hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビブリオコレラを二系統に分類する遺伝子座MS6_A0927の機能解析

Vibrio choleraeは遺伝子座MS6_A0927にmetY(M)遺伝子(1,269 bp)あるいはluxR-hchA(LH)遺伝子(約1,600 bp)のいずれかを有し、これにより2系統に大別される。LH遺伝子を破壊したV. cholerae 32426(⊿LH)株は、親株に比して通常の栄養培地における生育には変化がないが、コレラ毒素産生能は著しく低下する等、いくつかの表現型の変化が認められた。RNA-seq解析を行ったところ、変異株においてrpoS及びmutS遺伝子の発現が確認されなかった。そこで、当該遺伝子領域に対してPCR及びシークエンスを行ったところ、rpoS-mutS遺伝子領域の脱落が認められた。さらにV. choleraeのビルレンス遺伝子の主要な転写制御因子の一つであるToxRをコードする遺伝子に突然変異中に終始コドンが生じる変異も確認された。この変異株のToxR及びToxSの発現量は親株に比して著しく高かったが、ToxTおよびコレラ毒素遺伝子の発現量は低値を示した。これらの結果より、ToxRの遺伝子変異が、32426(⊿LH)株のコレラ毒産生の低下をもたらしたと推定される。ダブルクロスオーバーの相同組換えによりLH遺伝子を破壊した結果であるが、標的以外の複数の遺伝子にも変異が生じていることが明らかになった。32426(⊿LH)株に変異が多数発生したメカニズムについては次年度以降の解明を待たねばならない。LH遺伝子の破壊株の作製を再度試みたところ、rpoS-mutS領域、toxR遺伝子には変異は認められなかった。現在、全ゲノムシークエンスを行い、LH及びMの機能解析に用いることが出来る標的遺伝子のみを欠失した変異株であるか確認中である。重要な機能を担うrpoS及びmutS遺伝子が、試験管内での培養中に、コレラ菌のゲノムから自然に脱落するという現象は報告もなく、全く想定していなかった。再度変異株の作製及びゲノム配列の確認などに時間を要しているが、最終的に標的遺伝子のみを欠失した変異株が作製できたようである(現在、全ゲノムシークエンスで確認中)。変異株32426(⊿LH)だけが特異的な表現型を示した要因の一端が解明された。M遺伝子産物はo-acetylhomoserine sulfhydrylaseの機能を担っていることが推定されるため、メチオニンの中間産物(O-acetyl-L-homoserine)と硫化物(Methanethiolなど)を合成最小培地に添加し、親株と変異株間での増殖能の差異を比較する。その際、添加した硫化物から亜硫酸、硫酸への酸化を制限するために、無酸素または低酸素条件下で培養する。一方、LH遺伝子についての解析は、酸などによる酸化ストレス耐性に寄与するのではないかという仮説に基づき、人工胃酸でコレラ菌にストレスをかけ、その後、高濃度の重炭酸塩(膵液を想定)で中和後、菌の生存率を比較する実験などを行う。Vibrio choleraeは遺伝子座MS6_A0927にmetY(M)遺伝子(1,269 bp)あるいはluxR-hchA(LH)遺伝子(約1,600 bp)のいずれかを有し、これにより2系統に大別されることを国際誌に発表した。131種類以上の血清型を含む341株の供試株の解析においても、両遺伝子を欠失したV. choleraeは見出されていない。世界各地で分離されているV. cholerae流行株は全てLH遺伝子を保有していた。LH遺伝子またはM遺伝子を破壊したV. cholerae株を作製し、表現型への影響について解析した。ダブルクロスオーバー相同組み換えにより当該遺伝子座を破壊したV. choleraeを4株作製した。次に、野生株(親株)及び破壊株間の表現型を比較したところ、4株の破壊株中3株は、特に違いを認めなかったが、LH遺伝子を破壊した32426(⊿LH)株は、親株に比して通常の栄養培地では増殖能に差はないが、貧栄養培地では増殖能の遅延、運動性の低下、バイオフィルム形成能の増加、カタラーゼ産生の増加、ゼラチン/カゼインの分解能の低下が認められた。また、コレラ毒素産生能をGM1ガングリオシドELISAによって測定した結果、32426株が647 ng/mLであるのに対し、その破壊株は25 ng/mLと約25倍の減少が確認された。株特異的に認められた現象であるので、LH遺伝子の破壊による影響かどうかを今後、検証する必要がある。V. choleraeの主要病原因子であるコレラ毒素の産生を著しく低下させた原因についての理解は特に重要であると思われる。計画通り、V. choleraeの遺伝子座MS6_A0927に位置するM遺伝子またはLH遺伝子をダブルクロスオーバー相同組み換えにより欠失させ、4株の破壊株を作製した。また、培地、温度、pHなどの条件を変えて、表現型に与える影響を解析した。1株であるが、LH遺伝子破壊後、表現型に著しい変化を認めた。LH遺伝子を破壊したV. cholerae 32426(⊿LH)

株は、親株に比して通常の栄養培地における生育には変化がないが、コレラ毒素産生能は著しく低下する等、いくつかの表現型の変化が認められた。RNA-seq解析を行ったところ、変異株においてrpoS及びmutS遺伝子の発現が確認されなかった。そこで、当該遺伝子領域に対してPCR及びシークエンスを行ったところ、rpoS-mutS遺伝子領域の脱落が認められた。さらにV. choleraeのビルレンス遺伝子の主要な転写制御因子の一つであるToxRをコードする遺伝子に突然変異中に終始コドンが生じる変異も確認された。この変異株のToxR及びToxSの発現量は親株に比して著しく高かったが、ToxTおよびコレラ毒素遺伝子の発現量は低値を示した。これらの結果より、ToxRの遺伝子変異が、32426(⊿LH)株のコレラ毒産生の低下をもたらしたと推定される。ダブルクロスオーバーの相同組換えによりLH遺伝子を破壊した結果であるが、標的以外の複数の遺伝子にも変異が生じていることが明らかになった。32426(⊿LH)株に変異が多数発生したメカニズムについては次年度以降の解明を待たねばならない。LH遺伝子の破壊株の作製を再度試みたところ、rpoS-mutS領域、toxR遺伝子には変異は認められなかった。現在、全ゲノムシークエンスを行い、LH及びMの機能解析に用いることが出来る標的遺伝子のみを欠失した変異株であるか確認中である。重要な機能を担うrpoS及びmutS遺伝子が、試験管内での培養中に、コレラ菌のゲノムから自然に脱落するという現象は報告もなく、全く想定していなかった。再度変異株の作製及びゲノム配列の確認などに時間を要しているが、最終的に標的遺伝子のみを欠失した変異株が作製できたようである(現在、全ゲノムシークエンスで確認中)。変異株32426(⊿LH)だけが特異的な表現型を示した要因の一端が解明された。32436株のLH遺伝子の破壊後、親株と比して顕著な表現型の違いを見出したが、株特異的現象であったため、再度、同株を用いて破壊株を作製し、同様な結果が得られるかどうかを検証する。親株と破壊株を用いたRNA-seq解析を行い、遺伝子発現パタンの強度差から、当該遺伝子の機能推定を試みる。M遺伝子産物はo-acetylhomoserine sulfhydrylaseの機能を担っていることが推定されるため、メチオニンの中間産物(O-acetyl-L-homoserine)と硫化物(Methanethiolなど)を合成最小培地に添加し、親株と変異株間での増殖能の差異を比較する。その際、添加した硫化物から亜硫酸、硫酸への酸化を制限するために、無酸素または低酸素条件下で培養する。一方、LH遺伝子についての解析は、酸などによる酸化ストレス耐性に寄与するのではないかという仮説に基づき、人工胃酸でコレラ菌にストレスをかけ、その後、高濃度の重炭酸塩(膵液を想定)で中和後、菌の生存率を比較する実験などを行う。試薬の購入の際、想定した価格よりも廉価に購入することができたため、若干の次年度使用額が生じた。想定外の実験結果により、全ゲノムシークエンス等の追加実験が必要となり、年度使用額の変更が生じたため。
マイクロ・ナノオーダの機能性薄膜における変形および破壊過程の解析に関する研究

繊維配向した柱状構造を有する多結晶ナノ銅薄膜を対象に,分子動力学法を用い単軸引張シミュレーションを実施し,変形・破壊挙動に及ぼす結晶粒径および繊維配向の影響について定量的評価を行った.多結晶ナノ銅薄膜は,平面をVoronoi分割法によって領域分割し,厚さ方向に伸張させることで柱状構造を有すモデルとして構築した.Voronoi粒子に,繊維配向軸として<100>,<110>,および<111>,また,比較として無配向モデルを構築した.まず,<110>繊維配向を有する薄膜の変形挙動の検討を行った.マクロな変形挙動である応力-ひずみ関係において,ひずみの負荷によって平均応力が増加し,結晶粒界より部分転位が放出され,それに連なる積層欠陥の形成により非線形性が顕著になった.更なるひずみの負荷により,粒界よりき裂が生じ平均応力が急激に減少することを示した.また,結晶粒径の減少に伴い剛性が低下することを明らかにした.さらに,0.2%耐力は,結晶粒径が15nmよりも大きければ,Hall-Petchの関係に従い,結晶粒径の減少とともに耐力が増加したが,それよりも小さくなると,結晶粒径の減少とともに耐力は減少し逆Hall-Petchの関係が生じることを示した.また,結晶粒径の減少により,結晶粒の変形抵抗および格子ひずみに対する弾性定数が増加した.これらの特異な挙動は,結晶粒径の減少に伴い,単位体積あたりに占める結晶粒界の割合が増加するため,マクロな変形挙動において結晶粒界の変形挙動が支配的になるためであると考えられる.また,異なる繊維配向を有する多結晶モデルにおいて,0.5%耐力は系のSchmid因子の平均値の増加とともに減少して<110>配向,<111>配向,<100>配向の順に最大応力が小さくなることを明らかにした.繊維配向した柱状構造を有する多結晶ナノ銅薄膜を対象に,分子動力学法を用い単軸引張シミュレーションを実施し,変形・破壊挙動に及ぼす結晶粒径および繊維配向の影響について定量的評価を行った.多結晶ナノ銅薄膜は,平面をVoronoi分割法によって領域分割し,厚さ方向に伸張させることで柱状構造を有すモデルとして構築した.Voronoi粒子に,繊維配向軸として<100>,<110>,および<111>,また,比較として無配向モデルを構築した.まず,<110>繊維配向を有する薄膜の変形挙動の検討を行った.マクロな変形挙動である応力-ひずみ関係において,ひずみの負荷によって平均応力が増加し,結晶粒界より部分転位が放出され,それに連なる積層欠陥の形成により非線形性が顕著になった.更なるひずみの負荷により,粒界よりき裂が生じ平均応力が急激に減少することを示した.また,結晶粒径の減少に伴い剛性が低下することを明らかにした.さらに,0.2%耐力は,結晶粒径が15nmよりも大きければ,Hall-Petchの関係に従い,結晶粒径の減少とともに耐力が増加したが,それよりも小さくなると,結晶粒径の減少とともに耐力は減少し逆Hall-Petchの関係が生じることを示した.また,結晶粒径の減少により,結晶粒の変形抵抗および格子ひずみに対する弾性定数が増加した.これらの特異な挙動は,結晶粒径の減少に伴い,単位体積あたりに占める結晶粒界の割合が増加するため,マクロな変形挙動において結晶粒界の変形挙動が支配的になるためであると考えられる.また,異なる繊維配向を有する多結晶モデルにおいて,0.5%耐力は系のSchmid因子の平均値の増加とともに減少して<110>配向,<111>配向,<100>配向の順に最大応力が小さくなることを明らかにした.
脳の可塑性に有効な手浴方法の開発とその脳生理学・心理物理学的検証

本研究の目的は、脳の可塑性に有効な手浴方法の開発とその有効性を脳生理学的・心理物理学的に検証することにあった。健常者16名中8名と脳卒中片麻痺の患者女性2名・男性2名に開発中の手技で手浴を実施した。健常者を2群に分けて行った本手浴と温水に浸けるだけの実験では実施前後で、血圧やストレス度に変化はなかったが、手指関節可動域の拡大には共に有効で有意差があった。また片麻痺患者に対する手浴時に脳波計測も行い、一次運動野の賦活状態を視たが、関連性は明らかにできなかった。しかしながら、この手浴実施で女性と男性患者各1名ずつに手の麻痺状態の改善が見られ、脳の可塑性に対する有効性が示唆された。本研究の目的は、脳の可塑性に有効な手浴方法の開発とその有効性を脳生理学的・心理物理学的に検証する事にある。現在まで10名の健常者に手浴予備実験と、2名の脳卒中後片麻痺の患者に本実験を行なってきたが、手関節および手指関節可動域の計測において、従来のゴニオメーターによる計測では計測者により誤差が生じ、データの信頼性に欠ける事がわかった。更に、手関節と手指関節可動域の計測では、手浴実施直前と直後・30分後・1時間後と4回、手関節と手指関節を一つひとつ計測していくため時間がかかり、実験期間も連日3週間と長いため、被験者の疲労と精神的な負担が大きい事がうかがえた。手浴は本来心地よさを感じるとされているが、本実験でのストレス度計測では、手浴後に値が低下したのは健常者8名中4名であった。計測手技の未熟練が問題だと考えられる。そのため、本研究者が院生として所属する九州工業大学大学院生命体工学研究科において、KINECT for WindowsとPC13X7000-i7-SSBを用い、手をKINECT for Windowsに写す事で手関節と5本の手指関節可動域を可視的に提示できるソフトを開発中である。このソフト使用により、手指関節可動域等の計測が瞬時にでき、また被験者は、KINECT forWindowsに実際に映し出された自身の手を見ながら手浴前後の可動域の変化を自分で確認できるという利点があり、本実験の手関節と手指関節可動域等の計測に対する問題は解決すると思われる。また、心理物理学検証法の一つとして、KINECT for Windowsを用いた顔の表情スケールのソフトはすでに開発を済ませている。尚、唾液アミラーゼによるストレス度計測は、被験者が高齢で認知症を有する場合は、モニターチップを噛んだり飲み込んだりする危険が考えられ、認知症を有しない被験者を選択する必要がある事がわかった。平成24年度の計画は予備実験1で健常者10名に利き手でない側の手を対象とし、手浴なし日・40°Cの湯に3分間つける日・手浴実施日の午前9時から14時まで1時間毎に(1)指示PIP関節屈曲角度(2)母指掌側外転角(3)示指ー中指間距離を測定。予備実験2は健常者5名に、両手10分間の湯外でのツボ押し洗い法、石鹸なし手浴、石鹸使用手浴時にそれぞれ被験者・施行者同時脳波測定を行い実験は1日1種目とする。尚、実施前後のストレス度を唾液アミラーゼで計測するとした。本実験は脳卒中後数年を経過した片麻痺患者10名に、上記予備実験2の内容で実験を行うとした。本年度は、右利き健常者5名を5分間の設定でA群2名(40°C湯に左手つけるだけ)、B群3名(40°C湯中でツボ押し洗い)に分け、血圧・脈拍測定、ストレス計測と簡易脳波計による実験を行なった。手指計測は昨年の予備実験で最も結果が顕著であった示指ー中指間距離のみ計測。結果は、手浴前後で血圧・脈拍共に両群中4名が低下、ストレスは5名中実験補助をした2名を除いて3名が低下、脳波は出現し難いとされるα2が装着時から出続け、当機使用の検討を要する。示指ー中指間距離は5名共に手浴直後の距離は伸びたが、湯につけただけのA群は手浴終了1時間後に手浴前の長さに戻り、手浴30分後の計測が必要。本実験は9年前にクモ膜下出血発症した右片麻痺の患者1名を3週間実施した。心不全の為湯温は38°Cで行った、血圧・脈拍は日により上下し特定できない。示指ー中指第2関節間距離と手関節角度を手浴前・直後・30分後・1時間後に測定。30分後まで距離・角度共伸びていたが1時間後にはほぼ元に戻った。これらの結果より本手浴による効果は期待できるが、効果の持続方法の考案が必要である。本年度は、本研究のテーマである手浴の4つの要素の内、1「40°Cの湯に非利き手を5分間浸ける」、2「40°Cの湯中で非利き手を5分間マッサージ洗い」の2つに要素をしぼり、対象を2群に分け、それぞれ健常者4名ずつで予備実験を行なった。

結果として、血圧は2群が実施後で若干低下したが、有意差はなかった。唾液アミラーゼによるストレス値計測は、実施条件として実験1時間前から絶飲食としたが、1群で実験前に飲食をしていた被験者のアミラーゼ値が高く、結果的に1・2群の値で有意差はなかったが、患者に本実験を実施する場合での条件遵守注意事項として課題が残った。当実験では対象が健常者であり、手指角度計測では最も結果が明確に出ると思われる示指外転距離の変化についてのみ実施前・直後・1時間後で計測を行なった。有意差はなかったが、直後で2群の示指外転距離が1群より若干伸びが良く、P=0.08の結果を得た。被験者数を増やす事で更に良結果が得られる事も考えられる。当実験の結果は、本年4月にタイで行われたChristian University主催のInternational ConferenceにてResearch Presentationを行なった。尚、本研究者が院生として所属する九州工業大学大学院生命体工学研究科において、KINECT for WindowsとノートPC13X7000-i7-SSBを用い、手関節と5本の手指関節可動域を瞬時に計算して提示できるソフトを開発していたが、使い易さでLeapに変更し、現在そのソフト開発の継続中である。本研究の目的は、脳の可塑性に有効な手浴方法の開発とその有効性を脳生理学的・心理物理学的に検証する事にある。今年度は介護老人保健施設で脳卒中後片麻痺のある利用者6名を被験者とし、手浴施行者1名・補助者2名で実施した。また、本実験では手の運動時の脳波を測定するため簡易脳波計を用いた。実施は本研究者ら3名の勤務時間外で、被験者が夕食を済ませた17:5018:20の時刻に開始し、利用者の体調により47日間の日数で行った。内女性1名は、脳波計やパソコンを設置した実験室に車椅子で入室した時点で「怖い」と言い、女性他1名も緊張が強く共に収縮期血圧が170180mmHg台に上昇したため実験開始前に中止、被験者から外れていただいた。残り4名中1名を除き3名も実験開始前に各々の通常血圧範囲より高くなるか低くなる等の変動があった。平成25年度の男性患者2名の実験では、看護衣の施行者1名、開始時刻13:30頃、脳波計は使用せず手関節と手指関節角度計測のみで23週間実施し、今回の様な血圧の変動はなかった。高齢者にとって簡易脳波計とは言え、電極やそのリード線、夕食後という開始時刻、実験着を着た本研究者ら3名の存在に加え、この3名中2名と面識がない等の実験条件が今回の血圧変動に影響した可能性が考えられる。脳波については、手浴実施前後で緊張度に変化はない傾向にあった。実験を継続できた被験者4名は、脳の障害部が異なっているため下垂手で手指の痙縮がひどい等麻痺手の状態も様々で被験者に合わせて手浴の手順を変える必要がある事がわかった。顕著に本手浴効果があった利用者は2名で、下垂手・手指痙縮高度な1名は両手がスムーズに組めるようになり、手の掌握運動ができなかった1名は、親指先端からの第1関節屈曲伸展運動と他4指全て第1関節は伸びた状態であったが、第2・第3関節は屈曲して掌握運動ができるようになった。本研究の目的は、脳の可塑性に有効な手浴方法の開発とその有効性を脳生理学的・心理物理学的に検証することにあった。健常者16名中8名と脳卒中片麻痺の患者女性2名・男性2名に開発中の手技で手浴を実施した。健常者を2群に分けて行った本手浴と温水に浸けるだけの実験では実施前後で、血圧やストレス度に変化はなかったが、手指関節可動域の拡大には共に有効で有意差があった。また片麻痺患者に対する手浴時に脳波計測も行い、一次運動野の賦活状態を視たが、関連性は明らかにできなかった。しかしながら、この手浴実施で女性と男性患者各1名ずつに手の麻痺状態の改善が見られ、脳の可塑性に対する有効性が示唆された。
キュウリとメロンの光合成産物転流経路における糖代謝機構の解明に関する研究

平成元年度から平成3年度の実験によって,メロンとキュウリの転流は,葉と茎と果実における維管束システムにしたがって行われ,転流物質の糖代謝は次のように行われていることが明らかになった。1.メロンとキュウリにおいて,光合成産物の転流は,葉→茎→果実→種子の維管束配列と連絡にしたがった特定の維管束内を転流していた。2.メロンとキュウリの茎と果柄内における転流物質はこれまでの研究と同じく,主にラフィノ-スとスタキオ-スを中心とする少糖類で行われていた。3.果実の中においても,果托には比較的高い割合の少糖類が認められた。4.単托内における少糖類の全糖に対する割合は^<14>CO_2施与後の時間が減過するほど低くなった。5.果実内部においても, ^<14>CO_2施与後の経過時間が短いほど少糖類が多く認められ,時間が経過するほど少なくなった。6.時間が経過すると,果実の主な貯蔵物質は,メロンではスクロ-スが除々に多くなり,キュウリではグルコ-スとフルクト-スが多くなった。5.以上の結果,本実験のように維管束システムにしたがった転流経路を考慮してサンプルを切り出すことによって初めて,メロンとキュウリの転流は,茎においてのみならず果柄においても果実内においても,おもにラフィノ-スとスタキオ-スを中心とする少糖類で行われることが明らかになった。メロンの第一次側枝第一節に雌花を1花着生させ、他の雌花、雄花、側枝及び主茎と側枝の頂端部を摘除した株を供試した。残した第一次側枝の第一節位葉に^<14>CO_2を施与し、^<14>C-光合成産物の転流経路上の転流物質を調べた。その結果、次の5点が明らかになった。1.メロンにも葉序の左右性に従った器官配列の左右性が存在する。2.葉、茎、果実の維管束走向は他のウリ科野菜(キュウリなど)と相同性が認められる。3.葉から果実への光合成産物の転流は果托の特定の維管束を経由して果実内部に至る。4.メロンの葉柄、茎の中での転流物質である小糖類は果実内面にも認められ、特に果実内部の転流経路上にある維管束部分にはかなりの高い濃度で小糖類が存在する。5.果実内の糖組成は、転流経路上において、時間の経過に従って、周辺の柔組織と同じようにスクロ-ス割合が高くなる。以上の結果、メロンの転流物質である小糖類は、これまで言われていたような果柄で特異的に分解されることはなく、果実の内部にもかなりの程度転流していることが明らかになった。果実の内部においても、転流経路に従って進むほど、時間が経過するほど、徐々に分解されて、スクロ-スとして蓄積することが明らかとなった。上記の結果について、園芸学会で2報に分けて発表した。キュウリの第一次側枝第1節に両性花を1花着生させ,他の両性花、雄花、側枝及び主茎と側枝の頂端部を摘除した株を供試した。残した第一次側枝の第一節位葉に^<14>CO_2を施与し、^<14>Cー光合成産物の転流経路上の転流物質を調べた。その結果、次の3点が明らかになった。1。葉から果実への光合成産物の転流は果托の特定の維管束を経由して果実内部に至る。2。キュウリの葉柄、茎の中での転流物質である少糖類は果実内部にも認められ、特に果実内部の転流経路上にある維管束部分にはかなり高い濃度で少糖類が存在する。3。果実内の糖組成は,転流経路上において、時間の経過に従って、周辺の柔組織と同じようにグルコ-ス、フルクト-スの割合が高くなる。

以上の結果、キュウリの転流物質である少糖類は、これまで言われていたように果柄で特異的に分解されることはなく、果実の内部にもかなりの程度転流していることが明らかとなった。果実の内部においても、転流経路に従って進むほど、時間が経過するほど、徐々に分解されて、グルコ-ス、フルクト-スとして蓄積することが明らかとなった。上記の結果について、園芸学会で1報、国際園芸学会議で1報発表した。平成元年度から平成3年度の実験によって,メロンとキュウリの転流は,葉と茎と果実における維管束システムにしたがって行われ,転流物質の糖代謝は次のように行われていることが明らかになった。1.メロンとキュウリにおいて,光合成産物の転流は,葉→茎→果実→種子の維管束配列と連絡にしたがった特定の維管束内を転流していた。2.メロンとキュウリの茎と果柄内における転流物質はこれまでの研究と同じく,主にラフィノ-スとスタキオ-スを中心とする少糖類で行われていた。3.果実の中においても,果托には比較的高い割合の少糖類が認められた。4.果托内における少糖類の全糖に対する割合は^<14>CO_2施与後の時間が経過するほど低くなった。5.果実内部においても, ^<14>CO_2施与後の経過時間が短いほど少糖類が多く認められ,時間が経過するほど少なくなった。6.時間が経過すると,果実の主な貯蔵物質は,メロンではスクロ-スが徐々に多くなり,キュウリではグルコ-スとフルクト-スが多くなった。5.以上の結果,本実験のように維管束システムにしたがった転流経路を考慮してサンプルを切り出すことによって初めて,メロンとキュウリの転流は,茎においてのみならず果柄においても果実内においても,おもにラフィノ-スとスタキオ-スを中心とする少糖類で行われることが明らかになった。
軸索保護機構解明と神経疾患治療への応用

神経軸索変性はアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患を含む多くの神経疾患における神経細胞死の前段階として観察される。従来,これらの神経変性疾患に対して,神経細胞死抑制の観点からの治療的アプローチ研究が行われてきたが,神経変性と軸索変性がそれぞれ独立したプロセスであることから,軸索変性の抑制が治療効果を示す例も報告されている。近年,神経軸索の傷害後変性が著しく遅延する自然発症変異マウスWallerian degenerationslow(Wld^s)マウスが発見され(Lumn,E。R。et al。Eur。J。Neurosci。1,27-33.1989),このマウスを用いた研究から軸索変性の抑制が神経細胞死を含む多くの神経機能の保護に繋がる事が報告されている。そこで本研究では神経軸索保護という観点から,個々の疾患の発症機序とは殆ど無関係に,神経軸索を保護するメカニズムを活性化することによって神経疾患に対する治療効果を得ようとする従来には見られなかった全く独創的な治療法を提案する。この目的を達成するために,Wld^sマウスで軸索保護を担っているタンパク質nicotinamide mononucleotide adenyltransferase1(NMNAT1)を組み込んだアデノ随伴ウイルスベクターを作成した。また,軸索保護機構の細胞内伝達機構を解明するために,培養DRG細胞を用いてマイクロアレイ解析を行い,NAD処理した時に,250以上の遺伝子発現量が上昇すること,500以上の遺伝子発現量が減少することを発見した。R。et al。Eur。J。Neurosci。
包括的評価による有機フッ素化合物ｎ－ＥｔＦＯＳＥの胎児期・幼若期曝露影響の解明

N-EtFOSE(N-ethylperfluorooctane sulfonate amide ethanol)はPFOSの製造過程で使用され、その影響が懸念されている。本研究は、胎児期ならびに幼若期のラットにN-EtFOSE曝露をそれぞれ行い生殖系への影響を包括的に評価した。本研究の結果、N-EtFOSE胎児期曝露によって、胎盤遺伝子の発現量が変化し、その遺伝子群は雌雄胎仔のあいだで異なることが示唆された。また、幼若期曝露によって、雄ではテストステロン合成関連遺伝子の発現量変化や血清テストステロン濃度の低下がみられ、雌では、異常性周期の増加やエストロゲン合成関連遺伝子の発現量変化がみられた。本研究は平成23年度から25年度の3年間の間に、これまで申請者が実施し蓄積してきた「胎児期曝露による出生時への影響」に加え、「幼若期曝露による生殖時期への影響」ならびに「胎児期曝露による生殖時期への影響」をそれぞれ調べ、N-EtFOSEの胎児期・幼若期曝露による生殖系への影響を包括的に評価することが目的である。平成24年度は、雄幼若期におけるN-EtFOSEによる生殖系への影響も明らかにするために、N-EtFOSE経口投与実験をコントロール群(0 mg/kg/day)、低濃度群(1 mg/kg/day)、高濃度群(10 mg/kg/day)の各条件で、3週齢のWistar-imamichiラット(各群それぞれ5匹ずつ)を対象に5週間実施した。その結果、高濃度群において、有意な体重減少や相対精巣重量の増加を明らかにするとともに、血清テストステロン値の有意な低下、ステロイド合成酵素関連遺伝子の発現量変化を認めた。また、雌幼若期におけるN-EtFOSEによる生殖系への影響についても、N-EtFOSE経口投与実験を実施し、現在解析を行っている。平成25年度は、雌幼若期におけるN-EtFOSE曝露による生殖系への影響を明らかにするために、経口投与実験をコントロール群(0 mg/kg/day)、低濃度群(1 mg/kg/day)、中濃度群(5 mg/kg/day)、および高濃度群(10 mg/kg/day)の条件で、3週齢のWistar-imamichiラットを対象に5週間実施した。その結果、中濃度ならびに高濃度群では異常性周期の割合の増加、ステロイド合成関連遺伝子発現量の変化を認めた。本研究は平成23年度から25年度の3年間の間に、これまで申請者が実施し蓄積してきた「胎児期曝露による出生時への影響」に加え、平成23年度に「幼若期曝露による生殖時期への影響」、平成24年度に「胎児期曝露による生殖時期への影響」をそれぞれ調べ、n-EtFOSEの胎児期・幼若期曝露による生殖系への影響を包括的に評価することが目的である。その中で、平成23年度は、以下の2点について主に研究を進めた。(1)これまでに蓄積した「胎児期曝露による出生時への影響」のデータを利用し、胎児期におけるN-EtFOSE曝露によって、胎盤重量の増加、および胎盤のホルモン応答に関与する遺伝子群や血管形成に関与する遺伝子群の発現量変化を明らかにした。また、これらの影響は、雌胎仔より雄胎仔において顕著であることを見出した。(2)雄幼若期におけるN-EtFOSEによる生殖系への影響も明らかにするために、N-EtFOSEをコントロール群(0 mg/kg/day)、低濃度群(1 mg/kg/day)、高濃度群(10 mg/kg/day)の各条件で、3週齢のWistarラット(各群それぞれ5匹ずつ)に6週間経口投与した。その結果、投与12日目から、高濃度群において、コントロール群や低濃度群と比較して有意な体重減少を認めた。また、投与終了時における対肝臓重量の増加ならびに相対精巣重量の増加が明らかになったことから、N-EtFOSE幼若期曝露による雄の精巣への影響が示唆された。精子形成をはじめとした生殖系への影響について、組織学的検討を行うとともに、血中ホルモンやステロイド合成酵素関連遺伝子の発現などとの関連を調べることで検討を行っている。本研究は平成23年度から25年度の3年間の間に、これまで申請者が実施し蓄積してきた「胎児期曝露による出生時への影響」に加え、「幼若期曝露による生殖時期への影響」ならびに「胎児期曝露による生殖時期への影響」について、それぞれ調べ、N-EtFOSEの胎児期・幼若期曝露による生殖系への影響を包括的に評価することが目的である。平成24年度終了時点で、雌雄の幼若期曝露による生殖時期への影響について研究を進めている状況であり、「胎児期曝露による出生時への影響」について、現時点で実施に至っていない。そのため、当初研究計画に比べ、研究の達成度はやや遅れている。

本研究は平成23年度から25年度の3年間の間に、これまで申請者が実施し蓄積してきた「胎児期曝露による出生時への影響」に加え、平成23年度に「幼若期曝露による生殖時期への影響」、平成24年度に「胎児期曝露による生殖時期への影響」をそれぞれ調べ、N-EtFOSEの胎児期・幼若期曝露による生殖系への影響を包括的に評価することが目的である。研究の目的に対して、平成23年度終了時点で「胎児期曝露による出生時への影響」に加えて、「雄の幼若期曝露による生殖時期への影響」に関する研究を進めている状況であり、「雌の幼若期曝露による生殖時期への影響」に関しては、現時点で未実施である。当初の予定より「胎児期曝露による出生時への影響」に関する研究に時間がかかったこと、また、「雄の幼若期曝露による生殖時期への影響」を明らかにするための経口投与実験が6週間毎日投与する必要上、設定できる期間が限られることなどから、平成23年度研究計画の一部である「雌の幼若期曝露による生殖時期への影響」について、実施に至らなかった。そのため、当初研究計画に比べ、研究の達成度はやや遅れている。平成25年度は、現在解析を行っている「雌の幼若期曝露による生殖時期への影響」を、すでに実施した雄の幼若期曝露による結果とともに「幼若期曝露による生殖時期への影響」として評価する。また、「胎児期曝露による生殖時期への影響」についても研究をすすめ、る有機フッ素化合物であるN-EtFOSEの胎児期・幼若期曝露影響の包括的評価に繋げる。平成24年度は、「雌の幼若期曝露による生殖時期への影響」ならびに「胎児期曝露による生殖時期への影響」を中心に研究を進める予定である。それぞれについて投与実験を行ない、平成25年度の包括的評価に向けて、必要なデータやサンプルを集める。また、平成23年度に実施した「雄の幼若期曝露による生殖時期への影響」に関して、相対重量の変化がみられた精巣に着目し、精子形成をはじめとした生殖系への影響について、明らかにする。平成25年度は、支払額として計画通りの額を請求し、当初の計画に沿って、成長や生殖系への影響を組織学的手法ならびに生化学的手法を用いて評価し、影響に関与する因子を分子生物学的手法によって探索する。平成23年度は支払額として1,800,000円を請求した。平成24年度は、本研究の実験系の確立と「雄の幼若期曝露による生殖時期への影響」について研究を実施したが、「雌の幼若期曝露による生殖時期への影響」については、実施に至っていない。そのため、平成23年度の実質支出額は請求支払額に比べて少ない状況である。平成23年度に実施できなかった「雌の幼若期曝露による生殖時期への影響」と当初の計画通りに「胎児期曝露による生殖時期への影響」を中心に行なう。そのため、平成24年度は、支払額として計画通りの額を請求し、平成23年度の差引額と併せて、研究推進のために使用する。当初の計画に沿って、それぞれの影響について、成長や生殖系への影響を組織学的手法ならびに生化学的手法を用いて評価し、影響に関与する因子を分子生物学的手法によって探索する。
生体分解性高分子を用いた脈絡膜新生血管に対する網膜下薬物送達システムの開発

目的:加齢黄班変性症など脈絡膜新生血管(CNV)を生じる疾患の治療法として、インターフェロンβ(IFNβ)の薬物療法が研究されているが、局所の薬物濃度維持が困難である点が問題となっている。本研究は、全身・健常組織に影響せず、CNVにIFNβを徐放し、特異的に作用する網膜下ドラッグデリバリーシステムの開発を目的としたものである。方法:グルタルアルデヒド架橋とアルカリ処理及び酸処理により、等電点を調節した生体吸収性ゼラチンマイクロスフェアと塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)との複合体を経硝子体的に家兎眼網膜下に注入しCNVモデルを作成。IFNβを含浸させたゼラチンマイクロスフェア複合体をCNVモデルの硝子体腔内または網膜下に注入し、脈絡膜新生血管の経時的変化を検眼鏡、蛍光眼底造影にて観察を行った。結果:コ.ントロール群(n=2)ではbFGF注入後2週間からCNVを確認し、その後、CNVは48週間まで増強・維持し、その後消退。ゼラチンマイクロスフェア網膜下注入群(n=2)、及びゼラチンマイクロスフェアとIFNβ硝子体腔注入群(n=2)では、CNVはコントロール群と同様の経過。しかし、ゼラチンマイクロスフェアとIFNβ網膜下注入群(n=2)ではCNVは消退せず、増殖性硝子体網膜症(PVR)の所見を呈した。bFGF含浸ゼラチンマイクロスフェア網膜下注入によりCNVモデル作成が可能であった。IFNβ硝子体腔内または網膜下注入では脈絡膜新生血管の改善は認められなかった。今後、さらに脈絡膜新生血管の病態、薬物療法の種類及び投与方法の検討が必要であると考えられた。また、bFGF含浸ゼラチンマイクロスフェア、IFNβ含浸ゼラチンマイクロスフェアの網膜下注入で増殖性硝子体網膜症(PVR)が惹起されたことから、今後、PVRモデル作成により、同病態の解明や新たな治療法の開発の可能性も示された。(1)生体吸収性ゼラチンマイクロスフェアの作製:ゼラチンマイクロスフェアをwater in oil下で撹拌、グルクルアルデヒドによる架橋により作製した。徐放対象因子に応じて、アルカリ処理及び酸処理により、ゼラチンの等電点を調節し、グルタルアルデヒドを用いた化学架橋により、含水率及び生体吸収性、薬物溶出性をコントロールした。ゼラチンマイクロスフェアと塩基性線維芽細胞増殖因子及びインターフェロンβとで多イオン形成により結合した。(2)ステロイド徐放薬剤の作製:脂溶性のステロイド薬であるデキサメサゾンをポリ乳酸からなる粒子に含有させ、生体内で徐放する薬剤を開発した。ポリ乳酸と脂溶性のデキサメサゾンをジクロロメタンとイソナプロパノールの混合溶液に溶解し粒子を作製、ポリビニルアルコール溶液中で攪拌しながら粒子に含まれる有機溶媒を液中乾燥させた。この手法により、高濃度にステロイドを含有するポリ乳酸粒子を作製する事ができた。(3)脈絡膜新生血管モデルの作製:家兎眼に手術用顕微鏡下で、塩基性線維芽細胞増殖因子を含浸させたゼラチンマイクロスフェアを、マイクロピペットを用いて家兎毛様体扁平部より挿入して網膜下腔に注入し、脈絡膜新生血管を惹起させることができた。検眼鏡検査、眼底カメラ、蛍光眼底造影、光学顕微鏡検査により、脈絡膜血管新生の経時的変化を検証した。(4)網膜下ドラッグデリバリーシステム:家兎の実験的

脈絡膜血管新生モデル眼において、蛍光眼底造影検査で病巣より蛍光漏出が認められたものを使用して、インターフェロンβ等の薬剤を含有させたゼラチンマイクロスフェアを硝子体腔及び病巣部の網膜下に注入した。網膜下薬物送達の経時的変化を検眼鏡検査、眼底カメラ、蛍光眼底造影、光学顕微鏡検査により検証した。(1)等電点の異なるゼラチンの作製:アルカリ処理、酸処理により等電点を調節したゼラチンに、コハク酸、エチレンジアミンを用いて側鎖の修飾を行い、等電点が段階的に異なる計4種類のゼラチンを用意した。ゼラチンは豚の腱より抽出しており、4種類のゼラチンの分子量はほぼ同じである。(2)ゼラチンをフルオロセインイソシアネート(FITC)で標識:(1)で用意した各ゼラチンに対しFITCによる標識を試みた。反応させるFITCの濃度をそれぞれ変化させる事により、4種類のゼラチンにおいて導入率がほぼ一定のFITC標識ゼラチンを作製する事ができた。反応液をゲル濾過法により回収し、ゼラチン濃度をTNBS法により測定し、より確実な結果とした。(3)硝子体腔内に投与されたゼラチンの動態の観察:FITCで標識したゼラチン、あるいは非水溶性ステロイドを懸濁させたゼラチンを用いて、豚眼硝子体内投与後の硝子体腔内での動態をリアルタイムにデジタル撮影する事に成功した。また、FITCで標識したゼラチンを硝子体内に投与した後、10%ホルマリン溶液で固定し標本を作成。網膜硝子体界面を組織学的に検証した。FITCの蛍光強度を増幅させるために抗FITC抗体を用いた二重染色法で検証した。(4)網膜硝子体界面におけるゼラチンの動態の定量的解析:兎眼および豚眼から摘出した硝子体を破砕した後乾燥させる。乾燥硝子体面上のゼラチンの動態を蛍光強度測定により定量的に検証した。4種類のゼラチンの動態において差異が認められた。目的:加齢黄班変性症など脈絡膜新生血管(CNV)を生じる疾患の治療法として、インターフェロンβ(IFNβ)の薬物療法が研究されているが、局所の薬物濃度維持が困難である点が問題となっている。本研究は、全身・健常組織に影響せず、CNVにIFNβを徐放し、特異的に作用する網膜下ドラッグデリバリーシステムの開発を目的としたものである。方法:グルタルアルデヒド架橋とアルカリ処理及び酸処理により、等電点を調節した生体吸収性ゼラチンマイクロスフェアと塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)との複合体を経硝子体的に家兎眼網膜下に注入しCNVモデルを作成。IFNβを含浸させたゼラチンマイクロスフェアをCNVモデルの硝子体腔内または網膜下に注入し、脈絡膜新生血管の経時的変化を検眼鏡、蛍光眼底造影にて観察を行った。結果:コントロール群(n=2)ではbFGF注入後2週間からCNVを確認し、その後、CNVは48週間まで増強・維持し、その後消退。ゼラチンマイクロスフェア網膜下注入群(n=2)、及びゼラチンマイクロスフェアとIFNβ硝子体腔注入群(n=2)では、CNVはコントロール群と同様の経過。しかし、ゼラチンマイクロスフェアとIFNβ網膜下注入群(n=2)ではCNVは消退せず、増殖性硝子体網膜症(PVR)の所見を呈した。bFGF含浸ゼラチンマイクロスフェア網膜下注入によりCNVモデル作成が可能であった。IFNβ硝子体腔内または網膜下注入では脈絡膜新生血管の改善は認められなかった。今後、さらに脈絡膜新生血管の病態、薬物療法の種類及び投与方法の検討が必要であると考えられた。
レ-ザ-電解顕微鏡の開発と応用

金属組織観察や耐食合金の局部腐食感受評価、あるいはレ-ザ-めっきやレ-ザ-エッチング微細加工法へ応用することを目的として、走査レ-ザ-電解顕微鏡(Scanning Laser Enhanced Electrochemical Microscopy:SLEEM)の開発を行なった。レ-ザ光源として小型で制御の容易な半導体レ-ザ-(AlGaAsタイプ、平成2年度には出力40mW、波長830nm、さらに平成3年度には高出力80mW型を導入)を用いて、その出力をバイアス電圧のコントロ-ルによって、10Hzから100Hzの矩形波にチョップし、電解質溶液中において定電位に保たれた合金試料に走査しながら照射し、そのときの熱励起による電解電流の変化を、ロックインアンプによって検出するのが、本走査レ-ザ-電解顕微鏡の基本原理である。定電位において検出されるレ-ザ-励起電解電流はその電位における電解電流に比例することが明かとなり、また照射周波数依存性は、照射による表面温度上昇を仮定したモデルの予測したとうり低周波数ほど応答電流値が大きくなることが見出された。ステンレス鋼の場合、その合金成分であるFe、Cr、Niは、それぞれ電位に依存する固有の電解電流を示すので、レ-ザ-励起電流も成分に依存することが明かとなった。また試作したプロトタイプの装置はレ-ザ-スポット径(約10μm)にほぼ等しい位置分解能を有する。以上の解析に基づき成分に依存する大きなレ-ザ-応答電流の得られる最適条件を検討した結果、Feが活性溶解しCrが不働態化するステンレス鋼の不働態域において、鋭敏化ステンレス鋼の結晶粒界におけるCr欠乏域を検出することに成功した。また過不働態電位域の定電位においては、逆にCr量の多い領域のレ-ザ-応答電流が大きくなるので、この条件において二相ステンレス鋼のα相、γ相結晶粒像を検出することができた。さらに微細加工には活性態および過不働態域の定電位条件が適していることが明らかとなった。金属組織観察や耐食合金の局部腐食感受性評価、あるいはレ-ザ-めっきやレ-ザ-エッチング微細加工法への応用することを目的として、走査レ-ザ-電解顕微鏡の開発を行なった。すなわち走査レ-ザ-電解顕微鏡のプロトタイプを試作し、その基本的性能を検討するとともに、ステンレス鋼の粒界腐食像や二相ステンレス鋼のα、γ相結晶粒像の検出に成功した。レ-ザ-光源としては小型で制御の容易な半導体レ-ザ-(AlCaAsタイプ、出力40mW、波長830nm)を用いて、その出力を、バイアス電圧のコントロ-ルによって、10Hzから100Hzの矩形波にチョップし、電解質溶液中において定電位に保たれた合金試料に走査しながら照射し、そのときの熱励起による電解電流の変化を、ロックインアンプによって検出するのが、本走査レ-ザ-電解顕微鏡の基本原理である。定電位において検出されるレ-ザ-励起電解電流はその電位における電解電流に比例することが明かとなり、また照射周波数依存性を検討した結果、低周波数ほど応答電流値が大きくなることが見出された。

以上の解析に基づき成分に依存する大きなレ-ザ-応答電流の得られる最適条件を検討した結果、Feが活性溶解しCrが不働態化するステンレス鋼の不動態域において、鋭敏化ステンレス鋼の結晶粒界におけるCr欠乏域を検出することに成功した。また過不働態電位域の定電位においては、逆にCr量の多い領域のレ-ザ-応答電流が大きくなるので、この条件において二相ステンレス鋼のα相、γ相結晶粒像を検出することができた。金属組織観察や耐食合金の局部腐食感受性評価、あるいはレ-ザ-めっきやレ-ザ-エッチング微細加工法へ応用することを目的として、走査レ-ザ-電解顕微鏡(Scanning Laser Enhanced Electrochemical Microscopy: SLEEM)の開発を行なった。レ-ザ光源として小型で制御の容易な半導体レ-ザ-(AlGaAsタイプ、平成2年度には出力40mW、波長830nm、さらに平成3年度には高出力80mW型を導入)を用いて、その出力をバイアス電圧のコントロ-ルによって、10Hzから100Hzの矩形波にチョップし、電解質溶液中において定電位に保たれた合金試料に走査しながら照射し、そのときの熱励起による電解電流の変化を、ロックインアンプによって検出するのが、本走査レ-ザ-電解顕微鏡の基本原理である。定電位において検出されるレ-ザ-励起電解電流はその電位における電解電流に比例することが明かとなり、また照射周波数依存性は、照射による表面温度上昇を仮定したモデルの予測したとうり低周波数ほど応答電流値が大きくなることが見出された。ステンレス鋼の場合、その合金成分であるFe、Cr、Niは、それぞれ電位に依存する固有の電解電流を示すので、レ-ザ-励起電流も成分に依存することが明かとなった。また試作したプロトタイプの装置はレ-ザ-スポット径(約10μm)にほぼ等しい位置分解能を有する。以上の解析に基づき成分に依存する大きなレ-ザ-応答電流の得られる最適条件を検討した結果、Feが活性溶解しCrが不働態化するステンレス鋼の不働態域において、鋭敏化ステンレス鋼の結晶粒界におけるCr欠乏域を検出することに成功した。さらにステンレス鋼のレ-ザ-電解微細加工には活性態および過不働態域の定電位条件が適していることが明らかとなった。
バイオテクノロジーに関する名古屋大学とノースカロライナ州立大学間協力研究の推進

別紙(様式5)に記している様に、3年間にわたる共同研究実施期間中、名古屋大学農学部(NU)からはノースカロライナ州立大学(NCSU)に計11名の研究者がおもいた。一方NCSUからNUに12名が来訪した。これらはいづれも比較的短期間の滞在による研究交流ではあったが、主題にかかげたバイオテクノロジー領域における両大学研究者間の科学的知見の交換に益すること大きく、将来にわたる共同研究実施計画に関して有用かつ重要な成果をもたらした。就中NCSUの研究者、Drs.Parks,Thompson,Huber,Petters,Theilの来学の意義は大きい。これがもとになって、NUの若手研究者、及び大学院学生が渡米することとなった。また、NCSUの関連研究者訪問の道も開かれた。たとえば、NUからは三木清史(大学院学生)がDr.Petters研究室に赴いて6ケ月研究した。近く木全洋子(大学院学生)はTheil教授のもとでPh.Dを取得するため渡米する計画である。また、佐々木卓治はNCSUの招へいプログラムによって10ケ月間Food Technology学科においてSwaisgood教授と共同研究を行った。Biochemistry学科のHead,Dr.Paul AgrisがNUにおいて行ったDNA,RNAの生物物理学に関するセミナーもはなはだ高度のものであった。これ等すべてが両大学の研究者に益するところはまことに大きいものであった。直接本研究計画に名を連ねたものに加えてNCSUのJapan Center長、Mr.John Sylvesterは第2年次NUの非常勤講師として来学し、大学院学生に対して特別講義を行った。それは日米の学術交流プログラム、特にNCSU-NUの学術提携の現状並びに将来を展望するものであり示唆に富むものであった。本共同研究が実施される契機になったのは、NCSUのS.Huber教授が外国人客員教授としてNUに6ケ月滞在し、赤沢、杉山等とともに行った共同研究と、また大学院学生に対する指導である。それ等の具体的成果として、別紙に示す様な論文が発表されている。アメリカ合衆国・ノースカロライナ州立大学(以下「NCSU」という. )と名古屋大学の学術交流協定の実をあげるため,バイオテクノロジーを具体的な協力研究の領域とさだめて,相互の研究者の訪問によって共同研究等によって実績を上げようとするものである.即ちお互いが合意した研究者が相手側の研究室等におもむいて研究を行うことは具体的な目的とする.バイオテクノロジーは,世界的,社会的ニューズのある自然科学分野であるが,幸にNCSUと名古屋大学は日米において夫々実績をもつ大学として,これまで実を上げてきた.本研究計画の実施によって.これを質的に向上させることを期待している.金光桂二教授は林学,森林生態学分野に交流課画を推進するためにおもむいたものであり,第2年次降の交流について討論し,今後のことについてはFAX等で連絡をつることを約束した.上に述べた様に, Huber教授の来日が都合により実現しなかったため,今年度はすべて名古屋大学側からの渡米となったが,その成果はいずれの研究者についても極めて実りのあるものであった.別紙(様式5)に記している様に、3年間にわたる共同研究実施期間中、名古屋大学農学部(NU)からはノースカロライナ州立大学(NCSU)に計11名の研究者がおもいた。
前頭連合野の報酬処理系におけるモノアミンの役割

我々は、前頭連合野の報酬処理系におけるモノアミンの役割を解明するため、サルを用いてニューロン・分子両レベルを組み合わせた総合的研究を行った。まず、報酬処理系の神経基盤を明らかにするために、様々な課題を用いてニューロン活動を記録した。サッケード後の報酬の有無がランダムである眼球運動性遅延反応課題を用いて、直前の反応(サッケード方向)かつ報酬の有無に依存して活動を変化させるニューロンが前頭連合野背外側部に豊富に存在することを見出した。これらのニューロン群は、報酬の有無を直前の行動反応と結びつける役割を果たすと考えられる。次に、報酬依存的な行動制御に関わるニューロン機構を明らかにするため、行動結果(報酬の有無)に基づいて選ぶべきcueを切り替える必要がある、眼球運動性セット切替課題を用いてニューロン活動を記録したところ、行動の切替えに必要な情報がすべて前頭連合野ニューロンによって再現されることがわかった。これらのニューロン再現は、報酬依存的なセット切替学習に重要な役割を果たすと考えられる。更に、記憶誘導性の感覚運動変換を必要とする遅延アンチサッケード課題を用いて、報酬期待は前頭連合野の記憶過程を主に増強し、運動準備などの行動制御過程にはあまり影響を与えないことを明らかにした。前頭連合野における報酬情報は、行動決定に使用される記憶に関与し、決定後の準備過程には影響を与えないものと考えられる。モノアミンの役割については、眼球運動性セット切替課題遂行中のサル前頭連合野へのドーパミンD1、D2、ノルアドレナリンα2受容体いずれかの阻害剤の局所注入により調べた。その結果、D1受容体阻害剤注入後のみ、前に選んだcueに固執するエラーの頻度が増加した。このことからセット切替にはD1受容体の関与が示唆される。以上我々は、前頭連合野の報酬処理系における神経・分子基盤に関する貴重な成果を得た。本研究の目的は,前頭連合野における報酬に基づいた行動におけるモノアミンの役割を明らかにすることにある.この目的のために,まず,2頭のサルに眼球運動性の報酬依存的ルール切り替え課題(Oculomotor self-alternation,OSA)を訓練した.この課題では,10-15試行のブロックで,赤と緑の視覚刺激のどちらかが報酬と結びついており,サルは今どちらの刺激が報酬と結びついているかを自分でモニターし、ルールにしたがって切り替えなければならない.この課題遂行中にドーパミン受容体阻害剤を前頭連合野の局所部位に微量投与し,注入前と後の行動パラメータを比較・解析した.その結果,ドーパミンD1受容体阻害剤であるSCH23390を投与した場合に,一部の領域で、行動を切り替えるまでに多くの試行数を要する,行動の切り替えが出来ないなどの障害が見られた.D2受容体阻害剤であるスルピライド,ノルアドレナリン受容体阻害剤である,ヨヒンビン,プラゾシン,プロプラノロールの投与ではこれらの障害が見られなかった.このことは,前頭連合野の担う報酬に基づいたルールの切り替えにドーパミン中でもそのD1受容体が重要な役割を担っていることを示唆する.今後はさらに,このことをニューロンレベルで調べるために,同様の課題遂行中にニューロン活動を記録し,課題関連活動が見つかったらそのニューロンに対して薬物を直接投与し,実際にドーパミンがどのようにニューロン活動を修飾するのかという問題にアプローチする予定である.我々は、前頭連合野の報酬処理系におけるモノアミンの役割を解明するため、サルを用いてニューロン・分子両レベルを組み合わせた総合的研究を行った。本研究の目的は,前頭連合野における報酬に基づいた行動におけるモノアミンの役割を明らかにすることにある.この目的のために,本年度は前頭連合野の報酬処理系をニューロンレベルで解析した。2頭のサルに眼球運動性の遅延課題を訓練し,反応としての記憶誘導性サッケードの後に報酬がもらえる試行と報酬無しの試行をランダムに混ぜた。