hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
てんかん重積発作後の神経細胞障害におけるアストロサイトを介した制御機構

カイニン酸(KA)は痙攣とともに脳内海馬の神経細胞傷害を引き起こす。本研究では、KAが血管内皮細胞に膜型プロスタグランジンE(PGE)合成酵素(mPGES-1)とアストロサイトにPGE_2レセプターEP3を誘導することを発見した。そして、合成されたPGE_2はアストロサイトのEP3を活性化し、アストロサイト内のCa^<2+>を上昇させグルタミン酸の流出を増やし、神経細胞傷害を悪化させることがわかった。これは血管内皮細胞による新たな神経細胞傷害制御メカニズムである。誘導型PGE_2合成酵素mPGES-1ノックアウトマウス(mPGES-1^<-/->)と野生型マウス(WT)の海馬内にカイニン酸(KA)を微量注入するてんかん痙攣重積動物モデルを作成し、経時的な海馬内PGE_2量、直腸温の変化および48時間後の海馬CA3領域の残存神経細胞数を比較した。WTはmPGES-1^<-/->に比べ24時間後PGE_2量は約3倍であり、残存神経細胞数が有意に少ないことがわかった。直腸温には有意な差はなかった。以上の結果より、KA投与後に海馬血管内皮細胞で誘導されるmPGES-1はPGE_2産生を増やし神経細胞障害を促進することがわかったが、そのPGE_2は体温上昇を介さず局所的に作用していることもわかった。続いて、mPGES-1^<-/->とWTの海馬組織培養を用いて、KA刺激後のアストロサイト内Ca^<2+>変化とグルタミン酸放出、PGE_2産生、神経細胞障害を比較し、神軽細胞障害における血管内皮細胞mPGES-1由来PGE2こよるアストロサイトを介した制御メカニズムを明らかにした。培養液中にKAを添加し、17時間後の海馬組織培養を用いて実験を行った。WTの組織内PGE_2量はKA無添加群に比べ有意に上昇していた。Ca^<2+>はFluo-4を用いて可視化し、アストロサイトはSR101によって標識し、アストロサイト内Ca^<2+>輝度変化を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、WTに比べmPGES-1^<-/->ではアストロサイト内Ca^<2+>輝度が低く、一定時間観察内の輝度変化も軽度であることがわかった。次に、培養液中に放出されるグルタミン酸の量を比較したところ、mPGES-1^<-/->群が有意に少ないことがわかった。また、神経細胞障害のマーカーとして頻用されているpropidium iodide(PI)染色を行い、PI取り込み率を求め細胞障害の程度をmPGES-1^<-/->とWTで比較したところ、mPGES-1^<-/->群においてPI取り込み率が有意に低いことがわかった。以上の結果から、血管内皮細胞mPGES-1から合成されるPGE_2はアストロサイトからのCa^<2+>依存性グルタミン酸放出を促進し、それが神経細胞障害の増強を引き起こしていると考えられた。誘導型PGE_2合成酵素mPGES-1ノックアウトマウス(mPGES-1^<-/->)と野生型マウス(WT)の海馬組織培養を用いて、KA刺激後のアストロサイト内Ca^<2+>変化とグルタミン酸放出、PGE_2産生、神経細胞障害を比較し、神経細胞障害における血管内皮細胞mPGES-1由来PGE_2によるアストロサイトを介した制御メカニズムを明らかにした。培養液中にKAを添加し17時間後の海馬培養組織においてアストロサイト内Ca^<2+>輝度変化を共焦点レーザー顕微鏡で観察すると、mPGES-1^<-/->に比べWTではアストロサイト内Ca^<2+>輝度が高く、一定時間観察内の輝度変化も強いことがわかった。また、培養液中に放出されるグルタミン酸の濃度もWT群が有意に多く、また、神経細胞障害を示すpropidium iodide(PI)染色の取り込み率もWT群が有意に高いことがわかった。このWTにおけるCa^<2+>輝度上昇はCa^<2+>キレート剤(BAPTA)によって抑制され、それに伴ってグルタミン酸の量もPI取り込み率も低下した。以上の結果から、神経細胞障害はCa^<2+>依存性グルタミン酸放出によると考えられた。また、mPGES-1^<-/->の海馬培養組織にKAと共にPGE_2を添加すると、WT同様のアストロサイト内のCa^<2+>輝度上昇、培養液中グルタミン酸濃度上昇、PI取り込み率の上昇が観察された。これからも、血管内皮細胞mPGES-1から合成されるPGE_2はアストロサイトからのCa^<2+>依存性グルタミン酸放出を促進し、それが神経細胞障害の増強を引き起こしていると考えられた。

また、海馬内にカイニン酸(KA)を微量注入するてんかん痙攣重積動物ラットモデルでは、コントロール群ではほとんど認められなかった、アストロサイトのendfootにおけるPGE_2のレセプターの発現誘導が認められた。endfootは血管内皮細胞を取り囲むように存在するため、血管内皮細胞で産生されたPGE_2が直接アストロサイトのendfootに作用している可能性を強く示唆した。アストロサイトの細胞内カルシウム輝度上昇を引き起こすプロスタグランジンE_2(PGE_2)レセプター(EP)のサブタイプを決定するため、mPGES-1ノックアウトマウス(mPGES-1^<-/->)と野生型マウス(WT)の海馬スライス培養を作成し、mPGES-1^<-/->たの海馬スライス培養にカイニン酸(KA)と各EP agonistを作用させたところ、EP3 agonistのみがアストロサイトのカルシウム輝度を上昇させた。また、WTの海馬スライス培養に各EP antagonistを作用させたところ、EP3 antagonistのみがアストロサイトのカルシウム輝度上昇を抑制した。さらに、ラットの海馬にKAを微量注入し、神経細胞死を引き起こす動物モデルを作成し、その脳標本を用いてEP3レセプターの海馬内細胞分布を免疫染色法によって調べたところ、KA投与群はコントロール群に比べ、血管を取り巻くアストロサイトのend footに発現が強化されることがわかった。以上の結果から、KA刺激によって血管内皮細胞で産生されたPGE_2はアストロサイトのend footのEP3レセプターを活性化してアストロサイトの細胞内カルシウム輝度上昇を引き起こすと考えられた。さらに、WTとmPGES-1^<-/->を用いて、多発性硬化症モデル(EAE)を作成し、両群の運動障害の発症時期、重症度、症状の持続期間などを比較検討した結果、EAEの発症時期に有意差は認められなかったが、mPGES-1^<-/->はWTに比べて、症状は軽症でありその持続期間も短いことがわかった。これより、mPGES-1が合成するPGE_2は多発性硬化症の重症化、遷延化に関与することが示唆された。
近代ドイツにおける細菌学を通じた衛生観念の変容に関する研究

昨年度に引き続き、平成26年度も衛生博覧会運動に照準を絞って近代ドイツ社会における細菌論の普及過程について研究した。その際、19世紀の博覧会にまで遡り、細菌論が定着する以前の展示の特徴についても考察の射程を広げ、その成果を論文「コッホ細菌学と衛生博覧会」(『史境』第68号、2014年)として公表した。また、その後はドイツ第二帝政期における最大規模の国際衛生博覧会であるドレスデン国際衛生博覧会(1911年)を考察の対象とし、その中間報告として「ドレスデン国際衛生博覧会に見る細菌論の啓蒙戦略」と題して第35回歴史・人類学会(於・筑波大学)で発表を行った。本研究の目的は、不可視の病原体が感染症を惹起するという細菌学の知が、衛生博覧会を中心とする社会衛生学者の啓蒙活動を通じていかに当時の公衆の間に普及していったか、そのプロセスを再構成することにある。そこで、平成25年度は、当該研究目的に関する史資料の収集に力点を置いた活動を行った。具体的には、ベルリンの州立文書館および連邦公文書館に所蔵されてある衛生博覧会に関するパンフレットならびに主催者の通信文書を調査することで、衛生博覧会の主催者側が設定していた理念および目的を確定することに努めた。また、これらの衛生博覧会における展示内容(各種感染症に罹患した臓器の模型や人体内部の構造を可視化した蝋人形、さらには罹患率や死亡率の推移を調査した統計結果を示した機械装置等)を写した写真資料等も渉猟し、主催者側が啓蒙を行うにあたってどのような方法を選択したかを把握するよう努めた。さらにそれに加えて、本研究の目的が、こうした啓蒙活動を消費する一般公衆の感受性の変化も突き止める点にあることから、おもにヴァイマル時代に各種の公共施設で掲示された衛生に関する注意喚起文書等を調査し、そこから当時の公衆における病気感染への恐怖心の蔓延を再構成することにも重点を置いた。以上の史資料から、本研究計画の支柱となる専門知の「流通」と「消費」という二つの側面、すなわち専門家自身がみずからの専門知(細菌学的発想)を通俗化する際に施す知の内容の改変と、その専門知を当時の公衆が既存の解釈格子を通じて咀嚼し理解する過程の二側面を同時に解明できるはずである。本年度では、昨年度に引き続き近代ドイツにおける細菌論の普及プロセスについて研究を進めた。本研究の「目的」として、ヨーロッパ社会の衛生観念が具体的にいかなる過程を経て今日のように不可視の病原体に恐怖する心性として形作られたのか、その歴史的経緯を解明するという点にあった。この研究目的に照らし、「研究実施計画」では19世紀後半からヨーロッパ社会で流行した衛生博覧会というイベントを、本研究の考察にとって最適な事象として取り上げることにしていた。映画やラジオが普及する以前の社会にあっては、この博覧会こそ商品の広告や民衆啓蒙のための、最大にしてほぼ唯一のイベント形式となっていたからである。上記のような研究計画に沿って、本年度の研究活動を進めた結果、その成果の一つとして論文「コッホ細菌学と衛生博覧会:ドイツ衛生運動史序説」(『史境』第68号、2014年)を刊行した。ここでは考察の範囲を1880年代にドイツで初めて開催された衛生博覧会である「全ドイツ衛生・救命博覧会」にまで遡らせたうえで、20世紀初頭にいたるまでの衛生学者による啓蒙戦略を分析した。その結果、パストゥールやコッホによって確立された近代細菌学は、それ以前の瘴気論にもとづく衛生学の学説を「科学的」な根拠や手続きに則って放逐したのではなく、衛生博覧会という場で来場者に「知性の犠牲」を強いること、つまり学説の内容を納得させるのではなく、顕微鏡や標本写真などによる「感動」を植えつけることで、社会的認知を得ようとしていたことが明らかとなった。ここから、細菌学が社会の衛生観念を根底から変えることができたのは、決してその学説の有効性によるのではなく、むしろ非科学的な次元での瘴気論との権力闘争で勝利を収めたからではないかという仮説を立てることができる。26年度が最終年度であるため、記入しない。ドイツ近現代史26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、初年度のうちに研究テーマに関する史資料の収集はその大部分が達成されたと思われる。今後、これらの史資料の分析を、専門知の「流通」と「消費」の二局面に分けて段階的に進めていく必要があるが、史料収集作業そのものが、申請時点で想定していた分量よりもはるかに大きな成果を挙げることができたことから、全体的には「おおむね順調」と判断してもよい。上記「現在までの達成度」で触れたように、今後の研究方策としては初年度に収集した資料を分析し、その結果を公表していくことに重点が置かれる。

二年目にあたる本年度では、帝政期ドイツで最大規模の「ドレスデン国際衛生博覧会」(1911年)ならびにその先駆にあたる「国民病とその撲滅」(1903年)という、二つの衛生博覧会における専門家の戦略と公衆の反応を分析していくことになる。
口腔細菌のバイオフィルム形成因子の発現は唾液タンパク質によって制御されるか?

本研究の目的は口腔疾患のみならず様々な全身疾患を誘発することが知られている口腔バイオフィルムの形成に際して、唾液タンパク質がどのように関わるかを調べるものである。本年度はStreptococcus mutansの口腔バイオフィルム形成因子の遺伝子発現に及ぼす唾液の影響を調べた。S.mutans Xcを培養してリン酸緩衝液(PBS)で洗浄した後、ヒト安静時唾液を遠心分離して得られた上清中に懸濁し、37°Cで1時間培養した。菌体を回収した後RNAを抽出し、バイオフィルム形成因子である菌体表層タンパク質抗原(PAc)およびグルカン合成酵素(GTF)の遺伝子発現をリアルタイムPCR法で調べた。その結果、唾液と反応させた菌体のPAc遺伝子発現は、対照(PBS処理)と比較して2.0倍に上昇し、一方GTF遺伝子発現は、0.1倍に低下した。菌体と唾液との反応時間を変化させた場合、顕著な差は認められなかった。また他のS.mutans株(MT8148、UA159)を用いたところ、発現の程度に差はあるもののPAc遺伝子発現の上昇、GTF遺伝子発現の低下が同様に認められた。次にS.mutansのPAcとGTFのタンパク発現レベルを経時的に調べたところ、PAcの発現はほぼ一定であるのに対して、GTFの発現は時間とともに低下した。以上の結果からPAcは唾液タンパク質と反応する因子であるため、唾液の存在によりその遺伝子発現が上昇する何らかの作用が働くこと、GTFはグルコースの存在下に活性が発現される酵素であるため唾液は影響を及ぼさないことが推測された。PAc遺伝子発現の上昇をもたらす唾液中のタンパク質を同定するため、唾液の分画を行い菌体への作用を確認中であるが、このタンパク質の機能領域を決定することにより口腔バイオフィルムの形成抑制が可能である。口腔バイオフィルム形成に重要な役割を果たすStreptococcus mutansを用いて実験を行った。まず唾液タンパク質で被覆したポリスチレンプレートに各種液体培地を加えて培養を行い、形成されたバイオフィルム菌体のタンパク質発現をSDS-PAGEとウェスタンブロットで調べた。その結果、菌体の初期付着に関与する菌体表層タンパク質抗原(PAc)およびグルカン合成酵素(GTF)の発現は、浮遊菌体と比較して顕著な差は認められなかった。次に最少培地にグルコース、フルクトース、スクロース等を炭素源として添加して同様に実験を行ったが、いずれの炭素源の場合もバイオフィルム菌体と浮遊菌体との間にPAcおよびGTFの発現に差は認められなかった。この点については、さらに遺伝子レベルの発現解析を行う計画である。そこで培地中に濾過滅菌した唾液を混入してS.mutansを培養し、形成されたバイオフィルム菌体を回収してSDS-PAGEによる解析を行ったところ、浮遊菌体と比較して新たに4本のバンド(32,45,110,250kDa)が出現していることが認められた。さらにバイオフィルム菌体には唾液アミラーゼが多く結合していることが認められ、バイオフィルムの形成時にアミラーゼが何らかの役割を演じていることが推測された。
垂直眼球運動系の神経積分器における持続的活動を生成するための神経回路メカニズム

脳幹の舌下神経前位核(PHN)とカハール間質核(INC)はそれぞれ水平性、垂直性の視線制御に関与している。これまでの研究により、PHNやINCの興奮性神経回路の活性化が視線保持に重要であり、神経回路の活性化についてはPHNではカルシウム透過型AMPA受容体(CP-AMPA受容体)の活性化が起点となっているが、INCではCP-AMPA受容体の活性化に依存しないことが示唆された。そこで、本年度は、INCの活性化メカニズム、特にNMDA受容体の関与について、明らかにすることを目的とした。生後約3週齢のラットからINCを含むスライス標本を作製し、INCニューロンからホールセル記録を行った。0.2秒の高周波刺激によってINCニューロンで自発性シナプス電流応答(EPSC)の頻度が数秒にわたって増大するが、この増大がNMDA受容体の拮抗薬であるAPVの投与により変化が生じるのかを検討した。その結果、APVの投与によりEPSCの頻度が増大する時間が激減した。さらに、記録しているニューロンにグルタミン酸受容体の作動薬を局所投与してNMDAとAMPA受容体を介する電流の比を調べたところ、INCはPHNに比べてNMDA受容体を介する電流応答が大きいことが明らかになった。また、Ca2+依存性非選択性陽イオンチャネル(ICAN)の関与を調べたところ、INCではPHNほどICANが強く関与していないことも明らかになった。以上の結果により、INCでは、PHNとは異なり、興奮性神経回路が活性化にはNMDA受容体の活性化が必要であることが示された。本年度はINCでの興奮性神経回路の活性化メカニズムの探索を試み、NMDA受容体の活性化が必要であることが示され、本研究課題の重要なテーマの一つを明らかにできた。この成果は今年の3月に開催されたアジア・オセアニア生理学連合大会(FAOPS2019)にて発表した。以上のことから、おおむね順調に進展していると考える。現在、電気生理学的解析とともに、PHNとINCでのCP-AMPA受容体の分布の違いを明らかにするためコバルト取り込み法を用いた形態学的解析を行っている。この研究は当初の研究計画には記載していなかったものであるが、成果が得られれば電気生理学的手法によって得られた知見をより確かなものにできることが期待される。また、本研究課題のもう一つの重要テーマはPHNとINCとの結合関係を明らかにすることである。両者の直接的な神経連絡の特性を明らかにするために、一方に蛍光トレーサーを注入して、逆光標識される投射ニューロンを同定してその特性を明らかにすることを計画している。また、現在、並行して行っている研究から、PHNとINCは小脳を介して連絡していることも明らかになってきた(Sugimura and Saito, FAOPS2019にて発表)。したがって、PHN、INC、小脳との関係性についても明らかにし、本研究課題をさらに推進させていく計画である。

両者の直接的な神経連絡の特性を明らかにするために、一方に蛍光トレーサーを注入して、逆光標識される投射ニューロンを同定してその特性を明らかにすることを計画している。また、現在、並行して行っている研究から、PHNとINCは小脳を介して連絡していることも明らかになってきた(Sugimura and Saito, FAOPS2019にて発表)。したがって、PHN、INC、小脳との関係性についても明らかにし、本研究課題をさらに推進させていく計画である。現在使用している研究機器の動作が悪くなり本研究課題の遂行に支障をきたす恐れがあったため、機器を使用しない3月の学会期間中に機器のチェックと補修を業者に依頼した。その業者から機器補修の終了が4月以降であるとの通知を受けたことから、その費用を2019年度に使用するように繰り越したため。
ＥＵの規範パワーの持続可能性に関する実証研究

上半期に東京で理論研究担当分担者数名と代表者で会合を開き、本科研プロジェクトの理論枠組を批判的に考察した。とくにBrexitの動向について、実証研究の対象に取り上げるべきかを再考した。下半期には京都にて全体研究会合を開催、分担研究者9名に研究協力者2名を加え、本科研プロジェクトで設定した理論枠組と実証研究対象のすりあわせを実施した。この会合では、EUの通商政策と競争政策に関して、とくにWTO改革の視点から明確に異なるふたつの実証分析が示され、マルチラテラリズムとリーガリゼーションの視点について重要な検討課題を得ることができた。またEUトルコ関係に加えて、EU中国関係を本科研プロジェクトの検討課題に加えるかどうかを理論的に詰めて議論した。そして実証研究対象については柔軟に調整していくべきことを確認した。また3月には人権デモクラシー担当分担者によるブリュッセルでの聞き取り調査を実施、難民社会統合と域内治安確保の規範対抗関係に関して、リーガリゼーションとメインストリーミングの視点から重要な知見を得ることができた。なお、代表者・分担者による本研究プロジェクト関連の講演や新聞記事寄稿、学会報告などについては、本科研プロジェクトのWebサイトに掲載しているが(https://sites.google.com/view/npe2017/)、その内容については、代表者・分担者の間でLINEグループを通じて共有している。日常的なディスカッションもこれにより進められている。当初2年目に予定していた作業はほぼ完了した。2回予定していた全体研究会合は1回のみに終わったが、理論担当分担者と代表者の会合により補足した。上半期に予定していた政策文書とアクタースピーチアクトの分析は、Brexitの予想外の情勢により当初予定のものからシフトし、Brexitに関わる規範言説分析を追加的に進めた。全体会合は京都で開催し、規範パワーの概念、その持続可能性の制度的条件、その客観的認識を可能にする指標、EUの制度的条件が加盟国の集合的政治意思を方向づけるとする仮説の精緻化・洗練化について、プロジェクト参加メンバーで批判的に検討を進め、概念枠組や経験事例選定に関する部分的な問題も発見した。海外インタビューは3月にブリュッセルにて、人権デモクラシー関連(難民社会統合と治安確保の規範対抗関係)で実施した。なお昨年度設置したWebサイト<https://sites.google.com/view/npe2017/>上で研究活動を適宜公表している。全体会合をあと2回ほど実施、中間研究成果を研究書として公表する。出版社との交渉はすでに終了しており、2019年度8月末を目途に本プロジェクト参加10名と研究協力者3名が入稿、2020年3月までに公刊する。公刊後は外部からコメンテーターを招聘し書評会を開催するとともに、EU学会や国際政治学会あるいはUACESにおいて、研究発表を行っていく。そうした出版と学会報告を通じて本研究プロジェクトの成果と意義を批判的に再検討したのちに、研究代表者が本プロジェクトにより生みだされた知見を再確認し、批判的コメントに対してフォローアップしていくための研究書を、2021年3月までに公刊する。(1)先行研究のレビューを進めるとともに、海外学会(英国EU学会など)に参加、さらにブリュッセルなどヨーロッパ諸国で実務者および海外研究者にアクセス、インタビューを実施するなかで、本研究課題に関わる研究状況をサーベイし、<EUの規範パワーの持続性>という研究テーマの意義およびアクチュアリティについて再確認できた。規範パワー論はEU政治研究においていまだ<終わった>研究課題ではなかった。(2)研究会を3回実施(関学大・東海大・新潟国際情報大)、理論枠組と役割分担の微調整を行った。また4名の研究協力者に参加してもらい、理論枠組と実証事例の整合性について批判的視点を加えてもらった。この一連の研究会の結果、規範パワーたろうとする加盟国首脳の政治意思と、EUの対外関係にみられる4つの制度的特徴(マルチアクターシップ・シンクロナイゼーション・リーガライゼーション・メインストリーミング)の関係性をどう理論的に突き詰めていくかについて、メンバー間に意見の不一致があることが分かり、今後の理論的討究の課題が浮き彫りとなった。それは大きくは、合理主義アプローチに依拠した因果関係として仮説化していくべきか、それとも構成主義アプローチに依拠した構造化プロセスの把握を目指していくべきなのか、という二つのアプローチの対抗関係であり、次年度の研究会で詰めていくべき課題となった。なお4年後の研究成果発表のため、メンバーそれぞれの研究課題を仮題として章立てを作り、出版社を決め、出版へ向けた交渉に入った。一年目に当初予定した作業はほぼ完了した。理論的課題を確認し事例分担を調整する研究会を実施(予定では2回のところ、3回実施できた)、海外連携者とコンタクトを取り本研究課題の意義についてコメントをもらい、海外の学会に出席、関連研究状況について確認し、関連研究文献を購入、過去2、3年ほどに出版された学術書の内容を見定めつつ、本研究課題の意義とオリジナリティについて認識を固めることができた。なお、適宜研究活動を公表するためにWebサイトも設置した。URLは次の通り。<https://sites.google.com/view/npe2017/>上半期に東京で理論研究担当分担者数名と代表者で会合を開き、本科研プロジェクトの理論枠組を批判的に考察した。

この会合では、EUの通商政策と競争政策に関して、とくにWTO改革の視点から明確に異なるふたつの実証分析が示され、マルチラテラリズムとリーガリゼーションの視点について重要な検討課題を得ることができた。またEUトルコ関係に加えて、EU中国関係を本科研プロジェクトの検討課題に加えるかどうかを理論的に詰めて議論した。そして実証研究対象については柔軟に調整していくべきことを確認した。また3月には人権デモクラシー担当分担者によるブリュッセルでの聞き取り調査を実施、難民社会統合と域内治安確保の規範対抗関係に関して、リーガリゼーションとメインストリーミングの視点から重要な知見を得ることができた。なお、代表者・分担者による本研究プロジェクト関連の講演や新聞記事寄稿、学会報告などについては、本科研プロジェクトのWebサイトに掲載しているが(https://sites.google.com/view/npe2017/)、その内容については、代表者・分担者の間でLINEグループを通じて共有している。日常的なディスカッションもこれにより進められている。当初2年目に予定していた作業はほぼ完了した。2回予定していた全体研究会合は1回のみに終わったが、理論担当分担者と代表者の会合により補足した。上半期に予定していた政策文書とアクタースピーチアクトの分析は、Brexitの予想外の情勢により当初予定のものからシフトし、Brexitに関わる規範言説分析を追加的に進めた。全体会合は京都で開催し、規範パワーの概念、その持続可能性の制度的条件、その客観的認識を可能にする指標、EUの制度的条件が加盟国の集合的政治意思を方向づけるとする仮説の精緻化・洗練化について、プロジェクト参加メンバーで批判的に検討を進め、概念枠組や経験事例選定に関する部分的な問題も発見した。海外インタビューは3月にブリュッセルにて、人権デモクラシー関連(難民社会統合と治安確保の規範対抗関係)で実施した。なお昨年度設置したWebサイト<https://sites.google.com/view/npe2017/>上で研究活動を適宜公表している。当初の予定通り進めていく。2018年度は引き続き、先行研究の網羅的なレビューを通じた仮説の洗練化・既存の統合理論との接合と、政策文書、政治アクタースピーチ、実務者インタビューの分析(上記指標利用)を進め、研究会を最低でも2回開催し、メンバー間で知見を共有、ピアレビューの形で相互に批判的に認識を深めていく。またBrexit交渉が最終局面を迎えているので、本研究課題の研究作業分担に再調整が必要となる事態が発生していくかどうか、注視していく。そのため本年度は英国で開催される海外学会に参加、本研究課題に関連したパネルにも出て、動向をつかんでおきたい。加えて、PESCOの進展が著しいので、事例研究に付け加えていくべきか検討する必要が出てきている。そこで(当初は予定していなかったが)PESCOの動向把握にも時間を割いていきたい。
沖縄独自の死の文化を基盤にした看取り教育プログラムの開発

本研究では、地域の文化的特性を取り入れた看取りの概念を明確にし、沖縄独自の死の文化を基盤とした終末期がん患者の看取り教育プログラムの開発を目的としている。開発した教育プログラムを沖縄県内のがん拠点病院等の看護師を対象に実施し、評価することで病棟から外来、在宅へとつなぐ持続的な地域文化に根ざした質の高い看取りケアの明確化と教育プログラムの構築を図る。平成30年度は、台湾の看護師2名(緩和ケア病棟看護師1名、がん専門病院の看護師1名)を対象に台湾文化に根ざした看取りについて半構造的面接を実施した。その結果、緩和ケア病棟の看護師は、仏教徒の患者が死亡すると、往生室(念仏を唱える部屋)で家族や親族が患者を囲み8時間念仏を唱えることを支援していた。往生室の設備がないICUにおいては、病院の敷地の内にある葬儀社の一室で、家族が患者の死後8時間、念仏を唱えることができるように支援するなど「患者の成仏と家族の安寧のための念仏を唱える時間を確保」していた。また、台湾の慣習として、葬儀の際に着る服が本当の最後の服になり、靴下も合わせて7枚の服を着せるという慣習がある。よって、看護師は、死亡退院する際に着せる服が最後の服でないことを知るなど「死の文化に関する慣習を認識する」ことが重要であると述べていた。看取りの場は異なるが、台湾の看護師は、患者が成仏できるように家族が念仏を唱えることを支援するなどグリーフケアを行っていた。研究が遅れている理由としては、昨年度、研究者は病気療養から復職したが、自身の体調を整えるために時間がかかり研究時間が確保できなかったためである。沖縄の文化的特性を取り入れた看取りについての調査を基に、アンケート作成を行う。その後、研究協力者である沖縄県内のがん看護専門師と緩和ケア認定看護師の協力を得て、アンケート内容の妥当性の確認を行う予定である。その後、沖縄県内の看護師を対象に沖縄の文化的特性をふまえた看取りに関するアンケート調査後に看取り教育の内容を整理し、沖縄独自の死の文化を基盤とした終末期がん患者の看取り教育プログラムの開発を行う予定である。本研究の目的は、地域の文化的特性を取り入れた看取りの概念を明確にし、沖縄独自の死の文化を基盤にした終末期がん患者の看取り教育プログラムの開発をすることである。平成27年度の研究実施計画は、1文献検討、2国内外の看護師を対象とした面接調査によるデータ収集を計画していた。1については、CINAHL、Medline、Cochrane Library、医学中央雑誌web版およびハンドリサーチにて、国内外における文化的特性を取り入れた終末期がん患者の看取りに関する文献検索を実施した。その結果、地域の文化的特性を取り入れた看取りに関しての論文は3件であった。地域での支え合いや遺体への尊厳としてのヌジファという沖縄独特の抜魂の儀式が家族のグリーフケアにつながることが示唆されている。また、伝統的に行われていた死後の処置として、手を縛る、遺体をシーツで覆うなどの実施について家族は希望していないが、遺体への薄化粧(死化粧)に関しては、家族は望んでいることが報告されている。2については、沖縄の文化的な特性を取り入れた看取りについての文献検討の結果を、面接調査の質問項目に追加し、質問内容の検討を行う予定である。平成27年度は研究方法に関するセミナーへ参加することで、研究を遂行するための研究者自身の研究能力を高めることにつなげたことと国内外の学会で終末期がん患者の臨終直後の家族ケアについて発表し、教育・研究者と意見交換を行った。地域の文化的特性を取り入れた看取りについての文献収集や内容の検討に時間を要したためである。本研究の目的は、地域の文化的特性を取り入れた看取りの概念を明確にし、沖縄独自の死の文化を基盤にした終末期がん患者の看取り教育プログラムを開発することである。平成28年度の研究実施計画は、1国内外の看護師に対しての文化的特性を踏まえた看取りについての面接調査を実施し、データ分析の実施、2文化的特性を基盤にした看取り概念の明確化の計画であった。1に対しては、沖縄県内でがん看護に携わる看護師10名(がん診療連携拠点病院、緩和ケア病棟及び在宅訪問看護師)に、半構造的面接調査を行った。その結果、がん看護に携わる看護師は、病院で患者が亡くなると、看護師は家族の長老や葬儀社の職員が【患者のマブイをあの世に導くヌジファ(抜霊)の儀式】のための時間を確保し、その様子を見守っていた。患者が亡くなった時にヌジファができないと、遺族は後日、病院や病室を訪れ【ユタと呼ばれる霊能者(シャーマン)とともにヌジファ(抜霊)の儀式】を行うこともあった。沖縄の独自の看取りであるヌジファの儀式を病院で行うことに対して、看護師は、【遺される家族のグリーフケア】であり地域文化として【受け継がれている儀式は意味があるもの】と捉えており、他の入院患者に迷惑がかからない範囲であれば許容するという認識であった。2については、沖縄県の離島及び近隣の外国である台湾のがん看護に携わる看護師に面接調査を実施し、文化的特性を基盤にした終末期がん患者の看取り概念の明確化を実施する予定である。平成28年度は、国内外の学会において文化的ケアを取り入れたがん患者の看取りに関する発表を行い、教育・研究者と意見交換を行い、文化の違いよる看取りについて理解を深めることができた。がん看護に携わる看護師との面接日程の調整が困難で計画通りの面接調査が実施できなかった。

本研究では、地域の文化的特性を取り入れた看取りの概念を明確にし、沖縄独自の死の文化を基盤にした終末期がん患者の看取り教育プログラムの開発を目的とする。開発した教育プログラムを沖縄県内のがん拠点病院等の看護師を対象に実施し、評価することで、病棟から外来、在宅へとつなぐ、持続的な地域文化に根ざした質の高い看取りケアの明確化と教育プログラムの構築を図る。平成28年度は、沖縄県内のがん看護に携わる看護師10名(がん診療拠点病院、緩和ケア病棟および在宅訪問看護ステーション)を対象に面接調査を実施し、沖縄の看取りに関する文化的特性のカテゴリーを抽出した。沖縄では、病院で患者が亡くなると身体を離れたマブイ(霊魂)が、亡くなった病室に残り、成仏できないと信じられている。そこで看護師らは、「患者のマブイをあの世に導くヌジファ(抜霊)の儀式」「ユタと呼ばれる霊能者(シャーマン)と共にヌジファ(抜霊)の儀式」などを行っていた。患者の死後に行われる「ヌジファの儀式」は、家族のグリーフケアや受け継がれる文化として看護師が意味づけを行っていたことが明らかになった。平成29年度の実施計画は、平成28年度の調査結果を受けて、沖縄独自の死の文化を基盤とした終末期がん患者の看取りに関する質問紙の原案を作成し,質問紙調査を実施する位置づけであった。平成29年度に実施したことは、面接調査で明らかになったことをさらに深めるために、終末期がん患者、特に臨終での文化的考慮についての文献検討を実施した。その結果、3件の文献が確認された。看取りに関する異文化相互間の調査報告から、台湾では患者が病院で亡くなると、魂が成仏できないと信じられており、沖縄と同様な考え方であることがわかった。研究の進捗が遅れた理由としては、大学の前期は教育業務(講義、演習、実習)に充てる時間が多く、夏季休暇および後期に研究時間を確保する予定であったが、研究者自身の病気療養に伴い、予定していた研究時間が確保できなかったためである。本研究では、地域の文化的特性を取り入れた看取りの概念を明確にし、沖縄独自の死の文化を基盤とした終末期がん患者の看取り教育プログラムの開発を目的としている。開発した教育プログラムを沖縄県内のがん拠点病院等の看護師を対象に実施し、評価することで病棟から外来、在宅へとつなぐ持続的な地域文化に根ざした質の高い看取りケアの明確化と教育プログラムの構築を図る。平成30年度は、台湾の看護師2名(緩和ケア病棟看護師1名、がん専門病院の看護師1名)を対象に台湾文化に根ざした看取りについて半構造的面接を実施した。その結果、緩和ケア病棟の看護師は、仏教徒の患者が死亡すると、往生室(念仏を唱える部屋)で家族や親族が患者を囲み8時間念仏を唱えることを支援していた。往生室の設備がないICUにおいては、病院の敷地の内にある葬儀社の一室で、家族が患者の死後8時間、念仏を唱えることができるように支援するなど「患者の成仏と家族の安寧のための念仏を唱える時間を確保」していた。また、台湾の慣習として、葬儀の際に着る服が本当の最後の服になり、靴下も合わせて7枚の服を着せるという慣習がある。よって、看護師は、死亡退院する際に着せる服が最後の服でないことを知るなど「死の文化に関する慣習を認識する」ことが重要であると述べていた。看取りの場は異なるが、台湾の看護師は、患者が成仏できるように家族が念仏を唱えることを支援するなどグリーフケアを行っていた。
スピン偏極電流によるコヒーレント磁化反転とそのダイナミックス

強磁性体からなるナノピラーやナノワイヤーに電流を流すと、伝導電子のスピンと局在スピンモーメントの間で角運動量の移動(スピントランスファー)が生じ磁化反転や磁壁の移動が可能である。しかし、これまでの実験では温度上昇に伴いスイッチング速度が低下するなど単純な理論からは理解できない現象が見られた。そこで、本研究では、電子の波動関数の対称性の制御された高品質単結晶バリヤナノピラーおよびナノワイヤーにスピン偏極電流を注入し、スピン角運動量の移動のダイナミクスを解明することを目標に実験を行った。まず、素子に斜め方向に磁場を印加した状態で高周波電流を与えることにより、スピントルクによる強磁性共鳴を誘起し、整流作用を得た。この整流電圧の周波数スペクトルを調べることにより、素子のスピントルクダイナミクスが分かる。実験の結果、スピン注入磁化反転が可能な素子でも、スペクトル形状の素子間のばらつきが大きく、素子内の磁化の運動がよく制御されていないことが分かった。そこで、素子の形状、積層、大きさ、膜厚などを変化させてよりコヒーレントで再現性のよい磁化の運動を実現することを試みた。その結果、強磁性層を薄くすることと外部磁場などで磁区を制御することが有効であることが分かった。また、交換結合した層におけるスピントランスファーダイナミクスの研究を行った。交換結合磁界は均一性がよいのでよりコヒーレントな運動が期待される。実験の結果、交換結合した層の共鳴を得ることに成功した。また、電流により交換結合した層を磁化反転することにも成功した。しかし、磁化反転は完全ではなく中間状態への遷移が見られた。ダイオード測定と平行してノイズの測定を行った。その結果、大電流域で低周波のスペクトル強度が増大することを見出した。このことは、大電流注入において素子内のコヒーレンシーが失われていくことを示している。磁性体からなるナノピラーやナノワイヤーに電流を流すと、伝導電子のスピンと局在スピンモーメントの間で角運動量の移動(スピントランスファー)が生じ磁化反転や磁壁の移動が可能である。しかし、これまでの多結晶系における実験ではスピントランスファーは注入スピンの緩和に伴って起こり、スピントランスファーに関してコヒーレントな現象は見出されていない。今年度は、電子の波動関数の対称性と干渉性の制御された高品質単結晶ナノピラーおよびナノワイヤーにスピン偏極電流を注入し、高周波応答を観測することによりスピン角運動量の移動のダイナミクスを解明することを目指した。まず、様々な素子の高周波特性を評価するために、スピントランスファー素子用の高周波特性評価装置を開発した。次に、微小磁性体の強磁性共鳴を測定することを目指し、この装置を用いた測定感度の見積もりを行った。具体的には、電磁波の導波路幅を様々に変化させたウェーブガイドを作製し、そこに強磁性体のワイヤーを固定し、その強磁性共鳴を測定した。その結果、線幅1.5μmでも十分な強度の共鳴信号を観測することに成功した。続いて、電子のコヒーレントな伝導が巨大トンネル磁気抵抗効果を生み出すとされているMgOを障壁層に用いたトンネル接合素子にスピン偏極電流を注入し、素子からの高周波応答を測定した。素子内の磁性層におけるスピンの歳差運動に伴う共鳴ピークを高感度に観察することに成功し、スピントランスファーによるダイナミクス解明への道筋が示された。

しかし、これまでの実験では温度上昇に伴いスイッチング速度が低下するなど単純な理論からは理解できない現象が見られた。そこで、本研究では、電子の波動関数の対称性の制御された高品質単結晶バリヤナノピラーおよびナノワイヤーにスピン偏極電流を注入し、スピン角運動量の移動のダイナミクスを解明することを目標に実験を行った。まず、素子に斜め方向に磁場を印加した状態で高周波電流を与えることにより、スピントルクによる強磁性共鳴を誘起し、整流作用を得た。この整流電圧の周波数スペクトルを調べることにより、素子のスピントルクダイナミクスが分かる。実験の結果、スピン注入磁化反転が可能な素子でも、スペクトル形状の素子間のばらつきが大きく、素子内の磁化の運動がよく制御されていないことが分かった。そこで、素子の形状、積層、大きさ、膜厚などを変化させてよりコヒーレントで再現性のよい磁化の運動を実現することを試みた。その結果、強磁性層を薄くすることと外部磁場などで磁区を制御することが有効であることが分かった。また、交換結合した層におけるスピントランスファーダイナミクスの研究を行った。交換結合磁界は均一性がよいのでよりコヒーレントな運動が期待される。実験の結果、交換結合した層の共鳴を得ることに成功した。また、電流により交換結合した層を磁化反転することにも成功した。しかし、磁化反転は完全ではなく中間状態への遷移が見られた。ダイオード測定と平行してノイズの測定を行った。その結果、大電流域で低周波のスペクトル強度が増大すことを見出した。このことは、大電流注入において素子内のコヒーレンシーが失われていくことを示している。
ピッチ系炭素繊維原料の可溶化と物性制御：ボトムアップバルク化学手法の確立へ向けて

石炭ピッチ繊維を管状電気炉により空気中で加熱して不融化ピッチを調製した。この際、加熱温度が高い方が酸素含有量が多く、カルボニル基が主に含まれることがわかった。さらにこの不融化ピッチをRMgBrで処理してアルキル化ピッチを調製したところ、水酸基の存在が観察された。アルキル化により不融化ピッチに比べて溶解度の向上が見られ、吸収・蛍光スペクトルでは長波長シフトが観測された。また、より高温で焼成したアルキル化ピッチの方が分子量が増加していた。さらにアルキル化ピッチにマイクロ波を照射することで、脱水反応が進行した。脱水後のピッチサンプルにおける10%重量減少温度は不融化行程での加熱過程に依存していた。平成26年度は(1)熱処理温度を変えた不融化ピッチライブラリの調製、(2)不融化ピッチのアルキル化反応による可溶化と物性解明、の二点について研究を行った。(1)では紡糸処理を行った石炭ピッチを管状電気炉により空気を流通させながら加熱する温度を200-400°Cで50°Cずつ変化させて不融化ピッチを調製した。得られた不融化ピッチを元素分析、XPS、IRにより分析したところ、加熱温度が高い方が酸素含有量が多く、含有酸素の多くはカルボニル基であることがわかった。しかし350°C以上で加熱した場合は重量の減少が見られ、一部の炭素成分が酸化して二酸化炭素になることが示唆された。一方、加熱前の粒子サイズと不融化ピッチの性質の間に相関は見られなかった。(2)では不融化ピッチの塩化メチレン不溶分に対してアルキル化を行ったが、350°C以上で加熱した不融化ピッチに対してはアルキル化がほとんど進行しなかった。これはカルボニル基が多く導入されて溶解度が下がったためだと考えている。一方、300°Cで1.5時間焼成した不融化ピッチの塩化メチレン不溶分に対して1-hexyl,2-ethylhexyl,1-dodecyl,p-dodecyloxyphenyl基を導入したアルキル化ピッチを調製した。いずれにおいても不融化ピッチに比べて溶解度の向上が見られ、IRによりカルボニル基の減少とOH基の増大を観測した。吸収・蛍光スペクトルでは長波長シフトが観測された。GPCによる分子量測定を行ったところ、より高温で焼成したアルキル化ピッチの方が分子量が増加していた。アルキル化ピッチをAr雰囲気下、300°Cで焼成したところ、IRスペクトルにおいて水酸基の減少が観測されると共に、TG-DTAにて水分子の脱離によると考えられる重量減少も確認された。アルキル化ピッチのXRD測定により、これらがrGOやgraphiteに比べて少し長い層間距離を持つこと、アルキル基が長くなるほど層間距離が大きくなることがわかった。(1)熱処理温度を変えた不融化ピッチライブラリの調製、では石炭ピッチ繊維を管状電気炉により空気中で加熱する温度を200-400°Cで50°Cずつ変化させて不融化ピッチを調製した。得られた不融化ピッチを元素分析、XPS、IRにより分析、加熱温度が高い方が酸素含有量が多く、その多くはカルボニル基であることがわかった。(2)不融化ピッチのアルキル化反応による可溶化と物性解明、では300°Cで1.5時間焼成した不融化ピッチをアルキル化してアルキル化ピッチを調製した。ここで新たな研究項目(3)アルキル化ピッチの脱水反応による物性変化の追跡、を追加して検討した。アルキル化ピッチをAr雰囲気下、300°Cで焼成したところ、IRスペクトルにおいて水酸基の減少と共にアルキル基の減少が観測され、溶解度の低下も同時に起こることがわかった。そこで他の手法による脱水反応を検討したところ、マイクロ波の照射により、アルキル基の脱離を抑えながら脱水反応を達成することができた。マイクロ波による脱水は加熱による脱水よりも高い溶解度のピッチサンプルを与えたため、溶液物性を明らかにした。また、TG-DTAにより脱水後のピッチサンプルにおける10%重量減少温度が(1)の不融化行程での加熱温度および加熱時間に依存していることも明らかになった。すなわち、不融化行程の制御によりアルキル化ピッチの物性を制御できたため、本研究の目的の大部分は達成できたと言えるだろう。

また、より高温で焼成したアルキル化ピッチの方が分子量が増加していた。さらにアルキル化ピッチにマイクロ波を照射することで、脱水反応が進行した。脱水後のピッチサンプルにおける10%重量減少温度は不融化行程での加熱過程に依存していた。研究項目(1)においては当初の計画通り不融化行程の熱処理温度を変化させることで、その温度範囲の上限を見極めると共に、得られる不融化ピッチの酸素含有量が熱処理温度に依存して変化すること、粒子サイズは不融化ピッチの性質には影響を与えないこと、を見いだした。研究項目(2)では不融化ピッチに対して複数種類の異なるアルキル基を導入し、溶解度・吸収スペクトル・蛍光スペクトル・X線光電子スペクトル・XRD・TG-DTA・分子量解析がアルキル基の種類により異なることを明らかにできた。計画していた全ての検討を行うことができたため、当初の研究実施計画通り進展していると言えるだろう。有機元素化学・有機金属化学・石炭研究目的に記した(3)を行う。(3)酸化的共平面化反応を通したアルキル化ピッチのπ共役サイズ変化による溶液物性制御(2)で得られるアルキル化ピッチライブラリに対して、酸化的共平面化反応を適用することで、ピッチサンプルに含まれる分子群のπ共役系の大きさを制御する。ここでは、酸化的共平面化反応に有効であるとされるルイス酸群、AlCl3, FeCl3, Sc(OTf)3などの反応条件を広く検討する。反応を行った後、溶解度が保持されているかどうかを確認し、反応前後での紫外可視吸収スペクトルや三次元蛍光スペクトルの変化を見極める。さらに(2)と同様に得られた材料の各種光学特性を比較し、酸化的共平面化反応前後での比較を行う。まとめとして(1)-(3)で得られる情報を整理して、石炭ピッチを用いた有機デバイス作製に必要な知見を得る。また、(2),(3)で得られるサンプル群については、色素増感太陽電池における色素、有機薄膜太陽電池における有機半導体のどちらかの代替、有機EL素子の活性層やキャリアブロック層、としての利用の可能性を探るために、実際のデバイス作製を行って評価を行う。
高速人工抗体創製法 の開発とタンパク質 １分子単位定量への 応用

平成29年度の研究により、TRAP提示法を用いた人工抗体選択系が完成し、また、コムギ胚芽を用いることで標的タンパク質の調製に成功した。そこで平成30年度は、コントロールタンパク質群と少数タンパク質群をコムギ胚芽で調製し、TRAP提示法による人工抗体選択系を用いて抗体の作製を試みた。これにより少数タンパク質群に対して人工抗体を得ることに成功した。大腸菌で人工抗体を発現してその解離定数を測定したところ、数数十nMの解離定数をもつ人工抗体が得られたことが分かった。一方で、平成29年度はアミノ基を持つシラン化剤で修飾、無水酸処理によるあるカルボン酸の生成、NHS活性化の一連の操作により、タンパク質を効率よく固定化できるガラス基板の作製に成功していた。さらにガラス表面の凹凸を少なくするために、モノメトキシシランを使用して、ガラス表面の均質な修飾を試みた。様々な条件検討の結果、AFMでの観察で凹凸が数nm以下の修飾ガラス基板の作製に成功した。そこで、人工抗体をTAMRA蛍光基で修飾してガラス基板に直接固定化して蛍光を測定した。この実験の結果、TAMRA蛍光基は蛍光強度が十分でないことが分かった。そこで、蛍光強度が23倍強いとされるJF549を合成し、さらにこれをGGGGGKペプチドに修飾して、SortaseAを用いて人工抗体に結合させた。その結果、見かけの蛍光強度が1.52倍の人工抗体が得られた。次に、モデルタンパク質であるEGFR1を固定化したガラス基板に、抗EGFR1人工抗体を含む溶液をのせてEGFR1の1分子検出を試みた。このときガラス基板の表面のPEG修飾により人工抗体の特異的な吸着が大きく抑えられることが分かった。ただし、この非特異的吸着は完全に抑えられるものではなく、より精密な1分子定量には、非特異的な吸着をさらに抑える工夫が必要であることも示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。標的タンパク質に高親和かつ特異的に結合する人工抗体を得るためには、人工抗体の骨格の選択と人工抗体ライブラリ遺伝子の質が大切である。本研究では、人工抗体の骨格として多くの実績があり小型である2種類のタンパク質を使用した。まず、ヒトのフィブロネクチンの1ドメイン(10FN3:90残基程度)の3つのループ部分の遺伝子を様々な長さのランダム配列に置き換えた遺伝子を作製した。また別に、ラマ一本鎖抗体の抗原認識ドメイン(sAb:120残基程度)の3つのループ部分の遺伝子を様々な長さのランダム配列に置き換えた遺伝子も作製した。これらの遺伝子の質を担保するために、それぞれ217遺伝子と215遺伝子についてDNA配列解析を行い、約60%の遺伝子が人工抗体ライブラリとして使用可能な遺伝子であることが分かった。また、ループ配列も完全にランダム化されており、進捗状況でも述べたように10兆種類のライブラリの多様性も確保できていることから、作製したライブラリは質の高いものであると考えられる。次に、我々が以前にペプチド選択法に開発したTRAP提示法を改良して、高速人工抗体創製法の開発を試みた。様々な条件を最適化し、人工抗体のN末端を改良することで、人工抗体を効率よく提示する方法を確立した。さらに、本方法を用いて血管内皮細胞増殖因子受容体2に対して結合する人工抗体の選択操作を行い、血管内皮細胞増殖因子受容体2に結合するフィブロネクチンの1ドメインとラマ一本鎖抗体の遺伝子ライブラリを得ることに成功した。まず、ヒトのフィブロネクチンの1ドメインとラマ一本鎖抗体の抗原認識ドメインの3つのループ部分の遺伝子を、様々な長さのランダム配列に置き換えた遺伝子を作製した。通常、この大きさの遺伝子の合成には外部委託遺伝子合成サービスを利用するが、本研究では10兆種類以上のランダム配列を持つ人工抗体遺伝子が必要であることから、ランダム配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを、多様性を保つように設計された方法によって組み合わせて、人工抗体遺伝子ライブラリ遺伝子を作製した。こうして作製した遺伝子を、これらの遺伝子の質を担保するために、それぞれ217遺伝子と215遺伝子についてDNA配列解析を行ったところ、フィブロネクチンについては124遺伝子、ラマ一本鎖抗体についても124遺伝子の遺伝子について、正しい骨格の塩基配列を保持していることが分かった。60%の遺伝子が正しい配列を持つことから本遺伝子はライブラリ遺伝子として十分に質の高いものであるといえる。また、ループ部分の配列は完全にランダム(NNKコドン)であり、遺伝子のライブラリ化が成されていることが確認できた。次に、我々が以前に開発したTRAP提示法を、人工抗体を提示するように最適化して高速人工抗体創製法を確立した。翻訳時の翻訳に関わる因子の濃度や、人工抗体自身のN末端の配列を最適化することで、効率よく人工抗体を提示することが可能となった。こうして開発した高速人工抗体創製法を用い、計画を前倒しして、血管内皮細胞増殖因子受容体2に対して結合する人工抗体の選択を試みた。その結果、ヒトのフィブロネクチンの1ドメインと、ラマ一本鎖抗体の抗原認識ドメインを骨格としたライブラリから、標的に結合活性を持つ人工抗体の遺伝子ライブラリの濃縮に成功した。H27度は、モデルタンパク質であるVEGFR2に対する抗体の選択をTRAP提示法を用いて行い、高い親和力を持つ人工抗体を得ることに成功している。ただ、この過程で、選択操作を繰り返すたびに遺伝子が短くなるなど、本来はペプチドの選択系として開発したTRAP提示法の問題点も見えてきた。

そこでH28年度は、その原因を探り、これがmRNA-DNAピューロマイシンリンカー複合体の形成効率が低くなっているためであることをつきとめた。さらに、この形成効率の低下は、修飾したDNAを使用することで抑制できることを発見し、人工抗体選択系の大きな問題点を解決することに成功した。さらに、少数タンパク質を含む標的タンパク質を10種類選定し、これを動物細胞からクローニングして大腸菌に発現させた。10種類のうち正しく発現した4種類を用いて、実際にTRAP提示法を用いた選択をおこなった。6回の選択操作を繰り返したが、標的タンパク質に結合する人工抗体は現在のところ得られていない。その大きな原因は、大腸菌による標的タンパク質発現系であると考えている。H29年度は動物細胞で、正しい折りたたみをもつタンパク質を発現することで、標的タンパク質の質を高めて、人工抗体の取得に挑む。本研究の目的のためには、1細胞を破砕して、その内部のタンパク質を基板に効率よく固定化する技術が必要である。そこで、簡便に1細胞をガラス基板上に取り出し、その内容物を基板上に固定化する技術の開発に取り組んだ。その結果、1細胞を取りだし発現させた緑色蛍光タンパク質(GFP)を基板上に固定化して、これを全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF)を使って検出することに成功した。今後は、基板の修飾方法など、タンパク質の効率的な固定化方法を目指す。このようにH28年度は、研究の最終目標に達するまでの個々の技術を平行して開発した。昨年度に、TRAP提示法を使用してモデルタンパク質であるVEGFR2に高い親和性で結合する人工抗体の取得に成功した。しかし、この人工抗体を作製する段階で、本来はペプチドの選択のために作製したTRAP提示法が、必ずしも人工抗体の選択には最適ではないことが分かってきた。その大きな原因は、ペプチドに比べて人工抗体の遺伝子が長く、効率的にmRNA-ピューロマイシン複合体が形成できないためであると考えられた。そこで本年度は、効率的なmRNA-ピューロマイシン複合体の形成のために様々な条件を検討した。その結果、mRNAとアニールをするDNAを修飾をもつものに置き換えることで、効率よくmRNA-ピューロマイシン複合体が形成されることが分かった。さらに少数タンパク質を含む10種類の遺伝子をA549細胞のcDNAからクローニングし、tRNAを動物細胞タンパク質発現用に補完した大腸菌で発現させた。このうち完全長が発現した4種類のタンパク質について精製を行い、これを磁気ビーズに固定化して、TRAP提示法による選択を行った。選択操作は6回行ったが、現在のところ目的の人工抗体は得られていない。これは、ヒトの標的タンパク質を大腸菌で発現しているため一定の正しい折りたたみ構造を持っていないためであると考える。本研究を推進するためには、1細胞を分離してガラス基板上で溶解しタンパク質を基盤に固定化する技術が必要である。そこで、GFPを発現したHela細胞を培養し、ここから1細胞をマイクロインジェクターで分取して、ガラス基板にまく技術を確立した。