hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
柔らかい植生と周辺乱流場の相互作用に関する基礎的研究

本研究では,植生の幹の直径程度あるいは植生背後に生じる後流が認識できる程度の長さを最小のスケールとして,植生の運動,植生を起源とする乱れと水流の持つより大きなスケールの乱れとの相互干渉を明らかにすることを目的として,木理実験と数値計算を実施した.植生の縮尺を河道のそれと同一にすると,植生と流体間に生じる流体力に関する抵抗則が実物と模型との間で変化することになる.そこで,縮尺の異なる歪み模型により実験を行なうことにした.実験結果そのものに一般性がないことを補うために,植生と流体運動の間の相互作用をモデル化し,それを基礎とする数値計算を実施して,モデル化の妥当性を評価するための基礎データとして利用することとした.乱流計算における植生と乱流の相互作用のモデル化については,前年度において検討した固体粒子運動と流体運動の相互作用について開発した乱流モデルを発展させた.植生と乱流場との相互作用を表示する最も単純な流れ場として,河床に植生を有する等流場に関する鉛直一次元の数値解析を実行した.この数値計算においては,直径や高さといった植生固体の特性と植生密度による流動構造の変化,特に,植生と河床との流体抵抗力の分担,植生部と無植生部との流量分担等について検討した.実務上は,植生部の視覚的な特性によって,植生部と無植生部の基本的な流量分担が決定されている.これでは河道の疎通能力を過小に見積もったり,逆に過大に見積もる可能性があり,治水計画の精度上問題がある.今回の研究で,植生帯特性と流量分担との関係を明確にしたことによって,実務設計面においても有益な情報を提供するものと考えられる.一連の植生水理に関する研究を概観すると,植生による速度分布の変化やそれらによる流砂への影響など,植生帯と無植生帯との間での乱流輸送に関するものが多く見られる.しかしながら,植生を有する河道の洪水疎通能や河床・堤防の安定性,流水に対する植生の安定性など,実務上極めて重要な項目に対して,何ら適切な解答が得られていないのが実状である.本研究の最終的な目標は無数の植生を有する植生帯の河川流に対する影響を明確にすることにある.しかしながら,対象とする空間スケールを大きくすると植生と乱れの相互作用についても空間平均された曖味なものになってしまい,その本質を見失う可能性が生じる.そこで,ここでは植生の茎の直径程度あるいは植生の背後に生じる後流が認識できる程度の長さを最小のスケールとして,植生の運動,植生を起源として生じる乱れと水流の持つより大きなスケールと乱れとの相互干渉を明らかにすることを目的とする.本年度は主として1)固体粒子群と乱流場との相互作用に関する数値計算および2)PIVによる流速場計測技術習得に関する検討を行った.1)により固体粒子群の混入により比較的粒径が大きい場合については,粒子後流により生じる乱れにより水流の乱流強度は増加するが,乱れのスケールは逆に減少し,両者が重合すると全体としては乱流輸送が抑制されることがわかった.一方,粒子径が小さい場合には乱れ強度,長さスケールともに抑制されることがわかった.また,固体粒子と乱流の相互作用を導入した数値計算を実施した.2)については,PIVを用いて透過性構造物から生じる乱れ場と周辺流動との相互作用について検討することを試みた.流速の空間分解能や時間分解能などについて様々な問題が生じ,解決は次年以降に持ち越しとなった.本研究では,植生の幹の直径程度あるいは植生背後に生じる後流が認識できる程度の長さを最小のスケールとして,植生の運動,植生を起源とする乱れと水流の持つより大きなスケールの乱れとの相互干渉を明らかにすることを目的として,木理実験と数値計算を実施した.植生の縮尺を河道のそれと同一にすると,植生と流体間に生じる流体力に関する抵抗則が実物と模型との間で変化することになる.そこで,縮尺の異なる歪み模型により実験を行なうことにした.実験結果そのものに一般性がないことを補うために,植生と流体運動の間の相互作用をモデル化し,それを基礎とする数値計算を実施して,モデル化の妥当性を評価するための基礎データとして利用することとした.乱流計算における植生と乱流の相互作用のモデル化については,前年度において検討した固体粒子運動と流体運動の相互作用について開発した乱流モデルを発展させた.植生と乱流場との相互作用を表示する最も単純な流れ場として,河床に植生を有する等流場に関する鉛直一次元の数値解析を実行した.この数値計算においては,直径や高さといった植生固体の特性と植生密度による流動構造の変化,特に,植生と河床との流体抵抗力の分担,植生部と無植生部との流量分担等について検討した.実務上は,植生部の視覚的な特性によって,植生部と無植生部の基本的な流量分担が決定されている.これでは河道の疎通能力を過小に見積もったり,逆に過大に見積もる可能性があり,治水計画の精度上問題がある.今回の研究で,植生帯特性と流量分担との関係を明確にしたことによって,実務設計面においても有益な情報を提供するものと考えられる.
チロシンキナーゼを介するサイトカインによるシグナル伝達機構に関する研究

1)私はこれまでに、インターロイキン2(IL-2)のIL-2受容体(IL-2R)を介した増殖誘導シグナルには、src型チロシンキナーゼの活性化によるc-fos/c-jun遺伝子の転写誘導、c-myc遺伝子の転写誘導、およびbcl-2遺伝子の転写誘導に至る少なくとも3つの独立したシグナル伝達経路が存在することを明らかにしている。本年度は、成人T細胞白血病の発症メカニズムに、IL-2シグナル伝達に重要なこれらのシグナル伝達分子が関与している可能性があることを示した。成人T細胞白血病の原因ウイルスであるHTLV-Iの転写活性化因子p40^<tax-1>がIL-2の増殖シグナル伝達に重要なシグナル伝達分子lckまたはc-myc遺伝子と協調的に働くことにより、HTLV-Iウイルス感染T細胞のIL-2非依存的増殖を誘導している可能性があることが示唆された。2)既に、IL-2のIL-2Rを介したシグナル伝達経路のうち、bcl-2遺伝子の転写誘導に至る経路はIL-2非存在下でのapoptosis抑制に働いており、このシグナル伝達経路はJakキナーゼを介するシグナル伝達経路とは独立していることを示している。本年度は、新たにapoptosis抑制作用を有するBAG-1の遺伝子がIL-2刺激により発現誘導され、このシグナル伝達経路はIL-2Rβ鎖の細胞増殖誘導に必須のSer-rich領域を介すること、また、Jak3キナーゼを介するシグナル伝達経路とは独立していることを明らかにした。さらに、IL-2Rγ鎖の細胞内領域の各領域の役割について、解析した結果、膜近傍のSH2亜領域を有するγ鎖変異体は、IL-2刺激によるJak3キナーゼの活性化を誘導しないが、Jak1キナーゼおよびStat5の活性化を誘導することを解明した。すなわち、IL-2刺激によるJak1キナーゼの活性化は、Jak3キナーゼ活性化のシグナル伝達経路とは独立して誘導されていることが示唆された。
卵子成熟のためのFSH受容体遺伝子導入顆粒膜細胞を用いた遺伝子治療の基盤的研究

(1)ラット顆粒膜細胞を用いたin vitro培養及びFSHレセプター遺伝子導入実験の結果、FSHR遺伝子を初代培養顆粒膜細胞に導入することにより、減少したFSHRを再び発現させ、かつ減弱するFSH刺激に対する細胞反応性を回復する培養系を確立したことから、遺伝子治療による未熟卵子のex vivoでの成熟が期待される。(2)FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞のin vitroラット卵子成熟に対する効果の検討を行ったところ、遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で高い成熟が観察された。同時に卵子の培養を行った培養液上清中のE2濃度を測定したところ、E2の産生量は共培養なし群と遺伝子導入なしの顆粒膜細胞との共培養で測定感度以下であったが、FSHR遺伝子導入群では高濃度の産生を認めた。(3)in vitroでの顆粒膜細胞との共培養により成熟した卵子の受精率は、遺伝子導入なしの顆粒膜細胞との共培養群で29.9%、FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で16.0%と遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で高い受精率が観察された。(4)卵子顆粒膜複合体の状態でFSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養によりin vitroで成熟したラット卵子の受精能の検討の結果、in vitroで成熟したラット卵子の受精率は、FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で高い受精率が観察された。1、ラット顆粒膜細胞を用いたin vitro培養およびFSH受容体遺伝子導入実験未熟雌ラットをdiethylstilbesrol(DES)で刺激した後、卵巣を無菌的に摘出、26G針にて卵胞を穿刺し、顆粒膜細胞を採取し培養した。FSH受容体数を125I-FSHを用いたbinding assay法により測定した。また顆粒膜細胞の機能の指標としてFSH刺激によるE2産生能を測定した。一方、ヒトFSHR遺伝子をアデノウイルスに組み込んだ組換えアデノウイルス(Ad-FSHR)を作成、培養1日目にMOI 10にて顆粒膜細胞に導入し、同様にFSH受容体数、E2産生能を測定した。FSH受容体数は培養0日目は6071±719/cellであり、FSH刺激によりE2が2865pg/ml産生された。3日目のFSH受容体数は2390±/cell、E2産生量も382pg/mlと減少し、7日目ではFSH受容体はほとんど消失し、E2産生量も測定感度以下となった。一方、Ad-FSH受容体導入顆粒膜細胞では、3日目では受容体数が6752±76/cell、E2産生は1310pg/mlと未導入細胞と比較して有意に増加、培養7日目においてもFSH受容体数が1851±385/cellと発現しており、E2も365pg/mlと産生されていた。2、FSH受容体遺伝子導入顆粒膜細胞のin vivoラット卵子成熟に対する効果の検討DESで刺激した幼若雌ラットより採取した卵子をAd-FSHR遺伝子導入顆粒膜細胞と共培養しその成熟を検討した。培養開始後36時間でMetaphaseIIまで進み第一極体の放出が認められる頻度は共培養なし群で31.6%,遺伝子導入なしの顆粒膜細胞との共培養群で38.2%、遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養では62.1%とより多くの卵子の成熟が観察できた。本実験の結果FSH受容体遺伝子導入により、in vitroの培養の環境でも顆粒膜細胞の機能を保持できること、さらに遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養により卵子の成熟を促進できることが確認された。1.FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞のin vitroラット卵子成熟に対する効果の検討in vitro培養開始後2436MII(Metaphase II)まで進み

第1極体の放出が認められる頻度は共培養なし群で31.6%、遺伝子導入なしの顆粒膜細胞との共培養群で38.2%、FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で62.1%と顆粒膜細胞との共培養群、特に遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で高い成熟が観察された。同時に卵子の培養を行った培養液上清中のE2濃度を測定したところ、E2の産生量は共培養なし群と遺伝子導入なしの顆粒膜細胞との共培養で測定感度以下であったが、FSHR遺伝子導入群では高濃度の産生を認めた。2.FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養によりin vitroで成熟したラット卵子の受精能の検討in vitroでの顆粒膜細胞との共培養により成熟した卵子の受精率は、遣伝子導入なしの顆粒膜細胞との共培養群で29.9%、FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で16.0%と遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で高い受精率が観察された。3.卵子顆粒膜複合体の状態でFSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養によりin vitroで成熟したラット卵子の受精能の検討採卵された卵子を顆粒膜細胞からはずさずに、卵子顆粒膜複合体の状態でFSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養によりin vitroで成熟したラット卵子の受精率は、遺伝子導入なしの顆粒膜細胞との共培養群で40.5%、FSHリセプター遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で17.6%と遺伝子導入顆粒膜細胞との共培養群で高い受精率が観察された。
全エクソンシーケンスによる非特異性多発性小腸潰瘍症の原因遺伝子同定

エクソーム解析により非特異性多発性小腸潰瘍症はSLCO2A1遺伝子のホモ変異ないしコンパウンドヘテロ変異に起因することを突き止め、“Chronic Enteropathy Associated with SLCO2A1" (CEAS)という新規の名称を提唱した。同遺伝子は肥厚性皮膚骨膜症の原因としても知られており、一部の非特異性多発性小腸潰瘍症患者において、肥厚性皮膚骨膜症の臨床徴候を有することも明らかにした。非特異性多発性小腸潰瘍症(CNSU)の15家系24例(患者16例、非発症者8例)から書面による同意が得られた。4家系6症例(CNSU患者5例、非発症者1例)においてエクソームシークエンスを行った。血族結婚を有する3家系3症例において、dbSNP135に未登録の非同義的もしくはスプライス部位の変異がホモ型にみられる遺伝子は9個のみであった。同胞発症である2症例においても同9遺伝子内に変異を認めた。非発症者1例の情報で候補遺伝子を除外したところ、遺伝子Aのみに絞り込まれた。日本人コントロール検体747例では、3例においてエクソン7のスプライス部位の変異をヘテロ型で有していたが、他3ヶ所の変異は全くみられなかった。他CNSU患者11例について同遺伝子内のエクソン領域の変異を検索したところ、11例中10例にタンパクの機能変化をきたしうる遺伝子変異をホモ変異もしくはコンパウンドヘテロ変異として有していた。以上よりCNSUの原因遺伝子として遺伝子Aを同定した。他CNSU患者11例について同遺伝子内のエクソン領域の変異を検索したところ、12例中11例にタンパクの機能変化をきたしうる遺伝子変異をホモ変異もしくはコンパウンドヘテロ変異として有していた。クローン病患者603例について同遺伝子変異の有無を検索したところ、2例にコンパウンドヘテロ変異を認め、臨床情報はCNSUに矛盾しないものであった。上記結果について第22回日本消化器関連学会週間(第56回日本消化器病学会大会、第88回日本消化器内視鏡学会総会)で発表した。論文作成の上、現在投稿中である。非特異性多発性小腸潰瘍症は、潰瘍による貧血と低蛋白血症を特徴とする、まれな消化管疾患の一つである。本症の原因や病態については不明な点が多いが、家系内に血族結婚を認める症例や同胞発症例があることから常染色体劣性遺伝病である可能性が示唆されている。本研究では、全エクソームシークエンスを用いて本症の原因遺伝子を同定し、疾患概念を確立することを目的とした。4家系6症例(患者5例、非発症者1例)において全エクソームシークエンスを行った。dbSNP135データベースの情報および家系情報を用いて候補遺伝子の絞り込みを行ったところ、SLCO2A1遺伝子のみに絞り込まれた(4ヶ所の変異部位)。日本人コントロール検体747例では、3例においてイントロン7のスプライス部位の変異をヘテロ接合型で有していたが、他3ヶ所の変異は全くみられなかった。他の非特異性多発性小腸潰瘍症患者12例について同遺伝子内のエクソン領域の変異を検索したところ、12例中11例にタンパクの機能変化をきたしうる遺伝子変異をホモ接合型もしくはコンパウンドヘテロ接合型変異として有していた。以上より非特異性多発性小腸潰瘍症の原因としてSLCO2A1遺伝子遺伝子を同定した。エクソームシークエンスを用いた解析から非特異性多発性小腸潰瘍症の原因遺伝子を同定することができており、結果を学会で発表済みである。また論文は投稿中である。消化管全国の施設から本症が疑われる患者のゲノム検体を収集し、遺伝子解析を行う。また遺伝学的に確定診断できた症例においてその臨床徴候をより詳細に調査し、本症の臨床像を明らかにする。また同定した原因遺伝子をノックダウンしたモデルマウスを作成し、小腸潰瘍発症における機序を明らかにする。エクソームシークエンスを用いた解析から非特異性多発性小腸潰瘍症の原因遺伝子を同定することができた。

平成25年度にエクソームシークエンスで原因遺伝子候補の絞り込みを行い、全ての候補遺伝子についてダイレクトシーケンスを用いて再現性を確認する予定としていたが、候補遺伝子を1個に絞り込むことが可能であった。同遺伝子内の変異の一部は制限酵素を用いてタイピングすることが可能であり、クローン病検体を用いたジェノタイピングも比較的安価で可能だったため。非特異性多発性小腸潰瘍症は、炎症性腸疾患の一つであるクローン病との鑑別が臨床的に難しく、正しく診断されていない可能性があるため、クローン病と診断されている患者の既採取ゲノム検体を用いて、同定した遺伝子内の変異の有無を検討する。また同遺伝子についての機能解析を行い、学会発表・論文執筆を行う。全国の施設から本症が疑われる症例のゲノム検体を収集し、今回同定した遺伝子内の全エクソンについてダイレクトシーケンスを行い、変異の検索を行う。また同遺伝子内の変異の一部は制限酵素を用いてタイピングすることが可能であったため。クローン病患者検体についてダイレクトシーケンスを行い、非特異性多発性小腸潰瘍症との遺伝的相違を確認するとともに正しく診断されていない患者を同定する。
1級、2級-ジオールの2級カルビノール炭素原子上への選択的炭素鎖導入反応の開発

キラルな3級または4級炭素原子をもつ天然有機化合物を合成する場合、2位に3級または4級のキラル中心を持つ1級アルコールは有用な合成ユニットになる。本研究は、1, 2-ジオールを環状亜硫酸エステルにした後有機金属化合物を反応させ、より立体的に混んだ炭素原子上に有機基を導入する反応系を開発することを目的としている。1、キラルな3級炭素原子の生成(4S)-4-(3-ベンジルオキシ-1-プロペニル)-2-オキソ-1, 3, 2-ジオキサチオランに(CH_3)_3Alを反応させたところ、ジオキソチオラン環の4位をメチル基が攻撃したSN2型生成物である5-ベンジルオキシ-2-メチル-3-ペンテン-1-オールとSN2'生成物である5-ペンジルオキシ-4-メチル-2-ペンテン-1-オールの混合物が44%の収率で得られた。(4S)-4-(1-ヘキシニル)-2-オキソ-1, 3, 2-ジオキサチオランと(CH_3)_3Alを反応させた場合には、3-オクチン-1,2-ジオールが生成した。一方、(4S)-2-オキソ-4-(メチルジフェニルシリル)メチル-1, 3, 2-ジオキサチオランと(CH_3)_3Alとの反応では、2級炭素原子上にメチル基が導入された2-メチル-3-(メチルジフェニルシリル)-1-プロパノールが収率89%で得られた。2、キラルな4級炭素原子の生成4-シクロヘキシリデン-2-オキソ-1, 3, 2-ジオキサチオランにMe_3Alを反応させたところ、予期したように反応は3級炭素原子上でおこり、1-ヒドロキシメチル-1-メチルシクロヘキサンが収率92%で得られた。同様に、各種の(4S)-4-アルキル-2-オキソ-4-フェニル-1, 3, 2-ジオキソチオランのendo-異性体およびexo-異性体と(CH_3)_3Alとの反応でも、対応する2-メチル-2-フェニル-1-アルカノールが6098%ee(化学収率: 9398%)で生成した。
男性ホルモン依存性転写活性化に対する多環芳香族炭化水素の抑制作用のメカニズム

5α-dihydrotestosterone(DHT)によって活性化された遺伝子の転写に対する3-methylcholanthrene(3MC)の抑制作用の機構解明を目的とし、本研究を行った。その結果、3MCによる抑制作用の発現には、男性ホルモン受容体(AR)とアリル炭化水素受容体(AhR)の複合体形成や男性ホルモン応答遺伝子の転写調節領域上に存在するAhR結合配列へのAhRの結合が重要な役割を果たしていることが示唆された。ダイオキシン類や多環芳香族炭化水素類(PAHs)には、男性ホルモンに対する阻害作用、即ち、抗男性ホルモン作用がある。本研究では、PAHとして3-methylcholanthrene(3MC)を、男性ホルモンとして5α-dihydrotestosterone(DHT)を使用し、そのメカニズムについて解明を試みた。まず、ヒト前立腺がん由来LNCaP細胞を、DHTを単独又はDHTと3MCの組み合わせで処置し、細胞における男性ホルモン受容体(AR)の発現量が3MCによって変化するか検討した。その結果、DHTで処置した細胞におけるARの発現量は、3MCによって変化しなかった。また、DHTによるARの核内移行に対する3MCの影響を検討したところ、3MCによる変化はみ照れなかった。以上の結果か照、3MCによる抗男性ホルモン作用は、ARの発現量や核移行量の減少によらないことが示唆された。次に、細胞を3MCやDHTでそれぞれ単独又はDHTと3MCの組み合わせで処置した後核抽出液を調製し、抗AhR抗体を用いた共免疫沈降法により、ARとAhRが核内で複合体を形成しているか検討した。その結果、3MCを単独、またはDHTと3MCを組み合わせで処置した細胞では、抗AhR抗体との共免疫沈降物中にARが検出され、DHTと3MCを共処置した細胞では、3MCを単独処置した細胞に比べ、より多くのARが検出された。また、DHTを単独処置した細胞では、抗AhR抗体との共免疫沈降物中に、ARは検出されなかった。以上の結果から、DHTと3MCを組み合わせで処置した細胞では、AhRとARが複合体を形成していることが明らかになり、3MCによる抗男性ホルモン作用にAhRとARの複合体形成が関与していることが示唆された。環境中に存在する化学物質でヒトや野生動物の内分泌機能に障害を与える内分泌撹乱物質が大きな社会問題となっており、これまでにダイオキシンや自動車の排気粉じん中に多く含まれる多環芳香族炭化水素(PAH)が転写制御因子であるアリル炭化水素受容体(AhR)を活性化することにより男性ホルモン依存性転写活性化を抑制することが報告されている。本研究では、その機構を明らかにすることを目的とし、男性ホルモン応答性ヒト腫瘍由来細胞を用いて研究を行った。男性ホルモンにより転写が活性化される代表的な遺伝子である前立腺特異抗原(PSA)の転写調節領域上にはAhR結合配列であるXREが8カ所存在する。AhRのPSA遺伝子の転写調節領域への結合がPAHの抑制効果に影響を及ぼすか検討した。PSA遺伝子の転写調節領域上に存在するXREについて、1カ所または複数か所を削除した種種の転写調節領域を含むルシフェラーゼ発現プラスミドを用いたレポーターアッセイを行った。その結果、ある部分のXREを欠損したプラスミドを用いたアッセイでは、男性ホルモンによって誘導されたルシフェラーゼ活性がPAHによって減弱しなかったことから、PSA遺伝子の転写活性化に対するPAHの抑制作用に転写調節領域上のXREが関与していると示唆された。一方、男性ホルモンは男性ホルモン受容体(AR)に結合しその作用を発揮する。PIASxαは複合体を形成することによりARを不活性化するタンパク質の一つであり、PIASxαがPAHの抑制作用に関与している可能性が考えられる。そこで、siRNAによってPIAsxαをノックダウンしてPAHの抑制作用を検討したところ、PIASxαをノックダウンした細胞でもPAHの抑制作用が観察された。以上の結果から、PIASxαは男性ホルモン依存性転写活性化に対するPAHの抑制作用に関与していないと考えられた。
ワーク・ファミリー・コンフリクトとメンタルヘルスの関連性に関する心理学的考察

現代生活の精神健康を考えるとき、仕事と家庭とのバランスは無視できない問題である。仕事と家庭のそれぞれの要求が両立せず、仕事(家庭)の要求が家庭(仕事)における達成を阻害する状況をワーク・ファミリー・コンフリクトと呼んでいる。これは仕事満足感や家庭満足感、生活全体の満足感を引き下げる効果を持ち、現代人の精神健康に深く関わっていると考えられている。本研究では、ワーク・ファミリー・コンフリクトの定義とその心理学的メカニズムを検討することにより、現代人のメンタルヘルスに及ぼす影響を明らかにし、その個人の立場からの対処または組織の側からの対策についての知見を得ることを目的とした。また、自己理解を促進するため、個人の結果を全体の平均値とともに個人にフィードバックする試みも実行された。本研究において得られた主な知見は以下の通り。まず、ワーク・ファミリー・コンフリクトが仕事が家庭生活を阻害する葛藤、家庭・家事・育児が仕事生活を阻害する葛藤、両立しているために時間のないあわただしさを感じざるを得ない葛藤の3因子構造を持つことが明らかとなった。また、共働き男性群と共働き女性軍および男性妻専業主婦群を比較したところ、共働き男性群と男性妻専業主婦との間には尺度得点間の差はまったくなく、むしろ男女間に有意差が見られた。これらのことから、女性が共働きする状況においても、仕事と家庭のあり方に関する心理学的概念において、男女差は引き続き明確であることが言えた。加えて、個人に結果をフィードバックするにあたって、フィードバックの意義、フィードバックされるべき内容、フィードバックの問題点などが検討された。本年度は3年計画の第1年次であり、主に資料収集と予備調査のデータ解析および分析を通じて、ワーク・ファミリー・コンフリクトの概念を構成することに費やされた。本年度の時点では、ワーク・ファミリー・コンフリクトをストレス・モデルにおけるストレスの結果生じる情動と位置づけ、「役割葛藤の一形態であり、組織からの要求への対処が家庭での達成を阻害し、また家庭からの要求への対処が組織での達成を阻害することから生み出される、罪障感や過重感などの情動反応」と定義し、ストレス・モデルを援用したワーク・ファミリー・コンフリクト・モデルを構成した。本モデルはワーク・ファミリー・コンフリクトの発生メカニズムおよびプロセスを扱っており、個人内的要因として(1)キャリア開発志向(2)家庭志向、環境要因として(3)組織からの要求(4)家庭からの要求、長期的結果変数として(5)仕事満足度(6)家庭満足度という6つの要因が取り上げられた。予備調査の結果、(3)組織からの要求や(4)家庭からの要求が高いと、ワーク・ファミリー・コンフリクトが高いことが示された。加えて、これらの関係は個人の(1)キャリア開発志向や(2)家庭志向の高さによって、要求の与えるネガティブな影響が大きくなってしまう場合のあることが明らかとなった。このように、本モデルは多くの要因を視野に入れる必要があると同時に、それぞれの要因が相互に影響を持つことから、そのメカニズムの解明は非常に困難をきわめると予想されるが、一定の知見を目指し、次年度の課題としてモデルの精緻化およびその検証方法の検討に取り組みたい。本年度は3年計画の第2年次であり、昨年度構築されたワーク・ファミリー・コンフリクト・モデルをもとに、資料収集と予備調査のデータ解析および分析を通じて、ワーク・ファミリー・コンフリクトの質問紙を構成することに費やされた。また、個人から収集した結果を個人にフィード・バックするためのフィード・バック冊子が作成された。これは被調査者の調査参加への動機づけを高めるとともに、個人の知る権利を確保し、さらに、メンタルヘルス促進における自己理解と自己管理の効果をねらったものである。ワーク・ファミリー・コンフリクトの定義として、「役割葛藤の一形態であり、組織からの要求が家庭における個人の達成を阻害し、また家庭からの要求が組織における個人の達成を阻害すること」を採用した。ここで定義されるワーク・ファミリー・コンフリクトは個人の仕事満足度や家庭満足度、メンタルヘルス全体にネガティブな影響を及ぼす。

このとき、個人内的要因として、仕事関与および仕事参加、家庭関与および家庭参加がワーク・ファミリー・コンフリクトの発生の程度に関わり、さらにワーク・ファミリー・コンフリクトが個人の精神健康にネガティブな影響を与える関係を調整すると考えられる。次年度は本年度作成された質問紙を企業に働く人々を対象に実施し、収集されたデータの解析・考察を通して、ワーク・ファミリー・コンフリクトの発生のメタニズムおよびその影響について、知見を報告する。本年度は3カ年の研究の最終年度にあたり、一昨年、昨年と検討してきたモデルにそって、質問紙調査を実施し、分析・考察を行った。また、個人の結果を全体の平均値とともに個人にフィードバックする試みも実行された。本研究において得られた主な知見は以下の通り。まず、ワーク・ファミリー・コンフリクトが仕事が家庭生活を阻害する葛藤、家庭・家事・育児が仕事生活を阻害する葛藤、両立しているために時間のないあわただしさを感じざるを得ない葛藤の3因子構造を持つことが明らかとなった。また、共働き男性群と共働き女性群および男性妻専業主婦群を比較したところ、共働き男性群と男性妻専業主婦との間には尺度得点間の差はまったくなく、むしろ男女間に有意差が見られた。これらのことから、女性が共働きする状況においても、仕事と家庭のあり方に関する心理学的概念において、男女差は引き続き明確であることが言えた。個人に結果をフィードバックするにあたって、フィードバックの意義、フィードバックされるべき内容、フィードバックの問題点などが検討された。これらの結果は、研究報告書にまとめられた。今後学会等で、結果を発表し、さらに検討を加える予定である。
マントル細胞リンパ腫の浸潤・転移における接着分子の関与とその分子生物学的検討

2)遺伝子学的検討リンパ腫症例の凍結材料よりRNAを抽出し、cDNAを作成し、サイトカイン・サイトカインレセプターの発現をRT-PCR法で検討したが、特異的な増幅が得られなかった。プライマーデザインの再考の上、再検討が必要と考えた。1)免疫組織学的検討(1)病変部別phenotypeの検討:MCL27例とprimary-MLP4例を検討した。MCL27例中,経過を追えた19例中l0例に節外性病変を認めた。進展先は消化管(MLPtype)3例,脾3例,眼瞼3例,皮膚3例,扁桃1例,顎下腺1例,軟部l例(重複あり)であった。MCLのphenotypeはCD20 27/27,CD30/27,IgM27/27,IgD12/27,CD520/27,CD10 0/27,CD23 2/19,cyclin D1 21/27だった。パラフィン切片で検討が可能だった7例の節外病変部(眼瞼2例,消化管3例,扁桃1例,顎下腺1例)ではphenotypeに差異は認められなかった。Primary MLPの4例のphenotypeはCD20 4/4,CD30/4,IgM4/4,IgD2/4,CD54/4,CDl00/4,CD230/4,cyclin D1 4/4であり,MCLの典型像をとり,その差異は認められなかった.(2)接着分子の検討:末梢リンパ節と腸管パイエル板へのhomingに関連するリンパ球側の接着分子である,L-selectinとIntegrinα4β7の検討を行った。L-selectinはMCL7/17,MLP3/4に陽性症例を認め,MCLの発現態度と節外性病変の有無とに関連はなかった。integrinβ7に対するpolyclona1抗体を用いて検討を行ったが,検討したMCL11例,MLP2例の全例に陽性を示し,報告されているようなMLP特異性の発現は見られなかった。integrinβ7monoclonal抗体(Act-1)を作成したDr.A.I.LazarovitsよりAct-1の供与を受け,現在その抗体にて再度検討中である。他の接着分子(CD1la,CD18,CD54,CD44,CD34,CD49d,CDl03,CDl06)についても発現傾向に差は認められていないが,今後症例を増やし検討する予定である。また比較的眼瞼・皮膚への進展症例が多く,CLA(cutaneous lymphocyte antigen)の検討を進めたいと考えている。2)遺伝子学的検討リンパ腫症例の凍結材料よりRNAを抽出し,cDNAを作成した。サイトカイン・サイトカインレセプターのprimerのデザインを思案し,RT-PCRの準備,予備実験中である。
自己免疫性肝炎における抗核抗体き多様性とその産生機序-認識エピトープとVH遺伝子の解析

自己免疫性肝炎、慢性C型肝炎、原発性胆汁酸肝硬変における抗核抗体の質的意義について検討し、以下の新たな知見が得られた。尚、検討には診断時および経過観察中に採血が必要と思われた際に得た血清の一部を用いたが、その際に採取した検体の一部を本検討に用いることを患者に説明し承諾を得た。1自己免疫性肝炎、慢性C型肝炎における抗核抗体の対応抗原の検討HepG2細胞より抽出した核原を抗原として用いたウエスタンブロット解析により、自己免疫性肝炎では90%以上の症例で32kDaタンパクが抗核抗体の主要対応抗原として認められた。慢性C型肝炎における抗核抗体の対応抗原は症例により異なり、共通して強く認識される抗原はなく、多数の抗原を弱く認識していることが示された。一方、原発性胆汁性肝硬変では5055kDaタンパクが抗核抗体の主要対応抗原として同定されたが、染色パターンはdiscrete speckled patternにもかかわらず、セントロメア抗体の認識抗原である17kDaタンパクは認めなかった。2自己免疫性肝炎、慢性C型肝炎の抗核抗体産生B細胞のVH遺伝子ファミリーレパトア解析現在検討中であるが、これまでのところ抗核抗体産生B細胞のVH遺伝子ファミリーの発現に自己免疫性肝炎、慢性C型肝炎に特異的な偏りは認められていない。
動脈硬化症の膀胱機能に及ぼす長期的影響について

平成24年度までの研究成果:まず、先行研究(Nomiya et al. Neurourol Urodyn 2011)に準じて、動脈硬化ラットモデルの作成を行った。作成後24週目に、代謝ゲージによる排尿記録、膀胱内圧測定、膀胱血流測定を行った所、モデルの再現性が確認できた。さらに、AI群では膀胱壁の血流が有意に低下していることが確認された。組織学的検討でも、AI群で総腸骨動脈、内腸骨動脈、膀胱壁内動脈で内弾性板の有意な肥厚が観察された。平成25年度の研究成果:AI群とcontrol群の平滑筋条片を用いてオルガンバススタディーを行い各種薬剤、電気刺激に対する反応性の検討を行った。80mM KCL、1mM ATPに対する収縮反応は、AI群で有意に低下していた。Cchによる濃度反応曲線では、10-7M10-3Mの濃度で、AI群は収縮力が有意に低下していた。さらに、経壁電気刺激では、AI群は収縮力が有意に低下していることが明らかとなった。次に、Cch 10-6Mによる膀胱平滑筋の収縮張力の経時的な検討では、AI群では一過性収縮反応は低下しているが、持続性収縮反応は保たれていていた。そこで、持続収縮に関与するRhoA/Rho-kinase系の検討を行った。オルガンバススタディーでは、control群に比べAI群では、Rho-kinase阻害剤(Y-27632)に対する弛緩反応が有意に増強していた。ウエスタンブロットでは、AI群でRhoA、ROKβの発現が有意に増強していた。これらの結果より、長期間の慢性膀胱虚血では、排尿筋過活動を呈するが、全体としての収縮力は低下すること、持続性の収縮張力は保たれていることが示された。この原因として、RhoA/Rho-kinase系の発現増強が関与しており、虚血による膀胱収縮力低下に対する、代償作用の可能性も考えられた。研究の初年度である平成24年は、まず研究実施計画にそって、S-Dラットを使用し動脈硬化モデルの作成から開始した。これは以前に当科で開発した世界初のモデルで有り(Neurourol Urodyn 2011)、機能的に過活動膀胱を呈することを我々は報告している。モデルの再現性を確認するため10匹のラットを使用し、両側総腸骨動脈からバルーンカテーテルを挿入して内膜損傷を引き起こし、高コレステロール食を摂取させた。手術後8週間で膀胱を摘出し、H-E染色にて膀胱の組織学的検討を行ったところ、膀胱壁内の動脈と総腸骨、内腸骨動脈に内膜中膜の肥厚が認められた。また、コントロール群、sham群では、動脈硬化のみられないことも確認された。覚醒下での膀胱内圧測定では、動脈硬化ラットモデルが排尿間隔が短く頻尿となっていることも確認できた。モデルの再現性の確認後、オルガンバススタディーによる各種薬剤への反応性の検討を行った。具体的には、膀胱の弛緩作用を持つRhoーkinase阻害剤(Y27632)を使用し、その反応性をモデル群、コントロール群、sham群で比較した。途中経過ではあるが、動脈硬化モデルでは、膀胱平滑筋条片の収縮の持続反応が増強していた。また、平滑筋の収縮の持続に関与するrho-kinaseの阻害剤による弛緩反応は、コントロール群やsham群と動脈硬化群に大きな差は無いような傾向であった。

手術手技が安定せず、動脈硬化ラットモデルの再現性を確認するために時間がかかってしまったため、予定よりやや進捗状況は遅れている。まず、初年度に達成できなかった計画の実験を行う。若干の遅れはあるが、手技は安定してきており、データも出てきているため、計画に沿って平成25年度の研究を行う予定である。研究計画書に沿って行う予定である。
1780年代から1830年代の英国における感受性文化と女性と慈善の関係

本年度は、まずMary Wollstonecraftの言説にみられる感受性文化の影響を洗い出した。いわゆる理性的非国教徒(Rational Dissent)の影響が濃厚であるというWollstonecraftであるが、実際のところ感受性文化の枠組みのなかで著作を書き、そして感受性の言説を取り込んでいったことは否定できない。矛盾する理性的非国教徒の言説と距離をとりながらも、その思想を咀嚼し、感受性の言説によって表現しようと試みた形跡が彼女の小説には明確に浮かびあがっている。特に初期の自伝的な小説Maryは、感受性の言説が慈善の思想と絡み合いながら、やがては理性的非国教徒の急進的な思想へと接点を結ぼうとする経緯が見られる。それはあまりに未分化なものであることも事実だが、しかしその未分化な言説こそ、感受性文化に育まれ、その言説と思想を原動力としながら慈善活動をし、公共圏へと参入しようとしていた同時代の女性たちの状況を象徴している。その後、感受性の言語を女性詩人たちが全体的にどのように取り込みながら、ロマン派男性詩人たちの言説と距離を取ろうと試みたのかを、特に慈善にかかわる言説、1790年代の奴隷貿易廃止運動に関係する言説を中心に考察した。女性たちは自らの文学的伝統がない状況において、感受性の言説に依拠しながらも、慈善にかかわる言説を著すことで公共圏に参入しようとしたのである。しかし、その試みには常に「公共圏の不安」が付きまとっていたことも事実である。最後は感受性の文化の枠組みのなかから慈善活動を歴史的な見地から俯瞰した。宗派や社会的に異なる階層に属する女性たちが慈善活動という特殊な領域において協働をなしとげた。しかし一方で、彼女たちの言説には互いの利益と信条の齟齬に対する不安と緊張が含まれている。その曖昧な関係が18世紀末の女性の感受性文化と慈善の関係を象徴している。今年度は18世紀女性の感受性の歴史的・社会的意味を、主要な海外の学術論文を精査した上で、2回にわたる英国リサーチによって歴史資料を調査することによって以下の事例を明らかにした。「感受性」や「情操」、「憐憫」、「共感」、「善意」といった18世紀的美徳は、イギリスの経験哲学・道徳哲学によって体系づけられ、中流階級を主軸とした社会経済の活性化と繁栄の中で「上品な」(polite)社交性・社会性を示す美徳としても賛美された。それは感受性文学を構成する一方で、貧困が社会問題化していく過程で慈善と結びついていく。18世紀中葉に慈善事業が未曾有の規模で行われたことと、感受性文学が出現したことは根底では軌を一にしているのである。感受性豊かな慈善の美徳は、男性だけではなく生来的に感性・感覚が鋭敏であると考えられていた女性にも適用されていく。18世紀における女性の慈善への関与は軽視されがちであるが、特に18世紀後半の風俗改善運動、日曜学校や慈善学校をはじめとする協同慈善事業、奴隷貿易廃絶運動など、女性の目覚しい活躍は言説の点からみても明白である。家庭的・女性的とされる感受性がその延長線上で慈善と結びつくことで、それまで私的領域に閉じ込められていた中流階級女性たちが、女性としてのアイデンティティを失うことなく社会的、時に政治的な役割を獲得していく契機となったのである。ハンナ・モアやプリシラ・ウィイクフィールドが知性ある中流階級女性にとって可能な範囲で慈善活動を行なうことこそ女性の専門職であると論じたことは、慈善を突破口として女性たちが「公共圏」へ参入しようとしていた証である。それはこの時代の女性文学の一側面でもある。女性による感受性文学、あるいはその派生としての言説には慈善の概念や行為が扱われている小説が多いが、それらはいわば女性慈善文学群を構築している。Sarah ScottのMillenium Hall(1762)はその好例だ。感受性文学の修辞や18世紀道徳思想を背景に、ジェンダー化された独身女性たちが貧しい人々の母親代わりの救済者として活動する姿が画かれている。18世紀後半から19世紀にかけて、文学をひっくるめた公共圏の中で慈善は女性にとってますます大きな関心事となっていく。

しかし、その試みには常に「公共圏の不安」が付きまとっていたことも事実である。最後は感受性の文化の枠組みのなかから慈善活動を歴史的な見地から俯瞰した。宗派や社会的に異なる階層に属する女性たちが慈善活動という特殊な領域において協働をなしとげた。しかし一方で、彼女たちの言説には互いの利益と信条の齟齬に対する不安と緊張が含まれている。その曖昧な関係が18世紀末の女性の感受性文化と慈善の関係を象徴している。
プロテオーム解析に基づくリジン発酵の解析と最適化

リジン発酵プロセスを対象に、二次元電気泳動によるリジン生産菌(Brevibacterium flavum,ホモセリン要求株)の細胞内の遺伝子産物の定量・定性を行い、その経時的変化を解析することにより、新たなバイオプロセスの最適化・制御の開発を目的とした。二次元電気泳動に用いるサンプル調製において、細胞溶解法にガラスビーズによるホモジナイゼーションを検討した結果、タンパク質溶出の最も効率的な条件を決定した。また、この菌体破砕時にPMSF(プロテアーゼ阻害剤)及びアセトン沈殿法によりタンパク質を濃縮した結果、タンパク質スポットの検出が大幅に改善することがわかった。次に、このサンプル調製法で、培養フェーズを解析した結果、菌体増殖期(約480)、リジン生産期前期(約450)、後期(約320)と培養フェーズが移行するにつれてタンパク質スポット数が減少し、また発現量を示すスポットの大きさも減少することがわかった。さらに培養フェーズと発現タンパク質の関連性を調べるために、二次元電気泳動マップの画像解析を行い、ペプチドマスフィンガープリンティングによって解析されたデータベースに基づきタンパク質の同定を行った結果、菌体増殖期では解糖系に関係する酵素(Eno,Gpm,Pfk,Fda,Tpi,Gap)とTCAサイクルに関係する酵素(FumC,Mqo,AceB)を同定することができた。リジン生産期前期では解糖系やTCAサイクルの酵素が同様に発現を確認することができ、さらに増殖期では見られなかったリジン生産系の酵素(DapA,Ddh)を同定することができた。これらから、リジン生産における菌体の培養状態の変化を二次元電気泳動で解析しうることが明らかになった。今後、従来リジン発酵の生産性を制限していた因子を明らかにすると共に、その制限因子を克服するための最適な制御策を検討する。平成14年度:リジン生産菌培養実験と2次元電気泳動解析【目的】リジン生産プロセスを対象に、2次元電気泳動を用い、リジン生産菌の遺伝子産物の定量・定性を行い、その経時的変化を追跡する。本年度は、再現性のあるデータの取得と精度向上を実現するため、最適な菌体の前処理方法を検討し、2次元電気泳勒データを取得する。【実験方法】菌株にはリジン生産菌であるBrevibacterium flavum(ホモセリン要求株)を用いた。容積5Lの小型発酵層を用い培養を行った。培養開始12時間後(増殖期、菌体濃度約8g/l)にサンプリングを行い、培養液を遠心分離し菌体を回収した。回収した菌体を0.05Mリン酸バッファーで懸濁し、0.1mmのガラスビーズと種々の割合で混合しポルテックスで撹拌を行い、菌体内のタンパク質を抽出した。二次元電気泳動にはMultiphor II(Amersham Biosciences)を使用した。一次元目は固定化pHゲルストリップを使用し、タンパク質をpH310の範囲で等電点によって分離した。二次元目は分子量1万20万の範囲で分離した。分離したタンパク質は銀染色によって可視化した。【結果】回収菌体とガラスビーズを種々の割合で混合しタンパク質を抽出について検討した結果、菌体とガラスビーズを3(ml):3(ml)すなわち、1対1の割合で混合したとき最も効率的なタンパク質の溶出が見られた。この抽出タンパク質を用いて二次元電気泳動を行った結果、pH36および分子量1万20万の領域においては、明瞭なスポットが確認され、良好なタンパク質の分離が確認された。観察可能なスポット数は100程度であった。

しかしながらタンパクのスポットが不明瞭な領域が存在すること、定性できるスポット数がまだ不十分であるなどの問題があり、今後これらの点について検討を進める予定である。平成15年度:2次元電気泳動によるリジン発酵ブロセスの解析【目的】2次元電気泳動によるリジン生産菌内の遺伝子産物の定量・定性を行い、その経時的変化を追跡し、異なる培養状態における生理学的状態の解析を行う。本年度は、実際の培養サンプルを用いた2次元電気泳動を行い、その結果を解析した。【実験方法】菌株にはリジン生産菌であるBrevibacterium flavum(ホモセリン要求株)を用いた。容積5Lの小型発酵層を用い培養を行った。培養開始12時間(増殖期)、14時間目(リジン生産期)にサンプリングを行った。2次元電気泳動の方法は前年度の検討結果に基づき行った。また、2次元電気泳動マップからのタンパク同定は、泳動結果の画像解析を行い、データベースをもとに行った。【結果】その結果、菌体増殖期で検出されるタンパク質のスポット数に比べてリジン生産期で検出されるタンパク質のスポット数が著しく減少していることがわかった。このことから菌体増殖期とリジン生産期の培養状態では、タンパク質発現状況が非常に異なることが明らかとなった。これは、リジン生産期ではスレ__<100>オニン飢餓状態にあるため、このような菌体の生育に不利な培地栄養条件が、菌体の生理機能を急速に低下させ、タンパク質の発現を大幅に減少させたと考えられる。また、これらの二次元電気泳動マップの比較から8つのタンパク質が増殖期とリジン生産期に同時に発現していたことが明らかになった。このように、二次元電気泳動マップから培養状態の相違と発現したタンパク質の情報を得ることが可能であった。平成16年度:二次元電気泳動によるリジン発酵プロセスの解析1.目的二次元電気泳動によるリジン生産菌内の遺伝子産物の定量・定性を行い、その経時的変化を追跡する。本年度は、種々の微生物培養フェーズにおけるタンパク質レベルの動態変化の解析を行った。2.実験方法菌株には、リジン生産菌であるBrevibacterium flavum(ホモセリン要求株)を用いた。容積5Lの小型発酵槽を用いて回分培養を行い、菌体増殖期、リジン生産期前期及び後期において得られた菌体サンプルを用いて、二次元電気泳動を行った。また、二次元電気泳動マップからのタンパク質の同定は、画像解析を行い、二次元電気泳動データベースを用いた。3.結果二次元電気泳動に用いるサンプル調製において、菌体破砕時にPMSF(プロテアーゼ阻害剤)及びアセトン沈殿法によりタンパク質を濃縮した結果、スポットの検出が大幅に改善された。特に、これまでタンパク質スポットが殆ど検出されなかったリジン生産期後期で、約320個のスポットが検出された。このサンプル調整法で、種々の培養フェーズの解析した結果、菌体増殖期では解糖系の酵素6種類とTCAサイクルの酵素3種類を同定することができた。一方、リジン生産期前期及び後期では、増殖期では検出されなかったリジン生合成に関与する酵素2種類が同定できた。これは、スレオニン存在下では協奏的フィードバック阻害のために、リジンは過剰に生産されないが、スレオニン枯渇下では協奏的フィードバック阻害が解除され、リジンの過剰生産が行われるためと考えられる。
移植拒絶反応に伴う新しい急性炎症反応性蛋白の診断的・機能的役割の解明

S100A8/A9 complexは急性炎症の際にマクロファージ及び好中球が発現する蛋白であり,ヒト白血球から精製する必要があつた。しかし,今日ヒト白血球を大量に入手することは極めて困難である。そこで,S100A8及びS100A9蛋白に対するcDNAを作製後発現ベクター(pCold I>に挿入し,プラスミドを構築した。このプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し,S100A8及びS100A9蛋白を発現させることを試みた。その結果,両蛋白は大腸菌体内に発現させることに成功したので,Ni-アガロースカラムを用いてそれぞれの蛋白を精製した。次に,S100A8及びS100A9を用いてヘテロダイマーであるS100A8/A9の作製を試みた。その結果,これらサブユニットを混合しアルカリ性で処理することにより本蛋白を効率よく作製することに成功した(約5060%)。次に,この試料を酸性で処理することによってさらに精製度を上げることができた(約70%)。最後に,この試料を濃縮後ゲル濾過を行い目的成分を得た。最終精製度は約80%であった。このヘテロダイマーを用いて本蛋白の抗炎症性蛋白としての機能を明らかにするために,動物実験を実施した。まず動物(ラット)の腹腔内にLPSを投与し,肝障害の動物モデルを作成した。次に,LPS投与後1.0または3.5時間後に本蛋白を1mgずつ腹腔内に投与し,肝障害が抑制されるかどうかを組織学的に検討した。その結果,本蛋白の投与群のラット肝組織は有意に肝障害が抑制されていることを確認することができた。また,NOxの産生も有意に減少した。さらに,S100A8/A9結合アフィニティーカラムを用いて,本蛋白が炎症性サイトカインと結合することを生化学的に証明することができた。一方,本蛋白に対するELISAを膵島移植患者の血清に応用し,その臨床的有用性について検討した。膵島移植後の拒絶反応に対する実質的なマーカーは血中グルコース濃度の変動である。しかし,この変動は非常に緩慢であり移植細胞が生着する肝組織内で炎症が起こっているのかどうかを判定することは困難である。移植後の監視において,AST及びALTなどの炎症マーカーに先だって本蛋白が著しく上昇する事実を本研究で初めて確認することができた。この事実は本蛋白はグルコースより拒絶反応に伴う炎症に対して特異性及び感度により優れていることを示唆するものである。このように,S100A8/A9 complexは急性炎症性変化に対する有用なマーカーであることを間接的に示すことができた。当初,赤十字血液センターから白血球層を提供して頂きヒト白血球からS100

A8/A9complexの精製を試みていたが,その精製は非常に困難であった。そこで,今回新しい電気泳動システムを導入しS100A8/A9complexの精製を試みたところ,S100A8/A9 complexのみ迅速に,かつ大量に精製することに成功し,本蛋白を用いた動物実験を行った。その結果,S100A8/A9 complexの機能の一部を実験的に示すことができ,報告した(投稿中)。ところが,赤十字血液センターの輸血用血液処理システムの変更により,材料となるヒト白血球の提供が途絶えることになり,S100A8/A9 complexの確保が急務となった。そこで我々は,遺伝子工学技術を駆使してリコンビナントのS100A8及びS100A9を作製することを試みた。まず,発現後の精製が容易になるように遺伝子ヒスタグの配列を加えたプラスミドを作製した。次に,このプラスミドを大腸菌体内に挿入し形質転換を行った。LB培地で培養しIPTGで蛋白の発現を誘導したところ,大腸菌体内に両タンパク質を発現させるに成功した。続いて,両タンパク質の精製にも成功し,研究に必要な大量のS100A8及びS100A9を無尽蔵に確保する系を確立した。しかし,我々が目的としている蛋白はS100A8/A9 complexであることから,S100A8及びS100A9ヘテロダイマーであるS100A8/A9complexを構築する研究を続けており,現在,約40%の効率でヘテロダイマーの合成に成功している。次年度は,今年度生化学的に精製したヘテロダイマーS100A8/A9complexを用いた動物実験により,我々の最大の目的である急性炎症における本蛋白の本質的な機能的役割を解明したい。S100A8/A9 complexは急性炎症の際にマクロファージ及び好中球が発現する蛋白であり,ヒト白血球から精製する必要があった。しかし,今日ヒト白血球を大量に入手することは極めて困難である。そこで,S100A8及びS100A9蛋白に対するcDNAを作製後発現ベクター(pCold I)に挿入し,プラスミドを構築した。このプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し,S100A8及びS100A9蛋白を発現させることを試みた。その結果,両蛋白は大腸菌体内に発現させることに成功したので,Ni-アガロースカラムを用いてそれぞれの蛋白を精製した。次に,S100A8及びS100A9を用いてヘテロダイマーであるS100A8/A9の作製を試みた。その結果,これらサブユニットを混合しアルカリ性で処理することにより本蛋白を効率よく作製することに成功した(約50-60%)。次に,この試料を酸性で処理することによってさらに精製度を上げることができた(約70%)。最後に,この試料を濃縮後ゲル濾過を行い目的成分を得た。最終精製度は約80%であった。このヘテロダイマーを用いて本蛋白の抗炎症性蛋白としての機能を明らかにするために,動物実験を実施した。まず動物(ラット)の腹腔内にLPSを投与し,肝障害の動物モデルを作成した。次に,LPS投与後1.0または3.5時間後に本蛋白を1mgずつ腹腔内に投与し,肝障害が抑制されるかどうかを組織学的に検討した。