hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳内知覚情報伝達経路の分析による認知と身体運動制御との関連の検討

身体運動によって運動課題を達成するしくみを解明には、如何にして知覚情報をもとにして動作の組織化が行われるのかについて理解する必要がある。本研究では、標的物に手を伸ばして捕捉する(Grasping)動作および、標的物の大きさを判断し同様の手指関節運動によって表示する(Matching)動作を、単純な円形の標的物あるいは、Ebbinghaus錯視を誘発する同様の標的物に対して遂行する場合の、視覚情報に基づいて手指関節運動による動作が形成される過程の大脳皮質レベルの活動の特徴を捉えることを試み、認知的情報処理が視覚情報に基いて動作が組織化される過程への関与について検討した。被験者10人がGrasping課題およびMatching課題をそれぞれ80試行遂行中の脳波および手指関節角度変化を計測し、課題動作開始時点前後に対する脳波に関して、Event-related synchronization/desynchronization(ERS/ERD)分析を行った。Grasping動作、Matching動作ともに同様の視覚刺激に対して同様の手指関節運動を産出するのだが、大脳皮質の活動を示すERDは、この視覚情報処理と関節運動の産出に関与する部位(視覚野・体性感覚野・運動野)に見られた。さらに、Grasping課題では後頭葉に皮質の活動の抑制を示すERSが見られた。Matching課題では標的の大きさを判断するという認知的情報処理が関節運動産出に介在するのに対して、Grasping課題の遂行には認知的情報処理が必ずしも必要でないことから、このERSは認知に関連した脳内情報処理の抑制と関与することが示唆された。以上の結果については、2007年8月、Santos(Brazil)にて開催された運動制御の国際学会にて発表するとともに、論文を国際学会誌に投稿中である。研究の目的:合目的な身体運動は、知覚-運動制御システムの連携によって組織化される。視覚情報は、脳内で外界に関する認知をもたらす情報処理(Ventral stream)と、状況に応じた動作産出を導く経路(Dorsal stream)により処理され、それぞれ認知・運動制御に関連すると報告されている。この知見を基に、知覚-運動産出過程に関与する大脳皮質レベルの活動特性について、「視覚情報による認知的活動が標的物を認識する」と、「視覚情報が動作を産出する」という過程に着目しながら検討する。本年度の研究実施報告:手を伸ばして人差指と親指により、標的をつまむ動作(Grasping課題)に対して、同様の手指関節の捕捉動作により、標的物の捕捉サイズを評価して表す(Matching課題)という動作課題を用いた。Ventral/Dorsal streamsの知見より、これらは同様の手指関節運動が産出されるが、課題遂行に必要とされる認知的情報処理過程は異なると考えられる。これらの運動課題遂行中の脳波を分析し、課題の性質に応じた脳内情報処理の特徴を探った。被験者10名が、コンピュータ画面上に表示される直径3cmの円形標的物に対して、以上2つの運動課題を行い、動作中の脳波を計測した。大脳皮質の活動レベルの増加を示す脳波の事象関連脱同期化(ERD)を分析した。(1)標的が表示されると、前頭部のERDは広範な周波数帯域において増加した。これは、Matching課題において顕著であった。(2)手指関節運動中は、Grasping課題では、広範な周波数帯域での顕著なERDが後頭・頭頂部に見られた。(3)前頭部および知覚運動野では、2つの課題によって異なる周波数帯域でのERDがみとめられた。以上の研究成果については、2007年8月に開催される学会Progress in Motor Control VI(Sao Paulo, Brazil)において発表することを予定している。今後の研究の展開について:本研究は、「運動課題遂行のための知覚-運動制御連関に関与する脳内情報伝達経路を見出し、それによってパフォーマンスにおける意識や認知的活動の影響・機能を探る」という大局的目標の基礎となる。

そのための実験パラダイムを確立するには、現在のデータをより詳細に検討する必要がある。特に、運動課題遂行中の脳波データについて系時的変化を、さらに検討したい。また、運動課題条件を操作することで、認知的活動の動作への影響を脳内活動の特徴の点から検討したいと考えている。身体運動によって運動課題を達成するしくみを解明には、如何にして知覚情報をもとにして動作の組織化が行われるのかについて理解する必要がある。本研究では、標的物に手を伸ばして捕捉する(Grasping)動作および、標的物の大きさを判断し同様の手指関節運動によって表示する(Matching)動作を、単純な円形の標的物あるいは、Ebbinghaus錯視を誘発する同様の標的物に対して遂行する場合の、視覚情報に基づいて手指関節運動による動作が形成される過程の大脳皮質レベルの活動の特徴を捉えることを試み、認知的情報処理が視覚情報に基いて動作が組織化される過程への関与について検討した。被験者10人がGrasping課題およびMatching課題をそれぞれ80試行遂行中の脳波および手指関節角度変化を計測し、課題動作開始時点前後に対する脳波に関して、Event-related synchronization/desynchronization(ERS/ERD)分析を行った。Grasping動作、Matching動作ともに同様の視覚刺激に対して同様の手指関節運動を産出するのだが、大脳皮質の活動を示すERDは、この視覚情報処理と関節運動の産出に関与する部位(視覚野・体性感覚野・運動野)に見られた。さらに、Grasping課題では後頭葉に皮質の活動の抑制を示すERSが見られた。Matching課題では標的の大きさを判断するという認知的情報処理が関節運動産出に介在するのに対して、Grasping課題の遂行には認知的情報処理が必ずしも必要でないことから、このERSは認知に関連した脳内情報処理の抑制と関与することが示唆された。以上の結果については、2007年8月、Santos(Brazil)にて開催された運動制御の国際学会にて発表するとともに、論文を国際学会誌に投稿中である。
陽電子寿命測定法を用いた構造物の疲労検査装置の開発

近年、インフラ老朽化が問題視され、構造物の安全性評価手段が求められている。陽電子寿命測定法を適用すれば、金属疲労を早期に探知出来る可能性があることから、その適用が望まれるが、従来の陽電子寿命測定ではサンプルの切出し加工が必要であるため、実現が困難であった。そこで本研究では、当研究室で開発した、サンプルの切り出し不要の陽電子寿命測定技術を適用し、オンサイトで構造物の測定を実現するための要素技術の開発を行った。これまで陽電子消滅を用いた金属疲労や照射損傷・クリープ損傷の研究が行われてきたが、従来の陽電子寿命測定法ではサンプルの切出し加工が必要である為、実際の原子炉や航空機等の構造物に関する疲労診断法としては応用出来ずにいた。そこで当研究室では、サンプルの切出し加工なしで陽電子寿命測定を可能とするアンチコインシデンス法を開発した。本研究ではこのアンチコインシデンス法を実際の原子炉や航空機等の構造物の測定に応用する為の要素技術の開発を行った。陽電子寿命測定法はNa-22放射性同位元素を用い、Na-22の取扱が許可された放射線管理区域で行う必要があるが、オンサイト(管理区域外)測定を実現するには下限数量以下(Na-22は1 MBq以下)の日本アイソトープ協会が認可した密封線源(規制対象外密封線源)が必須であり、また、短時間で高精度に測定できることも求められる。そこで平成25年度は、日本アイソトープ協会との共同開発により製品化した、カプトンフィルム製Na-22密封線源を適用し、また、陽電子寿命測定システムの時間分解能と検出効率の決定に重要なファクターとなるシンチレータサイズの最適化を行うことで、東洋精鋼株式会社との共同開発により行っているアンチコインシデンス法を適用した陽電子寿命測定装置プロトタイプのテスト販売開始に至った。また、汎用性の向上を目的としたポータブル型陽電子寿命測定装置の開発を行い、その上で必須となる、試作した遮光性を有するTi薄膜製Na-22線源について性能評価を行った。研究実績の概要として、近年、原子炉の経年劣化が問題となり、これまで陽電子消滅を用いた原子炉の金属疲労や照射損傷・クリープ損傷の研究が行われてきた。しかし、従来の陽電子寿命測定法ではサンプルの切出し加工が必要である為、実際の原子炉や航空機等の構造物に関する非破壊診断法としては応用できなかった。本研究ではこのアンチコインシデンス法を実際の原子炉や航空機等の構造物の測定に応用する為の要素技術の開発を行う。平成24年度はアンチコインシデンス法のための高性能Na-22密封線源の開発を行った。陽電子寿命測定法はNa-22放射性同位元素を用い、Na-22の取扱いが許可された放射線管理区域内で行う必要があるが、原子炉や航空機等の検査装置として応用する場合は放射線管理区域外で測定できることが求められる。その為、陽電子寿命測定用の線源としては下限数量以下(Na-22は1 MBq以下)の日本アイソトープ協会が認可した密封線源(規制対象外密封線源)の適用が必須となる。そこでまず、日本アイソトープ協会との共同開発により、高性能なNa-22密封線源の作製し、日本アイソトープ協会より規制対象外Na-22密封線源として製品化に至った。この技術を応用すれば、検査装置として、より高性能なNa-22密封線源の開発が可能になると考えられる。線源性能としては、ノイズとなる長寿命成分を低減すると共に、フィルム内で陽電子が消滅する割合を低減させることが求められる。そこで今回、Na-22をカプトンフィルムとシンチレータで封入した新線源(通常は2枚のカプトンフィルムで封入)を試作し、アンチコインシデンス法において線源内で陽電子が消滅する割合を約半分に低減しノイズ成分のない、高性能線源が実現した。通常、陽電子寿命測定では100万カウント程度積算(数時間測定)し、統計精度を高めて解析を行うが、本装置をオンサイトで利用する上では、数分程度の短時間測定が求められる。その場合、解析において線源成分をどう扱うかが重要となる。そこで平成26年度は陽電子寿命測定の解析条件についての検討とそれを行った。単結晶Siの陽電子寿命測定を2万カウントで10回測定し、線源成分(カプトン寿命380 ps)を固定した場合と固定していない場合で解析を行った。

この結果、線源成分(カプトン寿命380 ps)を固定せず解析した場合のサンプル寿命の標準偏差は28 psであったのに対し、固定することにより6.3 psとなり、積算の少ない場合線源成分(カプトン寿命380 ps)を固定して解析することにより良好な解析結果を得られることがわかった。これにより本研究により開発された線源により高精度な陽電子寿命測定が期待できる。また、本研究課題を通して得られた結果を基に本装置の仕様を決定し、プロトタイプを作製した。放射線計測現在までの達成度としては、前年度試作したポータブル型寿命測定装置の開発の上で必須となる遮光性を有するTi薄膜製Na-22線源を採用した陽電子検出器で観察された約1%のノイズの影響について検討したところ、要因はアンチコインシデンスを行う上でノイズをキャンセルする為に用いているシンチレータの寿命成分の可能性であることが考えられた。この長寿命成分が観察される現象はカプトンフィルム製Na-22密封線源では観察されない現象であり、Ti薄膜等の金属系薄膜を適用する際に観察されるものと考えられる。そこでシンチレータ由来の陽電子寿命成分をモデルとしたノイズの計算評価を行ったところ単結晶シリコンの陽電子寿命にして10 ps程度短く見積もってしまう傾向があることがわかった。そこで、長寿命成分をフィッティングパラメータに予め追加し、通常2成分解析を行うところを3成分解析することで、このサンプル寿命のずれを1桁程度緩和できるとの計算結果を得た。この値は短時間でのその場測定においては十分許容できる範囲と考えられる。この知見を解析条件に考慮した解析システムに反映していく、また本成果について論文を作成中である。現在までの達成度としては、日本アイソトープ協会との共同開発により、規制対象外の高性能陽電子密封線源が製品化された。性能評価を行ったところ、ノイズとなる長寿命成分は観察されず、高い品質が確認された。しかし、本線源は線源強度を保証するものであり、現状ではノイズ成分を保証してはいない為、ノイズ成分解析用プログラムを開発し、信頼性の向上を図る。また、このノウハウにより作製したカプトンシンチレータ線源の性能評価を行い、同時にノイズ成分が無く、かつ線源成分も約半分に低減されたアンチコインシデンスに特化した高性能線源が完成した。更に、25年度予定であった、ポータブル型寿命測定装置として遮光性を考慮した陽電子検出器の開発についても行い、Ti薄膜を用い遮光性を有する陽電子検出器が完成した。しかし、線源性能を評価したところ、ノイズとなる長寿命成分が1%程度観察された。この原因については現在調査中であるが、アンチコインシデンス法の原理的な要因の可能性が考えられる。今後この1%のノイズの影響について計算評価等を行っていき、許容範囲を超えると判断した場合はフィッティングなどの解析的な対応を検討する。インフラ構造物等の安全性評価に対する需要は日々変化している。交付申請当時は原子炉の疲労診断技術が重要だと考えられたが、原子炉廃止の傾向や、近年のインフラ老朽化の安全性評価への注目が高まっている。よって今後の研究推進方策としては、測定対象の形状や高放射線環境下等の様々な条件での測定を想定したポータブルタイプの陽電子寿命測定システムの開発に重点しする。
DNA修復時に働くRNRの活性調節機構の解析

バランスの取れたデオキシリボヌクレオチド(dNTP)の供給はDNA修復に必須である。ここで、我々はリボヌクレオチドレダクターゼ(RNR)サブユニットRRM1とRRM2が非常に迅速にダメージ部位に集まることを見出した。RRM1はTip60と生理的に結合した。I-SceIカセットを持つ細胞のクロマチン免疫沈降解析はRRM1がTip60依存的にダメージ部位へ結合することを示した。Tip60と結合できない活性を持つRRM1変異体はRRM1を除去したG1期の不完全なDNA修復を補うことができなかった。RRM1のC末部位によりRNRの集積を阻害するとDNAダメージに対する細胞の感受性を敏感にした。我々はTip60依存的なRNRのリクルートはDNA修復に対しdNTPを供給する必須の役割りを演じると提案する。リボヌクレオチドレダクターゼ(RNR)はDNA修復の際に原料となるdNTPsを供給する経路の律速酵素である。dNTPsプールは厳密に制御されていて不適当な供給はDNAに変異をもたらすことが明らかとなっている。出芽酵母からヒトに至るまでRNRは二つの大サブユニットR1と小サブユニットR2から構成される四量体として機能している。R1には活性中心とdATPによるアロステリック調節部位がある。我々は哺乳動物細胞においてRNRとTip60がクロマチン上で会合しTip60依存的にDNA修復箇所に移動することを報告した。Tip60がRNRの局在のみならず活性調節においても機能している可能性を考え以下の研究を行った。1) in vitroのTip60アセチルトランスフェラーゼアッセイヒトのR1タンパクを約100アミノ酸ごとに8つのペプチドに分割し、リコンビナントタンパクを大腸菌の系を用いて発現させた。Tip60については昆虫細胞に発現させ、Glutathion agarose-beadsによりpull-downし酵素とした。In vitroにおいてアセチル基を転移させた後抗アセチル化リジン抗体により検出するとアミノ酸1-100の中にTip60によりアセチル化されるリジンが存在することが示された。2)アミノ酸1-100の中のリジンを順次アルギニンに置換しin vitroアセチル化アッセイを行い5番目(K5)と17番目(K17)のリジンがアセチル化を受けていることを明らかにした。3)同定したアセチル化部位をリジンからアルギニンに変異させたR1変異体(R1 KR), R2およびTip60の複合体を昆虫細胞内で形成させ、抗アセチル化リジン抗体により検出するとK5RおよびK17Rともにアセチル化のシグナルが減少し、両部位がTip60によりアセチル化されていることを示唆した。ヒトをはじめとして全ての真核生物は常に内的、外的要因によるDNA損傷に曝されている。DNAの損傷を迅速に修復することは生物の生存にとり必須であり、この機構がうまく働かないことで癌などの疾患を引き起こすことになる。DNA修復には塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復や二重鎖切断修復など損傷の種類に応じて修復機構が異なるが、全ての場合に新たなDNA合成を必要とする。筆者はDNA修復に伴うDNA合成の原料となるデオキシリボヌクレオチドの供給に核酸の合成経路の律速酵素、リボヌクレオチドレダクターゼ(RNR)とDNA修復に必須であるヒストンアセチル化酵素Tip60の会合が重要であることを報告している。さらにTip60によるRNRのアセチル化修飾が活性調節する可能性を考えin vitroでアセチル化アッセイを行ったところ、RNRの5番および17番リジン残基がTip60依存的にアセチル化されることを見出し、昨年報告した。今年度はさらに詳細な検討を加えたところ、5、17番リジンに加え24、48番のリジンもアセチル化されていること質量分析により明らかにした。これらのアセチル化もTip60に依存するのかin vitroのアッセイ系において検討すると、Tip60によってアセチル化されることがわかった。RNRのアセチル化がその活性に影響を与えうるか知るために昆虫細胞内でRNR単独、あるいはRNRとTip60の共発現を行い、このタンパクを用いてRNR活性を測定するとTip60と共発現させたRNRでは活性が増強していることが明らかとなった。現在in vtroで同定した部位を変異させ、アセチル化されないようにしたタンパク質を調整してTip60依存的な酵素活性の増強が得られるのか試験しているところである。これらのアセチル化が活性に影響を与える場合、いかなる変化がRNR分子内で起きているのか、アロステリック調節との関わりから検討を進めて行く予定である。DNAの安定性を維持することは我々ヒトを含む全ての真核生物にとり最も重要であると言える。

このためDNAが紫外線なのど外的要因、または活性酸素など内的要因により損傷を受けるとこれを速やかに修復する機構が発達して来た。これらの修復機構の欠陥は癌などの重篤な疾患の原因となることが明らかにされている。我々はDNA修復に伴うDNA合成の際に原料となる核酸(dNTPs)をDNAポリメラーゼに供給するための機構を明らかにした。この機構はdNTPs産生経路の律速酵素リボヌクレオチドレダクターゼ(RNR)がDNA修復に必須の働きを持つヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)であるTip60と複合体を形成することでDNA損傷部位に到達し、その近傍でdNTPsの産生を行うと考えられるものであった。このときRNRの触媒サブユニットRRM1はTip60によるアセチル化修飾を複数箇所受けていることを昆虫細胞内にRNRのリコンビナント変異体とTip60を共発現させる方法によるin vitroのアッセイ系で明らかにした。また内在性のRRM1をMS解析することによりin vivoにおいてもRNR内にアセチル化修飾を受けていることを確認した。これらのアセチル化部位のうちRNRのアロステリック調節部位内に位置するものはRNR活性に影響を与えることが予想されるので昆虫細胞内において発現させたRRMI野生型およびアセチル化されるリジンアルギニンに置換したKR変異体、RRM2調節サブユニット、Tip60を発現させ、精製しRNR活性を測定するとRRM1がアセチル化されることで活性が維持される傾向にあることが明らかになって来た。
治療標的検索のための肺がん細胞におけるメカニカルストレスの解析

がん細胞は、周囲からの物理的な力に対して特異的な反応を有することが予想されている。肺がん細胞株にストレッチ刺激や基質硬度の変化などの物理刺激を与えて、細胞増殖や分子発現への影響を検討した。基質硬度の低下により、PD-L1の発現は低下し、細胞増殖は抑制された。薬理学的な実験より、アクチン依存的な機序であった。腫瘍の基質の硬度などの物理的な微少環境が腫瘍免疫の制御にも関与することが示唆された。がん細胞は、周囲からの物理的な力に対して特異的な反応性を有すると推測される。本研究では、がん細胞に対する物理的な力(メカニカルストレス)の解析により、がんの進展、転移のメカニズムの理解を深め、それを阻止する新たな治療戦略の立案を目的とする。上記の目的のため、培養ヒト肺線維芽細胞、肺癌細胞株(A549 H460)、不死化肺上皮細胞(上皮細胞にCDK4、hTERT遺伝子を導入して作成)、KRASを遺伝子導入した不死化肺上皮細胞などの種々の細胞を作成、準備した。これらの細胞を、培養dish表面の弾性(2-50 kPa)をハイドロゲルにより調整できるPetrisoft (Matrigen社CA)で培養して、細胞増殖、細胞形態を検討した。肺線維芽細胞では、50 kPaに比較して、2 kPaでは細胞の増殖能の低下や細胞形態(細胞面積cell area,周囲長perimeter,縦横比aspect ratioなど)が変化した。さらに、ウェスタンブロット法や免疫染色においてα-SMA蛋白発現ならびにアクチンストレスファイバー形成などの変化を認めた。それらに比較して、肺癌細胞、不死化肺上皮細胞において、2 kPaの弾性の基質では、上記の肺癌細胞、不死化上皮細胞ではそれらの変化は認めなかった。がん細胞において、基質弾性の低下に関わらず、細胞増殖や細胞の機能を維持できることが示唆され、さらに低弾性(0.5 kPa)の基質における検討や低血清下での検討を予定している。本研究では、細胞株に対して、伸展刺激の負荷、軟弾性の基質上の培養により、細胞の増殖能、Ca2+濃度や細胞骨格の変化などの形態学的な変化が生じるかを検討し、さらに細胞内のmRNA、マイクロRNAの発現や細胞外への情報伝達物質の分泌能を検討する計画であった。しかしながら、培養ヒト肺線維芽細胞においては、弾性の変化により細胞増殖能やたんぱく質の発現レベルの低下を認めたが、癌細胞においては、増殖能の変化は軽微であり、形態学的に顕著な変化も認めなかった。当初の予想では、不死化肺上皮細胞株や上皮性の性質が強い肺癌細胞株において、線維芽細胞と同様な変化が生じると予想していたが、予想には一致しなかった。そのため、さらに培養条件(基質より軟性にする。培養液の血清の濃度を変化させる)を変化させて、癌細胞もしくは不死化細胞株の増殖が抑制を検討する。抑制タンパク質の発現パターンが変化する条件を模索する。また、がん細胞にストレッチ(進展)刺激により、細胞内骨格、細胞内Ca2+濃度、遺伝子(mRNA,マイクロRNA)発現パターン、サイトカイン分泌、エクソソームの放出などの変化を検討する予定であったが、ストレッチ(進展)刺激を細胞に与える実験装置のセッティングに時間を要しており、担当する予定の協力者の不在などのため、癌細胞で検討が若干遅れている。がん細胞は、周囲からの物理的な力に対して特異的な反応を有することが予想される。それの特性を解明して、癌細胞特異的な治療法を見いだすことを研究の目的としている。がん細胞を培養表面の弾性を低下させて条件(0.5 kPa, 2 kPa)で培養すると、多くのがん細胞では細胞増殖が抑制されたが、肺癌細胞H460と中皮種細胞MESO1においては、増殖の抑制効果が減弱することが判明した。肺正常上皮細胞を不死化した細胞株HVEC、それにKRASを導入して悪性度と高めた細胞株においても、低い弾性で増殖が可能であった。このことは、当初は癌の進展、悪性化の進行にともない、低い弾性条件において増殖が可能になることを予想していいたが、一部の癌においては、低い弾性条件において、正常上皮細胞よりも強く増殖が抑制されることが判明した。このことは、一部の肺癌細胞株の増殖には、基質の硬さ、おそらくがん細胞及び間質性細胞による細胞外マトリックスの硬さが、癌細胞の増殖に必須であることが示唆された。さらに、本年度は、腫瘍免疫で注目されている腫瘍細胞におけるPDL1分子の発現が基質の硬度により、発現が低下することを見出した。PDL1の発現は、インターフェロンγなどの種々のサイトカイン、oncogene signalなどで複雑に制御されることが知られているが、細胞環境すなわち基質の硬度によっても制御される可能性を見出した。肺癌治療において、PD1抗体療法は既に、臨床の場において使用されているので、肺癌細胞の周囲の基質の硬度により、増殖のみならず、腫瘍免疫の反応性が制御される可能性があり、細胞による反応性に違い、そのメカニズムを検討していく予定である。この研究の目的は、肺癌細胞株に生じるメカニカルストレスの反応性を解明して、治療標的を検索するものである。当初は、悪性度の進行に伴い、メカニカルストレス(低硬度基質、進展刺激)のもとで細胞増殖が、正常上皮と比して変化することが予測していたが、正常細胞に比して、強く増殖が抑制される細胞株と抑制されない細胞株が存在することが判明した。

現在基質の硬度における細胞内伝達経路の変化を検討しており、Rho系の信号が制御しているかを、種々の阻害剤を用いて検討中である。肺細胞に進展刺激を生じると、ATPの細胞外への放出が増加することをすでに報告しているが、肺癌細胞にATPを添加すると、PDL1の発現が変化する可能性を検討しているが、一部の肺癌細胞では、発現が増加する傾向があった。このように、基質の硬度の変化やメカニカルストレスに関連したATPなどにより、PDL1発現が変化することを見出しており、その制御経路を解明しつつある。メカニカルストレスが、細胞増殖のみでなく、腫瘍免疫においても重要な役割をはたしていることが示されており、そのメカニズムが解明されれば、PD1抗体療法の効果予測因子や、効果を増強する併用療法の開発につながると思われる。このように、物理的な刺激に関連した治療標的を探索中です。本研究においては、治療標的の探索という点では、メカニカルストレスとPDL1発現の関連を明らかにしつつあり、進捗していると考える。がん細胞は、周囲からの物理的な力に対して特異的な反応を有することが予想される。それの特性を解明して、癌細胞特異的な治療法を見いだすことを本研究の目的としている。がん細胞を培養表面の弾性を低下させて条件(0.5 kPa, 2 kPa)で培養すると、多くのがん細胞では細胞増殖が抑制されたが、肺癌細胞H460と中皮種細胞MESO1においては、増殖の抑制効果が減弱することが判明した。肺正常上皮細胞を不死化した細胞株HVEC、それにKRASを導入して悪性度と高めた細胞株においても、低い弾性で増殖が可能であった。当初は癌の進展、悪性化の進行にともない、低い弾性条件において増殖が可能なことを予想していいたが、一部の癌においては、低い弾性条件において、正常上皮細胞よりも強く増殖が抑制されることが判明した。このことは、一部の肺癌細胞株の増殖には、基質の硬さが、癌細胞の増殖に必須なことが示唆された。また、腫瘍免疫で注目されているPDL1分子の発現が、基質の硬度により、発現が低下することを見出した。PDL1の発現は、インターフェロンγなどのサイトカイン、oncogene signalにより複雑に制御されるが、細胞環境すなわち基質の硬度によっても変化することを見出した。機序としては、アクチン重合の阻害剤であるサイトカラシンDにより阻害されるので、アクチン依存性であることをしました。さらに、RNA干渉により、PDL1分子の発現を低下させると、細胞増殖も抑制された。物理学的な力が、肺がん細胞の増殖や腫瘍免疫にも関与していることが示唆された。がん細胞は、周囲からの物理的な力に対して特異的な反応を有することが予想されている。肺がん細胞株にストレッチ刺激や基質硬度の変化などの物理刺激を与えて、細胞増殖や分子発現への影響を検討した。基質硬度の低下により、PD-L1の発現は低下し、細胞増殖は抑制された。薬理学的な実験より、アクチン依存的な機序であった。腫瘍の基質の硬度などの物理的な微少環境が腫瘍免疫の制御にも関与することが示唆された。上記の問題の解決のために、使用する細胞株の種類を増やし、培養条件(低濃度血清の培地、増殖因子付加の培地)を変更して、基質の弾性度やコーティングを改良することにより、細胞の増殖能の差が検出できるようにする。
ゲルマニウム／ひずみーシリコンヘテロ接合を用いたトンネル電界効果トランジスタ

27年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞内αNTPプールの不均衡が誘導するDNA二本鎖切断と細胞死の分子機構

マウス乳癌由来FM3A細胞の細胞内αNTPプールが不均衡になるとDNA二本鎖切断が起き、100200kbpという特異的な大きさのDNA断片とapotosisに特有なヌクレオソーム単位(180bp)らラダー状DNA断片を生じ細胞は死に至る。我々は、この細胞死を、αNTP Imbalance Deathと名付けた。この細胞死はタンパク質合成阻害剤サイクロヘキシミドにより抑制される。さらにチミジル酸合成酵素阻害剤FUdRの作用によりαNTPプールが不均衡となったFM3A細胞のlysate中には、Controlの細胞には検出されないDNA二本鎖切断酵素(エンドヌクレアーゼ)が誘導され、この酵素がαNTP ImbalanceDeathに重要な役割を果たしていると考えられる。そこでαNTPプール不均衡時に誘導されるエンドヌクレアーゼの単離精製を行った。FM3A細胞にFUdR(1μM)を作用させ、この時誘導されるDNA二本鎖切断酵素の製精を行い性質を調べた。DNAを含むSDS-PAGEにより分子量45,000付近にDNA binding proteinとエンドヌクレアーゼが検出され、目的の酵素の分子量は45,000であることが明らかとなった。この精製したDNA二本鎖切断酵素は、至適pH6.0で二価金属イオンを要求せず10mM以下の低NaCl濃度で強い二本鎖切断活性を示した。この酵素は裸のファージDNAをランダムに二本鎖切断したが、ミニクロモソーム構造をとるSV40ゲノムDNAは切断しなかった。今回精製したエンドヌクレアーゼは従来知られている酵素とは全く異なる新しい酵素である。またFUdRは細胞をS期で停め細胞死を引き起こすことがすでに分かっており、この時生じるDNA断片の100200kbpのサイズは哺乳動物細胞のreplication unitとほぼ一致することから、このDNA二本鎖切断はS期の細胞のDNA複製開始点において、ほどけてむき出しとなった裸のDNAの部分を切断していると考えられる。我々は哺乳動物細胞内dNTPプ-ルが不均衡になるとDNA二本鎖切断を行う酵素が誘導さ細胞が死に至る機構について研究を行った。DNA二本鎖切断に行う酵素(endmucpase)をDEAEーaganoseカラムクロマトグラフィ-で10mMacl分画に分取し、phospho collulose,CMーcellulose及びby dnoxylaptiteカラムクロマトグラフィ-で精製し、SDSーアクリルアミドゲル電気泳動でsingle tomlである事を銀染色で確めた。分子量は約50Kダルトンであり、ゲル慮過カラムクロマトグラフィ-で約100Kダルトンである事から二量体であると推定した。この電気泳動を単一になったタンパク質がendonucloseであるかどうか確認するため、DNAを封したSDSーアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動後、リン酸カリウムbuffer中で12時間洗う事でSDSを除去し、ゲル内でmuclaseの反応を行い、エチジュ-ム、ブロマイドで染色する事でmuclase反応が進行した部位がDNAが切断され染色されずバンドとして検出される。この方法を用いたところ我々の精製したタンパク質はmuclase活性を有している事が判った。一般にendonuclaseはCA^+aMg^+イオンを活性発現のため必要とするが、我々のmuclseはこれら二価イオンを必要とせず、リン酸カリウムbuffer(10mM,pH6.0)中で反応する事が判った。

現在このendumulere活性を有するタンパク質のアミノ酸列をブロッテング法で行い既知の酵素かどうかを検討中である。面白い事にこのendemuclaseはM13ファジ二本酸DNAを用いて性質を調べたところ、ス-パコイルド二本鎖DNAを選択的に切断(二本鎖)する事が分った。マウス乳癌由来FM3A細胞の細胞内dNTPプールが不均衝になるとDNA二本鎖切断が起き、100200Kbpという特異的な大きさのDNA断片とapotosisに特有なヌクレオソーム単位(180bp)のラダー状DNA断片を生じ細胞は死に至る。我々は、この細胞死を、dNTImbalance Deathと名付けた。この細胞死はタンパク質合成阻害剤サイクロヘキシミドにより抑制される。さらにチミジル酸合成酵素阻害剤FdURの作用によりdNTPプールが不均衡となったFM3A細胞のIysate中には、Controlの細胞には検出されないDNA二本鎖切断酵素(エンドヌクレアーゼ)が誘導され、この酵素がdNTPImbalance Deathに重要な役割を果たしていると考えられる。そこでdNTPプール不均衡時に誘導されるエンドヌクレアーゼの単離精製を行った。FM3A細胞にFdUR(IuM)を作用させ、この時誘導されるDNA二本鎖切断酵素の精製を行い性質を調べた。DNAを含むSDS-PAGEにより分子量45,000付近にDNA binding Proteinとエンドヌクレアーゼが検出され、目的の酵素の分子量は45,000である事が明らかとなった。この精製したDNA二本鎖切断酵素は、至適pH6.0で二価金属イオンを要求せず10mM以下の低Nacl濃度で強い二本鎖切断活性を示した。この酵素は裸のファージDNAをランダムに二本鎖切断を示したが、ミニクロモソーム構造をとるSV40ゲノムDNAは切断しなかった。今回精製したエンドヌクレアーゼは従来知られいる酵素とは全く異なる新い酵素である。またFUdRは細胞をS期で停め細胞死を引き起こすことがすでに分かっており、この時生じるDNA断片の100200Kbpのサイズは哺乳動物細胞のreplication unitととほぼ一致すこととから,このDNA二本鎖切断はS期の細胞のDNA複製開始点において、ほどけてむき出しとなった裸のDNAの部分を切断していると考えられる。
子どもから老人までを対象としたストレスマネジメント教育システムの開発

本研究は、児童期から青年・壮年期に至る現代人のもつ問題点を解決する手段として最近米国教育界で試行が始まった「ストレスマネジメント教育」を実現するための支援機器の開発と、これを利用した教育プログラムの作成を試みるものであった。ストレス反応を計測・モニターする支援装置(RMA;remote multiamplifier)本体の設計と、これを駆動するための基本プログラムの仕様策定は平成7年度中に完了し、平成8年秋にプロトタイプ3機を完成、そして本年度には評価用最終版10機を完成・配布した。廉価・軽量・簡便なRMAは、脳波、筋電図、眼電図、心電図、呼吸、皮膚温などの生体信号を合計9チャンネル測定でき、パソコンと連動して作動する。RMA駆動基本ソフトは、RMAプロトタイプの完成後、RMA評価プログラムを2種開発の上、幾度かのバ-ジョンアップを経て、今年度秋に一応の完成をみた。Windows95上のVisual BASICで稼動するこの基本ソフトは、機種を問わず使用できるので、特殊な用途のプログラムも、ボタンを貼り付けただけで追加できる。今年度は、(1)心拍率と自発性瞬目を使ったストレス反応性測定プログラム、(2)驚愕性瞬目反射を使った不快気分測定プログラム、(3)脳波周波数成分、指尖部・額部皮膚温、ならびに額部筋電図を使ったリラクセーション訓練効率化プログラム、および(4)胸腹部呼吸曲線の合成波形を使った腹式呼吸法修得プログラムなどを試作し、その評価実験を行った。今後は、RMAを中心に据えた、子どもから勤労者、主婦、老人、病者・障害者等を対象としたストレスマネジメント教育のための、より具体的・実際的なプログラムを開発する予定である。本年度はストレスマネジメント教育システム作りの基本部分の設計を行った。すなわち、(1)パーソナルコンピュータにシリアルインターフェースで接続できる9chの生体信号計測機器(リモートセンサー・アンプ)の基本設計、(2)胸部・腹部呼吸曲線計測用センサー技術の評価、ならびに(3)ストレスマネジメント実施プログラムの策定を並列的に行った。(1)システムの設計・制作本リモートセンサは、8chの生体現象として、汎用電気現象4ch用アンプ(脳波、筋電図、眼電図)、および呼吸2ch、皮膚温ないし核温1ch、心電図測定用の専用アンプ、ならびに直流現象入力用汎用アンプの合計9chからなる。16bitのマイクロプロセッサ(MP)を内臓し、専用言語によってデジタルフィルタリング、脳波等の周波数成分積分値計算、心電図r波検出とr-r間隔計算等の1次処理まで遂行し、9600bpsの速度でパーソナルコンピュータ本体に転送するような仕様である。3月末日現在、基本回路の設計を終え、基盤作成ならびにMP用プログラムのコ-デイング作業を行っているところである。(2)胸部・腹部呼吸曲線計測用センサー銅製鋼材繊維をコイルに加工した新素材を用いて、呼吸測定用シャツの試作をし、予備実験を行ったが、良好な結果は得られなかった。今回のシステムでは、ZnSO4混入チューブを縫いつけたシャツの制作に決定した。(3)ストレスマネジメント実施プログラムの策定研究分担者が定期的に集まり、GreenbergのStress managementの輪読会を実施するとともに、各種研究会・学会から必要な情報、すなわちストレスマネジメント技法の習得ならびにプログラム作成のノウハウを蓄積した。現在小中学児童版(震災被災児童版を含む)、大学生版、タイプA者版、入院成人患者版、の試作版を完成した。平成8年度は9月に完成予定のリモートセンサを利用した、児童用、成人用、老人用の教育プログラムを完成させ、試用実験を行う予定である。ストレスマネジメント教育システム開発の二年目にあたる平成8年度は、(1)リモートマルチアンプ(RMA)の完成、(2) RMA評価ソフトの開発、ならびに(3)呼吸法習得プログラムの開発を行った。(1) RMAの完成本システムの中心となるリモートマルチアンブ(RMA)を完成させた。

RMAは、9チャンネルの生体アンプ部、一部処理部、およびパソコンとの通信部の3つの部分に分かれる。平成8年7月に評価版3機、そして同11月には改良版3機を完成し、現在最終版10機の制作中である。(2) RMA評価プログラムの開発RMAをパソコン上のWindows95からコントロールし、RMAから送られてくる生体情報をパソコン上に表示・加工、かつRMAの性能が全て評価できるソフトウェアを開発した。本ソフトは当初DOS上で、そして現在はWindows95上のVisual Basic V4.0によって稼働している。本ソフトを用いて、現在もRMAの不具合調査と最適測定条件検索のための予備的実験を行っている。(3)呼吸法習得プログラムの開発平成8年度中にマルチメディア技術を駆使した呼吸法習得のための教材プログラムの大枠を完成し、目下開発・コーディング中である。現在開発中のプログラムは、成人を対象としたもので、ストレス評価部と、ストレスコントロール部とからなる。ストレス評価部は、ストレッサー、ストレス反応、コーピングスタイル、性格、ソーシャルサポート等ストレス緩和要因をインタラクティブに評価・診断する。ストレスコントロール部は、ストレス反応を抑えるための各種技法(呼吸法、自律訓練法、筋弛緩法)を、呼吸、心電図、脳波、眼球運動等の生体情報をモニターすることによって効率よく習得させるものである。平成9年度上半期には、RMAの機能を充分生かした大学生向けソフトを完成させ、下半期には当初の予定通り、対象者を児童、老人にまで広げたソフトウェアを完成させたい。本研究は、児童期から青年・壮年期に至る現代人のもつ問題点を解決する手段として最近米国教育界で試行が始まった「ストレスマネジメント教育」を実現するための支援機器の開発と、これを利用した教育プログラムの作成を試みるものであった。ストレス反応を計測・モニターする支援装置(RMA;remote multi amplifier)本体の設計と、これを駆動するための基本プログラムの仕様策定は平成7年度中の完了し、平成8年秋にプロトタイプ3機を完成、そして本年度には評価用最終版10機を完成・配布した。廉価・軽量・簡便なRMAは、脳波、筋電図、眼電図、心電図、呼吸、皮膚温などの生体信号を合計9チャンネル測定でき、パソコンと連動して作動する。RMA駆動基本ソフトは、RMAプロトタイプの完成後、RMA評価プログラムを2種開発の上、幾度かのバ-ジョンアップを経て、今年度秋に一応の完成をみた。Windows95上のVisual BASICで稼動するこの基本ソフトは、機種を問わず使用できるので、特殊な用途のプログラムも、ボタンを貼り付けだけで追加できる。今年度は、(1)心拍率と自発性瞬目を使ったストレス反応性測定プログラム、(2)驚愕性瞬目反射を使った不快気分測定プログラム、(3)脳波周波数成分、指尖部・額部皮膚温、ならびに額部筋電図を使ったリラクセーション訓練効率化プログラム、および(4)胸腹部呼吸曲線の合成波形を使った腹式呼吸法修得プログラムなどを試作し、その評価実験を行った。
転写制御系の変化の解析に基づく芳香族化合物代謝系オペロン造成機構の解明

CA10株のCAR分解に関与するcar遺伝子群([ORF9]carAaAaBaBbCAcAdD)(CARからアントラニル酸[AN]への変換に関与)、ant遺伝子群(antABC)(ANのカテコールへの変換に関与)が両オペロンの5'上流に存在するP_<ant>プロモーターからAN誘導的に発現することを示した。さらに、転写制御領域、制御タンパク質、エフェクター分子、転写開始点も解明した。まだ、carオペロンはcarAa直上流のσ^s依存性carAaプロモーターから構成的に転写されることも明らかにした。P_<ant>プロモーターは本来antオペロンの上流に存在したが、挿入配列の転移に伴い、car遺伝子群の上流へと転移し、car遺伝子群のCAR生育時の発現誘導(代謝中間体であるANを誘導基質とする)に関与することを示した。2.新規カルバゾール分解菌の単離と祖先型car遺伝子群の転写制御機構新たに10株のCAR資化菌を取得し、CAR分解系遺伝子群の構造解析の結果、Janthinobacterium sp.J3株のcar遺伝子群がCA10株のcar遺伝子群の祖先型であることが明らかになった。J3株のcar遺伝子群は、不安定な代謝中間体であるメタ開裂物質により転写誘導されるP_<u13>プロモーターの制御下にあり、発現誘導機構や発現プロファイルがCA10株のcar遺伝子群とは全く異なることが示された。特にCA10株のcar遺伝子群の場合は強い発現量が長く継続する傾向が見られ、ISの転移に伴うP_<ant>プロモーターを獲得することでCARの効率的分解に適した形に進化したことが示された。約15kbのcar遺伝子群(carAaAaBaBbCAcAdDFE)は、carAaからcarDまでとcarFEの2本の主要な転写単位としてカルバゾール生育時に誘導的に転写されており、carAa遺伝子上流にはアントラニル酸ジオキシゲナーゼ遺伝子の一部(ORF9)とそのプロモーター部分が転移している。プライマー伸長法により、carAa、carF、ORF9の開始コドンからそれぞれ38bp、117bp、79bp上流に転写開始点が存在していることが明らかになった。carAaの転写開始点は、carAa遺伝子を含むタンデムに重複した領域に見出された。また、レポータージーンアッセイによりORF9の転写開始点上流50100bpに転写を正に制御する領域が、上流100200bpに負に制御する領域の存在が示された。2、他のダイオキシン・カルバゾール分解菌が有するcar遺伝子群様遺伝子群の転写様式の解明car遺伝子群周辺領域の遺伝子構造を詳細に比較検討した結果、K23株、J3株、OM1株のcar遺伝子群ホモログはCA10株のそれと類似した転写様式を有していることが予想された。一方、Sphin gom onas sp.KA1株のcar遺伝子群(carAaBaBbCAc)の上流逆向きにGnt R familyのregulatorタンパク質をコードする遺伝子が見出された。CA10株には該当する酵素遺伝子は存在しないことから、KA1株のcar遺伝子群はCA10株のそれと全く異なる機構で転写誘導が起こっている可能性が示唆された。3、選択圧がダイオキシン・カルバゾール分解系遺伝子群の構造と転写様式の変化に及ぼす影響の解析レポーター遺伝子をcar遺伝子内に挿入した変異体作成用のプラスミド構築を行っている。car遺伝子群([ORF9]carAaAaBaBbCAcAdD)は、ORF9上流に存在するアントラニル酸誘導性antプロモーターと、carAa直上流のcarAaプロモーターから転写される。

レポータージーンアッセイにより、ORF9上流にantプロモーターが存在した場合、カルバゾール生育時においてcar遺伝子群の発現量が約3倍程増大することが示された。また、経時的な発現解析から、carAaプロモーターからは構成的に発現することが示された。また、carAaプロモーターはcarAa開始コドン上流309492bpに存在することも明らかとなった。2、他のcar遺伝子群様遺伝子群における転写様式3、選択圧がダイオキシン・カルバゾール分解系遺伝子群の構造と転写様式の変化に及ぼす影響の解析昨年度に引き続きレポーター遺伝子car遺伝子群内に挿入した変異体作成を行うとともに、栄養培地、無機培地を用いてケモスタット装置によりCA10株などを培養する際の培養条件の検討を行った。car_<CA10>オペロン([ORF9]carAaAaBaBbCAcAdD)の転写には少なくとも2つのプロモーター、アントラニル酸誘導性プロモーターP_<ant>と構成的プロモーターP_<carAa>が関与する。また、P_<ant>は本来アントラニル酸代謝に関わるantオペロンのプロモーターであり、ISPrelの転移によってORF9の上流にも存在する。本年度、antオペロン上流にコードされる2つのAraC/XylS familyの転写制御因子候補(ORF22,ORF23)のうち、ORF23産物がP_<ant>のアントラニル酸誘導的発現に必須であることが明らかになりAntRと命名した。この結果から、AntRはant遺伝子群上流、ORF9上流の2つのP_<ant>を介して、カルバゾールをカテコールにまで変換する酵素系全ての誘導的発現を制御することが示された。一方、P_<carAa>はcarAa開始コドン上流446406bpの領域に存在することが明らかとなり、更にP_<carAa>はσ^S依存性プロモーターであることが示唆された。以上より、CA10株のカルバゾール分解系においては、P_<carAa>から微弱に発現したcar遺伝子群産物がカルバゾールをアントラニル酸まで変換し、生じたアントラニル酸がP_<ant>からの強力な遺伝子発現を誘導する転写活性化サイクルが機能していることが明らかになった。2.他のダイオキシン・カルバゾール分解菌が有するcar遺伝子群様遺伝子群の転写様式の解明Janthinobacterium sp. J3株が有するcar_<J3>オペロン([ORFU13]carAaBaBbCAcAdD)はcar_<CA10>オペロンの祖先型であることが詳細な塩基配列の比較から推定されている。car_<J3>オペロンの転写には誘導性プロモーターと、P_<carAa>様の構成的プロモーターが関与することが明らかとなった。ORFU13開始コドン71bp上流に転写開始点が見出され、相当するプロモーターをP_<u13>と命名した。また、P_<u13>はcar_<J3>オペロンの上流逆向きにコードされるGntR familyの転写抑制因子CarR_<J3>によって制御されていた。
アクチナイド化合物のフェルミ面の研究

アクチナイド化合物の5f電子は、局在性の強い希土類化合物の4f電子と、遍歴性を示す遷移金属化合物の3d電子の中間に位置している。その特異な物理的性質の解明は、物性基礎論のみならず、新しい磁性・超伝導材料の応用的開発の見地からも極めて重要となっている。価数揺動・高密度近藤状態など、伝導電子と4f電子との結合による多体電子状態は、Ce、Sm、Ybなどの希土類イオンを含む化合物の特異な磁性・超伝導の本質であり、国内外で精力的に研究されている。類似した異常磁性はウランを中心としたアクチナイド化合物の5f電子系においても見出され、その基本物性の解明は本重点領域研究「アクチナイド化合物の物性」の基本課題である。これらのf電子系に共通して見られる特徴は、極めて大きな有効質量をもつ重い電子の存在である。重い電子は、異常磁性を示すだけではなく、UP_<t3>などでは超伝導を示す場合もあり、酸化物高温超伝導体と本質的類似性がある。本研究班では、極低温(10mK)、強磁場(14.5T)下での超音波、帯磁率等の精密測定をおこない、アクチナイド化合物、希土類化合物の重い電子系のフェルミ面構造、有効質量の詳細な実験を目標にしている。極低温下でのdHVA効果の実験に必要である大型希釈冷凍機の独自開発は、本計画研究の中心課題であり、東北大学科学計測研究所附属工場で設計製作をおこなっている。科研に設置された第1号機は完成し、試運転が進められている。東北大理に設置される第2号機は設計が終了し製作が進められている。超伝導磁石は、納入後に重大な欠陥が見出され、修理をおこなっていたが、完了し次年度当初から予定の実験が始められる。勿論、既存の^3Heクライオスタットを用いた研究は精力的に進められ、UC、UB_<12>などのアクチナイド化合物でdHVA効果の観測に成功するなど少しずつではある成果が出ている。
真菌類ゲノムからの新規酵素遺伝子発見

本研究では真菌類ゲノムを用いて、遺伝子が未定義の酵素反応に対する遺伝子配列を明らかにしていくことを目的としている。代表者らは先行研究において、微生物ゲノムを用い100種類以上の遺伝子未知酵素反応について対応する遺伝子を計算機的に予測し、2例については実験的にその酵素活性を実証している。真核生物に関しては遺伝子未知の代謝反応が数多く報告されているにもかかわらず、遺伝子のゲノム上の位置関係とそれらの遺伝子機能類似性に相関がないために上記の手法を利用することができなかった。本研究計画の目的はオーファン酵素の遺伝子配列を真菌ゲノムを利用して発見することである。本研究でこれらの遺伝子が明らかになれば、これまで機能の存在すらわからなかった酵素反応機構を大規模な配列類似性検索で予測することが可能になり、昨今のデータ解析の時代において、非常に大きな前進になることは間違いない。本研究ではそこで開発した解析パイプラインを活用し、真菌類に用いるために改良した。真菌類においては遺伝子がオペロン構造を取る例がほとんどないため、遺伝子のゲノム上の隣接関係を利用することが困難である。しかしながら遺伝子系統プロファイル類似度などのパラメーターを利用することで原核生物種にたいする予測パイプラインと同様に、真菌類に対しても80%以上の正答率でオーファン酵素に対する遺伝子配列を予測することが可能となり、現在報告論文を準備中である。また、本遺伝子予測パイプラインの一部であるドメインを利用した機能アノテーションについては論文として報告している。ここでは特定の酵素反応に特的に現れるドメイン構造をデータベース化しており、そのドメイン構造から遺伝子予測を行うパイプラインである。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子反応が報告されている生体内酵素反応は4000種類を超えているが、その三分の一は実際の酵素タンパク質のアミノ酸配列及びその遺伝子配列が報告されていない。ゲノム解析などの基礎になる遺伝子への機能アノテーションは既知の遺伝子配列に対する類似度を元に行われており、このような化学的知識に対する遺伝子配列情報の欠如は本来生体が持つ酵素機能の三分の一以上を取り逃がしていることなる。そこで、本研究では、真菌類ゲノムを用いてそれら遺伝子が未定義の酵素反応に対する遺伝子配列を明らかしていくことを目的としている。真核生物に関しては遺伝子未知の代謝反応が数多く報告されているにもかかわらず、遺伝子のゲノム上の位置関係とそれらの遺伝子機能類似性に相関ないために上記の手法を利用することができなかった。これまで真核生物種では原核生物のような遺伝子隣接関係と機能的な相関が確認されていなかったが、近年、真菌類における代謝経路では遺伝子クラスター(シンテニー)が確認された。構築した遺伝子予測パイプラインはバクテリアと同じパラメーター設定だとランダムに予測したものとほとんど変化がない結果となった。現在、酵素反応特異的なドメイン情報及び、化合物の変換パターンを利用した予測手法を組み合わせた統合アノテーションツールの開発を行っている。今後は遺伝子距離のみならず遺伝子発現量などの他のパラメーターを加えて予測精度を上げていく予定である。