hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低逆転頻度期の古地球磁場強度長期連続変動の解明－外核プロセスへの新たな制約

平行して、マイクロ波着磁/消磁システムの改良のため、導波管部品の一部選定と購入を行った。海底堆積物の残留磁化測定とデータ解析は順調であるが、火山岩試料の選定と、マイクロ波着磁/消磁システムの改良が進んでいないため。地球磁場変動は大きな強度変化も伴うが、その変化については、現在までに過去約200-300万年間の強度相対値連続変動が解明された状態に留まっている。すなわち、逆転頻度が100万年あたり4-5回という、地球史で見れば「現在」の熱境界条件下での変動が解明されたに過ぎない。本研究では、100万年あたり2回という低逆転頻度を示す過去約35004200万年間、つまり、「現在」とは熱境界条件が大きく異なる期間について強度連続変動の解明に取り組むことを目的としている。前年度までに測定を完了したIODP Site U1403, U1408, U1409, U1410 u-channel試料の自然残留磁化(NRM),非履歴性残留磁化(ARM),等温残留磁化(IRM)のデータ解析を進めた。これらの試料の詳細なNRM分析結果に基づく古地磁気極性層序の報告論文が受理・掲載された。Site U1403およびU1408の残留磁化データから、一定の岩石磁気的均質性を満たす深度区間を見出すことが出来たため、38-50 Maにおける古地磁気強度相対値連続変動の復元を試みることとした。高時間解像度で復元を行うことを目指し、u-channel連続試料の測定結果からデコンボリューション解析を行うための基礎的検討を行い、関連論文を投稿し、受理・掲載された。平行して、マイクロ波着磁/消磁システムの改良のため、導波管部品の選定・購入も継続して行った。前年度と同様、海底堆積物の残留磁化測定とデータ解析は順調であるが、火山岩試料の選定とマイクロ波着磁/消磁システムの改良が進んでいないため。IODP Site U1408, U1409, U1410からの試料について、ARMおよびIRM測定を進めて行く。マイクロ波着磁/消磁システムの改良についても、平行して取り組む。IODP Site U1403, U1408, U1409, U1410 u-channel試料の各種残留磁化測定の結果の詳細解析を進め、過去約3500万年前5000万年前の期間の古地磁気強度相対値連続変動の復元に取り組む。NRM, ARM, IRMデータの解析を完了させ、良好な岩石磁気特性パラメーターを示す層準を選別し、過去約3500万年前4200万年前の期間を中心に古地磁気強度相対値連続変動を復元する。火山岩試料の選定と、マイクロ波着磁/消磁システムの改良を継続する。
原子炉遠隔実習のシステム整備と実践

教育用原子炉を用いて原子炉の実験や実習を学生が行う場合に,設備や放射線の安全管理のために利用時間を十分に確保できない状況にある.そこで,インターネットを用いた遠隔教育のシステムを開発して,原子炉を用いた実験や実習を実践した.そして,インターネットを用いた遠隔教育と原子炉実習を組む合わせた体系的な原子炉教育システムを提案した.教育用原子炉を用いて原子炉の実験や実習を学生が行う場合に,設備や放射線の安全管理のために利用時間を十分に確保できない状況にある.そこで,インターネットを用いた遠隔教育のシステムを開発して,原子炉を用いた実験や実習を実践した.そして,インターネットを用いた遠隔教育と原子炉実習を組む合わせた体系的な原子炉教育システムを提案した.この取り組みは,近畿大学原子力研究所の教育研究用原子炉を用いて行われている原子炉のしくみを学ぶ実習をインターネットを用いた遠隔教育に取り込んで実施することをめざしている.実現の可能性が確認できた試行段階の現状から出発して,遠隔実習システムの整備,教材の開発,実習の実践へと展開していく計画である.今年度はシステムの整備と一部教材の開発を進めた.遠隔の教室で中心的なツールとなるのは,コンピュータのディスプレイに原子炉の運転状況を分かり易く表示した「仮想コンソール」と称する画面である.この画面は,原子炉出力の変化およびこれを制御している制御棒の動きを時間的な推移が理解し易いグラフィックによって表すと同時に,運転員の操作あるいは原子炉室など関連箇所を切り替えで映した映像で構成する.グラフィックに比べると映像の充実度が低かったため,Webカメラ等の補強および画像処理の改善を行った.一方,教材開発においては,インターネットを用いたオンラインの遠隔実習の内容を整理して,原子炉を運転していないオフラインでも教材として使えるようにデジタルライブラリーとすることを開始した.原子炉実習テキストにある実習課題の中で,原子炉施設に立ち入ることなく実施可能な課題の一部について課題別の教材を作成した.これは,教員による課題の解説と運転員による操作を兼ねた映像,そして運転のデータを示すグラフィックが映像に同期して再生されるしくみである.教材開発に関しては次年度以降の計画を多少前倒しした.これは,近畿大学の原子炉での実習に摂南大学の学生が参加したため,上記の教材の効果を予習と復習で試す機会として前倒しした.この結果,本年度予定していたシステム整備の一部に遅れが生じたため,原子炉点検のためのインターフェイスなどは次年度に継続することになった.近畿大学原子力研究所の教育研究用原子炉では,大学の工学系学科の学生を中心に原子炉のしくみを学ぶ体験型実習プログラムを長年実施している.この実習にインターネットを用いた遠隔教育を加える試みに取り組んでいる.今年度は遠隔実習システムの整備,教材の開発,遠隔実習の実践に関して次のように実施した.原子炉の運転状態を表す制御コンソール上の表示において,遠隔実習では出力系と制御系の情報を今まで使用していた.今回のシステムの整備では,原子炉起動前点検など安全確認のための実習課題向けに,起動系や安全系の各種警報の表示灯を追加する必要があった.この情報を得るためのインターフェイスの動作確認を行い,出力系と制御系に統合して運転データをコンピュータに取り込むインターフェイスの仕様を確定した.そして,統合インターフェイスを現在製作中である.教材の開発ではサーバ用コンピュータを設置した.実習課題別に原子炉を運転して教員が解説をする映像とこの運転記録のデジタルデータをこのサーバに蓄積している.実習の実践では,原子炉を運転中に運転記録を遠隔の実習教室に送信してリアルタイムで行う学習方式の遠隔実習を東海大学工学部原子力工学科の学生を対象に平成22年10月に実施した.原子炉の運転と連動せずに上記(2)の教材を使って行う学習方式に比べると,リアルタイムで行う方式の実践機会は少ない.このため,今回は遠隔地におけるネットワーク設備などで多くの知見が得られた.詳細は今年9月の日本工学教育協会の年次大会にて発表を予定している.近畿大学原子力研究所では,教育研究用原子炉を用いて大学生のための実験や実習が行われている.これをインターネットを介して遠隔の教室で実施するシステムを整備して,原子炉遠隔実習を実践する.昨年度に引き続き,教材の作成と教育実践を行う計画であった。教材作成とは,原子炉施設で行う各種の実験に遠隔の教室からでも参加できるようにするために必要な機器やソフトウェアを作成することである.今年度は原子炉内の放射線を測定する遠隔実験に取り組んだ.原子炉内の中性子数の空間分布を遠隔から測定する実験である.小型の中性子検出器を炉内で上下に移動させて,中性子数の垂直方向の分布を測定した.測定法がシンプルで理解しやすく,10分程度の短時間で測定結果が得られるため遠隔実験の課題として適している.詳細は近畿大学原子炉等利用共同研究経過報告書(平成23年度)で報告する予定である.遠隔実習の実践に関しては,計画どおりには捗らなかった.原子力人材育成プログラムなど大学生を対象にして近畿大学原子力研究所で毎年行われている原子炉実習が,福島第一原子力発電所の事故の影響により例年の規模では開催されなかった.また,学生および一般社会人の関心が,現状では原子炉のしくみを知るよりは,放射線の知識と人体への影響について知ることに集まっている。放射線についての実験や実習の課題をこの遠隔実習の内容に加える必要がある.このように,今後日本における原子力発電の必要性についての議論が進み,日本のエネルギー源としての原子力発電の位置づけが定まってくれば,この遠隔実習の内容も社会のニーズに対応していくことが大切である.
超流動^3He-エアロジェル系における音波の理論的研究

昨年度に定式化した、二流体モデルに基づく現象論とケルディシュグリーン関数形式の微視的理論を用いて以下の研究を行った。1.第四音波に対する不純物効果。狭い隙間に閉じ込められた超流動ヘリウム3-エアロジェル系の音波を解析し、純粋なヘリウム3の場合とは異なるメカニズムで第四音波が伝搬することを示した。この研究結果を7月にイタリアで開かれた低温物理国際会議(QFS2004)で発表した。2.エアロジェル中超流動ヘリウム3における超音波吸収実験の解析。超流動相がBalian-Werthamer状態にあることを仮定し、理論モデルに含まれるパラメータを適切に選ぶことによって、常流動相から超流動相までの全温度領域で実験結果を再現することに成功した。この研究は11月に東京で開かれた国際会議(ISSP-9)の招待講演に選ばれた。3.超流動秩序変数の集団励起に対する不純物効果。純粋な超流動ヘリウム3では、squashing modeと呼ばれる秩序変数の集団励起が超音波吸収ピークとして明瞭に観測されるが、エアロジュル中では観測されないことがNorthwestern大学の実験グループによって報告された。その原因として、不純物散乱による準粒子状態密度の構造変化が考えられることを本研究で示した。この研究結果は2005年8月にフロリダで開かれる低温物理国際会議(LT24)で発表する予定である。上記の研究と平行して超流動ヘリウム3の音響インピーダンスの理論的研究を行った。従来の理論では考慮されていなかった、表面散乱による対破壊効果を定量的に評価することによって、実験とのよい一致が得られることを示した。超流動ヘリウム3のA相とB相での音響インピーダンスの数値計算結果を、それぞれ、QFS2004とISSP-9で報告した。エアロジェルは、シリカの鎖状高分子が網目状のネットワークを形成している物質で、非常に大きな空孔率をもつ多孔質体である。エアロジェル中に液体^3Heを導入すると、その混合系は、異方的BCS状態における不純物効果を研究するための理想的なモデル物質となる。本研究の目的は、この系の動的性質、特に、音波伝播の特徴を明らかにすることである。超流動^3He-エアロジェル系のダイナミクスを議論する際に留意すべき点は、低周波音響実験によって明らかにされたように、エアロジェルは液体と連動して弾性振動するため、エアロジェルを単に固定された不純物の集合体と見なすことはできないことである。本研究ではこの事実を考慮し、エアロジェルをランダムに分布した不純物のネットワークから成る弾性体と捕らえ、その弾性運動と液体の運動との結合を不純物散乱過程での運動量交換に起因する一種の摩擦力を導入して記述し、超流動^3He-エアロジェル系の音波伝播の微視的理論を構築した。理論の定式化には、ケルディシュ形式の非平衡グリーン関数理論を用いた。本年度の前半で、音波伝播の微視的記述に必要な方程式群を整理した。また平行して、二流体理論に基づく現象論を展開し、流体力学的音波の分散関係を導出した。この分散関係から、エアロジェル中の第4音波の減衰が、エアロジェル液体間の摩擦に支配されることを明らかにした。本年度の後半では、微視的理論を流体力学的領域に適用し、先に導出した流体力学的音波の分散関係に対する微視的裏付けを与えるとともに、二流体理論に現れる現象論的パラメータを決定した。
単離平滑筋細胞におけるカルシウム動態と平滑筋作用薬の評価

平滑筋作用薬を正しく評価し、より優れた薬物を開発する基礎を作るためには、個々の薬物を最新の知識に照らし、かつ生理的条件下でその作用の詳細を解折しなければならない。そのような立場から、細胞内カルシウム動態に関して生化学的に解明された最新の事実を生理的条件下に検索できる単離平滑筋細胞の実験糸を確立することが本研究の目的である。すでに昨年度には基本的ないくつかの部分システムについての検討を終えているが、本年度には総合的に種々の検討を行い、次のような実験糸が確立された。1.昨年度の補助金で購入した顕微蛍光測光システムを用い、単離細胞内に注入したfura-2の蛍光強度を340nmと380nmの2波長励起で測定し、細胞内カルシウム濃度を測定する。2.パッチ電極を介して膜電位を制御し、膜電流を測定する。あるいはそのパッチ電極を介して細胞内にfura-2その他の物質を注入する。3.圧力注入装置を用い、ガラス微小電極内に充填したカルバコールなどのアゴニストを単離細胞の近傍に投与する。膜電位、膜電流、蛍光強度の信号は持続的にPCMレコーダーに取り込むことも、単発現象をA/D変換ボードを介してマイクロコンピューターに取り込むこともできる。1、2、3の実験はどの組合せでも、また3者同時にも行うことができる。このような実験系によって、例えばイノシトール三燐酸をパッチ電極から注入して細胞内カルシウム濃度の増加を確認し、また、それに対する薬物の効果を見ることができた。現在予定より少し遅れてしまった、これらの技術を駆使して、G蛋白質の作用を阻害するGDPβS、あるいはイノシトール三燐酸とその受容体の結合を競合的に阻害するヘパリンなどを細胞内に注入してから、細胞外にアゴニストを投与してそのときのカルシウム動態がどのように変化するかを見ることなどを含め、平滑筋の細胞内カルシウム動態の解折を進めているところである。本研究の初年度の計画は,単離平滑筋細胞にパッチクランプを行いながら細胞内カルシウム濃度を測定する方法を確立することである.これらの方法の内,我々の経験が最も少ないのはパッチクランプであったので,細胞が細長く電気的な特性の点で不利な平滑筋細胞を使う前に直径数ミクロンの球状細胞を用いて予備的実験を行った.細胞をパッチピペットに吸着させ,ギガシールを形成した後,ピペットに陰圧を加えることによって局所の細胞膜を破り,いわゆるホールセルクランプを行うことができた.この状態で細胞内カルシウム濃度を測定するために,細胞内に蛍光カルシウム指示薬furaー2を導入して340及び380nmで励起したときの蛍光強度を測定した.Furaー2の導入には,パッチ電極から直接注入するか,或は保存液中にfuraー2AMをくわえて細胞自身に取り込ませる方法の両方を試みたが,どちらの場合の十分量のfuraー2を導入することができた.安定したパッチクランプ及び蛍光測定をおこなうためには,測定系の振動を極力抑えなければならないが,空気バネ式の除振台によってそれを達成することができた.得られた測定値すなわち,膜電位,膜電流, 340nm励起及び380nm励起の蛍光強度は,アナログデジタル変換機によって数値データに変えた後マイクロコンピューターによって取り込み磁気ディスクに保存した.この様な新しい実験系の開発と並行して,スキンドファイバーを用いた研究を進めた.我々は,共に平滑筋カルシウムストアは均一ではなく,カルシウムによるカルシウム放出機構とイノシトール三燐酸によるカルシウム放出機構(IICR)の両方を持つストア(Sα)とIICRのみを持つストア(Sβ)があることを示した.今年度リアノジンがSαの機能を選択的に除去することを見出した.次年度は,この様な新しい発見を単離平滑筋細胞の実験に応用して,更に詳しい平滑筋のカルシウム動態を研究して行く.平滑筋作用薬を正しく評価し、より優れた薬物を開発する基礎を作るためには、個々の薬物を最新の知識に照らし、かつ生理的条件下でその作用の詳細を解折しなければならない。

現在予定より少し遅れてしまった、これらの技術を駆使して、G蛋白質の作用を阻害するGDPβS、あるいはイノシトール三燐酸とその受容体の結合を競合的に阻害するヘパリンなどを細胞内に注入してから、細胞外にアゴニストを投与してそのときのカルシウム動態がどのように変化するかを見ることなどを含め、平滑筋の細胞内カルシウム動態の解折を進めているところである。
リアノジン受容体不整脈原性変異体の活性制御モデル構築と治療薬探索への応用

心筋のCa2+遊離チャネルである2型リアノジン受容体(RyR2)の変異は、カテコラミン誘発性多型性心室頻拍、特発性心室細動、QT延長症候群からの不整脈など、様々なタイプの致死性不整脈や突然死を引き起こすことが知られているが、その発症機序や治療方法はまだ確立されていない。本研究計画では、RyR2の様々な変異がどのような性質を持ち、どのような機序で種々の疾患を引き起こすのか調べ、またそれらの治療薬法の基盤を作る事を目的とした。平成27年から29年度にかけては、様々な疾患変異について、HEK細胞発現系を用いた疾患変異の機能評価と、培養心筋細胞セルラインを用いた不整脈発生メカニズムの検討を行った。変異RyR2安定発現HEK細胞系では、細胞質および小胞体のCa2+モニタリング、[3H]リアノジン結合によりRyR2活性を定量的に評価した。その結果、催不整脈性変異にはCa2+遊離活性が亢進するgain-of-function (GOF)型と活性が著しく低下するloss-of-function (LOF)型がある事を見出した。GOF型では活性の亢進の程度と疾患の重症度に良い相関がみられた。一方、WT RyR2を恒常発現する培養心筋細胞に変異RyR2を発現させ、LOF型の不整脈発生機序について検討したところ、LOF変異は、さらに二つの型に分けられることが分かった。平成29年から30年度にかけては、上述の過程で見出した小胞体Ca2+モニタリングを利用したRyR2作用薬の大規模スクリーニング系を構築し、数種類の新規RyR2阻害薬を見出した。それらのいくつかは心不全モデルマウスやRyR2変異マウス心筋で見られるCa2+ sparkやCa2+ wave等の不整脈の前兆現象を抑え、摘出心筋の異所性自動能も抑制した。RyR2阻害薬の抗不整脈薬としての応用可能性が示唆された。心筋興奮収縮連関に中心的な役割を果たすCa2+遊離チャネル/2型リアノジン受容体(RyR2)の変異はCPVT (カテコラミン誘発性多型性心室頻拍)をはじめとしたさまざまな心室性不整脈疾患の原因になる事が知られる。RyR2のCa2+遊離活性は、細胞質側のCa2+ (CICR)と小胞体内腔側Ca2+ (SOICR)の2種類の機構により制御されるが、CPVTやその他の疾患変異においてこれらの制御がどのように変化するのか未だ一致した見解がない。本研究計画ではRyR2変異がどのように心室性不整脈につながるCa2+動態をもたらすか理解し、治療薬探索のための基盤を作ることを目的とする。27年度は、心室性不整脈疾患として、CPVTと特発性心室細動(IVF)、QT延長症候群(LQTS)に関連付けられる変異に注目した。変異RyR2をHEK細胞に発現し細胞質及び小胞体のCa2+動態解析を行い、また[3H]リアノジン結合によりCa2+依存性Ca2+遊離(CICR)活性を測定した。さらにCICR活性から得られたパラメータを用い、Ca2+動態のシミュレーションを試みた。その結果、RyR2からの自発的Ca2+遊離は基本的には細胞質側のCa2+、すなわちCICRにより制御されること、すべてのCPVT変異ではCICR活性が高まり自発活動性が上昇している事が分かった。一方、IVFやLQTS変異ではCICR活性が高まるものと低下する変異があることが、蛋白発現して解析する事により初めて明らかとなった。現在、計画通り、細胞質およびERのCa2+測定、[3H]リアノジン結合によるCICR活性を感度よく定量的に測定することが出来、それぞれの疾患変異の重症度や性質が明らかになってきた。また、シミュレーションも連携研究者の協力により順調に進んでいる。さらに、RyR2阻害薬および促進薬の探索も同じシステムを用いてはじめたところである。。心筋細胞の興奮収縮連関において中心的な役割を果たしている小胞体Ca2+遊離チャネル/2型リアノジン受容体(RyR2)の変異は、カテコラミン誘発性多型性心室頻拍(CPVT)、特発性心室細動(IVF)、QT延長症候群(LQTS)等さまざまな催不整脈性疾患の原因になることが知られる。これらは、リアノジン受容体の変異が何らかのCa2+調節機構の異常をきたし、不整脈を惹起すると考えられるが、それぞれの疾患の詳しい機序や治療法はまだ確立されていない。本研究計画では、RyR2の様々な変異がどのようなCa2+動態変化を起こし種々の催不整脈性疾患を惹起するのか明らかにし、治療薬探索のための基盤を作ることを目的としている。研究実績は以下の3つに大別される。1.平成27年度から28年度にかけ、様々な変異RyR2を非心筋細胞であるHEK293細胞に発現して細胞質と小胞体Ca2+をモニターし、また[3H]リアノジン結合測定によるCa2+依存性活性の測定から、変異RyR2分子単独の性質を調べた。その結果、催不整脈性RyR2変異体にはgain-of-functionタイプ(CPVT、IVF、LQTS)とloss-of-functionタイプ(IVF、LQTS)の全く性質の異なるものがあり、同じ診断名が付いていてもその機序には正反対のものがある事を見出した。

2.平成28年度は心筋系の培養細胞(マウス心筋由来のHL-1細胞、ヒトiPS細胞由来分化心筋細胞)への発現に成功し、心筋環境下の変異RyR2の特性を検討した。活動電位を有する心筋細胞での検証により、Ca2+動態変化から不整脈に至る過程の検討が可能になった。3.この研究の過程で確立したER Ca2+測定法を利用し、共同研究者の協力を得て化合物ライブラリからRyR2に作用する薬物の探索を行い、現在いくつか有望な薬物候補が見出されている。計画通り、HEK293細胞を用いた定量的な活性測定法を確立し、変異体の重症度の判定が出来るようになった。また、Ca2+誘発性Ca2+遊離活性と自発的Ca2+オシレーションの関係を見出した。さらに心筋系培養細胞への発現にも成功し、不整脈発生機序の理解の道筋を付けた。さらには、小胞体Ca2+モニタリングによるRyR2作用薬の探索に着手し、実際にいくつかの有望なRyR2作用薬の候補を見出した。これらを考慮すると、計画はおおむね順調に進捗している。心筋の興奮収縮連関に重要な役割を果たす筋小胞体のCa2+遊離チャネル/リアノジン受容体(RyR2)は5000アミノ酸サブユニットのホモ4量体から成る巨大なチャネル蛋白で、その変異は様々な致死性不整脈を惹起することが知られている。すでに300か所を越える疾患変異(優性変異)が報告され、これらが惹起する不整脈にはカテコラミン誘発性多型性心室頻拍(CPVT)、特発性心室細動、単連結性トルサードポアン、QT延長症候群などがある。しかしこれらの変異がなぜ様々な不整脈疾患を引き起こすのかよく分かっていない。本研究では、上記の様々な疾患変異について、HEK細胞発現系を用いた疾患変異の機能評価と、培養心筋細胞セルラインを用いた不整脈発生メカニズムの検討を行った。変異RyR2を安定発現させたHEK細胞系では、細胞質および小胞体のCa2+モニタリング、[3H]リアノジン結合によりRyR2活性を定量的に評価した。その結果、催不整脈性変異にはCa2+遊離活性が亢進するgain-of-function (GOF)型と活性が著しく低下するloss-of-function (LOF)型がある事を見出した。GOF型では活性の亢進の程度と疾患の重症度に良い相関がみられた。一方、WT RyR2を恒常発現する培養心筋細胞に変異RyR2を発現させ、LOF型の不整脈発生機序について詳しい検討を行った。その結果、LOF変異は、さらに二つの型(心筋細胞に自発的Ca2+遊離(Ca2+ wave)を引き起こすものと、全くCa2+ waveを起こさずに活動電位誘発性Ca2+トランジエントのピークを減少させ小胞体Ca2+蓄積を起こすタイプ)に分けられたことから、WTとLOF変異型のヘテロ4量体チャネルの性質の違いがCa2+動態の違いに反映される事が示唆された。これらが再分極過程に及ぼす影響について数理モデルを用いて検討中である。さらに申請者は小胞体Ca2+モニタリングを利用し、RyR2作用薬のハイスループットスクリーニング系を立ち上げ、いくつかの新規RyR2阻害薬を見出した。(1)HEK発現系: HEK細胞に野生型および疾患変異RyR2を発現し、細胞質と小胞体のCa2+変化および[3H]Ca2+遊離活性を定量的に測定した。その結果これまでに調べた20種類のCPVT変異については、CICR活性が亢進し自発的Ca2+遊離活性が亢進するgain-of-function型であることが分かった。
軽いハイパー核の3体・4体構造とハイペロン混合

ハイパー核分野で、早急に要求されているΛΛ-ΘN-ΣΣ相互作用を含む軽いハイパー核の3体・4体構造研究を行った。まず、^4H_<ΛΛ>の精密4体計算を行い、この未発見ダブルラムダハイパー核が束縛状態として存在するためには、引力的なΛΛ-ΘN-ΣΣ相互作用が必要不可欠であることが本研究から明らかにされた。さらなる解析のためには、クオークレベルからの研究の必要性を感じた。しかしながら、クオークレベルからの研究をおこなうためには、uuddssの6体問題に基づく研究になるため、報告者の理論では非常に困難である。しかし、この研究へ少しでも近づくために、uudds-barの5体計算を行った。おりしも、2003年、テータ粒子として阪大実験グループが発見し、現在、話題を呼んでいる。報告者は、6体問題への一つの足がかりとして、この5体問題を研究することにした。この5体計算を行うために、(1)報告者が提唱開発した「ガウスローブ基底関数に基づく少数多体計の厳密計算法」を適用し、精密5体計算として取り扱う。(2)N+K散乱チャネルを陽に取り入れるように理論・計算プログラムを完成させる。(3)強いクオーク・クオーク間、クオーク・反クオーク間相関を適切に記述できる組み替えチャネル5体系基底関数を作成する。(4)クオーク間相互作用としては、Isugrらが3クオーク系、4クオーク系に使用した標準的な相互作用を用いる。この計算で分かったことは以下の通りである。(i)N+Kチャネル以外のconfinedチャネルの基底関数を用いるとテータ粒子の発見されたエネルギー領域に、1/2^-,1/2^+の束縛状態が存在する。しかし、これらの状態は、N+K散乱チャネルを加えて散乱の境界条件の元に解くと、非共鳴連続状態となる。(ii)より高いエネルギー領域に幅の狭い共鳴状態が存在する。1/2^-でN+Kの閾値より540MeV上に幅が0.24MeVの共鳴が、1/2^+で539MeV上に幅が110MeVの共鳴が存在することを明らかにした。これは、実験値と異なる結果を生み出している。さらなる解析を行っているところである。KEKにおけるJ-PARCプロジェクトを視野に入れたストレンジネス核物理の最優先課題の一つはダブルラムダハイパー核の生成である。2000年に初めてダブルラムダハイパー核、^6_<ΛΛ>Heが不定性なく束縛状態として発見された。この発見は、皆無に等しいYY相互作用の情報に新しい光を投げかけるものである。また、上記のように、現在、ダブルラムダハイパー核生成の計画が進行中である。従って、実験に先駆けた発見されるであろうダブルラムダハイパー核のエネルギー準位の理論的予言が最重要課題である。報告者は、まず^6_<ΛΛ>Heをα+Λ+Λの3体問題に基づいて、構造研究を行い、ΛΛの望ましい強さを現象論的に決めた。そして、未発見のダブルラムダハイパー核、(i)^7_<ΛΛ>Heをα+N+2Λ,(ii)^9_<ΛΛ>Li, ^9_<ΛΛ>Beをα+3^H(3^He)+2Λ, (iii)^10_<ΛΛ>Beを2α+2Λの4体計算に基づいた構造計算を行い、実験に先駆けた準位構造の予言を行なった。ここで、KEK-E373実験で発見された^10_<ΛΛ>Be(デマチヤナギイベント)が励起状態の発見であることを指摘した。ここで用いたΛΛ相互作用は、ΛΛチャネルのみの相互作用である。次年度は、ΛΛ-≡N-ΣΣ結合を含む現実的YY相互作用を用いて、ΛΛ-≡N-ΣΣ結合メカニズムの解明を行なう。今年度の研究成果をPhysical Review Cに掲載した。また、この研究成果を2002年8月に上海で行なわれた「第2回アジア・パシフィック少数系物理国際会議」、及び2002年9月にスロベニアで行なわれた「第18回ヨーロッパ少数系物理国際会議」で招待講演者として発表した。近年、^6He_<ΛΛ>が束縛状態として発見された。また、新しくダブルラムダハイパー核が発見される可能性が示唆されており、理論的予言が急務とされておる。報告者は、これまでの理論的予言・来るべき実験データの解析・評価の成果によって、報告者の理論的研究は十分に予言力があると確信している。そこで、報告者は、この^6He_<ΛΛ>の実験データを足がかりとして、^4H_<ΛΛ>の精密4体計算を行なった。この核は束縛状態として存在する可能性が実験的に示唆されている最も軽いダブルラムダハイパー核であり、近年E906でその存在を示唆する実験データが得られたが、束縛エネルギーが求まるまでに至らなかった。^4H_<ΛΛ>の探索実験は引き続き計画されており、KEK-JAPERIで計画されているJ-PRACプロジェクトのハイパー核物理実験プロジェクトの一つの実験でもあり、このハイパー核の理論的研究は急務とされている。

報告者は、自身の精密4体計算を活用し、現実的YY相互作用を用いて、^4H_<ΛΛ>の束縛状態としての存在の可能性を吟味した。まだ準備的段階の計算であるが、^4H_<ΛΛ>が束縛状態として存在するためには、ΛΛ-ΞN結合相互作用が重要であることが分かった。また、同時に、この核が束縛するためには、28MeV上に存在するNNNΞ閾値からみて、NNNΞ状態がどの位置に存在するかに依存することが分かった。したがって、^4H_<ΛΛ>の束縛状態の存在の有無の議論のためには、Ξハイパー核の構造研究も同時に重要であることが分かった。現在、NNNΞ系、及びNNΞ系についても平行して構造研究を進めている。^4H_<ΛΛ>やNNNΞ系、NNΞ系の詳細な構造研究については、平成16年度に引き続き行なう予定である。ハイパー核分野で、早急に要求されているΛΛ-ΘN-ΣΣ相互作用を含む軽いハイパー核の3体・4体構造研究を行った。まず、^4H_<ΛΛ>の精密4体計算を行い、この未発見ダブルラムダハイパー核が束縛状態として存在するためには、引力的なΛΛ-ΘN-ΣΣ相互作用が必要不可欠であることが本研究から明らかにされた。さらなる解析のためには、クオークレベルからの研究の必要性を感じた。しかしながら、クオークレベルからの研究をおこなうためには、uuddssの6体問題に基づく研究になるため、報告者の理論では非常に困難である。しかし、この研究へ少しでも近づくために、uudds-barの5体計算を行った。おりしも、2003年、テータ粒子として阪大実験グループが発見し、現在、話題を呼んでいる。報告者は、6体問題への一つの足がかりとして、この5体問題を研究することにした。この5体計算を行うために、(1)報告者が提唱開発した「ガウスローブ基底関数に基づく少数多体計の厳密計算法」を適用し、精密5体計算として取り扱う。(2)N+K散乱チャネルを陽に取り入れるように理論・計算プログラムを完成させる。(3)強いクオーク・クオーク間、クオーク・反クオーク間相関を適切に記述できる組み替えチャネル5体系基底関数を作成する。(4)クオーク間相互作用としては、Isugrらが3クオーク系、4クオーク系に使用した標準的な相互作用を用いる。この計算で分かったことは以下の通りである。(i)N+Kチャネル以外のconfinedチャネルの基底関数を用いるとテータ粒子の発見されたエネルギー領域に、1/2^-,1/2^+の束縛状態が存在する。しかし、これらの状態は、N+K散乱チャネルを加えて散乱の境界条件の元に解くと、非共鳴連続状態となる。(ii)より高いエネルギー領域に幅の狭い共鳴状態が存在する。1/2^-でN+Kの閾値より540MeV上に幅が0.24MeVの共鳴が、1/2^+で539MeV上に幅が110MeVの共鳴が存在することを明らかにした。これは、実験値と異なる結果を生み出している。さらなる解析を行っているところである。
強太陽光環境下での塩素化ナフタレンの光分解挙動の実態把握

当該年度の目標は、75種類の異性体を持つ塩素化ナフタレン(PCN)について、二次元ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて全異性体を完全分離すること、及び当該年度以前に実施した実環境での太陽光照射試験結果と疑似照射試験である耐候性試験結果を比較することであった。前者では、低塩素化体をより多く含む飛灰試料を抽出・精製しPCNの同定を試みたが、三塩素化体の完全分離は困難であった。ただし、全73ピークの分離は実現している。後者では、米国(ハワイ州)、中国(雲南省・四川省・北京)及びインド(ラジャスターン州)での実環境下での太陽光照射試験結果と耐候性試験結果を比較したところ、照射条件等を完全一致させることは困難であったが、PCN光分解の過程において両者に共通の異性体及び光分解物の存在が確認できた。共通の異性体はダイオキシン様毒性が報告されている五・六塩素化体の一部で、光分解中にその存在量が一時的に上昇していた。また、照射試料に元々存在していた、ダイオキシン様毒性が報告されている七塩素化体では、毒性がないとされる他の七塩素化体よりも分解速度が遅かった。特徴的な挙動を示した、これら異性体は毒性だけでなく、環境残留性も高いことから、モニタリングデータとの相互比較において興味深い知見となった。加えて、共通の光分解物としてフェノール系化合物が検出された。この化合物は既報等では確認できず、新たな光分解物であったと考えられるが、より正確な化合物同定には精密質量数での評価が必要であった。得られた結果は、既存のモニタリグデータの再評価だけでなく、リスク評価の高度化にもつながる知見であり、さらなるPCN光分解経路の探索にも重要な結果であると考えられた。当該年度の研究内容は、75種類の異性体を持つ塩素化ナフタレン(PCN)について、二次元ガスクロマトグラフ質量分析計(GCxGC-MS)を用いて、全75異性体を完全分離すること、及び高山環境にて実際の太陽光照射試験を実施することであった。前者では、これまでの実績で73種の異性体分離が実現しており、分離困難であった三塩素化体の同定に取り組んだ。その課題解決に高濃度のPCNを含有する飛灰試料を用いたが、分離困難であった当該異性体の濃度が十分でなく、同定結果を確定するには至らなかった。そこで、異なる形式の焼却炉(ストーカ炉や流動床炉)からの飛灰を比較することで、今後、PCN異性体の完全分離を目指す。後者では、当初の予定よりも国立天文台ハワイ観測所との試料設置に関する調整が長引き、ハワイでの高山環境での太陽光照射試験を実施できなかった。ただし、他の高山環境(中国雲南省など)での太陽光照射試験は実施しており、回収した試料中のPCN異性体組成をGCxGC-MSで分析する予定である。供した試料は、物質収支の評価を精度良く行うための肝であるため、国家計量標準機関により開発される標準物質の一つである標準液の調製に多用される質量比混合法を用いて水溶液を調製しており、より正確なPCN物質収支の把握が期待される。高山環境では、分光光度計を用い分光放射照度分布を確認し、得られた照度分布を基に実験室光源を用いた照射試験を実施するため、これらの比較により、正確なPCNの光分解経路を把握でき、その結果を既存の環境モニタリングデータの再解析に用いることで、有用な基礎的知見が得られると考えられる。PCNが高濃度で残留する飛灰試料を用いて、異性体分離・同定が不十分な三塩素化体に関する分析条件の確立が行えなかったため。また高山環境での太陽光照射試験では、中国での実施は可能であったが、ハワイ・マウナケア山での試料設置に関する調整が難航し、当該試験が未実施となったため、やや遅れているとした。当該年度は研究計画(3年間)の2年目であったが、4カ月後に研究代表者の異動(事務職:2016年8月から1年間)により、研究実施内容は限定的であるが、得られた知見を報告する。当該年度の目標は、75種類の異性体を持つ塩素化ナフタレン(PCN)について、二次元ガスクロマトグラフ質量分析計(GC×GC-MS)を用いて、全75異性体を完全分離すること、及び高山環境にて実際の太陽光照射試験を実施することであった。前者は実施困難であったが、後者では、中国での試料設置に関する調整を行い、許可を得て、その高山環境(中国雲南省など)での太陽光照射試験を実施した。回収した試料中のPCN異性体組成をGC×GC-MSで分析した結果、特定の異性体(一部の六塩素化体)が残留するだけでなく、それらの増加傾向を明らかにした。当該試験では、試料容器(Pyrex製及び石英製)差異を併せて比較したが、分解効率に差があったものの、残留する異性体は両容器とも同様であったことを確認した。これら異性体はダイオキシン様毒性が高い異性体であることが知られており、この分解挙動はリスク評価において非常に興味深い結果であると考えられた。今後は高山環境で、分光光度計を用い分光放射照度分布を確認し、得られた照度分布を基に実験室光源を用いた照射試験を実施することで、より正確なPCNの光分解経路を把握できることが期待され、その結果を既存の環境モニタリングデータの再解析に用いることで、有用な基礎的知見が得られると考えられる。

2016年8月から弊所キャリアパス方針に従い、事務職に異動(1年間)しており、研究実施が困難であるため。復帰後は研究計画の最終年度となるが、上述の理由から1年間の研究期間の延長申請を行い、目標達成を目指す予定である。当該年度は当初研究計画(3年間)の最終年であったが、2年目途中からの代表研究者の異動(2017年8月から研究現場に復帰)により、研究実施内容は限定的となったが、得られた成果を報告する。当該年度の目標は、異動により2年目の目標と同様で、75種類の異性体を持つ塩素化ナフタレン(PCN)について、二次元ガスクロマトグラフ質量分析計(GCxGC-MS)を用いて、全75異性体を完全分離すること、及び高山環境にて実際の太陽光照射試験を実施することであった。前者では、低塩素化体をより多く含む飛灰試料を抽出し同定を試みているが、完全分離には至っていない。後者では、米国(ハワイ州)及び中国(雲南省)での太陽光照射試験において、PCNの比較対照として用いたp,p'-DDT及びγ-HCHの分析を実施した。p,p'-DDTはPCN同様に光分解が確認されたが、γ-HCHは光分解されない地点が存在した。この結果は、地点間の光分解経路の差異を示唆していると考えられた。また、地点による光分解挙動の差異をさらに検討するため、上述の高山環境だけでなく、新たな高山環境(中国四川省)や標高の低い地点(中国・北京、インド・ラジャスタン州)も太陽光照射試験に組み込んだ。その結果、標高の低い地点でもPCNやp,p'-DDTの光分解が確認された。つまり、照度だけでなく、光度・光束なども重要な因子であると考えられた。この分解挙動の解明は、既存のモニタリグデータの再評価につながるだけでなく、リスク評価においても興味深い知見であると考えられる。今後は、実環境から得られた照度等データを基に実験室光源を用いた照射試験を実施することで、より正確なPCNの光分解経路を把握することが期待できる。弊所キャリアパスに従い2017年7月末まで事務職に異動しており、復帰後も実験棟の空調改修工事が実施されたことから、研究実施が困難であったため。最終年度の1年間延長が認められたため、引き続き目標達成を目指す予定である。当該年度の目標は、75種類の異性体を持つ塩素化ナフタレン(PCN)について、二次元ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて全異性体を完全分離すること、及び当該年度以前に実施した実環境での太陽光照射試験結果と疑似照射試験である耐候性試験結果を比較することであった。前者では、低塩素化体をより多く含む飛灰試料を抽出・精製しPCNの同定を試みたが、三塩素化体の完全分離は困難であった。ただし、全73ピークの分離は実現している。後者では、米国(ハワイ州)、中国(雲南省・四川省・北京)及びインド(ラジャスターン州)での実環境下での太陽光照射試験結果と耐候性試験結果を比較したところ、照射条件等を完全一致させることは困難であったが、PCN光分解の過程において両者に共通の異性体及び光分解物の存在が確認できた。共通の異性体はダイオキシン様毒性が報告されている五・六塩素化体の一部で、光分解中にその存在量が一時的に上昇していた。また、照射試料に元々存在していた、ダイオキシン様毒性が報告されている七塩素化体では、毒性がないとされる他の七塩素化体よりも分解速度が遅かった。特徴的な挙動を示した、これら異性体は毒性だけでなく、環境残留性も高いことから、モニタリングデータとの相互比較において興味深い知見となった。加えて、共通の光分解物としてフェノール系化合物が検出された。
アダプター分子Grb10によるWntシグナル伝達経路抑制の分子機構の解明

Grb10のWnt経路に対する影響の解析を行う事によって、本年度得られた結果は以下の通りである。1)293T細胞におけるLuciferase Reporter assayによれば、Grb10の強制発現は、Wnt3aにより誘導されたTCF依存性の転写活性を強く抑制したが、恒常的活性化型のβ-cateninの強制発現による転写活性化を全く抑制出来なかった。従ってGrb10の作用点は、明らかにβ-cateninより上流と考えられた。この結果に一致して、Grb10強制発現細胞では、対象細胞に比較して、Wnt3a刺激によるβ-cateninの蓄積は阻害された。2)Grb10のSiRNA処理により内在性Grb10の発現量を30%にまで低下させた293T細胞では、Wnt3aにより誘導されたTCF依存性転写活性は、対象のLacZ SiRNA処理細胞の示す値の250%にまで亢進した。従って実際に内在性のGrb10がWntシグナル伝達経路を負に制御している事が確認された。TCF依存性のリポーターアッセイによれば、Grb10の強制発現はWnt経路を強く抑制し、その作用点は、β-cateninの上流であり、Grb10を強制発現した細胞では、正常細胞に比べ、Wnt3a刺激によるβ-cateninの誘導は著しく押さえられた。さらにRNAiによってGrb10の発現を抑制すると、TCF依存性の転写活性は高進した。従ってGrb10は正常細胞に於いて、Wnt経路の負の制御因子として働いていた。Grb10の欠損変異体を用いた解析によれば、C末端のSH2、およびN末端の両方が、Wnt経路の抑制に必要であった。一方、Wnt刺激によって、LRP6の細胞質ドメインにAxinがリクルートされると、Axinはβ-catenin分解複合体のScaffoldとしての機能を失い、β-cateninの蓄積が生じる。Wntに誘導されたAxinとLRP6との結合は、Grb10によって阻害される事が、免疫共沈殿法に明らかになった。LRP6の細胞質ドメインを巡ってGrb10とAxinが競合しており、これがGrb10によるWnt経路の抑制の分子機構であろうと推測した。
集学的治療による頭頚部癌の分化・アポトーシス誘導に関する基礎的・臨床的検討

口腔癌から分離、樹立した扁平上皮癌細胞株を用い、集学的治療の立場より、分化・アポトーシス誘導を試み、その機序を検討した。すなわち、株化細胞を放射線(γ線)、抗癌剤(5-FU、ペプロマイシン)、分化誘導剤(TGF-β、ベスナリノン)、あるいはLAK細胞(IL-2によって誘導)でもって処理した後、細胞周期制御因子(p53、p21、cyclin D and E、Bcl-2、Bax)の発現、細胞内活性酸素、カスパーゼの活性化等より、分化・アポトーシスを検討した。その結果、1,TGF-βおよびベスナリノンによってG1 arrestによる分化が誘導された。その際、p21によるRb蛋白のリン酸化抑制はp53に非依存性であった。2,5-FUおよびペプロマイシンあるいは放射線により、分化誘導は認められたものの、アポトーシス誘導が観察され、放射線と抗癌剤の併用は相加的効果をもたらした。これらによるアポトーシスにおいて、5-FUではS期に、放射線ではG2期に細胞が集積した。3,LAK細胞と抗癌剤および放射線との相加的、相乗的効果が認められ、特に、放射線照射後にLAK細胞で処理した場合には、強い相乗効果が認められた。LAKによるアポトーシス誘導は、Fas-Fas Lによるcaspase-3の活性化と共に、granzyme Bにも依存し、さらには、ミトコンドリア内の活性酸素の上昇によっても支持されていた。以上の結果より、口腔扁平上皮癌に対しては、免疫・化学・放射線による集学的治療が有効であると示唆された。実際に、5-FU、ペプロマイシン、γ線に加えてLAK治療を行った口腔癌は、LAK治療を行わなかったものより、より良好な治療効果が得られた。γ線、5-FU、ペプロマイシンおよび非特異的免疫療法による集学的治療を行うと共に、基礎的に扁平上皮癌細胞の分化・アポトーシス誘導を検討し、以下の結果を得た。1.集学的治療により、口腔癌の約40%にCRを得、PRにおいても多数において縮小手術が可能で、患者のQOLが良好に保存された。2.癌細胞はγ線、ペプロマイシンではG2/M期に、5-FUではS期に集積し、アポトーシスが誘導された。しかしながら、これらによる分化誘導作用は非常に弱く、分化誘導剤の1つであるベスナリノンによってG1期停止に伴い分化が誘導された。4.分化およびアポトーシス誘導はp53に非依存性であり、みる限り、bcl-2ファミリー蛋白の発現とも明確な関係は見出せなかった。5. p21はG1期停止ー分化誘導には必須であったが、p21 sense遺伝子をトランスフェクトし、p21を強発現しても、分化・アポトーシスは大きくは増強されなかった。結果より、集学的治療によって良好な口腔癌の制御が得られたが、その根拠として集学的治療による分化・アポトーシス誘導が考えられた。具体的には、γ線および5-FU、ペプロマイシンによる扁平上皮癌細胞のアポトーシス誘導はS期およびG2/M期よりp53非依存性に誘導されることが明らかとなった。その際、bcl-2ファミリー蛋白による制御を明確に証明し得なかったが、その理由として、bcl-2蛋白による制御を凌駕する因子が関与し、アポトーシスが誘導されている可能性が示唆される。その点を、今後、追求する予定である。頭頚部癌に対する有効な集学的治療を確立する目的で、5-FU、放射線(γ線)、およびIL-2によって誘導したLAK細胞による扁平上皮癌細胞のアポトーシス誘導を、cell free系を用いながら検討した。

その結果、1)5-FUとLAK細胞による処理では、相加的なアポトーシスの増強しか認められなかったものの、γ線照射後にLAK細胞で処理すると相乗的にアポトーシスが誘導された。2)γ線によるアポトーシス誘導は、ミトコンドリア内の活性酸素レベルの上昇に強く依存していた。3)ミトコンドリア内活性酸素の上昇に伴い、ミトコンドリア膜電位の低下、チトクロームCの放出が観察されたが、Bcl-2ファミリー蛋白の中でBaxのみならず、Bcl-2もその発現が上昇した。4)LAK細胞によるアポトーシス誘導は、Fas-Fas LシグナルおよびgranzymeBによるcaspase-3の活性化と共に、ミトコンドリア内の活性酸素の上昇-チトクロームCの放出が観察され、これらの所見はγ線で前処理した細胞をLAK細胞と混合培養した時、より著明に観察された。これらの結果より、5-FU/γ線で処理した後にLAK療法を行うと、より良好な治療効果が得られることが示唆された。LAK細胞によるアポトーシス誘導の一つの機序として、ミトコンドリア内の活性酸素レベルの上昇が関与していることが明らかとなったが、その機序は本研究からは、未だ明かにすることは出来なかった。さらに、γ線とLAK細胞の協調作用に関しては、γ線処理によるFasの発現の上昇によることを明らかにしたものの、相乗効果はそれのみに依存しておらず、この点の解明も、今後に残された。
NAIPsによる赤痢菌認識機構

本研究はNAIPsに着目し、非鞭毛性病原細菌である赤痢菌感染モデルを用いて、赤痢菌感染が引き起こすインフラマソーム活性化においてNAIPsがどのように関与するのか明らかにすることを目的として実験を行った。その結果、赤痢菌のIII型分泌装置を構成するinner rod proteinであるMxiIがNAIP2による認識を受け、NLRC4インフラマソーム活性化を誘導することを明らかにした。近年、NAIPsと呼ばれるタンパク質の一群が、病原細菌の認識において重要な役割を担うことが示唆されている。サルモネラ菌感染モデルを用いた報告例では、NAIP5が主にサルモネラ菌の鞭毛構成タンパク質であるフラジェリンを特異的に認識してNLRC4インフラマソームの活性化を引き起こすというモデルが提唱されているが、一方赤痢菌のような非鞭毛性病原細菌の感染はどのようにして認識され、インフラマソーム活性化とそれに伴う激しい炎症応答が引き起こされるのかわかっていない部分が多い。NAIPファミリータンパク質がアダプター分子として機能しNLRC4と病原細菌由来トリガー分子との相互作用がおこるという最新の仮説にヒントを得て、本研究はNAIPsに着目し、赤痢菌をはじめとする非鞭毛性病原細菌の認識機構の解明、及びNAIPsによるリガンド認識特異性決定の機構を解明することを目的として実験を行った。本研究は赤痢菌が感染の際に引き起こす激しい炎症応答に焦点を当てたものであり、本研究により得られた知見は、将来的には炎症を制御する新規薬剤開発への手がかりとなる可能性が期待される。本年度の研究成果としては、非鞭毛性病原細菌の代表として赤痢菌感染モデルを用い、インフラマソーム活性化を引き起こす赤痢菌由来のトリガー分子の特定を行った。具体的には、赤痢菌エフェクター遺伝子を発現ベクターに組み込み、マウス骨髄マクロファージにて発現させ、Pyroptosis誘導能の検証を行うことによりインフラマソームトリガーとしての活性を検証した。次に特定したトリガー分子が活性化しているインフラマソームはNLRC4であることを、siRNAノックダウン実験及びNLRC4-KOマウス由来のマクロファージ細胞を用いた赤痢菌感染実験により明らかにした。赤痢菌、サルモネラ菌などの病原細菌の感染に対し、宿主は菌体をマクロファージに取り込んだ後、菌体由来分子を認識してNLRC4インフラマソームを活性化させ炎症性サイトカインの産生・分泌を誘導し、最終的に激しい炎症応答を起こす。サルモネラ菌ではNLRC4が主に鞭毛構成タンパク質であるフラジェリンを特異的に認識して激しい炎症応答を引き起こすことが知られているが、赤痢菌のように鞭毛を持たない病原細菌も存在しており、NLRC4がどのようにしてこれら非鞭毛性病原細菌を認識できるのかわかっていない部分が多かった。近年、NAIPsと呼ばれるタンパク質の一群が、病原細菌が引き起こすインフラマソーム活性化において重要な役割を担うことが示唆されている。本研究はNAIPファミリー質タンパク質に着目し、非鞭毛性病原細菌である赤痢菌を感染モデルとして用い、赤痢菌感染が引き起こすインフラマソーム活性化において、これらがどのように関与するのか明らかにすることを目的として実験を行った。本研究の結果、赤痢菌のIII型分泌装置を構成するinner rod proteinであるMxiIがNAIP2による認識を受け、NLRC4インフラマソーム活性化が引き起こされることを明らかにした。MxiIとNAIP2との間にはタンパク質レベルでの親和性が認められた一方、NAIP5との間には認められなかった。以上のことは、NAIPsによる病原細菌由来分子の認識には、各NAIPによって特異性があることを強く示唆するものである。本実験計画にはプライマリマクロファージ細胞を用いたトランスフェクションの実験系(siRNAノックダウン、及び過剰発現系)が重要な位置を占めているが、プライマリマクロファージ細胞は扱いが難しく、特にトランスフェクション系との相性は悪く、これまでに一般的に行われている手法では十分な効率を得ることができない。従って、効果的な実験系を確立するために数ヶ月から場合によっては1年以上の期間を見積もっていた。しかしながら、実験計画の早い段階でトランスフェクション効率を上げる効果的な手法を見つけることができ、予測していたよりも順調に実験データ取得できるようになった。さらに、所属先である東京大学医科学研究所の研究環境は非常に充実しており、本研究計画の進展に寄与するところが大きかった。従って、平成26年度分の実験として計画書に示した分はほぼ完了することができた。以上のように実験手法の確立が予想以上に順調に進んだことから、実験計画は当初の想定以上に進んでいると判断している。細菌感染と免疫今後の本研究課題の推進方策については、基本的に当初の予定通りに進めつつ、前項に述べたように進展状況が順調であることから、実験計画を追加して予定している。これまでの研究において、赤痢菌感染に伴い誘導されるインフラマソーム活性化は、赤痢菌のMxiIとIpaH7.8に依存的であることが判明したため、この両因子とNAIPsとの関連性を重点的に検証する。

具体的には、各種NAIPsのshRNA/siRNAノックダウン解析により赤痢菌トリガー分子がどのNAIP依存的にインフラマソームを活性化させるのか特定する。同時に、赤痢菌トリガー分子を発現させた細胞中におけるNAIPの挙動を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する。また、インフラマソーム複合体は細胞中に1つの大きなスポットとして確認されるが、赤痢菌トリガー分子及びNAIPとインフラマソーム複合体の挙動を観察する。更にASC重合体構造との局在関係を検証する。次に、赤痢菌トリガー分子と各NAIPsファミリータンパク質間の結合特異性を検証する。各NAIPsをクローニングし、yeast 2 hybrid、GSTプルダウンアッセイ、免疫沈降法等の手段を用いることを予定している。既報論文ではサルモネラ菌のフラジェリンがNAIP5を結合することが報告されているため、本報告の再現性を確認しつつこれをコントロールとして用い同時に検証する。NAIPsは活性体として高次構造をとるという仮説が提唱されているため、共焦点レーザー顕微鏡観察及びイムノブロット解析の手段を用い、NAIP高次複合体構造の検出を試みる。次年度使用額が生じた理由は、第一には安価な実験系の確立に成功し経費の節約ができたためである。本研究計画において重要な位置付けにあるマクロファージ細胞に対するトランスフェクション実験は、使用するnucleofectorのキットが高価であるため、それをふまえて支出予定額を算出していた。しかしながら、本実験計画を遂行する過程で安価な手法を模索し、安価且つ効率の良い手法を確立することができた。また、本実験計画で多用しているELISAキットも主流メーカーのものは高価であるが、安価で品質のよいキットの選定を行い、大幅にコストダウンすることができた。第二の理由としては、国際会議での口頭発表のための経費として計上していた分が他の財源から補助により賄うことができたためである。また、予定していた英文添削及び実験補助のための人件費・謝礼については、共同研究者の協力によりかからず経費削減することができた。次年度使用額の使用内訳としては、実験計画を施行するうえで必要な機器類、培地・プラスチック製品・試薬類・抗体などの消耗品費、シークエンス解析・プライマー作成・siRNA作成などの依頼費用、各種サイトカイン測定用ELISA、LDH等のキット類の購入に充てることを計画している。次年度に繰り越した分の予算は、追加した実験計画のための費用に充てる予定である。更に本研究により得られた成果は、来年度に論文投稿及び国内外における学会発表にて積極的に情報公開を行う予定であり、そのための論文校正費、論文投稿料、学会参加のための経費に充てることを企図している。