hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スーパー線型正準変換

有限個のボソン係とフェルミオン系の生成削滅作用素を混ぜて変換する任意の線形正準超変換は,フォック超空間のある(Weakly)ユニタリー変換によって引き起こされることを証明した.これが,主要結果である.まず,上記の線形正準超変換の全体はOSPというリースーパー群をなす.OSPの任意の1つLに対して,フォック超空間のある変換Uがあって,UがLを引こ起こし,Berezin解析と普通の解析の統合であるスーパー解析(Super Analysis,超解析)の計算によればUはLから積分核で具体的に決定される.問題はUが(weakly)ユニタリーであることを示すことになるが,積分核が複雑なので,直接には困難である.OSPの生成元に関するある種の議論をすることにより,特別なOSPの要素Lに対応するUのユニタリー性を議論すればよいことがいえる.2通りの場合に分けて,リー・スーパー群に関する議論とGaussの積分公式の拡張を用いることで解決する.以上の結果を出す過程で,Lie super群の一般論やHilbert superspaceの線形位相空間的構造に関する議論,さらにG^∞-classの関数についての議論などが現れ,これ等の抽象論が具体的な問題に有効に適用できることが確認された.最初に述ベた結果から,OSPの要素Lに上にのベたUを対応させる写像を考えると,リースーパー群のOSPの表現についてのある種の命題が導かれる。
データマイニングによる院内感染サーベイランスの評価とアウトブレイクの効果的検出

厚生生労働省院内感染対策サーベイランス(JANIS)事業において、全国数十の医療施設から院内感染の発生状況を把握するデータが収集されている。しかし、臨床現場が求めているような具体的な実際的な情報の還元がおこなわれておらず、そのための疫学的評価システムの構築が要望されている。本研究の目的は、院内感染サーベイランスにデータマイニングを応用して、院内感染サーベイランスの評価とアウトブレイクの効果的検出を実現する疫学的評価システムを構築することにある。本年度はJANIS事業のICU部門の大規模コホートデータを用いて、院内感染サーベイランスにて収集したデータの集計解析における統計学的従来法とデータマイニング法の適用について検討した。また、現場のスタッフの情報収集の労力を減らし、院内感染サーベイランスを効率的におこなうために、病院情報システムの活用について検討した。1.ニューラルネットワークを用いて統計学的従来法(多重ロジスティック回帰モデル)よりも予測精度が優れたアウトカムを予測するモデルを構築した。(IMECS 2007発表)4.病院情報システムにある情報から院内感染発生率を算出できるか検討した。(環境感染2007)5.サンプリングにより院内感染発生率の分母のディバイス装着日数を推計する方法を提案し、予測精度を評価した。(日本環境感染学会2008発表、日本衛生学会2008発表)厚生生労働省院内感染対策サーベイランス(JANIS)事業において、全国数十の医療施設から院内感染の発生状況を把握するデータが収集されている。本年度は既存の文献のレビューから院内感染サーベイランスにデータマイニングを応用した事例、院内感染サーベイランスにおいてアウトブレイクを検出した事例を調査した。また、院内感染サーベイランスの大規模コホートデータ(ICU入室患者を対象にしたもの)を収集して、基礎になるデータベースを構築した。統計学的解析からえた結果として、以下を報告した。1.院内感染は死亡の増加や入院の延長をもたらすが、院内感染患者が敗血症を併発すると、これら医療負担が増大することを示した。非感染患者を1とした標準化死亡比は敗血症を併発しない院内感染患者で1.18(95%信頼区間:0.82-1.21)、敗血症を併発した院内感染患者で2.43(95%信頼区間:1.88-3.09)であった。生存者の平均在室日数は非感染患者で3.8日、敗血症を併発しない院内感染患者で11.8日、敗血症を併発した院内感染患者で15.0日であった。データマイニングの適応事例として、以下を報告した。2.ニューラルネットワークを用いて、従来法(多重ロジスティック回帰)よりも予測精度が優れた予測モデルを構築した。3.ニューラルネットワークを用いて、時間軸上のイベントを考慮した予測モデルを構築した。(日本環境感染学会2008発表、日本衛生学会2008発表)
脂質非対称センシング機構の解明および応用研究の基盤形成

細胞膜の脂質二重層では、内外層で脂質組成や役割が異なっている。本研究では、その様な脂質非対称の状態を脂質非対称センサータンパク質Rim21が感知する仕組みを解明し、応用研究に向けた基礎知見を得ることを目指している。平成30年度は、Rim21の翻訳後修飾の解析で進展があった。申請者は、Rim21がN結合型糖鎖修飾を受けることを以前に報告している。しかし、その修飾部位は不明であった。今回、典型的なN結合型糖鎖修飾モチーフに変異を導入したが糖鎖修飾への影響は見られなかった。そこで、非典型的なモチーフを含めて変異解析の規模を拡大したところ、Rim21が非典型的な糖鎖修飾モチーフでN結合型糖鎖修飾を受けることを見出した。この部位での糖鎖修飾は脂質非対称センサー複合体の形成や下流のシグナル伝達因子集合体の形成には必要ではなかった。しかし、この糖鎖修飾部位に変異を導入するとRim21の半減期が延長した。また、このRim21変異タンパク質は生化学的な細胞分画や界面活性剤による可溶化アッセイにおいて、野生型のRim21とは異なる挙動を示した。このことは、N結合型糖鎖修飾を受けていないRim21は、細胞膜において野生型とは異なる脂質微小環境に局在することを示唆している。近年、糖鎖部分での相互作用を介して、膜タンパク質が脂質の微小環境に出入りするモデルが提唱されており、興味深い。Rim21のユビキチン化を介したシグナル伝達に関しても進展があった。Rim21に端を発するRim101経路にはユビキチン化反応が必要である。平成30年度では、脱ユビキチン化酵素Doa4がRim101経路の不要なあるいは過剰な活性化を抑制していることを見出した。このことは、ユビキチン化と脱ユビキチン化の拮抗作用によって、脂質非対称シグナルのON/OFFの調節がなされていることを示している。脂質非対称の感知およびシグナル伝達機構を解明するには、脂質非対称センサーRim21の分子解剖が欠かせない。その意味で、Rim21のN結合型糖鎖修飾部位を同定し、N結合型糖鎖修飾がRim21の脂質微小環境への局在を調節していることを明らかにした意義は大きい。近年、膜タンパク質が糖鎖同士の相互作用を介して、脂質の微小環境に出入りするモデルが提唱されており、Rim21はそのモデルの検証における良い例に成り得るため、その意味でもこの成果は意義深い。脱ユビキチン化酵素Doa4が、Rsp5によるユビキチン化反応と拮抗する形でRim101経路の不必要あるいは過剰な活性化を抑制していることを見出したことも成果の一つである。ユビキチン化と脱ユビキチン化の拮抗作用による生体反応の制御は、ユビキチンの分野で重要な話題の一つになっている。本研究の成果は、この様な拮抗作用の新たなパラダイムとなり得る。この様に、脂質非対称センサータンパク質Rim21に対する翻訳後修飾(N結合型糖鎖修飾、ユビキチン化ー脱ユビキチン化)に関して、新たな知見が得られた点は平成30年度の大きな成果である。その一方で、脂質非対称センサーモチーフと脂質の相互作用に関する研究、質量分析によるRim21のユビキチン化部位の同定、病原性真菌類のRim21の解析に関しては、予定していた進展は見られなかった。特に、Rim21のユビキチン化部位の同定は、Rim21の発現量が極端に低いため、質量分析の検出感度を下回ってしまった。そこで、in vitroでRim21組換えタンパク質をユビキチン化する系を設計し、おおむね完成した。総合すると、予定通りに進まなかった部分もあるが、新たな知見が得られた面もあり、おおむね順調に進展していると言える。Rim21のN結合型糖鎖修飾に関して、平成30年度に明らかにした内容を中心にした論文の作成、投稿を行う。そのためのデータ取得や投稿後にレフェリーから求められたリバイス実験などを行う予定である。Rim21のユビキチン化部位の同定に関しては、確立しつつあるin vitroユビキチン化反応の実験系を用いて、Rim21組換えタンパク質のユビキチン化を試験管内で大量に行い、質量分析によってユビキチン化部位を特定する予定である。ユビキチン化部位が決定できたら、その部位に変異を導入することで、ユビキチン化が果たす役割を明らかにする。これらの結果に、平成30年度に明らかにした脱ユビキチン化酵素Doa4によるRim101経路の抑制効果に関する内容も併せた内容で論文化を目指す。そのためのデータ取得や投稿後にレフェリーから求められたリバイス実験を行う。Rim21による脂質非対称の感知機構に関しては、脂質非対称センサーモチーフと脂質人工膜との相互作用に関するin vitro実験を推進する。並行して、in vivoで細胞膜とRim21のセンサーモチーフとの相互作用をライブイメージングで明らかにする。この部分は、平成30年度に予定通りに進行しなかった部分であり、平成31年度では重点的に行う。病原性真菌類のRim21に関する研究も行う。出芽酵母のRim21で脂質非対称の感知に重要であることが判明したアミノ酸残基に関して、病原性真菌であるCandida glabrataのRim21の該当するアミノ酸残基に変異を導入し、脂質との結合実験などを行う。

このことにより、脂質非対称感知機構の真菌類一般での保存性を検証し、真菌感染症に対する創薬に寄与する知見を得る予定である。細胞膜の脂質二重層間では脂質組成や役割が異なるが、本研究ではその様な脂質非対称の状態をセンサータンパク質Rim21が感知する分子機構の解明と応用研究に向けた基盤形成を目指している。平成28年度は、Rim21のC末端細胞質領域(Rim21C)に存在するセンサーモチーフが、実際に膜のどの様な状態を感知することで脂質非対称をモニターしているか、という問題に対してin vivoとin vitro解析によって新たな知見を得る計画であった。In vivo解析に関しては、細胞膜脂質に関する様々な突然変異体を用いてGFP-Rim21Cと細胞膜との結合を顕微鏡下でモニターした。その結果、細胞膜内層に豊富に存在するホスファチジルセリンがRim21Cと細胞膜の結合に関与することを示唆した。一方、in vitro解析では、Rim21Cの組換えタンパク質の大量精製が難航している。しかし、これまでに試した大腸菌での発現系、カイコ幼虫での発現系に加えて、小麦胚芽抽出物を用いた無細胞系での大量精製も試みたところ、純度はかなり改善された。収量は依然として十分ではないため、さらなる改善が必要である。その一方で、Rim21Cと様々な脂質組成の人工膜との相互作用を、より少ない量のRim21Cでも解析出来る方法も模索しており、リポソームとGST-Rim21Cを用いたバイオレイヤー干渉法で良い感触を得た。病原性真菌類のRim21は真菌感染症に対する良い創薬ターゲットとなる可能性がある。そこで、病原性真菌Candida glabrataのRim21C領域をクローニングし、GFP融合タンパク質として出芽酵母に発現したところ、出芽酵母のRim21Cと同様の挙動を示した。すなわち、出芽酵母と病原性真菌類では同様の感知システムが機能していると予想され、出芽酵母で得た知見を適用できる可能性が高くなった。脂質非対称センサーが実際にモニターする細胞膜の状態について、負電荷を有するホスファチジルセリンがセンサーモチーフとの相互作用に関わることを示唆したのは大きな前進である。これまでに、センサーモチーフはホスファチジルセリンを含めた幾つかの負に荷電した脂質と結合することをin vitrolipid overlay assayで示してきたが、ホスファチジルセリン合成酵素の欠損株を用いたin vivo解析でそれを支持した形となった。ホスファチジルセリンは細胞膜では細胞質側の層にほとんどが存在し、非対称分布を示す脂質分子種の代表例となっており、存在量も多い。したがって、細胞内でもセンサーモチーフと相互作用しうるトポロジーであり、実際のセンシング過程を捉えている可能性が十分にある。これらのことから大きな前進と言える。一方で、in vitro解析は、Rim21C組換えタンパク質の大量精製が難航していることから期待した様な成果は得られていない。その中でも、試行錯誤によって無細胞発現系でこれまで以上に純度の高い組換えタンパク質が精製できたこと、また少量の組換えタンパク質でも人工膜との相互作用を定量的に解析出来る実験系の構築に目途がたったこと、などは明るい材料である。病原性真菌類のRim21Cが、出芽酵母と同様の挙動を示す事を示唆し、出芽酵母で得た知見を適用しうることを示した点は評価できる。
乳癌治療におけるAlloimmune response応用についての基礎的研究

本研究に関連した事項として、大量化学療法によるより効果的なmass reductionについての検討が必要と考え、この項目を今回の検討に含めた。しかし、化学療法単独では生命予後の改善に至ったとの報告は数少ない。この点mass reductionされた腫瘍を免疫監視機構による再燃、再発の抑制におけるAlloimmuno responseの応用の可能性について以下の検討を行った。HLAは、個体を識別するためにCD8細胞への抗原提示に重要な役割を果たしていると考えられている。特に癌抗原認識にはCD8細胞のT cell receptorによる認識とHLAーClass Iによる抗原提示が必要とされ、これにco-factorとしてのAlloimmuno responseの関与を利用した腫瘍抑制効果を得ることを本研究の最終目的としてた。本研究期間中には基礎研究として乳癌細胞のHLA-Class I抗原欠損について検討した。効果的なmass productionを目的とした化学療法に関しては、再発乳癌を対象とした大量化学療法によるmass reduction効果の検討では末梢血幹細胞移植によりかなりのmass reductionが行え、観察期間が短く予後判定するには至らなかったがCR例がかなり得られることが分かった。Alloimmuno responseの基礎的な研究として、乳癌の組織におけるHLA-Class I抗原欠損の欠損頻度を評価する方法について、組織を単離細胞化してフローサイトメトリー法を用いた評価が可能であり、本法では測定値が数値化されるため判定量が可能でより正確に欠損度を評価することができるとの結果が得られた。研究目的HLA Class I欠損した腫瘍細胞とこれに対応するリンパ球のセルラインを得るために研究材料の収集、及び前処理を平成10年度に施行した。乳癌では約3割にHLA Class I欠損腫瘍が存在する事が今回の研究により判明した。このHLA Class Iの欠損が癌の進展、悪性度についてp53、臨床的予後との比較を行ったが、この点では有意な所見は得られなかった。今後、この点に絞って実験的な研究を追加する予定である。研究実施研究材料の収集1)対象症例1998年2月より6月までの5ケ月間に乳房切除術、およびリンパ節郭清を施行した15例の乳癌手術対象患者よりインフォームド・コンセントを得た後、乳癌組織、リンパ節、末梢血単核球を採取した。患者の組織型は、非浸潤性乳管癌2例、浸潤性乳管癌11例、硬癌2例であった。腫瘍はtl 3例、t2 11例、t3 1例で、リンパ節転移は、3個以内(nla)3例、4個以上(n1b 1、n3 1)2例であった。2)研究材料の前処理乳癌組織中のHLA Class I抗原の発現率を検討するために、モノクローナル抗体(W6/32,DAKO)を用いて、免疫組織染色および単離細胞浮遊液を作成してフローサイトメトリー法によりHLA Class I抗原の発現について検討した。HLA Class I陰性例は、免疫組織染色では25%に、フローサイトメトリー検査では発現率20%以下の症例が27%に認められた。研究成績の報告以上の成績について、HLA Class I抗原とp53抗原発現率、臨床経過による悪性度評価について第36回日本癌治療学会(福岡)にて報告を行った。乳癌の治療成績を向上させるには、第1に外科的切除であれ、化学療法であれ何らかの方法によりmass reductionを行うこと、また、第2にその後の再燃、再発をいかに抑制するかとの問題がある。乳癌に対するmass reductionについては大量化学療法の腫瘍抑制効果について数多くの報告がされている。しかし、何れの方法単独では生命予後の改善に至ったとの報告は数少ない。このため、本研究に関連した事項として、大量化学療法によるより効果的なmass reductionについての検討を今回の検討に含めた。特に癌抗原を認識するにはHLA-Class I抗原が必要とされる。

このような免疫的な機序によるmicro levelでのAlloimmuno responseを応用した抗腫瘍効果を得ることを本研究の最終目標とし、これに関連した乳癌細胞のHLA-Class I抗原欠損の意義について以下の検討および報告を行った。効果的なmass reductionを目的とした化学療法に関しては、第35回癌治療学会、第25巻、第26巻の「癌と化学療法」誌上において主として、再発乳癌を対象として化学療法によるmass reduction効果の検討を行い報告した。また、Alloimmuno responseのきわめて基礎的な研究として、乳癌の組織におけるHLA-Class I抗原欠損について欠損頻度と、悪性度(p53を測定することにより推測した。)を比較検討し第36回癌治療学会に報告した。
大腸癌の転移・再発のモノクローナル抗体による質的画像診断

腫瘍の画像診断に,腫瘍関連抗原に対する抗体を用いることは,抗体のもつ特異性により腫瘍の病理学的性格を反映するため、質的診断を行う上で最も理論にかなったものといえる。我々は大腸癌の転移・再発の質的診断を行うために、大腸癌組織に最も高い発現率を示すcarcinoembryonic antigen(CEA)に対するモノクローナル抗体CEA102を作製し、その臨床応用に取り組んできた。^<131>I標識抗体を用いた臨床応用に続き、今回診断機器として3次元的解析が可能なSingle Photon Emission CT(SPECT)を使用し得る^<111>Inを用い,その体内動態、および臨床応用を試みた。^<131>Iと^<111>Inそれぞれの標識CEA102の体内動態と画像の比較を大腸癌移植ヌードマウスを用い比較検討した結果、^<131>I標識では投与後5-6日目が最も鮮明であったが、^<111>In標識では1-3日目が最も鮮明であった。組織内分布をみると、^<131>I標識では肝、腎における放射活性は4日目以降対腫瘍比は1以下となったが、^<111>In標識では肝脾の対腫瘍比は3日目以降もすべて1を越えた。これらにより両核種の至適撮像時期には差があり、また^<111>In標識はSPECTの応用が出来るため骨髄内再発巣などの評価に有用であるが、肝転移の評価には^<131>I標識が適していると考えられた。大腸癌の画像診断の臨床応用において、^<131>I標識CEA102を用いて施行した20症例の陽性率は15/21(71.4%)で、各病巣別では、原発巣4/4(100%)、肝転移5/6(83.3%)、局所再発5/10(50%)、鼠径リンパ節転移1/1(100%)であった。^<111>In標識CEA102を用いて10例の臨床例を行い、陽性率は7/10(70.0%)であった。直腸癌局所再発は診断機器としてSPECTを用い8例中5例に明瞭に診断することができた。以上よりモノクローナル抗体による画像は空間分解能からみた画像の質としてはCT、MRIに劣るが、質的診断において有用性を示した。我々は、大腸・直腸癌に対する質的画像診断をめざして、CEAに対するモノクローナル抗体CEA102を作製し、^<137>I標識抗体を用いて、臨床例25例を行った。その結果、直腸癌局所再発の診断において、術後の肉芽性変化と再発巣との識別に有効な症例を経験したが、画像のQuality、時間がかかる等の欠点を有するため、その改良としてF(ab′)_2分画の利用、FCRによるAutoradiography等の基礎的検討を行ってきた。しかしながら、^<131>Iはgamma-線の放出により画質が不十分であり、またSPECTが用いられない等、大腸癌で最も診断の困難な直腸癌の局所再発の診断には不向きである。

そこで平成5年度は^<111>Inの使用を中心に1.^<111>Inと^<131>Iの実験モデルを用いてその体内動態を検討し、^<111>Inの至適投与量、適切な撮影時期の検討、2.SPECTを用いて多数の臨床例を行い、一般検査としての実用性を検討する、等を課題として行った。ヌードマウスを用いた実験において、^<131>Iが35日目に腫瘍集積比が最も高いのに対し、^<111>Inでは1日目が最も強く、以後減弱した。また^<111>Inは肝・脾などの網内系への取り込みが高く、時に腫瘍より集積率が上昇した投与抗体量は^<131>Iと同様24mg(ヒトの場合)でよいことが判明した。臨床例は進行大腸癌6例、CEA産生小腸腫瘍に行い、標識抗体投与後13日間、planer scan及びSPECTを施工して撮影したところ、全例に描出が可能であった。以上より^<111>Inの有用性が示されたが、肝・脾へのとり込みが強いため、肝再発等への画像診断が困難であるため、平成6年度はTc^<99m>等の核種による画像診断を中心に行う予定である。腫瘍の画像診断に、腫瘍関連抗原に対する抗体を用いることは、抗体のもつ特異性により腫瘍の病理学的性格を反映するため、質的診断を行う上で最も理論にかなったものといえる。我々は大腸癌の転移・再発の質的診断を行うために、大腸癌組織に最も高い発現率を示すcarcinoembryonic antigen(CEA)に対するモノクローナル抗体CEA102を作製し、その臨床応用に取り組んできた。^<131>I標識抗体を用いた臨床応用に続き、今回診断機器として3次元的解析が可能なSingle Photon Emission CT(SPECT)を使用し得る^<111>Inを用い、その体内動態、および臨床応用を試みた。^<131>Iと^<111>Inそれぞれの標識CEA102の体内動態と画像の比較を大腸癌移植ヌードマウスを用い比較検討した結果、^<131>I標識では投与後5-6日目が最も鮮明であったが、^<111>In標識では1-3日目が最も鮮明であった。組織内分布をみると、^<131>I標識では肝、腎における放射活性は4日目以降対腫瘍比は1以下となったが、^<111>In標識では肝脾の対腫瘍比は3日目以降もすべて1を越えた。これらにより両核種の至適撮像時期には差があり、また^<111>In標識はSPECTの応用が出来るため骨盤内再発巣などの評価に有用であるが、肝転移の評価には^<131>I標識が適していると考えられた。大腸癌の画像診断の臨床応用において、^<131>I標識CEA102を用いて施行した20症例の陽性率は15/21(71.4%)で、各病巣別では、原発巣4/4(100%)、肝転移5/6(83.3%)、局所再発5/10(50%)、鼠径リンパ節転移1/1(100%)であった。^<111>In標識CEA102を用いて10例の臨床例を行い、陽性率は7/10(70.0%)であった。直腸癌局所再発は診断機器としてSPECTを用い8例中5例に明瞭に診断することができた。以上よりモノクローナル抗体による画像は空間分解能からみた画像の質としてはCT,MRIに劣るが、質的診断において有用性を示した。
E型肝炎の血清疫学的研究と予防法の確立

E型肝炎はA型肝炎とにて経口感染で伝播し、急性肝炎をおこすだけで慢性化しない。インド、ミヤンマー、ネパール、中国のウイグル自治区など南アジアを中心にして観察される。E型肝炎の様な未知の感染症の研究はだいたい研究方法はきまっていて、我々も常道に従って研究を進めた。1.先ず感染実験モデルを確立する。2.患者或は感染した動物からウイルスを分離する。3.ウイルスの核酸のクローニングをし塩基配列を決定する。4.この肝炎の血清免疫学的、又核酸からの診断方法を確立する。5.この診断キットを使用してこの肝炎の血清疫学的研究を行う。6.ワクチン、γ-グロブリンによる予防方法を確立する。そして現在我々の研究は1から5まできわめて順調に進み、あと6の研究を残すのみとなった。E型肝炎の疫学と臨床:E型肝炎は多くの流行が報告されている他、散発性の肝炎もかなりある。我々の調査期間中でもトルファン、ヤンゴンで小流行があり、これらの流行からウイルスの分離、ウイルス核酸のクローニング、全塩基配列の決定を行うことができた。またこれらの地域では散発性の急性肝炎の中でもE型肝炎がかなりあることも明かにされた。この事実は北京、上海ですら散発性の肝炎の中に10%程度E型肝炎があることがはっきりした。今年度調査したチベットのラサでははっきりしたE型肝炎の流行は明かに出来なかったが、散発性の急性肝炎の4.3%がE型肝炎であった。なお日本では散発性の肝炎の内の非A非B型非C肝炎499例についてE型肝炎の可能性を調査したが、5例がE型肝炎であることが判明した。急性肝炎全体の0.3%に相当する。その内3例は流行地への旅行者であったが、2例は海外旅行をしておらず二次感染の可能性があった。インドでの肝炎の流行は、子供の間に流行するのはA型肝炎でこのE型肝炎は若い成人の間に流行する事が明かであった。この事実は他の国でも同様であり、一つの謎になっている。そのため再感染実験も行ったが、再感染は証明されなかった。このウイルスはA型肝炎ウイルスのように感染性が強くなく流行地でも全ての子供が感染して抗体を持つという様な状態にならない為かもしれない。E型肝炎の感染実験:かにくいざる、あかげざるを使用し、十分なウイルス量を経静脈的に接種すれば100%感染が成立することが明かになった。ウイルスは血中のみならず胆汁中にウイルスを排出するが、胆汁中の殆ど純培養に近い形でウイルス粒子が証明された。肝炎の組織像は他のウイルス性肝炎と殆ど同じであった。E型肝炎ウイルス:E型肝炎ウイルスは形態からカリシウイルスに似ている。このウイルスは凍結融解や塩化セシウムなどに対して比較的弱い。感染したかにくいざるの胆汁からRNAを抽出し、λgt11に入れてcDNAライブラリーを作製した。これからimmunoscrleening法によりE型肝炎ウイルスの核酸の一部のクローニングに成功した。ミヤンマー散発例の株とミヤンマー有効例の株、それにウイグル自治区の二株、合計4株のウイルスの全塩基配列を決定した。ミヤンマー株と中国株のホモロジーは塩基で93%、アミノ酸で98%であった。E型肝炎の診断:釣り上げたクローンを抗原としてE型肝炎診断のためのE型肝炎抗体のEIA法によるアッセイ系を作った。この抗体アッセイ系はE型肝炎に特異的ではあるが、ORF2の部分のエピトープを使用した抗体はE型肝炎のトランスアミナーゼの上昇とともに陽性となるが、肝炎から回復すると3カ月ぐらいで陰性化する。従って急性のE型肝炎の診断にこのアッセイ系は使用できるが、血清疫学的調査には使用できないことが明かになった。研究遂行上の問題点:E型性肝炎は主として開発途上国で見られ、これらの国々では保健衛生上重要な病気の一つである。所が日本では僅かな輸入肝炎の症例以外はほとんどない。この肝炎が蔓延している開発途上国で先進的な技術による研究は不可能にちかい。この様な意味からこのテーマは日本が開発途上国の保健衛生の貢献しうる最適なものであった。日本では市場がないため、日本の製薬会社はE型肝炎の診断試薬、ワクチンを作る意図が全く、我々の研究は5で終了せざるを得ないのが現状である。このような研究の継続が発展途上國援助の枠内でできるシステムが望まれる。

我々の調査期間中でもトルファン、ヤンゴンで小流行があり、これらの流行からウイルスの分離、ウイルス核酸のクローニング、全塩基配列の決定を行うことができた。またこれらの地域では散発性の急性肝炎の中でもE型肝炎がかなりあることも明かにされた。この事実は北京、上海ですら散発性の肝炎の中に10%程度E型肝炎があることがはっきりした。今年度調査したチベットのラサでははっきりしたE型肝炎の流行は明かに出来なかったが、散発性の急性肝炎の4.3%がE型肝炎であった。なお日本では散発性の肝炎の内の非A非B型非C肝炎499例についてE型肝炎の可能性を調査したが、5例がE型肝炎であることが判明した。急性肝炎全体の0.3%に相当する。その内3例は流行地への旅行者であったが、2例は海外旅行をしておらず二次感染の可能性があった。インドでの肝炎の流行は、子供の間に流行するのはA型肝炎でこのE型肝炎は若い成人の間に流行する事が明かであった。この事実は他の国でも同様であり、一つの謎になっている。そのため再感染実験も行ったが、再感染は証明されなかった。このウイルスはA型肝炎ウイルスのように感染性が強くなく流行地でも全ての子供が感染して抗体を持つという様な状態にならない為かもしれない。E型肝炎の感染実験:かにくいざる、あかげざるを使用し、十分なウイルス量を経静脈的に接種すれば100%感染が成立することが明かになった。ウイルスは血中のみならず胆汁中にウイルスを排出するが、胆汁中の殆ど純培養に近い形でウイルス粒子が証明された。肝炎の組織像は他のウイルス性肝炎と殆ど同じであった。E型肝炎ウイルス:E型肝炎ウイルスは形態からカリシウイルスに似ている。このウイルスは凍結融解や塩化セシウムなどに対して比較的弱い。感染したかにくいざるの胆汁からRNAを抽出し、λgt11に入れてcDNAライブラリーを作製した。これからimmunoscrleening法によりE型肝炎ウイルスの核酸の一部のクローニングに成功した。ミヤンマー散発例の株とミヤンマー有効例の株、それにウイグル自治区の二株、合計4株のウイルスの全塩基配列を決定した。ミヤンマー株と中国株のホモロジーは塩基で93%、アミノ酸で98%であった。E型肝炎の診断:釣り上げたクローンを抗原としてE型肝炎診断のためのE型肝炎抗体のEIA法によるアッセイ系を作った。この抗体アッセイ系はE型肝炎に特異的ではあるが、ORF2の部分のエピトープを使用した抗体はE型肝炎のトランスアミナーゼの上昇とともに陽性となるが、肝炎から回復すると3カ月ぐらいで陰性化する。従って急性のE型肝炎の診断にこのアッセイ系は使用できるが、血清疫学的調査には使用できないことが明かになった。研究遂行上の問題点:E型性肝炎は主として開発途上国で見られ、これらの国々では保健衛生上重要な病気の一つである。所が日本では僅かな輸入肝炎の症例以外はほとんどない。この肝炎が蔓延している開発途上国で先進的な技術による研究は不可能にちかい。この様な意味からこのテーマは日本が開発途上国の保健衛生の貢献しうる最適なものであった。日本では市場がないため、日本の製薬会社はE型肝炎の診断試薬、ワクチンを作る意図が全く、我々の研究は5で終了せざるを得ないのが現状である。このような研究の継続が発展途上國援助の枠内でできるシステムが望まれる。
イネPolycomb複合体が制御する胚乳発生機構の解明

これまでの解析から,イネのPolycomb repressive complex 2(PRC2)構成因子の1つであるOsEMF2aは,初期胚乳発生,特に胚乳の細胞化の過程に関わっていることを明らかにしてきた.そこで本研究では,イネ胚乳におけるPRC2が制御する胚乳発生メカニズムを明らかにすることを目的としている.PRC2標的遺伝子を同定することを目的とし、前年度までにOsemf2a変異体における細胞化しない胚乳のRNA-seq解析を実施し,Osemf2aの胚乳で発現変動する遺伝子を抽出した。更に今年度は、イネ胚乳におけるH3K27me3のChIP-seq解析を実施した。Osemf2a変異体で発現が上昇し、H3K27me3の修飾の見られる遺伝子は3,612個あり、これらの遺伝子はイネ胚乳におけるPRC2の標的遺伝子であると考えられた。シロイヌナズナにおける先行研究からMADS-box転写因子は、胚乳の細胞化に関わるPRC2の標的であることが報告されている。そこで、今回同定したPRC2標的遺伝子のうち、細胞化タイミングに相関が見られた3つのMADS遺伝子に着目し、その機能解析のためにCRISPR/Cas9による変異体の作成を進めている。また、Osemf2a変異体と野生型イネとの相互交雑による表現型観察と、OsEMF2aの対立遺伝子特異的なシークエンス解析から、OsEMF2aが母親由来の対立遺伝子からのみ発現するインプリント遺伝子であることを明らかにした。更に、Osemf2a変異体において、受粉せずに子房が肥大する表現型が観察されたため、組織学的な観察を実施したところ、受精せずに胚乳核が分裂を起こす自律的胚乳核分裂が観察された。当初の計画通り進行しており、本年度はイネ胚乳におけるChIP-seq解析を完了し、イネの胚乳におけるPRC2標的遺伝子を多数同定することができた。中でも、細胞化の制御に関わる可能性の高いMADS遺伝子を絞込むことができ、CRISPR/Cas9による変異体の作出に取り掛かることができた。また、OsEMF2aがインプリント遺伝子であることを明らかにすることができた。加えて、emf2a変異体において自律的な胚乳核分裂が見られることから、イネPRC2が、胚乳発生だけでなく受精前の胚乳核分裂を抑制する機能を担っている可能性を示すことができた。細胞化の制御に関わる可能性の高いMADS遺伝子の変異体の機能解析を実施する。加えて、その他のPRC2標的遺伝子やOsemf2a変異体で発現変動する遺伝子の機能からイネPRC2が制御する初期胚乳発生のメカニズムを明らかにする。また、Osemf2a変異体において自律的胚乳核分裂が観察されたため、自律的胚乳核分裂の生じた子房におけるトランスクリプトーム解析を実施することで、胚乳核分裂に関わる遺伝子の発現が見られるのかを明らかにする。イネの初期胚乳発生は収量や品質を決定する重要な過程である.コメの主成分であるデンプン合成が行われる登熟過程に関わる研究は古くから行われており,関連する因子も数多く単離されている.一方で,登熟期以前の過程,初期胚乳発生に関わる分子は,ほとんど明らかになっていない.これまでの解析から,イネのPolycomb repressive complex 2(PRC2)構成因子の1つであるOsEMF2aは,初期胚乳発生,特に胚乳の細胞化の過程に関わっていることを明らかにしてきた.そこで本研究では,イネ胚乳におけるPRC2が制御する胚乳発生メカニズムを明らかにするため,イネPRC2変異体の機能解析と共に,胚乳におけるトランスクリプトームおよびChIP-seq解析から,初期胚乳発生に関わるPRC2標的遺伝子を同定し,その機能解析を実施する.今年度はOsEMF2a以外のPRC2構成因子の胚乳発生への影響を明らかにするため,全てのPRC2構成因子のT-DNA挿入系統を取得した.T-DNA挿入系統の無いものに関してはCRISPR/Cas9システムを用いて変異体系統の作出を行った.その結果,OsFIE2以外のT-DNA挿入系統または変異体を取得することができたが,emf2a変異体と同様に胚乳発生に異常の見られる変異体は得られなかった.イネPRC2構成因子はそれぞれ2コピー存在するため,機能重複しているものと考えられる.しかし,OsEMF2aにもOsEMF2bがパラログとして存在するが, emf2aでのみ胚乳発生の異常が見られるため,OsEMF2a単体で主要な機能を担っていることが示唆された.また,PRC2標的遺伝子の同定に向けて, emf2aから得られた細胞化していない胚乳のRNA-seq解析を実施し,野生型イネの細胞化前後の胚乳と比較することで,emf2aの胚乳で発現変動する遺伝子を抽出した.当初の計画通り進行している.当初はemf2a以外の胚乳発生の異常が見られる変異体を同定し,複数の変異体で同様の解析を実施する予定であったが,胚乳で表現型の見られる変異体は同定できなかった.しかし,胚乳の細胞化過程にはOsEMF2aが単体で主要な機能を担っていることが明らかにできた.また,emf2aの胚乳のRNA-seq解析からPRC2標的遺伝子の候補を同定することができた.

これまでの解析から,イネのPolycomb repressive complex 2(PRC2)構成因子の1つであるOsEMF2aは,初期胚乳発生,特に胚乳の細胞化の過程に関わっていることを明らかにしてきた.そこで本研究では,イネ胚乳におけるPRC2が制御する胚乳発生メカニズムを明らかにすることを目的としている.PRC2標的遺伝子を同定することを目的とし、前年度までにOsemf2a変異体における細胞化しない胚乳のRNA-seq解析を実施し,Osemf2aの胚乳で発現変動する遺伝子を抽出した。更に今年度は、イネ胚乳におけるH3K27me3のChIP-seq解析を実施した。Osemf2a変異体で発現が上昇し、H3K27me3の修飾の見られる遺伝子は3,612個あり、これらの遺伝子はイネ胚乳におけるPRC2の標的遺伝子であると考えられた。シロイヌナズナにおける先行研究からMADS-box転写因子は、胚乳の細胞化に関わるPRC2の標的であることが報告されている。そこで、今回同定したPRC2標的遺伝子のうち、細胞化タイミングに相関が見られた3つのMADS遺伝子に着目し、その機能解析のためにCRISPR/Cas9による変異体の作成を進めている。また、Osemf2a変異体と野生型イネとの相互交雑による表現型観察と、OsEMF2aの対立遺伝子特異的なシークエンス解析から、OsEMF2aが母親由来の対立遺伝子からのみ発現するインプリント遺伝子であることを明らかにした。更に、Osemf2a変異体において、受粉せずに子房が肥大する表現型が観察されたため、組織学的な観察を実施したところ、受精せずに胚乳核が分裂を起こす自律的胚乳核分裂が観察された。当初の計画通り進行しており、本年度はイネ胚乳におけるChIP-seq解析を完了し、イネの胚乳におけるPRC2標的遺伝子を多数同定することができた。中でも、細胞化の制御に関わる可能性の高いMADS遺伝子を絞込むことができ、CRISPR/Cas9による変異体の作出に取り掛かることができた。また、OsEMF2aがインプリント遺伝子であることを明らかにすることができた。加えて、emf2a変異体において自律的な胚乳核分裂が見られることから、イネPRC2が、胚乳発生だけでなく受精前の胚乳核分裂を抑制する機能を担っている可能性を示すことができた。計画通り,PRC2によってH3K27me3修飾を受けている遺伝子を網羅的に同定するため,イネの胚乳におけるH3K27me3抗体を使用したChIP-seq解析を実施する.また,今年度行ったRNA-seqの結果とChIP-seqの結果から,PRC2の標的遺伝子を同定する.その中で,胚乳の細胞化タイミングに相関関係の見られる遺伝子について,変異体の作成を行い,その機能解析を実施する.emf2aでは胚乳発生が異常になり,種子が致死するが,わずかに胚乳細胞の形成が見られる.加えて,emf2a・emf2bの二重変異体では,種子の致死率が増加することから,寄与率は低いもののOsEMF2bも胚乳発生過程に関与している,またはOsEMF2aの機能を部分的に補填している可能性が考えられる.そこで,OsEMF2aとOsEMF2bの胚乳における機能解析を実施し,その機能の違いを明確に明らかにする.細胞化の制御に関わる可能性の高いMADS遺伝子の変異体の機能解析を実施する。加えて、その他のPRC2標的遺伝子やOsemf2a変異体で発現変動する遺伝子の機能からイネPRC2が制御する初期胚乳発生のメカニズムを明らかにする。
小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のＸ線結晶構造解析

真核細胞は脂質二重膜によって仕切られる様々な細胞小器官で構成される.そのため,細胞小器官や細胞膜への物質輸送は膜小胞を介して行われる.細胞の運動や形態変化,極性の形成などの「細胞の形と機能」に関わる多くのプロセスにおいて小胞輸送は必須な役割を担う.本研究では,小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のX線結晶構造解析を行い,複雑かつ精密に制御された複合体構築の原理と機能メカニズムの解明を通して小胞輸送制御のメカニズムの一端を原子の精度で明らかにした.また,本研究を通じで得られた複合体研究の技術基盤を活用した共同研究を展開して,複合体によるその他の細胞機能制御機構の解明に役立てた.真核細胞は脂質二重膜によって仕切られる様々な細胞小器官で構成される.そのため,細胞小器官や細胞膜への物質輸送は膜小胞を介して行われる.細胞の運動や形態変化,極性の形成などの「細胞の形と機能」に関わる多くのプロセスにおいて小胞輸送は必須な役割を担う.本研究では,小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のX線結晶構造解析を行い,複雑かつ精密に制御された複合体構築の原理と機能メカニズムの解明を通して小胞輸送制御のメカニズムの一端を原子の精度で明らかにした.また,本研究を通じで得られた複合体研究の技術基盤を活用した共同研究を展開して,複合体によるその他の細胞機能制御機構の解明に役立てた.小胞輸送によるタンパク質や脂質の適切かつ正確な配置は,細胞の運動や形態変化,極性の形成などの「細胞の形と機能」に関わる多くのプロセスにおいて決定的に重要な役割を果たす.本研究では,「細胞の形と機能」の獲得において重要な役割を担う小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のX線結晶構造解析を行い,複雑かつ精密に制御された複合体構築の原理と機能メカニズムの解明を通して小胞輸送制御のメカニズムを原子の精度で明らかにすることを目的とする.本年度は,膜融合の特異性と高効率性を保証するExocyst複合体のSec6サブユニットのホモログであるM-Secの結晶構造を3.4Å分解能で決定した.また,研究項目A03の稲垣教授との共同研究により,M-Secがイノシトールリン脂質PI(3,4,5)P_3に強く結合することを見出した.また,低分子量GTPase Rabを,対応する細胞小器官の膜に固定する役割を担う膜タンパク質GDFの予備的な結晶化に成功し,放射光施設SPring8のBL41XUにおいて7Å分解能の回折データセットを収集した.今後,結晶化条件や発現コンストラクトの変更によって分解能の向上が期待される結果である.さらに,RabとGDFとの複合体の調製・結晶化に向けて,GDFとRabとの複合体形成に必要な脂質修飾をRabに導入するための発現系を構築した.SNAREタンパク質を小胞体膜に挿入するGET複合体では,膜埋込み活性を直接担うGET3サブユニットと基質タンパク質との複合体の予備的な結晶を得た.小胞輸送によるタンパク質や脂質の適切かつ正確な配置は,細胞の運動や形態変化,極性の形成などの「細胞の形と機能」に関わる多くのプロセスにおいて決定的に重要な役割を果たす.本研究では,「細胞の形と機能」の獲得において重要な役割を担う小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のX線結晶構造解析を行い,複雑かつ精密に制御された複合体構築の原理と機能メカニズムの解明を通して小胞輸送制御のメカニズムを原子の精度で明らかにすることを目的とする.今年度は,低分子量GTPase Rabを対応する細胞小器官の膜に固定する役割を担う膜タンパク質GDFに対する特異的なモノクローナル抗体を作成し,Fab断片とGDFとの複合体との結晶化スクリーニングを開始した.高分解能結晶が得られることを期待している.さらに,RabとGDFとの複合体の調製・結晶化に向けて,脂質修飾をRabに導入する方法を確立し,脂質修飾RabとGDFとの複合体の結晶化を進めている.また,SNAREタンパク質を小胞体膜に挿入するGET複合体では,膜埋込み活性を直接担うGET3サブユニットとGET1受容体の細胞質ドメインとの複合体の結晶構造を決定し,変異体解析と合わせて,GET1受容体がGET3二量体の開状態を安定化していることを示唆する結果を得た(論文改訂中).昨年度,3.4Å分解能で構造決定を行ったM-Sec(膜融合の特異性と高効率性を保証するExocyst複合体のSec6サブユニットのホモログ)は,PIP2との結合とその細胞での役割を明らかにするための機能解析を進め,現在論文を準備中である.小胞輸送によるタンパク質や脂質の適切かつ正確な配置は,細胞の運動や形態変化,極性の形成などの「細胞の形と機能」に関わる多くのプロセスにおいて決定的に重要な役割を果たす.本研究では,「細胞の形と機能」の獲得において重要な役割を担う小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のX線結晶構造解析を行い,複雑かつ精密に制御された複合体構築の原理と機能メカニズムの解明を通して小胞輸送制御のメカニズムを原子の精度で明らかにすることを目的とする.今年度は,低分子量GTPase Rabを細胞小器官の膜に固定する役割を担う膜タンパク質GDFについて,リポソームに埋め込んだGDFを抗原とすることで,高分解能結晶の作成に有効だと考えられている立体構造を特異的に認識する抗体の調製を開始した.また,これまでに得られているGDFの結晶について,脱水処理などの工夫を続けたが,分解能の改善は見られなかった.SNAREタンパク質を小胞体膜に挿入するGET複合体では,部位特異的架橋によるTAタンパク質との複合体安定化を行った.

架橋部位の同定と架橋条件の最適化を行うことで,今後の複合体の結晶化につながる結果が得られた.一昨年度,3.4 A分解能で構造決定を行ったM-Sec(膜融合の特異性と高効率性を保証するExocyst複合体のSec6サブユニットのホモログ)は,構造リファインメントを再検討することで分解能を3.0 Aまで向上させた. PIP2およびRalとの結合に関する機能解析の結果と合わせて,論文を投稿した.Exocyst複合体全体については,アフィニティータグの追加などで構造解析に適する試料の調製を試みたが,サブユニット間での発現のばらつきが大きいため,新たな工夫が必要だと思われる.構造未知であるSec10サブユニットについては,システイン残基への変異の導入などで4.5 A分解能程度の回折データは得られたが,構造決定には,結晶のさらなる改善が必要である.小胞輸送によるタンパク質や脂質の適切かつ正確な配置は,細胞の運動や形態変化,極性の形成などの「細胞の形と機能」に関わる多くのプロセスにおいて決定的に重要な役割を果たす.本研究では,「細胞の形と機能」の獲得において重要な役割を担う小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のX線結晶構造解析を行い,複雑かつ精密に制御された複合体構築の原理と機能メカニズムの解明を通して小胞輸送制御のメカニズムを原子の精度で明らかにすることを目的とする.今年度は,低分子量GTPase Rabを細胞小器官の膜に固定する役割を担う膜タンパク質GDFについて,リポソームに埋め込んだGDFを抗原とすることで,高分解能結晶の作成に有効な立体構造を特異的に認識する抗体の調製を試みたが、期待した抗体は得られなかった.一方,これまでに試していなかった生物種の結晶化を行うことで微結晶を得た.C末端に一回膜貫通ヘリックスをもつタンパク質(TAタンパク質)を小胞体膜に挿入するGET複合体では,小胞体膜上のGET3受容体であるGET1/2複合体を安定に調製して結晶化を試みたが,結晶は得られなかった.一方,TAタンパク質の品質管理に関わるBag6タンパク質のTAタンパク質結合ドメインを同定し,その結晶構造を決定した.3.0 A分解能で構造決定を行ったM-Sec(Exocyst複合体のSec6サブユニットのホモログ)は, PIP2およびRalとの結合に関する機能解析の結果と合わせて論文を投稿し、現在改訂中である.Exocyst複合体全体については,共発現コンストラクトの改良による試料の改善を検討したが,構造解析に適する質と量の試料調製にはさらなる工夫が必要である.構造未知であるSec10サブユニットについては,セレノメチオニン標識タンパク質を用いた異常分散法による位相決定を試みたが,構造決定には,結晶のさらなる改善が必要である.
金属延性破壊の中性子による内部構造計測に基づく高精度せん断加工解析システムの構築

本研究では、実際に単軸引張試験にて延性破壊が発生した時点との対比により限界ダメージ値を同定する手法、及び亀裂発生を表現する弾塑性FEMに関するアルゴリズム等の最適化を図り、実際にプレス金型によるせん断加工実験結果との対比等をもとに、亀裂発生箇所及び進展方向等せん断変形過程時の材料挙動が予測できることを確認した。また、金属材料(SS400)が変形する際の材料内部構造変化を中性子回折により延性破壊に至るまで連続的に観察し、材料の局所くびれ変形過程による板幅減少、板厚減少後の破断に至る過程を(110)結晶粒群の体積分率の変化として中性子線回析により捉えることができることを明らかにした。材料の亀裂進展により発生する現象であるせん断加工に対して、弾塑性FEM解析により材料変形過程を予測するために、亀裂(延性破壊)の発生時点とする延性破壊条件式及び材料固有の閾値(限界ダメージ値)の同定方法を明らかにした。本研究では、材料の破断部位が亀裂に至るまでの変形履歴に沿った応力-歪関係の積分値を延性破壊条件式により延性破壊とする閾値(限界ダメージ値)として定義した。実際には単軸引張試験より得られた材料特性をもとに同条件にて弾塑性FEM解析を行ない、くびれ発生とともに応力集中が生じた部位の要素に対して実試験にて延性破壊が発生した時点との対比により限界ダメージ値を同定する手法として構築した。さらに、任意要素の変形履歴に沿った応力-歪関係の積分値が適用材料固有の限界ダメージ値を超えた時点で延性破壊として、その要素を除去する方法にて亀裂発生を表現するアルゴリズムが導入された弾塑性FEMを使用して、板材のプレス加工による単純せん断加工解析を行なった。これにより、材料がせん断変形を伴なう亀裂進展により材料が分離させるまでの変形過程を計算機上で逐次可視化することができた。また、引張強度及び加工性が異なる鋼板を使用して実際にプレス金型によるせん断加工実験を行ない、板材変形過程を高速度カメラで動画撮影することにより材料及びプレス加工条件(せん断条件)の違いが亀裂発生・進展に与える影響を観察した。これらのせん断加工実験結果対解析結果の比較により、亀裂発生箇所及び進展方向等せん断変形過程時の材料挙動を弾塑性FEM解析により予測できることを確認し、限界ダメージ値の同定手法及びFEM解析における取り扱いが適していることを明らかにできた。新たな延性破壊条件式を弾塑性FEMに導入し、実際に金属材料試験片を使用した単軸引張試験に加えて平面歪状態を仮定した引張試験方法を考案して試験を行なうことにより同定された材料固有の閾値(限界ダメージ値)をもとにせん断加工解析精度検証を行なった。また、材料がせん断変形を伴なった亀裂進展により材料が分離されるまでの変形過程に対する弾塑性FEM解析精度向上のために、任意要素の変形履歴に沿った応力-歪関係の積分値が単軸引張試験より得られる限界ダメージ値を超えた時点を延性破壊として亀裂発生を表現するアルゴリズムの最適化を図った。これにより、実際のプレス金型における複雑な工具条件(形状、負荷条件等)に対して亀裂発生・進展に与える影響が把握できる解析精度、計算安定性及び計算効率の向上を確認できた。また、金属材料が変形する際の材料内部構造変化を観察するために、小型加速器を使用した中性子源システム(RANS)による結晶構造の非破壊計測を行なった。RANSでは7MeVまで加速した陽子をBeターゲットに当てて、生成した中性子をポリエチレン減速材に通すことでmeVからMeVまでの広いエネルギースペクトルの中性子が得られる。このことから、金属結晶の格子定数をカバーする波長のエネルギー領域を用いて、材料試験機にて鋼材に引っ張り変形を加える前後に対して回折実験を行ない、金属材料変形による集合組織の変化を捉えることができた。小型加速器を使用した中性子源システム(RANS)による回折実験では、動的な材料塑性変形過程に対応した結晶構造変化を捉えることが難しいことから、大強度陽子加速器施設(J-PARC)を使用した回折実験の詳細検討を行ない、実際に工学材料回折装置(愛称:匠)を使用して延性破壊に至るまでの結晶構造変化を捉える実験を行なった。匠を使用した回折実験では、材料試験片が短軸引張試験により延性破壊に至るまでの時間変化に対して逐次結晶構造変化を捉えるために、くびれ現象が発生して破断に至る直前まで試験片中央部に中性子ビーム照射エリアを確保できる特殊形状を有する試験片を製作し、引張変形の進行に対する引張軸に平行及び垂直方向の回折中性子強度を測定した。この回折実験により、bcc結晶の回折面である(110)、(200)、(211)、(220)、(310)、(222)に対する中性子強度が塑性変形の進行に伴なって変化していくことが追跡でき、すべての結晶ですべりが進行していることが確認できた。特に、(110)結晶粒群の比率が他の方位の結晶粒に比べて大きく、塑性変形の進行に対する増加傾向も顕著であり、試験片の幅が減少し始めるくびれ現象発生時、さらに板厚減少が顕著になる各段階では(110)結晶粒群の増加の割合が変化していることが明らかとなった。したがって、材料破断に至る直前の局所くびれ変形過程における幅減少、板厚減少を中性子線回析により捉えることが可能と考えられる。また、弾塑性FEMによるせん断加工解析では、延性破壊条件として限界ダメージ値の同定及びアルゴリズムの改修等により、実際のプレス金型における複雑な加工条件下での成形解析でも計算が止まることなく成形条件最適化のために有用な解が得られることが確認できた。