hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鱗食性シクリッドが示す左右性行動の神経基盤を行動学的・生理学的に探る

(2)鱗食行動の行動成分のうち左右差が現れる胴の屈曲運動が,後脳のM細胞で駆動される逃避運動に酷似することを明かにした.(1)と(2)の研究成果はPLoSONE (2012)に発表し,さらに新聞・テレビ・ラジオ報道でも大きく取り上げられ国内外に反響をよんだ.(3)当初の予想を超えて,視覚入力が鱗食行動の左右差を発現する上で重要な役割を果たすことが見出され,左右性の神経基盤に関して,M細胞の上流回路が絞り込まれたことは大きな発展である.(4)M細胞は鱗食シクリッド(Perissodus microlepis)と類似した進化的背景をもちながら食性が大きく異なるタンガニイカ湖産ベントス食魚(Cyphotilapia frontosa),デトリタス食魚(Aulonocranus dewindti)について形態学的・電気生理学的に同定し比較できた.(5)鱗食行動におけるM細胞の活動計測については,当初の電気生理学的手法と無線送信を組み合わせるシステムは困難を極めたが,神経活動に伴うimmediate early genesを指標にして目的を達成した.(6)鱗食魚の行動発達については,タンガニイカ湖で捕獲した稚魚の胃から捕食した鱗を採取し,左右性の解析が始まった.左右性の獲得が学習によるか否かを推定できると期待される.(1)鱗食行動の左右性の発現には,視覚入力が重要な役割を果たすと考えられるので,明視野と暗視野での鱗食行動の運動力学的な解析を進める.(2)immediate early genesを指標にした神経細胞活動の解析を,M細胞およびその上流の回路(視蓋など)にさかのぼって行う.(3)稚魚の鱗食行動を,胃の内容物あるいは直接高速度撮映により解析し,鱗食行動の発達過程および左右性の獲得過程を調べる.(4)以上の研究成果を論文にまとめるとともに国際学会で発表する.主に(1)シクリッドの飼育用品,(2)行動計測に用いる物品,(3)研究成果の発表のための投稿料や国際学会への旅費に用いる.
新規Akt結合蛋白の機能解析

Protein kinase B/Akt(以下Aktと呼ぶ)はセリン、スレオニンキナーゼであり、受体型チロシンキナーゼの下流のシグナル伝達因子として、細胞増殖、生存などに重要な役割を果たしていることが明らかになっている。Aktは原癌遺伝子の一種であり、その恒常的な活性化は細胞の癌化と密接に関わっていることが多くの例で示されている。現在までにAktによってリン酸化される基質蛋白質が多数同定され、その生理学的、病理学的意義が解析されてきたが、Aktによる癌化促進機構は必ずしも明らかにはされていない。特に浸潤性の高い悪性の癌とAkt活性化に相関があるという報告もあるが、その機構は不明である。われわれはAktシグナル伝達経路の役割を解明する目的で、yeast two hybrid法を用いてAkt結合蛋白質の同定を行った。その結果、2つの独立したクローンを得、塩基配列を決定したところ、2つのクローンはoverlapした同じ遺伝子の配列を有していることが判明した。Aktのどのドメインに結合するかを詳細に検討した結果、AktのC末端領域と特異的に結合した。全長cDNAのアミノ酸配列の解析では既知の機能ドメインはなく、全く新規の分子である。C末端領域にAktによってリン酸化されるコンセンサス配列が存在し、in vivo kinase assayでAktによってリン酸化されることから、Aktの新規基質であると推定された。作製した抗体で細胞内局在を検討したところ、移動する細胞の先端部でアクチン細胞骨格系と共局在することから、細胞の移動、接着あるいは浸潤を制御している可能性が示唆された。よって今日まで研究が進められているAktの基質とは全く異なる機能を有している可能性が高く、未知であった細胞運動、癌浸潤におけるPI3キナーゼ/Akt系のシグナル伝達の役割を解明できるものと期待できる。
ドイツ・ロマン派の超域言語論的研究

本研究の立てた課題は、ドイツ・ロマン主義という文字通りの生粋ドイツ的に見える精神運動がその内実においていかに一国民国家と一言語の枠を超えた領域に広がる超域的な運動であったかを、今日のポストナショナルな時代に即応した形で考えることであった.例えば東欧諸国の民族主義運動に与えたドイツ・ロマン主義の政治思想、日本の民族学の成立に対するドイツ・ロマン主義の影響、あるいはドイツ・ロマン主義の神話学がフランス象徴主義に与えた甚大な影響など、予期した広がりは十分獲得できたと考えている。しかし空間的地域的限定を越えることだけがドイツ・ロマン主義の唯一の特質なのではない。学際性や知的越境といった、学問領域としての「超域性」もまたドイツ・ロマン主義の特質である。本研究が意識的に行ったのは、文学作品に研究対象に絞らずにむしろ一見文学とも哲学思想とも関係のなさそうな領域での言語現象の分析(言語態分析)を通してであった。例えばマルクスの『資本論』におけるロマン主義的神話的表象の活用や、クライストにおける批判的大学経営思想、アーリア・ゲルマン民族原郷問題というディスクールの創始者でフェルディナン・ド・ソシュールの言語学上での師でもあるアドルフ・ピクテとロマン主義の関係などである。ドイツ・ロマン主義の空間的・学問的超域性と密接に絡んだ問題群は、イエーナやベルリンといった近代の大学制度の起点を形成したドイツ・ロマン主義の側面であった。研究分担者の多くはドイツのヘーリッシュやキットラーフランスのラクー・ラバルト、アメリカのバーティといった多様な論客の参加を得て開催された二つの国際的シンポジウム『ロマン主義コロキウム』(1998年3月)、東京大学国際シンポジウム『知の総合。ドイツ・ロマン主義のディスクール』(1998年9月)を企画・立案し、本研究の掲げた課題を個々の事例において追求した。初年度の平成9年度はドイツ・ロマン派の雑誌とゲルマン語文献学、特にゲルマン神話学関連の図書を購入し、研究基盤を整えることに勤めた。ミュンヒェン宇宙論派に関する研究をいかに進めるべきかをベルリン大学ゲルト・マッテンクロット教授やハンブルグ大学のミヒャエル・グロースハイム教授、チュービンゲン大学のバ-ル・ミュラー氏と討議し、当面、その個々の思想家に関する論文集を出版する計画を立て、現時点では臼井はクラ-ゲスとシューラーに関する論考を送付した。刊行はともに平成10年度になる。その他、オーストラリア・アデレ-ド大学のトニ-・スティーヴンス教授、ドイツ・トリア-大学のユルリングス教授、スイス・バ-ゼル大学のガブリエル・ブラントシュテッター教授、ドイツ・ミュンヒェン大学のゲルハルト・ノイマン教授などとドイツ・ロマン主義の細目を論じ合う機会を得た。研究分担者の一人、川中子義勝はその長年のハーマン研究によってドイツ・ミュンスター大学よりハーマン賞を受賞した。科研2年度の平成10年度はインドゲルマン語関係の文献、特にゲルマン神話学関連の雑誌に重点をおいて図書を購入した。オーストリア・アデレイド大学からエンゲルハルト・ヴァイグル教授を招待し、ドイツ・ロマン主義の基本的理念がアレクサンダー・ヴォン・フンボルトを介して新設ベルリン(フンボルト)大学の総合的学問理念に結実して行く時点に焦点を合わせて講演・討論会を開いた。対仏半反ポレオン戦争という国家的危機意識を背景とするドイツの学問制度の中に「神話学」というテーマが登場し、ドイツ・ロマン主義の文学・哲学の中心的ディスクールを形成したが、臼井はこの土壌の一角から後に民族主義的ゲルマン・アーリア主義が生長することを、特に北方ゲルマン神話を代表する『エッダ』の受容史を通じて論じた(論文は来年度、発表する予定)。本科研メンバーの一人川中子義勝は国際的なハーマン賞を受賞し、ドイツに講演旅行に赴いた。

今年度は、本科研のメンバーを中心に東京大学国際シンポジウム『知の総合-ドイツ・ロマン主義の知のディスクール』(平成10年9月14日から18日)を開催したが、来年度は本科研の締めとして、テュービンゲン大学よりマンフレート・フランク教授を招待し、ノヴァーリスの言語哲学を核とする討論会を計画し、現在、その準備を進めている。科研最終年度の平成11年度は、ゲルマン神話関係の研究を進める一方、日本に焦点を合わせて研究会を重ねた。とくに学生の参加を奨励しつつ開いた月例研究会で重視したのは、日本浪蔓派とそれに前後する日本の文芸思潮であった。志賀直哉や川端康成や横光利一などに代表される白樺派や新感覚派などはヨーロッパの新ロマン主義的潮流に対応しているが、するとりわけ初期ロマン主義の影響の濃いのは日本浪蔓派である。ドイツ・ロマン主義はその核心においてナショナリズムを用意した思想運動であったが、特殊に日本的な美と日本国家の理想像の追求する日本浪蔓派がドイツ・ロマン主義の理論構築に多くを負っていることはなお深く追求されるべきテーマとして残っている。とりわけ、明治以降のナイション・ステイトの立ち上げと日清・日露の戦争を経て、やがて軍国化する日本において独自の論陣を展開した保田興重郎は深い問題を提示している。21世紀を「民族の時代」と考えるのが通例であるとすれば、そうした民族や国家や言語に関する言説を最初に成立させた存在として新たにドイツ・ロマン主義が問題になっている。民族という問題系と世界的普遍性という矛盾する問題系を併せ持ったドイツ・ロマン主義特有の問題構成を精密に見当してみる必要がある。現在、科研成果報告書を、世界の各地域に跨り、かつ本質的問題設定において相互に連関性のある論集としてまとめるべく努力している。
代謝酵素・トランスポーターの機能協関を考慮した薬物動態の定量的予測システムの開発

本研究では、肝臓・腎臓・小腸といった薬物の吸収や排泄に重要な臓器における代謝酵素・トランスポーターの協調的な役割について定量的に考察するための基盤構築を目標とした。腎臓においては、LLC-PK1細胞に取り込みトランスポーターOAT1,OAT3を発現させることで経細胞輸送が観察できる系を構築し、種々の化合物のapical側のトランスポーターの関与を示唆した。また、apical側のトランスポーターとしてMrp4に着目し、adefovirやceftizoximeなどの排出に関与していることをノックアウト動物を用いた解析から明らかにした。肝臓については、代謝酵素のヒトにおける発現誘導時のクリアランス予測法を確立し、CYP3A4誘導時の薬物動態の予測が良好に出来ることを示した。さらに、肝血管側のトランスポーターであるMrp3が、fexofenadineやmethotrexateといった未変化体薬物の動態に影響することをノックアウト動物や遺伝子発現系を利用して、初めて実証した。さらに、小腸においては、排出トランスポーターBCRPと硫酸抱合酵素SULTの発現分布が共に小腸下部に多いことを示すとともに、4-MUSやminoxidil sulfateなど硫酸抱合体の管腔側への排出が小腸下部で多いことを実証し、SULTとBCRPによる協調的な異物解毒機構を明らかにした。さらに、BCRPは、dantrolene, prazosinのような薬物や、MelQx,PhIPのような発がん性物質をも基質とし、脳内・精巣内への分布を決めるトランスポーターとしても機能していることを示した。また、その排出は、P-gpとBCRPで化合物の物性により寄与が決まることも示した。また、小腸内におけるCYP3A4の薬物間相互作用を定量的に示すための方法論を構築し、midazolamとketoconazoleの薬物間相互作用を、見かけの消化管容積を導入することで、良好な予測が可能となることを示した。ブタ近位尿細管由来細胞であるLLC-PK1細胞をtranswell上に単層培養することで、各種有機アニオン類の経細胞輸送を観察した。その結果、LLC-PK1細胞では経細胞輸送が見えない化合物について、腎取り込みトランスポーターであるrat Oat1,Oat3を発現させると、これらはbasal側に発現し、これらそれぞれの代表的な基質であるp-aminohippurate (PAH), dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS)の経細胞輸送が、それぞれの発現細胞において観察されたことから、おそらくLLC-PK1細胞には内因性の排出トランスポーターが発現していることが示唆された。一方、ループ利尿薬であるfurosemide, bimetanide、チアジド系利尿薬であるtrichlormethiazide, hydrochlorothiazide、HMG-CoA還元酵素阻害薬pravastatinなど多数の薬物についても、取り込みトランスポーターを発現させることで、経細胞輸送が観察された。さらに、内因性のトランスポーター候補を同定すべくRT-PCRを行ったところ、MRP2,MRP4,BCRP, UAT, OATv1が見られ、PAH輸送に対するこれらの遺伝子の影響を見たところ、MRP4 siRNA発現系で、経細胞輸送が一部低下したことから、MRP4の関与が認められたが、UATでは、siRNAの効果はなく、寄与が小さいと考えられた。また、膜電位依存性のトランスポーターと異なる輸送系の両方の存在が認められた。また、代謝酵素のヒトにおける発現誘導の定量的な予測をヒト肝細胞の結果を用いて試みた。ヒト肝細胞におけるCYP3A4の薬物濃度

依存的な誘導率を観察し、一方で、臨床報告のある3A4誘導事例から見積もった定常状態における非結合型薬物を使って予測を試みたところ、予測値と実測値がかなり良好な相関を示したころから、ヒト肝細胞を用いてCYP3A4誘導の予測が可能であることが示された。排泄トランスポーターbreast cancerresistance protein (BCRP)は、硫酸抱合体を良好な基質とすること、ならびに小腸の管腔側に発現していることから、小腸におけるBCRPの機能評価をin situ反転腸管法を用いて行った。その結果、小腸における4-methylumbelliferone(4-MU)の硫酸抱合体(4-MUS)や、minoxidil sulfatの管腔側への排出クリアランスは、小腸下部の方が大きいことが示された。一方で、これらの硫酸抱合に関与する酵素であるSULTの抱合活性についても、小腸下部のほうが大きいことが示され、さらに発現分布を調べたところ、BCRPもSULTsも小腸下部の方が上部より発現量が大きいことが示された。このことから、BCRPがSULTにより硫酸抱合されたものを効率よく排出するといった協調的な作用を発揮するために、発現分布を同じくしていることが示唆され、代謝酵素とトランスポーターの協調的な異物解毒機構の1つが明らかとなった。また、腎臓におけるMrp4の機能を調べるため、Mrp4ノックアウトマウスを用いた検討を試みた結果、HIV治療薬であるadefovirや、セファロスポリン系抗生物質であるceftizoximeがMrp4の基質となることがin vitro実験系より確認されるとともに、Mrp4ノックアウト動物において、定常状態における血中濃度が野生型と比較して大きいことや、腎臓内濃度が高いことが示されたことから、これらの腎排出にMrp4が関与することが示された。一方、腎臓の取り込み側については、ヒト腎スライスと遺伝子発現系を用いた解析の結果、adefovirについては、主にOAT1が機能することが明らかとなったが、ceftizoximeについては、OAT1,OAT3といった既存の有機アニオントランスポーターの機能だけでは説明できない取込みが観察された。本年度は,多くの薬物の体内動態,臓器分布を決定する要因となるトランスポーターと薬物の組合せを多数決定するとともに,薬物間相互作用の予測を行う上で重要な1要因である,小腸における相互作用を定量的に予測するための理論的考察ならびに動物実験による検証を行なった。まず,dantrolene,prazosin,triamtereneのような薬物,MelQxやPhIPのような発がん性物質の脳内・精巣内への分布にBcrpが関与することを明らかにした。さらに,Bcrp基質の中でも,弱酸性基質はP-gpへの認識は弱いが,中性や塩基性のBcrp基質は同時にP-gpにも認識され,協調的に組織内への移行を制限していることが明らかとなった。さらに,脳内へのoseltamivirの移行については,P-gpが主に関与することを動物実験により明らかにした。
人工膜小胞への再構成とプロテオミクスによる尿酸輸送機能単位の定量的発現機能解析

トランスポーター分子の機能特性に基づき、特定の臓器あるいは特定の膜ドメインでの小分子の細胞膜輸送のモデリングを行う際、複数のトランスポーター間の機能共役が輸送機能を大きく修飾する場合は、培養細胞発現系等で得られた単一分子の機能特性の情報では不十分な場合が想定される。本研究は、その典型的な例として腎近位尿細管の管腔側膜ドメインの尿酸輸送を研究対象とし、再構成人工膜小胞プロテオリポソームとプロテオミクスを用いて、管腔側膜ドメインの尿酸輸送を担う「機能単位」(高効率で機能共役し合うトランスポーター群)の実体を解明し、「機能単位」としての特性を明らかにすることを目指した。尿酸輸送機能単位の再構成を試みる目的で、構築したバキュロウイルス/昆虫細胞発現系を用いて、URAT1、SMCT2およびPDZK1タンパク質を発現・精製した。これらのトランスポーターを人工膜小胞に再構成することで調製したプロテオリポソームを用いて、それぞれの基質の輸送活性を解析し、また同一のプロテオリポソームに分子複合体として再構成して分子間機能共役を検出することに成功した。また、URAT1およびSMCT2の輸送機能、複合体形成時の輸送機能への影響を詳細に解析した。さらに、網羅的定量的質量分析法を用いて、野生型マウスから調整した刷子縁膜小胞における腎近位尿細管尿酸輸送関連トランスポーターの発現量を定量解析した。また野生型マウスから調整した刷子縁膜小胞を材料にトランスポーターの免疫沈降を行い、共沈降したタンパク質を質量分析計で解析した結果、新たな結合様式を示唆する結果が得られた。尿酸トランスポーター関連分子集積の構成分子とその量比の解析、再構成したプロテオリポソームの解析、相互作用様式の解析により、尿酸トランスポーター関連分子集積として形成される尿酸輸送機能単位の機能特性を明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。腎近位尿細管管腔側膜ドメインには、尿酸の取り込みと排泄を担うトランスポーター群が分子集積し、その近接効果により基質のやり取りを介した機能共役が効率化され、尿酸輸送の機能単位を形成している。この分子集積の機能を捉え、定量的に記述することが、腎臓での尿酸handlingのモデリングを行う際に必須のプロセスとなる。そのため本研究では、尿酸トランスポーター関連分子集積として形成される尿酸輸送機能単位の機能特性を明らかにすることを試みた。本年度はプロテオミクスを用いて腎近位尿細管管腔側膜ドメインのトランスポーターを網羅的に解析し、管腔側膜ドメインの尿酸輸送機能単位に加わり得るトランスポーター候補を網羅する重要な情報を得た。FLAGタグURAT1トランスジェニックマウスからBBMVを調整し、抗FLAGタグ抗体ビーズを用いて共免疫沈降を行い、共沈降するタンパク質を質量分析で同定し、トランスポーターが分子集積して形成する尿酸輸送機能単位を明らかにした。さらにURAT1、SMCT2およびPDZK1タンパク質を発現・精製し、同一のプロテオリポソームに分子複合体として再構成して分子間機能共役を詳細に解析し、分子間機能共役を実証した。

尿酸トランスポーター関連分子集積の構成分子とその量比の解析、再構成したプロテオリポソームの解析、相互作用様式の解析により、尿酸トランスポーター関連分子集積として形成される尿酸輸送機能単位の機能特性を明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね実施計画通りに研究が進み、順調である。今年度の成果を論文としてまとめる準備も進んでいる。今年度に得られた情報を基に、より定量的なデータの取得を目指す。特に計画の変更予定、遂行する上での問題点はない。
数論とエルゴード理論

ディオフォンタス近似の同次近似問題におけるLittlewoodの予想というのは∀α_1,α_2,-,α_n,∀ε>0に対しqΠ|qα_i-p^i|<εを満たす整数p_1,p_2,-,p_n,qが存在する。である。当初の目的は、この予想のα_1,_2,-,α_nを2次無理数としたばあいについて扱うことであった。まず、この予想ににた次の問題に対して得られているLagariesの結果について検討した。である。
ギランバレー症候群誘発リスクの高いカンピロバクター・ジェジュニの迅速診断法の開発

ギラン・バレー症候群(GBS)患者由来のCampylobacter jejuni O:19菌体から可溶性抗原を調製し,それを免疫したマウスを使って,常法により細胞融合実験を行った結果、3264クローンのハイブリドーマが得られた。ハイブリドーマのスクリーニングは,2株のO:19および6種類の他の血清型のC. jejuni菌体に加え、C. coli, C. lari, C. upsaliensisから調製した可溶性抗原を用いたELISAにより実施した。その結果、C.jejuni O:19に対して特異的な反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが1クローン得られた。平成30年度に妊娠したため、妊娠障害等により予定していた実験ができなかった。妊娠に伴う研究遅延があったため、平成30年度に予定していた内容を平成31年度に実行する。具体的には、開発を目指しているイムノクロマト法は,サンドイッチタイプの検出系であるため、まずC. jejuni O:19を平成30年度に作出した特異抗体と挟みこめるもう一つのペア抗体を作出する。ついで、作出した抗体を用いてC. jejuni O:19特異的イムノクロマト法を構築し、本法と既に開発済みのカンピロバクターのイムノクロマト検出系を組み合わせ,1本のテストメンブレン上でカンピロバクター感染とそれがC. jejuni O:19感染であるかどうかを迅速かつ簡便に診断可能なイムノクロマト法を構築する。さらに本イムノクロマト法を用いて,糞便乳剤(懸濁液)から直接カンピロバクターとC. jejuni O:19を同時に検出する方法を構築し,その有用性を評価する。(理由)妊娠により、平成30年度に予定していた実験が実施できなかったため。(使用計画)平成30年度に予定した計画を平成31年度に実施する。
ヒト化モノクローナル抗体の核内移行による新規分子標的療法の開発

CD26は広汎なヒトがんに発現している。ヒト化抗CD26抗体(Ab)でがん細胞を処理するとがん細胞の増殖抑制と共にCD26とAbは細胞質内から核内に移行した。クロマチン免疫沈降法にてCD26とPOLR2Aの転写調節領域が特異的に会合することを同定した。Abに抗がん分子Xを結合させたところ、X結合Abが、Abのみよりも極めて高効率にCD26依存性にがん細胞の増殖能の極度の低下を誘導した。一方、CD26を発現する正常ヒト内皮細胞やTリンパ球では、Ab核内移行はなく増殖抑制は認められなかった。X結合Ab-Xをマウスへ投与したところ、異種移植したヒトがんの増殖抑制能は、Abよりも強い効果が得られた。CD26は広範囲のヒトがん種において細胞膜表面に発現している。そこで独自に開発したヒト化抗CD26モノクローナル抗体(以下Ab)が、細胞表面CD26に反応するとCD26とともに細胞質内へエンドサイトーシスされ、さらに核内に移行することから、Abに抗がん分子を結合させることで、これらの分子をがん細胞の核内へ誘導し、副作用を抑えつつ、効率の良い新たながんの分子標的療法の開発を行った。アルキル化薬、白金化合物、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管阻害薬,抗腫瘍性抗生物質をAbに結合させ、アフィニティカラムにて精製した。この抗がん分子結合Abと非結合Abおよび抗がん分子を用いて、試験管内で各種ヒトがん細胞株を用いて、抗がん作用を増殖抑制能、細胞死誘導能を指標に検討した。その結果、代謝拮抗薬X結合Abが、Abのみよりも極めて高効率にCD26依存性にがん細胞の細胞死を誘導し、増殖能の極度の低下を示した。一方、CD26を発現する正常ヒト内皮細胞やTリンパ球では、同じAb-X濃度での増殖抑制や細胞死誘導は認められなかった。またこれらの効果は、X処理を単独行う場合の約1/50001/10000の濃度で示された。さらに、Ab-X結合分子がAb同様に、がん細胞核へ移行することが免疫電子顕微鏡的観察および共焦点レーザー顕微鏡観察で明らかとなった。またAb-X結合分子をマウスへ投与したところ、体内でのAb-X結合分子の半減期はAbとほぼ同様であり、異種移植したヒトがん(中皮腫、腎癌、リンパ腫)の増殖抑制能は、Abよりも強い効果が得られた。本Abは、核内移行だけでなく、細胞周期を抑制することでがん細胞の増殖を直接抑制する効果とともに、抗体依存性細胞傷害および補体依存性細胞傷害機構を介した免疫学的な抗がん作用もあることから、これらの様々な効果が抗がん作用として相乗・相加になることが期待される。
複合熱源多目的開放型海洋温度差発電の基礎的研究

本研究が最終目的とする複合熱源多目的開放型海洋温度差発電は、昼間には温海水を太陽熱で加熱して80°C前後の高圧蒸気と加熱水を作り、この蒸気と加熱水をフラッシュさせて得られる中・低圧蒸気とを膨張させて大出力を得、またタービンの俳気を表面凝縮器で淡水に、残りの蒸気を直接接触凝縮器で経済的に凝縮させる多機能凝縮器を用い、発電、淡水造水および冷海水の海洋牧場利用の多目的性を有する。本年度の研究目的は上記発電方式を開発する上で最も重要な太陽加熱器と多機能凝縮器の基礎性能を実験的に求め、その結果を基礎に実用規模のプラントの最高性能等の条件とその性能などを求め、従来の開放型との比較より本発電方式の優れた特性を明らかにすることである。熱工学的には支障がないので冷海水としては水道水を用い、温海水としては水道水を加熱して大気温より25°C前後高くしたものを用い、次の成果を得た。太陽熱加熱器の断熱ガラスの吸収、反射等の損失により温水の吸熱効率の上限値は81.4%である。加熱管内伝熱特性を示すNu数はGr数とRe数の比であるGr/【Re^2】の値により変化し、純強制対流層流発達流のNu=4.36に対し0.1前後で約3.9倍となり、本発電方式で主に利用する1に近い範囲で軸方向の逆流とふく射損失のために低下する。上部に表面凝縮器、下部に直接凝縮器部を備えた多機能凝縮器を試作し、温水をフラッシュさせた蒸気で性能を研究した。フラッシュと直接接触凝縮器で噴出させた水滴より空気が溶出し、表面凝縮器の性能は空気がない場合より4060%低下することが分った。太陽加熱器の実験結果を基に、昼間出力約40MWe、夜間4MWeのプラントにつき、熱効率と単位温海水流量当りの出力(比出力)につき最適条件と性能を求めた。加熱器出口温度80°Cの場合、熱効率は従来の開放型の2倍、比出力は約12倍、造水昌は6.5倍で、出力増加はエンタルピー増加によること、一日平均比出力は約4倍であることを明らかにした。
病原真菌における細胞外ステロール取り込み機構の解明

病原真菌Candida glabrataは、ヒト消化管に常在する酵母であるが、免疫の低下した患者において播種性の感染を引き起こす。C. glabrataは宿主体内で細胞外のステロールを取り込んで利用することが示唆されているが、その生理的意義や詳細な分子メカニズムについては明らかにされてこなかった。本研究では、遺伝子破壊C. glabrata株の解析結果より、ステロールトランスポーターAus1pおよび細胞壁マンノプロテインTir3pがステロール取り込みに必須であること、またAUS1およびTIR3の発現量は血流感染時と同程度の鉄欠乏条件で顕著に増加することを見出した。病原真菌Candida glabrataのステロール取り込みにかかわる因子を同定し、ステロール取り込みメカニズムを解明することを目的とした。平成26年度はこれまで継続して研究していたマンノプロテイン遺伝子TIR3の実験と論文作成を行い、論文を投稿した(Biochim Biophys Acta. 2015Feb;1851(2):141-51)。新たなステロール取り込みに必要な因子についてはステロール取り込み状態の細胞における網羅的遺伝子発現解析を行い、現在はデータ解析の途中である。病原真菌Candida glabrataのステロール取り込みにかかわる因子の同定を試みた。ステロール取り込みが活性化される鉄欠乏培地において培養した際に、発現量が増加する遺伝子について破壊株を作製し、ステロール取り込みが欠失するような株のスクリーニングを行った。Saccharomyces cerevisiaeの研究より、機能が推測される遺伝子について遺伝子破壊株を作製したが、ステロール取り込みが失われるあるいは低下するような遺伝子は見出せなかった。次年度は最終年度であるが、方針転換をすべきであると考えられる。C. glabrataではなく遺伝学的解析に最も適した近縁種であるS. cerevisiaeを用いて、ステロール取り込みができない変異株のスクリーニングを行い、ステロール取り込みに必要な新規因子を同定する。研究代表者の所属変更により研究が滞った。また、現在の実験手法では新規ステロール取り込み因子を同定することが困難であると考えられる。したがって研究実績の概要に示したような方針転換が必要であると判断した。C. glabrataは宿主体内で細胞外のステロールを取り込んで利用することが示唆されている。本研究では、宿主体内でステロール取り込みに関わる因子を同定することを目的とした。遺伝的に近縁種であるSaccharomyces cerevisiaeの先行研究の結果から、ステロール取り込みに関わると予想される遺伝子の破壊株を作製した。遺伝子破壊株の解析結果より、ステロールトランスポーターAus1pおよび細胞壁マンノプロテインTir3pがステロール取り込みに必須であることを明らかにした。AUS1遺伝子破壊株は、マウス感染実験において臓器定着率すなわち病原性が低下することを見出した。また、AUS1およびTIR3の発現量は鉄欠乏条件で顕著に増加することを見出した。血液中の鉄イオンはトランスフェリンと結合しており、利用可能な鉄イオン濃度はきわめて低く保たれている。以上の結果より、C. glabrataは血流感染時にステロール取り込みが活性化されると考えられた。また、Aus1pは分裂時には娘細胞に局在しており、新しい世代の細胞において選択的にステロール取り込みを活性化していると考えられた。以上の結果より、AUS1とTIR3のみでステロール取り込みを活性化できると推測されたが、AUS1とTIR3遺伝子を強制発現させたC. glabrata株は、細胞外ステロールを取り込まなかった。この結果は、AUS1とTIR3以外にもステロール取り込み活性を調節する遺伝子の存在を示唆している。Candida glabrataのステロール取り込みに必須であるTIR3の解析を完了させ、論文投稿に従事していた。現在AUS1、TIR3以外のステロール取り込みにかかわる因子の探索を開始したところである。S.cerevisiaeにおけるステロール取り込みに必須の遺伝子(AUS1とDAN1)をともに強制発現し、常にステロールを取り込むような組換え株を作製する。この株をもとにステロール取り込みが欠失するような変異株を単離し、ステロール取り込みに必須の新規遺伝子の探索を進める。微生物学平成26年度に完了しなかった網羅的遺伝子発現解析を終える。またステロール取り込みにかかわる候補遺伝子についてモデル酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いた実験系を構築する。2015年11月に前倒し支払い請求を行った。核酸抽出方法を変更したため一部のキットの購入しなかったため。今年度、研究方針を変更する可能性がありその際に必要となる消耗品・試薬を購入する。
生体内情報伝達機構解明を指向したホスファターゼ抵抗性リン酸化ペプチドの合成

蛋白質のチロシン、セリン、スレオニン残基のリン酸化、脱リン酸化が生体内情報伝達系において重要な役割を果たしていることが明らかになるにつれ、近年生体内情報伝達機構解明のためのリン酸化ペプチド・タンパク質の需要が高まっている。このような観点より『生体内情報伝達機構解明を指向したホスファターゼ抵抗性リン酸化ペプチドの合成』を遂行し以下のような実績をあげることができた。2.前述の合成はD/Lの混合物の合成であったので、ヨウ化アルケニルに対するクロスカプッリング反応および不斉補助基を結合させた状態での水素化ならびにアミノ化反応を用いることにより立体選択的にF2Pmab誘導体を合成すべく現在検討を加えている。3.これら合成法を応用して各種ホスファターゼ抵抗性リン酸化ペプチドの合成を行い、現在これら合成ペプチドの生理活性について検討を加えている。
軍事史的観点からみた１８～１９世紀における名誉・忠誠・愛国心の比較研究

本科研では、1819世紀のいわゆる「近代移行期」を対象とし、日本、中国、オスマン帝国、ドイツ、フランスにおいて、軍事の担い手が帯びていたエトスの特徴を、政治・経済・軍事・近代思想などさまざまな分野で、直接的・間接的に影響を及ぼし合っていた地域相互の連関性を考慮しつつ、軍事史的観点から比較史的に考察した。名誉・忠誠・愛国心のエトスは、社会における身分・階層・階級と伝統的思考方法を基礎とし、新たな軍事技術と軍事編制の導入、軍事思想の理念や軍事教育の方法、軍人の徴募方法、宗教・民族によるアイデンティティ、「国家」意識やナショナリズムなどと、複雑に絡み合いながら形成されたことが明らかになった。本研究の目的は1819世紀の日本、朝鮮、中国、オスマン帝国、ドイツ、フランスにおいて、軍事の担い手が帯びていたエトスを比較研究することにある。平成26年度は、日本史・西洋史・東洋史が研究対象とする空間領域と、近世・近代の時代区分をこえて議論できるように、7回の研究集会を開いて相互の情報交換と研究成果の共有を目指し、3回のシンポジウムを開催するほか、若手研究者育成のための若手セミナーを2回実施する計画をたてた。科研集会では、「名誉・忠誠・愛国心をみる視角」を考え、フランス・日本・朝鮮におけるフランス革命史研究の動向を共有し、平成27年度に実施する講演会と国際シンポジウムの打ち合わせを行った。また京都の仏教大学で実施した第6回研究集会では、アメリカ海軍兵学校における規律維持問題と、戦後日本における傷痍軍人会に関する報告を依頼し、東浅井民俗資料館で地域に残された軍事史料を閲覧するなど、科研の研究視角を広げるための機会を1泊2日でもうけた。シンポジウムは、「1819世紀の中央・東アジアにおける民族的アイデンティティと国家への忠誠」「1819世紀における地理的認識とナショナリズム」「軍事技術・軍事訓練と名誉・忠誠」の3回行った。研究対象地域を異にする研究者2人を組み合わせることで、比較することによりみえてくるさまざまな論点を議論した。パリ・ディドロ大学からの研究者にも参加してもらった。若手セミナーは大学院生、非常勤講師など若手研究者に報告を依頼し、「西南戦争における情報統制と記者派遣」「エゴドキュメントから読み解く忠誠のヨーロッパ史」の2回を実施した。平成26年度は当初の計画以上に、研究を進めることができた。平成27年度は、パリ第一パンテオン・ソルボンヌ大学教授で、フランス革命史研究所所長でもあるピエール・セルナ氏を招聘して、講演会「現代社会とフランス革命」(コメンテーターは東欧史、司会は近世フランス史)と、国際シンポジウム「革命と軍隊ー明治維新・辛亥革命・フランス革命の比較からみえてくるものー」(他の報告者は幕末史と中国史で、司会は近代ドイツ史)を開催した。また埼玉大学での講演会(コメンテーターはフランス革命研究者3人)に共催で参加した。講演会は、西山暁義「反独=親仏、親独=反仏?ドイツ帝国のアルザス・ロレーヌと「愛国心」」、福間良明「「戦争の社会学」の視角:社会学と歴史学の境界領域とその諸相」の2回、開催した。さらに若手研究者育成のために、斉藤恵太「近世バイエルンにおける軍務官の名誉と忠誠ー役人と軍人、領邦君主と皇帝のはざまで」と題する若手セミナーも開いた。合宿は、2回行った。会津若松市に残る戊辰戦争戦没者慰霊の踏査を行い、戦没者慰霊について論文や本を書いている研究者を招聘して、レクチャーを受けた。また鹿児島市内に残る西南戦争に関する史跡と熊本県田原坂の現地踏査、知覧の特攻平和会館・万世の特攻平和祈念館を比較して回り、田原坂西南戦争資料館では学芸員よりレクチャーを受けた。戊辰戦争と西南戦争に関する現地踏査により、幕末から明治10年までに起きた戦争について、知識を共有することができた。なお、保土ヶ谷のイギリス連邦墓地で行われたアンザック慰霊祭にも参加した。科研集会は7回開催した。主に活動報告、計画立案、国際シンポジウムのプレ報告、セルナ氏との打ち合わせや原稿化の相談、平成28年度の国際シンポジウム招聘者やコメンテーター・報告者の相談などである。なお、中国、ドイツ、フランス、トルコに1人ずつ派遣して史料調査も行った。平成27年度は当初の計画以上に、研究を進めることができた。ピエール・セルナ氏を招聘した講演会と国際シンポジウムには、2日間で200人近くの聴衆が参加した。また、講演会についても、毎回2530人が来場して、講演後の討論は2時間以上かかっても終わらないほどである。その意味で、本科研の研究テーマが徐々に共有されつつあるといえる。早稲田大学高等研究所の人文科学分野における研究プロジェクトとして共催したことにより、そのホームページを利用して講演会やシンポジウムのお知らせを広報することができたのも、大きな助けとなった。ピエール・セルナ氏の講演は『日仏歴史学会会報』に、国際シンポジウムの記録は『早稲田大学高等研究所紀要』第8号に掲載して公表した。とくに、『早稲田大学高等研究所紀要』は紙媒体だけでなくweb版もあり、報告要旨は英語で書くことになっているので、活動記録としては望ましいといえる。平成28年度には、トルコのイスタンブールからオスマン帝国の軍事史を専門にしている研究者を招聘して、講演会ならびに国際シンポジウムを行う予定である。

平成27年度の講演会・国際シンポジウムの際の経験を活かして、招聘候補者への交渉を早めにはじめ、決定後もシンポジウムの報告者やコメンテーター、司会者の人選、翻訳や逐次通訳の手配など、メンバーで手分けして協力できたため、1月末には講演者とコメンテーター、シンポジウムの報告者、逐次通訳者、司会者、翻訳者などをすべて確定することができた。国際シンポジウムは、報告者の組み合わせと司会の誘導、それによる活発な討論に開催の妙があり、それは経験を重ねて会得できるものであると感じた。そのためには、発想や議論が共有されねばならず、その意味で時間がかかるものでもある。日本史・東洋史・西洋史という枠組みを超えて、自由に意見交換ができるプラットフォームとして、本科研が機能しつつある段階にきたと考える。平成28年度は、トルコのイスタンブル大学文学部歴史学科准教授でトルコ近代史、特に軍事史を研究しているギュルテキン・ユルドゥズ氏を招聘して、近代転換期における軍事的エトスの変容と市民の形成に関する講演会とシンポジウムを企画した。第1回科研集会でプレシンポ報告会を行い、トルコの軍事史についての勉強会も設けた。しかし、講演会の1週間前にトルコで軍事クーデター未遂事件が起こり、公務員の海外出国が認められずユルドゥズ氏は来日できなくなった。すでに報告の翻訳が終わっていたことから、講演会「無名の兵士ー近代トルコ(1792-1918)における軍事的エトスと市民権の形成」(コメンテーターはドイツ近代史、司会は中国近代史)、シンポジウム「軍事的エトスの近代史」(他の報告者は日本近代史とロシア近代史、司会者はドイツ近代史)をユルドゥズ氏不在で実施した(7月23日・24日)。講演会は4月に松本彰「ドイツ近現代の「名誉・忠誠・愛国心」ードイツ諸国の国歌を中心に」、10月に井上泰至「サムライ像の変遷ー武将伝・武家説話の江戸と近代」、平成29年3月に竹本知行「幕末・維新の西洋兵学と近代軍制ー大村益次郎とその継承者」の3回開催した。合宿は2回実施した。平成28年8月3日5日に、幕末の箱館戦争関係箇所の踏査を行った。1日目は函館高専の教員に、2日目は箱館奉行所館長にレクチャーを依頼した。平成29年2月6日7日には、幕末に長岡藩周辺地域で行われた北越戦争関連の記念館・博物館・史料館などと、戊辰戦争関連の護国神社を巡見した。科研集会は6回行った。国際シンポジウムのプレ報告、打ち合わせや原稿化の相談、計画立案、活動報告などである。平成29年5月に一橋大学で開催される第67回日本西洋史学会大会において、本科研の成果を小シンポジウムの形で公表することが決まった。本科研では、1819世紀のいわゆる「近代移行期」を対象とし、日本、中国、オスマン帝国、ドイツ、フランスにおいて、軍事の担い手が帯びていたエトスの特徴を、政治・経済・軍事・近代思想などさまざまな分野で、直接的・間接的に影響を及ぼし合っていた地域相互の連関性を考慮しつつ、軍事史的観点から比較史的に考察した。名誉・忠誠・愛国心のエトスは、社会における身分・階層・階級と伝統的思考方法を基礎とし、新たな軍事技術と軍事編制の導入、軍事思想の理念や軍事教育の方法、軍人の徴募方法、宗教・民族によるアイデンティティ、「国家」意識やナショナリズムなどと、複雑に絡み合いながら形成されたことが明らかになった。
西表海底火山噴火(1924年)に伴う軽石流出災害の基礎的研究

1924年の西表海底火山の噴火で流出した軽石と、他の軽石との区別はつぎのようにおこなった。まず、肉眼的観察によって色と包有物を比較する。問題の西表海底火山の軽石は白色で、包有物が少ない。つぎに、肉眼観察で選び出された軽石について塩分を注意深く除去したのち、全岩化学分析をおこなう。問題の軽石はデーサイトで、Si【O_2】が7374%と高いのに【K_2】Oは1.1%,MgOは0.15%で、ともに非常にとぼしい。そのため、これに注目することによって区別がつく。以上の実験を採集した軽石についておこない、西表海底火山のものであることが明らかな軽石について、大きさと含有比を調べた。その結果、火山に近い西表島では大きさ・含有比ともに大きく、黒潮の下流方向に遠ざかるにつれていずれも減少する。すなわち、西表島では最大1mであるのに対して、500m離れた沖縄島では5cmほどにすぎない。また、肉眼観察で選び出された軽石の中での含有比は石垣島では70%であるが、沖縄島周辺では320%である。これらのことは、西表海底火山噴火ののち、八重山諸島が軽石で囲まれ、港が使いものにならなくなった、という記録と調和的である。つぎに、軽石を粉砕し、斑晶鉱物を集め、EPMAによる化学分析をおこなった。その結果アンデシン,フェロホルトノライト,フェロハイパシン-ユーライト,オージャイトフェロオージャイト,チタン鉄鉱,磁鉄鉱,石英(?)からなることが明らかになった。以上の結果は、本年2月、仙台市で開催された岩石鉱物鉱床学会で発表した。
コモン・ローの形成と教会

13世紀イングランドで作成された裁判実務書の分析を通して、国王裁判所の訴訟手続と教会裁判所の訴訟手続の比較検討をおこなった。具体的には、『訴訟および法廷の書』(1写本のみ伝来)と「聖俗の法廷における訴訟手続』(3写本が伝来)を詳細に比較分折することによって、在地レベルにおいて聖俗両裁判手続の間で一定の関連性が認められること、また裁判実務書は作成者それぞれの関心に応じて内容が一様ではないことを明らかにした。本研究の目的は、コモン・ロー体系の基礎をなすことになる民事事件(主として土地訴訟)における国王裁判の諸手続、とりわけ訴訟開始のための重要な国王令状の成立過程において、教会法ないし教会人が果たした役割を実証的に解明することにある。この目的を達成するために、本年度は、『ロンドン司教ギルバート・フォリオットの書翰集』(The Letters and Charters of Gilbert Foliot)および刊行中の『イングランド司教文書集』(English Episcopal Acta)等の公刊史料を主たる素材として、教会人(高位聖職者)の発した文書(書翰・証書等)の中から、初期コモン・ロー裁判手続の原型となる法理論および裁判実務を抽出することを試みた。これにより、従来法理論面で指摘されるにとどまっていたコモン・ローに対する教会法の影響を、裁判実務レヴェルで少しく具体的に明らかにすることができた。公刊史料の検討作業と並行して、写本史料の分析・検討も行った。平成19年8月には、イングランドに出張し、オクスフォード大学ボドリー図書館に所蔵・保管されている『聖俗の訴訟手続に関する論考』(Diversarum curiarum diverse sunt consuetudines)(MS Rawlinson C.775)等を閲覧した。本写本については、その後解読を進めているが、刊本(Publications of the Selden Society, vol.60)においては、ケンブリッジ大学ゴンヴィル・キース・カレッジ図書館にのみ写本が存在するものとされているが(Caius College, MS. 205)、ボドリー図書館所蔵の写本も少なくとも途中まではほぼ同一の内容であることを確認することができた。本研究の目的は、12世紀後半イングランドにおける俗権と教権の権力闘争の過程の中で、コモン・ロー成立の法的・歴史的要因を明らかにすることにある。すなわち、コモン・ローの成立を教会法理論との対抗関係あるいはその影響下に捉え直すこと、そのことによって、従来もっぱら封建裁判権あるいは地方的裁判権との対抗関係の中で議論されてきたコモン・ロー成立史を根本的に見直すこと、これが本研究の目的である。本年度は、この目的の実現に向けて、国王訴訟手続と教会訴訟手続の比較検討を、裁判実務書の分析を通しておこなった。具体的には、主として、『聖俗の訴訟手続に関する論考』(Diversarum curiarum diverse sunt consuetudines)の残存1写本であるオクスフォード大学ボドリー図書館蔵のMS Rawl inson C.775(pp.127-150)を解読・検討した。本写本は、(1)序、(2)教会訴訟手続、(3)世俗訴訟手続から構成されており、刊本の元となっているケンブリッジ大学ゴンヴィル・キーズ・カレッジ図書館蔵の別の写本(Gonvill&Caius College,Cambridge,205/111,pp.409-429)と構成は同じであるが、細かく見ていくと、後者に収められている教会刑事裁判の部分、ローマ教皇庁宛の委任書翰が欠落していること等、総じて簡略化された記述となっていることが判明した。本年度は、前年度に引き続き、国王裁判所の訴訟手続と教会裁判所のそれとの比較検討を裁判実務書の分析を通しておこなった。具体的には、主として『訴訟および法廷の書』(De placitis etcuriis tenendis)と『聖俗の法廷における訴訟手続』(Forma placitandi in curiis tam ecclesiasticis quam laicis)の2史料を対象として、残存写本(前者についてはCambridge University Library, Ee I, 1, ff. 233r-235rの1写本、また後者については(1)Gonvill&Caius College, Cambridge, 205/111, PP.409-429 ;(2)Cambridge University Library, Mm I, 27, ff.76v-77v ;(3)Oxford Bodleian Library, Rawlinson C.775,pp.127-150の3写本)も詳細に検討しながら、地方レベルにおける聖俗訴訟手続の関連を調べた。その結果判明したのは次の点である。第一に、教会訴訟手続については『訴訟および法廷の書』にはほとんど言及がなく、他方『聖俗の法廷における訴訟手続』では写本(1)の記述が写本(2)では欠落しており、写本(3)も簡略化している。このような違いは、写本(1)の場合、その作成者Robert Carpenter IIの主君William de Insulaが1258年に空位になったウィンチェスター司教区の後見権に関与していたために、同管区における教会法の運用に関心を有していたことから説明されると考えられる。

第二に、世俗訴訟手続については、『訴訟および法廷の書』は主として領主裁判所(court leet)における裁判実務を描写しているのに対して、『聖俗の法廷における訴訟手続』は主として国王巡回裁判手続を描写している。但し、写本(3)は両者に言及している。第三に、『聖俗の法廷における訴訟手続』からは、聖俗訴訟手続の関連について、次の二点が明らかになった。(a)教会裁判所における証人手続と国王裁判所における陪審(アサイズ)による証明手続の間にはパラレルな展開が見られること、(b)教会裁判所のみならず世俗裁判所においても、伝統的な口頭手続の重視に加えて書面の利用が進行していること(陪審員名の令状への書き込み、刑事事件における評決の記載など)。
コレラ毒素Bサブユニットの粘膜免疫アジュバント活性機構に関する研究

研究実績の概要は以下のとおり.研究課題のコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)の粘膜免疫アジュバント活性機構に関する研究において、平成15年度は、免疫担当細胞の解析(抗原特異的T細胞増殖反応、抗体産生細胞等)、抗原刺激細胞のサイトカインアッセイを行った。マウスはBALB/cを使用し、rCTB:10μg(経鼻)でジウテリアトキソイドと共に4回免疫した。また、昨年の報告と同様に、アルミニウムアジュバント2.5μg(皮下)、コレラトキシン(CT,100ng,経鼻)も使用し、比較対照とした。単核球を免疫マウス脾臓から、比重遠心法で分離し、1×106cell/mlの条件で、rCTBを10μg/mlの濃度で培養し、各種サイトカイン産生の比較を行った。結果として、インターフェロンガンマ(IFN gamma)の産生が多く、IL4等は余り観察されなかった。IFNgammaの産生量の経日変化をみると、rCTB添加後2日目でピークに到達し、以降その産生は低下していった。この現象は、免疫アジュバントの種類に関係なく、全てで同様の結果を得た。各アジュバントで免疫した単核球を上記で決めたrCTB濃度で共に2日間培養し、細胞表面マーカーに対するモノクロナール抗体で染色後、FACScanによりセルソーティングし、アジュバントによる差の有無を検討した。測定細胞数を固定して観察した結果、rCTBの添加の有無で、CD4/CD8の細胞比が極端に変化したことが初めて示された。またCD11b抗体陽性細胞がrCTBの添加で有意に上昇していることが観察された。rCTBはホロトキシンのCTとは事なり、in vitorでIFN gammaを産生させ、炎症を抑える方向に向かわせていることが考えられる。研究実績の概要は以下のとおり.研究課題のコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)の粘膜免疫アジュバント活性機構に関する研究において、平成14年度は、rCTB、コレラトキシン(CT)、アルミニウムの粘膜に対するアジュバント最適量の比較、rCTBアジュバントのマウスストレインによる比較、粘膜免疫誘導部位である腸管隣接リンパ組織からの細胞調整法の確立、抗原刺激細胞のサイトカインアッセイを行った。各アジュバントをジフテリアトキソイドと共に経鼻ないし皮下投与し、抗ジフテリア抗体測定してアジュバント量を調べた結果、各アジュバント、量をrCTB:10μg(経鼻)、CT100ng(経鼻)、アルミニウム2.5μg(皮下)とすると平均0.2-0.4u/mlの抗ジフテリア抗体が得られることが解った。BALB/c、C57BL/6、C3H/HeNの3系を使用し、rCTB:10μg(経鼻)でジフテリアトキソイドと共に免疫した結果、抗ジフテリア抗体の産生(平均0.2-0.4u/ml)に大きな差は認められなかった。粘膜免疫誘導部位である腸管隣接リンパ組織からの細胞調整法の確立、抗原刺激細胞のサイトカインアッセイのため、まず、マウス脾臓ないし腸管よりT細胞分離の系を確立し、FACSで細胞の分離状況を確認した。Percoll比重遠心法やナイロンウールカラムを組み合わせて細胞を分離した結果、ほぼ100%に近いT cellを分離することが出来た。この方法により、分取した細胞をジフテリアトキソイド、rCTBと共に刺激し、サイトカイン産生を測定した。IL-4、IL-5はあまり変化が見られなかったが、rCTBの添加でIFN-gammaの産生が上昇した。以上より、アジュバント量と抗原量を固定し、免疫担当細胞を効率良く分離されたことから、平成15年度は免疫担当細胞の解析(抗原特異的T細胞増殖反応、抗体産生細胞等)を主体として進める予定である。
新規NF-κB制御因子IκB-ζの発現誘導機構

申請者らが同定した新規因子IκB-ζは、LPSなどの微生物由来成分やIL-1βの刺激によりその発現が誘導されるが、これらと同様の遺伝子群の発現を誘導することが古くから知られているTNF-αの刺激ではほとんど誘導されない。阻害剤を用いた実験とレポーター解析により、IκB-ζの誘導には転写因子NF-κBが必要であることを明らかにしている。まず、この発現の刺激特異性が転写レベルであることを予想して、IκB-ζ遺伝子の転写開始点近傍の最長約11kbpをもつ種々のゲノム断片をルシフェラーゼレポーターの上流に導入してプロモーター解析を行なったが、IκB-ζの発現に見られる刺激特異性は認められなかった。そこで、上記の刺激による転写誘導を核ラン・オン解析(nuclear run-on assay)により評価したところ、IκB-ζの転写は、すべての刺激により同様に誘導されたので、その刺激特異性は転写レベルで決定されているのではないことが明らかになった。そこで、以下の方法により、転写後のIκB-ζmRNAの安定性を検討した。未刺激の細胞においてIκB-ζの発現はほとんど認められないので、構成的にIκB-ζmRNA全長を発現する細胞株を構築し、この細胞を転写阻害剤であるアクチノマイシンDで処理し、その分解速度を検討した。アクチノマイシンD処理時に同時にLPSやIL-1βで刺激した場合にのみ特異的にIκB-ζmRNAの安定化が観察された。まず、ヒト及びマウスIκB-ζの転写開始点近傍のゲノムDNA断片を取得し、プライマー伸長法やRACE(rapid amplification of cDNA ends)法により、転写開始点を決定した。IκB-ζの転写開始点を含む種々のゲノム断片に関して、ルシフェラーゼを用いたリポーター系によりプロモーター/エンハンサー活性を評価した結果、転写開始点上流300bp以内に位置するNF-κB結合配列が重要であることが明らかになった。しかし、転写開始点から最大上流約11kb、下流20kbを含む、構築したすべてのリポーターでIκB-ζの示す発現の刺激物質選択性を再現することはできなかった。一過性のリポーター遺伝子の導入では、刺激によるクロマチン構造の変化など、転写開始点近傍のDNAへの転写(調節)因子の結合が実際の細胞内の状態を反映していない可能性を考え、恒常的にリポーターを発現する細胞株を樹立して同様の評価を行ったが、結果は一過性の場合と同様であった。各種シグナル伝達因子の阻害剤や強制発現による解析からもIκB-ζの発現におけるNF-κBの必要性は明らかになったが、TIRドメインに特異的なこの遺伝子の発現を司る分子機構は未だ明らかになっていない。現在、IκB-ζのプロモーター領域への転写調節因子の結合の刺激特異性をクロマチン免疫沈降法による直接の検出と、IκB-ζのmRNAの安定性について検討を進めている。