hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の対照的適応戦略に関する次世代分子生態学

対照的な適応戦略を持つ姉妹種の間で、どのような遺伝的変化が生じているかを、次世代シークエンサーを活用して解析した。キスゲ属の姉妹種(アゲハチョウ媒の昼咲き赤花種ハマカンゾウとススメガ媒の夜咲き黄花種キスゲ)では、赤い色素であるアントシアニンの量と発現量が相関する遺伝子群を同定した。これらのうち、調節遺伝子の変化によって赤花から黄花への進化が起きたことが支持された。キイチゴ属の姉妹種(落葉性・温帯性のヤクシマキイチゴと常緑性・暖帯性のリュウキュウイチゴ)では、赤色光受容体の抑制遺伝子が2種間で大きく分化していることが判明し、光受容体の抑制が落葉性・温帯性の違いに関与していることが示唆された。ハマカンゾウ(赤花・アゲハチョウ媒)とキスゲ(黄花・スズメガ媒)の花色の違いを決めているアントシアニン合成系遺伝子の特定に取り組んだ。次世代シークエンサーを使ったRNA-seq解析により、R2R3 MYB familyである転写因子(調節遺伝子)Anthocyanin 2がキスゲの花の発生過程で抑制されることを確かめた。また,ハマカンゾウの送粉者であるアゲハチョウについて,花粉一粒ジェノタイピング技術を用いて花粉の移動を実測した。その結果,短い雌蕊をもち上向きの花の方が花粉を受け取る確率が高く,浅い花冠を持つ花でより多くの花粉が運ばれていた。花粉持ち越しの減衰率はマルハナバチやハチドリよりも高かった。送粉者の花粉付着部位が翅であり,翅上の付着場所にバラツキが大きいことが理由として考えられる。ゲノム情報を用いて、温帯性キイチゴ(屋久島に分布の南限をもつモミジイチゴ)と亜熱帯性キイチゴ(屋久島に分布の北限をもつリュウキュウイチゴ)の関係を調べた。両者は姉妹関係にあり、おおよそ100万年前に種分化したと推定された。モミジイチゴは分布の南限を最終氷期にも維持したが、リュウキュウイチゴは最終氷期以後に分布を北上させ、屋久島においてモミジイチゴの分布と接触し、異なる環境に適応した近縁種との遺伝的な交流が確認された。在来種ニホンタンポポ、外来種セイヨウタンポポ、およびその雑種(無性的に種子を生産し日本各地に分布)について、耐病性遺伝子R-geneの多様性を調べ、732個の配列を得た。ニホンタンポポでは、地域特有のクラスターは認められず、地域を超えて多様な遺伝子が維持されていた。一方雑種には、計11個の特有のクラスターが認められた。雑種では、日本の病原体と共進化してきたニホンタンポポのR-geneを持たない方が有利なのかもしれない。ハマカンゾウとキスゲを材料に、つぼみ3ステージの花弁について、次世代シークエンサーを用いたRNA-seqを行った。発現量比較を行った結果、花色・花香の種差に関与していると考えられる、生合成系の候補遺伝子を得た。ハマカンゾウとキスゲの雑種F2世代を用い、花粉一粒ジェノタイピング技術を用いて、アゲハチョウとスズメガが花形質に与える淘汰圧を測定した。アゲハチョウは赤花と弱い花香を好み、アゲハチョウによってハマカンゾウ的花形質が有利となった。しかし、スズメガは意外にも花色にも花香にも明瞭な選好性を示さなかった。この結果から、キスゲの花色・花香は、スズメガ類よりもむしろ、ヤガなど他の夜行性の蛾類に対する適応であることが示唆された。温帯性キイチゴ(屋久島に分布の南限をもつモミジイチゴ)と亜熱帯性キイチゴ(屋久島に分布の北限をもつリュウキュウイチゴ)の両方が分布する屋久島では、高地に分布するモミジイチゴと低地に分布するリュウキュウイチゴの間に、中間的な標高帯において交雑帯が検出された。過去の気候変動によって異所分布する近縁種の分布域が接触し、遺伝的な交流が生じた、という仮説を検証するために、キイチゴ属のゲノム配列の決定を進め、系統関係を推定した。日本には在来種ニホンタンポポ、外来種セイヨウタンポポ、および両者の雑種(3倍体または4倍体、無性的に種子を生産しながらも稀に花粉を通じて在来種と戻し交配する)が広く分布している。雑種が日本の病原体に対して適応進化のしている可能性を検証するため、耐病性遺伝子R-geneの多様性を調べた。まず、GS FLX-tiを用いたESTライブラリ作成によって、2倍体在来タンポポで176個の候補R-geneを得た。次に2倍体在来タンポポ、雑種、セイヨウタンポポについて、レタスのNBS領域のプライマーを用いてPCR、クローニングを行い、732個の配列を得た。

昼咲き種ハマカンゾウ(アゲハチョウ媒)と夜咲き種キスゲ(スズメガ媒)を材料として、送粉者についての野外実験、花色を決める遺伝子の解析、種分化過程のモデリングを総合し、昼咲種から夜咲種が分化する過程についての実証的な研究を行った。スズメガが夜間にUVの色覚を利用して花を選んでいる証拠を得た。花色の種差を決めている候補遺伝子として、R2R3MYB familyであるAN2様遺伝子を得た。この遺伝子は、キスゲでは配列長がハマカンゾウの2倍以上になっており、イントロン領域の2ヶ所に長い挿入があった。また、昼から夜への開花時間の変化が種分化を駆動する条件をモデリングにより解明した。一方で、次世代シーケンサーを用いたゲノム網羅的多型解析のための新たな手法として、マルチプレックスPCRによってゲノム内の数千以上の領域を同時に増幅し、同時に読み取る手法を開発した。ハマカンゾウとキスゲのF1個体の葯から花粉を単離し、花粉一粒ずつからDNAを抽出した後、この新手法による分析を行った。その結果、226座のSNPを得た。この新手法は簡便かつ低コストで、広い範囲の生物種・サンプルに対して迅速な遺伝的解析を可能にする。このほか、温帯性・落葉性のヤクシマキイチゴと、暖帯性・常緑性のリュウキュウイチゴの種分化の遺伝的背景を調べるために、ヤクシマキイチゴの全ゲノムドラフトシーケンスを決定した。さらに、ヤクシマキイチゴおよびリュウキュウイチゴ各4個体から得た、合計25,224個のSNPs(一塩基多型)を用いて2種間のFst(集団間分化)を推定し、高いFst値をもつゲノム領域を探索した。その結果、特に高いFst値をもつ領域の直下に、光受容体であるPhyAのサプレッサー遺伝子が見つかった。こうした遺伝子が、リュウキュウイチゴとヤクシマキイチゴの適応的種分化に関わったと推測される。26年度が最終年度であるため、記入しない。生態学26年度が最終年度であるため、記入しない。ハマカンゾウとキスゲを材料に進めているプロジェクトでは、(1)花色・花香の種差を決めている遺伝子を決定する、(2)雑種F2世代を含む実験集団を使って、アゲハチョウとスズメガが花色・花香に与える淘汰を一花粉粒PCR法によって実測する、という2つの主目標がある。後者については、昨年度までに研究目標をほぼ達成しており、今年度はさらに、花の向きという形質に新たに着目し、ハマカンゾウ的な上向きの花がアゲハチョウによって淘汰されることを示す証拠を得た。前者については、赤い蜜標の有無を決めるアントシアニン合成系の種差が、調節遺伝子(R2R3 MYB)の単一の変化で生じていることを支持する証拠を得ており、予定どおりの達成度である。温帯性キイチゴと亜熱帯性キイチゴを材料に進めているプロジェクトでは、(1)常緑性と落葉性などの種差を決めている候補遺伝子を探索する、(2)2種間の遺伝的交流(遺伝子浸透)が生じていることを検証する、という2つの主目標がある。前者については、花色・花香と異なり、生合成系から候補遺伝子を選ぶことができないので、ゲノム配列を決め、発現量を比較することで、候補遺伝子を探索している。ゲノム配列決定が順調に進んでおり、予定どおりの達成度である。後者については、分析をほぼ完了し、2種の分化・移住の歴史と、遺伝子浸透の歴史を推定できた。在来種ニホンタンポポ、外来種セイヨウタンポポ、およびその雑種を材料に進めているプロジェクトでは、耐病性遺伝子に着目し、在来種と外来種の違いを明らかにし、雑種がどちらの遺伝子をどの程度取り込んでいるかを評価することを目標としている。
VEC-DIC顕微鏡による神経細胞内液顆粒運動および粘度の測定

本研究の最終目的は、ビデオ強化型顕微鏡であるVEC-DIC (video-enhanced contrast-differencial interference contrast)顕微鏡を用いて培養神経細胞および培養グリア細胞の細胞内小器官の運動を観察し、定性的および統計力学的解析を試みることである。本年度は、ヒ-ティングステージを購入後、VEC-DIC顕微鏡の有効解像力を設定し、本顕微鏡を用いて得ることのできる極めて薄い光学的厚さの断層像を利用してビデオ録画像1フレーム毎の細胞内顆粒移動量(距離)を2次元的に測定して移動速度を算出することを試みた。そのために、先ず細胞内顆粒を豊富に含む血管内細胞を観察した。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECをカバーガラス上に生着させ培養した。倒置型微分干渉顕微鏡にCCDカメラを接続し、ヒ-ティングステージを装着した観察台に培養細胞HUVECをDMEM灌流下に設置した。CCDカメラにより画像を取り込み、中間変倍を経てイメージプロセッサーで高速画像処理を行いコントラストを強調し、これをビデオシステムに録画した。この方法により2万倍の拡大率が得られ、映像信号の増幅を通して、目に見えない小さな明るさの変化を検出することが可能となる。これよりさらに1フレームの画像を取り出し、画像処理装置により画像のsubtraction、細胞内小器官のサイズ計測などを行い検討した。その結果、ビデオ録画像を1フレーム毎に検討し、画面上の最小ピクセルのサイズが15.6×15.6nmであり、これ以上の大きさの顆粒であれば識別可能であることが判明した。この解像力を利用しHUVECを観察すると、核小体・細胞内顆粒が明瞭に判別でき、細胞内顆粒は活発に運動し一部核内に入り込む像も認められた。また、細胞膜を放射状に広げているfilopodiaおよびlam ellipodiaも明瞭に観察され、実験条件によってはこの細胞膜辺縁が波動様運動rufflingまたは空胞様拡大ballooningを起こすことも確認された。核の大きさは20.2±3.4μm×13.4±2.8μm(長軸×短軸)であった。さらに、本システムのもつ各断層像の高解像度を利用して、single particle tracking methodにより細胞内顆粒運動を2次元的に測定したところ、1-7μm/sの速さで移動していることが判明した。今後、細胞内顆粒がブラウン運動に従うか否かを検定の後、Einsteinの理論式を適用してゆく方針である。
凍土中のメタンハイドレイトの生成・解離に関する実験的研究

凍土中のメタンハイドレイトの生成・解離特性を測定するため15MPa耐圧の圧力容器、温度・圧力の制御系、測定システムを作成しメタンハイドレイトの生成・解離の実験を行った。実験試料としては、粒度の大きい試料の代表として珪砂(豊浦標準砂)、粒度の小さいものではベントナイトを用いた。また、内径がそれぞれ、10nm,50nmの空隙を持つ、構造のはっきりわかった粉末状ポーラスガラスを用いた。実験において、水分条件としては、水分飽和条件と細孔だけに水が存在する不飽和条件で行った。メタンハイドレイトの生成と解離過程では、大きなヒステリシスが存在し、解離曲線がより平衡状態の曲線に近くなることがわかった。実験結果として水分飽和条件の珪砂(豊浦標準砂)の場合は、メタンハイドレイトの解離曲線と水・メタンのみの系の解離曲線ときわめて良い一致を示した。これは、飽和条件の珪砂中の水の特性が自由水に近いためと考えられる。飽和条件のベントナイトの実験で、解離圧は、純粋なメタン・水系のメタンハイドレイトの解離曲線とほぼ一致した。これは、圧力変化が0.5MPaと小さいことなどから、メタンハイドレイトは試料の表面近くのみで形成されたことによると予想されるが、詳細は今後の課題である。飽和条件のポーラスガラスの場合は水・メタン系の解離曲線と一致した。これは、ポーラスガラス間の空隙中の水が自由水に近いためである。一方、空隙だけに水が存在する不飽和条件では、解離圧が高圧側にシフトするのが測定された。例えば、6MPaの圧力状態で、純粋なメタン・水系の温度からのずれΔTは、50nm細孔の場合は1.2Kであり、10nm細孔の場合は6Kになった。これは、ポーラスガラスの表面力などにより空隙中の水が強く拘束されていることによると考えられる。ポーラスガラス中の水の熱力学的性質を調べるため、核磁気共鳴法(NMR)を用いた不凍水量の測定を行った。この結果から、空隙中の水の凍結温度は自由水のものより大きくマイナスにシフトすることがわかった。これらの結果から、凍土中の、メタンハイドレイトの解離曲線は、水・メタン系のものより、低温高圧側にシフトし、これは、間隙に含まれる水が土粒子表面の表面力を大きく受けているためであることがわかった。今後は、この現象の理論解析を行っていく予定である。本年度は、凍土中のメタンハイドレイトの生成・解離特性の測定のための圧力容器、温度・圧力の制御系、測定器のシステムを作成することに、重点をおいた。予備実験として、1)メタン-水-メタンハイドレイト系、2)メタン-水飽和した砂-メタンハイドレイト系での実験を行なった。

1)の実験手順として、まず、圧力容器内に、水を入れて、その後、常温状態でメタンを5MPaの圧力で挿入し、その後試料の温度をメタンハイドレイト生成温度である0°Cにおいて、メタンハイドレイトの生成の様子を実体顕微鏡を通して、観察を行ない、ビデオに録画した。実験結果から、0°Cでは、過冷却のため、メタンハイドレイトの生成は観測されなかった。温度を-10°Cに設定したところ、水試料は凍結した、その後、氷を融解させるため、試料を1°Cの温度まで上げたところ、氷は融解したが、メタンハイドレイトは解離せず、生成されていることが観測された。以上の結果から、メタンハイドレイトの生成のためには、平衡温度より大きな冷却が必要であること、氷の形成が、メタンハイドレイト形成のトリガになりえることなどがわかった。この後、試料の温度を平衡温度より高くし、一度解離させ、再度温度を下げたところ、今度は0°Cでもメタンハイドレイトの生成が観測され、生成・解離特性に温度履歴の影響のあることがわかった。そこで、実験装置を、試料中心部に銅線を接触し、その銅線の温度を試料全体の温度より下げることにより、メタンハイドレイト生成のためのきっかけとなる様、装置を改良し、実験を行なった。この実験では、予定したように、試料の中心部から凍結が進むのが観測された。2)の実験手順として、まず、圧力容器内に水で飽和した砂を入れて、その中心部に、冷却用銅線を接触させ、常温状態で、メタンを5MPaの圧力で挿入し、その後、試料の温度をメタンハイドレイト生成温度である-1°Cにおいて、メタンハイドレイトの生成を観察した。試料は中心部から、凍結するのが観測され、その際メタンハイドレイトも形成されるのが確認された。今後は、種々の圧力、温度条件で実験を行ない、メタンハイドレイトの生成・解離特性の測定を行なう予定である。本年度は、凍土中のメタンハイドレイトの生成・難解の実験を行った。実験試料としては、粒度の大きい試料の代表として珪砂(豊浦標準砂)、粒度の小さいものではベントナイトを用いた。また、内径がそれぞれ、10nm,50nmの空隙を持つ、構造のはっきりわかった粉末状ポーラスガスを用いた。実験において、水分条件としては、水分飽和条件と細孔だけに水が存在する不飽和条件で行った。メタンハイドレイトの生成と解離過程では、大きなヒステリシスが存在し、解離曲線がより平衡状態の曲線に近くなることがわかった。実験結果として水分飽和条件の珪砂(豊浦標準砂)の場合は、メタンハイドレイトの解離曲線と水・メタンのみの系の解離曲線ときわめて良い一致を示した。これは、飽和条件の珪砂中の水の特性が自由水に近いためと考えられる。飽和条件のベントナイトの実験で、解離圧は、純粋なメタン・水系のメタンハイドレイトの解離曲線とほぼ一致した。これは、圧力変化が0.5MPaと小さいことなどから、メタンハイドレイトは試料の表面近くのみで形成されたことによると予想されるが、詳細は今後の課題である。飽和条件のポーラスガラスの場合は水・メタン系の解離曲線と一致した。これは、ポーラスガラス間の空隙中の水が自由水に近いためである。一方、空隙だけに水が存在する不飽和条件では、解離圧が高圧側にシフトするのが測定された。例えば、6MPaの圧力状態で、純粋なメタン・水系の温度からのずれΔTは、50nm細孔の場合は1.2Kであり、10nm細孔の場合は6Kになった。これは、ポーラスガラスの表面力などにより空隙中の水が強く拘束されていることによると考えられる。ポーラスガラス中の水の熱力学的性質を調べるため、核磁気共鳴法(NMR)を用いた不凍水量の測定を行った。この結果から、空隙中の水の凍結温度は自由水のものより大きくマイナスにシフトすることがわかった。
細胞親和性の異なるHIVの活性化CD4陽性T細胞における増殖性の解明とその制御

HIV-1の活性化CD4+T細胞における増殖性および病原性を左右する宿主因子の一つとして、CD4+T細胞上のHIV-1第二受容体の発現制御が考えられる。これらの受容体の中で重要なものは、CCR5とCXCR4であり、より詳しい抗原構造の解析やin vivoでのウイルス中和実験に用いるため、それぞれの抗原に対して特異的なラット由来単クロン抗体の作製に成功した。CCR5に対する抗体T-227は、細胞外部N末領域を認識しWBにおいて40-41kDaのCCR5抗原分子を検出した。CXCR4に対する抗体は、細胞外部N末領域を認識する抗体(A145)と、細胞外部2ndloopを含む領域を認識認する抗体(A80)が作製できた。以上の特異的単クロン抗体と市販のマウス単クロン抗体を用いて、CD4+T細胞の多重染色を行い、freshな細胞にはCXCR4が多量に発現されるが、CCR5は陰性であることが確認された。刺激によってCCR5の発現が誘導されてくるが、CXCR4は、培養期間が長くなるにつれてその発現量は減少していった。特にCD4+Tクロンでは、CCR5陽性、CXCR4弱陽性の表現形のものが多かった。これらのクロン細胞は、マクロファージ親和性HIV-1に高い感受性を示したが、T細胞株親和性HIV-1には耐性か低い感受性であった。ところが、このT細胞を刺激することによってCCR5のdown-modulationとCXCR4のup-regulationが観察され、同時にこれらのクロン細胞は、T細胞株親和性HIV-1に高い感受性を示し、マクロファージ親和性HIV-1低い感受性を示すようになった。つまり、メモリー細胞と活性化早期細胞では、CCR5とCXCR4の発現は異なり、それぞれの発現量に比例してマクロファージ親和性HIV-1とT細胞株親和性HIV-1に対する感受性も異なることが示唆された(論文作成中)。
GIS(地理情報システム)を用いた高齢者の「閉じこもり」発生要因の研究

1.研究の具体的内容本研究では,従来「閉じこもり」など高齢者の外出行動の関連要因とされてきた身体・心理・社会要因に加え,居住地と生活圏の広がり,交通手段など地域のありよう等の環境要因の影響を明らかにすることを目的とした.自治体施設の利用,高齢者の「閉じこもり」割合,の2つについて環境要因の関連を検討した.自治体施設の利用と環境要因の関連の検討は,愛知県の1自治体を分析対象として行った.保健センター等の施設の利用状況に関連する要因として施設への距離,交通手段の2つの環境要因を検討した.自治体施設の利用は男女とも,施設までの距離が短いほど有意に多かった.女性では交通手段が豊かなほど利用が多かった.高齢者の「閉じこもり」割合と環境要因の関連の検討は,愛知県の10自治体を対象地域として行った.外出頻度の少ない「閉じこもり」と小学校区単位の環境要因(人口密度を指標とした)の関連を検討した.人口密度が低い小学校区ほど,外出頻度週1回以下の「閉じこもり」の者の割合は多いという有意な関連が示された(Spearmanの相関係数は-0.60)2.意義・重要性高齢者の外出行動への環境要因の影響を明らかにした本研究の成果は,介護予防において必要性が強調される,ハイリスク・ポピュレーションの両戦略に対し示唆を与えると考えられる.ハイリスク戦略は,要介護リスク者を「特定高齢者」として把握し,介護予防事業への参加を進めるものである.この特定高齢者は全国一律で全高齢者の5%以内とされているが,「閉じこもり」の割合に環境要因による地域差があるという本研究の結果は,不利な地域への対策の必要性を示唆する.一方ポピュレーション戦略は,非「閉じこもり」がら「閉じこもり」への移行を防ぐ一次予防を目指し地域全体へ介入するものであるが,地域の介入すべき要因を明らかにした本研究の結果は介入事業のヒントになると考えられる.2003年度日本福祉大学AGESプロジェクト調査対象自治体のうち,調査の承諾が得られた愛知県の2自治体を対象に調査を行った.調査対象地域での現地調査・対象地区地図データの取り込みにより高齢者の外出行動の目的施設・道路・公共交通路線等を網羅し,GIS上に経緯度座標での落とし込みを行った.これらの情報に加え,2003年と2004年度AGESプロジェクトの4万人Cross-sectional調査データの分析結果を元に調査票の検討・作成を行った.調査項目は,当初予定していた外出頻度,外出先,身体的要因,心理的要因,社会環境的要因,IADL,利用交通手段などの項目に加え,「閉じこもり」先行研究のレビューを通じて重要であると考えられた,外出や社会参加についての家族の理解や支援,高齢者の安心できる・気兼ねなく行くことのできる外出先(居場所)などを追加した.また,本研究計画が2時点の調査票調査を行うというメリットを生かし,対象自治体の一部で「閉じこもり」予防・解消を目的とする,新しい介護予防事業を大学と自治体,自治体内の住民組織の共同により準備中である.同事業は生活圏レべルに物理的・心理的にアクセシビリティの高い拠点を形成し,高齢者の社会参加・ソーシャルネットワークの形成を促進することを目的としている.社会参加・ソーシャルネットワークは「閉じこもり」の関連要因であり,この要因への介入により地域全体の「閉じこもり」の発生を抑制することが可能であると考えられる.この変化を2時点の調査票調査によりとらえることで,「閉じこもり」予防事業の効果評価を行うことが可能になる.調査票の設計にあたっては,評価に用いる社会参加状況を捉えるための項目,潜在的な社会参加需要・外出需要を測るための項目を重点的に強化した.対象地域に調査票を配布し,現在回収・集計作業を行っている.日本における高齢者の「閉じこもり」についての文献学的研究を行い,その一部をまとめたものを日本公衆衛生雑誌に投稿し採択された.文献学的研究において,調査対象高齢者の身体の虚弱状況,用いた「閉じこもり」定義を考慮したうえでも,各先行研究間で「閉じこもり」高齢者の割合にばらつきが見られることが明らかになった.全体的に見て都市的な地域よりも農村的な地域で「閉じこもり」が多いという傾向がみられ,「閉じこもり」の発生と地域要因の関連について検討する必要性が確認された.地域要因を構成する一つの因子として,生活関連施設整備密度の低さ,それにともなう利用する外出先への距離の長さが考えられる.外出の目的施設までの距離と施設利用状況の関連について,GISを用いて分析・検討を行った.その結果,保健センター等の自治体の施設への利用の有無と施設と居住地間の距離は,女性でのみ有意な関連が見られた.この分析結果については第19回保健福祉学会学術集会で発表を行った.1.研究の具体的内容本研究では,従来「閉じこもり」など高齢者の外出行動の関連要因とされてきた身体・心理・社会要因に加え,居住地と生活圏の広がり,交通手段など地域のありよう等の環境要因の影響を明らかにすることを目的とした.自治体施設の利用,高齢者の「閉じこもり」割合,の2つについて環境要因の関連を検討した.自治体施設の利用と環境要因の関連の検討は,愛知県の1自治体を分析対象として行った.保健センター等の施設の利用状況に関連する要因として施設への距離,交通手段の2つの環境要因を検討した.自治体施設の利用は男女とも,施設までの距離が短いほど有意に多かった.女性では交通手段が豊かなほど利用が多かった.

高齢者の「閉じこもり」割合と環境要因の関連の検討は,愛知県の10自治体を対象地域として行った.外出頻度の少ない「閉じこもり」と小学校区単位の環境要因(人口密度を指標とした)の関連を検討した.人口密度が低い小学校区ほど,外出頻度週1回以下の「閉じこもり」の者の割合は多いという有意な関連が示された(Spearmanの相関係数は-0.60)2.意義・重要性高齢者の外出行動への環境要因の影響を明らかにした本研究の成果は,介護予防において必要性が強調される,ハイリスク・ポピュレーションの両戦略に対し示唆を与えると考えられる.ハイリスク戦略は,要介護リスク者を「特定高齢者」として把握し,介護予防事業への参加を進めるものである.この特定高齢者は全国一律で全高齢者の5%以内とされているが,「閉じこもり」の割合に環境要因による地域差があるという本研究の結果は,不利な地域への対策の必要性を示唆する.一方ポピュレーション戦略は,非「閉じこもり」がら「閉じこもり」への移行を防ぐ一次予防を目指し地域全体へ介入するものであるが,地域の介入すべき要因を明らかにした本研究の結果は介入事業のヒントになると考えられる.
細胞オルガネラ局在性を有する金属イオン蛍光プローブの開発と一細胞多重染色への応用

細胞内におけるシグナル伝達機構を分子レベルで解明するためには,細胞内におけるシグナル伝達物質の時間的・空間的動態を捉える必要がある。その有用な手法として,細胞内オルガネラに対して特異的に局在化する蛍光プローブを開発し,各種金属イオンの部位特異的な可視化を行った。蛍光プローブにコレステロール基あるいはカチオン性官能基を組み込むことによって,細胞膜およびミトコンドリアにそれぞれプローブ分子を集積することに成功した。さらに,生細胞内における亜鉛および銅一価イオンの局所的蛍光イメージングも達成した。本年度は,細胞内の特定オルガネラにおける部位特異的な亜鉛イオンの挙動を検出するため,新規蛍光プローブの合成と機能評価を行うた。1つはミトコンドリアへの局在化を指向したローダミン型であり,もう1つは分子内にコレステロール基による細胞膜局在化を図ったフルオレセイン型の亜鉛蛍光プローブである。いずれの分子も同じ亜鉛イオン結合部位を有している。(1)亜鉛蛍光プローブの物性評価亜鉛イオンに対する蛍光応答特性について評価するために,オルガネラ局在性を取り除いた化合物を用いて検証した。いずれのプローブ分子骨格も高い水溶性を有しておりほぼ無蛍光であるが,亜鉛イオンの添加により100倍以上もの蛍光増大を示した。一方で亜鉛錯体の結合解離定数は異なり,フルオレセイン型の場合は30nM程であったのに対し,ローダミン型では300nM程度となり,蛍光団の種類により有効検出濃度が異なることがわかった。いずれも,蛍光応答は亜鉛イオンに対して特異的であり,他の金属イオンの共存実験から生理的条件下においても亜鉛イオンを高感度に検出できることを確認した。(2)オルガネラ誘導基の機能検証前述のプローブ分子自身は蛍光OFFの状態であるため,オルガネラへの局在化を確認するには,常時蛍光がONとなるモデル分子を用いた蛍光イメージング実験を行う必要がある。それぞれの蛍光プローブから亜鉛イオン結合部位を取り除いた蛍光分子を合成し、HeLa細胞の染色を行った。その結果,コレステロール基を有するフルオレセインは細胞膜から,ローダミン型の分子からはミトコンドリアからの発光がそれぞれ観測された。後者の分子はシステインチオールと共有結合可能なクロロアセトアミド基を有している。すなわち,ミトコンドリアに発現しているタンパク質のシステイン残基と共有結合することができ,4回の洗浄操作によっても細胞外に溶出することなく安定に存在していることがわかった。(3)部位局在型亜鉛蛍光プローブそれぞれの分子を用いて細胞系における亜鉛イオンの検出を行った。その結果,フルオレセイン型のプローブでは細胞膜近傍のローダミン型のプローブではミトコンドリア近傍の局所的な亜鉛イオン濃度変化を可視化できることを明らかにした。ミトコンドリア局在能を有する亜鉛および銅一価蛍光プローブの開発し,各プローブの機能評価および生細胞を用いた蛍光イメージングを行った。1タンパク質との共有結合部位を有するミトコンドリア局在型亜鉛蛍光プローブの開発前年度まで得られた研究成果を踏まえて,新たな亜鉛イオン結合部位を有するプローブを開発した。これを用いてミトコンドリアをラベル化し,その後亜鉛イオンに対する蛍光応答性について検討したところ,これまでの蛍光プローブに比べ非常に大きな蛍光増大が観測された。この細胞に内在性チオールマスキング剤であるNEMを添加したところ,ミトコンドリア近傍での蛍光上昇が確認されたことから,グルタチオンに取り込まれていた亜鉛イオンが放出され,ミトコンドリアに移行したことが示唆された。また,蛍光強度の変化は亜鉛イオン濃度変化のみを表しており,ミトコンドリア膜電位の影響を受けないことも示された。2スピロ環の開閉反応を利用した銅一価蛍光プローブの開発前年度で得られた銅一価蛍光プローブRdlTPA-TPPの細胞内における局在について検討した。銅イオンを含まない培地で培養したHeLa細胞に対してRdlTPA-TPPを加えたところ,細胞内部から点状の蛍光が観測された。共染色実験の結果から,この蛍光は酸性オルガネラと一致していることがわかり,プローブのごく一部が酸性領域に局在し開環していることが明らかとなった。続いて銅イオンを含む培地で培養した細胞を用いて検討したところ,ミトコンドリアからの非常に強い蛍光が観測され,局所的な細胞内銅イオンの検出に成功した。一方,先に示した酸性オルガネラからの蛍光強度については変化が認められなかったことから,リソソームなどには銅一価イオンプールが存在しないことが明らかとなった。具体的な成果は以下の通りである。1共有結合可能なミトコンドリア局在型亜鉛蛍光プローブの開発内在性チオールと共有

結合可能な官能基であるクロロアセトアミド基を有するローダミンと対象化合物であるアセトアミド型のローダミン蛍光色素をそれぞれ合成し,ミトコンドリアの染色を行った。ミトコンドリア膜電位の脱分極剤であるCCCPを添加したところ,前者ではほとんど変化しなかったのに対し,後者では細胞質への拡散に伴う蛍光強度の減衰が確認された。すなわち,クロロアセトアミド基はミトコンドリア膜に発現しているタンパク質チオールと共有結合していることが明らかとなった。次に,ミトコンドリアをラベル化後,さらに細胞質に拡散する別の亜鉛蛍光プローブを用いて共染色を行った。この細胞に対してカルシウムアゴニストを添加したところ,ミトコンドリア近傍の蛍光強度がわずかに減少し,同時に細胞質中の亜鉛イオン濃度上昇に伴う蛍光強度の増大が観測された。すなわち,ミトコンドリアから亜鉛イオンが放出する様子をリアルタイムで観測することに成功した。2スピロ環の開閉反応を利用した銅一価蛍光プローブの開発ロドール蛍光色素のフェノール水酸基をアルキル化するとスピロ環を形成し無蛍光物質になることが知られている。そこで,ロドールの酸素原子に銅イオン反応部位であるTPA配位子を,窒素原子にミトコンドリア局在性を有するTPP部位を導入しした新規銅一価蛍光プローブを合成した。グルタチオン存在下で銅イオンを添加したところ,100倍以上もの蛍光増大が認められ,銅一価プローブとして機能することを確認した。同様の蛍光増大は細胞内ミトコンドリアにおいても認められ,ミトコンドリアに存在する銅イオンのイメージングに成功した。プローブ分子を細胞膜あるいはミトコンドリアに局在化させるのみならず,ミトコンドリア内に発現しているタンパク質と共有結合を形成させることで,プローブ分子の安定な局在化を達成することができた。このような共有結合を介したプローブのラベル化は研究計画以上である。一方で,ゴルジ体,核,および小胞体にラベル化可能な蛍光プローブについてはやや遅れている。以上の成果を総合的に判断し,研究計画はおおむね順調に進展していると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。亜鉛イオンおよび銅イオンについて,それぞれミトコンドリア局在型の蛍光プローブを計画通りに合成することができ,その有用性を検証することができた。すなわち当初研究目的に従い,おおむね順調に進展していると言える。いずれの化合物も大変興味深い性質を示し,現在学術論文を執筆しているところである。また亜鉛イオンについては,内在性亜鉛のイメージングに成功し,細胞質へ放出される過程をリアルタイムで追跡することができた。この過程をより詳細に検討することにより,シグナル伝達物質としての機能評価が可能になる。銅イオンプローブについては,当初計画・設計していた化合物の機能が予想よりも低かったため,ロドール型へと変更したところ,高い銅イオン検出能を有するプローブを得ることができた。細胞膜およびミトコンドリアを異なる蛍光団を持つプローブでそれぞれ染色することができたため,この2つを用いて同時に行う「多重染色」を行う。また,さらに異なるオルガネラ局在性を指向したプローブ分子の開発についても今年度に引き続き行う。
ポスト装着破折歯の応力解析と実証実験との比較

三次元有限要素法による応力解析を行い,下顎小臼歯の歯槽骨吸収の原因となる荷重成分の方向を調べるため,歯槽骨吸収型と歯槽骨非吸収型の三次元有限要素モデルを作成し,頬側,舌側,近遠心方向からの荷重を行った.歯根膜の圧縮応力を示すマイナス値の第3主応力の分布を調べた.その結果,舌側から荷重した歯槽骨非吸収モデルにおいて頬側歯頸部中央部と近遠心隅角部に応力集中帯が認められたのに対し,歯槽骨吸収モデルでは応力集中帯が認められなかった.一方,頬側,近遠心方向からの荷重に対して,応力集中帯は認められなかった.これらより,舌側からの荷重成分による圧縮応力により頬側の歯槽骨吸収が生じることが示唆された.三次元有限要素法による応力解析を行い,下顎小臼歯の歯槽骨吸収の原因となる荷重成分の方向を調べるため,歯槽骨吸収型と歯槽骨非吸収型の三次元有限要素モデルを作成し,頬側,舌側,近遠心方向からの荷重を行った.歯根膜の圧縮応力を示すマイナス値の第3主応力の分布を調べた.その結果,舌側から荷重した歯槽骨非吸収モデルにおいて頬側歯頸部中央部と近遠心隅角部に応力集中帯が認められたのに対し,歯槽骨吸収モデルでは応力集中帯が認められなかった.一方,頬側,近遠心方向からの荷重に対して,応力集中帯は認められなかった.これらより,舌側からの荷重成分による圧縮応力により頬側の歯槽骨吸収が生じることが示唆された.歯槽骨吸収の原因となる荷重方向を調査し歯根破折のメカニズムを解明するためにボスートー装着歯のなかで,口腔内で歯根破折を起こしている歯を対象とし,歯周ポケットの診査,動揺度の診査,打診等,チャートを記録した.そしてスタディモデルを作製し,デンタルX線撮影を行い歯根破折の二次元的観察および,周囲歯槽骨吸収の二次元的観察を行った.さらに歯科用小型X線CT(3DX)撮影を行い歯根破折の三次元的観察および,周囲歯槽骨の三次元的観察を行った.これをもとに歯槽骨吸収の存在する,歯槽骨吸収モデルと,歯槽骨吸収の存在しない,歯槽骨非吸収モデルを作成した.今後は歯根破折の様相を調べるために,エポキシ歯牙に築造窩洞形成を行い,これに金銀パラジウム合金で支台築造後,荷重実験を行う.さらに頬側に歯槽骨吸収を引き起こす力の方向を検討するため三次元有限要素法による応力解析を行い,歯槽骨吸収の原因となる荷重方向を調査する.その結果,舌側荷重に対し歯槽骨非吸収モデルでは,頬側歯頸部中央部と近遠心隅角部に応力集中帯が認められるのに対し,歯槽骨吸収モデルでは,歯根中央部に応力が分散し,歯槽骨吸収の最も根尖よりの部分では応力集中は観察されないことが予想される.そして歯槽骨非吸収モデル,歯槽骨吸収モデル,共に頬側荷重,近心側または遠心側荷重に対しては頬側歯頸部付近への応力集中はみられないと予想する.この結果とエポキシ歯牙への荷重実験結果を比較し,歯根破折のメカニズムを解明する.歯槽骨吸収の原因となる荷重方向を調査し歯根破折のメカニズムを解明するためにポスト装着歯のなかで,口腔内で歯根破折を起こしている歯を対象とし,歯周ポケットの診査,動揺度の診査,打診等,チャートを記録した.そしてスタディモデルを作製し,デンタルX線撮影を行い歯根破折の二次元的観察および,周囲歯槽骨吸収の二次元的観察を行った.さらに歯科用小型X線CT(3DX)撮影を行い歯根破折の三次元的観察および,周囲歯槽骨の三次元的観察を行った.これをもとに歯槽骨吸収の存在する,歯槽骨吸収モデルと,歯槽骨吸収の存在しない,歯槽骨非吸収モデルを作成した.現在,歯根破折の様相を調べるために,エポキシ歯牙に築造窩洞形成を行い,これに金銀パラジウム合金で支台築造後,荷重実験を行っている.さらに頬側に歯槽骨吸収を引き起こす力の方向を検討するため三次元有限要素法による応力解析を行い,歯槽骨吸収の原因となる荷重方向を調査した.その結果,舌側荷重に対し歯槽骨非吸収モデルでは,頬側歯頸部中央部と近遠心隅角部に応力集中帯が認められるのに対し,歯槽骨吸収モデルでは,歯根中央部に応力が分散し,歯槽骨吸収の最も根尖よりの部分では応力集中は観察されなかった.そして歯槽骨非吸収モデル,歯槽骨吸収モデル,共に頬側荷重,近心側または遠心側荷重に対しては頬側歯頸部付近への応力集中はみられなかった.これは2009年6月25日,雑誌に投稿した.今後,この結果とエポキシ歯牙への荷重実験結果を比較し,歯根破折のメカニズムを解明する.三次元有限要素法による応力解析を行い,下顎小臼歯の歯槽骨吸収の原因となる荷重成分の方向を調べるため,歯槽骨吸収型と歯槽骨非吸収型の三次元有限要素モデルを作成し,頬側,舌側,近遠心方向からの荷重を行った.歯根膜の圧縮応力を示すマイナス値の第3主応力の分布を調べた.その結果,舌側から荷重した歯槽骨非吸収モデルにおいて頬側歯頚部中央部と近遠心隅角部に応力集中帯が認められたのに対し,歯槽骨吸収モデルでは応力集中帯が認められなかった.一方,頬側,近遠心方向からの荷重に対して,応力集中帯は認められなかった.

これらより,舌側からの荷重成分による圧縮応力により頬側の歯槽骨吸収が生じることが示唆された.さらに、事前に行った口腔内で歯根破折を起こしている歯を対象とした,歯科用小型X線CT(3DX)撮影による歯根破折の三次元的観察および,周囲歯槽骨の三次元的観察の結果に対して実証実験を行った.試料にはエポキシ歯牙を用いた.まず、エポキシ歯牙の歯冠部分を削除し、これに根管充填および、築造窩洞形成を行い,金銀パラジウム合金で作製したメタルコアーをスーパーポンドにて合着し支台築造を行った.そして歯根膜の代わりとなるシリコーンを介在させ、樹脂に植立後、荷重実験を行った.荷重実験は頬側の歯槽骨が吸収していない試料と、頬側の歯槽骨が吸収している試料の二種類について行い、歯科用小型X線CT(3DX)撮影の観察結果と比較する.現在、頬側の歯槽骨が吸収している試料に荷重を行っていが、40Kg/f付近まで荷重を行うと、歯槽骨吸収部から、歯根膜と、エポキシ歯牙を稙立している樹脂とが剥がれ、エポキシ歯牙に歯根破折を起こすまでの荷重がかけられない為、歯根膜の材料と接着材を模索中である.
左室拡張期弾性率のPre-conditioningによる変化

平成6年度に発表したデータをもとに(循環器科、第37巻5号、1995、日本胸部外科学会総会、1994、日本生理学会総会、1994、アジア心臓血管外科学会総会1994)、段階的に増加する虚血浸襲を加え本研究の主題である時間的変化に関する基礎データを集めた。その結果興味深いことに左室拡張能の時間的変化は数時間の単位では虚血浸襲が一定でも変化し、かつ弾性率と粘性率ではまったく異なった変化をした(世界心臓学会、1994、日本胸部外科学会1995、国際心不全シンポジウム、1995、日本生理学会総会、1995)。以上の実験結果を踏まえ虚血浸襲後の弾性率の変化の時間依存性を鑑みて、当初予定していたpre-conditioningの条件決定には虚血浸襲後の経時的な拡張能の変化に関するデータが必要であると判断した。そこでそれまでのデータを解析した結果pre-conditioningのような軽度の虚血浸襲の際には時間依存性の程度が不安定でありもっと強い虚血浸襲の方が安定した時間依存性を認めることが推測されたため平成7年度にはイヌを用いて冠状動脈の前下行枝領域に20分の完全温阻血を加えていわゆるmyocardial stunningの状態での拡張能変化を調べることとした。全16頭に対し実験を行いその生理学的検討を行うとともに、組織学的検討を半定量的に行うために新たな画像解析ソフトを西独より購入し(Jandel Scientific Gmbh.,SigmaScanPro)、一部の報告でmyocardial stunningの際に超急性期にも認められるという結合組織の変化について検討を加えるべく実験を進めた。しかしながら解析ソフトが結合組織の染色を正確に認識できず整合性のあるデータとならなかったため最終報告には至らなかった。1994年度科学研究費実績報告当初計画の研究資材の購入に当たってはできるだけ申請書のものと同一のものを購入すべく予算を執行した。そのために今年度分については当初計画と比して備品費が相対的に多くなってしまった。超音波精密距離計については注文生産でもあり実際に納品されたのは1994年9月になってからであるが、同年10月には試験を終え11月から実験に使用開始できる状態になっている。また解析情報の増大に伴って新たなデータ処理システムの構築が必要となり、16チャネル用のADコンバータ-を備え光磁気記憶装置を持ったシステムを購入した。このデータ処理システムと現有のシステムとの整合性を保ちつつ、システムのセットアップを行なった。その結果12月までに概ね作動する状況となり、1995年1月より当初予定の実験を開始している。実験系としては犬の急性実験モデルを用いた気絶心(stunned heart)での左室拡張能に関する生理学的解析系と病理学的解析系を並行して進めている。1995年7月までに動物実験を終了する予定で現在鋭意進行中である。またこの虚血にまつわる諸問題の中でも気絶心についてはその機構自身が不明であり、将来的にも大きな研究課題となることが予想される。我々のこれまで提唱してきた左心室の拡張能における粘性の重要性はこの問題では特に大きく取り扱われることが他の研究結果から予想され、この問題を広く提起する目的で1994年9月には世界心臓学会で虚血心における心室の粘性と弾性の反応の違いを報告した。今後さらにこの点を追及していくつもりである。

その結果興味深いことに左室拡張能の時間的変化は数時間の単位で虚血浸襲が一定でも変化し、かつ弾性率と粘性率ではまったく異なった変化をした(世界心臓学会、1994、日本胸部外科学会総会1995、国際心不全シンポジウム、1995、日本生理学会総会、1995)。以上の実験結果を踏まえ虚血侵襲後の弾性率の変化の時間依存性を鑑みて、当初予定していたpre-conditioningの条件決定には虚血浸襲後の経時的な拡張能の変化に関するデータが必要であると判断した。そこでそれまでのデータを解析した結果pre-conditioningのような軽度の虚血侵襲の際には時間依存性の程度が不安定でありもっと強い虚血侵襲の方が安定した時間依存性を認めることが推測されたため平成7年度にイヌを用いて冠状動脈の前下行枝領域に20分の完全温阻血を加えていわゆるmyocardial stunningの状態での拡張能変化を調べることとした。全16頭に対し実験を行いその生理学的検討を行うとともに、組織学的検討を半定量的に行うために新たな画像解析ソフトを西独より購入し(Jandel Scientific Gmbh.,SigmaScanPro)、一部の報告でmyocardial stunningの際に超急性期にも認められるという結合組織の変化について検討を加えるべく実験を進めた。実験は年度内に終了したが、上記の解析ソフトが海外発注のため本年2月に届いたところであり、近日中に論文にまとめるべく解析を急いでいる段階である。
炭素繊維強化炭素複合材料の破壊挙動の理解を通した高強度化に関する研究

昨年度製作した積層構成を4:1,3:1,2:1,1:1に制御した直交積層型炭素繊維強化炭素(C/C)を用いて今年度は新たにせん断試験を行った。それぞれの方向での引張試験、せん断試験、破壊靭性試験の結果を総合して破壊挙動の理解を行った。Iosipescu法を用いたせん断試験では引張試験と同様、せん断弾性率、せん断強度ともに繊維の配向比率により決定されていることが明らかとなった。両側切り欠き付き試験片の破壊挙動は、荷重方向の繊維が多い場合は、荷重負荷方向に平行に切り欠き先端から上下方向にクラックが進展する様子が観察された。一方、1:1以上に荷重方向の繊維が少ない場合は切り欠きからクラックは真っ直ぐに荷重方向に垂直に伸びる様子が観察された。切り欠き付き試験片の最大破壊応力は、0度:90度が1:4から増加し1:1まで増加する様子が観察された。その後0度方向の繊維が増加しても最大破断応力は変化しなかった。これは破壊が荷重方向の繊維を破壊するモードから、せん断破壊モードに移行し結果的に切り欠き敏感性が完全に失われたことを表している。せん断強度は1:1の場合が最も大きく、2:1、3:1、4:1となるにつれて低下した。せん断強度の低下と破壊抵抗の増加により破壊モードの遷移が発生することが確かめられた。この結果、これまでC/Cの破壊モードはせん断型であるとされてきたが、必ずしもそうではなくせん断強度とクラックの進展抵抗によって決定されていることが明らかとなった。現在、これらの実験データと観察された破壊モデルを用いて定量解析を実行中である。レーザーコースティックス法は、材料の変形により発生する入射光と反射光の干渉でできる像の形から変形の状態を精度よく測定することができ、簡単な光学システムで構成され比較的安価に作製できる点が特徴である。現在までに現有のインストロン型引張試験機にレーザーコースティックス装置を組み込むためにx-y-z3軸ステージを作製した。ついで、波長630nmのHe-Neレーザーを光源とする光学システムからなるレーザーコースティックス装置を作製しステージ上に取り付けた。アクリル樹脂を用いてレーザーコースティックス装置のキャリブレーションを行っており、来年度からC/C複合材料に適用していく予定である。東レ製炭素繊維M40を用いて一方向繊維強化型C/C、積層構成を4:1、3:1、2:1、1:1に制御した直交積層型C/Cをアクロス社に依頼し作製した。それぞれの材料に対して、単軸引張試験と両側切り欠きつき試験片を用いた破壊試験を行った。これにより、0度方向と90度方向の繊維配向比を1:33:1まで変化させた材料の破壊現象を調べることが出来た。端軸引張試験の結果は引張強度、引張弾性率はほぼ繊維の配向比率によって決まっていることが明らかとなった。すなわち、破断ひずみは積層構成によって変化しなかった。これにより、トランスバースクラックは引張強度に影響を与えないことが推測され、C/Cの高強度化のためには0度方向の繊維束そのものの伸度を増やす必要があると思われた。また、両側切り欠き付き試験片では、0度方向の繊維が多い場合にはクラックは荷重方向に平行に上下に伸びる様子が観察された。クラックが荷重方向に平行に伸びた場合は最終的な破壊はクラックと関係ない部位で生じており、完全に切り欠き敏感性が無くなることが明らかとなった。
ショ糖合成系の制御がイネの生育および収量形成に果たす役割の解明

本研究では、イネの葉におけるショ糖合成の鍵酵素として知られるショ糖リン酸合成酵素(SPS)に着目し、その酵素活性が上昇/低下したイネを解析することで、イネの糖代謝、ひいては生育、収量におけるSPSの役割を明らかにすることを目的としている。NIL-SPS1は、日本型水稲品種「コシヒカリ」を遺伝的背景とし、SPSをコードする主要な遺伝子であるOsSPS1近傍がインド型水稲品種「カサラス」に置換された系統である。葉身のSPS活性が親品種のコシヒカリよりも高く、一穂籾数が多いことが明らかとなっており、カサラス型のOsSPS1が一穂籾数を増加させる可能性が示唆されていた。本年度は、NIL-SPS1にコシヒカリを戻し交雑したF3集団、およびNIL-SPS1にOsSPS1の発現を低下させるRNAiコンストラクトを導入した系統の一穂籾数に着目し解析を行った。その結果から、OsSPS1はNIL-SPS1の高い一穂籾数には関与していない可能性が高いと考えられた。昨年度までのSPS変異体の解析から、SPSがソース葉におけるショ糖合成の制限要因であるというこれまでの定説がイネでは当てはまらない可能性が示唆された。本年度は昨年と同様にOsSPS1ノックダウン(KD)系統の圃場試験を行い、同様の結果を得た。また、昨年度までに作出したOsSPS11ノックアウト(KO)系統とOsSPS1-KD系統を交配し、OsSPS1-KD/OsSPS11-KO個体を得ることに成功した。この系統は野生型と同様の栄養成長を示した。この結果はOsSPS1, OsSPS11ダブルノックアウト系統を用いた昨年度までの解析結果を支持している。今後、この系統を用いることで、イネのSPSに関するより詳細な解析が行われることが期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。イネのSPS遺伝子の1つであるOsSPS1に関する突然変異系統のうち葉身のSPS活性が有意に低下したノックダウン系統2系統の解析を行った。まず、幼植物の葉身のSPS活性、遺伝子発現をそれぞれの野生型と比較したところ、両系統ともSPS活性およびOsSPS1の遺伝子発現が低下したノックダウン系統であるが、その低下程度は異なっていることが明らかとなった。次に、水田圃場で栽培したイネを用いて糖・デンプン濃度の比較および成長解析を行った。葉身では両系統とも糖・デンプン濃度が高い傾向にあった一方、葉鞘ではデンプン濃度が有意に低かった。一方で、生育に差は見られなかった。以上の結果から、ノックダウン系統ではSPS活性の低下により転流効率が低下している可能性があるが、その生育における影響は通常の生育条件下では限定的であると考えられた。ノックダウン系統の解析で得られた結果を担保するため、その原品種である日本晴のOsSPS1遺伝子発現抑制系統を作出した。また、OsSPS1を破壊した突然変異系統の解析からOsSPS1の花粉の糖代謝における関与が示唆されていた。そこで、穎花および花粉における発現解析、正逆交配および成熟花粉割合・花粉発芽率の測定を行った。その結果、OsSPS1が破壊された花粉は正常にデンプンが蓄積して成熟するが、発芽することができないことが明らかとなり、OsSPS1の花粉の発芽における重要性が示された。葉身のSPS活性が高い系統であるNIL-SPS1については、戻し交雑を行うとともにそのOsSPS1遺伝子発現抑制系統を作出した。昨年度までに選抜したSPSをコードするOsSPS1に関する発現抑制系統を材料として用いた。これらの系統の葉身のSPS活性、糖デンプン濃度、糖代謝関連遺伝子の発現を測定するとともに野生型と生育を比較した。その結果、SPS活性はそれぞれの野生型と比較して25-50%まで低下していたが、糖デンプン濃度、OsSPS1以外の遺伝子発現に差は見られなかった。また生育にも差は見られなかった。次にOsSPS1発現抑制系統を様々な環境条件で栽培し生育を比較したが、野生型とKDに有意な生育の差が見られる条件は存在しなかった。また、水田圃場での栽培試験の結果野生型とKDとで生育・乾物生産・収量に差は見られなかった。以上の結果からSPS活性が最大50%まで低下してもイネの糖代謝および生育には影響を及ぼさないことが明らかとなった。さらにSPS活性が低下した系統を解析するためCRISPR-Cas9systemによりOsSPS1単独変異体、OsSPS11単独変異体、OsSPS1, OsSPS11二重変異体を作出した。

このうち二重変異体ではSPS活性が野生型の約15%であったが、野生型と同様の生育を示した。このことは、SPSがソース葉におけるショ糖合成を律速しているという考え方がイネでは当てはまらない可能性を示唆している。葉身のSPS活性が高い系統であるNIL-SPS1については、戻し交雑系統のF2集団を圃場で栽培し、遺伝子型の調査からOsSPS1がホモに固定されたと思われる系統を選抜した。本年度のOsSPS1発現抑制系統およびCRISPR-Cas9system系統の解析から、SPSがソース葉におけるショ糖合成を律速しているという、これまで他の植物の解析から確立されてきた考え方がイネでは当てはまらない可能性が示唆された。この結果は予想外であったが、その新規性は高く、現在国際誌に成果を発表する準備を進めている。また、NIL-SPS1を用いた解析に関しても順調に系統の確立が進んでいる。以上の結果から判断すると、研究はおおむね順調に進展していると言える。本研究では、イネの葉におけるショ糖合成の鍵酵素として知られるショ糖リン酸合成酵素(SPS)に着目し、その酵素活性が上昇/低下したイネを解析することで、イネの糖代謝、ひいては生育、収量におけるSPSの役割を明らかにすることを目的としている。NIL-SPS1は、日本型水稲品種「コシヒカリ」を遺伝的背景とし、SPSをコードする主要な遺伝子であるOsSPS1近傍がインド型水稲品種「カサラス」に置換された系統である。葉身のSPS活性が親品種のコシヒカリよりも高く、一穂籾数が多いことが明らかとなっており、カサラス型のOsSPS1が一穂籾数を増加させる可能性が示唆されていた。本年度は、NIL-SPS1にコシヒカリを戻し交雑したF3集団、およびNIL-SPS1にOsSPS1の発現を低下させるRNAiコンストラクトを導入した系統の一穂籾数に着目し解析を行った。その結果から、OsSPS1はNIL-SPS1の高い一穂籾数には関与していない可能性が高いと考えられた。昨年度までのSPS変異体の解析から、SPSがソース葉におけるショ糖合成の制限要因であるというこれまでの定説がイネでは当てはまらない可能性が示唆された。本年度は昨年と同様にOsSPS1ノックダウン(KD)系統の圃場試験を行い、同様の結果を得た。また、昨年度までに作出したOsSPS11ノックアウト(KO)系統とOsSPS1-KD系統を交配し、OsSPS1-KD/OsSPS11-KO個体を得ることに成功した。この系統は野生型と同様の栄養成長を示した。この結果はOsSPS1, OsSPS11ダブルノックアウト系統を用いた昨年度までの解析結果を支持している。今後、この系統を用いることで、イネのSPSに関するより詳細な解析が行われることが期待される。本年度の解析により、OsSPS1ノックダウン系統の性質が明らかとなり、新たに作出した遺伝子発現抑制系統と合わせて次年度以降の解析に用いる供試材料が確立された。また、OsSPS1の花粉における役割に関する解析は研究計画を前倒しして実施したものであるが、その内容をまとめたものが英語原著論文に受理されており、計画以上の結果が得られたと言える。NIL-SPS1を用いた解析に関しては戻し交雑が予定より1年遅れているものの、遺伝子発現抑制系統の作出は計画通り進行しており、次年度以降の解析には支障がないと考えられる。OsSPS1ノックダウン系統については水田圃場での解析の再現性を確認する。