hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PSTI欠損に伴い発生する生物学的諸現象(オートファジー細胞死、膵炎)の機構解析

トリプシノーゲンの異所性(膵内)活性化(トリプシン生成)にひきつづいて生じる連鎖的な諸プロテアーゼの活性化によって、膵の構成細胞が自己消化されるに至るという機構が,膵炎の主要な発症機構と考えられている。我々が樹立した膵分泌性トリプシンインヒビター欠損マウスの膵腺房細胞で誘導されるオートファジー(自食作用)の役割を解析する目的で、膵臓腺房細胞で特異的にオートファジーが欠失するマウスを作製した。このマウスは生理的条件下では異常は示さないが、セルレインで膵炎刺激を誘導すると、抵抗性を示した。さらに単離した膵腺房細胞に細胞内トリプシン活性化刺激を加えると、トリプシンの活性化がほとんど検出されないことが判明した。このことは腺房細胞内トリプシン活性化、つまり、膵炎発症機構にオートファジーが重要な役割を担っていることを示している。1.Rat elastasel promoter/enhancer(膵臓腺房細胞で特異的に発現する)+ヒトPSTI cDNA(wild、N34S、R67c)+PolyAのトランスジーンをマイクロインジェクション法により受精卵に移植し、トランスジェニックマウスを作製した。現在ラインの樹立を行っている。ラインの樹立後、Psti欠損マウスと交配して、通常状態での膵炎発症の有無、およびセルレインの腹腔内投与により誘発した急性膵炎の重症度を比較する。2.膵腺房細胞で特異的に働くRat elastaselpromoter/enhancer遺伝子の下流にCre遺伝子を結合したプラスミドを作製し、マイクロインジェクション法でマウス受精卵に導入し、腺房細胞特異的にCre蛋白を発現するマウスの作製を行った。このマウスとconditional Atg5欠損マウスと交配し、膵腺房細胞特異的オートファジー欠損マウスを作製した。このマウスは現在出生後12カ月齢まで観察を行っているが、生理的条件下では特に表現型は示さなかった。つまり通常状態では膵腺房細胞ではオートファジーは必ずしも必要ないことが判明した。しかしこのマウスに急性膵炎を惹起する刺激を行うと、コントロールマウスに比較して膵炎に伴う腺房細胞障害が抑制された。さらにオートファジーによって腺房細胞が障害されるメカニズムを明らかにするために、腺房細胞を単離して、細胞内のトリプシノーゲンを活性化させる刺激を行ったところ、単純Atg5欠損腺房細胞ではトリプシノーゲンの活性化が抑制されることが判明した。膵臓腺房細胞内でトリプシノーゲンがトリプシンに活性化されるメカニズムを明らかにした。1.急性膵炎の発症には、膵腺房細胞内におけるトリプシンの異所性活性化が原因であるとされてきた。しかし本来細胞内では活性化されにくい仕組みになっているはず(トリプシノーゲンとして存在している)のトリプシンがどのようなメカニズムで活性化されるのか、これまで明らかにされていなかった。われわれは膵臓内在性トリプシンインヒビターのノックアウトマウスの解析から、トリプシンの活性化とオートファジー(自食作用)が共存していることを見出し、オートファジーとトリプシンの活性化には何らかの関連があるのではないかと考え、条件的(膵腺房細胞)Atg5欠損マウスを作製し、実験を行った。さらにオートファジーによって腺房細胞が障害されるメカニズムを明らかにするために、腺房細胞を単離して、細胞内のトリプシノーゲンを活性化させる刺激を行ったところ、Atg5欠損腺房細胞ではトリプシノーゲンの活性化が抑制されることが判明した。膵臓腺房細胞内でトリプシノーゲンがトリプシンに活性化されるメカニズムを明らかにし、Journal of Cell Biologyにアクセプトされた。2. PSTIの膵臓以外の臓器における機能を明らかにするために、まずPSTIの全身の局在を明らかにした。膵臓以外にも胎生期の脳、消化管、泌尿生殖器にも発現が確認され、トリプシンインヒビター以外にも多彩な機能を有していることが示唆された。この研究成果はHistochemistry and Cell Biologyにアクセプトされた。1.ヒトPSTI過剰発現

マウスの作製変異PSTIが遺伝性膵炎の原因遺伝子であることを証明するために、ラットエラスターゼ1プロモーター+ヒトPSTI遺伝子およびヒト変異PSTI(N34SおよびR67C)のcDNAをマウス受精卵に導入し、マウスラインを樹立した。これらのマウスではmRNAレベルでヒトPSTIの発現は確認されたが、蛋白レベルでの発現が確認できなかった。PSTI cDNAは250bpと非常に小さいために、このような現象が起きるのではないかと考え、各エクソン間にイントロンの一部(5'側200bp、3'側300bp)を挟み込むPSTI minigeneを作製し、再度マウスを樹立することにした。2. PSTIによるオートファジー制御の可能性オートファジーは細胞外からのシグナルによって、mTORを介して制御されていることが知られている。Psti欠損マウスの膵臓では過剰なオートファジーが誘導されることから、Pstiはいったん細胞外に分泌された後、再度細胞外からmTORを制御している可能性が考えられる。そこで培養細胞にPSTIリコンビナント蛋白を細胞外から加える実験を行った。膵癌細胞はPSTI蛋白によって、細胞増殖が促進されるが、細胞外のPSTIはEGFRを介して、細胞内シグナル伝達系に作用していることが明らかとなった(Molecular Cancer Research)。さらにPsti欠損膵ではmTOR蛋白が欠失していることも判り、PSTIがオートファジーの負の制御因子である可能性が示唆された(Current Enzyme Inhibition)。
不安症・強迫症に対する認知行動療法の治療効果予測

不安症や強迫症などの精神疾患に対する認知行動療法は、薬物療法に劣らない治療効果を発揮するが、提供できる医療機関や治療者の数は限られている。そこで、認知行動療法が奏効する可能性が高いと判断される患者に優先的に提供していくためには、治療反応性が高いと予測することが有効である。本研究では、認知行動療法の治療効果を、認知機能検査とMRI脳機能・形態画像により、従来より高い確率で予測できる因子を探索する。
有限群のカルタン行列の固有値

Gを有限群、標数p>0の代数的閉体F上の群環をFGとし、そのblockをB、Bのdefect groupをDとする。BのCartan行列のCの固有値、特にPerron-Frobenius固有値ρについてはあまりよく知られていなかったが、我々は次のようないくつかの事実を発見した。1.trivial FG-加群のprojective coverの次元をu、Gの最大正規p-部分群の位数をqとすると、q≦ρ≦uが成り立つ。Gがp-可解群のとき、あるいはDが巡回群のときは、ρ≦|D|が成り立つ。ここで一般の場合の評価式において、下限と上限が共にBに無関係な量であるのは、満足すべき結果ではない。Bに依存する量であってかつきれいな形で書けることが望ましい。2.ρは整数とは限らないが、もし整数ならば|D|以下のpのべきになることがわかった。Dが巡回群のときは、|D|に一致する。これが巡回群でなくても一般に成り立つのではないかと思われるが、まだ未解決である。3.ρはCの様々な性質を反映している。Cの列和達はBに属する既約FG-加群のprojective cover達の組成因子の個数を表している。一般にρは列和達の平均の値に近く、従ってBの根基のべき零指数t(B)と何等かの関係があると思われる。Dが巡回群のとき、またBがtame typeのときなどは、t(B)≦ρが成り立つ。その他いくつかの結果から、我々は、任意の群、任意のblock Bについてt(B)≦ρが成り立つであろうと予想している。しかし、まだGがp-可解群のときすら、未解決である。
近代化による環境変化の地理情報システム

本総括班の主たる活動は本領域の全研究に関するチェックとレビュ-であるが、具体的には以下の研究および全体の指導と調整を行なった。1.総括班会議と並行して平成2年6月(第1回)と平成3年3月(第2回)にシンポジュウムを開催した。第1回シンポジュウムにおいては研究方針について討議し、第2回では計画・公募の全研究の発表をにもとづき本年度の成果を評価した。2.明治以降の経済統計、地図、水文、気候に関する統計の整備状況の年表を作成し、資料収集と分析の指針とした。これに基づき研究班相互の調整を行なった。3.本領域の研究で共通の分析法となる地理情報システムに関しては、本年度は9大学と1研究所にARC/INFOを導入した。総括班ではこのシステム構築、価格等の検討を行なったほか、システム操作の講習会を開催した。また、メッシュ図に関しては国土数値情報の処理に関するソフトを「GIS技術資料」として公開した。4.本研究領域の国際協同研究(IGBPおよびHDGEC)における位置づけを検討した。デ-タベ-ス、時空間分析と並んで、環境変化のモデル化が急務であると考えられた。また、国際協力に関しても具体的な計画を推進した。5.計画・公募の全ての研究成果を取りまとめ、「近代化による環境変化の地理情報システム、平成2年度総合報告書I、II」(総頁数554ペ-ジ)を刊行した。情報交換と研究調整を目的とし、隔月に年6回ニュ-ズレタ-を発行した。
果樹枝への外科的処理効果は何故生じるか?木部と師部の通導性の同時測定による解明

期間後半の計画に沿って、オウトウ`佐藤錦'の苗木を用いて、ガラス室内で幹に4種の外科的処理を施し、枝内の蒸散流量計測に使用する茎熱収支法(HB法)および^<13>C法により木部と師部の通導性を比較した(実験1)。また、実験圃場の`高砂'成木2樹の3年生枝に同種の外科的処理を施し、葉や果実への影響を比較した(実験2)。なお、両法の実験設定・条件は期間前半(平成15年度)の結果を参考にしたが、外科的処理内容は新たに設定し直し、環状はく皮処理(A区)、師部をほとんど傷つけずに千枚通しで枝に穴をあけ、極細の糸鋸で木部を破壊し、その部分には流動パラフィンを注射器で注入する部分的木部切断処理(B区)、彫刻刀で幹の一部を削り、木部と師部の通導性を同時に部分的に破壊する刀傷処理(C区)および無処理(D区)とした。実験1と実験2とも各区4反復した。【実験1の中味】幹を通じて上昇した水量(蒸散量)はガラス室内の気象条件の日変化や実験材料の違い、とりわけ、着葉数などに強く影響を受け、HB法からの蒸散量の絶対比較は困難であった。しかし、外科的処理を施す以前からHB法を継続観測する方法により、蒸散量の相対比較(処理以前に対する処理後の蒸散量の減少率の比較)を行ったところ、蒸散量の減少率には、A区>B区≒C区>D区の大小関係が認められた。処理直後では環状はく皮処理が蒸散をも減退することは注目すべき結果であろう。師部を通じて根に転流した^<13>C量にはD区≒B区>C区>A区の大小関係が認められた。【実験2の中味】葉厚にはA区>B区≒C区≒D区、葉緑素相対濃度(SPAD)にはD区≒B区>C区≒A区、果実重量にはC区≒D区>B区≒A区、果実着色(a^*値)と糖度(Brix)にはA区>B区≒C区≒D区の大小関係が認められた。期間前半の計画に沿って、1)オウトウとセイヨウナシの苗木を用いて、ガラス室内で^<13>C法および枝内の蒸散流量計測に使用する茎熱収支法(HB法)の適切な実験設定や実験手法を検討するとともに(実験1)、2)両樹種の成木に3種類の外科的処理を施し、枝葉と果実に及ぼす影響の調査に加え、処理方法、強さ、時期などを検討した(実験2)。【実験1の中味】(1)前年地植えの1年生苗木を塩化ビニル樹脂製ポットに移植したとき、ガラス室内では翌年の6月あるいは9月頃に実験を行うのが望ましいこと、(2)HB法装置(購入した測定装置、Flow4)の運転方法に習熟できたこと、(3)HB法による茎内水移動速度と重量法による蒸散速度(電子台秤法、Sartorius F3200S)の間に密接な関係を見出したこと、(4)同化産物と水の両者の移動を調節するための外科的処理には木部のみ除去する環状はく皮のほかに、木部と師部の両者を部分的に削り取る処理(彫刻刀利用)および師部をほとんど傷つけずに木部のみ部分的に除去する方法(ナイフの利用)を考案したこと、(5)ポット植え材料に^<13>C処理を施すための装置を検討し、アルミアングルと塩化ビニルフィルム袋を用いた簡易な同化チャンバに、内部に^<13>CO_2発生装置と外部に冷却装置(mist & fan)を取り付け、必要数製作したこと、(6)高温のガラス室内における同装置の運転試験(チャンバ内気温、相対湿度、CO_2発生後のガス濃度の変化)の検討、(7)<13>C施与材料のサンプリング方法(根量の調査など)の検討などの実験成果を得た。【実験2の中味】無処理区に比べ、(1)結縛処理と捻枝処理は両樹種とも果径、糖度、葉厚を増大、(2)捻枝はセイヨウナシの枝の枯死をもたらした、(3)イオン発生シートの被覆の効果は無かった。【実験1の中味】

幹を通じて上昇した水量(蒸散量)はガラス室内の気象条件の日変化や実験材料の違い、とりわけ、着葉数などに強く影響を受け、HB法からの蒸散量の絶対比較は困難であった。しかし、外科的処理を施す以前からHB法を継続観測する方法により、蒸散量の相対比較(処理以前に対する処理後の蒸散量の減少率の比較)を行ったところ、蒸散量の減少率には、A区>B区≒C区>D区の大小関係が認められた。処理直後では環状はく皮処理が蒸散をも減退することは注目すべき結果であろう。師部を通じて根に転流した^<13>C量にはD区≒B区>C区>A区の大小関係が認められた。【実験2の中味】葉厚にはA区>B区≒C区≒D区、葉緑素相対濃度(SPAD)にはD区≒B区>C区≒A区、果実重量にはC区≒D区>B区≒A区、果実着色(a^*値)と糖度(Brix)にはA区>B区≒C区≒D区の大小関係が認められた。
肺癌浸潤B細胞が認識する腫瘍抗原の抗体療法への応用

肺癌細胞に高発現する細胞表面蛋白であるUOEH-LC-1に対する特異的抗体療法を構築することを目的としている。UOEH-LC-1蛋白を組み換えタンパク質として産生・精製し、マウスに免疫することにより、UOEH-LC-1蛋白に対する抗体を産生するB細胞を作製した。このB細胞をミエローマ細胞と融合し、IgG抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。UOEH-LC-1蛋白高発現肺癌細胞株A110L移植SCIDマウスモデルにおいて、尾静脈より精製抗体を投与するin vivoの実験を施行した。しかし、コントロール群に比較して、UOEH-LC-1抗体による抗腫瘍効果は認めなかった。本研究は、肺癌細胞に高発現する細胞表面蛋白であるUOEH-LC-1(Cancer Res.2007 67:8351-7.)に対する抗体療法を確立する目的で、以下に示す計画を進めている。UOEH-LC-1蛋白を組み換えタンパク質として大量に生産・精製し、マウスに免疫することによりUOEH-LC-1蛋白に対するモノクローナル抗体を得る。マウスを用いた治療モデルを作製し、in vivoでの抗腫瘍効果の有無を確かめる。さらにヒト化抗体の作製を検討する。平成20年度は、UOEH-LC-1蛋白を産生、精製し、この蛋白に対するモノクローナル抗体を作製する過程を行っている。まずUOEH-LC-1蛋白を組み換えタンパク質として産生・精製した。次に、2匹のマウスに対してUOEH-LC-1蛋白を繰り返し免疫することにより、1匹は4回、もう1匹は5回免疫後に、マウス血清中に抗体の産生を認めた。これらを犠牲死させ、ミエローマ細胞と融合した。得られたハイブリドーマの限界希釈を施行することで、8株のハイブリドーマクローンを樹立した。最終的に2クローンのIgM抗体を産生する株を得ることができた(15E2,10B2)。これらのIgM抗体はいずれもUOEH-LC-1蛋白を認識することをELISA法にて確認している。さらに現在FACS,免疫染色法により抗体の特異性の評価を行っている。今回のハイブリドーマはいずれもIgM抗体産生株しか樹立できずIgG抗体産生株が得られなかった。原因として、免疫するUOEH-LC-1蛋白量が足りなかったためクラススイッチが起きなかった可能性が考えられた。現在は、UOEH-LC-1蛋白量を増量(1回あたり10μg)してマウスに免疫し、IgG抗体を産生するハイブリドーマの作製を行っている。本研究は、肺癌腫瘍内浸潤B細胞に認識され肺癌細胞に高発現する細胞表面蛋白であるUOEH-LC-1に対する特異的抗体療法を構築することを目的としている。当該年度においては、UOEH-LC-1蛋白を組み換えタンパク質として大量に作製・精製し、マウスに免疫することによりUOEH-LC-1蛋白に対する臨床応用可能なモノクローナル抗体を得ることを目標とした。研究初年度はIgM抗体しか得ることができなかったため、本年度は、モノクローナルIgG抗体を得ることを目標とした。これまでは、免疫するUOEH-LC-1蛋白量が足りなかったためIgG抗体へのクラススイッチがうまく起きなかった可能性が考えられた。今回、抗体を産生するB細胞の誘導において、UOEH-LC-1蛋白を増量(1回あたり10μg)してマウスに免疫した。その結果、マウス血清中に抗体産生を認めたため、犠牲死させミエローマ細胞と融合を行った。得られたハイブリドーマに対して、限界希釈を施行することで2株のハイブリドーマクローンを樹立した。スクリーニングの結果、1クローンのIgG抗体産生株を得た(7B6E)。このモノクローナルIgG抗体は、サブクラスIgG1であり、UOEH-LC-1蛋白を認識することをELISA法にて確認した。さらに現在、FACSおよび免疫組織化学染色により抗体のUOEH-LC-1蛋白に対する特異性の評価を行っている。今後、このモノクローナルIgG抗体のin vitroにおける抗腫瘍効果の評価、および動物治療モデルを作成し、in vivoでの治療効果の有無を検討する。本研究は、肺癌腫瘍内浸潤B細胞に認識され、かつ肺癌細胞に高発現する細胞表面蛋白であるUOEH-LC-1に対する特異的抗体療法を構築する目的に対して3年計画で進めている。本年度は計画最終年度にあたる。研究初年度はIgM抗体しか得ることができず、次年度に1クローンのIgG抗体産生ハイブリドーマ株(サブクラスIgG1)を得ることに成功した(7B6E)。本年度は採取したモノクローナルIgG1抗体がUOEH-LC-1蛋白を認識するかどうかの検討を行った。まず、7B6Eハブリドーマ株を大量培養し培養上清よりIgG抗体の精製を行った(SHP)。

精製した抗体(SHP)は濃度依存性にUOEH-LC-1蛋白を認識することをELISA法にて確認した。UOEH-LC-1蛋白を固層化したプレートに抗体を添加して、ELISAを施行したところ精製抗体(SHP)はハイブリドーマ培養上清(7B6E)より強くUOEH-LC-1蛋白を認識した。次に、腫瘍細胞上に発現するUOEH-LC-1蛋白を精製抗体(SHP)が認識するかどうか、フローサイトメトリーを用いて確認した。UOEH-LC-1蛋白高発現肺癌細胞株A110Lに対しての抗体認識を確認したところ、200ng/mlでその認識を認め、その認識は濃度依存性に増強を認めた。以上より作製したIgG抗体(UOEH-LC-1抗体)が肺癌細胞表面上に発現するUOEH-LC-1蛋白を認識することを確認した。このin vitroの結果のもとに、UOEH-LC-1蛋白高発現肺癌細胞株A110L移植SCIDマウスモデルでの、尾静脈より抗体を投与するin vivo実験を施行した。しかし、コントロール群(PBS投与)に比較して、UOEH-LC-1抗体による抗腫瘍効果は認めなかった。現在、抗体の投与量、投与間隔などの条件設定を行っている。
膵癌微小環境normalizationと浸潤を導くleading cellの解明

コラーゲン・ゲル三次元培養モデルを作成し、膵癌細胞と膵星細胞を共培養したところ、膵星細胞が膵癌浸潤を先導する形で浸潤しており、さらに基質リモデリングによりコラーゲン配列を浸潤方向に変化させていた。膵星細胞の基質リモデリング因子のひとつとしてEndo180を同定した。Endo180をノックダウンした膵星細胞は浸潤能が抑制され、それに伴い膵癌細胞の浸潤も抑制された。またEdno180を抑制した膵星細胞では、ミオシン軽鎖IIのリン酸化が減少しており、ミオシン軽鎖IIを介した細胞骨格のリモデリング能の低下が膵星細胞の運動能力を低下させ、基質リモデリング能が低下すると考えられた。我々は、膵星細胞が細胞外マトリックスに与える影響を検討するため、膵星細胞が作成する細胞外マトリックスを作り出す技術を用いて、ヒト膵癌切除組織から樹立した膵星細胞から細胞外マトリックスを作成した。三次元細胞外マトリックスは、フィブロネクチンやI型コラーゲンを豊富に有し、通常ディッシュ上での培養と比較して、癌細胞の上皮間葉転換を促進することが判明した。また、その線維配列を解析すると、作成する際の細胞数が多いほど平行な線維の割合が増加することが判明した。膵星細胞の活性化因子の一つとして知られるTGFβの添加実験では、膵星細胞が作成する細胞外マトリックスの質的特徴に明らかな変化はみられなかったが、低酸素下においては通常酸素下と比較して誘因にマトリックスの線維の平行性が増加した。次に、膵癌浸潤を先導するleading cellの検討を行うため、コラーゲン・ゲルを用いた三次元培養モデルを作成し、膵癌細胞と膵星細胞の培養を行ったところ、ゲル上に膵癌細胞と膵星細胞の共培養群では、膵癌細胞単独群、膵星細胞をゲル内に埋め込みゲル上に癌細胞を培養した群と比較して、有意に膵癌細胞の浸潤・増殖能が増加した。また膵癌細胞の浸潤に先立って膵星細胞の浸潤がみられ、leading cellの役割を担う膵星細胞が存在することが判明した。さらに膵星細胞が浸潤したコラーゲン・ゲルは浸潤がないものと比較して、有意にコラーゲンの線維方向に変化がみられ、浸潤した膵星細胞が基質リモデリングを行っていることが示唆された。また、その線維配列を解析すると、低酸素下においては通常酸素下と比較して誘因にマトリックスの線維の平行性が増加した。膵星細胞が作り出した細胞外マトリックス上で膵癌細胞を培養して観察したところ、マトリックスの平行な線維の割合が多いほど、膵癌細胞の運動軌跡が増加した。次に、膵癌浸潤を先導するleading cellの検討を行うため、コラーゲン・ゲルを用いた三次元培養モデルを作成し、膵癌細胞と膵星細胞の培養を行ったところ、ゲル内に膵癌細胞と膵星細胞の共培養群では、膵癌細胞または膵星細胞単独群と比較して、有意に膵癌細胞の浸潤・増殖能が増加した。膵星細胞の基質リモデリング因子のひとつとして、コラーゲン取り込みレセプターであるEndo180に注目した。Endo180を抑制した膵星細胞と、膵癌との共培養において、膵癌の浸潤が低下した。膵星細胞のEndo180を抑制すると、膵星細胞の基質リモデリング能が低下し、癌浸潤が抑制されると考えられた。ヒト切除組織由来膵星細胞から三次元細胞外マトリックスを作成することに成功し、その線維構築の評価方法も確立したこと、さらに作成した三次元細胞外マトリックスを使用して、癌細胞と細胞外マトリックスの相互作用も検討でき、平行な線維成分が多いほど癌細胞の運動が増強することが判明した。また膵癌におけるleading cellについては、その役割を担っている膵星細胞が存在することを証明し、膵癌進展におけるleading cellの役割として、間質リモデリングの関与が示唆されたこと、さらに膵星細胞の基質リモデリング因子のひとつとしてEndo180が同定できるなど、一定の成果を得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられた。細胞外マトリックスの線維配列の変化といった質的特徴の変化が癌浸潤に関与していることが確認できたが、膵星胞のphenotypeによる細胞外マトリックスの質的特徴と量的特性パターンについては今後検討が必要である。膵癌の過剰な間質増生は、膵星細胞の持続的なmatrix remodelingによって維持される。また、膵癌浸潤を先導するleading cellが存在し、間質の質的配列の影響を受けると考えられている。そこで、膵癌微小環境の正常化であるnormalizationにより、leading cellの制御を目的として研究をおこなった。まず、膵星細胞が作成する細胞外マトリックスに着目し、その線維配列を解析したところ、低酸素下においては通常酸素下と比較して有意にマトリックスの線維の平行性が増加した。

細胞外マトリックス上で膵癌細胞を培養したところ、マトリックスの平行な線維の割合が多いほど、膵癌細胞の運動軌跡が増加した。次に、膵癌浸潤を先導するleading cellの検討を行うため、コラーゲン・ゲルを用いた三次元培養モデルを作成し、膵癌細胞と膵星細胞の培養を行ったところ、膵星細胞が膵癌浸潤を先導する形で浸潤していく様子が観察できた。さらに、Leading cellである膵星細胞は基質リモデリングによって、基質のコラーゲン配列を浸潤方向に変化させていた。また、膵星細胞の基質リモデリング因子のひとつとしてEndo180を同定した。Endo180の膵星細胞のEndo180の発現が生体内で膵癌浸潤能にあたえる影響について検討するため、マウス膵同所移植モデルでの実験を行ったところ、shRNAを用いてEndo180をノックダウンした膵星細胞と膵癌細胞を共移植した群では、コントロール群と比較して有意に膵星細胞の腺房や間質への浸潤能が抑制され、それに伴い腫瘍ボリュームも有意に減少した。またEdno180を抑制した膵星細胞では、ミオシン軽鎖IIのリン酸化が減少しており、ミオシン軽鎖IIを介した細胞骨格のリモデリング能の低下が膵星細胞の運動能力を低下させ、基質リモデリング能が低下すると考えられた。コラーゲン・ゲル三次元培養モデルを作成し、膵癌細胞と膵星細胞を共培養したところ、膵星細胞が膵癌浸潤を先導する形で浸潤しており、さらに基質リモデリングによりコラーゲン配列を浸潤方向に変化させていた。膵星細胞の基質リモデリング因子のひとつとしてEndo180を同定した。Endo180をノックダウンした膵星細胞は浸潤能が抑制され、それに伴い膵癌細胞の浸潤も抑制された。ヒト切除組織由来膵星細胞から三次元細胞外マトリックスを作成することに成功し、その線維構築の評価方法も確立したこと、さらに作成した三次元細胞外マトリックスを使用して、癌細胞と細胞外マトリックスの相互作用も検討できた。また膵癌におけるleading cellについてはその存在を確認し、膵癌進展におけるleading cellの役割として、間質リモデリングの関与が示唆されたことなど、一定の成果を得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられた。一方で膵癌細胞のphenotypeによる細胞外マトリックスの質的特徴と量的特性パターンについては十分に検討を行うことができなかった。Leading cellの主な役割は基質リモデリングと考えられ、細胞外マトリックスの線維配列の変化といった質的特徴の変化が癌浸潤に関与していることが確認できた。今後はさらに細胞外マトリックスの質的特徴や量的特徴と、癌浸潤についての関連を調べるため、硬度や配列が異なる細胞外マトリックス上で培養した膵癌細胞の形態、及び増殖能、遊走能、浸潤能を評価する。また膵星胞のphenotypeによって細胞外マトリックスの質的特徴と量的特性パターンについて違いがあるか検討を行っていく。
唾液腺腺様嚢胞癌の悪性度に関する因子の研究

1.症例の予後調査について過去7年間の腺様嚢胞癌症例は18例(大唾液腺10例、小唾液腺8例)であった。現在まで無病生存例は9例で5例は死亡し残り4例は担癌生存である。死亡例は局所再発の有無はあったが、最終的にいずれも肺転移から呼吸不全をおこしたものであった。この腫瘍における遠隔転移の機構の解明が必要であると考えられた。2.腫瘍の免疫組織化学的検討検討した18例中、6例で異変型p53の発現がみられた。またEGF,EGFRの発現のみられる腫瘍細胞も存在した。しかしながら全体として増殖能を示す指標は低く,この腫瘍の特異性が客観的に示された。増殖能は低いが転移能が高い理由を今後検討する必要がある。検索する対象を更に拡大する必要性を感じた。3.腫瘍の染色体分析本年は新鮮例が一例しか得られず、腫瘍の分離、培養があまり良好といえなかった。結果として正常型の染色体のものしか観察できなかった。この方法は習熟が必要でこのような頻度の少ない腫瘍にはあまり適した方法ではないようである。今後、実施には工夫が必要である。4.統括今回の検討で腺様嚢胞癌は増殖能が低いのにかかわらず、遠隔転移が多発していることが判明した。転移に関連する因子として細胞接着因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、CD44などについて今後検討してゆく予定である。
タオル、衣服・寝具材料としてのパイル地の快適性能設計に関する研究

熱・水分移動の実験については、サーモラボIIに接続させる、水の送出機能を付けた熱測定部(BT box)すなわち発汗シミュレータを、試料端方向への熱の漏れの低減や微量水分の送出精度の向上などに留意して設計、試作した。主熱板(直径46mm)の周囲に保護熱板リングを設け、主熱板とガードリングの面積比に合わせて、水を送出する孔を主熱板に1個、ガードリングに6個空け、各マイクロシリンジと個別に接続し、モーターで不感蒸散レベルから多量発汗まで一定速度でプランジャーを移動させることにより、熱板の各孔から水を送出する構造とした。熱板温度の安定性もよく(皮膚温一定条件)、発汗速度の切り替えに対応した潜熱も含めた熱損失量の過渡的変化が捉えられ、布試料間の差も現されるものの、布と熱板間の空気層の温度。湿度(衣服内気候)については、温湿度センサーでの結露が懸念された。今後、より小型の高速応答温湿度センサーに変えて測定を試みるほか、測定精度向上のための改良や条件設定などさらに検討を重ねた上で、パイル地の熱・水分移動の特徴を明らかにする。一方・アパレル用の細番手糸を用いたパイル組織の異なる布や、緯糸打ち込み数とパイル倍率を各3段階変化させ試織したパイル地などを試料として、布の構造特性と、力学・表面特性値およびそれらから誘導されるドレープ性や立体曲面性能、最適シルエット判別値と、官能評価による触感や各種用途に対する適性などの相互の関連を示した。スカートの揺動の美しさの視覚評価実験では、各種婦人服地と比較してパイル地のスカートの美しさの評価値は低く、また、パイル倍率が高いほど触感は好まれるが、繰り返し水洗濯後、オーバーロック処理した裁ち端でのパイル糸の突出が目立つなど、衣服素材としてパイル地を用いる場合、デザイン、縫製仕様の面などで留意する必要性が示唆された。市販のタオルや衣服・寝具用反物パイルなどから織物構造、糸構造、繊維素材、加工などの異なる各種パイル地37種を選定し、女子大学生が手触りの良さについて5段階評価を行い、さらに温かさ、やわらかさ、なめらかさ、総合的な好き嫌いなどの各項目についてSD法による手触り評価を行った。一方で、これらの布の構造特性やKESシステムによる力学・表面特性、通気性、過渡熱移動特性などを測定し、パイル(ループ)あるいはシャーリング、無撚糸使用などの各種タイプ別のパイル地の特性値に見られる特徴および手触り評価値との関連を示した。特に衣服向けに開発された薄手のパイル反物に注目し、同じ地経糸、緯糸、パイル糸で機密度および打ち込み本数を同一条件とし、織組織構造を変化させたパイル地の各特性値の変化を調べた。また、実際に衣服用布地としての適性を見るため、外観の美しさや着用感などの実験用スカートをパイル地以外の布とともに作製した。熱・水分移動特性については、恒温恒湿室の制御不具合発生のため、充分な精度のデータが得られず、温湿度調整コントロールボックスを急遽試作することとなった。また、発汗した皮膚に着用した場合の衣服内温湿度や熱・水分移動量を測定するため、人体の発汗データや発汗シミュレータなどの文献を参考にして、発汗シミュレータを設計し、次年度試作して実験可能とするとともに、コントロールボックス内で種々の温湿度条件下での調湿した布の力学・表面特性、乾燥特性などもあわせて実施予定である。現在、同一糸使い・織組織で、パイル倍率のみ段階的に変化させたサンプルなどをメーカーに試織依頼中で、パイル培率の違いが布の上記各特性に及ぼす影響を、洗濯による物性変化やパイルのねじれなど繊維集合構造の変化も含めて、次年度にまとめる予定である。

スカートの揺動の美しさの視覚評価実験では、各種婦人服地と比較してパイル地のスカートの美しさの評価値は低く、また、パイル倍率が高いほど触感は好まれるが、繰り返し水洗濯後、オーバーロック処理した裁ち端でのパイル糸の突出が目立つなど、衣服素材としてパイル地を用いる場合、デザイン、縫製仕様の面などで留意する必要性が示唆された。
高齢摂食・嚥下障害者に対する咀嚼・嚥下補助床の臨床的有効性に関する検討

嚥下(飲み込み動作)に障害のある高齢者に対する歯科的な対応として、嚥下補助床とよばれる特殊な入れ歯を用いた方法が応用され始めているものの、その作製基準などは定められていない。今回我々は、嚥下補助床の作製基準の一つである咬合高経(かみ合わせの高さ)に関する研究を行った。その結果、嚥下機能の低下した高齢者においては、嚥下補助床の作製に際して、咬合高径を通常の義歯と比較して低く設定する必要性のあることが明らかとなった。【目的】摂食・嚥下障害者に対する歯科的対応の一つとして下顎臼歯部の咬合支持を保ちながら、口蓋の容積を調節して舌運動を容易にした嚥下補助床(swalloaid;SA)が考案され、いくつかの報告がなされている。先行研究よりSAの臨床的な効果は認められているものの、多様な嚥下障害を有する高齢者に対するSAの明確な作成基準が確立されていない現状にある。そこで、咬合高径の変化に伴う固有口腔の容積変化が嚥下時の口蓋部舌圧に及ぼす影響について検討を行った。【対象と方法】十分な説明の後に、本研究への参加に同意の得られた口腔機能に問題を認めない高齢者3名(女性3名)を対象とした。口蓋部に小型圧力センサ(PS-2KC,共和電業製)を埋め込んだ上顎咬合床を作成し、プリンを嚥下した時の口蓋部舌圧を測定した。圧力センサは仮想正中線上3か所、左右側方2か所の計5か所に設置した。通法にて作成した上下顎咬合床に対して、-3mm、-5mm咬合高径を下げた下顎咬合床を作成し、同様の舌圧測定を行い、それぞれについて検討を行った。【結果と考察】各被験者ともに咬合高径の低下により、各センサ部位において最大圧に違いが認められ、その様式は個人により異なる結果であった。嚥下時の舌と口蓋の接触時間では、高径が低くなることにより、前方と比較して後方部で長くなる傾向を示した。口腔機能に問題のない高齢者では、代償的な運動により、固有口腔の容積変化を補正している可能性が考えられた。【まとめ】本研究より、咬合高径の変化による固有口腔の容積変化が、嚥下時の口蓋部舌圧に影響を及ぼす可能性が示唆された。なお、本研究は昭和大学歯学部医の倫理委員会の審査、承認(2007-33)を経て行われた。本年度は、十分な説明の後に本研究への参加に同意の得られた介護老人保健施設利用看8名(男性2名、女性6名、平均年齢歳)を対象とした。対象者の選定に当たっては、歯科医師が嚥下機能のスクリーニングを行い、プリンの嚥下に問題のないと判断された者とした。初年度の実績から同部位に小型圧センサを埋め込んだ咬合高径の異なる2種類の研究用SAを作製し、最大圧および作用時間について検討を行った。研究用SAの咬合高径は通法によるものと、通法から5mm下げたものとした。8名の対象者のうち2名においては通法にて作製したSAにおいては嚥下が困難であり、危険と判断されたため、6名のデータにて検討を行った。危険と判断された2名においては、通法にて咬合高径を設定したSAの装着が困難であった者1名と通法によるSAの装着は可能であったが嚥下動作が困難であった者1名であった。なお、咬合高径を通法より5mm下げたSAでは2名ともにプリンの嚥下は可能であった。嚥下の口腔期における食塊移送の様子を表すとされる正中線上に設定した各センサに注目すると、前方部(切歯乳頭後方)では、6人の被験者のうち4名において、最大圧の増加が認められた。しかしながら、舌口蓋接触時間においては増加したものは3名であった。同様に中央部、後方部においても、4/6および5/6の割合にて最大圧が増加しているものの、舌口蓋接触時間では減少する者が半数以上存在した。側方部では、左右とも咬合高径の低下に伴い、最大舌圧は被験者全員において増加する傾向を示した。舌口蓋接触時間では、増加する者と減少する者の割合が、半数ずつであった。以上の結果から、嚥下機能の低下した高齢者においても咬合高径の低下による嚥下時の舌圧および舌口蓋接触時間は、後方部においてその影響は受けやすいことが明らかとなった。
生体膜の情報受容と伝達機構の生理と病態:プロテインキナーゼCの研究

プロテインキナーゼC(PKC)の情報伝達における役割の解明は医学生理学領域での重要な課題となっている。最近、その分子多様性が明らかとなりその生理意義が問題となりつつある。本研究では過去4ケ年間で多数のPKC分子種の構造を決定し、その臓器特異性、機能の調節に果たす役割の化学的基盤の解明を目指した解析を実施し、以下の成果を得た。1.cDNAの解析から6種のPKC分子種の全構造を決定し、微妙に異なるが共通した構造を持つことを明らかにした。これまでに同定したα、β、γ、δ、ε、ζ種は異なった遺伝子によって支配されているが、β種の中にはスプライシングの相違によるもの(βI、βII)が存在している。2.すべてのPKCを共通して認識する抗体の他、各分子種を特異的に識別する抗体を作成した。各cDNAを動物細胞に発現させ、単離することにも成功した。これらを用いて、各分子種の酵素化学的分析や分子生物学的解析の道を開くことができた。3.酵素化学的および組織化学的解析の結果、α、βI、βII、γ種のPKCはそれぞれ特有の分布を示し、ことにγ種は中枢神経系にのみ存在している。さらに、多種のPKCは細胞内においても存在部位や様式が異なっている。4.各分子種は微妙にその性質が異なっており、活性化様式や基質識別機構機能の特異性が相違している。特にδ、ε、ζ種ではCa^<2+>やジグリセリドによる活性化が明瞭でなく、受容体との共役機構の違いが示唆される。また、細胞刺激の際のトランスロケーションやダウンレギュレーションといった動態でも分子種で特異性が異なる。以上の成果から、各種の細胞や組織がそれぞれ微妙に違ったPKCを有し、それぞれ相違した情報を伝達し、細胞機能を制御していることが明らかとなり、当初の目的を達成した。私共が提唱しているプロテインキナーゼCを介する生理活性物質の受容機構は、代謝内分泌や神経生理学の領域のみでなく、細胞分化や癌研究、免疫学、心脈管学など広い領域にわたって細胞反応の基本構傷の解明、病態解析への足がかりとして注目を集めている。本研究は各種の外界シグナルに対する細胞応答に際して重要な役割を担うプロティンキナーゼCに焦点をあて検討をおこない、以下の成果をおさめた。即ち、プロテインキナーゼCはイノシトールリン脂質の代謝回転により生成される1,2-sn-ジアシルグリセロール(DG)により活性化を受けるが、合成DGを用いた解析の結果、試験管内のみならず細胞を用いた実験系においてもプロテインキナーゼCは1,2-sn-DGにより活性化をうけ、2,3-sn-DGや1,3-DGによってはほとんど活性化されず、本酵素がDGの立体異性体を認識していることが明らかとなった。また、プロテインキナーゼCを大量に分離精製する方法を確立し、本酵素のアミノ酸組成とその部分構造を解析した結果、本酵素には他の蛋白質リン酸化酵素と類似したアミノ酸配列の部分をもつことが明らかとなった。またプロテインキナーゼCのアミノ酸組成中の疎水性アミノ酸の含有率は中程度であるのにかかわらず精製酵素は強い疎水性を示し、本酵素の分子中に脂質により活性調節をうける疎水性ドメインが存在するという従来の解析結果を支持する結果が得られた。そこで脂質によるプロテインキナーゼCの活性化機構の検討をおこなうため、リン脂質の単分子膜を用いて解析をおこなったところ、単分子膜においてもDGはプロテインキナーゼCを活性化し、またその活性化はリン脂質の密度に依存することが明らかとなった。

次年度以降は、本年度に得られたプロテインキナーゼCの酵素化学的、生化学的基盤をもとにして生理的および病態現象の物質的背景の解析をおこなうことを計画している。私共が提唱しているプロティンキナーゼCを介する生理活性物質の受容機構は、代謝内分泌や神経生理学の領域のみでなく、細胞分化や癌研究、免疫学、心脈管学など広い領域にわたって細胞反応の基本構築の解明、病態解析への足がかりとして注目を集めている。本研究は、昨年度にひき続き、各種の外界シグナルに対する細胞反応に際して重要な役割を担うプロティンキナーゼCに焦点をあて検討をおこない、以下の成果をおさめた。即ち、プロティンキナーゼCの構造解析の結果得られた本酵素の部分アミノ酸配列を用いてオリゴメクレオチドプローブを作成し、プロティンキナーゼCの分子クローニングを行った。ヌクレオチド配列から推定されるプロティンキナーゼCは、約670アミノ酸残基より構成され、そのC末端側に、ATP結合領域を含む蛋白質リン酸化酵素に共通の構造を有する。このプロテインキナーゼCのC末端領域は、サイクリックAMP依存性蛋白質リン酸酵素およびサイクリックGMP依存性蛋白質リン酸化酵素と高い構造類似性を示した。また、本酵素のN末端側領域は、従来報告されている他の蛋白質リン酸化酵素とは構造相同性を示さず、疎水性アミノ酸であるシスティンがクラスターを形成していることが明らかとなった。一方、プロティンキナーゼCはイノシトールリン脂質の加水分解により生成される、ジアシルグリセロール(DG)により活性化をうけるが、合成DGを用いた解析の結果、試験管内および細胞を用いた実験系においても、本酵素はDGの立体異性体を認識していることが明らかとなった。プロティンキナーゼCはそのN末端側のシスティンクライスター部分によりDG立体異性体を識別していることが考えられる。次年度以降は、本年度までに得られたプロティンキナーゼCの構造化学的基盤をもとにして、生理的、および病態現象におけるプロティンキナーゼCの機能の解析を行うことを計画している。私共が提唱しているプロテインキナーゼCを介する生理活性物質の受容機構は,代謝内分泌や神経生理学の領域のみでなく,細胞分化や癌研究,免疫学,心脈管学など広い領域にわたって細胞反応の基本構築の解明,病態解析への足がかりとして注目を集めている.本研究では,昨年度に引き続き,各種の外界情報シグナルに対する細胞反応に際して重要な役割を担うプロテインキナーゼCに焦点をあて検討をおこない,以下の成果をおさめた.プロテインキナーゼCは極めて構造の酷似する多数の分子種の集合体であるが,そのうち7種についてcDNAを得,その全構造を決定した.主要な4種については特異的抗体を作成し,各組織より分離分別した分子種との免疫化学的対応に成功した. cDNAを直接COS細胞に発現させて得た酵素との対比と合わせて,各分子種のcDNA構造と酵素蛋白質の対応に成功し,プロテインキナーゼC分子種の構造と機能の関連の解明の化学的基盤を得た.これらの分子種はその活性化様式で,Ca^<2+>やジアシルグリセロールの依存性で微妙な差が見られることに,ある一種は極めて低濃度のアラキドン酸によっても活性化されることから,アラキドン酸力スケードに強い関連を持つと考えられる.また,ECFレセプターやミエリン塩基性蛋白質に対する基質特異性も各分子種で異なっている.ラット各組織での発現様式やリンパ球系培養細胞等を用いた解析から細胞内局所や細胞をホルボールエステルで刺激した際のトランスロケーション等でも各分子種の特異性を見出しつつある.
CCN2機能制御による慢性腎臓病の新規治療法の開発

CCN2(旧称CTGF: connective tissue growth factor)の機能制御による、新規慢性腎臓病治療戦略の開発を目指して、計画通りの研究を進めている。Cre-LoxPシステムを用いて、1whole CCN2の尿細管上皮細胞特異的ノックアウトマウス、2モジュールXX欠損CCN2発現トランスジェニックマウスを用い、1片側尿管結紮モデル、2虚血再灌流モデル、3腎亜全摘モデルを作成し、病変の進行速度の変化とCCN2モジュールXXが線維化に関わる機序に焦点を当てて解析中である。昨年度中に予定していたサンプルの取得を完了した片側尿管結紮モデル、虚血再灌流モデルについて、RT-PCR、Western blottingを用いて、細胞外基質、炎症性サイトカイン、線維化に関わるサイトカインの産生量をmRNAレベルで、幾つかの細胞内シグナル伝達系に関する検証をリン酸化シグナルの変化で検討を行った。結果、whole CCN2の尿細管上皮細胞特異的ノックアウトマウス、モジュールXX欠損CCN2発現トランスジェニックマウスの双方で、いずれのモデルにおいても腎線維化の進行が統計学的にも有意に抑制されていた。mRNAレベルではコラーゲン、フィブロネクチンの発現抑制に加え、TGF-bやPAI-1など腎病変進行の際のkey moleculesの発現も同様に有意な抑制が確認された。細胞内のシグナル伝達系については、インテグリンーFAK(focal adhesion kinase)のリン酸化の抑制が顕著であり、関連する(下流と考えられる)幾つかの分子についてもリン酸化の抑制が確認された。CCN2-インテグリンの相互作用について確証を得るために、1中和抗体を用いた阻害実験、2デコイペプチドを用いた阻害実験、3CCN2陰性培養線維芽細胞を得て正常CCN2の強制発現系での検討を予定している。度々報告している腎亜全摘モデルにおけるモデル作成の歩留まりの悪さが影響して、同モデル作成に関する一部の計画は大きな遅延、予定の変更を余儀なくされた。昨年の報告の通り、マウスストレインの変更(腎門部の剖出が容易で血管系の結紮が行いやすい系統)で上記の問題を解決し、予定数のサンプルを得ることが出来た。しかし解析に際して、結紮モデルでは評価対象となる部位の周辺に虚血壊死後の瘢痕組織が隣接しており、通常通りwhole kidneyをサンプルとすると正確な評価が不可能であった。そこでレーザー光を用いたマイクロダイセクション法を試みた。正常組織ではマニュアル通りの方法で良好な結果が得られたが、線維化が進行した組織では、レーザー光を最小限に絞っても組織の焼灼が生じてしまい、当該箇所のみを切り出すことが困難であった。未固定のサンプルをビブラトームで薄切し、実体顕微鏡下で用手的に組織を切り分ける方法は、未染色では組織状態の把握が難しく作業が困難であったり、染色過程が原因と思われるRNAの断片化の問題があり難渋している。Western blottingを行うに十分量のタンパクサンプルを収集することが難しく、他の方法(プロテインアレイなど)は予算の問題で施行の目処が立っていない。他のモデルを用いて研究目標は十分に達成しつつあるが、一部の研究計画は未完のままとなる可能性も生じてしまっている。本課題は「追加(再現)実験の実施や学会参加、論文投稿」の目的で1年の期間延長をお願いした。インテグリンはCCN2の特異的受容体では無く、CCN2の作用がFAKのリン酸化に直接影響するか否かを検証する必要があり、従来予定してたデコイペプチドによる阻害実験の他にも、各モジュール特異的中和抗体を用いた追加実験、さらに、我々が用いた遺伝子改変マウスから初代培養細胞を取得し、同細胞に正常CCN2を強制発現させた際のFAKや線維化形質の変化(正常CCN2の遺伝子導入のみで形質が正常化するか否か)を検討する必要があると考えている。これらの追加実験結果も含めて、2019年度の学会・研究会での発表および論文作成を予定している。当初の予定通り、CCN2が慢性腎臓病の進行に及ぼす影響を、マウス進行性腎障害モデルを用いて検討した。先天的なCCN2欠損マウスは致死的で生まれず、ヘテロなノックアウトマウスモデルでは形質が明らかではないことが知られており、当研究室ではCre-LoxPシステムを用いて、細胞特異的にCCN2の遺伝子操作を行う系を確立した。また、一昨年度までの検討で、尿細管上皮細胞特異的にwholeのCCN2発現を欠損すると、片側尿管結紮モデルにおける腎線維化が有意に抑制される事を明らかにしている。そこで昨年度(平成28年度)はCCN2のモジュール単位に注目し、特に線維化に関わると予想されるモジュールIV(エクソン4-5)を欠失した変異型CCN2を有する遺伝子改変マウスを作成して本研究に用いた。初めに片側尿管結紮モデルを作成し、8時間、24時間、3日、7日で腎臓を摘出して経過を検討した。時間と共に結紮側では水腎症が進行し、伴って腎実質は萎縮、間質には線維化が認められる様になった。変異型CCN2発現マウスでも水腎症の進行は野生型とほぼ同様であったが、間質線維化は抑制された。フィブロネクチンの沈着程度は免疫染色で、膠原線維染色としてはシリウスレッドとマッソントリクローム染色を行ったが、H.E.染色の観察所見と同様の傾向にあり、我々の予想通り、CCN2モジュールIVが線維化に有意な影響を及ぼすことが明らかとなった。

その他、線維化や炎症に関わるサイトカイン類のRT-PCRを用いた遺伝子発現経過の検討を開始している。遺伝子改変マウスの作成と維持に関しては、計画通り概ね順調に進んでいる。whole CCN2の尿細管上皮細胞特異的ノックアウトマウスで認められた線維化抑制作用が、変異型CCN2発現マウスで認められるか否かが最初の懸案事項であったが、平成28年度中に終了した実験結果を確認する限りでは、ほぼ予想通りの内容であった。whole CCN2の欠失と、エクソン4-5/モジュールIV欠損CCN2との形質を比較することで、モジュールIVの作用を明らかにすることも本研究の重要な課題であり、まずはwhole CCN2欠損モデルで十分な結果の蓄積がある片側尿管結紮モデルを用いて、各種の遺伝子発現を比較している。RT-PCR自体は本研究室のルーチンワークであり、手技自体も順調に施行され、考察に耐えうる結果を取得できている。当初の計画では別の進行性腎障害モデル(虚血再灌流モデルおよび腎亜全摘モデル)を平成28年度中に作成終了する予定であったが、虚血再灌流モデルに関しては約50%の進捗状況(まずは各時点でn=5を目標に検体を採取中)である。腎亜全摘モデルに関しては、モデル作成の歩留まりが悪く、術後に死亡してしまう個体があるため、手技自体を工夫している最中である。マウスのバックグラウンド(遺伝子的な背景、系統)によっても腎動脈の剖出の難易度に差異があり、Balb/cやC57/B6に比較すると、S129、SJLの系統はやや難易度が高い印象がある。また、我々が用いているマウスの同系統は腎線維化に感受性が高いため、術後の腎機能障害が高度になり死亡していまう可能性も考え、死亡例の詳細な剖検を行っている。動物愛護の観点にも配慮して、死亡例からも最大限の知見を得て、早急に学問的に有意義な実験系を確立するように日々務めている最中である。以上の状況から、研究は計画通り進行しているものの、若干の遅れを生じている。研究計画通りCCN2(旧称CTGF: connective tissue growth factor)の遺伝子改変モデルを用いて腎臓の線維化機序に関する研究を進めている。CreLoxPシステムを用いて、1whole CCN2の尿細管上皮細胞特異的ノックアウトマウス、2モジュールXX欠損CCN2発現トランスジェニックマウスを用いて、1片側尿管結紮モデル、2虚血再灌流モデル、3腎亜全摘モデルを作成し、病変の進行速度の変化とCCN2の特にモジュールXXが線維化に関わる機序に焦点を当てて解析中である。昨年度課題であった腎亜全摘モデルの術後短期死亡に関しては、CCN2遺伝子改変マウスにおける創傷治癒過程での線維化の遅延が原因であることが判明した。抗線維化形質として我々の予想通りではあったが、モデルとしては望ましくないため、結紮範囲を縮小するなどの工夫を試みた。しかし損傷範囲を減少するとマウスでは慢性期の線維化程度が大きく損なわれてしまう。そこで手技は当初の予定通りとし、マウスの系統を変更することで安定したモデル作成を実現する方針とした。片側尿管結紮モデル、虚血再灌流モデルについては予定通り全サンプルを採取完了することができた。
ホモロジーモデリングとアビニシオ法の統合による高精度タンパク質構造予測手法の開発

今年度は、フラグメントアセンブリ方式によるab initio法の予測精度の改善と、ホモロジーモデリングとの統合化を行った。1.予測構造を評価する統計ポテンシャルについて、今年度新たに、二次構造パッキングのポテンシャルを導入することにより、βシートの予測精度を大幅に向上させることができた。類似配列をもたない。25個のタンパク質(残基数40135、α:7個,β:6個,α/β:12個)のうち、ネイティブ構造とのRMSDが6.5Å未満のものは14個であった。2.構造クラスタリング手法については、URMSを距離指標に用いることにより、従来のRMSDを距離指標とするクラスタリングに対して、25個のタンパク質のうち20個のタンパク質で、より精度の高い予測構造を得ることができた。3.構造既知のタンパク質をより有効に生かすために、フラグメントアセンブリ方式において、部分的な構造をあてはめるフラグメントの長さを可変にすることにより、フラグメントに合致するよい構造があれば、できるだけ広い部分をテンプレートとして利用できるようにした。フラグメントの長さを5残基から始めてスコアが最大になるように増加させていく手法は、従来の9残基固定のフラグメント長の方式に比べて、精度の高い予測を行うことできること、構造が既知で類似のタンパク質がある場合は、その構造をテンプレートとして利用する手段となることを確認した。4.構造予測システムが生成する多数のモデル構造のうち、構造が保存されている部分はネイティブの構造に近いという知見を得ており、そのことを利用して、構造が保存されている部分の構造特徴を制約条件として繰り返し予測を行う手法を開発した。この手法は、類似のタンパク質構造をテンプレートして予測する際にも利用することができる。類似配列をもたない。