hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞表面抗原を利用した下垂体前葉組織幹細胞の同定と単離、その分化誘導の探索

ラット下垂体前葉ではS100β陽性細胞の85%が幹細胞マーカーであるSOX2を発現する。本研究では、SOX2陽性を示すS100β陽性細胞が、細胞表面抗原であるCD9を発現することを組織学的手法及び分子生物学的手法により同定した。そして、CD9抗体とpluriBead&reg; CellSeparationkitを使うことで簡単にラット下垂体前葉からSOX2陽性かつS100β陽性細胞(SOX2/S100β陽性細胞)を単離することに成功した。そして単離した細胞がCXCR4やOCT4、CD24など種々の幹細胞マーカーの高い発現を示した。このSOX2/S100β陽性細胞を細胞外マトリクスの一種であるラミニンコート上でウシ胎児血清を含む培養液で培養すると、BMPシグナリングを介して、内皮細胞へ分化することを明らかにした。さらに、血管が過形成されるプロラクチノーマのモデル動物を作成し、その下垂体前葉においてSOX2/S100β陽性細胞が減少し、内皮細胞が増加したことから、生体内においてもSOX2/S100β陽性細胞が内皮細胞へと分化している可能性が示唆された。この結果は学会にて発表し、Scientific Reportsにアクセプトされた。現在単離したSOX2/S100β陽性細胞のホルモン産生細胞への分化誘導をin vitroの系で行っている。組織幹細胞はある程度の多分化能を持ち、発生過程や細胞死、損傷組織の再生において、新しい細胞を供給する役割を持つと考えられている。下垂体前葉は、5種類のホルモン産生細胞と、非ホルモン産生細胞であるS100βタンパク質陽性細胞(S100β陽性細胞)と、血管系の細胞から構成される。S100β陽性細胞はheterogeneityが高く、樹状細胞様のもの、アストラサイト様、上皮細胞様、そして、前葉組織幹細胞の可能性が示唆されてきた。申請者は、この幹細胞性のS100β陽性細胞がCD9という膜タンパク質を発現することを明らかにした。そしてCD9抗体と市販のキットを使用することで、幹細胞性のS100β陽性細胞の単離に成功した。そして単離した細胞は血管網様構造を形成すること、そのシグナル伝達はBMPであることを明らかにした。この結果は、すでに論文としてアクセプトされており、研究業績から鑑みても当初の計画通りに進展していると判断できる。下垂体前葉は、ホルモンの合成・分泌を行い、成長、生殖、代謝、行動など多くの生体機能の制御に関与している重要な内分泌器官である。申請者は、ラット下垂体前葉において幹細胞マーカーであるケモカインレセプターCXCR4とSOX2を発現する細胞は、細胞表面抗原CD9が発現することを見出した。本研究では、1)CD9陽性を示すS100β陽性細胞を組織学的手法及び分子生物学的手法により同定した。そして、CD9抗体とpluriBead Cell Separationkitを使うことで簡単にラット下垂体前葉からCD9/S100β/SOX2/CXCR4陽性細胞を高純度で単離することに成功した。
真菌感染に対するToll-like receptorを介したワクチン開発

近年、免疫担当細胞に存在するToll-like receptor(TLR)が、ウイルス、細菌、真菌の遺伝子や菌体成分を認識することによって、細胞が活性化され炎症性サイトカインやケモカインの分泌を誘導している、またTLRは、その認識するリガンドによって現在11種(ヒト)認められ、TLRファミリーが知られている。その遺伝子がマウスおよびヒトでクローニングされている。その中でTLR2はグラム陽性細菌のペプチドグリカンやリポタイコ酸、Treponema maltophilumの糖脂質、Leptospira interrogansのLPS、Saccharomyces cerevisiaeのザイモザンなどを認識し、TLR4はLPS、リポタイコ酸、真菌細胞壁を認識し、TLR9は細菌に特異的なCpGモチーフ含有の非メチル化DNAを認識することが知られている。そこで、犬および猫の自然免疫機構を解明するため、犬のTLR2、4、9遺伝子および猫のTLR4のクローニングを行い、さらに各組織におけるこれらTLRのmRNAの発現を検討した。クローニングしたのTLR2、4、9遺伝子のアミノ酸配列は既知の動物(ヒト、マウス、ウシ)の同じ番号のTLR遺伝子と、それぞれ高い相同性を示した。また猫のTLR4遺伝子のアミノ酸配列も既知の動物と高い相同性が認められた。この結果から、各動物のTLRは、同様の働きをしていると考えられた。犬の各組織におけるTLR2、4、9の発現をRT-PCRによって検討したところ各TLRは検討した様々な臓器で確認された。各TLRは各組織において免疫機構に重要な機能を果たしているものと考えられた。今後は、各TLRのTLR2遺伝子多型と易感染性との関連について検討各抗TLRモノクローナル抗体を作成して、各TLRの機能解析を行う予定である。既に最近のLPSを認識していると考えられるイヌのToll-like receptor (TLR)4の遺伝子配列を決定し、データベース上で公開するとともに、学術雑誌で発表している。一方TLR9は細菌特有の遺伝子であるCpG-DNAを認識することが報告されている。そこでイヌのTLR9のクローニングを行い、cDNAの全塩基配列を解析した。決定したイヌのTLR9の塩基配列は3419bpで、ウシ、ヒト、マウスの同遺伝子との相同性は、それぞれ84.3%、83.6%、76.3%であった。またイヌのTLR9遺伝子にコードされているアミノ酸配列は、1032アミノ酸残基で、ウシ、ヒト、マウスの同遺伝子とのアミノ酸配列の相同性は、それぞれ82,7%、81.4%、74.8%であった。さらに犬の正常組織における本遺伝子発現について、RT-PCRを用いて解析したところ、末梢血単核球、リンパ節、脾臓で発現が確認され、胃、肝臓、筋肉、心臓、腎臓、小腸、大腸、肺、皮膚、膀胱には発現が認められなかった。以上、イヌのTLR9の研究結果については、学術雑誌Vet. Immunol. Immunopatholにて印刷中である。さらに、細菌のペプチドグリカンを認識すると考えられるイヌのTLR2の遺伝子配列についても決定し、データーベース上で公開している。このように今回の研究計画に必要なイヌのTLRの遺伝子の情報は得たことから、来年度の研究を開始できる状態にある。
フォトクロミック色素の画像安定化と光記録用機能性色素材料開発への応用

有機材料の特異な機能を引き出す試みが活発に行われており、フオトクロミック材料はその代表的なものである。光で可逆的に色調が変化するだけでなく、その可逆的分子講造変化に基づく様々な機能制御も可能にするので、光知能材料創設への期待がかかっている。本研究では、スピロピラン系色素の熱及び光安定性の改善策確立、半導体レーザーに感受性をもつスピロピラン系色素の開発、さらには、スピロピラン-メロシアニンの異性化を分子認識機能と組合せ、分子認識に誘起された構造変化と情報発信が行える多機能型人口レセプターの設計及び合成等、超生物分子の開発に向けた基礎的研究を行った。以下に今年度の研究実績の概要を記述する。1.半導体レーザーに感受性を持つスピロピラン系色素の合成を行い、800nm付近に吸収を有する化合物を合成した。2.上述の化合物の置換基を種々変換し、そのスペクトル特性を検討した。3.スピロピラン系色素の吸収スペクトル、安定性と構造の相関性を検討した。4.アルカリ金属イオンの認識に基づいて発色するクラウン化スピロベンゾピランを種々合成し、発色のイオン選択性を検討した。5.アルカリ土類金属イオンの認識に基づいて発色するクリプタンド型スピロベンゾピランを合成し、4と同様の検討を行った。6.核酸塩基の認識に基づいて発色するスピロピリドピランを合成し、発色の核酸塩基に対する選択性を検討した。有機材料の特異な機能を引き出す試みが活発に行われており、フォトクロミック材料はその代表的なものである。光で可逆的に色調が変化するだけでなく、その可逆的分子構造変化に基づく様々な機能制御も可能にするので、光知能材料創設への期待がかかっている。本研究では両性対イオン種(芳香族オキシカルボン酸亜鉛)添加によるスピロピラン系色素の熱及び光安定性の改善策確立、半導体レ-ザ-に感受性をもっスピロピラン系色素の開発、フォトンモ-ド記録システムにおける非破壊読み出しの確立、半導体レ-ザ-と有機非線形光学材料の組合せによる一光源二波長素子に適合性をもつフォトクロミック色素の開発を行った。また、スピロピランーメロシアニンの異性化を、分子認識機能と組合せ、分子認識に誘起された、構造変化と情報発信が行える多機能型完全人工レセプタ-の設計及び合成等、超生物分子の開発に向けた基礎的研究を行った。1.半導体レ-ザ-に感受性を持つスピロピラン系色素の合成デザインをPPP MO法を用いて行い800nm付近に吸収を有する化合物の合成に成功した。2.上述の化合物の置換基を種々変換し、そのスペクトル特性を詳細に検討した。3.スピロピラン系色素の熱及び光安定性に及ぽす対イオン種(芳香族オキシカルボン酸亜鉛)の寄与を明らかにするため、そのX線構造解析を行った。4.スピロピラン系色素の吸収スペクトル、安定性と構造の相関性を検討した。5.核酸塩基認識機能を有するスピロピリドピランの設計と合成に成功した。
多分化能を有する脱分化脂肪細胞(DFAT)を用いた顎骨再建法の確立

脱分化脂肪細胞(DFAT)は多分化能を有し、採取効率の良い間葉系幹細胞様細胞として注目されている。しかし、DFATを骨再生研究に用いている試みは少ないため、今回DFATを用いた顎骨再建に関する研究を行った。更に、骨分化能を向上させる試みとして、三次元培養法も組み込み、細胞実験及び動物実験を行った。細胞実験の結果、脂肪由来間葉系幹細胞(ASCs)よりDFATの方が骨分化能が優れており、更に三次元培養したDFATの方が骨分化能が優れていた。また、動物実験の結果、三次元培養したDFATを移植した群が最も優れた骨再生能を示した。脱分化脂肪細胞(DFAT)は間葉系幹細胞と比較し、再生医療に適した細胞である。また、スフェロイド技術を応用する事で更なる再生能の向上が得られるのではないかと考えた。しかし、DFATを用いた骨再生研究はまだ少なく、DFATスフェロイドに関する研究も未だにない。本研究の目的はDFATスフェロイドの骨分化能及び再生能を評価する事である。【方法】骨分化誘導後アリザリンレッド染色を行う事で骨分化能を評価した。また、骨関連遺伝子及びタンパクの発現を比較した。実際に生体内で骨再生が促進されるかどうかを検討するために、ラット頭蓋骨中央に直径8mmのトレフィンバーを用いて骨欠損を作製し、細胞の移植を行った。移植群はコラーゲンスポンジ単体(CS群)をコントロール群として、CS群+DFAT(DF群)、CS群+DFATスフェロイド(DFS)、CS群+骨分化誘導を行ったDFAT(DF-O群)、CS群+骨分化誘導を行ったDFスフェロイド群(DFS-O群)の計5つの群を用いた。手術3か月後屠殺を行い、&micro;CT解析及びHE染色にて評価した。【結果】スフェロイド化する事で骨分化能は向上した。また、ALPやRunx2等の骨関連遺伝子の有意に高い発現やALP,Runx2及びOsterix等の骨関連タンパクの高い発現を認めた。&micro;CT解析の結果、DF群と比較してDFS群では有意に高い骨形成率が認められた。HE染色の結果も同様に、CS群では欠損部の多くが結合組織であったのに対し、他群ではより多くの新生骨が認められ、更にDFS-O群において欠損部はほとんど新生骨で満たされていた。【考察】DFATスフェロイドは平面培養のDFATと比較して高い骨分化能を有しており、この事が生体内での骨再生を促進した事が示唆された。【結論】DFATスフェロイドは骨再生能も優れており、臨床応用に適した移植法である。現在の進捗状況は概ね良好に進行している。DFAT抽出法及びスフェロイド作製法は既に確立しており、骨分化誘導及び脂肪分化誘導時のアリザリンレッド及びオイルレッド-O染色を行い、骨及び脂肪系統への分化を確認している。またリアルタイムPCRやウェスタンブロッティングにより、骨関連遺伝子及び骨関連タンパクの発現及びスフェロイド化する事でそれらが上昇する事も確認済みである。In vitro実験としては、まだ免疫染色及び細胞走化性の評価が終了していない。理由として、免役染色に関しては、ラット由来細胞を用いているため抗体のマッチングが難しく、鮮明な染色像が得られる条件を模索している。細胞走化性の評価に関してはスクラッチ法及びトランズウェル法の両者を検討しているが、スフェロイドと平面培養の比較に用いる手法としてはやや難しい事が判明した。そのため、現在どのように評価をするべきかを再検討中である。動物実験としては次年度に顎骨への移植を検討していたが、リアルタイムPCRやウェスタンブロッティング及び染色の結果が得られた為、本年度に頭蓋骨欠損モデルを用いて実験を行った。評価としては&micro;CT解析による新生骨形成率の評価及びHE染色による病理組織学的評価を行った。その結果、本研究の有用性を示唆する結果が得られている。本研究の目的は多分化能を持つ脱分化脂肪細胞(DFAT)を用い新規3次元培養法によるスフェロイドを作製し、in vitroでの骨分化能及びin vivoでの顎骨欠損モデルにおける骨再生促進作用を検討することであった。DFATは多分化能を有し、成熟した脂肪細胞から多量に獲得可能な細胞群である。また、スフェロイドは分化誘導を促進させると言われており、近年研究が進んでいる。しかし、DFATにてスfロイドを作製する試みは今まで見られなかった。細胞源は成熟脂肪細胞であり、多量に獲得可能である。この技術が確立すれば骨再生のみならず、その他の細胞を用いた再生医療に大きく貢献できると考えられる。昨年度にDFATスフェロイドの作製法を確立した。次にDFAT及びDFATスフェロイドの骨分化誘導能に関するin vitro研究を行った。リアルタイムPCR、ウェスタンブロットの結果、DFATスフェロイドに骨分化誘導を行った群における骨関連遺伝子及びタンパクの発現が最も高かった。in vitroにてDFATスフェロイドの骨分化誘導能の高さを示したのちに、頭蓋骨欠損モデルラットにDFAT、DFATスフェロイド及びそれぞれに骨分化誘導を行った計4群の細胞を移植した。1,2,3か月のタイムポイントで&micro;CT撮影及びサンプリングを行い、骨形成能を評価した。その結果骨分化誘導を行ったDFATスフェロイド群が最も良好な骨再生効果を示した。本年度は脂肪由来幹細胞(ASCs)との骨分化誘導能比較実験を行った。

in vitroでは同様の手法にて骨分化誘導能を比較したところ、DFATスフェロイドに骨分化誘導を行った群が優れた骨分化誘導能を示した。また、ラット顎骨欠損モデルを作製し、動物実験も行った。脱分化脂肪細胞(DFAT)は多分化能を有し、採取効率の良い間葉系幹細胞様細胞として注目されている。しかし、DFATを骨再生研究に用いている試みは少ないため、今回DFATを用いた顎骨再建に関する研究を行った。更に、骨分化能を向上させる試みとして、三次元培養法も組み込み、細胞実験及び動物実験を行った。細胞実験の結果、脂肪由来間葉系幹細胞(ASCs)よりDFATの方が骨分化能が優れており、更に三次元培養したDFATの方が骨分化能が優れていた。また、動物実験の結果、三次元培養したDFATを移植した群が最も優れた骨再生能を示した。今後の研究方針として、現象としての骨再生促進効果及び骨分化能の向上という結果は得られているため、今後はその現象がなぜ起こるのかという所まで研究を進めていきたい。具体的な方法として、スフェロイド及び平面培養時の遺伝子発現の違いを再検討する事で、どういった経路による刺激を受けて骨分化が促進されるのか明らかにしてゆく。特に、BMPシグナル経路とWnt経路のクロストークは最近のトピックでもあるので、これらに注目する他、インテグリンやカドヘリンといった接着に関する要素及び細胞骨格に関する発現の違いに注目して研究を行う予定である。同時に前年度遂行できなかった免疫染色や細胞走化性の評価も行う。動物実験に関しては、現在顎骨への移植法を確立しつつあるが、既に頭蓋骨への移植実験にて良好な結果が得られているため、必要であれば行う事とする。口腔インプラント学本年度に行う予定であった研究の一部を次年度に行う予定であるからである。本年度完遂出来なかった免疫染色及び細胞走化性の評価を行うとともに、細かな遺伝子発現を比較していく。
糸状菌を用いた未利用資源からの直接発酵法による糖供給源としての有効利用

本研究は糸状菌Aspergillus aculeatusを用いた未利用資源からの直接発酵法による糖供給源としての有効利用を目的として研究を行った。まず、未利用資源から効率よく単糖を蓄積させる試みとして本菌に紫外線を照射し糖代謝能力を欠損した変異株を得た。この変異株はD-キシロースに対する生育能力を持たず、キシリトールを蓄積する性質を示し、D-グルコースやL-アラビノースに対する生育能力は欠損していなかった。このことからキシリトールからD-キシルロースに変換する酵素遺伝子が破壊されたことが示唆された。研究に用いた糸状菌はでんぷんだけでなくセルロースやヘミセルロースといった難分解性バイオマスの分解能力に優れた微生物でありすでに種々の多糖分解酵素が同定されている。つぎに、ヘミセルロースを最終的に単糖にまで分解するのに必要な酵素である、L-アラビノフラノシダーゼおよびD-キシロシダーゼの遺伝子クローニングを目的として両酵素の同定および精製を行った。両酵素は別々に存在し、オリゴ糖にも作用し最終的に単糖を生成する事のできる重要な酵素であると結論した。変異株によって蓄積されるキシリトールはより付加価値が高く応用が期待できる希少糖に変換できることを明らかにした。L-キシルロースは医薬品への利用が期待されるL-キシロースの原料としてキシリトールからアルカリジェネス属細菌によって生産されできた。また、同様にバイオマスから生産可能なD-グルコースから希少糖であるD-プシコースおよびD-アロースの大量生産も可能であった。一方で、変異株を用いた直接発酵法による単糖の生産は最終産物であるキシリトールの蓄積量が少なく、酵母を用いたキシリトール生産に比べて実用性が低いと考えられたので糸状菌単独で直接発酵するよりも酵母を組合わせた方法がより効率よくキシリトールを生産できると考えられる。Aspergillus aculeatusが培養上澄に生産する多糖分解酵素は糖転移反応をおこさず、多糖から単糖を効率よく生成することができる。菌体外に生産するアクセラーゼに含まれているβ-D-キシロシダーゼ及びα-L-アラビノフラノシダーゼが得られれば未利用資源からD-キシロースおよびL-アラビノースを容易に生産できるようになり、希少糖生産の原料に用いることが可能と期待され、両酵素を精製し、精製された本酵素の酵素学的諸性質について検討した。両酵素を単一の標品に精製し酵素学的諸性質を調べたところ、至適温度は60°C、温度安定性は50°Cまでであり、至適pHは酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)であることがわかった。Aspergillus aculeatusより糖生産酵素として重要なセルロース分解酵素の一種であるセロビオヒドロラーゼIの遺伝子のクローニングと大腸菌を用いた組換え酵素の大量生産に成功した。本酵素およびすでに組換え酵素として得ることのできる種々の酵素を組み合わせることで難分解性の多糖であるセルロースの分解再資源化が促進されると期待される。糖再資源化装置の試験稼動を開始した。現在、装置の条件至適化を行っており、カビを用いて農産廃棄物である籾殻の処理を試験稼動させて糖アルコールの一種であるキシリトールを生産できないかの検討を行っている。微生物単独での処理では効率が悪いので分解を促進するための酵素添加についても検討を行っている。家庭用生ごみ処理機を用いて代表的な農産廃棄物のひとつである小麦ふすまの分解を行った。また優れた多糖分解能力を有する糸状菌Aspergillus aculeatusを用いて小麦ふすまの分解を行った。次に、未利用資源から糖質を得るために、糸状菌Aspergillus aculeatusにUVを用いて変異を導入し変異株の取得を行った。高速液体クロマトグラフィーによる糖組成分析の結果、全糖については0日目、9日目同様にD-グルコース、D-キシロース、L-アラビノースが確認された。可溶性糖の0日目にはマルトトリオース、マルトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノースが含まれていることがわかった。坂口フラスコを用いて28°Cの恒温室で小麦ふすまの分解を試みた。可溶性糖量は1.0mgから0.1mgまで減少し全糖については39.8mgから14.1mgと約75%の減少が確認できた。高速液体クロマトグラフィーを用いた糖組成分析の結果、0日目の可溶性糖には各種オリゴ糖、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノースが確認され、15日目の可溶性糖にはD-グルコース、D-キシロース、L-アラビノースが確認できた。A.aculeatusを用いて容易に小麦ふすまを分解することに成功した。しかし分解だけでなく消費もされており糖類の抽出には至っていない。そこで小麦ふすまから糖類の抽出を行うためA.aculeatusに変異を導入しペントースの代謝経路を壊してやり、目的ペントースを蓄積するような変異株の作製を試みた。UVを用いてA.aculeatusに変異導入を試みたが、胞子形成能が欠如した変異株やキシリトールを含む培地上での生育が遅い変異株も確認できたが目的変異株の獲得には至っていない。

この変異株はD-キシロースに対する生育能力を持たず、キシリトールを蓄積する性質を示し、D-グルコースやL-アラビノースに対する生育能力は欠損していなかった。このことからキシリトールからD-キシルロースに変換する酵素遺伝子が破壊されたことが示唆された。研究に用いた糸状菌はでんぷんだけでなくセルロースやヘミセルロースといった難分解性バイオマスの分解能力に優れた微生物でありすでに種々の多糖分解酵素が同定されている。つぎに、ヘミセルロースを最終的に単糖にまで分解するのに必要な酵素である、L-アラビノフラノシダーゼおよびD-キシロシダーゼの遺伝子クローニングを目的として両酵素の同定および精製を行った。両酵素は別々に存在し、オリゴ糖にも作用し最終的に単糖を生成する事のできる重要な酵素であると結論した。変異株によって蓄積されるキシリトールはより付加価値が高く応用が期待できる希少糖に変換できることを明らかにした。L-キシルロースは医薬品への利用が期待されるL-キシロースの原料としてキシリトールからアルカリジェネス属細菌によって生産されできた。また、同様にバイオマスから生産可能なD-グルコースから希少糖であるD-プシコースおよびD-アロースの大量生産も可能であった。一方で、変異株を用いた直接発酵法による単糖の生産は最終産物であるキシリトールの蓄積量が少なく、酵母を用いたキシリトール生産に比べて実用性が低いと考えられたので糸状菌単独で直接発酵するよりも酵母を組合わせた方法がより効率よくキシリトールを生産できると考えられる。
傍腫瘍性小脳変性症の動物モデルの開発

傍腫瘍性小脳変性症関連抗原遺伝子pcd-17を導入したトランスジェニックマウスにおいては野生型に比べて明らかな臨床的及び病理的なphnotypeの違いは見出せなかった。これらのトランスジェニックマウスの臓器の解析では野生型マウスでは発現していない脾細胞に導入された遺伝子による抗原の発現を確認し得た。2年間の長期にわたり観察したが、悪性腫瘍の高率な発生を確認することはできなかった。pcd-17蛋白はMORFファミリー蛋白MRG15と有意に結合し得ることを証明した。pcd-17とMRG15をB-mybプロモーターレポータープラスミドと共発現させることにより、B-mybプロモーターに対して、pcd-17プラスミド単独では影響を示さないが、MRG15プラスミドと共発現させると、MRG15の活性作用に対して抑制性に作用する結果を得た。さらに、抗Purkinje細胞抗体(Yo抗体)を細胞内に移入してその影響を検討すると、pcd-17によって抑えられていたMRG15のB-mybプロモーター活性に対する脱抑制作用を示す結果が得られた。pcd-17はMRG15との結合を介してB-mybプロモーター活性を制御し得ることが明らかになった。このことは、pcd-17が小脳・脳幹の神経細胞に対し、Rb-E2F系を介した代謝調節に関与し、細胞の生存死に重要な働きをしている可能性が示唆された。傍腫瘍性小脳変性症動物モデルを作製する試みとして、酵母にマウスpcd-17遺伝子を導入して作製したrecombinant yeastを用いてwhole recombinant yeast免疫を行った。その抗原性を確認するとSJL/Jマウスがヒトのエピトープであるleucinezipper領域に対して反応することが確認された。この免疫により、SJL/Jマウスに対してヒトにみられると同様の抗Purkinje細胞抗体を誘導した。また、whole recombinant yeastで感作したSJL/Jマウスのリンパ球を抗原刺激することによりInterferon-gammaの産生がみられる結果を得た。この結果は新しい免疫手法によりSJL/Jマウスにヒトと同じepitopeに対する自己免疫現象を誘導し得ることを初めて明らかにした。傍腫瘍性小脳変性症に関連する小脳由来腫瘍・神経共通抗原遺伝子ヒトpcd17 cDNAをC57BL/6マウスの受精卵に注入して遺伝子改変マウスのラインを得た。野生型と臨床症状や病理所見に明らかなフェノタイプの違いは見出せなかったが、一つのラインに野生型には発現していない脾臓組織でのpcd-17蛋白の発現が確認された。発現の影響を細胞レベルで解析する為に機能を検討した。pcd-17がMRG Xと結合することは既に報告したが、同じMORFファミリーのMRG15とも結合することが確認された。MRG15が関与するB-mybプロモーター活性を検討すると、B-mybプロモーターにpcd-17単独では影響しないが、MRG15との共発現により、MRG15のプロモーター活性化を抑制する結果を得た。pcd-17はMRG15との結合を介し、MRG15のRb-1との結合と拮抗し、Rb-1のB-mybプロモーター活性に対する抑制作用を阻害したと考えられた。さらに、傍腫瘍性小脳変性症に関連しpcd-17のロイシンジッパー部位を認識する抗神経細胞抗体を細胞内に移入して蛋白間の結合を阻害して検討すると、抗体はプロモーター活性に対して活性作用を回復させる結果を得た。これらの結果により、pcd-17はMRG15との結合を介してB-mybプロモーター活性を制御し得ることが明らかになり、神経細胞に対しpcd-17がRb-E2F系を介した転写調節に関与し、細胞の生存に重要な働きをしている可能性を示唆した。さらに、pcd-17は小脳変性症に関連する蛋白との相互作用について検討した結果、遺伝性小脳変性症に関わる蛋白と結合することを見出した。また、pcd17のマウスホモローグであるmpcd17 cDNAを得た。酵母細胞発現プラスミドにpcd-17遺伝子を導入し、DNA免疫と同様の効果をもつ組み換え体酵母よる感作を試みた。

このことは、pcd-17が小脳・脳幹の神経細胞に対し、Rb-E2F系を介した代謝調節に関与し、細胞の生存死に重要な働きをしている可能性が示唆された。傍腫瘍性小脳変性症動物モデルを作製する試みとして、酵母にマウスpcd-17遺伝子を導入して作製したrecombinant yeastを用いてwhole recombinant yeast免疫を行った。その抗原性を確認するとSJL/Jマウスがヒトのエピトープであるleucinezipper領域に対して反応することが確認された。この免疫により、SJL/Jマウスに対してヒトにみられると同様の抗Purkinje細胞抗体を誘導した。また、whole recombinant yeastで感作したSJL/Jマウスのリンパ球を抗原刺激することによりInterferon-gammaの産生がみられる結果を得た。この結果は新しい免疫手法によりSJL/Jマウスにヒトと同じepitopeに対する自己免疫現象を誘導し得ることを初めて明らかにした。
凍結療法における新規凍結端子の開発

肺に対する凍結端子および外筒についてカーボン、銅、アルミニウムといった材質を検討したが、いずれも熱伝導面での優位性はあるも、強度の点で問題があった。耐久性やコストの検討から現状ではステンレス鉄製が最良と考えられた。肺は実質臓器ではあるが、気相と液相が臓器内に存在し、気相と液相では熱伝動が著しく異なる。一度凍結された肺組織は肺水腫をきたし、気相は消失する。これにより初回と2回目以降凍結時の熱伝動は劇的に変化する。このため肺の熱伝導特性の検討が重要と考えられた。肺は実質臓器ではあるが、気相と液相が臓器内に存在するという特徴がある。気相と液相では熱伝動が著しく異なるため、これは他臓器と大きく異なる特徴である。また一度凍結された肺組織は毛細血管の破綻を主な原因とすると考えられる肺胞を中心とした水腫をきたし、気相は消失する。これにより初回凍結時と2回目凍結時の熱伝動は劇的に変化する。凍結を端子および外筒の材質による熱伝導の差異以上に肺の熱伝導特性は重要と考えられた。まずは豚を用い、右開胸下に2mmの凍結端子を胸膜から3cm刺入し凍結5分、融解5分を2サイクル行なった。凍結範囲の確認は胸膜面で肉眼的に行った。針型温度センサーを胸膜面より3cm刺入し温度を計測した。計測は凍結端子刺入部より7から13mmの距離を測定した。凍結端子の先端温度は約ー130°C、1回目の凍結では凍結範囲の先進部は半径8±0.6mmに達した。その後1回目の融解により約5mmの肺内出血輪がその周囲に形成され、2回目の凍結ではその出血輪の範囲が凍結され先進部は半径13±0.6mmに達した。2回目の凍結時の温度分布は半径7,8,9,10,13mmで各々ー70±4、ー39±7、ー21±7、ー14±8、+29±3°Cであった。腫瘍細胞の殲滅には約ー20°C以下の凍結が必要であると報告されている。本実験の結果では半径約9mmの腫瘍であれば2mmの端子1本で局所制御が得られる可能性が示唆された。さらに温度計測点を40点に増やした温度計測装置においても同様な結果が二次元的に得られ、凍結温度は2回目以上において同心円状に3層に分布し、殺細胞的と思われる-20°C以下の範囲はその最内側約260平方mm、つまり半径にして約9mmであった。この範囲内に腫瘍を含むことが重要と考えられたが、腫瘍径がそれ以上の場合複数の端子をどのように配置すればよいかは今後の課題と考えられた。1.凍結範囲を可変できる凍結端子の開発についてブタモデルによる実験の結果、新規に作成した凍結端子においておおよそ予想された形状の凍結範囲がブタ肺内で作成されていることが想定されました。in vitroの実験結果では、凍結範囲をより大きな形状にするためには「繭」のような形にする方が良い一方で、その分アルゴンガスの消費が大きいというデメリットがあることがわかりました。2.大きな凍結範囲を得ることのできる凍結端子の開発について素材変更によってより大きな凍結範囲を得ることのできる凍結端子の開発を検討しましたが、素材はいくつか比較したもののほとんど凍結範囲のサイズに大きな違いがないことが明らかになりました。衛生面や安全性およびコスト面などからステンレス製が望ましいと考え、新規凍結端子を開発しました。3.凍結領域を凍結治療中に確認できる凍結端子の開発について比較的近い範囲では超音波装置を用いることで凍結領域を認識することが可能であることが明らかになりました。一方、距離が遠くなるに従って超音波装置のノイズが多くなってしまい検出能力が低下してしまうことも明らかになりました。そのため、凍結端子に同心円状の超音波装置を設置することで凍結範囲を比較的確実に測定することが可能と考えていますが、超音波装置の分だけ凍結端子が太くなってしまう恐れがあり、凍結端子を経皮的に穿刺して治療をすることから太い端子は都合が悪い面もあり今後の重要な課題であると考えます。申請時に想定した通りの日程案で研究が進んでいると考えます。初回申請時点で3つのポイントを元に研究を進めていくことを考えていましたが、本年度研究により素材の変更による新規凍結端子の開発はこれ以上すすめるのは難しいと考えます。そのため、凍結範囲を可変できる凍結端子の開発および凍結領域を凍結治療中に確認できる凍結端子の開発を優先して行いたいと考えます。凍結端子を可変できる凍結端子の開発においては、氷結塊を大きくするにはジュールトムソン効果を有効に起きるようにするのが効果的であることがわかってきています。即ち50MPa程度の超高圧ガスを低圧に向けてエンタルピー一定で細孔から噴出させることが重要であることがわかってきております。

凍結領域を想定する関数式を既に得ていることから、細孔の位置を安全に動かすことのできる凍結端子を開発したいと考えています。凍結領域を凍結治療中に確認できる凍結端子の開発については、前述しましたとおり凍結端子に超音波装置の分だけ凍結端子が太くなってしまう問題点がありますので、この点をどのように改善すればよいか検討し、試作品を作成し寒天モデルでの実用性を調べる実験を行う予定です。動物実験では1回の実験(2日間)で豚6頭の実験を行います。この実験に要する経費は1回あたり豚6頭、麻酔費用(獣医師への謝金および薬品代)、凍結治療用ガス代(アルゴンガス+ヘリウムガス)、福島県須賀川市での実験であるため交通費と1泊の宿泊費が必要となると考えます。その他、慶應義塾大学医学部内の実験室において寒天モデルを用いた実験を適宜行ない、これにかかる費用は凍結治療用ガス代(アルゴンガス+ヘリウムガス)および実験材料費になると考えています。
メサンギウム細胞における膜型メタロプロテイナーゼの発現-糸球体におけるメタロプロテイナーゼ-2の活性化機序-

慢性糸球体腎炎の進展過程でmetalloproteinase-2(MMP-2)の産生が亢進していることより、細胞外基質の修復分解にMMP-2は大きな役割をはたしているものと考えられる.糸球体メサンギウム細胞(MC)から分泌されたこのpro-MMPがin vivoで作用を発現するには,糸球体局所で活性化される必要がある.今回,pro-MMP-2の活性化に特異的な膜型MMPのヒトMCにおける発現を検討した.1、TNFで刺激した培養ヒトMCの細胞膜上の膜型MMPを免疫組織学的に検出した.細胞膜には顆粒状に膜型MMPが染色されており、膜型MMPがMC膜上に存在することが確認された.2、TNFで刺激した培養MCから精製したRNAに対し,GAPDHをコントロールとしてMMP-2,TIMP-2,膜型MMPのRT-PCRを行ない,相対的な遺伝子発現の変動を検討した.MMP-2,TIMP-2と同様に膜型MMP遺伝子の発現は、TNF刺激に対し濃度依存性に増加していた.3、培養MCから精製した膜成分をPro-MMP-2に添加すると、容量依存性にpro-MMP-2が活性化されることが確認された.4、ヒト糸球体でのMMP-2と膜型MMPの発現を免疫組織学的にABC法で検討した.ヒト糖尿病性腎症やIgA腎症においても、メサンギウム領域にMMP-2と同時に膜型MMPの発現が見られた。以上より本年度の研究では、MCが膜型MMP遺伝子を発現して膜型MMP蛋白を分泌し,これが同時にMCより分泌されたpro-MMP-2を活性化する機序が明らかとなった。ヒト糸球体においても膜型MMPが発現されており、急性炎症時のECM破壊や膜性増殖性糸球体腎炎での係蹄壁二重化部位へのメサンギウム細胞の移動などにMMP-2が積極的にかかわっていることが推測される.慢性糸球体腎炎の進展過程でmetalloproteinase-2(MMP-2)の産生が亢進していることより、細胞外基質の修復分解にMMP-2は大きな役割をはたしているものと考えられる.糸球体メサンギウム細胞(MC)から分泌されたこのpro-MMPがin vivoで作用を発現するには,糸球体局所で活性化される必要がある.今回,pro-MMP-2の活性化に特異的な膜型MMPのヒトMCにおける発現を検討した.1、TNFで刺激した培養ヒトMCの細胞膜上の膜型MMPを免疫組織学的に検出した.細胞膜には顆粒状に膜型MMPが染色されており、膜型MMPがMC膜上に存在することが確認された.2、TNFで刺激した培養MCから精製したRNAに対し,GAPDHをコントロールとしてMMP-2,TIMP-2,膜型MMPのRT-PCRを行ない,相対的な遺伝子発現の変動を検討した.MMP-2,TIMP-2と同様に膜型MMP遺伝子の発現は、TNF刺激に対し濃度依存性に増加していた.3、培養MCから精製した膜成分をPro-MMP-2に添加すると、容量依存性にpro-MMP-2が活性化されることが確認された.4、ヒト糸球体でのMMP-2と膜型MMPの発現を免疫組織学的にABC法で検討した.ヒト糖尿病性腎症やIgA腎症においても、メサンギウム領域にMMP-2と同時に膜型MMPの発現が見られた。ヒト糸球体においても膜型MMPが発現されており、急性炎症時のECM破壊や膜性増殖性糸球体腎炎での係蹄壁二重化部位へのメサンギウム細胞の移動などにMMP-2が積極的にかかわっていることが推測される.
スピンエコーを用いた加速器用高勾配四極〓場精密測定法の開発

今後、衝突型加速器や高輝度放射光光源の電磁石はますます高精度化、高安定化が要求されるが、大きな磁場勾配および強い放射線のため、運転状態にある加速器用電磁石の磁場を精密に測定する方法が全くなかった。本研究は勾配磁場測定にスピンエコーNMRを適用し、エコーで回復する核磁化の才差周波数を測定することで、このような問題を解決しようと意図するものである。平成11年度は、詳細なシミュレーション計算およびスペクトル解析におけるS/N比の理論的解析を実行することで、大きな勾配を有する磁場中でスピンエコーが観測可能であることを理論的に予想し、周波数固定型簡易スピンエコー装置を改良した装置により、0.55T/mの勾配を有する2.35kGの磁場中でスピンエコーが観測できることを実験的に実証した。これにより10kGにおいては5T/m以上の勾配でも観測可能であることを示した。以上と平行して、磁場の絶対値測定に必要な周波数可変型スピンエコー装置を開発するため、第一段階として、可変周波数型スピンエコー信号受信器の開発を行った。平成12年度は上記受信器と組み合わせて使用される、周波数可変型スピン反転用90度/180度パルス発生装置の開発を行い、現在受信器と組み合わせて測定システム全体としての最終調整段階にある。上記開発と平行してスピンエコー測定実験において、スペクトル解析における高速フーリエ解析を改良することで、2.35kGの勾配磁場にて磁場測定分解能0.45Gを実現することに成功し、0.1G以下の磁場測定分解能を実現できる確証を得た。またスピンエコーで観測される核磁化の才差周波数の変化率がNMR資料のサイズに依存することが理論的に予言されたが、これを実験的に確認するとともに、90度/180度パルスの高周波周波数を可変とすることでこのようなサイズ効果を除去し、磁場の絶対値に対応する才差周波数を同定することができることを示した。今後、KEKBのLERベンド(7.6kG)の約15G/cmの勾配磁場にて長期磁場測定を実施し、装置の信頼性試験を行いながらKEKB加速器の安定化に必要な磁場データを提供する予定である。その後高勾配磁場測定に最適なNMR資料の開発を進め、四極電磁石の磁場測定を実施していく予定である。2.35kGaussの勾配付電磁石磁場の精密校正及び、簡易型10MHzスピンエコー測定装置の性能改善を行うことで、0.48T/mの勾配磁場中におけるスピンエコー信号を明瞭に観測するとともに、種々のNMR資料及び磁場勾配条件のもとでの信号対雑音比の測定を行い、スピンエコー・シミュレーション計算の正当性を評価した。これにより、任意の条件のもとでのスピンエコーの観測が定量的に予測可能となり、また現実的な信号処理法の検討が可能となったことで、装置設計に関する具体的指針を得ることができた。上記に基づき、平成11年度交付金により第1試作段階である周波数可変型スピンエコー信号検出装置の設計及び製作を行い、現在その最終段階にあって当該装置の当初の目標性能の実現にむけて最終的な調整中である。今後、上記検出装置の目標性能を実現し、平成12年度に開発を予定しているスピンエコー用高出力パルス高周波増幅器を組み合わせることにより、磁場探査可能なスピンエコー装置の実現を図る。またこれと合わせて、実用機とするためにエコー信号検出コイル部の自動平衡装置の開発を行っていかなければならない。

平成12年度はスピンエコー用高周波パルス発生装置の開発を進め、磁場サーチ可能な周波数可変型スピンエコー装置の開発を行ってきた。現在最終調整段階にあるが、完成にはまだ若干の時間的猶予を必要としている。本装置は、Bファクトリーで稼動している加速器の四極電磁石磁場を測定するため、スピン反転用高周波周波数を31MHzを中心として約1%の可変が可能なように設計されており、7.3kG近傍の勾配磁場を23×10^<-5>の精度にて磁場をサーチすることができる。調整完了後性能確認を兼ねて加速器のエネルギー安定性モニターのために、電磁石内のビームパイプ外部の不均一磁場領域において、長時間の磁場モニタリングを実行予定である。本機の稼動によって動作中の加速器の磁場安定度が始めてNMRにて直接観測されることになり、加速器の安定性に関して重要な情報が得られるものと期待される。上記装置の開発と平行して、磁場測定装置としての機能の実現に不可欠な、高速フーリエ変換を用いたデーター処理法を開発し、定周波数スピンエコー装置により2.35kGの勾配付電磁石磁場中における陽子スピンのエコー信号周波数の磁場依存性を測定することに成功した。現在の分解能はFFTデーター点数で制限され約1Gである。今後メモリー容量を増大することで0.2G以下の分解能を目指す。また勾配磁場におけるNMR周波数変化に対する資料のサイズ効果が明瞭に観測され、理論計算の予測とよく合うことが確認された。用いた資料ではΔf_<NMR>/f_<NMR>〓0.5×ΔB/Bであった。サイズ効果に影響されない測定法の開発が今後の課題である。
鞘内免疫メカニズム解明と狂犬病治療の試み

狂犬病は致死的な人獣共通感染症で、現在もなお有効な治療法はない。本研究では、これまでの脳免疫に関する自家所見に基づき、鞘内免疫(脳脊髄液へのワクチン投与)によって狂犬病発症動物を治療する事を目指した。その結果、暴露前あるいは暴露後ワクチン接種を受けた個体では、発症後早期に鞘内免疫を行えば、脳炎に起因する症状は残るものの、100%延命可能であることを明らかにした。狂犬病発症例では心筋壊死を併発するが、その発生メカニズムは不明であった。心筋壊死は神経原性心筋症であり、狂犬病発症個体の治療に当たっては心筋症の併発に留意する必要がある事を本研究で明らかにした。不治の病である狂犬病の治療法開発を目的として本研究を行っている。これまでに7名が狂犬病発症後も生存し、いずれのヒト症例の脳脊髄液にも高値の中和抗体が証明されたことから、狂犬病を発症しているウサギの脳脊髄液中に狂犬病ワクチンを直接投与(鞘内免疫)し、狂犬病の治療を試みるとともに、その治療メカニズムの解明を試みた。その結果、狂犬病発症後鞘内免疫を施したウサギは100%生残し、生残例ではごく少量の狂犬病ウイルス抗原が脳に認められたが、ウイルス遺伝子は消失しており、狂犬病ウイルスを神経組織から排除することが出来た。また、生残したウサギの脳脊髄液中には高力価の中和抗体が誘導されていた。この実験結果を1報の論文として発表し、現在、2報目を投稿中である。しかし、(1)生残ウサギの中枢神経組織の損傷が重篤で、完全治癒には至らなかったこと、(2)鞘内免疫の前に皮下免疫を行う必要があったこと、(3)攻撃ウイルスとして街上毒ではなく、神経病原性固定毒を用いた、等の制限があり、完全な治療法開発には至っていない。しかし、狂犬病発症後回復したヒト症例のほとんどで重篤な後遺症が残ったこと、本治療法は暴露前あるいは暴露後ワクチン接種を受けた個体に適用可能であること、街上毒による狂犬病では神経組織の壊死/アポトーシスと脳炎が固定毒に比べて軽微であることから、今回我々が示した鞘内免疫による狂犬病の治療法が、将来、より完全で安全な狂犬病治療法の確立に発展する可能性がある。街上毒狂犬病ウイルス(1088株)をウサギに接種し、狂犬病発症後鞘内免疫によって治療する実験を大分大学医学部のBSL3レベル微生物封じ込め施設において行った。1回目実験では、狂犬病ウイルスをウサギの後肢筋に接種したところ、接種912日後に一過性の摂餌・摂水量の減少を示したが、その後45日以内に正常に回復し、狂犬病に特徴的な神経症状を示すウサギはなかった。2回目実験では、1088株をウサギの鼻腔内に接種したが、結果は1回目実験と同様であった。組織学的には、接種ウサギの脳に軽度の囲管性細胞浸潤が見られたが、ウイルス抗原あるいは脳炎病変は認められなかった。また、これらのウサギでは末梢血および脳脊髄液の中和抗体価が顕著に上昇していた。以上の結果から、街上毒接種ウサギでは接種ウイルスが接種局所から脳へ上行する期間が長く、その間に免疫が成立し、ウイルスが排除されてしまうと結論された。前年度までに行った固定毒狂犬病ウイルス接種実験と本年度の街上毒接種ウサギの心筋病変を検索したところ、狂犬病ウイルス接種によって重篤な脳病変を表したウサギでは心筋壊死が認められ、脳と心筋病変の程度は比例すること、心筋病変の発生は麻酔薬の投与回数あるいは投与量と無関係であること、カテコールアミン過分泌に特徴的な心筋過収縮帯壊死contraction band necrosisを伴うことが分かった。以上の所見から、狂犬病発症ウサギに認められた心筋壊死は神経原性心筋症であると結論された。狂犬病によって死亡した人では心筋壊死の発生することが報告されてきているが、その発生メカニズムとして神経原性心筋症を考慮すべきであり、心筋壊死は狂犬病脳炎の併発症である事が分かった。

その結果、狂犬病発症後鞘内免疫を施したウサギは100%生残し、生残例ではごく少量の狂犬病ウイルス抗原が脳に認められたが、ウイルス遺伝子は消失しており、狂犬病ウイルスを神経組織から排除することが出来た。また、生残したウサギの脳脊髄液中には高力価の中和抗体が誘導されていた。この実験結果を1報の論文として発表し、現在、2報目を投稿中である。しかし、(1)生残ウサギの中枢神経組織の損傷が重篤で、完全治癒には至らなかったこと、(2)鞘内免疫の前に皮下免疫を行う必要があったこと、(3)攻撃ウイルスとして街上毒ではなく、神経病原性固定毒を用いた、等の制限があり、完全な治療法開発には至っていない。しかし、狂犬病発症後回復したヒト症例のほとんどで重篤な後遺症が残ったこと、本治療法は暴露前あるいは暴露後ワクチン接種を受けた個体に適用可能であること、街上毒による狂犬病では神経組織の壊死/アポトーシスと脳炎が固定毒に比べて軽微であることから、今回我々が示した鞘内免疫による狂犬病の治療法が、将来、より完全で安全な狂犬病治療法の確立に発展する可能性がある。本年度中に街上毒(野外で発生している狂犬病の原因ウイルス)を用いた治療実験を終了するつもりであったが、本実験は我が国の限られた研究機関(国立感染症研究所と大分大学医学部)でしか実施できないため、その準備に時間がかかった。さらに、街上毒接種から発症までの潜伏期間が長期かつ個体によって不安定なため、陽性対照実験がうまく行かなかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。2013年4月中旬から街上毒を用いた治療実験を再開する。前回はウイルスをウサギの後肢筋肉内に接種したが、ウイルスが末梢神経を経て脳に到達する期間が長く、かつ不安定であった。そこで、今回は鼻腔粘膜にウイルスを接種する。鼻腔深部粘膜には神経細胞の一種である嗅細胞が広く分布しており、嗅粘膜に接種されたウイルスは短期間で脳の嗅球に到達することをマウス実験で確認したので、この接種ルートを用いることにした。
新世界ザルの通時的社会構造とその生息環境である熱帯雨林の動態に関する研究

私たちは南米コロンビア国・マカレナ地域において,そこの熱帯雨林に同所的に生息するオマキザル科7種の社会構造と,住環境である熱帯雨林の動態について,平成2年度から4年度まで,同国ロス・アンデス大学との共同研究としてインテンシヴな調査を行った。以下に3年間の研究成果の概要を述べる。1.新世界ザルの通時的社会構造に関して私たちはマカレナ地域の西部に設営した調査地で,そこに同所的に生息する大型4種のサル,ウーリーモンキー,クモザル,ホエザル,オマキザルの複数の群れをハビチュエーションないし餌づけし,全頭を個体識別し,3年間継続して群内・群間の社会変動の調査を行った。以下が主な成果である。1).ウーリーモンキーとクモザルで,旧大陸のサル類では唯一アフリカの大型類人猿で見い出された特異な父系の社会構造を持つことが明らかになった。2).同時に,父系の社会でメスの移出入のメカニズムが解明された。3).ウーリーモンキーで,オトナ・オスの母乳飲み行動というサル類では初めての行動が明らかにされ,その行動特性および性行動との関連が群しく分析された。4).ホエザルは群れに複数頭のオスを擁しながら基本的には単雄群の社会構造を持つことが解明された。5).ホエザル単雄群の,オスの移出入のメカニズムが明らかになった。6).ホエザルのこのような社会で,d-maleの交代時に必ず仔殺しが起ることが明らかにされた。7).仔殺し要因の旧世界ザルとの比較研究がなされた。8).オマキザルはニホンザルと同様の複雄複雌群であり,母系の社会を持つことが明らかになった。9).オスの群れ移出入のメカニズムが解明された。10).群れの分裂のメカニズムとその要因が調査された。11).同じ複雄複雌の母系の社会でありながら,オマキザルとニホンザルで社会構造のどの部分が異なるかが,新しい食物の伝播の仕方の異いを通して解明された。一方で,上記4種と同所的に生息する中型3種のサルについても同様の調査を行った。12).ティティとヨザルが共にペア型の社会構造を持つことが確められた。13).同じ社会構造を持つティティとヨザルで,生息環境のすみわけの実態が詳しく調査された。14).ティティとヨザルの,新世界ザルの系統進化上の位置が,上記すみわけの実態調査の結果を通して分析された。15).リスザルがサル類の中で特異な社会構造-複雄複雌群でありながらオスとメスが日常的にサブ・グループを作って生活する-を持つことが明らかになった。2.熱帯雨林の動態と構造に関して同じマカレナ調査地で熱帯雨林を生態学的に解析した。特に雨季と乾季2度づつの調査を3年間継続できたことで,以下の成果を得た。1).新たに1,300点を超える植物標本を作成した。2).コロンビア国内の主要研究機関とアメリカ・ミズーリ植物園において標本を比較・照合し,調査地の主要な植物323種を同定した。3).うち260種を写真撮影し図鑑を試作した。4).調査地の植物相が地理的分布様式の異なる4つの植物群から構成されていることを明らかにした。5).航空写真と現地踏査から植生と地形の基本構造を明らかにした。6).植物社会学的観点から植生を調べ,群落型の抽出・序列化を試みた。7).濫乱原上の生態系遷移を群落の組成と構造,微地形,土壌環境の面から群細に解析した。8).キク科の先駆低木Tessaria integrifoliaとBacchars salicifoliaの個体群動態を,個体のサイズ・分散構造,地上部諸器官でのアロケーション,雌雄性等の視点から解析した。9).クワ科の先駆高木Cecropia sp.の幼樹で,伸長成長量を継続測定した。10).1988年に設置した4ヶ所の永久方形区で再度毎木調査を行い,生死,幹肥大成長量,開花・結実の有無,被陰関系の変化などを把握した。11).新たに50X50mの永久方形区を2ヶ所設置し,植物群落の組成と構造を調べた。12).サルの採食行動と植物の開葉・開花・結実などのフェノロジーを同時記録した。13).熱帯雨林の植物とサル類との共進化のありようを解明するために,種子の散布様式と被食が発芽率におよぼす影響を調ベた。14).同様の調査を果実食の大型鳥類で行い,サルの場合と比較を行った。

1).ウーリーモンキーとクモザルで,旧大陸のサル類では唯一アフリカの大型類人猿で見い出された特異な父系の社会構造を持つことが明らかになった。2).同時に,父系の社会でメスの移出入のメカニズムが解明された。3).ウーリーモンキーで,オトナ・オスの母乳飲み行動というサル類では初めての行動が明らかにされ,その行動特性および性行動との関連が群しく分析された。4).ホエザルは群れに複数頭のオスを擁しながら基本的には単雄群の社会構造を持つことが解明された。5).ホエザル単雄群の,オスの移出入のメカニズムが明らかになった。6).ホエザルのこのような社会で,d-maleの交代時に必ず仔殺しが起ることが明らかにされた。7).仔殺し要因の旧世界ザルとの比較研究がなされた。8).オマキザルはニホンザルと同様の複雄複雌群であり,母系の社会を持つことが明らかになった。9).オスの群れ移出入のメカニズムが解明された。10).群れの分裂のメカニズムとその要因が調査された。11).同じ複雄複雌の母系の社会でありながら,オマキザルとニホンザルで社会構造のどの部分が異なるかが,新しい食物の伝播の仕方の異いを通して解明された。一方で,上記4種と同所的に生息する中型3種のサルについても同様の調査を行った。以下が主な成果である。12).ティティとヨザルが共にペア型の社会構造を持つことが確められた。13).同じ社会構造を持つティティとヨザルで,生息環境のすみわけの実態が詳しく調査された。14).ティティとヨザルの,新世界ザルの系統進化上の位置が,上記すみわけの実態調査の結果を通して分析された。15).リスザルがサル類の中で特異な社会構造-複雄複雌群でありながらオスとメスが日常的にサブ・グループを作って生活する-を持つことが明らかになった。2.熱帯雨林の動態と構造に関して同じマカレナ調査地で熱帯雨林を生態学的に解析した。特に雨季と乾季2度づつの調査を3年間継続できたことで,以下の成果を得た。1).新たに1,300点を超える植物標本を作成した。2).コロンビア国内の主要研究機関とアメリカ・ミズーリ植物園において標本を比較・照合し,調査地の主要な植物323種を同定した。3).うち260種を写真撮影し図鑑を試作した。4).調査地の植物相が地理的分布様式の異なる4つの植物群から構成されていることを明らかにした。5).航空写真と現地踏査から植生と地形の基本構造を明らかにした。6).植物社会学的観点から植生を調べ,群落型の抽出・序列化を試みた。7).濫乱原上の生態系遷移を群落の組成と構造,微地形,土壌環境の面から群細に解析した。8).キク科の先駆低木Tessaria integrifoliaとBacchars salicifoliaの個体群動態を,個体のサイズ・分散構造,地上部諸器官でのアロケーション,雌雄性等の視点から解析した。9).クワ科の先駆高木Cecropia sp.の幼樹で,伸長成長量を継続測定した。10).1988年に設置した4ヶ所の永久方形区で再度毎木調査を行い,生死,幹肥大成長量,開花・結実の有無,被陰関系の変化などを把握した。11).新たに50X50mの永久方形区を2ヶ所設置し,植物群落の組成と構造を調べた。12).サルの採食行動と植物の開葉・開花・結実などのフェノロジーを同時記録した。13).熱帯雨林の植物とサル類との共進化のありようを解明するために,種子の散布様式と被食が発芽率におよぼす影響を調ベた。14).同様の調査を果実食の大型鳥類で行い,サルの場合と比較を行った。