hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チロシンホスファターゼによる新しい細胞死の制御機構

この研究では、チロシン脱リン酸化酵素PTP-PESTを免疫系T細胞に遺伝子導入した際に新しいタイプの細胞死が誘導されているのではないかという観察から、その分子機序を明らかにするために研究を開始した。細胞死、細胞分裂、細胞数の測定、導入遺伝子の部分的欠失および責任部位の探索、結合分子の共発現などの様々な解析を行った。結果的にPTP-PESTは細胞死を誘導しているというよりもベクターのLTRに向かうシグナル伝達のうちの何処かを抑制することでベクターマーカーの発現を抑え、見かけ上細胞が減少していると解釈される結果を得た。従って過去の論文でも細胞死を誤解している可能性を検証する必要が生じた。この研究では、チロシン脱リン酸化酵素PTP-PESTをT細胞に遺伝子導入した際に新しいタイプの細胞死が誘導されているのではないかという観察から、その分子機序を明らかにするために研究を開始した。すなわち、遺伝子導入2日後にベクターのマーカーであるGFPやThy1.1を検出することが出来るが、T細胞の刺激を止めてIL-2を含む培地で2日間休ませると、マーカー陽性細胞が大幅に減少したという結果を得て、PTP-PESTの過剰発現により細胞死が誘導されていることが示唆された。まず本年度は、昨年度に行った細胞分裂をモニターする実験と細胞数の変動を追跡する実験を拡大しつつ追試した。また細胞周期の阻害分子Kip1を導入して同じ実験を試みた。Kip1によって細胞数の明らかな減少が観察されたのに対し、PTP-PESTでは減少しなかったので、昨年の観察を改めて補強する結果になった。さらに本現象におけるPTP-PESTの責任部位を探るために、プロリンモチーフ欠失コンストラクトを新たに増やして、その影響を比較した。その結果、全長のものが最も顕著な効果を示し、短くなるに連れてその効果を失うという傾向を確かめることが出来た。これらの結果を受けて、PTP-PESTの導入によって抑制されている細胞内シグナル経路としては、細胞培養系に添加されているIL-2やFCSによって恒常的に入るシグナル経路が筆頭候補として挙げられる。25年度はFCS、IL-2の存在下と、非存在下でその影響を比較する。仮説としては、恒常的に入る刺激によってベクターマーカーの発現が維持されていて、これをPTP-PESTが抑制すると、見かけ上細胞が減少するかも知れないというものである。そこでIL-2やFCSの下流に位置する正のシグナル因子Pyk2、STAT5などに対する影響も解析する。これまで、本現象におけるPTP-PESTの責任部位を探るためにPTP-PESTの部分的欠失コンストラクトの影響を比較した際、全長のものが最も顕著な効果を示し、コンストラクトが短くなるに連れてその効果を失うという結果が得られていた。そこで今年度は、逆向きの方法としてPTP-PESTそのものではなく、PTP-PEST結合分子のうちのどれがPTP-PEST導入細胞の減少を阻止できるか、共発現によるレスキュー実験を行った。PTP-PESTのC末側領域にはいくつかの特徴的な配列P1P4、NPLH、CTHが存在する。CTHに結合するPSTPIP1、P4に結合するCsk、NPLH配列に結合するp52Shc、p46Shc、主としてP3に結合するGrb2、さらにLckを導入した。しかしながら、予想に反して顕著なレスキュー効果を示すコンストラクトはなかった。発現させるタイミングをずらす必要があるかも知れないと考えている。その一方で、P1やP2に結合するCas、Paxillin、Pyk2のコンストラクトは用意できなかったので、今後作成したい。ここまでの知見をまとめて論文を投稿したが2つの雑誌にリジェクトされた。さらに別の雑誌に投稿する予定である。研究計画にはあったが投稿中の論文に含まれていない研究項目でまだ試みていない実験を今後試みる。即ちPTP-PESTが、培養液に含まれるサイトカインや成長因子からのシグナルが発現ベクターのLTRプロモーターに至る経路を抑制することで、ベクターのマーカーの発現を抑制して見かけ上、細胞が減少したように見えているのではないかという可能性を検証する。今年度は別の大学で新しい研究室を開くことになったので、研究環境の整備、基本的な実験器具や機材を揃えることに奔走した。また学部学生に対する講義を2科目の準備にも多くの時間を費やし研究を充分に行うことは難しかった。PTP-PESTを、レトロウイルスベクターpMXを使ってマウスのT細胞にtransfectionすると、2日後にベクターのマーカーであるGFPやThy1.1を検出することが出来るが、このT細胞の刺激を止めてIL-2を含む培地で2日間休ませると、Thy1.1(またはGFP)陽性細胞が大幅に減少した。またマーカー自身の発現強度も空ベクターに比べて低かった。これらの結果からPTP-PESTの過剰発現により細胞死が誘導されていることが示唆され、実験を開始した。

細胞が死滅ないし消失する過程を調べる目的でCFSEにより細胞を蛍光染色しその動態をモニターしたが、PTP-PEST導入細胞はそのベクターのマーカーであるThy1.1を見る限り、分裂が送れる様子は見られず、それにも拘らずやがて消失して追跡できなくなった。フローサイトメーター上でのCFSEとThy1.1の蛍光補正が、Thy1.1の発現が下がってからは充分ではなく正確に追跡できない状況である。これを何とか上手く補正する必要がある。次にAnnexin Vや7-AADでも染色したが、今のところPTP-PEST導入細胞で陽性細胞の増加は見られなかった。さらにPropidium Iodite(PI)による染色も行ったが、細胞周期の遅延は見られず、これらの結果から細胞死を積極的に示す傍証は期せずして得られていない。一方で、24wellプレートでPTP-PESTを導入したwellと、対照wellとで細胞数を比較すると、予想に反して両者に差は見られなかった。この結果から細胞死が実は誘導されていない可能性も生じて来た。もしかするとPTP-PESTは、サイトカインやGrowth factorからベクターのLTRプロモーターに至るシグナル経路か、その後の翻訳の段階のいずれかを抑制しているのではないかという可能性についても次年度は解析を進めたい。今年度の実験は、前年度に行った実験の再現性を、より慎重に確かめることから始めた。すなわち、細胞分裂をモニターするためのCFSEによる染色を、刺激開始後1日目および1日目+2日目のT細胞にPTP-PESTに感染させて追跡した。その両方の結果において、いずれも刺激を止めると見かけ上PTP-PEST導入細胞が減少する様子が追試できた。同様に、細胞数についても刺激後1日目および1日目+2日目に感染させたものに対して慎重にリピートしながら検討した。その結果、PTP-PEST感染細胞の絶対数の変化は、コントロールに比較して有意差は見られなかった。加えて、細胞周期の阻害分子であるKip1を導入した細胞では、細胞数の明らかな減少が観察されて、これによりPTP-PESTでは減少しないという観察を補強する結果になった。また本現象におけるPTP-PESTの責任部位を探るために、2番目、3番目のプロリンモチーフ欠失コンストラクト(それぞれdel-P2、del-P3)を新たに作成した。より短いものを加えることで、PTP-PESTの全長を均等に見渡せるようになり、用意した全てのコンストラクトの影響を比較した。その結果、観察される現象は全長のものが最も顕著な効果を示し、短くなるに連れてその効果が消失した。前年に引き続き、Bcl-2, Bcl-XL, Akt-E40KをPTP-PESTとそれぞれ同時に導入した細胞で、陽性細胞の割合の推移、ベクターマーカーのGFPまたはThy1.1の発現レベルの変化も追った。その結果、Aktの場合のみPTP-PESTの効果を打ち消す様子が観察された。
ネグリトの起源と適応に関する分子人類学的研究

本研究の目的は、東南アジアの先住民であるフィリッピンのネグリト集団の起源と適応進化を解明するプロジェクトの立ち上げ準備をすることにある。そのため、1970年代以降わが国に保管されているDNA試料の管理・利用、関連するアジア・オセアニアの諸民族集団に関する各種DNAデータベースの作成・分子系統分析等の実施方法を策定した。研究打ち合わせのための班会議は、平成18年6月28日(第1回:葉山にて)および平成19年2月18日(第2回:三島にて)に開催した。また、平成18年11月35日に高知工科大学にて開催された第60回日本人類学会大会にて、ネグリトを含むアジアの先住少数民族に関するシンポジウムを実施し、尾本・平井・数藤は「アジア・オセアニアの先住民:遺伝的起源から人権まで」と題する報告を行った。このシンポジウムのために、フィリッピン大学の人類学者F.Datar氏およびネグリトの人権問題にかかわる法律家C.Wyda氏の両氏を招聘し、ネグリト集団の現状および人権等に関する問題について報告・討論を行った。なお、ネグリトのDNA試料は197080年代に採取された古い試料で、今まで班員のもとに暫定的に保管されていたものである。これを今後の研究に用いるため、現行の倫理規定等に合せて、いかに保管・管理・運用するかを検討した結果、現在、総合研究大学院大学・葉山高等研究センター内に倫理審査委員会の設置を申し入れている。
新規機能性微粒子の創製及び評価

物質のもつ様々な機能を光で制御できる新しい物質や技術を開発する研究が盛んに行われている。特に磁気特性を光制御できる材料は、情報記録といった観点より非常に注目されている。本研究では、新規な手法による光制御型磁性材料の創製を目的として、光伝導性半導体と磁性体との複合を試みた。具体例として、光伝導性半導体であるCdS及び磁性体であるプルシアンブルー(PB)をそれぞれ逆ミセル法によって微粒子化し、その微粒子同士を混合することで新規光制御型磁性材料を作製した(J.Am.Chem.Soc. 128,10978-10982(2006).)。TEMより、それぞれの超格子が確認され、系内にCdS及びPBが存在していることが確認できた。この複合材料の磁気特性を評価したところ、磁気転移温度は約4K、2Kにおいてヒステリシスが観測された。この複合材料の光照射に伴う磁化の変化を2K、1mTで測定した結果、磁化は紫外光により減少し、2Kにいて、ヒステリシスは消失した。紫外光照射に伴う磁気特性の変化は、熱処理によって回復することが確認された。すなわち、紫外光照射による磁化のON/OFF制御に成功した。この光磁化変化を考察するために、紫外光照射前後におけるPB微粒子の電荷移動吸収帯(IVCTバンド(Fe^<II>-CN-Fe^<III>))、鉄原子間のCN伸縮振動、鉄原子の電荷状態をUV-vis吸収、IR、メスバウアー分光法においてそれぞれモニターしたところ、紫外光照射に伴いIVCTバンドの吸光度の減少、CN伸縮振動の低波数側へのシフトが観測された。さらにメスバウアー分光法では、鉄原子の電子状態が紫外光照射前後でFe^<III>からFe^<II>へ変化していることが観測された。以上の結果より、紫外光照射によりCdS微粒子の励起電子がPB微粒子へ移動することでPB微粒子が還元され、電荷状態が変化(Fe^<II>-CN-Fe^<III>からFe^<II>-CN-Fe^<II>)し、磁化が変化したと考えられる。また、紫外光照射を停止し、熱処理を施すとそれぞれ紫外光照射前の値まで回復した。
胆管癌に対する新しい集学的養子免疫療法〜IL-12遺伝子導入CTLとヒト型化バイスペシフィク抗体スーパー抗原複合体の応用〜

外科的治療が困難な高度進行胆管癌症例に対する治療成績の向上をめざして、LAK細胞を用いた養子免疫療法の基礎的研究を行った。腺癌関連抗原であるMUClを認識するマウス抗体MUSE 11 IgGとスーパー抗原Staphylococcalenterotoxin A(SEA)とを化学的に合成したSEA-IgGをLAK細胞に併用して、MUCl陽性胆管癌細胞株TFK-1に対する抗腫瘍効果をin vitroおよびSCID担癌マウスを用いたin vivo治療モデルにて著明な抗腫瘍効果が得られた。このSEA-IgGを臨床応用するためには作製の煩雑性、低収量、ヒトに対する高免疫性などを解決しなければならず、このため、より低分子の機能性抗体断片である一本鎖抗体(以下scFv)に注目して、SEAとMUSE 11 scFvを融合したSEA-scFvの大腸菌での作製を検討した。大腸菌にて作製したMUSE11 scFvおよびSEAの結合能をFACSにて確認した後、SEAの遺伝子とscFvの遺伝子を連結して大腸菌にて発現させた。まずSEA-scFvの発現を確認した後、ほぼ単一に精製を行った。精製したSEA-scFvはTFK-1およびLAK細胞の両者の結合活性を有していた。SEA-scFvの機能解析として、SEA-IgGとの細胞傷害性試験の比較検討を行い、LAK細胞単独では約20%の細胞傷害活性であったものが、濃度依存性に細胞傷害性が上昇して、0.5μg/mlでは両融合蛋白とも約80%の細胞傷害活性を示しる。さらに標的細胞をMUCl陰性株HT-17へ変更してその特異性を証明した。SEA-scFv単独投与にて細胞への毒性は否定された。さらに抗SEA抗体およびNUSEllによる抑制試験では、scFvのIgGに比較した結合活性の低さからMUSE11での抑制効果が低くなった。結果として、大腸菌を用いたSEA-scFvの作製に成功し、SEA-IgGと同様十分な抗腫瘍効果を示し、またその特異性も証明された。本研究は胆管癌だけでなくMUC1陽性の様々な腺癌に対する特異的な免疫療法としてより臨床応用に近づいたものといえる。切除不能胆道癌症例に対する養子免疫療法に着目し、腫瘍特異的抗原に対する抗体とスーパー抗原とを合成した上でLAK細胞に併用する独自な免疫療法に着目し、基礎的研究を行った。Effector細胞としてLAK細胞を用いた。腺癌関連の糖蛋白抗原であるMUC1の抗体・MUSE11およびそのF(ab′)2と、スーパー抗原であるSEAを化学的にSEA-MUSE11,SEA-F(ab′)2の形に合成した。標的細胞には当施設で樹立した肝外胆管癌細胞株(TFK-1)と肝細胞癌細胞株(HT-17)を使用し、前述した各種抗体を用いた際の標的細胞に対するLAK細胞のターゲッティング能および細胞傷害活性の増強効果について検討した。FACSによる解析ではSEA-MUSE11およびSEA-F(ab′)2はMUSE11側がTFK-1に強く反応し、SEA側がLAK細胞のMHC class II分子に反応して癌細胞とLAK細胞とを架橋することが明らかになった。

MUSE11単独,SEA単独,SEAとMUSE11を混合しただけのSEA+MUSE11、SEA-MUSE11およびSEA-F(ab′)2をそれぞれ用いたときのE/T比5の細胞傷害活性(48hr MTS assay法)の検討では、SEA-MUSE11群およびSEA-F(ab′)2群において0.01μg/mlの低濃度から60%前後の高い細胞傷害活性が認められた。またSEAであらかじめ刺激したLAK細胞は癌細胞に対する細胞傷害活性を上昇させることも示された。さらに、ウサギ抗SEA抗体およびMUSE11によるblocking testと、コントロールとして用いたHT-17に対する細胞傷害活性の検討により、合成抗体由来の傷害活性の肝外胆管癌細胞株(TFK-1)に対する特異性が確認された。SCIDマウスを用いて治療実験モデルを作成し抗腫瘍効果を検討した。すなわち、TFK-1を皮下に生着させたSCIDマウスに、2μgの各種抗体を加えて1時間4°Cでincubateした2×10^7個のLAK細胞とIL-2(500IU)を4日間連続尾静脈内に投与し、皮下腫瘍径を10週間測定した。また、各群ともに15匹から25匹のマウスを使用し、それぞれの腫瘍質量を換算した。その結果、SEA-MUSE11群とSEA-F(ab′)2群においてのみ早期から著しい抗腫瘍効果が認められ、その効果は観察期間中を通して持続した。最終的には腫瘍の完全消失は認められなかったものの、コントロール群に比して約70%の腫瘍増殖抑制が得られた。細菌性スーパー抗原の一つである黄色ブドウ球菌毒素(SEA)はMHCクラスII分子と結合して特定の高いTCRVβ鎖を持つT細胞を活性化するが、クラスII発現の高い組織に集積して全身の過剰なサイトカイン産生をもたらしショックを起こす可能性がある。今回、この副作用を軽減するため、遺伝子工学的に大腸菌を用いてSEAのクラスII結合部位に変異を導入したSEA D227Aを作成し、その免疫賦活能について検討した。先ずclassII陽性であるIC-2刺激CAK細胞とSEA D227親和性をFACScanで解析した。次いでヒト末梢血単核球(PBMC)にSEA D227を添加して48時間後のコロニー数を計測した。CAKをSEA D227Aで6時間刺激し、胆管癌細胞(TFK-1)に対するキラー活性をMTSassayで測定した。また、TFK-1に高率に発現するMOC1に対するmoAbであるMOSEIIとSEA D227Aを化学的にconjugateしたfusion proteinを作製し、in vitro υfusionproteinによってPBMCおよびLAKの7FK-1に対するキラー活性が増加するかを測定した。その結果、(1)SEA D227Aは、wild typeに比べclassII陽性細胞との親和性の着明な低下を認めた。(2)PBMCにSEA D227を添加すると、コロニーの形成が促進された。(3)SEA D227Aで前刺激するとLAKのin Vitroでのキラー活性が増強した。(4)fusion proteinによってPBMCおよびLAK細胞のIFK-1に対するキラー活性は濃度依存性に増強した。以上よりSEA D227Aは副作用が少なく、かつ有効な抗腫瘍効果をもつ免疫賦倍剤となりうる。
現場で働くプロの手描きデザイナのための対話的なセルアニメ制作支援ツール

本研究は,手描きアニメ制作を効率的に制作するためのデザイナ向け支援ツールを研究開発するものである.本研究の特色は,従来のCGにおける形状処理とは大きく異なり,デザイナが用いる経験的な技法を参考に,アニメ制作に特化したインタラクション手法を確立する点にある.具体的には,アニメ制作の工程である「モデリング」や「動きのデザイン」の効率化に加え「技法の定量化と活用法の検討」を目指す.本研究は,手描きアニメ制作を効率的に制作するためのデザイナ向け支援ツールを研究開発するものである.本研究の特色は,従来のCGにおける形状処理とは大きく異なり,デザイナが用いる経験的な技法を参考に,アニメ制作に特化したインタラクション手法を確立する点にある.具体的には,アニメ制作の工程である「モデリング」や「動きのデザイン」の効率化に加え「技法の定量化と活用法の検討」を目指す.
CGアーカイブデータを用いた任意のアクションシーンの構築手法に関する研究

本研究では,モーションキャプチャ(MoCap)を用いて俳優の生の演技を予めアーカイブしておいたアクションデータ(基本要素)を接合して,1人のCGキャラクタによる一連の剣戟アクションを構築する手法を提案した.また,1人のCGキャラクタによる一連の剣戟アクションを組み合わせて整合の取れたアクションシーンを構築する手法を提案した.さらに、構築したアクションデータを利用して,キャラクタの視点でアクションを体験することが可能な複合現実感システムの開発を行った.本研究では,モーションキャプチャ(MoCap)を用いて俳優の生の演技を予めアーカイブしておいたアクションデータ(基本要素)を接合して,1人のCGキャラクタによる一連の剣戟アクションを構築する手法を提案した.また,1人のCGキャラクタによる一連の剣戟アクションを組み合わせて整合の取れたアクションシーンを構築する手法を提案した.さらに、構築したアクションデータを利用して,キャラクタの視点でアクションを体験することが可能な複合現実感システムの開発を行った.本研究では,モーションキャプチャ(MoCap)等を用いて俳優の生の演技を予めアーカイブしておいたアクションデータを接合して,複数のCGキャラクタによる剣戟アクションシーンを自在に構築する手法を提案する.また,提案手法を用いて任意の剣戟アクションシーンを構築可能なツールの開発を行う.さらに,現実背景にCGを実時間で融合・提示する複合現実感技術を利用して,提案手法に上って構築された剣戟アクションシーンの任意の登場人物の視点でそのキャラクタの演技の稽古が可能な没入型システム(MR剣戟体験システム)を開発する.平成20年度の研究成果は以下の通りであった.1.基本要素からの一連の剣戟データ生成一体のCGキャラクタの剣戟アクションデータを,左上段の防御等の動作単位ごとにMoCap方式で収録したデータ(基本要素)を時系列的に接合することで1人のキャラクタによる一連の剣戟アクションの生成を試みた.接合フレーム間におけるキャラクタのポーズの不一致は,モーションブレンディング等の従来手法を用いて軽減した.2.アクションデータ間の位置・タイミング調整1.で生成した一連の剣戟アクションデータや1人ずつ収録した剣戟アクションデータを組み合わせ,アクションデータ間のタイミング・演技位置の整合をとることで,空間・時間的に整合のとれた複数人による複雑な剣戟シーンの構築手法を提案した.3. MR剣戟体験システムの開発本システムの体験者には,装着したMR合成表示用ヘッドマウントディスプレイを通して,実背景にCGキャラクタによる剣戟シーンが重畳された映像が提示される.この剣戟アクションに応じて,体験者が手に持った刀デバイスを使って予め決められた動きを演じることで剣戟のを実現する.体験者の演技はどれくらいお手本に沿ったものであったかを評価し,演技の習得に役立てる.本研究では,モーションキャプチャ(MoCap)等を用いて俳優の生の演技を予めアーカイブしておいたアクションデータを時系列上で接合し,それを複数対分組み合わせ調整することで,複数のCGキャラクタによる剣戟アクションシーンを自在に構築する手法を提案する.また,提案手法を用いて任意の剣戟アクションシーンを構築可能なツールの開発を行う.平成21年度の研究成果は以下の通りであった.(1)基本要素からの一連の剣戟データ生成一体のCGキャラクタの剣戟アクションデータを,左上段斬りや右下段の防御等の動作単位ごとにMoCap方式で収録したデータ(基本要素)を時系列的に接合することで1人のキャラクタによる一連の剣戟アクションの生成を試みた.接合フレーム間におけるキャラクタのポーズの不一致は,モーションブレンディング等の従来手法を用いて軽減した.(2)アクションデータ間の位置・タイミング調整(1)で生成した一連の剣戟アクションデータや1人ずつ収録した剣戟アクションデータを組み合わせ,アクションデータ間のタイミング・演技位置の整合をとることで,空間・時間的に整合のとれた複数人による複雑なアクションシーンの構築手法を提案した.(3)アクションシーン構築支援ツールの開発
卵胞退行における顆粒層細胞のアポトーシスの役割とその制御機構

哺乳類卵巣では排卵に際して発育を開始する卵胞の99%以上が選択的に死滅し、ごく一部のみが排卵にいたる。しかしこの生死を決定する分子制御機構は未だ不明な点が多い。この分子制御機構を解明する研究の一環として、顆粒層細胞にアポトーシスを誘導する分子、特に細胞表面に発現している受容体分子の同定とその制御機構を解明することを目的として本研究を進めた。実験顕微鏡下に健常と退行卵胞を識別でき、かつ卵胞を構成する細胞を容易に単離できるブタ卵胞を材料として用いた。健常卵胞の顆粒層細胞表層に存在し、退行の進行とともに消失する糖鎖の結合した膜蛋白を特異的に認識するモノクロナール抗体を作成できた。この抗体を培養顆粒層細胞の培養液中に添加することでアポトーシスを誘導できるので、この抗体が認識している膜糖蛋白はアポトーシスシグナル受容体のひとつであることが分かった。さらにこの細胞死受容体の細胞質内下流にはインターロイキンβ1転換酵素様プロテアーゼがアポトーシスシグナルの伝達に支配的に関与していることが阻害剤を用いた実験から確認された。このプロテアーゼを介して核内に伝達されたシグナルは、顆粒層細胞核内の中性Ca・Mgイオン依存性エンドヌグレアーゼのみを活性化してゲノムDNAをヌクレオソーム単位で切断することが分かった。併行して卵胞退行に伴って顆粒層細胞に特異的に発現するmRNAを検索した結果、インスリン様成長因子と血小板由来成長因子mRNAと塩基配列相同性の高いチロシンキナーゼ様蛋白をコードするmRNAが特異的に発現していることが分かった。これら顆粒層細胞アポトーシスの制御因子や細胞内シグナル伝達系をmRNA導入、抗体、阻害剤などにて人為的制御できる可能性が高まったことは当初予定していた以上の成果で、発生生物学全般にも貢献すると考える。哺乳類の卵巣における卵胞の選択的発育と死滅に、顆粒層細胞のプログラム細胞死(アポトーシス)が深く関与している。卵胞の選択機構を明らかとすべく進めている研究の一環として、ブタ卵胞を材料とし、顆粒層細胞にアポトーシスを誘導・制御する分子機構を調べている。本年度は、細胞膜表面糖鎖と蛋白の構造変化を明らかとするため、細胞膜結合糖鎖を認識し、螢光抗体法にてTUNEL陽性のアポトーシス進行中顆粒層細胞を特異的に染色できるポリクロナール抗体を作成した。この抗体とConA等の各種レクチンを用いてアポトーシスに伴う細胞膜表面糖鎖の変化を組織細胞化学的に解析した。並行して細胞膜表面糖鎖構造の変化を検出するモノクロナール抗体を作成し、これを用いてアポロ-シス細胞に特異的に発現糖鎖の検索を進めた。さらに2次元電気泳動法にてアポトーシスに伴う細胞膜蛋白組成の変化を調べ、糖鎖を糖鎖配列認識酵素にて切断後HPLC法にて構造の変化を分析した。次いで、正常と退行卵胞の顆粒層細胞からmRNAを調製し、R-PCR法にて増幅後、特異的mRNAを同定し、対応するcDNAをプローブとして完全なmRNAを釣り上げた。現在その塩基配列を決定中である。一部判明している配列のホモロジー検索から、Ca2+依存性アポトーシス誘導受容体であるFas抗原にホモロジーの高い蛋白質が発現していることが推察されたのでその検索に注力している。

この分子制御機構を解明する研究の一環として、顆粒層細胞にアポトーシスを誘導する分子、特に細胞表面に発現している受容体分子の同定とその制御機構を解明することを目的として本研究を進めた。実体顕微鏡下に健常と退行卵胞を識別でき、かつ卵胞を構成する細胞を容易に単離できるブタ卵胞を材料として用いた。健常卵胞の顆粒層細胞表層に存在し、退行の進行とともに消失する糖鎖の結合した膜蛋白を特異的に認識するモノクロナール抗体を作成できた。この抗体を培養顆粒層細胞の培養液中に添加することでアポトーシスを誘導できるので、この抗体が認識している膜糖蛋白はアポトーシスシグナル受容体のひとつであることが分かった。さらにこの細胞死受容体の細胞質内下流にはインターロイキンβ1転換酵素様プロテアーゼがアポトーシスシグナルの伝達に支配的に関与していることが阻害剤を用いた実験から確認された。このプロテアーゼを介して核内に伝達されたシグナルは、顆粒層細胞核内の中性Ca・Mgイオン依存性エンドヌクレアーゼのみを活性化してゲノムDNAをヌクレオソーム単位で切断することが分かった。併行して卵胞退行に伴って顆粒層細胞に特異的に発現するmRNAを検索した結果、インスリン様成長因子と血小板由来成長因子mRNAと塩基配列相同性の高いチロシンキナーゼ様蛋白をコードするmRNAが特異的に発現していることが分かった。これら顆粒層細胞アポトーシスの制御因子や細胞内シグナル伝達系をmRNA導入、抗体、阻害剤などにて人為的制御できる可能性が高まったことは当初予定していた以上の成果で、発生生物学全般にも貢献すると考える。
アポトーシス抑制分子XIAPの機能制御による遺伝子治療法の開発

腫瘍細胞におけるアポトーシス機構における分子相互関係の解明は,新たな治療法の開発に寄与する可能性がある.本研究は腫瘍細胞において抗アポトーシス分子として機能する可能性のあるXIAPの泌尿器科癌での発現,機能,さらに発現制御による新たな治療法の開発につなげることを目的とした.<XIAPに対するshort interference (si)RNAの作成>昨年度の研究結果からアンチセンスDNAでの発現抑制効果は,対照と比して十分でない可能性があり,より遺伝子発現抑制効果のあるsiRNAの作成を目指した.候補の遺伝子配列を3種選び,これをsiRNA発現用ベクターに組み込んだものの細胞株へのtransient transfectionにより検討した.この結果,ひとつのシークエンスが最も抑制効果があると思われた.<stable transfectantの作成>この発現ベクターを腎癌細胞株Caki-1および前立腺癌細胞株LNCapにtransfection, puromycinによる選択により,十数個のクローンを得た.現在,これらstable transfectantの各種アポトーシス刺激に対する感受性を検討中である.<腎細胞癌におけるXIAP発現とCRP, interleukin (IL)-6およびtumor necrosis factor(TNF) pathwayとの関係の検討>今回の検討の中で腎癌組織でのXIAPの発現と,患者血清中のCRPの値との間に相関が見られた.細胞株での検討では培養上清中に高濃度のIL-6,TNF-alphaを分泌し,かつXIAPを高発現する細胞株が同定された.このことはTNF-alphaの刺激伝達系を阻害することが,siRNAと併用することでXIAPのより完全な発現抑制につながる可能性があり,現在検討中である.腫瘍細胞におけるアポトーシス機構における分子相互関係の解明は,新たな治療法の開発に寄与する可能性がある.本研究は腫瘍細胞において抗アポトーシス分子として機能する可能性のあるXIAPの泌尿器科癌での発現,機能,さらに発現制御による新たな治療法の開発につなげることを目的とした.<XIAPに対するshort interference (si)RNAの作成>昨年度の研究結果からアンチセンスDNAでの発現抑制効果は,対照と比して十分でない可能性があり,より遺伝子発現抑制効果のあるsiRNAの作成を目指した.候補の遺伝子配列を3種選び,これをsiRNA発現用ベクターに組み込んだものの細胞株へのtransient transfectionにより検討した.この結果,ひとつのシークエンスが最も抑制効果があると思われた.<stable transfectantの作成>この発現ベクターを腎癌細胞株Caki-1および前立腺癌細胞株LNCapにtransfection, puromycinによる選択により,十数個のクローンを得た.現在,これらstable transfectantの各種アポトーシス刺激に対する感受性を検討中である.<腎細胞癌におけるXIAP発現とCRP, interleukin (IL)-6およびtumor necrosis factor(TNF) pathwayとの関係の検討>今回の検討の中で腎癌組織でのXIAPの発現と,患者血清中のCRPの値との間に相関が見られた.細胞株での検討では培養上清中に高濃度のIL-6,TNF-alphaを分泌し,かつXIAPを高発現する細胞株が同定された.このことはTNF-alphaの刺激伝達系を阻害することが,siRNAと併用することでXIAPのより完全な発現抑制につながる可能性があり,現在検討中である.平成14年度は主に移行上皮癌細胞についての検討を進め以下の結果を得た.1.正常移行上皮および移行上皮癌細胞におけるXIAPの発現の検討正常移行上皮での発現の検討では最表層の細胞で高発現であった.移行上皮癌細胞では手術切除標本108例中79例(73.2%)で発現を認めたものの,病理組織学的あるいは臨床的因子との有意な相関は認めなかった.2.移行上皮癌細胞におけるXIAPの発現の検討検討した4種の移行上皮癌細胞ではいずれも同程度の発現を認めた.3.アンチセンスオリゴDNAによるXIAP発現の修飾XIAP遺伝子転写開始部位から20merに対するS化オリゴヌレオチドを作成し,T24に対して,XIAP発現の抑制効果を検討した,この結果,20uMで24時間作用させた際に最も強い抑制効果が認められた(96.2%).4.XIAP遺伝子のクローニングと発現ペクターの作成293細胞からXIAP遣伝子のopen reading frameをRT-PCR法によりpTargetTTMにクローニングした.複数のクローンを単離し,シークエンシングにより配列にmisincorporationのないことを確認した.5.T24へのXIAP遺伝子導入と強制発現electroporation法にて上述の発現ペクターをT24に導入し,G418による選択を行った.この結果,15個のstable transfectantを得た.クローン番号2と8が親株と比して4?5倍のXIAP発現量をみとめた.平成15年度は尿路上皮癌細胞での研究を継続すると共に腎細胞癌での検討を進めた.A.移行上皮癌細胞での検討1.移行上皮癌細胞におけるアンチセンスオリゴDNAによるXIAP発現の抑制と,殺細胞効果の検討.T24に対してXIAP遺伝子転写開始部位から20merに対するS化オリゴヌレオチドによる,XIAP発現の抑制を行ったところ濃度依存的に生細胞数が87%まで減少した.2.XIAPに対するS化

オリゴヌレオチドとアドリアマイシンの殺細胞効果.両者を同時にT24細胞に作用させたところアポトーシスの亢進による殺細胞効果の増強を認めた.3.XIAP高発現株における検討.T24へのXIAP遺伝子導入により強制発現した細胞株では上記の条件での検討で親株に比して顕著ではないものの統計学的に有意な耐性を示した.以上より,S化オリゴヌレオチドによるXIAP発現の抑制は移行上皮癌の抗癌剤に対する耐性克服の手段となりうることが示された.B.腎細胞癌での検討.1.腎細胞癌手術切除標本における検討108例の腎細胞癌症例からの手術切除標本についてXIAPの発現につき免疫組織学的に検討した.この結果13例で陽性,20例で弱陽性,75例で陰性であった.これら症例の生存期間を調査したところ,5年生存率は陽性例で36%,弱陽性62%,陰性89%で統計学的に有意差を認めた.また,組織学的悪性度やT分類と相関し高度に発現していた.多変量解析では,組織学的悪性度やT分類とは独立した予後規定因子と考えられた.本研究は泌尿器科癌細胞でのアポトーシス機構の解明,特にアポトーシス実行タンパク分解酵素であるカスペース-3,7の抑制分子であるXIAPに着目し,この機能制御による泌尿器科癌における新たな治療法の開発に目的とするものである.今回のXIAPについての検討結果は以下のとおりである.<尿路上皮癌における検討>尿路上皮癌においては以下のことが明らかになった.1.XIAPは正常移行上皮では表層の細胞に強く発現されていた.2.尿路上皮癌108例中79例でXIAPの発現が見られたが,腫瘍の病期や組織学的悪性度とは関係は見られなかった.3.細胞株による検討では4種の細胞株(SCaBER, HT1376, T24 and RT4)すべてで発現を認めた.4.このXIAPをアンチセンスDNAで発現抑制をするとアポトーシスが誘導され,生細胞の率は87%まで低下した.またアドリアマイシンとの併用で相加効果を認めた.5.細胞株T24に対するXIAP発現ベクター導入による強制発現の結果アポトーシス刺激に抵抗性となった.以上より,尿路上皮癌ではXIAPの発現が抗がん剤等のアポトーシス刺激にたいする抵抗性を規定する分子となっていると考えられる.<腎細胞癌における検討>1.正常腎組織では近位および遠位尿細管に弱い発現が見られた.2.腎細胞癌では108例中33例に発現を認めた(20例は弱く,13例は強度に).3.これら3群での5年腫瘍特異的生存率を検討すると陰性89%,弱陽性62%,陰性36%と統計学的に有意差を認めた.以上より,腎細胞癌においてはより直接的なXIAP発現と腫瘍細胞の悪性度との関係が示唆された.<継続している研究の内容>XIAPに対するsiRNAを作成しそのXIAP発現抑制効果の検討と,各種アポトーシス刺激への感受性の変化を検討中である.
アカパンカビモデル糸状菌を用いたウイルス／宿主相互作用解析系の確立

ウイルス感染の報告例がないアカパンカビ(Neurospora crassa,子のう菌、糸状菌)で複製可能なウイルスを探索し、ウイルス/宿主相互作用解析のモデル系を確立するのが目的である。クリ胴枯病菌感染性マイコレオウイルス(MyRV1)、白紋羽病菌感染性パルティティウイルス(RnPV2)をアカパンカビの野生型、RNAサイレンシング成分(agl, dcl, rdr)各種変異株菌に導入し、ウイルス複製を確認した。それら宿主成分のウイルス感染への影響を解析中である。今後、アカパンカビの強力な遺伝学、さらには整備された各種研究ツールを利用し、宿主因子の探索を進め、さらに詳細な解析を行う予定である。本研究の目的は、ウイルス感染の報告例がないアカパンカビ(Neurospora crassa,子のう菌、糸状菌)で複製可能なウイルスを探索し、ウイルス/宿主相互作用解析のモデル系を確立することにある。アカパンカビでは利用可能な強力な遺伝学、さらには整備された各種研究ツールが利用可能である。これまでウイルス・宿主相互作用研究で着目されなかったこの系を利用し、新たな展開を図る。本課題は3つの中課題1[アカパンカビ感染性ウイルスの探索]、2[ウイルス病徴発現・複製に関与する宿主因子の同定]、3[ウイルス病徴発現・複製に関与するウイルス因子の同定]から構成させる。本年度は中課題1を継続し、中課題2の一部を実施した。具体的には以下の研究項目を遂行した。クリ胴枯病菌感染性マイコレオウイルス粒子(Suzuki et al., JGV, 2004; Hillman et al., JGV, 2004))をアカパンカビに導入した。その結果、野生型アカパンカビで安定して複製することを確認した。本課題の大きな成果となった。さらに、現在、白紋羽病菌感染性パルティティウイルス2粒子(Chiba et al., JVI, 2013)をアカパンカビに導入中である。さらに、Fungal Genetics Stock Centerから12のRNAサイレンシング変異株を取り寄せ、菌糸融合による水平伝搬でそれらにマイコレオウイルスの導入を試みている。本年度は中課題1を実施した。1クリ胴枯病菌感染性ハイポウイルスcDNA(Suzuki et al., JVI, 1999)をアカパンカビに導入した。2 Saccharomyces cerevisiae感染性ナーナウイルスcDNA(Esteban and Fujimura, PNAS, 2003)をアカパンカビに導入した。3クリ胴枯病菌感染性マイコレオウイルス粒子(Suzuki et al., JGV, 2004; Hillman et al., JGV, 2004))をアカパンカビに導入した。4白紋羽病菌感染性メガビルナウイルス粒子(Chiba et al., JVI, 2009)をアカパンカビに導入した。5 1-4の形質転換体あるいはトランスフェクタントからウイルスRNA(複製中間型dsRNAあるいはmRNA)を抽出し、感染の有無を確かめた。しかし、すべて陰性であった。本年度は中課題1-3を同時実施した。下記のように、世界初のカパンンカビで複製可能なウイルスの発見に至る成果につながった。

1クリ胴枯病菌感染性マイコレオウイルス(MyRV1)粒子(Suzuki et al., JGV, 2004; Hillman et al., JGV, 2004))をアカパンカビに導入し、ウイルス複製を確認した。2白紋羽病菌感染性パルティティウイルス(RnPV2)粒子(Chiba et al., JVI, 2013)をアカパンカビに導入し、ウイルス複製を確認した。3 1, 2で得られた感染株をRNAサイレンシング成分各種変異株と融合させ、それら宿主成分のウイルス感染への影響を解析中である。4 MyRV1変異株、RnPV2変異株をトランスフェクションにかけ、ウイルス複製を解析中。ウイルス学世界で初めて、アカパンカビで複製可能なウイルスの発見に至った。前年度の遅れを大きく取り戻すことができた。実験は予定通り遂行したが、感染性のウイルスが現在まで見つからなかった。現在のところ、いろんな原因が考えられる。例えば、使用したウイルスそのものがアカパンカビで複製能を持たない。あるいは、一部の導入アカパンカビで複製するが、多数の他の細胞には感染していない。2目はの要因はアカパンカビの増殖速度とも関連するかもしれない。従って、下の述べるような対策を講じて問題解決を図る。A [ウイルス病徴発現・複製に関与する宿主因子の同定]6感染が確認されたウイルスを1遺伝子欠失アカパンカビ変異株(他の植物/動物でウイルスに対する防御反応として認められているRNAi経路変異株)に菌糸融合により感染させる。宿主遺伝子の変異が病徴発現に及ぼす影響を野生型菌株のそれと比較することで明らかにする。宿主遺伝子の変異がウイルス増殖(RNA転写、複製)に及ぼす影響を精査する。B [ウイルス病徴発現・複製に関与するウイルス因子の同定]7マイコレオウイルス再編成株を上記宿主変異株に感染させ、野生型ウイルスとの挙動の比較解析する。さらに、ウイルスの各遺伝子を高発現させ、あるいはRNAサイレンシングにより発現抑制することによりウイルス病徴発現、複製への影響を調べる。まず、考えられるありとあらゆる手法及びウイルスを使って、アカパンカビへのウイルス導入を図る。当研究室で新規パルティティウイルスの新たなトランスフェクションあるいはプロトフージョンによる新たなウイルス導入法をクリ胴枯病菌で開発した(Chiba et al., 2013)。さらに、これまで粒子感染性がないと言われてきたトティウイルスについてもクリ胴枯病菌へのトランスフェクションに成功した。本手法・ウイルスをアカパンカビでも試みる。その上で、予定の中課題を進める。中課題2では、感染性ウイルスをアカパンカビ変異株に菌糸融合により感染させ、ウイルス複製、病徴発現を詳細に比較・解析し宿主因子の網羅的解析を進める。中課題3では、ウイルス逆遺伝学、ウイルス遺伝子再編成株の利用あるいはウイルス遺伝子の高発現、ノックダウンにより病徴発現・複製に関与するウイルス因子を同定する。前年度同様に、培地大口購入等により物品費の購入を抑制することができたため。アカパンカビで複製するウイルスが見つかったことで、来年度は実験量が大幅に増える。それに伴い、物品費が嵩むことが予想される。
食用ぎくの呈味成分に関する特徴解析

本研究では、食用ぎく花弁の呈味成分に関する特徴解析を試みるために、食用ぎくについて、味覚センサーによる味質、一般成分およびポリフェノール成分ほかから検討した。その結果、味質の酸味・塩味項目は、ヒトにほとんど影響を及ぼさないレベルであること、果糖、ブドウ糖、ショ糖構成比率が試料で類似していることからこれらの総量と甘味項目に強い関連を有することが推察された。また、苦味雑味、渋味刺激で強い値を示す黄色花弁の食用ぎくは、赤紫色・薄紫色系の花弁に比べて、苦味、渋味関連成分であるポリフェノール量をより多く含むことがわかった。現在、各地で地域伝統食品を見直す動きがあるほか、日本の食に対する世界の関心が寄せられるにつれて、それらを支える伝統食材に期待が寄せられている。秋冷の頃に香りや彩りを楽しめる新潟、山形をはじめとする東北地方で多く食される菊の花びら(以下、食用ぎく)」についても興味をもたれている伝統食材のひとつである。食用ぎくは、全国で60品種ほど栽培されているが、分類学的には観賞用と同じキクに分類される。食用として利用されている食用ぎくの多くは、苦味が少なく、花びらが大きくなるように品種改良されたものである。食用ぎくのおいしさは、しゃきしゃきとした歯ごたえと、ほのかな香り、そして甘さとほろ苦さにあると称されている。しかしながら、多くの場合地域伝統食材は、その食材に強い関心が寄せられていても、限られた地域で栽培・生産され、収穫時期も限定されているなど風物詩として利用される場合が多く、食味の特徴に基づいた客観的な品質評価される機会に恵まれなかったと判断できる。食用ぎくについてもその呈味特徴その構成に寄与する成分につても不明な点が多い。そこで、本研究では、食用ぎくの甘さとほろ苦さに着目して、食用ぎく呈味成分について成分分析を行なうと同時に味覚センサー装置を用いて客観的な食用ぎくの味の特徴について検討を試みることとした。その結果、食用ぎくの甘さとほろ苦さ、すなわち苦味渋み関連成分に関連する化学成分としてあげられるポリフェノール総量、ポリフェノール類のクロロゲン酸類、ルテオリン類、アピゲニン類について成分の有無、含有量について測定を実施し、得られた結果から分類を花弁の色の違いから試みることができた。呈味について味覚センサー装置を用いて測定した結果、花弁の形状・色に関わらず共通の味項目を明らかにすることができた。ひきつづき食用ぎくの呈味成分の特徴について、新潟市の特産品である赤紫花弁のかきのもと、黄色花弁の唐松系の食用ぎくおよび特徴ある花弁に分けて検討を進めた。農産物は一般的に品種、農地、気候などの影響を受けて栄養成分の変動が認められるので用いた食用ぎくについて五訂増補日本食品成分表分析マニュアルに基づいて一般成分(エネルギー、水分、たんぱく質、脂質、灰分、炭水化物、エネルギー、ナトリウム)分析をおこなった。加えて、食用ギクにおける苦味・渋味・甘味・旨味関連物質の検討を展開する目的で各平成26年度と同様の方法で得られた食用ぎく抽出液について各種アミノ酸成分の有無・傾向を調べた。また、苦味渋味を示し、機能性成分といわれる食用ぎくに含まれるポリフェノール成分についてどのような特性・機能性を有するのか探索するために、抗酸化活性について調べた。呈味の評価のみにとどまらずその有する機能性を明らかにすることは食用ぎく食品・食品素材としての有用性を高めると判断した。さらに、キクは古くから生薬として利用されておりその利用部位は限定されていない。一方、菊葉は熱を加えても緑色の鮮やかさが失われにくいため、敷き葉、料理のあしらいとして利用するほか、天ぷらの食材として広く利用されている。現在、流通している菊葉規格とされているものもあることから、流通している菊葉も加えて、菊葉に含まれるポリフェノール総量、ポリフェノール類のクロロゲン酸類、ルテオリン類、アピゲニン類について成分の有無、含有量についても測定した。以上の結果から、食用ぎくの一般成分、呈味成分および機能性を検討することで、食品・食品素材としての有用性について探究した基本的に計画していた実験を実施することできた。しかしながら、同品種であっても採取時期、採取場所によって試料品質の変動幅が大きいこと、さらに天候不順に伴う入手不可の試料も生じたため詳細な解析は困難を有した。そのため、昨年にひきつづき、新潟市の特産品である赤紫花弁のかきのもと、黄色花弁の唐松系の食用ぎくおよび特徴ある花弁に分けて各種食用ぎく呈味成分の特徴、有する機能性について検討を実施した。来年度においても、花弁の色の違いに視点を置いて、食用ぎくの呈味成分に関する検討を進める。キクは中国や日本などに分布する多年草で、古くより栽培されており身近な植物のひとつである。キクは解熱、解毒、消炎作用が認められており観賞のほかに薬用植物としても利用されている。地方・伝統野菜である食用ぎくは、含まれる特異成分の値、その食品特性については不明な点が多い。そこで、食用ぎくの呈味成分に関する特徴について検討を試みた。すなわち、新潟県在来系統品種の食用ぎくについて、味覚センサーによる味質および、花弁に含まれる呈味関連成分(たんぱく質、脂質、灰分、炭水化物、ナトリウム、ポリフェノール類ほか)ついて調べた。その結果、味覚センサーによる味質評価は、果糖、ブドウ糖、ショ糖構成比率が花弁試料で類似していることから、これらの総量と甘味評価に強い関連を有することが明らかとなった。

また、苦味雑味、渋味刺激で強い値を示す黄色花弁の食用ぎくは、赤紫色・薄紫色系の花弁に比べて、苦味、渋味関連成分であるポリフェノール量をより多く含むことがわかった。分類の指標として花弁の色の違いは有用と考える。なお、味覚センサーの評価結果から、食用ぎく花弁の酸味・塩味項目は、ヒトにほとんど影響を及ぼさないレベルであることがわかった。さらに、食用ぎく花弁のポリフェノール成分が、どのような特性・機能性を有しているのか探索した。抗酸化性は、総ポリフェノール量との間に強い相関を示すことが認められた。また、野菜の中で比較的ポリフェノール量が多いと報告される「しゅんぎく」の値よりも明らかに多く含むこと、ルテオリン7-O -(6"-O -マロニル)-グルコシド,アピゲニン7-O -(6"-O -マロニル)-グルコシドを含むことがわかった。広く利用されている菊葉の部位における特異成分、食品特性に関するデータがほとんどみあたらないことから、花弁部位にくわえて詳細な検討が必要であると考える。本研究では、食用ぎく花弁の呈味成分に関する特徴解析を試みるために、食用ぎくについて、味覚センサーによる味質、一般成分およびポリフェノール成分ほかから検討した。その結果、味質の酸味・塩味項目は、ヒトにほとんど影響を及ぼさないレベルであること、果糖、ブドウ糖、ショ糖構成比率が試料で類似していることからこれらの総量と甘味項目に強い関連を有することが推察された。基本的に計画していた実験を実施することできた。しかしながら、同品種であっても採取時期、採取場所によって試料の変動幅が大きいため、詳細な解析は困難であった。そのため、新潟市の特産品である赤紫花弁のかきのもと、黄色花弁の唐松系の食用ぎくおよび特徴ある花弁に分けて各種ポリフェノール成分の有無をもって、各種食用ぎくの特徴について検討を実施した。今後、花弁の色の違いに視点を置いて食用ぎくの呈味成分に関する検討を展開する。ひきつづき食用ぎくの呈味成分の特徴について、新潟市の特産品である赤紫花弁のかきのもと、黄色花弁の唐松系の食用ぎくおよび特徴ある花弁に分けて検討を進める。農産物は一般的に品種、農地、気候などの影響を受けて栄養成分の変動が認められる。実験に使用している食用ぎくは路地栽培を基本としているため、試料特性の変動幅が大きく、詳細な解析は困難な状況にあるが、各種アミノ酸成分の分析結果から、苦味・渋味・甘味・旨味関連物質が確認されていることから、来年度もこれらの成分を中心に検討を進めていく。さらに、規格ごとに菊葉が流通しているものの菊葉に含まれる食品成分、その特性については現在、それらの一般成分についても明らかにされていないことから菊葉についても検討を深めていく。複合領域、生活科学・食生活学ひきつづき食用ぎくの呈味成分の特徴について、新潟市の特産品である赤紫花弁のかきのもと、黄色花弁の唐松系の食用ぎくおよび特徴ある花弁に分けて検討を進める。
インドネシアにおける殺虫性タンパク質(ICP)産生菌の分離と遺伝子解析

殺虫性タンパク質(ICP)を産生するBacillus thuringiensis(BT)は、ICPの特異的な殺虫活性により広く微生物農薬として利用されており、近年多くの新しい性質を有しているBT菌株が数多く世界各国の土壌より分離されている。本研究では、従来のBTの生態を考慮し、土壌温度が好適で、湿度が保たれ、さらに昆虫種のバラエテイに富んでいる熱帯雨林の土壌をターゲットとしてインドネシア・ジャワ島各地の土壌からBTの分離を試みた。共同研究者である、ボゴール農科大学のDr.Bibianaによれば、インドネシアの土壌からは日本、アメリカならびにヨーロッパ各地の土壌より高頻度でBTが分離されることが報告されており、昨年度の調査による多くのBT分離株を得た。今年度は、昨年度の調査において多くのBT分離株が得られたような地点(大きな樹木が有る場所)と、よくBTが分離されることが報告されている桑園の土壌ならびに桑葉・蚕の糞からBTの分離を試みた。その結果、インドネシアジャワ島において約50地点の土壌・蚕室の残さ等をサンプリングし、30株以上のBT菌株を得た。これらの菌株については、H-serotypeによる同定を行った。その結果,亜種thuringiensis,alesti,sumiyoshiensis,sotto,darmstadiensis,aizawai等、さらに同定できないような新しいBT菌株も存在していた。現在引き続き分離ならびに分離株のcry遺伝子の同定、鱗翅目昆虫(カイコ、コナガ、ハスモンヨトウ)ならびに鞘翅目昆虫(ウリハムシ、ニジュウヤホシテントウ)に対する殺虫活性検定を行っている。昨年の共同研究ですでに、60株程度の分離菌株を得、それらの菌株についてはH-serotypeによる同定ならびに独自に開発したPCR法を用いたcry遺伝子同定法によりcryI・cryII・cryIII・cryIV・cryV遺伝子について調査を行った。これらの昨年の研究で得られたBT菌株の殺虫活性について、カイコ・コナガ・ハスモンヨトウ・ウリハムシ・ニジュウヤホシテントウについての殺虫活性検定を行った。その結果、コナガならびにハスモンヨトウに対して強い殺虫活性を示す菌株が数株得られた。これらの菌株は、H-serotypeによる同定により亜種kurstakiに分類された。しかしながら、kurstakiに同定される菌株では従来ハスモンヨトウに対する殺虫活性は報告されておらず、今までにない新しいBT菌株であることが明らかとなった。それらの菌株の内、INA02菌株についてはハスモンヨトウに対して殺虫活性を示すcryVに分類される遺伝子のクローニングならびに遺伝子構造解析を行った。亜種sottoに同定された菌株の中に、これまでに報告のない双翅目昆虫(ヤマトヤブカ)殺虫活性を示すような新しいタイプの株が存在していた。この菌株(SKW株)の羽翅目昆虫に対する殺虫活性を示すICP遺伝子の同定を試みた。その結果、この菌株はcryIIに分類される遺伝子が同定された。このcryII遺伝子についてはクローニングならびに遺伝子構造解析を行った結果、cryIIA遺伝子に類似した遺伝子であった。この遺伝子については、今後このSKW株のcryII遺伝子の持つ活性について本来のcryII遺伝子との殺虫活性判定との比較を鱗翅目ならびに鞘翅目昆虫に対して詳細に調査するつもりである。また、亜種tenebrionisに同定されたINA67菌株は、鞘翅目昆虫(ニジュウヤホシテントウ)に対する殺虫活性を有する分離株で、従来、鞘翅目昆虫に対して活性が報告されているcryIII・V両遺伝子は同定されず、現在この株のcryI遺伝子のクローニングならびに構造解析によりcryIBならびにcryIE遺伝子の存在が確認され、これらの遺伝子の殺虫活性について今後さらに検討する必要があると考えられた。このようにインドネシアの土壌からはまだ数多くの未知なるBT菌株の分離されることが予想され更なる詳細な調査を行う。