hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
角膜内皮細胞の増殖における内皮-実用相互作用

目的:本研究の目的は、角膜内皮細胞の増殖に角膜実質がどのように関わっているか内皮実質が相互作用をin Vitroの実験系を用いて細胞レベルから遺伝子レベルまで掘り下げて調べようとするものである。そのためには、まず角膜内皮-細胞と実質細胞を単離して培養することが必要である。この2種類の細胞のうち、実質細胞は単独でも容易に増殖し、細胞株を作ることができた。しかし、内皮細胞の増殖は、非常に困難である。初代培養においては、家兎、ヒト共に個体差、年齢差により非常に異なり、さらに初代培養を経て2代培養以降は急速に増殖能が低下する。遺伝子レベルで調べるためには十分な量の細胞が必要であり、内皮細胞を効率よく増殖させることが優先課題と思われる。そのため、今回は内皮細胞増殖の条件を確立するため、種々の増殖因子などの効果を中心に実験を進めた。結果:白色家兎角膜内皮細胞を用いて基本培地(Williams E)に牛胎児血清(FBS)、牛血清(CF)を加えた培地で初代培養を行った。次に実験系(2代培養)では血清中の既知、未知の因子による影響を除くため無血清培養を行い、種々の増殖因子の検索を試みた。その結果TGF-alpha、EGFは、角膜内皮細胞の増殖因子であることを見いだし報告した。また、ある種のサイトカイン(IL-1alpha、IL-1beta、IL-2)は単独では増殖促進効果を認めないが、TGF-alphaやEGFの効果を増殖することのできる増殖補助因子として働くことが解った。現在、これらの因子の他にも種々の物質を検討している(現在、HGFについて検討中)。これらの因子はほとんどが生理的な物質であり、角膜内の他の細胞(例えば実質細胞)が合成、分泌するのか、生体内の他部位からまわってくる可能性があるのか、など今後の課題である。
大腸菌oriCプラスミド複製系を用いたDNA合成阻害薬の検索に関する研究

本研究は、複製開始蛋白DnaAのATP結合活性に対する阻害を指標として大腸菌のDNA複製阻害剤を検索することを意図したものである。これまでの研究代表者らの予備的な研究により、インジゴの誘導体がDnaA蛋白のATP結合活性を阻害することが分かっていた。本研究では、インジゴから出発して種々の誘導体を合成し、それらの構造とDnaA蛋白へのATP結合の阻害活性との対応を検討した。その結果、アルキル側鎖の重要性など、DnaA蛋白のATP結合活性の阻害に有効な残基を見いだすことに成功し、最終的には、7マイクロモルという低い濃度で50%阻害を示す化合物を見いだすことができた。さらに、この化合物が、試験管内oriCプラスミド複製系において、開始反応を特異的に阻害することを見いだした。我々はこの結果を、1996年の、J.Biol.Chemに報告した。本年度は、種々のoriC複製蛋白の精製を行い、試験管内複製系の構築を目指した。その結果、DnaA,DnaB,DnaC,SSB,DNAジャイレース,プライマーゼ,DNAポリメラーゼIIIホロ酵素をきわめて純度高く精製することに成功した。さらにこれらの精製した蛋白から成るoriC複製系において、DnaA蛋白に依存した、効率の高いDNA合成反応を行わすことができた。したがって、本研究の遂行に必要な試験管DNA複製系の構築はできた、と評価できる。さらに本年度は、oriC複製反応に影響を与える薬剤の予備的な検索を開始した。その結果、インジゴから有機合成された新しい化合物がDnaA蛋白へのATPの結合を特異的に阻害することを見いだし報告した。また、DnaA蛋白に対する種々の合成脂質の効果の検討を行った。その結果、いくつかのアニオン性合成脂質の中に、DnaA蛋白へのATPの結合を強く阻害するものがあることを見いだした。さらに、種々のdanA変異株の薬剤耐性を系統的に検索することも併せておこなった。その結果、いくつかの温度感受性dnaA変異株の中に、臨床においてトランキライザーとして使用されている薬剤に対する感受性を示すものがあることを見いだした。すでに研究代表者らは、これらの薬剤が試験管内でのリン脂質によるDnaA蛋白の活性化を阻害する性質を有していることを示し報告している。本研究の成果は、これらの薬剤がDnaA蛋白をターゲットとした細胞増殖阻害効果を示すことを示唆するものであり、本研究計画の妥当性を支持するものである。DnaA蛋白は、大腸菌の染色体DNAの複製開始蛋白である。すでに研究代表者により、DnaA蛋白は、ATPと結合することにより、活性化することが見いだされている。本研究においては、DnaA蛋白へのATP結合の阻害活性を指標に、DnaA蛋白を標的とする、DNA合成の阻害薬の探索を試みた。その結果、インジゴの誘導体のひとつがDnaA蛋白へのATPの結合を阻害することが分かった。この物質は、DnaAの活性阻害剤として開発された有機合成化合物の最初の例である。さらに、この誘導体を出発物質として、アルキル側鎖を導入することにより、ATP結合の阻害に必要な濃度を著しく減少させることに成功した。この誘導体のDnaA蛋白のATP結合に対するKi値は10μM以下であった。さらにこの物質の、oriCプラスミドDNAの複製再構成系に及ぼす効果を検討したところ、この物質は、DNA合成に対して、強い阻害作用を示した。さらにこの薬剤の阻害作用は、複製反応の開始段階に選択的であり、プレプライミング段階後には作用しないことが分かった。さらにDnaA蛋白をあらかじめATPとプレインキュベーションすることによりATP型にしておくと、この薬剤によるDNA合成の阻害がみられなくなった。この結果は、この薬剤のDNA合成の阻害が、DnaA蛋白へのATPの結合を作用点とするものであることを強く示唆している。また、本研究では、2種の合成脂質の混合膜中での酸性脂質によるDnaA蛋白のATP結合の阻害が、酸性脂質のクラスター構造を必要とすることを示した。

その結果、アルキル側鎖の重要性など、DnaA蛋白のATP結合活性の阻害に有効な残基を見いだすことに成功し、最終的には、7マイクロモルという低い濃度で50%阻害を示す化合物を見いだすことができた。さらに、この化合物が、試験管内oriCプラスミド複製系において、開始反応を特異的に阻害することを見いだした。我々はこの結果を、1996年の、J.Biol.Chem.に報告した。
Ras・MAPキナーゼシグナルを抑制し、アポトーシスを誘導する新しい分泌性蛋白質

Argosは、EGFモチーフを有する分泌性蛋白質であり、ショウジョウバエの発生過程において細胞外よりRas/MAPK系の情報伝達を制御することにより細胞分化の調節を行っている。複眼特異的に発現する転写因子のGlassの結合領域を含む発現ベクターpGMRを用いて、複眼特異的にArgosを過剰発現するトランスジェニックフライ(GMR-argos)を作成した。GMR-argosの複眼を走査型電子顕微鏡で観察したところ、個眼の配列が不規則であり、個眼の数が著しく減少していることが明らかになった。さらに、切片を作成して観察したところ、光受容細胞及び色素細胞の数が減少していることが明らかになった。Argosを過剰発現した複眼をアクリジンオレンジで染色して観察したところ、野生型にくらべ細胞死が亢進していることが明らかになった。この細胞死がp35、diap1、diap2を共発現することにより有意に抑圧されたことから、ArgosによるRas/MAPK系の情報伝達の低下がICEファミリーのプロテアーゼを介するアポトーシスを誘導したものと解される。さらに、ArgosによるRas/MAPK情報伝達の抑制とアポトーシス誘導に関与する未知の分子の探索を目的として、GMR-argosの表現型を抑圧または増悪させるような変異体のスクリーニングを開始した。GMR-argosトランスジーンをゲノム上で安定化させるために、P因子転移酵素によりバランサー染色体へ再転移させた。現在この系統を、変異誘発剤であるEMSを摂食させた個体と交配し、GMR-argosの表現型を変化させる新しい変異体のスクリーニングを行っている。また、Argosの作用機序を生化学的に解析するための種々の準備を進めている。
ジェラ紀付加体の比較による黒瀬川ナップの検証

愛媛県大洲地域の野外地質調査を実施し,北部秩父テレーン,黒瀬川テレーン,南部秩父テレーンの分布状況および構造関係を明らかにした.従来,この地域の秩父帯の地帯区分は不明確であったが,各テレーンが北傾斜の低中角度衡上断層で境されることが判明した.このことは,南部秩父テレーンと北部秩父テレーンが黒瀬川テレーンの構造的下位でつながっていないことを意味する.南部秩父テレーンについては放散虫化石の産出記録が豊富で,海洋プレート層序の復元が行えるが,北部秩父テレーンは変成作用を被っており年代決定に耐える放散虫化石を得ることができなかった.しかし,調査地域東方では泥質岩より,前期ジェラ紀の放散虫化石が得られており,ジェラ紀新世ないし白亜紀古世の砕屑岩からなる南部秩父テレーンとは明瞭に年代差があることがわかる.このことは,南部秩父テレーンと北部秩父テレーンとでは,付加体の形成時期が異なることを示している.テレーン間の構造関係および放散虫化石による年代データから,四国西部地域では,黒瀬川テレーンナップ説は成立しない可能性が高い.今後,北部秩父テレーンについて放散虫化石の抽出に努め,海洋プレート層序の詳細な復元が必要である.また,他地域の秩父帯においても同様の検討を行って行きたい.なお,本研究の成果の一部は,平成8年4月に東北大学で開催される日本地質学会において発表する予定である.愛媛県大洲地域の野外地質調査を実施し,北部秩父テレーン,黒瀬川テレーン,南部秩父テレーンの分布状況および構造関係を明らかにした.従来,この地域の秩父帯の地帯区分は不明確であったが,各テレーンが北傾斜の低中角度衡上断層で境されることが判明した.このことは,南部秩父テレーンと北部秩父テレーンが黒瀬川テレーンの構造的下位でつながっていないことを意味する.南部秩父テレーンについては放散虫化石の産出記録が豊富で,海洋プレート層序の復元が行えるが,北部秩父テレーンは変成作用を被っており年代決定に耐える放散虫化石を得ることができなかった.しかし,調査地域東方では泥質岩より,前期ジェラ紀の放散虫化石が得られており,ジェラ紀新世ないし白亜紀古世の砕屑岩からなる南部秩父テレーンとは明瞭に年代差があることがわかる.このことは,南部秩父テレーンと北部秩父テレーンとでは,付加体の形成時期が異なることを示している.テレーン間の構造関係および放散虫化石による年代データから,四国西部地域では,黒瀬川テレーンナップ説は成立しない可能性が高い.今後,北部秩父テレーンについて放散虫化石の抽出に努め,海洋プレート層序の詳細な復元が必要である.また,他地域の秩父帯においても同様の検討を行って行きたい.なお,本研究の成果の一部は,平成8年4月に東北大学で開催される日本地質学会において発表する予定である.
天体・気象分野のミスコンセプション形成過程の検証と効果的な指導法の研究

天体・気象分野におけるミスコンセプションについて、大学生の自然認識の実態を授業等を通じて把握し、そのミスコンセプションから正しい科学的概念を形成するための教材開発を行い、大学・大学院の授業において学生の認識の変容を確認して教材の評価を行った。評価は大学の理科教育専攻学生と教職大学院の院生である。こうして得られたデータをもとに、研究協力校である京都府宮津市立中学校2校と京都地学教育研究会所属の高校教員と協働で開発した教材を用いた授業の試行実験を行った。特に気象分野におけるミスコンセプションは防災・減災という観点からも重要な内容であり、雷や雲に関する再現実験を通じて防災認識をどのように育成するかに重点をおいて教材開発を行った。その成果は、本研究の連携協力機関である京都地方気象台、日本気象予報士会、京都府総合教育センターの協力を得て、京都地方気象台職員研修会、日本気象予報士会研究成果発表会、京都地学教育研究会総会・研修会、京都府総合教育センター主催の採用2年目教員の研修会(2019年7月実施)等で成果発表を行い、ほぼ予定通り成果発表や一般への普及活動に生かすことができている。また、京都地学教育研究会の会員及び宮津市立中学校とは、本研究によりネットワークが構築できた結果、メーリングリストを用いて、筆者が大学生の実態から把握したミスコンセプションをもとに高校生のミスコンセプション実態も把握するアンケート項目を提供し、ミスコンセプションデータを集計して初等中等教育における指導法の改善に生かせる教材を提供できるようになった。2019年3月には、こうしたネットワークを通じて高校生1200人以上の天体に関するミスコンセプションアンケート調査を実施し現在集計中である。今後そのデータをもとに教材開発を行い、初等中等教育から高等教育に至る体系的な学びについて研究を深める予定である。当初、研究協力機関との協力調整を行い研究をスタートさせたが、本研究が採択される以前に研究に関する協力要請を行って承諾を得ていたことから、スムーズに研究がスタートできた。また、大学生のミスコンセプションに関して、事前に所属する大学の授業および教職大学院において把握できていたデータがあり、その内容をもとに5月には京都地学教育研究会および宮津市立中学校との研究協力を開始することができた。その結果、夏に実施する教員免許状更新講習において受講者に研究成果をもとにした教材の提供を行うことができた。さらに、研究成果を年度後半に開催された学会等で発表することができ、2本の論文としても投稿することができた。また、本研究をもとに、高校地学等の授業の指導法を一斉授業形態からすべての授業をグループワークに変更した教員があり、その成果の波及効果として学校内での授業研究会で成果発表が行われるなどの予想しない効果が生まれた。そうした連携協力校での成果のほかに、連携協力機関である京都地方気象台、京都府総合教育センター、京都地学教育研究会、日本気象予報士会との連携が一層緊密になり、メーリングリストでのアンケート等の情報共有がすぐに行える体制が構築できたことがスムーズに研究をすすめていく上で大きな力になっている。ミスコンセプションによる授業の改善は、多忙な学校現場の状況下において教材開発を行う余裕があまりない教員にとって歓迎される結果となり、教員との良好な関係を築けたことが予定していた計画以上に研究が進展したことにつながっている。さらに、本研究が防災・減災に関する内容を含んでいることから、普段あまり交流のない京都地方気象台の台長をはじめとする職員に興味をもってもらえたこと、京都府総合教育センターや京都府教育委員会、宮津市教育委員会の理解が得られたことが研究の進展を支えてくれたと考えている。今年度は、すでに天体分野のアンケート調査を終えており、集計作業を待って、教材開発に取り組む予定である。また、先行して実施してきた気象分野におけるミスコンセプションの新たな事例を研究するほかそのデータをもとにした研究協力校による学校での実践事例研究を一層実施していく予定である。本研究の中心となる大学の理科教育専攻学生や教職大学院の院生を含めた教材開発と研究協力校の教員との教材評価等を行いながらミスコンセプションの改善につながる体系的な指導法を研究していく予定である。その際、初等中等教育から高等教育への体系的な接続を考えたものとして公開できるようなまとめを行いたい。そのために、学会等での発表や論文投稿をすすめるとともに、国内の研究者との交流だけでなく国際学会での発表を視野に入れて、海外の研究者との交流を目指したい。特に、ミスコンセプションの研究に関しては、欧米ではすでにミスコンセプションンの系統表が作成されているとの報告もあることから、そうした点を交流し、特に研究データが少ない地学分野におけるミスコンセプションの系統表を構築することに視点をおいて研究を進めたいと考えている。中学校の理科教員は、大学時代に化学・生物専攻であった教員が多く、地学専攻であった教員は極めて少ない。そのため、天体・気象分野のミスコンセプション研究を授業改善に生かす効果は大きな意味を持つと考えられ、中学校の理科教員との協働を宮津市立中学校だけでなく教職大学院を修了した院生のネットワークを活用して、近隣の京都市立中学校教員とも連携をスタートさせてネットワークをさらに拡大して研究を進めていきたい。

こうして得られたデータをもとに、研究協力校である京都府宮津市立中学校2校と京都地学教育研究会所属の高校教員と協働で開発した教材を用いた授業の試行実験を行った。特に気象分野におけるミスコンセプションは防災・減災という観点からも重要な内容であり、雷や雲に関する再現実験を通じて防災認識をどのように育成するかに重点をおいて教材開発を行った。その成果は、本研究の連携協力機関である京都地方気象台、日本気象予報士会、京都府総合教育センターの協力を得て、京都地方気象台職員研修会、日本気象予報士会研究成果発表会、京都地学教育研究会総会・研修会、京都府総合教育センター主催の採用2年目教員の研修会(2019年7月実施)等で成果発表を行い、ほぼ予定通り成果発表や一般への普及活動に生かすことができている。また、京都地学教育研究会の会員及び宮津市立中学校とは、本研究によりネットワークが構築できた結果、メーリングリストを用いて、筆者が大学生の実態から把握したミスコンセプションをもとに高校生のミスコンセプション実態も把握するアンケート項目を提供し、ミスコンセプションデータを集計して初等中等教育における指導法の改善に生かせる教材を提供できるようになった。2019年3月には、こうしたネットワークを通じて高校生1200人以上の天体に関するミスコンセプションアンケート調査を実施し現在集計中である。今後そのデータをもとに教材開発を行い、初等中等教育から高等教育に至る体系的な学びについて研究を深める予定である。当初、研究協力機関との協力調整を行い研究をスタートさせたが、本研究が採択される以前に研究に関する協力要請を行って承諾を得ていたことから、スムーズに研究がスタートできた。また、大学生のミスコンセプションに関して、事前に所属する大学の授業および教職大学院において把握できていたデータがあり、その内容をもとに5月には京都地学教育研究会および宮津市立中学校との研究協力を開始することができた。その結果、夏に実施する教員免許状更新講習において受講者に研究成果をもとにした教材の提供を行うことができた。さらに、研究成果を年度後半に開催された学会等で発表することができ、2本の論文としても投稿することができた。また、本研究をもとに、高校地学等の授業の指導法を一斉授業形態からすべての授業をグループワークに変更した教員があり、その成果の波及効果として学校内での授業研究会で成果発表が行われるなどの予想しない効果が生まれた。そうした連携協力校での成果のほかに、連携協力機関である京都地方気象台、京都府総合教育センター、京都地学教育研究会、日本気象予報士会との連携が一層緊密になり、メーリングリストでのアンケート等の情報共有がすぐに行える体制が構築できたことがスムーズに研究をすすめていく上で大きな力になっている。ミスコンセプションによる授業の改善は、多忙な学校現場の状況下において教材開発を行う余裕があまりない教員にとって歓迎される結果となり、教員との良好な関係を築けたことが予定していた計画以上に研究が進展したことにつながっている。
無作為化臨床試験における共変量の不均衡がログランク検定のサイズに与える影響

本研究は、例えば薬効を立証するための無作為化臨床試験において、群間での患者背景のばらつきの不均衡の程度を測る指標を考案し、その不均衡が統計解析のサイズに及ぼす影響をシミュレーションにより推定することを目的とする。患者不均一性は、Coxの比例ハザードモデルλ(t|z)=λ_0(t)exp(β^Tz)で定義される予後指数β^Tz、すなわち対数相対ハザードの分布を用いて表わす。但し、zは共変量ベクトル、βは回帰係数ベクトル、β^Tはβの転置、λ_0(t)は時刻tでのbaseline hazard、λ(t|z)は共変量ベクトルzを与えたときの時刻tにおけるhazardである。この方法を適応する実例として、肉眼的S_2あるいはS_3の胃癌治癒切除症例を対象に、共通の補助免疫化学療法に併用する抗癌剤をA群Tegafur、B群5-FU、C群Carmofurとした3つの治療法が生存時間に及ぼす治療効果を比較した無作為化臨床試験を検証する。漿膜面浸潤により層別化され3群に無作為に割り付けられた。解析対象は、A群227例、B群231例、C群222例である。簡単のためA、Cの2群で検証する。昨年度定義した、群間の不均衡を表わす指数V=(H_1-H_0)/(H_1+H_0)と、それを標準化したVQを用いて、層別ログランク検定のサイズとの関係を明らかにした。但しH_1、H_0をそれぞれ治療群と対照群におけるexp(予後指数)の平均を表わし、Q^<-1>はVの標準誤差を表わす。0.1間隔に設定したVQの絶対値に対するexactなサイズを、シミュレーションによって求めた結果を表にまとめた。例えば、予後指数の標準偏差σ=0.6でVQ=1.85ならば、サイズは9.2±0.3%と推定された。ログランク検定のサイズは、標準化不均衡指数に依存し、標本の大きさとは独立であった。また、表にまとめた結果から、層別ログランク検定のexactなサイズは、σの値に関わらず、VQ≦1のとき5%以下で層別ログランク検定は適用可能であるが、VQ>1のとき5%を超えてしまうので、群間の不均衡を修正するために、折れ線コックス回帰法のような柔軟で有効な回帰モデルが用いられるべきであると考えられる。患者不均一性は、Coxの比例ハザードモデルλ(tlz)=λ_0(t)exp(β^Tz)で定義される予後指数β^Tz、すなわち対数相対ハザードの分布を用いて表わす。但し、zは共変量ベクトル、βは回帰係数ベクトル、β^Tはβの転置、λ_0(t)は時刻tでのbaseline hazard、λ(tlz)は共変量ベクトルzを与えたときの時刻tにおけるhazardである。予後因子に対する予後指数の非線形性のために生じうるバイアスを避けるために、「折れ線Coxモデル」により求めた折れ線関数の形の予後指数を用いると、この予後指数の全ての症例に対する分布のレンジは約5.2であり、各層でのレンジは3.2から4.0であった。層別を行なっても各層内にはかなりの不均一性を含んでいることが分かった。さらに、H_1、H_0をそれぞれ治療群と対照群におけるexp(予後指数)の平均を表わすとする。群間の不均衡を表わす指数として、V=(H_1-H_0)/(H_1+H_0)と定義し、それを標準化したものをVQと表わすと、前述の臨床試験のVQは-1.674であった。今後VQと層別ログランク検定のサイズとの関係を明らかにする。この方法を適応する実例として、肉眼的S_2あるいはS_3の胃癌治癒切除症例を対象に、共通の補助免疫

化学療法に併用する抗癌剤をA群Tegafur、B群5-FU、C群Carmofurとした3つの治療法が生存時間に及ぼす治療効果を比較した無作為化臨床試験を検証する。漿膜面浸潤により層別化され3群に無作為に割り付けられた。解析対象は、A群227例、B群231例、C群222例である。簡単のためA、Cの2群で検証する。昨年度定義した、群間の不均衡を表わす指数V=(H_1-H_0)/(H_1+H_0)と、それを標準化したVQを用いて、層別ログランク検定のサイズとの関係を明らかにした。但しH_1、H_0をそれぞれ治療群と対照群におけるexp(予後指数)の平均を表わし、Q^<-1>はVの標準誤差を表わす。0.1間隔に設定したVQの絶対値に対するexactなサイズを、シミュレーションによって求めた結果を表にまとめた。例えば、予後指数の標準偏差σ=0.6でVQ=1.85ならば、サイズは9.2±0.3%と推定された。ログランク検定のサイズは、標準化不均衡指数に依存し、標本の大きさとは独立であった。また、表にまとめた結果から、層別ログランク検定のexactなサイズは、σの値に関わらず、VQ≦1のとき5%以下で層別ログランク検定は適用可能であるが、VQ>1のとき5%を超えてしまうので、群間の不均衡を修正するために、折れ線コックス回帰法のような柔軟で有効な回帰モデルが用いられるべきであると考えられる。
ポテンシャルエネルギー駆動バイオミメティック液体操作

本申請課題は、MEMSや燃料電池などの液体の制御・操作が必要不可欠なマイクロフルイディクスデバイスの革新を目指し、感応性階層構造表面上でのポテンシャルエネルギーを駆動力とした省エネルギーな液体操作の実現を試みるものである。植物や昆虫などの生物は、生命活動に必要な水分を獲得するために、最低限の運動エネルギーに加え、表面構造由来のポテンシャルエネルギーで液体を操作している。この生物のもつ特異的な表面構造や液体操作機構に倣った機能表面上でのポテンシャルエネルギー駆動の液体操作に、表面組成や構造制御による刺激応答性を付与し、高度で精密な液体操作の実現を目指す。植物や昆虫などの生物は、生命活動に必要な水分を獲得するために、最低限の運動エネルギーに加え、表面構造由来のポテンシャ々エネルギーで液体を操作している。平成24年度は、前述した目的を達成するために、フナムシの脚の吸水現象をもたらす微細凹凸構造をモデル化した微細構造の作製、および、それらの表面濡れ特性評価を試みた。微細凹凸構造は、フナムシの微細構造を模倣したパターンをもつフォトマスクを介したフォトリソグラフィで作製した。作製した微細構造表面の接触角測定や吸水現象観察により、フナムシの吸水現象を再現できるかを確認した。金被覆した微細構造表面を疎水性または親水性官能基を末端にもつチオール化合物により表面化学修飾することで、吸水現象がどのように変化するかを検討した。その結果、パターンの配列幅やギャップの幅が小さく、パターンの高さが大きい流路を、より親水性処理することで、高効率な吸水現象が起こることがわかった。また、パターンの配列幅が狭すぎるパターンの場合、表面処理がうまく施せない事がわかった。本年度は、バラの花の機能を超越した刺激応答性のある水滴吸着をもつ超撥水表面の創成と微小液滴操作に関して重点的に研究を行った。これまでに、凹凸構造由来の超撥水性と水滴吸着性をもつ親水性ドーム構造とを複合することで、吸着性超撥水表面を作製した。この水滴吸着可能な超撥水性表面の親水性ドメインの分布密度勾配を付与したり、温度やpH応答性を付与したりすることで、微小水滴の吸着性を制御できることを見いだした。本年度は、親水性ドメインに分子吸着選択性を付与し、液滴中から選択的に物質吸着可能な表面の創成を試みた。具体的には、超撥水性を示す高分子凹凸構造表面に、機能性無機微粒子(分子吸着性をもつシリカ等)の機能ドメイン構造をハイブリッドさせ、超撥水性を保ちつつ、無機材料の有する多様な表面特性を発現させた。作製した機能性無機ドメイン融合超撥水表面の走査型電子顕微鏡画像を図2に示す。無機ドメインには直径500nmのシリカ微粒子を用いた。今後は、有機分子の吸着性を評価し、超撥水表面上における分子選択吸着に基づく多様な液滴操作について検討し、これまでに無い微量組成分離プロセスの構築を行う。生物は、生きるために必要な水や養分を取り込むために、多様なシステムを利用している。特に、一部の生物では、その表面や界面でのポテンシャルエネルギーを利用し、省エネルギーで効率よく液体を操作している。本研究では、蓮の葉表面のような超撥水凹凸構造、フナムシの脚のあるマイクロ流路構造、粘性細胞外物質の有する水蒸気透過抑制構造に着目し、その物理化学的な現象の解明を試み、新規な界面自由エネルギー駆動の液体操作デバイスへの応用を試みている。本年度は、超撥水構造表面の親水-疎水構造の分布制御や温度応答による微小液滴操作、微細階層構造をもつ流路の表面構造や表面組成制御による液体輸送・分離技術、親水性物質からなる薄膜の内部高次構造制御による水蒸気透過抑制膜の開発を行った。今後は、これまでの液体操作デバイスの研究に加えて、液体を操作可能な新しい生物(例えば、動吻動物の疎水性外骨格や、モスアイのサイズ依存超撥水性など)を実験対象に加えて、学術的にも重要な生物学分野における表面機能解析と物理科学分野における階層構造の表面ぬれ特性解析に関する新規学術的知見を積み重ね、工学的にも学術的にも非常にインパクトのある研究に結びつけていく。本研究では、前述した目的を達成するために、微細凹凸構造の作製と表面濡れ特性評価を試みる。微細凹凸構造は、フォトリソグラフィや鋳型転写法、自己組織化析出法により作製する。作製した微細構造表面の接触角や転落角などの表面ぬれ特性を、既設の接触角計を用いて測定する。

疎水性または親水性官能基を末端にもつ化合物による表面化学修飾により、表面ぬれ特性の組成依存性を検討する。本年度は、微細凹凸構造からなる流路構造を、三軸ロボットにより作製した突起構造の配列パターンを鋳型とした転写法を用いて作製し、表面ぬれ特性を光酸化反応を用いて制御し、自発流路を構築した。配列パターンを精密に制御することで、その流路特性を制御できることを見いだした。また、作製した微細凹凸構造の表面ぬれ特性をCVDにより制御することで、水のみならず異なる表面張力をもつ液体に対しても流路として機能することを見いだした。研究成果の論文投稿や特許取得、対外的な受賞や社会的な報道などの高い評価を受けており、概ね順調に進展していると判断できる。本申請課題は、MEMSや燃料電池などの液体の制御・操作が必要不可欠なマイクロフルイディクスデバイスの革新を目指し、感応性階層構造表面上でのポテンシャルエネルギーを駆動力とした省エネルギーな液体操作の実現を試みるものである。植物や昆虫などの生物は、生命活動に必要な水分を獲得するために、最低限の運動エネルギーに加え、表面構造由来のポテンシャルエネルギーで液体を操作している。この生物のもつ特異的な表面構造や液体操作機構に倣った機能表面上でのポテンシャルエネルギー駆動の液体操作に、表面組成や構造制御による刺激応答性を付与し、高度で精密な液体操作の実現を目指す。本年度は、微細凹凸構造からな流路構造を、3軸操作装置により作製した多孔アレイを鋳型とした転写法により作製し、その流路機能の最適化を試みた。その結果、配列パターンの最適化および、多孔アレイの小型化により、流路機能が大きく向上することが明らかになった。また、前年までに明らかにしているCVDによる表面修飾を施すことで、水のみならず多種の液体に対する流路として機能することを見いだした。研究成果の論文投稿や特許取得、対外的な受賞などの高い評価を受けており、概ね順調に進展していると判断できる。今後は研究機関を延長し、研究の進展が著しい凹凸構造からなる自発流路構造についての研究推進と研究成果の報告を重点的に行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。生物模倣工学今後も、研究計画に従って研究を遂行する。特に、フナムシ模倣流路の表面エネルギー制御に関しては、重点的に実験を行う。研究室の立ち上げと同時進行で研究を進めているため、ファシリティ整備や実験装置組み上げに時間を要したが、研究の進行の遅延を最低限に抑え、おおむね順調に進展していると判断できる。研究成果も論文投稿しており、おおむね順調に進展していると判断できる。
内生的な企業の異質性を考慮した特許政策および貿易政策の理論的分析

特許政策および貿易政策が企業間の生産性や技術の改善幅の散らばりにどのような影響を与えるのか理論的に分析する。具体的に特許政策に関しては、特許庁が特許権を付与する審査基準を厳格化した際、その後により良い技術が生まれ、特許を取得した技術の平均品質が向上するのかどうか検討する。貿易政策については、関税率の引き下げなどの貿易自由化を実行すると、低い生産性の企業や高い生産性の企業の割合がどのように変化するのか検討する。
冠動脈拡張術後早期の運動負荷試験による冠動脈再狭窄の予測-アラキドン酸代謝の不均衡と虚血性心電図変化との関連より-

労作性狭心症、一枝病変例に対して行われた経皮的冠動脈形成術(PTCA)成功例(残存狭窄50%以下の例)を対象としてPTCA施行前、3日後、10日後に症候限界性運動負荷試験を施行し、運動中の心電図をモニターした。さらに、運動負荷前後24時間の蓄尿を行い、プロスタサイクリン、トロンボキサンA_2の安定した代謝産物である11-dehydrothromboxane B_2および6-keto-prostaglandin F_1 alphaの濃度をRIA(PEG)法で測定した。そして、PTCA成功例において運動負荷試験による心電図上のST下降とアラキドン酸代謝の不均衡の関連およびこれらが再狭窄への進展の予測因子となりうるかどうかをPTCA施行3か月後に再狭窄の有無確認のため冠動脈造影を施行し検討した。この結果、再狭窄例においてPTCA施行前に行った運動負荷試験前後の尿中の11-dehydrothromboxane B_2濃度/6-keto-prostaglandin F_1 alpha濃度が運動負荷試験前に比べ運動負荷試験後に増加する傾向が認められた。しかし、再狭窄例のPTCA施行3日後、10日後の運動負荷試験では心電図上有意なST下降が認められたが運動負荷試験前後の尿中の11-dehydrothromboxane B_2濃度/6-keto-prostaglandin F_1 alpha濃度の変化は少なく、運動負荷試験における心電図上のST下降とアラキドン酸代謝の不均衡の関連は認められなかった。再狭窄の認められない例においてはPTCA施行前、3日後、10日後における運動負荷試験前後の尿中の11-dehydrothromboxane B_2濃度/6-keto-prostaglandin F_1 alpha濃度の変化は少なく運動負荷試験中の心電図上有意なST変化はなかった。以上より、PTCA後再狭窄へ進展する例ではPTCA施行前の運動負荷試験においてすでにアラキドン酸代謝の不均衡が認められ、再狭窄への進展の予測因子となりうる可能性が示唆された。
酵母CDC28キナーゼファミリーのPHO85キナーゼによる転写と細胞周期の制御

1. Pho85キナーゼと相互作用する因子の遺伝学的探索。pho85変異株中でG2サイクリンを過剰発現すると生育停止が起こること、pho4欠失では生育停止は抑圧されないことを見いだした。CLB2過剰発現株では大きい芽を持ち核が境界面に位置した状態で生育停止した細胞が多く観察された。pho80変異株中でCLB3を過剰発現すると芽が異常に伸長した細胞が多く観察された。これらの結果はPho85キナーゼがG2/Mの移行やM期の終了に関与している可能性を示している。細胞周期進行を阻害する薬剤のpho85変異株に対する効果を調べたところ、benomyl, MMSや紫外線照射に対しては野生株と差がなかったが、ヒドロキシ尿素に対しては感受性を示した。これはヒドロキシ尿素処理による生育停止からの回復の欠損によることがわかった。またCLB5を過剰発現するとヒドロキシ尿素に対し超感受性となった。これらの結果から、Cdc28/CIb5の阻害因子であるp40Sic1に対するPho85キナーゼの作用を調べたところ、p40Sic1がPho85キナーゼによって試験管内でリン酸化されること、pho85変異株中ではp40Sic1の分解が遅くなることを見いだした。これによりPho85キナーゼの標的の一つがCdkインヒビター(CKI)であるp40Sic1であり、Pho85キナーゼがCKIの分解を促進することにより、細胞周期進行に関与する可能性が示された。2. Pho85キナーゼと相互作用する因子の生化学的探索。酵母抽出液のゲル濾過、抗体アフィニティーカラム、およびGST-Pho85をリガンドとするアフィニティーカラムによる分析により、Pho85が他の数種の蛋白質と複合体を形成していること、複合体の形成にはPho80が重要な役割を果していることがわかった。3. Pho85キナーゼの機能ドメインの解析。種々のPho85キナーゼの変異体とPho80との結合親和性を調べたところ、E53A変異体はPho80に結合せず、K58A変異体は結合力が弱くなっていることがわかった。またPHO80を過剰発現するとE53A変異は抑圧されなかったが、K58A変異は抑圧された。これらのことから、E53残基はPho80との結合に重要であることがわかった。4. SKO1/ACR1とPHO85との遺伝的相互作用の解析。RAS-cAMP経路の下流に位置すると考えられるSKO1とPHO85との遺伝的相互作用をsko1欠失変異の導入あるいはSKO1過剰発現により調べたが、pho85変異形質の抑圧は見られなかった。RAS-cAMP経路の下流に位置すると考えられるSKO1とPHO85との遺伝的相互作用をsko
地域活性化につなげる多言語"Omotenashi"フレームワークの構築

増加する訪日外国人を迎えるにあたって、地域・団体の多言語化による"Omotenashi"を実現することによって活性化を図ることが出来るかどうかを実験・検証を進めている。そのために、平成29年度は、本研究の枠組みの構築並びに実証実験の場の選定、協力地域・団体との交渉などを行ってきた。平成29年度は本研究に関心を抱いた東海地域の県の観光協会と協力関係を結び、実証実験の場の候補地選定(3カ所)ならびにそれらの地域・団体に対しての説明会を行った。平成30年度では、静岡県の大型クルーズ客船の観光客を迎える複合施設において小規模な実験の開始し、実験データの収集並びに分析を行った。実験を開始した複合施設では、複数店舗から主に中国語を学習したいという参加者が30名近く参加した。被験者が任意での参加であるため、被験者のモチベーションを維持することが困難であったが、3か月余りにわたって追跡調査を行った。その結果は、11月にチリで開催されたWorldCALL 5thにて「Saving the high street: Designing onlinestudy for local businesses」として発表した。我々の取り組みについては、複数の国の研究者からも強く関心を持たれた。我々の研究においては、個人はもとより地域・団体における取り組みを対象としており、その後も、新しい地域・組織と協力をし、さらなる実験を行って、効果を検証していく予定である。平成31年度はすでに1団体から実験協力が得られていることから、別な角度からの分析を踏まえて、成果としてまとめていく。本研究はおおむね順調に進展をしている。実験協力団体・地域との交渉が最も難航するところであるが、静岡県観光協会の外郭団体のサポートを得て、平成30年度の実験協力先を確保することができた。また、平成31年度もすでに1団体からの協力が得られている。一方で、昨今の労働環境の改善の観点から、実験協力とはいえ、組織として従業員にどこまで強制力を持たせて参加させるかという点で、実験に参加しにくくなるという新たな問題が生じている。我々の研究に対して興味を持つ地域・団体は多いことから、平成31年度はその点の対応の仕方も含め、新たな実験協力先を募っていく。平成31年度は、観光地にある某ホテルにて実験を行う目途が立っている。別途、複数団体と調整中であり、研究最終年度としてまとめていくにあたって実験データのさらなる積み上げを予定している。また、3年間にわたる研究のまとめとして、31年度の後半に観光系の学会にて発表する予定である。今年度は研究最終年度に当たることから、実験データの集約・分析をし、最終的なまとめを行っていく。増加する訪日外国人を迎えるにあたって、地域・団体の多言語化による"Omotenashi"を実現することによって活性化を図ることが出来るかどうかを実験・検証を進めていく。その結果、1団体および1地域での小規模な実験の開始に着手をし、平成30年度にかけて実験データの収集並びに分析を行っていく。実験を開始した団体・地域は、多くの訪日外国人を迎える東海地域の美術館と近年大型クルーズ客船を迎えることになり地域の活性化を図ることを考えている沿岸地域の商店街である。当該商店街は地域経済の衰えにより、閉鎖する店も多くなっている。ここにクルーズ船で来日した外国人を迎え入れ、観光都市としての活性化を図りたいと考えている場所である。美術館および商店街(地域)共に、中国・韓国などのアジア系観光客を多く迎えるようになっており、英語ではない彼らの母国語での対応が望まれている。平成29年9月には本研究に用いる多言語学習システムのフレームワークとそれを用いた学習の仕組みについて、「ブレンディッドラーニングによる次世代型語学学習モデル」および「短時間サバイバル語学学習のためのカリキュラムデザイン」という題目で日本教育工学会第33回全国大会にて発表を行った。実験協力依頼の際に、県および市の観光関連部署を介することが多いことから、なかなか話し合いが進まずに進捗が遅れた時期も見られた。その点で29年度の後半での実験着手がやや遅れたが、学会やフォーラム等を通じて我々の研究活動に興味を抱いた団体等からも直接依頼を受けるようになったことから、実験の場の確保が出来るようになった。全体的に見て、概ね順調に研究は進展している。

その結果は、11月にチリで開催されたWorldCALL 5thにて「Saving the high street: Designing onlinestudy for local businesses」として発表した。我々の取り組みについては、複数の国の研究者からも強く関心を持たれた。我々の研究においては、個人はもとより地域・団体における取り組みを対象としており、その後も、新しい地域・組織と協力をし、さらなる実験を行って、効果を検証していく予定である。平成31年度はすでに1団体から実験協力が得られていることから、別な角度からの分析を踏まえて、成果としてまとめていく。本研究はおおむね順調に進展をしている。実験協力団体・地域との交渉が最も難航するところであるが、静岡県観光協会の外郭団体のサポートを得て、平成30年度の実験協力先を確保することができた。また、平成31年度もすでに1団体からの協力が得られている。一方で、昨今の労働環境の改善の観点から、実験協力とはいえ、組織として従業員にどこまで強制力を持たせて参加させるかという点で、実験に参加しにくくなるという新たな問題が生じている。我々の研究に対して興味を持つ地域・団体は多いことから、平成31年度はその点の対応の仕方も含め、新たな実験協力先を募っていく。平成30年度は、平成29年度に実験着手した地域・団体においても実験を行う目途が立っている。そこで、訪日外国人を迎える様々の立場の人・団体を対象とした実験を行うことによって、多言語化およびそれによる訪日外国人への"Omotenashi"効果の分析を行っていく。また、その結果の一部を、30年度の後半に国際学会にて発表する予定である。その後は、さらに、実験の続行並びにデータの収集・分析を進め、国内の学会においても発表していく予定である。平成31年度は、観光地にある某ホテルにて実験を行う目途が立っている。別途、複数団体と調整中であり、研究最終年度としてまとめていくにあたって実験データのさらなる積み上げを予定している。また、3年間にわたる研究のまとめとして、31年度の後半に観光系の学会にて発表する予定である。今年度は研究最終年度に当たることから、実験データの集約・分析をし、最終的なまとめを行っていく。当該年度は実験環境の整備の一環として、本研究で使用するシステムの改修をし、それをスマートフォンアプリケーション化する予定であった。しかし、スマートフォンアプリケーション化の計画をしている段階で、プログラム全体のかなりの書き換えが必要となることがわかり、また、その為の費用も当初予算の3倍近く必要となることが分かった。その結果、スマートフォンアプリケーション化を断念せざるを得なくなり、そのためにあてていた費用が余ることとなってしまった。今年度は実験そのものはインターネット環境の元、続行できるので引き続き行っていく。その実験結果に関する発表を、11月にチリで開催される国際学会で発表を予定していることから、当該年度に余ってしまった費用は国際学会への参加費並びに旅費として使用する。
炎症性腸疾患の克服をめざした新規治療薬シーズの探索

世界各地の伝承・伝統薬物資源から潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の治療に有用な医薬シーズを探索することを目的とする.すなわち,炎症性腸疾患の活動期において観察されるTNF-αの過剰産生により惹起される各種臓器障害や炎症反応などの種々の生体内イベントを軽減あるいは調節できる天然由来低分子化合物を探索するとともに,その活性発現の必須構造や構造活性相関を明らかにする.加えて,その病変部に顕著な増加が認められているマクロファージや好中球などのiNOS陽性細胞の活性化抑制作用およびその作用機序解明研究を実施し,もって新たな難治性炎症性疾患治療薬シーズを発見,提案することを目的とする.世界各地の伝承・伝統薬物資源から潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の治療に有用な医薬シーズを探索することを目的とする.すなわち,炎症性腸疾患の活動期において観察されるTNF-αの過剰産生により惹起される各種臓器障害や炎症反応などの種々の生体内イベントを軽減あるいは調節できる天然由来低分子化合物を探索するとともに,その活性発現の必須構造や構造活性相関を明らかにする.加えて,その病変部に顕著な増加が認められているマクロファージや好中球などのiNOS陽性細胞の活性化抑制作用およびその作用機序解明研究についてもあわせて実施し,もって新たな炎症性腸疾患治療薬シーズを発見,提案することを目的とする.当初の計画どおり,研究初年度である平成27年度において種々の薬用資源からTNF-α感受性低減作用を有する有望素材をピックアップすることができ,かつ,その含有成分の探索研究について概ね順調な進捗がみられていると考える.世界各地の伝承・伝統薬物資源から潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の治療に有用な医薬シーズを探索することを目的とする.すなわち,炎症性腸疾患の活動期において観察されるTNF-αの過剰産生により惹起される各種臓器障害や炎症反応などの種々の生体内イベントを軽減あるいは調節できる天然由来低分子化合物を探索するとともに,その活性発現の必須構造や構造活性相関を明らかにする.加えて,その病変部に顕著な増加が認められているマクロファージや好中球などのiNOS陽性細胞の活性化抑制作用およびその作用機序解明研究についてもあわせて実施し,もって新たな炎症性腸疾患治療薬シーズを発見,提案することを目的とする.二年目の今年度は,昨年度ピックアップされたTNF-α感受性低減作用を有する有望素材のうち,メース(Myristica fragrans,仮種皮)およびロウバイカ(Chimonanthus praecox,花蕾部)に加え,生薬麻黄などにアレルギー性炎症に関与するケモカインCCR3アンタゴニスト活性を見いだした.また,昨年度に引き続き有望素材のピックアップを目的に,TNF-α感受性低減作用をはじめとした各種抗炎症作用試験を実施したところ,ブラジル天然薬物アンディローバ(Carapa guianensis,種子および花部)に含有されるリモノイド成分およびタイ天然薬物Shorearoxburghii由来のオリゴスチルベノイド成分に,臓器障害モデルのひとつであるD-galactosamine / lipopolysaccharide誘発肝障害マウスモデルに対する肝保護作用を見いだした.研究所年度の昨年度にピックアップされた有望素材であるメース(Myristica fragrans,仮種皮)およびロウバイカ(Chimonanthus praecox,花蕾部)などに,新たな抗炎症作用メカニズムとしてCCR3アンタゴニスト活性を見いだすなどとともに,今年度も継続的に実施したスクリーニング試験により,新たな有望素材としてブラジル天然薬物アンディローバ(Carapa guianensis,種子および花部)に含有されるリモノイド成分およびタイ天然薬物Shorearoxburghii由来のオリゴスチルベノイド成分などを見いだすに至るなど,概ね順調な進捗がみられていると考える.世界各地の伝承・伝統薬物資源から潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の治療に有用な医薬シーズを探索することを目的とする.すなわち,炎症性腸疾患の活動期において観察されるTNF-αの過剰産生により惹起される各種臓器障害や炎症反応などの種々の生体内イベントを軽減あるいは調節できる天然由来低分子化合物を探索するとともに,その活性発現の必須構造や構造活性相関を明らかにする.加えて,その病変部に顕著な増加が認められているマクロファージや好中球などのiNOS陽性細胞の活性化抑制作用およびその作用機序解明研究についてもあわせて実施し,もって新たな炎症性腸疾患治療薬シーズを発見,提案することを目的とする.事業最終年度である平成29年度は,薫香生薬である乳香や没薬に含有されるテルペノイド成分にマウス腹腔マクロファージからのリポ多糖刺激による一酸化窒素産生抑制活性およびiNOS発現抑制活性を見いだした.また,人参果に含有されるエラグ酸配糖体に,マウス初代培養肝細胞を用いたD-ガラクトサミン誘発肝細胞障害抑制活性を見いだした.加えて,昨年度にアレルギー性疾患に関与するケモカインCCR3のアンタゴニスト活性を見いだした香辛料素材のメースに含有される成分に,RBL2H3細胞からの抗原刺激により誘発されるβ-ヘキソサミニダーゼおよびTNF-α遊離抑制活性を見いだすなど,本事業により新たな難治性炎症性疾患治療薬シーズを,種々の天然資源より見いだすことに成功した.世界各地の伝承・伝統薬物資源から潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の治療に有用な医薬シーズを探索することを目的とする.すなわち,炎症性腸疾患の活動期において観察されるTNF-

αの過剰産生により惹起される各種臓器障害や炎症反応などの種々の生体内イベントを軽減あるいは調節できる天然由来低分子化合物を探索するとともに,その活性発現の必須構造や構造活性相関を明らかにする.加えて,その病変部に顕著な増加が認められているマクロファージや好中球などのiNOS陽性細胞の活性化抑制作用およびその作用機序解明研究を実施し,もって新たな難治性炎症性疾患治療薬シーズを発見,提案することを目的とする.ピックアップされた候補素材の含有成分について活性評価し,その活性寄与成分を明らかにするとともに,iNOS発現至る細胞内シグナル伝達に及ぼす影響などを検討し,もって新たな炎症性腸疾患治療薬候補物質の提案に繋げたい.ピックアップされた候補化合物について,iNOS発現に至る細胞内シグナル伝達に及ぼす影響などを検討し,もって新たな炎症性腸疾患治療薬候補物質の提案に繋げたい.生薬・天然物化学
アルツハイマー病発症機序における転写障害の検討

アルツハイマー病の病態機序の解析は,βアミロイドからなる老人斑の沈着と,それに引き続く異常リン酸化タウ沈着から神経細胞死が生じるという「アミロイドカスケード仮説」を中心に検討されてきている.本研究課題では,「アミロイドカスケード仮説」とは異なる「γセクレターゼ調節不全による転写障害仮説」を検証することを目的とした.FAD関連PS1変異体においては,APPおよびDelta-1のC末端断片,AICD(APP intracellular domain),DICD(Delta-1 intracellular domain)の産生レベルは,野生型と比較し低下していた.これらのAICDおよびDICDの細胞内局在は,核分画に認められた.さらに,Gal4-VP16のレポーター配列をDelta-1のDICD内に組み入れ,ルシフェラーゼによるレポーターアッセイを行ったところ,PS1変異体では転写活性の低下を示した.以上の結果から,PS1変異を原因とするアルツハイマー病においては,γセクレターゼを介した転写活性調節異常が病態に関与している可能性が示唆された.今後の課題として,この転写活性異常のターゲットとなる転写因子の同定が重要であり,その候補としてCREB依存性の転写活性について詳細に解析する必要がある.アルツハイマー病の病態機序の解析は,βアミロイドからなる老人斑の沈着と,それに引き続く異常リン酸化タウ沈着から神経細胞死が生じるという「アミロイドカスケード仮説」を中心に検討されてきている.本研究課題では,「アミロイドカスケード仮説」とは異なる「γセクレターゼ調節不全による転写障害仮説」を検証することを目的とした.FAD関連PS1変異体においては,APPおよびDelta-1のC末端断片,AICD(APP intracellular domain),DICD(Delta-1 intracellular domain)の産生レベルは,野生型と比較し低下していた.これらのAICDおよびDICDの細胞内局在は,核分画に認められた.さらに,Gal4-VP16のレポーター配列をDelta-1のDICD内に組み入れ,ルシフェラーゼによるレポーターアッセイを行ったところ,PS1変異体では転写活性の低下を示した.以上の結果から,PS1変異を原因とするアルツハイマー病においては,γセクレターゼを介した転写活性調節異常が病態に関与している可能性が示唆された.今後の課題として,この転写活性異常のターゲットとなる転写因子の同定が重要であり,その候補としてCREB依存性の転写活性について詳細に解析する必要がある.1.家族性Alzheimer病関連プレセニリン1(PS1)変異体を安定発現する細胞株の作成家族性Alzheimer病を引き起こすPS1変異としてL11きP,ins156,G183V,ins352変異を発現プラスミドベクターに導入し,安定発現株を3種類の培養細胞(PS1欠損線維芽細胞,HEK293細胞,C6神経膠芽腫由来細胞)を作成した.これらの細胞から界面活性剤によりタンパク質を溶解し,PS1特異抗体を用いた免疫ブロットにてPS1の発現を確認した.これらの変異体のうち,ins156では全長型PS1から断片化への切断が抑制されていた.2.PS1変異体発現細胞におけるアミロイド代謝の検討PS1変異体発現細胞にAPPを共発現することによりβ-amyloid(Aβ)の産生を検討した.ins156変異体においては,既報の変異体と同様にAβ42/40の比率の上昇を認めたが,それ以外の変異体(L113P,G183V,ins352)ではAβ42/40の比率の上昇は野生型と変化なく,総Aβ分泌量はむしろ低下していた.3.転写活性をモニターするレポーターアッセイ系の樹立APPはγ-secretase切断によりC末端断片(γ-CTF)を産生し,その断片の核移行により転写を調節している可能性がある.その中で特にCREB依存性の転写活性を解析する目的で,γ-CTFにGal4-CREBのレポーター配列を付加したコンストラクトを作成した.現在,この融合タンパクを発現を免疫ブロットで,その核移行を含め検討している.アルツハイマー病の病態機序の解析は,βアミロイドからなる老人斑の沈着と,それに引き続く異常リン酸化タウ沈着から神経細胞死が生じるという「アミロイドカスケード仮説」を中心に検討されてきている.本研究課題では,「アミロイドカスケード仮説」とは異なる「γセクレターゼ調節不全による転写障害仮説」を検証することを目的とした.FAD関連PS1変異体においては,APPおよびDelta-1のC末端断片,AICD(APP intracellular domain), DICD(Delta-1 intracellular domain)の産生レベルは,野生型と比較し低下していた.これらのAICDおよびDICDの細胞内局在は,核分画に認められた.さらに,Gal4-VP16のレポーター配列をDelta-1のDICD内に組み入れ,ルシフェラーゼによるレポーターアッセイを行ったところ,PS1変異体では転写活性の低下を示した.以上の結果から,PS1変異を原因とするアルツハイマー病においては,γセクレターゼを介した転写活性調節異常が病態に関与している可能性が示唆された.今後の課題として,この転写活性異常のターゲットとなる転写因子の同定が重要であり,その候補としてCREB依存性の転写活性について詳細に解析する必要がある.