hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Hippo経路制御因子および破綻シグナルの検索

本研究は、腫瘍化の引き金となり、一方で組織再生にも必須であるYAP/TAZ活性の制御機構を解明することを目的としている。前年度まではsiRNAライブラリーや標準阻害剤も用いたレポータースクリーニングを行うことでYAP/TAZの活性を制御する因子を網羅的に検索し、結果、糖鎖修飾、低栄養応答、炎症応答関連遺伝子、機能未知キナーゼや、種々のストレス応答に関わる薬剤がYAP/TAZの活性制御に関与することを明らかにした。本年度、YAP/TAZ活性を阻害・もしくは亢進する新規シグナル関連薬剤に関しては、内在性のYAP/TAZの標的遺伝子発現、細胞増殖能、自己複製能への効果の検証した後に、『がん遺伝子産物YAP/TAZ機能調節剤』として、特許出願を済ませた。近年、YAP/TAZの活性化によりiPS細胞を誘導できることも報告されており、同定されたYAP/TAZ活性化剤は薬剤を用いたiPS細胞誘導の最適化や、損傷組織等の再生医療薬に利用できる可能性があり、一方YAP/TAZ抑制剤は新規の抗がん剤候補として期待できる。siRNAスクリーニングで単離してきたYAP/TAZ活性を制御する新規遺伝子に関しては、機能亢進の観点からアプローチをするため、cDNAをクローニングして、ドキシサイクリン(Dox)誘導型のcDNAのコンストラクトを導入したヒト細胞株を樹立した。現在、目的遺伝子が発現亢進した細胞株で、YREレポーター遺伝子や内在性のYAP/TAZの標的遺伝子の変動を解析しており、有望な結果を得ている。さらに、これらの機能亢進細胞株で、Hippo経路シグナル伝達因子やYAP/TAZとの相互作用を検討して、その作用点を見出そうとしている。がん抑制シグナルであるHippo経路の分子基盤を解明するために、その活性を制御し、機能的に相互作用する遺伝子や化合物を、細胞ベースのハイスループットスクリーニングや質量分析法により同定し、機能解析を行った。これらの研究により、その活性制御剤として、イベルメクチンを始めとする複数の薬剤を特許出願して一部を論文発表するとともに、Hippo経路の新規抑制標的として、がん遺伝子産物であるmicroRNA制御タンパク質Lin28Bを見出し、発表した。YAP/TAZは、Hippo経路の破綻により活性化され過増殖・がん幹細胞維持・腫瘍形成を促進する一方、種々の組織幹細胞でも機能し、その組織再生にも必須であることからも、生体恒常性の破綻と維持の両方に関わる諸刃の剣であることがわかる。それ故に、生体内でその活性が厳密にコントロールされていることが予想されるがYAP/TAZの活性化がどのような制御機構で、方や腫瘍化、一方で組織再生に向かうべく調節されているかは全く分かっていない。そこで、応募者はこれらの解明は、がんの予防・治療や再生医療の観点からも急務であると考え、その手がかりを得るためにYREレポーター導入細胞を利用して、siRNAライブラリーや標準シグナル剤キットのスクリーニングを実行し、YAP/TAZの活性を制御する遺伝子やシグナル・ストレス刺激を網羅的に検索した。その結果、代謝応答、免疫応答、細胞分化、細胞増殖、糖鎖修飾などに関わる複数の興味深いキナーゼやフォスファターゼを同定し、さらにJAK/STAT
リコンフィギュラブル微小流路によるモバイル細胞・細胞塊長期培養システム

リコンフィギュラブルな微小流路を実現する系を、小型のピン・精密アクチュエータ・PCベースの制御系を組みあわせることで作成し、次年度の細胞を用いた実験の準備が整った。1流路の側壁を構成するピン・チップの設計製作リコンフィギュラブル微小流路の一実装として,表面実装電子回路のジャンパとしての利用を想定された金めっきピンの断面を並べ,微小流路の側壁とした.これらピンは、細胞との共存も可能であることが、培養実験により確かめられた。これらのピンを、ポートとしての穴をあけたガラス板ではさみ固定することでチップを作成した。ピン一つの形状は300μm×300μmの正方形であり、微小流体制御に十分な寸法精度をもつことが、チップ内で流路を組むことにより確認された。2流路側壁(チップ内ピン)制御系の設計製作まず、研究実施計画において示した、点図セルをベースとしてピンの駆動をする系の設計検討を行ったが、駆動系の規模と部品の加工精度が大きく、費用面で実施不可能と判断したため、市販の精密アクチュエータを組み合わせてXYZマニピュレータを構成し、これをPCベースのモーション制御・画像取得解析ソフトウェアと組み合わせる設計に変更した。結果、倒立顕微鏡下でピンの10マイクロメートル単位での変位制御が可能となった。
ヒト前立腺における線維芽細胞成長因子およびその受容体の基礎的・臨床的検討

結論:以上の成績から,前立腺肥大症においては上皮細胞と間質細胞でFGFsおよびFGFRsの発現が異なり,これらを介する上皮間質相互作用による細胞増殖機構の存在が示唆された。一方,前立腺癌においてはその悪性化とともに上皮間質相互作用から逸脱し,自律性増殖機構の獲得が示唆された。(方法)手術的に得られたヒト前立腺肥大組織から上皮細胞と間質細胞をそれぞれ分離、培養し、FGFおよびFGFRの発現についてRT-PCR法で検討した。またヒト前立腺肥大症組織から直接RNAを精製して同様に検討を行った。前立腺癌についてはヒト前立腺癌由来でアンドロゲン依存症、細胞増殖能や転移能の異なるLNCaP、DU145、PC3の三つの細胞株で同様に検討した。(結果)前立腺肥大症においてはFGF-1、FGF-2、FGFR-1は上皮細胞および間質細胞のいずれにおいても発現が認められた。FGF-7は間質細胞に発現していたのに対して、上皮細胞には発現が認められなかった。FGFR-2(exonlllb)、FGFR-4は上皮細胞に発現していたのに対して、間質細胞には発現が認められなかった。前立腺肥大症組織からは上記のすべての発現が認められた。前立腺癌由来細胞株ではFGF-2はPC3、DU145に発現していたが、LNCaPには発現していなかった。FGFR-2(exonlllb)は前立腺由来細胞株ではいずれも発現が認められなかった。(結論)前立腺肥大症においては上皮細胞と間質細胞におけるFGFおよびFGFRの発現が異なっており、上皮細胞と間質細胞はFGFを介する細胞増殖の調節機構の存在が示唆された。一方、前立腺癌においては前立腺肥大症で認められる上皮と間質の相互作用から逸脱して自立性増殖が起きている可能性が示唆された。結果:LNCaPではFGF1,FGFR1およびFGFR2(IIIb)が,PC3ではFGF1,FGF2,FGFR1およびFGFR2(IIIc)が発現しており,LNCaPでは間質性のFGF2,FGF7の影響が示唆されるのに対して,PC3では間質からのFGF7の影響から逃れるとともに,FGF2の産生とFGFR2(IIIc)の発現で新たなオートクライン機構の形成が示唆された。ヒト前立腺癌組織の免疫組織学的検討では,癌細胞にFGF1,FGF2およびFGFR1の染色性が認められた。結論:ヒト前立腺癌においてFGFsとFGFRsの発現が認められ,その発現は前立腺癌の悪性化の進行,自律性増殖機構の形成に関与する可能性が示唆され,さらなる追究と臨床成績との関係が明らかにされることが期待される。
遺伝子多型による化学療法後末梢神経障害の感受性の相違

抗がん剤治療による末梢神経障害(CIPN)は発症機序に不明な点が多く、未だに有効な予防法・治療法が存在しない。CIPNは患者のQuality of life(QOL)を著しく低下させ、抗がん剤の投与量減少や治療中止を余儀なくされることがあるため、CIPNの予防・治療法の確立は急務である。申請者らはCIPNの患者から採取した血液より次世代シーケンサーを用いた全エキソーム解析を行うことで、CIPNのしびれ・痛み感受性に関する遺伝子多型を発見し、同一レジュメで行った場合にも生じる神経障害の重症度・感受性相違の個人差の原因を明らかにすることを目標とする。当科では化学療法施行後の末梢神経障害で通院中の患者のしびれ症状の緩和のためにメコバラミン等のビタミンB12製剤や漢方薬の牛車腎気丸等、疼痛に対してはプレガバリンやヂュロキセチン、抗うつ薬、抗てんかん薬、抗不整脈薬や副腎皮質ステロイド等が用いている。これらの治療にも関わらず症状が増悪している患者についてピックアップを行うことができた。患者は30代70代、基礎疾患は乳がん、子宮体癌、S状結腸癌、横行結腸癌、肺がん、骨髄腫、急性リンパ性白血病等であり、化学療法として使用した薬剤はパクリタキセル、シクロフォスファミド、シスプラチン、ゲムシタビンなど多岐にわたる。このなかでCTCAEIIIIIを変動している患者について検討を行っている。末梢神経障害について感覚鈍麻(hypesthesia)、異常感覚(dysesthesia:刺激なし、paresthesia:刺激あり)、感覚脱失(anesthesia)、感覚過敏(hyperesthesia, allodynia)に分け、化学療法ごとに軸索障害(axnopathy)、神経細胞体障害(neuronopathy)、軸索障害(myelinopathy)に分類した。現在、末梢神経障害の評価は他の神経疾患(ギランバレー症候群や傍腫瘍性ニュロパチー、炎症性脱髄性多発神経炎等)を鑑別した上で問診と身体診察所見に加え、知覚検査や腱反射、神経伝導速度検査等を行うことで診断するが、これらの検査は煩雑な上に、神経障害の早期予見や投与量調節の判断基準にはならない。化学療法後の末梢神経障害については患者の自己申告に基づいて行われている。対象患者をCTCAE III以上の患者としたが、現在CTCAEIII程度に増悪するまで放置されている患者は少なく、悪化する以前に化学療法が変更されたり減量される方針である。自己申告に基づく重症度分類のみでは研究に必要腰な患者数を確保することが困難である可能性もあるため、その他の基準についても慎重に検討している。上記の診断基準では不十分な可能性があり、温度覚、振動覚、モノフィラメントによる刺激、冷覚刺激、タッチパネルでの反応時間の遅延など複数の指標を組み合わせることも考慮している。患者のリクルート作業が完了すれば、順次遺伝子解析を行っていく。

上記の診断基準では不十分な可能性があり、温度覚、振動覚、モノフィラメントによる刺激、冷覚刺激、タッチパネルでの反応時間の遅延など複数の指標を組み合わせることも考慮している。患者のリクルート作業が完了すれば、順次遺伝子解析を行っていく。遺伝子解析を行うための予算であったが、当該解析についてまとめて行った方が安価で済む可能性があり(現在交渉中)、本年度分の遺伝子解析を保留しているところである。このため検査代が残っている状況であるが、まとめて行う時に保留分の検査代全てを使用する予定である。
若年女性の体型認識の触発因子とヘルスプロモーションによる是正効果の検証

若年成人女性が持つ体型認識および関連する精神疾患の発症リスクを検証するため、生活習慣やメディアの影響のアンケート調査のほか、詳細な身体計測、体組成測定、生化学マーカーと遺伝子の多型解析を行った。約6割の女性が自身の体型に不満を持っていたが、健康的な生活習慣は行っていなかった。また遺伝子多型はプロポーションや脂肪分布、思考に関与している可能性が示唆された。本研究では国が発信している健康情報は健康的な生活習慣や体型認識と関連が見られなかったため、今後効果的なヘルスプロモーション戦略が必要と考えられる。平成22年度は1.本研究の実施に必要なゲノム倫理審査委員会からの承認手続き、2.本研究の目的の一つである体型認識および健康情報の入手先、また国が発信しているヘルスプロモーションの認識が体型認識に与える影響を把握するためのアンケート調査および対象群に対して妥当性の検証が必要と考えられる複数のスケールのパイロット調査、3.そして23年度に行う調査で必要となる、主に採血と遺伝子解析に必要な試薬や消耗品の購入を行った。これらは平成23年度に実施する遺伝子多型や生理学マーカー、体組成測定などを含めた包括的・多角的調査を実施する準備として重要な工程である。倫理審査は研究代表者が所属する組織内に設置されているゲノム倫理審査委員会に研究計画書などの関連書類を提出し、平成22年度6月30日に研究の承認を得た。アンケート調査については、18歳から25歳の若年女性311名に対して実施した。アンケートから、Body mass index(BMI)が適正範囲であっても6割以上の女性が自身の体重に不満を持っており、国が発信しているヘルスプロモーションメッセージを認識していない者は食事に対しての関心が薄く、体型に対して不満を持つことが判明した。解析結果の一部は研究代表者が国内の複数の大学と行っている共同研究データとあわせて平成23年7月に開催される国際学会で抄録が審査中である。また、パイロット調査を行ったスケールについても日本人女性に対して妥当性が観察された。本アンケートは平成23年度に行う調査でも引き続き使用することとした我が国では痩せているにもかかわらずやせ願望を持つ若年成人女性が増加している。不必要な減量行動は本人のみならず低出生体重児とその後の小児肥満リスクの増加など、次代の国民の健康と我が国の医療費に大きな影響を及ぼすと考えられる。本研究では、我が国の若年成人女性が持つ体型認識(ボディ・イメージ)が近年精神疾患や思考との関連が示唆されている遺伝子多型を含めどのような因子に影響を受けているのかをアンケートおよび身体計測・体組成測定の実測と採血による結果から検証し、また同時に国が発信しているヘルスプロモーションメッセージが適切に若年女性の間に浸透しているか、そして減量行動とそれに関わる疾患の抑制効果について検討した。平成23年度は18歳から21歳までの若年女性を対象に、1)アンケート調査、2)国際基準による詳細な身体計測、3)多周波生体バイオインピーダンス法(InBody)およびdual energy x-ray absorptiometry(DXA:Lunar Prodigy)による体組成測定、そして血液サンプルからの4)遺伝子多型と5)生化学バイオマーカーを収集し、体型認識との関連を調査した。アンケート結果は前年度実施したアンケート結果と併せ、年齢など必要な質問項目を回答していた368名分を用い、自己申告による身長と体重を元にBody mass index(BMI:kg/m^2)で世界保健機関が推奨しているパブリックヘルスアクションポイント(アジア人に対してはBMI値23kg/m^2以上)にしたがい群分けを行い解析した。実測を行った集団(75名)に対しては身体計測や体組成、遺伝子多型と体型認識や生活習慣との関連について解析した。アンケート結果については今年3月末までに抄録を2報投稿し、すでに蓄積していたデータと併せて国際学会でポスター発表を行った。平成24年度も、国際学会での口頭発表がすでに決まっている。
英語though節の話し言葉における談話機能分析

本研究は、電子コーパスから話し言葉に現れる英語のthough節を収集し、(1)though節には従属節だけではなく、従来指摘されてこなかった独立節の用法があること、(2)though節の話し言葉における談話機能、および話し言葉と書き言葉における機能の違い、(3)独立節に現れるthoughは談話標識として分析できるか、(4)though節の独立用法は、文法化の節接続に関する単方向性の仮説の反例となるか否か、の4点を明らかにすることを目的として行う。
肝細胞癌治療におけるアポトーシス誘導、分子標的治療併用の試み-Transgenic mouseを用いた検討-

肝癌培養細胞(PLC/PRF/5,Huh7,HepG2)に対し、まずPPARγagonistとして使用可能なrosiglitazone, pioglitazoneを加え、3種類の細胞ともapoptosiswo誘導する事を見い出した。生理的な濃度でさらに抗癌作用を高めるために、抗癌剤との併用でapoptosisの促進が得られないかどうかを検討したところ、5FU, CDDP, Epirubicinの3種類の抗癌剤の内でEpirubicinでさらに有意にapoptosisが促進される事を見い出した。これらは臨床でも応用可能な組み合わせであり、今後in vivoでの併用効果を検討する。EGF receptorを介した細胞増殖系とPPARγの系はPPARγのligandにより、reactive oxygenを介してSrcからEGF receptorが活性化されることが示されてきており、最近EGF-receptorの阻害剤であるZD1839はPPARγagonistによるExtracellular signal regulated kinase(Erk)の活性化を阻害する事が示された(JBC:278:46261-69)。よって我々が当初計画したPPARγagonistとZD1839の併用は同時併用は単にPPARγagonistの作用を打ち消すだけになる可能性が有る。よって、まずは、この系が培養細胞でも再現されるかどうかを検討し、細胞へ順序を変え、また併用して細胞増殖抑制効果をみる。
練り返し粘土の変形-強度特性に発現する誘導異方性に関する研究

平成8年度に交付された科学研究費の補助により、等方粘土に初期せん断履歴を与えて異方性を生じさせた後に主軸の方向を変化させて再びせん断を行うという一連の実験を実施し、それにより以下に示す新しい知見を得た。1.今回行った実験から、せん断履歴を受けた粘土の最大せん断応力面上における初期せん断始点からの累積せん断ひずみが、同じ応力のときにおける等方粘土の最大せん断応力面上のせん断ひずみよりも大きな場合には、その粘土は弾性的な挙動を示す。それに対し、せん断履歴を受けた粘土の最大せん断応力面上の初期せん断開始点からの累積せん断ひずみが、同じ応力のときにおける等方圧密粘土のせん断ひずみと同じかあるいはそれよりも小さな場合、その粘土は非弾性的な挙動を示すことが明らかになった。2.上記よりせん断履歴を受けた粘土のその後のせん断変形挙動を決定する第1の要因は、せん断応力とせん断履歴によってそれに引き続く過程の最大せん断応力面上に生じるせん断ひずみの大きさであり、履歴を与える過程から再びせん断を行う過程に移行する際の主軸の回転によってこの最大せん断応力面上のせん断ひずみの大きさが変化するため、せん断履歴を受けた粘土の変形挙動には異方性が現れることになる。3.また今回行った実験からせん断履歴を与える際のせん断応力が増加するに従ってその後に現れる異方性もより強くなることが明らかになったが、これは履歴を与える際のせん断応力が大きくなるにしたがって主軸の回転に伴う最大せん断応力面上の残留せん断ひずみの変化がより大きくなるために生じる現象である。4.強度についてはせん断履歴の有無に関わらず変化しない。今後は上記の知見をもとに粘土の応力・ひずみ関係の数学的な記述、つまり構成方程式の開発に取り組む所存である。
虚血後の中枢神経細胞のアポトーシスに対するMPPの遺伝子治療への応用

中枢神経細胞は部位により性質が異なるので、神経細胞の性質を持ちアポトーシス誘導が容易な、ラット褐色細胞腫、PC-12 cclllineを用いた。70%confluentの培養条件で、血清を極低容量にする前処置後、37°C(正常体温)、33°C(低体温)の2条件で、この細胞を1%酸素(低酸素)にそれぞれ0、12、24、36、48時間暴露させた。1)Hoechst33342とPropidium iodideで2重染色し、蛍光顕微鏡を用いて、それぞれ少なくとも1000個以上の細胞で、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、正常細胞の出現率をカウントした。2)細胞をバッファーで融解させ、細胞内の蛋白を抽出した。電気泳動後、ウエスタンブロッティングを行った。Fas蛋白、SAPKの発現量をNIH image densitometry法で観察、測定した。〈結果〉l)いずれの温度でも経時的にアポトーシス細胞の出現率が増加し、48時間後に最大となったが、33°Cではその割合は37°Cに比べ低かった。2)いずれの温度でもFas蛋白の発現量は増加し、12時間後に最大となった。以後減少したが、33°Cでは増加の割合は37°Cに比べ低かった。SAPKの発現量には有為差がみられなかった。〈考察〉低体温は、低酸素によるアポトーシス誘導を減弱させる。これにはFas蛋白誘導減少が関与している。なぜ低体温でFas蛋白誘導減少がおこるかは今後解明しなければならない。これらの結果を今年のアメリカ麻酔学会に応募する。中枢神経細胞は部位により性質が異なるので、神経細胞の性質を持ちアポトーシス誘導が容易な、ラット褐色細胞腫、PC-12cell lineを用いた。電気泳動後、ウエスタンブロッティングをFas抗体を用いて行った。Fas蛋白の発現量をNIH image densitometry法で観察、測定した。<結果>1)いずれの温度でも経時的にアポトーシス細胞の出現率が増加し、48時間後に最大となったが、33°Cではその割合は37°Cに比べ低かった。2)いずれの温度でも経時的にFas蛋白の発現量は増加し、48時間後に最大となったが、33°Cではその割合は37°Cに比べ低かった。<考察>低体温は、低酸素によるアポトーシス誘導を減弱させる。これらの結果を今年のアメリカ麻酔学会に応募の予定である。
糸球体上皮細胞の心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体の性状と限外濾過調節機構

腎臓に働き利尿と尿中ナトリウム排泄を促進する心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の受容体は腎臓では主に糸球体と髄質内層に分布することが結合試験により、生物活性のあるA、B、生物活性のないCの3種類のサブタイプがあることが分子生物学的手法で示されている。これらサブタイプの腎臓での細胞局在はこのホルモンの作用機序を知るうえで重要である。本研究ではこれら3種のcDNAをサブクローニングしcRNAプローブを作製し、それを用いたribonuclease protection assayとin situ hyblidization法や抗サブタイプC抗体を用いた免疫組織化学でANP受容体サブタイプの腎臓内局在を検索した。その結果、糸球体のANP受容体サブタイプmRNA発現量はC>A>>B髄質内層ではA>>C=Bの順であることがribonuclease protection assayで、糸球体のサブタイプCとA受容体mRNAはともに糸球体上皮細胞に、髄質内層のサブサイプA受容体mRNAは集合管上皮細胞に発現していることがin situ hybridization法で明らかになった。免疫組織化学でもサブタイプC受容体は糸球体上皮細胞に局在し、Western blot法で糸球体のサブタイプC受容体は分子量64Kの単量体で存在し、肺などで報告されている2量体となっていないことが分かった。また、糸球体のサブタイプC受容体mRNAはalternative splicingによる2種類があることがribonuclease protection assayの成績から示唆された。以上の結果からANPは糸球体上皮細胞のサブタイプA受容体に結合し糸球体限外濾過を促進し、髄質内層の集合管上皮細胞のサブタイプA受容体に結合しそこでのナトリウム再吸収を抑制すると考えられた。このことは糸球体上皮細胞が糸球体限外濾過を調節していることを示し、従来の糸球体限外濾過はメサンギウム細胞により調節されるとする仮説と異なる説を提示した。腎臓で利尿ナトリウムの排泄を促進する心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の受容体にはA、B、Cの3種類のサブタイプがあることが分子生物学的方法で明らかにされた。そこでそれらの受容体サブタイプmRNAと蛋白の腎臓内局性と細胞分布を検索した。A、B受容体のcDNAはD.L.Garbers博士(Howard Hughes Medical Institute,Nashville),C受容体cDNAは広瀬茂久博士(東京工業大学)より供与された。これらのcDNAをPGEM3Zにサブクロ-ニングしRNAポリメラ-ゼをつかいRNAプロ-ブを作成した。それを用いて腎臓の糸球体、皮質、髄質外層、髄質内層より抽出したRNAとRNase Protection Assayを行なった。その結果、ANPの受容体のRNAは糸球体に非常に多く発現しており、サブタイプではC>A>Bであった。糸球体以外にはCタイプ受容体のmRNAが髄質外層、髄質内層に糸球体の約1/100量認められた。受容体サブタイプに対する抗体はまだCタイプしか作られていない。その抗体を用いた免疫組織化学でもC受容体蛋白は糸球体にほぼ限局して存在し、わずかに髄質外層の直血管や髄質内層の集合管に認められた。糸球体を可溶化し抗C受容体抗体を用いたWestern blotを行ない糸球体のC受容体蛋白は分子量は64Kdであるが非環元下でも同じサイズであったことから肺などで報告されている64kdの二量体ではなく単体で存在していると考えられた。これらの結果からANPは糸球体に作用し、糸球体において限外瀘過を促進することで利尿とナトリウム排泄を増加させると推定された。

このことは糸球体上皮細胞が糸球体限外濾過を調節していることを示し、従来の糸球体限外濾過はメサンギウム細胞により調節されるとする仮説と異なる説を提示した。腎臓に働き利尿と尿中ナトリウム排泄を促進する心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の受容体は腎臓では主に糸球体と髄質内層に分布することが結合試験により、生物活性のあるA、B、生物活性のないCの3種類のサブタイプがあることが分子生物学的手法で示されている。これらサブタイプの腎臓での細胞局在はこのホルモンの作用機序を知るうえで重要である。本研究ではこれら3種のcDNAをサブクローニングしcRNAプローブを作製し、それを用いたribonuclease protection assayとin situ hybridization法や抗サブタイプC抗体を用いた免疫組織化学でANP受容体サブタイプの腎臓内局在を検索した。その結果、糸球体のANP受容体サブタイプmRNA発現量はC>A>>B、髄質内層ではA>>C_=Bの順であることがribonuclease protection assayで、糸球体のサブタイプCとA受容体mRNAはともに糸球体上皮細胞に、髄質内層のサブタイプA受容体mRNAは集合管上皮細胞に発現していることがin situ hybridization法で明らかになった。免疫組織化学でもサブタイプC受容体は糸球体上皮細胞に局在し、Western blot法で糸球体のサブタイプC受容体は分子量64Kの単量体で存在し、肺などで報告されている2量体となっていないことが分かった。また、糸球体のサブタイプC受容体mRNAはalternative splicingによる2種類があることがribonuclease protection assayの成績から示唆された。以上の結果からANPは糸球体上皮細胞のサブタイプA受容体に結合し糸球体限外濾過を促進し、髄質内層の集合管上皮細胞のサブタイプA受容体に結合しそこでのナトリウム再吸収を抑制すると考えられた。
がんの悪性進展に伴う細胞接着システムの破たんの分子機構

がん細胞はその悪性進展に伴い、接着性を低下させる一方で、浸潤能を獲得する。本研究では、このような過程におけるがん細胞と細胞接着分子の相互作用を調べた。主要な成果として、以下の結果を得た。良性腫瘍ではがん細胞はラミニン332などの基底膜分子に接着し、限局する。しかし、浸潤部位ではこのラミニンのサブユニットの一つであるラミニンγ2(Lmγ2)を過剰に発現する。本研究ではLmγ2が上皮間葉変換(EMT)に伴って発現すること、Lmγ2は血管内皮細胞に作用して血管透過性を亢進させる一方で、がん細胞に対してはがん幹細胞マーカー分子であるCD44に直接結合し、がん細胞の移動を促進することを明らかにした。基底膜から間質へ浸潤するがん細胞、および完全に接着能を失った浮遊性がん細胞に焦点をあてて、がんの悪性進展に伴う細胞接着システムの異常の機構を調べた。(1)がんの基底膜浸潤において、ラミニン332(Lm332)の限定分解によるLm332のマトリックス(ECM)形成能の消失、接着能低下、および運動能亢進が明らかになった。一方基底膜を通過し、間質内に浸潤したがん細胞は上皮ー間葉移行(EMT)を起こすことが知られている。本研究では3種の上皮性がん細胞にTGF-βでEMTを誘導し、ECM分子の変化や細胞形質の変化を調べた。EMTを誘導したがん細胞は、上皮基底膜の接着分子であるLm511の構成鎖であるLmα5鎖が減少する半面、Lmγ2鎖、Lmα4鎖、フィブロネクチンの産生が大きく促進された。また、EMT誘導がん細胞は間質型接着分子であるフィブロネクチンやI型コラーゲンに対する接着性が大きく上昇するとともに運動能も高めた。これらの結果から、EMTの誘導によって上皮性Lmの発現が減少する半面、間質型接着分子の産生やそれに対する接着能が上昇し、運動能も高めることが分かった。このような形質変化によってがん細胞は間質内浸潤が可能になると思われる。(2)浮遊性ヒト大腸がん細胞Colo201を特定のチロシンキナーゼ阻害剤で処理すると短時間で細胞は上皮様の接着形態を回復することが明らかになった。そこでこの阻害剤を用いてColo201細胞の浮遊化の機構を調べた。Colo201細胞の再接着誘導にはタンパク質合成は必要なく、またインテグリンなどの細胞接着装置も保持していることが判明した。接着関連細胞内シグナルの変化を調べた結果、阻害剤処理によってパキシリンのチロシンリン酸化が大きく亢進することから、この分子のリン酸化レベルが細胞接着を決定していると考えられた。がん細胞の悪性進展に伴い、一部の細胞は接着性を低下させる一方で、高い浸潤能を獲得する。本研究ではこれまで、がんの浸潤能獲得過程における細胞接着分子の作用を明らかにしてきた。本年度は、より生体により近いがん浸潤モデルとして三次元コラーゲンゲル共培養系を構築し、がん細胞の浸潤を調節する細胞外分子の作用を解析した。また、これまでの研究を継続し、がん浸潤マーカー分子であるラミニンγ2鎖の新規作用を調べた。(1)がん浸潤モデルとして膵がん細胞Panc-1または肺がん細胞A549と正常線維芽細胞の三次元コラーゲンゲル共培養系を構築し、がん浸潤を調節する因子を調べた。コラーゲンゲル上のがん細胞は単独では殆どゲル内に浸潤しないが、ゲル内に線維芽細胞が存在すると著しく浸潤した。線維芽細胞が産生するがん浸潤促進因子として肝細胞増殖因子(HGF)を同定した。がんの悪性化因子であるTGF-β自体はがん細胞の浸潤を促進したが、意外なことに、TGF-β阻害剤は共培養系でのがん浸潤を強く促進した。この現象は、TGF-β阻害剤が、がん細胞由来のTGF-βのHGF産生抑制作用を阻止することによって起きることが判明した。この結果は、TGF-β阻害剤の抗がん剤としての臨床応用において、逆にがんの悪性化が生じる可能性を示唆する。(2)ラミニンγ2は基底膜の重要な接着分子であるラミニン332のサブユニットの一つである。ラミニンγ2は多くのがんの浸潤先進部位で高発現する。本研究では、ラミニンγ2が、がん幹細胞の重要なマーカー分子であるCD44に直接結合し、がん細胞の移動を促進することを初めて明らかにした。この結果は、ラミニンγ2がCD44と協調的にがん幹細胞の機能維持に関与する可能性を示唆する。

基底膜から間質へと浸潤するがん細胞、および完全に接着能を失った浮遊性がん細胞に焦点をあてて、がんの悪性進展に伴う細胞接着システムの異常の機構を調べた。(1)昨年度までに、ラミニン332(Lm332)の限定分解によるLm332マトリックス(ECM)形成能の消失、接着能低下、および運動能亢進が起こること、また、TGF-βで上皮ー間葉移行(EMT)を誘導することにより、がん細胞による細胞接着性ECMの産生や運動性が変化することを明らかにした。今回、より生体に近いがん浸潤モデルとして、三次元コラーゲンゲル内でのEMT誘導がん細胞の挙動を調べた結果、通常の単層培養系とは全く異なり、EMT誘導がん細胞が微小管主体の大きな浸潤姓突起を形成すること、EMT誘導によりがん細胞の増殖能が抑制されることなどを明らかにした。これらの結果から、間質でのがん細胞の浸潤には間質型コラーゲンとの相互作用による微小管主体の浸潤姓突起の形成が特に重要と考えられる。(2)浮遊性ヒト大腸がん細胞Colo201をチロシンキナーゼ(JAK)阻害剤で処理すると、短時間で細胞は上皮様の接着形態を回復することを既に明らかにした。この阻害剤を用いてColo201細胞の浮遊化の機構をさらに調べた結果、阻害剤処理によってパキシリンとp130Casのチロシンリン酸化が大きく亢進することから、Colo201細胞においてはこれらの分子のリン酸化の抑制により浮遊化することが判明した。さらに種々の細胞骨格調節因子に対するsiRNAを用いた実験から、JAKが阻害剤の標的ではなく、タンパク質脱リン酸化酵素活性の亢進が浮遊化にとって重要であることが示唆された。EMT誘導されたがん細胞が示す形質変化については十分な知見が得られたので、論文を準備中である。浮遊性がん細胞Colo201の浮遊化機構についてはパキシリン酸化レベルの異常が明らかになったが、その上流にあるシグナル伝達因子の異常についてはまだ明らかになっていない。25年度が最終年度であるため、記入しない。EMT誘導されたがん細胞が三次元環境下で示す新規な形質変化を明らかにし、論文を発表した。浮遊性がん細胞Colo201の浮遊化機構についてはパキシリンのリン酸化レベルと脱リン酸化酵素の重要性が明らかになったが、阻害剤の標的酵素が未解明である。初年度に、TGF-βなどの作用によりEMTを起こしたがん細胞が発現する細胞外マトリックス分子や細胞接着性の変化についてほぼ明確にすることができた。次年度はさらに悪性進展したがん細胞の浮遊化機構について、Colo201細胞を用いてシグナル伝達因子の異常を明確にする。候補分子は既に明らかになったので、siRNAを用いた実験により異常分子を同定する。EMT誘導されたがん細胞が三次元環境下で浸潤するために必要な因子、またそのような細胞が過剰産生するラミニンγ2鎖の役割を明らかにする。悪性進展したがん細胞の浮遊化機構については、阻害剤の標的酵素と脱リン酸化酵素の関係を明らかにする。
重複遺伝子を持つダイズフラボノイド代謝経路の転写因子を標的とした改変

本研究では、ダイズ種子中に含まれる機能性成分の一つであるイソフラボン類の代謝工学的改変を行うため、フラボノイド代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を制御するMYB転写因子を同定するための新たな技術の確立を目指した研究を行った。その結果、標的遺伝子の発現制御に関わる転写因子評価システムを開発し、ゲノム中に多数存在する転写因子のうち標的遺伝子の発現制御に関わる分子を特定することに成功した。本研究は高度に重複したゲノムを持つダイズを材料として、MYB転写因子に変異を導入することで、近年、機能性成分として注目を集めるイソフラボン類を含むフラボノイド化合物の代謝経路に関与する複数の酵素遺伝子の発現を協調的に制御し、これらの化合物の子実中での蓄積量を調節することを目指したものである。イソフラボンは一般的に試験管内で比較的強い抗酸化活性を持ち、近年、食品の機能性成分としても注目を集めているが、このうちダイズ子実中に含まれるゲニステインは弱いエストロゲン様作用を示すほか、ダイズィンやそのアグリコンであるダイゼインには骨粗しょう症を予防する効果があることも知られており、ダイズのフラボノイド代謝経路の改変により、子実中のイソフラボン蓄積量を増加させることが期待されている。そこで、本研究は、我々がダイズにおいて開発してきた逆遺伝学的変異体スクリーニングシステムを利用して、子実中のイソフラボン含量の改変に利用できる新たな突然変異体の単離を目指しており、本年度は、1ダイズ子実中でフラボノイド代謝に関与する酵素群の遺伝子の発現を制御しているMYB転写因子をコードする標的遺伝子を特定するため、ゲノム塩基配列情報および遺伝子発現解析の結果に基づいた絞り込みを行うことと、2TILLING法を用いたスクリーニングにより、これらの標的遺伝子に突然変異を生じた系統を単離することを目的として研究を進めた。その結果、イソフラボン代謝遺伝子の発現制御に関与していると考えられるMYB遺伝子の同定に成功したほか、いくつかの突然変異候補系統を得ることに成功した。本研究では、高度に重複したゲノムを持つダイズを材料として、MYB転写因子に変異を導入することで、近年、機能性成分として注目を集めているイソフラボン類を含むフラボノイド化合物の代謝経路に関与する複数の酵素遺伝子の発現を協調的に制御し、子実中におけるこれらの化合物の蓄積量を調節することを目的としている。ダイズ子実中に含まれるイソフラボンは、試験管内において一般的に比較的強い抗酸化活性を持っていることに加え、これらの分子種であるゲニステインやダイジンは弱いエストロゲン様作用を持つことも知られており、MYB転写因子を介したダイズのフラボノイド代謝遺伝子の発現制御によって、ダイズにおけるフラボノイド代謝経路を改変し、子実中のイソフラボン蓄積量を変化させる新たないく育種法の開発を目指している。そのため本研究では、ダイズゲノム中に数多く存在しているMYB遺伝子のうち、子実中でのフラボノイド代謝酵素遺伝子の発現制御に関与していると考えられる候補遺伝子を得るため、H25年度には、塩基配列情報および遺伝子発現情報に基づいた選抜を行った他、H26年度には、転写因子としての機能に基づいて更に選抜を行うための活性評価システムの構築等を行った。その結果、遺伝子の構造、発現パターンおよび標的となるプロモーターに対する活性の3つの異なる条件による絞り込みが可能となり、現在、最終年度に標的とするMYB遺伝子の特定を進めている。ダイズ種子中に含まれるイソフラボン類は、試験官内において一般的に比較的強い抗酸化活性を持つことに加え、これらのうちゲニスティンやダイジンといった分子種は弱いエストロゲン様活性を持つことも知られており、近年、機能性成分として注目を集めている。そこで、本研究では、高度に重複したゲノムを持つダイズを材料として、これらのフラボノイド代謝酵素をコードする遺伝子の発現制御に関与するMYB転写因子を同定し、この遺伝子に変異を導入することで、イソフラボン類を含むフラボノイド化合物の代謝経路に関与する複数の酵素遺伝子の発現を協調的に制御し、これらの化合物の種子中での蓄積量を調節するための新たな技術の確立を目指した。本年度はH26年度までの研究で開発した、N. benthamianaを用いたフラボノイド代謝遺伝子の転写制御に関わる転写因子の評価システムを用いて、CHS遺伝子の転写制御に関わる一部のMYB遺伝子の同定に成功したが、DNAマイクロアレイ解析の結果得られたすべての候補MYB遺伝子の評価には至らなかった。しかしながら、本研究で新たに開発したMYB遺伝子の機能評価系の有用性は確認できたことから、今後、本研究の成果を活用したMYB遺伝子の機能評価と、これを活用したフラボノイド代謝系の代謝工学的改変の道筋が明らかにできたと考えられる。H25年度の研究では、ダイズゲノム中に600以上存在するMYB様転写因子をコードする遺伝子を対象として,塩基配列情報ならびに登熟中の種子におけるイソフラボン蓄積パターンの解析とDNAアレイによる遺伝子発現パターンの解析の比較から、一次候補遺伝子を約50個にまで絞り込んだ。

H26年度の研究では、これらの一次候補遺伝子の更なる絞り込みを行うため、qRT-PCR法による詳細な遺伝子発現パターンの解析を進めるとともに、転写因子としての機能性を評価するため、標的となるCHS遺伝子のプロモーターとGUSレポーター遺伝子を融合させたキメラ遺伝子を組み込んだ、組換えN. benthamiana系統の作成と一次候補MYB遺伝子をアグロインフィルトレーション法によって一過的に発現させるためのプラスミドベクターを作成した。植物分子育種学現在、前述の機能性評価システムを用いて、一次候補遺伝子の機能性評価を試みており、H27年度は10個程度の最終候補遺伝子に絞り込んで、TILLING法によるMYB遺伝子破壊系統の作成を行う予定である。また、得られたMYB変異遺伝子については、前述のシステムを用いて野生型の遺伝子産物と比較した際の転写活性の変化を評価するとともに、変異遺伝子を持つダイズ系統を栽培し、子実中のフラボノイド含量を分析することで、それぞれの遺伝子における変異がフラボノイド代謝に与える影響を明らかにする予定である。登熟中のダイズ種子サンプルを用いたHPLCによるイソフラボン含量の分析データと、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析のデータの比較により、未熟種子中のイソフラボン合成に関与する代謝酵素遺伝子とこれらの発現と協調的な発現パターンを示すMYB遺伝子の同定に成功した。さらに、これらの標的遺伝子の一部についてはTILLING法による変異体のスクリーニングに着手し、複数の変異体候補系統を見出した。現在の所、これらの候補系統中にナンセンス変異を生じた個体は得られておらず、更に規模を拡大した変異体のスクリーニングが必要であると考えられる。しかしながら、初年度の目標についてはほぼ達成しており、研究計画はおおむね順調に進展しているといえる。研究計画の変更に伴い、本年度の物品費の執行額が少なかったことに加え、当初予定していた研究成果発表のための学会参加費(旅費)の執行がなかったため。2年目以降の研究計画については、当初の計画通りTILLING法による変異体のスクリーニングを続け、標的となるMYB遺伝子の機能が欠損した系統の探索を進める。また当初の計画では、得られたMYB突然変異候補系統を栽培し、未熟種子におけるイソフラボン代謝関連遺伝子の発現量をqRT-PCRによって解析し、それらの変異MYB遺伝子の効果を評価する予定であったが、より短期間で変異MYB遺伝子の効果を評価するため、MYB転写因子の標的となるイソフラボン代謝関連遺伝子のプロモーター配列とレポーター遺伝子を融合したキメラ遺伝子を導入した遺伝子組換え植物を用いた評価系の作成にも取り組み、研究期間内での目標達成に向かって研究を加速化させる。次年度の研究実施費用ならびに研究成果発表のための学会参加費用として充当する予定である。主に当初予定していた研究発表のための学会参加費(旅費)と論文投稿のための経費(その他・謝金)等の執行がなかったため。2年次以降の研究発表、論文投稿費用として使用する予定である。
パーソナリティが食行動、および将来の身体的健康にどのような影響を及ぼすのか

本研究は「地域在宅高齢者の個人の性格=パーソナリティが健康行動、食行動、および将来の身体的健康にどのような影響を及ぼすのか」について明らかにすることを目的として研究を行った。種々のパーソナリティーと高次生活機能低下との関連を見たところ、「非協調性」傾向が高い者、ならびに「外向性」傾向が低い者において7年後の高次生活機能低下と有意な関連が認められた。先の検討からこれらパーソナリティーは、不健康な生活習慣を送っている者が多いことからも、適切かつ効果的な指導を行う上で、重要な一指標となりうる可能性が考えられた。効果的な健康教育・指導を行う為には、対象者の生活習慣の把握だけでなく、環境や個性などを鑑み包括的な取り組みを行うことが求められる。対象は、1986年より岩手県花巻市(旧大迫町)において実施されている大規模コホート「大迫研究」のうちベースライン時60歳以上の地域在住高齢者である。パーソナリティーの検討には、妥当性・信頼性の検討されたEysenck Personality Questionnaire-Revised日本語版(EPQ-R)を用いた。健康意識・健康行動には、主観的健康感、食行動・食習慣、飲酒、運動、喫煙習慣等を設問、食事摂取状況の把握には詳細な食事摂取頻度調査票を用いた。産休により中断、平成24年度研究再開後は、平成23年度の研究を継続、「非協調性」「外向性傾向」「神経症傾向」のパーソナリティーが、健康行動、中でも朝食欠食、間食、夜食に関する食行動や、食事摂取頻度調査(Tsubono Y, 2001)を算出された栄養・食品摂取とどのような関連があるのかについて、検討を継続してきた。一方、種々のパーソナリティーにおける健康行動が、将来の身体的健康にどのような影響を及ぼすかについて、最終的なアウトカムである身体的健康とどのように関わるかについて、健康障害としては比較的早期に現れる「高次生活機能低下」との関連を見たところ、「非協調性」傾向が高い者、ならびに「外向性」傾向が低い者において7年後の高次生活機能低下と有意な関連が認められた。パーソナリティーの検討には、妥当性・信頼性の検討されたEysenck Personality Questionnaire- Revised日本語版(EPQ-R)を用いた。ベースライン時の調査から、1「非協調性」傾向が高い:高齢、男性、現在も喫煙、現在も飲酒、長時間睡眠、運動をしていない、心疾患既往、身体機能低下者が多い、2「外向性」傾向が高い:男性、喫煙・飲酒習慣がない、主観的健康観が高い、規則的に食事をとっている者が多い、3「神経症」傾向が高い:男性、短時間睡眠、主観的健康観が低い者が多い、ことが明らかとなった。一方、食事摂取との関連では、特にタンパク質、脂質摂取量が、「非協調性」・「神経症」傾向においては得点が高くなるほど減り、「外向性」傾向では得点が高くなるほど増える傾向が認められた。方、種々のパーソナリティーにおける健康行動が将来の身体的健康にどのような影響を及ぼすかについて、健康障害としては比較的早期に現れる「高次生活機能低下」との関連を見たところ、「非協調性」傾向が高い者、ならびに「外向性」傾向が低い者において7年後の高次生活機能低下と有意な関連が認められた。

今年度は、ベースライン時の調査データを用い、「地域在住高齢者の「非協調性」「外向性」「神経症」の個々のパーソナリティが、健康行動、食行動、および食品選択とどのような関連があるか」についての横断的検討を行った。その結果、(1)「非協調性」傾向が高い:高齢、男性、現在も喫煙、現在も飲酒、長時間睡眠、運動をしていない、心疾患既往、身体機能低下者が多い、(2)「外向性」傾向が高い:男性、喫煙・飲酒習慣がない、主観的健康観が高い、規則的に食事をとっている者が多い、(3)「神経症」傾向が高い:男性、短時間睡眠、主観的健康観が低い者が多い、ことが明らかとなった。一方、食事摂取との関連では、特にタンパク質、脂質摂取量が、「非協調性」・「神経症」傾向においては得点が高くなるほど減り、「外向性」傾向では得点が高くなるほど増える傾向が認められた。次年度は、今年度に引き続きそれぞれの因子間の関わりを含む詳細な分析を実施、報告を行っていく予定である。今年度は産休による中断から始まったものの、本研究の全体としては予定通り(年度計画以上)の進展となった。今年度は順調な滑り出しではあったものの、後半から妊娠により中断を余儀なくされ、全体としてはおおむね順調な進展となった。本研究は2年計画であったが、産前・産後休暇を挟んだため、期間延長をおこない3年計画となった。中断はあったものの、全て計画通りの順調な進展であった。次年度は研究の総括とともに、国内外の報告を重視した取り組みを行っていく予定である。次年度は前半が産前・産後休暇を挟むため、今年度と合わせた研究を進める予定である。また、当初次年度予定していた研究内容に関しては、産後、研究期間の延長を行い、その次の年度の研究内容として分析・報告を進める。当初2年目に使用予定だった研究費を用い、国内外の学会、雑誌への発信を進める。今年度は、妊娠により国内外への報告までには至らなかったため、次年度は今年度の研究費を用い、国内外の学会や論文報告等を行う予定である。
脳血管攣縮をひきおこす新しい細胞内シグナル伝達機構の解明

脳血管障害学で未解決かつ重要な問題である脳血管攣縮の発生メカニズムを解明するために、平成12年度は、以下にのべるよう、主として細胞内Ca2+-張力同時測定法およびスキンド法を含む細胞分子生物学的手法で研究を実施した。ウシ脳血管(中大脳動脈)を材料に、光学的細胞内Ca2+-張力同時測定法を用いて、スフィンゴ脂質(SPC)で生じる持続性収縮におけるProtein kinase C系、Rho-kinase系のブロッカーの作用を検討した。次に、スキンド血管平滑筋標本を作成し、細胞内情報伝達に影響する物質や遺伝子産物を細胞内潅流することで細胞内情報伝達機構を直接検討した。これらの研究の結果、SPCは濃度依存性に細胞質Ca2+濃度を変化させることなく脳血管平滑筋に持続性の異常収縮を引き起こすこと、このCa2+非依存性収縮がRho-KinaseのblockerであるY27632により抑制されること、脳血管のスキンド平滑筋標本で、SPCがGTP非存在下にCa2+非依存性異常収縮を引き起こし、この異常収縮もY27632で阻害されることなどが、解明された。
高エネルギー可視光線であるブルーライトによる動物細胞障害過程の解明

本計画では、可視光線による細胞死誘導メカニズムを解明することを主たる目的として研究を進めた。その結果、青色光は細胞内活性酸素の蓄積、さらにミトコンドリア膜電位の脱分極を誘導した。さらに、青色光はフォスファチジルセリンの細胞膜外露出を誘導した。ミトコンドリア膜電位はミトコンドリア依存性アポトーシスの指標である。以上の結果から、青色光はミトコンドリア機能障害を引き起こし、アポトーシスを誘導していることが明らかとなった。生物は、生から死へのプロセスの中で常に外的ストレスにさらされている。主として、紫外線、放射線、化学物質などがあげられ、これまでに多くの報告がなされている。本研究では日常生活で常にさらされる可視光線に着目し、動物細胞に与える影響について解明を試みた。現在までのところ以下の成果を得ている。B16F1およびB16F10メラノーマ細胞に対し、光量子束密度150μmol m-2 s-1の単色光(青、緑、黄、赤)を照射した。細胞生存率を求めたところ青色光(460 nm)照射群において著しい生存率の低下を認めた。さらに、青色光の照射12時間後に細胞内活性酸素量の上昇、24時間後にミトコンドリア膜電位の脱分極が確認された。ミトコンドリア膜電位の崩壊は早期アポトーシスの特徴であり、以上の結果から青色光がメラノーマに対し、ミトコンドリア依存性アポトーシスを誘導していることが明らかとなった。昨年度に引き続き、可視光線の細胞死誘導メカニズムの解明を試みた。2013年度では、光量子束密度150 μmol m-2 s-1の青色光がB16F1メラノーマの細胞死を顕著に誘導することを報告した。しかし、光量子束密度を統一した実験系では、照射した波長によってエネルギーが異なるという欠点がある。そこで2014年度からエネルギー量を統一した実験系を確立し、以下の成果を得ている。青色光を10 W m-2の強度でB16F1メラノーマに照射し各種分析を進めたところ、昨年度と同様に細胞死、ミトコンドリア膜電位の脱分極の誘導が確認された。さらに、ミトコンドリアに得意的に存在するカルジオリピンの酸化誘導、カスパーゼ-3の活性化が誘導されることが明らかとなった。カルジオリピンの酸化によってミトコンドリアからシトクロムcが放出されることが知られている。以上の結果から、青色光がミトコンドリア依存性アポトーシスを誘導していることが明らかとなった。さらに、青色光がメラニン生成カスケードに与える影響も明らかにした。その結果、メラニン生成の誘導に関与するMicrophthalmia-associated transcription factorの遺伝子転写が誘導されることが確認された。これは青色光がメラニン生成誘導効果を有することを示唆する結果であり、今後はさらなる研究を進める計画である。分子細胞生物学本研究は可視単色光による細胞死誘導メカニズムを明らかにすることである。現在までのところ、青色光をメラノーマに照射することで、細胞死、特に早期アポトーシス時に特徴的にみられる細胞内活性酸素量の上昇、ミトコンドリア膜電位の脱分極が検出されている。さらに、照射エネルギー量(30Wm-2、50Wm-2)を統一して行った実験においても青色光特異的に細胞死を誘導していることが明らかとなった。以上の結果から、ブルーライトがメラノーマの細胞死を誘導していることが証明されたと判断しており、本分野における今後の研究の多様化が期待される。よって現在までのところ本研究計画は順調に進展していると考えられる。現在、がん細胞であるメラノーマに対するブルーライトの影響を調査しているが、今後は正常細胞の性質を持つ繊維芽細胞株を用いた実験も同様に行いたいと考えている。また、研究計画通りブルーライトが細胞周期におよぼす影響について調査を進める計画である。しかし、予備実験の結果より、照射強度、照射時間の変更によって細胞周期の挙動が予想以上に多様性に富んだものであることが明らかとなってきている。そのため、今後は細胞周期を中心に研究を進める可能性も考えられる。既存の購入した消耗品類の利用が可能となったため、物品費に余裕が生じた。研究は順調に行われているため、今年度は消耗品、備品の購入は多くなると考えられる。そのため、助成金は計画通り執行できると考えている。