hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異機種計算機環境におけるモーバイルオブジェクト実行システムに関する研究

本年度は,昨年度の研究成果の外部公表を行うとともに,提案方式の検証を行うために,昨年度実装したプロトタイプシステム上で以下のアプリケーションの実装を行い,評価を行った.1.既存プログラミング言語のモーバイル化あるプログラミング言語システムにモーバイルエージェントの機能を導入しようとする場合,プログラミング言語システムの実行時システムの実行状態を直列化(シリアリゼーション)する必要があるため,それを実装するシステムプログラマには,対象プログラミング言語システムに関する深い知識と多大な作業量が要求される.本実現では,昨年度の研究成果で実現した,分散環境でユーザ透明に移動可能なモーバイル・メモリセグメントの機構を用いて,明示的なシリアリゼーション記述をすることなしに,モーバイルエージェントシステムを系統的に実現する方法を提案した.2.仮想機械独立なアプレットの実現WWW環境において,サーバにあるプログラムコードを動的にダウンロードし,クライアントサイトでのセキュリティ保全を行いながら実行することを可能としたプログラムコードをアプレットと呼ぶ.現在の多くのアプレットシステムは,実装の容易さや異機種環境への対応などの利点から,計算機アーキテクチャに独立な仮想機械コードを用いてアプレットを実現している.仮想機械コードは,インタプリタによる解釈実行,もしくはネイティブコードへの変換処理を伴うため,仮想機械コードの設計が実行時性能に大きく影響する.しかし,通常,アプレットシステム毎に仮想機械コード表現を固定していて,変更することはできない.本実現では,昨年度実装したプロトタイプ上で,仮想機械コードをネイティブコードに変換するJust-In-Time(JIT)コンパイラをモバイル化することで,仮想機械コードの設計に独立なアプレット実行環境を実現した.本年度は,異機種環境においても各計算機の性能を最大限に利用するモーバイルオブジェクト実行システムの設計を行った.・動的双方向変換の実現異機種環境において,オブジェクト移動時にオブジェクトを正準表現形式を用いて記述することにより,各計算機アーキテクチャの違いを吸収することができる.一方,オブジェクト実行時は,計算機性能を最大限に利用することができるネイティブ表現を用いることが望ましい.本年度は,正準表現とネイティブ表現の間を双方向に変換する技術を実現した.モーバイルオブジェクトに含まれるプログラムコード,データ,計算状態のそれぞれに対して変換を行う.また,新しい計算機アーキテクチャや正準表現に柔軟に対応するために,用いる正準表現を動的に選択する機構を実現した.・双方向変換可能な正準表現形式の設計動的双方向変換に使用する正準表現形式に関する検討を行った.本年度は,オブジェクトに含まれるプログラムコード,データ,計算状態のそれぞれに双方向変換が可能な正準表現の条件ついての検討を行い,6つの条件を定義した.・プロトタイプシステムの実装上述した条件を満たす正準表現形式を用いて,動的双方向変換に基づいたモーバイルオブジェクト実行システムのプロトタイプを実装した.実装環境は,オペレーティングシステムのサービスおよびインターフェースが同一で計算機アーキテクチャのみが異なる環境を用いた.本研究費で購入した計算機をLAN環境に接続し,プロトタイプシステムの動作テストを行い,動的双方向変換の有効性を検証した.本年度は,昨年度の研究成果の外部公表を行うとともに,提案方式の検証を行うために,昨年度実装したプロトタイプシステム上で以下のアプリケーションの実装を行い,評価を行った.1.既存プログラミング言語のモーバイル化あるプログラミング言語システムにモーバイルエージェントの機能を導入しようとする場合,プログラミング言語システムの実行時システムの実行状態を直列化(シリアリゼーション)する必要があるため,それを実装するシステムプログラマには,対象プログラミング言語システムに関する深い知識と多大な作業量が要求される.本実現では,昨年度の研究成果で実現した,分散環境でユーザ透明に移動可能なモーバイル・メモリセグメントの機構を用いて,明示的なシリアリゼーション記述をすることなしに,モーバイルエージェントシステムを系統的に実現する方法を提案した.2.仮想機械独立なアプレットの実現WWW環境において,サーバにあるプログラムコードを動的にダウンロードし,クライアントサイトでのセキュリティ保全を行いながら実行することを可能としたプログラムコードをアプレットと呼ぶ.現在の多くのアプレットシステムは,実装の容易さや異機種環境への対応などの利点から,計算機アーキテクチャに独立な仮想機械コードを用いてアプレットを実現している.仮想機械コードは,インタプリタによる解釈実行,もしくはネイティブコードへの変換処理を伴うため,仮想機械コードの設計が実行時性能に大きく影響する.しかし,通常,アプレットシステム毎に仮想機械コード表現を固定していて,変更することはできない.本実現では,昨年度実装したプロトタイプ上で,仮想機械コードをネイティブコードに変換するJust-In-Time(JIT)コンパイラをモバイル化することで,仮想機械コードの設計に独立なアプレット実行環境を実現した.
新規血栓溶解剤の開発を目指したケミカルバイオロジー研究

環状ペンタペプチドマルホルミンA1(MA1)の構造活性相関は、MA1の血栓溶解促進活性に分子内ジスルフィド結合の形成および疎水性側鎖の存在が重要なことを示した。また、MA1の血栓溶解促進と細胞毒性には相関が観察されなかったことから、両活性の分割が可能であることが示唆された。放射性同位体標識体と蛍光標識体を用いた実験は、MA1の細胞内局在を明らかにした。また、マルホルミンアフィニティー担体の使用によって、65kDaと22 kDaの細胞内マルホルミン高親和性タンパク質が検出された。近年の血栓性疾患発症の増加傾向から、その治療ならびに予防は重要である。本研究では、微生物二次代謝産物から発見した血栓溶解促進物質マルホルミンの細胞内分子標的をケミカルバイオロジーアプローチによって明らかとし、また構造活性相関研究からマルホルミンをファーマコアとした新規血栓溶解剤の応用を目指す。さらに、同定した分子標的をターゲットとする新たな低分子化合物の探索を行なう。以上の研究により、新しい作用機序を有した血栓溶解剤開発の分子基盤を創製する。平成20年度は、in vitro線溶活性評価系を用いた天然型及び還元型マルホルミンの構造活性相関を行なうために、マルホルミン生産菌であるAspergillus niger F7586株を培養し、マルホルミンA1を含む天然型マルホルミン類の単離・精製を行なった。現在、マルホルミンA1の分子内ジスルフィド結合を還元アルキル化した還元マルホルミンの作製を進めている。また、マルホルミンをリード化合物とした非天然型マルホルミン誘導体のin vitro線溶活性評価を行うため、2つの方法((1)固相担体に順次アミノ酸を導入して直鎖状ペプチドを調整後、ジスルフィド結合を形成させ、担体からの脱離、最後に還化する方法。(2)システインのスルフヒドリル基に固相担体を導入し、順次アミノ酸を導入して直鎖状ペプチドを調整後、還化し、最後に、担体からの脱離とジスルフィド結合の形成を同時に行う方法。)で誘導体合成の条件検討を行っている。平成21年度は、in vitro線溶活性評価系を用いた天然型及び還元型マルホルミンの構造活性相関を行なうために、マルホルミン生産菌であるAspergillus niger F7586株を培養し、天然型マルポルミンA1、A2、A3(B1b、C)、A4、B4を単離・精製した。また、マルホルミンAlの分子内ジスルフィド結合を還元した還元マルホルミンA1、さらにアルキル化した還元アルキル型マルホルミンA1を固相化法によって合成した。マルホルミン合成に先立ち、マルホルミンの部分構造体であるジスルフィドD-システイニル-D-システインを作成し、in vitro線溶活性評価系で活性評価したところ、活性は認められなかったことから、活性発現にはタイトな環状構造が必須であることがわかった。今後、天然型及び還元型マルホルミンの構造活性相関を進め、側鎖のアミノ酸やジスルフィド結合の重要性を調べる。また、マルホルミンの分子標的を同定するための、蛍光標識マルホルミンや光アフィニティータグ/ビオチン標識マルホルミンの作成も進めている。平成22年度は、in Vitro線溶活性評価系を用いた非天然型マルホルミンの構造活性相関を行なった。非天然型マルホルミンは2-クロロトリチルクロリド担体を用いた固相合成により作成した。天然型マルホルミンA1(MA1)の分子内ジスルフィド結合を還元した結果、血栓溶解促進活性は消失した。天然型MA1の構成アミノ酸をアラニンに置換した5種の誘導体の活性評価の結果、L-ValをL-Alaに置換した3-AlaMA_1が天然型MA_1と比較して約50%の活性を示したのに対し、他のアラニン誘導体は活性を示さなかった。

天然型MA1内の疎水性トリペプチド(L-Val-D-Leu-L-Ile)をリジンに置換した3種の誘導体の活性評価の結果、いずれのリジン誘導体にも促進活性が見出せなかった。しかし、リジン側鎖のε-アミノ基をBoc基で保護したリジン誘導体には促進活性が検出された。同様に、疎水性トリペプチドをフェニルアラニンに置換した3種の誘導体からも促進活性が検出された。以上の結果から、MA1の活性発現には分子内ジスルフィド結合および疎水性側鎖の存在が重要なことがわかった。また、活性に依存しない細胞毒性の増強が確認された。これは、MA1による血栓溶解促進活性と細胞毒性が相互に依存せず、分割できる可能性を示した。今後、リジン誘導体を用いたマルホルミンアフィニティーカラムを作成し、細胞内分子標的の同定を進めていく。
伝統工芸技法の仮想体験に基づくミュージアムのディジタル化技術の開発

本研究では,より進んだデジタルミュージアムの実現を目的として,工芸技法を仮想的に体験できるシステムや映像を対話的に生成したり制御したりするシステムを開発した.具体的には,沈金技法をCG空間で仮想体験できるシステムや,三次元CG空間で縄文土器の文様生成をシミュレーションするシステムなどを開発した.また多数のビデオ素材を同時に再生しながら対話的操作を行うシステム,運動視差立体視CGを用いたシステム,お絵描きをCGで拡張するシステムなどを開発した.また,ソーシャルメディアを用いて,ミュージアム所蔵品に関する様々な知識を共有できるオンラインミュージアムを提案した.本研究では,より進んたデジタルミュージアムの構築を目指して,ミュージアムで活用できる対話的CG作成手法やNPR手法,展示用CG手法を開発する.日本の伝統美術工芸技法も対象として,ミュージアム来館者が楽しんだりミュージアムでの調査研究で活用できる伝統工芸仮想体験システムの開発を行う.またミュージアムの資料や情報を来館者に効果的に提示するシステムの開発を行う.平成24年度は,まず縄文土器を研究する考古学者などを対象にして,対話的縄文生成シミュレーションシステムを開発した.実際の縄文土器制作に使用される二段縄や棒巻き付け縄の三次元形状を仮想空間で再現して,これらの仮想縄をCG空間の仮想土器上で転がすことで,縄文生成のリアルタイムシミュレーションを行った.これにより,様々な縄の生成と縄文の確認をCG上で素早く正確に行うことが可能となり,縄文土器文様の研究に活用することができるようになった.次に,ミュージアムの写真やビデオの資料を来館者に効果的に提示することを目的として,多数のビデオ素材を同時に再生しながら,ユーザが対話的に映像や音声を強調することができるシステム「GAYAIT」を開発した.このシステムは名古屋市科学館で常設展示されるとともに,科学館50周年イベントの特別展示でも使用された.また対話的NPR手法として日本の伝統工芸手法のガラス切子に着目して,レイトレーシングの高速化に基づく対話的ガラス切子細工体験システムの開発を行った.加えて,運動視差による立体視に対応した対話的三次元CG作成手法も開発した.その他に三次元CG基盤技術として,実際のスケッチブックの絵から三次元CGを作成する手法,実空間やユーザを三次元CG化して対話操作する手法などを開発した.なお,これらの研究成果のいくつかは国内外の会議や学会誌で発表を行った.本研究では,より進んたデジタルミュージアムの構築を目指して,考古学者やミュージアム学芸員の研究補助を目的としたデジタルシステムの開発を行ってきた.また,ミュージアムで活用できる対話的CG作成手法の開発や,それらを活用したインタラクティブデジタルコンテンツの開発を行ってきた,平成25年度は,考古学者向けのCGを用いた対話的縄文生成シミュレーションシステムについて,目的の特性を持つ縄を対話的かつ直感的に生成することができるインタフェースを開発した.また,実際の縄によって生成された縄文と縄文生成シミュレーションで生成した縄文との詳細な比較を行い,システムの有用性を検証した.さらに,遺跡から出土した土器片からの土器復元の補助を目的として,三次元データに基づく接合部自動認識に関する基礎研究を行った.次に,ミュージアムで活用できるシステムとして,星座を立体的に観察することができる天体ビューアの開発を行った.運動視差立体視技術を用いることで,星座の星が空間中に浮かんでいるように感じ,ユーザが動き回ることで地球以外から見た星座の様子を仮想的に観察できるシステムである.また,テーブル上の物体を擬似的に三次元コピーするシステムの開発を行った.これは,テーブル上の置いた物体を三次元的にスキャンしたデータを生成して,そのデータをユーザの視点に合わせて運動視差立体視CGで表示することで,物体の三次元CGがテーブル上に残像のように存在することを体験できるシステムである.その他,スケッチブックにペンでお絵描きをすることで三次元CGを対話的に生成するとともに,お絵描きを通じて三次元CGとのインタラクションを行うことができるシステムの開発を行った.なお,これらの研究成果のいくつかは国内外の会議や学会誌で発表を行った.本研究では,より進んだデジタルミュージアムの実現を目的として,工芸技法を仮想的に体験できるシステムや映像を対話的に生成したり制御したりするシステムを開発した.具体的には,沈金技法をCG空間で仮想体験できるシステムや,三次元CG空間で縄文土器の文様生成をシミュレーションするシステムなどを開発した.また多数のビデオ素材を同時に再生しながら対話的操作を行うシステム,運動視差立体視CGを用いたシステム,お絵描きをCGで拡張するシステムなどを開発した.また,ソーシャルメディアを用いて,ミュージアム所蔵品に関する様々な知識を共有できるオンラインミュージアムを提案した.本研究では,より進んだディジタルミュージアムの構築を目指して,対話的CG作成手法やNPR手法をミュージアムで活用するための技術を開発する.主に日本の伝統美術工芸技法を対象として,ミュージアム来館者が楽しんだりミュージアムでの調査研究で活用できる伝統工芸仮想体験システムの開発を行う.またミュージアム内やオンラインで情報発信や情報共有を行うシステムの開発を行う.平成23年度は主にミュージアム来館者向けのシステムのための手法開発を行った.申請者が開発してきた仮想沈金システムを拡張して,濃淡画像から輪郭部分を抽出して,沈金のための三次元的な素彫りを仮想漆面に自動的に施す手法を開発した.この手法は沈金の生成手法を紹介するシステムに応用可能である.

また,考古学者との共同研究で三次元CG空間で縄文生成を対話的に再現する手法を開発した.縄文生成に様々な縄の三次元形状を球ベースで構築して,これらの仮想縄を仮想粘土板上で転がしながら衝突判定を行うことで,リアルタイム縄文生成シミュレーションを実現した.様々な縄の生成とその縄による文様の確認をCGで素早く行うことが可能となり,縄文土器文様の研究や紹介に活用することが可能となる.ソーシャルメディアを活用したオンラインミュージアムの提案も行った.所蔵品に関する様々な知識の共有や複数のミュージアムの連携を行うことで,初心者にはわかりやすく,熟練者には幅広い知識の習得が可能となった.さらに多数のビデオ素材を同時に再生して,ユーザ操作に応じて一つのビデオ素材の映像と音声を強調して提示するシステム「GAYAIT」を開発した.これはメディアアートの一種だが,ビデオ素材を印象的に再生することができるため,科学館の映像素材を展示するためのシステムにも用いられることになった.なお,これらの研究成果のいくつかは国内外の会議で発表を行った.本研究の目的は,既存のミュージアムに対してコンピュータ技術を活用したデジタルミュージアムの構築のための技術を開発することである.特に日本の歴史や文化に関する文化財を保有するミュージアムにおいて,CGやVR,マルチメディア技術を活用して,来館者や研究者が使用できるシステムを開発する.また,そのための基盤技術を開発する.平成23年度は主に来館者に向けた技術やシステム開発を行った.その中では,伝統工芸の一つである沈金に着目して,CG空間で対話的に沈金を体験できる仮想沈金システムの開発や拡張を行った.また,ソーシャルメディアを活用したオンラインミュージアムを開発した.さらに,縄文生成シミュレーションの基盤技術を開発したり,ミュージアムでの展示に活用できる映像提示基盤技術「GAYAIT」を開発した.そして,平成24年度は来館者に加えて,ミュージアム内の研究者に向けた技術やシステム開発を進めた.その中で開発した縄文生成シミュレーションシステムは,縄文土器制作で実際によく使われる二段縄や棒巻き付け縄の三次元形状を仮想空間で再現して,リアルタイムで土器表面で縄を転がすシミュレーションを行い,縄文を三次元CGで正確に生成することを可能とした.これは考古学者による様々な縄による縄文文様の研究を支援することができる.また映像提示技術「GAYAIT」を名古屋市科学館のビデオ資料を提示する常設展示物の中で使用したり,50周年記念イベントで活用することができた.これらの成果は国内の学会誌や国内外の会議で発表を行った.加えて,伝統工芸ガラス細工である切子を仮想空間で体験する手法の開発を進めるとともに,三次元CGを対話的かつ直感的に生成するための基盤技術の開発を行って国内外の会議で発表を行った.以上のことにより,おおむね順調に研究が進展していると判断する.本研究の目的は,既存のミュージアムに対してコンピュータ技術を活用したディジタルミュージアムの構築のための技術を開発することである.
HER2導入マウスによる胆道発癌、癌進展因子の探索と新規イムノトキシン療法の開発

BK5.ErbB2トランスジェニックマウスの解析BK5.erbB2トランスジェニックマウス(以下Tgマウス)胆嚢癌ではWt胆嚢に比して、Muc1、Muc3の転写レベルは低下していたが、Muc4は顕著に増加していた。インサイツハイブリダイゼーション・免疫組織化学よりMuc4mRNAおよび蛋白はTgマウス胆嚢癌の癌上皮に顕著に発現していた。また免疫組織化学よりMuc4はerbB2と同一癌上皮部位に発現していた。免疫沈降の結果よりMuc4はerbB2と複合体を形成しており、Wt胆嚢に比してTgマウス胆嚢癌ではerbB2のチロシンリン酸化は顕著に亢進していた。Tg胆嚢癌部に比して、気管、食道、前胃におけるMuc4発現は微弱または陰性であった。本TgマウスにおけるMuc4発現は、胆嚢癌部位のみに過剰発現が認められたこと、癌部は非癌部に比して顕著な発現が認められたこと、erbB2と複合体を形成することより、そのチロシンリン酸化を亢進することより考えて、胆嚢発癌またその進展にかかわるerbB2シグナル伝達機構の活性化に重要な役割を演じていることが推測された。ヒト胆嚢癌における癌関連粘液形質MUC4の解析ヒト胆嚢癌51例における手術標本についてMUC4の発現頻度および病理学的悪性度との関連性について検討した。その結果、MUC4は51例中34例(67%)に発現していた。特に、高分化あるいは中分化腺癌における発現頻度が高率であった。免疫沈降と蛍光免疫染色の結果、MUC4は癌遺伝子産物であるerbB2と会合していた。さらにMUC4とerbB2の会合はerbB2の顕著なリン酸化と関連していた。その下流では、MAPK、Aktのシグナル分子のリン酸化が生じており、またアラキドン酸代謝の活性化因子であるCOX-2の強い誘導が観察された。細胞実験において、heregulinの存在下では、MUC4の過剰発現は細胞増殖能を亢進させた。これらの解析結果より、MUC4は、胆嚢癌部位のみに過剰発現が認められたこと、erbB2と複合体を形成することより考えて、胆嚢発癌またその進展にかかわるerbB2シグナル伝達機構の活性化に重要な役割を演じていることが推測された。BK5.ErbB2トランスジェニックマス(以下Tgマウス)はErbB2過剰発現し,3ヶ月でほぼ100%に高分化型胆嚢癌を発症する.本Tgマウスにおける胆嚢癌発生のメカニズムについて,ErbB2シグナル伝達機構の活性化の点より検討するために,Tgマウス胆嚢癌における粘液糖蛋白の発現プロフィールを出生後より経時的変化を解析し,さらにMuc4とerbB2の複合体形成についても検討した.生後2,4,8,12週のTg胆嚢について胆嚢癌の発生頻度,ムチン遺伝子プロフィール(PCR),Muc4発現(PCR,インサイツハイブリダイゼーション,免疫組織化学),Muc4とerbB2の複合体形成(免疫沈降)について解析を行い,野生マウスと比較した.またTgマウス胆嚢の癌部および非癌部におけるMuc4発現の比較(PCR,免疫組織化学),胆嚢癌部とerbB2の過剰発現が認められる気管,食道,前胃におけるMuc4発現の比較(免疫組織化学)についても検討した.本Tgマウスにおける胆嚢癌の発生頻度は2週(50%),4週(43%),8週(67%),12週(100%)であった.12週Tg胆嚢癌ではWtに比して,Muc1,Muc3の転写レベルは低下していたが.Muc4は799-1732%まで増加していた.インサイツハイブリダイゼーション・免疫組織化学の解析よりMuc4mRNAおよび蛋白はTgマウス胆嚢癌の癌上皮に顕著に発現していた.また免疫組織化学よりMuc4はerbB2と同一癌上皮部位に発現していた.免疫沈降の結果よりMuc4はerbB2と複合体を形成しており,Wtに比してTgマウス胆嚢癌ではerbB2のチロシンリン酸化は顕著に亢進していた.Tgマウス胆嚢癌におけるMuc4発現強度は2週を除いて顕著な発現を示していた.2週Tg胆嚢においても,癌部は非癌部に比してその発現は有意に増加していた.胆嚢癌部に比して,気管,食道,前胃におけるMuc4発現は微弱または陰性であった.本TgマウスにおけるMuc4発現は,胆嚢癌部位のみに過剰発現が認められたこと,癌部は非癌部に比して顕著な発現が認められたこと,出生早期より高齢の胆嚢癌において顕著な発現が認められたこと,erbB2と複合体を形成することより,そのチロシンリン酸化を亢進することより考えて.胆嚢発癌またその進展にかかわるerbB2シグナル伝達機構の活性化に重要な役割を演じていることが推測された.次年度は、本マウス胆嚢癌に対するイムノトキシン療法の抗腫瘍効果について解析する予定である。BK5.ErbB2トランスジェニックマウスの解析BK5.erbB2トランスジェニックマウス(以下Tgマウス)

胆嚢癌ではWt胆嚢に比して、Muc1、Muc3の転写レベルは低下していたが、Muc4は顕著に増加していた。インサイツハイブリダイゼーション・免疫組織化学よりMuc4mRNAおよび蛋白はTgマウス胆嚢癌の癌上皮に顕著に発現していた。また免疫組織化学よりMuc4はerbB2と同一癌上皮部位に発現していた。免疫沈降の結果よりMuc4はerbB2と複合体を形成しており、Wt胆嚢に比してTgマウス胆嚢癌ではerbB2のチロシンリン酸化は顕著に亢進していた。Tg胆嚢癌部に比して、気管、食道、前胃におけるMuc4発現は微弱または陰性であった。本TgマウスにおけるMuc4発現は、胆嚢癌部位のみに過剰発現が認められたこと、癌部は非癌部に比して顕著な発現が認められたこと、erbB2と複合体を形成することより、そのチロシンリン酸化を亢進することより考えて、胆嚢発癌またその進展にかかわるerbB2シグナル伝達機構の活性化に重要な役割を演じていることが推測された。ヒト胆嚢癌における癌関連粘液形質MUC4の解析ヒト胆嚢癌51例における手術標本についてMUC4の発現頻度および病理学的悪性度との関連性について検討した。その結果、MUC4は51例中34例(67%)に発現していた。特に、高分化あるいは中分化腺癌における発現頻度が高率であった。免疫沈降と蛍光免疫染色の結果、MUC4は癌遺伝子産物であるerbB2と会合していた。さらにMUC4とerbB2の会合はerbB2の顕著なリン酸化と関連していた。その下流では、MAPK、Aktのシグナル分子のリン酸化が生じており、またアラキドン酸代謝の活性化因子であるCOX-2の強い誘導が観察された。細胞実験において、heregulinの存在下では、MUC4の過剰発現は細胞増殖能を亢進させた。これらの解析結果より、MUC4は、胆嚢癌部位のみに過剰発現が認められたこと、erbB2と複合体を形成することより考えて、胆嚢発癌またその進展にかかわるerbB2シグナル伝達機構の活性化に重要な役割を演じていることが推測された。
知識・サービス経済における新しい男性性―福祉雇用レジームの変化に関する基礎的研究

本研究では、産業構造の変化と雇用の多様化が男性性の再編にどのような影響を与えているのか明らかにすることを目的とし、IT・情報系企業5社の労使に対する聞き取り、非正規雇用者を含む526名に対するアンケート(有効回答率51.7%)、内23名への聞き取りを行った。サラリーマン男性性の形成に企業の労務管理が大きな役割を果たした通り,男性性変化の抑制・促進要因としても大きな役割を果たしていることが分かった。正規雇用者においてはそれが男女協業への足かせになっており、非正規労働者においては、正規雇用で求められるフレキシビリティやコミットメントを忌避する志向性が、「うしろめたさ」を伴いながらも明確に示された。理論面では、昨年のドイツにおける共同研究者との対話から、サラリーマン男性性に影響を与えうる福祉ー雇用レジームを支える制度として、雇用形態に着目すべきであることが示唆された。正規雇用の制度化が現在のサラリーマン男性性を支えるカギとなっているのなら、正規雇用が相対化されつつある今、特に新しい産業で働く若い世代を中心に、これまでの男性性が正当性を失っている可能性は十分ある。一方で、性別役割分業についてのクロスセクショナルなデータに基づく議論は既存の男性性イデオロギーの強さを報告しており、実際にどの程度仮説通りの変化があるのか、もしないとすればその理由を確認する必要が生じている。こうした理論面での議論の進展から、調査対象については、正規雇用の正当性が強く残る産業と弱い産業(古く伝統的な産業と新産業)を対比させつつ、その内部で雇用関係に焦点をあて、彼らがどのような男性性を実践しているのか観察する必要が生じている。こうした理論面での進展や研究代表者の所属機関変更などにより、ここ一年で予定していた量的・質的調査を組み合わせた実地調査は行うことができなかった。しかし、昨年来の課題として指摘していた、「より効果的に非正規雇用者にアクセスでき、かつ彼らの労働契約の状況や労働組織の状況に一定の目配りができる調査対象選定」という点については、より慎重を期して臨むことができた。その結果、新所属機関の所在地における行政への聞き取りや業界団体の調査を新たに行い、調査対象の選定について一定の進捗があった。当該年度において、遅れの生じていた実査を行うことができた。調査に入るにあたり、平成24年度における理論的検討から、実査では「より効果的に非正規雇用者にアクセスでき、かつ彼らの労働契約の状況や労働組織の状況に一定の目配りができる調査対象」を選定する必要が生じており、正規雇用者も含む労務管理の全体を把握しつつ、その中で非正規雇用者がどのように位置づけられているのか、理解する必要があった。そこで実査の対象として、札幌市のワーク・ライフ・バランス(WLB)推進事業に参加する企業から、特にIT・情報産業に分類される中小企業5社を選び調査依頼を行った。そして、5社に対して事前アンケートと聞き取り、うち4社526名に対するアンケート(有効回答率51.7%)、さらに聞き取り協力賛同者から非正規雇用労働者を含む23名を選び聞き取りを行った。企業の実態を把握しつつ、非正規雇用者にアクセスすることができた。札幌市の事業参加企業を対象とした理由は、市への提出資料で労務管理施策の一部が明らかなこと、また、性別役割分業・男性性への影響のあるWLBについて、企業側で一定の見識を持っていることが期待されたからである。引き続きデータの分析を続けているが、非正規雇用者の男性性については、やはり企業との関係性から、正規雇用者との比較を行うことが有効であることが分かってきた。企業の労務管理の在り方が労働者の選択肢に与える影響を勘案した上で調査の結果を解釈すると、まず第一に、正規雇用者の企業への社会統合の強さが確認できる。男性の稼ぎ主意識も、正規・非正規を問わず依然強固であった。一方で、転勤やサービス残業など、正規雇用に典型的に求められるいくつかの実践について、非正規雇用者は明瞭に拒絶する態度を見せている。しかし、その結果として稼ぎ主役割を全うできないことに対して、劣等感を抱きがちであることが分かった。知識・サービス経済化と雇用改革の中、フレキシブルな生産体制やプロジェクト型の労働組織が導入され、そこでは不安定で多様な雇用関係が拡大している。そのため、標準的雇用を背景に成立した「サラリーマン男性性」は正当性を失い、日本における男性性は再構築の過程にあると考えられる。平成23年度の研究計画では、福祉ー雇用レジーム論において同様の「男性稼ぎ主型」に分類されてきたドイツの共同研究者と議論を重ね、再編の理路について仮説を提示することであった。

先行するドイツでの調査を踏まえた議論から明らかになったことは、日本対比非正規雇用の規制が厳しく、そもそも正規雇用者に対しても労働時間管理が比較的厳格に行われてきたドイツでは、「男性性」を支える資源としての「時間」の重要性が指摘されている。新しい産業領域ではワークライフバランスを取ることが難しい仕事や働き方が増えており、その結果「時間」へのコントロールを失うことが男性性の変化に大きな影響を与えているのではないか、という議論である。一方日本においては、高度成長に至る時期にはすでに労働者は「労働時間」に関するコントロール能力を失っており、そもそも「サラリーマン男性性」を支える資源となっていない。むしろ終身雇用をささえた長期雇用・ライフステージ調整給・企業福祉の諸制度が人々の日々の生活とライフコースに安定を与えていたことが大きな資源となってきた。そうした資源へのアクセスは正規雇用者でも難しくなっているが、そもそもアクセスを与えられていない非正規雇用という雇用形態に着目することが重要であると考えられる。前年度に行った実地調査の分析を進めてきた。まず明確になったことは、日本のサラリーマン男性性は日本的経営の形成とともに形作られてきたが、その変化も雇用の多様化や労務管理の変化とのかかわりにおいて考察できるということである。対象企業においても雇用の多様化や正規雇用に対する成果主義の導入が顕著であり、男性性に関わる諸変数に対するその影響を確認できた。労務管理制度の変化・運用については、対象企業でも全国調査と同様の傾向が観察でき、正規雇用者に対するフレキシビリティとコミットメントの要求は相変わらず高い。その結果正規雇用男性の家事への参画はどうしても限られたものとなっている。特に、意識の上では男女協業的であっても、労働時間や疲れがそれを許さないという状況は、企業と労働者の関係性が男女の役割分業や性別秩序に与える影響の大きさをあらためて確認させるものであった。非正規雇用男性の中には、積極的であれ消極的であれ、企業への従属的なキャリアや生き方から距離を取るような生き方を模索している人たちがいた。非正規雇用で働く男性は、正規雇用労働者であることのプレッシャーを引き受けることと、自分の生活に対するさまざまな裁量を維持することへの志向性の間で、矛盾を抱えながら生きている。非正規雇用にとどまる人々には、転勤やサービス残業などを含む、正社員としての責任を回避したいという欲求が強く存在している。これは企業中心社会からの自立志向とも捉えうる志向性と言うことができるだろう。ただし、現状こうした態度や意思を「堂々と」示すことが難しいようである。彼らが実際に得られている賃金や安定性、それに対する社会的評価は高いとは言えず、そうした現実を目の前にして、彼らは自分たちの選択が正当なものだという確信が得られないでいることが明らかとなった。社会学当初予定の実地調査を行うことができなかったのは「遅れ」であるが、特に理論上の有意義な進展によって、調査デザインや調査対象選定に対してより細かな戦略を立てる必要が生じたことによるもので、むしろ積極的な意義があると考えている。現状既に、今夏の実地調査に向けた準備を着々と整えており、おおむね順調に進捗している。若干遅れの生じていた実査を、平成24年度末の予定通りに行った。
正常ならびに病的状態における唾液腺総排泄管の形態と機能に関する実験的研究

1)ヒト耳下腺管の組織構築について:解剖実習屍体から摘出したヒト耳下腺管(ステンセン管)を用い、その組織構築を検索した。その結果、耳下腺管の組織構築は運動能を有する尿管等に酷似しており、唾液腺総排泄管には自律的ならびに受動的運動能があり、唾液排泄の調整を行なっているものと推察された。また、一部の耳下腺管周囲にはリンパ装置が存在しており、これは上行性感染に対して何等かの防御作用を担っているものと考えられた。2)カニクイザル耳下腺管の組織構築について:カニクイザルの耳下腺管を組織学的ならびに超微構造的に検索した。その結果、カニクイザル耳下腺管の組織構築は基本的にはヒトのものと同様であった。また、上皮には多くの粘液細胞が混在しており、このことは唾液腺総排泄管が単なる唾液の輸送路としてではなく、原唾液に諸蛋白成分を添加して最終唾液の生成に大きな役割を演じていることを示唆する所見と考えられた。以上に加え、311に示した解剖学的ならびに病理学的研究を行なった。3)ヒト耳下腺導管中のcrystalloidの唾石原性について4)実験的唾液腺症について5)正常ヒト小唾液腺におけるリンパ球滲潤について6)ラット顎下腺における上皮内リンパ球について7)ヒト耳下腺におけるびまん性オンコサイト症について8)ヘモクロマトーシスにおける口腔乾燥症状について9)ヒト副耳下腺の組織学的検索について10)ヒト顎下腺の導管系にみられる石灰化物について11)ヒト耳下腺腺体外リンパ節における唾液腺上皮の出現状況について1)ヒト耳下腺管の組織構築について:解剖実習屍体から摘出したヒト耳下腺管(ステンセン管)を用い、その組織構築を検索した。3)ヒト耳下腺導管中のcrystalloidの唾石原性について4)実験的唾液腺症について5)正常ヒト小唾液腺におけるリンパ球滲潤について6)ラット顎下腺における上皮内リンパ球について7)ヒト耳下腺におけるびまん性オンコサイト症について8)ヘモクロマトーシスにおける口腔乾燥症状について9)ヒト副耳下腺の組織学的検索について10)ヒト顎下腺の導管系にみられる石灰化物について11)ヒト耳下腺腺体外リンパ節における唾液腺上皮の出現状況について
中枢神経系におけるVHL腫瘍抑制遺伝子の役割の解明

von Hippel-Lindau(VHL)病は,小脳や脊髄の血管芽腫と網膜の血管腫、腎癌、褐色細胞腫などを高率に生ずる常染色体優性の遺伝性疾患であり、1993年に染色体第3番短腕より単離され、その遺伝子(VHL遺伝子)の塩基配列が明らかとなった。この疾患は、潜在的な患者も含めて我が国には約3000人の患者がいるものと推定されているが、これまで正確な疫学調査はなされていない。われわれはこれまで腎癌(Cancer Res 54:2852,1994)と血管芽腫(Cancer Res 54:4845,1994)のみならず,神経膠腫(Cancer Res57:1035,1997)でVHL遺伝子変異を見出したほか,VHL病の家系の遺伝子診断を約80家系収集して行い,成果をあげてきた(Hum Mol Genet4:2233,1995:Jpn J Cancer Res87:423,1996;脳神経51:33,1999)。また、散発性の血管芽腫か遺伝性のVHL病かの判別もこの遺伝子診断でおこなってきた。さらに、正常組織におけるVHL遺伝子の発現を検討し、中枢神経系の神経細胞,腎近位尿細管細胞等に発現を認めた(J Pathol 180:271,1996).現在、VHL病家系の遺伝子解析を継続中であるほか,VHL遺伝子産物に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いたimmunoblot法にてVHL遺伝子産物の発現を正常の神経細胞だけでなく,血管芽腫や神経膠腫の細胞質において確認しており、RT-PCR法にてmRNA発現も検討したところ,神経膠腫においては悪性度が高くなるほどVHL遺伝子産物の発現がなくなる傾向が認められた.また,中枢神経の発生段階で神経幹細胞からの分化に関わっているかどうかを検討したところ,ニューロンへの分化に関与していることが明らかとなり,またニューロンの細胞周期を制御している可能性が示唆された.von Hippel-Lindau(VHL)病は,小脳や脊髄の血管芽腫と網膜の血管腫、腎癌、褐色細胞腫などを高率に生ずる常染色体優性の遺伝性疾患であり、1993年に染色体第3番短腕より単離され、その遺伝子(VHL遺伝子)の塩基配列が明らかとなった。さらに、正常組織におけるVHL遺伝子の発現を検討し、中枢神経系の神経細胞,腎近位尿細管細胞等に発現を認めた(J Pathol 180:271,1996).現在、VHL病家系の遺伝子解析を継続中であるほか,VHL遺伝子産物に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いたimmunoblot法にてVHL遺伝子産物の発現を正常の神経細胞だけでなく,血管芽腫や神経膠腫の細胞質において確認しており、RT-PCR法にてmRNA発現も検討したところ,神経膠腫においては悪性度が高くなるほどVHL遺伝子産物の発現がなくなる傾向が認められた.また,中枢神経の発生段階で神経幹細胞からの分化に関わっているかどうかを検討したところ,ニューロンへの分化に関与していることが明らかとなり,またニューロンの細胞周期を制御している可能性が示唆された.von Hippel-Lindau(VHL)病は,小脳や脊髄の血管芽腫と網膜の血管腫、腎癌、褐色細胞腫などを高率に生ずる常染色体優性の遺伝性疾患であり、1993年に米国の国立癌研究所のZbarらにより染色体第3番短腕より単離され、その遺伝子(VHL遺伝子)の塩基配列が明らかとなった。この疾患は潜在的な患者も含めて我が国には約3000人の患者がいるものと推定されているが、これまでに正確な疫学調査はなされていない。われわれはこれまで腎癌(Cancer Res 54:2852,1994)と血管芽腫(Cancer Res 54:4845,1994)にVHL遺伝子変異を見出したが,昨年には神経膠腫(Cancer Res 57:1035,1997)においてもVHL遺伝子変異を見出した.VHL病の家系の遺伝子診断を約70家系収集して行ってきたが(Hum Mol Genet4:2233,1995),本年度は,さらに数を増やしこの疾患の家系の遺伝子診断を行い、それによってVHL遺伝子のどのような異常が血管芽腫や腎癌などの発生の関与とこれらの腫瘍の発生のメカニズムを検討してきた。

さらに、正常組織におけるVHL遺伝子の発現を検討し、中枢神経系の神経細胞,腎近位尿細管細胞等に発現を認めた(J Pathol 180:271,1996).現在、VHL病家系の遺伝子解析を継続中であるほか、VHL遺伝子産物に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いたimmunoblot法にてVHL遺伝子産物の発現を正常の神経細胞だけでなく,血管芽腫や神経膠腫の細胞質において確認しており、RT-PCR法にてmRNA発現も検討中であり,神経膠腫においては悪性度が高くなるほどVHL遺伝子産物の発現がなくなる傾向が認められた。von Hippel-Lindau(VHL)病は,小脳や脊髄の血管芽腫と網膜の血管腫、腎癌、褐色細胞腫などを高率に生ずる常染色体優性の遺伝性疾患であり、1993年に染色体第3番短腕より単離され、その遺伝子(VHL遺伝子)の塩基配列が明らかとなった。この疾患は、潜在的な患者も含めて我が国には約3000人の患者がいるものと推定されているが、これまで正確な疫学調査はなされていない。われわれはこれまで腎癌(Cancer Res 54:2852,1994)と血管芽腫(Cancer Res 54:4845,1994)のみならず,神経膠腫(Cancer Res 57:1035,1997)でVHL遺伝子変異を見出したほか,VHL病の家系の遺伝子診断を約80家系収集して行ってきたが(Hum Mol Genet 4:2233,1995),本年度は,さらに数を増やしこの疾患の家系の遺伝子診断を行ってきた。また、散発性の血管芽腫か遺伝性のVHL病かの判別もこの遺伝子診断でおこなってきた。さらに、正常組織におけるVHL遺伝子の発現を検討し、中枢神経系の神経細胞,腎近位尿細管細胞等に発現を認めた(J Pathol 180:271,1996)現在、VHL病家系の遺伝子解析を継続中であるほか,VHL遺伝子産物に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いたimmunoblot法にてVHL遺伝子産物の発現を正常の神経細胞だけでなく,血管芽腫や神経膠腫の細胞質において確認しており、RT-PCR法にてmRNA発現も検討したところ,神経膠腫においては悪性度が高くなるほどVHL遺伝子産物の発現がなくなる傾向が認められた.また,中枢神経の発生段階で神経幹細胞からの分化に関わっているかどうかを検討したところ,ニューロンへの分化に関与していることが明らかとなり,またニューロンの細胞周期を制御している可能性が示唆された.
歯の細胞外環境因子としての基底膜分子の機能解析

昨年度までに解析したネフロネクチンの歯胚発生過程における発現パターン、歯胚器官培養系における機能解析の結果をもとに、本年度は主にネフロネクチンの基底膜分子として歯胚発生に与える影響について解析を行った。これまでの研究で、ネフロネクチンはRGD配列を有しており、インテグリンα8β1と結合することが報告されている。そこで、免疫染色法、リアルタイムPCR法を用いて歯胚発生におけるインテグリンα8の局在を検討した。その結果、歯胚発生初期である蕾状期から帽状期にかけて発現が増強し、胎生15.5日齢歯胚をピークに減少していくことがわかった。また、マウス臼歯歯胚発生の各ステージにおける免疫染色により、間葉細胞に主に発現することが確認された。以上から、インテグリンα8は間葉系細胞に発現し、主に歯胚発生の初期において発現することが確認された。実際、胎生14.5日齢歯胚を採取し、ネフロネクチンsiRNA存在下で器官培養を行うと、歯胚の形成が抑制される知見を得ており、歯原性上皮細胞の分化時期への影響だけでなく、歯胚形成過程においても重要な役割を持っている可能性が考えられる。また、ネフロネクチンは上皮細胞より分泌され基底膜に局在することから上皮間葉相互作用により歯胚の形成を制御している可能性が示唆された。本研究期間を通して、ネフロネクチンは歯の発生初期において基底膜に発現し、上皮-間葉相互作用によって細胞増殖を引き起こし、歯胚の形成に重要な役割を担っている可能性が示唆された。また、エナメル芽細胞分化期においては、その発現が基底膜の消失と共に消えることで、エナメル芽細胞の分化を引き起こすことが示唆された。これらの知見は歯の発生機序の一端の解明にとどまらず、将来的な歯の再生技術に寄与するものと考えられる。本研究期間を通じて、当初の計画通り、ネフロネクチンの歯胚発生時期における発現パターン及び、エナメル芽細胞分化における機能の解析が完了した。これらの知見が将来の歯の再生技術へ応用されることが期待される。本年度が当研究課題の最終年度であり、研究計画は完了している。当研究成果は論文発表に向け、現在執筆中である。本研究では、歯胚発生過程におけるエナメル芽細胞の分化メカニズムを明らかにするために、1)歯の発生におけるネフロネクチンのパターンの解明、2)ネフロネクチンによるエナメル芽細胞分化制御解明、3)ネフロネクチンいたエナメル芽細胞分化誘導法の開発を主な目的として、研究を開始した。本年度は主に、ネフロネクチンの歯胚発生過程における発現パターンの解明、歯胚器官培養系におけるネフロネクチンの機能解析を行った。まず、歯胚発生におけるネフロネクチンの局在を確認するため、胎生13.5日齢マウスより凍結切片を作成し、免疫染色法にてネフロネクチンの蛋白レベルでの発現を確認した。上顎第一臼歯歯胚において、上皮に強い発現が観察された。さらに、歯胚の上皮と間葉を顕微鏡下にて分離し、リアルタイムPCRにて上皮と間葉におけるネフロネクチンの発現パターンをRNAレベルで解析したところ同様に間葉と比較して上皮に強い発現が認められた。また、基底膜分子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンとネフロネクチンの多重染色において、局在の一致が認められたことから、ネフロネクチンは基底膜に局在し、細胞外マトリックス分子として、歯胚発生に何らかの影響を与えている可能性が示唆された。さらに、歯胚発生の各ステージにおいてネフロネクチンの発現パターンを解析するため、胎生13日齢から生後7日齢までの歯胚を採取し、ネフロネクチンの発現量をリアルタイムPCRにて比較した。その結果、胎生13日齢から生後3日齢まではその発現に大きな変化は認められなかったが、生後7日齢でネフロネクチンの発現量が低下した。解剖学的には生後7日齢ではエナメルマトリックスの分泌が盛んに行われている時期であり、また基底膜の消失時期とも一致することからネフロネクチンがエナメル芽細胞の分化制御に何らかの影響を与えている可能性が示唆された。昨年度解析したネフロネクチンの歯胚発生過程における発現パターン、歯胚器官培養系における機能解析の結果をもとに、本年度は主にエナメル芽細胞分化制御の解明、基底膜分子として歯胚発生に与える影響について解析を行った。ネフロネクチンには二つの変異体が存在している。ネフロネクチンの歯原性上皮細胞における機能を詳細に検討するために、二つの全長cDNAのクローニングを行い、ネフロネクチン発現ベクターを作製した。それぞれを歯原性上皮細胞株に遺伝子導入を行ない、機能解析を行った。まず、分化に対する影響を検討するために、遺伝子導入後7日間培養を行い、総RNAを回収し、エナメル芽細胞の分化マーカーであるアメロブラスチンの発現をリアルタイムPCRにて解析した。遺伝子導入群は二つの変異体共にアメロブラスチンの発現が抑制されていた。また、細胞増殖能も検討したところ、両遺伝子導入群共に細胞増殖能の活性化が認められた。この結果は昨年度解析した歯胚器官培養系におけるsiRNAを用いた抑制系の実験との結果と一致しており、ネフロネクチンがエナメル芽細胞の分化制御に関与し、ネフロネクチンの発現がエナメル芽細胞を未分化な状態に維持している可能性が示唆された。また、これまで得られた知見よりネフロネクチンは歯胚発生時期の基底膜に存在し、細胞外マトリックス分子として機能している可能性が考えられる。そこでネフロネクチンリコンビナントタンパク質を作成し、培養ディッシュにコーティングを行い、機能解析を行った。

歯原性上皮細胞株、歯原性間葉細胞株を用いて細胞接着能の検討を行ったところ、両細胞共に細胞接着能の増加が認められた.また、細胞増殖能も活性化された。以上から、ネフロネクチンは細胞外マトリックス分子としての機能を有しており、上皮細胞、間葉細胞両方に影響を及ぼしている可能性が考えられる。昨年度までに解析したネフロネクチンの歯胚発生過程における発現パターン、歯胚器官培養系における機能解析の結果をもとに、本年度は主にネフロネクチンの基底膜分子として歯胚発生に与える影響について解析を行った。これまでの研究で、ネフロネクチンはRGD配列を有しており、インテグリンα8β1と結合することが報告されている。そこで、免疫染色法、リアルタイムPCR法を用いて歯胚発生におけるインテグリンα8の局在を検討した。その結果、歯胚発生初期である蕾状期から帽状期にかけて発現が増強し、胎生15.5日齢歯胚をピークに減少していくことがわかった。また、マウス臼歯歯胚発生の各ステージにおける免疫染色により、間葉細胞に主に発現することが確認された。以上から、インテグリンα8は間葉系細胞に発現し、主に歯胚発生の初期において発現することが確認された。実際、胎生14.5日齢歯胚を採取し、ネフロネクチンsiRNA存在下で器官培養を行うと、歯胚の形成が抑制される知見を得ており、歯原性上皮細胞の分化時期への影響だけでなく、歯胚形成過程においても重要な役割を持っている可能性が考えられる。また、ネフロネクチンは上皮細胞より分泌され基底膜に局在することから上皮間葉相互作用により歯胚の形成を制御している可能性が示唆された。本研究期間を通して、ネフロネクチンは歯の発生初期において基底膜に発現し、上皮-間葉相互作用によって細胞増殖を引き起こし、歯胚の形成に重要な役割を担っている可能性が示唆された。また、エナメル芽細胞分化期においては、その発現が基底膜の消失と共に消えることで、エナメル芽細胞の分化を引き起こすことが示唆された。これらの知見は歯の発生機序の一端の解明にとどまらず、将来的な歯の再生技術に寄与するものと考えられる。本研究期間を通じて、当初の計画通り、ネフロネクチンの歯胚発生時期における発現パターン及び、エナメル芽細胞分化における機能の解析が完了した。これらの知見が将来の歯の再生技術へ応用されることが期待される。本年度が当研究課題の最終年度であり、研究計画は完了している。当研究成果は論文発表に向け、現在執筆中である。
眠らないルシフェラーゼを創る

ホタルのルシフェラーゼによる黄緑色の発光は様々なアプリケーションに利用されている。しかしながら生成物阻害のために反応が長時間続かない。そこで生成物阻害を引き起こしている原因を探るために生成物阻害が弱まったH247A変異体を作成した。この変異体の構造解析を行ったところ、N末ドメインとC末ドメインの相互作用が弱まっており、活性部位が広がりやすくなり、これが生成物阻害の減少につながったと推察できた。蛍の発光反応は微生物汚染の検出、遺伝子の発現解析や分子イメージングによる癌の転移経路や薬物の体内動態の解析など、既に幅広く応用されている。しかしながら反応により得られた生成物による阻害の影響により発光がフラッシュ発光となり、発光が持続しないことが、応用研究への妨げとなっている。そこで様々な変異体を作成し、活性を保持したまま生成物阻害が解除される変異体ルシフェラーゼの探索を行った。しかしながら、野生型のルシフェラーゼの活性を完全に保つような変異体は得られなかった。そこで、その中でも持続発光し、活性を有するH247A変異体に着目し、X線結晶構造解析を行い、野生型と比較することにより発光持続型の構造要因を明らかにすることを目的に研究を行った。H247A変異体と反応中間体アナログであるDLASAとの複合体の立体構造を1.6A分解能で決定した。得られた立体構造を野生型と比較したところN末端ドメインのループ上にあるSer201とC末端ドメインのLys531の相互作用が観測されず、Lys531の位置が変化していた。この構造変化はH247A変異体においてHis247とSer201の水素結合がなくなったことと、変異により空間が生じたためと考えられた。したがってHis247は活性部位近傍におけるN末端ドメインとC末ドメインの相互作用に重要な残基であることが示唆された。またこの相互作用が弱まったことにより、生成物阻害が減少し持続型発光性を示したものと考えられた。すなわち、活性状態の空間配置はとるものの、その構造を崩しやすくするための変異が持続発光に必要であることが示唆された。ホタルルシフェラーゼの反応は生化学、分子生物学の研究や検査のツールとして広く利用されている。しかしながらこの発光反応は短時間で急激に減衰してしまうという欠点を有しており、これは生成物阻害が原因と考えられている。ルシフェラーゼは2つのドメインを有しており、普段は開閉を繰り返しているが、反応の際は基質を取り込みしっかりと閉じた状態になる。この状態で反応が進行するが生じたオキシルシフェリンが活性部位から離れにくいため生成物阻害が生じる。またCoA存在下において発光が持続することも知られている。そこで、ルシフェラーゼのドメイン間の結合に関わるアミノ酸残基の変異およびCoAとの複合体状態の解析を目指した。生成物阻害解除を引きおこす変異体についてはドメイン間の結合もしくはリガンド結合部位付近のアミノ酸を候補にし、62種類の変異体を作成した。大腸菌で発現を行わせ、その破砕上清を用いて発光スペクトルの測定を行った。するとS201A, S203A, T204A, L206Aと中間体アナログ複合体のときに観測できる200番台のループ構造の変異体に候補がたくさん見つかった。さらに精製標品を用いたところL206Aは野生型よりも減衰が緩やかであった。この部分はAMPを囲む位置に存在する。オキシルシフェリンはAMPによってフタをされた状態になっていることからAMPの位置の固定が生成物阻害につながっている可能性が新たに示唆された。CoAの発光に対する挙動を調べたところ200から500μMのときに最大活性を示した。そこで約15mMのCoA濃度において結晶化を試み、数種類の結晶を得ている。現在得られているルシフェラーゼについて、多くは発光反応が減少しているもののすでに予定していたものより多くの変異体の作成に成功している。ほとんどの変異箇所は立体構造からは発光反応に直接関わることのないアミノ酸残基であることが推定される。しかしながら活性が劇的に減少する箇所からほとんど変化がない場所まで存在することから、発光に関わるさらなる位置の同定に利用できると考えられる。またルシフェラーゼの特徴であるフラッシュ発光のみならず、フラッシュを生じないglow発光のものが得られており、その挙動の違いと発光強度との関係が明らかになってきており、生成物阻害解除のための基礎データを収集できたと考えている。またCoAとの反応に対する挙動も判明しつつあり生成物阻害解除に向けた基礎実験ができたと考えている。ルシフェラーゼの生成物阻害解除の理解をより深くするためにはルシフェラーゼの発光メカニズムの理解を進めることも重要である。生成物阻害解除にCoAが何らかの状態でルシフェラーゼに関わっていることは明らかである。ルシフェラーゼは反応を行わせるためにドメインがつねに動いていると考えられるが、その途中段階にCoAを認識しやすい構造があると予想される。これはCoA濃度を上げていくと活性が低下していくことからも考えられる。