hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単結晶及び双結晶セラミックスにおける表面拡散のAFMによる研究

バイクリスタルと単結晶の両方のMgO試料で加熱時間が長くなると表面に突起が生成した。これをAFMで調べたところ加熱時間と共に大きくなり、高温程その傾向は強かった。この突起の生成原因などの詳細については今後検討する予定である。試料として用いた双結晶SrTiO_3は市販のもので、前年度に用いた双結晶MgOと同じ方位関係にあった。すなわち、双結晶を構成する2つの結晶粒子の表面は共に(100)面であり、これらの[010]方向間の角度は24°で、傾角粒界を形成している。表面は粒界領域を含めて平らで、原子間力顕微鏡(AFM)では粒界の存在は確認できない。この試料をAFMで観察後、空気中、11501400°Cに所定時間加熱し、AFMで再び観察して粒界溝の幅(w)などを測定した。得られた粒界の断面図には粒界溝の生成と同時に盛り土が観察され、Mullinsの理論的解析に良く対応する変化を示した。これは、双結晶MgOの結果と少し異なる結果であった。この測定から、wは各温度において時間の関数t^<1/4>に比例することが分かった。すなわち、SrTiO_3の粒界溝の発達は表面拡散により進行していると考えられる。さらに、粒界溝の深さhについても類似のプロットが直線関係を示し、表面拡散機構を支持した。このhの時間依存性は干渉顕微鏡による方法では求められないので、AFMによる方法の特徴である。なお、AFMでは2面角も測定できるが、データにばらつきが大きかった。この粒界溝の発達のデータを用いて計算した表面拡散係数は同じ方法で測定したMgOの表面拡散係数に近い値であった。このことは今後さらに検討する必要がある。また、この温度範囲では本研究結果はSrTiO_3中の酸素格子拡散係数と同程度の値であったが、Srの格子拡散係数よりかなり大きい値であった。なお、この物質のTiの格子拡散係数は報告されていない。これらのことから、本研究結果は陽イオンのうち拡散の遅い陽イオンの表面拡散係数ではないかと予想される。
T細胞分化機構の構造生物学的研究

T細胞は抗原の刺激に応じて抗原に適したサブセットに分化することにより,適正な免疫応答を誘導する.T細胞分化・制御に関わるIL-23およびIL-27とこれらの受容体の認識機構の解明を構造生物学的に行うため,IL-23,IL-27およびこれらの受容体を大腸菌またはHEK293T細胞を用いて発現させた後,精製・結晶化を行った.IL-23については,X線を用いた解説実験を行い,その結晶構造を解析した.T細胞は抗原の刺激に応じて抗原に適したサブセットに分化することにより,適正な免疫応答を誘導する.T細胞分化・制御に関わるIL-23およびIL-27とこれらの受容体の認識機構の解明を構造生物学的に行うため,IL-23,IL-27およびこれらの受容体を大腸菌またはHEK293T細胞を用いて発現させた後,精製・結晶化を行った.IL-23については,X線を用いた解説実験を行い,その結晶構造を解析した.免疫応答が適正に誘導されるには,抗原の種類に応じてT細胞が分化する必要がある.T細胞は,CD8陽性T細胞である細胞傷害性T細胞とCD4陽性T細胞であるヘルパーT(Th)細胞に大別される.Th細胞は,産生するサイトカインの種類により,1型(Th1)と2型(Th2)に分類され,各々細胞性免疫または液性免疫に関わる.ナイーブTh(Th0)細胞にIL-27が作用するとTh1細胞を誘導することが知られている.また近年になり,Th1およびTh2への分化を抑制した環境にIL-23を加えてTh0細胞を培養すると,炎症性サイトカインIL-17を産生するT(Th17)細胞に直接分化することが報告された.本研究の目的は,T細胞の分化誘導機構を構造生物学的に解明することである.本件度は,IL-23と特異的受容体であるIL-23Rの複合体の構造解析を目指した.IL-23についてはHEK293S細胞を用いた発現系を,IL-23Rについては大腸菌を用いた発現系を構築した.これらの蛋白質の精製を行った後,混ぜて共結晶により結晶化を行った結果,結晶を得た.放射光実験施設において回折実験を行い,2.6A分解能までのデータを収集した.この結晶の空間群はP61で,格子定数はa=b=108.925A, c=83.329Aであった.2008年末に報告されたIL-23の構造を用いて分子置換法により構造解析を行ったところIL-23単独の結晶あることが分かった.今回得られた結晶は,報告済みの結晶と空間群が異なるため,現在構造の精密化を進めているところである.免疫応答が適正に誘導されるには,抗原の種類に応じてT細胞が分化する必要がある.T細胞は,CD8陽性T細胞である細胞傷害性T細胞とCD4陽性T細胞であるヘルパーT(Th)細胞に大別される.Th細胞は,産生するサイトカインの種類により,1型(Th1)と2型(Th2)に分類され,各々細胞性免疫または液性免疫に関わる.ナイーブTh(ThO)細胞にIL-27が作用するとTh1細胞を誘導することが知られている.また近年になり,Th1およびTh2への分化を抑制した環境にIL-23を加えてThO細胞を培養すると,炎症性サイトカインIL-17を産生するT(Th17)細胞に直接分化することが報告された.本研究の目的は,T細胞の分化誘導機構を構造生物学的に解明することである.本件度は,昨年度結晶化および構造を解析した糖修飾を受けたIL-23の結晶構造の精密化を2.6Å分解能でR値が19.50%まで行った.また,IL-23受容体であるIL-23RおよびIL-12Rβ1の単独およびIL-23との複合体の構造を明らかにするため,GSTタグを融合したこれらの受容体の発現系の構築を大腸菌を用いて行った.これらの融合型受容体の精製に成功したが,GSTタグを切除すると不溶化してしまった.現在,GSTタグ融合型受容体であるIL-23RまたはIL-12Rβ1とIL-23を混ぜて,複合体として精製を行うことが可能か試みているところである.これらの複合体を精製した後,受容体に結合しているタグを酵素により切除し,結晶化・構造解析を行う予定である.免疫応答が適正に誘導されるには,抗原の種類に応じてT細胞が分化する必要がある.T細胞は,CD8陽性T細胞である細胞傷害性T細胞とCD4陽性丁細胞であるヘルパーT(Th)細胞に大別される.Th細胞は,産生するサイトカインの種類により,1型(Th1)と2型(Th2)に分類され,各々細胞性免疫または液性免疫に関わる.ナイーブTh(Th0)細胞にIL-27が作用するとTh1細胞を誘導することが知られている.また近年になり,Th1およびTh2への分化を抑制した環境にIL1-23を加えてTh0細胞を培養すると,炎症性サイトカインIL-17を産生するT(Th17)細胞に直接分化することが報告された.本研究の目的は,T細胞の分化誘導機構を構造生物学的に解明することである.T細胞上にある補助刺激分子の抑制型受容体CTLA-4について結晶構造解析を行った.リガンドであるB7-1およびB7-1/CTLA-

4複合体と構造を詳細に比較することにより,B7-1とCTLA-4が構造変化を伴わずに結合することが分かった.もう一つのリガンドであるB7-2との結合では,B7-2の構造変化を伴ってCTLA-4と複合体を形成することが分かった.また,IL-23とIL-12Rβ1の認識機構を構造生物学的に解明するため,GST融合IL-12Rβ1を大腸菌を用いて発現させた後,複合体として精製を行った.現在,GSTを切除して分離する方法を検討しているところである.IL-23RについてもIL-23との複合体結晶の調製を試みている.今後,これらの複合体結晶の調製を行い,これらの分子認識機構の詳細な解明を行う.
環境・行動情報に基づくウミガメ混獲メカニズムの解明:持続可能な漁業へのアプローチ

絶滅が危惧されるウミガメ類の減少要因のひとつとして漁業による混獲が挙げられている。しかし、海洋を生息域とするウミガメ類の生態は謎に包まれており、ウミガメ混獲の機序はよく分かっていない。本研究課題では、ウミガメ類の生息域利用特性を、データロガーや衛星テレメトリーといった海洋動物行動計測の最新技術を用いて明らかにし、漁業とウミガメ類との共存を図ることが目的である。平成18年度は、アオウミガメの潜水データを取得するために、タイ国フーヨン島においてデータロガーを用いた野外調査を行った。18年度は雨季(5月から10月)の調査を中心に実施した。産卵上陸したアオウミガメの成体に加速度・水深・水温が記録できるデータロガーを装着して、産卵期間中の潜水データを得た。同時に、個体の産卵した1腹あたりの卵数、卵径、総産卵数を調べた。研究の成果は、平成18年12月にタイ国バンコクで行われたSEASTAR2000・アジアバイオロギングシンポジウムにて口頭発表した。また平成19年3月末に開催された、平成19年度日本水産学会大会にてポスター発表を行った。本研究の目的は、ウミガメ類の行動と漁業を含む海洋環境との関係を理解からウミガメ類の混獲回避策を提案することである。モデルケースとしてアンダマン海とタイ湾に生息するアオウミガメを中心に研究を行う。そのための方法として、直接観察が困難を極めるウミガメ類の行動を、生物装着型記録計や衛星発信機を利用して記録する。平成16年度は、新しく開発した測器を用いたウミガメの行動追跡手法の確立を中心に研究を進めた。ウミガメ類の海中での行動を三次元で理解するために、地磁気加速度記録計を開発した。平成16年5月からタイ国シミラン諸島で野外調査を実施して、産卵期中のアオウミガメ雌成体に記録計を装着することに成功した。得られたデータから、アオウミガメの方位・姿勢を算出することで、アオウミガメの海中での行動を3次元で再現することに成功した。結果は、Proceedings of 4th SEASTAR2000 Workshopに掲載された。今後の展望として、アオウミガメの潜水行動には様々なパターンがみられるが、方位・姿勢データから各潜水パターンが有する役割を理解できると予想された。ウミガメ類の回遊行動を高精度で追跡するために、GPSアルゴス発信機を開発した。極軌道衛星を利用した位置測位システム(アルゴスシステム)は、動物の行動を追跡する手法として広く利用されている。しかし、測位データは100-4000mの誤差を持っているため、小さなスケールで動物の行動パターンを理解することができない。そこで、高精度で位置情報を取得できる全地球測位システム(GPS)に着目し、GPS受信機を搭載したアルゴス送信機(GPSアルゴス)を開発した。飼育条件下と自然条件下で実証実験を行い、タイマイおよびアオウミガメの行動を高精度で追跡することに成功した。得られた結果はZoologicalScienceに採録が決定している。本研究の目的は、ウミガメ類の行動と漁業を含む海洋環境との関係を正確に記述することでウミガメ類の混獲回避策を提案することである。モデルケースとして東南アジア海域に生息するアオウミガメChelonia mydasを対象とする。本研究では、目的を達成するための方法として、砂浜での産卵調査と、記録計や発信機を利用したバイオロギング手法による行動調査を行う。タイ国の主要なアオウミガメ産卵場であるフーヨン島において産卵調査を行った。調査の主な目的は、アオウミガメの繁殖季節性メカニズムについて理解することである。前肢付け根に金属標識とマイクロチップを装着することで個体識別を行った。通常、アオウミガメの産卵期は砂浜の砂中温度によって支配されているが、フーヨン島は温度が通年安定いるため通年産卵が見られる。このような温度制約から解放された個体が、何を指標として産卵期を決定しているかは明らかではない。本研究の標識調査により、個体の産卵期は温度制約から解放されても大きく変化しないことが明らかになり、個体の産卵期はカレンダーを指標にしていることが示唆された。この研究結果は、Journal of Zoologyに掲載受理された。フーヨン島で産卵するアオウミガメの海洋における潜水深度・経験水温をデータロガーを用いて記録した。アオウミガメのメス成体は、1シーズンに産卵を約5回繰り返す。産卵と次回産卵との間隔は約10日である。データロガーを装着したアオウミガメは、この期間の多くを20m以下の浅い潜水を繰り返していたが、時折50mを越える深い潜水も行うことが明らかになった。フーヨン島周辺海域の地形から、この期間中のアオウミガメはリーフエッジを生息場所としていることが示唆された。また、今後の課題として、加速度データロガーなどを利用して潜水行動の機能を解析する必要がでてきた。この結果は、Proceedings of International Symposium on SEASTAR2000 and Bio-logging Scienceに掲載された。

平成18年度は、アオウミガメの潜水データを取得するために、タイ国フーヨン島においてデータロガーを用いた野外調査を行った。18年度は雨季(5月から10月)の調査を中心に実施した。産卵上陸したアオウミガメの成体に加速度・水深・水温が記録できるデータロガーを装着して、産卵期間中の潜水データを得た。同時に、個体の産卵した1腹あたりの卵数、卵径、総産卵数を調べた。研究の成果は、平成18年12月にタイ国バンコクで行われたSEASTAR2000・アジアバイオロギングシンポジウムにて口頭発表した。また平成19年3月末に開催された、平成19年度日本水産学会大会にてポスター発表を行った。
動脈硬化巣平滑筋細胞におけるLDL受容体類似モザイク蛋白LR11の機能解明

本研究の目的は、動脈硬化におけるLDLR遺伝子ファミリーLR11の受容体機能を明らかにすることである。LR11蛋白を高発現した血管平滑筋細胞を樹立するために、LR11cDNAと血管平滑筋A7r5細胞にトランスフェクションし、2種類の安定発現株の選択に成功した。本樹立株を用いて、血管平滑筋機能を検討した結果、ベクターのみトランスフェクションしたコントロール細胞に比べ、ボイデンチャンバー法による細胞遊走能とコラーゲンゲルをコートしたトランスウエルを用いた浸潤能が亢進していることが明らかになった。この機能亢進は、LR11機能を抑制する中和抗体、RAP(Receptor Association Protein)、アポ蛋白Eにより抑制された。これらの細胞はLR11蛋白の発現とともに、uPAR (urinary type plasminogen activator receptor)を高発現していることが明らかになり、その機能を抑制することにより亢進した細胞遊走および浸潤能は消失した。uPAR蛋白の代謝を検討した結果、LR11発現細胞において遅延していることが示され、これらの結果は、LR11がuPAR代謝を阻害することにより細胞外マトリックスに対するプラスミノーゲンによるプロテアーゼ作用を増強し、細胞遊走および浸潤を増大することを明らかにした。LR11過剰発現マウス作成のために、LR11cDNAを卵細胞に導入し、発育固体の樹立に成功した。アルブミンプロモーター制御における肝細胞でのLR11発現を確認した。このモデルマウスは、上記の成績と合わせ、動脈硬化修飾モデルとレて有用になると考えられる。これらの研究実績は当初の研究計画のほぼ100%に相当するものであり、その一部は、英文雑誌に発表された。本研究の目的は、第一に、我々が新たに同定したLDLR遺伝子ファミリーLR11の受容体機能について、発生工学による過剰発現モデルを作成し、本蛋白の機能解析とともにこれらの生物学的意義を解明し、動脈硬化の機序解明およびその治療法の開発のための新たな病態モデルを作成することにある。第二に、LR11の血管壁構築細胞である平滑筋の増殖および遊走における受容体機能を明らかにすることである。本年度、実験計画に沿い、LR11過剰発現マウス作成のために、LR11cDNAを卵細胞に導入するとともに、発育固体の選択段階に入っている。また、LR11特異抗体の作成のためにGST-LR11ドメインII蛋白の作成に成功し、モノクローナル抗体作成を行っている。さらに、ウイルスを用いた組織導入LR11cDNA構築のために、ウイルスベクターへのcDNA構築を行い、約7kbの断片の接合に成功し、ほぼ完了段階に入った。これらの研究実績は当初の研究計画のほぼ100%に相当するものであり、これらの実績をもとに、来年度モデル動物作成、組織発現検討および遺伝子修飾を予定している。これらの細胞はLR11蛋白の発現とともに、uPAR(urinary type plasminogen activator receptor)を高発現していることが明らかになり、その機能を抑制することにより亢進した細胞遊走および浸潤能は消失した。

uPAR蛋白の代謝を検討した結果、LR11発現細胞において遅延していることが示され、これらの結果は、LR11がuPAR代謝を阻害することにより細胞外マトリックスに対するプラスミノーゲンによるプロテアーゼ作用を増強し、細胞遊走および浸潤を増大することを明らかにした。LR11過剰発現マウス作成のために、LR11cDNAを卵細胞に導入し、発育個体の樹立に成功した。アルブミンプロモーター制御における肝細胞でのLR11発現を確認した。このモデルマウスは、上記の成績と合わせ、動脈硬化修飾モデルとして有用になると考えられる。これらの研究実績は当初の研究計画のほぼ100%に相当するものであり、その一部は、英文雑誌に発表された。
チームアプローチによる小児慢性疾患患者の自己管理教育・支援に関する研究

慢性疾患を持ちながら生活する小児とその家族を対象に、自己管理を支援するための方法論を開発し、疾病や病期、病状、発達段階に特徴的な小児と家族に対する支援モデルを示す事を目的に研究を展開した。活動の主体は1型糖尿病患者を対象とした研究の継続と、慢性疾患を持つ子どもの家族への支援である。特に、IT機器を用いた支援システムを新規導入し研究活動の基盤整備を実施した。1.1型糖尿病患者を対象にした研究の継続と研究成果の統合と発展(1)IT機器を用いた1型糖尿病患者の生活環境やライフイベントに対応した支援評価を、経時的に振り返り、効果的な支援内容の分析を行った。そして、思春期における自己管理支援には携帯電話によるe-SMBGが支援ツールとして有用であることを確認した。(2)糖尿病サマーキャンプでの自己管理支援方法やキャンプの有用性を検討し、キャンプ運営の基準を示した。(3)糖尿病療養指導に関する教育システムの構築を目的に、愛媛CDE活動について研修企画運営を担当し、その評価を実施した。(4)研究成果を統合し「1型糖尿病をもつ子どもと家族への支援」について、第9回日本糖尿病教育・看護学会学術集会で会長講演として報告した。2.疾患や障害をもつ子どもとその家族への支援事例の研究疾患や障害をもつ子どもの母親を対象に、母親の内的変化について質的研究手法を用いて分析し、母親が積極的な変容をきたす内的構造を示し、その支援方法を検討した。3.支援システムの新規導入と開発慢性疾患患者やその家族を支援する宿泊施設として設立されたファミリーハウスに、家族や自己管理支援のシステムとして、インターネットに接続可能なコンピューターシステムを導入し、相談事業や直接支援活動が実施できるように整備した。慢性疾患を持ちながら生活する小児とその家族を対象に、自己管理を支援するための方法論を開発し、疾病や病期、発達段階に特徴的な患児と家族に対する支援モデルを示すことを目的に研究を展開した。その活動の主体は1型糖尿病患者を対象とした研究の継続と、IT機器を看護活用するための基礎的な準備活動であった。1.1998年から継続しているテレビ電話を用いた1型糖尿病患者の支援を継続し、個々の事例の成長期(中学進学、高校進学、社会人としてのスタート)に注目して、血糖コントロール状態、患者とのIT機器を用いた交信内容、糖尿病サマーキャンプでのインタビューや活動状況をデータとして分析を進めている。IT機器の進歩によって、携帯電話、IP電話が活用できる環境に変化してきた。しかし、ケアや患者教育に活用するためには、通信費やシステムの更新などの対応がタイムリーには展開できないことが、研究を発展させ評価するための課題となっている。2.糖尿病サマーキャンプをフィールドとして、子ども達がキャンプで撮影した写真から視覚経験分析手法を用いて子どものキャンプに対する思いを検討し、さらに子どもへのインタビューを加え質的に分析した。その結果、キャンプには仲間やスタッフの人的交流・人的環境が重要であることを確認した。3.受験期に入院した小児への支援方法、年長の重度障害児を持つ母親の生活と負担度に関する調査、入院中の子どもに対する面会時間の延長に関する検討、子どもがNICUに入院中の母親へのインタビューなど、小児看護領域における研究の基礎となるテーマで、文献検討や予備調査的な研究活動を実施した。4.小児がん患者、重症新生児、低出生体重児とその家族を対象としたIT機器による支援システムの構築に関しては、対象となる施設との研究設備の設定について交渉中であり、機器設置の準備を進めた。活動の主体は1型糖尿病患者を対象とした研究の継続と、慢性疾患を持つ子どもの母親に対する支援事例の分析を実施した。

また、IT関係の機器を用いた支援システムを新規導入し研究活動の基盤整備を実施した。1.1型糖尿病患者を対象にした研究の継続と研究成果の統合と発展(1)IT機器を用いた1型糖尿病患者の生活環境やライフイベントに対応した支援評価を、経時的に振り返り、効果的な支援内容の分析を行った。特に、思春期にある2事例の支援では、携帯電話の活用によるe-SMBGが有用な支援ツールであることが示された。(2)過去の研究成果を統合し、小児期の1型糖尿病患者への自己管理教育・支援の専門性、支援モデルについて、第9回日本糖尿病教育・看護学会学術集会で会長講演として報告した。(3)1型糖尿病患者を対象に実施している糖尿病サマーキャンプでの実践活動や研究成果を統合し、キャンプ運営やキャンプにおける自己管理支援方法や支援モデルについて報告した。(4)糖尿病療養指導に関する教育システムの構築を目的に、愛媛CDE活動について研修企画運営を担当し、その評価を実施した。2.出生前診断で障害が存在する子どもを出産した母親、摂食障害を持つ子どもの母親を対象に、母親の内的変化について質的研究手法を用いて分析し、母親が積極的な変容をきたす内的構造を示し、その支援方法を検討した。3.支援システムの新規導入と開発慢性疾患患者やその家族を支援する宿泊施設として設立されたファミリーハウスに、家族や自己管理支援のシステムとして、インターネットに接続可能なコンピューターシステムを導入し、相談事業や直接支援活動が実施できるように整備した。
肺形成に関与するhai-1遺伝子の単離とその機能の解析

フォークヘッドドメインをもつ遺伝子ファミリーは多数存在し、それぞれが異なったコンパートメントの発生分化に関わっていることが期待されている。我々が新しくクローニングした遺伝子hai-1はそのファミリーの一員であり、肺にのみ分布していることから肺形成に重要な役割を果たしていることが期待される。まず、ノーザン解析の結果、hai-1遺伝子は肺にのみ発現していることが再確認できた。次に、インサイチュウハイブリ法により、肺内のhai-1 mRNAの分布をみてみると、細気管支上皮細胞とII型肺細胞に発現していることが明らかになった。このことは、hai-1が肺の系譜蛋白である可能性を示唆しているので、非常に興味深い事実である。hai-1蛋白の標準遺伝子についての検討では、サーファクタント蛋白B遺伝子のプロモーターに対するhai-1蛋白の効果を調べた。その結果、hai-1蛋白はそれ単独ではサーファクタント蛋白Bプロモーターに影響を与えないが、他のメンバーであるHNF-3αと共に作用して、サーファクタント蛋白Bプロモーターの転写を活性化することが判明した。肺内でのファミリー遺伝子間の共同作用を意味しているものとして興味深い。次に、マウス染色体hai-1遺伝子のクローニングをおこない、得られた13個のゲノミッククローンの解析の結果、マウス染色体hai-1遺伝子はイントロンを一つ持っており、イントロンはフォークヘッドドメインよりカルボキシル末端側であることも判明した。さらに、hai-1遺伝子の機能を知るため、現在ターゲティングベクターを作り、ノックアウトマウスを作製しようとしている。
遺伝子多型マーカーによる血管合併症の一次予防とその診断方の開発

血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)は、血中ではリポ蛋白と結合して存在しているが、日本人では約4%に家族性にPAF-AH活性が欠損していることが報告されている。今年度の研究では、PAF-AH活性の測定を行うと共に、酵素活性欠損の原因であるPAF-AHの遺伝子変異とリポ蛋白濃度、さらに血管障害との相関を検討した。島根難病研究所を脳ドックの目的で受診した症例について、無症候性脳梗塞の存在と血清中Lp(a)の測定と分子量フェノタイプの解析を行うとともに、DNAを抽出しアポ蛋自(a)<Apo(a)>遺伝子の上流部分にみられる遺伝子多型と血清Lp(a)濃度の相関、および、無症候性脳梗塞の発生との関連について検討を行った。Lp(a)濃度は低分子量フェノタイプをもつ症例において高くなる傾向があり、また、無症候性脳梗塞がみられる頻度も高くなる。その傾向は50-70歳の比較的若い年齢層において顕著となり、有意な差がみられた。大学病院に入院した有症候性の脳のラクナ梗塞の症例でも同様な解析を行い、比較検討を行ったところ、無症候性の場合と同様の傾向が認められた。現在、血中ホモシスチンの濃度と関連があるMethylenetetrahydorofolate reductase(MTHFR)遺伝子の多型とラクナ梗塞との相関の解析を行っている。さらに、トロンビン受容体とトロンボモジュリンの遺伝子についてもSSCP法を用いて遺伝子多型マーカーを検索し、トロンビン受容体遺伝子には5つのDimorphicmarkersとトロンボモジュリン遺伝子の4カ所の多型マーカーを見出した。これを用いて、冠動脈造影で50%以上の狭窄が認められた韓国人の症例について解析を行い、トロンボモジュリン遺伝子の5'上流に存在する-33G toA変異による遺伝子多型と冠動脈疾患の有無との間に相関があることを見いだした。さらに、脳梗塞の存在との関連について解析をすすめている。
日本の流通システムの理論的・実証的分析

本研究は、日本の流通システムについて、それを構成する関係企業の行動、企業相互間の連携関係を整合的に説明し得る理論的フレ-ムワ-クを構築し、(1)日本の流通システムの機能メカニズムを経済学的に理解すること、(2)国際的視野から見た特異性を明確に浮かび上がらせることを目的とする。従来、「事情」の「解説」に任されていた分野に、最近の経済理論を武器にして本格的に取り組み、研究メンバ-も、産業組織、企業行動の現実的側面に関心の深い研究者に限定せず企業理論に関心の深い研究者を加えた。研究を進める過程で、必要に応じて研究メンバ-の追加的な参加を求めたため、本研究の主たる成果である『日的の流通』(三輪・西村編、東京大学出版会)への参加者は当初よりの参加者の2倍以上に膨れ上がっている。各参加者が別途公表したものについては文献リストを参照されたいが、共同作業の主たる成果である『日本の流通』についてのみ紹介しておく。全編は13の研究論文と、2つの統括的なコメント論文で構成され、450頁に及ぶ。流通に関する全般的な見方を提示し、マクロデ-タを用いた分析結果収める「日本経済と流通」の部分には3つの論文が属する。「日本の流通の特微」について具体的に議論する5つの論文では、流通系列化、リベ-ト、参入障壁、多段階性と返品制、企業間取引関係などが個別の産業に焦点を合わて詳細に検討されている。「流通規制と政府活動」では、関連する規制全般について検討する論文と、大店法システムと農協についてそれぞれ検討する論文を収める。「流通と情報には物流と「情報化」についてそれぞれ論じた論文を収めている。この研究プロジェクトは、(1)緊密な連絡を保ちつつ独立した研究を平行して進め、同時に、(2)「日本の流通」に関する包括的な研究書をつくり今後の研究のさらなる進展のための礎をつくることを目指するものである。(2)の研究書の作成はこのプロジェクトの目的の一部にすぎない。各メンバ-の研究は、緊密な連絡を保ちつつも独立して行われるものであり、その一部を利用して(必要な部分を補い)研究書を作成するという方がプロジェクトの実態を正確に反映しているといえる。各メンバ-はそれぞれの研究テ-マについて研究を進め、その過程で情報収拾のために取材をし、連絡会議を開いた。研究書を作成する計画に関連する平成元年度の研究経過は次のとおりである。(イ)三輪、西村が中心となり、新飯田、後藤、倉澤、若杉、上田を加えた7人でプログラム・コミティ-を構成した。(ロ)昨年2月8日に東京大学でプロコミの会議を開き、本研究の柱となるべきいくつかの研究テ-マを確定した。(ハ)(ロ)の結論をもとに、論文執筆予定者に電話等で依頼をした。(ニ)昨年4月22日に東京でミ-ティングを開き、具体的な研究計画およびその内容について意見交換をした。(ホ)昨年9月2日3日に東京大学でミニ・コンファレンスを開催し、草稿を提出してそれをめぐって意見交換をした。同時に、計画の見直しを行った。(ヘ)現在は、平成2年3月30日4月1日のコンファレンスで報告する論文を作成している段階である。(研究書の出版予定は本年12月である。)進行途上であるから多くはないが、すでに、別掲のようなディスカッション・ペ-パ-が討論に供されている。本研究プロジェクトの最終年度である平成2年度は、4月上旬のコンファレンス(於御殿場)で始まり、そこで報告された論文を改訂し、発展させる作業を中心に展開された。中心的な成果は、平成3年2月に刊行された『日本の流通』(三輪・西村編、東京大学出版会)に結実している。

本研究は、日本の流通システムについて、それを構成する関係企業の行動、企業相互間の連携関係を整合的に説明し得る理論的フレ-ムワ-クを構築し、(1)日本の流通システムの機能メカニズムを経済学的に理解すること、(2)国際的視野から見た特異性を明確に浮かび上がらせることを目的とする。従来、「事情」の「解説」に任されていた分野に、最近の経済理論を武器にして本格的に取り組み、研究メンバ-も、産業組織、企業行動の現実的側面に関心の深い研究者に限定せず企業理論に関心の深い研究者を加えた。研究を進める過程で、必要に応じて研究メンバ-の追加的な参加を求めたため、『日本の流通』への参加者は当初よりの参加者の2倍以上に膨れ上がっている。共同作業の主たる成果である『日本の流通』は、全編は「日本経済と流通」「日本の流通の特徴」「流通規制と政府活動」「流通と情報」の4つの部分に分かれ、13の研究論文と、2つの総括的なコメント論文で構成され、450頁に及ぶ。研究参加メンバ-は当初計画以上の成果を挙げたと自負し、今後の研究の基礎としての役割を十分に果たし得る成果であると確信している。
多段階分化促進遺伝子発現と自動除去型ベクターの融合による高効率高純度分化誘導法

本研究では、高純度分化細胞の単離のために、分化誘導効率の向上と分化細胞選択の最適化の両方を、独自の自動除去型SeVdpベクターを用いて実現させる。誘導効率向上のためには、各分化段階特異的なmiRNAを利用して、ベクターからの遺伝子発現を分化段階に合わせてコントロールする。また分化細胞選択のために、目的分化細胞特異的に発現するmiRNAによって分化細胞からのみベクターが自動除去されるようにして、分化細胞のみを選択する。そして最終的に、ベクターを一度導入するのみで高効率高純度分化誘導を実現させる。
沈み込み境界における地温匂配の時間変化、及び高圧変成岩上昇のタイムスケール

1)四国三波川帯の瀬場地域はエクロジャイトナップの境界を含む地域であるが、報告者は、このナップ境界からナップ内部へ向かい、褶曲構造とガーネットの内部微細構造の変化を調査・記載した。その結果、ナップ境界がある変形段階(DA)において広域変形の核として振る舞ったことがわかった。これを踏まえ、広域変成作用における変形段階の推移が新たなナップの付加に付随して起こるという新モデルを提案した(Journal of Structural Geology誌に受理され、印刷中)。2)三波川帯の含エクロジャイト変はんれい岩の起源を知るため、瀬場変はんれい岩周辺の岩石を用いて主要・微量元素の全岩化学組成分析(XRFによる)を行った。その結果、従来マントルウェッジ起源と考えられていた同岩体の化学組成が、外縁部で周囲の堆積起源岩に近づいてゆく傾向が認識された。この事は同岩体の海洋底起源を支持し、従来の学説と相反する。その後の野外調査で得られた情報も併せ、報告者は含エクロジャイト変はんれい岩類の原岩は海洋底起源のオリストリスであるという結論に達した。この成果は2002年10月に大阪大学で行われた日本岩石鉱物鉱床学会で発表し、現在、Journal of Petrology誌に投稿中である。3)四国東部に産する高越エクロジャイトに対して相平衡岩石学的な解析を行い、沈み込み時の温度・圧力履歴を導出した。これまでに三波川変成岩から得られている沈み込み時の温度・圧力履歴とこの結果を併せる事で、高圧変成岩上昇期には沈み込み帯の温度構造が高温・低圧側に大きくシフトしている事が判明した。このような特異な温度構造を説明するため、沈み込み帯への海嶺の接近を組み込んだ熱モデル計算を構築、実施した結果、高圧変成岩の上昇が海嶺沈み込みの直前期に起こる事が示唆された。この成果は現在、投稿準備中である。
新規拡散係数測定装置の開発および生体分子反応ダイナミクスへの応用

本研究では生体分子の高次構造をよく反映する拡散係数という物理量に着目し、その時間分解検出法の開発を行った。ストップトフローシステムの開発を行い、過渡回折格子法と組み合わせることで様々なタンパク質の反応検出に適用可能なシステムを構築した。スリット状の溶液噴射を利用した拡散測定法も立ち上げたが、乱流の発生により観測したい自由拡散計数の安定な計測は達成できなかった。しかし上記システムを用いて、時計タンパク質の集合反応や光センサータンパク質の変性反応を時間分解で捉えることに成功した。拡散係数は分子の大きさや溶媒との相互作用に依存し、溶質分子の物性をよく反映する物理量である。蛋白質においてもその構造や会合状態の変化によって拡散係数が顕著に変化することが明らかになっており、蛋白質全体の動きを捉える上で有用な指標になりつつある。本研究では拡散係数測定に有効な光誘起過渡回折格子法を発展させ、簡便で精度が高く、また光励起を要しない測定手法の開発を行っている。さらにこの技術を独自に開発するストップトフローシステムと組み合わせることで、従来は困難であった光反応性を持たない蛋白質の反応検出を目指している。本年度は上記目標を達成するため、新規なストップトフロー装置の開発を主に行った。既存のシステム(RX2000)はサンプル消費量が多く(120マイクロリットル)、貴重な蛋白質試料の測定には不向きであったため、第一にサンプル消費量の低減を目指した。また蛋白質反応を実時間でモニターするために、時間分解能の向上も同時に行った。具体的にはTジャンクション型マイクロ流路を混合場として用い、流路径を小さくすることで一度の混合に必要なサンプル消費量を2マイクロリットル以下に抑えることを達成した。しかし、一般にマイクロ流路中の流体は層流状態になりやすく二液の混合は起こりづらい。そこでコンプレッサーとプランジャポンプを併用し高圧力で送液を行った結果、乱流が生じ混合効率が飛躍的に高まることをハイスピードカメラによる撮影で確認した。送液のON/OFFは1ミリ秒以下のデッドタイムで開閉可能な高速バルブによって制御しており、全てを一つのコンピュータで制御できる再現性の高いシステムを構築した。さらに混合セル内に設けた測定窓を用いて吸収・蛍光測定を行い、システムの装置応答関数や混合速度の見積もりを行った。これまでに混合後1ミリ秒程度の時定数で起こる化学反応を捉える事に成功している。一年目の計画通り、ストップトフロー装置の開発を達成した。一度の測定に必要なサンプル消費量は2マイクロリットルであり、これは当初の目標を大きく上回っている。またハイスピードカメラにより混合過程を動画撮影し、ミキシングポイントから測定窓までサンプルが移動する時間は140マイクロ秒であることがわかった。またその間に混合がほぼ完了していることも確認できており、従来装置の性能を大きく上回るシステムの開発に成功した。また混合バルブやストップバルブの開閉タイミングを細かく制御することで、少量試料のミキシングであっても混合比を一定に保つことを達成した。以上から当初予定していたよりも質の高いシステムが開発できたため、計画以上に進展したと評価する。本年度は前年度に立ち上げたストップトフロー装置を用いて蛋白質の反応研究に取り組んだ。測定には過渡回折格子(TG)法を用いたが、光反応性の無いタンパク質からTG信号を得るためには、光反応性の分子でタンパク質をラベルする必要がある。そのために本研究ではフォトクロミックな性質を持つスピロピランを用いた。スピロピランの光可逆的な吸収スペクトル変化を利用することで、屈折率変化を誘起し、TG信号を得ることができると期待したためである。実際に様々なタンパク質をラベルして測定した結果、S/N比の高い信号を得ることに成功し、高い精度で拡散係数を決定できた。例えばシアノバクテリア由来の時計タンパク質KaiCをラベルして測定したところ、分子量から予想される拡散係数と良く一致する結果が得られた。またKaiCはATP存在下では六量体として安定に存在する一方、ATP非存在下では単量体になる。それぞれの条件でTG法を用いて拡散係数を測定したところ、明確な差が観測され、会合状態の違いに敏感な測定法であることを確認した。次にストップトフローとTG法を組み合わせることで、高速混合によって引き起こされる分子間反応の時間分解検出に取り組んだ。具体的にはKaiC単量体とATPを高速混合し、その後の反応を拡散係数変化として時間分解検出することを試みた。その結果、混合後の遅延時間を長くしていくと拡散係数が減少する様子が観測され、六量体を形成する過程を捉えた結果となった。KaiC単量体が不安定であるため、解析可能なデータの採取には至っていないが、今後条件を改良することで、複合体形成ダイナミクスの詳細を明らかにする予定である。ストップトフロー装置の開発に成功し、サンプル消費量や時間分解能など当初の想定を上回るスペックを達成した。また高速混合により引き起こされるタンパク質反応を時間分解で検出することに成功し、本装置の応用性を示すことができた。一方で、スリット孔からの溶液噴射を用いた拡散係数測定は再現性が乏しい。噴射後に乱流が発生してしまい、拡散係数の正確な決定が困難なためである。そこで本研究では拡散係数測定に有効な光誘起過渡回折格子法を発展させることを目指した。

そのためにストップトフローシステムを独自に開発し、過渡回折格子法と組み合わせることで従来は困難であった光反応性を持たない蛋白質の反応検出を行った。新規に立ち上げたストップトフローシステムは、サンプル消費量、デッドタイム、混合効率など従来システムを上回る性能を有することを確認した。これを用いて、まず光センサータンパク質の変性ダイナミクスを捉え、さらに光反応性のない時計タンパク質の集合反応ダイナミクスを調べた。結果、変性により機能を失う過程を光反応性の消失として捉えることに初めて成功し、また時計タンパク質KaiCの6量体形成反応を時間分解で捉えることにも成功した。こうした分子構造変化や離合集散反応はタンパク質機能に重要な反応であり、今後様々な系に適用可能なシステムの開発に成功した。さらに多孔スリットから縞状の蛋白質溶液噴射を溶媒中で行い、これによって形成される過渡的な回折格子の消滅過程(蛋白質分子の拡散過程)を回折光強度の時間変化として検出することも試みた。しかし、回折光は検出されたものの、噴射に伴う乱流を完全に抑えることが出来ず、再現性の高い測定は困難であった。流体シミュレーションを基に、噴射速度やスリットのデザインの調整も行ったが、得られる拡散係数が文献値と大きく異なり、自由拡散を捉えることはできなかった。本研究では生体分子の高次構造をよく反映する拡散係数という物理量に着目し、その時間分解検出法の開発を行った。ストップトフローシステムの開発を行い、過渡回折格子法と組み合わせることで様々なタンパク質の反応検出に適用可能なシステムを構築した。スリット状の溶液噴射を利用した拡散測定法も立ち上げたが、乱流の発生により観測したい自由拡散計数の安定な計測は達成できなかった。しかし上記システムを用いて、時計タンパク質の集合反応や光センサータンパク質の変性反応を時間分解で捉えることに成功した。今後は多孔スリットから縞状の蛋白質溶液噴射を溶媒中で行い、これによって形成される過渡的な回折格子の消滅過程(蛋白質分子の拡散過程)を回折光強度の時間変化として検出するという独自の手法開発を行う。既にテスト実験は始めており、格子状スリットから溶液を噴射した結果、回折光は得られるものの再現性の良いデータ採取には至っていない。これは恐らく噴射に伴う乱流の発生が原因であるため、流体シミュレーションを用いて乱流を抑えるべく最適な噴射速度・スリット幅を検討する予定である。その後、実験でシミュレーション結果を検証し、適切な系が明らかになり次第様々な分子の拡散係数測定に着手する。引き続きKaiCタンパク質の六量体形成ダイナミクスの解明に取り組む。単量体を安定化する条件を検討し、S/N比の高いデータの取得を達成する。他にも立ち上げたシステムをフォールディング反応や酵素反応など様々な系に適用し、その分子機構の理解に努める。一方で、格子状の溶液噴射による拡散測定を実現するために、流体シミュレーションを取り入れた条件検討を行い、スリット孔デザインや噴射速度の最適化を達成する。
炎症誘導性の細胞死に着目した、慢性炎症性疾患の病態の解明と治療法の開発

近年、アポトーシス以外の細胞死の存在に注目が集まっており、これらが周囲の細胞に様々なシグナルを発信して、炎症、免疫応答、線維化、修復、再生といった細胞死後の生体応答をコントロールしている可能性が明らかになってきている。パイロトーシスはカスパーゼ1依存性であり、ネクローシス様に細胞が破裂する細胞死である。細胞死直後にインターロイキン1βやインターロイキン18といった炎症性サイトカインを放出するため、炎症誘導性の細胞死といわれている。本研究は、周囲組織に炎症を惹起する壊死性細胞死として、主にパイロトーシスに着目し、これが炎症の持続と促進に関与していると考え、研究をおこなっている。まずはパイロトーシスの生体内での動的解析を目的として、光プローブの作成をおこなった。パイロトーシスはプロテアーゼであるカスパーゼ1により切断され、活性化したガスダーミンDが、細胞膜を破壊することにより細胞死を実行する。そこで、カスパーゼ1の活性化を検出するために、不活性化した環状のルシフェラーゼの間にカスパーゼ1の特異的基質配列を挟み込んだ光プローブを作製した。この光プローブのカスパーゼ1特異的基質部位が切断されるとルシフェラーゼが活性化フォームにもどり活性化する仕組みを利用して、生体内でのカスパーゼ1の活性化を動的かつ経時的に解析できる検出系の確立を現在目指している。さらに、カスパーゼ1の活性化により誘引される生体内での分子生物学的変化をウェスタンブロット法やPCR法などを用いて解析した。具体的には、肝細胞株を用いて、CRSPR法や脂肪酸投与によるカスパーゼ1の活性化をおこなっているところである。また、ガスダーミンDの活性化およびインターロイキン1β放出を誘引する因子について探索中である。カスパーゼ1活性化の検出を目的に、不活性化した環状のルシフェラーゼの間にカスパーゼ1の特異的基質配列を挟み込んだ光プローブのデザインと作製は完了した。現在、マウス肝細胞、マクロファージ(肝Kupffer細胞を想定して)への導入を試みている(リポフェクション、エレクトロポレーション法など)が、十分なS/N比が得られていないため、プローブのデザインなどの改善を試みている。同時に、カスパーゼ11がパイロトーシスに関与している可能性が出てきたため、この光プローブのデザインと作製中である。肝細胞株に光プローブを導入し、生体内でのカスパーゼ1またはカスパーゼ11の活性化を動的かつ経時的に解析できる検出系を確立する。その後、NASHなどの肝炎症性疾患において予想される肝細胞病態の解析を、光プローブを用いておこなう。マウスの肝臓実質細胞に光プローブを導入し、これをパルミチン酸やリポポリサッカライドなどで刺激することにより、脂肪蓄積、炎症を誘導し、パイロトーシスの発生の有無を同一細胞で動的かつ経時的に観察する。これにより、パイロトーシスが関与している可能性がある病態を推定する。また、パイロトーシスと他の制御された細胞死(ネクロプトーシス、アポトーシスなど)との比較検討を行い、これらの細胞死の各種病態における役割を解析する。つぎに、得られた結果をもとに、その関与がもっとも考えられる病態をもつマウス疾患モデル(NASHモデル、各種肝炎モデルなど)を作製する。具体的には、肝細胞株を用いて、CRSPR法によるカスパーゼ1の活性化をおこなっているところである。また、ガスダーミンDの活性化を誘引する因子について探索中である。現在、マウス肝細胞、マクロファージ(肝Kupffer細胞を想定して)への導入を試みている(リポフェクション、エレクトロポレーション法など)。十分なS/N比が得られていないため、プローブのデザインなどの改善を試みている。

同時に、ガスダーミンDをマーカーとしたパイロトーシスの評価法の検討を進めている。近年、アポトーシス以外の細胞死の存在に注目が集まっており、これらが周囲の細胞に様々なシグナルを発信して、炎症、免疫応答、線維化、修復、再生といった細胞死後の生体応答をコントロールしている可能性が明らかになってきている。パイロトーシスはカスパーゼ1依存性であり、ネクローシス様に細胞が破裂する細胞死である。細胞死直後にインターロイキン1βやインターロイキン18といった炎症性サイトカインを放出するため、炎症誘導性の細胞死といわれている。本研究は、周囲組織に炎症を惹起する壊死性細胞死として、主にパイロトーシスに着目し、これが炎症の持続と促進に関与していると考え、研究をおこなっている。まずはパイロトーシスの生体内での動的解析を目的として、光プローブの作成をおこなった。パイロトーシスはプロテアーゼであるカスパーゼ1により切断され、活性化したガスダーミンDが、細胞膜を破壊することにより細胞死を実行する。そこで、カスパーゼ1の活性化を検出するために、不活性化した環状のルシフェラーゼの間にカスパーゼ1の特異的基質配列を挟み込んだ光プローブを作製した。この光プローブのカスパーゼ1特異的基質部位が切断されるとルシフェラーゼが活性化フォームにもどり活性化する仕組みを利用して、生体内でのカスパーゼ1の活性化を動的かつ経時的に解析できる検出系の確立を現在目指している。さらに、カスパーゼ1の活性化により誘引される生体内での分子生物学的変化をウェスタンブロット法やPCR法などを用いて解析した。具体的には、肝細胞株を用いて、CRSPR法や脂肪酸投与によるカスパーゼ1の活性化をおこなっているところである。また、ガスダーミンDの活性化およびインターロイキン1β放出を誘引する因子について探索中である。カスパーゼ1活性化の検出を目的に、不活性化した環状のルシフェラーゼの間にカスパーゼ1の特異的基質配列を挟み込んだ光プローブのデザインと作製は完了した。現在、マウス肝細胞、マクロファージ(肝Kupffer細胞を想定して)への導入を試みている(リポフェクション、エレクトロポレーション法など)が、十分なS/N比が得られていないため、プローブのデザインなどの改善を試みている。同時に、カスパーゼ11がパイロトーシスに関与している可能性が出てきたため、この光プローブのデザインと作製中である。肝細胞株に光プローブを導入し、生体内でのカスパーゼ1の活性化を動的かつ経時的に解析できる検出系を確立する。その後、NASHなどの肝炎症性疾患において予想される肝細胞病態の解析を、光プローブを用いておこなう。マウスの肝臓実質細胞に光プローブを導入し、これをパルミチン酸やリポポリサッカライドなどで刺激することにより、脂肪蓄積、炎症を誘導し、パイロトーシスの発生の有無を同一細胞で動的かつ経時的に観察する。これにより、パイロトーシスが関与している可能性がある病態を推定する。また、パイロトーシスと他の制御された細胞死(ネクロプトーシス、アポトーシスなど)との比較検討を行い、これらの細胞死の各種病態における役割を解析する。
ヒト歯髄幹細胞による細胞シートを用いた再生医療の実現に向けた基礎的研究

本研究は、再生医療において歯髄幹細胞による細胞シートを用いた臨床応用の実現を目的とした。ヒト歯髄幹細胞を長期間培養することにより細胞シートの作製法を開発した。ヒト歯髄幹細胞シートは骨関連マーカーの発現をしていた。このシートをマウス骨欠損部位に移植すると骨形成を誘導した。次に、ヒト歯髄幹細胞を軟骨誘導培地にて培養することにより軟骨細胞シートを作製した。この細胞シートは軟骨関連マーカーを発現し、マウス皮下に移植したところ、分解されることなく、軟骨の性質が維持されていた。これらの結果からヒト歯髄幹細胞により作製した細胞シートは骨および軟骨再生に有用であることが示された。本研究は、歯髄幹細胞による細胞シートを用いた臨床応用の実現を目的としている。本年度においては、前年度に歯髄幹細胞による細胞シートを作製し、さらに骨分化誘導培地にて培養することにより骨基質タンパク質を含む細胞シートの作製が可能であることを確認した。本年度では、まず、この骨誘導により作製した細胞シートを免疫不全マウスの頭蓋骨欠損部に移植し、骨再生の可能性について検討を行った。予想していた結果に反して、骨誘導を行った細胞シートでは骨再生は認められず、誘導せずに作製した細胞シートにて骨再生が認められた。しかし、再生骨の厚さは正常骨に比較して薄いものであった。今後、さらに正常骨に近い形状に再生する方法を検討する必要がある。この結果については、3rd TERMIS World Congress 2012 “Tissue Engineering and Regenerative Medicine"にて結果を発表するとともに現在投稿中である。次に、軟骨および神経細胞シートの作製を検討した。歯髄幹細胞より軟骨および神経分化に関連する培養液にて培養することにより細胞シートを作製した。軟骨細胞シートはアルシアンブルー染色に陽性を示し、RT-PCR法にて軟骨に特異的なマーカーであるType II collagen, sox 9の発現を示した。神経細胞シートでは、免疫染色にて神経のマーカーであるNeurofilamentの発現を確認し、RT-PCR法においてもNeurofilament、NSE(neuron specific enolase)の発現を認めた。これらの結果から、軟骨および神経細胞シートが軟骨、神経の再生への有用性が示唆された。次年度においては、これらの軟骨、神経細胞シートを動物モデルに移植して、組織再生の可能性を検討する予定である。本研究では、医療廃棄物となる抜去歯の歯髄幹細胞により作製した細胞シートを再生医療に応用することを目的とする。これまで、20歳から30歳までの患者30名の抜去智歯より歯髄幹細胞を分離・培養を行い、幹細胞の性質があることを確認した。また、この細胞が、神経、骨、軟骨に分化することを確認し、凍結保存しても細胞の性質に変化がないことも確認した。まず、歯髄幹細胞から骨組織再生のための細胞シートを作製し、動物実験にて骨再生の可能性を証明した。次に、軟骨組織再生のために軟骨細胞シートを作製し、その特性について検討した。その結果、歯髄幹細胞から作製した軟骨細胞シートは軟骨関連タンパクを発現し、遺伝子発現においてもType II collagen、Aggrecan、SOX 9の発現を認めた(第23回日本口腔内科学会にて発表)。本年度では、まず、軟骨細胞シートが生体内でどのような挙動を示すか検討するために、免疫不全マウスの皮下に移植して観察した。移植後6週では、軟骨細胞シートは白色弾性軟の組織を形成し、これを組織学的に検討すると、アルシアンブルー染色に陽性で免疫組織化学的手法により軟骨関連タンパクの発現を示した。このことから、生体内においても軟骨細胞シートは軟骨の性質を維持していることが示された(第13回日本再生医療学会総会にて発表)。さらに、この細胞シートをマウス膝関節の軟骨欠損部に移植して欠損部の再生能について検討した。移植後6週では、移植した細胞シートは皮下移植実験と同様に軟骨関連タンパクの発現を示し、軟骨の性質を維持していたが隣接軟骨のように肥大軟骨層の形成までは認められなかった。今後の研究により、肥大軟骨層の再生が可能となるように検討を行う予定である。本研究は、再生医療において歯髄幹細胞による細胞シートを用いた臨床応用の実現を目的としています。歯髄幹細胞の多分化能と長期間培養により細胞シートが形成されることを利用して、細胞の足場(Scaffold)を必要としない歯髄幹細胞による再生医療の実現に向けて、歯髄幹細胞の特性を詳細に検討し、歯髄幹細胞の分化誘導法および移植に適した細胞シートの作製法を確立することを目的としています。患者より抜歯した智歯よりヒト歯髄幹細胞を分離培養し、歯髄幹細胞の特性について検討した。