hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
漁業と海獣類の共存に向けた生態系解析と順応的管理のマニュアル化に関する研究

このような漁業との競合は,北海道沿岸においてゼニガタアザラシだけでなく,キタオットセイについても懸念されているが,30年以上研究が継続されているゼニガタアザラシと比較して,キタオットセイでは基礎的知見の蓄積が不足していることが昨年度の情報交換会で明確なものとなった.そこで本年度は,キタオットセイに関して,これまでわかっていること,今後明らかにする必要があることについて,漁業者や行政,研究者が一同に介して勉強会を開催し,そこで課題の共有をすることができた.これまで北海道沿岸では明らかになっていなかったゼニガタアザラシの性別,成熟段階,季節による食性の違いを明らかにした.また,国内外での学会での発表も多数行っているほか,論文も発表したことから、当初の予定通り、順調に研究が進んでいると判断した.沿岸漁業において,近年課題となっている海獣類と漁業との共存を実現するためには,被害を軽減しつつ,順応的管理を進めていく必要がある.本研究では,漁業と海獣類の共存に向けた生態系解析を行うことにより,順応的管理のマニュアル化につなげることを目的とし,ゼニガタアザラシ,及びキタオットセイを主な対象種として研究を行った.今年度は,襟裳岬において捕獲・混獲されたゼニガタアザラシの腸内容物のDNA分析から明らかにした性別,成熟段階,季節ごとの食性について,投稿に向けて論文にまとめた.また,松前において捕獲,混獲されたキタオットセイからも腸内容物を採取し,ミトコンドリアCOI領域における次世代シークエンシングを行った.この結果、18種類の魚類と8種類の頭足類が検出され、中でもホッケとスルメイカは全ての年で出現したことが明らかとなった.これらの魚種は漁獲対象種であること,また近年,漁獲量が減少していることから,資源の減少とキタオットセイによる捕食が重なることによって,漁業への影響が強くなっていることが考えられた.さらにキタオットセイがどこから来遊しているのかを明らかにするため,ヒゲ中の放射性炭素同位体(炭素14)分析を行った.その結果,ヒゲの最も根元の部位の炭素14は,日本海側で捕獲した個体が,太平洋側で捕獲した個体に比べて高い値を示し,直近の利用海域である捕獲海域の炭素14が反映されていることが示唆された.また,ヒゲを根元から先端まで3mmずつ切断して分析し,時系列での変化を見た結果,親潮系海流と黒潮系海流の値の間を変動していたことが明らかとなった.また,知床や根室でも漁協や漁業者に聞き取りを行った結果,海獣類と漁業との競合は各地で問題視されているが,地域によって競合が懸念されている種は異なっていることが明らかとなった.概ね順調ではあったが,実験装置の不具合により分析が進まず,論文の取りまとめ及び投稿が遅れたため.今後は,食性の季節変化を明らかにする.また陸棲哺乳類による農業被害の対策などと比較することで,順応的管理手法について,マニュアル化を進めていく.海獣類について,明らかになっていること,またその課題について,漁業者にもわかるような資料を作成し,発信する.また,陸棲哺乳類による農業被害の対策などと比較することで,順応的管理手法について,マニュアル化を進めていく.いずれの海獣類においても,全ての個体を排除することは困難であり,共存していくことが必要となっている.カワウによる漁業被害では,ゾーニングによる管理が行われていることから,海獣類による漁業被害防止対策においても,管理の考え方についてまとめ,オンラインで公開していく.また,論文を投稿していく.旅費について,会合を札幌で行うことにより,安い航空券を購入できたり,旅費が不要だったりしたため分析機器の調子などで分析が進まず,投稿論文のまとめが遅れたため.次年度は,英文校閲費や投稿料,成果報告のホームページ制作などに使用する.現地での調査旅費に使用する.
Ｎａｖｉｅｒ－Ｓｔｏｋｅｓ方程式の自由境界問題の解のダイナミクスの数学解析

本研究では流体内部の影響で境界が変化する自由境界問題の解の安定性解析を行うことを目的としている。本年度は斜面を流れる非圧縮粘性流体に対する定常解の線形安定性の解析を行った。斜面を流れる非圧縮粘性流体の自由境界問題はBenneyにより底面及び水面が平らな場合に得られるNavier-Stokes方程式の定常解(Nusselt解)からの摂動として定式化されている。この方程式系は適切な変換や近似によりOrr-Sommerfeld方程式や倉本-Sivashinsky方程式、KdV-Burgers方程式やBenney方程式等の数多くの方程式が導出されることが知られている。この為、Navier-Stokes方程式の自由境界問題としての安定性を考察することは他の方程式系に対する意味付けとしても大変重要な課題となっている。井口達雄教授と上野大樹博士との共同研究により、Nusselt解周りで定式化されたNavier-Stokes方程式の自由境界問題の線形化解析を行い、波数分解法により高周波パートと低周波パートに関してスペクトル解析の結果を得た。関連した方程式系において斜面の角度が十分小さい時、臨界Reynolds数が角度に依存しない値として導出されることが知られており、中間層に関しては臨界Reynolds数を考慮に入れた解析を行う必要があり、現在研究を進めている段階であるが、現在まではおおむね順調に進展していると言える。今後は線形化解析において残った箇所のスペクトル解析を行う。関連した方程式系の臨界Reynolds数との関連性を調査すると共に本問題における臨界Reynolds数を同定し、その臨界Reynolds数以下におけるスペクトル解析を行う。さらに線形化解析の結果を得ることができ次第、その結果を基に非線形解析を行う。また、上記の問題は非圧縮Navier-Stokes方程式に関してさかんに研究が行われているのに対して圧縮性Navier-Stokes方程式に対しては結果はまだ少ない。本研究で得られた知見を基に問題を圧縮性粘性流体への問題に拡張することも目指す。
アレルギー性脳炎誘起性エフェクターT細胞のクローニングと治療法の開発

1.実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)の抗原としては従来ミエリン塩基性蛋白(MBP)が良く知られていた。本研究は中枢神経ミエリンのもう1つの主要蛋白であるプロテオリピッドアポ蛋白(PLP)がEAEの抗原となること、それはT細胞によってひきおこされること、MBPによってひきおこされるEAEよりヒトの多発性硬化症に近いことを示した。特にPLPの一成分であるDM-20がマウスに広汎な脱髄を伴う慢性再発性EAEをひきおこすことの発見及びPLPに特異的に反応する脳炎誘起性T細胞ラインの樹立はオリジナリティーの高い研究成果である。」2.MBPに特異的に反応するT細胞ライン,クローンを樹立し、EAEの発症機序を細胞レベルで明らかにした。即ち脳炎誘起性T細胞は他のT細胞の関与なく単一クローンで十分病気をひきおこし得ること、そのT細胞はヘルパーT細胞の表面マーカーを有すること、Ia遺伝子産物に拘束されること、特異抗原やレクチンのみでなくアロ抗原によっても活性化されることを示した。これは自己免疫疾患の発症機序を考える上に重要な示唆を与えた。3.ラットが急性EAEから回復すること及び回復後耐性を獲得する事実は良く知られている。その機序を解明することは治療法の開発に重要な示唆を与える。本研究は耐性獲得機序には抗原決定基特異的なものと非特異的なものがあること、エフェクターT細胞の分化が抑制されていることを明らかにした。また一旦活性化されたエフェクターT細胞は持続的抗原刺激があっても不活化されること、それは1つには細胞の分化増殖サイクルに関連したものであり、1つは病巣環境因子に起因すると考えられた。抗クロノタイプ抗体による特異的治療については現在研究が進行中である。
ポリフェノール抱合体の活性発現機構の分子基盤となる標的細胞との相互作用解析

本研究では、代表的な食品由来ポリフェノールであるケルセチンの機能性発現メカニズム解明と標的分子同定を目標に研究を進めた。ケルセチンの主要代謝物であるケルセチングルクロン酸抱合体(Q3GA)と硫酸抱合体(Q3'S)はそれぞれマクロファージ細胞において抗炎症活性を示した。ケルセチンおよびQ3GAをそれぞれ誘導化し、標的分子探索のためのプローブの合成を完了した。また、タンパク質へ非共有結合したケルセチン誘導体を架橋剤によって固定化する条件を決定した。一方で、ヒトにおけるケルセチン代謝物のLC-MS/MSによる検出系を確立し、食事摂取方法による代謝パターンの変動についての解析がが可能となった。本年度は食品中の主要なポリフェノールであるケルセチンに着目して検討を行なった。ヒトにおいて経口摂取したケルセチンは、吸収される過程でquercetin-3'-sulfate(Q3'S)やquercetin-3-glucuronide(Q3GA)などの抱合体へと変換され、血中を多くても数μMの濃度で循環する。そこで、ヒト血中濃度レベルのケルセチンおよびケルセチン抱合体が抗炎症作用を示す可能性について検討を行った。Q3'Sは、ケルセチンとスルファミン酸との反応により調製した。Q3GAは、ハスの葉エキスより単離・精製を行うことで調製した。マウスマクロファージ様細胞株J774.1に対して、LPS処理による炎症誘導を行い、24時間後に培地中のNO量をGriess法によって評価した。ケルセチンおよび抱合体は、LPSとの同時処理に加え、LPS処理の一定時間前あるいは一定時間後に処理する方法を実施した。その結果、2 μMのケルセチンおよび抱合体は、LPSとの同時処理においてはNO産生を全く抑制しなかった。しかし、LPS処理の28時間前あるいは48時間後に処理したところ、いずれの場合においても2 μMでNO産生を有意に抑制した。また、LPS処理によって分泌されたサイトカイン類を含む培地とともにケルセチンあるいは抱合体を処理したところ、やはりNO産生に対する顕著な抑制効果が認められた。以上の結果より、ヒト血中濃度レベルのケルセチンおよび抱合体は特定の時間帯で働くシグナル経路に作用し、抗炎症作用を示す可能性が示唆された。NO産生につながるシグナル伝達経路におけるケルセチンおよび抱合体の標的分子の探索が今後の課題である。また、ケルセチンの標的タンパク質を探索するためのプローブ合成に着手し、アビジン-ビオチン反応およびクリック反応に応用可能なケルセチンプローブの合成方法を確立した。本課題2年目の平成27年度では、フラボノイドであるケルセチンおよびその抱合体(グルクロン酸抱合体と硫酸抱合体)の標的分子探索へ向けた検討を行った。具体的には1.標的分子探索のためのケルセチン及び抱合体の化学プローブ合成、および2.合成した化学プローブを用いた標的分子探索へ向けた検討、である。1.標的分子探索のためのケルセチン及び抱合体プローブ合成:ケルセチンについては無水酢酸/ピリジン系により水酸基をすべてアセチル化により保護したのち、既報を参考にイミダゾールを用いた7位選択的な脱アセチル化を行った。その後、7位に三重結合を有するハロゲン化物を結合させたアルキン化ケルセチンを合成した。一方、グルクロン酸抱合体であるQ3GAのカルボキシル基を利用し、ここに三重結合を有するアミンであるプロパルギルアミンを縮合させ、アルキン化Q3GAを合成した。調製したアルキン化ケルセチンおよびアルキン化Q3GAはもとのケルセチン、Q3GAと同様の抗炎症活性を有することを確認したことから、これらの標的分子探索に有用であることが示唆された。2.合成した化学プローブを用いた標的分子探索へ向けた検討:ケルセチンおよび関連化合物のタンパク質への結合は共有結合ではなく一般的には水素結合や疎水結合によるものと考えられており、細胞からのタンパク抽出の過程で結合が外れることが懸念される。そこで、ケルセチンあるいは抱合体のマクロファージ細胞への投与後に、架橋試薬による固定化を試みることにした。その結果、アルキン化Q3GAはタンパク質に固定されることが確認されたが、アルキン化ケルセチンではタンパク質への固定が認められなかった。よって、アルキン化Q3GAは細胞への投与を介した標的分子探索への応用が可能であることが示唆された。平成27年度中において、食事由来の主要なポリフェノールの一種であるケルセチン及びその抱合体の標的分子探索のための化学プローブを合成することに成功した。ケルセチンおよびその抱合体の抗炎症活性発現機構に関わる標的分子を探索することが、本課題の中心的な達成目標であるため、最終年度である平成28年度中に本プローブを用いて標的分子の探索を進めることが十分可能であるため、概ね順調と判断した。【背景と目的】ケルセチンは日常的に摂取される代表的な食品フラボノイドであり、経口摂取するとQuercetin 3'-O-sulfate (Q3'S)やQuercetin 3-O-glucuronide (Q3GA)などの抱合体に代謝され体内を循環する。これまでに、グルクロン酸抱合体であるQ3GAは、マクロファージを標的として集積し、かつマクロファージが有する脱抱合活性によりアグリコンへ変換され抗炎症作用を発揮することが示唆されている。一方、硫酸抱合体であるQ3'Sにおいてはこのような作用は確認されていない。よって、グルクロン酸抱合体からの脱抱合がケルセチンの機能性発現に重要と示唆されている。

しかし、Q3GAや脱抱合後のケルセチンアグリコンの標的タンパク質は明らかにされておらず、詳細な作用メカニズムが不明である。そこで本研究では、クリック反応を用いた標的タンパク質の探索のために、Q3GA及びケルセチンにアルキンを導入した化学プローブの合成を試みた。一方、LC-MS/MSによる血中ケルセチン代謝物検出方法を確立し、ヒトにおけるケルセチン代謝パターンについて詳細な解析を試みた。【方法と結果】ケルセチンのB環をジフェニル化により保護した後、4-ブロモ-1-ブチンを用いて3位の水酸基にアルキンを導入した。酸加水分解によって保護基を外すことで最終生成物を得た。また、Q3GAとプロパルギルアミンとの縮合反応からアルキン化Q3GAを調製した。これらの生成はLC-TOF-MSにより確認した。これらのアルキン化物は元化合物と同程度の抗炎症活性を示したことから、モデルプローブとして利用可能であると考えられた。また、Q3GAおよびQ3'SのLC-MS/MS分析条件を確立し、ケルセチンを摂取したヒト及びマウスの血漿中より、これらケルセチン代謝物の検出が可能となった。本研究では、代表的な食品由来ポリフェノールであるケルセチンの機能性発現メカニズム解明と標的分子同定を目標に研究を進めた。ケルセチンの主要代謝物であるケルセチングルクロン酸抱合体(Q3GA)と硫酸抱合体(Q3'S)はそれぞれマクロファージ細胞において抗炎症活性を示した。ケルセチンおよびQ3GAをそれぞれ誘導化し、標的分子探索のためのプローブの合成を完了した。また、タンパク質へ非共有結合したケルセチン誘導体を架橋剤によって固定化する条件を決定した。一方で、ヒトにおけるケルセチン代謝物のLC-MS/MSによる検出系を確立し、食事摂取方法による代謝パターンの変動についての解析がが可能となった。本課題はポリフェノールの機能性発現機構における標的分子の探索を主な目的としており、本年度はヒト血中濃度レベルの低濃度領域において、ケルセチンやその抱合体がマクロファージにおいて抗炎症作用を発揮するために必要な実験条件を明らかにすることができた。また、次年度においてケルセチンの標的分子を探索するためのプローブ合成方法も確立することができた。以上より、本課題は当初の予定通り順調に進展していると評価する。平成27年度中に合成に成功した化学プローブのうち、ケルセチンを出発物質として合成したアルキン化ケルセチンを用いて標的タンパク質探索へ向けた予備検討を実施したところ、標的分子回収の際に必要な実験処理となるタンパク質への架橋に十分な反応性を有していなかったことから、本プローブは標的分子探索に適さないことが分かった。このような課題に対応する方策として、平成28年度では、合成したプローブを活用できる他の標的分子回収方法を検討する一方で、他の誘導法によるケルセチンプローブの再合成を試みることにより、培養細胞からケルセチン標的タンパク質を最も安定に単離出来るような方法論の確立を進める予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。食品機能学本研究課題をさらに推進するためには、ポリフェノール類の作用標的分子の探索が不可欠である。
腎癌を対象としたインターフェロン併用樹状細胞療法の臨床応用に関する研究

腎摘除術を施行された転移性腎細胞癌患者を対象とし、腎摘除時に採取した自己腫瘍組織を免疫源として樹状細胞(DC)ワクチンを作成し、IFNαあるいはスニチニブと併用投与する臨床試験を実施した。研究期間中に5例を組み入れた。DCワクチンの平均投与回数は10.6回で、全例DCワクチンの投与に伴う重篤な合併症はなく、安全に投与可能であった。本科研費の執行以前から開始していた患者を含めた8例について、スニチニブおよびワクチン投与前後での免疫応答の変化を解析した。DCワクチンとスニチニブの併用投与によって抑制的な免疫細胞が減少し、免疫学的な抗腫瘍効果が増強される可能性が示唆された。【研究の進捗状況】転移性腎細胞癌患者を対象として、第II相試験を東京大学倫理委員会承認のもと開始した。15例を上限としているが、2013年度終了時点で2名(50代男性、70代女性)を登録し、治療を行った。それぞれ12回、6回のDCワクチンの投与を行ったが、重篤な合併症を来すことなく投与可能であった。免疫学的反応を評価するための試料は採取済みであるが、アッセイは症例の集積が進んでから行う予定である。【研究の意義】転移性腎細胞癌の治療として実績のあるIFNαとDCワクチン治療を併用することによって、分子標的薬のような副作用を避けつつより強い免疫応答を惹起させ、予後の延長や生活の質(QOL)を改善するものと期待する。今回の臨床研究でその安全性と有効性を評価し、臨床応用への可能性を検討することは、従来の治療方法では十分な治療効果を享受することができなかった腎癌患者に対する治療戦略上の有用な選択肢を追加することに繋がり、臨床上の重要な意義をもつものと考えられる。【次年度の目標】東京大学医学部附属病院に加え、三井記念病院で手術を行った症例の登録も可能になったため、2014年度中に十分な症例を集積することを目標とする。【研究の概要】腎摘除術を施行された転移性腎細胞癌患者を対象とし、腎摘除時に採取した自己腫瘍組織を免疫源として樹状細胞(DC)ワクチンを作成し、IFNαと併用投与する臨床試験を計画し、実施した。転移性腎細胞癌の標準治療が分子標的薬に移行したことを受けて、平成26年7月からはDCワクチンとの併用薬を限定しない治療プロトコールに変更して試験を実施した。【研究実績】平成25年度に2例、26年度に1例、27年度に2例を組み入れた。本科研費の執行以前から開始していた患者を含めた8例について、sunitinibおよびワクチン投与前後での免疫応答の変化を解析した。DCワクチンとsunitinibの併用投与によって抑制的な免疫細胞が減少し、免疫学的な抗腫瘍効果が増強される可能性が示唆された。この結果は平成26年のSociety of Immunotherapy of Cancerの年次学術集会で発表し、J. Immunother Cancerに論文報告した。【研究の意義】DCワクチンが安全に投与可能であることを示すとともに、分子標的薬との併用投与によって治療効果が増強される可能性が示唆されるものであった。転移性腎細胞癌の治療はIFNから分子標的薬にシフトしたが、免疫学的機序を利用した治療法の併用が有用である可能性を示す結果は重要なものであると考えられた。がん免疫治療15例を登録を目標としているが、2013年度終了時点で登録された患者は2例であり、3年間で十分な症例を集積して免疫応答の評価を行うためには迅速な症例のエントリーが必要と考えられるため。これまで東京大学医学部附属病院で手術を受けた患者のみ登録可能であったが、関連施設(三井記念病院)で手術を施行した患者も登録できるようにした。主施設である東京大学医学部附属病院、協力施設である三井記念病院の倫理委員会審査を終了し、症例登録が可能になっている。また、使用するIFNを1種類に限定していたが、2014年度中に販売中止になることが判明したため、他のIFN製剤も使用可能なようにプロトコールを変更する予定である。
簡易型「キャピラリー電気泳動-化学発光検出」装置の開発と遺伝子診断への応用

キャピラリー電気泳動-化学発光検出法における簡易小型化学発光検出セルを新しく考案・試作し、その性能を評価した。実験は、過シュウ酸エステル系発光試薬を用いて、ダンシルアミノ酸をモデル試料に選んだ。ガラス管を用いたバッチ型検出セルにおいて、ガラス管内の発光試薬量、キャピラリーからの泳動緩衝溶液の流入量などがエレクトロフェログラムに与える影響を詳しく調べた。600μlの発光試薬を含む3.8mm内径のガラス管を検出セルに用いた場合、ダンシルトリプトファンを3.3x10^<-8>1x10^<-5>Mの定量濃度範囲で分析できた。また、テフロンチューブを検出セルに用いたフロー型の化学発光検出器においては、コンパクトな遮光検出部を開発し、装置の小型化を検討した。フロー型であるため連続分析が可能であり、迅速、簡便、かつ再現性のよい分離・検出ができた。このフロー型の化学発光検出器を用いて、ミセル動電クロマトグラフィーの分離モードでダンシルアミノ酸混合試料を分離・検出した。さらに、本研究では、ポリマー溶液を用いたキャピラリーゲル電気泳動法と化学発光検出器を組み合わせた新しい分析技術を開発し、生体高分子の分離・検出について報告した。モデル生体高分子試料として蛍光標識タンパク質および蛍光標識DNAを分析した。リゾチーム、チトクロームC、およびリポヌクレアーゼAの蛍光標識タンパク質混合試料がポリマー溶液を用いたキャピラリーゲル電気泳動によって分離された。また、60から1000塩基対の蛍光標識DNAフラグメントを分離・検出した。簡易型「キャピラリー電気泳動-化学発光検出」装置をバッチ型検出セルおよびフロー型検出セルにおいて検討し,遺伝子診断の基礎的検討として,DNAフラグメントを分析できる可能性を示した。ダンシルアミノ酸の定量濃度範囲は1x10^<-7>1x10^<-5>Mであった。蛍光標識DNAを分析するにあたり、蛍光標識アデニンを吸光、蛍光、および化学発光検出で調べてS/N(シグナル/ノイズ比)での感度の比較を行なった。S/Nは、それぞれ4.0、38、および130であり、化学発光検出の高感度特性が示された。さらに、60から1000塩基対のDNAフラグメントを分離・検出した。簡易型「キャピラリー電気泳動-化学発光検出」装置をバッチ型検出セルおよびフロー型検出セルにおいて検討し,上記の研究成果を得ることができた。また,遺伝子診断の基礎的検討として,DNAフラグメントを分離・検出できる可能性を示した。キャピラリー電気泳動-化学発光検出法は高い分離能と優れた検出感度を有する新しい分離・検出法として注目されている。

キャピラリー電気泳動-化学発光検出法の開発においては、電気泳動部と検出器との接続方法、すなわち、化学発光検出セルの設計が重要な研究課題となっている。本研究では、キャピラリー電気泳動-化学発光検出法における簡易小型化学発光検出セルを新しく考案・試作し、その性能を評価した。ガラス管を用いたバッチ型検出セルにおいて、ダンシルトリプトファンを3.3x10^<-8>1x10^<-5>Mの定量濃度範囲で分析できた。また、テフロンチューブを検出セルに用いたフロー型の化学発光検出器においては、ミセル動電クロマトグラフィーの分離モードでダンシルアミノ酸混合試料を分離・検出した。さらに、本研究では、ポリマー溶液を用いたキャピラリーゲル電気泳動法と化学発光検出器を組み合わせた新しい分析技術を開発し、生体高分子の分離・検出について報告した。モデル生体高分子試料として蛍光標識タンパク質および蛍光標識DNAを分析した。リゾチーム、チトクロームC、およびリボヌクレアーゼAの蛍光標識タンパク質混合試料を分析した。オープンキャピラリーでは分離することができなかった3成分がポリマー溶液を用いたキャピラリーゲル電気泳動によって分離できた。蛍光標識DNAを分析するにあたり、蛍光標識アデニンを吸光、蛍光、および化学発光検出で調べてS/N(シグナル/ノイズ比)での感度の比較を行なった。S/Nは、それぞれ4.0、38、および130であり、化学発光検出の高感度特性が示された。さらに、60から100塩基対のDNAフラグメントを分離・検出できる可能性が示された。
心血管系細胞内Caイオン代謝蛋白の細胞工学的および遺伝子工学的解析とその臨床応用:特にその発現機構の解析

研究助成を頂き、当初の研究予定を80%程度達成することができた。関係各位に深謝するとともに、以下その成果を箇条書で記載する。1.血管平滑筋細胞内Caイオン(〔Ca^<2+>〕)_1)動態を2次元画像として解析する機器を独自に開発して研究に供した。この結果血管平滑筋は〔Ca^<2+>〕_1の調節系は決して単一でなく、細胞の増殖過程に依存して電位依存性Caチャンネル、IP_3作動性CaチャンネルとCa^<2+>/カフェイン/リオニジン作動性Caチャンネルは独立に機能発現する事が示された。2.血管内皮細胞と平滑筋細胞の共存培養させ、両者の〔Ca^<2+>〕_1動態を同時観測することに世界で初めて成功した。内皮細胞の刺激物質としてATPを用いた時、単独培養下では内皮細胞も平滑筋細胞も〔Ca^<2+>〕_1は一過性に上昇したが、両者の共存培養では上記の内皮細胞の反応に約5秒ほど遅れて、隣接する血管平滑筋細胞の〔Ca^<2+>〕_1が一過性に減少した。これらの反応にはdown-regulationやtachyphylaxisは認められなかった。共存培養の時に認められた平滑筋細胞内の〔Ca^<2+>〕_1の低下はATP刺激により内皮細胞からEDRFが生産され、隣接する血管平滑筋に作用する結果である事を各種EDRF遮断物質を用いて証明した。2.脂質の中で最も動脈硬化を来す作用の強いlysophosphatidylcholineは上記EDRFの作用を抑制し、ATPによる血管平滑筋細胞の〔Ca^<2+>〕_1低下作用を減弱させ、その拡張機能を妨げる事を示した。この結果は動脈硬化発生の機序に重要な一石を投じる物と自負している。3.ET_A,ET_B受容体がエンドセリン-1と-2を認識する部位を分子生物学的にキメラ遺伝子を設計し、COS細胞にtransfectionして検討して各エンドセリンの結合と〔Ca^<2+>〕_1測定実験から、受容体のIとIV,V,VI,VIIの膜貫通部分が認識部位である事を証明した。4.臨床研究として冠攣縮性狭心症の発症にはエンドセリンの血中濃度が高い事と、これに他の要因が加わる事が必要である事を提唱した。以上の諸結果は3年間で19編の英文原著論文にまとめられ(裏面の発表論文一覧を参照)、更に2編投稿準備中である。今後はこれらin vitro中心の結果をin vivoの研究に発展させ、動脈硬化の病態解明と治療に応用する予定である。1)血管手滑筋細胞内Ca^<2+>反応の非均質性:筆者らは大動脈から分離した血管平滑筋細胞を初代培養した系により、筋組織全体を用いた系では全く予想されなかった重要な知見をいくつか得た。即ち血管平滑筋細胞はそのCa応答が一様でなく、カフェイン感受性CaチャンネルとIP_3感受性Caチャンネルは平等に全ての細胞に共存するとは限らず、各々のチャンネルの片方のみ反応する事が判明した。この結果は、一般的に各種血管作働性物質で刺激した時に、その反応結果を組織全体を用いて平均を観察しても不十分で、正確には個々の細胞レベルで観測し、その上に立って全体像を再構築する必要が有る事を示している。2)血管平滑筋細胞内Ca^<2+>反応の細胞周期の依存性:平滑筋細胞内Caチャンネルの機能的発現は、その細胞増殖過程と密接に関連している。増殖開始前の休止期には、電位依存性、カフェイン感受性、IP_3感受性のCaチャンネルは同じ一つの細胞上に共存しているが、細胞分裂が始まり、対数増殖期に入ると、これら3種のCaチャンネルが一過性に発現しなくなった。しかし細胞が培地中で密集状態まで増殖すると接触抑制によって細胞分裂が停止すると、重位依存性とIP_3感受性Caチャンネルは再分化して再び反応するようになるが、カフェイン感受性Caチャンネルは脱分化して再発現しなかった。従って各Caチャンネルの発現は、独立に制御されている事を示す。3)PDG下によるCaチャンネル発現の調節:上記3種のCaチャンネル発現の細胞分裂時期による可塑性は、平滑筋細胞の成長促進因子の血小板由来成長因子(PDGF)で細胞増殖を亢進させると、試験管内で制御できた。即ちPDGFで各チャンネルの発現は全て抑制され、逆に無血清培地でPDG下の存在しない時は、各チャンネルの発現が促進された。本年度も継続研究の補助金を頂き、当初の研究の中、細胞工学実験で大きな成果を得て、論文発表を行うことができた。以下その成果を、列記する。(1)血管平滑筋細胞の反応の多様性ラット大動脈平滑筋細胞の初代培養を用いて、蛍光顕微鏡による一次元画像解析により、各種血管作働物質刺激を行って各細胞内カルシウムイオン(Ca2+)濃度を測定した。筋小胞体から放出されるCa2+は、細胞によって大きく異なり、カフェインにのみ反応する細胞IP3系を介するアンジオテンシンIIにのみ反応する細胞が、同一視野内に共存し、従来のCa2+放出系は、各細胞に均質に存在するのではなく、発現するCaチャンネルも異る事が示唆された。(2)Ca2+チャンネル発現の調節上記Ca2+チャンネルの非均質性は、細胞の増殖過程に依存して調節される事が判明した。

即ち、無血清培地で増殖をG6期に停止させると、カフェイン感受性Caチャンネル、IP3感受性Caチャンネル、および電位依存性Caチャンネルの3種とも発現し、又、逆に血小板由来成長因子(PDGF)で成長を促進させると、3種のCaチャンネルが全て発現しなくなり、PDGFはこれらCaチャンネル発現を負に調節する。(3)内皮細胞と血管平滑筋の共存培養によるCa調節筆者らは、世界で初めて両者の共存培養に成功し、ATP刺激によって、内皮細胞から内皮由来弛緩因子(EDRF)が放出され、隣接する血管平滑筋内のCa2+濃度を低下させる事を示した。又、非常に興味有る事にEDRFは内皮細胞自身にも働いて、Ca2+濃度を調節するオートクリン機構を有する事も解明した。研究助成を頂き、当初の研究予定を80%程度達成することができた。関係各位に深謝するとともに、以下その成果を箇条書で記載する。1.血管平滑筋細胞内Caイオン(〔Ca^<2+>〕)_1)動態を2次元画像として解析する機器を独自に開発して研究に供した。この結果血管平滑筋は〔Ca^<2+>〕_1の調節系は決して単一でなく、細胞の増殖過程に依存して電位依存性Caチャンネル、IP_3作動性CaチャンネルとCa^<2+>/カフェイン/リオニジン作動性Caチャンネルは独立に機能発現する事が示された。2.血管内皮細胞と平滑筋細胞の共存培養させ、両者の〔Ca^<2+>〕_1動態を同時観測することに世界で初めて成功した。内皮細胞の刺激物質としてATPを用いた時、単独培養下では内皮細胞も平滑筋細胞も〔Ca^<2+>〕_1は一過性に上昇したが、両者の共存培養では上記の内皮細胞の反応に約5秒ほど遅れて、隣接する血管平滑筋細胞の〔Ca^<2+>〕_1が一過性に減少した。これらの反応にはdown-regulationやtachyphylaxisは認められなかった。共存培養の時に認められた平滑筋細胞内の〔Ca^<2+>〕_1の低下はATP刺激により内皮細胞からEDRFが生産され、隣接する血管平滑筋に作用する結果である事を各種EDRF遮断物質を用いて証明した。2.脂質の中で最も動脈硬化を来す作用の強いlysophosphatidylcholineは上記EDRFの作用を抑制し、ATPによる血管平滑筋細胞の〔Ca^<2+>〕_1低下作用を減弱させ、その拡張機能を妨げる事を示した。この結果は動脈硬化発生の機序に重要な一石を投じる物と自負している。3.ET_A,ET_B受容体がエンドセリン-1と-2を認識する部位を分子生物学的にキメラ遺伝子を設計し、COS細胞にtransfectionして検討して各エンドセリンの結合と〔Ca^<2+>〕_1測定実験から、受容体のIとIV,V,VI,VIIの膜貫通部分が認識部位である事を証明した。4.臨床研究として冠攣縮性狭心症の発症にはエンドセリンの血中濃度が高い事と、これに他の要因が加わる事が必要である事を提唱した。以上の諸結果は3年間で19編の英文原著論文にまとめられ(裏面の発表論文一覧を参照)、更に2編投稿準備中である。今後はこれらin vitro中心の結果をin vivoの研究に発展させ、動脈硬化の病態解明と治療に応用する予定である。
積層材の層間はく離強度の弾性論的研究

近年,CVDやPVDによるセラミックスコーティングなどに見られるように,積層材料の使用が急速に拡大しつつある.積層材料においては特に層間はく離が問題であるため,層間応力を正確に把握することにより層間はく離を事前に予測して破壊を未然に防ぎ,強度的な信頼性を向上させることが重要である.本研究では,積層材料が外力を受ける場合の層間応力を弾性論に基づいて解析し,層間応力と外力や積層材料の性質などとの関連を体系的に明らかにすることを目的とした.本年度は,積層材料の表面に外力が作用する問題のモデルとして,剛体パンチの圧入を受ける二層半無限体の応力解析法を軸対称三次元弾性論に基づいて定式化し,応力や変位の分布を計算するための計算機プログラムを作成した.本解析手法では,剛体パンチと積層材料の表面との間の接触条件(摩擦の有無),パンチの形状(平面,曲面),表面層の厚さ,表面層と下層との材料定数比などの種々の因子をそれぞれ変化させた場合について応力・変化の解析が可能である.研究の結果,以下の知見が得られた.(1)パンチを一定の力で圧入する場合,表面層と下層との層間の応力は,表面層が下層に比べて軟らかくなるほど大きくなり,表面層の厚さが薄くなるほどその傾向は顕著になる.(2)平面底剛体パンチの場合,パンチと表面層との間の摩擦によって部分的な滑りが生じる場合は,全面が固着した場合と摩擦のない場合との中間の状態になり,応力分布は固着部分と滑り部分の境界で折れ曲がりを生じる.(3)摩擦が応力分布に及ぼす影響は,表面層と下層の横弾性係数の比が増大するにつれて大きくなる.なお,本研究の成果は今後学会等で公表する予定である.近年,CVDやPVDによるセラミックスコーティングなどに見られるように,積層材料の使用が急速に拡大しつつある.積層材料においては特に層間はく離が問題であるため,層間応力を正確に把握することにより層間はく離を事前に予測して破壊を未然に防ぎ,強度的な信頼性を向上させることが重要である.本研究では,積層材料が外力を受ける場合の層間応力を弾性論に基づいて解析し,層間応力と外力や積層材料の性質などとの関連を体系的に明らかにすることを目的とした.本年度は,積層材料の表面に外力が作用する問題のモデルとして,剛体パンチの圧入を受ける二層半無限体の応力解析法を軸対称三次元弾性論に基づいて定式化し,応力や変位の分布を計算するための計算機プログラムを作成した.本解析手法では,剛体パンチと積層材料の表面との間の接触条件(摩擦の有無),パンチの形状(平面,曲面),表面層の厚さ,表面層と下層との材料定数比などの種々の因子をそれぞれ変化させた場合について応力・変化の解析が可能である.研究の結果,以下の知見が得られた.(1)パンチを一定の力で圧入する場合,表面層と下層との層間の応力は,表面層が下層に比べて軟らかくなるほど大きくなり,表面層の厚さが薄くなるほどその傾向は顕著になる.(2)平面底剛体パンチの場合,パンチと表面層との間の摩擦によって部分的な滑りが生じる場合は,全面が固着した場合と摩擦のない場合との中間の状態になり,応力分布は固着部分と滑り部分の境界で折れ曲がりを生じる.(3)摩擦が応力分布に及ぼす影響は,表面層と下層の横弾性係数の比が増大するにつれて大きくなる.なお,本研究の成果は今後学会等で公表する予定である.
探針法および囲い込み法のさらなる展開

偏微分方程式に対する境界値逆問題あるいは逆散乱問題として定式化される、媒質中の不連続性についての情報を、さまざまな物理量からなる観測データから抽出する問題について、研究代表者が過去に発見した二つの基本的方法である探針法と囲い込み法のさらなる展開を目指して研究した。その結果弾性体の方程式、熱方程式、Laplace方程式, Helmholtz方程式等で記述される境界値逆問題において、長い間懸案となっていた問題についての解決を得た。解の一組のCauchyデータを使った囲い込み法の弾性体における空洞、介在物あるいは亀裂などの不連続性の存在する場所や形状を抽出する問題は支配方程式が連立であることや特異点での解の挙動が複雑であることから長い間懸案であった。今回対応する二次元の問題を考え、亀裂が線状でその端点のひとつが弾性体表面における既知の点であるという仮定のもとで、もう一つの未知の端点を、表面における`うまく制御された'応力と対応する変位の一組から決定する公式を確立した。証明は池畠の囲い込み法のアイデアにもとづき、次の三つにわけられる。まず解の亀裂先端での、その特異性をあらわす展開公式の厳密な収束証明を与えた。その本質は、亀裂先端の近傍を変換した領域で、Airyの応力関数をMuskhelishviliの議論を用いて解析接続したとき、先端に対応する点が除去可能特異点になっていることであることが分かった。次に弾性体の方程式の複素指数関数解とデータから大きな独立変数の指示関数を構成し、指示関数の変数無限大における完全漸近展開公式を、解の展開公式を使って確立した。最後にその完全漸近展開公式を使って、応力拡大係数が消えないという条件を導入するかわりにより緩い条件である`うまく制御された'応力を表面から加えると、指示関数が変数無限大のとき真に代数的減衰をすることを証明した。さらに未知の亀裂とは独立に与えることができる`うまく制御された'応力の例を与えた。これは、どのような力を表面に与えれば、亀裂の情報を抽出できるか、という問いにたいするひとつの解答であると考えられる。今後は非等方弾性体や空洞、介在物等についてはどうかという点を解き明かしたい。(1)解の一組のCauchyデータを使った囲い込み法の弾性体における空洞,介在物あるいは亀裂などの不連続性の存在する場所や形状を抽出する問題は支配方程式が連立であることや特異点での解の挙動が複雑であることから長い間懸案であった。(2)さらに長年の懸案だった,針列の具体的な閉じた形での構成という探針法についての基本的問題に対して,支配方程式がLaplace方程式またはHelmholtz方程式で針が線分で与えられる場合に簡潔な解答を与えた。簡単に言うと,Yarmukhamedovが1972年に発表したLaplace方程式に対する特別な基本解の正則部分から針列が構成されるということである。さらにこの針列は針上の各点で爆発しているという知見を得た。(3)Mittag-Leffler関数を使った囲い込み法と探針法の亀裂の逆問題への応用のアイデアを適用して,亀裂の可視部の情報をもたらす陽な方法を提唱するとともにその数値実験を実行しその有効性と限界を検証した。(4)熱伝導体中の未知の介在物,あるいは中に発生した,腐食による空洞,亀裂の場所や形についての情報を物体表面における有限観測時間における温度および熱流束の有限個の組から抽出する逆問題もまた基本的で重要な逆問題である。今回はこの問題を空間1次元の場合について考察し,囲い込み法を使ったそれらの情報の抽出公式を確立した。1.熱伝導体の表面の一部における有限観測時間における温度および熱流束の組から、その表面からできるだけ離れた、内部の指定した点における温度の時間発展についての情報を抽出する問題は、応用上重要な典型的な逆問題である。今回は、支配方程式が熱方程式に帰着される場合においてこの問題を考察し、囲い込み法の考え方による具体的な抽出公式を確立した。その核心は、逆向き熱方程式の通常の基本解とは異なる、大きなパラメタを持った特別な基本解を構成しパラメタを無限大にしたときの挙動を調べることでなされた。副産物として熱方程式に対するCarleman型の公式も得られた。2.熱伝導体中に発生した空洞などの欠陥の情報を、有限観測時間において物体表面に与えた熱流束と対応する表面温度分布から抽出する問題の解は非破壊検査等に応用をもつ。今回は、この問題への囲い込み法の応用について研究した。逆向き熱方程式の大きなパラメタを持つ実の指数関数解を使って、極めて簡明な、空洞の凸包等の情報を抽出する公式を得た。この結果は、以前の、空間1次元の場合の結果の、空間2,3次元への拡張になっている。有限観測時間におけるデータを使っているということと、大きなパラメタに依存した熱流束を物体表面に与え対応する表面温度分布からある量を計算するとそれが空洞の支持関数等の情報を与えるというこの方法の、他のさまざまな逆問題への展開は、今後の課題である。

3.囲い込み法による、表面における応力と対応する変位の一組から弾性体中に発生した空洞の存在する場所や形状を抽出する問題は支配方程式が連立であることから長い間懸案であった。今回は、変位の支配方程式が空間2次元におけるNavier方程式に帰着されかつ空洞が多角形状である場合、その支持関数を抽出する公式を確立した。多角形の頂点の近傍における解の展開の収束証明を与えた点が核心部分である。
熱核とグリーン関数の漸近解析とその応用

放物型偏微分方程式に対する初期値・境界値問題の非負値解の一意性定理を応用して、歪積型楕円型方程式のマルチン境界を決定する方法を与えた.また、リーマン多様体上の筒状領域での2階放物型偏微分方程式の非負値解の構造を精力的に研究し、熱核に対する一般的な仮定IU「intrinsic ultracontractivity]の下で任意の非負値解の具体的な積分表示を与えた.さらにIUから[定数関数1が随伴楕円型作用素の小摂動である]ことが従うことも示した.一方、土田哲生とともに周期係数楕円型作用素を研究し、グリーン関数の漸近形を与えるとともに極限吸収原理を示した.放物型偏微分方程式に対する初期値・境界値問題の非負値解の一意性定理を応用して、歪積型楕円型方程式のマルチン境界を決定する方法を与えた.また、リーマン多様体上の筒状領域での2階放物型偏微分方程式の非負値解の構造を精力的に研究し、熱核に対する一般的な仮定IU「intrinsic ultracontractivity]の下で任意の非負値解の具体的な積分表示を与えた.さらにIUから[定数関数1が随伴楕円型作用素の小摂動である]ことが従うことも示した.一方、土田哲生とともに周期係数楕円型作用素を研究し、グリーン関数の漸近形を与えるとともに極限吸収原理を示した.村田實はリーマン多様体上の2階放物型偏微分方程式に対する初期値-境界値問題の非負値解の一意性定理と歪積型2階楕円型偏微分方程式に対するMartin境界とMartin核の分解理論を用いて、統一的方法により様々の楕円型偏微分方程式に対するMartin境界とMartin核を具体的に決定した(J.Math.Soc.Japan,57(2005),387-413)。この方法により、例えばR.S.Martin, R.G.Pinsky, D.Ioffe, V.Maz'ya等によって調べられた楕円型方程式達の正値解の構造を統一的に決定することができる。富崎松代は広義拡散過程の、標本路が状態区間の端点へ到達しないという条件のもとでの時刻無限大での漸近分布を示し、標本路の状態区間の端点での挙動が漸近状態に与える影響を明らかにした。広義拡散作用素のスペクトルが点スペクトルからなるか連続スペクトルからなるかによって、漸近挙動の状態が大きく異なることが分かる。村田實はリーマン多様体内の領域と区間との直積上の2階放物型偏微分方程式の非負値解全体の構造を研究し、熱核に対する仮定-intrinsic ultracontractivity-の下で任意の非負値解を積分表示する公式を与えた(Advanced Studies in Pure Mathematics, 44(2006), 283-289)。この公式はLipschitz筒に対するFabes等の結果(1986)を一挙に一般化するもので、対応する楕円型方程式に対するMartin境界を決定すればこの公式により放物型方程式の非負値解を具体的に積分表示できるので、多くの具体例を統一的に計算する事が可能になった。村田實・土田哲生はユークリッド空間上の周期係数自己共役2階楕円型作用素のレゾルベントの連続スペクトル点への極限の存在を示し、その積分核の無限遠での漸近形を与えた(J.Math.Kyoto Univ., to appear)。富崎松代は一次元広義拡散過程の調和変換に対して、変換後の拡散過程が状態区間の端点の一つを正則境界として挙動する場合に、その境界での局所時間の逆関数の分布の状態を、Kreinの対応の立場から研究し、特に、消滅測度一定のベッセル過程の調和変換の推移確率密度の表現を用いて、原点での局所時間の逆関数がガンマ過程であることを示した(Ann.Reports of Graduate school of Humanities and Sciences Nara Women's University, to appear)。これは、確率論的手法により得られたC.Donati-MartinとM.Yorによる結果(2005)の解析的な証明でもある。内山耕平は古典的なランダムウオークについて始点と終点を固定(条件付け)したときの訪問点の平均個数について精密な漸近評価を与えた。村田實は筒状領域での2階放物型偏微分方程式の非負値解に対する積分表示を研究し、対応する熱核の内在的超縮小性という一般的で最適な仮定の下で任意の非負値解を表示する公式を確立した。この積分表示は対応する楕円型マルチン境界と固有>関数展開を用いて表される具体的公式である。また、熱核の内在的超縮小性から小摂動性が従うことも示した。石毛和浩は大阪府立大学の壁谷善継氏との共同研究により,熱方程式の最大点挙動について,特にポテンシャル項付き熱方程式の場合について考察身行った.これらの解析には,以前の石毛・壁谷の研究に合わせて,ポテンシャル項から派生する特異点の困難さを回避ずる必要があった.また,熱方程式の最大点の挙動は,正値調和関数を通して,ポテンシャル項の無限遠点での挙動に強く影響を受げるということを明らかになった.また,これらの解析を半線形熱方程式の藤田指数の決定問題に応用し,フィレンツェ大学のSalani氏と解の等高面の凸性に関する研究も行った.富崎松代は開区間上で定義された一次元広義拡散作用素に対して小摂動性の概念を考察し、それが対応する広義拡散過程の境界の状態により特徴付けられることを示した。また遠度測度に関する推移確率密度関数の内在的超縮小性についても考察し、尺度、速度測度による十分条件を求めた。相川弘明は境界Harnack原理とCarleson評価の同値性を導いた.

また,比較原理を用いることにより,ユークリッド空間内の滑らかな領域でp-調和関数に対する境界Harnack原理を導いた.さらに容量密度条件の下で,調和測度がダブリングになる領域を特徴付けた.内山耕平は平均0で2+D次のモニメントを有ずるD-次元正方格子上のランダムウオークについて、(i)1点への到達時刻の精密な漸近評価及び(ii)ピン止め条件の下での訪問点の個数の期待値の精密な漸近評価を得た。村田實はP.J.Mendezとともにリーマン多様体上の筒状領域での2階放物型偏微分方程式の非負値解の構造を研究し、一般的でほぼ最適な仮定[定数関数1が随伴楕円型作用素の半小摂動である]の下で任意の非負値解の具体的な積分表示を与えた。(その成果は論文として投稿中。)村田が2007年にJ.Functional Analysisにて熱核に対する仮定[intrinsicultracontractivity]の下で任意の非負値解の具体的な積分表示を与えるまでは、放物型方程式の非負値解の積分表示は抽象論と極僅かの例のみが知られていたが、この結果は一般の仮定の下で非負値解の具体的な積分表示を与える定理として決定的なものである。また半小摂動から熱核のsemi-intrinsic ultracontractivityが従うことも示した。内山耕平は周期グラフ上のランダムウオークのGreen関数と遷移確率の漸近評価を与えた。また正方格子上のランダムウオークを到達点について条件付けたときに、訪問点の平均個数の漸近評価を与えた。志賀啓成はKlein群の単連結連結成分のリーマン写像を精力的に研究し,その連続度研究の観点から正則関数の連続度に関するHardy-Littlewoodの定理を拡張した.また, Holomorphic motionの拡張問題について新しい知見を得た.
神経活動依存的な遺伝子発現システムの構成的解析

本研究は、神経細胞における活動依存的な遺伝子発現制御をモデルに、それに関わる多数の転写因子の活性を定量的かつ経時的に計測、およびそれらの活性を操作することを通じ、細胞における遺伝子発現制御機構を構成的に明らかにすることを目的とする。その目的のため、細胞において多数の内在転写因子の活性を定量的かつ高精度に測定する手法を開発し、それを用いて、培養神経細胞または生体における神経活動依存的な多数の転写因子の活性を明らかにし、それらを基に個々の遺伝子の発現制御の数理モデルを作成する。本年度は、マウス海馬神経細胞および大脳皮質神経細胞の初代培養系に50種類以上の転写因子に関するレポーターウイルスを感染させ、それぞれの転写因子の神経活動依存的な活性変化を定量PCR法を用いた定量計測を昨年度に引き続き実行した。これらの解析の結果、培養神経細胞系において神経活動依存的な活性変化を示す転写因子を多数明らかにすることに成功し、また、複数のタイムポイントにて解析を行うことにより、それぞれが特徴的なタイムコースでの活性変動を示すことをあきらかにした。また、神経伝達阻害剤や、抑制性シナプス応答阻害剤などの薬剤により、神経活動の強弱を人為的に制御した際の転写因子活性のパターン変化を明らかにし、各転写因子は神経活動の強弱に単純に反応しているのではなく、刺激の種類や強弱により多様で複雑な活性変化を起こすことを明らかにした。さらに、刺激を与えるタイミングを厳密に制御するために、チャネルドロドプシンを発現させ、それを介して光により人為的に神経活動を制御する実験セットアップの整備を行った。昨年度に研究開始当初は予定されていなかった研究代表者の所属機関の変更と、研究室の引越しがあり、新所属機関において遺伝子改変生物実験設備と動物実験設備を新たに整備する必要があったため、研究の進捗が当初の予定通りには進んでいない。一方で、設備の整備は本年度において終了したため、次年度は遅れを挽回することができると考える。今年度までの実験により、培養神経細胞において50種類以上の転写因子がそれぞれ特徴的なタイムコースにより、神経活動誘発後にその活性を変化させることを明らかにしている。次年度はこれまでの知見をまとめ、各転写因子の活性タイムコースを元に転写因子活性が標的遺伝子の発現を制御するモデルを作成し、複数の転写因子により発現制御されるような人工プロモーターを作成することでこれを検証する。本年度は、転写因子活性を可視化することが可能な転写因子活性レポーターウイルス(Abe et al., PNAS, 2015)を改変し、50種類以上の転写因子に関するレポーターウイルスを作成、それらの高力価溶液を精製した。これらのウイルスをマウス海馬神経細胞および大脳皮質神経細胞の初代培養系に感染させ、それぞれの転写因子について神経活動依存的な活性変化を複数のタイムポイントにおいて定量計測した。使用する検出系を見直し、同一細胞または同一サンプルにおいて最大8種類の転写因子の活性を同時定量計測することを可能にする改良を施した。これらの解析の結果、神経活動依存的な活性を示す転写因子を多数同定することに成功し、また、転写因子により活性変化のタイムコースが異なることを明らかにした。本研究では高い精製度をもつ高力価ウイルスを効率的に多量作成することが不可欠であり、ウイルス作成プロトコールの整備は本研究の今後の研究の進捗に貢献する。本年度においては、50種以上の転写因子の活性を可視化することを可能にするレンチウイルスベクターを順次作成した。またウイルスの精製に関し、プロトコールの至適化を行い、効率的かつより安価に高力価ウイルスを作成する独自プロトコールを確立した。次に、作成したウイルスベクターを用い、マウス海馬神経細胞の初代培養系を用いて、培養神経細胞における50種類以上の内在転写因子の活性の定量計測を行った。高カリウムバッファーによる神経活動誘発処理2時間後、6時間後と無刺激群との内在転写因子活性の違いを解析し、レポーター遺伝子の定量PCR法により転写因子活性を定量計測した。その結果、神経活動誘発処理群において、既知の神経活動依存的な転写因子CREB, EGR1, MEF2, SRFなどの転写因子の活性上昇が認められた。また、上記の転写因子の他にも、10種の転写因子に関して有意な活性上昇がみられ、12種の転写因子に関しては活性の低下が観察された。また、それぞれの転写因子について活性のタイムコースは異なり、特に、早い活性変化や遅い活性変化を示す転写因子については、より詳細な活性変化のタイムコースを解析した。