hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ものづくり学習における神経教育学的アプローチを取り入れたカリキュラム開発

本調査では,のこぎり引き経験の少ない大学生20名が実験に参加した。実験条件として,教示群(10名)と試行教示群(10名)を設定した。教示内容は両刃のこぎりの刃(縦引き用の刃と横引き用の刃)の違いについてであった。教示群では,先に教示を与えその後切断調査を行うことを2回繰り返した。試行教示群では,教示を行わずに1回目の切断調査を行い,その後教示をしてから再度切断調査を行った。切断成績は,のこぎり引きの切断長さと切断誤差を計測し,その平均を取ることで評価を行った。脳活動の評価では,計測中の動きに対する制限が少なく,日常生活に近い環境下での脳機能計測が可能な近赤外線分光法(NIRS:Near Infra-Red Spectroscopy)を用いた。具体的には,調査協力者ごとに酸素化ヘモグロビン濃度(Oxy-Hb)及び脱酸素化ヘモグロビン濃度(Deoxy-Hb)についてHb波形を表示した。次に,各調査協力者のHb波形から総加算平均波形を算出した。なお,Deoxy-Hb波形は,Oxy-Hb波形に比べて実験では顕著な変化を示さなかったことから,分析対象から除外した。本研究では,脳活動の計測を行っているが,データの分析には脳科学に関する専門知識や統計処理が必要であり,予定よりも多くの時間を要した。そのため,平成29年度内に予定していた論文投稿が30年度に持ち越しとなったため。本研究では,加工教育における工具操作やその指導方法について神経教育学の観点から検証した。具体的には,教示方法の異なる2つの条件を設定したのこぎり引きにおいて切断成績を評価するとともに,切断時の脳血流量を近赤外線分光法(NIRS:Near Infra-red Spectroscopy)により計測した。平成30年度は,平成27年度平成29年度までに得られた研究成果をまとめ,論文投稿を行った。論文は,科学教育研究(日本科学教育学会)第42巻第4号(2018年12月発行)に掲載された。研究成果の概要を下記に示す。のこぎり引き経験の少ない大学生20名を調査協力者として,試行教示群(最初は教示を行わずに1度切断を行い,その後教示をしてからもう一度切断を行う群)と教示群(最初に教示を行い,2度切断を行う群)を設定し,のこぎり操作時の切断成績と脳活動を測定するための調査を実施した。その結果を以下にまとめる。1切断成績について:教示群は試行回数が増えるにつれて切断の長さが伸びるのに対し,試行教示群では教示後の試行において切断長さが停滞することが示された。2脳活動について:教示群では教示が与えられても試行を繰り返すにつれて脳活動が減少していた。試行教示群では,1度切断した経験と教示された内容を統合させて作業に臨んだため,試行を繰り返しても脳活動が活性化することが明らかになった。これらの研究成果から,教示方法を変えてのこぎり引きを行うことで,脳活動に配慮した教育を施せる可能性が示唆された。27年度の予備調査により検討したのこぎり引きの教示方法に基づき,28年度は本調査を2実施する。全ての調査(予備調査を含む)は茨城大学倫理委員会の承認を経て行う。調査協力者から得られたデータの公表にあたって,個人のプライバシーを侵害しないようにする。個人情報の保護に関する申し合わせを調査票に丁寧に記載し,調査協力者の同意を得る。
神経節接合物シュワン細胞における新規LPA受容体の固定および局在解析

1,神経筋接合部シュワン細胞におけるリゾフォスファチジン酸(LPA)受容体ファミリー遺伝子群の発現解析ラツト坐骨神経の神経筋接合部および軸索周囲の各部位から複数の単一シュワン細胞を単離回収後、各細胞に由来するtotal RNAを抽出精製した.研究分担者・矢追により最近開発された単一細胞全cDNA増幅法により,先のRNAから各細胞由来全cDNA画分を調整した.これらcDNA画分を鋳型とする,シュワン細胞マーカーS-100β遺伝子特異的プライマーによるPCRを行い,これらcDNA画分が,各部位に局在するシュワン細胞に由来することを確認した.次に,LPA受容体ファミリーに属する既知遺伝子全8種各々に特異的なプライマーを用いて,先のcDNAを鋳型とするPCRを行ったその結果,既知のLPA受容体ファミリーのうち,IpA1とIpA2が両シュワン細胞において発現していること,更にIpA3とIpB1が神経筋接合部シュワン細胞特異的に発現していることが示唆された.そこで,ラットヒラメ筋切片を用いたin situ hybridizationにより,神経筋接合部シュワン細胞におけるIpA3とIpB1の発現を調べた結果,両受容体mRNAの発現は,軸索周囲シュワン細胞との比較において神経筋接合部シュワン細胞特異的であることが明らかとなった.さらに,神経筋接合部シュワン細胞で特異的に発現していることが確認されているHerpと一致して,IpA3とIpB1が発現していることを確認するため二重in situ hubridizationを行っている.2,神経筋接合部シュワン細胞に発現する新規LPA受容体の探索既知LPA受容体ファミリーの膜貫通領域アミノ酸配列におけるコンセンサス配列をもとにデイジェネレイート・プライマー混合物を設計し,これらのブライマーを用いたPCR反応を行りたが,現時点においては新規LPA受容体の同定には至っていない.1,神経筋接合部シュワン細胞におけるリゾフォスファチジン酸(LPA)受容体ファミリー遺伝子群の発現解析ラツト坐骨神経の神経筋接合部および軸索周囲の各部位から複数の単一シュワン細胞を単離回収後、各細胞に由来するtotal RNAを抽出精製した.研究分担者・矢追により最近開発された単一細胞全cDNA増幅法により,先のRNAから各細胞由来全cDNA画分を調整した.これらcDNA画分を鋳型とする,シュワン細胞マーカーS-100β遺伝子特異的プライマーによるPCRを行い,これらcDNA画分が,各部位に局在するシュワン細胞に由来することを確認した.次に,LPA受容体ファミリーに属する既知遺伝子全8種各々に特異的なプライマーを用いて,先のcDNAを鋳型とするPCRを行ったその結果,既知のLPA受容体ファミリーのうち,IpA1とIpA2が両シュワン細胞において発現していること,更にIpA3とIpB1が神経筋接合部シュワン細胞特異的に発現していることが示唆された.そこで,ラットヒラメ筋切片を用いたin situ hybridizationにより,神経筋接合部シュワン細胞におけるIpA3とIpB1の発現を調べた結果,両受容体mRNAの発現は,軸索周囲シュワン細胞との比較において神経筋接合部シュワン細胞特異的であることが明らかとなった.さらに,神経筋接合部シュワン細胞で特異的に発現していることが確認されているHerpと一致して,IpA3とIpB1が発現していることを確認するため二重in situ hubridizationを行っている.2,神経筋接合部シュワン細胞に発現する新規LPA受容体の探索既知LPA受容体ファミリーの膜貫通領域アミノ酸配列におけるコンセンサス配列をもとにデイジェネレイート・プライマー混合物を設計し,これらのブライマーを用いたPCR反応を行りたが,現時点においては新規LPA受容体の同定には至っていない.1,神経筋接合部シュワン細胞におけるリゾフォスファチジン酸(LPA)受容体ファミリー遺伝子群の発現解析ラット坐骨神経の神経筋接合部および軸索周囲の各部位から複数の単一シュワン細胞を単離回収後、各細胞に由来するtotal RNAを抽出精製した.研究分担者・矢追により最近開発された単一細胞全cDNA増幅法により,先のRNAから各細胞由来全cDNA画分を調整した.これらcDNA画分を鋳型とする,シュワン細胞マーカーS-100β遺伝子特異的プライマーによるPCRを行い,これらcDNA画分が,各部位に局在するシュワン細胞に由来することを確認した.次に,LPA受容体ファミリーに属する既知遺伝子全8種各々に特異的なプライマーを用いて,先のcDNAを鋳型とするPCRを行った.その結果,既知のLPA受容体ファミリーのうち,lpA1とlpA2が両シュワン細胞において発現していること,更にlPA3とlPB1が神経筋接合部シュワン細胞特異的に発現していることが示唆された.そこで,ラットヒラメ筋切片を用いたin situ hybridizationにより,神経筋接合部シュワン細胞におけるlpA3とlpB1の発現を調べた結果,両受容体mRNAの発現は,軸索周囲シュワン細胞との比較において神経筋接合部シュワン細胞特異的であることが明らかとなった.軸索損傷再生修復過程における両受容体タンパクの役割を調べるために現在,ラット両受容体に対するポリクローナル抗体を作製している.2,神経筋接合部シュワン細胞に発現する新規LPA受容体の探索既知LPA受容体ファミリーの膜貫通領域アミノ酸配列におけるコンセンサス配列をもとにディジェネレイト・プライマー混合物を設計した.現在,これらのプライマーを用いたPCR反応の条件検討を行っている.

1,神経筋接合部シュワン細胞におけるリゾフォスファチジン酸(LPA)受容体ファミリー遺伝子群の発現解析ラット坐骨神経の神経筋接合部および軸索周囲の各部位から複数の単一シュワン細胞を単離回収後、各細胞に由来するtotal RNAを抽出精製した.研究分担者・矢追により最近開発された単一細胞全cDNA増幅法により,先のRNAから各細胞由来全cDNA画分を調整した.これらcDNA画分を鋳型とする,シュワン細胞マーカーS-100β遺伝子特異的プライマーによるPCRを行い,これらcDNA画分が,各部位に局在するシュワン細胞に由来することを確認した.次に,LPA受容体ファミリーに属する既知遺伝子全8種各々に特異的なプライマーを用いて,先のcDNAを鋳型とするPCRを行った.その結果,既知のLPA受容体ファミリーのうち,IpA1とIpA2が両シュワン細胞において発現していること,更にIpA3とIpB1が神経筋接合部シュワン細胞特異的に発現していることが示唆された.そこで,ラットヒラメ筋切片を用いたin situ hybridizationにより,神経筋接合部シュワン細胞におけるIpA3とIpB1の発現を調べた結果,両受容体mRNAの発現は,軸索周囲シュワン細胞との比較において神経筋接合部シュワン細胞特異的であることが明らかとなった.さらに,神経筋接合部シュワン細胞で特異的に発現していることが確認されているHerpと一致して,IpA3とIpB1が発現していることを確認するため二重in situhybridizationを行っている.2,神経筋接合部シュワン細胞に発現する新規LPA受容体の探索既知LPA受容体ファミリーの膜貫通領域アミノ酸配列におけるコンセンサス配列をもとにディジェネレイト・プライマー混合物を設計し,これらのプライマーを用いたPCR反応を行ったが,現時点においては新規LPA受容体の同定には至っていない.
分子機能と形態を同時撮像する管球X線を用いた実用的超高解像度３次元蛍光CTの開発

これまで我々は放射性同位元素を使用せずにPETやSPECTといった核医学診断装置と同様の生体機能画像を得ることができる画像診断装置として、X線で励起した特定物質から蛍光を利用する蛍光CTを開発してきた。そのX線源として放射光実験施設の放射光を利用してきた。本研究では、X線源を管球X線に代えた実用的な蛍光CTを開発し、生体機能と形態の超高解像度3次元画像を同時に得ることを目的とする。本年度は、以下の研究成果を得ることができた。(1)検出システムの試作:蛍光X線検出用エネルギー弁別可能な2次元検出器として、厚さ5 mmのピクセルNaIと光電子増倍管を組み合わせた検出器を用いたデータ収集システムを構築した。アメリシウムから放出される60 keVのガンマ線を検出し、エネルギーピークを確認することができた。これによって、ヨウ素造影剤から放出される28keVの蛍光X線が検出できる可能性が示唆された。また、シミュレーションを行い、蛍光CTの投影データを得るために検出器前面に装着するマルチピンホールコリメータを設計した。(2)画像再構成アルゴリズムの開発:コーン状の管球X線に対応した透過X線CT用の画像再構成アルゴリズムを開発した。また、励起X線としてコーン状の管球X線を利用した蛍光CT用の画像再構成アルゴリズムを開発した。(3)画像解析ソフトウェア開発:蛍光CT画像(機能画像)と透過X線CT画像(形態画像)の重ね合わせ表示を可能とした。また、蛍光CT画像と透過CT画像の各画像フォーマットに対応させ、リアライン機能、リスライス機能を実装した。シミュレーションを行い、マルチピンホールコリメータの設計はしたが、作製はしていない。また、被写体の回転、管球X線の制御、検出器のデータ収集を制御するためのシステムの試作がまだである。画像解析ソフトウェアでの生体機能定量も未完である。システムの試作や画像再構成アルゴリズムの開発にはシミュレーションが必要であるが、これまでに構築した複数コンピュータによる並列処理に加えて、高エネルギー加速器研究機構の中央計算機システムのワークサーバクラスタを利用して、シミュレーションを高速に行う。これによって、システムの試作や画像再構成アルゴリズムの開発を加速させる。また、画像再構成アルゴリズムの開発や画像解析ソフトウェアの開発において、実データを利用して検証を行うが、蛍光CT装置の試作を待たずに実データに近いデータを利用して開発を推進する。具体的には、高エネルギー加速器研究機構で収集した蛍光CTデータやSPECTデータなどの入手しやすいデータを利用する。我々は放射性同位元素を使用せずにPETやSPECTといった核医学診断装置と同様の生体機能画像を得ることができる画像診断装置として、X線で励起した特定物質から蛍光を利用する蛍光CTを開発してきた。本年度は、まず放射線計測用モンテカルロシミュレーションソフトウェア(Geant4)の動作環境を構築し、X線励起によって発する蛍光を検出するシステムのシミュレーションプログラムを作成した。その後、偏光特性の違いから放射光より管球X線の方がノイズ成分となる散乱線の含有量が多くなることが予想され、この違いをシミュレーションによって比較評価した。その結果、放射光と比較して管球X線励起の場合2.5倍程度散乱線量が多くなることがわかった。したがって、管球X線励起蛍光CTでは散乱線補正がより重要となる。画像再構成アルゴリズムの開発も進めた。放射光はほぼ平行光であるが、管球X線を励起光とした場合、入射X線の幾何学はコーンビーム状となる。これに対応した透過X線CT画像再構成アルゴリズムおよび蛍光CT画像再構成アルゴリズムを開発する必要があるが、本年度はこれらのプログラムの骨格を作成することができた。また、X線画像検出器からのデータを収集するシステムを準備できた。さらに、蛍光CT画像(機能画像)と透過X線CT画像(形態画像)を重ね合わせ表示するためのソフトウェアの骨格を作成した。シミュレーションでの検討が遅れている。放射光と管球X線では、単色X線と連続X線の違いがあり、蛍光の発光量が異なるが、蛍光CT画像の画質への影響をシミュレーションで比較評価する計画であった。また、マルチピンホールコリメータの設計のためのシミュレーションを計画していたが、これらが未完である。それ以外は順調に進展している。

また、シミュレーションを行い、蛍光CTの投影データを得るために検出器前面に装着するマルチピンホールコリメータを設計した。(2)画像再構成アルゴリズムの開発:コーン状の管球X線に対応した透過X線CT用の画像再構成アルゴリズムを開発した。また、励起X線としてコーン状の管球X線を利用した蛍光CT用の画像再構成アルゴリズムを開発した。(3)画像解析ソフトウェア開発:蛍光CT画像(機能画像)と透過X線CT画像(形態画像)の重ね合わせ表示を可能とした。また、蛍光CT画像と透過CT画像の各画像フォーマットに対応させ、リアライン機能、リスライス機能を実装した。シミュレーションを行い、マルチピンホールコリメータの設計はしたが、作製はしていない。また、被写体の回転、管球X線の制御、検出器のデータ収集を制御するためのシステムの試作がまだである。画像解析ソフトウェアでの生体機能定量も未完である。シミュレーションを複数のコンピュータを用いて分散処理しているが、シミュレーション研究を推進するためにコンピュータの台数を増やして実施する。加えて、大学院生の作業補助時間を増やす。システムの試作や画像再構成アルゴリズムの開発にはシミュレーションが必要であるが、これまでに構築した複数コンピュータによる並列処理に加えて、高エネルギー加速器研究機構の中央計算機システムのワークサーバクラスタを利用して、シミュレーションを高速に行う。これによって、システムの試作や画像再構成アルゴリズムの開発を加速させる。また、画像再構成アルゴリズムの開発や画像解析ソフトウェアの開発において、実データを利用して検証を行うが、蛍光CT装置の試作を待たずに実データに近いデータを利用して開発を推進する。具体的には、高エネルギー加速器研究機構で収集した蛍光CTデータやSPECTデータなどの入手しやすいデータを利用する。
メタルハニカムによるディーゼル微粒子の処理と内部構造の最適化

ディーゼル車はガソリン車に比べると燃費がよいため,ヨーロッパを中心にその利用が増加している.しかしながら,ディーゼル車の排気ガスに含まれるすすなどの粒子状物質(PM)には発がん性があり,また,花粉症などの健康被害も懸念されている.そのため,東京都など都市部を中心に自動車の排出ガス規制が強化され,基準を満たさないトラックやバスなどのディーゼル車は新規登録ができないなどの対策がとられている.このディーゼル微粒子の対策として,コージェライトや炭化ケイ素からなる多孔質のフィルター(Diesel Particulate Filter, DPF)により排気ガス中のPMを吸着・除去する方法が開発された.しかし問題点として,フィルター内にPMが捕集されると,次第に排気圧力が増大して燃費が悪化し,最悪の場合エンジン停止に至ることが報告されている.したがって現状のフィルターは,ある程度PMが捕集された時点でフィルター自体を交換するか,PMを焼却する過程(フィルターの再生過程)が必要となっている.そこで本研究では,構造が単純で熱処理が可能なメタルハニカムについて検討した.既に3次元のX線CT法により撮影したNiCrの多孔体金属の画像から構造を分析し,その内部構造を数値解析に用いることによりメタルハニカム内の流れを調べた.解析手法には多孔体の流れに適した格子ボルツマン法(Lattice Boltzmann Method)を用い,ハニカム内の流れ,反応,拡散を考慮した流れ数値シミュレーションを行った.また,すす粒子によるフィルターの目詰まりを防ぐため,すす粒子を含む排気ガスの流れを模擬し,メタルハニカムによるすす粒子の焼却処理を検討した.フィルター内部の温度を変化させたときのすすの燃焼反応を調べた結果,すすを焼却処理するために必要なフィルター壁の温度や排気ガス中の酸素濃度などの条件が明らかとなった.ディーゼル車の排ガスに含まれる有害物質のうち,特に粒子状物質(PM)については対策が急務となっている.近年,PMを処理するフィルター(Diesel Particulate Filter, DPF)が開発されたが,効率的にPMを捕集することは容易ではない.PMをフィルターにより効率的に捕集・除去するには,実験による試行だけでなく数値解析も行い,最適な内部形状の検討などの製品開発を行うことが望ましい.本研究では,多孔体の内部にすす粒子が吸着する現象を計算により模擬した.具体的には,すすの堆積計算において,入口からすすを含んだ混合気を流入させ,多孔体壁面に衝突したすす粒子は全て壁面に吸着するとした.堆積が進んですすの質量分率が1を越えた場合は,その格子点を流体が浸入しない領域とみなす.これにより,すす粒子が吸着し流れが変化する様子が計算できるが,一旦吸着したすす粒子は脱離しないとした.また,粒子の吸着に最適なフィルターの内部構造を検討することを目的とし,二相の分離現象に着目して,任意の空隙率や濡れ面積を持つ多孔体を計算により作成した.ここで,多孔体の生成方法について説明する.計算では水と油など二相が分離する現象を.格子ボルツマン法により模擬する.このとき,二相の境界面をもとに多孔体の形状を決定した.仮想的な青と赤の二相を考え,一方の相(赤)を流体,もう一方(青)を移動しない固体と考えることにする.空隙率は計算初期に与える二相の割合から決まるので,異なる時刻における二相の分布を用いることにより,空隙率を変えずに濡れ面積のみを自由に変化させることができる.本解析の結果,(1)NiCrのメタルハニカムと同じ空隙率・濡れ面積を持つ多孔体構造を生成することができた,(2)生成させた多孔体を用いて,格子ボルツマン法により多孔体内部にすす粒子が吸着する様子を模擬することができた.ディーゼル車はガソリン車に比べると燃費がよいため,ヨーロッパを中心にその利用が増加している.しかしながら,ディーゼル車の排気ガスに含まれるすすなどの粒子状物質(PM)には発がん性があり,また,花粉症などの健康被害も懸念されている.そのため,東京都など都市部を中心に自動車の排出ガス規制が強化され,基準を満たさないトラックやバスなどのディーゼル車は新規登録ができないなどの対策がとられている.このディーゼル微粒子の対策として,コージェライトや炭化ケイ素からなる多孔質のフィルター(Diesel Particulate Filter, DPF)により排気ガス中のPMを吸着・除去する方法が開発された.しかし問題点として,フィルター内にPMが捕集されると,次第に排気圧力が増大して燃費が悪化し,最悪の場合エンジン停止に至ることが報告されている.したがって現状のフィルターは,ある程度PMが捕集された時点でフィルター自体を交換するか,PMを焼却する過程(フィルターの再生過程)が必要となっている.そこで本研究では,構造が単純で熱処理が可能なメタルハニカムについて検討した.既に3次元のX線CT法により撮影したNiCrの多孔体金属の画像から構造を分析し,その内部構造を数値解析に用いることによりメタルハニカム内の流れを調べた.解析手法には多孔体の流れに適した格子ボルツマン法(Lattice Boltzmann Method)を用い,ハニカム内の流れ,反応,拡散を考慮した流れ数値シミュレーションを行った.また,すす粒子によるフィルターの目詰まりを防ぐため,すす粒子を含む排気ガスの流れを模擬し,メタルハニカムによるすす粒子の焼却処理を検討した.フィルター内部の温度を変化させたときのすすの燃焼反応を調べた結果,すすを焼却処理するために必要なフィルター壁の温度や排気ガス中の酸素濃度などの条件が明らかとなった.
日本産アゲハチョウと寄主植物との共進化の化学的解明:アオスジアゲハの産卵刺激物質

本研究ではアオスジアゲハの産卵刺激物質を単離・同定し、日本産アゲハチョウ亜科のチョウと寄主植物の共進化における化学物質の役割の体系的な研究を完成させることを目的とした。その結果、産卵行動を刺激するにはChlorogenic acid、3-O-Glu-Quercetinが必要であることを解明し、ジャコウアゲハ族の産卵刺激物質より真正アゲハ族のそれらに近いことを解明することで、アゲハチョウの食草進化に植物に含まれる化学物質が深く関与していることを証明した。アゲハチョウの産卵行動は寄主植物に含まれる化学物質に制御されることが知られており世界的に研究が行われているが、2族の中間に位置するアオスジアゲハ族の産卵刺激物質に関する研究は行われておらず、世界中からその解明が待ち望まれている。野外の網室の中でアオスジアゲハの産卵行動を人工的に再現する生物試験を既に確立していたが、これに改良を加えるため産卵行動における誘因因子の必要性について検討した。その結果、クスノキ由来の芳香成分には本種の誘因物質が含まれることが判明し、これの存在下では誘因回数が上昇することが判明した。そこで触角電図(EAG)およびGC-EAD、GC-MSを用いて誘因物質を解析し、最終的に雌雄両成虫に対する誘因物質としてdecanalとnonanalを同定した。これら2化合物を用いて産卵刺激に関する生物試験をおこなうことで、産卵刺激活性の生物試験の成功率を上昇させることに成功した。新たに確立した生物試験方法をもとに、クスノキ葉の抽出物質を液-液分配で分画すると活性物質は有機層と水層の両画分に分配されたため、まず水層の活性成分の検討を行った。ODSカラムおよび逆相系HPLCで分画することにより活性は3画分に分画されるものの、単独では活性を示さず、これらを合一することで活性を示すことが判明した。昨年は天候不順のため生物試験が十分に行えず活性の追及はこれ以上行えなかったが、それぞれの画分の主成分について単離・精製し、機器分析の結果からsucrose,chlorogenic acidを同定した。これらの活性の有無が今後の検討課題となる。野外の網室の中でアオスジアゲハの産卵行動を人工的に再現させるために網室内にクスノキ抽出物を溶解した寒天ゲルで表面を覆ったクスノキ新鞘を設置し、さらに誘因刺激としてdecanalとnonanalを加えた産卵刺激活性評価システムを構築した。このシステムを用いてアオスジアゲハ幼虫の摂食刺激物質として同定したショ糖、Chlorogenic acid、3-0-Glu-Quercetin、α-Linolenicacidの活性を評価することで産卵刺激活性の発現にはChlorogenic acid、3-0-Glu-Quercetinが必要であることを解明した。これにより、ウマノスズクサ科を寄主としアリストロキア酸類・サイクリトール・桂皮酸誘導体類を産卵刺激物質としているジャコウアゲハ族と、主にミカン科を寄主としフラボノイド類・サイクリトール類・桂皮酸誘導体類・含窒素化合物類を産卵刺激物質としているアゲハチョウ族の中間に位置し、クスノキ科を主要寄主とするアオスジアゲハはフラボノイド類と桂皮酸類縁体を産卵刺激物質として利用していることが判明し、ジャコウアゲハ族の産卵刺激物質より真正アゲハ族のそれに近いことが判明し、アゲハチョウの食草進化に植物に含まれる化学物質が深く関与していることが証明された。さらにアオスジアゲハの食草として知られるゲッケイジュ・シロダモ・タブノキにはChlorogenic acid、3-0一Glu-Quercetinの両化合物が含まれることが判明し、近縁種の寄主であるヒュウガナツ・ブンタン・レモンにはChlorogenic acidが含まれず食草と産卵刺激物質の存在が一致していた。
分子生物学的手法を用いた肥大心筋における虚血耐性低下要因の解明に関する研究

本研究は、ラット灌流心モデルを用い、通常の心筋保護法ではその保護効果に問題を有する肥大心における細胞内イオン(Ca,Na)細胞内pHの変動を通常の再灌流施行時との比較において検討すること、ならびに虚血中の細胞外pH環境を変化させた状態でのCaイオン動態の検討をすること。および容量負荷肥大心の組織学的検討並びに癌遺伝子の発現について検討し、以下の結果を得た。(1)腹部大動脈-大静脈の短絡作成後4週で心筋重量が2倍になった肥大心筋群で、虚血20分後及び再灌流5分後の細胞内Ca及びは正常心筋に比し有意に高値であった。(2)肥大心筋群においても正常心筋群と同様、再灌流時にterminal cardioplegiaを施行することにより再灌流時に発生するCa濃度の一過性上昇が抑制され、teminal cardioplegia非施行時に比し早期に細胞内Ca濃度が正常化され、心機能回復率も有意に高値となった。(3)正常心筋群の無酸素-酸素化モデルで再灌流時に細胞内pHの二峰性の変化が認められた。再灌流直後に一過性にpHの低下を認め10-15分後にかけて次第に上昇した。(4)ラット灌流心の無酸素-再酸素化モデルにおいて細胞内Naの変化についても検討した。その結果、細胞内Na濃度は虚血20分後に虚血前値と比し有為に上昇した後、再灌流10分後に正常化することがあきらかとなった。(5)容量負荷による心肥大モデルにおいて心筋細胞の肥大は負荷後2週目より認められたが、免疫組織染色によるc-mycの発現に関する検討では、容量負荷後2時間目より既にc-mycが発現していることが証明された。本年度までの研究は、ラット潅流心モデルを用い、通常の心筋保護法ではその保護効果に問題を有する肥大心における細胞内イオン(Ca,Na)動態、および細胞内pHの変動を通常の再潅流施行時との比較において検討すること、ならびに虚血中の細胞外pH環境を変化させた状態でのCaイオン動態の検討を重点的に行い、以下の成果が得られた。(1)腹部大動脈-大静脈に短絡を作成した後4週を経過させることにより心筋重量が2倍になった肥大心筋群では、虚血20分後の細胞内Caの上昇は正常心筋に比し有意に高値であった。また、再潅流5分後の細胞内Ca濃度は、肥大心筋群で正常群に比し有意に高値であった。(2)肥大心筋群においても正常心筋群と同様、再潅流時にterminal cardioplegiaを施行することにより再潅流時に発生するCa濃度の一過性上昇が抑制され、terminal cardioplegia非施行時に比し早期に細胞内Ca濃度が正常化され、再潅流後の心機能回復率も有意に高値となった。(3)正常心筋群の無酸素-再酸素化モデルにおいては再潅流時に細胞内pHの二峰性の変化が認められた。再潅流直後に一過性にpHの低下を認め10-15分後にかけて次第に上昇した。〓(4)ラット潅流心の無酸素-再酸素化モデルにおいて細胞内Naの変化についても検討した。その結果、細胞内Na濃度は虚血20分後に虚血前値と比し有意に上昇した後、再潅流10分後に正常化することが明らかとなった。本年度の研究は肥大心における形態学的及び、癌遺伝子の発現に関し検討することである。

雄性S-DラットにGarciaらの方法により腹部大動脈-下大静脈瘻による容量負荷モデルを作成し、2日目、2週目、8週目に体重、心筋重量の測定を行い、また心筋組織標本のH-E染色、マッソントリクトーム染色、及び免疫組織染色による心筋組織内のc-mycを測定し以下の結果を得られた。(1)正常群に比して、容量負荷ラットにおいては2週目より心筋重量の増加、左心室壁の肥厚、心筋細胞の肥大が認められた。(2)免疫組織染色においては負荷2時間目よりすでにc-mycの発現が認められ、容量負荷の非常に早期の段階において肥大発生のメカニズムが発現していることが明らかになった。
寄生蜂の餌探索における情報利用の化学生態学的解析

寄生蜂コナガサムライコマユバチは、アブラナ科植物の重要害虫であるコナガの幼虫に寄生する。本寄生蜂が寄主探索で利用するキューとしてコナガ食害時に誘導される植物揮発性成分が報告されているが、本研究で新たに餌探索に利用するキューとして花香に由来する複数の芳香族化合物とテルペン類を明らかにした。その上で、本寄生蜂は自らの空腹状態に応じて、探索キューを適切に使い分けて寄主と餌を探索していることを証明した。これらを通して、生物間相互作用における花の生態学的役割について新たな知見を得た。また、本成果から新たな害虫管理技術の開発に繋がると期待される。多年生のアブラナ科植物であるイヌガラシから採取した花序を水差しにし、放出される揮発性成分を吸着剤(Tenax TA)へ引き込むことでダイナミック捕集を行った。また、花序を切り取った残りのロゼッタ葉についても、同様の方法で揮発性成分を捕集した。捕集した成分を熱脱着法でガスクロマトグラフ-質量分析計(GC-MS)へ導入することにより分析比較し、複数の花香成分を明らかにした。尚、切り離した直後に捕集を行ったことから、傷害によって誘導される抵抗性発現に伴う揮発性成分の変化は、花序とロゼッタ葉ともまだ生じていなかったと考えられる。コマツナの花香では花に特異的な芳香族化合物が少なからず含まれていたのに対し、イヌガラシの花香ではそれらがほとんど検出されず、ロゼッタ葉から放出される多様なテルペン化合物のうちの数成分によって主に花香が構成されていた。バイオマスあたりに換算すると、それらの成分は葉よりも花から高濃度で放出されていると考えられる。イヌガラシで明らかになった花香成分について、各々の標準品を用いて寄生蜂コナガサムライコマユバチ雌成虫の選好性を行動試験で評価した。各成分に徐放性を与えるため、triethyl citrateを溶剤として一連の濃度で溶液を調製した。空腹の雌はいずれの成分についても、高濃度の溶液に対して選好性を示す傾向があった。一方、満腹の雌ではそうした選好性が明確には認められなかった。これらのことは、本寄生蜂が様々な香気成分を情報として利用でき、それらが高濃度で存在する場合に餌源と結び付けて探索していることを示唆する重要な知見といえる。また、害虫の天敵である寄生蜂の行動を制御する農業技術を開発するヒントとなる。本研究で得た成果を学会や研究会等(国内3件、海外1件)で発表した。また、本成果の一部と関連して特許を出願した。本寄生蜂の雌成虫は、寄主体液摂取(host-feeding)を行わず、花蜜などを餌として利用していると考えられる。寄主幼虫の食草であるアブラナ科植物の花は、最も手近にある餌源のひとつであると予想される。Brassica属の一員であるコマツナの花からヘッドスペースに放出される匂い(揮発性成分)を吸着剤(Tenax TA)でダイナミック捕集し、これをエーテルで再溶出して試料溶液を調製した。この溶液をダミーの花に塗布して呈示すると、空腹の寄生蜂はこのダミーに対して選好性を示すことを確認した。この行動試験で用いた個体は、過去に花香を経験したことが無いことから、寄生蜂が示した反応は生得的なものであると示唆される。次に、昼間の花香と夜間の花香を捕集して同様の方法で試験すると、空腹の寄生蜂は昼間の花香に対して有意な選好性を示したのに対し、夜間の花香に対する寄生蜂の選好性は観察されなかった。そこで、花から経時的に捕集した揮発性成分をGC-MS(ガスクロマトグラフ-質量分析計)で分析し、花香成分の放出動態を調査した。その結果、テルペン類や芳香族化合物群の放出量が昼間と夜間で顕著に増減することが判明した。市販の標準品を用いて、各成分を単独で行動試験に供したところ、空腹の寄生蜂はテルペン類と芳香族化合物群の双方に対して濃度依存的に反応した。また、蜜源が存在していないにも関わらず、ダミーに定位した個体の多くが採餌行動をとる様が観察された。花香成分が寄生蜂の餌探索から摂食にいたる一連の行動に強い影響を及ぼすことが明らかとなった。本研究で得られた成果について、学会や研究会等(国内2件・海外1件)において発表した。また、関連する研究成果を学術誌および機関紙にて発表した。イヌガラシを材料に用い、コナガ幼虫の食害に伴って放出される花香成分の変化や、それが寄生蜂コナガサムライコマユバチの行動に与える効果を調べた。イヌガラシではロゼッタ葉から放出される揮発性成分のうち数成分が花序からも放出されていることを昨年度に確認している。開花株から採取した花序を水差しにし、この揮発性成分を捕集してガスクロマトグラフ-質量分析計(GC-MS)で分析した。コナガ食害株由来の花序と未被害株由来の花序とで比較したところ、両者の揮発性成分の組成に顕著な違いはなかった。一方、花序を切除せず株全体の揮発性成分を分析すると、未被害株よりも食害株で多く放出されていた。

行動試験において、開花した未被害株とこれにコナガを食害させた株(花あり食害株)とを同時に呈示したところ、寄生蜂の雌は食害株を好んで定位した。この食害株とその花序を切除した食害株(花なし食害株)とを呈示した場合、寄生蜂は顕著な選好性を示さなかった。この傾向は絶食させた雌の寄生蜂でも同様であった。花香成分の標準化合物を用いた行動試験では、各々の花香成分に寄生蜂の誘引性を確認しているが、開花イヌガラシではコナガ食害で誘導される揮発性成分が寄生蜂を誘引する際に、花香の寄与はあまり大きくないことが示唆された。また、コマツナを材料に用いて、花の存在がコナガ成虫の産卵に及ぼす影響を調べた。開花していないコマツナ株に花序の水差しを添えて飼育容器内に設置し、そこへ羽化後1日令の交尾雌を導入して産卵させた。対照として、別の飼育容器内で花序を添えない株へ産卵させた。翌日にそれぞれの植物上に産まれた卵を計数したところ、花序を添えた植物では対照株への産卵数の約6割にとどまっていた。花序には幼虫の天敵となる寄生蜂だけでなく卵を捕食する天敵等も訪れることから、コナガ雌成虫は花の近傍で産卵を抑制しているものと推測される。昨年度から引き続き、イヌガラシを材料に用いて、花の香気成分や花以外の植物体から放出される揮発性成分がコナガ幼虫の食害に伴ってどのように変化するのかについてより多くの反復データを得るべく、それらの揮発性成分を吸着担体で捕集し、ガスクロマトグラフ-質量分析計(GC-MS)で分析した。また、花序のある食害株と花序のない食害株に対する寄生蜂コナガサムライコマユバチの反応をみる選択試験についても反復を追加し、本寄生蜂が空腹・満腹に関わらず両者を識別しないことを確認した。本結果は、食害株が放出する揮発性成分の存在下では、花の有無が寄生蜂の選好性に影響を与えないことを示しており、天敵誘引剤に応用する場面では、すでに本寄生蜂を誘引することが知られている植食者誘導性植物揮発性成分にさらに花香成分を追加しても、誘引性が大きく高まることは期待できないことが示唆された。しかし、寄主である害虫を低密度に抑え続ける上では、圃場に寄生蜂を誘引し定着させるための花香成分による天敵誘引剤の活用が有効である考えられる。寄生蜂コナガサムライコマユバチは、アブラナ科植物の重要害虫であるコナガの幼虫に寄生する。本寄生蜂が寄主探索で利用するキューとしてコナガ食害時に誘導される植物揮発性成分が報告されているが、本研究で新たに餌探索に利用するキューとして花香に由来する複数の芳香族化合物とテルペン類を明らかにした。その上で、本寄生蜂は自らの空腹状態に応じて、探索キューを適切に使い分けて寄主と餌を探索していることを証明した。これらを通して、生物間相互作用における花の生態学的役割について新たな知見を得た。また、本成果から新たな害虫管理技術の開発に繋がると期待される。平成26年度の研究計画としては、これに沿ってコナガ幼虫の食害が花香の組成と寄生蜂の行動に与える効果を調べ、また、花の存在がコナガの産卵に及ぼす影響を明らかにすることができた。しかしながら論文にまとめる上では、統計的に十分なだけの反復を増やして慎重な検討を要する部分がある。化学生態学本研究で新たに、コマツナ花の存在がコナガの産卵を抑制することが示唆された。これは生物間相互作用において、花が直接的・間接的に果たしている機能的意義を論じる上でとても興味深い。今後、他の花でもコナガに対して同様の効果があるのか、また、コナガ以外の昆虫でも花の近傍では産卵を抑制するのかなど、「花による産卵抑制」がどれほど一般的な現象であるのか、或いは、どのような条件のときにこの現象が現れるのか、といった新たに取り組むべき課題が生まれた。
根粒原基と茎頂分裂組織の発生制御機構

根粒形成の遠距離制御機構の解析ミヤコグサより特定したKLAVIER遺伝子はLRR型の受容体型キナーゼをコードしており、HAR1と相互作用することによってシュートから根粒数を制御する。今年度は、根粒形成に必要とされるサイトカイニンシグナリングとKLAVIERの関連について解析した。ミヤコグサのサイトカイニン受容体LHK1の恒常的活性型は、根粒菌の感染なしに根根粒様構造を誘導することができる。LHK1の恒常的活性型の優性変異体Snf2とklavierの2重変異体の解析から、KLAVIERは、Snf2によって誘導される自発的根粒形成の抑制にも機能していることが明らかになった。SAMダイナミクスの数理解析SAMの自己組織的でダイナミックな振舞いを理解するために、WUSCHEL(WUS)-CLAVATA(CLV)相互作用ダイナミクス、CZ-PZ相互依存関係、細胞分裂、の3つの条件を取り込んだ数理モデルを構築し、シミュレーションによる解析を行った。その結果、clvやklavier変異体にしばしば観察される帯化や二叉分岐などのSAMの基本的な振舞いを再現するパラメータを見いだした。今年度は、シグナリングのポジティブフィードバックが破綻しているwus変異体について解析し、wus特有の弱く多原基のSAMの振舞いを再現することに成功した。
複合的構造解析による膜内プロテアーゼRsePの膜内・膜外での基質認識機構の解明

本年度の研究では、結晶構造の決定を目指して、結晶化条件の最適化を重点的に行い、結晶化試薬の組成と結晶の形状の関係を詳細に調べた。様々な形状の結晶を凍結し、放射光施設においてX線回折実験を行ったが、分解能の顕著な向上は見られなかった。分解能が向上しないことの理由に、蛋白質試料の純度と安定性が十分に高くないことが考えられたため、蛋白質試料の調製方法を抜本的に見直すこととした。その結果、発現量については大きな改善は見られなかったものの、性状が顕著に改善された蛋白質試料が得られるようになった。安定性の高い試料は、構造解析だけでなく、機能解析においても有効活用できるものと期待される。また、固体NMR法による構造解析については、基質膜蛋白質試料を化学合成によって調製し、膜に再構成して予備的な測定を行ったところ、基質膜蛋白質が脂質二重層に正常に組み込まれていることが確認できた。昨年度に引き続き、精製用のタグの比較を重点的に行った。現在使っているタグは、末端領域だけでなく、内部配列にも挿入可能であることが分かった。また、本年度の研究では、抗体との複合体の結晶化にも取り組んだが、原子レベルの分解能のデータを得ることは出来なかった。結晶化の対象を増やすため、別の生物種由来の膜内プロテアーゼの精製にも取り組み、試料調製の目処が立った。また、連携研究者との共同研究から、膜内プロテアーゼの膜内部での基質認識に関する重要な知見が得られ、Elife誌で論文発表を行った。単に精製用のタグを付け替えるだけは結晶性の改善は見られなかったが、タグの挿入部位を変えることが可能だということが分かり、また、他の生物種のホモログについても精製の目処が立ったことから、結晶化の対象が広がり、今後より広範に条件検索を行うことができる環境が整ってきたから。本年度は、2つの生物種由来の標的膜タンパク質について、重点的に結晶化条件の探索を行った。うち1種については、タグ配列を分子内部に挿入したコンストラクトを作製し、抗体断片との複合体の結晶化に取り組んだところ、単結晶が得られる条件が見つかった。しかしながら、結晶化の再現性は低く、また、同じようなサイズの結晶を用いても回折点が観測される場合とされない場合もあり、安定したデータ収集を行うためには、さらなる条件検討が必要であることがわかった。また、もう1種の標的膜タンパク質については、結晶化条件のスクリーングから比較的多数の条件を見つかっている上、結晶化の再現性も比較的良好であった。そこで、放射光施設の微小結晶用のビームラインを利用してX線回折実験を行ったところ、低分解能ながらも回折データの収集を行うことができた。ただし、現状のデータセットは、構造決定可能な分解能には達していないため、先行研究で取得した標的膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を断片化し、複合体の結晶化にも取り組んだ。このモノクローナル抗体は、標的膜タンパク質の可溶性ドメインを断片化して精製し、マウスに免疫して作製したものであった。モノクローナル抗体は免疫した部分断片だけでなく、全長の膜タンパク質に対しても高い親和性を示したが、抗体の結合によって標的の膜タンパク質が不安定化することも分かった。以上の結果から、抗体断片との複合体での結晶化を目指す場合は、抗体結合部位の最適化を行う必要があることが分かった。抗体との複合体形成については、さらなる条件検討が必要であるが、標的膜タンパク質の1つについては、低分解能ながらも回折データの収集に成功しており、構造決定に向けて進展が見られたと言えるから。昨年度までの研究では、2つの生物種由来の標的膜タンパク質について結晶化を行ってきたが、本年度はさらにもう1つの生物種由来のホモログを取り上げ、発現と結晶化に取り組んだ。試料調製では、通常末端に融合するタグ配列をタンパク質に内部に挿入することで精製スキームの簡略化を図った。また、このタグ挿入タンパク質については、抗体断片との結晶化も行なった。昨年度の研究において、抗体断片との複合体で結晶の得られていたコンストラクトについては、結晶の再現性の向上を目指しタグの挿入部位の最適化を行った。その結果、タグ挿入部位を変化させたコンストラクトについても同様に抗体断片との複合体の結晶が得られた。また、本年度研究に取り組んだ3種の膜タンパク質のうち、上記のものとは別の1種については、これまでの研究から単独状態で結晶が得られることが分かっていた。このタンパク質について可溶化に用いる界面活性剤の検討などを行い結晶性の改善を試みたところ、分解能の有意な向上が見られた。さらに本年度は、標的膜タンパク質の可溶性領域の部分断片を用いることでタグ配列の挿入方法の検討を行なった。具体的には、部分断片にタグ配列を挿入した変異体タンパク質を発現させ、抗体断片との複合体のX線結晶構造を解析することで、タグ挿入による標的タンパク質の構造変化などを詳細に調べた。その結果、適切に挿入部位を設計することで、標的タンパク質の構造を安定に保つことが可能であることが明らかになった。精製条件の改良の結果、従来に比べて格段に安定な蛋白質試料が得られるようになった。この成果によって、より良質の結晶が得られるようになることが期待されるだけなく、活性測定や相互作用解析を初めとした機能解析についても、より信頼度の高いデータが得られるようになることが期待される。

また、固体NMR法についても、疎水性が高い基質ペプチドの合成を迅速に完了しただけでなく、脂質二重層に組み込むことにも成功しており、今後の構造解析に向けた準備が早くも整った状態にある。以上のような状況を考慮し、本研究課題は、当初の予想以上に進展していると考える。今後は、タグを内部配列に挿入したコンストラクトや他の生物種のホモログを対象し、それぞれに結合する抗体断片を調製し、複合体での結晶化に取り組んでいくことを計画している。また、複合体解析や固体NMR解析の推進に向けて、基質候補の探索にも取り組んでいきたいと考えている。すでに回折データが得られた標的膜タンパク質については、結晶化条件の最適化や抗体断片との複合体での結晶化条件の探索を進めることで、原子レベルの分解能での構造決定を達成したいと考えている。別種の膜タンパク質については、タグ配列挿入部位の最適化を行うことで、安定して結晶が得られ、データ収集を行うことが可能な条件を探索する。また、基質との複合体での構造決定を目指し、安定して結合する基質の探索にも取り組んでいく。29年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物学本年度の研究によって確立した新規の精製手法によって得られる高品質の蛋白質試料を活用することで、出来るだけ早く構造解析に使用可能な単結晶を作製したいと考える。結晶の品質の改良においては、抗体Fab断片の結合による目的蛋白質のさらなる安定化なども視野に入れ、条件検討を進めていきたいと考える。固体NMR法による構造解析については、本年度の予備的な実験結果に基づいて、まず基質単独の状態での構造情報を収集していくことを計画している。そして、複合体の状態での構造解析に向けて、試料調製やデータ収集の条件の最適化を進めていきたいと考える。タグの付け替えによって構造解析が加速するかと期待していたが、結晶性の大きな改善が見られず、研究計画の変更を余儀なくされた。再び、遺伝子組換え実験に立ち戻って条件検討を行ったため、すでに購入した機器、物品等で実験を遂行することが可能となり、新規での機器、物品の購入が不要となったことが主な理由である。X線回折データが得られている膜タンパク質については、抗体断片との複合体を作成することで、X線回折の分解能を向上させることを計画していたが、元々可溶性領域の部分断片を用いて抗体を作製したためか、全長タンパク質に対して抗体を結合させると、タンパク質が不安定になってしまった。このため、全く異なる方法によって抗体を結合させる条件を検討しなければならない状況となり、使用計画の変更が必要となった。X線結晶構造解析における研究で、当初得られていた結晶から十分なデータが得られず、新規の精製手法の検討を行ったため、研究費使用計画を変更するに至った。条件検討の結果、良質の蛋白質試料が得られるようになり、研究自体には進展が見られている。次年度は抗体を結晶化に使用するため、抗体精製に関する高額試薬を多数購入する必要があり、これに繰り越した予算をあてる。また、結晶化が進展した暁には放射光実験の出張も増えることが見込まれるため、出張旅費等にも繰り越した予算をあてることを計画している。標的タンパク質については可溶性領域の部分構造が研究代表者の先行研究によって明らかになっている。
臓器固有幹細胞による術後肺再生療法の開発

代償性肺成長(compensatory lung growth:CLG)の分子機序を明らかにし、II型肺胞上皮細胞(AT II)を用いて術後肺の再生を導くことを目的とした。成熟ラットの左肺全摘後には、残存肺は過膨張となり、間質組織の増生が主体で肺胞の新生は認めなかったが、AT II(2.5×106個)を全摘後翌日に経気道的に補充することで、移入細胞が生着し、残存肺において肺胞の新生がおきることが示唆された。【背景】肺切除後の残存肺で重量、容積、DNA量が失われた分を補うように回復することが報告され、代償性肺成長(Compensatory lung growth)として知られている。残存肺容量と胸腔容量との較差により生じるMechanical stretchや、残存肺の灌流血流量の増加をトリガーとすることが報告されているが、その分子機序は明らかではない。ラット左肺全摘モデルを用いて右残存肺の組織形態と遺伝子発現プロファイルの変化を解析した。【方法】週齢7週のWistar ratを用い左肺全摘を行う全摘群(P群)と開胸のみのSham operation群(S群)を作成し、3日、1週、1か月、3か月、6か月後に犠牲死させ、それぞれの右肺における湿重量を測定し組織切片による形態学的解析を行った。さらにP群の残存右肺より経時的にmRNAを抽出しマイクロアレイ(4 plex expression array, Roche NimbleGen)を用いて26,208個の遺伝子を網羅的に解析した。コントロールには先に摘出した左肺を用いた。【結果・考察】全摘後早期(術後3日、1週)に残存肺の重量・体積が増加し、細胞分裂に関する遺伝子発現の増加を認めたが、細胞増殖は全摘後早期に限ったものであり、全摘後後期(術後1か月、3か月、6か月)では、肺胞腔は拡大したままで、本来の成熟以外の成長の要素は捉えられなかった。一方で、全摘後後期には血管新生や炎症反応および血管・神経・胸膜の発生・分化に関わる遺伝子の発現が大きく変動しており、神経・血管系の再構築が示唆された。【展望】「全摘後の残存肺では、肺再生の足場となる潜在性は秘めているものの、その基となる幹細胞が十分ではないのではない」と仮説を立て、肺胞レベルの組織幹細胞として知られるII型肺胞上皮細胞を、術後早期に気道内移入した肺再生モデルによる研究を次年度に行う予定である。肺切除後に残存肺に生じる代償性肺成長の機序についてはいまだ解明されていない。本研究では、7-8週齢雄性Wistar ratを用いて左肺全摘モデルを作成し、全摘後残存肺が経時的に過膨張することを形態学的に証明するとともに、マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子解析により、術後早期に限り細胞増殖に関わる遺伝子の発現が増強していること、神経・血管・胸膜などの発生・分化に関わる遺伝子の発現が増強するが、肺胞上皮に関わる遺伝子の発現は変化しないことを確認した。その結果から、「肺切除後残存肺において、術後早期の増殖期に肺胞領域の組織幹細胞を内包するII型肺胞上皮細胞を補充することで肺再生がおきる」と仮説を立て、左肺全摘後翌日に同種ラットから分離したII型肺胞上皮細胞を気道内移入するモデルを作成した。雄をドナー、雌をレシピエントとするsex-mismatch modelを作成し、Y染色体を認識するプローブを使用したFISHおよびリアルタイムPCRで移入細胞の生着を確認したところ、左肺全摘後に移入した細胞は生着したのに対し、開胸のみ施行した後に移入した細胞は生着せず、肺全摘そのものが肺胞の再生に必要な因子であることが示唆された。また左肺全摘後に過膨張を呈していた肺胞は、移入後には肺胞密度が増加し、新たな肺胞の新生が示唆された。肺切除後残存肺において限局的にでも肺胞の再生が促進できれば、呼吸機能を維持し外科治療の適応拡大、ひいては治療成績の向上に貢献できるものと思われる。本研究は、肺切除後残存肺において早期におこる増殖シグナルの基で、分化能を持つATIIを生着させ新たな肺胞の再生を誘導することを示しており、肺再生医療の礎として意義があり、今後の肺再生医療の発展に貢献することが期待される。
グロー放電プラズマの電離度測定装置の開発

本開発では、プラズマの生成過程に着目し、より深いプラズマ生成メカニズムの理解を支援するための「プラズマの電離度測定装置」を製作した。具体的には、放電管中に設置したプローブへの印加電圧Vpをスイープさせながらプローブに流れる電流Ipを測定し、得られたVp-Ip特性のグラフを用いてプラズマの電離度を導出する。この実験を行うために必要となる放電管、プローブ、電極、真空計装置、保護抵抗等は、既存の装置を使用した。これらの既存の装置に以下の機構を追加で製作することで、プラズマの電離度測定を学生が安全かつ効率的に行えるようなシステムを構築した。・プラズマ生成用の高圧直流電源の制御システムプラズマ生成用の高圧電源の制御にはプログラマブルロジックコントローラー(PLC)を用いた。電源としては、外部からのOV-10Vの信号で出力電圧および電源のON、OFFを切り替えられるものを使用し、プログラマブルロジックコントローラーのDAC出力値で電圧値の連続的な制御および、10モジュールで電源の出力の切り替えを行うようにすることで、プラズマ生成に関わる電源電圧の制御をPLC経由でパソコンからの操作が可能になった。・測定値のデジタル化とオンライン解析プログラムプラズマの電離度の導出は、Vp-lp特性の飽和領域に対して接線を引き、得られたY切片の値を基にいくつかの計算をする必要があるが、放電管内の発光状態を刻々と変化させながら電離度の推移を追いかけることを可能としたかったため、オンライン解析プログラムを製作した。具体的には、PLCのADCモジュールで電源の電流値、電圧値、電源のON・OFF等のステータスを断続的に読み込み、得られた測定値のデジタル値を、PLCの通信モジュールを用いてパソコンに転送し、LabViewを用いて製作したプログラムで演算おおびグラフ描画等をさせる。以上のような装置の開発を行い、学生実験用のプラズマ電離度測定装置を製作した。オンライン解析プログラムに関しては、大人数の学生の使用に合わせて、実際の学生の使用に合わせて改良を加える必要がある。