hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
魚類における性的二型多様化の分子遺伝機構

尻鰭の性的二型の度合いの異なる北日本と南日本のメダカ集団についてQTL解析を行った。その結果、個々の発生ステージで異なるQTLが同定されたこと、鰭間で共通するQTLと共通しないQTLがあること、オスで同定したQTLはメスでは効果が少ないことなどを見いだした。これらの結果は、成長ステージ間、雌雄間、形質間での遺伝的相関が一定程度は解消されていることを示している。また、体型の性的二型の度合いの顕著な海型イトヨと軽微な河川型イトヨのF2雑種についてQTL解析を行い、体型の差異に関与する有意なQTLを同定した。さらに、イトヨにおいて遺伝子操作法を確立した。本年度は、性的二型の遺伝基盤をQTLで解析した。まず、性的二型の度合いの異なる沖縄と青森のメダカについてF2雑種を作出し、発達段階を追跡して性的二型の出現の表現型を解析した。ついで、全ゲノム配列に基づいてSNP解析のシステムを構築し、F2の遺伝型を決定した。その結果、いくつかの有為なQTLが同定でき性的二型の変異にかかわる遺伝機構が明らかになった。また、性的二型の度合いの異なる海と河川のイトヨについてF2雑種を作出し、現在、表現型と遺伝型を解析中である。メダカの性的二型に関しては、昨年度得られたF2雑種に関して尻ビレの発達段階を追跡してQTL解析する数学的手法についてアメリカの共同研究者と協力してプログラムを開発した。このorthogonal polynomial法を利用した手法を用いてQTLマッピングを行い有為な遺伝子座を見いだした。この成果について論文にまとめ投稿した。QTL領域に、いくつかの候補遺伝子を見いだし、これらの遺伝子発現解析を行うべく新たな交配家系を作出した。また、青森と沖縄のメダカの全ゲノム配列を比較し、性決定領域のヘテロ接合度を解析した。トゲウオに関して、性的二型の度合いの異なる海と河川のイトヨについてF2雑種を作出し、遺伝型を決定し、連鎖地図を作出した。さらにgeometric morphometric法を利用してQTLマッピングを行い、有為なQTLを見いだした。また、トゲウオで遺伝子操作するシステムの構築に成功した。性的二型の顕著な沖縄メダカと顕著でない青森メダカの雑種のF2について尻鰭長、背鰭長、尾鰭長、乳頭状突起数などを計測し、QTL解析を行った。その結果、雌雄で共有するQLTは少ないことが明らかになり、その成果は、雌雄間での遺伝子座内性的葛藤が解消されていることを示す。また、尻鰭長、背鰭長、尾鰭長、乳頭状突起数の間で共有するQTLもあるものの独自のQTLもあり、それぞれ個別の遺伝子制御を受けていることが明らかになった。この成果は、機能的に連関した複数の組織が個別に進化できるか連関進化をするかに関する重要な知見を与える。また、青森と沖縄のオスとメスを入れ替えたF2についても同様の解析を行った。その結果、両家系にて共通するQTLが見つかった。このQTLは環境やY染色体にも影響を受けず、また、親集団内でアリル頻度の高い遺伝子座であると考えられることから、この領域内の候補遺伝子を探索した。具体的には鰭の発生や性ステロイドのシグナリングに関与する遺伝子を探索した。これらについて鰭発生時の発現レベルを定量PCR法で解析した。その結果、複数の有力な遺伝子を同定した。これらの成果は、既に二報の論文として報告し、現在、さらに一報の論文を投稿準備中である。また、性的二型の顕著な海産イトヨと顕著でない河川産イトヨについてF2を作出し、幾何学的形態解析法を用いて体型を定量化し、QTL解析を行った。その結果、複数の少数の効果の強いQTLが同定できた。これらは雌雄で共有しているものとしていないものの双方が見つかった。これは、一部の遺伝子では遺伝子座内性的葛藤が解消されていないことを示す。これらの成果については、論文を準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。進化遺伝学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の初年度の計画通り、性的二型のQTL解析は完了し、いくつかの興味深い知見が得られているから。当初の予定通り、メダカとトゲウオの性的二型のQTLマッピングが完了し、いくつかの候補遺伝子を見いだしたから。また、トゲウオで遺伝子操作するシステムを構築できたから。今後は、QTLの解析を進めて成果を論文発表する。また、RNAseqなどQTLとは別の手法を組み合わせて行く。候補遺伝子について遺伝子発現を解析するとともに、遺伝子操作魚を作出し、これらについて性的二型を解析する。

また、性ステロイド投与時の性的二型や候補遺伝子の発現を解析する。26年度が最終年度であるため、記入しない。成果を論文にまとめる。また、性的二型発現時期における転写産物の解析を行う。豪雪のため、共同研究者の青森でのメダカ採集が年度中で困難であり、それに伴うメダカ飼育水槽の購入が次年度へ持ち越しとなったため。8346円と小額であるが、メダカ飼育水槽の購入に使用する。
臨床看護師に対する看護研究支援システムの開発と有効性の評価に関する研究

本研究の目的は、応募者が以前の科学研究費補助金で開発し一定の成果を確認した看護学生向けの自己学習支援システムを臨床看護師向けの看護研究支援システムに応用し、その有効性を評価することである。本システムを臨床看護師に自由に使用してもらうことで、看護研究に対する主体的な取り組みの促進や研究自体の質向上に影響及ぼす要因が明らかになる。また、このシステムを有効活用してもらいながら、システム改良のサイクルを回していくことで、より一層、望ましいものへと発展させていくことが期待できる。また、システムはオープンリソースをベースとして作成しているため、比較的自由に改良を加えられるメリットもある。研究スタート1年目は臨床看護師が看護研究に取り組むうえで困難に感じる点、研究を進める上での要望などについて、先行研究による文献検討、及び、研究実施予定施設の研究メンバー(研究支援の経験のある者)の数回にわたるグループ討議から明らかにし、その結果に基づいて支援システムの改善につなげる予定であった。しかし、この検討プロセスの中で導き出された研究遂行の困難さや研究遂行に関する要望は非常に多岐にわたり、本研究の目的を達成するには、その背景にある要因について1つ1つさらに掘り下げて検討し、その解決策がICTの活用によって果たして改善されるのかどうかも含め精査していくことが必要との結論に至った。そこで、実際のシステムの改良を本年度は先送りし、上述のより詳細な検討を進めると共に、支援者側からの考えだけではなく当事者からの要望に対するヒアリングも早い段階であわせて行うこととした。支援システムの改良を先送りしたことは研究遂行の遅れとも取れるが、このプロセスを急いで改良を進めてしまうよりも、検討すべき重要なことに事前に気づけた点で、研究遂行上、意味があったと評価できる。また、詳細な検討を行ったうえで作成することによって費用的にも無駄を減らすことにつながる。なお、システム改良を先伸ばしても研究期間全体における研究遂行及び研究目的の達成に関しては大きな問題はないと考える。2019年度前半は研究実績で述べた検討を進めるとともに、研究実施者やこれから研究に取り組もうと考えている者のヒアリングを行う(研究実施予定施設外)。その後、後半で、研究実施支援システムの仕様書の作成、学生に使用していたシステムの実際の改良を行い、臨床看護師向けの試作版の作成へとつなげていく。(理由)予算の大きな割合を占めていたシステム改良を翌年度に先延ばししたため。(使用計画)次年度にシステムの改良を実施する予定であり、その各段階で使用する。また、それにあわせ、データ抽出の機能についてのプログラムも組み込む予定のため、その開発費としても使用する。
行動活性化療法のメカニズムの解明と国内のがん患者に対する新たなプログラムの開発

【研究の目的】行動活性化療法は、主に非がん患者の抑うつに対して有用性が示されているが、がん患者への介入試験は乏しく、国内では治療マニュアルも存在しない。さらに、がん患者の抑うつを改善させるメカニズムは解明されていない。そこで、私たちは国内で初めてがん患者に対する行動活性化療法プログラムを開発した。本研究の目的は、行動活性化療法の国内のがん患者に対する実施可能性と有用性を検証し、がん患者の抑うつを改善させるメカニズムを解明することである。【研究実施計画】2018年度に行動活性化療法プログラムを用いた前後比較試験を行い、2019年度中に目標症例数を達成する。その結果を分析し、抑うつを改善させるメカニズムを解明する。そして、より効果的な行動活性化療法プログラムを開発する。2018年度から開始する前後比較試験では、軽症以上の抑うつを有するがん患者に対して、計7回の行動活性化療法プログラムを行う。その結果、primary endpointの抑うつの重症度を測定する尺度HRSD(Hamilton Rating Scale for Depression)の寛解割合が、行動活性化療法プログラム実施後に55%以上(先行研究より設定)であれば有用性があると判断する。本研究と同様にHRSDをendpointとする先行研究を踏まえ、予定登録数を32例とした。【2018年度に実施した研究成果】2018年度より行動活性化療法プログラムを用いた前後比較試験を開始し、現在実施中である。これまでに予定登録数32例中13例を登録している。このまま症例蓄積を継続し、2019年度中には目標症例数を達成する予定である。その結果から、がん患者の抑うつを改善させるメカニズムを解明し、より効果的な行動活性化療法プログラムを開発する。2018年度より行動活性化療法プログラムを用いた前後比較試験を開始し、これまでに13例を登録している。2年間で32例を登録予定であるため、1年間で少なくとも16例以上を集積する必要がある。従って、13例という数字は「やや遅れている」という判断に該当すると考えられる。この原因として、院内外に対する行動活性化療法プログラムの周知が不十分であったことが主な原因と考えられる。2019年度中に予定登録数の32例を達成できるよう、現在実施中の介入試験を継続する。プログラムの周知が課題であるが、1院内の全病棟および外来への案内の貼付、2HPやセミナー・ワークショップでの発信、3行動活性化療法プログラムに関するパネル・動画作成、4国内外の学会発表や論文化、など様々な方法で周知を行う予定である。従って、本年度と比較して次年度は改善が見込まれる。【当該助成金が生じた状況】本年度は主に研究の遂行に取り組んできたため、国内外の学会での成果発表の機会が少なく、旅費として見込んでいた費用の消費が少なかったことが次年度使用額が生じた主な理由であると考えられる。

【翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画】次年度は、目標症例数を達成して解析を終了するため、当該助成金と合わせた費用を国内外での成果発表や論文化等に活用する予定である。
コンクリートの充填不良リスクの定量的予測とその展開

本研究では、コンクリートの充填不良の発生モデルとして、型枠内を自由落下するコンクリートからモルタル成分が鉄筋に付着して逸失し、粗骨材過多となったコンクリートが型枠底部を先行して充填するモデルを提案した。同モデルに基づいて、型枠を通過するコンクリートの調合、流量および配筋条件が、鉄筋によって逸失するモルタル成分の量に与える影響を実験によって明らかにした。また、一度粗骨材過多となったコンクリートの充填不良のリスクを解消するために必要な振動エネルギーについても考察を行った。得られた実験結果を基に、壁工事のケーススタディを通じて、コンクリートの充填不良のリスクを定量的に予測する手法を示した。コンクリートの充填不良は、建設現場で頻繁に発生する不具合であるにも関わらず、必ずしも十分な防止策が講じられていない。本研究は、充填不良のリスクを定量的に予測することを目的とし、実験・検討を行ったものである。平成28年度に下記の成果が得られた。1.壁部材のコンクリート工事を想定した充填不良のモデルとして、型枠内を自由落下するフレッシュコンクリートからモルタル成分が鉄筋に付着して逸失することで型枠底部に充填不良が生じるモデル(モルタル逸失モデル)を提案した。2.モルタル逸失モデルに基づいて、コンクリートの流動性および流量、鉄筋径を因子とし、フレッシュコンクリートの打込み時に鉄筋に付着するモルタル成分(逸失モルタル)の量を測定対象とした実験を行った。その結果、横筋および縦筋による逸失モルタル量はコンクリートの流量の対数と鉄筋の周長との積と比例関係にあること、鉄筋の交差部による逸失モルタル量の変化はコンクリートの流量の対数と鉄筋径の2乗との積と線形関係にあること、高流動コンクリートは低スランプタイプ、普通スランプタイプおよび中流動タイプのコンクリートと比較して逸失モルタル量が少ない傾向にあることを明らかにした。3.モルタル成分を逸失することで粗骨材過多となったフレッシュコンクリートが、振動締固めによって充填不良を解消する現象の再現実験を行った。同コンクリートの充填不良を解消するために必要な締固めエネルギーは、健全なコンクリートを充填する場合と比較して著しく大きいことを明らかにした。これらの成果は、充填不良リスクの定量的推定方法を確立するために必要な基礎的知見と考えられる。予備実験の結果をふまえて当初の研究計画を修正した。一部では予想を上回る成果が得られたものの、予算の都合等によって実験データが不足し、十分に検討できなかった課題が残されている。検討不足となった課題は、平成29年度の研究計画に加えて実施することが可能である。全体としては、おおむね順調に進展していると考えられる。前年度に提案したモルタル逸失モデルに基づき、コンクリートの充填不良の原因となる打込み時の鉄筋によるモルタル成分の減量(逸失モルタル量)について検討した。今年度は、コンクリートの流量(5, 10, 15, 20 L)およびスランプ(普通スランプ、中流動、高流動)、鉄筋の間隔(100, 150, 200 mm)および位置(水平方向の鉄筋について上端から19本目の高さ)を因子とした実験を行い、各因子が逸失モルタル量に与える影響について検討した。その結果、次の知見が得られた。(1)前年度の実験と同様に、コンクリートの流量の増加に伴って逸失モルタル量が増加する傾向が認められた。また、普通スランプ、中流動、高流動タイプのコンクリートの順に逸失モルタル量が減少傾向を示し、高流動タイプの逸失モルタル量が顕著に小さかった。(2)水平方向に配された鉄筋による逸失モルタル量は、基本的に下に配された鉄筋のものほど小さく(例外的に最上端の鉄筋の方が、上端から2本目の鉄筋より小さかった)、上端から6本目以降で一定傾向を示した。(3)普通スランプおよび中流動タイプのコンクリートを用いた実験では、鉄筋間隔を150 mmとした型枠の逸失モルタル量が最も大きくなった。しかしながら、今回の実験結果から鉄筋間隔と逸失モルタル量と間に明確な関係を見出すことができなかった。(4)鉛直方向に配された鉄筋の上端から0200 mmの範囲に付着する逸失モルタル量は、他の範囲の約5倍であった。(5)鉄筋の交差によって生じる逸失モルタル量の変化の平均値は、コンクリートのスランプに関わらずほぼ一定であった。一方、高流動タイプにおけるばらつきが、普通スランプおよび中流動タイプと比較して小さかった。これらの実験結果を反映し、前年度に提案した充填不良リスクの推定式を、実構造物の配筋条件に応じて補正する手法を提案した。平成28年度に提案した逸失モルタル量の推定式は、適用範囲が型枠内の比較的高い位置に配筋された鉄筋(コンクリートの流速がほぼ0)に限定される。型枠内の全ての鉄筋に適用範囲を拡大するにあたり、コンクリートの流速に配慮した推定式の修正が必要と考えられる。

また、粗骨材過多となったコンクリートの充填不良を解消するために必要な締固めエネルギーが、健全なコンクリートより大きいことを把握できたが、締固めエネルギーの定量化には至っていない。試験方法を見直し、締固めエネルギーを定量的に測定したうえで、影響因子を明らかにする実験が必要である。平成29年度は、これら課題の検討に加えて、当初から計画していた推定式の検証、最適設計および運用法の提案を実施する。建築材料・施工平成28年度に端数まで使い切るより、次年度に繰り越した方がより有効に研究費を利用できると判断したため。物品費として、試料の材料費等に充てる予定。
アブレーション・プラズマの生成にともなう高速流体力学現象の解明

本研究では,パルス軽イオンビームをターゲットに照射することで生成されるアブレーション・プラズマの観測実験を行った。実験では、マルクス型高電圧発生装置、収束形状を持つ外部印加型磁気絶縁ダイオードなどで構成されるパルス軽イオンビーム発生装置を用いて、エネルギー密度E=9.1J/cm^2のプロトンおよび炭素で構成される軽イオンビームを発生させた。また、ターゲットにはアルミニウム材を用いた。まず、アブレーション・プラズマのプルーム像を積分写真を用いて観測した。これより、プルーム像の空間輝度分布を明らかにした。ただし、アブレーション・プラズマの生成にともない発生する衝撃波などを観測するには干渉計測など時間分解可能な可視化計測法を用いる必要がある。次に、アブレーション・プラズマの成長過程をストリーク計測した。得られたアブレーション・プラズマの時間変化により、プラズマの平均拡散速度を4.45mm/μsと見積もった。これは、同程度のエネルギー密度を持つパルス・レーザーを用いて生成したアブレーション・プラズマの場合と比較して明らかに低い値であった。これは、パルス時間幅の違いによるものである。また、アブレーション・プラズマ中の飛散粒子を明らかにするために分光計測をおこなった。しかしながら、軽イオンビーム生成時に起こる陽極プラズマの発光と重なり、明確な計測結果は得られなかった。より詳細にアブレーション・プラズマを観測するには、可視化計測法の改良とともに迷光対策を十分に施す必要がある。
鼻副鼻腔線維芽細胞に特徴的に発現するマイクロRNAの同定とその役割の解明

健常な鼻粘膜と健常な肺線維芽細胞から線維芽細胞を単離し、種々のサイトカインで刺激し、誘導されるmicroRNAを検討した。また鼻茸(鼻副鼻腔粘膜の慢性炎症)と肺線維症の肺線維芽細胞も同時に刺激し誘導されるmicroRNAの発現、鼻のそれとの違いを検討した。TGF-βで刺激すると肺線維芽細胞でmiR-146aが誘導され、鼻では誘導されていない。IL-13やIL-4、TNF-αで鼻線維芽細胞を刺激するとTSLPが産生され、さらにmiR-375が誘導されている。線維芽細胞は、部位により役割が異なっていることが分かってきている。同じ呼吸器である鼻・副鼻腔や肺を比較しても役割に違いが存在することが明らかになりつつある。鼻副鼻腔線維芽細胞は、種々のTLR ligandsに反応しケモカインやサイトカインを産生する。またTGF-βで刺激しても線維化へと誘導しない、などの特徴がある。一方、肺線維芽細胞は、LPS,poly(I:C)を除いたTLR ligandsにはほとんど反応せず、またTGF-βに反応して活性化され線維芽細胞に変換され、線維化へ誘導する。これら特徴にはmicroRNAの制御が働いているとかんがえられる。1958年に提唱された分子生物学の中心原理では、一つの遺伝子から一つのmRNAが転写され、一つのたんぱく質ができるというものであった。しかし近年のnon-coding RNA(ncRNA)(small interfering RNAやmicroRNAなどからなる)の発見により、ゲノムの領域を大きな遺伝子領域が覆い一つの遺伝子から多数のRNAが転写され、そのRNAのうち約半分はncRNAとしてRNA大陸を形成していることが明らかになった。これらのncRNAは機能性RNAとして遺伝子に働き、種々の細胞の分化や増殖、サイトカイン・ケモカイン産生を始めとする自然免疫や獲得免疫応答を制御していると考えられている。気道線維芽細胞として、健常鼻粘膜、慢性炎症を伴っている鼻粘膜線維芽細胞として鼻茸、健常肺、慢性炎症を伴っている肺線維芽細胞として肺線維症肺、を用い線維芽細胞を単離し、それぞれの部位により発現するmicroRNA、炎症の有無によるmicroRNAの発現の違いを検討している。特に鼻副鼻腔の線維芽細胞に発現するmicroRNAの検討を行っている。一方、肺線維芽細胞は、LPS,poly(I:C)を除いたTLR ligandsにはほとんど反応せず、またTGF-βに反応しで活性化され線維芽袖胞に変換され、線維化へ誘導する。今までのところ、鼻副鼻腔線維芽細胞に特徴的なmicroRNAは同定されていない。TLR ligandsやサイトカイン刺激でのmicroRNA発現を、気道の部位の異なる線維芽細胞で検討している。

一方、肺線維芽細胞は、LPS, poly(I:C)を除いたTLR ligandsにはほとんど反応せず、またTGF-βに反応して活性化され線維芽細胞に変換され、線維化へ誘導する。これら特徴にはmicroRNAの制御が働いているとかんがえられる。1958年に提唱された分子生物学の中心原理では、一つの遺伝子から一つのmRNAか転与され、一つのたんぱく質ができるというものであった。しかし近年のnon-coding RNA(ncRNA)(small interfering RNAやmicroRNAなどからなる)の発見により、ゲノムの領域を大きな遺伝子領域が覆い一つの遺伝子から多数のRNAが転写され、そのRNAのうち約半分はncRNAとしてRNA大陸を形成していることが明らかになった。これらのncRNAは機能性RNAとして遺伝子に働き、種々の細胞の分化や増殖、サイトカイン・ケモカイン産生を始めとする自然免疫や獲得免疫応答を制御していると考えられている。健常な鼻粘膜と健常な肺線維芽細胞から線維芽細胞を単離し、種々のTLR ligandで刺激し誘導されるmicroRNAを検討している。また鼻茸(鼻副鼻腔粘膜の慢性炎症)と肺線維症の肺線維芽細胞も同時に刺激し誘導されるmicroRNAの発現、鼻のそれとの違いを検討している。TLR ligand以外にもTGF-β、IL-13(IL-4)やTNF-αでの刺激を行い同様な検討を行っている。TGF-βで刺激すると肺線維芽細胞でmiR-146aが誘導され、鼻では誘導されていない。IL-13やIL-4、TNF-αで鼻線維芽細胞を刺激するとTSLPが産生され、さらにmiR-375が誘導されている。
干潟域の低次生産過程における親生物元素循環の定量化と生態系モデルの構築

本研究では、地球上で最も単位面積当たりの動物生産量が高い場であるとされながらも、研究上のさまざまな隘路により、これまで包括的な知見が極めて限られていた干潟域における基礎生産過程や、それに続く食物網のダイナミクスについて、詳細かつ長期の調査研究を基礎として、さまざまな素過程の定量化を進めるとともに、将来の環境管理に必要不可欠である干潟域の生態系モデルの構築を同時に実施する事を計画して実施した。我が国のように南北に細長く温度環境等が大きく異なる環境場に点在する干潟群の汎用的なモデル化を、1カ所の干潟での観測例のみで構築することは不可能である。そこで、我々の研究チームは、北海道から九州までの代表的な3カ所の干潟を選定し、それぞれの場所で同質・同種の観測・実験結果を得て、従来知見の乏しかった底生生物の親生物元素動態にはたす役割を定量化するとこで、我が国では初めてのケースとなる基礎生産から高次生産まで含めた包括的な生態系モデルを構築することを目的とした。高松の河口干潟において実施された研究により、底生珪藻の基礎生産量を正確に見積もることができた。また、そのレベルは、瀬戸内海の海水中の基礎生産量を超える値であることを明らかにした。さらに、底生動物と環境因子の関係について詳細に把握した。その結果、生物は環境因子により生物量やその組成に影響を与えられるが、逆に生物自自身が環境を作り替えていることも明らかにした。最終的に、干潟域での包括的な生態系モデルを作成することに成功した。3ケ所の研究フィールドともに、毎月1回以上の定期観測を実施することができた。北海道東部・瀬戸内海・有明海とも、水柱に存在するクロロフィルa現存量に比べて、堆積物表層で得られるクロロフィルa現存量の方が12桁大きく、干潟域の底生生物群集の生物生産を支えているのが、底生珪藻などの底生微細藻類であることが、明らかとなった。3ケ所それぞれの定点における2436時間の連続観測の結果より、干潮時前後の潮位が低く、流速が速くなる時間帯に表層堆積物のかなりの部分が再懸濁して、底層水中のクロロフィルa濃度を著しく高めることを見出した。多くの部分は、現地の大型底生懸濁物含者によって消費されると考えられるが、一部は、潮流により潮下帯などに運ばれ、近接する海域の生物生産も支えていることが推察された。また、各態粒子中(懸濁物・沈降粒子・堆積物)の、安定同位体比を測定したところ、δ^<13>C値が-14-16程度であることから、干潟上の有機物の主要力起源は、底生珪藻であることが明らかとなった。調査海域である火散布沼内の基礎生産者の現存量を水柱と表層堆積物に分けて定量化した結果、水柱の植物プランクトン態Chla量は、周年に渡って数mg/m2程度であった。一方、表層(0-0.5cm)堆積物中の底生微細藻類由来のChla量は、数十から百数十mg/m2にも達しており、底生微細藻類が主要な基礎生産者であることが明らかとなった。当該干潟域には、大型海藻類やアマモが大量に繁茂しており、これらの生産物から生起する食物網についても精査する必要がある。昨年度と同様に、流向・流速計による観測では、干潮の最強流時に、堆積物粒子が大量に再懸濁している様子が捉えられた。その影響は、34時間継続していた。この再懸濁時に表層堆積物粒子とともに底生微細藻類も水中に舞い上がり、Chla濃度が数十倍に増加していた。安定同位体比を用いた系内の食物網解析では、3つの異なるタイプの基礎生産者(底生微細藻類・大型海藻類・アマモ)から派生する食物連鎖系が共存していることが明らかになった。さらに、多くの底生大型動物は前2者の混合物を利用している可能性が示唆された。

これらのことは、懸濁粒子や沈降粒子あるいは表層堆積物の安定同位体分析でも矛盾無く説明できた。沼内の2定点において、漸位が著しく変化する時間帯で15分毎に採水する時系列観測を行ったところ、クロロフィル濃度は、表層・底層とも数倍から十数倍変化していることが明らかとなった。また同時にバクテリアの現存量も粒径が小さな粒子が舞い上がる時間帯に増加することから、粒子の表面積に依存しており水中の現存量は潮位変化に同調していることが分かった。小型底生動物(とりわけ線虫類)の分布は、極めて変化に富んでおり、堆積物の環境影響を強く受けている事が明らかになった。このことは線虫類などのメイオベントスが堆積物の環境指標者として利用できることを示唆している。本研究フィールドに生息する底生珪藻の動態と環境諸因子の因果関係を解析するために、それぞれの項目間の相関分析を行ったところ、すべての定点において、日射量、気温、表泥温度、間隙水中の栄養塩濃度に正の相関関係が得られ、沼奥部・沼中央部では水温と間に正の相関関係が、水柱の栄養塩濃度、塩分との間に負の相関関係が得られた。その結果、火散布沼に生息する底生珪藻は、幅広い光・温度条件に適応し、彼らが利用する栄養塩の起源が外洋水や堆積物からの溶出である可能性があると考えられた。また、水柱のChl.a現存量が堆積物表層よりも極小(0.19.1mg/m^2)であったことに加え、24時間連続採水の分析結果から、干潮の時間帯前後に表層堆積物が巻き上げられていたことから、火散布沼の生物生産は堆積物表層の底生珪藻が支えていると考えられた。また、既往の文献値と比較すると、火散布沼ではかなり高密度で存在していることがわかった。次に、火散布沼に生息する底生珪藻の増殖特性を把握するために、堆積物試料から、干潟における夏季特定優占種であったNitzchia sp.と、すべての定点で年間優占種であったNavicula sp.を単離し数回維持培養を繰り返し、単一種の株を作った。その株を用いて、光、塩分、栄養塩濃度をそれぞれ5段階、温度を8段階変化させ813日間培養しそれぞれの比増殖速度を求めた。室内培養実験から、比増殖速度は、Nitzschia sp.はμ=0.00.80/day、Navicula sp.ではμ=0.01.00/dayあるごとがわかった。両種共に-5°C、0μE/m^2sという条件では成長が見られず、Navicula sp.は、200μE/m^2s 15°C・25psu条件で、Nitzschia sp.は200μE/m^2s 15°C・30psu条件で最大の比増殖速度を示した。また、Navicula sp.は-3°Cでも成長が見られたが、Nitzschia sp.は見られなかった。本実験結果と既往の文献値を比較したところ、研究フィールドに生息する底生珪藻は、強光・高塩分条件においても成長し、低温から高温という幅広い温度条件に適応しており、好冷性を持ちながら、温帯域に生息する底生珪藻に似た特徴を持つと考えられた。また、河川流入量が極小であるという現場の特徴から、年間優占種のNavicula sp.は、一般的な河口域干潟に生息する底生珪藻や、夏季特定優占種のNitzschia sp.に比べ、栄養塩類に対して短時間の変動よりも季節変動に適応した動態を示している可能性があり、その生理的特徴の相違から、優占する場所・季節が異なっていたと考えられた。
潜在型TGF-β活性化拮抗オリゴペプチド投与による肺線維化抑制効果の検討

仮説と目的障害を受けた未熟損傷肺に対して、潜在型TGF-β活性化拮抗オリゴペプチド(LSKL)を投与することによって、TGF-βの活性を抑制し肺線維化を軽減できるのではないかとの仮説をたてた。14年度は、ブレオマイシンによる肺線維化モデルラットをもちいて、LSKLを吸入により投与し、1)2週間後の体重増加の比較、2)肺コンプライアンスの比較、3)肺実質のヒドロキシプロリン量の比較、において、いずれもLSKL群が生食群に比較して、肺線維化を軽減し、損傷を抑制することを明らかにした。15年度はこのモデルにおいて、TGF-β活性化が実際に抑制されているかどうか検討した。方法結果結論一連の結果より、LSKLの吸入による投与は、このモデルにおいて、TGF-βの活性化を抑制し、線維化を軽減し、生理学的なパラメータを改善した。今後は、臨床応用を目指し、投与方法や安全性等検討したい。仮説と目的障害を受けた未熟損傷肺に対して、潜在型TGF-β活性化拮抗オリゴペプチド(LSKL)を投与することによって、結果的にTGF-βの活性を抑制し肺線維化を軽減できるのではないかとの仮説をたてた。ブレオマイシンによる肺線維化モデルラットをもちいてLSKLを吸入により投与し、生理学的な効果を検討した。方法4週齢のSDラットの気管内にブレオマイシン(15mg/kg body weight)を投与し、肺線維化モデルを作成し、生食またはLSKLをチャンバー内で30分間、吸入にて2週間投与した。(各N=12)。体重変化と肺コンプライアンス、肺実質のヒドロキシプロリン量を比較した。結果1)2週間後の体重増加は、LSKL群が生食群より大きかった。(1.29±0.40 vs1.09±0.38p=0.44)。2)肺コンプライアンスはLSKL群が生食群より有意に大きかった(1.98±0.46 vs 1.36±0.16ml/cmH20/kg, p<0.05)。3)肺実質のヒドロキシプロリン量はLSKL群が生食群より有意に低かった(7.36±1.25 vs 9.30±12,7μg/mg lung tissue, p<0.05)。結論これらの結果より、LSKLの吸入により投与は、このモデルにおいて、肺線維化を軽減し、損傷を抑制すると考えられた。今後は、組織的な検討やTGF-βの測定等を重ね、投与方法等さらに検討を加える予定である。昨年度は、プレオマイシンによる肺線維化モデルラットをもちいて、LSKLを吸入により投与し、1)2週間後の体重増加の比較、2)肺コンプライアンスの比較、3)肺実質のヒドロキシプロリン量の比較、において、いずれもLSKL群が生食群に比較して、肺線維化を軽減し、損傷を抑制することを明らかにした。今回はこのモデルにおいて、TGF-β活性化が実際に抑制されているかどうか検討した。方法4週齢のSDラットの気管内にブレオマイシン(15mg/kg body weight)を投与し、肺線維化モデルを作成し、生食またはLSKLをチャンバー内で30分間、吸入させ、day1,day3.day7の肺実質のactiveTGF-β/total TGF-β比を比較した。(各N=13)。結果day1,day3.day7の肺実質のactiveTGF-β/total TGF-β比は、生食群では、1.61,1.65,1.92 LSKL群では、0.90,1.50,1.11であり、LSKLの吸入によって、TGF-βの活性化が抑制された可能性が示唆された。結論一連の結果より、LSKLの吸入による投与は、このモデルにおいて、TGF-βの活性化を抑制し、線維化を軽減し、生理学的なパラメータを改善した。
腫瘍依存性血管新生・リンパ管新生を抑制する遺伝子改変幹細胞移植による分子標的治療

マウス皮下組織にsarcima-180あるいはNFSA腫瘍細胞株を接種するとゆっくりとした腫留の形成が認められる。これらの動物にACE阻害薬のリジノプリルあるいはAT1受容体格抗薬のTCV-116を投与すると、血管新生および腫瘍増殖は強く抑制された。腫瘍周囲ストローマを含む試料でAT受容体サブタイプの発現解析を行うと、AT2およびAT1bは全く検出されず、AT1aのみ検出された。免疫組織化学でAT1の組織内発現を調べると、AT1を発現しているのは腫瘍細胞ではなくむしろ腫瘍周囲めストローマであった。致死量の放射線をWTのC57BL/6に照射し、WTあるいはATlaノックアウトマウスめ骨髄細胞を尾静脈より移植し、その後LLCを接種すると、AT1aノックアウトマウスの骨髄細胞を移植したマウスで、腫瘍増殖および血管新生の著しい抑制がみられた。AT1aノックアウトマウスには、欠損する遺伝子にLacZ遺伝子を導入しているので、β-galの免疫組織化学をおごなうと、確かにAT1aノックアウトマウスの骨髄細胞を移植したマウスで、ストローマ部位で陽性像が認められた。さらに同部位でVEGFの発現を調べると、AT1aノックアウトマウスの骨髄細胞を移植したマウスで、減少していることが判明した。骨髄より間質に浸潤するストローマ細胞のAT1aを選択的にノックアウトすることで、がん依存性の血管新生、増殖が抑制され、遺伝子を改変した骨髄細胞移植が固形腫瘍の治療になりうることを示すことが出来た。本年度は、宿主PG受容体の腫瘍血管新生における役割を解析することに主眼をおき、PG受容体ノックアウトマウス、受容体拮抗薬を用いて検討を加えた。腫瘍ストローマの血管新生をミミックするスポンジ移植モデルでは、EP1,2,3,4にそれぞれ特異性の高いアゴニストを投与するとEP3アンゴニストが血管新生を用量依存的に増強し、EP3ノックアウトマウスのスポンジ血管新生はWTのそれに比較して、有意に血管新生が抑制された。スポンジ肉芽組織にはCOX-2の発現があり、それによって産生されたPGE2が血管新生を増強していた。EP3シグナリングはVEGFの発現増大を引き起こし、そのVEGFに血管新生は依存していた。EP1,2,3,4のそれぞれの受容体ノックアウトマウスとIP受容体ノックアウトマウスにLLC細胞を接種するとWTに比較してEP3ノックアウトマウスで腫瘍増殖、腫瘍血管新生が抑制され、腫瘍増殖および腫瘍依存性の血管新生において、宿主側の受容体が重要であることが明らかになった。EP3受容体拮抗薬はWTの腫瘍増殖および腫瘍依存性の血管新生を抑制したが、EP3ノックアウトでは全く無効で、これからも宿主側のEP3が重要であること明らかにすることができた。VEGFの発現をWTの腫瘍、ストローマで確認したところ、腫瘍組織よりストローマで発現が強く、EP3ノックアウトではストローマでのVEGFの発現が強く抑制されていた。VEGF受容体キナーゼ阻害薬の投与ではWTで腫瘍増殖および腫瘍依存性の血管新生が強く抑制された。腫瘍新生血管におけるペリサイトの装着もEP3ノックアウトマウスでは抑制が見られ、新生血管の成熟度にもEP3受容体が関与することが明らかであった。EP3シグナリングを改変した骨髄細胞移植による血管新生の抑制が見られるかどうか検討する基盤が整った。マウス皮下組織にsarcoma-180あるいはNFSA腫瘍細胞株を接種するとゆっくりとした腫留の形成が認められる。これらの動物にACE阻害薬のリジノプリルあるいはAT1受容体拮抗薬のTCV-116を投与すると、血管新生および腫瘍増殖は強く抑制された。免疫組織化学でAT1の組織内発現を調べると、AT1を発現しているのは腫瘍細胞ではなくむしろ腫瘍周囲のストローマであり、一部新生血管で発現が認められた。上述のsarcoma-180移植モデルの血管新生にも、VEGFが重要な役割を果たすことが明らかであった。腫瘍ならびにその周囲のストローマでのVEGFの発現を蛋白レベルで免疫組織化学で調べると、腫瘍細胞よりむしろストローマ細胞でのVEGFの発現が強く認められ、AT1受容体拮抗薬のTCV-116の投与により特にストローマでその発現の減弱がみとめられた。VEGFのmRNAをみてみても全く同様の推移を確認できた。さらに宿主ストローマのAT1a受容体シグナリングの重要性を確認するため、AT1a受容体ノックアウトマウスを用いて腫瘍接種モデルの検討を行った。同受容体ノックアウトマウスとワイルドタイプマウスにLLC細胞を背部皮下組織に接種すると、ワイルドタイプでの増殖に比べAT1aノックアウトマウスでは増殖が抑制された。CD31染色で確認した腫瘍組織内での新生血管密度はAT1aノックアウトマウスで極めて低値を示した。同受容体ノックアウトマウスとワイルドタイプマウスに腫瘍を接種し、TCV-116を両マウスに連日投与すると、ワイルドタイプで腫瘍増殖、腫瘍依存性の血管新生が強く抑制されたのに対し、AT1aノックアウトマウスではTCV-116の抑制効果は全くみられず、これからも宿主側のAT1a受容体シグナリングが主に作用していることが明らかにできた。AT1aノックアウトマウスではVEGFの誘導もかからないことが見いだされた。

これらの動物にACE阻害薬のリジノプリルあるいはAT1受容体格抗薬のTCV-116を投与すると、血管新生および腫瘍増殖は強く抑制された。腫瘍周囲ストローマを含む試料でAT受容体サブタイプの発現解析を行うと、AT2およびAT1bは全く検出されず、AT1aのみ検出された。免疫組織化学でAT1の組織内発現を調べると、AT1を発現しているのは腫瘍細胞ではなくむしろ腫瘍周囲めストローマであった。致死量の放射線をWTのC57BL/6に照射し、WTあるいはATlaノックアウトマウスめ骨髄細胞を尾静脈より移植し、その後LLCを接種すると、AT1aノックアウトマウスの骨髄細胞を移植したマウスで、腫瘍増殖および血管新生の著しい抑制がみられた。AT1aノックアウトマウスには、欠損する遺伝子にLacZ遺伝子を導入しているので、β-galの免疫組織化学をおごなうと、確かにAT1aノックアウトマウスの骨髄細胞を移植したマウスで、ストローマ部位で陽性像が認められた。さらに同部位でVEGFの発現を調べると、AT1aノックアウトマウスの骨髄細胞を移植したマウスで、減少していることが判明した。骨髄より間質に浸潤するストローマ細胞のAT1aを選択的にノックアウトすることで、がん依存性の血管新生、増殖が抑制され、遺伝子を改変した骨髄細胞移植が固形腫瘍の治療になりうることを示すことが出来た。
心筋幹細胞移植医療の実現化に向けたヒト心筋幹細胞特異的増幅因子のクローニング

平成17年7月1日より、心筋幹細胞移植医療の実現化に向けたヒト心筋幹細胞特異的増殖因子のクローニングに関する研究課題に関し、特にsignal sequence trap法を使ったadult由来心筋幹細胞の増殖因子の同定に関する研究を開始した。採取したadult由来マウス心筋幹細胞からのcDNA library作製し、レトロウイルスパッケージング細胞であるPlatE細胞にRoche社のFuGENE6を使用して導入し、レトロウイルスとして回収した。回収したレトロウイルスを感染効率が20%弱になるように調整してBa/F3細胞に感染させ、96well plateに10000個/wellで撒き、IL-3非存在下で2週間程培養した。培養により、シグナル配列を持たないpMX-SSTが感染したBa/F3細胞は死滅し、シグナル配列を持ったcDNA断片を融合したpMX-SSTが感染したBa/F3細胞のみ増殖が認められ、最終的に200近くの細胞クローンが認められた。これらの細胞クローンから染色体DNAを抽出した後、vector primerを用いてPCRを行い、挿入cDNA断片を回収した。回収したcDNA断片のすべてに対してシーケンサーによる解読を行い、NCBI BLASTホームページ上のnucleotide-nucleotide blastを使って相同性検索を行ったところ、adult由来マウス心筋幹細胞に特異的に発現している分泌タンパク質が2つ認められた。この2つは、RT-PCRでもmRNA発現が亢進していることを確認し、そのうちの1つは免疫染色でsphereを形成している細胞上に強くタンパク発現していることも確認した。現在、これらの同定されたタンパク質についてrecombinantによる薬物的刺激実験とノックアウトマウスを使った抑制実験の2つの方向から、同定されたタンパク質のマウス心筋幹細胞への増殖に対する効果を解析すべく準備を進めている。今後、同定されたタンパク質が増殖に関わることが明らかになれば、ヒト心筋幹細胞への応用が可能かどうか検討していく予定である。
直腸微小血管の制御機構と自動能

直腸細動脈mural cells(血管平滑筋や周皮細胞)は周期的かつ同期的な自発細胞内Ca2+上昇を示した。小胞体からの自発Ca2+放出に続くCa2+活性化Cl-チャネルを介したCl-流出(=脱分極)は、ギャップ結合でつながる近隣のmural cellsを脱分極させて電気的に同期させると考えられた。続くT型およびL型電位依存性Ca2+チャネルからのCa2+流入により細胞間で同期した自発Ca2+上昇が生じた。T型とL型Ca2+チャネルは、それぞれ自発Ca2+上昇の頻度と持続時間も増加させた。自発Ca2+上昇に基づく細動脈自発収縮は、直腸壁が糞塊で伸展される際の虚血リスクを低下させると推察された。内容物により伸展される臓器(胃、直腸、膀胱など)では、細動脈のmural cells(血管平滑筋やぺリサイト)間で同期して、自発的かつ周期的な細胞内Ca2+上昇がみられる。このCa2+上昇により微小血管の自発収縮が惹起され、臓器伸展時におこりうる微小血管の虚血を防ぐものと推察される。今年度は、Ca2+活性化Cl-チャネルとT型およびL型電位依存性Ca2+チャネルのはたらきに焦点をあて、直腸細動脈のmural cells間で同期した自発的Ca2+上昇がおこるしくみについて検討した。【免疫染色】直腸粘膜標本にアルファ平滑筋アクチン免疫染色を施し、微小血管網を共焦点レーザー顕微鏡にて撮影した。曲がりくねった直径1525 μmの毛細血管前細動脈(precapillary arteriole)が豊富に観察された。細動脈mural cellsの丸い細胞体は、血管の外側へ飛び出して観察された。【細胞内Ca2+イメージング】Ca2+蛍光指示薬Cal-520をラット直腸粘膜下層標本内の毛細血管前細動脈mural cellsに取り込ませた。Cal-520にCa2+が結合すると、蛍光シグナルが強くなる性質を利用し、mural cells内のCa2+変動について検討した。自発的Ca2+上昇の発生・伝播機構について各種阻害剤などを使用して検討した。その結果、小胞体からの自発的Ca2+放出が、Ca2+活性化Cl-チャネルを開口させて脱分極(Cl-流出)をひきおこすことや、この脱分極がギャップ結合を介して伝わることで複数のmural cellsどうしが電気的に同期することが推察された。さらに脱分極により、電位依存性のT型およびL型Ca2+チャネルが開き、それぞれが自発的Ca2+上昇の頻度促進と持続時間延長に寄与すると考えられた。「研究実績の概要」に示した毛細血管前細動脈mural cells内の自発的Ca2+上昇機構をまとめ、論文として発表したことから、おおむね研究は順調にすすんでいると自己評価した。これまでに我々は、伸展性臓器(膀胱、胃、遠位結腸)において細静脈mural cells内の自発的Ca2+上昇機構およびそれにともなう細静脈自発収縮について報告してきた。本研究で用いた直腸粘膜下層標本においても同様の細静脈自発活動が認められた。そのため、今回の主な研究対象である細動脈mural cells内の自発的Ca2+上昇機構と細静脈のそれとを比較することができ、以下の相違点が認められた。1)細静脈muralcells間における自発的Ca2+上昇の同期性は、L型電位依存性Ca2+チャネルブロッカー(nifedipine)により失われたのに対し、細動脈ではnifedipine存在下でも同期性は保たれていた。つまり、細静脈mural cellsでは、Ca2+活性化Cl-チャネルの開口による脱分極に引き続いておこるL型電位依存性Ca2+チャネルからのCa2+流入による脱分極増強作用が細胞間同期性の維持に必須であった。これに対して、細動脈mural cellsでは、Ca2+活性化Cl-チャネルの開口による脱分極のみで細胞間の電気的カップリングがおこると考えられた。2)細静脈mural cellsでは、T型電位依存性Ca2+チャネルの関与がみられなかったが、細動脈mural cellsではT型とL型Ca2+チャネルがそれぞれ自発的Ca2+上昇の頻度促進と持続時間延長とにかかわっていることが示された。本研究では、直腸の細動脈mural cells(血管平滑筋や周皮細胞)で自発Ca2+上昇が生ずることを見出し、その機序を調べた。最終年度には内皮細胞によるその制御についても検討した。ラット直腸粘膜下層の直径約20マイクロメートルの毛細血管前細動脈(precapillary arteriole)において、mural cellsは丸い細胞体を有し、数本の突起をのばしていた。細動脈mural cellsはギャップ結合によってつながり、細胞間で同期した周期的な自発細胞内Ca2+上昇を示した。小胞体IP3受容体からの自発的Ca2+放出がCa2+活性化Cl-チャネル(CaCCs)を開口させると、脱分極(細胞外へのCl-流出)がおこり、T型およびL型電位依存性Ca2+チャネルを介したCa2+流入により細胞間で同期した自発Ca2+上昇を示すと考えられた。以前報告した胃腸細静脈の自発Ca2+上昇・自発収縮は、CaCCs開口による脱分極が近隣のmural cellsへ伝わる際にL型Ca2+チャネルが開き、さらなる脱分極を誘発することで同期性が保持された。これに対し、細動脈ではCaCCs

開口による脱分極自体が大きく、細胞間の電気的同期を生ずるのに十分と推察された。細動脈mural cellsのT型およびL型Ca2+チャネルの開口は、それぞれ自発Ca2+上昇の頻度と持続時間を増加させた。一方、内皮細胞から常に放出される一酸化窒素(NO)は、細動脈mural cells内でcGMP産生を促して自発Ca2+上昇頻度を抑制していた。cGMP分解酵素phosphodiesterase 5はこれに拮抗して働いていた。直腸壁は、糞塊により伸展されると血液が滞りやすい。細動脈mural cellsの周期的な自発Ca2+上昇は、周期的な細動脈自発収縮をひきおこして虚血を防ぐための機構であると推察された。直腸細動脈mural cells(血管平滑筋や周皮細胞)は周期的かつ同期的な自発細胞内Ca2+上昇を示した。小胞体からの自発Ca2+放出に続くCa2+活性化Cl-チャネルを介したCl-流出(=脱分極)は、ギャップ結合でつながる近隣のmural cellsを脱分極させて電気的に同期させると考えられた。続くT型およびL型電位依存性Ca2+チャネルからのCa2+流入により細胞間で同期した自発Ca2+上昇が生じた。T型とL型Ca2+チャネルは、それぞれ自発Ca2+上昇の頻度と持続時間も増加させた。自発Ca2+上昇に基づく細動脈自発収縮は、直腸壁が糞塊で伸展される際の虚血リスクを低下させると推察された。微小血管の自発活動について組織標本を用いた生体外(in vitro)の研究を行い、その機構を明らかにしてきた。一方、血管の自発活動は、麻酔により抑制されるとされており、麻酔下の動物を用いた生体内(in vivo)における微小血管自発収縮の観察を行うためには、様々な実験条件の検討・工夫が必要と考えられる。現在、麻酔下のラットを用いて結腸粘膜下層細静脈の周期的収縮測定を試みている。生理学・形態学ラット直腸粘膜下層標本を用いたin vitro実験において、血管を支配する神経を刺激するために用いる神経刺激装置一式を購入する予定であった。しかしながら、実験を進める過程で毛細血管前細動脈は神経性の制御よりも自発性の活動の方が主であることが判明した。そのため本年度は刺激装置一式の購入は行わず、細動脈平滑筋の自発的細胞内Ca2+上昇機構の解明に焦点をしぼって研究を進めた。毛細血管前後の微小血管における自発活動機構およびその形態を詳細に検討するため、様々な試薬および抗体を購入する予定である。
大腸菌における転写終結、mRNA3末端形成機構と遺伝子発現制御

大腸菌等の細菌細胞内において、終止コドンを持たないmRNAから生産される不完全なポリペプチド鎖には、trans-translationと呼ばれる最近明らかにされた機構により11アミノ酸からなる特異的な「Tag配列」が付加される。Tagの付加したポリペプチド鎖はプロテアーゼによって速やかに分解され、細胞から除去される。trans-translationにはSsrA RNA(tmRNA)と呼ばれる低分子RNAが重要な役割を果たすことが分かっていたが、その具体的な標的はこれまで同定されていなかった。本研究ではプロテアーゼに耐性を示す変異Tag配列を付加することのできるSsrA-DDを構築し、Tagの付加したポリペプチド鎖を直接検出する型を確立し、それを利用した解析から、大腸菌のlactose repressor(Lacl)がtrans-translationの標的となること、それが「外界のlactoseに対する大腸菌の迅速な応答を保証する」という生理学的意義を持つことを明らかにした。また、LacIに対するtrans-translationは、LacIが自分自身のORFのすぐ近傍に存在するLac operator(O3)に結合することでlacI遺伝子の転写伸長を妨げ、不完全なlacI mRNAをつくり出すことにより起こることを明らかにした。さらにSsrA-DDを利用した解析等から、通常の研究室内環境で生育する大腸菌細胞内でtrans-translationが頻繁に起こっていることも明らかにした。典型的なrho-independent terminator(RIT)を持つ大腸菌crp遺伝子の下流に第二のRITとして大腸菌rmB遺伝子のRIT(rmBT1)を配したdouble terminator系では、二つのterminator間の距離が200bp以下の時に限り、crpterminator(crp t)を通り過ぎて下流側のterminatorまで転写されているmRNAが検出できる。これは転写が単純にRITで終結するのではなく、RITを超えて200塩基以内に転写が終結し、その産物がプロセスされることで結果的にmRNAの3'末端がRITにマップされていることを示唆する。この転写のreadthroughはcrpの翻訳に依存しており、翻訳終止コドンとRITの距離がある程度以上離れるとreadthrough効率が下がる。この現象がcrpに特異的なものではなく広く大腸菌の遺伝子について見られる現象であることを示すために大腸菌ゲノム上から終止コドンとRITとの距離が10塩基から15塩基程度とcrpと同程度の幾つかの遺伝子を選んで同様のdouble terminatorを構築し、readthoughの有無を調べたところ、dapD、speD各遺伝子においてcrpの時と同様に転写のreadthoughが観察された。しかし、crr遺伝子については現在までのところdouble terminator系でのreadthroughは見られていない。これらの結果から、翻訳に依存した転写のreadthroughがcrpの例に限らず一般的に言えること、単純に終止コドンとRITとの間の距離が転写のreadthroughを規定するのではなく、RIT自身の構造、周辺の塩基配列などによって転写がどこで終結するのかが決定されていることが示唆された。