hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
災害被災地への迅速架橋を目的としたシザーズ型緊急橋の耐震安全性評価

今回のパラメトリック解析の範囲内では,最大曲げ応力は,静的解析と比べ約3倍の値を示した。言い換えると,地震下での主部材の安全率を考えると3倍以上の値が必要になると言える。研究最終年度である平成29年度は,初年度の研究成果を踏まえ,(1)振動実験による動的特性の解明,(2)実験結果を反映した解析モデルの構築,(3)幾種かの地震波・解析モデルを想定した地震応答解析を計画している。まず項目(1)では,初年度で実施した解析モデルの妥当性について,振動実験に基づく動的な面からも引き続き評価を行い,項目(2)のモデル化の整合性を改めて評価する。この振動実験については,既往の研究で試作した実験橋を用いる。実験結果を反映したモデル化を行った後には,項目(3)にあるように,被災現場を想定した地震応答解析を行う。ここでは,幾種かの解析モデルを構築し,その地震時挙動を検証し,たわみや応力などの物的特性を評価する。項目(3)で得られた結果をその解析条件によって系統的分類をし,被災現場でのシザーズ型緊急橋の耐震安全性に関する基礎資料として整理する。29年度が最終年度であるため、記入しない。構造工学・橋梁工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
グローバル危機とアジア経済

グローバル危機を契機に、(特にアジア地域における)経済間の相互連関が注目されるようになった。また、危機の発生確率を軽減するために各国が採るべき政策や制度への関心が高まると同時に、危機への耐性を維持する観点から、資本管理政策が主権国家の政策手段として広く受け入れられるようになった。本研究の成果は多岐に及ぶが、その核心的部分は、(1)経済連関をはかる手法を開発したこと、(2)実証的に経済統合の性格を特定化したこと、(3)資本管理政策の有効性を検証したこと、(4)危機発生確率を低下させるための政策、制度を明らかにしたことにある。アジア経済と世界経済とのマクロ連関については、強まっているという意見と、分離しつつあるという意見がある。また、アジア域内の金融統合の是非については、積極的に進めるべきであるという意見と、危機に対する耐性を維持する観点から漸進的に行うべきであるという意見がある。本研究は、2008年秋に始まったグローバル金融危機を踏まえ、アジア経済と世界経済のマクロ連関およびアジア域内のマクロ相互依存を解明し、金融統合がアジアにとって正の影響を与えるのか、それとも負の影響を与えるのかを分析することを目的としている。初年度は「マクロ相互依存班」(永易、岩壷)、「金融統合班」(高木、廣瀬)、「政策協調班」(小川、江阪)が密接に連携しつつ、グローバル危機がアジア経済に与えた影響、危機前後でのアジア経済のマクロ相互依存、アジア通貨の動き(円キャリートレードの役割を含む)に焦点を当て、多くの研究成果を上げた。これらの研究の中には内外の学会で報告し、すでに公刊されたものもある。加えて、2010年2月には内外の専門家を招いて、ワークショップを開催し、研究代表者および分担者5名が、量的緩和政策における介入の役割、金融統合、マクロ連関について、現在進行中の研究を発表し、今後、アカデミックジャーナル掲載に向けた質の向上をはかることができた。特に初年度の中心的課題は、マクロ連関と金融統合の関係を数値化することであったが、ワークショップで発表した岩壷の未完成論文「Financial Integration and InternationalTransmission of Business Cycles : Evidence from Dynamic Correlations」では目的の達成にむけた大きな成果が得られている。もちろん経済分析の性格上、このような複雑な問題に単純な答えを与えることはできない。世界経済、地域経済を構成する金融的、実体的要素を分解し、分析を積み上げていく他に方法はない。本年度は、「マクロ相互依存班」(永易、岩壷)、「金融統合班」(高木、廣瀬)、「政策協調班」(小川、江阪)が密接に連携しつつ、金融統合度や通貨連関の程度を測る指標の開発、金融規制改革のインパクトに焦点を当て、多くの研究成果を上げた。とくに、永易の東アジアのマクロ連関に関する研究や岩壷の国際景気循環の伝達経路に関わる研究は特記すべき成果である。加えて、金融改革の効果、プルーデンシャル規制の量的指標、危機後の国際通貨制度や地域通貨協力のあり方についても、重要な成果が得られた。2011年2月には初年度に続き、内外の専門家を含めた国際ワークショップを開催し、研究代表者および分担者が、現在進行中の研究を発表し、今後、アカデミックジャーナル掲載に向けた質の向上をはかることができた。本研究の出発点は、2008年秋に始まったグローバル危機と前後して、アジア経済の現状と今後の政策に関して対立する見解があるという認識であった。すなわち、現状に関しては、アジア経済と世界経済のマクロ連関が強まっているという意見と、分離しつつあるという意見がある。また、今後の政策に関しては、域内金融統合を積極的に進めるべきであるという意見と、危機に対する耐性を維持する観点から漸進的に行うべきであるという意見がある。本研究は、プロジェクト3カ年を通じた具体的な進化の結果として、アジア経済と世界経済のマクロ連関およびアジア域内のマクロ相互依存を解明し、金融統合の是非、為替および資本勘定政策の在り方、地域協力体制の改革を分析することができた。

本年度も、過去同様、「マクロ相互依存班」(永易、岩壷)、「金融統合班」(高木、廣瀬)、「政策協調班」(小川、江阪)が密接に連携しつつ研究活動を続けてきたが、とくにアジアの通貨協力、グローバル危機後の為替政策、固定相場制の危機に対する耐性、景気循環の国際伝播、アジアの経済金融統合、国際金融アーキテクチャーの改革に関して成果を挙げた。さらに、グローバル危機の延長線上にある欧州ソブリン危機についても、国際通貨基金(IMF)を中心として、国際経済政策における新たなコンセンサスとなりつつある資本規制の有効性についても、実証分析を行った。これらの研究の中には、定評ある国際学術誌にすでに掲載されたものもある。最終年度も、過去2年間と同様、内外の専門家を含めた国際ワークショップを開催し、研究代表者および分担者が、現在進行中の研究を発表し、今後、アカデミックジャーナル掲載に向けた質の向上をはかることができた。
腹膜播種の成立における好中球細胞外トラップの意義―宿主免疫側からの検討

好中球細胞外トラップ(NETs)は、遊離癌細胞を捕捉しがん転移を促進する可能性があることが示唆されている。申請者らは、ヒト腹腔内滲出好中球由来のNETsがヌードマウスにおける腹膜播種の成立を促進し、DNAseによるNETsの分解で播種再発が予防できる可能性を示唆する結果を得た。本研究では、T細胞とマクロファージの機能に対するNETsの作用をIn vitroで検討するとともに、免疫能を有するマウスの腹膜播種モデルでも、NETsが同様の播種増強効果が発揮しうるか?を検証する。また、この実験系に癌細胞由来エクソソームを共存させることで、上記の現象に如何なる変化が見られるか?についても検討を加える。
金属錯体の酸化還元に伴う配位子の塩基性変化を用いた金属イオンの捕集システムの開発

二つのRuを架橋したオキソイオン(O^<2->)の塩基性は,Ruの酸化数の変化に伴い,大幅に変化する.すなわち,Ruの酸化数を変えることにより,架橋オキソへのルイス酸(金属イオンなど)の相互作用を制御できる.本研究は,このような性質を持つ錯体を自己集積化した電極を用いて,電位制御により,溶液中の金属イオンとの相互作用を可逆的に制御できる系の構築を目指し,同時にこの手法を用いて電極上に金属錯体超分子系を構築することを目的とした.成果は以下のようにまとめられる.(1)金電極上への安定な自己集積化膜の生成条件を確立した.すなわち,サイズの大きな錯体の集積化膜の安定化には,有機化合物との混合膜が,また錯体と電極とを繋ぐ部分のアルキル鎖に導入したペプチド基の水素結合が有効であることを示した.(2)オキソ架橋錯体の電極上でのプロトン共役電子移動を定量的に明らかにした.オキソ架橋Ru錯体の自己集積化膜が、水溶液を媒体として基本的に溶液中と同様の応答を示すこと,さらに自己集積化膜の独自の特徴として,溶液中の陰イオンによる電位制御が可能なことも示した.さらに,生化学的にも重要なFe-O-Fe型錯体について、初めて酸化型,還元型のオキソ架橋のpKaを評価した.(3)オキソ架橋錯体と各種ルイス酸(各種金属イオンおよびBF_3)との相互作用を初めて定量的に明らかにした.ことにAl^<3+>などとの相互作用では,プロトン付加以上に酸化状態の影響が大きいことを定量的に示した。(4)金電極上でのルテニウム多核錯体の段階的オリゴマー化を実現した.上の成果を応用した金属イオンと電極修飾クラスター錯体との相互作用では,金属イオンの安定的な固定に問題があったが,Ru三核錯体の自己集積化膜について,酸化還元に伴う配位子の脱着を利用することで三核錯体を電極上に計画的、段階的に数層積み上げオリゴマー化するための基礎的なアプローチを確立することが出来た.以上の成果は、まだ限られた錯体系について調べられたものであるが、一般性を持つ知見が多く、応用性も期待出来るので、今後の関連研究への発展が期待できる。本研究計画では,主に重遷移金属イオンの単核および複核錯体を用いて,電気化学的に錯体の酸化状態を制御して,溶液系からの金属イオンの可逆的な捕集を行えるシステムの開発を目的とする。さらに,本研究では生体の金属イオンの捕集,貯蔵,輸送,排出などの現象機構を理解する上での基礎的に重要な情報を提供することも付属的な目的としている。本年度では特に,研究目的に適合した錯体の設計,合成に主力を注いだ他,すでに合成した錯体を用いてその酸化還元に伴う金属イオンの吸脱着挙動を調べた。(1)目的に適した錯体の合成。Ru,Os,Reのオキソ錯体に絞り合成した。酸化還元に伴うオキソ基の塩基性の変化に着目し,かつ酸化還元過程で骨格構造が安定に保たれるには,これらの金属イオンが適当と考えたからである。

Ru_2(μ-O)(μ-CH_3COO)_2型骨格(架橋のカルボン酸イオンが2ヶ)をもつ錯体を数種合成したが,これらではオキソ架橋へのプロトン付加と連動した酸化還元挙動がサイクリックボルタモグラム(CV)で観測された。一方,M_2(μ-O)(μ-RCOO)型(架橋のカルボン酸イオンが1ヶ)(M=Ru,Os)錯体,M_2(μ-O)_2型(架橋のカルボン酸イオンなし)(M=Re,Os)錯体、trans-Re(O)_2型単核錯体はいづれも十分なプロトン共役酸化還元挙動を示さなかった。(2)金属イオン付加と共役した酸化還元挙動。Ru_2(μ-O)(μ-CH_3COO)_2型錯体について,数種の金属イオン存在下で,CVを測定した結果,一部の金属イオンについてオキソ基への付加と連動した酸化還元挙動は観測されたものの,アセトニトリル中の水が顕著な影響を及ぼし,理想的な挙動を見い出すための条件設定が難しい点も明かとなった。(3)金電極上へのオキソ錯体の固定とそれによる酸化還元挙動の観測。ルテニウム三核,および鉄複核オキソ錯体を金電極上に導入することに成功した。そして,この電極が水溶液中でプロトン付加と連動した酸化還元挙動を示すことを明かにした。本研究計画の目的は、主に重遷移金属イオンの単核および複核錯体の酸化状態を電気化学的に制御して、溶液系から金属イオンを可逆的に捕集出来るシステムを開発することである。さらに、本研究では生体系にみられる金属イオンの捕集、貯蔵、輸送、排出などの現象の機構を理解する上での基礎的に重要な情報を提供することも付属的な目的としている。今年度は初年度に合成した錯体のうち特にオキソ架橋型の複核ルテニウム錯体に注目し、その金属イオン存在下での酸化還元挙動を非水溶液中で詳細に調べると共に、その金電極上への固定化と機能評価を行った。その結果、非水溶液中での金属イオンのオキソ架橋との相互作用は期待したほど速やかではなく、最終目的のためには問題点も多いことが明かとなってきた。(1)オキソ架橋Ru複核錯体の金属イオン存在下での酸化還元挙動。RU_2(u-O)(u-CH_3COO)_2型錯体を用いて研究を進めた。アセトニトリル中、Al^<3+>、Na_+、Li共存下では、還元状態でこれら金属イオンがオキソ架橋と相互作用することがあきらかとなった。相互作用により酸化還元電位が大幅に正側にシフトしたが、プロトン付加に比べ、酸化還元波の可逆性は劣り、相互作用の速さは本研究の最終目的には不十分であることがわかった。(2)RU_2(u-O)(u-CH_3COO)_2型錯体を固定化した金電極の酸化還元挙動。この型の錯体の金電極上への導入にようやく成功し、その特徴であるプロトン共役電子移動反応について調べた。その結果、溶液中で観測された挙動と同様の優れたプロトン共役電子移動が認められた。測定系としては、水溶液を用いたが、もとの錯体が水に溶けないことから、水溶液系でこの錯体の酸化還元挙動が初めて観測されたことになる。この結果は、固体上に固定化した金属錯体のプロトン共役電子移動として最初の観測結果である。本年度は目的に向けての一定の成果も得られたが、問題点もまた明かとなり次年度の目標も明確となった。本研究計画では,主に重遷移金属イオンの単核および複核錯体を用いて,電気化学的に錯体の酸化状態を制御して,溶液系からの金属イオンの可逆的な捕集を行えるシステムの開発を目的として研究を進めてきた。前年度までに,Ru_2(μ-O)(μ-CH_3COO)_2型錯体を金属極上に自己集積化し,その水溶液との界面でのプロトン共役電子移動挙動を観測した。しかし,この自己集積化膜は被覆率が低く,さらに繰り返しの電位スキャンで錯体が徐々に解離するなど問題点が多く,当初の目的には不適当であった。
走査型透過電子顕微鏡法を用いた析出型合金における整合析出メカニズムの解明

析出初期のGP-IからGP-IIに変化するメカニズムに関して、HAADF-STEM法によりGP-Iが混在する状況を詳細に検討した結果、3つのAl層がCu単原子層により挟まれているGP-II構造が最初から多数存在し、それが安定して成長するという考え方を提出した。また、θ'相がGP-II上に核生成することを示す写真もHAADF-STEM法により撮影した。時効前期過程においてGP-Iゾーン上に析出するδ'相は初期段階においてはランダムに析出するが、時効が進むにつれてGP-Iゾーンを挟む二つのδ'相は必ず逆位相の関係にあることを見出し、その理由としてLi-Cu-Li結合が高いエネルギーを持つからであることを指摘した。そしてこの逆位相の関係にあるδ'-GPI-δ'の構造体は通常のAl-Cu系でGP-Iゾーンが安定とされている温度域よりはるかに高い220°Cでも安定に存在することを示した。一方、時効後期過程においてはθ'相およびT1相が主要な析出相であるが、これらの相について次の点を明らかにした。(a)θ'相はAl-Cu2元系の場合では正方晶に属するがAl-Li-Cu系において、c方向の格子定数が増加すること。さらにAlマトリックスの{100}より傾いて成長する場合があることを見出した。そしてこの原因がLiのθ'相への固溶に起因すること及びTB相との関連を指摘した。(b)T1相についてはLiの不足に伴ってAl-Cu-Mg系などで頻繁に見出されるω相に連続的に変態することをHREMにより見出した。また、高分解能電子顕微鏡のシミュレーションからAlマトリックスに対しω相は二つのバリアントを持つこと、そして、これらのバリアントにT1相から連続的に成長が進むことを実験的に示した。粒状GP相を詳細にHAADF-STEM法により調べた結果、この段階ですでに{111}面に沿ってAgがnmオーダーで強い濃度分布をもっていることが判明した。また、θ相がGP-II上に核生成することを示す写真もHAADF-STEM法により撮影した。粒状GP相を詳細にHAADF-ST脳法により調べた結果、この段階ですでに{111}面に沿ってAgがnmオーダーで強い濃度分布をもっていることが判明した。したがって、これまで明らかとなっていなかった六方晶系に属するγ相の析出核が粒状GP相の段階から存在していることが強く示唆される。焼き入れ直後からδ'相が存在するのはLiが約2wt%以上の場合であり、それ以下ではδ'相は存在せず、先にGP-Iゾーンが析出することを明らかにした。このGP-Iゾーン上にδ'相が析出し、安定な複合組織を作ることが示唆された。さらにこのGPゾーンはAl-Cu系の存在限界温度である1800Cを上回る2200C程度まで安定して存在すること、その原因は歪みを緩和するように析出するδ'相にあることを示した。一方、これまで構造が定まらなかったT1相に関して、この相が格子定数cが8.8-9.4Åの範囲にあるいくつかのバリアント相を呈することを示す実験事実を高分解能電子顕微鏡、およびHAADF-STEM法により得た。

ロッド状に析出するラーベス相の構造を明らかにするため、まず高分解能電子顕微鏡観察を行った。さらにこの系ではc面状にGPゾーンが析出していることを見いだし、この両相に起因する回折パターンを得た。時効前期過程においてGP-Iゾーン上に析出するδ'相は初期段階においてはランダムに析出するが、時効が進むにつれてGP-Iゾーンを挟む二つのδ'相は必ず逆位相の関係にあることを見出し、その理由としてLi-Cu-Li結合が高いエネルギーを持つからであることを指摘した。そしてこの逆位相の関係にあるδ'-GPI-δ'の構造体は通常のAl-Cu系でGP-Iゾーンが安定とされている温度域よりはるかに高い220°Cでも安定に存在することを示した。一方、時効後期過程においてはθ'相およびT1相が主要な析出相であるが、これらの相について次の点を明らかにした。(a)θ'相はAl-Cu2元系の場合では正方晶に属するがAl-Li-Cu系において、c方向の格子定数が増加すること。さらにAlマトリックスの{100}より傾いて成長する場合があることを見出した。そしてこの原因がLiのθ'相への固溶に起因すること及びTB相との関連を指摘した。(b)T1相についてはLiの不足に伴ってAl-Cu-Mg系などで頻繁に見出されるω相に連続的に変態することをHREMにより見出した。また、高分解能電子顕微鏡のシミュレーションからAlマトリックスに対しω相は二つのバリアントを持つこと、そして、これらのバリアントにT1相から連続的に成長が進むことを実験的に示した。時効初期段階においてGPゾーンおよびpre-β'相は認められないことを確認した。一方、β'相はシミュレーションおよび格子定数の結果からMgZn2のラーベス相と思われる。これは母相のc軸方向に成長したロッド状の析出物でかつ母相のc軸と整合性がよく、母相との方位関係は[010]_<β'>//[001]_<Mg>,[008]_<β'>//[120]_<Mg>であった。また、β相はa=5.06nm, c=2.6nmの六方晶系に属する結晶であることを明らかにした。一方、母相との方位関係は一意でなく、今後さらにこの析出相の構造および母相との整合関係を調べる必要がある。
脾腫に伴う脾臓機能異常と肝線維化・肝発癌における肝脾臓器相関の解明

1.肝線維化に伴い腫大した脾臓における線維化の検討(継続)昨年度に引き続き、門亢症患者(軽度から高度までの40症例)から摘出した脾臓組織の系統的な組織学的検討を行った。門亢症の脾臓では門脈圧の亢進に伴う赤脾髄の脾洞の増生・拡張、および脾洞内皮に挟まれた赤脾髄間質(脾索)の狭小化が観察され、門亢症が高度になるにしたがって、赤脾髄脾索内における線維化が増強していた。線維性コラーゲンの産生にかかわると考えられるalpha-SMA陽性細胞が同部位に多数認められ、赤脾髄の細網細胞マーカーを用いて、2重免染を行った結果、細網細胞の筋線維芽細胞への形態変化が脾臓線維化の病態であることが示唆された。また、線維化の原因として、酸化ストレスの関与を検討したところ、赤脾髄における各種酸化ストレスマーカーの増強とNADPHoxidase(NOX)の強発現が観察された。このことから、門亢症の脾腫に伴う線維化に酸化ストレスが関与していることが強く示唆された。2.ヒト硬変肝における脾摘後の形態変化の観察(継続)脾摘を先行させた肝切除症例(肝癌患者)の非癌部組織を用いて、免疫組織学的検討を行った。脾摘後に多数の類円形で粗大な単球/マクロファージ(CD68陽性)が線維性瘢痕組織から肝小葉にかけて動員され、それに沿うように幹細胞マーカー(CK19, EpCAM)陽性細胞の拡がりが観察された。単球/マクロファージの一部は、MMP-1を発現していた。一方、前述の脾摘症例(40例)のうち、経過観察期間に肝癌を発症して肝切除が施行された7例において、9例中7例で線維化の改善を認めた。動因マクロファージを中心とした、肝修復機構の存在が示唆された。ヒトでの解析は順調に進んでいるが、肝発癌に与える影響については、解析準備中である。脾臓細網細胞の筋線維芽細胞への形質転換のメカニズムをさらに詳細に検討していく。また、脾摘と肝発癌の関連について、データ収集を図る。1.肝線維化に伴い腫大した脾臓の組織学的変化の詳細な検討門脈圧亢進症(門亢症)に伴う脾腫の組織学的検討の歴史は古いが、意外にも系統的な検討はなされていない。今回、門亢症患者(軽度から高度までの40症例)から摘出した脾臓組織の系統的な組織学的検討を行った。門亢症の脾臓では門脈圧の亢進に伴う赤脾髄の脾洞の増生・拡張、および脾洞内皮に挟まれた赤脾髄間質(脾索)の狭小化が観察された。さらに、門亢症が高度になるにしたがって、赤脾髄脾索内における線維性コラーゲンの発現が増強し、その産生にかかわると考えられるalpha-SMA陽性細胞が同部位に多数認められた。また、脾索の線維化を判定量的に検討すると、術前の脾臓体積および血小板数との間に、それぞれ正および負の相関が観察され、門亢症の進行とともに脾臓赤脾髄の線維化が進行することが示唆された。2.ヒト硬変肝における脾摘後の単球/マクロファージ、肝幹細胞様細胞の観察脾摘を先行させた肝切除症例(肝癌患者)の非癌部組織を用いて、免疫組織学的検討を行った。一方、前述の脾摘症例(40例)のうち、経過観察期間に肝癌を発症して肝切除が施行された7例において、脾摘時の肝生検組織と肝切除時の非癌部肝組織を用いて、脾摘後の肝線維化の変化を検討すると、7例中6例で線維化の改善を認めた。これらの現象から、ヒトにおいても、線維化に陥った脾臓の摘出が肝線維化の改善に寄与することが示唆された。免疫組織学的検討はほぼ順調に進んでいるが、機能的な解析がやや遅れている。線維性コラーゲンの産生にかかわると考えられるalpha-SMA陽性細胞が同部位に多数認められ、赤脾髄の細網細胞マーカーを用いて、2重免染を行った結果、細網細胞の筋線維

芽細胞への形態変化が脾臓線維化の病態であることが示唆された。また、線維化の原因として、酸化ストレスの関与を検討したところ、赤脾髄における各種酸化ストレスマーカーの増強とNADPHoxidase(NOX)の強発現が観察された。このことから、門亢症の脾腫に伴う線維化に酸化ストレスが関与していることが強く示唆された。2.ヒト硬変肝における脾摘後の形態変化の観察(継続)脾摘を先行させた肝切除症例(肝癌患者)の非癌部組織を用いて、免疫組織学的検討を行った。脾摘後に多数の類円形で粗大な単球/マクロファージ(CD68陽性)が線維性瘢痕組織から肝小葉にかけて動員され、それに沿うように幹細胞マーカー(CK19, EpCAM)陽性細胞の拡がりが観察された。単球/マクロファージの一部は、MMP-1を発現していた。一方、前述の脾摘症例(40例)のうち、経過観察期間に肝癌を発症して肝切除が施行された7例において、9例中7例で線維化の改善を認めた。動因マクロファージを中心とした、肝修復機構の存在が示唆された。ヒトでの解析は順調に進んでいるが、肝発癌に与える影響については、解析準備中である。ヒト脾臓赤脾髄において、線維性コラーゲン産生細胞が観察されたことから、同細胞の由来および線維芽細胞への転換メカニズムの解明を進めていく。また、脾摘により脾臓内に集積した単球系細胞による肝線維化改善のメカニズム解明を進める。脾臓細網細胞の筋線維芽細胞への形質転換のメカニズムをさらに詳細に検討していく。また、脾摘と肝発癌の関連について、データ収集を図る。免疫組織学的検討を行うための抗体薬が海外業者が作製するものであり、抗体納入時期が29年度末までに間に合わないことにより、その購入予定額が次年度への繰越となった。今年度、予定通り繰越額を利用して抗体薬の購入を行う。脾臓線維化のメカニズムを検討する目的で、ヒト脾臓の免疫組織学的検討を進めたが、年度内に必要な抗体試薬が入手困難であり、次年度に繰り越して研究を行うこととなった。
骨肉腫治療標的分子の探索～ラット発癌モデルとマウス肺転移モデルによる解析～

当該研究においては、先行研究である基盤研究C(課題番号08099681)で得た成果を論文発表した。(Int J Oncol. 2012Feb;40(2):409-17.)本研究ではさらに骨肉腫肺転移成立過程における肺宿主細胞と骨髄由来細胞の役割を明らかにすることを重点的に実験を行った。文献的に報告のみられるGFPマウスから採取した骨髄細胞をC3Hマウスに移植する方法を試み予備実験にて骨髄は生着したものの、LM8マウス骨肉腫細胞を皮下移植しても肺転移は観察されなかった。MHCクラスI分子が異なるため何らかの拒絶反応が生じたと考えられ、骨髄由来細胞の関与を示す結果であったが、さらなる解析は困難と判断した。またPTH製剤テリパラチドをラットに長期投与して発生する骨肉腫から、さらなる細胞株樹立に努めたが、継代不可能なものが多く、結果的に細胞増殖の活発な1株と緩徐な1株の計2株の樹立に留まった。種々の条件でヌードマウスへの可移植性を検討したが、in vivoへの生着が得られなかった。この研究遂行上の障害は予測困難な要因によるものと判断している。この他、肉腫肺転移機構の解析を重点的に、骨肉腫から軟部肉腫(とくに滑膜肉腫)にも対象疾患を拡げて実施した。それぞれの肺転移モデルにおいて、皮下移植後の末梢血中および肺組織中のEPC, MSCを種々の条件下にてFACS解析にて定量するべく予備実験をおこなっていたがこの時点で研究責任者の異動に伴い継続困難となった。本研究にて得た知見を共同研究者に引継ぎをおこなったので、今後研究体制を整え再度進展を試みることになろう。まず先行研究である基盤研究C(課題番号08099681)で得た成果を論文発表した。本研究ではさらに骨肉腫肺転移成立過程における肺宿主細胞と骨髄由来細胞の役割を明らかにすることを重点的に実験を行った。先行研究ではGFPマウスのC3Hマウスへのバッククロスを計画したが、時間的制約から作成を断念していた。この反省から文献的に報告のみられるGFPマウスから採取した骨髄細胞をC3Hマウスに移植する方法に変更して再度この課題に取り組んだ。予備実験にて骨髄は生着し体表からもGFPを確認することに成功したものの、LM8マウス骨肉腫細胞を皮下移植しても肺転移は観察されなかった。また先行研究でLM8の初期肺転移巣の形成に肺の血管内皮細胞の関与が示されていたため、ルシフェラーゼを恒常的に発現するLM8細胞を左心室に注射し、尾静注モデル・皮下移植モデルと同様に肺への臓器特異的転移がみられるかをin vivo imaging (IVIS)にて観察した。しかし、心注後1週間でのIVISの観察では腎臓への転移が主となる結果で、4週たっても組織学的には肺転移は観察されなかった。LM8の血管内皮細胞への接着のみでは肺転移巣は成立しえないことを示す結果で、種々の臓器由来の血管内皮細胞の採取と培養が技術的に可能となっているが、この実験系を用いた解析に進むためにはさらに予備データが必要と考えられた。PTH製剤テリパラチドをラットに長期投与して発生する骨肉腫から、さらなる細胞株樹立に努めたが、継代不可能なものが多く、結果的に細胞増殖の活発な1株と緩徐な1株の計2株の樹立に留まった。このためPTH誘発骨肉腫モデルの解析は大きな進展が見られなかった。この遂行上の障害は予測困難な要因によるものと判断している。

我々が確立した骨肉腫肺転移モデルを用いた実験では、マウスの系統が異なるため先行研究と同様に困難がある。肉腫治療の現状を考えたとき、青少年に好発する骨肉腫が代表的疾患ではあるが四肢発生例の5年生存率は90%程度と高く、予後改善の余地が残される軟部肉腫も重要な研究課題である。このことから骨肉腫モデルでは比較的簡便なアプローチを選択した。大きなブレークスルーは得られなかったが、着実に知見を得てきており今後の展開に寄与するものと考えている。我々の研究グループでは骨肉腫の他、滑膜肉腫を種々の実験に用いており、次年度以降、さまざまな実験に供することができるよう、in vivo imagingで観察可能な細胞株の樹立を進めた。従来高肺転移株LM8にルシフェラーゼを恒常発現する細胞を実験に用いていたが、その親株であるDunn、また軟部肉腫として滑膜肉腫細胞株に同様のラベルしたものを作成した。また主としてこれらの実験を行う大学院生が1年目であったため、技術習得に時間を要したことも一因で、これらの要因により実質的な成果につながらなかったものと考えている。PTH誘導ラット骨肉腫は製剤開発当初しか入手困難でその細胞株は貴重であることから、ヌードマウスへの生着をさらに試みる。加えて病理学的解析とPTH応答性をすでに多くの知見が得られているラット骨肉腫細胞株UMR106と比較検討する。これらのデータをまとめて英文雑誌へ投稿へと進める。また当初の計画に立ち返り、平成24年度の研究を推進する。肉腫肺転移機構の解析を重点的に、骨肉腫から軟部肉腫(とくに滑膜肉腫)にも対象疾患を拡げて実施する。LM8肺転移モデルでは、皮下移植後の末梢血中および肺組織中のEPC, MSCを種々の条件下にてFACS解析にて定量する(経時的変化、親株DunnとLM8との比較、皮下移植モデルと尾静注モデルとの比較、異所性皮下移植肺モデル、Collagen gelなどにLM8培養上清を含浸させ、cell freeな系との比較など)。またEPC, MSCをあらかじめ尾静注したマウスにおける肉腫肺転移に与える影響を種々の条件下にて比較(VEGF, IGF, IL-6などのknock downした場合の影響もしくは中和抗体投与時の影響など)。これらの解析からEPC, MSCの転移形成における役割を明らかにするとともに、主にin vivo系を用いて骨髄由来細胞動員に果たす腫瘍細胞や肺組織の影響を明らかにする。すでに知見が得られている分子を中心に作用機序についても検討を加える。研究継続のため、平成23年度の研究経費とほぼ同等の経費が必要である。実験の中心となる大学院生は2年目となり技術の習熟が進み、本年度は昨年より研究推進しやすい状態となる。前年度繰り越した費用と合わせて昨年度同様の研究費が必要と見込まれる。
新しいpHおよび温度応答性材料の分子設計と機能発現

本研究は我々が見いだしてきたアミノ基とシリル基を有するポリサイラミンヘテロテレケリックの新規刺激応答性材料としての可能性を追求したものである。ポリサイラミンは主鎖にエチレンジアミンと3-シラペンタン構造を交互に有し今までにない全く新しい構造を有する。主鎖にシリコン結合を有するため、非常に運動性が高く、-90°C程度のガラス転移点を有している。しかしながらポリサイラミンのジアミン部分を酸によりプロトン化することにより主鎖の運動性が急激に低下する事がわかった。実際、そのガラス転移点は50°Cにも達する。この傾向は用いる酸によって変わることから、ケイ素のルイス酸性によりアニオンがポリマーにバインドすることが確かめられた。このようにアミノ基のプロトン化とともにシリコン周辺のアニオンバインドがポリマー鎖コンホメーションに大きく影響するため、ポリサイラミンを用いてi)表面処理剤、ii)架橋ゲルの2つの機能性材料設計を試みた。ポリサイラミンの片末端にアルコキシル基或いはチオール基を導入することによりガラス基板及び金表面へのポリサイラミンの担持が可能であった。実際、金表面では2.3nm^2/molとかなり高密度に表面処理が達成された。この表面はpH等の環境に応答して、表面の堅さを急激に変化させる新しい材料である。この表面ポリサイラミンの自由末端にはフリーのアミノ基を有し、機能分子の担持等更なる機能の付与が可能であり、興味深い。ポリサイラミンを基本骨格とするゲルはpHによりゲル鎖のゴム弾性が急激に変化するため、ゲルイオン浸透圧から期待される膨潤度に比べ、著しく大きい値を示した。この結果は、膨潤する事により柔らかくなるこれまでのイオン性ハイドロゲルとは全く反対の特性であり、新しい材料として有用である。このポリサイラミンゲルは廻りの温度によっても環境応答するため興味深い。
化学物質の呼吸器アレルギー感作性を評価する新しい動物実験代替法の開発

アレルギー感作性の評価の動物実験代替法の汎用性を考えると、プライマリーDCの代わりに株化したDCを用いる可能性を検討する必要がある。これまでに、株化したDCの良い細胞株は知られていない。そこで、今年度は、ヒトiPS細胞からDC前駆細胞を調製することを試みた。方法としては、いくつか報告が既にあるので、その内のフィーダー細胞フリーでサイトカインで分化誘導する方法と、ストローマ細胞(C3H10T1/2)を用いて分化誘導する方法で検討した。その結果、どちらの方法でも、途中に血液細胞が産生される塊iPS-Sacの形成を介して、血液細胞が分化誘導された。そこで、次に、このiPS-Sac由来の血液細胞をそのまま、さらにCD34+細胞に精製して、c-MYCやBMI1、BCL-XLなどの細胞周期・生存・死に関する分子をGFPとバイシストニックに発現するレンチウイルスを感染させた後、GM-CSFとSCFで培養を続けた。その結果、GFP陽性の増え続ける細胞が、得られることがわかった。まず、前者の方法でiPS-Sac由来の血液細胞をそのまま感染させた場合、GFP陽性細胞が直ぐに得られ、強い増殖性を有していたが、DCへの分化誘導能は低かった。一方、後者の方法で、iPS-Sac由来の精製したCD34+血液細胞を感染させると、徐々にGFP陽性の細胞の割合が増していき、この細胞はDCへの分化誘導能が高かった。実際に、3次元DC共培養系に用いると、代表的な感作性化学物質による刺激で、成熟化のマーカーであるCD86やCD80の共刺激分子の発現の増強や、Th2分化に重要なOX40L発現の選択的増強に見られる傾向にあった。ところが、細胞の継代の途中で急に増殖性が悪くなってしまった。現在、さらに、安定した増殖性の高い不死化したiPS細胞由来DC前駆細胞を作製する条件検討を続けている。安定した不死化したiPS細胞由来DC前駆細胞の作製は、未だ完成しておらずさらに現在検討中ではあるが、一般的に細胞株の樹立には時間がかかるため、想定の範囲内と言って良いと思う。今後の研究推進の方策として、(1)安定した細胞株の樹立には、時間がかかるため、平成30年度の増殖性の高い不死化したiPS細胞由来DC前駆細胞を作製する条件検討をさらに続ける。それと、(2) 3次元DC共培養系にCD4+T細胞も加えた3次元DC/T共培養系が確立できないかを、まず、プライマリーのヒト末梢血単球由来DCとCD4+T細胞を用いて検討する。(1)不死化の方法として、平成30年度までのc-MYC単独、c-MYC/BMI1、および3者の組み合わせに他に、不死化細胞の作製に汎用される不死化能力の高いヒトテロメア逆転写酵素hTERTの遺伝子をGFPとバイシストニックに発現したレトロウイルスも用いて検討する。既報では、c-MYCだけでも不死化細胞が作製できるとか、c-MYC/BMI1/BCL-XLではあるところで失速するとか、iPS細胞の種類により血液細胞になりやすい細胞とそうでない細胞があるとかあるので、これらについても検討する。(2)T細胞を用いた場合、アレルギーの感作性を調べる一番良いマーカーは、Th2分化の強力な分化誘導因子で、Th2細胞のエフェクターサイトカインでもあるIL-4である。そこで、DC系にさらにCD4+T細胞も加えた3次元DC/T共培養系を確立し、IL-4発現を指標に皮膚と呼吸器感作性の識別が可能か検討する。3次元DC共培養系では、刺激後24時間後にはDCの他の層への移動は殆ど見られなかったことより、DC層だけを外し、その上に新たにヒト末梢血由来ナイーブCD4+T細胞を加え、さらに2、5、7日後にリアルタイムRT-PCR解析を行う。用いるCD4+T細胞としては、アロジェニックとシンジェニックの場合が考えられるが、シンジェニックの場合は、アロジェニックな場合に比べ反応性が1/1031/104に落ちるので、再刺激の必要性も含め、どちらのT細胞が良いか比較検討する。

一方、後者の方法で、iPS-Sac由来の精製したCD34+血液細胞を感染させると、徐々にGFP陽性の細胞の割合が増していき、この細胞はDCへの分化誘導能が高かった。実際に、3次元DC共培養系に用いると、代表的な感作性化学物質による刺激で、成熟化のマーカーであるCD86やCD80の共刺激分子の発現の増強や、Th2分化に重要なOX40L発現の選択的増強に見られる傾向にあった。ところが、細胞の継代の途中で急に増殖性が悪くなってしまった。現在、さらに、安定した増殖性の高い不死化したiPS細胞由来DC前駆細胞を作製する条件検討を続けている。安定した不死化したiPS細胞由来DC前駆細胞の作製は、未だ完成しておらずさらに現在検討中ではあるが、一般的に細胞株の樹立には時間がかかるため、想定の範囲内と言って良いと思う。今後の研究推進の方策として、(1)安定した細胞株の樹立には、時間がかかるため、平成30年度の増殖性の高い不死化したiPS細胞由来DC前駆細胞を作製する条件検討をさらに続ける。それと、(2) 3次元DC共培養系にCD4+T細胞も加えた3次元DC/T共培養系が確立できないかを、まず、プライマリーのヒト末梢血単球由来DCとCD4+T細胞を用いて検討する。(1)不死化の方法として、平成30年度までのc-MYC単独、c-MYC/BMI1、および3者の組み合わせに他に、不死化細胞の作製に汎用される不死化能力の高いヒトテロメア逆転写酵素hTERTの遺伝子をGFPとバイシストニックに発現したレトロウイルスも用いて検討する。既報では、c-MYCだけでも不死化細胞が作製できるとか、c-MYC/BMI1/BCL-XLではあるところで失速するとか、iPS細胞の種類により血液細胞になりやすい細胞とそうでない細胞があるとかあるので、これらについても検討する。(2)T細胞を用いた場合、アレルギーの感作性を調べる一番良いマーカーは、Th2分化の強力な分化誘導因子で、Th2細胞のエフェクターサイトカインでもあるIL-4である。そこで、DC系にさらにCD4+T細胞も加えた3次元DC/T共培養系を確立し、IL-4発現を指標に皮膚と呼吸器感作性の識別が可能か検討する。3次元DC共培養系では、刺激後24時間後にはDCの他の層への移動は殆ど見られなかったことより、DC層だけを外し、その上に新たにヒト末梢血由来ナイーブCD4+T細胞を加え、さらに2、5、7日後にリアルタイムRT-PCR解析を行う。用いるCD4+T細胞としては、アロジェニックとシンジェニックの場合が考えられるが、シンジェニックの場合は、アロジェニックな場合に比べ反応性が1/1031/104に落ちるので、再刺激の必要性も含め、どちらのT細胞が良いか比較検討する。端数をピッタリ合わすことが難しいため、次年度使用額が生じた。次年度請求額と合わせて、消耗品の購入に充てる。
IgA腎症病態発現へのTh1/Th2バランス制御の効果-若年好発症IgA腎症 (HIGA) マウスへのIL-12投与の検討-

我々が確立した若年より高IgA血症を呈し、有意な腎及び脾臓でのTGFβの発現増強を伴い、IgA沈着と腎硬化病変を呈してくるHIGAマウスにおいて、そのIgA腎症様病態の背景にあるTh1/2バランスをさぐり、さらにIL-12投与によるその病態の変化を検討した。1) Th1/2バランスの検討Th1,Th2それぞれの特異的な優位性を示すC57BL/6およびBalb/Cマウスと比較した結果、加齢とともに脾臓CD4+細胞のIL-4およびTGFβの産生が増強していることが示された。これはのコントロールマウスでの加齢による低化とコントラストを呈するもので、本マウスに特徴的である。IFNγ発現は若年より他のマウスに比して高かった。また、どのマウスよりもTGFβの発現量は常に多かった。2) IL12投与実験病変の発現が完成した30週齢の本マウスに、Th1系を誘導するIL-12を300ng,7日間投与したところ、IgAの血中濃度の低下とともに腎糸球体の有意な細胞性半月体形成と間質細胞浸潤および腎内のマクロファージの浸潤増強を認めた。これは脾CD4+細胞のIL4の産生低下を伴っており、IL-12によるTh2→Th1へのshiftが起こっていることを示している。また元々増強していたTGFβの発現はさらに増強した。一方、本マウスではIFNγの発現もlatentに増強していることから、IL-12によるTh1の誘導が局所でのIFNγのさらなる発現を介して腎実質細胞を刺激するとともにマクロファージを誘い込み、半月体形成を起こしたと考えられる。以上の所見はヒトIgA腎症の急性炎症性病変増悪及び、その修復後の慢性腎硬化進行を免疫学的に説明しうる病態と考えられ、その意味で本マウスの慢性進行型IgA腎症モデルとしての可能性がさらに示唆された。(1)平成9年度においては10週令、及び30週令の雌HIGAマウス、及びTh1の優位コントロールとしてC57BL/6(B6)マウス、Th2優位コントロールとしてBalb/cマウス夫々10匹づつの血清を採取し、脾細胞中のCD4陽性T細胞のPHA,PMAで刺激し、上清を回収し、各種Th1/2細胞由来と考えられるサイトカイン濃度を測定した結果1)血中IgA濃度:10週令、30週令ともにHIGAマウスで有意に血中IgA高値を示し、B6マウスがそれに次ぎ、Balb/cマウスは低値であった。HIGAマウス、Beマウスともに加令によりIgA高値の有意な上昇をみた。2)脾細胞中のcytokine濃度:IL-4はbalb/cマウスで10、30週すべて有意に高く、B6では低値を示し、HIGAはその中間であった。IL-4は加令によりHIGAで有意に産生類が上昇したが、他のマウスでは低下し、加令によるHIGAマウスのTh2能の優位性が示された。UFN-γの産生は、各週令でBalb/のc産生がB6より強く、諸家の報告と一致しなかった。HIGAマウスでのIFN-γの産生能はB6より強く、無刺激下ではナイーブT-cellのIFN-γ産生能の上昇がある可能性が示唆された。

(2)同時に、脾腔内のマクロファージによるIL-12の産生能を検討したが、三種のマウス間に一定の傾向はなかった。(3)IL-12の短期投与においては、その100,300,1000ng/dayを7日間を30週令のHIGAマウスに投与し、CD4cellのIL-4産生能は、用量依存性に低下したが、300ng/dayの群で有意な腎病変の活動化を認め、同時に腎IgA沈着の減少を確認した。IL-12によるTh1への誘導が本マウスでは急性増悪をもたらしたと考えられ、ヒトIgA腎症の急性増悪の機序の解明につながると考えられた。我々が確立した若年より高IgA血症を呈し、有意な腎及び脾臓でのTGFβの発現増強を伴い、IgA沈着と腎硬化病変を呈してくるHIGAマウスにおいて、そのIgA腎症様病態の背景にあるTh1/2バランスをさぐり、さらにIL-12投与によるその病態の変化を検討した。1) Th1/2バランスの検討Th1,Th2それぞれの特異的な優位性を示すC57 BL/6およびBalb/Cマウスと比較した結果、加齢とともに脾臓CD4@@S1+@@E1細胞のIL-4およびTGF βの産生が増強していることが示された。これはのコントロールマウスでの加齢による低化とコントラストを呈するもので、本マウスに特徴的である。IFNγ発現は若年より他のマウスに比して高かった。また、どのマウスよりもTGF βの発現量は常に多かった。2) IL12投与実験病変の発現が完成した30週齢の本マウスに、Th1系を誘導するIL-12を300ng,7日間投与したところ、IgAの血中濃度の低下とともに腎糸球体の有意な細胞性半月体形成と間質細胞浸潤および腎内のマクロファージの浸潤増強を認めた。これは脾CD4@@S1+@@E1細胞のIL4の産生低下を伴っており、IL-12によるTh2→Th1へのShiftが起こっていることを示している。また元々増強していたTGF βの発現はさらに増強した。一方、本マウスではIFNの発現もlatentに増強していることから、IL-12によるTh1の誘導が局所でのIFNγのさらなる発現を介して腎実質細胞を刺激するとともにマクロファージを誘い込み、半月体形成を起こしたと考えられる。以上の所見はヒトIgA腎症の急性炎症性病変増悪及び、その修復後の慢性腎硬化進行を免疫学的に説明しうる病態と考えられ、その意味で本マウスの慢性進行型IgA腎症モデルとしての可能性がさらに示唆された。
日本の臭素系難燃剤汚染による環境及び人体負荷影響の解明

H1415年度の研究実績としては、以下のことが明らかとなった。まず、過去15年間に渡って、大阪湾及び大和川河口で毎年捕獲された、スズキ及びボラ試料を用いて臭素化難燃剤の汚染度の経年変化の検討を試みた。その結果、PBDEsの需要動向と、スズキとボラの可食部中に観察されたPBDEsの蓄積性においては、1990年までの低臭素化体中心の汚染と、91年以降の高臭素化体汚染に分けることができるという世界的にも極めて稀な汚染傾向を示すことが判明した。一方、TBBPAに関しては、その濃度変動も需要量には相関せず横ばいであった。次に、ヒト母乳を用いて、人体汚染実態の解明を試みたところ、PBDEsには、かなり汚染レベルに差異があることが観察されたまた、TBBPA及びTBPs濃度は、需要量の高いTBBPAよりもTBPs濃度の方が高く、母乳中に高濃度に含まれていることが明らかとなった。また、興味深いことに、初産婦試料の中において、PBDEs、TBBPA及びTBPsといったBFRs全てにおいて、他の母乳よりも高濃度に汚染されていることが観察され、高濃度暴露者の存在も明らかとなった。最後に、現在市販されている牛乳や粉ミルクを用いて比較、検討を試みた結果、PBDEs濃度を比較してみると、人口乳として繁用されている粉ミルク中に、極めて高濃度の汚染が観察された。これは、母乳において最高濃度を示した初産婦においても、その濃度は13ng/g lipidであったのに対して、粉ミルクでは、最高濃度で170ng/g lipidの試料が観察された。さらに、その異性体パターンを見ると、母乳に関しては、TeBDEやPeBDEといった低臭素化体のPBDEsが比較的高い割合で検出されたが、粉ミルクに関しては、HxBDEDeBDEといった高臭素化体のPBDEsの汚染がほとんどの割合を占めることが観察され、極めて興味深い結果となった。初年度においては、現在、BFRsとして最も使用されている四集化ビスフェノールA(TBBPA:27,300トン;全BFRs需要量の47%)と、欧州を中心に問題視されているポリ集化ジフェニルエーテル(PBDEs)に着目し、約16年前より大阪湾及び大和川河口で毎年捕獲され、長期保存されていたスズキとボラ試料を用いて、上記両化合物の需要動向とその汚染実態との関係について検討を試みた。その結果、19862000年までのPBDEsの需要動向とスズキとボラ可食部中に観察されたPBDEsの蓄積性には興味深い傾向が観察された。すなわち、1990年以前までは、低臭素化体の難燃剤であるTetra/PentaBDEsが使用されていたことより、両魚中に高濃度のPBDEs(36臭素化体)が蓄積していたのに対して、1991年以降ではそれら低臭素化体が減少していることが観察された。一方、DeBDEの需要は90年をピークにその後徐々に減少しているものの、魚中に観察されたDeBDEの蓄積濃度は95年までほぼ横這いであった。このことから、我が国のPBDEsによる魚介類等の海洋生物試料の汚染は、90年までの低臭素化体汚染と91年以降の高臭素化体(DeBDE)汚染に分けることができると考察した。

これは、1999年に大阪湾9カ所で採取した底質中のPBDEs汚染調査において、検出されたPBDEsの90%以上がDeBDEであったことからも支持された。TBBPAの需要量に関しては、調査初年度である1986年の需要量と比較して、2000年のそれは約2.7倍まで増加していたが、蓄積濃度に関しては、どの試料も比較的軽度な汚染であり、需要量の経年変動とは相関していなかった。これは、TBBPAが環境内及び生体内半減期が比較的短い化合物であることに帰因するものと推察された。H1415年度の研究実績としては、以下のことが明らかとなった。まず、過去15年間に渡って、大阪湾及び大和川河口で毎年捕獲された、スズキ及びボラ試料を用いて臭素化難燃剤の汚染度の経年変化の検討を試みた。その結果、PBDEsの需要動向と、スズキとボラの可食部中に観察されたPBDEsの蓄積性においては、1990年までの低臭素化体中心の汚染と、91年以降の高臭素化体汚染に分けることができるという世界的にも極めて稀な汚染傾向を示すことが判明した。一方、TBBPAに関しては、その濃度変動も需要量には相関せず横ばいであった。次に、ヒト母乳を用いて、人体汚染実態の解明を試みたところ、PBDEsには、かなり汚染レベルに差異があるととが観察された。また、TBBPA及びTBPs濃度は、需要量の高いTBBPAよりもTBPs濃度の方が高く、母乳中に高濃度に含まれていることが明らかとなった。また、興味深いことに、初産婦試料の中において、PBDEs、TBBPA及びTBPsといったBFRs全てにおいて、他の母乳よりも高濃度に汚染されていることが観察され、高濃度暴露者の存在も明らかとなった。最後に、現在市販されている牛乳や粉ミルクを用いて比較、検討を試みた結果、PBDEs濃度を比較してみると、人口乳として繁用されてしいる粉ミルク中に、極めて高濃度の汚染が観察された。これは、母乳において最高濃度を示した初産婦においても、その濃度は13ng/g lipidであったのに対して、粉ミルクでは、最高濃度で170ng/g lipidの試料が観察された。さらに、その異性体パターンを見ると、母乳に関しては、TeBDEやPeBDEといった低臭素化体のPBDEsが比較的高い割合で検出されたが、粉ミルクに関しては、HxBDEDeBDEといった高臭素化体のPBDEsの汚染がほとんどの割合を占めることが観察され、極めて興味深い結果となった。
オピオイドによる脊髄視床路ニューロン活動の調節機構

ラット(生後2週齢)視床VPL核に、麻酔下で蛍光トレーサー注入手術を行い、数日後に腰部脊髄スライス標本を作製した。逆行性標識されたスライス内の脊髄視床路(STT)ニューロンを、蛍光顕微鏡下に同定し、深部後角に分布するSTTニューロンからパッチクランプ記録を行った。脊髄深層にはμ型オピオイド受容体の存在することが知られている。前年度はこの選択的アゴニスト、DAMGO(1μM)を灌流液中に投与し、その作用を検討した結果、μ型オピオイド受容体の活性化によって、STTニューロンには過分極が引き起こされ、自発的な活動電位の発生も、興奮性シナプスが誘発する活動電位の発生も、ともに抑制作用を受けることが示唆された。引き続き今年度はシナプス入力が誘発する活動電位の発生様式を検討した。EPSP入力による発火パターン多くの中枢グルタミン酸作動性シナプスと同様に、STTニューロンに入力するEPSPは、AMPA受容体を介する成分とNMDA受容体を介する成分との両者から成っていた。AMPA受容体依存性スパイクの潜時は4-8msで、NMDA受容体依存性スパイク潜時は10-40msであった。検討した全てのSTTニューロンには、過分極で活性化されるカチオンチャネル(HCNチャネル)活性がみとめられたが、HCNチャネルブロッカーの投与によって、EPSP誘発性スパイクの発火ウインドウが延長したことから、STTニューロン発火ウインドウの設定に、HCNチャネル活性が関与すると考えられた。また一部のSTTニューロンではEPSPの低頻度繰り返し刺激により誘発スパイク数が増加していくWind-upが出現した。IPSP入力による発火パターンGABAおよびグリシン受容体を介するIPSPを刺激で誘発すると、HCNチャネルが活性化され、その結果リバウンドの脱分極でスパイクが発生した。このリバウンドスパイク潜時は約60-130msであった。ラット(生後2週齢)の視床VPL核に、麻酔下において蛍光ラテックスビーズの注入手術を行った。その数日後、腰部脊髄のスライス標本(厚さ400ミクロン)を作製し、逆行性に標識されたスライス内の脊髄視床路(STT)ニューロンを、蛍光顕微鏡下に同定しこれからパッチクランプ記録を行った。主として深部後角に分布するSTTニューロンから記録を行った。脊髄深層にはμ型オピオイド受容体の存在することが知られているので、この選択的アゴニスト、DAMGO(1μM)を灌流液中に投与し、以下1)-3)のパラメータに関して、その作用を検討した。1)STTニューロンの活動性の指標として、活動電位をセルアタッチト法により細胞外記録した。自発的に発生する活動電位の頻度は、DAMGOによって減少し、DAMGOを洗い流すと回復の傾向が見られた。2)ホールセル法によって膜電位を細胞内記録すると、DAMGOによって数ミリボルト以上の過分極が発生し、DAMGOを洗い流すと回復の傾向が見られた。3)細胞外通電刺激によって興奮性シナプス電位を誘発すると、これによって単発ないし複数の活動電位がSTT、ニューロンに発生した。刺激で誘発される活動電位の個数は、DAMGOによって減少した。また、活動電位発生までの潜時がDAMGOによって延長する場合があった。上記の結果から、μ型オピオイド受容体の活性化によって、STTニューロンには過分極が引き起こされ、自発的な活動電位の発生も、興奮性シナプスが誘発する活動電位の発生も、ともに抑制作用を受けることが示唆された。