヒ細胞の分化は阻害されていることが明らかになった。一方,我々はX-linked lissencephaly and ambiguous genitalia(XLAG)の患者DNAを調べることで,Arx遺伝子における変異が本疾患の原因遺伝子であることを明らかにした。これまでに10人の患者に付いて調べたところ,9人に本遺伝子内に変異を同定した。これらの多くはturancation typeの変異であったが,中には点変異も含まれており,本因子の機能を調べる上で貴重な情報となることが期待される。現在,本因子の機能を調べる目的で人患者に見い出された変異を有するARXを作製し,そのDNA結合能や転写活性可能に付いて検討しているところである。生殖腺の発生メカニズムに関する研究はWT-1、Ad4BP、SOX-9、DAX-1、EMX-2、GATA-4などの生殖腺の形成に不可欠な転写因子の同定により大きく進展した。これらの因子は生殖腺形成過程の極めて早い時期から発現し、各々特徴的な性依存的発現を示すことが知られている。これらの因子はいずれもその発現異常によって生殖腺の形成に欠損を生じることから、その発現様式や発現量は正常な生殖腺の形成にとって重要であると推測される。内分泌撹乱物質が生殖腺や付属生殖器官の形成に影響を与えることは、既に動物実験などで証明されているがそのメカニズムについては未だ不明な点が多い。我々の予備的な実験によると、内分泌撹乱物質は胎仔生殖腺におけるAd4BPの発現量を減少させることが明らかになっている。従って、その作用は生殖腺の形成に不可欠な転写因子の発現異常を招くことを通じて引き起こされるものであることが推測される。このような観点からこれら転写因子の胎仔生殖腺における発現量を正確に定量することは、内分泌撹乱物質の生殖腺に対する影響を評価するためには不可欠であると思われる。本研究はこれらの転写因子の発現量を簡便かつ再現性良く定量する系を構築することを目的に行われた。サーマルサイクラー社製のライトサイクラーを用いて、微量RNAからの再現性良い定量系を確立することが出来た。この定量系を用いて代表的な内分泌撹乱物質を母体へ投与したところ、胎仔生殖腺におけるP45017alphaの発現量が大幅に減少することが明らかになった。しかしながら、この遺伝子を制御するAd4BPやDax-1などの転写因子の発現が顕著に変動することはなかった。

現在更に詳細な検討を行っているところである。内分泌撹乱物質の生殖腺形成に与える影響を明らかにするためには,その作用メカニズムを解明することが重要である。本研究では生殖腺の形成初期過程で発現する種々の転写因子やエストロジェンレセプターを研究対象として,その発現やリガンド類似物質の影響を検討するアッセイ系を確立するものである。本年度はエストロジェンレセプターに対するリガンド類似物質の結合強度をアッセイするシステムを構築した。本研究においては分子間相互作用を鋭敏に検出することが可能なビアコアによるアッセイを行った。センサーチップ上にエストロジェンレセプター結合配列をもつビオチン化オリゴヌクレオチドを結合させ,各種物質の存在下におけるエストロジェンレセプターのDNA結合能を調べた。これまでに知られている種々のエストロジェン様物質はエストロジェンレセプターのDNA結合能を濃度依存的に促進させることが明らかになった。このことは,本アッセイ系を用いることで,各種化学物質がエストロジェン様作用を示すか否かを極めて簡単に調べることが可能となった。アンドロジェンレセプターを用いて,同様のアッセイ系を構築することを試みているが,アンドロジェンレセプターがバキュロウイルスを用いた発現系ではDNA結合活性を有する状態では発現しないことが分かり,現在更に検討中である。また,生殖腺形成過程でAd4BP/SF-1やDax-1などの核内受容体が発現することが知られているが,これらのリガンドはこれまでのところ不明である。同様のアッセイ系を用いリガンドの検索を行っているが,Ad4BP/SF-1の蛋白質としての不安定性のため再現性のある結果を得ることが困難な状態である。このことは,リガンド非存在下における本因子の特徴かもしれず,今後の検討課題である。動物個体に対する内分泌撹乱物質の影響を評価するには,その作用メカニズムの解明が必要である。従って,本研究では性分化の分子メカニズムを解明するために,主に未分化生殖腺から性分化時期の生殖腺に発現する転写因子に焦点を当て,その機能と発現調節機構を明らかにすることを目的に行なわれた。我々は既にAd4BP/SF-1と相互作用する因子を酵母two-hybrid screeningによって単離してきた。これらの因子の中で胎仔生殖腺に特異的に発現するもののうち,構造上転写因子であることが期待される因子に付いて検討を行なった。そのうちの一つがPaired type homeo boxを有するaristalessと類似のArxであった。本因子は生殖腺の性分化時期には間質細胞に発現し,後に間質細胞の他にperitubular cell,血管内皮細胞などに発現するが,ライディッヒ細胞にはその発現は認められなかった。Arx遺伝子破壊マウスの生殖腺を調べたところ,野生型マウスに比べ小型で,間質に形態上の異常が観察された。また,.各種マーカー遺伝子の発現から,セルトリ細胞は正常に分化しているが,ライディッヒ細胞の分化は阻害されていることが明らかになった。