hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インテリジェント細胞バイオセンシングシステムの創出

細胞は基本的に増殖することが可能であり、様々な成長因子などの作用によって分化することもできる。また環境変化による自分自身へのダメージを診断・修復する機構も備えており、細胞の内外で様々な情報伝達を行っている。細胞はこのような自己修復・自己診断・環境応答といった「インテリジェンス性」を持っているため、細胞を材料として用いることにより、きわめて高度なインテリジェントバイオセンシングシステムを実現できる可能性がある。特に細胞の持つ「環境応答機能」は、細胞周辺の物理的な環境変化のみならず、化学物質によっても発現される。本申請課題は、この化学物質による細胞応答を測定することによって化学物質が生体に与える影響を測定する「インテリジェント細胞バイオセンシングシステム」を創出することを目的として行った。前年度まで主として一酸化窒素(NO)を指標として、血管内皮細胞に薬物刺激を与えたときのNO放出挙動を測定することにより、細胞バイオセンシングシステムを作製してきた。本年度の研究では、ここで開発した細胞バイオセンシングシステムの基本原理に基づいてその汎用性を示すため、免疫系細胞とヒスタミンオキシダーゼを組み合わせることにより、アレルギー物質に対する細胞バイオセンシングシステムの構築を試みた。このためまず、ここで使用するヒスタミンの酸化酵素であるヒスタミンオキシダーゼの遺伝子発現・精製を行い、基本的な電気化学的特性を評価した。次いで、本システムでアレルギー物質に応答してヒスタミンを放出する細胞を培養し、この細胞が化学物質刺激により放出するヒスタミンを、オキシダーゼにより酸化し細胞と一体化した電極上で電気化学的に検出した。以上の結果、構築したインテリジェント細胞バイオセンシングシステムが、生細胞に影響を与える化学物質の評価に有用であることが明らかとなった。本申請課題では、外部刺激に対して応答するインテリジェント材料として生細胞を利用することにより、薬物や毒物が生体に及ぼす影響を評価できる、新しい概念の環境応答型インテリジェント細胞バイオセンシングシステムの開発を目的としている。細胞バイオセンシングシステムを構築するためには、細胞とその信号応答を検出する電極との界面の設計が重要である。つまり金属材料である電極の表面上で、いかにして生細胞を接着・培養するかである。このため、電極基板に対して疎水性相互作用により良好に接着する疎水性タンパク質配列に細胞接着部位を導入したタンパク質を設計して、遺伝子工学的に合成した。疎水性タンパク質として、安定なβ-スパイラル構造を形成することが知られているAla-Pro-Gly-Val-Gly-Valのヘキサペプチドからなる繰り返し構造を利用した。また細胞接着部位としては、3つのアミノ酸で細胞表面のインテグリンと接着することが知られているArg-Gly-Asp(RGD)配列を利用した。設計したタンパク質に基づいて対応するDNAを合成し、大腸菌体内の遺伝子発現により目的タンパク質を合成した。得られたタンパク質の材料表面への吸着は原子間力顕微鏡を用いて行った。またこのタンパク質をコーティングした材料表面での細胞接着能を評価した。その結果、このタンパク質は疎水性材料表面に効率よく吸着し、かつ十分な細胞接着機能を有していることが明らかとなった。また細胞バイオセンシングシステムを構成する細胞応答検出部位として、3電極系からなる電気化学測定系を作製した。このシステムで細胞を培養する前に、まずこのセンサのNO応答特性を評価した。その結果、このシステムにより十分な感度でNO測定できることが明らかとなった。本申請課題では、外部刺激に対して応答するインテリジェント材料として生細胞を利用することにより、薬物や毒物が生体に及ぼす影響を評価できる、新しい概念の環境応答型インテリジェント細胞バイオセンシングシステムの開発を目的としている疎水性人工タンパク質をコートした電極上で血管内皮細胞を培養して、細胞バイオセンシングシステムを構築した。電極と細胞を、タンパク質の薄膜を介して密着させ一体化することにより、細胞から放出される極微量の物質を正確かつ迅速に定量することができる。

まず本システムにより、NO放出を指標とした血管作用性薬剤の評価が可能であることを確認するため、既知の薬剤により、細胞から放出されるNOのセンシングを行った。血管弛緩作用を示す薬剤としアセチルコリンを用いた。アセチルコリンは血管内皮細胞のNO放出を増加させ、その結果血管弛緩を誘導することが知られている。本細胞バイオセンシングシステムにアセチルコリンを種々の濃度で添加した時に放出されるNOを定量した結果、濃度依存的にNOが放出されることが示された。また、血管弛緩を阻害する薬剤として知られるN-monomethyl-L-arginineをアセチルコリンとともに細胞バイオセンサに添加し、NO放出量の変化を追跡した結果、その放出量が濃度依存的に阻害されることが示された。以上、構築した細胞バイオセンシングシステムによるによるNO放出挙動の測定結果を、従来のNO測定法であるグリース法による結果と比較することにより、本細胞バイオセンシングシステムの有効性を評価した。細胞は基本的に増殖することが可能であり、様々な成長因子などの作用によって分化することもできる。また環境変化による自分自身へのダメージを診断・修復する機構も備えており、細胞の内外で様々な情報伝達を行っている。細胞はこのような自己修復・自己診断・環境応答といった「インテリジェンス性」を持っているため、細胞を材料として用いることにより、きわめて高度なインテリジェントバイオセンシングシステムを実現できる可能性がある。特に細胞の持つ「環境応答機能」は、細胞周辺の物理的な環境変化のみならず、化学物質によっても発現される。本申請課題は、この化学物質による細胞応答を測定することによって化学物質が生体に与える影響を測定する「インテリジェント細胞バイオセンシングシステム」を創出することを目的として行った。前年度まで主として一酸化窒素(NO)を指標として、血管内皮細胞に薬物刺激を与えたときのNO放出挙動を測定することにより、細胞バイオセンシングシステムを作製してきた。本年度の研究では、ここで開発した細胞バイオセンシングシステムの基本原理に基づいてその汎用性を示すため、免疫系細胞とヒスタミンオキシダーゼを組み合わせることにより、アレルギー物質に対する細胞バイオセンシングシステムの構築を試みた。このためまず、ここで使用するヒスタミンの酸化酵素であるヒスタミンオキシダーゼの遺伝子発現・精製を行い、基本的な電気化学的特性を評価した。次いで、本システムでアレルギー物質に応答してヒスタミンを放出する細胞を培養し、この細胞が化学物質刺激により放出するヒスタミンを、オキシダーゼにより酸化し細胞と一体化した電極上で電気化学的に検出した。
微量イノシトールリン脂質による髄鞘形成、および糖代謝機構の解析

ホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸の唯一の合成酵素であるホスファチジルイノシトール3リン酸5-キナーゼ(PIPKIII)の細胞種特異的な遺伝子欠損マウスを作製し、髄鞘形成および、筋肉における糖代謝の制御機構を解析した。その結果、中枢神経系のオリゴデンドロサイトでのPIPKIIIの重要性を見出した。また、筋肉ではPIPKIIIがインスリンによる糖代謝亢進作用を負に制御するという新知見を得た。ホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸の中枢神経系における髄鞘形成の詳細な制御機構を明らかにするために、神経細胞、およびグリア細胞で特異的にホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸合成酵素であるPIPKIII遺伝子を欠損するマウスを作製した。神経細胞で特異的に遺伝子欠損を導く事のできるtau-Creトランスジェニック(Tg)マウスとの交配の結果、神経細胞特異的なPIPKIII遺伝子欠損マウスは出生10日後までに死亡し、中枢神経系の全ての細胞種で遺伝子欠損を導いた場合よりも重篤な予想外の表現型が認められた。一方で、MBP-Cre Tgマウスとの交配で作製したオリゴデンドロサイト特異的なPIPKIII遺伝子欠損マウスは、加齢とともにほぼ全例で両側性の下肢痙性麻痺を発症するというヒトの遺伝性痙性対麻痺に似た、大変興味深い病態を示した。今後、発症の分子機構について詳細な解析を予定している。ホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸の筋肉細胞における糖代謝制御機構を明らかにするために、筋肉特異的PIPKIII遺伝子欠損マウスを用いた解析を行った。高脂肪食負荷による肥満モデルにおいては、耐糖能試験の結果、インスリン抵抗性の改善が認められた。この結果はインスリン抵抗性を伴う糖尿病の治療薬の新たな創薬標的分子としてPIPKIIIが有用であることを示唆するものである。今後、PIPKIII欠損によるインスリンシグナリングへの影響の解析を予定している。神経細胞で特異的に遺伝子欠損を導く事のできるEmx1-Creトランスジェニック(Tg)マウスとの交配の結果、神経細胞特異的なPIPKIII遺伝子欠損マウスは正常に生まれ、外観上の異常を認めなかった。さらに大脳および小脳に着目した組織学的解析においても、髄鞘形成に大きな異常は認められなかった。一方で、MBP-CreTgマウスとの交配で作製したオリゴデンドロサイト特異的なPIPKIII遺伝子欠損マウスは、加齢とともにほぼ全例で両側性の下肢痙性麻痺を発症するというヒトの遺伝性痙性対麻痺に似た、大変興味深い病態を示した。さらに脳梁に着目した超微形態解析を行うことで、髄鞘形成不全が見出された。これらの結果から、髄鞘形成には神経細胞ではなくグリア細胞(オリゴデンドロサイト)におけるPIPKIIIの役割が重要であることが初めて明らかとなった。ホスファチジルイノシトール3,5-ニリン酸の筋肉細胞における糖代謝制御機構の解析においては、筋肉特異的PIPKIII遺伝子欠損マウスを用いた解析で明らかとなった個体レベルでの耐糖能の改善に関して、培養筋細胞を用いた系では再現することは出来なかった。この結果から、PIPKIIIがインスリンシグナリングへ直接的な影響を及ぼしている可能性は低いと考えられた。
ベンゼ-シクロヘキサン混合蒸気からの結晶生成-結晶核生成臨界条件と分離精製-

装置内を残留空気圧無視小まで排気後、以下に述べる二つの異なる方法で実験を行った。(1)圧力上昇法:凝縮面を定温に設定後、テスト・セクションを排気系から隔離し、蒸気を蓄積することにより結晶を生成する。(2)徐冷法:一定小排気速度で蒸気を連続排気し、テスト・セクション内を定圧に設定後、凝縮面下の冷却筒に冷媒を送入・循環することにより結晶を生成する。圧力上昇法では、圧力上昇速度が減少する点、徐冷法では、圧力が降下する点を臨界核化点とみなした。蒸気の圧力が480970Paの範囲で、純粋ベンゼンとシクロヘキサンおよびベンゼンの組成63%,70%,78%の混合蒸気に対して、核化から初期成長に至る実験を行い、以下の知見を得た。1.圧力上昇法の場合、混合蒸気系では結晶の生成と同時に液膜が生成し、固、液共存の状態が目視観察された。2.圧力上昇法においては、混合蒸気の臨界過飽和比αは純粋ベンゼンのそれとほとんど等しく、αの対数と臨界温度Tscの逆数1/Tscは勾配が正の直線関係を示した。3.徐冷法においては、圧力上昇法の場合と同様、混合蒸気の臨界過飽和比は純粋ベンゼンのそれとほとんど等しいことが認められたが、αはTscに依存せず略一定とみなして差支えないことがわかった。装置の製作に手間取ったため、精製・分離効果について詳細な検討ができなかったが、これについては、今後の課題として取組む予定にしている。
ニューラルネットワークを用いた完全非接触-感染症・熱中症スクリーニングシステム

2020年の東京オリンピック・パラリンピックの選手村における使用を想定した、立位でも座位でも測定可能とする完全非接触の感染症・熱中症スクリーニングシステムを開発し、実際に病院等で性能評価をすることを目的としている。28年度には計測部を頸動脈に当てて呼吸、体温、心拍を測定するポータブル化したシステムを試作し、29年度には病院において臨床試験を行った。システム計測部には呼吸測定用の24GHzの小型ドップラーレーダ、体温測定用の放射温度計、心拍測定のための光電脈波センサを埋め込み、看護師が片手で患者の頸動脈に聴診器状の計測部を当てることにより操作可能とし、本体は肩掛けが可能なように調整した。最終年度となる30年度には本システムを用いて、超高齢者を対象とした介護型の病院で臨床試験を行った。(Journal of Sensor 2018,4371872)現状では光電脈波を用いているために、計測部を聴診器のように首に当て心拍数を計測するが、内蔵した放射温度計で表面体温、内蔵のレーダで呼吸をモニターするこができ、内科外来で医師が行う診察と同様な項目を10秒程度で確認できるようになった。本システムが本格的に稼働すれば、感染症の流行の発生をいち早く把握できるほか、検温時に入院患者をモニタリングすることで、重症化へ至る前兆などを把握する事が可能となると期待される。さらに、同様のシステムを用いて高坂クリニックで取得したインフルエンザ患者の呼吸数、心拍数、体温を用いて機械学習を行い、ランダムツリーアルゴリズムを採用した感染症スクリーニングシステムを完成させ、季節性インフルエンザ患者を対象とする試験臨床を行い約96%の感度と特異度を達成し(Journal of Infection 2019, Impact Factor=4.6)、熟練した医師に肉薄する感染症のスクリーニングが可能となった。本研究は2020年の東京オリンピック・パラリンピックの選手村における使用を想定した,立位でも座位でも測定可能とする完全非接触の感染症・熱中症スクリーニングシステムの開発を目的としている.今年度はこれまでに開発したシステムを改良し移動性を持たせ,計測部を頸動脈に当てて呼吸,体温,心拍を測定するシステムを設計した.計測部には呼吸測定用の24GHzの小型ドップラーレーダー,体温測定用の放射温度計,心拍測定のための光電脈波センサーを埋め込み,ニューラルネットワークや非線形判別法を用いた熱中症や感染症の判別アルゴリズムを検討し,設計段階においてユーザビィリティーの高いシステムを開発するための問題点を抽出した.いかなる人でも公平に使え,使い方が単純・自明,必要な情報がすぐに認知でき,使用者への負担を必要としないデザインとするべくプロダクトデザインと試作を行った.また男子大学生を対象にバイスクルエルゴメーターによる運動負荷後の深部体温を,試作したシステムを用いて推定し,深部体温計を用いた実測値と比較した.相関係数=0.8の相関が認められた.病院においては感染症・熱中症に関わらない身体の異変を捉える実地運用を行った.その結果,80歳以上の高齢者10名を対象に,看護師が計測部を軽く頸動脈付近に当てることにより,心拍信号と呼吸信号捉えられることが確認できた.発汗などの体温を調節する機能が低下し,暑さ,寒さに対する感覚が鈍くなる高齢者にとっては,簡易な方法で身体の異変を捉える事が可能となった.また本年度はクラウドを利用したシステムの構築をした.共同研究する病院でのデータをリアルタイムで分析拠点となる大学研究室内で受信するものである.本システムが本格的に稼働すれば,感染症の流行の発生をいち早く把握できるほか,入院患者を長期モニタリングすることで,重症化へ至る前兆などを把握する事が可能となる.これまでのシステムを改良し移動性を持たせ,計測部を頸動脈に当てて呼吸,体温,心拍を測定するシステムを設計した.学生を対象としたバイスクルエルゴメーターによる運動負荷後の深部体温推定と深部体温計を用いた実測値との比較をし,相関係数=0.8の相関が認められた.本来の目的は完全非接触システムであり,二次感染防止のため,初年度に開発したシステムを完全非接触とする必要性がある.また初年度に構築したクラウドシステムにて得られるデータについても,より良い利用方法を模索していかなければならない.感染症スクリーニングシステムは発症に伴う炎症反応を呼吸数,心拍数,体表温度などから感染症発症の有無を10秒程度で推定するシステムである.システムはシンプルだが,スクリーニング対象となる患者,多岐にわたる感染症,さらに誤判別の社会的影響等の要素により,その判定アルゴリズムは極めて重要である.研究中のニューラルネットワークとk-means法やfussy法を併用した判定アルゴリアズムは以下の点で極めて独創的でかつ有益である.その特徴は,A)患者が一人増えるたびに,システム自体が最適なスクリーニング条件を更新する.B)臨床応用に重要な,High risk群の高精度な抽出が可能である.しかし最適な判定アルゴリズムは未だ定まっておらず,以下のような研究の余地を多く残している.1症例数が増えると計算量が膨大となり,リアルタイムの処理を行えなくなる.また測定対象者が動くと,スクリーニング精度が極端に低下するなどの限界を有する.2現状ではニューラルネットワークは各患者,各健常者間の症状の類似性(Distance)のみで,High risk患者,患者,健常者に分類している.

SIRSの診断基準や,各種感染症患者の一般的,呼吸数,心拍数,体温などの情報も用いておらず,実用化に当たっては改良の余地が多くある.本研究は2020年の東京オリンピック・パラリンピックの選手村における使用を想定した完全非接触の感染症・熱中症スクリーニングシステムを開発し、病院等での性能評価を目的としている。昨年度はシステムをポータブル化し、計測部を頸動脈に当てて心拍、体温、呼吸を測定するシステムを設計、試作したが、本年度は病院における臨床試験を行った。臨床試験に用いたシステムの計測部には心拍測定用の光電脈波センサー、体温測定用の放射温度計、呼吸測定用の24GHzの小型ドップラーレーダーを埋め込み、看護師が片手で患者の頸動脈に聴診器状の計測部を当てることにより操作可能で、本体は肩掛けが可能なように調整した。本システムを用いて、感染症に伴う炎症反応の有無を判別するため、決定木分析などのニューラルネットワークを用いたアルゴリズムを検討した。超高齢者を対象とした介護型病院で臨床試験を行い、研究結果は一流誌(Journal of Sensors)に原著論文として採択された。本システムでは光電脈波を用いているため、計測部を聴診器のように首に当て心拍数を計測するが、内蔵した放射温度計で表面体温、内蔵の24GHzの小型ドップラーレーダーで呼吸をモニターすることができ、内科外来で医師が行う診察と同様の項目、心拍数・体温・呼吸数を10秒程度で確認できるようになった。呼吸測定の重要性は十分に認識されてはいるものの、その測定の煩雑さから病院で実測されることが少ない呼吸数を10秒程度で測定できるようになった臨床的意味は極めて大きい。現状では、呼吸数の測定精度は必ずしも高くはないが、本システムが本格的に稼働すれば、感染症の流行の発生をいち早く把握できるほか、検温時に入院患者をモニタリングすることで、重症化へ至る前兆などの把握が期待される。科研費の助成を受け、病院で臨床試験を行うまでに至った意義は極めて大きい。これにより、システムの実用性と安全性が高いレベルで両立していることが確認された。研究実績の概要でも述べたとおり呼吸数の測定精度は、実用レベルではあるものの必ずしも高いものではない。これはマイクロ波レーダーが超高感度であるために患者の体動の他、病室にいる看護師や介護スタッフの動きをも検知してしまうためと推察される。レーダーの最適な感度調整や医療スタッフへの教育など、検討すべき事項は多い。しかし、本年度までに病院で試験的に使用できるプロトタイプを試作し、病院で臨床試験を行い、試験結果が一流誌に採択されていることを鑑みると、進捗状況は極めて順調であると言える。システムを軽量化、ポータブル化したことで、本システムは女性の看護師が本体を肩掛けし、片手で計測部を聴診器のように頸動脈付近に当てることが可能となった。これにより、患者と看護師の相対的体動をキャンセルすることにも成功している。今後は更なる使いやすさを追求し、実用化の検討も行っていきたい。2020年の東京オリンピック・パラリンピックの選手村における使用を想定した、立位でも座位でも測定可能とする完全非接触の感染症・熱中症スクリーニングシステムを開発し、実際に病院等で性能評価をすることを目的としている。28年度には計測部を頸動脈に当てて呼吸、体温、心拍を測定するポータブル化したシステムを試作し、29年度には病院において臨床試験を行った。
海底動圧変動記録を用いた東北沖地震活動の時空間推移

沈み込み帯における地震活動の詳細な把握は,2011年東北沖地震のような巨大地震の発生や関連現象の理解には必要不可欠である.今後,東北沖地震の直前・直後の観測記録が増えることはないため,東北沖地震前後の地震活動を詳細に明らかにするにはこれまでに得られた観測記録をさらに活用する必要がある.本研究はこれまで着目されてこなかった海底圧力計の地震動成分(動圧成分)に着目し,東北沖の地震発生場の時間的・空間的な変化(例:2011年東北沖地震前後の応力場の変化)の解明を試みる.沈み込み帯における地震活動の詳細な把握は,2011年東北沖地震のような巨大地震の発生や関連現象の理解には必要不可欠である.今後,東北沖地震の直前・直後の観測記録が増えることはないため,東北沖地震前後の地震活動を詳細に明らかにするにはこれまでに得られた観測記録をさらに活用する必要がある.本研究はこれまで着目されてこなかった海底圧力計の地震動成分(動圧成分)に着目し,東北沖の地震発生場の時間的・空間的な変化(例:2011年東北沖地震前後の応力場の変化)の解明を試みる.
神経変性における細胞内ＴＤＰ－４３凝集体の意義の解明

TDP-43は筋萎縮性側索硬化症(ALS)および前頭側頭葉変性症(FTLD-U)などの神経変性疾患において出現するユビキチン陽性細胞内凝集体の主要構成成分として同定された。これら疾患では、TDP-43の蓄積と同時に著しい神経脱落がみられ、その病変の拡大と臨床症状の進行は非常によく一致する。つまり、TDP-43の異常が神経変性に関与していることが予想されるが、その詳細については明らかになっていない。そこで、今年度は、全長TDP-43あるいはTDP-43の部分欠損変異体を導入することにより培養細胞株内においてTDP-43凝集体を形成する細胞モデルを用いて、TDP-43による神経細胞毒性メカニズムについて検討した。ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に、全長TDP-43あるいは患者脳においてその蓄積が確認されるTDP-43のC末断片発現コンストラクトを導入し、神経細胞毒性への影響を検討した。その結果、全長TDP-43発現細胞では、凝集体の形成は見られないものの、カスパーゼの活性化とG2/M期での増殖停止を伴う細胞死が観察された。一方で、TDP-43のC末断片を導入した細胞では、細胞質における凝集体の形成が見られ、凝集体を形成している細胞では増殖が著しく抑制されていることがわかった。また、RNA polymerase IIやいくつかの基本転写因子がTDP-43凝集体内に巻き込まれており、その転写活性も阻害されていた。さらに、実際にFTLD患者脳でもTDP-43陽性dystrophic neuritesにおけるRNAポリメラーゼIIの共局在が観察された。これらのことより、過剰な全長TDP-43の発現あるいはC末端断片による凝集体の形成は,細胞の増殖阻害や転写制御の異常を引き起こすことが明らかとなり、これらの異なるメカニズムによる細胞毒性がTDP-43 proteinopathyの発症あるいは病態進行に関与している可能性が示唆された。これらの結果は,Human Molecular Geneticsに掲載が決定した(in press)。25年度が最終年度であるため、記入しない。前頭側頭葉変性症(FTLD-TDP)や筋萎縮性側索硬化症(ALS)の患者脳などに見られるユビキチン陽性の細胞内異常凝集体の主要な構成タンパク質としてTDP-43が同定された。本年度は,患者脳より調製した不溶化TDP-43を凝集核(シード)として細胞内に導入する方法を開発し,これを用いて細胞内に異常TDP-43が蓄積する細胞モデルの構築を試みた。予め全長TDP-43のプラスミドを一過性に発現したSH-SY5Y細胞に,様々な患者脳より調製した不溶性画分(TDP-43の細胞内凝集体が含まれる画分)をトランスフェクション試薬と共に導入した。数日間培養したのち細胞を回収し,抗リン酸化TDP-43抗体を用いた免疫組織化学的解析や,可溶性画分と不溶性画分に分画して抗リン酸化TDP-43抗体などによるイムノブロットを行った。その結果,蛍光顕微鏡による観察において,本来ならば細胞内で不溶化しないプラスミド由来の全長TDP-43がリン酸化を受けて細胞内で凝集体を形成することが判明した。またイムノブロットにおいては,不溶性画分に全長TDP-43の蓄積およびC末端断片が顕著に検出された。

特にC末端断片のバンドパターンは,シードとして加えた患者由来の不溶性画分のバンドパターンとほぼ同じであった。この結果は,細胞内において,外から加えた不溶化TDP-43が凝集のシードとなって可溶性TDP-43が蓄積することを示唆している。さらに,乳酸脱水素酵素(LDH)漏出アッセイにより,このようなTDP-43の凝集体を形成する細胞において細胞死が認められた。この結果より,細胞内において全長TDP-43が蓄積することにより細胞死が引き起こされる可能性が考えられる。当初の計画の通り,年度ごとに順調に遂行されている。患者脳の不溶性画分を用いた細胞モデルは,当初の計画通り今年度にほぼ構築でき,これを用いてさらなる解析を検討しているところである。患者脳の不溶性画分を用いた細胞モデルを用いて,患者脳シードの新たな性質について検討している。非常に興味深い結果が出ており,今後の研究展開が期待できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ムスカリン性アセチルコリン受容体の高次構造

本試験研究では、ムスカリン性アセチルコリン受容体を対象として高次構造解明の為の基礎研究を行った。当初の目的は下記の通りであった。(1)高次構造研究に必要な量の受容体を得るため、バキュロウイルスを用いた高度発現系及び抗原性の高いペプチドとの融合受容体を利用した効率的な精製系の開発、(2)十分量精製したムスカリン受容体の2次元結晶の調製と電子顕微鏡写真の解析による立体構造の解明、(3)リガント・受容体複合体のTransferred Nuclear Overhauser Effect(TRNOE)の測定、それによる受容体に結合したアセチルコリンの構造の決定とリガンド結合に関与するアミノ酸残基の構造の推定、(4)受容体3次元結晶の調製とX線による構造解析の検討。3年間の研究で下記のような結果を得た。(1)バキュロウイルスを用いた高度発現系の開発、適当な変異体を用いた高効率精製系の開発を行うことが出来た。(2)精製した受容体の電子顕微鏡での観察で1次元的な配列を示唆する結果が得られたが、まだ2次元結晶は得られていない。(3)受容体に結合したメタコリン(S(+)-O-acetyl-β-metylcholine)のTRNOEの測定を行い、C-C結合がトランスの配置をとることを示す結果を得た。(4)3次元結晶作製には精製受容体量が不足しており、まだその試みを開始していない。この研究の過程でいくつかの副次的な成果が得られた。(1)ムスカリン受容体m1-m5サブタイプをバキュロウイルス-Sf9系で発現させ、それらのリガンド特異性及び被可溶化能を決定した。(2)ムスカリン受容体m2サブタイプに特異的なアロステリックリガンド、αラパチョンを見出した。(3)ムスカリン受容体のカルボキシ末端にあるパルミチル残基の動態、機能を明らかにした。本年度はムスカリン性アセチルコリン受容体の大量発現系を構築することを主眼として研究した。ムスカリン受容体m2サブタイプのバキュロウイルス発現系における発現効率の向上、構造多様性の排除を目的に、各種変異体を作製した。【.encircleda.】効率的な精製のためN末端に抗体エピトープを融合したもの、【.encircledb.】分子種多様性をのぞくため糖鎖付加部位のアスパラギン残基をアスパラギン酸に変えたもの、【.encircledc.】発現量改善のためポリヘドリンN末11残基を融合したもの、【.encircledd.】翻訳時のN末端小胞体膜透過を促進するためシグナルペプチドを付加したもの、【.encirclede.】第三細胞内ループの中央部分は脱感作に関わる部位でこれを除いてもG蛋白質の活性化能はは失われないのでN末側の変異体のそれぞれにつき、第三細胞内ループ中央部分を除いたもの、などである。これらはいずれも野生型と同じリガンド結合能を示した。また、第三細胞内ループ中央部分を欠損させた変異種は、野生種と同様、Gタンパク質Gi、Goを活性化した。糖鎖を除去した変異体の発現量は、野生型と変わらず、第三細胞内ループを除くことにより発現量が1.5-2倍になった。ポリヘドリンN末を融合したものは逆に発現量が約1/2に減少した。ムスカリン受容体の構造解析に用いることのできる界面活性剤の検索を行った。ムスカリン受容体m2サブタイプ糖鎖除去変異体を発現させたSf9膜を用いて、各種界面活性剤のムスカリン受容体に対する作用を検討した。

リガンド非存在下で受容体を安定に可溶化できるのはジギトニンのみであったが、親和性の高いリガンドQNBを結合した受容体はコール酸系統、アルキルグルコシド系統の界面活性剤の多く、また長鎖長のポリオキシエチレン系界面活性剤によりリガンド結合状態を保ったまま可溶化された。本年度はムスカリン受容体m2サブタイプ(m2受容体)のC末側の変異体の作製、精製法の改善に取り組み、また二次元結晶化を試行した。受容体を簡便かつ効率的に精製するため、C末端尾部にヒスチジン6残基を融合した変異体を作成した。この変異体は金属キレートゲルにより一段階で20倍精製された。各種金属イオンを調べたところ、Coを結合した樹脂が精製に最適であることが分かった。ヒスチジン6残基の導入によって、m2受容体のGタンパク質活性化能は損なわれなかった。また、ヒスチジン6残基の導入は、培養細胞でのC末端尾部へのパルミチル化に影響しなかった。パルミチル化されない変異種はGタンパク質活性化能が低下する。ヒスチジン・Coゲル精製法は、従来のリガンドアフィニティークロマトグラフィーより精製効率は落ちるが、簡便で早く、回収率も高い。大量試料の処理に適しており、リガンドアフィニティークロマトグラフィーとの組み合わせにより、二次元結晶化に用いる受容体の精製が効率化される。また、この精製系のみで得られた標品はそのままリガント・受容体複合体のNMR・TRNOE測定によるアセチルコリンの構造決定用の試料として利用可能と考えている。現在その試料を蓄積中である。二次元結晶化の試行では、予備的実験ながら一時元的な並びが観察された。今後さらに条件を検討する予定である。ムスカリン受容体m2サブタイプの変異体を定常的に発現させる系を確立した。この変異体は糖鎖結合Aspを変異させ、第三細胞内中央部を除去し、C末端にヒスチジン6残基を融合したもので、発現効率がよく、簡便に精製できることがこれまでの研究で分かっている。約50nmolの受容体を含む21のSf9細胞培養液が1週間で得られる。200nmolの受容体を含む膜標品からCoカラムを用いた単一操作で約50nmolの部分精製標品の調製が可能である。受容体の可溶化、精製にはジギトニンを使用しているが、ジギトニンはリン脂質平面膜の生成を抑制するという問題点がある。種々の界面活性剤の検討を行い、テトラデシルマルトシドにより受容体が比較的安定なことを見出した。現在、ジギトニンをCHAPSまたはテトラデシルマルトシドに変えた標品について2次元結晶化の試みを行っている。受容体は並ぶ傾向が見られるが、結晶化には至っていない。受容体に結合したリガンド分子のコンフォメーションを解析する目的で、メタコリン(O-acetyl-β-metylcholine)の光学異性体を乳酸から合成した。光学異性体s-メタコリンと部分精製m2受容体の混合物でTRNOEの測定を行っている。非特異的結合に由来する信号の分離を検討中である。
上皮-免疫細胞間の接着を中心とする腸管恒常性維持機構の解明

In vitroでのDP-IEL分化誘導系において、Eカドヘリン添加の及ぼす影響について検討したが、実験結果が安定せず、まだ結論を出すに至っていない。In vivoでのEed欠損によるDP-IEL分化の促進についてもDP-IELを高頻度に誘導できず、安定した結果が得られていない。<EedによるIELの制御機構と、その腸管恒常性維持への寄与の解明>T細胞特異的Eed欠損では、腸管恒常性が乱されるという予備的な結果を得ていた。Eed欠損による腸管へのT細胞ホーミングに異常がある可能性について、野生型およびEed欠損型骨髄細胞の競合的移植により検討した。その結果、Eed欠損T細胞は野生型と比較して、脾臓、リンパ節において相対的な微小減少が見られた。一方IEL分画においては、Eed欠損T細胞は著明な相対的な減少が見られた。このことよりEed欠損T細胞が、IEL分画へのホーミング、あるいはそこでの生存に障害があることが明らかとなった。<IEL機能解析のための新規遺伝子変異系の構築>これまでIELの腸管免疫における役割の解明は、IELだけを除く/機能改変する手段がないことから、他の免疫細胞と比べて大幅に遅れている。この状況を打破するために、IELの上皮細胞間局在という性質を利用して、IEL特異的に細胞操作を行える系の確立を目指している。H30年度では、細胞間接着依存的に細胞死を誘導する系、およびCre組換え遺伝子を活性化する系のDNAコンストラクトを構築した。DP-IEL誘導におけるEカドヘリンの役割については、実験条件などに関して引き続きの検討が必要である。またin vivoでDP-IELを安定的に誘導できるL. reuteriの投与条件についてもさらなる検討を要する。IEL機能/細胞生存へのEedの役割に関しては、EedがIELの恒常性維持に関与することを示すデータが得られた。またIEL特異的細胞機能操作系についても、着実な前進が見られた。DP-IEL誘導におけるEカドヘリンの役割の検討、およびL. reuteri投与によるin vivoでのDP-IEL誘導によるEedの関与の検討に関しては、実験条件のリファインメントを行ってゆく。またIEL機能/細胞生存へのEedの役割に関しては、EedがIEL分画へのホーミングに必要なのか、あるいはIEL分画における細胞生存に必要なのかについて、アポトーシスを抑止するBcl2導入遺伝子バックグラウンドでEed欠損させることにより、さらなる検討を進める。またRag2欠損マウスにEed欠損T細胞を導入することでも、検討を進めてゆく。IEL特異的細胞機能操作系についてはDNAコンストラクトができたので、細胞株へコンストラクトを導入し、予測通りに操作系が働くかを検証する実験系を構築することを目指す。

IEL特異的細胞機能操作系についてはDNAコンストラクトができたので、細胞株へコンストラクトを導入し、予測通りに操作系が働くかを検証する実験系を構築することを目指す。研究の進展状況に計画との若干のずれが生じたため。次年度使用額については、研究の進捗に即して適切に使用していく計画である。
室内化学反応がもたらす新しいシックハウス問題の解明

1.室内におけるOzoneとの化学反応を考慮した室内化学物質濃度予測手法の開発(2)居室模型を用いた各種建材を設置した場合のOzone気中濃度分布の測定(1)で用いた建材を居室模型に配置し、換気量を変動させて室内Ozone濃度分布測定を行った。低換気量のケースではOzone反応量が増加し、Ozone濃度低下量が大きい結果となった。(1)で得られた建材のMass-Accommodation Coefficientを用いて、(2)で示した居室模型実験を対象とした数値解析を行い、解析精度の検証を行なった。近年のシックハウス問題において二次汚染物質として2E1Hが高濃度で検出される事例が報告されているが、具体的な発生メカニズムや対策は未解明である。(1)想定される発生メカニズムと環境因子の特定室内では床が2E1Hの発生源と想定され、床下地材のアルカリの水分が塩化ビニル床材の可塑剤として添加されているDEHP(Di-2-ethylhexylphthalate:フタル酸ジ-2-エチルヘキシル)を分解させ2E1Hを発生すると考えられる。発生メカニズム実証のために放散試験を行った結果、床下地材がアルカリ性の水分を含んだ試験サンプルのみ2E1Hの放散量が増加した。1.空気中での化学反応を組み込んだ室内化学物質濃度の数値解析1.1室内化学反応を簡易にモデリングし、生成される物質の室内濃度の事前予測を行った。ここではOzoneとTerpene類の室内化学反応を研究対象としている。結果:反応物質と生成物質濃度の時間推移を比較した時、生成物質の濃度が反応物質を上回る。1.2さらにOzoneは、換気による移流・拡散、化学反応の他、固体壁面に対する吸着・分解現象を考慮する必要がある。そこで簡易なOzoneの固体壁面の沈着モデルを組み込み、Ozoneが自己減衰する可能性を考慮した解析を行った。結果:Ozoneの自己減衰による室内化学物質濃度の低減は、化学反応量ならびに換気による除去量と比較して相対的に小さい。2.材料表面におけるOzoneの吸着・分解速度に関する吸着等温式モデルと除去係数モデルとの比較化学物質の室内濃度を正しく予測するためには、材料表面における吸脱着(シンク効果)等を考慮する必要がある。特にOzoneは吸着や分解により、生成物質の生成量への影響が大きいと考えられるため、材料表面における吸着速度を2つのモデルを用いて検討した。(1)吸着等温式モデル(吸着等温式から得られる気相換算濃度で材料表面における汚染物質濃度を定義し、その表面濃度勾配と気中の分子拡散から吸着速度を求める)と、(2)除去係数モデル(材料表面で分子レベルでの吸着分解を考慮し、沈着速度を用いて吸着速度を求める)を用いて、両者を比較した。結果:沈着速度と材料表面における汚染物質の気相換算濃度を適当に与えれば、(1)、(2)の両モデルは良い対応を示すが、Ozoneのように自己減衰する物質の材料表面における気相換算濃度は測定できない事から、実用的な簡易モデルとしては、(2)の除去係数モデルを用いるのが良い。
触媒的タンパク質機能欠失法の開拓

生命現象の理解や創薬において、タンパク質機能の解明は必要不可欠な検討事項である。本研究では、特定タンパク質の選択的かつ触媒的分解を通じた新規タンパク質機能欠失法の開拓を研究目的とした。我々はペプチドの創薬展開を目指した研究の一環として、外部刺激応答型ペプチド機能変換法の開発、ペプチドミメティックの合成研究、ボスファターゼ抵抗性リン酸化ペプチドの創製研究に携わってきた。これら従来の研究を基盤として、タンパク質分解に必要なデグロン分子の合成を行った。さらに、標的タンパク質分子を釣り上げるために必要な釣竿分子のデザイン合成を行うとともに、新奇リガンド依存型タンパク質ラベル化試薬の開発を行った。申請者はペプチドの創薬展開を目指した研究の一環として、外部刺激応答型ペプチド機能変換法の開発、ペプチドミメティックの合成研究、ボスファターゼ抵抗性リン酸化ペプチドの創製研究に携わってきた。さらに、標的タンパク質分子を釣り上げるために必要な釣竿分子のデザイン合成を手掛けた。1.非分解性ボスホデグロン分子とし、リン酸化アミノ酸部位にはボスファターゼ抵抗性リン酸化アミノ酸を、ペプチド結合部位はプロテアーゼ抵抗性ペプチドミメティックを利用し、ホスホデグロン分子に非分解性を付与した。2.外部刺激応答性については、ボスファターゼ抵抗性リン酸化アミノ酸部位をゲージド化し、外部からの光照射に伴ったリン酸部位の再生による活性型ボスホデグロンへの変換について検討した。3.エストロゲンレセプター(ER)をモデル標的タンパク質とし、ER結合性分子タモキシフェン誘導体を合成し、これと非分解性ホスホデグロン分子とのハイブリッド分子を創製について検討した。4.刺激応答型ペプチド結合切断デバイスを利用した、標的タンパク質同定用新規分子の開発に成功した。本研究では、タンパク質の選択的かつ触媒的分解を通じた新規タンパク質機能欠失法の開拓を研究目的とした。本年度は標的タンパク質分子を釣り上げるため(濃縮)に必要な釣竿分子のデザイン合成を手掛けた。標的タンパク質同定にいたる一連の実験手順として、次の操作を考えた。(1)生理活性物質であるベイト分子と標的タンパク質問の結合形成、この際、ベイト分子には光親和性標識部位とアルキン部位を導入し、ベイト-標的タンパク質複合体形成後、光照射を行いベイト-標的タンパク質問に共有結合を形成させる。(2)ベイト-標的タンパク質複合体のアルキン部位とLinkerのアジド部位でクリック反応を行い、ビオチン化Linker-ベイト-標的タンパク質複合体を形成させる。(3)この複合体をビオチンカラムに固定化、(4)Linker部位の化学選択的切断を行い、次いでTag分子による化学選択的修飾を行う。Tagを指標とした標的タンパク質同定を行う。以上の計画の下、下記の検討を行った。温和かつ化学選択的切断が可能な刺激応答型アミノ酸を利用したアミド結合切断デバイスを開発し、これをCleavable Linkerの基盤構造とした。また、またアミド結合切断後に生じる官能基については、アルデヒド類によって選択的な修飾が可能なオキシアミノ基を利用した。Cleavable Linkerはその両末端にビオチンと標的タンパク質-ベイト複合体分子との結合部位が必要となる。標的タンパク質-ベイト複合体の結合にはクリック反応を利用することとし、Linkerの一端にはアルキンユニソトとのクリック反応が可能なアジド基を導入するした。本年度は標的タンパク質分子を釣り上げるため(濃縮)に必要な釣竿分子のデザイン合成と実際のタンパク質濃縮への実験を検討した。さらに、特定タンパク質をリガンド特異的に標識する新規化学的手法を開発した。(1)生理活性物質であるベイト分子と標的タンパク質間の結合形成、この際、ベイト分子には光親和性標識部位とアルキン部位を導入し、ベイト-標的タンパク質複合体形成後、光照射を行いベイト-標的タンパク質間に共有結合を形成させる。

温和かつ化学選択的切断が可能な刺激応答型アミノ酸を利用したアミド結合切断デバイスを開発し、これをCleavable Linkerの基盤構造とした。また、またアミド結合切断後に生じる官能基については、アルデヒド類によって選択的な修飾が可能なオキシアミノ基を利用した。前年度までの研究を基盤とし、まずCeravable Linkerの化学合成を行った。モデルタンパク質としてエノラーゼを選択し、エノラーゼへのアルキンユニットの導入、Cleavable Linkerとのクリック反応、アビジンカラムによる濃縮、フッ素アニオンのよる濃縮操作を行い、当初の計画通り、タンパク質濃縮が可能であることを確認した。現在、効率性の向上について検討中である。またCleavable Linkerとは別に、タンパク質リガンド特異的にTag分子を導入できる機能性分子としてチオエステル等価体として機能するN-sulfanylethylanilideユニットを開発し、現在これを利用した標識化を進めている。
地下水資源保全のための灌漑用水プライシング政策の開発と評価

本研究では、灌漑農業が黄河中上流域の水資源に与える影響を経済・水文モデルによる統合的な分析枠組により分析した。そこで本研究ではまず、MIKE SHE分布型水循環モデルを利用して対象地域の水循環プロセスのモデル化を実施した。構築されたモデルは1994-1995年の月別水量の観測値でキャリブレートし、1996-1997年の観測値を利用してモデルの妥当性を検証した。その結果、対象地域における河川水量・地下水涵養量を妥当な範囲で予測できることを確認した。次に構築されたモデルにより、灌漑農地の拡大や灌漑効率の変化が地域の水資源量に与える影響の分析をおこなった。その結果、灌漑面積の更なる拡大は対象地域の水資源に危機的な影響を与えかねない一方で、灌漑方式の変更などによる効率改善が問題の軽減に大きく寄与する可能性が定量的に示された。平成21年度は先行研究のサーベイ、基礎的データの収集と試行的なモデル分析、および海外の共同研究者との関係構築に主要な力点を置いた。まずデータについては、本研究の対象である中国山東省における土地利用状況、農業生産における各種作物の生産形態や灌漑用水の利用状況、標高・地質・土壌などのGISデータなどを現地の共同研究者と収集し、実証分析で利用可能なフォーマットへの整備する作業を進めた。また利用可能な一部のデータを利用して、中国農業における効率性について試行的な実証分析をおこなった。この結果は平成21年10月に中国地質大学(北京)にて開催された研究セミナーの場で報告し、出席した研究者と結果の解釈についての意見交流や、関連する情報交換などを進めた。また平成21年度は、表層流・地下水の循環を物理的にシミュレートするモデルとして、デンマーク水理研究所(DHI)が開発するMIKE SHE水文モデル・MIKE 11水理モデルを導入し、付属のサンプルデータを利用してモデルの動作検証をおこなった。今後は同モデルを山東省の対象フィールドに適用し、効率性研究とあわせて農業における灌漑用水利用の変化が表層流・地下水環境に与える影響を評価するためのプラットフォームを構築する方針である。持続可能な発展の必要条件として、長期的な水資源の保全は多くの途上国に共通する課題であり難題である。一部のアジア諸国ではすでに深刻な水不足が顕在化しているが、その多くが灌漑農業による河川・地下水の汲み上げに端を発している。中国北部ではもともと降雨量が少ないことに加え、黄河断流が大きな社会問題となったことなどにより、灌漑用水における河川水から地下水への移行が急速に進んでいる。しかし過剰な地下水汲み上げによる環境への負荷は大きく、地下水位の低下によりすでに数多くの湖沼が消失し、土壌の塩類集積による耕作放棄も増加の一途をたどっている。そこで本研究では、灌漑農業が黄河中上流域の水資源に与える影響を経済・水文モデルによる統合的な分析枠組により分析した。
T細胞活性化の時空間的制御の解析

T細胞の活性化は、副刺激シグナルによって正に負に制御されている。特に負の制御は、活性化が過剰になり自己免疫疾患にならないようにフィードバック制御として重要な役割を果たす。抑制受容体として重要なPD-1によるT細胞活性化のダイナミックな抑制制御のメカニズムを解析した。T細胞活性化は、TCRミクロクラスターによって誘導されることを明らかにしてきたが、抑制受容体PD-1は、T細胞活性化に伴ってTCRミクロクラスターと共存し、TCRがcSMACを作ると、PD-1もCD28と同様にcSMAC(CD310w領域)に集結した。PD-1は活性化に伴ってリン酸化され、SHP2をリクルートしてTCRミクロクラスターに集結したTCR直下のシグナル分子の脱リン酸化を誘導した。PD-1による活性化抑制がTCRミクロクラスターに共存することが必須かを解析するために、細胞外領域の長さを変えた種々のPD1変異分子を作製発現させて、その局在と機能を解析した。細胞外領域の大きな分子は、TCRミクロクラスターとも共存できず、SHP-2をリクルートせず抑制活性を持たなかったのにたいして、Igドメインが2つまでの小さな分子では、ミクロクラスターに存在しSHP-2をリクルートして、活性化抑制を示した。このPD-1ミクロクラスターを介した活性化抑制を、より生理的条件下で誘導されているか、を解析した。抗原ペプチドにて頻回免疫したマウスのT細胞は、PD1を高発現し、抗原刺激への反応が抑制されたアナジー状態にある。PD-L1存在下で刺激するとPD-1はTCRミクロクラスターに局在し、SHP-2をリクルートして活性化抑制をするが、抗PD-L1抗体でブロックすると、ミクロクラスター局在も抑制活性も見られなくなった。これらより、PD-1は活性化にともなってダイナミックに動態し、PD-1がミクロクラスターに存在することによってSHP2を介して、PD-1によるT細胞活性化の抑制制御に重要であることが判明した。
エチニレンユニットによる新規拡張π共役型ジシレンの創製

ケイ素-ケイ素二重結合化合物であるジシレンは、オレフィンと比べて小さなHOMO-LUMOギャップを有している。その性質に着目して、近年ジシレン部位を共役系骨格に組み込む研究が盛んに行われている。既に我々は(万)-1,2-ジアルキニルジシレンの合成に成功し、アルキニル基による共役延伸効果を明らかにした。さらなる拡張π共役型ジシレンの合成を指向して、既に合成に成功しているアルキン末端にトリメチルシリルおよびトリメチルゲルミル基を有する1,2-ジアルキニルジシレンに対する脱シリルおよびゲルミル化反応を検討した。その結果、ジエチルエーテル中メチルリチウムを作用させた際に目的とする反応が進行し、片側のアルキニル基上でリチウムアセチリド種が生成していることを各種NMR測定によって確認した。リチウムアセチリド種の単離には至っていないが、これらに対しフェノール類を作用させることによってプロトン化が可能であり、対応する末端アルキン部を有するジシレンを単離することに成功した。これら反応は全てジシレン部位を保持したまま進行している。またトリメチルゲルミル基を有する系においては、両側の脱ゲルミル化・プロトン化が進行した化合物が副生成物として生成していることも確認している。これらは、ジシレン上の置換基としてはアセチリドおよび末端アセチレンはカップリング等その多様な反応性が知られていることから、これらの反応によって得られるジシレン類は、ジシレンを有する共役拡張分子合成における優れたビルディングブロックになるものと期待される。
文明としての「北方」-異文化共存の可能性

調査研究の結果、得られた知見は以下の通りである。1.「北方」を地理的に定義するのではなく、わが国との関わりを中心に文明論的に、そして近年の国際関係、地域連繋の点から定位すると、極東ロシア、北東アジア、中央アジアを含む、北西ユーラシアの拡がりに21世紀的な意味を見出すことができる(「北方」といえば北米、スカンディナヴィア、極北、ロシア北部等を含むが、ここでは上述の積極的な定義が重要である)。2.1で定めた「北方」地域に関しては、その大半が社会主義の洗礼を受けたことも含め、ロシア語、ロシア文明のきわめて強い影響下にある(学術制度から日常生活にも到る)。3.しかしながらこうした文明・文化の状況は現在あくまでグローバル化の渦中にあり、いわゆる従来のロシア文明ととらえることは妥当でない。4.中央アジア、極東ロシアにおける韓国の存在は極めて大きい。それに反し、歴史的にはさまざまな関わりがあるもののわが国の存在感は弱い。5.上述の域内でのヒト・モノの移動は想像以上に進行している(アゼルパイジャン、チェチェン人が極東ロシアに多数移住していること、またスターリン時代の強制移住による中央アジアの朝鮮人の存在など)。6.この地域を概観すると、周辺地域である日本、韓国などの相対的な経済先進地域が北方中心域に刺激を与えているようにみえるが、こうした経済的インパクトが社会変化を支配するところまではいっていない。7.ユーラシア鉄道計画等の北方地域に関わるプロジェクトに対し、日本の関心と関与が圧倒的に少ない。平成12年度は5回の研究会議を開催し、本研究計画実施のための方法と全体テーマ、個別研究テーマを再確認するとともに、進捗状況についてそれぞれ発表を行った。また海外実地調査については、極東ロシア(平成12年9月)、大韓民国(平成12年9月および平成13年3月)において実施した。極東ロシア実地調査では、ハバロフスク、ウラジオストック両市で、北方都市文化の実態調査、北方文明をめぐる文献資料調査、研究機関および政府機関における関係者、識者に対する集中的インタビュー調査を実施した。大韓民国では、政府・民間でのユーラシア・中央アジア政策と民間企業の進出に関わるインタビュー調査、韓国における「北方観」の言説をめぐる文献資料調査を行った。今年度は、日本国内の戦後期を中心とした「北方」に関する関連研究分野の文献の収集と検討、政府機関の「北方政策」の概要の把握、「北方」をめぐるさまざまな言説の検討を行い、本研究計画の基礎となる文献資料調査と、資料の検討をほぼ終了した。それぞれの学的分野にとどまらぬ、いわゆる「北方言説」の総合的な検討はこれまで殆ど行われておらず、この研究計画のひとつの貢献と考えている。実地調査については現在、研究班として、また個別に成果の発表を準備中である。今回実地調査に協力を賜った(たとえばロシア極東科学アカデミー、ハバロフスク市政府など)関係機関からは、本研究計画のテーマに強い関心が寄せられ、本格的な共同研究をさらに推進する旨の提案が寄せられている。初年度の研究は国内・外で順調に進捗し、現在そのとりまとめを行うとともに、二年度の詳細な研究計画を作成中である。平成13年度は、日本国内では、戦後日本で構想された、「北方」をめぐる開発、国際関係、経済関係、文化交流に関する政策及びその実践について文献資料調査を行い、研究討議を札幌で順次実施した。また、上記に関する集中的インタビューを識者、関係者に行った。いわゆる「南方」あるいはアジア・太平洋との交流が戦後日本の地域的、ないしは国際的な構図の中心を占めてきたことは言うまでもないが、それを補完する意味で、さらにまた地球レベルでのわが国の文化・文明・経済・政治の位置どりを固定化させぬ意味で、「北方」がカウンターバランスの役割を果たしたことが研究の結果明らかになりつつある。また海外調査としては、モンゴルにおける「北方」概念のあり方と北東アジアの文化、経済、国際の関係をめぐる実態調査を行った。この調査についてはモンゴル国立大学歴史学科の全面的な協力を得た。