hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
F_1-ATPaseの分子内対称と触媒機構

F1ATPase(サブユニット構成α3β3γδε、分子量38万)は,呼吸鎖が形成する、膜を隔てた水素イオンの濃度勾配をATPに変換するATP合成酵素の可溶性部分であり、生体エネルギー変換で重要な役割を果たす分子である.F1ATPaseの触媒機構の理解の深化のため、牛心臓のF1のヌクレオチド結合型構造モデルを使って、分子置換法を用いることにより、好熱菌F1のα3β3複合体のヌクレオチド非依存型の構造を3.2Å分解能で決定することを本研究で目指した.構造解析はいくつかの困難に遭遇したが、結晶構造を得ることが出来た.α3β3複合体の結晶化の困難さを、調製法の検討、結晶化条件の検討を行うことで克服した後、放射光で3.2Å分解能回折データを収集した.データ解析の結果、空間群はP312(a=160Å)と確定した.この回折データを用い、CCP4プログラムパッケージを用いて分子置換法による構造計算を行った.非対称単位あたりのモデルを確立したあと、rotation function, translation functionの計算,rigid body refinementを行った.更にXplorを用いて通常のrefinementを行い、現在Rfactorは16.2%である.ヌクレオチド非存在下で、3個のαサブユニット、3個のβサブユニットは等価であるような対称的構造をとる.これはヌクレオチド存在下でのミトコンドリアF1の非対称な構造と対照的である.αサブユニット、βサブユニットとも、ミトコンドリアのF1のサブユニットのうち、開いたサブユニット(αTP、βE)と非常によく似たコンホメーションをとっており、それをうけて活性部位のインタフェースは開いていることがわかった.F1ATPase(サブユニット構成α3β3γδε、分子量38万)は,呼吸鎖が形成する、膜を隔てた水素イオンの濃度勾配をATPに変換するATP合成酵素の可溶性部分であり、生体エネルギー変換で重要な役割を果たす分子である.F1ATPaseの触媒機構の理解の深化のため、牛心臓のF1のヌクレオチド結合型構造モデルを使って、分子置換法を用いることにより、好熱菌F1のα3β3複合体のヌクレオチド非依存型の構造を3.2Å分解能で決定することを本研究で目指した.構造解析はいくつかの困難に遭遇したが、結晶構造を得ることが出来た.α3β3複合体の結晶化の困難さを、調製法の検討、結晶化条件の検討を行うことで克服した後、放射光で3.2Å分解能回折データを収集した.データ解析の結果、空間群はP312(a=160Å)と確定した.この回折データを用い、CCP4プログラムパッケージを用いて分子置換法による構造計算を行った.非対称単位あたりのモデルを確立したあと、rotation function, translation functionの計算,rigid body refinementを行った.更にXplorを用いて通常のrefinementを行い、現在Rfactorは16.2%である.ヌクレオチド非存在下で、3個のαサブユニット、3個のβサブユニットは等価であるような対称的構造をとる.これはヌクレオチド存在下でのミトコンドリアF1の非対称な構造と対照的である.αサブユニット、βサブユニットとも、ミトコンドリアのF1のサブユニットのうち、開いたサブユニット(αTP、βE)と非常によく似たコンホメーションをとっており、それをうけて活性部位のインタフェースは開いていることがわかった.
身体バランスの保持へ果す咬合の役割

I.目的:クレンチングに伴い発現する頸部筋の筋活動が頭部の固定に関与しているという仮説をもとに、身体への側方衝撃を負荷した場合のクレンチング強度と頭位変化および重心動揺との関係について検討した。II.方法:顎口腔系に異常を認めず、個性正常咬合を有する男性5名(平均年齢27.4±3.4歳)を選択し、左右咬筋および胸鎖乳突筋に筋電図の表面電極を貼付し、加えて頭部と体幹に磁気背センサ式3次元空間計測装置の2個のセンサを設置し、重心動揺計上で直立姿勢をとらせた。被験者が各種クレンチングを施行した時点で、振り子を用いて、被験者の頭部、肩部、腰部に対して、側方から被験者にタイミングを計られないように不規則なタイミングで、衝撃荷重を負荷した。胸鎖乳突筋および咬筋の筋活動量筋電図積分値、体幹センサに対する頭部センサの相対角度である頸部側屈角、頸部回旋角、頸部前後屈角の衝撃負荷によって生ずる振幅最大値と、頭位軌跡長、重心動揺軌跡長を算出し、分析した。III.結果と考察:1.胸鎖乳突筋の筋活動量はクレンチング強度が増加すると増大すること、また衝撃負荷後の筋活動量が衝撃負荷前のそれよりも有意に増大した。2.クレンチングによって、頭位変化および重心動揺が抑制されることが示唆された。3.クレンチング強さおよびクレンチング部位の差が頭位変化および重心動揺の大きさに及ぼす影響は認められなかった。4.頭位軌跡長・重心動揺軌跡長比は身体バランスを表示する有効なパラメータとなることが示唆された。本研究の結果から、クレンチングに協調して認められる頸部筋の筋活動は、身体のバランスを乱すような外力に対して頭部を固定し、頭位変化を抑制するとともに、全身の重心動揺を抑制することが示唆された。1.目的本研究は、クレンチングが身体の平衡性を乱すような外力に対して、頭位ならびに身体の平衡性を安定化させるとの仮説をもとに、クレンチングの強度が頭位ならびに身体の平衡性に及ぼす影響と閉口筋活動の頚部筋活動に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。2.方法被験者は、難聴および平衡障害がなく、顎口腔系に異常を認めず、身体運動時に不随意的にクレンチングが発現する男性5名とした。記録の採取は、被験者に咬筋筋活動を指標とした聴覚的フィードバックにより、クレンチング強さを段階的に変化させた条件で噛みしめを試行させ、腰部に身体の平衡性を乱すような衝撃を負荷し、この時の咬筋および頬鎖乳突筋の表面筋電図、頭位(磁気センサー式3次元空間計測装置)全身の重心動揺(平衡機能ならびに重心動揺測定装置)を同時に記録した。また、クレンチング時の咬合カバランスを咬合力診断フィルム(Dental Prescale)と専用解析装置(Occluzer FPD-707)を用いて記録した。3.結果と考察クレンチング強度の増加に伴い、胸鎖乳突筋の筋活動の増加が、頭位変化と重心動揺については減少する傾向が認められた。被験者は個性正常咬合を有しており咬合力バランスとの関連は示されなかった。これらの結果から、クレンチングが身体への衝撃負荷による頭位変化および重心動揺の補正に関与する役割を担っていることが示唆された。なお、平成19年度は、口腔内装置により咬合バランスの変化させることで全身の姿勢保持におけるクレンチングの役割について詳細に検討する予定である。I

目的:クレンチングに伴い発現する頸部筋の筋活動が頭部の固定に関与しているという仮説をもとに、身体への側方衝撃を負荷した揚合のクレンチング強度と頭位変化および重心動揺との関係について検討した。II方法:顎口腔系に異常を認めず、個性正常咬合を有する男性5名(平均年齢27.4±3.4歳)を選択し、左右咬筋および胸鎖乳突筋に筋電図の表面電極を貼付し、加えて頭部と体幹に磁気センサ式3次元空間計測装置の2個のセンサを設置し、重心動揺計上で直立姿勢をとらせた。被験者が各種クレンチングを施行した時点で、振り子を用いて、被験者の頭部、肩部、腰部に対して、側方から被験者にタイミングを計られないように不規則なタイミングで、衝撃荷重を負荷した。胸鎖乳突筋および咬筋の筋活動量筋電図積分値、体幹センサに対する頭部センサの相対角度である頸部側屈角、頸部回旋角、頸部前後屈角の衝撃負荷によって生ずる振幅最大値と、頭位軌跡長、重心動揺軌跡長を算出し、分析した。III結果と考察:1.胸鎖乳突筋の筋活動量はクレンチング強度が増加すると増大すること、また衝撃負荷後の筋活動量が撃負荷前のそれよりも有意に増大した2.クレンチングによって、頭位変化および重心動揺が抑制さることが示唆された。3.クレンチング強さおよびクレンチング部位の差が頭位変化および重心動揺の大きさに及ぼす影響は認められなかった。4.頭位軌跡長・重心動揺軌跡長比は身体バランスを表示する有効なパラメータとなることが示唆された。本研究の結果から、クレンチングに協調して認められる頸部筋の筋活動は、身体のバランスを乱すような外力に対して頭部を固定し、頭位変化を抑制するとともに、全身の重心動揺を抑制することが示唆された。
反強誘電-強誘電フラストレーションがもたらすリラクサー強誘電体の巨大応答機構

巨大な誘電・圧電応答が観測されているリラクサー誘電体のMorphotropic Phase Boundary(MPB;菱面体晶-正方晶組成境界)が,潜在的に反強誘電-強誘電相境界でもあることが系統的な微視的実験により明らかになってきた.本研究では,“相転移を回避する急速な冷却"を用いて,相転移より高温側の巨大応答状態を凍結し,不均一な系における反強誘電-強誘電競合状態の解明を目指している。2018年度は急速な冷却を行うためのレーザーやレーザー光を集光する為の光学機器を購入し、レーザー加熱システムの構築を行った。急冷する速度は加熱に用いるレーザーの遮蔽速度と試料サイズに依存するが,特に強誘電体のような絶縁体では熱の拡散速度が遅いため,試料サイズが律速になる.通常の実験室で得られる冷却速度を遥かに超える102-103 K/Sの冷却速度を実現するには試料サイズを極力小さくする必要があり、本年度は研磨治具の開発により、薄さ50μmの単結晶試料の作成に成功した。また,予想される競合状態は,冷却速度により,マクロスコピックな強誘電R相,強誘電T相,反強誘電相のみならず,それらのメゾスコピックなドメインが考えられ,散漫散乱の強度はBragg反射より23桁低くなることが予想される.微小な試料からの弱い散漫散乱シグナルの観測を行うため、輝度の高い放射光X線が得られるSPring8にて実験を行った。最初のSPring8でのX線回折実験では、レーザーにより常誘電相まで加熱することが出来ず、期待したような回折パターンの変化が得られなかった。この原因として現在、以下の項目を検討している。1)試料サイズ:試料サイズが小さければ小さい程、温度の上昇は大きくなる。2018年度は断面積1mm^2の単結晶試料を用意したが、まだ試料サイズが大きすぎる可能性がある。2)レーザー集光:レーザー光は実験環境の都合上、レーザー光源から試料近くまで光ファイバーで導入し、試料近くでレンズを用いて集光している。集光系の調整ミスにより試料に伝わるエネルギー密度が減少してしまう可能性がある。3)レーザー光吸収効率:試料の冷却速度を向上させるために50ミクロンの非常に薄い単結晶試料を用意したが、逆に薄いがためにレーザー光が試料で十分吸収できずに透過してしまう可能性がある。2019年度は、レーザークエンチ法を確立させるために以下の改良を行う。1)試料断面積の小型化:更なる温度の上昇の為には断面積の小さな試料を用意する必要がある。これまでの10倍の昇温を実現する為、現在1mm^2の試料断面積を0.1mm^2と1/10にする。2)レーザー集光システムの改良:光ファイバーを用いることで、その端面でエネルギーが10%ずつロスしてしまう上、ファイバー出口でレーザーは発散光になってしまうため、どうしても集光効率が悪化する。本年度はファイバーを用いずにレーザーを試料に照射する光学系を構築して、集光効率を向上させる。3)レーザー光吸収効率の向上:レーザー光を吸収する金属の粉体を試料に塗布するなどして、レーザー光の吸収効率を向上させるこれらの改良を行ったレーザークエンチを用いることで、相転移より高温側の巨大応答状態を凍結し,不均一な系における反強誘電-強誘電競合状態の解明を目指す。

3)レーザー光吸収効率:試料の冷却速度を向上させるために50ミクロンの非常に薄い単結晶試料を用意したが、逆に薄いがためにレーザー光が試料で十分吸収できずに透過してしまう可能性がある。2019年度は、レーザークエンチ法を確立させるために以下の改良を行う。1)試料断面積の小型化:更なる温度の上昇の為には断面積の小さな試料を用意する必要がある。これまでの10倍の昇温を実現する為、現在1mm^2の試料断面積を0.1mm^2と1/10にする。2)レーザー集光システムの改良:光ファイバーを用いることで、その端面でエネルギーが10%ずつロスしてしまう上、ファイバー出口でレーザーは発散光になってしまうため、どうしても集光効率が悪化する。本年度はファイバーを用いずにレーザーを試料に照射する光学系を構築して、集光効率を向上させる。3)レーザー光吸収効率の向上:レーザー光を吸収する金属の粉体を試料に塗布するなどして、レーザー光の吸収効率を向上させるこれらの改良を行ったレーザークエンチを用いることで、相転移より高温側の巨大応答状態を凍結し,不均一な系における反強誘電-強誘電競合状態の解明を目指す。SPring8でのレーザークエンチ実験を行うためのレーザーや光学機器を購入したが、予定よりも低い金額で購入出来た。生じた次年度使用額は、次年度の光学機器の改良に用いる。
遺伝毒性試験の新機軸－ＤＮＡ損傷、突然変異、染色体－

新規化合物開発現場では、安全性評価のため遺伝毒性試験が重要であり、より信頼性の高い試験法の開発が望まれている。本研究では、DNA損傷、突然変異、染色体異常をエンドポイントとする、メカニズム解明型の新しい遺伝毒性試験を開発した。DNA損傷については、DNAアダクトーム法の大幅な時間短縮と高感度化を実現した。突然変異については、1分子リアルタイムDNAシーケンサーを用いて、任意の細胞、組織における突然変異を検出する方法、SMRT突然変異解析法を開発した。また、化学物質によるDNA損傷を介さない染色体異常の誘発に、DNA損傷応答の阻害が重要であることを突き止め、この活性を評価する手法を開発した。本研究では遺伝毒性のメカニズムをDNA損傷、突然変異、染色体のレベルで明らかにする、新しい遺伝毒性試験の開発を目指している。まず、DNA損傷をLC/MS/MSで網羅的に検出する方法、「DNAアダクトーム」を用いて、カーボンナノチューブやフラーレン等のナノマテリアルのDNA損傷性の評価や、ラット個体を用いたDNAアダクトーム法の適用研究を行った。次に、任意の組織の任意の遺伝子における突然変異を検出する方法、「SMRT法」の開発をめざし、SMRTDNAシーケンサーに関する情報収集するとともに、テンプレート作成法の開発を進め、平成24年度にパイロット実験を行う目途をつけた。一方、次世代シーケンサーを用いて、化学物質が誘発する突然変異をゲノムワイドに検出する手法を考案した。まず、サルモネラ菌を用いたパイロット試験として、変異原処理したサルモネラ菌5クローンと、未処理の5クローンをランダムに選択し、全ゲノムシーケンスを行った結果、変異原処理したクローンで複数の突然変異を検出できた。すなわち、表現型によらない、機器分析による突然変異の検出に道を開いたことになる。さらに、「DNA損傷を介さない染色体異常誘発の分子ターゲット」を明らかにするため、TIP60およびヒストンH2AX、ミスマッチ修復酵素MLH1などに着目したストレス応答ネットワークのプロテオーム解析を行い、染色体異常を高感度に検出するバイオマーカー候補を探索した。また、DNA損傷応答に関わるタンパク質に着目して、リン酸化プロテオーム解析によって、独自に構築したγ線応答性リン酸化タンパク質データからATM/ATRの基質認識配列であるSQ/STモチーフをもつ基質部位を898個抽出した。これらの中には既知・未知問わず多数のDNA損傷応答に関連するタンパク質が含まれていると考えられ、次年度以降の研究材料として用いる予定であるDNAアダクトーム法はDNA損傷性の判定試験として有用であるが、従来法では100μgのDNA試料が必要で、1サンプルあたりの分析時間も約7時間と長く、実用化の大きな障害になっていた。そこで最新のLC/MS/MSを導入し、プロトコールの見直しを行った結果、必要なDNA量は10μg、分析時間は約80分となり、大幅なスループットの改善が達成された。また、昨年度開発した、イルミナ社の次世代DNAシーケンサーを用いる表現型によらない突然変異検出法についてもデータを蓄積した。さらに、一分子リアルタイムDNAシーケンサー(SMRT)を用いた変異原性試験の実証実験の準備を進めた。さらに、DNA損傷応答可視化細胞を用いた遺伝毒性試験の開発を行った。DNA損傷の指標としてヒストンH2AXのリン酸化が注目されている。我々はリン酸化されたH2AXに特異的に結合するMDC1タンパク質にGFPをつなぎ、DNA損傷応答を簡便に、リアルタイムで検出できるようにした。また画像処理でこの反応を自動計数するソフトウエアも作成した。この方法は、DNA損傷を検出できるだけでなく、カフェインのようにDNA損傷応答を阻害することで染色体異常を誘発する化合物のスクリーニングにも使える。これを用いて、このような活性を持つ化合物をカフェイン以外に2種類発見した。一方、遺伝毒性物質のターゲットを突き止めるためには、複雑な生体分子ネットワークにアプローチする必要があり、このためには主要な生体分子について正確に定量する必要がある。そこで、MRMによる定量的プロテオーム系を構築するため、細胞分裂、DNA修復、細胞死、中心代謝経路などにかかわる約500種類のタンパク質を感度よく測定できるペプチド配列を選別し、内部標準ペプチドを合成した。また、分担者の足立はATPと結合するキナーゼを濃縮し、活性化しているキナーゼのみを効率的にプロテオーム解析する新しい手法を開発した。本研究では遺伝毒性のメカニズムをDNA損傷、突然変異、染色体のレベルで明らかにする新しい遺伝毒性試験の開発を目指している。DNA損傷に関しては我々が開発した「DNAアダクトーム法」を使ってヒトの胃で生じているDNA付加体を網羅的に解析したり、大気汚染物質3ニトロベンズアンスロンによる付加体の修復過程について解析した成果がまとまった。また、化学物質がサルモネラ菌に誘発する突然変異を次世代DNAシーケンサーを用いてゲノムワイドに検出する手法に関する研究がまとまった。これは、サルモネラ菌を試験物質に曝露後、コロニー単離し、次世代DNAシーケンサーで全ゲノム解析するだけという単純な方法である。さらに、ヒト細胞を用いた同様の研究も進めており、現在データを解析中である。この方法の良いところは、表現型による選択が不要で、変異の有無を確実に判定できる点である。学会発表したところ複数の製薬会社から注目を集めた。一方、「DNA損傷を介さない染色体異常誘発の分子ターゲット」を明らかにするため、タンパク質複合体解析、リン酸化プロテオーム変動解析などの手法で、染色体異常につながるタンパク質の挙動について、探索的なデータ収集を行っているが、その過程でいくつかの重要な発見があった。分担研究者の井倉らは、TIP60ヒストンアセチル化

酵素がヒストンH2AXをアセチル化することによりリン酸化されたH2AXをクロマチンから放出させ、リン酸化されたH2AXによる集積を正常な染色体にまで拡散しないようにDNA損傷部位に限定させることを見出した。また、代表者の松田らは、ピルビン酸キナーゼM2がアセチル化の基質であるアセチル補酵素Aの核内における供給に重要な役割を果たしていることを明らかにした。これらの成果は現在投稿準備中である。11分子リアルタイムDNAシーケンサーを用いた新しい変異原性試験の開発PacBio RSIIDNA sequencerは1分子リアルタイムのシーケンスが可能であるので、原理的にはDNAをただ正確にシーケンスするだけでどんな低頻度の突然変異でも検出することが可能である。しかも任意のDNAサンプルが適用できるので、in vitroおよびin vivoの変異原試験、さらには体細胞突然変異のバイオモニタリングにも応用可能である。そこで変異頻度がわかっているDNAサンプルについて、PacBioシーケンサーで分析を行い、極低頻度の変異検出が可能かどうか検討した。SMRTbellという環状テンプレートを作成し、同じDNA分子を何回も繰り返し読んだ結果、予想通りの変異頻度が検出され、少なくとも10 Mbpあたり数個程度の突然変異であれば、アーティファクトによるバックグラウンドに邪魔されることなく、正確に突然変異を検出できることが明らかとなった。2染色体異常誘発メカニズムの分類に関する研究化学物質の発がん性の予測という観点でみると、染色体異常試験や小核試験の結果は疑陽性が多く、化学物質の安全性評価において問題となっている。染色体異常誘発物質は大きく分けてDNAを直接損傷するものと、染色体の構造維持に重要なタンパク質を阻害するものがある。我々は、DNA損傷応答タンパク質の阻害により染色体異常が誘発されることを見出し、DNA損傷応答の指標である、ヒストンH2AXのリン酸化をLC/MS/MSによりハイスループットに定量する方法を開発した。また、分担者の井倉は、ゲノムストレスに対するヒストンの化学修飾の変化をクロマチン免疫沈降法で解析し、特にTIP60ヒストンアセチル化酵素複合体によるヒストンH2AXのアセチル化がDNA損傷領域で増幅され、この結果、損傷領域のクロマチンを弛緩させることを見出した。化学物質の安全性評価において遺伝毒性試験は特に重要であり、より信頼性の高い遺伝毒性試験を開発することは極めて重要である。今回我々は、PacBio社の1分子リアルタイムDNAシーケンサー(SMRTシーケンサー)を用いた、極めて簡便な変異検出法を開発した。
脱皮ホルモンEcdysteroidによるマダニの卵形成機構の解明

マダニは家畜を含む哺乳類から吸血し、時に宿主に病気を媒介するため畜産業を中心に世界的に大きな問題となっている。吸血はマダニの唯一の栄養摂取行為であり、従来から吸血とそれに誘導される生理現象の研究が行われている。中でも吸血によって誘導される卵黄タンパク質(Vg)合成については古くから研究がなされ、脱皮ホルモン(E)に制御されると考えられている。本研究はEによるマダニの卵黄形成制御機構に焦点を当てた。昨年度にマダニOrnithodoros moubataのVg遺伝子を同定し、その制御領域の解析からVg転写制御にはEとその受容体複合体(E/EcR/RXR複合体)による制御に加え、Eによって転写制御されるE初期遺伝子の関与が疑われた。本年度は初期遺伝子のうちE75について部分配列を同定し、Vg発現時にE75の発現が確認された。また、E投与によるVg転写についても検証し、生体内に近い濃度でVg発現が維持されることが明らかになった。さらに吸血後の交尾・未交尾雌におけるVg発現の詳細な解析から、マダニのVg転写はEのみならず栄養によっても制御される可能性が示唆された。Vg発現を詳細に比較すると、産卵開始までの時期におけるVg転写発現は交尾・未交尾雌でよく似ており、その差が大きくなるのは産卵開始後であることが明らかになった。また吸血後の未交尾雌を交尾させた場合、交尾直後にVg発現が上昇した。吸血後でもE濃度が低い未交尾雌において、初期の段階でVg転写が誘導されたことから、第一に栄養摂取によってVg転写が誘導され、その後交尾の刺激によって合成・分泌されるEがさらなる転写を誘導するという、2段階の制御系が存在する可能性が明らかになった。この制御は他の節足動物でも存在が疑われるものであり、今後発展してゆく基礎的なモデルを確立したと考えられる。吸血性のマダニは吸血によって成長や産卵を行う。しかし、吸血の際宿主に様々な病気を媒介するため、畜産、医療分野において警戒されている。マダニの産卵には吸血が必要不可欠であり、吸血した雌体内では卵形成が行われる。一般に節足動物の卵形成はホルモンによって制御され、卵黄タンパク質(Vg)合成もホルモンの制御下にある。マダニのVg合成は脱皮ホルモンEcdysteroid(E)によって制御されると考えらる。そこで、Vg遺伝子の転写制御系を明らかにすることを目的に研究を行った。平成20年度の研究において、マダニのVg遺伝子のcDNA全長配列及びその上流配列を決定した。Vg遺伝子のmRNA発現は吸血によって誘導され、交尾・未交尾雌間で大きく異なっていた。Vgの発現は脂肪体及び中腸で見られた。Vg遺伝子の同定及び発現解析については、現在投稿論文に向けて準備中である。Vg遺伝子の転写制御はE及び2つの核内レセプター(EcR、RXR)によって制御されると考えられており、マダニにおいては吸血するとEcR、RXRの発現量が上昇することが既に明らかになっている。また、吸血後の交尾雌のみで体液中のE濃度が上昇することも知られている。本研究において、Vgの発現は両レセプターの発現直後から開始したことから、マダニのVg発現はE、EcR、RXRによって制御されると考えられ、E濃度が高い交尾雌のみが必要レベルのVg発現が誘導され、正常な産卵が起こると考えられる。また、Vg転写制御に関わると考えられるE74、Broad Complex(BRC)についての配列決定も試み、各因子に含まれる機能ドメインの配列を決定した。今後は全長の同定を行い、詳しい発現解析を行う予定である。
単一細胞直接可視化法による樹木細胞分化機構の新規イメージング解析技術の開発

本研究課題では、交雑ポプラなど樹木の培養細胞から複雑な細胞壁構造を有する二次木部様細胞へ直接分化する新規モデル系を開発した。管状要素への誘導率や形状を制御するため、培地の植物ホルモン条件を確立した。また、トチノキのカルスから誘導した管状要素は、細胞全体の厚い二次壁とせん孔様の構造を有しており、複雑な細胞壁形成機構を解析する優れたモデル系であるといえる。GFP遺伝子と微小管付随タンパク質をコードする遺伝子を発現させて、交雑ポプラの単一培養細胞における微小管の挙動を高精細共焦点レーザ顕微鏡法を用いて連続的に可視化した。微小管の消失や局在が、壁孔など細胞壁構造のパターン形成を制御しているといえる。再生可能な資源・エネルギーである木質バイオマスの有効利用のためには、樹木の形成層細胞が生産する仮道管、道管要素、木部繊維など二次木部細胞の分化機構を理解することが重要である。これまでにも、二次木部細胞の分化機構に関する研究が行われているが、依然充分な知見は得られていない。そこで本研究課題では、樹木培養細胞から二次木部様細胞へ直接分化する新規モデル系を用いて、細胞壁構造のパターン形成を解析する。さらに、細胞骨格の関連遺伝子とGreen Fluorescence Protein(GFP)遺伝子を導入した培養細胞を作成し、高精細共焦点レーザ顕微鏡法など新規生体イメージング解析技術により、細胞骨格の動的変化をリアルタイムで解析できる単一細胞直接可視化法の開発にチャレンジする。交雑ポプラのカルスから管状要素への誘導率を向上させるため、培地の植物ホルモン条件を検討したところ、オーキシン輸送阻害剤により管状要素の誘導が阻害された。オーキシンの極性輸送が、管状要素の誘導に必須であるといえる。また、広葉樹であるトチノキの幼葉からオーキシンとサイトカイニンを組み合わせてカルスを誘導し、増殖性が高い交雑ポプラと共存培養を行ったところ、細胞全体に堆積した二次壁を有する管状要素が誘導された。さらに、細胞構造を詳細に解析したところ、誘導された管状要素には、二次壁に壁孔様の構造とは明らかに異なる、せん孔様の構造が観察された。トチノキからの培養細胞は、植物の通水経路として重要なせん孔の形成機構を解析する優れたモデル系になる可能性が高いといえる。一方、GFP遺伝子と微小管付随タンパク質をコードする遺伝子を発現させて、微小管の挙動を共焦点レーザ顕微鏡法を用いて連続的に解析したところ、管状要素の分化に伴い微小管の局在が動的に変化した。微小管の配向や局在が、壁孔など複雑な構造のパターン形成を制御しているといえる。本研究の目的は、樹木の培養細胞から直接二次木部様細胞を誘導する新規モデル系を確立し、細胞壁の形成過程を高精細共焦点レーザ走査顕微鏡法など新規生体イメージング解析技術で解析し、細胞骨格の動的変化などを単一細胞レベルでリアルタイムで解析することである。現在までの研究により、交雑ポプラなどの培養細胞から、厚い細胞壁と複雑な修飾構造を形成する管状要素を安定的に誘導する条件の設定に成功している。また、トチノキの培養細胞から発達したせん孔を形成する新規モデル系を確立した。さらに、交雑ポプラにおいてGFP遺伝子と微小管付随タンパク質をコードする遺伝子を発現させた培養細胞を作出し、培養細胞内の微小管の配向の動的変化を共焦点レーザ走査顕微鏡法により安定的に観察できる系を確立した。これまで得られた成果の一部は学会で発表し、論文として公表したことから、順調に研究が進んでいると判断した。再生可能な資源である木質バイオマスの有効利用のためには、樹木の形成層細胞が生産する仮道管や道管要素など二次木部細胞の分化機構を詳細に理解することが重要である。そこで本研究課題では、樹木培養細胞から複雑な細胞壁構造を有する二次木部様細胞へ直接分化する新規モデル系を開発する。さらに、細胞骨格の関連遺伝子とGreen Fluorescence Protein(GFP)遺伝子を導入した培養細胞を作成し、細胞骨格の動的変化をリアルタイムで解析できる単一細胞直接可視化法の開発にチャレンジする。交雑ポプラのカルスから管状要素への誘導率や形状を制御するため、培地の植物ホルモン条件を検討したところ、オーキシンの種類により管状要素のサイズが変化することを明らかにした。また、トチノキからカルスを誘導し、交雑ポプラのカルスと共存培養を行ったところ、細胞全体に厚い二次壁を有する管状要素が誘導された。誘導された管状要素の二次壁の構造を詳細に解析したところ、せん孔様の構造が観察された。さらに、管状要素の誘導率の向上を目的として誘導培地の検討を行ったところ、オーキシンの一種であるNAAとブラシノライドの組み合わせにより高い管状要素面積率が得られた。トチノキからの培養細胞は、道管要素に類似した、せん孔の形成を誘導することが可能であり、複雑な細胞壁形成機構を解析する優れた新規モデル系であるといえる。一方、GFP遺伝子と微小管付随タンパク質をコードする遺伝子を発現させて、交雑ポプラの単一培養細胞における微小管の挙動を高精細共焦点レーザ顕微鏡法を用いて連続的にイメージング解析したところ、管状要素への分化に伴い微小管の局在が動的に変化した。特に、微小管の部分的な消失や消失部分の周囲への局在が壁孔形成に重要であることを明らかにした。微小管の消失や局在が壁孔など複雑な細胞壁構造のパターン形成を制御しているといえる。

本研究課題では、交雑ポプラなど樹木の培養細胞から複雑な細胞壁構造を有する二次木部様細胞へ直接分化する新規モデル系を開発した。管状要素への誘導率や形状を制御するため、培地の植物ホルモン条件を確立した。また、トチノキのカルスから誘導した管状要素は、細胞全体の厚い二次壁とせん孔様の構造を有しており、複雑な細胞壁形成機構を解析する優れたモデル系であるといえる。GFP遺伝子と微小管付随タンパク質をコードする遺伝子を発現させて、交雑ポプラの単一培養細胞における微小管の挙動を高精細共焦点レーザ顕微鏡法を用いて連続的に可視化した。微小管の消失や局在が、壁孔など細胞壁構造のパターン形成を制御しているといえる。樹木の培養細胞から、厚い二次壁と有縁壁孔やせん孔など複雑な修飾構造を有する二次木部様細胞を直接誘導する条件をさらに検討しする。特に、せん孔の形成が認められたトチノキの培養細胞において、誘導率の向上とさらに発達したせん孔を形成する系を確立する。トチノキにおいても交雑ポプラ同様に、GFP遺伝子と微小管付随タンパク質をコードする遺伝子を発現させた培養細胞の作出を試み、細胞骨格の動的解析を進め、有縁壁孔とせん孔の形成機構の違いを明らかにする。また、GFP遺伝子とアクチン結合タンパク質をコードするfimbrin遺伝子を発現させた培養細胞を作出し、培養細胞から分化中の細胞における微小管およびアクチンフィラメントの立体配置を解析し、細胞分化における細胞骨格の役割を明確にする。単一細胞レベルでの細胞骨格の解析は、高精細共焦点レーザ走査顕微鏡法とともに多光子励起顕微鏡法を用いて行う予定である。以上の研究から得られた成果を最終報告書にまとめ、学会等で発表するとともに、論文として広く公表する。木質科学培養細胞の誘導条件の設定など、研究が計画よりスムーズに行うことができたため、各種試薬や顕微鏡調整用品の購入費など当初予定していた物品費が減少した。そこで、予算を有効に使用し、次年度の研究を充実させるため、予算を次年度に繰り越すことにしたため、次年度使用額が生じた。培養細胞の細胞壁成分や細胞骨格を可視化する上での各種試薬等の消耗品に使用する。また、得られた成果を発表するための国内および国際学会での旅費に使用する。また、これまでに得られた成果を基に、現在作成中の論文の英文校閲費や論文投稿料に使用する予定である。
ヒトループス腎炎・マウスループス様腎炎におけるPD-1/PDリガンドの役割の研究

自己免疫疾患の発症は、遺伝的背景に多彩な外的要因が組み合わされて、トレランスが破綻することによって起こる。ループス腎炎の発症機序は不明であるが、何らかの誘因が末梢トレランスを破綻させ、自己反応性Tリンパ球の生存と活性化をもたらし、自己免疫応答を誘発する。最近CD28・B7ファミリー分子がT細胞の活性化とその活性化後の制御に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。なかでもPD-1は、抑制性シグナルをリンパ球に伝達する分子としてトレランスの維持にきわめて重要であると考えられる。PD-L1は非血液細胞に広汎に分布しており、末梢トレランスに深く関わっていることが推察される。そこで、我々は、PD-1/PD-Lの異常がループス腎炎で存在するか、PD-1/PD-Lシステムを修飾するとループス様腎炎が起こるか、を解明することを目的として、マウス・ループス様腎炎モデルで解析した。我々は、ループス様腎炎のモデルであるNZB/W F1マウスにおけるPD-1/PD-L1の発現を確認した。PD-1は腎浸潤リンパ球上に発現し、PD-L1は浸潤リンパ球・糸球体細胞・尿細管細胞に発現していた。これらのことから、PD-1/PD-L1経路がループス様腎炎の発症への関与が推定された。次にNZB/W F1マウスに抗PD-L1抗体を3ヶ月間腹腔内投与した。抗PD-L1抗体投与群は非投与群に比べて早期に尿蛋白が出現し、約半数のマウスが早期に死亡したので、抗PD-L1抗体投与は腎炎を増悪させると結論された。また、抗体投与群で血清中インターフェロンγ(IFNγ)が著増しており、リンパ球を介して病態を修飾している可能性が強く示唆された。以上のようにPD-1/PD-Lシステムは自己免疫疾患の発症と密接に関連しており、今後の研究の進展が自己免疫疾患の治療法の開発につながることを期待している。1.NZB/W F1マウスのSLE自然発症におけるPD-1/PD-L発現の研究NZB/W F1マウスを用いて、腎炎発症前と発症後の腎臓・リンパ節・脾臓を摘出し、抗マウスPD-1/PD-L1・PD-L2抗体・抗T/Bリンパ球抗体などを用いて、浸潤リンパ球・間質細胞・腎実質細胞におけるNZB/W F1・PD-L2の発現分布を免疫化学染色や多重染色を用いた免疫蛍光組織染色などにて解析を開始した。その結果、腎炎発症前のNZB/W F1マウスにはPD-1/PD-L1・PD-L2が発現せず、リンパ球浸潤のある腎炎の尿細管や浸潤リンパ球にPD1/PD-L1の発現を認めることが分かった。抗マウスPD-L1/L2中和抗体の腹腔内投与により、NZB/WF1マウスの腎炎発症が増悪するかを調べる。現在、ハイブリドーマをラット腹腔内に注射し、抗PD-L1抗体の大量調整が進み投与実験に必要な量の抗体が調整できたところである。3.ヒト唾液腺におけるPD-1・PD-L1発現の検討ヒト・シェーグレン症候群の唾液および口唇生検標本を材料として唾液中リンパ球のPD-

1発現や唾液腺組織中のPD-1・PD-L1発現を検討した結果、唾液中Tリンパ球や唾液腺浸潤Tリンパ球がPD-1を発現していることが分かった。またPD-1発現Tリンパ球が抑制性サイトカインであるIL10を発現していることが分かった。一方シェーグレン症候群の唾液腺で抗原提示の始まる場所とされる導管においてPD-L1の発現が認められた。このことは、PD-1/PD-L1システムがシェーグレン症候群の末梢トレランス誘導に関与していることを示唆するデータである。平成18年度に以下の研究成果を得た。NZB/W F1マウスを用いて、腎炎発症前と発症後の腎臓・リンパ節・脾臓を摘出し、抗マウスPD-1/PD-L1・PD-L2抗体・抗T/Bリンパ球抗体などを用いて、浸潤リンパ球・間質細胞・腎実質細胞におけるNZB/W F1・PD-L2の発現分布を免疫化学染色や多重染色を用いた免疫蛍光組織染色などにて解析した。その結果、腎炎発症前のNZB/W F1マウスにはPD-1/PD-L1・PD-L2が発現せず、発症後のリンパ球浸潤のある腎炎の尿細管や浸潤リンパ球にPD1/PD-L1の発現を認めることが分かった。また、糸球体血管内皮細胞にもPD-L1の発現することが明らかになったが、メザンギウム細胞にはPD-L1の発現はみられなかった。また、マウス脾臓の実験から、PD-1が、CD4陽性T細胞には発現するが、CD8陽性T細胞には発現しないことが明らかになった。抗マウスPD-L1中和抗体の腹腔内投与により、NZB/WF1マウスの腎炎発症が増悪するかを調べた。月齢4ヶ月より3ヶ月間抗PD-L1抗体を投与すると、非投与マウスに比較して、投与マウスは尿蛋白がより早期に出現し、また早期に腎不全により死亡するマウスが出現し、抗PD-L1抗体がNZB/WF1マウスの腎炎発症を増悪させることが明らかになった。1.2.よりPD-1/PD-L1システムが、NZB/W F1マウスの増悪因子として関与していることが明らかになった。
流通式in-situ XAFS法の開発と酸化物ナノ粒子水熱合成過程のその場観察

流通式装置を用いて高温高圧水中から金属酸化物を合成する過程において、金属イオンの反応過程及び反応速度を評価するために、まず高温高圧セルに金属塩水溶液を封じ込めて加熱しつつ、X線吸収微細構造(XAFS)スペクトルを測定した。その結果、高温でXAFSスペクトルを測定できることを確認した。ここで、高温高圧セルの窓材への酸化物の析出が生じるという課題が存在することを見出し、その解決方法を提案した。平成27年度は、金属酸化物ナノ粒子の合成過程をその場X線吸収分光法で測定するために必要な装置開発、反応系の選択、金属イオン濃度など反応条件の検討を行った。装置としては、現有の高温高圧下で溶液を保持でき、ダイアモンド窓を2つ有するセルを用いて透過法でX線吸収分光できることを確認した。但し、ナノ粒子合成時にダイアモンド窓に金属酸化物が析出することがあり、反応系の選択や濃度調整が必要なことも明らかとなった。反応系としては、これまでの実験でおおよその反応パスの推定ができている酸化セリウムや酸化チタンのナノ粒子合成過程を対象とすることとした。これらについては、反応過程の液相、固相成分を通常のX線吸収分光測定で観察することで、おおよその反応過程を明らかにした。また、これらの酸化物ナノ粒子の合成過程で、有機分子を共存させて表面修飾を行う場合についても、同様の検討を行った。この場合、金属イオンと有機分子がまず反応して、その後、これが分解するという反応過程も明らかとなった。金属イオン濃度については、事前のダイヤモンド窓及び水による減衰を考慮して、0.1 mol/L程度でのその場合成実験であれば観測できるという予測のもと、実験を行った。その結果、この濃度でX線吸収分光測定が可能であることを確認する一方、ダイヤモンド窓へのナノ粒子の析出も観察された。そこで測定に用いるX線のエネルギーをより高くして、ダイヤモンド窓での吸収を小さくしつつ、低い濃度での合成実験を行うことが良いことが明らかとなった。平成27年度の研究により、現有のセルがin situ XAFSに用いることができること、用いるX線エネルギーの条件、測定対象とする金属原子の選択基準などを明らかにすることができるとともに、実際の合成では窓材に析出する可能性があることなど、測定を行う際の問題点も知ることができた。流通式反応装置を用い高温高圧水中で金属イオンから金属酸化物ナノ粒子を合成する過程において、金属イオンの反応過程及び反応速度を評価するため、in situでX線吸収微細構造(XAFS)を測定する装置の開発を目的として研究を行った。まず、測定対象とする金属種を決定するために、既存の回分式装置を用いて金属イオン水溶液を加熱し、各反応時間におけるXAFSスペクトルを測定して、in situ測定に適した金属種の選定を行なった。これより、硝酸セリウムから酸化セリウムナノ粒子を合成する系、硝酸鉄から酸化鉄ナノ粒子を合成する系を用いることとした。続いて、高温高圧XAFSセルを用いた水溶液中金属種のXAFS測定を行なった。in situ XAFSセルを回分式装置として用い、金属イオン水溶液をセルに封入し、その温度を徐々に上げつつXAFS測定を行なった。その結果、XAFSセルのダイヤモンド窓自体の吸収、散乱によりX線の強度が下がるものの、反応開始時の室温では金属イオン水溶液に対応するXAFSスペクトルが測定され、これが温度上昇とともに金属酸化物に相当するスペクトルに変化する様子を明らかにした。これより、流通式装置に組み込んだ場合においてもXAFSスペクトルを評価できることが示された。一方、この回分式in situ XAFS測定を続けると徐々にダイヤモンド窓に酸化物が析出することも明らかとなった。酸化物が析出すると水溶液中の金属種スペクトルと重畳されたスペクトルが測定されるため、窓への析出を抑制する必要があり、窓材に析出しない反応系の探索も行ったが、XAFS測定の機会が限られていることから、流通式装置のin situ XAFS測定には至らなかった。しかし、窓材への析出を抑制すること、窓を用いることによる流れの滞留を考えることなど、今後の装置設計に向けた指針を得ることができた。平成27年度の成果をもとに、1)高い入射エネルギーを持つX線を使って、XAFS測定を行う。2)従って、対象とする元素は原子番号の大きい金属元素を用いる。3)もし、その金属元素の水熱合成において、窓材に酸化物が析出しやすいようだったら、低い濃度での実験を行う。4)この実験系に置いて、高温、高圧下での水熱合成について、in situ XAFS測定を行うという方針を決定している。化学工学、反応化学、ナノ粒子現有のin situセルに対する改造が必要であると想定したが、実際に測定をしてみると大規模な改造が必要でなく、改造費が予定額よりも少なくなったため。平成28年度に、より多くの種類の金属酸化物を用いた実験を行うための試薬代として用いる。
漸近解析的方法による非線形問題の研究

1.非線形可積分系における漸近解析的側面,およびその数理物理学への応用について考察し,特に弦の方程式やウィザム方程式について一連の成果を得た.2.コルテヴェグ・ドフリーズ方程式などの純分散型発展方程式における分散性衝撃波の現象,スウィフト・ホ-ヘンバーグ方程式などの散逸型発展方程式における長時間挙動,などについて数値シミュレーションを行った.3.ブラウン運動に関して知られている結果を非マルコフ的な正規過程のクラスに拡張し,逆にこれによってブラウン運動に関する理解が深まった.4.ディオファントス近似の問題にBeuker積分を応用して,対数値の非2次無理数度を改良することができた.5.2次元複素力学系の放物型不動点近傍での解析を行い,弱放物型吸引領域の存在を発見した.6.postcritially finite self-similar set上の非線形力学系の相空間構造およびその上のラプラシアンの固有値の漸近挙動を調べ,特にシェルピンスキーガスケットの場合にきわめて精密な結果を得た.1.非線形可積分系における漸近解析的側面,およびその数理物理学への応用について考察し,特に弦の方程式やウィザム方程式について一連の成果を得た.2.コルテヴェグ・ドフリーズ方程式などの純分散型発展方程式における分散性衝撃波の現象,スウィフト・ホ-ヘンバーグ方程式などの散逸型発展方程式における長時間挙動,などについて数値シミュレーションを行った.3.ブラウン運動に関して知られている結果を非マルコフ的な正規過程のクラスに拡張し,逆にこれによってブラウン運動に関する理解が深まった.4.ディオファントス近似の問題にBeuker積分を応用して,対数値の非2次無理数度を改良することができた.5.2次元複素力学系の放物型不動点近傍での解析を行い,弱放物型吸引領域の存在を発見した.6.postcritially finite self-similar set上の非線形力学系の相空間構造およびその上のラプラシアンの固有値の漸近挙動を調べ,特にシェルピンスキーガスケットの場合にきわめて精密な結果を得た.
t-Jモデルの相図と物理的性質

(1)ネール、ボンド及び1重項RVBの秩序変数を取り入れたスレーブボソン平均場理論により2次元t-Jモデルを調べた。そして、ネールオーダーが消える臨界のドーピング量近傍ではリエントラント的振る舞いが現れること、有限のドーピング領域では副格子磁化は温度の関数として1度極大を示し低温で下がりだすこと、さらに低温では1重項RVBオーダーがネールオーダーと共存すること等を明らかにした。このスレーブボソン平均場理論では1重項RVBオーダーとホロンのボーズ凝縮の共存相が超伝導相である。そして後者はホロンの分散関係に3次元性を取り入れれば有限温度で起こる。このことからこの理論では3次元性を取り入れれば超伝導とネールオーダーの共存が起こると考えられる。(2)クーロン斥力が十分大きいとして単一バンドハバードモデルから有効ハミルトニアンを導くと3サイトのスピン反転を含むホッピング項が現われる。この項はt-Jモデルでは無視されているが、これによりモデルの物理的性質が大きく変わる可能性がある。一方、ホール系高温超伝導体では微視的なモデルはd-pモデルであり、Zhang-Rice singletの形成を通じてt-Jモデルが得られると考えられているが、このときも同様の項が現われる可能性がある。我々はd-pモデルに基づいて摂動計算によりその項を導出した。そして、この3サイト項は単一バンドハバードモデルから求めたものと同じ形にまとまり係数の大きさも後者と同程度であるが、符号が逆であり強磁性的であることがわかった。最近接電荷間の相互作用項等もクラスター計算により評価したが、それらの係数は十分小さい。これらのことから't-J+強磁性的3サイトホッピング項'モデルがホール系高温超伝導体の有効ハミルトニアンとして適当であると考えられる。これらの成果はそれぞれ現在、投稿準備中である。
ヴィーコの社会存在論に関する研究

ヴィーコの社会存在論の問題構成を、広く17世紀形而上学、17世紀科学革命の問題諸連関の中に位置づけ、その革新性を明らかにした。ヴィーコが、社会という目に見えない存在を一つの自存的な実在として捉える際に手がかりを与えたのは、意外にも数学であった。数学的無限は、数学的認識の中で構成されたものではありえず、しかも物理的な無限性とは独立な対象として、その実在が確保されなければならない。この点を明らかにするため、初年度は、アリストテレスの数学論を中心に、数学的対象をめぐる存在論の歴史を検討した。第二年度は、ヴィーコの『形而上学』に内在しながら、その数学存在論、物理学的存在論の構成を解明し、それがデカルトの仮無限の哲学と対立したガリレオの実無限の哲学を引き継ぐものであったことを明らかにした。同時に、ヴィーコによる精神の存在論の新たな問題構成を、アリストテレスの共通感覚論、16世紀の霊魂論論争、17世紀の機械原因論などの文脈に位置づけながら解明し、それが社会存在論へつながる結構を示した。以上の新しいヴィーコ理解について、イタリアナポリのヴィーコ研究所を訪問し、サンナ所長、カッチャトーレ教授との討論を重ねた。ヴィーコの社会実在論のヒントは、数学的対象の実在論にあった。物理世界と異なり、感覚に与えられない数学的対象が数学的認識に先立って存在するか否かは、まさに感覚に与えられない社会を実在として捉え、この実在に対する経験科学として社会科学を位置づけようとする試みにとって、決定的な試金石となったからである。そこで、本年度は、アリストテレスによる数学の基礎づけと数学的対象の存在論の検討を行なった。その成果として、アリストテレスの論証理念が、デカルト以来の近代の演繹理念といかに異なるかを実証し、その論証理念がエレア派-プラトン主義の真知主義を批判するための公理的方法の提唱であったことを明らかにし、さらには、それが16世紀のパドヴァ・アリストテレス主義における「数学の確実性」論争や「往復論証」の理念を介して、ガリレオの新科学にいかに継承されていくかを解明した。今後は、アリストテレスの数理存在論が、プロクロスの批判を介して、ヴィーコの社会存在論の構想へといかに繋がるか、その経路を検証し、17世紀科学論の基本的構図を明らかにしながら、所期の研究目的であるヴィーコの社会存在論の歴史的地位と今日的意義の解明を完成させたいと考える。ヴィーコの存在論の問題構成を広く17世紀形而上学、17世紀科学革命の問題諸連関の中に位置づけ、その革新性を明らかにした。執筆した論文の第一章では、クローチェの解釈「改竄」に疑義を提出しつつ、ヴィーコの存在論と中世神学との関係について論じ、第二章では、ヴィーコの数学論、自然科学論の新しさを論じ、特に2500年余にわたる数理哲学史全体の中にヴィーコの存在論を位置づけ、ヴィーコが、無限という数学的対象の存在論を構築することを通じて、存在論全体の問題構成の革新に必然的に到達し、ゲーデルなど今日の数理存在論にも匹敵する構成を可能にするとともに、ヴィーコの自然科学論もまたアインシュタインの相対性理論に匹敵する境位に至ったことを明らかにした。第三章では、16世紀の霊魂論論争の中でデカルトのコギト論を位置づけるとともに、それを批判したヴィーコの精神の存在論の画期的意義を明らかにした。これらを踏まえ、第四章で、ヴィーコの社会存在論の構成を明らかにし、それがローマ万民法の伝統に立って、近代の自然法と契約論を両面批判したものであることを示した。以上の新しいヴィーコ理解について、イタリアナポリのヴィーコ研究所を訪問し、カッチャトーレ教授、サンナ教授らと討論を重ねた。またヴィーコ研究所の書誌雑誌に日本のヴィーコ研究の紹介論文を書く予定である。
脳神経細胞の生存・機能維持因子の解明と応用

本研究班では神経細胞の生存・機能維持を司る神経栄養因子や関連物質の作用およびその分子機構を明らかにすることにより、神経変性疾患における根本的治療原理の確立を目指すことを目的としている。本年度は医科の点につき明らかにした。1)昨年度、脳内ミクログリアに特異的に発現する新規カルシウム結合蛋白(iba-1)を発見したが、本年度はさらに、iba-1が生体内ではモノマーとして存在するリン酸化蛋白であることを明らかにした。また、本蛋白は核内移行する可能性も示唆されており、ミクログリアにおける機能が注目される。(高坂)2)小脳顆粒細胞のBDNFまたは高カリウムによる細胞死抑制がワ-トマニンによって阻害されることから、これらの細胞死の抑制にPI3キナーゼが関与していることが明らかにされた。(畠中)3)生体がストレスを受けた際に上昇するコルチコステロンが培養神経細胞の細胞死を引き起こすことが明らかとなった。また、これらの神経細胞ではBDNFの発現が低下しており、さらにBDNFの添加によって細胞死が抑制されることから、コルチコステロンはBDNFの生合成に何らかの影響を与えることが示唆された。(古川)4)本研究班で明らかにしてきたグリオスタチンやリポコルチン-1などのグリア由来神経栄養因子の発現調節には、細胞内cyclic AMPの濃度が極めて影響を与えることが明らかとなった。(加藤)5)神経栄養因子のシグナル伝達分子として重要なRasと相同性があるR-Rasの活性化制御について検討した結果、CDC25^<Mm>およびC3Gによって活性化されることが明らかにされた。(服部)6)顔面神経切断モデル動物を用い、細胞内で変動する遺伝子群の探索を行った結果、ニューロン内でアップレギュレートされる5′-ヌクレオチダーゼの一部と共通配列を有する新規の遺伝子(Neurorep1)を同定した。Neurorep1は、5′-ヌクレオチダーゼの活性調節を担う可能性も示唆され、興味深い。(北村)本研究班では神経細胞の生存・機能維持を司る神経栄養因子および関連物質の作用機構を明らかにすることにより、神経変性疾患における脳細胞の選択的な氏のメカニズムを解明し、根本的治療原理の確立を目指すことを目的としている。本年度は以下の点につき明らかにした。1)ミクログリア由来プラスミノーゲン(PGn)の作用メカニズムを解明するため、アミノ酸配列に高いホモロジーがある肝細胞成長因子(HGF)のニューロンに対する成果を検討した。その結果、HGFにもPGn同様の神経栄養効果があること、更にHGFの効果はプロトオンコジーンであるc-met受容体を介したものであることを明らかにした。(高坂)2)ラットの海馬や新皮質の培養ニューロンを高酸素気相下におくと、DNAの断片化を伴ういわゆるアポトーシスの状態で、細胞死に至ることが判明した。(畠中)3)ニューロトロフィンとそれらの受容体であるtrkファミリーに対する特異的な抗体を作成し、それぞれの脳内局在を免疫組織化学的に検討した。その結果、胎生期ラットでは大脳皮質プレートのニューロンにNT-3が強陽性になるなど、脳形成にもニューロトロフィン群が重要であることが示唆された。(古川)4)アストロサイトの分裂を抑制する新規の栄養因子であるグリオスタチンが皮質ニューロンの培養で、著明にシナプス形成を促進することが明らかとなった。(加藤)5)神経栄養因子のシグナル伝達に重要な分子であるRasを活性化するC3Gおよび不活性化するGAP1^nの新たな2つの因子を発見した。(服部)6)培養大脳皮質ニューロンでのネットワークを実験的に切断し、再生時における遺伝子の変動につき検討を加えた結果、GAP43などシナプス関連遺伝子が変動することを明らかにした。(黒田)7)神経変性疾患のひとつである瀬川病の原因遺伝子として注目されているGTP cyclohydro lase Iに対する特異抗体の作成に成功した。(永津)8)顔面神経切断モデル動物を用い、細胞内で変動する遺伝子群の探索を行った結果、ニューロン内でダウンレギュレートされるR IN G-H2モチーフを有した新規の遺伝子を同定した。(北村)本研究班では神経細胞の生存・機能維持を司る神経栄養因子および関連物質の作用機構を明らかにすることにより、神経変性疾患における脳細胞の選択的な死のメカニズムを解明し、根本的治療原理の確立を目指すことを目的としている。1)脳内ミクログリアに特異的に発現する新規カルシウム結合蛋白(iba-1)を発見した。本遺伝子は静止期ミクログリアにも弱いながらも発現が認められるが、活性化ミクログリアで顕著に発現誘導されることが明らかとなった。また本遺伝子は精巣において発達時期の精子細胞にも発現しておりその機能が興味深い。(高坂)2)p53ノックアウトマウスの培養神経細胞を用い、放射線照射による細胞死の検討を行ったところ、本マウスの神経細胞は放射線照射にレジスタントであることが明らかになった。(畠中)3)ニューロトロフインとそれらの受容体であるtrkファミリーに対する特異的な抗体を作成し、それぞれの脳内局在を免疫組織化学的に検討した。その結果、胎生期ラットでは大脳皮質プレートのニューロンにNT-3が強陽性になるなど、脳発生にもニューロトロフイン群が重要であることが示唆された。(古川)4)アストロサイトの分裂を抑制する新規の栄養因子であるグリオ