hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中央省庁の組織形態と政策活動：大規模データセットに基づく時系列分析と省庁間比較

1970年代以降の日本の官僚機構はいかに変化したのか.省庁により組織形態や政策活動がいかに異なるのか.政治的要因,組織内在的要因,環境要因のいずれが強く効くのか.それはなぜなのか.こうした一連の問いに対して,本研究は,財務省,経産省,厚労省,国交省についての組織と活動に関する観察データを遡及的に収集することで答えていく.研究成果は,省庁の違いを自明視しがちな既存の行政研究による理解を塗り替えるものとなるだろう.同時に,海外との共同研究,対象とする省庁を拡大した後継研究への展開,オープンデータの活用など実務への示唆も視野に入っているのが,本研究の特徴である.1970年代以降の日本の官僚機構はいかに変化したのか.省庁により組織形態や政策活動がいかに異なるのか.政治的要因,組織内在的要因,環境要因のいずれが強く効くのか.それはなぜなのか.こうした一連の問いに対して,本研究は,財務省,経産省,厚労省,国交省についての組織と活動に関する観察データを遡及的に収集することで答えていく.研究成果は,省庁の違いを自明視しがちな既存の行政研究による理解を塗り替えるものとなるだろう.同時に,海外との共同研究,対象とする省庁を拡大した後継研究への展開,オープンデータの活用など実務への示唆も視野に入っているのが,本研究の特徴である.
不均一流下における土壌微生物の群集構造が窒素循環に及ぼす影響

不均一流下での土壌微生物の群集構造とその窒素循環へ影響を明らかにするために、滅菌型ヘレ・ショウ土壌槽を用いた培養実験を行い、不均一流内外の土壌DNAを抽出してPCR後、変性剤勾配ゲル電気泳動法(DGGE)でDNAを分離し、分離バンド数と蛍光強度からShannon-Wienerの多様性指数を求めた。しかし、DGGE法を多様性評価に用いるには、メタゲノム試料のheteroduplexが問題となるため、ssDNAとheteroduplexを分解・断片化するS1ヌクレアーゼ処理を行い、多様性指数を修正した。この問題はrDNAなどの進化的に保存された配列で深刻で、S1ヌクレアーゼ処理のないPCR-DGGE法では、最大で微生物種数の2乗の増幅産物が与えられることを示した。また、TaqDNAポリメラーゼは増幅エラーによって多様性指数に影響を与え、非特異産物と培養不能な微生物のDNAが区別できなくなるため、φ29DNAポリメラーゼを用いた予備増幅後、3'末端を固定化核酸で修飾したプライマーと3'->5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを併用したPCRで、DGGE法の効率を高める工夫を行った。DNAに基づく土壌微生物の解析では、死滅微生物のDNAが混入する可能性があるため、分解の速いRNAに基づく解析も試みた。しかし、コンポスト中のRNA回収率はDNA回収率と比べて著しく低く、コンポスト化時の加熱で死滅した微生物や、放線菌などの内生胞子のDNAが多量に含まれることが塩基配列からも確認された。また、CARD-FISH法による微細スケールでの微生物空間分布解析は、土壌の自家蛍光等の問題のため、今後の課題となった。根粒菌の単一菌株を対象としたRNAの検出は可能であったため、窒素循環と空間分布形成に関与する遺伝子の解析を行った。以上の結果を国際誌に投稿するため2報の論文にまとめた。不均一流下での土壌微生物の群集構造とその窒素循環へ影響を明らかにするために、無菌的な条件で不均一流を研究するためのヘレ・ショウ土壌槽を設計し、この土壌槽を用いた培養実験を行った。また、不均一流が形成する含水比の二次元分布を、surface probe型誘電率水分計を用いて非破壊的に測定する手法を検討した。培養実験後、土壌から抽出したDNAをPCR(polymerase chain reaction)によって増幅した。PCRのプライマー設計は、16S rDNA、nifH、nirS/K、nosZ、exoQ、mcpの各遺伝子について行った。また、PCRによる非特異的産物を除去するためにネスト用のプライマーも設計し、タッチダウンなどの反応条件の検討も行った。このPCRで増幅した土壌DNAサンプルは、変性剤勾配ゲル電気泳動法(DGGE)にて分離し、分離したバンドの数と蛍光強度からShannon-Wienerの多様性指数を求めた。DGGEによる分離は、ヘテロデュプレックスを形成しにくいDNAを検出するための短時間の分離法と、通常のDGGE法の両方を検討した。また、すべてのDGGE実験は、ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)とあわせて行い、PCRによる非特異的産物がDGGEのバンドに混入していないことを確認した。その結果、nifH遺伝子の多様性指数は、不均一流内外の位置によって著しく変動し、安定した浸潤部で高い値を示すことがわかった。また、窒素イオン種の濃度分布によると、硝酸イオン濃度が高くなる部位で、nifH遺伝子が減少することなども確認された。以上の成果は、関連する学会で積極的に発表し、国際学会での発表も予定している。また、本年度において無菌的環境でのヘレ・ショウ実験法がほぼ確立したため、次年度における原著論文の完成に向けて実験データの蓄積を進めている。不均一流下での土壌微生物の群集構造とその窒素循環へ影響を明らかにするために、滅菌型ヘレ・ショウ土壌槽を用いた培養実験を継続し、不均一流内外の土壌DNAを抽出してPCR後、変性剤勾配ゲル電気泳動法(DGGE)でDNAを分離し、分離バンド数と蛍光強度からShannon-Wienerの多様性指数を求めた。また、微生物群集構造を正確に反映したPCR条件を求めるため、SantaLucia and Watkins(2005)のイノシン含有DNAの熱力学パラメータを参考にして、アニーリング温度等を修正した。さらに、不均一流内外の遺伝子量の違いを大まかに比較するため、定量ルーラーを用いたポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)をDGGEと併せて行った。不均一流下での培養実験は、均一流・フィンガー流・バイパス流の3種類の条件で行った。その結果、フィンガー流によって浸潤境界面の比率が増大し、多様性指数の空間平均値が増大することが、昨年度の実験と同様に確認された。また、この結果を説明する簡易なモデルを作成し、日本土壌肥料学会で発表した。バイパス流下では、マクロポア内部の水蒸気凝結により、亜硝酸イオン濃度の低下とnosZ遺伝子の増加が局所的に生じることを見出した。この結果は、昨年度のデータと合わせて国際土壌学会で発表した。マクロポア内部の凝結条件は、地表面蒸発速度をCampbell型の蒸発速度と風による水蒸気輸送速度の和とし、相転移による熱の発生・吸収を考慮した簡易な計算で確認された。以上の解析は、環境中で安定なDNAに基づくものであるため、環境条件の違いを敏感に反映するRNAを標的として培養・固定・抽出などの条件検討を行い、高感度なCARD-FISH法による微生物の分布と発現解析を行う環境を整備した。

また、DGGEで得られたDNA断片の一部について、TAクローニングによる塩基配列の検証を継続している。不均一流下での土壌微生物の群集構造とその窒素循環へ影響を明らかにするために、滅菌型ヘレ・ショウ土壌槽を用いた培養実験を行い、不均一流内外の土壌DNAを抽出してPCR後、変性剤勾配ゲル電気泳動法(DGGE)でDNAを分離し、分離バンド数と蛍光強度からShannon-Wienerの多様性指数を求めた。しかし、DGGE法を多様性評価に用いるには、メタゲノム試料のheteroduplexが問題となるため、ssDNAとheteroduplexを分解・断片化するS1ヌクレアーゼ処理を行い、多様性指数を修正した。この問題はrDNAなどの進化的に保存された配列で深刻で、S1ヌクレアーゼ処理のないPCR-DGGE法では、最大で微生物種数の2乗の増幅産物が与えられることを示した。また、TaqDNAポリメラーゼは増幅エラーによって多様性指数に影響を与え、非特異産物と培養不能な微生物のDNAが区別できなくなるため、φ29DNAポリメラーゼを用いた予備増幅後、3'末端を固定化核酸で修飾したプライマーと3'->5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを併用したPCRで、DGGE法の効率を高める工夫を行った。DNAに基づく土壌微生物の解析では、死滅微生物のDNAが混入する可能性があるため、分解の速いRNAに基づく解析も試みた。しかし、コンポスト中のRNA回収率はDNA回収率と比べて著しく低く、コンポスト化時の加熱で死滅した微生物や、放線菌などの内生胞子のDNAが多量に含まれることが塩基配列からも確認された。また、CARD-FISH法による微細スケールでの微生物空間分布解析は、土壌の自家蛍光等の問題のため、今後の課題となった。根粒菌の単一菌株を対象としたRNAの検出は可能であったため、窒素循環と空間分布形成に関与する遺伝子の解析を行った。以上の結果を国際誌に投稿するため2報の論文にまとめた。
脳内におけるACEの内在性基質の探索と記憶保持との関連

1.目的中枢移行性のアンジオテンシン変換酵素阻害薬(カプトプリル他)に認知機能の低下を防ぐ効果があることが報告されたがその作用機序は未だ解明されていない。本研究では、記憶保持増強効果の認められたカプトプリル投与ラット脳において増加するペプチドを検索し、insulin-regulated amino-peptidase(IRAP)の内在性基質を決定することを目的とする。2.方法(1)IRAPの内在性基質の探索(2)ラット脳ペプチドの精製および構造解析カプトプリル投与ラットにおいて特異的に発現する質量数に相当するペプチドをHPLC法にて精製し、精製したペプチドは、タンデム型質量分析計にてそのアミノ酸配列を決定した。3.結果(1)SELDI-TOF-MSによる脳内変動ペプチドの解析では、カプトプリル投与群で質量数2000前後の領域において複数のピークが増加し、低質量数の領域においてはピークが減少した。(2)発現変化を認めたピークの一部についてはグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のフラグメントであることが判明した。
教育達成格差の生成メカニズムについての実証研究

本課題では、入手可能な日本の個票データを用いて、日本社会における教育格差のメカニズム(どのようにして出身階層が教育達成の格差となるのか)について実証的に検討した。該当期間に、10の査読付き原著論文(単著7編・第一著者の共著3編)を発表した。これらの研究結果は、各教育段階(小学校・中学校・高校)において、どのように出身家庭の社会経済的地位が教育機会格差・学力格差・意欲格差などと関連しているのかを示している。また,個人水準だけではなく居住地域や学校という集団水準の役割についても明らかにした。なお、研究知見を世界の教育格差研究に位置付けるため、主に英語で発信された(10編のうち7編は英字論文)。本研究の目的は,教育達成に格差が生じる過程を,義務教育と高校教育についての大規模データの二次分析を通して実証的に解明することである。本年度,最初に検討したのは文化資本の家庭内相続である。親子の読書量の増減に関係があることを明らかにするために,厚生労働省が実施している21世紀出生児縦断調査を用い,共同研究を行った。小学生児童の縦断データ分析の結果,親の学歴と読書習慣による格差ー児童間の読書量格差,それに父母の読書習慣によって児童の読書量が分化していることが明らかとなった。次に着目したのは,高校生の教育期待と大学受験準備時期の学習時間の関連である。そのために国立教育政策研究所による高校3年生の学力調査データを用い,マルチレベル媒介分析を行った。その結果,生徒個人と学校水準,両方の水準で社会経済的地位が進学期待を媒介し大学受験を想定していると思われる授業外長時間学習に繋がっていることが明らかになった。次に,居住地域によって教育に対する意識が異なるのか,全国規模の社会調査であるSSP-I2010データをマルチレベル構造方程式モデルによって分析した。その結果,居住地域の大卒者割合が個人の教育意識を分化していた。換言すると,住んでいる場所によって教育に対する価値観が異なることが示された。最後に,義務教育段階の教員職務満足度の学校間格差に着目した。国際的にも学校間格差が少なく比較的平等主義的であるとされる日本の義務教育制度であるが,OECDによる国際教員指導環境調査(TALIS)の日本データを分析した結果によると,生徒の社会経済的地位の学校平均が生徒の問題行動の多寡を媒介して教員の学校間職務満足度と関連していた。これら4編の論文は,個人・学校・地域の社会経済的地位によって教育に関する個人の習慣・行動・意識などが異なるー日本社会における教育の不平等生成メカニズムの一部を実証的に示している。該当年度の業績は査読付論文3本である(うち1本は掲載決定で発行は2016年度)。どの研究も大きなテーマは,義務教育についての大規模データの二次分析を通して教育達成に格差が生じる過程を実証的に明らかにすることにあった。1本目は,社会関係資本研究である(単著・日本語)。厚生労働省が実施している21世紀出生児縦断調査を用い,父母の学校活動関与と小学校児童の学校適応について分析した。親の学歴と世帯収入によって父母の学校活動頻度は分化していた。そしてこの学校社会関係資本として解釈される活動頻度が,小学校児童の学校適応を左右していた。2本目は,努力の不平等研究である(共著・英語)。同じく21世紀出生児縦断調査を分析し,努力の不平等について検討した。親の子育ては,親自身の学歴と世帯収入によって異なり,その差異が子どもの学校外学習時間を分化していた。親の学歴などによる子の学校外学習時間格差は,小学校1年から学年が上がるにつれ拡大するが,該当論文は,社会経済的地位によって異なる子育てによってその格差が部分的に説明できることを明らかにした。3本目は,経済資本研究である(単著・日本語・掲載決定で発行は2016年度)。再び21世紀出生児縦断調査を分析し,学校児童の学校外教育活動(習い事)利用格差を明らかにした。未就学段階(幼稚園・保育園)から検討し,親学歴・世帯収入によって利用率が異なること,学齢が上がるときにより利用するようになるかどうかも親学歴・世帯収入によって異なること,観察されない要因を統制しても世帯収入と習い事利用には関連があることを示した。これら3編の査読論文は,国際的に学校間格差が少ないとされる標準化された義務教育制度を持つ日本においても,学校外で教育格差が存在・拡大することを実証的に明らかにしたー日本社会における教育の不平等生成メカニズムの一部を実証的に示している。概ね計画通りに進行している。該当年度の業績は査読付き論文2本である。ただ,そのうち1本は2015年度内に掲載決定し発行が2016年度であったので,2015年度実績報告書ですでに記述している。よって,本報告では1編についてのみ言及する。本論文は,平成23年度に内閣府が中学3年生とその保護者を対象とした調査(「親と子の生活意識に関する調査」)による個票データを二次分析し,教育における地域格差を明らかにした実証研究である。日本の義務教育は標準化された制度を特徴とするが,出身家庭の社会経済的地位による学習努力の格差ー努力の不平等が指摘されてきた。たとえば,前年度の実績である論文(「Emerging inequality in effort」)は,小学校段階における親学歴による学習努力量の格差を実証的に明かにしている。該当年度の実績である論文では,個人と近隣の2水準のマルチレベルモデルによって,中学3年生における努力格差を検討した。まず,高校受験の数か月前の時点においても,住んでいる地域によって学習時間に差があることを確認した。

その上で,近隣の社会経済的地位が近隣の大学進学期待水準を介して学習時間と関連していることを実証的に示した。これは,個人の社会経済的地位だけではなく,地域の社会経済的地位によって努力格差が存在することを示唆している。換言すれば,本研究の知見は,標準化された義務教育制度に加えて高校受験という大きな学習圧力があっても,個人・地域の双方の水準で社会経済的地位に基づく学習努力格差があることー誰もが目標の高校に向かって全力で勉強しているわけではなく,努力投入量に階層性があることを明らかにしたといえる。これは日本社会における教育の不平等生成メカニズムの一部であると考えられる。本課題では、入手可能な日本の個票データを用いて、日本社会における教育格差のメカニズム(どのようにして出身階層が教育達成の格差となるのか)について実証的に検討した。該当期間に、10の査読付き原著論文(単著7編・第一著者の共著3編)を発表した。これらの研究結果は、各教育段階(小学校・中学校・高校)において、どのように出身家庭の社会経済的地位が教育機会格差・学力格差・意欲格差などと関連しているのかを示している。また,個人水準だけではなく居住地域や学校という集団水準の役割についても明らかにした。なお、研究知見を世界の教育格差研究に位置付けるため、主に英語で発信された(10編のうち7編は英字論文)。概ね計画通りに進行している。アクセスできる大規模データを用い,教育達成に格差が生じる過程を可能な限り多くの側面で実証的に示す。教育社会学アクセスできる大規模データを用い,教育達成に格差が生じる過程を可能な限り多くの側面で実証的に示す。計画していた海外学会発表を実行できなかったため。国際学会にて発表する。また,発表用の研究を進展させるために必要な物品・図書を購入する。
組合せ構造のモジュラー表現の研究とその応用

アソシエーションスキームの理論は、統計学、特に分散分析における実験計画法の理論から生まれた。代数学と組合せ論の両方に属する理論であり、ある意味で群の一般化とみなすことができる。よって群の表現(行列に帰着させて構造をとらえる手法)と同様にアソシエーションスキームの表現を考える事ができる。本研究の目的は、アソシエーションスキームの表現を調べ、それを組合せ構造の様々な理論に応用することにある。ボースメ・メスナー代数とは標数0の体上におけるアソシエーションスキームの隣接代数で常に半単純である。これまで多くの結果が得られている。一方、正標数の体上におけるアソシエーションスキームの隣接代数はモジュラー隣接代数とよばれており、得られている研究結果は多くない。また、隣接代数には、自然な表現とそれに付随する加群がある。これらを標準加群とよんでいる。モジュラー隣接代数に付随する加群をモジュラー標準加群とよんでいる。花木章秀氏(信州大学)と吉川昌慶氏(兵庫教育大)により、クラス2のモジュラー標準加群の構造から強正則グラフのパラメータよりも詳細な特徴付けの可能性が示唆されている。モジュラー標準加群の構造を決定するには、モジュラー隣接代数の構造の解明が不可欠である。最も有名なアソシエーションスキームの一つであるハミングスキームについて、吉川氏により多項式環の単項式イデアルによる剰余環と同型であることが証明されている。今年度、ハミングスキームH(n,2)の標数2の体上におけるモジュラー標準加群の構造を決定できた。実際にはモジュラー標準加群の直既約直和分解の方法を明らかにできた。これは、言い換えるならば高々1次のn変数多項式からなる標数2の体上の代数FXと、変数のインデックスへのn次対称群の作用で不変な元からなる部分代数FSを考えた時、FXを右FS加群として、その直既約直和分解を得たことになる。モジュラー標準加群の直既約直和分解を求めるに当たって、直既約性の証明には、一般パラメータに対しての証明を行うため、基となる組合せ構造を反映させる簡易な基底を見つける必要があるが、ハミングスキームの場合、構造が単純であるがゆえ、可能性のある基底の取り方が膨大だったため決定に時間がかかった。2019年度は、前年度明らかにしたパラメータqが2の場合のハミングスキームのモジュラー標準加群の構造を基にし、パラメーターqが2以外のハミングスキームのモジュラー標準加群の構造決定の検討を行う。パラメータqを一般的にすると隣接代数の構造が複雑になることが分かっているので、手始めにパラメータqが2べきの場合の構造決定を行う予定である。この場合、隣接代数構造はH(n,2)と同型であるが、モジュラー標準加群の構造は異なると思われる。

パラメータqを一般的にすると隣接代数の構造が複雑になることが分かっているので、手始めにパラメータqが2べきの場合の構造決定を行う予定である。この場合、隣接代数構造はH(n,2)と同型であるが、モジュラー標準加群の構造は異なると思われる。
動的知識管理機能を有するデータベースワークベンチの研究開発

データベースの応用分野の拡大に伴い,各分野に適した機能を追加してより機能の高いデータベース管理システムを開発するための研究が盛んになりつつある.本研究では,高機能化したマイクロコンピュータをデータベースワークベンチとして用いることにより,学術情報の知的処理に役立つシステムの研究開発を行っている.本研究の具体的な成果は次のとおりである.1.分担者の研究分野別に学術情報処理機能を整理した.データベース(上林,吉川,小西,小島),アルゴリズム(今井),理論回路(岩間),知能情報処理(田中,高木),並行処理(最所).2.上記により知能データベースワークベンチに必要な機能を整理し,その実現法を検討した.具体的には3と4で示すモデルを提案し,各分野に適用することにより,モデルの改良,システムに必要な機能の追加を行った.3.均一性の高い設計データモデルを提案した.このモデルはデータの階層性,履歴,利用者の共同作業等を扱えるもので,これを用いて論理回路図,プログラムなどをデータとする論理回路設計用データベースを設計した.4.オブジェクト指向モデルに基づくモデルを提案し,オブジェクトにおける階層性の一般化を行った.様々な意味付けが行われている階層性を統一的に扱えるようにし,オブジェクトの集合に対する階層性やその処理アルゴリズムの計算の複雑さを明らかにした.5.データベースワークベンチの基本機能を実現し,実際に処理を行うことにより機能を検討した. OBASIIIをデータベースとして用いたワークベンチで, 1980年以降に主要な雑誌や国際会議で発表されたデータベースに関する文献をデータとし,処理結果をデータベース文献集としてまとめた.本研究では,研究討論会を九州大学で各年度2回,合計4回行い,研究発展状況の発表および討論を行った.データベースの応用分野の拡大に伴い,各分野に適した機能を追加してより機能の高いデータベース管理システムを開発するための研究が盛んになりつつある.本研究では,高機能化したマイクロコンピュータをデータベースワークベンチとして用いることにより,学術情報の知的処理に役立つシステムの研究開発を行っている.本研究の具体的な成果は次のとおりである.1.分担者の研究分野別に学術情報処理機能を整理した.データベース(上林,吉川,小西,小島),アルゴリズム(今井),理論回路(岩間),知能情報処理(田中,高木),並行処理(最所).2.上記により知能データベースワークベンチに必要な機能を整理し,その実現法を検討した.具体的には3と4で示すモデルを提案し,各分野に適用することにより,モデルの改良,システムに必要な機能の追加を行った.3.均一性の高い設計データモデルを提案した.このモデルはデータの階層性,履歴,利用者の共同作業等を扱えるもので,これを用いて論理回路図,プログラムなどをデータとする論理回路設計用データベースを設計した.4.オブジェクト指向モデルに基づくモデルを提案し,オブジェクトにおける階層性の一般化を行った.様々な意味付けが行われている階層性を統一的に扱えるようにし,オブジェクトの集合に対する階層性やその処理アルゴリズムの計算の複雑さを明らかにした.5.データベースワークベンチの基本機能を実現し,実際に処理を行うことにより機能を検討した. OBASIIIをデータベースとして用いたワークベンチで, 1980年以降に主要な雑誌や国際会議で発表されたデータベースに関する文献をデータとし,処理結果をデータベース文献集としてまとめた.本研究では,研究討論会を九州大学で各年度2回,合計4回行い,研究発展状況の発表および討論を行った.現在データベースの応用分野が広がりつつあり、それらの分野に適した機能を追加してより機能の高いデータベース管理システムを開発するための研究が盛んになりつつある。本研究では、高機能化したマイクロコンピュータをデータベースワークベンチとして使用することにより、学術情報の知的処理に役立つシステムの研究開発を行っている。本年度の具体的な成果は次のとおりである。1.分担者の研究分や別に学術情報処理機能を整理した。データベース(上林,吉川,小西,小島)、アルゴリズム(今井)、論理回路(岩間)、知能情報処理(田中,高木)、並行処理(最所)。2.上記により、知能データベースワークベンチに必要な機能を整理し、その実現方法を検討した。具体的には3と4で示す2つのモデルを提案した。3.均一性の高い設計データモデルを提案した。このモデルは、データの階層性、データの履歴、利用者の共同作業等を扱える自由度の高いものである。4.オブジェクト指向モデルに基づくモデルの提案。5.高水準利用者インタフェースを設計した。利用者のレベルはさまざまであるので、効率の良い自然言語型インタフェースを設計した。6.データベースワークベンチの基本機能の実現。ワークベンチ用のデータベースとしては、dBASE【III】を用い、これを利用してワークベンチの基本機能の実現を行った。7.特に、履歴管理については、それに適したエディタを開発した。このエディタは、データの論理的な対応を求め、それによるデータ圧縮を実験したり、一括訂正の機能を実現している。本年度は、研究討論会を2回九州大学で行い、研究発展状況の発表および討論を行った。
コロイドによって安定化されたエマルションの構造とダイナミクス

生体膜は脂質二重膜構造によって細胞器官の内外を仕切っており、千種類にも及ぶ脂質分子や膜タンパク質、コレステロールなどから構成されている。近年、生体膜上において特定の成分の集合ドメインが存在することが報告されており、シグナル伝達などの生体機能との関連が期待されている。その一方でドメインの形成機構はまだ明らかになっておらず、膜面上における生体機能の物理的機構の解明には至っていない。本研究では上記の問題解明へ寄与することを目的として、脂質二重膜における新しいドメイン形成機構の提案を行った。具体的には、飽和脂質と不飽和脂質からなる脂質単層膜を考え、相分離の自由エネルギーに膜内の脂質組成場と脂質疎水鎖の配向場との結合効果を取り入れた。その結果上記の自由エネルギーによって、低温の場合には磁性薄膜やブロック共重合体と同様にミクロ相分離現象が記述され、高温の場合にはゆらぎの相関長と特徴的波数の二つの長さスケールを持つ濃度ゆらぎが記述されることが明らかになった。続いて、二重膜の膜間に働く相互作用に着目し、結合二重膜の自由エネルギーの提案を行った。まず、高温状態における二重膜の濃度ゆらぎの相関関数を解析的に得た。膜間の結合によって片方の膜からもう一方の膜にゆらぎが誘起され、特に二枚の膜で異なる特徴的長さを持つ場合には、結合によって小さな波数のピーク位置で強くゆらぎが誘起される。続いて、低温状態における二重膜の相分離過程を数値シミュレーションによって求めた。その結果、二つの膜で特徴的波数が異なる場合に、様々な新しいミクロ相分離パターンが得られた。以上の結果は、生体膜におけるドメイン形成のみならず、新しいパターン形成機構を提案した点において意義深く、実験的検証が必要である。生体細胞の内と外を仕切る生体膜は、数千種を超える脂質分子や膜タンパク質等から構成されている。生体膜におけるドメイン形成は生体機能と関連していると考えられているが、その形成メカニズムなどについては明らかになっていない。近年ワシントン大のグループによって、組成が異なる二枚の脂質単層膜を貼りあわせた非対称な二重膜が合成され、二つの相分離する単層膜が膜間相互作用の効果によって結合することが示された。我々はこの現象からヒントを得て、二枚のミクロ相分離する単層膜が結合した場合に起こる現象を、粗視化された二重膜の自由エネルギーを解析することにより予測した。まず、臨界温度よりも低温の場合に、平均場理論を用いて二重膜の相図を作成した。さらに二重膜の一様状態からの相分離の時間発展を数値的に求めた。特に二枚の膜でミクロ相分離構造の周期が異なる場合に、結合の効果によって膜間にフラストレーションが生じ、その結果として様々な複雑な相分離パターンが得られることが分かった。この成果はChemPhysChem誌にて発表し、得られたパターン図は雑誌の表紙に採用された。続けて、高温状態での二重膜における濃度揺らぎの解析を行った。この状況は二枚の2次元のマイクロエマルションが結合した状態であるとみなすことができる。このような状態において、膜間相互作用によって二枚の単層膜それぞれに濃度揺らぎが誘起される。そしてその誘起される揺らぎのスペクトルは、それぞれの膜における構造関数のクロス相関で決まることが示された。さらに二重膜の濃度揺らぎの減衰挙動について調べ、結合の効果によって一枚の膜内での濃度揺らぎが二つの異なる時定数をもつ指数関数の足し合わせで減衰することが分かった。これらの解析結果と実際の生体膜におけるドメイン形成との関連について考察した。
魚介類の風味とその発現機構に関する研究

魚介類の風味とその発現機構を明らかにする目的で、きわめて新鮮なブリSeriola quinqueradiate(ハマチ)の普通肉エキスを化学分析と呈味テストに付して呈味発現に必要とされる有機成分を同定した。その結果、グルタミン酸、ヒスチジン、IMPおよび数種のアミノ化合物が必須であることがわかった。ブリおよびベニザケ(Oncorhynchus nerka)筋肉の熱水抽出エキス中では、含有されるゼラチンや脂質は主として「まったり感」、「なめらかさ」、「魚臭」などの発現に寄与することが明らかとなった。ラット味蕾先端部に存在し脂肪や脂肪酸と結合する脂肪酸トランスポーター(FAT/CD36)の遺伝子発現に注目し、この発現制御に大きく関わるリガンド要求性核内転写因子(核内受容体)、特に脂肪酸をリガンドとするペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPARs)の発現制御の解析を行った結果、PPARsは長鎖脂肪酸、特に高度不飽和脂肪酸は飽和脂肪酸に比べより強い親和性を有すること、高度不飽和脂肪酸をはじめとするPPARsリガンドがPPARsを介してその標的遺伝子の一つであるFAT/CD36の転写調節を正に制御することなどを解明した。味細胞におけるうま味の受容に際して、グルタミン酸と核酸関連物質との間で起こる相乗作用に着目して、マウス舌から味細胞を単離しパッチクランプ法によって電気的応答を記録した。代謝型グルタミン酸受容体のアゴニストであるtrans-ACPD、L-AP4は核酸関連物質共存下において、相乗的に興奮性応答が大きくなること、この相乗効果がGタンパク質を介して行われていることなどが明らかとなり、うま味の情報は代謝型グルタミン酸受容体、次いでGタンパク質-セカンドメッセンジャーというプロセスで運ばれると結論づけた。魚介類の風味とその発現機構に関する研究を進める目的で、本年度は材料としてハマチ(ブリ若魚)を用いて下記の成果(1-3)を得た。また、ラットおよびマウスを用いて下記の予備的な研究を行い成果(4および5)を得ることができた。1.きわめて新鮮な上記魚類の普通肉(背肉部)を分離し、熱湯によってエキス画分を含む抽出液を調製し、各種の化学分析法によって遊離アミノ酸、核酸関連物質、有機塩基化合物などの低分子化合物の分析を行なった結果、その組成の大部分を明らかにした。2.上記のエキス画分は低分子化合物以外にタンパク質、脂質や多糖類など高分子成分を含むが、本年度はタンパク質に着目し、アミノ酸分析、電気泳動などによって組成を検討したところ、その過半がゼラチンであることが明らかとなった。3.上記の成果に基づいて合成エキスを調製し、呈味試験を行ったところ合成エキスの風味は、熱湯によって抽出したエキスのそれといくぶん類似してはいるもののかなり隔たりがあることがわかった。そこで、これに精製したコラーゲン(I型)から調製したゼラチンを加えて呈味試験を実施したところ、熱湯抽出液のもつ風味に近づくことが明らかとなった。4.脂質の味認識機構を解明するため、まずラットを用いた脂質選択実験を行った。その結果、ラットは脂肪酸溶液を好んで選択摂取することが明らかとなった。さらに、生体膜上に脂肪酸分子を特異的に認識する受容機構が存在することが示唆された。5.うま味に感受性をもつマウスから、酵素処理によって味細胞を単離し、うま味物質にたいする電気的応答をパッチクランプ法で記録した。その結果、うま味物質にたいして3種類の応答パターンを示したので、うま味の受容には複数のメカニズムが関与するものと推察した。ブリSeriola quinqueradiataの呈味成分を明らかにする目的で、筋肉の熱水抽出液中に含まれる含窒素低分子成分、有機酸、無機イオンなどを定量し、この結果に基づいて調製した再構成エキスを用いて呈味テストを実施した。

その結果、遊離アミノ酸(グルタミン酸、α-アミノ酪酸、α-アミノアジピン酸、β-アミノイソ酪酸、γ-アミノ酪酸およびヒスチジン)およびイノシン酸が主要な有機呈味成分となっていることが明かとなった。うま味にたいして感受性をもつマウスの味細胞を用いたパッチクランプ実験から、核酸関連物質によって相乗効果を示したグルタミン酸応答のみをうま味応答と考え、種々のグルタミン酸アゴニスト応答との比較によりうま味応答の性質を調べた。その結果、うま味応答は、既知のグルタミン酸受容体とは異なっていた。このことから見て、本受容体は、新規のタイプの受容体である可能性が高いことがわかった。また、これまでに味蕾の細胞膜上で脂肪酸を認識するタンパク質としてfatty acid translocase(FAT)を見いだし、報告したが、本年度はさらにFATなど脂肪酸の認識、代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現が、脂肪酸をリガンドとする核内転写因子、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPARs)によって増大することを明らかにした。魚介類の風味とその発現機構を明らかにする目的で、本年度はブリSeriola quinqueradiata(ハマチ)筋肉の熱水抽出液中に含まれるエキス成分を分析し、その結果に基づいて再構成エキス(合成エキス)を調製し、タンパク質や脂質の風味への関与などについて検討した。下記の成果を得た。きわめて新鮮なハマチの普通肉から熱水によって抽出したエキスを調製し、各種の化学分析法を駆使してエキス成分を分析し、エキス窒素のほぼ全量(95%)の帰属を解明した。熱水抽出エキス中に含まれるタンパク質はアミノ酸分析、電気泳動などによって組成を検討したところ、その大部分(約80%)がゼラチンであることがわかった。上記の合成エキスの味質は、熱水によって抽出したエキスのそれと幾分類似してはいるものの、かなり隔たりがあることが明らかとなった。そこで、この合成エキスに、ブリ筋肉から精製したコラーゲン(I型)を加熱して調製したゼラチンを添加することによって味質の変化を検討したところ、熱水によって抽出したエキスのそれに類似することがわかった。さらに本研究ではエキス中に含まれる脂質の役割を解明するため、ハマチおよびベニザケ腹部筋肉の脱脂を目的としてn-ヘキサンで処理して脱脂エキスを調製し無処理のものと味質を比較したところ、「まったり感」、「なめらかさ」、「魚臭」等の強度が有意に低下するだけでなく酸味が強まることもわかった。ついで、この脱脂エキスにDHAエチルエステルを添加したところ、「まったり感」や「なめらかさ」が回復し、酸味も弱まった。また、ハマチでは合成エキスにDHAエチルエステルを添加したところ、これらの味質以外にも、表現することが難しい複雑な感覚が付与されることが明らかになった
アメリカ・カナダ社会科における多文化的シティズンシップ育成の理論的・実践的研究

アメリカとカナダにおける多文化的社会科教育論と「多様性」・「統一性」の両者に尊重したカリキュラムや教科書の分析を通して,アメリカ・カナダともシティズンシップ教育では,「活動的市民」,「活動的な貢献者」の育成を視野に入れた「良識ある市民」を育成することが必要であり,その「良識あるシティズンシップ」は,社会の「多様性」と「統一性」の両者を尊重した多文化的シティズンシップであることことを明らかにした。本研究は,国内の多文化化・価値の多様化の進展に伴う教育の課題に応えるために1多文化主義(Multiculturalism)を前提とするシティズンシップ(Citizenship)育成のあり方を考える基礎的研究である。多文化教育の先進国であるアメリカとカナダにおける多文化的社会科教育論と「多様性」・「公共性」の両者に尊重した教育実践(カリキュラムや教科書等の教材を含む)の比較検討を通して,日本における多文化共生社会の教育のあり方について考察を行った。本年度は3年度の初年度にあたり,資料の収集・分析及び検討を行った。具体的には,本年度の研究として,主に以下の三点について研究活動を行った。(1)アメリカ・カナダで開発・実践されている多文化的社会科カリキュラムの収集・分析を行った。具体的には,今年度はアメリカ・カリフォルニア州,カナダ・アルバータ州教育局に赴き,社会科教育担当者及びカリキュラム開発担当者への意見聴取を行った。(2)アメリカ・カリフォルニア州,カナダ・アルバータ州の社会科カリキュラムを収集し,分析した。(3)全米社会科評議会(NCSS)の第88回研究大会に参加し,多文化的社会科教育の動向について収集・分析した。本研究は,国内の多文化化・価値の多様化の進展に伴う教育の課題に応えるために,多文化主義(Multiculturalism)を前提とするシティズンシップ(Citizenship)育成のあり方を考える基礎的研究である。本年度は3年度の2年目にあたり,収集した資料の分析及び検討を行った。(1)アメリカ・カナダで開発・実践されている多文化的社会科カリキュラムの分析を行った。(2)ドイツ・ニーダーザクセン州,ハンブルグ市教育局に赴き,カリキュラム開発担当者への意見聴取を行った。アメリカ・カナダで開発されている多文化的シティズンシップ育成カリキュラムの特色を明らかにするために,ドイツで開発されたカリキュラムと比較研究を行った。(3)本プロジェクトの研究成果の中間報告を,全国社会科教育学会第58回全国研究大会シンポジウムで発表を行った。本研究は,国内の多文化化・価値の多様化の進展に伴う教育の課題に応えるために,多文化主義(Multiculturalism)を前提とするシティズンシップ(Citizenship)育成のあり方を考える基礎的研究である.多文化教育の先進国であるアメリカとカナダにおける多文化的社会科教育論と「多様性」・「公共性」の両者に尊重した教育実践(カリキュラムや教科書等の教材を含む)の比較検討を通して,日本における多文化共生社会の教育のあり方について考察を行った。本年度は3年度の最終年度にあたり,収集した資料の分析及び検討を行った。アメリカ・カナダともシティズンシップ教育では,「活動的市民」,「活動的な貢献者」の育成を視野に入れた「良識ある市民」を育成することが必要であり,その「良識あるシティズンシップ」は,社会の「多様性」と「統一性」の両者を尊重した多文化的シティズンシップであることことが明らかになった。(1)これまで収集したアメリカで開発・実践されている多文化的社会科フレームワーク,カリキュラム,教科書,教材の分析を行った。(2)アメリカ・カリフォルニア州National Center for history in theSchoolsにおいて,専門家からの意見聴取・情報収集を行い,アメリカで開発されている合衆国史ナショナル・スタンダードにおける多文化的シティズンシップ育成の視点を明らかにした。(3)本プロジェクトの研究成果を,全国社会科教育学会第59回全国研究大会,日本国際理解教育学会第20回研究大会特定課題研究シンポジウム,CitizED 6th International Conferrenceにおいて発表を行った。
植物の光応答の空間構造とその制御機構の解明

植物の主要な光受容体であるフィトクロムは、ほとんど全ての組織・器官で発現している。しかしながら、個々の細胞のフィトクロム応答が個体応答へと統合される仕組みには多くの謎が残されている。本研究では、我々が最近開発した微細組織の網羅的遺伝子発現解析法やレーザー顕微手術法を活用し、フィトクロムによる光応答のより詳細な空間構造を子葉における避陰応答や、赤色光によるフック解消応答を題材に調べた。本年度においては、子葉の内部の光情報のやり取りを解析するため、既存の自作照射装置に改良を加え、子葉の一部に遠赤色光照射を行い、領域特異的な遺伝子発現応答をqPCR法により調べた。この結果、葉肉組織の応答が領域自律的であるのに対して、維管束におけるオーキシン応答にはより広い領域の照射が必要なことが分かった。さらに、オーキシン合成遺伝子YUCsの発現誘導パターンを調べ、この結果とよく合う応答パターンを示すことを確認した。フック解消応答については、1)網羅的遺伝子発現解析の結果を精査し、偏差成長に対応した伸長成長関連遺伝子の変動は観察されないものの、光合成関連遺伝子の発現がフックの外側で顕著であることを発見した。一方、部分照射実験やレーザー顕微手術による解析を試みたが、残念ながら設定した実験条件では成長応答を観察することはできなかった。子葉から胚軸への未知シグナルについては、網羅的な遺伝子発現解析の結果をもとに、いくつかの遺伝子の関与を想定し、当該の変異体の種子を入手して表現型を調べたが、期待されるような表現型は見られなかった。以上の解析により、子葉内の光シグナル伝達に関して重要な知見を得ることができた。一方、フック解消については同様のアプローチが簡単ではないことが分かった。子葉から胚軸への未知シグナルについてついても、順遺伝学などによる全く新しいアプローチが必要なことが示唆された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。固着生活を営む植物は、その生き方に適した環境応答能を身につけている。その重要な特徴として、個々の細胞が高い環境応答能をもつことが挙げられる。本研究では、この個々の細胞が示す応答が個体応答へと統合される仕組みについて、分子生物学的、分子遺伝学的な手法を用いて明らかにすることを目指す。本年度の成果は以下の通りである。シロイヌナズナの芽生えより、主に葉肉と表皮組織よりなり維管束を含まない微細組織片と、維管束を含む組織片を調製し、従来法で調製した単離維管束とともに、組織マーカー遺伝子や光応答遺伝子の発現レベルをqPCR法により確認した。また、ハクサイ芽生えのフック構造について、湾曲の内側、外側の組織片を別々に調整し、同様の解析を行った。これにより、芽生えの異なる領域の遺伝子発現を精度よく測定するための実験条件を確立した。また、避陰応答による胚軸伸長促進について、子葉から胚軸へ伝わる長距離シグナルの正体を明らかにするため、すでに行われていた子葉と胚軸の遺伝子発現応答の網羅的解析結果をもとに検討したが、子葉における長距離シグナル生成と直接関連しそうなものは見いだされなかった。一方、胚軸における解析の結果から、いくつかの遺伝子の発現がこの長距離シグナルの制御を受けている可能性が示唆された。さらに、子葉内での組織間シグナル伝達を解析するため、すでに維管束で光応答することが知られているFT遺伝子の発現について解析したが、1回の光処理では十分な応答が見られず、組織間シグナル伝達を解析するためのターゲット遺伝子としては適当でないことが判明した。本研究では、細胞や組織レベルの光応答が個体レベルの光応答にどのように統合されるかを明らかにすることを目指している。この目的にそって、1)器官・組織レベルの光応答マップの作製、2)避陰応答における器官間シグナル伝達機構の解析、3)組織間シグナル伝達の機構の解析を進めた。1)については、シロイヌナズナ芽生えより子葉と胚軸から微細組織片を調製し、それらの組織片から、効率良くcDNAライブラリーを調製しqPCR法によって、任意の遺伝子の発現を定量できることを示した。また、ハクサイ芽生えのフックの内側と外側の組織についても、同様の技術を開発した。これらの解析を網羅的遺伝子発現解析に拡張することにより、光刺激(陰刺激を含む)に対する植物体の部位毎の応答の違いを包括的に把握することが可能になると期待される。2)については、これまでの解析結果から、シロイヌナズナ芽生えの子葉において、陰刺激後数時間以内に、胚軸へ伝えられる未知の長距離シグナル分子が生成されることが示唆されている。そこで、子葉において過去に行った網羅的遺伝子発現応答の結果を用いて、シグナル生成に関わりそうな遺伝子の応答を探索したが、そのようなものは見いだされなかった。一方、胚軸のデータを解析した結果、未知シグナルを受容して発現が上昇するような遺伝子の候補が幾つか見出されたので、今後は、これらの挙動を解析することで、未知シグナルの性質を明らかにする予定である。3)については、子葉内での組織間シグナル伝達を解析するため、FT遺伝子に注目した解析を進めたが、比較的弱い応答しか認めらず、組織間シグナル伝達の解析には適当でないことが分かった。この結果を受け、維管束でのシグナル応答の解析を進めるためのターゲット遺伝子をより広く探索するため、RNA-seqによる網羅的解析のための予備実験に着手した。

しかしながら、個々の細胞のフィトクロム応答が個体応答へと統合される仕組みには多くの謎が残されている。本研究では、我々が最近開発した微細組織の網羅的遺伝子発現解析法やレーザー顕微手術法を活用し、フィトクロムによる光応答のより詳細な空間構造を明らかにするとともに、それを支える分子機構の解明をめざした。本年度においては、以下の3項目について研究を行った。光応答のマッピング:遠赤色光刺激を与えたシロイヌナズナの芽生え子葉より2種類の微細組織片と維管束を単離し、RNA-seq法により網羅的遺伝子発現解析を行った。この結果について、光応答を示した遺伝子の発現パターンをクラスター解析を用いて比較したところ、維管束には未知の光応答遺伝子が多数発現することが分かった。また、赤色光による胚軸上部のフック解消について、フックの内側と外側から微細組織を単離し同様の解析を行った。しかしながら、内側と外側の光応答で期待したほどの顕著な差は見られなかった。この点については、次年度継続して解析を行うこととした。子葉から胚軸へ伝達される未知シグナル:昨年度の網羅的解析で、EXPs, AGPsなどの遺伝子の発現が子葉から胚軸へ伝達される未知シグナルにより上昇することが示唆された。そこで本年度は、これらの応答をqPCR法により確認した。組織間シグナル伝達機構:組織間のシグナル伝達を調べるために、フィトクロムを組織特異的に発現する系統の種子を入手し、その発現パターンを確認したが、理由報告されているようなパターンを再現することはできなかった。一方、YUC遺伝子については、網羅的な解析で光応答が確認されたものの、発現量が低いためにqPCR法による解析は簡単ではないことが分かった。これについては、次年度、再挑戦する計画である。本年度は、当初の目標である網羅的解析を行うことができた。この意味では、本研究は概ね順調に進展していると言える。特に子葉の組織レベルの解析においては、未知の光応答遺伝子が多数見つかるなど、興味深い結果が得られた。一方、フック解消については、従来言われているような植物ホルモンの関与が読み取れるような結果では無かった。次年度以降は、この理由に迫る解析を進める必要がある。子葉から胚軸へ伝達される未知シグナルについては、未知シグナルに対して胚軸で応答する遺伝子の候補として、EXPs, AGPsの応答が確認されたことの意義は大きい。一方、組織間のシグナル伝達については、フィトクロムを組織特異的に発現する植物の利用が困難なことが分かったので、次年度以降は、部分照射の解析に力を入れる予定である。植物の主要な光受容体であるフィトクロムは、ほとんど全ての組織・器官で発現している。本研究では、我々が最近開発した微細組織の網羅的遺伝子発現解析法やレーザー顕微手術法を活用し、フィトクロムによる光応答のより詳細な空間構造を子葉における避陰応答や、赤色光によるフック解消応答を題材に調べた。
生分解性高分子ナノゲルによる革新的細胞核内タンパク質デリバリー技術の創成

私達が設計・開発した疎水性アミノ酸結合ヘパリンは,水中で自己会合してナノサイズの組織体を形成し,その内部にタンパク質を担持することが可能であった。タンパク質を担持したナノ組織体をエレクトロポレーションにより細胞質に導入すると,ナノ組織体は速やかに核膜孔複合体と相互作用し,その後は細胞核に移行し集積した。このナノ組織体は細胞適合性を有しており,機能性タンパク質やタンパク質医薬の核内輸送用ナノキャリアとして有用である。平成25年度では、芳香族性もしくは脂肪族性の疎水性基で部分疎水化した両親媒性ヘパリンを複数種類合成し、それらの疎水性相互作用に基づく自己組織化によって水中でナノゲルを形成させ、ナノゲルの安定性(会合体形成濃度)、ナノゲルサイズ、表面電荷について調べた。また、エレクトロポレーションによりナノゲルをHeLa細胞の細胞質内に導入し、核内移行性について調べた。その結果、重量平均分子量が17,000のヘパリンに数本から数十本の芳香族性疎水性基を導入したナノゲルは、平均粒子径が100nm程度で表面が負に帯電しており、細胞質内に導入されたのち、15分後には核内に移行することがわかった。一方、脂肪族性疎水性基で疎水化して得られたヘパリンナノゲル(上記の芳香族性疎水化ヘパリンナノゲルと同程度のサイズおよび表面電荷を有する)では、細胞質から核内への移行は見られなかったことより、ナノゲルの核膜孔通過には芳香族分子の存在が必要であることが示唆される。ナノゲルの核膜孔通過特性を規定する要因に関するさらなる情報を得るため、芳香族性疎水化ヘパリンナノゲルと脂肪族性疎水化ヘパリンナノゲルで物性の差異を調べたところ、脂肪族性疎水化ヘパリンナノゲルでは架橋点が静的であるのに対して、芳香族性疎水化ヘパリンナノゲルの架橋点は動的であることが分かった。また、両ナノゲルで機械的強度が大きく異なることが分かった。以上より、ナノゲル架橋点の動的性質およびナノゲルの機械的強度が核膜孔通過特性を左右しうる重要な因子であると示唆される。これらの知見は、次年度に実施する核膜孔通過能を有するナノゲルの設計指針を構築するうえで有用である。平成24年度では、タンパク質デリバリーキャリアを構築するために必要な両親媒性ポリ乳酸グラフト化ヘパリンの合成に先立ち、アルキル鎖で部分疎水化した両親媒性ヘパリンを合成し、それらのナノゲル形成能、ナノゲルの物性、細胞内局在について調べた。その結果、重量平均分子量が17,000のヘパリンに数本から数十本のアルキル鎖を導入した両親媒性ヘパリンは、PBS及び培地中で平均粒子径が90300 nmの微粒子を形成することを動的光散乱測定により確認した。これらナノ粒子の走査型電子顕微鏡画像より、ナノ粒子はネットワーク状の多孔質体であることが示され、これよりこのナノ粒子はゲル状微粒子(ナノゲル)であると示唆される。一方、アルキル鎖導入本数が高い両親媒性ヘパリンからはコロイド安定性が高いナノゲルが得られたことより、アルキル鎖間の疎水性ドメインがナノゲル構造を保持する架橋点であると示唆される。また、アルキル鎖導入本数を変化させることにより、ナノゲル粒子径の調整は可能であった。これらナノゲルのゼータ電位測定より、ナノゲル表面は大きく負に帯電しており、表面電位はヘパリンへのアルキル鎖導入本数に依存しないことが分かった。また、これらナノゲルをエレクトロポレーションにより数種類のヒト細胞に取り込ませ、その細胞内局在を定量的に調べる実験手法を確立した。以上より、平成24年度の研究成果は平成25年度に実施するポリ乳酸グラフト化ヘパリンナノゲルの分子設計に指針を与えるものであり、また、種々の細胞実験から得た技術・ノウハウはポリ乳酸グラフト化ヘパリンナノゲルの細胞内導入量および細胞内局在を定量的に評価するために有用である。平成26年度では、フェニルアラニンやロイシンなど疎水性アミノ酸を多糖の側鎖として結合した両親媒性高分子を合成し、側鎖同士の会合を駆動力として自己組織化させることでナノゲルの創製を試みた。このナノゲルでは、疎水性側鎖が形成する会合ドメインが、インポーチンがもつ疎水ポケットのような働きを示し、核内移行性を示すと期待している。そこで、自己組織化ナノゲルの合成、物性、核膜孔通過能、ナノゲルへの分子担持、および核内への物質輸送キャリアとしての特性について検討した。具体的には、分子量19000のヘパリンを用い、ヘパリンのカルボキシ基と疎水性アミノ酸(フェニルアラニン、ロイシン)のアミノ基をDMT-MMを用いて縮合し、ヘパリン一分子あたりの疎水性アミノ酸の結合本数が426本の範囲で異なる両親媒性ヘパリンを合成した。両親媒性ヘパリンをPBSに溶解すると約100nm程度のナノゲルを形成した。

ピレンを疎水性蛍光プローブとして用いたナノゲル水溶液の蛍光スペクトル解析より、両親媒性ヘパリンは濃度依存的な自発的会合を示し、ナノゲル内部に疎水性物質を内包可能な疎水空間を持つことが分かった。蛍光ラベル化ナノゲルをエレクトロポレーションによりHeLa細胞の細胞質に導入し、経時的な細胞内局在観察を行ったところ、ナノゲルは細胞質導入後速やかに細胞核周辺に集積し、1時間後には核の蛍光とナノゲルの蛍光が共局在したことから、両親媒性ヘパリンナノゲルは核膜孔通過能を有することが分かった。また、ナノゲルにはカチオン性タンパク質の内包能があることも分かった。以上より、本研究課題で設定した目的である、核内にタンパク質を輸送可能な新規なナノキャリアの作製を達成できたと言える。生命高分子科学これまでの研究により、核内移行性を有するナノゲルの開発には成功しているものの、核内移行性のメカニズムに関しては未解明である。平成25年度にサイズ・形状・表面電荷が異なる芳香族性疎水化ヘパリンナノゲルおよび脂肪族性疎水化ヘパリンナノゲルの細胞核内移行性を評価し、それらの相関を調べることにより核膜孔通過特性を決定するナノゲルの特性を同定し、それに基づき核内移行性ナノゲルのメカニズム解明および合理設計のための指針を確立する予定であったが、解析の結果上記特性中のサイズに加えて、計画段階では未注目であったナノゲル架橋点の動的性質およびナノゲルの機械的特性も重要であると示唆されるデータが得られたことより、本研究計画を一年間延長し、次年度にナノゲル架橋点の動的性質および力学強度と核内移行性との関係をあらたに解析することとしたため。平成24年度では、ポリ乳酸グラフト化ヘパリンナノゲルの合成、物性評価、タンパク質内包特性評価、ナオゲルの細胞毒性評価の実施を計画していた。実際には、上記のとおり、まずはアルキル鎖グラフト化ヘパリンナノゲルを合成し、その物性評価、細胞毒性評価、細胞内取り込み評価、細胞内局在評価を行った。当初合成する計画であったポリ乳酸グラフト化ヘパリンナノゲルではなく、別の組成を有するナノゲルで先行実験を行っているが、それを用いて計画していた以上に研究が進展している。この先行実験で得た知見、実験手技、解析技法は追って合成するポリ乳酸グラフト化ヘパリンナノゲルの評価にも適用できる。以上、年度をまたいで、研究の進行順序は計画とは多少変わったものの、本研究課題が2年間で完遂する計画であることを考えれば、平成24年度では概ね順調に研究計画が進展していると判断できる。平成26年度では、芳香族性疎水化ヘパリンナノゲルのサイズ、動的性質、力学強度と核内移行性との関係を解明することにより、核内移行性を規定するナノゲル物性を同定する。さらに、その知見をもとにして同定した物性を増強したナノゲルを合成し、その細胞核内移行性を調べる。この繰り返しにより、核移行特性を増強する。ナノゲルの核内移行性は正常細胞株、がん細胞株、幹細胞など多種の細胞で検討する。以上の検討により、高効率な核膜孔通過特性を有する生分解性ナノゲルを合理的に設計する指針の確立を目指す。平成25年度では、先行しているアルキル鎖グラフト化ヘパリンナノゲルのタンパク質内包・放出特性評価(in vitro実験、in cell実験)に加えて、当初より計画していたポリ乳酸グラフト化ヘパリンナノゲルの合成、物性評価、タンパク質内包・放出特性評価、細胞毒性評価、細胞取り込み特性評価、細胞内局在評価を実施し、新規な細胞核内タンパク質デリバリー技術の確立を目指す。