hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
半導体光集積回路の超高速動作に関する研究

本研究は、半導体光集積回路において、超高速光変調の方法を探ると共に、光変調器・非相反素子等の光デバイスの半導体基板上へのモノリシック集積の可能性を明らかにすることを目的として行い、以下の成果を得た。1.超高速光変調器:量子井戸構造を用いた電界印加形変調発光素子で超高速光変調の可能性を実証した。量子化次元を向上した素子として量子箱を用いた光変調器により超高速の可能性を理論的に示し、CalnAs/CaInAsP/InP量子細線レ-ザで低温パルス発振動作を確認した。また、共振型電極光変調器による超高周波帯光変調の可能性を示した。半導体レ-ザの利得スイッチングと光ファイバ-の分散特性を利用して超短光パルス列の生成を行った。2.光集積回路用半導体レ-ザ:ガスソ-スMBE法によるGalnp/AlInP-MQWレ-ザの黄色(576nm)低温パルス発振、シリコン基板上のAlGaAs/GaAsレ-ザの室温連続発振、新型の分布反射型動的単一モ-ドレ-ザで高い前後比の片端面光出力動作が得られ、また、Sb系材料の光集積回路用としての有効性を明らかにした。3.集積半導体レ-ザの特性向上:安定な単一モ-ド動作が可能な利得結合型DFBレ-ザを提案、試作し、その優れた単一モ-ド特性を確認した。量子井戸レ-ザでは、線幅に対するキャリア漏れ効果の影響を明かにし、また、超短パルス発生のレ-ザ構造依存性を理論的・実験的に明らかにした。光集積素子としては、面発光レ-ザによる2次元レ-ザアレイを試作し2次元並列光処理システムへ応用の可能性を示し、半導体レ-ザ励起による薄膜光増幅素子の試作を行った。また、超狭線幅半導体レ-ザを基に光位相同期ル-プを実現した。4.光集積回路の偏波面制御:抵損失で光集積回路に有望な共振反射形導波路の偏向特性を理論的に明らかにすると共に、コンピュ-タ制御による極めて安定な光偏波面逐次制御装置を試作した。本研究は、半導体光集積回路において、現在の動作速度をはるかに上回る超高速光変調の方法を探ると共に、光変調器・非相反素子等の光デバイスの半導体基板上へのモノリシック集積の可能性を明らかにすることを目的として行い、以下の成果を得た。1.超高速光変調器:量子井戸構造を用いた素子として、電界印加形変調発光素子の超高速光変調の可能性を実証するとともに、交差型光スイッチのスイッチ動作を実現した。共振型電極光変調器による超高周波帯光変調の可能性を示し、また、プレーナ構造複合光電素子による超短電気パルス発生を行った。光集積回路として、実際に分布帰還形レーザと吸収型光変調器の集積を行い、その高速動作を達成した。2.集積半導体レーザの特性向上:半導体レーザの線幅に対する1/f雑音の影響、高周波重畳による雑音低減、量子井戸レーザの超短パルス発生のレーザ構造依存性を理論的・実験的に明らかにした。半導体レーザ励起による薄膜光増幅素子の試作を行った。面発光レーザーの室温連続発振に成功すると共に、その高速直接変調の可能性を理論的に明らかにした。

半導体のレーザの線幅を電気的帰還により低減し、0.8kHzという超狭線幅を達成した。3.光集積回路用新半導体レーザ:0.6μm帯GaInAsP/AlGaAs分布帰還形レーザの安定な単一モード発振、シリコン基板上のAlGsAs/GaAsレーザの低温連続発振及び室温パルス発振、新型の分布反射形動的単一モードレーザの安定な単一モードこおよび高効率化を達成した。また、sb系材料が光集積回路用として有効であることを明らかにした。4.光集積回路の偏波面制御:低損失・高アイソレーションとして有望な共振反射形導波路の特性を理論的に明らかにすると共に、コンピュータ制御による極めて安定な光偏波面逐次制御装置を試作した。本研究は、半導体光集積回路において、超高速光変調の方法を探ると共に、光変調器・非相反素子等の光デバイスの半導体基板上へのモノリシック集積の可能性を明らかにすることを目的として行い、以下の成果を得た。1.超高速光変調器:量子井戸構造を用いた電界印加形変調発光素子で超高速光変調の可能性を実証した。量子化次元を向上した素子として量子箱を用いた光変調器により超高速の可能性を理論的に示し、GaInAs/GaInAsP/InP量子細線レ-ザで低温パルス発振動作を確認した。また、共振型電極光変調器による超高周波帯光変調の可能性を示した。半導体レ-ザの利得スイッチングと光ファイバ-の分散特性を利用して超短光パルス列の生成を行った。2.光集積回路用半導体レ-ザ:ガスソ-スMBE法によるGaInP/AIInP-MQWレ-ザの黄色(576nm)低温パルス発振、シリコン基板上のAIGaAs/GaAsレ-ザの室温連続発振、新型の分布反射型動的単一モ-ドレ-ザで高い前後比の片端面光出力動作が得られ、また、Sb系材料の光集積回路用としての有効性を明らかにした。3.集積半導体レ-ザの特性向上:安定な単一モ-ド動作が可能な利得結合型DFBレ-ザを提案、試作し、その優れた単一モ-ド特性を確認した。量子井戸レ-ザでは、線幅に対するキャリア漏れ効果の影響を明らかにし、また、超短パルス発生のレ-ザ構造依存性を理論的・実験的に明らかにした。光集積素子としては、面発光レ-ザによる2次元レ-ザアレイを試作し2次元並列光処理システムへ応用の可能性を示し、半導体レ-ザ励起による薄膜光増幅素子の試作を行った。また、超狭線幅半導体レ-ザを基に光位相同期ル-プを実現した。4.光集積回路の偏波面制御:低損失で光集積回路に有望な共振反射形導波路の偏向特性を理論的に明らかにすると共に、コンピュ-タ制御による極めて安定な光偏波面遂次制御装置を試作した。
障害児の母親のための母性確立及び母親支援教育プログラム開発に関する研究

本研究によって最終年度までに得られた成果は、以下のようにまとめられる。1.文献的研究から、障害児の母親の適応状態を評価する必要性が明らかとなった。そのため、母親の障害受容(適応)を評価する質問紙を作成した。これを用いて、発達障害が疑われる乳幼児をもつ母親の初期の障害受容過程の分析を行い、障害の受容には、母親と子どもの能動的相互交渉の成立が重要であることを明らかにした。2.母親、妊婦、大学生女子、高校生女子、父親、大学生男子、高校生男子、の7群を対象とし、母性概念の内包が5つの特性群から構成されることを確認した。この母性の深化モデルに基づき、障害をもつ子の母に対する母性支援モデルの作成した。3.聴覚障害児とその母親のコミュニケーションの事実過程の分析を通して、聴覚障害児の早期教育においては、子ども・家族・専門家の間の、調和的コミュニケーションの成立が重要であることを明らかにした。4.口唇・口蓋裂児の母親を対象として、彼女らの心理社会適応の背景となる要因について分析を行った。それに基づき、統合保育を行う上で母親との係わりが困難であった事例について、組織的な援助指導を行った。これらの事例を通して、母親への対応のあり方等を検討した。5.重複障害児の母子相互作用を追跡的に分析を行い、障害をもつ子どもの指導に際しては、養育者の教育活動を支援することも重要であることが分かった。6.聴覚障害幼児の読唇指導について、読唇指導法の報告・指導書をもとに各指導法の問題点を整理し、母親教育の方針にいて検討した。本年度の研究成果は、以下のように要約される。1.障害の疑いから確定診断にいたる間の、(1)母親がおかれる長期的な不安とその経過、(2)それが母性形成に及ぼす影響、そして(3)それに対する母親支援のあり方等に関する問題について、PSYCINFO、MEDLINE等のデ-タベ-スを利用して文献的に整理分析を行なった(村井、高林、高橋、早坂)。2.母親の母性段階を査定するための、母性段階質問紙を構成した(仁平)。3.視覚障害児の母親の母性確立を促し、その育児行動を支援するプログラムを作成するための基本的要件を探ることを目的に、愛着行動の形成不十分な障害児とその母親の事例を追跡検討した。まず、愛着行動形成過程について資料を整理し、児童の探索活動、交信活動の発達と関連させて分析を加えた。また、これまでのいくつかの実践事例をまとめ、視覚障害幼児の能動的・自発的行動を促進させるためのカリキュラム作成を行なった(新谷、吉武)。4.聴覚障害児・脳障害児の行動形成過程における母親の役割を明らかにするため、母子交信上、聴覚障害児の母親に必要でありながら難解な読唇の知識について、実験および文献研究を行い、簡明なモデル化を試みた。また、脳障害児20名を対象に、コミュニケ-ション・言語形成を行なった。その結果、コミュニケ-ション、音声言語の形成過程の資料を得た。特に音楽の活用が音声言語形成に有効である事が判明した(菅井、坂本)。5.口唇・口蓋裂児の母親の心理的適応に関わる要因の分析を行い、母親の人格特性や家族などの環境要因が、母親の子どもの障害の受容に大きく関与していることを明らかにした(足立)。平成4年度においては、母親支援教育プログラムを作成するための基礎資料である、障害児の母親の心理反応過程の実態や対処行動の分析が主として行なわれた。本年度の研究の進展状況とそこでの知見の主たるものを、以下に要約する。(1)昨年度の文献的な研究から、母性発達段階の評価尺度、ならびに障害児をもつ母親の現在の適応状態の評価尺度について、新たに作成する必要性が明らかとなった。そのため、障害児をもつ母親との面接調査を行い、尺度作成のための基礎資料を得た。

また、思春期以降の女子を対象とした母性の発達段階評価尺度については、主として女子高校生を対象に、その適用研究を行なった(村井、高林、高橋、早坂)。(2)障害児の母親の母性を測定する尺度を作成するために、従来の母性尺度の比較検討を行うとともに、新たな母性尺度を構成してきた(仁平)。(3)障害児母子通園施設での資料の収集は、一応その結果の分析が可能な程度に達した。これまでの分析から、母子間の円滑なコミュニケーション成立の条件を抽出し、母親支援プログラムの作成に取りかかった(菅井、坂本)。(4)昨年度に続いて、重複障害児2名とその母親について、母子の相互作用について追跡してきた。その結果、母親の子どもに対する認知的・情動的枠組みの変容をとらえることができた(新谷、吉武)。(5)口唇・口蓋裂児の母親の不安内容の分析から、母親が知覚する子どもの問題には、健常児の親と同類のものと、障害に起因するものの2種類があることが明かとなった(足立)。本年度の研究成果は、以下のようにまとめられる。1.平成3年度に行なった文献的研究からの知見に基づき、母親の障害受容(適応)を評価する質問紙を作成した。これを用いて、発達障害が疑われる乳幼児をもつ母親の初期の障害受容過程の分析を行い、障害の受容には、母親と子どもとの能動的相互交渉の成立が重要であることを明らかにした。2.母親、妊婦、大学生女子、高校生女子、父親、大学生男子、高校生男子の7群を対象とし、母性概念の内包が5つの特性群(ステレオタイプ的母、愛する母、養育する母、健康な母、開かれた母)から構成されることを確認した。この母性の深化モデルに基づき、障害をもつ子の母に対する母性支援モデルの作成した。3.実際の聴覚障害児とその母親のコミュニケーションの事実過程の分析を通して、聴覚障害児の早期教育においては、子ども・家族・専門家の間の、調和的コミュニケーションの成立が重要であることを証明した。4.統合保育を行う上で母親との係わりが困難であった2つの事例について、障害児の母親の適応を説明する新しいモデル(Wallander et al.,1988)に基づき、組織的な援助指導を行った。これらの事例を通して、母親の子供の発達に対する過剰な期待、また発達に目に見えた変化がない時期の母親への対応のあり方、などを考察した。5.障害をもつ子どもの指導を効果的に行うためには、養育者の養育活動を支援することも重要な要件である。コミュニケーションの活動が初期状態にある6名の教育相談事例を通して、強化すべき適合的養育態度と、抑制すべき不適合的養育態度を考察した。6.聴覚障害幼児の読唇指導は、一般には母子教育の形式をとって行われている。読唇指導法の報告・指導書から、それぞれの指導法の問題点を整理し、母親教育の方針について検討した。
臓器再生をめざした唾液腺分枝形態形成機構の解析

本研究は、口腔乾燥症(ドライマウス)の新しい治療法を開発するために、唾液腺再生をめざして、臓器形態形成機構を解明することを目的としている。具体的には、胎生期マウスの唾液腺の分枝部位(cleft)と非分枝部位(bud)から、上皮組織を摘出し、比較することにより、形態形成に寄与する新規遺伝子群を明らかにすることである本研究は、口腔乾燥症(ドライマウス)の新しい治療法を開発するために、唾液腺再生をめざして、臓器形態形成機構を解明することを目的としている。具体的には、胎生期マウスの唾液腺を用いて、分枝部位(cleft)と非分枝部位(bud)から、組織を摘出し、形態形成に寄与する新規遺伝子群を明らかにする予定である。平成19年度に実施した研究の成果については、1.器官培養システムの構築米国NIHから大阪大学に赴任後、新しい研究室と研究グループを立ち上げて、器官培養実験を開始した。2.胎生期マウス唾液腺組織のレーザーマイクロダイセクションの実施マイクロダイセクションを行うための、凍結切片作製の条件決めを行った。組織は15μmの厚みを超えるとレーザーによる切り出しは困難となり、12μm程度の厚みで切り出しを行うと操作性と組織回収効率がよかった。唾液腺を器官培養し、組織を摘出後、RNase等による組織変性を防ぐための予備実験を行い、RNA抽出後、遺伝子解析を続けるために十分な質と量であることを確認した。3.抽出したRNAからcDNAの合成それぞれのRNAからT7RNA amplification法を用いて、遺伝子を増幅した後、遺伝子解析に適切な純度であることを確認し、T7-SAGE法の条件決めを行った。現在、cleftとbudの唾液腺上皮から、組織を回収し、RNAを抽出し、遺伝子発現解析に向けてのRNAの量と質を確認しているところである。唾液腺形成時期における唾液腺上皮cleftに発現する遺伝子のprofileを作成するため、研究をさらに推進する予定である。具体的には、胎生期マウスの唾液腺の分枝部位(cleft)と非分枝部位(bud)から、上皮組織を摘出し、比較することにより、形態形成に寄与する新規遺伝子群を明らかにすることである。平成20年度に実施した研究の成果については、1.唾液腺の分枝形態形成に関わる遺伝子のスクリーニングcleftとbud領域の上皮組織からT7-SAGEライブラリーを作製し、それぞれの領域に発現する遺伝子群を同定した。cleft/budとして比較し、cleftに強く発現する遺伝子に着目した。2.cleft上皮に特異的に発現する遺伝子の発現量・発現分布確認定量的real-time PCRとin situ hybridization法を用いて、同定した遺伝子(仮名:遺伝子A、名称検討中)がcleftに強く発現していることを確認した。遺伝子AのsiRNAを作製し、器官培養中の唾液腺に導入したところ、分枝形態形成が阻害され、分枝形態形成に関与する可能性が示唆された。4.器官培養を用いた遺伝子導入実験アデノウィルス等を用いて、唾液腺に遺伝子Aを強制発現させようと準備中である。哺乳類の臓器への遺伝子導入はなかなか安定した結果が得られず、過去の研究においても成功例が少ないのが現状である。技術的に改良を加え、人工唾液腺臓器モデルの開発へと研究を発展させる予定である。
古代天皇系譜と氏族始祖伝承の形成に関する基礎的研究

『古事記』『日本書紀』に記される天皇関係系譜の復原を前年度に引き続いて行った。とりわけ,6世紀中葉後半期に造作されたと推測されるものに重点を置いた。この時期には和珥氏が王統譜形成に大きな役割を果たしたことが,和珥氏系の皇子女名が架上されていること,血縁関係も多く架上されていること,「某+タラシ」形式の天皇・皇族名とともに,「ヒコ+某」形式の人・神名や「ヤマトネコ」系の人名も和珥氏と関係をもつことから、明らかになった。また,和珥氏が,この事実によって,大きな勢力を有するものであったことも,明らかになったと言いうる。蘇我氏が当該期に「大臣」として有力であったことは周知のことであるが,「タケ+某」形式の人名との関係やこの形式の人名の系譜が復原しえたにとどまり,蘇我氏の新興性がこのことからうかがえることになった。拙著『古代の天皇と系譜』(1990年10月,校倉書房刊)で天皇系譜の架上過程から,王統譜形成に継体朝,欽明敏達朝,推古朝の三段階を『記』『紀』編纂以前の画期として想定した。欽明敏達期の系譜の復原との関係で,それより前の段階での系譜が変改されたとみられるものが幾つか発見しえた。その復原も今行っているところであるが,少なくとも次のことは明らかになったと思う。神武=カムヤマトイハレヒコホホデミは欽明敏達期に成立したものであり,それ以前はイハレヒコとホホデミとは分離独立していた。イハレヒコに代表される「某+ヒコ」形式の人名は継体期の王統譜で既に位置づけられていた。この「某+ヒコ」はそれぞれの妃とされるものとの関係から、磯城周辺の氏族との関係が想定されるということである。『古事記』『日本書記』にみえる人名及び神名とそれぞれの名の形態をもとに,「某+ヒコ」「某+ミミ」「ヒコ+某」「某+タラシ」「某+ワケ」などに分類し,それぞれの系譜の形成過程を検討すとともに,それらの形式の人・神名と諸氏族とのかかわりを追求している。その結果、『古事記』『日本書記』に伝えられる系譜が形成される前に,和珥氏や蘇我氏などによって系譜が形成,あるいは改変されていたことが,具体性をもって指摘しうるようになった。系譜の復原を通して,固形式の人・神名が6世紀中葉前後の段階において,密接なつながりを有するものとして王統譜に位置づけられていたことが推定できるようになった。とりわけ重視して検討を加えたのが「ヒコ+某」形式の人・神名であるが、それぞれの人・神名と関係する后妃や氏族,その他説話を含む伝承を勘案したことにより,和珥氏系とのつながりが極めて大きいことが判明した。また,この「ヒコ+某」形式の神・人名の本来の系譜関係については,6世紀段階の現実に存在した継体・安閑・宣化・欽明・敏達の系譜をもとに造作されていたことがほぼ確定的に言えるようである。『古事記』『日本書記』にみられる系譜にどのようにして定着するにいたったかは未だ検討中ではあるが,「某+ミミ」の神・人名と関係が深いことが明らかとなったことから,この「ミミ」系譜の変改がまず問題であること,次いで和珥氏と対立的存在であった蘇我氏による変改が推測できる。なお,両「某+ミミ」の神・人名は多氏と密接な関係を有したことが明らかとなったことから,ほとんど実体が伝えられていない多氏について,和珥・蘇系氏と勢力を争えるほどのものであった可能性が出てきており,6世紀前半以前の倭政権の構造を考える新たな課題も設定できそうに思われる。

イハレヒコに代表される「某+ヒコ」形式の人名は継体期の王統譜で既に位置づけられていた。この「某+ヒコ」はそれぞれの妃とされるものとの関係から、磯城周辺の氏族との関係が想定されるということである。
マルチカラーFACSによる成人T細胞白血病細胞の解析とハイリスクキャリアの同定

本研究は成人T細胞白血病細胞がCADM1+/CD7-の集団として同定され、治療経過のモニターで有用であること、HTLV-1感染細胞は腫瘍化の過程でCADM1-/CD7+、CADM1+/CD7dim、CADM1+/CD7-と変化し、これらの発現パターンにより中間段階の細胞を純化できること、ハイリスクキャリアではこれら中間段階の細胞が増加していることを明らかにした。1)急性型ATLのマルチカラーFACS(HAS)による解析今年度はあらたに10例の急性型症例の解析を追加し合計15例での検討を行った。急性型におけるCD3dim/CD7(-)の集団をソーティングしサイトスピン標本を検討した結果、この集団にはflower cellが濃縮されていた。さらにinverse PCRによりmajorなclonal bandが検出され、この集団がATL腫瘍細胞集団と考えられた。本法によるATL細胞検出効率の評価のためTCR Vβrepertoireを解析したところ、この集団は98%以上が同一クローンであり、他の集団はバックグラウンドと同様であったことからHASによるCD3dim/CD7(-)集団の検出は100%近い高純度でATL細胞を濃縮していると考えられた。これら症例を治療経過に伴い継時的に解析したところ病勢を非常によく反映し、治療抵抗性になる症例では早期にCD3dim/CD7(-)集団が増加し、病勢評価の有用なツールとなることが明らかになった。2)ATL各病型のHASによる解析とハイリスクキャリアの同定6例のくすぶり型(うち3例皮膚型)、7例の慢性型、33例のキャリアの解析を行い、くすぶり型ではCD3dim/CD7dimの集団が増加し、CD3dim/CD7(-)集団も増加すること、慢性型ではくすぶり型に近いものからCD7(-)の割合が高く急性型に近いパターンを示すものまで存在すること、キャリアでは多くの症例は健常人に近いパターンを示しCD7dim%vs.CD7(-)%の2次元プロットでゾーン分けできることが判明した。キャリアの一部ではくすぶり・慢性型ゾーンに入るものがあり、これらの症例は末血プロウイルス量が高い、異常リンパ球の割合が高いなどハイリスクと考えられる症例で一部はくすぶり型に移行、ハイリスクキャリアの同定に有用な方法となり得ることが示唆された。HTLV-1キャリアからATLへの病態進行に伴うCD3/7FACS(HAS)はさらにキャリア症例の解析を追加し、病態によるパターンを確立し現在論文投稿中である。一部のキャリアがindolent ATLと同様のパターンを示し、これらのデータがもとになって、厚労科研「ATLの診療実態・指針の分析による診療体制の整備に関する研究」において病型分類の再検証が始まっている。CD7highとdimの分離をより明確にするため、ATLで高発現することが報告されているTSLC-1(CADM1)を加えた解析を行い、TSLC-1はCD7の発現の低下とともに高発現しており腫瘍化過程の早期から発現することを明らかにするとともに、これを用いてCD7high/dimをクリアに分離できることを示した。これら集団をソーティングし、東大新領域渡邉俊樹教授との共同研究で発現アレイ解析を行い、CD7highとdim/lowは明瞭に発現パターンが異なるがdimとlowは極めて似ており、特定のシグナル系が活性化している可能性が示唆された。東大先端研油谷浩幸教授との共同研究によりDNAメチル化の網羅的アレイ解析も進行中である。急性型症例の解析を継続し、急性型症例の治療に伴うプロカウント法による定量的ATL細胞同定系を確立した(論文準備中)。治療経過に伴い、継時的にCD7low集団のTCR Vβレパトア解析を施行すると、CD7減少時でも大部分は発症時と同じクローンであるが、一部別クローンが検出された。このことは最終的なATLへの腫瘍化はCD7low集団の中で起こることを示唆しており、急性型症例のCD7low集団とindolent ATL症例のCD7low集団をアレイ解析で比較することで腫瘍化に寄与する異常を検討する予定である。HTLV-キャリアATL患者のCD3/7の発現パターンのmulti-color FACS解析(HAS1G、論文報告)にATLで高発現していることが報告されているTSLC1を組み込んだ解析系(HAS2G)を昨年度までに開発し、今年度約60例のキャリアATL患者の末梢血をHAS2Gで解析を行い、TSLC1(+)/CD7dim、TSLC1(+)/CD7lowの集団が病態の進行とともに増加することを確立した。これらの集団において最近ATL細胞で著明に発現が低下していることが報告されているmiR31の発現を検討したところ著明に低下しており、一部のキャリアではすでに腫瘍化の過程を進行しているクローンが出現していることが明らかになり、これらの症例は発症ハイリスク群と考えられた(論文準備中)。さらにこれらの集団を対象にした発現アレイ解析によって検出された腫瘍化過程で発現が変化する遺伝子、あるいはパスウェイの解析を進めS1Pパスウェイなどいくつかの重要なパスウェイの関与を示唆する結果を得て、現在その詳細を解析中である。

TSLC1を組み込んだHAS2GはTSLC1(+)/CD7lowという集団として明瞭かつ特異的に急性型ATL腫瘍細胞を検出するためいろいろな応用が可能であり、1つHAS1Gでは非腫瘍性T細胞のCD7発現が著明に低下するため解析できなかった造血細胞移植後症例における残存、再発ATL細胞の検討であり、7例の移植後患者で末梢血を解析し移植後再発を早期に検出可能であることを示した。また、近年の抗CCR4抗体の臨床導入に伴いATL細胞のCCR4発現の有無の検討が重要になって来ているが、これまでの検出法ではATL細胞以外の影響を受けるため正確な評価は時に困難であったがHAS2Gと組み合わせることでATL細胞のCCR4発現を明瞭に解析できることを示した。当初の計画になかったTSLC-1を加えた解析系を開発し、その結果当初予測されたよりはるかに正確な解析が行えるようになった。また、CD7dim/low集団の解析についてもよりpureな解析系を導入したことにより明瞭なデータが得られるようになり(以前の系で行った発現アレイでは明瞭なデータを得られなかった)、HTLIV-1感染細胞腫瘍化初期における変化の手がかりが得られつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究開始年度に立てた研究目標はほぼ達成されており、CD7dim/low集団のcharacterizationも進みつつある。今後は、さらにこれらの集団のcharacterizationを進める。研究実績の概要に記載した急性型症例のCD7lowとindolent typeのCD7low集団のアレイ解析により腫瘍化に重要な遺伝子発現変化が見いだされれば、そこから新たな研究の展開が期待される。ハイリスクキャリアとindolent ATLを一緒にした病態概念については、今後上記厚労科研「ATLの診療実態・指針の分析による診療体制の整備に関する研究」(塚崎班)との共同研究として解析を進めていく予定である。
光合成生物の塩ストレス防御に対するNa^+/H^+アンチポーター遺伝子の役割

植物のNa^+/H^+アンチポーターは、ナトリウムイオンの細胞外への排出および液泡への蓄積、細胞内pHおよび体積の調節など植物生理学的に極めて重要な役割を果たしていると考えられているが、その分子的性質の解明が望まれている。本申請課題では、植物・ラン藻のアンチポーターが、1)どのような膜スパン(トポロジー)構造をとっているか、2)輸送するイオンは何か、3)イオン輸送に関わるアミノ酸の特徴は何か、を分子レベルで明らかにする。同時に、4)アンチポーター遺伝子を導入した植物、ラン藻を作出し、耐塩性植物の開発を目指して研究を行なった。.その結果、次のような成果を得た。2)ゲノム解析の結果、ラン藻には1個のCa^<2+>/H^+アンチポーター遺伝子をもっていることが予想された。Ca^<2+>/H^+アンチポーター遺伝子を耐塩性ラン藻から単離し、その性質を検討した結果Ca^<2+>/H+アンチポーターはアルカリ性のpHで塩濃度が高いときに重要な役割を果たすことを明らかにした(Waditee et al.,J.Biol.Chem.,2004)。3)ゲノム解析の結果、ラン藻には2個のNhaP型Na^+/H^+アンチポーターと3個のNapA型Na^+/H^+アンチポーター遺伝子が存在することが明かとなった。NapA型アンチポーターは植物、動物、バクテリアで機能に不明な点が多いので、NapA型アンチポーター遺伝子を耐塩性ラン藻から単離し、その性質を検討した。研究は順調に進行し、投稿準備中である。4)耐塩性ラン藻に存在するもう一つのNhaP型アンチポーター遺伝子ApNhaP2を単離し、そのイオン輸送活性、構造、生理的役割について検討した。これについても、研究は順調に進行し、投稿準備中である。5)植物(アラピドプシス)の細胞質膜には多数のNapA型アンチポーター遺伝子が存在するが、それぞれのアンチポーターの役割を明らかにするために、RTPCRで単離し、膜スパン(トポロジー)構造、輸送するイオンにういて検討をを検討した。。6)これらの遺伝子のいくつかを植物に導入した形質転換植物の作出を進めている。7)これら成果の一部については、高倍(2件)、waditee(2件)がイギリ、オックスフォーで開催された会議、およびハワイで開催されて国際会議で発表した。このように、本研究課題は順調に進行している。植物のNa^+/H^+アンチポーターは、ナトリウムイオンの細胞外への排出および液泡への蓄積、細胞内pHおよび体積の調節など植物生理学的に極めて重要な役割を果たしていると考えられているが、その分子的性質は今後の課題である。同時に、4)アンチポーター遺伝子を導入した植物、ラン藻を作出し、耐塩性植物の開発を目指すことである。3)耐塩性ラン藻に存在するもう一つのNhaP型アンチポーター遺伝子ApNhaP2を単離し、そのイオン輸送活性、構造、生理的役割について検討した。これについても、すでに、多くの有用な知見が得られている。4)植物(アラビドプシス)の液泡膜には6種類のNhaP型アンチポーター遺伝子が存在するが、それぞれのアンチポーターの役割を明らかにするために、RTPCRで単離し、膜スパン(トポロジー)構造、輸送するイオンについて検討をはじめている。5)これらの遺伝子のいくつかを植物に導入した形質転換植物の作出を進めている。6)これら成果の一部については、高倍(1件)、waditee(1件)がイギリス、オックスフォードで開催された会議で発表した。

4)耐塩性ラン藻に存在するもう一つのNhaP型アンチポーター遺伝子ApNhaP2を単離し、そのイオン輸送活性、構造、生理的役割について検討した。これについても、研究は順調に進行し、投稿準備中である。5)植物(アラピドプシス)の細胞質膜には多数のNapA型アンチポーター遺伝子が存在するが、それぞれのアンチポーターの役割を明らかにするために、RTPCRで単離し、膜スパン(トポロジー)構造、輸送するイオンにういて検討をを検討した。研究は順調に進行し、投稿準備中である。。6)これらの遺伝子のいくつかを植物に導入した形質転換植物の作出を進めている。7)これら成果の一部については、高倍(2件)、waditee(2件)がイギリ、オックスフォーで開催された会議、およびハワイで開催されて国際会議で発表した。このように、本研究課題は順調に進行している。
上皮の細胞間接着・極性形成におけるクローディンの役割とその下流シグナル

前年度には、タイト結合膜貫通分子クローディン-6が、F9幹細胞の上皮分化コーディネーターとして働くことを示した。今年度はそれに引き続き、上皮分化誘導に必要なドメイン決定、共役分子と転写因子の同定、マウス胚性幹細胞(ES細胞)を用いた知見の一般化を行った。まずは、2種のCldn6細胞外ループ欠損体をF9幹細胞に導入し、Cldn6どうしの対合に必要な第二細胞外ループを欠損するCldn6は上皮分化誘導を示さないことがわかった。また2種のC末端細胞内ドメイン欠損体をF9幹細胞に導入し、上皮分化誘導にはC末端細胞内ドメインの前半が必要であることがわかった。またC末端にある4つのチロシン残基をアラニンに置換した変異体を導入し、上皮分化誘導には第196番と第200番のチロシン残基およびそのリン酸化が必要であることを明らかにした。続いて免疫沈降法ならびに各種阻害剤処置を試行し、活性型Srcファミリー・キナーゼがCldn6と共役して上皮分化誘導することを突き止めた。またRNA干渉法およびレチノイド受容体ノックアウト細胞を用いた検討から、Cldn6による上皮分化誘導は転写因子としてレチノイド受容体とHepatocyte Nuclear Factor-4α(HNF4α)を介することがわかった。最後に多分化能を保持したより生理的な幹細胞であるマウスES細胞の胚様体形成過程を解析することで、ES細胞においてもCldn6が上皮分化を誘導することを示し、これまでの知見を一般化した。本研究によってCldn6が新たな上皮分化トリガーとしてはたらくことが示された。転写因子による分化誘導は多数の報告があるが、単一の細胞接着分子による上皮分化誘導はこれまでに報告がなく、本例は再生医学および発生学において新たな展望をもたらすものである。タイト結合膜貫通分子クローディンとそれを含む細胞間接着装置複合体が、幹細胞を上皮細胞に分化させるコーディネーターとして働くことを示すため、次の実験を遂行した。まず以前より樹立していた、マウスF9幹細胞にタイト結合分子クローディン-6(Cldn6)を恒常発現させた、F9:Cldn6細胞について詳細な解析を行った。その結果F9:Cldn6細胞では、他のタイト結合分子や極性制御分子の発現がCldn6の発現量に依存して亢進しており、形態的にも発達した細胞間接着装置複合体と高度の細胞極性を有する成熟上皮細胞への分化を認めた。これらの作用はRNAiによるCldn6のノックダウンで抑制された。クロストリジウム腸型毒素のC末ペプチドであるC-CPEは、細胞障害をきたさずにCldn6を細胞膜上から除外することができる。F9:Cldn6細胞に対してC-CPEを処置したところ、Cldn6の発現量は保たれているものの、上皮分化が有意に抑制された。したがってCldn6による細胞間接着が、上皮細胞分化における新たなコーディネーターとなることが示された。さらに下流シグナル分子を同定するため、Cldn6のC末変異体ならびに欠損体の発現ベクターを作成し、これらの恒常発現株を樹立して解析中である。また免疫沈降法ならびに質量解析法を用いて、Cldn6と共役する分子の候補を複数得ており、これらについても解析を進めている。本研究によってCldn6を中心とした蛋白質複合体が新たな上皮分化コーディネーターとなることが示されれば、幹細胞を上皮細胞に分化誘導する手法を確立する新たな突破口になると考えられ、再生医療の発展に大きく寄与するものと期待される。年次計画に示したとおり、順調に進展している。Cldn6を含む細胞間接着装置複合体の機能と下流シグナルについて解明するために、下記の検討を行う。

Cldn6のC末変異体およびC末欠損体を恒常発現させたF9幹細胞を樹立し、その性状を解析する。免疫沈降法並びに質量解析法によって得られた、Cldn6と共役する可能性のある複数個の候補分子の機能ついて、過剰発現ならびにRNA干渉法などの手法を用いて性状解析する。さらにマウスES細胞を用いて、F9細胞で得られた知見が一般化できるかどうか検討する。
発達障害者の感覚特異性の脳磁図計測と再現モデルによる診断・評価・支援システム構築

自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder; ASD)児・者の6995%が何らかの感覚の問題を有しており、聴覚や視覚に代表される感覚異常を呈することが多いことが報告されている(Hazen, 2014)。音に対する不安や恐怖や、光に対する過敏さによる視界の不明瞭さにより日常生活適応に影響を及ぼしているものの(Lane et al., 2010, 2011)、その神経科学的な基盤は未だ明らかではなく明確な治療法はない。本研究では1)ASD児において視覚過敏の合併率と特徴2)視覚提示課題に対する脳の反応における違い3)日常生活場面でよく見られる動画+音声の刺激に対する反応の違いについて検討を行った。結果:コミュニティーサンプル(TD)58名、当院に通院中の自閉症児61名にアンケートを行った。TD群と比較して光の粒子状や輝度の強調された視覚効果がASD児に多いことがわかったMEGを用いた研究においては輝度を増強した刺激や水玉のようなノイズを重ねた刺激を用いて行った。視覚刺激に対する一次視覚野の反応の潜時は刺激の種類によらず一貫しており、TDとASDで明らかな差はなかった。一方一次視覚野の反応の大きさ(amplitude)はASDでTDよりも大きく、その傾向は刺激の種類によらず、一貫していた。一方動画刺激と聴覚刺激を組み合わせた刺激提示においては、最初の視覚刺激に対して感覚過敏性の強いASD群(ASD with AS)で情動に関わるinsulaの反応が有意に増強していた。感覚統合の中枢である右BanksSTSでは視聴覚同時刺激においてASD with AS群の反応が他の2群よりも明らかに増強していた。ASDの感覚刺激に対する反応性は側頭葉>後頭葉で、感覚特異性の指標の結果と一致する。また、感覚統合に関してもASD with ASでは異なる可能性がある。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は1.対象者のリクルート:6歳から10歳の男子でIQ75以上の定型発達児(TD)と自閉症スペクトラム障害児(ASD)を各6名、5名ずつ研究に参加していただいた。2.感覚特異性についてのアンケートの作成と実施:視覚刺激に対する感覚特異性について調べるためのアンケートを作成し、実施した。それによるとASD者の中には光って見えたり、光の玉のようなものが飛んでいるように見えたり、コントラストが強い見え方をする人がいることがわかった。TDにおいては日常の中で光の加減で『(実際に)光って見える」という経験を答えている人はいたが、特異な見え方をする人はいなかった。3.脳磁図計測時のタスクの作成:1)静止画刺激で3種類の視覚刺激を作成:物体の写真を撮影し、画像処理をかけてコントラストを強くしたものと、光の玉のような画像を重ねたものを作成した。2)動画刺激で風景の動画と、それをコントラストを強くした動画を作成し、動画タスクを作成した。脳磁図計測:これらのタスクを用いてTD6名、ASD5名に計測を行った。6.MEG解析結果:一次視覚野反応までの潜時に関して群間差は認めなかった。反応の大きさについてはASDで大きい傾向を示した。刺激の差異による違いについては有意な差を認めなかった。今後症例数を増やして検討を行っていく予定である。計測に関わる設定はすべて終了し、計測を開始できている点においては計画通りである。被験者数がまだ少ないため、あと半年でできるだけ被験者数を増やすように努力する予定である。現在の計測結果からプレリミナリーな結果をまとめたが、まとまった数の計測が終了してから再度検討を行い、統計的処理をしていく予定。ASDの感覚刺激に対する反応性は側頭葉>

後頭葉で、感覚特異性の指標の結果と一致する。また、感覚統合に関してもASD with ASでは異なる可能性がある。研究の進捗としては概ね順調であるが、現在の結果からみるとシミュレーションシステムを用いた刺激によってTDで"ASDと同様の脳活動を惹起する"というわけにはいかない印象である。しかし、その違いについて詳細に検討することで、よりASD児の感覚特異性の神経基盤の理解につながる可能性はある。また、今の所、どのような"感覚フィルター"を用いるのがASD者の支援につながるのかという観点では結論が出ていない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
形彫り放電加工を利用した曲り穴加工

研究目的:本研究は、これまで機械加工で2工程以上に分けて加工していた曲り穴加工を所有の汎用放電加工機に電極を左右に曲げるためのフレキシブル電極、アタッチメントを取り付けることにより、1工程での加工を実現することを目的として行った。研究方法:1.市販ミニュチュアチェーンを改良し、先端部に曲げ制御をするために銅電極を取り付け、その他のチェーン部分に取り付ける絶縁カバーを製作し、先端電極制御のためのワイヤ、挫屈防止のバネ薄板を配してフレキシブル電極を製作した。手動にて電極の曲げ制御ができることを確認した。2.制御用のパソコンに購入したコントロールボード、加工位置検出用ボードを組み込み、電極位置検出、制御用のプログラムを作成した。このプログラムよりステップモーターを制御し電極を左右に曲げ制御するアクチュエーターを製作した。3.電極制御の様子を観察するために実際の穴加工を行う前段階として2mmの薄板にて可視化加工を行い、プログラムにより先端電極の制御できることを確認した。その後曲り穴開け加工を行った。研究成果:実際の材料に曲り穴加工を行い、可視化加工と同じ曲げ角、当面の目的であった1カ所の曲り穴加工をすることができた。最終目標でもある、2カ所の目の曲がり穴加工を行ったが、曲げ加工をすることは可能であるが、意図する制御角度での曲げ加工には至っていない。継続的にプログラム、電極の改良を行っている。この電極とは別に、プラスチック球を利用した新しいフレキシブル電極を考案・製作し、可視化加工段階ではあるが2カ所の曲り穴加工が実現できた。この新電極は3次元の曲り穴加工の可能性を秘めていると考えている。これらの加工の仕組みは、折あるごとに学生に紹介している。
クルフ語・マルト語の比較文法と比較語彙集の作成

本研究において、マルト語の書き起こしコーパスに基づいた記述文法を作成し、出版の準備中である。クルフ語に関しては、文法調査と録音の書き起こしを終え、現在それに基づいて文法記述を執筆中である。クルフ語の語彙に関しては、5000語の語彙集の作成を終えた。マルト語項目の記入は今後続ける予定である。本年度は、2度のインドへの現地調査によって、クルフ語およびマルト語の民話収集と書き起こし、および文法調査をして、また語彙収集の作業を始める予定にしていた。しかし1度目の調査中に盗難によって資料を失い、そのためクルフ語についてしか調査することはできなかった。2度目の調査ではクルフ語、マルト語の調査地を確定した上で、コンサルタントから予備的語彙調査を始め、また民話等口頭伝承の採取と書き起こしを行った。クルフ語は話者数の急速な減少に直面しており、ヒンディー語の影響が少ない調査地を見つけることが困難であった。またマルト語は方言差が激しく、中心となる方言を同定することが容易でなかった。したがって調査地とコンサルタントを確定したことはきわめて重要な一歩であった。語彙については、今年度の作業は書き起こし録音から語彙を回収していくという形を取らざるを得なかった。調査期間が短いため、聞き取りによって語彙調査を行うことが容易でなく、かつ調査票を預けて記入してもらうという方法が成功しなかったので、体系的な語彙調査にはまだ取り組むことができていない。本平成21年度の前半には昨年度調査の録音を書き起こし、語彙集の項目作成を行いました。9月には、クルフ語コンサルタントであり研究協力者のバブル・ティルキ氏を招請し、語量集のクルフ語部分の作成と、録音データの書き記こしと翻訳、および文法の聞き取り調査を2週間にわたって集中的に実施しました。2月には民話など言語資料の録音と、文法の聞き取り調査を行うため、インド・ジャールカンド州のパークル県、ラーンチー県、グムラー県のクルフ語、マルト語話者の村を訪問しました。本年度予定していた調査内容のうち、語彙集の特にマルト語の部分については目標を達成できませんでしたが、録音書き起こしによる自然発話の収集と文法調査は順調に終了しました。本年度の前半には、前年度までに作成したマルト語コーパスに基づいてマルト語の文法記述と語彙表作成を行い、完成させた。現在出版を準備中である。またクルフ語とマルト語の動詞形態法について、対照研究を行い、その成果を12月にラクナウで開催されたインド言語学会大会で発表した。12月に行った現地調査ではマルト語文法のうち不明の部分について聞き取りを行い、文法記述を改訂した。クルフ語についてはコーパスをより充実させるよう、同月の現地調査でジャールカンド州グムラー県で調査地を増やし、民話を採取した。2月にはインド・ラーンチー大学からクルフ語コンサルタントを招聘して共同で録音データの書き起こし、分析と文法記述のための聞き取りを行うとともに、クルフ語の語彙集の作成を昨年度に継続して行った。
受精成立条件の免疫細胞学的・微細形態学的研究

(1)精巣上体通過精子の細胞膜膜内粒子の変動について各種哺乳類の精巣上体各部から得た精子を凍結レプリカ法により観察した。一般的に先体周囲細胞膜(PAPM)には10nmを超える大粒子と、より小さくて圧倒的多数を占める小粒子が存在する。ハムスタ-、ウサギ、ブタでは小粒子が一過性に六角配列を示し、先体後には部粒子の紐状配列が形成される。しかし膜内粒子の密度が他の動物に比べて低いヒトの精子では粒子の規則的配列は認められない。これらの結果、膜内粒子が規則的配列をとる条件として【○!1】同じ大きさの粒子が多数存在する事、【○!2】粒子が流動する事、【○!3】粒子の移動をブロックする様な集合要素の存在等があげられる。(2)ハムスタ-精子の成熟に伴う膜ステロ-ル密度の上昇についてフィリピン-凍結割断法による観察の結果、精巣上体起始部の精子ではPAPMのフィリピン-ステロ-ル複合体(FSC)は、390/μm^2であったが頭部屈曲通過後の精子では約500/μm^2と増加することが認められた。これにより膜構造が補強されると考えられる。(3)In vitro受精能獲得に伴うハムスタ-精子の細胞膜変化について精巣上体尾部から得たハムスタ-精子をTyrode液中で培養して経時的に観察した結果、PAPMのFSC密度は2時間培養後に約2030%に減少し、先体反応精子の出現する3時間後にはPAPMの小粒子が減少して膜内粒子欠損部が形成された。(4)モノクロ-ナル抗体の作製マウスの精巣から造精細胞を単離後、蛋白質を抽出して二次元電気泳動で分離し、特定のスポットをマウスに免疫してモノクロ-ナル抗体を得た。その内の13D3は同種の70kDa熱ショック蛋白質ファミリ-の一つhsc71を認識する。間接免疫蛍光法によりhsc71は造精細胞では細胞質全体に、精子では中片に局在することがわかった。1.精子成熟に伴う膜内粒子(IMP)や膜ステロールの分布変動を観察するため,精巣上体各部から得たハムスター精子をフリーズレプリカ法とフィリピン法で観察した.精巣上体頭部後半から尾部前半に存在する精子では先体部細胞膜に六角状配列したIMPが見出され,又頭部の後輪付近には線状に配列したIMPが見られた.フィリピン処理法では精子の部分によってステロール部布が著しく異り,先体部細胞膜に高密度に分布し,しかも精巣上体通過に密度が上昇することが見出された.またこの部分では大多数のフィリピンーステロール複合体がE面で凸に現れることから脂質二重層の外葉側にステロールがより多く存在し,内葉側にあるステロールよりも外部への出入りが容易な事が示唆された.2.受精能獲得に伴うIMPやステロールの変動を観察するため,ハムスター精巣上体尾部から得た精子をin vitroで培養し,経時時に1.と同様に観察した.培養開始直後の精子では先体部細胞膜のIMPは一様に分布しているが, 2-3時間培養後の受精獲得した精子の同部にはIMP消失領域が出現した.又フィリピン処理の結果,この間に同部のステロールが激減することが見出された.3.ヒトの精巣上体精子を1.と同様に観察した所ハムスターと異り,先体部細胞膜のステロールは両葉共に高密度である事が示唆された.

現在先体部細胞膜のステロール密度やステロールの存在部位(内葉か外葉か)が種による受精能獲得時間の差と相関関係を持つか否か検討中である.4.マウス造精細胞より単クローン抗体を作り,それが後期精母細胞から精子細胞を認識し,また熱ショック蛋白も認識することが明らかにあった.この抗体が認識する蛋白は精子細胞の運動に関するエネルギー変換蛋白と関係がある事が示唆された.ゴールデンハムスター精子の精巣上体内成熟とinvitroで受精能獲得に伴う細胞膜の変化を通常凍結割法とフィリピン処理法で観察した。精巣上体内精子の先体周囲細胞膜(PAPM)には大小二種の膜内粒子が区別できる。大粒子は直径約11nmで疎に存在し、小粒子は直径約89nmで圧倒的多数を占める。精巣上体尾部の成熟精子PAPMには膜内粒子の規則配列は認められないが、精巣上上体通過中には二種類の規則配列が一過性に出現する。一つはPAPMのパッチ状領域に見られる六角状配列で、遠位頭部から体部を通過中に出現する。他は先体後部後輪付近の線状配列で、"コード"に相当すると考えられ、頭部中頃から近位尾部を通過中に出現する。成熟精子ではフィリピン-ステロール複合体(FSC)はPAPMで500μm^2と精子膜中最高の密度を示す。この密度は近位頭部から得た精子では成熟精子の約70%であり精巣上体通過中に増加する。成熟精子をTyroce液で培養して受精能獲得を誘起し、経時的変化を観察すると、二時間培養後にはPAPMのFSCは約2030%に減少し、同時に先体の中間部や赤道部を被う細胞膜には膜内粒子欠損部が出現し始める。またこの時期には先体後部の後輪付近に"コード"が出現する。先体反応した精子が出現し始める三時間培養後にはPAPMの小粒子の多くが消失するが、大粒子の数には変化が見られない。残留した膜内粒子は互に集合する傾向がみられ、PAPM全域に膜内粒子欠損部が形成される。ステロールは膜の安定に関与しているといわれ、PAPMは先体外膜と膜融合を起す場であるので、成熟過程で起こるステロールの増加は精子の安全輸送に寄与すると考えられる。受精能獲得の過程ではステロールの激減に伴って膜内粒子が消失し、膜融合の条件が成立すると考えられる。他に金コロイド標識抗体法を用いて精子被覆抗原の成熟変化を追跡中であり、マウス卵透明帯を大量に得るためにパコール分離法を検討中である。(1).モノクロ-ナル抗体の作製技術を修得する目的でモノクロ-ナル抗体の作製を試みた。マウスの精巣から造精細胞を単離してタンパク質を抽出し、二次元電気泳動で分離した後、特定のスポットを切り出しマウスに免疫してモノクロ-ナル抗体を作製した。こうして得られた抗体のうちのひとつ(13D3)は71kDaのタンパク質を認識する。このタンパク質はイムノブロッティングやATP結合特性などからマウスの70kDa熱ショックタンパク質ファミリ-の一つで構成的に発現しているhsc71と同定された。この抗体13D3を用いて間接免疫蛍光法を行うと、単離した造精細胞では細胞質が一様に反応するが、精子では中片のみに局在することがわかった。現在マウス卵透明帯を大量に得るためにバコ-ル分離法を検討中である。(2).精巣上体通過及び受精能獲得に伴う精子頭部細胞膜の変動各種哺乳動物の精巣上体内精子やハムスタ-、モルモットのIn vitro受精能獲得中の精子を一部フィリピン処理して凍結割断レプリカ法で観察した。一般的に先体周囲細胞膜(PAPM)には10nmを超える大粒子と圧倒的多数を占める小粒子が存在する。
新規に同定した3つの本態性高血圧の疾患感受性遺伝子の機能解析

我々はゲノムワイド相関解析(GWAS)を行い、その新規候補遺伝子の中で3つの遺伝子に着目し多面的解析を行った。LPIN1遺伝子はその中でも特に大きくその解析を進め、LPIN1遺伝子のノックアウトマウスを飼育し、高血圧を示す事を証明した。その他2つの遺伝子に関しては、ヒト集団で再現性の確認ならびに疾患感受性アリルの同定を行った。今回の研究により、新規候補遺伝子の高血圧症への関与を示す事が出来た。ただし、機序の解明など、今後の課題である。我々が本態性高血圧症に対してマイクロサテライト多型を用いたゲノムワイド相関解析を行い、新規感受性候補領域として19か所同定した。その中でも特に興味深い3つの遺伝子(LPIN1,SMOC2,XRCC5)に関して機能解析を予定した。本研究の目的は3つの遺伝子が本態性高血圧症の感受性遺伝子であることを証明することである。2008年度は、同定した3つの本態性高血圧に対する疾患感受性遺伝子の機能解析の一部を行った。(1)3つの遺伝子に関して、前向きコホート集団約2200人での遺伝子タイピングならびに遺伝統計学的解析を行った。前向きコホート集団でのゲノム多型を診療情報としたデータベースの構築を行っている。特定の感受性アリルが血圧値に影響を与えたことを、日本腎臓学会総会ならびに日本高血圧学会で報告した。(2)内分泌臓器としての脂肪組織に着目しヒト内臓脂肪での遺伝子発現量を測定することを計画した。脂肪組織を外科的手術にて採取した。脂肪細胞の保存方法ならびにRNA化する際の最適な条件検討を行い、プロトコールを作成した。平成21年5月8日現在、38検体収集しDNA抽出ならびにRNA抽出を行った。(3)LPIN1遺伝子のノックアウトマウスであるfldマウスの飼育を行い、繁殖により安定した個体数の確保を行い、その表現型の解析としてtail-cuff法による非観血的血圧測定をした。ノックアウトマウス11匹と対照群21匹に対し、異なる週齢でtail-cuff法で25回血圧測定、平均値をそのマウスのデータとした。収縮期血圧に関して、ノックアウトマウス群は平均126mmHg、対照群は112mmHgとP値0.01以下と有意差を認めた。今後、更に個体数を確保した段階で、カテーテル挿入によるテレメトリー式の観血的血圧測定法や各臓器の病理学的解析を予定している。平成21年度以降は、上記3つの遺伝子に対して感受性アリル・感受性ハプロタイプの確定、ヒト脂肪検体での遺伝子発現量を測定し発現量を感受性アリルの関連を解析する。さらにコホート集団でのゲノム多型を診療情報とし毎年追加される臨床情報と併せてデータベースの構築を完成させる。我々が本態性高血圧症に対してマイクロサテライト多型を用いたゲノマライド相関解析を行い、新規感受性候補領域として19か所同定した。その中でも特に興味深い3つの遺伝子(LPIN1, SMOC2, XRCC5)に関して機能解析を予定した。平成21年度も引き続き、同定した3つの本態性高血圧に対する疾患感受性遺伝子の遺伝統計字的解析ならびに機能解析を行なった。(1)3つの遺伝子に関して、前向きコホート集団約2200人での遺伝子タイピングならびに遺伝統計学的解析を行い、前向きコホート集団でのゲノーム多型を診療情報としたデータベースの構築をした。さらに同定した感受性アリルならびにハプロタイプが日本人以外の他人種で再現性があることを確認するためにVanderbilt大学との共同研究に着手した。(2)内分泌臓器としての脂肪組織に着目しヒト内臓脂肪を外科的手術にて採取し遺伝子発現量の測定を開始した。平成22年5月10日現在、43検体収集しmRNAの定量を行なった。今後、診療情報・遺伝子多型情報と合わせ、発現量の変化ならびにgene-gene interactionの関係を検討しでいく。(3)LPIN1遺伝子のノックアウトマウスであるfldマウスの飼育を行い、繁殖により安定した個体数の確保を行い、その表現型の解析を行なった。カテーテル挿入によるテレメトリー式の観血菌血圧測定法や各臓器の病理学的解析を行なっている。平成22年度は最終報告年度として上記の結果をまとめ、新規高血圧感受性遺伝子の遺伝子多型ならびに組織発現、マウスを用いた表現型に関して論文化を行い、世界に新規高血圧感受性遺伝子を報告していく。2万個のマイクロサテライトマーカーを用いて、ゲノムワイド関連解析を行い19個の新規高血圧感受性遺伝子を特定し報告した。その中でodds比1.54を得たLPIN1遺伝子は、以前よりインスリン抵抗性や内臓脂肪での発現などメタボリックシンドロームとの関連がみられている。同遺伝子が高血圧に関与する報告は世界で初めてであり、ヒト内臓脂肪組織での発現を調べることで、その他の遺伝子との関連や成因の検討を行った。横浜市立大学附属病院において全身麻酔下での手術を行った患者さんから得た資料で、内臓脂肪ならびに皮下脂肪の一部を採取した。LPIN

1遺伝子以外に脂肪細胞でインスリン抵抗性やメタボリックシンドロームに関与していると報告されている、アンジオテンシノーゲン遺伝子(AGT),PPARγ遺伝子(PPARG),アディポネクチンに関する遺伝子(ADIPOQ,ADIPOR1,ADIPOR2)も遺伝子発現を定量した。高血圧として加療中の高血圧群と正常血圧群の2群に分類して、血圧値や種々の採血データ、身体所見を比較した。今回の脂肪細胞の解析から、LPIN1遺伝子がアディポサイトカインと関連のある遺伝子・タンパク質を介して高血圧を発症するという可能性を示したものであった。この3年間、我々はLPIN1遺伝子がヒト集団での高血圧症と関連する事を示してきた。その事から、糖脂質代謝をターゲットとして、ゲノム情報からin silicoで作成した化合物を作り新規高血圧治療薬を作成していく。