hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
全ゲノム情報に基づいた病原微生物と常在菌の多様性と病原遺伝子に関する情報学的研究

少なくとも10kb以上の断片ゲノム配列がテータベースに存在する2000種を超える既知原核生物種に加えて、約1100種類のウイルス、配列解析の進んでいる約50種類の真核生物、約700種類のオルガネラ配列の全体を5kbに断片化し、地球シミュレータを用いて、4連塩基頻度に関するBLSOM解析を行った。真核と原核生物については96%の高精度で分離していた。オルガネラとウイルス相互や、これらと核ゲノムとの分離も80%レベルと高い。2000種を超える既知原核生物種に関して、25の系統群への分離の度合いを調べると、85%レベルで正しい系統群を反映して分離していた。体内環境や共生生物系を含む環境由来の大半のゲノム断片の系統推定を可能にできた。原核生物で系統群を間違えて分離した15%の配列上には、水平伝播をした外来性的な配列が多く見出され、病原性と関係する遺伝子群が濃縮されている可能性が高い。これらのカタログ化を行った。ヒトやマウスの腸内試料を対象にしたメタゲノム解析が進行しており、データベースに登録された配列は1Gb分に達している。これらの大量断片配列についてのBLSOM解析を行なっているが、ヒトやマウスの腸内試料で見出された生物多様性は、サルガッソ海を代表とする海洋試料やミネソタの土壌試料に比べれば遥かに低かったが、個体差とその特徴が特定できた。BLSOMを用いると比較的少量しか存在しない生物種由来のゲノム配列についてもゲノム別での再集合が可能になる。機能未知タンパク質類の機能推定法を確立する目的で、機能が特定された2853種類のCOGカテゴリーへ分類がなされている、微生物ゲノム由来の約11万個のタンパク質類のアミノ酸配列をテストデータとして用いた。24連アミノ酸頻度を対象に地球シミュレータを用いて大規模BLSOMを作成し、精度高くCOGへの分類を再現する計算条件を見出した。感染症の病原性や感染のメカニズムの解明には、ヒトのみならず広範囲の生物試料由来の混合ゲノムDNAを対象にしたメタゲノム解析が有用となる。その際の情報学的基盤の整備として、真核と原核生物ゲノムのみならず、ウイルスやミトコンドリアやクロロプラストやプラスミド等の既知の全塩基配列を対象にした大規模なBL-SOMを作成し、生物系統ごとの自己組織化を実現することが重要である。現時点で10kb以上の断片ゲノム配列がデータベースに存在する2000種を超える既知原核生物に加えて、約1100種類のウイルス、配列解析の進んでいる約50種類の真核生物、約700種類のオルガネラ配列の全体を5kbに断片化し、地球シミュレータを用いて、4連塩基頻度に関するBL-SOM解析を行った。真核と原核生物については96%の高精度で分離(自己組織化)していた。原核生物種に関して、25の系統群への分離の度合いを調べると、85%レベルで正しい系統群を反映して分離していた。ゲノム配列の解析に加えて、アミノ酸の連文字頻度に着目したBL-SOMを開発した。アミノ酸の配列データベースに登録されているタンパク質で、機能が特定されている2853種類の機能カテゴリー"COG"へ分類されている約11万個のタンパク質について、2連と3連アミノ酸頻度を対象に、地球シミュレータを用いて大規模BL-SOMを作成し、機能カテゴリーへの分類を実現する解析条件を求めた。現時点で蓄積している大量の機能未知のタンパク質類について、機能機知のタンパク質類と混合して大規模BL-SOMを作成し、機能未知と既知タンパク質がマップ上でアソシエートすることを指標に機能推定を行っている。特に病因との関係が知られているタンパク質とアソシエートする機能未知タンパク質に注目している。機能

未知タンパク質類の機能推定法を確立する目的で、機能が特定された2853種類のCOGカテゴリーへ分類がなされている、微生物ゲノム由来の約11万個のタンパク質類のアミノ酸配列をテストデータとして用いた。24連アミノ酸頻度を対象に地球シミュレータを用いて大規模BLSOMを作成し、精度高くCOGへの分類を再現する計算条件を見出した。
偏光光化学によるハロゲン化銀含有ガラス中の析出銀微粒子の異方性制御

微粒子析出の異方性制御を探索する過程で,光ファイバ用ゲルマニウムドープシリカガラスの光感応性,特に高圧水素処理を施した試料がKrFエキシマレーザ照射に対して極めて高い光感応性を示すことを見出した。従ってゲルマニウムドープシリカガラスの紫外可視領域における光吸収,フォトルミネッセンスおよび電子スピン共鳴による調査に重点を置いて研究を行った。アンジュレータ光を利用した照射実験を分子科学研究所UVSOR BL3A1ラインにて行った。ゲルマニウムドープシリカガラスに36eV光の偏光照射を行い,フォトルミネッセンス測定および電子スピン共鳴の測定を行った。照射時の光化学反応をモニターするために,3.1eVおよび4.2eVにおけるフォトルミネッセンスを観測したところ,フォトルミネッセンスの減衰は拡張指数関数的であり,主として化学反応が酸素空孔などのゲルマニウム関連の欠陥サイトにおいて生じていることが確認された。また,アンジュレータ光照射試料の電子スピン共鳴の測定を行った結果,ゲルマニウムE'中心が観測されたが,その照射光の偏光方向に対する異方性は観測されなかった。常磁性中心の生成においては、KrFエキシマレーザの2光子過程により生じた電子・正孔対の無輻射緩和過程が支配的な影響をもつことを明らかにした。位相格子を用いて光照射により回折格子を形成し,光誘起屈折率変化を調査した。その結果,屈折率変化と紫外域における光吸収との相関関係を見出した。またシリカガラスへの大線量^<60>Coγ線照射によりシリコン微粒子が生成することを確認し,可視発光を示すことを見出した。アンジュレータ光を利用した照射実験を平成7年2月13-18日および8年2月12日-17日、分子科学研究所UVSOR BL3A1ラインにて行った。照射時の光化学反応をモニターするために、3.1eVおよび4.2eVにおけるフォトルミネッセンスを観測したところ,フォトルミネッセンスの減衰は拡張指数関数的であり,主として化学反応が酸素空孔などの欠陥サイトにおいて生じていることが確認された。アンジュレータ光照射試料の電子スピン共鳴の測定を行った結果,ゲルマニウムE'中心が観測されたが,その照射光の偏光方向に対する異方性は観測されなかった。エキシマレーザ照射実験の準備段階として、実験試料は光学的に良質のハロゲン化銀含有ガラスを入手した。光照射実験装置として、エキシマレーザにグランレーザープリズムを組み合わせた偏光照射装置を構築した。さらに,光学的測定装置として,グラントムソンプリズム,キセノン分光光源,および分光器からなる異方性評価装置を作製した。また,ガラスへのエキシマレーザ・放射線照射効果について,真空紫外分光および電子スピン共鳴により,その評価を行った。その結果,特に,エキシマレーザ照射においては2光子過程により生じた電子・正孔対の無輻射緩和過程が常磁性中心の生成において支配的な影響をもつことが明らかとなった。また、シリカガラスへの大線量^<60>Coγ線照射によりシリコン微粒子が生成することを確認した。

ゲルマニウムドープシリカガラスに36eV光の偏光照射を行い,フォトルミネッセンス測定および電子スピン共鳴の測定を行った。照射時の光化学反応をモニターするために,3.1eVおよび4.2eVにおけるフォトルミネッセンスを観測したところ,フォトルミネッセンスの減衰は拡張指数関数的であり,主として化学反応が酸素空孔などのゲルマニウム関連の欠陥サイトにおいて生じることが確認された。また,アンジュレータ光照射試料の電子スピン共鳴の測定を行った結果,ゲルマニウムE'中心が観測されたが,その照射光の偏光方向に対する異方性は観測されなかった。常磁性中心の生成においては,KrFエキシマレーザの2光子過程により生じた電子・正孔対の無輻射緩和過程が支配的な影響をもつことを明らかにした。位相格子を用いて光照射により回折格子を形成し,光誘起屈折率変化を調査した。その結果,屈折率変化と紫外域における光吸収との相関関係を見出した。またシリカガラスへの大線量^<60>Cor線照射によりシリコン微粒子が生成することを確認し,可視発光を示すことを見出した。
ToF-SIMSを用いた木質細胞壁成分のケミカルマッピング

本研究の目的は、飛行時間型二次イオン質量分析(ToF-SIMS)を用いて、顕微レベルでの細胞壁化学成分の分布を明らかにすることである。本研究において、リグニンモノマー分子イオンのイメージングにより、広葉樹カエデにおいて、道管はグアイアシル、木繊維はシリンギルリグニンに富むことを示した。また、リグニンモデル化合物を用いた結果、ToF-SIMSによるリグニンS/G比算出の信頼性が高いことが示唆された。以上の結果により、ToF-SIMSのリグニン分布解析に対する有用性が示された。本研究の目的は、生体分析においていまだ適用例の非常に少ない、新しい分析手法である飛行時間型二次イオン質量分析(ToF-SIMS)を用いて、細胞壁レベルでの細胞壁成分分布と化学構造の関連を明らかにすることである。樹木細胞壁において、細胞壁構成化学成分であるリグニンの不均一性やその堆積過程は、完全には解明されていない。昨年度においては、以前に既に同定済みのリグニン由来の特徴的なToF-SIMS二次イオンを用いて、広葉樹カエデにおけるグアイアシル(G)とシリンギル(S)リグニンの特定組織における分布の違いを明らかにした。これまでに、GとSリグニンからなる広葉樹組織では、重要な組織である道管はGリグニンに富むことが、紫外線顕微分光法やモイレ反応といった組織染色法などによって示唆されていた。しかしこれらの方法では、入手できる化学構造には限界があった。今回、ToF-SIMSによるGとSリグニンの分子マッピングによってリグニン不均一分布を直接的に可視化した。その結果、カエデ木部組織において、木繊維はSリグニンに富むのに対し、道管はGリグニンに富む構造をとることが明らかとなった。とりわけ、道管と道管の間に存在する穿孔板部分において、Gリグニンが豊富であることが顕著であった。これにより、顕微による組織的な情報も持併せたToF-SIMS分子マッピングを用いることは、特定組織のリグニンの特徴的分布解明に適していることが示された。ToF-SIMSの特徴は、未処理の生体試料において、特定成分の分布可視化が可能なことである。樹木細胞壁においては、細胞壁構成成分であるリグニンの不均一性やその堆積過程は、完全には解明されていない。これまでに、既に同定済みのリグニン由来の特徴的なToF-SIMS二次イオンを用いて、広葉樹カエデにおいて、道管はグアイアシル(G)リグニンに富み、木繊維はSリグニンに富むことを示した。これは、紫外線顕微分光法やモイレ反応といった組織染色法などの結果を支持するものであり、ToF-SIMSによって、より簡便にG、Sリグニンの分布が分かることが示された。また、リグニンモデル化合物を用いて、ToF-SIMSによるGとSリグニンの比(S/G比)検出の信頼性を検討した。TOF-SIMSによるS/G比は、GとSリグニンに特徴的なモノマー分子イオンの強度により検出した。今回、モノマー、ダイマー、8-0-4ポリマーモデル化合物それぞれにおいて、S型とG型のモル比を決めた混合液を調製した。その結果、SIMSにより検出されるS/G比は、モノマー、ダイマーでは実際のS/Gモル比よりもかなり高い値であり、ポリマーにおいては、実際のS/Gモル比に非常に近い値が算出された。以上の結果より、木材中のリグニン分子はポリマーであることから、TOF-SIMSによる木材中リグニンのS/G比算出の信頼性が高いことが示唆された。この結果により、ToF-SIMSのリグニン分析への有用性が示された。
CD15s抗原を利用した血液型不適合腎移植および異種移植における免疫抑制剤の調節

今回の研究では2年にわたって容量を調節しながら末梢血中に残存するBリンパ球を解析し、また、手術時にとられた脾臓内のBリンパ球を免疫染色し、治療困難である高感作者に対する抑制剤の適応量を決定した。フローサイトメトリーではB細胞の数のみならず、活性を抗CD15s抗体をもちいることによって調べた。過去の研究では、休止期では発現しないCD15s抗原が活性期では賦活化するとわれわれは報告してきた。数量のみならず活性においても免疫抑制の状態を綿密にモニターし、最終的に治療困難である抗HLA抗体陽性例患者治療の参考にしたいと考えている。もう一方の対象患者は血液型不適合移植患者である。1989年に当科では血液型不適合移植における免疫抑制は手術中の脾臓摘出を施行している。しかし、特に小児における脾臓摘出は異論が絶えない。脾臓は細菌のフィルターであるために、摘出後にはとくに肺炎球菌の抗原量が爆発的に増加すると報告されている。そのため、スウェーデンを中心に脾臓摘出を施行しないでこの種の移植(不適合移植)を試行するプロトコールが行われてきている。高感作者同様、血液型不適合で脾臓摘出を試行しない患者に対してもリツキサンを投与し脾臓内のBリンパ球を根絶する。フロー解析において術後のB細胞のモニターをおこない液性免疫能を観察する。もっとも問題となっている高感作者や血液型不適合患者に対する新たな免疫抑制にとって改革的な時期をむかえているのかもしれない。今回の研究では液性免疫能による拒絶反応をCD15s抗原のモニタリングによってとらえることが主眼である。われわれは、腎臓移植後に急性拒絶反応となった患者のリンパ球上に接着因子の1つであるCD15s抗原が表現していることを発見した。拒絶反応は一種の炎症反応でありこのような糖鎖抗原の発現によって患者血清中には新たな抗糖鎖抗体の出現をもたらし、抗原抗体反応の連鎖反応によってさらなる拒絶反応の悪化をもたらすことが考えられる。特に1989年から本施設で施行されているような血液型不適合の腎臓移植は通常では考えられないような自己と異なる血液型を移入される異型輸血のようなモデルであり、血液型不適合移植を成功させるには、術前における患者体内の抗体の除去などさまざまな免疫抑制の調節が必要である。1989年から今までにおける不適合移植患者で急性拒絶反応から移植腎喪失となった患者の保存血清を使用して実験を行った。裏面の報告のごとく、拒絶を受けて移植腎臓が喪失した患者の血清中には通常の2倍から3倍の抗糖鎖抗体が産生されていた。この抗体は従来のヒトの血液型であるA型、B型のいずれにも反応しうる抗体でありその反応性はポリクローナルであった。このようなポリクローナルな抗体の産生が拒絶反応の連鎖反応に悪化する可能性があり、移植術前には抗体特異的な吸着法ではなく、血漿交換などの使用によって、より広範囲な抗体除去が拒絶反応の回避さらには移植腎臓の正着延長につながると考察される。現在このような抗体が移植後に出現してくる時期、および免疫抑制剤の減量の時期との関連性に解析をくわえ検討をしている。免疫抑制剤の進歩によって移植腎正着率が90%以上になる一方で、当科においても移植後一ヶ月以内の早期に移植腎を喪失するケースも相変わらず年間1-2名は経験する。こういった患者におこる拒絶反応は抗HLA抗体を介する液性拒絶反応が中心であると考えられている。

フローサイトメトリーではB細胞の数のみならず、活性を抗CD15s抗体をもちいることによって調べた。過去の研究では、休止期では発現しないCD15s抗原が活性期では賦活化するとわれわれは報告してきた。数量のみならず活性においても免疫抑制の状態を綿密にモニターし、最終的に治療困難である抗HLA抗体陽性例患者治療の参考にしたい考えている。もう一方の対象患者は血液型不適合移植患者である。1989年に当科では血液型不適合移植における免疫抑制は手術中の脾臓摘出を施行している。しかし、特に小児における脾臓摘出は異論が絶えない。脾臓は細菌のフィルターであるために、摘出後にはとくに肺炎球菌の抗原量が爆発的に増加すると報告されている。そのため、スウェーデンを中心に脾臓摘出を施行しないでこの種の移植(不適合移植)を試行するプロトコールが行われてきている。高感作者同様、血液型不適合で脾臓摘出を試行しない患者に対してもリツキサンを投与し脾臓内のBリンパ球を根絶する。フロー解析において術後のB細胞のモニターをおこない液性免疫能を観察する。もっとも問題となっている高感作者や血液型不適合患者に対する新たな免疫抑制にとって改革的な時期をむかえているのかもしれない。今回の研究では液性免疫能による拒絶反応をCD15s抗原のモニタリングによってとらえることが主眼である。
暗黒物質探索ための単原子メ-ザ-法による超高感度マイクロ波検出装置

単原子メ-ザ-法;リュドベルグ原子ビ-ムレ-ザ-分光法を用いて従来にない超高感度でマイクロ波を検出する装置を開発しようとするものである。特にここでは、2.4GHz近傍のaxion転換マイクロ波を高感度で検出する目的で、リュドベルグ状態にレ-ザ-光で励起されたアルカリ原子ビ-ムを、液体ヘリウム3で冷却された超伝導Nbによる空洞共振器に通し、転換マイクロ波を吸収した原子のみ選択的に検出する装置系を開発する。昨年度は主として液体ヘリウム3クライオスタット、空洞共振器、原子ビ-ム系、電離イオン検出用フィ-ルドイオン化装置を製作したが、今年度は実施計画どうりに、リュドベルグ原子生成用のレ-ザ-源の製作整備を行った。まず現有のアルゴンイオンレ-ザ-励起リング色素レ-ザ-のプラズマチュ-ブを交換し、ミラ-系を購入してルビジュウム(Rb)原子が励起出来るように整備した。また半導体レ-ザ-素子を購入してRb原子励起に適合する素子を選別し、温度および電流制御回路システムを自作することにより、安定でかつ波長幅の狭い(single mode)レ-ザ-源を3台製作完成させた。温度安定度は10^<-6>以下(300μK以内)であり、また電流安定度も2μA以下を実現出来ており、ルビジュウム原子をリュドベルグ状態に長時間安定に励起するに十分な性能を得ている。これらのレ-ザ-系を用いて実際にCs,Rb原子の励起を行って蛍光観測によりその性能をチェック確認した。現在、原子ビ-ムのリュドベルグ状態励起を実際に行い、蛍光観測とフィ-ルドイオン化装置を用いてその確認及び空洞共振器通過の効果観測のためのデ-タ処理系の整備を行っているところである。これらの全計測システムの完成により今後、まず空洞共振器内黒体放射検出とその影響を調べ、次に2.4GHz近傍のマイクロ波検出を、自動周波数掃引システムの整備により実施出来るようにする予定である。
東南アジアの生物多様性保全のための雄アリ同定システムの構築

本年度は3年計画の最終年度であった。3年間で国内所蔵の東南アジア雄アリコレクションの概要がほぼ明らかになったと言えるだろう。だが、同時に、さらなるインベントリー情報の整備が検索システム構築には不可欠な要素であることも明らかになった。東南アジアにおける雄アリ検索システムの完成には到らなかったものの、その基礎となる知見や環境整備は3年間で大きく前進したといえる。今年度はこうした研究成果を英・和文の論文5編、著作1編、雑誌記事1編、国際学会発表1編、国内学会発表3編として公表した。昨年より本格的にカリフォルニア科学アカデミーとの共同研究を行ない、インベントリー情報が整備されたマダガスカル地域の雄アリ検索システムを構築し、このうちハリアリ亜科については発表に至った。さらにカギバラアリ亜科の研究を進めており、亜科内の翅脈の比較形態について国際学会で発表した。また、日本産アリ類の分類学的な研究を進め、アギトアリ属とウロコアリ属について発表した。また、屋久島調査の過程でハリアリ属に新知見が見出されたため、屋久島の調査報告とともに発表した。今年度は分類学的な研究と並行して、これまで蓄積された学術的な情報を分類研究者以外の研究者や一般社会へ還元するための、Web公開型データベースの整備に力を入れた。日本産アリ類画像データベースの改訂については昨年から進めていたもので、これを7月に2007年ベータ版としてWeb上に公開した。また、Web公開情報の安定的な保存と普及をさらに進め、学術的な引用に耐える環境を整備するため、新たなコンテンツを加えたデータベースを2008年CD-ROM版として、3月に出版した。また、データベースの改訂と運営を通して、現在のWeb公開型データベースが抱える問題点と展望を発表した。本年度は,3年計画の1年目であることから,前半の半年にアメリカのカリフォルニア科学アカデミーで雄アリを含む膨大な所蔵標本を使ってマダガスカル生息属の雄アリ形態情報を収集した.マダガスカルには東南アジアでは入手しにくい共通属が多く生息し,東南アジアにおける雄アリ検索表作成を大きく前進させた.また,当アカデミーは世界的に著名なアリ類画像データベースを運営しており、その画像作成技術とWeb上での同定情報提供技術を習得した.後半は,まず東南アジアにおけるアリ研究者のミーティングに参加し,研究発表およびフィールド調査を行なうとともに,東南アジアの研究者らとの交流をもった.国内では主に,これまでほとんど情報が無かった国内所蔵の雄アリコレクションの調査に重点を置いた.東南アジアコレクションを所蔵している鹿児島大学理学部と香川大学農学部を訪問し,それぞれの研究室所蔵のコレクションの中の雄アリ標本の借用およびデータベース化を行ない,同定システム構築の基盤を整備した.今後作成する同定システムのWeb公開の準備として,まずアメリカで得た技術と知識を基盤に,日本で運営する日本産アリ類データベースの改訂に必要な環境および技術を習得し,具体的改訂作業に着手した.東南アジア産のアリ類の分類学的な整備の面から,日本からインドにまで広く分布するアギトアリの分類学的な検討を継続している.また,鹿児島大学のグループと共に,ハナナガアリ属の分類学的な検討を行ない,その雄アリの部分を担当,まもなく発表する予定.本年度は雄アリ検索システムの構築に向け、前述の材料収集のほかに東南アジアのアリ類の分類体系整備に力を入れつつ、国内の画像データベースの改訂とそれに必要な国内のアリ類の分類の整備を並行して行なった。この成果は学術論文3編と学会発表4編として発表された。具体的には、アジア産ハナナガアリ属の分類学的な再検討で雄アリの部分の執筆を担当し、属内での雄アリ形質の分類的な有用性を検討、日本昆虫学会で発表した。さらにその材料で雄アリの形質からカギバラアリ亜科全体の体系を再検討し、これを国際学会で発表した。並行して分類学的検討を継続していたアギトアリとその近縁種の研究成果も受理され、まもなく出版となる。国内では、検索システムの基盤となる日本産アリ類画像データベースの情報更新を進め(現段階で約190件を更新)、改訂方針と途中経過を日本蟻類研究会の大会で発表した。また国内の分類体系整備にもつとめ、最新の日本産種名一覧と世界の属名一覧をまとめ、現在印刷中の日本産ウロコアリ属Strumigenysの未記載種の検討結果についての発表を行なった。さらに国内の分布情報整備のため、2004年から2006年まで熱帯農学研究センターが参加した屋久島での調査を基に同島のアリ相をまとめ、まもなく出版予定である。これに加えて春にはタイのカセサート大学と国立科学博物館を訪問して、博物館とは共同研究を行なうことで合意できた。国内コレクション内の所蔵状況把握にもつとめ、鹿児島大学と香川大学を訪問し、山根教授コレクションや伊藤教授コレクションを探索して前者についてのデータベース化を行なった。

また、日本産アリ類の分類学的な研究を進め、アギトアリ属とウロコアリ属について発表した。また、屋久島調査の過程でハリアリ属に新知見が見出されたため、屋久島の調査報告とともに発表した。今年度は分類学的な研究と並行して、これまで蓄積された学術的な情報を分類研究者以外の研究者や一般社会へ還元するための、Web公開型データベースの整備に力を入れた。日本産アリ類画像データベースの改訂については昨年から進めていたもので、これを7月に2007年ベータ版としてWeb上に公開した。また、Web公開情報の安定的な保存と普及をさらに進め、学術的な引用に耐える環境を整備するため、新たなコンテンツを加えたデータベースを2008年CD-ROM版として、3月に出版した。また、データベースの改訂と運営を通して、現在のWeb公開型データベースが抱える問題点と展望を発表した。
ヒトSOD遺伝子導入マウスを用いた神経損傷におけるSOD保護効果の研究

Superoxide(O2^-)の細胞障害機序解明のため、その消去酵素であるヒトSuperoxide dismutase(SOD)遺伝子導入マウス(Tg)とコントロールマウス(nTg)において中大脳動脈(MCA)閉塞による一過性脳虚血モデルと,15gの重りの自由落下による頭部外傷モデルにおいて,immediate early geneのc-fosと70kDa熱ショック蛋白(hsp70)のmRNAの発現について検討した.MCA閉塞後のc-fosとhsp70の発現についてまずラットを用いて検討した後,マウスにおいてMCA閉塞10分と60分の2虚血群において検討した.梗塞を形成しない10分虚血群ではTgにおいてc-fosとhsp70の発現時間の延長および発現領域の拡大が認められ,Tgが軽度の虚血に対してよりsus ceptabilityが高いことが示された.しかし,60分虚血群における梗塞巣,hsp70およびc-fosの発現領域は,Tgにおいて有意に縮小しており,明らかな保護効果が認められた.頭部外傷モデルにおいても,外傷後のc-fosとhsp70の発現はTgにおいてより縮小しており,また脳浮腫形成と血液脳関門の透過性亢進もTgで有意に抑制され、頭部外傷後の二次的障害におけるSODの保護効果が明かとなった。さらに、O2^-の血液脳関門におよぼす影響を検討するため、マウスの脳血管内皮細胞を膜上に一層に培養したモデルを作成し、細胞内にO2^-を発生するmenadionを添加した後の電気抵抗の変化を測定した。しかし,TgではnTgに比し有意に電気抵抗が減弱し,鉄キレート剤の前投与によりnTgと同様の値に復したことより,TgではSODの増加によりHaber-Weise反応を介しH2O2からhydroxy radicalの産生を惹起した可能性が示唆された。これらの結果はSODの保護効果を示すものの,O2^-やH2O2の代謝過程においてSODの増加がhydroxy radicalの産生を促し、細胞障害性に働く可能性も示唆され、SODが保護効果を発揮するためには、SODにより産生されたH2O2の消去系が十分に作動することが必須であると考えられた。
グリオブラストーマの腫瘍形成規定因子の同定

グリオブラストーマ起源細胞の特性を解析し、腫瘍塊形成を規定する因子の同定を目標として研究を行った。具体的には:(1)グリオブラストーマのマウスモデルを用いて、複数の腫瘍起源細胞のクローンを樹立し、その増殖能、浸潤能などのフェノタイプ解析を行った。その結果、腫瘍起源細胞の代謝特性がクローンによって大きく異なることを見出した。(2)樹立した腫瘍起源細胞の遺伝子プロファイルを解析し、(1)で同定した性質の規定因子候補を同定した。(3)同定した特性・規定因子の機能解析を行い、グリオブラストーマ起源細胞がエネルギー代謝経路として解糖経路のみならず、酸化的リン酸化経路も使用できることを証明した。本研究ではグリオブラストーマ(GBM)における腫瘍形成規定因子の探索及びGBM起源細胞の特性の解析を行った。前年度ではInk4a/Arf -/-、H-RasV12過剰発現のGBM起源細胞を複数樹立して、その特性を解析した結果、エネルギー代謝が異なる起源細胞が存在することを見出した。具体的に、メタボローム解析、代謝関連酵素の発現確認によって、生存・増殖に必要なエネルギーを主に好気的解糖系代謝から産出する起源細胞と解糖系代謝の利用が少ない起源細胞が存在することを証明した。本年度では解糖系代謝の利用が少ない起源細胞に注目をし、代謝経路をさらに解析した。細胞外フラックスアナライザーを用いた代謝経路・産物のプロファイリングにより、そのような起源細胞は主に酸化的リン酸化を利用することを見出した。さらに、そのような起源細胞が解糖系代謝を利用する起源細胞と比較して高いミトコンドリア予備能を有することを明らかにした。また、本年度は上記の結果の生物学的な意義を腫瘍組織レベルで検証した。まず、腫瘍形成能について調べたところ、代謝が異なる起源細胞が同じ効率で腫瘍を形成することがわかった。しかし、代謝関連酵素の発現など、起源細胞の代謝特性は腫瘍組織内及び腫瘍幹細胞でも保たれていることが明らかになり、現行の治療に対する反応性が異なる可能性が示唆された。また、腫瘍起源・幹細胞の代謝特性そのものが新しい治療の標的となりうることも考えられた。グリオブラストーマにおける腫瘍形成能を規定する因子の同定を最終目標として本年度は以下の実験を行った。まずInk4a/Arf -/-、H-RasV12過剰発現の脳腫瘍起源細胞よりsingle cell cloningを用いて樹立したクローンのフェノタイプを解析した。その結果、いずれのクローンも脳腫瘍幹細胞の性質を維持しながらも、その代謝経路には差異がみられることを見出した。グルコース消費量、乳酸及びATP産生量の計測より、エネルギー産生における使用代謝経路は、クローンAがより解糖系に傾いているのに対し、クローンBが酸化的リン酸化を主に用いていることを明らかにした。また、それぞれのクローンのメタボローム解析により、上記の違いを代謝産物レベルでも確認したと共に、クローンAがペントースリン酸経路を有意に使用することによって核酸を合成し、高い増殖能を維持していることがわかった。さらに、メタボローム解析よりどの腫瘍起源細胞も正常の神経幹細胞と異なる代謝経路を利用していることが明らかとなったため、その代謝の違いが治療のいい標的になりうると考え、以降代謝経路の解析を中心に行った。それぞれのクローンのマイクロアレイ解析により、代謝経路に関連した酵素で遺伝子発現が有意に高いものを同定し、同定したものについてはタンパクレベルで発現確認を行った。その結果、クローンAでは解糖系の促進を制御するヘキソキナーゼII及びピルビン酸キナーゼM2アイソザイム(PKM2)が有意に上昇しており、またTCA回路を能動的に抑制しているピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1(PDK1)も上昇していることが明らかとなった。さらに、クローンAでは上記酵素の発現を制御する低酸素応答転写因子HIF-1及びc-mycの発現も上昇していることが確認され、クローンにおいて代謝経路の主要な制御因子となっている可能性が示唆された。本研究ではGBMにおける腫瘍形成規定因子を探索すると同時に、GBM起源細胞の特性の解析を行うことが最終目標としていましたが、本年度ではまず起源細胞の特性の解析により代謝経路の差異を明らかにし、腫瘍形成規定因子を探索する入り口を確定した。また一年目の具体的目標であったInk4/ARFノックアウト正常神経幹細胞と脳腫瘍起源細胞のクローンの遺伝子プロファイリング、蛋白レベルの発現解析、代謝分子の網羅的解析(メタボローム解析)が完遂でき、規定因子の絞込みに成功した。本年度では前年度同定した因子(代謝酵素及びそれらを制御する転写因子)を中心に、腫瘍組織レベルでの発現解析を行い、腫瘍形成群・腫瘍非形成群に特異的に発現している因子をさらに絞り込む。また、有力な候補分子・遺伝子の役割及び機能解析をマウスモデルで行った後、それらの因子を各クローンでノックダウン/過剰発現させ、腫瘍形成能を規定する因子を同定する。

具体的に、以下の手順で研究を推進する:まず、同定した複数の腫瘍形成能規定因子候補の発現を移植後早期の腫瘍塊で確認する。RT-PCR,ウエスターン・ブロット、組織切片の免疫染色を用いて、一次腫瘍で高発現を示すものを同定する。さらに、免疫染色及びレーザーマイクロダイセクションを用いて腫瘍内の高発現部位を評価し、起源細胞の局在について検討する。また、二次腫瘍についても同様な解析を行う。浮かび上がった有力な候補分子・遺伝子の役割及び機能解析をマウスモデルで行う。クローン細胞を各因子に対するRNAi及び抗体で処理し、マウス脳に移植を行い、腫瘍形成能を再評価する。また、フローサイトメトリーによるソーティングが可能な場合、Ras-NSCを陽性細胞、陰性細胞に分け、各グループをマウスの脳に移植し、腫瘍形成能を確認する。さらに、病理標本・髄液・血液サンプルの定性的・定量的解析を行い、同定した因子がバイオマーカーとして適しているかどうか検証する。主にマウスモデルを用いて解析を行うため、動物購入料・飼育量、実験用材料及び試薬の消耗品に研究費を使用する予定である。また、日本癌学会学術総会、日本脳神経外科学術総会、日本脳腫瘍学会などにおいて成果の学術発表を行い、また、専門分野における情報収集を行う予定であり、その旅費として使用する計画である。
オキシクロライド高温超伝導体の高圧下単結晶育成と電子物性

Ca_<2-x>Na_xCuO_2Cl_2は、劈開性に富み清浄なCuO_2面が得られる、絶縁体からアンダードープ組成の試料が得られる、斜方晶歪みやモジュレーションがない、という特徴を全て兼ね備える唯一の高温超伝導体で、角度分解光電子分光(ARPES)やSTMの対象として最適の物質である。高圧下のフラックス法でこの超伝導体の単結晶試料を育成し、ARPESとSTMの測定を行った。x=0.1(T_C=13K)の試料のARPESデータには、シャドウバンドや大きな擬ギャップという絶縁体の名残が明確に残っていた。このことから、この系の金属化がLa_<2-x>Sr_xCuO_4の様なギャップ内状態の成長による物ではなく、ケミカルポテンシャルシフトによる物であることが示唆された。また、x=0.08と0.12の試料を用いたSTM測定では、約20Åの相関長を持つパッチ状、又は川状の模様が観察された。像のコントラストの濃淡に応じて状態密度も変化しており、金属相と絶縁体相への相分離が起こっていると考えられる。合成時の圧力をこれまでの6GPaから最高10GPaにあげることで、オーバードープ組成の試料作成に成功した。また、磁場中で配行した粉末試料を用いてμSR測定を行った。母物質であるCa_2CuO_2Cl_2はT_N=250Kの反強磁性絶縁体であるが、ドーピングに伴ってT_Nは急激に減少し、x=0.01で消失した。これはLa_<2-x>Sr_xCuO_4のx=0.02の半分の濃度である。さらに、金属絶縁体転移を起こすペロブスカイトPrNiO_3、強磁性強誘電体BiMnO_3等の結晶育成と物性研究を進めた。前者については放射光を用いた単結晶、粉末X線回折によって、金属絶縁体転移温度でNiの電荷不均化を伴う構造転移が起きていることを明らかにした。また、BiMnO_3に関連して、BiCoC_3、BiCrO_3、BiNiO_3の粉末試料作成と構造解析を行った。今年度はオキシクロライド超伝導体Ca_<2-x>Na_xCuO_2Cl_2の超伝導相図作成を行った。これまではアンダードープ領域の試料しか得られていなかったが、合成時の圧力を6GPaから8GPaへと上げることでオーバードープ(x=0.25)の試料を得ることに成功した。また、粉末試料を磁場中で配向させ、スタイキャストで固めて安定化した試料を用意してNMRとμSRの測定を行い。常電導から超伝導状態への移り変わりを調べた。その緒果、x=0.1(Tc=10 K)の試料において、50Kで擬ギャップが生じていることが分かった。擬ギャップ的な振る舞いは単結晶試料を用いて行った元気抵抗の測定でも見受けられた。擬ギャップ温度の組成依存性については14年度の課題である。Ca_<2-x>Na_xCuO_

2Cl_2培った高圧下単結晶試料育成の技術を応用し、ペロブスカイトPrNiO_3の単結晶育成を行った。この化合物は135Kで金属絶縁体転移を超こすが、明確な構造転移は見つかっておらず、そのメカニズムはよく分かっていない。得られた単結晶試料を粉砕して順良な粉末試料を得て、SPring-8のBLO2B2に設置された大型デバイシラーカメラで粉末X線回折パターンを測定し、マキシマムエントロピー解析を行った。その結果、e_g軌道がab面内で整列するために金属絶縁体転移が超こることが示唆された。Ca_<2-x>Na_xCuO_2Cl_2の磁場中配向した試料について、カナダ・トライアンフでμSR測定を行い、磁気相図の作成を行った。母体のCa_2CuO_2Cl_2(x=0)はT_N=250Kの反強磁性絶縁体である事が知られているが、x=0.0025で120K、0.005で10Kとキャリアドープに伴ってT_Nは急激に低下し、0.01では反強磁性長距離秩序が完全に消失することが分かった。このことからLa_<2-x>Sr_xCuO_4に比べて反強磁性秩序の消失が低キャリア濃度で起こり、超伝導の出現は高キャリア濃度で起こる、この系の特徴が明らかになった。二つの秩序相(反強磁性と超伝導)の間の広い組成領域にはスピングラス相があると予測されるが、今年度内に明らかにすることは出来なかった。これは次年度以降の課題である。また、単結晶試料のSTM測定によって、アンダードープ試料の超伝導状態では、異なる電子状態が空間的に分布した不均一が生じていることを見いだした。さらに、Ca_2CuO_2Cl_2xCaClO_4+xCuOの出発組成から合成した試料が、最高で38KのT_cを持つ超伝導体となることが分かった。これはCa_<2-x>Na_xCuO_2Cl_2の最高のT_cである28Kよりも高く、また、試料が化学的に安定な特徴もある。現段階ではこのキャリアドープのメカニズムが塩素を酸素で置換するためなのか、または格子間位置に過剰の酸素が入るためなのはかは不明であるが、今後粉末試料の中性子散乱実験や単結晶を用いた構造解析、蛍光X線分析によって明らかにしていきたい。
古典文献の計量的分析

三種類の古典文献に関し計量的分析を行った。(1)『源氏物語』の計量分析『源氏物語』と同時期の『うつほ物語』のデータベースを作成し、助動詞、助詞、副詞、形容動詞、形容詞、名詞、動詞、など各品詞の言葉の出現率の観点から『源氏物語』と『うつほ物語』の比較分析を行い、ほぼ同時期に成立したにもかかわらず用いている言葉、特に副詞、形容動詞、助詞、形容詞にかなり差異があるという、興味深い結果を得た。(2)『法華経』の計量分析『法華経』27巻の成立順等を研究するため、『法華経』及び『法華経』の前後に成立した『八千頌般若経』、『十地経』のサンスクリット語のデータベースを作成し,出現した言葉の頻度の観点から、三教典の文章の比較分析を試み、『法華経』27巻の成立を推定するのに有効となる知見を得た。(3)井原西鶴作品の計量分析西鶴作品の複数著者説を検討するため、西鶴散文作品のデータベースの作成を行った。今年度は、『懐鏡』、『日本永代蔵』、『色里三所世帯』、『武家義理物語』、『嵐無常物語』、『新可笑記』、『本朝桜陰比事』の作品のデータベースを作成し、既に完成している10作品のデータベースと合せて、基礎的な計量分析を行った。今年度は以下の三つの古典を中心に計量的分析に関する研究を進めた。(1)『源氏物語』すでに完成している『源氏物語』データベースを用い、『源氏物語』54巻における名詞、動詞、助詞等の各品詞の使用率を中心に計量的分析を行った。特に助詞の使用率に関しては、詳細な分析を行い、会話文と地の文(会話文以外の文)とでは助詞の使用方法が異なり、会話文では54巻の各巻で余り違いが見られないが、地の文では使用方法が異なることを明らかにした。また、このような地の文での助詞の使用方法の違いを分析することによって、54巻の成立順序に関して、新たな説を提案した。(2)西鶴作品計量分析のための井原西鶴作品のデータベース作成を進めた。『好色一代男』,『好色二代男』,『好色一代女』,『好色五人女』,『椀久一世の物語』の五作品に関しては、品詞の活用形等について情報の不完全な部分は残るが、一応データベースが完成したので、自立語約8万5千語に関し語彙用例索引を作成し、計量分析のための基盤を作った。(3)サンスクリット大乗仏典『十地経』,『八千領般若経』のデータベースを作成するとともに、すでに完成している『法華経』のデータベースを用い、不変化辞を中心に計量分析を進めた。この中で、韻文と散文では不変化辞の用い方に差があることなど今後の研究に必要となる重要な情報を得た。(1)『源氏物語』作成済みの『源氏物語』のデータベースを用いた計量分析で,以下のことを明らかにした。・主要7品詞(名詞,動詞,形容詞,形容動詞,副詞,助詞,助動詞)に関する計量分析で,『源氏物語』の中の会話文と地の文における種々の言葉の出現率の差異を明らかとし,従来からいわれていた「会話文と地の文では使用される言葉が異なる」という説を数量的に裏付けた。・『源氏物語』の後半の10巻(「宇治十帖」)と前半の44巻では,名詞,助動詞などの品詞や,「ひと」「こと」などのよく用いられる言葉の出現率に統計的に有意な差があることを明らかにし,「宇治十帖」他作家説が出てくる根拠を明確とした。昨年完成した『好色一代男』,『好色二代男』,『好色一代女』,『好色五人女』,『椀久一世の物語』の五作品に関しては,入力情報のチェックを行い,本年度入力した『武道伝来記』,『男色大鑑』,『西鶴諸国はなし』,『本朝二十不孝』,『好色盛衰記』の五作品に関しては索引作成の基礎作業を行った。(3)サンスクリット大乗仏典昨年は『法華経』に関し,不変化辞を中心に計量分析を進めたが,本年度は『十地経』,『八千領般若経』も含め,三経典のデータを用い不変化辞の使用率を分析し,法華経の成立過程の研究に必要となる重要な情報を得た。古典テキストの文章の数量的特質(文長,品詞の出現頻度,単語の出現頻度等)の計量分析を中心に,従来の古典学の研究法とは異なる切り口で古典を分析する方法を確立し,古典学研究の新しい分野を開拓することが本研究の目的である。今年度は下記の文献・源氏物語及び関連文献・梵文法華経,八千頌般若経,十地経・井原西鶴全作品を対象として研究を進めた。(1)『源氏物語』の計量分析『源氏物語』54巻の成立順序を検討するため,助詞を中心に分析を行った。また『紫式部日記』,『雲隠六帖』,『山路の露』,『手枕』等の『源氏物語』関連文献に関しても分析を試みた。(2)サンスクリット大乗仏典『法華経』,『八千頒般若経』,『十地経』の計量分析『法華経』の前後に成立した『八千頒般若経』,『十地経』の文章の特徴比較から,いまだ明確となっていない『法華経』27巻の成立順序の推定を試みた。

(3)井原西鶴作品の計量分析計量分析のために,西鶴作品の次の5作品(『西鶴諸国はなし』,『本朝二十不孝』,『男色大鑑』,『武道伝来記』,『好色盛衰記』)のデータベースを構築した。三種類の古典文献に関し計量的分析を行った。(1)『源氏物語』の計量分析『源氏物語』と同時期の『うつほ物語』のデータベースを作成し、助動詞、助詞、副詞、形容動詞、形容詞、名詞、動詞、など各品詞の言葉の出現率の観点から『源氏物語』と『うつほ物語』の比較分析を行い、ほぼ同時期に成立したにもかかわらず用いている言葉、特に副詞、形容動詞、助詞、形容詞にかなり差異があるという、興味深い結果を得た。(2)『法華経』の計量分析『法華経』27巻の成立順等を研究するため、『法華経』及び『法華経』の前後に成立した『八千頌般若経』、『十地経』のサンスクリット語のデータベースを作成し,出現した言葉の頻度の観点から、三教典の文章の比較分析を試み、『法華経』27巻の成立を推定するのに有効となる知見を得た。(3)井原西鶴作品の計量分析西鶴作品の複数著者説を検討するため、西鶴散文作品のデータベースの作成を行った。今年度は、『懐鏡』、『日本永代蔵』、『色里三所世帯』、『武家義理物語』、『嵐無常物語』、『新可笑記』、『本朝桜陰比事』の作品のデータベースを作成し、既に完成している10作品のデータベースと合せて、基礎的な計量分析を行った。
深さ方向分解能の高いオージェ電子分光法によるSi/Geヘテロ界面の評価

オージェ光電子分光装置の試料台にアッタッチメントを取り付け試料台の傾斜角度を原子層オーダーで測定できるような70度まで傾けられるようにした。しかしながら試料の極最表面に残留する炭素の為光電子の信号が減衰してしまい十分な分解能が得られなかった。どの段階で表面に炭素が付着するのかを系統的に調べた結果、ターボ分子ポンプ+ロータリーポンプの組み合わせの系ではロードロック部分に付着している炭素の影響が大きく表面に数原子層の堆積を生じてしまい検出したい1原子層の信号が減衰してしまい上手く測定ができなかった。そこで、本研究助成で購入したイオンポンプ及びソ-プションポンプの排気系とした。これにより基板表面の炭素汚染は1原子層以下に抑えることができた。XPSの測定結果と各種の偏折モデルを考慮した理論計算とのフィッティングから4原子層シリコンを成長させた試料において最表面に1層ゲルマニウムが偏析しているほか基板との界面から1層目に約10%程度のゲルマニウムの偏析があると推定される結果も得られ、オージェ電子分光法では表面第1層の偏析しているゲルマニウム層の影響が大きくエッチングによりこの層を取り除かなければ正確な評価が難しいことが分かった。原子層エッチングではシリコン及びゲルマニュウムについて行った。ゲルマニウムについては再現性が得られなかったため原子層エッチングのメカニズムを明らかにするためシリコンの(111)面を用いてセルフリッミトのための吸着とエッチングのための脱離を時間的に分離し温度変調を用いて1サイクルあたり1/6原子層のエッチングを実現した。この温度はかなり高温であるのでゲルマニウムとのヘテロ構造にはそのまま応用できないので低温化をはかる必要があり現在検討中である。
時間・角度分解光電子差分分光による正孔動力学多次元イメージ法の開発

半導体の物性やデバイス機能の発現において、伝導帯励起電子系と同様に価電子正孔系の役割は重要であるが、これまでその動的挙動を直接観察する手法が存在しなかった。本研究では、代表者らが開発した時間・角度分解光電子差分分光の手法と、佐賀大学が所有する光電子軌道制御多次元イメージング装置を融合し、励起電子系と正孔系密度分布の緩和過程を、時間・エネルギー・運動量の多次元空間において解明する。更に、光電子分光イメージと電子正孔再結合に伴う発光スペクトルを時間分解的に同時測定する事により、励起直後から再結合に至るまでの励起キャリア系の緩和過程を、電子系と正孔系の両面から、総合的かつ統一的に明らかにする。
調節性へムプールの変化に即応するためのヘム生合成調節機構の解明

ヘムは様々なタンパク質の補欠分子として機能する生体には必須の小分子で、全ての細胞で合成されている。一方で過剰なヘムは酸化ストレスの誘因となる事から、その生合成は厳密に制御される。本研究においてはヘム生合成系の律速酵素である非特異型アミノレブリン酸合成酵素(ALAS1)の翻訳後修飾機構が厳密なヘム産生の制御にどの様に関わるかについて検討を行なった。その結果、ALAS1がミトコンドリア内で特定のタンパク質分解酵素とヘム依存性に分解されている可能性が高い事などを見出し、その発現制御において新たな翻訳後修飾機構が関与する可能性が高い事を明らかにする事ができた。本研究はヘムによるヘム生合成系の制御機構のうち、ヘム生合成系の初発反応を触媒し、同系の律速酵素でもある5ーアミノレブリン酸合成酵素(以下ALASと省略)の機能発現をヘムがどのように制御しているのかを明らかにすることを目的に行なっている。ALASは細胞質で翻訳された後にミトコンドリアに移行し、ミトコンドリアのマトリクスで機能する酵素であるが、全ての細胞で発現するALAS1と赤芽球のみで発現するALAS2の二つのアイソザイムが存在する。ALAS2をヒト培養細胞でFLAG-tagとの融合たんぱく質として発現させ、tagに対する抗体を用いて免疫沈降を行って精製し、その精製たんぱく質に含まれるたんぱく質を液体クロマトグラフィーと質量分析装置を併用した検討(LC/MS)により解析したところ、LONP1というたんぱく質がALAS2と結合することが明らかとなった。LONP1はALASと同様に細胞質で翻訳された後にミトコンドリアのマトリクスに移行してATP依存性にたんぱく質を分解する酵素で、近年、ヘム依存性にALAS1の分解を促進することが報告された。従って、ALAS1と同様にALAS2もヘム依存性に分解される可能性があるため、現在は細胞内のヘム量が、ALAS2とLONP1との結合にどのような影響を及ぼすかについてさらに検討中である。また、LC/MS法を用いて、LONP1以外にもALAS2と結合するたんぱく質をいくつか同定することができたので、それらのたんぱく質とALASとの結合の意味についてもさらに検討予定である。ヘムは全ての細胞で合成され、様々なタンパク質の補欠分子として必須の働きを担う小分子で、その生合成の調節は主としてヘム生合成系の初発反応を触媒する5ーアミノレブリン酸合成酵素(5-aminolevulinate synthase: ALAS)の発現の調節により行なわれている。ALASには全ての細胞で発現しているALAS1と赤芽球系細胞でのみ発現しているALAS2の二つのアイソザイムが存在し、赤芽球ではALAS2が、その他の細胞ではALAS1が細胞内のヘム量を適切に維持する。ALASはゲノムにコードされ、ミトコンドリアのマトリクスに移行して機能する酵素で、転写・翻訳・翻訳後調節の全ての段階でその発現が制御される事が知られているが、本研究は未知のALASの発現制御機構を明らかにする事を目的に行なわれた。まず、ヒトALAS2に関してはカルボキシル末端の約30アミノ酸が本来の酵素活性を抑制する事により赤芽球中のヘムの合成を適切に制御すること明らかにし、さらに、ALAS2遺伝子の第1イントロンに転写を促進する未知のエンハンサー領域が存在する事を明らかにした。また、平成25年度にはALAS1タンパク質の翻訳後調節機構を明らかにする事を目的に、質量分析装置を用いてALAS1タンパク質と相互作用をするタンパク質の同定を試み、ALAS1タンパク質と細胞内で複合体を形成するタンパク質として100種類以上のタンパク質を同定した。それらの中には細胞質におけるALAS1タンパク質の凝集を抑制する機能を有するとみられるシャペロンタンパク質や、ALAS1の分解に関わると考えられるタンパク質分解酵素なども含まれており、細胞内のヘム量の変化に応じてALAS1の機能を制御する可能性が高いと予想される。今後はこれらのタンパク質がどの様にALAS1タンパク質の機能発現に関わっているのかを明らかにする予定である。5-アミノレブリン酸合成酵素(以下ALAS)はヘム生合成系の律速酵素で、その発現は、最終産物のヘムにより転写、翻訳、翻訳後修飾の全ての段階で負に制御されている(negative feedback)。ALASは細胞質で翻訳された後にミトコンドリアへ移行し機能するが、申請者はヘムによりALASが細胞質でホモダイマーのまま共有結合する事により(covalent homodimerの形成;以下C-H)ミトコンドリアに移行できなくなる事を見出した。すなわち、ヘムによるC-Hの形成促進は、ヘムによるnegative feedbackの一翼を担う可能性が高い。従って、本研究はCーHの形成機構の詳細を明らかにすることにより、新たなnegative feedback機構を解明する事を目的としている。

今年度は、再現性よく効率的に研究を進める事を目的に、まず精製・検出用にtagを付与したALASを安定的に、かつ誘導性に発現させる恐tのできる細胞株の樹立を試みた。その結果、ALASのカルボキシル末端にFLAG-tagを付与した組換えタンパク質をテトラサイクリンの添加により誘導性に発現させる事のできるHEK293細胞を樹立する事に成功した。次に、FLAG-tagに対する抗体を用いた免疫沈降によりC-Hも含めて精製できる事を確認した後、ヘムの添加によりALASタンパク質が非特異的な酸化を受けるかどうかの検討を、カルボニル化タンパク質検出キットを用いて行なった。すなわち、過剰なヘムがALASタンパク質を酸化し、その結果CーHの形成が促進されるのではないかと考えたが、CーHの形成におけるALASタンパク質酸化の関与は同定できなかった。平成24年度には平成23年度の遅れを取り戻し、現在はおおむね順調に進展している。平成23年3月11日に発生した東日本大震災とそれに引き続く4月7日の余震により研究室の設備は壊滅的な被害を受けたため、研究の開始を遅らさざるを得なかった。また、その後も被災した研究機器の更新に時間を要したため、通樹の研究体制に戻るまでに時間がかかったため、研究の進展は現在でもやや遅れている。LC/MSを用いてALAS1およびALAS2と結合する新たなたんぱく質を同定することができたので、今年度は主として、それらのたんぱく質とALASとの結合がどの様な意味を持っているのか、さらには結合を増強したり現弱したりする条件を明らかにすることを目標として研究を推進したい。平成23年3月11日に発生した東日本大震災により研究室の設備は壊滅的な被害を受け、なかなか通樹の研究体制に戻れなかったため、研究の進展が遅れることとなった。このため、一部の研究費を次年度に使用する事とした。現在行なっている研究計画に大きな変更は無いが、研究方法を見直す事などにより、より効率よく研究を進める事ができる様に努力したい。予定より効率よく研究を遂行できたため、次年度に使用する予定の研究費(642円)が生じた。当該研究費については平成25年度に請求する研究費と合わせて使用する予定であるが、研究計画に大きな変更はない。次年度使用額は自然災害に伴う研究の遅れにより計画どおり遂行できなかった事により生じたものであり、当初,平成23年度中に行なう予定であった研究を行なうために必要な経費として平成24年度請求額と合わせて使用する予定である。