hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
材料の物性値とエロージョンの関係解明

エロージョンは,物体表面に粒子が繰り返し衝突することによって起こる摩耗現象であり,これからの循環型社会構造における産業廃棄物処理施設(材料を粉砕し再利用する各種リサイクルプラント等)において,益々重要視されている.しかし,エロージョン現象は関与している因子が多いため,複雑なエロージョン挙動を示すことから,エロージョン全般的なデータが不足している.そのため,さまざまな作業環境によるエロージョンの予測やリサイクルプラント等の設計に役立つためのエロージョンの解明が期待されている.このような観点から,材料特性から材料のエロージョン特性の予測の可能性を探る目的から,実際のリサイクルプラントの運転条件に近い条件で実験を行い,エロージョン率(摩耗量/衝突粒子量)とさまざまな材料特性の関係について検討を行い,以下のような結果を得た.1)粒子衝突角度によって摩耗メカニズムが異なり,これらの摩耗メカニズムには粒子形状と材料特性(硬さや加工硬化指数など)が大きく関与する.2)エロージョン率と材料特性(硬さ,ヤング率,引張り強さ,C・ρ・ΔT,融点,原子間結合エネルギーなど)の間にはエロージョン発生条件によっては相関関係が認められたことから,一般的によく知られている材料特性から各種エロージョン発生条件に対するエロージョン率の予測が可能であるとの結論を得た.i)30°45°といった低衝突角度において,これらの相関関係がより明確であるii)60°以上の高衝突角度になるにつれて,これらの相関関係が成立しなくなるiii)衝突速度が変化しても,i),ii)の関係が認められることが明らかとなったiv)粒子形状が変化しても,i),ii)の関係が認められることが明らかとなったエロージョンは,物体表面に粒子が繰り返し衝突することによって起こる摩耗現象であり,これからの循環型社会構造における産業廃棄物処理施設(材料を粉砕し再利用する各種リサイクルプラント等)において,益々重要視されている.しかし,エロージョン現象は関与している因子が多いため,複雑なエロージョン挙動を示すことから,エロージョン全般的なデータが不足している.そのため,さまざまな作業環境によるエロージョンの予測やリサイクルプラント等の設計に役立つためのエロージョンの解明が期待されている.このような観点から,材料特性から材料のエロージョン特性の予測の可能性を探る目的から,実際のリサイクルプラントの運転条件に近い条件で実験を行い,エロージョン率(摩耗量/衝突粒子量)とさまざまな材料特性の関係について検討を行い,以下のような結果を得た.1)粒子衝突角度によって摩耗メカニズムが異なり,これらの摩耗メカニズムには粒子形状と材料特性(硬さや加工硬化指数など)が大きく関与する.2)エロージョン率と材料特性(硬さ,ヤング率,引張り強さ,C・ρ・ΔT,融点,原子間結合エネルギーなど)の間にはエロージョン発生条件によっては相関関係が認められたことから,一般的によく知られている材料特性から各種エロージョン発生条件に対するエロージョン率の予測が可能であるとの結論を得た.i)30°45°といった低衝突角度において,これらの相関関係がより明確であるii)60°以上の高衝突角度になるにつれて,これらの相関関係が成立しなくなるiii)衝突速度が変化しても,i),ii)の関係が認められることが明らかとなったiv)粒子形状が変化しても,i),ii)の関係が認められることが明らかとなった研究期間は2年間であり、本年度は、実験を主体とし、種々の金属材料を用いて、粒子衝突条件を変化させ、実験データの蓄積を行った。また、以下に示すような各種金属のエロージョン特性やエロージョン摩耗メカニズムについて検討を行った。1)粒子の衝突角度が変化した場合と衝突速度が変化した場合の各種延性金属材料のエロージョン特性2)エロージョン表面に加工硬化層や薄片の重なった状態が形成され、それらが表面から剥離脱落する摩耗メカニズムの解明3)エロージョン表面に形成された硬化層の深さとエロージョン挙動の関係4)エロージョンと材料の機械的性質の相関関係この様に、研究は今年度蓄積したデータとそのデータから得られたエロージョン特性や摩耗メカニズムの解明などをベースにして、来年度は材料特性の異なる材料に対して追加のエロージョン実験を行い、さらにデータを蓄積することにより1)材料のどんな特性がエロージョン率とより一層の相関関係があるかを明確にし、2)エロージョンに関与している関係因子(ex.粒子衝突角度や速度及び粒子形状など)が変化した場合に、1)の結果にどのような影響を及ぼすかを明らかにする。これらの研究成果は、大変な労力と費用のかかる実験を行わなくても、エロージョンの発生する装置の寿命予測を可能にしてくれる。エロージョンは,物体表面に粒子が繰り返し衝突することによって起こる摩耗現象であり,これからの循環型社会構造における産業廃棄物処理施設(材料を粉砕し再利用する各種リサイクルプラント等)において,益々重要視されている.しかし,エロージョン現象は関与している因子が多いため,複雑なエロージョン挙動を示すことから,エロージョン全般的なデータが不足している.そのため,さまざまな作業環境によるエロージョンの予測やリサイクルプラント等の設計に役立つためのエロージョンの解明が期待されている.このような観点から,材料特性から材料のエロージョン特性の予測の可能性を探る目的から,実際のリサイクルプラントの運転条件に近い条件で実験を行い,エロージョン率(摩耗量/衝突粒子量)とさまざまな材料特性の関係について検討を行い,以下のような結果を得た.1)粒子衝突角度によって摩耗メカニズムが異なり,これらの摩耗メカニズムには粒子形状と材料特性(硬さや加工硬化指数など)が大きく関与する.

2)エロージョン率と材料特性(硬さ,ヤング率,引張り強さ,C・ρ・ΔT,融点,原子間結合エネルギーなど)の間にはエロージョン発生条件によっては相関関係が認められたことから,一般的によく知られている材料特性から各種エロージョン発生条件に対するエロージョン率の予測が可能であるとの結論を得た.i)30°45°といった低衝突角度において,これらの相関関係がより明確であるii)60°以上の高衝突角度になるにつれて,これらの相関関係が成立しなくなるiii)衝突速度が変化しても,i),ii)の関係が認められることが明らかとなったiv)粒子形状が変化しても,i),ii)の関係が認められることが明らかとなった
着生植物とアリの相利共生系が熱帯雨林の林冠生物群集に及ぼす波及効果の検証

本研究は、東南アジア熱帯雨林の林冠部において、群集レベルで果たすアリ-着生植物共生系の波及効果の解明を目的としている。今年度の研究実施計画では、マレーシア・ボルネオ島のランビル・ヒルズ国立公園にて野外調査をおこなうことにしていた。しかし、昨年度までに得られた野外調査のデータを解析した結果、着生シダ植物と共生するシダスミシリアゲアリが営巣する突出木と営巣しない突出木でアリの分布様式が異なり、シダスミシリアゲアリが突出木に生息する他種のアリの分布を制御することか明らかになった。そこで、野外請査をおこなわずに、昨年度までのデータを用いて解析した結果を論文にまとめ、Annals of the entomological society of Ameriaに投稿した。審査の結果、当該論文は受理され、公表された。また、実施計画どおりに、シダスミシリアゲアリのシロアリへの影響を検証するために、ランビル。ヒルズ国立公園の突出木で長期的に観測してきたシダスミシリアゲアリとシロアリのコロニー分布データを解析した。その結果、シダスミシリアゲアリがシロアリの分布に影響を及ぼすことを見出し、論文化を進めている。これらの成巣は、長期間の緻密なデータに基つくものであり、熱帯林生態系でアリがもつ重要な機能的役割を明らかにするうえで重要な研究となりうるだろう。さらには、実施計画どおり、ランビル・ヒルズ国立公園の林冠木でこれまでに収集された全てのアリ標本の種同定を終わらせ、林冠木上でのアリ種コロニーの長期変動を明らかにする研究に着手した。
ゲノムのピンポイント修飾を目指したDNA配列特異的な官能基転移反応の検討

がん遺伝子の例で示されるようにわずか1個の塩基の変化で、たんぱく質機能が大きく変化する。本研究は、このような塩基変換を引き起こす化学反応を配列および塩基特異的にコントロールできる高機能分子を開発しようとするものである。本研究では、化学的に遺伝子機能を改変する新しい手法の開発を目的とした。平成15年度に6位に官能基を含む2-aminopurine nucleoside誘導体とシトシンとの反応を分子軌道計算で予測し、シトシン4-アミノ基にニトロシル基を転移するヌクレオシドアナログとしてS-ニトロシル-6-チオグアノシンを設計した。さらに、チオグアノシンを保護基を用いてDNAに組み込んだ後、SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)と反応させることによりS-ニトロシル体に変換した。引き続きこのようにして合成した6-(S-ニトロシル)-置換-2aminopurineを含むDNAと標的位置にシチジン、5-メチルシチジン、アデノシン、グアノシン、チミジンを含む相補的DNAとの反応性を比較したところ、シチジンと5-メチルシチジン特異的に転移反応が速やかに起こることを確認した。平成16年度は,主に本反応による点変異誘起能について検討した。すでに、化学反応としては、シチジンあるいは5-メチルシチジンにニトロシル基が転移した標的DNAを酸性条件下1日-5日放置することによりシチジンからはdU(8%)とdC-diazoate^<15>(14%)が5-メチルシチジンからdT(42%)とd^mC-diazoate(13%)が生成することを見出している。そこで、平成16年度にはニトロシル転移DNAを鋳型とするポリメラーゼ反応による変異誘起について調べた。その結果、酸性条件下放置後のDNAは予想通りシチジンの変わりにアデノシンが取り込まれ変異が生じることが確認された。しかし、ニトロシル転移DNAそのものからは有意な変異は観測されなかった。引き続きポリメラーゼは基質特異性があることが知られているので、さらに異なるポリメラーゼによる検討の必要があるものと考えられる。結論として、本萌芽研究の期間内に従来まったく試みられていなかったニトロシル基の転移による配列および塩基特異的な変異誘起法の基礎を確立した。分子設計および合成6位に官能基を含む2-aminopurine nucleoside誘導体とシトシンとの反応を分子軌道計算で予測し、シトシン4-アミノ基にニトロシル基を転移するヌクレオシドアナログとしてS-ニトロシル-6-チオグアノシンを設計した。まず、チオグアノシンを保護基を用いてDNAに組み込んだ後、SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)と反応させることによりS-ニトロシル体に変換した。ニトロシル基転移反応の検討このようにして合成した6-(S-ニトロシル)-置換-2aminopurineを含むDNAと標的位置にシチジン、5-メチルシチジン、アデノシン、グアノシン、チミジンを含む相補的DNAとの反応性を比較したところ、シチジンと5-メチルシチジン特異的に転移反応が速やかに起こることが示された。さらに、シチジンを標的位置からずれた配列に対して転移反応は殆ど起こらず、ニトロシル転移反応が配列および塩基特異的であることが確認された。また、強い求核剤であるチオール基をもつグルタチオンとの反応は1mMの高濃度でも起こらなかったことから、本反応がハイブリダイゼーションによる近接効果によって起こることが示唆された。点変異誘起能の検討シチジンあるいは5-メチルシチジンにニトロシル基が転移した標的DNAを酸性条件件下1日5日放置した後、酵素加水分解を行い、塩基構造の変化を調べたところ、シチジンからはdU(8%)とdC-diazoate^<15>(14%)が得られ、5-メチルシチジンからdT(42%)とd^mC-diazoate(13%)が得られた。この結果から、本反応は配列特異的かつ塩基特異的に塩基変換を起こせる、画期的な方法であることが確認された。引き続きこのようにして合成した6-(S-ニトロシル)-置換-2

aminopurineを含むDNAと標的位置にシチジン、5-メチルシチジン、アデノシン、グアノシン、チミジンを含む相補的DNAとの反応性を比較したところ、シチジンと5-メチルシチジン特異的に転移反応が速やかに起こることを確認した。平成16年度は,主に本反応による点変異誘起能について検討した。すでに、化学反応としては、シチジンあるいは5-メチルシチジンにニトロシル基が転移した標的DNAを酸性条件下1日-5日放置することによりシチジンからはdU(8%)とdC-diazoate^<15>(14%)が5-メチルシチジンからdT(42%)とd^mC-diazoate(13%)が生成することを見出している。そこで、平成16年度にはニトロシル転移DNAを鋳型とするポリメラーゼ反応による変異誘起について調べた。その結果、酸性条件下放置後のDNAは予想通りシチジンの変わりにアデノシンが取り込まれ変異が生じることが確認された。しかし、ニトロシル転移DNAそのものからは有意な変異は観測されなかった。引き続きポリメラーゼは基質特異性があることが知られているので、さらに異なるポリメラーゼによる検討の必要があるものと考えられる。結論として、本萌芽研究の期間内に従来まったく試みられていなかったニトロシル基の転移による配列および塩基特異的な変異誘起法の基礎を確立した。
P. gingivalis誘導の細胞内クロストークがWnt5a発現に及ぼす影響

【目的】歯周炎はグラム陰性細菌感染による慢性炎症性疾患であり、支持組織の喪失と歯槽骨吸収を引き起こす。近年、non-canonical Wntシグナルは炎症の組織破壊において重要な役割を果たすことが報告された。さらにω-3多価不飽和脂肪酸由来のRvE1は好中球浸潤・炎症性サイトカイン抑制により抗炎症作用を有することが知られている。そこで本研究では、歯周病原細菌P.gingivalisによるWnt5a遺伝子の発現調節メカニズムを詳細に検討し、さらにRvE1によるWnt5a遺伝子発現の変化を検討することにより、歯周炎疾患進行における新たな炎症メカニズム及びRvE1による抗炎症メカニズムの解析を目指すことを目的とした。歯周炎はグラム陰性細菌感染による慢性炎症性疾患であり、支持組織の喪失と歯槽骨吸収を引き起こす。Wntは組織の分化・発生と深く関わっている糖タンパクとして基礎研究が発展してきた。近年、心臓血管疾患・リウマチ・敗血症等の研究において炎症性の組織破壊にもWntシグナルが重要な働きを担っていることが明らかとなった。過去に歯周炎とWnt5a遺伝子発現の関与について示した報告はなく、また単球におけるLPS誘導のWnt5a遺伝子発現の分子メカニズムについて報告したグループは少ない。我々はこれまでに歯周炎組織におけるWnt5a mRNA発現を示し、さらにヒト単球系細胞THP-1におけるP. gingivalis LPS刺激によるNF-κBシグナルを介してWnt5a mRNAが発現し、STAT1との相乗作用により増強することを報告した。P. gingivalis LPSはTLR2リガンドとして作用し、Wnt5a発現にはNF-κBの他MAPK・PI3Kなど多岐にわたる分子メカニズムが存在していることが考えられる。そこで本研究では、歯周病原細菌P. gingivalisによるWnt5a遺伝子の発現調節分子メカニズムを詳細に検討し、さらに発現されたWnt5aが他の歯周組織細胞にどのような影響を与えているのかを検討することにより、歯周炎疾患進行における新たな炎症メカニズムの解析を目指すことを目的とした。さらにω-3多価不飽和脂肪酸由来のレゾルビンE1(RvE1)は好中球浸潤・炎症性サイトカイン抑制により抗炎症作用を有することが知られている。そこで本研究では、歯周病原細菌P. gingivalisによるWnt5a遺伝子の発現調節メカニズムを詳細に検討し、さらにRvE1によるWnt5a遺伝子発現の変化を検討することにより、歯周炎疾患進行における新たな炎症メカニズムおよびRvE1による抗炎症メカニズムの解析を目指すことを目的とした。THP-1細胞において、P. gingivalis LPS刺激によるTLR下流のシグナル伝達のクロストークによりWnt5aが発現されるという仮説を立て、平成26・27年度の実験計画を提案したが、研究実施場所の変更に伴い、研究計画を以下のように一部変更した。WT FVBマウスおよびTg FVBChemR23+/+マウス由来腹腔内マクロファージを採取。各種阻害剤を用いてシグナル伝達を抑制、RvE1存在下非存在下においてP. gingivalis LPS/IFN-γ刺激を行い、Wnt5a mRNA発現変化をReal time RT-PCR法にて測定、ウエスタンブロッティングにより細胞内NF-κBシグナルタンパクを解析。2各阻害剤によりシグナル伝達を抑制し、P. gingivalis LPSにて刺激培養後、細胞内タンパク質を抽出する。ウエスタンブロッティングによりMyD88・TRAF6・IKKα/β・IκBαの細胞内タンパク量を測定、ソフトウェアを用いて定量し、その変化量を解析することにより、各シグナルがNF-κB経路に及ぼす影響を検討する。以上の実験から得られた結果を基にして、THP-1細胞におけるNF-κB経路と他のシグナル伝達経路とのクロストークを解析し、PI3K/Akt/mTORシグナルがNF-κB経路に影響を及ぼすことを示すことができた。【マウスマクロファージ細胞株を用い、NF-κB転写活性を検討】【腹腔内マクロファージ/脾臓Tリンパ球の共培養により各細胞間の相互作用を検討】Wnt5aはnon-canonical pathwayを刺激し、IL-6、IL-8、IL-1βのような炎症性サイトカイン産生と増強する。Tリンパ球および単球/マクロファージ細胞表面にはWnt5a受容体であるFz5およびROR2が発現していることが報告されており、細菌刺激により産生されたWnt5aやサイトカインはT細胞を含む単核級に作用すると考えられる。

以上のことにより、歯周炎局所で発現したWnt5aは単球/マクロファージおよびTリンパ球に作用し、炎症の持続や歯槽骨を含む組織破壊を誘発するという仮説を立てた。本研究では、歯周病原細菌により産生されたWnt5aの歯周組織への影響について明らかにするために、歯周組織構成細胞(単球/マクロファージ・Tリンパ球など)へのWnt5aの影響としてサイトカイン産生の変化をELISA法およびReal time RT-PCR法を用いて比較検討し、解析する。これにより、Wnt5aによるオートクライン/パラクラインの炎症経路を明らかとする。平成26・27年度にヒト単球系細胞THP-1を用い、LPS刺激によるWnt5a発現における細胞内シグナル伝達のクロストークを解析し、学会において発表する予定であったが、申請者の研究留学に伴い研究施設場所が変更となり、研究計画を一部変更し、ChemR23Tgマウスを用いてWnt5a発現の解析を行うこととしたため。申請者の研究留学に伴い、研究費の海外使用のための調整を行っていたため。実験に伴う以下の解析と学会での発表を平成28年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てる。1)マウスマクロファージ細胞株を用いた、NF-κBの遺伝子への転写活性の解析。(ルシフェラーゼレポーターアッセイ)研究計画書に沿って使用し、研究を遂行する。
受精鶏卵を用いたヒト腫瘍転移実験モデルの確立とその応用

本研究では転移の抑制および転移癌の治療法の開発を最終目的として、受精鶏卵を用いるヒト癌転移実験系を駆使して、転移性癌細胞の悪性形質発現に係わる生体物質並びに転移過程におけるそれらの発現意義を明らかにするとともに、転移抑制に有効な物質および効果的な使用法の研究開発を展開している。平成4年度の研究では、受精鶏卵胎児におけるヒト癌細胞の転移動態を明らかにし、さらに、ノーザンブロット法または特異抗体を用いた免疫組織化学染色法により高転移性癌細胞に発現される細胞外マトリックス分解酵素ならびに細胞接着因子を解析した。平成5年度は4年度の研究成果を基に、マトリックス分解酵素および細胞接着因子に対する阻害剤による転移抑制の可能性について検討した。その結果、フィブロネクチンあるいはラミニンに対する接着阻害合成オリゴペプチドとインテグリンβ_1サブユニットのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはヒト線維肉腫細胞であるHT-1080の転移を抑制し、接着因子が転移抑制において有用な標的となる可能性が示された。一方、本研究で試験した市販試薬級のマトリックス分解酵素阻害剤は明らかな転移阻害活性が認められず、持続的効果と癌細胞の浸潤局部への集積性を考慮した新たな阻害剤を開発する必要性が考えられた。また、現在開発中の抗腫瘍性2'-デオキシシチジン誘導体、CNDAC(2'-cyano-2'-deoxy-1-β-D-arabinofuranosylcytosine)およびDMDC(2'-deoxy-2'-methylidenecytidine)の転移抑制効果についても受精鶏卵法により検討した結果、CNDACとDMDCはともにヒト癌細胞の微小転移巣に対して強い治療効果を示すことが明らかとなった。微小転移巣の早期診断と治療は癌の治療の成否を決定づける最も重要な要因である。CNDACおよびDMDCはヒト癌細胞の微小転移巣に対して強い治療効果を示し、微小転移巣の早期治療や転移予防への実際的な応用も期待される。
悪性脳腫瘍に対する分子標的薬と遺伝子治療併用の新展開

グリオーマは脳に発生する悪性腫瘍で原発性脳腫瘍の約30%を占める。中でも悪性グリオーマの予後は極めて不良である。様々な治療法が試みられている中で、分子標的薬や遺伝子治療は有望な新規治療の一つである。本研究の目的としては、研究目的1:分子標的薬(bevacizumab、cilengitideやPD-1阻害剤)と遺伝子治療(新規OVまたはAd-SGE-REIC)との併用について検討する、研究目的2:分子標的薬(bevacizumab、cilengitideやPD-1阻害剤)と遺伝子治療(新規OVまたはAd-SGE-REIC)との併用効果のメカニズムを調べる、である。昨年度、分子標的薬bevacizumab、cilengitide、PD-1阻害剤や腫瘍溶解ウイルス、Ad-SGE-REICなどについて、本研究のセットアップを行った。腫瘍はU87dEGFRなどのヒト脳腫瘍細胞系列や脳腫瘍患者から承諾を得て採取した腫瘍由来細胞を用いて、脳腫瘍マウスモデルを作製し、生存期間や腫瘍径を調べた。さまざまな脳腫瘍モデル(幹細胞、モデルも含む)を用い、同様の効果がえられるか否かを検討した。さらに、本年度は、分子標的薬bevacizumab、cilengitideまたはPD-1阻害剤との併用について生存期間などを調べた。どの組み合わせがよいか検討した。さらには遺伝子治療単独と、分子標的薬と遺伝子治療との併用における、腫瘍浸潤、血管新生などについて調べた。今後、Bevacizumab、cilengitide、またはPD-1阻害剤により遺伝子治療を増強するメカニズムを調べる。Microarray,プロテオミクス、次世代シークエンスをおこなう。Gene chip,プロテオミクスから選ばれた因子をターゲットとする。統計学的データ解析を行い、学会発表・論文投稿する。昨年度は、Bevacizumabについては中外製薬より提供を受けることができた。Cilengitideは現在、アメリカ国立癌研究所(NCI)にあるCancer Therapy Evaluation Program(CTEP)のDr.ChenやDr. TakebeとMerck KgaAから無償で提供されている。マウス抗PD-1抗体については小野薬品株式会社と交渉し、供給していただいた。ヘルペスウイルスRAMBOと34.5ENVEはオハイオ州立大学脳神経外科Kaur教授より提供していただいた。Ad-REIC遺伝子治療についてはナノバイオ標的医療イノベーションセンター公文裕巳先生、当院泌尿器科那須保友先生よりAd-SGE-REICやコントロールベクターなど供給していただいた。コントロールとなるsurvival実験を行うことができた。さらに、本年度は、bevacizumab単独に比して、bevacizumabとRAMBOを併用することでの相乗効果や浸潤性の変化について検討した。In vitroでの検討で、bevacizumab単独群においてはcontrol群と比して有意に遊走・浸潤細胞は増加した。一方でbevacizumabとRAMBO-CM併用群ではbevacizumab単独群と比して遊走・浸潤細胞は有意に減少した。In vivoにおいてもbevacizumab投与群ではcontrol群と比して浸潤が強く見られたが、bevacizumabとRAMBO併用群では抑制された。さらにbevacizumabとRAMBO併用群ではbevacizumab単独治療群と比して有意な生存期間の延長が見られた。コントロール、Ad-SGE-REICまたはOV、薬剤、Ad-SGE-REICまたはOV +薬剤の4群でmicroarray,プロテオミクス、次世代シークエンスをおこなう。Ad-SGE-REICまたはOV注入後に屠殺し、脳腫瘍からmRNAを抽出し、GeneChipを用いる。次世代シークエンスにてメチル化を確認する。クラスター分析とオントロジー分析、Pathway解析を行う。Quantitative RT-PCRを行い発現の検証をする。プロテオミクスは、全タンパクを抽出し、2次元電気泳動により分離する。グリオーマは脳に発生する悪性腫瘍で、原発性脳腫瘍の約30%を占める。本年度は、分子標的薬bevacizumab、cilengitide、PD-1阻害剤や腫瘍溶解ウイルス、Ad-SGE-REICなどについて、本研究のセットアップを行った。腫瘍はU87dEGFRなどのヒト脳腫瘍細胞系列や脳腫瘍患者から承諾を得て採取した腫瘍由来細胞を用いて、脳腫瘍マウスまたはラットモデルを作製し、生存期間や腫瘍径を調べた。来年度は分子標的薬bevacizumab、cilengitideまたはPD-1阻害剤との併用について生存期間などを調べる。どの組み合わせがよいか検討する。さらには遺伝子治療単独と、分子標的薬と遺伝子治療との併用における、血管透過性の亢進、ウイルス力価の評価、ウイルス由来のgene量または、mRNA量、炎症・免疫細胞の浸潤などについて調べる。

Bevacizumabについては中外製薬より提供を受けることができた。Cilengitideは現在、アメリカ国立癌研究所(NCI)にあるCancer Therapy Evaluation Program(CTEP)のDr.ChenやDr. TakebeとMerck KgaAから無償で提供されている。マウス抗PD-1抗体については小野薬品株式会社と交渉し、供給していただいた。ヘルペスウイルスRAMBOと34.5ENVEはオハイオ州立大学脳神経外科Kaur教授より提供していただいた。Ad-REIC遺伝子治療についてはナノバイオ標的医療イノベーションセンター公文裕巳先生、当院泌尿器科那須保友先生よりAd-SGE-REICやコントロールベクターなど供給していただいた。コントロールとなるsurvival実験を行うことができた。グリオーマは脳に発生する悪性腫瘍で原発性脳腫瘍の約30%を占める。中でも悪性グリオーマの予後は極めて不良である。様々な治療法が試みられている中で、分子標的薬や遺伝子治療は有望な新規治療の一つである。本研究の目的としては、研究目的1:分子標的薬(bevacizumab、cilengitideやPD-1阻害剤)と遺伝子治療(新規OVまたはAd-SGE-REIC)との併用について検討する、研究目的2:分子標的薬(bevacizumab、cilengitideやPD-1阻害剤)と遺伝子治療(新規OVまたはAd-SGE-REIC)との併用効果のメカニズムを調べる、である。昨年度、分子標的薬bevacizumab、cilengitide、PD-1阻害剤や腫瘍溶解ウイルス、Ad-SGE-REICなどについて、本研究のセットアップを行った。腫瘍はU87dEGFRなどのヒト脳腫瘍細胞系列や脳腫瘍患者から承諾を得て採取した腫瘍由来細胞を用いて、脳腫瘍マウスモデルを作製し、生存期間や腫瘍径を調べた。さまざまな脳腫瘍モデル(幹細胞、モデルも含む)を用い、同様の効果がえられるか否かを検討した。さらに、本年度は、分子標的薬bevacizumab、cilengitideまたはPD-1阻害剤との併用について生存期間などを調べた。どの組み合わせがよいか検討した。さらには遺伝子治療単独と、分子標的薬と遺伝子治療との併用における、腫瘍浸潤、血管新生などについて調べた。今後、Bevacizumab、cilengitide、またはPD-1阻害剤により遺伝子治療を増強するメカニズムを調べる。Microarray,プロテオミクス、次世代シークエンスをおこなう。Gene chip,プロテオミクスから選ばれた因子をターゲットとする。統計学的データ解析を行い、学会発表・論文投稿する。
姉妹染色分体間の接着形成に必須なアドヘリン複合体の分子機能の探求

真核生物の姉妹染色分体はコヒーシン複合体により接着されており、この接着は遺伝情報の正確な分配・継承に必須である。本研究ではコヒーシンの染色体結合が時空間的にどう制御されているかを、コヒーシンの染色体結合を司る出芽酵母Scc2 (アドヘリン)のゲノム学・生化学的解析を通じて探求した。以下の諸点が明らかとなった。1,動原体とそれ以外の染色体部位(以下、染色体腕部)でコヒーシンの染色体結合は異なって制御されていた。動原体ではGI後期より結合が見られ、結合は動原体微小菅を破壊すると促進された。動原体コヒーシンの生理的意味を探るため、現在動原体への結合のみに欠損を示すScc2変異体を単離している。2,腕部のコヒーシンはS期に結合が開始した。DNA複製やS期誘導キナーゼには依存しないが、複製チェックポイントの制御下にはあった。その詳細な制御機構の解明は今後の課題である。3, Scc2は染色体腕部に遍在しており、Scc2の認識する染色体上因子はヒストンないしDNAであることが示唆された。現在生化学的検証が進行中である。4,Scc2は少なくとも3つのドメインをもち、N末Scc4サブユニットへの結合ドメイン、C末はコヒーシンとの相互作用ドメインであった。中央部は未同定の、しかし必須な機能をもつドメインであることも分かった。より詳細な生化学的解析に必要なコヒーシン、Scc2,Scc4タンパク質の大量発現系を構築した。コヒーシンは姉妹染色分体間接着のみならず、DNA修復や転写調節にも機能する重要な核内構造調節因子であることが分かってきている。いかにゲノムの特定部位に必要なタイミングでコヒーシンを結合させるのか、そのメカニズムの解明に向けた重要な基礎となる知見が本研究から得られたと考えている。なお、現在解明された点を発表すべく投稿論文を準備しているところである。本年度はコヒーシン・ローダーであるScc2/Scc4複合体(アドヘリン複合体)が細胞周期のいつ染色体上のどこで機能してコヒーシンを染色体にのせているか明らかにすることを目標とした。このために出芽酵母コヒーシンならびにScc2タンパク質に対するChIP-Chip(chromatin immunoprecipitation on DNA chip)法による解析を行い、次のことを見いだした。a)コヒーシンは動原体とそれ以外の部分(染色体腕部)で異なる挙動を示した。動原体では細胞周期を通じてローディングがおこり続けるが、腕部ではDNA複製期にのみ染色体への結合が見られた。b)コヒーシンの動原体への結合は紡錘体-動原体構造が失われると促進された。DNA合成期に起きる染色体腕部への結合はDNA複製そのものには依存していなかった。c)Scc2は紡錘体のない細胞で動原体近傍に結合していた。DNA合成期における結合位置はこれまでのところ検出できていない。以上より、Scc2/Scc4が様々な局面に応じて染色体の異なる部位へコヒーシンをのせている様相が明らかになってきている。現在Scc2が染色体上の何を認識してローディングの場所を決めているのか解明することを最優先課題としており、そのための生化学的実験系を今年度構築した。本年度はまた、Scc2タンパク質のドメイン解析を行った。その結果Scc2は少なくとも3つのドメインに分けられ、それぞれが異なる相手と相互作用するドメインであることが明らかになった。これらの相互作用をさらに詳細に解析してゆくため、昆虫細胞を用いた各因子の大量発現系を構築した。この成果は、次年度においてScc2/Scc4複合体によるコヒーシン・ローディングの分子機構を調べてゆく際の礎となるものである。

コヒーシンは姉妹染色分体間接着のみならず、DNA修復や転写調節にも機能する重要な核内構造調節因子であることが分かってきている。いかにゲノムの特定部位に必要なタイミングでコヒーシンを結合させるのか、そのメカニズムの解明に向けた重要な基礎となる知見が本研究から得られたと考えている。なお、現在解明された点を発表すべく投稿論文を準備しているところである。
VEGF陽性間質細胞群が血管新生に果たす機能的役割の解明

創傷治癒に伴う血管新生過程において、種々のVEGF陽性間質細胞中、周皮細胞が主たる役割を果たすこと、すなわち血管新生初期には新生血管の増殖と伸長を導き、かつ血管新生後期にはNG2を介するシグナル経路等を通じて血管壁を成熟・安定化させる機能的役割を有することが強く示唆された。また周皮細胞マーカーを発現するVEGF陽性線維芽細胞がこれら周皮細胞の前駆細胞として働くことも併せて示唆された。創傷治癒過程の血管新生におけるVEGF陽性間質細胞の機能的役割を解明するため、平成20年度には、微細構造レベルでの検索を行った。多数のVEGF陽性細胞が周皮細胞や大食細胞のマーカーを共発現して肉芽組織の間質に分布し、特に新生血管壁周囲に密着する所見は、これまでの光学顕微鏡レベルの多重染色標本における検索で明らかになっており、VEGF陽性細胞による血管新生の誘導が推測されているが、今回、肉芽組織をエポキシ樹脂に包埋して透過型電子顕微鏡下で観察したところ、有糸分裂像を呈する内皮細胞が既存の血管壁から問質へ突出して形成される内皮発芽構造に、間質細胞が密着する所見が認められた。これらの間質細胞は豊富な粗面小胞体とゴルジ装置で特徴づけられており、これらの細胞が盛んに蛋白合成を行っているものと考えられた。また、周皮細胞マーカーであるdesminに対する免疫染色を施した肉芽組織を樹脂包埋して観察を行ったところ、この間質細胞がdesminを発現していることも明らかとなった。以上の結果から、VEGF陽性細胞が周皮細胞様に血管壁に密着して血管新生を誘導する機能の一側面が微細構造レベルからもうかがわれた。今後はさらに大食細胞、基底膜、MMPのマーカーに対する免疫染色を肉芽組織に施し、樹脂包埋して電顕用に処理した試料を検索し、VEGF陽性細胞が血管新生時において果たすものと推定されている他の機能、組織修復に伴う遺残物・不要物の除去および基底膜の産生機能についても証明するべく検索を続けていきたいと考えている。平成21年度の研究では、新生血管の周囲に分布するVEGF陽性間質細胞群がPlatelet derived growth factorβ(PDGFRβ)を発現することが新たに明らかとなった。さらに、これらのVEGF+/PDGFRβ+細胞群が新生血管内皮に接着して周皮細胞様に位置する場合にはNG2 proteoglycanも併せて発現する。NG2は細胞外マトリックスとの接着やプロテアーゼ活性化の補助を行う分子であり、このことから、新生血管の周囲に分布するPDGFRβ+細胞がVEGFを産生して内皮増殖を促しつつ、内皮に接着してNG2 proteoglycanを発現し新たな血管ネットワーク構築に働くことが推測された。間質から新たにVEGF+/PDGFRβ+細胞群が血管壁内に導入されることは、増殖中の内皮とそれに接触する間質細胞が共に基底膜を欠く所見が透過型電子顕微鏡で得られたことからも示唆された。上記研究と並行して、最終年度に行う予定の東京女子医大先端生命医科学研究所との共同研究(これまでの研究の再生医学領域への応用を図る)についても予備的実験を開始した。今年度はその第一段階として、血管内皮細胞を含むラット左心室壁由来細胞を材料に培養した細胞シートを3層重ねて積層化し、立体的組織構築を持たせたものを宿主動物に移植して、移植細胞シート内の血管新生機構、および移植細胞シートと宿主動物間の血流開通機構について形態学的解析を試みた。目下のところ、これまでの創傷治癒モデルでの研究結果と同様、細胞シート内に新生される血管内皮先端に周皮細胞が付着すること、またGFP発現宿主動物を使った実験から、移植早期に細胞シートと宿主間に形成される連結血管の周囲に周皮細胞が分布することが明らかとなり、移植組織においても、周皮細胞が血管新生や血管網連結に重要な働きを果たすことが示唆されている。平成22年度には、これまでに行ってきた創傷治癒過程に認められるVEGF陽性の間質細胞群による血管新生の制御機構研究における最終段階の検索を行った。その結果として:(1)VEGF陽性間質細胞のうち、新生血管先端部で増殖性の内皮細胞に密着して分布する細胞の大部分は、alpha smooth muscle actin(SMA)、desminおよびplatelet derived growthfactor-beta(PDGFR-β)に陽性を示す周皮細胞であること、(2)先端部より後方に分布する周皮細胞が、間接的な血管壁の安定化作用を持つことが示唆されるNG2 proteoglycanに陽性反応を示すこと、(3)周皮細胞のVEGF陽性反応は新生血管先端から後方にかけて徐々に弱まり最終的には消失すること、(4)基底膜マーカーtypeIV collagenを用いた実験から、新生血管先端部の周皮細胞は基底膜を欠くが、後方にかけて次第に内皮と共通の基底膜に包まれること、が明らかとなった。これらの結果から、周皮細胞が血管新生制御機構に大きく寄与し、血管新生初期にはVEGF産生により内皮の増殖を促進するが、後期にはVEGF産生停止、NG2発現および基底膜の産生により、逆に新生された血管壁を成熟・安定させるよう、その機能をシフトさせることが強く示唆された。

さらに22年度には、応用的研究として心筋細胞シート移植動物を用いて移植組織内の血管新生についても検索を行った結果、細胞シート内に認められた新生血管にも周皮細胞の付着が密に観察され、周皮細胞による血管新生の制御機構にはモデルの違いを超えた普遍性があるものと考えられた。今後はこの細胞シート移植モデルの血管新生における周皮細胞の機能についてさらなる詳細な検索を行っていきたく、平成23年度からの科学研究費補助金を申請させていただいた。
卵巣癌大量化学療法における造血幹細胞移植の骨髄機能回復に関する研究

進行卵巣癌III期、IV期症例や再発例に対して、我々は末梢血幹細胞移植法(peripheral blood stem cell transplantation:PBSCT)を併用した大量化学療法を1991年1月より行ってきた。現在までにPBSCの採取を行ったものは50例であり、そのうち大量化学療法に至ったものは37例である。1996年4月より現在までにPBSC採取は17例に行い、その採取幹細胞を使用し実際に大量化学療法を行ったものは、9例に対し11回行った。大量化学療法のRegimenは、CBDCA1500mg/m^2、CPM3000mg/m^2を分3日間とした。本研究に先立ち患者またはその家族に、治療目的、治療内容、副作用などを十分に説明し同意を得て文書を保存するものとした。PBSCT併用大量化学療法では、いかにPBSCを多く採取するかが一つのポイントとなる。骨髄機能の急激な回復のときにPBSCを採取することが採取効率を上げるため、採取のための化学療法でCPMを1000mg/m^2とし、nadiorよりG-CSFを投与することとした。採取時のPBSCの評価として、総有核細胞数は、平均3.85×10^<10>(8.520.67×10^<10>)であった。CFU-GM数採取個数の検討では、平均1.74×10^8(0.0194.79×10^8)であった。PBSCTの評価として、移植後の骨髄機能回復では、生着不全は1例もなく全例骨髄機能の回復を認めた。白血球数は白血球100以下の期間は平均3日間で(05日間)、1000以下の期間は5.57日(4日間7日間)、3000以下の期間が平均9.8日(5日間12日間)、幹細胞移植日をDay0とすると、白血球数が1000を越える日は、平均Day8.71(Day8Day10)、3000を越える日はDay9.28(Day8Day10)であった。血小板数の比較では、血小板輸血なしに2万以上になる日は平均でDay8.28(Day7Day10)、5万以上になる日は平均でDay11.9(Day10Day13)であった。これは従来われわれが行ってきたABMT併用大量化学療法と比較すると,白血球100以下の期間では有意差を認めないが、白血球1000以上になった日、3000以上になった日、また血小板が5万以上になった日については有意差を認めた。PBSCTは従来のABMTと比較して大量の造血幹細胞を輸注することにより、より早い骨髄の回復が認められた。
ニコチンによる表皮アセチルコリン受容体の活性化は掌蹠膿疱症の発症に関与するのか？

掌蹠膿疱症(PPP)は、掌蹠の無菌性膿疱を主体とし、寛解・増悪を繰り返すうちに鱗屑を伴う紅斑性局面を来す難治性の慢性炎症性皮膚疾患である。病因のひとつに喫煙が指摘されており、罹患者の喫煙率は高いが、その機序は十分に検討されていない。本研究では、煙草中のニコチンが表皮もしくは汗腺・汗管に発現するニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を活性化することで、表皮の恒常性や炎症性サイトカインの産生に影響し、PPPの病態形成もしくは疾患の増悪に関与する可能性を考えた。培養表皮ケラチノサイト(NHEKs)と汗腺細胞(NGL-SG2)をニコチンで96時間刺激し、α3nAChRおよびα7nAChRの発現に変化がみられるか解析を行ったところ、ニコチン刺激による受容体の発現への影響は見られなかった。NHEKsとNCL-SG3をニコチン10nM、100nMで96時間刺激したところ、NHEKsにおけるタイトジャンクション構成分子、コルネオデスモシン構成分子、抗菌ペプチドの発現が有意に低下した。さらに、KLKsの発現も低下したが、セリンプロテアーゼインヒビターLEKTIの発現は上昇しており、タンパク分解酵素の活性に変化を生じている可能性が考えられた。一方、NCL-SG3では、変化がみられないことがわかった。以上から、ニコチン長期暴露は、表皮恒常性を変化させるが、汗腺細胞には影響しないと考えた。NHEKsをニコチンで72時間刺激したのちにTNF-αを添加したところ、ニコチン前処理群では、有意にIL-6、IL-8の発現が上昇することがわかった。NCL-SG3では、培養上清にのみサイトカインの上昇を認めた。このことから、長期ニコチン暴露は表皮ケラチノサイトにおけるTNF-α誘導性炎症を増強させると考えた。一方、汗腺細胞では、サイトカインの産生を誘導しないが、放出を促進する可能性が示唆された。正常ヒト表皮角化細胞(NHEKs)および汗管細胞(NCL-SG3)におけるニコチン刺激後のnAChRの発現検討を行った。NHEKsを低カルシウムと高カルシウム条件で培養し、0-500nMのニコチンを添加した。24時間後に培養細胞を回収し、α3nAChRおよびα7nAChRの発現に変化がみられるかRT-PCRにて解析を行った。24時間後、受容体の発現量は変化しなかった。さらにニコチン長時間刺激で変化が生じるか検討を行った。高カルシウム培養液でNHEKsの分化を誘導する同時に、ニコチン刺激を開始し、24、48、72、96時間後に培養細胞を回収した。ニコチン暴露96時間までα7nAChRの発現量に変化しなかった。また、NCL-SG3を同様にニコチンで96時間まで刺激したが、α7nAChRの発現に変化はなかった。掌蹠膿疱症の病態形成には、表皮内汗管の閉塞、抗菌ペプチド(dermcidin、cathelicidin)の産生増加などが膿疱形成に関わるとされている。NHEKsとNCL-SG3をニコチン250nMで96時間刺激し、細胞間接着分子、表皮分化マーカー、抗菌ペプチドの発現が変化するか、RT-PCR法および細胞染色により解析した。ニコチン暴露96時間後、NHEKsにおけるタイトジャンクション構成分子(Occuludin, Claudin-23, ZO-1)、コルネオデスモシン構成分子(desmoglein 1, Corneodesmosin)、抗菌ペプチド(Cathelicidin、β-defensin-2)の発現が有意に低下した。以上から、ニコチン暴露は表皮角化細胞におけるホメオスターシスを変化させるが、汗腺細胞には影響しないと考えた。初年度は、培養細胞を用いた研究を計画していた。現在まで、おおむね計画通りに進行している。当初の計画では、ニコチン刺激24時間後の培養細胞の変化を解析する予定であったが、細胞の状態に影響を与えないことがわかった。実臨床では、喫煙者は長期間ニコチンの暴露を受けていることを踏まえて、培養細胞に長時間ニコチンを作用させるよう実験条件を修正した。さらに、TNF-α誘導性炎症反応が、ニコチン刺激によって増強するか検討を行った。NHEKsを高カルシウムで培養し分化を誘導すると同時に、0-250nMのニコチンで刺激し、72時間後にTNF-αを添加し、さらに24時間培養を行った。コントロールは、ニコチン前処置のないTNF-α刺激のみを使用した。培養細胞を回収し、サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-22、IL-36等)の発現を定量的PCRとELISAにて解析した。その結果、ニコチン前処理群では有意にIL-6、IL-8の発現が上昇することがわかった。このことから、ニコチン暴露は表皮ケラチノサイトにおけるTNF-α誘導性炎症を増強させる可能性を考えた。実臨床においては、喫煙者は長期間ニコチンの暴露を受けていることを踏まえて、培養細胞に長時間ニコチンを作用させるよう実験条件を修正している。

また、マウスへのニコチン投与実験を検討していたが、煙草の煙を暴露するにあたって、器具が予定以上に高額であり入手困難なことから、ニコチン投与経路の再検討を行っている。掌蹠膿疱症(PPP)は、掌蹠の無菌性膿疱を主体とし、寛解・増悪を繰り返すうちに鱗屑を伴う紅斑性局面を来す難治性の慢性炎症性皮膚疾患である。病因のひとつに喫煙が指摘されており、罹患者の喫煙率は高いが、その機序は十分に検討されていない。本研究では、煙草中のニコチンが表皮もしくは汗腺・汗管に発現するニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を活性化することで、表皮の恒常性や炎症性サイトカインの産生に影響し、PPPの病態形成もしくは疾患の増悪に関与する可能性を考えた。培養表皮ケラチノサイト(NHEKs)と汗腺細胞(NGL-SG2)をニコチンで96時間刺激し、α3nAChRおよびα7nAChRの発現に変化がみられるか解析を行ったところ、ニコチン刺激による受容体の発現への影響は見られなかった。NHEKsとNCL-SG3をニコチン10nM、100nMで96時間刺激したところ、NHEKsにおけるタイトジャンクション構成分子、コルネオデスモシン構成分子、抗菌ペプチドの発現が有意に低下した。さらに、KLKsの発現も低下したが、セリンプロテアーゼインヒビターLEKTIの発現は上昇しており、タンパク分解酵素の活性に変化を生じている可能性が考えられた。一方、NCL-SG3では、変化がみられないことがわかった。以上から、ニコチン長期暴露は、表皮恒常性を変化させるが、汗腺細胞には影響しないと考えた。NHEKsをニコチンで72時間刺激したのちにTNF-αを添加したところ、ニコチン前処理群では、有意にIL-6、IL-8の発現が上昇することがわかった。NCL-SG3では、培養上清にのみサイトカインの上昇を認めた。このことから、長期ニコチン暴露は表皮ケラチノサイトにおけるTNF-α誘導性炎症を増強させると考えた。一方、汗腺細胞では、サイトカインの産生を誘導しないが、放出を促進する可能性が示唆された。TNF-α誘導性炎症反応が、ニコチン刺激によって増強するか検討を行う。NHEKsを高カルシウムで培養し分化を誘導すると同時に、0-250nMのニコチンで刺激し、72時間後にTNF-αを添加しさらに24時間培養を行う。コントロールは、ニコチン前処置のないTNF-α刺激のみを使用する。培養細胞を回収し、サイトカイン(TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-8、IL-17、IL-22等)、抗菌ペプチド(Cathelicidin, Dermcisin、β-defencin等)の発現を定量的PCRおよびウエスタンブロット法、免疫染色により解析する予定である。TNF-α誘導性炎症反応に追加して、ニコチンがTLRアゴニスト刺激へ反応性を変化させるか検討を行う。NHEKsを高カルシウムで培養し分化を誘導すると同時に、0-250nMのニコチンで刺激し、72時間後に至適濃度のPam2CSK4、FSL-1などのTLRアゴニストを添加し、さらに24時間培養を行う。コントロールは、ニコチン前処置のないアゴニスト刺激のみを使用する。培養細胞を回収し、サイトカイン(TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-8、IL-17、IL-22等)、抗菌ペプチド(Cathelicidin, Dermcisin、β-defencin等)の発現を定量的PCRおよびウエスタンブロット法、免疫染色により解析する。試薬などを効率的に購入するように努め、当初計画より経費の使用が節約できたことにより生じた。
機能性環境微生物群を用いた難分解性有機排水のメタン発酵処理

リアクターによる連続運転培養の最適な初期条件を決定し、通性嫌気性加水分解菌とメタン生成菌を別々に馴致して、特定の有機性排水に対する混合汚泥を培養した。さらに影響要因・最適な成長条件などの検討することを組み合わせて回分実験を行った。生物化学的な検討により、DMFの分解経路を推定し、「二段階反応仮説」を提出した。DMFの分解は、細菌によるDMFから中間生成物までの加水分解反応と古細菌による中間生成物からメタンまでの発酵反応の2つの部分がある。この仮説を検証しるために、「混合反応系」を工夫した。好気性汚泥と嫌気性汚泥を混合し、嫌気性条件で培養した結果はDMFのメタン発酵処理を世界で初めて実現した。機能性微生物の構造とその役割を解明した。DMF加水分解細菌とメタン生成古細菌の共生系の形成はDMFメタン発酵処理の鍵と考えた。その加水分解細菌は、好気性条件で指数的に増加し、嫌気性条件で生きることもできる。以上の結果を踏まえ、「好気と嫌気を組み合わせた二段階のシステム」を工夫しました。これから、長期的な連続実験を行い、リアクターの処理能力、安定性を把握することで、DMFメタン発酵を高効率に実現することを目指す。これからの研究計画は、UASBのスタートアップを始めると共に、反応槽にAnammox汚泥も接種し、窒素を含有する人工排水によって汚泥を馴致する。最適な運転条件を採用し、半年以上の長期連続運転を考察。UASBとOCARの組み合わせたシステムが互いに協力でくることを試験する。混合培養系微生物の群集変化について先端の分子生物学的手法を用いて主要なメタン発酵菌と加水分解菌の群集構造を解析する。これ以上に異なる段階に得られたデータに基づき、UASBとOCARプロセスの数式化・モデル化を行う。本年度では分解し難い有機物の一つ、ジメチルホルムアミドと(DMF)というものメタン発酵処理に関わる研究を続いて行った。嫌気性と好気性混合種汚泥によりDMFのメタン発酵を連続的に運転できた。メタゲノムなどの手法を用いて加水分解菌とメタン菌の割合を解析し、特定の機能が長期に持つことを検証した。この研究は、バイオマス資源を活用し、特定の産業からの分解し難い有機物を含有する排水の高効率処理及びエネルギー回収に促進した。リアクターによる長期連続実験の新たな結果により、もう2篇の論文を執筆し、これから投稿しておく。これ以上に異なる段階に得られたデータに基づき、UASBとOCARプロセスの数式化・モデル化リアクターによる連続運転培養の最適な初期条件を決定し、通性嫌気性加水分解菌とメタン生成菌を別々に馴致して、特定の有機性排水に対する混合汚泥を培養した。

これからの研究計画は、UASBのスタートアップを始めると共に、反応槽にAnammox汚泥も接種し、窒素を含有する人工排水によって汚泥を馴致する。最適な運転条件を採用し、半年以上の長期連続運転を考察。UASBとOCARの組み合わせたシステムが互いに協力でくることを試験する。混合培養系微生物の群集変化について先端の分子生物学的手法を用いて主要なメタン発酵菌と加水分解菌の群集構造を解析する。これ以上に異なる段階に得られたデータに基づき、UASBとOCARプロセスの数式化・モデル化
第三世代EGFR－TKIの耐性化機序の解明と臨床への還元システムの構築

第三世代EGFR-TKIへ耐性化した患者検体を収集するためにKLOG(keio lung oncology group)を通じて慶應義塾大学病院呼吸器内科関連病院より検体収集を行うフローの構築を行っている。既に得られている慶應義塾大学病院内の耐性症例の検体については患者腫瘍組織移植マウスモデルへの移植を成功しており、耐性機序の解析を進めている。現時点で得られている耐性検体から新規耐性機序の可能性がある結果が得られており、現在更に検討を進めている状況である。今後は更に検体回収を進め、各施設における耐性化の状況について評価を進める予定である。関係施設からの検体集積までには至っていないが、集積するシステムの構築は進んでいる。慶應義塾大学病院で得られた検体については既に解析は進んでおり、耐性化機序の解明を行う実験については問題なく行えている。耐性化検体を患者腫瘍組織移植マウスモデルに移植する手技は概ね確立できているため、今後は検体自体の集積を進めたい。関連施設における耐性化症例の実態についてはヒアリングを行えており、検体数は確保できる見込みが立っている。単一施設への検体収集について倫理的な側面や保管、管理方法などについて検討が必要な要素があるため期間内に更に調整を進める。