hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
疲労度センサーの開発

本年度は、疲労物質である乳酸を測定するセンサーの高感度化および測定濃度範囲の拡大を目的として、電子メディエーターを用いた測定方法の最適化を実施した。また、センサーの耐久性の検討やセンサーを被覆するための良好なポリマー材料の検索も行った。前年度に確立した酵素積層膜法により乳酸センサーを作製し、乳酸を測定する際に、フェロセン誘導体を電子メディエーターとして利用した。その結果、測定溶液中にフェロセン類が存在すると、フェロセンを用いずに測定した場合と比べると応答電流が約10倍程度に増幅されることが明らかになった。また、測定濃度範囲は0.05・1mM程度であり、唾液中の乳酸を測定するのに充分の性能を示し、従来法と比較して遜色のないものであった。電子メディエーターとして、正電荷、負電荷、および無電荷の3種類の異なる誘導体を用いたが、無電荷のフェロセンメタノールが最も好ましい結果を与えた。今後、電子メディエーターを電極に固定化すれば、乳酸センサーとして一層有用であると思われる。乳酸センサーの耐久性を約1ヶ月間検討したが、実質的な使用可能期間は2週間程度とかなり低耐久性であった。これは、酵素自体の不安定性によるものと考えられる。次に、センサーを被覆するポリマー材料の検討を実施したが、良好な材料を特定するには至らなかった。どのような材料で被覆した場合にも、応答電流が著しく低下すると同時に応答時間が長くなることが判明し、満足できる結果を得ることが困難であった。しかし、ポリマーで被覆すると、高濃度側の測定濃度範囲が拡大されることも確認した。本年度は、疲労度センサーとして機能する乳酸測定用酵素固定化電極の作製を検討した。はじめに、白金電極表面への乳酸酸化酵素(LOx)の固定化方法について検討を行った。吸着法、アルブミン架橋法、アビジン・ビオチン法などを検討し、さらにレクチン(コンカナバリンA、Con A)と糖の結合を利用する新しい方法の確立にも成功した。この方法では、糖(マンノース)で修飾したLOxとCon Aの水溶液に電極を交互に浸すだけの簡便な操作で、LOxとCon Aが単分子層として交互に電極上に累積固定化されることが明らかになった。本法により作製した乳酸測定用電極は、乳酸に対して電流応答を示すことが判明した。これは、LOxが電極表面で触媒活性を保持していることを示している。LOxを固定化する操作の回数を加減することにより、電極表面に固定化されるLOxの量を厳密に制御することが可能であった。この特性は、乳酸を測定する疲労度センサーの性能(特に出力電流値)を任意に制御できることを示しており、非常に有用な知見を得たものと考えている。このセンサーで、唾液中に存在する0.1-0.2mMの乳酸を測定することが可能であった。実際の唾液を測定対象にするには、このセンサーの表面を適切なポリマー材料で被覆して固定化されたLOx層を保護するとともに、測定試料の唾液とLOxが直接接触しないようにすることが必要であるが、いまだ最適なポリマー材料を決定するに至っていない。今後は、ポリマー材料の最適化と、実際の唾液中の乳酸の測定を実施し、疲労度センサーとしての性能を評価する予定である。
骨再生に向けた脂肪組織由来幹細胞の効率的な骨芽細胞分化誘導法の開発

未分化間葉系細胞株C3H10T1/2において、RAは骨芽細胞分化マーカーであるであるタイプIコラーゲン、オステオカルシン、BSPには作用しない可能性があるが、初期骨芽細胞分化マーカーであるALPをBMPシグナルと協調的に促進させることにより、骨芽細胞分化を促進することが明らかとなった。本研究においては、脂肪組織由来幹細胞を効率的に骨芽細胞に分化誘導をするシグナルとして、ビタミンAの代謝産物であるレチノイン酸(RA)を用いての研究を計画している。そこで脂肪組織由来幹細胞での検討に先がけて、RAの分化誘導メカニズム解明を目的に、マウス未分化間葉系細胞株C3H10T1/2細胞を用いて、RAの分子作用メカニズムの検討を行った。C3H10T1/2細胞はBMP2存在下でALP陽性の骨芽細胞様細胞およびオイルレッドO陽性の脂肪細胞に分化誘導されることが報告されている。BMP2存在下で、C3H10T1/2細胞にRAを添加すると、骨芽細胞分化はさらに促進された。一方、BMP2によって誘導される脂肪細胞分化はRA添加により強く抑制された。さらにBMPシグナルとRAシグナルの協調作用の分子メカニズムを明らかにする目的で、BMP2シグナルの伝達分子である、Smad1およびSmad4による骨芽細胞分化誘導に対するRAの作用を検討した。Smad1およびSmad4の過剰発現により、有意にALP活性が上昇し、骨芽細胞様細胞への分化がみられた。この効果はRA添加により著明に増強された。したがって、RAはSmad1およびSmad4と協調して骨芽細胞分化を促進することが明らかとなった。さらなるRAシグナルとBMPシグナルの協調作用メカニズムを解明を行うことにより、脂肪組織由来幹細胞の効率的な分化誘導法を検討出来ると考えている。そこで脂肪組織由来幹細胞での検討に先がけて、RAの分化誘導メカニズム解明を目的に、マウス未分化問葉系細胞株C3H10T1/2細胞を用いて、RAの分子作用メカニズムの検討を行った。RAシグナルはBMPシグナルと協調して骨芽細胞分化を誘導することが19年度の検討にてあきらかとなったことから、RAシグナルはBMPシグナルのターゲットとなる骨芽細胞分化マーカーを同定する目的でreal time PCR法を用い、メッセージレベルでの検討を行った。その結果、RAシグナル、BMPシグナルは共にアルカリフォスファターゼ(ALP)、オステリックス(OSX)の発現を促進させた。さらに同時に作用させることにより、その作用が協調的に増強されることが明らかとなった。しかし、タイプIコラーゲン、オステオカルシン、BSPの転写活性には影響を与えないことが明らかとなったシグナルの作用メカニズムの解明のためにSmad結合配列を組み込んだルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いて、Smadの転写活性に対するRAの効果を検討した。その結果、。RAは単独ではSmadの転写活性に影響は及ぼさなかったが、恒常的活性型BMPIaレセプターにより活性化されたSmadの転写活性をさらに促進することが示された。以上の結果より、RAはSmadの転写活性を促進することにより、骨芽細胞分化を増強することが示唆された。これらのことより、RAシグナルはBMPシグナルの下流に存在するシグナル伝達物質Smadと協調することにより、ALP、OSXの転写活性を促進させ、骨芽細胞分化を誘導している可能性が示唆された。これらの結果は、研究の核となる、脂肪組織由来幹細胞の効率的な骨芽細胞への分化誘導法を確立する重要な発見であると考えられる。
線虫モデルを用いたタウオパチー治療薬の戦略的スクリーニング

微小管結合タンパク質・タウの蓄積を伴う神経変性疾患を総称してタウオパチーと呼んでいる。タウオパチーの本質は異常タウによる神経機能障害であるが、その機構は不明である。したがって、治療法確立を目的としたin vitro解析系の構築は困難であり、神経機能を評価出来るin vivoスクリーニング系が必須といえる。本研究では既存のタウオパチーモデル線虫を基にした個体運動追跡システムによる行動評価系の構築、およびこれらモデル動物を用いた抗タウオパチー化合物の選出を行った。アルツハイマー病をはじめとする認知症では、変性神経細胞中に微小管結合タンパク質タウの蓄積が認められ、タウオパチーと呼ばれている。現在までにタウオパチー発症のメカニズムは不明であるものの、介護に代表される認知症を取り巻く社会経済的な負担、その疾患の多様性などの理由から治療薬の開発は喫緊の課題となっている。本研究では、これまでに構築したタウオパチーモデル線虫を用いて、タウによる神経機能異常を軽減される化合物の開発を目的としており、1,線虫モデルを応用した効率の良いin vivoスクリーニング系の構築と、2,クルクミンを中心とした抗タウオパチー治療薬の開発を進めるものである。1,高効率のスクリーニング系についてはmyo-2 :: DsRedの安定発現株(integrant)の構築を進行中であり、現在最終的なライン確立に至っている。構築後、基礎的な行動、形態学的解析と平行し、現存するタウ発現線虫との交配をすすめ、薬物スクリーニング系の構築に向けて順次進行する予定である。2,スクリーニング系の構築と平行して、既存のタウオパチーモデル線虫をもちいた様々な化合物の薬理解析をおこなった。その結果ウコン(curcuma longa)の黄色色素成分・クルクミンにこの神経機能障害を軽減させる効果があることを見出した。一方、本研究で用いたタウオパチーモデルではタウの重合がみられず、タウの重合阻害が期待されている化合物群については、本疾患モデルでは有効性を見出せなかった。さらなる解析により、クルクミンは神経細胞の形態学的異常を軽減させること、安定型微小管を形成するacetylated a-tubulinを増加させることを明らかとした。以上よりクルクミンはタウの重合過程とは異なるステップにおいて神経機能障害を軽減させること、その薬理作用として微小管の安定化を促す可能性が示唆された。現在までにタウオパチー発症のメカニズムは不明であるものの、介護に代表される認知症を取り巻く社会経済的な負担、その疾患多様性などの理由から治療薬の開発は喫緊の課題となっている。本研究では、これまでに構築したタウオパチーモデル線虫を用いてタウによる神経機能異常を軽減される化合物の開発を目的としており、1,線虫モデルを応用した効率の良いin vivoスクリーニング系の構築と、2,クルクミンを中心とした抗タウオパチー治療薬の開発を進めるものである。1,高効率のスクリーニング系についてはmyo-2;IDsRedの安定発現株(integrant)を構築し、基礎的な行動解析を行った後に、現存するタウ発現線虫との交配を終えた。蛍光実体顕微鏡と高感度CCDカメラによる蛍光動画撮影も成功し、NGM培地上の行動、M9緩衝液中でのthrashing行動などにおいて咽頭筋DeRed蛍光の自動追跡および運動量測定に成功した。さらにタウ遺伝子導入線虫または線虫の神経筋接合部アセチルコリン受容体agonistによる運動障害モデルにおいて、正常線虫とは異なる有為な運動障害の検出、定量化を可能にした。その結果ウコン(curcma longa)の黄色色素成分・クルクミンの他に構造上相関性の無い新たな有効化合物を見出した(特許出願の可能性があるため、化合物名は伏せる)。クルクミンの作用機序について解析した結果、in vitroタウ重合系では既存のタウ重合阻害剤(methylene blue)と同等な重合阻害活性が認められた。しかし、dimer形成が亢進するモデル線虫(punc-119::4R)を用いた解析では行動障害は改善されるもののdimmer formationは阻害されなかった。これより、クルクミンのin vivoでの効果については重合阻害とは異なる作用であると考えている。
枯草菌における2成分シグナル伝達系ネットワークの解析

前年度では、酵母2ハイブリッド法を用いて枯草菌のゲノムライブラリーから脱リン酸化酵素と相互作用をする蛋白質をスクリーニングし、Rapと相互作用する蛋白質を同定することができた。その中には、予想していたように2成分制御系調節蛋白質や脱リン酸化酵素を特異的に阻害するペプチドなども検出することができた。しかし、脱リン酸化酵素RapAと2成分制御系調節蛋白質SpoOFの既知の相互作用を検出することができなかったこと、数個のbaitに関しては2成分制御系調節蛋白質との相互作用が見られなかったことなど、問題点が残った。また、ComAをDNA binding domainとリン酸化されるreceiver domainと全てのRapとの相互作用を酵母2ハイブリッド法で確認したところ、ComAは前述したRapのDNA binding domainとのみ相互作用することを確認した。このことは、SpoOFには脱リン酸化を通して2成分制御系をコントロールしているが、ComAに関してはDNA結合を阻害することにより2成分制御系をコントロールしているという新しい事実を示唆している。
蛋白質工学的手法による酸化ストレス下で働く新規グロビン蛋白質の機能制御機構の解明

ニューログロビン(Ngb)は酸化ストレスから神経細胞を保護する働きを持つ。以前、我々は、ヒトNgbが酸化ストレス下にヘテロ三量体G蛋白質αサブユニット(Gαi)と特異的に結合しGDP解離阻害因子として働くことを明らかにした。本研究では、ヒトNgbのGlu53, Glu60, Glu118が、Ngbの細胞保護能及びGαi1との結合に重要であることを明らかにした。さらに、ヒトGαi1のLys46, Lys70, Arg208, Lys209, Lys210がヒトNgbとの相互作用に重要であることを明らかにした。以上の結果をもとに、ヒトNgbとGαi1との複合体の構造モデルを提唱することに成功した。ヒトのアンドログロビン(Adgb)は2012年に発見された精巣特異的に発現しているグロビン蛋白質であり、グロビンドメインとカルパイン類似ドメインとからなる融合蛋白質である。驚いたことに、グロビンドメインがcircular permutated型であり、しかもその間にカルモジュリン結合モチーフが挿入されている。Adgbの研究はこれまで遺伝子レベルでの研究が少しなされているだけで、蛋白質レベルでの研究はこれまで全く行われていない。そこで、本研究では、Adgb蛋白質の構造と機能を解析することを目指す。Adgbは巨大な蛋白質であることから、ドメインごとに分割したAdgb切断片を大腸菌を用いて発現させ、精製方法を確立した。さらに、精製したAdgb断片を抗原にしてポリクローナル抗体を作製した。今後、このAdgbに対するポリクローナル抗体を用いて、Adgbの蛋白質発現解析を推し進めていく予定である。また、各種Adgb切断片をHeLa細胞で発現させることも試みた。さらに、本研究では、ヒトのニューログロビン(Ngb)が持つ酸化ストレスに伴う神経細胞死を抑制する働きの作用機序を明らかにすることも目指す。NgbをbaitとするYeasttwo hybridscreeningによりNgbと結合する相手であることを我々が明らかにしたcystatin C及びflotillin-1の機能を解析するとともに、これら蛋白質とNgbとの蛋白質間相互作用に着目した解析を行い、結合部位のアミノ酸残基の候補を明らかにした。ニューログロビン(Ngb)は神経細胞に特異的に発現しているグロビン蛋白質であり、酸化ストレスから神経細胞を保護する働きを持っている。以前、我々は、ヒトNgbが酸化ストレス下にヘテロ三量体G蛋白質αサブユニット(Gαi/o)と特異的に結合し、GDP解離阻害因子(GDI)として働くことによりGαi/oの活性を抑え、cAMP量の減少を抑制することにより細胞死を防いでいることを明らかにした。本研究では、このNgbとGαi1との蛋白質ー蛋白質間相互作用部位の特定を試みた。NgbとGαi1それぞれ単独でのX線結晶構造解析の結果をもとにNgbとGαi1の複合体構造を予測し、相互作用に重要と考えられるアミノ酸残基を推定した。そして、候補のアミノ酸を部位特異的に置換した変異体を作製し、相互作用の解析をすることにより、ヒトNgbではGlu53, Glu60, Glu118の酸性アミノ酸が、ヒトGαi1ではLys46, Lys70, Arg208, Lys209, Lys210の塩基性アミノ酸が蛋白質ー蛋白質間相互作用に重要であることが明らかになった。さらに、ヒトNgbを神経細胞に過剰発現させると神経突起の伸長を促進するという最近の報告に着目し、我々が以前作製した細胞膜透過できしかもヒトNgbと同様な機能も持つキメラNgb蛋白質の神経突起伸長能を解析した。その結果、このキメラNgbは培地に添加しただけで神経突起を伸長させる働きを持っていることが明らかになった。さらに、細胞膜透過に重要なリジンを置換したキメラNgb変異体は神経突起の伸長を促進しなかったことから、キメラNgbは培地に添加された後、細胞膜を透過し細胞質内へ移行することにより、神経突起を伸長させると考えられる。本研究では、まず、NgbとGαi1との蛋白質ー蛋白質間相互作用部位の特定を試みた。NgbとGαi1それぞれ単独でのX線結晶構造解析の結果をもとにNgbとGαi1の複合体構造を予測し、相互作用に重要と考えられるアミノ酸残基を推定後、候補のアミノ酸を部位特異的に置換した変異体を作製し、相互作用の解析を行った。その結果、ヒトNgbではGlu53, Glu60, Glu118の酸性アミノ酸が、ヒトGαi1ではLys46, Lys70, Arg208, Lys209, Lys210の塩基性アミノ酸が相互作用に重要であることが明らかになった。この研究成果は、平成28年4月にScientific Reports (Nature Publishing Group)誌にて発表した。この研究成果については、現在論文を執筆中である。

ヒトのニューログロビン(Ngb)には酸化ストレスから神経細胞を保護する働きがある。我々はヘムの両側からHisが配位したbis-His型ヒトNgbが、ヘテロ三量体G蛋白質αサブユニット(Gαi/o)と結合し、GDP解離阻害因子として働きcAMP濃度の低下を抑えることで、細胞死を抑制することを明らかにした。また、魚類Ngbには細胞保護能がないが、細胞外から細胞質内に移行する細胞膜透過能があること、他方、ヒトNgbには細胞膜透過能がないことも見い出した。さらに、魚類Ngbの細胞膜透過能に重要なモジュールM1とヒトNgbの細胞保護能に重要なモジュールM2M4を融合し、培地に加えるだけで酸化ストレスから細胞を保護するキメラNgbの作製に成功した。本年度の研究では、ヒトNgbを過剰発現させると神経突起伸長が促進されるという最近の報告に着目し解析をした結果、キメラNgbの場合には、培地に添加しただけで神経突起の伸長が起こることが観察された。他方、ヒトNgbや魚類Ngbでは神経突起伸長の誘導は観察されず、また、細胞膜透過に重要なLysを変異させたK7A/K9AキメラNgb変異体においても観察されなかった。以上ことから、キメラNgbは細胞膜を透過し細胞質内に移行後に神経突起を伸長させることが判明した。さらに、遠位のHisをValに置換したH67VキメラNgb変異体においても神経突起の伸長が観察されたことから、片側からのみHisが配位したmono-His型Ngbにも神経突起の伸長能があることが明らかになった。mono-His型NgbはGαi/oとは結合しないことから、神経突起の伸長にはGαi/oとは異なる分子が関与していることが示唆された。また、キメラNgbの神経突起の伸長に重要な残基を解析した結果、神経突起の伸長能は細胞保護能よりも進化的に古い段階で獲得されたことが示唆された。ニューログロビン(Ngb)は酸化ストレスから神経細胞を保護する働きを持つ。以前、我々は、ヒトNgbが酸化ストレス下にヘテロ三量体G蛋白質αサブユニット(Gαi)と特異的に結合しGDP解離阻害因子として働くことを明らかにした。本研究では、ヒトNgbのGlu53, Glu60, Glu118が、Ngbの細胞保護能及びGαi1との結合に重要であることを明らかにした。さらに、ヒトGαi1のLys46, Lys70, Arg208, Lys209, Lys210がヒトNgbとの相互作用に重要であることを明らかにした。以上の結果をもとに、ヒトNgbとGαi1との複合体の構造モデルを提唱することに成功した。本研究では、ヒトAdgb蛋白質の大腸菌での発現系の構築、及び、蛋白質の精製手法の確立を目指した。Adgbは巨大な蛋白質であることから、ドメインごとに分割した各種のAdgb切断片を大腸菌発現系と培養細胞発現系において発現させて解析を進めた。大腸菌発現系では、様々な条件で発現を試み、Adgb切断片の発現の条件を決定し、その精製に成功した。さらに、精製したAdgb断片を抗原にしてポリクローナル抗体を作製した。今後、このAdgbに対するポリクローナル抗体を用いて、Adgbの蛋白質発現解析を推し進めていく予定である。培養細胞発現系では、各種Adgb切断片をHeLa細胞で発現させた。
植物における核DNAの構造変化の分子機構

ニンジンの根の組織片が、脱分化する時、DNAが同調的に複製される。その際、高GC含量の反復配列DNAがより早期から複製し始める。そのDNAについては、未熟単鎖DNA断片から中間複製分子への転換が遅れること、また、新生DNA鎖が完全二重鎖分子になることが、他のDNA成分より遅れることがわかった。われわれは、ソラマメの高度反復配列のFok I配列ファミリ-と1500bpファミリ-、Bam HI配列ファミリ-群の分子構造を既に明らかにしている。本研究は、前者が、Cバンドヘテロクロマチン領域に、後者のうち少しとも250bpファミリ-の配列は、染色体上ほぼ全域にわたって存在することを明らかにした。われわれは、ソラマメの185rRNA遺伝子の全塩基配列(1807bp)を決めた。また、ソラマメとニンジンの5.85rRNA遺伝子の一次構造のデ-タを用いて真核生物の5.85rRNAの分子進化の系統樹を作った。さらに、内部転写スペ-サ-の分子構造も比較した。ソラマメとエンドウマメのrRNA遺伝子の大スペ-サ-の全塩基配列を決定した。ソラマメには5種類の反復配列があるが、エンドウマメでは176bpの1種類しかなく、後者がより単純な構成をしていた。さらに、両植物間では大スペ-サ-の非反復性領域について56-78%の相同性がみられ、両属間の近縁関係が示された。ソラマメとエンドウマメのついて、rRNAの転写開始点をSl法で決めた。それを含む17bpの領域は同種間では同一で、かつトウモロコシやコムギとの間でも高い相同性を示し、機能的な重要性を示唆した。なお、ニンジンのrRNA遺伝子の大スペ-サ-領域の長さの変異性の分子的基盤についても解析した。シロイヌナズナの蛋白合成開始のメチオニンtRNAと、ヒスチジンtRNAの変異遺伝子の一次構造を決定した。植物の核ゲノムの分子構造の分化機構を理解する目的で,rRNA遺伝子(rDNA)tRNA相似DNA配列をクローン化し,構造を解析している.1.rDNA大スペーサー領域の構造解析rDNA大スペーサー領域内で,あるDNA配列が縱列に連続して重複する例は動植物で広くみられている.一般に,その反復領域は転写開始点より上流にあって,その重複が転写効率に関連するといわれている.ところで,ニンジンのrDNAでは,460bp配列の小規模な重複があるが,その配列中には転写開始点,あるいはプロセシングサイトがあり,特色のある構造なることが示された.他方,ソラマメの大スペーサーでは,前駆体rRNAの転写単位の3'側寄りにMluIまたはAccI処理で断片となる325bp配列の反復領域がある.そして,その反復配列群の両側が約150bpの同方向配列で取り囲まれていた.それらの325bp,150bp各配列に相同な配列を含むEcoRI断片が,ソラマメ核DNAのcharon35ライブラリーから発見された.それは高度に規則的に編成されているrDNAとは異質の核ゲノム領域由来のものらしく,その一次構造が現在解析中である.2.tRNA相似配列の解析エンドウマメtRNAに相同性を示す核DNAの2.5,4.5kbBamHI断片がクローン化され,一次構造を決めつつある.2.5kb断片中には,クロバー葉二次構造をとるDNA配列が3個発見された.

可溶性細胞質のtRNAは二次元ゲル電気泳動法で55スポットに分画された.クローン化してクロバー葉構造配列とのハイブリダイゼーションや,分画されたtRNA分子種の一次構造の解析などから,それら3種の配列はtRNAの僞遺伝子だと結論された.サザン法は,その配列のコピー数の多いことを示唆し,それが反復配列の可能性もあり,さらに詳細な解析を進めている.植物の核ゲノムにおけるDNAの構造的多様化機構を探る目的で、ソラマメ、エンドウマメのγRNA遺伝子(γDNA)と、シロイヌナズナのtRNA遺伝子をクローン化して一次構造を調査し、比較をおこなった。1.ソラマメの18SγDNAの全一次構造を決定し、既に報告されているイネ、ダイズ、トウモロコシと比較した。2.ソラマメと、エンドウマメのγDNAの大スペーサー領域の全配列を決定した。3.エンドウマメの大スペーサー領域内には、約175bpの配列のtandem重複がみられ、それ以外の反復配列は無かった。他方、ソラマメでは、長さと反復度の相互に異なる5種類の反復配列が発見された。エンドウマメの175bp反復配列単位は、ソラマメの2種類の反復配列の3'下流部分と5'上流部分から構成されていた。それら以外の流域についても5080%の相同性が認められ、両植物間での近い系統関係が示された。4.エンドウマメ、ソラマメのγRNAの転写開始点が決められた。その近辺の配列は相同性が高く、特に20bp領域は全く同一であった。転写開始点の近傍配列の重複は両植物ではみられず、既に報告したニンジンの場合とは相違していた。5.γRNA遺伝子とはゲノム内所在の異なるtRNA遺伝子について、その核ゲノム内での存在様式を知る目的で、シロイヌナズナからtRNA遺伝子を含む核DNA断片のクローンを集めた。6.3個のフェノールアラニンτRNA遺伝子と、メチオニンとアラニンのtRNAの遺伝子夫々1個を同定し、その上流、下流域の情報を集めた。7.それらの遺伝子はAT含量の高いDNA領域に分布しているが、動物でみられているようなクラスター的遺伝子分布はみられなかった。8.アラニンtRNA遺伝子は、植物での最初の報告である。植物核ゲノムの分子構造の分化機構の理解を目標に、高度反復配列、rRNA遺伝子、tRNA遺伝子の研究を進めた。ニンジンの高GC反復配列DNAは、根の組織が脱分化する際に、他のDNA成分よりも早く複製を始める。放射性チミジンによるラベルの後、DNAを変性庶糖精密度勾配遠心とBND-セルロ-スクロマトグラフィ-で解析した。45Sの岡崎断片が、サイズのより大きい複製中間分子に移行する速度が、その反復配列では遅れること、また、単鎖部分を含むDNA分子から完全二重鎖分子への経時的移行が、その反復配列サテライトDNAでは遅いことがわかった。ソラマメとニンジンの5.8SrRNA遺伝子の一時構造を決定し、真核生物の5.8SrRNAの分子進化の系統樹を作った。植物界の菌界からの分岐時点は、動物界の菌界よりの分岐点よりも後であることが示唆された。5.8SrRNA遺伝子の前後の内部転写スペ-サ-は、前者とは対照的に両植物間で著しく異なっていた。また植物は真核生物のなかで一番短い内部転写スペ-サ-を持つことも示された。シロイヌナズナのtRNA遺伝子のクロ-ンを集めて解析した。蛋白合成開始のメチオニンtRNA
リポソームを用いる臓器特異的外来遺伝子発現システムの開発

種々の陽性荷電リポソームの脂質組成、作製法をin vitroの系で比較検討したところ、脂質分子種としては八木らの開発したDOPE : DLPC : TMAG (2:2:1)の組成のもの、リポソームの大きさ、作製方法では最も簡単に作成できる多重層リポソームがもっともトランスフェクション効率が良く、再現性も良かった。また血清存在下で、リポソームを添加するのみという、細胞培養に好都合で、実験も簡単な方法で十分量の外来遺伝子の発現をみる系をつくることができた。レトロウイルスに特異的な遺伝子治療の試みとして、ウシ白血病ウイルス(BLV)感染細胞に、BLVのLTRの間にジフテリア毒素遺伝子を組み込んだ構築物を作製した。陽性荷電リポソームとの複合体で効率の良いトランスフェクションが可能がなことが示され、さらにこのプラスミドはBLV感染細胞で特異的に発現し、細胞を死にいたらしめることができた。なかなか有効な薬剤の登場しないレトロウイルス感染症の自殺遺伝子を用いる遺伝子治療の可能性を開くものである。これらの実験と平行してin vivo系でも、眼球におけるマーカー遺伝子の発現実験、腎臓組織内へのアンチセンスヌクレオチドの導入の実験をおこなった。眼球においては遺伝子と陽性リポソームの複合体を注入するすることでいろいろな眼球組織にマーカー遺伝子の発現が確認された。さらに点眼するという簡単な方法でも網膜を含む眼球組織に注射器での注入法と同等の遺伝子発現が認められた。種々の陽性荷電リポソームを比較検討した結果ではDOPE : DLPC : TMAGの組成のリポソームと遺伝子の複合体にもっとも活性の高いマーカー遺伝子の発現がみられた。また転写を抑制する活性をもつE2F decoyオリゴスヌクレオチドを腎臓に導入したところ抗Thy1.1抗体で惹起した実験腎炎の進展が抑制された。アンチセンス治療法やdecoyオリゴスヌクレオチド療法はその原理から、応用範囲の広い新しい治療法として注目を集めている。しかしながら通常の投与方法では効率が悪く、高い薬用量となり、まだまだ実用性に乏しい段階である。リポソーム法は簡単で、毒性も低くこれらの治療法の実用化に向けての実現性を高めるものである。陽性荷電リポソーム脂質組成のトランスフェクション効率の比較検討を行った。Dilauroylphosphatidylcholine(DLPC)、dioleoylphosphatidylethanolamine(DOPE)とtrimethylammonioacetyldido-decyl-Dglutamate chloride(T MAG)のリポソーム、DOPEとdimethyloctadecylammonium bromide(DDAB)のリポソーム、DOPEとdimetylaminoethanecarbmoylcholesterol(DC-Chol)のリポソーム、DOPEとdioleyloxypropyltrimethylammonium chloride(DOTMA)のリポソームをin vitroの細胞培養系でルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとする系で調べた。その結果いずれの陽性荷電リポソームでも遺伝子導入は可能であったが、無血清培地ではDC-CholリポソームとDDABリポソームが効率がよかった。また血清存在下ではTMAGリポソーム(DOPE:DLPC:TMAGモル比1:1:0.8)で効率の高い、安定した遺伝子導入がみられた。

またこの組成のリポソームは点眼および眼球内への注入による遺伝子導入においても、効率のよいことが判明した。さらに腎臓疾患の遺伝子治療の試みとして、転写因子E2Fに対するdecoy DNAを合成し、TMAGリポソームで細胞内に導入する実験を行ったところ腎炎モデルで細胞増殖を抑制する効果があることが見いだされた。種々の陽性荷電リポソームの脂質組成、作製法をin vitroの系で比較検討したところ、脂質分子種としては八木らの開発したDOPE:DLPC:TMAG(2:2:1)の組成のもの、リポソームの大きさ、作製方法では最も簡単に作成できる多重層リポソームがもっともトランスフェクション効率が良く、再現性も良かった。また血清存在下で、リポソームを添加するのみという、細胞培養に好都合で、実験も簡単な方法で十分量の外来遺伝子の発現をみる系をつくることができた。これらの実験と平行してin vivo系でも、眼球におけるマーカー遺伝子の発現実験、腎臓組織内へのアンチセンスヌクレオチドの導入の実験をおこなった。眼球においては遺伝子と陽性リポソームの複合体を注入するすることでいろいろな眼球組織にマーカー遺伝子の発現が確認された。さらに点眼するという簡単な方法でも網膜を含む眼球組織に注射器での注入法と同等の遺伝子発現が認められた。種々の陽性荷電リポソームを比較検討した結果ではin vitro系で効率の高かったDOPE:DLPC:TMAGの組成のリポソームと遺伝子の複合体にもっとも活性の高いマーカー遺伝子の発現がみられた。また腎臓内への転写を抑制する活性をもつE2F decoyオリゴスヌクレオチドを導入したところ抗Thy1.1抗体で惹起した実験腎炎の進展が抑制された。
慢性関節リウマチの疾患感授性遺伝子解析

2)In-gel competitive reassociation(IGCR)法により、二つの組織間の遺伝子発現のサブトラクションを行い、一方の組織で発現が亢進していると思われる遺伝子を選別することが可能となった。3)IGCR法により、RA患者関節滑膜とOA患者関節滑膜の遺伝子発現を比較した。OA由来cDNAをdriver、RA由来cDNAをtesterとしてサブトラクションを実施した結果得られたライブラリーのうち、300bp以上のものをクローニングし、70個についてシークエンスを行った。その結果、33個の既知の遺伝子、6個の未知の遺伝子を確認した。順次リアルタイムPCR法によりRA、OA関節滑膜間の遺伝子発現を比較する予定である。4)一方がRAであり、他方が健常である一卵性双生児2組の末梢血由来血球細胞より、ゲノムDNA、cDNAを作成し、それぞれIGCR法によりサブトラクションを行った。ゲノムDNA間の比較では明確な差異は認められなかった。一方、cDNA間の比較では、シークエンスにより、kinase関連・炎症関連遺伝子等が認められ、これらについて解析を実行中である。
口腔機能別オーラルケア・マネジメントの全身合併症低下に関する検討

消化管外科の周術期口腔機能管理患者に対して下記の調査を行った。摂食、咀嚼、嚥下に関する調査。食事内容に関する調査、嚥下状態に関する調査を入院カルテによる調査を行った。口腔検診(現在歯数、義歯の有無、歯周組織の状態、粘膜の状態、舌苔、口臭)口腔機能及び細菌の客観的検査(15)。唾液湿潤度の測定:口腔乾燥の簡易測定法として開発されたムーカスを用い測定した。細菌数の測定:口蓋最深部または舌背から滅菌綿棒を用いて1回転して資料を採取し細菌カウンターを用いて測定した。摂食、咀嚼、嚥下機能、など口腔機能カテゴリーで層別化した。誤嚥性肺炎など合併症、医療費などを目的変数とし、年齢、性別、オーラルケア・マネジメント前後での口腔検診、口腔機能及び細菌の客観的検査を説明変数とした単変量解析を実施した。単回帰分析によって有意となった項目を説明変数とし多変量解析を実施した。P<0.05を統計学的に有意とし、解析にはJMPpro14を使用した。咀嚼機能に関する検査に使用を予定していた咀嚼力判定ガム(ロッテ社製)が入手困難となり、代替案を検討していたが、現在までにエビデンスのあるシステムが販売されていない。また、唾液の性質を測定する検査機器の新製品が2016年末に登場し(ライオン株式会社SMTとアークレイ株式会社SiLL-Ha)、どちらの機器を使用すべきか、学会などの反応を調査しており、研究を今年度までに終えることができなかった。唾液吐出液から濁度とアンモニアの測定:唾液吐出液から濁度とアンモニア濃度を測定する。唾液は3ccの蒸留水を口に含み10秒間左右に軽く動かした後に吐出して採取する。Salivary Multi Test(SMT)を使用して、清掃度の基準として使用する。カンジダの測定:カンジダ数はオーラルケアの指標となる事ことから、舌より滅菌麺棒で10回ずつスワップして資料を採取して、クロムアガーカンジダ培地に塗抹し48時間培養後にカウントする。定量化した口腔環境、口腔機能と患者の疾患、全身状態、要介護度、医療費との関係について横断的に調査する。カルテなどの情報から、全身の状態に関する調査(要介護度、認知症高齢者の日常自立度、既往歴、現疾患、服薬状況、栄養状態、医療費、検査内容、内服薬)を行い、口腔環境や口腔機能が全身状態、要介護度、医療費に与える影響について検討する。口腔機能別オーラルケアの実施:口腔機能の状態によって患者をカテゴリー分類する。口腔機能を評価し段階的にカテゴリー化する。それぞれのカテゴリーでオーラルケアの方法を検討し、オーラルケアマニュアルを作成する。オーラルケアマニュアルをもとに、それぞれの患者に対しオーラルケアを実施する。これにより実施者間でのバイアスを軽減させる事ができる。口腔機能別オーラルケアによる誤嚥性肺炎など合併症・医療費の低減を実証:摂食、咀嚼、嚥下機能別のオーラルケア・マネジメントの実践が口腔と全身にどのような影響を与えるかを解析する。具体的には、研究分担者らの京都大学病院およびその関連病院において、個々人および家族の同意を得て、実施・評価する。A)入院患者を対象とし、口腔環境と口腔機能の定量的な評価法を検討する。対象:当科紹介受診された周術期管理を行った患者を対象とする。月に約130名程度が紹介受診されており、年間で約1500から2000人程度の患者が受診されている。そのため、研究の第一段階として1500人程度を目標に横断的調査を開始する。1摂食、咀嚼、嚥下に関する調査1.食事内容に関する調査、嚥下状態に関する調査を入院カルテによる調査を行う。2.咀嚼機能に関する検査:咀嚼力判定ガム(ロッテ社製,平野ら,2001)を義歯の有無に関わらず1分間咀嚼し色の変化を観察する。色の変化は色測計を用いる。2口腔検診(現在歯数、義歯の有無、歯周組織の状態、粘膜の状態、舌苔、口臭)3口腔機能及び細菌の客観的検査(15)1.唾液湿潤度の測定:口腔乾燥の簡易測定法として開発された方法を用い、Kiso-Wetを垂直に10秒間、摂食・保持後に取り外し湿潤幅を測定.(未実施)2.細菌数の測定:口蓋最深部または舌背から滅菌綿棒を用いて1回転して資料を採取しPCRインベーダー法にて総細菌数の測定。(未実施)3.唾液吐出液から濁度とアンモニアの測定:唾液吐出液から濁度とアンモニア濃度を測定する。(未実施)唾液は3ccの蒸留水を口に含み10秒間左右に軽く動かした後に吐出して採取する。濁度は、光電比色計を用い660nmの吸光度による測定。アンモニアの測定は、市販試験紙・アミノチェックTMを用い、発色の程度をポケットケムBA(アークレイ(株))で測定する。(未実施)4.カンジダの測定:カンジダ数はオーラルケアの指標となる事ことから、舌より滅菌麺棒で10回ずつスワップして資料を採取して、クロムアガーカンジダ培地に塗抹し48時間培養後にカウントする。(未実施)学内倫理委員会の申請、更新に期間を要したため。

A)入院患者を対象とし、口腔環境と口腔機能の定量的な評価法を検討する。対象:当科紹介受診された周術期管理を行った患者を対象とする。月に約130名程度が紹介受診されており、年間で約1500から2000人程度の患者が受診されている。そのため、研究の第一段階として1500人程度を目標に横断的調査を開始する。1摂食、咀嚼、嚥下に関する調査1.食事内容に関する調査、嚥下状態に関する調査を入院カルテによる調査を行う。2.咀嚼機能に関する検査:咀嚼力判定ガム(ロッテ社製,平野ら,2001)を義歯の有無に関わらず1分間咀嚼し色の変化を観察する。色の変化は色測計を用いる。2口腔検診(現在歯数、義歯の有無、歯周組織の状態、粘膜の状態、舌苔、口臭)3口腔機能及び細菌の客観的検査(15)1.唾液湿潤度の測定:口腔乾燥の簡易測定法として開発された方法を用い、Kiso-Wetを垂直に10秒間、摂食・保持後に取り外し湿潤幅を測定。2.舌圧の測定。(未実施)3.細菌数の測定:口蓋最深部または舌背から滅菌綿棒を用いて1回転して資料を採取しPCRインベーダー法にて総細菌数の測定。(未実施)4.唾液吐出液から濁度とアンモニアの測定:唾液吐出液から濁度とアンモニア濃度を測定する。アンモニアの測定は、市販試験紙・アミノチェックTMを用い、発色の程度をポケットケムBA(アークレイ(株))で測定する。(未実施)5.カンジダの測定:カンジダ数はオーラルケアの指標となる事ことから、舌より滅菌麺棒で10回ずつスワップして資料を採取して、クロムアガーカンジダ培地に塗抹し48時間培養後にカウントする。(未実施)学内倫理委員会の申請、更新に期間を要したため。また、個人情報保護法の改正により、患者個人情報の管理方法、データでの保存方法について検討を要したため。消化管外科の周術期口腔機能管理患者に対して下記の調査を行った。摂食、咀嚼、嚥下に関する調査。食事内容に関する調査、嚥下状態に関する調査を入院カルテによる調査を行った。口腔検診(現在歯数、義歯の有無、歯周組織の状態、粘膜の状態、舌苔、口臭)口腔機能及び細菌の客観的検査(15)。唾液湿潤度の測定:口腔乾燥の簡易測定法として開発されたムーカスを用い測定した。細菌数の測定:口蓋最深部または舌背から滅菌綿棒を用いて1回転して資料を採取し細菌カウンターを用いて測定した。摂食、咀嚼、嚥下機能、など口腔機能カテゴリーで層別化した。誤嚥性肺炎など合併症、医療費などを目的変数とし、年齢、性別、オーラルケア・マネジメント前後での口腔検診、口腔機能及び細菌の客観的検査を説明変数とした単変量解析を実施した。単回帰分析によって有意となった項目を説明変数とし多変量解析を実施した。P<0.05を統計学的に有意とし、解析にはJMPpro14を使用した。咀嚼機能に関する検査に使用を予定していた咀嚼力判定ガム(ロッテ社製)が入手困難となり、代替案を検討していたが、現在までにエビデンスのあるシステムが販売されていない。また、唾液の性質を測定する検査機器の新製品が2016年末に登場し(ライオン株式会社SMTとアークレイ株式会社SiLL-Ha)、どちらの機器を使用すべきか、学会などの反応を調査しており、研究を今年度までに終えることができなかった。定量化した口腔環境、口腔機能と患者の疾患、全身状態、要介護度、医療費との関係について横断的に調査する。
トンネル効果による高温超伝導体のエネルギ-ギャップの測定

本研究では主に3つのテ-マについて研究した。それぞれについて以下にその概略を示す。[1]主な超伝導物質について、そのエネルギ-ギャップの値、および2△/kTcの値を系統的に調べてきた。(1)従来から知られているLiTi_2O_4、BaPb_<1-x>BixO_3のエネルギ-ギャップを測定し従来のBCS理論から期待される値3.5を得た。(3)Bi系では2△/kTcの値は大変大きく(2△/kTc10)更に大きな異方性が存在する。Bi系のみなぜこのように大きな値をとるのか今の所明らかでない。(4)更に、電子注入型超伝導体(Nd_<1ーx>Cex)_2CuO_4のトンネル効果の実験も行った。得られた値は(2)のLa系のそれよりか少し大きい。[2][1]と平行して新しい超伝導体の探索を行ってきた。本研究費で発見した新物質としてはLn-Ce-Ba-Cu-O(Ln:Eu、Nd)系がある。さらに本物質をU.S.R.法を用いて相図を作成した。最近、新しいnon-Cuの超伝導体を発見したがそれについて現在単相化を行っている。[3]電子注入型超伝導体が従来のホ-ル型超伝導体と同じ物理的性質をもっているかどうかは大変重要な問題である。我々は、これら超伝導体の母物質Nd_2CuO_4,Pr_2CuO_4を作成して中性子回折を行い、これらの物質の磁気構造、二次元のスピン相関と超伝導の関係を調べた。
革新的デバイスを指向した有機両極性半導体の開発

本研究は、高移動度かつ安定に両極性挙動を示す有機半導体材料の開発と、それを用いて高性能なデバイスや新奇なデバイスを作製することを目的として行われたものである。本年度は、新規開発したペリレノチオフェンジイミド(PTI)および昨年度報告したペリレノジチオフェンジイミド(PDTI)を基盤として、両極性有機半導体材料を開発し、報告を行った。本研究は、高移動度かつ安定に両極性挙動を示す有機半導体材料の開発と、それを用いて高性能なデバイスやこれまでになかった新奇なデバイスを作製することを目的として行われたものである。本年度では、両極性有機半導体として“適したHOMO/LUMOレベル"を有する半導体分子の合成を行った。上記の“適したHOMO/LUMOレベル"とは、-5.0 5.5 eV(HOMO)および-4.0 -4.5 eV(LUMO)の範囲のものであるが、現状報告されている有機半導体骨格では要求されるLUMOレベルを満足することが困難であった。そこで、強い電子受容性を示し、かつ容易に化学的修飾が可能な有機半導体骨格である、ナフトチオフェンジイミド(NTI, J. Mater. Chem. C, 2016, 4, 8879.)を開発した。NTIを用いることで十分なLUMOレベルを持つ半導体分子(LUMO:-3.9 -4.3 eV)を種々合成することができ、特に、強い電子供与性分子骨格であるインダセノジチオフェン(IDT)と組み合わせた半導体分子(IDT-NTI)は、両極性有機半導体として適したHOMO/LUMOレベルを示した(LUMO:-4.0 eV, HOMO: -5.3 eV)。実際にIDT-NTIを用いて有機トランジスタデバイスを作製したところ、大気中でも安定に両極性挙動を示すことが明らかとなった。さらに、IDT-NTIは近赤外領域までの長波長の光吸収特性を示したため、光電変換デバイスへ応用したところ、電子アクセプターをして機能し、7%以上の良好な光電変換特性を示すことを確認した。平成28年度は高性能な両極性有機半導体の開発を目標とし、半導体分子の合成を行った。新規に開発した有機半導体骨格であるナフトチオフェンジイミド(NTI)と、優れた特性を示すことが報告されているインダセノジチオフェン(IDT)を組み合わせることで、新規半導体分子IDT-NTIを合成した。IDT-NTIは目標値を満足するHOMO/LUMOレベル(LUMO:-4.0 eV, HOMO: -5.3 eV)を有し、ねらいどおり大気安定な両極性トランジスタ特性を示した。現状ではIDT-NTIの電荷移動度がそれほど高くないことが問題となっているが(10-3 cm2/Vs)、可溶性置換基を変更することで向上をはかることが可能であると考えられる。また、IDT-NTIは近赤外領域までの光吸収特性と高い光電変換特性を示すことも明らかとなったため、太陽電池やフォトダイオードなどの光応答デバイスへの応用も期待できる。さらに、過去に報告した両極性半導体分子(PNDTI-BT、JACS, 2013, 135, 114445、LUMO:-4.1 eV, HOMO: -5.6 eV)を改良し、より均衡のとれた正孔・電子移動度を示す半導体分子(PNDTI-BT-DP、Adv. Mater., 2017, 29, 1602893)を報告した。PNDTI-BT-DPを用いて、単一材料での相補型インバータデバイスを作製したところ、極めて良好な特性(GAIN: 180, Vdd =40 V, W/L = 1500/40)を示した。本研究は、高移動度かつ安定に両極性挙動を示す有機トランジスタ材料の開発、および、開発した材料を用いて高性能または新奇な有機半導体デバイスを作製することを目的として行われたものである。本年度は、昨年度報告したナフトチオフェンジイミド(NTI)を用いたドナー-アクセプター型両極性半導体材料の開発を行った。開発した材料を用いたトランジスタは、それほど高いキャリア移動度を示さなかったものの、大気中で安定な両極性挙動を示した(電子移動度: 10-3 cm2 s-1 V-1,正孔移動度:10-4 cm2 s-1V-1)。加えて、大気安定かつ高性能な有機両極性半導体を実現できる分子骨格として、ペリレノジチオフェンジイミド(PDTI)を設計し、その合成に成功した。PDTIは、電極の仕事関数に近いHOMOLUMOレベルと、分子全体に非局在化したHOMOおよびLUMOを持った分子骨格として分子設計されたものであり、この分子骨格を用いることで昨年度までに報告した材料を用いた両極性トランジスタデバイスが抱えていた、1正孔キャリアの注入障壁が電子キャリアのそれに比べて大きい、2バランスの取れた正孔、電子伝導特性を得ることが難しい(偏ったHOMOおよびLUMOに由来する)といった欠点が克服できることが期待できる(manuscript in preparation)。加えて、PDTI誘導体は、その狭いHOMO-LUMOギャップに由来した近赤外領域までの長波長領域に吸収を持つため、赤外光の利用をねらう有機光電変換デバイスへの応用も期待できる。平成29年度は高性能な有機両極性材料の開発を目指し、目標に適した新規な半導体分子骨格の開発を行った。

昨年度までに報告したナフトジチオフェンジイミド(NDTI)やナフトチオフェンジイミド(NTI)などの半導体分子骨格を用いた両極性材料の持つ電子構造的な欠点を改善可能なものとしてPDTIを設計し、開発することができた。PDTIは期待した物性(NDTI、NTIと比較して高いHOMOレベル、分子全体に非局在化したHOMOおよびLUMO)を持つだけでなく、熱化学的にも安定であり、合成もより安価かつ容易に行うことが可能であった。実際にPDTI誘導体を用いて作製したトランジスタデバイスは、大気中でp型、n型特性において極めてバランスの取れた値を示すことも明らかとなった。PDTIを用いることで、本研究で標的とする“高性能な"両極性材料(高移動度、バランスの取れた正孔および電子伝導特性、大気安定に両極性を示すトランジスタを実現できる材料)の実現が期待できる。さらに、韓国浦項工科大学校のグループとの共同研究において、両極性半導体材料であるナフトジチオフェンジイミドポリマー(PNDTI-BT-DP)を用いたスプリットゲートトランジスタを作製した(manuscript submitted)。昨年度、自己組織化単分子膜を利用した選択的単極性化を報告したが、スプリットゲート構造によっても、PNDTI-BT-DPを用いたトランジスタ素子の単極性化が可能であることを見出した。加えて、同グループとの共同研究において、PNDTI-BT-DPを利用したトランジスタデバイスの極性が、高真空下で変化することを見出した。この結果により、両極性半導体PNDTI-BT-DPを用いて、真空センサーやガスセンサーへ応用を行うことが期待できる。以上のことから、現時点で本研究は当初の計画以上に進展していると言える。本研究は、高移動度かつ安定に両極性挙動を示す有機半導体材料の開発と、それを用いて高性能なデバイスや新奇なデバイスを作製することを目的として行われたものである。本年度は、新規開発したペリレノチオフェンジイミド(PTI)および昨年度報告したペリレノジチオフェンジイミド(PDTI)を基盤として、両極性有機半導体材料を開発し、報告を行った。今後は、本年度合成した大気安定に両極性挙動を示す半導体分子(IDT-NTIおよびPNDTI-BT-DP)を主軸として、可溶性置換基の変更などの分子修飾を施すことで、正孔・電子移動度の向上を目指して材料の開発を行っていく。また、他の候補分子についても更なる可能性を求めて合成開発を行っていく予定である。デバイス応用に関しては、今年度はPNDTI-BT-DTを用いた相補型インバータデバイスを報告したが、この発展研究として同材料を用いた低電圧駆動デバイスの作製を行う。また、IDT-NTIを用いた光電変換デバイスの開発も行っていく予定である。最終年度は、本年度開発したPDTIを主軸として、有機両極性半導体材料の開発を行う。PDTI誘導体について、安定性などの問題は既にクリアできているため、現時点で残された課題は正孔・電子移動度の向上である。これは可溶性置換基の最適化により、固体中での構造を制御することにより達成可能であると考えている。NDTIやNTI誘導体を用いて蓄積した知見を活かして、課題の達成を目指す。また、開発した材料を用いた新奇なデバイスへの応用も、今年度に引き続いて行っていく。具体的には、両極性半導体材料を用いたDual-Modeガスセンサーや、スプリットゲートトランジスタによるCMOSインバータなどの作製を予定している。
ネムリユスリカの乾燥耐性メカニズムの特定と関連遺伝子の機能解析

極限的な乾燥耐性能力を持つネムリユスリカ幼虫は乾燥しも死なない。再水和後に蘇生し、普通に発生し続ける。その乾燥耐性の分子機構を解明するために、蘇生過程の遺伝子発現を調べた。蘇生直後は抗酸化因子などのストレス関連遺伝子がまだ確認できたが、徐々に代謝が再開し、24時間後にDNAなどの修復が見られた。DNAの修復が影響する細胞周期のシンクロが認められなかった。一方、酸化ストレスにより、乾燥ストレス関連の遺伝子発現を誘導できるので、活性酸素が乾燥耐性の重要な引き金であると考えられる。ネムリユスリカの培養細胞で行った酸化ストレス応答の転写因子Cnc-Cを標的としたRNAi実験の結果はその仮説を裏付ける。ネムリユスリカ幼虫の極限的な乾燥耐性能力(アンヒドロビオシス)の分子メカニズムを解明するために、24年度は乾燥幼虫の蘇生過程における遺伝子発現の変動をマイクロアレイにより解析し、RNAiを開発し、酸化ストレス応答遺伝子を中心に機能解析を進めてきた。まずは、乾燥幼虫、蘇生後1時間の幼虫、蘇生後24時間の幼虫と通常の幼虫の4点でマイクロアレイ実験を行い、遺伝子発現の変動を特定した。その結果、乾燥幼虫から蘇生1時間までは乾燥耐性特異的な遺伝子群(抗酸化因子、シャペロンタンパク質、トランスポーターなど)が強く発現していた。一方、蘇生24時間後に一般代謝の回復が著しかった。蘇生後1時間から代謝を表す酵素活性機能の割合が増えはじめていたが、24時間後は消化機能やヘモグロビン生産などの通常代謝指標も回復しはじめていた。しかし、蘇生24時間後でもまだ通常幼虫のレベルまで回復していなかった。続いて、遺伝子機能解析のためにネムリユスリカの実験法を開発しつづけた。ネムリユスリカ由来の培養細胞Pv210にsiRNAをエレクトロポレーションにより導入する方法と幼虫にsiRNAとトランスフェクション試薬の混合液を微量注入するという導入法を開発した。酸化ストレスのセンサーであるKeap1遺伝子を目的にして、Pv210培養細胞では独立した3つのsiRNAで同様に40%までの遺伝子発現抑制率を得ることに成功した。幼虫では20%の確実なRNAi効果をえることができた。一方、酸化ストレス応答の転写因子であるCnc-Cを目的したRNAi実験により、培養細胞Pv210では80%という確実な発現抑制効果が得られた。下流遺伝子に対するCnc-CのRNAiの影響を確認したところ、Cnc-Cは基本代謝の遺伝子発現を抑制し、乾燥耐性関連遺伝子の発現を誘導したが、抗酸化因子に対する効果が見られなかった。ネムリユスリカの極限的な乾燥耐性能力(アンヒドロビオシス)の分子機構を解明するために、25年度はネムリユスリカ幼虫の乾燥過程と蘇生過程における細胞周期を検出し、マイクロアレイにより蘇生過程における遺伝子発現の解析を継続した。一方、遺伝子機能解析ツールの開発を進め、RNAiと遺伝子導入法を改良した。酸化ストレス応答メカニズムを中心に解析を行った。まずは、アンヒドロビオシスにおける細胞周期がシンクロサイズするか否かを確認するために免疫染色により細胞分裂のマーカーであるリン酸化ヒストンpH3を検出した。中腸とマルピギ管では細胞分裂が常に検出された。一方、蘇生一時間後に特異的なシグナルが脂肪体の核の中に検出された。乾燥幼虫の蘇生過程における遺伝子発現のマイクロアレイ解析を詳細に継続した。代謝回復を指標する遺伝子と共に様々な修復機構(筋肉、クチクラ、DNAや細胞膜)に関わる遺伝子が誘導されていることを確認した。また、蘇生過程ではポリアミンが重要な役割を果たしていることが示唆された。遺伝子機能解析に関しては、酸化ストレス応答機構の中心に働く転写因子Cnc-Cを標的にしてRNAi実験を継続した。ネムリユスリカの培養細胞Pv11でもPv210株と同様にCnc-Cの遺伝子発現量を80%抑制することができ、そのRNAi効果が一周間も維持できることも確認した。以前の結果と同じく、Cnc-Cが基礎代謝の遺伝子発現を抑制し、乾燥耐性関連の遺伝子発現を誘導していることも確認した。最後に遺伝子のKnock-in技術を開発するために、ネムリユスリカ由来のGAPDHプロモーターを含んだベクターをネムリユスリカ幼虫に注入し、蛍光タンパク質GFPの過剰発現を誘導することに成功した。この技術は今後の解析に役立つと期待している。ネムリユスリカ幼虫の極限的な乾燥耐性能力(アンヒドロビオシス)の分子メカニズムを解明するために、23年度は酸化ストレス応答を中心に研究進めてきた。まず、パラコート処理によって、ネムリユスリカ幼虫とネムリユスリカ由来の培養細胞Pv210を酸化ストレスに暴露し、マイクロアレイ解析によって酸化ストレスに応答する遺伝子群を同定した。