hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シェーグレン症候群の特異的制御へのアプローチ-自己抗原T細胞エピトープの解析-

シェーグレン症候群(SS)の口唇唾液腺には、T細胞を中心とした著明な細胞浸潤が認められ自己免疫発症に重要な役割を果している。浸潤T細胞のT細胞レセプター(TCR)解析から、それらが抗原刺激により誘導されていることが判明してきた。本研究では、唾液腺に浸潤したT細胞を認識する対応抗原を明らかにし、アナログペプチドを用いた特異的制御を目的とした。唾液腺に特有なT細胞のCDR3領域をコードする蛋白をプローブとして唾液腺のcDNAライブラリー由来蛋白をWest-Western法で解析した。その結果、唾液腺特異的自己抗原の一つとしてαアミラーゼが検出された。そこで、αアミラーゼのT細胞エピトープを明らかにするために、8種類のリコンビナント欠損蛋白(Ex1-1,AA16-56;Ex1-2,AA16-105;Ex1-3,AA16-171;Ex1-4,AA16-248;Ex1-5,AA16-293;Ex1-6,AA16-334;Ex1-7,AA16-367;Ex1-8,AA16-407)を作成した。SS患者末梢血中T細胞を用いて細胞内サイトカインの測定(IL-2)および定量PCR法によりIL-2mRNA量を指標としてT細胞エピトープを含む蛋白領域を検討した。11名のSS患者末梢血をスクリーニングしたところ、9名において、全長のアミラーゼコンビナント蛋白に対するT細胞反応が検出された。そのうち、1名において、Exon2,Exon5-6に少なくとも2個のアミラーゼのT細胞エピトープがあることが判明した。現在、自己反応性T細胞をアナジーに誘導し不活化するアナログペプチドをin vitroで選別中である。将来、抗原のアナログペプチドあるいは調節性ペプチドそのものをワクチネーションすることにより、SSの特異的制御が期待される。
インターロイキン1αの細胞内局在におよぼすリン酸化の役割

IL-1αの細胞内局在とリン酸化の関係を明らかにすることを目的として、IL-1α前駆体、IL-1α前駆体部分、または核移行シグナル配列を含む領域のそれぞれについて、リン酸化部位を含むものおよび含まないもの、そしてIL-1α成熟体部分を、それぞれβ-galとの融合タンパク質として一過的に発現させたところ、以下の結果が得られた。1.核移行シグナルを付加したβ-galは核に、核移行シグナルを持たないIL-1α成熟体/β-gal融合タンパク質は細胞質に局在が認められた。2. IL-1α前駆体部分の核移行シグナル配列とリン酸化部位を含む領域とβ-galとの融合タンパク質は、リン酸化部位の有無にかかわらず核に局在した。また、リン酸化部位を持つ前駆体部分との融合タンパク質も核に局在した。3. IL-1α前駆体/β-gal融合タンパク質は、当初、発現量が低くβ-gal活性を検出できなかったが、翻訳開始部分にKozak配列を付加することにより発現量が増加した。リン酸化部位を持つ野生型IL-1α前駆体は、核と細胞質の両方に存在していたのに対し、リン酸化部位を持たないIL-1α前駆体では、核のみに局在が観察された。しかし、これらの一過的な発現細胞におけるIL-1α前駆体のリン酸化の有無は検出できなかった。4. IL-1α前駆体/GFP融合タンパク質についても、リン酸化部位を持つものと持たないものについてβ-galとの融合タンパク質と同様の結果を得た。以上の結果より、リン酸化が核への移行を抑える働きがあることが示唆された。また、前駆体部分のみでは核に局在が見られたことから、IL-α前駆体のコンホメーションが細胞内局在に影響を与える可能性が考えられた。1.β-ガラクトシダーゼ(β-gal)と融合させたインターロイキン1α(IL-1α)発現プラスミドの作製リン酸化部位を含む(野生型)または含まないIL-1α前駆体は、終止コドンをBamHI部位となるように変異させた。また、IL-1α前駆体部分の核移行シグナル配列を含む領域についてリン酸化部位を含むものと含まないもの、さらにIL-1α成熟体部分を3'末端にBamHI部位を持つようにPCRによって増幅した。得られたそれぞれのBamHI断片を発現ベクターに挿入し、C末側でβ-galと融合タンパク質として発現するようなプラスミドを作製した。上記で作製した融合タンパク質発現プラスミドDNAをリン酸カルシウム法によりマウス線維芽細胞NIH/3T3にトランスフェクションし、2日後に細胞を固定した後、β-galの基質であるX-galを加えて青色の発色を観察した。核移行シグナルを付加したβ-galは核に、核移行シグナルを持たないIL-1α成熟体とβ-galとの融合タンパク質は細胞質に局在が認められた。IL-1α前駆体との融合タンパク質は発現量が低く局在を特定できなかったが、IL-1α前駆体部分の核移行シグナル配列を含む領域との融合タンパク質は、リン酸化部位の有無にかかわらず核に局在が見られたことから、リン酸化は局在に影響を与えていないように思われた。しかし、これらIL-1α前駆体の一部の領域とIL-1α前駆体とではコンホメーションが大きく異なり、その違いが局在に影響を及ぼしている可能性を否定できないため、今後、IL-1α前駆体の発現を上げるまたはより感度の高い融合タンパク質としての検出を試みる予定である。昨年度作製したIL-1α前駆体/β-ガラクトシダーゼ(β-gal)発現プラスミドは、発現量が低く細胞内局在を特定できなかった。

そこで、IL-1α前駆体の翻訳開始部分にKozak配列を付加したIL-1α前駆体/β-gal融合タンパク質発現プラスミドを作製した。また、Kozak配列を付加したIL-1α前駆体の下流にGFPタンパク質を融合させた発現プラスミドも作製した。2.融合タンパク質発現細胞におけるβ-gal活性の検出上記で作製した融合タンパク質発現プラスミドDNAをリン酸カルシウム法によりマウス線維芽細胞NIH/3T3にトランスフェクションし、2日後に細胞を固定した。β-galの基質であるX-galを加えて青色の発色によりβ-gal活性を観察したところ、Kozak配列を付加したことにより融合タンパク質の発現量が増加し、より多くの細胞で発色が観察された。リン酸化部位を持つ野生型IL-1α前駆体は、核と細胞質の両方に存在していたのに対し、リン酸化部位を持たないIL-1α前駆体では、核のみに局在が観察された。IL-1α前駆体/GFP融合タンパク質についても同様の結果を得た。一過的な発現細胞において、32p-正リン酸標識後の免疫沈降によってIL-1α前駆体のリン酸化の有無は検出できなかったが、これらの結果より、リン酸化が核への移行を抑える働きがあることが示唆された。また、成熟体部分の配列を含まないリン酸化部位を持つ前駆体部分では核に局在したことから、IL-1α前駆体のコンホメーションが細胞内局在に影響を与える可能性が考えられた。
拡散強調画像を用いた肛門括約筋・神経叢の機能評価と術後機能温存の予測

本研究は,拡散強調画像を用いて,直腸癌の術前評価として内外肛門括約筋の機能などを評価し,腫瘍との解剖学的な位置関係の評価,術後の排尿・排便障害などの温存を向上することを目的としている.これにより,手術計画において原発巣の切除範囲やリンパ節・神経叢の郭清範囲など,肛門機能の温存が可能かの決定に寄与し,術後合併症を回避し,Quality of lifeに関わる術後機能の温存をめざすことができると予測する.直腸癌の外科手術においては直腸切断術および永久人工肛門造設が行われてきたが,近年では肛門を温存する様々な術式が開発されている.しかしながら,超低位前方切除術や側方郭清術の後遺症として,排尿障害や排便障害が患者のQOLを左右する.よって,術前に直腸周囲の内外肛門括約筋への浸潤程度や機能を予測・評価することは術前計画にとって非常に重要な課題である.直腸癌の化学放射線療法前後にMRI検査が施行された14例を対象に,肛門周囲筋群の厚み,括約筋のT2信号とADC値を計測し,加療前後で比較した.また21例に対し拡散テンソル画像を用いて,直腸周囲筋群のFA値,ADC値を計測し,トラクトグラフィーの作成を試みた.加療前後において,加療後の外肛門括約筋は加療前と比べて厚みが減少し,ADC値の上昇がみられた.また,15軸を用いた拡散テンソル画像から得られた外肛門括約筋のFA値およびADC値との間に中等度の相関がみられた.トラクトグラフィーでは,外肛門括約筋,内肛門括約筋の筋線維と思われるファイバーを描出することができ,手術前の治療計画に有用となる可能性がみられた.本研究は,拡散強調画像を用いて,直腸癌の術前評価として腫瘍進展範囲,神経叢や神経枝線維の走行,内外肛門括約筋の機能などを評価し,腫瘍の神経浸潤の有無,腫瘍と神経叢との解剖学的な位置関係,術後の排尿・排便障害などの温存を向上することを目的としている.これにより,手術計画において原発巣の切除範囲やリンパ節・神経叢の郭清範囲など,肛門機能の温存が可能かの決定に寄与し,術後合併症を回避し,Quality of lifeに関わる術後機能の温存をめざすことができると予測した.研究の第1段階として腹部骨盤領域において拡散テンソル画像の最適化を行う.腹部骨盤領域では,神経線維のほかに様々な臓器や脈管などが複雑に存在しているため,3次元的に方向の異なる水分子の拡散速度から,一定の方向に向かって連続する神経線維の拡散速度を分離する必要がある.そこで,神経線維の抽出に有用かつ最適なb値を見い出すことを第1段階とする.また,呼吸運動や血管内の血流などの異方性にも影響を受けることが予想されるため,撮像パラメータ,画像分解能,呼吸同期撮像などについても最適化する必要がある.さらに,現在応用されている中枢神経系のソフトウェアを改良して,最適化する必要がある.拡散テンソル画像を用いて,腫瘍進展範囲の評価や神経線維の描出に対する有用性を検討し,臨床応用が可能な定量的診断を試みる.直腸癌の術前検査としてMRIが施行された患者に対して,腫瘍の進展範囲や神経の走行,肛門括約筋の容積などを評価するため,m-DIXON法,intravoxel incoherent motion画像,拡散テンソル画像を撮像した.サンプル症例数が少ないこと,および画像解析ができていないこと.本研究は,拡散強調画像を用いて,直腸癌の術前評価として腫瘍進展範囲,神経叢や神経枝線維の走行,内外肛門括約筋の機能などを評価し,腫瘍の神経浸潤の有無,腫瘍と神経叢との解剖学的な位置関係,術後の排尿・排便障害などの温存を向上することを目的としている.これにより,手術計画において原発巣の切除範囲やリンパ節・神経叢の郭清範囲など,肛門機能の温存が可能かの決定に寄与し,術後合併症を回避し,Quality of lifeに関わる術後機能の温存をめざすことができると予測する.直腸癌の外科手術においては直腸切断術および永久人工肛門造設が行われてきたが,近年では肛門を温存する様々な術式が開発されている.しかしながら,超低位前方切除術や側方郭清術の後遺症として,排尿障害や排便障害が患者のQOLを左右する.よって,術前に直腸周囲の神経線維の走行,内外肛門括約筋への浸潤程度や機能を予測・評価することは術前計画にとって非常に重要な課題である.一方,今日の画像診断技術は飛躍的な進歩を遂げており,脳神経外科領域では拡散テンソル画像を用いて中枢神経の白質線維組織を描出することができるようになり,術後機能温存が重要となる錐体路近傍の病変に対する摘出術などで,術前・術中ナビゲーションとして応用されている.拡散テンソル画像は神経線維や筋線維などの走行を描出できるため,腹部骨盤領域の外科手術においても有用である可能性がある.術前に神経線維の走行や腫瘍の進展範囲などをあらかじめ評価しておくことは重要で,術後機能温存に寄与すると予測し,QOLの維持や改善が期待できる.今年度においては,直腸癌の術前検査として撮像された拡散強調画像を用いて,テンソル画像をフリーソフトを用いて作成することを試みた.症例のサンプル数が少なく,画像解析ができていないこと.本研究は,拡散強調画像を用いて,直腸癌の術前評価として内外肛門括約筋の機能などを評価し,腫瘍との解剖学的な位置関係の評価,術後の排尿・排便障害などの温存を向上することを目的としている.

これにより,手術計画において原発巣の切除範囲やリンパ節・神経叢の郭清範囲など,肛門機能の温存が可能かの決定に寄与し,術後合併症を回避し,Quality of lifeに関わる術後機能の温存をめざすことができると予測する.直腸癌の外科手術においては直腸切断術および永久人工肛門造設が行われてきたが,近年では肛門を温存する様々な術式が開発されている.しかしながら,超低位前方切除術や側方郭清術の後遺症として,排尿障害や排便障害が患者のQOLを左右する.よって,術前に直腸周囲の内外肛門括約筋への浸潤程度や機能を予測・評価することは術前計画にとって非常に重要な課題である.直腸癌の化学放射線療法前後にMRI検査が施行された14例を対象に,肛門周囲筋群の厚み,括約筋のT2信号とADC値を計測し,加療前後で比較した.また21例に対し拡散テンソル画像を用いて,直腸周囲筋群のFA値,ADC値を計測し,トラクトグラフィーの作成を試みた.加療前後において,加療後の外肛門括約筋は加療前と比べて厚みが減少し,ADC値の上昇がみられた.また,15軸を用いた拡散テンソル画像から得られた外肛門括約筋のFA値およびADC値との間に中等度の相関がみられた.トラクトグラフィーでは,外肛門括約筋,内肛門括約筋の筋線維と思われるファイバーを描出することができ,手術前の治療計画に有用となる可能性がみられた.拡散テンソルトラクトグラフィーを作成し,神経線維を描出できるようにb値などを含め,最適化を行う.また肛門括約筋の容積などを計測し,症状やADLなどと対比する.トラクトグラフィーを作成できるように,拡散強調画像の軸設定,b値設定を改善し,コンソール上からの画像出力方法,フリーソフト入力時の画像形式についても再考する.研究対象症例数が少なく,画像評価・解析ができていないため.症例サンプルの保存に必要な記憶媒体と画像解析に必要なソフト購入画像評価に用いるPC,解析ソフトの開発・購入
イヌメラノーマに対するmicroRNAを用いた個別化医療の確立

まず、イヌメラノーマ細胞の放射線感受性に影響を与えるmiRNAとして、miR-205を同定した。miR-205はイヌメラノーマ細胞の放射線感受性を増強することを見出し、論文化しJapanese Journal of Veterinary Researchに投稿し、受理された(Wada Y, Noguchi S, et al. 2019 in press)。また、その他の放射線感受性に影響を与えるmiRNAとしてmiR-374bを同定した。我々はイヌメラノーマ細胞にX線照射を行い、放射線抵抗性株を作製した。miR-374bは放射線照射後のメラノーマ細胞および放射線抵抗性株において有意に発現亢進しており、メラノーマ細胞にmiR-374bを導入すると放射線抵抗性が亢進することを見出した。また、miR-374bの放射線抵抗性メカニズムはがん抑制遺伝子であるPTENの発現低下が関与することが明らかとなった。ルシフェラーゼアッセイにより、miR-374bはPTENを標的遺伝子とすることも併せて明らかとなった。これらの結果より、イヌメラノーマ細胞においてはmiR-374b/PTENシグナルカスケードが放射線治療の反応性に重要であることが示された。この内容については、現在論文執筆中である。本研究課題が開始してから2年間で、イヌメラノーマの放射線感受性に関わるmiRNAを2種類同定することができた。1種類に関しては既に論文化することに成功し、2種類目も論文執筆可能なデータを得ることができた。以上の理由から、おおむね順調に進展していると判断した。2本目の論文を投稿し、受理されるところまで進めるとともに、同定した2種類のmiRNAに関して、臨床サンプルを用いて発現量と放射線治療の効果についてprospectiveに検証する予定である。平成29年度においては、まずイヌメラノーマ細胞株CMM1およびKMeC、ヒトメラノーマ細胞株A2058の放射線感受性を検証し、各細胞株のLD50線量を決定した。A2058細胞に対し、LD50に相当する4Gyで放射線照射を行い、6および12時間後にトータルRNAを抽出した。A2058細胞の照射前および6時間後のトータルRNAを用いて、microRNAmicroarrayに供し、放射線反応性microRNA群を検証した。また、イヌメラノーマ細胞株KMeCおよびCMM1を用いて放射線耐性株を作製した。作製は、LD50に相当する放射線を月曜日から金曜日まで照射し、およそ4週間かけて行った。microarrayで候補として挙げた数種類のmicroRNAについて、当初A2058細胞、KMeC細胞、CMM1細胞に放射線を各細胞のLD50相当の線量で照射し、照射前、照射後6および12時間でトータルRNAを抽出し、real time PCRで発現の変化を検証したが、microarrayの結果を再現できなかった。そこで、耐性株と非耐性株間で発現の違いをreal time PCRで検証した。その結果、miR-Xの発現が複数の細胞株で同様のパターンを示した。放射線照射後の継時的変化においてmiRNAの発現パターンがmicroarrayの結果を再現しなかった理由としては、照射線量の誤差や細胞回収のタイミングの誤差などが影響した可能性が考えられた。一方、放射線耐性株は安定的にその表現型を有しているため、実験の再現性という観点から優れている、と考えた。放射線抵抗性株の作製および放射線照射に反応するmiRNAの網羅的解析(microRNA microarray)は予定通り終了している。研究対象とするmicroRNAの絞り込みに予定よりも時間を要したが、miR-Xを研究対象として絞り込んだ。現在、miR-Xがメラノーマ細胞の放射線感受性に与える影響を検証中である。miR-Xのmimicあるいはinhibitorをメラノーマ細胞に導入し、放射線感受性の変化を検証する。放射線感受性に与える影響を確認でき次第、miR-Xが関連するsignaling cascadeを同定する予定である。

また、放射線照射に反応するmicroRNA群をより強固に同定するために、放射線抵抗性株と非抵抗性株を用いてmicroarrayを行うことも検討している。2本目の論文を投稿し、受理されるところまで進めるとともに、同定した2種類のmiRNAに関して、臨床サンプルを用いて発現量と放射線治療の効果についてprospectiveに検証する予定である。平成29年度においては、検体保存用のディープフリーザー代を計上していたが、当該年度においては既存のディープフリーザーのスペースの利用で検体保存が可能であったため、購入を見送った。平成30年度においては、検体数に応じてディープフリーザーの購入を検討する。研究進捗状況は概ね予定通りだが、最終年度により発展的な分子生物学的実験を行う予定であり、そのための試薬代として当てるため、一部を最終年度に繰り越した。
不整形地盤における地震動増幅率を考慮した高精度地震動予測法の開発

傾斜基盤面の上端と下端における地盤モデルから1次元的に地震動伝達関数を求め、それらを重ね合わせることにより傾斜基盤上の堆積地盤面における2次元地震動伝達関数を補間推定する手法を開発した。本手法により、従来行われてきた等価線形化法などの地盤震動解析法の結果をそのまま用いて不整形地盤での地盤震動解析が可能となったうえ、実際の地盤への適用が極めて簡単な手法となった。具体的な地形を対象に地震ハザードマップを作成したところ、従来手法にもとづくマップと比べ使いやすさが向上することがわかった。本研究の目的は、地域により個々に想定される巨大地震における任意の地点の地震動(波形及び震度)を高い精度で予測する手法を開発し、地域防災に貢献することである。一般に地震動予測は震源から地表への震動の伝播メカニズムを想定して算出されるが、表層地盤はボーリング調査(点測定)に基づき数100m四方の独立した成層地盤メッシュとして扱われる。このため、地盤構造に急激な変動がある地域において予想される波動の反射・屈折は考慮されていない。すなわち、従来の地震動予測は隣接するメッシュ間のエネルギー収支の相互作用が考慮されていないため不整形地盤地域の予測には精度的に問題がある。本研究はこの問題点を解決し、不整形性を有する地盤の任意のどの地点においても精度の高いピンポイント地震動予測を可能にしようとするものである。本年度は、傾斜基盤面の上端と下端における地盤モデルから1次元的に地震動伝達関数を求め、それらを重ね合わせることにより傾斜基盤上の堆積地盤面における伝達関数を補間推定する手法を開発した。重ね合わせに用いる重み係数は、傾斜基盤上端からの距離と傾斜基盤の長さをパラメータとし、有限要素法によるパラメトリックスタディによりあらかじめ決定し一般化しておく。予め有限要素解析を行っているので、本法の適用時に有限要素法を行う必要が無い。従来行われてきた等価線形化法などの地盤震動解析法の結果をそのまま用いることができるので、これまでに蓄積されてきた地盤データの利用が可能であるとともに、実際の地盤への適用が極めて簡単である。具体的な地形を対象に地震波の入力レベルや地盤の軟弱さを変えて、さまざまなパラメトリックスタディを行った結果、本法で計算した地震動伝達関数は、有限要素法で計算したものと比較して、主たる固有振動数付近において高精度で一致することがわかった。重ね合わせに用いる重み係数は、傾斜基盤上端からの距離と傾斜基盤の長さをパラメータとし、有限要素法によるパラメトリックスタディによりあらかじめ決定したものを用いている。本手法により、従来行われてきた等価線形化法などの地盤震動解析法の結果をそのまま用いて不整形地盤での地盤震動解析が可能となった。されに、これまでに蓄積されてきた地盤データの利用が可能であるとともに、実際の地盤への適用が極めて簡単な手法となった。これらの結果をもとに、地震ハザードマップを作成したところ、従来手法にもとづくマップと比べ使いやすさが向上することがわかった。
脳腫瘍における不均一性獲得機序の解明と特異的治療法の開発

膠芽腫は非常に予後不良な脳腫瘍であり、現在行われている標準治療での平均生存期間は約15ヶ月程度である。近年、膠芽腫のサブタイプ解析が進められ、サブタイプ毎の異なる分子生物学的な特性を標的とした新たな治療法の開発に注目が集まっている。本研究では、膠芽腫のマウスモデル及びそのマウスの腫瘍から樹立した腫瘍幹細胞を用いて、脳腫瘍・脳腫瘍幹細胞のそれぞれのサブタイプの分子背景及びサブタイプを規定する因子を明らかにする。また、サブタイプ毎に治療効果を有する治療法を確立し、膠芽腫のサブタイプを標的とする新たな治療戦略の開発に貢献する。
染色体のドメイン構造

本研究の研究目的は、染色体機能に関わるDNAドメインを同定、クローン化し、これらと相互作用する特異的タンパク質の分子機能を解析することにより、染色体の分離・分配・維持・凝縮、組換えの分子機構を明らかにすることにある。このような目的に沿って以下に延べる実績があがった。1.分裂酵母において動原体機能必須領域のクローン化に成功した。約4000塩基対長の配列で、dgとdhと名付けられ、全塩基配列の決定もなされた。これらの配列を失なうと染色体は脱落する。一部を失なうと、減数分裂時に染色分体間の結合が弱まる。また人工染色体も作成された。2.ヒト細胞において染色体凝縮を調節する遺伝子のクローン化に成功しRCC1と名付けられた。コードするタンパク質は、数十残基におよぶ反復構造を有する。突然変異株を相補するDNA断片をケノムからクローン化することに成功した始めてのケースである。3.ニワトリの性染色体Wに特異的に存在する反復DNAに結合するタンパク質の同定・分離が可能となった。このタンパク質の性状を詳細に解析した。4.大腸菌において、染色体およびF因子の分配を調節する遺伝子を発見した。その一部については、遺伝子産物の同定が可能となり、そのタンパク質機能を追求した。5.マウスゲノム中に、個体変化に伴なう変化をおこす反復DNAを発見し、この配列が遺伝的交雑による解析が可能であることを明らかにした。6.仔牛〓腺トポイソラーゼに依存する組換え系試験管内反応を解析し中間体構造の同定を行なった。
軽量耐熱L1_2型Al_3Ti基合金の開発とTiAl合金への耐酸化傾斜皮膜の作製

高効率を目標とする各種エンジン用の新しい軽量耐熱構造用材料として要求されるものは第一に軽量性であり、さらに耐酸化性が求められる。現在、最も有力な候補材の一つにTi-Al系金属間化合物のTiAl合金(L1_0型、γ相)があり、すでに自動車用エンジンバルブ、ターボチャージャーなどに実用化されつつある。しかし、この材料は耐酸化性が必ずしも十分でなく、耐酸化処理を施さなければ高温での使用は800°Cが限界とされている。したがって、本格的な実用化を達成するためにはTiAl合金に耐酸化性の皮膜をコーティングする必要がある。一方、TiAl系金属間化合物の中には、きわめて優れた耐酸化性を有するAl_3Ti(正方晶、DO_<22>型)がある。この金属間化合物はTiAlよりさらに軽量であることから、次世代の軽量耐熱材料として期待され、また、TiAl合金に対する耐酸化性皮膜として研究されている。しかし、Al_3Tiは複雑な結晶構造であるためきわめて脆性的であり、このままでは軽量耐熱材料としても耐酸化性物質としても適用できる状況でない。そこで、申請者らは、Al_3Tiの複雑な結晶構造を、第三元素を添加する方法で単純な結晶構造(面心立方晶、L1_2型)に改変させて脆性を改善する研究を行った。この結果、Al_3TiにCrおよびMnを比較的多量(1316mol%)に添加したL1_2型Al_3Ti基合金は良好な組織と延性を示すことを見出した。さらに、Ti-Al-Cr系およびTi-Al-Mn系におけるTiAl合金(L1_0型)とL1_2型Al_3Ti基合金の間の相平衝関係(状態図)を作成して調べたところ、両相が互いに平衡相として存在できることがわかった。それゆえ、L1_2型合金をTiAl合金に対する耐酸化性の傾斜化皮膜(組成および組織が傾斜した皮膜)として使用できると考え、各種コーティング技術の開発研究を行った。この結果、申請者らは各自に開発した粉末パック法により、耐酸化性のL1_2型(Al,Cr)_3Ti合金がTiAl合金基板に傾斜化した皮膜として良好にコーティングできることを見出した。この方法は、粉末パック材としてあらかじめ作製したL1_2型(Al,Cr)_3Ti合金の粉末のみ使用し、パック材の焼結と拡散によって皮膜を形成させるもので、塩化アンモニウム等の活性化剤を使用しないのが特徴である。本研究では、さらに簡単なコーティングプロセスの開発を目的に、上述の合金粉末からなるパック材の代わりに、L1_2型(Al,Cr)_3Ti合金組成に配合したAl, Ti, Crからなる混合元素粉末のスラリーを用い、これをTiAl合金に塗布して加熱する方法によりコーティングすることを試みた。即ち、元素粉末間の燃焼反応によってL1_2型(Al,Cr)_3Ti合金をその場で合成し、これを基板に拡散させて皮膜を形成させた。この方法により、実用可能な耐酸化性の傾斜化皮膜を作製することに成功した。

本研究では、さらに簡単なコーティングプロセスの開発を目的に、上述の合金粉末からなるパック材の代わりに、L1_2型(Al,Cr)_3Ti合金組成に配合したAl, Ti, Crからなる混合元素粉末のスラリーを用い、これをTiAl合金に塗布して加熱する方法によりコーティングすることを試みた。即ち、元素粉末間の燃焼反応によってL1_2型(Al,Cr)_3Ti合金をその場で合成し、これを基板に拡散させて皮膜を形成させた。この方法により、実用可能な耐酸化性の傾斜化皮膜を作製することに成功した。宇宙・航空機用、自動車用あるいは高効率を目標とする各種エンジン用の新しい軽量耐熱構造用材料として要求されるものは第一に軽量性であり、さらに耐酸化性が求められる。現在、もっとも有力な候補材の一つにTi-Al系金属間化合物のTiAl合金(L1_0型、γ相)があり、すでに自動車用ターボチャージャーなどに実用化されつつある。しかし、この材料は耐酸化性が必ずしも十分でなく、耐酸化処理を施さなければ高温での使用は800°Cが限界とされている。したがって、本格的な実用化を達成するためにはTiAl合金に耐酸化性の皮膜をコーティングするか、耐酸化性物質(部材)を接合するなどして使用することが必要かつ不可欠となる。一方、Ti-Al系金属間化合物の中には、きわめて優れた耐酸化性を有するAl_3Ti(正方晶、DO_<22>型)が存在する。この金属間化合物はTiAlよりさらに軽量であることから、次世代の軽量耐熱材料として期待され、TiAl合金に対する耐酸化性皮膜としても数多く研究されている.しかし、Al_3Tiは複雑な結晶構造であるためきわめて脆性的であり、このままでは軽量耐熱材料としても耐酸化性物質としても適用できる状況ではない。そこで、申請者らは、Al_3Tiの複雑な結晶構造を、第三元素を添加する方法で単純な結晶構造(面心立方晶、L1_2型)に改変させて脆性を改善する研究を行った。この結果、Al_3TiにCrおよびMnを比較的多量(1316mol%)に添加したL1_2型Al_3Ti基合金は良好な組織と延性を示すことを見出した。さらに、Ti-Al-Cr系およびTi-Al-Mn系におけるTiAl合金(L1_0型)とL1_2型Al_3Ti基合金の間の相平衡関係(状態図)を作成して調べたところ、両相が互いに平衡相として存在できるだけでなく、きわめて類似した結晶構造と格子定数を有していることがわかった。それゆえ、L1_2型合金をTiAl合金に対する耐酸化性の傾斜化皮膜として使用できると考え、各種コーティング技術の開発研究を行うことにした。現在、申請者らが行った塩化アンモニウムなどの活性化剤をまったく使用せず、L1_2型Al_3Ti基合金の粉末のみをパック剤とする新しい粉末パック法によって、比較的良好な耐酸化性の傾斜化皮膜を作製できることが明らかになった。高効率を目標とする各種エンジン用の新しい軽量耐熱構造用材料として要求されるものは第一に軽量性であり、さらに耐酸化性が求められるJ現在、最も有力な候補材の一つにTi-Al系金属間化合物のTiAl合金(L1_0型、γ相)があり、すでに自動車用エンジンバルブ、ターボチャージャーなどに実用化されつつある。したがって、本格的な実用化を達成するためにはTiAl合金に耐酸化性の皮膜をコーティングする必要がある。
ヒトゲノム由来の染色体外因子・・その基礎的理解から、革新的細胞工学技術へ

(A)ゲノム中で高度反復配列となった場合に、遺伝子発現が抑制される配列と,逆に高める配列が存在することを見いだした。すなわち、様々な配列をスクリーニングすることにより、反復した場合にどのような配列が発現を高めるのか、逆にどのような配列が低くするのかのリストを得た。具体的に後者としてはプラスミド、ファージ、等、原核細胞由来配列や、ヒトゲノム中のSINE, LINE等が含まれ、前者にはヒトゲノム中の複製開始領域、核マトリックス結合領域、独自にヒトゲノムから単離したB-3-31配列等が含まれた。このような配列は、それ自体が分子生物学上重要な発見となるとともに、動物細胞工学への応用が期待される。(B)マウス人工染色体特異的に導入配列を増幅させる方法を樹立した。具体的には、IR/MAR配列と、標的配列との相同配列の2者を持つプラスミドDNAを、相同配列特異的に切断するCas9/guide RNAと同時に細胞に導入する方法である。さらに、この方法でなぜ標的配列に特異的に組み込まれるのかについての分子機構を明確にするとともに、人工染色体上でLactose operator配列を増幅させることで、lactose repressor-GFP発現細胞内で人工染色体を生細胞可視化することに成功した。この方法は、標的とする染色体配列特異的に目的配列を増幅させる方法として、より広範な適用範囲を持つ動物細胞工学技術として発展途中である。(C)増幅した遺伝子が局在する染色体外因子DMの動態について、DM特異的に2本鎖切断を誘導することにより、DMの核内での凝集、修復、細胞分裂後の微小核形成を介したDMの排出や構造変換、といった、がん生物学上極めて大事な現象を明確にすることができた。【A】ヒトゲノム由来の染色体外因子であるDMに関する基礎的理解を深めた。特に、染色体外因子の特殊性を、ヒストン修飾に関して明確にすることができた。すなわち、DMは、同じ配列からなる染色体腕のHSRとは転写・複製・修復・組み換えにおいて大きく異なることを我々は以前の研究で示してきた。今回、この問題の基盤となる分子構造を明確にするために、クロマチン免疫沈降法と、DNAメチル化の双方を調べて、DMとHSRを比較した。その結果、極めて興味深い成果が上がったため、PlosONE誌にに公表した。また、DMはDNA2本鎖切断に伴って凝集することが過去の我々の実験から示唆されていた。今回、この点を明確にするために、配列特異的な切断をCRISPR-Cas9を用いて誘導することで検討した。その結果、そのような切断によって短期間で効率よくDMは凝集し、さらにそれが排出されることが示された。これは、極めて興味深い実験系が樹立されたことを意味する。【B】DMに関する理解とDMを介する遺伝子増幅系を応用する研究に進展が見られた。すなわち、人工染色体上で目的遺伝子を増幅させる実験系の樹立を目指し、CRISPR-Cas9を用いてIR/MARプラスミドを人工染色体に効率よく組み込む手法が樹立された。さらに、IR/MARプラスミドにより増幅させた遺伝子は、発現抑制を受けやすいという大きな問題があったが、その問題解決に前進が見られた。すなわち、細胞内で反復配列となったときにrepeat-induced gene silencingにより発現抑制を受ける配列と、逆に発現が高まる配列があることを見出した。これは真核細胞に特有の配列であることが示唆されたが、CpG密度とは関係なかった。これらの発見の応用を今後検討する。当初計画していた重要な項目の複数について、大きな進展が見られた。すなわち、染色体外因子の基礎的理解に関して重要な進展があったとともに、その応用面でも着実な進展があった。さらに、派生した重要な問題である「反復配列による発現抑制」の問題について、重大な発見があった。これらの点は、基礎研究・応用研究、双方に大きな派生効果を持つ成果である。(A)ヒトゲノム由来の染色体外因子であるDMの動態に関する基礎的理解が深まった。すなわち、ヒト・げっ歯類の細胞融合によりヒト染色体が選択的に断片化し、DMが効率よく形成されて安定に維持されることを見出し、その理解を深めた。そのようなDMの形成と維持は、低酸素で効率が良いことが示唆された。また、独自な遺伝子増幅系であるIR/MAR遺伝子増幅法でDMが形成される効率は、低酸素状態で効率良くなることを見出したが、低酸素により誘導されるSirt1をCas9により欠失させても大きな影響を受けることを見出した。さらに、DMの排出に関わると考えられる細胞質bLebの効率がSirt1の機能と関連することを見出した。このような発見は、遺伝子増幅と細胞質運動が関連することを示唆しており重大である。(B)DMを介する遺伝子増幅系を応用する研究に大きな進展が見られた。すなわち、IR/MAR遺伝子増幅法と人工染色体技術を融合させるために、IR/MAR、目的遺伝子、人工染色体との相同配列の3者を持つプラスミドを、相同配列を切断するCRISPR/Cas9プラスミドと同時導入すると、極めて効率よく人工染色体上で増幅することを見出し、その機構を示唆する結果を得た。この方法を用いて、人工染色体上でLacO配列を増幅させ、それをLacR-GFPで可視化することに成功した。この方法は、標的とする任意の染色体領域で、目的遺伝子を増幅する方法として発展させることが可能であり、大変重要であるため、現在そのような研究を集中的に進めている。

さらに、増幅して反復配列となると遺伝子発現を抑制する配列と促進する配列の2種類があることを見出した。さらに、それを分類・理解を深めつつあるため、今後、任意の染色体領域で目的遺伝子を高い発現状態で増幅させるという独創的で重大な細胞工学領域の創成につながると期待される。研究代表者の独自技術であり多数の特許を取得しているIR/MAR遺伝子増幅法と、鳥取大の押村教授らが樹立した人工染色体技術を融合することは、当初からの大きな夢であったが、その方法については模索が続いていた。しかし、本研究を進める過程で、相同配列とCRISPR/Cas9を利用することが突破口になることを見出した。さらに、その機構を解明する過程で、この方法が、任意の標的とする染色体領域で目的遺伝子を増幅させる技術になることが強く示唆された。一方、遺伝子増幅して反復すると、発現を高める配列が存在することを見出し、独自に単離した2種類の配列を反復させることが極めて有効に発現を高める方法となることを見出した。このような2つの方向からの技術を融合すれば、独自性の高い革新的で重要な細胞工学技術を創生できることが示唆された。これは、当初計画では思いもよらなかった大きな進展である。さらに、基礎研究面でも、染色体外因子の形成・安定性と、それを介する遺伝子増幅にSirt1が関与すること、および、それが細胞質運動を介すること、が示唆されたが、これも当初計画が予想を遥かに超えて大きく進展した成果である。(A)ゲノム中で高度反復配列となった場合に、遺伝子発現が抑制される配列と,逆に高める配列が存在することを見いだした。すなわち、様々な配列をスクリーニングすることにより、反復した場合にどのような配列が発現を高めるのか、逆にどのような配列が低くするのかのリストを得た。具体的に後者としてはプラスミド、ファージ、等、原核細胞由来配列や、ヒトゲノム中のSINE, LINE等が含まれ、前者にはヒトゲノム中の複製開始領域、核マトリックス結合領域、独自にヒトゲノムから単離したB-3-31配列等が含まれた。このような配列は、それ自体が分子生物学上重要な発見となるとともに、動物細胞工学への応用が期待される。(B)マウス人工染色体特異的に導入配列を増幅させる方法を樹立した。具体的には、IR/MAR配列と、標的配列との相同配列の2者を持つプラスミドDNAを、相同配列特異的に切断するCas9/guide RNAと同時に細胞に導入する方法である。さらに、この方法でなぜ標的配列に特異的に組み込まれるのかについての分子機構を明確にするとともに、人工染色体上でLactose operator配列を増幅させることで、lactose repressor-GFP発現細胞内で人工染色体を生細胞可視化することに成功した。この方法は、標的とする染色体配列特異的に目的配列を増幅させる方法として、より広範な適用範囲を持つ動物細胞工学技術として発展途中である。(C)増幅した遺伝子が局在する染色体外因子DMの動態について、DM特異的に2本鎖切断を誘導することにより、DMの核内での凝集、修復、細胞分裂後の微小核形成を介したDMの排出や構造変換、といった、がん生物学上極めて大事な現象を明確にすることができた。
慢性炎症を呈する非肥満2型糖尿病患者に特異的な自己抗体の探索および病的意義の解明

日本人を含むアジア人においては、非肥満者においてもメタボリック症候群、脂肪肝、糖尿病や動脈硬化性疾患の発症リスクの高いことが知られている。私たちは脂肪肝炎やサルコペニアを呈する非肥満2型糖尿病患者においてT細胞が活性化している病態に注目し、非肥満2型糖尿病患者のある一群において、T細胞が特有の自己抗原により感作されて活性化し、その活性化T細胞とB細胞のインタラクションから疾患特異的自己抗体が産生され、慢性炎症を発症するという機序の着想を得た。新規疾患特異自己抗体検索目的に、当科研究室にて現在進行中のコホート研究(『生活習慣病関連肝疾患のコホート調査研究』)に同意を頂いた患者の保存血清を用い、産業技術総合研究所(創薬分子プロファイリング研究センター五島直樹先生)に自己抗体プロファイリング用プロテインアレイの受託解析を依頼したが、2017年6月末に、改訂された「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」に対応するため実験計画書の修正を要するとの連絡があったため、本学倫理委員会に実験計画書の再申請を行った。2017年9月28日承認を受けた後、対象とした患者(病態群(BMI 23kg/m2未満で筋量減少・脂肪肝を共に呈する症例) 4名、対照群(BMI 23kg/m2未満で筋量減少・脂肪肝を共に認めない症例) 3名)より同意書を再取得し、同時に末梢血単核球採取を行い凍結保存した。2017年11月下旬には全ての同意書を取得し、2017年12月から2018年1月にかけてプロテインアレイ解析を行って頂いたが、病態群内で共通する自己抗体を見出すことが出来なかった。そのため現在、病態群のBMIの定義を25kg/m2未満に変更して対象患者数を増やし、再度産業技術総合研究所にてプロテインアレイを施行する方向で準備を進めている。2018年5月下旬解析予定である。当初、早期のプロテインアレイ実施を目指しておりましたが、平成29年5月30日より施行された「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」の改正版に対応するため、実験計画書の修正が必要となりました。新しい倫理指針に対応する書類を本学倫理委員会より承認を受けるまで測定の実施を待機する必要があり、また対象患者の方より本研究に関する同意を再度得る必要がありましたので、研究の開始が遅れました。対象患者数が少なかったこと、血清の状態が不良な検体が混在したこと(※血清の凝固により、IgG分画の量が極度に少なかったsampleがあった)が要因として考えられたため、現在対象患者を広げ、血清を再度取得し、2018年5月末から6月にかけての再測定を目指して準備を整えている。病態群に共通する自己抗体が見出された場合、その特異抗原を貼付したELISAプレートを産業技術総合研究所にて作成して頂くことで話はまとまっており、ELISAプレートが完成し次第、コホート研究の全保存血清を用いて自己抗体の量を定量し、肝臓の状態、筋肉の状態、炎症反応との関連を調査し、候補自己抗体の感度・特異度を検討する。またプロテインアレイを行った病態群の保存血球を用い、T細胞と自己抗原を用いたex vivo assayを併行して行っていく。

新しい倫理指針に対応する書類を本学倫理委員会より承認を受けるまで測定の実施を待機する必要があり、また対象患者の方より本研究に関する同意を再度得る必要がありましたので、研究の開始が遅れました。対象患者数が少なかったこと、血清の状態が不良な検体が混在したこと(※血清の凝固により、IgG分画の量が極度に少なかったsampleがあった)が要因として考えられたため、現在対象患者を広げ、血清を再度取得し、2018年5月末から6月にかけての再測定を目指して準備を整えている。病態群に共通する自己抗体が見出された場合、その特異抗原を貼付したELISAプレートを産業技術総合研究所にて作成して頂くことで話はまとまっており、ELISAプレートが完成し次第、コホート研究の全保存血清を用いて自己抗体の量を定量し、肝臓の状態、筋肉の状態、炎症反応との関連を調査し、候補自己抗体の感度・特異度を検討する。またプロテインアレイを行った病態群の保存血球を用い、T細胞と自己抗原を用いたex vivo assayを併行して行っていく。2017年度は、対象患者の血球保存のために必要な試薬・消耗品の購入、及び初回のプロテインアレイに要した研究費を請求させて頂きました。初回プロテインアレイでは病態群内で共通する自己抗体を見出すことが出来なかったため、2018年度に対象患者数を増やしてプロテインアレイを再試行して頂く予定であり、そのために2017年度の残金を2018年度に使用させて頂くことと致しました。
セマフォリンとその受容体による神経回路形成の制御の研究

神経軸索はさまざまな誘引因子と反発因子に反応することで特定の道筋に沿ってガイドされ標的に到達する。セマフォリン(semaphorin)は神経軸索の伸長を制御する機能を持つ分子で、ニューロピリン(neuropilin)とプレキシン(plexin)はセマフォリンの受容体である。本研究では、マウスと線虫を対象にして、以下の5点の研究を実施し、セマフォリンとその受容体による神経回路形成の制御の分子的実体を明らかにした。さらに、この研究過程で、セマフォリンとその受容体が神経回路形成のみならず、神経細胞の移動、心臓・血管形成、あるいは上皮組織の形態形成をも制御していることを明らかにした。(1)マウス神経系で発現する新規なプレキシンの同定(3)新規マウスclass6 semaphorinの同定と受容体の同定(4)neuropilin-1/neuropilin-2二重変異マウスを用いたセマフォリンシグナルの解析(5)線虫C. elegansにおけるプレキシン機能の解析神経軸索はさまざまな誘引因子と反発因子に反応することで特定の道筋に沿ってガイドされ標的に到達する。(1)マウス神経系で発現する新規なプレキシンの同定(3)新規マウスclass6 semaphorinの同定と受容体の同定(4)neuropilin-1/neuropilin-2二重変異マウスを用いたセマフォリンシグナルの解析(5)線虫C. elegansにおけるプレキシン機能の解析個体発生の過程で多様でかつ恒常的な神経回路を産み出す分子機構を明らかにすることを目的として、神経軸索ガイド分子セマフォリン(Semaphorin)とその受容体であるニューロピリン(Neuropilin)とプレキシン(Plexin)遺伝子機能を欠損した動物を系統的に作製し、その表現型の解析を行い、以下の成果を得た。1、マウスPlexinAファミリーに属するPlexinA3遺伝子のCre-loxPを用いたコンデイショナルノックアウトを試み、Cre-loxP挿入変異マウスを得ることに成功し、現在、受精卵をCreで処理しPlexinA3遺伝子ノックアウトマウスを得る準備を進めている。2、PlexinA2、PlexinA4遺伝子ノックアウトマウスの表現型の解析を行い、PlexinA2欠損マウス胚では末梢神経系に全く異常がないこと、PlexinA4欠損マウス胚では末梢神経線維の走行が乱れるがその異常の程度はSema3A欠損マウス胚、Neuropilin-1欠損マウス胚に比べ小さいことが判明した。さらに、Neuropilin-1欠損マウス胚のDRGニューロンはSema3Aに対する反応性を完全に失っているが、PlexinA4遺伝子ノックアウトマウス胚のDRGニューロンはSema3Aに対する反応性は低下しているが、完全には失っていないことが判明した。このことは、PlexinA4以外にSema3Aのシグナルを伝える受容分子が存在することを示唆している。3、線虫のセマフォリン遺伝子Plx1破壊株を作製し、この破壊株では神経系には顕著な異常は認められないが、上皮系組織の形成が大幅に乱れることが明らかになった。また、Plx1が線虫の膜結合型セマフォリンと相互作用することを見い出した。この結果は、線虫ではプレキシンを介したセマフォリンシグナルが上皮の形態形成に必須であることを示唆している。個体発生の過程で多様でかつ恒常的な神経回路を産み出す分子機構を明らかにすることを目的として、神経軸索ガイド分子セマフォリン(Semaphorin)とその受容体であるニューロピリン(Neuropilin)とプレキシン(Plexin)遺伝子機能を欠損した動物を系統的に作製し、その表現型の解析を行い、以下の成果を得た。1、Neuropilin-1/Neuropilin-2ダブルノックアウトマウスを作製し、この変異マウス胚では脊髄神経節、交感神経節の節形成が大幅に低下することを明らかにした。この結果は、Neuropilin-1ならびにNeuropilin-2を介したclass 3 Semaphorinのシグナルが神経細胞の移動と集積に関与することを示している。2、PlexinA2ノックアウトマウスを作製し、その表現型の解析を行った。その結果、この変異マウスでは末梢神経系に全く異常がないが、小脳顆粒細胞の位置異常があることが判明した。3、PlexinA4ノックアウトマウスを作製し、その表現型の解析を行った。この変異マウス胚では抹消神経線維の走行が乱れるが、これ以外に、海馬神経回路や前交連の形成に異常があることが判明した。これら2点の結果は、プレキシンを介したセマフォリンシグナルが中枢神経回路の形成と細胞移動の制御に関与することを示している。

4、線虫のPlexin変異株の解析を行い、上皮細胞由来の陰門の形成に異常があることが判明し、線虫ではプレキンンを介したセマフォリンシグナルが上皮細胞の移動と配列を制御することが明らかとなった。さらに、線虫Plexinの下流で機能する可能性がある遺伝子の検索を行い、複数の候補遺伝子の分離に成功した。個体発生の過程で多様でかつ恒常的な神経回路を産み出す分子機構を明らかにすることを目的として、神経軸索ガイド分子セマフォリン(Semaphorin)とその受容体であるニューロピリン(Neuropilin)とプレキシン(Plexin)の遺伝子機能を欠損した動物を系統的に作製し、その表現型の解析を行い、以下の成果を得た。1、Plexin-A2ノックアウトマウスを作製し、その表現型の解析を行い、この変異マウスでは小脳顆粒細胞の位置異常があることが判明した。一方、Plexin-A2のリガンドと予測されるSema6Aの遺伝子ノックアウトマウスの解析を行い、Plexin-A2ノックアウトマウスと同じ小脳顆粒細胞の位置異常があることが判明した。更に、Plexi-A2/Sema6Aダブルノックアウトマウスでこの異常が部分的に加算されることを明らかにした。このことは、Plexin-A2とSema6Aが機能的に連関していることを示唆している。3、Plexin-A1ノックアウトマウスは致死であることが判明し、遺伝子改変マウスでの解析が不可能であった。そこで、Plexin-A1の機能阻害抗体を作製し、Plexin-A1を介したSema6C,Sema6Dシグナルが軸索伸張を抑制することを見出した。これら3点の結果は、プレキシンを介したセマフォリンシグナルが神経回路の形成の制御に関与することを示している。4、線虫でPlexinの下流で機能する可能性がある遺伝子の検索を行い、複数の候補遺伝子の分離とその機能の解析を行った。
口腔細菌のメタボロトーム解析を利用した歯周疾患の診断法の開発と制御の試み

【目的】歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisは糖非発酵性であり、主にアミノ酸を炭素源として、エネルギーを獲得する。この菌においては、acetyl-CoAと無機リン酸からphosphotranacetylase (Pta)の触媒によってacetyl phoshpateを産生し、その後、ADPの存在下でacetate kinase (Ack)によって、ATPを合成することが知られている。本研究では、この反応に関与するPtaおよびAckの遺伝学的および酵素学的解析を行った。【結果】PtaのKm値は72.0 ±8.1 μMであり、kcat値は1544 ±109 s-1であった。また、その反応の最適pHは9.0であった。一方、Ackの酵素反応はacetyl phosphateとADPを基質としてping-pong bi-bi反応であり、acetyl phosphateに対するKm値は177 ±51.2 μMであり、kcat値は435.5 ±32.2 s-1であった。もう一方の基質であるADPに対するKm値は585 ±19.2 μM、kcat値は421 ±159.6 s-1であった。その反応の最適pHは8.0であり、MnイオンまたはMgイオンが反応に必要であった。RT-PCRによって、ptaとackは独立して転写されることが明らかとなった。また、ptaとackに隣接する上流および下流の遺伝子の不活化株は得られるが、ptaとackの不活化株は得られなかった【考察】PtaおよびAckはP. gingivalisのATP獲得に重要な働きがあることが示唆された。概ね研究計画どおりに進行している。口腔細菌のGC/Msデータをとり、短鎖脂肪酸の産生のプロファイルを作成する予定である。歯周病原細菌Porphyromonas gingivalisはグルコースのみを炭素源にした場合、ほとんど成長できず、主にアミノ酸やペプチドを炭素源に生命活動を維持している。この細菌のATPの産生は、アスパラギン酸やグルタミン酸を基質に短鎖脂肪酸を合成する経路から分岐する経路が関与することが予測されてきた。phsophoacetyltransferase(PTA)は無機リン酸存在下において、Acetyl-CoAからacetyl phosphateを産生し、その後acetate kinase(ACK)はacetyl phosphateとADPから酢酸とATPを産生する。本研究では、それらの酵素の精製酵素を作成し、酵素学的な性質を決定した。PTAのKmおよびkcat値は、0.072 ±0.008 mMおよび1544 ±109 s-1であった。この酵素の最適pHは9.0であった。一方、ACKのacetyl phosphateに対するKmおよびkcat値は、0.177 ±0.051 mMおよび435.5 ±32.2 s-1であり、ADPに対するKmおよびkcat値は、0.585 ±0.19 mMおよび421 ±160 s-1であった。ACKの最適pHは8.0であり、反応にMnおよびMgイオンが必要であった。これらの遺伝子は、Reversed Transcriptase-PCR法を用いた実験より、オペロンを形成しておらず、単独で転写されることが示唆された。また、これらの遺伝子はエリスロマイシンやカナマイシンなどの一般的な薬剤耐性遺伝子を使用する一般的な不活化できなかった。一方、予めプラスミドの形で遺伝子を導入したのちは、不活化できるので、必須遺伝子であることが示唆された。一年目の研究計画に概ね則っており、問題ないと考える。ATP産生については、このタンパク質だけではないと考えられているが、その証拠がみつけられなかった。

しかし、解糖系の酵素が存在し、一部にATPの産生に関与することが示唆されたものもある。今後、それらの酵素が実際Porphyromonas gingivalisの内部でどのように発現し、機能しているのかを検討する。口腔細菌のGC/Msデータをとり、短鎖脂肪酸の産生のプロファイルを作成する予定である。理由:歯周病細菌による酪酸合成メカニズムの解析を行う過程で、予想外に複雑な遺伝子群が関与していることが明らかとなり、その解明を次年度に行う。使用計画:酪酸産生に関与する酵素の精製、酵素の基質、発色系に用いる試薬などに用いる。プラスチック器具、ガラス器具、試薬などに用いる。費用のかかる実験を後回しにした関係で、本年度に1231676円が生じた。