hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局在化基底による新しい固体電子励起状態計算手法の開発

本研究課題では、ガウス基底関数を用いた高分子の励起状態の第一原理計算法を開発したほか、固体の励起状態計算手法に関して様々な手法を提案した。概要は以下の通りである。1.ガウス型基底関数を用いたHartree-Fock結晶軌道理論、結合クラスター(coupled-cluster)理論、及びequation-of-motion coupled-cluster理論を用いて、一次元周期系で励起状態を計算する手法を開発した。これによって電子相関を高精度に取り込んだ高分子の励起状態計算が可能となった。ポリエチレンにこの手法を適用し、計算された励起エネルギーの値が実験値と良く一致することを示した。2.スピン非制限型密度汎関数法でポリジアセチレンの電子状態を計算し、アセチレン型とブタトリエン型の中間の構造で二つのスピン密度波の状態が存在すること、それらに対応するポテンシャルエネルギー関数が大きく異なっていることを明らかにした。3.ベーテ・サルピータ方程式と密度汎関数法を用いて励起状態を求める手法について、electron-hole相互作用を局所的な相互作用として近似することにより、計算を簡略化する方法を提案した。4.動的平均場理論とGW近似を組み合わせて強相関物質の励起状態を計算する手法を提案した。LMTO法を用いたNiの電子状態計算に適用し、実験のバンドエネルギーと良く一致することを示した。5.時間依存密度汎関数理論における交換相関核f_<xc>を二次元Hubbardモデルの解から求め、エネルギー依存性を調べた。多体励起に伴う励起ピークが見られるエネルギー領域では、f_<xc>が大きなエネルギー依存性を持っていることを明らかにした。1.局在化基底を用いた電子状態計算プログラムの開発今年度から局在化基底(ガウス基底関数)を用いた第一原理固体電子状態計算のプログラム開発をスタートさせ、周期境界条件(一次元)を用いた結晶軌道Hartree-Fock計算及びpost Hartree-Fock計算を行うプログラム群を作成した。Hartree-Fock近似よりさらに進み、より厳密に電子相関を取り扱う様々な手法を結晶系に適用するためには、二電子原子積分を結晶軌道の基底に変換したもの(分子系の分子積分に相当するもの)を生成する必要がある。しかし結晶系においては、分子にはない並進対称性から生ずる問題、特に格子の和を有限項で打ち切ることに由来する計算上の問題点があることがわかった。これらを解決する方法を考案し、積分変換のプログラムを作成した。この積分変換のプログラムは、すでに開発した二次のRayleigh-Schrodinger摂動法(MP2)、coupled-cluster(CC)法、equation of motion(EOM)-CC法(励起状態計算)などのプログラム群と結合させることができる。このようにプログラム開発にあたっては、様々な計算手法を比較・検証することが容易になるように、プログラムがプラットフォームとしての機能を持つように注意を払った。現在、水素原子からなる一次元系でのMP2,CC法などのテスト計算を行えるまでになり、エネルギーの収束性について調べた。現在、現実的な系への適用、励起状態の計算を進めている。2.時間依存密度汎関数法(TDDFT)における交換相関核の研究TDDFT法は電子励起状態計算手法の1つであるが、密度汎関数法における共通の問題として、交換相関ポテンシャルに関わる問題があり、計算精度向上の鍵となっている。交換相関ポテンシャルの問題点を明らかにするために、ここでは線形応答関数χ(およびその核fxcに着目し、Hubbardモデル(二次元3×3サイト)によって得られた厳密解とRPA, TDLDA, LDAによる数値を比較した。その結果、一電子励起を主体として記述できる励起状態においてはfxcのエネルギー依存性は小さいが、多体励起を主体とした励起状態(サテライト)ではfxcは大きなエネルギー依存性を持っていることがわかり、この場合、TDDFT法で用いられる断熱近似が有効でないことが明らかとなった。

前年度から局在化基底(ガヴス基底関数)を用いた周期境界条件による第一原理固体電子状態計算のプログラム開発を行っている。昨年度までに計算に必要な数式の導出を行い、1次元のHartree-Fock結晶軌道法、積分変換、二次のMoller-Plesett摂動法、coupled-cluster(CC)法、equation of motion CC(EOM-CC)法のプログラムの基本的な動作確認を行った。今年度は引き続いてプログラムの整備・改良を進めた。開発しているプログラムの計算量が非常に多いため、実際のアプリケーションでは並列計算機を有効に活用する必要がある。そのために全てのプログラムについてOpenMPによる並列化を行った。その結果、共有メモリ型の計算機(例えばOrigin2000)で高速に実行することが可能となった。また、メモリ使用量を削減する等、プログラム全般を見直して実行効率の改善を図った。現時点でOrigin2000/32CPUにおいて、ピーク性能の10%弱の性能が出せるようになり、200程度の軌道数(5つのk点で40軌道相当)が扱えるようになった。プログラムの性能をもう少し向上させることができれば、Origin2000で300軌道程度、SR11000等ではさらに大きな問題が解けるようになると考えられる。開発したプログラム群を用いて水素原子の1次元鎖の電子状態計算を行い、coupled-cluster法による基底状態のエネルギーがk点の増加に対して収束することを確認した。また、full-CIのエネルギーとの比較を行い、coupled-cluster法のエネルギーがfull-CIエネルギーの良い近似値となっていることも確認した。これらの結果については7/20-26にドイツ・ボンで開催された第11回ICQC国際会議で発表した。また、より現実的な系への適用例として、ポリエチレンの励起状態計算を行った。周期境界条件による計算と同時にオリゴマーを用いた計算を行い、両者のエネルギーの比較を行った。その結果、両者のエネルギー差が周期系においてはk点の増加、オリゴマーにおいては分子長の増加に対して減少していくことを確認した。最低一重項エキシトン状態の励起エネルギーは最小基底関数を使った場合で15eV程度、double-zeta基底で11eV程度という結果が得られており、現在投稿準備中である。(1)前年度までに、一次元周期境界条件を用いたHartree-Fock法、二電子積分変換、二次Moller-Plesett摂動法、coupled-cluster(CC)法、equation-of-motion CC(EOM-CC)法のプログラム開発を進めてきた。今年度は二次摂動法もしくは逆Dyson方程式を解く方法でバンドギャップを求めるプログラムを追加したほか、新しく導入されたスーパーコンピュータHitachi SR11000への移植等を行った。
糖脂質糖鎖による骨代謝制御機構

当該年度は、b系列ガングリオシドと昨年、骨代謝に関与することが示されたグロボ系糖脂質に着目し、それらの糖脂質が骨代謝に及ぼす影響について検討した。まず、骨芽細胞および破骨細胞前駆細胞であるマクロファージにおけるb系列ガングリオシドの発現をフローサイトメトリーを用いて解析した結果、骨芽細胞では発現していなかったが、マクロファージでは発現しており、これらの発現は、RANKLによる破骨細胞分化誘導後には消失もしは減弱した。そこで、マクロファージに発現するb系列ガングリオシドが破骨細胞分化に関与しているのかについて明らかにするため、b系列ガングリオシド合成に必要な糖転移酵素を欠損させたGD3合成酵素遺伝子ノックアウトマウス(GD3S KOマウス)の骨髄由来マクロファージを用いて、破骨細胞分化能を検討した。その結果、野生型とGD3S KOマウス由来のマクロファージの間で、破骨細胞分化能には差が認められなかった。次に個体レベルでのb系列ガングリオシド欠損による骨代謝への影響を検討するためGD3S KOマウスの骨表現型をマイクロCTを用いて解析した。その結果、15週齢の野生型とGD3S KOマウスの間で、骨量に有意な差は認められなかったが、40週齢のGD3S KOマウスでは、加齢に伴う骨量の減少が野生型マウスと比較して有意に抑制された。また、骨芽細胞数においては、15および40週齢の野生型とGD3S KOマウスの間では差が認められなかったが、破骨細胞数は40週齢のGD3S KOマウスで有意に減少した。以上の結果より、マウスにおけるb系列ガングリオシドの欠損が破骨細胞数を減少させることで骨吸収を減弱させ、加齢に伴う骨量の減少を抑制することが判明した。また、昨年度、示されたGb3合成酵素遺伝子欠損による骨量の減少が、骨形成の抑制によることがカルセインを用いた二重標識で明らかになった。骨芽細胞および破骨細胞(破骨細胞前駆細胞を含め)における糖脂質の発現プロファイルを明らかにした。また、中性糖脂質合成に必要なGb3合成酵素遺伝子ノックアウトマウスでは、野生型と比較して、骨量が低下することが明らかになり、この骨量低下は、骨芽細胞減少による骨形成能の低下によるものであることが示された。b系列ガングリオシドを欠損させたGD3合成酵素遺伝子ノックアウトマウス(GD3S KOマウス)の解析の結果、b系列ガングリオシドは、直接的作用ではなく、間接的作用により破骨細胞数を制御し、加齢に伴う骨量の減少に関与することが示唆された。以上のことより、おおむね順調に進展していると思われる。グロボ系糖脂質Gb4やb系列ガングリオシドが骨芽細胞や破骨細胞(破骨細胞前駆細胞)に直接的もしくは間接的に作用し、骨代謝を制御していることが細胞レベルおよび糖転移酵素遺伝子のノックアウトマウスを用いた実験により示されてきたので、今後は、これらの糖脂質がどのような分子メカニズムで、骨代謝を制御しているのかについて解明したいと考えている。糖脂質が骨代謝制御に関与しているのかについて明らかにするため、まず、骨芽細胞および破骨細胞(破骨細胞前駆細胞を含め)における糖脂質の発現プロファイルをフローサイトメトリーを用いて検討した。その結果、骨芽細胞(マウス骨芽細胞株MC3T3-E1細胞)では、モノシアリル糖脂質GM1、GD1aおよびグロボ系糖脂質Gb4の発現が認められた。また、MC3T3-E1細胞を成熟な骨芽細胞へ分化誘導させた結果、GM1およびGD1aの発現の低下が認められた。一方、破骨細胞前駆細胞であるマクロファージ(マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞およびマウス骨髄細胞由来のマクロファージ)では、骨芽細胞にも発現していたGM1、GD1aの他にジシアリル糖脂質GD3、GD2、GD1b、GT1bの発現も認められた。しかし、これらの発現はRANKL添加による破骨細胞への分化誘導後には、減弱もしくは消失した。骨芽細胞で発現が認められたGb4が骨代謝制御に関与しているのかを明らかにするため、Gb4を含めたグロボ系糖脂質が欠損しているGb3合成酵素遺伝子ノックアウトマウスにおける骨表現型をマイクロCTを用いて解析した。その結果、このノックアウトマウスの大腿骨では、野生型と比較して、有意にBV/TV(骨量)の減少が認められた。以上の結果より、骨芽細胞で発現するGb4が、骨形成促進に関与している可能性が示唆された。また、alpha 2アドレナリン受容体作動薬であるguanabenz、clonidineおよびxylazineをマクロファージに添加すると、破骨細胞への分化が抑制された。糖脂質は、神経系を制御していることが知られていることより、破骨細胞前駆細胞で発現している糖脂質が細胞膜で、alpha 2アドレナリン受容体を調節することで、破骨細胞への分化を制御している可能性が考えられた。骨芽細胞および破骨細胞(破骨細胞前駆細胞を含め)における糖脂質の発現プロファイルが明らかになった。また、Gb3合成酵素遺伝子ノックアウトマウスでは、野生型と比較して、骨量が低下することが明らかになり、骨芽細胞表面に発現するGb4が、骨芽細胞への分化あるいは増殖に関与する可能性が示唆されているので、おおむね順調に進展していると思われる。

当該年度は、b系列ガングリオシドと昨年、骨代謝に関与することが示されたグロボ系糖脂質に着目し、それらの糖脂質が骨代謝に及ぼす影響について検討した。まず、骨芽細胞および破骨細胞前駆細胞であるマクロファージにおけるb系列ガングリオシドの発現をフローサイトメトリーを用いて解析した結果、骨芽細胞では発現していなかったが、マクロファージでは発現しており、これらの発現は、RANKLによる破骨細胞分化誘導後には消失もしは減弱した。そこで、マクロファージに発現するb系列ガングリオシドが破骨細胞分化に関与しているのかについて明らかにするため、b系列ガングリオシド合成に必要な糖転移酵素を欠損させたGD3合成酵素遺伝子ノックアウトマウス(GD3S KOマウス)の骨髄由来マクロファージを用いて、破骨細胞分化能を検討した。その結果、野生型とGD3S KOマウス由来のマクロファージの間で、破骨細胞分化能には差が認められなかった。次に個体レベルでのb系列ガングリオシド欠損による骨代謝への影響を検討するためGD3S KOマウスの骨表現型をマイクロCTを用いて解析した。その結果、15週齢の野生型とGD3S KOマウスの間で、骨量に有意な差は認められなかったが、40週齢のGD3S KOマウスでは、加齢に伴う骨量の減少が野生型マウスと比較して有意に抑制された。また、骨芽細胞数においては、15および40週齢の野生型とGD3S KOマウスの間では差が認められなかったが、破骨細胞数は40週齢のGD3S KOマウスで有意に減少した。以上の結果より、マウスにおけるb系列ガングリオシドの欠損が破骨細胞数を減少させることで骨吸収を減弱させ、加齢に伴う骨量の減少を抑制することが判明した。また、昨年度、示されたGb3合成酵素遺伝子欠損による骨量の減少が、骨形成の抑制によることがカルセインを用いた二重標識で明らかになった。骨芽細胞および破骨細胞(破骨細胞前駆細胞を含め)における糖脂質の発現プロファイルを明らかにした。また、中性糖脂質合成に必要なGb3合成酵素遺伝子ノックアウトマウスでは、野生型と比較して、骨量が低下することが明らかになり、この骨量低下は、骨芽細胞減少による骨形成能の低下によるものであることが示された。b系列ガングリオシドを欠損させたGD3合成酵素遺伝子ノックアウトマウス(GD3S KOマウス)の解析の結果、b系列ガングリオシドは、直接的作用ではなく、間接的作用により破骨細胞数を制御し、加齢に伴う骨量の減少に関与することが示唆された。以上のことより、おおむね順調に進展していると思われる。骨芽細胞において、グロボ系糖脂質Gb4が発現し、その糖脂質が欠損しているGb3合成酵素遺伝子ノックアウトマウスでは、野生型と比較して、骨量の低下が認められた。そこで、今後は、このノックアウトマウスでみられた骨量低下が、骨形成低下によるものなのか、もしくは、骨吸収促進によるものなのかを明らかにするとともに、Gb4による骨代謝制御の分子メカニズムを解明したいと考えている。また、骨芽細胞分化誘導の過程で、発現が低下するGM1やGD1aの意義について検討したいと考えている。
林家自身による素材生産の発展可能性について

近年一部の地域で、林家自身による間伐など素材生産への取り組みが盛んになってきている。本研究の課題は、そうした林家自身による素材生産が、(1)戦後造林木が間伐期に入ったことに対する対応にすぎず、主伐期に入れば衰える一過性のものなのかどうか、(2)現在一部地域に限られているものが、更に広がり、一般化していくものであるのかどうか、(3)もし一般化していくものであるとすれば、それを可能にする条件整備はどうすれば良いのか、以上3点を明らかにすることである。研究結果の概略は、以下のとおりである。(1)林家の自伐は、当初は、採算に合い難い間伐材生産を、可能な限り費用を掛けずに実行しようとするところから始まっている。林道・作業道の開設・延長と林内作業車等の導入により、初回間伐はともかく2回目、3回目ともなれば、一定の自家労賃部分を得ながら実施可能となってきている。こうした間伐材生産は、その延長として齢級の高い素材の抜き伐り的生産に変化していくものと思われる。皆伐による主伐材生産については、将来においても専門の素材業者が担当するであろうが、現実には、皆伐はほとんど行われないと想定される。したがって、林家自身による素材生産は、一過性のものではなく、継続される可能性が高いものと思われる。但し、現在の担い手が高齢化していけば素材生産の性格上継続困難となろう。後継者問題がうまく解決できるかどうかに係わっているといえる。(2)現在一部地域に限られている林家の自伐は、戦後造林木が成熟し、採算が合うようになってくれば、それに従って、広がりを見せるものと予想される。(3)一般化を可能とする条件整備は、常識的ではあるが、育林生産過程の技術的向上による林木の単価の上昇と林道・作業道の開設・延長と林内作業車等の導入による生産コストの軽減、さらには比較的若く元気な担い手の存在である。
矯正的歯の移動時の歯周組織におけるCTGFとアポトーシスの役割

矯正的歯の移動時の骨リモデリングについて究明するため、歯槽骨の骨細胞におけるCTGFの発現とアポトーシスに着目して実験を行った。その結果、機械的刺激によるCTGFの発現とそれに続くアポトーシスの亢進により、歯の移動の際認められる骨のリモデリングが引き起こされることが示唆された。得られた研究成果をJournal of dental researchに投稿し、既に受理され、現在印刷中である。矯正的な歯の移動の際認められる骨リモデリングでは、歯槽骨や歯根膜などで構成される歯周組織で多くのタンパクと遺伝子の発現レベルの変化が知られているが、その詳細は明らかでない。CTGFは、骨芽細胞、線維芽細胞や血管内皮細胞の動態を制御することが報告されている。一方、ラットの歯の移動で発現するCTGFの役割は、歯槽骨牽弓側で歯の移動を開始して12時間後という初期に強く発現していることから、骨芽細胞による骨形成に影響を与えているだけでなく、その他の役割も担っていることが推測された。また、大動脈平滑筋細胞や腎線維芽細胞などにおけるアポトーシス誘導に、CTGFの関与が示唆されている。アポトーシスは、生物の発生過程や恒常性の維持に必須な現象であるが、作用機構やシグナル伝達系については不明な点が多い。以上のことから、矯正的歯の移動時の歯周組織でのアポトーシスにおけるCTGFの役割を解析することとした。我々のこれまでの研究から、マウスを用いた実験的歯の移動モデルにおいて、CTGF mRNAは圧迫側の歯根膜および歯槽骨に発現し、さらにその経時的発現パターンがTUNEL陽性骨細胞の発現パターンと類似していることが明らかとなった。これらの結果は矯正的歯の移動の際認められる骨細胞のアポトーシスの亢進に、CTGFが関与することを示唆している。現在、ニワトリ胚頭蓋骨から採取してさらに0B7.3で同定した骨細胞のin vitroの系で、我々が開発した機械的刺激装置を用いてメカニカルストレスを付与した際のCTGFとアポトーシスの関係について分子レベルでの解析を進めている。また、骨芽細胞や破骨細胞についても同様の検索をしており、それらの研究から得られた成果を、今後国際誌に発表していく予定である。矯正的な歯の移動の際認められる骨リモデリングでは、歯槽骨や歯根膜などで構成される歯周組織で多くのタンパク質と遺伝子の発現レベルの変化が認められる。CTGFは、骨芽細胞、繊維芽細胞や血管内皮細胞の動態を制御することが知られている。また、大動脈平滑筋細胞や、腎繊維芽細胞などにおけるアポトーシスの誘導に、CTGFが関与することが示唆されている。以上のことから、我々は矯正的歯の移動時の歯周組織におけるアポトーシスの役割を解明することを目的としてCTGFに着目して検索を行った。我々はマウスを用いて矯正的歯の移動モデルを作製し、in situ hybridizationによりCTGFの遺伝子発現を検索した。さらに、TUNEL、ISOL染色によりアポトーシス陽性細胞の発現を経時的に観察した。その結果、圧迫側の骨細胞では、CTGFが歯"の移動開始から12時間後まで増加し、その後経時的に減少したことから、歯の移動のメカニカルストレスが加わった初期において一過性に歯槽骨圧迫側で多く発現することが明らかになった。アポトーシスについては、TUNEL陽性骨細胞が歯槽骨圧迫側において歯の移動開始から12時間後まで増加し、その後経時的に減少した。また、ISOL陽性骨細胞が歯の移動12時間後、歯槽骨圧迫側に多く認められた。これらの結果は、機械的刺激によって誘導されたCTGFとアポトーシスの発現が、矯正的歯の移動時の骨リモデリングにおいて重要な役割を担っている可能性を示唆している。これらの研究から得られた成果は、既に国際誌に投稿し受理された。
先進諸国におけるエイズの基礎研究に関する調査

エイズの研究を推進している各国の研究者及び行政官にあい,対策,研究費,研究システム,新しい知見,実験技術,疫学的情報,バイオハザードなどの情報を収集し,実験結果を比熊するとともに,共同研究,材料交換,人的交流の可能性について検討することを目的とする.なおこの調査結果を特定研究「AIDSの総合的基礎研究」班の運営に生かす.小高,森は米国サンフランシスコ地区で情報を収集後,NIH,CDCでエイズの疫学,対策について多くの一般的情報を得た.ことにNIHにおいては今後のエイズ対策を決定するための二日間の会議を傍聴するという機会を得た.なお,英国,フランスではエイズ研究の研究者に,英国ではエイズ対策の責任者にあい,またベルギーではアフリカのエイズ状況に関する情報を集めた.鶴尾は米国国立癌研において,抗エイズ薬を多数,安全にスクリーニングするための技術を修得し,これをわが国に導入するための了解をとりつけた.さらに治療薬開発の情報を収集した.高月は米国において,エイズの病態,予防,治療,疫学などについて討議した.最近米国においてはHTLVー1感染が拡大する傾向にあり,輸血事業関係者からHTLVー1に関するわが国の経験をきかれ,情報を求められることが多かった.速水はアフリカにおけるヒト,サルのウイルスを分離した実積をふまえて,ドイツ霊長類センターで,サルを用いた感染実験を行うこと,またフランス,英国のグループとアフリカでウイルスの共同調査を行なう計画を立案した.全体として,米国のNIH,CDC,フランスのパスツール研究所のようなエイズ研究の中心的機関のほか,米国,英国,フランス,ドイツ,ベルギーの五大学,五研究所,その他を訪れたことになり,多くの新しい情報を入手し,エイズ(研究)の現状,問題点について討議することができた.速水グループとイギリス,フランスあるいはドイツとの共同計画は,一方ではアフリカにおけるウイルスの実地調査であり,他方ではサルをを用いたエイズのモデル実験であるので,本海外学術研究の延長として,今後ある期間,資金的裏付けを必要とする.エイズの研究を推進している各国の研究者及び行政官にあい,対策,研究費,研究システム,新しい知見,実験技術,疫学的情報,バイオハザードなどの情報を収集し,実験結果を比熊するとともに,共同研究,材料交換,人的交流の可能性について検討することを目的とする.なおこの調査結果を特定研究「AIDSの総合的基礎研究」班の運営に生かす.小高,森は米国サンフランシスコ地区で情報を収集後,NIH,CDCでエイズの疫学,対策について多くの一般的情報を得た.ことにNIHにおいては今後のエイズ対策を決定するための二日間の会議を傍聴するという機会を得た.なお,英国,フランスではエイズ研究の研究者に,英国ではエイズ対策の責任者にあい,またベルギーではアフリカのエイズ状況に関する情報を集めた.鶴尾は米国国立癌研において,抗エイズ薬を多数,安全にスクリーニングするための技術を修得し,これをわが国に導入するための了解をとりつけた.さらに治療薬開発の情報を収集した.高月は米国において,エイズの病態,予防,治療,疫学などについて討議した.最近米国においてはHTLVー1感染が拡大する傾向にあり,輸血事業関係者からHTLVー1に関するわが国の経験をきかれ,情報を求められることが多かった.速水はアフリカにおけるヒト,サルのウイルスを分離した実積をふまえて,ドイツ霊長類センターで,サルを用いた感染実験を行うこと,またフランス,英国のグループとアフリカでウイルスの共同調査を行なう計画を立案した.全体として,米国のNIH,CDC,フランスのパスツール研究所のようなエイズ研究の中心的機関のほか,米国,英国,フランス,ドイツ,ベルギーの五大学,五研究所,その他を訪れたことになり,多くの新しい情報を入手し,エイズ(研究)の現状,問題点について討議することができた.速水グループとイギリス,フランスあるいはドイツとの共同計画は,一方ではアフリカにおけるウイルスの実地調査であり,他方ではサルをを用いたエイズのモデル実験であるので,本海外学術研究の延長として,今後ある期間,資金的裏付けを必要とする.
ポリグルタミン病のDystrophic Neuritesの神経細胞障害機序の研究

今まで、我々は長さ依存性にかつ閾値をもってポリグルタミン鎖が凝集体を作ること、この凝集体形成が周辺のアミノ酸配列により強く影響を受けることを明らかとしてきた。さらに、この凝集体がCOS細胞の細胞質内ではMTOC(microtubules organizing center)に形成されintermediate filamentsと密接な関連があることを明らかとしてきた。またmicrotubules networkを破壊してもaggregationは形成されるがMTOCへの集積は認めず、核近傍のaggregationが形成されるためにはmicrotubules networkを介した移送が必要であることを明らかとした。この現象は細胞内unfolding Protein分解機構であるaggresomeと同じ性質を有している。これらの実験により増大ポリグルタミン鎖のCOS培養細胞内での処理過程は明らかとなった。さらに細胞内での不要蛋白処理機構を確認するために、数種類の異なる長さの増大ポリグルタミン鎖を有したstable induciblecell lineをNeuro2a、HEK293で作製した。この細胞株はFlp-inシステムを用い、全く同一のShgle integration siteへの導入株であるため、他の要因を可能な限り除去して確認できる系である。この系を用い、増大ポリグルタミン鎖の細胞内代謝が長さ依存性に影響を受けていることが確認されている。今後、その細胞内代謝の違いが細胞機能に与える影響について軸索輸送を含めさらに検討を加える予定である。増大ポリグルタミン鎖はaggresomeにindependentに凝集体を形成し、形成された凝集体は細胞内のしかるべきところに移送される。一方神経細胞内でのaggresomeの存在については確認されていない。現在、神経細胞内での不要蛋白処理機構を確認するために、数種類の異なる長さの増大ポリグルタミン鎖を有したstable induciblecell lineをNeuro2aで作製している。並行して正常神経細胞での蛋白、mRNA移送の観察方法の確立するためにStaufen-GFP融合蛋白発現ベクターを作成している。この現象は細胞内unfolding protein分解機構であるaggresomeと同じ性質を有している。本年度は細胞内での不要蛋白処理機構を確認するために、数種類の異なる長さの増大ポリグルタミン鎖を有したstable induciblecell lineをNeuro2a、HEK293で作製した。この細胞株はFlp-inシステムを用い、全く同一のsingle integration siteへの導入株であるため、他の要因を可能な限り除去して確認できる系である。
ビシクロ骨格の高度遮蔽能によるチアゾリニリデン系NHCの反応性制御に関する研究

コンホメーションの固定されたビシクロ環による必要最小限の立体保護を活用したカルベンの高度反応制御を、緩和な条件での反応が期待できるN,S系チアゾリリデン型NHCにおいて検討する。反応活性種の保護に必要な立体障害を持ちながら、反応基質の接近を妨げることのない特徴的な構造をもつNHCを開発して、反応特性を解明するとともに、有機合成化学への有効活用法について検討を行う。
水産養殖におけるプロバイオティクス候補菌の標識化と動態解析

本研究では研究室で飼育可能なアワビをモデル生物として、添加するプロバイオティクス菌にあらかじめ標識化した株を作製し、宿主の消化管における動態を解明することを目的とした。プロバイオティクスの生菌数測定の結果、標識化された2株は投与停止後3日目または5日目まで消化管内から検出された。また、飼育水中では標識化された2株は3日目または7日目まで検出された。平成19年度は以下の結果を得た。すでに本研究室では抗菌活性を有する乳酸菌を2株分離し、同定済みであるが、これら2株に対して有効なシャトルベクターを開発した。すなわち、染色体DNAと部分的に相同領域を有する線状DNA断片を電気窄孔法で導入し、既存のspacプロモーターを有するプラスミドによる相同組換え能を利用してGFP蛍光を発することができる株を作出した。このベクターは大腸菌を乳酸菌に組み替えが可能であり遺伝子操作をより容易にすることができた。また、相同組換え部位はαガラクトシターゼ遺伝子とした。平成20年度にはこのベクターの乳酸菌における安定性、有効性を検証する予定である。さらに、アワビの消化管内細菌等からプロバイオティクス養殖に適した株の分離に成功した。具体的には乳酸菌と同様にVibrio属などの有機酸を生産する通性嫌気性細菌をターゲットとし、これらの分離株に対し、乳酸菌でのスクリーニングと同様の試験を課し、ライブラリを構築した。これまでにアワビ消化管内で優占しているという報告のある新種のVibrio属細菌について約60株程度分離することができた。また、魚類消化管内で分離された報告のあるPhotobacterium属細菌について20株のライブラリーを構築した。また、これまでに分離されたことのない新規な細菌群の分離に成功した。平成20年度にはこれらの株のプロバイオティクス効果の検証を行う予定である。本年度は(1)メガイアワビ消化管内の常在菌の特定(2)これら常在菌特異検出プローブの作製(3)メガイアワビ消化管内の各常在菌の定量を行った。摘出した消化管を粉砕し組織液を作成した。組織液を、0.5%アルギン酸含有ZoBell2216E平板培地で20°C、5日間培養後、ランダムに30コロニー釣菌し、オキシダーゼ試験陽性、OF試験F(発酵型)の菌株を16SrRNA遺伝子系統解析に供し、消化管内の常在菌を特定した。さらにコロニーハイブリダイゼーション法(Tanaka et al., 2002)を用いて常在菌の核酸プローブを作製し、その特異性を検討した。これらの常在菌と考えられる菌の標識を作成し、反応時間12時間、反応温度60°Cでハイブリダイゼーションを行うことによりそれぞれの常在菌を検出することが可能であった。本条件を用いて2008年12月に採取したメガイアワビサンプルに供したところ、V. halioticoli近縁種が平均で1.4×10^7 CFU/g (gut waight)検出された。さらにV.gallicus近縁種およびV. coralliilyticus近縁種がそれぞれ約1.5×10^7 CFU/g、8.0×10^5CFU/g検出された。Agarivorans albus類似菌は検出限界以下であった。ちなみに総生菌数は約4.5×10^7CFU/gであった。
直交的振動導入による表面上での酵素タンパク質の動的機能制御

本研究では、基質あるいは酵素自身を固定化した基板を、縦方向あるいは横方向に振動させ、その周波数や波形を操作することで、表面における酵素の反応性などを制御することを目指した。まずは、縦方向に振動する基板を用い、その基板上での反応性制御を、振動によって制御することを試みた。はじめに、表面における酵素反応活性の評価システムの構築を行った。はじめに、市販の圧電スピーカー素子に厚さ1mmの金属チタン板を導電接着した。この接着したチタン表面を陽極酸化し反射干渉分光法膜厚計測用の干渉層として機能する酸化チタン膜層を規定の厚さに形成させた。この厚み振動チップを用いて、表面における酵素反応を、基質タンパク質の表面に対する吸着、酵素の基質への結合、およびそれに引き続く基質の分解と酵素の脱離に伴う、表面結合タンパク質膜厚の変化として追跡する測定システムの構築をまず行った。このシステムを用い、圧電素子チップを様々なモードで振動させながら、複数の基質タンパク質とプロテアーゼの組み合わせで、振動モードに依存した酵素反応活性スペクトルを測定した。様々な検討の結果、作成した素子の共振周波数である10.85MHzで数百kHzの頻度でパルス振動させると、パルス頻度に応じて酵素活性が増大もしくは減少することがわかった。そこで、基質タンパク質として牛血清アルブミン(BSA)、カゼインを用い、プロテアーゼとしてサブチリシン、パパイン、サーモライシンを用いて、これらの基質と酵素の6個の組み合わせに関して、酵素活性における高周波縦振動(10.85MHz)のパルス振動効果(100kHz-900kHzの100kHz刻み)を調べた。その結果、基質と酵素の組み合わせで、その活性パルス効果のスペクトルが大きく変わることがわかった。例えばBSAを基質とした場合、サーモライシンを加水分解酵素として用いると、100-600kHzの範囲において2割程度の活性向上が認められ、さらに900-1000kHzの範囲では4割程度活性が向上した。これに対し、同じ基質にサブチリシンを作用させた場合では、いくつかの帯域で大きく活性が低下することがわかった。400kHzではその活性は半分程度になり、800-1000kHzの帯域ではその活性は4割程度にまで落ち込んだ。また、同じ酵素を用いても基質に応じてそのパルス効果スペクトルは変化した。生体の中では、多くの基質と酵素が混在している。以上今回得られた知見は、パルスをチューニングすることによって、複雑な反応系における特定の基質と酵素の組み合わせの活性を制御する方法論を提示する。このメカニズムは不明であるが、分子レベルでのこのようなパルス効果の研究はなく、新しい時代を開き得るものと期待できる。
変分問題、最適化問題と非線形偏微分方程式の総合的研究

量子物理現象、化学反応現象や生命現象を含むさまざまな非線形現象の数理モデルとして現れる非線形偏微分方程式の解の構造の厳密な数学解析を通して、数学的視点からの現象のより深い理解を獲得することをめざす。特に、境界条件と環境効果の解の構造への影響、定常パターン形成のメカニズムと形状、固有値最適化問題に関するより深い理解を変分法、スペクトル解析および漸近解析を用いて推進していく。
近代日本における知識人宗教運動の言説空間-『新佛教』の思想史・文化史的研究

本研究では、仏教清徒同志会(新仏教徒同志会)とその機関誌『新佛教』に関して、基礎的な伝記資料を収集しつつ、多方面からモノグラフ研究を進めた。それにより、新仏教運動につながる進歩的仏教者の系譜を明らかにし、出版物、ラジオ、演説に依存する宗教運動という性格を分析した。新仏教とその周辺の仏教者によって、仏教の国際化がどう担われていたか、欧米のみならず他のアジア諸国との関係についても論証した。(1)『新佛教』に寄稿する多くの仏教者の伝記的データを集約し、今後の研究の基礎資料とする。(2)各研究分担者ごとの個別のテーマの考究。これについては当初は以下のようなテーマでスタートした。『新佛教』運動史、古河老川と『新佛教』運動の生成、高島米峰と社会的ネットワーク、『新佛教』における信仰の位相、『新佛教』をめぐる明治のメディア、加藤咄堂と修養運動の系譜、新佛教と宗教教育、日本仏教の「普遍化」への模索。本プロジェクトでは、年に2回の研究会を開催し、基礎的調査作業ならびに個別研究の情報交換と相互批評を行い、また同時に、可能な限り、明治仏教の史跡訪問や関連領域の研究者による講演も実施している。今年度第1回の研究会は8月に開催され、宗教学会パネルに向けての発表と議論を重ね、同時に国柱会関係の史跡を訪問できた。この成果をもって、9月に日本宗教学会にてパネル「『新佛教』の言説空間、その宗教史・文化史的意味」を開催、古河老川、境野黄洋、毛利清雅に関する研究ならびに本プロジェクトの意義と基本方針を学会に問うことができた。なお、このパネルのレジュメは『宗教研究』82巻4号に掲載されている。第2回の研究会は2月に開催され、『新佛教』同人の伝記調査について発表と情報交換を行い、また岩田文昭氏(大阪教育大)を招いて、『新佛教』とも交流のあった仏教者で日本の精神分析にも影響を及ぼした近角常観についての研究発表を聞いた。この時はさらに清澤満之記念館を訪問できた。基礎的調査作業では、年度当初は『新佛教』デジタル化を予定していたが、今年度末よりすずさわ書店がCD-Rの発売を開始したので撮影作業は不要になったが、『新佛教』CD-R購入ならびに『新佛教』と関係の深い『佛教』誌のデジタル化の予算が必要になっている。また当初予定していた『新佛教』の巻ごとの調査よりも、『新佛教』同人ごとに伝記的な調査を行う方が有効であると判断されたので、各研究分担者が『新佛教』同人を毎年3名調査することにしている。(1)第5回研究会を8月2829日に開催し、深沢英隆氏(一橋大学)を招いて、「知識人宗教の諸問題」についての発表を聞いた。また研究会々員の碧海寿広氏より「近代真宗の体験主義-近角常観とその信徒たちの信仰」の発表があった。さらに日本宗教学会第68回学術大会パネル「明治仏教の国際化と変貌」「明治仏教史を上書きする」についての準備発表会を実施。ならびに伝記的調査についての会員からの発表があった。(2)日本宗教学会第68回学術大会パネル(9月13日、京都大学)では、以下の二つのパネルを開催。明治仏教の国際化と変貌(1)明治20年代仏教界における神智学をめぐる言説吉永進一(2)明治期仏教とユニテリアニズム-佐治実然を手がかりに-高橋原(3)エリザベス・アンナ・ゴルドン夫人をめぐって安藤礼二(4)鈴木大拙における東洋と西洋-在米中の思想変遷を中心に-守屋友江明治仏教史を上書きする(1)"仏教"を"演説"する星野靖二(2)演説・講演というメディアと近代仏教-啓蒙から修養へ-岡田正彦(3)前田慧雲と「自由討究」-本願寺教団の対応と宗学研究法-岩田真美(4)高嶋米峰と丙午出版社大谷栄一(3)第6回研究会を2月27日(土)に開催し、研究分担者各自の調査の報告ならびに、共著執筆を視野に入れた今後の研究計画について意見を交換した。また、坂本慎一氏(PHP研究所)を招いて「新仏教運動が後世に与えた影響」についての発表をうかがった。寺院や宗門を離れて知識人宗教として成立した新佛教運動は、その性質を評価する上で、教育機関、出版媒体が重要であることは昨年度までの研究会で確認され、宗教学会パネルで議論されてきたところである。また、近代仏教には、日本やスリランカのローカルな現象という側面だけでなく、世界同時多発的に発生したグローバルな現象でもあることが、近年、各国の近代仏教研究者から指摘されてきたところであり、日本の新佛教運動もその視点から研究される必要がある。本年度は、教育とメディアに国際化という問題を加えて、8月に研究会を行い、9月の宗教学会でパネル発表を行った。

そこで論じられた問題は、高島米峰を中心とする新佛教運動の出版戦略と教育との関係、そして新佛教に隣接する、『中央公論』編集長で高輪佛教大学の中心人物であった櫻井義肇の周辺に存在する西本願寺内の進歩派であり、西本願寺派仏教者たちの国際的な活動であった。さらに、これに付随して、コーク大学(アイルランド)のBocking教授と高輪佛教大学を訪問したアイルランド人僧侶ダンマローカについての情報交換を行い、また大正、昭和時代における西本願寺派国際仏教者である宇津木二秀についての研究調査を行い、仏教国際化の広がりを確認することができた。一方、すでに続けてきた基礎的な伝記研究をこれと並行して進めており、メーリングリストを活用しての情報交換だけでなく2月に研究会を開催し意見を交換し、平成23年度内の報告書の執筆に向けての準備を進めることができた。本年度は、新仏教の後期に焦点を当て、第70回宗教学会学術大会で「アジア/戦争/新仏教」と題するパネルを主宰した(代表、大谷栄一)。進歩的とされる新仏教運動が、帝国主義とも迎合的であったことや、『新佛教』廃刊後に高島米峰はラジオという新しいメディアによって成功したことなど、従前見落とされてきた側面に光を当てることができたと思われる。10月13日15日に国際日本文化研究センターで開催された国際研究集会「近代と仏教」(代表:末木文美士)では、吉永、大谷が参加し、吉永は神智学と明治仏教、大谷は国柱会とダルマパーラをテーマに、それぞれ発表を行い、近代仏教について国内外の研究者たちと意見交換を行い、新仏教を含む日本の近代仏教運動を、世界的な近代化のネットワークの視点から研究する必要性を認識した。また、8月27日龍津寺(静岡市清水区)、12月10日求道会館(東京都文京区本郷)にて、近代仏教に関連する公開講演会を行い、一般に向けての情報発信を行った。3月には研究分担者や研究協力者の論文を集めて報告書を完成し、資料を附録につけてDVD版で発行した。この報告書では、新仏教の起源、海外の仏教徒との関係、政治と宗教の問題、『新佛教』の運動体の性格、丙午出版社を中心としたメディアと大学の関係、並行するもう一つの新仏教運動であった高輪仏教大学、『新佛教』から折口信夫までを含む錯綜する思想運動、井上秀天と鈴木大拙の海外経験、加藤咄堂と修養、新仏教同人のイスラーム研究、新仏教と中国近代仏教との関係など、ほとんどの論文がまったく新しい視点からの考究であった。これらの論文によって、多数の方向から光を当てることで『新佛教』の輪郭を提示することができた。
新型リボザイムにおける構造-活性相関及び非標準型塩基対形成能のNMRによる研究

ハンマーヘッド型リボザイム及び新型リボザイムである鉛リボザイムの塩基配列にもとずいたモデルDNA、RNAを作成し、その立体構造、特に非標準型塩基対A:G塩基対が形成されているのかどうかを、NMRを用いて明らかにした。A:G塩基対は標準型塩基対ではないにもかかわらず、研究した4種のモデルDNA及びRNAのいずれにおいても塩基対の形成が見い出された。さらに塩基対の様式は、塩基配列に依存して、異なったものになる事がわかった。モデルRNAで見出されたA:G塩基対の構造は、塩基の横に塩基が配置されるside by side型という、非常にきわだったものである事がわかった。この特徴的な構造が、新型リボザイム・鉛リボザイムにおける切断反応のメカニズムと密接に結びついている可能性が示唆された。さらに新型リボザイムそのものの構造研究より、同様なA:G塩基対形成が強く示唆された。
個別がん患者ゼノグラフトによる前臨床化学療法シミュレーションシステムの基礎研究

本研究では各種がん手術検体(原発・転移)から迅速かつ高効率に個別がん患者ゼノグラフト(individual Cancer Xenograft, iCX)を作出するプロトコールを検討した。これらのiCXでは継代毎の病理組織学的変化や遺伝子学的変化が極めて少ないことを確認した。大腸癌肝転移例iCXにおいてin vitro抗がん剤感受性を実施したところ、臨床経過と良好な相関が認められた。また、ゼノグラフトのオミクス解析結果から大腸癌の肝転移にZNF185の関与が示唆され、臨床検体で検討したところ転移予測因子として有用であることが明らかにした。iCXは個別化医療・癌基礎的研究への有用性が示唆された。神奈川県立がんセンターより提供された各種がん手術検体(原発・転移)を速やかにNOGマウス皮下に移植した。移植後4週の時点で生着確認を行い、生着が確認された腫瘍ゼノグラフトについては、継代移植を実施した。3代以上継代移植することができた腫瘍ゼノグラフトを個別がん患者ゼノグラフト(individual Cancer Xenograft, iCX)として実験に使用した。本年度約30株のiCXの樹立に成功した。これらのiCXは、病理組織学的に外科手術検体のがん細胞・組織と比べても形態学的変化が少ないことを確認している(第71回日本癌学会学術総会発表、於横浜)。これらのiCXのうち、大腸癌肝転移例の4例についてCollagen gel Droplet embedded culture-Drug Sensitivity Test(CD-DST)によるin vitro抗がん剤感受性を実施し、その結果を臨床材料で得られた結果と比較解析したところ、iCXでの結果と良好な相関関係があることを見いだした。また、臨床材料(大腸癌肝転移巣)を用いたCD-DSTの一般的に50%程度と言われるが、iCXを用いた場合、成功率はほぼ100%であった。1例ではあるが、臨床の場で実際の治療に使われ腫瘍縮小効果が確認できた薬剤は、CD-DSTでも「高感受性」と評価されるなど、個別化医療への応用が期待される(第51回日本癌治療学会学術集会、於京都)。現在、大腸癌肝転移症例約10例についても結果を蓄積しており、より良好な結果を得ている。各種がん手術検体をNOGマウス皮下に移植し作成した個別がん患者ゼノグラフト(individual Cancer Xenograft, iCX)を本年度約30株樹立に成功した。これまでに蓄積した症例より、効果的な樹立条件・方法について統計学的に検討し、転移巣よりの移植や検体摘出後少し時間をおいてからの移植が生着率がよいことなどを発見し、より効果的なiCXの樹立に役立つものと考えられた(2015アメリカ癌学会にて発表予定)。また、大腸癌および膵癌肝転移ゼノグラフトにおけるプロテオーム解析結果によりZNF185が肝転移を予測するマーカーとして有用であることが示唆され、大腸癌手術症例における臨床検討においても有意な相関が認められた。これらの結果は2014年アメリカ癌学会において学会発表、Molecular and Clinical Oncology誌にて論文発表行った。さらに大腸癌肝転移症例iCXを用いた抗がん剤感受性試験(CD-DST)を20例程度実施し、臨床結果と比較検討した。臨床結果をよく相関しているのみならず、新鮮検体を用いたCD-DSTでは成功率が低いことが問題であるが、iCXをもちいたCD-DSTでは非常に高い成功率を維持しており、個別化医療の応用が高く期待される(論文作成中)。本年度までに約60株程度のiCXを樹立し、その中には原発性脳腫瘍やGISTなどの希少がんも含まれしている。また、10例程度は網羅的遺伝子解析を行った。in vivo抗がん剤感受性試験については、食道癌症例については良好な結果を得られたものの、歯肉癌症例についてはiCXがヒト由来リンパ腫となってしまい感受性試験実施できなかった。しかしながら、この原因不明の現象とされているヒト由来リンパ腫についてin situ hybridizationによる検討を行ったところEbstein-Barrウィルスの関与が示唆された。腫瘍病理学これまでのiCX作成結果より、効率的なiCX作成の条件を統計学的に見つけ出しており(転移巣利用するなど)、今後はより効率的かつ迅速にiCX作成できると考えられる。網羅的遺伝子解析には比較的時間がかかるため、なるべく迅速にiCX作成し、網羅的遺伝子解析に進めるように今後も条件を検討していく。来年度は、網羅的遺伝子解析の結果を30例を目標に終了したのち、これまで行った抗がん剤感受性試験の結果と統計学的解析を行い新たな因子の発見を試みる。初年度計画はおおむね順調に経過している。CD-DSTは結果を比較検討するために症例が豊富である大腸癌肝転移例から実施し、現在10例ほど結果を得ることができた。

しかし、臨床材料を用いたCD-DSTの成功率が低いため、結果の比較検討にはより多くの症例が必要であり、今後も症例を追加していく予定である。さらに、CD-DSTを実施予定の膵癌や肺癌症例についても多くのiCXが樹立できた。来年度実施予定のIn vivo NOGマウス抗がん剤感受性試験に対しての予備実験にも着手することができ、食道癌と歯肉癌iCXにおいてin vivo抗がん剤感受性試験を実施を開始する予定である。iCXの樹立にかかる期間や、希少がんなどは比較検討に十分な症例数が揃うのに時間がかかった。樹立できたものより網羅的遺伝子解析を実施しているが、予定実施数より下回っていたため、使用予定額との差が生じた。臨床応用するためには可及的速やかに、より多くのiCXを樹立し、抗がん剤感受性試験を実施し、その結果を臨床での治療実績データと比較検討することが重要である。我々がこれまでの行ってきたゼノグラフト樹立データより、効果的・効率的な樹立方法を更に改良を進める。また、本年度着手できなかった網羅的ゲノム解析を用いた継代ごとのiCXの遺伝子発現の変化を検討し、どの時点における感受性試験の実施が適切かを検討する予定である。同時に、抗がん剤治療が重要な位置を占めている乳癌、肉腫、脳腫瘍などについても比較検討を実施するために、多種多様ながん腫の収集を進めていく。これまでの研究結果よりiCXの樹立手技を改良し、より効率的かつ迅速化できようになってきた。また、網羅的遺伝子解析もiCX樹立後順次実施しており、来年度は予定解析数を実施できる見込みである。また、iCXの樹立については希少がんなどアンメットメディカルニーズの高い症例を中心に樹立を継続する。個別がん患者ゼノグラフト; iCX樹立は、患者から得られたがん組織片をNOGマウスで3代以上継代移植され、初めて樹立される。この過程におけるiCXの遺伝子発現変化の有無を詳細に解析する目的で、網羅的遺伝子発現解析の実施を計画していたが、継代に予想以上の時間を費やしたため、継代数の異なる複数のiCX由来RNA材料が揃わず、網羅的遺伝子発現解析の本年度中の実施を見送った。網羅的遺伝子発現解析費用が比較的高額になることに加え、RNA材料の抽出試薬等の購入も予定数を下回ったため、使用予定額との差が生じた。初年度、3代以上継代移植し樹立に至った腫瘍ゼノグラフトでは網羅的遺伝子発現解析用のRNA材料収集が予想以上に難航し、網羅的遺伝子発現解析の実施が見送られた。2年度目には高品質RNAを各継代のiCXより調製し、網羅的遺伝子発現解析を実施する。他の計画は予定通りに進行していることから、当初計画通り、平成26年度に予定した物品を購入し実験を進める。神奈川県立がんセンターから提供される各種がん手術検体についても計画通り、NOGマウス皮下に移植してiCX株の樹立を継続する。
ビフィズス菌のアラビノガラクタンープロテイン代謝機構に関わる糖質分解酵素群の解析

アラビノガラクタン-プロテインは、β-1,3/1,6-ガラクタン鎖がL-アラビノース等で修飾されたII型アラビノガラクタン鎖(II型AG)を持つ植物糖タンパク質である。Bifidobacterium longum等の一部のビフィズス菌はII型AGに対する資化性を有することが報告されていたが、その分解代謝機構は未解明であった。本研究では、B. longum JCM1217株由来のエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼ、β-1,6-ガラクタナーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼの諸性質と転写量の解析を行うことにより、B. longumにおけるII型AG分解代謝機構の全容の解明に成功した。本年度は、ビフィズス菌Bifidobacterium longumが有するアラビノガラクタン-プロテイン(AGP)に対する分解酵素群のうち、糖質分解酵素(GH)ファミリー30に属すエンド-β-1,6-ガラクタナーゼ(BLLJ_1841)の諸性質の解析を中心に研究を行った。大腸菌で発現させた133kDaの組換えBLLJ_1841タンパク質をβ-1,6-ガラクトオリゴ糖に作用させたところ、β-1,6-ガラクトビオース(β-1,6-Gal2)の遊離が確認できた。一方、β-1,3とβ-1,4-ガラクトオリゴ糖には作用しなかった。本酵素の至適pHは4.5、至適温度は40°Cであった。AGPと類似した構造を有するカラマツ由来のII型アラビノガラクタン(LWAG)と部分酸分解LWAGを基質として用いて遊離糖の解析を行った結果、LWAGと部分酸分解LWAGからβ-1,6-Gal2のみが遊離された。その相対活性は部分酸分解LWAGを100%とした場合、LWAGで13.3%であった。また、β-1,6-ガラクトオリゴ糖にB.longum培養菌体を作用させたところ、β-1,6-Gal2の生成を確認したことからエンド-β-1,6-ガラクタナーゼが菌体表層に局在していると考えられる。さらに、転写量解析を行った結果、LWAGを炭素源とした培養菌体でグルコース培養菌体の32倍の転写量であった。また、遺伝子クラスターを形成しているエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼ(BLLJ_1840)では、109倍もの転写量の増加が確認された。以上の結果、エンド-β-1,6-ガラクタナーゼとエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼがII型アラビノガラクタン存在下で転写誘導され、II型AGに対して協調的に作用することで効率的に分解しているものと考えられる。本年度は、ビフィズス菌Bifidobacterium longumが有するアラビノガラクタン-プロテイン(AGP)に対する分解酵素群のうち、糖質分解酵素(GH)ファミリー43に属すエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼ(BLLJ_1840)の諸性質の解析を中心に研究を行った。大腸菌で発現させた組換えBLLJ_1840タンパク質をβ-1,3-ガラクトオリゴ糖に作用させたところ、ガラクトース(Gal)の遊離が確認できた。一方、β-1,4とβ-1,6-ガラクトオリゴ糖には作用しなかった。本酵素の至適pHは5.5、至適温度は40°Cであった。AGPと類似した構造を有するカラマツ由来のII型アラビノガラクタン(II型AG)を基質として用いて遊離糖の解析を行った結果、Gal、β-1,6-Gal2、β-1,6-Gal3、β-1,6-Gal4、L-アラビノース(L-Ara)で修飾されたβ-1,6-Gal3が同定された。糸状菌や放線菌で報告されているエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼが側鎖を除去したβ-1,3-ガラクタンに対する反応性が最も高いのに対して、本酵素はβ-1,3-ガラクタンよりβ-1,3-β-1,6-ガラクタンに対して9倍程度高い反応性を有していた。以上の結果、BLLJ_1840は側鎖が付加されたβ-1,3-ガラクタン主鎖を非還元末端側から切断するエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼであることが明らかとなった。また、本酵素はL-Araが付加しているII型AGに対しては低い反応性を示したことから、側鎖を分解する他の酵素群と協調的に働くことで、効率的にII型AGを分解できるものと考えられる。