hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
現在バクテリアにおける翻訳途中脱離ペプチジルtRNAの産生メカニズムの解明

2)を進める上で当初、RNase mazFを用いて細胞内mRNAをレポーター遺伝子由来のものだけにする解析系を設計していたが、遂行中にアンチSD部分をmazFによって切断されたリボソームがSD配列を持たないmRNAを翻訳するといった論文が発表され、mazFの強制発現がmRNAの翻訳パターンを変化させる可能性が出たため、現在新たな方針を検討中である。一方で、申請時は24年度に進める予定であった3)drop offを引き起こすtRNA、rRNAの構造的要素の特定について研究開始時期を前倒しすることにした。本年度はrRNA構造とdrop offの関連について研究を進めた。P1トランスダクションによって変異rRNA解析用株(KT101株)にPth温度感受性形質を導入したKT101_Pthts株を作成し、変異体の温度感受性の亢進やpep-tRNAのプロファイリング解析し、drop offと関連する塩基を特定しその機能を調べている。本年度、細胞内pep-tRNAのプロファイリング解析をほぼ確立したので、今後はこの系を利用して研究を進めていく。1)変異rRNAがdrop offに与える影響について調べ、その塩基の機能について新しい知見を得ることを目指す。rRNAはコドンーアンチコドン対合やペプチジル転移反応など翻訳の中枢となる場を提供していることが知られている。更に、近年では特殊な新生ペプチド鎖とリボソームトンネル構成塩基の相互作用が発現調節に関わる例が報告されている。本年度の研究により、1)を十分に遂行する材料が揃ったと考えており、今後は精力的に進めるつもりである。また、関連して、tRNA、rRNAは要所に修飾塩基を備えているが、その機能についていまだ未知なことが多く、本研究では修飾塩基の機能解明についても視野に入れて研究を進める予定である。具体的には、修飾塩基合成酵素の欠損株にPth温度感受性形質を導入し、温度感受性の亢進とpep-tRNAプロファイリングを解析していく。2)2番目コドンの曖昧性については、mazFがrRNAのアンチSD配列を切断するため研究方針に変更が生じたが、1)で用いているrRNAを改変する技術を利用してmazFに切断されないrRNAを作成し、2番目コドンの曖昧性の解析に特化した系を構築することを考えている。これまで、drop offを誘発する翻訳因子についての研究は多くあるが、ほとんどが遺伝学的なアプローチに限られており、実際にどのようなpep-tRNAがどの程度drop offしているかについての知見はない。本研究はpep-tRNAのペプチドやtRNAの種類について詳細に検証することが出来る点で過去の研究とは一線を画すと考えており、今まで捉えられることがなかったdrop offによる新たな翻訳調節機構の提唱を目指していきたい。本年度にpep-tRNAの抽出等を含め解析系をほぼ確立したため設備備品等に次年度の研究費を費やす予定はない。消耗品等やその他の費用(受託解析費や保守費用等)については本年度と同程度の費用を次年度使用する予定である。
離散的反応拡散系の自己組織化能力を利用したデジタル画像処理技術の開発

本研究は、情報科学と非線形科学の両分野の境界領域に光を当て、離散的な非線形素子を持つ反応拡散系が示す特徴的な自己組織化能力を解明するとともに、画像処理への応用など非線形科学を基礎とする新しい情報科学分野を創成することを目的とした。特に、コントラストの小さな映像からのエッジ抽出、自己組織的な領域分割、画質改善、そしてノイズの多い画像からのロバストな情報抽出、S/N向上、さらに両眼立体視の新たな解析手法等の開発を具体的なテーマとした。具体的には、1)拡散現象の離散計算における近似の問題の検討、2)反応と拡散における非局所的結合の影響の検討、3)閾値を持つ非線形系に特有な確率共鳴現象の利用、4)反応拡散系とニューラルネットワークとの結合モデルの検討、5)連続入力される動画像データに対応できるモデルの構築、6)ノイズロバストなモデルの提案と、数値解析による実証、7)開発した非線形反応拡散モデルを用いた視覚機能の解釈などの検討を行った。その結果、以下のような有用な知見が得られた。1)自己組織的な多値化モデルの提案による画像の領域分割手法の提案(発表2)、2)離散的反応拡散モデルにおける確率共鳴現象を用いた、雑音環境下での視覚機能実現(発表3)、3)多層反応拡散モデルを用いたステレオ画像処理手法の提案(発表4)、4)自己抑制型の反応拡散モデルを用いたステレオ画像処理手法の提案(発表5)、5)連続する画像入力に対する反応拡散モデルの適用による錯視現象の理解(国際会議発表予定)。査読論文2編、著書1編が印刷中であり、国際会議発表は口頭発表が認められた(2007年7月)。本研究は、情報科学と非線形科学の両分野の境界領域に光を当て、離散的な非線形素子配列を持つ系が示す特徴的なパターン形成・自己組織化能力を解明するとともに、画像情報処理への応用など、非線形科学を基礎とする新しい情報科学技術を開発することを目的とする。特に、従来野村らにより提案されてきた「反応拡散モデルの自己組織化機能」を基礎とした画像情報処理手法を発展させ、実用的なアルゴリズムとして確立する事を目指している。1)内部信号源として、周期振動とガウス揺動を含む確率共鳴項を付加したモデル、2)光触媒を持つ化学反応を模して、連続する画像情報を次々と入力するモデル、を新たに開発し、それぞれノイズロバスト性の向上(確率共鳴を取り込んだモデル)や、人の視覚系特有の錯視特性(光触媒機能を取り込んだモデル)の再現が可能なことを示してきた。
高温溶融塩蓄熱材の高効率利用のための熱的能動操作に関する研究

1.実験装置の作製溶融蓄熱材がもつ潜熱を効果的に利用するための熱的操作方法を見いだすため,融解・凝固挙動観察のための可視化装置を作製した.耐熱性および化学的反応防止の2点に注意を払い,測定サンプル容器をパイレックスガラス,および石英ガラスを用いて作製した.測定サンプル容器側面および下面にヒ-タを取り付け,温度コントロ-ラによってプログラムに従った昇温・降温制御可能な回路を組んだ.さらに,下面ヒ-タ下部には流水循環部を付設し,降温プロセスにおいて広範囲の条件下で温度制御できる構造とした.2.融解・凝固挙動の可視化実験溶融塩(チオシアン酸カリウム・融点175°C)の融解および凝固挙動について観察を行った結果,(1)融解時において,溶融塩内に自然対流が生じること,(2)凝固時において,針状あるいは樹枝状の,いわゆるデンドライト構造が観察されること,さらに,(3)冷却速度により凝固層先端部の性状が異なることがわかった.3.冷却速度の検討潜熱採熱過程における溶融塩の過冷却挙動に及ぼす冷法速度の効果について検討した結果,(1)冷却伝熱面での冷却速度が小さいほど,過冷却領域が進行すること,(2)過冷却状態解消直後の凝固層成長率は,冷却速度が小さいほど大きいことが明らかになった.4.溶融塩試料初期温度の検討過冷却領域に及ぼす試料初期温度の効果について検討を行った.その結果,冷却速度一定でも,初期温度により過冷却度に及ぼす影響が異なり,(1)初期温度が低いほど過冷却が進行すること,(2)過冷却解消直後における凝固層が高いという測定結果が得られた.1.実験装置の作製溶融蓄熱材がもつ潜熱を効果的に利用するための熱的操作方法を見いだすため,融解・凝固挙動観察のための可視化装置を作製した.耐熱性および化学的反応防止の2点に注意を払い,測定サンプル容器をパイレックスガラス,および石英ガラスを用いて作製した.測定サンプル容器側面および下面にヒ-タを取り付け,温度コントロ-ラによってプログラムに従った昇温・降温制御可能な回路を組んだ.さらに,下面ヒ-タ下部には流水循環部を付設し,降温プロセスにおいて広範囲の条件下で温度制御できる構造とした.2.融解・凝固挙動の可視化実験溶融塩(チオシアン酸カリウム・融点175°C)の融解および凝固挙動について観察を行った結果,(1)融解時において,溶融塩内に自然対流が生じること,(2)凝固時において,針状あるいは樹枝状の,いわゆるデンドライト構造が観察されること,さらに,(3)冷却速度により凝固層先端部の性状が異なることがわかった.3.冷却速度の検討潜熱採熱過程における溶融塩の過冷却挙動に及ぼす冷法速度の効果について検討した結果,(1)冷却伝熱面での冷却速度が小さいほど,過冷却領域が進行すること,(2)過冷却状態解消直後の凝固層成長率は,冷却速度が小さいほど大きいことが明らかになった.4.溶融塩試料初期温度の検討過冷却領域に及ぼす試料初期温度の効果について検討を行った.その結果,冷却速度一定でも,初期温度により過冷却度に及ぼす影響が異なり,(1)初期温度が低いほど過冷却が進行すること,(2)過冷却解消直後における凝固層が高いという測定結果が得られた.
モアレ法と画像相関法を用いた材料のナノ・ミクロ・ミリ-マルチスケール変形計測法

ナノオーダー,サブミクロンオーダー,ミクロンオーダーまでの4桁にわたる変形量をほぼ同時に計測できる手法の開発は、材料の損傷生成機構解明にとって重要なことである。そのため走査型電子顕微鏡を用いた画像相関法や電子線モアレ法によるマルチスケール変形測定法を開発することを目的とした。このため、半導体を作製する電子線リソグラフィーやフォトリソグラフィーを用いて、ナノオーダー(数十から数百ナノメーター)のランダムパターン作製技術や同手法およびナノインプリント法を用いてマイクロメーターオーダーのグリッドを試料上に作製する技術を開発した。ナノオーダーのランダムパターンを用いた画像相関法によりナノオーダーの変形量を、マイクロメーターオーダーのグリッドを用いてサブミクロンオーダーの変形量を測定し、このマイクログリッドをモデルグリッドとして用い、電子線をグリッド上に照射して、電子線モアレ法によりミクロンオーダーの変形量を測定する技術を開発した。さらにこの手法を用いて、複合材料の強化繊維・強化粒子とマトリックスの界面近傍の変形や積層材料の界面近傍の変形挙動や、セル構造金属材料(発泡金属:スポンジのような金属材料)のセル壁の変形・破壊挙動を計測解析した。さらに、この手法をナノインプリント用のレジスト(ポリマー)にグリッド作製時に生じる応力によって生じるき裂先端の応力拡大係数測定、ナノパウダーパーティクルの不規則性を計測、熱による変形量計測に応用した。さらに得られた結果を取りまとめ、学会発表・論文発表を行った。当初計画されていた「マルチスケール変形測定法の開発」は計画通りに進んだ。この技術は他のディバイスと組み合わせて熱変形計測に用いたり、ナノパウダーパーティクルアレーの規則性測定に用いられるなど、他分野への応用も実施され、計画以上に進展したと考えられる。本研究はこの年度で終了したが、今後は実構造物材料の損傷生成過程解明等に本手法を用いていきたい。ナノオーダー,サブミクロンオーダー,ミクロンオーダーまでの4桁にわたる変形量をほぼ同時に計測できる手法,「マルチスケール変形測定法」を開発することを目的に,半導体を作製する技術である電子線リソグラフィーやフォトリソグラフィーを用いてナノオーダー(数十から数百ナノメーター)のランダムパターンを試料上に作製し、同じ技術を用いて、マイクロメーターオーダーのグリッド(主に直交格子)を試料上に作製する技術を開発した.作製したナノオーダーのランダムパターンを用いた画像相関法によりナノメーターオーダーの変形量を,マイクロメーターオーダーのグリッドを用いてサブミクロンオーダーの変形量を測定し,さらに、このグリッドをモデルグリッドとして用い,電子線モアレ法によりミクロンメーターオーダーの変形量を測定する.これにより4桁以上(数十ナノメーター数百ミクロン)の解像度の幅を持つマルチスケール変形測定法が可能となる.作製したランダムパターンやマイクロメーターオーダーのグリッドは試料とは二次電子発生量が異なる物質を使用すると画像相関法は言うまでもないが,電子線をグリッド上に照射した際の二次電子発生量の違いで輝度の異なる縞(電子線モアレ縞)を生じ,このモアレ縞よりミクロンオーダーの変形量を測定することを可能にした.さらにこの電子線モアレ法を用いて,ナノパーティクルアレーの2次元平面での3方向の粒子間隔を同時に求める方法を開発したナノオーダー,サブミクロンオーダー,ミクロンオーダーまでの4桁にわたる変形量をほぼ同時に計測できる手法の開発は、材料の損傷生成機構解明にとって重要なことである。東日本大震災および福島第一原子力発電所の事故の影響に対するの安全確認のため、「王慶華」氏の来日2.5ヶ月が遅れ、さらに出産のために出産・育児休暇を3か月間取ったため、ランダムパターンとグリッド作製技術およびモアレ縞観察技術開発と技術開発関連の研究にとどまっている。今後は開発した手法を用いて、複合材料の強化繊維・強化粒子とマトリックスの界面近傍の変形や積層材料の界面近傍の変形挙動や、セル構造金属材料(発泡金属:スポンジのような金属材料)の3重点近傍やセル壁の変形・破壊挙動、複合材料の材料による熱膨張の様子を計測解析する。特に、荷重負荷時と除荷時の変形量の違いより塑性変形と弾性変形を分離して測定し、応力分布を計測できるようにする。

福島第一原子力発電所の事故の影響に対するの安全確認のための2.5ヶ月の来日の遅れ、および出産・育児休暇分は延長が可能なので、当初の目標は十分に達成可能である。本研究はこの年度で終了したが、今後は実構造物材料の損傷生成過程解明等に本手法を用いていきたい。
志賀毒素Bサブユニットの結合による細胞内刺激伝達の病態形成における作用の解明

一方、ACHN細胞ではStx-1Bの添加により細胞骨格系の再構成が起こるが、アポトーシスの誘導は起こらない。しかし、正常ヒト腎皮質上皮由来の初期培養細胞(HRCEC)では、Stx1 Bのみでもアポトーシスによる細胞死が誘導されることが確認された。両者の比較を行ったところ、ACHN細胞ではBcl-2の発現がHRCECに比較して非常に高いことがその一因であることが示唆された。ACHN細胞とHRCECとのStx1 Bによる細胞内刺激伝達の差について解析することにより、Stx1結合による細胞死誘導の発生要因について、また逆にStx1 Bによるアポトーシスを抑制する手段について明らかになることが期待される。志賀毒素(Stx)はO157株等の腸管出血性大腸菌(EHEC)が産生する主要な病原性因子で、RNA切断酵素活性を持つAサブユニットと標的細胞上の受容体Gb3に対する結合能を有するBサブユニットから構成される蛋白毒素である。Stxの細胞毒性の本態はAサブユニットの作用に起因した蛋白合成阻害であると考えられているが、最近、Bサブユニットを介する結合のみでも標的細胞に刺激伝達が起こり種々の変化がもたらされることが明らかにされている。本研究ではこれまでに、Stx1Bサブユニットのみの遺伝子組換え体の結合によって、腎癌由来細胞株ACHNに糖脂質豊富膜ドメインを介して一連の細胞内刺激伝達が誘導され、Ezrin、Paxillin等の細胞骨格の形成にかかわる蛋白のリン酸化が起こり、これに伴ってCD44、actin、tublin、vimentin、cytokeratin等の細胞内局在が変化して細胞骨格の再構成が誘導され、細胞接着性の低下や仮足形成といった細胞の形態変化が起こることが明らかにしている。また、以上のような細胞変化に、Gb3/raftを介して誘導されるSrc型チロシンキナーゼ、PI3キナーゼ、Rhoキナーゼ等の活性化の関与が示唆された。一方、これらの刺激伝達が毒素の細胞内輸送に関与する可能性を考え、種々のキナーゼ抑制剤を投与して毒素の細胞内輸送に対する影響について検討した結果、PI3キナーゼの活性を抑制することにより毒素の細胞内輸送が遅延することが明らかとなった。以上の結果は、Stxの持つ作用におけるB subの役割が単に毒素の標的細胞への吸着のみではなく、細胞内刺激伝達誘導によって毒素の細胞内輸送を促進させることにより、ホロ毒素の細胞毒性の発現に寄与している可能性を示している。
角質層除去皮膚への抗原塗布による新しい癌免疫治療法の開発に関する研究

MHCクラスIH-2Kb分子に結合しCTLを誘導できることが知られているHSVgpB,VSVNP,TRP-2,MUT1,OVAペプチドを、テープストリッピングにより角質層除去した皮膚へ塗布した場合、角質層除去後12-24時間で塗布した時に最も強く近傍リンパ節内においてそれらペプチドに特異的なCTLが感作された。テープストリッピングB6マウス耳翼によるペプチド塗布を行った2週間後に、同マウステープストリッピング腹部による同じペプチド処理を行うと、全身でペプチド特異的CTL活性が高まった。耳翼あたり2040μgのペプチド塗布した時、最も強いCTLの感作が観察された。この方法によりTRP-2(B16メラノーマのエピトープ)またはMUT1(3LL肺癌細胞のエピトープ)免疫したマウスは、それぞれB16細胞または3LL細胞の皮下移植を拒絶した。さらにこの免疫法をB16または3LL担癌マウスに行った時、各々癌細胞増殖の極端な低下が観察された。表皮LCの蛍光DNAの取り込みは角質層破壊直後が最も効率良く、この結果は、経皮免疫法がDNA治療への応用の可能性を示唆させた。さらに角質層破壊による経皮的免疫法をヒトに応用するためには、TSよりもGSの方が効率的に角質層を破壊できること、年齢に応じた有効なストリッピング回数が存在することが判明した。さらに効果的にGSとペプチド塗布を行えば、経皮的免疫法でヒト生体内でもCTLを感作できることを初歩的に確認することができた。樹状細胞(DC)がCTLへ強く抗原感作することが知られるようになり、この細胞と癌抗原ペプチドを用いた癌の免疫治療法に関する研究が飛躍的に進歩した。しかしながらそれら研究のほとんどは、樹状細胞の前駆細胞(多能性幹細胞)を複雑な単離培養の後得られる大量の樹状細胞を必要とするため、臨床応用という点で実現性が乏しいようだ。一方、皮膚にはランゲルハンス細胞(LC)と呼ばれる樹状細胞が多数常在しているので、皮膚を用いた簡便な癌免疫治療法が可能かもしれない。正常皮膚のLCは休止状態にありそのままではCTLへの感作能が弱く、何らかの方法で皮膚LCを活性化させる必要がある。近年我々は、角質層をテープストリッピング(TS)により破壊した皮膚では、LCがT細胞への抗原提示能を高めることを証明した。そこで今回は、角質層破壊皮膚への癌抗原ペプチド塗布による生体内での特異的CTL感作について検討し以下の結果を得た。1:表皮角質層をTSした皮膚への816メラノーマ(TBP-2),または肺癌(MUTl)ペプチドを塗布を数回行なうと、全身でペプチド特異的CTし活性が高まる。2: 1の強さは元々持っているpCTL頻度の大きさに依存する。3: 1によりTRP-2又はMUT1により免疫したマウスは、それぞれB16又は肺癌細胞の移植を拒絶する。または増殖を抑える。(ワクチン効果)4: B16または肺癌担癌マウスを1と同様にそれぞれTRP-2またはMUTlペプチドで免疫すると、癌細胞の増殖を抑制する。(治療効果)5: 1による免疫効果は表皮のMHCクラスII強陽性細胞(ランゲルハンス細胞)を介して成立するこれまでの研究により、テープストリッピングまたはアセトンによる脂質抽出により、角質層を急性に破壊した皮膚では、角質層破壊後1224時間をピークに表皮ランゲルハンス細胞がTh細胞ばかりでなくCTLにも抗原提示できるように強く活性化し、近傍のリンパ節へ移動することを証明した。本年度研究においては、角質層破壊皮膚へのCTLエピトープとなる抗原ぺプチドまたはDNAの塗布における生体内でのCTL活性、さらには抗原ペプチド含有テープを開発し、その角質層破壊皮膚への応用について検討を行った。1:ペプチドの塗布(1)テープストリッピン皮膚へ蛍光標識OVAペプチドを塗布後、経時的に近傍リンパ節内のペプチド含有細胞数を計測したところ、ペプチド塗布から12時間以降に塗布ペプチドが検出された。(2)B16

メラノーマエピトープであるTRP-2ペプチド、3LL肺癌エピトープであるMUT1ペプチドを角質層破壊皮膚に塗布した場合、それぞれに特異的なCTL活性が生体内で高まるが、その効率は、それぞれのペプチドに特異的なCTLプレカーサー頻度に依存していた。(3)単離ランゲルハンス細胞にHSP-TRP-2ペプチドをパルスした場合、TRP-2塗布よりもCTL誘導能が明らかに高まったが、その角質層破壊皮膚への塗布では何の増強も観察されず、逆にCTL誘導効率は減少した。(1)1.2Kbよりなる蛍光標識DNAをテープストリッピング皮膚に塗布したが、表皮内へのDNAの浸透は観察されず、従ってランゲルハンス細胞内へのDNAの取り込みは観察されなかった。[1-(3),2-(1)からペプチド以上の大きさの分子は表皮内に浸透しずらいと考えられた。]3:ペプチド含有粘着テープTRP-2またはOVAペプチド含有粘着テープを日東電工(株)との共同で開発した。皮膚に貼った場合、脂溶性のTRP-2ペプチドテープはペプチドが放出されにくいが、水溶性のOVAペプチドは効果的に放出され、表皮内に浸透することが判明した。角質層を粘着テープによるストリッピング(TS)で急性に破壊した皮膚は、その後24時間をピークに物質透過性を高め、表皮ランゲルハンス(LC)も活性化し、MHC分子,CD40,CD80,CD86などT細胞の抗原提示に重要な分子の発現を増強させ、近傍リンパ節へと移動する。そこで、B6マウスを用いた系でTS後24時間が経過したマウス耳翼皮膚にメラノーマ関連抗原(MAA)ペプチドTRP-2を塗布したところ、近傍の頚部リンパ節内でTRP-2特異的CTL誘導が見られた。さらにその2週間後に腹部TS皮膚を用いてTRP-2ペプチド塗布を再度行えば、全身でTRP-2特異的CTLを感作できることが判明した。In vitro実験からTS皮膚を介したCTL感作は表皮LCに依存的である。TS皮膚を用いてTRP-2免疫したマウスはメラノーマ細胞の移植を拒絶できるが、同様に肺癌ペプチド免疫したマウスに肺癌細胞を移植した場合、その効果はメラノーマ細胞を用いた場合より弱い、この原因として、もともと存在する種々の腫瘍に特異的なCTLプレカーサー頻度が多分に影響している。次にマウス研究をヒトで応用するために、角質層破壊後のヒト表皮LC表面抗原を解析した結果、マウスと同様にMHC,CD40,CD80,CD86分子の発現がガラス基盤付着瞬間接着剤ストリッピング(GS)を用いた角質層破壊から1224時間後に増強すること、さらには最大限のLC活性化を実現するためには、年齢に応じたGS回数が重要なことが判明した。さらに、GSにより角質層破壊した皮膚へのマラリアまたはHIVペプチド塗布では、その後末梢血中におけるそれらペプチド特異的なCTL頻度がわずかながら(47%)増強することも判明した。以上の結果より、経皮的ペプチド免疫法はマウスなどげっ歯類ばかりでなくヒトにおいても応用可能であると考えられた。
細胞間コミュニケーション分析に向けた多点細胞分泌物採取デバイスの開発

本研究は、細胞分泌物による細胞間コミュニケーションの分析を実現するため、200μmの空間分解能で微量液体採取が任意の回数行える、マイクロバンドルプローブ(μBundle)の開発を目的としている。多数の毛細管の束から構成させるμBundleを培養組織等の試料に接近させμBundle中に分泌物を吸引する。毛細管の位置と吸引タイミングから、細胞分泌物の空間分布を経時的に取得し化学分析する。本研究では多数の神経回路で構成される中枢神経組織を対象として、高次神経機能と細胞分泌物の関係性をμBundleによる多点経時分析によって解析する。
血管原性脳浮腫の研究:血液脳関門の観点から

ラット脳より毛細血管内皮細胞,アストロサイト,ペリサイトを分離培養し,血液脳関門のin vitroモデルを作成した.スタチンを投与することでTEERは約30%上昇し,sodium fluorosceinの透過性は低下し,バリア機能が上昇した.さらにスタチン投与にてclaudin-5の発現が上昇した.細胞内除法伝達経路としてはGGPPが重要であることを同定した.臨床症例では特に内頸動脈海綿静脈洞瘻の患者5例について臨床像,血管造影所見,治療効果などについて分析した.臨床症例では原因は交通事故3例,転倒・転落2例で,外傷から治療までの期間は1ヵ月から7ヵ月であった.血管造影上,全例で上眼静脈への流出を認め,眼症状を来した.Cortical refluxを伴っていた症例では脳出血を合併した.シャント量はhigh flow 3例,moderate flow 2例であった.治療はシャント閉塞術を3例に,母血管閉塞術を2例に施行した.治療後に3例でシャントは消失し,2例でわずかに残存したが,その後閉塞した.治療後に眼球突出および結膜充血は改善したが,1例で軽度の外転神経麻痺が残存した.1例で脳出血による運動性失語と右半身麻痺が残存した.ラット脳より毛細血管内皮細胞,アストロサイト,ペリサイトを分離培養し,血液脳関門のin vitroモデルを作成した.スタチンを投与することでTEERは約30%上昇し,sodium fluorosceinの透過性は低下し,バリア機能が上昇した.さらにスタチン投与にてclaudin-5の発現が上昇した.細胞内除法伝達経路としてはGGPPが重要であることを同定した.臨床症例では特に内頸動脈海綿静脈洞瘻の患者5例について臨床像,血管造影所見,治療効果などについて分析した.臨床症例では原因は交通事故3例,転倒・転落2例で,外傷から治療までの期間は1ヵ月から7ヵ月であった.血管造影上,全例で上眼静脈への流出を認め,眼症状を来した.Cortical refluxを伴っていた症例では脳出血を合併した.シャント量はhigh flow 3例,moderate flow 2例であった.治療はシャント閉塞術を3例に,母血管閉塞術を2例に施行した.治療後に3例でシャントは消失し,2例でわずかに残存したが,その後閉塞した.治療後に眼球突出および結膜充血は改善したが,1例で軽度の外転神経麻痺が残存した.1例で脳出血による運動性失語と右半身麻痺が残存した.スタチンは脂質の低下作用があり,高脂血症の治療薬として用いられているが,その他にも内皮細胞保護効果などの効果がある.血液脳関門(Blood-brain barrier;BBB)in vitroモデルを用いてスタチンのBBBの効果について検討した.2週令Wistarラットおよび高血圧ラットより脳毛細血管内皮細胞を分離し,Transwellに培養することにより,BBB in vitroモデルを作成した.Transendothelial electrical resistance(TEER)を測定した.sodium fluoresceinおよびEvans blue albuminの透過性を測定した.内皮細胞は敷石状となりBBBの特徴であるclaudin-5,occludin,ZO-1などのtight junction蛋白を発現していた.また,Scavenger receptorを発現し,標識されたLDLは細胞内に取込まれた.スタチンの投与ではTEERは有意に上昇し,claudin-5が強く発現していた.tPAは脳毛細血管内内皮細胞に対して傷害性に作用し,脳梗塞の2次性増悪に関与し,スタチンは脳毛細血管内内皮細胞にclaudin-5の発現を亢進させ,バリア機能を高めることが明らかになった.硬膜動静脈における脳浮腫についても検討し,適切に治療することで多くは改善することを第25回日本脳神経血管内治療学会総会において発表した.ラット脳より毛細血管内皮細胞,アストロサイト,ペリサイトを分離培養し,血液脳関門のin vitroモデルを作成した.スタチンを投与することでTEERは約30%上昇し,sodium fluorosceinの透過性は低下し,バリア機能が上昇した.さらにスタチン投与にてclaudin-5の発現が上昇した.細胞内除法伝達経路としてはGGPPが重要であることを同定した.臨床症例では特に内頸動脈海綿静脈洞瘻の患者5例について臨床像,血管造影所見,治療効果などについて分析した.臨床症例では原因は交通事故3例,転倒・転落2例で,外傷から治療までの期間は1ヵ月から7ヵ月であった.血管造影上,全例で上眼静脈への流出を認め,眼症状を来した.Cortical refluxを伴っていた症例では脳出血を合併した.シャント量はhigh flow 3例,moderate flow 2例であった.治療はシャント閉塞術を3例に,母血管閉塞術を2例に施行した.治療後に3例でシャントは消失し,2例でわずかに残存したが,その後閉塞した.治療後に眼球突出および結膜充血は改善したが,1例で軽度の外転神経麻痺が残存した.1例で脳出血による運動性失語と右半身麻痺が残存した.
平均型ベクトル基準値を持つ多目的マルコフ決定過程の凸最適解の研究

平均型ベクトル基準値を持つ多目的有限マルコフ決定過程の問題とは多目的評価値を持つ動的数理計画問題の1つである。割引率を持つマルコフ決定過程問題とよく対比される。R^P_+をPー次元ユ-クリッド空間での非負象限とする。本研究はR^P_+に関する最大化問題(パレ-ト問題)に対する大域的凸最適解の存在と解法について考察した。原点を頂点に持つ閉凸錐の減少系列でR^P_+を含むものをK_0⊃K_1⊃...⊃R^P_+とする。本研究の第1の目的は大域的凸最適解の存在性を示すことであった。それはK_0を閉半空間や辞書式順序を与える凸錐などに選ぶと,政策改良法によって収束した時に得られる極大解が求めるものであることを示すことにより達せられた。第2の目的は最も一般的な多重マルコフ連鎖の場合へ発展させることであった。それは推移確率行列の余因数行列を用いて,多重連鎖をきっちりといくつかのエルゴ-ド類に小分割することによって得られた。またパレ-ト解は1つの集合を形成するのであるが,そこで最適性の判定にもこれは適用できるなど新しい発見があった。BASICプログラミングによって数値計算例を与えることができた。第3の目的は多状態多重連鎖をなすベクトル基準値を持つマルコフ決定法が,数理学習認識論におけるパタ-ン認識の問題へと応用することであった。いわゆるボルツマンマシン問題を多重連鎖の場合へと拡張することにより乱画像の復元をもつと改良したい。12のサンプルデ-タをハ-ドディスク上に作成し,手作業でニュ-ロコンピュ-タのボ-ド上で試運転処理してみると,目的に近い結果が得られている。プログラム記述領域の64キロバイトという制約のために,総合運転をなすには到っていない。第1と第2の目的が達せられたので,中間結果としてとりあえず宮崎大学教育学部紀要第72号に英文で投稿する。第3の目的は実験終了し次第報告する。
T細胞ホメオスターシス増殖の調節機構の解明

Cytotoxic Tlymphocyte associated antigen-4(CTLA-4)は、T細胞の活性化に伴って一過性に発現し活性化に対する負のシグナルを伝達するホメオスターシス調節分子であるが、その誘導機構は明らかになっていない。ヒトおよびマウスにおいて、CTLA-4遺伝子の発現低下はさまざまな自己免疫疾患を発症するという事実はT細胞のホメオスターシス維持におけるCTLA-4の重要性を示している。研究代表者は、平成14年度においてCTLA-4欠損マウス、IL-2/IL-2R欠損マウス両者ともにT細胞の異常増殖が認められ生後数週齢前後までに死亡することに着目し、CTLA4の発現誘導におけるIL-2の役割およびCTLA-4のホメオスターシス増殖機構における分子基盤を明らかにする事を目的として検討した。その結果、野生型マウス、IL-2/IL-2R欠損マウス、MHCクラスI拘束性TCRのみを発現するマウス(P14TCR)、P14TCR IL-2/IL-2R欠損マウス、MHCクラスII拘束性TCRを発現するマウス(Cyt5.cc7TCR)、Cyt5.cc7TCR IL-2/IL-2R欠損マウスなどの解析から、「IL-2はCTLA-4の発現に必須のサイトカインである」という重要な知見を得た。またIL-2はCTLA-4分子の細胞内局在を調節しているのではなく遺伝子発現を誘導していることを見い出した。さらに平成15年度には、ヒトT細胞でもCTLA-4の発現誘導にIL-2が必要であることを明らかにした。またin vivoにおいても樹状細胞の生産するIL-2がCTLA-4の誘導を介したT細胞のホメオスターシス制御に重要であることを示唆する結果を得ており、今後検討していく予定である。1)単一のTCRを発現しIL-2あるいはIL-15遺伝子を欠損する(TCR-RAG-2KO-IL-2KO、TCR-RAG-2KO-IL-15KO)マウスを作製した。それらのマウス由来のT細胞を抗原ペプチドで刺激したところ、TCR-RAG-2KO-IL-2KOマウスT細胞ではCTLA-4がほとんど誘導されずIL-2を添加することでCTLA-4の誘導が正常レベルに回復した。一方、TCR-RAG-2KO-IL-15KOマウス由来のT細胞にはコントロールマウスと同程度のCTLA-4が誘導された。以上のことから,抗原特異的な系でもIL-2こそがCTLA-4の誘導に必須であるごとが証明された。2)in vivoでのT細胞ホメオスターシス増殖におけるCTLA-4の役割を明らかにする目的で、TCR-RAG-2KO-CTLA-4KOマウスを作製した。同マウス由来のT細胞をRAG-2KOマウスに移入しin vivoでのホメオスターシス増殖を検討した結果、コントロールマウスに比べ増殖の有意な亢進が観祭され、CTLA-4を介する刺激によりT細胞ホメオスターシス増殖が抑制されることが示された。本年度の研究では、平成14年度の研究成果をさらに発展させて、ヒトT細胞においても活性化に伴うCTLA-4の発現誘導にIL-2が重要なことを見い出した。またin vivoでのCTLA-4発現誘導におけるIL-2の重要性とホメオスターシス増殖の制御における同機構の役割を検討した。MHCクラスI拘束性の単一のT細胞レセプター(TCR)を発現するコントロール

TCR-RAG-2KOマウスおよびTCR-RAG-2KO-IL-2KO、TCR-RAG-2KO-IL-15KOマウスからナイーブT細胞を分離して、それぞれのT細胞をRAG-2KO、RAG-2KO-IL-2KO、およびRAG-2KO-IL-15KOマウスに移入した。経時的に末梢血を採取し、検出されるT細胞の数を指標にして、生体内でのホメオスターシス増殖におけるIL-2の重要性を検討した。その結果、TCR-RAG-2KO T細胞をRAG-2KOマウスに移入した系に比べて、同T細胞をRAG-2KO-IL-2KOマウスに移入した場合にはホメオスターシス増殖の有意な亢進が、逆にRAG-2KO-IL-15KOマウスに移入した際にはホメオスターシス増殖の低下が観察された。その他の系では顕著な差異は観られなかった。このことから、ホメオスターシス増殖の促進と抑制には、おそらく樹状細胞由来のIL-2とIL-15がそれぞれ重要であることが示唆された。
ATLに対する有効な造血幹細胞移植/細胞・免疫療法の開発

成人T細胞白血病(ATL)はレトロウイルスであるHTLV-Iに感染したT細胞が引き起こす悪性腫瘍で、その治療は困難を極めている。この現状を打開するために、本研究では、ATLを治すための新しい治療を開発することを目指した。まず、現在行われている同種造血幹細胞移植を安全に行い、しかも治療成績を上げるためには何が必要かを明らかにした。さらに、より副作用が少なくて有効な治療を開発するために、ATL細胞を特異的に傷害する免疫反応を起こす方法を開発した。本研究では、従来のものよりも有効なATLに対する造血幹細胞移植/細胞・免疫療法を開発することを目的としている。初年度はそのための基礎研究として、ATLに発現する新しい腫瘍関連抗原の同定、担癌状態での免疫抑制機構の解析、移植後再発例(AML)対するWT-1ペプチドと樹状細胞(DC)を用いた細胞・免疫療法の臨床試験を行った。(1)患者血清を用いたSEREX法によるスクリーニングでATLの1例よりがん関連抗原SRPK1を同定し、これが実際にその白血病細胞に発現し、患者血清が反応することを証明した(Br.J.Haematol.,130:382,2005)。また、HLA class Iに結合しているペプチドをLC/MS解析で直接網羅的に同定する方法により、ATL由来の3種の細胞株から10種類のallele拘束性の新しい腫瘍関連ペプチドを同定した。その中の一つのペプチドを用いて実際に健常人ドナーよりCTLを誘導することに成功し、それがHLA class I拘束性、抗原特異的にATL細胞を殺傷することを示した(論文投稿中)。(2)以前より担癌マウスの系において、CD11b+Gr-1+の骨髄性免疫抑制細胞(MSC)と呼ばれる細胞が増加しており、NOやTGF-βを産生することなどによって、腫瘍に対するT細胞反応を抑制することが知られている。MSCの免疫抑制活性を抑える因子を探すために、担癌マウスの脾細胞に種々のサイトカインを加えたところ、インターフェロン(IFN)-α/βを加えたときにのみMSCの活性が抑えられて、T細胞の増殖が回復することを見いだした。(3)AMLの同種造血幹細胞移植後再発例でDLIが無効だった症例に対して、ドナー単球由来DCとWT-1ペプチドを用いた細胞・免疫療法を施行し、殆ど副作用がなく安全に行えることを確認した。今後これらの研究成果を実際のATLの治療に応用する予定である。1.SEREX法およびLC-MS法を用いたATL関連腫瘍抗原の同定と免疫治療への応用同種移植後のATL患者の血清を用いたSEREX法による解析で、GVL関連抗原候補としてAMFRを同定した。AMFRは膜蛋白でありtestisおよび一部の症例のATL細胞に強く発現していたことから、抗体療法や細胞療法の標的分子になる可能性がある。一方、3種類のATL細胞株からHLA class I結合ペプチドをHPLC-Mass spectrometry(LC-MS)法にて解析し、188個の各HLA拘束性ペプチドをシークエンスし、RT-PCRによる正常組織との発現比較から10個の新規腫瘍抗原候補を同定した。その中で、cancer-testis抗原の一つであるPRAMEのB*62拘束性ペプチドGQHLHLETF、および新規抗原CDKL5のB*62拘束性ペプチドQVNQAALLTYに関して、B*62+健常人よりそれぞれの抗原に特異的なCTLを誘導することに成功した。それぞれのCTLはB*62+ PRAME+またはB*62+ CDKL5+のATL細胞株に対して特異的細胞傷害活性を示した。これらのペプチドは、ワクチン療法、樹状細胞療法、腫瘍特異的DLIへの利用が期待される。2.ATLに対する同種移植の成績、問題点、今後の改善計画2007年3月までに計24例のATL患者に同種造血幹細胞移植を実施し、観察期間中央値22ヶ月(1-51ヶ月)の時点で、移植時に部分寛解以上の治療効果が得られていた13例中10例が生存中である。移植前化学療法抵抗例での成績は不良であり、全症例の2年生存率は24%であったことから、至適な移殖方法の確立のためには、ATLの病型別に、前処置、幹細胞ソース、GVHD予防法など生存に影響を与える有意な因子を同定することが必要と考えられる。(研究目的)本研究では、1)現在ATLに対して実施している造血幹細胞移植を、より安全に、より多くの症例に、かつ有効におこなう方法を開発し、一方で、2)細胞・免疫療法に最適の標的抗原を検索し、臨床に使用可能で有効なエフェクター細胞の作成にむけた基礎研究をすすめ、現在の造血幹細胞移植よりも一層有効なATLに対する造血幹細胞移植/細胞・免疫療法の開発を目的とする。(平成19年度の研究成果)1)患者血清を用いたSEREX法によるスクリーニングとLC/MSを用いたATL細胞のHLA classIペプチドの網羅的解析を継続しておこなった。

LC/MSでは、ATL患者由来の白血病細胞株から数種類のallele拘束性のペプチドを同定し、その中で新規抗原CDKL5由来ペプチドで、HLA拘束性のCTLの誘導が可能であることを証明した(J. Immunother.,30:499-505,2007)。同種造血幹細胞移植後にGVT効果が観察された患者の検体を用いたSEREX法により、これまで様々な癌種でその発現と予後との相関が報告されているAMFRが単離されたが(Int. J. Hematol.,83:351-555,2006)、免疫組織染色により一部ATLでの過剰発現を確認した。2)一方で、日本造血細胞移植学会・骨髄バンク・臍帯血バンクに登録されたATLに対する同種造血幹細胞移植全症例を対象にした過去最大の後方視的解析をおこない、厳密な統計学的手法を用い、移植時寛解・非寛解を問わず、I-II度の急性GVHD発症群での生存率が、非発症群より良好でおり、graft-versus-ATL効果の存在が示唆されることを初めて明らかにした(2007年米国血液学会で発表)。(研究目的)本研究では、1)現在ATLに対して実施している造血幹細胞移植を、より安全に、より多くの症例に、かつ有効におこなう方法を開発し、一方で、2)細胞・免疫療法に最適の標的抗原および免疫学的手法を検索し、臨床に使用可能で有効なエフェクター細胞の作成にむけた基礎研究をすすめ、現在の造血幹細胞移植よりも一層有効なATLに対する造血幹細胞移植/細胞・免疫療法の開発を目的とする。(平成20年度の研究成果)1)ATL患者で同種造血幹細胞移植後にGVT効果が観察された時期の血清を用いて、SEREX法による標的抗原のスクリーニングを引き続きおこない、ATL患者由来の白血病細胞株からLC/MSを用いて同定されたPRAMEに対しての生体内でのCTLの解析をペンタマーを用いて複数の患者でおこなった。2)日本造血細胞移植学会・骨髄バンク・臍帯血バンクに登録されたATLに対する同種造血幹細胞移植全症例を対象にした後方視的解析をおこない、造血幹細胞ごとの移植成績を比較するとともに、成績に影響する因子を解析した(投稿準備中)。一方で、AMLの同種移植後再発に対する樹状細胞を用いた細胞免疫療法の成果を発表するとともに(Am J Hematol 83 : 315-317, 2008)、ATLと同様に難治性造血器腫瘍である高齢者AMLに対し樹状細胞療法の免疫療法を進め、安全性とともに、5例中3例で免疫反応を、2例でstable diseaseの臨床効果を得た。また、樹状細胞の活性化方法を最適化することにより、T細胞刺激に重要なCD70の発現を亢進させる方法を見いだした(投稿中)。こうした一連の基礎的、臨床的研究により、適切な抗原と組み合わせたATLに対する細胞免疫療法を行ううえでの基盤を確立した。【目的】1)現在ATLに対して行われている造血幹細胞移植の安全性、有効性を高め、対象症例の拡大を図るとともに、2)新たな細胞・免疫療法の開発に向けて、臨床に使用可能で有効な免疫細胞を作製するための基礎研究を進める。これらを組み合わせることにより、難治性疾患であるATLの治療成績を改善することを目的とする。【平成21年度の成果】
理論化学計算に基づく高選択的有機反応の設計

有機反応の経路を制御し,望む生成物だけを与える高選択的な有機合成を実現することは化学者の長年の夢である.この究極の目的に向けて,本研究は,ab initio分子軌道法計算によって複雑な有機反応の選択性の発現要因を解明し、これを実験結果に照らして評価しながら新有機反応の計算を行なった.本年度は,実験的に重要なジアルキル銅リチウムのアセチレンへの付加反応に関する理論検討を中心におこない,なぜ多原子クラスター構造がこのような試薬の活性発現に重要なのかを明らかにした.本研究ではこの点について明らかにするためにab intio分子軌道法計算を行った.有機銅試薬のモデルとしてE,Fを用い,基底関数としてCuに関してはWachtersの全電子用拡張基底にHayらのdiffuse d関数を加えたものを用い,その他の元素に関しては6-31G^*を用いた.まずHartree-Fock法を用いて反応経路を検討したところ,原系,生成物,付加の遷移状態が求まったが、遷移状態に至るπ錯体は求まらなかった.これはCuとアセチレンとの相互作用が過少評価されたためであろう.また遷移状態のエネルギーをMP2法で1点計算をしたところ原系に比べて遷移状態が40kcal/mol程度と非現実的に高かった.第一周期遷移金属の銅原子では電子相関が重要であることが明かとなった.そこでfrozen core近似のMP2法を用い構造最適化を行った結果,原系,錯体,遷移状態,生成物が求まり,活性化エネルギーはMP2レベルで26.6kcal/molと求められた.有機反応の経路を制御し,望む生成物だけを与える高選択的な有機合成を実現することは化学者の長年の夢である.この究極の目的に向けて,本研究は,ab initio分子軌道法計算によって複雑な有機反応の選択性の発現要因を解明し、これを実験結果に照らして評価しながら新有機反応の計算を行なった.本年度は,実験的に重要なジアルキル銅リチウムのアセチレンへの付加反応に関する理論検討を中心におこない,なぜ多原子クラスター構造がこのような試薬の活性発現に重要なのかを明らかにした.本研究ではこの点について明らかにするためにab intio分子軌道法計算を行った.有機銅試薬のモデルとしてE,Fを用い,基底関数としてCuに関してはWachtersの全電子用拡張基底にHayらのdiffuse d関数を加えたものを用い,その他の元素に関しては6-31G^*を用いた.まずHartree-Fock法を用いて反応経路を検討したところ,原系,生成物,付加の遷移状態が求まったが、遷移状態に至るπ錯体は求まらなかった.これはCuとアセチレンとの相互作用が過少評価されたためであろう.また遷移状態のエネルギーをMP2法で1点計算をしたところ原系に比べて遷移状態が40kcal/mol程度と非現実的に高かった.第一周期遷移金属の銅原子では電子相関が重要であることが明かとなった.そこでfrozen core近似のMP2法を用い構造最適化を行った結果,原系,錯体,遷移状態,生成物が求まり,活性化エネルギーはMP2レベルで26.6kcal/molと求められた.
イネいもち病菌におけるDNA二本鎖切断修復による進化機構の解明

本研究では無性的な生活環を有するイネいもち病菌の遺伝的多様性および病原性変異が,体細胞分裂期に生じるDNA二本鎖切断(DSBs)を起点とした修復過程(相同組換え)において生じるかどうかの検証を目的とした。これまで,いもち病菌ゲノムにおけるDSBs修復機構について有用な知見は得られていない。そこで,相同組換えモニター系および希少制限酵素遺伝子I-Sce Iを用いて,いもち病菌ゲノムにおける人為的DSBsの導入とその修復機構の基礎研究をおこなった。相同遺伝子がゲノム内に散在しているいもち病菌系統においては,活性酸素誘導剤等の薬剤ストレスおよびDSBsの導入により,非交叉型の相同組換えが有意に誘導されることを見出した。同様に,相同組換えに必要な相同領域の長さや遺伝子のコピー数等の諸条件についても明らかにした。一方で,相同配列が存在しない系統においては,主に遺伝子内部またはその遺伝子領域全般が高い割合で欠失するのに対して,相同配列を有する系統においては欠失の割合の減少に伴い,相同組換え頻度の割合が上昇することから,体細胞相同組換えはゲノムの安定化に寄与していると同時に,多様性の創出にも貢献していることが考えられた。DSB修復と病原性変異との関連性を調査するために,糸状菌用に改変した人工ヌクレアーゼZFNおよびTALENを構築した。ZFNはI-SceIの15%程度のヌクレアーゼ活性を示し, Scytalone dehydratase (SDH)遺伝子のターゲッティング効率を約50%程度まで上昇させたが,強い細胞毒性が観察された。一方, TALENはI-SceIとほぼ同等のヌクレアーゼ活性を示し, SDH遺伝子ターゲッティング効率を100%まで上昇させた。以上より糸状菌用人工ヌクレアーゼの構築に成功し,高効率遺伝子ターゲッティング法を確立した。さらに,非病原性遺伝子を標的としたTALENによるDSB導入により,その修復過程でいもち病菌の病原性変異が生じることを見出した。DNA二本鎖切断修復過程において生じる遺伝的変異は,自然界で確認されているいもち病菌の遺伝的多様性と非常に類似していることを明らかにした。また,これらの知見をから任意のゲノム配列に二本鎖切断を導入することが可能な糸状菌用人工ヌクレアーゼZFNおよびTALENを構築した。TALENを用いることで,内生の遺伝子への二本鎖切断導入が可能となり,病原性変異とDSB修復の関連性を明らかにした。また,ヌクレアーゼ活性評価の過程で,新たな遺伝子ターゲッティング法の開発に成功したことから,当初の計画以上に進展したと評価した。いもち病菌を含む糸状菌は他の高等真核生物とは異なる独自のDNA二本鎖切断修復機構を有していることが考えられた。今後は人工ヌクレアーゼを用いた糸状菌独自のゲノム編集技術の確立や植物病原糸状菌のゲノム環境に依存したゲノム再編成機構について推進していくことができる。本研究では無性的な生活環を有するイネいもち病菌の遺伝的多様性および病原性変異が,体細胞分裂時に生じるDNA二本鎖切断(DSBs)とその修復過程(相同組換え)において生じるかどうかの検証を目的とする。イネいもち病菌のDSBs修復機構については有用な知見が得られていないことから,本年度は相同組換えモニター系および希少制限酵素遺伝子1-Sce Iを用いて,イネいもち病菌ゲノムへの人為的DSBsの導入とその修復機構の基礎的解析をおこなった。相同遺伝子がゲノム内に散在しているイネいもち病菌系統においては,活性酸素誘導剤等の薬剤ストレスおよびDSBsの導入により,非交叉型の相同組換えが有意に誘導されることを見出した。相同配列が存在しない系統においては,主に遺伝子内部またはその遺伝子領域全域が高い割合で欠失するのに対して,相同配列を有する系統においては欠失の割合の減少に伴い,相同組換え修復の割合が上昇することから,体細胞相同組換えはゲノムの安定化に寄与していると同時に,多様性の創出にも貢献していることが考えられた。上記の知見から,DSBsの人為的導入が遺伝子ターゲッティング法の高効率化に応用することが可能でると考え,相同組換えモニター系を用いた遺伝子ターゲティング効率の簡易評価法を構築した。その結果,外来DNAの導入と共に標的遺伝子内にDSBsを誘導することで,遺伝子ターゲッティング効率を大幅に上昇させることに成功した。

一方で,相同配列が存在しない系統においては,主に遺伝子内部またはその遺伝子領域全般が高い割合で欠失するのに対して,相同配列を有する系統においては欠失の割合の減少に伴い,相同組換え頻度の割合が上昇することから,体細胞相同組換えはゲノムの安定化に寄与していると同時に,多様性の創出にも貢献していることが考えられた。DSB修復と病原性変異との関連性を調査するために,糸状菌用に改変した人工ヌクレアーゼZFNおよびTALENを構築した。ZFNはI-SceIの15%程度のヌクレアーゼ活性を示し, Scytalone dehydratase (SDH)遺伝子のターゲッティング効率を約50%程度まで上昇させたが,強い細胞毒性が観察された。一方, TALENはI-SceIとほぼ同等のヌクレアーゼ活性を示し, SDH遺伝子ターゲッティング効率を100%まで上昇させた。以上より糸状菌用人工ヌクレアーゼの構築に成功し,高効率遺伝子ターゲッティング法を確立した。さらに,非病原性遺伝子を標的としたTALENによるDSB導入により,その修復過程でいもち病菌の病原性変異が生じることを見出した。DSBs修復過程において生じる遺伝的変異は,自然界で確認されているイネいもち病菌の遺伝的多様性と非常に類似していることを示した。また,これらの知見を応用することで,新たな遺伝子ターゲッティング法への応用に発展させることに成功し,当初の計画以上に進展したと評価した。DNA二本鎖切断修復過程において生じる遺伝的変異は,自然界で確認されているいもち病菌の遺伝的多様性と非常に類似していることを明らかにした。また,これらの知見をから任意のゲノム配列に二本鎖切断を導入することが可能な糸状菌用人工ヌクレアーゼZFNおよびTALENを構築した。TALENを用いることで,内生の遺伝子への二本鎖切断導入が可能となり,病原性変異とDSB修復の関連性を明らかにした。また,ヌクレアーゼ活性評価の過程で,新たな遺伝子ターゲッティング法の開発に成功したことから,当初の計画以上に進展したと評価した。今年度に得られた知見から,イネいもち病菌の進化がDSBsとその修復過程によって生じることの実証をおこなう。また,実用的な高効率遺伝子ターゲッティング法の確立を新たな目標として設定する。これらの目標を達成するためには,特定の遺伝子領域に自由にDSBsを導入することが必要となる。本研究では近年注目を集めているtranscription activator-like effector nucleases(TALENs)を用いて更なる研究の推進を計る。TALENsにおいては既に,イネいもち病菌用の作成ツールを構築し,適用可能であることを実証している。いもち病菌を含む糸状菌は他の高等真核生物とは異なる独自のDNA二本鎖切断修復機構を有していることが考えられた。今後は人工ヌクレアーゼを用いた糸状菌独自のゲノム編集技術の確立や植物病原糸状菌のゲノム環境に依存したゲノム再編成機構について推進していくことができる。