hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
AFMナノラビングによる液晶分子の直接配向制御法の確立と光デバイス作成への応用

本研究は、原子間力顕微鏡(以下、AFM)プローブによる液晶分子の直接配向現象を用いて、液晶分子の配向状態を直接的にかつ精密に制御する技術を確立するとともに、本技術によって液晶応用光デバイスの試作を目的として行い、以下のことが明らかとなった。1)AFMラビングする膜厚の知られた液晶薄膜を作成するため、溶剤による液晶の希釈およびスピンコート法を用いた。このために、液晶薄膜の膜厚を精度よく測定するための方法を考案した。先端直径が100nm以下の微細ガラスプローブ先端を、その軸に対して直角に微小振動(振幅10nm以下)させてプローブ先端が表面に接触すると第1の減衰が生じ、次に基盤表面に近づくと第2の大きな減衰が生じる。これら2つの減衰が得られるプローブの移動距離から膜厚が計測される。この測定法により10nmの精度で液晶膜厚を計測することに成功した。2)スピンコート法により作成された膜厚の知られた液晶薄膜に、プローブ押しつけ力、走査速度等のパラメータを変えてラビングをすることで得られたAFMラビング膜を、分子の配向状態が観測できる複屈折近接場光学顕微鏡を用いて複屈折の位相差と主軸方位分布を観測および定量評価した。この結果、プローブ走査速度は比較的低速に、プローブ走査密度は1ミクロンあたり1本とすることで確実な配向が可能であること、プローブの押しつけ力は、最低0nNでも配向出来ることが分かった。また、AFMの走査モードをベクトル走査とすることで、任意の配向パターン(放射状、同心円状、格子状およびその組合せ)を製作することに成功した。3)放射状パターンと直線配向基盤の組合せによる液晶セルを製作し、放射偏光子を用いて新規な複屈折計測を考案した。本手法の特徴は、偏光変調をせずに短時間で計測できることである。実験の結果、精度に課題が残るものの、予期したとおり高速に測定出来ることが明らかとなった。本研究は、原子間力顕微鏡(以下、AFM)プローブによる液晶分子の直接配向現象を用いて、液晶分子の配向状態を直接的にかつ精密に制御する技術を確立するとともに、本技術によって液晶応用光デバイスの試作を目的とした。今年度は、以下のことが明らかとなった。1)液晶薄膜の作成と膜厚制御AFMラビングする膜厚の知られた液晶薄膜を作成するため、溶剤による液晶の希釈およびスピンコート法を用いた。2)AFMラビングによる配向条件の探索スピンコート法により作成された膜厚の知られた液晶薄膜に、以下のようなパラメータを変えてラビングをすることで得られたAFMラビング膜を、分子の配向状態が観測できる複屈折近接場光学顕微鏡を用いて複屈折の位相差と主軸方位分布を観測および定量評価した。1.プローブ走査速度2.プローブ走査密度3.プローブ押し付け力4.プローブ走査エリア5.配向の再現性6.配向状態の持続時間

この結果、プローブ走査速度は比較的低速に、プローブ走査密度は1ミクロンあたり1本とすることで確実な配向が可能であること、プローブの押しつけ力は、最低OnNでも配向出来ることが分かった。また、配向の再現性や持続時間は、比較的高く、安定して配向可能であることが分かり、次年度に向けて液晶光デバイス作成の上で重要な知見が得られた。本研究は、原子間力顕微鏡プローブによる液晶分子の直接配向現象を用いて、液晶分子の配向状態を直接的にかつ精密に制御する技術を確立するとともに、本技術によって液晶応用光デバイスの試作を目的とした。前年度の研究において、原子間力顕微鏡プローブによるプローブ走査速度及び押しつけ力の最適化による液晶配向条件を見いだした。この知見をもとに、本年度は、以下の研究を行い、幾つかの成果が得られた。1)任意液晶配向パターン原子間力顕微鏡の走査モードのうちプログラム走査が可能なベクトルスキャンモードを用いて液晶薄膜をナノプローブで走査し、放射状パターン、6角形、48角形配向パターン、格子状配向パターン、さらに放射状と48角形の複合パターンを作製することに成功した。特に、放射状パターンでは偏光顕微鏡を用いてその光学特性を明らかにし、偏光状態変化から液晶が放射状に配向していることを観測した。2)液晶セルの製作放射状配向基板とローラーラビングでガラスビーズスペーサを挟んだ液晶セルを製作し、透過偏光特性を測定した。その結果、ローラーラビング方向と平行に直線偏光を入射させることで、放射状直線偏光が得られること、ローラーラビング方向に直交直線偏光を入射させると、接線方向直線偏光が得られることが明らかとなった。3)ワンショット複屈折計測放射偏光が得られる液晶セルを用いたワンショット複屈折計測法を考案した。原理は、回転直線偏光法で、直線偏光子を回転させる代わりに、放射偏光子を用いることで等価的に回転する直線偏光を得ている。試料を透過した光はCCDカメラで強度分布を求め、位相シフト法により画像解析して複屈折を算出する。実際に、複屈折量を変えながら測定した結果、再現性のある測定が可能であることを明らかにした。
分子線による表面反応新機構解明へのアプローチ

現在、固体表面でおこる化学反応(表面反応)は、触媒化学工業、半導体産業など多くの分野において中心的な役割を果たしており、応用面からも表面反応を理解することがますます重要になってきている。表面反応が起こるプロセスにおいて、まず気体分子は外部から表面に近づき、表面に衝突し、そして吸着する。この表面における衝突過程が表面反応に大きな影響を持っており、表面反応機構を原子レベルで解明するためには、衝突の効果を考慮する必要がある。研究の目的は、表面反応新機構と考えられる衝突過程の効果を明らかにすることである。実験は、超音速分子線の技術を用いて並進・振動エネルギーを独立に制御した気体分子を試料表面に照射し、形成された表面吸着種や脱離生成物を観測する、という手順で行った。気体分子の運動エネルギーを制御するための分子線作製装置、表面吸着種の吸着状態を調べるための赤外分光装置、脱離生成物を検出するための質量分析計を用いた。あらかじめ水素を飽和量吸着させておいたニッケル表面にさらにCOを吸着した表面を作成し、そこにキセノン原子を照射するとCOの吸着位置の変化することがわかった。キセノン原子との衝突によりCOが得たエネルギーは、COの脱離、解離、振動励起など様々なプロセスを引き起こすために消費される可能性があるが、COの拡散に利用されたと考えられる。ただし、水素が吸着した表面ではCOは吸着位置が変わらないと考えられるので、キセノン原子との衝突でCOが水素原子を取り除いた上で拡散する、という複雑なプロセスが引き起こされていることがわかった。本研究の目的は,超音速分子線の技術を用いて並進・振動エネルギーを独立に制御した気体分子が表面反応に及ぼす影響をあきらかにすることである。今年度は、大きな並進エネルギーを持った気体原子が固体表面吸着種の脱離反応に及ぼす影響について実験を行い、機構を明らかにした。実験は、あらかじめ窒素分子を吸着させておいた単結晶Ni(100)表面にエネルギー制御したキセノン分子を照射するという手順で行った。結果は以下のとおりである。1.キセノン原子運動エネルギーにしきい値が存在すること照射するキセノン原子の運動エネルギーにしきい値が存在し、値が0.84eV以下の場合は、吸着している窒素分子を脱離させることができない。このしきい値は窒素分子の束縛エネルギーに起因しており、簡単なモデルを用いて他の手法で求めた場合とほぼ同じ束縛エネルギーを導くことがわかった。2.キセノン原子はランダムに窒素分子を取り除くこと通常、吸着分子を表面から取り除くには試料を昇温する手法が取られる。窒素分子を吸着したNi表面を昇温すると吸着分子が脱離するのみならず表面を拡散するため、表面で島を形成する。しかし、キセノン原子を照射することによって窒素分子を取り除いた場合はキセノン原子がランダムに窒素分子を取り除くため表面はランダムに吸着した窒素分子に覆われている。これは、大きな並進エネルギーを持った気体原子を固体表面に照射することにより、他の手法では得られない表面構造を創り出すことができる可能性を示唆している。
細胞周期制御因子FBXW7を利用したGIST細胞の治療抵抗性克服を目指して

手術検体からのGIST細胞株樹立については、monoclonalな安定した細胞株の樹立に至らなかった。当科および関連施設においてGIST234例のデータベースを作成、うち97症例についてFBXW7の免疫染色を行った。FBXW7はGIST腫瘍部にて全例で発現し、高発現群で予後不良であった。更なるGIST臨床検体および臨床データの集積を行っている。臨床データにつき学会、シンポジウム等で発表した。当科において以前より行っていたGIST臨床検体からの細胞株樹立につき、樹立に成功したと考えられたが、monoclonalな安定した細胞株の樹立には至らず継代が困難で、in vitroの実験を安定的に施行することは困難であった。以後も細胞株樹立に向けGIST臨床検体を用いた研究、実験を継続しているが、それと並行しin vitroのFBXW7抑制実験等はGIST T1細胞を用いて行っている。また、当科および当科関連施設にて、GISTに対して治療を施行した234症例のうち、病理学的検討が可能である97症例(当科39症例、他施設58症例)に対して、免疫染色を行い病理学的因子、予後との関連につき検討した。腫瘍径の平均は45mm、原発部位は胃74.2%、小腸11.3%、十二指腸6.2%の順であった。正常細胞にも発現しているFBXW7は、GIST97例の腫瘍部においても、全例で発現を認めた。発現強度を1+(<30%)、2+ (3060%)、3+(>60%)の3群に分け検討したところ、FBXW7 high expression群で予後不良の傾向をみとめた。イマチニブ使用症例での治療効果、予後との関連につき検討するとともに、他施設のGIST検体、標本を取り寄せ、症例数を増やして検討してゆく予定である。GIST手術検体からのGIST細胞株樹立については、monoclonalな安定した細胞株の樹立に至らず継代が困難であり、現時点でin vitroの実験を安定的に施行することは困難な状況である。引き続きGIST手術標本を採取し細胞株樹立を試みている。当科および北関東の関連施設においてGIST234例のデータベースを作成しているが、病理学的検討が可能な臨床検体のある97症例についてFBXW7の免疫染色を行い、病理学的因子、予後との関連につき検討した。FBXW7はGISTの腫瘍部にて全例で発現をみとめた。発現強度を1+、2+、3+の3群に分け検討すると、FBXW7高発現群で予後不良の傾向をみとめた。症例数を増やしての検討や、イマチニブ等分子標的薬使用症例での治療効果、予後との関連につき検討するため現在、更なるGIST臨床検体および臨床データの集積を目指し各施設の倫理委員会へプロトコールを提出、審議中である。in vitroの実験では、先述した通り自施設でのGIST細胞株樹立が困難なため、GIST-T1細胞株を用いてFBXW7の抑制実験を施行している。siRNAによる抑制ではトランスフェクションの方法としてリポフェクション法およびエレクトロポレーション法にて導入効率の条件検討も行った上で施行した。施行後の細胞にGFPによる発光を確認しており、導入自体はできていると考えられるがWestern blot法での確認ではタンパクの抑制を確認できなかった。shRNAによる抑制も試みたが、この方法もWestern blotにて抑制は確認できなかった。GIST手術検体からのGIST細胞株樹立について、monoclonalな安定した細胞株の樹立に至らず継代が困難であり、現時点でin vitroの実験を安定的に施行することはが困難な状況であるため、当初の予定よりやや遅れている。引き続きGIST手術標本を採取し細胞株樹立を試みているところである。また、GIST T1細胞を用いたin vitroの実験ではFBXW7の抑制が通常のsiRNA法、shRNA法でうまく行えず、試行錯誤を繰り返しており、現在Crispr/Cas9法にて抑制を試みている段階であり、予定より遅れている。症例数を増やしての検討や、イマチニブ等分子標的薬使用症例での治療効果、予後との関連につき検討するため現在、更なるGIST臨床検体および臨床データの集積を目指し各施設の倫理委員会へプロトコールを提出、承認をいただいた。

施行後の細胞にGFPによる発光を確認しており、導入自体はできていると考えられるがWestern blot法での確認ではタンパクの抑制を確認できなかった。shRNAによる抑制も試みたが、この方法もWestern blotにて抑制は確認できなかった。通常の方法での抑制が困難でありCrispr/Cas9法にてFBXW7の抑制実験を進めていく予定である。手術検体からのGIST細胞株樹立については、monoclonalな安定した細胞株の樹立に至らなかった。当科および関連施設においてGIST234例のデータベースを作成、うち97症例についてFBXW7の免疫染色を行った。FBXW7はGIST腫瘍部にて全例で発現し、高発現群で予後不良であった。更なるGIST臨床検体および臨床データの集積を行っている。臨床データにつき学会、シンポジウム等で発表した。当科において以前より行っていたGIST臨床検体からの細胞株樹立につき、樹立に成功したと考えられたが、monoclonalな安定した細胞株の樹立には至らず継代が困難で、in vitroの実験を安定的に施行することは困難であった。以後も細胞株樹立に向けGIST臨床検体を用いた研究、実験を継続しているが、樹立が困難であり、in vitroのFBXW7抑制実験等はGIST T1細胞を用いて行っている。また、GIST臨床検体について、他施設症例についての免疫染色等に関する標本貸出手続き等が遅れているため、全体としてやや予定より遅れている状況である。細胞株樹立に関しては引き続きGIST手術標本を採取し細胞株樹立を試みていく。GIST臨床検体における検討では、当初の97例でFBXW7高発現群で予後不良の傾向をみとめた。今後症例数を増やしての検討や、イマチニブ等分子標的薬使用症例での治療効果、予後との関連につき検討する予定であり、更なるGIST臨床検体および臨床データの集積を目指し各施設の倫理委員会へプロトコールを提出、審議中である。in vitroの実験では、GIST-T1細胞株を用いてFBXW7の抑制実験を施行しているが通常の方法での抑制が困難でありCrispr/Cas9法にてFBXW7の抑制実験を進めていく予定である。消化器外科当科での安定した細胞株樹立が困難であれば、in vitro、in vivoの今後の研究、実験につき、GIST T1細胞を用いて行っていきたいと考えている。また、GIST臨床検体について、他施設症例についての免疫染色等に関する手続きがやや遅れているので今後早急に進めていきたいと考えている。
RNAスプライシングを介した新たな細胞分裂開始機構の解明

SNW1はRNAのスプライシングや特定の遺伝子の転写に関与していることが知られている。申請者はSNW1の発現抑制が細胞分裂の進行を停止させ、細胞死を誘導することを見出した。さらにSNW1がEFTUD2とSNRNP200というスプライシング因子を直接結合することを確認した。EFTUD2とSNRNP200の発現を抑制すると、SNW1発現抑制と同様に細胞分裂の停止、また細胞死の誘導が観察された。さらにSNW1とこれらの結合を阻害するフラグメントタンパク質を発現させたところ、発現抑制と同様な現象が見られた。SNW1の機能抑制は、細胞分裂を阻害し、細胞死を誘導すると考えらる。細胞分裂には多くの複雑な制御機構が関与している。しかしながら、その詳細なメカニズムはいまだ不明である。我々は様々な手法を用いて新たな細胞分裂に関わる重要な因子の探索を行ってきた。その結果、いくつかのRNA結合タンパク質が細胞分裂の進行に重要であることを見出した。今回我々はBCAS2、CDC5L、SNW1というタンパク質に注目した。これらのタンパク質の発現を抑制すると多くの細胞は分裂期で停止するか、もしくは細胞死を引き起こした。これらのタンパク質がどのようにして細胞分裂を制御するか明らかにするため、それぞれに結合するタンパク質の網羅的な解析をおこなった。いくつかのタンパク質が同定されたが、多くはRNAのスプライシングに関わるタンパク質であった。その中で我々はEFTUD2、PRPF8、SNRNP200というRNAスプライシングに必須なタンパク質に注目した。これらの遺伝子の発現をそれぞれsiRNAという手法を用いて抑制すると、細胞分裂の進行が顕著に抑制された。さらにいくつかの癌細胞において発現を抑制すると、細胞死が誘導され、細胞増殖が顕著に抑制された。この結果は、これらの分子を標的とした癌治療の可能性を示唆する。さらに我々はSNW1、BCAS2、CDC5LがどのようにしてEFTUD2、PRPF8、SNRNP200に結合するのかを明らかにする詳細な検討をおこなった。現在進行中であるが、SNW1は中央分のSKIP領域を介してEFTUD2のN末、またSNRNP200のC末に結合していることが明らかとなった。申請者はsiRNAを用いたスクリーニングにより、SNW1やBCAS1という遺伝子の発現抑制が細胞分裂を顕著に抑制することを見出した。これらのタンパク質は主にRNAのスプライシングに関与していることが知られている。そこで申請者は本研究において、主にSNW1が細胞分裂の進行においてどのような役割を担っているか明らかにすることを試みた。SNW1の発現を抑制した細胞をタイムラプス顕微鏡を用いて観察したところ、染色体の分配に異常が起こり、また分裂の終了後に細胞死が起こることが確認された。免疫染色などの結果、SNW1の発現抑制により、分裂時における染色体と微小管の接着が阻害されることが観察された。SNW1はRNAスプライシングに関与することから、分裂に必須なタンパク質の発現に関与していると考えられた。そこでSNW1が発現を制御する分裂因子の同定を試みた。しかしながら、現在のところその同定には至っていない。SNW1がどのように細胞分裂に関与するか検討するため、SNW1と結合するタンパク質の同定を行った。その結果、SNRNP200、EFTUD2というタンパク質がSNW1を直接結合することが判明した。SNW1のSKIP領域はEFTUD2のN末、またSNRNP200に二つあるSec63領域に結合した。そしてSNW1と二つのタンパク質の結合を阻害すると、細胞分裂の阻害、また細胞死が誘導されることが観察された。SNW1はEFTUD2とSNRNP200と複合体を形成し、細胞分裂に関わるタンパク質の発現を促進し、分裂の進行を制御している可能性が考えられる。腫瘍生物学昨年度はBCAS2、CDC5L、SNW1がどのような複合体を形成するのかを明らかにすることを目標としていた。今回網羅的な解析をおこなうことで、これらのタンパク質がRNAスプライシングに関わるタンパク質と複合体を形成することを明らかにし、さらにEFTUD2、SNRNP200、PRPF8というタンパク質と複合体を形成することを様々な方法で確認している。また、EFTUD2、SNRNP200、PRPF8のそれぞれが細胞分裂の進行や細胞の増殖に必須であることを見出している。当初の予定では、これらの複合体がどのようなRNAと結合しているかを明らかにすることも目的としている。これは困難な実験であるが、準備も進みつつあり、実験の進行は順調であると結論できる。BCAS2、CDC5L、SNW1がどのようにして他のRNAスプライシング因子と複合体を形成しているかを詳細に検討し、明らかにする。

そしてその複合体形成を抑制するようなタンパク質を用いて、細胞分裂の進行が抑制されるか、また細胞死が誘導されるかなどを検討する。当初の目的にはなかったが、複合体形成を抑制する阻害タンパク質が癌治療に応用できるか検討する。BCAS2、CDC5L、SNW1が細胞分裂をどのようなメカニズムで進行させるかを明らかにするため、結合するRNAの同定をこころみる。これらのタンパク質を免疫沈降し、そして抽出したRNAをシークエンスにて同定する。そしてこれらのタンパク質がRNAの翻訳を介して細胞分裂を制御しているか検証する。
アンキリンリピートによるBARドメイン様の脂質膜の形態制御機構の研究

アンキリンリピートドメインは、33アミノ酸のユニットが繋がって、バナナのような湾曲した構造をとることが多い。ANKHD1は全体で25リピートを持つことから、アンキリンリピートドメインの部分のみで1500アミノ酸を超える大きなタンパク質である。他の膜変形ドメインとしてよく解析されているBARドメインタンパク質は、250ー300アミノ酸であることを考えると、1分子で、BARドメイン数分子に相当する大きさとなる。立体構造予測をもとに、脂質膜と相互作用するアミノ酸残基をアミノ酸の点変異により同定し、試験管内での再構成実験により、脂質膜との相互作用および切断機序を同定した。具体的には、立体構造予測において、バナナ状の大きな足場部分とその近傍の両親媒性ヘリックス部分の両方が脂質膜との相互作用に重要であることがわかった。ゴルジ体は、小胞体(ER)やエンドソーム、細胞膜へ小胞を放出し、またこれらのオルガネラから小胞を受け取っている。したがって、これらのオルガネラにおけるANKHD1の局在を調べるとともに、ANKHD1の過剰発現やRNAiによるノックダウンで、これらのオルガネラの形態がどのように変化するか調べた。その結果、エンドソームの形態に異常がみられた。さらに、ANKHD1の全長での脂質膜切断活性を明らかにする。大腸菌を用いた発現系を用いて全長タンパク質の発現精製を試みたところ、全長から立体構造を取らないと思われるIDP領域を除いた部分の精製に成功した。PCとPEあるいはPCとPSに加えて様々なフォスフォイノシタイドを添加した再構成リポソームをもちい、脂質膜との結合と切断を調べたところ、脂質膜を切断する活性を遠心分析により見出した。概ね研究計画どおりに進捗し、ANKHD1の脂質膜切断機序および機能するオルガネラを同定しつつあるため。したがって、これらのオルガネラにおけるANKHD1の局在を調べるとともに、ANKHD1の過剰発現やRNAiによるノックダウンで、これらのオルガネラの形態がどのように変化するか、様々なマーカータンパク質に対する抗体を用いるなどして調べる。また、脂質膜の切断をおこなうANKHD1のタンパク質断片を発現させ、局在する細胞内小器官の形成、消失を、オルガネラマーカータンパク質の抗体染色により調べ、ついでWestern blottingによりタンパク質量の増減を調べることで、オルガネラの増加や減少を調べる。予備的な実験結果から、エンドソームにおける機能を見出しているため、特にエンドソームマーカータンパク質であるRab5やEEA1などとの共局在を調べる。また昨年度精製に成功したANKHD1の様々なタンパク質断片を用いて、脂質膜の切断機序を詳しく解析し、また、電子顕微鏡を用いて、脂質膜の切断を確かめる。2017年度の研究では、ANKHD1のアンキリンリピートドメインによる切断機序を解析した。立体構造予測によれば、多数のアンキリンリピートはらせん状の立体構造を形成する。ANKHD1の場合は、前半の15リピートおよび後半の10リピートに分けられる。タンパク質立体構造予測から、タンパク質表面の脂質膜と相互作用すると考えられるアミノ酸残基を推定し、これらに変異を導入したタンパク質断片、及び、野生型のタンパク質断片を大腸菌により発現精製し、試験管内での脂質膜との相互作用を調べた。脂質膜としては、PCとPEあるいはPCとPSを用いて再構成した人工膜、あるいは、粗精製脂質画分であるFolch脂質を用いて再構成した人工膜を用いた。超遠心により、比較的分子量の大きなリポソーム(人工膜)を沈殿させ、大きなリポソームの沈降に伴いタンパク質が沈殿するかどうか調べることで、タンパク質と脂質膜の結合を調べた。ここで、リポソームが沈殿しなければ、脂質膜は小胞化したと考えられる。その結果、脂質膜を断片化するANKHD1のフラグメント及び、断片化に影響を与えるアミノ酸残基を同定した。超遠心による方法に加えて、さらに、ANKHD1による脂質膜の切断活性を電子顕微鏡解析により確認した。次に、細胞内でのANKHD1の機能を明らかにするために、脂質膜の切断をおこなうANKHD1のタンパク質断片を発現させた細胞と、ANKHD1の発現をRNAiにより減弱させた細胞を用意した。これらの細胞の細胞内小器官の形成、消失を、オルガネラマーカータンパク質の抗体染色により調べ、ついでWestern blottingによりタンパク質量の増減を調べることで、オルガネラの増加や減少を調べた。その結果、ある特定のオルガネラの減少が見られた。計画の通りに研究が進んでいるため。

したがって、これらのオルガネラにおけるANKHD1の局在を調べるとともに、ANKHD1の過剰発現やRNAiによるノックダウンで、これらのオルガネラの形態がどのように変化するか調べた。その結果、エンドソームの形態に異常がみられた。さらに、ANKHD1の全長での脂質膜切断活性を明らかにする。大腸菌を用いた発現系を用いて全長タンパク質の発現精製を試みたところ、全長から立体構造を取らないと思われるIDP領域を除いた部分の精製に成功した。PCとPEあるいはPCとPSに加えて様々なフォスフォイノシタイドを添加した再構成リポソームをもちい、脂質膜との結合と切断を調べたところ、脂質膜を切断する活性を遠心分析により見出した。概ね研究計画どおりに進捗し、ANKHD1の脂質膜切断機序および機能するオルガネラを同定しつつあるため。2018年度の研究では、脂質膜と相互作用するアミノ酸残基をアミノ酸の点変異により同定し、試験管内での再構成実験により、脂質膜との相互作用および切断機序を同定する。また、これらのオルガネラの制御は、PI(4)Pなどのフォスフォイノシタイドの制御下にあることが多いので、PI(4)Pなどを添加した人工膜を作成し、その効果も調べる。ゴルジ体は、小胞体(ER)やエンドソーム、細胞膜へ小胞を放出し、またこれらのオルガネラから小胞を受け取っている。したがって、これらのオルガネラにおけるANKHD1の局在を調べるとともに、ANKHD1の過剰発現やRNAiによるノックダウンで、これらのオルガネラの形態がどのように変化するか調べる。大腸菌を用いた発現系を用いて全長タンパク質の発現精製を試みる。ANKHD1は、大きなタンパク質で発現が難しいことも予想されるため、293細胞を用いたタンパク質の発現も試みる。得られた全長タンパク質を用いて、PCとPEあるいはPCとPSに加えて様々なフォスフォイノシタイドを添加した再構成リポソームをもちい、脂質膜との結合と切断を検討する。したがって、これらのオルガネラにおけるANKHD1の局在を調べるとともに、ANKHD1の過剰発現やRNAiによるノックダウンで、これらのオルガネラの形態がどのように変化するか、様々なマーカータンパク質に対する抗体を用いるなどして調べる。また、脂質膜の切断をおこなうANKHD1のタンパク質断片を発現させ、局在する細胞内小器官の形成、消失を、オルガネラマーカータンパク質の抗体染色により調べ、ついでWestern blottingによりタンパク質量の増減を調べることで、オルガネラの増加や減少を調べる。予備的な実験結果から、エンドソームにおける機能を見出しているため、特にエンドソームマーカータンパク質であるRab5やEEA1などとの共局在を調べる。
機能性重金属の分離・濃縮・精製新技術の開発に関する基礎的研究

各研究分担者における研究を相互に連絡しつつ進展させ、その成果の一部を平成5年10月1214日、九州大学工学部において開催された資源・素材関係学協会合同秋季大会において一つの分科会を組織して、発表・討論を行った。以下、テーマ別に研究成果を簡単に述べると、次の通りである。テーマ(1)新しい亜鉛乾式製錬法:阿座上・中沢は、金属鉄による酸化亜鉛還元の速度論について研究し、鉄還元揮発法適用の実用性を検証した。板垣は、亜鉛の高圧還元融体採取法の基礎としてCu-Zn-X(X=Pb,Ag,Au)3元系の成分の活量について研究を行った。テーマ(2)亜鉛蒸気の凝縮:朝木は、固気インジェクションにおける物質移動について基礎実験を行い、また、不破は、ISP溶鉱炉の一次元数学的モデルによる解析を行った。テーマ(3)含亜鉛原料からの浸出:木内は、廃乾電池からの亜鉛の分離回収について実用的な研究を行い、佐々木は、高温における硫酸鉄の加水分解に及ぼす金属硫酸塩の影響について研究を行った。籏は、新しい亜鉛浸出残渣処理工程について実験に基づく新プロセスの提案を行った。テーマ(4)亜鉛の電解採取:梅津は、酸性硫酸塩溶液中での鉛合金のアノード挙動について、また、小池は、亜鉛電解時におけるアルコール類添加について研究を行った。粟倉は、塩化物水溶液からの亜鉛電解採取について、福島は、亜鉛電解における浄液と不純物の挙動について研究を行った。テーマ(5)鉛溶錬:武田は、ISP溶鉱炉炉床部における亜鉛・鉛の挙動について平衡論的研究を、山内は、ソーダスラグによる溶融鉛からの不純物除去について、また、中村は、鉛電解反応機構について研究を行った。小川は、熱拡散による鉛中ビスマス除去に関する考察を行った。以上の諸研究の成果は、今後の亜鉛・鉛製錬技術に大きい影響を与える事が確信される。研究の発足に当り、まず全研究者による研究連絡会を開催し、各研究分担者の研究計画の説明とそれに対する討議を行った。その後、研究分担者は各自の研究分担項目について精力的な研究の進展に取組んだ。以下テーマ別に簡単に述べると、テーマ(1)新しい亜鉛乾式製錬法に関して、阿座上、中沢は金属鉄による酸化亜鉛の還元速度についてその機構を明らかにする立場から研究を進め、成果を上げつつある。板垣は直接融体採取法の理論計算を行った。テーマ(2)亜鉛蒸気の凝縮について、朝木、不破はISPによる亜鉛製錬所の実地調査を行い、亜鉛蒸気凝縮過程のモデル実験を計画し、装置の製作を進めつつある。中村は亜鉛液滴の物理性状について調査を進めている。テーマ(3)舎亜鉛原料からの浸出について、木内と佐々木は、とくに1次浸出残渣からの亜鉛回収方法について研究を進めており、籏はより早純化された湿式製錬法の構想を進めつつある。テーマ(4)亜鉛電解採取について、福島は電解時の微量成分の挙動を調べ、小池は省エネルギ電解法の開発、栗倉は塩化物水溶液電解法の開発を進め、梅津は新しい合金陽極材料の研究を進めつつある。テーマ(5)鉛溶錬その他について武田は鉛溶錬の基礎として種々のスラグ組成と酸素圧の下でのスラグー鉛間の諸成分の分配関係について研究を進め、山内はNa_2Oを含むスラグを用いた場合の成分挙動を調査している。小川は新しい金属精製法について基礎研究を進めつつある。

これらの諸研究は、いずれも順調な進展をみせており、さらに継続して研究を進展させ、その経過について対論するための会合を企画するとともに順次学会誌等への成果の公表が期待される。各研究分担者における研究を相互に連絡しつつ進展させ、その成果の一部を平成5年10月1214日、九州大学工学部において開催された資源・素材関係学協会合同秋季大会において一つの分科会を組織して、発表・討論を行った。以下、テーマ別に研究成果を簡単に述べると、次の通りである。テーマ(1)新しい亜鉛乾式製錬法:阿座上・中沢は、金属鉄による酸化亜鉛還元の速度論について研究し、鉄還元揮発法適用の実用性を検証した。板垣は、亜鉛の高圧還元融体採取法の基礎としてCu-Zn-X(X=Pb,Ag,Au)3元系の成分の活量について研究を行った。テーマ(2)亜鉛蒸気の凝縮:朝木は、固気インジェクションにおける物質移動について基礎実験を行い、また、不破は、ISP溶鉱炉の一次元数学的モデルによる解析を行った。テーマ(3)含亜鉛原料からの浸出:木内は、廃乾電池からの亜鉛の分離回収について実用的な研究を行い、佐々木は、高温における硫酸鉄の加水分解に及ぼす金属硫酸塩の影響について研究を行った。籏は、新しい亜鉛浸出残渣処理工程について実験に基づく新プロセスの提案を行った。テーマ(4)亜鉛の電解採取:梅津は、酸性硫酸塩溶液中での鉛合金のアノード挙動について、また、小池は、亜鉛電解時におけるアルコール類添加について研究を行った。粟倉は、塩化物水溶液からの亜鉛電解採取について、福島は、亜鉛電解における浄液と不純物の挙動について研究を行った。テーマ(5)鉛溶錬:武田は、ISP溶鉱炉炉床部における亜鉛・鉛の挙動について平衡論的研究を、山内は、ソーダスラグによる溶融鉛からの不純物除去について、また、中村は、鉛電解反応機構について研究を行った。小川は、熱拡散による鉛中ビスマス除去に関する考察を行った。以上の諸研究の成果は、今後の亜鉛・鉛製錬技術に大きい影響を与える事が確信される。
GDF-5/β-TCP複合体によるイヌ前頭洞内骨形成とインプラント周囲組織の観察

実験1:GDF-5の担体として平均粒径300μmのβ-TCPを使用した。rhGDF-5/β-TCP複合体はβ-TCPの1g当たりに対してrhGDF-5を500μgコーティングして製作した。両側の前頭洞を露出して、前頭洞挙上部に2gのrhGDF-5/β-TCP複合体を滅菌生理食塩水に浸して移植した。対照側にはβ-TCPを移植した。移植後124週で非脱灰研磨標本を製作し、前頭洞内の骨形成を観察した。4週後、実験側は既存骨の隣接部に既存骨と連続した骨組織の形成が確認された。8週後、実験側では骨髄形成が認められ、β-TCP顆粒の吸収は全体の中心部まで進行していた。対照側は、実験側と同様に既存骨と連続した骨組織の形成が認められるようになったが、顆粒の大半は吸収されずに残存していた。12週後、実験側はrhGDF-5に誘導された骨は梁状部分が太く発達していた。24週後、実験側ではβ-TCP顆粒のほとんどが骨に置換した状態だったが、対照側では部分的にβ-TCP顆粒の残存が確認された。実験2:GDF-5/β-TCP複合体を移植した4週後の部位にTi-6Al-4v合金製インプラントを埋入した。インプラントを埋入して4、8、12週後に上記の方法に準じて製作した組織標本のインプラント周囲骨組織を観察した。インプラント埋入から8週後、対照側ではインプラント界面と骨組織の接触を確認できなかったが、実験側では埋入窩内に形成された骨組織とインプラント界面の接触を確認した。インプラント埋入から12週後、実験側ではインプラント界面に対する骨接触率が増加した。材料と方法:ビーグル成犬(体重1012kg)の左右前頭洞を使用した。recombinant human Growth Differentiation Factor-5 (GDF-5)の担体として平均粒径300μmのβ-tricalcium phosphate (β-TCP)を使用した。rhGDF-5/β-TCP複合体はβ-TCPの1g当たりに対してrhGDF-5を500μgコーティングして作製した。前頭洞粘膜挙上部の作成は、従来のサイナスリフトの術式に準じて行った。右側前頭洞挙上部に2gのrhGDF-5/β-TCP複合体(rhGDF-5を1000μg含む)を滅菌生理食塩水に浸して移植した。対照側(左側)にはβ-TCPのみを滅菌生理食塩水に浸して移植した。移植後1,2,4,8,12,16週でビーグル犬を屠殺し、頭部灌流固定後、試料を摘出、ポリエーテル樹脂で包埋、薄切後、非脱灰研磨標本を作製した。前頭洞内の骨形成を塩基性フクシン・メチレンブルー重染色で組織学的に観察した。結果:1週後の実験側は、既存骨に近い部分の顆粒間に幼弱な骨組織の侵入が観察された。2週後、実験側は既存骨と連続した骨組織が観察されるようになり、顆粒間への幼弱骨組織の侵入が、1週後のそれに比較して進行していた。β-TCPのみを移植した2週後の対照側は、顆粒間への幼弱骨組織の侵入を殆んど認めなかった。4週後、実験側は既存骨と接する周囲にこれと連続した骨組織の形成が観察された。対照側は実験側に比較して移植した顆粒と顆粒の間隔が狭く、凝集された状態が観察された。8週後、実験側は既存骨と連続した骨組織で満たされ、β-TCP顆粒の吸収は全体の中心部まで進行していた。

対照側は、実験側と同様に既存骨と連続した骨組織の形成が認められるようになったが、顆粒の大半は吸収されずに残存していた。12週後の実験側は顆粒の吸収が進行し、rhGDF-5に誘導された骨は既存骨と連続し、梁状部分が太く発達していたが、8週後の実験側に比較して洞粘膜挙上量の減少が認められた。16週後の実験側は12週で観察された傾向の進展を認めた。対照側は顆粒の吸収が進行し、既存骨と接する部分に連続した形成骨が観察された。材料と方法:ビーグル成犬の左右前頭洞を使用した。recombinant human Growth Differentiation Factor-5 (GDF-5)の担体として平均粒径300μmのβ-TCPを使用した。rhGDF-5/β-TCP複合体はβ-TCPの1g当たりに対してrhGDF-5を500μgコーティングして製作した。右側前頭洞挙上部に2gのrhGDF-5/β-TCP複合体(rhGDF-5を1000μg含む)を滅菌生理食塩水に浸して移植した。対照側(左側)にはβ-TCPのみを滅菌生理食塩水に浸して移植した。移植後124週でイヌを屠殺して頭部灌流固定後、試料を摘出、ポリエーテル樹脂で包埋、薄切後、非脱灰研磨標本を製作した。前頭洞内の骨形成を塩基性フクシン・メチレンブルー重染色で組織学的に観察した。GDF-5/β-TCP複合体の移植後4週で前頭洞内に誘導された骨組織にTi-6Al-4V合金製インプラント(直径3.7mm、骨内長8mm)を埋入した。インプラントを埋入して4、8、12週後に上記の方法に準じて製作した塩基性フクシン・メチレンブルー重染色標本のインプラント周囲骨組織を観察した。なお、標本はインプラントの長軸方向に薄切した。結果:4週後、実験側は既存骨と連続した骨組織の形成が確認された、対照側の骨形成は既存骨隣接部に限局していた。8週後、実験側は既存骨と連続した骨組織で満たされ、β-TCP顆粒の吸収は全体の中心部まで進行していた。12週後、実験側はrhGDF-5に誘導された骨は梁状部分が太く発達していたが、8週後の状態に比較してβ-TCP顆粒の吸収による挙上量の減少が認められた。24週後、実験側と対照側の形成骨は類似した組織所見を呈するようになった。しかし、β-TCP顆粒のほとんどが骨に置換した状態だった実験側に対して、対照側では部分的にβ-TCP顆粒の残存が確認された。インプラント埋入から4週後、対照側、実験側ともに埋入窩内の骨組織の形成に明らかな差を認めなかった。インプラント埋入から8週後、対照側ではインプラント界面と骨組織の接触を確認できなかったが、実験側では埋入窩内に形成された骨組織とインプラント界面の接触を確認した。インプラント埋入から12週後、実験側ではインプラント界面に対する骨接触率が増加した。
火炎CVDによる非酸化物機能性材料の合成

火炎CVDによる非酸化物機能性材料の合成を目指して平成7年度から9年度にかけて総合的研究を行った。まず火炎中での固相析出過程を調べるために、酸素-水素拡散層流火炎中にTetraethylorthogermaniumu(TEOG)を送入してゲルマニア超微粒子を合成し、既に行っていたシリカ超微粒子の生成機構との比較検討を行った。ゲルマニア超微粒子生成の場合、火炎下部の酸素不足領域でまずGeOの核発生がおきるが、原料濃度が低いと出来たGeO粒子が火炎上部に至るまでの温度上昇に伴って一度完全に昇華し、火炎上部の酸素過剰領域でGeO_2粒子として再び核発生・成長・ブラウン凝集を起こしていることが分かった。減量濃度が高いと火炎下部での発生GeO粒子が昇華しきらずに火炎上部にいたり、酸化されつつ更にGeO_2の析出が生じていることが分かった。シリカ生成の場合には、昇華過程が無く超微粒子生成機構が全く異なっていた。すなわち、火炎中での固相析出機構に対する減量の種類、原料濃度、火炎温度分布の影響を明らかにした。次に同じ酸素-水素拡散層流火炎に1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazane(HMDS)を送入し、窒化ケイ素粒子合成を試みた。火炎上方で粒子を補集すると完全に酸化されたシリカ粒子のみであったが、火炎中にマグネシア管を挿入して還元炎上方から粒子を補集するとSiN粒子が採取された。火炎は高温場であるが、酸素過剰領域に触れさせない工夫をすれば非酸化物を得る事が可能であることが分かった。拡散層流火炎では適当な反応領域の大きさが制限されるため、予混合火炎による非酸化物合成を試みた。まず、アセチレン-酸素予混合炎によるダイヤモンド薄膜合成実験を行い、既往の報告と同程度の好成績を得た。更に、火炎中にHMDSを挿入し、ダイヤモンドライクのSiC薄膜生成を確認した。最終年度はアセチレンをプロパンに変えて実験的研究を行い、SiCウィスカ-を得たが、その生成機構などについて結論を得るに至っていない。石英製四重管バーナーの中心管からキャリヤ-ガスArと窒素源NH_3、および窒素を含むケイ素源HMDS(hexamethyldisilazane)を送入し、その外側に水素、さらにその外側にシールガスAr、最外環に酸素を送入して酸素-水素層流拡散火炎中で窒化ケイ素粒子を合成した。供給比[NH_3]/[Si]を8.3-41.7の範囲で変えた。窒化ケイ素は非常に酸化され易いので、内径9mmのマグネシア管を火炎中に送入して生成した粒子をサンプリングした。FTIR測定の結果、Si-N伸縮結合に対応する800-900cm^<-1>のピークが観察された。また、Si-O伸縮結合に対応する460cm^<-1>および1280cm^<-1>のピークも見られた。TEM写真によれば、[NH_3]/[Si]=8.3のとき、平均粒径18nmの1次粒子が凝集して50-100nm程度の2次粒子を形成し、さらにこの2次粒子が凝集した凝集体が観察された。[NH_3]/[Si]=

16.7では凝集体を形成する2次粒子の大きさが減少していることが観察され、さらに1次粒子の中に非常に小さな黒点(TEM写真)が見られた。電子線回折リングから、α-Si_3N_4結晶が存在していることを確認した。さらに供給比が41.7になると太さ10nmの針状粒子が観察され、α-Si_3N_4の(301)面および(330)面、β-Si_3N_4の(200)面および(301)面の電子線回折リングが観察された。針状粒子はβ-Si_3N_4と思われる。NH_3流量を増加させて供給比を上げたため、ガスの線流速が増加して火炎温度が下がり、供給比41.7における火炎温度は約1100Kである。熱CVD法において1700K以上での熱処理で針状結晶が観察された報告と比較すると、かなり低温でβ-Si_3N_4が生成したことになる。ガス供給比が増すと粒子径はほぼ10nm程度にまで減少したが、濃度変化の他に火炎温度降下、反応領域での滞留時間の減少、の複合された影響があるものと考えられる。アセチレン-水素予混合火炎中にジシラザンを送入し,モリブデン基板上にSiC薄膜合成を試みた。FTIR分析によりSi-O結合が確認されたが,Si-O結合がかなりの割合を占めていた。今年度はSi-Cが出来たことを確認するにとどまったが,予混合火炎中に,必ず存在する酸素を燃焼反応の方へ消費させることによりSi-O結合を抑制する工夫が必要である。これは,原料ガス組成,基板の温度・形状あるいは挿入位置を適正にすることにより達成できると考えている。また,基板を火炎中から取り出す際に空気中の酸素によって酸化されてしまうことも考えられる。これを防ぐために,火炎の周囲を窒素雰囲気とすることも検討中である。原料ガスを変えることも検討すべきであると考え,今年度はアセチレンをプロパンに変えた実験的検討も行った。プロパン-水素予混合火炎中にジシラザンを送入し同様の実験を行ったところ,Si-C結合を顕著に示す生成物を得た。SiCの存在割合は基板上の付着場所によって大きく異なっており,今後,Si-C結合の割合を増していくための有用な指針が得られつつある。プロパン酸素予混合火炎中にヘキサメチルジシラザンを送入し、Mo基板上へのSiC薄膜合成を試みた。当初、Mo基板は直径15mm、長さ25-35mmの丸棒を用いたが、前年度のアセチレン酸素予混合火炎の場合と異なり、基板上への固相析出は見られなかった。基板ホルダーの表面上への固相析出が見られたため、Mo基板を丸棒から直径5cmの円盤へと変え、それに応じて基板ホルダーの仕様も変更した。冷却水流量調整による基板温度の調節、基板とバーナー距離の調節などによりMo基板上への透明な固相析出を見たが、同時にMo基板がエッチングされており、元素分析の結果酸化Moであることが分かった。Moは高温では酸化されやすく、基板温度が600°C以上になっていたものと思われる。一方、基板の材質も固相析出に影響を与えると考え、Siウエハ-を基板とした固相析出を試みた。原料ガス組成、基板とバーナーとの距離を種々変化させたところ、ある条件下において基板上に繊維状のSiCを高速で析出させることが出来た。基板上でリング状に析出しており、そのリングは還元炎と酸化円との境界に位置していた。すなわち、酸化炎の高温により還元炎中でSiCプリカーサーが生成析出したものと考えられる。残念ながらこの繊維状SiCの析出はその後再現できず、詳細な析出機構の検討に至っていないが、近未来のターゲットと考えている。
成長ホルモンパルスジェネレーターの電気生理学的同定

成長ホルモン(GH)は下垂体より間欠的に、すなわちパルス状に分泌されており、そのパルスパターンが生理作用の発現を第一義的に決定している。例えば、ラットにおいては雄ではほぼ正確に3.3時間毎に高振幅の分泌が起こるが、雌では高頻度で低振幅の分泌が起こり、このような分泌パターンの差が体成長の性差の原因となっている。一方、我々はヒトGH(hGH)遺伝子を導入した形質転換ラットを作出することに成功している。このラットには顕著な肥満、高血糖、インスリン抵抗性などが発現し、典型的なインスリン非依存性糖尿病が惹起された。我々はその根本的な原因はGHのパルス状分泌が欠如したためであると考え、hGHを間欠的に投与したところ、これらの病態が大きく改善した。すなわち、GHのパルスパターンが糖・脂質代謝の制御に関与していることが明かとなり、中枢による代謝制御機構の解明に、GHパルスジェネレーターの興奮性を直接モニターするシステムが期待されている。本研究は、未だ同定されていないGHパルスを誘起する視床下部神経機構、すなわちGHパルスジェネレーターの電気活動を記録するシステムの確立を試みたものである。下垂体からのGHのパルス状分泌を制御している視床下部のGH放出ホルモン(GRH)ニューロンとGH放出抑制ホルモン(SRIF)ニューロンの存在する領域のニューロン群の電気活動を多ニューロン発射活動記録法を用いて記録したところ、それぞれの領域から間欠的な興奮を示す特徴的なニューロン群の電気活動が記録できた。GHの分泌を促進するGH-releasingpeptideを投与することにより、GH放出を促進する部位の活動は低下し、GH放出を抑制する部位の活動は上昇した。これらの結果は、本研究により記録された電気活動が、GHのパルス状分泌の制御に関わるものであることを示唆している。一方、我々はマウス乳清酸性蛋白遺伝子のプロモーター領域とヒトGH(hGH)遺伝子のコーディング領域を結合したキメラ遺伝子を導入した形質転換ラットを作出することに成功している。このラットでは持続的に低レベルのhGHが血中へ放出され、内因性のラットGH(rGH)の放出は抑制されている。さらに、このラットには顕著な肥満、高血糖、インスリン抵抗性などが発現し、典型的なインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)が惹起された。本研究は、未だ同定されていないGHパルスを誘起する視床下部神経機構、すなわちGHパルスジェネレーターの電気活動を記録するシステムの確立を試みるものである。本年度においては、下垂体からのGHのパルス状分泌を制御している視床下部のGH放出ホルモン(GRH)ニューロンと、GH放出抑制ホルモン(SRIF)ニューロンの存在する領域のニューロン群の電気活動を多ニューロン発射活動記録法を用いて記録するシステムの確立を行った。
神経細胞の核内リン脂質代謝の制御機構

我々は、イノシトールリン脂質代謝により生じる二次メッセンジャー・ジアシルグリセロール(DG)の代謝酵素であるDGキナーゼ(DGK)について、核移行シグナルとアンキリンリピートを持つIV型DGK(DGK-IV, DGKzeta)アイソザイムの神経細胞における機能的役割を追求してきたが、その研究過程においてIV型DGKと約58%の相同性を示す新しいアイソザイム、DGKiotaをラット脳cDNAライブラリーからクローニングし解析を行った。DGKiotaは、IV型DGKと同様に核移行シグナルとアンキリンリピートを有する1051個のアミノ酸からコードされており、分子量は116kDaと推定された。DGKiotaは脳および眼球に強く発現し、脳内では大脳皮質、線条体、海馬、小脳に遺伝子発現が認められた。さらに我々は、選択的スプライシングにより2つのDGKiotaスプライス変異体が生じることを明らかにし、分子量の大きい順よりDGKiota-1(116kDa), DGKiota-2(92.7kDa), DGKiota-3.(64.4kDa)と命名した。これら3つのスプライス変異体の機能的差異を調べるために、エピトープタグ法により培養細胞内での細胞内局在を調べたところ、いずれの変異体も核移行シグナル領域を含んでいるにもかかわらず細胞質に局在が認められた。混合ミセル法による酵素活性測定では、DGKiota-1の活性を100%とすると、DGKiota-2は約50%、DGKiota-3は0%の酵素活性を示した。以上より、DGKiotaの機能調節にはこの選択的スプライシング機構が関与することが強く示唆された。今後、核移行シグナルを有するIV型DGKおよびDGKiotaに関して、神経細胞における細胞質一核の移行のメカニズム、そしてその機能的役割について精査していく予定である。
関節運動によるメカニカルストレスは関節痛を軽減し組織を修復できるか？

滑膜へのメカニカルストレス(MS)がどのように神経に情報伝達を行うか、滑膜細胞と後根神経節細胞の共培養システムを用い検証した。滑膜へのMSにより細胞内小胞体からのカルシウムイオン遊離とTRPV4チャネルの活性化によるカルシウムイオンの流入が生じ、滑膜から神経へカルシウムイオン依存性の情報伝達をしていることが示唆された。さらに、初期変形性関節症の治療法検討に有用なモデルとして、ラット正常膝関節に対する強制走行時の関節組織変化を組織学的に検討した。6週間の強制運動負荷で関節症様の変化が観察されなかった。適正体重での走行による関節運動は関節にとって適度なメカニカルストレスで有益であった可能性がある。本研究は、関節を構成する滑膜細胞と神経細胞との生理的な相互作用を解明することによって、神経を含む関節構成組織にメカニカルストレスが及ぼす影響を明らかにすること、さらに疼痛軽減や組織修復を図る治療的対応の基盤確立を目的としている。平成25年度はこれまでに確立した骨芽細胞と神経細胞の共培養システムを用い生理学的機能実験を行った。まず、関節の疼痛や炎症と関連が深い細胞である滑膜細胞と神経細胞との細胞間相互作用を検証するため、生後10週以降のマウスの後根神経節細胞から神経細胞を、膝関節滑膜から滑膜細胞を単離し共培養を作製した。その後、蛍光カルシウム指示薬であるFluo-3AMを負荷し、申請者らが確立した共培養機械的刺激実験システムを用い滑膜細胞に機械的刺激を加えた。ガラスマイクロピペットを装着したマニュプレーターを用いて、単一の滑膜細胞に対しメカニカルストレスを与えることで神経ー滑膜細胞間の求心性の反応が得られるかどうかを検討した。その結果、滑膜細胞への機械的刺激により滑膜細胞内のカルシウム濃度の上昇後、次いで神経細胞の反応を認めた。これまでの研究で明らかにした骨芽細胞ー神経細胞間の反応とはことなり、カルシウム濃度の変化は緩やかであった。今後は、信号伝達を行う生理活性物質や両細胞の受容体の特定を行う予定である。また、次年度以降の研究準備としてラット関節症モデルの作成およびモデルラットに施行する関節運動についても検討を行った。今後はラットをトレッドミルにて強制走行させ関節症自然発生モデルを検討する予定である。今年度は、実験動物ラットを用いた変形性関節症(以下、OA)モデルの検討を中心にすすめた。先行研究を参考にし、本研究に適したOAモデルを同定することを目的とした。強制走行によるモデルにおいては、先行研究以上の走行負荷を加えるものの、OA様の変化を十分に観察することが出来なかった。次に外科的介入を用いたモデルにおいては、内側側副靭帯切除、内側半月板切除、前十字靭帯切除の3段階で関節不安定性を調整して検証し、あわせて週齢による違いも検証した。その結果、前十字靭帯切除モデルでは週齢に関わらず大腿骨側で軟骨層を認めないEburnationが観察された。脛骨側軟骨で部分的に軟骨細胞の再生所見を認めたが、この所見は9週齢で活発であり、その他の週齢においてはごくわずかに認める程度であった。半月板切除モデルでは前十字靭帯切除モデルと比べ、15週齢では軽微な変化であったものの9週齢では脛骨側の軟骨損傷も強く、より重度な結果を示した。内側側副靭帯切除モデルではいずれの週齢においてもOA様の変化は観察されず、加えて強制走行をさせたモデルにおいても軟骨に著明な変化を認めなかった。また、ヒトにおける膝蓋大腿関節の病態を把握するため、まず健常人における膝関節の加齢変化をMRIにて分析した。若年者と高齢者の比較において膝蓋骨の挙動には著名な差は見られなかった。加齢にともない膝蓋大腿関節の軟骨量減少が観察された。大腿骨前脂肪体、大腿部筋量の減少も観察され、膝蓋骨位置に影響を与えている可能性が示唆された。今後、有病者における分析を進めるとともに、動物モデルの同定には膝蓋大腿関節の組織所見を観察する予定である。変形性膝関節症の疼痛の原因の一つと考えられている滑膜組織に生じる神経原性炎症の病態解明には、滑膜と神経の相互作用の解明が必要であるが、病態生理の解明に先立ち、生理的な状態における滑膜細胞のメカニカルストレス(MS)に対する細胞内カルシウム(Ca2+)を介するシグナル伝達経路を明らかにする必要性があった。そのため本年度は滑膜細胞単培養での実験をすすめた。滑膜細胞はMSにより、直ちに滑膜細胞内Ca2+濃度の上昇を起こし、外液Ca2+存在下において滑膜細胞は複数回のMSに反応した。一方、Ca2+フリー条件化では初回MSに反応するが、2回目MSには反応しなかった。従って、MSに対するCa2+上昇反応に細胞内小胞体から細胞質内へのCa2+遊離が関わっていると考えられる。今後さらにCa2+を介するシグナル伝達経路の解析をすすめていく予定である。動物モデルの同定については新たな外科的介入方法として、内側半月脛骨靭帯を切除するモデル(DMMモデル)を作成し、検証を行った。対象には6週齢、9週齢、12週齢のラットを用い、術後4週時点での組織所見を観察した。その結果、12週齢のラットにおいては半月板を介さない関節面の限定された箇所に、軟骨表層のFibrillation像と軟骨基質の染色性の低下を認めた。