hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己免疫性腎疾患における樹状細胞と細胞内シグナル伝達の関与

ヒト全身性エリテマトーシス類似の病態を呈するMRL-Fas^<lpr>マウスを用いて自己免疫性腎障害における樹状細胞(DCs)とp38MAPKの関与を検討した.われわれの結果よりDCsはp38MAPK活性化を介して自己免疫性臓器障害の進展に関与することが示唆された.樹状細胞の制御は自己免疫性臓器障害の新たな治療標的として有用であると考えられた。ループス腎炎を代表とする自己免疫性腎炎において,自己反応性トレランスの破綻が発症に関与することが知られているが,その抗原提示細胞の対応抗原やeffector細胞との関連など不明な点が多い.樹状細胞はプロフェッショナルな抗原提示細胞として非リンパ組織を含め種々の臓器に分布し自己に対するトレランスにも関与しており、最近,炎症性疾患の進展過程において樹状細胞の果たす意義が報告されている.さらに樹状細胞の活性化においてシグナル伝達経路としてp38MAPKが関与することが報告されている.しかしながら、腎疾患における樹状細胞の浸潤・活性化ならびに疾患進展機序との関連は目下のところ十分に解明されてはいない.そこで全身性エリテマトーシスにおいて樹状細胞ならびにケモカイン,およびp38 MAPKの相互機序に着目し,進行性腎障害への関与とその制御による腎不全進展阻止の可能性にむけた研究を行った.この研究課題においてはヒト全身性エリテマトーシス類似の病態を呈するMRL-Fas^<lpr>マウスを用いて自己免疫性腎障害における樹状細胞(DCs)とp38MAPKの関与を検討した.MRL-Fas^<lpr>マウスの腎臓でDCsは疾患活動性に一致して増加した.p38MAPK抑制薬の投与により疾患活動性は低下し、DCsの浸潤も低下した.DCsの成熟に関与するサイトカインであるHMGB-1はp38MAPK抑制により発現が低下した.TNF-α,IL-1βにて刺激した培養未熟ヒトDCsはp38 MAPK抑制にて成熟化の抑制,HMGB-1分泌低下が認められた.以上よりDCsはp38MAPK活性化を介して自己免疫性臓器障害の進展に関与することが示唆された.これらの結果より樹状細胞の制御は自己免疫性臓器障害の新たな治療標的として有用であると考えられた。ループス腎炎を代表とする自己免疫性腎炎において,自己反応性トレランスの破綻が発症に関与することが知られているが,その抗原提示細胞の対応抗原やeffector細胞との関連など不明な点が多い.近年,肝炎モデルや炎症性腸疾患モデルなどの炎症性疾患の進展過程において樹状細胞(DCs)の果たす意義が報告されている.またDCsにはCCR7に代表されるケモカイン受容体が発現し、その遊走にケモカインの関与すること,さらにDCsの活性化においてp38MAPKが関与することも報告されている.一方,われわれは急速進行性糸球体腎炎の進展機序にhighmobility group box chromosomal protein-1(HMGB-1)とその受容体(RAGE)が関与していることを確認した(投稿準備中)が,最近DCsがp38MAPKを介し活性化するとHMGB-1を分泌することが報告されている.そこでわれわれはループスモデルマウスにおいてDCsならびにケモカイン, HMGB-1およびp38MAPKの相互機序に着目し,進行性腎障害への関与を検討した.腎臓においてDCsは疾患活動性に一致して増加し, DCsの成熟に関与するHMGB-1が腎臓に認められた. p38MAPK抑制によりHMGB-1の蛋白およびmRNA発現のいずれも減少した. TNF-α, IL-1βにて刺激した培養DCsはFR投与で成熟化が抑制され, HMGB-1, IL-12, IL-23分泌も減少した.以上の結果よりDCsはp38MAPK活性化を介して自己免疫性臓器障害の進展に関与し,その制御は治療標的として重要な因子であると考えられた.
移動体と連携した自律分散型センシングによる交通基盤施設のリアルタイム危機制御

まず,移動体(列車,自動車)によるセンシング手法の確立に向けた研究を行った.計測システムはMEMS加速度計,位置を知るための小型GPS,小型ノートブックPCから構成し,車両,自動車に設置してフィールドで測定を行った.線路や路面の状態と加速度(鉛直)応答との関係を調査し,その再現性,速度依存性,車両依存性などを調べた.再現性は,極めて高いことが確認された.車両依存性については,同一路面(軌道)上での応答からキャリブレーションする方法を提案した.GPSによる位置同定は誤差が大きいため,路面や軌道における特徴点(段差,レール継ぎ目)を利用して,誤差を大幅に減らす方法を提案した.次に,橋梁などの構造物系におけるセンシングデータの処理法について検討を加えた.用いたのは,横浜ベイブリッジで行われている地震応答記録(過去20年分)である.最新の多点入力多点出力同定手法を改良し,高次モードの同定にも成功し,あわせて,地震時には,特異な振動モーで振舞うことを同定解析から明らかにした.次に,移動体と構造系(橋梁)の双方をセンシングした場合の動的応答からの構造同定の定式化を行い,移動体の荷重として作用を知ることによる同定精度の構造を数値計算例を通じて明らかにすることができた.一方,センシングの手法として,近年注目されているワイヤレスセンサーによる測定手法についての検討を行った.Imote2を用い,そのミドルウェアの開発(同期計測,データ欠損,散協調型処理)を行い,実用化への道に近づけた.まず,移動体(列車,自動車)によるセンシング手法の確立に向けた研究を行った.計測システムはMEMS加速度計,位置を知るための小型GPS,小型ノートブックPCから構成し,車両,自動車に設置してフィールドで測定を行った.線路や路面の状態と加速度(鉛直)応答との関係を調査し,その再現性,速度依存性,車両依存性などを調べた.再現性は,極めて高いことが確認された.車両依存性については,同一路面(軌道)上での応答からキャリブレーションする方法を提案した.GPSによる位置同定は誤差が大きいため,路面や軌道における特徴点(段差,レール継ぎ目)を利用して,誤差を大幅に減らす方法を提案した.次に,橋梁などの構造物系におけるセンシングデータの処理法について検討を加えた.用いたのは,横浜ベイブリッジで行われている地震応答記録(過去20年分)である.最新の多点入力多点出力同定手法を改良し,高次モードの同定にも成功し,あわせて,地震時には,特異な振動モーで振舞うことを同定解析から明らかにした.次に,移動体と構造系(橋梁)の双方をセンシングした場合の動的応答からの構造同定の定式化を行い,移動体の荷重として作用を知ることによる同定精度の構造を数値計算例を通じて明らかにすることができた.一方,センシングの手法として,近年注目されているワイヤレスセンサーによる測定手法についての検討を行った.Imote2を用い,そのミドルウェアの開発(同期計測,データ欠損,散協調型処理)を行い,実用化への道に近づけた.鉄道や道路などの高架橋の保全のための損傷検知,地震などの突発災害時のあとの損傷検知をセンシングにより行う方式を研究してきた.荷重源として,あるいは,センシング情報の収集として,自動車や列車などの移動体も視野に入れている.本研究で現在行っていること,および得られた知見は,1)多次元ARモデルを使った局部応答からの分散型損傷検出アルゴリズムの構築とその検証2)ウェーブレートを使った地震応答のデータからのリアルタイム損傷検出アルゴリズムの構築とその検証3)東大キャンパス建物での地震応答計測とデータの蓄積4)実建物,構造物を対象とした簡易リアルタイム損傷検出法の構築5)長大橋を対象に,横浜ベイブリッジの多点地震応答記録を入手し,開発した多点入力多点出力データにより動特性同定を適用し,高次モードまでの固有振動数,モード減衰,モード形の検出に成功した6)上記の間題において,橋軸方向の1次モードに3種類存在することがわかった.この3つのモードは,端部の2つのリンクが回転するか否かによって生じ,設計では考慮されていないモードが実地震時に発生しうることを明らかにした.また,この回転の有無が大地震の応答,安全性に及ぼす影響について,検討を加えた.まず,移動体(列車,自動車)によるセンシング手法の確立に向けた研究を行った。計測システムはMEMS加速度計,位置を知るための小型GPS,小型ノートブックPCから構成し,車両,自動車に設置してフィールドで測定を行った。線路や路面の状態と加速度(鉛直)応答との関係を調査し,その再現性,速度依存性,車両依存性などを調べた。再現性は,極めて高いことが確認された。車両依存性にっいては,同一路面(軌道)上での応答からキャリブレーションする方法を提案した。GPSによる位置同定は誤差が大きいため,路面や軌道における特徴点(段差,レール継ぎ目)を利用して,誤差を大幅に減らす方法を提案した。次に,橋梁などの構造物系におけるセンシングデータの処理法について検討を加えた。用いたのは,横浜ベイブリッジで行われている地震応答記録(過去20年分)である。最新の多点入力多点出力同定手法を改良し,高次モードの同定にも成功し,あわせて,地震時には,特異な振動モーで振舞うことを同定解析から明らかにした。次に,移動体と構造系(橋梁)の双方をセンシングした場合の動的応答からの構造同定の定式化を行い,移動体の荷重として作用を知ることによる同定精度の構造を数値計算例を通じて明らかにすることができた。

一方,センシングの手法として,近年注目されているワイヤレスセンサーによる測定手法についての検討を行った。Imote2を用い,そのミドルウェアの開発(同期計測,データ欠損,散協調型処理)を行い,実用化への道に近づけた。
破骨細胞との共存下における癌細胞の生存促進と薬剤耐性の機序の解明およびその克服

酸性環境下において骨髄腫細胞は酸を感受しPI3K-Aktを介する生存経路を活性化し、この活性化がさらに自らのpHセンサーの発現を増強し骨髄腫細胞の酸感受性と生存シグナルを亢進するという悪循環が形成されていることが示唆された。また、酸環境下では骨髄腫細胞の転写因子Sp1の核移行が促進され、ヒストン脱アセチル化酵素HDACの発現が誘導されアポトーシス誘導因子DR4の遺伝子発現が抑制された。HDAC阻害薬はこのDR4の発現抑制を回復させた。よってDR4アゴニスト抗体とHDAC阻害薬の併用、PI3K-Akt経路阻害薬は酸が賦与する骨髄腫細胞の薬剤耐性を克服する治療薬の候補と考えられた。DR4は検討したすべてのMM細胞に構成的に発現していた。乳酸を添加しpH6.8に調整した培地でMM細胞株(RPMI8226、INA6、MM1S)を培養すると、DR4 mRNAとともに細胞表面DR4の発現が著明に低下していた。また、破骨細胞との共存培養によってもMM細胞のDR4の発現が低下した。さらに、このような酸性環境下ではrTRAILによるMM細胞株に対する細胞傷害活性が減弱した。そこで我々は、酸性環境でDR4の発現低下がおこるメカニズムについての検討を行った。酸性環境では、ヒストンH3、H4のアセチル化が減少しており、さらにHDAC1、HDAC2の増加を認めた。加えて、HDACの発現を調節することで知られる転写因子SP1の核移行をみとめた。これらのことからDR4の発現低下にはヒストン脱アセチル化によるエピジェネティックな制御が関わっていることが推察され、ChIP assayによって酸性環境ではヒストンH3K9の脱アセチル化がDR4プロモーター領域においておこっていることを明らかにした。HDAC阻害剤であるバルプロ酸は酸性環境においてもDR4の発現を回復させた。酸性環境においては抗DR4アゴニスト抗体はその抗腫瘍効果を減弱させたが、バルプロ酸との併用により抗DR4アゴニスト抗体は酸性環境においても抗腫瘍効果を発揮した。多発性骨髄腫(MM)骨病変部では高度な酸性環境が形成されており、MM細胞が酸環境に適応しつつ薬剤耐性を獲得するという機構を明らかにしてきた。しかし、腫瘍細胞の酸感受受容体(pHセンサー)の発現調節機構については不明なことが多い。今回、酸性環境が及ぼすMM細胞のpHセンサーの発現とその下流シグナルの調節機序について調べた。1)酸性培地あるいは破骨細胞との共存下でMM細胞株を培養すると、Aktのリン酸化とともにPim-2キナーゼの発現が誘導された。2) MM細胞株ではTDAG8、TRPV1などのpHセンサーが様々なレベルで発現したが、酸性環境下および破骨細胞共存下ではこれらの発現が亢進した。特に、破骨細胞との共存下ではこれらの発現亢進がより著明であった。3) PI3K阻害薬LY294002の添加により、酸性環境下でのAktのリン酸化の誘導が消失するとともにこれらのpHセンサーの発現亢進も減弱した。Pim阻害薬SMI-16aも用量依存的に酸性下でのpHセンサーの発現亢進を抑制した。4)酸性下ではMM細胞の転写因子Sp1の核移行が促進され、この核移行はLY294002の添加によって抑制された。Sp1阻害薬terameprocolの添加により特に低pH領域を感知するTRPV1の酸性下での発現亢進が選択的に抑制された。5) Pim阻害薬SMI-16aは酸性下でより強力にMM細胞株に細胞死を誘導した。この作用はPI3K阻害薬の併用で協調的に増強された。MM細胞は酸を感受しPI3K-AktおよびPim-2を介する生存経路を活性化し、この活性化がさらに自らのpHセンサーの発現を増強しMM細胞の酸感受性と生存シグナルを亢進するという悪循環が形成されていることが示唆された。Pim阻害薬およびPI3K-Akt経路阻害薬は酸環境が賦与するMM細胞の薬剤耐性を克服する治療薬の候補と考えられた。骨髄腫細胞あるいは癌細胞株における細胞外pH受容器であるGタンパク共役受容体およびバニロイド受容体のTRPV1を発現しており、また、酸性環境(乳酸添加下、破骨細胞との共存培養下)においては癌細胞の生存に重要な役割を担うAktのリン酸化の亢進が認められた。多くのMM細胞に構成的に発現しているdeath receptorのDR4の発現が酸性環境下mRNAおよびタンパクともに著明に低下していた。

このDR4の発現低下およびrTRAILによるMM細胞株に対する細胞傷害活性が減弱しており、酸性環境でDR4の発現低下がおこるメカニズムについての検討を行った結果、ヒストンH3、H4のアセチル化が減少しており、さらにHDAC1、HDAC2の増加を認めた。加えて、HDACの発現を調節することで知られる転写因子SP1の核移行をみとめた。これらのことからDR4の発現低下にはヒストン脱アセチル化によるエピジェネティックな制御が関わっていることが推察され、ChIP assayによって酸性環境ではヒストンH3K9の脱アセチル化がDR4プロモーター領域においておこっていることを明らかにした。HDAC阻害剤であるバルプロ酸は酸性環境においてもDR4の発現を回復させ、酸性環境においては抗DR4アゴニスト抗体はその抗腫瘍効果を減弱させたが、バルプロ酸との併用により抗DR4アゴニスト抗体は酸性環境において抗腫瘍効果を発揮した。以上の結果より、MM細胞と破骨細胞が形成する酸環境はMM細胞の生存シグナルを増強し、さらに免疫系細胞の機能を抑制し腫瘍細胞を免疫監視機構から逸脱させるが、MM細胞にDR4の発現抑制をもたらし、免疫担当細胞の機能抑制と相まってTRAILに対する耐性を獲得させることが示唆された。また、HDAC阻害薬の併用は酸性環境下においてTRAIL作用を用いた細胞免疫療法の治療効果を回復させると考えられた。25年度が最終年度であるため、記入しない。酸性環境におけるAktのリン酸化促進とpH感受受容体、Pim-2ならびにヒストン脱アセチル化などのエピジェネティック制御の関連を調べるとともに、同様の機構によりDR4以外の様々な遺伝子が酸性環境において調節されていることが予想されるため、酸性環境が種々の細胞に与える影響について、より一層の分子生物学的に分析する。また、骨髄腫モデルマウスを用いた免疫療法はin vivo実験が確立されていないため、そのモデルおよび方法の確立を行う。TRAILとHDAC阻害薬の併用が細胞株を用いた実験で有効であることが示されたので、動物モデルを確立でき次第、これらの併用療法のより臨床的な意義を求める。
回転場の非圧縮流体に対する漸近展開とその応用

Coriolis力を伴った定常Navier-Stokesに対し,2乗可積分空間で解をCoriolis^(-m)のオーダーで漸近展開し(m=2,3),それぞれのオーダーの漸近方程式とその解の解析を行った.Coriolis力を伴った定常Navier-Stokesに対し,2乗可積分空間で解をCoriolis^(-m)のオーダーで漸近展開し(m=2,3),それぞれのオーダーの漸近方程式とその解の解析を行った.本研究の目的は、Coriolis力を伴うNavier-Stokes方程式(回転場の流体)にたいして、次の問題を解決することである:1)定常解のCoriolis力ついての解の漸近展開。2)漸近展開の各項の方程式(モデル方程式)の決定。3)モデル方程式の検証。今年度は、定常解の漸近展開を一般のp乗可積分空間で行えるか否かを解析した。ただし1<p<∞である。結果的は解決に至らなかった。本年度の研究では、p乗可積分関数空間での解の解析は本問題にはなじまないことが分かった。Coriolis項を含むStokes問題が、Coriolis力に対して一様評価を持たないことが判明しためである。今後考えられるのは、重みを持ったp乗可積分関数空間でCoriolis力に関して一様評価が出来るかと言うことだが、今後の検討課題である。現在は、2乗可積分空間の場合に、Coriolisの漸近挙動は分かっているので、この解の漸近挙動を更に明確にする為1/(Coriolis力)のオーダーで漸近展開し、それぞれのオーダーの漸近方程式とその解の存在と一意性の解析を行っている。1/(Corlolis力)のオーダーで漸近展開以外にも、1/(Coriolis力)^mのオーダーでの漸近展開で意味のある漸近展開が出来るかどうかも検討する予定である。これらの解析は、まとまりのある結果とはなっていないので解析を進めていく予定である。この解析を通じ意味のあるモデル方程式が現れることを期待しているところである。今年度は、2乗可積分空間の場合に、解を1/(Coriolis力)^mで漸近展開し、それぞれのオーダーでモデル方程式を導出し解析を行うことを目的とした。実際にはm=2,3のオーダーで漸近展開し、それぞれのオーダーの漸近方程式の解の解析を行なった。研究協力者の笹山氏の享禄の下に数値解析を行い、解の状況をしらべた。現状では、数値解析の誤差のためか、この解析を通じ意味のあるモデル方程式かどうか判断がつかない状況である。この誤差を判断するために、収束する近似解を構成する解析を行った。この解析にはCoriolis力について一様な評価も必要なため、解析はまだ結果に至っていない。このほかにもCoriolis力を伴う現象には、境界層(Eckman境界層)が典型的な現象として知られている。この現象についてモデル方程式を新たに作るために、接合漸近展開の観点から境界層の解析も行った。ただし境界層の解析については、回転場のないNavier-Stokes方程式の境界層を表すモデル方程式Prandtle方程式を対象とし、最近のZ.Xin、Analysis of some singular solutions in fluid dynamicsの解析を参考にし、L^2上のSbolev空間で解析できるかを解析している途中である。接合漸近展開から,境界層方程式を正当化する解析は,いくつか近いものはあるが,未だ満足のいく状況ではない。L^2空間での解析が行えると,マッチングがうまくいく可能性がある。以上が今年度の研究実績である。昨年度は,2乗可積分空間の場合に,解を1/(Coriolis力)^mのオーダーで漸近展開し(m=2,3),それぞれのオーダーの漸近方程式とその解の解析を行った.さらに境界層方程式の解析も行った.今年度は,今までの解析に加え,境界層方程式の更なる解析も併せて行った.回転場での流体モデルの検証には,境界層の挙動をどう見るべきかを考える必要があるのではないか,という事に昨年度思い至ったのが理由である.Coriolis力のない場合でも境界層方程式の解析は容易ではないので,Coriolis力のない場合を取り扱った.この計算は今後の研究の下地にする計算で,今年度は,定常2次元境界層方程式,いわゆるPrandtl方程式のある条件(後述)を満たす解が,境界の近くでどのような挙動示すかを解析する準備の計算を行った.具体的には,どのような変数変換でPrandtl方程式の解のエネルギーが定義出来るかを,様々な変数変換で調べてみた.対象とした方程式はPrandtl方程式のVon Mises形式である.この方程式は境界に平行な速度成分の2乗が満たす方程式で,境界に垂直な変数は流線とした方程式である.この方程式の解のクラスは境界に垂直な変数に関して単調増加で,境界上では0(境界条件),境界から離れた場所での解の値は正である様なクラスとした.なおこのような解は実際に構成されている(Oleinik, Matsui-Shirotaなど).この解に対する満足の行く変換はまだ発見できていないが,おおむねの方向はとらえることが出来た.なお,本研究の論文成果は執筆中である.以上が今年度の研究実績である.
成長期から成熟期にかけての身体活動レベルとラット骨格筋機能の関連性について

本研究は成長期成熟期にかけての自発運動がラット骨格筋の形態・機能的特性に及ぼす影響について検討した。4週齢のSD系雄ラットを1週間の予備飼育の後,15週齢まで10週間の自発運動実施群(15VA群)と35週齢まで30週間自発運動実施群(35VA群)及び,それぞれの週齢にマッチした安静群,計4群に無作為に分けた。それぞれの実験期間終了後,ラットを麻酔下で屠殺し,ヒラメ筋及び足底筋を摘出した。摘出筋の湿重量後,それらを直ちに-80°Cのディープフリーザー内で保存した。その後,それぞれの筋で筋線維タイプ別の筋線維横断面積(CSA),ミオシン重鎖(MHC)アイソフォーム組成及びクエン酸合成酵素(CS)活性の測定を行った。自発運動量の影響は,MHCアイソフォーム組成においては足底筋において顕著に認められた。TypeIIB MHCの相対値は,同週齢のSC群に比べ15VA,35VA群とも有意に低下した。それに伴い15VA群ではTypeIIA MHCの相対値が,335VA群ではType IIX MHCの相対値が,同週齢のSC群に比べ有意に増加した。また,各MHCアイソフォームの相対値と自発運動量との関係を検討した結果から,1)低いレベルの活動量でも足底筋のType IIB MHC→Type IIX MHCへの移行は起こりやすい傾向にあること,2)Type IIX MHC→Type IIA MHCへの移行には,比較的高いレベルの活動量が必要になることが示唆された。CSAの有意な増加は35VA群の足底筋におけるType IIX, IIB線維のみで認められた。また,両自発運動群のCS活性は,足底筋,ヒラメ筋とも有意な増加は認められなかった。これらの結果から,自発運動量に対する応答は骨格筋のそれぞれの機能及びラットの成熟過程によって異なることが示唆された。4週齢のSD系雄ラットを1週間の予備飼育の後、無作為に安静(SC)群と自発運動(VA)群の2群に分け30週間個別飼育した。実験期間終了後、ラットを麻酔下で屠殺し、ヒラメ筋及び足底筋を摘出した。摘出筋の湿重量を測定した後、それらを直ちに-80°Cのディープフリーザー内に凍結保存した。その後、筋線維タイプ別の横断面積(CSA)及びミオシン重鎖(MHC)アイソフォーム組成の分析を行った。ラットの自発運動量は,その成熟過程に伴い変化した。すなわち,精力的な身体活動期を含む自発運動開始110週目における1日当たりの平均自発走行距離は2456±1421mであったのに対し、11週目30週目までのその値は551±209mと著しく減少した。また、実験終了後の体重は、両群間に有意な差は認められなかった。しかし、VA群の足底筋の筋湿重量(体重当たりの相対値)は、SC群に比べ有意な高値を示した。CSAに関しては、VA群の足底筋type IIx及びIIb線維がSC群の値に比べ有意な高値を示し、MHCアイソフォーム組成では、足底筋のtype IIbにおいてVA群の値がSC群に比べ有意な低値を、type IIxでは有意な高値を示した。type IIa及びtype I線維のCSAは11週目30週目の自発運動量と高い相関(type IIa : r=0.857,P<0.05,type I : r=0.925,P<0.01)が認められ,MHCアイソフォーム組成においても、同様の傾向が認められた。これらの結果から、身体活動量の低下抑制が、骨格筋の、特に速筋中の遅筋線維及び速筋線維の一部において、その形態や機能の維持に重要な要因であることが示唆された。

CSAの有意な増加は35VA群の足底筋におけるType IIX, IIB線維のみで認められた。また,両自発運動群のCS活性は,足底筋,ヒラメ筋とも有意な増加は認められなかった。これらの結果から,自発運動量に対する応答は骨格筋のそれぞれの機能及びラットの成熟過程によって異なることが示唆された。
側鎖構造に起因するグルコシノレートの多様な生理的役割の解明

植物二次代謝産物であるグルコシノレート(GLS)は、外敵に対する化学的防御物質であると同時に、植物自身の生命活動を制御するシグナルとしてもはたらくと考えられている。本研究では、GLSの多機能性と、一個体あたり20種類にも及ぶ側鎖構造の多様性との関係を明らかにすることを目指した。様々なGLSで処理したシロイヌナズナ実生のトランスクリプトームを比較解析し,「GLSに幅広く保存される機能」と,「特定の側鎖構造をもつGLS分子種のみが示す機能」に関する知見を得た。また、安定同位体標識GLSを合成し、LCMSを用いた代謝物解析から、細胞内で活性発現の起点になると考えられる新しい分解経路を見出した。二次代謝産物の構造多様性は多くの天然物化学者を魅了してきたが、その生産意義を生理的役割の観点から実験的に証明できた例はごくわずかである。植物二次代謝産物であるグルコシノレートは、外敵に対する化学的防御物質であると同時に、植物自身の生命活動を制御するシグナルとしてもはたらくと考えられている。植物一個体が生産するグルコシノレートの側鎖構造は20種類にも及ぶため、本研究では「グルコシノレートの多機能性は側鎖の化学構造の多様性に由来するのか」に着目した。グルコシノレート分子種ごとの機能差を細胞レベルで検出することを目的とし、「植物培養細胞」と「メタボローム・トランスクリプトーム統合解析」を組み合わせた評価系の構築と活用を行った。本年度は、化合物ツールとして利用するグルコシノレート類の化学合成と、グルコシノレートを生産するモデル植物であるシロイヌナズナを用いた各種評価系の構築を行い、以下の結果が得られた。1トリプトファン由来グルコシノレートの化学合成を行い、それをもとに分子ターゲット同定を指向したプローブ化合物を作製した。2様々なグルコシノレートで処理したシロイヌナズナ実生のトランスクリプトームを比較解析し、側鎖構造に起因する生理活性の多様性を検証した。特に、ストレス応答に関連する遺伝子群の発現変動パターンがグルコシノレートの種類によって大きく異なることが見出された。3シロイヌナズナ培養細胞および植物体のプロトプラスト化を行い、グルコシノレート処理に対する応答を細胞レベルで観察可能な評価系を構築した。本研究では様々な側鎖をもつグルコシノレート分子種の活性差について、1グルコシノレート処理細胞のメタボローム・トランスクリプトーム、および2グルコシノレート分解物と直接結合する内在タンパク質という2つの角度からの検証を予定している。1については、各種グルコシノレートで処理したシロイヌナズナ実生のデータ取得・解析手法について予備検討を終え、グルコシノレート分子種に応じた発現変動遺伝子群の抽出にも成功した。今後、オミクスデータの再現性・統計学的有意差の確認とリアルタイムPCRなどによる検証実験を終えれば、論文化を期待できる段階まで達している。2については、論文記載のグルコシノレート合成法を再現でき、非天然型の誘導体合成にも成功した。一方で、放射性同位体標識グルコシノレートの合成には、収率・廃棄物・コストの面から合成ルートの再検討が必要であり、この点が課題である。非放射性プローブ化合物の合成は完了しているため、適用可能なグルコシノレート分子種は限られるものの、当初の目的である結合タンパク質の同定に向けた実験系構築は継続可能である。前年度に得られたトランスクリプトームの結果を検証する過程で、シロイヌナズナに添加したグルコシノレートが予想よりも速やかに分解されていることが分かった。これは植物組織の破壊を伴わない未知の分解機構を介すると考えられたため、植物細胞内で生成する分解産物が従来の経路と異なる可能性が生じた。そこで本年度は、側鎖構造に由来する活性差の検証に先立ち、グルコシノレートに共通する細胞内分解のメカニズム解明を目指し、以下の結果を得た。1脂肪族アミノ酸由来グルコシノレートを重水素でラベルした誘導体を合成し、LC-MSを用いて分解産物の網羅的解析を行った。2液体培地中のシロイヌナズナに添加したグルコシノレートは速やかにイソチオシアネートに分解され、続いて化合物X, Yの蓄積が観察された。メタボロームおよびトランスクリプトームの解析から、この変換反応に必要な代謝物・遺伝子を複数同定した。3遺伝子発現およびグルコシノレート量の変動がグルコシノレート添加時の応答と類似している環境ストレス条件を見出し、両条件の比較解析を行った。

様々なGLSで処理したシロイヌナズナ実生のトランスクリプトームを比較解析し,「GLSに幅広く保存される機能」と,「特定の側鎖構造をもつGLS分子種のみが示す機能」に関する知見を得た。また、安定同位体標識GLSを合成し、LCMSを用いた代謝物解析から、細胞内で活性発現の起点になると考えられる新しい分解経路を見出した。1では、各種グルコシノレートで処理したシロイヌナズナ実生のデータ取得・解析手法について予備検討を終え、現在、十分な反復数を持つメタボローム・トランスクリプトームデータの取得に取り掛かっている。得られた結果について、予備実験の再現性および統計学的有意差を評価し、グルコシノレートに共通する変化(候補A)・特定のグルコシノレート分子種のみが示す変化(候補B)に該当する遺伝子群を選抜する。ストレス応答に関与する遺伝子群に大きな発現量変化が見られているため、これらを特に注視する。得られた候補遺伝子の変異株を取得し、より多様なグルコシノレート分子種に対する表現型を比較解析することで、グルコシノレートの生理機能と候補遺伝子との関係を明らかにする。2においては、グルコシノレートの14C標識化技術を引き続き検討していく。並行して、非放射性タグ分子を組み込んだ誘導体を用い、グルコシノレート分解物と直接結合する内在タンパク質の同定を目指す基盤技術を構築していく。解析モデルとして、細胞壁合成を制御することが知られる特異なグルコシノレート分子種の内在ターゲット同定を目指す。現在、アルキンタグを導入した誘導体を作成し、オリジナルと同様の生理活性を保持することが確認できた。この誘導体で処理したシロイヌナズナの全タンパク質を抽出し、蛍光官能基やビオチンと結合させることで、誘導体の分解物と直接結合している生体分子を可視化後、MS解析により同定する。候補遺伝子が本グルコシノレート分子種の活性に寄与しているかは、培養細胞やプロトプラストにおける一過性ノックダウンによって評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。天然物化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
圧力ジャンプによる結晶成長の速度論的観察

結晶成長機構に及ぼす圧力の効果は未だ明らかではない。本研究では、圧力ジャンプによって速度論的観察の環境を大幅に向上させ、成長形(溶解形)・成長(溶解)速度の圧力・温度・組成・過飽和度依存性の系統的な観察を行なう。それにより拡散、核生成、二次元核生成、ラフニング転移等における圧力の効果を探索する。(1)自動化には至らなかったが、マッキントッシュのパソコンに結晶画像を入力し、より高精度な成長速度の読み取りが可能になった。(2)トルエン溶媒から成長するベンゼン及びナフタレン単結晶の成長形のコーナーが、各組成で、臨界温度Tc以下ではシヤープ、以上ではラウンドし、そのTcは組成(圧力)依存性を示すことは前年度報告した。このモルフォロジー変化はコーナーの位置に(過飽和度が十分に低ければ)小さな特異面が存在し、Tcでその面のサーマル・ラフニング転移が起きるためと考えられる。本年度にさらに検討を進めた結果、上記のラウンドとシヤープの変化は上羽の理論と密接に関係することが分かり、新しい研究の方向が見いだされた。(3)パラキシレンについては、a.溶解過程の速度論的観察により拡散係数の圧力・温度依存性のラフな評価ができ、b.核生成頻度の圧力・温度依存性の検出と、c.成長形の温度・圧力・組成・過飽和度依存性の系統的な観察が行なわれた。bでは界面張力の圧力依存性が導出された。cでは成長形が多面体から骸晶に変化する臨界過飽和度の存在とその圧力・温度依存性が見いだされ、ステップ自由エネルギーの圧力・温度依存性により説明可能であることが示された。その他に拡散係数の圧力・温度依存性も考慮すべきであるが、aの結果を用いた検討は未了である。しかし、cの臨界過飽和度から評価されたステップ自由エネルギーと、cの界面張力が同様な圧力依存性を示すことは、ステップ自由エネルギーの圧力依存性検出を支持しているといえよう。
DNA損傷時の修復蛋白質の挙動をトレースする非侵襲センサーマウスの開発と時空解析

本研究では、DNA損傷時の修復蛋白質の挙動をトレースするために、非侵襲センサーマウスを開発することを第一の目的とした。Ku70はDNA二本鎖切断損傷(DSB)を認識し、結合する修復蛋白質である。DNA修復時のKu70の挙動をトレースするために、GFPに融合したKu70(GFP-Ku70)を発現するマウスを作製した。また、導入したGFP-Ku70はDSB損傷を損傷直後から検出するために有効であることをマウス上皮細胞で確認した。放射線はDNAに損傷を起こし、ガンや遺伝病等を誘発する。従って、医療放射線、飛行環境、原子力事故等を主な線源とする放射線の人体への影響の解明は安全性評価や放射線防護の実際に即して今後の重要な課題である。他方、これまで主に培養細胞を材料とした解析により得られてきた「分子レベルでの放射線応答機構の解析結果」を実際の人体の放射線影響の解明とリスク評価の精度向上に役立てるには、今後、培養細胞での解析に加えて、非ヒトモデル哺乳類個体を材料とした分子レベルでの解析が不可欠とされている。本年度は、DNA修復蛋白質Ku70の挙動と損傷した細胞の運命をトレースするためのDNA損傷センサーマウスを開発することを目的に研究をスタートした。トランスジェニックマウスの作出を成功させる為には、導入遺伝子の構築が重要であるが、中でもプロモーターの選択は重要である。そこで、本研究では皮膚で十分な発現量が期待されるプロモーターの選択を行った。はじめに、予備実験を行い外来性のセンサーとして利用するGFP融合Ku70蛋白質の発現を皮膚の上皮細胞で恒常的に強力に誘導するプロモーターとして、ケラチン分子種のプロモーターを選択した。次いで、遺伝子工学技法により、プロモーターの下流にGFPを融合したKu70遺伝子を連結した発現(プラスミド)ベクターを構築した。次いで、発現ベクターを大腸菌で大量複製した後に、制限酵素処理により、GFP-Ku70とプロモーター領域、TATA配列、ポリAシグナル等からなる発現に必要な最小限の遺伝子断片にし、導入用に精製を行った。それから、定法に従いトランスジェニックマウス(C57BL/6J)を作出し、遺伝子導入の可否を尾由来のゲノムDNAを材料に特異プライマーを用いたPCR法により行った。その結果、複数の遺伝子導入されたマウスが検出された。また、非侵襲で経時的に解析するための損傷イメージング実験システムの構築に向けた基礎実験を開始した。21年度は、GFP-Ku70を皮膚表皮基底細胞で発現するマウスの有効性の検証を引き続き行った。同時に、非侵襲で経時的に解析するための損傷イメージング実験システムの構築を目指し実験を行った。前年度までに作出した複数系統のマウスについて産子への遺伝子導入の可否を尾由来のゲノムDNAを材料に特異プライマーを用いたPCR法により確認した。その結果、生殖細胞を通じて導入遺伝子が子孫に遺伝することを確認できた。次に、導入遺伝子が安定して発現することを確認するために、皮膚を材料に導入遺伝子産物の発現量をウエスタンブロット法と細胞染色法で検証を行った。その結果、全ての系統で十分な発現量が得られていないことが明らかになった。そこで、発現ベクターを再構築し直し、常法に従い、再度、トランスジェニックマウス(C57BL/6J)を作出した。それから、得られた産子の遺伝子導入の可否を尾由来のゲノムDNAを材料に特異プライマーを用いたPCR法により行った。その結果、4匹のマウスのゲノムDNAから導入した遺伝子断片が検出された。また、皮膚の一部について導入遺伝子産物の発現を確認したところ、十分な発現量が得られていた。同時に、損傷イメージング実験システムの構築に向けて、種々の条件検索のための基礎実験を培養細胞やマウス個体を用いて進めた。

22年度は、GFP-Ku70を皮膚表皮基底細胞で発現するマウスの開発とそのマウス系統の樹立を目指して、引き続き実験を行った。同時に、非侵襲で経時的に解析するための損傷イメージング実験システムの構築を目指して、培養細胞やマウス個体を材料に種々の基礎実験を進めた。前年度までに再構築し直した発現ベクターにより作出した複数のトランスジェニック(Tg)マウス(C57BL/6J)系統について産子への遺伝子導入の可否を、特異プライマーを用いたPCR法により解析した。その結果、導入遺伝子が生殖細胞を通じて子孫に安定に遺伝することを、尾由来のゲノムDNAを材料に再確認できた。次に、導入遺伝子が安定して発現することを確認するために、子孫マウスの皮膚を材料に導入遺伝子産物の発現量をウエスタンブロット法で検証した。その結果、少なくとも一系統では十分な発現量が得られていることが明らかになった。以上の結果は、GFP-Ku70を皮膚表皮基底細胞で発現するマウス系統が得られたことを示唆する。ところで、これまでのところTGマウス(♀)からの子孫は得られたが、TGマウス(♂)からの子孫は得られていない。尚、この雌雄差については例数が少ないので、今後、更に検討する必要がある。
ノニルフェノール(内分泌攪乱物質)化合物分解遺伝子の解明

ノニルフェノールモノエトキシレート(NPEO_1)やノニルフェノールジエトキシレート(NPEO_2)は工業用界面活性剤のノニルフェノールポリエトキシレート(NPEOn)が微生物分解されて生じる内分泌かく乱物質である。本研究では我々が海浜環境から分離したノニルフェノール-1,-2,-3エトキシレート(NPEO_<1-3>)分解細菌Marinobacter sp. TY4株について、その分解活性や遺伝子構造ならびに突然変異株を用いて分解に関与する遣伝子の解析を行った。その結果,(1)catA欠失株の作製に成功したが、(2)欠失株がNPEO1-3を分解したことから,catA遺伝子はNPEO_<1-3>分解に直接関与していないことがわかった。(3)欠失株には微弱なカテコール分解活性が残っていた。カテコール分解遺伝子を複数持つ細菌がすでに報告されていることから,TY4株はこのcatAの他にもカテコール分解遺伝子を持ち,これによりNPEO1-3が分解されると推察された。(4)Marinobacter sp.TY4株は粒子にノニルフェノール化合物が吸着した状態でのみ分解能を発揮することがわかった。(5)benA欠失株はNPEO1-3分解に関与するcatA以外の遺伝子の発現に影響して分解能の発現を遅らせることが示唆された。(6)分解活性が定常期細胞にのみ見られたことから,定常増殖期に入って脆弱になった細菌細胞から分解酵素が漏出して,NPEO_<1-3>を分解していると考えられた。ノニルフェノールモノエトキシレート(NPEO_1)やノニルフェノールジェトキシレート(NPEO_2)は工業用界面活性剤のノニルフェノールポリエトキシレート(NPEOn)が微生物分解されて生じる内分泌かく乱物質である。これら物質は水質や底質から頻繁に検出され,魚介類の健康被害が危惧されている。我々は,ノニルフェノール-1,-2,-3エトキシレート(NPEO_<1-3>)分解細菌Marinobacter sp.TY4株を海浜環境から分離し,それが芳香族化合物分解遺伝子群(catBCA,benABCDKE)を持つことを明らかにしている。そこで,芳香環の開裂に重要な酵素のカテコール1,2-ジオキシゲネース遺伝子(catA)を欠失した突然変異株を構築し,その分解活性を調べた。その結果,(1)catA欠失株の作製に成功したが、(2)欠失株がNPEO_<1-3>を分解したことから,catA遺伝子はNPEO_<1-3>分解に直接関与していないことがわかった。カテコール分解遺伝子を複数持つ細菌がすでに報告されていることから,TY4株はこのcatAの他にもカテコール分解遺伝子を持ち,これによりNPEO_<1-3>が分解されると推察された。(4)また分解活性は培養基質に影響されないことから構成酵素と判断され、(5)分解活性が定常増殖期4日以降の細菌細胞にのみ見られたことから,定常増殖期に入って脆弱になった細菌細胞から分解酵素が漏出して,NPEO_<1-3>を分解していると考えられた。これら物質は水質や底質から頻繁に検出され,魚介類の健康被害が危供されている。

我々は,ノニルフェノール-1,-2,-3エトキシレート(NPEO_<1-3>)分解細菌Marinobacter sp.TY4株を海浜環境から分離し,それが芳香族化合物分解遺伝子群(catBCA・benABCDKE)を持つことを明らかにし、17年度ではカテコール1,2-ジオキシゲネース遺伝子(catA)を欠失した突然変異株を構築し,catA遺伝子のほかにNPEO_<1-3>分解に関与する遺伝子の存在を示唆している。18年度では、catAの下流域に存在するベンゾエート1,2ジオキシゲナーゼ遺伝子benAの欠失株を作製してその影響を調べた。その結果,(1)benA欠失株の培養増殖液中のNPEO_<1-3>分解能は野生株やcatA欠失株の分解能よりも後れて発現することが分かった。(2)一方、培養定常期の細胞を集積して行った実験では、野生株との分解能の違いは見られなかった。(3)したがってbenA欠失株はNPEO_<1-3>分解に関与するcatA以外の遺伝子の発現に影響して分解能の発現を遅らせることが示唆された。(4)一方、新たにNPEO_<1-18>の混合液に極性シリカゲルを加えて分解実験を行ったところ、NPEO_<1-18>の完全分解が見られ、Marinobacter sp.TY4株は粒子にノニルフェノール化合物が吸着した状態で分解能を発揮することがわかった。
TNF-αシグナルとEGFシグナルの交差干渉におけるTAK1キナーゼの役割

増殖因子EGF受容体ファミリーは、肺がん、乳がんをはじめ多くのがん細胞で過剰発現や変異等が報告されており、がん悪性化に密接に関与している。一方、サイトカインTNF-αはストレス応答シグナルを活性化し、がん細胞の生存や転移などに密接に関与している。本研究では、TNF-シグナルとEGFシグナルがTAK1キナーゼを介して相互に影響しあい、それぞれのシグナルに対して抑制的に作用することを見出した。ErbB受容体ファミリーは、肺がん、乳がんをはじめ多くのがん細胞で過剰発現や変異等が報告されており、がん悪性化に密接に関与している。一方、TNF-αシグナル伝達系は、NF-κBやJNK/p38 MAPKなどのストレス応答シグナルを活性化し、がん細胞のアポトーシス制御や転移などに密接に関与していることが明らかにされてきた。そこで、本研究では、TNF-αシグナルとEGFシグナルの協調的制御機構について検討した。その結果、EGFによるJNK/p38活性化は、TNF-αシグナルにおいて重要な役割を果たすTAK1の活性化を介さないことを確認した。ところが、EGFはTAK 1活性化因子TAB1およびTAB2のリン酸化を誘導した。TAB1のリン酸化はp38を介していること、TAB2のリン酸化はp38を介していないことを見出した。また、これらリン酸化が起こると、TNF-αtによるTAK1活性化が阻害されることを見出した。これとは逆に、TNF-αシグナルはEGFRのチロシンキナーゼの活性化を介さずに、細胞内へ局在化させることを見出しており、両結果からTNF-αシグナルとEGFシグナルはお互い阻害し合うという現象(交差干渉)があることを見出した。また、ErbB受容体のがん悪性化に関する研究を行い、マウスメラノーマ細胞の転移能にheregulin刺激によるErbB3活性化が関与していることを見出した。これには、ErbB3とEGFRがヘテロダイマーを形成し、EGFRチロシンキナーゼが細胞内シグナルに重要な役割を果たしていることを見出した。さらに、成人T細胞白血病ウイルスの癌遺伝子産物TaxによりTAK1の恒常的活性化が起こっていることを見出した。これは、TAB2の過剰発現により起こっていること、下流のJNK-ATF2経路を活性化することを見出した。一方、TNF-αシグナル伝達系は、NF-κBやJNK/p38/ERK MAPKなどのストレス応答シグナルを活性化し、がん細胞のアポトーシス制御や転移などに密接に関与していることが明らかにされてきた。まず、EGF刺激がTAK1非依存的にTAB1およびTAB2のリン酸化を起こし、これがTNF-αによるTAK1活性化を抑制することを見出した。また、TAK1の下流シグナルであるNF-κB活性化も抑制した。一方、TNF-αシグナルはEGFRのチロシンキナーゼの活性化を介さずに、既存のチロシン残基以外のリン酸化、およびそれに伴う細胞内局在化を誘導することをすでに明らかにしている。そこで、その分子機構を解析した結果、TAK1の下流でERKを介してEGFRのThr-669が、またp38を介してEGFRのSer-1046/1047がリン酸化される二つの新しいシグナル伝達経路が存在することを見出した。Thr-669はEGFで刺激した場合においても強くリン酸化されたが、Ser-1046/1047はリガンド刺激ではほとんどリン酸化されなかった。このうち、TAK1-p38-EGFR経路はEGFRの細胞内局在化を制御するとともに、TNF-αシグナル伝達機構においてNF-κB生存シグナルとは全く独立した新たな生存シグナルとなっていることを突き止めた。以上のように、TNF-αシグナルとEGFシグナルの交差干渉の分子機構においてTAK1キナーゼが重要な役割を果たしていることを明らかにした。
血管内分泌機構(シトルリン-アルギニンサイクル)を利用した、進行動脈硬化病変治療-加齢動物進行動脈硬化モデルにおける誘導型NO合成酵素と可溶性グアニレートシクラーゼの役割-

一旦形成された動脈硬化症の治療法はまだなく、抗高脂血症薬によるプラーク安定化療法も20%前後の発症抑制に過ぎない。我々は家兎進行動脈硬化症ではNO分泌及び内皮依存性弛緩反応の低下は血清脂質を是正しても回復しない事を観察した。高脂血症、糖尿病、加齢の各動脈硬化危険因子が単独又は相互に作用する進行動脈硬化モデルを作成し,誘導型NO合成酵素(iNOS),活性酸素(O_2^-),ONOO-及びシトルリン-アルギニンサイクルの役割を検討した。結果)1)動脈硬化症におけるiNOS,ONOO-の役割:従来はeNOSの研究が主体で、iNOSの役割は不明であった。我々は、動脈硬化進行病変のマクロファージ、T細胞にiNOSを認め、周囲にONOO-を認めた。当該部位はNOSの基質である酸素及びアルギニンの不足領域でiNOSがO_2^-を産生すると推測された。2)シトルリンアルギニンサイクルの動脈硬化病変での変動:アルギニンは血中に多量に存在するが、アルギニン投与は抗動脈硬化作用を認める(アルギニンパラドックス)。動脈硬化血管、退縮血管における、アルギニン代謝経路;アルギナーゼI,II、及びシトルリン(NOS反応物質)からアルギニン再生成を誘導するシトルリン-アルギニン回路の動態を検討した。高脂肪食負荷動脈硬化形成時に、飲水中にシトルリンを投与し、無投与時、アルギニン投与時と比較検討した。動脈硬化進展抑制には飲水中のアルギニン濃度2%以上(3g/kg)が必要であり、シトルリンには作用はなかった。3)動脈硬化血管におけるニトログリセリン耐性獲得とシトルリン-アルギニンサイクル:加齢及び糖尿病各々のみでは内皮機能の低下のみを認めたが、加齢糖尿病モデルでは、平滑筋機能であるニトログリセリンの反応が低下し耐性が形成された。この耐性解除にはシトルリン及びアルギナーゼ阻害剤が部分的に有効であった。目的)高脂血症、糖尿病、加齢の3つの動脈硬化危険因子が単独又は相互に作用する進行動脈硬化モデル(家兎、ラット)を作成し、誘導型NO合成酵素(iNOS)、活性酸素(O_2)、ONOOの関与と、シトルリン-アルギニンサイクルの役割を解明する。結果)各種動脈硬化症におけるiNOS,ONOOの役割を明らかにする。方法)高脂血症モデルは、家兎に0.5%コレステロール負荷食を投与して作成した。糖尿病モデルはラットにストレブトゾトシンを接種しIDDMモデルを作成した。9週齢から108週齢まで各週齢のものを用い、加齢の影響を検討した。結果)高脂血症家兎においては、動脈硬化進行病変にiNOSを認め、ONOOをの存在を示唆するニトロチロシンも認めた。NOSの基質であるアルギニンは血中には多量に存在するが、組織中にも高濃度を認めた。動脈硬化血管、退縮血管において、アルギニン代謝経路であるアルギナーゼI,IIの産生を認めた。ラット糖尿病モデルにおいては加齢ラットにおいて血管内膜の皮厚を軽度認めるのみであった。血管反応性も、内皮由来NO分泌反応よりも、中膜平滑筋機能の低下を認め、高脂血症モデルとは異なっていた。

iNOS、ニトロチロシンを加齢糖尿病ラットの中膜平滑筋に認めた。シトルリン(NOS反応物質)からアルギニン再生成を誘導するシトルリン-アルギニン回路の動態についても検討している。これらより、動脈硬化の危険因子より動態が異なり、NO、活性酸素のみで一元的に説明できない可能性が示唆された。一旦形成された動脈硬化症の治療法はまだなく、抗高脂血症薬によるプラーク安定化療法も20%前後の発症抑制に過ぎない。我々は家兎進行動脈硬化症ではNO分泌及び内皮依存性弛緩反応の低下は血清脂質を是正しても回復しない事を観察してきた。今年度は高脂血症による進行動脈硬化モデルを家兎に作成し,誘導型NO合成酵素(iNOS),活性酸素(O2-),ONOO-及びシトルリン-アルギニンサイクルの役割を検討した。結果)1)家兎においては、動脈硬化進行病変のマクロファージ、T細胞にiNOSを認め、周囲にONOO-を認めた。当該部位はNOSの基質である酸素及びアルギニンの不足領域でiNOSがO2-を産生すると推測された。活性酸素産生酵素であるNADPHオキシダーゼの分布の変動も検討した。2)シトルリンアルギニンサイクルの動脈硬化病変での変動:アルギニンは血中に多量に存在するが、アルギニン投与は抗動脈硬化作用を認める(アルギニンパラドックス)。動脈硬化血管、退縮血管における、アルギニン代謝経路;アルギナーゼI,II、及びシトルリン(NOS反応物質)からアルギニン再生成を誘導するシトルリン-アルギニン回路の動態を検討した。高脂肪食負荷動脈硬化形成時(0.5%コレステロール食12週間)に、飲水中にシトルリンを投与し、無投与時、アルギニン投与時と比較検討した。動脈硬化進展抑制には飲水中のアルギニン濃度2%以上(3g/kg)が必要であり、シトルリンには0.4%では作用はなかった。アルギナーゼ阻害剤としてバリン、ノルバリン、オルニチンの影響を検討した。in vitroでは、ノルバリンに効果を認めた。
混合仮説検証型並列音素ラベリング(PPL)方式による話者独立音声認識システム

混合仮説検証型並列音素ラベリング方式に基づく単語音声認識システムによる認識・実験を通して、話者独立システムの認識率向上と大語彙化に対する問題点を明らかにし、その解決を試みた。(1)これまでに得られている並列音素ラベリング方式による単語音声認識システムで、辞書の単語数を1845語にして、さまざまなタイプの話者独立型のシステムの性能評価を行った。従来のタイプの話者独立型システムのエラーレートは20.7%であったが、本研究で提案のシステムのエラーレートは16.2%であり、PPL方式の有効性が確かめられた。(2)提案のPPL方式のシステムのエラーレートは、2000語程度で16%程度で一応満足できる性能であったが、エラーレートが必ずしも十分低くないので、エラーの解析を行っている。セグメンテーションとラベリングのエラーが主な原因であることは明らかであるので、それらのシステムの性能改善を試みている。(3)音素リファレンスセットの構成法として、声質の似た話者の基本セットは混合し、似ていない話者の基本セットは混合しないで並列に使用する形の構成法によるシステムが最も認識率が高いことを確かめた。