hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医療的ケアを必要とする重症心身障害児の教育支援のための方略開発-教育現場における子どもを中心とした連携モデルの作成-

本研究は、北海道の肢体不自由養護学校に通う重症心身障害児(以下、重症児)が必要としている医療的ケアとヘルスケアの現状および問題を明らかにすること、重症児が必要としている医療的ケアとヘルスケアに取り組む養護教諭と看護職の役割を明らかにすること、子どもを中心とした教育支援の方略を検討すること目的とし、調査を行った。平成13年度、肢体不自由養護学校の教職員と寄宿舎指導員に対しアンケート調査を実施し、その後、面接調査も実施した。平成14年度、肢体不自由養護学校に通う子どもの保護者に対し面接調査を実施した。平成15年度、肢体不自由養護学校の養護教諭に対し面接調査を実施した。これらの調査から、北海道の肢体不自由養護学校には様々な障害や疾患で健康問題をもつ子どもが通学しており、教職員は子どもの健康を維持するよう観察、判断を行いながら、子どもに合わせた教育活動を行っているのが現状であった。また、障害や病気などの医療に関する専門的な知識は、自己学習や研修などの個人的努力により得ているが、医療の専門職でないことが判断の迷いに影響すること、保護者や医療機関との連携に不安を抱いているという問題が確認できた。養護教諭は在籍する子どもの障害や病気など個々の健康問題を把握し、健常児とは異なる健康に関する援助を行うという状況の中で学校保健を担っていた。今後は医療的ケアを順調に推進させるために学校の中心的役割を果たす存在である事が示唆された。子どもを中心とした教育支援として、医療的ケアをすすめていくための視点から、体制の整備と充実は勿論であるが、教職員が実践につなげるための具体的な研修の強化、医療の専門職から適時、助言や指導が得られる連携システムの確立、子どもに合わせた医療的ケアの手技や方法に関する個々のマニュアルの作成、医療に関するアドバイザーとしての看護職者の役割の明確化が示唆された。本研究の目的は重症心身障害児(以下、重症児)が通う養護学校において、重症児が必要としている医療的ケアとヘルスケアの現状、及び問題を明らかにすること、車症児が多く必要としている医療的ケアとヘルスケアに取り組む養護教諭、及び看護職の役割を明らかにすること、さらに教育現場おける重症児中心の養護(教育)と看護のモデルを作成し実践を試みることである。平成13年度は、重症児が必要としている医療的ケアとヘルスケアの現状、及び問題を明らかにすることを中心に以下の内容を実施した。1.質問紙調査北海道内の肢体不自由養護学校8校で、質問紙調査を実施した。質問紙の内容は、先行研究を参考に作成した養護学校児童・生徒の健康管理に関するもので、形式は自記式質問紙とした。対象者は教職員・寄宿舎指導員で、合計362人から回答が得られた。現在、結果に関する統計学的分析、及び内容分析を進めており、得られた結果は各養護学校に報告する予定である。2.聞き取り調査質問紙調査の回答者の中から、聞き取り調査の協力が得られた教職員57人に対し、現在、聞き取り調査を実施中である。先行研究と質問紙調査を参考に作成した面接ガイドに沿って、養護学校児童・生徒の健康管理に関する内容について半構成的面接を実施している。聞き取り調査による結果は質的帰納的分析を行い、得られた結果は各養護学校に報告する予定である。平成14年度は、データ収集の整理・分析を行うと共に、重症児を持つ家族が、児の医療的ケアとヘルスケアの現状をどのように捉えているかについて調査する予定である。

本研究の目的は重症心身障害児(以下・重症児)が通う養護学校において、重症児が必要としている医療的ケアとヘルスケアの現状、及び問題を明らかにすること、重症児が多く必要としている医療的ケアとヘルスケアに取り組む養護教諭、及び看護職の役割を明らかにすること、さらに教育現場における重症児中心の養護(教育)と看護のモデルを作成し実践を試みることである。平成14年度は、以下の内容を実施した。1.質問紙調査前年度(平成13年度)に実施した結果の分析を継続して行った。結果から、教職員・寄宿舎指導員は児童・生徒の健康状態を総合的に把握し個別性を重視した対応が望まれること、保護者や他職種との連携や医療的ケアに関し検討が必要なことが明らかとなった。教職員・寄宿舎指導員の児童・生徒の健康状態の把渥方法、健康管理上の工夫・配慮についてまとめた結果の一部は、平成14年11月第49回小児保健学会で発表、また本調査の結果は平成15年1月に協力校8校に報告した。2.聞き取り調査質問紙調査の回答者のうち協力が得られた教職員・寄宿舎指導員41名に対し、重症児への健康管理とヘルスケアの具体的内容について聞き取り調査を実施した。また、札幌市近郊在住で肢体不自由養護学校に通う重症児の保護者5名に対しても健康管理とヘルスケアの具体的内容について聞き取り調査を実施した。今後、得られたデータの分析をすすめると共に、保護者の聞き取り調査の追加をする予定である。結果は、協力していただいた教職員・寄宿舎指導員および保護者に報告予定である。本研究の目的は、重症心身障害児(以下、重症児)が通う養護学校において、重症児が必要としている医療的ケアとヘルスケアの現状、及び問題を明らかにすること、重症児の多くが必要としている医療的ケアとヘルスケアに取り組む養護教諭、及び看護職の役割を明らかにすること、さらに教育現場における重症児中心の養護(教育)と看護の連携モデルを試案することである。平成15年度は、これまでの調査結果(肢体不自由養護学校に勤務する教職員・寄宿舎指導員へのアンケート調査、及び聞き取り調査・肢体不自由養護学校に通う子どもを持つ家族への聞き取り調査)を踏まえ、養護学校において医療的ケアとヘルスケアの中心的役割を果たしている養護教諭に対し調査を行った。北海道内の肢体不自由養護学校8校に勤務する養護教諭11名に聞き取り調査を実施し、回答を得た。結果から肢体不自由養護学校の養護教諭が行っている、子どもの健康状態のアセスメント方法やケアの提供、養護教諭の役割についての示唆が得られた。全調査により北海道の肢体不自由養護学校の教育現場における現状と問題が明らかとなった。そこで、重症児がより良い状態で教育を受けるためにどのような連携が必要であるかを、今後の課題を含め提言した。また、これまでに実施した教職員・寄宿舎指導員の調査結果についてまとめたものを、第12回日本小児看護学会(平成15年7月)、第50回日本学校保健学会(平成15年11月)、第50回日本小児保健学会(平成15年11月)で発表した。
鉄筋コンクリート一般化構成則

温度環境制御装置およびサーボ型アクチュエータの制御システムを開発し,これを用いて各種の実験を行い,以下に示すコンクリートおよび鉄筋コンクリートの一般化された構成則を構築した.1.無筋コンクリートの構成則(1)一軸引張応力下における破壊基準を載荷時間と環境温度の関数で記述することができた.(2)一軸圧縮応力下における構成方程式を載荷時間と応力経路の関数として統一して記述することに成功した.(3)多軸応力下における構成方程式を要素の弾塑性破壊の概念によって統一的に記述できた.2.鉄筋コンクリートの構成則(1)鉄筋とコンクリートとの付着に関して,付着応力と相対変位の関係にひずみ量の影響を入れた構成方程式う導いた.この構成方程式は,コンクリート強度,鉄筋径の如何にかかわらず,片引き試験・両引き試験・長埋込み定着試験など各種試験に広く適用可能な一般的な構成則である.(2)ひびわれた鉄筋コンクリート板要素が交番繰返し載荷を受ける場合の構成則を,コンクリートの引張剛性・ひびわれ平行方向のコンクリート圧縮剛性・ひびわれ面できせん断伝達に関する昨年度の研究成果に基づいて作成した.この構成則は既発表の板要素についての実験結果のすべてを正しく評価できる.(3)(1)と(2)とを組合わせて,鉄筋コンクリート壁の解析を行う有限要素プログラムを開発し,我々の一般化構成則の適応を評価した結果,極めて満足すべきものであった.温度環境制御装置およびサーボ型アクチュエータの制御システムを開発し,これを用いて各種の実験を行い,以下に示すコンクリートおよび鉄筋コンクリートの一般化された構成則を構築した.1.無筋コンクリートの構成則(1)一軸引張応力下における破壊基準を載荷時間と環境温度の関数で記述することができた.(2)一軸圧縮応力下における構成方程式を載荷時間と応力経路の関数として統一して記述することに成功した.(3)多軸応力下における構成方程式を要素の弾塑性破壊の概念によって統一的に記述できた.2.鉄筋コンクリートの構成則(1)鉄筋とコンクリートとの付着に関して,付着応力と相対変位の関係にひずみ量の影響を入れた構成方程式う導いた.この構成方程式は,コンクリート強度,鉄筋径の如何にかかわらず,片引き試験・両引き試験・長埋込み定着試験など各種試験に広く適用可能な一般的な構成則である.(2)ひびわれた鉄筋コンクリート板要素が交番繰返し載荷を受ける場合の構成則を,コンクリートの引張剛性・ひびわれ平行方向のコンクリート圧縮剛性・ひびわれ面できせん断伝達に関する昨年度の研究成果に基づいて作成した.この構成則は既発表の板要素についての実験結果のすべてを正しく評価できる.(3)(1)と(2)とを組合わせて,鉄筋コンクリート壁の解析を行う有限要素プログラムを開発し,我々の一般化構成則の適応を評価した結果,極めて満足すべきものであった.温度環境制御装置およびサーボ型アクチュエータの制御システムを開発し、以下を示すコンクリートおよび鉄筋コンクリート構成則構築に必須の情報を得るとともに、構造解析に使用できる構成方程式の提案を行った。〔無筋コンクリートの構成方程式〕(1)高温環境にある若材令コンクリートの1軸引張実験を行い、引張強度の載荷速度依存性を明らかにした。(2)繰り返し応力を受けるコンクリートの変形挙動は、可逆変形を代表する弾性剛性のみが繰り返しの影響を受けるとして統一的に記述できることが判明した。この事実に基づき、繰り返し履歴を考慮した弾塑性破壊構成式の導出を行い、実験結果を精度良く予測することが可能となった。〔鉄筋コンクリートの構成式〕(1)繰り返し応力下におけるコンクリートの引張剛性を、初めて実験的に明らかにするとともに、繰り返し構成モデルの提案を行った。(2)ひびわれ間のコンクリートの挙動を、ひびわれ直交方向の平均ひずみで記述する構成式を見出し、弾塑性破壊則に則って統一的に記述した。(3)繰り返し応力下におけるコンクリートひびわれ面での応力伝達構成式を、新たに導入した接触面密度の概念で統一的に記述することに成功した。(4)以上のミクロレベル構成式を組み合せた鉄筋コンクリートのマクロレベル構成方程式を導出し、個々のミクロレベル構成式が果たす役割について総合的に把握することができた。以上の成果の一部は、本年8月、オランダで開催される鉄筋コンクリートの有限要素解析に関するシンポジウムにおいて、基調報告として発表される予定である。
離職家族の変容と生活ネットワークの実証的研究

本研究は、1960年代に展開された石炭産業のスクラップ化、すなわち「エネルギー革命」政策の推進によって大量に発生した炭鉱失業者のキャリアを追跡調査し、失業・離職が労働者とその家族にどのような影響を及ぼすかを実証的に明らかにすることを課題とする。調査手法は、量的観察と事例分析(生活史)を併用して用いた。また、離職の地域移動を軸に、広域移動グループと非移動グループの2つに分けて調査を実施した。非移動グループの特性を考察するために、旧産炭地域の変容過程を明らかにした。地域の基幹産業である石炭産業の崩壊により、地域社会は経済機能の大部分を喪失した。以来30年以上の年月が経過したが、その傷痕は未だに癒えずに残っている。産業構造の変動が地域社会と人々に与えた影響の重大さを認識すべきであろう。離職者の生活に関して触れれば、移動グループの生活は、移動直後の経済的困難を克服し比較的安定した退職・年金生活に移行したと言えよう、そのことは収入、住居の面から読み取れる。それに対して、非移動グループの生活は、失業時の条件(中高年、家族構造)もあり経済的には不安定を余儀なくされて今日に至っているといわざるをえない。しかし、日常の人的な繋がり、人間関係の側面から両者を比べれば、移動グループは、30年を経過しても表層的な人間関係を形成するに留まり、孤立・孤独な生活を余儀なくされている。それに対して、非移動グループのそれは、相互援助のネットワークが旧炭住社会と同質のものが維持されている。本研究は、1960年代に展開された石炭産業のスクラップ化、すなわち「エネルギー革命」の推進によって大量に発生した失業・離職者家族を対象に、その家族の生活歴と生活ネットワークの変遷過程を実証的に明らかにするとともに、旧産炭地の諸問題を総合的に分析する課題を有する。本年は、本研究開始の初年度であり、平成10年の7月に研究スタッフ(研究分担者3名と研究協力者2名)による研究会を行ない、従来の研究成果と到達点を踏まえて、今後の調査・研究方法の確認を行なった。また、高橋(研究代表)が「ライフスタイルと生活史」、高川(研究協力者・元炭鉱会社就職斡旋課長)が「自分史」のテーマで研究報告を行なった。具体的な調査対象者へのインタービューとは、関東・大阪への広域移動層は高橋、吉田が行ない。旧産炭地域滞留層へは、若林、山本が実施した。旧産炭地域の動向を共通理解するために研究スタッフ全員での行政、企業等へのヒヤリング、資料収集は平成11年3月に実施した。本年度の調査データは、現在整理の段階であるが、それと並行して行なった文献研究をまとめたものとして、「生活史研究試論」と題して高橋が発表した。この論文は、生活史調査に新たな視点の導入を提示するものである。特に、1960年代の経済成長期と1970年代以降の消費生活の質的な転換を明確化し、80年代、90年代と「生活」の時代区分の必要性を論じた。本研究は、「エネルギー革命」によって失業・離職を余儀なくされた元炭鉱労働者とその家族の生活歴を調査し、生活の変容過程を総合的に明らかにするとともに、旧産炭地域の諸間題を総合的に捉えようとするものである。本年の調査研究は、次の3点に整理することがてきる。1)筑豊・旧炭鉱労働者への面接調査実施(平成11年10月)2)旧炭鉱労働者・家族へのアンケート調査(郵送法平成12年2月実施)3)旧産炭地域の現状調査(平成12年3月実施)調査対象の離職者が、閉山からほぼ35年の年月を経た今日、ほぼ全体の80%の人々は広域移動(移動グループ)を経験し、残りの20%の人々は旧炭鉱地域、その周辺都市にて居住(非移動グループ)している。

この両者を生活の安定度、生活満足度、生活ネットワークの構築などの諸側面で比較する作業を現在行なっている。また、1985年、1988年にも同じ対象者へのアンケート調査を実施しているので、そのデータを再度分析し、経年変化を加える分析作業も並行して進めている。なお、旧産炭地の現状については、若林氏が「旧産炭地の地域変動と地域振興」(高知大学教育学部研究報告第2部第60号)のタイトルで発表をおこなった。本研究は、1960年代に展開された石炭産業のスクラップ化、すなわち「エネルギー革命」政策の推進によって大量に発生した炭鉱失業者のキャリアを追跡調査し、失業・離職が労働者とその家族にどのような影響を及ぼすかを実証的に明らかにすることを課題とする。調査手法は、量的観察と事例分析(生活史)を併用して用いた。また、離職の地域移動を軸に、広域移動グループと非移動グループの2つに分けて調査を実施した。非移動グループの特性を考察するために、旧産炭地域の変容過程を明らかにした。地域の基幹産業である石炭産業の崩壊により、地域社会は経済機能の大部分を喪失した。以来30年以上の年月が経過したが、その傷痕は未だに癒えずに残っている。産業構造の変動が地域社会と人々に与えた影響の重大さを認識すべきであろう。離職者の生活に関して触れれば、移動グループの生活は、移動直後の経済的困難を克服し比較的安定した退職・年金生活に移行したと言えよう、そのことは収入、住居の面から読み取れる。それに対して、非移動グループの生活は、失業時の条件(中高年、家族構造)もあり経済的には不安定を余儀なくされて今日に至っているといわざるをえない。しかし、日常の人的な繋がり、人間関係の側面から両者を比べれば、移動グループは、30年を経過しても表層的な人間関係を形成するに留まり、孤立・孤独な生活を余儀なくされている。それに対して、非移動グループのそれは、相互援助のネットワークが旧炭住社会と同質のものが維持されている。
好中球と細胞外マトリックスとの相互作用による角膜実質細胞の活性化の検討

本年度は,昨年度の研究結果を基に,I型コラーゲンゲルとの相互作用により好中球より放出され,角膜実質細胞を活性化させる因子の検索を行った。1)好中球の培養上清に,副腎皮質ステロイドおよび漢方薬の抽出物であるトリプトライドを添加して培養し,角膜実質細胞のコラーゲン分解活性を測定した。またRNAを抽出し,real-time PCR法を用いてMMP mRNAの発現を検討した。ステロイド剤およびトリプトライドはいずれも濃度依存的に,好中球培養上清によって促進された角膜実質細胞によるコラーゲンゲル分解を抑制した。またこれらの薬剤は角膜実質細胞のMMP mRNAの発現を抑制した。3)好中球を健常人の末梢血より分離し,単層培養あるいはコラーゲンゲル内において一定時間培養し,培養上清を回収し,Multi-Plexサスペンションアレイシステムで17種類のサイトカイン濃度を測定した。I型コラーゲンゲル内で培養した好中球では単層培養した好中球に比し,TNF-αやIL-1βなどの炎症性サイトカインの産生の促進が認められた。またIL-8などの種々のケモカインの産生促進も認められた。好中球によるIL-8の産生はゲル内のコラーゲンの濃度依存的に促進された。これらの結果より,好中球はコラーゲンゲルで培養すると活性化され,種々のサイトカインやケモカインを放出し,これらの因子が角膜実質細胞に作用してコラーゲンゲル分解を促進することが明らかとなった。またこれらの相互作用によるコラーゲンゲル分解は,ステロイド剤やトリプトライドなどの薬剤によって制御可能であることが明らかとなった。好中球とI型コラーゲンとの相互作用による,角膜実質細胞のコラーゲン分解に与える影響の検討家兎より分離した好中球を単層培養あるいは種々の濃度のI型コラーゲンで作成した3次元ゲル内において48時間培養した。培養上清を回収し,家兎角膜実質細胞を含んだI型コラーゲンゲルに重層し,さらに48時間培養し,培養上清を限外濾過して得られた低分子コラーゲン断片を加水分解し,得られるハイドロキシプロリン量を測定し,コラーゲン分解量を定量した。その結果,好中球を培養したI型コラーゲンの濃度依存的に角膜実質細胞によるコラーゲン分解が促進した。また,角膜実質細胞を含まないコラーゲンゲルに好中球の培養上清を添加しても,コラーゲン分解は促進しなかった。培養上清中に含まれるMMP蛋白をwestern blot法で検討したところ,好中球培養上清自身にはMMP-1およびMMP-3の両者とも検出できなかった。一方,角膜実質細胞は少量のMMPを産生したが,好中球培養上清を添加することよりMMP-1およびMMP3蛋白の産生が促進した。この作用は,好中球を単層培養に比しコラーゲンゲルで培養した上清の方が,より強い促進作用を示した。さらに,角膜実質細胞におけるMMP mRNAの発現をreal-time PCRで検討したが,単層培養に比し,コラーゲンゲルで培養した好中球の上清は,角膜実質細胞に作用し,MMP mRNAの発現をより強く促進させた。これらの結果より,好中球の培養上清自身は,コラーゲン分解活性やMMPなどを含んでいないが,effectorである角膜実質細胞に作用して,MMPの産生を亢進させる事を介して,コラーゲン分解を促進させるmodulatorとしての役割があることが明らかとなった。また,この促進作用は,好中球をコラーゲンでprimingするとより増強する事が明らかとなった。
不活動由来の痛みの末梢機構解明と理学療法学的介入方法の可能性を探る

研究代表者らはこれまでに4週間のギプス固定によるラット足関節不動モデルにおいて、不動12週から痛覚閾値が低下し、これは不動期間に準拠して顕著になることを明らかにしており、痛みの発生メカニズムの一部に皮膚の組織学的変化が関与すると推察している。すなわち、表皮の菲薄化や末梢神経密度の増加といった変化が痛みの発生し始める不動12週後と一致して認められ、これらの変化は不動期間の延長に伴って顕著になるという知見を得ている。また、不動4週目の足底においてはケラチノサイト由来神経成長因子(NGF)の発現増加も認めている。一方、近年、ケラチノサイトにおいて侵害刺激の受容に関与する受容体が発現・機能していることが明らかとなり、痛みの病態との関連も報告されている。そこで、本研究ではケラチノサイトにおけるNGFと代表的な痛み関連受容体TRPV1およびP2X3の発現変化について経時的に検討することを目的とした。不動期間を1・2・4週に設定し、各不動期間終了後、足底皮膚を採取し免疫組織学的解析を行った。その結果、NGFの発現は不動1週後から通常飼育ラットに比べ有意に増加しており、その発現レベルは不動期間を通して維持された。一方、TRPV1およびP2X3の発現は不動2週後から通常飼育ラットに比べ有意に増加しており、不動期間依存的な増加を認めた。今回、皮膚の組織学的変化は不動12週という早期から生じ、痛みの発生状況と同様の経時的推移を示したことから、その発生メカニズムに深く関与することが推察された。NGFは神経成長を促すのみならず、神経細胞におけるTRPV1やP2X3を含めた疼痛関連分子の遺伝子・蛋白の発現を調節するメディエーターとしても機能する。したがって、本研究成果は不動に伴う痛みの皮膚ー神経系における情報伝達機構の変調を解明していく足掛かりとなるものと考える。
ダイオキシンによる出生児発育障害：周産期児の成長ホルモン低下の意義とその機構

ダイオキシンの妊娠期曝露による出生児発育障害は、低用量の曝露で生起し、子供の一生の健康を脅かすため深刻な問題である。我々は昨年までに、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)母体曝露により、胎児の脳下垂体において成長ホルモン(GH)の合成が顕著に低下すること、並びにそれが上記障害の一端を担うことを見出している。そこで本研究では、GH発現低下を規定しうるダイオキシンの標的因子を探索した。ダイオキシンの標的因子を探索するため、胎児脳下垂体を用いてDNAマイクロアレイ解析を行った。TCDDによる変動の傾向がGHと類似した遺伝子を抽出し、胎生期の変動状況を解析した。その結果、機能がほとんど理解されていない遺伝子であるDeath associated protein-like 1 (DAPL1)の発現のみが、GH低下が出現する胎生18日目よりTCDD依存的に低下する事実が判明した。また、ダイオキシンによる毒性発現において重要な役割を担う芳香族炭化水素受容体(aryl hydrocarbon receptor: AHR)欠損ラットを用いた解析により、GHおよびDAPL1発現低下はAHR依存的に生じることも確認された。そこで、DAPL1発現低下の毒性学的意義を検討するため、胎児脳下垂体より調製した初代培養細胞にDAPL1 siRNAを導入し、GH発現に対する影響を検討した。その結果、DAPL1発現低下によりGH発現も抑制されることが明らかとなった。以上の成果から、TCDDは胎児脳下垂体においてDAPL1発現抑制を標的としてGH発現を低下させ、発育障害を惹起するとの新規毒性機構が見出された。29年度が最終年度であるため、記入しない。妊娠母体のダイオキシン曝露により出生児に出現する発育障害は、障害発現に要する用量が小さく、影響が長期間継続することから問題が大きい。これまでに私は、最強毒性のダイオキシンである2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)母体曝露により、周産期児の脳下垂体において成長ホルモン(growth hormone; GH)発現が顕著に低下することを見い出した。GHは児の発育に必須であることから、TCDDは発達期のGH低下を介して、成長抑制や成長後の障害形質のインプリントをもたらすとの仮説が想定される。本研究では、TCDD曝露胎児に直接GHを補給しその効果を検証することで、胎児期GH低下の毒性学的意義を検証した。TCDD曝露胎児にGHを補給しその効果を検討した結果、GHの下流で働くinsulin-like growthfactor-1 (IGF-1)発現ならびに出生児体重のTCDD依存的な低下は、GHの補給により正常水準まで改善することが明らかとなった。さらに、成長後に生じる短期記憶障害や脂質代謝異常も胎児へのGH補給により改善ないし改善傾向を示した。さらに、ダイオキシンによる毒性発現に重要である芳香族炭化水素受容体(aryl hydrocarbon receptor; AhR)が胎児期GH低下に関与するか否かを検討するため、AhR欠損ラットを用いて検討を行った。その結果、野生型の児において生じるTCDD依存的なGH発現の低下は、欠損型では全く認められなかった。以上の成果から、TCDDはAhRの活性化を介して児のGHならびにIGF-1発現を減少させ、発育を障害することが明らかとなった。本年度は、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)が児のgrowth hormone (GH)低下を起点として発育を障害する可能性を検証することを目的に研究を遂行した。胎児期GH低下に基づく障害を明らかにするため、TCDD曝露胎児に直接GHを補給しその効果を検証した。その結果、TCDD依存的な胎児期のGH低下とそれに基づくIGF-1低下が出生後早期に出現する低身長または低体重の主たる要因であることを実証することができた。さらに、胎児期のGH低下は成長後の短期記憶障害や低コレステロール形質に対しても一定の寄与を有することが見い出された。現在、胎児期にGHを補給した児の成長後の肝臓および血液を用いてメタボローム解析を行い、障害の規定因子またはバイオマーカーの探索を行っている。今後は、骨および筋肉への影響を検討するため、各組織切片のヘマトキシリン-エオジン染色による病理組織学的な解析、あるいは、骨代謝または形成に関わる細胞マーカーやタンパク質のmRNA発現および血中レベルの変動を解析する予定である。さらに、当初の計画には含まれていなかったが、芳香族炭化水素受容体(aryl hydrocarbon receptor; AhR)欠損ラットを用いて、本障害に対するAhRの寄与も検討した。その結果、TCDDは胎児のAhR活性化を介してGH発現を抑制し発育を障害することも明らかにすることができた。従って、本年度は胎児期のGH低下の毒性学的意義をある程度明らかにすることができ、またAhRの寄与についても検証することができたため、おおむね順調に進展したと考えられる。我々は、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)母体曝露により、胎児の脳下垂体において成長ホルモン(GH)の合成が顕著に低下すること、並びにその機構の一部には、GH産生細胞の増殖誘導因子であるコルチコステロン低下が寄与することを見出している。

そこで本研究では、TCDDが胎児期のGH細胞増殖に及ぼす影響に着目しGH低下の詳細な機構を解析すると共に、本障害を規定しうるダイオキシンの標的因子を探索した。TCDDが胎児脳下垂体のGH産生細胞数に及ぼす影響を解析した結果、GH陽性細胞数が顕著に減少することが明らかとなった。そこで、TCDD曝露母体に減少するコルチコステロンを補給したところ、TCDDにより低下する胎児GH産生細胞数が改善する傾向を示した。以上の成果から、TCDD母体曝露によるGH産生細胞の増殖抑制機構の一部にはコルチコステロン低下が寄与することが明らかとなった。しかし、GH産生細胞数の低下は、母体へのコルチコステロン補給では正常水準にまで復帰せず、他の標的因子の可能性が示唆された。そこで、ダイオキシンの標的因子を探索するため、胎児脳下垂体を用いてDNAマイクロアレイ解析を行った。TCDDによる変動の傾向がGHと類似した遺伝子を抽出し、胎生期の変動状況を解析した。その結果、機能未知の遺伝子であるDeath associated protein-like 1 (Dapl1)の発現のみが、GH低下が出現する胎生18日目よりTCDD依存的に低下する事実が判明した。現在、この遺伝子に着目し、その発現低下の意義と機構の解明を目指している。本年度は、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)母体曝露による、胎児期の成長ホルモン(GH)発現低下の機構を明らかにすることを目的に研究を遂行した。手始めに、TCDDが胎児脳下垂体のGH産生細胞数に及ぼす影響を解析した。その結果、TCDDはGH産生細胞数の減少を通してGH発現を抑制するという新規機構を明らかにすることができた。さらに、ダイオキシン曝露母体に低下するコルチコステロンを補給した結果、ダイオキシンによる胎児GH産生細胞数の減少が一定の改善を示した。この効果は、ヒト臨床用量に基づいた用量のグルココルチコイドを母体に単回処理することによって認められるため、ヒトへの応用性をもつダイオキシン発育障害の新規治療法としての発展が期待できる。また、DNAマイクロアレイ解析を行い、GH産生細胞数の減少を引き起こすダイオキシンの標的因子を探索した。その結果、機能未知の遺伝子であるDeath associated protein-like 1 (Dapl1)の発現が、GH低下と同時期にTCDD依存的に低下することが明らかとなった。現在、この遺伝子に着目し、その発現低下の意義と機構を解析している。ダイオキシン依存的なGH低下の原因遺伝子と同定した暁には、本遺伝子を標的とした対策を検討することで、ダイオキシンによる発育障害の根本的解決を目指している。これらの成果により、現在までの進捗はおおむね順調であると考えられる。ダイオキシンの妊娠期曝露による出生児発育障害は、低用量の曝露で生起し、子供の一生の健康を脅かすため深刻な問題である。
tPAによる細胞外マトリックスプロテオグリカンの分解と神経回路の可塑性

成体においては、幼児期の臨界期と異なり構造レベルでの変化(可塑性)を消失し神経構造は安定している。しかし、外因性のコンドロイチナーゼ酵素を脳内に注入すると、成体脳においても神経回路の可塑性が回復することが大脳視覚野で報告されている(Pizzorusso et.al.,2002 ; Fox and Caterson, 2002)。このことは、細胞外マトリクス環境が神経回路の可塑性と密接な関係にあることを示している。申請者は、神経活動依存的にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが分解されることをバソプレッシン神経系で報告している(Miyata et al., 2004)。よって、バソプレッシン神経においては、神経活動増加により分泌された内因性の分解酵素が、細胞外マトリックス環境を変化させることで、神経回路可塑性を誘発している可能性がある。本研究においては、細胞外マトリクスを分解する酵素系であるtPAならびにplasminogenに着目し研究を行った。tPAノックアウトマウスは、浸透圧刺激を与えてもバソプレッシン放出が野生型に比べ有意に低く、慢性的浸透圧刺激を与えると顕著な浸透圧上昇により、短期間で死に至ることが分かった。一方、リコンビナントtPAを、摘出下垂体後葉に作用させると有意にバソプレッシン分泌を促進した。さらに、慢性浸透圧負荷を課すことでtPA-Plasminogenシステムを介して血管細胞外マトリクスlamininが分解されることが明らかになった。tPA-Plasminogen系は脳の可塑性に関与することが示唆されているがそのメカニズムについてはほとんど解明されていない。本研究においては、tPAならびにPlasminogenノックアウトマウスを用いて、浸透圧刺激を与えた時のバソプレッシン分泌を調べた。その結果、tPAノックアウトマウスは急性と慢性の両刺激に対して、またPlasminogenノックアウトマウスは慢性刺激に対してバソプレッシン分泌に異常が認められた。tPAは細胞外マトリクスを分解する経路とLRP-1に作用してシグナル伝達に関与する経路が示唆されている。そこで、Plasminogenの局在を調べたところ下垂体後葉の血管系に特異的に存在することが明らかになった。さらに、Plasminogenノックアウトマウスにおいては慢性浸透圧刺激によるLamininの分解が抑制されていることより、血管のマトリクス構造の変化がバソプレッシンの透過性に影響を与えていることが明らかになった。さらに、LRP-1の局在を調べたところバソプレッシン神経の終末部に存在しtPAがLRP-1を介して急性バソプレッシン放出に関与している可能性が示唆された。以上の結果は、tPAによるバソプレッシン放出機構には、LRP-1による急性反応とPlasminogenの活性化による細胞外マトリクスLamininの分解による血管透過性の慢性反応の2経路が存在することがわかった。tPAが、バソプレッシン神経終末部へ直接的に作用しバソプレッシン放出を促進しないか調べた。摘出下垂体後葉を500nMリコンビナントtPAで処理すると33mM High K+刺激と同じレベルのバソプレッシン放出が確認された。しかし、このバソプレッシン放出促進はLRP受容体拮抗剤で阻害されなかった。一方、下垂体後葉血管のlamininタンパクは慢性的浸透圧刺激によりdownregulationされるが、これはplasminogenノックウアトマウスでは観察されないことよりバソプレッシン神経の活動増加により放出されたtPA-plasminogenシステムによりlamininが分解されることが分かった。血管Lamininの分解は、バソプレッシンの血管透過性に関与すると考えられる。tPAおよびplasminogenノックアウトマウスのバソプレッシン放出異常は、バソプレッシン神経の活動低下や下垂体後葉にける微細構造レベルの低下ではないことも明らかとなったバレル領域における、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの局在と発現変化について調べた。
琉球弧島嶼の沈降運動に関する地質学的検証

琉球弧の一部である沖縄島及び宮古島の間には広いプラットフォーム状(平らな高まり)の地形が存在している.本研究ではこの高まり状の地形の地質学的な発達史に関して,島嶼の沈降という切り口で研究を進めた.プラットフォーム状の地形は,その縁辺における断層運動に伴って,壊れるように沈降していること.プラットフォームの高まり自体はほぼ安定していて,約1万数千年前の最終氷期にはサンゴ礁が存在していた可能性が高いことが明らかになった。本研究では,かつては琉球弧の島嶼の一部であった可能性のある沖縄島と宮古島の間の高まりにおいて,高分解能マルチチャンネル構造探査,第四紀堆積層の音響層序学的な解釈,精密地形調査,岩石採取,採泥調査とその年代決定により,1.島嶼の沈降が,いつどの様に開始したかを検証する.沈降運動は琉球弧を胴切りする方向の層運動に関連していると考えられ,断層運動の変位量や速度を求める.2.陸続きであったとされる宮古島と沖縄島の間の溝がいつから形成され,発達したかを解明する.それによって,従来の研究よりも精度の高い古地理の復元を試みる.当該年度の研究では,研究計画に沿って,以下の通りの調査・解析を実施した.67月に船舶を用いた精密測深調査の実施.そのデータの解析作業を行った.精密地形調査の結果,宮古曽根北西縁においては,水深約120 mにテラス状の地形を見いだした.この平坦面はその西の水深約130 mから比高10 m程度の斜面が存在する.さらに,調査域南西部の現在の水深約60 m(重宝曽根)には明瞭なサンゴ礁地形が認められることが分かった.サンゴ礁地形は少なくとも南北方向に1 km以上連続し,幅は500 m以上に達する.地形断面から見る礁嶺の水深は約55-60 mで,その外縁部には縁脚ー縁溝系が発達する.また礁嶺内部はモート状の地形が認められた.今回見つかったこれらの高まりは,現世のサンゴ礁地形に酷似しており,後氷期の海水準変動と調査海域のテクトニクスと合わせて議論するために重要な結果である.本研究では,かつては琉球弧の島嶼の一部であった可能性のある沖縄島と宮古島の間の高まりにおいて,高分解能マルチチャンネル構造探査,第四紀堆積層の音響層序学的な解釈,精密地形調査,岩石採取,採泥調査とその年代決定により,1.島嶼の沈降が,いつどの様に開始したかを検証する.沈降運動は琉球弧を胴切りする方向の層運動に関連していると考えられ,断層運動の変位量や速度を求める.2.陸続きであったとされる宮古島と沖縄島の間の溝がいつから形成され,発達したかを解明する.それによって,従来の研究よりも精度の高い古地理の復元を試みる.本計画の最終年度であるが,研究は全体として計画に沿って進めることができた.平成23年度は淡青丸を用いた調査航海を実施し,当該海域で反射法音波探査を実施するとともに,岩石試料の採取に成功した.平成24年度には小型船舶を用いた精密測深調査の実施.この結果,宮古曽根北西縁においては,水深約120 mにテラス状の地形を見いだした.この平坦面はその西の水深約130 mから比高10 m程度の斜面が存在する.さらに,調査域南西部の現在の水深約60 m(重宝曽根)には明瞭なサンゴ礁地形が認められることが分かった.サンゴ礁地形は少なくとも南北方向に1 km以上連続し,幅は500 m以上に達する.地形断面から見る礁嶺の水深は約55-60 mで,その外縁部には縁脚ー縁溝系が発達する.また礁嶺内部はモート状の地形が認められた.今回見つかったこれらの高まりは,現世のサンゴ礁地形に酷似しており,後氷期の海水準変動と調査海域のテクトニクスと合わせて議論するために重要な結果である.平成25年度はデータの解析を進め,国際誌への成果の公表,国際学会での発表を行った.琉球弧の一部である沖縄島及び宮古島の間には広いプラットフォーム状(平らな高まり)の地形が存在している.本研究ではこの高まり状の地形の地質学的な発達史に関して,島嶼の沈降という切り口で研究を進めた.プラットフォーム状の地形は,その縁辺における断層運動に伴って,壊れるように沈降していること.プラットフォームの高まり自体はほぼ安定していて,約1万数千年前の最終氷期にはサンゴ礁が存在していた可能性が高いことが明らかになった。本研究では,かつては琉球弧の島嶼の一部であった可能性のある沖縄島と宮古島の間の高まりにおいて,高分解能マルチチャンネル構造探査,第四紀堆積層の音響層序学的な解釈,精密地形調査,岩石採取,採泥調査とその年代決定により,1.島嶼の沈降が,いつどの様に開始したかを検証する.沈降運動は琉球弧を胴切りする方向の断層運動に関連していると考えられ,断層運動の変位量や速度を求める.2.陸続きであったとされる宮古島と沖縄島の間の溝がいつから形成され,発達したかを解明する.それによって,従来の研究よりも精度の高い古地理の復元を試みる.当該年度の研究では,研究計画に沿って,主に2つの調査・解析を実施した.1つは,学術研究船「淡青丸」による調査を実施した.研究計画で実施予定だった3カ所からの岩石採取に成功した.そのうち,1箇所の試料は泥岩を含んでおり,今後,堆積年代を決める予定である.反射法音波探査に関しては,海況が良くなかったため1測線のみ行うことができた.

2つ目は,「なつしま」NT09-11航海の分析作業で有り,ほぼ完了して,論文作成作業に入ることができた.平成24年度には投稿に至るように作業を進めている.さらに,過去のデータの分析では沖縄島の南方海域の分析も合わせて実施中である.慶良間海裂は,沖縄島南方に発達する溝であるが,最大水深1,700 mに達する.急激な沈降運動に伴って形成されたと考えられる.この沈降運動に関しても解析を行い,成果をまとめている.平成24年度は計画通り海域における調査が実施できた.当該年度の調査によって古いサンゴ礁地形を見つけ出すことができた.今回見つかった地形は,極めて明瞭なサンゴ礁地形で,従来,琉球弧における調査では氷期にはサンゴ礁が発達していなかったとする地形学・地質学的な知見を覆すものである.現在は,水深と地形のみが判明したが,これらの年代値を調べることができれば,テクトニクスに関する議論がきるものと考える.水深120 mの付近では明瞭なサンゴ礁地形は発達していない.一方で,現在の水深で約5560 mにサンゴ礁地形が見つかった.このサンゴ礁が後氷期の海面が急激な上昇をする時期に対応するとすれば,この地域は地質学的に安定,あるいは隆起している可能性がある.今回の結論は今後,この地域のテクトニクスを議論する上では極めて重要な結論である.2011年11月12月に学術研究船「淡青丸」の航海KT11-30航海を実施できた.本航海では,実際に岩石試料が採取でき,これらの分析を行えば,研究目的の達成に近づくと思われる.航海時には海況が悪く,音波探査は大幅に測線を削減せざるを得なかった.可能であれば,2013年度の航海に応募して,さらにデータを加えるつもりである.一方で,既存データの解析は順調に進んでおり,査読論文の公表に向けて,いくつかの研究発表(口頭発表)を行っている.実際の調査は平成24年度に完了したと言える.そこで,残された年度においては研究成果を取りまとめに重点を置く.まとめるべき成果は以下の通りである.1.既存データ分の論文を作成して,データを公表する.重要な点は宮古曽根における宮古鞍部の沈降運動に関してである.2.宮古曽根の55-60 m水深の沈水サンゴ礁の解析を行う.既存データとしては,地形データが主体となるので,これらを公表する.3.次期計画の策定と,課題の拾い出し.平成24年度調査によって,サンゴ礁地形を見いだすことができた.今後はその試料を採取することが一つの課題となる.つまり,年代値を明らかにすることができれば,本研究は国際的にも非常に重要な汎世界的な海水準の変動曲線に関する重要な成果が得られる可能性が高い.2012年春に新たな調査のための準備に入る予定である.既存データの解析から得られた沈水したサンゴ礁地形を解析して,構造的沈降運動を解明する方法を予定している.宮古島東方沖の水深150 m100 mの海域の精密地形調査を実施し,沈水サンゴ礁存在を確認する.既存データの公表に関しては,研究分担者と共に,速やかに行う予定である.次年度は最終年度となるため,研究成果の発表を行う予定である.特に,24年度の結果を国際誌に投稿を目指して,それに向けた支出を行うこととする.主に,論文作成のための,学会の参加費及び,それの公表のために支出する.2012年度の予算の多くは,航海における傭船費および測深機器のレンタルとオペレーションに使う予定である.また,宮古島東方沖調査および,その準備のための国内旅費を予定している.沈水サンゴ礁に関する研究の成果発表を予定しており,ケアンズで行われる国際サンゴ礁学会に参加する.
部位指向性SODの分子設計と活性酸素代謝制御

脳血管障害をはじめとする各種の疾患にスーパーオキシドラジカルが病態増悪に関与する可能性が示唆されているが、活性酸素ラジカルが短寿命であるために病巣局所で選択的に消去する事が困難であった。これまでに、化学修飾法および遺伝子工学的手法を用い、長時間作動型の病巣指向性SOD、血管内皮細胞指向性SOD(HB-SOD)、腎近位尿細管指向性SOD等を開発してきた。これらの部位指向性SOD群を用い、特定の組織細胞局所でスーパーオキシドを特異的に消去することにより、高血圧、脳虚血障害、脳浮腫、虚血再循環性不整脈、肝移植病態、ストレス潰瘍等における病態が著明に改善することから、多彩な疾患に活性酸素が深く関与する事を明らかにしてきた。さらに、本研究により肝実質細胞膜Galactoseレセプター及び網内系細胞のMannoseレセプターに特異的に結合する肝指向性SOD(GAL-SOD & MAN-SOD)を開発した。これらの肝指向性SODを用いて解析した結果、以下のことが判明した。HB-SODを用いて解析した結果、血管内皮周辺におけるスーパーオキシドラジカルの過形成が遺伝性及び非遺伝性高血圧ラットの血圧上昇の原因になっていることが明らかになった。本所見は、活性酸素代謝制御の観点から新たな高血圧治療が可能であることを世界で初めて示した研究であり、その意義は極めて大きい。Mannoseレセプター含有細胞に特異的に集積するMAN-SODを正常ラットに投与したところ、投与直後に全身の血圧が完全に消失し、数分以内に動物が死亡した。本降圧作用がMannose結合アルブミンで拮抗阻害される事、及び失活したMAN-SODはこの様な降圧作用を示さないことから、スーパーオキシドが血圧維持に不可欠な生理活性分子であること、及び全身の抵抗性血管のトーヌスがMannoseレセプター含有細胞により統合制御されていることが判明した。本研究により確立された活性酸素が全身血圧を統合制御するという新概念は血液循環研究の分野に新たなページを開くものであり、その医学的意義は極めて大きい。研究実績概要これまでに、ヒトCu/Zn型SODを用い、アルブミンと可逆的に結合して長時間循環する病巣指向性SM-SOD、長鎖脂肪酸を共有結合した細胞膜脂質親和性AC-SOD、および遺伝子組換えによりヘパラン硫酸に高親和性を示す内皮細胞指向性HB-SODを開発し、これらのSODが個体レベルでの虚血再循環性不整脈、致死性不整脈、脳浮腫、あるいは内毒素性角膜潰瘍の発現を極めて有効に阻止することを示してきた。平成5年度は腎尿細管指向性AH-SOD(糸球体濾過後に近位尿細管細胞に集積)、肝細胞指向性Gal-SOD(肝細胞Galactose Receptorに特異的に結合)、およびKupffer細胞指向性Man-SOD(同細胞のMannoseReceptorに特異的に結合)を開発した。また、これらの新規SODの静脈内投与後の体内動態や組織細胞内分布動態を経時的に解析した結果、AH-SODが腎近位尿細管細胞に、GAL-SODが肝実質細胞に、MAN-SODがKupffer細胞を主体とする網内系細胞に特異的に集積する事が明かとなった。病態モデル動物で解析した結果、AH-SODが制ガン剤のシスプラチンによる腎障害を特異的に阻止軽減する事が判明した。さらに、HB-SODは虚血性脳神経障害、心筋梗塞、高血圧症(SHRおよび食塩負荷ラット)における病態を著明に改善する事が判明した。

これは、HB-SODが血管局所のO_2^-による内皮依存性血管弛緩因子(NOあるいはそのSH反応産物)の不活化を阻止することにより各種の高血圧病態を改善するためであること明らかとなった。また、Mannose受容体を有する正常動物の組織細胞にMan-SODを濃縮動員すると血圧が急激かつ特異的に低下して短時間で動物が死亡することが判明した。これらの観察結果から、スーパーオキシドラジカルが病態増悪因子としてのみならず、特定の血管構成細胞を介して正常血圧を維持するための生理活性分子として不可欠な成分であることを初めて示したものである。脳血管障害をはじめとする各種の疾患にスーパーオキシドラジカルが病態増悪に関与する可能性が示唆されているが、活性酸素ラジカルが短寿命であるために病巣局所で選択的に消去する事が困難であった。これまでに、化学修飾法および遺伝子工学的手法を用い、長時間作動型の病巣指向性SOD、血管内皮細胞指向性SOD(HB-SOD)、腎近位尿細管指向性SOD等を開発してきた。これらの部位指向性SOD群を用い、特定の組織細胞局所でスーパーオキシドを特異的に消去することにより、高血圧、脳虚血障害、脳浮腫、虚血再循環性不整脈、肝移植病態、ストレス潰瘍等における病態が著明に改善することから、多彩な疾患に活性酸素が深く関与する事を明らかにしてきた。さらに、本研究により肝実質細胞膜Galactoseレセプター及び網内系細胞のMannoseレセプターに特異的に結合する肝指向性SOD(GAL-SOD & MAN-SOD)を開発した。これらの肝指向性SODを用いて解析した結果、以下のことが判明した。HB-SODを用いて解析した結果、血管内皮周辺におけるスーパーオキシドラジカルの過形成が遺伝性及び非遺伝性高血圧ラットの血圧上昇の原因になっていることが明らかになった。本所見は、活性酸素代謝制御の観点から新たな高血圧治療が可能であることを世界で初めて示した研究であり、その意義は極めて大きい。Mannoseレセプター含有細胞に特異的に集積するMAN-SODを正常ラットに投与したところ、投与直後に全身の血圧が完全に消失し、数分以内に動物が死亡した。本降圧作用がMannose結合アルブミンで拮抗阻害される事、及び失活したMAN-SODはこの様な降圧作用を示さないことから、スーパーオキシドが血圧維持に不可欠な生理活性分子であること、及び全身の抵抗性血管のトーヌスがMannoseレセプター含有細胞により統合制御されていることが判明した。本研究により確立された活性酸素が全身血圧を統合制御するという新概念は血液循環研究の分野に新たなページを開くものであり、その医学的意義は極めて大きい。
アーバンフォレストリー概念にもとづく都市緑地の社会的・生態的評価とその国際発信

本研究は日本では未発達の「アーバンフォレストリー(以下、UF)」概念に注目した都市緑地の評価を日本で初めて行い、成果を国際発信することを目的とする。具体的には、首都東京(特別区)を対象に、リモセン画像による樹冠面積の把握、各種データの統合などにより、都市の緑地を一体的に捉えた上で、社会・生態の両側面から、UFを発展させるにあたっての課題を整理する。
歯周病原性細菌の表層にある抗原性の強い蛋白質のクロ-ニング

歯周病原性菌として最も疑われている細菌Porphyromonas(Bacteroides)gingivalisの最表層にある蛋白質は、ホストの免疫応答、あるいは病気の発症に強く関連していると予想される。なぜなら、菌の表層に存在することから、真先にホストに認識されると考えられるからである。申請者らは、本菌の表層にある抗原性の強い主要蛋白質の一つである75K蛋白質(実際には200万の複合体を形成)を精製し、この蛋白質のより深い研究と臨床応用のために構造遺伝子のクロ-ン化を行なうことを目的とした。初年度、本蛋白質遺伝子を含むと考えられるBam HI DNA断片をpUCプラスミッドにクロ-ク化し、次年度はこのDNA断片の制限酵素マップを作成した。さらにクロ-ン化に使ったプロ-ブの結合位置、すなわちN末端部位が、上記のマップのどの領域に存在するのかを決定した。これにより、少なくとも遺伝子の大部分はこのDNA断片上にあることが判明した。さらに得られたリコンビナントの遺伝子産物を抗体でスクリ-ニングし、遺伝子の全域が含まれているのか否かを検討した。しかし上記のpUCプラスミッドで作製したリコンビナントからは、特異抗体で探索しても、いかなる遺伝子産物も検出できなかった。そこで、より強力な発現ベクタ-につなぎ換えて、再度同様な検討を行なったところ、75K蛋白質より少し大きな77Kの分子量を持った蛋白質が検出された。これにより、遺伝子の全領域がこのクロ-ン化されたDNA断片上に存在する可能性が一段と高くなった。今後、構造遺伝子の全域とその上流のプロモ-タ-領域の塩基配列の決定を行い、本蛋白質の一次構造とその発現調節についての情報を得るべく研究を進める予定である。この研究の課程で、本菌の病原因子のクロ-ン化の一つの方法論が確立したと考えている。本菌の場合、遺伝子産物の同定には、特別な発想ベクタ-を用いる事が必須である事も分かった。成人性歯周炎の有力な原因菌であるPorphyromonas(Bacteroides)gingivalisの外膜に存在すると考えられる75K蛋白質のクロ-ニングを目的としている。この蛋白質は強い抗原性のあることがわかっている。〔方法〕75K蛋白質を精製し、N末端アミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列に対応する複数のDNAプロ-ブを合成する。このDNAプロ-ブを使用して本菌染色体DNAにあると考えられる遺伝子を検索した。〔結果〕75K蛋白質を精製し、36番目まで、N末端のアミノ酸配列を決定した。この配列の中で、18番目がトリプトファンで、31番目がメチオニンであった。このニつのアミノ酸に対応するコドンは、それぞれ、UGGとAUGのみである。そこで、この重複のないコドンをそれぞれ含む二種類のDNAプロ-ブ(20量体)を合成した。このDNAプロ-ブの5^1末端を^<32>Pで標識し、このプロ-ブの結合するDNA断片の存在とサイズを、本菌染色体DNAで検索した。すると、PstIで、1.7kb、BamHIで4.2kbのDNA断片にプロ-ブが結合することが判明した。そこで、上記の断片をクロ-ニングすべく、PstI,BamHIを使って作成したpUC19のリコンビナントをあわせて5000株余りスクリ-ニングした。この結果,BamHIで作成したリコンピナントから1個の陽性クロ-ンを発見した。

このリコンビナントは、予想どおり、4.2kbのBamHI断片を組込んでいたので、期待したとおり、75K蛋白質遺伝子をクロ-ン化したものと考えている。〔今後の展望〕4.2kbのBamHI断片を組込んだクロ-ンに、目的とする遺伝子の全域が存在するのか否かさらに、このクロ-ンは75K蛋白質を発現するのか否かなどについて検討を進めると共に、塩基配列を決定するための準備をおこないたいと考えている。歯周病原性菌として最も疑われている細胞Porphyromonas(Bacteroides)gingivalisの層表蛋白質は、ホストの免疫応答、ひいては病気の発症に強く関連しているはずである。なぜなら、歯の最表層に存在することから、真先にホストに認識されると考えられるからである。申請者らは本菌の表層にある抗原性の強い主要蛋白質の一つである75K蛋白質を精製し、この蛋白質のより深い研究と臨床応用のために構造遺伝子のクロ-ン化を行なうことを目的とした。初年度、本蛋白質遺伝子を含むと考えられるBam HI DNA断片をpUCプラスミッドにクロ-ン化した。2年度はこの断片の制限酵素マップを作成した。さらにクロ-ン化に使ったプロ-ブの結合位置、すなわちN末端部位が、上記のマップとどの領域に存在するのかを決定した。これにより、少なくとも遺伝子の大部分はこのDNA断片上にあることが判明した。さらに得られたリコンビナントの遺伝子産物を抗体でスクリ-ニングし、遺伝子の全域が含まれているのか否かを検討した。しかし上記のリコンビナントからは、特異抗体で探索しても、いかなる遺伝子産物も検出できなかった。そこで、より強力な発現ベクタ-につなぎ換えて、再度同様な検討を行なったところ、75K蛋白質より少し大きな77Kの分子量を持った蛋白質が検出された。これにより、遺伝子の全領域がこのクロ-ン化されたDNA断片上に存在する可能性が一段と高くなった。今後、構造遺伝子の全域とその上流のプロモ-タ-領域の塩基配列の決定を行い、本蛋白質の一次構造とその発現調節についての情報を得るべく研究を進める予定である。