hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
咀嚼機能の変化が全身の健康状態に及ぼす影響に関する縦断調査

また、この傾向は、咀嚼に関する高齢者自身の主観的な自己評価とPGCモラールスケール値との間にも認められた。また、高齢期の全身の健康状態に大きな影響を当たる生活習慣との間には、食事ならびに間食摂取などの食生活に関するものが、特に咀嚼機能と大きく関係していた。本研究の結果より、咀嚼機能の向上は食生活状況の改善を通して、最終的に全身の健康状態の向上に寄与するとの仮説が構築された。次年度以降は、経年的変化を追跡しながら、初年度でのcross-sectional調査で得られた仮説を立証していく予定である。本研究の目的は、高齢期の咀嚼機能が全身の身体的・精神的・社会的健康状態にどのような影響を及ぼしているかを調べることである。初年度の研究結果より、ADL低下の初期段階より咀嚼機能の低下が観察されたことより、2年次の本研究では、特に虚弱老人の咀嚼機能に着目して調査を行った。対象者として、宮崎県延岡市内に居住している健康老人100名と虚弱老人100名を用いた。年齢と性別については両群間でマッチングさせた。咀嚼機能を評価するために、ここでは感圧フィルムを用いたプレスケール法による最大咬合力、現在歯数、咀嚼スコア等の測定を行った。また、移動、食事、着衣、入浴、排泄の基本ADLと、より高次の生活活動能力についても老研式生活活動指標を用いて評価した。さらに、精神的健康状態をみるために改訂長谷川式簡易知能評価スケール(HDS-R)を用いて評価した。社会的健康状態については、PGCモラールスケールを用いて評価した。データ解析の結果、現在歯数に関しては虚弱老人と健康老人の間に有意差は認められなかったが、最大咬合力については虚弱老人において有意に低い値を示した。このことは、虚弱老人では現在歯数の減少が表面上認められなくても、ADLの低下の初期段階より先行して咬合力が低下する可能性を示唆していた。また、HDS-Rスコアを用いて高齢者の知的機能と咀嚼機能との関連性を調べたところ、両者の間に有意な関連性が認められた。このことは、咀嚼機能と脳機能に関する基礎的研究結果を裏付けるものであり、今後追跡調査の必要性があると考えられた。また、昨年同様、PGCモラールスケールで評価されたQOLの3つの階層(心理的動揺・安定に関わる因子、老化に対する態度に関する因子、孤独感・不安感に関わる因子)のうち、特に「老化に関わる因子」が咀嚼機能と強く関係していた。本年度では、昨年度より調査を行っている高齢者の認知機能と咀嚼機能との関連性について、より詳細な分析を行った。また、本年度は本研究の最終年度にあたるため、今までに蓄積された断面調査のデータを用いて縦断研究を行い、高齢期の咀嚼機能の変化と全身の健康状態の変化との関連性を調べた。まず、認知機能と咀嚼機能の関連性であるが、年齢、基本的ADL、性別などの交絡要因を除くために、これらの要因についてマッチングさせて解析を行った。対象者は44名の痴呆老人と44名の非痴呆老人であった。この両群において、最大咬合力、咬合面積、現在歯数、摂取可能食品から求められた咀嚼スコアについて調べたところ、非痴呆老人群は痴呆老人群と比較して有意に高い咀嚼機能評価値を示した(P<0.05)。次に、縦断研究の結果であるが、研究期間内に認められた咀嚼機能の変化が、老研式活動能力指標で評価された高次ADL、HDS-Rで評価された認知機能ならびにPGCモラールスケールで評価されたQOLレベルとどのような関連性を有するのかを調べた。咀嚼機能の変化については、最も客観性に優れ、歯科治療などの咬合・咀嚼機能の変化を鋭敏に反映する最大咬合力を指標として、「咀嚼機能上昇群」、「変化なし群」、「低下群」の3群に分けた。その結果、咀嚼機能の変化は、高次ADLならびに認知機能の変化と有意に関係していた(P<0.05)。すなわち、咀嚼機能が低下した者に、高次ADLや認知機能が低下した者が多かった。一方、咀嚼機能変化とQOL変化との間には有意な関連性は認められなかった。
開放端磁場における電子サイクロトロン共鳴加熱による捕捉電子の生成

開放端磁場に沿った熱流制御として、サーマルダイクを検討した。エンドプレートからでた2次電子に電子サイクロトン共鳴加熱(ECRH)を行うことで、2次電子がプラズマ閉じこめ領域に入るのを抑制し、高温電子との粒子交換を抑え、熱流損失を軽減する。しかし、エンドプレートの負電位により跳ね返された高温電子もECRHを受けると、熱流損失の軽減が予想通りにはいかなくなる。このため、高温電子加熱について詳細な研究を行った。電位モデルとECRH応答関数を用いて、開放端磁場に沿って逃げる高温電子が、エンドプレートの負電位により反射されたのちECRHを受けると、その8割が端部において磁場と電位中に捕捉される捕捉電子になることを示した。捕捉電子は多重加熱を受け、その半分はエンドプレートに達する。その結果、現在の実験状況では、エンドプレートでみた熱流はサーマルダイクによりわずかに増加する。電位モデルによると、捕捉電子量が増えると、端部の途中の電位は降下する。実験面では、静電プローブを用いて、サーマルダイクをおこなった時の端部の電位の変化を観測した。また、熱電対と赤外線カメラを用いて、エンドプレートの温度上昇を観測した。その結果、サーマルダイクにより、エンドプレート前面1mの電位が降下した。エンドプレートの温度上昇は、サーマルダイクがない場合と顕著な差は見られなかった。熱流制御の他の方法であるメッシュバイアスでは、明らかに温度上昇が減っている結果が得られている。これらの実験結果は、上で示したサーマルダイクの高温電子加熱による捕捉電子生成の結果と考えて矛盾はない。高温電子加熱を抑えるには、加熱共鳴点のドップラーシフトを利用し、磁場の形状を変えることで達成できる。
新奇二元機能電極触媒の創製と一体化再生型燃料電池の革新

1では、研究期間で確立した最適方法でTiOxNy/ACを作製した。HERに対する2と3について、構成元素の化学状態をX線光電子分光法で調べ、ガスクロマトグラフィーを使用した水素生成量の測定結果との相関を調べた。そして、TiOxNy/AC中のTiONとTiNの比と水素生成量に関係を見出し、TiおよびNの化学状態がHER活性を決定する一つの主要因であることを明らかにした。そして、HERに対するTiOxNy/ACの触媒作用機序において、Nが反応活性点となっている可能性も見出した。また、ORRに対する2と3の研究も進め、熱窒化温度の上昇にともないTiOxNy/ACのORR開始電位は貴になり、900°Cの熱窒化処理で0.7 V以上とACに比べて貴であることを明らかにし、TiOxNyがORRへの触媒として作用することを見出した。さらにORRへの触媒作用機序を明らかにすべく、Koutecky-Levichプロットによる解析を行い、反応電子数は概ね2と推定できた。以上、TiOxNyのHERとORRへの触媒作用機序を明らかにする研究目的に対して、HERにはNが反応活性点となっている可能性を、ORRにはTiOxNyが反応活性点で、反応電子数は概ね2であることを初めて見出した。4について、2と3に時間を要したため、I-URFCの原理確認を行うことを最優先とし、硫酸水溶液を電解液としたI-URFCセルを組み立て、HERを行った後にORRを行うことに初めて成功し、I-URFCの原理を確認できた。当初の研究計画にしたがい、活性炭への酸化チタン(TiO2)担持と熱窒化により1TiOxNy/ACの作製に取り組み、2その水素発生反応(HER)と酸素還元反応(ORR)触媒活性測定を行い、3両反応への触媒作用機序の解明に着手した。1では、“ヤシ殻粉末状活性炭(AC)"に、チタン源であるフッ化チタン酸アンモニウム水溶液とホウ酸水溶液を用いてTiO2粒子を担持させる方法について検討を行った。TiO2の担持状態を電界放出型走査型電子顕微鏡(FE-SEM)で観察した結果、活性炭をホウ酸水溶液に分散させた後にフッ化チタン酸アンモニウム水溶液を加える方法で、AC上でのTiO2の担持状態が最も良好と判断できかつ担持量が30wt%強と最も高くなることがわかった。次に、アンモニア気流中で加熱処理する熱窒化処理により、TiO2/ACを熱窒化させた。窒化が有意に進むと考えられる700°C以上の任意の温度で処理を行った後、X線回折法やX線光電子分光法などで窒素導入状態について調べた結果、800°C以上で明確にTiO2からTiOxNyへと組成が変化、すなわちAC上のTiO2の窒化が進むことが明らかとなった。計画書通り、窒素量を全自動元素分析装置で測定したが、有効な結果が得られなかったと判断されたため、以降はX線光電子分光法で推量することとした。2についても計画書通り、作製したTiOxNy/ACのHERとORRの触媒活性測定をデュアル電気化学アナライザーと回転電極装置を用いて行った。電解液として過塩素酸水溶液を用いて測定を行った結果、HERへもORRへも二元機能的に触媒活性を示すことを明らかにした。3についても計画書通り、両反応への触媒作用機序の解明を目指して、HERへのTafel解析ならびにORRへのKoutecky-Levich解析についても着手を開始し、相関についての検討を始めた。当初計画通りに研究を計画スケジュールに沿って進めることができている。なお、当初計画ではTiO2の熱窒化処理後の窒素量について、全自動元素分析装置で行うこととしており、その装置を借用して実際に測定を行ったが、X線光電子分光法での測定も行って検討した結果、後者の結果からの推量の方がベターと考えられたため、現在その分析手法を用いて研究を進めている。4について、2と3に時間を要したため、I-URFCの原理確認を行うことを最優先とし、硫酸水溶液を電解液としたI-

URFCセルを組み立て、HERを行った後にORRを行うことに初めて成功し、I-URFCの原理を確認できた。本研究については、活性炭を触媒の構成材料として用いている。活性炭には数多くの種類があるが、日本で最大の活性炭メーカーと共同研究関係が構築できたため、今後は同社から活性炭の提供を受けて、触媒作製ならびに評価を進めることができるようになったことが一点目として挙げられる。素性が明らかな活性炭を用いて研究を進めることで、より良い二元機能性を発現する触媒の作製が可能もしくは設計指針が得られることが期待できる。二点目として、水素生成反応に対する触媒活性を評価するにあたって、Tafel解析を進める予定であったが、難しさが出てきている。そこで、まず実測可能な反応開始電位(過電圧)との関係性について調べることで対応したいと考えている。研究計画書に記載の通り、本研究の実施に必要な物品としてデュアル電気化学アナライザーを購入した。その他物品を購入しなかった理由として、日本で最大の活性炭メーカーと契約を締結して、活性炭の提供を受けることができるようになったこともあり、活性炭粉末を購入する必要がなくなったことが挙げられる。旅費については学会発表分を見込んでいたが、結果として企業との共同発表となったため、旅費を本経費から支出する必要がなかったので執行していない。人件費、その他についても執行する必要が本年度はなかった。いずれの使用予定額についても、来年度以降、研究の実施と学会での成果発表や論文投稿などに必要な経費として適宜執行する予定である。
日本の文脈におけるビデオゲームのローカライゼーション

本研究課題「日本の文脈におけるビデオゲームのローカライゼーション」は、日本のビデオゲームの「ローカライゼーション」の現状と実態を「社内ローカライゼーション」という形態に着目して、解明するものである。本研究の目的は大きく分けて三つある。第一に、日本のゲームの海外における受容を翻訳およびローカライゼーション(現地化)という新たな観点から考察することである。第二に、既存のトランスレーションスタディーズ(翻訳研究)のディシプリンに対して、まだ研究の蓄積が少ない、マルチメディアや視聴覚メディアの翻訳の実例を提供することである。それはこのディシプリンに大きなインパクトをもたらすと予想される。そして第三に、「社内ローカライゼーション」のためにはどのような社内体制や社員の雇用・教育が必要であるのかを明らかにして、日本のゲーム企業に対し、将来の経営管理の指針を示すことである。本研究は、いまだ研究蓄積が少ない、マルチメディアや視聴覚メディアの翻訳の実例を提供するものとして、大きなインパクトをもたらすことが予想される。初年次である本年度は、主に文献調査を通じて研究計画の策定を行った。その際、ビデオゲームを対象とした研究に加えて、グローバル企業やNPOといった組織内での翻訳(者)の位置付けに関する研究など、翻訳研究(トランスレーションスタディーズ)の最新の成果も取り入れた。また関東および関西で、日本国内のゲーム企業で翻訳に従事するクリエイターに対するインタビュー調査を開始した。これは次年度に本格化させる予定である。本研究課題はおおむね順調に進展している。来日直後の研究分担者に、日本国内での研究発表の機会を与えることができた。最終年度となる次年度も当初の研究計画通りに推進される。すなわち、日本国内のゲーム企業へのインタビューを行い、そのデータを英語に翻訳し、分析する。また論文執筆と研究成果発表を行い、ゲーム研究および翻訳研究の国際学会に参加して報告とネットワーキングを行う。
ＨＣＮ２遺伝子異常により発症する熱性けいれんのｉＰＳ細胞を用いた病態解明

熱性けいれん患者より発見された過分極活性型環状ヌクレオチド依存性チャネル(HCN)変異遺伝子をiPS細胞と神経系の細胞に遺伝子導入し、神経分化に伴うHCN2の働きの変化をパッチクランプ法を用いて検討したところ、ラット海馬CA1細胞において変異型ではコンダクタンスが上昇していた。また細胞内のチャネル蛋白の分布については、PC-12において細胞膜への移行が確認された。動物神経細胞実験においても培養細胞と同様の結果が得られ、今回の研究はこの遺伝子変異をもつことにより個体が熱性けいれんを発症しうる可能性を示唆した結果になり、熱性けいれんの病態解明の一助になることが大いに期待されるものである。当初の計画では、平成25年度にHCN2変異体遺伝子を導入した培養細胞、ラット海馬細胞を使用し、パッチクランプ法を用いてHCN2チャネル活性の評価を行い、変異型HCN2遺伝子と野生型の比較を行う予定であった。また「熱性けいれん」と同様の環境による実験を行う予定であった。さらにPC-12やCA1細胞を使用しマーカー遺伝子を用いて変異型HCN2チャネルの組織内分布も観察する予定であった。しかし、HCN2変異体遺伝子を導入したラット海馬細胞の状態が悪く、活性評価の実験期間が長引いている。上記の実験と平行する形で、以前から進めていたHCN2変異遺伝子についての実験結果をまとめ平成25年度、論文発表した。この実験では、患児と母親に発症が認められた家族性熱性けいれんにおいて、HCN2の遺伝子変異が発見されたことから、この変異が熱性けいれん発症に重要な役割を果たしていると考え活性評価を行った。HCN2変異蛋白を発現させた培養細胞を使って電気生理実験を行った結果、ホモ変異型ではコンダクタンスが上昇していた。また熱性けいれん時の体温変化の状態に似せるため細胞外液の温度を変化させ活性化電位の移動度を検証したところ、ホモ変異型では野生型と比べ著明に脱分極側に移動していた。またactivation kineticsについてはホモ変異型、ヘテロ変異型共に野生型と比べ有意に減少していた。以上の結果からこの変異体は温度感受性が野生型と異なることが示され、今回発見されたHCN2変異は熱性けいれん発症の引き金になる可能性が示唆された。これらの結果は平成25年度、PLOS ONEに掲載された(2013年, Volume 8, e80376)。今回の発表は熱性けいれんの病態解明の一助になることが大いに期待されるものである。当初の計画では、平成24年度にHCN2変異蛋白の発現分布を観察する目的でHCN2変異体遺伝子を培養細胞、ラット海馬CA1細胞に導入予定であった。まずエレクトロポレーション法にて導入を試みたが予想していた蛋白発現を得ることが出来なかったため、原因の解明同定を試み、予想以上の時間を費やした。現在はウイルスベクターを用いて遺伝子導入を試みている。上述の実験と平行する形で、以前から実験を進めていたHCN2変異遺伝子のヘテロ発現実験を行った。この実験ではHCN2変異蛋白を発現させた培養細胞を使い、灌流液の温度を熱性けいれん時の体温変化と同様な温度(35度から38度)に設定して実験を行い、野生型、ホモ変異体、ヘテロ変異体と三者を比較し、変化が見られるかを検証した。この実験の結果、野生型とヘテロを比較した際、活性化電位に有意差は認められなかったが、活性化時の時定数においてヘテロでは野生型と比べ有意に減少していた。この傾向はより生理学的な電位(脱分極電位)付近において顕著であった。また35度から38度の間について温度・コンダクタンスの相関について評価した際、ヘテロでは野生型とは明らかに異なる傾向が示されたため、この変異体は温度による特別な修飾を受けている可能性が示唆された。以上から、今回用いたHCN2変異体はヒトにおいて熱性けいれん発症の原因となる可能性が示唆された。以上の実験結果についてまとめ、現在論文投稿中である。熱性けいれんは病因に諸説あるが、未だに原因の特定されていない疾患の一つである。そして熱性けいれんとHCN2変異遺伝子の直接的関連を示すデータは現在まで発表されていない。今回の実験は熱性けいれんの病態解明の一助になることが大いに期待されるものであり、このHCN2変異体の実験は非常に意義のあるものと考えられる。今年度は(1)HCN2変異体遺伝子をラット海馬細胞に導入(2)パッチクランプ法を用いてHCN2チャネル活性の評価を行い、変異型HCN2遺伝子と野生型の比較を行った。また、(3)PC-12やCA1細胞を使用し変異型HCN2チャネルの組織内分布も観察した。

さらに(4)変異型HCN2遺伝子をiPS細胞から分化した神経幹細胞球に導入し分化誘導を行った。(1)、(2)、(3)の実験の結果、ラット海馬CA1細胞における機能評価では、培養細胞と同様の結果(変異型では野生型よりもコンダクタンスが上昇していた)が得られた。また細胞内の分布については、PC-12において細胞膜への移行が確認された。(4)については変異型HCN2遺伝子をiPS細胞から分化した神経幹細胞球に導入する過程が非常に困難であったため予定通りに進行せず大幅に遅れ現在分化誘導中であるため現時点で比較が困難な状態である。以上の結果から動物神経細胞においても培養細胞と同様の結果が得られた。このことから今回の研究は熱性けいれんが個体レベルでも起こりうる可能性を示唆した結果になり、熱性けいれんの病態解明の一助になることが大いに期待されるものである。また今年度は前年度に発表した論文(HCN2変異遺伝子についての実験結果をまとめ、PLOSONEに発表2013年, Volume 8, e80376)についての発表(生理学研究所)、講演(名古屋市立大学)を行った。パッチクランプ法を用いたイオンチャネル電流の測定ならびに電気生理学的解析当初の予定では、平成25年度中に(1)培養細胞、ラット海馬CA1細胞への遺伝子導入(2)発現チャネルの評価、(3)iPS細胞の樹立・神経細胞分化、を行う予定であった。しかし、変異遺伝子を導入した海馬細胞の状態が悪く、状態を良くするために条件検討を何度も行い多くの時間を費やした。以上の理由から現在(2)の途中であるので「やや遅れている」を選択した。当初の予定では、平成24年度中に(1)培養細胞、ラット海馬CA1細胞への遺伝子導入(2)発現チャネルの評価、の二項目を行う予定であった。しかし、当該年度にエレクトロポレーション法にて遺伝子導入を試みるも予想していた発現量を得ることが出来なかったため、うまくいかなかった原因の洗い出しを行った。原因の同定のため予想していたよりも多くの時間を費やした。以上の理由から現在(1)の途中であるので区分は「やや遅れている」を選択した。当初の予定では平成25年度中に遺伝子導入と発現チャネルの評価、iPS細胞の樹立を行う予定であったが、現時点では発現チャネルの評価の段階である。このため引き続き発現チャネルの評価を行い、この実験の終了後iPS細胞の樹立を引き続き行う。使用するiPS細胞については、申請者が以前所属していたてんかん分子病態研究所において既にiPS細胞の樹立神経幹細胞球のストックまで完了しているのでこれを使用する。FGF-2などの神経成長因子・誘導因子を投与し神経分化・誘導を進める。また、上記実験が予定通りに進展しない場合も考えられるので、並行して研究代表者の所属する研究室にて発見されたCaチャネル遺伝子変異の機能評価も併せて行う。当初の予定では平成24年度中に遺伝子導入と発現チャネルの評価を行う予定であったが、現時点では遺伝子導入の途中の段階である。このため引き続きウルイスベクターによる遺伝子導入を行い、これが成功すれば発現チャネルの評価を引き続き行う。発現チャネルの評価については、パッチクランプによる電気生理学的手法を用いて全細胞電流の測定と活動電位の測定、共焦点顕微鏡によるチャネルの発現分布評価、ウエスタンブロットによる蛋白発現量の比較を行う予定である。
ヒト細胞高生着・分化・増殖NOD-scid,γKOマウスの実用化に関する研究

NOD/Shi-scid,γKO(NOG)マウスの実用化評価のために行われた研究の結果、1.NOGマウスの生産指数、産仔回数などの生産効率を検討した結果、NOD-scidと変わらない効率を示すことが分かった。さらに、現在体重、臓器重量などの本マウスの経時的な基礎データの採取を継続して行っている。2.NOGのヒト細胞高生着性に関連する細胞を検索した。その結果、CD11c^+およびCD11b^+細胞をそれぞれ除去した細胞でも生着性は高く、それら以外の細胞群の可能性も考えられ、現在まで特定されるに到っていない。3.NOGマウスへのヒト臍帯血由来幹細胞移入によって、CD4+,CD8+ T細胞が分化する。また、B細胞も分化し、ヒト型抗体を産生する。その他の細胞においても、高分化・増殖性は様々な研究者によって確認され、このマウスがヒト造血モデルとして最適であることが立証された4.ヒトPBMCを生着させたこのマウスで、HIV-1の増殖が極めて高いことが分かった。5.NOGマウスの耳介後部にHTLV-1感染細胞を移植すると、極めて短期間で著名な腫瘤を形成し、かつ他臓器への搬種が認められた。6.このマウスにmyeloma cell lineであるU266細胞を静脈内投与すると、移入後7日でマウス骨髄のみにhomingし、かつ増殖することによって、ヒトの場合と同様な広範な骨破壊・脊髄叢への侵入による下肢麻痺を引き起こすことが明らかとなった。7.また、このマウスでは従来のSCIDマウスやNOD-scidマウスと比較して、初代腫瘍細胞の生着が極めて高いことが明らかになったばかりでなく、種々の腫瘍細胞の転移が認められ、腫瘍転移実験系としても優れていることが明らかとなった。本研究期間中に、NOGマウスがヒト細胞の分化増殖のアッセイばかりでなく、ヒト疾患モデルとして極めて有用であることが明瞭となった。NOD/shi-scid,γK0 (NOG)マウスの実用化の価値評価のために、ヒト臍帯血由来CD34+細胞またはヒト末梢血単核球の移入し、従来の抗NK抗体(抗asialo GM1または抗IL-2b)処置NOD/Shi-scidおよびJackson研究所由来NOD/LtSz-scid,β2m KOマウスとの比較で、ヒト細胞の分化、増殖の程度を検討した。その結果、NOGマウスは他2マウスと比較して極めて優れた生着性を示した。特に従来困難とされていたヒトCD34+細胞から、ヒトCD4+またはCD8+細胞が高率に分化し、末梢血でも十分に検出可能であることは驚く結果であった。また、ヒト型抗体の検出も可能であった。この高生着性には、γ遺伝子を欠損することによるT, BおよびNK細胞以外の細胞の機能欠損が関連していることが一連の実験から明らかにされた。このNOGマウスの応用例として、ヒト末梢血を移植後、HIVを接種すると高ウイルス血症が誘導され、腹水、脾臓、血中のCD4陽性T・細胞が特異的に破壊された。このマウスにLPSを接種すると感染細胞が中枢神経内への侵入し、神経細胞にアポトーシスが誘導されるエイズ脳症モデルとなりうることがわかった。また、従来3ヶ月以上を要したHTLV-

1感染細胞の生着性も極めて高く、移植後3週問程度で大きな腫瘍隗を形成し、また末梢血中にも白血化の状態で認められ、HLTL-l動物モデルとして極めて有用であることが分かった。ヒト腫瘍株の増殖性も極めて高く、従来のSCIDマウスと比べて、極めて短期問で腫留を形成した。以上の結果から、ヒト細胞の生着性が極めて高く、今後の再生治療等を含む異種細胞、組織を生着させることによって行う実験に極めて有用な動物であることが明かとなった。NOD/Shi-scid,γKO(NOG)マウスの実用化評価のために本年度に行われた研究の結果を概述する。1.NOGマウスのgenetic moniteringを行った結果、γKOマウス由来のC57BL/6J由来遺伝子が少量ながら残っていることが確認され、NOD/Shi-scidマウスへの戻し交配を行って、当該遺伝子の除去を行った。2.NOGマウスの生産指数、産仔回数などの生産効率を検討した結果、NOD-scidと変わらない効率を示すことが分かった。さらに、現在体重、臓器重量などの本マウスの経時的な基礎データの採取を継続して行っている。3.抗NK抗体処置NOD-scidマウスの脾細胞およびその細胞亜群をNOGマウスに移入後、さらにヒト細胞を移入する実験系によって、NOGのヒト細胞高生着性に関連する細胞を検索した。その結果、CD11_c^+およびCD11_b^+細胞をそれぞれ除去した細胞でも生着性は高く、それら以外の細胞群の可能性も考えられ、現在まで特定されるに到っていない。4.昨年度報告したNOGマウスへのヒト臍帯血由来幹細胞移入で認められる高分化・増殖性は様々な研究者によって確認され、このマウスがヒト造血モデルとして最適であることが立証された。5.このマウスにmyeloma cell lineであるU266細胞を静脈内投与すると、移入後7日でマウス骨髄のみにhomingし、かつ増殖することによって、ヒトの場合と同様な広範な骨破壊、脊髄叢への侵入による下肢麻痺を引き起こすことが明らかとなった。6.また、このマウスでは従来のSCIDマウスやNOD-scidマウスと比較して、初代腫瘍細胞の生着が極めて高いことが明らかになったばかりでなく、種々の腫瘍細胞の転移が認められ、腫瘍転移実験系としても優れていることが明らかとなった。
内分泌撹乱物質による性ステロイドホルモン攪乱作用メカニズムの解明

申請者はダイオキシン類の性ステロイドホルモン撹乱作用機構の分子メカニズム解明を核内転写制御因子間のシグナル伝達のクロストークに着目した。すなわち女性ステロイドホルモン(エストロゲン)の作用において応答するエストロゲンレセプター(ER)α、ERβが、ダイオキシンレセプタ-(Aryl hydrocarbon receptor, AhR)およびArntにより遺伝子発現制御機構に撹乱作用を示す可能性を検討した。培養細胞を用いたin vitro系の結果から、ERα及びβへの転写活性が、エストロゲン非存在下において3MCにより誘導され、AhRおよびArntを介して活性化していることを見いだした。さらに、これら両者が細胞内で直接的に相互作用していることを明確にし、これら分子間の相互作用部位を同定した。ERは2つの転写活性化領域を保持しており、N末端側のエストロゲン非依存的な転写活性化領域(AF-1)とC末端側のエストロゲン依存的な転写活性化領域(AF-2)である。ERとAhRとの相互作用領域はAF-1領域であった。このことは、エストロゲン非存在下において3MCがAhR、Arntを介してERの転写活性を誘導する可能性を強く示唆するものである。CBP/p300はERおよびAhRの共通した転写共役因子として知られているが、この際、ERに3MC依存的に結合したAhRがCBP/p3O0と結合し、転写誘導を導いていることが判明した。現在これら一連の作用機構がin vivoで反映されているか検討している。当教室にてERα遺伝子欠損マウスとAhR遺伝子欠損マウスを確保している。これらモデルマウスを用い、3MCが示すエストロゲン撹乱作用を組織、ならびに遺伝発現制御に着目し検討している。具体的にはこれら遺伝子欠損マウスにおける3MCでの子宮重量の変動、およびER標的遺伝子であるc-fos、VEGFの遺伝子誘導を観察している。
抗体分子の電荷不均一性の遺伝子工学的研究

1タンパク質中のアスパラギン残基の脱アミド反応は、隣接するアミノ酸残基の影響を受けることが知られており、セリン、グリシンなどの特定のアミノ酸がN末側あるいはC末側に位置すると、加速されるといわれている。抗α_1-アンチトリブシンマウスモノクローン抗体Fab'断片の大腸菌発現系を用い、脱アミド反応を起こしやすいと考えられる、アスパラギンおよびグルタミンについて、一カ所ずつセリンに変異させた変異体6種を確立した。2各変異体ならびに野生型のFab'断片を調製し、ヒンジ部位の1残基のシステインをテトラメチルローダミンで標識した。スラブゲル等電点電気泳動により、主ピークを約99%の純度に精製した。3 6種の変異体ならびに野生型標識Fab'を、pH7.5、37°Cで15時間、ならびに30時間インキュベートした後、自家製の蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動装置を用い、ピークの不均一化の程度を調べた。野生型では、元のピーク(pI 5.59)の醸性側にpI 5.42のピークが現れ、さらにインキュベーション時間の延長とともにpI 5.37のピークが出現した。元のピークの全体に占める割合を求め、この減少速度から不均一化反応の速度を求めた。6種の変異体の内4種では、野生型の不均一化速度とくらべて、10%以内の変化しか見られなかったが、2種では野生型の35%および約70%まで不均一化の速度が低下していた。この結果から、マウスIgGl Fab'の電荷不均一化の主要な原因はアスパラギン残基の脱アミド反応であり、その位置はγ鎖の135番目(Kabat)とカッパー鎖の157番目(Kabat)であることが明らかになった。4主要な脱アミド部位のアスパラギンを2カ所セリンに変異させた、二重変異体を作成した。この二重変異体では、不均一化速度は野生型の8%にまで低下していた。この改変体は、電荷的に不均一化しにくいアフィニティープローブの作成に有用と考えられる。5アスパラギンの脱アミド反応が特定の部位で起こることを明らかにし、その速度についての定量的知見を得た。現在、さらに立体構造と脱アミド反応速度の関係を調査中である。1抗α1-アンチトリプシンマウスモノクローン抗体Fab'断片の大腸菌発現系を確立した。より強力なリボソーム結合配列(SD配列)の採用や培養条件の検討によって、Fab'断片の発現量を約10倍増加させることができた。2ヒンジ部位に残した単一のシステイン残基を蛍光標識し、アガロースゲル等電点電気泳動によって精製することにより、等電点の均一な蛍光標識Fab'断片を得る方法を確立した。3 PCRによる変異導入の際に、目的とする変異のみを確実に導入する方法を確立した。鋳型として、配列の信頼性の高いプラスミド由来のDNAを大量に用い、PCRによる増幅量をできるだけ少なくするとともに、校正能力を持つ耐熱性DNAポリメラーゼを使用することにより、極めて信頼性の高い変異導入が行えるようになった。

4脱アミド反応が起きやすいと報告されているセリンまたはグリシンのN末端側に位置するアスパラギンに注目し、アスパラギンをセリンに変換した改変体を5種作製した。作製した変異体の塩基配列を調べた結果、目的とする変異のみが導入されていることを確認した。1タンパク質中のアスパラギン残基の脱アミド反応は、隣接するアミノ酸残基の影響を受けることが知られており、セリン、グリシンなどの特定のアミノ酸がN末側あるいはC末側に位置すると、加速されるといわれている。抗α_1-アンチトリプシンマウスモノクローン抗体Fab'断片の大腸菌発現系を用い、脱アミド反応を起こしやすいと考えられる、アスパラギンおよびグルタミンについて、一カ所ずつセリンに変異させた。昨年度確立した5種の変異体に加え、今年度はさらに1種の変異体を確立した。2各変異体ならびに野生型のFab'断片を調製し、ヒンジ部位の1残基のシステインをテトラメチルローダミンで標識した。スラブゲル等電点電気泳動により、主ピークを約99%の純度に精製した。3 6種の変異体ならびに野生型標識Fab'を、pH7.5、37°Cで15時間、ならびに30時間インキュベートした後、自家製の蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動装置を用い、ピークの不均一化の程度を調べた。野生型では、元のピーク(pI 5.59)の酸性側にpI 5.42のピークが現れ、さらにインキュベーション時間の延長とともにpI 5.37のピークが出現した。元のピークの全体に占める割合を求め、この減少速度から不均一化反応の速度を求めた。6種の変異体の内4種では、野生型の不均一化速度とくらべて、10%以内の変化しか見られなかったが、2種では約70%および約35%と不均一化の速度が低下していた。この結果から、マウスIgG1 Fab'の電荷不均一化の主要な原因はアスパラギン残基の脱アミド反応であり、その位置はカッパー鎖の157番目(Kabat)とγ鎖の135番目(Kabat)であることが明らかになった。4主要な脱アミド部位のアスパラギンを2カ所セリンに変異させた、二重変異体を作成した。この二重変異体では、不均一化速度は野生型の約8%に低下していた。この改変体は、電荷的に不均一化しにくいアフィニティープローブの作成に有用と考えられる。5アスパラギンの脱アミド反応が特定の部位で起こることを明らかにし、その速度についての定量的知見を得た。現在、さらに立体構造と脱アミド反応速度の関係を調査中である。
筋収縮と毛細血管損傷との関連性

高強度のエキセントリック運動は筋組織の損傷を引き起こす.損傷した組織の筋細胞は浮腫や壊死などを起こしていることが観察される.その一方で,微小循環網を形成している毛細血管の形態的な損傷はほとんど起こらないことが光学顕微鏡による形態観察によって明らかにされた(平成13年度研究実績).しかしながら,毛細血管を形成する血管内皮細胞の微細構造や微小循環血流量などの機能的な能力がエキセントリック運動によって受ける影響については不明である.そこで今年度はラットの運動誘発性の筋損傷モデルにおいて,骨格筋毛細血管の超微細構造を電子顕微鏡によって観察し,さらに運動負荷後(運動1,3,7日後)に見られる安静時の筋血流量の変化について検討した.血流量はマイクロソフェア(Microsphere : MS)法によつて調べた.その結果,光学顕微鏡観察と同様に損傷筋の毛細血管内皮細胞はエキセントリック運動によって構造的なダメージを受けていないことが観察された.また,筋血流量機能については,運動後7日までの安静時筋血流量が対照脚と比較して運動脚では有意に高い結果が示された.そして運動脚の血流量は運動後1,3,7日の順で経時的に低下することが示された.損傷した筋組織では運動3日後までに白血球の浸潤などが活発に見られることから,筋組織内における微小循環血流の高い状態が続いていることが考えられる.以上のように,本研究では損傷筋において毛細血管は正常な形態と機能が保たれていることが明らかにされた,これは運動負荷後に観察される筋血流量の確保に貢献しているものと推察できる.本研究では高強度運動後の筋線維と毛細血管の経時的変化を調べ,毛細血管が筋線維の損傷や回復にどのように影響しているのかについて検討した.本実験では対象としてWistar系雄ラット13週齢を用いた.ラット用に開発した運動負荷装置を用いて,電気刺激によるエキセントリック運動を右後肢に300回負荷した.運動1, 3, 7日後に灌流固定法により筋を固定し,運動の主働筋である腓腹筋を摘出した.腓腹筋において,速筋線維の割合が高い表層部と遅筋線維の割合が高い深層部を分析した.固定した筋組織はエポキシ樹脂に包埋し,ミクロトームにて厚さ1μmにスライスした.トルイジンブルー染色を施し,光学顕微鏡にて形態計測をおこなった.得られた結果は以下の通りである.1)本研究の運動プロトコルによって高強度のエキセントリック運動1, 3, 7日後の運動脚に筋線維の損傷が認められた.1日後では過収縮による膨張が,3日後では白血球の浸潤が,7日後では再生過程にあり小さな中心核が存在する筋線維が多く認められた.損傷した筋線維の割合は表層部,深層部それぞれ1日後では77.1±27.4%, 31.6±10.4%, 3日後では86.8±13.0%, 53.9±16.2%, 7日後では58.9±21.4%, 29.3±10.6%であった.2)運動1, 3, 7日後の毛細血管形態には閉塞,内皮細胞の崩壊などは見られず,その絶対数にも変化がなかった.毛細血管内腔は表層部では1日後,3日後,深層部では3日後に有意な増加が認められた.また,運動1日後では両部位で蛇行の程度が大きいことが認められた.以上の結果から,高強度運動によって毛細血管の閉塞、崩壊は認められず、微小循環機能低下が筋損傷の主要因になっていないことが示唆された.また,損傷した筋での毛細血管の内腔および蛇行程度の変化は、筋の血流量を確保し筋損傷の回復促進に貢献している可能性があると考えられる.高強度のエキセントリック運動は筋組織の損傷を引き起こす.損傷した組織の筋細胞は浮腫や壊死などを起こしていることが観察される.その一方で,微小循環網を形成している毛細血管の形態的な損傷はほとんど起こらないことが光学顕微鏡による形態観察によって明らかにされた(平成13年度研究実績).しかしながら,毛細血管を形成する血管内皮細胞の微細構造や微小循環血流量などの機能的な能力がエキセントリック運動によって受ける影響については不明である.そこで今年度はラットの運動誘発性の筋損傷モデルにおいて,骨格筋毛細血管の超微細構造を電子顕微鏡によって観察し,さらに運動負荷後(運動1,3,7日後)に見られる安静時の筋血流量の変化について検討した.血流量はマイクロソフェア(Microsphere : MS)法によつて調べた.その結果,光学顕微鏡観察と同様に損傷筋の毛細血管内皮細胞はエキセントリック運動によって構造的なダメージを受けていないことが観察された.また,筋血流量機能については,運動後7日までの安静時筋血流量が対照脚と比較して運動脚では有意に高い結果が示された.そして運動脚の血流量は運動後1,3,7日の順で経時的に低下することが示された.損傷した筋組織では運動3日後までに白血球の浸潤などが活発に見られることから,筋組織内における微小循環血流の高い状態が続いていることが考えられる.以上のように,本研究では損傷筋において毛細血管は正常な形態と機能が保たれていることが明らかにされた,これは運動負荷後に観察される筋血流量の確保に貢献しているものと推察できる.
新たなＴ細胞不活化経路を標的とした癌治療法の臨床導入を目的とした研究

Herpesvirus entry mediator (HVEM)の腫瘍における役割を検討した。RNA干渉法を用いて腫瘍のHVEM発現をノックダウンしたところ、腫瘍細胞の細胞周期停止が誘導され、増殖能が抑制された。マウス皮下腫瘍モデルにおいても、HVEMノックダウンによって、腫瘍増殖が有意に抑制された。摘出した腫瘍を免疫染色で検討したところ、HVEMノックダウン腫瘍ではコントロール治療を行った腫瘍に比べKi67陽性率が有意に低く、腫瘍浸潤CD8+リンパ球数が有意に多かった。以上の結果から、HVEMノックダウンにより細胞周期停止による増殖抑制と腫瘍局所での抗腫瘍免疫が誘導されることが判明した。in vitroでの腫瘍にけるHVEMの役割の解明。RNA干渉法を用いて、HVEM発現のノックダウンを行った。MTSアッセイの結果、ヒト食道扁平上皮癌細胞株TE-1、TE-6、およびマウス大腸癌細胞株colon26いずれにおいても、HVEM発現ノックダウンにより細胞増殖が有意に抑制された。FACSによる細胞周期解析の結果、TE-1、TE-6ではG2/Mアレストが、colon26ではG1アレストがHVEMノックダウンにより誘導されることが判明した。colon26細胞はp53野生株であり、TE-1、TE-6はp53変異株であり、HVEMノックダウンによる細胞周期停止はp53に依存すると考えられた。また、HVEMノックダウンではアポトーシスは誘導されなかった。以上のことから、HVEMノックダウンでは細胞周期停止により癌細胞の増殖が抑制されることが判明した。in vivo実験系でのHVEMノックダウンによる抗腫瘍効果の確認と機序の解析。colon26細胞株による皮下モデルにおいて、HVEMノックダウンの効果を確認した。その結果、HVEMノックダウンにより有意な抗腫瘍効果を確認し得た。摘出した腫瘍を組織学的に検討したところ、HVEMノックダウン腫瘍は腫瘍内壊死面積が有意に増加していた。また、HVEMノックダウン腫瘍ではコントロール治療を行った腫瘍に比べKi67陽性率が有意に低く、p27陽性率が有意に高かった。また、HVEMノックダウン腫瘍では腫瘍浸潤CD8+リンパ球数が有意に多かった。real-time PCRを行ったところ、INF-γやIL-2の発現がHVEMノックダウン腫瘍で有意に上昇していた。HVEMを標的とした治療では、腫瘍抗原特異的T細胞を活性化・誘導するだけではなく、直接的な抗腫瘍効果を得られる可能性があり、他のT細胞不活化経路阻害よりも強力な抗腫瘍効果が期待できるものと考えられる。in vitro実験系でのHVEMノックダウンによる抗腫瘍効果の確認と機序の解析。MTSアッセイでヒト食道癌株TE-1ならびにマウス大腸癌株Colon26においてヒト食道癌株TE-6と同様にHVEMノックダウンによる有意な細胞増殖抑制効果を確認し得た。次いで、HVEMノックダウンによる癌細胞増殖抑制効果の機序解明のためにフローサイトメトリーによる細胞周期解析を行った。結果、TE-1、TE-6ではG2/Mアレストが、Colon26ではG1アレストがHVEMノックダウンにより誘導されることが判明した。Annexin V/propidium iodide染色を行った結果、HVEMノックダウンではアポトーシスは誘導されなかった。Colon26による大腸癌皮下モデルにおいて、HVEMノックダウンにより有意な抗腫瘍効果を確認し得た。摘出した腫瘍を免疫染色で検討したところ、HVEMノックダウン腫瘍ではコントロール治療を行った腫瘍に比べKi67陽性率が有意に低く、p27陽性率が有意に高かった。おおむね当初の計画通りに進行している。しかしながら、免疫不全マウスでの抗腫瘍効果の確認には至らなかった。ヒト食道癌株を生着させることができなかったためである。次年度では他の細胞株を用いて行う予定である。24年度の結果に基づいて、さらに臨床応用を目指した応用・発展的研究を行い、HVEM経路を標的とした治療の有用性を検証する。HVEM経路阻害と既存化学療法との併用効果についての検討。

HVEM経路阻害と現在臨床で使用されている化学療法剤(5-FU、Taxotel、Gemcitabineなど)との併用効果について、臨床を想定したin vivoの治療実験を行う。相乗効果が得られた場合には、最適な化学療法薬剤と阻害抗体との投与スケジュールを検討する。相乗効果の得られた抗腫瘍効果について、real-time PCRあるいはFACS解析等により、in vitroでの機序の解析を行う。さらに本研究では、分子標的薬(抗VEGF抗体、抗EGFR抗体、抗HER2抗体など)とHVEM経路阻害、化学療法との併用効果についても同様のモデルでの検討を行う。HVEM経路阻害によるメモリーT細胞の誘導と腫瘍再発抑制効果についての検討。応募者は特に術前(腫瘍摘出前)の腫瘍抗原が豊富な段階で、HVEM経路阻害を行うことで、より効率的に腫瘍抗原特異的なメモリーT細胞が誘導されるのではないかと予想する。腫瘍接種の後、腫瘍径が10mm以上に達した時点から一定期間HVEM経路阻害治療(HVEM si-RNAあるいはモノクローナル抗体)を行う。その後に腫瘍を一旦外科的に完全切除する。対照群には、コントロール治療(scrambled RNAあるいはisotypeのコントロール抗体)を行う。切除後100日以上経過した時点で、元と同系の腫瘍およびそれとは異なる腫瘍を再接種する。仮に治療群で、同系の腫瘍のみが、生着しないかあるいは自然退縮するようであれば、in vivoにおいて、効果的なメモリーT細胞が誘導された可能性がある。脾臓やリンパ節を摘出し、機序をFACSで解析を行い、これを証明する.該当なし。
ＨＩＶ伝播を制御する細胞性因子の探索と薬剤耐性克服を目的とした基盤研究

HIV-1に対する現在の薬剤は、ウイルス性酵素の機能を阻害する。これらは、併用療法において特に有効であるが、未だ薬剤耐性は発生する。それ故、HIV-1感染に対するより効果的な治療の方向性は、ウイルスタンパク質のみを標的とした従来の戦略よりはむしろ新たな治療戦略の開発を求めている。HIV-1は感染の際に多くの宿主タンパク質を利用し、このことはウイルス-宿主間の相互作用を阻害することは、抗ウイルス療法の開発のために重要であるかもしれないということを示唆している。このコンセプトで開発された薬剤は、耐性ウイルスの出現を最小に抑える可能性があり、新たな治療法開発に寄与できる可能性がある。現行のHIV多剤併用療法は、薬剤耐性、副作用により、治療を開始した患者の実に2040%が、治療に失敗すると報告されている。本研究では、現行の多剤併用療法の問題点を改善するために、HIV伝播を制御する未知の細胞性因子を探索し、HIV粘膜感染防止のための新規治療標的を選別することで、HIV粘膜(膣)感染防止を目指した新規治療戦略を提案することを目的とする。具体的には以下の3点を有機的に連結させた研究サイクルを回して研究を行うことにしている。1)HIV粒子を構成するウイルスプロテオームの解析(新規細胞性因子および翻訳後修飾の同定)、2)新規細胞性因子および翻訳後修飾のHIV感染初期過程における機能解析3)粘膜感染モデルを用いた細胞性因子を標的としたHIV粘膜(膣)感染防止効果の検証プロテオーム解析の結果、ウイルス粒子内にはglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)が取込まれていることを明らかにした。また、GAPDHのHIV感染初期過程における役割を検討したところ、GAPDH取込みを減少させたウイルスは感染価が上昇し、一方でGAPDHの取込みを増加させたウイルスでは感染価が減少した。この2種類のウイルスを詳細に調べたところ、HIV-1逆転写反応のプライマーとなるtRNA^<Lys3>の取込み量がGAPDHの取込み量と逆相関していた。つまりGAPDHはtRNA^<Lys3>のHIV-1粒子内への取込みを抑制する働きをもつことを初めて明らかにした。本知見は、根治療法開発に向けたtRNA^<Lys3>取込み機構に関する更なる理解のために有用なものであると考えられる。これまでのHIV粒子プロテオーム解析の結果、HIVがコードするCAタンパク質の一つのSer16-Pro17モチーフにおいてSer残基特異的にリン酸化を受けていることを明らかにできていた(J. Biol. Chem. (2010) 285(33):25185-25195.)。我々は、このリン酸化を受けたモチーフを細胞内ペプチジルプロリルイソメラーゼPin1が認識することにより、HIV-1 RNAを保護していたCAコアのSer16-Pro17モチーフにおけるcis-trans異性化反応を介して崩壊するというHIV脱殻過程の新たなモデルを提唱している。今年度、CAタンパク質のSer16-Pro17モチーフをSer残基特異的にリン酸化する酵素がERK2であることを同定した(J. Gen. Virol. (2014) 95,1156-1166)。ウイルスの出芽時、ERK2はCAタンパク質の前駆体であるPr55とともにウイルス粒子内に取り込まれる。その後、前駆体タンパク質Pr55はHIV ProteaseによってProcessingをうけ、intermediatesを生じると、CAタンパク質のSer16-Pro17モチーフがERK2によってリン酸化を受けるというモデルを見出した。 ERK2阻害剤を用いた実験で、いくつかのERK2阻害剤がHIV脱殻過程を標的とした新規の抗HIV剤の候補となり得る知見を得ることができた。HIVウイルス粒子の2次元電気泳動を行い、あらたなCAタンパク質の翻訳後修飾を見いだした(現在投稿論文作成中であるため詳細を表示できない)。その翻訳後修飾部位はこれまで報告のないアミノ酸残基が翻訳後修飾を受けており、その部分に変異を導入したウイルスの感染価が低下することを確認することができた。さらに、ウイルス複製過程の内、逆転写過程が上手く進まないために、感染価が低下することも確認ができている。現在、その翻訳後修飾の意義を詳細に検討するために、脱殻過程における影響などポストエントリーのどの過程で一番影響があるかを明らかにしていく予定にしている。次に、Yeast Two Hybridを用いた検討によって、CAタンパク質と相互作用する宿主タンパク質を見いすことができた。これまでに、siRNAを用いて宿主細胞の発現を低下させるとウイルスの感染価が低下することを確認済みである。今後、この相互作用タンパク質がウイルス後期感染過程に影響するかを検討する予定にしている。Pin1阻害剤の探索に関しては、Pin1 inhibitor PiBよりも阻害活性が高く、特異性が高い阻害剤を見出すことが難しい状況にあり、これまでにない方法で阻害剤を探索し、in vivoによる評価を実施する必要があると感じている。

一方、Pin1がリン酸化Ser16-Pro17部分に相互作用するためには、Ser残基がリン酸化する必要があるため、ERK2阻害剤やMEK阻害剤によるHIV脱殻阻害効果を検討しており、すでにFDAに認可を受けている阻害剤が一定の効果を示している点は興味深い。26年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス学26年度が最終年度であるため、記入しない。GAPDHに関連する研究はすでに論文に掲載された。また、別の因子についても現在revision中で、まもなく研究成果を報告できる予定にしている。また、共同研究等を介して、本研究で得られた知見を基に、阻害剤のスクリーニングを進めようと考えている。ERK2阻害剤が新規の抗HIV剤として活用できる可能性を見いだしたことと、Pin1によるHIV脱殻モデルにおいてSer16-Pro17モチーフのERK2によるSer16残基のリン酸化が脱殻過程には必要であることを見いだせたことは、宿主キナーゼによりウイルス性CAタンパク質がリン酸化を受け、リン酸化が脱殻のための分子スイッチとなっているという学問的に重要な発見につながるととともに、HIVが有する易変異原性に対抗できる治療戦略の構築に寄与できると期待できるため。今後も具体的には以下の3点を有機的に連結させた研究サイクルを回して研究を行うことにしている。1)HIV粒子を構成するウイルスプロテオームの解析(新規細胞性因子および翻訳後修飾の同定)2)新規細胞性因子および翻訳後修飾のHIV感染初期過程における機能解析3)粘膜感染モデルを用いた細胞性因子を標的としたHIV粘膜(膣)感染防止効果の検証本年度も申請書のPDCAサイクルに則って研究を展開するが、ERK2阻害剤を用いる場合、ウイルス粒子内に取り込まれているERK2だけをより積極的に阻害するといった戦略をさらに導入できれば、さらにERK2阻害剤の抗HIV剤としての期待はますます高まる。DDSの概念もうまく導入して、in vivoにおける候補阻害剤の効果を評価したいと考えている。また、HIVの逆転写過程そのものを阻害するための新たな抗HIV戦略の開発もすすめており、化合物候補のスクリーニングを行うためのY2Hを用いたプラットホームがほぼ完成できたので、それをつかって、候補を決め、新規抗HIV剤の候補として適当であるか評価したい。残としては基金が27,541円発生したが、ほぼ計画的に執行できていると思われる。なお、次年度も以下の有機的に連結させた研究サイクルを回して研究を行うことにしている。1)感染初期過程に関与する新規細胞性因子および翻訳後修飾の同定(HIV粒子プロテオーム解析):三隅将吾2)新規細胞性因子および翻訳後修飾のHIV感染初期過程における機能解析:庄司省三
乳癌・大腸癌の浸潤・転移を規定する腫瘍間質線維芽細胞・細血管内皮の時性解析

1.浸潤性乳管癌(Invasive ductal carcinoma, IDC)巣内線維化巣(Fibrotic focus, FF)を構成する線維芽細胞の増殖能が、IDC患者の予後を推測する上で非常に重要な予後因子となることを後ろ向き検討により証明した。今回さらに439例のIDC症例による前向き検討において、IDCにおけるFFの存在が、浸潤性乳管癌の重要な予後因子となることを確認し、さらにFF長径が8mmを越えるIDC症例はリンパ節転移の有無、ホルモン受容体蛋白発現の有無で層別化を行った検討において腫瘍再発率、遠隔臓器転移率がFFの長径が8mm以下のIDC症例に比べ有意に高いことを証明した。2.潰瘍型進行大腸癌において腫瘍厚が予後を反映することを証明したが、今回の検討においてその腫瘍厚を規定しているのは腫瘍細胞の増殖能ではなく、腫瘍間質線維芽細胞、細血管内皮細胞の増殖能であることを明らかとし、後者2者増殖能がリンパ節、肝臓等の遠隔臓器転移に密接に関係していることを証明した。3.IDCにおいてリンパ管腫瘍塞栓、静脈腫瘍塞栓およびリンパ節転移腫瘍の性状を検討し、それら成分の性状がIDCの増殖・進展にどの様な影響を与えるのか前向き検討を行った。その結果、核分裂数・アポトーシス数が多い脈管腫瘍塞栓成分および器質化静脈塞栓を有するIDC症例は、これらの所見を認めないIDC症例に比べ、有意に予後が不良であった。また、リンパ節転移腫瘍性状では、腫瘍細胞核分裂数、リンパ節外浸潤およびリンパ節外腫瘍塞栓の有無が重要な予後因子となることを明らかとした。1-3の検討は、腫瘍間質細胞、脈管内腫瘍成分、リンパ節転移腫瘍成分がIDC並びに進行大腸癌の浸潤・転移において重要な役割を担っていることを初めて明らかにしたものである。今まで、浸潤性乳管癌内の線維化巣が、浸潤性乳管癌患者の予後因子となることを後ろ向き検討により証明してきたが、今回439例の浸潤性乳管癌症例による前向き検討において、癌巣内に腫瘍間質線維芽細胞よりなる線維化巣の存在が、浸潤性乳管癌の重要な予後因子になることをあらためて確認した。この検討において、線維化巣の長径が重要であることが判明し、線維化巣の長径が8mmを越える乳管癌症例は、リンパ節転移の有無、ホルモン受容体蛋白発現の有無で層別化を行った検討において、腫瘍再発率、遠隔臓器転移率が線維化巣の長径が8mm以下の症例に比べ有意に高いことを証明した。また、線維化巣の長径が17mmを越える乳管癌症例は特に悪性度が高く、リンパ節転移、ホルモン受容体蛋白発現の有無に関係なく、長径が17mm以下の乳管癌症例に比べ腫瘍死率が有意に高いことを明らかとした。以上のことは、浸潤性乳管癌の腫瘍間質成分、特に線維芽細胞が乳管癌の悪性度を規定する上で、腫瘍細胞成分より重要な役割を担っていることを証明したことになる。また、この検討は前向き検討であることから、研究者の意図が加えられた検討ではない。よって、後ろ向き検討に比べより一層信頼性の高い結果と考えられる。また、我々はリンパ管内に侵入した腫瘍細胞の性状と乳癌の浸潤・転移の関係を解明するため前向き検討を行った。その結果、リンパ節転移陰性群ではリンパ管内腫瘍塞栓形成腫瘍細胞のアポトーシス数が、リンパ節転移陽性群ではリンパ管内腫瘍塞栓形成腫瘍細胞の核分裂数が重要な腫瘍の浸潤・転移規定因子となることを明らかとした。