hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトｉＰＳ細胞に対する新規単クローン抗体の作成とその機能解析

多能性幹細胞研究において汎用されている抗体はヒトiPS/ES細胞ばかりでなく、EC細胞(胎児性がん細胞)をも認識する欠点を持つ。私たちは、本研究によりヒトEC細胞を認識しないヒトiPS/ES細胞マーカー抗体2種の作成に成功した。Rー10Gは抗TRA-1-60抗体と同様にケラタン硫酸を認識する抗体であり、これらの糖鎖はムチン様膜糖タンパク質であるポドカリキシン分子上に発現することを明らかにした。Rー17Fは、抗SSEA-3抗体と同様に膜脂質を認識する抗体であるが、ヒトiPS/ES細胞特異的な細胞障害活性をもつことを明らかにした。糖鎖認識抗体は細胞表面糖鎖の変化を鋭敏に察知するプローブであり、ヒトiPS/ES細胞のマーカー抗体としても広く利用されている。しかしながら、これら既存の抗体のほとんどがEC細胞(embryonal carcinoma cell、胎児性がん細胞)を免疫原として得られたものであり、iPS /ES細胞に特異的な成分を認識するものではない。申請者らは、これまでの研究によりヒトiPS細胞を免疫原としてマウスを免疫し、iPS/ES細胞に特異的な2種の単クローン抗体(R-10GおよびR-17F)の作成に成功している。iPS細胞表面のR-10Gエピトープは低硫酸化ケラタン硫酸(硫酸化ポリラクトサミン骨格を持つ)であり、このエピトープはポドカリキシンというI型膜タンパク質上に発現することを明らかにしている。その後の研究により、R-10Gエピトープは、意外にも、ヒトiPS/ES細胞以外にヒト成体の脳組織に発現していることが判明した。従来の市販の硫酸化ケラタン硫酸を認識する抗体で脳を染色すると、一部の特徴的な部位が染色されるため、ケラタン硫酸は脳のごく限られた領域に存在すると考えられていたが、R-10Gはかなり広範に脳組織を染色するため、R-10Gを用いた、脳におけるケラタン硫酸の役割に関する新しい研究が開始されている。R-17Fに関しては、iPS細胞表面の糖脂質を認識するが、従来の糖脂質性iPS /ES細胞マーカー抗体である、SSEA-3, SSEA-4とは異なるエピトープを認識するものであり、R-17FエピトープはiPS細胞のユニバーサルマーカーとなることが明らかとなった。さらに興味あることには、iPS /ES細胞にR-17Fを加えてインキュベートすると、これらの細胞が傷害作用を受けることが判明した。従来より用いられているヒトESやiPS細胞のマーカー抗体の多くは糖鎖認識抗体である。すなわち、SSEA-3, SSEA-4のエピトープはグロボシリーズの糖脂質であり、TRA-1-60、TRA-1-81のエピトープはケラタン硫酸である。しかしながら、これら既存の抗体のほとんどがEC(embryonal carcinoma)細胞(胎児性がん細胞)を免疫原として得られたものであり、iPS/ES細胞にのみ特異的な抗体ではない。われわれはヒトiPS/ES細胞に対してより厳密な特異性を有する糖鎖認識抗体を作製することを目的として、ヒトiPS細胞(Tic)を免疫原としてマウスに免疫し、30株のヒトiPS細胞結合活性をもつ抗体を産生するハイブリドーマを得た。しかしながら、これらの抗体のほとんどは、従来のマーカー抗体と同様にヒトEC細胞にも結合した。iPS/ES細胞とEC細胞は何れも多分化能を有する無限増殖細胞であり、EC細胞が、がん細胞であることを除けば、両者の区別は困難であることから、予想された結果であった。しかしながら、幸運にも、30株ハイブリドーマの内の2株(Rー10GおよびRー17F)は、われわれの探していた、ヒトiPS/ES細胞に陽性でヒトEC細胞に陰性の抗体を産生していた。これらの抗体はヒト成体および胎児の組織を、わずかな例外を除いて、ほとんど染色せず、期待された通りの、ヒト多能性幹細胞を認識する新たなマーカー抗体であり、ヒトiPS胞上の糖鎖の役割を明らかにするための新しい分子プローブとして基礎および応用研究に広く利用されることが期待されている。また、R-10Gにより認識されるヒトiPS細胞上の抗原分子はケラタン硫酸修飾を受けたポドカリキシンであることが明らかにされている。ヒトiPS/ES細胞マーカー抗体として汎用されているTRA-1-60抗体、TRA-1-81抗体はケラタン硫酸を認識する抗体であり、SSEA-3抗体、SSEA-4抗体はグロボシリーズの糖脂質を認識する抗体である。しかしながら、これらの抗体は、ヒトiPS/ES細胞ばかりでなくヒトEC細胞(胎児性がん細胞)をも認識する欠点を持つ。私たちは、ヒトEC細胞を認識しないでヒトiPS/ES細胞を認識する抗体を産生するハイブリドーマ2種の作成に成功した。

このうち、R-10GはTRA-1-60抗体などと同様にケラタン硫酸を認識する抗体であり、一方、R-17Fは、SSEA-3抗体などと同様に、膜脂質を認識する抗体であった。平成25年度までの研究により、R-10GはTRA-1-60抗体、TRA-1-81抗体と同様に、ヒトiPS/ES細胞に高発現するムチン様膜糖タンパク質であるポドカリキシン分子上に発現することを明らかにしている。また、ヒト各種組織切片を用いた免疫組織染色により、R-10GはヒトiPS/ES細胞以外に脳組織に強く発現することを見い出していた。平成26年度の研究において、私たちは、R-10Gのエピトープは,脳では、プロテインチロシンホスファターゼ(PTP)-ZETA (ホスファカン)に発現していることを明らかにした。PTP-ZETAは中枢神経系に発現し、神経系ネットワークの形成や安定化などに関与すると考えられており、R-10Gのエピトープがこれらの機能調節に関与する可能性を示唆しており興味深い。また、予備実験の結果から、R-17Fは細胞膜糖脂質を抗原とすると考えられていた。平成26年度は、ヒトiPS細胞をクロロホルム/メタノール(2/1, v/v)で処理し、全脂質を抽出し、これを分取TLCで分画する方法により、R-17F抗原を精製することに成功した。糖鎖生物学R-10G抗体がヒト成体脳組織をiPS細胞と同程度の強さで染色することは意外な観察であった。一方、R-10Gエピトープはヒト胎児脳組織には発現しておらず、本エピトープはiPS細胞が分化を開始すると急速に消失し、やがて生後間もなく脳組織の形成、シナプスの形成期に再度発現するものと思われる。すなわち本エピトープはiPS細胞の規格化、標準化のためのツールとして、大変有効であるばかりでなく、脳組織形成の新しいマーカーとしての利用が期待されており、実験開始当初の予想を超えた大きな社会的、学術的波及効果を生んでいる。R-17F抗体に関しては、iPS細胞のユニバーサルマーカー抗体となる可能性が高い。すなわち、R-10G抗体を用いることにより単一コロニーを形成する未分化状態のiPS細胞が実はヘテロな糖鎖抗原を発現する異なった細胞集団であることが明らかになったのと対称的に、これらのヘテロなiPS細胞群が実は一つの共通マーカー(R-17Fエピトープ)を持つことを示しており、別の意味で大きな社会的、学術的価値を有すると期待されている。1.ヒトiPS細胞に発現するR-10Gエピトープとしてのケラタン硫酸の構造と機能の解析R-10G抗体カラムを用いて、抗原タンパク質を精製し、次に、精製抗原タンパク質を、各種ケラタン硫酸分解酵素(ケラタナーゼ,ケラタナーゼΠ、エンド-β-ガラクトシダーゼなど)で分解し、分解物をポストカラム検出法を用いたイオンペア逆相HPLCで分析した。その結果、ほとんどすべての分解物がGal-GlcNAc (6S)の2糖からなることが示され、Rー10Gエピトープはガラクトース残基の硫酸化の度合いの低い低硫酸化ケラタン硫酸であることが明らかとなった。ケラタン硫酸を認識する抗体としては、5D4などが市販されているが、これらは高硫酸化ケラタン硫酸を認識する抗体でありiPS細胞には結合しない。2.ヒトiPS細胞におけるR-10G抗原の細胞生物学的性質の解析R-10Gにより免疫蛍光染色したiPS細胞の共焦点レーザー顕微鏡像をTRA-1-60、TRA-1-81による染色像と比較したところ、R-10Gはほとんどすべての細胞に結合した。
抗癌薬血中濃度モニタリング及び薬物動態関連遺伝子情報に基づく個別投与設計法の確立

化学療法既治療肺癌症例におけるアムルビシン(AMR)の至適投与量の設定並びに体内動態特性の評価を目的として、第I相臨床薬理試験を行うとともに、in vitroの系においてAMRの細胞膜輸送におけるP-糖蛋白質(P-gp)の関与について検討した。1.AMRの血中濃度は二相性に下降し、短い分布相と長い消失相(消失半減期:6.2±2.0h)を示した。また、活性代謝物であるアムルビシノール(AMR-OH)は投与直後に最高血中濃度に達し、その後持続的に血中に認められた(消失半減期:16.2±4.6h)。AMRおよびAMR-OHの各血中濃度-時間曲線下面積(AUC)比から求めた変換率は15.1%であった。2.AMRのクリアランスにおいて大きな個体間変動が観察された(変動係数=49.8%)。一方、AMRのAUCとAMR-OHのAUCに強い相関関係が認められた(r=0.903)。3.AMRによる血液毒性とAMRおよびAMR-OHのAUCとの間に相関傾向が認められた。4.化学療法既治療症例を対象とした第I相試験の結果に基づき、AMRの至適投与量は35mg/m^2と推定された。用量制限因子は血小板減少、不整脈および好中球減少であった。5.AMR投与3時間後のAMRおよびAMR-OHの血中濃度とAUCとの間に良好な相関が認められた(AMR, r=0.917; AMR-OH, r=0.979)。6.AMR及びAMR-OHの細胞膜輸送にはP-gpが寄与していることを明らかにした。以上、本研究では化学療法既治療肺癌症例におけるAMRの至適投与量並びに体内動態特性を明らかにするとともに、AMRの体内動態並びに抗腫瘍効果の面において、P-gpが寄与していることを明らかにした。本年度は化学療法既治療肺癌症例におけるamrubicinの至適投与量の設定並びに体内動態特性の評価を目的として、臨床薬理試験および第I相試験を行った。以下に得られた知見を要約する。1、Amrubicinの血中濃度は二相性に下降し、短い分布相と長い消失相(消失半減期:6.2±2.0h)を示した。また、Amrubicinolは投与直後に最高血中濃度に達し、その後持続的に血中に認められた(消失半減期:16.2±4.6h)。Amrubicinおよびamrubicinolの各血中濃度-時間曲線下面積(AUC)比から求めた変換率は15.1%であった。2、Amrubicinのクリアランスにおいて大きな個体間変動が観察された(変動係数=49.8%)。一方、amrubicinのAUCとamrubicinolのAUCに強い相関関係が認められた(r=0.903)。3、Amrubicinによる血液毒性とamrubicinおよびamrubicinolのAUCとの間に相関傾向が認められた。4、化学療法既治療症例を対象とした第I相試験の結果に基づき、amrubicinの至適投与量は35mg/m^2と推定された。以上、本年度は化学療法既治療肺癌症例におけるamrubicinの至適投与量並びに体内動態特性を明らかにした。

代表的な薬物トランスポータとしてP-糖タンパク質(P-gp)に着目し、アムルビシン(AMR)およびアムルビシノール(AMR-OH)の細胞膜輸送におけるP-gpの関与について検討した。1.ブタ腎由来培養上皮細胞(LLC-PK1)およびヒトP-gpを過剰発現したL-MDR1細胞を用いた殺細胞実験によりL-MDR1細胞ではAMRおよびAMR-OHに対する感受性が低下していることが明らかとなった。また、AMRおよびAMR-OHの細胞内蓄積量はL-MDR1細胞で有意な低下が観察された。一方、シクロスポリン(CyA)の併用によりL-MDR1細胞における感受性および細胞内蓄積量はLLC-PK1細胞と同程度にまで上昇した。2.AMRおよびAMR-OHの経細胞輸送実験において、L-MDR1細胞におけるapical側への輸送亢進並びにbasal側への輸送低下が認められた。一方、CyAの併用によりL-MDR1細胞における経細胞輸送はLLC-PK1細胞と類似した挙動を示した。これらの結果から、AMRおよびAMR-OHはP-gpの基質であることが明らかとなった。3.ヒト肺癌A549細胞を用いた検討において、A549細胞にはP-gpが発現しており、CyAの併用によるAMRおよびAMR-OH細胞内蓄積量並びに殺細胞効果の上昇が観察された。以上の結果より、AMRおよび活性代謝物であるAMR-OHの細胞膜輸送にはP-gpが関与していることが判明した。さらに、肺癌細胞における抗腫瘍効果の面でもP-gpが一部関与している可能性が示唆された。
環境毒性のない薬剤によるカ-ネーション切花の鮮度保持に関する研究

1.α-アミノイソ酪酸(AIB)NOプレハーベスト処理による鮮度保持効果の検討AIBは,エチレン生合成の前駆物質ACCのアナログでありエチレン生成を阻害する。AIBはカ-ネーション切り花に対して鮮度保持効果を示す。AIBをカ-ネーション切り花の収穫前(プレハーベスト)に潅水にまぜて土壌に施用し,開花後収穫して,切り花の鮮度を調査した。その結果,AIBの土壌処理による投与は,切り花の鮮度保持に効果を示すことが明らかになった。2.ACC酸化酵素の精製・性質の解析とACBCの作用カ-ネーションの老化花弁から同酵素を抽出後,部分精製し,酵素学的性質を決定した〔最適pH=7-7.5,Fe^<2+>・アスコルビン酸・NaHCO_3(CO_2)の要求性,ACCに対するKm=111-125μM,分子量=35kDa〕。また,6種類のACC類似化合物の中で,1-アミノシクロブタン-1-カルボン酸(ACBC)が最も強い阻害作用を示した。阻害様式はACCに対する拮抗阻害であり,阻害定数はKi=20-31μMであった。ACBCおよびそのN-置換体は,カ-ネーション切り花に対して鮮度保持効果を有することが明らかになった。3.1.1-ジメチル-4-(フエニルスルホニル)セミカルバジド(DPSS)の作用機構DPSSは,1995年に報告された,カ-ネーション切り花に対して顕著な鮮度保持効果を有する薬剤である。DPSSはエチレン生成を抑制することにより鮮度保持効果を発揮する。カ-ネーションの老化花弁から,ACC酸化酵素とACC合成酵素を抽出して,in vitroにおけるDPSSの作用を検討し,DPSSは両酵素の活性を阻害しないことを明らかにした。1.カ-ネーション花弁のACC酸化酵素の精製と薬剤の作用:カ-ネーション花弁からACC酸化酵素を単離精製して一般的な酵素学的性質を調べた.さらに,数種のACC類似化合物の酵素阻害作用を比較し,ACBC(1-aminocyclobutane-1-carboxylic acid)が最も強い阻害作用を持つことを明らかにした.ACBCの阻害様式は拮抗阻害で,Ki=20μMでありACCのKm=125μMよりも小さかった.(植物化学調節学会創立30周年記念大会,於宇都宮大学,平成7年10月で発表).2.ACBC誘導体のデザインと酵素阻害活性:植物体での移行性を考慮して,鮮度保持効果の高いACBC誘導体として,N-アセチル-ACBC(Ac-ACBC)とN-ベンゾイル-ACBC(Bz-ACBC)をデザインし入手した.これら2つのACBC誘導体もACC酸化酵素酵素活性を阻害することを見いだした.阻害活性は,ACBC>Ac-ACBC>Bz-ACBCの順であった.3.ACBCおよびACBC誘導体のカ-ネーション切り花に対する鮮度保持効果:カ-ネーション切り花に対する鮮度保持効果は,Bz-ACBC>AC-ACBC>ACBCの順に大きかった.これはACBCを誘導体に変えることによって,ACBCが分解されにくくなり細胞内濃度が高く保たれることによると考えられた.4.AIBの収穫前(プレハーベスト)処理によるカ-ネーション切花の鮮度保持効果の検討:5月に定植したカ-ネーションを材料にして,開花前に水やりを兼ねてAIB(α-アミノイソ酪酸)で処理した.開花後,各処理区の切花について花弁の萎凋までの日数を調査しAIBのプレハーベスト処理が切り花の鮮度を高めることを見いだした.今後,切花内のAIB濃度を測定して,有効濃度を明らかにする予定である.

1.ACBCのカ-ネーションACC酸化酵素に対する作用と切花の鮮度保持効果:ACBCがACC酸化酵素の強力な拮抗阻害剤として働くこと,およびカ-ネーション切花に対し鮮度保持効果を示すことを明らかにし,課題を終了した.結果は,Plant and Cell Physiology Vol.38, No.3に発表した.2.新規切り花鮮度保持剤1,1-ヂメチル-4-(フェニルスルホニル)セミカルバジド(DPSS)の作用機構:アフィニティーゲルを用いて,カ-ネーションからDPSS結合因子の単離を試みたが成功しなかった.一方,DPSSSが除草剤クロロスルフロン(Chr)に誘導されるエチレン合成を阻害することを見いだした.Chrはアミノ酸合成に作用することが知られているので,この結果から,DPSSがアミノ酸代謝に作用してエチレン生成を阻害することが示唆された.現在,カ-ネーション老化花弁のL-メチオニンとS-アデノシルメチニオン含量に対するDPSSの作用を検討している.3.スプレーカ-ネーション切花の鮮度保持に対するDPSSの作用:スプレーカ-ネーションにおいて,DPSSが花弁の老化を抑制すると共に,蓄の開花を抑制することを示す予備的結果を得た.これは,DPSSの新用途の開発に結びつくと考えられるので,次年度に詳しく検討する予定である.4.AIBおよびDPSSの収穫前処理によるカ-ネーション・デルフィニウムの切り花の鮮度保持効果:AIBの収穫前施用と異なり,DISSの収穫前施用は,カ-ネーションに鮮度保持効果を示さなかった.デルフィニウムについては現在栽培中であり次年度に結果が得られる予定である.1.新規切り花鮮度保持剤1,1-ヂメチル-4-(フェニルスルホニル)セミカルバジド(DPSS)の作用機構:DPSSは,スルフォニルウレア(SU)骨格を持つ新規カ-ネーション用切り花鮮度保持剤である.人畜に対して極めて低毒性である.昨年度に,トマト幼植物においてDPSSがSU除草剤(クロロスルフロン,Chr)の誘導するエチレン生成を阻害することを見いだしたが,今年度は,このDPSSとChrの拮抗作用がカ-ネーション切り花におけるエチレン生成においても見られることを明らかにした.また,DPSSがカ-ネーション花弁の分岐鎖アミノ酸(ロイシン,バリンなど)や糖(スクロース,グルコース,フルクトース)の含量に影響を与えないことを明らかにした.これらの結果から,カ-ネーション花弁には,老化開始時のエチレン生成において重要な役割を果たすSU結合サイトがあり,これに対してDPSSが作用することを考察した.なお,DPSSがACC合成酵素とACC酸化酵素のin vitro活性を阻害しないことを,Plant Growth Regulation Vol.23に発表した.2.スクロースの鮮度保持作用の仕組み:スクロースの鮮度保持作用は,エチレン生成の開始を送らせることによって発現されることを明らかにした.3.アブシジン酸(ABA)合成阻害剤(フルリドン,Flu)の鮮度保持効果:カ-ネーション切り花の老化が,ABA処理によって促進され,一方,ABAの合成阻害剤であるFlu処理によって抑制されることを明らかにした.カ-ネーション切り花の老化過程においては,ABAが関与していることが示唆されたので,現在,ABA含量の変化の分析を行っている.
全く新しいアプローチによるNMRマイクロスコープの開発

臨床の現場においてMRマイクロスコープを実現するための,最も効果的なシステムである,「臨床用MRIの静磁場のみを使用し,独立した撮像システムを有するMRマイクロスコープ(MR Microscope using an Independent Console System : MRMICS)」を開発し,その有効性を実験的に検証した.本システムを構築するにあたり,MRIシステムを,コンパクトにかつポータブルにする必要が生じたため,世界初のポータブルMRIコンソールを開発し,MRMICSに使用した.有効性の検証は,植物試料(蕗やセロリなどの植物の茎)と生体試料(ヒトの虫垂,大動脈,大腿骨頭,ブタの軟骨など)を用い,1.5T(テスラ)の臨床用MRIの磁石を利用して行い,二次元画像において,50μm×50μmの画素サイズ,三次元画像においては,(150μm)^3(200μm)^3の画素サイズで,明瞭に構造を描出することに成功した.これらは,臨床用MRIのみでは決して取得できない,大変有意義な画像データである.また,in-vivoの生体などにも使用可能とすべく,サーフェイス勾配コイルを開発し,撮像実験を行った.なお,臨床用MRIの静磁場を利用できないユーザーに対するシステムとして,上記のポータブルMRIコンソールと高磁場(1.0T)永久磁石を用いたMRマイクロスコープを開発し,(50μm)^3(200μm)^3の画素サイズで実用的なレベルの撮像が可能であることを示した.これにより,普及型のMRマイクロスコープを提案した.臨床の現場においてMRマイクロスコープを実現するための,最も効果的なシステムである,「臨床用MRIの静磁場のみを使用し,独立した撮像システムを有するMRマイクロスコープ(MR Microscope using an Independent Console System : MRMICS)」を開発し,その有効性を実験的に検証した.本システムを構築するにあたり,MRIシステムを,コンパクトにかつポータブルにする必要が生じたため,世界初のポータブルMRIコンソールを開発し,MRMICSに使用した.有効性の検証は,植物試料(蕗やセロリなどの植物の茎)と生体試料(ヒトの虫垂,大動脈,大腿骨頭,ブタの軟骨など)を用い,1.5T(テスラ)の臨床用MRIの磁石を利用して行い,二次元画像において,50μm×50μmの画素サイズ,三次元画像においては,(150μm)^3(200μm)^3の画素サイズで,明瞭に構造を描出することに成功した.これらは,臨床用MRIのみでは決して取得できない,大変有意義な画像データである.また,in-vivoの生体などにも使用可能とすべく,サーフェイス勾配コイルを開発し,撮像実験を行った.なお,臨床用MRIの静磁場を利用できないユーザーに対するシステムとして,上記のポータブルMRIコンソールと高磁場(1.0T)永久磁石を用いたMRマイクロスコープを開発し,(50μm)^3(200μm)^3の画素サイズで実用的なレベルの撮像が可能であることを示した.これにより,普及型のMRマイクロスコープを提案した.臨床の現場においてMRマイクロスコープを実現するための,最も効果的なシステムである,「臨床用MRIの静磁場のみを使用し,独立した撮像システムを有するMRマイクロスコープ(MR Microscope using an Independent Console System:MRMICS)」を開発し,その有効性を実験的に検証した.本システムを構築するにあたり,MRIシステムを,コンパクトにかつポータブルにする必要が生じたため,世界初のポータブルMRIコンソールを開発し,MRMICSに使用した.有効性の検証は,植物試料(蕗やセロリなどの植物の茎)と生体試料(ヒトの虫垂,大動脈,大腿骨頭,ブタの軟骨など)を用い,1.5T(テスラ)の臨床用MRIの磁石を利用して行い,二次元画像において,50μm×50μmの画素サイズ,三次元画像においては,(150μm)^3(200μm)^3の画素サイズで,明瞭に構造を描出することに成功した.これらは,臨床用MRIのみでは決して取得できない,大変有意義な画像データである.ところが,本システムを,様々な臨床用MRIで使用する際の問題点も明らかとなった.すなわち,MRIのシールドルームの中で,AC電源をいかに確保するか,そしてシールドルームおよびMRI本体のグランドレベルとポータブルMRIユニットのグランドレベルをいかに接続するか,などの設置および接地に関係する微妙な問題が,来年度以降の問題点として残された.臨床の現場においてMRマイクロスコープを実現するための,最も効果的なシステムである,「臨床用MRIの静磁場のみを使用し,独立した撮像システムを有するMRマイクロスコープ(MR Microscopeusing an Independent Console System:MRMICS)」を開発し,その有効性を実験的に検証した.本システムを構築するにあたり,MRIシステムを,コンパクトにかつポータブルにする必要が生じたため,世界初のポータブルMRIコンソールを開発し,MRMICSに使用した.有効性の検証は、植物試料(蕗やセロリなどの植物の茎)と生体試料(ヒトの虫垂,大動脈,大腿骨頭,ブタの軟骨など)を用い,1.5T(テスラ)の臨床用MRIの磁石を利用して行い,二次元画像において,50μm×50μmの画素サイズ,三次元画像においては,(150μm)^3(200μm)^3の画素サイズで,明瞭に構造を抽出することに成功した.これらは,臨床用MRIのみでは決して取得できない,大変有意義な画像データである.また,in-vivoなどの生体などにも使用可能とすべく,サーフェイス勾配コイルを開発し,撮像実験を行った.なお,臨床用MRIの静磁場を利用できないユーザーに対するシステムとして,上記のポータブルMRIコンソールと高磁場(1.0T)

永久磁石を用いたMRマイクロスコープを開発し,(150μm)^3(200μm)^3の画素サイズで実用的なレベルの撮像が可能であることを示した.これにより,普及型のMRマイクロスコープを提案した.
英語における内包的他動詞の獲得に関する認知科学的研究

本研究では、内包的他動詞であるneedに相当する他動詞の言語間変異を司る生得的制約に関し、英語の獲得の観点から検討を行った。英語を母語とする幼児約10名分の発話を詳細に分析した結果、他動詞needを他動詞haveよりも有意に先に獲得する幼児は観察されなかった。この結果は、「他動詞haveを持つ言語のみが他動詞needを持ちうる」とするHarves & Kayne (2008)の主張に対し、言語獲得からの支持を与えるとともに、言語間変異を司る生得的制約の存在に対しても新たな証拠を与えるものと解釈できる。これと関連して、項削除の言語間変異を司る生得的制約や、「断片的な答え」の形式に関する言語間変異を司る生得的制約に関しても、獲得の観点から検討を加えた。平成21年度は、英語の他動詞であるhave及びneedに関する理論的研究、およびそれに関係する理論的研究・獲得研究を概観するとともに、英語におけるhaveとneedの獲得過程に関する調査を開始した。先行研究における言語間変異に関する観察では、「他動詞haveに相当する動詞を持つ言語においてのみ他動詞needに相当する動詞が存在でき、他動詞needを持つにもかかわらず他動詞haveを持たない言語はない」という事実が明らかにされている。この観察に基づき、これまでにCHILDES databaseに収められている英語を母語とする幼児の自然発話10名分の予備的分析を行ったところ、英語の獲得において、「needがhaveよりも先に獲得されることはなく、したがって、他動詞needは獲得されているが他動詞haveは獲得されていないという中間段階は存在しない」という事実が明らかになってきた。本プロジェクトにおけるこの新たな発見は、先ほど述べた言語間変異に関する一般化が、「ヒトは遺伝により生得的に与えられた言語獲得のための仕組み(「普遍文法」)があり、その仕組みが言語の可能な異なり方を制約している」という生成文法の根本的仮説に対し、新たな証拠を与えるものである。この予備的分析の主な結果は、Sugisaki (2009) "The Acquisition of HAVE and NEED in English"(上智言語学会における招待講演)において公表した。引き続きデータ分析を続け、この証拠の妥当性をより高めていく予定である。本年度は、英語の内包的他動詞needの獲得過程を、幼児発話コーパス(CHILDES)を用いてさらに詳細に調べ、needに相当する他動詞の言語間変異を司る生得的制約の解明に向けたさらなる研究を実施した。約20名のデータを分析した結果、「他動詞needが存在するためには他動詞haveが存在しなければならない」という生得的制約の存在に対し、より強力な証拠を得ることができた。その成果は論文としてすでにまとめられており、現在、専門誌への投稿に向けた最終的な確認の最中である。また、本研究のテーマである、「幼児発話コーパスを用いた言語獲得研究」と関連する研究として、「英語・スペイン語獲得における断片的な答え」(コネチカット大学のWilliam Snyder氏との共同研究)および「日本語の格助詞及び後置詞の獲得」の2つの研究もあわせて実施した。幼児発話コーパスに含まれる英語・スペイン語の獲得データを分析した前者の研究では、wh疑問文に対する「答え」の持つ構造が、大人のものと同質であるか否かを分析した。幼児発話コーパスに含まれる日本語の獲得データを分析した後者の研究では、幼児が獲得最初期から格助詞と後置詞を区別することができるか否かを分析した。これらの研究はいずれも、「幼児は、ある性質を発話するようになった段階で、その性質に関して大人と同質の知識を持つ」ことを明らかにし、英語の内包的他動詞needの獲得に関する研究で得られた結論を強めることとなった。これらの研究の成果の一部は、2010年8月に開催されたGLOW in Asia VIIIおよび2010年11月に開催された第35回Boston University Conference on Language Developmentにおいて発表されるとともに、2010年11月に出版されたThe Proceedings of the Eleventh Tokyo Conference on Psycholinguisticsに論文として収められている。
歯の移動における歯根膜細胞の役割に関する細胞組織学的,分子生物学的研究-クローン分析のヒト歯根膜細胞への応用

クローン分析の手法を用いて分化段階に応じて単一の歯根膜細胞から由来するコロニーを分離することにより多様な形質を発現する歯根膜細胞を均一な細胞集団毎に分離・培養して、歯根膜細胞の培養系を確立することと、その培養系を用いて歯の移動における歯根膜細胞の役割を解明することを目的に以下の実験を行った。矯正治療の必要性で抜歯と決定された小臼歯や第三大臼歯の歯根から歯根膜を剥離し、細片にして、培養ディシュにのせ、10%ウシ胎仔血清含有Dalbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で培養した。培養を続けると10日2週間後に細長い線維芽細胞様の細胞がアウトグロースして歯根膜組織片のまわりの培養ディシュを被うようになり、さらに培養を続けてゆくと丸い形の細胞が次にアウトグロースしてくる。20日頃にはその様な丸い形の細胞が歯根膜組織片のまわりを囲いその外側に先にアウトグロースした細長い線維芽細胞様の細胞が培養される。また、これらの中間の形態をした細胞も培養ディッシュを位相差顕微鏡で調べると、ところどころにひとかたまりになって存在していた。次に継代数と細胞形態、細胞増殖能の検討を行ったところ、15-20継代で本来の機能を喪失した。そこで歯根膜を歯根表面より剥離した後、コラゲナーゼおよびトリプシン処理を行い、細胞障害性が可及的に少なく、個々の細胞に分離する手法を確立した。組織片を酵素処理した場合、様々な形態の細胞が培養ディッシュに付着し、主に線維芽細胞様細胞が増殖した。これらの細胞のうち線維芽細胞様細胞以外は免疫染色法によりcytokeratin抗体に染色された。cytokeratin陽性細胞はマラッセの上皮残遺由来と考えられ、ラット歯根膜の免疫染色の結果から神経栄養因子のレセプター、trkAがマラッセの上皮残遺由来の上皮細胞に特徴的に発現していることが明らかになった。これにより新たに,ヒト歯根膜の初代培養系でのtrkAの発現様相を研究する予定であり,このような形態的に異なる細胞の特徴を免疫組織化学的、分子生物学的手法にて解析する予定である。また、96wellにて単一細胞に分離分散した歯根膜線維芽細胞を培養し、数種のクローンを分離してヌードマウスヘの移植組織片を作成した。ラットを用いたin vitroの実験により歯の移動における歯根膜細胞の役割を検討した。これらの知見は現在国際誌に受領済,投稿中である。クローン分析の手法を用いて分化段階に応じて単一の歯根膜細胞から由来するコロニーを分離することにより多様な形質を発現する歯根膜細胞を均一な細胞集団毎に分離・培養して、歯根膜細胞の培養系を確立することと、その培養系を用いて歯の移動における歯根膜細胞の役割を解明することを目的に以下の実験を行っている。

矯正治療の必要性で抜歯と決定された小臼歯や第三大臼歯の歯根から歯根膜を剥離し、細片にして、培養ディシュにのせ、10%ウシ胎仔血清含有Dalbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で培養し、2-3日毎に培養液の交換を行う。この様にして培養を続けると10日2週間後に細長い線維芽細胞様の細胞がアウトグロースして歯根膜組織片のまわりの培養ディシュを被うようになり、さらに培養を続けてゆくと丸い形の細胞が次にアウトグロースしてくる。20日頃にはその様な丸い形の細胞が歯根膜組織片のまわりを囲いその外側に先にアウトグロースした細長い線維芽細胞様の細胞力に培養される。組織片を酵素処理した場合、上記の形態を含む様々な形態の細胞が培養ディッシュに付着し、主に線維芽細胞様細胞が増殖した。これらの細胞のうち線維芽細胞様細胞以外は免疫染色法によりcytokeratin抗体に染色され、歯根膜組織に歯肉以外の上皮由来細胞が多数混入していることが示唆された。また基本培地数種について、それぞれの形態の違う細胞の増殖に対する影響を検討したが、特に線維芽細胞様細胞以外の形態の細胞を積極的に支持する培地はなかった。また、これらの中間の形態をした細胞も培養ディッシュを位相差顕微鏡で調べると、ところどころにひとかたまりになって存在していた。現在、このような形態的に異なる細胞の特徴を免疫組織化学的、分子生物学的手法にて解析中である。さらに、96we11にて単一細胞に分離分散した歯根膜線維芽細胞を培養し、数種のクローンを分離してヌードマウスへの移植組織片を作成中である。クローン分析の手法を用いて分化段階に応じて単一の歯根膜細胞から由来するコロニーを分離することにより多様な形質を発現する歯根膜細胞を均一な細胞集団毎に分離・培養して、歯根膜細胞の培養系を確立することと、その培養系を用いて歯の移動における歯根膜細胞の役割を解明することを目的に以下の実験を行った。矯正治療の必要性で抜歯と決定された小臼歯や第三大臼歯の歯根から歯根膜を剥離し、細片にして、培養ディシュにのせ、10%ウシ胎仔血清含有Dalbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で培養した。培養を続けると10日2週間後に細長い線維芽細胞様の細胞がアウトグロースして歯根膜組織片のまわりの培養ディシュを被うようになり、さらに培養を続けてゆくと丸い形の細胞が次にアウトグロースしてくる。20日頃にはその様な丸い形の細胞が歯根膜組織片のまわりを囲いその外側に先にアウトグロースした細長い線維芽細胞様の細胞が培養される。次に継代数と細胞形態、細胞増殖能の検討を行ったところ、15-20継代で本来の機能を喪失した。そこで歯根膜を歯根表面より剥離した後、コラゲナーゼおよびトリプシン処理を行い、細胞障害性が可及的に少なく、個々の細胞に分離する手法を確立した。組織片を酵素処理した場合、様々な形態の細胞が培養ディッシュに付着し、主に線維芽細胞様細胞が増殖した。これらの細胞のうち線維芽細胞様細胞以外は免疫染色法によりcytokeratin抗体に染色された。Cytokeratin陽性細胞はマラッセの上皮残遺由来と考えられ、ラット歯根膜の免疫染色の結果から神経栄養因子のレセプター、trkAがマラッセの上皮残遺
バーニングマウス症候群における脳内疼痛調節機構の変調に関する研究

口腔顔面領域の代表的な原因不明痛である、バーニングマウス症候群(BMS)について、その病態解明のために、脳内の疼痛調節機構について、定量感覚検査、機能核磁気イメージング(fMRI)法を用いて検討を行った。BMS患者では、痛みを感受する際の時間的修飾や空間的修飾が健常者に比べて増強しており、脳内の痛みの調節機構の変調が関わっているものと考えられた。BMSでは痛みに対する馴れが生じにくい。ガム咀嚼後、BMS患者では痛みの軽減がみられるが、この時、BMS患者では対照群に比べて背部注意ネットワークの活性化がみられ、左側視床と左側前頭下回弁蓋部、左側視床と右側小脳第7領域の結合の増強がみられた。16名のバーニングマウス症候群(以下BMS)の患者(40-69歳の女性)と16名の健康女性(40-69歳)においてインタークロス社製Peltier装置NC200を用いて右側手掌および右側下口唇にPeltier素子を当てることで,Baseline32°C32秒を加えた後に非侵害刺激40°C32秒,Baseline32秒,侵害熱刺激48°C32秒,Baseline32秒の順で刺激を繰り返し,その間,T2強調画像を撮像した。1口唇刺激,2手掌刺激により,それぞれア)侵害刺激時,イ)非侵害刺激時のvoxel値を記録し,SPM8,MatLab2009bを用いて,a)侵害刺激時ー非侵害刺激時(侵害刺激による特異的脳活動),b) BMS群ー対照群(BMS増強部位)ならびに対照群ーBMS群(BMS減少部位)を求めた。また,非侵害刺激32秒と侵害刺激32秒をそれぞれ前半の16秒と後半の16秒に分け,前半と後半における脳活動の差異を検討した。さらに,非侵害刺激と侵害刺激の1回めから4回めの各刺激によって引き起こされた脳活動の差異についても比較検討した。その結果,BMS群では,対照群に比べて口唇刺激時に有意に後半の刺激で脳の前方部位(前頭前野,運動前野,帯状回,島)の活動が増強しており,時間的加重が認められた。一方,1回めの刺激(侵害刺激ー非侵害刺激)と4回めの刺激(侵害刺激ー非侵害刺激)を比べると,対照群では帯状回に活動の抑制が見られたのに対し,BMS群ではこの抑制が見られなかった。すなわち,侵害刺激に対する慣れが生じないことがわかった。これらのことは,本来健康な人が有している侵害刺激に対する脳の調節機構がBMS患者では障害されていることを示す。初年度は,これまでの経緯を受けて,BMS患者と健康成人女性における侵害刺激に対する脳の時間的反応特性を明らかにした。特に,従前の研究で明らかだったBMS患者の脳の反応が,口唇刺激で手掌刺激時よりも活動が弱かったこと,BMS患者では健康対照に比較して侵害刺激に対する反応が増強していたことの原因として,時間的加重や慣れの欠如といった,脳における疼痛の調節機構の破綻があることが明らかになった。これらの事実は,BMS患者における末梢からの痛み刺激の処理機構に何らかの障害が生じていることを示すものである。代表者らは,これまでにバーニングマウス症候群(BMS)患者と健康対照において,侵害熱刺激に対する脳活動を比較し,特に内側系の帯状回を中心に,刺激の反復による馴れが生じることを報告した。今回の研究では,この中枢神経の特異的な反応が脳の器質的構造に関係しているのかの検討を行った。14名の女性の舌痛症患者と年齢の一致した16名の健康女性をコントロールとした。そしてこれら対象者に灰白質体積を日本大学医学部付属病院にてMRIで撮像した。解析には,MATLAB2017aを用い,灰白質体積はStatistical Parametric Mapping12(以下SPM12)を用い,Voxel-based morphometry(以下VBM)により評価した。評価には,年齢,病脳期間,疼痛VASスケールを共変量とした。その結果,BMS患者群はコントロール群に比較して背側後帯状皮質,背側前帯状皮質,前運動野,扁桃体,縁上回,前頭前野背外側に増大が見られた。一方,縁上回では減少が見られた。次に,BMS群における灰白質体積の変化と年齢・病脳期間・疼痛VAS値との相関を示す領域を求めた。年齢との相関では,中側頭回,角回に,病脳期間では前頭眼野,嘴峰,前頭前野背外側,前運動野に正の相関が見られた。疼痛VAS値では相関の見られた領域は無かった。すなわち,従前の研究で機能異常が観察された,痛みの修飾機構に関わる内側系の疼痛回路に当たる部位に灰白質の増大が見られた。帯状皮質や扁桃体は疼痛や認知に深く関わっており,BMS患者群で帯状皮質や扁桃体に灰白質体積の変化がみられたことは,BMSでは疼痛認知の修飾作用に何らかの影響が及んでいることが考えられる。また,脳体積との相関では,年齢や病脳期間に相関が見られ,これらの領域は疼痛の抑制や知覚に関わる領域であるため,体性感覚に変化が生じたと考えられた。これまでの研究は,すべて順調に進んでおり,研究発表も予定通りに行ってきている。海外での評価も相応に受けていると考えている。

但し,研究協力者の阿部修教授が,日本大学医学部放射線学系から東京大学大学院大学放射線医学に移籍となったため,研究協力機関の環境設定(倫理員会の承認を含む)にしばらく時間が必要となることが考えられる。それに伴い,本年度の画像データのの収集がもしかしたら予定通りに行えなくなる可能性も否定できない。その場合は,できる範囲で日本大学医学部放射線学系の協力を得てデータの収集に努める予定である。本年度は,ガム咀嚼前後のBMS患者ならびにコントロールにおける脳のコネクティビティを観察した。安静時(ガム咀嚼前)の脳コネクティビティでは,BMS患者において前頭下回言語領域と後上側頭回間の結合が対照群に比べて弱かったのが,ガム咀嚼後には,右側前上側頭回と左側島皮質,右側前上側頭回と左側中心前回,右側前上側頭回と左側側頭平面,右側横側頭回と左側前上側頭回,右側横側頭回と左側側頭平面などの結合がさらに減弱していた。一方,ガム咀嚼の後にBMS患者で対照群に比べて結合が増強したコネクティビティとしては,背部注意ネットワークと左側中側頭回の側頭後頭領域,左側視床と左側前頭下回弁蓋部,左側視床と右側小脳第7領域などがみられた。次に,BNS患者と対照群における各種刺激に対する感覚の閾値をドイツ神経ネットワークの方法に準じて定量的に計測観察した。その結果,舌における冷覚閾値は,BMS群で有意に増大していた(less sensitive)。また,冷痛覚閾値は,BMS群でやはり有意に増大していた(less sensitive)。一方,温覚閾値,温痛覚閾値は,いずれも有意差を認めなかった。一方,機械痛覚閾値でも有意差を認めなかった。Pin PrickによるWind-up率については有意差を認めなかった。次に,口唇に侵害電気刺激を加え,手掌に接触熱刺激を加えた時のconditioned pain modulationについて検討を行った。電気刺激に対するWind-up率(WUR)の熱刺激を加えることによっていずれの群においても軽減した。一方,間隔を置いた繰り返し刺激に対するhabituationは,対照群で明らかで,BMS群では欠落していた。軽減率は,BMS群と対照群では,有意差がみられなかった。口腔顔面領域の代表的な原因不明痛である、バーニングマウス症候群(BMS)について、その病態解明のために、脳内の疼痛調節機構について、定量感覚検査、機能核磁気イメージング(fMRI)法を用いて検討を行った。BMS患者では、痛みを感受する際の時間的修飾や空間的修飾が健常者に比べて増強しており、脳内の痛みの調節機構の変調が関わっているものと考えられた。BMSでは痛みに対する馴れが生じにくい。ガム咀嚼後、BMS患者では痛みの軽減がみられるが、この時、BMS患者では対照群に比べて背部注意ネットワークの活性化がみられ、左側視床と左側前頭下回弁蓋部、左側視床と右側小脳第7領域の結合の増強がみられた。今後は,この破綻した痛みの調節機構に対してどのようなアプローチが有効かについて検討を行ってゆく。すでにチェアサイドでの検討において,ガム咀嚼や空咀嚼(擬似咀嚼)によって,BMS患者の自覚疼痛強度が減少するとのデータを有しているので,運動系の賦活が何らかの関与を行っていることが示唆される。この点をfMRIで観察する予定である。本計画の最終年にあっては,BMSの疼痛修飾における脳活動の変調がどのような機序で起こるのかをさらに解き明かすために,介入を加えた際の脳活動の変化について検討を行う予定にしている。
心材成分生合成の分子機構解明に関する基礎研究

本研究の目的は、心材形成の生化学・分子生物学的機構の全貌解明にいたる第一段階として、心材に特異的且つ多量に蓄積する心材抽出成分の生合成に着目して、これに与る遺伝子の機能解明を行うことである。本研究では、まず、数種の新規フェニルプロパノイド心材成分生合成酵素について、cDNAを取得し、その機能解析を行った。すなわち、ノルリグナン(ヒノキレジノール)合成酵素、リグナンOMTおよび新規フラボノイドOMTのcDNAである。これらの遺伝子の機能を、対応する組換え酵素の生化学的解析および遺伝子発現解析に基づき検討した。その結果、リグナンOMTは、リグナン中に複数存在する水酸基の内の一つを位置選択的にメチル化すること、またヒノキレジノール合成酵素は、2つのサブユニットからなり、サブユニットの組成比が、生成物の幾何異性とエナンチオマー組成を決定することを示した。次に、フェニルプロパノイドモノマーの合成にかかわる酵素をコードする遺伝子ファミリーメンバーも多数取得し、その発現解析ならびに組換え酵素が触媒する反応の速度論解析を行った。その結果、ケイヒ酸モノリグノール経路のいくつかの遺伝子の機能が特定された。また、リグナン合成に関わる新たな酵素ピノレジノールレダクターゼと対応する遺伝子を見出し、その生化学的特性について解明した。すなわち、同酵素にはアイソフォームが2種存在し、それぞれ基質のエナンチオマーに関する選択性が異なること、また、両アイソフォームの発現状況の違いにより、生成リグナンのエナンチオマー組成の変動が説明できることが示された。さらに、これらの酵素遺伝子を起点として、生合成調節に与る転写因子を数種単離することができた。よって、これらの成果は、心材形成の分子機構解明に対する基盤の一部を提供した。本研究の目的は、心材形成の生化学・分子生物学的機構の全貌解明にいたる第一段階として、心材に特異的且つ多量に蓄積する心材抽出成分の生合成に着目して、これに与る遺伝子の発現調節機構の解明を行うことである。本年度は、心材形成に伴い特異的に発現するリグナンおよびノルリグナンの合成酵素遣伝子のクローニングを目指して研究を行った。研究は、以下の通り予定通り進行している。1、フェニルプロパノイド合成酵素のcDNAクローニング既に我々は、アスパラガスからcis-ヒノキレジノール合成酵素を見い出していたが、本年度は、スギからtrans-ヒノキレジノール合成酵素を見い出した。次に、アスパラガスこのうちノルリグナン合成酵素のcDNAクローニングに初めて成功した。また、代表的なリグナンであるアクチゲニン生成に関わるメチル基転位酵素(OMT)のcDNAクローニングに初めて成功した。これは、リグナン特異的OMTのcDNAクローニングに関する初めての報告である。2、クローニングされたcDNAの機能解析得られたヒノキレジノール合成酵素とリグナンOMTの組換え酵素を大腸菌で発現させ、得られた組換え酵素の機能を解析した。その結果、リグナンOMTは、リグナン中に複数存在する水酸基の内の一つを位置選択的にメチルかすること、またヒノキレジノール合成酵素は、2つのサブユニットからなり、サブユニットの組成比が、生成物の幾何異性を決定することが明かとなった。また、上記cDNAと既に当研究室でクローニングされていた、フェニルプロパノイド生合成に関わるcDNAの発現状況をリアルタイムPCRを用いて解析した。その結果、ケイヒ酸モノリグノール経路のいくつかの遺伝子が機能が特定された。なお、以上の成果は11.に記載の論文で公表した他、リグニン討論会および木材学会大会で発表した。

本年度は、心材形成に伴い特異的に発現するリグナンおよびノルリグナンの合成酵素遺伝子のクローニングを目指して研究を行った。研究は、以下の通り予定通り進行している。昨年度までに得られたヒノキレジノール合成酵素とリグナンOMTの組換え酵素を大腸菌で発現させ、得られた組換え酵素の機能を、前年度に引き続き解析した。その結果、リグナンOMTとヒノキレジノール合成酵素が触媒する反応の速度論的性質の詳細が解明された。また、本年度は新たにフラボノイドOMT遺伝子も単離された。本遺伝子は、リグナンOMTとホモロジーが極めて高いにもかかわらず、両酵素の基質特異性が大きく異なり、フェニルプロパノイド合成酵素の進化の観点から興味深い。また、フェニルプロパノイドモノマーの合成にかかわる酵素(CAldOMT,CCoAOMT,CAD,SAD)をコードする遺伝子ファミリーメンバーも多数取得し、その発現解析ならびに組換え酵素が職倍する反応の速度論解析を行った。その結果、ケイヒ酸モノリグノール経路のいくつかの遺伝子の機能が特定された。本研究の目的は、心材形成の生化学・分子生物学的機構の全貌解明にいたる第一段階として、心材に特異的且つ多量に蓄積する心材抽出成分の生合成に着目して、これに与る遺伝子の発現調節機構の解明を行うことである。本年度は、昨年度に引き続き心材形成に伴い特異的に発現するリグナンおよびノルリグナンの合成酵素遺伝子のクローニングを目指して研究を行った。本年度は新たに新規OMT遺伝子が単離された。本遺伝子は、シリンギルリグニン合成に関わるCAldOMTと同じクレードに属するものの、それほどホモロジーは高くなく、その組換え酵素は、経費さんモノリグノール経路上の可能な基質に対し、同程度の気質特異性を示す新規OMTである。本酵素は、フェニルプロパノイド合成酵素の進化の観点から興味深い。また、フェニルプロパノイドモノマー合成の最終段階にかかわる酵素(CAD, SAD)の組換え酵素を作成し、それらが触媒する反応の速度論解析を行った。その結果、これらの酵素に就き、全く新たな基質特異性と阻害パターンを示すことが示された。本年度は、昨年度に引き続き心材形成に伴い特異的に発現するリグナンおよびノルリグナンの合成酵素遺伝子の特性解析を行った。すなわち、リグナン合成に関わる新たな酵素ピノレジノールレダクターゼと対応する遺伝子を見出し、その生化学的特性について解明した。すなわち、同酵素にはアイソフォームが2種存在し、それぞれ其質のエナンチオマーに関する選択性が異なること、また、両アイソフォームの発現状況の違いにより、生成リグナンのエナンチオマー組成の変動が説明できることが示された。
CCR5/CXCR3 阻害による急性および慢性腎拒絶反応の制御

ラット腎移植急性拒絶反応モデルにおいて、CCR5/CXCR3拮抗薬はシクロスポリン(CsA)との併用により著明な生着率の延長効果が認められた。作用機序としてT細胞の移植腎への遊走抑制効果とマクロファージの尿細管への浸潤抑制効果、活性化の抑制効果が考えられた。CCR5、CXCR3の阻害は腎移植後拒絶反応の有効な治療手段となる可能性が示唆された。腎移植後の急性拒絶反応(AR)は依然として長期予後に影響を及ぼす重大なリスクファクターであり、ARを抑制する手段としてケモカイン受容体を阻害する方法が注目を集めている。ケモカイン受容体のうちCCR5/CXCR3の阻害がAR抑制に最も効果的であり、T細胞とマクロファージは両者とも発現している。T細胞においては移植臓器への遊走に関与していることが報告されているが、マクロファージのCCR5/CXCR3の役割については不明な点が多い。DAからLEWラットへのMHCフルミスマッチ腎移植モデルでは、移植腎は約7日以内に拒絶される。CsAを2mg/kg×6日間という低容量・短期間で投与(低容量CsAモデル)することで、生着率は710日(中央値9日)と軽度延長し、初期のCD4/CD8陽性細胞の浸潤を抑えた上でマクロファージの浸潤のみが残る。移植腎から分離したマクロファージでCCR5/CXCR3の発現が脾臓から分離してきたマクロファージよりも増加していた。そこで、低容量CsAモデルにCCR5/CXCR3拮抗薬(TAK)を投与して(CsA+TAK群)、マクロファージの浸潤を抑制して検討した。免疫組織染色ではCD4/CD8陽性T細胞に関しては、CsA+TAK群と低容量CsA群との間に差は認められず、両群とも十分に抑制されていた。しかし、ED-1染色ではCsA+TAK群においてマクロファージの浸潤が抑制されており、RT-PCRにてIL-1β、IL-18、CCL2、CCL4のmRNA発現が低下していた。CsA+TAK群の生着日数は1160日(中央値38日)と著明な生着延長効果が認められた。CCR5、CXCR3の阻害は腎移植後ARの有効な治療手段となる可能性が示唆された。MHCフルミスマッチであるDA→LEWラット腎移植モデルに、CsAを2mg/kg ×6日間投与し(低容量CsAモデル)、初期のCD4/CD8+T細胞の浸潤を抑えた上でマクロファージの浸潤のみを残すモデルの作成を試みた。低容量CsA投与により生着率は無治療群の67日に対し、710日と有意に延長した。病理組織検査では、低容量CsA投与によって無治療群で認められた血管炎が抑制され、間質の細胞浸潤や尿細管炎中心の拒絶反応像となった。免疫組織染色ではCD4/CD8+T細胞の移植腎への浸潤は、低容量CsA投与によって十分に抑制されたが、マクロファージの浸潤は徐々に増加傾向にあった。RT-PCRにてマクロファージに関連するIL-11β、IL-18およびCCL23は無治療群との間に鎖は認めなかった。移植腎から分離したマクロファージでは、ケモカイン受容体CCR5、CXCR3の発現が脾臓から分離したマクロファージよりも増加していた。低容量CsAモデルにCCR5、CXCR3拮抗薬(TAK)を投与して(CsA+TAK群)、マクロファージ浸潤抑制を検討した。免疫組織染色ではCD4/CD8+T細胞はCsA+TAK群と低容量CsA群との間に差は認められず、両群とも十分に抑制された。ED-1染色ではCsA+TAK群においてマクロファージ浸潤が抑制された。また、CsA+TAK群ではRT-PCRにて、マクロファージ関連サイトカイン、ケモカインのmRNAの発現が低下していた。CsA+TAK群の生着日数は1160日と著明な生着延長効果が認められた。以上よりDA→LEWのラット腎移植モデルにおいて、低容量CsAを投与することによって、マクロファージ優位な急性拒絶反応モデルが作成されたことを確認した。DA→LEWラット腎移植モデルに、CsAを2mg/kg ×6日間投与することで(低容量CsAモデル)、初期のCD4/CD8+T細胞の浸潤を抑えた上でマクロファージの浸潤のみを残すモデルの作成の確立に成功した。このモデルを用いて、CCR5およびCXCR3拮抗薬であるTAKを投与(CsA+TAK群)することで、移植腎へのマクロファージの浸潤が抑制された。また、RT-PCRにて、マクロファージ関連サイトカイン、ケモカインのmRNAの発現が低下していることも確認した。