hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単一細胞内の化学過程可視化のための分子認識プローブの開発

1.ミトコンドリアに局在する蛋白質を同定するプローブ分子を開発した.プローブを連結した被検蛋白質がミトコンドリアに輸送されると,ミトコンドリア内でプロテインスプライシング反応により緑色蛍光蛋白質(GFP)が形成されることを氷示した.更に開発したプローブにcDNAライブラリーから作製した未知の蛋白質を連結し,ミトコンドリア蛋白質を網羅解析する手法を開発した.新規ミトコンドリア蛋白質を同定することに成功した(Nature Biotech.,21,287-293(2003)).2.エストロゲンとエストロゲンリセプター(ER)との結合とそれに続くDNAとの結合により環境化学物質をスクリーニングする方法を開発した.DNAを固定化したガラススライド上に,大腸菌発現系により調製した黄色蛍光蛋白質(YFP)-ER及びエストロゲンを添加し,エストロゲン依存的にDNAに結合するERの量を蛍光強度により測定した.ビスフェノールA等の環境化学物質を高速スクリーニングできることを示した(Anal. Sci.,in press).
保育者の精神的健康を促進する心理的援助の方策

本研究は、保育者の精神的健康を維持するために有効な心理的援助プログラムを開発することを目的として行われた。まず保育者を対象とした質問紙調査より、「積極的解決」「放置・回避」「仕事外の充実」「慎重・冷静」4因子構造の保育者ストレスコーピング尺度を作成した。そのうち、GHQ28で測定した保育者の精神的不調を有意に低減させる因子は「積極的解決」のみという結果を得た。この「積極的解決コーピング」に焦点を当てた認知行動療法を援用した面談を5名の保育者を対象に月に1回、6ヶ月間実施し、面談時のGHQ12の測定値を確認したところ、全員精神的健康が維持・上昇する結果を得て、面接介入の効果があることが分かった。本研究は、保育者の精神的健康を維持するために有効な心理的援助プログラムを開発することを目的としている。初年次(平成26年度)は、研究実施計画に基づき、保育者特有の職業ストレスコーピング尺度を作成するために、職場の異なる保育士および幼稚園教諭に対して、職務上のストレッサーに対するコーピングの聞き取り調査を行った。調査結果より、当初予定していた松尾・清水の小学校教師版ストレスコーピング尺度(2008,松尾一絵・清水安夫)よりも、庄司らの「職業用コーピング尺度」(1992,庄司正実・庄司一子)および五十嵐・宮下・田中の「中学校教師におけるコーピング尺度(2003,五十嵐守男・宮下敏恵・田中輝美)の項目が保育者のコーピングに共通性が高いと考えられた。そこで、これらを参考に保育者のコーピングについての60項目の質問を作成し、郵送法による質問紙調査の配布・回収を、平成26年7月9月にかけて行った。調査協力は南関東4県7自治体の幼稚園・保育所・認定こども園合計103園に対し依頼し、782名の保育者の回答を得られた。当初の計画では、調査対象とする保育者数は最低300名としており、計画を大きく上回る回答数を得られ、統計による分析の信頼性は上がったと考えられる。回答を数値化し、因子分析を行った結果、庄司らによる会社員(専門技術者・技能者・事務職者・営業職者その他)を対象とした「職業用コーピング尺度」が、積極的行動・認知、回避的行動・認知、症状対処の3因子より構成されているのに対し、積極的問題解決、気分転換行動、放置・回避行動、学習促進行動(すべて仮称)の4因子が抽出された。既に池田の先行研究(2012)より、保育者のストレス構造は他の職業者と異なる知見が得られたが、ストレスコーピングにおいても特有の方法を持つという結果が得られた。本年度(平成27年度)は、研究実施計画に沿って、保育者特有の職業ストレス・コーピング尺度を作成するために、初年次(平成26年)に行ったものと同じ60項目からなる質問紙調査を行った。郵送法により配布・回収は、平成27年9月11月にかけて実施した。二度目の質問紙調査を行った理由として、対象者を増やして尺度の信頼性・妥当性を高めるためと、一度目の質問紙に対する調査協力者の人数が954名(初年次の実施状況報告書提出後に、更に172名の回答を得た)中、幼稚園教諭163名・保育士791名と保育士の割合が大きかったため、調査結果に偏りが出るのを防ぐためである。調査協力は、東京近郊の幼稚園・保育所・認定こども園合計76園に依頼し、626名の保育者(うち、幼稚園教諭186名・保育士439名)の回答を得られた。当初の計画では、調査対象とする保育者数は最低300名としており、幼稚園教諭の合計だけで349名、保育士と合せて1580名となり、両者に共通した“保育者"としての尺度作成において信頼性は上がったと考えられる。回答を数値化し、因子分析を行った結果、初年次の結果同様、積極的解決、気分転換行動、放置・回避行動、学習促進行動(すべて仮称)の4因子が抽出され、妥当性も高まったと考えられる。現在は、保育者用ストレス・コーピング尺度作成に関して論文作成中である。また、質問紙調査の分析と並行して、月に一回程度のペースで、保育園園長1名・幼稚園園長1名・保育所保育士2名・幼稚園教諭1名に対し、ストレス・コーピング尺度の結果と認知行動療法を援用した面談を行い、面談前後の精神的健康度をGHQ-12により測定し、一定の成果を得た。現在、心理的介入援助プログラムの試作を行っている。本年度に関しては、研究実施計画に沿った研究活動をし、研究目的に沿った調査・分析を行い、研究成果をあげることができた。初年次の遅れを取り戻し、質問紙の再配布・回収、分析も行い、保育者用ストレス・コーピング尺度を作成した。また、保育者5人を対象とした面談も並行して行い、それぞれ面談介入による精神的健康度の上昇を確認したが、面談時間が予定より長引くことが多く、逐語録が想定以上に増えたため、内容の分析は終えていない。以上、特に面談について計画より多くの時間を有したための遅れは見られたものの、信頼性・妥当性の高い保育者用ストレス・コーピング尺度の作成を可能にした点を考慮し、現在までの進捗状況を「おおむね順調に進展している」と自己点検、評価した。

本年度は(平成27年度)は、研究実施計画に沿って、次年次に完成させた保育者特有のストレスコーピング尺度の4因子のうち、精神的健康の悪化を防ぐうえで最も有効だと考えられる「積極的解決コーピング」に焦点を当てた認知行動療法を援用した面談を実施し、面談前に行ったGHQ12の測定値を対象者毎に半年間の期間で確認したところ、全員精神的健康が維持・上昇する結果を得られ、面接介入の効果があることが分かった。対象者は、職場と職位の異なる、保育園園長1名・幼稚園園長1名・保育所保育士2名・幼稚園教諭1名とした。面談の目安とした、保育者ストレスコーピング尺度については、幼稚園教諭・保育所保育士1580名を対象とし、聞き取り調査と庄司らの「職場用コーピング尺度」(1992,庄司正実・庄司一子)を参考に、新しく作成した質問紙調査より、「積極的解決」「放置・回避」「仕事外の充実」「慎重・冷静」の4因子を得た。そのうち、GHQ28で測定した保育者の精神的不調を有意に低減させる因子は「積極的解決」のみという結果を得た。ゆえに、先行研究より参考にした庄司らの「職場用コーピング尺度」は、コーピングの有効性の測定を目的としていないものであったが、本研究により、保育者の職場ストレスに有効なコーピングが明らかになった。本年度(平成28年度)行った面談介入によって精神的健康の維持・上昇という一定の成果が見られた。面接の逐語録より、保育者の語りが、現在の不満や状況報告的内容から、仕事における優先順位や「何よりも子どもが第一」といった内容へと変化が見られ、「積極的解決コーピング」の下位項目からも、説明のつくものであった。本研究は、保育者の精神的健康を維持するために有効な心理的援助プログラムを開発することを目的として行われた。まず保育者を対象とした質問紙調査より、「積極的解決」「放置・回避」「仕事外の充実」「慎重・冷静」4因子構造の保育者ストレスコーピング尺度を作成した。この「積極的解決コーピング」に焦点を当てた認知行動療法を援用した面談を5名の保育者を対象に月に1回、6ヶ月間実施し、面談時のGHQ12の測定値を確認したところ、全員精神的健康が維持・上昇する結果を得て、面接介入の効果があることが分かった。初年次に関しては、概ね研究実施計画に沿った研究活動を展開し、研究目的に沿った調査・分析を行い、研究成果をあげることができた。しかし、調査対象者数が計画を大きく上回ったために、分析の信頼性は上がったものの、入力作業に当初の計画の倍以上の時間を必要とし、その後、分析を行いコーピング尺度を作成する時期が遅れてしまった。その結果、初年次に計画していたコーピング尺度の妥当性検証のための質問紙の再配布・回収が不可能となった。以上、計画外の時間を有したための計画の遅れはあったものの、研究成果の信頼性をあげるデータを得られた点を考慮し、現在までの達成度を「おおむね順調に進展している」と自己点検、評価した。「現在までの進捗状況」にも示したように、初年次の遅れを取り戻し、保育者用ストレス・コーピング尺度の作成が可能になったので、論文として発表する。また、面談の逐語録の分析を行い、心理的介入プログラムの試作から本格的な実施を行い、完成させることとする。
スポーツ規範意識がドーピング意識に与える影響に関する社会学的研究

WADA(2017)の「2016 Anti-Doping Rule Violations (ADRVs) Report」ではイタリアがドーピング件数世界1位となった。依田ら(2017)は日本人とイタリア人の比較を行い、イタリア人のドーピング意識をモデリングの検証により明らかにしたが、なぜイタリアはドーピングが多いのかについて明らかになっていない。以上のことから、平成30年9月3日から9日でイタリアにて学術調査を行った。調査にあたった施設は4件であり、ドーピング意識とスポーツ規範が形成される社会的な要因をコーチの立場から伺うため、Direzione Scuola dello Sportに対し聞き取り調査を行った。対応にあたってくれたのは、Angelo Altieri氏で十分な聞き取りを行うことができた。聞き取り内容は1イタリアのコーチシステムについて、2イタリアのドーピング数が多い理由について、3イタリアのアンチ・ドーピング教育についての3点であった。スポーツ協会の立場からは、Federations Civlistica ItalianaのPaola Pavoni氏、Federations Atletica LeggeraのDino Ponchio氏とRiccardo Ingallina氏に対し聞き取り調査を行った。当初、Federazione MotociclisticaのGirgia Santini氏にも聞き取り調査を行う予定であったが、当日急な用件で外出してしまい、秘書から別の日程を提示されたが、出張期間外だったため、回答文章のみを受け取った。聞き取り内容は、1フェデレーションの歴史、2活動内容、3選手登録数や成績、4ドーピング違反者への対応、5なぜ選手はドーピングを行うのかの5点であった。上記のインタビュー内容をまとめ、研究雑誌に投稿し、発表する予定である。イタリアの学術調査では、「2016 Anti-Doping Rule Violations (ADRVs) Report」からドーピングが最も多いCycling(38件)、3位のAutomobile Sports(9件)、4位のAthletics(8件)のフェデレーションに対し、調査を行うことができた。また、CONIが開講しているScuola Dello SportのディレクターであるAngelo Altieri氏にコーチの立場から聞き取り調査を行なうことができ、イタリアのドーピング事情について多くの知見を得ることができた。現在、これらのインタビュー内容をまとめ、研究雑誌への投稿準備を行っている段階である。今後の研究の推進方策としては、令和元年にアメリカのスポーツ専攻学生に対して依田ら(2017)で信頼性・妥当性が確認された尺度を用いて、ドーピング意識とスポーツ規範の調査を行う予定である。また、イタリアで行った調査と同様の項目でアメリカと韓国のスポーツ組織に対しても聞き取り調査を行う予定である。旅費に関しては、当初の計画より、イタリア調査にかかる費用が抑えられた。人件費および謝金に関しては、現地アポイントメントと通訳料が当初の計画より抑えられたが、聞き取り調査で得られたテープ起こしにかかる業務委託費と現地の通信費(3名分)などが生じたため、その他として計上した。差額分に関しては、次年度アメリカと韓国の調査を行う費用とする。
ロバストなデータ解析のための最適化モデリングの深化

経営科学におけるデータ解析に基づく意思決定(ビジネスアナリティクス)において、その技術のロジックを人間が解釈し易いように、手法の再整備を目指す。より具体的には、現実社会で見られるデータが持つ、扱いづらい性質のいくつかに注目し、研究代表者らが最近提示した非凸最適化のモデリング技法を用い、なるべく統合的な形でデータ解析手法を提示していく。
酵素による立体選択的酸化と電極還元を組合せた新規キラル合成法開発

酵素の高い立体選択性を利用して特定のエナンチオマーあるいはジアステレオマ-を生産する方法が各種開発されている。しかし、ラセミ体の全量を特定のエナンチオマーあるいはジアステレオマ-に変換する方法はほとんど開発されていない。本研究では、酵素反応と電極還元を組み合わせることによりラセミ体を全量、特定のエナンチオマーあるいはジアステレオマ-に変換する新しい系を開発することを目的としている。ラセミプロリンを基質として用い、水素化ホウ素ナトリウム存在下でD-アミノ酸オキシダーゼを作用させると、ラセミプロリンは全量L-プロリンに変換された。転換率は約98%、生成物の光学純度は100%であった。ピペコリン酸を基質とした場合にも同様な変換が起こり、用いたラセミ体は全量、L体に転換された。転換率は約99%、生成物の光学純度は100%であった。一方、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンなどのα-アミノ酸を基質として用い、高濃度(13M)のアンモニアの存在下で同様な検討を行ったが、ラセミ体からL体への転換率は5560%であった。用いた基質の大部分は対応するヒドロキシ酸に転換された。水素化ホウ素ナトリウム還元の代わりに電気的還元を用いることを検討し、Δ^1-ピロリン-2-カルボン酸は、炭素電極を作用電極とし、銀/塩化銀電極を対照電極とする系で効率よく還元されることを見いだした。上述の転換系で、D-アミノ酸オキシダーゼの代わりにL-アミノ酸オキシダーゼを用いれば、ラセミ体からD体が生成すると考えられる。プロリンあるいはピペコリン酸を唯一の炭素源あるいは窒素源として生育する微生物を土壌より分離し、プロリン及びピペコリン酸を酸化する新しい酵素を生産するカビを分離した。
慢性電気刺激による網膜神経節細胞の長期生存・軸索再生

軸索切断後の網膜神経節細胞(RGC)の生存と軸索再生が電気刺激によって促進できるかどうかを明らかにすることが本研究の目的である。1)昨年度に引き続き、視神経切断直後の一過性の電気刺激によって、ネコRGCの1週間後の生存が促進可能かどうかについて調べた。RGCを予め逆行性標識しておき、切断直後にカフ型双極電極を装着し、持続時間300μsecのパルス刺激を20Hzで2時間加えた。一発のパルスの電流量は0(sham),0.5,1,3,5mAと変化させた。1週間後に網膜伸展標本上で生存細胞数を計数し、生存率を調べた。その結果、網膜全体にわたったRGCの生存率は、切断群の40.6%に対して3mAで75.5%と増加することがわかった。しかし、1mAでは網膜中心部だけには効果があるものの、網膜全体のRGCの生存率は、50.2%と有意な増加は見られなかった。2)ネコ視神経を切断後、末梢神経を自家移植し、眼球側の視神経断端にカフ電極を設置した。カフ電極からの導線を、頭蓋骨上の小さな刺激装置に繋いだ。動物の行動をできるだけ抑制せずに意識下で慢性的に刺激するために、刺激コマンドを無線で頭蓋骨上の刺激装置に送り刺激した。毎日1時間の刺激を6週間行った後に、移植片の縫合部から2cm離れた部位に逆行性色素を注入したが、網膜上で標識された網膜神経節細胞は観察されなかった。これは、当初準備していた無線刺激装置の出力が最大約0.8mAと不足していたことに加え、連日の単相矩形波パルス刺激が、移植片そのものに障害を与えた可能性が考えられた。もし栄養因子の発現や感受性の増強が起こっているならば数日間は持続すると考えられることなどから、今後、3日おきなどの少し軽い電気刺激で再度検討する必要があると考えられた。形態学的・生理学的に明瞭なサブタイプを持つネコの網膜神経節細胞(RGC)を用い、軸索切断後の細胞の生存と軸索再生が電気刺激によって促進できるかどうかを明らかにすることが本研究の目的である。本年度は、in vivoにおけるネコ視神経の電気刺激法・刺激パラメータの確立を中心に研究を行った。1)視神経に慢性的に埋め込み可能な電極として、シリコンチューブと銀板電極を組み合わせた、カフ型双極電極を作成した。この電極を用いた視神経の逆行性刺激に対する誘発反応および単一ニューロン活動を記録した結果、持続300μsec、1-3mA程度の電流量の刺激を用いると有効に視神経内の軸索を刺激できることがわかった。2)視神経切断直後の一過性の電気刺激によって、ネコRGCの1週間後の生存が促進可能かどうかを調べた。RGCを予め逆行性標識しておき、切断直後にカフ型双極電極を装着し、パルス刺激を20Hzで2時間加えた。一発のパルスの電流量を0(sham),0.5,1,3,5mAと変化させ、持続時間は300μsecで固定した。1週間後に網膜伸展標本上で生存細胞数を計数し、生存率を調べたところ、網膜全体にわたったRGCの生存率は、3mAの刺激の時に有意に増加した。3)3mAの刺激を与えた時に網膜上の一定領域の生存細胞すべてに細胞内色素注入を行って樹状突起の形態から細胞タイプを同定し、タイプ別の生存率を求めた。その結果、α細胞の生存率に変化は無かったが、中心視力を担うβ細胞や、その他の細胞タイプの生存率は有意に増加した。以上の結果から、切断直後の急性電気刺激によって、1週間後という短期のネコRGCの生存促進が可能であることがわかった。次年度は、データを追加すると共に、慢性電気刺激によってRGCの生存および軸索再生の促進が可能かどうかを検討する。

これは、当初準備していた無線刺激装置の出力が最大約0.8mAと不足していたことに加え、連日の単相矩形波パルス刺激が、移植片そのものに障害を与えた可能性が考えられた。もし栄養因子の発現や感受性の増強が起こっているならば数日間は持続すると考えられることなどから、今後、3日おきなどの少し軽い電気刺激で再度検討する必要があると考えられた。
企業評価における売上高と原価の予測に関する研究

企業評価を行う際には様々な情報が利用されうるが、この情報には過去の情報と(予測された)将来の情報がある。後者においては、特に将来の利益(業績)ないし財務諸表を予測することで、この情報を利用した企業評価が考えられる。そのため、既存のモデル等を用いて売上高と原価の予測を行い、企業評価のより一層の精度向上のために有用な情報が得られると考えた。本研究のうち、本年度では売上高予測に関しての研究を行った。ここでは、企業評価において必要となる項目の一つとしての売上高予測に注目している。その際、経営者自身による売上高予測と企業外部者が入手し得る補足情報を用いた売上高予測、そして経営者や企業の補足的な情報に関係なく過去の売上高を用いる売上高予測について分析し検討を行った。今回は、特に店舗販売を主とする小売企業を対象とし、店舗について新規店と既存店に分け、そのような店舗に関する補足情報を用いた売上高予測を行った。結果は、企業外部者には知りえない情報をもっている経営者による売上高予測が最も精度が高かった。補足情報に基づいた売上高予測は、経営者予測ほどの精度の高さは伺えないものの、それでも過去の売上高を用いる売上高予測よりは大いに精度が高いものであった。そして、補足情報を開示している企業の経営者予測が高い精度を有していることも明らかとなった。これは、補足情報を開示することが、経営者の予測に対して正確性を要求することとなり、結果として、企業の開示情報の信頼性を問われるものと考えられる。このことは、2004年3月期決算から導入されたMD&Aの有用性を主張できるものであろう。本研究では、(1)売上高予測、(2)原価予測という二つの領域に分けて研究を進め、この二つの結果から将来の財務諸表の予測を行うことで、企業評価において有用な情報を与えることを目的としている。最終年度である平成20年度では、予測に関して様々な統計手法を用いて検討を行い、これらの結果を総括したうえで、その結果が企業評価に対してどのような影響を及ぼすのかについても検討を行った。ただし、売上高予測に関しては、実体経済の状況も踏まえ、より深い分析を続けることが必要である。また本研究で実証を行っていくうえで、データベースの作成が大きな問題となり、売上高の実績値、経営者(アナリスト)予測および原価項目については、財務データとして市販されているデータなどが使用可能であり、必要となるデータについて収集・整理された。しかし、2004年度3月期決算から導入された「経営者による財務・経営成績(MD&A)」の内容項目に関するデータの確認・集計・加工がまだ不十分である。この情報の収集時には、データマイニングのアプリケーションソフトを用いて、何らかの用語(単語)の頻度などを測定し、重要度などを調べて利用したいと考えている。これらの情報を売上高および原価の予測に活用することで、より詳細な分析が可能であると思われ今後の課題としたい。
脱蛋白天然ゴムラテックスを原料とするゴム新素材の開発

天然ゴムラテックスを蛋白分解酵素と界面活性剤で脱蛋白化することによりゴムの窒素含有率は0.38%から0.02%以下に低下した。天然ゴムの強度は蛋白質を除去しても変化しないが、粘度は低下し加工性や耐久性は向上した。密度、ガラス転移温度、融点、結晶化速度などの熱的性質は、蛋白質を除去しただけではほとんど変化しなかった。PCAおよびELISAテストにより、本手法による脱蛋白天然ゴムはアレルギー反応を起こさないことが証明された。脱蛋白天然ゴム(HDPNR)ラテックスにラジカル開始剤とアルデヒドを加えて振とう酸化分解を行うことによりゴム分子鎖の切断を行った。HDPNRラテックスに過流酸カリウムとプロピオンアルデヒドを加えて60°Cで5時間振とう酸化分解を行った場合、極限粘度([η])は7.2から0.5に低下した。未処理の天然ゴムラテックスでは[η]はわずかに減少するだけだった。ラテックスでの低分子化にはラテックス濃度や界面活性剤の種類はほどんど影響しなかった。IRおよびNMR測定から、低分子化されたゴムは末端にアルデヒドとケトンを有するテレケリック液状ゴムであることが明らかにされた。DPNRラテックスのスチレンとのグラフト共重合化を有機レドックス系開始剤のtert-butyl hydroperoxide(TBHPO)-tetraethylenepetamine(TEPA)を用いて30°Cでおこなった。グラフト共重合におけるスチレン含有率とグラフト効率は開始剤濃度に依存し、濃度が2.6×10^<-3>mol/lのとき最も大きな値を示した。グラフト共重合体のacetone/2-butanone(3:1)混合液による抽出物のオゾン分解生成物をGPC測定することにより求めたグラフトポリスチレンの分子量は開始剤濃度に依存して大きくなった。DPNRラテックスと未処理の天然ゴムラッテクスをグラフト共重合したとき、得られたゴムのスチレン含有率、グラフト効率、グラフト鎖の分子量、グラフト点の数が両者で異なるのは、天然ゴムの蛋白質を完全に除去したことによるものであると推定した。未処理の高アンモニアラテックスの窒素含有率は0.3%であったが、アニオン系の界面活性剤と蛋白分解酵素を加えたあと遠心分離を3回行うことにより窒素含有率は0.01%以下に低下した。このラテックスに有機系と無機系のラジカル開始剤を加えて温度を上げたところ全ての開始剤で低分子化が起きた。t-ブチルハイドロパーオキサイドとテトラエチルペンタミンのレドックス系開始剤を加えて室温で2時間攪拌したところ脱蛋白天然ゴムの分子量は増加した。精製したラテックスにスチレンモノマーを加えラジカル開始剤でグラフト化を行いメチルエチルケトンとアセトンで抽出を行ったところ、スチレンのグロスポリマーと低分子化したポリイソプレンをグラフトポリマーから抽出できた。グラフトポリマーの分子量は反応前のゴムより低分子化していた。精製したラテックスを65°Cで3時間振とうしても極限粘度はほとんど変化せず約6程度であった。塩化コバルトを加えて3時間浸透すると32.5程度に低下した。カルボニル反応試薬であるフェニルヒドラジンの存在下、塩化コバルトを加えた振とう酸化分解では極限粘度は0.50.7に低下した。分解により生じた末端アルデヒド基がフェニルヒドラジンにより安定化されたことを分光学的に確認した。塩化コバルトの変わりにラジカル開始剤を加え少量のプロピオンアルデヒドを添加した振とうでもゴムの分子鎖切断が起こり極限粘度は0.65まで低下した。NMR測定から分解生成物の両末端基がアルデヒドとケトンであると推定した。

グラフト共重合体のacetone/2-butanone(3:1)混合液による抽出物のオゾン分解生成物をGPC測定することにより求めたグラフトポリスチレンの分子量は開始剤濃度に依存して大きくなった。DPNRラテックスと未処理の天然ゴムラッテクスをグラフト共重合したとき、得られたゴムのスチレン含有率、グラフト効率、グラフト鎖の分子量、グラフト点の数が両者で異なるのは、天然ゴムの蛋白質を完全に除去したことによるものであると推定した。これまでに確立した脱蛋白処理法によって得た脱蛋白天然ゴムラテックスを利用して新材料開発及びラテックス貯蔵中の分子量と物性の変化について検討した。脱蛋白天然ゴムラテックスはtert-ブチルヒドロペルオキシド/テトラエチレンペンタミン系のレドックス開始剤を用いると主鎖の分子量低下を起こさず、スチレンのグラフト共重合が効率よく進行することが分かった。通常の高アンモニアラテックスよりスチレン含有率が高く、グラフト効率87%が得られた。ポリイソプレン鎖のオゾン分解で得られるグラフトスチレン鎖の分子量は通常の天然ゴムより低く、グラフト点の多いことが分かった。脱蛋白天然ゴムとスチレンのグラフト共重合体から作成したフィルムは天然ゴム自体の約3倍の引張強度を示した。これらのことから界面活性剤で安定化した脱蛋白天然ゴムはグラフト共重合体の合成に有利であることが明かとなった。脱蛋白天然ゴムラテックスに過硫酸カリと1-プロパナ-ルを加えて65°Cで振盪すると、ラテックス濃度や界面活性剤の種類によらず急速に低分子化し、5時間で[η]は1以下に達した。アルデヒドは酸化分解で生じたポリマー末端アルデヒドとアルドール縮合してポリマーの再結合を防止していることが分かった。末端基はケトンと数種のアルデヒドから成り、エポキシ基も数%生成することが認められた。得られた低分子量天然ゴムはラテックスとして安定に存在することから、従来にない液状ゴム材料としてその応用を検討することとした。脱蛋白天然ゴムラテックスは適当な老化防止剤(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenolなど)を添加すると貯蔵中に分解を起こさず、また、ゲルの生成やグリーン強度の変化もなく貯蔵できることが分かった。天然ゴムラテックスを蛋白分解酵素と界面活性剤で脱蛋白化することによりゴムの窒素含有率は0.38%から0.02%以下に低下した。天然ゴムの強度は蛋白質を除去しても変化しないが、粘度は低下し加工性や耐水性は向上した。密度、ガラス転移温度、融点、結晶化速度などの熱的性質は、蛋白質を除去しただけではほとんど変化しなかった。PCAおよびELISAテストにより、本手法による脱蛋白天然ゴムはアレルギー反応を起こさないことが証明された。脱蛋白天然ゴム(HDPNR)ラテックスにラジカル開始剤とアルデヒドを加えて振とう酸化分解を行うことによりゴム分子鎖の切断を行った。HDPNRラテックスに過硫酸カリウムとプロピオンアルデヒドを加えて60°Cで5時間振とう酸化分解を行った場合、極限粘度([η])は7.2から0.5に低下した。未処理の天然ゴムラテックスでは[η]はわずかに減少するだけだった。ラテックスでの低分子化にはラテックス濃度や界面活性剤の種類はほとんど影響しなかった。
AFLP法によるマダイの遺伝的形態異常特異的マーカーの探索

本研究では、マダイの人工種苗生産において生じる遺伝的形態異常(透明個体と湾曲個体)について、AFLP解析を行うことで形態異常に特異的なDNAマーカーを開発することを目的とした。まず、正常個体と各形態異常個体をそれぞれ10個体ずつ混合したバルクDNAを用いたAFLP法により各形態異常に特異的なAFLPバンドを探索したところ、透明個体と湾曲個体でそれぞれ14個の特異的バンドを得ることに成功した。次に、特異的バンドが見られたプライマー対を用いて個体毎に再度AFLP解析を行い、特異的バンドの再現性を確認したところ、透明個体では6個のバンドで、湾曲個体では3個のバンドで再現性が認められた。次に、各特異的バンドを切り出してクローニングし、塩基配列を解析した。また、得られた塩基配列については我々が次世代シーケンス解析により取得済みのマダイゲノム配列と相同性検索を行い、特異的配列を含むスキャフォールドを探索すると共に、得られたスキャフォールド配列を用いてAFLP断片全体を増幅するプライマーを設計した。また、設計したプライマーを用いてAFLP断片を増幅するとともにダイレクトシーケンス法による塩基配列解析を行うことで、両形態異常に特異的な一塩基多型(SNP)を探索した。その結果、透明個体と湾曲個体で各1個の特異的SNPを単離することに成功した。多検体を用いて本特異的SNPのジェノタイピングを実施したところ、透明個体特異的SNPは97.1%、湾曲個体特異的SNPは75. 4%の識別率となった。以上の結果から、透明化個体を識別するには十分な精度のSNPマーカーの開発に成功したが、湾曲個体の識別率についてはまだ改善の余地があるため、今後、AFLPプライマーを増やすなどの方法で探索深度を上げ、より有効なマーカーを開発する必要がある。
金属間化合物の非化学量論性と弾性特性

液体ヘリウム温度における弾性率測定装置の製作液体ヘリウム温度での弾性率を効率良く測定するため、温度変化および試料交換が容易な連続フロー型クライオスタットCF-1200(オックスフォード・インストゥルメンツ社製)を設備備品として購入した。また、このクライオスタットに合わせて、試料セルを新たに設計、製作した。現在、京都大学極低温センターのヘリウム液化機の運転が停止しているため十分なテストが行えていないが、いくつかの金属間化合物の極低温における弾性率の値が明らかになりつつある。非化学量論性と弾性特性との関連いくつかの第3元素を添加したNi_3(Al,X)について弾性率測定を行った。組成による違いを議論する前に、同一組成の試料を用いて直方体共振法の測定精度について検討を行った。その結果、ほとんどの測定値は0.5%以内のばらつきの範囲に入っていることが分かった。特にC_<44>については誤差のほとんどが密度の誤差から生じており、密度が正しく測定されれば0.1%程度の誤差しか生じないことが明かとなった。他の弾性率については密度の他に試料の直方体からの僅かなずれが誤差の要因であった。これについても、さらに正確な直方体形状に試料を加工することによって精度の向上が期待できる。組成の違いによる弾性率の違いは極く小さなものであるようで、残念ながら今回の測定では上記の測定誤差のなかに入ってしまい、系統的な結論を出すには至らなかった。X線回折による格子定数の測定などによって密度を正確に導きだせば、上記の測定誤差をかなり小さくすることが可能である。非化学量論性と弾性特性との関連を明らかにするためには、今後このような点も考慮に入れて、さらに正確な測定を行う必要がある。
尿酸塩結晶による冠動脈の局所炎症を標的とした先進的診断・治療法開発

血清尿酸値の上昇は心血管病の予後マーカーであるが、尿酸低下療法が心血管疾患を抑制したとするエビデンスは少ない。尿酸は結晶として析出することで局所のIL-1β産生を介して好中球を誘導し慢性炎症を形成する。このことは小動物を用いた基礎的検討で明らかとされているが、適切な画像診断法がなく、痛風患者で冠動脈に尿酸塩結晶が蓄積しプラークの形成に寄与しているかは明らかでない。本研究は、尿酸塩結晶のもつ複屈折性に注目し厚み1μmの尿酸塩さえ描出できるPS-μOCT診断法を開発することで、冠動脈に対する尿酸の直接的関わりを検討し同時に動物モデルを作成し痛風患者の治療法として抗炎症療法の開発を目指すものである。
RAGE シグナル抑制による肺高血圧症治療法の新規開発

1.乳酸・グリコール酸共重合体(co-poly-lactic/glycolic acid: PLGA)という生体内で加水分解され水と二酸化炭素になる物質をナノ粒子化し、イマチニブならびにベラプロストを封入した薬剤封入ナノ粒子を作成した。肺高血圧症モデルラットに気管内投与すると右室収縮期圧や右室肥大の抑制をみとめ肺高血圧の改善がみられた。2.肺動脈性肺高血圧症(PAH)の肺動脈平滑筋細胞の増殖は亢進しており、TIR/BB-loop類似構造体(mimetic), AS-1にてRAGEシグナルを抑制してみると、過剰な増殖が抑制された。【肺高血圧モデルラットにおけるナノメディシンの開発】【肺動脈性肺高血圧症(PAH)患者の肺動脈平滑筋細胞における終末糖化産物受容体(RAGE)シグナル抑制による過剰増殖・アポトーシス抵抗性・炎症に対する効果の検討】血小板由来増殖因子(PDGF)が肺動脈性肺高血圧症(PAH患者)の肺動脈平滑筋細胞においてRAGE発現を増強し、炎症誘導シグナルであるNFkBの核内移行や炎症に関わるCOX2の発現も増強することを発見した(日本循環器学会2015発表)。共同研究者の阪口(岡山大学細胞生物学)等はToll/IL-1 receptor (TIR) adaptorprotein: TIRAPがRAGEシグナルを伝達していくことを報告しており(Sakaguchi et al. PLoSONE 2011)、そこで我々は培養したPAH肺動脈平滑筋細胞においてTIR/BB-loop類似構造体(mimetic), AS-1にてTIRAP機能を抑制してみると、PDGFによる過剰増殖は有意に減弱した(日本循環器学会2016発表)。すなわちPAH患者の肺動脈平滑筋細胞において、PDGFなどの増殖刺激は一部はRAGEの発現増強を介して、過剰な増殖を引き起こしており、TIRAP機能抑制を介してRAGEシグナルを抑制することが治療につながる可能性が示された。【肺高血圧モデルラットにおけるナノメディシンの開発】Prostacyclin Analogue(ベラプロスト)を封入したナノ粒子を気管内投与する治療法(ナノメディシン)の開発に成功した。【PAH患者の肺動脈平滑筋細胞におけるRAGE)シグナル抑制による過剰増殖・炎症に対する効果の検討】TIRAP機能抑制を介してRAGEシグナルを抑制することが過剰増殖をおさえることを発見した。【肺高血圧モデルラットにおけるナノメディシンの開発】【肺動脈性肺高血圧症(PAH)患者の肺動脈平滑筋細胞における終末糖化産物受容体(RAGE)シグナル抑制による過剰増殖に対する効果の検討】【肺高血圧モデルラットにおけるナノメディシンの開発】Prostacyclin Analogue(ベラプロスト)ならびにimatinibを封入したナノ粒子を気管内投与する治療法(ナノメディシン)の開発に成功した。【PAH患者の肺動脈平滑筋細胞におけるRAGEシグナル抑制による過剰増殖に対する効果の検討】PAH肺動脈平滑筋細胞において過剰な細胞増殖とRAGEの発現亢進がおきており、TIRAP機能抑制を介してRAGEシグナルを抑制することが過剰増殖をおさえることを発見した。【肺高血圧モデルラットにおけるナノメディシンの開発】乳酸・グリコール酸共重合体(co-poly-lactic/glycolic acid: PLGA)をナノ粒子化し、イマチニブ、ベラプロストを封入した薬剤封入ナノ粒子を、モノクロタリン誘発性ならびにsugen-hypoxia誘発性肺高血圧症モデルラットにおいて、気管内投与すると右室収縮期圧を低下させ、右室肥大を抑制した。すなわち肺高血圧の改善を引き起こした(Nakamura et al. J Clin Med. 2017,中村一文最新医学2017)。これらのナノ粒子は肺動脈性肺高血圧症(PAH)の肺動脈平滑筋細胞の増殖を抑制する。【PAH患者の肺動脈平滑筋細胞におけるRAGEシグナル抑制による過剰増殖に対する効果の検討】特発性PAHと遺伝性PAH由来の培養肺動脈平滑筋細胞において検討したところ、RAGEならびにRAGEのリガンドであるS100A8/9蛋白の発現が無刺激下に増強しており、さらに血小板由来増殖因子(PDGF)刺激にてRAGEの発現は増加した。PAH肺動脈平滑筋細胞の増殖は無刺激・PDGF刺激のいずれの状態においてもPAHのない対照(control)の肺動脈平滑筋細胞より亢進しており、TIR/BB-loop類似構造体(mimetic), AS-1にてTIRAP機能を抑制してみると、無刺激ならびにPDGF刺激のいずれの増殖反応も抑制した。すなわちPAH患者の肺動脈平滑筋細胞において、一部はRAGEの発現増強を介して、過剰な細胞増殖がひきおこされており、TIRAP機能抑制を介してRAGEシグナルを抑制することが治療につながる可能性が示された(現在論文revision準備中)。【肺高血圧モデルラットにおけるナノメディシンの開発】

前述の如くベラプロストを封入したナノ粒子を気管内投与する治療法(ナノメディシン)の開発に成功したが、今後TIR/BB-loop類似構造体(mimetic), AS-1封入したナノ粒子による治療法開発に応用する。【PAH患者の肺動脈平滑筋細胞におけるRAGE)シグナル抑制による過剰増殖・炎症に対する効果の検討】前述の如くIRAP機能抑制を介してRAGEシグナルを抑制することが過剰増殖をおさえることを発見したが、今後アポトーシス抵抗性を抑制するか検討する。【肺高血圧モデルラットにおけるナノメディシンの開発】前述の如くベラプロスト・imatinibを封入したナノ粒子を気管内投与する治療法(ナノメディシン)の開発に成功したが、今後TIR/BB-loop類似構造体(mimetic), AS-1を封入したナノ粒子とRAGEアプタマーを封入したナノ粒子による治療法開発に応用する。【PAH患者の肺動脈平滑筋細胞におけるRAGEシグナル抑制による過剰増殖・炎症に対する効果の検討】前述の如くIRAP機能抑制を介してRAGEシグナルを抑制することが過剰増殖をおさえることを発見したが、今後炎症・アポトーシス抵抗性を抑制するか検討する。循環器内科学・分子細胞生物学・肺高血圧症
昆虫の羽化リズムを制御する複数振動体系とその適応的意義の解析

多くの昆虫は体内にある内因性の時計機構(概日時計)を使って、ある特定の時間帯に蛹から成虫に羽化する。ウスグロショウジョウバエでは羽化のタイミングを制御する概日時計機構には光感受性のA振動体と温度感受性のB振動体が関わることが示されているが、この実体はいまだ不明である。本研究では、分子遺伝学的手法が有効であるキイロショウジョウバエ羽化リズムを解析することにより、2つの振動体の実体を明らかにする。昨年度は、キイロショウジョウバエにおいても羽化のタイミングを制御する機構には光感受性の概日時計と温度感受性の概日時計の2振動体が関与することを示した。本年度は、遺伝子組換え体を用いて、振動体があると考えられているPDF発現細胞と前胸腺の概日時計の機能を組織特異的に阻害し、明暗周期と温度周期の位相関係の変化に伴う羽化の位相変化にどのような影響があるかを調べた。その結果、PDF発現時計細胞は光感受性のA振動体に相当し、前胸腺はA振動体の制御を受ける温度感受性のB振動体であることが証明された。さらに前胸腺以外にも、温度感受性の時計細胞が脳内にあることが示唆された。この細胞はPDF陽性細胞以外の時計細胞であると考えられる。実験に用いた遺伝子組換系統において、ターゲットの組織でのみ概日時計の機能阻害が起きていることを、組織学的手法と歩行活動リズムへの影響を観察することで、すでに確認している。これらの内容は国際学会と国内の学会において発表した。また、今年度の結果により、論文執筆に足りうるデータが揃ったので、論文執筆をし、投稿を急ぐ。27年度が最終年度であるため、記入しない。昆虫はある特定の時間帯に蝋から成虫になる(羽化)。羽化直後は、昆虫が水分を失いやすく弱い状態であるので、羽化に適した時間に羽化する必要がある。羽化のタイミングは体内にある内因性の時計機構(概日時計)によって決められ、この概日時計機構には環境の因子(光、温度)に異なる感受性を持っ複数の概日時計が関与することが先行研究で明らかになっている。本研究は、分子遺伝学的手法によってさまざまな遺伝的操作が行えるキイロショウジョウバエを用いて羽化リズムを解析することにより、羽化リズムを制御する複数振動体系の実体を分子レベルで明らかにすることを目指すものである。本年度は羽化のタイミングを測定する機器のセットアップと、実験に使用する遺伝子組換え体の遺伝的バックグラウンドを均一にするためのもどし交雑に時間を割いた。これらの作業に想定よりも時間がかかったため、本年度は遺伝子組み換え系統を用いた実験は行わなかった。一方、光同調機構については興味深い知見が得られた。視覚系がさまざまなレベルで機能不全になる突然変異系統や、青色光受容分子であるクリプトクロムが機能しない突然変異系統において羽化のタイミングを制御する概日時計機構の光同調能について調べたとろ、クリプトクロムと視覚系の両方が光受容機構に関与することがわかった。クリプトクロムが機能しなくとも、リズムの同調能は野生型とほぼ変わらないのに対し、視覚系が機能しないと羽化の位相が大きく暗期へと移行し、全暗ではリズムの減衰が見られた。つまり、蝋では光への同調にクリプトクロムよりも視覚系を主に使用していると考えられる。成虫ではクリプトクロムが主要な光受容器であると考えられており、発生に伴って、主要な光受容体が変化する可能性が示唆された。この内容には、H25年11月の時間生物学会にて発表した。今後はこの知見をもとに、光と温度に異なる感受性を持っ振動体の実体を遺伝子組換え体を使用した実験で明らかにする。ウスグロショウジョウバエでは羽化のタイミングを制御する概日時計機構には光感受性の振動体と温度感受性の振動体が関わることが示されているが、この実体はいまだ不明である。本年度は、2つの振動体の性質を明らかにするため、明暗周期と温度周期をさまざまな位相で組み合わせた条件下での羽化のタイミングを調べた。羽化の位相は明暗周期と温度周期の位相関係の変化に伴って変化した。これはキイロショウジョウバエの羽化のタイミングを制御する機構に光感受性と温度感受性の概日時計の2振動体が関与すること、および、明暗周期と温度周期の同調因子としての相対的な強さが同等であることを示している。さらに、同様の条件で飼育したハエの羽化パターンを温度一定の全暗条件で観察したところ、光感受性の振動体が温度感受性の振動体の上位にあることを支持する結果を得た。キイロショウジョウバエでは脳と前胸腺という内分泌器官にある概日時計が羽化のタイミングを制御することが分かっている。この2つの振動体が光感受性および温度感受性に相当するかを調べるため、遺伝子組換え体を用いて概日時計の機能を組織特異的に阻害し、明暗周期と温度周期の位相関係の変化に伴う羽化の位相変化にどのような影響があるかを調べた。全身の概日時計を機能阻害したハエの羽化はどんな条件下でも無周期におこり、温度の上昇あるいは明期の始まりといった急激な刺激に、羽化が誘導されることはなかった。

今後は、脳にある概日時計、前胸腺にある概日時計のみを特異的に機能阻害し、明暗周期と温度周期の位相関係の変化に伴う羽化の位相変化を解析する予定である。多くの昆虫は体内にある内因性の時計機構(概日時計)を使って、ある特定の時間帯に蛹から成虫に羽化する。ウスグロショウジョウバエでは羽化のタイミングを制御する概日時計機構には光感受性のA振動体と温度感受性のB振動体が関わることが示されているが、この実体はいまだ不明である。本研究では、分子遺伝学的手法が有効であるキイロショウジョウバエ羽化リズムを解析することにより、2つの振動体の実体を明らかにする。昨年度は、キイロショウジョウバエにおいても羽化のタイミングを制御する機構には光感受性の概日時計と温度感受性の概日時計の2振動体が関与することを示した。本年度は、遺伝子組換え体を用いて、振動体があると考えられているPDF発現細胞と前胸腺の概日時計の機能を組織特異的に阻害し、明暗周期と温度周期の位相関係の変化に伴う羽化の位相変化にどのような影響があるかを調べた。その結果、PDF発現時計細胞は光感受性のA振動体に相当し、前胸腺はA振動体の制御を受ける温度感受性のB振動体であることが証明された。さらに前胸腺以外にも、温度感受性の時計細胞が脳内にあることが示唆された。この細胞はPDF陽性細胞以外の時計細胞であると考えられる。実験に用いた遺伝子組換系統において、ターゲットの組織でのみ概日時計の機能阻害が起きていることを、組織学的手法と歩行活動リズムへの影響を観察することで、すでに確認している。これらの内容は国際学会と国内の学会において発表した。また、今年度の結果により、論文執筆に足りうるデータが揃ったので、論文執筆をし、投稿を急ぐ。今年度は、実験条件を再検討し、計画を大幅に変更した。その結果、実験にかかる時間を短縮することができ、予定していた実験はおおむね順調に進行た。引き続き、同様のレジームで実験を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。野生型を使用した羽化パターンを調べる実験はおおむね終了することができたので、今後は遺伝子組み換え系統を使用して個々の振動体を特異的に阻害する実験をおこなう。また、明暗周期と温度周期をさまざまな位相で組み合わせた条件において脳の概日時計と前胸腺の概日時計がどのような挙動を示すのか、抗概日時計タンパク質抗体を用いた免疫組織化学法によって明らかにする。実験に必要不可欠であったTrikenetics社(アメリカ)の羽化リズム測定装置の納品がかなり遅れたこと、セットアップに時間がかかったことから,その装置を使った実験の開始が遅れたことが原因である。また、想定していたよりも羽化リズムの光への反応性が弱く、実験デザインを変更する必要があったことも要因となった。当初、温度サイクルや明暗サイクルを組み合わせた複雑なレジームでの実験を複数行うことを予定していたが、実験をより単純化して、スピードアップを図る。また、ハエの飼育条件を再考し、実験までのすべての過程を短縮するよう改善したい。
カルベノイドをモデルとした1,n-両極反応性有機金属中間体の創製

(1)炭素鎖延長を伴ったアリル亜鉛種の発生と反応:プロパルギル位に脱離基を有するアルキニルジンケートは円滑な1,2-アルキル移動を起こし、対応するアレニック亜鉛種を効率的に与える。同様なアルキル移動がアリル位に脱離基を有するアルケニルジンケートより進行すれば、炭素鎖が延びたアリル亜鉛種を発生できることになる。アルケニルジンケート中間体はメタンスルホン酸3-ヨードアリルへのハロゲン・亜鉛交換により発生できると考え、トリブチルジンケートとの反応を検討したところ、ブチル基が導入されたアリル亜鉛種が効率よく発生できることがわかった。このアリル亜鉛種は、続いてアルデヒドと処理することにより対応するホモアリルアルコールを与えた。調整した亜鉛種を直接反応に用いた場合にくらべ、塩化亜鉛と処理したのちにアルデヒドとの反応に用いた場合、反応効率ならびに立体選択性の点でより良好な結果が得られた。(2)アルキニルジンケートの環化反応:ホモプロパルギル位に脱離基を有するアルキニルジンケートは1,2-アルキル移動反応を伴ってexo-環化し、1-(シクロプロピリデン)アルキル亜鉛種を与える。本環化反応の一般性を調べるため、遠隔位に脱離基を有するアルキニルジンケートの反応を検討した。トルエンスルホン酸5-ヘキシニルや6-ヘプチニルより発生するアルキニルジケ-トは、exo-環化ともにendo-環化も起こし、1-(シクロアリキリデン)アルキル亜鉛種とシクロアルケニル亜鉛種を与えた。1,3-ジフェニルイソベンゾフランによる捕捉実験ならびに^<13>C標識実験より、シクロアルケニル亜鉛種の生成は、アルキニルジンケートの環化により生じたシクロアルキンへのカルボメタル化を経由して進行したことが明らかとなった。
過酸化脂質の高選択的かつ超高感度化学発光検出法の開発と生体試料分析への応用

本研究では、生体内の酸化還元情報を得るための指標として、過酸化脂質に着目し、その高選択的かつ超高感度な化学発光分析法の確立を試みた。このための手段として新たに高速液体クロマトグラフィー/オンライン紫外線照射/過シュウ酸エステル化学発光検出系を創案した。本システムを用いた場合、標的分子が過酸化部位と蛍光性母核の両者を有する場合のみ、紫外線照射がトリガーとなって化学発光を生じることから、極めて選択的に過酸化脂質を識別することが可能になると考えた。また、このシステムにおいては、シュウ酸ジエステル以外のポスト試薬が不要なため、ノイズの低減が可能となり、大幅な感度の増加が期待できる。まず、オレイン酸を光増感酸化して得られる試料を蛍光標識して、その化学発光検出を検討した。その結果、本法の選択性に関しては期待通りの結果が得られたものの、感度に関しては蛍光検出よりも劣る結果となった。この原因を調査したところ、紫外線照射によるヒドロペルオキシドから過酸化水素の生成効率の低さ(0.5%)が原因であることが判明した。そこで紫外線照射に代わる方法としてフェントン反応に注目し、ヒドロペルオキシドからヒドロキシルラジカルあるいは過酸化水素の生成を試みたところ、過酸化水素量に換算して7.4%の収率が観測された。この収率は紫外線照射法による収率の約15倍であった。今後、さらに条件の最適化を行うことで、この収率はさらに向上するものと期待できる。以上、化学発光検出に基づく過酸化脂質の高選択的かつ高感度な定量法の開発を試みた。本研究においては、ヒドロペルオキシドと蛍光性母核の両者を有する標的分子のみが選択的応答を示す分析システムの構築を試みたが、この蛍光性母核は化学発光性母核に置き換えることも可能である。今後、ヒドロペルオキシドから化学発光に関与する活性酸素種を高い収率で産生可能な反応あるいはシステムを追求することで、本法は更に高感度な過酸化脂質の検出法になるものと考える。過シュウ酸エステル化学発光(PO-CL)はシュウ酸ジエステルと過酸化水素との反応によって高エネルギー中間体が生成し,これにより共存する蛍光物質が発光する現象である。申請者はこれまで,有機過酸化物を紫外線照射により過酸化水素へと変換し,これを高感度に検出する方法を開発してきた。本申請では,蛍光標識した過酸化脂質に紫外線照射することで過酸化水素を発生させ,これと標識蛍光物質とシュウ酸ジエステルの3者が共存する条件でのみ効率的な化学発光を示す化学発光検出系の構築を目的として,以下の検討を行った。1)モデル化合物として不飽和脂肪酸であるオレイン酸を用い,これを光増感酸化してオレイン酸ヒドロペルオキシドの調整を行った。2)オレイン酸ヒドロペルオキシドを対象とする蛍光標識法を,2種類の蛍光標識試薬(HCPI及びNeOTf)を用いて検討し,それぞれの蛍光標識条件を確立した。3)オレイン酸ヒドロペルオキシドの蛍光標識体を,高速液体クロマトグラフィーで分離後,オンラインで紫外線照射し,PO-CL検出する分析システム(ポスト化学発光試薬としてシュウ酸ジエステルのみを用いる)の構築を試みた。このための基礎的検討として,フローインジェクション装置を用い,紫外線照射条件及び化学発行反応条件等の最適化を行った。以上の検討の結果,現在までのところ,本システムを用いて蛍光標識した過酸化物を期待した感度で検出するには至っていない。この原因を詳細に調査した結果,紫外線照射による過酸化物から過酸化水素への変換効率の低さが低感度の原因であることが明らかとなった。

従って,次年度は,Fenton反応などを利用する他の過酸化水素発生系の検討,及び過酸化水素をより高感度に検出できる化学発光検出系の検討,などを行っていく予定である。本研究では、生体内の酸化還元情報を得るための指標として、過酸化脂質に着目し、その選択的かつ高感度な化学発光分析法の確立を試みた。このための手段として高速液体クロマトグラフィー/オンライン紫外線照射/過シュウ酸エステル化学発光検出系を創案した。本システムを用いた場合、標的分子が過酸化部位と蛍光骨格の両者を有する場合のみ、紫外線照射がトリガーとなって化学発光を生じることから、極めて選択的に過酸化脂質を識別することが可能になると考えた。また、このシステムでは、シュウ酸ジエステル以外のポスト試薬が不要なため、ノイズの低減が可能となり、大幅な感度の増加が期待できる。前年度までの研究において、本法の選択性に関しては期待通りの結果が得られたものの、感度に関しては蛍光検出よりも劣る結果が得られた。この原因を調査したところ、紫外線照射によるヒドロペルオキシドから過酸化水素の生成率の低さ(0.5%)が原因であることが明らかとなった。そこで紫外線照射に代わる方法としてフェントン反応に注目し、ヒドロペルオキシドからヒドロキシルラジカルあるいは過酸化水素の生成を試みたところ、過酸化水素量に換算して7.4%の収率が観測された。この収率は紫外線照射法による収率の約15倍であった。今後、さらに条件の最適化を行うことで、この収率はさらに向上するものと期待できる。以上、化学発光検出に基づく過酸化脂質の高選択的かつ高感度な定量法の開発を試みた。本研究においては、ヒドロペルオキシドと蛍光性化合物の両者を有する標的分子のみが選択的応答を示す分析システムの構築を試みたが、この蛍光性化合物は化学発光性化合物に置き換えることも可能である。今後、ヒドロペルオキシドから化学発光に関与する活性酸素種を高い収率で産生可能な反応あるいはシステムを追求することで、さらに高感度な過酸化脂質定量法が開発可能と考える。