hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子改変ショウジョウバエ及びマウスによるラミニンの機能の解析

すなわち、i)個別に合成されたα,β,γ鎖は単独では分泌されず、ii)まずβとγが相互認識して会合するが、iii)この段階ではαは会合できず、iv)βとγが長腕C末端でジスルフィド結合されてからα鎖が会合して細胞外に分泌されることを示した。4)培養下で脂肪細胞に分化する3T3-Ll株はα4,β1,γ1のcDNAだけを発現しておらず、これらのmRNA量は脂肪細胞への分化に伴って増加し、それらの産物が会合したラミニン1(α4β1γ1)のみが脂肪細胞では形成されることを明らかにした。ラミニンは基底膜と呼ばれる上皮や内皮細胞層の裏打ち構造、に含まれる主要な糖タンパク質で、組織細胞の遊走、増殖や分化に作用する。ジスルフィド架橋されたα鎖、β鎖とγ鎖が会合して、3本の短腕と1本の長腕を持つ十字架構造をしている。近年、多数のラミニン異型体がヒト及びマウスで発見され、その構造と機能の研究は複雑な様相を呈している。α鎖の異型体が5種類、β鎖の異型体が3種類、γ鎖の異型体が2種類発見され、これらが様々に組み合わされた11種類の三量体が知られている。ショウジョウバエでは、α鎖、β鎖とγ鎖が各一種類しか発見されておらず、哺乳動物に比べて解析が単純である。本研究では、ショウジョウバエとマウスを並列させてラミニンの機能を究明した。本研究の実績は次のようである。1)鎖間会合に寄与する長腕配列を様々に欠失したマウスのα1,β1,γ1cDNAをサル腎臓由来のCOS1細胞で発現させると、内在性のサルのα1,β1,γ1と会合して雑種ラミニンを作ることを示した。2)ラミニン鎖の長腕における会合過程では、そのC-末端とN-末端が異なる役割を果たしいることを示した。3)ショウジョウバエ・ラミニンを大量合成するKc167細胞を利用して、α,β,γが会合して分泌される順序を明らかにした。すなわち、i)個別に合成されたα,β,γ鎖は単独では分泌されず、)まずβとγが相互誌識して会合するが、)この段階ではαは会合できず、)βとγが長腕C末端でジスルフィド結合されてからα鎖が会合して細胞外に分泌されることを示した。4)培養下で脂肪細胞に分化する3T3-L1株はα4,β1,γ1のcDNAだけを発現しておらず、これらのmRNA量は脂肪細胞への分化に伴って増加し、それらの産物が会合したラミニン1(α4β1γ1)のみが脂肪細胞では形成されることを明らかにした。
コンクリート構造物の閉じたき裂評価のための低周波非線形超音波映像法の創出

高度経済成長期に建設されたインフラの経年劣化が社会問題となっているが、その安全性保障のための非破壊検査法の開発が喫緊の課題である。しかし、インフラの大半を占めるコンクリートは金属より遥かに不均質で高減衰のため、MHzの周波数帯域を用いる通常の超音波法では計測できない。本研究では、コンクリート構造物の閉じたき裂の低周波非線形超音波映像法の創出を目的として、その基盤技術を開発した。送信に接触探触子を用いて、受信にレーザ振動計走査を用いた基礎実験でその有効性を実証した。さらに、高効率な送受信圧電探触子の試作、ユーザフレンドリーの映像化プログラムの試作も行った。高度経済成長期に建設されたインフラ(トンネル、橋梁等)の経年劣化が社会問題となっているが、その安全性保障のための非破壊検査において、「閉じたき裂」は最難関課題だった。これまで、我々は閉じたき裂の映像法(subharmonic phased array for crack evaluation: SPACE)を開発し、金属試験片でその有効性を実証してきた。しかし、インフラの大半を占めるコンクリートは金属より遥かに不均質で高減衰のため、超音波の伝搬・散乱挙動が極めて複雑であり、これまでのMHz帯域のSPACEでは検査できない。そこで本研究では、コンクリート構造物の閉じたき裂の低周波非線形超音波映像法を創出することを目的とする。本年度は下記2項目を遂行した。[1]コンクリート試験片の準備:本年度はコンクリート試験片に2種類の欠陥を導入した。1つ目は、発泡スチロール薄板を挿入することで、剥離欠陥を模擬した。2つ目は、鉄筋コンクリートを再現するため、鉄筋を導入した。また、鉄筋コンクリートでは、鉄筋腐食に伴う鉄筋-コンクリート間の剥離が強度低下を引き起こすため、塩化ナトリウム水溶液に試験片を浸漬させた後、鉄筋に電気を流すことで、加速腐食試験を行った。尚、これらの試験片作製は平成28年度以降も継続する。[2]低周波送信探触子の検討:1 MHzおよび500 kHzの圧電探触子を用いて、[1]で作製したコンクリートブロックで減衰を調べた。ここでは、広帯域にフラットな受信特性を持つレーザ干渉計を受信側に用いた。その結果、両探触子で高周波成分が減衰する結果が得られたが、受信波形の中心周波数が500 kHz以下であったことから、500 kHzの探触子が適していることが分かった。また、き裂などの欠陥に対する感度向上のため、それらの探触子に適した斜め入射用の楔のプロトタイプも作製した。尚、これらの探触子作製は平成28年度以降も継続する。[1]低周波送信探触子の設計・試作とレーザ振動計スキャンによる評価:昨年度は基礎的検討として受信に高額なレーザ振動計スキャンを用いていた。そこで本年度は、現場への適用性を考慮し、送受信可能な探触子の設計と試作を行った。素子からの音場だけではなく、電気インピーダンスも考慮しながら素子サイズを設計した。さらに、レーザ振動計による計測により、不感帯の原因も検討し、その低減にも成功した。その結果、大型の鉄鋼試験片において、これまでは観察できなかった底面エコーを明瞭に観察できることを確認した。[2]映像化アルゴリズムの構築:試作した探触子を用いて、映像化の基本性能を確認した。その結果、昨年度までは高額なレーザ干渉計が必要だったが、今回は送受信同一の探触子での計測ができる目途が立った。当初の予定通り、進んでいる。1.低周波送信探触子の高性能化:高散乱のコンクリート部材には、アレイ探触子の高性能化が必須である。そこで、音場と電気インピーダンス整合の両面から、対象に応じた素子構造の設計指針について検討した。素子サイズを小さくすると、広範囲に音場が広がるが、単位面積当たりのエネルギーは小さくなるため、SN比の低下につながる。一方、素子サイズを大きくすると、直下方向に強い音場を持つが、高効率圧電材料を用いると、電気インピーダンスの低下が問題となる。

本年度は、様々なサイズの素子を試作し、電気インピーダンス、音場計測を行うことで、検査範囲に応じた最適設計があることを実験的に確認した。2.試作した低周波アレイ探触子と映像化アルゴリズムを用いた低周波非線形超音波映像法の実装として、LabVIEWによりユーザーフレンドリーな映像化プログラムを構築した。これにより、映像化だけではなく、映像化範囲各点の波形解析・周波数解析も容易に実現可能となった。以上より、低周波非線形超音波映像法の基盤を確立した。高度経済成長期に建設されたインフラの経年劣化が社会問題となっているが、その安全性保障のための非破壊検査法の開発が喫緊の課題である。しかし、インフラの大半を占めるコンクリートは金属より遥かに不均質で高減衰のため、MHzの周波数帯域を用いる通常の超音波法では計測できない。本研究では、コンクリート構造物の閉じたき裂の低周波非線形超音波映像法の創出を目的として、その基盤技術を開発した。送信に接触探触子を用いて、受信にレーザ振動計走査を用いた基礎実験でその有効性を実証した。さらに、高効率な送受信圧電探触子の試作、ユーザフレンドリーの映像化プログラムの試作も行った。当初の予定通り、進んでいる。「低周波送信探触子の改良」を引き続き遂行するとともに、より現場に近い試験片での実証試験を検討する。非破壊検査本年度遂行した「コンクリート試験片の準備」および「低周波送信探触子の検討」を引き続き遂行するとともに、レーザ振動計スキャンによる伝搬・散乱挙動の可視化、遅延則や周波数ファイル処理を採用した映像化アルゴリズムの構築を行う。当初、初期設計に基づき低周波探触子を大量に作製しアレイ化を行う予定だったが、平成27年度に低周波送受信探触子の設計改良を続けた結果、当初の想定以上に大幅に性能が向上した探触子を試作できる目途が経った。そこで、改良された設計に基づき、次年度探触子を大量に試作し、アレイ化することで、当初の想定より高性能なアレイ探触子を実現できると考えられることから、探触子の大量作製を次年度に行うこととした。未使用額はその経費に充てることとしたい。平成26年度に、コンクリート試験片結果での波形計測がメインの基礎実験結果について学会等で発表する予定であったが、更に実験を進めることで、映像化結果も含めたよりインパクトのある形での発表が可能になることが分かったため、計画を変更し、次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。アレイ探触子作製の経費に使用する予定である。学会発表の経費に使用する予定である。
酵素合成される新規プロ型アスコルビン酸の活性酸素消去能と自己免疫疾患への応用

これまで我々は、アスコルビン酸(AsA)の安定型誘導体である2-O-α-Dグルコピラノシル-L-アスコルビン酸(AA-2G)が、哺乳動物α-グルコシダーゼ、イネ種子α-グリコシダーゼやバチラス属CGTaseの糖転移反応により合成され、動物の細胞や生体に投与するとビタミンC活性を発揮することを見いだした。さらにこのものは、AsA同様コラーゲン合成をも促進することを証明した。今回は、本化合物の免疫活性を調べると共に、活性酸素障害治療薬としての可能性を追究する目的で、若干の研究を行なった。その結果、(1)AsAは、in vitro脾細胞培養系において、培養開始時にその適当量を添加しても免疫賦活作用は認められなかったが、AA-2Gには強い免疫賦活作用が認められた。(2)そこで、この原因がAsAの不安定性に基づくものと考え、頻回添加を試みたところ、AsAにもAA-2G同様の活性が認められるようになった。(3)AA-2Gのこの作用はα-グルコシダーゼ阻害剤キャスタノスペルミンの存在下では消失した。以上の知見は、AA-2Gの作用は細胞表面又は細胞内で酵素的にAsAが適量かつ持続的に遊離され、遊離されたAsAが免疫賦活作用をを示していることを示唆するものである。(4)次に白血球や鶏胚線維芽細胞を用いて、in vitro実験でAsAとAA-2Gの細胞障害性を比較したところ、0.5mM以上においてAsAに強いラジカル反応に基づく細胞障害性が見られたのに対し、AA-2Gには全くそのような障害性は認められなかった。この障害性はカタラーゼの添加で抑制された。(5)さらにAsAとAA-2Gを培養細胞に添加し、細胞内に取り込まれたAsA含量を調べたところ、AsA添加時には、きわめて大量のAsAが細胞内に認められたが、AA-2G投与の場合には少量であった。両者の生物活性が同等に認められることから、過剰に取り込まれたAsAが細胞障害の原因と考えられた。(6)鶏胚を用いたハイドロコーチゾン誘導白内障のモデルに対し、AA-2GはAsAに比べ有意に強くこれを抑制した。この原因としてグルタチオンの増量が示唆された。AsAとAA-2Gに関し、活性酵素のスカベンチャーとしての有効性については小腸刷子縁膜の脂質過酸化に対する抑制作用の予備的検討を現在行っている。申請者らは哺乳動物組識ホモジネ-トを用い、アスコルビン酸(AA)とマルト-スより新規安定型アスコルビン酸誘導体が生成すること,さらにはその構造が2ー0ーαーDーグルコシルーLーアスコルビン酸(AAー2G)であることを決定した。本酵素はαーグルコシダ-ゼであることが判明したので、AAー2Gの量産を目的に、種々の糖転移酵素をスクリ-ニングした結果、コメ種子αーグルコシダ-ゼやシクロデキストリングルカノトランスフェラ-ゼ(CGTase)にもAAー2G生成活性のあることを見出した。

今回、標記研究課題を逐行するため、CGTaseを用いAAー2Gの量産を行った。即ち、反応液中にAA500g、αCD1000g、B.stear othermophilus由来CGTase400,000単位を加え、pH5.5に調整し、60°C,24hr糖転移反応を行った。反応後CGTaseとAILー1010を用い限外濾過により系から除いた。その後15,000単位のグルコアミラ-ゼを加え、pH4.5、50°C、24hrで加水分解し、中間体として得られるマルトオリゴアスコルビン酸をすべてAAー2Gとした。反応後、アミラ-ゼは前述と同様の方法で系から除いた。この際のAAー2Gの含量は33%であった。AAー2Gはイオン交換樹脂、アンバ-ライトHFSー471X、3×400cmで精製した。最終的にAAー2Gは97%純度で250g得られた。AAー2Gは熱,光、酸化的条件下においても極めて安定であることは既に判明している。生理活性に関しても、ヒト皮膚線維芽細胞コラ-ゲン合成促進作用ならびに抗壊血病活性を有していることが証明されている。本研究における課題の一つは、AAー2Gの自己免疫への応用を考えているが、培養リンパ球等を用いる基礎研究においては本来AAの細胞障害性が問題となっている。そこでAAとAAー2Gのin vitro細胞障害性に関し、マウス脾細胞及び鶏胚細胞を用い、比較したところ、AAー2Gには細胞障害性のないことが判明した。これまで我々は、アスコルビン酸(AsA)の安定型誘導体である2ーOーαーDーグルコピラノシルーLーアスコルビン酸(AAー2G)が、哺乳動物αーグルコシダ-ゼ、イネ種子αーグリコシダ-ゼやバチラス属CGTaseの糖転移反応により合成され、動物の細胞や生体に投与するとビタミンC活性を発揮することを見いだした。さらにこのものは、AsA同様コラ-ゲン合成をも促進することを証明した。今回は、本化合物の免疫活性を調べると共に、活性酸素障害治療薬としての可能性を追究する目的で、若干の研究を行なった。その結果、(1)AsAは、in vitro脾細胞培養系において、培養開始時にその適当量を添加しても免疫賦活作用は認められなかったが、AAー2Gには強い免疫賦活作用が認められた。(2)そこで、この原因がAsAの不安定性に基づくものと考え、頻回添加を試みたところ、AsAにもAAー2G同様の活性が認められるようになった。(3)AAー2Gのこの作用はαーグルコシダ-ゼ阻害剤キャスタノスペルミンの存在下では消失した。以上の知見は、AAー2Gの作用は房胞表面又は細胞内で酵素的にAsAが適量かつ持続的に遊離され、遊離されたAsAが免疫賦活作用を示していることを示唆するものである。(4)次に白血球や鶏胚線維芽細胞を用いて、in vitro実験でAsAとAAー2Gの細胞障害性を比較したところ、0.5mM以上のにおいてAsAに強いラジカル反応に基づく細胞障害性が見られたのに対し、AAー2Gには全くそのような障害性は認められなかった。この障害性はカタラ-ゼの添加で抑制された。(5)さらにAsAとAAー2Gを培養細胞に添加し、細胞内に取り込まれたAsA含量を調べたところ、AsA添加時には、極めて大量のAsAが細胞内に認められたが、AAー2G投与の場合には少量であった。両者の生物活性が同等に認められることから、過剰に取り込もれたAsAが細胞障害の原因と考えられた。(6)鶏胚を用いたハイドロコ-チゾン誘導白内障のモデルに対し、AAー2GはAsAに比べ有意に強くこれを抑制した。
視細胞に必須の抗酸化酵素：遺伝性網膜変性における役割について

遺伝性網膜変性に対する抗酸化療法については基礎研究レベルでは多数の候補物質が報告されている。最近グルタチオンペルオキシダーゼ4(Gpx4)が視細胞にとって必須の抗酸化酵素である事が見出されたため、本研究ではGpx4の遺伝性網膜変性への関与について検討した。その結果、遺伝性網膜変性モデルマウスにおいて、Gpx4が網膜変性の進行に関与する知見を得た。Gpx4は遺伝性網膜変性疾患における進行抑制治療のターゲット候補となる可能性が示唆された。先ず、rd1のバックグラウンドでGPx4+/-とGPx4+/+のマウスを作製した。P12, P16, P21で眼球摘出し、固定、HE染色で視細胞層の厚さの定量を行った。また、桿体視細胞と錐体視細胞への分化が完了するP7P12時点においては、各種opsinの発現量などに差がないかreal-time RT-PCRで評価した。GPx4の発現減少によって網膜変性が進行しやすくなる知見を得た。また、GPx4+/-マウスの網膜では、GPx4+/+マウスの網膜と比較して、ミトコンドリア量(mitochondrial biomass)が減少していることがミトコンドリアDNA量の検討によって示唆された。また、網膜色素上皮細胞のcell line (ARPE-19)を用いる実験も行った。これまでにARPE-19に視細胞外節を貪食させるとPGC-1αを誘導発現することが報告されてきた。GPx4も他の抗酸化酵素と同様にperoxisome proliferator-activated receptor γcoactivator-1α(PGC-1α)の下流に位置している。そこで、ARPE-19培養細胞に視細胞外節を貪食させ、ARPE-19細胞を回収してmRNAの発現レベルを検討したところ、GPx4を含む種々の抗酸化酵素の発現が上昇していることが確認された。網膜予備実験で示唆された事項が確認された。網膜色素上皮細胞と視細胞の関連の中でもGPx4の発現が調節されていることが分かった。また、ミトコンドリア量が減少していることがミトコンドリアDNA量の検討によって示唆された。また、網膜色素上皮細胞のcell line (ARPE-19)を用いGPx4が視細胞外節貪食後に上昇していることが確認できた。網膜色素上皮と視細胞外節貪食の関連からin vitroの研究を進める。予備実験で示唆された事項が確認された。
気相合成法を利用したポリマー基ナノ・マイクロコンポジットの新しい製法の研究

本研究では蒸着法を応用した新しい複合材料作製法を用いることで高分子材料と硬質材料のコンポジットを作った。本手法により溶融可能な高分子に対して非晶質炭素やシリカなどの硬質無機材料のサブミクロンスケールでの分散が可能となった。また、既存の混錬法などの複合化手法よりも簡便にコンポジットが作製できるようになり、さらにはプラズマ処理を施すことによって界面が親和性を帯び、界面接着が良くなる場合もあった。高分子母材としては最も汎用的に使用されているポリエチレンに焦点をあてた。また、分散材としては非晶質炭素および酸化ケイ素を用いて大気圧下において複合材料作製を試みた。作製したコンポジットの構造評価および物性評価を実施した。コンポジットの構造評価を行ったところ、光学顕微鏡および動的光散乱法を用いることにより分散材のサブミクロンスケールでの分散が確認された。また、分散させる際のポリマー溶融体母材の粘度が分散させる非晶質炭素のサイズに大きく影響することがわかった。これより、あらかじめ高分子母材の粘度を決めることで分散材の粒径をコントロールすることが可能となることがわかった。また、実験条件を大気圧下から真空下へと移行して予備実験を実施した。ここでは、母材として同様のポリエチレンを、分散材としてDLC(非晶質炭素の1種)を用いてコンポジット作製を行った。その評価を大気圧下と同じように行ったところ、DLC含有にともないヤング率の増加が確認された。これは材料内部でDLCが強化材として機能したと考えられる。また、熱物性試験結果により材料の融点、結晶化温度の上昇が確認された。これはDLCが複合材料内部で有効に結晶核剤として機能したことを意味していると考えられる。本研究では蒸着法を応用した新規手法を用いることで高分子材料と硬質材料のコンポジットを作製した。この方法により溶融可能な高分子に対して非晶質炭素やシリカなどのサブミクロンスケールでの分散が可能となった。また、これまでの方法よりも容易にコンポジットが作製できることが考えられ、さらにプラズマ処理を施すことによって界面が親和性に優れることが予想される。まず、高分子母材としては最も汎用的に使用されているポリエチレンを、分散材としては非晶質炭素を用いて実験を行った。その作製したコンポジットの評価を、構造評価、物性評価の観点から行った。コンポジットの構造評価を行ったところ、光学顕微鏡および動的光散乱法を用いることにより非晶質炭素のサブミクロンスケールでの分散が確認された。また、分散させる際のポリマー溶融体母材の粘度と分散させる非晶質炭素に関係性があることがわかった。次に熱物性評価を行ったところ、非晶質炭素の分散によって結晶化温度が向上した。これは、分散した非晶質炭素が結晶核として作用していることが考えられる。また力学物性評価を行った結果、コンポジット材はもとの材料に比べて弾性率、破断ひずみともに増加する傾向がみられた。特に破断ひずみに関しては、微細スケールの粒子の分散によって著しく増加しており、高分子内部で非晶質炭素が擬似架橋のような役割を果たしていることが示唆された。
腫瘍選択的高分子ミセルMRI造影剤

本研究の目的は、MRI造影剤を疎水・親水の2層構造を有する「高分子ミセル」の内殻に内包し、画像強調能力を固形がんにおいて発揮させ、微小ながん組織を選択的に強調できる新規MRI造影剤を開発することである。In vitroにおいて、目的とするMRI造影剤の作製を達成し、MRI造影効果の制御が可能であることを示した。また、in vivoにおいては固形がんへのターゲティングを達成し、MRIによって画像強度の増加が認めら、本MRI造影剤が固形がんのイメージングに応用できることが示唆された。本研究の目的は高分子ミセルを用いて、がん組織のみに画像を強調できるMRI造影剤の開発を行うことである。平成20年度の研究実施計画及びその成果は、下記の通りである。1. In vitro高分子ミセル型MRI造影剤の作製とその評価2. In vivo高分子ミセル型MRI造影剤の評価本年度、ポリエチレングリコールーポリリシン(PEG-P(Lys))からなるプロックコポリマーに対して、ポリエチレングリコール-ポリアスパラギン酸(PEG-P(Asp))をカウンターポリアニオンとして用いて、高分子ミセルの作製と疎水性内殻の緩和能への影響を検討した。また作製した高分子ミセル型MRI造影剤のin vitro実験を行った。1.高分子ミセル型MRI造影剤の作製PEG-b-P(Lys)からなるカチオン性プロックコポリマーに対となるポリアニオンを加え、高分子ミセルの調整を行った。PEG-P(Asp)に疎水性基であるベンジル基または、ヘキサデシル基を任意の割合で導入し、疎水性度と緩和能の変化について検討した。9.4Tの磁場において、疎水性基が低導入率の場合と、疎水性基の高導入率の場合に緩和能が減少した。これは疎水性相互作用とイオン相互作用のどちらも高分子ミセル形成への影響が緩和能に影響していることを示唆している。2.高分子ミセル型MRI造影剤のin vitro評価作製した高分子ミセルMRI造影剤の細胞毒性試験を行った。アニオン/カチオン比が1以上となる高分子ミセルMRI造影剤の細胞毒性は、MCF-7細胞においてほとんど示さないのに対して、それ以下となり、カチオン比が現れるとそれに対応して毒性を顕著に示すことが分かった。この高分子ミセルMRI造影剤は、細胞レベルにおいて安定な高分子ミセルを形成していることが分かった。本研究で作製した高分子ミセル型MRI造影剤のin vitro評価を行い、次年度に行うin vivo試験に向けて基礎的な評価を行った。当該年度において、昨年度までにin vitro試験によって得られた結果を基に、in vivo試験とMRI実験を行った。In vitro動物試験によって固形がんへのMRI造影剤のターゲティングを行うにあたり、作製した高分子ミセルMRI造影剤の血液中における安定性を評価した。高分子ミセルの作製条件を検討することによって、血中循環の安定性を改善することができた。これは、正常組織への余分なターゲティング(肝臓、脾臓)を極力減らし、ターゲットである固形がんへの選択性を高めることに対して重要な条件である。マウス固形がん(Colon26)に対して、上記血液循環が安定であった高分子ミセルMRI造影剤を用いて行ったとtころ、固形がんへの本MRI造影剤のターゲティングに成功し、MRIのT1強調画像法によって腫瘍の画像強調が投与前に対して、増強されることを確認した。当該研究において行ったin vivo固形がんイメージングは、in vitroにおいて達成された血液-固形がんにおけるMRI造影効果を制御する概念を直接反映するものではないため、ターゲティングの成功とイメージングの増強に関しては完全に一致するとは言えない。今後、固形がんにターゲティングされたMRI造影剤の造影効果がどのように変化していくのかを検討することによって、MRIによってさらに画像が増強されることが期待され、MRIによる画像化の有効性が高まると考えられる。当該研究における高分子ミセルMRI造影剤は固形がんのイメージングに有効であることが示唆された。
多項式環のwild自己同型に関する研究とその多変数公開鍵暗号への応用

本研究は、Affine代数幾何において重要な対象であるwild集合を調べ、新しい暗号方式を開発するというものである。現在広く使われている暗号方式は、量子コンピュータという、現在のコンピュータと異なる原理に基づくコンピュータが完成すると使えなくなってしまうことが知られている。量子コンピュータに耐えうると考えられている効率の良い暗号として、多変数暗号を挙げることができるが、多変数暗号に属する既存方式で実用的なものは少なく、新しい方式の提案が望まれていた。本方式は、多変数暗号の一方式であり、暗号には積極的には応用されてこなかった、wild集合という暗号の安全性を高めると考えられる対象を用いている。安全性と効率性の両面を備える、次世代の暗号方式の開発が期待される。当初の研究計画では、1、(1)、wild集合の生成法の開発、(2)、wild集合の評価、(3)、wild集合を用いた暗号方式の開発、という三段階に分類し、今年度は1(1)と1(2)を部分的に行うとしていた。実際の本年度の研究では、1(1)を重点的に進めたため、1(2)について時間を取ることはできなかった。一方、1(2)の部分も含め、暗号の研究者と議論する方が適切だと考え、1(3)の研究を進めることとした。具体的には、2、(1)wild集合の生成法の開発、(2)wild集合を用いた暗号方式の開発、の二点について具体的に研究を進めた。2(1)については、多項式環の研究者との議論を行いながら、wild集合と思われる集合の元を生成する具体的な手順を開発した。また、計算機上に実装を行い、与えた手順が効率的に動作することを確認した。2(2)については、2(1)の生成手順を組み込んだ上、既存の多変数暗号を模倣することで、新しい暗号方式を構成した。これにより、wild集合を用いた新しい暗号方式が開発されたと考えることができる。
アジア諸国の緑化に資する制度的機構としての参加型森林管理

本研究の目的は、参加型森林管理の成功例として様々な側面から研究されてきたインドのJoint Forest Management(以下、JFM)を基準として用いて、アジア諸国の比較研究を実施することによって次の諸点を明らかにすることであった。1.アジア諸国における参加型森林管理の制度的・政策的な特徴の解明。2.アジア諸国における参加型森林管理の実施に関わるステークホルダーの役割および特徴の解明。3.参加型森林管理に関する議論がコモンズ論に果たす理論的貢献の検討。前年度までの研究によって,タイ,ラオス,フィリピン,インドを訪問して主な情報収集は終了したので、本年度は研究成果をまとめて投稿論文等の原稿を複数作成した。また,8月に外国人特別研究員(バローニー氏)をオーストラリアのブリスベンで開催された国際森林学会(IUFRO)に出張させ、研究成果の一部を下記の題名にてポスター発表を行った。今年度の研究目的は、参加型森林管理の成功例として様々な側面から研究されてきたインドのJoint Forest Management(以下、JFM)を基準として用いてアジア諸国の比較研究を実施することによって、(1)アジア諸国における参加型森林管理の制度的・政策的な特徴を解明し、(2)アジア諸国における参加型森林管理の実施に関わるステークホルダー(政府・NGO・資金提供組織など)の役割および特徴を解明することであった。そのため、研究分担者がラオス、フィリピン、インドを訪れて情報収集をおこなうとともに、主要な利害関係者からのインタビューを実施した。その結果として国際学術雑誌に論文を3編投稿し、国際学会での発表用論文を1編準備し、英字新聞の記事を1編投稿した。まだ審査中であるので雑誌名は明記しないが、投稿論文の著者およびタイトルは下記の通りである。
スラスタ駆動式水中回転弾性アームの位置決め制御

DCモータなどにより回転軸にトルクをかけてアームを回転させる従来の水中アームでは、付加質量による慣性力や速度の2乗に比例する流体抗力などの大きな流体力によりアーム付け根に大きな曲げ応力が生じてしまう。そこで本研究では、アーム先端付近に取り付けられたスラスタにより最大曲げ応力を抑えてアームを回転させるスラスタ駆動式水中回転弾性アームを提案し、その位置決め制御システムの設計手法を最適制御理論をもとに確立した。さらに、水中回転弾性アーム模型を製作し、パソコンを中心に制御システムを構築、位置決め制御実験を行い、開発された制御システムの有効性を確認した。本研究により得られた主な成果を以下に示す。1.長さ0.8m、外径19mm、内径17mmのアルミ製アームを1秒以内に90度位置決めさせることを目標に最大推力が30Nのスラスタを製作した。スラスタの推力が大きくなり制御時間が短くなるにしたがい、スラスタの動特性が無視できなくなることが明らかになった。そこで、スラスタの動特性を表す式をスクリューに関する運動量理論、トルクと流体抵抗の関係などより導き、スラスタモデルを確立した。そしてモデルの妥当性をステップ応答実験により確認し、モデルの係数をステップ応答実験より決定する方法を開発した。2.計算機シミュレーションおよび制御実験より、スラスタモデルに最適制御理論を適用するための線形化は最大推力の1/2のところに注目して行えばよいことが明らかになり、スラスタモデルの線形化手法を確立した。そしてスラスタの動特性を考慮することにより水中アームを速やかに位置決めさせられることを確認した。3.スラスタ駆動式水中回転弾性アームの場合、収束時間がほぼ同じである回転軸駆動式に比べ、アームに生ずる最大曲げ応力を約1/4に抑えられることが明らかになった。
脱硫菌とPAH分解菌による芳香族縮合型複素環化合物分解マトリックス構築と環境浄化

1.微生物分解経路の解析およびマトリックスの作成微生物分解マトリックス化試験の対象化合物として、遺棄化学兵器のモデル化合物クロロエチルエチルスルフィド(CEES)、クロロエチルフェニルスルフィド(CEPS)の分解を検討した。研究室保存のベンゾチオフェン(BT)およびジベンゾチオフェン(DBT)脱硫菌計8株を用いて、CEES、CEPSを唯一の硫黄源として生育する菌(脱硫菌)を選抜した。これらの基質を資化生育する菌株はすべてBT脱硫菌であり、両基質の脱硫菌3株を用いて、代謝物の解析を行った。現在のところ、CEPSについてのみ分解代謝物が得られており、S酸化化合物であるスルホン、脱塩素化合物がGC/MSにより同定されている。脱硫された代謝物を検出できていないため、継続して検討し、CEES, CEPSの脱硫分解経路を明らかにするとともに、分解関連酵素の影響についても明らかにする。2.分解関連遺伝子の解析1.微生物分解経路の解析およびマトリックスの作成:微生物分解経路の解析は、新たに検討開始した化合物(CEES、CEPS)の脱硫菌の選抜に成功したことから、詳細な検討を進める基盤ができたといえる。2.分解関連遺伝子の解析:遺伝子破壊株ライブラリーの構築と当該ライブラリーからの脱硫能欠損株の選抜は、解析結果から選抜方法の適正が検証されたため、学会発表を行った。前者は、分解経路の全容解明が必要であり、後者は、分解に直接関連する酵素系遺伝子や分解オペロンに関連する遺伝子破壊株の取得ができれば、さらに成果発表可能である。いずれも最終目標に達したとは言えないが、検討の基盤を確立した。以上のことから、当該年度計画事項に関しては概ね順調に進展していると言える。1.分解関連遺伝子解析ー前年度に検討を開始した分解関連遺伝子解析を継続し、分解酵素遺伝子の発見を目指す。2.新規微生物の探索ー微生物ライブラリーの拡充を目的として国内外環境試料からの各種芳香族縮合型複素環化合物分解菌の探索を高塩濃度条件下で実施することで新種微生物の取得をめざす。国内試料として周辺の土壌試料だけでなく、動物の糞内の腸内微生物など、これまで検討の少なかった試料を用いた探索を試みる。従来法にみられる炭素源としての分解菌の探索は行わず、培地に硫黄源フリー培地にDBTなどの有機硫黄化合物を唯一の硫黄源とする集積培養を行うことで新規微生物取得の可能性を高くする。3.微生物ライブラリーによる複合基質の分解ー環境中での分解挙動を知るために、基質を混合し、上記分解マトリックスデータを元に選抜した分解微生物と複合基質の分解経過を解析する。各種基質の分解の優先順位、分解微生物を混合した場合の残存性と培地組成の関係を明らかにする。4.芳香族縮合型複素環化合物(ACHC)分解速度の改良ー前年度既に検討を開始し、分解を確認した化学兵器モデル化合物CEES、CEPSと脱硫遺伝子群dsz発現ベクターによる組換え菌を用いた分解速度の改良を実施する。1.微生物分解経路の解析およびマトリックスの作成微生物分解マトリックス化試験に先立ち、芳香族縮合型複素環化合物と環境汚染に関する文献調査を行い、検討基質として脱硫分解報告が少ないもの(チアンスレン(TH))、脱硫分解報告がないもの(フェノキサチイン(PX)、フェノチアジン(PH)、スルファメトキサゾール(SMX))を選抜した。研究室保存の各種有機硫黄化合物分解菌を用いて培養試験を行ったところ、DBT脱硫細菌R.erythropolis KA2-5-1はTH、PX、PHを唯一の硫黄源として生育した。さらに上記培養抽出液のGC-MS解析結果から、分解中間体の構造を推定した結果、スルホン化合物を経由するこれまで報告のない代謝経路によることを明らかにした。また、Gordonia sp. TM414株はTHを同様に分解することも明らかにした。2.分解関連遺伝子の解析上記分解特性の結果と分解遺伝子の関連を明らかにすることを目的に、KA2-5-1株由来の脱硫遺伝子群dszA, B, CをRhodococcus sp.を宿主として発現する各種発現ベクターを用いて評価した。その結果、KA2-5-1株において認められた分解基質をいずれも同じ分解経路で分解することが分かり、dsz遺伝子群が分解に関与していることが明らかとなった。ベンゾチオフェン(BT)の硫黄分を選択的に酸化除去する能力(以下BT脱硫)のあるRhodococcus jostii T09株のBT脱硫遺伝子解明を目的に、T09遺伝子破壊株を構築するための基礎的検討を行った。トランスポゾンベクターの電気パルス法による検討の結果、生育培地および電圧が形質転換効率に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。微生物分解経路の解析は、質量分析により中間代謝物の構造を速やかに明らかにすることができたため、学会発表を行った。形質転換効率が不明であったため、トランスポゾンベクターを用いた遺伝子破壊株構築が不確定要素であったが、順調に立ち上げることができ、条件の最適化によりライブラリー構築の目途が立った。以上のことから、初年度計画事項に関しては概ね順調に進展していると言える。

これらの基質を資化生育する菌株はすべてBT脱硫菌であり、両基質の脱硫菌3株を用いて、代謝物の解析を行った。現在のところ、CEPSについてのみ分解代謝物が得られており、S酸化化合物であるスルホン、脱塩素化合物がGC/MSにより同定されている。脱硫された代謝物を検出できていないため、継続して検討し、CEES, CEPSの脱硫分解経路を明らかにするとともに、分解関連酵素の影響についても明らかにする。2.分解関連遺伝子の解析1.微生物分解経路の解析およびマトリックスの作成:微生物分解経路の解析は、新たに検討開始した化合物(CEES、CEPS)の脱硫菌の選抜に成功したことから、詳細な検討を進める基盤ができたといえる。2.分解関連遺伝子の解析:遺伝子破壊株ライブラリーの構築と当該ライブラリーからの脱硫能欠損株の選抜は、解析結果から選抜方法の適正が検証されたため、学会発表を行った。前者は、分解経路の全容解明が必要であり、後者は、分解に直接関連する酵素系遺伝子や分解オペロンに関連する遺伝子破壊株の取得ができれば、さらに成果発表可能である。いずれも最終目標に達したとは言えないが、検討の基盤を確立した。以上のことから、当該年度計画事項に関しては概ね順調に進展していると言える。1.分解関連遺伝子解析ー前年度に検討を開始した分解関連遺伝子解析を継続すると共に保存菌株プロモータの遺伝子解析を実施する。すなわち、微生物ライブラリーに含まれているPseudomonas putida HKT554の分解関連遺伝子であるナフタレンジオキシゲナーゼのプロモータ配列を明らかにする。2.新規微生物の探索ー微生物ライブラリーの拡充を目的として国内外環境試料からの各種芳香族縮合型複素環化合物分解菌の探索を高塩濃度条件下で実施することで新種微生物の取得をめざす。国内試料は沖縄、高尾山周辺の土壌試料を用い、国外試料はMOU契約を締結済みのチュニジアにて収集する。チュニジアでの試料収集はBorj-Cedriaecopark研究所環境分野助教Dr. Leila Ben Moussa El Bassi、准教授Dr. El Akrem Hayouniの協力のもとに行う。また、従来法にみられる炭素源としての分解菌の探索は行わず、培地に硫黄源フリー培地にDBTなどの有機硫黄化合物を唯一の硫黄源とする集積培養を行うことで新規微生物取得の可能性を高くする。文献調査から、酵母類にも脱硫分解活性の可能性があるため、酵母による分解検討を追加実施する。3.微生物ライブラリーによる複合基質の分解ー環境中での分解挙動を知るために、基質を混合し、上記分解マトリックスデータを元に選抜した分解微生物と複合基質の分解経過を解析する。各種基質の分解の優先順位、分解微生物を混合した場合の残存性と培地組成の関係を明らかにする。4.芳香族縮合型複素環化合物(ACHC)分解速度の改良ー前年度既に検討を開始している脱硫遺伝子群dsz発現ベクターによる組換え菌を用いた分解速度の改良を継続する。1.分解関連遺伝子解析ー前年度に検討を開始した分解関連遺伝子解析を継続し、分解酵素遺伝子の発見を目指す。
デュアルイオン液体ゲートによる超低消費電力グラフェンデバイスの開発

当該年度では、イオン液体ゲートを用いた電界印加方法で二層グラフェンのバンドギャップ形成を行い、その物性研究とデバイスへの応用開発を行った。グラフェン上部にイオン液体を接触させ電界を印加することにより、0235meVバンドギャップ制御が可能であることを電気測定から確認した。また、バンドギャップ形成による二層グラフェンの物性への影響を調べるため、電界強度を変化させながらラマン分光測定を行った。1600cm^<-1>付近に観測される対称性の違う2つのフォノンピークの強度とエネルギーを解析することより、電界印加はKohn anomalyを介して光学フォノンのエネルギーを増減させ、また、対称フォノンと反対称フォノンの混成の強さに影響を与えることが分かった。これらの電界依存性は、バンドギャップ形成がバンド内電子遷移とバンド間電子遷移の強度を増減させることに起因する。さらに、グラフェントランジスタの特性向上および低電圧化を試みる研究を行った。イオン液体に電圧を印加することによって生じる厚さ35nmの電気二重層により、イオン液体ゲートは300nmのSiO_2ゲート絶縁膜用いたバックゲートの200倍の効率で電界印加が可能であることが分かった。さらに、グラフェンを基板から浮かした構造を作製し、グラフェン下部に接触させたイオン液体ゲートで動作させることで、移動度・on/off比・動作電圧の改善を行った。結果、わずか3Vのゲート電圧動作で20の高いon/off電流比を得るデバイスを作製することが出来た。当該年度の研究結果により、イオン液体を用いた二層グラフェントランジスタの物性と優れた特性を解明した。また、イオン液体を用いたグラフェン下部からの電界印加に成功したことにより、二つのイオン液体をグラフェンの上下方向から接触させた「デュアルイオン液体構造」作製が可能であること、そして、超低電圧デバイス実現への見通しを得た。(抄録なし)当該年度では、イオン液体ゲートを用いた電界印加方法で二層グラフェンのバンドギャップ形成を行い、その物性研究とデバイスへの応用開発を行った。(抄録なし)
FEN1はアンチエイジングに関与しているか?

(1)ヌクレアーゼ活性を失わせたFEN1(nuclease-defective FEN1, ND FEN1)をコラーゲンプロモータにより発現させたトランスジェニックマウスを長期間観察した結果、一部のトランスジェニックマウスに脱毛や体重減少、脾臓の肥大化、腎臓ののう胞形成など早期の老化によるものと思われる形態学的変化を認めた。しかしながら脊髄の側弯や寿命の短縮は認められなかった。(2)このマウスに長期間(5か月)にわたって紫外線(UV-B)の皮膚照射を続けた後、紫外線照射からの回復過程を観察するとNDFEN1トランスジェニックマウスでは22匹中13匹に悪性腫瘍の発生をみた。一方、野生型マウスでは24匹中7匹に悪性腫瘍の発生が認められた。(3)ND FEN1をテトラサイクリンの存在下で発現するように遺伝子組み替えをした細胞では、低酸素分在環境下において、DNA修復の制御に重要な役割を果たしているH2AXのリン酸化を抑制できない状態であることがわかった。これらの結果からFEN1の活性が失われるとDNAの修復が円滑に行われず、そのために更にH2AXの活性が亢進し、老化や紫外線に対する発癌作用を助長していると考えた。現在、in vivoとin vitroの両面からFEN1欠損が細胞や個体の老化に与える影響を検討中である。1)in vivoでは生後1年以上を経過したFENトランスジェニックマウス間で老化を示す組織学的な指標に差があるか否かを解析中である。現在までのところ(1)骨(2)皮膚(3)脾臓(4)心臓(5)卵巣についてパラフィン包埋した切片上での解析を進めているが、両者間に大きな差異は認められていない。但し、FEN1トランスジェニックマウスでは脾臓にのう胞を形成している個体があり、このことが老化と関連性があるのかを検討中である。2)in vitroでは肺から単離した繊維芽細胞を使って、長期間継代し、その(1)分裂能(2)老化の進行を示す蛋白質(例えば、P21cip1)の発現レベルに正常マウスとFEN1トランスジェニックマウス間で差異があるか否かを解析中である。更に我々は老化とDNA修復との密接な関係に注目し、FEN1を不活性化させた時のDNA修復機構の変化について検討を開始した。この際用いたのはT24ヒト膀胱癌細胞に様々な遺伝子変異をおこさせたFEN1をテトラサイクリンにより発現誘導させることができるようにした細胞株、T24TR、T24WT、T24ND及びT24PCである。それぞれの特徴は以下のとおりである。T24TR......T24細胞に空のプラスミドを導入したものT24WT......野生型FEN1をテトラサイクリン存在下で発現するT24細胞株T24ND......同じくテトラサイクリン存在下でヌクレアーゼ活性を失ったFEN1を発現するT24細胞株T24PC......テトラサイクリン存在下でPCNAとの結合能力を失ったFEN1を過剰発現するT24細胞株以上の4種類のT24細胞株にX線やMMSにてDNA障害をひきおこした後DNA修復によるタンパク質の挙動にどのような老化が認められるかを現在解析中であるが、FEN1と修復タンパク質H2AXとの関連を示唆する結果が得られている。結果を第48回歯科放射線学会総会(大宮)にて発表予定である。本年度は、exonuclease活性を失わせたFEN1(nuclease-defective FEN1、ND FEN1)をコラーゲンプロモータにより発現させたトランスジェニックマウスに長期間(5か月)紫外線(UV-B)を皮膚に照射し続けた後、紫外線障害からの回復過程をやはり長期に亘って観察し、紫外線による癌化にFEN1がどのように関わっているかについて、検討した。事前に行ったパイロットスタディーでは紫外線を照射した3匹のトランスジェニックマウスの内、2匹で紫外線に照射した部分の皮膚に悪性腫瘍の発生を確認できた。一方、野生型のマウスでは3匹中、悪性腫瘍の発生を確認できたものは1匹もいなかった。組織学的には発生した腫瘍は2匹共に肉腫(fibrosarcoma)と考えられる。

現在遺伝子、蛋白発現様式等を解析中である。現在、トランスジェニックマウス、野生型マウス共に匹数を増やして照射実験が進行している。一方、in vitroにおいては野生型のFEN1を過剰発現させたヒトT24膀胱癌細胞ではコントロールのT24細胞と比べ増殖能力が促進されていることがわかった。これに対し、nuclease活性を失活させたFEN1(ND FEN1)を強制発現させたT24細胞とPCNAへの結合能力を失わせたFEN1(PC FEN1)を発現させた細胞ではコントロールと比べても増殖能力が低下していることがわかった。現在、このメカニズムについても解析中である。nuclease活性を失わせたFEN1(nuclease-defective FEN1,ND FEN1)をコラーゲンプロモータにより発現させたトランスジェニックマウスに長期間(5か月)紫外線(UV-B)を皮膚に照射し続けた後、紫外線障害からの回復過程をやはり長期に亘って観察し、紫外線による癌化にFEN1がどのように関わっているかについて、検討した。事前に行ったパイロットスタディーでは紫外線を照射した3匹のトランスジェニックマウスの内、2匹で紫外線に照射した部分の皮膚に悪性腫瘍の発生を確認できた。一方、野生型のマウスでは3匹中、悪性腫瘍の発生を確認できたものは1匹もいなかった。組織学的には発生した腫瘍は2匹共に肉腫(fibrosarcoma)であった。トランスジェニックマウス、野生型マウス共に匹数を増やして実験をした結果、トランスジェニックマウス22匹中13匹に悪性腫瘍の発生を確認できた。一方、野生型でも悪性腫瘍の発生は認めることができたが(24匹中7匹)、明らかな有為差があった。更にKaplan-Meier解析を行った結果、トランスジェニックマウスと野生型マウスとの間で、腫瘍の発生頻度ならびに発症時期の早遅に明らかな有為差を認めた。また、in vitro実験において、野生型FEN1を過剰発現させたヒトT24膀胱癌細胞とnuclease活性を失活させたFEN1を強制発現させた細胞とで、DNA障害刺激に対するH2AXのリン酸化に明らかな差が認められた。このことはFEN1がDNAの修復機構に重要な役割を荷っていることを示しており、ひいてはこの差が、in vivoでの紫外線照射後の組織修復過程ににおいてFEN1nuclease活性を失った皮膚線維芽細胞からより高頻度に悪性腫瘍が発生した原因の1つであると考えた。以上の結果は、平成21年度日本歯科放射線学会総会(大阪)で発表の予定である。また、結果を論文として公表する予定である。
非天然アミノ酸を認識するアミノアシルtRNA合成酵素の創製

本研究で作製した酵母チロシルtRNA合成酵素(TyrRS)の43位のチロシン残基をグリシンに置換した変異体(Y43G)は野生型のTyrRSが全く認識しない3-ヨードチロシンをtRNAに受容させることができる。そこで、Y43Gがその他のチロシンアナログを認識できるかどうかを、酸性PAGE法によって網羅的に解析した。その結果、多くの3-置換チロシンアナログを認識できることが示された。特筆すべきは光化学反応性の3-アジドチロシンをtRNAに受容できることである。これを生体外タンパク質系でタンパク質に部位特異的に導入させることができれば、他タンパク質との相互作用をたやすく解析することが可能になると考えられる。次に種々のチロシンアナログの中でY43Gのもっともよい基質であるDOPAをタンパク質に導入させることを試みた。もし、Y43GがサプレッサーtRNAに対して触媒的に働けば、部位特異的に、しかも効率よくDOPAをタンパク質に導入させることができるはずである。大腸菌の生体外タンパク質合成系に^14Cで標識されたDOPAを加え、モデルタンパク質であるGreen Fluorescent Protein(GFP)を合成させたところ、放射能の取り込みは見られなかった。しかし、GFPのアンバー変異遺伝子、アンバーサプレッサーtRNA、Y43Gと[^14C]DOPAを加えた場合には、GFPに放射能が取り込まれたことが観察された。このことは、GFP遺伝子のアンバー部位に特異的に[^14C]DOPAが取り込まれたことを示している。本研究では、アミノアシルtRNA合成酵素を改変し非天然アミノ酸をtRNAに受容させ、タンパク質に部位特異的に導入することを一つの目標にしており、上記の結果から、それを達成できたと考えられる。酵母チロシルtRNA合成酵素(TyrRS)のチロシン認識部位と考えられるアミノ酸残基をアラニンとグリシンに置換した10種類以上の変異体を作製した。ほとんどの変異体はtRNAにチロシンを受容させる活性を失っていたので、酸性PAGE法を用いてチロシンアナログ受容の可能性を探ったが、チロシンを認識しない変異体はどれもチロシンアナログを認識しなかった。しかし43位のチロシン残基をグリシンに置換した変異体(Y43G)はチロシンに対する活性を僅かに有していた。そこでtRNAにチロシンアナログを受容させるか検索したところ、種々の3位に置換基を持つチロシンアナログが受容された。特筆すべきは、野生型のTyrRSが全く認識しない3-ヨードチロシンをtRNAに受容させたことで、この意味では新規なTyrRSが創製されたと言える。次にY43Gの種々のチロシンアナログに対する速度論的パラメーターを求めた。その結果チロシンに対するKmは野生型と比較して80倍大きく、約1mMとなっていた。その他の3-置換チロシンアナログに対するKmもおおよそ、1mMとなっていた。このことは、チロシン認識部位のスペースが広がったことで、チロシンに対する結合能が低下したかわりに、置換基のあるチロシンを受け入れる余裕が生まれたということを示す。つまり非天然アミノ酸に対する特異性が上昇したとは必ずしも言えない。ただ3位に水酸基を持つDOPAに対するKmは0.5mMと3-置換チロシンアナログの中ではもっとも小さく、チロシンに対するKmよりも小さくなった。野生型TyrRSのDOPAに対するKmは1.8mMと大きいので、大腸菌の生体外タンパク質合成系にY43G、サブレッサーtRNA、DOPAを加えることで、サプレッサーtRNAが触媒的に働きながら、タンパク質の部位特異的にDOPAを導入することができるか試みる。
豚筋肉中に存在する発色促進成分の同定と有効利用

最近の肉製品加工業においては、一般に製造工程の短縮化が図られ、特にソ-セ-ジ類では、カッティング操作で原料肉に塩漬剤を添加後短時間内に加熱処理が行われている。この場合の発色反応は加熱工程で急速に進行し、この反応に筋肉成分、特に筋漿の低分子量(LMS)画分中の物質が促進効果を示すことが明らかにされてきた。本研究は、豚筋肉から発色促進成分を効率的に分離精製する方法を確立し、有効成分の同定ならびに作用効果を明らかにし、発色の観点から有効利用への可能性等を試みようと計画されたものである。まず豚筋肉から筋漿の抽出性について検討し、筋肉ホモジェネ-トをpH6.5に調整し1時間保持することによって最高の抽出性が得られることを確認した。また、LMS画分のゲルろ過において、溶出液として酢酸緩衝液(pH5.5)を使用することが最適であり、紫外部(248nm)吸収による溶出パタ-ンの作成ならびに各フラクションの発色促進効果を有するピ-クが、いずれも溶出液としてこの緩衝液を用いることにより明確に観察できた。続いて、LMS画分に存在する有効成分の作用について検討し、この成分の発色促進効果は、ヘム色素のニトロソ化反応の加速のみならずヘム色素の熱変性の促進に起因することを明らかにした。さらに有効成分の分離を試み、作用効果の強い画分は3種のアミノ酸を主成分とするペプチドであると推定できた。次に、高速液体クロマトグラフィ-による有効成分分取の諸条件を検討した。逆相シリカ系カラムを用い、トリフロル酢酸ーアセトニトリルの濃度勾配法により溶出した結果、ゲルろ過法で得た発色促進画分領域中の成分は、230nmにおける吸光度測定で78個のピ-クに分別することができた。筋漿低分子量(LMS)画分中の発色促進成分を豚筋肉から効率的に分離し、その成分を分取すると共に作用効果を明らかにすることを目的とし実験を進めた。LMS画分を調製する際に先ず豚の胸最長筋から筋漿を水で抽出するが、その際常法として行ってきたpH6.5に調整する方法が無調整よりも抽出性が良いこと、抽出時間は常法の1時間に対し1晩でも筋漿の収量に差異は無いことなどを確認した。また、LMS画分のゲルロ過を行い、LMS画分自体の最大吸収波長(248249nm)で溶出パターンを調べたが、溶出用緩衝液の種類によってはそのパターンが異なり、ミオグロビンと亜硝酸塩を用いた発色試験にも適する緩衝液を見出すのに多くの時間を費やした。すなわち、Veronal-酢酸緩衝液(従来から用いたが低温下で結晶が折出)とMcIlvaine緩衝液を用いた場合とで溶出パターンが異なり、さらに後者の緩衝液は嫌気的および好気的条件のいずれでもLMS画分の発色試験においてアセトンによる発色色素の抽出を阻害し、正確に発色の程度を測定することができなかった。そこで、酢酸緩衝液を用いて調べたところ、発色度の測定に何ら阻害効果を示さず低温下で成分の結晶も折出しなかった。これをLMS画分のゲルロ過に用いた場合、紫外部吸収のあまり高くない領域で発色促進効果を有するピークが明確に観察され、このパターンはニンヒドリン反応陽性物資のそれと一致した。次に有効成分分取の諸条件を見出すため、ペプチドに着目して、逆相シリカ系のカラムならびにトリフロル酢酸の水溶液とそのアセトニトリル溶液の濃度勾配溶出法により高速液体クロマトグラフィーを行った。