hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家畜腸管パイエル板モデル培養系によるイムノバイオティック機構の解明とその応用戦略

本研究は、世界に先駆けて樹立した家畜腸管上皮細胞株を用い、家畜対応型の的確なイムノバイオティクス選抜評価系の構築を進め、その実用性を検討した。その結果、ブタおよびウシ対応型の抗炎症性や抗ウイルス免疫性のイムノバイオティック評価系が確立でき、ブタにおけるインビボ試験により、その有用性が検証できた。本研究成果は、薬剤に頼らない家畜の健全育成技術の向上と関連産業の飛躍的発展に大きく貢献する。【目的】本研究は、食経験豊富な腸管免疫活性型乳酸菌「イムノバイオティクス」による、健全な家畜育成技術の実現に向け、家畜イムノバイオティクスの的確な選抜評価システムを確立する。本年度は、子ブタ・子ウシ腸管上皮細胞(PIEおよびBIE)を用いて、病原体リガンドによる免疫応答性を解析し、子ブタおよび子ウシに対応したイムノバイオティクス評価系の基礎を築くことを目的とした。【研究成果】1.(1)PIEおよびBIE細胞におけるパターン認識受容体(PRR)の発現を解析し、ロタウイルス(RV)および毒素原性大腸菌(ETEC)の認識性に関連するToll様受容体3および4の顕著な発現が遺伝子およびタンパクレベルで認められた。(2)dsRNAリガンド刺激によるPIE細胞からの炎症性サイトカイン発現について定量的リアルタイムPCR法で解析し、評価系構築のための免疫応答パラメータの候補を選定した。また、ETEC刺激によるBIE細胞における免疫応答パラメータについても設定した。2.(1)PIE細胞からのM細胞分化誘導を、トランスウエルを用いた蛍光ビーズの通過を指標として試みたが、その誘導は困難であった。(2)BIE細胞からM細胞を分化誘導することができた。これらの成果は、家畜に対応した腸管免疫評価系の基礎を築くものとして、大変有意義である。【研究の目的】本研究は、世界に先駆けて腸管バイエル板モデル培養系から家畜イムノバイオティクスの的確な選抜評価システムを確立し、その有用性検証と発展的応用を目的としている。本年度は、子ブタ腸管上皮細胞(PIE細胞)を用いた、腸管細胞共培養系を構築し、病原体に対するイムノバイオティクスの抗炎症性について解析した。また、PIE細胞および子ウシ腸管上皮細胞(BIE細胞)におけるイムノバイオティクスの抗炎症機構について解析した。【研究成果】1.PIE細胞と腸管パイエル板免疫担当細胞の共培養システム構築:インターセル内でPIE細胞を単層培養後、ブタ腸管バイエル板免疫担当細胞の培養ウエル上に移し、インターセルを介した共培養を構築した。2.共培養系におけるとイムノバイオティック評価:上皮細胞側をイムノバイオティクスで刺激後、ETECで刺激することで、PIE細胞および免疫担当細胞からの炎症性および調節性サイトカイン発現を指標として、共培養系における抗炎症性評価が可能となった。3.イムノバイオティック機構の解析: PIE細胞およびBIE細胞における、イムノバイオティクスの抗炎症機構について、TLR上流および下流のシグナル調節性が示唆された。本年度は、昨年度構築した、ブタ腸管上皮(PIE)細胞やウシ腸管上皮(BIE)細胞を用いた、腸管細胞共培養系を基礎とし、病原体に対するイムノバイオティクスの抗炎症機構について解明し、イムノバイオティック評価システムの有用性について検討した。【研究成果】1.PIE細胞およびBIE細胞における抗炎症機構の解析: PIE細胞およびBIE細胞を選抜イムノバイオティクスで刺激し、ETECで刺激後の抗炎症性発現機構について、遺伝子およびタンパクの両面より解析した。その結果、パターン認識受容体の発現には影響せず、細胞内のシグナル調節因子の発現および修飾制御により、抗炎症性を発揮することが明らかとなった。2.共培養系におけるイムノバイオティック機構の解析: PIE細胞と腸管バイエル板免疫担当細胞との共培養システムを用いて、ETEC刺激に対する抗炎症機構について解析した結果、PIE細胞における抗炎症性とともに、免疫担当細胞における免疫制御が認められ、両細胞間のサイトカインクロストークが考えられた。3.評価システムの有用性検証:選抜イムノバイオティクスのブタインビボ試験を行い、抗炎症効果や免疫機能の増強等が認められた。以上の結果から、家畜対応型のイムノバイオティック評価系の有用性が検証でき、詳細な機構解明が飛躍的に進むものと期待された。
音韻構造の普遍性に関する理論音韻論的研究

「モ-ラ」・「音節」という概念が英語と日本語の音韻記述にどのように機能しているかを、アクセント規則や語形成規則をはじめとするさまざまな言語現象の分析を通じて分析し、言語間にどのような共通性と相違点が見られるかを理論的観点から考察した。具体的には次の4つの問題を考察した結果、以下のような知見を得た。1.混成語形成などの日本語の記述に「モ-ラ」という概念が語分節の単位として機能している。2.英語の音韻規則・語形成規則の記述に用いられる「モ-ラ」という概念は、語の音韻的長さを測る単位としての機能であり、これは日本語のモ-ラが持っている機能の一部に過ぎない。3.英語の分析に有用とされている「音節量」という概念が音韻構造の変遷と現代日本語の音韻構造を理解する上で重要なものである。4.日本語の「シラビーム方言」と、英語をはじめとする「音節言語」の間には、アクセント規則などにおいて共通性が見いだされ、この点において日本語の「モ-ラ方言」との間に体系的な差異が見られる。このような研究結果を踏まえると、(1)日本語話者が「モ-ラ」の持つ複数の言語機能をどのようにして獲得するかという言語習得に関する問題、(2)日本語の歴史の中で、「モ-ラ」がどのように確立されてきたかという音韻史の問題、(3)世界の自然言語に、英語と日本語のいずれのタイプの音韻構造が一般的かという類型論の問題、以上3つの問題が今後の課題として残されている。
精神分裂病多発家系におけるDNA連鎖解析

ドパミンD4レセプター遺伝子には48塩基対を1単位とした繰返し配列があり、2-8回繰り返しの7種類の対立遺伝子が存在する。この多型はクロザピンの結合に関して異なった薬理学的特性を示すことが、VanTolらにより報告されている。この多型が精神分裂病発症過程にも何らかの関わりを持っている可能性がある。われわれは精神分裂病の遺伝的素因を明らかにする目的で、精神分裂病とDRD4遺伝子多型との相関を調べることを企図した。[対象及び方法]対象とした患者群は2群あり、家族内発症例のある精神分裂病(同胞発症例の片方;41名、親に発病者がいる例;11名、子に発病者がいる例;3名)をB+群、家族内発症例のない患者群47名をB-群とした。健常対照群は52名である。DRD4遺伝子多型の検索は末梢血からDNAを抽出し、PCR法により多型性を検出した。[結果]B+群において繰り返し数の多い(4回以上の繰り返し)配列の頻度が有意に高かった。またB+群において2回繰返しの頻度が健常対照群より有意に低かった。従って家族内発症例のある精神分裂病とDRD4遺伝子多型との相関が見られた。次にB-群において4回繰返し配列の頻度が健常対照群より有意に高くみられた。従って家族内発症例のない精神分裂病ともDRD4遺伝子多型との相関がみられた。B+群とB-群を比較すると、5、6回繰返し配列がB+群において有意に高く出現していた。5回繰り返し配列のみでもB+群において有意に高く出現していた。以上のようにB+群、B-群いずれにおいてもDRD4遺伝子多型と精神分裂病の相関が認められた。今回の研究課題の最終目標である連鎖分析まで到達していないが、今後DRD4遺伝子多型のシークエンスを含め、連鎖解析を行なっていく方向で研究を進めていく予定である。1.ドーパミD4レセプター遺伝子には48塩基対を1単位とした繰返し配列があり、2-8回繰返しの7種類の対立遺伝子が存在する。我々はこれらの多型と精神分裂病が相関する可能性を考えた。その相関を調べる前段階として健康人DNAを用いて、PCR法による本遺伝子多型性の検出法を確立した。本遺伝子多型性領域のGC含量は85%と高いために、通常のPCRより高い温度条件で反応を行なう必要がある。そこで高耐熱性酵素Vent(exo^-)DNA polymeraseを用いて種々の条件検討を行ない、最適条件を見出した。PCRの温度サイクルは、基本的には、99°C,1.5分のdenaturationと79°Cと75°C、2分のannealingとextensionとした。最初の15サイクルではannealingとextensionは79°Cとし、後の15サイクルでは、annealingとextensionは75°Cとした。各々の最初のannealingの時にVent DNA polymeraseを各4単位、計8単位投入した。次に、健康な日本人52名の多型性を調べたところ、対立遺伝子頻度は、D4.2(2回繰返し:以下同様):0.154,D4.3:0.010,D4.4:0.778,D4.5:0.048,D4.6:0.010であった。遺伝子頻度は各対立

遺伝子頻度から導かれる理論値とほぼ一致しており、Hardy-Weinbergの法則を満たしていた。これらの結果は、D4レセプター遺伝子多型性のPCR法による解析が可能であることを示している。2.精神分裂病が2名以上発病している家系について、各構成員を診断基準に基づき、診断を行ない、血液採取を現在行なっている。またその血液からDNA抽出を行ない、サンプルを集めている。以上より平成5年度研究実施計画はほぼ予定通り達成された。ドーパミンD4レセプター遺伝子には48塩基対を1単位とした繰返し配列があり、2-8回繰返しの7種類の対立遺伝子が存在する。この多型はクロザピンの結合に関して異なった薬理学的特性を示すことがVan Tolらにより報告され、向精神薬に対する反応の個体差に関係する可能性があり、精神分裂病発症過程にも何らかの関わりを持っている可能性がある。われわれは精神分裂病の遺伝的素因を明らかにする目的で、精神分裂病とDRD4遺伝子多型との相関を調べることを企図した。〔対象及び方法〕対象とした患者群は2群あり、家族内発症例のある精神分裂病55名(同胞発症例の片方;41名、親に発病者がいる例;11名、子に発病者がいる例;3名)をB+群、家族内発症例のない患者群47名をB-群とした。そして健常対照群は52名である。DRD4遺伝子多型の検索は末梢血からDNAを抽出し、平成5年度に確立したPCR法により、多型性を検出した。ただし、平成5年度にはPCRにVent(exo^-)polymeraseを用いたが、この酵素は1otにより活性がかなり異なることがわかったため、本年度は7-deaza-deoxyguano-sineを用いて、PCRを行なった。〔結果〕B+群において繰返し数の多い(4回以上の繰返し)配列の頻度が有意に高かった。またB+群において2回繰返しの頻度が健常対照群より有意に低かった。従って家族内発症例のある精神分裂病とDRD4遺伝子多型との相関が見られた。次にB-群において4回繰返し配列の頻度が健常対照群より有意に高くみられた。従って家族内発症例のない重症精神分裂病ともDRD4遺伝子多型との相関がみられた。B+群とB-群を比較すると、5、6回繰返し配列がB+群において有意に高く出現していた。5回繰返し配列のみでもB+群において有意に高く出現していた。以上のようにB+群、B-群いずれの群においてもDRD4遺伝子多型と精神分裂病との相関があった。またB+群とB-群とを比較しても遺伝子分布には有意差がみられた。連鎖研究が行なえる適切な家系がまだ見つかっておらず、平成6年度研究実施計画の最終的目標には到達していない。
主催者意識及び立地環境をパラメーターとしたオープンガーデンの観光基盤モデルの完成

日本のオープンガーデンは、「自宅の庭を無料で公開する」という一点で共通しているものの、地域によって運営主体や手法、目的が異なっている。そのため、課題の把握と対処の仕方も場当たり的にならざるを得なかった。本研究の目的は、先進事例から明らかにした日本のオープンガーデンの類型を、主催者の意識と開催地の空間特性というデータに基づいて全国規模で実証することである。これによって、オープンガーデンを持続可能な地域資源として位置づけ、交流人口・関係人口を供給する安定した観光資源の基盤整備を行う。
レドックス活性な新規水酸化物ナノ物質の合成及び電気化学エネルギーデバイスの開発

多種な遷移金属イオン(Fe, Co, Ni等)を層状複水酸化物に導入できる新規合成手法を開発し、その高結晶性サンプルを単層剥離することによりレッドクス活性な水酸化物ナノシートを得た。正に帯電する水酸化物ナノシートを酸化グラフェンに代表される負電荷をもつ2次元ナノシート同士とのヘテロ複合化を簡便な静電的相互作用プロセスで実現した。このヘテロ積層した複合材料をスーパーキャパシタの電極に用いると、電気容量の大幅増大、しかも数秒で充放電可能という優れた特性を確認した。さらに、複合材料は電極触媒として酸素発生反応を効率的に促進し、非常に小さい過電圧(0.21V)で水の電気分解が可能となることが分かった。2価遷移金属イオン(Co^<2+>)と3価アルミ(Al^<3+>)の塩及び尿素の混合水溶液をオイルバス加熱することにより、Co^<2+>-Al^<3+>層状複水酸化物の高結晶性六角板状結晶(ナノプレート)を合成した。また、2価遷移金属イオン(Co^<2+>, Fe^<2+>, Ni^<2+>)の塩とヘキサメチレンテトラミンの加水分解により、Co(OH)_2,Co_<1-x>Fe_x(OH)_2(x=1/3, 1/4, 1/5, 1/6)及びCo_<1-x>Ni_x(OH)_2(x=1/3)ブルーサイト六角板状ナノプレートを合成した。これらブルーサイト結晶を出発物として使い、臭素やヨウ素酸化を用いたトポ化学的手法により、ブルーサイト結晶中のCo^<2+>やFe^<2+>イオンの一部(約1/3)を3価に酸化することによって、ホスト層に正電荷を生じさせ、同時に層間に臭素やヨウ素陰イオンと水分子を取り込ませることにより、Co^<2+>-Fe^<3+>, Co^<2+>-Co^<3+>, Co^<2+>-Ni^<2+>-Co^<3+>層状複水酸化物に誘導した。得たCo^<2+>-Al^<3+>, Co^<2+>-Fe^<3+>, Co^<2+>-Co^<3+>, Co^<2+>-Ni^<2+>-Co^<3+>水酸化物を過塩素酸や硝酸イオンに交換し、ホルミアミドの中に振動させ、カチオン性水酸化物ナノシートを合成できた。一方、Hummers法を用い、酸化グラファイトの作製を行った。酸化グラファイトを水中で単層剥離し、酸化グラフェンを得た。ヒドラジンや水素還元過程を最適化し、酸化グラフェンから質の良いグラフェンの合成に成功した。異種電荷を持ったグラフェンと遷移金属水酸化物ナノシートが合成できたことで、ナノシート同士の交互積層が可能になった。両者の静電的相互作用を利用し、直接混合してフロキュレーションさせ、交互に積層して超格子構造を形成していることが確認できた。今後、各種基板上に水酸化物ナノシートとグラフェンを交互に吸着させる(レイヤーバイレイヤー累積)ことによりヘテロ多層膜の構築を試みる。ブルーサイトから層状複水酸化物へのトポケミカル反応について、ホストシート内の遷移金属イオンの価電子交換による電荷ホッピングメカニズムを解明した。この反応機構に基づき、水酸化物ナノシート中の金属組成制御に関する指針を得た。また、アニオン性酸化物ナノシート(酸化チタン)とグラフェンを組み合わせた多層膜の形成を試み、ナノシート同士の複合化技術開発に関する重要な知見が得られた。異種電荷を持った(還元)酸化グラフェンと遷移金属(Co-Al, Co-Ni)複水酸化物ナノシートを直接混合してフロキュレーションさせ、両者の静電的相互作用によりナノシート同士の交互積層することを可能にした。絶縁性の複水酸化物ナノシートと導電性のグラフェンとの直接隣接する積層超格子構造の層間距離は、酸化グラフェンの還元程度に依存し0.8nm以上1.3nm未満の範囲であることを明らかにした。このような構造を有する超格子構造体は、優れた電気化学特性を有し得ることが確認できた。超格子構造体を擬似容量キャパシタ電極材料として用いた場合、遷移金属複水酸化物ナノシートの酸化・還元反応により、最大700F/gまで比容量を増大することが可能であることを明らかにした。この比容量は、グラフェン電気二重層スーパーキャパシタの6倍であり、グラフェンよりも優れた電極材料となり得ることを示唆する。また、絶縁性の複水酸化物ナノシートと還元された導電性のグラフェンとが交互に分子レベルで配列しているので、電荷輸送効率が向上し得る。

その結果、超格子構造体を用いた場合、還元された酸化グラフェンに匹敵する高速充電・放電の高出力性能を示した。具体的には、約100Hzまで理想的なキャパシタ特性を維持できる。このレート特性は、超格子構造体が擬似容量キャパシタやスーパーキャパシタの電極材料として好適であることを言える。また、良質な水酸化物ナノシートを得るために、その前駆体である水酸化物ナノコーンの合成過程を最適化し、高純度のナノコーンをオイルバスで安価に合成できるプロセスを開発した。ナノコーンをホルムアミド・水の混合溶媒中において、加熱により剥離させる新しい手法を考案し、その剥離メカニズムを明らかにした。これまでのCo2+-Al3+系、Ni2+-(Co2+)-Co3+系水酸化物ナノシートに加え、本年度はNi2+-Fe3+系のレドックス活性な水酸化物の合成及びナノシート化に成功した。層状水酸化物中の遷移金属組成(Ni2/3-Fe1/3, Ni3/4-Fe1/4, Ni4/5-Fe1/5)を系統的にチューニングすることによって、ナノシートの電荷密度の調整を可能にした。各種Ni2+-Fe3+系水酸化物ナノシートを用い、酸化グラフェン(GO)や還元グラフェン(rGO)との交互積層することにより超格子構造を有する複合材料を作製した。この超格子複合材料を電極触媒として水の電気分解による酸素発生反応を考察した。酸化グラフェンは触媒活性を殆ど示さなかったのに対し、レドックス活性な水酸化物ナノシートとGO或はrGOとの複合材料は酸素発生を高効率的に促進することが分かった。水酸化物の遷移金属組成や層間間隔等が電極触媒に及ぼす影響を明らかにした上、組成及び構造を最適化した複合材料(Ni2/3-Fe1/3・rGO)は過電圧が約0.21 V、Tafel勾配が約40 mV/decadeに達する優れた性能を確認した。この高い触媒効果により単三電池(1.5V)一本だけで水の電気分解が可能であることを初めて実証した。レドックス活性な水酸化物ナノシートと高導電性グラフェンとの分子レベルでのヘテロ複合は協同作用を産み出し、優れた電気化学性能につながったと考えられる。本研究によって、レドックス活性な水酸化物とグラフェンとの超格子複合材料は貴金属代替酸素発生電極触媒としての新たな応用可能性が期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。材料化学26年度が最終年度であるため、記入しない。グラフェンと遷移金属水酸化物ナノシートの合成プロセスを確立した。両者の静電的相互作用を利用したフロキュレーション過程の中、グラフェンと水酸化物ナノシートが交互に積層して超格子構造を形成していることを実証した。今後の電気化学特性考察に用いられる活性物質電極の作製が可能になり、次年度研究に進めるための土台ができたと言える。グラフェンと遷移金属水酸化物ナノシートとの静電的相互作用を利用したフロキュレーションプロセスを活用し、ナノシート同士が交互に積層した超格子構造が形成できることを実証した。超格子構造体を擬似容量キャパシタ電極材料として用い、優れた電気化学特性を有し得ることが確認できた。研究目的である大容量電気化学エネルギー貯蔵デバイスの作製に向けて順調に進んでいると言える。グラフェンと遷移金属水酸化物ナノシートの積層体形態、層間環境を様々にチューニングすることによって、電気化学反応に適した高効率のイオン拡散や電子輸送が両立できる超格子構造を設計する。
第一原理手法による界面電場・スピン軌道結合系数の見積とスピン変換物質デザイン

今年度は貴金属fcc(111)表面, fcc金属(111)ビスマス表面合金,ビスマス酸化物(Bi2O3)バルク, Bi2O3/貴金属fcc(111)界面のスピン軌道結合係数を定量的に求め、これまで報告されている実験結果との比較、実験グループで実施中の測定結果と比較をおこなった。また、運動量空間のスピン構造を計算し、詳細にスピン軌道結合係数を明らかにした。fcc金属(111)Bi表面合金については、Rashba効果が発現する最小モデルであるBiM2(M=Cu, Ag, Au, Ni, Co, Fe)超薄膜についてfcc遷移金属, fcc貴金属について、系統的に調べた。これらの結果から、大きなスピン流ー電流変換が報告されているBi/Ag系のみが特殊であり、Rashba係数の貴金属の層数依存性を調べた結果、Bi/Agのみ層数にほとんど依存せず、ラシュバ状態が強く局在していることが明らかになった。この成果は、第18回結晶成長国際会議(ICCGE-18)にて発表をおこない、論文としてまとめられた(N. Yamaguchi, H. Kotaka, and F. Ishii, J. Cryst. Growth, in press, arXiv:1609.09782)。スピン変換現象の一つである異常ネルンスト効果について、前年に引き続き、Skyrmion結晶系について詳しく調べた。特に、スキルミオン結晶のサイズが大きくなればなるほど、異常ホール効果、異常ネルンスト効果が大きくなることが明らかになり、スキルミオン結晶が高効率な熱電変換材料の候補となりうる可能性を示した。この成果は論文としてまとめられた(Y. P. Mizuta and F. Ishii, Scientific Reports, 6, 28076(2016))。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は閃亜鉛型構造のIII-V族の半導体のバルクならびに人工超格子のスピン軌道結合係数について, (001)面, (110)面の異なる結晶方位にについてスピン軌道結合係数を定量的に求め,これまで報告されているIII-V族化合物半導体系の実験値とよい一致を示すことを明らかにした。また運動量空間のスピン構造を計算し、より詳細にスピン軌道結合係数の結晶方位依存性・内部電場依存性を明らかにした。以前から継続して研究をおこなってきたウルツ鉱型構造の半導体であるZnOの(10-10)表面の薄膜系においては,水素終端の効果(表面電場)を明らかにした。ウルツ鉱型の(10-10)面と閃亜鉛型の(110)方向は共に運動量空間においてスピンの緩和時間が長くなる"persistent spin helix"型のスピン構造を示すことを明らかにした。以上に加えて、実空間の非自明なスピン構造であるMeron, Skyrmion等のナノスピン構造を示す系において、巨大な異常ネルンスト効果を示す可能性があることを明らかにした。同様にスピンがノンコリニア秩序をもつパイロクロア型Ir酸化物,スピネル型Ir酸化物について調べ,電子相関の強さによる金属絶縁体転移ならびに、磁気相図を明らかにした。Skyrmion系の巨大ネルンスト効果の可能性を理論的に明らかにした。モデル計算ではあるが、第一原理計算による現実系でも同様の結果が得られており、スピンを活かした巨大な熱電変換現象の萌芽的研究となりつつある。スピン軌道結合係数については、磁性体と半導体との接合系について、格子不整合等を考慮に入れた大規模計算をおこなう。Skyrmion系の異常ネルンスト係数については,より現実的な物質について第一原理計算をおこない、実験グループとも議論をおこないながら研究を進めていく。

Ir酸化物系については前年度と同様に, A05公募班の小野田繁樹氏(理化学研究所)と共同で研究を進めていく。最終年度のため、研究成果について迅速に論文として成果発表をおこなう。28年度が最終年度であるため、記入しない。
年金運用に関しての理論的・実証的研究

年金資金などの長期に渡る資金運用を考える上で非常に重要である利子率の期間構成変動に関しての新しいモデルを開発した。具体的には、経済全体の初期保有量の成長率がOrnstein-Uhlenbeck過程に従うという仮定の下で、効用関数に関してについては非常に弱い制約しか置かない均衡モデルによって利子率の期間構成を分析し、瞬時的フォワード・レートがforward martingale measureと相対的危険回避度を用いて簡単な形に表現できることを示した。さらに、満期を無限に近づけたときのフォワード・レートの極限としての長期利子率が、成長率、主観的割引率および相対的危険回避度の下限によって決定される定数となることが示された、さらに、その特殊ケースとして、DRRA効用長関数を持った代表的投資家の経済を分析し、フォワード・レートが非負となる条件を求め、さらにイールドカーブがU字型をとる可能性があること、またボラテリティがHeath-Jarrow-Mortnの対数正規モデルとVasicekモデルの凸結合の形となることを示した。また、年金運用をはじめとして金融機関の資金運用にとって重要であるリスク管理と資本計画の問題を統合的に分析し、リスク管理の問題を明示的に考慮した最適な資本計画を分析し、資本計画とリスク管理が,外部資金調達の資本コストといかに関連しているかを検討し、一般的で整合的であるにもかかわらず比較的単純な資本計画とリスク管理に関する評価基準を導いた。本年度は年金基金の運用に関しての理論的な分析を行い、次のような研究成果が得られた。現実の運用においては、市場における投資環境は一定ではなく、事後的な収益率はもちろんであるが、株式などの証券の期待収益率自体が変動していると考えられる。よって、投資環境が変動してゆく場合の最適なポートフォリオ戦略について分析い、特に株式などの証券の期待収益率が変動する場合について詳細な分析を行った。運用期間が長い場合には,短期的な視点からの運用を繰り返すような戦略をとることによって大きなロスが生じる可能性を指摘した。さらに、現実の資産運用においては、証券取引についての取引費用が無視できない場合が多い。そこで、取引費用が存在する場合について,連続時間モデルでの分析を行った。多期間モデルや連続時間モデルで取引費用を明示的に考慮すると,最適ポートフォリオを求めるのは非常に困難になるが,この論文では最適ポートフォリオを求めるためのひとつの手法を提示し,その分析を行った。さらに、現実の資産運用においては、債券のデフォルト・リスクの問題を無視することができない。それゆえ、デフォールト・リスクの問題を分析する第一歩として、デフォルト・リスクが存在する場合の利子率の期間構成の種々の既存のモデルを、デフォルト発生に対するアプローチの仕方から、オプション価格理論の応用として信用リスクを評価するコンティンジェントクレイムアプローチとデフォルト発生の確率課程を外生的に与えてしまうリデュースドフォームの二つに分類して整理した。(1)アメリカにおいては株価指数連動型年金、個人変額年金など、保証水準が存在する一方で、株価上昇のメリットが享受できるような年金商品の販売が増加しており、これらは今後日本でも一般化されることが予想されている。このような年金商品の商品設計、その裏にある資金運用を、満期におけるペイオフが原資産のリターンの幾何平均となるアベレージ・レート・オプションの価格付けを用いて分析した。アベレージ・レート・オプションの価格の解析解を導出し、それを用いて年金商品設計における株価追随率と予定利率の関係および年金受託者の運用戦略を導出し、商品設計やヘッジ戦略を導出した。さらに数値計算によってその商品設計や運用戦略の実務的な有効性を確認した。(2)公的年金・私的年金を問わず大きな問題となっている予定利率の水準の設定について、生命保険会社における団体年金をモデル化し、シミュレーション分析によって分析した。年金加入者の効用を最大するように設定し、団体年金勘定の数値モデルを展開し,保険会社の行うべき最適な投資戦略と配当戦略を理論的に導出した上で、金融環境や年金勘定の自己資本比率をパラメーターとし、年金加入者にとって妥当と思われる予定利率水準を検討した。予定利率を適切な水準以上に高めると自己資本を低下させる結果を招き、年金運営の健全性を低め、顧客である年金加入者に対するコスト負担が増大するために効用が低下してしまうという結果が得られた。

すなわち、予定利率が高いほど年金加入者にとって有利であるという一般的な通念に反して、年金加入者の観点から評価しても予定利率を過度に引き上げることは好ましくないことが示された。年金資金などの長期に渡る資金運用を考える上で非常に重要である利子率の期間構成変動に関しての新しいモデルを開発した。具体的には、経済全体の初期保有量の成長率がOrnstein-Uhlenbeck過程に従うという仮定の下で、効用関数に関してについては非常に弱い制約しか置かない均衡モデルによって利子率の期間構成を分析し、瞬時的フォワード・レートがforward martingale measureと相対的危険回避度を用いて簡単な形に表現できることを示した。さらに、満期を無限に近づけたときのフォワード・レートの極限としての長期利子率が、成長率、主観的割引率および相対的危険回避度の下限によって決定される定数となることが示された、さらに、その特殊ケースとして、DRRA効用長関数を持った代表的投資家の経済を分析し、フォワード・レートが非負となる条件を求め、さらにイールドカーブがU字型をとる可能性があること、またボラテリティがHeath-Jarrow-Mortnの対数正規モデルとVasicekモデルの凸結合の形となることを示した。また、年金運用をはじめとして金融機関の資金運用にとって重要であるリスク管理と資本計画の問題を統合的に分析し、リスク管理の問題を明示的に考慮した最適な資本計画を分析し、資本計画とリスク管理が,外部資金調達の資本コストといかに関連しているかを検討し、一般的で整合的であるにもかかわらず比較的単純な資本計画とリスク管理に関する評価基準を導いた。
口腔粘膜上皮-小唾液腺ユニットを標的とした口腔乾燥治療の創薬応用

口腔乾燥症は虫歯や歯周病などの口腔疾患、誤嚥による肺炎等の感染症リスクの一因であり、医療機関のみならず在宅、施設においての口腔乾燥症に対するケアの重要性が浸透しつつある。一方で口腔乾燥症治療薬として認可されたムスカリン受容体作動薬は神経-唾液腺をターゲットとし、唾液の主要供給源である大唾液腺の機能亢進を狙ったものであるが、シェーグレン症候群等のごく限られた口腔乾燥症の適応しかない上に、唾液腺以外の臓器への副作用の可能性もある。さらに、現在はムスカリン受容体作動薬の適応とならない患者には漢方薬が用いられるが、体質の見極めや量や期間等、効果的な処方をする上で経験値が必要である。また、口腔保湿剤など他の治療法は対症療法であり、効果が弱い。したがって、副作用が少なく広い適応を持ち、なおかつ効果的なうがい薬・口腔ケア製品等の局所投与できる薬剤の開発が必要である。口腔乾燥症のモデルとして唾液腺障害動物が用いられてきたが、ドライアイ・ドライスキンのin vitroモデルが報告されている中、口腔乾燥のin vitroモデルが開発されていないことは、上皮の局所病態の理解不足となるだけでなく、ケミカルライブラリー等による薬剤スクリーニングの応用の機会を失うことになり、口腔乾燥症治療法開発の大きな障害となっている。そこで申請者は口腔粘膜上皮の付属器として存在する小唾液腺に着目し、口腔粘膜上皮-小唾液腺複合体によるin vitro口腔乾燥モデルを開発することを本研究の目的とした。所属組織の異動によってヒト小唾液腺細胞が入手困難となったため、方針を変更せざるを得なくなりマウス小唾液腺組織の培養とマウス小唾液腺組織を3次元培養組織に移植することでモデル作成を試みた。マウス小唾液腺は3次元培養上皮に生着し、1日後には導管上皮との接合とピロカルピン刺激による唾液の分泌も認められたが、2日目以降まで維持することはできなかった。機能的解析を行うことができるin vitroモデルの作成についてさらに検討していく。実験が遅れているため繰越金が生じた。次年度消耗品購入等に使用する予定である。
付け爪を応用した無拘束実時間心拍モニタリングデバイスの開発と在宅医療への展開

在宅医療における遠隔モニタリング用ウェアラブルデバイスとして、付け爪型脈波計の開発を行った。付け爪型脈波計の利点は以下に示す三点である。爪には汗腺、感覚神経がないことから、計測装置の装着に伴う不快な装着感がない。付け爪の要領で爪に固定することにより数週間にわたる強固な固定を確保できる。人体には20枚の爪があることから、複数のデバイスを異なる爪に取り付けることで、多点同時計測が可能である。本研究では小型脈波計測回路を開発、生活環境下における24時間脈波計測を実施した。取得した脈波から心拍数を算出した結果、心拍数の日内変動を確認することができた。付け爪型脈波計を開発し在宅医療における遠隔モニタリングへの応用を図る事が本研究の目標である.デバイス取り付け部位を爪とすることで,長期間強固な固定が可能である.また爪には感覚神経,汗腺が無いため装着時の違和感を抑えることができる.複数の爪に取り付けることで多波長・多点同時計測も可能である.平成27年度は,小型反射式光電脈波計測回路の試作を行った.計測回路はLED(530nm)から照射された光の反射光をフォトダイオードにて検出し,フィルタおよび増幅回路を経て出力するものとした.20歳男性を被験者とし,椅子に座り安静状態において左手中指より計測し,脈波を取得することが出来た.試作回路の大きさは11mm×12mm,消費電力は30mWとなった.容量数mAhの市販ボタン電池を使用することを想定した場合,一週間程度の連続使用を実現するためには1/100から1/1000程度の省電力化を図る必要がある.大きさに関しては,無線回路,計測回路,電源を含め100mm2程度とする必要があることから,現在の計測回路の1/3程度までの小型化が必要である.一方,得られた脈波の波形に関しては十分な精度が得られたと考えられる.当初の予定では平成27年度は固定方法の検討,測定原理の確立,LED、フォトダイオード、マイクロコントローラ、メモリ、電池により構成され測定値を内部メモリに蓄える一次プロトタイプの開発を行うとしていた.また,平成28年度は生体内通信を利用した,異なる爪に装着した複数のデバイス間の通信,平成29年度はデバイスからLANに接続された無線端末への外部通信を予定していた.現状では,小型反射式光電脈波計測回路の試作,評価を行い測定原理の確立を達成したところである.計測回路はLED(530nm)から照射された光の反射光をフォトダイオードにて検出し,フィルタおよび増幅回路を経て出力ものであり,更なる小型化と省電力化により実用化が可能と考えている.一方,現時点において固定方法の検討,一次プロトタイプの開発については終えられておらず,計画はやや遅れている状況である.今後の対応として,計画を変更予定である.具体的には予定されていた一次プロトタイプ(無線通信機能を含まず,内部メモリに蓄積する方式)の開発の前に無線通信回路の開発を実施する.これにより平成27年度内に脈波測定機能,無線機能,電源の主要構成要素を備えた付け爪型脈波計の開発に目処を立てる.平成29年度に実証実験が可能なレベルまでプロトタイプの改良を進め,性能を評価する.また,この際に合わせて爪への固定方法の検討を行う.生体内通信を用いたデバイス間通信については,爪のインピーダンスが高く,電源の制約から実現が難しいと考えられている.そのため,個々のデバイスに無線通信機能を持たせ,LANに接続された無線端末を経由してPC端末にて脈派情報集約,解析する方式とすることで,多点同時計測を実現する.終末期の療養場所について60%以上の国民が自宅を希望している。また65歳以上の高齢者数は2060年には約40%と予想されている。この様な将来を見据えると、在宅療養患者の急変にいち早く気づくことのできる遠隔モニタリングシステムの重要性は言うまでも無い。本研究では在宅医療における遠隔モニタリング用ウェアラブルデバイスとして、付け爪型脈波計を開発している。付け爪型脈波計の利点は次の三点である。すでに商品化されているウェアラブルデバイスとしてワイヤレス心電計が挙げられる。ケーブルフリーで心電図を取得できるが皮膚への電極貼り付けが必須であり長期間使用した場合、装着による違和感が避けられない。また入浴時はセンサーの着脱が必要であり装着失敗や脱落のリスクがつきまとう。その他にも指輪、腕時計、鬘、コンタクトレンズなどを応用した様々なウェアラブルデバイスが開発されているが、付け爪型とした場合のように、長期間、安全に不快な装着感を感じることなく計測を行うことは困難である。本デバイスが実現されれば不快な装着感の無い遠隔モニタリングデバイスが実現でき、在宅医療の向上に寄与することができる。1.小型光電脈波計測回路の開発:爪に装着可能な大きさの反射型光電脈波計を開発した。計測回路はLEDから照射された光の反射光をフォトダイオードにて検出,フィルタおよび増幅回路を経て出力する。計測回路の大きさは11×11mmである。実験より十分な精度で脈波を計測することができた。消費電力は30mWであり、99.6%がLEDの消費電力であった。

2.脈波計測回路の消費電力削減:開発した脈波計測回路の消費電力は30mWであり、小型のボタン電池を用いた場合、連続使用時間は数分程度となる。今後、開発する無線通信システムにも電力が必要となることから、現時点で脈波計測回路の省電力化が必須であった。そこで、LEDをPWM駆動し点滅させ、消費電力を低減することとした。Duty比を0.01とした場合でも脈波を観測することができた。これにより消費電力を1/100の300μWまで削減することができた。3.生活環境下での24時間脈波計測:爪に光電脈波計測回路を装着した場合、指の曲げ伸ばしや物体との接触、体の動きに伴う血流変化が外乱となり、脈波計測が妨げられることが課題である。そこで、爪に開発した小型脈波計測回路を爪に固定し、24時間の連続脈波計測を行い、外乱の影響を検討した。実験中は入浴、睡眠、食事を含む普段通りの生活を送ることとした。実験結果より活動時間帯は、外乱の影響が強かったが、心拍数の日内変動を確認することができた。外乱除去手法の開発も今後の課題と言える。4.無線通信システムの開発:Bluetoothモジュールの選定および開発環境構築を行った。研究を進める中で脈波計測回路の消費電力が大きいこと、外乱の影響が強いことが明らかとなり、上記2,3についての実験が必要となった。これにより上記4に示す無線通信システムの開発についてはICの選定および開発環境の構築までに留まった。在宅医療を受ける患者の遠隔モニタリング用ウェアラブルデバイスとして、付け爪型脈波計の開発を行った。付け爪型脈波計の利点として次の三点が挙げられる。爪には汗腺、感覚神経がないことから、計測装置の装着に伴う不快な装着感がない。また付け爪の要領で爪に固定することにより数週間にわたる強固な固定を確保できる。さらに人体には20枚の爪があることから、複数のデバイスを異なる爪に取り付けることで、多点同時計測が可能である。その一方、指の曲げ伸ばしや物体との接触に伴う外乱により、脈波計測が妨げられることが課題として考えられる。本研究期間では、付け爪型脈波計を生活環境下で使用した場合の外乱の影響を検討した。実験のために試作した脈波計測回路は反射型光電脈波計とし、光源のLEDの波長は530nmとした。計測回路はLEDから照射された光の反射光をフォトダイオードにて検出,フィルタおよび増幅回路を経て出力する。計測回路の大きさは11mm×11mmである。計測回路は紫外線硬化樹脂にて包埋することで防水仕様とした。計測回路の固定には接着剤を用い、左手親指の爪に固定した。電源およびデータロガーは左腕に固定し電源ケーブル、信号ケーブルにより計測回路と接続した。被験者は33歳男性とし24時間、サンプリング周波数1kHzにて脈波を記録した。計測したデータについてはLabChartの心拍数算出機能を用いて、心拍数に変換した。実験結果より日中の活動時間帯については、休息をとっている間は心拍数を得ることができたものの、その他では外乱の影響が大きく、心拍数の算出ができない時間が多かった。睡眠中について安定して脈波を計測することができた。
シェーグレン症候群におけるB細胞活性化機構の解析

今回の検討では、シェーグレン症候群(SjS)のB細胞活性化機構に果してEpstein-Barrウイルス(EBV)が関与しているか否かについて主に検討を行った。その結果、まず血清中の抗viral capsidantigen(VCA)抗体価はIgG、IgMクラス共、正常対照群に比して高値を認めた(P<0.01)。現に口腔内へのEBVの排泄をみる目的で、口腔内うがい液を臍帯血リンパ球に接種し、その細胞株化能を検討した。その結果、正常対照群の口腔内EbV排泄率は約40%であったのに対して、SjS患者群では87%と有意の高値を認めた。またSjS患者群はT細胞を介したEBV特異的制御機構にも欠陥のあることがinvitroの実験系において確認された。現に末梢血から無刺激下でB細胞株が樹立される頻度について検討を行ったところ、正常対照からは全く細胞株が樹立できなかったのに対して、SjSでは高率に自律性に増殖するB細胞株が樹立することができた。これらのB細胞株はいずれもEBV核内抗原であるEBNAを発現し、B細胞分化抗原であるCD20を細胞表面に保有していた。さらにこれらSjS由来のB細胞株は高率に、かつ大量にEBV産生を行っていたが、対照として用いた慢性関節リウマチ、ベーチェット病患者由来のB細胞株からは全くEBV産生は認められなかった。現在、これらB細胞株からのサイトカイン産生、自己抗体産生について検討を行うと共に、B細胞クローニングを限界稀釈法を用いて試み、10種類程のB細胞クローンを得たところである。
新規抗ウイルス剤開発を目指したＨＰＶ過形成誘導機構の解明

HPV感染は、子宮頸癌や頭頸部癌の重要危険因子である。これらの癌の予防・治療にはHPVに対する抗ウイルス剤の開発が期待されている。そこでHPVの複製機構、および腫瘍形成機構を解明することで、有望な抗ウイルス剤の標的分子を同定することを目的とした。その結果ウイルスのE6遺伝子産物がウイルス複製効率に重要であることが分かった。またE7遺伝子産物は腫瘍誘導に関与するのみ出なく、子孫ウイルス粒子の産生にも寄与していることが示された。これら、E6やE7の作用機序を更に解明することで、有望な抗ウイルス剤の分子標的が同定可能であると考えられる。本年度は、HPVの複製モデルを利用して各種サイトカインや、新規合成化合物の抗ウイルス効果を確認した。HPVの複製モデルとしては、ヒト角化細胞(keratinocyte)を用い、それにHPVゲノム型DNAをエピゾーム状に安定導入する系を利用した。この細胞を、未分化状態の単層培養、カルシウム分化誘導、メチルセルロース懸濁培養法、さらに「皮膚モデル培養系」に適用し、各分化段階でのHPVゲノムの複製効率を定量した。更に「皮膚モデル培養系」では、表皮過形成誘導についても検討を加えた。その結果、1型インターフェロンによってHPV複製の抑制、及び抗腫瘍効果が確認された。また、キナーゼ阻害剤のひとつ(compound #2)において、同様の効果が確認された。しかし、この化合物に関しては、単独で若干ではあるが、角化細胞分化抑制効果が認められたので、HPV特異的な作用かどうかに関しては検討が必要である。HPVの制御遺伝子の機能に関して、E7が分化依存的なウイルスゲノムの複製にかかわることが示された。この結果は、E7が腫瘍形成に対する分子標的になり得ることを示している。本研究では、HPVの複製および過形成誘導機構の解明を通して、抗ウイルス剤の分子標的を探ることを目的とした。HPV感染は子宮頸癌や頭頸部癌発症の重要なリスクファクターであり、感染予防・治療法の開発が望まれている。しかし、HPVの感染・複製は感染標的である上皮細胞の組織形成プログラムに強く依存しており、通常の組織培養法では解析が困難であった。ここでは初代培養ヒト角化細胞を利用し、細胞分化誘導が可能な系においてHPV複製を観察し、更に「皮膚モデル培養系」を応用することで、HPV複製環及び過形成誘導を再現できる実験系を構築した。HPVの各制御遺伝子に点変異を入れ、その機能を解析する"reverse genetics"により、E6遺伝子産物がHPVゲノムの複製効率に非常に重要であることが示された。過形成誘導にはE7の機能が関与することはすでに報告しているが、E7はHPVの後期複製や粒子酸性にも重要であることが分かった。またE4遺伝子産物はアグリソーム様凝集塊を形成することで、HPV複製環の前期-後期切り替えに関与している可能性を示した。これらの知見から、E6及びE7が抗ウイルス・抗腫瘍形成の標的として有望であることが示された。今後はその分子標的を更に絞り込むことで、抗ウイルス剤として機能する化合物のデザインをすすめたい。本年度は、子宮頸癌との関連性の高いHPV16型DNAを用いてウイルス複製系の構築をおこない、その実験系を用いてHPV制御遺伝子の役割をリバースジェネティクス法によって解析した。その結果、E4とE5に細胞分化に応じたウイルス複製制御機能があることを見出した。E4は分化に依存したウイルスゲノムの増幅に関与しており、産生的ウイルス複製に寄与していることが示唆された。E5は未分化の基底細胞でのウイルス複製を抑制し、HPVの持続感染の制御にかかわっている可能性が示された。E6に関しては、これまでに細胞内でのウイルスゲノム維持に必須であると報告されていた。しかし今回用いた実験系によって、ゲノム複製効率には関与するが、必須ではないことが明らかとなった。しかしながらE6欠損HPVの複製効率は非常に低く、このE6によるゲノム複製調節機構は有望な抗ウイルス剤の標的になり得ると考えられた。E6に関してはp53の他にも、多くの宿主因子との相互作用が報告されている。今後は、HPVゲノム複製効率にE6のどのような機能が関わっているかを明らかにしたい。E7も同様にゲノムの維持に必須であると報告されていたが、今回の実験ではゲノムの維持にも、分化依存的なゲノムコピー数の増幅にもほとんど関与していないという結果が得られた。同様の結果はHPV18を用いた解析によっても得られたことから、用いる実験系の差異によってE7の機能発現が異なる可能性が考えられた。E6,E7は感染部位に過形成を誘導する責任因子であると考えられている。E7による過形成誘導はすでに報告しており、E6に関しても弱い異形性を誘導する活性を見出した。これらの形成異常とウイルス複製との関連性に関して、解析をすすめている。

これらの知見は抗ウイルス剤の標的を同定する上で、重要な基盤となるものである。抗ウイルス剤の評価系が着実に構築されている。HPVは人を感染標的として特異的に持つため、その病原性や複製を、他の動物モデルでは検証し得ない部分がある。その点で「皮膚モデル培養系」が効果的にウイルス複製モデルとして利用できる点は、この研究の進展に多いに寄与している。HPVの複製は感染標的である重層上皮細胞の分化に強く依存しており、従来の実験系では再現することが困難であった。そのため複製機構の解析はあまり進展していなかった。この研究では重層上皮形成を再現する『皮膚モデル培養系』を利用して、HPVの複製を高度に再現する系を利用した。また、新規のHPVレプリコンを開発し、それを『皮膚モデル培養系』に応用することで、効率と再現性の高い解析系を構築することが出来た。HPVの生活環(life cycle)におけるHPV制御遺伝子の役割は不明な点が多い。今回の結果から、それらの機能についていくつかの新知見を得ることが出来た。過形成誘導に関してはE7のみでなく、E6にも上皮形成異常を誘導する活性を見出した。次年度は更に解析をすすめ、過形成阻害がHPV複製抑制に寄与するかどうかを確認したい。以上、HPV感染による過形成誘導、および細胞分化に応じたウイルス複製制御機能に関していくつかの新知見が得られ、これらは抗ウイルス剤の標的因子の同定の基盤となるものである。今後は、更に検証する化合物、サイトカインなどの対象を増やして、より効果的な抗HPV化合物の同定をすすめる。またその作用機序についても解析を加えることで、抗HPV剤のデザインを可能にする。HPV遺伝子機能に関しても、更に詳細な解析を行い、新規の分子標的を提案する。今後は、HPV感染による過形成誘導機構を詳細に解明し、その阻害がウイルス複製に影響するかどうかを検討する。またHPV生活環の解明をすすめることで、新規抗ウイルス剤の分子標的を探る。HPV制御遺伝子によるウイルス複製制御機能に関しては、『皮膚モデル培養系』をより有効に活用することで、新知見を得られる可能性が高いと考えられるので、重点的に解析をすすめる。次年度は、主に細胞培養や各種検出実験における消耗品購入に充てる予定である。また成果発表のための出版費や、学会等での発表への旅費にも充てる。研究の効率化のため、実験補助員の人件費としても使用予定である。研究費の多くは、初代培養細胞の購入・維持に必要な消耗品費に充てる。また『皮膚モデル培養系』の構築に必要な試薬類、およびその組織免疫学的解析に必要な抗体類の購入も計画している。その他、研究成果の公表を目的とした学会参加のための出張旅費や、論文発表にかかる経費にも充てる。
蛋白質のアミノ末端側からの高次構造形成の解析

1.新しい直接発現ベクタ-、ATGーTAG vector、を開発し、ニワトリリゾチ-ムのモジュ-ル結合体1+2+3+4+5(M1-5と略記)、M1ー4、M1ー3、M2ー5、M2ー4の大腸菌での発現を行った。M1ー2ならびにM1の融合蛋白質としての発現はできなかった.2.発現非誘導時の抑制は、minimal media中では完全であったが、rich media中では不完全であった。IPTG濃度や培養温度変化によっても可溶化状態への発現はできなかった。発現物の一次構造は期待通りであった。3.これらのモジュ-ル結合体はジスルフィド結合開裂下、天然リゾチ-ムに比べ、αーヘリックス含量が減少し、βーシ-ト含量が増加しているCDスペクトルを示した。この「残存」構造は、GuHCl変性において非協同的な転移を示した。グリセロ-ル、ソルビト-ル、メタノ-ル、トリフルオロエタノ-ル等は二次構造量を増加させた。4.変性・還元状態で精製したモジュ-ル結合体の再生(再酸化)物は、逆相HPLC溶出パタ-ンより、M1ー5とM2ー4を除いては、10種以上の分子種の混合物であった。ポリオ-ルやアルコ-ルを加えて再生した場合、M2ー5は立体構造の増加を示したが、協同的な三次構造形成は見られなかった。一方、ポリペプチド鎖全長を含むが特定のジスルフィド結合を一本欠いたリゾチ-ム改変体は、グリセロ-ル存在下で効率よく再生さ、天然リゾチ-ムと同程度の溶菌活性ならびに2次構造量を示した。5.M2ー5のアミノ末端を残基21まで伸長させ、ジスルフィド結合が3本架かり得るような改変体を作製し、グリセロ-ル存在下での再生を行ったが、正しいfoldingは見られなかった。従って、酵素活性を持つような立体構造の形成のためにはポリペプチド鎖のアミノ末端部分の残基1ー20が必要であり、一方、上述のM1ー4等の結果から、カルボキシル末端の残業108ー129も必要である事が示された。この研究の目的はニワトリ・リゾチ-ムのカルボキシル末端側、種々の位置までのポリペプチド鎖を遺伝子工学的手法を用いて作製し、それらの高次構造を調べる事である。1990年度の研究結果からは、以下に述べるように、全体の立体構造形成におけるカルボキシル末端領域の重要性が示唆された。先ず大腸菌での発現に関しては、リプレッサ-遺伝子のコピ-数を増大させても、rich meduiumを培地に用いて場合、非誘導時の発現の抑制は完全ではない事、一方、Mg+カザミノ酸を用いると抑制が完全にかかる事がわかった。発現させたポリペプチドの一次構造については、アミノ末端およびカルボキシル末端部のアミノ酸配列は予想通りのものであった。

これらのポリペプチドがジスルフィド結合欠損下でどの程度の高次構造をとるかを見る為に、変性・還元、システイン残基をcarboxamidomethyl化した物の円偏光二色性測定を行った所、nativeな全長分子の3ー4割程度の高次構造が見られ、残基当たりの構造量はmodule5を含む融合体において比較的多い事がわかった。次いでジスルフィルド結合の再生操作を行った所、逆相クロマトグラフィで見る限り、module1+2+3+4+5と2+3+4を除いては10種以上の分子種の混合物であり、再生に伴う高次構造の増加は、module1+2+3+4+5を除いては、module2+3+4+5において最も大きい事がわかった。以上、これまでの実験結果は、アミノ末端から順次独立に高次構造形成が起こると言うよりは、カルボキシル末端に近いある領域に至って初めて、協同的に構造形成が起こることを示唆する。しかし、再生混合物の酵素活性測定によれば、module1+2+3+4も、module2+3+4+5と同程度の活性を示すので、今後、再生混合物からジスルフィド結合パタ-ンが単一の分子種を分種を分離・分取し、それらの高次構造を調べる予定である。昨年度より行っている大腸菌でのニワトリリゾチ-ム断片ポリペプチドの発現において、種々のIPTG濃度や培養温度を試したが、可溶化状態への発現はみられなかった。これらのポリペプチドはジスルフィド結合開裂下、天然リゾチ-ムに比べ、αーヘリックス含量が減少し、βーシ-ト含量が増加しているCDスペクトルを示した。GuHCI変性曲線より、この「残存」構造は多くの相互作用により協同的に形成されるような三次構造ではない事が示された。ポリオ-ルやアルコ-ルの添加は二次構造量を増加させた。変性・還元状態で精製したポリペプチドの再生(再酸化)反応において、ポリオ-ルやアルコ-ルを共存させると、モジュ-ル結合体M2ー5は立体構造の増加を示したが、協同的な三次構造形成や有意な酵素活性は見られなかった。一方、ポリペプチド鎖全長を含むが特定のジスルフィド結合を一本欠いたリゾチ-ム改変体は、グリセロ-ル存在下で効率よく再生され、天然リゾチ-ムと同程度の溶菌活性ならびに2次構造量を示した。グリセロ-ルの効果はαーラクトアルブミンの再生においても見られた。M2ー5のアミノ末端を残基21まで伸長させ、ジスルフィド結合が3本架かり得るような改変体を作製し、グリセロ-ル存在下での再生を行ったが、「正しい」foldingは見られなかった。従って、酵素活性を持つような立体構造の形成のためにはポリペプチド鎖のアミノ末端部分の残基1ー20が必要であり、また、昨年度のM1ー4等の結度から、カルボキシル末端の残基108ー129も必要である事になる。両末端のモジュ-ルM1およびM5が安定な立体構造形成に必要な、いわば「構造モジュ-ル」であり、中の3つのモジュ-ル、M2,M3,M4が「機能モジュ-ル」なのかも知れない。今後は、構造モジュ-ルを保持し、機能モジュ-ルを欠失あるいは置換させた変異体を作製・解析すべきであろう。