hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海藻培養最適化に向けた海藻群の挙動解析シミュレータの開発と水流制御技術の構築

これは今後の糸状海藻における海藻培養に対する貢献が期待できる成果といえる.今後の課題として海藻培養効率化を行う上で糸状海藻に限らず,昆布などの葉面積を広い藻類やホンダワラなどの木構造を持つ藻類に対する培養の効率手法の検証と提案を行うことでエネルギー開発分野への貢献が期待できる.当該年度における研究目的は,大規模海藻培養に向けた柔軟構造物用の基盤シミュレータの開発と応用である.ソフトロボティクス用シミュレータであるVoxCADの演算処理をGPUにより高速化に着手し,成果として,ソフトロボティクス分野における弾性体の運動を高速かつ定量的に分析可能なシミュレータが得られた.この貢献はこれまでシミュレータに基づく解析が困難である柔軟構造物に対する新しい知見や科学的アプローチを検証できる点で有用である.本申請研究の有用性を示すために,進化ロボティクスとソフトマターの両分野における知見を取り入れた複合シミュレーションを提案し,流体環境における柔軟構造物の運動制御の最適化の検証を実施した.結果として,柔軟構造物の形状と運動は,環境とタスクにより変化し,相関関係が含有されることを形状進化の観点から定量的評価に基づき科学的に示した.この貢献は,海藻培養研究において各海藻種が成長するために適切な環境とその水流制御法の対する一つの知見として重要である.今後の研究の展開として,本申請研究で改良した弾性体用物理演算ライブラリを応用し,海藻培養に要する機材である水槽や攪拌器等の運動制御にも適用することが可能である.海藻培養を一つの弾性系としてみなすことで,より計算精度の高い挙動解析を実施することができ,実際の海藻培養における実測結果をフィードバックとしてシミュレータに導入する機構を構築することで,実際の海藻培養の現場に更なるか科学的知見を与えることが可能となるため、今後も継続し本研究に着する予定である.,当該年度における研究成果は,物理シミュレータを用いて糸状海藻の一種であるスジアオノリ同士の絡み制御を制御するための水流特性を解析することが目的である.本目的に対して,物理シミュレーション上での定量評価指標を提案することで既存研究では行われていなかった絡みの定量的解析を絡みの特徴に基づいた数理モデルの開発とパターン分類器を組み合わせることで可能にしたことだけに留まらず,実際の海藻の絡みに対して適切な実験機材と検証方法を用いてその妥当性の検証を行った.また,物理シミュレータと実環境を提案した絡みの定量評価指標を用いて比較および検証することで絡み発生の起因となる水流特性を究明し,シミュレータ上での水流制御方法を実際の水流に適用することで実際に生じる絡みの発生量を抑制可能であることを示した.これらの成果は期待していた以上の進捗であり,次年度以降において当該研究がより先の研究に取り組めることを意味している.
ポリフェノールによるBcl-xLに対する作用機序の解明と新たながん治療法の開発

私たちはこれまで、ポリフェノールによる抗腫瘍効果の作用機序を研究してきた。その結果、アポトーシス調整蛋白であるBcl-xLとMcl-1が共同してアポトーシスを抑制していることを発見した。この過程において、ポリフェノールは常にMcl-1を抑制するが、Bcl-xLは抑制される場合と逆に活性化される場合があるという興味深い現象を見いだした。本研究では、この研究を発展させ、ポリフェノールのBcl-xLに対する作用機序を分子レベルで解明し、消化器がんに対するポリフェノール療法による新たながん治療法を開発することを目的とする。H29年度はポリフェノールがBcl-xLに及ぼす効果とアポトーシスの関係を検索し、Bcl-xLとMcl-1を同時に抑制することで非常に強いアポトーシスを誘導することを確認した。さらにそのシグナルの確認を行ったところSTAT3のリン酸化を抑制することでこれらの作用が発揮されることを突き止めた。H30年度はさらにSTAT5の関与をwestern blotやcell death ELISA kitを用いて検索したが、ほとんど関与がないことが判明した。また、炎症性サイトカインであるIL-6を投与することでBcl-xLとMcl-1が活性化されることが新たに判明し、ポリフェノールはこの活性化されたBcl-xLとMcl-1を抑制することが判明した。さらに大腸がんの臨床検体を用いて免疫染色を行い、Bcl-xLとMcl-1の発現と進行度についての検討を網羅的に行った。これらの結果を踏まえ、今後遺伝子変異の有無・発現の程度とポリフェノールの効果についての検討を行う予定である。これらをコントロールするシグナルやさらにその上流をコントロールする炎症性サイトカインの関与についても新たに発見することができた。また臨床検体を用いた網羅的検討を行い、Bcl-xLとMcl-1と大腸がんの進行度に関係を検討することができた。しかしポリフェノールの効果の強弱についてMutation analysis kitやTaqManアレイプレートで遺伝子変異の有無・発現の程度を検討する予定であったが、この点が進んでいないのが現状である。ポリフェノールがBcl-xLに及ぼす効果とアポトーシスの関係をMutation analysis kit、TaqManアレイプレートで遺伝子変異の有無・発現の程度を検討する。また、Bcl-xL特異的阻害剤であるABT737やA-1155463などの薬剤とポリフェノールの併用がもたらす効果を検証する。H29年度はポリフェノールがBcl-xLに及ぼす効果とアポトーシスの関係をwestern blotやcell death ELISA kitを用いて検索した。その結果、Bcl-xLとMcl-1を同時に抑制することで非常に強いアポトーシスを誘導することを確認した。またその上流シグナルも確認をすることができた。しかしその効果の強弱についてMutation analysis kitやTaqManアレイプレートで遺伝子変異の有無・発現の程度を検討する予定であったが、この点が進んでいないのが現状である。

また臨床検体を用いた網羅的検討を行い、Bcl-xLとMcl-1と大腸がんの進行度に関係を検討することができた。しかしポリフェノールの効果の強弱についてMutation analysis kitやTaqManアレイプレートで遺伝子変異の有無・発現の程度を検討する予定であったが、この点が進んでいないのが現状である。ポリフェノールがBcl-xLに及ぼす効果とアポトーシスの関係をMutation analysis kit、TaqManアレイプレートで遺伝子変異の有無・発現の程度を検討する。また、Bcl-xL特異的阻害剤であるABT737やA-1155463などの薬剤とポリフェノールの併用がもたらす効果を検証する。臨床検体を用いてBcl-2 family蛋白の発現と予後・病理学的因子の関係を免疫染色を用いて行う。
遮熱型傾斜機能材料の熱損傷挙動に及ぼす熱負荷条件の影響

新しい耐熱材料として遮熱型傾斜機能材料(Functionally Gradient Materials : FGM)の研究,開発が活発に行われている.FGMの信頼性の向上等のためには,FGMの熱損傷を解明する必要があるが,組成が複雑に変化しているため,詳細な損傷メカニズムの解明はなされていない.そこで本研究では,FGMの熱損傷メカニズムを解明するための第1ステップとして遮熱コーティング(Thermal barrier coatings : TBCs)の熱損傷を検討した.試験片としてNi基超合金上にNiCoCrAlY合金とZrO_2-8%Y_2O_3(YSZ)を大気圧プラズマ溶射した.試験片を赤外線加熱炉を用いて熱負荷を与えた.本研究では特に冷却条件を様々に変化させ,所定のサイクル数毎に表面の組織観察およびX線残留応力測定を行った.さらに皮膜単体の熱分析も行い,これらのデータをもとに有限要素法による非定常熱応力解析を行い,TBCの熱損傷を理論的にも検討し,以下の結果を得た.溶射された状態のTBC内には引張残留応力が発生しており,後熱処理や繰返し熱負荷を与えることにより残留応力は減少する.これは溶射過程で皮膜中に生じたネットワーク状の微視き裂が開口して縦割れが進行し,残留応力を解放するためである.ただし加熱後に皮膜側から急冷する熱サイクルを与えた場合,YSZ中に層間はく離が生じ,皮膜表面の残留応力は急激に増加する.この現象は応力解析の結果より,加熱時に皮膜に生じる非弾性ひずみが冷却過程で圧縮応力を引き起こし,皮膜中で座屈現象を生じ,層間はく離を引き起こしたためでる.これらの結果より,熱負荷条件によりTBCの損傷形態は大きく異なるが,X線的残留応力も変化し,損傷評価法の一つとしてX線回折法の適用可能性を示している.新しい耐熱材料として遮熱型傾斜機能材料(Functionally Gradient Materials : FGM)の研究,開発が活発に行われている.FGMの信頼性の向上等のためには,FGMの熱損傷を解明する必要があるが,組成が複雑に変化しているため,詳細な損傷メカニズムの解明はなされていない.そこで本研究では,FGMの熱損傷メカニズムを解明するための第1ステップとして遮熱コーティング(Thermal barrier coatings : TBCs)の熱損傷を検討した.試験片としてNi基超合金上にNiCoCrAlY合金とZrO_2-8%Y_2O_3(YSZ)を大気圧プラズマ溶射した.試験片を赤外線加熱炉を用いて熱負荷を与えた.本研究では特に冷却条件を様々に変化させ,所定のサイクル数毎に表面の組織観察およびX線残留応力測定を行った.さらに皮膜単体の熱分析も行い,これらのデータをもとに有限要素法による非定常熱応力解析を行い,TBCの熱損傷を理論的にも検討し,以下の結果を得た.溶射された状態のTBC内には引張残留応力が発生しており,後熱処理や繰返し熱負荷を与えることにより残留応力は減少する.これは溶射過程で皮膜中に生じたネットワーク状の微視き裂が開口して縦割れが進行し,残留応力を解放するためである.ただし加熱後に皮膜側から急冷する熱サイクルを与えた場合,YSZ中に層間はく離が生じ,皮膜表面の残留応力は急激に増加する.この現象は応力解析の結果より,加熱時に皮膜に生じる非弾性ひずみが冷却過程で圧縮応力を引き起こし,皮膜中で座屈現象を生じ,層間はく離を引き起こしたためでる.これらの結果より,熱負荷条件によりTBCの損傷形態は大きく異なるが,X線的残留応力も変化し,損傷評価法の一つとしてX線回折法の適用可能性を示している.
聴覚障害児の階層的概念の獲得における帰納的推論過程の分析

聾学校児童生徒の語彙の獲得状況は約3歳の遅滞が認められ,中学部段階では9歳レベルに達するが,その後は漸増傾向が示された。また,「生き物」に関する階層的概念の獲得は小学校児童に比較して,遅滞する傾向が認められたが,特に「生き物」という最上位の抽象的な概念獲得が遅滞していた。また,聾学校児童生徒および小学校児童ともに,帰納的推論の獲得が認められる条件は同様であった。より上位の概念に関する一般帰納においては前提の典型性が高いほど,また,結論の特殊性が高いほど,また,等水準の概念に関する特殊帰納においては前提と結論の類似性が高いほど,帰納的推論が促される傾向にあった。混合帰納ではより事例が多い方が帰納的推論が促されていた。この混合帰納においては聾学校小学部第1学年から第6学年段階および小学校児童の低学年段階から中学学年段階にかけての獲得傾向が示されていた。今後は聾学校児童生徒の帰納的推論が促されやすい条件を整えて,概念的知識の獲得を促していくことが重要であると考えられた。聴覚障害児における概念獲得においては,抽象的概念や科学的概念の獲得が遅滞し長期化することが明らかにされている。また,その要因について分析したところ,抽象的な知識や科学概念に関する知識の獲得は促せたが,概念的な類推能力が獲得されにくいことが認められた。そこで,帰納的推論(具体的な体験や経験および知識から帰納的に,より抽象的な知識を関連づけるための推論)における一般帰納,特殊帰納,混合帰納の獲得過程について,聾学校小学部第1学年から高等部専攻科までの児童生徒を対象に検討したところ,言語能力との関係が深いことが認められた。また,小学校児童では高学年段階で,帰納的推論能力が獲得される傾向が認められるのに対して,聾学校児童生徒で認められた。しかし,階層的概念に関する知識を提示すると,高等部生徒においては,階層的概念の知識を活用して,一般帰納がより促進されることも認められ,階層的概念の獲得を促進し,活用能力を向上させることも必要であると考えられた。これらのことから,帰納的推論の獲得においては,言語能力の向上と,階層的概念の獲得を促していくことが重要であると考えられる。階層的概念の獲得を促すためには,各具体的な事例に関する概念属性をより多く獲得させるとともに,各事例間の共通属性の抽出が求められる。今後はこの概念的な抽出能力と帰納的推論能力の関係を明らかにすることも重要であると考えられる。聾学校児童生徒の「言語獲得」や「概念獲得」における課題を解決するための示唆を得ることを目的にして,「生き物」に関する概念の階層的な概念構造の獲得における帰納的推論を促す要因を検討した。聾学校児童生徒および小学校児童ともに,帰納的推論が認められる条件は同様であった。上位下位の概念関係理解に基づく一般帰納においては前提の典型性が高いほど,また,結論の特殊性が高いほど,帰納的推論が促される傾向が示されていた。等水準関係における特殊帰納においては前提と結論の類似性が高いほど,帰納的推論が促される傾向にあった。これらの結果から,典型性の高さはより上位の概念との関係理解に基づく帰納的推論を導き,概念的な接近も同様に帰納的推論を導きやすいということを示している。上位下位の概念関係と等水準の概念関係が含まれている混合帰納も提示事例の概念水準が上位下位の概念水準にまたがる混合帰納においても,前提の単純増加性の一般と特殊で,より事例が多い方が帰納的推論が促される傾向が認められた。また,この混合帰納においては聾学校児童および小学校児童の低学年段階から中学学年段階にかけての獲得傾向が示されていた。この結果,聾学校児童生徒においても,小学校児童と同様に帰納的推論が促されていることから,それぞれの概念関係に応じた推論状況を踏まえた上で,聾学校児童生徒の帰納的推論が促されやすい条件に応じた概念事例の提示によって,より多くの概念事例や概念的知識の獲得を促していくことが重要であると考えられた。
発達障害に係わる各種リスクファクターの遺伝衛生学的研究

解熱鎮痛剤アスピリン,アセトアミノフェンのゲノム突然変異誘発の可能性についてマウスを用いて検討した。実験の方法は次のとおりである。ICR雌マウス(生後34ケ月と1112ケ月)に排卵誘発処理を行った。アスピリン及びアセトアミノフェンをHCG投与1時間前に経口投与した。投与量は対照(5%アラビアゴム)、250,500mg/kgである。ただし、加令群ではアスピリン投与実験のみを行った。薬剤処理の12時間後、卵を回収し、Tankowski法で染色体標本を作成した。アスピリン投与実験(若年マウス)では、250mg群30匹,500mg群26匹から910個,862個の卵を回収した。そのうち208個,168個を染色体分析した。アセトアミノフェン投与実験(若年マウス)では、250mg群18匹から545個,500mg群20匹から623個の卵を回収した。染色体分析はそれぞれ116個,129個で可能であった。対照では20匹から624個の卵を回収、うち148個が分析可能であった。高一倍性異常はいずれの群にも発見されなかった。加令マウスを用いた実験は、アスピリン投与のみ行った。250mg群16匹,500mg群12匹,対照群18匹に投与した。それぞれの群で416個,341個,527個の卵を回収し、98個,65個,100個のみ分析可能であった。高一倍性異常は250mg群で3個(3.1%),500mg群で1個(0.7%),対照群で2個(2.0%)のみであった。薬剤投与で高一倍性異常は増加傾向を認めなかった。若年群との比較では加令群に高一倍性異常の多発傾向を認めたが、例数が不十分なため有意の差は現在のところない。低一倍性異常の出現頻度は老若マウスをとわず各群で1015%認められ、いずれもスライド作成時の人工産物と思われる。以上の結果から、解熱鎮痛剤はマウスの第一成熟分裂の段階で染色体異常を誘発することは確認できなかった。またマウスの加令により高一倍性異常は増加の傾向を示したが、解熱鎮痛剤が相加的又は相乗的に染色体異常の発生を増強せしめるか否かについても確認できなかった。
イオン液体中における分子集合系を利用する生体触媒反応

イオン液体(ILs)は、様々な陽イオンと陰イオンの組み合わせによって、既往の溶媒にはない興味深い性質を示す常温溶融塩である。近年、ILsは、酵素を用いた物質変換など広範囲にわたる応用において、環境への負荷低減可能な溶媒として注目されている。ILs中の酵素反応は、従来の有機溶媒中での酵素反応と比較して、高い転換率、高いエナンチオ選択性、高い酵素安定性を示すことが報告されている。しかしながら、酵素タンパク質は大部分のILsに不溶であるため、酵素をILsへ懸濁させたまま反応を行う一部の応用に留まっている。これまでに我々は、陰イオン界面活性剤(AOT)と1-ヘキサノールを用いて、疎水性のIL([C_8mim][Tf_2N])中にナノメートルサイズの安定な水環境を提供するwater-in-IL(w/IL)型マイクロエマルジョンの調製に成功した(Chem.Phys.Chem.9,689,2008)。w/ILエマルジョンは、その微少水滴中に酵素を可溶化することができ、従来の油中水滴(water-in-oil:w/o)型エマルジョンと同様に、水と界面活性剤分子の層によって、ILとの接触による酵素の失活を防ぐことが可能である。そこで我々は、w/ILエマルジョンに溶解したリパーゼPS(Green Chem.10,597,2008)と西洋わさびペルオキシダーゼ(Langmuir 25,977,2009)の2種類の酵素について、その触媒特性を検討した。その結果、w/IL型エマルジョン中の酵素活性は、イソオクタンとAOTを用いて形成する従来のw/o型エマルジョン中の酵素活性よりも高いことが確認された。また、w/ILエマルジョン中の酵素活性は、基質濃度、W_o(界面活性剤に対する水のモル比)、pH、1-ヘキサノール含有量といったパラメータに依存することを確認した。本研究で開発したw/ILエマルジョン系は、酵素反応場、分離技術、タンパク質リフォールディング、ナノマテリアル合成、薬物送達技術など様々な分野に展開が可能な新たな分散系として、広範な応用が期待される。イオン液体は不揮発性の溶媒であり、従来の揮発性有機溶媒の代替溶媒として期待されている。最近では、イオン液体を酵素反応の溶媒として利用する試みが活発に行われている。しかしながら、生体分子である酵素やタンパク質はほとんどのイオン液体には溶解しない。この問題に対し、本研究では疎水性のイオン液体中にマイクロエマルションの水滴を形成し、酵素などの生体分子をイオン液体に可溶化することを試みた。その結果、ヘキサノールを補助溶媒としてアニオン性界面活性剤AOTをイオン液体に溶解し、ここに少量の水を添加することでAOTの自己集合が形成された透明な水/イオン液体マイクロエマルションの構築に初めて成功した(ChemPhysChem,vol.9,pp.689,2008)。この新規分子集合系は相挙動観測、界面張力測定、動的光散乱法により評価した。界面活性剤AOTとイオン液体のアルキル鎖どうしの疎水性相互作用、およびAOTの親水基とマイクロエマルション内水相の相互作用によって安定な分子集合体を形成したと推察される。さらに、通常のイオン液体および水飽和イオン液体には酵素は可溶化しなかったが、イオン液体マイクロエマルション中には様々な酵素・タンパク質を可溶化することが可能であった(Green Chem,(in press),2008)。また、可溶化した脂質分解酵素リパーゼの蛍光分析により、内水相中の酵素はバルク水相と同様の環境下にあることを明らかにした。さらに、イオン液体マイクロエマルション中に存在するリパーゼは従来の有機溶媒中に形成されたマイクロエマルションよりも高い酵素活性を発現した。この活性向上の理由としては(1)内水相のミクロ環境の変化(蛍光分析により確認)、(2)基質などの反応に関わる化合物の水/イオン液体間の分配、(3)補助溶媒である1-ヘキサノールの存在、が考えられる。

そこで我々は、w/ILエマルジョンに溶解したリパーゼPS(Green Chem.10,597,2008)と西洋わさびペルオキシダーゼ(Langmuir 25,977,2009)の2種類の酵素について、その触媒特性を検討した。その結果、w/IL型エマルジョン中の酵素活性は、イソオクタンとAOTを用いて形成する従来のw/o型エマルジョン中の酵素活性よりも高いことが確認された。また、w/ILエマルジョン中の酵素活性は、基質濃度、W_o(界面活性剤に対する水のモル比)、pH、1-ヘキサノール含有量といったパラメータに依存することを確認した。本研究で開発したw/ILエマルジョン系は、酵素反応場、分離技術、タンパク質リフォールディング、ナノマテリアル合成、薬物送達技術など様々な分野に展開が可能な新たな分散系として、広範な応用が期待される。
妊娠期における肝幹細胞の活性化機構と生殖機能における役割

マウスでは、妊娠期に肝臓が肥大化することが知られており、母体の代謝機能の昂進に必須と考えられる。臓器の肥大化には肝細胞の増殖・分化が重要であるが、その制御機構や生理機能は不明である。そこで本研究では、妊娠期における肝細胞のダイナミクスと制御機構の解明を目的として研究を行った。前年度において、妊娠の進行に伴い肝細胞の増殖率が亢進し、妊娠後期には細胞の肥大化が起こることが分かった。今年度は、肝臓に存在する複数の肝前駆細胞のラベルトレース解析を行った。その結果、門脈域のSox9陽性肝前駆細胞と中心静脈域のAxin2陽性肝前駆細胞は、どちらも妊娠期に増殖はするが、各領域内にとどまることが分かった。また、増殖率は肝小葉の領域内で異なることが観察され、妊娠における肝細胞の応答を時空間的に制御する機構の存在が示唆された。妊娠期には、母体の複数の臓器でサイズや機能が変化する。特に肝臓は顕著に肥大化することが知られており、母体の代謝機能の昂進に必須と考えられる。当該年度では、まず、妊娠期の各ステージにおける肝細胞の増殖率を測定したところ、時期特異的に増殖率が増加し、その後減少することが分かった。また、増殖率だけでなく、細胞の大きさも変化することが明らかとなった。次に、肝細胞をラベルできる複数のレポーターマウスを用いて、妊娠の進行に伴う肝細胞のラベルトレース解析を行った結果、レポーターマウスの種類によって肝細胞ダイナミクスが異なることが分かった。すなわち、肝細胞はヘテロな集団であり、妊娠に応答して増殖する細胞集団と、応答しない細胞集団が存在することが示唆された。また、妊娠に伴って胆管上皮細胞の増殖率も増加することが分かった。非妊娠と妊娠マウスから胆管上皮細胞を単離しRNAseqにより遺伝子発現プロファイルを比較したところ、妊娠期に顕著に増加する複数の遺伝子群が存在することが分かった。当初の計画通り、妊娠期における肝細胞の増殖パターンと細胞系譜解析、ならびに胆管上皮細胞の遺伝子発現解析を実施・完了することが出来た。当初の計画通り、妊娠期における肝細胞の遺伝子発現変化を解析する。胆管上皮細胞の遺伝子発現変化と照らし合わせ、肝細胞と胆管上皮細胞の相互作用が存在する可能性を検証する。また、妊娠期において肝細胞または胆管上皮細胞で発現が上昇する遺伝子について、機能抑制による妊娠・胎児成長への影響を解析する。
膵癌の浸潤・増殖を阻害する細胞膜透過性ペプチドを応用した新規治療法の開発

C16orf74のN末端14アミノ酸を部分的に欠損した変異体を作成し、免疫沈降でダイマー形成に重要な部位を確定した。結果的にN末端番目と14番目のシステインが、ダイマー形成に重要であることが判明した。C16orf74のN末端15アミノ酸と同一のペプチド配列と細胞膜透過性シグナルを組み合わせた11R-DB (dimer blocking) peptideを作成し、C16orf74のダイマー阻害実験を施行したところ、ペプチド用量依存性にダイマー阻害が観察された。また、膵癌細胞株に対する11R-DB治療実験を施行したところ、WSTアッセイによる細胞増殖抑制効果を得た。マトリゲルインベージョンアッセイとHUVEC細胞を用いた血管透過性の検討では、11R-DB治療群で浸潤能ならびに細胞透過性の抑制を示した。Wound healingアッセイでも、同様に11R-DB治療群で遊走能の低下を来した。細胞骨格関連蛋白との細胞免疫染色ならびに免疫沈降法による検討から、C16orf74と相互作用する新たな分子としてインテグリンαVβ3やIntegrin linked kinase (ILK)を同定した。細胞形態の観察から、C16orf74はインテグリンαVβ3やILKを介して、浸潤能に影響していると考えられた平成31年度に予定していた下記2つの実験はおおむね順調に施行できた。(1)ダイマー阻害部位の同定が特定され、同部位を阻害する細胞膜透過性ペプチドを作成し、膵癌の増殖阻害、浸潤阻害効果をin vitroならびにin vivoで確認した。(2)新たな結合蛋白としてインテグリンαVβ3とILKを同定した。現在の細胞膜透過性シグナルはポリアルギニンを使用しているが、全ての細胞に取り込まれるという弱点がある。最近、腫瘍血管(新生血管)内皮細胞や腫瘍間質細胞に効率的に分子を取り込ませるペプチド配列が報告され、RGDモチーフ(RGD4C)やiRGD (CRGDK/RGPD/EC)を用いたドラックデリバリーが注目されている。これらの配列をC16orf74阻害ペプチド配列に結合し、膵癌細胞導入効率ならびに増殖抑制効果を評価する。2ヒト膵癌株の同所移植モデルマウスを作成し、同CPPを腹腔内あるいは静脈内投与したのち、腫瘍内への取り込み率を蛍光顕微鏡で評価する。ルシフェラーゼを導入した膵癌腫瘍の系は確立済みで、ペプチドに蛍光ラベルすることで、腫瘍(green)とペプチド(red)のmargeにより腫瘍内への取り込み効果を評価する。In vitro/in vivoで従来のポリアルギニンシグナルペプチドと比較し、取り込み効率、投与量および腫瘍縮小効果を検証する。
スクラムジェットにおける燃焼ガスジェットによる着火・保炎システムの開発

スクラムジェットエンジンの燃焼を対象に、過濃混合気の燃焼ガスジェットを利用した着火・保炎システムを開発することを目的とした本研究で、ジェット内でのCHラジカルの発光計測および、平面レーザー誘起蛍光法(PLIF)によるOHラジカルの蛍光計測を行った結果、以下のことが明らかになった。(1)パルスジェット点火によるCHラジカル発光計測とOHラジカル蛍光計測により、活性な物質の噴出は、火花放電時間により支配されていることが明らかになった。(2) PLIF法によるジェット内のOHラジカル蛍光計測の結果、大きな尺度の渦構造が観測された。(3)キャビティに過濃な混合気を利用する程、ジェット内のOHラジカルの蛍光面積と強度が大きくなることが明らかになった。(4)ジェット内のOHラジカルの蛍光面積と蛍光強度は、キャビティ容積とオリフィス直径に大きく影響されることが明らかになった。スクラムジェットエンジンの燃焼を対象に、過濃混合気の燃焼ガスジェットを利用した着火・保炎システムを開発することを目的とした本研究で、平成8年度は、レーザー誘起蛍光法(LIF)システムの製作、及びその有効性の検討を行った。小型QスイッチYAGレーザー(コンテニュアムSurelite II-10)、高周波発生器、波長分離器と色素レーザーを組み合わせ、波長283.553nmのシート状のレーザー光をバーナー火炎に入射した。この場合、OHラジカルのA^2Σ^+-X^2IIの電子エネルギー遷移における(1,0)バンド吸収線を利用することになる。励起されたOHラジカルは、(1,1)、(0,0)バンドからの蛍光を発するので、バンドパスフィルター(中心波長307nm、半値幅15nm)を通して観測した。バンドパスフィルターを通った光は、高速ゲート付きイメージインテンシファイヤーとCCDカメラによりとらえられ、フレームメモリーを介して、コンピューターのメモリーに書き込み、画像処理を行った。イメージインテンシファイヤーのゲートをOHラジカルの自発光がとらえらえられない高速にして(100200ns)計測を行った。その結果、バーナー火炎においては、火炎帯そのものより、少し流された既燃域に最も蛍光の強い場所が存在することなどが明らかになり、本LIFシステムが有効であることを確認した。スクラムジェットエンジンの燃焼を対象に、過濃混合気の燃焼ガスジェットを利用した着火・保炎システムを開発することを目的とした本研究で、平成9年度は、パルスジェットのジェット内でのCHラジカルの発光計測および、レーザー誘起蛍光法(LIF)によるOHラジカルの蛍光計測を行った。蛍光計測は、昨年度制作したシステムで行った。すなわち、小型QスイッチYAGレーザー(コンテニュアムSurelite II-10)、高周波発生器、波長分離器と色素レーザーを組み合わせ、波長283.553nmのシート状のレーザー光と、高速ゲート付きイメージインテンシファイヤーとCCDカメラによりとらえた。その結果、以下のことが明らかになった。(1)パルスジェット点火によるCHラジカルの発光計測より、キャビティに充てんする混合気の当量比φ_c=0.8で放電後1.0ms付近、φ_c=1.5で放電後3.0ms付近でCHラジカルの噴出が止まっていることがわかった。(2)PLIF法によるパルスジェット内のOHラジカルの蛍光計測の結果、大きな尺度の渦構造が観測され、ジェット内部のOHラジカルは一様に分布しているのではなく、ジェットの先端付近でかつ内部に最大の蛍光領域があることがわかった。スクラムジェットエンジンの燃焼を対象に、過濃混合気の燃焼ガスジェットを利用した着火・保炎システムを開発することを目的とした本研究で、平成10年度は、昨年度に引き続き、パルスジェットのジェット内でのレーザー誘起蛍光法(LIF)によるOHラジカルの蛍光計測を行った。蛍光計測は、小型QスイッチYAGレーザー(コンテニュアムSureliteII-10)、高周波発生器、波長分離器と色素レーザーを組み合わせ、波長283.553nmのシート状のレーザー光と、高速ゲート付きイメージインテンシファイヤーとCCDカメラによりとらえた。燃焼室には、当量比0.8のメタン-空気混合気を、またキャビティ内には当量比1.5のメタン-空気混合気を充填した。本年度は、キャビティ容積とオリフィス直径の影響を調べるために、キャビティ容積を170と340mm^3の2種類用意して、それぞれのキャビティ容積に対して、オリフィス直径を2.5と4.0mmの2種類での実験を行った。さらにLIF計測と同時に燃焼室内の圧力測定も同時に行い、圧力上昇とLIFの面積、面積平均強度、積分強度との関係について考察した。
ナノスケール変態強化を発現する新奇高靭性セラミックスの開発

本研究ではナノスケール変態強化を発現する新奇セラミックス物質の開発を目的に研究を行った。その結果、2つの大きな研究成果を得ることができた。一つ目は、破壊誘起アモルファス化による変態強化を発現する物質としてペロブスカイト型MgSiO3多結晶体を見出した。この物質はある意味非常にありふれた物質で、地球の深さ670km以深、地球の岩石部分の底(深さ2900km)までの最主要鉱物である。この地球の体積の約8割を占め地球そのものと言ってもいい物質を、一気圧下で構造用セラミックスとして使用すると変態強化、変態塑性を示し、とても割れにくいセラミックスであることを見出した。この成果はとても重要なので、現在も補足データを収集しており万全の状態で論文投稿する予定である。2つ目は、立方晶窒化ケイ素・透明多結晶体の合成に成功した。これは割れにくいセラミックスを創り出すつもりで取り組んだ研究だが、予期せず、全物質の中で3番目に硬く高い透明性を示す物質の合成に成功した。さらにこの物質は他の超硬質材料とは異なる特性も有しており、超硬質材料をこれまでとは違った用途で産業利用する可能性を開く物質になるかもしれない。発表した論文は世界中のメディアで取り上げられた。内定年度:2015所属研究機関:ドイツ電子シンクロトロン(ドイツ)平成28年度は、スピネル型窒化ケイ素透明多結晶体の合成とその機械的性質の評価を行った。これは全物質中で3番目に硬い物質であり、この物質が透明になるメカニズムを原子分解能透過型電子顕微鏡観察により明らかにした。最も硬い透明セラミックスであるダイヤモンドの空気中での耐熱性は約700°Cまでと比較的低い。これは高温空気中でダイヤモンドが酸化し二酸化炭素になり、さらにダイヤモンドが石墨に変態してしまうからである。一方、スピネル型窒化ケイ素は、硬さはダイヤモンドに劣るが、空気中での耐熱性はそれを大きく凌ぐ1400°C以上であることが知られている。したがって、スピネル型窒化ケイ素透多結晶体は、ダイヤモンドウィンドウでは耐えることができない過酷な環境で使える耐熱硬質ウィンドウとして使用できる可能性を持つ物質である。この成果は東工大およびドイツ電子シンクロトロンにおいてプレスリリースし、日本およびヨーロッパで広く報道された。さらに、MgSiO3アキモトアイト・ペロブスカイト多結晶体の合成とその機械的性質の評価、シンクロトロン放射光を用いた評価、マイクロカンチレバー試験、第一原理計算を用いた亀裂先端に相当する引張応力下での原子の振る舞いの評価を行った。このうちMgSiO3ペロブスカイトが破壊誘起アモルファス化に起因する変態強化を示し、とても割れにくいセラミックスであることを示すデータが得られつつある。平成29年度に、この研究をさらに進める。本研究では、高靭化する可能性がある硬質セラミックスとして以下の物質を研究対象とした:ダイヤモンド、立方晶窒化ホウ素、スピネル型窒化ケイ素、MgSiO3アキモトアイト、MgSiO3ブリッジマナイト。これらの物質のうち、スピネル型窒化ケイ素透明多結晶体の合成とその物性測定の結果を論文として報告した。これを日本とドイツでプレスリリースし、日本を含む世界で広く報道された。さらに、MgSiO3ブリッジマナイトが高靭化し、MgSiO3アキモトアイトがそうならないことを示した。前者が割れにくくなるメカニズムをシンクロトロン放射光、マイクロカンチレバー試験を用いて評価した。さらに国際共同研究を進め、このメカニズムの物理的背景を第一原理計算によって追求している。この研究結果を、平成29年度の前半に論文投稿すべく現在も研究を進めている。上記、5つの物質のうち3つに関して大きく研究が進展した。残る物質であるダイヤモンドと立方晶窒化ホウ素に関しても合成条件の確立のための研究を進めつつある。研究開始は、平成28年12月であるが本基金を利用させていただくことにより、短い期間で多くの成果を得ることができたと考えている。今後は、ナノ多結晶ダイヤモンドおよびナノ多結晶立方晶窒化ホウ素の合成に重点的に取り組み、それらの物質が高靭化しているメカニズムの解明のために、以下の評価に取組む。

放射光を利用したX線吸収分光測定およびX線回折測定、透過型電子顕微鏡による観察、マイクロカンチレバーを用いたミクロサイズ材料試験はこれまで通り行う。さらにこれらに加えて、SPring-8、ナノフォーカスビームを利用した100nm程度の空間分解能を有するX線回折実験を行う予定である。これにより、破断面に形成された“破壊誘起アモルファス層"の構造情報を得ることを目指す。さらに、これまで以上に国際共同研究を推進する。第一原理計算に関しては、南カリフォルニア大学との共同研究をこれまで通り推進する。さらに、スピネル型窒化物に関して、パリ13大との共同研究を開始する。東工大への着任が平成28年12月1日であり、本研究の開始はそれから約1ヶ月後である。初年度に、研究に必要な備品を購入するために多くの予算を計上した。しかしながら、幾つかの備品は入札のために納品まで長い期間が必要であることが判明し、またあるものは製作に時間がかかり平成28年度内に納品されなかった。これらの設備品のうち幾つかは平成29年度のはじめに納品され、またいくつかは近く納品予定である。納品時に予算執行となるため、平成28年度に予算消化することができず、平成29年度使用額が生じた。この次年度使用額は使途がほぼ確定し、平成29年度前半に執行が予定されている。執行される金額は申請した研究計画にしたがっている。平成28年度分からの次年度使用額に関しては、高額な備品の入札を完了し現在納品待ちである。よって、この次年度使用額に関してはすでに使途が確定している。平成29年度に請求した助成金は、申請書の使用計画に沿って執行させていただく予定である。平成29年度は主にナノ多結晶ダイヤモンドおよび立方晶窒化ホウ素合成に必要な消耗品を購入し、物質合成および評価を重点的に行う。これらの合成を円滑に進めるため、技術補佐員、事務補佐員の雇用をすでに開始した。さらに、これまでに得られた成果を国際学会などで発表する。さらに国際共同研究をさらに活発化させるため、アメリカ、ドイツ、フランス、スロバキアなどの共同研究者との議論を行う。
(BEDT-TTF)_2MHg(SCN)_4(M=K,Rb,Tl)における電子基底状態

数年前、京大・石黒グループとの共同研究中、α-(BEDT-TTF)_2KHg(SCN)_4の電気抵抗が約200mK以下で減少することを見い出した。その後、同じ系列の(BEDT-TTF)_2RbHg(SCN)_4にも同様の現象があることが判り、フィラメント状の超伝導によるものと指摘した。これらの電子基底状態は、M=K,Rb,Tlでは、約8K以下でSDW相、M=NH_4では約0.8K以下で超伝導相と考えられてきた。しかし前者に関しては、はっきりしない点も多い。そこで、M=K,Rbの1K以下での抵抗減少の原因を究明し、真の電子基底状態を決める為、磁気的測定を試みた。測定としては、rf SQUIDを用いてAC帯磁率と磁化を同時に測定した。予想される信号が小さいので、バックグランドを極力抑える必要がある。先ず、測定システムの動作チェックと比較の為にM=NH_4の測定を行った。得られた臨界磁場の温度依存性は、J.Brooksらのものと良く一致している。一方、M=Kでは一つの試料について小さい反磁性信号が観測されたが、その大きさから推測すると、全体積の1%程度によるものと考えられる。又、約数ガウス程度の弱い磁場でこの反磁性信号が消えてしまう。これから超伝導成分が存在するとしても、非常に弱いものであると考えられる。さらにM=Rbについては、これまで2種類の試料について同様の測定を行ったが、バックグランドを越える反磁性信号は観測されていない。今後、多くの試料についての測定の他、一軸性高圧下の測定を行いたい。さらに静水圧下では、ヘリウムを圧力媒体とする精密な圧力制御が可能な高圧装置の開発を計画している。
グライコプロテオームを中心とした複合オミクス解析による疾患モデルの糖鎖機能解析

糖鎖の生体内機能を解明する方法の一つは、糖鎖の生合成を担う糖転移酵素遺伝子を改変(欠損)し、それによって生じた表現型を解析することである。本研究では糖鎖改変細胞・マウスを用い、新規グライコプロテオミクス技術等の解析により、糖転移酵素が生合成する特定糖鎖のキャリア糖タンパク質を同定し、表現型に関連する分子群とそのメカニズムの解明を試みた。グライコプロテオミクス技術・IGOT法ならびに新規技術(Glyco-RIDGE法)を用いることで、各種糖鎖(Lewis x、LacdiNAc、pLN、コンドロイチン硫酸構造など)のキャリア分子の同定や表現型の解析を行った。本課題では、各糖転移酵素特異的な標的タンパク質の大規模同定を行うために、糖転移酵素遺伝子ノックアウト(KO)マウス群を用い、糖鎖キャリア分子(糖ペプチド)をレクチン捕集して、野生型とKOマウスとの比較グライコプロテオーム解析を行っている。まずは、Lewis x構造(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-R)を合成する、α1,3-フコース転移酵素9(Fut9)に着目し、KOマウスを用いた解析を行った。Fut9が発現している腎臓をサンプルとして使用し、野生型及びKOマウスからグライコプロテオーム解析によるルイスx糖鎖のキャリアタンパク質の網羅的な解析を行なった。同定には新規に開発されたグライコプロテオーム解析技術・ツールを使用した。解析の結果、24個のルイスxキャリアタンパク質(42個のルイスX糖鎖付加部位、317個の糖ペプチド)が同定され、腎臓で合成されるルイスx糖鎖のほとんどは、Fut9により合成されていることが確認された。また、現在はシアル酸を除去したサンプルを用いて解析しているが、この手法を様々な組織やサンプルに応用するためには、シアル酸を含めて解析が出来るようになることが求められるため、その解析条件の検討を進めているところである。また、core3 O型糖鎖、LacdiNAc糖鎖、ポリラクトサミン糖鎖をキャリーする糖タンパク質を網羅的に同定し、その機能を解析するために、糖鎖キャリア糖タンパク質を効率的に捕集するための系(レクチンアフィニティーなどによる捕集の系)の構築を行い、野生型マウス細胞あるいは臓器、細胞株を用いて同定を行った。並行して次世代シークエンサーによる全トランスクリプトーム解析も行っており、グライコプロテオーム解析との融合により、糖鎖生合成系の破綻により起こりうる疾患の病態と分子メカニズムの解明に結びつけたい。本研究ではグライコプロテオームを中心とした複合オミクスの解析により、ノックアウトマウス(疾患モデルマウス)や改変細胞を用いて糖鎖構造及び糖鎖遺伝子の機能解明を目指している。これまでに、基本解析技術・手順を確立し、標的キャリア糖タンパク質を効率良く捕集するためのレクチンの選定と、その捕集系の構築、最適条件を検討する作業を進めてきた。当該年度に新たに開発したグライコプロテオーム解析技術・ツール(Glyco-RIDGE法)を用いて、糖鎖キャリア分子を網羅的・ハイスループットに同定するための系の構築のモデルとして、まずは糖転移酵素Fut9について実証実験を進め、Fut9遺伝子の野生型及びKOマウスの腎臓におけるルイスx糖鎖のキャリアタンパク質(Fut9が標的とする糖タンパク質)の同定に成功した。また、その他の糖鎖特異的なキャリア糖タンパク質の捕集系の開発・同定も順調に進んでいる。糖鎖遺伝子の発現の異なる細胞で次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析も実施し、パスウェイ解析やグライコプロテオームの解析結果との統合も進めた。CRISPR/Cas9システムによる糖鎖遺伝子KO細胞の作製も進んでおり、グライコプロテオーム解析やトランスクリプトーム解析へと展開する予定である。以上のように当該年度の研究計画は順調に進んでいる。まずは、Lewis x構造(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-R)を合成する、α1,3-フコース転移酵素9(Fut9)に着目し、Fut9 KOマウスを用いた解析を行った。昨年度の腎臓に引き続き、脳組織を使用してグライコプロテオーム解析によるルイスx糖鎖のキャリアタンパク質および糖鎖構造の(野生型とKOマウスとの)比較解析を行なった。脳グライコームを分析し比較した結果、WTでは複数のフコースを持つ糖鎖(一つ以上のルイス型フコース)があり、多くの糖鎖にシアル酸が付加されていた。また、2型のLacdiNAc糖鎖の生合成に関与する酵素であるB4GALNT3、B4GALNT4遺伝子の欠損マウスあるいは細胞株を用いてグライコプロテオミクス解析によるLacdiNAc-omicsを遂行し、そのキャリアタンパク質候補の同定と解析を行った。同じく1型のLacdiNAc糖鎖の生合成に関連するB3galnt2 KOマウスは胎生致死のため、交配し発生時期毎に胎仔マウスを取得し、重量測定、遺伝子型解析、一次培養、組織染色などを実施した。モデル細胞を用いてグライコプロテオーム解析を行った結果、キャリアタンパク質候補の同定に成功した。

以上のように、新たなグライコプロテオミクス解析によって各種糖鎖キャリアが同定されたので、表現型との関連を解析することで、糖鎖の生体内機能を明らかにすることができると期待される。本研究ではグライコプロテオームを中心とした複合オミクスの解析により、ノックアウトマウス(疾患モデルマウス)や改変細胞を用いて糖鎖構造及び糖鎖遺伝子の機能解明を目指している。これまでに、基本解析技術・手順を確立し、標的キャリア本研究ではグライコプロテオームを中心とした複合オミクスの解析により、ノックアウトマウス(疾患モデルマウス)や改変細胞を用いて糖鎖構造及び糖鎖遺伝子の機能解明を目指している。これまでに、基本解析技術・手順を確立し、標的キャリア糖タンパク質を効率良く捕集するためのレクチンの選定と、その捕集系の構築、最適条件を検討する作業を進めてきた。当該年度に新たに開発したグライコプロテオーム解析技術・ツール(Glyco-RIDGE法)を用いて、糖鎖キャリア分子を網羅的・ハイスループットに同定するための系の構築のモデルとして、まずは糖転移酵素Fut9について実証実験を進め、腎臓におけるルイスx糖鎖のキャリアタンパク質の同定に成功し、引き続き他の糖転移酵素B4galnt3(4)、B3ganlnt2、B3gnt2、B3gnt6等の糖鎖遺伝子KOマウスあるいはCRISPR/Cas9システムによる糖鎖遺伝子KO細胞を用いて、糖鎖のキャリアタンパク質同定を進めている。糖鎖遺伝子の発現の異なる細胞で次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析も実施し、グライコプロテオームの解析結果との統合、およびパスウェイ解析を進めた。以上のように当該年度の研究計画は順調に進んでいる。今後は統合的に得られる情報を元に機能との関連について解析を進めていく予定である。本課題では、糖鎖の生体機能解明のため、野生型と糖鎖遺伝子改変型の細胞やマウスを研究材料として、最新の解析技術を用いた比較グライコプロテオーム解析による糖転移酵素の標的タンパク質の同定と糖鎖構造解析を行った。グライコプロテオミクス技術・IGOT法ではN型糖鎖キャリア分子と付加位置を同定することが出来る。そこで、LacdiNAc(タイプI)構造を合成するB3GALNT2に着目し、発現細胞からLacdiNAc結合レクチンを用いたIGOT法によりキャリア分子を同定した。さらに、KD実験によりLacdiNAc構造がN型糖鎖上に存在すること、KOマウスの胎児での組織構造異常を明らかにした。次に、新規グライコプロテオミクス技術(GR法)では、糖ペプチドの質量および保持時間を使用し、MS2を必要とせずに糖ペプチド上の糖鎖構造が解析できる。そこで、HL-60細胞におけるポリラクトサミン(pLN)糖鎖のキャリア分子の同定を試みた。糖ペプチドを親水性相互作用クロマトグラフィー分画した試料を分析した結果、pLN糖鎖が高親水性画分に濃縮された。HL-60細胞では31個のpLNキャリアタンパク質群が同定され、それらはシグナル伝達、受容体、細胞移動および細胞接着などの機能に関連する分子を含むことが明らかとなった。さらに、コンドロイチン硫酸の生合成に関わるCSGalNAcT1(T1)とCSGalNAcT2(T2)のダブルノックアウトマウス(DKO)を作製し、表現型解析を行った。DKOは呼吸不全による胎生致死であった。軟骨特異的DKOでは、四肢が極端に短縮していた。
浸潤突起を選択的に採取できる新技術レーザープロテオミクスによる肺癌浸潤機構の解明

細胞の運動や癌細胞の浸潤に重要な役割を担う偽足突起はタンパク採取が可能であった。タンパク分画をそれぞれ抽出後に2次元電気泳動に供すると、2508個のタンパクスポットが観察され、211スポットが偽足突起分画タンパクと細胞体分画タンパクとの間で4倍以上の有意な発現差を持って同定された。偽足突起に高発現を示す候補タンパクの内、既に細胞運動への関与が知られているRAB1A, HSP90B, TDRD7, vimentinに関して偽足突起への高発現が認められた。偽足突起に高発現が認められるタンパクは細胞の運動や浸潤に強く関与し、これらの研究は肺癌の新たな治療開発の可能性を示唆している。偽足突起は培養細胞においてその腹側から垂直方向に突出するアクチンリッチな構造物であり、細胞の運動、癌細胞の浸潤に重要な役割を担う。ヒト腫瘍細胞をファイブロネクチンでコートされた3μmの穴あきメンブレンの上で培養すると、その細胞の運動能に合わせて偽足突起を穴に突出するように形成する。これにエキシマレーザーにより水平方向にレーザーを照射させ、細胞の細胞体の部分のみを除去する。これにより残存した偽足突起は明らかなダメージなくタンパク採取が可能であった。この方法により採取した偽足突起のタンパク分画と細胞体のタンパク分画をそれぞれ抽出後に高感度蛍光色素により標識させ、2次元電気泳動に供した。結果、2508個のタンパクスポットが観察され、211スポットが偽足突起分画タンパクと細胞体分画タンパクとの間で4倍以上の有意な発現差を持って同定された。これらを質量分析に供して46個の偽足突起に高発現を示す候補タンパクを同定した。これらの内、既に細胞運動への関与が知られているRAB1A, HSP90B, TDRD7, vimentinに関して細胞蛍光免疫染色にてタンパク発現を確認したところ、偽足突起への高発現が認められた。また、RAB1Aに関して過剰発現および発現を抑制する実験をおこなったところ、過剰発現させて細胞株では偽足突起の数が増加し、突起の伸長幅も増大したが、RAB1Aの発現を抑制させるといずれも減少した。偽足突起に高発現が認められるタンパクは細胞の運動、浸潤に非常に強く関与している可能性が示唆された。この技術による偽足突起に特異的なタンパクの同定は偽足突起の更なる理解や、腫瘍細胞における悪性の表現型の理解のみならず悪性腫瘍の新たな治療開発に大きな利益をもたらす。この新技術を生物学的特性の異なる複数のヒト肺癌細胞株を用いて、新規ターゲットの同定とその浸潤機構の解明を行うことができることが解った。肺腺癌細胞株の生物学的特性と浸潤突起部のタンパク解析を実施した。多種のヒト肺腺癌細胞株においてEGFR、HER2、RAS遺伝子変異をhigh-resolution melting analysisにより高感度で特異性高く検索し、ALK rearrangementの有無を免疫組織染色やreverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)、chromogenic in situ hybridization assayで調べ、その結果に応じて検索した細胞株を生物学的特性別に分類した。また、ヒト肺腺癌細胞株PC-9はEGFR変異を認めることが分かっており、コントロールとして使用した。ファイブロネクチンコートを施した穴あきポリエチレンテレフタレート(PET)メンブレン上で細胞を培養し、confluent状態にして突起を伸長させ、特殊なレーザー照射後に浸潤先進部にあたる突起のみを採取し、タンパク抽出を行った。さらに細胞のcellbody部分をscratchにて採取し、タンパク抽出を行った。突起のみの微量タンパクとcell bodyのタンパクそれぞれにおいて2D-DIGE法にてタンパク発現解析を行った。2次元泳動によりタンパクを分離し、cell bodyと比較して突起に高発現を認めるタンパクスポットの選出を行った。各実験は3回ずつ行い、スキャタープロットにて再現性の確認を行った。LC-MS/MS法により浸潤突起部で高発現する候補分子の同定、選出したスポットに関してgel digestionを行い、精製、分断されたペプチドをLC-MS/MSに供してそれぞれのスポットのタンパク同定を行った。多種のヒト肺腺癌細胞株においてEGFR、HER2、RAS遺伝子変異、ALK rearrangementの有無を各種方法で調べた。また、ファイブロネクチンコートを施した穴あきポリエチレンテレフタレート(PET)メンブレン上で細胞を培養し、confluent状態にして突起を伸長させ、特殊なレーザー照射後に浸潤先進部にあたる突起のみを採取し、さらに細胞のcellbody部分をscratchにて採取し、タンパク抽出を行った。突起のみの微量タンパクとcellbody全体ののタンパクそれぞれにおいて2D-DIGE法にてタンパク発現解析を、さらに2次元泳動によりタンパクを分離し、cell bodyと比較して突起に高発現を認めるタンパクスポットの選出を行った。

浸潤突起部で高発現する候補分子の同定を行った。以上より、予定通り進んでいる。今後は浸潤に特異的である候補分子の機能解析を追加的に行うことにしている。浸潤に特異的である候補分子の機能解析1)計画1によって同定された候補分子の中から(a)発現の変化・増幅の程度が大きい、(b)機能性蛋白と推測される、(c)浸潤・悪性化と関連する機能が示唆される、(d)細胞の運動性への関与が示唆される、の観点から解析すべき分子を選定する。2)分子生物学・細胞生物学及び実験病理学の手法を駆使してその分子の機能を明らかにする。3)浸潤に関わることが確認された分子に関してはヒト検体において再現性を確認して、ヒト肺腺癌において治療のターゲットとなるか否かの可能性を模索する。この方法として遺伝子レベルはRT-PCRで、タンパクレベルは免疫組織染色やwestern blotで行う。更に最新の試験を得るために学会に参加する。以上より、実験機器、実験消耗品、旅費、人件費に使用する予定である。