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小学校音楽科における「音を聴き味わい楽しむ時間」の導入効果に関する研究

小学校音楽科において、音自体の質感や音色を聴き味わう力は、しんと静まる→音の傾聴→感じたことの言語化や動作化、などの活動の積み重ねで高められること、またその感受性は多様な音楽への興味関心をひらく契機となる可能性が、明らかになった。スペクトルアナライザー等による倍音構造とその変化の可視化体験も、小学校中学年生が音色の決定要因への関心を深め、音楽における音への意識を高めるために有効な補助手段となる。研究期間2年目に当たる25年度は、東京都豊島区立南池袋小学校4年生(2クラス68名)を対象に、音楽授業に参与しながら「音を聴き味わい楽しむ時間」を設けた。同校の都合により研究実践の回数は当初の予定通りに取れず、11回に留まった。音楽担当教員(初任者)との連携には苦慮することが多く、現場との協力関係による実践研究の困難に直面した。研究実践の内容は、1.様々な音色の聴取+その音を用いた「音楽づくり」活動の組織2.「聴く」という行為への多角的な注意喚起3.歌唱や器楽と関連づけた「音色」への関心喚起4.長期休暇中の音探しとカードへの記入5.周波数解析ソフトによる音の視覚化体験、である。4.については、共感的なコメントを入れ、すべて児童に返却した。3月初旬に、作曲家・尺八演奏家の中村明一氏の協力を仰ぎ、「音を楽しむ音楽会」を企画・実施した。内容は、音色を生み出す倍音が極めて豊富な楽器である、尺八、ハープギターを主としたソロと、ベースも加えたジャズ風セッションであった。事前学習のために2月に45分の授業を行った。弾性波としての音の性質、倍音の概念について、様々な楽器や児童の声を、周波数解析ソフトにより視覚化する活動を通して講義した。コンサート後、昨年度に引き続き児童への質問紙調査を実施・回収した。昨年度分と比較しながら、現在分析中である。概ね明らかになったことは、(1)倍音の概念は小学校中学年にも理解が可能であること(2)音の視覚化体験は、聴き方にプラスの影響を与えること、である。他方、24年度の研究経過の発表を次の通り行った。1『季刊音楽鑑賞教育』誌上2日本学校音楽教育実践学会第18回大会(口頭発表)3日本音楽教育学会第44回大会(口頭発表)これらの発表に対して、学校現場と研究者諸氏から意見や今後の方向性に対する要望があり、一定の成果を収めることが出来た。2012年4月2013年3月にわたって、東京都品川区立立会小学校において、「音を聴き味わい楽しむ時間」の研究実践を行った。3年生3クラス(計108名)を対象とした音楽授業で、各回20分程度の実践を、隔週1回ペース、合計16回行った。実践内容の概要は、以下のようなものである。1.しんと静まる練習。2.持参した音源から発する音について響き具合や音色をよく聴く練習。これは出来るだけ多様な経時的変化を含む、比較的音量の小さい音を選ぶ。3.1つのもの(例:新聞紙、紙箱、カサ袋、雨花石)から多様な音色を出す工夫と聴き合う練習。4.「音の立ち上がり」「音色(おんしょく又はねいろ)」「音のすがた」という言葉を使用して、音のイメージを持つ練習。5.音を聴いて動きで表現する練習。6.音を聴いてオノマトペで表現する練習。(プリント記入など)7.長期休暇期間の課題としての音探し→「音見つけカード」への記入。提出物には、共感的なコメントを入れてすべて返却。8.その他。以上については、映像及びメモによる記録、児童の提出物コピーが資料として蓄積された。2月半ば、作曲家・尺八奏者の中村明一氏の協力を仰ぎ、「音をみる・きく音楽会」を企画・開催した。「音のおはなし」として、これまで身体を通してのみ味わっていた音の姿を、周波数解析ソフトの画像によって見せる試みを行った。言語音、環境音には多くの周波数成分が含まれ、それによって多様な情報が伝えられていること、音楽の表現力はそれを人間が工夫し作ったり使ったりしていることを伝えた。尺八音楽を中心とする音楽会ながら、児童は集中して聴けた。質問紙調査を行い、資料として整理中である。予定外だが、3月に立会小学校で行われたオーケストラコンサートでも、本研究の対象児童がどのような聴きかたをしたか、質問紙調査を行った。最終年度は、研究課題のゴールを「倍音構造の経時的変化に対する児童の感受性は、一定の指導により高められることを明らかにし、その方法を提案すること」と整理し直した。音楽科教師が、音色を「倍音構造の経時的変化」としてとらえ、その音楽教育的な意義を適切に理解する一助として、教材DVDとそれに対応する内容の解説小冊子の作成を課題とした。

24年度には東京都品川区立立会小学校第3学年、25年度は同豊島区立南池袋小学校第4学年の音楽授業におけるアクションリサーチにより、(1)音をよく聴く姿勢は、授業における働きかけによって形成することができる(2)周波数解析による音の視覚化が、音に対する児童の多くの気づきにつながる(3)音や音色の知覚・感受体験を、授業で丁寧に跡づけることは、多様な音楽への興味喚起につながる(2年度とも、児童になじみのなかった尺八の古典音楽鑑賞の機会を設けデータをとった)以上3点について、記述的研究としての成果は上げることができた。26年度にはいり、2年間の成果を国際音楽教育学会(ISME)で口頭発表したほか、2年間のアクションリサーチで、研究者自身が蓄積した「児童が音をよく聴く態度を形成するための指導法」に基づき、教材DVD『みんなで音を聴いてみよう』をプロデュースした。学習指導要領に示されている「身近なものや自然の音を聴く」活動を、音楽科の学習につながるように実施するためのノウハウを、具体的な素材及び活動事例として提示している。本DVDは、NPO「音を楽しむONGAKUの会」の協力を得て撮影・編集した。音色を、倍音構造の経時的変化という面からとらえることにより、日本の古典音楽(筝や尺八などの音楽)から現代のポピュラー音楽までを、統一的に見る視野を得ることができる。このことを教師向けに解説していくことが、今後の課題である。音楽科教育2つの理由による。研究協力校との連携の問題25年度は東京都豊島区立池袋小学校4年生を研究実践の対象とした。同校では25年度から初任者の音楽専科教諭が着任し、音楽科の運営に関して必然的に余裕がなかった。研究者として、予定した研究の遂行以前に授業支援が大切だと考え、そのペースの中で研究の軌道修正を試みたが、首尾よく行うことは出来なかった。取る予定だったデータが充分に取れていない。本務校における管理業務の著しい増加明星大学教育学部の学部長補佐として、担当授業コマ数が減らないままに管理業務が著しく増加し、研究のために使える時間を取るのが非常に困難な1年間だった。教育活動においても、所属学部が初めての卒業生を出すに当たり、教員採用試験や就職試験へのサポートが必要で、業務が増加した。研究実践と、年間2回の学会口頭発表の準備に追われ、それ以上進展させることができなかった。小学校現場に入って行う実践研究であるため、受け入れ先の確保やその人的・物的環境、信頼関係などが非常に大きな実施条件となる。その点において24年度はきわめて順調であり、25年度についても新しい協力校との関係をスムーズに構築して研究を進めている。他方、本務校の業務が非常に多忙化したことが原因で、授業実践後の整理および本研究に必須の質的・量的分析のための時間が、24年度は十分に得られなかった。また、実践の補助にアルバイトを使ったが、かなり洗練された作業を含むデータ整理部分については、適当なアルバイト人材を見つけられなかった。そのため24年度に得た貴重なデータの分析が進捗していない。また学会における口頭発表や、少なくとも経過を報告した研究ノートの発表をすることが出来なかった。しかしながら、協力者の中村明一氏をはじめ、録音技術者の専門家(以上は音の現象についての音楽的・音響学的助言)、音楽教育学会員の研究者諸氏(以上は、データの質的・量的分析の技術的方法に関する助言)などとの交流により、研究の進め方について多くの示唆を得た。
分子光捕捉を目指したプラズモニックナノ構造の作製

ブラウン運動する分子やナノ粒子を安定に捕捉するプラズモニックナノ構造を電磁場シミュレーションにより詳細に解析し明らかにした。さらにその構造を実際に作製して、新たに開発した近接場顕微鏡によって光局在特性を評価するとともに、ナノ粒子が従来の方法と比較して格段に安定に捕捉できることを定量的に証明し、当初の計画通り、研究を達成することに成功した。金属ナノ構造に光を照射すると、金属構造中に含まれる自由電子が光エネルギーを吸収することにより集団振動(局在表面プラズモン)を始め、その結果金属ナノ構造の表面近傍のナノ領域に極めて高い光局在場が生じる。この光局在場では極めて大きな光放射圧(電場勾配力)が分子やナノ物質に働くことが予想される。そこで、時間領域差分法(FDTD)を用いて金属ナノ構造近傍の電場分布を計算し、光放射圧が働く領域と場所毎に働く光放射圧の強さを見積もった。その結果、1.光増強度の高い構造は光の局在特性も高く一度光捕捉した分子の閉じ込めは大きい一方、光放射圧が働く領域が極めて小さくなる、2.光増強度の低い構造は光の局在性も低く、光放射圧が働く領域は広くなるが分子に働く光放射圧の大きさは小さくなることがわかった。そこで、金ナノダイマー構造のギャップ距離が小さくかつその距離を緩やかに変化する金ナノ構造を提案した。提案した金属ナノ構造を電子線ビームリソグラフィで作製するにあたり、電子線描画の条件、現像条件、金属蒸着条件、リフトオフ条件等の最適化を行った。現在の所高い再現性は未だ得られないものの2ナノメートル以下の精度で金ナノ構造のギャップを作製することに成功している。広い入射波長に対応するために、多様なサイズのナノ構造作製条件も模索している。来年度はFDTDを用いて構造の最適化を進めると共に電子線ビームリソグラフィでナノ構造を作製し、その電場分布と光放射圧を直接観察するためにAFMと光学顕微鏡を組み合わせた装置を構築する。昨年度に提案したナノ構造のギャップモードプラズモン局在場におけるナノ粒子の光捕捉シミュレーションを、FDTD法にMaxwell応力法を導入することにより行った。その結果、入射レーザー強度を1MW/cm^2に設定した場合、直径5nmのシリコンナノ粒子に約10pNの力が働き、熱運動エネルギーkTよりも遥かに大きい光圧ポテンシャル井戸に10nm以下の位置精度でナノ粒子を捕捉できることが見積もられた。ギャップモードプラズモン光局在場を観察することに特化した散乱型近接場顕微鏡を開発し、昨年度に提案した金ナノ構造を電子線ビームリソグラフィで作製し光局在場測定を行ったところ、約9nmの極微小光局在スポットの観察に成功した。また、同時に測定した位相像を解析したところ、走査プローブにプラズモン共鳴特性に応じて変化する光放射圧が働いていることがわかった。この結果はプラズモン光放射圧を直接測定した初めてのものである。複数のナノギャップ構造をガラス基板上に作製し、直径1μm、350nmのポリスチレンナノ粒子の光捕捉実験も行った。光照射領域内にあるナノギャップ構造において、ナノ粒子をパラレルトラッピングすることに成功した。このときの光照射強度は従来の集光レーザーを用いたナノ粒子の光捕捉に比べ4桁も小さく、1MW/cm^2のレーザー光照射によって数nmのナノ粒子をも捕捉できることが期待された。さらにサイズや配向の異なるナノギャップ構造を作製して同様の実験を行ったところ、それらの局在プラズモン共鳴特性に依存したナノ粒子の光捕捉ができることを明らかにした。最終年度はこれまでに開発してきた技術やノウハウを総動員して金ナノブロックペアのギャップモードプラズモン局在場におけるナノ粒子の光捕捉を理論と実験の両方から進めてきた。その結果、以下の知見が得られた。1.昨年度に開発したMaxwell応力法を用いた理論シミュレーション解析により得られた結果・捕捉粒子の屈折率が高い場合や粒子サイズがギャップ幅程度の場合、捕捉粒子が光局在場を大きく変化させことにより粒子の光閉じ込めが著しく増強することを明らかにした。・Rayleigh近似が成り立つ場合に比べ、最大捕捉力および光捕捉ポテンシャル深さ共に捕捉粒子の屈折率・サイズに強く依存することを証明した。・集光レーザーを用いた従来の光捕捉に比べ、本手法は捕捉力およびポテンシャル深さ共に3桁以上大きくなることがわかった。2.新たに開発した光局在場に捕捉されるナノ粒子の位置揺らぎ測定システムを用いた実験により得られた結果・プラズモン光局在場のナノ空間分布を反映した位置揺らぎヒストグラムを測定することに初めて成功した。・ブロックペア長軸および短軸方向におけるトラップのバネ定数は計算値と良い一致した。・プラズモントラッピングは集光レーザーに比べ3桁程度強い力で捕捉できることを明らかにした(上述にあるように理論シミュレーションによる結果と良い一致)。・捕捉粒子に働く放射圧はプラズモン励起光強度に線形に依存することを実験的に示し、この結果よりプラズモントラッピングに与える熱対流の影響は、実験で用いた光強度に置いて無視できる程小さいことを明らかにした。
固体材料表面への新規なタンパク質付着配向制御技術の開発

固体表面との相互作用を緩和する「クッションタンパク質」として,物理的強度が高い単量体タンパク質である超好熱菌Thermococcus Kodakaraensis由来Ribonuclease HII(HII)を利用し,モデル表面としては親水性ポリスチレン(PS)およびステンレス(SUS316L)を用いて,バイオ分子の固定化特性の調査を行った.N末端に各種固体表面親和性ペプチドを連結したHIIのC末端にHis-tag(モデルペプチド)または緑色蛍光タンパク質(GFP)(モデルタンパク質)を連結した各種キメラタンパク質をそれぞれ発現,精製した.そして,まずこれらを親水性PSプレート上に固定化し,ELISAによって固定化率,検出感度を調べた.その結果,His-tagについては,表面高親和性タグ(PS-tag : RAFIASRRIKRP)+HIIに連結することで1000倍濃度のタンパク質(BSA)共存下においても優先的に表面に固定化できることがわかった.さらにHIIのC末端にフレキシブルリンカー(FL : GGGS)を挿入することにより,酵素標識抗His抗体を用いた検出の感度向上がみられた.また,GFPを固定化した場合,PS-tagだけではなくHIIも連結した方が,より強固な固定化が可能であった.一方,ステンレス表面へのペプチド(His-tag)の固定化についても検討を行ったところ,ステンレス高親和性タグ(SS-tag :ADGEGEWTSGRR)+FLに連結した場合に比べ,HIIをSS-tagとFLとの間に挿入することで,検出感度が劇的に向上した.すなわち,抗体に標識化された検出用酵素とステンレス表面との相互作用がHIIの挿入により高度に低減されたと考えられた.これらの結果から,固体表面親和性ペプチドおよびFLを連結したHIIを「クッションタンパク質」として固定化対象のバイオ分子に連結することで,各種表面上に対して,配向および構造を維持しつつ優先的かつ機能的に固定化しうることがわかった.目的タンパク質と固体表面との間に相互作用を緩和するクッションタンパク質を挟み込み,さらに固体表面親和性ペプチドタグを連結することで結合に配向性・自由度を持たせる,金属表面への新規なタンパク質固定化法について検討を行った.まず,ステンレス表面に高い親和性を示すペプチドをFliTrx^<TM>ランダムペプチドライブラリーシステムを用いて検索した.その結果,N末端に2つのアルギニン残基を有し,かつ酸性アミノ酸残基を複数個含むペプチド(SS25)が高い親和性を示すことを見出した.牛膵臓由来RNaseAにSS25を連結したタンパク質を用いて,ステンレス表面に対する付着特性を調べたところ,タグを連結することによる固定化の配向制御および表面上における構造崩壊の抑制が強く示唆される結果が得られた.また,データベース検索を行い,高い物理強度を有するタンパク質のモデルとして超好熱始原菌Thermococcus kodakarensis由来RNaseHII (RNaseHII_<TK>)を採用し,付着特性の解析を行った.その結果,ステンレス表面に対する不可逆付着率は68%であった.また,付着後の残存活性を調べたところ,10.3%であった.さらに,RNaseHII_<TK>のNおよびC末端にそれぞれSS25を連結させた変異型酵素の調製を行い,同様に付着特性解析を行ったところ,タグ連結酵素はどちらも見掛け直角平衡型の吸着等温線を示した.すなわち,タグを介してステンレス表面に非常に強固に付着していることが示唆された.さらにステンレス表面付着後の残存活性率が6070%とRNaseAの場合と比べて高い値が得られた.したがって,高い物理的強度を有するタンパク質に親和性ペプチドタグを連結することで,固体表面上で付着の配向が制御されると同時に非常に高い機能保持効果が得られることがわかった.まず,固体表面親和性ペプチドタグをタンパク質に連結することにより付着の配向性を確保するタンパク質固定化法について,ポリスチレン(PS)をモデル表面とした検討を行った.PS親和性ペプチドをGlutathion-S-transferase(GST)のC末端に連結した融合タンパク質を固定化後,GSTのN末端配列認識抗体を用いてELISAを行ったところ,高度に配向が制御されていることがわかった.一方,目的タンパク質と固体表面との間に相互作用を緩和するクッションタンパク質を挟み込むという,金属表面への新規なタンパク質固定化法についても検討を進めた.本年度はステンレスおよびチタン表面にそれぞれ高い親和性を示すペプチド(それぞれSS25:RRGSTWEGEGDA,TBP:RKLPDAPGMHTW)を高い物理強度を有する超好熱始原菌Thermococcus kodakarensis由来RNaseHII(RNaseHII_<TK>)に連結した各種クッションタンパク質を用いて,様々な条件のもと吸着実験を行った.チタン表面に対しては吸着場のpHが6-7の場合,全てのタンパク質は直角型の吸着平衡関係を示したが,TBP連結クッションタンパク質は不可逆吸着率が96%と最も高い値を示した.また酸性pH領域(pH3-4)では吸着量の低下が見られたが,野生型のRNaseHII_<TK>と比べると吸着量は多かった.これらのことから,TBPを介したチタン表面への吸着が強く示唆された.

一方,ステンレス表面に対する吸着実験では,SS25連結クッションタンパク質についてのみ直角型の吸着平衡関係が見られ(pH6-7),不可逆吸着率に関しても92%であった.以上,金属表面親和性ペプチドを連結させたクッションタンパク質を利用することで,タンパク質を固体表面上に強固に付着させることが可能であることがわかった.固体表面との相互作用を緩和する「クッションタンパク質」として,物理的強度が高い単量体タンパク質である超好熱菌Thermococcus Kodakaraensis由来Ribonuclease HII(HII)を利用し,モデル表面としては親水性ポリスチレン(PS)およびステンレス(SUS316L)を用いて,バイオ分子の固定化特性の調査を行った.N末端に各種固体表面親和性ペプチドを連結したHIIのC末端にHis-tag(モデルペプチド)または緑色蛍光タンパク質(GFP)(モデルタンパク質)を連結した各種キメラタンパク質をそれぞれ発現,精製した.そして,まずこれらを親水性PSプレート上に固定化し,ELISAによって固定化率,検出感度を調べた.その結果,His-tagについては,表面高親和性タグ(PS-tag : RAFIASRRIKRP)+HIIに連結することで1000倍濃度のタンパク質(BSA)共存下においても優先的に表面に固定化できることがわかった.さらにHIIのC末端にフレキシブルリンカー(FL : GGGS)を挿入することにより,酵素標識抗His抗体を用いた検出の感度向上がみられた.また,GFPを固定化した場合,PS-tagだけではなくHIIも連結した方が,より強固な固定化が可能であった.一方,ステンレス表面へのペプチド(His-tag)の固定化についても検討を行ったところ,ステンレス高親和性タグ(SS-tag :ADGEGEWTSGRR)+FLに連結した場合に比べ,HIIをSS-tagとFLとの間に挿入することで,検出感度が劇的に向上した.すなわち,抗体に標識化された検出用酵素とステンレス表面との相互作用がHIIの挿入により高度に低減されたと考えられた.これらの結果から,固体表面親和性ペプチドおよびFLを連結したHIIを「クッションタンパク質」として固定化対象のバイオ分子に連結することで,各種表面上に対して,配向および構造を維持しつつ優先的かつ機能的に固定化しうることがわかった.
軸配位鉄フタロシアニン系電荷移動錯体への非対称性導入による磁場応答誘電体の開発

軸配位子に非対称性を導入した系ではFe(Pc)(CN)Clからなる電荷移動錯体でのみ誘電緩和現象が観測された。局所的に分子間相互作用の不均化が存在している可能性が指摘される。これは分子ユニットへの非対称性の導入が本研究目的に有効な手段となることを意味する一方で、軸配位子への非対称性の導入では分子間相互作用の不均化を誘起するに十分な効果を得られないことも意味している。そこで、Pcの4つの外周ベンゼン環のうち隣接する2つずつのベンゼン環に対して非対称性を導入した配位子の合成も行った。その際、Pcの類似配位子であるtbpを用いた電荷移動錯体も作製し、環状配位子の変化による電気磁気物性変調を評価した。巨大磁気抵抗効果を発現する軸配位鉄フタロシアニン(Fe(Pc)L2, L:軸配位子)からなる電荷移動錯体の基底状態は電荷不均化にあることが近年の実験と理論研究から明らかになった。本研究では軸配位鉄フタロシアニン系分子ユニットに非対称性を導入することで、分子間相互作用に不均化を導入し、基底状態の電荷不均化と分子間相互作用の不均化から誘電性を発現させることを目的としている。25年度(初年度)は、軸配位子の非対称化を目指した。これまでにCN、Cl、Brを軸配位子として導入した鉄フタロシアニンユニットの構築に成功しているが、いずれも同種の配位子をもったもの、すなわち、ジシアノ、ジクロロ、ジブロモ鉄フタロシアニンユニットであった。軸配位子により分子間相互作用の大きさに変調が見られることが分かっており、異種の軸配位子を導入したFe(Pc)(CN)Cl、Fe(Pc)(CN)Br、Fe(Pc)BrClの三種の分子ユニットを構築することで、分子間相互作用の不均化を期待した。すべての電荷移動錯体の結晶構造解析を行ったところ、いずれもTPP[Fe(Pc)LL']2であり、これはTPP[Fe(Pc)L2]2と同形であった。分子間相互作用の見積もりのため、重なり積分を計算したところ異種軸配位子体は同種軸配位子体の中間の値を示していることが分かった。TPP[Fe(Pc)(CN)Cl]2については極低温で誘電緩和の兆候も見られている。巨大磁気抵抗効果を発現する軸配位鉄フタロシアニン(Fe(Pc)L2, L:軸配位子)からなる電荷移動錯体の基底状態が電荷不均化にあることを利用し、本研究では軸配位鉄フタロシアニン系分子ユニットに非対称性を導入することで、分子間相互作用に不均化を導入し、基底状態の電荷不均化と分子間相互作用の不均化から誘電性を発現させることを目的としている。そこで、26年度はフタロシアニンへの非対称性の導入を行なうにあたり、環状配位子の変化による分子間相互作用の変調の評価のため、類似配位子であるテトラベンゾポルフィリン(tbp)を用いた電荷移動錯体を作製した。従来研究と同様に、テトラフェニルホスホニウム(TPP)をカウンターカチオンとして用いることで、TPP[Fe(tbp)(CN)2]2なる電荷移動錯体を得ることに成功し、これが予想通りTPP[Fe(Pc)(CN)2]2と同形であることを確認した。ただし、分子間相互作用に注目すると、Pc錯体に比べてtbp錯体では重なり積分が一割以上減少している。これはメソ位が窒素原子からメチン基に置き換わったことにより、Pcでは隣接分子間で斥力が働いていた部分がtbpで引力が働いていることによる。すなわち、環状配位子への非対称性の導入が、本研究の目的に適した分子設計と成りうることを強く示唆する結果を得られたと言える。巨大磁気抵抗効果を発現する軸配位鉄フタロシアニン(Fe(Pc)L2, L:軸配位子)からなる電荷移動錯体の基底状態が電荷不均化にあることを利用し、軸配位鉄フタロシアニン系ユニットに非対称性を導入することで分子間相互作用に不均化を導入し、基底状態の電荷不均化と分子間相互作用の不均化から誘電性を発現させることを目的とした分子設計を行なった。Fe(Pc)(CN)Cl、Fe(Pc)(CN)Br、Fe(Pc)BrClの三種類の分子ユニットとその電荷移動錯体の作製に成功していたが、後者2つはその再現性が低く、これまでに得られていた電子物性データが本質的なものであるかに疑問があった。そこでFe(Pc)(CN)Br、Fe(Pc)BrClからなる電荷移動錯体を再現よく得る手順を確立しその電子物性を再検証したところ、得られた全ての電荷移動錯体は同形であるにも関わらず、Fe(Pc)(CN)Clからなる電荷移動錯体でのみ誘電緩和を観測することができことが確認された。三つの試料の分子配列に有意な相違は確認されないが、Fe(Pc)(CN)Clを構成成分とする電荷移動錯体においては局所的に分子配列が二量化している部分が多く存在していると考えられる。一方、軸配位子への非対称性では分子間相互作用への十分な不均化を誘起することは難しいと考え、Pcへの分子修飾も試みた。

その一環として、Pcと分子構造が酷似したテトラベンゾポルフィリン(tbp)を構成成分とする電荷移動錯体を昨年度までに作製し、Pcからなる電荷移動錯体と同形であることを確認していたが、その電気・磁気特性、および、磁気抵抗特性を検証したところ、分子構造のわずかな相違に起因して電気・磁気特性も磁気抵抗特性も大きな変調を見せることが分かった。これはPcへの非対称な分子修飾が本研究目的の達成に有効な手段となり得ることを示唆するもので、フッ素、塩素などをPcの4つの外周ベンゼン環へ非対称に導入した錯体の合成を試みたが電荷移動錯体を得るまでは至らなかった。軸配位子に非対称性を導入した系ではFe(Pc)(CN)Clからなる電荷移動錯体でのみ誘電緩和現象が観測された。局所的に分子間相互作用の不均化が存在している可能性が指摘される。これは分子ユニットへの非対称性の導入が本研究目的に有効な手段となることを意味する一方で、軸配位子への非対称性の導入では分子間相互作用の不均化を誘起するに十分な効果を得られないことも意味している。そこで、Pcの4つの外周ベンゼン環のうち隣接する2つずつのベンゼン環に対して非対称性を導入した配位子の合成も行った。その際、Pcの類似配位子であるtbpを用いた電荷移動錯体も作製し、環状配位子の変化による電気磁気物性変調を評価した。環状配位子のわずかな分子修飾が大きな分子間相互作用の変調を誘起できることは、本研究の当初計画の妥当性を強く指示するものと言え、そのようなデータが得られたことは研究の進捗状況が概ね順調に進んでいることを示している。有機固体化学軸非対称系について、試料作製の困難さから誘電測定について再現性の担保がされていない。早急に良好な3試料を作製し、誘電特性について確かなデータを収集する。26年度から行なっている環状配位子への非対称性導入について、電荷移動錯体単結晶の作製と電気特性評価が可能となるよう務める。環状配位子錯体への軸配位子導入において、異種配位子の導入は従来報告がなかった。配位子場の強いものが優先的に配位することが容易に起こるためである。本研究目的の達成には異種軸配位子導入は重要な検証すべきアプローチの一つであり、この課題を合成スキームの工夫により達成できたのは意義が大きい。また、一種ではあるが誘電性についても興味深い兆候が見られた点も、本研究が当初計画に従い順調に進展していることを示している。得られた試料の誘電特性評価を予備的に行なえるようLCRメータの購入を予定していたが、軸非対称系試料の良質な結晶を再現して作製するに至らず、購入を見合わせたため次年度使用額が発生した。誘電性について、その再現性の確認、発現機構の解明のためのより詳細な実験を行う必要がある。一方、環状配位子であるフタロシア任への非対称性導入にも今後はより取り組む。軸配位子以上に明確な分子間相互作用の変調を期待できる一方で、その合成は困難を極めることが予想されるが、すでに予備実験により複数のアプローチからフタロシアニン間の非対称化に取り組んでいる。26年度、27年度中に非対称フタロシアニンの結晶化、および、その電荷移動錯体の結晶化と電気特性研究の道筋を立てる。LCRメータの購入を設置を行なうために使用したいが、試料作製用電源などの購入に充てることが本研究計画の進展により寄与する面もある。慎重に検討の上で適切に使用するが、連携研究者との協力体制を考慮すれば後者の使途を現時点では計画している。得られた試料についての予備実験の結果を考慮し、誘電測定のためのLCRメータの購入を検討していた。軸非対称系電荷移動錯体の構築は困難であり、25年度の半ばを過ぎてから達成し、その誘電データの解釈を行なうことに時間を要したことで適切な機器を見積もることが難しかった。
誘電体ナノ粒子分散ポリマーハイブリッド非線形光学材料の創製と光位相制御

(1)欠陥の少ないチタン酸バリウムナノ粒子を作製する2段階熱分解法と、(2)チタン酸バリウムナノ粒子をプロピレンカーボネイト(有機溶媒)中に分散させたスラリーを用いた比誘電率測定と有限要素法によるシミュレーションを組み合わせた粒子誘電特性評価法という2つを組み合わせることで、チタン酸バリウムナノ粒子の誘電特性におけるサイズ効果を検討した結果、2段階熱分解法を真空中(1Pa)で行った場合は、約60nmの粒子径で最大比誘電率15000を得たのに対し、2段階熱分解法を大気中で行った場合は、約140nmの粒子径で最大比誘電率5000を得た。従って、本研究では以下の2つの問題点、(1)比誘電率がある粒径で最大値を示す理由、(2)合成法の違いにより、比誘電率のサイズ依存性が異なる理由、について検討を行った。まず最初に(1)の原因を検討する前に、スラリーを用いた比誘電率測定法以外に、チタン酸バリウムナノ粒子をエポキシ樹脂に種々の濃度で分散させたナノ粒子分散ポリマーハイブリッド材料を作製し、その誘電特性を評価した。その結果、誘電率5000のチタン酸バリウムナノ粒子を分散させたポリマーハイブリッド材料の比誘電率は、誘電率3000のチタン酸バリウム粒子を分散させたポリマーハイブリッド材料よりも同じ体積分率では常に大きな値を示す一方、誘電損失はほとんど変化しなかった。特に、40vol%で比誘電率62、60vol%で比誘電率80と、これまでに報告されたポリマーコンポジットの誘電率と同じ体積分率で比較すると、はるかに大きな値を示すことから、高い比誘電率が正しいことを明らかにした。またその周波数依存性についても検討を行い、数GHzまでは高い誘電特性を維持することを確認した。また、この高い比誘電率の起源を明らかにするため、遠赤外反射測定によりTHz領域での比誘電率のサイズ依存性について検討を行った。このため、チタン酸バリウムナノ粒子同士が最密充填構造を持つ3次元コロイド結晶を移流集積法により作製した。これを用いることで初めてチタン酸バリウムナノ粒子のTHz領域での比誘電率の測定に成功した。その結果、チタン酸バリウムの比誘電率を決定する最も振動数の低い光学振動モードであるソフトモードの振動数が、最大の比誘電率を持つ粒径において最も小さくなること、すなわちTHz領域での比誘電率がその粒径で最大になることを見いだした。従って、高い比誘電率が数十GHzという光の領域においてまで安定に存在できることを確認できた。このことは、このチタン酸バリウムナノ粒子分散ポリマーハイブリッド材料が遠赤外線の領域において、高い比誘電率を維持できることを意味する。今後は、この材料において非線型光学効果が実際に得られるのかについて検討を行う予定である。

このことは、このチタン酸バリウムナノ粒子分散ポリマーハイブリッド材料が遠赤外線の領域において、高い比誘電率を維持できることを意味する。今後は、この材料において非線型光学効果が実際に得られるのかについて検討を行う予定である。高誘電率を持つ誘電体ナノ粒子として、チタン酸バリウムを選択し、蓚酸バリウムチタニルを原料とする2段階熱分解法を更に改良することで、一回の合成で100gのチタン酸バリウムナノ粒子の合成が可能となった。この改良方法では、真空処理は670°C、3時間行うだけで、その後大気雰囲気中で通常の高温熱処理を行うことで、粒子径を制御した。しかしながら、以前行っていた真空中で高温で熱処理して得られたチタン酸バリウムナノ粒子とは異なる比誘電率のサイズ依存性を示した。以前のやり方で合成した場合には、粒子径70nmで、比誘電率は15,000という最大値を示したのに対し、今回の方法で合成した場合には、粒子径140nmで、比誘電率は5,000で最大値を示した。そこで、この原因を明らかにすべく、高輝度放射光を用いた精密構造解析を行った。その結果、これまで考えられてきたチタン酸バリウムのサイズ依存性とは異なり、室温で強誘電体相である正方晶構造が常誘電体である立方晶構造に変わる粒子径である臨界径が、20から40nmの間にあること、そして、比誘電率が最大を示す粒子の結晶構造は、正方晶性が本来の1.011より少し低い1.0066付近にあること、そしてこの前後において、結晶構造、電子密度分布とも何ら特異的な異常を示さないことを見いだした。なお、ここで得られた結晶構造は、前回の比誘電率が15,000を示した70nmのチタン酸バリウムナノ粒子の結晶構造に類似していることがわかった。また、結晶構造に最も大きな影響を与えると考えられる格子振動の状態を見積もるため、ラマン散乱測定を行い、精密な格子振動解析を行った。その結果、ソフトモードについては装置の限界で観測できなかったものの、それ以外の振動モードに関しては粒子径の減少にもかかわらず、格子振動数が全く変わらないことを見いだした。この現象はこれまで考えられてきた強誘電体の相転移現象とは完全に異なる現象であることを見いだした。現在、この現象を説明するためのモデルについて考察を行っている。また、これとは別に、有機無機ハイブリッドインクは、有機溶媒にプロピレンカーボネイトという物質を用いることで全くチタン酸バリウムにダメージを与えず、また分散性も良いことを見いだし、順調に作製は進んでおり、すでに10vol%までの濃度で十分にナノ粒子が分散したインクの作製に成功した。インクジェット式プロッターについては作業は順調に進んでいるが、完全には完成しておらず、来年度早々に完成する予定である。(1)欠陥の少ないチタン酸バリウムナノ粒子を作製する2段階熱分解法と、(2)チタン酸バリウムナノ粒子をプロピレンカーボネイト(有機溶媒)中に分散させたスラリーを用いた比誘電率測定と有限要素法によるシミュレーションを組み合わせた粒子誘電特性評価法という2つを組み合わせることで、チタン酸バリウムナノ粒子の誘電特性におけるサイズ効果を検討した結果、2段階熱分解法を真空中(1Pa)で行った場合は、約60nmの粒子径で最大比誘電率15000を得たのに対し、2段階熱分解法を大気中で行った場合は、約140nmの粒子径で最大比誘電率5000を得た。従って、本研究では以下の2つの問題点、(1)比誘電率がある粒径で最大値を示す理由、(2)合成法の違いにより、比誘電率のサイズ依存性が異なる理由、について検討を行った。
18世紀後期東北日本における質物奉公人の存在形態に関する歴史社会学的研究

本研究の目的は、18世紀仙台領磐井郡の村方宗門帳及び町方史料から質物奉公人データベースを構築し、奉公人の性別・年齢別構成、世帯内地位、身代金額、奉公期間、奉公先(空間的移動)などを解明することである。このうち町方史料については、記載の信憑性を今少し慎重に検討する必要があるので、本報告からは除外する。175360年までの西磐井郡峠村質物奉公人の延べ数は810人で、男子532人、女子278人であった。奉公年齢は男子で1079歳未満の範囲に分布し、最頻値は3034歳層(103人)に、女子では574歳未満の範囲に分布し、最頻値は2529歳層(60人)にあった。奉公人の世帯内地位は、男子では世帯主の総領179人、同弟52人、同次男以下の男子41人が多く、女子では世帯主妻92人、同嫁52人が多かった。身代金は120切の間に広く分散していた。身代金と年齢の関連を男子に限り単(1753)年でみると、相関係数は全体(63人)で0.41であるが、30歳未満層(38人)に限定すると0.74と高くなった。男子30歳以下層(40人)の回帰方程式はY=-0.089*0.632/xであるが、40歳以下層(54人)ではY=+5.395*0.338/xとなり、身代金の上昇は若干層で顕著であるが、中高年層ではプラトー化した。一方、女子の場合年齢と身代金の相関は、単年の度データ数が僅少でもあり、観察されなかった。男女とも奉公期間は原則として2年であり、以後契約を更新するのが通例であった。男子の奉公先を郡別にみると、同郡内225人(42.3%。うち自村内111人[21%])、栗原郡203人(38.2%)、登米郡66人(12.4%)、遠田郡14人(2.6%)牡鹿郡11人(2.1)東磐井郡10人(1.9%)で、遠距離の仙台城下2人(0.4%)、志田郡1人(0.2%)等は例外だった。女子の奉公先は近距離にあり、同郡内134人(48.2%。うち自村内39人[14.0%])、栗原郡75人(27.02%)、東磐井郡41人(14.7%)、登米郡28人(10.1%)であった。
ラット網膜色素上皮細胞に発現する内向き整流カリウムチャネルの同定とその機能解析

1)電気生理学的検討前年度の研究によりラット網膜色素上皮細胞にはKir4.1に似た性質を持つK^+チャネルが存在することが明らかとなった。平成12年度ではラット網膜色素上皮細胞に対する全細胞電流を記録したが、この全細胞電流記録はそのコンダクタンスが細胞外液のK^+濃度に依存しないという性質を有しており、Kir4.1とは性質の異なるものであった。2)分子生物学的検討ラット網膜切片に対してin situ hybridization法を用いて検討したが、その結果Kir4.1のmRNAの発現が網膜色素上皮細胞および網膜グリア細胞に一致して観察された。3)免疫組織学的検討ラット網膜切片において光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて免疫組織学的検討を行った。光学顕微鏡を用いての観察では網膜色素上皮のapical側に抗ラットKir4.1抗体による染色像が確認された。なお、この染色像は上皮細胞のマーカーである抗サイトケラチン抗体による染色像と一致していた。電子顕微鏡を用いた観察ではKir4.1の染色像は網膜色素上皮のapical microvilliの先端から中間部にかけて存在しており、microvilliの根元あるいはbasolateral側には存在しなかった。これらのことから網膜色素上皮細胞には内向き整流カリウムチャネルの一種であるKir4.1がapical膜、とりわけmicrovilliの先端から中間部にかけて機能的に発現していることが強く示唆された。これまでの電気生理学的検討により網膜色素上皮細胞にはKirが存在することが示唆されていたが、今回の研究により、その存在および分子生物学的性質が初めて確認された。また、その細胞内局在に関しても興味深い知見が得られた。今回の電気生理学的検討からはKir4.1以外のチャネルが存在する可能性が示唆されており、今後はこのチャネルの解明および機能分担について検討を進める予定である。1)電気生理学的検討生後1014日のDAラットからシート状に新鮮分離した網膜色素上皮細胞に対してパッチクランプ法の一種である単一チャネル記録法を行った。その結果、網膜色素上皮細胞のapical側細胞膜からは約22pS(細胞外液、ピペット溶液のカリウム濃度は伴に145mM)のコンダクタンスを持つカリウムチャネルの活動が記録された。このチャネルは高い開口率(0.70.9)を示し、また開口時にノイズであり(open noise)、内向きのコンダクタンスに比し、外向きのコンダクタンスは非常に小さかった。これらの特徴は既知の内向き整流カリウムチャネルの一種であるKir4.1に一致するものであった。2)分子生物学的検討電気生理学的検討よりKir4.1が網膜色素上皮細胞で発現する否かを検討した。まず、ラット網膜色素上皮細胞から抽出した全RNAに対して、ラットKir4.1の特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。その結果、ラット網膜色素上皮細胞にKir4.1のmRNAが存在することが確認された。3)免疫組織学的検討抗ラットKir4.1抗体および上皮細胞のマーカーである抗サイトケラチン抗体を用いてラット網膜切片を2重染色した。その結果、抗Kir4.1抗体の染色像は網膜色素上皮細胞のapical microvilliに強く見られ、この部分では抗サイトケラチン抗体の染色像と一致していた。こららのことから網膜色素上皮細胞に内向き整流カリウムチャネルの一種であるKir4.1がapical膜に機能的に発現していることが強く示唆された。網膜色素上皮細胞のapicalに存在する内向き整流カリウムチャネルは網膜下腔のカリウム濃度の恒常性維持に重要な役割を果たすと考えられており、今回の結果はこれまで不明であったその構成要素を分子生物学的手法を用いて初めて同定した意義深いものと考えられる。
アクチン・アクチン結合蛋白質相互作用を阻害する小分子化合物の解析

昨年に引き続き、我々が見出したアクチン-アクチン結合蛋白質の結合を阻害する薬剤の解析を進めた。これまで結合阻害が見られるアクチン結合蛋白質はプレクチンやスペクトリンなど、アクチン結合ドメインにカルポニンホモロジー(CH)ドメインを有することを見出していた。そこで今年度はまず、CHドメイン以外のアクチン結合ドメインを持った蛋白質とアクチンとの結合を阻害するか検討を行った。その結果、コータクチンやミオシンなどのアクチン結合蛋白質との結合も阻害することが明らかとなった。さらにディファレンシャルスキャニングフルオロメトリーを用いた測定により、薬剤がG-アクチンのみならず、F-アクチンとも直接結合することが明らかとなった。以上の結果から、この薬剤はG-アクチン及びF-アクチンと直接結合し、さまざまなアクチン結合蛋白質との結合を阻害することが明らかとなった。複数のアクチン結合ドメインを有するアクチン結合蛋白質との結合を阻害することから、アクチンと結合することでアクチン構造を大きく変化させている可能性が高くなった。さらに生合成類縁体を用いた解析より薬剤構造中のエポキサイドは、1)アクチンとの結合には直接関与していないが、共有結合を介して阻害を安定化させること、2)細胞膜透過性に重要なことが、また、水酸基のメチル化(メトキシ基)が活性に重要なことが明らかとなった。現在、共有結合する性質を利用して、アクチン上の結合部位の同定を行っているところである。ケミカルバイオロジーの基本的手法であるケミカルジェネティクスは「蛋白質すべてに特異的な阻害剤が存在する」という概念を根幹に据えて展開している。しかし酵素などの基質認識をする一部の蛋白質を除くと、蛋白質のほとんどには小分子化合物が結合するに適したポケットは有しておらず、特異的阻害剤は期待できない。しかしそのような蛋白質もそのほとんどは複合体で活性を示すことを考えると、複合体形成を妨げることで阻害効果を得ることは可能だと考えられる。このような考え方は以前からあったものの、実際に蛋白質-蛋白質相互作用を阻害するような小分子化合物は若干の例外を除くとほとんど報告が無い。この理由として、1)蛋白質同士の会合面はポケット構造などの特徴が乏しいため、小分子阻害剤が結合しにくく、2)蛋白質同士は広い会合面積で結合エネルギーを稼ぐため、狭い結合面積しか持たない小分子阻害剤はエネルギー的に不利である、などが挙げられている。しかしながら我々が解析を進めている化合物は、分子量600以下の小分子であるにも関わらず、アクチンとアクチン結合蛋白質との結合を阻害することを見出した。このことは小分子化合物が蛋白質-蛋白質相互作用を阻害でき、そのメカニズムに興味が持たれる。今年度は先にビオチン化物を用いて結合蛋白質として単離したアクチン結合蛋白質との結合を検証した。しかしながら得られたアクチン結合蛋白質と化合物との直接薬剤との結合が見られず、代わって単量体G-アクチンとの結合がカロリメトリーITCにより確認された。さらにこの化合物は、単量体G-アクチンと結合するものの、他のアクチン阻害剤とは異なりF-アクチンへの重合にほとんど影響を与えず、電子顕微鏡レベルで正常なアクチン繊維を形成することを確認した。現在、F-アクチンとの結合を検討しているところである。
金属グレーティング導波路上を伝搬するSAWソリトンの実験的検証

近年,弾性波素子に於いても,小型化,高周波化,大電力化が進み,その非線形特性が無視できない状況になりつつあるように思われる.また位相共役波の発生やコンボルバのように非線形現象を積極的に利用した応用素子も盛んに研究開発されてきている.さて現在までのところ,一部の例外を除いて,これらの弾性波素子に於ける非線形現象を考察の対象とする場合,それらを非線形素子として積極的に利用する場合に於いても,摂動法を用いた微小信号からの近似で取り扱える範囲に議論を限定しているようである.一方摂動近似が成り立たなくほどの大振幅領域で弾性波素子を安定に使用することを考えた場合,非線形現象特有の不安定性が大きな障害になることが予想される.そこで波の分散性と非線形性をバランスさせて非線形固有のモードであるソリトンを発生させることができれば大振幅領域で安定に弾性波素子を使用することができるようになる可能性がある.本研究者はこのような観点から弾性波の中で最も簡単に非線形効果の生ずる弾性表面波(SAW)をソリトン化させる研究に着手した.まず,金属グレーティング導波路がソリトン発生でよく知られている非線形格子と一致することを見いだし,次に実験的にSAWソリトンの発生を検証した.周波数60MHzパワー密度2-7W/mmのSAWを幅1mum厚さ1000ÅのA1金属ストリップアレイからなるグレーティング導波路の一端から導波させその波形変化を観測した.その結果正弦波SAWが2つのソリトンと思われる負振幅のパルス波列に分裂し波高値の大きなパルスが小さなそれに追いつき最後にまた正弦波に再帰する現象を確認した.これらの観測波形はK-dV方程式を解いた時の波形と酷似しており,この方程式の保存則を観測波形が満足していることも確認した.また導波路から金属グレーティングを取り除いたときのSAWのショックウェーブも確認した.近年,弾性波素子に於いても,小型化,高周波化,大電力化が進み,その非線形特性が無視できない状況になりつつあるように思われる.また位相共役波の発生やコンボルバのように非線形現象を積極的に利用した応用素子も盛んに研究開発されてきている.さて現在までのところ,一部の例外を除いて,これらの弾性波素子に於ける非線形現象を考察の対象とする場合,それらを非線形素子として積極的に利用する場合に於いても,摂動法を用いた微小信号からの近似で取り扱える範囲に議論を限定しているようである.一方摂動近似が成り立たなくほどの大振幅領域で弾性波素子を安定に使用することを考えた場合,非線形現象特有の不安定性が大きな障害になることが予想される.そこで波の分散性と非線形性をバランスさせて非線形固有のモードであるソリトンを発生させることができれば大振幅領域で安定に弾性波素子を使用することができるようになる可能性がある.本研究者はこのような観点から弾性波の中で最も簡単に非線形効果の生ずる弾性表面波(SAW)をソリトン化させる研究に着手した.まず,金属グレーティング導波路がソリトン発生でよく知られている非線形格子と一致することを見いだし,次に実験的にSAWソリトンの発生を検証した.周波数60MHzパワー密度2-7W/mmのSAWを幅1mum厚さ1000ÅのA1金属ストリップアレイからなるグレーティング導波路の一端から導波させその波形変化を観測した.その結果正弦波SAWが2つのソリトンと思われる負振幅のパルス波列に分裂し波高値の大きなパルスが小さなそれに追いつき最後にまた正弦波に再帰する現象を確認した.これらの観測波形はK-dV方程式を解いた時の波形と酷似しており,この方程式の保存則を観測波形が満足していることも確認した.また導波路から金属グレーティングを取り除いたときのSAWのショックウェーブも確認した.
C型肝炎ウイスル(HCV)構造蛋白質の成熟化、品質管理及び粒子産生機構の解析

昨年度までにHCV複製複合体においてATPレベルが亢進している可能性を示した。そこでATPレベルの亢進がHCVの複製に依存していることを確認するために、ウイルスのポリメラーゼ阻害剤を用いて複製を阻害した際のATPレベルの変化を解析した。その結果、HCVの複製を短時間阻害すると複製複合体のATP濃度はさらに亢進するが、長時間阻害すると定常状態に戻ることが確認できた。このことから、ATPレベルの亢進はHCVの複製に依存していることが確認できた。さらにミトコンドリアを染色したところ、ATPレベルが亢進している活性化状態にある複製複合体は、ミトコンドリアと近接していることが確認できた。HCV複製複合体にミトコンドリアから直接的にATPが流入している可能性が示唆された。ミトコンドリアのみならず、ERやゴルジ体、脂肪滴が局在や形態を変化させてHCVの複製及び粒子産生の場を構築している可能性が報告されており、HCVの生活環が細胞内オルガネラの局在に与える影響の一端として、有用な知見が得られたと考える。現在、ATP局在の撹乱がHCV粒子産生・分泌経路に与える影響について解析を行っている。以上の結果は本年度海外誌に発表した。一方で、次世代シークエンサーを用い、パッケージングシグナル関連配列の探索を行なった。これまでのHCV研究では各塩基について優位に存在する塩基をつなげた、仮想的なコンセンサス配列が主に用いられてきた。本年度、複数の次世代シークエンサーと従来のPCR法を組み合わせることで、一患者由来の血清中に存在するHCVのゲノム配列を、全長にわたり経時的に決定することに初めて成功した。現在患者血清内に存在するウイルスの全長配列を比較解析し、パッケージングシグナル関連配列の探索を行っている。さらに本手法は、HCVの多種性が病態や薬剤耐性獲得にどのように寄与するかの理解に繋がると期待できる。C型肝炎ウイルス(HCV)粒子形成および成熟化機構の解明を目的として、以下の実験を行った。1.HCV粒子形成時のウイルスゲノムRNAに対する管理機構について、ゲノムRNAが粒子内に取り込まれる際のリード配列、即ちパッケージングシグナルの探索という観点から検証した。(1)HCV粒子内RNAの大規模網羅的シークエンス解析を行い、3'UTRにRNAのウイルス粒子内への取り込み効率を高める配列が存在することを確認した。(2)3'UTR配列に対してランダムに変異を導入したレプリコンを用い、感染性粒子産生効率を大幅に低下させる変異を同定した。(3)RNAの二次構造予測を行い、得られた変異が3'UTRの構造を大きく変化させうることを確認した。以上から、同定した変異或はそれに伴うゲノムRNAの構造変化が、感染性粒子産生効率に影響を及ぼすことが示され、その変異周辺の配列がパッケージングシグナルである可能性が示唆された。2.FRET技術を利用して細胞内のATP濃度を可視化するプローブ(ATeam)を用いて、HCV複製時の複製複合体におけるATPレベルを検証した。これにより、複製を維持した状態でHCV粒子産生・分泌経路を観察可能になると期待できる。本年度は、HCV複製細胞特異的なATeam発現系の構築と検証を行った。(1)HCV複製複合体におけるATPレベルをモニターするために、HCV NS5A蛋白質にATeamを融合した発現系を構築し、複製が維持されることを確認した。(2)共焦点顕微鏡で観察したところ、複製複合体の存在を示唆する顆粒状のFRETシグナルが検出された。以上から、HCV複製複合体においてATPレベルが亢進していることが示唆された。この実験系により、個々のHCV複製細胞中におけるATPの挙動を時間的、空間的に解析することが可能となった。FRET技術を利用して細胞内のATP濃度を可視化するプローブ(ATeam)を用いて、HCV複製時の複製複合体におけるATPレベルを検証した。この可視化技術により、複製を維持した状態でHCV粒子産生・分泌経路を観察可能になると期待できる。本年度は、HCV複製細胞におけるATPの挙動を、細胞質と複製複合体それぞれについて定量的に解析した。HCV複製複合体におけるATPレベルをモニターするために、HCV NS5A蛋白質にATeamを融合した発現系を構築した。共焦点顕微鏡で観察したところ、複製複合体の存在を示唆する顆粒状の発現部位で、強いFRETシグナルが検出された。抗ウイルス抗体を用いた免疫染色を行ったところ、この顆粒部位においてウイルス蛋白質が共局在していた。FRETレベルとATP濃度の相関からATP濃度を解析したところ、細胞質のATP濃度はおよそ2mMから1mMに低下しており、一方、顆粒状の部位では510mMと非常に亢進していた。以上から、HCV複製複合体においてATPレベルが亢進している可能性が示唆された。同時に細胞質におけるATP濃度が半分程度に低下していることから、HCV複製によるエネルギー消費の亢進により、宿主細胞内のエネルギー系が撹乱されていることが示された。ATPは宿主細胞における様々な反応に関与しており、細胞質におけるATPレベルの低下は宿主生理活性の広範囲に影響を及ぼすと考えられる。ウイルス感染による、ATPのような小分子の局在や濃度変化はこれまで報告がなく、ウイルス感染が宿主細胞に与える影響について、新たな知見が得られたと考える。

今後、HCV感染生細胞において、HCV粒子産生・分泌経路を観察可能な系として発展させていくことを試みる。昨年度までにHCV複製複合体においてATPレベルが亢進している可能性を示した。そこでATPレベルの亢進がHCVの複製に依存していることを確認するために、ウイルスのポリメラーゼ阻害剤を用いて複製を阻害した際のATPレベルの変化を解析した。その結果、HCVの複製を短時間阻害すると複製複合体のATP濃度はさらに亢進するが、長時間阻害すると定常状態に戻ることが確認できた。このことから、ATPレベルの亢進はHCVの複製に依存していることが確認できた。さらにミトコンドリアを染色したところ、ATPレベルが亢進している活性化状態にある複製複合体は、ミトコンドリアと近接していることが確認できた。HCV複製複合体にミトコンドリアから直接的にATPが流入している可能性が示唆された。ミトコンドリアのみならず、ERやゴルジ体、脂肪滴が局在や形態を変化させてHCVの複製及び粒子産生の場を構築している可能性が報告されており、HCVの生活環が細胞内オルガネラの局在に与える影響の一端として、有用な知見が得られたと考える。現在、ATP局在の撹乱がHCV粒子産生・分泌経路に与える影響について解析を行っている。以上の結果は本年度海外誌に発表した。一方で、次世代シークエンサーを用い、パッケージングシグナル関連配列の探索を行なった。これまでのHCV研究では各塩基について優位に存在する塩基をつなげた、仮想的なコンセンサス配列が主に用いられてきた。本年度、複数の次世代シークエンサーと従来のPCR法を組み合わせることで、一患者由来の血清中に存在するHCVのゲノム配列を、全長にわたり経時的に決定することに初めて成功した。現在患者血清内に存在するウイルスの全長配列を比較解析し、パッケージングシグナル関連配列の探索を行っている。さらに本手法は、HCVの多種性が病態や薬剤耐性獲得にどのように寄与するかの理解に繋がると期待できる。