hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己免疫疾患の治療標的としての長寿命形質細胞の解析

本研究の目的は、天疱瘡モデルマウスを用いて、自己免疫疾患の免疫抑制治療への抵抗性の原因の一つと考えられる長寿命形質細胞を単離し、その表面高原、遺伝子の解析をすることにより、持続的な抗体産生そして長寿命の機序を明らかにすることにある。さらに特異的な細胞表面マーカーを同定し、それをターゲットとした治療法の確立を目指す。B細胞を特異的に除去する抗マウスCD20抗体(以下MB20-11)を発症前の天疱瘡モデルマウスに投与し、肉眼的にも血清学的(組換えDsg3蛋白を抗原としたELISA法)にも天疱瘡の発症が完全に抑制されることを示した昨年度に引き続き、今年度は発症後のモデルマウスにMB20-11を投与し、その効果を評価した。2週毎にMB20-11を投与したマウスは、コントロールマウスに比してDsg3に対する抗体価は、投与2週間後で約60%、4週間後で約40%となり、その後は抗体価の低下は見られなかった。肉眼的には、MB20-11を投与したマウスの脱毛・びらんの改善は認められなかった。以上の結果より、抗Dsg3抗体の約40%は、B細胞を除去しても維持されていることになり、すなわち長寿命形質細胞によって産生されている抗体であると考えられた。次にMB20-11を投与したマウスの脾臓・骨髄・リンパ節より、抗体産生細胞数をELISPOT法にて計測した。しかし、いずれの臓器においても抗体産生細胞を検出することができなかった。コントロールマウスの抗体産生細胞数も、脾臓においても0.05%程度しかなく、長寿命形質細胞の絶対数が非常に少ないことが推測された。長寿命形質細胞の単離と同定を行うことが出来なかったが、間接的ではあるものの、その存在を確認することはできた。長寿命形質細胞、は、治療に難渋する天庖瘤の原因の1つであり、その追究は、新しい自己免疫抑制治療の開発につながり得ると考える。本研究の目的は、大疱瘡モデルマワスを用いて、自己免疫疾患の治療抵抗性の原因と考えられる長寿命形質細胞を生細胞のまま分離し、その表面抗原、遺伝子発現の解析をすることにより、持続的な抗体産生そして"長寿命"の機序を明らかにすることにある。さらに特異的な細胞表面マーカーや発現遺伝子を同定し、それをターゲットとした治療法の確立を目指す。平成18年度は、長寿命形質細胞の分離の前段階として、発症前の天疱瘡モデルマウスにB細胞を特異的に除去する抗マウスCD20抗体(以下MB20-11)を投与し、MB20-11の効果を評価した。発症前にMB20-11を投与したマウスはコントロールに比して、形態学的には体重減少を認めず、脱毛・びらんを全く生じなかった。また組換えDsg3を抗原として用いたELISA法にてもDsg3に対する抗体価の上昇を認めず、ELISPOT法にて抗Dsg3抗体生産B細胞数を計測したが、脾臓・骨髄・リンパ節の全てにおいて検出されなかった。以上の結果よりMB20-11は抗体産生B細胞を除去することにより天疱瘡の発症を予防することが示された。また、モデルマウスの脾臓・骨髄・リンパ節における抗体産生細胞数を経時的にELISPOT法にて計測したところ、脾細胞移植28日経過後も骨髄の抗体産生細胞は少数のままであった。従来オバアルブミンなどの外来抗原を免疫した場合、抗体産生細胞は初めに脾臓などの二次リンパ組織にいるが、時間経過と共に骨髄に移動しそこでニッチを形成すると考えられている。今回の結果から、長寿命形質細胞のニッチが骨髄以外にある可能性が示唆された。平成19年度は、発症後のモデルマウスにMB20-11を投与し、その効果を評価する。そしてそのマウスから長寿命形質細胞を単離し、その表面抗原の解析を行う。

しかし、いずれの臓器においても抗体産生細胞を検出することができなかった。コントロールマウスの抗体産生細胞数も、脾臓においても0.05%程度しかなく、長寿命形質細胞の絶対数が非常に少ないことが推測された。長寿命形質細胞の単離と同定を行うことが出来なかったが、間接的ではあるものの、その存在を確認することはできた。長寿命形質細胞、は、治療に難渋する天庖瘤の原因の1つであり、その追究は、新しい自己免疫抑制治療の開発につながり得ると考える。
超分子複合体のらせん構造誘起によるアシンメトリック配位空間と非対称反応場の創出

本研究では、複数の有機分子を階層的、自律的に組み上げることによって、デザイン可能なアシンメトリックナノ空間を有する超分子多孔性物質を構築する。このような多孔性物質のナノ空間表面を配位性分子で化学修飾し、触媒金属を配位させることで精緻にコントロールされた非対称反応場を創出し、物理刺激(光、熱)を印加することにより反応が進行する高度に制御された超分子不斉ナノリアクターを創製する。さらに、究極的にはCO2を比較的温和な条件でアミノ酸等へのキラル物質変換することに挑戦する。
悪性胸膜中皮腫術後の回復期身体運動機能及び健康関連QOLに対する術後活動量の影響

【はじめに】悪性胸膜中皮腫(MPM)は、アスベスト暴露により胸膜などに発生する予後不良かつ急速に侵攻する悪性腫瘍である。先行研究では、MPMに対する肺胸膜全摘術後中長期にかけての身体・運動機能及び健康関連QOLの経過報告がされているが、術後急性期における報告は少ない。また臨床場面では術後の疼痛などにより活動量が低下していると思われる症例にしばしば遭遇するが、術後の活動量が退院時の身体機能、健康関連QOLに影響するかについての検討は見られない。今回我々は、MPM術後の活動量が、退院時の身体運動機能及び健康関連QOLにどのように影響を与えるかを調査し、身体的特徴及び変化特性を明らかにすることを目的とした。【対象と方法】対象は、MPMに対して胸膜切除/肺剥皮術を施行した患者8名(うち女性2名)。身体機能とQOLは活動量、握力、膝伸展筋力、6分間歩行距離、肺活量、健康関連QOL(SF-36)、を手術前及び術後退院時に測定した。【結果】握力、6分間歩行距離、肺活量、健康関連QOLの身体機能に関する項目は大きく低下した。術後活動量については、病棟での入院生活において3Mets以上の負荷強度の高い活動性を認めた症例は少なく、多くの症例が1.6Metsから2.9Mets以下の中等度の活動性にとどまっていた。活動量と身体機能の関係は、術後早期から、日常的に中等度以上の活動性を有していた症例の方が、そうでない症例に比べ身体機能の低下の度合いが少ない傾向にあった。【結語】MPM術後急性期においては、術後早期からの離床を積極的に進めることが術後活動量の増大につながり、身体機能の低下を防ぐ可能性があることが示唆された。
ネオスポラ原虫の垂直感染関連因子の同定とワクチン及び診断システムへの応用

1.牛血清のサンプリングネオスポラ原虫抗体陽性牛のうち、流産あるいは異常産を起こした母牛および正常な出産をした母牛の血清サンプリングを実施した。当初、山形県家畜保健衛生所を介したサンプリングを予定していたがサンプル数の確保が困難だったため、宗谷家畜衛生保健所よりサンプルを確保した。2.原虫由来タンパク質と組換えタンパク質の回収プロテオームマップの作成およびELISA法の抗原に用いるために、分離精製したネオスポラ原虫NC-1株(犬から分離した世界的標準株)から可溶性タンパク質を調整した。またELISA法に用いる原虫由来組換えタンパク質として、大腸菌発現系によるNcSAG1,NcSRS2,NcGRA7の生産・精製方法を確立した。3.原虫由来組換えタンパク質を用いたELISAによる牛血清のスクリーニング上記組換えタンパク質を抗原としたELISA法により牛血清のスクリーニングを実施したところ、ネオスポラ陽性で正常出産した群と比較して、ネオスポラが感染し流産を起こした個体において抗NcGRA7抗体の上昇が確認できた。4.二次元電気泳動による虫体分泌タンパク質のマッピング回収した原虫タンパク質液を二次元電気泳動にて展開した後にタンパク質染色(クマシー染色・銀染色など)を行い、さらに画像解析を行うことでプロテオームマップを作成した。回収した原虫タンパク質液を二次元電気泳動にて展開した後に、スクリーニングした牛血清を用いたイムノブロッテイングを行い、流産あるいは異常産を起こした母牛および正常な出産をした母牛の血清が認識する原虫由来分子を比較検証することを予定している。
成人T細胞白血病細胞発症におけるHTLV-Iウイルス抗原の解析

ATL症例の末梢血単核球またはリンパ節細胞より抽出した染色体DNAを用いてサザン法によりHTLV-IHTLV-Iプロウイルスを解析した。プローブとしては全HTLV-Iを使用することにより欠損型プロウイルスを有する症例をサザン法により同定しうる。解析した27例中、完全型プロウイルスは11例(約40%)、欠損型ウイルスは16例(約60%)であった。欠損型プロウイルスの割合は従来の報告に比べ高率であった。欠損型プロウイルスのできる機序には2種類あると考えられている。一つはスプライシングにより欠損が生じ、5'-LTRが保存されるタイプであり、もう一つは5'LTRを含む欠損が起こっているタイプである。我々の解析した症例では欠損型プロウイルスの内、40%が前者の、そして残りの約60%が後者のタイプであった。これらの症例のうち代表的なものを選びgenomicDNAよりlambdaDashu IIを用いライブラリーを作成し欠損型プロウイルスを含むクローンを単離し欠損を塩基配列レベルで検討中である。また、これらの症例の細胞を用いHTLV-I抗原、特にTax,Rexの発現を蛋白レベルで検討中である。これらの解析によりATLにおける欠損型プロウイルスの頻度が従来の報告以上に高頻度であることや、2種類の欠損型プロウイルスが確かに存在し、ほぼ同数見られることを証明した。さらに研究を進め、これらの欠損型プロウイルスを有するATL細胞がウイルス抗原(Tax,Rexなど)を発現しうるか、ひいてはTaxが白血病の初期のみに必要なのか、それとも維持にも必要かを明らかにできるものと考える。
創薬を先導する有機フッ素化合物の合成法の開発

(1)ジペプチドイソスターを指向したフッ素置換オレフィンの効率的合成法の開発に関しては、フッ素原子の特徴に着目した反応設計に基づく有機銅試薬とジフルオロアリル誘導体の脱フッ素アリル置換反応による立体および位置選択的な合成法を確立した。本反応の応用としてペプスタチンのフッ素オレフィンアナログの合成を検討した。さらに、ジハロフルオロ化合物と低原子価クロムとの反応によるフッ素置換ビニルエーテル類やフッ素置換ビニルエステル類の新規な合成法を見出した。これらのフッ素化合物は加水分解酵素阻害などの生理活性の面で興味が持たれる。(2)グルタミン酸受容体サブタイプ特異的作用薬の開発を指向したフッ素置換配座固定型グルタミン酸アナログの合成では、申請者が開発したフルオロヨード酢酸エステルのオレフィンへのラジカル付加反応を経由する立体選択的合成を応用したシクロプロパン骨格を有するアナログの合成などを行った。(3)入手容易なトリフルオロアセトアルデヒドヘミアセタールを合成素子とする反応開発では、アミノスチレン誘導体との反応によるトリフルオロメチル置換キノリン類の効率的合成法を確立した。(4)2点配位をコンセプトとした特異なルイス酸触媒の分子設計に基づく付加環化反応の開発では、これまで低収率あるいは反応がしないなどの問題点があったエステル基を連結鎖とする基質の分子内Diels-Alder反応に有効な触媒の開発に成功した。フルオロアクリル酸エステルなどフッ素置換基質でも好結果を得た。(5)フッ素化合物への展開は今後であるが、新規な不斉分子として興味が持たれるアトロブ異性アミド誘導体の触媒的不斉合成と生成物の不斉反応への展開で多大の成果を挙げた。これまでの実績や新規な研究計画に基づいて研究を展開し今年度は下記の実績を達成した.(1)ジペプチドイソスターを指向したフッ素置換オレフィン類の合成法の開発に関しては,ジフルオロアリル誘導体の銅塩共存下トリアルキルアルミニウムを用いた脱フッ素アリル置換反応が生成物におけるほぼ完全な立体選択性の点から極めて有用であることを明らかにし,さらに反応機構の提唱に至った.また,イミデート[3,3]転位反応を経由するルートについての検討も行い,まず,末端ビニル型ジフルオロアリル化合物の脱フッ素アリル置換反応による転位基質の合成においてこれまでの問題点であった一般性の低さを,調製容易なGrignard試薬の適用により解決することができた.(2)クロム化学を基盤とするハロフルオロ化合物を用いたフッ素置換オレフィン類の合成法の開発について検討を開始した.まず,ジブロモフルオロエチルエーテル誘導体はマンガン共存下塩化クロム(II)との反応により,対応するフルオロビニルエーテルがほぼ完全な立体選択性で得られることを見い出した.また,ブロモフルオロアルケンと塩化クロム(II)との反応では幾何異性体間で顕著な反応性の差があるため,アルデヒドへのフルオロアルケニル化反応はZ体を選択的に合成できることを見い出した.(3)これまで未解決であったエステル基を連結鎖に含む分子内Diels-Alder反応に有効なルイス酸の開発を検討した.2点配位のコンセプトに基づいた検討から,フルオロアクリル酸エステルを含めて1,7,9-トリデカエノエート誘導体の分子内Diels-Alder反応の開発に成功した.このほか,パラジウム触媒を用いた触媒的不斉N-アリール化反応による光学活性な軸不斉アミド誘導体の合成法の開発にも成功している.これまでの実績や新規な研究計画に基づいて研究を展開し今年度は下記の実績を達成した.(1)ジペプチドイソスターを指向したフッ素置換

オレフィン類の合成法の開発に関しては,ジフルオロアリル誘導体のアルキル銅試薬による還元的脱フッ素化反応に引き続くハロゲン化アルキルによるアルキル基導入反応について詳細な検討を行うとともに、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害活性ペプチドであるペプスタチンのスタチン-アラニン部分のアミド結合をフルオロオレフィンに置換したジペプチドユニットの合成に成功した。さらに、これまではZ異性体の合成法開発を検討して来たが、今年度はE異性体の合成法として閉環メタセシスを用いた方法の検討を開始し今後につながる知見を得た。(2)クロム化学を基盤とするハロフルオロ化合物を用いたフッ素置換オレフィン類の合成法の開発については、ブロモフルオロアルケンと塩化クロム(II)との反応が幾何異性体間で反応性の顕著な差があることを利用して、種々のアルデヒドヘのフルオロアルケニル化反応によるZ体選択的な合成法の開発を行った。(3)安価に入手容易なトリフオロアセトアルデヒドエチルヘミアセタールを合成素子とする反応開発の一環として、オルトアミノスチレン誘導体との反応による2-トリフルオロメチルジヒドロキノリン、テトラヒドロキノリンおよびキノリン類の効率的合成法の開発に成功した。(4)不飽和ラクトン類をジエノフィルとするDiels-Alder反応に有効なルイス酸の開発を検討し、ビストリフルオロメタンスルホニルメタンとトリメチルアルミニウムから容易に調製できるアルミニウムメチドが極めて有効な触媒であることを見いだした。上記の他,不斉パラジウム触媒を用いた分子内触媒的不斉N-アリール化反応による光学活性な軸不斉ラクタム誘導体の合成法の開発に成功し、さらに得られた軸不斉分子の不斉反応への応用としてエノレート化学への展開を行って好結果を得ている。これまでの実績や新規な研究計画に基づいて研究展開を図り今年度は下記の成果を挙げた。(1)ペプチドミメティックスを指向したフッ素置換オレフィンの合成に関しては、これまでの結果を踏まえてフルオロアルケニルクロム種の発生とアルデヒドへの付加反応とフルオロビニル部位を反応部位のひとつとする閉環メタセシスによるE異性体の合成について検討した。前者については、ブロモフルオロアルケンと塩化クロム(II)との反応では幾何異性体間で反応性に大きな差があり、種々のアルデヒドへの付加反応ではフルオロオレフィン部に関してZ異性体の合成に適用可能である事を明らかにした。さらに、本反応を用いてベスタチンのフルオロオレフィンアナログの合成を検討した。後者の閉環メタセシスに関しては、種々検討した結果フッ素置換により反応性の顕著な低下が認めらるものの、目的物の収率などの点から本反応が適用可能な基質構造を明らかにした。(2)安価に入手容易なトリフルオロアセトアルデヒドヘミアセタールを用いる反応開発では、N-アリル-オルトアミノフェノールとの反応で得られるN,0-アセタール類が種々のアルキルリチウムと容易に反応して脱フッ素化を伴ってアルキル基が導入される反応を見出した。さらに、本反応の中間体はカルボニル化合物やハロゲン化剤など種々の親電子と反応して新たな結合形成が可能である事も見出した。(3)昨年度
初学者における傾聴のうわすべりの解明とその回避のための臨床心理学的研究

現在まで、初学者における傾聴のうわすべりの解明とその回避について、臨床心理面接におけるセラピストの介入のタイミングやコンテクストがクライアントにもたらす心情を連続的に計測するという観点から研究をすすめている。本研究では、実験的に感情状態を検証するアプローチに注目し、聴いてもらえた、主訴が改善に向かっている、といった実感をクライアントに生起させる聴き方を傾聴とみなした。そして音声研究や感性工学のアプローチを取り入れ、「傾聴しているー傾聴していない」といった面接についての実感を評価者に評価させ、傾聴の問題を実証的に明らかにした。具体的には、臨床心理面接コーパスならびにクライアントの実感を計測する方法として評価値を連続的に時系列で入力できる感情推移観測システム(以下、EMOsystem [EMOtional MOvement Observation system])を用いて、評価者によるクライアントの感情状態の評価を定量化した。特に初年度となる2018年度は、そのためのアプローチとしてこれまで実施してきた実験について、東京女子大学心理臨床センター紀要において、以下の3つの観点からすすめてきた評価結果を報告することより、現時点での到達点と課題を整理した。まず、研究1において、臨床心理面接コーパスを対象としたEMO systemによる評価を試みることで、傾聴の連続的評価の実際を示した。次に、研究2では、研究1によって得られた傾聴の連続的な評価と、従来の要素的なタグ評価とを比較することで、EMO systemによる傾聴評価の特徴を示した。最後に、研究3において、EMO systemの評価者として、臨床心理士と初学者とを比較することで、評価者属性が傾聴評価に与える影響を示した。傾聴を進行中の臨床心理面接において生じる感情にかかわる連続的な事象としてとらえていくための評価の実際と課題について、東京女子大学心理臨床センター紀要で報告したことから、心理臨床の基礎研究とその応用の観点からレビューをうけることができた。そのなかで、評価者によるEMO評価値について、同一面接に対して評価しながら、事例ごとに評価者間で評価の仕方が異なっており、専門家間でも傾聴評価はばらつくことが明らかになった。傾聴の評価は一義的に規定されるものではなく、正解を定めにくい。一方で、概念の評価について様々な立場の評価者間の一致や不一致、変化の方向性の相違を議論し、そのことへの自覚を促すことは、面接の基盤的な理解や実践の幅を広げることとなる。二年目となる2019年度はこれをふまえて、連続評価手法を他に展開するための重要なステップとし、評価対象となるデータをさらに抽出・分析をすすめる。傾聴には文化的特徴が見られることを新たに確認しつつある。たとえば傾聴に際して、日本語母語話者ではセラピストは黙ってクライアントの話にうなずき相鎚を打つのに対し、英語母語話者ではセラピストは積極的にクライアントに質問したり確認したりしている。そのため日本語母語話者である初学者は、英語母語話者による臨床心理面接の教材等において、セラピストが傾聴していないように感じたりそのままクライアントに適用することに戸惑ったりといったズレが生じることがある。国内外の臨床心理面接の効果研究から、傾聴はセラピストやクライアントの関心・背景によらない最も基本的・普遍的な態度とされ、さらに文化をふまえた知識がエビデンスに基づき示される必要があるが、未検証のままであるため、本課題に比較文化の観点を導入することを今後の研究の推進方策とする。

一方で、概念の評価について様々な立場の評価者間の一致や不一致、変化の方向性の相違を議論し、そのことへの自覚を促すことは、面接の基盤的な理解や実践の幅を広げることとなる。二年目となる2019年度はこれをふまえて、連続評価手法を他に展開するための重要なステップとし、評価対象となるデータをさらに抽出・分析をすすめる。傾聴には文化的特徴が見られることを新たに確認しつつある。たとえば傾聴に際して、日本語母語話者ではセラピストは黙ってクライアントの話にうなずき相鎚を打つのに対し、英語母語話者ではセラピストは積極的にクライアントに質問したり確認したりしている。そのため日本語母語話者である初学者は、英語母語話者による臨床心理面接の教材等において、セラピストが傾聴していないように感じたりそのままクライアントに適用することに戸惑ったりといったズレが生じることがある。国内外の臨床心理面接の効果研究から、傾聴はセラピストやクライアントの関心・背景によらない最も基本的・普遍的な態度とされ、さらに文化をふまえた知識がエビデンスに基づき示される必要があるが、未検証のままであるため、本課題に比較文化の観点を導入することを今後の研究の推進方策とする。海外出張を予定していたが研究代表者の公認心理師試験受験と重なり中止とし、2019年度に延期することになった。
一時停止状態にある翻訳の再開を保証する機構の解明

翻訳の一時停止と適切なキューに基づく機動的翻訳制御は、新生鎖のフォルディング等の多様な翻訳活動に必要である。翻訳の一時停止には、mRNAの2次構造依存、rare codon依存等と幾つかの機構があるが、能動的な翻訳再開の機構が明らかになっている例は少ない。さらに翻訳停止mRNAは、No-Go Decay(NGD)という品質管理に曝されており、生物は機動的翻訳停止とNGDを巧妙に使い分けていると考えられる。我々は機動的翻訳停止に対する翻訳再開機構やこれと共役したNGDのON-OFF機構が存在する、もしくは、確率的な翻訳再開タイミングとNGD発動のタイミングが微妙にバランスされていると推測し、そのような機構の解明を目指し、酵母を用いた分子遺伝学的な解析計画を立案し、今年度は以下の課題に取り組んだ。小胞体ストレス応答に関わるHAC1 mRNA前駆体は細胞質スプライシングを鍵イベントして翻訳を再開するまで、安定な翻訳停止状態にある。Rlg1は細胞質スプライシングの際にエキソン連結に関わるRNA ligaseだが翻訳再開に関わる事が判っている。今回多数のrlg1変異の解析から、Rg1は非翻訳状態のHAC1 mRNA前駆体の安定化にも関わることが示された。HAC1 mRNA前駆体の安定化不全、または、HAC1 mRNA成熟体の翻訳再開不全を示すrlg1変異の多コピーサプレッサーが多数単離されており、翻訳停止時のRNA品質管理回避に関わると思しき因子や翻訳再開に関わる因子群が同定されつつある。他方、codon依存の翻訳停止/遅延を理解するには翻訳時のtRNAの利用可能状況、即ちtRNA量の絶対定量が必要となる。このためtRNAの3'末端を配列特異的に標識する方法を確立した。この手法により、炭素源等の栄養状態や生育状態によって、tRNA種の量比が変化する事が明らかとなった。28年度が最終年度であるため、記入しない。翻訳の一時停止と適切なキューに基づく翻訳再開(「機動的翻訳停止」)は、新生鎖のフォルディング制御等の多様な翻訳活動に必要である。我々は機動的翻訳停止に対する翻訳再開機構やこれと共役したNGDのON-OFF機構が存在する、もしくは、確率的な翻訳再開タイミングとNGD発動のタイミングが微妙なバランス上に成り立っていると推測し、そのような機構の同定と解明を目指し、出芽酵母を用いた分子遺伝学的な解析計画を立案し、今年度は以下の課題に取り組んだ。HAC1 mRNA前駆体は、細胞質スプライシングを鍵イベントしての翻訳再開するまで安定な翻訳伸長停止状態にある。先ずは、HAC1前駆体mRNAの安定性に関して解析を行い、HAC1 mRNAは翻訳可能な成熟体が前駆体よりもXrn1依存の分解を受け易いこと、そのスプライシングにおけるエキソン結合効率は低い事を明らかにした。この結合に関わるRNA ligaseであるRlg1は翻訳再開に関わる事が判っているが、現在rlg1変異の多コピーサプレッサーの単離を通じて翻訳再開に関わる因子の同定を進めている。他方、機動的翻訳停止とNGDが競合するならば、特定のisodecoder tRNAとNGD因子との量比で何れが優先するかが決まると予想される。そこで、tRNAの量が温度感受性に変化する変異株の取得を目指した。現在、major tRNAであるtRNA-LysUUUについて目的の変異を取得すると共に、こうした解析に必要なtRNA量の絶対定量法をほぼ確立した。HAC1 mRNAの安定性、翻訳制御に関する解析は予定通り進行している。また、tRNA量の絶対定量法の開発には目処がつき、生育条件によるtRNA量の変化の検出も見られるようになった。さらにtRNA量の減少を引き起こすtRNA-LysUUUのts変異株の分離にも成功し、tRNA量の急激な変化に対する出芽酵母の翻訳・mRNA品質管理システムの対応を解析する準備が整いつつある。以上の事から、計画はほぼ順調に進んでいると考えられる。

今回多数のrlg1変異の解析から、Rg1は非翻訳状態のHAC1 mRNA前駆体の安定化にも関わることが示された。HAC1 mRNA前駆体の安定化不全、または、HAC1 mRNA成熟体の翻訳再開不全を示すrlg1変異の多コピーサプレッサーが多数単離されており、翻訳停止時のRNA品質管理回避に関わると思しき因子や翻訳再開に関わる因子群が同定されつつある。他方、codon依存の翻訳停止/遅延を理解するには翻訳時のtRNAの利用可能状況、即ちtRNA量の絶対定量が必要となる。このためtRNAの3'末端を配列特異的に標識する方法を確立した。この手法により、炭素源等の栄養状態や生育状態によって、tRNA種の量比が変化する事が明らかとなった。今年度は、昨年度の研究進捗を生かし、翻訳制御とmRNA品質管理の関係の分子メカニズムに迫る方向で、予定通りの研究展開を図る。また、当初、minor tRNAの量変化にだけ着目した翻訳制御解析を計画していたが、major tRNAであるtRNA-LysUUUの突然変異取得に成功した事から、こちらに対しても解析を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子機械学分野ホームページ
楕円振動切削加工に関する研究

実績概要本研究では、延性モード楕円振動切削と呼ぶ新たな加工方法によって、硬脆材料の延性モードでの超精密切削を実現し、加工精度と加工能率を両立し得る新たな実用的超精密加工技術を開発することを目指して研究を行った。本年度は、前年度に引き続いて基礎的な溝加工実験を行い、さらにその成果を踏まえて平面加工を試み、下記の成果を得た。1.安定した任意の楕円振動軌跡が得られる工具振動システムの開発すでに開発している超音波楕円振動工具では、2方向に同一周波数で位相差を持つ共振を励起して楕円振動を得ているが、2方向の振動の干渉が大きいため、所望の楕円軌跡を得ることが容易ではない。そこで、高速回転体の制御において用いられるクロス制御の手法を応用して干渉を除去し、安定した任意の楕円振動軌跡を得ることのできる制御システムを構築した。開発したシステムでは、機械的共振周波数を自動的に追尾する制御,2方向の振幅を目標値に保つ制御,および2方向の振動の間の位相差を目標値に保つ制御を同時に行うことができる。2.旋削加工への適用と開発した工具振動システムの有用性の検証上記の工具振動システムの各制御ゲインの調整を行い、本システムによって安定化した楕円振動によって切削実験を行った。ここでは、代表的な3次元切削加工である旋削加工を行った。その結果、安定化しない従来のシステムに比べて、大幅に形状精度、仕上げ面粗さを向上し得ることを確認した。3.加工条件に関する検討まず、切削油剤の供給方法について検討を行った。切削油剤を塗布する方法、ミスト状にして供給する方法、および乾式の切削を比較した結果、ミスト状にして供給した場合に最も良い仕上げ面粗さが得られることを確認した。4.実用的な諸効果の検討本手法によって期待される実用的な諸効果すなわち加工精度の向上、加工変質層やばりの低減、びびり振動の抑制、被削材の工具への凝着の抑制、工具摩耗の減少などについて確認を行った。5.楕円振動エンドミル加工装置の試作(回転工具への適用)実用的には、旋削加工のみならず、エンドミル加工、ドリル加工などの回転工具による加工に適用することが望まれる。そこで、円振動装置を回転軸の中に組み込み、楕円振動切削加工法を適用したNCフライス盤を開発した。基礎実験の結果、超精密旋盤上での実験と同様に切削力が大幅に低減することを確認した。本研究では、これまでの研究成果に立脚し、楕円振動切削という新たな加工技術を確立することを目指して研究を行った。平成11年度に行った研究により,主に下記の成果を得た。開発したシステムでは、機械的共振周波数を自動的に追尾する制御,2方向の振幅を目標値に保つ制御,およに2方向の振動の間の位相差を目標値に保つ制御を同時に行うことができる。また、現在、楕円振動の方向と切削の方向との関係についても検討を行っており、この両者がどのような関係にあるときに最も切削力や切りくず厚さが低下し、また仕上げ面性状が向上するかを明らかにしつつある。

ここでは、代表的な3次元切削加工である旋削加工を行った。その結果、安定化しない従来のシステムに比べて、大幅に形状精度、仕上げ面粗さを向上し得ることを確認した。3.加工条件に関する検討まず、切削油剤の供給方法について検討を行った。切削油剤を塗布する方法、ミスト状にして供給する方法、および乾式の切削を比較した結果、ミスト状にして供給した場合に最も良い仕上げ面粗さが得られることを確認した。4.実用的な諸効果の検討本手法によって期待される実用的な諸効果すなわち加工精度の向上、加工変質層やばりの低減、びびり振動の抑制、被削材の工具への凝着の抑制、工具摩耗の減少などについて確認を行った。5.楕円振動エンドミル加工装置の試作(回転工具への適用)実用的には、旋削加工のみならず、エンドミル加工、ドリル加工などの回転工具による加工に適用することが望まれる。そこで、円振動装置を回転軸の中に組み込み、楕円振動切削加工法を適用したNCフライス盤を開発した。基礎実験の結果、超精密旋盤上での実験と同様に切削力が大幅に低減することを確認した。
DNA多型による魚類の人工種苗および野生集団の遺伝的多様性に関する研究

3カ年の研究成果は以下の通りである。1.野生集団の保全のための遺伝学的診断指針の確立を目指して、生物集団内の遺伝的多様性の定量法の開発を試みた。遺伝的多様性の定量用遺伝マーカーとして、主としてマダイのマイクロサテライト領域とその周辺域のDNAシークエンシングを行い、シングルローカス検出用プライマーを設計し、実際の検出条件を検討した。2.ミニサテライト部位の変異を検出するマルチプルローカス法はマダイのクローン集団の識別に応用できること、マイクロサテライト部位の変異を検出するシングルローカス法は極めて近縁性の高いマダイ地域集団間の遺伝的分化の検出に有効であることを確認した。3.有用魚種のDNA変異レベルの定量的研究として、マダイのマイクロサテライトDNAの養殖用人工種苗の変異保有水準が野生集団のそれに比べ、減退していることを確認し、ヘテロザイゴシチ-の低下の程度にもとづき、養殖集団の近交係数を推定した。4.マダイ人工種苗における集団の有効な大きさ(Ne)を推定するため、マイクロサテライトDNAマ-カ一により親子鑑定を行い、人工種苗の生産に実際に関与した親魚の数を推定した。性比や各親魚が残した子供の数の偏りにようる影響を修正したところ、非継続的採卵において要求される親魚数の基準を辛うじて確保されていたことが判明した、5.遺伝マーカーの生態研究への応用例として、ゴンズイ稚魚群の再編成に関する実験的研究がおこなわれ、稚魚群の遺伝的均質性と成魚の遺伝的変異の拡大現象および群の再編成の過程がトレースされた。幼魚では捕食者からの逃避という適応的利益が群形成の要因となり、成魚では近親交配を避けるため群内の個体が入れ替わるという推論を行うなど、魚類の群れ行動の適応的意義について考察した。本年度の研究実績は以下のようにまとめられる。1.新しい遺伝標識として、マダイを対象魚種として用い、単遺伝子座法であるマイクロサテライト部位の検出を試みた。その結果、GTあるいはCAを単位としたマイクロサテライト遺伝子座を単離でき、5つの遺伝子座を得ることができた。それぞれの遺伝子座において顕著な多型性が見られ、バンドの検出域が広く、型判別も容易であった。配列の反復数の違いによって区別される対立遺伝子数が1632と多く、ヘテロ接合体率は0.6750.907とアイソザイムに比較して著しく高かった。マイクロサテライト遺伝子座におけるこのような変異性の高さは、今後の様々な研究へこの遺伝標識を応用できる可能性を示唆している。2.RAPD法が集団の解析に有用であるかどうかを判定するために、クローンアユ6系統について尾鰭サンプルより抽出したDNAを用い、RAPD法により得られたDNA断片のバンドパターンのクローン間比較を行った。その結果、6系統内ではバンドパターンは全て同一であったものの、系統間ではバンドパターンは異なり、6系統について個体判別することが可能であった。このことより、RAPD法が集団分析を行う上で実験手法として有用であることが確認された。3.続いて、ゴンズイ稚魚群内の遺伝的構成を明らかにするための研究に必要な予備的実験を行い、実験手法を確立した。ゴンズイ成体の生の標本、冷凍標本、エチルアルコール液浸標本、ホルマリン液浸標本を用意し、各標本から血液、尾鰭を採取した。各標本でRAPD法を試みた結果、冷凍標本、エチルアルコール液浸標本の尾鰭サンプルが最も適していることが明らかになった。また、RAPD法を用いる上で適切なテンプレートDNAの量を決定した。本年度の研究業績は以下のようにまとめられる。1.マダイ人工種苗5集団および野生1集団を用い、昨年度得られた5つのマイクロサテライト遺伝子座について検討した。

5つの遺伝子座における変異性のレベルは、人工種苗5集団で対立遺伝子数が522、ヘテロ接合体率が0.6590.942となり、顕著な多型性を示した。一方、野生集団では対立遺伝子数が1326、ヘテロ接合体率は0.7620.928であり、人工集団に比べやや高い値を示した。特に、継代数の多い人工種苗2集団で5つの遺伝子座の平均対立遺伝子がそれぞれ7.4および9.4、平均ヘテロ接合体率がそれぞれ0.669および0.786となり、変異性の減退が認められた。マイクロサテライト遺伝子座におけるこのような結果は、遺伝的多様性の評価においてこの遺伝標識の利用性の高さを示唆した。2.稚仔魚から成熟個体まで群れを形成するゴンズイ(Plotosus lineatus)は生活史の初期には一腹子からなる群れを構成し、成長に伴い群れの再編成により個体が入れ替わり、遺伝的に多様になることが予想される。そこで、このことを検証するため群れ内の遺伝構造について、多型の認められたアイソザイム遺伝子座であるCK^*を用いて検討した。その結果、体長の小さい群れはそれぞれ一腹子に近いが、成長に伴いそれぞれの群れにおいて混合が生じ、各群れの遺伝的構造が任意交配集団に近づくことが明らかにされた。本年度の研究結果は以下の通りである。1.野生集団の保全のための遺伝学的診断指針の確立を目指して、生物集団内の遺伝的多様性の定量法の開発を試みた。遺伝的多様性の定量用遺伝マーカーとして、アユおよびマダイを用いて、マイクロサテライト領域とその周辺域のDNAシークエンシングを行い、シングルローカス検出用プライマーを設計し、実際の検出条件を検討した。2.ミニサテライト部位の変異を検出するマルチプルローカス法はクローン集団の識別に応用できること、マイクロサテライト部位の変異を検出するシングルローカス法は極めて近縁性の高い地域集団間の遺伝的分化の検出に有効であることを確認した。3.有用魚類のDNA変異レベルの定量的研究として、本土の海産系アユと奄美大島の亜種リュウキュウアユをそれぞれ主集団と島嶼集団の代表として採集し、変異保有水準と遺伝的分化レベルを定量した。変異保有水準は健全な地域集団と考えられるアユでは著しく高く、絶滅が危惧される地方集団のリュウキュウアユでは著しく減退していることが判明した。4.マダイではマイクロサテライトDNAの養殖用人工種苗の変異保有水準が野生集団のそれに比べ、減退していることを確認し、ヘテロザイゴシチ-の低下の程度にもとづき、養殖集団の近交係数を推定した。5.ゴンズイ稚魚群の再編成に関する実験的研究については、稚魚群の遺伝的均質性と成魚の遺伝的変異の拡大現象および群の再編成をトレースした。幼魚では捕食者からの逃避という適応的利益が群形成の要因となり、成魚では近親交配を避けるため群内の個体が入れ替わるという推論を行うなど、魚類の群れ行動の適応的意義について考察した。
弾性表面波のウェーブレット解析による材料表面層の機械的特性評価

材料の表面を高強度化あるいは高機能化するために多様な表面改質技術が利用されており,それに応じて材料表面層の機械的特性の評価法も多く研究されている.その一つに,弾性表面波の分散性を利用して,超音波の伝播速度を計測することにより表面層の機械的特性を評価する方法がある.この方法は,非破壊的な評価が可能である点に最大の長所があるが,従来,超音波の波形データから伝播速度の分散特性を算出する際に繁雑な波形データ処理が必要であるという難点があった。本研究は,近年著しく発展した波形解析手法であるウェーブレット変換による波形データ処理を適用することにより、弾性表面波の伝播速度の分散特性を正確かつ簡便に計測する手法を開発するとともに,それを応用して超音波による材料表面層の非破壊評価法の信頼性の向上や適用範囲の拡大を図ったものである.本研究によって本年度に得られた成果は以下の通りである.(1)表面改質財を模擬したモデル試験片を検討・製作した.(2)超音波探触子を用いて弾性表面波を送受信する装置を製作した.(3)(1)の試験片を用いて(2)の装置により超音波試験を行い,弾性表面波の測定データを得た.(4)ウェーブレット変換による超音波波形の解析および弾性特性の算定を行うソフトウェアを製作した.現在は,(3)で得られた測定データを(4)のソフトウェアによって解析し,弾性特性評価を行っている.今後は,評価結果の妥当性を検討し,実験装置およびソフトウェアの改良を図る予定である。
Ｎ末端ルールに従う基質蛋白質の網羅的新規発見

1蛋白質分解系(ユビキチンリガーゼ)を欠損した変異酵母を用いたとき、不安定化蛋白質が蓄積した際に細胞はObr1蛋白質を多量に発現・蓄積することでストレス耐性を獲得して生き延びることを発見した。2N末端ルールに従う基質蛋白質を認識する酵素(L/F転移酵素)による基質蛋白質の認識速度は、N末端から2残基目のアミノ酸配列によって違いがあることを見いだした。そこで、2残基目の配列を網羅的に変化させた種々の化学合成ペプチドを作製し、そのそれぞれにおける反応速度を詳細に解析することで規則性を見いだした。1.N末端ルールに関する遺伝子(aat)を欠損させた大腸菌、および野生型大腸菌の抽出液を作成した。前者の抽出液中には、不安定化蛋白質が蓄積していると思われる。後者は比較対照実験として用いた。2.申請者の標識法(NEXT-A反応)を用いて、不安定化蛋白質のN末端にのみバイオ直交性反応点を持つ非天然アミノ酸を標識することを試みた。さらに、このアミノ酸上の反応点特異的なビオチン化を行った。この時、銅触媒なしでのHuisgen付加反応を用いて、反応点特異的なビオチン化反応ができたことは、人工不安定化蛋白質(R-DHFR)を内部標準物質として用いることで確認した。3.ビオチン標識後の蛋白質混合物を、ストレプトアビジン-アガロースカラムに通し、N末端不安定化蛋白質のみをゲル上に濃縮することを試みた。モデル実験として、N末端にリジンを持つ蛍光蛋白質をアビジンゲル上に固定化させ、回収できることは既に確認している。濃縮されたビオチン化蛋白質の電気泳動を行うことで分子量分画した。その際、内部標準物質として用いた人工不安定化蛋白質(R-DHFR)のほかに、不安定化蛋白質と思われるバンドが確認できた。4.野生型大腸菌には見られずに、aat欠損型大腸菌のみに見られた蛋白質バンドを切り出し、トリプシン消化を行った。消化後に生じたペプチド断片を回収し、質量分析法(LC/MS)にてN末端不安定化蛋白質を同定した。その結果、予期せず(NEXT-A反応用酵素である)L/F-転移酵素がビオチン化されていた結果、これが濃縮されたことが分かった。非天然アミノ酸であるアジドフェニルアラニンが、何らかの機構でL/F-転移酵素の活性中心に共有結合したものが若干量できた結果、Huisgen付加にてビオチン化されたものと思われる。その他のN末端不安定化蛋白質においては本手法では濃縮されなかった。5.また、上記1-4と同じ実験を、大腸菌を出発試料として用いるのではなく、ユビキチン化酵素(Ubr1)欠損型出芽酵母を用いて同様に行った場合についても、同様の結果が得られた。真核生物からの不安定化蛋白質探索を試みた。1.酵母ゲノムDNAクローンライブラリーを購入し、この中から、N末端ルールや蛋白質分解系に関連すると考えられる遺伝子を数百個ピックアップした。これらを全て網羅的に、N末端ルールに関する遺伝子(ubr1)を欠損させた変異酵母、および野生型酵母へと形質転換し、それら全ての蛋白質を独立に発現させて各々の抽出液を作製した。変異酵母の抽出液中には、不安定化蛋白質が蓄積されることを期待した。なお、各クローンDNAの各翻訳産物は、各酵母由来と蛋白質HAタグおよび抗体由来ZZドメインタグとの融合蛋白質になっている。野生型酵母に対しても、同様の形質転換および蛋白質発現を行い、比較対照実験として用いた。抽出液をSDS-PAGE後のCBB染色、および抗HAタグ抗体を用いたウエスタンブロットにて解析した。解析の結果、ほぼ全ての酵母由来蛋白質の発現が確認された。変異酵母および野生型酵母を用いた時で比較したとき、蛋白質の発現が確認された組の中では、蛋白質量および分子量が変化している組は見あたらず、不安定化蛋白質候補はこの時点では見つからなかった。2.酵母由来の爽雑蛋白質を取り除くため、上記発現させた各蛋白質に対してIgG-Sepharoseを用いたプルダウン精製を行った。精製した各蛋白質に対して、申請者の標識法(NEXT-A反応)を用いて、不安定化蛋白質候補のN末端にのみバイオ直交性反応点を持つ非天然アミノ酸による標識を試みた。さらに、このアミノ酸上での反応点特異的な蛍光標識を試みた。標識操作の後、蛋白質をSDS-PAGEにより分子量分画し、蛍光イメージャーによるゲルイメージングを行ったが、不安定化蛋白質候補は見つからなかった。3.本実験を行う過程で、人工的な不安定化蛋白質(SF-GFP;モデル蛋白質)のN末端に対してNEXT-A反応を行うことにより、部分環状構造を持つ蛋白質へと変換可能であることが分かり、論文としてまとめ、発表を行った(Chem.Commun.,2011他)。de novoでの不安定化蛋白質探索実験を1原核生物および2真核生物の両面より試みた。

1:大腸菌でのN末端ルールに則る不安定蛋白質は、細胞内で極めて迅速に分解される必要があることから、不安定蛋白質のL/F転移酵素による認識も極めて迅速に行われる必要があると考えた。N末端から12残基までをランダム化したファージディスプレイ用de novoペプチドライブラリー中から、不安定化蛋白質のN末端配列候補を探し出すべく、L/F転移酵素に短時間で強く結合するペプチド配列の選択を行ったが、バイアス等の問題が生じた。一方で一連の過程において、基質ペプチドのN末端から2残基目の配列によって、L/F転移酵素による認識速度にある程度の差異があることを見いだした。2残基目の配列を網羅的に変化させて、そのそれぞれにおける反応速度を詳細に解析を行うことで規則性を見いだし、N末端ルールに則る不安定蛋白質との関連性を考察し、FEBS Open Bio誌に論文発表を行った。2:N末端則関連遺伝子欠損株(ΔUBR1など)においてN末端則基質を過剰発現した場合、細胞の表現型に異常が現れるのではないかと推測した。そこで、真核生物である出芽酵母を用いてN末端則の基質探索を行うため、ランダム化したペプチド遺伝子をコードするベクターライブラリーを構築した(Pept. Sci.)。ベクターは酵母シャトル型ベクターを用い、GAL1/10プロモーター下にグルタチオンS-転移酵素(GST)遺伝子、ユビキチン遺伝子(UB)、および12残基のランダム化ペプチド遺伝子(X12)をタンデムに配列した。ペプチドは融合タンパク質GST-Ub-X12として翻訳され、翻訳後に脱ユビキチン化酵素によるプロセッシングを受け、X12のペプチドが遊離する。大腸菌のケミカルコンピテントセルへの導入効率が極めて悪いため、現在これを改善している。化学合成ペプチド(ライブラリー)を用いた不安定化ペプチド配列の探索を行った。特にN末端から2残基目の配列に着目し、NEXT-A反応二段階目のL/F転移酵素による酵素反応を速度論的に解析を行い、優位な差が見られた。そこで、2残基目の配列を網羅的に変化させた種々の化学合成ペプチドを作製し、そのそれぞれにおける反応速度を詳細に解析した。これにより、単にどのようなN末端配列が不安定化ペプチドになり易いかといった情報だけでなく、何故それが不安定化ペプチドになりうるか、という考察を行った。本規則性を見いだし、N末端ルールに則る不安定化蛋白質との関連性を考察し、論文としてまとめ、発表を行った(FEBS Open Bio, 3, 252 (2013))。並行して、酵母内にてde novoペプチドライブラリーを作製することで不安定化ペプチドを探索することも試みた。N末端ルールに関する転移酵素遺伝子を欠損させた大腸菌を用いた時、および大腸菌と異なる生物種(出芽酵母)由来の細胞抽出液を用いた時のいずれも、申請者の手法(NEXT-A反応)を用いた人工不安定化蛋白質の濃縮・同定は成功している一方で、未知の天然不安定化蛋白質の同定には至っていない。未知蛋白質のこれら抽出液中の濃度が、当初予定していたよりも大幅に少ないと考え、上記DNAクローンライブラリーからの過剰発現による探索を行うことで解決を試みたが、同様の結果を得た。
カリックスアレーンを有機触媒に用いる新規不斉反応系の開発

本研究では、マクロ環状化合物の一つであるカリックスアレーンの有機触媒としての可能性に着目し、カリックスアレーンを触媒として用いる新しい不斉反応系の開発を目的としている。まず、カリックスアレーンの触媒としての機能を検証するために、p位にスルホン酸基を有するカリックスアレーン(Calix-SN)を用い、種々のL-アミノ酸(Ala、Leu、Phe、His、Tyr、Trp、Lys、Arg)あるいはそのエステル基質の加溶媒反応(加水分解反応、エステル化反応(メタノーリシス))における反応特性ついて速度論的に検討した。アミノ酸エステル基質の加水分解反応では、Calix-SN存在下、Ala基質以外の殆どの反応で反応速度の低下(負の触媒作用)が観測され、一方、アミノ酸基質のエステル化反応ではHis、LysおよびArg基質の反応速度が顕著に増大し、塩基性アミノ酸基質に対する特異的触媒作用が明確になった。さらに、^1H-NMR測定からはCalix-SNの触媒機能の発現が基質との包接錯体形成に由来していることが示され、カリックスアレーンの有機触媒としての有用性を明らかにするとともに、天然酵素類似の高選択的なカリックスアレーン触媒の開発の可能性を示した。現在、次のステップとして、不斉識別能を有するカリックスアレーン触媒の合成を試みている。環状構造体であるカリックスアレーンにp-置換基を非対称的に円配列することにより不斉認識機能を付与することが可能と考え、多段階合成法による置換基の導入を行っている。得られたキラルカリックスアレーンを用い、D(L)-アミノ酸をエナンチオマー基質とする不斉反応における触媒機能について検討する予定である。本研究では、マクロ環状化合物の一つであるカリックスアレーンの有機触媒としての可能性に着目し、カリックスアレーンを触媒として用いる不斉反応系の開発を目的としている。まず、p位にスルホン酸基を有するカリックスアレーン(Calix-SN)を用い、L-アミノ酸(Ala、Phe、His、Tyr、Trp)を基質とするメタノール溶液中でのエステル化反応(メタノーリシス)における触媒機能を検討した。これらの基質なかで、Calix-SNはHis基質の反応に対しては特異的な触媒作用を示すことが明らかになった。また、^1H-NMR測定からは、その触媒機能の発現がCalix-SNとHis基質の静電的相互作用による複合体形成と反応中間体の安定化に由来していることが示された。一方、L-アミノ酸のエステルを基質とする水溶液中での加水分解反応を観測したところ、エステル化と同様にHis基質の反応を加速したが、Trp基質に対しては反応を阻害し、疎水性相互作用による反応不活性な複合体の形成を示唆した。これらの結果より、カリックスアレーンが種々の分子間相互作用により特異的に基質と包接錯体を形成し、また、その包接形態により選択的な有機触媒として働くことを明らかにした。さらに、環状構造体であるカリックスアレーンは、特定のp-置換基を非対称に円配列することにより不斉環境を形成することが考えられる。そこで、現在、不斉認識能を有するカリックスアレーン触媒の合成を行っており、得られたカリックスアレーンを用い、D(L)-アミノ酸をエナンチオマー基質とする加溶媒反応(エステル化反応、加水分解反応)における不斉触媒機能(反応加速性、不斉選択性)について検討する予定である。
可溶型受容体LR11欠損モデルを用いた血管平滑筋細胞の病的形質の制御

放出可溶化LR11を用いた内膜SMCsの病的形質変換の修飾を解明し内膜平滑筋細胞バイオマーカーとしての臨床的意義を探索した。内膜平滑筋遺伝子LR11機能を修飾することにより動脈硬化巣を変化させた。血中可溶型LR11濃度が従来の動脈硬化危険因子とは独立した動脈硬化マーカーであった。可溶型LR11の血中濃度は動脈硬化症における新規の血管傷害バイオマーカーとなると考えられる。動脈硬化巣における中膜より内膜へSMCsが遊走,増殖する過程で,病的形質の制御遺伝子として遊離型分化抑制因子LR11の発現が重要であり,この欠損モデル動物を用いた血管機能を解析することが,病巣内でのSMCsの分化,脱分化の機序を明らかにする。本研究の目的は,LR11ノックアウト動物の血管細胞の機能解析により病巣形成における内膜SMCsの形質変換機構を解明し,分泌可溶化LR11を用いた内膜SMCsの病的形質変換の修飾を探索することである。1)LR11ノックアウトマウスの動脈壁SMCsの機能解析LR11ノックアウトマウス血管壁SMCsの細胞骨格の変化を組織免疫学解析により評価した。培養LR11^<-/->SMCsのミオシンアイソフォーム蛋白はLR11^<÷/÷>SMCsに比べて幼弱型ミオシンが減弱し成熟型アイソフォームが増大した。LR11^<-/->SMCは,PDGF-BBやアンギオテンシン(Ang)IIによるアクチン再構成が傷害されるとともにこれらのサイトカインによる細胞運動能および遊走能が減弱した。とりわけAngII刺激によるアクチン再構成変化はほぼ消失した。2)リコンビナント放出可溶型LR11の作成ヒト型およびマウス型LR11全長cDNAを用いて,プロテアーゼ(TNF-a converting enzyme,TCE)感受性部位より細胞外領域のみ有するリコンビナント蛋白に対応する部分cDNAを作成し,cDNAを大腸菌にて大量発現させGST精製によるリコンビナント放出可溶型LR11蛋白の精製に成功した。本リコンビナント蛋白が,SMCsのuPARと特異的に結合しインテグリン/FAKシグナルの活性化を引き起こすことを明らかにした。本研究成果は交付申請書に計画したほぼ100%の研究成果であり,LR11ノックアウトSMCsにおける内膜SMCsの形質変換機構が傷害されることが明らかになった。リコンビナント可溶化LR11を用いた内膜SMCsの病的形質変換機構を継続する。平滑筋細胞のフェノタイプ変換と機能変化のメカニズムに関わる基礎概念を臨床医学で展開することの必要な病的細胞として血管内膜平滑筋細胞がある。我々は、内膜平滑筋細胞の遺伝子発現を網羅的に調べ、特異的に発現するLDL受容体スーパーファミリーLR11を同定し、これが細胞骨格の変化へのサイトカイン感受性克進の原因であることを明らかにした。本研究は、LR11ノックアウト動物の血管細胞の機能解析により放出可溶化LR11による内膜SMCsの病的形質変換の修飾を解明し、新規の内膜平滑筋細胞バイオマーカーとしての臨床的意義を探索することである。本研究成果から、LR11遺伝子は特に平滑筋細胞の遊走能の亢進に必要であり、LR11遺伝子が欠損することにより遊走能が低下する。内膜平滑筋特異的遺伝子LR11は、動脈硬化の進展における平滑筋細胞の中膜から内膜への遊走と増殖過程に重要であり、LR11機能を修飾することにより動脈硬化巣を変化させる可能性がある。Lr11^<-/->マウス血管平滑筋細胞の解析から、LR11はウロキナーゼ受容体/インテグリンを介したとりわけAngII刺激での細胞アクチン再構成に重要であり、Lr11^<-/->細胞ではこれが障害されることにより遊走能が減弱することが明らかになった。血中可溶型LR11濃度が頚動脈内膜中膜肥厚度と密接に関連し、多変量解析の結果、従来の動脈硬化危険因子とは独立した動脈硬化マーカーとなることが示唆された。以上の結果から、可溶型LR11の血中濃度の測定は動脈硬化症における新規の血管傷害バイオマーカーとして臨床的にあらたな診断および治療学的アプローチとなると考えられる。今後、血中可溶型LR11濃度の正確なアッセイ系を確立することが急務と考えられる。