hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト神経系不死化細胞株の網羅的樹立と三次元モデル構成の試み

ヒト骨格筋由来微小血管内皮細胞に関しては至適培養環境もほぼ研究代表者の教室で確立しており、トランスポーターやジャンクション分子などの解析も進行中である。ヒト皮膚筋炎血清を用いたin vitro実験も平成24年度中に施行できるものと考えている。平成24年度に株化を目標とするヒト細胞は、脳軟膜細胞、髄膜血管細胞(内皮細胞、血管周細胞、平滑筋細胞)、オリゴデンドログリアに加え、末梢神経神経周膜細胞である。余力があればミクログリアなども株化の対象とする。初年度の実験により、各細胞毎に至適培養条件が大きく異なることが明らかになっており、平成24年度は条件整備にも配慮した一次培養を心がけることで対処する。本研究は剖検脳という不定期に供給される出発材料に依存する。現時点で最も研究を阻害する因子となっているのは、剖検数の絶対的な減少によって培養に耐えうるヒト剖検脳が十分に収集できないことであり、この点は研究代表者の所属する組織以外の協力施設を増やすことで対処したいと考えている。初年度に確立できた細胞株はヒト骨格筋由来微小血管内皮細胞のみであり、他の細胞は株化から大量培養、機能解析のプロセスに乗らなかったため、培養器具や培地、血清などの購入費用に余剰ができた。平成24年度は複数の細胞株樹立が見込めるため、この費用を消耗品購入に充填する予定である。平成24年度の使用予定は、成果発表のための旅費70万円と、初年度からの繰越金を合わせた121.8万円での実験用消耗品購入である。
ヒ素の発癌に関わる化合物について-その化学構造と毒性

ヒ素は毒性の高い物質として知られており、ヒトにおいて皮膚や肺における発癌物質であると認められている。しかし、その発癌のメカニズムや究極の発癌物質についてはわかっていない。これまでの研究で、われわれは、ジメチルアルシン酸(DMAV)長期投与ラットは膀胱発癌を引き起こし、その尿中より未知ヒ素代謝物(M2)が、糞中には未知ヒ素代謝物(M3)が多く検出されること、さらに、この代謝物の生成には大腸菌A3-6が関与することを報告した。また、この反応はシステイン(Cys)要求性であることも明らかにした。本研究では、in vitroでのA3-6による未知ヒ素代謝物の生成およびin vivoでのラットにおけるDMAVの代謝におけるCysと大腸菌の役割について調べた。さらに、M2の細胞毒性および化学的特性についても調べた。大腸菌A3-6によるM2の生成はDMAVに対しCysの比が23の時に最大であった。また、DMAV、ジメチルアルシナス酸(DMAIII)を経てM2、M3と変わっていくことが明らかになった。in vivoでのラットにおけるDMAVの代謝実験は過剰のCysにより大腸菌により生成されるM-3の量が上昇するというわれわれのin vitroでの結果と一致していた。次に、M2の化学的特性を調べた。M2は過酸化水素による酸化によりDMAVにもどること、DMAVと還元剤との反応物に一致することがわかった。以上のことよりM2はDMA関連化合物であることが示唆された。また、分子量154でイオウを1つ含む化合物であることも明らかになった。細胞毒性の実験では、M2を多く含む試験溶液は、強い細胞毒性、強い分裂中期捕捉性、高率の4倍体および異数体生成能、有意な染色体異常、SCE誘起性を示した。また、M2の細胞毒性はSOD添加により軽減されることより、その毒性発現にはROSが関与することが示唆された。ヒ素は自然環境中や生体内に広く存在する元素であり、毒性の高い物質として知られており、ヒトにおいて皮膚や肺における発癌物質であると認められている。しかし、その発癌メカニズムや究極の発癌物質についてはわかっていない。これまでの研究で、我々はジメチルアルシン酸(DMAV)をラットに長期間投与し、その尿および糞中より未知ヒ素代謝物(M1、M2、M3)が検出されることを報告した。さらに、これらの代謝物の生成には大腸菌A3-6が関わっており、M2、M3はDMAVから、M1はトリメチルアルシンオキサイド(TMAO)から大腸菌により生成されることを明らかにした。今年度はこのM1、M2、M3の生成のされ方およびその毒性について調べた。また、生成したM2の化学的特性についてもLC-ICP-MSおよびLC-MSで調べた。大腸菌によるM2の生成はDMAVに対しCysの比が23の時に最大であり、M3の生成は34の時に最大であった。また、DMAVジメチルアルシナス酸(DMAIII)を経てM2、M3と変わっていくことが明らかになった。一方、M1の生成はすばやく起こり、TMAOに対しCysが23の時に最大であった。DMAVに対しCysの比13の時に大腸菌より生成される代謝物は非常に強い細胞毒性を示した。このことはM2が非常に強い毒性を示すことを示唆している。また、この毒性はSOD添加により軽減されることより、毒性発現にはROSが関与することが示唆された。

次に、M2の化学的特性を調べた。M2は過酸化水素による酸化によりDMAVにもどること、DMAVと還元剤との反応物に一致することがわかった。以上のことよりM2は3価のDMA関連化合物であることが示唆された。また、分子量154でイオウを1つ含む化合物であることも明らかになった。ヒ素は発癌物質であると認められているが、その発癌のメカニズムや究極の発癌物質についてはわかっていない。これまでの研究で、われわれは、ラットにジメチルアルシン酸(DMAV)を長期投与すると膀胱発癌を引き起こし、その尿中より未知ヒ素代謝物(M2)が、糞中より未知ヒ素代謝物(M3)が多く検出されることを報告した。また、この代謝物の生成には大腸菌が関与し、Cys要求性であることも明らかにした。昨年度の研究では、大腸菌存在下、DMAVに対しCysの比が23の時にM2の生成が最大になること、また、ジメチルアルシナス酸(DMAIII)を経てM2、M3と変化することを明らかにした。さらに、M2が分子量154でイオウを1つ含む化合物であることも明らかにした。今年度の研究ではin vivoでのDMAVの代謝におけるCysと大腸菌の役割、尿中からのDMAIIIの検出およびヒ素代謝物の細胞毒性に関する研究を行った。ラットにおけるDMAVの代謝実験で、過剰のCysと大腸菌投与によりM2からM3への生成量が上昇した。このことは、in vivoの結果がin vitroの結果と一致することを示しており、大腸菌による未知ヒ素代謝物の生成にCysが大きく関わっていることが今回in vivoでも初めて証明できた。また、3価のメチルヒ素化合物を定量するため、キレート抽出とLC-ICP-MSによる測定を組み合わせた方法を確立し、DMAV投与ラットの尿の分析を行った。その結果、DMAIII、MMAIII、トリメチルアルシンを尿中より検出した。細胞毒性の実験では、DMAIIIおよびM2を多く含む試験溶液は、強い細胞毒性、強い分裂中期捕捉性、高率の4倍体および異数体生成能、有意な染色体異常、SCE誘起性を示した。このことは、これらの化合物が発癌に関わっている可能性を示唆している。
日本人英語学習者の読解におけるテーマ理解プロセスの解明

本研究の目的は,日本人英語学習者が英文全体のテーマを理解するプロセスを理論的・実証的に検証することである。3年目にあたる本年度は,補足データの収集(テーマ情報とその他のテキスト情報が,読解後の心的表象にどのように反映されるか)と総合考察を行った。今年度前半には,暗示されたテーマ情報と,その他の暗示情報の理解を比較した実証研究を行い,英語学習者の読解におけるテーマ理解プロセスをより詳細に明らかにした。結果から,英語学習者は物語文中に暗示されたテーマを推論によって理解することが難しいことが確認された。また,暗示されたテーマは,暗示された登場人物の感情よりも理解度が高く,暗示された登場人物の目標・行動・状態に関わる情報と同程度に理解されていることも示された。今年度後半には,1年目の研究課題である「説明文読解における方略的なテーマ理解の検証」,2年目の研究課題である「英文読解におけるテーマ理解にともなう認知プロセスの検証」にかかわる複数の実験結果をふまえて総合考察を行った。具体的には,「物語文読解と説明文読解におけるテーマ理解プロセスの共通点・相違点」「テーマ理解を促すタスクが読解中の処理や読解後のテキスト理解に与える影響」「学習者の英文読解力とテーマ理解プロセスの関わり」という3つの観点から考察を行った。本研究課題の主要な発見は,以下の3点にまとめられる:(a)物語文読解と説明文読解におけるテーマ理解は,英語学習者の読解において自動的に起こるプロセスではなく方略的な処理によって引き起こされるものである,(b)説明文はタスク教示よりも学習者の英文読解熟達度の影響を受けやすく,物語文読解は英文読解熟達度よりもタスク教示の影響を受けやすい,(c)英語学習者は物語文と説明文の両方において,タスク教示に応じて読みの目的を変化させようとする。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、日本人英語学習者が英文全体のテーマを理解するプロセスを理論的・実証的に検証することである。今年度は、「説明文読解における方略的なテーマ理解」を検証課題とし、実験を実施した。説明文読解におけるテーマ理解を検証するために、テーマ理解を方略的に行わせる「読みの目的」の効果を検証した。また、読みの目的と読み手の第二言語読解熟達度の関わりにも焦点を当てた。68名の日本人大学生を(a)テーマ理解条件:テキスト全体を通して書き手が伝えようとしているメッセージを考える、(b)統制条件:テキストの内容を理解する、という2つの読みの目的に割り当てた。テキストを読解後に、テーマ理解課題と筆記再生課題を行った結果、読解条件間で有意な差は見られず、読解条件に関わらず高熟達度群が低熟達度群よりも課題の成績が良かった。さらに、テーマ理解課題の解答を質的に分析した結果、テーマ理解に失敗する読み手は、パラグラフ単位のメインアイディアをテキスト全体のテーマととらえている傾向にあった。日本人英語学習者は、テキストの広範囲にわたる情報の統合が困難であることが示唆された。読解条件間でテーマ理解に差が見られなかったため、今後はより効果的な教育的介入を含む実験群を想定した実験を実施予定である。次年度は、読解中に起こるテーマ理解プロセスを詳細に検証するための実験を実施予定である。そのための予備実験として、説明文読解中の発話プロトコルデータを収集する予備実験を実施した。日本人大学生10名に、テーマ理解の教示がある条件とない条件とで説明文を読解させた。その際、自身の思考を発話させながら読解をさせた(発話思考法)。発話プロトコルデータの分析結果をもとに、実験手法や分析方法を改良した後、次年度に本実験を実施する予定である。2年目にあたる本年度は、「英文読解におけるテーマ理解にともなう認知プロセスの検証」を課題とし、日本人英語学習者が物語文・説明文のテーマを理解する際に、どのような認知プロセスを要するのかを明らかにした。説明文を用いた実験では、30名の日本人大学生が2つの説明文について、統制条件(テキストの内容理解を目的とした読み)とタスク条件(各パラグラフを読解するごとにテーマ理解タスクがある読み)で読解を行った。その際、1文ごとに読解中に心内で何を考えているかを報告する「発話プロトコル法」を用いた。新近性効果を防ぐための干渉課題を行った後、テキスト内容で覚えていることをすべて書き出す筆記再生課題を行った。協力者の発話を分類した結果、タスクの有無にかかわらず、学習者の認知資源は語や文の分析に多く割かれており、テキスト内の情報を統合する推論や、テキスト内容に対する評価・反応などの割合は限られていた。一方で、タスク条件では統制条件よりも読解後のテキスト理解度が高かった。これらの結果から、学習者は与えられたタスクに応じて読解中のプロセスそのものを変化させることは難しいものの、タスクに従事する中でテキスト情報を大局的に処理した結果、最終的に構築された心的表象の一貫性が高まったことが示唆された。物語文を用いた実験では、30名の日本人大学生を対象とし、4つの短い物語文の半数を統制条件、残り半数をタスク条件で読解した。

前述の実験と同様、発話プロトコル法、干渉課題、筆記再生課題の手順を行った。筆記再生課題を採点・分析した結果、タスク条件では統制条件よりも有意にテキスト理解度が高くなっていた。発話プロトコルデータについては、現在分析中である。本研究の目的は,日本人英語学習者が英文全体のテーマを理解するプロセスを理論的・実証的に検証することである。3年目にあたる本年度は,補足データの収集(テーマ情報とその他のテキスト情報が,読解後の心的表象にどのように反映されるか)と総合考察を行った。今年度前半には,暗示されたテーマ情報と,その他の暗示情報の理解を比較した実証研究を行い,英語学習者の読解におけるテーマ理解プロセスをより詳細に明らかにした。結果から,英語学習者は物語文中に暗示されたテーマを推論によって理解することが難しいことが確認された。また,暗示されたテーマは,暗示された登場人物の感情よりも理解度が高く,暗示された登場人物の目標・行動・状態に関わる情報と同程度に理解されていることも示された。今年度後半には,1年目の研究課題である「説明文読解における方略的なテーマ理解の検証」,2年目の研究課題である「英文読解におけるテーマ理解にともなう認知プロセスの検証」にかかわる複数の実験結果をふまえて総合考察を行った。具体的には,「物語文読解と説明文読解におけるテーマ理解プロセスの共通点・相違点」「テーマ理解を促すタスクが読解中の処理や読解後のテキスト理解に与える影響」「学習者の英文読解力とテーマ理解プロセスの関わり」という3つの観点から考察を行った。本研究課題の主要な発見は,以下の3点にまとめられる:(a)物語文読解と説明文読解におけるテーマ理解は,英語学習者の読解において自動的に起こるプロセスではなく方略的な処理によって引き起こされるものである,(b)説明文はタスク教示よりも学習者の英文読解熟達度の影響を受けやすく,物語文読解は英文読解熟達度よりもタスク教示の影響を受けやすい,(c)英語学習者は物語文と説明文の両方において,タスク教示に応じて読みの目的を変化させようとする。研究計画通り、実験実施等の進捗があった。研究成果は、口頭発表や研究論文として発表され、一定の評価を得ている。27年度が最終年度であるため、記入しない。3年目は、これまでに実施した実験の結果をふまえて、特に(1)物語文と説明文読解におけるテーマ理解プロセスの共通点・相違点、(2)テーマ理解を促すタスクが読解中の処理や読解後のテキスト理解に与える影響、(3)学習者の英語熟達度とテーマ理解プロセスの関わり、などの観点から総合考察を行う予定である。研究計画通り、実験実施等の進捗がある。また、研究成果は、口頭発表や研究論文として発表され、一定の評価を得ている。2年目の研究では、説明文読解における、オンラインでのテーマ理解プロセスを検証する。具体的には、読解時間測定法や発話思考法を用いて、日本人英語学習者が説明文を読解中にどのようにテーマを構築するのかを観察する。また、テーマ理解プロセスに必要な読解処理を調べるために、読解中に読み手が用いるストラテジーにも注目する。これら一連の研究において、学習者の第二言語読解熟達度の影響も、要因として考慮する。
バイオディ-ゼル資源作物ジャトロファに由来する毒性成分の生体影響評価に関する研究

バイオディーゼル資源作物のジャトロファは毒性成分を含み、食用に適さない。そのため、食用作物との競合を起こさないバイオ燃料資源として注目されている。本研究ではジャトロファより毒性成分の一つであるホルボールエステル(PE)を単離し、生体影響評価を行った。その結果、マウスにおいてジャトロファPEを塗布した場合、高濃度では急性毒性を示した。ジャトロファPEは培養細胞を用いた形質転換試験では強い発がんプロモーター活性を示したので、急性毒性を示さない低濃度のジャトロファPEをマウスに塗布したが、発がんは見られず、培養細胞と動物では異なった結果を示した。バイオディーゼル燃料の原料作物であるジャトロファ(Jatropha curcas、ナンヨウアブラギリ)は、有毒成分を含むことから食用に適さず、「食糧生産との競合」を引き起こさない資源作物として注目を集めている。耕作地確保のために環境を破壊する必要もなく、廃棄物の利用も推進されている。しかしながらジャトロファは有害成分を多く含んでおり、燃料や残渣の生産・流通過程でのヒトへの健康影響が懸念されている。そこで申請者は、ジャトロファに含まれる有害成分について、単離・精製法及び簡易測定法を確立し、その手法を用いて栽培から流通までの過程でのヒト及び環境に対する影響評価を行い、より安全にジャトロファを活用するためのガイドラインの作成を提案すると共に、炭素循環型社会の推進への貢献を目的とした。まずジャトロファの有毒成分であるホルボールエステル(PE)類の検出と大量精製の系を確立した。本実験ではバイオディーゼルの原料となる種子から、有機溶媒による抽出とHPLCによってPE類を単離し、LC-MS、NMRにより構造を確認した。これにより、以後の実験に用いるために不可欠なジャトロファの主要な有毒成分の標準品を大量に得ることが可能となった。次に、ジャトロファ由来PE類の発がん性、および毒性について評価した。in vivo実験としては、種子より単離したPEを、背面を除毛したマウスの皮膚に塗布し、発がんプロモーション活性について検討した、また、in vitro実験としては培養細胞を用いた形質転換試験(コロニー形成試験)を行った。この実験により、ジャトロファ由来PE類の毒性発現機序の解明に向けての有用なデータが得られた。バイオディーゼル資源作物であるジャトロファ(Jatropha curcas)より毒性成分の1つであるホルボールエステル類の単離を行った。新規な単離方法を開発し、ホルボールエステル類の大量精製に成功した。ジャトロファには6種のホルボールエステルが含まれているが、培養細胞を用いた形質転換実験の結果、最も力価が高く含量の多かったホルボールエステル画分(DHPB)について、マウスを用いてその毒性について検討した。分取したホルボールエステルをマウスに塗布した結果、高濃度では急性毒性を示し、体重の減少、脾臓の萎縮や下痢、消化管からの出血などが見られた。血液では白血球、特にリンパ球の減少が顕著であった。形質転換試験において、DHPBは強い活性を示したため、発癌プロモーターとしての活性があるものと考えられた。そこで、マウスに発癌イニシエーターである7, 12-ジメチルベンズ[a]アントラセンを塗布した上で急性毒性を示さない程度の低濃度でDHPBの塗布を行ったが、これらのマウスには発癌は見られなかった。同濃度のホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)ではマウスに発癌が見られたことから、培養細胞を用いた形質転換試験は、必ずしも実際の発癌プロモーター活性を反映しないことが示唆された。ジャトロファ塗布マウスにおいて脾臓の萎縮が見られたので、ジャトロファ塗布マウスの脾臓よりcDNAライブラリを作成し、DNAマイクロアレイを行った結果、GM-CSF, IFN-γ, IL-6, LIX mRNAレベルの上昇が見られた。また、簡便なジャトロファ由来ホルボールエステル類の検出法として、ホルボールエステル類の共通構造であるホルボール環に対する抗体を作成し、ELISA法の確立を試みたが、ホルボール環への化学的修飾が難航し、抗体の作成には至らなかった。1年目に行うとしていたジャトロファ由来PE類の単離・精製については手法を確立した。また、分取したPEを用いた動物実験も数度に渡って行い、ある程度の結果を得ている。また、in vitro実験については、予備実験の段階ではあるが、手法としては確立されている。以上のことから本実験はおおむね順調に進展していると判断する。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続きジャトロファ由来PE類の毒性評価をin vivo、in vitroで行うと共に、ジャトロファからのバイオディーゼル生産の際の副産物の毒性を評価する。すなわち、そこに含まれるPE類の定量を行う。HPLCを用いた方法は既に確立したが、大量の溶媒を用いるなど、抽出操作が煩雑であるため、より簡便で、ハイスループットな方法を検討する。

そのために、ジャトロファ由来PE類に対する抗体を作製し、EHSA法によってPE類を定量する測定系を確立する。これにより、ジャトロファからのバイオディーゼル生産が行われる発展途上国等への技術移転を容易に行うことを目指す。24年度が最終年度であるため、記入しない。
レドックス制御と細胞がん化の情報伝達

本研究は、細胞がん化に重要なWntシグナルの伝達因子Dishevelled (Dv1)に結合する新規因子として見つけたnucleoredoxin(NRX)の機能、またがん化への関与について調べることを目的としている。生物個体レベルでのがん化について調べるためNRX遺伝子ノックアウトマウスを作製したが、ホモマウスは出生直後に死亡した。この原因を調べたところ、頭骨の形成異常が認められた。細胞を分取して解析すると、骨芽細胞の数がコントロールと比較して増加していることが判明した。また個体の生死に深く関わる器官である心臓において左右の心室を隔てる隔壁部位の形成が不全になっていることも明らかとなった。これらの異常がどのようなメカニズムで起こるのか現在のところ不明であるが、非常に興味深い結果を得ることができた。また個体レベルでがん化との関連について調べるため、p53ヘテロマウスとの掛け合わせを行い、ダブルヘテロマウスの作製も行っている。Wntシグナル伝達の抑制に重要な、NRXとDvlの結合に関して詳細な解析を行った。その結果、NRXの活性中心内にある二つのシステインのうちC末側のシステインが結合に必須であった。しかし、一般に反応性が高いと言われているN末側のシステインはセリンに置換しても結合性は変わらなかった。このことは、Dv1と複合体を作った状態でもNRXは酸化ストレスに応答できることを意味しており、ストレス応答性のWntシグナル伝達制御における役割をより明確にすることができた。一方、NRXの新規結合蛋白質の探索を行ったところ、がん化に重要と言われている脱リン酸化酵素が見つかってきた。いくつかの脱リン酸化酵素は活性中心のシステイン残基が酸化修飾を受けることが知られており、NRXとの機能的関連が示唆された。前年度までの研究成果として、細胞内の酸化還元(レドックス)制御因子として発見されたnucleoredoxin (NRX)がDishevelled (Dvl)に結合することによってWntシグナル伝達を阻害する事を見つけていた。NRXの生理機能および細胞がん化との関わりを明らかにするため、今年度はNRXの遺伝子ノックアウトマウスの作製を行った。ヘテロマウスは特に異常な表現型を示さなかったが、ホモマウスは致死であった。ホモマウスは出生直前から直後にかけて死亡していること、また野生型マウスやヘテロマウスと比較して体が小さいことが判明している。現在、この死因を明らかにするための解析を進めている。一方、NRXの分子機能をより厳密に解析するため、胎生期のノックアウトマウスから繊維芽細胞を樹立した。今後、この細胞を用いてトランスクリプトーム、プロテオーム解析などを行い、NRXの機能解析をさらに進めてゆく予定である。最後にNRXとDvlの結合がレドックス制御を受けていることを見つけていたが、その分子メカニズムに関しての解析も進めた。NRXには酸化還元活性に重要なシステイン残基が2つあり、酸化状態ではそれらがジスルフィド結合を形成して蛋白質のコンフォメーション変化を導くと考えられている。これらのシステインをセリンに変異させた実験から、Dvlとの結合および機能阻害にはC末側のシステインが重要であることが分かった。恐らくNRXが酸化されてC末側のシステインがジスルフィド結合を作ることでDvlとの結合が切れてしまうと考えられる。現在この可能性に関してより厳密な理解を得るため、Dvl/NRX複合体の立体構造解析を行うべく、その準備などを進めている。
発熱炎症病態下におけるオセルタミビル及び非ステロイド性抗炎症薬の中枢毒性発現機構

現在、インフルエンザ治療薬オセルタミビル服用後の異常行動やNSAIDsジクロフェナクナトリウムによる脳炎・脳症の誘発または症状悪化が社会問題となっている。これら薬剤と有害事象との関連性は未だ不明である。そこで本研究では、発熱・炎症病態下の薬物血液脳関門(BBB透)過性変化に着目し、以下の成果を得た。(1)新規in vitro炎症発熱BBBモデルを構築した。(2)炎症時BBBの透過性変化は、ペリサイト由来MMP-9の増加が関与していた。(3)ジクロフェナクナトリウムの脳透過性は変化しなかった。現在、インフルエンザ治療薬であるオセルタミビル服用後の異常行動やジクロフェナクナトリウムによるインフルエンザ脳炎・脳症の誘発または症状悪化が大きな社会問題となっている。しかし、これら薬剤と有害事象との関連性は未だ不明である。そこで本研究では、インフルエンザ罹患時の代表的な症状である発熱・炎症病態下におけるオセルタミビルおよび非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)の脳移行性変化とこれに伴う血液脳関門(BBB)及び神経細胞機能障害を解明することを目的とする。本年度は、ミクログリア共培養でのin vitroBBBモデルの構築と熱負荷モデルの構築およびオセルタミビル、ジクロフェナクナトリウム、アセトアミノフェンの組織中濃度測定法確立を目指し、以下の成果を得た。1.既に構築しているin vitro BBBモデルに対して、初代培養ミクログリアを共培養する培養条件(播種細胞数、培養日数など)を検討し、至適条件を設定した。本モデルでは、炎症状態を想定したLPS刺激による活性化ミクログリアとの共培養モデルも構築可能で、炎症状態でのBBB透過性評価(NaFおよびエバンスブルーアルブミン透過性)を実施した。結果、ミクログリア活性化炎症状態では、透過性亢進が認められ、BBB機能低下が示唆された。2.ジクロフェナクナトリウムおよびアセトアミノフェン測定法についてはHPLCによる測定方法を確立した。オセルタミビルについては、主代謝物も含めた測定を想定し、同時測定法を構築中である。研究遂行上必須の実験系の確立がほぼ終了し、現在各薬物処理でのBBB機能へ及ぼす影響につき検討している。そこで本研究では、インフルエンザ罹患時の代表的な症状である発熱・炎症病態下におけるオセルタミビルおよび非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)の脳移行性変化とこれに伴う血液脳関門(BBB)及び神経細胞機能障害を解明することを目的とした。本年度は、昨年度構築した活性化ミクログリア共培養でのin vitroBBB炎症モデルを用いて、NSAIDsのBBB透過性を評価した。また熱負荷BBBモデルの構築を試みた。さらに炎症時のBBB病態におけるペリサイトの役割について検討した。本年度の成果は以下のとおりである。1. BBB炎症モデルでのジクロフェナクナトリウムの透過性には変化は認められなかった。2.高温度負荷(38-41°C)により、脳血管内皮細胞のNa-FおよびEBA透過係数は、温度依存的に増加した。またこのときの細胞傷害は認められなかった。本モデルはBBB発熱モデルとして有用である。3.炎症病態下によりBBB構成細胞であるペリサイトはMMP-9などを放出し、BBB機能低下を引き起こしていることが分かった。以上、本研究は、新たに炎症・発熱時のin vitro BBBモデルの構築を行った。また炎症病態下BBBでのペリサイトの役割に関する分子機構を明らかとした。
クリーンサープラス会計に基づく企業評価モデルによる株式新規公開価格の評価

15年度は前年度から構築作業を行ってきた新規公開企業の財務データベースを完成させ,これを利用した実証分析を行った.実証研究の成果は「株主資本価値評価方法の公開価格算定への適用に関するノート」として発表した.論文では株式新規公開時の公開価格算定の基礎として,複数の株主資本価値評価モデルの適用可能性を検討し,推定値と実際の公開価格との比較を行った.多くのファイナンスの教科書で紹介されている配当割引モデルやキャッシュフロー割引モデルは実務上,必要な配当やキャッシュフローの推定が難しく,推定誤差を小さくできる可能性から残余利益モデルの優位性を指摘した.その他,評価マニュアルで取り上げられている純資産法,類似企業比準法についても検討した.また,2001年にJASDAQ市場で公開した97社を例にとり,純資産法,RIM,国税方式の3つの評価モデルによる推定値の算出と公開価格の比較を行った.公開価格との評価誤差を求めたところ,3つの評価モデルとも公開価格より過小評価となった.次に回帰分析では,公開価格を従属変数として評価モデルの有用性,その他の要因を分析した.純資産法による推定値を用いた回帰では,統計的に有意な結果は得られず,純資産法と公開価格の関係は否定された.RIMによる推定値を用いた回帰では,3つのモデルの中で最も高い説明力を得た.単回帰式では約35%,評価モデルの推定値に利益予想成長率を加えた重回帰ではさらに上昇し,企業のクロスセクションに対する説明力は約43%に達した.また,比準方式では決定係数は低いものの,推定値は有用な変数であることが確認された.14年度の計画は実証分析に用いる企業評価モデルの検討と,分析に用いるデータの収集,および分析用データベースの構築であった.14年度全体を通じて,クリーンサープラス会計の概念を用いた企業価値評価モデルに関する理論,実証両面において文献の収集を実施し,モデルの比較・検討を行った.モデルには企業収益に対して線型情報ダイナミクスの問題,またデータの定常性の問題が存在することを確認した.上記モデルと割引キャッシュフロー法による評価法との比較を行い,新規公開企業の企業価値を予測する点で両手法の長所,短所を確認した.本研究では1997年から2001年にかけてJASDAQ市場でブックビルディングにより新規公開した358社を分析対象とした.クリーンサープラス会計の概念を用いた企業価値評価モデルでは,現在の財務諸表と将来の利益予測値データがあれば良いが,新規公開企業の公開前後の財務特性を反映したケースを考慮して,分析用データベースを公開前5年までの財務データを含むものとした.公開後の株価,出来高,公開後財務情報のデータベースは完成し,事前分析を開始することができたものの,公開時および公開前財務データは元データからの電子化の途中である.15年度は前年度から構築作業を行ってきた新規公開企業の財務データベースを完成させ,これを利用した実証分析を行った.実証研究の成果は「株主資本価値評価方法の公開価格算定への適用に関するノート」として発表した.論文では株式新規公開時の公開価格算定の基礎として,複数の株主資本価値評価モデルの適用可能性を検討し,推定値と実際の公開価格との比較を行った.多くのファイナンスの教科書で紹介されている配当割引モデルやキャッシュフロー割引モデルは実務上,必要な配当やキャッシュフローの推定が難しく,推定誤差を小さくできる可能性から残余利益モデルの優位性を指摘した.その他,評価マニュアルで取り上げられている純資産法,類似企業比準法についても検討した.また,2001年にJASDAQ市場で公開した97社を例にとり,純資産法,RIM,国税方式の3つの評価モデルによる推定値の算出と公開価格の比較を行った.公開価格との評価誤差を求めたところ,3つの評価モデルとも公開価格より過小評価となった.次に回帰分析では,公開価格を従属変数として評価モデルの有用性,その他の要因を分析した.純資産法による推定値を用いた回帰では,統計的に有意な結果は得られず,純資産法と公開価格の関係は否定された.RIMによる推定値を用いた回帰では,3つのモデルの中で最も高い説明力を得た.単回帰式では約35%,評価モデルの推定値に利益予想成長率を加えた重回帰ではさらに上昇し,企業のクロスセクションに対する説明力は約43%に達した.また,比準方式では決定係数は低いものの,推定値は有用な変数であることが確認された.
クロルデン禁止後の有機リン系白アリ防除剤の居住者汚染とその防止方法に関する研究

防除家屋Aの空気中クロルピリホス濃度は床下で防除1カ月後、6カ月後、9カ月後、1年2カ月後にそれぞれ10.9、1.8、24.7、1.8μg/m^3であった。台所では、それぞれ0.20、0.10、0.11、0.17μg/m^3であり、汚染レベルの低下はみられなかった。また、防除後1年2カ月の家屋Bにおいて、毎月1回、精白米に吸着したクロルピリホス量を測定したところ、クロルピリホス濃度は8ppbから41ppbの間で上下し、吸着量は夏期に多く、冬期に少ないこと、また、防除後2年半経過しても、クロルピリホスのコメ汚染はほぼ同レベルで継続していることが認められた。クロルピリホスの吸着したコメを炊飯前に水で3回洗浄すると、コメ中のクロルピリホスはもとの60%が除去された。電気炊飯器による炊飯では洗浄米中のクロルピリホスはほとんど除去されなかった。防除家屋居住者のクロルピリホス1日摂取量を試算すると、クロルピリホス濃度20ppbのコメを1日に2合(300g)炊飯して食べ、クロルピリホス濃度0.16μg/m^3の空気を1日に15m^3呼吸したとすると、摂取量はどちらも2.4μgとなり、クロルピリホス摂取の寄与率は50%ずつと計算された。なお、クロルピリホスのADIは、0.01mg/kg体重/日であり、住居でのクロルピリホスの許容基準は10μg/m^3(USA)である。精白米をポリ容器に封入すると、1週間後でも空気中クロルピリホスのコメへの吸着はなく、防除家屋では、コメは空気の入れ替わりの少ない容器に貯蔵することが白アリ防除剤の汚染を防止するために効果的と考えられた。防除家屋居住者の母乳29例についてクロルピリホス濃度を測定したが、いずれも検出限界値未満であった。
強誘電性ペロブスカイト型酸窒化物および酸硫化物の誘電分極メカニズム

強誘電体の強誘電性や誘電分極のメカニズムは,カチオンーアニオン間の結合状態と深く関わっているので,結晶中のアニオンサイトを変化させれば誘電・強誘電特性が変化することは明らかである.しかしながら,複合アニオン誘電体の合成の難しさなどの原因により誘電特性に及ぼすアニオン置換効果はほとんど明らかになっていない.本研究では,ペロブスカイト型酸窒化物および酸硫化物の強誘電体関連物質を合成し,部分窒化あるいは部分硫化による誘電分極への影響をフォノンおよび電子状態の観点から定量的に明らかにする.強誘電体の強誘電性や誘電分極のメカニズムは,カチオンーアニオン間の結合状態と深く関わっているので,結晶中のアニオンサイトを変化させれば誘電・強誘電特性が変化することは明らかである.しかしながら,複合アニオン誘電体の合成の難しさなどの原因により誘電特性に及ぼすアニオン置換効果はほとんど明らかになっていない.本研究では,ペロブスカイト型酸窒化物および酸硫化物の強誘電体関連物質を合成し,部分窒化あるいは部分硫化による誘電分極への影響をフォノンおよび電子状態の観点から定量的に明らかにする.
スポーツ技術の評価システムの開発に関するバイオメカニクス的研究

本研究の目的は,バイオメカニクス動作データベースとして利用できる動作パターンのモデル(動作モデル)の作成法を開発すること,および動作モデルとVTRで撮影した選手や学習者の動作との比較や技術の評価が可能なシステムの開発することである.1.平成6,7年の両年にわたって,陸上協議の短距離疾走,走高跳,走幅跳,棒高跳,砲丸投げ,槍投げ,サッカーのインステップキックなどの動作における身体各部位の座標データをバイオメカニクス的手法(DLT法)によって収集し,規格化・平均化の手法を用いて標準的動作モデル(Model of standard motion)を作成した.2.動作の変動性(Motion variability)の指標として,標準偏差および変動係数を用いた.上述した運動における角度の標準偏差および変動係数を検討した結果,標準偏差および変動係数によって動作の変動性を検討できること,変動性を検討することによってスポーツ技術を評価したり,観察する場合の着眼点あるいは要点を見いだすことが可能であることなどがわかった.3.スポーツ技術の評価システムのプロトタイプを開発した.本システムはデータベースと表示系から構成されており,データベースから任意の時点のスティックピクチャーを取り出して,ディスプレイに表示するとともに,選手や学習者の動作を撮影したVTR画像も同時に表示できるようになっている.しかし,プロトタイプはワークステーション(HP715/50)上で実現したもので,ハード,ソフト両面の機能的制約のため,当初計画したようなステムをノート型パソコン上で構築するには至らなかった.しかし,1996年内には当初計画したようなシステムが完成すると思われる.本研究の目的は,バイオメカニクス動作データベースとして利用できる動作パターンのモデル(動作モデル)の作成法を開発すること,および動作モデルとVTRで撮影した選手や学習者の動作との比較や技術の評価が可能なシステムの開発することである.1.平成6,7年の両年にわたって,陸上協議の短距離疾走,走高跳,走幅跳,棒高跳,砲丸投げ,槍投げ,サッカーのインステップキックなどの動作における身体各部位の座標データをバイオメカニクス的手法(DLT法)によって収集し,規格化・平均化の手法を用いて標準的動作モデル(Model of standard motion)を作成した.2.動作の変動性(Motion variability)の指標として,標準偏差および変動係数を用いた.上述した運動における角度の標準偏差および変動係数を検討した結果,標準偏差および変動係数によって動作の変動性を検討できること,変動性を検討することによってスポーツ技術を評価したり,観察する場合の着眼点あるいは要点を見いだすことが可能であることなどがわかった.3.スポーツ技術の評価システムのプロトタイプを開発した.本システムはデータベースと表示系から構成されており,データベースから任意の時点のスティックピクチャーを取り出して,ディスプレイに表示するとともに,選手や学習者の動作を撮影したVTR画像も同時に表示できるようになっている.しかし,プロトタイプはワークステーション(HP715/50)上で実現したもので,ハード,ソフト両面の機能的制約のため,当初計画したようなステムをノート型パソコン上で構築するには至らなかった.しかし,1996年内には当初計画したようなシステムが完成すると思われる.本研究の目的は,動作パターンのモデル(以下,動作モデル)をデータベースとして作成し,動作モデルとVTRでとらえた実際の動作を比較することによって技術の評価が可能なシステムの開発を行うことである.平成6年度にはデータベースの作成法に関する研究を実施した.1.データ収集(1)競技会における大学男子走幅跳選手12名の踏切1歩前から踏切離地までの跳躍フォームを高速度VTRカメラ(1台)を用いて撮影した.画像をVTRデジタイザにより分析し,身体各部位の2次元座標を得た.さらに,一流走幅跳選手(男子)7名のフォームを第78回陸上競技日本選手権(1994,6)および第8回アジア大会(広島,1994,10)において高速度VTR(2台)により撮影し,3次元動作分析法により身体各部(23点)の3次元座標を得た.(2)大学一流サッカー選手10名のインステップキック動作を高速度VTR(2台)を用いて撮影し,3次元動作分析法により下肢および体幹の関節点(17点)の3次元座標を得た.2.動作データの規格化および平均化走幅跳の動作モデルを作成するため,踏切1歩前および踏切の2局面のkinematicsデータを各局面の時間で規格化して重ね合わせ,それを平均した.複数の選手のフォームを規格化・平均化したものを検討した結果,走幅跳についてはこの処理法によって熟練者の動作モデルの作成が可能であることがわかった.サッカーのインステップキックについては,データ処理が終了したところであるが,軸足接地からボールリリースまでの局面について同様の動作モデルを作成する予定である.本研究の目的は、動作パターンのモデルをデータベースとして作成し,このモデルとVTRなどでとらえた実際の動作を比較することによって技術の評価が可能なシステムの開発を行うことである.本年度(継続研究の最終年度)には,(1)データベースの作成,(2)モデルおよび被評価フォームのパソコンへの表示および評価ソフトウェヤの開発を中心に研究を実施した.1.データ収集および動作モデルの作成平成6年度に引き続いて,動作データの収集,規格化・平均化による動作モデルの作成を行った.本年度には,陸上競技の走幅跳,走高跳,実験における砲丸投げ,槍投げの各動作の3次元データを収集し,作成可能な動作モデルの幅を拡大することができた.2.システム本体の開発まず,システムをパソコンのみで構築することを試みた.しかし,現在のノート型パソコンのみでは,当初に意図したような機能をもつシステムは構築できないと判断された.

そこで,専門家の協力を得て,ワークステーション(HP社)上でシステムの開発を試みた.開発したシステムは,本研究で意図した機能を備えており,基本的には本研究の目的の大部分を達成することができた.そして,成果の一部をシステムのプロトタイプを福岡ユニバシア-ドのFISU/CESU会議(平成7年8月)において報告し,デモンストレーションを行った.現在,専門家の協力を得て,上述のシステムをパソコン上で実現することを試みているところである.最近におけるパソコン関連技術の進歩は著しいので,1年以内に実現可能な所まできていると思われる.
電気化学測定を用いた溶存金属錯体の光反応解析

これまでの研究で、光照射に伴う副次的な電気化学応答を軽減し、光照射下での電気化学測定を行う手法の開発に成功している。そこで次に、今回開発した測定手法を用いて種々の金属錯体について光照射下でのサイクリックボルタンメトリー測定を行い、溶存金属錯体の光反応に由来する電気化学応答の観測とその反応解析を試みた。CO2還元能を持つテトラフェニルポルフィリン鉄(III)錯体(Fe(tpp)Cl)の測定を行ったところ、Ar雰囲気下におけるCV測定では、暗所下ならびに光照射下においてFe(tpp)Clの酸化還元過程に由来する3つの可逆な酸化還元波が観測された。一方、CO2雰囲気下では、暗所下ならびに光照射下においてCO2還元反応に由来する触媒電流が観測された。また、CO2雰囲気下、暗所下においてはー1.7 V付近に不可逆なピークが観測された。このピークは反応系中に存在する[FeI(tpp)]ーとCO2還元反応により生成したCOとの酸化的Fe-CO再結合反応由来であるとの知見がある。一方、光照射下のCV測定では、暗所下で観測された不可逆なピークがほぼ消滅した。光照射下においては上記の酸化的Fe-CO再結合反応の後、Fe-CO光解離反応が進行し、生成した[FeII(tpp)]は電極表面上で直ちに[FeI(tpp)]ーに再還元される。従って、Fe-CO再結合反応由来の酸化電流は[FeII(tpp)]の還元電流に相殺され、暗所下で観測された不可逆なピークが消滅したと考察される。以上の結果より、電気化学的触媒反応系中における光反応の存在を見出し、その光反応に由来する電気化学応答の観測に成功した。以上の結果を総括し、本研究では光照射下における溶存分子化合物の電気化学測定について全く新しい手法を開発することに成功した。今後の展望としては、種々の光触媒反応における電気化学的解析への展開が期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、溶存する光反応活性種の電気化学挙動を解析し、電極近傍における光反応活性種のダイナミクスを明らかにすることで、光反応活性種の電子状態及び反応性を電気化学的に検出する新規測定手法の開拓することを目的としている。具体的には、まず各光応答性分子に対して様々な測定条件で電気化学測定を行うことにより、溶液中の光電子移動反応における電気化学応答に関するデータを収集する。次に、実験で得られた各データに対して電気化学シミュレーションを行い、拡散係数等の各パラメータを検証し、濃度プロファイルを明らかにする。以上の研究で光反応活性種のダイナミクスを明らかにした後、様々な光反応系について電気化学測定を行い、反応機構解析を試みる。本年度は電気化学測定における光反応活性種のダイナミクスを明らかにすることを目指し、種々の金属錯体について光照射下におけるサイクリックボルタンメトリー測定を行った。まず、光増感剤として知られるトリス(2, 2'-ビピリジン)ルテニウム(II)([Ru(bpy)3]2+)、化学光量計として知られるトリス(オキサラト)鉄(III)酸カリウム(K3[Fe(ox)3])、CO2還元触媒として知られるテトラフェニルポルフィリン鉄(III)塩化物(Fe(tpp)Cl)について、光照射下においてサイクリックボルタンメトリー測定を行った。その結果、各金属錯体溶液において、光反応に由来する電気化学応答の観測に成功した。次に得られたボルタモグラムを用いて電気化学シミュレーションを行ったが、完全なフィッティングは困難であった。これは光照射下において通常の測定条件下とは全く異なる物質輸送が生じているからであると考えられる。一方で、これらのシミュレーションを行うことにより、定性的には光反応が進行していることを示すことができた。本年度は種々の金属錯体について光照射下でのサイクリックボルタンメトリー測定を行い、溶存金属錯体の光反応に由来する電気化学応答の観測に成功した。また、測定により得られたボルタモグラムを用いて電気化学シミュレーションを試みた。光照射下において通常の測定条件下とは全く異なる物質輸送が生じているため完全なフィッティングは困難であったが、定性的には光反応が進行していることを示すことができた。以上の状況より、おおむね順調に進展していると判断した。

このピークは反応系中に存在する[FeI(tpp)]ーとCO2還元反応により生成したCOとの酸化的Fe-CO再結合反応由来であるとの知見がある。一方、光照射下のCV測定では、暗所下で観測された不可逆なピークがほぼ消滅した。光照射下においては上記の酸化的Fe-CO再結合反応の後、Fe-CO光解離反応が進行し、生成した[FeII(tpp)]は電極表面上で直ちに[FeI(tpp)]ーに再還元される。従って、Fe-CO再結合反応由来の酸化電流は[FeII(tpp)]の還元電流に相殺され、暗所下で観測された不可逆なピークが消滅したと考察される。以上の結果より、電気化学的触媒反応系中における光反応の存在を見出し、その光反応に由来する電気化学応答の観測に成功した。以上の結果を総括し、本研究では光照射下における溶存分子化合物の電気化学測定について全く新しい手法を開発することに成功した。今後の展望としては、種々の光触媒反応における電気化学的解析への展開が期待される。今後はマイクロフローセルや回転ディスク電極(RDE)、微小電極といった、常に物質輸送が促進されている電極を用いた測定も行い、溶存金属錯体の光反応に由来する電気化学挙動についてより詳細に検討を行う予定である。また、光触媒反応の電気化学的解析法の構築を試みる。具体的には、様々な光触媒反応系について、光触媒として機能する金属錯体の合成を行い、光照射下において電気化学測定を行う。基質や犠牲酸化還元剤との共存下においても測定を行い、各電子移動過程について分析することで、反応機構解析を試みる。また、触媒電流の観測を行い、触媒回転頻度(TOF)の解析等、定量的な評価方法の構築を試みる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
光合成機能の獲得に伴う色素体及びミトコンドリアの転写複製活性の変化とその制御

トウモロコシは典型的なC_4植物であるが、葉位あるいは葉の発達・老化段階に依ってはC_3的な光合成特性を示すと報告されている。トウモロコシ芽生えの各葉について、クロロフィル含量が最大になる時期のCO_2補償点を測定した結果、第一葉、第二葉、第三葉いずれもC_4植物に特徴的な低い値を示したのに対し、幼葉鞘は極めて高い値を示した。組織切片観察の結果、幼葉鞘にはC_4植物に特徴的なクランツ構造がなく、C_4光合成に必要なC_4型PEPCのmRNA及びタンパク質も検出されなかったことから、幼葉鞘はC_3型の光合成を行っていることが示唆された。次に第一葉の成熟/老化過程における光合成特性の変化を解析し、CO_2補償点は葉の成熟につれ低下し、老化に伴って高くなることを明らかにした。組織切片観察の結果から、維管束鞘細胞よりも葉肉細胞の方が早く葉緑体が退化すること、またwestern解析の結果から、維管束鞘細胞で働くRubiscoよりも葉肉細胞で働くC_4型PEPCの方が早く分解/消失することが示された。これらの結果から、トウモロコシの老化葉がC_3的な光合成特性を示すのは、CO_2を濃縮する役割を果たしている葉肉細胞が維管束鞘細胞よりも早く老化し、機能を失うためと推測された。また、RT-PCRによりパクテリアのDNA polymerase Iとの類似性が認められるアラビドプシス遺伝子の単離を行い、この遺伝子産物が葉緑体へ移行するためのトランジットペプチドをもち、DNA polymerase IのN末端側にあるエキソヌクレアーゼ活性部分のみをコードしていることを明らかにした。
ミトコンドリア遺伝子を完全核移行させた真核生物の創成

ミトコンドリアは独自の遺伝情報(ゲノム)を有しているが、酸化ストレスによる変異を蓄積し、難治疾患であるミトコンドリア病や老化を引き起こすと考えられている。本研究では、ミトコンドリアゲノムにコードされた遺伝子を核へ移管し、発現することを目的とした。具体的には、1ミトコンドリア遺伝子を核遺伝子化するためのコドン改変、2細胞質リボソームによるタンパク質合成効率を上げるためのコドン最適化、3プレ配列付加によるミトコンドリア標的化、を目指した。本研究では、出芽酵母のミトコンドリアゲノムにコードされた呼吸鎖関連の遺伝子全てを核内の染色体へ組み込み、細胞質で合成したタンパク質をミトコンドリアへ輸送するシステムを構築して、ミトコンドリアゲノムを持たずに呼吸増殖する「ミトコンドリア・ゲノムレス細胞」を創成する。加えて、この改変細胞をオミックスの手法を用いて解析し、ミトコンドリアゲノムの酸化損傷のリスクから解き放たれた細胞が獲得する性質を解明する。上記の目的を達成するために、平成25年度においては、(1)核ゲノムの使用コドンに改変させた遺伝子に選択マーカー・関連核遺伝子の転写調節配列・ミトコンドリア輸送および仕分けシグナルを付加した「合成カセット」を設計し、人工遺伝子合成にてクローニング、(2)形質転換により合成カセットを核ゲノムへ挿入、(3)得られた酵母株のミトコンドリアDNAを変異剤処理により完全に欠損させて、ミトコンドリア・ゲノムレス細胞を作製、の3段階の達成を目指した。まず、(1)の人工遺伝子合成によるクローニングについて、検討と改良を行なった。一般に、同じ塩基配列からなるコドンが連続したり、AGCTの塩基組成に偏りがあると、DNA合成装置での遺伝子作製がうまくいかないことがある。この問題を克服するため、繰り返し配列部分のコドンの塩基配列を可能な範囲で多様化し、コドンを変更すること無くGやCで置換するなどの改変を大胆に加えた。その結果、目的の遺伝子DNAを合成することが可能となった。ミトコンドリアは太古の昔、酸素呼吸能力を獲得した細菌が宿主細胞に共生し、そのゲノムの大部分を宿主核に移行させることで小器官化したと考えられている。現存するほとんどの真核生物のミトコンドリアには呼吸鎖関連の遺伝子をコードしたゲノムが今も存在しており、活性酸素種による酸化障害を受けて変異ゲノムの蓄積を引き起こし、難治疾患であるミトコンドリア病や老化の原因となる。上記の目的を達成するために、平成26年度においては、(1)人工合成した遺伝子カセットをプラスミドにクローニングすることに成功した。また、(2)ミトコンドリアDNAの目的遺伝子に変異をもつ酵母細胞に対して人工遺伝子プラスミドを導入し、プラスミドから転写・翻訳されたタンパク質を検出した。(3)一方、人工遺伝子プラスミドによる変異細胞の表現型の回復は部分的であり、さらなる改良が必要であることがわかった。とりわけ、細胞質で合成された目的タンパク質のミトコンドリアへの標的化・膜透過・ミトコンドリア内膜への組込みの各ステップについて、最適化を目指してゆく。ミトコンドリアは生体内のATPのほとんどを産生する「細胞の発電所」であり、生命の生と死を司る細胞小器官である。その起源は細胞内共生説、すなわち酸素呼吸能力を獲得した細菌が宿主細胞に共生し、そのゲノムの大部分を宿主核に移行させることで小器官化したと考えられている。一方、真核生物の進化の方向性を考えた場合、ミトコンドリア遺伝子群をより安全な核へ移管し、究極的には「ゲノムレス」のミトコンドリアが誕生すると想定できる。本研究の目的は、細胞内共生進化の最終段階を合成生物学的に実現し、それにより創成される細胞の生理機能を理解しようとするものである。本年度の研究で、目的タンパク質の遺伝子配列としてこれまで試してきたCOX3の代わりに、ATP9遺伝子を普遍暗号に対応するよう変更し、プレ配列をN末端に付加したものを、ATP合成酵素複合体の核コード遺伝子ATP2由来の5'-および3'-UTRの間に挿入した。人工遺伝子合成したATP9カセットをプラスミドにクローニングし、酵母細胞に導入、タンパク質の発現をウェスタンで確認したところ、ミトコンドリアゲノム由来のAtp9タンパク質のレベルより低いことがわかった。この原因として、疎水性の膜貫通ドメインが親水性の膜透過チャネルを効率よく通過できないこと、マトリックスへの輸送後の内膜への組込みが予想よりも難しいことが考えられる。