hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢疾患早期診断の為の微量末梢血シングルセル PCR を用いた概日リズム診断法の開発

ヒトリンパ球由来細胞系を用いてシングルセルでの時計遺伝子発現検出系の構築を行った。培養中の細胞をセルソーターを用いてシングルセルレベルで分取し、これを1ステップでRNA抽出および逆転写によるcDNAの合成を行った。その結果、このヒト細胞に発現するすべてのヒト時計遺伝子群をシングルセルレベルで検出することに成功した。通常の時計シグナルは、ギャップ結合やシナプスなど細胞同士の接触によって時計シグナルが同期していると考えられる。しかし、浮遊細胞である血球系細胞にリズムがあるのか?またそうであるなら、どのようなシグナルによって浮遊細胞の時計は同調しているのであろうか。そこで今回、シングルセルレベルの血液検査に先立ち、まずはヒトリンパ球由来細胞系を用いてシングルセルでの時計遺伝子発現検出系の構築を行った。具体的には、ヒトの時計遺伝子として次の20遺伝子, Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2, Clock, Npas2, Arntl1, Arntl2, Dbp, Tef, Hlf, Nfil3, Rora, Rorb, Rorc, Nr1d1, Nr1d2, Bhlhe40, Bhlhe41,およびコントロール遺伝子としてRplp0とActbの発現を定量化するため、各遺伝子に対してTaqman realtime PCR用のprimerとprobeを設計・合成した。さらに、培養中の細胞をセルソーターBD FACSAriaII Cell Sorterを用いてシングルセルレベルで分取し、これを直接CellsDirectにかけることにより1ステップでRNA抽出および逆転写によるcDNAの合成を行った。さらにこの微量なcDNAを解析するあたり、ナノリットルレベルで定量的PCRを行うことのできる超微小流体制御遺伝子解析装置BioMark-Iシステムを用いてアッセイを行った。
コ-クス充填層型高周波誘導加熱炉プロセスの開発

本研究はコ-クス充填層を誘導加熱し、還元性雰囲気下で溶解および精錬を行うことを目的として進められた。要約すれば、以下のような研究成果が得られている。1単一円筒黒鉛の高周波誘導加熱を行い、伝熱メカニズムを考慮した数学的モデルを構築した。印加電圧、試料形状の条件を変えて非定常伝熱実験を行った。2鉄球とコ-クスの二層充填層の誘導加熱実験を行い、数学的モデルによる数値シミュレーション結果と比較検討した。3導電性流体の電気抵抗を測定する、液ホールドアップの測定法を開発した。4充填層内液流れの連続性と非連続性を判定する新しい方法を提案した。5染料付着による固液濡れ面積の測定法を提案した。6充填層の壁近傍での不均一流れを除去することに成功した。7鉄スクラップの溶解現象を含む高周波誘導加熱炉の総合的数学モデルにより、加熱炉の最適操業条件について検討した。研究成果はいくつかの学協会誌に論文として発表されている。鉄球とコ-クスの二層充填層の研究では、これまで不明であった伝熱の機構、とくに、最高温度の場所、溶融開始位置などが明らかとなった。また、冷間実験における液ホールドアップの測定法、液流れの判定法、固液濡れ面積の測定法はいずれも斬新な方法であり、今後関連する分野で広く応用されていくだろう。平成7年度の研究概要は以下の通り。1)単一円柱黒鉛およびコ-クスを高周波誘導加熱することにより伝熱メカニズムを明らかにした。印加電圧、試料の形状と大きさ、などの条件を変えて実験を行った。2)コ-クスと鉄スクラップの二層充填層を高周波誘導加熱し、1)と同様の検討を行った。3)高周波誘導加熱による単一円柱および充填層の加熱現象を数学的モデルで表現し、数値実験を試みた。4)冷間模型実験装置により、静的および動的な液体ホールドアップを測定した。さらに、固液接触面積の測定法を開発し、高周波炉内で予測される条件下で、固液接触面積を測定した。5)実炉の操業データを整理した。6)4)および5)で得られたデータを3)の数学的モデルに適用した。以上の研究は、高橋、埜上、橋田の三人それぞれが、研究総括と総合的モデリング、基礎実験とエネルギー評価、実炉のデータ収集と整理の分野を主に担当して遂行した。1単一円黒鉛の高周波誘導加熱を行い、伝熱メカニズムを考慮した数学的モデルを構築した。印加電圧、試料形状の条件を変えて比定常伝熱実験を行った。5塗料付着による固液濡れ面積の測定法を提案した。鉄球とコ-クスの二層充填層の研究では、これまで不明であった電熱の機構、とくに、最高温度の場所、溶融開始位置などが明らかとなった。
繊毛・鞭毛の軸糸が持つ9+2構造の必然性

繊毛・鞭毛は9+2と呼ばれる普遍的パターンの軸糸構造を持つが、波動運動を発生させる上でこの形であることに合理的な理由を見つけることはできない。本研究は、クラミドモナス突然変異株bld12を用いて繊毛・鞭毛の9+2構造を撹乱し、その構造と運動性を調べ、9+2構造が種を超えて高く保存される理由を探ることを目指した。その結果、運動性の検討には至らなかったが、9+2構造の構築と機能を理解する上で重要な内部構造間の相互作用に関する知見が得られた。運動性繊毛、および鞭毛は、その内部に9+2と呼ばれる特徴ある構造の軸糸をもつ。この構造パターンは普遍的であり、原生生物からヒトに至るまでほとんど変わらない。本研究では、クラミドモナス突然変異株bld12を用いて9+2構造を撹乱し、その構造と運動性の関係を調べることによって9+2構造が高い保存性を示す理由を探ることを目的として開始した。23年度はbld12軸糸の構造異常を詳細に検討し、周辺微小管の数が8本の軸糸では軸糸中央部分のスペースが小さいために、中心対が形成されないことを明らかにした。また、微小管数が10本の軸糸では、中心対と一部のラジアルスポークヘッドの間に隙間ができ、周辺微小管の環状配置がゆがむことが明らかになった。このことから、ラジアルスポークが中心対と結合し、周辺微小管を軸糸中央方向に引っ張っていることを明らかにした。24年度は微小管数が8本または10本のみの軸糸を形成させるため、bld12変異株が欠失するSAS-6分子に変異を導入し、これをbld12に発現させることを試みた。SAS-6はコイルドコイルを介してダイマーを形成し、2つの球状の頭部と1本の尾部からなる分子形状をもつ。このダイマー9個が頭部を介して9回対称に会合し、鞭毛基部の9回対称性の確立に大きく寄与することがわかっている。今回、頭部の会合面にあるアミノ酸配列を改変し、in vitroで30%が7回対称、40%が8回対称、30%が9回対称に会合する変異SAS-6を得て、それをbld12に発現させたところ、鞭毛の形成率は大きくなったものの、微小管を8本、9本、または10本もつ軸糸の分布はbld12と変わらなかった。従って、SAS-6分子の9+2構造確立への寄与は限定的であることが示された。これは当初の目的とは異なるが、9+2構造が進化的に保存されてきた理由の一端を説明する重要な発見である。繊毛・鞭毛の内部にある軸糸は、9+2と呼ばれる特徴ある構造になっている。しかし、これまでの知見を総合しても、繊毛の波動運動を発生させる上で、9+2構造であることに合理的な理由を見つけることはできない。本研究では、新しく単離したクラミドモナス突然変異株bld12を用いて9+2構造を撹乱し、その構造と運動性の関係を調べことによって9+2構造が高い保存性を示す理由を探ることを目的とする。23年度はbld12軸糸の構造異常をまず詳細に検討した。bld12は、周辺微小管の数が異常な鞭毛を形成する。この株の鞭毛は正常な軸糸が約90%を占めるが、周辺微小管の数が8本(以下、軸糸-8)または10本(軸糸-10)のものがそれぞれ5%ずつ、11本のものがわずかに含まれる。軸糸-8では軸糸中央部分のスペースが小さいために、中心対が形成されないことが示唆されていたが、観察の例数を100以上にしても、やはり中心対は観察されないことを明らかにした。また、軸糸-10では、軸糸の直径が大きくなるため、中心対と一部のラジアルスポークヘッドの間に隙間ができ、周辺微小管の環状配置がゆがむことが明らかになった。この隙間とゆがみは、一部のラジアルスポークが中心対と結合することによって生じると考えられる。クラミドモナス鞭毛の軸糸では、鞭毛打1回につき、中心対が1回転し、その回転の情報が周辺微小管上の内腕ダイニンに伝えられて、活性を調節すると考えられている。しかし、中心対がラジアルスポークを押しているのか、引っ張っているのかはこれまで全くわかっていなかった。今回の観察により、初めて、引っ張っていることが視覚的に示された。9+2構造が乱れたbld12軸糸の詳細な観察により、中心対-ラジアルスポークから周辺微小管に伝えられる情報の実体を明らかにすることができた。しかし、鞭毛運動全体と軸糸構造との関係は、まだアプローチできていない。

中心対とラジアルスポークの相互作用における、中心対上の突起の役割を詳細に検討する。さらに、SAS-6に変異を導入して軸糸-8または軸糸-10のみを形成するクラミドモナス株を作製し、その鞭毛の運動性を検討する。軸糸構造を電子顕微鏡で観察すること、遺伝子操作でSAS-6タンパク質のアミノ酸配列を改変することが主な実験操作になる。次年度の研究費は、主に、これらの実験操作に必要な試薬類に当てる予定である。
潜水反射試験により示される自律神経機能は加齢の影響を受け、血圧と関連するか？

本年度は潜水徐脈に対する1心肺体力の影響および2潜水徐脈と生活習慣病の有病率の関係を検討した。140-59歳の男性43名を心肺体力の基準値(健康づくりのための身体活動基準2013)により2群に分け、潜水徐脈を比較した。その結果、高体力群と低体力群に年齢や身体組成に差はないが、高体力群の方が低体力群より潜水徐脈が高値を示した(P < 0.01)。潜水徐脈は副交感神経機能を評価しており、中年男性において基準値以上の高い心肺体力を持つ者は高い副交感神経機能を有することが示唆された。先行研究では若年者や高齢者において潜水徐脈と心肺体力の関係が検討されていたが、中年者のデータは本研究によって初めて示された。この成果を第73回日本体力医学会大会にて発表した。2男性193人(48-67歳)および女性81人(44-58歳)の潜水徐脈と生活習慣病の有病率の関係を検討した。統計解析にはロジスティック回帰モデルを用い、年齢(連続変数)、性別(男女)、BMI(連続変数)、身体活動(有無)、生活習慣病の家族歴(有無)、喫煙習慣(3群)、飲酒習慣(4群)を調整した多変量調整オッズ比と95%信頼区間を算出した。その結果、糖尿病の有無と潜水徐脈に統計的に有意な関係が観察された(P for trend = 0.016)。日本人中高齢男女において、糖尿病の有無と潜水徐脈の間に量反応関係が示される可能性がある。この成果を第6回介護予防・健康づくり学会にて発表し、若手奨励賞を受賞した。また潜水反射試験中の血圧応答のデータも収集しており、今後解析を進める予定である。おおむね計画通りに測定を進めている。ただし、学内の実験装置の入れ替えがあり、測定のできない時期があった。その時期にはデータ解析や学会発表の準備、論文執筆を進め、研究全体としてはおおむね順調に進展していると言える。所属先の変更(大学の異動)があったが、前任校の研究者と連携を取り、今後も継続したデータ収集が可能なことを確認している。具体的には潜水反射試験中の血圧応答のデータ収集を更に進め、年齢別や体力別に潜水徐脈および血圧応答を検討する予定である。5月下旬にアメリカスポーツ医学会(ACSM)にて学会発表をおこない、本年度中に論文投稿を予定している。学内の研究設備(MRI)の入れ替えにより、2018年11月2019年3月の実験が中止となり、次年度使用額が生じた。2019年度は年間を通して実験を進められる予定であり、対象者の幅を広げることで予算を使用できる見込みである。
がん免疫療法の免疫関連有害事象に関する新規バイオマーカーについての研究

本年度、悪性黒色腫患者のHLA型と抗PD-1抗体による免疫関連有害事象(immune-related adverce event, irAE)との相関、および、患者のHLA型と抗PD-1抗体に対する治療反応性との相関の検討を行いました。前者は有意なデータがいまだ得られていないため、後者の研究の成果を報告させていただきます。ニボルマブで加療中の悪性黒色腫患者69名に参加いただき、RECIST 1.1に基づき、完全奏効、部分奏効、安定(6ヶ月以上)に相当する患者を治療反応群としました。末梢血より患者のHLA型を解析し、治療反応性に相関があるHLA型を解析しました。その結果、全体では奏効率17%であったのに対し、HLA-A*26を有する患者では奏効率が42%であることがわかりました。HLA-A*26は日本人での保有率が11.5%と頻度が高いものです。海外の過去の報告では、抗PD-1抗体ペンブロリズマブへの治療反応性と患者のHLA型との間に相関は無いとの報告もあり(Rizvi et al., 2015)、われわれの得た結果は日本人に固有のものである可能性があります。今後は、このHLA-A*26がどのように悪性黒色腫患者の腫瘍免疫に関与するのかというメカニズムを解明する事を目指したいと考えています。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
近代アイスホッケーにおける得点パターンとその傾向分析

研究の目的:戦略的スポーツにおいては,統計データを基にした戦略立案が望まれるが,国内のアィスホッケーにおいては,戦略分析・立案は実績ある選手の経験に依るものが多く,必ずしも統計データなどの裏づけとともに語られていない.本研究は,チームごとのシュートパターンの傾向・フォーメーション分析のための基礎データを収集する.継続的なデータ収集のために,ソフトウェアの開発や,データベース化に向けた内部表現などの開発を行う.研究の方法:苫小牧市で開催された第3回全国高校選抜アイスホッケー大会の全ての試合をビデオ撮影し,その映像をもとに各種統計データを蓄積する.研究成果:1.試合ごとに得点時のシュート位置・シュートコース・アシストコースを手作業で記録した.チームごとのシュートパターンが見られるものになったが,現在は紙べースでの蓄積であり,有効利用のために作成したチャートのデジタル化手法を考案中である.2.スコアシートのデジタル化および設定条件による得点時間帯分布データを出力するソフトの開発を行った.チームや得点差など各種条件を変化させて対象とする試合を絞り込んで得点時間帯の分布図を作成できる.作成したチャートについて各方面の指導者諸氏と意見交換を行い,高い評価を得た.作成したチャートの解釈や,練習指導への導入,戦略的に利用できる統計データの種類などを検討中である.3.第10回感性工学会大会において,アイスホッケーの情報化支援について基本的アイディアを発表した.現在は,「常識」的に言われている選手への指示が本当に正しいものなのか統計的に検証し,体育系学会での発表に向けて準備中である.研究の目的:戦略的スポーツにおいては,統計データを基にした戦略立案が望まれるが,国内のアィスホッケーにおいては,戦略分析・立案は実績ある選手の経験に依るものが多く,必ずしも統計データなどの裏づけとともに語られていない.本研究は,チームごとのシュートパターンの傾向・フォーメーション分析のための基礎データを収集する.継続的なデータ収集のために,ソフトウェアの開発や,データベース化に向けた内部表現などの開発を行う.研究の方法:苫小牧市で開催された第3回全国高校選抜アイスホッケー大会の全ての試合をビデオ撮影し,その映像をもとに各種統計データを蓄積する.研究成果:1.試合ごとに得点時のシュート位置・シュートコース・アシストコースを手作業で記録した.チームごとのシュートパターンが見られるものになったが,現在は紙べースでの蓄積であり,有効利用のために作成したチャートのデジタル化手法を考案中である.2.スコアシートのデジタル化および設定条件による得点時間帯分布データを出力するソフトの開発を行った.チームや得点差など各種条件を変化させて対象とする試合を絞り込んで得点時間帯の分布図を作成できる.作成したチャートについて各方面の指導者諸氏と意見交換を行い,高い評価を得た.作成したチャートの解釈や,練習指導への導入,戦略的に利用できる統計データの種類などを検討中である.3.第10回感性工学会大会において,アイスホッケーの情報化支援について基本的アイディアを発表した.現在は,「常識」的に言われている選手への指示が本当に正しいものなのか統計的に検証し,体育系学会での発表に向けて準備中である.
ペーパーメカトロニクスの基礎研究

本研究は,紙に印刷するだけで,立体構造,回路,アクチュエータ,電源のすべてを製作する『ペーパーメカトロニクス』という新技術を確立するための基礎研究である.我々は,これまでに,紙に高揮発性インクと有機アクチュエータを印刷して,自律的に立体構造を形成することに成功している.本研究ではさらに駆動部分の印刷による製作に挑戦した.機械系の連続的な駆動には繰り返し伸縮など周期的な運動の生成が不可欠である.そこで、電鈴に着想を得た電気機械式の自励振動機構,および,電気流体現象による非線形自励振動による周期的な運動の生成を試み,紙に印刷するだけで運動するメカニズムの作製が可能であることを示した.本研究は,市販のインクジェットプリンタを用いて紙に折り曲げ図,アクチュエータ・回路・バッテリーを印刷し,立体構造形成から駆動までの全てを行う紙ロボットを実現することを目的としている.これまでに、印刷によって立体構造を自律的に構成することおよび機能性インクによって紙が局所的に膨潤することで屈曲するアクチュエータの作製に成功しているが、本年度は、紙ロボット実現のための自律駆動メカニズムの開発と,立体構造生成のための印刷手法の確立に注力した.特にアクチュエータと回路を実現する機能性インクの吟味と目的構造と印刷パターンの関係を解明し,ペーパーメカトロニクスの要素技術を確立することを目指して研究を進めた..印刷法を用いた構造形成については,印刷パターンの検討に加えて,あらかじめ切込みを入れた紙による自動立体構造形成手法を確立した.印刷機と同様に操作できるカッティングマシンで紙を切るプロセスを導入することで,従来の立体構造よりも多様な構造の実現が可能となった.また、コイルの印刷とその性能の検証を行い,さらにアクチュエータの駆動を行う電鈴機構を作るための印刷パターンの設計について研究を行った.コイルに関しては,巻き数・線幅・間隔などのパラメータを加味した上で,使用する電源から得られる最大磁力を理論的および実験的に検討した.磁力はコイルに流す電流の量に依存するため,紙面上に印刷した導線の抵抗値を減少させる方法の検討も必要になる.電鈴機構の展開図の設計に関しては,適切な構造を設計することで,直流電流源から外部に設置したネオジム磁石と相互作用させることによって,23分間自励振動を誘起することに成功した.さらに,電鈴機構とは別に,熱アクチュエータを用いた自励スイッチング機構についても検討を行った.本年度は,紙に切込みを入れて効果的に印刷パターンによる構造生成を行う手法の検討と,コイル印刷による電鈴機構の設計開発を行った.進捗度としてはおおむね計画時の想定通り結果を得た.特に印刷電鈴機構は,本研究において重要な考察事項であったが,実験を繰り返すことで自励振動を引き起こすことに成功した.今後は機構をモデル化することで,自励振動を誘起するために重要なパラメータの探索を行う。並行して進めていた,立体配線基板の開発も終了した.従来,立体配線基板は大規模な装置,複数の手順を踏んで作製されることが多かった.そこで我々は,1枚の紙面上に構造と配線を印刷することによって,立体配線基板を作製する手法を開発した.具体的には,1枚の紙に印刷することで構造と配線を構成する手法を開発した.銀ナノ粒子インクが描画されたパターンが配線となり,構造形成用インクで描画された線に沿って紙が自発的に折れ曲がることによって構造が形成される.これらのインクは,通常のインクジェットプリンタのカートリッジに充填されているため,小規模な装置で簡単に作製することができる.銀が印刷された部分についても,構造形成後も導電性が確保されていることも確認できた.以上により,電鈴機構を印刷法で作製することが可能になった.電鈴機構の製作実験では,従来とは異なる種類の紙を用いていたため,これまでの成果を総合して立体配線基板を用いたメカトロニクスの手法の確立が必要である.また,電鈴機構の駆動実験では,磁力の強いネオジム磁石を外部に設置していたため,ネオジム磁石の紙面上への印刷を検討している.薄膜の磁性体に対する着磁法が重要な検討課題である.また、磁力を用いない手法の検討を始めるなど新しい可能性も開けている.本研究では,マイコンなどの電子部品は使用せずに印刷のみで駆動するインテリジェントメカニズムを設計する.具体的な目標としては,直流電源をエネルギ源として振動を発生するシステムの検討と開発である.前年度は電鈴の機構に着目し,直流電源から通電した電流路とネオジム磁石とを相互作用させることで,自励振動を誘起させることに成功した.しかし,印刷配線の抵抗値は高く,磁石と相互作用するほどの磁場を誘起するためには,大きな電流を必要とする.そこで,本年度は低電流で駆動する電気流体現象に着目し,自励振動発生システムの開発を目指した.電気流体現象とは,絶縁性流体に浸された2対の電極間に高電圧を印可することによって,電極間の絶縁性流体が流動する現象のことである.我々は紙に櫛型の電極を印刷し電圧を印可することで動作する印刷平面ポンプを検討した.正極と負極が並び流動が発生するが、櫛形にすることで正負極対が多く設けられ,それぞれの流動が重ね合わさることで大きな流動となる.このときの流動の反作用力を利用することで,揺動するアクチュエータを作ることができる.印刷電極をブランコのように吊るし電圧を印可すると流動とは逆の方向に電極が揺動する.電圧・波形・電極間距離などを変えて揺動アクチュエータの基礎特性を調査した.

この調査過程で,電極と容器の底との距離を近づけると自励振動が発生することが確認された.この振動はリミットサイクルであり,外部から摂動を与えても元の周期に戻ることがわかった.リミットサイクルは線形強制振動とは異なり,外部刺激によって特性が変わらないという特徴を持つ.この系の電気力学的自励振動の機序を解明し,振幅・周期の制御方法を確立することで,印刷のみで作製できるインテリジェントメカニズムの実現が可能であるとの見通しを得た.本研究は,紙に印刷するだけで,立体構造,回路,アクチュエータ,電源のすべてを製作する『ペーパーメカトロニクス』という新技術を確立するための基礎研究である.我々は,これまでに,紙に高揮発性インクと有機アクチュエータを印刷して,自律的に立体構造を形成することに成功している.本研究ではさらに駆動部分の印刷による製作に挑戦した.機械系の連続的な駆動には繰り返し伸縮など周期的な運動の生成が不可欠である.そこで、電鈴に着想を得た電気機械式の自励振動機構,および,電気流体現象による非線形自励振動による周期的な運動の生成を試み,紙に印刷するだけで運動するメカニズムの作製が可能であることを示した.印刷による構造生成に関しては,印刷する紙質の最適化の問題は残されているものの,主要な課題は解決できたと考えている.今後はまずは立体配線基板の作製法を応用した,印刷自励機構の開発を目指す.立体基板の配線の抵抗値は,プロトタイプで用いた配線の抵抗値と異なるため,電気的・構造的特性値を考慮に入れて開発を行う.作成時の熱処理についても最適化できていないため,温度や湿度を考慮に入れた実験解析を行うことで,配線の抵抗率を減少させる.また,印刷幅を太くするなど設計を工夫することによって抵抗値を調整することは可能である.並行して,磁性体の印刷を進める.プロトタイプには磁力の大きなネオジム磁石を用いたため,ネオジム磁石の印刷を試みている.しかし,ネオジムは磁化に必要な磁界が比較的大きいため,磁化させることが難しいことから他の可能性も検討する..さらに,代替法として,電熱によって体積が変化する熱応答性材料を電磁石の代わりにする実験も行う.電気熱アクチュエータの開発は以前に行っているため,配線基板上に同様の処理を施すことによって作製できると期待している.磁性体・熱応答性材料いずれにしても,電気系と機械系が結合することで自励振動するメカニズムを創出できると考えている.本研究のまとめとして,印刷による多足駆動メカニズムを確定し,ロボット本体の立体構造形成と合せて,印刷のみによる紙ロボットを製作し自律歩行実験を行い、ペーパーメカトロニクスの可能性を実証することを計画している.完全自律型のロボットとするにはエネルギ源の印刷による実装という課題が残っている.これについてはキャパシタの印刷による可能性を確認する予定であるが,紙面印刷でエネルギ密度を高めるのには限界があることから,駆動時間が限られるのはやむを得ないと考えている.計測・情報工学海外での学会発表を行わなかったこと,および謝金が不要な範囲で実験などが出来たことが主な理由である。材料部品など消耗品の支出が大きくなると考えられるので主に物品費に使用する計画である.また、学会誌発表に係る費用も増えることを予想している.全体として次年度請求額に加えて適切に使用する。
恒常的身体拡張を目的とした親和性向上技術と、遠隔操作および運動支援への応用

本研究では、道具が身体の一部として認知される道具身体化の原理を装着型運動支援機器へ適応可能なレベルへ拡張し、装着型支援機器の身体化を促進する脳・神経生理的親和性向上技術の研究開発を行い、物理的に限界にある機器の軽量化・小型化・応答性・配置を認知・知覚の観点から進め、恒常的に装着可能な装着型人支援機器を製作し、健常者および障害者の恒常的身体拡張を実現する。H29年度は、下記の4テーマについて具体的に研究を進めた。1)下肢麻痺患者の歩行再建を目指した外骨格型歩行支援ロボットの操作インタフェース。電気刺激による歩行状態のリアルタイム知覚を目指した操作インタフェースを開発し、杖を有する2足歩行ロボットの操作実験を行い、操作性の向上を確認したが、新たな問題を把握した。2)アームを持つ移動ロボットの遠隔操作インタフェースの研究開発。ヘッドマウントディスプレイと非接触操作インタフェースを開発し、冗長自由度を有するロボットを用いた物体操作実験により本インタフェースの持つ問題を明確化した。3)走行時の運動負荷を低減する外骨格装置の試作。膝関節の伸展トルクを支援する軽量な装着型走行支援デバイスを製作し、走行実験によりその効果を評価した。4)指のリハビリを目的とした外骨格型反射誘発デバイスの試作。空気圧アクチュエータを用いた指の反射を誘発する運動刺激を与えるデバイスを試作し、反射が誘発されることを確認した。H29年度は、上記の4テーマを推進し、順調に研究が進んでいると言える。H29に推進した4テーマについて、それぞれ技術課題が明確となってきているので、その解決に向けて検討し、成果を得る予定である。
Webベースのドイツ語マルチメディア教材開発に関する研究

13年度に撮影したドイツ人教員1名のインタビューのビデオ映像をPCに取り込み、ノンリニア編集して、Web上で公開できる形に加工した。さらにこのビデオ素材をWebベースの教材プラットフォームであるWeb Exerciseに組み込んでドイツ語の聴き取り訓練用の教材を作成した。作成した教材は、我々が担当するドイツ語の授業で実際に使いながらその効果を検証した。授業での検証結果をふまえて教材を改良し、さらに全体を統一の取れた内容にするためにはもう少し時間が必要であるが、なるべく早い時期に完成させ、Web上で公開する予定である。また上記の教材開発と平行して、ドイツ語読解力訓練用の教材作成システムも自然言語処理の研究者の協力を得て開発した。これは辞書を引かずに多読ができるように、Webブラウザーの画面上で未知語にマウスポインターを置くとその単語の意味が表示される「注釈付きテクスト」が簡単に作成できるシステムで、Web上での簡単な加工作業で適切な訳語を付与できる。フリーウェアとして公開できるように、自前の独和辞書を使いながら拡充していくので、テクストを加工することによって、同時に辞書を鍛えることができるようになっている。こちらも現在辞書を整備している段階であるが、近い内に公開できる見通しである。ドイツ語マルチメディア教材開発の最新動向を把握するため、スイスのルツェルン経済大学で7/308/4まで開催された「第12回国際ドイツ語教育学会」のマルチメディア分科会に参加して、コンピュータやインターネットを活用した新しいドイツ語教育について、各国の研究者と広く情報交換を行なうと共に、ドイツ、アメリカ、ポーランド等で開発されたドイツ語教育ソフトウェアを試用する機会を得た。また、国内でも日本ドイツ語情報処理研究会、西日本独文学会教育部会研究発表会等のITを利用した外国語教育をテーマにした研究会に参加し、他大学の研究者と広く意見交換と討議を行なった。以上のような調査・研究会参加・意見交換等で収集した資料を整理し、文字、音声、映像等のマルチメディアを利用したドイツ語教材の作成に着手した。まずは教材作成に必要な機器等(デジタルビデオカメラ、ノンリニア編集用のパーソナルコンピュータおよびビデオ編集ソフトウェア)を購入し、それを使って同僚のドイツ人教員1名のインタビューを撮影した。また、Webベースの教材作成のためのソフトを試用し、それを用いた教材作成方法を検討した。来年度はさらに数名分のインタビューを撮影すると共に、ピデオの編集と教材化をすすめて、試作した教材を後期の授業で実際に使いながら改良を加えていく予定である。さらにこのビデオ素材をWebベースの教材プラットフォームであるweb Exerciseに組み込んでドイツ語の聴き取り訓練用の教材を作成した。
ベトナム中部都市のコミュニティー内におけるRSV性呼吸器感染症の伝搬経路の解明

本研究では、呼吸器ウイルスの単独感染、重複感染が下気道炎の重症化に及ぼす影響を調べた。中部ベトナムで5歳未満の子供の入院呼吸器感染症1,992例から鼻咽頭スワブを採取し、13種類の呼吸器ウイルスを同定した。60.9%から少なくとも1種類の呼吸器ウイルスが同定され、9.5%は重複感染であった。RSウイルス(RSV)とヒューマン・メタニューモ・ウイルス(HMPV)の単独感染が、下気道炎の発症に関係していた。RSVにライノウイルス(HRV)、HMPVが重複感染すると、より下気道炎発症のリスクが高かった。本研究はベトナム中部都市ニャチャン市のコミュニティー内におけるRSV感染症の伝搬を解明することを目的としている。前年度に対象地域より地域中核病院に入院した小児の呼吸器感染症症例の臨床データを収集し、multiplex-PCR法を用いた病原ウイルス同定の結果とともに分析した。その結果、5歳未満の小児においてライノウイルスの感染率が24.2%と最も高く、次いでRSVが20.1%であった。またRSV感染はRSV非感染より1.3倍肺炎になるリスクが高いことが判明した。本年度は上記の小児呼吸器感染症症例のサーベイランスを継続するとともに、350人の健康小児を対象として鼻咽頭検体を採取し、病原ウイルスの同定を行った。その結果、健康小児においても2.9%においてRSV感染が確認され、症例対象研究によりRSV感染が入院のリスクを22倍上昇させることが明らかとなった。これはインフルエンザウイルスに比べて2.5倍高い値であった。これらの結果は、公衆衛生策上重要な知見である。まずRSVの不顕性感染が少なからず認められるという事実は、いっけん無症状の小児が感染源としてコミュニティー内に存在し、感染の拡大に寄与している可能性を示唆する。これは端的に、RSV感染小児の隔離策はそれほど有効でないということである。そしてRSV感染はベトナムのコミュニティー内における小児の入院リスク、さらに重症化リスクの因子として、インフルエンザよりも大きなウェイトを占めることが明らかとなった。これはインフルエンザワクチンの導入とともに、RSVに対する適切な予防策をとることが、ベトナムを含む東南アジア地域の小児保健政策において有用であることを意味している。Respiratory syncytialvirus(RSV)は、小児のウイルス性重症呼吸器感染症の最大の原因であり、主に発展途上国において小児死亡の大きな原因となっている。これまでの報告からは、途上国の多く存在する熱帯地では、RSVの伝搬パターンが温帯域とは異なることが示唆される。しかし、熱帯地において、RSVがコミュニティー内でどのように伝搬するのか、何が重症化の因子になっているのかは、解明されていない。本研究は、小児呼吸器感染症サーベイランスが進行中のベトナム中南部ニャチャン市において、熱帯地における小児RSV感染症の伝搬パターンと、重症化因子の解明を目的として行った。当該年度は、当研究室が2007年より実施している小児呼吸器感染症サーベイランスのデータ、および住民ベースの横断調査を行い、RSVを含む呼吸器ウイルス感染症が小児肺炎の入院、および重症化に及ぼすリスクの解明、およびRSVとそれ以外の呼吸器ウイルスの重複感染が重症化に及ぼす影響について解析を行った。その結果、1992例の急性呼吸器感感染症入院小児のうち、397例が下気道感染症であった。このうち60%から呼吸器ウイルスが同定され、24%がライノウイルス、20%がRSV、12%がインフルエンザウイルスであった。9.5%は呼吸器ウイルスの重複感染であった。RSVとヒトメタニューモウイルスは単独で呼吸器感染症の重症化に関係していた。さらに、RSVはライノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、パラインフルエンザウイルス3型と合併感染すると、さらに重症化が増すことが判明した。24年度が最終年度であるため、記入しない。
妊娠中からの初産婦とパートナーに向けた乳幼児揺さぶられ症候群予防プログラムの作成

泣き止ませ難い子ども泣きが直接的誘発要因となり、養育者が子どもを揺さぶる乳幼児揺さぶられ症候群は、養育者の誰もが加害者となる危険性を持つが、乳児の泣きに関する正しい教育により予防可能な虐待であるとも言われている。そこで本研究では初産婦とそのパートナーに向けた乳幼児揺さぶられ症候群予防プログラムを作成し、妊娠中から出産後早期にかけ指導に導入することで、その介入効果を検討することである。介入の結果、初産婦とそのパートナーにおいて、泣きおよび乳幼児揺さぶられ症候群に関する知識と理解を高める効果が認められた。しかし、泣きに直面して生じるフラストレーションについては明らかな効果は認められなかった。本研究の目的は、妊娠中および出産後早期の母親とパートナーを対象に、乳児期の子どもの泣きへの理解と対応を含めた、我が国における乳幼児揺さぶられ症候群(SBS:Shaken Baby Syndrome)予防プログラムを作成することである。予防プログラムを作成するにあたっては、申請者による先行研究(Okamoto,M.2012)で実施した妊娠中からの子どもの泣きへの対応含む子育て支援プログラムの内容を中心に、海外のSBS予防プログラム等を参考にした。本研究の目的を遂行するにあたり、平成25年度はSBS予防のための教材として両親学級や退院指導で使用できるDVDと小冊子を作成した。DVDのタイトルは「Stop!Stop!乳幼児揺さぶられ症候群」で、視聴時間は10分で前半は“泣きと上手につきあうために"、後半は“ご存知ですか乳幼児揺さぶられ症候群"とした。小冊子のタイトルは「そっと、離れて。乳幼児揺さぶられ症候群予防BOOK」で全10ページである。構成内容は、1SBSとは何か、2SBSの起こる養育者の社会的背景について、3SBSの予防方法と養育者自身のケアについて、4泣くことの意味と成長に伴う泣きの特徴とパターン、5泣きへの具体的な対処方法、6養育者のための社会資源の紹介と活用についてである。平成26年度の継続研究では、上記のDVDと小冊子を取り入れた両親学級を開催し、実施前後のSBSに関する知識の変化、泣きへの対処方法の気付きと理解状況を質的研究にて分析し、その結果を基に量的研究のための質問紙を作成する。本研究の目的は、妊娠中からの初産婦とそのパートナーに向けた、乳児期の子どもの泣きへの理解と対応を含めた乳幼児揺さぶられ症候群(SBS;Shaken Baby Syndrome)予防プログラムを作成することである。予防プログラムを作成するにあたっては、先行研究(Okamoto,M.2013)で実施した妊娠中からの子どもの泣きへの対応を含む子育て支援プログラムの内容を中心に、海外のSBSに関する先行研究を参考にした。平成25年度は、予防プログラム実施で使用するDVD及び小冊子を作成した。平成26年度は、出産施設において開催する両親学級で、上記のDVD及び小冊子を実際に取り入れ、質的研究方法によりその介入効果を吟味することにした。対象は学級に参加した妊娠後期の初産婦とパートナーで本研究への調査協力に同意した5組である。子どもの泣きの特徴、泣きへの対処方法、SBSに関する知識、SBS予防に関連した対処方法、支援者としての気付きと理解状況を学級終了後に半構造化面接法にてインタビューを行った。現在、内容分析の途中であるが、両親ともに持続する泣きへの理解と対処への心がけ、SBSの背景への理解と行為に対する意識の変化、SBSによる脳へのダメージに関する具体的な知識の獲得、孤立した子育てにならないための発想の転換、父親からはパートナーへの支援者としての心構えが認められた。平成27年度の継続研究では質的研究を発展させ、上記DVDと小冊子を取り入れた両親学級での介入効果を測るため質問紙法による仮説検証を実施する。参考文献本研究の目的は、妊娠中からの初産婦とそのパートナーに向けた乳児期の子どもの泣きへの理解と対応を含めた乳幼児揺さぶられ症候群(SBS:Shaken Baby Syndrome)予防プログラムを作成し、その効果を検証することである。予防プログラム実施において、使用するDVD及び小冊子を作成した。DVDの視聴時間は約10分、小冊子は全10ページである。両ツールの構成内容は1SBSとは何か、2SBSの起こる養育者の社会的背景、3SBSの予防方法と養育者自身のケア、4泣くことの意味と成長に伴う泣きの特徴とパターン、5泣きへの具体的な対処方法、6養育者のための社会資源の紹介と活用についてである。平成27年度は、乳幼児揺さぶられ症候群予防プログラムを実践しその介入効果を検証した。先に対照群が通常の両親学級を受講、その後介入群では予防プログラムDVDと小冊子を学級に導入すると共に、出産後23週頃に介入群の自宅に同様のDVD等を郵送した。また出産後2か月過ぎに、予防プログラムの効果を測るための質問紙を両群の自宅宛てに郵送、記載後返送してもらった。結果、研究対象者数は対象群で初産婦62名、パートナー59名、介入群は初産婦55名、パートナー48名であった。両群の初産婦及びパートナーの特性に有意差はみられなかった。初産婦、パートナーにおける両群比較では、乳児の泣きとSBSに関する知識や泣きへの対応の工夫に有意な差が見られた。また初産婦の情緒的動揺では、泣きに直面した際の苛立ち感は対照群と比較し介入群が低値であった。また、有意差は認められなかったが、パートナーでは泣かれた際に自分を落ち着かせるため安全を確かめてその場を離れた行為が対照群に比べ高値で、知識面のみならず介入による行動変容にも効果が認められた。

泣き止ませ難い子ども泣きが直接的誘発要因となり、養育者が子どもを揺さぶる乳幼児揺さぶられ症候群は、養育者の誰もが加害者となる危険性を持つが、乳児の泣きに関する正しい教育により予防可能な虐待であるとも言われている。そこで本研究では初産婦とそのパートナーに向けた乳幼児揺さぶられ症候群予防プログラムを作成し、妊娠中から出産後早期にかけ指導に導入することで、その介入効果を検討することである。介入の結果、初産婦とそのパートナーにおいて、泣きおよび乳幼児揺さぶられ症候群に関する知識と理解を高める効果が認められた。しかし、泣きに直面して生じるフラストレーションについては明らかな効果は認められなかった。本研究は、妊娠中からの初産婦とそのパートナーに向けた、乳児期の子どもの泣きへの理解と対応を含めた乳幼児揺さぶられ症候群(SBS;Shaken Baby Syndrome)予防プログラムを作成することである。平成25年度は、予防プログラム実施で使用するDVD及び小冊子を作成し、平成26年度は、出産施設において開催する両親学級で、上記のDVD及び小冊子を実際に取り入れ、質的研究方法によりその介入効果を吟味することにした。研究を進めるにあたり、調査施設における倫理委員会の審査を受け承認後に実施した。調査対象は学級に参加した妊娠後期の初産婦とパートナーで本研究への調査協力に同意した5組であった。子どもの泣きの特徴、泣きへの対処方法、SBSに関する知識、SBS予防に関連した対処方法、支援者としての気付きと理解状況を学級終了後に半構造化面接法にてインタビューを行った。内容分析の途中であるが、インタビュー内容をコード化しサブカテゴリー化の分類段階で、両親ともに持続する泣きへの理解と対処への心がけ、SBSの背景への理解と行為に対する意識の変化、SBSによる脳へのダメージに関する具体的な知識の獲得、孤立した子育てにならないための発想の転換、父親からはパートナーへの支援者としての心構えが認められた。現在、カテゴリー化へとより抽象度を高める作業を行うとともに、研究の妥当性を確保するための討議を研究スタッフ間で実施している。以上のことから、本研究における現在までの実施状況から、達成度の評価についてはおおむね順調に進展していると判断した。医歯薬学平成27年度は、昨年度まで実施していた質的研究において、乳幼児揺さぶられ症候群予防プログラム導入により、子どもの泣きの特徴、子どもの泣きへの対処方法、乳幼児揺さぶられ症候群に関する知識、乳幼児揺さぶられ症候群予防に関連した対処方法、支援者としての気付きと理解状況についての研究対象者の変化と、不足箇所の確認と吟味を深める作業を継続する。また、質的研究で得られた内容を参考にしながら、乳幼児揺さぶられ症候群予防プログラムの介入効果を検証するための質問紙を作成する。介入効果の検証については、調査施設で開催する両親学級において、通常の両親学級受講者を対照群、通常の両親学級に乳幼児揺さぶられ症候群予防プログラムを取り入れた学級受講者を介入群とし、プログラムの効果を追跡調査する。調査対象者は、選定基準に合致し、研究参加の同意が得られた初産婦とそのパートナーとする。調査対象者数は、質問紙の質問項目数から算定し対照群および介入群ともに5060組とする。
光に依存した遺伝子発現調節システムの開発と利用

青色光受容体PixDを利用して、任意の遺伝子の発現を光制御する方法の構築を目指した。クロスリンクと質量分析によりPixDのダイマーの予想構造を得た。この情報を利用し、先に開発したPixDによる転写因子光制御法PICCOROの改良を進め、植物の花の形成を司る転写因子AGAGOUSの制御を試みた。PixDを恒常的に発現するシロイヌナズナを複数ライン単離することに成功した。またPixEのPixD相互作用部位をドミナントネガティブ型AGAMOUSに融合した。この融合したコンストラクトを、上記PixD発現シロイヌナズナに導入し、そのホモラインを複数ライン単離することに成功した。本研究では、青色光受容体PixDとPixDと光依存的に相互作用するタンパク質PixEを利用して、任意の転写因子の機能を光依存的にインターカレートすることにより、真核多細胞生物個体内で任意の遺伝子の発現を時空間制御する方法を構築することを目指している。また、確立した方法を利用して、今まで調べることのできなかった神経発生に関与する転写因子の機能、植物の形態形成に関与する遺伝子、光でのみ解析可能な代謝調節因子に関する研究を遂行する。これまでの研究で、PixDは暗所で10量体を形成しており、光照射によりこの10量体は2量体にコンフォメーションを変えることがわかっている。またPixEは10量体のPixDのみに結合し、2量体のPixDには結合しないことがわかっている。しかしPixDおよびPixEのどの部位が相互作用しているのはよくわかっていない。今年度は、イーストツーハイブリッド法を利用して、PixDとPixEの相互作用の最小部位を明らかにする実験を遂行した。その結果、PixDのC末端とPixEのN末端が相互作用していることがわかった。これまでにゼブラフィッシュの尻尾の形成に必要な転写因子NtlにPixEを融合させたコンストラクトの作成および、PixDを恒常的に発現させるゼブラフィッシュの作成に成功している。この組換えゼブラフィッシュ内に組換えNtl遺伝子を導入すると、その機能が光依存的に制御されうることを明らかにした。この方法をPICCORO(PixD complex-dependent control)と名付け、発表した。また、確立した方法を利用して、今まで調べることのできなかった神経発生に関与する転写因子の機能、植物の形態形成に関与する遺伝子、光でのみ解析可能な代謝調節因子に関する研究を遂行することも目指している。したがって、PixDの2量体と10量体の平衡状態は、PixDの光感受性を決定する重要な要因と考えられる。しかしPixDの2量体構造は未知である。今年度は、PixDの光感受性を変化させる変異体の作出を目指し、PixDのダイマー構造に関する情報を得ることを目指した。具体的には、精製したPixDに対し、クロスリンクを施し、得られた架橋物をマス解析することで分子間架橋位置を決定した。次にドッキングシミュレーションによりPixDのダイマーの構造をいくつか予想し、その中から分子間架橋がかかる可能性が最も高いものを選択Jすることで、PixDの予想構造を得ることができた。またゼブラフィッシュとショウジョウバエを用いて、昨年度までに確立したPICCORO法の改良を進めた。本研究では、青色光受容体PixDと、PixDと光依存的に相互作用するタンパク質PixEを利用して、任意の転写因子の機能を光依存的にインタカレートすることによって、真核多細胞生物個体内で、任意の遺伝子の発現を光制御する方法を構築することを目指した。また確立した方法を利用して、今まで実現不可能だった植物の形態形成に関与する遺伝子の発現を光でコントロールすることを試みた。PixDは暗所で10量体を形成し、光照射によって10量体が壊れ、ダイマー構造に変化することがわかっていた。しかし、10量体の構造は結晶構造解析によって明らかになっていたが、ダイマー構造は一過的にしか形成されないこともあり、その構造は不明であった。そこで昨年度より、クロスリンクと質量分析法を組み合わせた解析を行ってきた。その結果PixDのダイマー構造の予想構造を得ることに成功した。このことで、PixD-PixEの複合体形成とその乖離の光依存的ダイナミクス変化の様式がほぼ明らかになった。この上記情報を利用して、先に開発したPixDによる転写因子光制御法PICCOROの改良を進めた。この改良型PICCOROを利用し、モデル植物シロイヌナズナを材料に、植物の形態形成を光制御することを試みた。具体的には、花の形成を司る転写因子AGAGOUSをPICCORO法により光制御することを試みた。まずPixDを恒常的に発現するシロイヌナズナを複数ライン単離することに成功した。次に、PixEのPixD相互作用部位をドミナントネガティブ型AMAGOUSに融合した。

この融合したコンストラクトを、上記PixD発現シロイヌナズナに導入し、そのホモラインを複数ライン単離することに成功した。今後、得られたラインの表現型解析を進めることで、PICCORO法を用いた新しい植物内の転写の光制御技術の開発が進むものと期待される。青色光受容体PixDを利用して、任意の遺伝子の発現を光制御する方法の構築を目指した。クロスリンクと質量分析によりPixDのダイマーの予想構造を得た。この情報を利用し、先に開発したPixDによる転写因子光制御法PICCOROの改良を進め、植物の花の形成を司る転写因子AGAGOUSの制御を試みた。PixDを恒常的に発現するシロイヌナズナを複数ライン単離することに成功した。またPixEのPixD相互作用部位をドミナントネガティブ型AGAMOUSに融合した。昨年度までに、PixD-PixEの相互作用を利用して遺伝子の発現制御を光照射で行う方法PICCOROの構築し、実際にゼブラフィッシュ内で転写因子の活性制御に成功した。今年度はこの遺伝子発現制御の光依存性を変化させることを目標に研究を進め、PixDの光感受性を決定する2量体構造の予想構造を得ることに成功した。このことからこれまでの研究は比較的順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学ゼブラフィッシュを材料に構築したPICCORO法の改良を更に進める。またPICCORO法を他の生物種に応用することを行う。具体的には、高等植物のシロイヌナズナとモデル動物であるショウジョウバエを用いて、これらの生物種内で任意の転写因子を光制御できるかを調べる。シロイヌナズナにおいては、花の形成に必要な転写因子に対し、ショウジョウバエにおいては色素の形成を誘導する転写因子に応用する。前者の研究に関しては既に研究を開始しており、PixDを植物用過剰発現プロモータ(35Sプロモータ)に連結したコンストラクトの作成を終了している。これまで、PixD-PixEの光依存的相互作用の最小領域の検討、PixD-PixEの光依存的相互作用を利用したゼブラフィッシュ内での転写因子機能制御の検討、を計画し実験を遂行してきた。最初の実験に関しては、イーストツーハイブリッド法を利用して、PixDのC末端とPixEのN末端が相互作用することを明らかにすることができた。またPixDを恒常的に発現するゼブラフィッシュを作成し、その中でPixEを発現させたところ、その機能が光依存的に制御されうることを明らかにできた。これらのことから、これまでの研究は順調に進展しているといえる。ゼブラフィッシュとシロイヌナズナの飼育費用が、他のラボとの共同利用により、予定よりも費用がかからなかったため。構築したイーストツーハイブリッド法を利用して、相互作用が失われる、もしくは失われない変異体の単離を行う。
細胞膜透過性ペプチドを用いたがん性疼痛治療薬の開発

神経細胞やがん細胞にはTrkAというタンパク質が存在し、痛みやがん細胞の増殖に関係することが知られている。これまでの研究でTrkAの作用を抑制するIPTRK3という薬剤を開発し、動物実験で鎮痛作用をもつことを明らかにした。本研究では、さらに4つの薬剤(IRTRK4, IPTRK5, IPTRK6, IPTRK7)のTrkAに対する効果を検討し、がん細胞の増殖およびがん性疼痛に対する効果を検討した。そしてIPTRK3とIPTRK5ががん細胞の増殖抑制効果とがん性疼痛に対する鎮痛作用を同時に持つことを明らかにした。神経成長因子(NGF)の高親和性受容体TrkAは、チロシンキナーゼ活性を有する/。TrkA活性は侵害受容性疼痛や神経障害性疼痛の発症に関与し、またTrkAをもつ悪性腫瘍細胞の増殖に関与することが知られていることから、TrkA活性抑制薬は、がんによる痛みと腫瘍増殖を抑制する新しいがん性疼痛治療薬となる可能性がある。研究代表者によるこれまでの研究では、細胞膜透過性ペプチドのIPTRK3を開発し、動物実験で鎮痛効果を持つことを明らかにしてきた。今回の研究では、IPTRK3のアミノ酸配列を一部改変した新しいペプチド(IPTRK4とIPTRK5)を作成し、リコンビナントTrkAを用いたキナーゼアッセイと、マウス悪性黒色腫細胞株(B16-F1細胞)におけるこれらのペプチドの増殖抑制効果を検討した。キナーゼアッセイでは、IPTRK3は100μMで有意にTrkA活性を抑止したが、IPTRK4とIPTRK5は、より低濃度の1μMで有意に活性を抑制した。FITCでラベルしたこれらのベプチドを用いて、B16-F1細胞における細胞膜透過性を確認し、またTrkA抗体を持いて、B16-F1細胞におけるTrkAの存在を確認した。その後、NGF刺激による細胞増殖とTrkAチロシンリン酸化に対するこれらのペプチドの効果を検討したところ、IPIRK5が最も強く抑制することが明らかとなった。IPTRK5は今回の実験濃度(1,10,100μM)では細胞毒性を示さず、100μMでアポトーシスを来すことが明らかとなった。以上のことから、平成23年度以降の、担がん動物を用いたがん性痛抑制作用と腫瘍増殖抑制作用を調査する実験において、IPTRK5は、新規がん性痛治療薬の有力な候補となりうることが明らかとなった。平成22年度のin vitroにおける実験結果より、TrkA活性を抑制する細胞膜透過性ペプチド(IPTRK3およびIPTRK5)の、マウスメラノーマ細胞(B16-F1)を移植したマウスにおけるがん性痛に対する効果を検討した。方法は、C57BL/6Jマウスの左足底皮下にB16-F1細胞を移植したマウスメラノーマモデルを作成し、移植後5日から9日目までペプチドを毎日1回腹腔内投与し、痛み反応(機械刺激過敏反応)と足容量を計測した。IPTRK3とIPTRK5は共に、マウスメラノーマモデルにおける痛み反応と足容量の増加を有意に抑制した。細胞膜透過性ペプチドIPTRK3およびIPTRK5は、メラノーマの増殖とがん性痛を共に抑制する、新しいがん性痛治療薬となる可能性がある。またこれまで侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、がん性疼痛のいずれに対してもin vitroおよびin vivo実験で抑制作用を示したIPTRK3のTrkA以外のプロテインキナーゼにおける酵素活性抑制作用を明らかにするため、プロファイリングアッセイを行った。結果は酵素活性部位の構造が類似しているTrkB, TrkCの酵素活性も同様に抑制することが明らかとなった。また初期の実験段階では抑制作用はないと考えていたインスリン受容体チロシンキナーゼ活性も、TrkAに対する抑制作用と同程度の抑制効果を示すことが明らかになった。さらにErKやPKCδ、PKCεなどTrkAの細胞内情報伝達系の下流に存在するプロテインキナーゼ活性も強く抑制することが明らかとなり、IPTRK3はプロテインキナーゼに対する特異的作用により鎮痛効果を来すことが示唆された。研究実施計画に記載したTrkAとTrkBの両方の活性化ループのアミノ酸配列に相同なペプチド(GDFGMSRDとTMLPIR)と、細胞膜透過性ペプチド(YGRKKRRGRRR)を含む新規ペプチドの作成を行った。これまでの研究では、これら2つのペプチドをリンカーのε-アミノカプロン酸で直列で結合させてきたが、本年度はシステイン(C)を2つ用いた分子間SS架橋体で結合させた以下のペプチドを作成した。本ペプチドによるin vitroにおけるTrkA活性抑制作用を検討中である。当初に予定した新規ペプチドIPTRK4とIPTRK5において、IPTRK5を用いた動物実験まで遂行することができ、まだ不十分ではあるが、その結果を得ることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。

研究機関を異動したため、すべての実験機器の搬送と設置、および研究体制の再構築が必要であったため。これまで開発してきたペプチドとは構造が異なるペプチドを作成し、鎮痛効果のより高いペプチドを開発する。既に臨床応用されつつある他の細胞膜透過性ペプチドの構造も参考にして、バイオアベイラビリティーの高い薬剤の開発を目指す。25年度が最終年度であるため、記入しない。今回作成した両ペプチドのin vitroおよび細胞培養実験を継続し、これまで作成したペプチドよりもバイオアベイラビリティーの高い薬剤であるか検討する予定である。