hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多次元上のファジィ集合による多変数システム制御

複雑な多変数システムの状態を、人が認識しているような大局的であいまいなことばにより表現するシステム制御を実現した。あいまいな表現のために多次元ファジィ集合を適用し、計算処理を行うシステムを開発した。多次元のデータをサンプルし自動拡張することでファジィ集合の編集を行うシステムを開発した。対象として22次元のヒューマノイドロボット実機及びシミュレーションサッカーを題材にした行動制御を行った。研究計画にもとづき以下の3つの内容を行った。多次元ファジィ集合をこのへんファジイ集合と呼ぶことにする。実機ヒューマノイドロボット実験システムの開発を行い、GR-001型ロボットとUSB通信システム、ビデオ計測、加速度計による状態計測準備を行った。ブレーキモードを用いてユーザが指定した自由姿勢角度の多変数読み込みを可能とした。ロボカップシミュレーションリーグ3D部門公式システムのバーチャルヒューマノイド18自由度モデルを用いて多変数システムの制御手法の検討を行った。関節数を2ないし3としたモデルにおいて、重心の静的安定性を保持しながら姿勢の変更を行う制御実験を行った。複数の回転関節からなるロボットの重心移動による転倒の境界条件は非線形な逆関数で与えられる。この境界を多次元ファジィ集合で直接的に表現することで見通しの良い知識による制御ができた。これらの結果を、インテリジェントシステムシンポジウム、人工知能学会研究会、及びロボカップ秋キャンプポスターにて発表した。また、本手法を用いて出場したロボカップジャパンオープンで準優勝した。ファジィ演算ライブラリの調整を行い、機能検証のために一次遅れ系のファジィ制御実験を行った。制御位相平面上で座標軸と直行しない2次元のあいまいな部分領域を多次元ファジィ集合で表現し、3つのファジィ制御規則で、9つの従来型ファジィ制御規則と同等の性能を確かめた。規則数削減の効果による見通しの良い知識の有用性についてファジィシステムシンポジウムで発表した。研究計画にもとづき以下の内容の研究・開発を行った。本年度は19年度の成果であるヒューマノイドロボットシステムの姿勢制御を主たる対象として、そこにかかわる暖昧な状態表現を実際に多次元ファジィ集合で記述した。人の知識にもとづいて100程度の概念表現を取得できるGUIシステムを構築した。ロボカップサッカーシミュレーション3Dサーバと連動して姿勢の安定性を確認しつつ姿勢の拡張探索を行うことでユーザの直感に合わせた多次元ファジィ集合表現を可能とした。記述されたファジィ集合による実制御の効果について、あいまいな姿勢による状態空間の経路探索を行うことで基礎的なロボットの姿勢制御および行動制御できることを明らかにした。実験により本手法の有効性を検証し、あいまいな姿勢の知識にもとづく制御を実現した。途中結果についてはインテリジェントシステムシンポジウムで発表し、全体について人工知能学会SIG-AIChallenge研究会で発表予定である。また、多次元ファジィ集合の基礎的な考察と応用について日本知能情報ファジィ学会誌に解説論文を掲載した。さらに、本研究にもとづくサッカーロボット構築により、ロボカップジャパンオープン人工知能学会賞を受賞した。平成22年度は本課題の最終年度として全体のまとめとさらなる実用化のための課題検証を行った。モーション制御の基礎となる姿勢状態のファジィ集合データの拡充をロボカップ3Dシミュレータにより行い、20年度に実現した基礎的な静的動作より複雑で高度な歩行実験を行った。1)ファジィ集合表現獲得システムの改良として以下の開発および実験を実施した。1-1)実機教示から姿勢情報を獲得するシステムを改良した。1-2)ロボカップ3Dシミュレータを用いて集合獲得するシステムに改良を施しOSC(Observation based States Creator)を構築した。1-3)22次元のファジィ集合をロボットをもちいてユーザに提示するシステムをOSCの機能として実装した。1-4)獲得した集合をもちいたなめらかな歩行行動の制御実験を行った。2)ヒューマノイド姿勢の多次元ファジィ集合表現の拡大と処理の高速化として以下の研究を行った。2-1)姿勢獲得エディタを用い、人の知識から姿勢の概念表現語を収集した。2-2)対象のもつ幾何構造を保存するファジィ集合生成アルゴリズムを提案し実装および検証した。2-3)演算の高速化を目指しGPGPUによる処理を設計した。以上の成果により22次元を持つヒューマノイドロボットにおいて獲得した「直立」や「片足立ち」など行動制御に必要な知識をもちい、数理的なモデルによらないあいまいで柔軟な歩行行動が実現した。この結果は、ヒューマノイドロボットに限らず多変数システムの制御において有効であると言える。本成果は、4編の論文として、人工知能学会、ファジィ学会、情報処理学会で発表を行った。
モデルチェッキング法の限界を超えるダイナミック実時間システムのための論理的検証法

我々の研究の枠組は論理的推論や演繹の方法論を用いて、ロジカル・リーズニングを実時間システムの構築等の形式仕様・形式検証に取り入れようとする点に(例えば伝統的モデルチェッキング法やオートマタ理論的分析と違った)最大の特徴がある。我々の方法論がダイナミックな変化を許す進化的、発展的実時間システム特有の検証、解析に対して有効であることを示した。また、神戸大学田村研究室グループからの協力も得て、我々の理論の実装を論理型プログラム言語上で進めた。これまでの理論的研究と実装的研究の統合も行った。論理的形式検証の方法論を認証プロトコルの安全性検証にも応用してきた。認証プロトコルの論理的検証においても、attackersの参入や新しい認証子の発行等のようなシステムのダイナミックな変化を捉える方法論を確立することが重要である。昨年度の準備研究の成果を踏まえて、protocol logicsの論理的分析を中心として、論理的検証の方法論の具体的応用を与えた。また、特に、認証プロトコルのagreement properties検証に関するprotocol logicの基本部分を一階述語論理上で再構成し、その完全性定理及び反例生成系を与えた。この理論の応用のための反例生成系の実装試作も行った。認証プロトコルの安全性検証に関する実時間解析の手法の研究も進めた。1.我々の形式仕様・形式検証の枠組は論理的推論や演繹の方法論を用いて、ロジカル・リーズニングを実時間システムの構築に取り入れようとする点に(例えば伝統的モデルチェッキング法やオートマタ理論的分析と違った)最大の特徴がある。又、このロジカル・リーズニングの基本として線形論理を用いることが有効であることを示してきた。形式仕様記述には線形論理が用いられ、仕様を満たすプロセスは線形論理証明で表示され、安全性等の自動検証のために必要とされる稠密時間概念の消去手続は線形論理証明の変換手続として実現された。このような線形論理を用いたロジカル・リーズニングが安全性自動検証などの一部の検証に有効であるのみならず、実時間システムの改良や修正等のより広い範囲の分析にも有効であることを示す目的で、実装計画を進めた。2.我々の方法論をダイナミックな変化を許す進化的、発展的実時間システム特有の検証、解析に対して応用した。現在までに試作した我々の線形論理自動検証系FATALISをダイナミックシステムの検証に適するように改良を進めた。3.セキュリティプロトコルの安全性検証のためのProtocol Logicsの主要部分が一階述語論理上で実現できることを示した。又、tracesをベースとしたformal semanticsを与え、我々のprotocol logicのsemantic completenessを与えた。又、これを使って我々のprotocol logicの決定問題を肯定的に解いた。さらにこの完全性証明を用いて時間制約を含む具体的なprotocolの安全性証明や反例生成の方法論を開発中である。
ポテンシャル勾配を有する高分子内空間における自在金属集積と電子物性の解明

金属イオンに対し高い配位能を有する部位を複数有する有機化合物(有機モジュール)と金属イオンを自己集合させれば、高分子主鎖に金属イオンが導入されることによって、電子移動特性に優れた有機-金属ハイブリッドポリマーが得られると予想される。そのように得られたポリマーは、電位や磁場や光によって金属の電子状態を変化させることで、その電子・光・磁性を可逆に制御できると期待される。ポテンシャル勾配を有する特異構造高分子を設計・合成し、高分子内ナノ空間における金属イオン及びクラスターの自在集積の実現を目的として、棒状の有機-金属ハイブリッドポリマーの合成にこれまで成功している。ビス(ターピリジル)ベンゼンを有機モジュールとして用い、酢酸鉄と錯形成させることで、青紫色のハイブリッドポリマーを得た。このポリマーをITO電極にキャストし、アセトニトリル中で電気化学的に酸化したところ、ポリマーフィルムが無色に変化した。逆に還元電位を印加すると、フィルムはもとの青紫色に戻った。この変化は可逆であり、このハイブリッドポリマーが優れたエレクトロクロミック特性を有することを見出した。さらに今回、様々な金属イオン種や有機モジュールを用いて、多彩な有機/金属ハイブリッドポリマーを開発し、それらの物性及びエレクトロクロミック特性を詳細に明らかにした。ルテニウムイオンを用いて得られたハイブリッドポリマーは赤系の発色を示し、有機モジュールを変えることで、その電荷移動吸収の最大波長がシフトすることで、色の調節ができることを見出した。さらに、サイクリックボルタンメトリー測定から、有機モジュールへの官能基導入により、ハイブリッドポリマーの酸化還元電位もコントロールできることを見出した。π共役有機配位子を用いて高分子主鎖に金属イオンを導入すれば、電子移動特性に優れた有機-金属ハイブリッドポリマーが得られるだけでなく、電位や磁場や光によって金属の電子状態を変化させることで、その電子・光・磁性を可逆に制御できると期待される。ポテンシャル勾配を有する特異構造高分子を設計・合成し、高分子内ナノ空間における金属イオン及びクラスターの自在集積の実現を目的として、棒状の有機-金属ハイブリッドポリマーの合成に成功した。ポリマーの発色は、金属からターピリジン部位への電荷移動吸収によって生起する。従って、ターピリジンのLUMOポテンシャルを変えれば、ポリマーの発色の制御が可能となると予想される。そこで、電子吸引基としてブロモ基を、また電子供与基としてアルコキシ基を導入したビス(ターピリジル)ベンゼンを設計・合成し、それらの有機モジュールと用いてハイブリッドポリマーを合成したところ、それぞれ緑色、および青色となり、以上の結果から、ターピリジンの電子状態を置換基の導入によって変えることで、ハイブリッドポリマーの色を制御できることが判明した。また、電子線回折と分子モデリングを組み合わせることで、結晶中におけるハイブリッドポリマーの高分子構造を明らかにすることに成功した。
連星中性子星における一般相対論的準平衡形状の数値的研究

連星中性子星の準定常段階において、アインシュタイン方程式を解いて連星系の時間発展を数値的に追う事により、軌道収縮速度や放出される重力波を求める事が、本研究の最終目的である。この状況は、重力波放出による軌道収縮時間が軌道周期よりも十分長く、連星系が徐々に進化していくと近似できる。従って、連星系を直接時間発展させずに、連星中性子星のバリオン質量を固定した上で、いろいろな連星間距離での平衡解を求めて系列を構成する事により、連星系の進化をモデル化することができる。本研究では、中性子星の状態方程式として原子核物理学から導かれたモデルを採用し、連星間距離が離れている時から合体直前までの系列を数値的に求めた。この様に、現実的な状態方程式を使って連星中性子星の準平衡解系列を求めたのは、本研究が世界初である。得られた結果の内、連星系の結合エネルギーについては、連星間距離が離れているときは3次のポスト・ニュートン近似によって求められた結果と良く一致していることが挙げられる。これは、中性子星の表面近くに「クラスト」と呼ばれる状態方程式的に軟らかい部分が存在し、中性子星が潮汐変形しにくくなっているためであると解釈できる。また、連星間距離が近付いてくると、中性子星の中心部分に存在する「コア」と呼ばれる状態方程式的に硬い部分の影響で、3次のポスト・ニュートン近似の結果から、ポリトロープ型の状態方程式の場合と比べて急激に離れていくことが判った。連星中性子星の準定常段階において、アインシュタイン方程式を解いて連星系の時間発展を数値的に追う事により、軌道収縮速度や放出される重力波を求める事が最終目的であるが、今年度は、連星系を直接時間発展させるという事はせずに、連星中性子星のバリオン質量を固定した上で、いろいろな連星間距離での平衡解を求めて系列を構成した。これは、重力波放出による軌道収縮時間が軌道周期よりも十分長いという近似の下、連星系が徐々に進化していくことをモデル化したものである。本研究では、一般相対論的な連星中性子星で、質量の異なった星で構成されている場合について世界で初めて準平衡解を求め、連星間距離が離れている時から合体直前までの系列を求める事に成功した。本研究では、中性子星の状態方程式をポリトロープでモデル化し、その断熱指数が2の場合について数値計算を行った。新たに明らかになった結果としては、同期回転する場合の連星中性子星に関しては、連星系を構成する2つの星に少しでも質量差があれば、平衡解の系列の終点は軽い方の星の潮汐破壊による質量放出であり、渦無し回転している場合は、等質量星で構成されている場合も非等質量星の場合でも潮汐破壊による質量放出で終ることが挙げられる。また、連星系の安定性と関係のある、全エネルギーが最小値を取る点に関しては、渦無し回転している場合には存在せず、同期回転する場合では、等質量のときには存在するが質量差が大きくなるにつれて潮汐破壊が起こる方が先に来るようになる傾向を発見した。更に、等質量星からなる連星系の場合について、進化の過程で放出される重力波を四重極公式で評価し、その振動数がどのように変化するかについても調べた。この研究により、連星間距離が近いときの重力波の振動数の変化と星のコンパクトさとの間に関係を付ける事ができた。連星中性子星の準定常段階において、アインシュタイン方程式を解いて連星系の時間発展を数値的に追う事により、軌道収縮速度や放出される重力波を求める事が本研究の最終目的である。本研究では、中性子星の状態方程式としてポリトロープを採用し、その断熱指数が1.8から3の間の値を取る場合について数値計算を行い、連星間距離が離れている時から合体直前までの系列を求めた。その結果の一つとして、ニュートン重力を用いた計算によって求められた連星系の平衡解の系列に、エネルギーの最小値が存在したならば、一般相対論的な数値計算結果でも存在すべきである、という興味深い示唆を得た。更に、上で求めた一般相対論的準平衡解を初期データとして用い、動的合体数値シミュレーションも行った。その結果、質量が全く同じ星で構成された連星系の場合と違い、非等質量星で構成されている場合は、合体後に中心に形成されるブラックホールの周りにできる降着円板の質量の割合が大きくなることが分った。また、本研究の最終目標である、連星中性子星の準定常段階における時間発展を数値的に追うためのスペクトル法による数値計算コード開発も進展し、現在までのところ論文発表には至っていないが、2次元定常解を求めることができるようになっている。

本研究では、中性子星の状態方程式として原子核物理学から導かれたモデルを採用し、連星間距離が離れている時から合体直前までの系列を数値的に求めた。この様に、現実的な状態方程式を使って連星中性子星の準平衡解系列を求めたのは、本研究が世界初である。得られた結果の内、連星系の結合エネルギーについては、連星間距離が離れているときは3次のポスト・ニュートン近似によって求められた結果と良く一致していることが挙げられる。これは、中性子星の表面近くに「クラスト」と呼ばれる状態方程式的に軟らかい部分が存在し、中性子星が潮汐変形しにくくなっているためであると解釈できる。また、連星間距離が近付いてくると、中性子星の中心部分に存在する「コア」と呼ばれる状態方程式的に硬い部分の影響で、3次のポスト・ニュートン近似の結果から、ポリトロープ型の状態方程式の場合と比べて急激に離れていくことが判った。
超短時間作用性選択的β1遮断薬の虚血心筋保護作用機序

長短時間作用性選択的β1遮断薬(ランジオロール)の虚血心筋保護作用機序を単離モルモット心を用いて調べた。ランジオロールは虚血再灌流心に対し、心保護作用を有し、その心保護作用は心仕事量減少とは無関係であることが分かった。さらに、虚血による活性酸素産生を抑制し、フォスフォランバンのリン酸化を抑制する事が判明した。1.虚血再灌流心におけるβ遮断薬の心保護作用の比較(金谷憲明)モルモットを用い、ランゲンドルフ法による摘出拍動心臓標本を作製し、左心室圧、心拍数、冠血流量、心筋酸素消費量を測定した。虚血/再灌流心モデルとして、灌流停止による一過性の全虚血後、再灌流を行った。我々の行った予備実験では45分の虚血後に再灌流を行うと、1時間後の左心室圧は虚血前の70%程度までしか回復しない。1)虚血/再灌流心に対するβ遮断薬前投与の心保護作用:虚血15分前に各種β遮断薬(プロプラノロール、エスモロール、ランジオロール)を投与し、虚血/再灌流による心収縮力低下が軽減するか、β遮断薬を前投与しない対照群と比較検討した(各群、n=7)。その結果、β遮断薬は虚血再灌流による心収縮力低下を軽減することが分かった。2.心仕事量減少を介する心保護作用機序を検討(金谷憲明)β遮断薬の心保護作用が、その心仕事量減少を介する2次的なものなのかを調べた。摘出心は、β遮断薬を15分間前投与された群(n=7)と、β遮断薬による心仕事量減少を補う目的で、心室ペーシングにより心拍数を一定(300/分)にした群(n=7)とで心機能を比較した。その結果、β遮断薬は心仕事量の減少とは無関係に心保護作用を有する事が判明した。1.PLBのリン酸化を介する心保護作用機序(金谷憲明)β遮断薬の直接心保護作用として、PLBのリン酸化を介する心保護作用機序の関与を調べた。摘出心臓は、45分の全虚血後に90分の再灌流を行った。β遮断薬としてランジオロールを用い、虚血前に15分間のβ遮断薬前投与を行った。心室標本を凍結保存しておき、後日、生化学的分析をおこなった。心室標本は、250mM sucrose, 1mM EDTA, 50mM Trisを含むbuffer中にhomogenateした。それを600gで10分間遠心し、さらに上清を8,000gで10分間遠心した。上清をさらに、15,000gで60分間遠心し、その上清をSDS-PAGE(polyacryl-amide gel electphoresis)にかけた。
酵母を用いた中枢神経系における転写因子新遺伝子クローニングシステムの開発

本研究計画では、酵母(S.cerevisiae)内にて、広く哺乳動物の転写因子活性化能の定量を可能とするシステム(yeast-based luciferase assay;以下YLAと略)の構築を目的とする。それにより、転写因子の制御因子を単一あるいは複数個同時発現して制御システムを酵母内に再構築して検討を可能とする。本年度は以下の成果を得た.1)p53 responsive element(p21,Bax)を含むプロモータ駆動をFirefly luciferaseをリポーターとして測定するシステムを完成,Renilla luciferase(内部標準)とともにp53,p73,p63によるプロモーター活性化の測定に成功した.2)p53の変異体80種の転写活性化能を測定し,変異体は必ずしも全ての転写活性を失っているわけではないことを見いだした(投稿準備中).3)p53に相互作用し,転写活性を上昇させるc-Abl,p33ING1,ING2を同時導入し,それらによる転写活性の上昇を確認した.4)Tcf-4/β-cateninの転写活性を測定するアッセイも同様に確立し,APCを同時導入して転写活性が抑制されることを確認した(投稿準備中).さらに本年度中にp53,p73,p63遺伝子またはTcf-4/β-cateninとともにcDNA libraryをADE2またはFirefly luciferaseのリポーター酵母株に導入し,これらの転写活性を調節する新しい遺伝子のクローニングをモデル実験として行う予定である.本研究計画では、酵母(S.cerevisiae)内にて、広く哺乳動物の転写因子活性化能の定量を可能とするシステム(yeast-based luciferase assay;以下YLAと略)の構築を目的とする。それにより、転写因子の制御因子を単一あるいわ複数個同時発現して制御システムを酵母内に再構築して検討を可能とする。本年度は以下の成果を得た.1)p53 responsive element(p21,Bax)を含むプロモータ駆動下にFirefly luciferaseを発現する酵母染色体組み込み型リポータプラスミドを作成し,これを酵母株yPH857の染色体に組換え導入してリポーター酵母株を作製した.3)酵母発現ベクターによりp53をリポーター酵母株に発現させ,ELISA定量および内部標準Renilla luciferaseにてモニターされるp53発現量に依存してFirefly luciferaseの転写が起こることが確認され,YLAの基盤技術を確した.本研究計画では、酵母(S.cerevisiae)内にて、広く哺乳動物の転写因子活性化能の定量を可能とするシステム(yeast-based luciferase assay;以下YLAと略)の構築を目的とする。本年度は以下の成果を得た.1)p53 responsive element(p21,Bax)を含むプロモータ駆動をFirefly luciferaseをリポーターとして測定するシステムを完成,Renilla luciferase(内部標準)とともにp53,p73,p63によるプロモーター活性化の測定に成功した.2)p53の変異体80種の転写活性化能を測定し,変異体は必ずしも全ての転写活性を失っているわけではないことを見いだした(投稿準備中).3)p53に相互作用し,転写活性を上昇させるc-Abl,p33ING1,ING2を同時導入し,それらによる転写活性の上昇を確認した.4)Tcf-4/β-cateninの転写活性を測定するアッセイも同様に確立し,APCを同時導入して転写活性が抑制されることを確認した(投稿準備中).さらに本年度中にp53,p73,p63遺伝子またはTcf-4/β-cateninとともにcDNA libraryをADE2またはFirefly luciferaseのリポーター酵母株に導入し,これらの転写活性を調節する新しい遺伝子のクローニングをモデル実験として行う予定である.
破骨細胞応答型薬剤溶出ナノ粒子の開発

本研究は、転移性骨腫瘍の進行を防ぐ薬剤(ビスフォスフォネート: Bp)を長期間放出する薬物送達システム(DDS)の開発を目的とする。特に、生体親和性に優れ、骨と直接結合するリン酸カルシウムに着目して、細胞活動に応答して薬剤を放出する能動的な機能の付加を目指す。薬剤を表面に吸着して複合化することによって、Bpの担体としてはハイドロキシアパタイト(Hap)よりリン酸八カルシウム(OCP)が優れていることを示した。さらにBpを取り込んだアモルファスのリン酸カルシウムを新規に合成し、表面吸着型の約4倍のBpを複合化できることを示した。本研究では、破骨細胞の働きを抑制するビスフォスフォネート(Bp: C_2H_8O_7P_2)の薬物送達(DDS: Drug Delivery System)担体としてリン酸八カルシウム(OCP: Ca_8(HPO_4)_2(PO_4)_4・5H_2O)に着目した。OCPは層状化合物であるため、層間にBpをインターカレーションできれば、破骨細胞の働きに応じてOCPが溶解されBpを放出する「細胞応答型DDS担体」としての応用が期待される。一方、OCPは準安定物質のため、合成時のpHやカルシウム/リン比によって容易に他のリン酸カルシウムとなる。そのため、BpをOCPと複合化しDDS担体とするためには、BpのOCP形成過程に及ぼす影響を明らかにすることが重要である。そこで本年度は、OCP合成プロセスにおけるBpの影響を調べることを目的とした。OCPを、Bp非共存下でリン酸緩衝液と酢酸カルシウム水溶液から合成した場合、リン酸緩衝液のpHが低い時にはリン酸水素カルシウム二水和物(DCPD: CaHPO4・2H2O)が生成し、リン酸緩衝液のpHが6.7の時には、最も結晶性の良いOCPが得られた。合成時間を変化させると、時間とともに結晶相が変化し、初期(17分)ではDCPD相が見られるが、時間が経つ(180分)とOCP単相となった。このことから、OCPは、前駆的に形成したDCPDを経て生成すると考えられる。一方、OCPを、Bpを添加したリン酸緩衝液と酢酸カルシウム水溶液から合成した場合、180分の場合でもBpの添加量が多いときはDCPDが生成することがわかった。すなわち、Bpの共存下では、DCPDからOCPへの形成が妨げられる。また、OCPへのBpの吸着量は0.23μmol/mgであったことから、Bpと生成したリン酸カルシウムの化学結合がOCP形成に影響を及ぼしていると考えられる。次に、α-リン酸三カルシウム(α-TCP: Ca3(PO4)2)の加水分解によってOCPを合成した。その結果、70°C、pH5で180分の反応によってOCPを形成させることができた。一方、α-TCP水溶液にBpを添加し同様の条件で反応させたところ、180分でもOCPは形成せず、α-TCPのままであった。すなわち、プロセスに関係なく合成系にBpを添加することで、BpはOCP形成に影響を及ぼすことが明らかとなった。本研究は、転移性骨腫瘍の進行を防ぐ薬剤(ビスフォスフォネート:Bp)を長期間放出する薬物送達システム(DDS: Drug Delivery System)の開発を目的とする。DDS担体として、生体親和性に優れ、骨と直接結合するリン酸カルシウムに着目した。本DDS担体は、がん細胞によって破骨細胞が活性化されると担体自身が溶解して、Bpを放出して破骨細胞の働きを抑制する「細胞応答型DDS担体」である。以下の2つの合成方法を探索した。(1)ナノ結晶の表面吸着による複合化:リン酸八カルシウム(OCP)とハイドロキシアパタイト(HAp)を湿式法で作製し、HEPES緩衝液に浸漬してBpを吸着させた。Bpの吸着等温線はLangmuir型であり、その飽和吸着量は緩衝液のpHが低いほど大きくなった。Bpは表面のカルシウムイオンに結合する。カルシウムイオンはOCPの(h00)面に多く存在するため、[001]方向に生長させたOCPの結晶の飽和吸着量が大きくなった。Bpの担体としてHApよりOCPが優れていることを示した。(2)ナノ結晶中にBpを取り込む複合化:Bpを含む酢酸カルシウム水溶液をリン酸ナトリウム水溶液に滴下攪拌して、Bpをリン酸カルシウム結晶内部に複合化した。Bpの添加量が高くなると、OCP相は第二リン酸カルシウム(DCPD)に変化し、さらに高いBp濃度になるとアモルファスのリン酸カルシウムが析出した。アモルファスリン酸カルシウムは、高濃度(約22wt%)のBpを含有でき、その量は方法(1)の4倍に達した。

本複合体が、リン酸カルシウム形の新型のアモルファス構造をもつこと、およびBpのDDS担体として有望であることを示した。今後、Bpの薬効を長期間・有効に持続させるため、DDS担体の最適形態を制御する。
バイオマス廃棄物を利用したセシウムの吸着・除去剤の開発

市販の柿渋粉末、粉茶、並びに柿渋抽出後の残渣廃棄物、およびバイオディーゼル油抽出後の微細藻類残渣廃棄物を原料としてセシウム(I)イオンに対して選択性を示す吸着剤を開発した。これらはいずれもゼオライトA程ではないが、それに近い吸着容量を発現した。さらにミカン搾汁残渣を原料としたストロンチウム(II)イオンに対して選択性を有する吸着剤も開発した。これらを用いて最初にストロンチウム(II)を吸着・除去し、次にセシウム(I)の吸着・除去を行うプロセスを提案した。セシウム等の放射性物質で汚染された環境の浄化のために、安価で大量に入手可能なバイオマス廃棄物の吸着・除去剤の開発を行った。これらは他の吸着・除去剤と比較すると容易に焼却可能であるため、問題の放射性物質を吸着した後、焼却することにより放射性物質をコンパクトな形で保存・保管することが可能で、除染後の長期保管に適しているという利点を有する。このような観点から市販の柿渋粉末、粉茶、並びに柿渋液抽出後の残渣廃棄物、およびバイオディーゼル油抽出後の微細藻類残渣廃棄物を原料としてセシウムイオに対して選択性を有する吸着剤を開発した。これらはいずれも現在セシウムに対しての吸着剤として汎用されているゼオライトA程ではないが、それに匹敵する程の吸着容量を発現した。さらに当初の研究目標ではなかったが、ストロンチウムの吸着・除去剤としてミカン搾汁残渣を原料とした吸着剤の開発を行った。これら両タイプの吸着剤を用いて、最初にストロンチウムを吸着・除去し、次にセシウムの吸着・除去を行うという除染プロセスを提案した。代表的なポリフェノール化合物である柿タンニンを多く含む柿渋抽出物ならびにカテキンを多く含む茶葉粉末といったバイオマスの原料を濃硫酸を用いて縮合架橋することにより吸着剤を調製した。また油脂を抽出した後の微細藻類廃棄物を用いて同様な操作により別のタイプの吸着剤の調製も行った。いずれの吸着剤においてもセシウムをナトリウムに比べてより選択的に吸着することが明らかとなった。吸着速度は迅速で瞬間的に平衡状態に達した。吸着等温線の評価により、これらの吸着剤は現在実用的に使用されているゼオライトには及ばないものの、それに近い最大吸着量を発現することが明らかとなった。吸着量に対するpHの効果より、いずれの吸着剤においてもセシウムは陽イオン交換反応により吸着されていると推察された。すなわちポリフェノール化合物を含む吸着剤ではフェノール性水酸基の水素原子がセシウムに対して陽イオン交換反応を行うとともに、隣接の水酸基の酸素原子が配位することにより安定な5員環キレートが形成されると推察された。また微細藻類廃棄物の吸着剤では、これを構成するタンパク質の有する硫黄や窒素といった、いわゆるソフトなルイス塩基として働く原子を有する残基を持つアミノ酸がソフトなルイス酸であるセシウムにより選択的に配位することによりセシウムに対して選択的な吸着が起こると推察した。本研究の一部は平成24年5月18日の日刊工業新聞に報道され、いくつかの企業からの問い合わせを受けた。その中の群馬県太田市のヒフミ産業(株)とは共同研究を実施することとなり、平成24年11月16日に同社との共同の特許を出願するに至った。本研究で開発されたバイオマスの吸着剤は吸着容量が現在実用化されているゼオライトに迫るものであり、ナトリウム等の他の競合元素に対しての選択性も大きい。これらは当初の予想をかなり上回るものであった。また廃棄物に近い安価な原料からシンプルな方法により製造できるため低コストであり、実用化も期待できる。これまで接触のあった企業からも高い評価を得ている。今後は先に得られた吸着剤によるバッチ実験の成果に基づき、これらを充填したカラムによるセシウムの連続吸着ならびにナトリウムからの分離の研究を行う。吸着剤の関しては木質や稲藁、麦藁に含まれるリグニンに注目し、これにカテコールやピロガロールの官能基を固定化したリグノカテコールやリグノピロガロールの吸着剤を調製し、セシウムに対しての吸着特性を研究する。またセシウム以外の放射性元素であるストロンチウムにも注目し、ミカンの搾汁残渣やアオサ等の海藻廃棄物によるストロンチウムの吸着についても研究する。平成24年度の研究においてそれなりの成果が得られたので、国内および国外の学会において研究成果を公表する。そのための旅費に本研究費を使用する。実験にはアルバイトの学生を雇用するため、そのための謝金を本研究費より支払う。
欧州統合と対EU戦略の国際比較

本研究から導かれる主要テーゼは、以下の通り。(1)ドイツ・シュレーダー政権の「ヨーロッパ政策」は、国家主権の移譲を憲法条約で規定することを求める「フィッシャー構想」(02年5月)が示すように、欧州統合の進展に極めて積極的である。ドイツは、欧州安保防衛政策の構築に積極的に貢献し、対米依存度の強い従来の欧州安全保障政策の自立性を高めようと努めている。(2)冷戦後のアジア太平洋地域では、EUを柱に共通の安全保障政策をめざす欧州とは異なり、複数の安全保障体系が並存しつつ発展している。現在の日米安保同盟、「有志連合」など危機対応型同盟だけでなく、ASEAN地域フォーラム(ARF)のような国家間の信頼醸成・対話をめざす「多角的協調的安全保障」の枠組みづくり、また北朝鮮を包摂する形での危機管理をめざすOSCE型の安全保障体系づくりも試みられている。これらはASEANとEUの経験を参照しつつ、今なお国民国家の規範力が強いこの地域の特色を反映した安全保障ネットワークを形成している。(3)アフリカには西アフリカ諸国経済共同体(ECOWAS)のようにEC・EUをモデルとした経済・政治統合をめざす動きがあるが、ここでは欧州統合の進展よりも、「市民社会」支援をめざすNGOのグローバルな展開の影響が大きい。第三世界の社会編成を踏まえずにグローバル・レヴェルで構築された規範が、「援助政策」を通して適用される場合、規範が歪められ、現地に混乱を来たすケースが多い。(4)冷戦後の欧州各国では、第二次大戦とナチ・ドイツの暴力支配、コミュニズムの記憶をめぐる議論が、被害者への個人補償問題と連動して活発化しているが、これは東アジアの歴史問題に影響を与えている。EUは反ジェノサイドを標榜する「人権空間」として自己を定義しているが、その観点からの「人道的介入」が新たな犠牲を生むというジレンマを脱し切れていない。本年度は、EUの政策諸分野における対外関係、および域外諸国・地域の対EU関係に関して発行された文献資料を網羅的に収集、コンピュータ・データベースに蓄積・整理して、EUと域外諸国・地域との複雑な関係の全体像をつかむ一方で、そうした関係を理解するための理論枠組の構築を試みた。まず研究代表者の木畑は平成12年6月に「欧州統合と環太平洋地域統合」について、分担者の森井は7月に「欧州統合の新展開と冷戦後東アジアの安全保障」について、石田は9月に「現代欧州の歴史認識と東アジアの行方」について、足立は11月に「EUにおける外国人問題の現状」について、川村は平成13年1月に「ヨーロッパにおける文化交流の方向性」について研究報告をおこなった。また平成12年10月には外務省審議官神余隆博氏を招いて公開シンポジウム「欧州統合と21世紀の東アジア」(駒場キャンパス、参加者約120名)を開催し、木畑「ヨーロッパの中の英国、アジアの中の日本」、山影「ASEANの経験を普遍化できるか」、森井「EU拡大のための深化とドイツの統合モデル」が報告をおこない、麻生は司会を、石田はコメンテーターを務めた。また麻生は平成12年9月にドイツに、木畑は10月にイギリスに、石田は10月に中国に、それぞれ欧州統合の現状分析とアジア諸国の対EU戦略に関する基礎資料を収集し、あわせて各地域のEU研究者との交流を深めるために外国出張をおこなった。また研究遂行に必要なコンピュータを購入するなど、設備面の拡充をはかった。

本年度は、昨年度に引き続き、EUの政策諸分野における対外関係、および域外諸国・地域の対EU関係に関する文献資料をコンピュータ・データベースに蓄積し、EUと域外諸国・地域との複雑な関係の全体像を把握するための分析・理論的考察をすすめた。とくに、EU側と域外側の双方の側面に関する研究を各人の分担領域において展開し、各域外国・地域の対EU戦略の国際比較を行うための基礎的枠組を作成する作業を行った。まず研究代表者の木畑は平成13年6月に「旧植民地地域の対EU関係」について、分担者の森井は7月に「EU共通安保政策」について、石田は9月に「EUの政治文化と歴史認識」について、井関は11月に「東欧諸国のEU加盟問題」について、福永は平成14年1月に「EU内の司法協力」について研究報告をおこなった。また平成13年9月にはドイツ・ヨーロッパ研究室(ドイツ学術交流会寄付講座)とともに、アンソニー・フォースター(英国統合幕僚大学防衛学研究学科研究主任)、ライムント・ザイデルマン(ドイツ・ギーセン大学教授)、上田隆子(国際基督教大学教授)を招いて公開シンポジウム「ヨーロッパの安全保障とニース条約後のEU」(駒場キャンパス、参加者約120名)を開催し、山本が司会を、森井がコメンテーターを務めた。また井関は平成13年8月にドイツに、石田は10月に中国に、森井は平成14年3月にドイツに、それぞれ欧州統合の現状分析とアジア諸国の対EU戦略に関する基礎資料を収集し、あわせて各地域のEU研究者との交流を深めるために外国出張をおこなった。また研究遂行に必要なコンピュータを購入するなど、設備面の拡充をはかった。研究最終年にあたる本年度は、これまでに蓄積してきたEU政策諸分野における対外関係、および域外諸国・地域の対EU関係の文献資料を整理・分析し、EUと域外諸国・地域との変化に富んだ複雑な関係の全体像をつかむと同時に、先の2年間各自の役割分担に則っておこなわれてきた研究の総括に従事した。まず研究代表者の木畑は平成14年5月に「旧植民地地域の対EU関係の変容」について、分担者の森井は6月に「EUとG8-21世紀の国際秩序」について、井関は7月に「EU拡大とナショナリズム」について、石田は10月に「統合ヨーロッパの歴史認識の変容」について、川村は11月に「ドイツとEUの対外文化政策の現状」について、足立は12月に「カリブ地域のヨーロッパ認識」について、福永は平成15年1月に「EU・ドイツの国際司法政策」についてそれぞれ総括的な研究報告をおこなった。また平成15年1月には東京大学ドイツ・ヨーロツパ研究室(ドイツ学術交流会寄付講座)の協力を得て、楊彪(華東師範大学副教授)氏を招いて公開シンポジウム(駒場キャンパス、司会:石田)を催し、東アジアにおける現代ドイツ・EU研究の現状と課題をめぐって議論を交わした。また井関は平成14年8月にドイツに出張し、ベルリン自由大学の専門研究者と「グローバリゼーションとトランスナショナルNGO」について意見を交換した。また森井は平成14年12月に韓国ソウルで開かれた「日韓現代ヨーロッパ研究会」に出席し、冷戦後のヨーロッパ安全保障環境の変容と共通安全保障防衛政策の展開について研究成果を発表した。
圧および化学受容器を介する呼吸・循環の総合活動

1.ヒトにおける血液ガス組成に由来する圧反射への影響について無侵襲的に頸動脈体圧受容器を刺激するネック・カラ-を作製した。低酸素、高炭酸ガス、低酸素+高炭酸ガスの混合気を吸入させながら、種々の陰圧負荷によるNeck suctionを行った。1)圧受容器の刺激効果は、呼息に有効なゲ-ト現象が見られた。2)炭酸ガスは常に圧受容器の刺激効果を抑制するように働いた。3)酸素欠乏と炭酸ガスは圧反射の徐脈に相乗効果を認めらた。4)Neck suctionの効果は、40と60mmHgとの間に飽和状態に達する。2.脳血流に対する血液ガスの変化の影響低酸素刺激の効果が、圧受容器活動において予期したほどの大きさが認められなかった。それで、低酸素により脳循環がどのように変化するかを測定し、上に述べた研究結果と如何に対応するかを検討することとした。脳血流は、無侵襲的に、レ-ザ-・ドプラ-法を用いて、大脳中動脈の血流速度を検出した。血液ガスレべルは(1)肺胞酸素圧200mmHgの高酸素レベル、(2)肺胞炭酸ガスレベルを5mmHg上昇させる高炭酸ガス、(3)肺胞酸素レベルを50mmHgに低下させた低酸素、(4)高炭酸ガスを低酸素の組合わせ。の4種の条件下で、20分間連続的に脳血流を測定した。実験は5人の被験者につき、4つの実験条件の間に30分の休憩を置いて連続実施した。さらに、日を置いて、一連のテストを再度実施した。実験結果は、目下解析中であるが、大凡の傾向として、1)低酸素刺激の効果は脳血流を増加させるが、その時定数は比較的長い。2)炭酸ガスは急速に脳血流を増加させる。3)低酸素と炭酸ガス刺激は脳血流増加に対し相乗作用がある。ことが見出された。3.低酸素時における呼吸・循環に二相性の抑制と脳血流の変化低酸素は、生体の組織の機能を維持する上で重要であるが、とくに中枢神経系は酸素の欠乏に対して弱いとされている。最近、低酸素が10分以上持続する場合、初期の末梢化学受容器の刺激に由来する呼吸、循環系の活動が次第に低下する二相性の抑制が大きな関心を集めている。この機転については、1)低酸素刺激中に、中枢性の呼吸抑制物質、アデノシン、GABA、乳酸などが次第に蓄積する可能性。2)末梢化学受容器の活動が時間と共に順応し、低下する可能性。などが論ぜられている。しかし、いずれも決定的な直接の証明がない。また、動物実験の結果は、必ずしもヒトに対して当てはまらないことが主張されている。われわれは、この二相性の呼吸循環の抑制を脳血流の面から説明できるか否かを検討した。この実験のためには、オックスフォ-ド大学で開発されたコンピュ-タ-制御の迅速、正確な血液ガス調節装置が必要であった。この問題については、昨年行われた共同研究で3名の被験者について予備な検討を行ったが正確な結論を得るに至わなかった。今回の実験では5名の被験者について測定することができ、結果の解析中である。2と3の報告については、共同研究者の支給が年度末となったために、まだ充分な実験デ-タの整理ができていないことを付言する。ことが見出された。3.低酸素時における呼吸・循環に二相性の抑制と脳血流の変化

低酸素は、生体の組織の機能を維持する上で重要であるが、とくに中枢神経系は酸素の欠乏に対して弱いとされている。最近、低酸素が10分以上持続する場合、初期の末梢化学受容器の刺激に由来する呼吸、循環系の活動が次第に低下する二相性の抑制が大きな関心を集めている。この機転については、1)低酸素刺激中に、中枢性の呼吸抑制物質、アデノシン、GABA、乳酸などが次第に蓄積する可能性。2)末梢化学受容器の活動が時間と共に順応し、低下する可能性。などが論ぜられている。しかし、いずれも決定的な直接の証明がない。また、動物実験の結果は、必ずしもヒトに対して当てはまらないことが主張されている。われわれは、この二相性の呼吸循環の抑制を脳血流の面から説明できるか否かを検討した。この実験のためには、オックスフォ-ド大学で開発されたコンピュ-タ-制御の迅速、正確な血液ガス調節装置が必要であった。この問題については、昨年行われた共同研究で3名の被験者について予備な検討を行ったが正確な結論を得るに至わなかった。今回の実験では5名の被験者について測定することができ、結果の解析中である。2と3の報告については、共同研究者の支給が年度末となったために、まだ充分な実験デ-タの整理ができていないことを付言する。
核酸およびタンパクの免疫組織学的・分子生物学的検出法を用いた皮下出血エイジング

本研究は受傷後発現する炎症性サイトカインのmRNAがどのように消長するかを比較・検討し,さらには皮下出血修復過程が多様性を有する原因を考察することを目指したものである。皮下出血モデルとしては従来皮下に自己血を注入するなどの方法が提唱されてきたが,法医学的に問題となる皮下出血の受傷機転,すなわち鈍体の打撲・圧迫とは本質的に異なる。そこでDDY雄性マウスを用い,背部中央の皮膚を剃毛し,中央を吊り上げ2枚のステンレスプレートで皮膚を圧迫する方法により皮下出血を作成した。まず血管修復因子として報告されているサイトカインtissue-type plasminogen activator(t-PA)の発現について検討したところ,皮下出血におけるt-PA mRNA発現量は受傷1時間後をピークとする経時的変動が認められた。皮下出血の発生機序は皮下の血管破綻であり,一般にplasminogen activatorは血管損傷後早期に毛細血管基底膜および細胞外器質を溶解し修復を促進するとされており,これが本検討における受傷後早期のt-PA mRNA発現量増大と関連していると考えられた。一方細胞外器質の一つであり創傷治癒への関与が報告されているfibronectinのmRNAの発現動態を検討したところ,皮下出血後のfibronectin mRNA発現量は損傷作成後後期をピークとする経時的変動が認められた。fibronectinの作用はオプソニン化への関与を含め多彩であるが,皮下出血治癒過程においては主として受傷後後期の組織リモデリングに関与しているものと推定された。またこれまであまり報告されていない,一定侵襲下での皮下出血に伴う炎症性細胞の動態の免疫組織学的検索も行い若干の知見を得た。これらの炎症細胞の動態と,それぞれ挙動の異なる複数のmRNAの発現を併せ検索することにより,データの分散が大きいとされる皮下出血においても比較的正確なエイジングができる可能性が示された。本年度は血管修復因子として報告されているサイトカインtissue-type plasminogen activator(t-PA)の発現を指標として皮下出血エイジングを試みた。そこで本研究では6週齢DDY雄性マウスを用い,背部中央の皮膚を1×1cmの範囲で剃毛し,中央を5mm吊り上げ2枚の2mm厚ステンレスプレートで皮膚を圧迫することにより皮下出血を作成することとした。皮下出血作成後,1,3,8,24,72,144,240時間後にマウスを屠殺し,5×5mm大で試料を採取した。これら皮膚試料について液体窒素を用いて破砕した後,ホモジナイズしRNAを抽出した。cDNAを合成しABI PRISM 7700Sequence Detectorを用いてQuantitative PCRを行いt-PA mRNA発現量を経時的に検討した。なお,内部標準にはGAPDHを用いコントロールは健常皮膚とした。また上記皮膚試料をホルマリン固定後,凍結切片(6μm厚)を作成しin situ hybridization法を用いてt-PA mRNA発現分布の変化について検討した。その結果皮下出血におけるt-PA mRNA発現量は受傷1時間後をピークとし,経時的変動が認められ,t-PA mRNAは皮下出血のエイジングに有用な因子の一つと考えられた。

また皮下出血の発生機序は皮下の血管破綻であり,また一般にplasminogen activatorは血管損傷後早期に毛細血管基底膜および細胞外器質を溶解し修復を促進するとされており,本検討における受傷後早期のt-PA mRNA発現量の増大との関連が示唆された。昨年度に引き続き,マウス皮下出血モデルを用いてサイトカイン発現を指標とする皮下出血エイジングの可能性について検討を行った。皮下出血モデルは法医学的に問題となる皮下出血の受傷機転,すなわち鈍体の打撲・圧迫に即し,組織に対する侵襲を一定とすることが可能という観点からステンレスプレートを用いて皮膚を圧迫する方法を採用した。本年度は重要な細胞外器質の一つであり創傷治癒への関与が報告されているfibronectinのmRNAの発現動態をQuantitative PCP法を用いて検討し,あわせてこれまであまり報告されていない一定侵襲下での皮下出血に伴う炎症細胞浸潤動態の免疫組織学的検索を行った。その結果,好中球は受傷1時間後には見出すことができ,8時間後までは皮下および真皮下層にとどまるものの,以後全層性に浸潤し72時間後に強い浸潤を見た。マクロファージは受傷3時間後に検出され,24時間後までは皮下および真皮下層にとどまるものの,以後全層性に浸潤した。リンパ球は144240時間後に検出された。炎症細胞は受傷後,出血部位を中心とした皮下組織・真皮下層への浸潤のみならず,皮膚全層に広がる傾向を示し,受傷後経過時間との関連について再現性のあるデータが得られた。一方皮下出血後のfibronectin mRNA発現量は損傷作成後後期をピークとして経時的に変動していた。fibronectinの作用はオプソニン化への関与を含め多彩であるが,皮下出血治癒過程においては主として受傷後後期の組織リモデリングに関与しているものと推定された。
神経系一酸化窒素合成酵素の活性調節の分子機構とその中枢性自律神経制御における役割

本研究は、ラットを用いて神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の中枢神経系における活性調節の機構を解明するとともに、中枢性の自律神経調節におけるnNOSの生理的意義を明らかにすることを目的とする。そこで、nNOSと相互作用する蛋白質を検索することによりnNOSの活性調節および役割の解明を試みた。即ち、nNOSのPDZドメインをGST融合蛋白質として大腸菌に発現させ、これを用いてnNOSアフィニティーカラムを作製し、nNOSと結合するタンパク質を牛脳から精製した。その結果、nNOSと結合する58KDaの蛋白質を見いだし、この分子をマイクロシーケンシング法により解析したところα1-syntrophinと判明した。nNOSとα1-syntrophinが骨格筋において結合していることは、すでに報告されていたが、中枢神経系での両蛋白質の結合は不明であった。そこで、脳における両蛋白質の相互作用について検討した。まず、α1-syntrophinの抗体を作製し、免疫細胞染色を行ったところ、培養脳神経細胞でnNOSとα1-syntrophinが共存していることが認められた。免疫組織化学染色では、視床下部PVH、および視交叉上核(SCN)など、nNOSが発現しているニューロンにα1-syntrophinの顕著なシグナルが検出された。さらに、共焦点顕微鏡を用いた実験で、nNOSとα1-syntrophin両蛋白質が、PVHやSCNの細胞の一部で共存していることが観察された。以上の結果は、nNOSが視床下部の機能において重要であること、また視床下部においてnNOSがα1-syntrophinと結合していることを示唆する。本研究は、神経型一酸化窒素合成酵素(NOS)の中枢神経系における活性調節の機構を解明するとともに、中枢性の自律神経調節におけるNOSの生理的意義を明らかにすることを目的とする。そのために、まず、flavin adeninedinucleotide (FAD)によるNOSの活性化の作用機序の解析を試みた。ラット脳のシナプス細胞膜画分を界面活性剤で可溶化後、FADagarose affinity chromatographyによって、FADと相互作用する蛋白質を精製し、溶出される蛋白質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、部分アミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列をホモロジー検索したところ、この蛋白質はグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)であることが判明した。GPDは細胞質に局在するので、細胞外からのFADと相互作用する可能性が考えられなかった。他にもこの方法でFADと相互作用する蛋白質が認められたが、やはり細胞質に局在する物質であった。細胞質とシナプス膜画分を完全に分離できないため、この方法ではFADと相互作用する物質に細胞質中のFADを補酵素とする酵素がたくさんとれてきてしまうと考えられた。そこで次に、神経型NOSと相互作用する蛋白質を検索することによりNOSの活性調節及び役割の解明を試みた。まず、yeast two-hybrid法によってNOSのN末端部分のPDZ domainと相互作用する蛋白質を検索した。いくつかのポジテイブクローンが得られており、現在、NOSとの相互作用を検討中である。さらに、GST-NOS融合蛋白質を大腸菌に産生させてカラムを作製し、牛脳の細胞膜画分からNOSと結合する蛋白質を精製し、部分アミノ酸配列を決定した。最近、抗体が作成できたので今後NOSとの相互作用、及び細胞内、組織内分布に関して詳細な検討を行なう予定である。
ベシクルを用いた超並列サスペンジョン型反応場の構築

本研究では、ベシクルなどの微小小胞を反応場として捉え、サスペンジョン中の微小小胞内部の閉鎖空間において、酵素反応などの生化学反応を超並列的に進めることのできる反応場の構築を行った。昨年度はwater-in-oil-water(W/O/W)液滴の崩壊を利用し、アルギン酸とポリエチレンイミンのポリイオンコンプレックス(PIC)膜により構成されるマイクロカプセルの作製を行った。カプセルを反応場として用いるには、酵素などの高分子は小胞内部に保持され、基質などの低分子は小胞外から内部へ供給されるように物質透過性を制御する必要がある。本年度はまず、カプセルへの物質内包化、及びカプセルを構成するPIC膜の物質透過性の評価を行った。その結果、カプセル内へ固体粒子などを均一に内包化できた。また、カプセルのPIC膜は、低分子は透過する一方で、固体粒子や分子量一万以上の高分子はカプセル内に保持される、分子量に応じた選択的物質透過性を有することが分かった。次に、こうして作製した半透性マイクロカプセルを反応場とし、超並列サスペンジョン型反応場としての実証実験を行った。モデル系として無細胞タンパク質合成系を用い、カプセル内へのマイクロコンパートメント化を試みた。テンプレートDNAおよび無細胞タンパク質合成に関与する酵素等を半透性マイクロカプセル内へ分注し、半透膜を通じて核酸やアミノ酸などの基質分子の供給を行った。その結果、カプセル内において活性を有するタンパク質が合成された。テンプレートDNAを限界希釈することで、各々のカプセルにおいて、独立かつ並列的にタンパク質合成を行うこともできた。本研究の成果により、反応器の超並列的な操作が可能なサスペンジョン型反応システムの実現に関して重要な知見が得られた。本研究では、両親媒性分子の二分子膜からなる閉鎖小胞体であるベシクルを反応場として捉え、サスペンジョン中のベシクル内部の閉鎖空間において、酵素反応などの生体反応を超並列的に進めることのできる反応場の構築を目指す。本年度は(1)反応場となる微小小胞の調製技術の確立、(2)微小小胞に対し、異なる物質を分注する技術の開発を行った。(1)に関して、反応場としては当初ベシクルを検討する予定であったが、強度の観点からより操作性の良いアルギン酸(Alg)のマイクロカプセルを検討した。まず、マイクロ流体デバイスを用いてW/O/W液滴の調製する方法を開発した。これにより、液滴径を均一に制御し、内水相に対し極めて高効率に物質を内包化することができた。個々の液滴に対して粒子を内包化し、その内包数を確率論的に制御することも可能であり、(2)の実現の見通しもたった。次に、マイクロ流体デバイスにより調製されたW/O/W液滴を基材として用い、アルギン酸カルシウムのマイクロビーズを作製する方法の確立を試みた。内水相にアルギン酸ナトリウム、外水相に塩化カルシウムを添加してW/O/W液滴を調製し、内外の水相間に浸透圧差を発生させて液滴を崩壊させることで、粒径、形状の均一なアルギン酸カルシウムのマイクロビーズを作製することができた。得られたアルギン酸カルシウムのマイクロビーズの表面をカチオン性ポリマー(ポリエチレンイミン、PEI)でコーティングすることで、ポリイオンコンプレックスで構成されるAlg/PEIマイクロカプセルを作製することができた。検討項目2:硝化細菌群が優占化した生物膜でのN2O発生調査小型の密閉型散水ろ床リアクタ-を4台用いて,高酸素濃度(NO2無添加,高酸素濃度/NO2添加,低酸素濃度/NO2無添加および1邸菱素濃度/NO2添加の4系タ嘘の同時運転を行い,N2O生成量を調査した。本実験は,下水処理場の活性汚泥を十分に希釈したものを植種して,硝化反応が確認された後(運転開始20日程度)すぐに行った。また,-回目の運転条件変更後通常運転を挟んで,二回目の運転条件の変更を行った(-回目と二回目では,各リアクターとも運転条件が異なる)。得られた結果は-,二回目とも同じ傾向であり,低酸素濃度/NO2そ添加条件においてN2O生成率が最も高く,平均でも除去されたNH4+の二割以上がN2Oとして放出されたことが示された。前年度の結果(運転200日以上の成熟した生物膜)でも,低酸素濃度γNO2添加条件でのN2O生成率が最も高かったが,その値は5%程度であった。これらの結果を比較より,未熟な生物膜より成熟した生物膜の方が,N2O発生量を抑制できることが示唆された。