hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キク科ブラキスコ-ム属の染色体進化と分子進化

昨年オ-ストラリアの共同研究者が採集・送付してくれた新たな10種の材料についても上記の方法でデ-タを出し、系統樹を作成する予定である。細胞学的および細胞遺伝学的成果は、一昨年の採集で持ち帰った固定標本、23種153個体の染色体数を調査し、5種で初めて染色体数(n=3、1種、n=4、3種、n=6、1種)を決定し、2種で新しい細胞型を見つけた。11種で、初めて詳細な核型を分析し、3種で詳細な細胞地理学的情報を得た。このデ-タは論文にまとめの投稿中である。19組合せで種間交雑を行ない種子を得た。分析の終了したBrachyscome goniocarpa(n=4)×__B.dichromosomatica(n=2)のデ-タは論文にまとめ投稿中である。タンパク質レベルの変異から系統樹を作成する目的で、デンプンゲル電気泳動による酵素多型の予備的調査も行なったが、種間の違いが大きすぎてバンド間の対応がつかず、系統樹作成にはあまり有効な情報が得られないことが明らかになった。ブラキスコ-ム属29種および種複成体145集団の染色体数を算定した。6種で初めての染色体数を、2種で新しい細胞型を、2種で新たにB染色体を報告した。体細胞分裂中期の核型を30分類群で、前中期の核型を25分類群で分析した。半数染色体全長で、2倍の違いがある2群を識別できる。それぞれが単系統であるか否かは、今後の検討課題である。この2群間では、染色体サイズが2倍も異なるにもかかわらず、容易にF_1雑種が得られる。この雑種では染色体凝縮が非同調的で、一方の親から由来した大型染色体は、全長に渡って早期凝縮がおきた。染色体凝縮のパタ-ンが異なる雑種でも、組合せによっては、高いゲノム間の親和性を示した。2群のそれぞれについて、染色体数はn=9から2まで変化しているにもかかわらず、半数染色体全長は一定で、ほとんど変化はみられなかった。核型の異同に基づいて、いくつかの分類群の整理が可能であった。染色体の腕比の変化は、本属の進化傾向と特別な関係を見い出せなかった。葉緑体DNAのRFLP解析は、19分類群を12種類の制限酵素で切断し、アガロ-ス電気泳動法により、DNA断片長変異のデ-タを得た。17個の共有派生的突然変異を検出し、ノコンギク属を外群として最大節約法で系統樹を作成した。半数染色体異数系列の中で、n=3が4より由来した例を除き、むしろn=5、6、9(一部)の染色体数はn=4から由来したことが示唆された。これらのデ-タは、1)ブラキスコ-ム属ではn=9から急激にn=4までの減少がおこり、減少過程の分類群は絶滅している。2)n=4レベルで、多数の種を分化させる二次的種分化がおきた。3)現存するn=5、6、7、8、9(一部)をもつ種は、染色体数が増加する過程で生じた可能性が高い.等を示唆しており、本属の染色体進化が予想をこえて、はるかにダイナミックにおきて、いることが明らかになった。
新規薬剤設計に基づく高感度アポトーシスイメージング剤の開発

本研究では、抗がん剤や放射線治療後の早期の治療効果判定を可能とするために、治療後に起こるアポトーシスを高感度に検出可能な新規イメージング剤の開発を目指して研究を行った。アポトーシスに伴い細胞表面に現れるホスファチジルセリンに親和性を有する低分子ペプチド「LIKKPF」を母体化合物とし、安定性を考慮してアミノ酸をD体に置換したfpkkil-NH2を設計・合成した。fpkkil-NH2はホスファチジルセリンに対する親和性を保持しており、また生体内の安定性も高かった。以上より、fpkkil-NH2を母体とする放射性薬剤はアポトーシスイメージング薬剤として有用である可能性が示された。本研究の目的は、「抗がん剤や放射線治療後の早期治療効果判定を可能とする高感度アポトーシスイメージング剤の開発」である。アポトーシスに伴い細胞表面に現れるホスファチジルセリンに親和性を有する低分子ペプチドを標的分子認識素子として選択し、放射性核種としては汎用性に優れたテクネチウム-99m(Tc-99m)を用いる。本研究では、新たな薬剤設計として、1標的分子認識素子(ペプチド)を複数有することで多価効果により親和性を向上、299mTc錯体とペプチドとの間にリンカーを挿入することで体内動態を制御、という2つの戦略を用いることで、既存のタンパク質を母体とする薬剤よりも高感度にアポトーシスを検出可能な新規イメージング剤の開発を目指しており、本年度はイメージング剤に用いるのに適当な1価配位子の選定を目標として研究を行った。最適な1価配位子の選定が本研究課題が成功するかどうかの重要な要因であることから、様々な1価配位子を設計・合成し、評価する必要がある。1価配位子に用いるペプチドとしては当初の計画通り6残基のペプチド「LIKKPF」を選定した。リンカーとしては当初はβアラニンを想定していたが、Tc-99m錯体の形成反応の進みやすさおよび錯体の安定性を考慮して、短いユニットのエチレングリコール鎖やγアミノ酪酸(GABA)を有する1価配位子の合成も試みた。また1価配位子とホスファチジルセリンの親和性を検討することができる細胞を用いた評価系の確立も合わせて行った。アポトーシスに伴い細胞表面に現れるホスファチジルセリンに対して親和性を有する低分子ペプチドを標的分子認識素子として選択し、放射性核種としては汎用性に優れたテクネチウム-99m(Tc-99m)を用いる。本研究では、新たな薬剤設計として、1標的分子認識素子であるペプチドを複数有することで多価効果により親和性を向上、299mTc錯体とペプチドとの間にリンカーを挿入することで体内動態を制御、という2つの戦略を用いることで、既存のタンパク質を母体とする薬剤よりも高感度にアポトーシスを検出することが可能な新規イメージング剤を目指している。本年度は、昨年度に引き続き配位子の合成と標識薬剤の合成を行った。ホスファチジルセリンに対して親和性を有する6残基のペプチド「LIKKPF」にリンカーとしてγアミノ酪酸を結合して、末端をTc-99mとの配位が可能なイソニトリルにした、1価配位子を作製することに成功した。続いて様々な条件下で標識実験を行ったが、標識体を得ることが困難であった。そこで、ペプチドを含まないモデル化合物を作製し、Tc-99m標識検討を行ったところ、6個の配位子が結合した6価錯体を作製することができた。また、アポトーシス細胞を検出するための対照化合物として、ホスファチジルセリンに結合するタンパク質、アネキシンVを蛍光標識した化合物を作製し、インビトロにおけるアッセイ系の構築を行った。アポトーシスに伴い細胞表面に現れるホスファチジルセリンに親和性を有する低分子ペプチドを標的分子認識素子として選択し、放射性核種としては汎用性に優れたテクネチウム-99m(99mTc)を用いる。新たな薬剤設計として、1標的分子認識素子(ペプチド)を複数有することで多価効果により親和性を向上、299mTc錯体とペプチドとの間にリンカーを挿入することで体内動態を制御、という2つの戦略を用いることで、既存のタンパク質を母体とする薬剤よりもアポトーシスを高感度に検出可能な新規イメージング剤の開発を目指して研究を行った。ペプチドとしてはホスファチジルセリンに親和性を有する6残基のペプチド「LIKKPF」を選択して、多価99mTc標識体の作製を試みたが、ペプチドがリジン残基を含んでいるため、99mTc錯体の作製が困難であった。そこで、他のモデルペプチドを用いた99mTc多価ペプチドの作製を試みたところ、6価ペプチドを安定的に作製する方法を確立することができた。一方、LIKKPFはL体アミノ酸からなるため、生体内で不安定であることが報告されている。そこですべてをD体にして、アミノ酸配列を逆にした「fpkkil」ペプチドを作製し、ホスファチジルセリンに対する親和性を検討したところ、L体ペプチドLIKKPFと同様の親和性を有していることを確認した。

本研究では、抗がん剤や放射線治療後の早期の治療効果判定を可能とするために、治療後に起こるアポトーシスを高感度に検出可能な新規イメージング剤の開発を目指して研究を行った。アポトーシスに伴い細胞表面に現れるホスファチジルセリンに親和性を有する低分子ペプチド「LIKKPF」を母体化合物とし、安定性を考慮してアミノ酸をD体に置換したfpkkil-NH2を設計・合成した。fpkkil-NH2はホスファチジルセリンに対する親和性を保持しており、また生体内の安定性も高かった。以上より、fpkkil-NH2を母体とする放射性薬剤はアポトーシスイメージング薬剤として有用である可能性が示された。目標とする1価配位子の合成が想定以上に難しく、合成段階での時間がかかっているため、様々な評価を行い1価配位子の選定をするところまでは至っていない。一方でホスファチジルセリンとの親和性を検討することが可能な細胞を用いた評価系についてはおよそ確立することができた。Tc-99m標識体の作製方法についてさらに精査すると共に、比較的容易に多価標識体を作製可能な、キレート剤を導入した多価化合物の作製も行い、ガリウム-67または銅-64で標識を行う事で、アポトーシスイメージング剤としての有用性検討に進む予定である。放射性医薬品学今後は、引き続き1価配位子の設計と合成を行い、色々な1価配位子を得る予定である。その後Tc-99m標識を行い、インビトロおよびインビボにおける評価を行うことで、優れた1価配位子を選出する。続いて、選定された1価配位子で標識したイメージング剤のアポトーシス検出能を既存の薬剤と比較検討を行う予定である。年度中に、もう一度、分担研究者との研究打ち合わせを行う予定であったが、予定が合わず実施できなかったため。次年度に研究打ち合わせ旅費として使用する予定である。
小骨固定・骨移植・骨再生・エンテーシス再建のためのチタンペーパーの開発

チタン繊維を素材とし、常温で圧縮荷重とせん断荷重を同時に付加し、繊維形状を残したまま板状に成形させたチタンペーパーは、骨と同等の弾性率と、骨形成に適している多孔性構造をもつ。このチタンペーパーに、骨髄間葉系幹細胞から分化させた骨芽細胞を複合し、ラットの骨欠損部に留置すると、従来のチタンプレートを用いるより高い骨組織修復能を示すことを明らかにした。長期間骨と密着して使用することが可能で、更に骨修復を促進することができるチタンプレートの用途は広く、骨折治療や骨再生医療など、今後ますます増加する骨疾患の臨床に大きく貢献することが期待できる。チタン繊維に圧縮荷重とせん断荷重を同時に負荷させることでチタンペーパーを試作した。アスペクト比(繊維の直径と長さの比)を変えた3種類のチタンペーパーについて、1.細胞培養実験、2.in vivoの骨再生試験、3.骨欠損修復実験、4.骨折治癒実験、5.エンテーシス再建実験などを行い、最適なチタンペーパーを決定した。これらの研究によって、新規チタンペーパーの整形外科治療における以下の5つの用途の有用性と、それぞれに適切なチタンペーパーの性状を探究する。1粉砕骨折や指骨等の骨折で、微小な骨片を母床の骨に固定する。2骨欠損修復において、チップ状の骨や海綿骨の移植、顆粒状ハイドロキシアパタイトの充填した欠損部をカバーする。3in vivoの骨再生医療において、多孔性足場材として骨形成タンパク(BMP)を複合し、必要部位に添付する。4in vitroの骨再生医療において、チタンペーパー上で骨形成細胞を増殖した新しい細胞シートを開発し、骨再生部位に移植する。5外傷や人工関節手術などで必要となるエンテーシス(腱と骨の付着部)の再建において、チタンペーパーでオーバーラップして縫合することにより、腱と骨の組織が入り込み結合を誘導する。本研究で検証するチタンペーパーの5つの用途は、全て現在の整形外科治療における重要な課題を解決する。1粉砕骨折や2骨欠損修復への応用は実現性が高く、早期に整形外科手術への導入が期待できる。3in vivoの骨再生医療は現在一般臨床に普及していないが、本研究により高い有効性を認められれば、その普及に貢献する。4in vitroの骨再生医療は新規性が高く、再生医療のイノベーションを生み出す可能性がある。5エンテーシス再建は整形外科の多分野における古くからの課題であり、チタンペーパーにより強固な結合が実現すれば、大きな意義がある。以下に実施した5項目の進捗状況を記載する。1.細胞培養実験:MC3T3-E1細胞をチタンペーパー上とチタン圧延材上で培養し、細胞増殖と細胞形態の観察を行った。AlamarBlue法を用いて蛍光強度を測定して比較し、両群で細胞増殖能に差は認めなかった。細胞形態観察評価として細胞核をヘキストで染色して蛍光顕微鏡で観察を行った。両群の細胞形態に異常は認められなかった。2.in vivoの骨再生試験:チタンペーパーにrhBMP-2を添加し、マウス背筋筋膜下に埋植して3週後の異所骨形成をマイクロCT,組織標本で評価した。骨形成体積および総骨質量は、チタン圧延材群とチタンペーパー群でほぼ同等であった。両群共に骨組織標本で異所性骨形成を認めた。3.骨欠損修復実験:ラット大腿骨から骨髄細胞を採取し、間葉系幹細胞を初代培養した後にrhBMP-2で骨芽細胞へ分化誘導した。チタンペーパー上に蛍光染色した骨芽細胞を播種し、蛍光顕微鏡で細胞接着を観察した後、ラット頭蓋骨欠損部に移植した。コントロールとして、細胞を播種しないサンプルを移植し比較した。骨芽細胞を接着させていない群では、埋植8週後組織標本で明らかな同所性骨形成を認めなかった。細胞を接着させ移植した群の骨組織像の評価は現在進行中である。4.骨折治癒実験:ラット大腿骨骨折モデルを作製してチタンペーパーによる骨固定を試みた。骨折部の再現性を得られるような骨折固定モデルの作製に難渋した。現在非荷重骨であるラットの頭蓋骨での粉砕骨折モデルにつき検討中である。5.エンテーシス再建実験:ラット踵骨剥離骨折モデルを作製中である。以上の様に、平成27年度計画を実施し、平成28年度計画を前倒して開始している。アスペクト比(繊維の直径と長さの比)25のチタンペーパーについて、1.細胞培養実験、2.in vivoの異所性骨再生試験、3.骨欠損修復実験、4.骨折治癒実験を行い、チタン骨再生用足場材の有用性に関して検討を行った。これらの研究によって、新規チタンペーパーの整形外科治療における以下の4つの用途の有用性を探究した。1、in vitroでチタンペーパー上でのマウス骨芽細胞(MC3T3-E1)の細胞接着能と増殖能、ラット骨髄間葉系細胞での細胞接着能と接着遺伝子を評価し、従来のチタン圧延材と比較して細胞に対する影響を検討する。2、in vivoの骨再生医療において、多孔性足場材として骨形成タンパク(BMP)をチタンペーパーに複合し必要部位に添付する。3、チタンペーパー上で骨形成細胞を増殖し、骨再生部位に移植して骨欠損部を修復する。4、粉砕骨折や指骨等の骨折における微小な骨片を、チタンペーパーを用いて母床の骨に固定する。これらのチタンペーパーの用途は、全て現在の整形外科治療における重要な課題を解決する。

in vitroでの骨再生に対する足場材を用いた骨再生研究は新規性が高く、再生医療のイノベーションを生み出す可能性がある。in vivoの骨再生医療は現在一般臨床に普及していないが、本研究により高い有効性が認められれば、その普及に貢献する。粉砕骨折や骨欠損修復への応用は実現性が高く、早期に整形外科手術への導入が期待できる。1.細胞培養実験:MC3T3-E1細胞をチタンペーパー上とチタン圧延材上で培養した。両群で細胞形態に異常は認めず、細胞増殖能にも差は認めなかった。骨髄間葉系幹細胞をラット大腿骨より採取して、培養した細胞をrhBMP-2で分化させて両群に播種した。共焦点レーザー顕微鏡像及び電子顕微鏡像で、両群共に細胞の形態異常は認めなかった。細胞接着遺伝子では両群間に発現遺伝子の違いを認めた。2.異所性骨再生試験:チタンペーパーとチタン圧延材にrhBMP-2を添加し、マウス背筋筋膜下に埋植して3週後の異所骨形成を評価した。骨形成体積および総骨質量は、両群でほぼ同等であった。両群ともプレートを取り囲むように異所性骨形成を認め、チタンペーパーでは繊維間の内部にも骨組織の形成が認められた。3.骨欠損修復実験:ラット大腿骨から骨髄細胞を採取し、間葉系幹細胞を初代培養した後にrhBMP-2を用いて培養して骨芽細胞へ分化誘導した。骨芽細胞をチタンペーパーとチタン圧延材に播種後、ラット頭蓋骨欠損部に埋植した。8週後の組織像では、チタン圧延材ではインプラント表面よりも骨膜に沿った骨組織修復を認めたのに対し、チタンペーパーはインプラントに接触した修復を認めた。インプラントと再生骨組織の接触率において、チタンペーパーはチタン圧延材に比べて有意に高かった。4.骨折治癒実験:ウサギの尺骨骨幹部中央に微小骨片を作製した。この微小骨片に対して長方形のチタンペーパーを圧着させて、ミニスクリュー2本を用いて尺骨に固定した。コントロール群は同様の粉砕骨片を作製して、固定を行わなかった。4週後に単純レントゲン像及びCT像を用いて評価した。コントロール群は骨修復が不十分で骨の連続性がない部分が認められたが、チタンペーパーで固定した群は充分な骨修復を認め全周性に骨癒合していた。チタン繊維に圧縮荷重とせん断荷重を同時に負荷させることでチタンペーパーを試作した。アスペクト比(繊維の直径と長さの比)25のチタンペーパーについて、1.細胞培養実験、2.異所性骨再生試験、3.骨欠損修復実験、4.骨折治癒実験を行い、チタンペーパーを用いた骨疾患治療の有用性に関する検討を行った。1では、骨芽細胞の接着性が良好であることを示した。2では、BMPを付加して筋肉内に埋入すると異所性に骨を形成した。3では、優れた骨誘導能により骨欠損を修復することを明らかにした。4では、骨折治療プレートとしてのモデルケースを示した。以上の研究から、チタンペーパーを骨再生医療や骨折治療材料に用いると、チタンの織り成す3次元構造と機械的特性により優れた骨形成・修復能を示すため、骨疾患治療に極めて有用であることが判明した。本研究で検証したチタンペーパーの用途は、現在の整形外科治療における重要な課題を解決する。
薬物動態解析と代謝酵素活性分析による安全かつ効果的な小児造血細胞移植術の確立

我々はCY心毒性の機序解明を目指した研究において、CY代謝物の1つであるacroleinがCY心毒性の主因であることを明らかにした。CYの代謝にはAldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1)が関与しており、ALDH1を介した代謝では細胞毒性の低いCarboxyethylphosphamide mustard (CEPM)の産生が増強する。一方でacroleinが産生する経路はALDH1を介さないことからacrolein産生におけるALDH1の働きは重要であると考えた。ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞をCYに曝露し、産生するacroleinの濃度を測定した。またCY曝露後2時間及び24時間のGSH濃度を測定した。HepG2はCYP2B6をほとんど発現していないため、CYがCYP2B6に代謝されて生じる4-hydroxycyclophosphamide (HCY)をCYの代わりに用いた。HCY曝露濃度依存的にacroleinは産生し、その産生量は曝露後1時間で最大値を示し24時間後には1/8に減少した。またHCY曝露後2時間でHCY曝露群とControl群(HCY曝露なし)のGSH濃度に有意な差は見られなかったものの24時間後にはHCY曝露群でGSHの有意な減少が見られた。続いてHepG2細胞のALDH1遺伝子をknock down (KD)した状態で同様の実験を行ったところKDの有無でHCY曝露によるacrolein産生量及びGSH濃度に有意な差は見られなかった。このことからBUやCYの致死的副作用発現機序においてacroleinの産生系よりacroleinの消去系がより重要であることが示唆された。造血幹細胞移植成績の向上に伴い、移植時の副作用の軽減や移植後の晩期合併症予防の観点から、busulfan(BU)・cyclophosphamide (CY)を含む移植前処置の安全性は重要な課題になっている。BUとCYは共通してGlutathione S-transferases (GST)という酵素の触媒反応を受けGlutathione (GSH)抱合という代謝を受ける薬剤である。今回、GST活性、GSH濃度を測定し、血中薬物・代謝産物の動態との関係を明らかにすることを目的とした。まずはin vitroの実験系で、マウス心筋細胞へCY代謝物の一つであるhydroxycyclophosphamide(HCY)、acroleinを曝露し、GSH濃度をELISA法で測定した。するとマウス心筋細胞内のGSH濃度は低下した。しかし、GSHの前駆物質であるN-acetylcysteine(NAC)を前処理して曝露するとGSH濃度は上昇し、HCY、acroleinによるGSHの減少を抑制し、かつ心筋細胞障害までも抑制することを見出した。次にin vivoの実験を行った。6週齢のメスのC57BL/6JマウスにNAC前処理した群ならびに生食投与群を作り、その後CYを腹腔内投与し、CYならびにCY代謝物のHCY、carboxyethylphosphoramide mustard(CEPM)の濃度をLC/MS/MS法で、肝臓のGSH濃度を測定した。その結果、GSH濃度はNAC濃度依存的に増加し、CY投与群で減少することが判明した。また、我々の測定系でマウスのHCY、CEPMの血中濃度測定も行うことができ、その薬物動態も解析することができた。HCYならびにCEPMの薬物動態(AUC:薬物血中濃度ー時間曲線下面積)はNAC投与群、非投与群では大きな差は認められなかった。in vitroの実験で、CY代謝物曝露とNAC投与によるGSH濃度に与える影響を検討したところ、予想通りCY代謝物曝露でマウス心筋細胞内のGSH濃度が低下し、NAC投与でGSH濃度が上昇し心筋障害を抑制することができた。これは、本研究のテーマであるアルキル化薬の副作用にGSHが重要な役割を果たしている可能性を示唆させた。in vivoの実験でもNAC投与により、GSH濃度がNACの濃度依存性にあがることも確認できた。in vitroの実験系で、NAC前処理によりCY代謝物曝露の心筋細胞障害を抑制することを証明しており、in vivoでもNAC投与によるCY心筋障害などの毒性の予防の可能性が期待できる。また、当初マウスでのCY代謝物測定が、検体量の問題で困難が予想されたが、今年度測定し、薬物動態を解析できることが確かめられた。臨床検体は今年度BUを前処置として用いた造血幹細胞移植が1症例、CYを用いた移植が4症例あり、全ての症例で研究参加の同意を得ることができ、血液を採取することができた。BU/CY/CY代謝物濃度の測定は行なうことができているが、GSH濃度測定やGST活性測定は検体数をもう少し集積してまとめて測定する予定である。以上より、今後予定している実験の大部分が少なくとも実現可能なことを確認でき、臨床研究だけでなくin vivoの実験系も確立できそうである。臨床検体の集積もできているので、初年度としてはおおむね順調に進展していると評価した。造血幹細胞移植の移植前処置で使用されるアルキル化薬、Busulfan (BU)とCyclophosphamide (CY)について、遺伝子多型だけでは予測できない薬物動態を、Glutathione S-transferase活性、Glutathione (GSH)濃度と血中薬物、代謝物濃度の観点から致死的副作用発現との関係を解析し、小児患者で薬物代謝能力に応じた安全かつ効果的な至適投与方法を確立することを目的とした。

最も難航を予想していたマウス尾静脈から採血したごく微量の血液でCYの代謝物濃度を測定することができた。またacroleinの産生に関与していると考えられているマウスALDH1A1遺伝子のノックダウンが、きちんと再現性を持って行うことができるようになった。あとは、この方法を用いてALDH1A1遺伝子のみならず他のGST遺伝子あるいはGSH産生に関与するCTH遺伝子ノックダウンマウスを作成し血中薬物・代謝物濃度の測定を行えばよいため、概ね順調に進展していると判断した。我々はCY心毒性の機序解明を目指した研究において、CY代謝物の1つであるacroleinがCY心毒性の主因であることを明らかにした。CYの代謝にはAldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1)が関与しており、ALDH1を介した代謝では細胞毒性の低いCarboxyethylphosphamide mustard (CEPM)の産生が増強する。一方でacroleinが産生する経路はALDH1を介さないことからacrolein産生におけるALDH1の働きは重要であると考えた。ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞をCYに曝露し、産生するacroleinの濃度を測定した。またCY曝露後2時間及び24時間のGSH濃度を測定した。HepG2はCYP2B6をほとんど発現していないため、CYがCYP2B6に代謝されて生じる4-hydroxycyclophosphamide (HCY)をCYの代わりに用いた。HCY曝露濃度依存的にacroleinは産生し、その産生量は曝露後1時間で最大値を示し24時間後には1/8に減少した。またHCY曝露後2時間でHCY曝露群とControl群(HCY曝露なし)のGSH濃度に有意な差は見られなかったものの24時間後にはHCY曝露群でGSHの有意な減少が見られた。続いてHepG2細胞のALDH1遺伝子をknock down (KD)した状態で同様の実験を行ったところKDの有無でHCY曝露によるacrolein産生量及びGSH濃度に有意な差は見られなかった。このことからBUやCYの致死的副作用発現機序においてacroleinの産生系よりacroleinの消去系がより重要であることが示唆された。今後は、まずはマウスでのCY投与下、NAC前処理併用下でのGST活性(血液、肝臓)を行ない、GST活性の測定を確立する。また、今年度in vivoで測定できなかったacroleinの測定を行い、acroleinの動態をNAC前処理ありの時となしの時で比較していく。また、CY投与群、NAC前処理ありCY投与群での心筋細胞の病理学的差の検討も行っていく。いずれの条件下のGSH濃度も肝臓だけでなく心筋細胞や血液での測定を計画している。BUにおいても、同様にBU投与群、NAC前処理併用群、それぞれのGSH濃度(血液、肝臓、心臓)、GST活性(血液、肝臓)、BU血中濃度を測定する。その後、CY群とのGSH濃度、GST活性の比較を行う。最終的には、BUとCYを連続して投与を行い、GSH濃度(血液、肝臓、心臓)、GST活性(血液、肝臓)を測定する。BUとCYの投与順変更の影響も検討する。
小型脳活動測定装置による長期的視点取得判断促進への感情戦略の検討

本研究では、誇り、および、ねたみ感情の喚起操作が長期的視点を取る判断を行うための促進法として有効か、判断傾向と判断時の脳の前頭前野の活性化状況から実験的に検討した。被験者に、誇り、および、ねたみ感情の喚起操作を行い、仮想事態での判断課題を遂行させ、小型脳活動測定装置を用いて、課題遂行中の前頭前野の反応を同時に測定した。その結果、長期的視点取得判断のためには、誇り感情よりもむしろねたみ感情の喚起操作のほうが、貢献しうる可能性が示唆された。短期的視点で自己利益を追求し長期的に多大な損失を被ったり利益を得られない後悔を招く結果を回避し、長期的視点により結果的に利益を享受し満足感や幸福感を増大させうる長期的視点取得判断の促進は、個人にとっても社会にとっても重要なことである。この点を踏まえ、本研究は、判断における長期的視点取得の促進法としての嫌悪系・ネガティブ感情、および、報酬系・ポジティブ感情喚起操作の有効性を検討することを目的とした。この目的の達成のため、小型脳活動測定装置による脳内反応を測定する判断の実験研究を実施した。具体的には、仮想事態でねたみと誇り感情の喚起操作を行い、その操作の長期的視点取得促進法としての有効性について、各操作の下での判断傾向と前頭葉部脳活動の活性化状態を検討した。誇り喚起条件では、自己が長期的視点を取得して成功した経験をした後、再び長期的視点の取得が必要な事態で判断を行った。ねたみ喚起条件では、社会的比較が最もなされやすい他者が長期的視点を取得して成功した後、再び自己も長期的視点取得が必要な判断を行った。小型脳活動測定装置によって前頭前野の活動を同時に測定した。結果は、ねたみ喚起条件のほうが長期的視点を取得した判断をする傾向がみられ、また前頭前野の活動との関連の可能性もみられ、長期的視点の必要な判断を行う場合、感情要因も影響している可能性、特に他者が長期的視点を取得した判断によって成功した場合に生じるねたみ感情の経験が、その後の自己の判断事態で長期的視点の取得を促す可能性が示唆された。従って、他者存在を顕在化させ、ねたみ感情等の社会的比較と関係するネガティブ感情を喚起させることが、長期的視点取得の促進法のひとつとして有効である可能性が示された。
高温高強度のための新しい形状記憶合金の研究

形状記憶合金は、21世紀の人類にとって有用な材料の一つとして注目を集めている。しかし、そのうちで最も高性能とされるチタン・ニッケル合金でさえ、100°C以上の温度では性能が劣化してしまって使用できない。本研究では、β相CuーAlーNi合金にMn、ならびにTiをそれぞれ適量添加することによって、合金の熱間加工性と熱安定性を改良し、最高使用温度を200°Cまで高めることに成功した。これにより、形状記憶合金材料の自動車産業・電気産業などへの応用開発が進むことが期待される。加えて、新素材分野での日欧共同研究の具体的な例として各国研究者の注目を集め、わが国の国際学術研究投資への熱意を示すうえでも、一定の貢献があったと思われる。一般に、β相CuーAlーNi系形状記憶合金は熱間・冷間ともに加工性がきわめて悪く、同類のβ相CuーZnーAl系形状記憶合金にくらべ、その実用性ははるかに低いとされている。けれども、CuーAlーNi系合金は、強度、熱安定性、耐食性などの点では、CuーZnーAl系合金より、はるかにすぐれれているという特徴がある。加工性の改良に成功しさえすれば、将来、実用化の見込みは充分にあるものと考えられる。このような見地から、本研究では、合金のAl含有量を通常の約14%から約12%にまで減少させた。これにより、従来のβ相CuーAlーNi系合金で、熱間加工中にしばしば直面した、きわめて脆い析出物γ_2相の発生とそれにともなうインゴットの破壊などの欠点を除去し、合金の熱間加工性を大幅に改善することが出来た。同時に、このようなAl含有量の減少はマルテンサイト変態温度の上昇をもたらし、その結果、形状記憶動作温度を、従来の約40°Cから、125°Cまで高めることができた。これにともなって、本合金の最高使用温度は飛躍的に上昇する結果となった、強度については、CuーAlーNi系形状記憶合金は、元来、CuーZnーAl系形状記憶合金に比べてはるかに高い強度を持つことが知られているが、本合金の場合、引張強さは約100kg/mm^2にも達する高い値が得られた。本合金の標準組成として、11.88%Al、5.06%Ni、2.01%Mn、1.01%Ti、rest Cuを決定することが出来た。この合金のマルテンサイト変態温度は、上述のとおり約125°Cであった。この合金は最高使用温度が、従来の合金とくらべてはるかに高く出来る特徴があった。たとえば、200°Cに於ける長時間時効にともなうマルテンサイト変態温度の挙動を比較すると、この合金は同じ変態温度を持つCuーZnーAl系合金の数倍以上の長時間にわたり変態温度が一定不変で、その後の変動幅も、はるかに少ないことなどが判明した。現在のところ本合金の実用化には、なお検討の余地がある。問題点としては、主として冷間加工性の悪さが挙げられる。その改善は容易なことではないが、なおいくつかの有効な材料学的手法による改善策が残されていると思われ、その成否が今後の開発の鍵を握るものと期待される。形状記憶合金は, 21世紀に向けてとくに有望な金属材料の一つとして,世界の注目を集めている.けれども,そのうち最も高性能・高信頼をうたわれるチタン・ニッケル合金材料でさえ,現在のところ100°C以上の温度では性能が劣化してしまって使用に耐えない.本研究は,このような形状記憶合金の最高使用温度を200°Cまで高め,そのうえ高い強度と優れた記憶特性を兼ね備えた新しい合金材料を,ベルギー・カトリック・ルーバン大学と共同で研究開発しようとするものである.CuーAlーNiーTiーMn合金の溶製と板材への圧延加工は, (株)神戸製鋼所に依頼した.その際,研究分担者・亀井清が目標合金組成と溶解作業方法を検討のうえ,これを指導した.溶解規模は150kgで,加工後には厚さ1.1mm,幅200mm,長さ320mmの板材となったもの18枚(総重量約9kg)を入手し,試料とした.その平均組成は, 11.8%Al,5.07%Ni,1.01%Ti,2.01%Mn,残部Cuで,形状記憶動作のめあすとなるマルテンサイト変態温度はMs=126°C,Mf=105°C,As=125°C,Af=139,材料の引張り強さはσ.ナ_<B.ニ>=84kg/mm^2,破断伸びδ=5.2%(10°Cのとき)のものが得られた.杉本孝一・赤松勝也は, 6月に試料3kgを携えてカトリック・ルーバン大学へ出向き, 3名の外国人研究分担者らと討議を重ね,今後の研究の進め方を打ち合わせた.その際,予想される材料のノーハウをめぐる無用な粉争を防止する目的で,互いに研究協定を結ぶことを約束し,数日の協議を経てその原案を作成し,帰国した.この原案は,引き続き双方で修正を重ねたうえ, 10月には双方がこれに調印した.

今後,先端技術分野での国際共同研究においては,この種の協定の締結が両国間研究者の相互理解と,大学院学生を含む多数の研究協力者達の協力態勢の強化のためにきわめて重要なことを痛感した.10月にはフンベク講師を本学に招へいし,合金の熱的安定性に関してこれまでに実施した予備実験のデータを示して,互いに意見を述べ討議を重ねた.また, 3月中にはアーノート教授を本学に招へいし,溶製した合金鋳塊の加工方法の検討を行う.また,研究分担者中村康彦・杉本隆史らは,本合金の恒温変態線図の作成,ならびに形状記憶特性予備試験などを実施し一定の成果を得た.来年度以降も,上記と同様の試験研究を続行して,本合金の強度と動作温度のいっそうの特性向上をはかる研究を行う予定である.形状記憶合金は、21世紀の人類にとって有用な材料の一つとして注目を集めている。しかし、そのうちで最も高性能とされるチタン・ニッケル合金でさえ、100°C以上の温度では性能が劣化してしまって使用できない。本研究では、β相CuーAlーNi合金にMn、ならびにTiをそれぞれ適量添加することによって、合金の熱間加工性と熱安定性を改良し、最高使用温度を200°Cまで高めることに成功した。これにより、形状記憶合金材料の自動車産業・電気産業などへの応用開発が進むことが期待される。加えて、新素材分野での日欧共同研究の具体的な例として各国研究者の注目を集め、わが国の国際学術研究投資への熱意を示すうえでも、一定の貢献があったと思われる。一般に、β相CuーAlーNi系形状記憶合金は熱間・冷間ともに加工性がきわめて悪く、同類のβ相CuーZnーAl系形状記憶合金にくらべ、その実用性ははるかに低いとされている。けれども、CuーAlーNi系合金は、強度、熱安定性、耐食性などの点では、CuーZnーAl系合金より、はるかにすぐれれているという特徴がある。加工性の改良に成功しさえすれば、将来、実用化の見込みは充分にあるものと考えられる。このような見地から、本研究では、合金のAl含有量を通常の約14%から約12%にまで減少させた。これにより、従来のβ相CuーAlーNi系合金で、熱間加工中にしばしば直面した、きわめて脆い析出物γ_2相の発生とそれにともなうインゴットの破壊などの欠点を除去し、合金の熱間加工性を大幅に改善することが出来た。同時に、このようなAl含有量の減少はマルテンサイト変態温度の上昇をもたらし、その結果、形状記憶動作温度を、従来の約40°Cから、125°Cまで高めることができた。これにともなって、本合金の最高使用温度は飛躍的に上昇する結果となった、強度については、CuーAlーNi系形状記憶合金は、元来、CuーZnーAl系形状記憶合金に比べてはるかに高い強度を持つことが知られているが、本合金の場合、引張強さは約100kg/mm^2にも達する高い値が得られた。本合金の標準組成として、11.88%Al、5.06%Ni、2.01%Mn、1.01%Ti、rest Cuを決定することが出来た。この合金のマルテンサイト変態温度は、上述のとおり約125°Cであった。この合金は最高使用温度が、従来の合金とくらべてはるかに高く出来る特徴があった。たとえば、200°Cに於ける長時間時効にともなうマルテンサイト変態温度の挙動を比較すると、この合金は同じ変態温度を持つCuーZnーAl系合金の数倍以上の長時間にわたり変態温度が一定不変で、その後の変動幅も、はるかに少ないことなどが判明した。現在のところ本合金の実用化には、なお検討の余地がある。問題点としては、主として冷間加工性の悪さが挙げられる。その改善は容易なことではないが、なおいくつかの有効な材料学的手法による改善策が残されていると思われ、その成否が今後の開発の鍵を握るものと期待される。
金属酸素活性種が関与する酵素反応の全原子計算

本研究では量子化学計算を用いて、金属酵素活性種が有する特殊な電子状態や反応性を解析した。特にQM/MM法を用いた計算から、酵素全体の影響を考慮したより現実に近い検討を行った。これらの成果により、これまで9報が学術論文誌に掲載された。また、国内外の学会で積極的に発表を行い高い評価を得た。ビタミンB12は十数種の酵素の補酵素として働く事が知られている。このうちジオールデヒドラターゼは、1,2-プロパンジオールの脱水反応を触媒する酵素である。本酵素による反応は、アデノシルコバラミン中のCo-C結合がホモリティックに開裂することにより始まる。これにより生じたアデノシルラジカルが基質の1位の炭素から水素を引き抜き、1,2-diol radicalが生成する。この後、水酸基の転移から1,1-diol radicalを経てアルデヒドと水分子に分解される。近年、Toraya、YasuokaらはジオールデヒドラターゼのX線構造解析を行い、基質1,2-プロパンジオールはアデノシルコバラミン中のCoから約11.7の距離にあるK+に配位していることを見出した。このX線構造に基づき、全原子(約13500原子)を含む現実モデルを構築し、QM/MM法を用いてこの反応の理論的解析を行った。我々はこの反応において重要なアミノ酸残基と考えられてきたHis143をAlaに置換したジオールデヒドラターゼ変異体His143Alaおよび、Glu170を置換したGlu170Gln、Glu170Ala、Glu170Ala/Glu221Alaの合計四つの変異体についてQM/MM計算によりその触媒機構を明らかにした。Glu170Gln変異体での水酸基転移の活性化エネルギーは17.4kcal/molとなり、野生型での活性化エネルギー13.6kcal/molに比べて、大きく上昇することが判明した。実験的にもこの変異体は野生型の1%以下の活性しかないことが知られており、この高い活性障壁が反応の進行を妨げていると予想される。これが変異体での反応性低下の直接的原因であることが判明した。ヘムや非ヘム鉄酵素による触媒反応において生成する反応性中間体は、生物無機化学や生化学の分野で熱心に研究されている。これらの研究を通じてヘム、非ヘムの鉄オキソ中間体は様々な炭化水素の酸化反応に対して重要な役割を果たすと考えられている。本年度は、Namらとの共同研究により、非ヘム鉄錯体(TPA)Fe(ClO_4を用いたオレフィンの酸化反応に関して実験とDFT計算の両面からその理論的解析を行った。アルキルペルオキソ錯体[(TPA)Fe^III-OOt-Bu]がエチレンを直接酸化する反応経路とO-O結合のラジカル的な開裂を経て生成したオキソ錯体が反応活性種となるふたつの反応経路についてそのエネルギー変化を解析した。構造最適化および振動解析には密度汎関数法のひとつであるB3LYIP法を用い、基底関数にはLACVP^*を用いた。全反応において電荷は+2とした。また多重度はO-O結合開裂過程では2重項、4重項、6重項、基質酸化過程では3重項、5重項をそれぞれ考慮した。また、第6配位子としてアセトニトリルとピリジンN-オキシドのふたつを用い、配位子の違いによる反応性変化を評価した。すべての計算においてJaguar 5.0のプログラムを用いた。基質としてエチレンを用いた。計算の結果、反応の初期段階であるO-O結合開裂の活性化エネルギーは24.5kcal/molであり、アルキルパーオキソ種が直接反応する場合の活性化エネルギー44.Okcal/molより低いことが判明した。このため、鉄オキソ種の生成が速やかに進行するものと予想される。つづくエチレンの酸化過程では、活性化エネルギーの高い第一段階目のC-O結合の生成が律速であることが示唆された。この反応経路はP450の反応と類似しており、実験結果も考慮すると非ヘムのアルキルペルオキソ鉄錯体もまた有用な酸化剤となりうると判明した。また、アルキルペルオキソ錯体の第6配位子がO-O結合の活性化に大きく影響を与えることを明らかにした。銅ヒドロペルオキソ種およびオキソ種は、ドーパミン-Bモノオキシゲナーゼ(DBM)をはじめとする酵素の活性中心に含まれ、重要な役割を担っていると考えられている。長年、単核銅の活性種は銅ヒドロペルオキソ種であるとされてきたが、QM/MM法を用いた理論的解析によって、DBMの活性点において銅オキソ種が最も高い反応性を有していることを明らかにした。また、銅ヒドロペルオキソ種のO-O結合が周辺タンパクによって活性化されるのであれば、銅オキソ種が活性種となり得ることが示唆された。しかし、この反応活性種を模した錯体は有用な触媒となることが期待されるものの、その反応性および反応機構の詳細は未だ解明されていない。

そこで、密度汎関数法に基づく解析により銅錯体(N4Py)Cu-OOHによるエチレンのエポキシ化反応の理論的解析を行うことを目的とし、ヒドロペルオキソ錯体が直接基質を酸化する反応経路と、O-O結合のラジカル的開裂を経て生成したオキソ錯体が基質を酸化する反応経路について、それぞれエネルギー変化の検討を行った。銅ヒドロペルオキソ種による反応では、エチレンの炭素が近位酸素と結合する経路1と、遠位酸素と結合する経路2のふたつの反応経路を考慮した。経路1の活性化エネルギーは26.3kcal/molであるが、経路2は39.7kcal/molと極めて高いため、経路1で反応が進むことが明らかとなった。中間体は1重項と3重項とで構造、エネルギー共に近いため、スピン反転が生じ得ると考えられる。反応系から中間体にかけては、エネルギーが低い3重項で反応が進行すると考えられる。一方、生成系は1重項状態が3重項よりも41.4kcal/mol安定であることから、中間体でスピン反転が起こり、中間体から生成系にかけては1重項で反応が進むことが明らかとなった。
In vivoスクリーニングによるB細胞リンパ腫関連がん遺伝子解析

本研究の全体構想は、B細胞リンパ腫形成に関わる遺伝子をcDNAライブラリーを用いたin vivoスクリーニングによって明らかにすることである。特に、多くの悪性リンパ腫において異常活性化が認められるNF-κBと協調的にリンパ腫形成に作用する遺伝子、シグナル伝達系を明らかにし、臨床応用可能な分子標的治療へ発展するための研究基盤を確立することを目的としている。この目的のために、B細胞性リンパ腫からcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーを恒常的活性化NFkBとともに正常B細胞に遺伝子導入し、マウスへの移植後の造腫瘍性を指標にcDNAライブラリーをスクリーニングしてリンパ腫発生に必須の遺伝子を同定して行く。この際に重要な点は、リンパ腫の正常対応細胞である末梢B細胞に恒常的活性化NFkBとともにcDNAライブラリーを導入することである。しかしながら現時点でこのことを可能にする有効な手段が報告されていない。そこで本年度は、末梢B細胞にレトロウイルスにより遺伝子を有効に導入する方法の開発に力点を置いた。研究代表者は、マウスの未分化プロB細胞にレトロウイルスで遺伝子導入する方法を確立しているので、この細胞をin vitroで末梢B細胞に分化させる方法を試みた。まず、CD40リガンドと液性因子BAFF,CXCL13を分泌するストローマ細胞を樹立した(3T3/CD40L/BAFF/CXCL13)。プロB細胞に遺伝子を導入し、同細胞を3T3/CD40L/BAFF/CXCL13と共培養し,さらに抗IgM抗体でB細胞受容体を刺激することによりIgG陽性の末梢B細胞に分化させることに成功した。Bcl6をプロB細胞に導入しておくと効率が上がった。以上より、末梢B細胞に任意の遺伝子を発現させる系が樹立できたので、今後はcDNAライブラリーの機能的スクリーニングに移行したい。
投下型高温熱量計の開発

本研究では,投下型熱量計を構成する(1)高温加熱炉,(2)試料容器,(3)試料投下装置,(4)断熱型水熱量計,の4つの基本部分に対して高温化の対策を施し,15001900Kの温度範囲で高精度の測定ができる高温型の投下型熱量計を試作,開発するとともに,高温用に開発された投下型熱量計の妥当性と適応性を検証した。本研究結果は次のように要約される。1)試料加熱炉として,良好な温度均一性を有し,また最高2000Kの高温まで使用できるランタンクロマイト発熱体を用いたケラマックス炉を設計,作製した。2)窒化ボロン製るつぼを内蔵した透明石英製の試料容器を開発し,1850Kの高温まで使用できることを確認した。3)圧搾空気を用いて試料の投下,引き上げを行わせる試料投下装置を作製した。試料が熱量計放熱室中に入ると落下速度は減速し静止する。これより試料容器の破損を防ぐことでき,同一試料,同一容器を用いた繰り返し実験が可能となった。4)熱量計本体として,断熱型水熱量計を採用した。熱量計は純水3.4kgを入れたガラス製のデュワー瓶,銅製放熱板が取り付けられている銅製の円筒形放熱室から構成されている。熱量計の水温変化は,白金抵抗温度計により0.001Kまで読み取られる。α-アルミナを用いて熱量計当量を測定した。本熱量計の熱量計当量は17.7kJ/Kと決定された。5)金の熱含量測定を行い,金の融体の熱含量および比熱を導出し,既存のデータとの整合性を調べ,高温用に改良,開発された本装置の妥当性を確認した。金属,酸化物,硫化物などの高温エンタルピーを測定することを目的として,5001700°Cまでの温度範囲で使用できる投下型熱量計の開発を試みた。試作された投下型熱量計の性能を下記に列記する。I.試料加熱装置(1)加熱炉はケラマックス発熱帯を用いていおり,試料を5001700°Cの温度範囲で,昇温,降温が可能であった。(2)加熱炉の均熱帯は,10001500°Cの温度範囲で10mmであった。(3)加熱炉にはガス導入部,排出部を備えており,試料系内の雰囲気を制御することが可能であった。II.断熱型水熱量計(1)熱量計当量は,約20kJ/Kを有した。(2)空調設備を有する部屋において,熱量計は水温変化が±0.001°C/min以内の断熱性能を示した。(3)試料放熱室はガス導入部,排出部を備えており,雰囲気を制御することが可能であった。III.試料投下装置(1)圧搾空気を用いた装置であり,スプライン軸およびケーブルシリンダーによる昇降が可能で,投下速度は0.50.6m/secの間で調節が可能である。(2)熱量計放熱室内では,機械的ショックを和らげるために,等加速度を減じるように空気量を調節できるようにした。本年度の研究結果は次のように要約される。

1)熱量計本体として,断熱型水熱量計を採用した。熱量計は純水3.4kgを入れたガラス製のデュワー瓶,銅製放熱板が取り付けられている銅製の円筒形放熱室から構成されている。熱量計の水温変化は,白金抵抗温度計により0.001Kまで読み取られる。α-アルミナを用いて熱量計当量を測定した。本熱量計の熱量計当量は17.7kJ/Kと決定された。2)金の熱含量測定を行い,金の融体の熱含量および比熱を導出し,既存のデータとの整合性を調べ,高温用に改良,開発された本装置の妥当性を確認した。3)半導体で興味のもたれるシリコンの比熱を7001750Kの温度範囲で測定し,得られた熱含量-温度の関係より,融点および融解熱が決定された。また固体領域の熱含量にShomate関数を適用して,また,融体領域の熱含量に対しては最小二乗法を適用して,比熱の温度式の導出を行った。
海洋発光生物の化学的研究

富山湾に棲息するホタルイカおよび発光ゴカイに対して、以下に示す化学的な検討を加えた。1.ホタルイカ(<Watasenia>___ー<scintillans>___ー)の発光様式について;ホタルイカは死後その発光を再現できないと言われてきた。われわれは、これまでにイカの発光器からWatasenia luciferin(WL)を単離し化学的条件下(DMSO)でその発光を再現させた。今回の実験では生物発光条件下での発光を検討した。その結果、発光器のMgCl_2溶液のホモジネ-トにATPを加えると死後の発光を再現させることができ、さらに発光が終息した液にWLを加えると再び強く発光した。そこで、このATP依存型のLーL反応の機構を明らかにするためにWLをluciferyl adenylateに誘導し、現在このものがLーL反応の基質であるか否かについて検討を加えつつある。2.発光ゴカイ(<Odontosyllis>___ー<undecimdonta>___ー)について;発光ゴカイは年間を通じて9月下旬から10月上旬にかけて日没1時間後約30分に限って繁殖のため海面に浮上してくる。この間雌は発光液を放出しながら雄を誘引する。われわれは、この興味深い生物リズムに関連するluciferinおよびoxyluciferinを純粋に単離し、oxyluciferinはbenzyl誘導体として結晶化させ、現在それぞれの構造を検討中である。一方、ゴカイのMeOH抽出物から11種類の6ーpropionyllumazine類を単離した。それらのうちの3種は6ーβーhydroxypropionyl側鎖のcyclic enolーphosphate構造を持つ誘導体であることがわかった。興味あることに、これらをゴカイの水浸液中室温で放置すると,それぞれ脱リン酸を伴って6ーpropionyllumazine誘導体に変換されることがわかった。また、今回新しく発見した新種のゴカイから、これまでのゴカイには存在しない6ーpropionyllumazineの2量体を単離することができた。富山湾などに棲息するホタルイカ(Watasenia sintillans)および発光ゴカイ(Odontosillis)の発光系に対して化学的検討を加えた。1.ホタルイカの発光様式についてホタルイカは、死後その発光を再現できないと言われて来た。われわれは、これまでにイカの発光器および肝臓から発光物質(Watasenia Luciferin)とその関連物質(Watasenia oxyLuciferin)を単離し、化学的条件下でその発光を再現させた。今回(昭和63年度)は生物学的条件下でホタルイカの死後の発光の再現とその発光様式の解明を試みた。その結果、新鮮なイカであれば発光器のMgCL_2溶液のホモジネートにATPを加えると死後の発光が再現でき、さらにその発光が終息した液に別に発光器から抽出した発光物質を加えると再び強く発光し、イカの生態時と同一波長(460nm)の発光を観測することができた。つぎに、この発光後の液を処理したところ、化学発光で得たW.axy Luciferinと同一の蛍光物質を単離することができた。この事実からホタルイカの発光はLuciferin-Luciferase反応(L-L反応)によることが立証でき、その発光様式はすでに明らかにした化学発光と同一機構で進んでいることがわかった。なお、この様な生物発光におけるATPおよびMg^<2+>の役割については現在検討中である。

2.発光ゴカイについてこの発光生物の採集は、当初10,000匹程度を目標としていたが、10月上旬から下旬にかけて、延べ218人による精力的な採集を行った結果、約34,000匹(1.23Kg、凍結乾燥重量149g)の材料を取得することができた。現在までに、このゴカイの発光はATP、Mg^<2+>を必要としない単純なL-L反応によるものであることを明らかにし、ついで3種の蛍光物質を単離、それぞれの構造と発光とのかゝわりを検討中である。1.ホタルイカの発光様式について前年度に明らかにしたホタルイカ生物発光におけるATP,Mg^<2+>の役割を調べるため、ホタルイカシフェリンのラクチム型AMPエ-テル体を合成し、ルシフェラ-ゼ活性(L-L反応)を調べたところ不活性であった。このことからホタルイカの発光様式はゲンジボタルのように活性AMPエステル体を基質とするものではないことがわかった。2.発光ゴカイについて発光ゴカイは年間を通じて9月下旬から10月下旬にかけて、日没1時間後、約30分に限って繁殖のため海面に浮上してくる。この間、雌は泳ぎながら発光液を海水中に放出して雄を誘引する。この発光の波長は509nmであった。つぎに、発光が終った海水を処理し、発光液と同一波長を示す螢光物質(オキシルフェリン)を単離した。一方、採集したゴカイの含水メタノ-ル抽出物からルシフェリンを純粋に単離することができた。このものは生物発光(L-L反応、この場合はATP,Mg^<2+>不要)あるいは化学発光(DMSO-t-BuOK)条件下で強く発光し、上記発光液と同様のオキシルシフェリンを与えた。さらに、ゴカイのメタノ-ル抽出液から6-プロピオニルルマジンを含む7種のルマジン誘導体を単離、それぞれの構造を明らかにし、現在それらと発光物質との関連性について検討を加えつつある。また、昨シ-ズン中に、富山湾にはこれまでと異なった新しい生物リズムを持つゴカイが棲息していることを確認することができ、現在、種の同定およびその発光系について化学的検討を加えつつある。富山湾に棲息するホタルイカおよび発光ゴカイに対して、以下に示す化学的検討を加えた。1.ホタルイカ(Watasenia scintillans)の発光様式について;ホタルイカ発光器から単離したWatasenia luciferin(WL)は、DMSO中では強く化学発光し、一方、発光器のMgCl_2溶液のホモジネ-ト中ではATP依存型のluciferinーluciferase(LーL)反応を示した。この反応における基質をゲンジボタルの場合と同様なluciferyl adenylate型化合物と考え、WLをluciferyl adenylateに誘導し、LーL反応に付したところ不活性であった。そこで今回はその発光条件を種々検討する一方、発光器におけるWLの存在状態を調べるため発光物質の単離を試みた。