hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ワークフローの認証の証明によるPKIの応用拡大の研究

本年度は、研究目的としてあげた1.Webサービスの枠内でワークフローのロジックを拡張、2.「承認」を具体化したものとして電子署名つきの電子文書を採用、3.2.で構築した論理体系の証明系を検討に対し、具体的に次の成果を得た。1.ワークフローのロジックの拡張・3.論理体系の証明系の提案2.電子署名つきの電子文書を採用さらにこれに電子署名を組み合わせることで、セマンティクスを電子署名の強度の枠内で保証する枠組を得ることに成功した。3.その他研究の副産物として、IdPから渡ってくる属性情報の品質の解析を行い、結果としてIdPとSP双方の品質をグレード(拡張LoA)として表現する枠組を構築した。さらに、暗号に関係して2008年に発生したOpenSSLの事故の解析も行った。本年度は、研究目的としてあげた1.Webサービスの枠内でワークフローのロジックを拡張、2.「承認」を具体化したものとして電子署名つきの電子文書を採用、3.2.で構築した倫理体系の証明系を検討に対し、具体的に次の成果を得た。1.ワークフローのロジックの拡張・3.論理体系の証明系の提案SAMLをベースとしたauthentication/authorizationにおいて、PDP(Policy Decision Point)の拡張を提案することができた。具体的にプログラム理論で使われるCTL(Computation Tree Logic)のサブセットとしてDTLを提案し、それがドキュメントのセマンティクスを記述できることを実証し、発表した。2.電子署名つきの電子文書を採用さらにこれに電子署名を組み合わせることで、セマンティクスを保証する枠組みを得ることに施行した。3.その他研究の副産物として、電子署名つきの電子文書が従来型のWebアプリケーションの認証の強化をともなうSSOの実現に有効であることを示した。さらにオープンソースソフトウェアの運用実態を調査する中で、運用の安全さを評価する指標を提案することができた。加えて、Web中の文書のタグセットからセマンティクスを自動的に抽出する枠組みを提案した。
GSK-3βの抑制によるWntシグナルの増強を介した骨形成誘導法に関よる研究

GSK-3βを抑制させWntシグナリングを活性化させるsgRNAの2'-O-methyl化RNAを合成した.また,2'4'-Bridged Nucleic Acid(LNA : Locked Nucleic Acid)をいくつかの塩基に挿入した種々の2'-O-メチル化RNAを合成した.これらのsgRNAを,293細胞,MC3T3-E1細胞,CH310T1/2細胞等にトランスフェクションして,リアルタイムRT-PCR法,Western blot法などにより,骨芽細胞の分化の指標となるmRNA発現などに及ぼす影響を調べた.LNA塩基を挿入することによって,ノックダウン効果がどのように変わるかについて詳細に調べたところ,ある部位へのLNA塩基の挿入はノックダウン効果を増大させることが明らかになった.さらに,TLR5,6といった一本鎖核酸に応答する受容体を介したインターフェロン誘導についてELISA法を用いて調べたところ,IFN-αの産生は認めれず,有害性がないことが考えられた.マウス個体にzenograftによってsgRNAを投与する系を確立した.HL60細胞をこの方法により投与して腫瘍の形成が認められた.このマウスにsgRNAを投与すると腫瘍の増大の減少が認められ,in vivoで,sgRNAの効果が明らかになった.これまでにin vitroで効果が認められたsgRNAをマウスに局所ならびに全身投与した.pQCTを用いて,このマウスの骨量ならびに骨形成量を測定したところ,骨量の有意な増大が認められた.また,血清中の種々のマーカーについてELISA法を用いて測定し,副作用の有無を調べたところ,非投与マウスと比べて大きな変化が認められず,副作用の少ないことが示唆された.これらの結果から,sgRNAの動物個体レベルへの応用の可能性が大きく広がった.研究代表者らの研究グループが開発したsgRNA/tRNaseZLを用いた新規の遺伝子発現の制御法は,切断活性が核内に存在することやsiRNAよりもさらに短いRNAでも機能するのが大きな特色である.本研究では,まず標的とするヒトGSK-3βmRNAについて,RNA2次構造予測のソフトウエアを用いて2次構造を予測した.切断予定部位は,予想構造を考慮しできるだけ折りたたみ構造の少ない部位を選択した.この標的部位の上流でtRNA前駆体に類似したステム-ループ構造を形成し塩基対合しうる配列(sgGSKH)や直線的に塩基対合する配列(sgGSKL)を選択した.このsgGSKHとsgGSKLのオリゴヌクレオチドを合成し,polIIIプロモーター下で発現させる発現プラスミドを作成した.また,これらの2'-O-methyl sgRNAを合成し,293細胞にリポフェクタミン2000を用いてトランスフェクトした.細胞を可溶化しGSK-3β抗体を用いたウエスタンブロットを行なったところ,GSK-3βのタンパク質が著しく減少した.また,β-catenin/Tcfの結合領域を含むTop-flashルシフェラーゼレポーターのルシフェラーゼ活性は,sgRNAによって増加した.この切断活性は,tRNaseZLを過剰発現させた293細胞では増加し,tRNaseZLをsiRNAによってノックダウンさせた細胞では減少した.これらの結果は,sgGSKHやsgGSKLがtRNaseZLによってGSK-3βmRNAを細胞内で有効に切断したことを示した.さらにマウスC2C12細胞にsgGSKLを導入したところ,osteoprotegrin mRNAが増大した.以上の研究の一部は,Dr.Mario Moerl (University of Leipzig, Leipzig, German)との共同研究で行った.sgGSKLについて,生体内での骨形成促進効果を調べるため,マウスを用いた動物実験による評価を行った.雄4週齢JcI:ICRマウスを用い0.5-5nmolの種々の濃度の2'-O-methyl sgGSKL RNAもしくはpRNA Tin-H1.2/Neo-sgGSKLを頭蓋骨骨膜下に投与した.コントロールとしてsgLucH1を用いた.同時にトランスフェクションに用いるカチオニックリポソームの効果も検討した.また,hydrodynamics gene transfer法を用いてマウスの尾静脈に種々の濃度の2'-O-methyl sgGSKL RNAもしくはTin-H1.2/Neo-sgGSKLを投与した.経時的に頭蓋骨を採取し,骨の厚さを測定した.さらに,副作用の程度を予測するために,このsgRNAが正常細胞の遺伝子発現パターンに影響を与えているかどうかを定量RT-PCRやDNAマイクロアレーによって解析を行った.sgRNAはリポフェクタミンのようなカチオニックリポソームを用いなくても,細胞に取り込まれること,他の遺伝子発現パターンに大きな変動がないことが明らかになった.すなわち,sgRNAは,裸のsgRNAで効果があること,副作用がなく特異的に標的遺伝子の発現を抑制することが考えられた.また,sgGSKLの投与によって骨の厚さの増大が観察され,このsgRNAは有効な骨形成促進活性を有することが考えられ,さらに詳細な検討を続けている.GSK-3βを抑制させWntシグナリングを活性化させるsgRNAの2'-O-methyl化RNAを合成した.また,2'4'-Bridged Nucleic Acid(LNA : Locked Nucleic Acid)をいくつかの塩基に挿入した種々の2'-O-メチル化RNAを合成した.これらのsgRNAを,293細胞,MC3T3-E1細胞,CH310T1/2細胞等にトランスフェクションして,リアルタイムRT-PCR法,Western blot法などにより,骨芽細胞の分化の指標となるmRNA発現などに及ぼす影響を調べた.

LNA塩基を挿入することによって,ノックダウン効果がどのように変わるかについて詳細に調べたところ,ある部位へのLNA塩基の挿入はノックダウン効果を増大させることが明らかになった.さらに,TLR5,6といった一本鎖核酸に応答する受容体を介したインターフェロン誘導についてELISA法を用いて調べたところ,IFN-αの産生は認めれず,有害性がないことが考えられた.マウス個体にzenograftによってsgRNAを投与する系を確立した.HL60細胞をこの方法により投与して腫瘍の形成が認められた.このマウスにsgRNAを投与すると腫瘍の増大の減少が認められ,in vivoで,sgRNAの効果が明らかになった.これまでにin vitroで効果が認められたsgRNAをマウスに局所ならびに全身投与した.pQCTを用いて,このマウスの骨量ならびに骨形成量を測定したところ,骨量の有意な増大が認められた.また,血清中の種々のマーカーについてELISA法を用いて測定し,副作用の有無を調べたところ,非投与マウスと比べて大きな変化が認められず,副作用の少ないことが示唆された.これらの結果から,sgRNAの動物個体レベルへの応用の可能性が大きく広がった.
少低温要求性で早生のモモの育種とその効率化ならびに産物の活用

多低温要求性品種(約900CH)と小低温要求性品種(100-200CH)の交配で得られた中低温要求性品種(500CH前後)で早生の`KU-PP1'、`KU-PP2'および他の選抜系統(HFP1など)について、自家受粉ならびに他家受粉を行った。得られた果実から種子を取り出し、胚培養を行った。その際、果実採取時期、滅菌方法(果実のまま滅菌するか、核を取り出してから滅菌するか)、培養手順(直接胚培養をWPM培地で行うか、SH培地で胚珠培養の後にWPM培地での胚培養に移すか)、胚の層積貯蔵期間について、検討した。交配の組み合わせによる胚の生存率への影響はみられなかった。滅菌方法では、果実全体を滅菌するほうが、核の滅菌よりも発芽率が高かった。層積期間は、胚の生存率には影響しなかったが、層積期間が長いほど、ロゼット化率が減少した。果実採取時期は、開花後70日後よりも90日後に採取した胚で、発芽率や生存率が高かった。培養手順については、発芽率や生存率に明確な差異は認められなかった。これらの研究結果より、新品種の胚培養に適した条件が示された。ただ、全体的に発芽率は高かったものの、その後の生存率がやや低いのが問題であった。これは、試験管で培養した際に、アルミキャップでふたをしたため、ふたの近くまで伸びたシュートが光不足で枯れたことが主因と思われる。次年度は、透明キャップを用いて同様の実験を行う予定である。得られた実生について、ポットに移植し、圃場に移した。この実生について、次年度には低温要求量、その翌年には果実品質の調査が可能になると見込まれる。また、少低温要求性早生モモで問題となる多雌ずい形成についても発生条件を検討した。少低温要求性早生品種では、花芽形成が早くなり、それにより高温遭遇機会が増えるため、多雌ずい花が増加する可能性が示された。実験担当者が熱心に本研究に打ち込んでおり、予定通り順調に研究が進んでいる。新品種の胚培養における各種好適条件をさらに探るとともに、発芽後の生存率を高めるための工夫を検討する。得られた実生について、低温要求量の調査を行い、低温要求量の遺伝様式を示すとともに、低温要求量の少ない系統を選抜する。低温要求量の少ない系統については、果実品質の調査も行い、優れるものを選抜する。選抜した系統について、ハウスでの促成栽培を行って、加温開始時期や加温温度条件などを検討する。実験が順調に進み、失敗による試薬等の再購入がほとんどなかったため、わずかではあるが次年度使用額が生じた。
ポリフェノールへの光照射により発揮される新しい感染創傷治療法の提案

本研究では、ポリフェノールの一種であるプロアントシアニジン(PA)が有する細胞増殖促進効果の検証を行った。試験にはヒト歯肉線維芽細胞を使用した。試験の結果、PAは濃度依存的に細胞増殖促進効果を発揮することが分かった。更に、純水・滅菌生理食塩水・血清無添加培地に暴露させストレスを負荷する条件では、PAにて短時間処理を行うことで細胞保護効果を発揮し、生存細胞減少の抑制および細胞内で生成される活性酸素の上昇抑制が確認された。以上の結果から、細胞増殖促進効果による創傷の治癒促進だけでなく、細胞保護効果により生体へのダメージを軽減できる可能性が示され、感染創傷治療におけるPAの有用性が示唆された。本研究は、ポリフェノールが有する線維芽細胞増殖促進効果およびポリフェノールへの光照射により生成が促進される過酸化水素の水素光分解を介したラジカル殺菌の効果を検証し、殺菌効果と創傷治癒効果を併せ持つ新しい技術を開発するための基礎的検討を目的として行っている。これまでに、ポリフェノールは、光酸化により過酸化水素を生成し、さらにその過酸化水素の光分解で生成したヒドロキシルラジカルが短時間で殺菌作用を発揮することを明らかにした。また、ラット全層皮膚欠損モデルを用いた過酸化水素光分解殺菌法の安全性評価試験にて、創傷治癒の促進傾向が認められたことから、過酸化水素などの活性酸素の短期暴露により肉芽組織を形成する線維芽細胞の増殖が促進される可能性が示唆されている。本年度は、ポリフェノール類のヒト歯肉線維芽細胞(HGF)に対する増殖促進作用の検証に加え、細胞保護作用の評価を中心としてin vitro試験を行った。その結果、ポリフェノール類の中でもプロアントシアニジンが高い細胞増殖促進効果を示したことから、プロアントシアンジンを用いて炎症性刺激、飢餓ストレスおよび浸透圧ストレスなどの各種stressor刺激に暴露されたHGFに対する影響を検討した。プロアントシアニジンで前処理されたHGFは、これら刺激下においても高い細胞増殖能を維持したことから、プロアントシアニジンの優れた細胞保護作用が確認された。これらの効果に過酸化水素光分解殺菌を付与することで、組織保護および修復作用を併せ持つ安全な殺菌技術へと発展させていきたいと考えている。本研究は、ポリフェノールが有する細胞増殖促進効果およびポリフェノールへの光照射により生成する過酸化水素を利用した過酸化水素光分解殺菌の効果を検証し、殺菌効果と創傷治癒効果を併せ持つ新しい技術を開発する基礎的検討を目的として行われた。これまでの研究で、ポリフェノールは光分解によりヒドロキシルラジカルに由来する殺菌作用を発揮することが明らかになっている。また、ラットを用いた試験では創傷治癒の促進傾向が認められたことから、活性酸素の短期暴露により肉芽組織を形成する線維芽細胞の増殖が促進される可能性が示唆されている。本年度は、昨年度の試験でポリフェノール類の中でも効果の高かったプロアントシアニジンを用い更なる検証を行った。試験の結果、プロアントシアニジン前処理により過酷環境下でも細胞減少の抑制および細胞内で生成される活性酸素(ROS)の上昇抑制が確認された。このことから、細胞内に取り込まれたプロアントシアニジンによって直接的抗酸化作用や酸化防御メカニズムに関与する遺伝子発現が起こる可能性、細胞膜に局在したプロアントシアニジンの吸着および受容体を介した細胞保護作用という作用機序が示唆された。本研究の結果は、創傷の殺菌後にプロアントシアニジンによる治癒促進が期待できるものであり、更に前処理により得られる高い細胞保護作用は侵襲的な処置への応用の可能性も示唆した。今後、作用機序の解明を進め臨床応用の実現に向けた研究を進めていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度計画していたin vitro試験では、順調に結果を得ており、数種類のポリフェノールの中でもプロアントシアニジンの細胞増殖促進効果が高いことを確認した。加えて、試験を進める中で細菌感染を想定した炎症性刺激および各種ストレス刺激に対するプロアントシアニジンの細胞保護効果を示唆する興味深い成果も得られた。今後予定している細胞増殖促進および細胞保護の作用機序検証、ならびにラットを用いたin vivo試験に向けた、適切な試験設定の基盤となる知見であり、本研究は着実に進展していると考えている。本年度の研究で得られた結果を踏まえ、細胞増殖促進作用および細胞保護作用の機序を検証する。さらに、ラットを用いたin vivo試験として全層皮膚欠損創モデルを用いた創傷治癒促進効果の検証ならびに局所創傷感染モデルを用いてプロアントシアニジン処理時に光照射を併用した場合の殺菌効果の検証までを行いたいと考えている。
加齢脳における長期記憶学習依存的な神経細胞死発生機構の解明

本研究は長期記憶AMI発症の細胞・分子機構について明らかにすることを目的としている。前年度までに我々は「加齢個体では長期記憶学習後、記憶の固定および読み出しに重要な神経細胞がKlg/Repo/dEAAT1経路不活性化により過興奮し、その結果機能不全がひきおこされ、AMIとなる」ことを示唆する結果を得ていた。具体的には、(1)グリア特異的グルタミン酸トランスポーターdEAAT1がKlg/Repo依存性長期記憶形成に必要であること、(2)加齢個体では学習後、Klg/Repoの活性低下のため、dEAAT1の発現増加が抑制されており、グルタミン酸活性を抑制できないことが長期記憶AMIの原因であること、(3)加齢個体では学習後、グルタミン酸活性を抑制できないことにより長期記憶の固定および読み出しに重要な特定神経細胞の過興奮およびカスパーゼ活性化を促すこと、(4)この細胞で学習後の神経活動およびカスパーゼ活性を抑制すると長期記憶AMIがレスキューされること、(5)この細胞のカスパーゼ活性化は学習後の過剰なグルタミン酸入力の結果であること、一方で(6)神経の過興奮によるカスパーゼ活性化は当初の予想に反し、細胞死ではなく非細胞死機構を介して特定細胞の機能不全、結果としてAMIを引き起こしているらしいことを明らかにしていた。本年度は上の(1)-(2)の結果を「記憶の固定時にはグルタミン酸シグナルの抑制機構(Klg/Repo/dEAAT1)が必要であるが、加齢個体ではこの抑制機構が障害されるために長期記憶AMIが起こる」という内容にまとめ、論文発表した(iScience. 2019 Apr 13;15:55-65.)。一方、予定していたカスパーゼ活性化により影響を受けたのが記憶固定化か?読み出しか?明らかにする計画については実験設備・条件の確立を終了し、現在解析中である。加齢脳において長期記憶学習後、記憶細胞の形成が正常かどうか?確認する2つの実験(学習後にcAMP応答性因子CRTCが核移行している細胞、または最初期遺伝子c-fosを誘導した細胞の可視化・計測)をスタートできただけでなく、今までに得られた結果の一部を論文発表できたため。カスパーゼ活性化により影響を受けたのが記憶固定化か?読み出しか?明らかにする計画(A)記憶細胞の可視化・解析、(B)読み出し神経経路の活動の可視化について引き続き遂行し、得られた結果を上の(3)-(6)と合わせて論文投稿を行う予定である。加齢性記憶障害(Age-related Memory Impairment, AMI)は脳老化の重要な指標となっているが、その発症の分子機構については不明な点が多い。私達は以前、ショウジョウバエで(1)長期記憶学習依存性に若齢脳では見られない細胞死が加齢脳で見られること、(2)長期記憶形成に必要なグリア細胞接着因子Klingon (Klg)、その下流因子であるグリア転写因子Repoの発現が加齢脳で低下していること、(3)若い個体でのKlg/Repoの不活性化も長期記憶学習依存性の細胞死を誘導することを見いだした。当該研究は長期記憶形成のリスクという新たな視点から、Klg/Repo経路を介した神経細胞死抑制機構と、これが加齢により低下したことが長期記憶AMIの発症基盤であるという新規仮説を提唱し、立証・解明することを目的としている。本年度はKlg/Repo経路の活性低下が細胞死および長期記憶AMIを引き起こすのか検証し、さらにKlg/Repo経路のターゲット分子の探索を行った。その結果、repoをグリアで急性強制発現させると加齢体の長期記憶AMIはレスキューできることが明らかになった。一方、予定していたrepoの急性強制発現によるklg変異体および加齢個体の細胞死のレスキューについては実験設備・条件の確立までを達成した。また、klg/Repoのターゲットとして神経興奮毒性を抑制するグルタミン酸トランスポーターdeaat1を見いだし、(I)deaat1変異体では長期記憶障害および学習後の細胞死が観察されること、(II)その急性強制発現がklg, repo変異体や加齢個体の長期記憶障害をレスキューできること、を見つけた。これらの結果はdeaat1がKlg/Repo依存性長期記憶形成に必要であること、この欠損が長期記憶AMIを引き起こすことを示唆している。産休・育休取得のため、予定した実験は次年度に延期した。我々はショウジョウバエで(1)長期記憶学習依存性に若齢脳では見られない細胞死が加齢脳で見られること、(2)長期記憶形成に必要なグリア細胞接着因子Klingon(klg)、グリア転写因子Repoの発現が加齢脳で低下していること、(3)若い個体でのklg/repoの不活性化も長期記憶学習依存性の細胞死を誘導することを見出した。本研究はklg/repoと長期記憶AMIの関係を立証した上で、長期記憶学習後になぜ加齢脳では細胞死が誘導されるのか?この細胞死が長期記憶AMIとどのような関係にあるのか?を明らかにすることを目的としている。前年度までに我々は行動遺伝学的手法を用いて、グリア特異的グルタミン酸トランスポーターdeaat1がklg/repo依存性長期記憶形成に必要であること、これら強制発現が長期記憶AMIをレスキューする結果を得ていた。

本年度は薬理学的及び遺伝学的手法により、(1)長期記憶学習後の記憶固定時における細胞死制御因子カスパーゼ活性上昇が長期記憶AMIの原因であること、(2)すべての神経ではなく、特定の神経細胞におけるカスパーゼ活性上昇が長期記憶AMIの原因であること、(3)加齢個体におけるカスパーゼ活性上昇はdeaat1強制発現により抑制できること、を示唆するデータを得た。以上の結果は、加齢個体では、klg/repo/deaat1経路の活性低下が学習後の特定神経細胞におけるカスパーゼ活性上昇を促すこと、それによって長期記憶AMIがひきおこされることを示唆している。行動遺伝学的手法および組織染色法を用いたレスキュー実験により、加齢個体では長期記憶学習することにより、脳内でカスパーゼ活性が上昇すること、特に一部の神経細胞における活性上昇が長期記憶AMIに関与していることを明らかにできた為。本研究は長期記憶形成のリスクという観点から、記憶形成時のKlg/Repo経路を介した神経細胞死抑制機構と、これが加齢により低下したことが長期記憶AMIの発症基盤であるという仮説を立証・解明することを目的としている。前年度までに我々は(1)グリア特異的グルタミン酸トランスポーターdEAAT1がKlg/Repo依存性長期記憶形成に必要であること、(2)加齢個体では学習後、dEAAT1の発現増加が抑制されており、グルタミン酸活性を抑制できないことが長期記憶AMIの原因であること、(3)加齢個体では学習後、グルタミン酸活性を抑制できないことにより特定の神経細胞の過興奮および細胞死制御因子カスパーゼ活性化を促し、結果として長期記憶AMIが引き起こされることを明らかにしていた。本年度は(1)カスパーゼの影響を受ける特定の神経細胞が長期記憶の固定および読み出しに重要であること、(2)この細胞でカスパーゼ活性を抑制すると長期記憶AMIがレスキューされること、(3)長期記憶学習後一時的に薬理学的手法または遺伝学的手法により、特定細胞のグルタミン酸受容体活性を抑制すると、加齢体でのカスパーゼ活性化が抑制できると同時に記憶が回復すること、予想に反し、(4)加齢個体で特定神経細胞数は学習後変化しないこと、を明らかにした。以上の結果は、「加齢個体では長期記憶学習後、記憶の固定および読み出しに重要な特定細胞がKlg/Repo/dEAAT1経路不活性化により過興奮し、その結果生じるカスパーゼの非細胞死機能により長期記憶AMIが起こる」ことを示唆している。行動遺伝学的手法および組織染色法を用いたレスキュー実験により、加齢個体では長期記憶学習後、記憶の固定および読み出しに重要な特定の神経細胞が過興奮およびカスパーゼ活性化することで、長期記憶AMIを引き起こすことを明らかにできたため。本研究は長期記憶AMI発症の細胞・分子機構について明らかにすることを目的としている。前年度までに我々は「加齢個体では長期記憶学習後、記憶の固定および読み出しに重要な神経細胞がKlg/Repo/dEAAT1経路不活性化により過興奮し、その結果機能不全がひきおこされ、AMIとなる」ことを示唆する結果を得ていた。具体的には、(1)グリア特異的グルタミン酸トランスポーターdEAAT1がKlg/Repo依存性長期
乳酸輸送担体(MCT)の発現量の変化が運動時及び運動後の乳酸の代謝に与える影響

乳酸輸送担体(MCT)のタンパク発現量は、トレーニングなどによって変化するのか、またその変化と運動時における乳酸の代謝とはどのように関係しているのかを検討した。まずMCTにはいくつかのアイソフォームがあるが、骨格筋や心筋に多いのはMCT1とMCT4であることを確認した。さらにトレーニングによる変化については、まずマウスの回転ケージ自由運動モデルにおいて、運動量がMCT1の増加に関係する因子であることがわかった。またマウスのさまざまトレーニングによる変化を検討した。MCT1は持久的トレーニング、またその一種と考えられる回転ケージ自由運動、また高強度トレーニングで、タンパク発現量が増加した。一方MCT4は持久的トレーニングや回転ケージ自由運動では、タンパク発現量が増加しなかった。しかし高強度トレーニングでは増加した。したがってMCT4のタンパク発現を高めるには運動強度が重要であることがわかった。MCTの変化、特にMCT1のタンパク量は、運動時の血中乳酸濃度を有意な負の相関が認められることから、MCT1タンパクの増加が運動時の乳酸の酸化による利用に関係していることが示唆された。次にラットのSTZモデル糖尿病ラットにおいては、糖代謝の低下と同様にMCT1及びMCT4タンパク量は低下した。しかし持久的トレーニングを行わせることにより、MCT1及びMCT4タンパク量は増加した。すなわち糖代謝が低下と高進に伴い、MCT1だけでなくMCT4のタンパク量も変化することが示された。さらにMCT1の細胞内局在に注目し、ミトコンドリアを単離してミトコンドリアMCT1のタンパク量を求めたところ、持久的トレーニングで増加し、運動時の血中乳酸濃度を有意な負の相関関係が認められた。このことはMCT1の増加が乳酸の酸化利用に大きく影響することをさらに裏付けた。乳酸輸送担体MCTについては、現時点ではその存在がようやく明らかになった段階であり、運動やトレーニングによってその発現がどのように変化し、それにより運動時及び運動後における乳酸の代謝がどう影響を受けるのかなどは明らかではないといえる。ここでMCTはタンパクであるから、その濃度を求めるには抗体を用いたウェスタンブロット法が用いられる。そこで本年度はMCT1及びMCT4の抗体を作成し、これらを用いてウェスタンブロット法により、タンパクレベルでラットのヒラメ筋、足底筋、長指伸筋、心臓、肝臓、腎臓などの組織による両輸送担体の発現量を比較検討した。その結果MCT1は心筋やヒラメ筋など酸化能力の高い組織に多いこと、MCT4はfastタイプの割合が多いと考えられる筋に多いことを確認した。このことは筋線維組成とMCTの発現とに関係があることを示している。そこでラットの尾懸垂によって特にslowタイプ線維にた筋で萎縮あると考えられる筋でのMCTの濃度変化を求めた。その結果尾懸垂により萎縮した足底筋において、MCT1の発現低下が観察された。ただしMCT4も発現が低下していた。また尾懸垂時に筋をストレッチされた状態にすると筋萎縮がかなり防ぐことができることが知られている。この状態では、MCT1及びMCT4の発現低下も抑えられていた。したがってMCTの発現には、筋線維タイプ、筋活動、また筋の構造上の要因も影響することが示唆された。乳酸輸送担体MCTについては、その存在が明らかになった段階であり、違動やトレーニングによってその発現がどのように変化し、それにより運動時及び運動後における乳酸の代謝がどう影響を受けるのかなどは明らかではない。MCTには7種類あることが1998年に報告されたが、そのうち運動による乳酸の代謝に強く関連すると考えられるのは、遅筋線維に多いとされるMCT1、速筋線維に多いとされるMCT4である。

これらについて持久的運動や高い強度の運動、また持久的トレーニングによって乳酸輸送担体発現が受ける影響を明らかにするとともに、MCTの発現の変化が運動時及び運動後における乳酸の代謝に与える影響を明らかにしていくことが本研究の目的である。13年度はまずトレーニングによってMCT量がどのように変化するのかについて、ラットに加えてマウスについても行った。その結果、マウスの自由運動、持久的トレーニング、スプリントトレーニングによって、MCT特にMCT1のタンパク量が増加することが明らかとなった。ただしトレーニング効果が得られるには1週間では短く、3-6週間は必要と考えられた。また自由運動に見られるトレーニング効果は、強度の低い持久的トレーニングに近いことが示唆された。一方MCT4は一般的にはあまりタンパク量に変化が起きにくいことがマウスでも確認されたが、スプリントトレーニングを行えば、ある程度はMCT4のタンパク量も増加することがわかった。こうしたトレーニングによって、マウスの高強度運動において乳酸の産生は変化なく除去が高まっていることが示唆され、その除去の高進にMCTタンパクの増加も貢献していることが示唆された。さらに糖尿病は糖代謝が低下した状態と考えられ、この時の乳酸代謝も低下する。この時のMCT発現についてもラットを用いて検討した。STZ投与糖尿病ラットでは乳酸の代謝が低下し、MCTタンパク量も低下していることがわかった。乳酸の細胞膜通過に当たっては、乳酸輸送担体MCTが働いている。MCTには7種類あることが1998年に報告されたが、そのうち運動による乳酸の代謝に強く関連すると考えられるのは、遅筋線維に多いとされるMCT1、速筋線維に多いとされるMCT4である。これらについて運動やトレーニングによってタンパク発現が受ける影響を明らかにするとともに、MCT発現の変化が運動時及び運動後における乳酸の代謝に与える影響を明らかにしていくことが本研究の目的である。14年度はトレーニングによってMCT量がどのように変化する時間変化について検討した。その結果、マウスの自由運動、持久的トレーニング、スプリントトレーニングによって、MCT特にMCT1のタンパク量が増加するのであるが、1週間では短く、3週間以降は大きなさらなる効果が見られにくくなることから、マウスでは3週間程度のトレーニング期間が必要と考えられた。ただし1週間の持久的トレーニングではMCTには必ずしも変化がなくても、高強度運動中の代謝については血中乳酸濃度が低下するといった効果が見られた。このことは持久的トレーニングでは脂質代謝の高進も大きく影響していることを示すと考えられる。一方これまでの細胞全体のMCTを分析しているが、さらに細胞膜を単離し、その中のMCTを求めることで、細胞膜におけるMCTのタンパク発現量を検討した。その結果でもこれまでの細胞全体を用いた結果と同様に、持久的トレーニングでMCT1が増えることが示された。
セミパラメトリック計量分析

この研究プロジェクトではまず最近になりセミパラメトリック計量分析法と呼ばれている統計理論と計量経済分析について、特にその設計的分析法についての理論的な意義と限界について検討した。伝統的な統計的理論の立場に加えて、ノンパラメトリック分析やセミパラメトリック分析の長所と短所についての評価を試みた。パラメトリック・モデルでは統計モデルの設定が間違っていると、従来の統計的推定理論からは非現実的な結論ができることが知られている。他方、パラメトリック・モデルを仮定せずにノンパラメトリックな統計分析法を用いると、往々にしてあまり実際には役立たないようなごく弱い結論しか導かれないことが主張されている。まず、こうした統計家の間で語られている直感的な議論の妥当性について検討した。この研究プロジェクトでは特に数理統計学や計量経済分析において経験尤度法(Empirical Likelihood Method)と呼ばれている方法がかなりの関心を持たれているので、経験尤度法も理論と応用について集中的に検討した。そして標準的な計量経済モデルにおいて、経験尤度法による最尤経験尤度法(MEL法)と一般化積率(モーメント)法(GMM法と呼ばれることが多い)を比較することに主として理論的な面での大きな成果が得られた。これまで計量経済分析における実証研究でよく用いられて来ているGMM法よりもMEL法はかなり良い統計的性質を持っていることが明らかとなった。我が国における計量経済学・計量経済分析の分野ではセミパラメトリック計量分析やノンパラメトリック計量分析に関する統計学的研究や経済、経営の実証分析がこれまで必ずしも十分活発に行われていなかった。そこで国内の関係する分野の研究者を招いて2002年1月7日-8日に慶應義塾大学経済学部において研究会を開催した。会議での研究報告テーマは応用経済学、計量経済学、金融計量経済分析、統計学の特殊な分野(セミパラメトリック分析とノンパラメトリック分析)などであったが、関係する研究分野が多岐に及んでいるので様々な話題について議論を行った。プロジェクト参加者はそれぞれミクロ計量経済分析、質的変量分析、時系列計量分析、ベイズ計量分析、確率論などの分野で研究活動を行っているので、各自、自分の得意な分野との関連で初期の研究を進めている。研究参加者の中で国友と山本は研究全体を統括するとともに、時系列におけるセミパラメトリツク分析を検討し、矢島は特にstatistical spatial analysisと呼ばれている分野におけるセミパラメトリック計量分析を検討した。縄田は主としてクロスセクション・データを解析するミクロ計量経済分析におけるトービット分析と呼ばれている方法におけるセミパラメトリック分析とその応用を再検討した。特に金融に関連して倒産確率が他の状態に依存する場合など新しい分野への応用についても大森と国友が検討中である。大森はベイズ統計学の立場からこの間、セミパラメトリツク計量分析の方法とその応用を検討しているが、特に応用分野としては労働経済学や医学・生物統計学で応用が広いDuration Analysis(生存時間解析)などを中心として検討した。実証分析については縄田・国友・大森を中心に日本の金融市場や労働市場に関するこれまでの計量分析の文献を検討するとともにデータの整備を進めている。この研究プロジェクトではまず最近になりセミパラメトリック計量分析法と呼ばれている統計理論と計量経済分析について、特にその統計的分析法についての理論的な意義と限界について検討した。パラメトリック・モデルでは統計モデルの設定が間違っていると、従来の統計的推定理論からは非現実的な結論がでることが知られている。他方、パラメトリック・モデルを仮定せずにノンパラメトリックな統計的分析法を用いると、往々にしてあまり実際には役立たないようなごく弱い結論しか導かれないことが主張されている。まず、こうした統計家の間で語られている直観的な議論の妥当性について検討した。この研究プロジェクトでは特に数理統計学や計量経済分析において経験尤度法(Empirical Likelihood Method)と呼ばれている方法がかなりの関心を持たれているので、経験尤度法の理論と応用について集中的に検討した。

そして標準的な計量経済モデルにおいて、経験尤度法による最尤経験尤度法(MEL法)と一般化積率(モーメント)法(GMM法と呼ばれることが多い)を比較することに主として理論的な面での大きな成果が得られた。これまで計量経済分析における実証研究でよく用いられて来ているGMM法よりもMEL法はかなり良い統計的性質を持っていることが明らかとなった。
都市計画分析による社会資本論(パットナム)の検証-日本民主主義の条件の探求

本研究は・都市計画を素材に民主主義の条件を探求するものであった。具体的には土地区画整理事業の実際を、包括的な数量分析と個別の都市別事例研究によって明らかにし、それを素材に民主主義の存立条件を探ろうとした。調査研究の成果は次の通りである。(1)包括的数量的検討では、国土交通省が初めて集計した全国土地区画整理事業データの活用分析:地域的偏差、都市化指数の規定力などは確認できたが、その他社会資本的変数の規定力は確認できなかった。(2)個別都市別分析:大阪府、愛知県、鳥取県、山形県、愛媛県などの諸都市を検討:○事業の多さ←主体(行政当局、住民、農協等団体)の積極性←区画整理の歴史・経験・経済合理性の意識・住民の行政への信頼という因果関係を析出○事業数少ない西日本では行政当局の積極性や能力が、事業数の多い東日本では住民側の開発意欲が重要であった。前者はまちづくりという公益が、後者は不動産価値の増進が強調される傾向が認められた。(3)都市計画分析に基づく民主主義の存立条件の検討:○住民の行政への信頼、地域社会における共同体意識の存在、住民における経済合理性・計算性が土地区画整理事業の条件であることは明らかであり、これは民主主義の条件と重なり合う。また、この事業の実施によって住民の参加感覚、政治的有効性感覚が生まれることもほぼ認められた。○区画整理をめぐる民主主義の存立はみられるが、より広域的、あるいは抽象的な課題に対する民主主義については薄弱であると推測された。普遍的信頼のレベルが民主主義の政治には必要と思われるが、その薄弱さに日本の民主主義の存立の限界が認められた。本研究は、都市計画の実際を素材に、人間関係のパターンをもとに民主主義や経済発展を説明しようとする社会資本論に依拠し、日本のそれらの現状を明らかにすることを意図している。本年は3年計画の初年度であった。1調査研究枠組みの構築(1)R.パットナムによる「社会資本論」の検討およびそれをめぐる諸論争の検討を行った。(2)日本における民主主義論、特に民主主義制度の運用の実際に関する諸研究の検討を行った(政治文化論等)(3)社会資本論をふまえた都市計画制度(特に土地区画整理事業)、その成果、政治・経済・社会的要素などの関係の理論化を試みた。2調査資料の収集(1)日本における都市計画、特に土地区画整理事業に関する基礎データを収集した:都道府県別データの収集とその集約、および東京都、鳥取県、愛知県、福井県、愛媛県など、地域別の詳細調査の実施3調査研究の成果(1)社会資本的要素を何によって指標化するかについては結論が得られかった:様々な世論調査などを利用(2)都市計画、特に区画整理事業の運用の地域的多様性を明らかにできた:その違いは、都市化などハードな条件ばかりではなく、住民間の関係、住民と行政との関係など、いわゆる社会資本の構成要素からも生まれていることは明らかにできた。今後は、社会資本的要素の指標化につとめると共に、この実証データを体系的に処理することが課題となる。それを民主主義の実際と結びつけることが最終的な課題と考えている。本研究は、都市計画を素材に民主主義の条件を探求するものであり、本年度は具体的に都市計画、特に土地区画整理事業の実際を、包括的な数量的分析によって、さらに個別都市のケーススタディによって、同事業の存立条件を解明することを目指した。調査結果は次の通りである。(1)包括的数量的検討では、国土交通省が初めて集計した包括的土地区画整理事業データを活用することで、実施;地域的偏差、都市化指数の規定力などは確認できたが、社会資本などの規定力など新しい発見は認められなかった。

(2)個別都市別分析:東京都、大阪府、福井県、愛知県の数都市を検討(昨年検討の鳥取県などを含めて検討、大都市・地方都市・中小都市および東日本・西日本の区分で都市を選択)・積極的な地域では、行政当局、住民、団体(農協など)などいずれかの主体の積極性が認められる。それを規定する要因としては、これまでの区画整理の歴史・経験、経済的開発指向の強さ(経済的合理性)、住民の行政施策への姿勢(住民-行政関係が協力的か、敵対的か)などが指摘できた。・事業数の少ない西日本では行政当局の積極性やその能力が、事業数の多い東日本では住民側の開発意欲が重要であった。前者はまちづくりという公益が、後者は不動産価値増進が強調される傾向があった。本研究の最終年度は、以上の都市計画調査を素材に、地域づくり、さらには民主主義の成立の用件を検討することになる。本研究は、都市計画を素材に民主主義の条件を探求するものであった。具体的には土地区画整理事業の実際を、包括的な数量分析と個別の都市別事例研究によって明らかにし、それを素材に民主主義の存立条件を探ろうとした。調査研究の成果は次の通りである。(1)包括的数量的検討では、国土交通省が初めて集計した全国土地区画整理事業データの活用・分析:地域的偏差、都市化指数の規定力などは確認できたが、その他社会資本的変数の規定力は確認できなかった。(2)個別都市別分析:大阪府、愛知県、鳥取県、山形県、愛媛県などの諸都市を検討:○事業の多さ←主体(行政当局、住民、農協等団体)の積極性←区画整理の歴史・経験・経済合理性の意識・住民の行政への信頼という因果関係を析出○事業数の少ない西日本では行政当局の積極性や能力が、事業数の多い東日本では住民側の開発意欲が重要であった。前者はまちづくりという公益が、後者は不動産価値の増進が強調される傾向が認められた。(3)都市計画分析に基づく民主主義の存立条件の検討:〇住民の行政への信頼、地域社会における共同体意識の存在、住民における経済合理性・計算性が土地区画整理事業の条件であることは明らかであり、これは民主主義の条件と重なり合う。また、この事業の実施によって住民の参加感覚、政治的有効性感覚が生まれることもほほ認められた。○区画整理をめぐる民主主義の存立はみられるが、より広域的、あるいは抽象的な課題に対する民主主義については薄弱であると推測された。普遍的信頼のレベルが民主主義の政治には必要と思われるが、その薄弱さに日本の民主主義の存立の限界が認められた。
ヒザラガイの磁鉄鉱を主成分とする歯の形成メカニズム解明と環境・材料科学への応用

磁鉄鉱を主成分とするヒザラガイの歯の形成メカニズム解明のため、環境から歯に至るまでの鉄の移動過程と磁鉄鉱形成プロセスを検討した。またヒザラガイの元素濃集能力を応用し、Srや希土類元素のモニタリングの検討を行った。PIXEによる元素分析の結果、ヒザラガイの歯に対してSrの蓄積が認められた。また、ヒザラガイの歯のマトリクスであるキチンとリン酸化キチンに対するFeとCaの吸着実験を行い、リン酸化が金属元素の吸着に有利であることも見いだした。鉄は生物の必須元素であるが、体内で磁鉄鉱(Fe_3O_4)を形成し硬組織の主成分とする生物は、走磁性バクテリアとヒザラガイのみである。なぜこれらの生物が磁鉄鉱を形成するのかという疑問から、多くの研究者がヒザラガイに注目しているが、その磁鉄鉱形成メカニズムはまだほとんど明らかになっていない。ヒザラガイが環境に存在するどのような物質を鉄の供給源としているか、その鉄をどのような化学形で消化・運搬し、磁鉄鉱を形成しているか、どのように磁鉄鉱が選択的に形成されるのかを明らかにする目的で、研究を始めた。まず、4月に徳島県鳴門海岸でヒザラガイを50個体ほど採集し、実験室で数日放置し、排泄物を回収した。その内容物のうち、濾過で固形物を回収することができることを確認した。次に8月に福島県沿岸部でヒザラガイの採集を試みたが、震災の影響で潮間帯の生態系が荒廃しており、ヒザラガイをほとんど確認することができなかった。計画では、非被災地である徳島と被災地である福島でのヒザラガイの比較を行う予定であったが、福島の海岸が復活するにはもう少し時間を要するようであったため、徳島県のヒザラガイについての調査を進めることとした。ここで、ヒザラガイの胃の内容物から類推されるヒザラガイの歯の鉄の供給源に対して可搬型蛍光X線分析装置を利用して元素分析を行う計画であったが、可搬型蛍光X線分析装置の納期が9月以降になってしまい、潮汐の影響で良好なフィールド調査を行うことが平成24年度は困難になってしまった。このため、可搬型蛍光X線装置を活用したフィールド調査と試料採集を平成25年度に実施することとし、ヒザラガイの歯に対して、X線回折・XAFS法・ラマン分光・PIXE分析などを実施し、基礎データの取得を行った。石巻、沖縄、徳島で採集したヒザラガイの歯舌を樹脂包埋し、正中線まで研磨を進めた切片試料に対し、まずレーザーアブレーション-MSとマイクロPIXEによる2次元元素マッピングを行った。ヒザラガイの歯の摂餌面には鉄、背面にはリン酸カルシウムが濃集するが、その他摂餌面にはCo, Cu, Niが、背面にはSrなどのアルカリ土類金属と希土類元素がそれぞれ微少量共存することがわかった。Srについては放射性同位体比について検討を行う予定であったが、Srの含有量が小さく、東北地方で採集されたヒザラガイとその他の地域の間で有意差を得ることができなかった。次に希土類元素についてICP-MSを用いてより高感度な元素分析を行い、海水で規格化してREEパターンを求めたところ、成熟した歯と比較して歯の形成初期ではCeの正の異常とHREEの高濃縮が確認された。これと平行して、歯舌のマトリクスであるキチンに対するCaとFeの吸着能を評価するために、実験室系での吸着実験を行った。特に、多糖質であるキチンは官能基をリン酸化することにより、より高い金属イオンの吸着を示すことが期待されたため、通常のαキチンとリン酸化したキチンについて、海水と同じpH条件下における吸着能の差異を比較した。その結果、リン酸化により、Ca, Feの吸着能が向上することを確認した。石巻、沖縄、徳島で採集したヒザラガイの歯舌を樹脂包埋し、正中線まで研磨を進めた切片試料に対し、マイクロPIXEによる2次元元素マッピングを行った。Srについては、主成分であるFeの輻射の影響で、はじめはPIXEでの検出が困難であったが、プロトン入射の出力を押さえたところ、良好にSrのピークが検出できるようになった。このモードでヒザラガイの歯舌試料のPIXE分析を続行したが、地域差を見ることができなかった。これと平行して、歯舌のマトリクスであるキチンに対するCaとFeの吸着能を評価するために、実験室系での吸着実験を行い、金属吸着量を原子吸光度法で測定した。多糖質であるキチンは官能基をリン酸化することにより、より高い金属イオンの吸着を示すことが期待されたため、通常のαキチンとリン酸化したキチンについて、海水と同じpH条件下における吸着能の差異を比較した。同様の吸着実験をヒザラガイの歯舌のキチンで実施したが、原子吸吸光の検出範囲では優位な金属吸着を観察することができなかった。また、CaとFeの共存状態ではCaの吸着はFeよりも低かった。この理由を解明するために、次年度はキチンに吸着したCaとFeの化学状態分析を行う。

天然に生息するヒザラガイの採集について、沖縄・徳島などの非汚染地域では計画通り実施することができたが、東北地方、特に福島県の海岸域について、複数回採集を試みたにもかかわらず、ヒザラガイを発見することができなかった。これは、2011年の地震と津波の影響で海岸域の生態系がまだ十分回復していないこと、ヒザラガイの生息する岩礁帯が立ち入り禁止区域に多く存在し、現時点では採集を実施できないことが大きな原因である。宮城県中部の石巻の海岸では十分数のヒザラガイの生息を確認することができたが、これらについては放射性同位体の濃集を確認することができなかったため、福島県でのヒザラガイを入手することが重要であり、平成26年度では、これを達成することができなかった。石巻、沖縄、徳島、福島、オーストラリアで採集したヒザラガイの歯舌を樹脂包埋し、正中線まで研磨を進めた切片試料に対し、マイクロPIXEによる2次元元素マッピングを行った。ヒザラガイの歯の摂餌面には鉄、背面にはリン酸カルシウムが濃集するが、その他摂餌面にはCo, Cu, Niが、背面にはSrなどのアルカリ土類金属と希土類元素がそれぞれ微少量共存することがわかった。Srについては、主成分であるFeの輻射の影響で、はじめはPIXEでの検出が困難であったが、プロトン入射の出力を押さえたところ、良好にSrのピークが検出できるようになった。このモードで福島と徳島、オーストラリアで採集した歯舌試料のPIXE分析を続行したが、地域差を見ることができなかった。これと平行して、歯舌のマトリクスであるキチンに対するCaとFeの吸着能を評価するために、実験室系での吸着実験を行った。特に、多糖質であるキチンは官能基をリン酸化することにより、より高い金属イオンの吸着を示すことが期待されたため、通常のαキチンとリン酸化したキチンについて、海水と同じpH条件下における吸着能の差異を比較した。その結果、リン酸化により、Ca, Feの吸着能が向上することを確認した。また、CaよりもFeの方に優勢な吸着能を示した。これはヒザラガイの歯の形成機序と合致することから、ヒザラガイの歯への特異的な吸着にキチンが関連している可能性が示唆された。磁鉄鉱を主成分とするヒザラガイの歯の形成メカニズム解明のため、環境から歯に至るまでの鉄の移動過程と磁鉄鉱形成プロセスを検討した。またヒザラガイの元素濃集能力を応用し、Srや希土類元素のモニタリングの検討を行った。PIXEによる元素分析の結果、ヒザラガイの歯に対してSrの蓄積が認められた。また、ヒザラガイの歯のマトリクスであるキチンとリン酸化キチンに対するFeとCaの吸着実験を行い、リン酸化が金属元素の吸着に有利であることも見いだした。まだ実現できていない、福島地域でのヒザラガイの採集地域検索を実施する。オーストラリアでのヒザラガイの採集も実施し、元素濃集の種による差異や地域差について、日本と対応させながら検討する。同時に、日本でのヒザラガイの採集についても、継続して実施し、経時変化についてもデータを蓄積する。できていない、福島地域でのヒザラガイの採集地域検索について重点を置く。ヒザラガイの歯舌の形成環境と同様の、常温・常圧、中性付近での湿式による磁鉄鉱形成を、実験室系で再現することを試みる。この検討は既に九州大学理学部化学の横山拓史教授と共同で始めており、合成環境の中で鉄を酸化・還元する共存元素が存在すると、中性付近でも磁鉄鉱が選択的に形成されることを予備的な知見として得ている。
細菌内毒素受容体の同定とその機能解析

LPS受容体の特性に関する解析を行った。1.CD14陰性非マクロファージ細胞株のLPS反応性に関する解析。マウス骨髄ストローマ細胞株であるST2細胞は、CD14mRNAの発現はなかった。この細胞のLPS反応性を詳細に検討した。その結果、ST2細胞は低濃度のLPSにも反応してIL-6を産生する。LPSの多糖鎖部分や血清成分はST2細胞のLPS反応性にあまり影響がしない。LPSアゴニストであるタキソ-ルはST2細胞のIL-6mRNA発現を誘導し、この反応はLPSアンタゴニストであるRhodobacter spheroisdesリピドAによって抑制された。2.CD14遺伝子を導入したST2細胞株のLPS反応性およびLPS結合性に関する解析。マクロファージ上でのCD14分子の機能がCD14分子単独によるものか、それともCD14とLPS受容体との会合が必要なのかを解析する目的で、CD14遺伝子を発現ベクターに組み込みLPS反応性CD14陰性細胞株のST2細胞や、LPS受容体を発現していないと期待されるCOS細胞にCD14遺伝子を導入した。3.CD14非依存性のLPS結合実験の確率およびLPS結合特性に関する解析。CD14に依存しないLPSとLPS受容体との結合を観察することを目的として、ST2細胞に対する、標識LPSの結合実験を行った。この結果、ST2細胞ではCD14に依存しないLPS結合部位が存在することが明らかとなった。当初の研究計画に沿って、主にLPS受容体の特性に関する生物学的解析を行ない、予想以上の成果を得ることができた。特に、CD14分子に存しないでLPSに高感度で反応する非常にすぐれた細胞実験系の確立ができたことは、この研究の大きな進展であったと思う。この系を用いて、CD14に依存しないLPSとLPS受容体との直接の相互作用を解析し、その結果、これまでマクロファージでその存在が想定されていたがCD14分子のためにその実体が遮蔽されていたLPS受容体の特性の多くを明らかにすることができた。平成6年度は主にLPS受容体の特性に関する解析を行った。LPSアゴニストであるタキソ-ルはST2細胞のIL-6mRNA発現を誘導し、この反応はLPSアンタゴニストであるRhodobacter spheroidesリピドAによって抑制された。

3.CD14非依存性のLPS結合実験の確率およびLPS結合特性に関する解析。CD14に依存しないLPSとLPS受容体との結合を観察することを目的として、ST2細胞に対する、標識LPSの結合実験を行った。この結果、ST2細胞ではCD14に依存しないLPS結合部位が存在することが明らかとなった。平成6年度は当初の研究計画に沿って、主にLPS受容体の特性に関する生物学的解析を行い、予想以上の成果を得ることができた。特に、CD14分子に依存しないでLPSに高感度で反応する非常にすぐれた細胞実験系の確立ができたことは、この研究の大きな進展であったと思う。この系を用いて、CD14に依存しないLPSとLPS受容体との直接の相互作用を解析し、その結果、これまでにマクロファージでその存在が想定されていたがCD14分子のためにその実体だ遮蔽されていたLPS受容体の特性の多くを明らかにすることができた。さらに、このLPS受容体とCD14の関係、LPS受容体のLPS結合特性の詳細など引き続いて検討して行く予定である。LPS受容体の特性に関する解析を行なった。1.CD14陰性非マクロファージ細胞株のLPS反応性に関する解析。マウス骨髄ストローマ細胞株であるST2細胞は、CD14mRNAの発現はなかった。この細胞のLPS反応性を詳細に検討した。その結果、ST2細胞は低濃度のLPSにも反応してIL-6を産生する。LPSの多糖鎖部分や血清成分はST2細胞のLPS反応性にあまり影響がしない。LPSアゴニストであるタキソ-ルはST2細胞のIL-6mRNA発現を誘導し、この反応はLPSアンタゴニストであるphodobacter spheroidesリピドAによって抑制された2. CD14遺伝子を導入したST2細胞株のLPS反応性およびLPS結合性に関する解析。マクロファージ上でのCD14分子の機能がCD14分子単独によるものか、それともCD14とLPS受容体との会合か必要なのかを解析する目的で、CD14遺伝子を発現ベクターに組み込みLPS反応性CD14陰性細胞株のST2細胞や、LPS受容体を発現していないと期待されるCOS細胞にCD14遺伝子を導入した。3. CD14非依存性のLPS結合実験の確率およびLPS結合特性に関する解析。当初の研究計画に沿って、主にLPS受容体の特性に関する生物学的解析を行い、予想以上の成果を得ることができ、特に、CD14分子に依存しないでLPSに高感度で反応する非常にすぐれた細胞実験系の確立ができたことは、この研究の大きな進展であったと思う。この系を用いて、CD14に依存しないLPSとLPS受容体との直接の相互作用を解析し、その結果、これまでマクロファージでその存在が想定されていたがCD14分子のためにその実体が遮蔽されていたLPS受容体の特性の多くを明らかにすることができた。