hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
社会的隔離が引き起こす「孤独」の認知メカニズムの解明

前年度は、社会的隔離個体の再集団化飼育により、分界条床核や扁桃体の一部、視索前野などが活性化することを見出した。再集団化飼育下では、社会的接触行動がみられ、このとき、分界条床核や扁桃体の不安に関連する亜核は活性化しないことから、ここでみられる社会的接触行動は、不安に依存しない行動である。一方、動物社会では天敵から身を守るために身を寄せ合う行動がみられることが知られている。そこで、アルビノマウスが明るい光に対して不安を示すことから、暗期において明るい新奇ケージに複数個体のマウスを移したところ、社会的接触行動が誘導されることを見出した。そこで、このとき活性化する脳部位をマッピングしたところ、扁桃体や分界条床核の不安に関連する脳部位が活性化することが分かった。そこで、視索前野が社会的分離時にみられる抵抗反応、社会的接触行動に関わるのかを明らかにするために、ニューロンに対して興奮毒性を有するN-Methyl-D-aspartate (NMDA)により視索前野の部位特異的破壊実験を行った。その結果、抵抗反応と不安に依存しない社会的接触行動に異常が生じることが分かった。一方、不安により誘導される社会的接触行動には影響しないことが示唆された。前年度に神経ペプチドアミリンの受容体であるカルシトニン受容体発現細胞が視索前野に局在し、再集団化飼育で活性化することを見出した。本年度は、視索前野カルシトニン受容体発現細胞が明るい新奇ケージにマウスを移したときに活性化するかを検討した。その結果、カルシトニン受容体発現細胞に活性変化が見られなかった。以上から、不安に依存しない社会的接触行動の制御に視索前野カルシトニン受容体発現細胞が関わる可能性が示唆された。一方、不安により誘導される社会的接触行動には関与しない可能性が示唆された。当初の研究計画通り視索前野の神経細胞が孤独反応と社会的接触行動に関わることを見出したから。前年度までにマウスの子育て行動に関与することが示唆されるカルシトニン受容体発現ニューロンやドーパミンニューロンなどが再集団化飼育で活性化することを見出している。そこで今後の施策として再集団化飼育で活性化することを見出したこれらのニューロン群が「抵抗」反応および社会的接触行動に関与するのかをshort-hairpin RNA (shRNA)による発現抑制実験や薬理実験などで明らかにする。社会的孤立による「孤独」がどのように認知され、「抵抗」から「絶望」へと至る生理・行動変化(孤独反応)が引き起こされるのかの分子神経メカニズムはほとんど明らかではない。本年度は社会的隔離により引き起こされる孤独反応の行動学的解析手法を確立するため、同一ケージ内で中央に仕切りを挟むことにより、マウスをケージ内分離する手法を用いた。その結果、分離個体は仕切りの向こう側の個体を求めて、ケージの仕切りを噛む行動(「抵抗」反応)が増加することが分かった。次に、社会的隔離により活性が変化する脳部位を特定するため、転写活性化分子指標であるc-fosのマッピングを行った。その結果、社会的隔離により分界条床核や扁桃体の一部の亜核や視床下部腹内側核などが活性化することが分かった。特に内側扁桃体中心核(CeM)が活性化することが明らかになった。そこで、DREADDの一つであるhM3DqをCeMのCaMKIIa陽性ニューロンに導入し、CNO投与によりhM3Dqシグナルを誘導した。その結果、仕切りを噛む行動が増大したことから、CeMのCaMKIIa陽性ニューロンが「抵抗」反応に関わることが示唆された。一方、社会的分離2日後に中央の仕切りを取り外し、分離個体が元同居個体と自由に相互作用できるようにしたところ、分離個体は速やかに他個体と群居行動を示した。この時に活性が変化する脳部位を特定するためにc-fosのマッピングを行った。その結果、再集団化により、分界条床核や扁桃体の一部の亜核や視床下部腹内側核、内側視前野などが活性化することが分かった。抵抗反応に関わる可能性がある脳部位を特定し、活性化実験を行うことにより、実際に特定した脳部位が抵抗反応の制御に関わることを示すことができたから。

一方、不安により誘導される社会的接触行動には影響しないことが示唆された。前年度に神経ペプチドアミリンの受容体であるカルシトニン受容体発現細胞が視索前野に局在し、再集団化飼育で活性化することを見出した。本年度は、視索前野カルシトニン受容体発現細胞が明るい新奇ケージにマウスを移したときに活性化するかを検討した。その結果、カルシトニン受容体発現細胞に活性変化が見られなかった。以上から、不安に依存しない社会的接触行動の制御に視索前野カルシトニン受容体発現細胞が関わる可能性が示唆された。一方、不安により誘導される社会的接触行動には関与しない可能性が示唆された。当初の研究計画通り視索前野の神経細胞が孤独反応と社会的接触行動に関わることを見出したから。特定した候補部位が抵抗反応に関わるのかを明らかにするために、興奮毒性を用いた脳部位特異的破壊実験や薬理遺伝学的手法を用いた部位特異的活性化実験を行う。また、社会的隔離刺激に反応したニューロンの種類を同定するためにマーカー分子とc-fosに対する二重染色を行う。さらに、「孤独」で反応する脳部位間の相互関係を明らかにする目的で順行性・逆行性神経トレーサーを用いた投射解析を行う。前年度までにマウスの子育て行動に関与することが示唆されるカルシトニン受容体発現ニューロンやドーパミンニューロンなどが再集団化飼育で活性化することを見出している。そこで今後の施策として再集団化飼育で活性化することを見出したこれらのニューロン群が「抵抗」反応および社会的接触行動に関与するのかをshort-hairpin RNA (shRNA)による発現抑制実験や薬理実験などで明らかにする。
「理科実験ポートフォリオ」の作成と相互評価を取り入れた誤概念克服のための教授戦略

理科実験における誤概念克服を支援するため、子供達に「実験ポートフォリオ」を作成させ、それをマルチメディア共有データベースを用い、複数のクラスにまたがる大勢の子供どうしの間で交換・共有・相互評価させる活動を考えた。実験ポートフォリオとは、子供達一人一人が実験の予想や考察の局面で、考えたこと、感じたことなどを自由に書き留め、それらを集めたものである。本研究では、このアイデアに基づく実験指導法のモデル指導案の開発を目指した。平成11年度は、以下のことを行った。1.教授戦術のモデル化と新たな指導案の作成平成10年度に試行した力の単元の授業の指導案をもとにして、「実験ポートフォリオ」を用いた理科実験の教授戦術をモデル化した。そして、電気の単元で、同じ教授戦術に基づく指導案を作成した。2.研究授業の実施力と電気それぞれの単元の指導案について、前年度と同じで研究授業を実施した。3.評価とまとめ力と電気それぞれの単元の指導案について、(3)と同じ方法で評価を行った。そして、(4)でモデル化した「実験ポートフォリオ」を用いた理科実験の教授戦術の有効性について検証した。さらに、個々の実験ポートフォリオの特徴を、認知的領域・情意的領域の二つの観点から、チェックリスト表を使って分析した。それらの結果をもとに、認知的変容や情意的変容が、子供どうしの間でどのような相互作用に起因するものか、因果関係を検討することが、今後に残された課題である。平成10年度は、以下のことを行った。1.指導案の作成小学校高学年で、誤概念が問題となりやすい力に関する単元を取り上げた。そして、実験に関する指導案を、授業者となる教師達と協力して作成した。2.研究授業の実施研究授業は三つの研究協力校で行なった。3.評価誤概念の除去と科学的知識の獲得にどれだけ成功したかという認知的領域での評価に加え、科学的探究に伴う喜びや興奮がどれだけあったかという情意的領域での評価も併せて行なった。現在は、これらの結果を、今まで筆者らが蓄積してきた色々な指導方略に基づく授業の結果と比較し、期待どおりの成果があったか、また問題があるとしたらどのような点か検討し、力の単元の指導案を改訂している段階である。
フタル酸ジ-2-エチルヘキシルの毒性メカニズムの解明と、メカニズムを基にしたリスクアセスメント

DEHPのダイナミクスの種差に関する研究-特にPPARαを介したシグナル伝達の種差の解明を行った。マウス、ラット、マーモセットに0mmol/kg、1mmol/kg、2mmol/kgのDEHPを経口投与し、肝を採取した。その一部から速やかにtotalRNAを抽出し、定量リアルタイムPCR法で、PPARα.およびその標的遺伝子発現(ペルオキシゾーム系酵素とミトコンドリア系酵素)を解析した。残りの組織からwestern blot分析用のサンプルを調整し、PPARα標的遺伝子産物の定量を行った。その結果、以下の点が明らかとなった。1)PPARα-mPNAはマウス、ラット肝において増加傾向ではあったが、有意差はなかった。マーモセット肝においては全く増加を示さなかった。2)DEHPはマウス、ラット肝のミトコンドリア酵素(MCAD, VLCAD、いずれも脂肪酸のβ酸化に係る酵素)を若干誘導したが、マーモセット肝では影響は観察されなかった。3)DEHPはマウス、ラット肝のペルオキシゾーム酵素(PT, PHいずれも脂肪酸のβ酸化に係る酵素)を誘導し、その程度はラットの方がマウスより強かった。マーモセット肝ではこれらの酵素の誘導は観察されなかった。初年度の研究において、DEHPのキネティクスにおおきな影響を与えるリパーゼの活性は、マウス>ラット>マーモセットであることを示した。この結果から、PPARαに配位するDEHPのモノエステル体(MEHP)の生成量は、マウス>ラット>マーモセットであり、PPARα標的遺伝子発現もこのような順位で誘導されることを想定していたが、実際はラット>マウスであった。これらの結果は、DEHPのキネティクスのみならずダイナミクスにも種差があり、両者は必ずしも同様には観察されないことを示唆する。今後、このダイナミクスの種差の機序を解明することが、DEHPの正しいリスク評価につながる。
細胞外ヌクレオチド受容体による好塩基球機能調節メカニズムの解明

本研究では、細胞外ヌクレオチドの好塩基球機能に対する影響を明らかにすることである。申請者はこれまでに、好塩基球がUTPを自然分泌していることや細胞外UDP受容体であるP2Y6受容体シグナルが好塩基球のFcεRI依存的活性化に影響を及ぼすことを明らかにしてきた。しかしながら、好塩基球におけるP2Y6受容体シグナルの詳細や、好塩基球が細胞外ヌクレオチド分解能を有するか不明である。2018年度は、好塩基球におけるP2Y6受容体シグナルを明らかにし、FcεRI依存的脱顆粒に及ぼす影響の機序解明を行った。まず、ヒト末梢血好塩基球をUDPで刺激し、Gタンパク共役型受容体のセカンドメッセンジャーの変化を確認した。UDP刺激によりcAMP量の増加と細胞内カルシウム濃度の上昇が確認され、この細胞内カルシウムの上昇はP2Y6受容体阻害剤、cAMP合成酵素阻害剤、カルシウムキレート剤で抑制された。このことは、好塩基球のP2Y6受容体シグナルは、cAMPを介して細胞内カルシウム濃度を調節していることを示唆する。次に、P2Y6受容体阻害剤と培養した好塩基球をFcεRI依存的活性化刺激し、IP3および細胞内カルシウムの濃度変化を確認したところ、P2Y6受容体阻害剤と培養した好塩基球では、FcεRIシグナルのIP3が小胞体を刺激するが小胞体貯蔵カルシウムの細胞内放出が行われていないことを示している。FcεRI依存性脱顆粒には、小胞体内カルシウムの細胞内放出が必要である。これらの結果は、P2Y6受容体刺激がcAMPを介し、小胞体カルシウムの貯蔵に関与することでFcεRI依存性脱顆粒に寄与している可能性を示唆する。2018年度の当初の目標は、好塩基球のP2Y6受容体の細胞内シグナルを明らかにするとともに、FcεRIシグナルに及ぼす影響を確認することであった。P2Y6受容体シグナルは、予想とは異なる結果となったが目標通り確認できた。FcεRIシグナルとP2Y6受容体シグナルの関連性について、当初はリン酸化タンパク質により検討する予定だったが、細胞数、タンパク量などの問題により行わず、細胞内カルシウム濃度測定とIP3測定により行った。当初予定していたリン酸化タンパクの検出は、今後必要であると考えるが、今回の方法でも、検討するために必要な結果が得られており、全体的な進捗状況としてはおおむね順調とした。2018年度は細胞内シグナルを検討したが、好塩基球がUDPを産生しP2Y6受容体を刺激しているか不明である。先行研究で、好塩基球がUTPを分泌していることを明らかにしているので、2019年度は、好塩基球の細胞外加水分解酵素の発現、好塩基球のUTP加水分解、加水分解により産生されたUDPが好塩基球の活性化に影響を及ぼすか確認する。

先行研究で、好塩基球がUTPを分泌していることを明らかにしているので、2019年度は、好塩基球の細胞外加水分解酵素の発現、好塩基球のUTP加水分解、加水分解により産生されたUDPが好塩基球の活性化に影響を及ぼすか確認する。
摂食・休眠行動に対応したマウス嗅球への新生顆粒細胞の組み込み様式の解析

嗅球の顆粒細胞は大人になっても産生され続けており、嗅球内で日々細胞死と既存の回路への組み込みを繰り返している。これまで当研究室の研究により、摂食制限下のマウス嗅球において覚醒時の嗅覚入力依存的に食後休眠時に新生顆粒細胞が細胞死を起こして嗅球から排除されることが明らかになっている。そこで、この覚醒ー休眠サイクルは新生顆粒細胞を排除するだけでなく、既存の嗅球回路に組み込むのにも重要であると仮定し、新生顆粒細胞の形態変化の解析を行った。そこで、新生顆粒細胞をこのレンチウイルスによって標識したマウスに摂食制限を行い、14日後の各時間帯における形態を解析したところ、食前の時間帯には顆粒細胞が嗅球投射ニューロンから嗅覚入力を受ける領域においてfilopodiaが多く見られる一方で、食餌中及び食後休眠時には小さなheadを持つスパインが増加していた。この結果は食餌中の嗅覚入力を受けた新生顆粒細胞が持つfilopodiaがスパインへと変化する可能性を示唆する結果である。また、摂食制限を開始すると同時に鼻孔閉塞を行い、嗅覚入力を遮断した嗅球の新生顆粒細胞は、嗅球投射ニューロンのmitral cellの細胞体が並ぶ領域での樹状突起の分岐が増え、その領域に存在するスパインなどの突起が通常の嗅球の物と比べて増加していた。さらに、通常の嗅球の新生顆粒細胞と比べ、この領域に存在するスパインは大きなheadを持つ物が占める割合が大きくなっていた。この結果は、嗅覚入力をあまり受けることの出来ない新生顆粒細胞はmitral cellの細胞体やその近傍から少しでも入力を受けようと変化しているのではないかと考えられる。(抄録なし)(抄録なし)嗅球の顆粒細胞は大人になっても産生され続けており、嗅球内で日々細胞死と既存の回路への組み込みを繰り返している。(抄録なし)(抄録なし)
結核菌由来硫酸転移酵素の立体構造解析及び基質検索

結核菌ゲノムの遺伝子解析の結果、これまで4種類の硫酸転移酵素が推定されている。これらの予想1次構造は、既知硫酸転移酵素との相同性が10%以下と極めて低く、又相互問にもほとんど相同性が見られない。これらの遣伝子産物が硫酸転移酵素であるかどうかも含めて、その機能の推定はゲノム情報のみでは困難である。我々は、現在までにこの内STF1が糖脂質に対する硫酸転移活性を示唆するという予備的な結果を得ている。このSTF1について、立体構造を決定するとともに、真の基質を決定し、硫酸化糖脂質の生合成過程の一端を明らかにするとともに、結核菌のおける硫酸転移反応の生物学的意義の一端を明らかにすることを本研究の目的とした。本年度は、前年度に行ったSTF1の大腸菌による発現、精製、結晶化に基づいて、結晶化条件の最適化を図るとともに、重原子同系置換体結晶を作成、シンクロトロンでのX線解説実験を行った。その結県、複数の重原子同系置換体結晶を得ることができた。X線回折データの測定においては、異常散乱効果を最適化したX線の波長を選択し、良好なデータを入手することに成功した。これらのデータを用いて、MIRAS法により位相情報を決定し、立体構造構築に十分な質の電子密度を得ることができた。コンピューターグラフィックスソフトを使用して、分子モデルを構築し、精密化を行うことで、STFの立体構造を決定できた。STF1の立体構造をは、予想どおり、硫酸転移酵素に特有のPAPS結合モチーフの構造を持っており、立体構造の観点からも、STF1は硫酸転移酵素であることが、強く支持された。結核菌ゲノムから、硫酸転移酵素と予想されるSTF1蛋白質のクローニング、大腸菌によるリコンビナントタンパク質の大量発現系の確立、大量精製を行った。合計20L程度の大腸菌の培養を行い、当たり20mgの精製蛋白質を得ることができた。この蛋白質を用いて様々な蛋白質条件のサンプルを作成し、それぞれ約800条件の結晶化スクリーニングを行った結果、2種類の条件でSTF1結晶を得ることができた。これらの結晶について、X線回折実験を行った結果、分解能1.5オングストロームという高分解能の回折データを収集することができた。又、構造解析における位相情報収集の為に、水銀及び臭素置換体結晶の作成を行った。異常分散効果を含めた重原子同型置換法による位相計算を行ったところ、立体構造決定に十分な電子密度マップを得ることができた。最終的に分解能1.5オングストロームという高分解能での立体構造決定に成功した。STF1の立体構造を、すでに立体構造が明らかとなっている他の硫酸転移酵素と比較したところ、硫酸基供与体PAPS結合部位周辺の立体構造は、ほぼ同様のものであった。主鎖のフォールドが似ているだけでなく、PAPS認識に関わる測鎖の配置とコンフォメーションも保存されていた。このことは、STF1が硫酸転移酵素であることを強く示唆する結果である。又、基質結合部位と予想される領域は、疎水性が高い溝状の構造をしており、糖脂質や糖を結合するのに適切な構造であると考えられる。現在、本酵素の基質を立体構造情報からと、通常の活性測定の両面から検索している。これらの予想1次構造は、既知硫酸転移酵素との相同性が10%以下と極めて低く、又相互間にもほとんど相同性が見られない。これらの遺伝子産物が硫酸転移酵素であるかどうかも含めて、その機能の推定はゲノム情報のみでは困難である。

このSTF1について、立体構造を決定するとともに,真の基質を決定し、硫酸化糖脂質の生合成過程の一端を明らかにするとともに、結核菌のおける硫酸転移反応の生物学的意義の一端を明らかにすることを本研究の目的とした。本年度は、前年度に行ったSTF1の大腸菌による発現、精製、結晶化に基づいて、,結晶化条件の最適化を図るとともに、重原子同系置換体結晶を作成、シンクロトロンでのX線解説実験を行った。その結果、複数の重原子同系置換体結晶を得ることができた。X線回折データの測定においては、異常散乱効果を最適化したX線の波長を選択し、良好なデータを入手することに成功した。これらのデータを用いて、MIRAS法により位相情報を決定し、立体構造構築に十分な質の電子密度を得ることができた。コンピューターグラフィックスソフトを使用して、分子モデルを構築し、精密化を行うことで、STFの立体構造を決定できた。STF1の立体構造をは、予想どおり、硫酸転移酵素に特有のPAPS結合モチーフの構造を持っており、立体構造の観点からも、STF1は硫酸転移酵素であることが、強く支持された。
イギリスの痴呆症の介護基準と痴呆症の介護職員の職業能力形成に関する実証的研究

イギリスを含む西欧諸国では、近年「介護の質」をめぐる論議が盛んである。中でもイギリスは、「介護の質」を担保するために、2000年にケア基準法制定し、施設と在宅の双方における「介護の質」の引き上げに向けて新しい取り組みを行なってきた。本研究は、介護がとりわけ対人サービスであることから、介護職員の職業能力形成について検討し、わが国における「介護の質」の引き上げの政策的な含意を探ろうとしたものである。本研究の成果として以下のものを得た。1.2004年にイギリスの民間高齢者施設の見学と職員への聞き取り調査を実施した。その結果から、環境、苦情処理、個別のケアプランは、ある程度機能しているものの、職員の職業能力形成のためのプログラムは、組まれていない。認知症の介護については、そのほとんどが経験に頼っている。2.2000年に制定されたケア基準法に沿って、高齢者の入居施設と在宅事業についての最低基準の内容を明らかにしたことと、介護職業資格に関わる基準を明らかにした。すなわち、いずれの部門でも50%の介護職員が全国職業資格(NVQ)のレベル2を取得しなければならない。3.イギリスにおける教育制度と職業資格の関係を明らかにした。これらは、主として継続カレッジあるいはeラーニングで担われている。4.全国職業資格レベル2の取得のための教育プログラムとテキストの内容及び達成基準を明らかにした。5.2006年にイギリスの保健省に出向き、ケア基準制定後の資格取得状況及び事業所の職業訓練の聞き取り調査を行なった。6.2004年に訪問調査した高齢者施設の監査報告書の継続調査を行なった結果、2006年に介護職員の資格取得率が50%になった。さらに、その他の基準のスコアも向上していることがわかった。今後の課題として、教育技術省の調査の必要が明らかになったため、継続調査を行なう予定である。3年間に及ぶ研究の初年度である本年度は、次の4つの作業を行なった。1.イギリスの全国介護基準に関する2000年法の背景とその内容の検討。2.2000年法制定後、20032004年に実施された高齢者入居施設の監査官意見書の検討。3.2000年法制定後の介護市場の変化を探る資料の収集と検討。4.イギリスの高齢者施設の見学と聴き取り調査の実施。本年度は、以上の検討を踏まえて、ロンドン市内の高齢者施設(認知症高齢者の入居している施設)である次の3ヶ所の現地調査を行なった。(1)タワー・ブリッジナーシングホーム(Tower bridge Nursing Home -128床を有する大規模施設)、(2)アストン・グランジ(Aston Grange -45床の内、認知症高齢者29名の施設)、(3)ロス・ワイルド・ナーシングホーム(Ross Wyld Nursing Home -54床の内、認知症高齢者22名の施設)で(1)、(2)については見学、(3)については、2000年法の基準をもとに聴き取り調査を行なった。2000年法の目的が、ケアサービスの水準の向上や市場部門の供給するヘルスケアの監視にあるとすれば、(3)の聴き取り調査からすると、環境、苦情処理、個別のケアプランでは、ある程度機能はしているものの、職員の職業能力形成のための教育プログラムは、組まれていない。認知症の介護については、その殆どが経験に頼っているのも事実である。次年度以降は、介護基準に盛り込まれている職員の資格NVQLevel2の教育内容の検討に着手する。研究2年目である本年度は、次の3つの作業を行った。

1.イギリスの全国介護基準に関する2000年法に沿って、高齢者の入居施設及び在宅事業についての全国最低基準の内容を明らかにすることと、介護の職業資格に関わる基準を明らかにすること。2.イギリスにおける教育制度と職業資格制度の関係を明らかにすること。3.全国職業資格あるいはスコットランド職業資格レベル2の取得のための教育プログラムとテキストの内容及び達成基準の検討をすること。今回検討したテキストは、全国教育カレッジ(National Education College, NEC)と介護のための技術機構(skills for care)の二つである。これらの教育は、主として継続教育カレッジあるいはe・ランニングで担われている。教育は、義務教育後の若年者の職業訓練と、企業の従業員訓練として実施されている。また、社会人の職業訓練とキャリア開発の目的もあわせ持つ。研究の最終年度となる次年度は、本研究の主目的である認知症の教育プログラムに定評のあるエイジ・コンサーン、スターリング大学などの現地調査を行う予定である。本年度は、3年に及ぶ研究の最終年度として次の3つ作業を行なった。1.イギリスへの現地調査の実施を行なった。(1)キングス・ファンド(King's Fund)にて高齢者介護サービスに関する資料、長期介護に関する資料、介護ビジネスに関する資料、ロンドンの介護市場に関する資料を入手した。(2)保健省(Department of Health)にて、2000年のケア基準法制定後における介護職員の資格習得状況及び事業所の職業訓練方法等の聞き取り調査を実施した。この結果、Department for Education for Skillsの調査も必要であることがあらたにわかり、複数資料を入手することができた。2. 2004年に調査訪問した施設、ロス・ワイルド・ナーシングホームのインスペクションレポートの継続調査を行なった。ケア基準法では、2005年までに職員の50%がNVQのレベル2以上を求めていたにもかかわらず、2006年9月に実現している。3.エイジ・コンサーン(Age Concern)で実施している訓練テキストの収集と、特定非営利活動法人エイジコンサーン・ジャパンから、邦訳のテキストが入手できたことも、大きな収穫であった。以上の資料や文献の整理と立ち入った検討を行い、そのうちのいくつかを成果として公表した。最後に、これらの作業のまとめとして報告書を作成した。
超高速測光によるカリウムチャネル機能測定法の開発と応用

内向き整流カリウムチャネル(Kirチャネル)は多種類のメンバーが存在するファミリーからなり、カリウムイオン(K+)を選択的に透過させるチャネルである。一次構造上で、N末端、C末端ともに細胞質内にあって、膜貫通領域を2つ持っており、その間にチャネルポア(穴)を形成する主な領域となっているH5とよばれる互いに相同性の高い領域が存在している。Kirチャネルはこのサブユニットが4つ集まって1つのポアを作る4量体として存在している。その機能として、細胞静止膜電位を深める作用、静止膜電位を安定化させる作用、細胞の興奮を抑制する作用、K+の輸送、インスリンの分泌など多彩な機能を持っている。Kirチャネルの機能の解析法として、パッチクランプによる電気的な測定とルビジウム(Rb)の放射性同位体を用いた測定法があるが、それぞれに問題点も存在した。申請者らは本研究によって、Kirチャネルファミリーの構造、分布、機能をさらに明かとするとともに、これまでのカリウムチャネルの機能測定法に替わりうる方法、或いはこれまでの測定法の欠点を補いうる新たな測定法の開発をおこなうことを試みた。本研究によって(1) Kirチャネルの1つKir4.1/KAB-2について、このチャネルの分布局在と機能を明らかとし、局在化のメカニズムについて検討を加え、さらに水チャネルAQP-4との共存について調べた。(2)新しいATP感受性Kirチャネルのスルフォニルウレア受容体サブユニットをクローン化し、血管平滑筋に発現するATP感受性Kirチャネルを明らかとした。(3) Kirチャネルの新たなサブフォームをクローン化し、また、いくつかのKirチャネルについて遺伝子の染色体上での位置を決定した。(4)新たなカリウムチャネル測定法を検討し、その問題点を明かとした。カリウムチャネルの機能をパッチクランプ法に加えて測定する新しい系を開発するために、まず、網膜のグリア細胞であるミュラー細胞を使ってこの細胞に発現するチャネルを分子レベルで同定をおこなった。単一の分離ミュラー細胞を用いたRT-PCRによってミュラー細胞にはK_<AB>-2チャネルが大量に発現していることが判明した。さらに、パッチクランプ法による解析でもミュラー細胞には内向き整流カリウムチャネルが1種類のみ発現しており、そのチャネルの性質は培養細胞に発現させたK_<AB>-2と全く同じ性質であることがわかった。さらに特異抗体による組織染色からもK_<AB>-2がミュラー細胞の細胞全体に広く分布しながらも膜上で、集積(clustering)して発現していることが判明した。K_<AB>-2のC末端にはPSD-95ファミリーと結合する配列があることからミュラー細胞で発現しているPSD-95ファミリーをRT-PCR法で検討した結果、SAP97が存在することがわかり、SAP97の免疫染色によってSAP97もミュラー細胞に集積して発現していること、培養細胞でK_<AB>-2とSAP97を共発現させるとK_<AB>-2が集積し、さらに、SAP97がK_<AB>-2の膜上での発現を増加させることを明らかとした。また、免疫電顕による解析の結果、K_<AB>-2はミュラー細胞が血管内皮細胞に接している部位や硝子体に面している部位に多量に発現していることを明らかとした。この特徴ある分布と外向き電流を少しながらも通すというK_<AB>-2の性質からK_<AB>-2はグリアのspatial bufferingの機構においてK+の吸い込みと放出の両方に作用している可能性が考えられた。内向き整流カリウムチャネルファミリーは細胞静止膜電位の形成と安定化、維持あるいは、カリウムの輸送をおこなっているとされている。このなかで申請者らのグループによってクローン化されたKir4.1/K_<AB>-

2は脳グリア細胞に発現していることがin situ hybridizationによって明らかとなった。そこでこのKir4.1の分布と機能を調べるために網膜の主要なグリア細胞であるミュラー細胞をもちいてさらに検討した。Kir4.1 mRNAはミュラー細胞に発現していた。さらに、Kir4.1抗体を使うことによってチャネル蛋白質自体もミュラー細胞膜上に広く分布していること、Kir4.1は膜上ではパッチ状に集積(クラスタリング)して存在していることが判明した。このクラスタリングの機構を生化学的、細胞生物的に検討したところ、網膜ミュラー細胞ではSAP97という3つのPDZドメイン、SH3領域、グアニル酸キナーゼ領域をその構造内に持っている細胞内蛋白質がKir4.1のC末端にあるSer-Asn-Valという配列に結合することによってKir4.1-SAP97のコンプレックスができ、さらにSAP97が互いに凝集することによって起きていることがHEK293T細胞を使った再構成実験によってわかった。また、ミュラー細胞のKir4.1の発現はミュラー細胞を培養化することによって消失すること、培養液にインスリンを添加しておくとKir4.1 mRNAの発現がおこるが、Kir4.1は細胞質にとどまって膜上に発現しないこと、インスリン存在下にラミニンを作用させると機能を持ったKir4.1の膜上での発現がみられ、この際、Kir4.1は膜上でクラスタリングしていることを見い出した。即ち、ラミニンはKir4.1の細胞質から膜上へのトランスロケーションに働いていることが強く示唆された。Kir4.1の機能は神経細胞が興奮した際に細胞外に放出するK+を吸収し、さらにそのK+を別の部位へ放出するsaptial bufferingをおこなっているものと考えられた。この機能をカリウム蛍光試薬を用いて現在検討している。内向き整流カリウムチャネル(Kirチャネル)は多種類のメンバーが存在するファミリーからなり、カリウムイオン(K+)を選択的に透過させるチャネルである。一次構造上で、N末端、C末端ともに細胞質内にあって、膜貫通領域を2つ持っており、その間にチャネルポア(穴)を形成する主な領域となっているH5とよばれる互いに相同性の高い領域が存在している。Kirチャネルはこのサブユニットが4つ集まって1つのポアを作る4量体として存在している。その機能として、細胞静止膜電位を深める作用、静止膜電位を安定化させる作用、細胞の興奮を抑制する作用、K+の輸送、インスリンの分泌など多彩な機能を持っている。Kirチャネルの機能の解析法として、パッチクランプによる電気的な測定とルビジウム(Rb)の放射性同位体を用いた測定法があるが、それぞれに問題点も存在した。申請者らは本研究によって、Kirチャネルファミリーの構造、分布、機能をさらに明かとするとともに、これまでのカリウムチャネルの機能測定法に替わりうる方法、或いはこれまでの測定法の欠点を補いうる新たな測定法の開発をおこなうことを試みた。
嗅神経細胞再生におけるPSD-95(Dlg4)の役割の解析

嗅神経細胞(嗅細胞)は神経細胞でありながら、死滅と再生を繰り返す特殊な細胞であり神経再生過程の観察に適した細胞である。嗅細胞は、分化・成熟していく過程で鼻腔側に樹状突起を、中枢側に軸索を伸長しシナプスを形成する。シナプス後部蛋白Dlg4(PSD-95)は、様々なシナプス蛋白に結合する足場蛋白であり、神経細胞の分化とともに樹状突起に多く局在するようになるが、嗅神経細胞の分化・成熟におけるPSD-95の役割はわかっていない。本研究では、PSD-95が嗅細胞の再生に果たす役割を明らかにすることで、嗅覚再生治療の手掛かりとする。Dlgノックダウンマウスの確立in vivoでのDlgノックダウンのため様々な方法を試した。ノックダウンのためのプラスミドの投与経路として、点鼻投与や腹腔内投与などでRNAiを試みた。また、導入試薬も複数試し、投与のタイミング、量などを変えながら至適条件を探索した。しかし、標的臓器での効果が見られなかった。ワイルドタイプマウス、嗅神経障害モデルマウスでの解析Dlgのサブタイプのうち、主にDlg1とDlg4について解析を行った。Dlg1とDlg4はともに、嗅粘膜、嗅球において発現を確認することができた。さらに、Dlg4は、Dlg1と比べてより強い発現がみられ、Dlg4の発現は、OMP(olfactory marker protein)と似たような局在を示した。しかし、嗅球内の2次ニューロンにおける発現は確認できなかった。Dlg4は嗅粘膜-嗅球のルートのなかで、特に嗅繊毛、嗅神経細胞軸索、糸球体僧帽細胞層において強く発現しており、樹状突起先端に局在する傾向がみられた。RNAi実験のin vivoでの確立のため、様々な方法を試している。今回、嗅神経細胞へのRNAiを、点鼻投与で試みているが、in vivoでのRNAiは干渉時間が短いようで、有効な干渉効果がみられていない。現在、投与のタイミング、量など条件を変えながら至適実験条件を検討している。また、腹腔内投与など点鼻投与以外の方法での導入方法も検討している。RNAiプラスミドの導入方法として、プラスミドベクター、リポソーム系試薬などをを用い至適方法を探索中である。Dlg4に対するRNAiは市販されているものを使用し試行中であるが、他の論文で使用されているものでの実施を検討している。嗅神経障害モデルマウスでの解析嗅覚研究でよく用いられているメチマゾールによる障害モデルで解析をするため、まず正常マウスの嗅上皮におけるDlg1, Dlg4の免疫染色実施している。月齢6か月のマウスを用いて、おもにDlg1, Dlg4,成熟嗅神経細胞マーカー(OMP), BDNFを解析している。成熟嗅神経細胞マーカー(OMP), BDNFに関しては、既発表の論文に準じているが、Dlg1、Dlg4に関しては、各種の抗体を用いて至適条件を探索中である。上記研究の最新情報の収集と、至適条件設定などの技術的情報を得るために、日本鼻科学会や日本耳鼻咽喉科学会などに参加している。脳由来神経栄養因子(BDNF: brain-derived Neurotrophin factor)は嗅神経細胞の再生に重要な因子の一つで、嗅上皮再生の過程で嗅球と嗅上皮に発現している。BDNF刺激により神経細胞の樹状突起に、シナプス後部タンパク質Dlg4(PSD-95)が輸送されることが報告されているが、嗅上皮細胞におけるDlgの役割は明確になっていない。BDNF及びDlgが嗅神経細胞の再生に果たす役割を明らかにする。前年度から引き続きin vivoでのRNAiの確立のため、様々な方法を試している。Dlg1、Dlg4の両者において、投与経路を点鼻や腹腔内投与や静脈注射などを試し、観察までの時間、投与量など条件を変えながら試しているが、再現性のある安定した効果がみられていない。引き続き情報収集をしながら至適条件を探索し、確立を目指している。嗅神経障害モデルマウスでの解析メチマゾールによる障害モデルと、嗅糸切断による障害モデルを試している。障害後からの回復過程を、直後、24時間後、48時間後、72時間後と時間経過別に、Dlg1,Dlg4,OMP,BDNFの免疫染色により解析をしている。各種抗体、染色条件の違いなど至適条件を探索しながら、解析を継続している。上記研究に関する最新の知見、情報の収集や、技術的情報を得るために、日本鼻科学会や日本耳鼻咽喉科学会などに参加している。in vivoでのRNAiで安定した効果がみられない。また使用している抗体で安定した染色が得られない。

また、導入試薬も複数試し、投与のタイミング、量などを変えながら至適条件を探索した。しかし、標的臓器での効果が見られなかった。ワイルドタイプマウス、嗅神経障害モデルマウスでの解析Dlgのサブタイプのうち、主にDlg1とDlg4について解析を行った。Dlg1とDlg4はともに、嗅粘膜、嗅球において発現を確認することができた。さらに、Dlg4は、Dlg1と比べてより強い発現がみられ、Dlg4の発現は、OMP(olfactory marker protein)と似たような局在を示した。しかし、嗅球内の2次ニューロンにおける発現は確認できなかった。Dlg4は嗅粘膜-嗅球のルートのなかで、特に嗅繊毛、嗅神経細胞軸索、糸球体僧帽細胞層において強く発現しており、樹状突起先端に局在する傾向がみられた。in vivoでのRNAi効果に不確実性があり各種市販の商品で、カタログ上見られる効果が見られない。引き続きノックダウンマウスの確立を試行しながら、嗅覚障害モデルマウスを用い免疫染色での解析を続ける。引き続き、ノックダウンマウスモデルの確立を試行しながら、薬剤性嗅覚障害モデルマウスの走査電子顕微鏡での観察に最適な時期を設定し、電顕による三次元的微細構造の観察を予定する。購入予定であった機器、試薬は既存のものを用いることができたため、新たに購入する必要がなくなった。購入予定であった機器、試薬は既存のものを用いた。今年度必要となる機器、試薬として使用する予定である。今年度必要となる機器、試薬として使用予定である。
強誘電体超微粒子含有テルライト系ガラスの作製と非線形光学効果

本研究の目的は、熱処理法および溶解分散法を用いて強誘電体微結晶を多量に含有した透明なテルライト系ガラスを作製し、新しい非線形光学ガラスとしての可能性を検討することである。得られた研究成果をまとめると次のようになる。1.50TeO_2-35Li_2O-15Nb_2O_5組成のガラスを二段熱処理することにより、粒径約10μmの強誘電体LiNbO_3結晶を含有した透明なガラスの作製に成功した。また、70TeO_2-15BaO-15TiO_2組成のガラスから粒径約10μmのBaTiO_3結晶を析出させることに成功した。粒径が非常に大きいにも係わらず透明になった理由は、マトリックスであるテルライト系ガラスと析出した強誘電体結晶との屈析率差が非常に小さく、界面での光の散乱が少ないためと解釈された。2.安定なテルライト系ガラスに焼結法で作製したLiNbO_3およびKNbO_3結晶を直接分散させる方法を新たに開発した。LiNbO_3結晶の場合は、80TeO_2-15Li_20-5Nb_2O_5組成のガラスを用いると有効にLiNbO_3結晶を分散させることができた。Li_2O/Nb_2O_5比の大きい組成を用いることがポイントであり、これはLiNbO_3結晶のLi^+イオンが選択的にガラス中に溶解することを抑えているためと解釈した。KNbO_3結晶の場合は、種々の組成のテルライト系ガラスに有効に分散させることができた。いずれの場合でも、ガラス中の結晶の粒径は10μm程度であり、試料は透明であった。3.KNbO_3結晶を含有した透明なテルライト系ガラスから第二高調波の発生を確認した。したがって、本研究で開発した複合ガラス試料は新しい非線形光学ガラスとして期待できることがわかった。
アポトーシス細胞の抗炎症メカニズムに着目した新たな炎症治療用材料の開発

炎症は、古くから熱・痛みを伴う赤みや腫れと広く理解され、感染や組織傷害に対して生体が発動する組織修復機構とされてきた。しかし、近年、この炎症が消散せず慢性化した状態が、数々の疾患の要因となっていることが示唆されている。最近の研究においても、アルツハイマー病の初期あるいは病気の確定後に、炎症に関与する抗体を投与することで症状が緩和し、認知課題において記憶が改善することが報告されている。しかし、抗体医薬は非常に高価であり、低分子薬の数倍から数十倍もする薬価がその普及を妨げている。そこで本提案課題では、アポトーシスを起こした細胞が細胞膜表面に露出するフォスファチジルセリン(PS)を介して免疫反応を抑制することに注目し、PSと類似構造を有するアポトーシス模倣新規合成ポリマーの合成およびその炎症治療への応用、特にアルツハイマー病への応用を目指して研究を行った。まう、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行い、合成した。合成方法としては、DNAの固相合成に用いられるホスホロアミダイト試薬を転用する手法を試みた。次に、マウス由来マクロファージであるRAW264.7を用い、免疫反応において中心的役割を果たす転写因子である核内因子の活性を測定することで、PS含有ポリマーの抗炎症活性を評価した。炎症性サイトカイン抗炎症性サイトカインのレベルをEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)および電気泳動により測定した。さらに脳免疫細胞MG-6(ミクログリア状細胞)を用いて抗炎症評価を行った。以上の結果より、マクロファージおよびミクログリアの炎症活性をPSが抑制することが明らかとなた。そこで本提案課題では、アポトーシスを起こした細胞が細胞膜表面に露出するフォスファチジルセリン(PS)を介して免疫反応を抑制することに注目し、PSと類似構造を有するアポトーシス模倣新規合成ポリマーの合成およびその炎症治療への応用、特にアルツハイマー病への応用を目指す。抗アルツハイマー性評価は、脳免疫細胞にアミロイドb刺激を加え、細胞間伝達物質の産生量から抗アルツハイマー性を評価する。細胞間伝達物質はベータ型変異増殖因子と腫瘍壊死因子の産生量を測定する。また、神経細胞へ与える毒性をMTTアッセイによって評価する。以上の実験を踏まえ、低毒性かつアルツハイマー治癒能の高いPSポリマーの最適形態を探索する。特に平成28年度は、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行い、合成する。合成方法としては、DNAの固相合成に用いられるホスホロアミダイト試薬を転用する手法を試みる。合成したBOC保護PSモノマーをラジカル重合によって重合した後に、BOC基の脱保護反応を行う。反応溶液を濃縮後、透析操作、さらに凍結乾燥することでPSポリマーを得る。平成28年度は、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行った。本反応を第一選択肢として採用する理由として、本反応能の中核を担うホスホロアミダイト試薬の高い反応制御性があげられる。本試薬は、中心のリン原子が3つの保護基によって保護されており、脱保護後にアミダイト試薬のリン原子が水酸基と結合し、亜リン酸エステルを形成することが知られている。すなわち、水酸基を有するモノマーを出発物質とすることで、モノマー由来の水酸基とセリン誘導体由来の水酸基の間にリン酸エステルを形成することが可能であると考えた。具体的には、BOC保護のセリンとホスホロアミダイト試薬を混和し、imidazole hydrochloride存在下で、2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA)を加えることでBOC保護PSモノマーを得た。分離精製には、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた。合成したBOC保護PSモノマーをラジカル重合によって重合する。重合したBOC保護PSポリマーにtert-butyl hydroperoxide、trifluoro aceticacidを加えることでBOC基の脱保護反応を行った。反応溶液を濃縮後、透析操作い、さらに凍結乾燥することでPSポリマーを得た。得られたPSポリマーの構造解析を1H NMRおよびGPCを用いて行ったところ、目的のポリマーの合成が確認された。平成29年度はこのポリマーを用いて抗炎症評価を行う。

そこで本提案課題では、アポトーシスを起こした細胞が細胞膜表面に露出するフォスファチジルセリン(PS)を介して免疫反応を抑制することに注目し、PSと類似構造を有するアポトーシス模倣新規合成ポリマーの合成およびその炎症治療への応用、特にアルツハイマー病への応用を目指す。日本の医療・介護予算は43兆円を超えるが、この背景にあるのがアルツハイマー型認知症の蔓延による要看護者数の増加である。一般に、アルツハイマー病を含む要介護が必要な疾患の約60%が何らかの炎症が原因であることが明らかとなっている。本課題で提案するようなアポトーシス細胞模倣型合成ポリマーが実現できれば、特異性と汎用性の両方を兼ね備えた新たなバイオマテリアルとしてその社会的インパクトは計り知れない。平成29年度は、PSポリマーの抗炎症効果について詳細に検討した。抗炎症評価用の細胞としてマウス由来マクロファージであるRAW264.7を選択しており、これに対する毒性、用量・共培養時間依存的抗炎症活性、用量依存的な細胞への取り込みをそれぞれ評価した。結果としてpoly(MPS)は0-50 mMの濃度域では細胞毒性を示さないことを明らかとし、用量・共培養時間依存的な抗炎症活性を確認した。これと同時に行った細胞への取り込み評価においても用量依存的にマクロファージへと分配していることを明らかとした。これに加え、ホスファチジルコリン模倣モノマーである2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC)とのランダム共重合体(poly(MPS-st-MPC))を作製した結果、poly(MPS-st-MPC)がMPSのホモポリマーに比してより優れた抗炎症能を有するということを明らかとした。炎症は、古くから熱・痛みを伴う赤みや腫れと広く理解され、感染や組織傷害に対して生体が発動する組織修復機構とされてきた。しかし、近年、この炎症が消散せず慢性化した状態が、数々の疾患の要因となっていることが示唆されている。最近の研究においても、アルツハイマー病の初期あるいは病気の確定後に、炎症に関与する抗体を投与することで症状が緩和し、認知課題において記憶が改善することが報告されている。しかし、抗体医薬は非常に高価であり、低分子薬の数倍から数十倍もする薬価がその普及を妨げている。そこで本提案課題では、アポトーシスを起こした細胞が細胞膜表面に露出するフォスファチジルセリン(PS)を介して免疫反応を抑制することに注目し、PSと類似構造を有するアポトーシス模倣新規合成ポリマーの合成およびその炎症治療への応用、特にアルツハイマー病への応用を目指して研究を行った。まう、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行い、合成した。合成方法としては、DNAの固相合成に用いられるホスホロアミダイト試薬を転用する手法を試みた。次に、マウス由来マクロファージであるRAW264.7を用い、免疫反応において中心的役割を果たす転写因子である核内因子の活性を測定することで、PS含有ポリマーの抗炎症活性を評価した。
高分子との相互作用による半導体量子ドットの発光特性制御

まず,core/shellタイプの半導体量子ドットであるCdSe/ZnSが高分子との相互作用により発光特性が改善されることを確認した。次に,高分子の代わりに金属ナノ粒子,TiO_2ナノ粒子との相互作用による,マクロな発光特性(蛍光スペクトル,蛍光寿命)と単一量子ドットの発光特性(蛍光スペクトル,蛍光寿命,Blinking)の変化を調べ,TiO_2ナノ粒子の場合にはBlinking特性が改善されることを見いだした。さらに,量子ドット溶液のフェムト秒位相緩和時間が溶媒の種類により大きく変化するという新規な効果を見いだした。CdSe/ZnS半導体量子ドットのクロロフォルム溶液に高分子(PMMA,PBD,PVP,PDMS)を添加した溶液状の試料を作製し,その発光スペクトル変化を測定した。以前にコア型CdSe量子ドットで観測したと同様な発光スペクトルの変化を検出した.すなわち,PMMA,PBD,PDMSの高分子を添加した場合には発光強度とスペクトル形状には大きな変化が見いだせなかったが,PVP高分子添加においては発光強度が大幅に減少した.この事実は,高分子環境が発光強度に及ぼす効果が,コア・シェル型とコア型の半導体量子ドットでほぼ同じであることを示しており,新しい知見であると考えられる.このような発光強度の変化は,高分子と量子ドットとの相互作用により,ドットの表面欠陥準位や励起子状態が影響されていることを示している.高分子環境下でのUV照射による発光特性の変化では,UV照射強度が強すぎてドットの破壊が生じた.しかし,その途中経過において,発光スペクトルのブルーシフトが観測され,コア・シェル型の量子ドットでもUV照射のエッチング効果で量子ドットのサイズが小さくなっていることが分かった。UV照射強度を下げて,発光スペクトル変化を調べている.蛍光寿命の測定,Pump-Probe法によるエネルギー緩和の測定には至らなかった.なお,高分子に代えてナノ粒子(TiO2,Ag,Au)を添加した場合には,マクロな発光強度が低下する場合もあるが,単一量子ドットのBlinking特性が改善される現象を見出した.これは,非常に興味深い結果である.昨年度に,CdSe/ZnS半導体量子ドットにTiO_2ナノ粒子を添加すると,溶液状態での蛍光強度が減少するとともに,単一量子ドットのBlinking特性が大きく変化することを見いだした.今年度は,まずこの現象をより詳細に調べ,ナノ粒子による発光特性制御について研究を行った.単一量子ドットの蛍光寿命とBlinking特性を測定した.単一量子ドットを測定するため,化学結合でガラス基板表面に量子ドットを固定した.蛍光寿命測定では,TiO_2ナノ粒子添加の前後で蛍光寿命に大きな差は確認できなかった.Blinkingの計測では,計測開始60秒後にガラス基板上の対象としている単一量子ドットにTiO_2ナノ粒子溶液を滴下し,TiO_2ナノ粒子を近接させることによるBlinking特性の変化を観測した.Blinking特性変化として,TiO_2ナノ粒子近接により,(1)まったく発光しなくなる,(2)強度は弱くなるが発光している時間が増加する,(3)BlinkingのON時の強度が増加した後しだいに弱くなる,などを検出した.これらの変化は,Blinkingの原因として知られるオージェ過程が,TiO_2ナノ粒子への電子移動過程と競合する結果として理解できる.CdSe/ZnS量子ドットとTiO_2粒子の距離が大きい場合には(1)が,距離が近い場合には(2)が,距離が変化している場合には(3)が観測されると考えられる.次に,本研究で目的とする高分子環境がCdSe/ZnS量子ドットの位相緩和に及ぼす影響を研究するため,量子ドット溶液の四光波混合実験を行った.購入した量子ドットの溶媒として,トルエン,クロロフォルムを用いたところ,四光波混合信号の時間波形が2つの溶媒で大きく変化することを見いだした.現在までの結果を公表すべく,国際会議に投稿中である.研究実施計画に沿って,半導体量子ドットの高分子・ナノ粒子環境に於ける光学特性変化と位相緩和の変化についての研究を実施した。得られた研究成果は次の通りである。【光学特性変化】CdSe/ZnS量子ドットの高分子による蛍光スペクトル,蛍光寿命の変化はCdSe量子ドットの場合とほぼ同じであった。TiO_2ナノ粒子を量子ドットに付加した場合には溶液では蛍光強度大幅な減少が観測されたが,蛍光寿命では大きな変化を見いだせなかった。しかし,ガラス基板上に化学的に固定した単一量子ドットでは,蛍光スペクトルと蛍光寿命にTiO_2によるわずかな変化が検出された。単一量子ドットのBlinking特性の測定では,量子ドットによってはblinking特性が改善されてOFF時間が減少するという興味ある現象を検出した。これは,求電子性の強いTiO_2との相互作用により新たな電子移動経路が導入されたことで,Blinkingの原因と考えられるAugerイオン化過程が抑制されたと考えられる。このような解析を踏まえて,研究結果を論文として公表した。【位相緩和特性変化】CdSe/ZnS量子ドット溶液に於ける四光波混合法による位相緩和の測定を行い,トルエン,クロロホルム溶媒での結果の再現性を確認した。

また,新たな溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定したところ,非常に長い位相緩和時間を観測することに成功した。これらの結果は,溶媒が量子ドットの位相緩和に非常に大きな影響を与えていることを示している。溶媒の双極子モーメントの大きさと位相緩和の相関について考察し,国内学会等で結果を発表した。また,論文として公表予定である。
金属－金属結合活性種を用いたアルケン類のオンデマンド合成

アルケンは、天然物や有機工業製品に広く含まれる重要な官能基であり、そのE/Z幾何異性を制御することは長年の有機合成化学における課題となっている。アルケンの幾何異性体は、通常、E体が熱力学的に安定であり、ひとたびE体アルケンが生じた場合、これをZ体に高収率で変換する手法には大きな制約があり、熱反応条件(暗所下)でE→Z異性化を高選択的に実現する手法の開発が強く求められている。本研究では、MーM結合活性種を用いた新しいアルケン異性化機構を提案・実証し、熱反応条件でのアルケンの選択的E→Z異性化反応を開発することを目指して研究をおこなっている。2018年度までに、高反応性錯体[Pd2(CH3CN)6][BF4]2を用いて、二核付加・立体反転・トランスオレフィネーションのそれぞれの段階が立体選択的に進行することを見出した。これらの選択的二核素反応に基づき、1,3-ジエンを選択的にE体からZ体へ熱異性化させることに初めて成功し、Z-ジエンを短時間かつ高選択的にオンデマンド合成する手法を開発した。さらに、up-hill型反応であるこのE→Z異性化を他の有機反応と反応共役させることが可能であることも実証した。MーM結合活性種を用いた新しいアルケン異性化機構を提案・実証し、熱反応条件でのアルケンの選択的E→Z異性化反応を開発することを目指して研究をおこない、目標とするオレフィンのup-hill型E→Z異性化を熱条件で達成することに成功した。特に、Z体を速度論的に選択的に発生させてこれを捕捉する手法を新たに開発した。よって、本研究は当初の計画以上に進展していると判断できる。今後は、これまでに得られている二核錯体誘起オレフィン異性化機構に関する知見に基づき適用できるオレフィン基質の拡大を狙う。また、二核反応機構をさらに発展させるべく、anti型の二核脱離によるZ体の速度論的捕捉を試みる。さらに、順調に研究が進展していることから、新たな反応活性種として期待されるPd(I)単核ラジカル種の単離同定にもとりかかる予定である。