hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「二重の経済危機」下における日本の縫製業とジェンダー―「日本的」技術の保持・継承

本年度は主として、次の二点に取り組んだ。第1に、日本の縫製業の歴史性、特に、東北地方(岩手県と福島県)について、文献研究および現地調査に基づいて明らかにした。具体的には、日本経済史、繊維産業史などの文献資料を用い、日本の縫製業の歴史的変遷を明らかにしたうえで、その中での東北地方の位置づけや特徴を、東北地方の経済及び社会構造、伝統・文化、ジェンダー規範(女性の就業率、内職状況など)をもとに考察した。第2に、「二重の経済危機」の影響とその対応について検討するために、2月に岩手県、福島県で縫製工場および地方自治体、産業振興センターでの聞き取り調査を行った。本調査を通じて、(1)「二重の経済危機」の影響(商品単価の推移や受注変動、女性労働者の雇用環境の変化)とその対応(国内外の受注を得るための商品開発、技術の高度化)に加えて、(2)東北地方に残存している縫製工場の現在の体質が、これまでの当該地域の経済、社会環境によって醸成されているという新しい発見がなされた。このことは、当該地域の縫製工場が抱える諸問題、たとえば不採算経営の体質、人材の不足、技術継承の困難について、当該地域の経済、社会環境がどのように変遷したかという視点から考えなおす点で、今後の研究に重要な示唆を与えると予測される。このほか、成城大学グローカル研究センターでのシンポジウム(平成24年10月6日)で、「女性雇用の創出と縫製産業ーバングラデシュから東北被災地へ」と題して報告を行った(招待講演)。また、本年度は海外製造を基盤とする海外移転企業の実態調査を十分に行うことが出来なかったが、申請者がこれまで行ってきたバングラデシュにおける日系縫製工場の女性労働者に関する論文を執筆し、学術雑誌『南アジア研究』に公表した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
価電子制御シリコン系量子ドット立体集積構造における高輝度エレクトロルミネッセンス

熱SiO_2膜上のSi量子ドット上にGeを選択成長させ、これを熱酸化して形成した極薄ゲルマニウム酸化膜上にSi量子ドット選択成長させることによって、自己整合的に一次元連結Siドットを形成することができることを明らかにした。さらには、n-Si(100)基板上に作成した一次元縦積み連結ドットを活性層としたAuゲート発光ダイオードを作成し室温におけるELを評価した結果、閾値電圧を超える順バイアス印加時において、金赤外領域の発光が認められ、Si-QDsを2層ランダム形成した場合と比べ、発光強度が増大する結果が得られた。これらと並行して、極薄熱SiO_2膜上のPt膜(2.0nm)にTPJミリ秒熱処理を行うことで、面密度3.0×10^<11>cm^<-2>、平均ドットサイズ4.0nmのPt-NDsが形成できることを明らかにし、このPt-NDsをフローティングゲートに応用したMOSキャパシタにおいて、Pt-NDsの深い仕事関数を反映して、膜厚4.0nmのトンネルSiO_2膜においてもドット当たり約2.7個の電子を2時間以上Pt-NDに保持できることを実証した。(1)Si熱酸化膜上への高密度Ge量子ドットの形成GeH_4-LPCVDおよびH_2-RP照射GeH_4-LPCVD後の表面形状像を測定した結果、GeH_4-LPCVDのみの場合はGe量子ドットの形成は認められず、平坦なGe膜(RMS:0.17nm)の形成が確認された。一方、GeH_4-LPCVD時にH_2-RP照射した場合は、面密度2×10^11cm-2のGe量子ドットの形成が認められた。表面形状像からドットの高さ分布を求めた結果、平均ドット高さおよび半値幅はそれぞれnm、-1.8nmであった。また、基板温度が室温から200°Cの範囲において、同条件でH_2-RP照射GeH_4-LPCVDした場合、CAD後の表面ラフネスはCAD前のSio_2と同程度(0.15nm)であり、Ge膜が形成されていないこともXPSにより確認している。さらに、基板温度300°CでH_2-RP照射GeH_4-LPCVDの堆積時間依存性を調べた結果、ドット密度は堆積時間30秒で飽和傾向にあるが、平均ドット高さは堆積時間の増加に伴い増大する。Geドットの高密度形成には、(1)水素ラジカルの供給によって、GeH_4分解を促進し、基板表面への反応前駆体の入射量が増大したこと、(2)OH終端表面への水素ラジカル入射によって脱水反応が進行し、核発生サイトとなるSiダングリングボンドの生成が促進したことが、起因していると理解できる。(2)超高密度Si量子ドットにおける二次元電気伝導Si_2H_6-LPCVD直前にOH終端した熱SiO_2表面に室温、100Torrで10minGeH_4を吸着させることで、面密度1.2×10_13cm-2で均一サイズのSi量子ドットを形成し、高密度Si量子ドット面内方向における電気伝導の時間依存性を評価した結果、15nA幅の23値を行き来するステップ状の変化が室温で認められた。この結果は、Si量子ドットを介して作られる電流パス(パーコレーションパス)近傍の中性ドットに電子が捕獲される時、その帯電効果により近傍のパーコレーションパス中のドット間トンネル過程を変調する結果として解釈できる。本年度は、シリコン系量子ドットの立体集積構造作成技術とその発光特性の定量評価を行うとともに、新規金属ナノドット形成技術開発に着目し、下記2点に力点をおいて研究を推進した。1.自己整合一次元連結Si量子ドットの形成と発光ダイオード応用熱SiO_2膜上のSi量子ドット上にGeを選択成長させ、これを熱酸化して形成した極薄ゲルマニウム酸化膜上にSi量子ドット選択成長させることによって、自己整合的に一次元連結Siドットを形成することができることを明らかにした。また、n-Si(100)基板上に作成した超高密度一次元縦積み連結ドットを活性層とした半透明Au電極のダイオード構造において、Au電極とn-Si(100)基板の仕事関数差を反映した明瞭な整流特性が認められ、順方向バイアス印加時において、室温で近赤外領域におけるエレクトロルミネッセンス(EL)が観測されることを明らかにした。

2.熱プラズマジェットミリ秒熱処理による高密度Ptナノドットの形成とフローティングゲートメモリ応用極薄熱SiO_2膜上のPt膜(2.0nm)に熱プラズマジェット(TPJ)の吹き付け走査によるミリ秒熱処理を行うことで、面密度3.0×10^<11>cm^<-2>、平均ドットサイズ4.0nmの均一サイズのPtナノドットが一括形成できることを明らかにした。さらには、このPtナノドットをフローティングゲートに応用したMOSキャパシタにおいて、ゲート掃引電圧の増加に伴い多数電荷保持に起因するフラットバンド電圧の増大が認められ、電荷注入後の保持特性において、Pt-NDsの深い仕事関数を反映して、膜厚4.0nmのトンネルSiO_2膜においてもドット当たり約2.7個の電子を2時間以上Pt-NDに保持できることを実証した。
網羅的遺伝子発現解析による新たな哺乳動物卵子体外成熟培養系の開発

本研究は,マウス排卵過程における卵胞内の遺伝子発現を経時的にかつ網羅的に解析し,成長因子,サイトカイン類が発現していること,それらが分泌し作用する仕組みを明らかとした.この成果を元に,哺乳動物において自然免疫系が受精を制御していることを初めて解明し,その機能の不全が体外受精における受精率の低下を引き起こすことを示した.さらには,それぞれの生理活性因子の添加時期を最適化した新規体外成熟培養法を考案した.本研究は,マウス排卵過程における卵胞内の遺伝子発現を経時的にかつ網羅的に解析し,成長因子,サイトカイン類が発現していること,それらが分泌し作用する仕組みを明らかとした.この成果を元に,哺乳動物において自然免疫系が受精を制御していることを初めて解明し,その機能の不全が体外受精における受精率の低下を引き起こすことを示した.さらには,それぞれの生理活性因子の添加時期を最適化した新規体外成熟培養法を考案した.本年度は,マウス卵子の排卵過程において卵丘細胞に特異的に発現する遺伝子を,マイクロアレイ法により網羅的に検出した.その結果,約3000種類の遺伝子発現が,排卵刺激ホルモンであるhCG処理により,増加,あるいは減少していることが明らかとなった.それら遺伝子は,これまで知られていたプロスタグランジンの合成に関与する遺伝子群,プロジェステロンの合成に関与する遺伝子群,ヒアルロン酸合成やその保持に関与する遺伝子群とともに,EGF like factorとその修飾酵素(Amphiregulin, Epiregulin, Adam17など),自然免疫にかかわるToll-like receptorとその下流シグナル経路にかかわるMyd88, Irf3や,サイトカイン,ケモカイン類なども発現していた.EGF like factorの発現は,プロジェステロン受容体遺伝子欠損マウスやプロスタグランジン合成酵素遺伝子欠損マウスで発現が有意に減少し,卵丘細胞におけるプロジェステロン合成やヒアルロンロン酸合成に必須であることも明らかとなった.自然免疫にかかわる因子に関しては,卵丘細胞に発現するToll like receptorを合成リガンドであるLPSで刺激した結果,細胞内のシグナル伝達経路の活性化と標的遺伝子の発現が誘起された.さらに食作用にかかわるスカベンジャ受容体も発現し,その作用により卵丘細胞は異物を貪食することも初めて明らかとした.これらの結果から,卵丘細胞は,非常に多様性を有する細胞であり,本年度に網羅的に検出した遺伝子の発現機構,その役割の詳細を検討することにより,卵子排卵機構の解明と,卵子体外培養の環境を最適化することにつながると期待された.本年度は,昨年度実施した「排卵過程の卵丘細胞に発現する遺伝子のデータベース化」の結果から,親水性の分泌因子の細胞からの放出に関与するエキソサイトーシス機構とプロテアーゼによる修飾機構について検討を行った.その結果,エキソサイトーシスに関与するSNAP25が,排卵過程においてプロジェステロン受容体依存的に発現していた.プロモーター活性測定の結果,卵巣でプロジェステロン受容体が転写因子であるSP1と相互作用し,Sp1/Sp/3サイトを介して,発現を制御していた.一方,Snap25が発現する神経細胞では,プロジェステロン受容体の過剰発現を行ってもプロモーター活性に影響はなかったことから,卵巣特異的制御機構が明らかとなった.さらに,siRNA法によるSnap25の遺伝子発現ノックダウン実験により,サイトカイン類の分泌がSNAP25によるエキソサイトーシス依存的であることも示された.昨年度に明らかとしたEGF like factorは細胞膜貫通部位,プロテアーゼによる切断部位とEGF部位を有し,プロテアーゼによる切断によりEGF部位が遊離し,標的細胞を刺激可能となる.様々なプロテアーゼ抑制剤を用いた実験から,TAPI-2が選択的に卵丘細胞のEGF like factorの機能を抑制したことから,TAPI-2の標的因子であるAD4M17に着目して研究を行った.その結果,TAPI-2が排卵過程に発現が上昇し,その遺伝子発現のノックダウンにより,標的細胞のERK1/2系の活性化が抑制され,これはEGFの添加により解除された.

これらの結果から,ADM17により修飾されて初めてEGF like factorは活性化することが初めて明らかとなった.以上の本年度の結果から,新規の体外培養法として,サイトカイン類やEGF like factorの添加条件を検討中であり,来年度はその確立を目指す本年度は,マイクロアレイ解析の結果明らかとなったNeuregulin 1の機能に着目し,その作用する卵丘細胞におけるERK 1/2のリン酸化が排卵期に誘起されることの意義について,卵巣特異的ERK1/2遺伝子欠損マウスの解析を行い, EGF like factorによる卵丘細胞でのERK1/2のリン酸化が,排卵期特異的な遺伝子発現に必須であることを初めて明らかとした(Fan, et.al., Development, 2008 ; Fan, et.al., Science, 2009).さらに,卵丘細胞特異的にEGF like factorにより発現する自然免疫系は, Toll-like receptorにより精子の接近を感知し,ケモカインを分泌することで精子の運動性を制御し,この機構が受精に必須であるという,受精における自然免疫機能について初めて解明した(Shimada et al., Development, 2008).これらの排卵期特有の遺伝子発現解析の結果を,ブタ卵丘細胞卵子複合体の体外培養系に応用し, 40%以上の卵子が体外受精により移植可能な胚盤胞期胚へ発生する新規体外培養系を開発した(Kawashima, et.al., Reproduction, 2008).これらの成果は,排卵期特有の遺伝子発現解析が,排卵機構の解明のみ成らず,体外培養系や体外受精系の改善につながることを示しており,マイクロアレイ解析の結果,発現上昇,減少が認められた500以上の遺伝子について,個々の詳細な検討が今後必要であると考えられた.
成長ホルモン関連ペプチドによるニワトリヒナ独自の脳内摂食調節機構の解明

本研究では成長ホルモンの分泌を促す成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)がニワトリヒナの摂食を抑制することを明らかにした。ニワトリGHRHはいくつかの断片が存在することが示唆されているが、それらの中でも全長ペプチドが最も強い摂食抑制作用を示すことを明らかにした。加えて、GHRHの摂食抑制作用が異常行動の誘発やストレス反応によって引き起こされるものではないことを明らかにした。さらに、成長ホルモンの分泌を抑えるプロラクチン放出ペプチドがヒナの摂食を促進することを明らかにした。これらの作用が哺乳類とは正反対であったことから、これらのペプチドがニワトリ独自の摂食調節機構に関わっていることを見出した。本研究ではニワトリヒナの脳内摂食調節機構における成長ホルモン関連ペプチドの役割について調べることを目的としている。本研究では成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)とプロラクチン放出ペプチド(PrRP)を対象としているため、初年度にあたる本年度ではGHRHとPrRPを脳室内投与した後の摂食反応を調べた。GHRHはGHRHとGHRH様ペプチド(GHRH-LP)が存在している。さらにGHRHはGHRH(1-27)とGHRH(1-47)、およびGHRH(1-27)のC末端がアミド化されたGHRH(1-27)アミドの3種類がある。そこで、4種のペプチドを合成し、それをヒナに脳室内投与した後の摂食量を測定したところ、いずれのペプチドもヒナの摂食行動を抑制することが明らかとなった。ただし、GHRH(1-27)の作用が他の3つよりも弱かったことから、GHRHの摂食抑制作用にはC末端側のアミノ酸配列、もしくはアミド化が必要であることが明らかとなった。さらに、内因性のGHRHと摂食調節の関係を明らかにするため、24時間絶食したヒナの間脳内GHRHおよびGHRH-LP mRNA発現量を調べたところ、GHRH-LP mRNAは増加する傾向に留まったものの、GHRH mRNAは有意に増加した。以上の結果から、内因性GHRHはヒナの摂食調節に関わっている可能性を示唆した。PrRPの実験でも同様のペプチドを合成し、ヒナに脳室内投与する実験も実施した。アミノ酸20個からなるPrRPを合成して脳室内投与すると摂食量が増加することを見出した。ただし、PrRPも構成するアミノ酸によって数種類あると考えられており、その他のPrRPの作用については今後の課題である。昨年度に引き続き、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)とプロラクチン放出ペプチド(PrRP)の作用について調べた。前年度は様々なアミノ酸長のGHRHおよびPrRP(1-20)の作用について調べたため、本年度はPrRP(1-30)およびPrRP(1-31)を脳室内投与した後のヒナの摂食行動の変化を調べた。その結果、いずれのPrRPもヒナの摂食を促進することが明らかとなった。次いで、GHRHおよびPrRPを腹腔内投与した後の摂食量の変化を調べたところ、GHRH(1-47)を投与した場合にのみ摂食量が低下し、その他のペプチドには効果がなかった。したがって、(1)中枢におけるGHRHとPrRPの作用はそれぞれ哺乳類とは正反対であること、中枢と末梢では作用がやや異なることを見出した。さらに、両ペプチドの作用機序を明らかにするため、1行動学的な観点からの作用機序解明、および2ストレスとの関係に着目した内分泌学的な観点からの解明を進めた。GHRHを脳室内および腹腔内投与した場合ではいずれも自発運動量に変化はなく異常な行動が見られなかった。さらに血中コルチコステロン濃度に変化が見られなかったことから、GHRHの作用は異常行動やストレスによるものではないと考えられた。PrRPを用いた実験については今後実施予定である。本研究ではニワトリヒナの脳内摂食調節機構における成長ホルモン関連ペプチドの役割について調べることを目的とした。これまでの研究により、ニワトリヒナでは哺乳類とは正反対に、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)が摂食抑制作用を有し、プロラクチン放出ペプチド(PrRP)が摂食促進作用を有していることが明らかとなっている。本年度では、まずGHRHの摂食抑制作用に関わるペプチド上の構造を見出すため、GHRHのC末端側にあたるGHRH(17-47)を脳室内および腹腔内投与したが、いずれもニワトリヒナの摂食に影響を与えなかった。これは、GHRHの摂食抑制作用にはC末端側のアミノ酸配列が無関係であることを示唆している。さらに、両ペプチドが成長ホルモン(GH)やプロラクチン(PRL)の分泌を介して摂食に影響を与えている可能性を検討する実験を実施した。まず、GHがニワトリヒナの摂食に影響を与える可能性を検証したが、GHの腹腔内投与はヒナの摂食には影響を与えないことを明らかにした。また、PrRPを脳室内または腹腔内投与しても血中GHおよびPRL濃度には変化が見られなかったことから、GHおよびPRLは両ペプチドの摂食調節作用とは関係がないことが示唆された。さらに、GHRHを脳室内投与した後の副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)の間脳内mRNA発現量を調べたが、特に有意な変化は見られなかったため、GHRHの摂食抑制作用にはCRHが関与していない可能性が見出された。最後に、GHRHを慢性的に末梢投与する実験を実施したが、投与開始の毎日の摂食量に変化は見られなかった。

これは、GHRHの摂食抑制作用が短期的なものであり、成長の調節とは無関係である可能性も示唆された。本研究では成長ホルモンの分泌を促す成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)がニワトリヒナの摂食を抑制することを明らかにした。ニワトリGHRHはいくつかの断片が存在することが示唆されているが、それらの中でも全長ペプチドが最も強い摂食抑制作用を示すことを明らかにした。加えて、GHRHの摂食抑制作用が異常行動の誘発やストレス反応によって引き起こされるものではないことを明らかにした。さらに、成長ホルモンの分泌を抑えるプロラクチン放出ペプチドがヒナの摂食を促進することを明らかにした。これらの作用が哺乳類とは正反対であったことから、これらのペプチドがニワトリ独自の摂食調節機構に関わっていることを見出した。当初予定の実験の大部分を実施しているので、(2)おおむね順調に進展していると判断した。家畜行動学、家畜生理学、家畜栄養学最終年度は、GHRHおよびPrRPがその他の摂食調節因子とどのような摂食調節ネットワークを形成しているかを明らかにする。そのため、両ペプチドを脳室内投与した後の間脳または視床下部における他の摂食調節因子の遺伝子発現量等を分子生物学的手法および組織学的手法で明らかにする。また、GHRHとPrRPは成長ホルモンの分泌に影響を与えると考えられているので、これらがヒナの成長にどのような影響を与えるかを調べる。まず、各発生段階における両ペプチドの遺伝子発現量を分子生物学的手法で明らかにする。さらに、GHRHまたはPrRPを慢性脳内投与した場合の摂食および体重の変化を調べ、成長と摂食調節の関係まで明らかにする。実験環境も整い、予定通りに研究が進んでいるので、(2)おおむね順調に進展していると判断した。本年度で必要な物品を全て購入したところ、試薬メーカーのキャンペーンなどにより、予定よりも安価に購入できたため、予想よりも低予算で研究を遂行できた。本年度の研究が十分に遂行できたと判断し、次年度の物品費に充てることにした。現在まで支障がなく研究が進んでいるので、以前に作成した研究計画に基づいて研究を進める。まず、PrRPをニワトリヒナに脳室内投与した後の摂食反応を調べ、ヒナにおけるPrRPの作用を特定する。この実験が終わった段階で次の段階に進む。これまでの成果により、GHRHもPrRPも哺乳類とは正反対の作用を示している可能性が高いため、次にその摂食調節作用機序について調べる。まず、各ペプチドの脳内分布などに関する情報がほとんどないため、組織学的手法や分子生物学的手法を用いて各ペプチドの分布を明らかにする。さらに、他の摂食調節因子との関係を薬理学的および分子生物学的手法で調べ、各ペプチドの摂食調節作用に関わる摂食調節因子を特定するとともに、その摂食調節神経ネットワークを明らかにする。次年度使用額を分子生物学的手法を用いた研究の物品費(消耗品)に充てる。本年度ではペプチドの合成等や実験動物などに研究費を使用する予定だったが、それらが予定よりも安価に購入できたうえ、実験も順調に進んだため、予想よりも低予算で研究が遂行できた。本年度研究計画も十分に進行したと判断したため、次年度で実施する組織学的手法や分子生物学的手法を用いた研究にに予算を充てることとした。
血管手術前後の各血管の血流量測定による脳内フローダイナミクスの解明

頸動脈の狭窄部位を金属製のステント(鞘から抜くと自然に大きくなるコイル状のもの)で広げる治療では、治療前後で脳内に供給する各動脈の血流量が変化すると予想される。この血流の変化は、ステント留置後の状態管理のために重要であるがこれまで経過を追った研究は少ない。私たちは頸動脈ステント留置術を行った患者さんの脳血流量を、術前、1日後、1週間後、3か月後の3回測定した。その結果脳血流量の合計は術後3か月にわたって変化し、新たな平衡状態に達するまで数か月かかることが分かった。科研申請時には予想していなかったことであるが、2014年1月にMRI装置が新しくなった。従来の撮影では若年者の速い血流を測定する場合にはアーチファクト(偽像)が見られたが、装置更新を契機にこのアーチファクトを除去することを目指し、撮影シーケンスの改良を図った。具体的には以前の撮影ではエコー時間が5.7msecであったが、これをより短時間にするようにした。現在、エコー時間として3.1msecが得られ、ほぼアーチファクトがない画像が得られている。この撮影法を使った研究計画書を当施設倫理委員会に提出し、現在審議中である。なお新しいMRI装置は今後少なくとも5年程度は更新がないので、本研究の今後の進行に影響を与えない。脳血流を核磁気共鳴装置(MRI)を用いて測定する研究であるが、前提として毎回の血流測定がほぼ一定である必要がある。このため3名の正常被験者で30分間の連続的な血流測定を行った。結果は変動係数が0.06 +/- 0.02であり、大きな変動がないことが分かった。頸動脈ステント前後の測定は1名の患者で得られている。術前に比べると、術後3か月の時点では両側中大脳動脈、脳底動脈が細くなっている。これは術前に開ききっていた動脈が、ステント留置後に正常な太さに戻ってきたことによると考えられる。本研究では頸動脈ステント留置患者に対して、ステント前、ステント1日後、ステント1週間後、ステント3か月後の計4回脳血流を測定する。また両側の内頚動脈、椎骨動脈と脳血流測定面の角度を測定した。これはこの角度が血流量測定の精度に関係するためである。これまで7例の被験者ではこの計4回の測定がすべて終了している。また別の4例の被験者では、ステント1週間後までの3回の測定が終了している。7例の被験者(68-84才メデアン71才男5女2)での測定によれば、各動脈と測定面との角度は1.4度から35.1度(平均18.0度、標準偏差8.3)であり、MRIの時期により差が見られなかった。3本の血管の血流量の合計はステント前、ステント1日後、ステント1週間後、ステント3か月後の各々の時期に対して、9.1+/- 2.8 (ml/sec平均+/-標準偏差), 11.0 +/- 2.3, 10.4 +/- 2.4, 9.6 +/- 1.8であった。椎骨動脈およびステントと対側の内頚動脈の血流量はステント前より時期を経るにつれて減少する傾向が見られた。ステントを受けた側の内頚動脈の血流量は、ステント前後で増加するが、その後は他の血管と同様に3か月の間で徐々に低下していく傾向が見られた。このことはステント後脳血流が安定するには数か月以上を要することを意味するものと思われた。昨年度まではステントの症例が少なかったが、この1年で10例が増えて予定の症例数に達した。私たちはまず施設の倫理委員会の許可を得た。その後説明および文書による同意が得られた11人の患者で、ステント留置前、留置1日後、1週間後、3か月後の両側内頚動脈、脳底動脈、両側中大脳動脈の血流量を測定した。測定には核磁気共鳴画像としてまず血管の構築が得られる三次元核磁気共鳴血管画像を撮影しそれをもとに測定するべき動脈になるべく垂直になるように、血流量測定のシーケンスであるシネ画像を設定した。撮影は患者の末梢拍動をモニターしながら測定した。撮影の特徴として画素サイズを0.6mmと先行研究より小さくしより誤差が少なくなるようにした。その後画像データをPCに送り動脈の拍動より半自動的に血管腔を定義する自作ソフトウエアを用いて解析した。結果として、ステント留置後、ステントを留置した内頚動脈と同側の中大脳動脈の血流量は増加した。対側の内頚動脈と脳底動脈の血流量は、留置3か月後では術前と比べて減少した。両側の内頚動脈と脳底動脈の血流量の合計は、ステント留置後増加し、その後の3か月で減少した。ステント留置と対側の中大脳動脈の血流量には有意な変化がなかった。結果の解釈として、頸動脈ステント留置後各血管の血流量はダイナミックに変化し、新しい平衡状態に達するために数か月要すると考えられた。

頸動脈の狭窄部位を金属製のステント(鞘から抜くと自然に大きくなるコイル状のもの)で広げる治療では、治療前後で脳内に供給する各動脈の血流量が変化すると予想される。この血流の変化は、ステント留置後の状態管理のために重要であるがこれまで経過を追った研究は少ない。私たちは頸動脈ステント留置術を行った患者さんの脳血流量を、術前、1日後、1週間後、3か月後の3回測定した。その結果脳血流量の合計は術後3か月にわたって変化し、新たな平衡状態に達するまで数か月かかることが分かった。血管に対して、垂直な断面を設定し血流を測定する必要があるが、この方法が煩雑であり時間がかかるために、被験者や患者が動くことが多く見られた。また頸動脈ステントの症例が半年間で1件と少なく、症例数を増やすことができなかった。あと3か月で測定が終了するので、今後は論文発表の準備をする。またこの研究の継続として自動的に血流量を測定するシステムを購入し、脳血流に影響する手術前後での血流量の測定を開始している。脳画像垂直な断面の設定については、そのためのソフトウエアおよびPCを別予算で購入し、脳血流測定に用いるMRI装置に2015年3月末に導入した。このため、今後は操作になれていない技師でも半自動的に撮影可能になった。また脳神経外科医師の異動があり、今後はステント症例が増える可能性がある。2015年5月、6月で新たに3名の頸動脈ステント予定患者がいるので、2015年度中には5-7名程度の患者が得られる見込みである。使用を予定していたMRI装置が2014年初期に更新になることが決定し、研究は更新後のMRI装置を用いた方が今後の継続性が望めると判断した。このため実質的に研究を開始して現在数か月しか経過していず、予定に対して遅れている。予定していた国際学会発表、論文作成などの支出がなかった。研究が遅れて推移しているために、被験者費用、国際学会発表、論文作成など当初予定していた支出がなかった。学会発表および英語論文校正費用として用いる。スタートは遅れたが、方法はほぼ確立しているので今後は順調に推移すると考えられる。今年度前半に正常被験者のデータを採取し、後半に発表、論文作成を行う。また頸動脈ステント留置患者の脳血流は並行して測定し、1年間で10名のデータ採取を目指す。平成27年度において正常被験者測定および患者での測定を集中的に行う予定である。また国際学会で結果の一部を発表するための旅費と英文論文校正費用が必要になる。計画に遅れがあり、平成25年度は謝礼を支払いする被験者がいなかった。他の業務の都合で予定していた学会に出席しなかった。平成26年度は、謝礼を必要とする正常被験者を撮影する予定である。次年度使用額はこの用途に用いる予定。
溶血性尿毒症症候群における尿細管障害の包括的病態解明研究

本研究はヒト尿細管培養細胞を用いて下痢関連溶血性尿毒症症候群(D+HUS)の尿細管障害機序を解明するものである。はじめにヒト尿細管培養細胞に志賀毒素(ST,1,2)を添加しアポトーシスが生じる適切な濃度と時間を検討したところ、10*-7μg/ml、24時間で適量のアポトーシスが起こることを確認した。次にarrayPCRを用いてmRNAレベルでアポトーシス関連蛋白を解析した。一部因子の増加を認めたが、特定のアポトーシスの経路関連因子ではなかった。またサイトカイン測定も行ったものの測定範囲内で増加は見られなかった。以上より本研究系ではD+HUSの尿細管障害機序解明は限界があると考えられた。細胞および志賀毒素(ST-1,2)の購入、及び細胞培養・細胞実験の手技確立に半年を要したため本格的実験開始が遅延した。開始後は研究計画書に沿って細胞死の検証を行った。まずはじめに尿細管培養細胞に志賀毒素を投与し、濃度・時間によるcell viabilityの測定をトリパンブルー染色を使用して行った。その結果ST-1,2ともおおむね10*-7μg/ml周辺の濃度で24時間incubateすることで適量の細胞死が起こることを確認した。この濃度は過去の多くの細胞での報告と大きく外れていないため妥当であると考えられた。次にこの細胞死にアポトーシスが関与している事の証明をTUNEL染色にて行った。上記で検証した志賀毒素の濃度および時間においてTUNEL染色を行ったところ、陽性になる細胞が多く存在し、定性的にアポトーシスであることが証明できた。現在この濃度における早期アポトーシスをAnnexinVの染色強度を使用することで定量的に明らかにすることを試みており、実験手技の確立及びデータ収集を行っている最中である。本手技が確立すれば今後は研究計画書に従ってアポトーシス関連分子の解析に移っていく。これまでの研究がベースになってアポトーシス促進・抑制物質の投与や、他の細胞での検証、サイトカイン・活性酸素等の他の因子の解析に進んでいくことができるものと考える。患者検体を使った解析も現在の手技確立後に収集していく予定である。平成25年度は尿細管培養細胞に志賀毒素を投与し濃度・時間による細胞のviabilityの測定を行った。これによって概ね毒素の濃度と暴露時間を決定したのちTUNEL染色によって細胞のアポトーシスを確認した。平成26年度には実際アポトーシスの定量を行いアポトーシス関連因子の種類と発現量を検討している。まずはTali Imaging Cytometerを用いて染色強度からアポトーシス細胞の定量化を行った。しかしながらアポトーシスを起こしている細胞は多くとも20%程度であったため再度濃度と暴露時間の検討を行った。ところがやはりアポトーシス細胞の割合が少なかったため、次にRT-qPCRによってアポトーシス関連分子の定量を行った。同様にアポトーシス関連分子の発現はごくわずかであり、現行の毒素量や投与法、測定法ではアポトーシスの誘導は不十分と考えた。今後は志賀毒素に加えてLPSやVEGF等過去の報告にあるような毒素を用いて確実にアポトーシスを誘導していくとともに徐々に集まりつつある患者検体にてアポトーシス関連蛋白やサイトカインの測定を行っていく予定であるヒト尿細管培養細胞に志賀毒素(ST-1,2)を投与し、濃度・時間によるCell Viabilityの測定をトリパンブルー染色にて行った。その結果ST-1,2ともにおおむね10*-7μg/ml周辺の濃度で24時間incubateすることで適量の細胞死が起こることを確認した。この濃度はこれまでに報告されているヒト培養細胞(血管内皮細胞や神経細胞)においてST投与にて起こる細胞死の濃度と同等であり妥当であると考えられた。次にヒト尿細管培養細胞における志賀毒素投与にて生じる細胞死に対するアポトーシス関与の有無を調べるためにTUNEL染色を行った。同濃度においてほとんどの細胞でTUNEL陽性となり、定性的にアポトーシスの関与が考えられた。さらにAnnexinV染色を定量的に行う事の出来る機器(Tali assay)を使用しアポトーシスの関与を定量的に行った。おおむね30-40%程度の細胞死にアポトーシスが関与しており、過去の他の細胞の報告よりもやや低めであるが定量的にも関与が示唆される結果となった。次に本研究の肝であるアポトーシス関連蛋白におけるmRNAでのRealtime qPCRをarrayで行うarrayPCRを行った。関連蛋白mRNAの一部に有意な上昇を認めたものの、特定のアポトーシスの経路に関連した因子の規則性を見出すことができなかった。また計画書通り一部のサイトカイン測定をELISAによって行ったものの測定した各種サイトカインに有意な上昇は見られなかった。以上よりこれらのassay系ではHUSとアポトーシスやサイトカインとの関連を示すことは困難であることが予想された。

以上より本研究系ではD+HUSの尿細管障害機序解明は限界があると考えられた。開始時に実験道具の準備や手技確立に時間を要した。その上で実験手技そのものは極めて順調に進めていたが、上記に記したように通常の方法ではアポトーシスの誘導に至らないことが分かった。他の実験方法を試してみる以外に計画書に記したような別の実験に取りかかるべく準備をしているが計画よりも遅れていることは事実である。小児腎臓病学今後は志賀毒素に加えてLPSやVEG、TNFαF等過去の報告にあるような毒素を用いて確実にアポトーシスを誘導していく方法を考えている。また計画書に書かれているようなサイトカインやケモカインの解析も同時に進めていく。また徐々に集まりつつある患者検体を使用してアポトーシス関連蛋白やサイトカイン、ケモカインなどのタンパク質の測定を行っていく予定である。細胞および志賀毒素(ST-1,2)の購入、及び細胞培養・細胞実験の手技確立に半年を要したため本格的実験開始が遅延した。残り半年の経過としては比較的当初の予定通り進めることができたが前述のようにアポトーシスの定量性に関して再度多くの検討が必要な状況である。現在様々な条件設定の変更や細胞種の変更等を行い検証を進めている状況ではある。しかしながら全体としては当初の計画よりかなり遅延していることは否めない状況である。アポトーシス関連分子の解析に計画よりも時間を要することが判明し解析に必要で使用期限が短いarrayPCRキットを実験の進捗に応じて買う必要があるため未使用額が生じた。また結果が出ていないため学会発表や論文作成に必要な経費についても未使用額が生じた。今後はアポトーシスの定量性を明らかにしていった上でさらにarray PCRを行うことでこれまでに全く知られていなかったアポトーシスの経路を明らかにすることができる。また他の細胞や因子に関しては同様のストラテジーで行うことができるため遅れを取り戻すべく進むことができると考えられる。アポトーシスの定量性が明らかにできなかった場合は現在の機器でなく別の機器を利用することも考えているがさらに実験が遅延することを考えると、Cell viabilityをさらに詳しく解析することで細胞死の定量性を明らかにし、array PCRに進めていくことも考慮する。またアポトーシスそのものが少なかった場合は他の文献もあるようにTNFαのような他の薬剤、サイトカインを加えることでさらにアポトーシスを促進することも考慮する。array PCRでアポトーシスの経路が明らかになれば実験は当初の予定に近づくことができる。この時点で患者検体の収集も考慮し、研究計画の遂行が可能となる可能性がある。arrayPCRを順次購入しHUSにおけるアポトーシスの経路を明らかにした後は阻害物質や培養条件変更によるアポトーシス抑制実験(RT-qPCRを使用予定)を行う。また患者検体にてアポトーシス関連蛋白やサイトカイン測定を行う。そこで得られた結果を学会発表や論文作成するために予算を使用する。
東アジアにおける鑑賞教育の現状調査ならびに比較研究

本研究は、近代以前から日本が緊密な文化的影響関係をもってきた東アジア諸国における鑑賞教育を調査することにより、(1)近代主義の功罪を見直し、今後の文化的・伝統的視点の生きた教育理念を構築していくこと、(2)教育現場での授業実践へと研究を推進させていくための基盤を得ること、を目的としている。調査内容は、理念に関わる資料収集と、現場の実践見聞を主としたフィールドワークを主とし、東アジアの鑑賞教育を対象として以下2つの視点から行った。(1)東アジア諸国(中国・台湾・韓国)における「近代」以降の鑑賞教育の理念と実践に関わる資料収集、および現在の美術教員による授業実践に関するフィールドワーク(2)東アジア諸国の鑑賞教育に対する欧米(アメリカ・ドイツ)の研究、および欧米における鑑賞教育の東アジアへの影響に関する調査研究成果の形態・研究成果報告書には、調査収集資料をもとに、研究メンバーがおのおのの視点から考察を加えたものを収録した。・研究期間中に収集した資料の中から文献を邦訳して抄録した。これは、今後の継続的な研究に向けて、研究メンバーが相互活用できる便宜をはかり、別途CD-ROMに収めた。・調査研究をすすめつつ、鑑賞教育の具体的なありかたを提示するため『鑑賞101選』を執筆・編集した。はじめに、歴史的・文化的に重要な作品を西洋・東洋からそれぞれ選出し、公教育において取り上げるべき作品の検討を行った。続いて、現場での授業で鑑賞教材として活用していくために、作品に関して3つの視点「作品のテーマと内容」「作品の見所」「美術史上の位置」を設け、全202作品を分担執筆した。・書画領域の共通課題を認識する上で、本課題と重要な接点をもつ国際会議(第5回書法文化書法教育国際会議)の研究論文選を別途刊行した。今後の課題報告書に収めた論考は、研究メンバーおのおのが、それぞれの国や自治体が発する教育方針を把握した上で、現状に根ざす実践上の課題を提起したものである。今後は、これらをカリキュラムや指導理念に反映させながら、実践の力を高めあうネットワークづくりを目指していきたいと考えている。本研究は、近代以前から日本が密接な文化的影響関係をもってきた東アジア諸国における鑑賞教育を調査することにより、文化的・伝統的視点の生きた教育理念の構築、および教育現場での授業実践へと研究を推進させていくための基盤をえることを目的としている。研究メンバーは互いに役割を分担し、以下の活動を行なった。また、国内において調査結果および収集資料を報告しあい、次年度以降の調査計画と比較のための視点を検討した。なお、研究初年度(本年度)は調査結果および基礎資料収集をもちよって研究方針を定めていく方法をとっているため、研究メンバー個人による論文執筆は行なっていない。1、台湾における調査(1)2004年8月25日から27日まで台湾で開かれた第3回アジア芸術学会の研究発表会において台湾の芸術研究の資料を収集するとともに、鑑賞教育をテーマとした台日のシンポジウムを開いて相互の教育理念と学校現場での問題点を討議した。(2)2004年12月25日から29日まで訪台し、市内の小学・中学における美術鑑賞の授業を視察、調査した。2、中国における研究交流文化的・伝統的視点の生きた教育理念がどのように実践されているかを視察するため淅江大学芸術学院を訪問し、書法と文学の検討会を実施した。3、アメリカにおける研究討議2004年10月13日16日から18日までアメリカ・サウスカロライナ大学で開催された

第4回漢字書法教育学会において、非漢字文化圏における書法鑑賞の視点がどのような点におかれているかを調査し、あわせて書法鑑賞の教育法に関する討議を行なった。4、ドイツにおける調査2005年2月26日から3月7日まで訪独し、ドイツの美術教育において東アジア美術がどのように捉えられているかを調査した。あわせて、ドイツにおける美術教育理念、鑑賞教育に関する資料を収集した。5、国内研究会台湾における鑑賞教育史の検討、杜衛教授より「中国の鑑賞教育理念」に関する知識提供をうけて討議した。1本年度の研究は、平成16年度の調査資料をもとに、どのような視点からこれらを分類し、さらに第2次・第3次調査を行うかの指針を検討することに力点をおいた。当初、前年度に行った日本国内におけるアンケート調査と同様のものを海外調査国(中国・台湾・韓国)において実施するべく用意をしたが、各々の国の教育制度における美術教育や書教育の目的が異なるために、即座に調査することは困難になった。そこで、現状調査・資料収集においては、以下の点を中心にすすめることとした。(1)国が示す美術教育における鑑賞教育の位置づけ(2)教育課程における書画ジャンルの位置づけと認識(3)小学校・中学校・高等学校・大学における授業観察(4)上記の学校間の連携、発達段階に応じた教育課程への認識について(5)学校と美術館の連携の有無、またそれらを生かした授業展開2本年度調査を行ったのは、以下の機関である。(1)中国(西安美術学院、宝鶏市小・中学校、宝鶏師範大学、西安師範大学)(2)韓国(釜山デザイン高等学校、釜山教育大学校、相堂小学校、海江中学校、釜山博物館)3上記の現状調査を比較研究へ展開させるため、講師を招いての講演会と研究メンバー企画のシンポジウムを開催した。(1)講演「東西美学思想交流における中国と日本」陳望衡(中国・武漢大学教授)(2)シンポジウム「東アジアの鑑賞教育を考える」神林恒道・萱のり子・新関伸也※なお、本研究は最終年度(平成18年度)に調査内容を総轄する予定ですすめているため、本年度は研究メンバーが個人レベルで成果を公表するための論文執筆を行っていない。本研究は、近代以前から日本が緊密な文化的影響関係をもってきた東アジア諸国における鑑賞教育を調査することにより、(1)近代主義の功罪を見直し、今後の文化的・伝統的視点の生きた教育理念を構築していくこと、(2)教育現場での授業実践へと研究を推進させていくための基盤を得ること、を目的としている。調査内容は、理念に関わる資料収集と、現場の実践見聞を主としたフィールドワークを主とし、東アジアの鑑賞教育を対象として以下2つの視点から行った。(1)東アジア諸国(中国・台湾・韓国)における「近代」以降の鑑賞教育の理念と実践に関わる資料収集、および現在の美術教員による授業実践に関するフィールドワーク
AB_n型分子の一段階重合による高分枝芳香族ポリアミドの合成

一分子中にカルボキシル基を1個、アミノ基を2個有するAB_2型モノマーを合成し、リン酸系縮合剤を用いた直接重縮合により高分枝芳香族ポリアミドを合成した。生成重合体は白色粉末として得られ、非プロトン性極性溶媒、メトキシエタノール等に可溶であった。IR、^1HNMR、^<13>CNMRから構造を確認した。モデル化合物を用いたピークの帰属を行い^<13>CNMRから算出した分岐度は0.48であった。生成重合体は一般的な高分枝高分子と同様に非晶質であり、DSCによるガラス転移点は200°Cであった。末端に多数存在するアミノ基を3,5-ジニトロ安息香酸クロリドで化学修飾したサンプルはガラス温度が約40°C上昇した。AB_2型モノマー、AB型モノマーの無触媒での加熱溶融重縮合を行った。AB_2型モノマーの重合からはガラス状固体が得られ、これをDMFに溶解して再沈殿精製することにより白色粉末状の重合体を得た。スペクトル測定による重合体構造、溶解性、熱特性などは溶液重合で得られたものと同一であった。一方、AB型モノマーの熱重合では、生成物の収率、粘度ともに低く、オリゴマーの生成にとどまった。本重合は溶媒、触媒等を必要としないため、反応条件(加熱時間、真空度など)により重合度の制御(特に低から中分子量体)が容易に可能である。重合体の分子量に対する粘度は直鎖高分子と比べて低く、実線の傾きから求めたMark-Houwink式の粘度指数は0.35であった。これは一般の線状高分子より小さな値であり、溶液中で三次元的広がりをもったコンパクトな状態をとっていることが推定される。AB型分子を合成し、重合することにより分岐度の高い(直鎖部が少ない)重合体の合成を試みた。AB型モノマーから合成した高分枝芳香族ポリアミドは末端基部(未反応アミノ基を2個もつユニット)が多く存在することが^1HNMRスペクトルより明らかとなった。
野球における最適な『肩を作る』方法の科学的検証

各種スポーツにおいて、その競技特有の表現や用語がある。その中の一つである、野球における『肩を作る』に本研究は着目する。この言葉は、試合等において全力投球を行うための準備を意味し、投球パフォーマンスの発揮だけでなく、外傷・障害の予防においても非常に重要な取り組みである。しかし、『肩を作る』とは何なのか?肩がどんな状態になるのか?については不明である。そのため実際の競技現場では、選手や指導者の経験もしくは感覚を頼りに『肩を作る』が行われている。そこで本研究では、『肩を作る』を科学的に検証し、投球パフォーマンスの向上を促しながらも、投球による外傷や障害の発生を予防できる最適な方法の確立を目指す。
骨肉腫に対する抗PD-1抗体の有用性の検証およびWntシグナルとの関連性の解明

メラノーマ等に対する有効な新薬である抗PD-1抗体が、骨肉腫に対して有効かどうか検証を行った。マウス背部皮下に骨肉腫を移植したモデルを作製し、抗PD-1抗体を投与した群としていない群の生存、腫瘍体積を比較したところ、抗PD-1抗体を投与することで生存日数が延長し、腫瘍体積の増大を抑制することができた。また、抗PD-1抗体の投与で腫瘍に対する免疫反応を抑制する抑制性T細胞を減らすことが新たに分かった。<方法>マウス(C3H/HeSlc、日本エスエルシー)の背部皮下にマウス骨肉腫細胞株(LM8、理研cell bank)を移植し、骨肉腫モデルマウスを作成した。準拠した論文に従い作成すると腫瘍の成長が早く、人道的エンドポイントで安楽死させた場合に肺転移が確認できない例が散見された。腫瘍死の再現としての妥当性と、抗PD-1抗体の肺転移への影響が評価しにくいとの観点からモデルマウス作成のプロトコールを検討した。マウス抗PD-1抗体(4H2、小野薬品工業)を腫瘍移植日から3回/週の頻度で合計5回(1回あたり20mg/kg)腹腔内投与し、腫瘍体積と生存期間を調査した。統計学的検討として腫瘍体積はt検定、生存期間は生存曲線を作成しLog Rank解析を行った。実験に当たり「研究機関等における動物実験の実施に関する基本指針」、「信州大学動物実験等実施規程」を順守した。<結果>初期の移植細胞数を1×10^7から1×10^6に減じ、人道的エンドポイントで安楽死させたところ全例肺転移を認めた。腫瘍体積はコントロール群560.5±297.1立方mmに対し、抗PD-1抗体群59.5±53.0立方mmと、腫瘍増大の抑制を認めた(移植2週後、p<0.01)。生存期間はコントロール群23.2±0.8日に対し、抗PD-1抗体群38.0±4.8日と、生存期間の延長を認めた(p<0.01)。<考察>抗PD-1抗体の投与は骨肉腫モデルマウスにおいて腫瘍の増大を有意に抑制し、生存率を改善した。PD-1/PD-L1インタラクションの阻害が腫瘍抑制的に作用したと考えられ、骨肉腫に対する抗PD-1抗体の有用性を示す結果であった。<意義および重要性>骨肉腫に対する抗PD-1抗体による治療成績は基礎研究レベルでも報告がなく、今回の結果は今後抗PD-1抗体を骨肉腫に適応拡大するうえで重要な意義を持つ。モデルマウスの作成は原著に従い行う予定であったが、人道的エンドポイントを順守すると予想外に早く腫瘍径が許容上限に至り、安楽死となることがあった。原著論文は、4週間の経過観察の後に100%の肺転移率を認めたという結果であったが、本研究では安楽死の時期が早いと肺転移を起こしていない場合があった。そこで、移植時の腫瘍細胞数を減じた群を作り、モデルマウスの作成方法の検討を行わなければならず、予想外に時間がかかった。その後の抗PD-1抗体の投与量や投与経路に関する実験系自体はもともと実験経験の蓄積がある小野薬品工業からの情報提供を受けたこともあり、順調に構築することができた。治療効果を検討するうえで要となるin vivo実験における生存日数の改善を示す結果がすでに得られており、今後は実験計画に従い、組織検体の評価や治療効果の機序の解明に進むことができる。in vitroでIFNγ刺激により骨肉腫のPD-L1発現が増強した。骨肉腫細胞株皮下移植マウスにおいて抗PD-1抗体(4H2)は腫瘍体積を抑制し、全生存期間を改善した。抗PD-1抗体の投与により、腫瘍に浸潤している抑制性T細胞(Treg)の割合が有意に減少した。抗PD-1抗体の投与で腫瘍のWnt古典経路標的遺伝子発現が有意に低下した。本研究結果はマウス骨肉腫皮下移植モデルにおける抗PD-1抗体の有用性を示すものである。現在他国にて実施されている複数種類のがんに対する抗PD-1抗体の臨床試験の中間結果において、骨肉腫に対する治療効果ははっきりしていない。この結果は単一のモデルではあるものの、骨肉腫に対し抗PD-1抗体の有用性を裏付けるものとなりうる。また、抗PD-1抗体の効果予測に使用されているPD-L1分子発現のメカニズムについても、今までほかのがん種において示されていたようにIFNγにより惹起されるという関係が骨肉腫においても成立することが分かった。さらに、抗CTLA4抗体で示されている抗体投与によるTregの減少も確認された。詳細なメカニズムについては現在検証を進めているが、抗PD-1抗体により、Treg上に発現しているPD-1分子を認識し、除去する機構が存在すると考えられる。抗PD-1抗体は腫瘍とT細胞のPD-1/PD-L1インタラクションを解除し、疲弊したT細胞を再活性化することが基本的な作用機序と考えられているが、腫瘍に対する免疫応答を抑制するTregを除去することにより、相乗的な抗腫瘍効果を得ている可能性か考えられる。

また、抗PD-1抗体の投与で腫瘍に対する免疫反応を抑制する抑制性T細胞を減らすことが新たに分かった。実験計画に従い組織検体の免疫染色を行い、腫瘍に対するT細胞の浸潤の有無を評価する。また、PD-L1およびPD-L2発現の変化、Wntシグナル活性(リガンド、レセプター、標的遺伝子、βカテニンの発現など)をリアルタイムPCRおよびウエスタンブロット法で解析する。そのうえで生存率、腫瘍の大きさ、遠隔転移の有無と分子生物学的解析の結果の相関性について検討し、治療効果および効果の優劣と分子生物学的な解析結果との関連性を解析する。さらに、実験計画書に従い、他の骨肉腫cell lineでも同様の結果が得られるかどうか検討を行う。現時点では抗PD-1抗体による治療とWnt経路の関連を示唆する所見は得られていないが、今後の解析の進捗によってはWnt阻害剤との併用治療を視野に検討を行っていく。また、治療効果に影響を与える可能性のある因子として、腫瘍のPD-L1分子発現量をはじめとした免疫チェックポイント分子の発現の評価を行う予定である。また、一方で抗PD-1抗体単剤では完治に至らない背景として、抑制性T細胞(Treg)の増加などが起こっている可能性を予備実験で確認しており、本実験としてデータを収集する予定である。T細胞自体の機能にも着目し、抑制性T細胞の割合や腫瘍免疫に関連する分子の発現を評価する予定である。整形外科当初計画で見込んだよりも安価で遂行できたため、若干の次年度使用額が生じた。次年度分と合算し、予定通り実験試薬およびキット、マウスの購入、維持に使用する。
複製新生鎖へのクロマチン形成機構の探索：AFMによる新生鎖クロマチンの可視化解析

新生鎖にヌクレオソームが形成されるメカニズムを明らかにする。とりわけ、直接可視化の手法を取ることで、ヒストンシャペロンと期待される各因子(CAF1、Asf1、Mcm2やDpb3-Dpb4など)の分子機能や、それらにより形成されるヌクレオソームの配位、もしくはクロマチン高次構造を明らかにする。そのために、各ヒストンシャペロン因子によるヌクレオソーム形成の様子をin vitroで再現し、その生化学的解析とAFM可視化解析を行う。また、各ヒストンシャペロン因子の変異株である酵母細胞から複製フォークの形成されたミニ染色体を回収し、それをAFMにより観察することで新生鎖のヌクレオソーム構造を検出する。