hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳類細胞における自食作用の分子機構および生理的意義の解析

哺乳類における自食作用制御因子の候補として、酵母の自食作用に必須な遺伝子産物と相同性を持つ哺乳類蛋白質について解析を行った。2年の研究期間に、以下の成果を得た。1)LC3の解析:酵母Apg8pと相同性を持つラット蛋白質LC3について、作成した特異抗体やcDNAを用いて解析を行い、約半分のLC3分子が合成後12時間の間に23kDa分子量が低下したフォームに変化すること、高分子量LC3は細胞質に分布するが低分子量LC3は自食作用を担う膜構造・自食胞に特異的に結合していることを明らかにした。低分子量LC3は、幾つかの薬剤や自食作用を誘導する栄養飢餓条件で増加した。この低分子量LC3が自食胞の形成などに関わっている可能性が考えられる。2)SKDlの解析:酵母Csclpと相同性が高いマウスAAA型ATPase・SKD1について、優性阻害が期待される変異SKD1遺伝子を作成し、培養細胞に導入して発現させた。共焦点レーザー顕微鏡による観察などから、初期エンドソームの分布と形態に異常が生じ、そこからのトランスフェリン受容体の再循環などが阻害されることが判明した。従って、SKD1は初期エンドソームの形態と輸送機能を制御しており、また自食作用にはそのようなエンドソーム機能が密接に関わっていることが示唆された。3)mAPG5遺伝子破壊マウスの作成:酵母Apg5pがApg12pと特異的に共有結合し、それが自食作用に必須であることが判明している。各々と相同性の高いヒトのhAPG5とhAPG12についても同様の結合が確認された。自食作用の細胞、組織、個体レベルにおける生理的意義を検討するため、マウスのホモログmAPG5の遺伝子破壊マウスを作成しつつある。mAPG5のゲノムDNAのクローニングに成功したので、ES細胞での当該遺伝子破壊をこれから行う。本年は研究計画に基づき哺乳類自食作用に関与する蛋白質の同定を中心に研究を展開し、以下のような成果を得た。1)MAP1-LC3ラットなどのMAP1-LC3(微小管結合蛋白質1の第3軽鎖)の遺伝子が酵母の自食作用に必須な遺伝子群の中のひとつと高い相同性を持つことが判明したので、その特異抗体を作成した。この抗体を用いてラット肝の細胞分画成分の解析を行ったところ、MAP1-LC3は自食作用の本体である自食胞を含むいわゆるオートリソソーム分画に特異的に局在していた。さらに遺伝子のクローニングを行いそれを培養細胞に導入し発現させることにより、MAP1-LC3には2つのフォームがあり、より短い分子は長い分子のC末端の切断によって生じることを明らかにした。短型はオートリソソーム分画に、長型は細胞質に局在しており、後者と異なり前者は微小管と結合していなかった。またヴィンブラスチンやバフィロマイシンなど自食作用に影響を及ぼす薬剤で細胞を処理すると短型が著しく増加した。現在、MAP1-LC3の細胞内分布を免疫電子顕微鏡法で調べている。今後は短型MAP1-LC3が自食作用にどのように関わるのか解析していきた。2)SKD1酵母の自食作用遺伝子CSC1と相同性が高いマウスSKD1遺伝子の産物はAAAファミリーに属するATPaseで、小胞輸送で膜融合に関与するNSFとも相同性を持つがその機構は不明である。SKF1が自食作用に関わっている可能性を検討するために、遺伝子クローニングと特異抗体の作成を行った。得た抗体を用いた免疫電子顕微鏡法によりSKD1が初期エンドソームに局在することを示した。

優性阻害が期待される変異SKD1遺伝子を作成し培養細胞に導入して発現させ、どのような影響が自食作用に現れるか現在解析している。本年は、酵母の自食作用に必須な遺伝子との相同性から哺乳類自食作用に関与すると思われる蛋白質について解析を行い、以下のような成果を得た。1)LC3の解析:酵母の自食作用遺伝子産物Apg8pと相同性を持つ機能不明のラットLC3が、ラット肝から得た各種オルガネラ分画のうち、自食作用を担う膜構造・自食胞を含むオートリソソーム分画に特異的に局在していることを既に示しているが、さらに免疫電子顕微鏡法によりLC3の自食胞膜への結合を観察した。また、パルス・チェイス実験等から、LC3は合成後12時間の間に半分ほどの分子が23kDa低分子量のフォームに変化すること、高分子量LC3が細胞質に分布する一方で低分子量LC3のみが自食胞に結合すること、などを明らかにした。2)SKDlの解析:酵母の自食作用遺伝子産物Csclpと相同性が高シ)、機能不明のマウスSKDlについても解析を行った。優性阻害が期待される変異SKDl遺伝子を作成し、培養細胞に導入して発現させたところ、初期エンドソームの分布と形態に異常が生じ、そこからのトランスフェリン受容体の再循環などが阻害された。従って、SKDlは初期エンドソームの形態と輸送機能を制御しており、また自食作用にはそのようなエンドソーム機能が密接に関わっていることが示唆された。3)自食作用関連遺伝子破壊マウスの作成:酵母の自食作用遺伝子産物Apg5pと相同性の高いヒトhAPG5が、hAPG12と特異的に共有結合することを明らかにした。この結合は、酵母Apg5pとApg12pでも見られ、酵母自食作用に必須であることが判明している。hAPG5が自食作用に関与している可能性を、細胞、組織、個体レベルで検討するため、遺伝子破壊マウスの作成を行いつつある。マウスのホモログmAPG5のゲノムDNAのクローニングに成功した。
低酸素ポテンシャル核燃料の製造と反応試験に関する研究

軽水炉に使用する次世代燃料に関して、FPガス放出の低減とともに酸素ポテンシャル(p(O_2))上昇を抑えるために、従来のUO_2に低原子価金属Mを加えて燃料をM_yU_<1-y>O_<2+x>固溶体とすることにより、UO_2とは異なりxの負値に幅広い不定比領域をもち、この領域内でp(O_2)を低い値に保つことができ、高燃焼度までの使用が可能となるような核燃料の製造に関する研究を行った。本年度はMg_yNb_zU_<1-y-z>O_<2+x>およびMg_yEu_zU_<1-y-z>O_<2+x>固溶体の固溶度や不純物相およびp(O_2)について調べた。Mg_yNb_zU_<1-y-z>O_<2+x>について、p(O_2)=10^<-13>およびp(O_2)<10^<-19>atmではNbは酸化物(NbO_2)または複合酸化物(Mg_2NbO_6)として析出し、UO_2へはほとんど固溶しないことが分かり、これらの酸素分圧ではNbの添加による熱力学的な性質の向上は難しいと考えられた。また、p(O_2)<10^<-19>atmでは未知の相が生成することが分かり、この相がこれまでに報告のない六方晶系の新酸化物であることが判明した。Eu_zU_<1-z>O_<2+x>固溶体のp(O_2)を測定すると、p(O_2)の急変位置がxの負値の領域にシフトすることが分かった。これは+2価をとる金属が固溶した場合に見られる現象であり、Euが一部+2価をとっているものと考えられた。さらにMg_yEu_zU_<1-y-z>O_<2+x>の場合にはMg添加量の増加によりこの急変位置はハイポ側へ大きくシフトした。シフト量は1200°CではMg濃度にほぼ比例することが分かった。軽水炉に使う二酸化ウラン燃料の高燃焼度化に対応して,FPガス放出の低減とともに酸素ポテンシャル(p(O_2))上昇を抑えるために,低原子価金属Mを加えて燃料をM_yU_<1-y>O_<2+x>固溶体とすることにより,UO_<2+x>とは異なりxの負値に幅広い不定比領域をもち,この領域内でp(O_2)は低い値に保つことができる核燃料の製造に関する研究を行った.本年度は,MgおよびEuあるいはNbを含む固溶体のp(O_2)や固溶度ならびにM_yU_<1-y>O_<2+x>の形態について調べた.Mg_yU【product】-yO_<2+x>固溶体の場合,p(O_2)の急変点がx≦0の領域に現れた.Mg_yEU_zU_<1-y-z>O_<2+x>の場合,zの増加につれて,xは負の方向へ,p(O_2)は増加する傾向が見られた.また,M_yU_<1-y>O_<2+x>はy<0.02に固溶限があり,それ以上では一旦2相になり,y=0.15において再固溶する様子が見られたが,Nbを添加した場合にも同様な挙動が見られた.さらに,TEMによりMg_yU_<1-y>O_<2+x>を観察すると.粉末X線回折において単相である固溶体中に,僅かながらMgO相が確認されるとともに,EDXスペクトルを用いて固溶体相中のMgを定量的に分析することができた.一方,H_2雰囲気,1200°Cにおいて調製したMg_yU_<1-y>O_<2+x>固溶体のyに対する密度の変化は,MgOが格子間および格子上に存在する可能性を示唆した.軽水炉に使用する次世代燃料に関して、FPガス放出の低減とともに酸素ポテンシャル(p(O_2))上昇を抑えるために、従来のUO_2に低原子価金属Mを加えて燃料をM_yU_<1-y>O_<2+x>固溶体とすることにより、UO_2とは異なりxの負値に幅広い不定比領域をもち、この領域内でp(O_2)を低い値に保つことができ、高燃焼度までの使用が可能となるような核燃料の製造に関する研究を行った。Mg_yNb_zU_<1-y-z>O_<2+x>について、p(O_2)=10^<-13>およびp(O_2)<10^<-19>

atmではNbは酸化物(NbO_2)または複合酸化物(Mg_2NbO_6)として析出し、UO_2へはほとんど固溶しないことが分かり、これらの酸素分圧ではNbの添加による熱力学的な性質の向上は難しいと考えられた。また、p(O_2)<10^<-19>atmでは未知の相が生成することが分かり、この相がこれまでに報告のない六方晶系の新酸化物であることが判明した。Eu_zU_<1-z>O_<2+x>固溶体のp(O_2)を測定すると、p(O_2)の急変位置がxの負値の領域にシフトすることが分かった。これは+2価をとる金属が固溶した場合に見られる現象であり、Euが一部+2価をとっているものと考えられた。さらにMg_yEu_zU_<1-y-z>O_<2+x>の場合にはMg添加量の増加によりこの急変位置はハイポ側へ大きくシフトした。シフト量は1200°CではMg濃度にほぼ比例することが分かった。軽水炉に使用する次世代燃料に関して、EPガス放出の低減とともに酸素ポテンシャル(p (O_2) )上昇を抑えるために、従来のUO_2に低原子価金属Mを加えて燃料をM_yU_<1-y>O_<2+x>固溶体とすることにより、UO_2とは異なりxの負値に幅広い不定比領域をもち、この領域内でp (O_2)を低い値に保つことができ、高燃焼度までの使用が可能となるような核燃料の製造に関する研究を行った。本年度はMg_yNb_zU_<1-y-z>O_<2+x>およびMg_yEu_zU_<1-y-z>O_<2+x>固溶体の固溶度や不純物相およびp (O_2)について調べた。Mg_yNb_zU_<1-y-z>O_<2+x>について、p (O_2) =10^<-13>およびp (O_2) <10^<-19>atmではNbは酸化物(NbO_2)または複合酸化物(Mg_2NbO_6)として析出し、UO_2へはほとんど固溶しないことが分かり、これらの酸素分圧ではNbの添加による熱力学的な性質の向上は難しいと考えられた。また、p (O_2) <10^<-19>atmでは未知の相が生成することが分かり、この相がこれまでに報告のない六方晶系の新酸化物であることが判明した。Eu_zU_<1-z>O_<2+x>固溶体のp (O_2)を測定すると、p (O_2)の急変位置がxの負値の領域にシフトすることが分かった。これは+2価をとる金属が固溶した場合に見られる現象であり、Euが一部+2価をとっているものと考えらた。
がんの発生と進展におけるミッドカイン作用機構の解明

1.がん発生とミッドカイン(MK):MKはNIH3T3細胞を形質転換した。この際の特徴として、細胞の基質からの易遊離性および核周囲へのMKの集積があった。また、ヒト大腸癌前癌部でのMKの発現を組織および蛋白レベルで確認した。2.がん進展とMK:高感度の酵素免疫測定法により血清中MKが肝がん患者で健常人に比べて有意に高値であることが明らかになった。一方、変異型MK(第3エクソンが欠失し、蛋白レベルでN末側の約半分が欠失したもの)がヒトがん組織で特異的に発現することを見い出した。さらにこれは消化器がんにおいてリンパ節転移巣で有意に高頻度に発現していた。3.MKとアクチビンの相互作用:アクチビンによるアフリカツメガエルの中胚葉誘導をMKが強く阻害した。しかもこれはMK、アクチビン各々の細胞内シグナル相互作用によるものであった。現在までに集積してきたデータと合わせると、MKが、TGF-βスーパーファミリーのいくつかのメンバーと相互作用するシグナル伝達系を持つ可能性がでてきた。がん発生におけるMKの立場は、NIH3T3細胞の形質転換能とヒト大腸癌前癌部での発現から、生物学的に意味のあるものになったと思われる。一方今年度の大きな収穫の一つとして、変異型MKの発現頻度と病期(リンパ節転移)の相関の発見が挙げられる。今後他の組織型での発現の解析、変異型MKそのものの機能解析を進める。MKの作用機構を解析する手がかりとして、アクチビンとの相互作用の発見は大きな進歩となった。TGF-βスーパーファミリーのメンバーとMKが相反する作用を示す例はこの他に、血管内皮線溶系におけるTGF-βとMK、歯芽発生におけるBMP-2とMKの例を挙げることが出来る。TGF-βスーパーファミリーではメンバーの中で、シグナル伝達の特異性と重複性が示されており、MKのシグナル伝達がその一部と相互作用する可能性がでてきた。今後、この点を眼目にMKのシグナル伝達の解析を進め、受容体の同定へ進展させたい。
キャッチャーズを応用した薬毒物分析の迅速化と信頼性の確保

法医学上重要とされる薬毒物について、キャッチャーズ法によるヒト全血試料からの薬毒物の抽出を試みた.これまでの研究で、ベンゾジアゼピン系、三・四環系薬物、フェノチアジン系、抗精神病薬類、β-ブロッカー類、覚せい剤関連薬物、脱法ドラッグ(トリプタミン系、カチノン系、カンナビノイド系など)、トリカブト毒、有機リン系農薬など様々な化合物の抽出が単一メソッドで抽出可能であることがわかった。これにより経験の少ない分析者でも簡単・迅速に分析が実施でき、質量分析と組み合わせることで質の高いデータを提供できるようになった。しかし、一部の高極性薬毒物については、抽出が困難であったため、今後更なる改良も必要である。法医学上重要とされている薬毒物について,キャッチャーズ法(QuEChERS)によるヒト全血試料中から薬毒物の抽出を試みた.これまでに報告されているQuEChERS法を参考にしながら,全血試料への最適化を行った.具体的には,(1)抽出ステップでは,試料の希釈倍率やQuEChERS試薬の添加量の調整を行ない,最適と思われる値を設定した.(2)精製ステップでは,いくつかの市販の分散型固相抽出(dSPE)を用いて精製の検討を行った.その結果,酸性薬物と塩基性薬物では最適なdSPEが異なり,使い分けが必要となることがわかった.さらに質量分析におけるイオン化抑制を防ぐために、リン脂質除去用のカートリッジも有効であることもわかった。これまでの研究で、ベンゾジアゼピン系薬物とその代謝物、三・四環系薬物、フェノチアジン系薬物、抗精神病薬、β-ブロッカー類、覚せい剤関連薬物、脱法ドラッグ(トリプタミン系・カチノン系・カンナビノイド系など)、トリカブト毒、有機リン系農薬など法医学領域に関連する様々な化合物の抽出・検出が単一メソッドで可能となった。また、改良したQuEChERS法は,経験の少ない分析者でも簡単に実施でき(現在の所要時間は5分程度)、LC-MS/MSやGC-MSと組み合わせることで質の高いデータを提供できるようになった。限られた人員の中で効率的に薬毒物分析業務が遂行できるため、法医学領域だけでなく救急医療現場での応用も可能であると考えている。しかし,一部水溶性の高い薬毒物については、通常のQuEChERS法による抽出は困難であるため、今後更なる改良が必要である。新たに薬毒物検査機器を導入し,検査体制を構築しようとする解剖実施機関において,最初に直面する問題は試料の抽出方法である.薬毒物の抽出法には様々なものが知られているが,対象とする薬毒物,試料の種類,量,状態によって使い分ける必要があり,分析初心者にとっては難しい選択となる.そこで,経験の少ない分析者でも,簡単かつ質の高いデータを提供できるようにすることが本研究の目的である.本年度は基礎実験として,法医学上重要とされている薬毒物の一部について,キャッチャーズ法(QuEChERS)によるヒト全血試料中から薬毒物の抽出を試みた.これまでに報告されているQuEChERS法を参考にしながら,全血試料への最適化を行った.具体的には,(1)抽出ステップでは,試料の希釈倍率やQuEChERS試薬の添加量の調整を行ない,最適と思われる値を設定した.しかし,一部の水溶性の高い薬毒物では抽出が困難であることもわかってきた.(2)精製ステップでは,いくつかの市販の分散型固相抽出(dSPE)を用いて精製の検討を行った.その結果,酸性薬物と塩基性薬物では最適なdSPEが異なり,使い分けが必要となることもわかった.本年度の基礎実験の結果から,QuEChERS法でほとんどの薬毒物が抽出可能であることがわかった.今後は抽出効率など詳細な検討を行ない実務におけるデータを取得していく.また,一部水溶性の高いものについては,QuEChERS法の条件を変更し再検討を行なう予定である.本研究の最終目的は、キャッチャーズ(QuEChRES)を改良し,経験の少ない分析者でも,簡単かつ質の高いデータを提供できるようにすることである.その中で本年度は、QuEChRES法について基礎的な実験を行ない、抽出法の条件をある程度絞り込むことであった。具体的には,(1)抽出ステップにおいて,試料の希釈倍率やQuEChERS試薬の添加量の調整を行ない,(2)精製ステップでは,いくつかの市販の分散型固相抽出(dSPE)を用いて精製の検討を行った.その結果、広範囲に薬毒物を抽出できる条件をいくつか絞り込むことに成功したので,次年度の研究にスムーズに移行できる。

一部水溶性の高い薬毒物については、抽出が困難であり条件の再検討を実施することになったが、研究全体としてみればおおむね計画通りであった。今後は、前年度に抽出可能であることが判明した薬毒物については、バリデーションのガイドラインに沿って、特異性、検量線の直線性、再現性や抽出効率などを詳細に決定していく予定である。バリデーション作業の完了後は、実際の法医試料に応用し、その有効性を確認する。特に法医試料に特徴的な変性・腐敗した試料における定量値の比較検討を行う.また、水溶性の高い薬毒物については抽出が困難であったことから、一部条件を変更し再検討する。該当なし
がん細胞浸潤突起における小胞輸送と微小管，アクチン繊維のクロストーク

がん細胞が形成する浸潤突起はアクチン繊維に富む細胞膜の突起状構造で細胞外基質を分解する活性を有することから,がん細胞の浸潤転移と密接に関係することが指摘されている。浸潤突起の形成と機能には微小管とアクチン繊維の2種の細胞骨格の相互作用が不可欠であるが,その分子メカニズムはこれまでのところほとんど明らかになっていない。また,浸潤突起には小胞輸送により細胞外基質分解酵素などが極性輸送されるがその制御機構についても未解明の点が多く残されている。本研究では,微小管とアクチン繊維の双方に結合するタンパク質に注目し,それが微小管とアクチン繊維の相互作用を仲介し,がん細胞の浸潤突起形成,浸潤転移に関わる可能性を検証し,その分子メカニズムを明らかにすることを目指す。また,浸潤突起への小胞輸送を制御する可能性についても解析する。本研究を進めることは浸潤転移の分子機構を理解することにとどまらず,がんの診断,治療の標的を提示する可能性も秘めていると考える。アクチン繊維と微小管の協調的相互作用を制御する分子はそれ自身が微小管とアクチン繊維の双方に結合する能力を持つことが期待されるが,申請者はそのような分子の候補としてMAPファミリーのタンパク質に着目した。研究代表者は,予備的実験として,これらMAPファミリーの分子が転移性がん細胞株で発現しているか,また,転移性がん細胞株の浸潤能とその発現パターンに相関があるかをイムノブロッティングにより解析した。その結果,解析した一つのMAPタンパク質は転移性がん細胞でのみ高い発現が認められた。浸潤性乳がん細胞株におけるこの発現パターンはがん浸潤の主要因子であるMT1-MMPと良く類似しており,このタンパク質が浸潤突起形成およびがんの浸潤に関与することを強く示唆する。新たに転移性がん細胞で高発現するMAPタンパク質を同定し、その発現分布について解析を進めることができたので。今後、さらに多くの転移性がん細胞株およびヒト組織由来のがん細胞株について浸潤能とMAPタンパク質の発現量の相関を解析する。同時に,マイクロアレイ発現データベースを用いてがん患者の予後とMAPタンパク質の発現レベルの相関についても解析を行う。物品購入等により生じた端数、10円を次年度に繰り越す。当該の10円は次年度経費とともに適正に使用予定である。
ＬＥＤ集魚灯設計スペックに対応する水産生物の視感度評価方法の確立

魚類の分光視感度を計測・評価するための簡易な網膜分光吸収計測システムを考案し構築した。市販小型分光器と広帯域LED光源を主要部品とし、暗順応状態で摘出した網膜小片を対象に、波長420-700nmの間で信頼性の高い分光吸収特性を推定可能な計測システムと評価できた。集魚灯漁業対象魚種のマアジ、カタクチイワシ、カタボシイワシの他に、マダイ等計10種の分光視感度を明らかにした。計測した桿体細胞の最大分光感度波長は、沿岸性および外洋性、さらに深海性魚類で相違した。本研究で得た分光視感度曲線を用い、灯光の視覚への作用効率を推定可能なエクセルワークシートを作成し、開発メーカーに提供し、試用段階に至っている。前年度に製作した単一視細胞の分光吸収を計測する顕微分光計測装置の運用を開始し、計測装置の校正を繰り返すとともに、マアジ、コイ網膜、さらに単細胞微細藻類を対象とし、10ミクロン程度の対象物の分光吸収特性計測を実施可能にし、分光吸収極大および分光吸収特性を表す曲線を得た。単一種の視細胞ごとに得た分光吸収曲線は既往のテンプレート関数で近似でき、視感度関数として表せた。漁業者が現用する白熱灯、ハロゲン灯、メタルハライド灯、さらには開発途上国で集魚灯として多用される蛍光灯を対象に光源の分光放射照度を計測し、それぞれの分光放射照度に対して魚類の視感度関数を乗じることで、光源種類ごとの作用効率(マイクロW/m-2/W)を求め、光源種間の比較を可能にした。本手法により、任意に放射波長を設計可能なLED集魚灯の作用効率評価を可能とした。本研究では、集魚灯光が魚類視覚に作用するまでの過程を工学的にとらえることを目標としており、海水中での光の伝搬についてもその特性を理解するとともに、その特徴を数値的に表現する必要がある。そこで、研究室が保有する、複数の海域において計測・推定した海水の光の波長別消散係数(減衰係数)を用い、集魚灯周りでの照度分布を推定するシミュレーションプラットホームの製作に着手した。現状では、光源を点光源と見なし、光源からの距離の増加の2乗に反比例して光が減衰するモデル式を利用しているが、洋上で実測した照度分布との間に明白な差が見られる事より、次年度にも本研究課題に継続的に取り組み、実海域での計測に基づいてシミュレーション精度を高めるモデル構築を必要とする。集魚灯が搭載する光源波長設計時に有益な魚類視感度を一般的な電気生理技術である網膜電図法(ERG)を用いて計測及び評価する際の閾値決定方法を確立した。従来、閾値決定は実験者の定めた最低応答電圧を指標に判断され、実験者ごとに結果の相違が生じることが考えられているが、本研究において、十分に強い光刺激に対する応答波形をテンプレート波形f(t)とし、それより弱い光刺激に対する応答波形g(t)との1遅延時間の分析および、2遅延時間補正後の両波形類似性の分析を行うことで、g(t)に光刺激に対する応答成分が認められるか否かを判定する方法を開発した。上記2項目の分析は正規化相互相関法で行うこととした。すなわち、遅延時間については相互相関法により遅れ時間τを求めることとし、波形類似性については遅れ時間τにおける相互相関係数(=相関係数)として得た。また、本手法を簡易に利用するために、一般的な表計算ソフトを用いて実験時に迅速に応答有無を判断できるワークシートとして完成させた。国内では計測事例が極めて少ない単一視細胞の分光吸収特性を計測する視細胞用の顕微分光計測装置を設計・製作した。原理的には諸外国の視覚生理学研究室が所有する同装置を模倣したもので、設計には台湾・中央研究院・研究員・厳宏洋博士の協力を得た。これまでに動作確認を終えており、次年度以降、本装置を用い、集魚灯対象魚種の視覚特性の解明を推進する。本研究は任意の放射波長を設計可能なLED灯を用いた集魚灯開発に寄与する漁獲対象魚類の分光視感度特性を計測するシステム構築を行い、それを用いて多魚種の視感度を明らかにするとともに、得られた分光視感度曲線を用いて、灯具開発者が利用可能な設計分光放射エネルギーの魚類視覚への作用効率を推定する方法の構築を目的とした。本年度は、昨年度までに完成させた計測システムを用い、集魚灯漁業対象魚種(カタクチイワシ、マアジ、カタボシイワシ)および水産有用種(クロメバル、マダイ、クロマグロ、トラフグ、ギンガメアジ、ヒラスズキ、アカグツ、ニホンウナギ、Anguilla bicolor bicolor)の計12魚種の分光視感度を明らかにした。

分光視感度には計測対象魚種の生息環境に応じた相違が見いだせた。淡水域および沿岸性の魚類では暗所視分光視感度のピークは>505nm、沿岸・外洋表層性の魚類では500-505nm、外洋性および深海性の魚類では<500nmに出現した。研究室がこれまでに計測し保有する沿岸域および外洋域における海中の分光放射照度分布を基に各海域に生息する魚類の最適感度波長を推測すると、概ね今回計測した各魚種の分光波長感度に合致することが明らかとなり、生息環境と視覚発達の関連性を定量的に評価する根拠を得た。本研究で得た各魚種の分光視感度を示す曲線式を求め、任意波長分布を持つ灯具により放射するエネルギーが対象魚種の視覚に作用する効率を求めるワークシートを作成し、集魚灯メーカ1社に配布し試用段階にある。省エネを背景にLED集魚灯の開発が進められているが、本研究により、魚類分光視感度を計測・推定する方法を従来法と比較して格段に簡易化できたことで、さらなる対象魚種の視覚特性に応じた灯具開発を効率的に行うことに寄与すると考えられる。魚類行動生理学本研究は、集魚灯の光が放射され、海水中を伝搬され、魚類視覚により受容されるまでの過程を工学的にかつ定量的に理解すること、さらに、その結果を集魚灯周りでの照度分布推定(シミュレーション)や設計者による波長設計の一助とすることを目的としている。本年度においては、前年度に製作した顕微分光計測装置による魚類視細胞の分光吸収計測を実施し、各種視細胞の分光感度を関数式で表すことを実現した。また、漁業者の現用する各種集魚灯及びLED集魚灯の放射スペクトルと顕微分光計測に分光視感度に基づいて、各種光源の魚類視覚への作用効率を推定した。さらに、他研究により計測・推定した研究室保有の海水の消散係数データをもとに集魚灯周りでの照度分布シミュレーションにも着手し、次年度に計画しているフィールド実証試験への準備も一部開始した。本年度計画した、1網膜電図(ERG)記録システムの構築については完了、2顕微分光光度計(MSP)の試作については完了、3特定魚種を用いたERGおよび試作MSP機器による計測結果と既往文献との計測結果の比較については、現状でキンギョを用いたERG実験を実施し、既往文献との整合性を確認している。試作MSPでの視細胞分光吸収特性の計測は現在準備中であり、4月後半から実施を予定している。現段階で試作MSP機器の動作確認は終了しており、詳細な校正作業を行っている状況である。網膜電図記録システム構築の成果については日本水産学会で口頭発表している。本研究課題の推進において大きな変更はなく、次年度の実証試験に向けての基礎研究の基本は完成しつつある。ただし、本課題で製作した顕微分光計測装置を用いた分光視感度の計測を行うには研究室での実験魚の短期飼育が必要とされ、必ずしも全ての水産有用魚種に本技術を利用可能とは言えない。そこで、既に製作した分光計測装置の小型版、かつ単一視細胞対象ではなく網膜そのものの分光を計測可能な簡易装置を自作し、野外での視感度計測を試みることを計画している。平成24年度に完成させた網膜電図記録およびその分析を概ね自動化するシステム、さらに試作顕微分光光度計を用い、平成25年度には集魚灯漁業対象魚種を供試魚としてこれまでに未解明な魚種の視覚特性を明らかにする。また、当該事業によって得られた多種の視覚感度特性を一般化、すなわち数値化して示す方法についても検討し、研究成果を研究者のみならず、集魚灯等の水産用光デバイスを開発する技術者にも活用しやすい成果の普及方法についても検討する。
漢代楚辞作品の多角的研究－文学・思想・文化研究資料としての再評価をめざして－

2018年度は、4月1日の交付決定後、早急にメール上で例会と研究会開催について話し合い、日程の調整をおこなった。5月下旬に、東北大学川内キャンパスで開催された東北中国学会前後の時間を利用して、第1回研究打ち合わせをおこなった。研究代表者の矢田、分担者の塚本と狩野、協力者の上原尉暢(関西大学非常勤講師〈当時〉)が参加し、研究期間全体の計画と予算について確認した後、漢代楚辞作品の訳注作成のため、使用する底本と訳注形式の決定、参考資料のリストアップをおこない、訳注担当作品の役割分担について再確認した。10月上旬に、東京大学駒場キャンパスで開催された日本中国学会前後の時間を利用して、第2回研究打ち合わせをおこなった。矢田・塚本・狩野、協力者の上原と木村真理子(東北大学大学院博士課程2年〈当時〉)が参加し、各自の作業進捗状況を報告するとともに、各自の研究の方向性や最新の研究動向について、情報交換をおこなった。2月下旬に、福岡女学院大学において、2018年度研究報告会および第3回研究打ち合わせをおこなった。矢田・塚本・狩野のほか、研究協力者の上原、高戸聰(福岡女学院大学准教授)が参加した。研究報告会では、矢田が「楚辞「哀時命」について」、塚本が「『漢魏六朝百三名家集題辭注』所収「王叔師集」を読む」、狩野が「二陸と楚辞」、上原が「王褒「九懐」研究」、高戸が「古代中国における蛇と巫の関係について」と題する研究発表をおこない、質疑応答を通して、各自の研究内容について議論をおこなった。また、研究打ち合わせでは、各自の担当する作品の訳注について、作業の進捗状況を報告するとともに、2019年度の具体的な研究計画について話し合った。矢田は、賈誼「惜誓」・淮南小山「招隠士」・東方朔「七諫」・厳忌「哀時命」の訳注と研究を担当している。このうち「惜誓」および「哀時命」については、訳注をほぼ完成させ、成果発表のための最終確認をおこなっているところである。加えて「惜誓」については、12月にすでに研究成果を論文として発表した。「哀時命」についても、2月の研究報告会において研究発表をおこない、現在、それをもとに研究論文を執筆中である。なお、12月に刊行した著書は、これまでの楚辞に関する研究成果をまとめたものであるが、本研究課題に関するものも一部含まれている。塚本は、王逸「九思」の、狩野は、劉向「九歎」の訳注を担当している。現在、両者ともに訳注作成のため、資料の精査をおこなっているところであり、2月の研究報告会において、その成果の一部をそれぞれ発表した。上原は、王褒「九懐」の訳注を担当している。訳注をほぼ完成させ、現在、その成果発表のための最終確認をおこなっているところである。また、王褒の作品に関する研究の成果を12月に論文として発表した。2019年度は、前年度に引き続き、各作品の訳注作成や研究論文の執筆を各自で進める。研究成果については、適宜、学術雑誌や学会等で発表していく。また、5月と10月に研究打ち合わせをおこない、各自の進捗状況を報告するとともに、訳注作成上の問題点について話し合う。2月には研究報告会をおこない、各自の研究成果を確認するとともに、研究打ち合わせをおこなって、次年度の具体的な研究計画について話し合う予定である。2020年度も引き続き作業と論文執筆をおこなう。前年度と同様、5月と10月の研究打ち合わせ、2月の研究報告会および研究打ち合わせを予定している。2021年度は、研究課題の完成をめざし、引き続き作業をおこなう。また、楚辞あるいは漢賦に関する国際学会に参加し、研究成果を発表する予定である。

矢田は、賈誼「惜誓」・淮南小山「招隠士」・東方朔「七諫」・厳忌「哀時命」の訳注と研究を担当している。このうち「惜誓」および「哀時命」については、訳注をほぼ完成させ、成果発表のための最終確認をおこなっているところである。加えて「惜誓」については、12月にすでに研究成果を論文として発表した。「哀時命」についても、2月の研究報告会において研究発表をおこない、現在、それをもとに研究論文を執筆中である。なお、12月に刊行した著書は、これまでの楚辞に関する研究成果をまとめたものであるが、本研究課題に関するものも一部含まれている。塚本は、王逸「九思」の、狩野は、劉向「九歎」の訳注を担当している。現在、両者ともに訳注作成のため、資料の精査をおこなっているところであり、2月の研究報告会において、その成果の一部をそれぞれ発表した。上原は、王褒「九懐」の訳注を担当している。訳注をほぼ完成させ、現在、その成果発表のための最終確認をおこなっているところである。また、王褒の作品に関する研究の成果を12月に論文として発表した。2019年度は、前年度に引き続き、各作品の訳注作成や研究論文の執筆を各自で進める。研究成果については、適宜、学術雑誌や学会等で発表していく。また、5月と10月に研究打ち合わせをおこない、各自の進捗状況を報告するとともに、訳注作成上の問題点について話し合う。2月には研究報告会をおこない、各自の研究成果を確認するとともに、研究打ち合わせをおこなって、次年度の具体的な研究計画について話し合う予定である。2020年度も引き続き作業と論文執筆をおこなう。前年度と同様、5月と10月の研究打ち合わせ、2月の研究報告会および研究打ち合わせを予定している。2021年度は、研究課題の完成をめざし、引き続き作業をおこなう。また、楚辞あるいは漢賦に関する国際学会に参加し、研究成果を発表する予定である。研究分担者の塚本と狩野が、訳注作成上必要な資料や物品の選定中であったため、物品費およびその他の経費に繰越金が生じた。また、塚本は研究打ち合わせや報告会に研究協力者を伴わず、県外での資料調査等の必要もなかったため、旅費に繰越金が生じた。両者とも、次年度には資料や物品の選定を終え、物品費・その他の経費の繰越金はそれらの購入費等にあてる予定である。塚本は、次年度以降の本格的な資料調査や学会参加費用、研究分担者の旅費等に、旅費の繰越金をあてる予定である。
保型形式の周期とＬ関数の特殊値の平均分布

(1)一般総実代数体上の正則ヒルベルト保型形式の標準L関数とそれを2次指標で捻じったL関数(あるいはその一回微分)の積の中心値に関して相対跡公式を明示化し、佐武パラメーターの一様分布やL関数中心値の新しい明示的劣凸評価などへの応用がえられた。(2)IV型対称領域で定義されたスカラー値正則保型形式のフーリエ係数のある定符号直交群の類群指標による重み付平均に関して、従来知られていた楕円モジュラー形式やジーゲルモジュラー形式の場合と整合する適切な正規化を提案した。この正規化平均フーリエ係数の2乗と標準L関数の中心値の積を解析するのに有用な和公式を証明した。総実代数体上の2次一般線形群の保型尖点表現で実素点における極大コンパクト群の作用に関して不変ベクトルを含むものの(=マース波動表現)うち、代数的導手が固定された平方自由イデアル(=レベル)となるもの全体を考え、ある2次体へのベースチェンジL関数の中心値を重みとした分布関数が研究対象である。22年度計画では、絶対ノルムが無限大に発散するような平方自由イデアルの塔に沿った、この分布関数の挙動の主要項を決定することを目標の一つに掲げたが、これは概ね達成された。また、固定されたレベルを持つマース波動表現のうち、無限素点における無限小指標に関する重み付きの数え上げ関数を導入し、この数え上げ関数に対してワイル法則型の漸近公式を導いた。この過程で、マース波動表現の標準L函数の中心値の中心指標に関する凸評価の部分的改善が可能であることも分かった。これら一連の結果は、保型グリーン函数を使って明示的に相対跡公式を計算することで得られる。結果は学術論文にまとめ現在投稿中である。年度の後半では、研究実施計画に述べた2次斜交群を特殊ケースとして含む、ランク2の直交群上の正則スカラー値保型形式の標準L函数の平均分布を調べるための予備的な研究に着手した。これは次年度への継続課題である。研究代表者(都築)の昨年度の研究成果は次のようにまとめられる。(A)IV型有界対称領域で定義されたスカラー値正則保型形式のフーリエ展開係数のある直行群の類群量指標による重み付平均に関して、その適切な正規化を提案した。これは、古典的な楕円モヂュラー形式の場合には、通用の正規化に本質的に一致するほか、2次のジーゲル保型形式の場合には予想されるフーリエ係数の増大度とも整合性を持っている。(B)固定された重さを持ち、IV型領域に作用する数論的離散群を定義するために用いた計量格子の判別式部分群に対応するレベルも持つ正則保型ヘッケ固有形式のなす有限集合に、(A)にいう正規化されたフーリヱ係数の2乗を使って確率測度を導入することで確率空間を構成する。この確率空間上で、村瀬篤・菅野孝史の定義した完備標準L関数の中心特殊値で定義される「確率変数」の1次モーメントを考察し、重さが無限に大きくなる際の誤差項付き漸近公式を証明した。このような漸近公式は古典的な楕円保型形式のL関数のほか、その2次対称積L関数などについても知られていたが、今回は大幅に一般化された状況設定で、高次のオイラー積の中心特殊値を取り出すことに成功した、という技術的側面での成果を強調しておきたい。これら(A)、(B)の内容は、2つの研究集会で発表済みであり、現在4本の学術論文を準備中である。一方、研究分担者(角皆)の研究成果は次のようにまとめられる。標点付き射影直線のモジュライ空間への置換群の作用の研究として、複比型ネーター問題に取組み、特に6次の場合に、幾つかの困難な場合を除いて、早稲田大学の橋本喜一朗氏との共著論文としてまとめ、査読つき国際集会報告集に掲載決定済である。また、種数0に於けるモジュラー単数の類似物として複比を捉える観点から、それらを根とする多項式の具体的構成に取組み、経過報告的な口頭発表を行なった。25年度の研究代表者の研究成果は次のようにまとめられる。(I)一般総実代数体上の正則ヒルベルト保型形式の予め指定した2次拡大への基底変換L関数の中心微分値を考える。所与の重さ(無限素点での離散系列のパラメーター)がすべて6以上であり、基底変換L関数の関数等式の符号が負であるような保型表現のうちコンダクターを共有するようなものの平均(harmonic moment)に対してコンダクターに関する誤差項付き漸近公式を導いた。

このような公式はGL(2)の保型形式の対角分裂トーラスに沿った周期積分に対応する相対跡公式の明示化とその拡張によって得られた成果で、なかんずく跡公式の所謂幾何サイドに現れる局所項たちをスペクトルパラメーター空間上のテスト関数の汎函数として完全に明示的に計算したことの重要性を強調しておきたい。漸近公式の誤差項のコントロールによって、非消滅中心L値(微分値)を有する正則保型表現の定義体の絶対次数の下からの評価について新しい結果を得ることが出来た。(以上は杉山真吾氏との共同研究である。)(II)総実代数体上で各実素点での符号条件を調整して得られるユニタリー群のコンパクト算術商の塔(志村多様体)を考える。非等方ベクトルの固定部分群から生じる算術サイクルのdeRhamコホモロジー類をヘッケ作用素で固有分解したときに生じる各既約成分のL2ノルムを重さとして採用すると、対応する佐竹パラメーターがパラメーター空間上のあるPlancherel測度について一様分布することを証明した。この成果は、やはり相対跡公式の局所項の明示的決定から得られたもので、(I)の研究手法の有効性が確かめられたことの意義は大きい。一般総実代数体に関するヒルベルトカスプ正則保型形式の2次拡大体への基底変換標準L関数の中心特殊値のスペクトル平均(重さ付1次モーメント)に関して、杉山真吾(阪大博士課程在学)との共同研究を行い、明示的な相対跡公式を構成した。さらに、その応用として次の2つの定理を証明した:(1)保型表現のコンダクターの増大に伴う佐竹パラメーターの中心L値加重付き一様分布定理(2)2次拡大への基底変換標準L関数の中心値に対する、無限素点でのパラメーター(保型形式の重さ)に関する明示的な劣凸評価式(1)に関しては、Ramakrishnan-Rogawski, Feigon-Whitehouseによる先行研究があるが、いずれも保型表現のコンダクターが平方因子を持たず、しかも基底変換する2次拡大が総虚である場合に限定されていたが、我々の研究でそれらの仮定を排除し、より一般的な状況で通用する結果が得られた。(2)に関しては、すでにMichel-Venkateshによって、劣凸評価の存在自体は一般的に確立されているが、我々の研究では方法論が従来と異なって相対跡公式の局所項の詳しい計算を利用している点や、我々の評価式は重さに関して明示的な劣凸冪指数を提示しているという点でも新しい知見を与えるものと期待している。上述の成果は英文の学術論文として完成済みで、現在はその発表に向け投稿先を検討中である。26年度研究実施計画の最後では、分裂階数が1のユニタリー群と一つサイズの小さな部分ユニタリー群の対に対するGross-Prasad周期に関連した相対跡公式の明示的研究に着手する予定であったが、その前段階として部分ユニタリー群の表現が自明である場合を考察した。この設定でのdistinguished保型表現は2次のユニタリー群の保型表現からの持ち上げで尽くされるというのが予想であり、2次ユニタリー群の表現が正則な場合にはKudla-Milsonによるフーリエ係数とポワンカレ級数を使った加法的な理論が知られている。Flickerによる2次ユニタリー群の保型表現からCM体上のGL(2)のdistingushed保型表現へのunstable changeの構成とその特徴付けによれば、直接CM体のdistinguished保型表現からユニタリー群のdistinguished保型表現への持ち上げを構成するのは自然である。26年度はそれぞれの群の相対跡公式を比較を行うために必要な道具を整備した。26年度が最終年度であるため、記入しない。整数論26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度では、当初の申請計画書の研究計画で詳述した第一段階はおおむね達成された。
難還元性酸化物を生成する金属粉の焼結体に関する研究

金属粉末の粒子表面には一般に酸化物が生成しているが、これは焼結体の性質に悪影響を及ぼすことが多い。そこで、粉末成形体の焼結に当たっては、難還元性の酸化物を生じる金属粉末については混合粉砕過程後の粉末表面の酸化の進行を抑制する事が重要となり、水素などによって還元可能な酸化物を生じる金属粉末については焼結の昇温の過程で成形体が緻密化する前に酸化物を十分に還元することが重要となる。前者の粉末表面の酸化の進行を抑制することを目的として、混合粉砕過程後の粉末の取り扱い雰囲気を、純度99%のアルゴンとし、かつ雰囲気温度を室温以下のマイナス40°Cとしたところ、チタン粉末については粉末の酸化量は通常の大気中での取り扱いの場合に比べて約70%となった。しかし、この値は期待値を遙かに下回った。そこで、次に、酸化物量が極めて多い金属超微粉について、その粉末成形体を焼結する場合、酸化物の還元を十分に行うと共に緻密でかつ超微細粒の焼結体を調製する為の研究を行った。その結果、(1)FeおよびCu金属超微粉(粒径はそれぞれ0.02,0.05μm、酸素量はそれぞれ15、6mass%)とそれらの混合粉については、残留酸素量が少ないと共に緻密な焼結体を得る為には、粉末成形体の相対密度および焼結の昇温速度のいずれも、普通粒度粉の場合に設定される値よりもかなり小さくする必要があること、(2)そのような焼結体の結晶粒径は0.31.5μmであり、溶解材に比べてかなり微細であった。次に、難還元性酸化物を逆に積極的に利用し、【A1_2】【O_3】酸化物分散強化型金属をCu超微粉を用いて作成する為の研究を行った。その結果、(1)Cu超微粉の緻密化はある臨界の酸化物量以上で阻害されるが、その臨界量は酸化物粉の粒径が小なるほど減少する、(2)Cu結晶粒径は酸化物量と共に微細となる、ことが明らかとなった。
薬剤性肺線維症の分子機構解明とその予測法・防御法の開発

薬物の肺障害性について、重篤な肺の線維化と深く関係する肺胞上皮細胞の上皮間葉転換(EMT)の観点から研究を行った。その結果、メトトレキサートなどの肺障害性薬物は、肺胞上皮細胞に直接作用しEMTを引き起こすこと、EMTの誘発にはSmad2のリン酸化、細胞外分泌因子、マイクロRNAなど様々な因子が関与すること、サプリメントとしても使用されているケルセチンはEMT抑制効果を持つことなどを明らかにした。これらの知見は、薬剤性肺障害の分子機構の理解や肺障害防御法の開発に有用と考える。肺線維症は、5年後の死亡率が約50%にも上るなど、極めて重篤な疾患である。薬剤性の肺線維症は抗がん剤など多様な薬物によって引き起こされるが、現在、その解析は遅れている。近年、線維化の原因として肺胞上皮II型細胞の筋線維芽細胞への転換(上皮間葉転換(EMT))が注目されている。本研究では、肺胞上皮細胞を用い、薬物によるEMTの誘発や分子機構の解析とそれを検出するための分子バイオマーカーを明らかにすることを第一の目的とする。次に、治療薬・予防薬の開発に向け、EMTを抑制しうる化合物・薬物を探索・同定することを第二の目的とする。初年度の成果は以下の通りである。1)ラット由来のRLE-6TN細胞から我々が樹立したRLE/Abca3細胞(Abca3遺伝子導入によって全体的にII型形質が高まった細胞)およびヒト由来のA549細胞を用い、TGF-β1によるEMTの誘発について解析した。TGF-β1によってこれら細胞の形態が紡錘状の線維芽細胞様に変化し、またアクチンフィラメントの走行も繊維状に変化した。さらに上皮系マーカー遺伝子の発現低下、間葉系マーカー遺伝子の発現上昇が認められ、TGF-β1によってEMTが誘発されていることが示された。2)次に、抗がん剤ブレオマイシンおよびメトトレキサートを用いて細胞を処置し、細胞の形態や遺伝子発現の変化について解析した。その結果、これら抗がん剤は、TGF-β1によるEMTと類似した変化を引き起こした。さらにRLE-6TN細胞とRLE/Abca3細胞でTGF-β1や抗がん剤処置の影響を比較したところ、我々が樹立したRLE/Abca3細胞のほうがより鋭敏にEMTを検出できることが明らかとなった。3)TGF-β1によるEMTに対する特発性肺線維症治療薬ピルフェニドンの影響について検討したところ、ピルフェニドンはTGF-β1によるEMTの抑制効果を示さなかった。薬剤性の肺線維症は抗がん剤など多様な薬物によって引き起こされるが、その機構解析は遅れている。本研究では、肺胞上皮細胞を用い、薬物によるEMT誘発の分子機構の解明とそれを検出するためのバイオマーカーを明らかにすることを第一の目的とする。次に、予防法の開発に向け、EMTを抑制しうる化合物を探索・同定することを第二の目的とする。平成27年度の成果は以下の通りである。1)ヒト由来A549細胞をメトトレキサート(MTX)で処置したところ、EMT様変化が誘発され、TGF-β1処置の場合と同様、Smad2のリン酸化が亢進した。さらに、TGF-β1のシグナル伝達を阻害するSB431542をMTXと併用したところ、細胞形態やmRNA発現から見たEMT様変化やSmad2のリン酸化が抑制された。しかし、TGF-β1の中和抗体を培養液中に添加してもMTXによるEMT誘発には影響を与えなかった。従って、MTXによるEMT誘発には、TGF-β1処置と類似したシグナル伝達経路が関与するが、TGF-β1のオートクリンは関与しないものと考えられた。2)ラット由来でII型の形質を高めたRLE/Abca3細胞において、アスコルビン酸およびケルセチンは、TGF-β1、MTX、ブレオマイシン(BLM)によるEMT様の細胞形態変化を顕著に抑制したことから、肺線維症抑制物質として有望と考えられた。当初計画していた抗がん剤によるEMT誘発の分子機構に関して、TGF-β1およびそのシグナル伝達経路の関与について明らかにすることができた。また、EMT抑制剤についても、有望な化合物(アスコルビン酸、ケルセチン)を見出すことができた。それらに加えて、マイクロRNAであるmiR-34aが、肺胞上皮細胞のEMTおよび肺線維症の新たな分子バイオマーカーとして利用できる可能性を見出した。平成28年度の成果は以下の通りである。1)ヒト由来A549細胞をメトトレキサート(MTX)で処置し、その培養上清を透析してMTXを除去し、Conditioned Medium (CM-MTX)を調製した。

A549細胞をCM-MTXで処置したところ、EMT様の変化が観察された。従って、MTXによるEMT誘発には上清中に分泌される何らかの因子の関与が示唆された。2)II型の形質を遺伝子工学的に高めたRLE/Abca3細胞において、ケルセチンはTGF-β1、MTX、ブレオマイシン(BLM)による間葉系マーカーα-SMAのmRNAおよびタンパク質の発現上昇抑制効果を持つことが明らかとなり、EMTマーカー発現の面からもケルセチンのEMT抑制効果が示された。3)RLE/Abca3細胞をBLMで処置することでmiR-34aの発現上昇およびその標的遺伝子であるNectin-1やABCA3の発現減少を認めていたため、miR34-aのmimicを細胞に導入し直接的な効果を検討した。その結果、miR34-aのmimic導入によって、Nectin-1およびABCA3のmRNA発現が減少することを認めた。MTXによるEMT誘発のメカニズムに関し、MTXによる何らかの因子(インターロイキン(IL)-6やIL-8などが候補)の細胞外分泌亢進が関与する可能性を見出した。またケルセチンによるEMT抑制効果について、EMTマーカーの面からさらに深く解析することができた。それらに加えて、マイクロRNAであるmiR-34aが、薬剤性のEMT誘発に関わる可能性を初めて明らかにした。薬剤性の肺線維症は抗がん剤など多様な薬物によって引き起こされるが、その機構解析は遅れている。近年、線維化の原因として肺胞上皮II型細胞の筋線維芽細胞への転換(上皮間葉転換(EMT))が注目されている。本研究では、肺胞上皮細胞を用い、薬物によるEMT誘発の分子機構の解明とそれを検出するためのバイオマーカーを明らかにすることを第一の目的とする。次に、予防法の開発に向け、EMTを抑制しうる化合物を探索・同定することを第二の目的とする。平成29年度の成果は以下の通りである。1)ヒト由来A549細胞をメトトレキサート(MTX)で処置し、その培養上清を透析してMTXを除去したConditioned Medium (CM-MTX)は、A549細胞にEMT様の変化を誘発する。しかし、細胞をMTXで処置する際に葉酸を併用したところ、CMによるEMT誘発は観察されなかった。さらに、CM-MTXによるEMT誘発効果も葉酸により抑制された。従って、葉酸はMTX誘発性肺障害の防御に有用である可能性が示唆された。2)前年度、ラット由来肺胞上皮細胞において、miR-34aの上昇がEMT誘発に関与する可能性を明らかにした。今年度はさらにヒト由来細胞において、ブレオマイシン(BLM)およびMTX処置によって共通してmiR-484が50%以下に減少することを見出した。miR-484のバイオマーカーとしての可能性やEMTとの関連性について、現在さらに検討を進めている。3)TGF-β1、BLMによるEMT誘発に対するケルセチンの防御効果についてさらに解析を進め、ケルセチンはリン酸化Smad2の上昇を抑制すること、またEMT抑制効果との関係は現在のところ明確でないが、TGF-β1、BLMによるROS産生も抑制することを見出した。薬物の肺障害性について、重篤な肺の線維化と深く関係する肺胞上皮細胞の上皮間葉転換(EMT)の観点から研究を行った。