hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
患者由来iPS細胞を用いたPendred症候群における甲状腺腫の解明

ヒトiPS細胞から甲状腺濾胞細胞の誘導方法の確立を目指した。既報の甲状腺前駆細胞誘導法や、甲状腺誘導方法を一部改編した条件で甲状腺前駆細胞のマーカーであるPAX8およびNKX2.1陽性細胞を免疫染色にて確認することができた。しかしながらPCRにて十分なNKX2.1の発現が認められなかった。気道上皮誘導の既存報告も参考にし、条件変更を繰り返し行った。しかしながら同様にPCRではNKX2.1の発現量は多くはなかった。現状では十分な誘導効率にて甲状腺前駆細胞を誘導する方法の確立ができていないと言わざるを得ない。引き続き、より誘導効率の良好な甲状腺前駆細胞誘導方法の確立を行う。まずは既報のiPS細胞より甲状腺前駆細胞である前腸誘導方法(Nat Biotechnol. 2011 Mar;29(3):267-72.)の追実験を行った。しかしながら、効率よく甲状腺前駆細胞のマーカーであるNKX2.1およびPAX8の陽性細胞を誘導することは不可能であった。そこで既報の誘導方法より種々の誘導因子を加えたり、培養日数の再検討を行い、NKX2.1およびPAX8陽性細胞を50%程度の誘導効率で誘導することができるようになった。誘導した細胞にTSH負荷を行い、甲状腺濾胞細胞へ分化誘導するよう培養を継続しているが、形態学的には濾胞構造の確認を得るに至っていない。胎児の濾胞細胞増殖にはTSHおよびインスリン負荷が必要との既報(Endocrinology. 1990 Feb;126(2):869-75.)があったため、あわせてインスリン負荷を行ったが、インスリンの有無で明らかな相違は認められなかった。また細胞培養液の遊離トリヨードサイロニン・遊離サイロキシン・サイログロブリンの濃度を測定したが、培養液単体のコントロールと比較して有意な上昇が認められなかった。既報の報告に比較し、効率よくNKX2.1およびPAX8陽性細胞をiPS細胞より分化誘導できるようになったのは確実な進歩である。その後の誘導条件の特定を行い、形態学的にも機能的にも甲状腺濾胞細胞の確認を行うよう実験を進める予定である。計画ではiPS細胞より甲状腺誘導方法の確立を27年度中に行う予定であった。しかしながら、甲状腺誘導には確立された報告がなく、種々の条件ふりを行うもいまだ効率よい甲状腺濾胞細胞誘導の方法が確立できない状況である。まずはヒトiPS細胞より甲状腺濾胞細胞の誘導方法の確立を目標とした。昨年度に引き続き既報の甲状腺前駆細胞である前腸誘導方法(Nat Biotechnol. 2011 Mar;29(3):267-72.)を一部改編した誘導方法にて、効率よい甲状腺前駆細胞の誘導を目指した。免疫染色では甲状腺前駆細胞のマーカーであるNKX2.1およびPAX8の陽性細胞を約50%の誘導効率で確認できるに至った。しかしながらPCRではPAX8の強発現は確認出来るのにたいして、NKX2.1の発現を確認することができなかった。そこで2015年に報告された甲状腺誘導方法(Cell Stem Cell 17, 1-16 November 5, 2015)に従った誘導方法を追実験してみた。しかしながら前述と同様の結果であり、PAX8は強発現であるものの、NKX2.1の発現を確認することができなかった。いずれにせよ既報の甲状腺前駆細胞誘導方法に再現性がないと考えられ、新たな条件の確定が必要と考えられた。これらの誘導条件を一部変更することでPCRでもNKX2.1の発現を確認することができた。しかし発現量が少なく誘導効率は良くないと推測される。わずかに甲状腺前駆細胞が誘導されている可能性より、今後さらに条件変更を繰り返し、まずは効率よく甲状腺前駆細胞誘導の方法を確立する。その後甲状腺濾胞細胞へ成熟させ、形態学的にも機能的にも甲状腺濾胞細胞の確認ができるように実験をすすめる予定である。甲状腺前駆細胞誘導方法には前出の2つの既報があるが、いずれも再現性がなく確立されていない状況である。一部改編し種々の条件ふりを行うもいまだ効率よい甲状腺濾胞細胞誘導の方法が確立できない状況である。昨年度に引き続きまずはヒトiPS細胞から甲状腺濾胞細胞の誘導方法の確立を目指した。既報の甲状腺前駆細胞誘導法(Nat Biotechnol. 2011 Mar;29(3):267-72.)や、既報の甲状腺誘導方法(Cell Stem Cell 17, 1-16 November 5, 2015)を一部改編した条件で甲状腺前駆細胞のマーカーであるPAX8およびNKX2.1陽性細胞を免疫染色にて確認することができた。しかしながらPCRにてNKX2.1の発現量が多くなく、甲状腺前駆細胞への誘導効率が高くないと推測された。甲状腺濾胞細胞と途中まで同じ発生分化経路をたどる気道上皮誘導の既存報告(Stem Cell Reports 3, 394-403 September 9, 2014)も参考にし、条件変更を繰り返し行った。しかしながら同様に免疫染色ではある程度PAX8およびNKX2.1陽性細胞が確認できるものの、PCRではNKX2.1の発現量は多くはなかった。それゆえ、健常人およびPendred症候群患者由来のiPS細胞よりそれぞれ甲状腺細胞を誘導し、比較検討を行うことができなかった。並行して行っている研究課題

「ヒトiPS細胞より誘導した甲状腺細胞の甲状腺機能低下症への再生医療実現に向けて」において引き続き、より誘導効率の良好な甲状腺前駆細胞誘導方法の確立を行う。その後甲状腺濾胞細胞へ成熟させ、形態学的にも機能的にも甲状腺濾胞細胞であることを確認できるように、実験を計画していく予定である。ヒトiPS細胞から甲状腺濾胞細胞の誘導方法の確立を目指した。既報の甲状腺前駆細胞誘導法や、甲状腺誘導方法を一部改編した条件で甲状腺前駆細胞のマーカーであるPAX8およびNKX2.1陽性細胞を免疫染色にて確認することができた。しかしながらPCRにて十分なNKX2.1の発現が認められなかった。気道上皮誘導の既存報告も参考にし、条件変更を繰り返し行った。しかしながら同様にPCRではNKX2.1の発現量は多くはなかった。現状では十分な誘導効率にて甲状腺前駆細胞を誘導する方法の確立ができていないと言わざるを得ない。引き続き、より誘導効率の良好な甲状腺前駆細胞誘導方法の確立を行う。引き続きiPS細胞より甲状腺濾胞細胞の誘導方法の確立を目指す。甲状腺前駆細胞への誘導効率は確実に上がっているので、条件ふりをさらに行い甲状腺濾胞細胞への誘導を目指す。今までは平面培地での培養であったが、三次元培養なども行っていく予定である。甲状腺TSHをはじめ分化誘導に使用する資材が1バイアル5万円程度と高価であることもあり、慎重に使用し購入計画を立てていた。そのため予定より予算に余裕が出た。分化誘導に使用する資材が1バイアル5万円程度と高価であることもあり、慎重に使用し購入計画を立てていた。未だ甲状腺濾胞細胞誘導方法の確立がされておらず、さらなる条件ふりが必要である。試薬を中心に購入する。いまだ甲状腺濾胞細胞誘導方法の確立がされておらず、さらなる条件ふりが必要である。
テーラーメイド型生体材料の骨形成促進機能付与

テーラーメイド型骨代替材に、骨形成能を有する薬剤を封入した薬剤徐放能を有するマイクロスフェアカプセルを組み込むことで、より安定した骨結合を得られる薬剤徐放担体の開発を目的とした。チタン多孔体の形状最適化、薬剤設計(薬剤の選定、マイクロスフェア粒子調整)は順調に進んでいる。今後は、チタン多孔体表面へのマイクロスフェア設置方法、条件の検討、さらにはin vivoにおける骨反応評価を行っていく。これまでに我々は、広範囲の骨補填材として、賦形性に優れ、モールドを用いずに作製可能なチタン多孔体の開発に成功している。この材料は、生体親和性にすぐれたチタンでありながら、骨に近似した弾性率を有するため、周囲骨と機械的になじみ、骨吸収することなく骨補填材としての効果を発揮する。また、表面の無数の空孔に骨組織の内部成長が起こり、強固で安定したな骨結合が期待される。この材料の機能化を目的に研究を開始した。チタン多孔体の形状最適化としては、スペースホルダー法を併用することで、所望の空孔系を制御することに成功した。これによって、空孔内に薬剤を設置、骨成長に有利な構造を付与できることになった。また、徐放薬剤設計として、生体親和性に優れるPLGAカプセルを選択し、内部に骨形成促進作用のある薬剤を封入することを試みた。徐放試験を行った結果、理想的な徐放曲線が得られ、SEMで確認したカプセル形状も申し分ない。我々は生体材料として注目されつつある、チタン多孔体の骨補填材としての応用研究を手がけている。より早期での骨結合を得られる骨補填材として、チタン多孔体内部に骨形成促進効果のある物質を貯蔵させ、局所的に徐放させることで効果を発揮する薬物徐放担体としての応用を目指すこととした。今年度の目的としては、チタン多孔体内にマイクロスフェア粒子(ポリビニルアルコールでできた粒子に薬剤を封入したもので、加水分解によって徐々に粒子が壊され、内部の薬剤が徐放されるもの)を取り込む条件の最適化であった。それに先立ち、チタン多孔体の材料設計を手掛けた。必要な空孔径を材料表面に配置し、そこにマイクロスフェア粒子を設置する必要があるためである。従来の我々が用いているチタン多孔体作製プロセスに改良を加えた。将来空孔となるためのスペーサーとして、PMMA(ポリメタクリル酸メチル樹脂)粉末を混合させて焼成することで材料表面に所望の空孔径を形成することに成功した。また、PMMA粉末の粒子径を変化させると、得られる空孔径のサイズを制御できることがわかった。さらに、焼成条件によっては生体の骨に強度を近似させられる特性も発見した。この材料に減圧下でマイクロスフェア粒子を含浸させると、空孔内に粒子が設置されており、これを走査型電子顕微鏡で確認した。次年度は引き続き材料設計の最適化を目指し、作製した試料を骨芽細胞との親和性を評価し、実際に動物実験(ラット大腿骨埋入試験)で効果を確認する予定である。チタン多孔体の材料設計のところでやや遅れを生じてしまった。最適な材料設計を考える上で、空孔径の最適化をはかるのに時間がかかった。骨形成、骨増殖に有効なチタン表面の空孔径サイズは100400μmと考えられている。我々のプロセスによるチタン多孔体を作製するために用いたチタン粉末は平均粒径が120μmである。このまま焼結させれば100μm以下の空孔しか得られない。そこで、将来、焼成後に空孔となるスペースを保持させるスペーサーを用いることとした。このスペーサーの材料選択には最終的にPMMAを選ぶまでにさまざまな条件で実験をおこなったため時間を費やしてしまった。現在は多孔体の空孔内に薬剤を設置させる条件の検討を始めたところである。当初の予定ではここでもっとも時間も労力もかかり、1年目の秋ごろから検討を開始できると考えていた。しかし、材料設計におもわぬ時間がかかり、現在実験を開始したところである。今後は、現在進行中の薬剤設置条件の検討をin vitroで評価する。骨芽細胞との反応性をオステオカルシンやアルカリフィスファターゼ活性などの骨形成マーカーによって評価する。さらに、疑似体液中に試料を浸漬し、チタン表面のアパタイト析出能を評価する。最終的には、ラット大腿骨に試料を埋入し、組織切片を作製、骨接触率や新生骨面積の測定を行い、組織学的に評価する。繰越金が発生した理由としては実験の遅れが挙げられる。動物実験を想定していたためである。また、細胞培養系の実験も遅れてしまったため繰越金が発生した。

計画としては、現在進行中の薬剤設置条件の検討をin vitroで評価する。骨芽細胞との反応性や、疑似体液中でのアパタイト析出能を評価するものである。試料にどのくらいの薬剤を設置できるか、その設置した薬剤量は適切か、徐放挙動は骨形成に関係したのか、を検討する。その後、実際に動物実験においてin vivo評価を行う。検討条件としては、コントロール、シンバスタチンのみ使用した試料、マイクロスフェア粒子設置した試料の3通りに、それぞれの薬剤の濃度、設置量と条件が多くなる。したがって多くの実験動物が必要になると考えられる。また、材料設計の新規性、進歩性を学会発表で行う。当初は薬剤設計を発表する予定であったが、その前段階の材料設計に関しても、チタン加工分野、歯科材料分野においては新規性のある内容であるので発表を行う。
情動記憶形成過程における脳内情報処理機構の時空間的変遷

大脳皮質内側前頭前野(mPFC)は「情動」の制御に重要であると考えられる。しかしながら、従来の技術的な制約もあって、特に行動中の動物から神経「集団」の活動を記録することで初めて調べられるような「神経群ネットワークとしての情報処理」に関する知見は、これまでのところ特にmPFCに関して非常に限定的である。本研究では、1)2光子イメージングによる多数の神経活動の経時的観察、2)深部イメージング、3)それらと光遺伝学を「同時に」行うための光学系、を統合させた独自のシステムを用い、擬似自由行動中のマウスmPFCでの神経活動の「記録・操作」を進めていく。そしてそれら技術を利用して、情動記憶形成過程における脳内情報処理機構の時空間的変遷を把握し、その仕組みを理解することを目的としている。これまでのところ、他の項目(現在までの進捗状況、今後の研究の推進方策)に記載するように、学習の前、最中、及び学習後の記憶想起中のマウスから、神経集団活動データの記録ができており、多くのデータを得た。さらに、数理学的なアプローチによりこれらの観測で得られたデータの解析を進めてきた。その結果、学習の過程や成立後における神経活動の変化など、記憶との関連が示唆されるいくつかの現象を検出している。また並行して、そこから得られた仮説を検証するために、神経活動操作技術の開発・光学系の構築も進めてきた。次年度以降の展開に向けて、計画通り順調に進んでいると考えている。2光子神経活動イメージング技術により、多数の神経からの同時活動記録を行った。情動に関わるmPFCからのイメージングには、マイクロプリズムを利用した深部イメージング技術を用いた。正中に沿って滑り込ませることで、神経結合を切断することなく深部に到達できるため、低い侵襲性を担保することができた。遺伝子コード型センサーの導入により長期的に細胞を標識し、従来困難であった「同一の神経細胞における学習前後での神経活動パターンの比較」を実現した。実験は頭部固定中の擬似自由行動可能なマウスを用いて行い、恐怖条件付けという古典的な学習を行うマウスからの神経活動記録を進めることが出来た。それらの技術を用いることで、学習の前、最中、及び学習後の記憶想起中のマウスから、神経集団活動データの記録ができている。すでに多くのマウスからデータが得られており、現在はこれらのデータの解析を進めている。計画に従い、機械学習の専門家との共同研究を進めており、それに加えて、記憶との関連が想定されるアンサンブル(神経細胞集団としての活動)の検出も試みている。それ以外にも、学習の過程や成立後における神経活動の変化など、記憶との関連が示唆される様々な現象を検出している。さらに、イメージングにより観察されたそれらの神経活動の意義、情動との関連性を検証するために、数理学的な手法に加えて、「今後の研究の推進方策」の項で述べるような「光遺伝学」により直接的に因果関係を調べる準備を各種進めている。従って、次年度以降の展開に向けて、計画通り順調に進んでいると考えている。まずは、解析によるイメージングデータの解読をさらに進め、脳内情報処理機構の時空間的変遷をより詳細に迫っていく。神経活動としては、恐怖を想起するような音(条件刺激)に対しての反応のみならず、嫌悪刺激そのものへの反応、逆に報酬に対しての反応、学習前の音そのものへの反応、そして動いたりすくみ行動をとったりすることによる反応など、様々な脳活動がデータとして同一マウスの同一細胞群から記録できている。これらのデータを系統的に調べていくことで、各神経細胞の個性ごとの役割の違いなども検証していく。また解析で得られた結果を元に、光遺伝学による因果関係の解明についても進める。まずは光学系構築を進めておき、解析が終わった段階で実際の検証実験に移行する。これまでに我々は、PV陽性の抑制性神経が視覚情報をコードするのに重要であることを明らかにした(Agetsuma et al., 2017)。PV細胞を光で特異的に抑制する方法により、本来PV細胞は、神経回路の同期性制御を介して情報量を制御することが分かった。そこで本研究でも、光遺伝学によるPV細胞の活動操作を行い、同期性の変化の誘導とそれによるマウス情動反応の変化を観察し、情動記憶を成立させるための基盤を明らかにしていく。また、光遺伝学的な神経活性化による記憶の「再生」も試み、観察された神経活動の意義を検証する。c-fosプロモーターを利用した記憶コード神経細胞群の標識や、SLMを利用した任意の神経細胞集団の活性化法(Packer et al., 2014)を導入し、光による人工的なパターン再生を行うことで、観察された神経活動の「記憶コード」への関与を調べる。特にSLMを利用した任意の神経細胞集団の活性化法に関しては、共同研究を通じて推進している。これらをできるだけ速やかに完成させ、検証実験へと展開する。本研究では、1)

2光子イメージングによる多数の神経活動の経時的観察、2)深部イメージング、3)それらと光遺伝学を「同時に」行うための光学系、を統合させた独自のシステムを用い、擬似自由行動中のマウスmPFCでの神経活動の「記録・操作」を進めていく。そしてそれら技術を利用して、情動記憶形成過程における脳内情報処理機構の時空間的変遷を把握し、その仕組みを理解することを目的としている。これまでのところ、他の項目(現在までの進捗状況、今後の研究の推進方策)に記載するように、学習の前、最中、及び学習後の記憶想起中のマウスから、神経集団活動データの記録ができており、多くのデータを得た。さらに、数理学的なアプローチによりこれらの観測で得られたデータの解析を進めてきた。その結果、学習の過程や成立後における神経活動の変化など、記憶との関連が示唆されるいくつかの現象を検出している。また並行して、そこから得られた仮説を検証するために、神経活動操作技術の開発・光学系の構築も進めてきた。次年度以降の展開に向けて、計画通り順調に進んでいると考えている。2光子神経活動イメージング技術により、多数の神経からの同時活動記録を行った。情動に関わるmPFCからのイメージングには、マイクロプリズムを利用した深部イメージング技術を用いた。正中に沿って滑り込ませることで、神経結合を切断することなく深部に到達できるため、低い侵襲性を担保することができた。遺伝子コード型センサーの導入により長期的に細胞を標識し、従来困難であった「同一の神経細胞における学習前後での神経活動パターンの比較」を実現した。実験は頭部固定中の擬似自由行動可能なマウスを用いて行い、恐怖条件付けという古典的な学習を行うマウスからの神経活動記録を進めることが出来た。それらの技術を用いることで、学習の前、最中、及び学習後の記憶想起中のマウスから、神経集団活動データの記録ができている。すでに多くのマウスからデータが得られており、現在はこれらのデータの解析を進めている。計画に従い、機械学習の専門家との共同研究を進めており、それに加えて、記憶との関連が想定されるアンサンブル(神経細胞集団としての活動)の検出も試みている。それ以外にも、学習の過程や成立後における神経活動の変化など、記憶との関連が示唆される様々な現象を検出している。さらに、イメージングにより観察されたそれらの神経活動の意義、情動との関連性を検証するために、数理学的な手法に加えて、「今後の研究の推進方策」の項で述べるような「光遺伝学」により直接的に因果関係を調べる準備を各種進めている。従って、次年度以降の展開に向けて、計画通り順調に進んでいると考えている。まずは、解析によるイメージングデータの解読をさらに進め、脳内情報処理機構の時空間的変遷をより詳細に迫っていく。神経活動としては、恐怖を想起するような音(条件刺激)に対しての反応のみならず、嫌悪刺激そのものへの反応、逆に報酬に対しての反応、学習前の音そのものへの反応、そして動いたりすくみ行動をとったりすることによる反応など、様々な脳活動がデータとして同一マウスの同一細胞群から記録できている。これらのデータを系統的に調べていくことで、各神経細胞の個性ごとの役割の違いなども検証していく。また解析で得られた結果を元に、光遺伝学による因果関係の解明についても進める。まずは光学系構築を進めておき、解析が終わった段階で実際の検証実験に移行する。
ミトコンドリアＲＮＡシャペロンｐ３２の分子基盤と病態解析

ミトコンドリアエネルギー代謝に必須の蛋白p32の分子機能を解明するため、p32コンディショナルノックアウトマウスの作製、解析を行った。脳特異的p32ノックアウトマウスを作製したところ生後8週齢で致死を示した。このマウスは神経細胞の軸索異常とオリゴデンドロサイトの分化異常を認めた。さらに、ミトコンドリアDNAがコードするタンパクの発現低下、酸化的リン酸化能の低下を認めた。ERストレス応答の亢進、酸素消費量の低下を認めた。P32はミトコンドリア代謝に必須のタンパクであり、p32異常が白質脳症につながると考えられた。細胞のATP産生の80%を担いエネルギー代謝の中心的な役割を担うミトコンドリアの機能異常はパーキンソン病などの神経変性疾患や心血管系の異常、がん、糖尿病、さらに老化に関連するといわれている。ミトコンドリアの酸化的リン酸化に関与するp32分子は疾患との関連が示唆されているが、その詳細な分子機構解析は皆無である。本研究ではミトコンドリア蛋白p32の各疾患との関わりについてコンディショナルノックアウトマウスの作製と、その機能解析、およびミトコンドリアエネルギー代謝とp32の機能連関を行うことでRNA chaperon p32の細胞、組織、個体レベルでの分子基盤について明らかにすることを目的とした。結果p32コンディションノックアウトマウスの作製を行った。Cre/ loxPシステムを用いた部位特異的ノックアウトマウスを作製してきた。ノックアウトマウスの解析には、組織学的解析と行動学的方法を考えている。全身ノックアウトマウスは胎生致死よりマウス胎仔からp32ノックアウト細胞を作製し、分子生物学的なアプローチからミトコンドリアの機能解析を行った。さらに、p32の細胞の機能変化を明らかにする。以上の研究により、機能未知なミトコンドリアタンパク質p32の生体内での本当の役割を解明する手がかりを得た。さらに、p32部位特異的ノックアウトマウス(心筋、神経)を作製し、個体レベルでどの組織、細胞に障害があるのか、その障害がどう症状とリンクするのか推測する準備が整った。今年度はp32の分子機能の解明として精製p32によるRNA結合、翻訳調節、相互作用する分子の同定と機能連関を明らかにした。p32機能異常による細胞の反応としてp32-/-細胞の細胞質翻訳活性低下、Oncosisによる細胞死の増大を観察した。作製したノックアウト細胞の増殖、形態を確認しミトコンドリアでの機能解析を進めた。ノックアウト細胞のミトコンドリア形態を、免疫染色(Mito Tracker Red、p32)、電子顕微鏡で確認した。ミトコンドリアでコードされているRNA量、DNA量をreal time PCRで定量したところ変化はなかった。ミトコンドリアエネルギー代謝に必須の蛋白p32の分子、細胞レベルでの機能解析、さらに種々の疾患への関与を解明するため、p32コンディショナルノックアウトマウスの作製、解析を行うことを目的とし、研究を遂行した。さらに、アセチル化翻訳後修飾の解析からミトコンドリア代謝制御を理解し、いかにアセチル化がp32の翻訳制御に関与するのかを明らかにした。(1)Cre/loxPシステムを用いて脳特異的p32ノックアウトマウスを作製したところ生後8週齢で致死。(2)作製したノックアウト細胞の増殖は増殖抑制の傾向にあった。ミトコンドリアでコードされているタンパク質(coxI、coxII、ND2)の発現量は減少していた。膜電位は減少し、ATP産生量も減少していた。(3)細胞質の翻訳機構の変化をp32ノックアウト細胞と野生型の細胞で比較検討したところ翻訳活性化に関与する、S6K, Ribosomal p70S6Kのリン酸化の減少を認めた。(4) RNAシャペロンp32がアセチル化するかアセチルリジン抗体を用いて検討しK89/K93がアセチル化することを観察した。このK89/K93のアセチル化に対する抗体も作成しp32のアセチル化、脱アセチル化の機序を解析する。リジン残基に変異を入れるとp32のRNA結合活性、機能とも低下していることが認められた。p32のアセチル化、脱アセチル化がそのRNA結合能に変化を与えるかをRNAゲルシフトアッセイにより検討し、アセチル化による機能低下を認めた。分子生物学ノックアウトマウスの作成には成功している。

さらに、組織特異的マウスの作成、心筋特異的、および神経細胞特異的マウスの作成には成功しているので概ね順調に進展している。さらに、組織学的解析、遺伝子発現解析より興味深い結果を得ている。本年度はp32コンディションノックアウトマウスの作製を行うことを目的にCre/ loxPシステムを用いた部位特異的ノックアウトマウスを作製してきた。ノックアウトマウスの解析には、組織学的解析と行動学的方法を考えている。全身ノックアウトマウスは胎生致死よりマウス胎仔からp32ノックアウト細胞を作製し、分子生物学的なアプローチからミトコンドリアの機能解析を行うことができた。今後はさらに、組織解析、初代培養細胞を用いた解析を加えることでさらに詳細な結果を得ることが期待される。遺伝子発現を網羅的に解析することでいかにp32たんぱくがミトコンドリア昨日と連関しているかを明らかにしていきたい。ミトコンドリア内代謝を変化させる条件を確立する。すなわち、窒素飢餓、ミトコンドリア膜電位消失(CCCP)によりミトコンドリアDNA (mtDNA), mtRNA, proteinの発現レベルがどのように変化するか、Real time PCR , western blotにより評価する。さらにRNAシャペロンp32がアセチル化するかアセチルリジン抗体を用いて検討する。すでに、p32に関してはK89/K93がアセチル化することをpreliminaryに観察しているこのK89/K93のアセチル化に対する抗体も作成しておりp32のアセチル化、脱アセチル化の機序を解析する。適切に使用したが3年目の使用に用いるため使用額が生じたノックアウトマウスの諾成、および解析、学会発表、論文作成コンディショナル・ノックアウトマウスの解析を続ける。特に、血管内皮細胞特異的ノックアウトマウスの解析を行う。動脈硬化との関連性を検証する。エネルギー代謝との関連ではSirt3がp32の脱アセチル化を直接担うのか検討する。そのためにin vitro, in vivoの系で評価する。具体的には、Sirt3過剰発現,あるいはSirt3 siRNA導入による発現低下の系においてp32のアセチル化のレベルをアセチルリジン抗体、およびp32アセチルリジン抗体を用いて評価する。
ＣＫ１を介した減数第一分裂期における染色体分配制御機構の解析

本申請者はモデル生物である分裂酵母を用いて、進化的に高度に保存されたリン酸化酵素であるI型カゼインキナーゼ(CK1)の減数第一分裂期における染色体分配制御機構の解析を行った。その結果、CK1変異株では減数第一分裂期においてmerotelic結合(スピンドル微小管と動原体との"間違った結合")が高頻度に観察された。この様なmerotelic結合は、その修正に必要なAurora B複合体(Chromosome Passenger Complex; CPC複合体)の変異株においても高頻度で観察されることから、Aurora B (Ark1)とCK1との機能的相関について解析を行った。まず、CK1変異株において、Aurora B複合体のサブユニットのうち、Ark1とINCENPのホモログであるPic1を同時に強発現させると、merotelic結合の出現頻度が顕著に抑圧されることが明らかになった。そこで、Ark1やPic1がリン酸化酵素であるCK1の標的となるかについて解析を行った結果、Pic1のC末端領域がin vitroでCK1により高度にリン酸化された。次に標的残基の同定を行った結果、Ark1の活性化に必要なIN boxとよばれるPic1 C末端領域に存在する3箇所のセリンが標的であることが明らかになった。また、標的残基の非リン酸化型pic1変異株では、CK1変異株と同様に減数第一分裂期においてmerotelic結合が高頻度に観察された。さらに、それらセリンをリン酸化模倣型に変異させたPic1とArk1をin vitroで反応させたところ、リン酸化模倣型Pic1はArk1を活性化することが明らかになった。よって、CK1はINCENPのリン酸化を介してAurora Bの活性化に機能するという、新たな制御機構の存在が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。その結果、減数第一分裂期においてmerotelic結合(スピンドル微小管と動原体との"間違った結合")が高頻度に観察されるCK1変異株では、merotelic結合の修正に必須な因子であるAurora B(Ark1)のセントロメア局在量が野生型に比べて低下することを見出した。また、CK1変異株でAurora B複合体の集積を回復させた結果、merotelic結合の出現頻度が部分的に抑圧されることが判明した。さらにCK1は、既知のArk1の局在制御因子であるSgo2と重複してArk1の局在制御を担うことも明らかにした。加えて、リン酸化酵素であるCK1の標的となる基質の同定を試みた結果、Ark1と複合体を形成する因子群(Chromosome Passenger Complex;CPC複合体)の中で、BirlのN末端領域とPiclのC末端領域がin vrtroでそれぞれCK1により高度にリン酸化されることが明らかとなった。また興味深いことに、CK1変異株では減数分裂期組み換え頻度が低下していることも明らかになった。減数分裂期組み換えが全く起こらないrec12破壊株でもmerotelic結合が高頻度で観察される。よって、CK1変異株で観察される著しいmerotelic結合の修正効率の低下は、Ark1のセントロメア局在量と減数分裂期組換え頻度が同時に低下することに起因することが予想された。同時にrec12破壊株を用い種々の解析を行った結果、組み換え反応の欠損がmerotelic結合の修正効率低下を誘起する分子機構を明らかにした(Sakuno T.et al.Dev.Cell.,2011)。

よって、CK1はINCENPのリン酸化を介してAurora Bの活性化に機能するという、新たな制御機構の存在が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。CK1が減数分裂期特異的にAurora Bのセントロメア局在を制御することと共に、減数分裂期組換えの制御に必要な因子であることを見いだしたことに加えて、制御減数分裂期組換えが動原体とスピンドル微小管との正しい結合を制御する分子機構を明らかにできたため。CK1を介したAurora B複合体のセントロメア局在と減数分裂期組換え、それぞれの分子機構を明らかにする上で必須な課題として、CK1によってリン酸化される基質を明らかにすることがあげられる。Aurora B複合体のセントロメア局在に関しては複合体構成因子の一部がin vitroでCK1によってリン酸化を受けることを見いだしている。また、姉妹染色分体の接着だけでなく減数分裂期組換えにも必要なRec8コヒーシンはin vivoでCK1によってリン酸化をうけることが明らかとなっている。よって、今後はこれら候補因子の解析を通じてCK1を介した制御機構に必須な基質同定に注力して研究を遂行する。
ベトナム戦争による枯葉剤が先天異常ならびに腫瘍発症に及ぼす影響に関する調査

枯葉剤散布地域であるベトナム・ベンチェ省における先天異常の発生頻度は近年低下している。原因としては、枯葉剤の影響が軽減している可能性、母体環境の向上などが考えられる一方、出生前診断の普及によりわずかな奇形でも人工中絶が行われている可能性も考えられた。また、絨毛癌は、分娩数が増加しているのにもかかわらず、低下傾向であった。早期の胞状奇胎が流産として治療されることになどが原因として考えられた。ベトナム社会主義共和国ベンチェ省に赴き、ベンチェ省の拠点病院であるグエンデンチュー病院の産科医とともに、2009年1月1日から同年12月31日までに同院で分娩した両親と子どもを対象とした先天異常児の調査を実施した。調査項目は、生年月日、出生時体重、週齢、病名、両親の年齢・喫煙・内服薬・先天異常・全身疾患の有無とした。生産児に先天異常が認められた場合は別紙の質問項目を記入するようアンケート調査を実施した。生産児数は男性3521人、女性3335人、計6856人であった。このうち先天異常児は男性28人、女性27人、計55人であった。出生児に占める先天異常児の割合は0.80%であった。最も多かったのは内反足9人、口唇口蓋裂(口唇裂含む)7人、多指および内反手6人、水頭症およびダウン症5人などの順であった。先天異常発生率は日本において約2%以下との報告が多いが、本調査においては約0.80%であり非常に低い発生率であった。これには、死産や新生児死亡が明らかではなく、重度の先天異常の場合は死亡扱いとなり、小児科への診断に至っていないためと考えられた。先天異常のなかでも最も多かった口唇・口蓋裂は日本と発生率に大きな差がないものの、水頭症や腹壁破裂は日本と比較し高頻度であると考えられた。さらに先天異常として無脳症が挙げられているが、現地の医療状況から考えると死産に近い状態ではないかと推察された。より詳細な先天異常データを得るためには、項目の確認やデータ収集の方法など、現地スタッフとのより細やかな連携が必要であると考えられた。これらの結果は第35回日本口蓋裂学会総会学術集会にて発表予定である。昨年に引き続き現地の疾患モニタリング予防センターにおいて継続的に調査を行うことで、疾患のデータを把握するとともに、現地へ赴き、同国側研究者と昨年度の調査内容につき検討し、調整を行った。先天異常の発生頻度はヒトではおよそ35%と報告されているが、2009年、2010年の調査結果では、これと比較し明らかに低く、口唇・口蓋裂の発生頻度も0.1%程度であり、以前の現地における我々の調査と比較しても低いものであった。これは産婦人科医による見落としや重度の先天異常の場合に死亡扱いとなることで、診断をする小児科医への受診に至っていない症例があると考えられ、小児科医以外にも現地スタッフとのより細やかな連携が必要と考えられた。そこで、ベンチェ省全体の4割以上の出生数を扱う同省の拠点病院であるグエンデンチュー病院をモデルに、現地での分娩から先天異常診断の方法について実態調査を行った。年間7000件程度の分娩に対し、産婦人科医10名、助産師45名で対応しており、通常の分娩は助産師のみにて対応していた。先天異常の抽出も助産師が行い、異常がないと判断した場合は、産婦人科医の診察を受ける事なく退院していた。助産師が異常と判断した場合のみ、産婦人科医の診察があり、治療が必要な場合に小児科へ依頼するシステムであった。診療システムの変更は困難であるため、今後は医師のみならず助産師とも診断方法の調整を行う必要があると考えられた。絨毛癌に関しては、現地の医師、看護師に、発生予防のプログラムの継続を依頼するとともに、必要に応じ実施のための説明会を行う準備がある事を伝えた。さらに、現地の人民委員会をはじめ政府機関の行政担当者と面談し、同研究に対するさらなる支援を要請した。昨年に引き続き現地の疾患モニタリング予防センターにおいて継続的に調査を行うことで、疾患のデータを把握するとともに、現地へ赴き、同国側研究者と昨年の調査内容につき検討し、調整を行った。2011年にグエンデンチュー病院において出生した児を対象とした調査では、先天異常は7710例中27例(0.35%)であった。水頭症と唇顎口蓋裂が6例と最も多く、無脳症、臍帯ヘルニア、腹壁破裂が2例で続いた。先天異常の発生頻度はヒトではおよそ35%と報告されているが、2011年の調査結果もこれと比較し明らかに低いものであった。昨年、産婦人科医、助産師に対する先天異常の病態、診査法のレクチャーを行ったが、まだ十分でない可能性も考えられた。

助産師への聞き取り調査では、半数以上が口蓋裂を見た事が無く、外表奇形はある程度判断する事は出来ても、口腔内の診査は十分に行われていない可能性も示唆された。さらに、近年超音波による出生前診断が普及し、異常が発見された場合、出産を希望せず中絶を行うケースが増えてきた事も発生率減少の要因と考えられた。今後も引き続き医師、助産師に対して口蓋裂を含めた先天異常の病態、診査法のレクチャーを行い、スクリーニング精度を上げる事で、より信頼性の高いデータの収集を行っていきたいと考えている。また、出生前診断と人工妊娠中絶の関連を検討するために、これらの実態調査の可能性について関連部局と検討を重ね、2013年からの調査につき協力を依頼した。絨毛癌に関しては、現地の医師、看護師に、発生予防のプログラムの継続を依頼するとともに、胞状奇胎患者の管理・登録業務および診断・治療に関する経過の調査を依頼した。また、必要に応じ実施のための説明会を行う準備がある事を伝えた。さらに、現地の人民委員会をはじめ政府機関の行政担当者と面談し、同研究に対するさらなる支援を要請した。現地の小児科医を軸に連携をとってきたが、現地スタッフ間の連携が不十分である可能性があり、先天異常の抽出方法につき小児科医のみならず、産婦人科医さらには助産師も含めた調整の必要性が出てきたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、現地の疾患モニタリング予防センターにおいて継続的に調査を行うことで、疾患のデータを把握するとともに、現地へ赴き、同国側研究者と昨年度の調査内容につき検討し、調整を行う。昨年度の調査にて助産師も診断のスクリーニングに関わっている現状が把握できたため、調査の精度をさらに向上させるため、今年度は医師のみならず助産師とも診断方法の調整を行う。また、現地医師が診断困難な症例を、実際に診察し診断を行う。我々が滞在中に来院できない患者に関しては、その診断法を現地医師と協議する。絨毛癌に関しては、昨年度の発生予防のプログラムの実施状況を確認し、現地の医師、看護師に、発生予防のプログラムの継続を依頼するとともに、必要に応じ実施のための説明会を行う。これらの計画を遂行する為に、現地の人民委員会をはじめ政府機関の行政担当者と面談し、同研究に対するさらなる支援を要請する。
カザフ核実験場周辺住民の放射性降下物被曝の実態解明－線量評価及び健康影響解析－

放射線による発がんなどのリスクは、ほぼ広島・長崎の被ばく者の調査により評価されてきた。その結果は国際放射線防護委員会(ICRP)での議論を経て、国内法である放射線障害防止法に取り入れられている。しかし原爆は一瞬の被ばくであるが、セミパラチンスクでは長時間かつ微粒子による被ばくである。従ってそのリスクは異なっている可能性がある。本研究は共同研究による被曝線量とリスク評価である。測定や調査は、1.土壌中のセシウムやプルトニウム、2.煉瓦、歯、染色体異常による被曝線量、3.聞き取り調査による心理的影響、4.データベースの整備とリスク、5.微粒子効果の動物実験などであり、被爆の実態を解明した。1.空路にて日本からソウル、アルマトイを経由して、セメイ市に入った。2.土壌、煉瓦、歯の収集を進めた。収集には現地のカウンターパート(カザフ放射線医学環境研究所、セメイ国立医科大学等)を中心とし、その他専門の病院や研究所)とともに行っている。3.採血と染色体異常などの検査は現地の住民や同様にカウンターパートの協力の下に進めている。4.内部被曝とベータ線被曝の解明のため、ラットを使った動物実験を行っている。原子炉(クルチャトフ)で2酸化マンガンの粉末を照射し、その後セメイ国立医科大学に持ち帰りラットへの影響を観察した。活動度、各臓器の病理学的な検査、血液の検査をった。各臓器に取り込まれた放射能も直接測定し、ベータ線を含めた正確な内部被曝線量を求めた。5.甲状腺や乳房などの検診結果の解析を進めデータベースへ入力している。6.外部被ばくや内部被曝も同様に計算しデータベースへ入力し被曝線量を求める準備をしている。まず、村平均の被曝線量を求め、次に個人の行動調査に基づき個人被曝線量を求める。7.心理的影響の現地調査と解析を進めている。8.カザフスタン、アメリカ、ロシア、ドイツ、フランスの研究者とも国際共同研究として進めている。9.広島・長崎の原爆被爆者について直爆者、早期入市者、黒い雨の地域にいた人、遠距離被爆者について広島大学のデータベースなどを使って解析し、内部被曝とベータ線被曝の影響の解析を行っている。10.マーシャル諸島での核実験の被曝線量評価とその影響などの調査も行っている。11.福島原子力発電所関連についても土壌、煉瓦をサンプリングし測定している。12.島根大学で国際シンポジウム(1月24日)および広島大学でのワークショップ(1月26日)を開催した。13.これまでのガンマ線に加え内部被曝とベータ線の被曝をキーワードに、これらの統一的理解、解明のため検討を進めている。1.現地への経路は、空路にて日本からソウル、アルマトイを経由して、セメイ市に入った。2.試料収集は、煉瓦、歯について行った。収集には現地のカウンターパート(カザフ放射線医学環境研究所、セメイ国立医科大学等)を中心とし進めた。3.本年度はラットを使った内部被曝の動物実験を中心に行った。内部被曝実験は2回行った。原子炉(クルチャトフ)で2酸化マンガンの粉末を照射し、その後セメイ国立医科大学に持ち帰りラットへの活動度への影響を観察した。各臓器の病理学的な検査、血液の検査も行った。4.さらに内部被曝実験に加えて、外部被曝であるCo-60を照射し運動量と線量との効果関係を調べた。この実験も2回行った。運動量の研究についてはその解析を進めている。5.甲状腺などの検診結果をデータベースへ入力した。6.外部被ばくや内部被曝も同様に計算しデータベースへ入力する準備をしている。8.カザフスタン、アメリカ、ロシア、ドイツ、フランスの研究者とも国際共同研究として継続して進めた。11.福島原子力発電所関連についても土壌、煉瓦を測定している。12.広島大学で国際シンポジウム(1月10-11日)および島根大学でのワークショップ(1月13日)を開催した。13.内部被曝とベータ線の被曝(特に粉じんによる)をキーワードに、ガンマ線による外部被曝線量を含め、統一的理解、解明のため検討を進めている。今回重点としたラットの内部被曝が予定通り実行できた。クルチャトフの原子炉でのMnの放射化のための中性子の照射とセメイ医科大学でのラットの運動量の経過観察、内部被曝線量と外部被曝線量の測定と計算、病理組織の変化等について順調に研究が進んだ。今年度は2回の内部被曝実験と2回の外部被曝実験を行った。そのほかの、広島・長崎、セミパラチンスク、マーシャル諸島、福島についても被曝とその影響研究は順調に進められている。1.現地へは、空路にて日本からソウル等を経由してアスタナ市やセメイ市に入った。2.煉瓦、歯の試料収集は継続している。収集にはカザフ放射線医学環境研究所、セメイ国立医科大学等を中心とし進めた。3.ラットを使った内部被曝の動物実験を中心に行った。内部被曝実験はすでに3回終了し、本年度は比較対象のためCo-60を使った外部被曝実験を2回行った。

Co-60を2Gy照射し、ラットへの活動度への影響を観察した。カイナール症候群と言われた倦怠感などの症状とも比較検討した。4.各臓器の病理学的な検査、血液の検査も行った。遺伝子DNAに対する変異の研究も行っている。動物の歯による被曝線量も測定した。5.これらは国際誌に2編発表済みで、2編が投稿中である。6.甲状腺などの検診結果をデータベースへ入力し、これも国際誌に発表した。7.心理的影響の現地調査と解析を進めている。以上は、カザフスタンだけではなく、アメリカ、ロシア、ドイツ、フランス等の研究者とも国際共同研究として推進した。8.あらたにアスタナ市で大気中の放射能や汚染物質をフィルターで収集測定し、大気中の塵とその拡散の状況を調べる実験を行った。放射能測定も平行して行っている。9.広島・長崎の原爆被爆者について直爆者、早期入市者、黒い雨の地域にいた人、遠距離被爆者について広島大学のデータベースなどを使って解析し、内部被曝とベータ線被曝の影響を解析した。10.マーシャル諸島での核実験の被曝線量評価とその影響などの調査も行った。11.福島原子力発電所関連についても土壌、煉瓦を収集し測定した。国際誌に発表した。12.島根大学での国際シンポジウム(12月8日)および広島市で国際ワークショップ(12月9-10日)を開催した。13.内部被曝とベータ線の被曝(特に粉じんによる)及びガンマ線による外部被曝を含め、統一的理解、解明のため検討を進めている。今回重点としたラットの内部被曝と外部被曝の実験、解析を予定通り実行し終了した。クルチャトフの原子炉で2酸化マンガンの粉末に中性子を照射しMn-56を生成しラットの内部被曝実験を行った。その後セメイ医科大学でのラットの運動量を測定しその経過観察を行った。その結果の解析、内部被曝線量と外部被曝線量の測定と計算、病理組織の変化、遺伝子DNAに対する変異の研究が順調に進んだ。さらに今年度はCo-60を使った外部被曝実験を2回行い無事終了した。投稿中2編を含め合計4編の論文ができている。そのほかの、広島・長崎、セミパラチンスク、マーシャル諸島、福島についても被曝とその影響研究は順調に進められている。さらに国際ワークショップを広島と島根で開催し、内部被曝など新しい知見が得られたことを発表し、世界的に認知され、検討が進んだ。1.空路にて日本からアルマトイ市経由でセメイ市に入った。2.土壞、煉瓦、歯を収集しその測定結果を論文にまとめた。特に土壌中のCs-137などの(約1,000ヵ所)データは今後の線量評価に不可欠である。収集は現地のカザフ放射線医学環境研究所、セメイ国立医科大学等と行った。3.甲状腺の検診結果(約1,000人)についても論文として発表した。4.セミパラチンスク近郊住民の被曝線量については、リヨンにあるWHOの研究所やアメリカ、ドイツ等の研究所との共同研究を行ってきたが、一時中断しているので今後実行する考えである。5.動物実験も行った。クルチャトフの原子炉の熱中性子で二酸化マンガンの粉末(3μm)を照射し、Mn-56を生成した。
職業的資質を育成するドイツ職業学校における国語科（ドイツ語科）の調査的研究

今年度の研究計画として、主に「基礎的資料の収集」、「収集した資料の分析・考察」、および「授業見学と研究交流」の3点を掲げていた。これに従って、以下の研究活動を実施し、本研究の基盤を形成することに努めた。1本研究の基礎的作業として、ドイツ・ノルトラインヴェストファーレン州の職業学校向け「ドイツ語/コミュニケーション科」のカリキュラムを翻訳し、職業コース別のカリキュラムの広がりと、個別性について考察した。その成果は、大阪国語教育研究会の月例会にて報告し、授業見学の準備とした。2平成30年9月に、ドイツ・ハンブルグ市にて開催されたドイツ語教授学シンポジウム(Symposion Deutschdidaktik)に参加し、本研究に関わる情報収集に努めた。特に、ドイツにおける文学教育に関する最新の研究にふれることができたのは、本研究にとっても大いに刺激を得ることができた。3平成31年3月に、ドイツ・パダーボルン市の職業学校Ludwig-Erhard-Berufskolegにて、二日間にわたり、営業職(Kaufleute)コースを中心に「ドイツ語/コミュニケーション科」の12の授業を観察した。その際、同行の先生方より多くの資料提供を得た。この成果をまとめる形で、目下、論文を執筆中である。4同月、ドイツにおける職業学校ドイツ語科の研究の第一人者であるブッパータール大学教授Christian Efing氏と面会し、今後の研究活動への協力と、先進的な授業開発を行っている学校の紹介を依頼し、許諾された。当初計画の中で、先行研究の少なさから研究活動の遅れが生じているのは、「わが国の国語教育関係資料の蒐集」である。専門科高等学校の国語科の研究および実践に関する資料を継続的に進めていきたい。また、調査時期の関係で、授業見学の成果を、今のところ論文にまとめ切れていないので、この作業にも努力をしていきたい。令和元年度の研究計画にしたがって、大きく次の3点に力をそそぎたい。、1前年度の基礎作業を通じて蒐集した文献、資料、授業観察データに基づいて、研究対象の分析2教育・福祉系の職業学校の授業見学3所属学会での中間的報告の実施今年度の研究計画として、主に「基礎的資料の収集」、「収集した資料の分析・考察」、および「授業見学と研究交流」の3点を掲げていた。、1前年度の基礎作業を通じて蒐集した文献、資料、授業観察データに基づいて、研究対象の分析2教育・福祉系の職業学校の授業見学3所属学会での中間的報告の実施
分子提示法によるsnRNA選択キャッチャーの構築と細胞内動態の定量への応用

多種生物のゲノム配列解析が完了し、分子レベルでの生命の理解や細胞内外の生体物質の相互作用の解明が進みつつある。そういう時代の流れの中で、生命現象を真に理解するためには、その生命を担っている細胞を一つの単位として、一細胞に含まれるタンパク質、DNA、RNA、糖などの生命分子の時空間での網羅的かつ定量的解析が必要である。その中でも最近ゲノム解析からsnRNA(小分子RNA)が重要視されてきている。本研究申請課題では、この小分子RNAの機能解析および細胞内分子間相互作用を解明するため、RNA分解酵素の分子認識機能を応用し、RNA結合能力のみを残して触媒部位を変異させたRNaseを酵母表層工学を用いて酵母表層にディスプレイし、その酵母をsnRNA分子キャッチャーとして用い、細胞内小分子RNAを網羅的に回収・定量解析を目指す。本申請研究のKeyツールとなる分子キャッチャーとは、回収したい分子に特異的な分子(酵素、抗体、ペプチドなど)を酵母表層にディスプレイさせた酵母ツールである。本年度は酵母表層にRNaseの分子認識ドメインのみを残したRNaseディスプレイ系を構築した。RNaseは、一次構造およびX線結晶構造が明らかになっており、かつ、生化学的性質も詳しく調べられているヒト膵臓由来RNase1を用いた。RNase 1全遺伝子はヒト膵臓cDNAからPCRにより取得した後、酵母表層ディスプレイ用プラスミドに挿入し、その際、RNase1の触媒残基(His12、His119)は他の残基に置換して、RNAを切断しないが結合能は維持した変異型RNase1を作製した。また、変異型RNase1提示酵母を用いたモデルRNA(合成RNA)との結合実験により、結合したRNAを定量的に測定することができた。
海洋動物由来の新規8ーオキソプリン類の合成

海綿の構成成分6ーiminoー1,9ーdimethylー8ーoxopurine (I)やイソギンチャクの構成成分caissarone(塩酸塩をIIで示す)は,天然プリン類としては珍しい8ーoxo構造を有しているので,これらの生物活性には興味が持たれる.これらの8ーオキソプリン類の化学合成は未検討であったので,本研究ではI及びIIを次のようにして合成し,それらの化学的性質を調べることができた.1.9ーMethyladenine(III)を臭素化し,得られた8ーBr体(IV)をMeIでメチル化すると8ーlromoー1,9ーdimethyladesine(V)が得られた.Vを沸騰酢酸中NaOAcで処理すると,標的化合物IがIIIからの通算収率25%で得られた.別法では,IVを1NNaOH水溶液中で煮沸し,生成した9ーmethylー8ーoxoadenineをMelでメチル化したところ,IIIからの通算収率63%でIを合成することができた.2.このようにして得たIは,1NNaOH水溶液中で煮沸すると,Dimroth転位を起してN___ー^6,9ーdimethylー8ーoxoadenine(VI)を与えた.Vも同様のDimroth転位を起すことが判明した.これらの転位の容易さを,1,9ーdimethyladenine(VII)を基準化合物に用いて反応速度論的に比較したところ,pH7.00ー11.42,40°C,イオン強度1.0ではV>VII>Iの順で転位が遅くなることが判明した.3.VIをMel/AcNMe_2でメチル化したところ,3ーMe体・HI塩(VIII)(収率50%)及び1ーMe体・HI塩(13%)が得られた.次に,VIIIの水溶液をAmberliteIRAー402(Cl^-)カラムに通すことによって,他の標的化合物IIを98%の収率で得た.ここに得られたIIは,天然caissarone塩酸塩と同定することができた.この結果,IIIから6工程,通算収率28%によるIIの合成経路を確立することができた.海綿の構成成分6ーiminoー1,9ーdimethylー8ーoxopurine (I)やイソギンチャクの構成成分caissarone(塩酸塩をIIで示す)は,天然プリン類としては珍しい8ーoxo構造を有しているので,これらの生物活性には興味が持たれる.これらの8ーオキソプリン類の化学合成は未検討であったので,本研究ではI及びIIを次のようにして合成し,それらの化学的性質を調べることができた.1.9ーMethyladenine(III)を臭素化し,得られた8ーBr体(IV)をMeIでメチル化すると8ーlromoー1,9ーdimethyladesine(V)が得られた.Vを沸騰酢酸中NaOAcで処理すると,標的化合物IがIIIからの通算収率25%で得られた.別法では,IVを1NNaOH水溶液中で煮沸し,生成した9ーmethylー8ーoxoadenineをMelでメチル化したところ,IIIからの通算収率63%でIを合成することができた.2.このようにして得たIは,1NNaOH水溶液中で煮沸すると,Dimroth転位を起してN___ー^6,9ーdimethylー8ーoxoadenine(VI)を与えた.Vも同様のDimroth転位を起すことが判明した.これらの転位の容易さを,1,9ーdimethyladenine(VII)を基準化合物に用いて反応速度論的に比較したところ,pH7.00ー11.42,40°C,イオン強度1.0ではV>VII>Iの順で転位が遅くなることが判明した.3.VIをMel/AcNMe_2でメチル化したところ,3ーMe体・HI塩(VIII)(収率50%)及び1ーMe体・HI塩(13%)が得られた.次に,VIIIの水溶液をAmberliteIRAー402(Cl^-)カラムに通すことによって,他の標的化合物IIを98%の収率で得た.ここに得られたIIは,天然caissarone塩酸塩と同定することができた.この結果,IIIから6工程,通算収率28%によるIIの合成経路を確立することができた.イギリス海峡に生息する海綿の1種Hymeniacidon sanguinea Grantの構成成分6-imino-1.9-dimethyl-8-oxopurine(I)は、1985年にCi-minoらによってN__ー^6-acetyl誘導体の形で上記の海綿から単離されたが、Iそのものは未知のままである。Iは、天然プリン類としては珍しい8-oxo構造を有しているので、その生物活性には興味が持たれる。本年度の研究においては、Iを次のようにして合成し、その化学的性質を調べることができた。1.9-Methyladenine(II)を臭素化し、得られた8-bromo-9-methyladenine(III)をMeIでメチル化、生成した1-methyl化体のHI塩を遊離塩基に導いて8-bromo-1,9-dimethyladenine(IV)を得た。IVを沸騰酢酸中NaOAcで処理すると、標的化合物IがIIからの通算収率25%で得られた。