hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ADAMTS9による蛋白質輸送制御機構の解明

線虫C.elegansにおいて、ADAMTS9のホモログであるGON-1の機能を抑制することにより、インスリン分泌細胞におけるインスリン分泌と、末梢組織におけるインスリンシグナル伝達経路のどちらが阻害されるかを検討した。その結果、GON-1の機能抑制により、インスリン分泌とインスリンシグナル伝達経路の両方が阻害されていることが示唆された。さらに、GONドメインのみを発現させることにより、上記の表現型が抑圧されることを見いだした。ADAMTS9は2型糖尿病のリスク遺伝子の1つである可能性が示唆されているが、その理由は解明されていなかった。そこで、本研究ではADAMTS9/GON-1の発現を抑制することによりインスリン受容体やグルコーストランスポーターの細胞膜への輸送、インスリンの分泌などが影響を受けている可能性を検討した。これまで線虫とほ乳類の培養細胞において、ADAMTS9/GON-1の発現を抑制することによりタンパクの分泌が抑制されることを見いだしていた。そこで、ADAMTS9がインスリンの分泌あるいはインスリン受容体の細胞膜への輸送メカニズムなどに関与している可能性を検討した。線虫を用いてDAF-16/FOXOの局在やインスリンの分泌を観察した結果、DAF-16::GFPは、Wild typeでは細胞質と核に局在しているが、gon-1 mutantではDAF-16の局在が変化していた。線虫のインスリンの1つであるINS-7は、Wild typeでは神経から分泌され、神経細胞内ではほとんど観察されないが、gon-1 mutantでは神経内にドット状に蓄積していた。これらのphenotypeはシグナル配列を付加したGONドメインを発現させることによってレスキューした。gon-1 mutantでは線虫のインスリンの1つであるDAF-28も正常に分泌されず、DAF-28を分泌しているASIとASJに蓄積していることがわかった。さらに、gon-1 mutantではdauerになりやすいことを見いだした。以上の結果より、線虫においてGON-1はインスリンシグナル伝達に関与している可能性が示唆された。これまでADAMTS9 /gon-1遺伝子の発現を抑制することでタンパクの分泌が抑制され、ERの形態に変化が見られ、ERストレスが負荷されることを見いだしていた(発表済み)。ADAMTS9は2型糖尿病のリスク遺伝子の1つである可能性が示唆されているため、ADAMTS9がインスリンの分泌あるいはインスリン受容体の細胞膜への輸送メカニズムなどに関与している可能性を検討した。線虫C.elegansをモデル生物として用い、FOXO/DAF-16の局在やインスリンの分泌を観察した。FOXO/DAF-16は、Wild typeでは細胞質と核に局在しているが、gon-1のknockout株では核に強く局在するようになっていた。線虫のインスリンはWild typeでは神経から分泌され、神経細胞内ではほとんど観察されないが、gon-1 knockout株では神経内に蓄積していた。これらのphenotypeはgon-1のプロモーターの下流でGONドメインを発現させることによってレスキューした。線虫において、インスリンシグナルはdauer形成と寿命に影響を及ぼすことが知られていることから、gon-1のknockout株を用いてdauer形成と寿命を測定し、gon-1 mutantではdauerになりやすく、また、寿命が伸びることが見出された。以上の結果より、線虫C.elegansにおいてGON-1は、インスリン分泌細胞においてインスリンの分泌に関与し、末梢組織においてインスリンシグナル伝達に関与していることが示された。ADAMTS9は細胞外に分泌され、細胞外マトリックスを分解する酵素として知られていたが、我々はADAMTS9が細胞外だけではなく、ER内で機能し、ADAMTS9の発現抑制により、ER-Golgi間の蛋白質輸送が阻害されること、この機能はC末端にあるGONドメインが重要であり、ヒトと線虫C.elegansで共通していることを見いだした(Yoshina et.al. 2012)。ヒトにおいて、ADAMTS9のSNPは2型糖尿病のリスク遺伝子の1つであることが報告されている。しかし、このSNPを持つことにより、β細胞におけるインスリン分泌と末梢組織におけるインスリン感受性のどちらに影響を及ぼすかは不明である。そこで線虫C.elegansを用い、ADAMTS9のホモログであるGON-1の機能を抑制することにより、インスリン分泌細胞におけるインスリン分泌と、末梢組織におけるインスリンシグナル伝達経路のどちらが阻害されるかを検討した。GON-1/ADAMTS9の有無によるDAF-16/FoxoとINS-7の局在変化を観察した結果、DAF-16::GFPはWild typeでは細胞質と核に局在しているが、gon-1 mutantでは核に強く局在するようになっていた。また、INS-7は、Wild typeでは神経から分泌され、神経細胞内ではほとんど観察されないが、gon-1 mutantでは神経内における蓄積が観察された。これらgon-1 mutantの表現型は、GONドメインを発現させることにより抑圧された。以上の結果より、GON-1の機能抑制により、インスリン分泌とインスリンシグナル伝達経路の両方が阻害されていることを見いだした。

昨年度の結果を論文として投稿中であるため、概ね順調に進展していると判断した。細胞生物学ほ乳類の培養細胞を用いて、ADAMTS9がβ細胞におけるインスリン分泌や末梢組織におけるインスリンシグナル経路にどのように作用しているか検討する。インスリン分泌細胞としてはINS1を使用し、末梢組織由来の培養細胞としては、筋細胞に分化させたC2C12や脂肪細胞に分化させた3T3-L1、肝細胞由来のHepG2を用いる。INS1を用いsiRNAを投与することによりADAMTS9の発現を抑制し、高グルコース刺激によりインスリンの分泌顆粒の挙動がどのように変化するかを検討する。また、末梢組織由来の培養細胞では、ADAMTS9の発現を抑制することによりインスリン刺激に対する応答性が変化するかを検討し、さらに、それぞれの末梢組織ごとに現れる表現型と2型糖尿病の病態との関連を検討する。C.elegansを用いてADAMTS9/GON-1と糖尿病の関係を検討し、ADAMTS0/GON-1の発現を抑制することにより、インスリンの分泌やインスリンシグナルに異常が見られることを明らかにした。従って、研究は概ね順調に進展していると評価した。線虫の培養が予定よりもスムーズに行われ、使用した消耗品量が少なかったため。平成25年度に得られた結果をを論文にまとめる予定である。今後はほ乳類の培養細胞を用いて研究を行い、哺乳類においてADAMTS9の機能と糖尿病の関係を調べる。培養細胞用のスライドチャンバー用の費用に充てる。培養細胞INS1を培養するためには、ポリ-L-リジンコートをしたスライドチャンバーを用いなければならないため、そのための費用にする。また、細胞培養用の血清、抗体、試薬、ウエスタンブロット用の各種試薬に充てる。当該研究費が継続のため、次年度使用額が生じている。主に細胞培養用試薬と消耗品、論文の校正費に使用する。
流動条件の管理による植物プランクトンの増殖抑制に関する研究

1.研究目的富栄養化現象において、水利用に最も重大な影響を与えるのは植物プランクトンの増殖であるので、植物プランクトンの増殖を抑制することが最も重要である。本研究では、流動が藻類増殖に影響を与える影響を明らかにし、この結果を水質浄化に用いることを目的として研究を行った。2.研究概要と研究成果本研究では、円形水路を用いた室内実験と旭川における現地観測を行うと共に、従来行った現地の池での実験結果も併せて検討を加え、以下の成果が得られた。(1)室内実験では、池の水に含まれる植物プランクトンを対象とした混合培養系の実験とクロレラを対象とした純培養実験とを行い、流動の増殖抑制に対する影響の程度が異なるが、どちらの場合も流速が植物プランクトンの増殖を抑制することを確認した。(2)増殖実験の結果を基に、増殖速度式を定式化し、速度式中の各種定数を決定した。混合培養系の場合にはシアノバクテリアが優占種となり、シアノバクテリアは、夜間に死滅が卓越する傾向があるのに対して、クロレラではそのような傾向は認められず、定式化された速度式が若干異なった。(3)旭川の現地観測の解析より、流速10cm/s未満の河道区間では植物プランクトンの増殖が生じ、流速25cm/s以上の河道区間では栄養塩類等の条件は大きく変わらないにも拘わらず植物プランクトン濃度は減少した。(4)現地での流動実験の結果より、流動状態により植物プランクトンの種が変化することが明らかとなった。富栄養化現象において、水利用に最も重大な影響を与えるのは植物プランクトンの増殖である。水域における藻類の増殖に関する研究においては、植物プランクトンの集積に関する検討を除けば、流動が考慮される事はほとんどなく、栄養塩、水温、光等を中心に検討されてきている。本研究では、藻類増殖に流動が関与するとの立場から、流動の藻類増殖抑制効果を検討し、この結果を水質浄化に応用することを目的としている。本年度は、初年度であり実験装置の整備を進めつつ、以下の検討を行った。従来の旭川ダム貯水池とその下流域における現地観測結果を整理し、河川における流速が10cm/sの付近を境界として、クロロフィル濃度に極端な違いが認められ、植物プランクトンが高濃度に増加する、もしくは高濃度で維持されるのは、流速が10cm/s以下の場合であることが判明した。室内実験においては、流速を変化させることができる円形水槽を用いて、流動の有無が藻類増殖と藻類種に及ぼす影響を検討した。静止した水槽で増殖が早く、流速を与えた場合に増殖が抑制されることが判明した。また、昼間だけ流動を発生させた場合と終日流動を発生させた場合の藻類増殖の違いは小さく、流動による藻類増殖制御を考える場合には、昼間の流動が重要であることも判明した。しかしながら、この増殖抑制のメカニズムは、流動の有無による藻類種の変化や、流速に伴い発生する鉛直混合による藻類が利用できる日射量の制限、もしくは、せん断力が微生物の共存関係に影響することなどが考えられるが、現在の段階では十分に明らかではない。なお、室内実験の結果をモデル式により解析を行った。冨栄養化現象において、水利用に最も重大な影響を与えるのは植物プランクトンの増殖である。それ故、植物プランクトンの増殖を抑制することが最も重要である。水域における藻類と流動との関係については、植物プランクトンの集積に関する研究を除けば、流動が考慮されることはなかったが、流速の大きな河道区間で植物プランクトンが増殖しないことは経験的に知られている。本研究では、流動の藻類増殖に及ぼす影響を明らかにし、この効果を水質浄化に応用することを目的としている。本年度は、昨年度に整備した実験装置を用いて室内実験を行うと共に、昨年度に明らかとなった室内実験と現地観測との乖離の原因を明らかにするために現地観測を行った。

最初に、現地観測では、流速の変化の小さい河道区間を選び、そこでのクロロフィルaの変化、水温、栄養塩濃度、日射量を観測した。クロロフィルaは増加する場合と減少する場合とがあり、流速10cm/s未満の水域では増加が生じ、流速20cm/s以上の区間では減少していた。なお、残念ながら10-20cm/sで流速が一定しているような河道区間は存在していなっかった。なお、植物プランクトンの増加、減少に、水温、栄養塩濃度及び水中の光量子量が影響しているとは考えられなかった。特に、流速により水中の光量子量が変化するかを検討したが、現在の段階では明確な差異が検出されていない。また、室内実験より、流速の藻類増殖に対する影響は、植物プランクトンの密度が高いと現れないという結果が得られている。現在、これらの結果を投稿中である。1.研究目的富栄養化現象において、水利用に最も重大な影響を与えるのは植物プランクトンの増殖である。それ故、植物プランクトンの増殖を抑制することが最も重要である。流域からの流入する栄養塩を除去することは根本的対策ではあるが、富栄養化現象で問題となる低濃度の栄養塩濃度を対象とする場合には、山林や水田からの流出水も無視できず、除去のみの対策を考えることは困難が大きい。本研究では、流動の藻類増殖に及ぼす影響を明らかにし、この効果を水質浄化に応用することを目的として行った。2.本年度の研究概要と研究成果従来は混合培養系を対象として実験したが、本年度はクロレラ(緑藻類)を対象として実験すると共に、実験結果及び現地観測結果の整理・解析を行った。研究成果に以下に列挙する。(1)室内実験より、シアノバクテリアとクロレラとでは、流動の増殖抑制に対する影響の程度が異なるが、どちらの場合も影響が確認された。実験結果に関する限り、シアノバクテリアの場合のほうが流動により強く抑制された。(2)増殖実験の結果を基に、増殖速度式を定式化し、速度式中の各種定数を決定した。シアノバクテリアの場合は、夜間に死滅が卓越する傾向があるのに対して、クロレラではそのような傾向は認められず、定式化された速度式が若干異なった。(3)現地観測の解析より、流速10cm/s未満の河道区間で増加が生じ、流速25cm/s以上の区間では減少していた。河道でのクロロフィル増加速度は実験で観測された増殖速度やや大きく、減少速度は実験で得られた死滅速度より数倍大きく、他の要因が関与している可能性が高い。この減少に対して水温、栄養塩濃度及び水中の光量子量は影響は確認できなかった。対象河川においては、10-25cm/sの範囲で流速があまり変化しない河道区間が存在せず増殖限界流速を求められなかった。(4)現地での流動実験の結果より、流動状態により植物プランクトンの種が変化することが明らかとなった。
音源として圧電発音体を用いた人工喉頭の頚部生体信号による制御と音源の最適化

これまでに喉頭傷害や喉頭癌等により,声帯の音源としての機能を失った患者のための人工喉頭の開発に関する研究を行ってきた.この人工喉頭は音源に軽量小型な圧電発音体を使用しているが,その発生音は人間の声帯音とは異なる.そのためこの音源の音質向上に関する研究を行った.また,発声音の制御を行うことで音声の明瞭度を向上させることが可能であり,頚部の筋電位信号に着目し,その信号を用いた制御に関する研究を行った.これまでに喉頭傷害や喉頭癌等により,声帯の音源としての機能を失った患者のための人工喉頭の開発に関する研究を行ってきた.この人工喉頭は音源に軽量小型な圧電発音体を使用しているが,その発生音は人間の声帯音とは異なる.そのためこの音源の音質向上に関する研究を行った.また,発声音の制御を行うことで音声の明瞭度を向上させることが可能であり,頚部の筋電位信号に着目し,その信号を用いた制御に関する研究を行った.本年度の研究において,以下の成果が得られた。1.複数の頚部筋から筋電位信号を検出し,それらの組合せからの「音声発生時にのみ」生じる信号の抽出。2.単一の筋電位(胸骨舌骨筋)を用いた制御用信号生成と音源制御。3.低音発生に適した新形状音源の作製。4.制御用信号を用いたスピーチバルブの制御。1.に関しては,胸骨舌骨筋,胸鎖乳突筋,輪状甲状筋を対象として筋電位信号を,首の上下,左右運動や発声時に測定し,それぞれの動作と筋電位信号との関係を調べた。その結果,首の上下運動からはいずれの筋電信号も得ることができず,左右運動時には胸骨舌骨筋と胸鎖乳突筋から,発声時には輪状甲状筋,胸骨舌骨筋からの筋電位の発生が確認された。このことから,胸骨舌骨筋と胸鎖乳突筋の筋電位をモニタリングすることで,発声時にのみ必要な信号を分離することが可能であると考えられる。2.に関しては,胸骨舌骨筋の筋電位から求めたRMS値を用いてピッチ周波数を,筋電位を全波整流した後に任意の時刻以前の一定区間の移動平均を求めたものを用いてオン/オフを制御する信号を得た。この信号を用いて, PC上のスピーカのピッチ周波数とオン/オフ制御を行った。3.に関しては,シミュレーションを用いて新形状の設計を行い,試作と評価を行った。その結果,共振周波数の低下は確認されたが,発生音の大きさに課題を残した。4.に関しては, 2.で求めたオン/オフ制御用信号を用い,試作したスピーチバルブの制御を行った。従来のスピーチバルブはワンウェイバルブを用いており,開放時においても気流抵抗となり使用者にストレスを与えるものであるが,試作したものは開閉を電磁スライダにより行い,開放時に気流抵抗となることが少ないという利点を持つ。実際の制御実験において,筋電位により任意に開閉を行うことが可能であった。2.と4.の成果は国内会議にて1件ずつの口頭発表を行った。本年度の研究において,研究計画実施計画に記載したもののうち,以下の1),2)に示す成果が得られ,さらに新しい試みとして3)の成果を得た.1)人工喉頭制御用信号を用いたスピーチバルブの制御.2)筋電位測定精度の向上.3)発声訓練用マイクロポンプの試作.1)測定により得られた胸骨舌骨筋の筋電位信号を全波整流したのち移動平均を取り,実験により見積もられた閾値と比較することで,人工喉頭のオンオフ制御に使用可能な信号を得ることができる.この信号を用いて,発声時にのみ閉鎖し,その他の呼吸時には開放される試作電気制御式スピーチバルブを使用した発声実験を行った。その結果,本スピーチバルブは平常時は良好な呼吸を実現し,発声時においては筋電位信号により閉鎖され,発声が可能となった.従来のスピーチバルブと比較して,平常時における呼吸抵抗のストレスが少ないため,小型化により日常生活へ適用可能であると考えられる.この成果に関して,国内会議において3件の口頭発表を行った.2)筋電位計測精度の向上のため,測定箇所の厳密化を目標として小型筋電位測定電極を試作し,これを用いて筋電位計測を行った.この測定電極は従来のものと比較して設置面積が1/7,電極間距離は1/2であるため,測定箇所を細かく調整することが可能である.その結果,検出信号への首の上下運動や回旋運動などの他の動作の影響を減少させることができ,これまで問題であった誤作動を減らすことが可能であると考えられる.3)カニューレ使用者への発声訓練として,これまでに酸素ボンベを使用した方法が用いられていたが,これを代替する小型のポンプ装置の試作を行った。この試作ポンプは筋電位信号で制御が可能である。1次試作品は流量が少なく十分な性能を発揮できなかったが,流量増大を目指した2次試作を進めている.
悪性黒色腫における骨髄由来抑制細胞の同定とその免疫抑制メカニズムの解析

我々は、マウスの抑制型マクロファージ、MDSCとTregsによる担癌体のトレランスの誘導の研究を行った。本プロジェクトにより我々は腫瘍内での抑制型マクロファージに関する8本の英文論文を発表した。さらに5本の英文論文が投稿中である。本プロジェクトを通して、我々は抑制型マクロファージのサブタイプを明らかにし将来的には癌患者においてこれらのマクロファージをターゲットとした、より理想的な治療法を確立することができる。本研究では悪性腫瘍内に浸潤してくる抑制型マクロファージの一種であるMDSC上の免疫抑制分子(B7 horming molecules)の発現とその免疫抑制機能の相関をマウス悪性黒色腫モデルを用いて検討したところ、マウス悪性黒色腫モデルではこれら免疫抑制分子が高頻度にMDSCの細胞表面に発現していることが分かった。また、制御性T細胞をマウス生体内で除去することの、MDSCにおける免疫抑制能への影響をin vivoで行うことにより、制御性T細胞がMDSCの機能を維持するのに必要か否かを検討し、正の相関性を認めた。また、現在臨床で悪性黒色腫に使用されている薬剤イミキモドやダカルバジンなど各種抗癌剤のMDSCの細胞表面マーカーへの影響を検討し、一定の効果があることを確認した。更にこれらマウスの結果をふまえて、ヒト皮膚悪性腫瘍におけるMDSCの動向を多岐にわたる癌腫(乳房外パジェット病、有局細胞癌、ボーエン病、ケラトアカントーマ)で検討し、以下の国際誌に発表した(J Invest Dermatol1報、Clin Dev Immunol 1報、Acta DermVenereol 5報、Dermatology 1報)。また、期間中に国際学会で口演を含む4回の発表を行い、今後の研究への情報収集を行った。今後、更にこれら抑制型マクロファージをターゲットとした新規皮膚悪性腫瘍治療法の開発の研究を行う予定である。抑制型マクロファージであるMDSCはその存在下に制御性T細胞を誘導し、腫瘍内で免疫寛容を形成することが知られている。そのため、ret melanomaモデルにおいて、腫瘍内に浸潤しているMDSCは高頻度に抑制型のco-stimulate moleculeであるB7H homologを発現していることを確認し、この中のB7H1を介してMDSCがT細胞の増殖を抑制していることを確認した。更に制御性T細胞のMDSCのフェノタイプに与える影響を、マウス悪性黒色腫モデルを用いて、検討した。その結果、ret melanomaモデルにおいては、制御性T細胞を除去すると、MDSC上のB7H homologの減弱が生じることを証明した(2012. Fujimura et al. JID)。更にこれらのMDSCの変化がMDSCのT細胞増殖抑制能、抑制型サイトカインであるIL-10の産生能に関わることも確認した。また、異なるマウスのB16 melanomaモデルにおいてもB7H1の発現を確認し、この発現が現在臨床で使用されている種々の薬剤の影響を受けることを確認しつつある。これと平行して臨床検体を用いて皮膚悪性腫瘍全般における抑制型マクロファージの存在と疾患の病態に関する研究を行い、Merkel細胞癌においてCD163陽性抑制型マクロファージが疾患予後に関与する可能性を示唆した(2012 Hidaka et al. Acta DermatoVenereologica)。現在臨床研究においては、悪性黒色腫、血管肉腫、有棘細胞癌等多岐にわたり解析を行っている。上記の通り、現在当プロジェクトは、第一段階として基礎論文としてインパクトファクター6点台と3点台の国際誌に採用される他、臨床応用を推進するため、臨床論文としても国際誌に二本採用されている。現在投稿中の論文で再実験が必要なものの、当初の予定を上回り、国際誌への採用が進んでいる。MDSCの抑制機能の解析に関しては、悪性黒色腫の汎用マウスモデルであるB16を用いて現在臨床で使用されている薬剤(ダカルバジン、インターフェロン、イミキモド等)のMDSCに与える影響の解析を進める。更に、ヒトの皮膚腫瘍全般において、この抑制型マクロファージの解析を免疫染色とフローサイトメトリーによる解析を中心に行う。B16マウス黒色腫モデルにおいてMDSCの抑制能に影響を与えることが既に他の癌種で報告されている、ビスフォスフォネートの腫瘍抑制能の検討を行う。また、これまで臨床において悪性黒色腫の治療に用いられてきた薬剤のMDSCに与えるメカニズムの解析をB16モデルで行う。さらに、これら薬剤で誘導されてきたMDSCの抑制機能の差異をT細胞増殖アッセイやELISA法によりサイトカイン産生能の検討を行う。更にヒトの検体においてMDSCの検討を行い、臨床研究への基礎データとする。具体的には悪性黒色腫ステージ2、3、4の患者の末梢血からbuffy coatを回収し、フローサイトメトリーを用いることにより、ヒトのMDSCとして知られているCD11b+CD33+CD14-HLA-DR-細胞の存在と比率を確認する。次にこの細胞表面のB7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4の発現を検討する。

また、これらの患者の原発巣のパラフィン組織より、免疫染色を行い、浸潤細胞内のMDSCの比率およびB7-horming moleculeを発現しているMDSCの存在を検討する。これらのマーカーと黒色患者のステージとの相関性を統計学的に解析する。
Caspaseファミリー遺伝子Mch3のノックアウトマウスの作製と解析

Caspaseはアポトーシスおよびサイトカインの分泌に関与するシステインプロテアーゼファミリーである。このCaspaseファミリーの生理的機能、特にアポトーシスにおける役割を解析するために、私たちのグループはICE(Caspase-1)およびCPP32(Caspase-3)のジーンターゲティングマウスを作製した。ICEノックアウトマウスにおいては、アポトーシスに顕著な異常を認めることはできなかったが、CPP32ノックアウトマウスでは、中枢神経系の発生における神経細胞死が抑制されていた。CPP32分子が神経細胞死において中心的な役割を果たしていることが示唆された。Caspaseファミリーのアポトーシスにおける役割をさらに解析するために、Mch3(Caspase-7)のノックアウトマウスを作製し、アポトーシスにおける機能を解明することを目標に研究を進めている。Caspase-7は、機能的にCPP32によく似たプロテアーゼである。Caspase-7ノックアウトマウスは胎生7.5日までに死亡する。Caspase-7を発現しないように両染色体の遺伝子座に変異を導入したES細胞を用いた解析では、staurosporin、UVなどのアポトーシスを起こす刺激に対し抵抗性を示す。また、Caspase-7はMAPキナーゼ系酵素MEKK-1の活性化に関与する可能性が示されていた。かし、このES細胞を使用した実験結果では、その活性化にCaspase-7は必須でないことが明らかになった。現在、胎生致死の原因を詳しく調べている。
高分子電解質架橋菌糸の高濃度培養系の開発

糸状菌は工業的に重要であり、高濃度培養法が開発されれば生産性向上に有効である。しかし菌糸が網目状に増殖するため物質移動が律速となり、高濃度培養は達成されていない。本研究は高分子電解質を用いた新たな手法により糸状菌の高濃度培養系を開発し、糸状菌利用工業に資する知見を提供することを目的とした。各種合成・天然高分子を用いて糸状菌Aspergillus nigerIFO 31012の高濃度菌糸集合体の作成を試みたところ、陽イオン高分子電解質であるトリメチルグリコールキトサン(TGCI)と陰イオン高分子電解質であるポリビニル硫酸カリウム(KPVS)を同量ずつ添加した場合に、良好な菌糸集合体が形成した。TGCIを単独で添加しても集合体が形成されないことから、糸状菌表面の負電荷とTGCIとが結合するのではなく、糸状菌表面電荷以上のTGCIとKPVSが同量存在することにより両電解質がポリエレクトリックコンプレックスを形成してゲル化し、ゲルが菌糸を包み込むことで集合体が形成されると推定した。形成された菌糸集合体の表面に糸菌が露出していれば菌糸同士が絡み合い、培養液の流動性が悪くなる。高分子電解質表面から菌糸が露出しないTGCIおよびKPVSの添加量を菌糸集合体の沈降速度から検討した結果、菌糸量に対するTGCIおよびKPVSの添加量が50%を超えると菌糸集合体の干渉が無くなり、遊離菌糸と比較して十分な沈降速度が得られる50%を最適添加量とした。菌糸集合体は菌糸をゲルが包み込んでいることから、菌糸同士が付着している状態と比較して菌糸間の物質移動が良好と期待される。遊離菌糸と高分子ゲル菌糸集合体とのグルコースの拡散係数を測定し比較した結果、遊離菌糸の拡散係数が4.45×10-8(m2/s)に対し高分子ゲル菌糸集合体のそれは6.15×10-8(m2/s)と約1.4倍大きくなった。
国際環境産業連関表に基づく非負行列因子分解を用いたクラスター分析と排出責任評価

本研究の目的は以下の通りである。1.国際産業連関理論と応用数学の分野で近年急速に発展している非負行列因子分解理論を融合することによって、各国の産業間生産連鎖構造から炭素クラスターを検出する方法の開発を試みる。2. 1.の産業クラスター分析法と多地域型単位構造モデルを組み合わせ、国際サプライチェーンを通したCO2誘発構造から炭素クラスターを検出する方法の開発を行う。3. 1.の実証分析として、アジア経済研究所作成のアジア国際産業連関表と国立環境研究所作成の国別部門別CO2排出量を用い、インドネシア、マレーシア、フィリピン、シンガポール、タイ、中国、台湾、韓国、日本、アメリカの10カ国、76産業部門を研究対象とし、当該国において検出された炭素クラスターが他国の炭素粗放的な産業クラスターに移行(変化)による環境影響を分析する。4. 2.の実証分析として、多地域型単位構造モデルによって推計できる国際的なCO2誘発行列を用いたクラスター分析を行うことによって、特に東アジア経済における排出集約度の高いクラスターの検出とその特徴分析を行い、日本のようなAnnex I諸国と中国をはじめとするNon-Annex I諸国の間の国際的なCO2排出責任論について定量的に議論する。26年度が最終年度であるため、記入しない。2. 1.の産業クラスター分析法と多地域型単位構造モデルを組み合わせ、国際サプライチェーンを通したCO_2誘発構造から炭素クラスターを検出する方法の開発を行う。3. 1.の実証分析として、アジア経済研究所作成のアジア国際産業連関表と国立環境研究所作成の別部門別CO_2排出量を用い、インドネシア、マレーシア、フィリピン、シンガポール、タイ、中国、台湾、韓国、日本、アメリカの10カ国、76産業部門を研究対象とし、当該国において検出された炭素クラスターが他国の炭素粗放的な産業クラスターに移行(変化)による環境影響を分析する。4. 2.の実証分析として、多地域型単位構造モデルによって推計できる国際的なCO_2誘発行列を用いたクラスター分析を行うことによって、特に東アジア経済における排出集約度の高いクラスターの検出とその特徴分析を行い、日本のようなAnnex I諸国と中国をはじめとするNon-Annex I諸国の間の国際的なCO_2排出責任論について定量的に議論する。国際産業サプライチェーンのクラスター分析のための事前研究として国内産業のサプライチェーンに関してクラスター分析を行った。本分析の関連する結果は、2013年開催の環太平洋産業連関分析学会研究発表会、The International Input-Output Associationにて報告した。また本研究成果は、英語論文として取り纏め、Ecological Economics誌に投稿予定である。当初の計画以上に進展しなかった理由として、国際サプライチェーンに関する分析に着手する前に、国内サプライチェーンに関する分析を行った結果、多くの問題点(クラスター分析の不安定性など)があったことが挙げられる。引き続き、国際サプライチェーンを通したCO2誘発構造からの炭素クラスター検出を進めていく。またそれに並行して、分析結果への理解に深く関わる、PajekやGephiなどのネットワーク視覚化ソフトを用いた結果の視覚化についても力を注ぎ、最終的には学術論文への掲載を目指す。
肝による蛋白質摂取の調節

以前に我々は、ラットに蛋白質とエネルギーの摂取量を自由に選ばせる選択摂食法を用いて、ラットがエネルギーのみならず蛋白質の摂取量をも調節していることを明らかにした。そこで、蛋白質摂取調節機序を追究するため、代謝の中心臓器であり、また種々の受容器が存在していると考えられている肝の関与について調べた。門脈・下大静脈吻合ラット(以下PCA)に5%および60%蛋白質食を自由に摂取させて35週間飼育した。蛋白質源としてカゼインと小麦グルテンを用いた。対照ラットには開腹術のみ施した。1.カゼイン:PCAのエネルギー摂取量は対照と差はなく、同じ成長を示したが、蛋白質摂取量は対照の8.0g/日に対し4.7g/日と少なかった。2.小麦グルテン:PCAのエネルギー摂取量は対照よりわずかに低値であったが、蛋白質摂取量は対照の20%と非常に減少した。そのため成長は明らかに劣っていた。この結果は、劣質蛋白質を与えられた場合正常ラットは蛋白質摂取量を増加させて良好な成長を維持するという我々の以前の成績と対照的である。これはPCAが過剰の食餌性窒素を処理できないためであると考えられる。そこで次に絶食後の摂取量について調べた。3.絶食PCAのカゼイン摂取量は対照と全く差がなくなった。しかし、4.絶食PCAのグルテン摂取量は、絶食前よりは増加したが、対照の25%に過ぎず、低値のままであった。このように、良質蛋白質の場合は絶食により蛋白質摂取量は正常に回復したが、劣質蛋白質ではわずかな増加しか見られなかった。体内の尿素やアンモニアが蛋白質摂取量を制限している可能性がある。そこで、5.食餌中に尿素を添加したがPCAの蛋白質およびエネルギー摂取量は影響されなかった。しかし、6.アンモニアを加えると、PCAの蛋白質摂取量は変化しなかったが、エネルギー摂取量は減少した。また、7.分岐鎖アミノ酸の添加は効果がなかった。
求心路遮断性疼痛における感覚・運動表象の定量化とバーチャルリアリティ訓練の効果

本研究では,求心路遮断性疼痛患者の「患肢の運動表象」の定量的評価方法を確立し,バーチャルリアリティ(Virtual Reality: VR)リハビリの効果と神経メカニズムに明らかにすることを目的とした.本研究によって,定量化された患肢の運動表象と求心路遮断性疼痛との間に有意な相関関係があることが確認された.そして,VRリハビリは患肢の運動表象と求心路遮断性疼痛を同時に改善させることも明らかにした.また,これらの効果は健肢の感覚運動情報の利用によってもたらされることが脳波解析によって示唆された.本年度では,求心路遮断性疼痛を有する者の運動表象あるいは感覚表象を定量的に評価し,それらと疼痛との関係を明らかにすることを計画していた.両手干渉課題から得られるOvalization Indexという指標を用いて,求心路遮断性疼痛患者の運動表象を定量化することに成功し,9名の求心路遮断性疼痛患者での計測を終え,定量化された運動表象と疼痛との間に有意な相関関係があることを明らかにした.つまり,運動表象が残存している求心路遮断性疼痛患者は,疼痛が軽度であるということを明らかにした.さらに,この定量化された運動表象は,患者自身が語る主観的な運動表象のデータと乖離しており,主観的に語られる運動表象と疼痛との間には有意な相関関係が認められなかった.このことは,定量化された運動表象と疼痛との関係を明確にするだけではなく,臨床現場における運動表象の定量的評価の意義の大きさを示す結果となった.なお,運動表象と求心路遮断性疼痛との関係を示した結果は,国際雑誌Neuroscience Lettersに掲載された.一方で,感覚表象の定量的評価に関して,その実施方法と解析手法を確立し,健常者での計測も終了した.そして,求心路遮断性疼痛患者数名にも実施したが,感覚障害が重度であること,手指の関節拘縮があることが原因で課題そのものが実施困難な症例が存在した.このような問題点を解決するために,現在では課題を簡略化し,感覚障害が軽度である脳卒中片麻痺患者での計測を6名実施した.その結果,健常者とは感覚表象が有意に変容していることが明らかとなった.この結果は,求心性入力に何らかの問題が生じると感覚表象が変容することを示唆するものである.今後は,これらの定量化された運動および感覚表象がリハビリテーションによって改善するのか,そしてその改善は疼痛改善に繋がるのかを明らかにする予定である.本年度に予定してた運動表象および感覚表象の定量的評価方法の確立に成功した.当初の予定では20名ほどの被験者数を想定していたが,実際にリクルートすることができたのは9名であった.その中でも運動表象と疼痛との間に強い相関関係が認められたことから,両者には密接な関係性があることが明らかとなった.また,平成28年度に計画しているバーチャルリアリティを用いたニューロリハビリテーションの効果検証に関して,バーチャルリアリティーシステムそのものは完成しており,既に複数人実施済みである.今後は,運動表象および感覚表象がバーチャルリアリティーを用いたリハビリテーションによって改善するのかを検証するとともに,それと同時に疼痛も軽減するのかを検証していく予定である.本年度では,運動表象を改善させることによって求心路遮断性疼痛が改善するのかを検証するとともに,その神経科学的メカニズムを脳波解析によって明らかにすることとしていた.実際には,前年度に確立した運動表象の定量評価方法である両手干渉課題から得られるOvalization Indexがバーチャルリアリティリハビリによって変化することにともなって,痛みの改善が得られるのかを調査した.その結果,10分間のバーチャルリアリティリハビリテーションによって,Ovalization Indexが有意に改善するとともに,疼痛強度も有意に減少した.加えて,それらの間に有意な相関関係が認められることを明らかにした.この研究成果は,国際雑誌European Journal of Painに掲載されている.また,バーチャルリアリティリハビリテーション中の脳波活動を計測して,運動野領域における両手間のコヒーレンスを算出した.その結果,麻痺肢を動かしているという運動錯覚を感じている時には,両手間の運動野コヒーレンスが高まっていることが明らかになった.これは,健肢の運動情報を利用して麻痺肢の運動表象を形成しているプロセスでの脳活動であると考えられ,麻痺肢の運動表象が再構築されるプロセスの一端を明らかにできたことになる.一方で,バーチャルリアリティリハビリによる効果のばらつきを検討することを計画していたが,対象者を十分にリクルートすることができなかったために,統計学的な検討は出来ていない.この点に関しては,改善が認められなかった症例に対するインタビューによって補完することが出来ており,「麻痺肢を動かそうとするだけで痛みを感じる」という特徴を有する症例にはリハビリ効果が少ないという結果が得られている.これらの一連の研究から,求心路遮断性疼痛のリハビリテーション効果とメカニズムの一端を明らかにすることができた.本研究では,求心路遮断性疼痛患者の「患肢の運動表象」の定量的評価方法を確立し,バーチャルリアリティ(Virtual Reality: VR)リハビリの効果と神経メカニズムに明らかにすることを目的とした.本研究によって,定量化された患肢の運動表象と求心路遮断性疼痛との間に有意な相関関係があることが確認された.そして,VRリハビリは患肢の運動表象と求心路遮断性疼痛を同時に改善させることも明らかにした.また,これらの効果は健肢の感覚運動情報の利用によってもたらされることが脳波解析によって示唆された.

今後は,既にシステムが整備されているバーチャルリアリティを用いたニューロリハビリテーションの効果検証を実施する予定である.そして,バーチャルリアリティーリハビリテーションによって改善するであろう運動・感覚表象の改善と疼痛の改善との間に有意な相関関係が認められるのかを調査する.また,数名の求心路遮断性疼痛患者に協力してもらい,バーチャルリアリティーリハビリ中の脳波計測を実施し,どのような脳活動が得られているのかを調査する.さらには,その脳活動の分析に基づいて,バーチャルリアリティーリハビリによって効果が得られた症例と効果が得られなかった症例の相違点を分析し,さらなるシステム改良を行う予定である.理学療法宿泊費を想定していた旅費が必要なくなったことが1度生じたため.次年度の論文作成に必要な英文校閲費に使用する予定である.
被服の触感や外観情報の判断を可能にするネットショップ画像製作と呈示技術の基礎研究

本研究では,ネットショップにおいて提示される被服および布地の画像から受け取れる印象と,実物から受け取る触感や外観に齟齬が生じるという問題を解決するために,被服および布地の触感や外観情報の判断を可能にするネットショップ画像の製作方法の開発を目的とした.異なる被験者群や布地を用いた実験により,1)被服や布地の質感評価およびそれらの画像製作のための指標となる触感評価語(9語)および外観評価語(8語)を明らかにし,2)それらの指標に基づいて,被験者群および布地に適応して被服や布地の質感(触感・外観)情報の提示を可能とする画像製作方法を開発した.平成25年度は,(I)布地質感判断の視覚・触覚の基礎的実験,(II)スタイル画(デザイン画)及びそれに基づいて設計・製作した被服等の呈示刺激の作成,(III)被服及び布地の撮影・評価実験環境の構築,(IV)評価項目(軸)の検討などを実施した.その結果,下記に示すことが明らかとなり,その成果を外部発表した.(学協会誌論文1件,査読付き国際会議2件,国内会議6件)(1)布地の撮影画像に対する視覚と布地の実物に対する触覚との質感同定には,布地撮影画像を呈示するディスプレイの視野サイズが大きく影響すること,そして視野サイズが制約されなければ,布地ドレープの複雑さが影響することを明らかにした.(2)上記(1)の布地質感の視覚-触覚同定実験に加え,布地の撮影画像と実物の視覚のみによる視覚-視覚同定実験と,布地の実物を用いた触覚のみのブラインドタッチによる触覚-触覚同定実験を実施した.これらの布地同定率を比較した結果,布地撮影画像に対する視覚情報が布地質感判断に最も大きく影響していることを明らかにした.同時に布地素材の相違が,布地の質感同定率に影響することを明らかにした.(3)被服および布地の感性評価実験に使用する被服の外観および触感評価語について,経験や知識が異なる多様な被験者群を用いて,関連する170語の収集,適切度調査・クラスタ化を実施し,共通して導出される汎用性のある17の評価語(外観評価語:8語,触感評価語:9語)を明らかにした.(4) “2013年ー2014年の春夏に流行するワンピース"をテーマに11種類のデザイン画を作成し,それに対応した生地を購入し,それらを使用したワンピースを縫製した.上記(3)で得られた評価語を用いて,デザイン画,ワンピース,布地を評価し,各々の評価傾向を明らかにした.平成26年度は,平成25年度の成果に基づき,下記[I]及び[II](a)-(d)を明らかにし,それらを外部発表した(学協会誌論文1件:採録決定,図書1件,特許出願1件,査読付き国際会議3件,招待講演2件,国内発表7件[日本感性工学会等])[I]まず,平成25年度の成果である「布地の質感(外観・触感)評価語」と,「KES(Kawabata Evaluation System)の風合い評価用語」及び「ファッション業界の経験的評価用語(素材軸:ファッション感性クラスタ)」との関係を検討した結果,それらが相互に深く関係することを明らかにした[学協会誌論文][査読付き国際会議].[II]次に,布地の質感評価語に注目した画像製作方法(a)-(d)を検討した.具体的には,(a)布地の“薄さ"・“厚さ"について,それらの評価と輝度特性との心理物理学的関係を明らかにし,透過率に注目した画像撮影方法[特許出願]を開発した.(b)布地の“粗さ"・“滑らかさ"について,それらの評価と物理特性(空間周波数、コントラスト等)との心理物理学的関係を明らかにし,撮影距離(倍率)に注目した画像撮影方法を開発した.(c)布地の“はりのある"・“柔らかい"について,それらの評価と布地ドレープの動き(回転運動の速度変化等)との心理物理学的関係を明らかにし[査読付き国際会議],布地の回転運動の変化に注目した画像撮影方法を開発した.(d)布地の“ドライ"・“ウェット"について,それらの評価と布地のギャザ倍率変化との心理物理学的関係を明らかにし,布地のギャザ分量によるドレープ変化に注目した画像撮影方法を開発した.これらは,本年度の研究目的である“新しい呈示画像コンテンツの製作"に関する方法であり,最終目的の“新しい画像呈示方法の検討"に直接的に関連する成果である.

平成27年度は,平成26年度の成果に基づき,下記(I),(II)を明らかにし,それらを外部発表した(学協会誌論文2件:採録,査読付き国際会議5件[2件は受理],国内発表7件).(I)平成26年度の成果である画像製作方法に基づいて作成した画像を用いて,異なる被験者群(被服系および工学系)による布地質感評価実験を実施し,両者の評価の相違点と共通点を明確にすることにより画像製作方法の適応性を検証した.具体的には,布地質感評価語:滑らか(フラット)-粗い(ラスティック),薄い(シン)-厚い(シック),はりのある(クリスプ)-やわらかい(ソフト),ドライ-ウェットに注目し,撮影距離,照明の明るさ,布地の動き・形状などを変化させて撮影する方法により画像群を製作した.そして,その画像群を提示した時の視覚による質感評価が,実際の布地の視覚および触覚による質感評価に最も近い撮影条件を被験者群毎に明らかにし,画像製作方法の適応性を明らかにした.(II)視覚に対する画像提示に加えて,布地表面凹凸を記録した触覚に対する振動提示の有効性を明らかにし,画像および振動提示による総合的な布地質感提示方法を検討した.具体的には,既開発の振動提示装置(TECHTILEツールキッド)とタブレット型ディスプレイを連動させて,布地画像に応じた布地表面凹凸の振動を提示する画像・振動提示システムを構築した.その結果,本システムによる布地画像・振動提示は,布地の滑らか(フラット)-粗い(ラスティック)の質感判断に対して有効であることを明らかにした.上記の結果を踏まえて,被験者の布地質感判断能力や質感伝達に必要な精度などを考慮した2ステップ制による総合的な布地質感提示方法を提案した.本研究では,ネットショップにおいて提示される被服および布地の画像から受け取れる印象と,実物から受け取る触感や外観に齟齬が生じるという問題を解決するために,被服および布地の触感や外観情報の判断を可能にするネットショップ画像の製作方法の開発を目的とした.異なる被験者群や布地を用いた実験により,1)被服や布地の質感評価およびそれらの画像製作のための指標となる触感評価語(9語)および外観評価語(8語)を明らかにし,2)それらの指標に基づいて,被験者群および布地に適応して被服や布地の質感(触感・外観)情報の提示を可能とする画像製作方法を開発した.当初は,デザイン画および被服の感性評価や同定実験を予定していた.しかし,平成25年度に明らかにした布地の質感評価語(外観評価語および触感評価語)と,布地の風合い評価用語,およびファッションにおける素材軸用語との関係を分析した結果,相互に深く関連することが明らかになった.そこで,本研究の最終目的である“新しい画像呈示方法の検討"を直接的に推し進めるためには,布地の質感評価語に注目した画像製作方法を主体的に検討するべきであるという考えに至り,その実験研究を実施した.その結果,布地の“薄さ"・“厚さ",“薄さ"・“厚さ",“はりのある"・“柔らかい",“ドライ"・“ウェット"のそれぞれの評価に関わる物理特性を明らかにし,それらに注目した画像製作・撮影方法を開発することができた.したがって,当初の予定とは異なるアプローチとはなったが,逆に最終目的に対しては当初の予定以上の進展となっているので,全体的な研究の達成度としては,おおむね順調に進展していると結論付けた.感性情報学,被服情報学,質感情報学,画像生成/製作技術平成27年度は,平成25・26年度の成果を踏まえて,下記を実施して研究目的の達成を目指す.[I]布地の各質感評価語(a)-(d)の感性評価とそれに関連する物理特性との関係を「感覚の違い(視覚,視触覚)」や「被験者による相違(被服系,工学系など)」に注目して実験を実施する.具体的な心理物理的関係は,(a)“薄さ"・“厚さ"ー輝度特性など,(b)“薄さ"・“厚さ"ー空間周波数,コントラストなど,“はりのある"・“柔らかい"ー回転速度・回転数など,(d)“ドライ"・“ウェット"ーギャザ倍率,ドレープ形状など,である.[II]その後,上記(I)の結果を比較検討し,「感覚の違い」および「被験者の違い」による布地質感評価に適応させるための物理的な特徴量を明らかにし,各被験者に適応した画像呈示方法を検討する.[III]
細胞内セラミド輸送の制御機構

細胞内の脂質選別輸送に脂質転移蛋白質の関与が示されつつあるが、当該輸送系の制御の仕組みは未解明である。本研究では、小胞体で合成されたセラミドをゴルジ体へと輸送する蛋白質CERTのセリン315のリン酸化によって、CERTと小胞体膜蛋白質VAPとの相互作用が顕著に増強すること、及び、そのことがセラミドの小胞体-ゴルジ体間輸送を上昇させることを見出した。別の特定部位での脱リン酸化がCERTのゴルジ体会合活性及び膜間セラミド転移活性を高進することも別途明らかにしている。これらの結果から、CERT依存性セラミド輸送は、複数の蛋白質リン酸化・脱リン酸化系の関与によって制御されていることが明らかとなった。膜脂質が生合成されるとき、異なるオルガネラの膜で起こる複数のステップを経るために、脂質分子自身は目的とする場所へ的確に移動している。しかし、特定のオルガネラ膜に存在する多種多様な脂質の中から特定の脂質を選びだして他のオルガネラ膜へと運んでいるメカニズムは、どの種類の脂質をとってみてもほとんどわからないままであった。主要膜リン脂質の一種であるスフィンゴミエリンの生合成では、小胞体で合成されたセラミドが、ゴルジ体に移行してスフィンゴミエリンへと変換される。我々は、セラミドの小胞体-ゴルジ体間選別輸送に特異的に関わる分子装置(CERTと命名)を発見し、CERTにはセラミドを小胞体から特異的に引き抜き、ゴルジ体に運搬して放出する機能があることを示し、タンパク質の選別輸送形式である膜小胞輸送機構とは全く異なる「分子引き抜き転移」機構でセラミドの選別輸送は行われていることを主張するに至っている。さらに、CERTのpleckstrinhomologyドメインのすぐ下流に多重リン酸化を受ける部分が存在し、この領域が多重リン酸化されるとCERT機能が負に制御されることをすでに明らかにしている。多重リン酸化部位以外にもCERTはリン酸化を受けていることが他の研究グループによる網羅的リン酸化タンパク質解析から示唆された。このリン酸化部位は、CERTが小胞体膜タンパク質であるVAPと会合するベプチドモチーフのすぐ上流に位置する。本年度は、このリン酸化を受けるセリン残基をグルタミン酸やアスパラギン酸もしくはアラニンに置き換えたCERT変異体を作製して解析を行った。その結果、本リン酸化はCERTのVAPと会合する機能を増強することが示唆された。脂質が異なるオルガネラ間を移動する際にどのようなメカニズムで運ばれているのか、そして脂質輸送はどのようなメカニズムで制御されているのかは、ほとんど未解明である。我々は、小胞体で合成されたセラミドをゴルジ体へと輸送する蛋白質・CERTを発見した。CERTの解析から、セラミドの小胞体-ゴルジ体間輸送は、両オルガネラ膜が接触した部位において高効率に行われていると示唆されているが、小胞体-ゴルジ体膜接触部位を構成する因子は未解明である。本研究では、CERTの機能を制御するメカニズムを明らかにするとともに、CERTが膜接触部位で機能する仮説を検証することを目的としている。本年度は、CERTの特定部位のリン酸化によって、CERTと小胞体膜タンパク質VAPとの相互作用が顕著に増強することを見出した。さらに、そのことがCERTを介するセラミドの小胞体-ゴルジ体間輸送を上昇させることも見出した。我々は、CERTの他の部位のリン酸化でVAP結合能以外の機能が負に制御されることもすでに報告している。これらの結果から、CERTがリン酸化によって複雑な制御を受けていることが明らかになった。また、海外との共同研究から、当初の計画外の成果をあげることもできた。偏性寄生細菌であるクラミジア・トラコマチスは先進諸国における性感染症の最大起因病原体となっている。この菌は宿主細胞の様々な脂質を利用して増殖することが知られていたがそのメカニズムは未知であった。我々は、クラミジア・トラコマチスの増殖には宿主細胞のCERTが重要であることを見出し、CERTは小胞体のセラミドを膜接触部位を介してクラミジア寄生胞に転移させて寄生胞の成熟化に寄与することを示唆する結果も示した。この発見は、膜脂質が膜接触部位において他の膜構造に転移することを支持する新たな証拠である。我々は、小胞体で合成されたセラミドをゴルジ体へと輸送するタンパク質・CERTを発見し、CERTを介したセラミドの小胞体-ゴルジ体間輸送は両オルガネラ膜が接触した部位において高効率に行われていると提唱するに至っている。本研究課題では、CERT機能を制御するメカニズムを明らかにすることを目的としている。

昨年度までに、CERTの315番目のアミノ酸であるセリン残基S315のリン酸化によって、CERTと小胞体膜タンパク質VAPとの相互作用が顕著に増強され、小胞体-ゴルジ体間セラミド輸送も高進することを明らかにした。本年度は、スフィンゴ脂質生合成の阻害した際にS315のリン酸化レベルが高まることを見出し、当該部位のリン酸化が細胞内の膜スフィンゴ脂質量を適切な範囲に調整することに寄与していると示唆した。これらの成果をまとめて英文原著論文発表した。一方で、近3倍体の核型を示すHeLa細胞において、ゲノム編集技術を用いて3つのCERT遺伝子座を全て破壊した変異株、さらにはCERT遺伝子とグルコシルセラミド合成酵素遺伝子の両方を破壊した変異株などの作製に成功し、英文原著論文として発表した。これら実験材料は今後さまざまな研究に役立つと期待される。また、スフィンゴミエリンとCERTの共進化に関する考察を広く論文調査をしながら行い、英文総説論文として発表した。脂質が異なるオルガネラ間を移動する際にどのようなメカニズムで運ばれているのか、そして脂質輸送はどのようなメカニズムで制御されているのかは、ほとんど未解明である。我々は、小胞体で合成されたセラミドをゴルジ体へと輸送する蛋白質・CERTを発見した。CERTの解析から、セラミドの小胞体-ゴルジ体間輸送は、両オルガネラ膜が接触した部位において高効率に行われていると示唆されているが、小胞体-ゴルジ体膜接触部位を構成する因子は未解明である。本研究では、CERTの機能を制御するメカニズムを明らかにするとともに、CERTが膜接触部位で機能する仮説を検証することを目的としている。昨年度は、CERTの特定部位のリン酸化によって、CERTと小胞体膜タンパク質VAPとの相互作用が顕著に増強すること、さらに、そのことがCERTを介するセラミドの小胞体-ゴルジ体間輸送を上昇させることも見出した。本年度は、当該リン酸化によって、CERTを介して小胞体とゴルジ体のリンクが起こることを示唆する結果を得た。すなわち、VAPとの相互作用が増強されるCERT S315E変異体をHeLa S3細胞に発現させると、細胞内にCERTがドット状に集積し、そこにはVAPおよびゴルジマーカーGMP130の一部も共局在した。しかし、VAPをノックダウンした場合やCERT S315E変異にFFATモチーフ変異やPHドメイン変異をさらに導入した場合では、このドット状の集積は観察されなかった。これらの実験結果は、CERT機能がリン酸化によって調整されていることを示すとともに、CERTは小胞体-ゴルジ体膜接触部位において機能しているという我々の提唱したモデルを強く支持する証拠でもある。当初の計画はほぼ計画通りに進展しているが、まだ、成果を論文発表するに至っていない。一方、当該年度の研究実績に記載したように当初の計画していなかったクラミジア菌の細胞内寄生におけるCERTの重要性を発見し、論文発表を行い、当該雑誌のトピックス記事としても紹介された。これらを総合することで、脂質輸送と膜接触部位という細胞生物学上のより大きな課題に対する独創的なアプローチ法に発展すると期待される。25年度が最終年度であるため、記入しない。