hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高スピン軌道相互作用酸化物ヘテロ構造での磁気スキルミオンの創出とナノスケール観察

パルスレーザー堆積法(PLD)ー低温走査型トンネル顕微鏡(STM)システムを用いて、電気伝導性をもつSrTiO3基板にSrVO3薄膜を作製し、低温STMによるin-situ観察を行った。その結果、膜厚4 nm以下の超薄膜において、原子構造と電子状態の異なる2つの表面が共存していることを発見した。この実験を通じて、PLD-STMシステムによる薄膜作製から低温STM観察に至る一連の実験フローの確立に成功した。絶縁体であるLaAlO3基板にアナターゼTiO2をPLDで作製し、低温STM観察を試みた。まず、抵抗加熱法を用いて、これまでのような導電性基板でなく、絶縁体基板を高温加熱する方法を開発した。その結果、TiO2薄膜のエピタキシャル成長には成功したものの、薄膜の電気伝導率が低く、STM観察を行うことができなかった。これは、TiO2薄膜作製時の酸素分圧が高く、十分な酸素欠損を薄膜中に導入できなかったからだと考えられる。そこで、酸素分圧を下げてTiO2薄膜を作製したところ、低温STM観察が可能な薄膜の作製に成功し、薄膜表面が(1×4)再構成構造をもつことを確認した。この結果は先行研究と一致する。希土類単酸化物薄膜の作製には薄膜作製中の酸素分圧が重要なパラメータとなるため、四重極型質量分析計を導入し、酸素分圧を精密に制御した上で作製する必要があることがわかった。PLD-STMシステムでスピン偏極STMを行うため、強磁性材料を探針先端に蒸着する機構を組み上げ、システムに取り付ける準備が完了した。本研究で要求される要素技術「PLDによる薄膜作製から低温STM観察に至る一連の実験フローの確立」、「絶縁基板にPLDで作製した薄膜の低温STM観察」、「PLD-STMシステムにおける強磁性材料の蒸着機構の準備」を達成することができ、希土類単酸化物薄膜の実験とスピン偏極STM観察が可能になったため。PLD-STMシステムを用いて、絶縁体であるYAlO3基板上に強磁性半導体EuOエピタキシャル薄膜を作製し、低温STMによるin-situ観察を行う。STMによる表面構造の評価、X線回折法による結晶構造評価から、原子レベルで平坦かつ幅の広いテラスをもつEuO薄膜が得られるように、薄膜作製条件(基板温度、酸素分圧など)を最適化する。酸素分圧に関しては、購入した四重極型質量分析計を用いて精密に測定を行う。PLD-STMシステムにおいて強磁性体探針を作製し、スピン偏極STM観察を行う。まず、すでに実績のある強磁性Coナノ構造やCoドープTiO2を用いて、スピン偏極信号の検出を確認する。その後、EuOエピタキシャル薄膜のスピン偏極STM観察を行い、磁気スキルミオンの観察を試みる。さらに、ホール抵抗測定において磁気スキルミオンの生成を示唆する結果が得られている希土類単酸化物ヘテロ構造のスピン偏極STMへと展開する。くわえて、EuO/LaO強磁性・超伝導へテロ接合を作製し、磁気伝導特性に加え、ミクロスケールにおける磁性と超伝導の共存状態の観察に取り組む。

STMによる表面構造の評価、X線回折法による結晶構造評価から、原子レベルで平坦かつ幅の広いテラスをもつEuO薄膜が得られるように、薄膜作製条件(基板温度、酸素分圧など)を最適化する。酸素分圧に関しては、購入した四重極型質量分析計を用いて精密に測定を行う。PLD-STMシステムにおいて強磁性体探針を作製し、スピン偏極STM観察を行う。まず、すでに実績のある強磁性Coナノ構造やCoドープTiO2を用いて、スピン偏極信号の検出を確認する。その後、EuOエピタキシャル薄膜のスピン偏極STM観察を行い、磁気スキルミオンの観察を試みる。さらに、ホール抵抗測定において磁気スキルミオンの生成を示唆する結果が得られている希土類単酸化物ヘテロ構造のスピン偏極STMへと展開する。くわえて、EuO/LaO強磁性・超伝導へテロ接合を作製し、磁気伝導特性に加え、ミクロスケールにおける磁性と超伝導の共存状態の観察に取り組む。直線導入機構の新規購入を予定していたが、現有品でも実験可能であることがわかったため、購入を取りやめた。一方で、薄膜作製に酸素量の精密制御が必要であることがわかったため、質量分析計を購入した。また、本研究で要求される要素技術の確立に向けて低温STM観察を行った際に、寒剤として液体ヘリウムではなく主に液体窒素を用いた。それにより必要な寒剤費を抑えることができた。以上の理由から、次年度使用額が生じた。次年度では、スピン偏極STM観察を行うため、熱ドリフトのさらなる抑制や探針先端の磁化状態の安定化が必須となり、液体ヘリウム温度での実験がメインとなる。そこで、次年度使用額を液体ヘリウムの使用料金に充て、十分な液体ヘリウム温度での実験回数を確保する。
マイクロダイセクション法によるセメント質・歯根膜に特異的な遺伝子の同定と機能解析

レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクションシステム(LCM)は、顕微鏡観察下において組織切片から単一の標的細胞集団のみを正確に採取して、その標的細胞からのRNA抽出を可能にした画期的なシステムである。そして、その分離採取された各細胞集団から得られたRNAを比較解析すれば、それぞれに特異的なマーカーを同定することも可能だと考え、LCMが可能な骨と歯牙を含む硬組織非脱灰凍結切片の作成を試みた。硬組織非脱灰凍結切片から抽出したRNAは28Sおよび18Sのピークが明確で、RT-PCR解析においても明瞭なオステオカルシン、GAPDHなどのバンドが確認され、RNAのクウォリティの高さを示唆する結果が得られた。続いて、LCMにより抽出されたRNAを増幅後、マイクロアレイ解析を行った結果、解析した約40000個の遺伝子のうち、2000個以上に発現レベルの差を認めた。上記のように、セメント質および歯根膜組織等の硬組織の遺伝子配列の解析が可能なRNA抽出法が確立され、組織特異的なマーカーの検索と機能解析が可能となった。セメント質に発現が強いものを順次選択し、定量的RT-PCR法によるスクリーニングを行った。LCMで得られるRNAの収量はきわめて少ないため、そして大腿骨・頚骨には歯周組織は含まれないことから、セメント(+)/歯根膜(-)/顎骨(+)/大腿骨(-)の遺伝子は、セメント質に関連するものである可能性が高いと仮定して、PCR解析には上記の組織を用いた。引き続き、In-situ hybrydizstion法によって、各遺伝子の局在を検索した。そして、上記遺伝子のうちのひとつの発現は、ヘルトビッヒの上皮鞘に特異的であることが明らかになり、歯根形成への関与が強く示唆された。この遺伝子の真の機能を検索するため、ノックアウトマウスの作出を計画し、ターゲティングベクターの設計を行った。レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクションシステムは、顕微鏡観察下において組織切片から単一の標的細胞集団のみを正確に採取して、その標的細胞からRNAの抽出を可能にした画期的なシステムである。そして、その正確に分離・採取された各細胞集団から得られたRNAを比較解析すれば、それぞれに特異的なマーカーを同定することも可能だと考えられる。現在までの検討で、脱灰パラフィン包埋切片では、その処理過程においてRNAの崩壊が激しくマイクロアレイなどの遺伝子配列の検索には適していないことが明らかになった。したがって、非脱灰凍結切片の作成が必要となったが、骨と歯牙を含む組織においては、これが困難極まるものであった。申請者らは、特殊なタングステンナイフとクライオフィルムおよびUV照射を併用することによりレーザーキャプチャーマイクロダイセクションが可能な非脱灰凍結切片を作成することに成功した。その過程においては、フィルムの種類また、接着剤とそれぞれの試薬の処理時間の検討に多くの時間がかかった。さらに、セメント芽細胞と歯根膜細胞における、レーザービームの至適強度などもわかった。そしてそれらの組織から抽出したRNAは28Sおよび18Sのピークが明確で、さらに、そのサンプルを用いたRT-PCR解析においても明瞭なオステオカルシン、コラーゲン、GAPDHなどのバンドが確認され、RNAのクウォリテイの高さを示唆する結果が得られた。上記の検討により、セメント質および歯根膜組織から遺伝子配列の解析が可能なRNA抽出法が確立され、各組織に特異的なマーカーの検索と機能解析の準備が全て整った。現段階では、マイクロアレイ解析の過程にあり、LCMにより抽出されたRNAを増幅キットを用いて増加させ、そのRNAの質と量の検定を行っている。本研究においては、レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクションシステムを用いて、組織切片から歯根膜、セメント質それぞれ単一の標的細胞集団のみを正確に採取して、RNAを抽出する。そして、その正確に分離・採取された各細胞集団から得られたRNAを比較解析し、各組織に特異的なマーカーを同定することが最終目標である。骨と歯牙を含む組織の非脱灰凍結切片の作成は、困難極まるものであったが、申請者らは、特殊なタングステンナイフとクライオフィルムおよびUV照射を併用することによりレーザーキャプチャーマイクロダイセクションが可能な非脱灰凍結切片を作成することに成功した。そしてそれらの組織から抽出したRNAは28Sおよび18Sのピークが明確で、さらに、そのサンプルを用いたRT-PCR解析においても明瞭なオステオカルシン、コラーゲン、GAPDHなどのバンドが確認され、RNAのクウォリティの高さを示唆する結果が得られた。しかしながら、マイクロアレイ解析のためには、RNAの収量が不足していることが判明し、凍結切片とレーザーキャプチャーの作業にさらなる時間を費やした。

LCMにより抽出されたRNAを増幅キットを用いて増加させ、そのRNAの質と量の検定を行った結果、増幅されたRNAのクウォリティは万全ではなかったが、39000個の遺伝子比較解析の結果、約2000個に遺伝子発現の差を認めた。現在、In-situ Hybridization法による、遺伝子発現の差異の確認作業を遂行中である。レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクションシステム(LCM)は、顕微鏡観察下において組織切片から単一の標的細胞集団のみを正確に採取して、その標的細胞からのRNA抽出を可能にした画期的なシステムである。そして、その分離採取された各細胞集団から得られたRNAを比較解析すれば、それぞれに特異的なマーカーを同定することも可能だと考え、LCMが可能な骨と歯牙を含む硬組織非脱灰凍結切片の作成を試みた。硬組織非脱灰凍結切片から抽出したRNAは28Sおよび18Sのピークが明確で、RT-PCR解析においても明瞭なオステオカルシン、GAPDHなどのバンドが確認され、RNAのクウォリティの高さを示唆する結果が得られた。続いて、LCMにより抽出されたRNAを増幅後、マイクロアレイ解析を行った結果、解析した約40000個の遺伝子のうち、2000個以上に発現レベルの差を認めた。上記のように、セメント質および歯根膜組織等の硬組織の遺伝子配列の解析が可能なRNA抽出法が確立され、組織特異的なマーカーの検索と機能解析が可能となった。セメント質に発現が強いものを順次選択し、定量的RT-PCR法によるスクリーニングを行った。LCMで得られるRNAの収量はきわめて少ないため、そして大腿骨・頚骨には歯周組織は含まれないことから、セメント(+)/歯根膜(-)/顎骨(+)/大腿骨(-)の遺伝子は、セメント質に関連するものである可能性が高いと仮定して、PCR解析には上記の組織を用いた。引き続き、In-situ hybrydizstion法によって、各遺伝子の局在を検索した。そして、上記遺伝子のうちのひとつの発現は、ヘルトビッヒの上皮鞘に特異的であることが明らかになり、歯根形成への関与が強く示唆された。この遺伝子の真の機能を検索するため、ノックアウトマウスの作出を計画し、ターゲティングベクターの設計を行った。
柳川三味線の研究

研究最終年度となる本年は、主に収集した文献、音源、楽器について精査を行なった。文献として特筆すべきは、柳川三味線演奏家の梅辻理恵氏が東京藝術大学における修士研究として平成2年にまとめた修士論文『地歌「柳川流」の三味線のついてー京都における柳川流の現状を中心としてー』を入手できたことである。この論文は当時の伝承者、楽器店への聞き取りから平成2年時点での京都における柳川三味線の現状が詳説されているほか、写真資料も豊富にまとめられており、現在柳川三味線に関するまとまった唯一の著作物である『京都の響き柳川三味線』(津田道子著、(社)京都當道会、平成10年)を補完する資料となりうるもので、今後の柳川三味線に関する研究に大きな示唆となり得るもので、今年度はこの2点の文献の精査を行なった。次に、研究期間中に法量調査を行なった楽器と研究分担者が過去に行なった江戸期の古楽器の三味線調査から、今日「柳川三味線」と呼ばれている古態の楽器は江戸期に極細の三味線に極めて近い作りがされていることがわかった。駒についても今日使われているものと似ている他、幕末期に鶴岡検校によって改良される以前の撥は古楽器に付属して伝わっている撥および江戸期の絵画資料に描かれた撥に酷似していることがわかった。研究のまとめとして東京藝術大学第1ホールで開催した「第2回古態の楽器による地歌鑑賞会」では、研究成果を報告するとともに研究協力者による柳川三味線の演奏披露を通して、柳川三味線の現代の受容の可能性について来場者へのアンケートを行い、今後の研究のための発展的な示唆を得ることができた。研究初年度である本年は、基礎的研究と仮説の構築、三味線製作者への聞き取り調査、フィールドワークによって演奏家所有の柳川三味線の現物調査、演奏家へのインタビュー、師匠筋の芸談や自身の経験についての情報収集、録音に残っているかつての柳川三味線の音色についての調査を行なった。楽譜と演奏音源を中心として、京都上派に伝わる地歌、祇園に伝わる地歌、柳川三味線についての関連資料を収集し、それらの分析・検討を通して、課題解決のための方法・内容の理論的枠組みを仮説的に構築ために、京都市内の三味線製作者へのインタビューおよび三味線製作者から寸法図や皮張りの方法についての情報を収集した。三味線についての調査では、フィールドワークによって、京都在住演奏家と収集家を中心に柳川三味線(三味線・駒・撥・皮・糸)の収集と採寸を行なった。また、かつての柳川三味線ついての音色の定義を行うために、古楽器の収集・SPレコードに残る録音音源の調査および収集をし、加えて古楽器の収集と整備収集した楽器の中で整備可能な楽器について、実際に古態の楽器の皮張りである「水張り」で皮を張り楽器として使用可能な状態とすることで、現代製作の楽器との音色の違いを波形分析で比較した。年度のまとめとしてそれまでの研究成果発表の場として「古態の楽器による地歌鑑賞会」を開催し、演奏家への意見聴取、来場者へのアンケートを行い、次年度への発展的な研究のための示唆を得た。当初に立てた年次計画に基づいて研究を進めたところ、予想以上に進捗している。特に楽譜及び音源資料、楽器製作資料については当初予想以上に成果があった。年度末に開催した成果発表会では、近年認識されている柳川三味線の音色と古態の柳川三味線の音色に違いがあることを、演奏者や来場客に認識してもらうことができ、今後の研究への大きな示唆を得られた。今年度入手した資料に基づき初年度に行った基礎的研究と仮説の再構築を行った。前年実施した成果発表会で来場者から「京都市内の邦楽器商で水張りによる皮張りが行われていること」という情報提供を受けたことに基づいて当該楽器商への聞き取り調査と研究代表者所有の楽器を水張りで修復を依頼した。その中で作業工程に関する画像資料の提供を受けることができた。完成した楽器を柳川三味線演奏家複数名に弾いてもらい、中でも戦前より柳川三味線で地歌の修業をした古老にはサワリがとても効いた良い楽器であるとの高評価をえた。8月には当該楽器を使用して舞台での演奏を行った。次に柳川三味線の演奏方法について、複数の演奏家に撥を当てる位置と皮面と撥の角度、撥を当てる強さについて実演をしてもらい、各人各様ではあったが「ムックリとした音」と表現される柳川三味線の音色を得るためにどのような工夫がなされているかについての情報収集を行うことができた。また関連して、京都上派を代表する地歌演奏家の萩原正吟の柳川三味線の演奏については、戦前は京都盲唖院でのレッスンのみで戦後は門弟への指導や公式の演奏(非公式で1度だけ演奏した)は行っていないという古老の証言について、別の萩原正吟門人に聞き取りを行いその証言が間違っていないことの裏付けを取ることができた。その他、楽譜と演奏音源を中心として、京都上派に伝わる地歌、祇園に伝わる地歌、柳川三味線についての関連資料の提供を受けることができた。京都在住の実演家の間では既知のことではあるが、京都上派の中でも、また同じ萩原正吟門下であっても同一の楽曲に複数の楽譜が存在し、そのいくつかの楽曲について楽譜を収集することができた。平成30年3月に京都市内で都内の音楽大学学生を対象として柳川三味線のレクチャーを実施し、小規模ではあるが研究成果の発表を行い研究成果を周知することができた。当初に立てた年次計画に基づいて研究を進めている。三味線製作者への調査では、伝統的な水張りの作業を撮影した写真の提供を受けた。

三味線についての調査では、フィールドワークによって柳川三味線(三味線・駒・撥・皮・糸)の収集と採寸をおこなうこととしているが、これについては十分な数の採寸が行えていない。録音に残っているかつての柳川三味線の音色についての調査として、SPレコードによる録音が始まった大正からの音源を対象として、SP盤等に残っている録音を中心に収集・調査をおこなっているが、これも絶対数が少なく新たな音源の入手はできていない。しかし、戦後のLPや私的録音された音源の入手ができデジタルファイル化を行った。収集した楽器の中で整備可能な楽器について、実際に皮を張り楽器として使用可能な状態とする点については、1挺の整備を行った。研究最終年度となる本年は、主に収集した文献、音源、楽器について精査を行なった。文献として特筆すべきは、柳川三味線演奏家の梅辻理恵氏が東京藝術大学における修士研究として平成2年にまとめた修士論文『地歌「柳川流」の三味線のついてー京都における柳川流の現状を中心としてー』を入手できたことである。この論文は当時の伝承者、楽器店への聞き取りから平成2年時点での京都における柳川三味線の現状が詳説されているほか、写真資料も豊富にまとめられており、現在柳川三味線に関するまとまった唯一の著作物である『京都の響き柳川三味線』(津田道子著、(社)京都當道会、平成10年)を補完する資料となりうるもので、今後の柳川三味線に関する研究に大きな示唆となり得るもので、今年度はこの2点の文献の精査を行なった。次に、研究期間中に法量調査を行なった楽器と研究分担者が過去に行なった江戸期の古楽器の三味線調査から、今日「柳川三味線」と呼ばれている古態の楽器は江戸期に極細の三味線に極めて近い作りがされていることがわかった。駒についても今日使われているものと似ている他、幕末期に鶴岡検校によって改良される以前の撥は古楽器に付属して伝わっている撥および江戸期の絵画資料に描かれた撥に酷似していることがわかった。研究のまとめとして東京藝術大学第1ホールで開催した「第2回古態の楽器による地歌鑑賞会」では、研究成果を報告するとともに研究協力者による柳川三味線の演奏披露を通して、柳川三味線の現代の受容の可能性について来場者へのアンケートを行い、今後の研究のための発展的な示唆を得ることができた。平成29年度は1年次に続く継続的な三味線製作者への聞き取り調査、フィールドワークによって演奏家所有の柳川三味線の現物調査、演奏家へのインタビュー、師匠筋の芸談や自身の経験についての情報収集、録音に残っているかつての柳川三味線の音色についての調査を行なう。取材する演奏家及び楽器店の範囲を広げ、現物調査では全国の博物館への調査を行う予定である。成果発表演奏会については演奏家及び来場者からも反響が大きかったことから今年度も実施したいと考えている。本研究の目的は、これまでに行われた柳川三味線について研究に再整理をすることであった。その上で、楽器としてみた柳川三味線の古態と現在の楽器との異同を明らかにし、柳川三味線以外の地歌三味線との演奏表現の違い、京都上派における地歌伝承の現況調査を行うことである。加えて、その特徴的な音色が「水張りによる皮張り」であることを検証しつつ、現在の三味線の皮張りの状況調査を行うこと、そして、文化財的視点から楽譜・音源のアーカイブ化を目的とするものである。
視床下部食欲中枢特異的遺伝子Serpinの機能の解明

視床下部弓状核は末梢臓器の栄養状態を感知するエネルギー代謝情報の中枢におけるゲートウェイであり、レプチンやインスリンなどの末梢由来ホルモンに応答する細胞が存在する特殊な脳領域である。これまでにわれわれは、肥満マウスにおける視床下部のRNA-Seqによるトランスクリプトーム解析を行うことにより、脳内では弓状核に極めて限局した発現を示し、かつ食事性肥満により弓状核のみで特異的に発現増加を示す内在性セリンプロテアーゼ阻害分子、Serpina3を同定した。本研究ではSerpinA3発現細胞を明らかにし、SerpinA3がエネルギー代謝恒常性において果たす生理的、病態生理的意義を解明することを目指して取り組んでいる。マウス脳切片を用いた免疫染色実験により、SerpinA3は視床下部においてアストロサイトやマイクログリア細胞ではなく、主としてニューロンに発現していること、特にベータエンドルフィンを発現するPOMCニューロンに発現していることを明らかにした。さらには、SerpinA3の過剰発現実験やリコンビナントタンパク質の添加実験により、SerpinA3がオートクリン的にニューロンのレプチン応答性に干渉する可能性と、マイクログリア細胞の活性化をもたらす可能性を見出した。これらの結果は、食餌性肥満により視床下部のニューロンで誘導されたSerpinA3が視床下部局所で“やせ"ホルモンであるレプチンの作用を障害し、肥満を増悪させ肥満に伴う代謝異常の原因となりうる可能性を示すものと考えられる。これまでに、CRISPR/Cas9システムによりSerpinA3をコードする遺伝子配列にflox配列を導入したノックインマウスの樹立とコロニーの繁殖に成功しており、今後はin vivoでのエネルギー代謝関連表現型の解析やその機序についての検討を重ねてゆきたい。マウス脳組織切片を用いた免疫染色実験、培養ニューロン細胞や培養マイクログリア細胞を用いた実験が予定通り実施できた。加えて、今後のコンディショナルノックアウトマウスの作製に用いるfloxマウスの繁殖に成功しており、研究の経過は概ね順調と考えている。今後はメカニズム研究とin vivoでの表現型解析の2つの研究に注力する予定である。すなわち、Tag付きSerpinA3タンパク質を用いて、ニューロンにおけるレプチン抵抗性誘導活性の評価やマイクログリア細胞活性化作用の評価を行い、Tag付きタンパク質でも再現できた場合には、Tagを用いた結合活性を指標に、古典的にはセリンプロテアーゼインヒビターと考えられてきたSerpinA3タンパク質の新しい結合パートナー分子の同定を目指す。一方で、POMCやAGRPプロモーターなど視床下部のニューロンサブポピュレーション特異的なプロモーターの下流にCREリコンビナーゼを発現するマウスとの交配により、SerpinA3コンディショナルノックアウトマウスを作製、またCAGプロモーターを用いたSerpinA3過剰発現トランスジェニックマウスを作製し、摂食量や体重、レプチン応答性を検討することでマウスの個体レベルでのエネルギー代謝制御におけるSerpinA3の役割を解明する。一方で、POMCやAGRPプロモーターなど視床下部のニューロンサブポピュレーション特異的なプロモーターの下流にCREリコンビナーゼを発現するマウスとの交配により、SerpinA3コンディショナルノックアウトマウスを作製、またCAGプロモーターを用いたSerpinA3過剰発現

トランスジェニックマウスを作製し、摂食量や体重、レプチン応答性を検討することでマウスの個体レベルでのエネルギー代謝制御におけるSerpinA3の役割を解明する。研究の遂行はほぼ予定通りに進んでいるが、floxマウスの繁殖に若干の遅延を生じ、genotypingのために使用する予定であった酵素などの試薬の使用が次年度に持ち越しとなってしまったため、約2万円の研究費の使用を次年度に繰り越させて頂きました。今年度に入って既にこの問題は解消しており、令和元年度については予定通りの内容で研究を遂行できるものと考えている。
磁気刺激と反復運動のハイブリッドによるリハビリの脳内機構の非侵襲的手法による解明

本研究代表者らは、脳卒中患者のADLを阻害する屈曲拘縮の改善に着目して、患側一次運動野(M1)への5Hz反復TMSと患側伸展筋群の反復運動を組み合わせるハイブリッド・リハビリを考案し(Koganemaru, Mima et al., Brain 2010)、本研究では機能的MRIで運動機能改善に至る脳内機構を解明する研究を行った。その結果、たんに刺激部位である患側一次運動野だけで可塑性が生じているのではなく、脳全体の運動機能ネットワークでの可塑性が生じることで臨床的改善が生まれることを示しており、今後の神経科学に基づいた科学的リハビリを創出する上で有用である。本研究代表者らは、従来の脳刺激法併用リハビリから発想を転換し、脳卒中患者のADLを阻害する屈曲拘縮に着目して、患側一次運動野(M1)への5Hz反復TMSと患側伸展筋群の反復運動を組み合わせ(ハイブリッド・リハビリ)、患側M1の特定の運動機能(手首関節の伸展)を選択的に改善する手法を考案した(Koganemaru, Mima et al., Brain 2010)。本研究計画は、この研究を発展させ、MRIと脳磁図という2種類の非侵襲的脳機能イメージング手法で運動機能改善に至る脳内機構を解明し、脳可塑性が(1)患側M1局所で生じているのか、(2)患側M1を含む脳内ネットワークの変化としても生じているのか、という問題を解決するものである。脳卒中患者11名(年齢は21-80歳、脳卒中患者は初回の皮質下の脳梗塞、脳出血患者で、画像所見等により脳卒中診断が確立され、発症後6ヶ月以上を経過したもの)を対象として、検査の開始前に、脳卒中後遺症の重症度については、リハビリテーション科医又は理学療法士又は神経内科医が評価した。介入には、Magstim Super Rapid(Magstim)を用い、すでに報告した方法にしたがって、患側M1に5Hz反復経皮的磁気刺激と手首の反復伸展運動を組み合わせたハイブリッド・リハビリを15分間行った。介入前後で機能的MRIを用いて、手指伸展・屈曲運動に関わる脳領域を記録し、神経可塑性と機能回復により、活性化する脳領域の変化を検討した。3TのMRI(現有設備)と全脳型脳磁図(現有設備)を用いた脳機能検査は、介入前、6週間の介入直後、介入2週間後、介入3ヶ月後に行う。また、臨床評価としては、日常生活での運動機能について詳細に評価するとともに、運動訓練効率及び痙縮の指標として、手指と手首の関節可動域と実験結果については解析中である。この研究を発展させ、現段階では、機能的MRIで運動機能改善に至る脳内機構を解明し、脳可塑性が(1)患側M1局所で生じているのか、(2)患側M1を含む脳内ネットワークの変化としても生じているのか、という問題を解決することを目指している。脳卒中患者11名(年齢は21-80歳、脳卒中患者は初回の皮質下の脳梗塞、脳出血患者で、発症後6ヶ月以上を経過したもの)を対象として、検査の開始前に、脳卒中後遺症の重症度については、リハビリテーション科医又は理学療法士又は神経内科医が評価した。介入には、Magstim Super Rapid (Magstim)を用い、すでに報告した方法にしたがって、患側M1に5Hz反復経皮的磁気刺激と手首の反復伸展運動を組み合わせたハイブリッド・リハビリを15分間行った。3TのMRI(現有設備)を用いた脳機能検査は、介入前、6週間の介入直後、介入2週間後に行い、実験結果については解析中である。本研究代表者らは、脳卒中患者のADLを阻害する屈曲拘縮の改善に着目して、患側一次運動野(M1)への5Hz反復TMSと患側伸展筋群の反復運動を組み合わせ(ハイブリッド・リハビリ)、患側M1の特定の運動機能(手首関節の伸展)を選択的に改善する手法を考案した(Koganemaru, Mima et al., Brain 2010)。この研究を発展させ、機能的MRIで運動機能改善に至る脳内機構を解明し、脳可塑性が(1)患側M1局所で生じているのか、(2)患側M1を含む脳内ネットワークの変化としても生じているのか、という問題を解決するために本研究を行った。脳卒中患者11名を対象として、すでに報告した方法にしたがって、患側M1に5Hz反復経皮的磁気刺激と手首の反復伸展運動を組み合わせたハイブリッド・リハビリを15分間行った。3TのMRI(現有設備)を用いた脳機能検査は、介入前、6週間の介入直後、介入2週間後に行った。

その結果、すでに報告したとおり(Koganemaru, Mima et al., Neurosci Res, 2015)、介入を行った運動である手指伸展運動については、それに関連した脳賦活が、患側一次感覚運動野、健側の帯状回運動野、運動前野で減少しており、これは運動機能改善と関連すると考えられた。いっぽう、リハビリ介入を行わなかった屈曲運動の脳内表現については介入前後での違いは認められなかった。本研究の結果は、たんに刺激部位である患側一次運動野だけでなく、脳全体の運動機能ネットワークでの可塑性が生じることで臨床的改善が生まれることを示しており、今後の神経科学に基づいた科学的リハビリを創出する上で有用な治験である。本研究代表者らは、脳卒中患者のADLを阻害する屈曲拘縮の改善に着目して、患側一次運動野(M1)への5Hz反復TMSと患側伸展筋群の反復運動を組み合わせるハイブリッド・リハビリを考案し(Koganemaru, Mima et al., Brain 2010)、本研究では機能的MRIで運動機能改善に至る脳内機構を解明する研究を行った。その結果、たんに刺激部位である患側一次運動野だけで可塑性が生じているのではなく、脳全体の運動機能ネットワークでの可塑性が生じることで臨床的改善が生まれることを示しており、今後の神経科学に基づいた科学的リハビリを創出する上で有用である。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学26年度が最終年度であるため、記入しない。順調に患者のリクルートができており、予備的解析では興味深い結果が得られつつある患者のリクルートは順調に進んでいるが、コントロール実験については計画の軽微な変更を行った。平成25年度以降は、24年度の計画(データ収集と個々人のレベルでの予備的な解析)を継続して行うものとする。H26年以降についても、H24、25年度と同様に計画を進めていく。ADLおよび脳可塑性への長期効果を見る目的で各個人での3ヶ月のフォローを行うため、実験期間としては最低2カ年を想定している。そのために、継続的研究遂行の理由で基金分を繰り越ししている被験者のリクルートの一部がが遅れているため、H26年度になっている前年度の計画を行っていく
消化管粘膜防御機構における消化管組織内補体制御因子の役割

本研究では,補体と細胞膜結合型補体制御因子の消化管における生理・病態生理的意義を,主にラット,ヒト,モルモット胃粘膜を用いて検討を行なった.ラットでは,左胃動脈を30分クランプ解放した際の胃粘膜上皮障害における補体の役割を検討したが,補体を枯渇化するCVFの前処置も,補体活性の阻害剤であるK-76COOHのいずれも虚血後に起こる粘膜障害を抑制した.ラット補体制御因子512抗原をモノクローナル抗体を用いた免疫組織科学では胃粘膜上皮,胃粘膜血管内皮に強い局在を認め,512抗体を用いての512抗原の機能阻害実験でも虚血後粘膜障害の増悪が観察された.ヒト胃粘膜ではdecay acceleratimg factor(DAF),membrene cofactor protein(MCP),homologous restriction factor 20(HRF20)を検討したところ,特に,DAFの発現が炎症(好中球・リンパ球浸潤)の程度と統計学的に有意に相関しすることを見いだした.また,Helicobacter pylori(Hp)感染者の胃液中の補体C3濃度および胃粘膜DAFの発現を除菌の前後で検討では,酸度の低い胃液ではHp感染者にC3濃度が高く,除菌が成功するとDAFの発現程度が減少することが判明しつつある.モルモットは現時点で唯一実験的にDAFの発現を遺伝子,蛋白レベルで検討できる動物種であるが,左胃動脈と大網動脈を30分間クランブしたモデルで,胃組織のDAFを検討した.免疫組織化学では,虚血後24時間,3日に,胃粘膜上皮細胞に有意なDAFの発現を認めたが,7日後には虚血前のレベルに低下した.Northern blottingでは,虚血後6時間の胃粘膜でRNA量が明らかに増加し,特殊なプローブを用いたRT-PCRでのisoformの検討では,膜貫通型が有意に増加していた.これらの成績から,特に虚血・循環障害による胃粘膜障害には,補体・補体制御因子系が重要性な役割を演ずると考えられた.本研究では,補体と細胞膜結合型補体制御因子の消化管における生理・病態生理的意義を,主にラット,ヒト,モルモット胃粘膜を用いて検討を行なった.ラットでは,左胃動脈を30分クランプ解放した際の胃粘膜上皮障害における補体の役割を検討したが,補体を枯渇化するCVFの前処置も,補体活性の阻害剤であるK-76COOHのいずれも虚血後に起こる粘膜障害を抑制した.ラット補体制御因子512抗原をモノクローナル抗体を用いた免疫組織科学では胃粘膜上皮,胃粘膜血管内皮に強い局在を認め,512抗体を用いての512抗原の機能阻害実験でも虚血後粘膜障害の増悪が観察された.ヒト胃粘膜ではdecay acceleratimg factor(DAF),membrene cofactor protein(MCP),homologous restriction factor 20(HRF20)を検討したところ,特に,DAFの発現が炎症(好中球・リンパ球浸潤)の程度と統計学的に有意に相関しすることを見いだした.また,Helicobacter pylori(Hp)感染者の胃液中の補体C3濃度および胃粘膜DAFの発現を除菌の前後で検討では,酸度の低い胃液ではHp感染者にC3濃度が高く,除菌が成功するとDAFの発現程度が減少することが判明しつつある.モルモットは現時点で唯一実験的にDAFの発現を遺伝子,蛋白レベルで検討できる動物種であるが,左胃動脈と大網動脈を30分間クランブしたモデルで,胃組織のDAFを検討した.免疫組織化学では,虚血後24時間,3日に,胃粘膜上皮細胞に有意なDAFの発現を認めたが,7日後には虚血前のレベルに低下した.Northern blottingでは,虚血後6時間の胃粘膜でRNA量が明らかに増加し,特殊なプローブを用いたRT-PCRでのisoformの検討では,膜貫通型が有意に増加していた.これらの成績から,特に虚血・循環障害による胃粘膜障害には,補体・補体制御因子系が重要性な役割を演ずると考えられた.本研究では,補体制御機構として重要な細胞膜結合型補体制御因子の消化管における意義を,ラット,ヒト,モルモット胃粘膜を用いて検討を進めている.ラットでは,補体制御因子5I2抗原をモノクローナル抗体を用いた免疫組織科学で胃粘膜上皮,胃粘膜血管内皮に強い局在を認め,本因子の存在が正常胃粘膜の維持に重要であるとの示唆を得た.ヒト胃粘膜ではdecay acceleratimg factor (DAF), membrene cofactor protein (MCP), homologous restriction factor 20 (HRF20)を検討したところ,特にDAFの発現が炎症(好中球・リンパ球浸潤)の程度と統計学的に有意に相関し,(好中球では有意確率p<0.001,順位相関係数rs=0.516で,リンパ球では有意確率p<0.01,順位相関係数rs=0.482),ヒト胃炎の病態にDAFが重要な役割を演じることを見いだした.モルモットは現時点で唯一実験的にDAFの発現を遺伝子,蛋白レベルで検討できる動物種であるが,胃虚血ストレスを負荷した後にDAFの発現が増加するどうかを中心に検討を進めている.その結果,モルモット胃粘膜DAFは虚血ストレス後約24時間で発現が増加し,約3日間発現が持続することが判明し,ヒトにおける検討と矛盾しない結果であった.

さらに,ラット左胃動脈を30分クランプ解放した際の胃粘膜上皮障害における補体の役割を検討したが,補体を枯渇化するCVFの前処置も,補体活性の阻害剤であるK-76 COOHのいずれも虚血後に起こる粘膜障害を抑制した.これらの成績から,特に虚血性胃粘膜障害における補体-補体制御因子系の重要性が明らかになりつつある.本研究では,消化管粘膜局所における補体活性化の制御機構として重要な膜結合型補体制御因子の意義を,ラット,ヒト,モルモット胃粘膜を用いて検討を進めている.ヒト胃粘膜ではdecay acceleratimg factor(DAF),membrene cofactor protein(MCP),homologous restriction factor 20(HRF20)を検討したが,特に,DAFの発現が炎症の程度と相関することを見いだした.また,Helicobacter pylori(Hp)感染者の胃液中の補体C3濃度および胃粘膜DAFの発現を除菌の前後で検討を進めているが,酸度の低い胃液ではHp感染者にC3濃度が高いこと,除菌が成功するとDAFの発現程度が減少することが判明しつつある.また,実験小動物において唯一,DAFを蛋白および遺伝子レベルで検討できるモルモットにおいて,実験的胃粘膜障害時のDAFの発現を蛋白および遺伝子レベルで検討した.左胃動脈と大網動脈を30分間クランプしたモデルで,虚血前,虚血後1,6,12,24時間,3,7日後に胃組織を採取し免疫組織化学染色を施行した.またNorthern blottingにてRNA量の変化を分析し,特殊なプローブを用いたRT-PCRで,最近同定された6つのisoformの発現変化を検討した.免疫組織化学では,虚血後24時間,3日に,胃粘膜上皮細胞に有意なDAFの発現を認めたが,7日後には虚血前のレベルに低下した.Northern blottingでは,虚血後6時間の胃粘膜でRNA量が明らかに増加し,isoformの検討では,膜貫通型の増加が見られた.さらに,ラット左胃動脈を30分クランプ解放するモデルでも,補体を枯渇するCVFの前処置や補体活性の阻害剤は,虚血後に起こる粘膜障害を抑制したが,胆汁酸による胃粘膜障害でもCVFの前処置で障害が抑制されることをみいだした.これらの成績から,種々の胃粘膜障害の病態に,補体-補体制御因子系の重要な役割を果たすと考えられる.
天疱瘡自己抗体の結合カイネティクスによる新たな病原性判定法の開発

尋常性天庖瘡(PV)はその自己抗原蛋白であるデスモグレイン3(Dsg3)に対する抗Dsg3抗体により水庖が形成される。これまでに我々はPVモデルマウスより抗Dsg3モノクローナル抗体(AK mAb)を複数単離し、新たな病原性を評価する方法として抗原と抗体の結合カイネティクスに注目し、表面プラズモンセンサー(Biacore)を用いてAK mAbとマウスDsg3蛋白及びヒトDsg3との結合解離係数(K_D)を算出し解析を行った。その結果マウスDsg3に対するK_D値は1.38×10^<-8>から4.81×10^<-10>で個々のmAbは異なるアフィニティを有していたものの、AK mAbのIn vivoにおける病原性と明らかな相関は認めなかった。そこで次にヒトDsg3に対するKn値を測定したところ5.61×10^<-7>から2.55×10^<-10>と同様に異なるアフィニティを有し、さらにmAbの結合アフィニティはin vitro dissociation assayを用いて検討した病原性と相関関係を有する事が確認された。実際の天庖術自己抗体はポリクローナル抗体であり、複数のエピトープが異なる抗Dsg3抗体が結合していると考えられる。そこで本度は異なる手法で作製したPVモデルマウスより単離した抗Dsg3mAb(NAK mA b)を用いて解析を行った。その結果異なるエピトープを認識するNAK1 mAb、NAK2 mAb、NAK7 mAb、NAK11 mAbを続けてアナライトとしてinjectionしたところNAK1 mAbとエピトープの競合するNAK7 mAbの結合は見られなかったものの、その他のNAK mA bは同時にDsg3分子上に結合できることが確認された。この結果よりIn vivoにおいても異なるエピトープを認識するDsg3抗体がDsg3分子上に同時に結合し接着障害を誘導している可能性が考えられた。以上より、Biacoreを用いた結合カイネティクス解析は天庖療の水庖形成機序の解明に有用な方法であると考えられた。天疱瘡自己抗原蛋白であるデスモグレイン3(Dsg3)と天疱瘡モデルマウスより作製した様々な病原性を有する抗Dsg3モノクローナル抗体(AK mAb)との抗原抗体結合カイネティクスをin vitroにて表面プラズモンセンサー(Biacore)を用いて解析した。まずAK mAbはBiacoreにてマウスDsg3蛋白と結合することが確認された。そこで各モノクローナル抗体の結合解離係数(K_D)を算出したところ、各AK mAbのマウスDsg3に対するK_D値は同一ではなかった。またAK mAbの病原性と結合カイネティクスの強弱について検討したが、両者の間には明らかな相関関係は認めなかった。次に病原性の異なるAK mAbをマウスに投与し、その血中半減期を測定することによりin vivoにおける病原性依存的な抗原抗体反応の解析を行った。異なる病原性を有するAK mAbをDsg3を発現しないDsg3ノックアウト(-/-)マウスおよび正常にDsg3を発現するDsg3+/+マウスに投与後、経時的に採血を行いELISA法にて血中の抗Dsg3抗体価を測定し半減期を算出した。病原性の強いAK mAbは自己抗原存在下(Dsg3+/+)では自己抗原非存在下(Dsg3-/-)に比べて有意にその半減期が他のAK mAbよりも早く、in vivoにおいては抗体の病原性の強度がその半減期に影響する可能性が考えられた。以上の結果よりBiacoreを用いた抗原抗体結合カイネティクスの解析およびin vivoにおける病原性依存的な抗原抗体反応の解析は、天疱瘡における自己抗体解析の有用な方法になるものと考えられた。次年度よりBiacoreにおいてはヒトDsg3に対する結合カイネティクスの解析、エピトープの異なるモノクローナル抗体同士の結合カイネティクスに対する影響などについて解析を進めていく予定である。尋常性天疱瘡(PV)はその自己抗原蛋白であるデスモグレイン3(Dsg3)に対する抗Dsg3 IgG抗体により細胞接着機能が障害され水疱が形成される。これまでに我々はPVモデルマウスより抗Dsg3モノクローナル抗体(AK mAb)を複数単離した。昨年度までの本研究においては、新たな病原性を評価する方法としての結合カイネティクス解析の有用性を検討するために、表面プラズモンセンサー(Biacore)を用いてAK mAbとマウスDsg3蛋白の結合解離係数(K_D)を算出した。AK mAbのマウスDsg3に対する結合カイネティクスは、同じ抗原上に結合する抗体にもかかわらず一様ではない事が判明し、また各AK mAbの病原性と結合カイネティクスとの明らかな相関関係は認められなかった。そこで本年度はまずヒトDsg3と反応性を有するAK mAbの病原性をヒト初代培養角化細胞を用いたin vitro dissociation assayを用いて検討した。細胞接着障害能はマウスDsg3に対するものと同様にAK23 mAbを代表とするアミノ末端を認識するAK mAbが強い傾向が認められた。次にヒトと交差反応性を有するAK mAbとヒトDsg3蛋白との結合カイネティクスの検討をBiacoreを用いて行った。病原性を有するAK mAbである、AK23 mAbを代表とするDsg

3細胞外領域のアミノ末端領域を認識する病原性のAK mAbは結合カイネティクスが強い傾向を示し、AK9 mAbを代表とするDsg3細胞外領域の中央からカルボキシ末端を認識する非病原性のAK mAbの結合カイネティクスは弱い傾向である事が確認された。これはヒトDsg3に対してはその結合カイネティクスが病原性と相関関係を有することを意味し興味深い結果である。今後はさらにわれわれが他に単離した新たな抗Dsg3モノクローナル抗体を用いて抗Dsg3抗体とDsg3蛋白との結合カイネティクスの詳細な検討を行う予定である。尋常性天庖瘡(PV)はその自己抗原蛋白であるデスモグレイン3(Dsg3)に対する抗Dsg3抗体により水庖が形成される。これまでに我々はPVモデルマウスより抗Dsg3モノクローナル抗体(AK mAb)を複数単離し、新たな病原性を評価する方法として抗原と抗体の結合カイネティクスに注目し、表面プラズモンセンサー(Biacore)を用いてAK mAbとマウスDsg3蛋白及びヒトDsg3との結合解離係数(K_D)を算出し解析を行った。その結果マウスDsg3に対するK_D値は1.38×10^<-8>から4.81×10^<-10>で個々のmAbは異なるアフィニティを有していたものの、AK mAbのIn vivoにおける病原性と明らかな相関は認めなかった。そこで次にヒトDsg3に対するKn値を測定したところ5.61×10^<-7>から2.55×10^<-10>と同様に異なるアフィニティを有し、さらにmAbの結合アフィニティはin vitro dissociation assayを用いて検討した病原性と相関関係を有する事が確認された。実際の天庖術自己抗体はポリクローナル抗体であり、複数のエピトープが異なる抗Dsg3抗体が結合していると考えられる。そこで本度は異なる手法で作製したPVモデルマウスより単離した抗Dsg3mAb(NAK mA b)を用いて解析を行った。その結果異なるエピトープを認識するNAK1 mAb、NAK2 mAb、NAK7 mAb、NAK11 mAbを続けてアナライトとしてinjectionしたところNAK1 mAbとエピトープの競合するNAK7 mAbの結合は見られなかったものの、その他のNAK mA bは同時にDsg3分子上に結合できることが確認された。この結果よりIn vivoにおいても異なるエピトープを認識するDsg3抗体がDsg3分子上に同時に結合し接着障害を誘導している可能性が考えられた。以上より、Biacoreを用いた結合カイネティクス解析は天庖療の水庖形成機序の解明に有用な方法であると考えられた。
小型魚類を用いたダイヤモンド・ブラックファン貧血症の発症機構の解明

先天性の赤芽球ろうであるダイヤモンド・ブラックファン貧血(DBA)患者の25%でリボソームタンパク質(RP)S19遺伝子の変異が確認された。しかし、すべての細胞に存在するRPと特定器官の異常がどう結びつくのかは全くわかっていない。そこで、正常なRPの量的不足により、赤芽球特異的に異常が起こるメカニズムをゼブラフィッシュの系で解明するために、DBAモデルの作製を試みた。まず、rps19以外のRP遺伝子も造血の異常に関わる可能性があると考え、モルフォリノアンチセンスオリゴを一細胞期の受精卵に注入する手法を用いて、21種類のRP遺伝子の発現抑制胚を作製した。これらの形態形成を24時間で詳細に観察し、さらに、2629時間胚の循環血球の密度や心拍の観察、3048時間胚に対するヘモグロビン染色を行った。その結果、rps19、rp135、rp135aおよびrp1p2遺伝子の発現抑制胚で特に血球密度の低下が観察された。これは脳や体幹の形態異常とは独立した表現型であった。つまり、造血系細胞は、これら4つの遺伝子の変異に対する感受性が高いと予想された。また、rps19発現抑制胚が示した血球数減少および形態異常は、合成したrps19のmRNAの注入によってほぼ完全に回復し、DBA患者型の変異を含むmRNAではそのような回復は見られないことを確認した。従って、rps19発現抑制胚はDBAの発症機序の解析に有用であると考えた。マウスを用いたDBAモデルの作製は成功しておらず、これまでの解析は細胞レベルに限られていた。本研究において、ヒトと同様の造血システムを有するゼブラフィッシュで貧血様の表現型を示す個体が得られたことにより、今後、RPS19が関わる赤血球形成過程について、新たな知見が得られることが期待される。ダイヤモンド・ブラックファン貧血症(DBA)の発症機序についてはほとんど知見が得られていない。重要な手がかりは、患者の約25%で確認されたリボソームタンパク質遺伝子RPS19の変異であり、その発現量が疾患と深く関わる可能性が高い。そこで、個体レベルでの解析を進めるために、ゼブラフィッシュにおいてRPS19の発現を抑制し、DBAモデルの作製を試みた。1.モルフォリノアンチセンスオリゴ(MO)による遺伝子の発現抑制ゼブラフィッシュの受精卵に、RPS19のmRNAに対するMOを微量(0.5μg/μl,0.5nl)注入してS19タンパク質への翻訳を阻害し、受精後24時間(hpf)胚の形態形成過程でおきた異常を観察した。その結果、頭部、卵黄伸長部の形成不全、耳石、尾部の変形、血球数の変化が認められた。これら表現型は、長さ25塩基のうち5塩基をミスマッチにしたMOを注入した場合にはみられないことから、S19タンパク質の量的低下によるものであると判断した。さらに、MOと共に人工合成したRPS19のmRNAを注入し、個体形成が回復することも確認した。2.RPS19発現抑制胚を用いた造血系転写因子の発現解析血球系細胞の各分化過程で特異的に発現する遺伝子(lmo2、gata1、gata2)に対するRNAプローブを作成し、816hpfで固定した胚を用いてホールマウントin situハイブリダイゼーションを行った。その結果、16hpf胚におけるgata1の発現が、正常胚に比べて減少している可能性が示唆された。3.DNAチップを用いた解析RPS19発現抑制胚(10、22、30hpf)からRNAを抽出し、ゼブラフィッシュの遺伝子14,900個のプローブが固定されたDNAチップを用いて発現解析を行った。現在、発現が大きく変動する遺伝子について解析を進めている。

本研究において、ヒトと同様の造血システムを有するゼブラフィッシュで貧血様の表現型を示す個体が得られたことにより、今後、RPS19が関わる赤血球形成過程について、新たな知見が得られることが期待される。
ラット軟骨全層欠損モデルの修復過程におけるBMPの発現と局在

6週齢ラット関節軟骨全層欠損モデルを用いて、軟骨組織により修復される幅0.7mmの小さな欠損と、線維性組織で修復される幅1.5mmの大きな欠損におけるBMPシグナリングについて検討した。欠損作成後、欠損中心領域におけるBMP-4、BMP-6、GDF-5とその受容体BMPRIA及びIB、BMPRII、ActRII/IIBの発現と局在について、免疫染色とin situ hybridyzation法を用いて経時的に観察した。幅0.7mmの欠損の軟骨修復過程では2日目、欠損中心の細胞にはBMP-4を含めリガンドの発現はみられなかったが、mRNAは発現していた。一方、受容体については、BMPRIA及びIB、BMPRIIはいずれも蛋白レベル及び遺伝子レベルで発現していた。4日目にBMP-4の蛋白の発現がみられた。BMP-6は発現していなかった。GDF-5はわずかに蛋白レベル及び遺伝子レベルでの発現がみられた。BMPRIA及びIB、BMPRIIは、2日目と同様にほとんどの細胞に発現していた。7日目には欠損中心の細胞はtype II collagen mRNAを発現する多角形細胞となり、BMP-4はその細胞と周囲の細胞に発現していた。またBMP-6とGDF-5も多角形細胞に発現していた。受容体については、いずれも多角形細抱とその周囲の細胞に発現していた。軟骨基質がみられる2週目には、BMP-4及びBMP-6はほとんどの軟骨細胞に蛋白レベル及び遺伝子レベルで発現していたのに対し、GDF-5の発現は肥大軟骨細胞に限局していた。また受容体はいずれもほとんどの軟骨細胞に発現していた。一方、幅1.5mmの欠損の線維性修復過程では、BMP-4は2日目では遺伝子レベルでのみ発現しており、4日目でわずかな細胞に蛋白レベル及び遺伝子レベルで発現していた7日目では遺伝子レベルでのみ発現していたが、それ以降発現はみられなかった。BMP-6及びGDF-5の発現は全時期を通じみられなかった。受容体についてはBMPRIA及びIB、BMPRIIはいずれの時期でも発現していた。今回の結果は、関節軟骨全層欠損の軟骨修復過程におけるBMPシグナリングにっいて、BMP-4シグナルは軟骨修復過程の開始に重要であること、BMP-6シグナルは軟骨細胞の成熟や肥大化へ関与している可能性があること、またGDF-5シグナルは軟骨細胞の肥大化に関与している可能性があることを確認するものと考えられた。術後1週では欠損部は紡錘形の未分化な細胞で充填され、欠損部深層での骨形成の進行に伴い、この未分化な細胞は多角形或いは類円形の細胞へと変化し、術後2週では修復組織の表面は隣接関節軟骨と同じ高さまで達し、また欠損部の軟骨下骨は隣接する軟骨下骨と同じ高さに達し、新生骨直上にはサフラニン-O及びII型コラーゲン陽性基質に囲まれた球状の軟骨細胞が出現した。