hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラジカル合成戦略による官能基密集型中分子テルペノイドの全合成と高度反応集積化

【背景】分子量400-4000の中分子天然物が低分子・バイオ医薬の優位点を併せ持つポストバイオ医薬として注目を集めているが、それらを医薬品開発のリード化合物として活用する事は、その化学構造の複雑さから極めて困難な課題である。この社会的要請の高い問題の解決に向け、本研究では、反応集積型高化学選択的ラジカル反応を鍵とした官能基密集型中分子テルペノイドの実用的全合成戦略の確立を計画した。具体的には、顕著な生物活性を有する官能基密集型中分子テルペンであるタキサン類およびクラジエリン類を、高化学選択的な分子間ラジカルフラグメントカップリングおよびラジカル環形成反応を用いて超効率的に全合成する。全合成を基盤とした本研究は、天然物化学・創薬化学・有機合成化学の複合領域において、大きな学術的波及効果を生むと共に、本新学術領域研究の特長である、高次機能中分子の創製を切り開く重要な基礎研究となる。【方法・結果】本年度は分子間ラジカル付加反応を鍵とする、抗がん剤タキソールの収束的全合成研究を遂行した。アシルテルリドおよびエノンを用いたラジカル付加反応により立体選択的にA, C環を連結した。続いて、パラジウム触媒を用いた分子内アルケニル化反応によるB環構築を行うことで、タキサン骨格を有する化合物を市販化合物から23工程で効率的に合成した。本生成物はタキソールを合成するための足掛かりとなる官能基を十分に備えている。本成果は米国化学会誌Organic Lettersに発表した。令和元年度の研究計画;前年度までに確立した化学選択的ラジカルカップリングを駆使し、1-ヒドロキシタキシニンおよびレジニフェラトキシンの全合成を達成する。具体的には求核的なα-アルコキシ炭素ラジカル種と求電子的なα-シアノエノンのラジカルカップリングにより中分子リード化合物の創製を視野に入れた、実用性の高い1-ヒドロキシタキシニンの合成経路を確立する。高度に極性官能基化されたタキサン骨格(6/8/6員環)は、極めて合成困難である。さらに、多くの極性官能基が存在する場合、利用可能な反応は大きく限定され、合成経路の設計は著しく困難になる。我々は、Et3B/O2システムによる官能基選択的ラジカル発生と求核的なα-アルコキシ炭素ラジカル種と求電子的なα-シアノエノンのラジカルカップリングによるフラグメント連結、およびMcMurryカップリング反応を用いてタキサン骨格を合成する、全く新しい収束的合成経路を設計した。平成31年度は、市販原料からのA環フラグメントおよびC環フラグメントの短工程合成経路を確立したのち、ラジカル反応を基盤とする鍵反応を用いて1-ヒドロキシタキシニン全合成を26工程程度で達成する。さらにその知見を最大限活用し、より高酸化度な抗がん剤タキソールの全合成に着手する。また、分子内7-endoラジカル環化反応を鍵とするレジニフェラトキシンの超短工程合成も実現する。

平成31年度は、市販原料からのA環フラグメントおよびC環フラグメントの短工程合成経路を確立したのち、ラジカル反応を基盤とする鍵反応を用いて1-ヒドロキシタキシニン全合成を26工程程度で達成する。さらにその知見を最大限活用し、より高酸化度な抗がん剤タキソールの全合成に着手する。また、分子内7-endoラジカル環化反応を鍵とするレジニフェラトキシンの超短工程合成も実現する。
対馬の近代建築に関する調査研究

本研究では、長崎県と朝鮮半島の中間に位置する島である対馬(長崎県対馬市)全域の悉皆調査を行い、これと特徴的な地域や遺構種別に関する4つの個別研究-近代遺構の地域的特色、厳原市街地の煉瓦造遺構の成立基盤、浅藻地区旧漁業倉庫の実測調査、鰐浦のコヤの形成原理と近代の変容-を併せることで、これまで明らかで無かった対馬の近代遺構の地域的特質の一端を明らかにした。対馬(長崎県対馬市)は九州の北方、玄界灘にあり、長崎県と朝鮮半島の中間に位置する島である。古くから交通・貿易・国防の要地として重視され、近代に入ってそうした性格は一層強まった。しかしながら、近代の遺構に関しては軍事遺構を除き、基礎的な所在確認もほぼ実施されていない状況にあった。本研究では、対馬全域の近代遺構の悉皆調査を行い、これと特徴的な地域や遺構種別に関する複数の個別研究を併せることで、対馬の近代遺構の地域的特質の一端を明らかにした。近代遺構の悉皆調査に関しては、全島を踏査し、聞き取りや関連資料の収集によって、これまでリストアップされていなかった工場・倉庫・商店などを含む近代遺構のデータを収集した。個別研究としては、第一に、これを近代遺構の地域的分布と社会変化との関連を、当時の新聞記事を中心とする文献調査を通して分析した。第二に、近代の新材料として、対馬では生産されなかった煉瓦が使われていることに着目し、厳原における煉瓦造遺構(住居の一部・倉庫・壁など)の分布を精査し、明治10年代に建設された監獄・工場や火災との関連を考察して、城下町の対馬らしい変容を示した。第三に、厳原以外の煉瓦造遺構の代表的なものとして、浅藻に残る大正期の旧漁業用倉庫について実測調査を実施し、その特徴を明らかにした。第四に、漁村集落の近代のありようの代表例として、対馬北部の鰐浦のコヤの現状を実測し、地図・地積図と照らし合わせて分布の変容を考察し、それとコヤの意匠・構法的特徴との連関を考察した。しかしながら、近世以前の形態を色濃く残す民家・集落等に関する研究が深められている反面、幕末以降の近代建築に関しては基礎的な所在確認も実施されていない。本研究は2年間で対馬全域の近代建築の悉皆調査を行い、文献調査と併せて、その全容を把握する。これによって、社会的背景に根ざした対馬の近代建築の地域的特質を明らかにし、地域資源としての認識に資することを目的とする。平成23年度は、対馬の近代建築の全容を把握し、社会的背景に根ざした地域的特質を解明するために、(1)全島の悉皆調査、(2)厳原市内の煉瓦造構造物の悉皆調査、(3)鰐浦のコヤの近代的変容の実地調査の3つを現地で進め、これに並行して、東京・広島などにおいて、関連資料の収集と分析を行った。(1)に関しては、対馬市上対馬地区(旧上対馬町)の19集落と上県地区(旧上県町)の22集落、計41集落を対象に現地で7日間の日程で悉皆調査を実施し、34棟の近代構造物の存在を背景と共に示した。(2)に関しては、現地調査によって全部で77件の煉瓦造構築物が厳原市街地に存在することを明らかにし、資料と聞き取りから、これらと明治10年代に建設された煉瓦造構築物である厳原監獄ならびに江口合名工場との関係を示すと共に、地域的特徴を分析した。(3)に関しては、対馬北部の鰐浦のコヤの現状を実測し、近代の地図・地積図と照らし合わせてその分布の変容を示し、それとコヤの意匠・構法的特徴との連関を分析した。本研究の主目的は、交付申請書に書いた通り、「社会的背景に根ざした対馬の近代建築の地域的特質を明らかにし、地域資源としての認識に資すること」にある。当初は専ら対馬全域の近代建築の悉皆調査によって、それを達成する予定であった。しかし、最初の現地調査で得た知見を検討した結果、より細かに近代の変容が現れている存在として〈厳原市内の煉瓦造構造物〉と〈鰐浦のコヤ〉の2つを対象に加えることにした。現地調査と文献資料の双方によって、今まで描かれなかったその近代史を描き出すことになる。これと、当初から目的としていた広範な悉皆調査をあわせることで、対馬の近代建築の地域的特色を明らかにする計画はより進展したものと捉えている。平成24年度は、まず対馬全島の悉皆調査の未踏査地域である峰地区・豊玉地区・美津島地区・厳原地区を探査する。次いで、近代の変容が現れているトピックとして、龍造寺分家をはじめとする〈伝統的民家の近代的展開〉を捉え、対象選定と実測調査ならびに資料調査を実施する。

最後に悉皆調査の中で特に重要と考えられ、所有者の同意が得られた34物件程度について、現地で7日間の日程で実測調査と資料調査を実施する。その際に資料の補足調査を行う。当初の申請通り、現地調査や資料調査の旅費、レンタカー代を中心に使用する計画である。
パルスレーザー分解とプラズマ発光検出を用いる新しい熱分解GCシステムの開発

本研究では、パルス熱分解装置を直結したガスクロマトグラフ(GC)と、プラズマ発光検出器をオンラインで組み合わせた、新しい熱分解ガスクロマトグラフ(Py-GC)測定システムを開発して、IRやNMRまでの分光学的な手法による解析が困難視されていた各種の機能性高分子や生体高分子などの微細構造を解析することを試みた。まず、これまで当研究室において高性能化が進められてきたPy-GC装置とヘリウムマイクロ波プラズマ発光検出装置を直結したシステムを構成して、その基本特性を含ハロゲンのエンジニアリングプラスチックを試料に用いて検討した。この結果、本解析システムが、従来のGC/MSを主たる手法とした、パイログラム上のピーク同定では、一義的に構造決定が出来なかった、多くのピークの同定に画期的な威力を発揮することが実験的に確かめられた。そこで、本手法を各種の高分子材料の構造解析へ適用することを試みた結果、主鎖中にヘテロ原子を含む様々な機能性高分子材料や動物および植物プランクトン中の微量脂質成分などの分子構造を迅速、簡便かつ高感度に解析することが出来た。さらに、同手法を利用した応用実験として、昇温機能を合わせ持った熱分解装置と、GC用プラズマ発光検出器をオンラインで直結させた解析システムを利用して、生分解性プラスチックとして、近年、注目されているキチン/キトサン試料や、木材の主要な構成成分の一つであり、パルプ化効率やパルプ特性に大きく影響するリグニンなどの天然高分子材料の新しい実用的な構造特性評価法を開発することもできた。本年度は当試験研究の備品として、新たに導入したヘリウムマイクロ波プラズマ発光検出装置とパルス熱分解装置を直結したガスクロマトグラフを結合した、測定システムを構成して、その基本特性を含ハロゲンのエンジニヤリング高分子である、ポリトリフルオロクロルエチレンを用いて、検討した。この結果、新しく構築した測定システムは、従来のGC/MSを主たる手法とした、パイログラム上のピーク同定では、一義的に構造決定が出来なかった、多くのピークの同定に画期的な威力を発揮することが、実験的に確かめられた。また、各種のシリコーンポリマーについても、Si発光による選択検出を行うことにより、パイリグラム上の含Si生成物を容易に識別することが可能になったばかりではなく、C,HおよびSiの元素別の検出信号を総合して各ピークの組成式の決定が可能になった。これと並行して、高分解能の熱分解GCによる高分子の微細構造解析の基礎検討を次の諸項目について行い、その成果を論文にして発表した。1)ポリスチレンの立体規則性の解析2)触媒存在下で硬化させたエポキシ樹脂の組成決定3)有機アルカリ存在下での高分子の反応熱分解の基礎条件の検討4)多性分アクリル樹脂の精密な組成分析および5)硫酸コバルト触媒存在下での熱分解を利用するポリアセタールの連鎖構造の解析本年度は、当基盤研究の備品として新たに購入した原子発光検出器用マイクロ波発生装置と、パルス熱分解装置を直結したガスクロマトグラフ(GC)とのオンライン直結システムを利用して、主鎖中にヘテロ原子を含む下記の機能性分子材料の微細構造解析およびプランクトンなどの環境試料中の脂質分析を行った。1.カチオン性ポリアクリルアミド系樹脂の組成決定2.ポリカーボネート樹脂の数平均分子量の絶対分析法の開発3.ポリメチルメタクリレートの分岐アルキル末端の定量4.動物プランクトン1個体中に含まれる脂質成分の解析以上の研究成果は、いずれも研究論文として国際学術誌に掲載されている。さらに、同手法を利用した応用実験として、昇温機能を合わせ持った熱分解装置を直結したGCと、原子発光検出器とのオンライン直結システムの開発も試みた。その結果、パルス熱分解法によって得られた知見と、昇温熱分解法を利用して得られた情報を総合的に解釈することにより、生分解性を備えた高分子材料として、近年、注目されているキチンおよびキトサンブレンド試料の相溶性を評価する新しい解析法を開発することができた。また、同手法を利用して、臭素-アンチモン系難燃化ポリエステルの熱分解機構を詳細に解析したところ、従来提案されていた難燃効果の発現機構に加えて、新たな発現機構を発見することもできた。

本年度は、当基盤研究の備品として新たに購入した、パルス熱分解装置を直結した原子発光検出器用ガスクロマトグラフ(GC)と、マイクロ波発生装置とのオンライン直結システムを利用して、主鎖中にヘテロ原子を含む下記の機能性高分子材料の微細構造解析およびキチン/キトサン試料などの生分解性を備えた高分子材料の構造解析を行った。・ポリスチレン型イオン交換樹脂の架橋点の定量・アニオン重合により合成されたポリメチルメタクリレートの末端基定量・臭素-アンチモン系難燃焼化ポリカーボネートの難燃効果の発現機構の解析・ポリメチルメタクリレートの立体規則性の実用分析法の開発・キチン/キトサンブレンド材料の相溶性の評価法の開発以上の研究成果は、いずれも研究論文として国際学術誌に掲載されている。さらに、同手法を利用した応用実験として、昇温機能を合わせ持った熱分解装置を直結したGCと、原子発光検出器をオンラインで直結させた解析システムの高分子材料の構造解析に対する適用を試みた。その結果、生分解生を有するため、近年、注目されているコハク酸およびブタンジオールを主成分とするポリエステルの生分解機構を、化学構造変化と対応させて解明することに初めて成功した。さらに、木材のパルプ化効率やパルプ特性を苗木段階で評価するための、木材の新しい実用的な材特性評価法を開発し、新しい品種の苗木育種の開発研究の分野にも大きく貢献した。
マイクロ波伝導度スペクトル測定法の開発とそれを用いた高温超伝導体のゆらぎの研究

昨年度までに、マイクロ波を用いた超伝導ゆらぎ伝導度スペクトルの測定によって、ホールドープ系高温超伝導体La_<2-x>Sr_xCuO_4における超伝導ゆらぎの次元性がキャリア濃度の増加にともなって2次元3次元2次元と異常な変化を示すことを初めて明らかにしたが、この結果を雑誌Physical ReviewBに投稿した。今年度は、ホールドープ系高温超伝導体とはキャリアの符号が異なる、電子ドープ系高温超伝導体La_<2-x>Ce_xCuO_4の超伝導ゆらぎについて、同様に、ゆらぎ伝導度スペクトルの動的スケーリング解析から測定を行い、そのキャリア濃度依存性を調べた。その結果、電子ドープ系高温超伝導体では超伝導ゆらぎの性質がキャリア濃度によらず全てのドープ領域で3次元XY的であることを初めて明らかにした。さらに、ゆらぎ伝導度の磁場依存性からも3次元XY的な超伝導ゆらぎが確認できた。このようなキャリア濃度に依存しない振る舞いは、キャリア濃度によってゆらぎの性質が大きく変化するホールドープ系高温超伝導体とは対照的であり、高温超伝導発現のメカニズムがホールドープ系と電子ドープ系で同一ではなく、クーパー対(超伝導電子対)の形成が、ホールドープ系では最適ドープ近傍を除いて2次元的である一方で、電子ドープ系では全ての組成領域で3次元的であることが分かった。同時にこのことは、ホールドープ系の最適ドープ近傍でCuO_2面間の超伝導の相関を増強する特殊なメカニズムが働いていることを示唆しており、近年議論されている「隠れた量子臨界点」にともなう量子臨界ゆらぎの影響の可能性が考えられる。以上のように、ホールドープ系、電子ドープ系双方の高温超伝導体の幅広い組成領域における超伝導ゆらぎの測定から、高温超伝導体の電子相図の包括的な理解に貢献する新たな知見を得ることができた。1、装置作製現有の超伝導マグネットを用いて、磁場下でのマイクロ波伝導度スペクトル測定を試みたが、超伝導ゆらぎの研究のためにはより小さい磁場中での測定が必要であることが明らかになり、専用の超伝導マグネットを自作した。金薄膜・ニクロム薄膜を用いて測定性能の検証を行った結果、温度10K300K、周波数0.1GHz10GHzの範囲で、磁場中を含めて交流伝導度の周波数依存性が得られることを確認した。2、NbN薄膜の超伝導ゆらぎ同測定装置を用いて、従来超伝導体であるNbN薄膜に対してマイクロ波伝導度スペクトル測定を行い、超伝導ゆらぎ伝導度の動的スケーリング解析を行った結果、理論と非常によく一致する結果を得られた。また、厚さの異なる試料を測定することで、膜厚によってゆらぎの次元性が変化していく様子を捉えた。(雑誌Physical Review Bに投稿中)3、銅酸化物高温超伝導体La_<2-x>Sr_xCuO_4薄膜の超伝導ゆらぎ同測定装置を用いて、キャリア濃度の異なるLa_<2-x>Sr_xCuO_4薄膜に対してマイクロ波伝導度スペクトル測定を行い、超伝導ゆらぎ伝導度の動的スケーリング解析を行った結果、不足ドープLa_<2-x>Sr_xCuO_4薄膜において、2次元超伝導のKosterlitz-Thouless転移を観測した。またx=0.15付近で、超伝導ゆらぎが突然3次元XYモデル的なものへと変化することを明らかにした。(雑誌Physical Review Bにて論文発表)1、ホールドープ系銅酸化物高温超伝導体薄膜の超伝導ゆらぎキャリア濃度の異なるLa_<2-x>Sr_xCuO_4薄膜に対してマイクロ波伝導度スペクトル測定を行い、超伝導ゆらぎ伝導度の動的スケーリング解析を行った。昨年度の不足ドープから最適ドープまでの測定に引き続き、今年度は最適ドープから過剰ドープ組成の測定を行い、全ての組成の超伝導臨界ゆらぎの測定を完了した。その結果、超伝導ゆらぎが2次元的XY的(x=0.06-0.14)、3次元的XY的(x=0.15-17)、2次元的であるが既知の普遍クラスとは一致しない振る舞い(x=0.18-0.20)とキャリア濃度によって大きく変化する様子を捉え、電子相図中で3つの領域があることを明らかにした。加えて、磁場中での測定から上記の結果がLa_<2-x>Sr_xCuO_4に本質的であることを示した。2、電子ドープ系銅酸化物高温超伝導体薄膜の超伝導ゆらぎ高温超伝導体の発現機構を議論する際には、ホールドープ系と電子ドープ系の比較は重要であり、ホールドープ系高温超伝導体と同様の測定を、電子ドープ系のLa_<2-x>Ce_xCuO_4薄膜についても開始した。従来は電極作成を高温焼成により行っていたが、La_<2-x>Ce_xCuO_4は加熱できないため、常温プロセスで接触抵抗を十分低減できる電極作成法を確立した。超伝導ゆらぎの測定に先立ち、常伝導状態の測定を行った結果、常伝導状態の伝導度スペクトルには構造はなく、ホールドープ系と同様の解析手法が有効であることを示した。

そして、x=0.075の試料について超伝導ゆらぎ伝導度の動的スケーリング解析を行った結果、3次元XY的な臨界ゆらぎを、電子ドープ系では初めて観測した。磁場中においても、0.5T以下の低磁場では3次元XYと定量的に一致したが、より高磁場では3次元XY的な振る舞いからの逸脱が観測されており、この領域の詳細な測定を予定している。昨年度までに、マイクロ波を用いた超伝導ゆらぎ伝導度スペクトルの測定によって、ホールドープ系高温超伝導体La_<2-x>Sr_xCuO_4における超伝導ゆらぎの次元性がキャリア濃度の増加にともなって2次元3次元2次元と異常な変化を示すことを初めて明らかにしたが、この結果を雑誌Physical ReviewBに投稿した。今年度は、ホールドープ系高温超伝導体とはキャリアの符号が異なる、電子ドープ系高温超伝導体La_<2-x>Ce_xCuO_4の超伝導ゆらぎについて、同様に、ゆらぎ伝導度スペクトルの動的スケーリング解析から測定を行い、そのキャリア濃度依存性を調べた。その結果、電子ドープ系高温超伝導体では超伝導ゆらぎの性質がキャリア濃度によらず全てのドープ領域で3次元XY的であることを初めて明らかにした。さらに、ゆらぎ伝導度の磁場依存性からも3次元XY的な超伝導ゆらぎが確認できた。このようなキャリア濃度に依存しない振る舞いは、キャリア濃度によってゆらぎの性質が大きく変化するホールドープ系高温超伝導体とは対照的であり、高温超伝導発現のメカニズムがホールドープ系と電子ドープ系で同一ではなく、クーパー対(超伝導電子対)の形成が、ホールドープ系では最適ドープ近傍を除いて2次元的である一方で、電子ドープ系では全ての組成領域で3次元的であることが分かった。同時にこのことは、ホールドープ系の最適ドープ近傍でCuO_2面間の超伝導の相関を増強する特殊なメカニズムが働いていることを示唆しており、近年議論されている「隠れた量子臨界点」にともなう量子臨界ゆらぎの影響の可能性が考えられる。以上のように、ホールドープ系、電子ドープ系双方の高温超伝導体の幅広い組成領域における超伝導ゆらぎの測定から、高温超伝導体の電子相図の包括的な理解に貢献する新たな知見を得ることができた。
たたら製鉄による鉄造りとその鍛造および啓蒙活動

1〈たたら製鉄の操業〉海岸における砂鉄採集、炉を組んでのたたら製鉄操業により、古来の鉄作りを今年も生徒ともに体験することができ、日本刀に代表される優れた刃物の材料となる和鉄を自分たちで作り出せた意義は大きい。さらに、たたら製鉄の理論・歴史についての学習会を持ったことで、たたら製鉄や鉄の奥行きを広げることができた。操業および理論学習ではNPOたたらのスタッフおよび東京藝術大学永田和宏教授に指導を仰いでいる。2〈刃物作りへ〉特に今年は、たたら操業で作った和鉄から、生徒と一緒に包丁やナイフなどの道具作りに結びつけることができたことが最大の成果である。操業におけるものづくりの面白さや和鉄作りの貴重さだけでも教育効果は絶大であるが、積年の夢であった和鉄からの道具作りにまで辿り着くことができたのが、今回の研究の成果である。これには職人でありながら丁寧に指導してくださるすばらしい教育者である愛媛県の刀匠藤田國宗氏のご指導に負うところが大きい。鉄作りからさらに4日間の鍛刀体験を経て道具を完成させたことで、生徒の到達感、満足感は大変大きなものとなった。3〈啓蒙活動〉本校の敷地で生徒と一緒にたたら製鉄の操業を行った。地学部の生徒が中心だが、授業でも操業への参加を呼びかけ、一般生徒も加わった。さらに、生徒の保護者や兄弟姉妹、他校教員生徒など多数の参加があり、それぞれの参加者が日本古来の砂鉄からの鉄作りを体験したことは大きい。本校の教職員から話題として挙がることも多く、操業の効果は絶大である。また、刀匠の指導を受けながら和鉄(地金)から刃物を鍛造するすべての工程をこなした体験は、生徒の満足度からして次世代へ確実に伝わっていくものと考える。
ヒト自己免疫疾患における抗原特異的免疫応答の解析系の構築

本研究ではT細胞レセプター(TCR)を手掛かりとした自己抗原特異的なT細胞免疫応答の解析を目的とした。方法としては、次世代シークエンスを用いたRA患者末梢血と滑膜のCD4陽性T細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析とTCRの配列解析により、増殖傾向の強いCD4陽性T細胞の表現型を解析した。その結果、RAの病勢と関連のある細胞集団がCXCR4陽性のメモリーT細胞であり、CXCR3陰性CCR6陰性CXCR5陰性細胞に属するCD4陽性T細胞クローンが、関節でCXCR4陽性で老化した表現型を取ることを明らかとした。本研究によりRAの病態に関与するT細胞クローンの動態の知見が得られた。これまでのマウスモデルの解析により、免疫学の解明は大きく進んできた。しかしこれは主に基礎免疫学研究でのことであり、臨床応用に眼を転じるとマウスの免疫学がヒト免疫疾患に結び付かないことがまま見受けられる。すなわちモデルマウスで有効な治療法がヒトでは有効でないことが多い。一因としてモデルマウスの病理像はヒト疾患と類似しているものの、アジュヴァント免疫による自己免疫誘導や、偏った遺伝素因上での自然発症など、ヒト疾患発症機構が必ずしも再現できていないことが考えられる。この問題点を克服するために、本研究ではヒトで病態を形成しているT細胞を同定し、その抗原特異的レセプターをex vivoで、またヒト化マウス上で詳細に解析する解析系を構築し、ヒト疾患の発症機構を明らかにすることを目的とする。今回は関節リウマチ(RA)末梢血および関節で増殖しているT細胞について、単一細胞解析と次世代シークエンス(NGS)を組み合わせることで定量的な解析法を確立した。この解析法により、(1) RAおよび健常人の末梢血CD4陽性T細胞中に数%を占める高度に増殖したクローン(Expanded Clone:EC)が存在し、RAでは健常人よりも増殖の程度が強いこと、(2)末梢血中のECはTh1の分画に集積していること、(3) RA関節にもECが存在し、末梢血よりもさらに高頻度であることが分かった。さらに単一細胞由来のmRNAの発現解析をNGSで行い、(4) RA関節に存在するECはTh1を規定する転写因子であるTbx21を発現していることも明らかとした。今後この手法の検体数を重ねて、ECの頻度と疾患活動性、治療抵抗性などとの関連、ECの抗原反応性などを検討することにより、RAの病態の解明を進めてゆく。本研究ではT細胞レセプター(TCR)を手掛かりとして、自己抗原特異的なT細胞免疫応答の解析を目的とした。まず関節リウマチ(RA)の自己抗原BiPに特異的なT細胞レセプターの解析を試みた。BiPエピトープを提示するHLA-DRテトラマーを作製し、テトラマー陽性細胞を単一細胞レベルで回収し、cDNAからTCRを同定した。同定した中で2種類のTCRをヒトCD4陽性T細胞に発現させたが、BiPおよびエピトープへの反応性が確認できなかった。そこで次にテトラマーによる解析ではなく、細胞のTCR自体の次世代シークエンス解析による、RAの抗原特異的免疫応答の解析を試みた。RA患者末梢血と滑膜のCD4陽性T細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析とTCRの配列解析により、増殖傾向の強いCD4陽性T細胞クローンを同定した。滑膜に浸潤傾向が強いCD4陽性T細胞クローンではCXCR4の発現、Th1型の遺伝子発現の亢進および老化した表現型を認めた。これらのクローンは末梢血では通常Th2に分類される、CXCR3陰性CCR6陰性CXCR5陰性の分画に集積していた。クローナリティを見ると、メモリーCD4陽性T細胞、特にCXCR3陰性CCR6陰性CXCR5陰性の分画が最も高いという結果であった。並行してマルチカラー解析を行ったところ、メモリーT細胞のCXCR4陽性細胞の割合はRAの病勢と相関を示し、今回同定した増殖したクローンが疾患の本質に関与していることが推測された。本研究で次世代シークエンスという新しい手法を単一細胞発現遺伝子解析とTCRレパトア解析に応用することで、RAの病態に関与するT細胞クローンの動態の知見が得られた。アレルギー・リウマチ学本研究により、関節リウマチ(RA)末梢血および関節で増殖しているT細胞について、単一細胞解析と次世代シークエンス(NGS)を組み合わせることで定量的な解析法を確立した。

この解析法により、(1) RAおよび健常人の末梢血CD4陽性T細胞中に数%を占める高度に増殖したクローン(Expanded Clone:EC)が存在し、RAでは健常人よりも増殖の程度が強いこと、(2)末梢血中のECはTh1の分画に集積していること、(3) RA関節にもECが存在し、末梢血よりもさらに高頻度であることが分かった。さらに単一細胞由来のmRNAの発現解析をNGSで行い、(4) RA関節に存在するECはTh1を規定する転写因子であるTbx21を発現していることも明らかとした。この手法は従来別個に行われていた遺伝子発現解析とT細胞クロナリティ解析を、同時に進めることができる点が画期的といえる。従来単一細胞解析、T細胞レパトア解析やマイクロアレイによる遺伝子発現解析は独立して行われていた。その場合、Th1など特定のT細胞サブセットで発現解析を行い、そのサブセット内で優位なクローンは同定できるが、そのクローン自体の正確な遺伝子発現は分からず、全体の中での頻度も分からなかった。T細胞が本来それぞれ別個のT細胞レセプター(TCR)を発現し、独立して抗原刺激を受けることを考えた場合、クローンごとの正確な遺伝子発現が分からないことは、ある意味致命的な限界であった。本手法では、RA生体内で増殖しているクローンのある時点での性質を統合的に把握することが可能としたことで、その限界を克服する手掛かりになると考えられる。この手法はRA生体内で増殖しているクローンの、ある時点での性質を統合的に把握することを可能とした。今後は症例数を増やし、DAS28などの疾患活動性、罹病期間、抗リウマチ薬や生物学的製剤への治療反応性などを組み合わせつつ、治療前後などに経時的に解析することで、増殖しているT細胞の病態への関与を検討していく。またECのTCRをレトロウイルスベクターを用いてCD4陽性T細胞上に再構築し、TCR自体の自己反応性や抗原特異性を検討してゆく。また免疫不全NOGマウスにECのTCRを再構築したCD4陽性T細胞を移入し、関節炎発症への寄与を検討していく。また関節にはECのように末梢血では増殖せず、関節でのみ増殖しているクローンが存在する。これらについても、単一細胞レベルでの発現遺伝子解析を行い、TCRの再構築による抗原特異性、病態形成性への関連などを検討する。RAではシトルリン化タンパクに対する抗体の出現が特徴的であるが、最近、RAで重要な疾患感受性遺伝子であるMHCクラスII分子のHLA-DRB1のP4ポケットのシトルリンへの結合性が高いことが報告されており、これらのクローンがシトルリン化エピトープに反応するかどうかも検討する。これらの解析により、RAの病態に対するCD4陽性T細胞の寄与が解析できると考えられる。ヒト個体の解析であり、検体間のばらつきは大きいが、動物モデルではなく疾患そのものの解析であり、得られる知見は臨床に直結することが期待される。
改良型4π検出器の開発によるシータ粒子の光生成とそのパリティの解明

今年度LEPSでは、去年度に引き続きΘ+探索のための実験テータの取りましが行われ、総統計量はこれまでの約3倍に達した。この実験の結果はΘ+の存在を確認するという意味で本研究課題と密接に関連しており、本研究員も積極的に取り組み、データ収集および検出器の較正などを行った。この実験は2007年7月で終了し、解析が進行中である。これに続き、本研究課題であるK*中間子を伴うΘ+光生成実験の、予備実験が2007年9月に行われた。これは液体標的や主検出器TPCをはじめ、本実験に近いセットアップで、各検出器のテストおよび実験での問題点を調べることを主な目的としたものであり、結果として光電増倍管の磁場に対する角度やTPCの磁場に対する位置など、実際にいくつかの問題点が明らかになった。10月以降、他の実験がLEPSビームラインで行われている間にデータを解析しつつ、これらの問題点に対する改善策をたて、本実験に備えることができ、またセットアップの手順を前もって確立できたたという点で、このテスト実験は非常に有意義であった。本実験は2008年1月にスタートしており、2月末までに取得されたデータの解析がある程度進んでいる。解析プログラムは未だ発展の余地があるが∧(1116)などのハイペロンをTPCを使って再構成することができている。一方で、本研究課題において重要なK*中間子を再構成するために必要なTPCによるK中間子の識別は今のところできていないが、粒子のTPC中でのエネルギー損失の補正や、粒子の通過位置を決定する方法の改善策など、今後行おうとしているアイディアがいくつかあり、これらがTPCの性能を上げることが期待される。実験は2008年4月に再開し、8月までデータの取得が行われる予定である。本年度、4π検出器Time Projection Chamberについてはその設計を終え、既に製作過程に入っているが、いくつかのトラブルにより未だ完成には至っていない。ただし、検出器の読み出し部分のみに関してはいくつかの性能試験を行うことができたのでそれらについて報告する。TPCは荷電粒子の飛跡を3次元的に再構成するが、その読み出し平面上での位置はcathode padに誘起される電荷の重心を求めることで得られるため、実際のpadの応答関数(Pad Response Function)を調べることはTPCの位置分解能を向上させるために重要である。Pad Response Functionとしては多くの場合Gaussianが用いられるがシュミレーションの結果、Gaussianよりも正しく実際のPad Response Functionを表すと考えられる関数を考案した。そこで、X線源とTPCの読み出し部分を用いてもPad Response Functionを実際に測定した結果、新たに考案した関数のほうがGaussianよりも実際のデータをよく再現していることがわかった。2読み出し平面内の位置分解能逆コンプトンγ線からの電子・陽電子対生成による電子線を用いてTPC読み出し部分に対し位置分解能の測定を行った。その結果、位置分解能は電子線の入射角が0度、12.5度、25度の時、それぞれ133μm、163μm、331μmとなった。角度が大きくなると目標値である300μmに達していないが、1で求めたPad Response Functionが完全には正しいものでないことなどいくつかの原因が挙げられ、改善の余地はあると考えており、解析を続行中である。昨年度完成予定であった4π検出器Time Projection Chamber (TPC)は今年度ようやく完成したが、現在SPring-8/LEPSではペンタクオークΘ+と思われるピークを再確認することを最重要課題とし、過去のデータを再解析するとともに、統計量を増すため過去に行われた液体重水素標的を用いた実験を再び行っている。そのためこのTPCを用いた実験は早くとも今秋からスタートする予定であり、計画よりも遅れることとなった。しかしながら現在行われている実験は本研究課題にとって非常に重要であり、本研究員も積極的に参加し、実験のセットアップやデータ収集を行っているほか、スペクトロメータの較正の一部を担当している。また、TPCに関しても、宇宙線および逆コンプトンγ線と固体標的を用いていくっかの性能試験を行った。TPCに磁場をかけて行った宇宙線、γ線を用いた実験のデータは現在解析中であるが、磁場をかけていない状態で行った宇宙線を用いた実験のデータを解析した結果、荷電粒子がTPC中を通ったときにできる遊離電子のドリフト速度は52mm/μs、拡散係数は513μm/√<cm>であることがわかった。これはシミュレーションや既に稼動している他のTPCと矛盾しない値である。また、ドリフト方向(Z方向)の位置分解能は平均で758μm、XY平面内の位置分解能は、ドリフト距離によって変化し326742μmとなったが、XY分解能については磁場をかけることで平均で260μmまで向上することが見込まれる。これは要求される性能(300μm以下)を満たす。この結果について2007年3月、日本物理学会において発表を行った。

これに続き、本研究課題であるK*中間子を伴うΘ+光生成実験の、予備実験が2007年9月に行われた。これは液体標的や主検出器TPCをはじめ、本実験に近いセットアップで、各検出器のテストおよび実験での問題点を調べることを主な目的としたものであり、結果として光電増倍管の磁場に対する角度やTPCの磁場に対する位置など、実際にいくつかの問題点が明らかになった。10月以降、他の実験がLEPSビームラインで行われている間にデータを解析しつつ、これらの問題点に対する改善策をたて、本実験に備えることができ、またセットアップの手順を前もって確立できたたという点で、このテスト実験は非常に有意義であった。本実験は2008年1月にスタートしており、2月末までに取得されたデータの解析がある程度進んでいる。解析プログラムは未だ発展の余地があるが∧(1116)などのハイペロンをTPCを使って再構成することができている。一方で、本研究課題において重要なK*中間子を再構成するために必要なTPCによるK中間子の識別は今のところできていないが、粒子のTPC中でのエネルギー損失の補正や、粒子の通過位置を決定する方法の改善策など、今後行おうとしているアイディアがいくつかあり、これらがTPCの性能を上げることが期待される。実験は2008年4月に再開し、8月までデータの取得が行われる予定である。
免疫化学測定法による低分子残留農薬の分析

残留農薬分析技術の確立は、環境負荷低減と野菜などの生鮮食品の安全性確保の観点から重要な課題である。本研究は、免疫的化学測定法(イムノアッセイ)を利用した簡便廉価、迅速、高精度、移動性などの特徴を有する低分子残留農薬分析法の確立を目的として研究を行った。その結果、標的農薬ハプテン合成を経て標的農薬特異的なモノクロナール抗体の作成に成功し、アゾキシストロビンやクロロタロニルなどの農薬に対しての免疫化学測定法を確立するとともに市販に至った。確立した技術は迅速で簡便・廉価な点で有用であり、微量で特異的に標的物質の定性や定量が可能である。また移動性が高く機器分析に比べて利点がある。本研究は、免疫的化学測定法(イムノアッセイ)を利用した簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する低分子残留農薬分析法の確立を目的として研究を行っている。農薬そのものはその低分子量ゆえに単独では免疫反応を起こさず、抗体が得られない。したがって低分子農薬に触媒的手法を用いてリンカーを導入(ハプテン)し、巨大蛋白と結合させてマウス免疫することで分子センサーとしての標的農薬特異的なモノクロナール抗体を作成する。得られる抗体の分析精度をppmppbレベルの水準を目標として低分子残留農薬分析法の確立をする。今年度は汎用抗菌剤であるアゾキシストロビン残留農薬センサー開発を行った。アゾキシストロビンハプテン群合成に伴い、高効率的炭素ー炭素結合形成触媒の開発やルテニウム系触媒を用いる触媒的不斉カルベン移動反応などを開発した。その後、アゾキシストロビンハプテンと巨大蛋白との結合体のマウス免疫により標的農薬特異的モノクロナール抗体を得ることに成功した。さらにこれをELISAに応用して、アゾキシストロビン残留農薬測定キットを完成し市販することに成功した。アゾキシスとロビン農薬への感度は数ng/mLから1000ng/mLであり広域濃度に対応する特徴的なセンサーとなった。これらの残留農薬センサーキットは農業試験場などで再試験され有用であることが実証されている。本研究で確立される技術は高価な機器分析に比べて、初期の目標設定である簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境での実装を持つことなどの多くの特徴を有し、環境監視や健康の維持に大きく貢献するものと考えられる。本研究は、免疫的化学測定法(イムノアッセイ)を利用した簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する低分子残留農薬分析法の確立を目的として研究を行った。残留農薬の微量分析は、一般的に、煩雑な前処理の後に、液体クロマトグラフや質量分析、あるいはそれらの連動した複合的、総合的分析機器類などの高価な分析装置に頼ると同時に分析場所も限られ、自在な分析方法とはほど遠く、総じて長時間の分析期間が必要であることがほとんどである。本研究では、免疫的化学測定法を応用し原理的に生物機能としての抗原抗体反応を利用する。免疫的化学測定法は標的化合物に対して特異的な抗体を用いるが、農薬は低分子化合物であるため、直接免疫しても抗体が得られない。そこで標的物質にカルボキシル基などの官能基を有する側鎖を導入した誘導体(一般にハプテンという)を高分子蛋白質のアミノ基と結合させて免疫源とし、蛋白質の一部としてハプテンを認識させることにより、標的化合物を特異的に認識する抗体を得た。その結果、本研究では、触媒的合成技術の開発、標識農薬ハプテン合成、農薬特異抗体の作成およびキット化まで行い残留農薬キットの市販に至った。この目的の達成により残留農薬の簡便・迅速・廉価検査法が確立され、環境負荷を監視できるばかりでなく行政、企業等の社会的責任を明確にすることができるとともに最も重要な人への健康被害を未然に防ぐことが可能となる。本研究で確立される技術は高価な機器分析に比べて多くの利点を有し、環境監視や健康の維持に大きく貢献すると考えられる。残留農薬の微量分析は、煩雑な前処理の後に、液体クロマトグラフや質量分析、あるいはそれらの連動した複合的、総合的分析機器類などの高価な分析装置に頼ると同時に分析場所も限られ、自在な分析方法とはほど遠く、総じて長時間の分析期間が必要であることがほとんどである。このような状況は、必然的に農薬の環境負荷物質としての側面である健康被害や社会的問題として表面化した後に、対応が図られる場合がほとんどである。加えて農薬のポジティブリスト制への政策的移行により、残留農薬の迅速な分析法の開発が求められている。

すなわち低分子農薬に触媒的手法を用いてリンカーを導入し、巨大蛋白と結合させてマウス免疫することで分子センサーとしての標的農薬特異的なモノクロナール抗体を作成する。得られる抗体の分析精度をppmppbレベルの水準を目標として低分子残留農薬分析法の確立をする。平成23年度では抗菌剤として用いられているアゾキシストロビン農薬の免疫的化学測定法を確立し、市販に至った。本研究で確立される技術は高価な機器分析に比べて多くの利点を有し、環境監視や健康の維持に大きく貢献する。機器分析が高価で時に煩雑な前処理や熟練技能を要するのに比べて、免疫的化学測定法は、原理的に生物機能としての抗原抗体反応を利用し、迅速で簡便・廉価な点に於いて有用であり、微量で特異的に標的物質の定性や定量が可能である。さらに自在な分析環境を提供しうる点において既存の総合的機器分析システムに比べて大きな利点がある。また使用有機溶媒も劇的に減少することができた。本研究目的を達成するため研究は2段階で進行する。即ち、第一段階は精密有機合成化学を基盤としたハプテン群の全合成であり、第二段階は抗体作作成である。ハプテン合成はELISA法による標的農薬の選択的定性・定量を達成するために、リンカー導入分子の設計が極めて重要である。実用に耐えうる感度(ppmレベル)の抗体が得られるまでハプテン合成の最適化を行うと同時に,適切な抗体が得られたときはと直ちにキット化し実用化する。触媒合成は報告した方法によってビス(オキサゾリニル)フェニルパラジウム(Phebox-Pd)およびオキサゾリニルフェニルルテニウム(Phebox- or Pheox-Ru)を合成し、触媒活性を同時に検討するためカウンターアニオンを変化させた系(BF4-, PF6-, OAc等)や配位子の芳香族環上置換基を電子供与基や電子吸引基を芳香族環に有する系を併せて合成した。さらにPhebox-Ru系触媒では芳香族環にカルボニル基やヘテロ原子が直結した農薬系で直接的にオルトメタレーションを経由してカルボニル基末端を有する側鎖を導入する検討を行った。その結果、アゾキシストロビンハプテン群合成に伴い、高効率的炭素ー炭素結合形成触媒の開発やルテニウム系触媒を用いる触媒的不斉カルベン移動反応などを開発した。その後、アゾキシストロビンハプテンと巨大蛋白との結合体のマウス免疫により標的農薬特異的モノクロナール抗体を得ることに成功した。これらの成果は、論文に掲載され( J.Agriculturaland Food Chemistry, 2012, 60, 904)、さらにアゾキシストロビン残留農薬センサーキットとして市販されるに至った。加えて農業試験場などで再試験され有用であることが実証されている。従って、本研究に関する達成度は十分に当初の計画以上に進展していると考えている。平成23年度の研究で免疫的化学測定法(イムノアッセイ)を利用した簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する低分子残留農薬分析法の確立を目的として研究を行った結果、ビスオキサゾリニルフェニル-Pd系触媒を用いて低分子農薬であるアゾキシストロビンにリンカーが導入された誘導体を全合成し、スカシ貝由来のキャリヤー蛋白と結合させてマウス免疫することでアゾキシストロビン標的農薬に特異的に認識するモノクロナール抗体を世界で初めて単離することができた。
音源位置情報を用いた単一マイクロホンによる雑音抑圧法

単一マイクロホンによる音源位置推定に関する研究を重点的に行った。単一マイクのみによる音源位置の推定手法は自身の研究を除けば未だに提案がされておらず、また本研究課題において、従来では複数のマイクを用いなければ表現できなかった音源位置情報を、単一マイクで表現する方法を確立するという点で非常に重要な意味を持っている。これまで自身はマイクで観測された信号が持つ音響的な伝達特性が、音源の位置に依存するという点に着目し、観測された信号から音響伝達特性を推定し、これを音源位置毎に学習・識別することで音源の位置をマイク一つで推定するという新たな音源位置推定の枠組みを提案してきた。しかし、これまでの研究では、一人の話者のみが発話していることを前提としており・複数の話者が同時に発話した場合の位置推定が困難であった。そこで今年度の取り組では、これまで提案した枠組みを元に、各話者・各位置における残響音声の音響モデルから、その混合音声信号の音響モデルをモデル合成により求めて用いることで、2話者の音源位置推定を単一マイクで行う手法について提案した。実験では、モデル合成を用いる提案手法が、モデル合成を用いない手法と比べて、優位な結果を示している。さらに、これまでの枠組みでは推定した位置の音響情報をあらかじめ学習しておく必要があり、学習していない位置の推定が困難な問題があった。そこで今年度の取り組では、限られた位置の音響情報を用いて、回帰分析を適用することにより、未学習の位置の情報を補間する手法を提案した。実験では、理想環境の元においては、平均7.7cmの誤差で未学習の位置を推定できた。この研究において、音響伝達特性はMFCCという特徴量で表現されていた。しかし、このMFCCの次元の中には音源位置を表現するうえで重要な次元と、そうでない次元があると考えられたため、本年度の研究では音源位置の識別に重要な次元を、Multiple Kemel Learning(MKL)の考え方によって自動的に選択し、重み付けする手法について提案した。3位置の識別タスクにおいて以前の手法では85%程度の識別率であったのに対して、この手法を用いることで90%まで精度を向上させることが確認できた。また、上記の研究に加えて、話者の頭部方向の推定手法についても検討を行った。音響伝達特性は音源の位置だけでなく、同じ位置でもその話者がどちらの方を向いて話をしているのかについても依存するため、これを利用することで話者の位置とその頭部方向も、上記の研究と全く同様の枠組みで推定することが可能となる。実験では顔方向3種類(前・横・斜め)の識別において、推定した音響伝達特性を用いた場合で65%、正解の音響伝達特性を用いた場合で93%の識別率が得られている。申請時の研究経過に沿って、音源位置推定に有効な音響伝達特性の表現方法について検討を行い、自身が以前に提案していた手法を大きく上回る性能を示した。提案する枠組みでは単一マイクで音源の位置が推定可能であるが、従来のマイクロホンアレーと比べるとまだ推定精度は十分とは言い難い。より高い推定精度を得るために、観測信号からの音響伝達特性の正確に推定について検討を行う必要がある。また提案する枠組みは雑音下や環境のミスマッチなどに対する検証が不十分であることが指摘されており、それらのロバストネスを含めた音響伝達特性の音源位置の表現能力に関して詳しく調査を行い、さらにそれらの能力を上げる方法について検討を行っていく。
発癌に関わるmicro-RNAの標的タンパク質の同定と癌化における分子機構の解明

申請者はマイクロRNA(miRNA)が癌に及ぼす影響の作用機序の解明と癌の分子標的治療薬の開発を目的とし、2次元電気泳動と質量分析計を用いたプロテオーム解析によるmiRNAの直接的な標的タンパク質の同定を行ってきた。標的miRNAそれぞれに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド(Greiner bio-one社)をし、miRNA miRNAを高発現している癌細胞株(SBC-3,MCF-7)に導入することによりタンパクの量的変動を確認した。IPG Dry Strip, pH3-10NL(BIO-RAD社)を用いて2次元電気泳動し、蛍光試薬(BIO-RAD社,GEヘルスケア社)によって染色後、ゲルイメージ像を解析用コンピューターとPDQuest ver. 8.0.1(BIO-RAD社)を用いて比較解析した。発現が1.5倍上昇していたものはスポットについて切り出しを行い、トリプシンによるゲル内消化後、HPLC-Chip/MS System(Agillent社)によってタンパク質を同定し、239種類のmiRNA標的候補タンパク質をえた。これら標的候補タンパク質に対し、mRNAの3'UTR領域をデータベース解析し、miRNA標的配列を探索することで、標的候補タンパク質の中から、miRNA標的配列を持つものを14種類同定するに至った。これら候補タンパク質については、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にこれら遺伝子のmiRNAの標的塩基配列を組み込んだプラスミドを作成し、ルシフェラーゼアッセイを行うことによって、miRNAによる標的遺伝子の発現抑制作用と、anti-miRNA locked nucleic acid(LNA)(Greiner社)によるmiRNA抑制(ルシフェラーゼ活性の回復)作用を確認し、いずれも良好な結果がえられた。引き続き、ウエスタンブロット解析によるタンパク質の変動を確認し、リアルタイムPCRによって標的遺伝子のmRNAは変動しないことを確認した。これらの検証実験から、14種類の候補タンパク質のうち、RAB14,IMPDH1, NPEPL1の3種類をmiRNAの直接的な標的として同定した。いずれも新規の標的遺伝子/タンパク質であった。申請者はマイクロRNA(miRNA)が癌に及ぼす影響の作用機序の解明と癌の分子標的治療薬の開発を目的とし、2次元電気泳動と質量分析計を用いたプロテオーム解析によるmiRNAの直接的な標的タンパク質の同定を行っている。miRNAの発現を自在に誘導することが可能な培養細胞にDoxicyclinを添加することによりHEK293細胞にmiRNAを高発現させた。miRNAの発現はGFPによる蛍光を顕微鏡で検出することによって確認した。また、Doxicyclin添加(+)および(-)細胞を回収し、Isogen(日本ジーン社)によりRNAを抽出後、TaqMan miRNA assay(Applied Biosystems社)を用いてmiRNAクラスターに含まれる各miRNAの発現量を定量したところ、Doxicyclin添加細胞で有意なmiRNAの発現上昇が確認できた。Doxicyclin添加(+)および(-)細胞からタンパク質を抽出し、IPG Dry Strip,pH3-10NL(BIO-RAD社)を用いて2次元電気泳動し、蛍光試薬(BIO-RAD社,GEヘルスケア社)によって染色後、ゲルイメージ像を解析用コンピューターとPDQuest ver.8.0.1(BIO-RAD社)を用いて比較解析した。解析によってえられた1265スポット中、発現が1.5倍減少していたものは48スポットであり、このうち37スポットについて切り出しを行い、トリプシンによるゲル内消化後、HPLC-chip/Ms System(Agillent社)によってタンパク質を同定し、64種類のmiRNA標的候補タンパク質をえた。これら標的候補タンパク質に対し、mRNAの3'UTR領域をデータベース解析し、miRNA標的配列を探索することで、標的候補タンパク質の中から、miRNA標的配列を持つものを2種類同定するに至った。これらは、miRNAの直接的な標的である可能性が高く、引き続き、ウエスタンブロッド解析によるタンパク質の変動を確認し、また癌細胞の増殖抑制効果も検討する予定である。これら候補タンパク質については、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にこれら遺伝子のmiRNAの標的塩基

配列を組み込んだプラスミドを作成し、ルシフェラーゼアッセイを行うことによって、miRNAによる標的遺伝子の発現抑制作用と、anti-miRNA locked nucleic acid(LNA)(Greiner社)によるmiRNA抑制(ルシフェラーゼ活性の回復)作用を確認し、いずれも良好な結果がえられた。引き続き、ウエスタンブロット解析によるタンパク質の変動を確認し、リアルタイムPCRによって標的遺伝子のmRNAは変動しないことを確認した。これらの検証実験から、14種類の候補タンパク質のうち、RAB14,IMPDH1, NPEPL1の3種類をmiRNAの直接的な標的として同定した。いずれも新規の標的遺伝子/タンパク質であった。