hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
死因決定・評価(異状死届出、検死、鑑定)に関する研究

1.我が国の検死制度は刑事訴訟法上に解剖手続が組み込まれているが、医師法21条に基づく医師の異状死届出に関しては本来犯罪捜査の端緒だけでなく、死因究明による公衆衛生上の被害拡大防止も目的としている。しかし、戦後の行政上の改編等から後者の目的は薄れ、また監察医(行政解剖)制度導入によって、司法解剖の前提として犯罪性が強調されることとなった。この点は、我が国の死因究明制度の歴史的沿革に由来する独特の問題であり、医師が異状死届出をためらい、場合によっては遺族の反対・抵抗の原因ともなっていることが示唆された。次に、司法解剖に基づく鑑定結果は、当該医療機関はもとより、遺族にも開示されないこと、また行政上も医療関連の司法解剖例の情報を集約し、再発防止策に活用するシステムは存在しないことから、刑事手続としての制約によって医療関連死の適正な死因究明・再発防止が阻害されていることが示された。2.医師及び検視官対象の調査を分析した結果、検視官は医師と比べて異状死届出を積極的にすべきであると考えていることが示された。また、医師は医療関連の死亡に関して司法解剖を選択しないのに対し、検視官は司法解剖を選択する人が多かった。また、医師は異状死届出をした場合は解剖による死因究明が望ましいと考えているのに対し、検視官は、届出を求めるが解剖までは必要ないと考えていることが示された。さらに、監察医制度施行地域及び都市部では、その他の地域より届出することを選ぶ傾向がみられた。これらの結果から監察医制度やその他の検案・解剖態勢の充実度も届出の意識に影響を与えていることが示唆された。遺族への調査では、遺族が死因究明及び情報開示を強く求めていることが明らかとなった。3.現状の異状死届出及び死因究明制度の限界をふまえ、保健所を医療関連の死亡の届出先として想定した新しい死因究明のためのシステムを検討した。保健所を活用するシステムとして4つのモデルを考案してそれぞれの長所と短所、立法・法改正の試案、実現可能性等を比較・検討した。1.司法解剖が行われた被害者遺族に関する調査について平成15年4月から平成15年7月まで、司法解剖が行われた被害者の遺族を対象として、解剖が遺族の心情に与える影響及び解剖の結果である死因が適切に遺族に伝わっているかについて、調査票によるアンケート調査及び電話によるインタビュー調査を行った。その結果、法律上・捜査上の様々な困難が伴うものの、遺族は死因を知ることを強く求めていること、死因を知ることがその後の心情や紛争の経緯にも影響を与える可能性があることなどが示唆された。これらの結果については近日中に学術雑誌に投稿予定である。(倫理審査委員会承認済)2.ドイツの異状死届出、解剖、鑑定制度について平成15年8月から平成16年1月まで、ミュンヘン大学附属法医学研究所において実態調査、資料収集を行った。また滞在中に検察官、医事紛争の調停所スタッフ、弁護士へのインタビューを行った。この調査を通じて、ドイツでは日本同様異状死の明確な定義が法文上存在せず異状死か否かを判断する医師の専門性や診断レベルの不足が指摘されていること、日本より広い範囲の死体が司法解剖の扱いとなっていること、法医学者は頻繁に出廷し、法律家とコミュニケーションが良くとれていること、医事紛争については患者や医師は、医師と法律家で構成される医師会内におかれた無料の鑑定機関を利用することができ、裁判に至る前にある程度の紛争が処理されていること、法医学教室とこの鑑定機関との連携は今後の課題と思われることなどが判明し、これらについて日本や他国と比較検討した。この結果についてはその一部を下記論文集に投稿した。その他の論点についても学術雑誌に投稿予定である。3.臓器取扱いなど倫理的問題司法解剖後の臓器の取扱いについて法律家・病理学者とディスカッションを行い、考察を下記学術雑誌に発表した。

遺族への調査では、遺族が死因究明及び情報開示を強く求めていることが明らかとなった。3.現状の異状死届出及び死因究明制度の限界をふまえ、保健所を医療関連の死亡の届出先として想定した新しい死因究明のためのシステムを検討した。保健所を活用するシステムとして4つのモデルを考案してそれぞれの長所と短所、立法・法改正の試案、実現可能性等を比較・検討した。
乳酸による細胞間エネルギー伝達を可視化する高感度蛍光乳酸センサーの開発

「生物の主要な細胞間エネルギー伝達物質はグルコースではなく乳酸である」というこれまでのmetabolismの常識を覆す説が近年提唱されている.この「非常識」を検証するには細胞間の乳酸動態を観察する必要があり,そのためには「細胞内」及び「細胞外」の乳酸を観察可能なセンサーが必要である.これまで細胞内外共に生体観察可能な乳酸センサーは全くなく,その開発が急務であった.これまでの研究で,申請者はタンパク質工学の手法を駆使して「細胞内」乳酸蛍光センサーG-iLACCO1を開発した.そこで本研究では,「細胞外」乳酸蛍光センサーの開発を目的とする.「生物の主要な細胞間エネルギー伝達物質はグルコースではなく乳酸である」というこれまでのmetabolismの常識を覆す説が近年提唱されている.この「非常識」を検証するには細胞間の乳酸動態を観察する必要があり,そのためには「細胞内」及び「細胞外」の乳酸を観察可能なセンサーが必要である.これまで細胞内外共に生体観察可能な乳酸センサーは全くなく,その開発が急務であった.これまでの研究で,申請者はタンパク質工学の手法を駆使して「細胞内」乳酸蛍光センサーG-iLACCO1を開発した.そこで本研究では,「細胞外」乳酸蛍光センサーの開発を目的とする.
広東住血線虫感染マウスのTh1/Th2サイトカイン応答

本研究では次の事項が明らかにされた。1.広東住血線虫(Angiostrongylus cantonensis;Ac)を感受性の異なるBALB/cとC57BL/6マウスに感染させると、両系統共に感染後12-15日にピークを有する髄液IL-5の産生が認められ、これが髄液好酸球増多の主原因となる。2.髄液中のT細胞にはIL-5, IL-4, IL-2のmRNAの発現が認められるが、IFN-γのmRNA発現は見られない。3.2系統間で4種サイトカインの産生に著差は認められなっかた。4.Mesocestoides corti(Mc)を予めAc感染の7-18日前に感染させておくと、Ac感染対照群よりマウスの病態が改善し、死亡率も低くなる。これはMcとAcの重複感染群で感染後30日前後における虫体の回収率が低いことに起因する可能性がある。5.Mc感染群ではTh2サイトカイン応答が優位であり、Ac感染群と較べると、IL-2の産生も顕著である。6.McとAc重複感染で見られる病態の改善を4種のサイトカイン応答の差異により説明することはできなかった。7.IL-5 transgenic mouseにAcを感染させると、虫体は脳内で早期に殺滅され、一方このマウスの髄液好酸球レベルは対照のC3H/HeNマウスより著しく高い。8.Ac感染IL-5 transgenic mouseの髄膜血管周囲や虫体の周囲には好酸球の著明な浸潤が認められ、好酸球は脱顆粒している。9.IL-5 receptor αgene knockout mouseにAcを感染させると、ヘテロタイプやワイルドタイプのマウスに較べて脳内虫体の回収数が著しく多く、これとは逆に髄液中の好酸球は著しく少ない。以上のことから結論として、Acがマウスに感染すると、Th2サイトカイン、とりわけIL-5の髄液局所における著明な産生が起こり、その結果、髄液に好酸球増多が惹起され、この好酸球が虫体を殺滅する、と言える。広東住血線虫に抵抗性のC57BL/6と感受性のBALB/cマウスに本虫を20隻感染させ、感染後41日まで経時的に髄液や血清を採取するとともに、脾細胞ならびに頸部リンパ節細胞を採取した。これらの細胞はin vitroで幼若成虫(1720日令)抗原で刺激し、培養上清を得た。これらの試料中のTh1(IFN-γ,IL-2)ならびにTh2(IL-4,IL-5)サイトカインをELISAにより測定したところ、髄液中のIL-5は感染後1214日にピークを有する一過性の強い応答を示し、その後急激に低下した。脾細胞や頸部リンパ節細胞を抗原で刺激した場合は感染後2030日にかけてIL-5の産生が著明であった。逆転写ポリミラーゼ連鎖反応(RT-PCR)でIL-5mRNAの発現をみたところ、感染後17日の脾細胞にも、また14日の髄液細胞にも著明なIL-5mRNAの発現が認められた。さらに、14日後の髄液細胞を好酸球とT細胞に分けてIL-5mRANの発現を調べたところ、mRNAは髄液好酸球には認められず、T細胞に認められた。

IL-4は髄液中にも検出されたが、そのピークはIL-5のそれより遅く、感染後20日であった。髄液に比べると抗原で刺激されたリンパ球のIL-4産生は弱く、脾細胞では感染後30日以降に産生を認めたが、頸部リンパ節リンパ球は殆ど応答を示さなかった。一方、髄液や脾細胞培養上清のIFN-γ産生は感染後20日にむしろ抑制が認められ、頸部リンパ節リンパ球のみは感染後30日以降にIFN-γの産生を認めた。IL-2は髄液と脾細胞培養上清において感染後30日以降明らかな応答を認めた。なお、血清中には実験期間を通じていずれのサイトカインも検出されなかった。これらのことから、広東住血線虫感染マウスではTh2サイトカイン応答がTh1サイトカイン応答より優勢であり、これら4種のサイトカイン応答に関する限り、2系統マウス間で質的な差異を認めなかった。本年度明らかにされた事項は次のとおりである。1.Mesocestoides corti(Mc)を予め広東住血線虫(Angiostrongylus cantonensis; Ac)の感染前7-18日に感染させておくと、Ac感染対照群に較べてマウスの病態が改善し、かつマウスの死亡率も低下する。2.McとAcの重複感染群ではAc感染後33日における脳内Ac虫体の回収率がAc感染対照群に較べて有意に低いことから、McとAc重複感染マウスに見られる病態改善や死亡率の低下は、脳内虫体数の低下に起因するものと考えられる。3.McとAc重複感染マウスとAc感染対照群のTh1(IL-2,IFN-γ)とTh2(IL-4,IL-5)サイトカイン応答には本質的な差異が認められず、これら4種のサイトカイン応答により病態の説明をすることは困難である。4.Mc感染対照群では感染後18日における脾細胞のIL-4とIL-5産生はAc感染群より有意に高く、IL-2の産生も顕著である。5.C3H系IL-5 transgenic mouseにAcを感染させると、脳内でのAcの殺滅は対照のC3H/HeNマウスより速やかにおこり、transgenic mouseの髄液や末梢血の好酸球レベルはC3H/NeNより著しく高い。これとは逆に6.129/Ola系とC57BL/6マウスのF2であるIL-5 receptor αknockout(-/-)mouseにAcを感染させると、感染後20日における脳内のAc回収率は対照の+/+マウスや+/-マウスより著しく多い。7.Knockoutmouseの髄液好酸球レベルは+/+マウスや+/-マウスに較べて著しく少なく、僅かに6%で、単核細胞が67%、好中球が27%を占めている。これらのことから、Ac感染時にはTh2優位のサイトカイン応答が誘導され、その結果増多する髄液の好酸球が脳内のAc虫体の殺滅に関与する、と結論される。
巨大公共事業の政策過程に関する比較研究

本年度は、2003年の完成を控え、事態が急展開を見せている九州新幹線鹿児島ルートを中心に現地調査を行った。九州新幹線鹿児島ルート沿線においては、開業間近となった現在、並行在来線問題や渇水被害に対する恒久対策問題等で関連主体の動きが活発化しており、これらの問題に関連する自治体への聞き取り調査を行った。また、千歳川放水路問題に関しては、自然保護団体に対する聞き取り調査を進めた他、公開となっている千歳川流域治水対策全体計画検討委員会を傍聴した。また、特に、千歳川放水路問題に関しては、研究上の基礎資料として、文献リストと詳細年表(原稿用紙換算で250枚分)の充実化を進めた。本年度にかけて中心的に調査を行った、九州新幹線鹿児島ルートおよび千歳川放水路は、奇しくも両者とも道県単位での結論のまとめが迫られていたという状況によって、さまざまな特徴が強調されている。巨大公共事業に関連する課題を討議するアリーナにおいて道県は一定の役割を担うが、課題の性質やアリーナをめぐる状況により、その行動は異なる。二つの事例では、解決を求められていた課題は受苦性が目立つものであり、政治過程においてこうした課題は、結論が、タイムリミットが迫るまで放置される傾向がある。県が主要なアクターとなっている並行在来線問題においては、県の譲歩によって問題の進展が図られたが、掲水問題においては、広域に被害が生じているにもかかわらず被害処理の範囲が市町村にとどまっており、県の活動は極めて不活発である。また、千歳川放水路問題においては、問題の範囲が市町村を超える広域であるが、事業主体が北海道開発局であるということから積極的にイニシアティヴをとろうとしない。このように、上位自治体として調整機能を期待されている都道府県レベルの自治体は、置かれた状況によってその機能を選択的に行使している。本年度は、環境影響評価の実施に至った北海道新幹線および長崎新幹線の沿線地域における聞き取り調査および九州新幹線鹿児島ルート沿線における聞き取り調査と現地踏査を行い、新幹線建設に関する知見を深めるとともに、千歳川放水路に関して、文献を収集するとともに、北海道新聞の縮刷版から関連記事を複写し、研究の基礎資料となる文献リストおよび原稿用紙換算で約160枚分の詳細年表を作成した。また、関係団体に対する予備的聞き取りを行い、千歳川放水路問題に関わる資料の提供を受け、来年度の本調査へ向けての基盤を固めた。今年度の成果から、巨大公共事業の政治社会学の理論化に向けて、諸々の有益な知見を得ることができ、また、いくつかの仮説を構築することができた。まず、巨大公共事業の進展に関しては事業によって多様性があり、受益性と開発地域の広さが関係しているように思われる。すなわち、受益性が高いと思われる事業、たとえば高速交通網整備やニュータウン開発では関係者の同意をとりやすく、比較的スムースに事業が進展するが、受益性が少ない事業、たとえば発電所、核施設、治水などでは関係者の同意を得るのが困難なため、事業の進展に歯止めがかかる。また、開発面積の広さについては、高速交通網や治水など、広範な地域に及ぶ事業においては関係自治体における熱意の差が見られるため、事業の進展に対して制約条件を形成しやすい環境にある一方で、消極的な自治体を取り込む力学が働くため、事業の撤回は困難である。反対に、発電所やニュータウン開発など、開発地域が限られる場合には、当該地域が反対の意を鮮明にした場合には、事業は非常に困難になるが、当該地域が賛成すると事業が素早く進展する傾向がみられる。しかし、原発を含む核施設の場合は例外である。
小中学生の「わがこと意識」促進要因解明による、主体的な防災学習プログラムの開発

本研究は、人生経験が浅く災害を具体的にイメージすることが難しい小中学生が、中央教育審議会が推奨し、新学習指導要領などにも取り上げられている能動的学修(アクティブ・ラーニング)やカリキュラム・マネジメントの考え方を援用しながら、防災専門家の介入のない教師ー児童生徒の教授過程において、災害を自分たちに引きつけて考える「わがこと意識」を持ち、教科学習の中で主体的に学ぶような学習プログラム(単元構想図・指導案)・教材等)を開発して、子どもたちの「生きる力」を向上させるものである。本年度は、プログラム・教材開発のための前提となる「わがこと意識」を高めて主体的に学ぶことができるような学習目標を明確化させるための意識調査を引き続き行い、定性的・定量的な分析を行った。特に、2011年東日本大震災において障害者(障害手帳所持者)の死亡率を見ると被災地全体の死亡率よりも2倍近く多かったことが指摘されていることをふまえ、様々な障害のある児童生徒への効果的な防災教育を検討するための基礎資料として、学校現場における防災教育の現状と課題,要望等を明きからにする質問紙調査と、自然災害を含む学校安全の危機を現場教員がどのように意識しているのかを把握する質問紙調査を行い、視覚障害のある児童生徒が、地震の揺れに突然遭遇した時や緊急地震速報を見聞きした際、近くに大人(補助者)が誰もいない状況に置かれても、自らの判断で身を守る行動がとれる防災教育プログラムを提案した。当初計画では、児童生徒が「わがこと意識」を持つための促進要因について心理学面接法・質問紙法による質的量的社会調査を引き続き実施して検討を行うことと、心理学・教育学の教育方法・技術論をもとに「わがこと意識」を持ちながら主体的に学べる防災学習プログラム(学習目標・単元構想図・指導案・教材等)の整備を、心理学・教育学におけるインストラクショナル・デザイン理論のADDIE理論の考え方ではじめることを目標としており、これらについては2011年東日本大震災の被災地である南三陸町、2009年兵庫県佐用町水害の被災地である佐用町、最近大きな災害発生がない栃木県をフィールドとして、実際に研究が進められていることは大きな成果であると考えている。特に、普通の小中学生だけはなく、2011年東日本大震災において障害者(障害手帳所持者)の死亡率を見ると被災地全体の死亡率よりも2倍近く多かったことが指摘されていることをふまえ、その現状を明らかにするための調査と、具体的な実践として「地震」における「視覚障害のある児童生徒」に焦点を当てて、視覚障害のある児童生徒が、地震の揺れに突然遭遇した時や緊急地震速報を見聞きした際、近くに大人(補助者)が誰もいない状況に置かれても、自らの判断で身を守る行動がとれる防災教育プログラムを提案した。またそのモデル校として、平成29年度の文部科学省委託事業「防災教育を中心とした実践的安全教育総合支援事業」の栃木県モデル校である栃木県立盲学校を選定した。ここでは、幼稚部から小中高等部、専攻科までがあり、通常の小・中・高等学校の教科教育と基本的に同じ目標、同じ内容で教育が行われており、障害をもたない子どもたちが使用するプログラムとの比較検討が可能であり、そのための実践・効果測定を行った。今後も、アクティブ・ラーニングやカリキュラム・マネジメントの考え方をもとに防災学習プログラムの開発・検証・改良を続けながら研究を促進させていきたい。特に、インストラクショナル・デザイン理論におけるADDIEプロセスに基づいた、現場教員等との協働による効果測定・評価を行っていく。ADDIE理論とは、学習プログラム設計を進めていくための基本となるプロセスモデルのことで、分析→設計→開発→実施→評価の5段階における英語の頭文字をとったものである。特に最終段階の評価を重要視しており、実際に現場で使用し、学習者の学習目標の達成度を評価することでその学習プログラム・教材を評価し改善・改訂につなげていきたい。今年度は障害をもつ児童生徒の中でも、「地震」における「視覚障害」に焦点をあてて、障害をもたない児童生徒のプログラムの一般性の検証と、視覚障害者向けのプログラムの効果測定を行った。今後は、障害の範囲を知的障害をもつ児童生徒に広げ、彼らが地震災害や緊急地震速報について正しい知識を身につけ、地震及び緊急地震速報を認知した際には、自らの危険を予測し回避する対応能力を高めることができるような教育プログラムの開発・検証を行うことで、障害をもたない児童生徒および、障害をもつ児童生徒も含めた、子どもたちの生きる力を向上させるような防災教育プログラムのあり方について提案をしていきたい。本年度は、研究初年度としてプログラム・教材開発のための前提となる、「わがこと意識」を高めて主体的に学ぶことができるような学習目標を明確化させるための意識調査を行い、定性的・定量的な分析を行った。これまでの防災教育で関係がある栃木県の小学生と教職員に対して「学校安全にまつわる20項目の危機」として意識調査を行い、「人生でも経験があり防災訓練等でも接する機会が多い,地震災害を出発点とした防災教育が有効である」ことを明らかにした。

そこで、例えば、地震防災教育、竜巻防災教育、火山防災教育などをそれぞれ単独で実施するのではなく,相互を組み合わせることによって自然災害に対する子どもたちの「生きる力」を維持することができるような教育プログラムの設計方法を提案してその実施可能性について、防災専門組織・教育委員会関係者等と検討を行った。当初計画では、児童生徒が「わがこと意識」を持つための促進要因について心理学面接法・質問紙法による質的量的社会調査を実施して検討を行うことと、心理学・教育学の教育方法・技術論をもとに「わがこと意識」を持ちながら主体的に学べる防災学習プログラム(学習目標・単元構想図・指導案・教材等)の整備をはじめることを初年度の目標としており、これらについては社会調査の実施分析および防災学習プログラムの提案が行えたことは大きな成果である。ただ今年度について、東日本大震災の被災地における被災学校教育現場の教員等へのインタビューやグループワークなどを通して、防災教育の検証を行うことを目的としていたが、東日本大震災からの復興が当初予定よりも大幅に遅れており(例えば住宅再建について、阪神・淡路大震災では震災から5年ですべての仮設住宅が解消されたが、東日本大震災では震災から6年が経過してもまだ仮設住宅等による避難生活が続いている)、被災地学校から「まだ震災の影響が残っており、新たな防災教育を進めることが難しい」との声があり、今年度計画していた被災地へのインタビュー等の調査研究が進まなかった。このためこれらについては次年度以降の課題として解決していきたい。本研究は、人生経験が浅く災害を具体的にイメージすることが難しい小中学生が、中央教育審議会が推奨し、新学習指導要領などにも取り上げられている能動的学修(アクティブ・ラーニング)やカリキュラム・マネジメントの考え方を援用しながら、防災専門家の介入のない教師ー児童生徒の教授過程において、災害を自分たちに引きつけて考える「わがこと意識」を持ち、教科学習の中で主体的に学ぶような学習プログラム(単元構想図・指導案)・教材等)を開発して、子どもたちの「生きる力」を向上させるものである。本年度は、プログラム・教材開発のための前提となる「わがこと意識」を高めて主体的に学ぶことができるような学習目標を明確化させるための意識調査を引き続き行い、定性的・定量的な分析を行った。特に、2011年東日本大震災の被災地である宮城県南三陸町の中学校教員とともに、防災教育・防災訓練の現状と課題を生徒への質的・量的な調査をもとに明らかにした。また、地震・津波以外の災害として、2009年の水害被災地である兵庫県佐用町の小学校において大雨災害防災教育プログラムを開発して、複数の学校で実践・検証を行った。さらに余震が多いなかでの人間に与える影響を明らかにするために、2016年熊本地震における被災地において質問紙調査を実施し、地域の活断層に対する知識が少ない被災者は、最初の地震後の余震に対する気づきが少なく、防災教育が必要であることを明らかにした。
口腔がんの発生にかかわるＲＮＡ結合タンパクの分解制御機構解明

本研究では、pp32のファミリーのpp32r1がどのようにHuRの分解を制御し、細胞のがん化に寄与しているかを解明した。pp32r1を強く発現しているがん細胞ではHuRのレベルが高かった。pp32r1はHuR分解に必要なcaspase3の活性を抑制し、pp32r1はpp32より強くHuRに結合した。これらの結果より、pp32r1はHuRと強く結合し、HuRを分解するcaspaseの働きを抑制することによりHuRタンパクを安定化し、細胞をがん化することが示唆できた。申請者らは最近、ARE-mRNAの安定化が細胞をがん化することを証明し、口腔がんなど多くのがんでもHuRが核外輸送され、ARE-mRNAも核外輸送・安定化されていることを見出した。さらに口腔がん細胞のHuRをノックダウンすると足場非依存性増殖能や浸潤活性も低下することを見出し、これらの成果に基づき申請者らは、ARE-mRNAの核外輸送システムの破綻による、新たな発がん機構を提唱している。本研究では、ARE-mRNAに結合するRNA結合タンパクHuRが分解制御されることによりどのように細胞のがん化に寄与しているかを解析している。これまで、口腔がん細胞のpp32ファミリーおよびHuRの発現を検討し、さらにpp32r1の口腔がんにおける役割を解析した。本年度は、pp32ファミリーによるHuRタンパクの分解、さらにpp32のノックダウンを行い、HuRの分解制御機構の解明を行った。1. pp32ファミリーによるHuRタンパクの分解:pp32を強制発現させた細胞では細胞質に存在しているHuRの発現量が低下していたのに対し、pp32r1を強制発現させた細胞ではpp32r1は細胞質にも局在し、それらの細胞では細胞質のHuR発現量が上昇していることが口腔がん細胞を用いた実験で明らかになった。2. pp32のノックダウン:pp32とHuRとの分解についても解析を行うために、がん細胞のpp32のノックダウンを行った。その結果、細胞質に存在しているHuR量が顕著に増加した。以上の結果よりpp32r1が過剰に発現されると、おそらくHuRの分解制御機構が抑制され、細胞質のHuR量が増加し、またpp32がノックダウンされてもHuRの分解が阻止されることが示唆できた。本研究では、ARE-mRNAに結合するRNA結合タンパクHuRが分解制御されることによりどのように細胞のがん化に寄与しているかを解析し、それらを制御することにより新しいがんの治療法を開発することを目的とする。本年度は口腔がん細胞のpp32ファミリーおよびHuRの発現を検討し、さらにpp32r1の口腔がんにおける役割を解析した。1.口腔がん細胞のpp32ファミリーおよびHuRの発現口腔がんを含むがん細胞、HEK293、SAS、HeLa、HT1080、HSC-3などで発現しているpp32r1、pp32、HuRをウエスタン法で検出し、正常細胞(MRC5、HGF、BJ)で発現しているそれらのタンパクと比較した。その結果pp32r1の発現ががん細胞で顕著に高く、他のタンパクはそれほど大きな差はなかった。さらに、それらタンパクの局在を免疫染色法で確認したところ、pp32r1はがん細胞の細胞質に多く存在し、その他のタンパクは主に核に局在することがわかった。2.pp32r1の口腔がんにおける役割pp32r1ががん細胞の形質に影響するか検討するため、SAS細胞にpp32r1を発現させ、軟寒天コロニー中でがん細胞の培養を行った。その結果pp32r1を発現している細胞は軟寒天中でもよく生育し、pp32r1はがん細胞の持つ足場非依存性増殖能を増強することが明らかになった。

これまで、口腔がん細胞のpp32ファミリーおよびHuRの発現を検討し、さらにpp32r1の口腔がんにおける役割を解析した。また、pp32ファミリーによるHuRタンパクの分解、さらにpp32のノックダウンを行い、HuRの分解制御機構の解明を行った。本年度は、口腔がん細胞を用いて、pp32やpp32r1を強制発現し、HuRの局在等を調べることにより、これまで解析してきた事実が実際に口腔がん細胞で再現されるか検討した。口腔がん細胞SASにpp32およびpp32r1の発現ベクターを導入し、HuRの局在を免疫染色法で調べた。その結果、pp32を発現している細胞ではほとんどのHuRが核に局在し、pp32r1を発現している細胞では、pp32r1とHuRはともに核及び細胞質両方に局在が認められた。また、同様の細胞を核と細胞質に分離し、各分画に存在するHuRをウエスタン法で検討した。その結果、pp32r1発現細胞の細胞質のHuRタンパク量は、pp32発現細胞のそれより多いことが明らかになった。これらの結果より、口腔がん細胞でも実際にpp32r1の発現がHuRの細胞質局在を促進することが解明された。実験病理学口腔がん細胞におけるARE-mRNAの核外輸送・安定化を解明する目的のため、ARE-mRNAに直接結合してその輸送に関わるHuRタンパクと結合するpp32とそのファミリーpp32r1について口腔がん細胞を用いて解析した。これまで本研究で主にがん細胞でpp32r1 (pp32r1は細胞がん化に関わると考えてられている)の発現が高かったことや、またpp32r1を発現させた細胞の足場非依存性増殖能が上昇したことは、pp32r1の発がん活性を別の角度から証明したことになるため貢献度が大きいと考える。さらに本年度はHuRの分解抑制機構詳細に検討し、pp32r1の発現が高い細胞では細胞質に存在するHuRの量が多いことを解明した。pp32発現細胞ではHuRの量は低下することがわかっていたため、我々の発見は非常に興味深い。さらに、pp32をノックダウンすることにより口腔がん細胞の細胞質でのHuR発現の増加が明らかになった。これらの現象より、おそらくHuRの分解制御機構が抑制され、細胞質のHuR量が増加したものと思われ興味深い。これらの事実をまとめると、本研究では様々な新しい知見が明らかになることによりHuRの分解機構およびpp32r1のもつ細胞がん化機構の一部がより詳細にわかるようになった。この点については達成度が高いと思われる。口腔がん細胞におけるARE-mRNAの核外輸送・安定化を解明する目的のため、初年度はARE-mRNAに直接結合してその輸送に関わるHuRタンパクと結合するpp32とそのファミリーpp32r1について口腔がん細胞を用いて解析した。pp32r1は細胞がん化に関わると考えてられており、今回の研究で主にがん細胞でpp32r1の発現が高かったことはいい発見だと判断できる。またpp32r1を発現させた細胞の足場非依存性増殖能が上昇したことは、pp32r1の発がん活性を別の角度から証明したことになるため貢献度が大きいと考える。今回の研究ではpp32r1高発現細胞やpp32をノックダウンした細胞では、なぜHuRの分解が阻害されたか不明であるので、今後この点について解析する必要がある。また、本研究の結果を応用すると、がん細胞で高発現しているpp
常在性薬物代謝型シトクロムP450発現の周期的変動に関する解析

生命活動の変動には一定の周期性を持ったものも多く、薬効発現の重要な変動要因となりうる。本研究ではCYP3A遺伝子の周期的発現変動をマウスをモデルに解析した。平成18年度にはメス特異的P450であるマウスCyp3a41およびCyp3a44遺伝子の発現に性周期依存性、日内変動があり、特にCyp3a41遺伝子の発現は発情前期から発情期に進むことで増加すること、日中より夜間に高いことを観察した。また、分泌に日内変動がある副腎皮質ホルモンによる調節を調べ、両遺伝子がグルココルチコイドホルモンによる促進的調節を受けていることが明らかにし、その調節はCyp3a41ではグルココルチコイド受容体(GR)、Cyp3a44ではGRに加えプレグナンX受容体(PXR)を介したものである事を明らかにした。平成19年度には、Cyp3a41遺伝子に注目し日内変動の機構解明を試みた。Cyp3a41遺伝子の5'上流領域約10kbまでを単離し、マウス肝細胞初代培養系を用いレポーター遺伝子アッセイを実施し、-163bpまでの領域に転写を促進するエレメントがあることを見いだした。その領域にはHNF4αの推定結合配列が認められ、変異導入による転写活性の低下、グルココルチコイドホルモンに対する応答性の低下が観察された。より生理的環境に近い条件で確認するためin vivoレポーター遺伝子アッセイを行い、転写活性はメスにのみ観察され変異によってレポーター遺伝子活性が消失することを明らかにした。ChIPアッセイにより、当該配列にHNF4αが結合し、結合量はメスで多い事も明らかになった。HNF4αmRNA発現は夜間に日中の2倍程高くなり、CYP3A41と相関が観察されることを考え合わせると、Cyp3a41遺伝子のメス特異的発現がHNF4αに依存するのみならず、発現の日内変動もHNF4α活性の変動に起因している可能性が示唆された。本研究では、薬物代謝酵素シトタロムP450、特にCYP3A遺伝子の周期的発現変動をマウスをモデルに解析した。マウスには、8つのCyp3a遺伝子(Cyp3a11,13,16,25,41,44,57,59)が存在するが、本年度は先ずヒトCYP3A4に近い発現プロファイルを示すメス特異的なCyp3a41とCyp3a44遺伝子について解析した。始めに定量的mRNA発現の解析を行うため、二つの遺伝子特異的なTaqManプローブを利用したリアルタイムRT-PCR法を構築した。メスマウスは45日の性周期(発情前期、発情期、発情後期、発情休止期)を示し、発情前期に両遺伝子の発現に影響を与えるエストラジオールの一過的な大量分泌が観察される。性周期と肝臓における両遺伝子の発現の関連を解析したところ、Cyp3a41遺伝子は、発情期に高いmRNA発現を示し、最も低い発情前期に比べ約2倍の発現を示した。一方、Cyp3a44はCyp3a41とは異なり、発情期に最も低い発現を示し発情休止期に最も高い発現を示した。日内変動について、エストラジオールレベルの低い発情後期から発情休止期おいて観察した。マウメは12時間の明暗サイクルのもと2ヶ月飼育し、12、16、20、0、4、8時に肝臓を摘出した。

その結果、Cyp3a41発現には日内変動が観察され、0時における発現が他の時刻に比べ約2倍の値を示した。一方、Cyp3a44には顕著な日内変動は観察されなかった。Cyp3a41とCyp3a44両遺伝子は調節領域においても高い塩基配列の相同性を示す。次年度は、二つの遺伝子について比較検討することで、Cyp3a41遺伝子発現の性周期依存的変動、日内変動をもたらす機構の解明を目指す。生命沽動の変動には一定の周期性を持ったものも多く、薬効発現の童要な変動要囚となりうる。本研究でCYP34遺伝子の周期的発現変動をマウスをモデルに解析した。昨年度、メス特異的P450であるマウスCyp3a41およびCyp3a44遺伝子の発現に性周期依存性、日内変動があることを観察した。また、分泌に日内変動がある副腎皮質ホルモンによる調節を調べたところ、両遺伝子がグルココルチコイドホルモンによる促進的調節を受けていることが明らかになり、Cyp3a41にはグルココルチコイド受容体(GR)、Cyp3a44にはGRに加えプレグナンX受容体が関与している事が明らかになった。そこで今年度はCyp3a41遺伝子に注目し、日内変動の機構解明を試みた。Cyp3a41遺伝子の5'上流領域約10kbまでを単離し、マウス肝細胞初代培養系を用いレポーター遺伝子アッセイを実施したところ、-163bpまでの領域に転写を促進するエレメントがあると予想された。その領域に日内変動が知られている転写因子の結合配列が存在するか調べたところ、HNF4αの推定結合配列が認められ、変異導入による転写活性の低下が観察された。また、その変異によってグルココルチコイドホルモン応答性も低下した。より生理的環境に近い条件で確認するため、in vivoレポーター遺伝子アッセイを行ったところ、転写活性はメスにのみ観察され、変異によってレポーター遺伝子活性はほぼ消失した。さらに、ChIPアッセイによりHNF4αの結合がメスで多い事が明らかになった。HNF4αとCYP3A41のmRNA発現は、共に夜間に日中の2倍程高くなり相関が観察されることを考え合わせると、Cyp3a41遺伝子発現の日内変動はHNF4α活性の変動に起因している可能性が示唆された。
線画の著作権を保護するため不正コピーの検出法

本研究では、線画の著作権を保護するため、実用できる検索法を目的とする。不正利用として、オリジナルをそのまま複製して利用することの他に部分的複製と手書きの複製と類似した複製がる。研究代表者は印刷と手書き複製に有効な検索法を提案したが、実際に著作権を保護すべき画像が大量にあるので、メモリ量と検索スピードの問題になる。この問題に対して、今年度の研究にはデータベース削減法を注目した。まず、コンピュータビジョンの分では様々なデータベース削減法を勉強した。識別性が高い特徴を取り抜き、よりコンパクトのデータベース構築法を提案した。その上、幾つの近似最近傍探索法を考案し、研究結果をlnternational Journal on Document Analysis and Recognition(IJDAR)論文誌に発表した。そして、コッミクスの構造解析法を参照し、著作権がない吹き出しを除去し、データベースの削減を行った。同程度の精度でより小さいデータベースで早く検索ができた。一方、類似した複製には従来手法の認識率が低い問題に対して、キャラクターの顔の特徴量を取り込んだ。機会学習で特徴を選んで、多段階で記述する方法を提案した。結果をまとめる論文をIEEJ Transactions on Electronics,Information and Systems論文誌に掲載された。更に、顔領域を拘らなく、キャラクターのすべての領域を考えた。局所特徴の照合による特定コッミクキャラクターの検出法を提案した。この手法では、回転や射影やおクルージョンなどによる変化があっても、有効的に同一のキャラクターが検出できる。研究結果をまとめて、International Conference on Document Analysis and Recognitionに投稿した。線画に拡張性がある検索法について、選り抜きインデキシングをハッシングの幾つの方法を考案した。識別性が低い部分を除去するデータベース削減法を提案した。同じ精度でデータベースを82.6%に、検索時間44%に削減できた。類似した複製には、識別性が高い局所特徴量を利用し、キャラクターの変化に対して、安定な検索法を提案した。そして、目標より多い漫画が収集できた。今100万枚のページがあった。平成25年度は廃止する本研究では、線画の著作権を保護するため、実用できる検索法を目的とする。平成25年度は廃止する
ENU変異熱帯熱マラリア原虫コレクションの構築と変異原因遺伝子同定法の開発

本研究では熱帯熱マラリア原虫を約70%の原虫が死滅する条件においてENUで処理し、遺伝子変異を誘発した原虫集団を作出した。次にENU変異原虫集団をメフロキンで処理し、新たにメフロキン耐性を獲得した原虫を選択した。この原虫における遺伝子変異を同定するために全ゲノム解析及びSNPs解析を行った。その結果、約2000個の変異が同定された。次に耐性の責任遺伝子を同定するために耐性原虫由来人工染色体ライブラリーを構築し、メフロキンによるスクリーニングを行った。その結果、メフロキン耐性遺伝子が組み込まれたと推定される原虫クローンを3種得ることに成功した。現在、この耐性遺伝子の同定を試みている。昨年度までにENUにより熱帯熱マラリア原虫を処理し、ランダムに変異を導入した原虫集団を得た。この集団をメフロキン処理し、新たにメフロキン耐性原虫株を樹立後、次世代シークエンサーによってゲノム上の遺伝子変異(SNPs)の決定を決定することを試みた。本年度はまず、昨年度に引き続き、SNPsを確実に決定するための配列決定条件を決定することを試みた。その結果、ABI社製Solid5500システムにより配列を決定後、Lifescopeによるマッピングを行った場合、正確にSNPsを決定することができ、約2000個のSNPsが存在することが示された。次に得られたメフロキン耐性原虫の性状解析を行った。まず、メフロキンに対する半数致死濃度(IC50値)を検討した結果、約35nMであることが判明した。ENUによる変異導入前のIC50値は約12nMであったことから、約3倍程度耐性能が上昇していることが示された。更に患者由来のメフロキン耐性株と比較した結果、ほぼ同等の耐性を示したことからENUにより獲得したメフロキン耐性原虫は臨床においても耐性を示すことが示唆された。またこの原虫よりゲノムDNAを精製し、熱帯熱マラリア原虫人工染色体を用いて遺伝子ライブラリーを原虫内に構築した。得られたライブラリーは原虫ゲノムを約10カバー程度していることが判明し、十分に耐性遺伝子のスクリーニングに使用できるものであった。現在、この遺伝子ライブラリーに対し、メフロキン処理を行い、耐性遺伝子の同定を試みている。平成26年度にはENU処理による遺伝子変異条件の決定し、ENU変異マラリア原虫株の樹立を行った。その結果、原虫(熱帯熱マラリア原虫3D7株)の70%が死滅する条件においてENUによる変異を持つ変異原虫集団を獲得することに成功した。続いて得られた原虫集団をメフロキン処理し、生存した原虫集団から限界希釈法により変異原虫をクローン化してENU変異メフロキン耐性原虫クローンを得た。次にこのクローンついて全ゲノム配列及び遺伝子変異(SNPs)の決定を行った。実験にはSOLID5500system(ABI社製)とION PROTON(ABI社製)を用い、得られた配列情報を熱帯熱マラリア原虫3D7株のゲノムと比較して変異を同定した。SOLID5500systemにより配列決定した場合はLifeScopeプログラムを用いてMappingし、更に同プログラムを用いてSNPsをコールした。一方、ION PROTONにより配列決定した場合はProton TorrentサーバーにてMapping及びSNPsのコールを行った。その結果、SOLID5500systemを用いた場合は約2000個のSNPsが同定されたのに対し、ION PROTONにより配列決定した場合は約20000個のSNPsが同定され、両者の間に約10倍の違いがあることが明らかとなった。更にこれらの差がSNPsコールによるものかを検討するために両シークエンサーより得られた配列のMapping情報をもとにCLC genomic workbenchを用いてSNPsコールを行った。その結果、SNPs数の違いに大きな変化は無く、SNPsコールではなく配列決定の手法による違いが原因であることが示唆された。現在、両手法で同定されたSNPsからいくつかを任意に選択し、実際にSanger法により変異を確かめ、何れの手法が最適であるか検討している。当該年度は計画通りENU処理により変異原虫集団を獲得し、更にこれらに対してメフロキン処理の行い、ENU変異メフロキン耐性原虫を獲得することに成功した。当初は温度感受性が変化した表現型を示す原虫の獲得を計画していたが、試験的に行った薬剤耐性試験により変異メフロキン耐性原虫集団を獲得でき、臨床上重要性が高く且つ本研究の目的である順遺伝学的な手法の確立に使用可能であるため同原虫集団に焦点を絞り研究を展開することとした。以上のことより当該年度に目的とするENU変異集団の確立と熱帯熱マラリア原虫人工染色体遺伝子ライブラリー構築に必要な研究試料の獲得に成功したため計画は予定通りに進展していると判断した。

寄生虫学まずENU変異メフロキン耐性原虫のゲノム解析を進め、SNPsを確定し、表現型に対する責任遺伝子(耐性遺伝子)の候補を同定する。既にSOLID5500system及びIONPROTONによりゲノム解析を終了し、SNPsの候補の同定まで成功していることから平成27年度中に達成できると見込んでいる。一方、得られたメフロキン耐性原虫について熱帯熱マラリア原虫人工染色体による遺伝子ライブラリーを作製し、Functional Screeningによりメフロキン耐性に対する責任遺伝子を同定する。既に手法については確立済みであるため、平成27年度内に達成できると予想する。当該年度はSOLID5500systemとIONPROTONによるゲノム解析とSNPs同定を中心に進めた。この実験はENUによる変異の導入を評価するために必須のものであり、計画していた多数のゲノム解析よりも先に確立する必要があった。その為、ゲノム解析に使用予定であった試薬用の予算に未使用が生じた。平成27年度前半にSNPs同定法を確立し、計画通り未使用額を変異原虫のゲノム解析に使用する。
多能性幹細胞を糖鎖で制御－多能性の維持・分化は糖鎖生合成経路の改変で得られるか？

本研究課題はアスパラギン結合型糖鎖の生合成を制御することで、多能性幹細胞の未分化維持に関する知見を得ることを目的とした。(1)マウスゴルジマンノシダーゼIA発現抑制による糖鎖構造への影響:未分化のマウスES細胞TT2にゴルジマンノシダーゼIA(MAN1A1)発現抑制用siRNAを導入した。その結果、細胞の糖鎖構造は、コントロールのGAPDH発現抑制用siRNA導入細胞と同様であった。TT2の未分化状態の糖鎖形成にMAN1A1は寄与していないと考えられた。(2)マウスゴルジマンノシダーゼIA欠損細胞の樹立:ES細胞TT2にMAN1A1gRNAを発現するプラスミドDNAを導入した。マーカーを指標に候補細胞を回収した。得られた候補細胞の中には、分化時に糖鎖構造が変化したものが見出された。(3)キフネンシン添加による効果:マンノシダーゼ阻害剤キフネンシンはMAN1A1の活性も阻害する。レチノイン酸の添加によりES細胞を分化させる系で、キフネンシンを添加したところ、1)糖鎖構造の解析から高マンノース型糖鎖のプロセッシング阻害が確認された一方、2)細胞形態に顕著な変化は見られなかった。また、キフネンシンの代わりにRNAiの手法により、mMAN1A1の発現抑制を行ったが、形態変化に関しては同様であった。(4)MAN1A1の転写開始点上流領域に見いだされたEST:ESTの機能解析の過程で、RT-PCR法によりその発現パターンを調べた。その結果、予想される転写物の一部の領域の発現が、TT2の分化に伴い変化することが見出された。(目的)本研究課題は再生医療の重要な材料である多能性幹細胞を取り扱う。再生医療には多能性幹細胞が必要である。その上、再生医療のコアは、胚性幹細胞(ES細胞)と人工多能性幹細胞(iPS細胞)の樹立、維持である。幹細胞の多能性の維持には、分泌性蛋白質が必要である。幹細胞自身が分泌する内因性の蛋白質の多くは、アスパラギン結合型糖鎖を持つ糖蛋白質である。また、肝細胞表面に局在する、分泌性蛋白質の受容体の多くも糖鎖を持つ糖蛋白質である。本研究課題はアスパラギン結合型糖鎖の生合成を制御することで、多能性幹細胞の未分化維持に関する知見を得ることを目的とする。詳述すると、多能性幹細胞研究の現状から導いた、「多能性幹細胞の未分化の維持は、分泌性の蛋白質因子やそのレセプターの糖鎖がハイマンノース型であることが必然」という仮説を、申請者の駆使する研究手法により検証し、発展させることが本研究課題の目的である。(平成27年度)マウスES細胞でのゴルジマンノシダーゼIAの強制発現による細胞の性状および糖鎖構造への影響を解析するES細胞でGolgiManIAの強制発現させることにより、(1)細胞が分化するか?、(2)糖鎖構造がどのように変化するか?を明らかにすることを目的とする。まず、マウスゴルジマンノシダーゼIA,IB,ICの発現用プラスミドDNAを作製する。次に、マウスES細胞TT2に、マウスゴルジマンノシダーゼIA発現プラスミドDNAを導入し強制発現させた細胞を作製する。得られた細胞の形態観察をするとともに、未分化マーカーの遺伝子の発現の変化や、抗原の発現の変化を解析する。さらに、TT2細胞をレチノイン酸で分化させる過程で、マウスゴルジマンノシダーゼIAを強制発現させたときに、糖鎖構造がどのように変化するか?を細胞より調製した糖鎖を解析することで、明らかにする。まず、マウスES細胞の糖鎖のみを単離解析するためには、(1)フィーダー細胞など余計な細胞の混入がなく、(2)培地に含有される血清由来の糖蛋白質の持ち込み量がなるべく低減され、かつ(3)ES細胞が多能性を維持する条件、を探す必要が生じた。そこで探索した結果、市販の2種類の合成培地で、上記(1)(3)を達成できることを見出した。合成培地で培養したTT2細胞は、レチノイン酸の添加により、Oct4の発現が消失するとともに、細胞の形態が変化したことから、平成27年度に確立した培養系で当初目的の実施項目を試せると考えられた。次に、mGolgiManIA発現用のプラスミドDNAを準備した。以上、糖鎖を解析するという目的に合致する、ES細胞からのサンプル調製法の確立に時間がかかり、当初の予定よりはやや遅れている。しかしながら、当初計画においても、平成27年度実施予定の項目が年度内に終了しない場合には、平成28年度に完遂することを考慮し、記載しており、許容範囲内と考えられる。その上、再生医療のコアは、胚性幹細胞(ES細胞)と人工多能性幹細胞の樹立、維持である。そこで、本研究課題はアスパラギン結合型糖鎖の生合成を制御することで、多能性幹細胞の未分化維持に関する知見を得ることを目的とする。

詳述すると、多能性幹細胞研究の現状から導いた、「多能性幹細胞の未分化の維持は、分泌性の蛋白質因子やそのレセプターの糖鎖がハイマンノース型であることが必然」という仮説を、申請者の駆使する研究手法により検証し、発展させることを本研究課題の目的とする。(平成28年度)(1)ES細胞でのマンノシダーゼ阻害剤の添加による細胞の性状および糖鎖構造への影響を解析する:マンノシダーゼ阻害剤キフネンシンはマウスゴルジマンノシダーゼIA(mMAN1A1)の活性も阻害する。レチノイン酸の添加によりES細胞を分化させる系で、キフネンシン添加による影響を探求した。その結果、細胞形態ではレチノイン酸添加後に顕著な変化は見られなかった。また、キフネンシンの代わりにRNAiの手法により、mMAN1A1の発現抑制を行ったが、同様であった。(2)ES細胞の分化系におけるnon-coding RNAの発現:mMAN1A1の転写開始点上流領域に見いだされたESTがnon-coding RNAであり、mMAN1A1の発現に関わる可能性を検討した。そこで、RT-PCR法により発現パターンを調べた。その結果、予想される転写物の一部の領域の発現が、分化前後で異なっていた。本研究課題実施中に情報が明らかになり、その意義が重要なmMAN1A1のnon-coding RNAに関する研究に着手したため、当初平成28年度に予定していた「糖鎖の調製、標識、解析」が遅延している。(目的)本研究課題は再生医療の重要な材料である多能性幹細胞を取り扱う。再生医療には多能性幹細胞が必要である。その上、再生医療のコアは、胚性幹細胞(ES細胞)と人工多能性幹細胞(iPS細胞)の樹立、維持である。幹細胞の多能性の維持には、分泌性蛋白質が必要である。幹細胞自身が分泌する内因性の蛋白質の多くは、アスパラギン結合型糖鎖を持つ糖蛋白質である。また、肝細胞表面に局在する、分泌性蛋白質の受容体の多くも糖鎖を持つ糖蛋白質である。本研究課題はアスパラギン結合型糖鎖の生合成を制御することで、多能性幹細胞の未分化維持に関する知見を得ることを目的とする。詳述すると、多能性幹細胞研究の現状から導いた、「多能性幹細胞の未分化の維持は、分泌性の蛋白質因子やそのレセプターの糖鎖がハイマンノース型であることが必然」という仮説を、申請者の駆使する研究手法により検証し、発展させることが本研究課題の目的である。(平成29年度)(1)マウスゴルジマンノシダーゼIA発現抑制による糖鎖構造への影響:未分化のTT2細胞にゴルジマンノシダーゼIA発現抑制用siRNAを導入した後、細胞を回収した。分画を行っていない細胞を材料として糖鎖を調整し、引き続き検出用のラベルを導入した。得られたマススペクトルのパターンは、コントロールのGAPDH発現抑制用siRNA導入細胞と比較したが、大きな変化が見られなかった。次年度において、前記細胞の解析を行う。次年度において、RNAiの期間を伸ばし、影響を解析する予定である。(2)マウスゴルジマンノシダーゼIA欠損細胞の樹立:Cas9-CRISPR系を利用して、ゴルジマンノシダーゼIA欠損ES細胞を樹立するために、TT2細胞にMAN1A1gRNAを発現するプラスミドDNAを導入した。マーカーを指標に候補細胞を回収した。次年度において、前記細胞の解析を行う予定である。平成29年度に実施予定であった「糖鎖の調整、標識、解析」に時間がかかり、遅延してしまったため。
ニューカレドニアと周辺地域の先住民語の研究-ネク語、ティンリン語の記述を中心に-

平成16年度から18年度にわたる本研究は、ニューカレドニア島とその周辺地域の先住民語、特にネク語、ティンリン語の記述を中心とした。この二言語は話者が200人余りの深刻に消滅の危機に瀕している言語である。両言語とも『Tinrin Grammar』(Osumi 1995)以外、ほとんど記録が無い。緊急の調査と記録の必要が迫られている。興味深い言語現象を多く持つこれらの言語の研究は言語理論、言語類型学に貢献するだけでなく、先史人類の移動という観点から比較言語学や考古学においても大変重要である。研究代表者は平成16年、17年の8、9月、19年2、3月にニューカレドニアのワウェ原住民部落及びヌメア市に滞在し、ネク語の語彙やテキストの収集及び社会言語状況の調査を行った。ティンリン語の語彙調査も行った。ヴァヌアツ、ブーゲンヴィル、ニューギニア島嗅部の言語や言語状況に関する情報は研究協力者および海外共同研究者から得た。辞書、文法の仏訳は海外共同研究者の協力で進行中である。出版成果の主なものは次のものである:動詞の仕組み一文化とことばをひもとくカギ『今、世界のことばが危ない』(クバプロ)・現代社会とメラネシアの言語『太平洋学会誌』96号・評価に関わる文法表現と意味一オセアニア言語を中心に『NEWSLETTER』日本オセアニア学会・Result-evaluation in grammar : a preliminary survey学会発表、2^<nd> Conference on the syntax of the World's Languages, University of Lancaster・その他、ハワイ大学、ロンドン大学(SOAS)、マックス・プランク研究所(ライプチッヒ)、ベルリン大学、ラトローブ大学でネク語、ティンリン語についてセミナー講演。大角翠(研究代表者)は平成16年7月30日から9月13日にニューカレドニア本島中南部、ワウェ部落に滞在しネク語の調査を行った。現地では、ルイ・ウインベを中心に、音韻、語彙の収集、会話、ナレーションの録音等を行い、また、隣接するオロウィン語の調査やヌメアでの国際セミナーにも参加した。チバウ・カナク文化センターが中心に進めているニューカレドニア先住民語の辞書作成に立ち会ったが、消滅の危機に瀕する言語を記録する緊急性を鑑みても、短期間に非専門家が行う辞書の編纂は問題を多く含んでいるとの印象を持った。ヌメアでは、領土全般の言語資料の調査、収集を引き続き行い、ド・ラ・フォンティネル教授他の研究者と意見交換を行った。A・オレロ氏はティンリン語の辞書項目のチェック、及びアンケート調査の協力を行った。ネク語は話者数が221人(1996年統計)と極めて少ない言語であり、先行記録はほとんどない。話者が存命するうちにできるかぎりの調査と記録の必要が迫られている。平成13、14年に大角がワウェで収集したネク語の基礎語彙とテキストは、分析,編集したのち、『環南太平洋の言語』第2号と第3号の中で発表した。ティンリン語とネク語は隣接した地域で話されているにも拘わらず、語彙、音韻、文法面のすべてにわたり非常に異なっており、比較言語学的にも興味深いものである。現在ネク語については語彙集の制作、テキストの文字化、文法分析を続けており、ティンリン語については文法、辞書の両方で、ブケーの協力のもと仏語訳を準備中である。周辺地域の言語調査は、大西正幸がブーゲンヴィル島のブイン、ナゴヴィシ語、内藤真帆がバヌアツのツツバ島語、千家愛子がバラサフ語、佐藤寛子が西ニューブリテン島のコーベ語のフィールド調査を行った。それぞれ言語学会、オセアニア学会、太平洋学会等で発表した。