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筋緊張性ジストロフィー症の遺伝子異常と細胞膜傷害に関する研究

本研究では筋緊張性ジストロフィー症の臨床症状の多様性と遺伝子異常との対応、遺伝子異常と細胞膜、特にNa^+チャンネル、Cl^-チャンネルの変化との関係を検討することを目的とした。1.筋緊張性ジストロフィー症(DM)のDNA解析本研究の趣旨に同意したDM患者、正常者からDNAを抽出し、19q13.3に存在する(CTG)の3塩基反復配列の増大をPCR法で検討した。正常者では150200kbの間に2本のバンドがみられたが、DM患者ではバンドは1本のみで、これは異常アレルの(CTG)反復配列の増大が大き過ぎるため、PCR法では増幅できなかったものと解釈した。現在サザンハイブリダイゼーション法による検討をすすめている。MBL社製のウサギ抗DM-PKポリクロナール抗体を用いて、酵素抗体法間接法で骨格筋細胞内のDM-PKの局在を検討した。正常筋細胞では筋膜に沿って部分的に茶褐色の反応物質を認めたが、DM(初期)では筋膜、細胞質内のいずれにも反応物質を認めなかった。神経原性萎縮筋細胞では正常筋と同様の染色性を示したが筋炎では筋細胞質内に茶褐色の反応物質を認め、これは再生線維の胞体内により顕著に認められた。3.筋細胞膜のイオンチャンネルの検討DM患者の筋組織から得た単核筋芽細胞と培養後の多核筋管細胞を用いて、細胞膜のイオンチャンネルの開閉現象による微小イオン電流をパッチクランプ法で測定した。しかし、単核筋芽細胞を用いた実験では一時的にギガシールが成立するも直ちにホールセルに移行し、記録は不能であった。また多核筋管細胞を用いた実験でもギガシールの成立に至らず、これも記録はできなかった。現在、この問題点を検討しつつ、動物の筋細胞を用いた基礎実験を行っている。本研究の目的は、筋緊張性ジストロフィー(DM)の遺伝子異常と細胞膜、特にNa^+チャンネル、Cl^-チャンネルの変化との関係を検討することであるが、平成6年度はDMの遺伝子産物とされるDMキナーゼ(DMK)の筋肉細胞内局在を免疫組織化学染色法の開発により検討した。【対象・方法】MBL研究開発部製のウサギ抗DMK抗体(0.85mg/500μl)を用いて、酵素抗体法(間接法)により、正常者、筋緊張製ジストロフィーおよび筋炎患者の骨格筋内DMキナーゼ(DMK)の局在を検討した。【結果】1.最初に抗DMK抗体の至適濃度の検討を行ったが、50倍希釈が染色する上で最適と判断した。2.DMKの局在正常者では筋線維(筋細胞)の筋膜が部分的に染色された。筋緊張性ジストロフィー(初期)では筋膜、胞体内のいずれも染色されなかった。筋炎では再生線維の胞体内、浸潤細胞、血管壁が染色された。【まとめと今後の方針】筋緊張性ジストロフィーではDMKの発現は低下しているという結果であるが、これは本症の遺伝子異常と関係したものかもしれない。今後は症例数を増やして検討を続けると共に、筋組織から抽出したDNAを用いた(CTG)の繰り返し数との対応、およびパッチクランプ法によるイオンチャンネル異常との関係についての検討を進める予定である。1.筋緊張性ジストロフィー症(DM)のDNA解析本研究の趣旨に同意したDM患者、正常者からのDNAを抽出し、19q13.3に存在する(CTG)の3塩基反復配列の増大をPCR法で検討した。

正常者では150200kbの間の2本のバンドがみられたが、DM患者ではバンドは1本のみで、これは異常アレルの(CTG)反復配列の増大が大き過ぎるため、PCR法では増幅できなかったものと解釈した。現在サザンハイブリダイザーション法による検討をすすめている。MBL社製のウサギ抗DM-PKポリクロナール抗体を用いて、酵素抗体法間接法で骨格筋細胞内のDM-PKの局在を検討した。正常細胞では筋膜に沿って部分的に茶褐色の反応物質を認めたが、DM(初期)では筋膜、細胞質内のいずれにも反応物質を認めなかった。神経原製萎縮筋細胞では正常筋と同様の染色性を示したが、筋炎では筋細胞質内に茶褐色の反応物質を認め、これは再生線維の胞体内により顕著に認められた。3.筋細胞膜のイオンチャンネルの検討DM患者の筋組織から得た単核筋芽細胞と培養後の多核筋管細胞を用いて、細胞膜のイオンチャンネルの開閉減少による微小イオン電流をパッチクランプ法で測定した。しかし、単核筋芽細胞を用いた実験では一時的にギガシールが成立するも直ちにホールセルに移行し、記録は不能であった。また多核筋管細胞を用いた実験でもギガシールの成立に至らず、これも記録はでいなかった。現在、この問題点を検討しつつ、動物の筋細胞を用いた基礎実験を行っている。
グルタミン酸脱炭酸酵素ノックアウトマウスを用いた神経発生機構の解明

1.GABA合成酵素であるマウスグルタミン酸脱炭酸酵素(mGAD-1,mGAD-2)のcDNAおよび遺伝子を単離し、構造を解析した。mGAD-1遺伝子は全長約56kbで翻訳領域は19個のエクソンにより構成されていた。その中に、2個の5非翻訳領域のエクソン(エクソンOA、エクソンOB)の存在を明らかにした。mGAD-2は50kb以上の遺伝子でエクソン1から7までエクソンノイントロン接合部位の塩基配列を決定し、その領域内の制限酵素地図を作成した。mGAD-2遺伝子についてはターゲッティングコンストラクト(プラスミド)を作成し、ES細胞に導入した。今後、相同組み換えが行った細胞を用いてノックアウトマウスを作成し、神経回路網におけるGAD遺伝子の役割を明らかにする。2.GAD遺伝子の発現調節機構を解明するため、mGAD-1及びmGAD-2遺伝子についてプロモーターを含む上流領域を単離した。mGAD-1遺伝子については(1)エクソンOAとエクソンOBとで発現様式に組織特異性があること。(2)それぞれのプロモータに、Krox-24やSp1などの転写因子結合部位の存在。(3)プロモーター及び両エクソンを含む約10kbの上流域にlacZ遺伝子を連結した融合遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成し、β-galactosidase染色を行った。その結果、大脳皮質や線条体などのmGAD-1遺伝子発現の多い領域に、lacZ遺伝子の発現が認められた。以上のことはプロモーター領域がmGAD-1遺伝子の発現に必要不可欠であることを示唆している。mGAD-2遺伝子については、約8kbの上流域をlacZ遺伝子に連結した融合遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを4系統を樹立した。今後、これらのトランスジェニックマウスを解析することにより、GABA作働性線維に特異的な転写因子結合配列の同定を行う。1)マウスグルタミン酸脱炭酸酵素(mGAD-1,mGAD-2)cDNAをマウス脳よりRT-PCR法にてそれぞれ合成した。これらのcDNAをプローブとしてマウスゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし、mGAD-1は全長約50kb、mGAD-2は40kb以上の遺伝子であることを明らかにした。また、エクソン1から5までのエクソン/イントロン接合部位の塩基配列を決定し、その領域内の制限酵素地図をそれぞれ作成した。mGAD-2遺伝子については相同組み換えに用いるターゲッティングコンストラクト(プラスミド)を作成した。今後、このプラスミドをマウスES細胞に導入することによりノックアウトマウスを作成し、神経回路網形成におけるGAD遺伝子あるいはGABA作働性線維の役割を明らかにする。2)GAD遺伝子の発現調節機構を解明する目的にてmGAD-1及びmGAD-2プロモーター領域のクローニングを行った。mGAD-1プロモーター(約8kb)とLac Z遺伝子の融合遺伝子を作成し、マウス卵に導入することにより、6匹の独立したトランスジェニックマウスを得た。今後、これらのマウスのLac Z遺伝子の発現を神経組織をはじめとする種々の組織および各発生段階において検討することにより、プロモーター機能を明らかにする。3)GABA合成酵素のマウス4-アミノブチルアルデヒド脱水酵素cDNAをマウス肝組織よりRT-PCR法およびRACE法を用いて単離し、塩基配列の決定を行った。(1)マウスグルタミン酸脱炭酸酵素(mGAD-1, mGAD-2)遺伝子を単離し、構造を解析した。mCAD-

1遺伝子は全長約45kbで翻訳領域は17個のエクソンから構成されていた。また、2個の5非翻訳領域のエクソン(OA及びOB)が存在していた。mGAD-2は50kb以上の遺伝子であり、エクソン1から7までのエクソンイントロン接合部位の塩基配列を決定し、その領域内の制限酵素地図を作成した。mGAD-2遺伝子については、相同組み換えに用いるターゲッテイングコンストラクトを作成し、マウスES細胞に導入することにより、相同組み換えが行った細胞をスクリーニングをしている。今後、組み換えがおこった細胞を用いてノックアウトマウスを作成し、神経回路網におけるGAD遺伝子あるいはGABA作働性線維の役割を明らかにする。(2)GAD遺伝子の発現調節機構を解明するため、mGAD-1プロモーター領域の改造を解析した。エクソンOA及びOBのそれぞれに対応するプロモータ領域には、Sp1やKrox-24などの結合配列に加えて神経系の転写制御に関与するNRSE及びCCAGGAGA配列の存在を明らかにした。さらに、これらのプロモーターを含む上流域(約10.2kb)をIacZレポーター遺伝子に融合したコンストラクトを導入したトランスジェニックマウスを作成し、プロモーター機能について検討した。2系統の独立したトランスジェニックマウスについて解析した結果、mGAD67遺伝子の発現量の多い領域(大脳皮質や線条体など)の神経細胞に特異的にIacZ遺伝子の発現が認められ、上記プロモーターが、mGAD67遺伝子の発現に必要不可欠であることを示唆する所見を得た。また、mGAD-2ピロモーターをIacZ遺伝子に融合したコンストラクトを導入したトランスジェニックマウスを4系統得た。今後、同様にmGAD-2プロモーター機能を明らかにする。
量子最適受信機の実現に向けた光子検出器の研究

1.平成20年度の研究目的:(1)光子検出器の不完全性が実験結果に及ぼす影響の解析(2)単一光子検出器の開発に着手2.研究実施計画(1)光子検出器の入射光子数依存性について調査(2)超低雑音電荷増幅器とシリコン・アバランシェフォトダイオードにより光子検出器の開発に着手3.研究実績の概要(1)当初理論解析による方法を模索したが、今回は実際に模擬実験を行った。パルス化した狭線幅レーザー光を強度変調し、その信号を構築した最適量子受信機により測定した。最適受信機に組み込まれている光子検出器の実験パラメータは光子検出効率と暗計数率である。光子検出効率が低い場合、信号が来ても受信機は光子を検出できない場合があるため、誤り率は増加する。一方で、暗計数は信号が来ていない場合に受信機が検出シグナルを出してしまうため、この場合も誤り率は増加する。つまり、検出効率が高く、暗計数率が低い光子検出器が必要となる。しかしながら、一般の検出器において、検出効率と暗計数率には比例関係がある。次年度は定量的な評価を行う予定である。(2)超低雑音電荷増幅器の性能について評価した。まず、電荷増幅器を用いて光子検出器を実現するためには、電荷増幅器が正確にアバランシェフォトダイオードから出力される電荷を読み出せる必要がある。この能力を調べるために、私は市販のアバランシェフォトダイオードを電荷増幅器に取り付け、微弱光を受信したアバランシェフォトダイオードから出力される電荷を電荷増幅器において読み出した。アバランシェフォトダイオード内で電子正孔対が1対生成された場合、その増倍分布の形状は明らかになっている。今回の実験で、その分布が再構成することができた。つまり、私が開発した電荷増幅器が正確にアバランシェフォトダイオードから出力される電荷を増幅できていることを確認できた。
科学分野をめぐるイスラームの多様性―イランの環境問題を事例に

本研究は、イラン人の環境意識を探り、いかにして環境科学がイスラームの枠組みに組み込まれるのか、という課題に取り組む。近年、イランでは大気汚染などの環境問題が日常化し、その性急なる解決が論及されている。政府は科学技術を駆使してその対策に乗り出す一方で、問題の解決へ向けて宗教指導者と連携しながらイスラーム的環境倫理観を市民へ発信している。科学知とイスラーム、という一見相反するパラダイムが環境分野において併存し、市民はこれらの言説を通して環境意識を形成している。本調査は、環境問題をめぐり市民の間で活発化し始めたイスラーム的視座に注目することで変化し続けるイスラームの多様性を理解することを目的とする。
ラット拡張型心筋症モデルにおける蛋白分解酵素MMPの作用機序解析及び治療法の開発

本研究の目的は,自己免疫性心筋炎・拡張型心筋症の新たな動物モデルを用いて病態を解析すると共に,近年様々な炎症性病変や組織破壊への関与が報告されているマトリクス・メタロプロテアーゼ(MMP)の心筋炎発症機序における役割を解析することである.更に,MMPの作用を特異的に阻害することにより,疾患の進行を抑制することを目指す.この目的を達成するために,1)よりヒト疾患に類似した動物モデルの作製,2)心筋炎・拡張型心筋症の発症及び進行におけるMMP発現動態の解析,3)MMP発現細胞の同定,4)MMPを標的とした治療法の開発,の4点に重点を置き研究を進めてきた.前年度までに,自己免疫性心筋炎・拡張型心筋症の発症機序におけるMMP分子の重要性を明らかにしたことから,19年度は,免疫組織科学染色,in situ zymography, gelatin zymographyを組み合わせてMMP産生細胞の同定を行った.その結果,炎症期の心臓では主にマクロファージがMMP-9を,慢性期では心筋細胞がMMP-2を発現していることが,疾患の進行に深く関与していることが示唆された.心筋炎を誘発したラットへのミノサイクリン投与によるMMP-9標的治療実験の結果,炎症期に本分子を抑制すると,心筋炎が顕著に軽症化するという結果を得た.現在,MMP-2の役割を検討するため,選択的阻害剤の投与による治療実験を進めている.両分子の作用を明らかにし,今後,RNAiなどを利用した特異的阻害剤を創製することにより,本疾患を早期に抑制する治療法の開発が期待される.本研究の目的は、自己免疫性心筋炎・拡張型心筋症の新たな動物モデルを用いて病態を解析すると共に、近年様々な炎症性病変や組織破壊への関与が報告されているマトリクス・メタロプロテアーゼ(MMP)の心筋炎発症機序における役割を解析することである。更に、MMPの作用を特異的に阻害することにより、疾患の進行を抑制することを目指す。この目的を達成するために、1)よりヒト疾患に類似した動物モデルの作製、2)心筋炎・拡張型心筋症の発症及び進行におけるMMP発現動態の解析、3)MMP発現細胞の同定、4)MMPを標的とした治療法の開発、の4点に重点を置き研究を進める。18年度は、心筋C蛋白の組換え蛋白をラットに免疫することにより、重症の自己免疫性心筋炎を誘発し、更に拡張型心筋症へ移行する動物モデルを作製した。病態の各進行時期におけるMMP発現を遺伝子及び蛋白レベルで定量解析した結果、発症初期の心筋組織においてMMP-9遺伝子及びゼラチナーゼ(MMP-2、MMP-9)活性の上昇が認められた。更に、重症度の異なる二つの心筋炎モデルを作製し両者を比較すると、疾患の重症度とMMP発現量の間に相関が見られた。これらの知見から、MMP分子が自己免疫性心筋炎・拡張型心筋症の発症機序において、重要な役割を果たしていることが示唆された。今後は、免疫組織科学染色や磁気細胞分離装置、レーザーマイクロダイセクションなどの手法を用いてMMP発現細胞の同定を予定している。更に、同定した細胞或いはMMP分子を標的とした特異免疫療法の開発について検討を進めたい。本研究の目的は,自己免疫性心筋炎・拡張型心筋症の新たな動物モデルを用いて病態を解析すると共に,近年様々な炎症性病変や組織破壊への関与が報告されているマトリクス・メタロプロテアーゼ(MMP)の心筋炎発症機序における役割を解析することである.更に,MMPの作用を特異的に阻害することにより,疾患の進行を抑制することを目指す.この目的を達成するために,1)よりヒト疾患に類似した動物モデルの作製,2)心筋炎・拡張型心筋症の発症及び進行におけるMMP発現動態の解析,3)MMP発現細胞の同定,4)MMPを標的とした治療法の開発,の4点に重点を置き研究を進めてきた.前年度までに,自己免疫性心筋炎・拡張型心筋症の発症機序におけるMMP分子の重要性を明らかにしたことから,19年度は,免疫組織科学染色,in situ zymography, gelatin zymographyを組み合わせてMMP産生細胞の同定を行った.その結果,炎症期の心臓では主にマクロファージがMMP-9を,慢性期では心筋細胞がMMP-2を発現していることが,疾患の進行に深く関与していることが示唆された.心筋炎を誘発したラットへのミノサイクリン投与によるMMP-9標的治療実験の結果,炎症期に本分子を抑制すると,心筋炎が顕著に軽症化するという結果を得た.現在,MMP-2の役割を検討するため,選択的阻害剤の投与による治療実験を進めている.両分子の作用を明らかにし,今後,RNAiなどを利用した特異的阻害剤を創製することにより,本疾患を早期に抑制する治療法の開発が期待される.
正常型プリオン蛋白の細胞内局在とその異常化分子機構の解明

プリオン蛋白の細胞内局在とその異常化の分子機構を解明するために、プリオン蛋白の高発現系として作製したトランスジェニック・マウスを用いてレコンビナント・プリオン蛋白の細胞局在を検討した。正常型プリオン蛋白は、中枢神経系では主にAxonに存在し、とりわけaxon terminalに多く存在する傾向がみられた。トランスジェニック・マウスの発生の過程でプリオン蛋白の発現を観察すると、耐性12日ころからaxonを中心に正常プリオン蛋白の存在が認められだし、神経細胞の未熟な段階では発現が少なく、神経細胞の移動が完成に近づくにつれ正常型プリオン蛋白が発現するのが明らかになった。dendriteよりaxonに多く存在することは、プリオン蛋白がGPIアンカー型蛋白であることがその局在に影響していると考えられた。また、中枢神経系以外では、主にneural crest由来の細胞で胎生早期から発現しており、副腎髄質、Auerbach神経叢、甲状腺C細胞などにつよく発現が認められた。特に、副腎髄質の細胞では胎生期のneural crestからの移動中から発現が認められ、ほぼ副腎皮質の細胞群の中に入る頃から発現が増すことが明らかとなった。各臓器で、正常型のプリオン蛋白のglycosylationには差が認められるという結果も得られた。このトランスジェニック・マウスを感染実験したところ、ヒトのプリオンに対して高い感受性を有することが明らかとなった。また、発病したマウスで異常プリオン蛋白の分布をWestern blot法で解析したところ、異常型のプリオン蛋白は現時点では中枢神経系でのみ確認され、一般臓器のプリオン蛋白の異常への変換が効率の悪いものであることを明らかにした。プリオン蛋白の異常化には、組織特異的な因子が必要であることを示唆する結果であった。レコンビナント・プリオン蛋白はヒト型であり、マウスのプリオン蛋白と区別可能な3F4というモノクローナル抗体で、レコンビナント蛋白のみを検出することが可能であった。各臓器における正常型プリオン蛋白をウエスタンブロットで検索したところ、分子量にかなりのばらつきがみられた。そこで、酵素をつかって糖鎖をのぞいたところ、分子量は完全に一致した。つまり、各臓器でのプリオン蛋白の糖鎖構造が異なることが明らかとなった。また、マウスの発生段階を検索し、正常プリオン蛋白がまずNeural Crest由来の細胞で発現しはじめることを明らかとした。つぎに、ヒト・プリオンを感染させて異常プリオン蛋白の存在を中枢神経系で検討した。正常プリオン蛋白は、おもにアクソンに存在していたが、異常プリオシ蛋白の局在は、正常プリオン蛋白とは異なり、シナプスに局在することを明らかとした。また、中枢神経系で正常から異常プリオン蛋白への変換が起こっているかどうかを、プリオン蛋白が界面活性剤不溶性となりしかもプロテアーゼ抵抗性であることを指標にしてウエスタンブロットで確認した。今後は、正常プリオン蛋白が発現する細胞で、異常プリオン蛋白への変換が起こるのかどうか、もし起こらないとすると、その変換の起こらない原因は何なのかを中心に平成11年度の研究を進めていく予定である。研究の進行は予定通り順調に進んでいる。

トランスジェニック・マウスの発生の過程でブリオン蛋白の発現を観察すると、耐性12日ころからaxonを中心に正常プリオン蛋白の存在が認められだし、神経細胞の未熟な段階では発現が少なく、神経細胞の移動が完成に近づくにつれ正常型プリオン蛋白が発現するのが明らかになった。dendriteよりaxonに多く存在することは、プリオン蛋白がGPlアンカー型蛋白であることがその局在に影響していると考えられた。また、中枢神経系以外では、主にneural crest由来の細胞で胎生早期から発現しており、副腎髄質、Auerbach神経叢、甲状腺C細胞などにつよく発現が認められた。特に、副腎髄質の細胞では胎生期のneural crestからの移動中から発現が認められ、ほぼ副腎皮質の細胞群の中に入る頃から発現が増すことか明らかとなった。各臓器で、正常型のプリオン蛋白のglycosylationには差が認められるという結果も得られた。このトランスジェニック・マウスを感染実験したところ、ヒトのブリオンに対して高い感受性を有することが明らかとなった。また、発病したマウスで異常プリオン蛋白の分布をWestern blot法で解析したところ、異常型のプリオン蛋白は現時点では中枢神経系でのみ確認され、一般臓器のプリオン蛋白の異常への変換が効率の悪いものであることを明らかにした。プリオン蛋白の異常化には、組織特異的な因子が必要であることを示唆する結果であった。
免疫老化への介入による新規循環器疾患治療戦略の確立

「免疫老化」は老化関連疾患と密接に関与している。糖尿病は老化関連疾患の一つである一方、糖尿病状態は個体の老化を促進する。加齢に伴い増加するProgrammed death-1(PD-1)陽性記憶型CD4陽性T細胞(老化関連T細胞)が、肥満に伴うインスリン抵抗性の発症に関与していること、老化関連T細胞への介入がインスリン抵抗性の改善をもたらしうることを明らかにすることを本研究の目的とした。本研究の結果、加齢マウスと同様に高脂肪食負荷肥満マウスでも老化関連T細胞が脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性を惹起していた。老化関連T細胞への介入は、加齢や肥満に関連した慢性炎症に対する新しい治療戦略となりうる。(1)加齢マウスにおけるPD-1+記憶型T細胞増加とインスリン抵抗性の関係加齢に伴い脾臓のみならず、内臓脂肪組織においてもPD-1+記憶型T細胞の割合が有意に増加した。100週齢の加齢マウスは、11週齢の若年マウスと比べ、耐糖能異常とインスリン抵抗性を示した。抗PD-1抗体治療は80週齢の加齢マウスにおいて、食事摂取量、体重、内臓脂肪重量を変えることなく、耐糖能異常とインスリン抵抗性を有意に改善した。(2)食事性肥満マウスにおけるPD-1+記憶型T細胞増加とインスリン抵抗性の関係4週齢から開始した高脂肪食飼育群では、著明な体重増加と内臓脂肪重量増加がみられ、18週齢の時点で通常食飼育群と比べ耐糖能異常とインスリン抵抗性を示した。高脂肪食負荷に伴い脾臓、内臓脂肪組織ともにPD-1+記憶型T細胞の割合が増加した。抗PD-1抗体治療は食事性肥満マウスにおいて食事摂取量、体重、内臓脂肪重量を変えることなく、耐糖能異常とインスリン抵抗性を改善した。また抗PD-1抗体治療は、内臓脂肪においてM1タイプマクロファージを減らし、制御性T細胞を増やし、脂肪組織での炎症性サイトカイン発現を減少させた。(3)PD-1+記憶型T細胞による炎症促進の分子メカニズムPD-1+記憶型T細胞は、PD-1-T細胞と比べ増殖能が低下していたが、osteopontinとIL-6を有意に発現していた。若年マウスから採取したPD-1-T細胞をCFSEでラベルし、食事性肥満加齢マウスに移植をしたところ、2週間後、PD-1+T細胞の割合が増加した。PD-1+CD44+T細胞をマクロファージと共培養した場合、PD-1-CD44-T細胞やPD-1-CD44+T細胞と比べ、マクロファージの遊走が増加し、炎症性サイトカインの発現が促進された。これらの効果は、抗osteopontin抗体、抗IL-6抗体添加で遮断された。1.脂肪組織における炎症性細胞のkinetics:高脂肪食(HFD)負荷開始後2週間(6週齢)から内臓脂肪(VAT)においてマクロファージの有意な増加が見られ経時的に漸増した。CD4+T細胞のVATにおける増加は10週齢で初めて有意であったが、PD-1陽性記憶型(PD-1+MP)T細胞は6週齢から有意に増加し、経時的に漸増した。免疫染色検査による観察では、PD-1+T細胞は王冠様構造に局在しマクロファージと一緒に傷害脂肪細胞を取り囲んでいた。2.PD-1+MP T細胞のadoptive transfer:PD-1+T細胞を熱可逆性ゼラチンポリマーに溶解し、エコーガイド下に通常食飼育6週齢レシピエントマウスのVATに直接的に注入した。細胞移植群では対照群と比べ、VATにおけるマクロファージ数は有意に増加し、その極性はM1優位であった。細胞移植群ではVATに王冠様構造が出現し、耐糖能異常とインスリン抵抗性が確認された。3.PD-1+MP T細胞の性状解析:PD-1-CD4+T細胞と比べPD-1+CD4+T細胞では、TCR刺激下の増殖能は有意に低かった。PD-1+CD4+T細胞は、TCR刺激下のリンパ球性サイトカイン(IL-2やIFNγ)分泌能は低いが、炎症性サイトカイン(オステオポンチンやIL-6)分泌能は高かった。PD-1+CD4+T細胞ではsatb1の発現が低く、C/EBPαの発現が高かった。PD-1+MP T細胞は高率にp21WAF1/CIP1を発現し、H2AX(pS139)の発現レベルも高かった。4.T細胞におけるPD-1発現誘導実験:VAT組織とPD-1-T細胞との共培養では、PD-1の誘導を観察できなかった。一方、PD-1-T細胞を食事性肥満マウスVAT由来脂肪組織マクロファージと共培養すると、PD-1の発現が観察された。HFD負荷時にクロドロネートリポゾーム治療によりマクロファージを除去すると、VATにおけるPD-1+T細胞の発現は、PBS投与群と比べ有意に減少した。5.ヒトにおける循環血中PD-1+T細胞出現率と糖尿病の関連:糖尿病患者では非糖尿病患者と比べ、末梢血液中のPD-1+CD4+T細胞の割合が有意に増加していた。【背景】免疫系の老化は「免疫老化」と呼ばれ、老化関連疾患と密接に関与している。糖尿病は老化関連疾患の一つである一方、糖尿病状態は個体の老化を促進しているとも推測されている。

本研究では、加齢に伴い増加するProgrammed death-1(PD-1)陽性記憶型CD4陽性T細胞(以下、老化関連T細胞)がインスリン抵抗性の発症に関与していること、インスリン抵抗性が老化関連T細胞を誘導し個体の老化を加速している可能性を検討することを目的とした。【方法と結果】1.100週齢の加齢マウスでは若齢マウスに比べ耐糖能は低下し、インスリン抵抗性は増大した。加齢マウスでは脾臓細胞のみならず、脂肪組織でも老化関連T細胞の割合の増加を認めた。2.高脂肪食負荷肥満マウスにおいて、インスリン抵抗性の出現を確認した。その経過における脂肪組織の老化関連T細胞及びマクロファージ、制御性T細胞、好酸球、好中球、B細胞の出現様式をFACSを用いて解析したところ、脂肪食開始早期から老化関連T細胞の増加を認め、その増加はM1タイプマクロファージの増加に先行していた。3.加齢マウス、高脂肪食負荷肥満マウスに抗PD-1抗体を投与し老化関連T細胞を約ー40%除去した。抗体治療によりいずれの群でもインスリン抵抗性は改善し、マクロファージのM1からM2への極性の変化と制御性T細胞の増加を認めた。4.非肥満マウスの脂肪細胞にPD-1陽性T細胞を養子移植することにより、脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性が誘導された。5.脂肪組織における老化関連T細胞誘導は、B細胞依存的であった。【結論】加齢マウスと同様に、高脂肪食負荷肥満マウスでも老化関連T細胞が脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性を惹起していた。老化関連T細胞に介入することが、加齢や肥満に関連した慢性炎症に対する新しい治療戦略となる可能性が明らかになった。「免疫老化」は老化関連疾患と密接に関与している。糖尿病は老化関連疾患の一つである一方、糖尿病状態は個体の老化を促進する。加齢に伴い増加するProgrammed death-1(PD-1)陽性記憶型CD4陽性T細胞(老化関連T細胞)が、肥満に伴うインスリン抵抗性の発症に関与していること、老化関連T細胞への介入がインスリン抵抗性の改善をもたらしうることを明らかにすることを本研究の目的とした。本研究の結果、加齢マウスと同様に高脂肪食負荷肥満マウスでも老化関連T細胞が脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性を惹起していた。老化関連T細胞への介入は、加齢や肥満に関連した慢性炎症に対する新しい治療戦略となりうる。英語論文を投稿したところ、再査読まで回ったものの最終的に不採択となった。そのため再査読対策の追加研究に追われ、本実験の進行に遅れが生じた。また平成26年度中に所属施設の異動があったため、研究に取り組む時間が減少した。医歯薬学当初の計画レベルでの研究はほぼ終了しているため、平成27年度中の英語論文発表を達成したい。その上で、本研究の成果をふまえたより実用的な抗体治療法の開発や、PD-1よりも老化関連T細胞に特徴的な表面マーカーの検索といった新たなステージの研究準備に取り掛かりたい。一時期、中国人留学生が本研究に興味を持ち、実験に協力してくれた。とくにflow cytometryによる解析において、経験者である彼の貢献は大きかった。平成26年度中に慶應義塾大学より兵庫医科大学への異動があったため、実験に取り組む時間が減少した。現在、兵庫医科大学においても継続的な実験が行える環境整備を行っており、そのため次年度への繰り越しとした。平成26年度中の英語論文発表を目指したい。
廃棄古紙を利活用した下排水高度処理技術の開発

今年度は、1.古紙分解微生物探索実験に用いるモデル古紙の選定、2.モデル古紙を用いた有用微生物選定実験、3.古紙分解性を評価するためのリグノセルロースの分析方法の確立、を実施した。まず、1.古紙分解微生物探索実験に用いるモデル古紙の選定では、段ボール、コピー用紙、トイレットペーパー(バージンパルプのものと再生紙)、セルロース粉末を、嫌気性活性汚泥と混合し、溶解性TOC成分の溶出挙動を測定した。その結果、分解性が比較的高く、また、既往のメタン発酵関連の研究で使用されており,結果の比較が可能なことから、バージンパルプのトイレットペーパー(エリエール)を実験用モデル古紙として選定した。次に、トイレットペーパー粉砕物を基質として、嫌気性活性汚泥と、各種微生物製剤(乳酸菌製剤、枯草菌製剤、放線菌製剤)を混合した水準に対して回分実験を行った。S-BOD,S-TOCの経日変化から、嫌気汚泥+パイナップル製剤と嫌気汚泥+枯草菌製剤の系列サンプル中にエリエール繊維が少ないという結果が得られ、パイナップル製剤(放線菌)と枯草菌製剤に紙分解能がある可能性が示唆された。しかしながら、S-TOCの溶出量は、3週間経過後も投入したトイレットペーパーが完全分解した場合の理論値の1020%程度の値にしかならなかった。そこで、紙の主成分であるセルロース、ヘミセルロース、リグニンの定量分析法を抽出し、各分析方法の比較を行った。その結果、亜塩素酸ナトリウム法とクラーソンリグニン法を合わせた分析方法を選定した。そのうえで、実験サンプルの分析を行い、その結果、ヘミセルロースの短時間分解は確認されたが、セルロースはほとんど分解されなかった。古紙中でも高い比率を占めるセルロースの分解率向上が今後の課題として抽出された。当初計画では、既往の研究においてメタン発酵タンクに古紙を投入することで、C/N比の改善と炭素源供給がなわれることで、メタン発酵の安定化とガス発生量の増大が示唆されているため、本研究においても反応速度は小さいものの、セルロースの分解が進むことを想定していたが、実験結果では、ヘミセルロースは比較的短時間で分解されるものの、セルロースの分解はほとんど起こらなかった。既往の研究事例では、リグのセルロースの形態分析までは行われておらず、既往の研究においてもヘミセルロースの分解だけで、上述の効果が得られている可能性が示唆された。このため、今後、実験条件(使用する微生物)に、実際のメタン発酵設備から採取した嫌気性活性汚泥を加えるとともに、トリコデルマ等の、セルロースの分解能を有するとされる微生物の利用を加える必要が生じた。古紙中の50%以上を占めるセルロースの分解性を高めるために、使用する微生物として実際のメタン発酵設備から採取した嫌気性活性汚泥を加えるとともに、トリコデルマ等の、セルロースの分解能を有するとされる微生物の利用を検討条件に加え、セルロース分解率/速度の向上を図る。さらに微生物の選定が終了した時点からは、古紙の前処理方法(裁断程度でよいか?微粉砕が必要か?)の検討を行う。また、古紙の未分解成分は、水処理系で発生する余剰汚泥に移行し、余剰汚泥の脱水性を向上させることが期待される。このため、古紙未分解物質の濃度と、汚泥脱水性改善効果の関係を実験的に明らかにする。以上のデータから、古紙分解物による還元性物質生成量と、脱水性改善効果を総合的に考慮した、古紙分解率目標値を決定する。なお、セルロース分解率が低い場合でも、脱水性改善効果だけでも最大効果の50%程度は得られるという試算結果は得られている。逆にセルロース分解率が高すぎると未分解残物/繊維分が減少し、脱水性向上効果は小さくなるが、その際は、未分解古紙自体を適当な割合で混合させればよい。最終的には、下水高度処理(N,P除去)実験装置に古紙分解物を投入し、N,P除去率向上効果と、余剰汚泥の脱水性改善効果を定量的に把握し、本提案システムの実用性検討を行う。なお、本システムの実用性検討に当たっては、古紙の入手に関わる費用や、どれだけの古紙を収集、運搬できるのかといった社会システムに関する検討が必要であり、並行して検討を進めていく。

そこで、紙の主成分であるセルロース、ヘミセルロース、リグニンの定量分析法を抽出し、各分析方法の比較を行った。その結果、亜塩素酸ナトリウム法とクラーソンリグニン法を合わせた分析方法を選定した。そのうえで、実験サンプルの分析を行い、その結果、ヘミセルロースの短時間分解は確認されたが、セルロースはほとんど分解されなかった。古紙中でも高い比率を占めるセルロースの分解率向上が今後の課題として抽出された。当初計画では、既往の研究においてメタン発酵タンクに古紙を投入することで、C/N比の改善と炭素源供給がなわれることで、メタン発酵の安定化とガス発生量の増大が示唆されているため、本研究においても反応速度は小さいものの、セルロースの分解が進むことを想定していたが、実験結果では、ヘミセルロースは比較的短時間で分解されるものの、セルロースの分解はほとんど起こらなかった。既往の研究事例では、リグのセルロースの形態分析までは行われておらず、既往の研究においてもヘミセルロースの分解だけで、上述の効果が得られている可能性が示唆された。このため、今後、実験条件(使用する微生物)に、実際のメタン発酵設備から採取した嫌気性活性汚泥を加えるとともに、トリコデルマ等の、セルロースの分解能を有するとされる微生物の利用を加える必要が生じた。古紙中の50%以上を占めるセルロースの分解性を高めるために、使用する微生物として実際のメタン発酵設備から採取した嫌気性活性汚泥を加えるとともに、トリコデルマ等の、セルロースの分解能を有するとされる微生物の利用を検討条件に加え、セルロース分解率/速度の向上を図る。さらに微生物の選定が終了した時点からは、古紙の前処理方法(裁断程度でよいか?微粉砕が必要か?)の検討を行う。また、古紙の未分解成分は、水処理系で発生する余剰汚泥に移行し、余剰汚泥の脱水性を向上させることが期待される。このため、古紙未分解物質の濃度と、汚泥脱水性改善効果の関係を実験的に明らかにする。以上のデータから、古紙分解物による還元性物質生成量と、脱水性改善効果を総合的に考慮した、古紙分解率目標値を決定する。なお、セルロース分解率が低い場合でも、脱水性改善効果だけでも最大効果の50%程度は得られるという試算結果は得られている。逆にセルロース分解率が高すぎると未分解残物/繊維分が減少し、脱水性向上効果は小さくなるが、その際は、未分解古紙自体を適当な割合で混合させればよい。最終的には、下水高度処理(N,P除去)実験装置に古紙分解物を投入し、N,P除去率向上効果と、余剰汚泥の脱水性改善効果を定量的に把握し、本提案システムの実用性検討を行う。なお、本システムの実用性検討に当たっては、古紙の入手に関わる費用や、どれだけの古紙を収集、運搬できるのかといった社会システムに関する検討が必要であり、並行して検討を進めていく。
生物活性を有する共役ポリエン化合物の高立体選択的合成

1.稲いもち病菌発芽抑制物質の合成......米を主食とする我が国にとって稲いもち病の防除は重要な課題の一つである。本研究では、59年度に稲いもち病菌発芽抑制物質であるジモルフェコリン酸のメチルエステル【1!】、およびその類縁体【2!】,【3!】の簡便な合成法を開発することができた。60年度は入手容易なオレイン酸を出発物質に用いてコリオリン酸t-ブチル(【4!】)および化合物【5!】の合成を行った。民官企業に依託してこれらの化合物のいもち病菌に対する活性を調べたところ、いずれも活性を示さなかった。活性の発現にはエステルを加水分解してカルボン酸にすることが必要と思われる。2.白あり道しるべフェロモン〔(3Z,6Z,8E)-3,6,8-ドデカトリエン-1-オール〕は合成できなかったものの、その研究途上において2,4-ジエン酸エステルをベンゼン中、二酸化セレンで酸化すると、一挙にフランおよびセレノフェン誘導体が得られる新反応を見い出した。このような温和な条件下でのジエンからのフランの合成例は今までに報告されておらず、学問的に極めて興味深い。3.オクタデカポリエンカルボン酸の合成......上記(1)で合成した【1!】【5!】の化合物についてショウジョウバエに対する殺虫試験を行なったところ、弱い殺虫性を示したのみで、殺虫剤として実用に供されるほどのものは得られなかった。
膜タンパク質機能制御のための光誘起電荷分離分子開発

細胞膜電位は神経細胞等において各種細胞活動を制御する重要な要素である。そのため、膜電位の人為制御は医療分野への利用も期待できる細胞工学的アプローチである。本研究では、光により細胞膜電位を制御する新規手法の開発を行った。この目的のために、細胞環境において光誘起により高効率で電荷分離する分子の構造を模索し、凝集体構造をとりながらも41%の量子収率を示す分子開発に成功した。この分子と、各種比較対象分子をPC12細胞やラット由来ニューロンの細胞膜に導入し、光照射することにより有意に細胞膜の脱分極を引き起こせることと、その脱分極の度合いが電荷分離状態への量子収率に相関を有していることを見出した。平成25年度は当初計画通り「細胞親和性の高い光電荷分離分子の開発」と「光電荷分離分子が細胞膜電位に及ぼす影響の解明(1)」を行った。前者の成果として、C60フラーレン-ポルフィリン連結型分子をベースとした細胞親和性分子として(a)四級アンモニウム部位を一つ及び二つ導入することで水溶性をコントロールした分子、(b)トリエチレングリコール部位を導入して両親媒性を向上させた分子、それぞれについて合成が完了した。(a)および(b)の分子の水溶液中での分子凝集挙動や各種分光学的特性を動的光散乱法や紫外・可視分光スペクトル測定、蛍光スペクトル測定を用いて検討したところ、それぞれに置換基導入に起因する挙動が確認された。特にここで、(a)の分子は顕著な水中安定性を有することが明らかとなった。この結果は、今後生体応用する際に、生体液中で分子が安定に存在し得ることを支持する有望な結果である。また、フラーレン部位に金属内包フラーレンを用いることを想定して[4+2]型環化付加反応による分子変換法の開発に成功した。後者の実験として、(a)および(b)の各分子について、ラット副腎褐色細胞腫由来のPC12細胞に導入後パッチクランプ法による細胞膜電位測定を行った。その結果、両者とも光照射に起因する膜電位の正電位側へのシフト(脱分極)が観測された。この結果から、分子(a)および(b)は当研究グループにおいて報告済のC60フラーレン-ポルフィリン連結型分子と同程度の脱分極誘導能力を有することが明らかとなった。更に、分子(b)においては、既存の分子と異なる脱分極速度や、電位変化を引き起こすことが示唆された。今後は、上記において明らかとなった置換基効果の更に詳細な影響解明と分子改良、その作用メカニズム解明を行うことを通して、光電荷分離分子を利用した新規細胞機能制御法としての基盤確立を行う。平成26年度は、当初計画通り「光電荷分離分子が細胞膜に及ぼす影響の解明」および「光電荷分離分子による細胞機能制御法の有効性検証」を行った。前年度から開発を続けているC60フラーレンーポルフィリン連結型分子について、分子の有する置換基効果が分子構造及び光電荷分離状態に及ぼす影響を一連の化合物を詳細に比較検討することで明らかにした。その結果、置換基を適切に選択することで、水中・細胞環境中にて電荷分離分子の凝集構造および電荷分離状態をコントロール出来得ることと、その電荷分離状態を利用することで細胞膜電位の光制御が可能であることを見出した。さらに、当初目標の一つとして掲げた「申請者が既に報告している分子系(J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 6092.;変化量+13 mV)よりも高効率の膜電位変化(本研究;+36 mV)」を達成した。また、本研究により開発した分子をラット由来ニューロンに適応可能であることを見出すとともに、光誘起膜電位制御に起因する神経発火の変調誘起に成功した。このことから、本手法は神経発火に関連する種々の細胞機能制御に有効な新規手法となり得ることが示された。さらに本研究のさらなる発展を目指し、フラーレン部位に金属内包フラーレンの導入を実現するために金属内包フラーレンの分子変換法を検討した。その結果、初めて金属内包フラーレンの炭素ケージ上に水素原子を導入することに成功した。この水素は更なる反応の基軸部位となり得るため、本成果からの知見を用いることで、細胞導入および電荷分離状態の利用により適した分子変換を容易にすると期待される。機能物質化学当初申請書に記載したアプローチに従い新規分子の合成を行い、予定通り完成した。得られたそれぞれの分子について構造解析と性能評価を行ったところ、期待した通り、置換基の種類に依存した特異的な置換基効果が観測された。特に、本研究の中心となる光照射による細胞膜電位変化挙動において、置換基効果に帰着出来得る特異的挙動が確認されたことから、当初予定どおり順調に進展していると言える。また、並行して金属内包フラーレンの利用も検討し、その前段階としての分子変換法開発に成功した。

今後は、当初計画通り、前述の分子群および、そこから新たに着想・開発した分子を用いて脱分極時に影響を受けているイオンチャネル同定をはじめとする詳細な細胞への作用メカニズムを明らかにする。また、ラットから採取したニューロンといった初代細胞培養を用いて、光電荷分離分子を利用した細胞膜電位脱分極現象を観測する。これによって、本手法が株化されたモデル細胞(PC12細胞)だけでなく、各種の神経系初代培養細胞でも適応できる汎用性の高さを有することを示す。
イタリア十五・十六世紀における古代建築の解釈について

平成19年度の科研費の成果としては、日本学術振興会による(本報告とは別の)科研費の出版助成を獲得し出版された『盛期ルネサンスの古代建築の解釈』(中央公論美術出版)が挙げられる。これは平成15年度東京大学大学院学位論文に大幅に加筆修正を施したものであり、本研究課題の中心となるテーマである。さらに共著として5月に出版された、加藤友康責任編集『歴史学事典14:ものとわざ』(弘文堂)では、「アスファルト」外、西洋建築史関係の16項目を執筆した。事典という性格上、広く浅い論述となっているが、美術史や考古学などの隣接諸分野との関連性が重視される本研究課題との関連からは実に有益な作業であり、未知の分野を調べる上でも得られた知見は大きかった。また8月に福岡大学で行われた日本建築学会の大会において、「イタリア15世紀後半のパラッツォの矩形の戸口について」と題する発表を行った。この発表も上記の『盛期ルネサンスの古代建築の解釈』と密接に関わるものである。平成17年度の科研費の成果としては、建築史学会に投稿した下記の審査論文が挙げられる。この論文は2006年3月に掲載されている。その他には、昨年の9月1日から3日に大阪の近畿大学で行われた日本建築学会の大会における下記の発表が挙げられる。なお、今年度の大会は9月7日から9日に神奈川大学で行われる予定で、現在、「ブラマンテのコンフォルミタの意味について」と題する発表原稿を準備中である。また、2月24日に東京大学生産技術研究所で行われた地中海学会若手交流会において、「中部イタリアにおける矩形ファサードの聖堂について」と題する発表を行った。さらに今年の5月13日に同研究所で行われる地中海学会月例研究会で、「ルネサンスにおけるギリシアの広場:フラ・ジョコンドのリアルト市場再建計画の復元的考察」と題する発表を行う予定である。以上の研究論文や発表は、平成15年度東京大学大学院学位論文に加えるかたちで、『盛期ルネサンスの古代建築の解釈』(中央公論美術出版)としてまとめられ、昨年11月に(本報告とは別の)科研費による出版助成に申請した。平成18年度の科研費の成果としては、今年2月に日本学術振興会による平成18年度科学研究費補助金(研究成果公開促進費)の交付を受け、中央公論美術出版より刊行された『盛期ルネサンスの古代建築の解釈』が挙げられる。この書は、2003年度東京大学大学院学位請求論文に加筆修正を施したものである。なお、ロッツ『イタリア・ルネサンス建築研究』(原著W.Lotz, Studies in Italian Renaissance Architecture, Cambridge, Mass., MIT Press 1977)という研究書の翻訳が、同じく中央公論美術出版から出版される予定で、昨年11月に同科研費による出版助成に申請した。昨年5月に東京大学生産技術研究所で行われた地中海学会月例研究会において、「ルネサンスにおけるギリシアの広場:フラ・ジョコンドのリアルト市場再建計画の復元的考察」と題する発表を行った。この発表は、上述の『盛期ルネサンスの古代建築の解釈』の第5章に所収されている。昨年9月に神奈川大学で行われた日本建築学会の大会において、「ブラマンテのコンフォルミタの意味について」と題する発表を行った。この発表も、上述の『盛期ルネサンスの古代建築の解釈』の付録1に所収されている。また昨年9月に三田の慶応義塾大学で行われた中世建築研究会において、「中部イタリアにおける矩形ファサードの聖堂について」と題する発表を行った。この発表はまだ中間報告の段階にとどまっているが、今後まとまり次第、学会誌などに投稿したいと考えている。
幹細胞を用いた機能連携型細胞デバイス作製法の開発

本研究では、「幹細胞から分化した異種系譜の細胞が共存し、それらが協調して機能を発揮する新規細胞デバイス作製」に適用可能な、「標的幹細胞の遺伝子発現状況を評価し、その状況に応じて標的細胞の転写因子活性を抑制することによって分化を誘導するための基礎技術」と「細胞同士が機能協調していることを評価するための、細胞間シグナル伝達物質であるインスリンをオンラインでモニタリングする基礎技術」の二つの技術開発に成功した。「研究の目的」本研究では、幹細胞から分化した異種系譜の細胞が共存し、それらが協調して機能を発揮する新規細胞デバイス作製のための基盤技術を開発することを目的としている。平成23年度は、多分化能を有するEmbryonicStem(ES)細胞を培養し、インジェクション技術を用いて標的細胞の転写因子発現を制御することにより希望の細胞系譜へと分化誘導する基本技術の確立を目的とした。「研究の計画」当初は、強制発現プラスミドやshRNA発現プラスミドの導入による転写因子発現自体を制御する方法を計画していた。しかしプラスミド導入の場合、転写因子発現制御への効果が現れるまでの時間が不明瞭であることから、転写因子活性自体を即時に制御する新しい方法論の開発を行った。「結果」インジェクション技術を用いて、標的細胞へ、核移行機能と蛍光機能を保持したままタンパク質をする方法を確立した。そこで、転写因子タンパク質を導入すれば、即時に活性が上昇することが期待できる。今年度は、ES細胞の未分化機能維持に重要な役割を担っていると報告されている転写因子:Oct3/4の大腸菌を用いたタンパク質合成法の確立を行った。その結果、(1)Histidine-Tagとの融合タンパク質として、(2)Rosettagami-2をホストとして用いて誘導発現を行い、(3)不溶画分を回収後、(4)尿素変性下においてアフィニティー精製を行い、(5)透析によりリフォールディングをことにより、比較的純度の高いOct3/4タンパク質を可溶化状態で得ることに成功した。転写因子の活性を即時に抑制する方法として、Decoy DNA法に着目した。Tet-Off Systemが組み込まれたEBRTcH細胞をモデルケースとして、tTA転写因子の結合サイトを含むDNA断片をDecoyとして標的細胞ヘインジェクション法により導入した。その結果、DecoyDNAを導入した細胞ではtTA転写因子により発現されるマーカータンパク質、Venus蛍光タンパク質の発現が低下した。tTAがDecoy DNAを認識し結合することにより、本来の転写活性が抑制された結果であると結論した。「研究の目的」本研究では幹細胞から分化した異種系譜の細胞が共存し、それらが協調して機能を発揮する新規細胞デバイス作製のための基盤技術開発を目的としている。前年度までにDecoy ODN(オトリDNA配列)フェムトインジェクション技術を用いて標的細胞の転写因子活性抑制制御を通じた標的単一細胞の分化誘導を試みたが、細胞状態の個体差が大きいため、単純な同一条件では分化誘導が制御しきれないことが示唆された。そこで本年度は、個々の細胞の状態を判断しながら分化誘導を行うために、単一生細胞レベルで標的遺伝子の発現状況を評価する新手法の開発を行った。「結果」・DNAを基本骨格としmRNAに結合するとFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)シグナルを生じる標的mRNA測定用DNAナノ構造体蛍光バイオセンサ(DNA-NTFB)を開発した。このDNA-NTFBは、in vitroにおいて標的mRNAを特異的に認識し濃度依存的なFRETシグナルを生じた。そこで細胞固定後にDNA-NTFBを用いてFluorescence in situhybridizationを行ったところ、標的mRNAのイメージングに成功した。次に生細胞内へDNA-NTFBを導入した後に細胞を固定し、FRETシグナル解析を行ったところ、標的mRNAのイメージングに成功していることが示唆された。これらの結果は、「DNA-NTFBを用いた細胞を殺さない単一細胞レベルの標的遺伝子発現状況評価」が実現可能であることを示唆するものである。本研究では幹細胞から分化した異種系譜の細胞が共存し、それらが協調して機能を発揮する新規細胞デバイス作製のための基盤技術開発を目的としている。平成24年度は平成23年度に開発したDecoy ODN(オトリDNA配列)フェムトインジェクション技術を用いて、標的細胞の転写因子活性抑制制御を通じた標的単一細胞の分化誘導法開発を行った。また異種細胞間機能協調のためのプラットフォーム技術開発に着手した。標的単一細胞の分化誘導法開発本年度はまずDecoy ODNフェムトインジェクション法による標的単一生細胞内の目的転写因子活性抑制制御の統計処理を行い、基本技術が確立できていることを確認した。次にES細胞の未分化状態維持に重要な役割を担っていると報告されているOct3/4転写因子の結合配列をDecoyODNフェムトインジェクション法によって標的生ES細胞へ導入したところ、明らかに形態の変化する細胞と変化しない細胞が存在した。このことは、Decoy ODNを細胞核へフェムトインジェクションしても、細胞状態の個体差が大きいため、単純な同一条件では分化誘導を制御しきれないことを示唆していると考察した。したがって、単一生細胞レベルで目的遺伝子の発現状況を的確に評価する手法の開発が必要であると判断した。

異種細胞間機能協調のためのプラットフォーム技術開発本年度はインスリンシグナル受容を可視化できるインスリンシグナルアクセプター細胞の作製を開始した。マウスES細胞から二種類のインスリンレセプター遺伝子のクローニングを行った。それらの遺伝子と発光タンパク質との融合タンパク質、もしくは蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現するプラスミドを構築した。生物工学平成23年度は、多分化能を有するES細胞を培養し、インジェクション技術を用いて標的細胞の転写因子発現を制御することにより希望の細胞系譜へと分化誘導する基本技術の確立を目的とした。タンパク質を標的ES細胞へ導入することに成功し、転写因子Oct3/4タンパク質を大腸菌を用いて発現し、可溶化状態で入手することに成功した。また標的単一ES細胞へDecoyDNAをインジェクションにより導入することによって、標的転写因子の活性抑制制御に成功したことから、転写因子活性制御のための基本技術の確立が出来たと判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度はDecoy ODN(オトリDNA配列)フェムトインジェクション技術を用いて、標的細胞の転写因子活性抑制制御を通じた標的単一細胞の分化誘導法開発を行った。ES細胞の未分化状態維持に重要な役割を担っていると報告されているOct3/4転写因子の結合配列をDecoyODNフェムトインジェクション法によって標的生ES細胞へ導入したところ、明らかに形態の変化する細胞と変化しない細胞が存在した。このことは、Decoy ODNを細胞核へフェムトインジェクションしても、細胞状態の個体差が大きいため、単純な同一条件では分化誘導を制御しきれないことを示唆していると考察した。このままでは効率的な単一生細胞の分化誘導は困難であることから、平成25年度に対策をとる予定である。異種細胞間機能協調のためのプラットフォーム技術開発に関しては、インスリンシグナルアクセプター細胞作製のための各種遺伝子のクローニングが順調に進んでいる。今後は、23年度に確立した、標的細胞内の転写因子活性制御法を用いて、実際に分化を誘導する。また、本研究は異種の細胞が協調して機能を発揮する細胞デバイスを作製するための技術開発であることから、本年度から、セルライン化された細胞をモデルとして用い、異種細胞間で機能協調させるための基礎技術開発を開始する。本年度の実験結果から、Decoy ODNを細胞核へフェムトインジェクションしても、細胞状態の個体差が大きいため、単純な同一条件では分化誘導を制御しきれないことが示唆された。