hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インスリンシグナル破綻がアルツハイマー病の分子病態に及ぼす影響

糖尿病に伴うインスリン抵抗性はアルツハイマー病(AD)の危険因子として知られている.インスリンシグナルの破綻がAD病態に与える分子機序を明らかにする目的で本研究を実施し,次の知見を得た.1)培養細胞外液にインスリンを添加するとβアミロイド(Aβ)が増加する,2)細胞外に過剰Aβが存在すると異常リン酸化タウが誘導される,3)過剰Aβ存在下ではインスリンシグナル伝達が障害される.これらの知見から,高インスリン血症はAD病態を加速させ,ADで生じているAβ依存性異常タウリン酸化にインスリンシグナル伝達不全が関与する可能性が考えられた.糖尿病に伴うインスリン抵抗性はアルツハイマー病(AD)の危険因子として知られている.インスリンシグナルの破綻がAD病態に与える分子機序を明らかにする目的で本研究を実施し,次の知見を得た.1)培養細胞外液にインスリンを添加するとβアミロイド(Aβ)が増加する,2)細胞外に過剰Aβが存在すると異常リン酸化タウが誘導される,3)過剰Aβ存在下ではインスリンシグナル伝達が障害される.これらの知見から,高インスリン血症はAD病態を加速させ,ADで生じているAβ依存性異常タウリン酸化にインスリンシグナル伝達不全が関与する可能性が考えられた.糖尿病の病態として注目されているインスリン抵抗性とアルツハイマー病の関連が,国内外の疫学研究により明らかにされており,インスリン抵抗性およびそれに伴う高インスリン血症はアルツハイマー病の危険因子として認識され始めている.インスリンシグナルの破綻がアルツハイマー病の病態に与える分子メカニズムを明らかにする目的で本研究を実施した.平成20年度においては高インスリン状態がβアミロイド産生に及ぼす影響について検討した.0-1000nMの濃度のインスリンをN2a swe細胞の培養液に添加し,16時間後に培養液中のAβをウエスタンブロットにより検討した.培養液中のAβはインスリン濃度依存性に増加した.さらにELISAにより培養液中のAβ40およびAβ42を分子種特異的に定量したところ,インスリン添加によりAβ40および42ともに有意な増加を認めたが,Aβ42/40比はインスリン添加により有意な変化は示さなかった次に,細胞内外のAβによるインスリンシグナル伝達障害を検討する目的で,Aβを過剰に産生するN2a細胞(APPswe)を作成した.この細胞では,細胞外のみならず細胞内にも過剰のAβが蓄積する.野生型N2a細胞にインスリン1μM刺激を加えたところ,刺激後15-30分でAktのリン酸化がピークを示したのに対し,N2a細胞(APPswe)ではAktのリン酸化のピークは刺激後60分と遅延していた.またN2a細胞(APPswe)では野生型N2a細胞に比し,GSK3βのリン酸化レベルはインスリン刺激前で蓄積を認める一方,インスリン刺激後ほとんど増加を認めなかった.これらの結果から,過剰なAβの蓄積はインスリンシグナル伝達を障害する可能性が示唆された.糖尿病の病態として注目されているインスリン抵抗性がアルツハイマー病・発症の危険因子となることが国内外の疫学研究で報告されている.しかしながら,インスリン抵抗性がアルツハイマー病の発病あるいは病態促進に関与する具体的事象に関する解析はほとんど行われていない.このような背景から,本研究は,インスリンシグナル破綻がアルツハイマー病の病態に与える分子機序を神経系培養細胞を用いて明らかにすることを目的に実施した.本年度は,タウ(4リピート1N)を安定発現する神経系培養細胞(Neuro2a)を作成した.この安定発現細胞にインスリン刺激を行い,インスリン受容体のリン酸化およびそれに続発するシグナルカスケード,具体的にはpAktおよびpGSK3 βについて解析した.アミロイドβ(Aβ)を過剰に産生するSwedish型アミロイド前駆体タンパク変異を一過性に安定発現細胞に発現させると,インスリン刺激後のインスリンシグナル伝達関連分子のリン酸化が抑制された.Aβ過剰産生環境で培養した細胞よりライセイトを抽出し,リン酸化タウを特異抗体で解析したところ,リン酸化タウが蓄積する傾向を認めた.一方,Aβ産生を抑制する阻害剤を細胞に添加すると,異常タウリン酸化は生じなかったことから,タウのリン酸化誘導はAβ依存性に生じている可能性が考えられた.これらの結果から,過剰Aβの産生によりインスリンシグナルの伝達不全と異常タウリン酸化が誘導されることが示唆された.糖尿病の病態として注目されているインスリン抵抗性とアルツハイマー病の関連が,国内外の疫学研究により明らかにされており,インスリン抵抗性はアルツハイマー病の重要な危険因子として認識されている.しかしながら,インスリン抵抗性がアルツハイマー病の発病あるいは病態促進に関与する具体的な現象についての解析はほとんどない.本研究では,アルツハイマー病の分子病態にインスリンシグナル伝達破綻が及ぼす分子機序について培養細胞を用いて明らかにすることを目的とした.本年度はマウス胎児由来初代神経培養細胞を用いた新しい共培養システムを構築し,インスリンシグナル伝達とアルツハイマー病の病態について検討した.この培養システムでは,ドナー細胞とレシピエント細胞を独立した細胞ディッシュで培養することで,ドナー細胞が産生する細胞外Aβがレシピエント細胞内のタウリン酸化を誘導することが可能である.ドナー細胞にAβを過剰産生するSwedish型アミロイド前駆体タンパク遺伝子を発現させ,レシピエント細胞(初代神経培養細胞)の内在性タウへの影響を検討した.

ドナー細胞にAβを過剰発現させるとレシピエント細胞の内在性タウ増強効果がリン酸化タウ特異抗体により検出された.同様の条件下で,インスリン添加を行いインスリンシグナル伝達を検討したところ,過剰Aβ存在下ではインスリンシグナル伝達不全の存在が示唆された.以上より,Aβ依存性異常タウリン酸化にはインスリンシグナル伝達不全が関与していることが示唆され,インスリンシグナル伝達を改善させる薬剤がアルツハイマー病の治療に繋がる可能性が示された.
哺乳類卵子の品質の判定法の開発:卵胞選抜の分子制御機構に基づいて

哺乳類卵巣に潜在する数十万の原始卵胞の1%以下が排卵に至り、残りは選択的に閉鎖する。多くの内分泌研究が行われてきたが選択調節機構は未解明である。近年、顆粒層細胞のアポトーシス、特に細胞死リガンド・受容体系と細胞内シグナル伝達が調節の鍵であることが分かってきた。本研究は、これらを精査し、アポトーシス・シグナル阻害因子(cFLIPとXIAP)が選択調節に支配的に関わり、卵子品質判定の指標として有用であることを示した。近年核移植技術を用いた体細胞やES細胞由来のクローン動物の作出、体外成熟・受精法の広領域での実用化、卵細胞質内顕微授精法の開発など様々な動物発生工学・生殖医療技術が編み出されて発展・活用されてきているが、ここで用いられる卵子の品質の科学的評価は未熟である。加齢にともなう卵子品質の低下は、胎児期に体細胞分裂を終えてしまってその後減数分裂を停止して長く休眠する哺乳類にとって避けられない宿命である。様々な領域で卵子が使用されているので、卵子の品質を科学的に見極める技術を開発することが急務である。哺乳類は休眠後に減数分裂を再開して発育・成熟する過程で99.9%以上の卵子・卵胞を選択的に死滅させてしまうことで不都合な卵子を取り除く機構を備えているが、本研究は申請者らが解明してきた卵子・卵胞を選択して死滅させる分子制御機構の成果を活用し、これを一段と発展させて死滅すべき卵子・卵胞を見極めて、残る高品質の卵子のみを動物発生工学や生殖医療に供することができる新規技術システムを開発しようとするもので、世界的にも極めて独創性が高くかつ社会に貢献する意義深いものである。多様な生殖戦略をもつ脊椎動物のうちで、多くの魚類のように数千から数億の仔の中で幸運かつ優れたものだけが生き残る生殖戦略と異なり、哺乳類は性周期毎に110個の僅かな数の卵母細胞を排卵して授精し、胎児を母体内で発生させてから出産し、それを大切に育てる生殖戦略をとって繁栄してきた。成熟した哺乳類の卵巣には、胎児期に途中で減数分裂を休止している卵母細胞(卵子)が5100万個含まれ、性周期毎に卵子は卵胞とともに発育・成熟して排卵に至る。この課程で、最終的に排卵にいたる卵胞・卵子の100倍以上が発達を開始するが、99%以上が選択的に死滅してしまい、1%未満のみが排卵に至る。このような卵胞・卵子の選択的死滅は、より優秀で強靭な子孫を残すための選抜戦略として重要であるが、これを制御している分子機構の全容は未だに解明されていない。本研究は、哺乳類の卵巣において繰り返される卵胞・卵子の選択的死滅を制御している分子機構を解明し、これをもとに本来死滅すべき低品質卵子と排卵にいたる高品質卵子を分別し、体細胞クローン動物作出などの様々な動物バイオテクノロジーに供される卵子の品質を保証できる技術を確立することを目指している。今年度は、卵胞に発現している細胞死受容体とデコイ受容体を同定し、細胞死受容体を介するアポトーシスシグナルの細胞内伝達系を担うカスパーゼ系の解析を進めた。さらに細胞膜直下に局在してアポトーシスシグナル伝達を阻害している新規な阻害因子(cFLIP:代表者らが遺伝子とアミノ酸配列を決定した)が顆粒層細胞に高発現している卵胞の卵子の健常性が高いらしいことを突き止めたので、これをパラメーターとして卵子品質判定法の開発を進めている。多様な生殖戦略をもつ脊椎動物のうちで,多くの魚類のように数千から数億の仔の中で幸運かつ優れたものだけが生き残る生殖戦略と異なり,哺乳類は性周期毎に110個の僅かな数の卵母細胞を排卵して授精し,胎児を母体内で発生させてから出産し,それを大切に育てる生殖戦略をとって繁栄してきた。成熟した哺乳類の卵巣には,胎児期に途中で減数分裂を休止している卵母細胞(卵子)が5100万個含まれ,性周期毎に卵子は卵胞とともに発育,成熟して排卵に至る。この課程で,最終的に排卵にいたる卵胞,卵子の100倍以上が発達を開始するが,99%以上が選択的に死滅してしまい,1%未満のみが排卵に至る。このような卵胞,卵子の選択的死滅は,より優秀で強靭な子孫を残すための選抜戦略として重要であるが,これを制御している分子機構の全容は未だに解明されていない。本研究は,哺乳類の卵巣において繰り返される卵胞,卵子の選択的死滅を制御している分子機構を解明し,これをもとに本来死滅すべき低品質卵子と排卵にいたる高品質卵子を分別し,体細胞クローン動物作出などの様々な動物バイオテクノロジーに供される卵子の品質を保証できる技術を確立することを目指している。

今年度は,卵胞に発現している細胞死受容体とデコイ受容体を同定し,細胞死受容体を介するアポトーシスシグナルの細胞内伝達系を担うカスパーゼ系の解析を進めた。さらに細胞膜直下に局在してアポトーシスシグナル伝達を阻害している新規な阻害因子(cFLIP:代表者らが遺伝子とアミノ酸配列を決定した)が顆粒層細胞に高発現している卵胞の卵子の健常性が高いらしいことを突き止めたので,これをパラメーターとして卵子品質判定法の開発を進めている。多様な生殖戦略をもつ脊椎動物のうちで、魚類のように数千から数億の仔の中で幸運かつ優れたものだけが生き残る生殖戦略と異なり、哺乳類は性周期毎に110個の僅かな卵子を排卵して授精し、胎児を母体内で発生させてから出産し、それを大切に育てる生殖戦略をとって繁栄してきた。成熟した哺乳類の卵巣には、胎児期に途中で減数分裂を休止している卵子が5100万個含まれ、性周期毎に卵胞とともに発育・成熟して排卵に至る。この課程で、最終的に排卵にいたる卵胞・卵子の100倍以上が発達を開始するが、99%以上が選択的に死滅してしまう。このような卵胞・卵子の選択的死滅はより優秀で強靭な子孫を残すための選抜戦略として重要であるが、これを制御している分子機構の全容は未だに解明されていない。本研究は、哺乳類の卵巣において繰り返される卵胞・卵子の選択的死滅を制御している分子機構を解明し、これをもとに本来死滅すべき低品質の卵子と排卵にいたる高品質卵子を分別し、体細胞クローン動物作出などの様々な動物バイオテクノロジ-に供される卵子の品質を保証できる技術を確立することを目指している。今年度は、卵胞に発現している細胞死受容体とデコイ受容体を同定し、細胞死受容体を介するアポトーシスシグナルの細胞内伝達系を担うカスパーゼ系の解析を進めた。さらに細胞内に局在してアポトーシスシグナル伝達を阻害している新規な阻害因子cFLIPおよびXIAP(遺伝子とアミノ酸配列を決定した)が顆粒層細胞に高発現している卵胞の卵子の健常性が高いらしいことを突き止め、これらを品質評価マーカーとした卵子品質判定法の開発を進めた。脊椎動物は、多様な生殖戦略をもつ。魚類では多くの仔の中で優れたものだけが生き残る。哺乳類では性周期毎に僅かの卵子が排卵され、授精して胎仔となり、母体内で発育して出産するが、これを大切に育てる。成熟した哺乳類の卵巣には、胎児期に減数分裂を開始し、出産後休眠している卵子が数万数十万個含まれており、性周期毎に卵胞とともに発育・成熟して排卵に至る。最終的に排卵にいたる卵胞・卵子の100倍以上が発達を開始し、途中で99%以上が選択的に死滅する。このような卵胞・卵子の選択的死滅は、優秀で強靭な子孫を残すための選抜戦略として重要であるが、分子制御機構の全容は未解明である。本研究の目的は、哺乳類の卵巣において繰り返される卵胞・卵子の選択的死滅を調節している制御機構を解明し、これを利用して本来死滅すべき「低品質卵子」と排卵にいたる「高品質卵子」を判別する手法を開発することである。これは、体細胞クローン動物作出などの様々な動物バイオテクノロジーに供される卵子の品質を保証できる技術を確立することにつながる。今年度は、卵胞顆粒層細胞に発現している可溶性細胞死受容体を同定するとともに細胞死受容体を介する細胞内アポトーシス・シグナル伝達系を担うカスパーゼ系分子機構の解析を進めた。加えて細胞内でシグナル伝達を阻害している阻害因子(cFLIPとXIAP)が顆粒層細胞に高発現している卵胞の卵子は健常性が高いことを確認し、卵子品質判定のマーカーとして優れていることを示した。
ロバストネスを考慮したグローバルサプライチェーンネットワーク設計問題の解法の開発

本研究では,現実のネットワーク設計問題において考慮すべき様々な条件を考慮したモデルを提案し,これらに対する解析,および容量スケーリング法,限定した分枝限定法や行・列生成法などを含む解法の開発を行った.続いて,基本的な容量制約をもつネットワーク設計問題に対して,デリート法を改良した貪欲法と容量スケーリング法を組み合わせた高速な新しい貪欲法を開発した.この高速解法を確率的シナリオ解析モデルに組み込むことにより,ロバストネスを考慮した新しいサプライチェーンネットワーク設計モデルに対する解法を開発した.従来の研究の整理:2011年から2014年に発行された国内外の文献を中心に,サプライチェーンネットワーク設計問題,グローバルサプライチェーンネットワーク設計問題の文献調査を実施し,分類・整理した.続いて,ロバストネス性を考慮したネットワーク設計問題に関係する国内外の文献調査を実施し,そのモデルの条件,解法,事例分析対象を分類・整理した.非分割フローを考慮したおよびフロー木条件を考慮したネットワーク設計問題に対するモデルおよび解法の開発:サプライチェーンネットワーク設計問題は,一般的なネットワーク設計問題と異なり,同一の始点・終点をもつ貨物のフローは途中で複数経路上で分割輸送されることはない.また,同一の終点をもつ貨物のフローは途中で混載されることはあっても,途中から複数経路上で分割輸送されることはない.このような非分割フロー条件とフロー木条件を考慮した2つのより現実的なサプライチェーンネットワーク設計問題を対象として,モデルおよび近似解法を提案した.また,数値実験を行ない,非分割フロー条件およびとフロー木条件がサプライチェーンネットワークに及ぼす影響を明らかにした.最低サービス水準を考慮したLTLネットワーク設計問題:サプライチェーンネットワークにおける主要な輸送形態であるLTLネットワーク設計の問題を扱った.LTLネットワーク設計では輸送便に対する最低サービス水準が重要であり,この条件を考慮したいくつかのモデルを開発した.さらに,数値実験により,最低サービス水準条件がサプライチェーンネットワークに及ぼす影響を明らかにした.容量制約をもつネットワーク設計問題に対するn分割不等式の開発:容量制約をもつネットワーク設計問題のための新しい強い妥当不等式である3分割不等式,4分割不等式およびn分割不等式を開発した.これらの妥当不等式を解析システムに組み込むことにより,強い下界値ならびに良い上界値を導出することが可能となる.分枝価格法を用いた容量制約をもつネットワーク設計問題の解法の開発:分枝限定法と列生成法を組み合わせた分枝価格法を用いた容量制約をもつネットワーク設計問題のための近似解法を開発した.数値実験を行い,提案した解法の有効性を示した.ホップ数を考慮した容量制約をもつネットワーク設計問題:ホップ数である施設等の経由回数を上限にもつ容量制約をもつネットワーク設計問題に対して,ホップ数を満足するパスのみを生成する列生成と容量スケーリング法などを組み合わせた解法を開発した.数値実験を行い,提案した解法の有効性を示した.容量制約をもつネットワーク設計問題のための貪欲型解法の開発:ロバストネスを考慮した容量制約のないネットワーク設計問題のための高速解法である貪欲型解法を適用した高速な貪欲解法およびメタ貪欲解法を提案した.前年度以前より継続研究していた容量制約をもつネットワーク設計問題のための容量スケーリング法と局所分枝法,区分的線形容量をもつネットワーク設計問題のための容量スケーリング法と局所分枝法,ロジスティクスネットワーク設計問題のためのラグランジュ緩和法に対する査読つき英語論文の学会誌等への掲載が決定した.ロバストネスを考慮したサプライチェーンネットワーク設計問題は,確率的・シナリオ的な要素を含む大規模な設計問題となるため,従来モデルで有効であった容量スケーリング法,局所分枝法,タブサーチ法などのメタ解法が有効に機能しないことが知られている.本研究では,関連する様々なモデル・問題に対する解法等を開発した.非分割フローおよびフロー木条件を考慮したネットワーク設計問題に対するモデルおよび解法を開発し,数値実験により非分割フロー条件およびとフロー木条件がサプライチェーンネットワークに及ぼす影響を明らかにした.最低サービス水準を考慮したLTLネットワーク設計問題に対するいくつかのモデルを開発し,数値実験により最低サービス水準条件がサプライチェーンネットワークに及ぼす影響を明らかにした.容量制約をもつネットワーク設計問題に対する強い妥当不等式である3分割不等式,4分割不等式およびn分割不等式を開発した.容量制約をもつネットワーク設計問題に対して,分枝限定法と列生成法を組み合わせた分枝価格法を用いた近似解法を開発し,数値実験により提案した解法の有効性を示した.ホップ数を考慮した容量制約をもつネットワーク設計問題に対して,ホップ数を満足するパスのみを生成する列生成と容量スケーリング法などを組み合わせた解法を開発した.数値実験を行い提案した解法の有効性を示した.容量制約をもつネットワーク設計問題に対して,ミノウクスの貪欲法を拡張した高速な貪欲法を開発し,容量スケーリング法による実行領域の限定と限定した分枝限定法を組合せた高速な近似解法を提案し,数値実験により従来の解と同程度の高精度の近似解を従来の解法と比較して1/10から1/100の短時間で算出できることを示した.この高速な貪欲法をシナリオモデルに拡張することに成功し,ロバストネスを考慮したシナリオ解析モデルに対する近似解法を開発した.本研究では,現実のネットワーク設計問題において考慮すべき様々な条件を考慮したモデルを提案し,これらに対する解析,および容量スケーリング法,限定した分枝限定法や行・列生成法などを含む解法の開発を行った.続いて,基本的な容量制約をもつネットワーク設計問題に対して,デリート法を改良した貪欲法と容量スケーリング法を組み合わせた高速な新しい貪欲法を開発した.

この高速解法を確率的シナリオ解析モデルに組み込むことにより,ロバストネスを考慮した新しいサプライチェーンネットワーク設計モデルに対する解法を開発した.ホップ数などの現実の条件を持つモデルに対する解法,従来型モデルに対する新しい解法の開発に成功し,数値実験により有効性を示すことができている.また,ロバストネスモデルのために必要な高速近似解法を提案することができ,大規模なロバストネスモデルへの対応が可能となった.ネットワーク設計高速な貪欲解法およびメタ貪欲解法を提案しており,これを用いた解析システムの開発を行なう.続いて,ロバストネスを考慮した確率モデルに組み込んだ解析システムの開発を行なう.続いて,これらの数値実験を実施する.ロバストネスモデルを中心に,従来の研究を調査・分類することができている.また,サプライチェーンネットワーク設計問題と従来型のネットワーク設計問題の相違点である非分割フロー条件,フロー木条件および最低サービス水準条件を考慮したモデル,解法の開発と数値実験を行ない,これらの条件がサプライチェーンネットワークに及ぼす影響を分析することができている.ロバストネスモデルは,確率的なモデルを含むため,数多くのシナリオモデルを解くことを繰り返す必要がある.このため,数値実験などによりサプライチェーンネットワーク設計問題で重要である条件を抽出したモデルを作成することが重要である.このため,平成25年に解析した条件以外の条件の影響を分析する必要がある.また,数多くのシナリオモデルを解くことを繰り返す必要があるため,複数コアの有効活用と複数CPUによる並列計算の効率化が重要である.
メゾメカニクス・アプローチによる高機能薄膜被覆材料の健全性評価

高機能薄膜被覆材料の薄膜,基板および被覆材料としての特性を評価し,それに基づいた強度評価手法を構築することを目的として本研究を実施した.以下に主な成果を示す.スパッタリング法を用いて,まずセラミック材料のアルミナ(Al_2O_3),炭化ケイ素(SiC)および窒化チタン(TiN)をターゲット材とし,種々の成膜条件の下でホウケイ酸ガラス基板上に単層スパッタ膜を形成し,これらの被覆材の機械的特性を実験的に検討した.Al_2O_3被覆材料およびAl_2O_3被膜においては優れた平面性状が得られるものの,強度特性が劣っていたが,TiN被覆材料およびTiN被膜は顕著な強度向上を示すのに対して,平面性状については他の被膜材種に劣るということがわかった.なお,SiC被覆材料およびSiC被膜における平面性状および強度特性は,Al_2O_3およびTiNの被覆材料,被膜の特性の中間に位置していた.ミクロ,マクロの両観点から実測データをもとにした,被覆材料の強度評価手法を検討した.ここでは,破面観察の結果,いずれの被覆材料についても破壊機構の相違がなかったので,上記の各種特性間の相関性のみを考慮して,ガラス基板に対する被覆材料の硬さ比,粗さ比およびスパッタ時間の関数として,新たに強度推定式を提案した.一部の条件を除いて,総じてスパッタ膜の材種によらず傾向の変化も含めてよい推定結果が得られた.次に,種々の成膜条件により電子基板用ガラス上に,Al_2O_3・SiC二層膜を被覆し,薄膜被覆材料を創成した.二層被覆材料の曲げ強度は高周波電源出力にはほとんど依存しないが,単層被覆材料よりも向上することが判明し,二層被覆化が強化改善に寄与することが示唆された.高機能薄膜被覆材料の薄膜,基板および被覆材料としての特性を評価し,それに基づいた強度評価手法を構築することを目的として本研究を実施した.以下に主な成果を示す.スパッタリング法を用いて,まずセラミック材料のアルミナ(Al_2O_3),炭化ケイ素(SiC)および窒化チタン(TiN)をターゲット材とし,種々の成膜条件の下でホウケイ酸ガラス基板上に単層スパッタ膜を形成し,これらの被覆材の機械的特性を実験的に検討した.Al_2O_3被覆材料およびAl_2O_3被膜においては優れた平面性状が得られるものの,強度特性が劣っていたが,TiN被覆材料およびTiN被膜は顕著な強度向上を示すのに対して,平面性状については他の被膜材種に劣るということがわかった.なお,SiC被覆材料およびSiC被膜における平面性状および強度特性は,Al_2O_3およびTiNの被覆材料,被膜の特性の中間に位置していた.ミクロ,マクロの両観点から実測データをもとにした,被覆材料の強度評価手法を検討した.ここでは,破面観察の結果,いずれの被覆材料についても破壊機構の相違がなかったので,上記の各種特性間の相関性のみを考慮して,ガラス基板に対する被覆材料の硬さ比,粗さ比およびスパッタ時間の関数として,新たに強度推定式を提案した.一部の条件を除いて,総じてスパッタ膜の材種によらず傾向の変化も含めてよい推定結果が得られた.次に,種々の成膜条件により電子基板用ガラス上に,Al_2O_3・SiC二層膜を被覆し,薄膜被覆材料を創成した.二層被覆材料の曲げ強度は高周波電源出力にはほとんど依存しないが,単層被覆材料よりも向上することが判明し,二層被覆化が強化改善に寄与することが示唆された.本年度は主として高機能薄膜被覆材料の創成,ならびにその表面性状と機械的特性に関して実験的検討を行った.得られた主な結果を以下に示す.まず,高周波(RF)スパッタリング装置を用いて,種々の成膜条件により電子基板用ガラス上に,アルミナ(A1203)・炭化ケイ素(SiC)二層膜および窒化チタン(TiN)単層膜を被覆し,薄膜被覆材料を創成した.被膜表面について,走査型レーザ顕微鏡により表面粗さなどの表面性状の3次元的観察および表面気孔率の計測を行った.A1203/SiC被膜の表面粗さ,気孔率に関しては成膜条件に対してほとんど依存しなかった.TiN被膜については,表面粗さは膜厚が厚いほど粗くなり,また膜厚が厚く,RF出力が低いほど気孔率が大きくなることがわかった.機械的特性としては,超微小硬度計により被膜硬さを,小型引張試験機により被覆材の曲げ強度をそれぞれ計測した.A1203/SiC二層被覆材の硬さは膜厚が厚いほど,またRF出力が高いほど高硬度になった.低RF出力で成膜したTiN被覆材料では,膜厚と硬さとの間に正の相関が認められた.また,二層被覆材料の曲げ強度はRF出力にはほとんど依存せず,単層被覆材料よりも向上することが判明した.TiN被覆材では,全体的に同じRF出力の場合には膜厚が厚い方が,また同じ膜厚の場合にはRF出力が高い方が,曲げ強度が上昇することがわかった.

なお,曲げ強度については,スパッタ時間が長くなることによりガラス基板自体の軟化に影響されることを考慮しなければならないことが示唆された.また,機械的特性の相関については,いずれの被覆材においても,高硬度の被膜の被覆材料ほど曲げ強度は高くなったが,曲げ強度と被膜硬さの関係は成膜条件に依存することが明らかになった.以上の成果を反映し,創成条件も考慮した上で,薄膜被覆材料の健全性評価を行う必要があることがわかった.本年度は,高周波マグネトロンスパッタリング法を用いて,セラミック材料のAl_2O_3, SiC, TiNをターゲット材とし,種々の成膜条件の下でホウケイ酸ガラス基板上にスパッタ膜を形成し,これらの被覆材の機械的特性を実験的に検討した.結果については以下のとおりである.スパッタ薄膜の表面粗さについては,高周波電源出力が同じ場合には膜厚ぶ厚い方が,また膜厚が同じ場合には高周波電源出力が高い場合に表面粗さが粗くなることがAl_2O_3被膜,TiN被膜において確認されたが,SiC被膜では特に依存性が認められなかった。硬さに関しては,ガラス基板単体よりもAl_2O_3被覆材料,SiC被覆材料,TiN被覆材料の順に高硬度となることがわかった.また高周波電源出力が同じ場合には膜厚が厚い方が,膜厚が同じ場合には高周波電源出力が大きい方が,硬さが大きくなった.曲げ強度については,Al_2O_3被覆材,SiC被覆材の膜厚の厚い被覆材に例外があるものの,高周波電源出力が同じ場合には膜厚が厚い方が,また膜厚が同じ場合には高周波電源出力が高い方が,曲げ強度が向上した.膜厚が厚い場合の強度低下については,スパッタ時間が長くなることによりガラス基板自体の軟化による影響を受けたと考えられる.ミクロ,マクロの両観点から実測データをもとにした,被覆材料の強度評価手法を検討した.ここでは,破面観察の結果,いずれの被覆材料についても破壊機構の相違がなかったので,上記の各種特性間の相関性のみを考慮して,ガラス基板に対する被覆材料の硬さ比,粗さ比およびスパッタ時間の関数として強度推定式を提案した.この推定式から得られた強度値は,総じてスパッタ膜の材種によらず,実験的に求めた強度特性に対してよい推定を与えた.
細胞内トリグリセリドリパーゼの分子的多様性に関する発生工学的研究

肥満は、糖尿病、高脂血症、高血圧などの動脈硬化危険因子を伴いやすい。肥満は脂肪細胞に蓄積したトリアシルグリセロール(TG)量と脂肪細胞の数によって規定される。特に、脂肪細胞中に蓄積したTGの分解はカテコラミンなどのホルモンによる活性化調節を受け、ホルモン感受性リパーゼ(HSL)が、その酵素活性を担うとされてきた。しかしながら、臨床的にはHSLの分子異常に起因する肥満症は発見されておらず、脂肪細胞の細胞内TG分解機構には多様性の存在が推測される。また、HSLは脂肪細胞以外の多様な臓器に発現しており、それらの臓器における機能の詳細は不明であった。そこで本研究では、発生工学の手法を用いてHSLのノックアウトマウスを作成し、その表現型を解析するとともに、脂肪細胞のTG分解酵素の特性について検討した。GXSXGを含むHSL活性中心をコードするエキソン6をネオマイシンに置換するタイプのターゲティングベクターを用いてHSLノックアウトマウスを作成した。白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)、精巣の中性コレステロール分解活性は感度以下に低下しており、nullのノックアウトであることが確認された。このマウスでは乏精子症に起因する男性不妊が観察された。体重増加曲線は野生型マウスとの間で差は認められず、褐色脂肪組織の肥大は認められたが、白色脂肪組織の肥大は観察されなかった。ところが、いずれの脂肪組織においても脂肪細胞の腫大は観察された。これらの事実から、脂肪細胞の多様性が示唆された。また、精巣のTG分解活性は欠損するが、WATやBATでは有意な残存活性が検出された。イソプロテレノールによる脂肪分解活性も、野生型マウスに比較して低下しているものの、明らかな残存活性が存在していた。TGリパーゼ活性もHSLとは異なる細胞内TGリパーゼの存在が推測された。脂肪細胞の多寡は肥満や糖尿病の発症に深く関与する。細胞内にトリグリセリド(TG)を蓄積しているが、その分解の調節に与える酵素としてホルモン感受性リパーゼ(hormone-sensitive lipase;HSL)が知られる。HSLの脂肪分解における役割を調べるために、HSLを欠損するマウスをジーンターゲティングによって作成した。HSLノックアウトマウス(HSL-/-)は、一見正常であり、体重増加曲線を調べる限り、肥満はきたさず、体の各部位の脂肪組織重量の増加はみとめられなかった。ところが、傍精巣上体脂肪組織や褐色脂肪組織を顕微鏡的に調べると、脂肪細胞の肥大が観察された。DNAあたりのTG含量の増加も認められた。β-アドレナリン受容体刺激活性を有するイソプロテレノールを静脈注射すると、血液中の遊離脂肪酸(FFA)とグリセロール濃度が増加した。白色脂肪組織から脂肪細胞を分離培養した系でイソプロテレノールを添加しても、野生型に比較して弱いながら、HSL-/-においても培養液中のFFAとグリセロール濃度の上昇が観察された。このことは、HSL以外にも細胞内のTGを加水分解する酵素が存在し、しかもこの酵素はホルモン感受性であることを示している。TGリパーゼ活性を測定したところ、HSL-/-の褐色脂肪組織においては野生型と同レベルのTGリパーゼ活性が認められた。一方、HSLのもうひとつの基質であるコレステロールエステルの加水分解活性は、HSL-/-においてほぼ完全に欠損していた。HSL-/-の白色脂肪組織は野生型に比較して低値ながら、十分量のTGリパーゼ活性が認められた。これらの事実から、脂肪細胞にはHSLとは異なる新たなTGリパーゼが存在することが、始めて明らかにされた。

肥満は、糖尿病、高脂血症、高血圧などの動脈硬化危険因子を伴いやすい。肥満は脂肪細胞に蓄積したトリアシルグリセロール(TG)量と脂肪細胞の数によって規定される。特に、脂肪細胞中に蓄積したTGの分解はカテコラミンなどのホルモンによる活性化調節を受け、ホルモン感受性リパーゼ(HSL)が、その酵素活性を担うとされてきた。しかしながら、臨床的にはHSLの分子異常に起因する肥満症は発見されておらず、脂肪細胞の細胞内TG分解機構には多様性の存在が推測される。また、HSLは脂肪細胞以外の多様な臓器に発現しており、それらの臓器における機能の詳細は不明であった。そこで本研究では、発生工学の手法を用いてHSLのノックアウトマウスを作成し、その表現型を解析するとともに、脂肪細胞のTG分解酵素の特性について検討した。GXSXGを含むHSL活性中心をコードするエキソン6をネオマイシンに置換するタイプのターゲティングベクターを用いてHSLノックアウトマウスを作成した。白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)、精巣の中性コレステロール分解活性は感度以下に低下しており、nullのノックアウトであることが確認された。このマウスでは乏精子症に起因する男性不妊が観察された。体重増加曲線は野生型マウスとの間で差は認められず、褐色脂肪組織の肥大は認められたが、白色脂肪組織の肥大は観察されなかった。ところが、いずれの脂肪組織においても脂肪細胞の腫大は観察された。これらの事実から、脂肪細胞の多様性が示唆された。また、精巣のTG分解活性は欠損するが、WATやBATでは有意な残存活性が検出された。イソプロテレノールによる脂肪分解活性も、野生型マウスに比較して低下しているものの、明らかな残存活性が存在していた。TGリパーゼ活性もHSLとは異なる細胞内TGリパーゼの存在が推測された。
成長円錐における局所的蛋白合成と細胞骨格の動態との関係解析

伸長中の神経突起の先端に存在する成長円錐は、手のひらをひろげたような扇形をしており、神経発生や神経再生の過程で重要な機能を有している。成長円錐が標的細胞を見出してシナプスを形成する過程は軸索ガイダンスと呼ばれ、神経回路網の形成において大切な現象である。近年、成長円錐に存在する分子、成長円錐が感受するガイダンス因子、誘発因子、反発因子などが明らかにされ、成長円錐の運動に関係する分子のはたらきが明らかにされてきた。さらに、局所的な蛋白質合成が神経細胞の機能に関わることが明らかになり、なかでも発達期の成長円錐では局所で蛋白質合成が起こり、成長円錐の方向性を変える機能に関与することが示唆されている。局所翻訳される蛋白質として、Rhoなどの細胞骨格制御因子のほかミトコンドリア機能の調節因子などが報告されている。しかし、翻訳(リボソームおよび翻訳因子群)によって局所的蛋白質合成が起こっている部位と細胞骨格との相互作用については不明である。この相互作用の解明は、成長円錐の転向運動のメカニズムを理解する上で重要である。本研究では、刺激に伴う成長円錐における局所的蛋白質合成と、微小管やアクチンフィラメントとの相互関係を形態学的に明らかにする方法を開発するために、細胞膜剥離法と原子間力顕微鏡を用いて成長円錐部分の細胞成分の新たなイメージング方法の検討を行った。その結果、細胞膜剥離処理をした成長円錐部分のアクチンフィラメントとチュブリンを蛍光免疫染色により標識し、同一部位を蛍光顕微鏡と原子間力顕微鏡で観察することに成功した。このイメージング技術を基盤にして、局所的蛋白質合成に関係するリボソーム蛋白質や翻訳装置なども蛍光標識することにより、蛋白合成部位と細胞骨格との相互関係を、今後形態学的に明らかにできる可能性がある。本研究では、超音波による細胞膜剥離法(unroof method)により成長円錐部分を処理し、内部の構造を原子間力顕微鏡(AFM; Atomic force microscopy)と蛍光顕微鏡を相補的に用いて、細胞骨格蛋白質分子のイメージングを試みた。その結果、成長円錐内部のアクチンフィラメントとチュブリンの局在とそのナノレベルの微細構造解析が可能であることが明らかとなった。この方法を基盤にすれば、成長円錐における局所的な蛋白質合成と細胞骨格との相互作用の3次元的な構造解析が可能であることが示唆されたため。本研究課題を遂行する上で、原子間力顕微鏡による観察では、いくつかの限界がある。具体的には、成長円錐部分の細胞骨格成分の詳細の同定が困難であったり、局所的タンパク合成部位の同定についても、蛍光標識して、蛍光顕微鏡を併用しても困難な場合がある。今後は、このような限界点を克服するために、細胞膜剥離フリーズエッチングレプリカ法(unroofing freeze-etching replica)も用いて、細胞骨格と局所的蛋白合成部位の空間構造の解析を電子顕微鏡によっても行っていく方針である。

今後は、このような限界点を克服するために、細胞膜剥離フリーズエッチングレプリカ法(unroofing freeze-etching replica)も用いて、細胞骨格と局所的蛋白合成部位の空間構造の解析を電子顕微鏡によっても行っていく方針である。
歯周病発症における遺伝的素因:アジュバント刺激によるサイトカイン産生能との関連

1.DBA/1,SWR/Jの両マウスに、アジュバント(グラム陽性菌ペプチドグリカン)腹腔投与後、3時間で摘出した肺を用いて、サイトカイン(IL-3,IL-4,G-CSF)の発現を、mRNAレベルで解析した。既に報告しているように(1992)、GM-CSFとM-CSFのmRNAは、DBA/1マウスにおいてのみ顕著な発現を示したのに対し、IL-3,IL-4,G-CSFmRNAは、どちらの系統からも検出できなかった。2.DBA/1マウスの関節炎発症誘導過程におけるGM-CSFの役割を知ることを目的として、TypeII collagenにアジュバントを加えて一度目の刺激を加えた日から、隔日でRabbit由来抗GM-CSF抗体を投与した時の、関節炎発症をみた。その結果、通常の刺激のみのマウス群に比べて、関節炎の発症が10日ほど遅延した。3.産生能に著しい系統差のあったサイトカインであるGM-CSFについて、その遺伝子の変異の有無を調べる為に、両マウスより染色体DNAを抽出し、Southern blottingを行った。制限酵素は、Pst-1,BamH1,Apa-1の4種類を使用して行ったが、DBA/1,SWR/Jの両マウスのGM-SCF-遺伝子の違いは、検出できなかった。さらに、塩基配列を調べ、遺伝子変異の可能性を追究してみる必要があると考えられる。4.この関節炎モデルにおけるリンフォトキシン(LT)の効果を知るためにDBA/1マウスにLT投与後24hの脾臓単核球(SMNC)をペプチドグリカン(PG)刺激下で48h培養した。DNA合成は、LT投与していないマウスと比べて有為な差は見られなかったが、培養後の上清中のGM-CSF活性は、LT投与したマウスSMNCでは対照と比べ、わずか1/10の活性しかなかった。以上のことから、LTとGM-CSFがコラーゲン誘導関節炎の発症に大きく関わっている可能性が示唆された。
人工ホストによる分子認識を原理とするリン酸イオン選択性電極の開発

1.多点水素結合により無機アニオンと選択的に錯体を形成するビスチオウレア誘導体リセプターを開発した.(Tetrahedron Lett.1995,36,6483)このうち,キサンテン骨格を持つビスチオウレア誘導体リセプターはリン酸イオンに対して多点水素結合により安定な錯体を形成することを見い出した.このリセプターは現在報告されているリン酸イオンに対する電荷中性リセプターのなかで最大の錯体安定度定数を持つ.(Tetrahedron,in press)3.キシレン骨格を持つビスチオウレア誘導体ホストを合成した.このホストに基づく液膜は,硫酸イオンに対して1.5x10^<-6>Mの濃度から電位応答を示し,妨害イオンの影響も少ない.この液膜のイオン選択性及び感度は,これまで報告されている硫酸イオン選択性液膜のなかで最も優れている.4.多点の水素結合を介して塩化物イオンと安定な錯体(錯体安定度定数(DMSO):860M^<-1>)を形成するビスチオウレア誘導体ホストを合成した.このホストに基づく液膜型イオン選択性電極は,従来のイオン交換体に基づくものよりも塩化物イオンに対する選択性が優れており,血清中の塩化物イオンの定量が可能である.(A nal,Chem.in press)これらの結果は,水素結合部位を有する電荷中性ホストがアニオン選択的液膜のための感応物質として有効であることを示している.現在更に優れた選択性をもつリン酸イオン及び塩化物イオン選択性液膜を開発するために,水素結合受容部位を2ヵ所ないし3ヵ所持つチオウレア誘導体リセプターの分子設計,合成を行なっている.1.多点水素結合により無機アニオンと選択的に錯体を形成するビスチオウレア誘導体リセプターを開発した.(Tetrahedron Lett.1995,36,6483)このうち,キサンテン骨格を持つビスチオウレア誘導体リセプターはリン酸イオンに対して多点水素結合により安定な錯体を形成することを見い出した.このリセプターは現在報告されているリン酸イオンに対する電荷中性リセプターのなかで最大の錯体安定度定数を持つ.(Tetrahedron,in press)3.キシレン骨格を持つビスチオウレア誘導体ホストを合成した.このホストに基づく液膜は,硫酸イオンに対して1.5x10^<-6>Mの濃度から電位応答を示し,妨害イオンの影響も少ない.この液膜のイオン選択性及び感度は,これまで報告されている硫酸イオン選択性液膜のなかで最も優れている.4.多点の水素結合を介して塩化物イオンと安定な錯体(錯体安定度定数(DMSO):860M^<-1>)を形成するビスチオウレア誘導体ホストを合成した.このホストに基づく液膜型イオン選択性電極は,従来のイオン交換体に基づくものよりも塩化物イオンに対する選択性が優れており,血清中の塩化物イオンの定量が可能である.(A nal,Chem.in press)これらの結果は,水素結合部位を有する電荷中性ホストがアニオン選択的液膜のための感応物質として有効であることを示している.現在更に優れた選択性をもつリン酸イオン及び塩化物イオン選択性液膜を開発するために,水素結合受容部位を2ヵ所ないし3ヵ所持つチオウレア誘導体リセプターの分子設計,合成を行なっている.
低次元量子スピン系銅酸化物におけるマグノンの巨大熱伝導の研究

本研究では、低次元量子スピン系銅酸化物におけるマグノンによる巨大熱伝導の機構を解明すること、および、熱伝導測定が相転移を捉える有効なプローブとなる可能性を探ることを目的とした。種々の低次元量子スピン系銅酸化物の大型単結晶を育成し、熱伝導を測定した結果、4本足スピン梯子格子系iLa_2Cu_2O_5と2次元スピン系C_3B_2O_6において、マグノンによる熱伝導が大きくなることを発見した。1次元スピン系Sr_2CuO_3とSrCuO_2において不純物置換効果を調べた結果、両系ともマグノンによる熱伝導が大きく、さらに、マグノンの平均自由行程は不純物間の平均距離と同程度であることが分かった。これにより、理論的予測どおり、熱を運ぶスピンの伝導はバリスティックであることが実証された。以上の研究により、マグノンが大量の熱を運ぶためには、スピン間の反強磁性相互作用が大きく、マグノンの分散の幅が大きいこと(すなわち、マグノンの速度が大きいこと)が重要であることが分かった。また、スピンギャップ系ではスピンギャップの形成によって、また、反強磁性に相転移する系では反強磁性長距離秩序の形成によってマグノンの平均自由行程が長くなり、マグノンによる熱伝導が増大する可能性があることが分かった。また、種々の相転移に伴う熱伝導の変化を調べた結果、Ca_2Y_2Cu_5O_<10>の反強磁性秩序状態におけるスピンフロップ転移、Cu_3B_2O_6の反強磁性秩序状態におけるスピンフロップ転移、低次元系ではないが、3次元スピンダイマー系TlCuCl_3の低温強磁場で出現するマグノンのボーズ-アインシュタイン凝縮転移、La_<2-x>Sr_xCuO_4とLa_<2-x>Ba_xCuO_4における磁場誘起磁気秩序の形成によって、熱伝導が大きく変化することを発見した。したがって、熱伝導測定が相転移を捉える有効なプローブであると結論できた。低次元量子スピン系と思われる種々の銅酸化物の熱伝導を測定した。1.2次元反強磁性系であるCu_3B_2O_6のネール温度(10K)以下の低温における熱伝導度の増大は、磁場の印加や少糧のZn置換によって大きく抑制されることから、主にマグノンによる熱伝導の増大によるものであることが分かった。また、反強磁性秩序状態における熱伝導度が、スピンフロップに伴って減少し、新たなスピン配列の安定とともに再び増加することから、熱伝導がスピン状態と密接な関連を持つことが分かった。2.2次元スピンギャッフ係であるSrCu_2(BO_3)_2の10K以下のスピンギャップ状態における熱伝導度の増大は、少量のZn置換によってほとんど変化しないことから、フォノンによる熱伝導の寄与であることが分かった。3.4本足梯子格子系La_2Cu_2O_5の大型単結晶の育成に世界で初めて成功した。熱伝導度は非常に異方的で、梯子の足方向で極めて大きくなることが分かった。それは、スピン間の交換相互作用Jの異方性で理解でき、Jの大きい梯子の足方向ではマグノンによる熱伝導の寄与が極めて大きいと結論された。この梯子の足方向でマグノンの寄与が大きいのは、スピン相関が反強磁性的であり、かつ、Jが約1000Kと大きいことから、マグノンの速度が音速以上に大きくなっているためと推測された。

4.1次元スピン鎖系Ca_2Y_2Cu_5O_<10>の熱伝導を測定した結果、ネール温度(30K)以下で僅かに上昇し、低温で磁場を印加すると、スピンフロップ磁場で急激に変化することが分かった。これは、熱伝導がスピン状態の変化のよいプローブであることを示している。また、熱伝導度の値が小さいことから、この系ではマグノンの寄与は小さいと言えるがそれは、鎖内のスピン相関が強磁性的であり、マグノンの速度が遅いためと推測された。1.典型的な低次元量子スピン系であるSr_2CuO_3(1次元スピン鎖系)とSrCuO_2(1次元2重スピン鎖系)および部分的にZnで置換したSrCu_<1-x>Zn_xO_2ついて、Traveling-Solvent Floating-Zone(TSFZ)法によって、大型単結晶を育成することに成功した。これらの物質におけるマグノンの熱伝導の存在を調べるために、現在、育成した単結晶を用いて熱伝導を測定中である。2.高温超伝導体La_<2-x>Sr_xCuO_4(LSC0)において最近中性子散乱実験によって発見され注目されている磁場誘起磁気秩序の起源を調べるために、TSFZ法で大型単結晶を育成し、磁場中で熱伝導を測定した。その結果、c軸に平行な磁場の印加による磁気秩序の発達によって熱伝導が大きく抑制されることを発見した。この磁場による熱伝導の抑制は、ゼロ磁場で既に磁気秩序が発達しているx=0.115では僅かであるが、その周辺の組成(x=0.10,0.13)で顕著になり、また、Znの部分置換によって磁気秩序が静的に安定化されている試料ではほとんどなくなることが分かった。以上の結果から、磁場誘起磁気秩序は、電荷とスピンの動的なストライプ秩序が磁場の印加で導入された磁束コアによってピン止めされて静的磁気秩序として安定化されたものである可能性が高いと結論した。さらに、c軸に平行な磁場の印加によって高温超伝導体のCuO_2面に形成される磁束コアもCuを部分置換したZnと同様に、動的ストライプ秩序のピン止めに有効であると結論した。3.La_<2-x>Ba_xCuO_4(LBC0)の大型単結晶を育成し、磁場中で熱伝導を測定した。その結果、x=0.10の試料において、c軸に平行な磁場の印加によって熱伝導が大きく抑制されることが分かった。したがって、LBC0においても2で述べたLSC0と同様のことが起こっていると結論した。1.典型的な1次元量子スピン系であるSr_2CuO_3とSrCuO_2およびCuサイトに不純物Pd、ZnあるいはNiを部分置換したSr_2cu_<1-x>Pd_xO_3、SrCu_<1-x>Zn_xO_2、SrCu_<1-x>Ni_xO_2について、Traveling-solvent Floating-zone(TSFZ)法によって大型単結晶を育成し、熱伝導を測定した。
αシヌクレイン蛋白凝集と神経細胞死の関連

αシヌクレイン過剰発現細胞を作成して蛋白凝集物形成と細胞死の関連を検討した。ヒトαシヌクレインを神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞株に導入した。これらの細胞を酸化的ストレスに曝露すると細胞質内にユビキチン、ニトロチロシン、ジチロシン陽性、ユビキチン陽性の淡白凝集体が形成された。HSP-27やαB-crystallinなどの低分子モレキュラーシャペロンもこの細胞内凝集体に共在しており、その組織化学的特徴はsynucleinopathy脳内の病的封入体と多くの共通点を持っていた。こうした凝集体形成は、キレート剤による鉄の除去により抑制されたが、このとき細胞死は増加した。逆に鉄の追加曝露により、凝集体形成は促進されたが、細胞死は抑制された。二重染色の結果、凝集体陽性細胞と活性型caspase3陽性細胞はほとんど一致しなかった。これらの実験結果は、病態下の蛋白凝集物形成が細胞防御的であることを強く示唆する。更に、細胞死の機序を検討するために、野生型・変異型αシヌクレインを過剰発現させた細胞の電気生理学的検討を行ったところ、変異型の発現により、細胞膜コンダクタンスが上昇し、脱分極時のカルシウム流入量も増大した。これらの実験結果から変異型シヌクレインによる細胞傷害の機序は、細胞膜のイオン透過性を何らかの機序により高めることによると考えられた。選択的黒質傷害の機序を解明する目的でドーパミン酸化物を高率に産生するチロシナーゼ発現系をコントロール可能な細胞モデルを作製した。この細胞モデルにαシヌクレインの過剰発現を組み合わせたところ細胞死の促進がみられたが、この時細胞死に先行して早期からミトコンドリアの機能低下が見られた。一方でMAP kinaseの変化は顕著でなかった。以上の結果はsynucleinopathyに於ける細胞死の引き金がミトコンドリア機能障害であることを示唆する。MSAを含むsynucleinopathyの病態解明のためα-synuclein過剰発現細胞を作成して蛋白凝集物形成と細胞死の関連を検討した。ヒトαシヌクレインを神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞に導入した。確立したαシヌクレイン過剰発現細胞は、形態・増殖率ともに目立った変化を示さなかった。これらの細胞を酸化的ストレスに曝露すると細胞質内にαシヌクレイン陽性の凝集体が形成された。凝集体はユビキチン、ニトロチロシン、ジチロシン陽性、ユビキチン陽性であり、構成蛋白は酸化的修飾を受けていること、またその代謝にユビキチン・プロテオソーム系が関与していることが示唆された。またチオフラビンS染色が陽性であることからβシート構造を主体とすることが示唆された。さらにHSP-27やαB-crystallinなどの低分子モレキュラーシャペロンはこの細胞内凝集体に共在していた。これらの組織化学的特徴はsynucleinopathy脳内の病的封入体と多くの共通点を持っており、その生成機序に共通の基盤を持つものと推定された。

本細胞モデルはsynucleinopathyの病態を検討する上で有用であると考えられた。前年度に引き続き、MSAを含むsynucleinopathyの病態解明のためαシヌクレイン過剰発現細胞を作成して蛋白凝集物形成と細胞死の関連を検討した。ヒトαシヌクレインを神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞株に導入した。これらの細胞を酸化的ストレスに曝露すると細胞質内にユビキチン、ニトロチロシン、ジチロシン陽性、ユビキチン陽性の淡白凝集体が形成された。HSP-27やαB-crystallinなどの低分子モレキュラーシャペロンもこの細胞内凝集体に共在しており、その組織化学的特徴はsynucleinopathy脳内の病的封入体と多くの共通点を持っていた。こうした凝集体形成は、キレート剤による鉄の除去により抑制されたが、このとき細胞死は増加した。逆に鉄の追加曝露により、凝集体形成は促進されたが、細胞死は抑制された。二重染色の結果、凝集体陽性細胞と活性型caspase3陽性細胞はほとんど一致しなかった。これらの実験結果は、病態下の蛋白凝集物形成が細胞防御的であることを強く示唆する。更に、細胞死の機序を検討するために、野生型・変異型αシヌクレインを過剰発現させた細胞の電気生理学的検討を行ったところ、変異型の発現により、細胞膜コンダクタンスが上昇し、脱分極時のカルシウム流入量も増大した。これらの実験結果から変異型シヌクレインによる細胞傷害の機序は、細胞膜のイオン透過性を何らかの機序により高めることによると考えられた。MSAを含むシヌクレイノパチーの病態解明のためαシヌクレイン過剰発現細胞を作成して蛋白凝集物形成と細胞死の関連を検討した。ヒトαシヌクレインを神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞に導入した。確立したαシヌクレイン過剰発現細胞は、形態・増殖率ともに目立った変化を示さなかった。これらの細胞を酸化的ストレスに曝露すると細胞質内にαシヌクレイン陽性の凝集体が形成された。特に凝集体形成率の高かった鉄について更に検討を進めたところ、二価鉄のみならず酸化的ストレス誘導能に於いて非活性型の三価鉄についても同様の凝集体形成促進作用が認められた。他の酸化的ストレス存在下に三価鉄を追加曝露したところ、凝集体形成は促進されたが、このとき細胞死は抑制された。逆に鉄キレート剤の追加曝露で、凝集形成は抑制されたが細胞死は促進された。以上の結果は凝集体形成が酸化的ストレス曝露下の細胞に対して保護的に働いている事を示唆する。一方で家族性パーキンソン病の原因として同定されているA53T変異を導入したαシヌクレインを過剰発現させたところ、野生型に比較して有意に細胞膜コンダクタンスが上昇していることがパッチクランプ法で明らかとされた。これらの結果はシヌクレイノパチーの病態として膜障害が重要であること、凝集体(封入体)形成が必ずしも必要でないことを示唆する。本細胞モデルはシヌクレイノパチーの病態解明について有用な細胞モデルであり、根治的な治療薬の創薬に於いても活用し得る有力なツールであると考えられた。