hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
菌根の拡大・生長の光学的手法による高精度計測とそれによる大気汚染影響評価

(5)顕微鏡視野における動的ESPIの実験系を本研究においては、研究代表者らが独自に開発した超高密度非接触変位計測法である「統計干渉法」による植物のナノメータレベルの動きの計測を行い、同時にすでに従来技術であるデジタル画像相関法の応用として、植物の動きの3次元解析を新たに提案した。統計干渉法による実験では、これまで誰も見たことがない新規な現象として「ナノメータゆらぎ」を発見した。さらに、この現象が環境負荷に対して敏感に応答するという新しい知見を得た。以下にこれらの成果を要約する。1)植物の茎および根が成長過程で回線運動をすることは古くから知られているが、本研究においては、デジタル画像相関法により、3次元的な運動をサブミリメータレベルの精度で定量解析した。2)植物の成長を「統計干渉法」によって秒レベルのサンプリング間隔でナノメータレベルの分解能で計測したところ、健康な植物においては、不規則な伸縮を繰り返す「ナノメータゆらぎ」現象が新規に確認された。3)植物の大気環境ストレス応答実験として、オゾンシロイヌナズナへのオゾン暴露実験をおこなったところ、ナノメータゆらぎが短時間に減衰し、注意報レベルのオゾン濃度で十分敏感に反応することが確認された。4)アカマツの根のナノメータレベルの動きは、菌根との共生に大きく依存することが、統計干渉法による計測の結果から確認された。以上、統計干渉法によって観察される「植物のナノメータゆらぎ」は、植物学の分野にこれまでにない全く新しい計測手段を提供し、また環境センシングという意味においても、新しい指標となる可能性を秘めており、新しい研究分野の萌芽として、今後の研究の進展を予感させる興味深い成果が得られた。
原子核の磁気遷移及びガモフ・テラー型遷移の研究

原子核の磁気能率やβ-崩壊率の研究は原子核構造の研究及び核子間の有効相互作用の研究に対して重要な役割を果たしてきた.最近では中間エネルギーの陽子や電子線を使った磁気遷移やガモフ・テラ型遷移の測定,さらに準弾性散乱領域における縦波及び横波成分の寄与の分離などより豊富な情報が得られている.これらの反応に対して,原子核の芯の励起,特にテンサー相関の影響,及び中間子交換電流, △-共鳴,更にクォーク構造等の効果等を統一的に検討してきた.中間エネルギーの陽子や電子線を使った磁気遷移やガモフ・テラー型遷移の測定により遷移強度が高い励起エネルギー状態へ分散している事が実験的に知られて来た.しかしながら理論的には非常に複雑なために分散の機構の解明はなされていなかった.我々はこの分散の機構の問題に対して定性的な議論と平行して二粒子-二空孔を含む芯励起の効果を定性的かつ定量的に研究した.そして従来の乱雑位相近似[RPA]を修正して拡張することにより基底状態相関や交換電流の効果も考慮出来る遷移強度の計算方法を開発した.最近中間エネルギーの陽子を使った(p,p')の実験による準弾性散乱領域でのスピン偏極量の測定が行われ話題となっている.この問題は我々の研究課題である磁気遷移及びガモフ・テラー型遷移と密接に関連しているために理論的に詳しく研究した.準弾性散乱では終状態が連続状態であるために応答関数の計算において連続状態を含むRPA方程式を使う必要がある.そのために従来の計算は核物質中で主に行われてきた.我々は有限核において連続状態を含むRPAを用いてパイオン凝縮の前駆現象等の影響を検討した結果,従来の核物質での計算結果とは定量的にかなり異なる結論を得た.更に連続状態を含むRPA計算で相互作用の交換項まで考慮出来る方法を開発し準弾性電子散乱におけるクーロン和則の問題に関しても研究した.原子核の磁気能率やβ-崩壊率の研究は原子核構造の研究及び核子間の有効相互作用の研究に対して重要な役割を果たしてきた.最近では中間エネルギーの陽子や電子線を使った磁気遷移やガモフ・テラ型遷移の測定,さらに準弾性散乱領域における縦波及び横波成分の寄与の分離などより豊富な情報が得られている.これらの反応に対して,原子核の芯の励起,特にテンサー相関の影響,及び中間子交換電流, △-共鳴,更にクォーク構造等の効果等を統一的に検討してきた.中間エネルギーの陽子や電子線を使った磁気遷移やガモフ・テラー型遷移の測定により遷移強度が高い励起エネルギー状態へ分散している事が実験的に知られて来た.しかしながら理論的には非常に複雑なために分散の機構の解明はなされていなかった.我々はこの分散の機構の問題に対して定性的な議論と平行して二粒子-二空孔を含む芯励起の効果を定性的かつ定量的に研究した.そして従来の乱雑位相近似[RPA]を修正して拡張することにより基底状態相関や交換電流の効果も考慮出来る遷移強度の計算方法を開発した.最近中間エネルギーの陽子を使った(p,p')の実験による準弾性散乱領域でのスピン偏極量の測定が行われ話題となっている.この問題は我々の研究課題である磁気遷移及びガモフ・テラー型遷移と密接に関連しているために理論的に詳しく研究した.準弾性散乱では終状態が連続状態であるために応答関数の計算において連続状態を含むRPA方程式を使う必要がある.そのために従来の計算は核物質中で主に行われてきた.我々は有限核において連続状態を含むRPAを用いてパイオン凝縮の前駆現象等の影響を検討した結果,従来の核物質での計算結果とは定量的にかなり異なる結論を得た.更に連続状態を含むRPA計算で相互作用の交換項まで考慮出来る方法を開発し準弾性電子散乱におけるクーロン和則の問題に関しても研究した.最近の話題として(P,P')の実験によるスピン偏極量の測定があり、この問題は我々の研究テーマである磁気遷移及びガモフ・テラー型遷移と密接に関連しており今年度はこの問題を中心に研究を行ってきた。高エネルギーの陽子の擬弾性散乱であり、終状態が連続状態であるため応答関数の計算で連続状態のRPA方程式の定式化を行い具体的な数値計算を行った。そしてパイオン凝縮の前駆現象等の効果を有限核で検討した結果、従来の核物質での結果とは定量的にかなり異なる結論を得た。より詳しい議論の展開には二粒子・二空孔状態の考慮や交換流の影響まで必要と思われる。これは来年度の主要テーマと考えている。従来のテンサー相関の効果は中性子数N=陽子数Zの原子核で評価されていたのであるが、ガモフ・テラー型遷移及び磁気遷移の実験はN≠Zを標的核として行われておりそこでのテンサー相関の効果はきちんと再評価する必要がある。今回は【^(48)Ca】において磁気遷移及びガモフテラー型遷移に対して定量的に評価した。従来の交換流は主に中間子自由度の影響であったが核子がクォーク・グルオン系であるために生じる交換流をクォーク・クラスター模型を使って詳細に調べた。結果は核子の大きさをどう評価するかに依るのであるが、軽い原子核のガモフ・テラー型ベータ崩壊に対して数パーセントの補正を与えることがわかった。これは従来の交換流及びテンサー相関による影響と同じ程度の効果である。磁気モーメントに対する相対論的効果を有限核で行った。結果はアイソスカラーの磁気モーメントに対してω×ソン交換によるRPA型の補正が重要であり、これを考慮すると補正はかなり小さくなる。
傍腫瘍性神経症候群に関連する神経抗原遺伝子の解析

(1)傍腫瘍性小脳変性症の神経関連遺伝子pcd17のleucinezipper領域をコード部分をプローブとして、ヒト小脳cDNAライブラリーから1,608塩基対のopenreading frameを持ち、予想される蛋白の分子量は60,460をコードする一つのcDNAクローンpcd17.2を分離した。この遺伝子にコードされる蛋白は8例の患者血清PCA-1抗体全てにPCD17.2抗原が認識されることが明らかとなり、新たな神経抗原蛋白であり、PCD17(PCD17.1)のisoform蛋白と考えられた。(2)PCD17.2のmRNAはヒト小脳において、PCD17.1mRNAの発現の局在や免疫組織化学で観察される抗原の局在と一致していた。ヒトゲノムDNAの解析から、pcd17.1遺伝子とpcd17.2遺伝子に明らかなintron構造は存在しないことから、この二つのisoform遺伝子はalternativesplicingによって生じたものではなく、ゲノム上でそれぞれの遺伝子が独立して存在している可能性が考えられた。(3)傍腫瘍性辺縁系脳炎に関連する遺伝子ple21の3つのRNA認識領のANNA-1抗神経細胞抗体に対する抗原性を検討したところ、いずれのRNA認識領域も抗体により認識されることが確認された。第3RNA認識領域については、抗体の認識に症例による差異が認められた。(4)ple21遺伝子のRNA認識領域のRNAとの結合性についてgelmobility shift assayにより検討した結果、c-mycとc-fosの31非翻訳配列に存在するAU-rich elementとの結合が証明された。(5)pcd17.1とpcd17.2遺伝子にコードされる蛋白は、homodimerizationを起こさず、異なるleucinezipper motifを有する蛋白と会合する可能性が示唆された。さらにpcd17遺伝子にコードされる蛋白はGALADNA結合蛋白とのhybrid蛋白に酵母細胞のGAL1promoterに対する転写活性があることが明らかになった。(6)ple21及びpcd17遺伝子のmRNA転写産物の小脳及び海馬における発現の局在を検討したところ、ple21の小脳と海馬、pcd17の小脳での転写産物の発現は抗原蛋白の分布と一致していたが、pcd17の海馬組織においては転写と翻訳の間に解離が存在していることが観察された。本研究は、傍腫瘍性小脳変性症に関連する神経蛋白遺伝子の機能についての解析と、同様な機能を持つと推定される新たな遺伝子の分離同定を目的としているが、平成7年度の研究経過としては、1)pcd17遺伝子をneomycin耐性遺伝子を有する真核細胞発現ベクターにsense及びantisenseの方向に組み換えた組み換え体遺伝子を作製し、その配列について確認した。2)この遺伝子を電気穿孔法によってHeLa細胞に遺伝子導入を行ない、G418で選択してtransfectantを得た。得られたtransfectantについて、遺伝子を発現する状況での長期培養を開始した。3)pcd17抗原のleucinezipper領域をコードする塩基対をプローブとしてヒト小脳cDNAライブラリーをスクリーニングし、ひとつのcDNAクローンを得て、その塩基配列を決定した。さらに3′-

RACE法により、この遺伝子の3′側を同定した。得られたクローンは5′側の370塩基対の異なり、この部分の塩基配列と推定アミノ酸配列をデータベースにより検索したが、他の遺伝子との間にも有意な相同性を示すような蛋白、遺伝子はみつからなかった。leucinezipper構造はpcd17遺伝子と共通する部分に認められ、塩基配列は完全な一致を認めた。4)pcd17cDNAと新たにクローニングしたcDNAに共通する部分をプローブとしたヒトゲノムDNAライブラリーからのクローニングにより、約22kbのヒトゲノム遺伝子クローンIPCDを得た。さらに、このファージのT7プロモーター側に上記遺伝子の蛋白コード領域を含むゲノム遺伝子が存在していることを確認した。この断片について塩基配列の解析を開始した。(1)肺小細胞癌に関連し、多彩な脳神経症状を呈する疾患の関連遺伝子ple21をHela細胞に対して遺伝子導入を試みた。細胞をG418で選択後、免疫細胞染色によりPLE21蛋白の安定した発現が確認され、ple21遺伝子の恒常発現細胞株を得ることができた。(2)ple21の3つのRNA認識領域をコードする塩基配列部分断片を発現ベクターに組み換え、大腸菌内に発現を誘導した組み換え体蛋白を作製した。これらの組み換え体蛋白の患者由来の抗神経細胞抗体に対する抗原性をwestern blottingにより検討した結果、いずれのRNA認識領域においても抗神経細胞核抗体との反応性が確認された。抗体との反応性は、第2RNA認識領域に最も強く、第1及び第3RNA認識領域についてはその反応性が弱いことが確認された。また、第1、第2RNA認識領域については、検索し得た全ての抗神経細胞抗体によって認識されることが確認されたが、第3RNA認識領域については、抗体の認識に症例による差異が認められ、この蛋白を認識しない抗体も存在することが明らかとなった。更に、ple21遺伝子の組み換え体蛋白PLE21のこれらのRNA認識領域が実際にRNAと結合し得るかについてgel mobility shift assayにより検討した。その結果、protooncogeneであるc-mycとc-fosの3ユ非翻訳配列に存在するAU-richelementとの結合が証明された。このelementが、mRNAの安定性に関与していることより、ple21蛋白が神経細胞においてこれらの遺伝子の発現の調節に関与している可能性が示唆された。(3)婦人科領域癌を伴う傍腫瘍性小脳変性症の関連遺伝子であるpcd17をGAL/1遺伝子の下流に組み換えた遺伝子を用いて、この遺伝子が転写活性化能を有することを見出した。
二分脊椎神経回路における抑制神経の変化

平成27年度はモデル動物手術修練に集中した。平成28年度は抑制ニューロンの変化の指標としてGABAとカスパーゼの免疫染色により二分脊椎ヒヨコの脊髄に生直前から神経障害が起こり始めていることを確認した。同時に運動障害の程度をデジタルカメラで記録した。平成29年度には本モデルを用い、特に興奮性のグルタミン酸、アセチルコリンと、抑制性のGABAの増減に注目して解析し、孵化後に運動機能が急激に悪化すること、それが孵化後の抑制神経系障害が原因であることを明らかにし、Disease Models & Mechanisms 10, 1421-1432, 2017(IF=4.7)に発表した。二分脊椎症は脊髄内にも傷害がおよび、運動、排尿障害、下肢の変形等が起こる整形外科等の領域で重要な疾患である。しかし、これまで適切なモデル動物が開発されていなかった為に充分な病態解明がなされていない。当研究室では、手術により脊髄を再開裂し、世界で始めて歩行異常を示す二分脊椎モデル動物を効率良く作成することに成功した。本研究は、神経伝達物質に対する免疫組織化学により上記神経異常に関する論文報告を行いながら、最終的には両神経異常を多光子顕微鏡により可視化、検討し、二分脊椎における歩行障害の原因を解明することを目的とする。まず平成27年度はモデル動物の作成の為の手術修練に集中した。受精卵を孵卵器に入れ、孵卵3日目に卵殻を切り取り羊水を一部取り除いて、鶏胚の脊髄背側を微少メスにより切開した。本手術は極めて繊細で、適当な指導者の下で訓練し習熟しなければ安定した結果は得ることが難しい。本手術を開発した研究者に手術手技の指導を受け、すでに30例の二分脊椎ヒヨコの作製に成功している。さらに抑制ニューロンの変化の指標としてGABA免疫染色を行い、抑制系の減少を確認した。さらにカスパーゼの免疫染色により二分脊椎ヒヨコの脊髄に生直前から神経障害が起こり始めていることを確認した。同時に運動障害の程度を動画データとして投稿ができるようデジタルカメラで記録した。特に興奮性のグルタミン酸、アセチルコリンと、抑制性のGABAの増減に注目して解析し、これらをまとめて投稿準備中である。一方で、トレーサーによる解析は時間が掛かる実験であるが、すでに共同研究者である今村教授の研究室との基礎実験を開始した。モデル動物は確実に作成できるようになった。その免疫組織化学的なデータはほぼ完了した。神経回路トレーサーの基礎実験を共同研究者と開始した。以上により、ほぼ、計画通りに順調に進展していると判断できる。すでにモデル動物の作成の為の手術修練は終了し、多くの二分脊椎ヒヨコの作製に成功している。二分脊椎ヒヨコの運動障害の確認を行い、当初予定していなかった知覚異常についてデジタルカメラ等を利用してデータをまとめた。生直後には下肢の刺激に対して二分脊椎でも正常に近い反応が見られたが、生後4日では反応が低下し、生後10日では、ほとんど反応が見られなくなった。同時に下肢の姿態や関連する筋肉の萎縮等について詳細に記録し、さらに灌流固定し筋肉の萎縮を正常動物と比較し、どの筋肉が特に障害されているかを解析した。また障害を受けた脊髄の免疫組織化学を行い、各神経伝達物質の変化を解析した。特に興奮性のグルタミン酸、アセチルコリンと、抑制性のGABAの増減に注目して解析した。GABAのみならず抑制ニューロンのサブタイフであるCalbindin, Calretinin等についても検討した。その結果、GABAを中心とする抑制系の入力が孵化後に急速に減少することが判明した。さらに、電子顕微鏡専門技官の助力を得て、電子顕微鏡により運動神経に終わる興奮性シナプスと抑制性シナプスを球形小胞シナプスと扁平小胞シナプスに分けて形態学的に解析した。ここでも扁平小胞を含む抑制系シナプスが極度に減少していた。また、アポトーシスの指標となるカテプシンの反応を免疫組織化学により染色すると、生後に脊髄の運動神経、抑制神経が強く障害されていることが判明した。これらをまとめて、孵卵後に二分脊椎モデルで起こる神経障害が、脊髄神経のアポトーシスによるものであるとして、論文を投稿中である。すでに当初の研究計画のほとんどが完了し、論文作成が終わっている。かなりレベルの高いインパクトファクターが8前後の雑誌に投稿しているが、リジェクトされており、コメントに従って修正している最中である。二分脊椎症は脊髄内にも傷害がおよび、運動、排尿障害、下肢の変形等が起こる重要な疾患である。本研究は、神経伝達物質に対する免疫組織化学により上記神経異常に関する論文報告を行いながら、最終的には両神経異常を多光子顕微鏡により可視化、検討し、二分脊椎における歩行障害の原因を解明することが目的である。

本手術を開発した研究者に手術手技の指導を受け、すでに60例の二分脊椎ヒヨコの作製に成功している。平成28年度は抑制ニューロンの変化の指標としてGABA免疫染色を行い、抑制系の減少を確認した。さらにカスパーゼの免疫染色により二分脊椎ヒヨコの脊髄に生直前から神経障害が起こり始めていることを確認した。同時に運動障害の程度を動画データとして投稿ができるようデジタルカメラで記録した。平成29年度には本モデルを用い、特に興奮性のグルタミン酸、アセチルコリンと、抑制性のGABAの増減に注目して解析し、孵化後に運動機能が急激に悪化すること、それが孵化後の抑制神経系障害が原因であることを明らかにし、動物モデル分野では世界的に評価の高いDisease Models & Mechanisms (IF=4.7)に論文をKhanの第一著者論文として発表した。一方で、トレーサーを用いた二光子顕微鏡による解析を共同研究者との基礎実験を開始した。平成27年度はモデル動物手術修練に集中した。平成28年度は抑制ニューロンの変化の指標としてGABAとカスパーゼの免疫染色により二分脊椎ヒヨコの脊髄に生直前から神経障害が起こり始めていることを確認した。同時に運動障害の程度をデジタルカメラで記録した。平成29年度には本モデルを用い、特に興奮性のグルタミン酸、アセチルコリンと、抑制性のGABAの増減に注目して解析し、孵化後に運動機能が急激に悪化すること、それが孵化後の抑制神経系障害が原因であることを明らかにし、Disease Models & Mechanisms 10, 1421-1432, 2017(IF=4.7)に発表した。現在までのデータをまとめて28年度内に論文発表を行う。28年度の推進方策は基本的には最初の申請書の研究方針の通りである。まず正常鶏胚を用いて神経回路トレーサーの基礎実験を進め、28年度内には正常動物でのデータを得る予定である。現在までの研究内容は一応一段落しているので、このデータを基にさらに二分脊椎の治療実験に取り組みたい。一部の期待出来る治療結果も得られているので、さらに実験を加えて論文作成に努めたい。残額は2万円以下と少額であるので、次年度に繰り越して有効に使用したいと考えた。当該年度は免疫組織化学を中心に行い、多くのデータが得られた。免疫組織化学は、適切な市販抗体が見つかったのであまり多くの費用が掛からずにデータを出すことが出来た。次年度は、電子顕微鏡に関するデータを多く必要としている為、電子顕微鏡の出来る技官の協力要請に、より費用が掛かると思われる。28年度の予算と共に、抗体等を購入したい。次年度は電子顕微鏡の専門技官の人件費に6万円X10ヶ月=60万円程度を考えている。当初予定していた抗体や薬品等を購入する費用は、現在までに購入したものが使用可能である為、必要分を追加すればよく、比較的安価で済む可能性が高いので、両者を相殺出来ると考えている。
アンジオテンシン変換酵素のアミノ酸配列、アイソザイムの検討とその医学的応用

ヒト肺(180gr)を出発材料とし、比活性105units/mgタンパクの高比活性を有し、sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis(SDS-PAGE)上、均一な本酵素0.3mgが得られた。SDS-PAGEでの分子量は170,000と計算され、クロマトフォカッシング法による等電点は4.8であった。精製酵素のアミノ酸配列をアミノ酸分析機により検索したところ、アミノ基末端からの配列は(NH_2)-X-XーPro-Gly-Leu-Glu-Pro-Gly-X-Phe-Ser-Ala-Arg-Glu-Ala-Gly-Alaと、17個中14個のアミノ酸配列を決定することができた。このアミノ酸配列はすでに報告されているウシ、ウサギ肺、ブタ、ウシ腎由来のアンジオテンシン変換酵素のN末アミノ酸配列と高い相同性を有していたが、ヒト腎由来の同酵素のそれとは異なるものであった。精製された本酵素を抗原としてBALB/cマウスを感作し、脾細胞を骨髄腫細胞と細胞融合し、8回のクロ-ニングにて細胞株を確立した。BALB/cマウス腹水より硫安分画、ゲルろ過法にて単クロ-ン抗体を精製した。得られた抗体はIgM抗体で、Western blotにて分子量約170,000のアンジオテンシン変換酵素に相当する部位に陽性バンドを認識した。同抗体を用いた蛍光抗体間接法にて、ヒト肺血管内皮細胞、腎糸球体毛細管内皮細胞、尿細管上皮細胞、精巣精細管上皮細胞が染色された。現在、これらの組織間での抗原性の差異を検討中である。本年度はヒト肺からの効率的なアンジオテンシン変換酵素の精製法の確立と、これを試料とした本酵素のアミノ酸配列の検討を目指した。ヒト肺(180gr)をWaring blender等でホモジナイズし、低速円心後その上清を22,000xgで遠心し、細胞膜分画を含む沈澱物にデタージェントを加えて疎水性の膜酵素等を可溶化した。従来、このようにして得られた膜分画の疎水性タンパク画分から、以下に述べるようなカラムクロマトグラフィー法により本酵素の精製を行ってきたが、この方法では精製効率が不十分であり、各種分析を行うに足りる精製酵素を得るのは困難であった。そこで、今回はデタージェント処理で得られた可溶化膜分画をトリプシンで処理し、これをhydroxy-apatiteによるカラムクロマトフラフィーを通し、さらに、SuperoseおよびMono Qのhigh performance column chromatographyを行うことにより本酵素の精製を行った。精製酵素のアミノ酸配列をアミノ酸分析機により検索したところ、アミノ基末端からの配列は(NH_2)-X-X-Pro-Gly-Leu-Glu-Pro-Gly-X-Phe-Ser-Ala-Arg-Glu-Ala-Gly-Alaと、17個中14個のアミノ酸配列を決定することができた。現在、各種臓器由来の本酵素のアイソザイムを検討中である。
マイクロニードル経皮ワクチン

先端部に卵白アルブミン(OA)を配置した2層および3層からなる溶解性マイクロニードルMNsを調製して検討を行った結果、3層MNsは表皮層に分布するLangerhans細胞への効率的な抗原のデリバリーを可能にし、より強い免疫反応を誘導した。一方、破傷風ワクチンにおいては皮膚の表皮層に多く分布するLangerhans細胞が経皮免疫のターゲット部位となっていることが明らかとなった。新型ウイルスによるパンデミック時や医療従事者の少ない発展途上国では、ワクチンの迅速な大規模投与の実施に問題がある。このため、注射よりも簡便で有効なワクチンの投与法としての経皮ワクチン用マイクロニードル(MN)が注目されている。経皮ワクチンによる免疫応答の初期ターゲット細胞である真皮内Dendritic細胞及びLangerhans細胞は、皮膚に高密度で分布している。それゆえ、角質層バリアを突破し表皮内に薬物を送達させるMNは経皮ワクチン用デバイスとして有用と考えられる。そこで、表皮層及び真皮層への抗原の効率的送達を目的とし、抗原保持部位を異にする2層及び3層のマイクロニードル・アレイを有するチップを作製した。コンドロイチン硫酸ナトリウムを基剤とし、卵白アルブミン(OA)を抗原として、OA含有の2層及び3層MNを稠製した。皮膚内デリバリー性および循環免疫応答からMNチップの評価を行った。MNの形状計測から、2層及び3層MNの抗原保持部位は先端から各々0約155μm及び約175約225μmであった。Brown Norway系雄性ラットの腹部除毛皮膚にOA含有MNで経皮免疫を行った結果、両MN投与群で、同量の皮下注射群に比べ有意に高い血漿中Ig(G+A+M)抗体の産生誘導が認められた。3層MN投与群では、2層MN投与群に比べ2.57倍の高値を示した。MN投与2週間後、IgE抗体の産生および炎症は認めなかった。皮下注射群でのIgE抗体の変化率は有意に高値を示した。ラット皮膚内の抗原送達部位を蛍光標識OAで測定した結果、2層MN投与群で皮膚表面から約200μm付近、3層MNで表面から約100μm付近に強い蛍光を認め、両MNから真皮層及び表皮層への抗原のデリバリーが認められた。従って、3層MNが注射に代わる簡便で有効かつ安全性に優れた新規経皮ワクチン用DDSであることが示唆された。破傷風ワクチン抗原を先端部に配置した2種類の溶解性マイクロニードル・アレイ・チップを高い再現性でもって調製する方法を確立した。抗原の充填部位の長さは先端から約70μmであった。至適投与量を探索するために高用量と低用量のチップを調製してワクチン抗原含量を測定したところ、約1.0Lfおよび2.0Lfであった。そこで、ラットを用いて免疫学的実験を行った。2層マイクロニードル・アレイ・チップ投与群については、1.0Lf投与群において、2週間後の血清中抗体価はNDであったが、その後、抗体価の上昇が認められた。すなわち、5622±1195U(4weeks),5341±1278U(6weeks),4053±1322U(8weeks)であった。一方、2.0Lf投与群では、2週間後の血清中抗体価は同様にNDであったが、その後、抗体価の上昇が認められ、4251±1020U(4weeks),3553±1347U(6weeks),1436±539U(8weeks)であった。次いで、3層マイクロニードル・アレイ・チップの調製にチャレンジして、成功を収めた。抗原の充填部位は先端から約250370μgであった。抗原の含量は約1.0Lfおよび1.5Lfであった。1,0Lf投与群において、血清中抗体価は、12849±3200U(2weeks),37863±6415U(4weeks),200758±39079U(6weeks),146441±21948U(8weeks)であった。一方、1.5Lf投与群では、血清中抗体価は、4220±812U(2weeks),267750±48572U(4weeks),172329±21342U(6weeks),163573±33895U(8weeks)であった。このように、3層マイクロニードルが極めて高い抗体価の誘導に成功を収めた。2層および3層マイクロニードル・アレイ・チップからの抗原のデリバリー部位は各々真皮層および表皮層であるので、破傷風ワクチンにおいては皮膚の表皮層に多く分布するLangerhans細胞が経皮免疫のターゲット部位となっていることが明らかとなった。

溶解性マイクロニードルの基剤として使用したコンドロイチン硫酸およびデキストランの安全性を検証するために臨床第1相試験を行ったが、投与部位の皮膚には炎症はみとめられず、安全性に富むDDSであることが検証された。平成23年度の破傷風ワクチン抗原を先端部に配置したマイクロニードル・アレイ・チップに次いで、概念の検証をより進めるために平成24年度は肝炎ワクチン抗原について検討を行った。抗原を配置する位置を異にする2種類、すなわち2層および3層のマイクロニードル・アレイ・チップを作成した。2層マイクロニードル・アレイ・チップの場合には先端から214±47μmの部位に抗原を配置した。3層マイクロニードル・アレイ・チップについては先端から247±22μm325±30μmの第2層の部位に抗原を配置した。2層マイクロニードル・アレイ・チップ中抗原含量は2.42±0.48および0.64±0.06μg、3層での抗原含有量は2.17±0.20および0.51±0.01μgであった。ラットを用いて免疫学的実験を行った。すなわち、2種類のマイクロニードル・アレイ・チップを各々2種類の投与量でラットに投与した後、2および4週間後に循環血液を採取して抗体価を測定した。高含量2層マイクロニードルでの抗体価の平均値およびSEは1.94±1.74mIU/mL(2weeks),33.34±13.65(4weeks)、低含量2層マイクロニードルでの抗体価は0.0007±0.0006(2weeks),13.57±6.45(4weeks)であった。高含量3層マイクロニードルでの抗体価は0.38±0.31(2weeks),5.89±2.71(4weeks)、低含量3層マイクロニードルでの抗体価は0.04±0.04(2weeks),0.59±0.46(4weeks)であった。2層および3層マイクロニードル・アレイ・チップからの抗原のデリバリー部位は各々真皮層および表皮層であるので、肝炎ワクチンにおいては皮膚の真皮層に多く分布するDendritic細胞が経皮免疫のターゲット部位となっていることが明らかとなった破傷風ワクチン抗原含有マイクロニードルが予想以上の循環血液中抗体価の上昇を引き出すことができた。特に、3層マイクロニードルにより皮膚表皮層の分布するLangerhans細胞が経皮免疫のターゲット細胞であることを明らかにすることが出来た。24年度が最終年度であるため、記入しない。今回の研究により、代表的な蛋白質性抗原である破傷風ワクチン抗原については表皮層に分布するLangerhans細胞が経皮免疫においてターゲット細胞であることが明らかとなったが、粒子状ワクチン抗原については未だ研究が行われていない。B型肝炎ワクチン抗原などの粒子状抗原を用いて、2層および3層マイクロニードルを調製し、その循環血液中抗体価の誘導能力を測定することにより、粒子状抗原についても表皮層に分布するLangerhans細胞がターゲット細胞であるかどうかの検証を行う必要がある。
水棲生物の生活史に着目した環境DNAによる縦断的連続性と魚道の機能評価

本研究は,長良川・揖斐川流域の河川・農業水路網を対象にして,水棲生物(魚類・甲殻類など)の生活史のボトルネックとなるダムや堰,落差工の影響を,環境DNAによる生物の縦断的な連続性の観点から,新たに魚道機能の評価,生息場の改善に繋げることが目的である.具体的には,水域の落差が生じる上下流間で,採水により魚類相を推定する環境DNAメタバーコーディングから在来種・外来種・貴重種などの生息域の分布を把握し,それらの生物種の在/不在情報から生物多様性の評価軸を考察するとともに,生物の生活史を考慮した魚道機能の評価などを行う.これらにより,水棲生物の生活史を考慮した流域再生と魚道機能の持続性を考察する.本研究は,長良川・揖斐川流域の河川・農業水路網を対象にして,水棲生物(魚類・甲殻類など)の生活史のボトルネックとなるダムや堰,落差工の影響を,環境DNAによる生物の縦断的な連続性の観点から,新たに魚道機能の評価,生息場の改善に繋げることが目的である.具体的には,水域の落差が生じる上下流間で,採水により魚類相を推定する環境DNAメタバーコーディングから在来種・外来種・貴重種などの生息域の分布を把握し,それらの生物種の在/不在情報から生物多様性の評価軸を考察するとともに,生物の生活史を考慮した魚道機能の評価などを行う.これらにより,水棲生物の生活史を考慮した流域再生と魚道機能の持続性を考察する.
Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子WTlの遺伝子産物の機能解析

Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子WTlは4つのzincfingerドメインを有する転写因子をコードしている。WT1産物の構造上の特徴としてalternative splicingによって4つのzincfingerのうち第3fingerと第4fingerのあいだにLys-Thr-Ser(KTS)の3アミノ酸があるもの(WT-KTS+産物)とないもの(WT-KTS-産物)が存在することが知られている。これまでWTl産物の機能としてKTS-産物がEGRl結合配列(GCGGGGGCG)に特異的に結合してこの配列をプロモーターに持つ遺伝子(IGF2,PDGF A chainなど)の転写活性を抑制することが報告されている。我々はこれまでhuman fetal kidneyのcDNAライブラリーから、既に報告された2種類以外に第3zinc finger全体がspliceされたWTldelF3産物を単離した。WTdelF3産物はこれまでWTlにmutationのあるWilms腫瘍にのみ発現するaberrantな蛋白質と考えられてきたが、われわれはRT-PCR法により同産物が正常組織でも発現することを見いだした。さらにこの産物の機能を知る目的でその結合配列を検索したところ、EGRl結合配列とは異なる特異的な配列(GTGTGGAGT)に結合することが明らかになった。さらにこの配列をPDGFAchain遺伝子のプロモーターに組み込んでその転写活性をCAT assayで検討したところ、WTldelF3産物は転写活性を抑制性に制御することが分かった。
ヒト細胞における各種紫外線損傷の修復動態の比較解析

本研究では紫外線損傷を認識するモノクロ-ナル抗体の樹立を図り、それら抗体を用いてヒト細胞における紫外線損傷の修復動態を比較検討することを目的とした。これまでにチミン二量体認識抗体3種、(6ー4)光産物認識抗体5種、Dewar型光損傷認識抗体1種の計9種を樹立した。254nmの紫外線10J/m^2を照射されたヒト細胞での各種損傷の修復動態を抗体を用いて調べたところ、(6ー4)光産物は紫外線照射後12時間で除去されるが、チミン二量体は24時間を経過しても約半数が残存していた。損傷により除去動態が異なることの意義を明かにするため、紫外線照射されたplasmidとヒト細胞抽出液を用いた無細胞修復合成系を導入した。本系はWood等によって修復合成に関わる因子の解析に役立つことが立証されている。無細胞修復合成系で観察される修復合成が損傷の除去を伴うか否かを調べたところ、チミン二量体と(6ー4)光産物は細胞内と同様な動態でplasmidから除去されていた。アセトフェノン存在下で313nm紫外線を照漏してチミン二量体を誘起させたplasmidを基質として用い、チミン二量体1個の除去に伴って修復合成されるpatchーsizeを求めたところ、1424塩基と大腸菌のそれに極めて近い結果を得た。一方、Dewar型損傷認識抗体を用い損傷生成の波長依存性を求めたところ、260nm紫外線によってもDewar型損傷が生成されることを見いだした。しかも、長波長紫外線は(6ー4)光産物をDewar型損傷に光異性化するので、太陽光紫外線(300nm<)によって生成される損傷はチミン二量体とDewar型損傷であり、(6ー4)光産物はほとんど生成されないことが明かになった。以上の結果から、太陽光紫外線の人体影響について考える場合、254nm紫外線照射の結果を長波長紫外線のそれに外挿することは誤りであることが判明した。1)種々のヒト細胞におけるチミン二量体と(6ー4)光産物の修復動態を解析した。まず、XPヘテロ細胞の修復動態を調べたところ、両損傷とも正常細胞に比べてやや遅い動態を示した。また、SVー40で不死化した細胞の修復能は、その初代培養細胞に比べてやや低い傾向が見られた。2)モノクロ-ナル抗体を用いたDNA損傷検出系の信頼性と感度の向上を目指して、チミン二量体に対する2種の抗体(TDMー2、TDMー3)と(6ー4)光産物に対する4種の抗体(64Mー2、64Mー3、64Mー4、64Mー5)を新しく樹立した(Mori et al.,1991)。これらの抗体を用いて、正常ヒト細胞における修復動態を比較したところ、抗体間で全く同一の修復動態が観察された(信頼性の向上)。また64Mー2、64Mー3、64Mー5抗体を用いることにより、5J/m^2以下の紫外紫によって誘発される(6ー4)光産物の検出が可能となり、チミン二量体と同じ線量域での解析が可能となった(高度の向上)。3)太陽光紫外線の生物影響を考える際に、(6ー4)光産物の光異性体であるDewar型光産物の解析が必須であることから、Dewar型光産物に対するモノクロ-ナル抗体の樹立を試みた。その結果、A3ー3ー3というクロ-ンが獲得され、現在詳細な性格付けを行なっている。

現在までに、(1)チミン二量体や(6ー4)光産物は認識しない、(2)(6ー4)光産物の光異性化により抗体の結合性が上昇する。(3)UVーDNAの室温でのアルカリ処理(Dewar型光産物の分解)により抗体の結合性が低下する、ことが明らかになっている。4)Woodらによる試験管内修復系を導入し、さらにモノクロ-ナル抗体による損傷定量系を併用することにより、試験管内における損傷の除去と修復合成を並行して追跡することが可能となった。この結果、修復合成量の増加とDNA中の両損傷の減少の動態はよく相関し、チミン二量体1個に対して約3塩基分のrepair patchが合成されることが示唆された。本研究では紫外線損傷を認識するモノクロ-ナル抗体の樹立を図り、それら抗体を用いてヒト細胞における紫外線損傷の修復動態を比較検討することを目的とした。これまでにチミン二量体認識抗体3種、(6ー4)光産物認識抗体5種、Dewar型光損傷認識抗体1種の計9種を樹立した。254nmの紫外線10J/m^2を照射されたヒト細胞での各種損傷の修復動態を抗体を用いて調べたところ、(6ー4)光産物は紫外線照射後12時間で除去されるが、チミン二量体は24時間を経過しても約半数が残存していた。損傷により除去動態が異なることの意義を明かにするため、紫外線照射されたplasmidとヒト細胞抽出液を用いた無細胞修復合成系を導入した。本系はWood等によって修復合成に関わる因子の解析に役立つことが立証されている。無細胞修復合成系で観察される修復合成が損傷の除去を伴うか否かを調べたところ、チミン二量体と(6ー4)光産物は細胞内と同様な動態でplasmidから除去されていた。アセトフェノン存在下で313nm紫外線を照射してチミン二量体を誘起させたplasmidを基質として用い、チミン二量体1個の除去に伴って修復合成されるpatchーsizeを求めたところ、1424塩基と大腸菌のそれに極めて近い結果を得た。一方、Dewar型損傷認識抗体を用い損傷生成の波長依存性を求めたところ、260nm紫外線によってもDewar型損傷が生成されることを見いだした。しかも、長波長紫外線は(6ー4)光産物をDewar型損傷に光異性化するので、太陽光紫外線(300nm<)によって生成される損傷はチミン二量体とDewar型損傷であり、(6ー4)光産物をほとんど生成されないことが明かになった。以上の結果から、太陽光紫外線の人体影響について考える場合、254nm紫外線照射の結果を長波長紫外線のそれに外挿することは誤りであることが判明した。
甲状腺ホルモン受容体バリアントα2の機能解析および作用機構の解明

甲状腺ホルモン受容体(TR)a2の機能解析および作用機構の解明TRa2は、活性型TRa1と同じ遺伝子から産生されるが、スプライシングの違いにより、C端のアミノ酸配列を異にした、T3結合活性を持たないTR variantである。TRa2は活性型TRの機能をdominant negativeに阻害することを種々の型の甲状腺ホルモンレスポンスエレメント(TRE)を用いた実験において確認し、dominant negative作用は標的遺伝子であるThyroid Response Element(TRE)の種類に関わらず認められることを確認した。また、DNA結合領域に変異を起こした変異TRa2を用いてトランスフェクション実験を行った結果このdominant negative効果は依然認められた。このことより、TRa2のdominant negative作用はDNA結合以前に蛋白-蛋白相互作用を介して発現しているものと考えられる。また、特異的抗体を用いてTRa2が各組織において広範に発現していること、発生段階の初期から発現していることを確認した、このことは、TRa2が発生、分化誘導に何らかの重要な働きをしていることを示唆していると考えられる。その機能を解析するために、現在、外部より発現の誘導が可能なかたちでTRa2を細胞内に導入したcell lineを樹立しTRa2を発現誘導した場合の細胞の形質変化、増殖および分化誘導に及ぼす影響を観察する作業を進めている。
X線が哺乳動物の着床前期受精卵に及ぼす影響の研究

放射線によるDNA損傷が受精卵に及ぼす影響は、出産を望む夫婦にとって重要な問題である。申請者は、X線を照射したマウス着床前期受精卵において、受精卵の細胞分裂が遅延すること、照射線量の増加に伴いハッチング率が低下すること、アポトーシスが誘導されること、そしてDNA切断部位周辺にDNA修復因子が集合することを明らかにした。X線照射したマウス受精卵の発生前核期と8細胞期のマウス受精卵に05GyのX線を照射し、発生の観察を行った。8細胞期受精卵では中線量(13Gy)以上のX線照射では胚盤胞が膨張して透明帯の外に出る「ハッチング」率が低下し高線量(5Gy)のX線照射では異常卵が増加するのに対し、前核期受精卵では高線量(5Gy)のX線照射によって異常卵は増加するが中線量以上のX線照射による「ハッチング」率の顕著な低下は観察されなかった。マウス受精卵におけるDNA修復遺伝子の局在X線照射したマウス受精卵にDNA修復関連遺伝子の抗体を用いた免疫染色を行った。X線照射によりDNA損傷修復に必要なヒストンH2AXのリン酸化が観察された。X線照射したマウス受精卵の着床、胎児への発生05GyのX線照射したマウス受精卵を偽妊娠マウスの子宮へ移植し、帝王切開によりその受精卵の着床と胎児への発生の観察を行った。中線量のX線照射では吸収胚の割合が増加して胎児の数が減少し、高線量のX線照射では着床率自体が低下した。今後は、(1)X線照射したマウス受精卵の発生や異常卵の生じる段階や時期の詳細な観察、(2)他のDNA修復関連遺伝子の発現や局在の変化、(3)「ハッチング」の影響を取り除くため透明帯を除去したX線受精卵の着床と胎児への発生、これらの解析から、X線照射によるDNA損傷がマウス着床前期受精卵に及ぼす影響を明らかにする。X線照射したマウス受精卵の発生前核期から8細胞期のマウス受精卵にX線を照射し、その後の発生の観察を行った。X線を照射した受精卵ではX線の照射線量の増加に伴い、細胞分裂が遅延していた。また、高線量のX線を照射した受精卵では凝集したDNAが観察され、アポトーシスの検出試薬を用いて解析したところ、それらの受精卵ではアポトーシスによる細胞死が誘導されていた。マウス受精卵におけるDNA修復遺伝子の局在X線照射したマウス受精卵のDNA修復遺伝子を、抗体を用いた免疫染色により観察した。DNAの切断部位周辺でリン酸化されるヒストンH2AXに加え、他のDNA修復遺伝子もヒストンH2AXがリン酸化されているDNA切断部位周辺に局在が観察された。そしてそれらの局在は時間の経過と共に消失し、着床前期受精卵においてもX線照射によるDNA損傷に対し、DNA修復が行われていることが予想された。中線量のX線を照射したマウス受精卵の発生、着床の解析中線量のX線を照射したマウス受精卵を偽妊娠マウスに移植し、受精卵の発生と着床の解析を行った。中線量のX線を照射した受精卵では、吸収胚の割合が増加し、胎児の数が減少していた。ハッチングの影響を解析するために、透明帯を除去した受精卵において同様に偽妊娠マウスへの移植と着床、発生の解析を予定していたが、季節により偽妊娠マウスにおける着床、出産数が変化し、通常の受精卵と比較してハッチングの影響を検討することが出来なかった。
スポーツ用義足における生体力学的特性の解明とデータベースの構築

本研究の目的はスポーツ用義足の形状,剛性,アライメント(装着方法)の違いがランニング中の生体力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることである.また,得られた知見に加えて,義足ユーザの体力特性や形態学的特徴を組み込んだデータベースを構築することであった.三次元動作解析による義足スプリンター18名の運動解析を行った結果,義足ランナーは左右脚間で非対称な力発揮戦略を行っていることが明らかとなった.加えて,実レース環境中の時空間変数は切断レベル、性別、人種、競技レベルといった要因の影響を受けることが明らかとなった一方,切断側や身長といった要因による明確な影響は認められなかった.本研究ではスポーツ用義足の形状,剛性,アライメント(装着方法)の違いがランニング中の生体力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている.また,得られた知見に加えて,義足ユーザーの体力特性や形態学的特徴を組み込んだデータベースを構築する.データベースは広く一般に向けて公開し,ユーザーの体力特性に応じたスポーツ用義足の最適な選定・装着法や,効果的なトレーニング法を指導現場や医科学支援スタッフに提案することを試みる。本年度は、先ず義足スプリンターのレース分析データベースの作成に従事した。ウェブ上にある義足スプリンターの公式動画(100m走および200m走)内において、各選手の公式タイムと総歩数を計測することでランニングの時空間変数(平均速度・平均ステップ頻度。平均ステップ長)を算出し、個人データ(レース開催年、レース名、予選/決勝・障害クラス・氏名・国籍・使用している義足・公式タイムなど)を紐づけてデータベースに組み込んだ。このデータベース(DBAS)は平成27年3月31日の段階で、健常者100名含む合計568名のデータとなっており、今後も継続してデータ数を増やしていく予定でいる。動作解析実験に関しては、日本代表の大腿切断者2名を三次元動作解析装置によって解析し、ランニング時の機械的特性を、キネティクスおよびキネマティクスの観点から調べている。なお、上述した実験の結果はすでに複数の学術誌や海外の学術学会に投稿し、採択されている。本研究ではスポーツ用義足の形状,剛性,アライメント(装着方法)の違いがランニング中の生体力学的特性に及ぼす影響を明らかにする.また,得られた知見に加えて,義足ユーザーの体力特性や形態学的特徴を組み込んだデータベースを構築する.データベースは広く一般に向けて公開し,ユーザーの体力特性に応じたスポーツ用義足の最適な選定・装着法や,効果的なトレーニング法を指導現場や医科学支援スタッフに提案する.本年度は昨年度に引き続き、義足スプリンターのレース分析データベースの拡充に取り組んだ。ウェブ上にある義足スプリンターの動画から各選手の総歩数をカウントし、公式タイムと組み合わせることによってレース時の時空間変数(平均速度、平均ステップ頻度、平均ステップ長)と算出し、個人データを紐づけてデータベース(DBAS)に組み込んだ。本データベースは平成28年3月31日の段階で健常者約100名を含む720名のデータで構成されている。本データベースから、1全クラスの共通事項として,日本人選手は北米・欧州選手と比べ100m走・200m走共に平均ステップ長が短い傾向にあること、2切断クラス・国籍を問わず、使用されている義足は主に2種類(Cheetah Xtreme,Sprinter 1E90)に大別されること、そして3外国人の一流選手4名の経年変化を追った結果、好記録が生み出される直前に義足を変更していること、が明らかとなった。こうした結果はすでに複数の学術誌で掲載されている。なお、データベース作成と並行して、義足スプリンターの動作解析実験も昨年度から引き続き取り組んでおり、平成28年3月31日の段階で日本代表レベルの義足スプリンター11名の実験・解析を終了している。今後は得られたデータから義足アライメントと地面反力、関節キネティクスおよび走速度との関係を明らかにしていく予定でいる。本年度もデータベースに200名以上のデータを加えることができたため。また、動作解析実験でも11名の義足スプリンターの計測を行うことができたが、これはT42クラスの日本人選手のほぼ全員であり、本研究を推進するうえで貴重なデータとなりうる。本研究ではスポーツ用義足の形状,剛性,アライメント(装着方法)の違いがランニング中の生体力学的特性に及ぼす影響を明らかにする.また,得られた知見に加えて,義足ユーザの体力特性や形態学的特徴を組み込んだデータベースを構築する.本年度は昨年度に引き続き,義足スプリンターのレース分析データベースの拡充に取り組んだ.2016年4月から2017年3月まで,動画共有サイトにアップロードされている義足スプリンターの動画から各選手の時空間変数(平均速度,平均ピッチ,平均ストライド)を算出し,全データ数は健常者含めて1046名を超えるものとなった.このデータベースをもとに,下腿義足を装着する義足ランナー14名の身長と時空間変数との関連を調べた.その結果,義足スプリンターの身長はいずれの時空間変数とも関連していないことが明らかとなった.これは義足のアライメント(構造的高さ)を考慮するうえで,極めて重要な知見といえる.また,下腿義足ランナーの競技レベル(A標準突破,B標準突破,それ以外)の違いは主に平均ストライドの違いによるもであることも明らかにしている.上記の結果はそれぞれ学術雑誌に筆頭著者として掲載が決定している.本研究テーマに関して解析したすべてのデータがIF付きの査読誌論文にて掲載が決定している(8報)ことは,本研究テーマの国際的認知度が飛躍的に高まっていることを示すものである.

また,世界チャンピオン数名の3次元動作解析を行う機会にも恵まれ,計測データは一般ユーザから世界チャンピオンまで,非常に幅広いものとなっている.これらは動画共有サイトから大量に抽出した義足スプリンターのレース分析データベースと同様にデータベース化され,スポーツ用義足の開発や走行リハビリテーションの構築に大きく貢献しうると考えている.本研究ではスポーツ用義足の形状,剛性,アライメント(装着方法)の違いがランニング中の生体力学的特性に及ぼす影響を明らかにする.また,得られた知見に加えて,義足ユーザの体力特性や形態学的特徴を組み込んだデータベースを構築する.本年度は昨年度に引き続き,義足スプリンターのレース分析データベースの拡充に取り組んだ.2017年4月から2018年3月まで,動画共有サイトにアップロードされている義足スプリンターの動画から各選手の時空間変数(平均速度,平均ピッチ,平均ストライド)を算出し,全データ数は健常者含めて1277名を超えるものとなった.このデータベースをもとに,下腿義足を装着する一流義足ランナー7名のタイムとピッチ・ストライドとの関連を調べた.その結果,一流義足ランナーの中でもピッチが主にタイム更新に貢献する者と,ストライドが貢献する者,さらにはそのいずれもが貢献する3パターンの選手がいることが明らかとなった.また,両大腿切断者と片大腿切断者で,200m走を行った際の平均速度,平均ピッチ,平均ストライドを比較した結果,両大腿切断者は相対的にピッチが低く,ストライドが長いことが明らかとなった.こうした時空間因子の違いは,膝継手の有無をはじめとした義足の構成要素の違いによるところが大きく,言い換えれば,この点の最適化がより速く走る上で重要であることを示唆している.加えて,三次元動作分析によって,片大腿切断者が全力疾走を行う際のキネティクス・キネマティクスが左右脚で異なることを明らかにした.これらの結果は下肢切断者がランニング動作を行う上で必要な条件を知る基礎的知見であり,学術的・社会的にも大きな成果が上がったと考えている.本研究の目的はスポーツ用義足の形状,剛性,アライメント(装着方法)の違いがランニング中の生体力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることである.また,得られた知見に加えて,義足ユーザの体力特性や形態学的特徴を組み込んだデータベースを構築することであった.三次元動作解析による義足スプリンター18名の運動解析を行った結果,義足ランナーは左右脚間で非対称な力発揮戦略を行っていることが明らかとなった.加えて,実レース環境中の時空間変数は切断レベル、性別、人種、競技レベルといった要因の影響を受けることが明らかとなった一方,切断側や身長といった要因による明確な影響は認められなかった.本年度は将来的にデータベースを構築するにあたって、義足スプリンターのレース分析データベースを作成することを重点化し、500名を超えるデータの収集に成功した。予想では100名程度であったため、大きな進展であったといえる。このデータベースには国内外の研究機関から早期公開を望む声があり、動作解析データの取り扱いも含めて検討している。昨年と同様、レース分析データベースと動作解析実験という二つのアプローチを行う。