hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物細胞壁構造を多義的に利用するカーボン材料設計

本研究では、木材の天然の細胞構造を微小反応装置として機能させることで、木材自身が熱分解して放出する微量なガスを原料とした気相成長により、新奇なカーボン材料を創製し、さらに、炭化後も保持される木材由来の細胞構造を、微小反応装置として再度活用して機能材料化に用いることを目的とした。これらの材料創製をとおして、木材細胞構造の微小反応場としての機構(マイクロシステム)を明らかにすることを研究の最終到達目標とする。まず円錐黒鉛ウイスカを担持させた木炭ブロックをそのまま電極として、電気酸化により、内部の円錐黒鉛ウイスカをインターカレーションさせることに成功した。「木材細胞構造を微小反応容器として用いるシステム」は炭素材料のみならず他の材料分野への応用展開も可能と考えられる。円錐黒鉛ウイスカのようなヘリンボン型炭素構造の場合、活性の高い炭素六角網平面エッジ部が表面に存在するが、それらが互いに結合して不活性化している。そこで先ず、エッジ部を露出させる活性化を試みた。この方法について、酸素など気体を利用した気相による方法と、酸化剤を作用させる液相による方法とがあり、前者について硫酸中を用いて電気化学的に行う方法を取った。反応の成否を顕微ラマン分光法、クライオ(極低温)透過電子顕微鏡観察とにより確認したところ、硫酸インターカレーションとともにエッジのダングリングボンドが外れ、活性化したエッジが露出しているようすをinsituで観察することに成功した。電池化や膨張黒鉛化などへの応用が可能で、電池、断熱材、緩衝材などの工業原料・資材など幅広い応用可能性を示す結果が得られた。国際植物材料科学当初予定していなかった発見により、大筋としてこのテーマに沿った展開であるものの、当初の計画を変更しつつ進めている。そのうえで、以下のような成果を挙げていることからおおむね順調に進展していると考えている。課題1において、旋回円すいカーボンに関して、その旋回構造を解明したことにより、植物細胞壁の成分・サイズがどのように関与しているか、探るべき課題が明らかとなりつつある。課題2において、これまでほとんどが外部温度でのみとらえられていた、炭化の初期段階において、木質そのものの発熱も込んだ内部温度を基準として、比表面積、セルロース結晶化度変化などを捉えなおすことにより、選択的熱分解による植物細胞壁成分を活かした機能炭素材料化への足掛かりを得た。課題1に関してはサトウヤシ葉鞘について、熱分解から炭化の中間温度域での炭化形成を詳細にし、この成果「サトウヤシ葉鞘繊維の低温熱処理による炭化形成(後藤晴加、斎藤幸恵、Farah Fahma、佐藤雅俊、岩田忠久、Myrtha Karina)」を第63回日本木材学会大会(2013年3月岩手大学)にて発表した。当初計画の7割程度まで達成したといえる。ただし1は今後触媒を用いた気相成長へ進め、2は細胞構造の微小反応容器として作用機構を記述・評価する方法の確立という目標を残すので、評価区分(2)とした。本研究を進める中で当初予定していなかった発見により、いずれも本テーマの目的に沿うが、2つの異なるサブテーマとして並行して進めることとなった。課題1に関しては、旋回円すい炭素フィラメントの生成機構に焦点を絞り、解明を進める。前述のように、特に植物細胞の炭素源としての機能、内腔サイズの効果について明らかにすることが重要である。
人物行動を伝えるための映像文法を用いた知的映像撮影・編集システムの構築

本研究では,情報学的な見地から,「効果的に情報を提示するために,どのような映像部品(単語)を用意し,どのような映像編集規則(文法)にしたがって提示すればよいか」という問題を自動化システムを構築しながら実証的に探ることを目的としている.そのために,本年度は主に,対話シーンを撮影・編集・伝送するマルチカメラシステムの構築,制約充足に基づく編集の枠組みに関する検討,インタラクティブに質問に対して答えることのできる映像メディアの構築を行った.以下のように,順調に研究が進行している.撮影・編集環境の構築:昨年度に引き続き,マルチカメラによる撮影,人物行動認識,映像編集を行うシステム構築を行った.現在はまだ,システマティックな検証を行うために必要な機能の一部しか備わっていないが,以下の節で示すような実験が可能になった.制約充足型映像編集モデル:TV番組,映画に現れる種々のシーンを参考にし,種々の編集を可能にするモデルの検討を行った.日本映画においては,対話シーンとして食卓やテーブルでの飲食シーンが用いられることが多いため,そのパターン化を行い,また,各部分について,その意図,効果について考察した.これらの結果を基に,リアルタイムの編集と制約充足で編集を行う枠組みの検討を行った.質問に答えることのできる映像メディア:「質問と答」の観点から映像の撮影と編集を考え、多視点の映像を効果的に使用するモデル(QUEVICO)を提案した.質問の答となる映像断片を検索するために適した映像のインデキシング手法を提案し,検索された映像断片を要約、編集することで簡潔な答をユーザに与える手法を実装した。
開放型法面保護工を施した切土法面の風化と維持管理に関する研究

沖縄本島南部の新第三紀島尻層泥岩地帯において実施された農業農村整備事業によって造成された切土法面について資料調査および現地調査を行った。また、降雨時に崩壊した泥岩切土法面の地盤調査と土質試験を実施した。得られた主たる成果は次のとおりである。1.農業農村整備事業で造成された泥岩切土法面は直高20m以下であり、ブロック積擁壁工と植生工で表面を保護したものが多く、最近は法面保護工として琉球石灰岩の石積み工や植生を施した法枠工が多く採用されている。2.泥岩切土法面には様々な変状がみられ、法面崩壊の発生頻度は施工からの経過年数が長いもので多く、密閉型よりも開放型の法面保護工を有する法面で多い傾向もみられ、法面崩壊は法面の劣化と関係していることが示唆された。3.法面崩壊は日降雨量が100mmを超えると発生しやく、崩壊発生件数は連続降雨量が多いほど増加する傾向が見られた。また、法面崩壊は南東、南、南西向きで湧水のある法面に多く発生し、同一地区に集中する傾向も見られた。これより法面崩壊には小断層等の不連続面の存在と雨水の浸透が強く関係していることが示唆された。4.施工後17年目に発生した法面崩壊は、切土による潜在不連続面の緩み、地表面と不連続面からの風化の進行による固結度の低下、大雨による不連続面の水圧増加などによって、不連続面のせん断強度が減少して発生したと想定された。5.切土法面の点検・維持管理として、梅雨や台風等の前に亀裂、排水路の損傷等を点検し、異常が発見されれば早急に修復し、法面への降雨の侵入防止および法面内からの湧水の排水促進を行っておけば法面崩壊の発生を減らすことができると考えられる。6.工事に先立って行われる調査ボーリング孔を地盤の地下水位や変位の自動観測等に活用することにより法面崩壊の危険性を予知できる可能性がある。沖縄本島南部の新第三紀島尻層泥岩地帯において実施された昭和48年以降の農業農村整備事業によって造成された切土法面について断面形状、法面保護工の種類、造成後の経過年数、劣化状況、崩壊状況などを現地調査と資料調査によって調べた。また、2001年9月25日の降雨時に南風原町津嘉山地内で崩壊した施工後17年目の切土法面について土質調査と土質試験を実施し、崩壊の原因について検討した。得られた成果は次のとおりである。1.直高20m以下の様々なタイプの切土法面が造成されているが、直高36mのブロック積み工で保護された法面の占める割合が多く、最近では自然環境や景観重視から琉球石灰岩の石積み工や植生を施した法枠工が多く見られる。2.工事関係者は南側斜面の切土工事中に崩壊が多いことを経験しており、切土後に崩壊した法面の向きも南東、南、南西方向に多い傾向が見られる。また、法面崩壊は同一法面で複数箇所発生する傾向も見られた。これらは法面崩壊に走向、断層、節理等の地質的要因が関与していることを示唆している。3.過去5年間の法面崩壊の発生頻度はS4857年に施工された切土法面で多かった。

これは法面崩壊が法面の劣化と関係していることを示唆している。4.法面崩壊は日降雨量100mmを超えると発生しやすく、崩壊発生件数は連続降雨量が大きいほど増加する傾向が見られる。5.南風原町内で発生した施工後17年目の切土法面の崩壊は、切土による潜在不連続面の緩みと雨水侵入の促進、法枠工からの風化作用によるせん断強度の減少、不連続面からの吸水によって発生した膨潤圧によるブロック積み擁壁の曲げ破壊とせん断破壊、大雨による不連続面の間隙水圧増加に伴うせん断抵抗の減少など、複数の現象が発生して崩壊に至ったと想定された。沖縄本島南部の新第三紀島尻層泥岩地帯において昭和48年以降に実施された農業農村整備事業によって造成された切土法面の断面形状、法面保護工の種類、造成後の経過年数、劣化状況、崩壊状況などを資料調査および現地調査によって調べた。また、豪雨時に崩壊した施工後17年目の泥岩切土法面の土質調査と土質試験を実施した。得られた主たる成果は次のとおりである。1.農業農村整備事業で造成された泥岩切土法面は直高20m以下であり、ブロック積擁壁工と植生工で表面を保護されているものが多く、最近では法面保護工として琉球石灰岩の石積み工や植生を施した法枠工が多く採用されている。2.泥岩切土法面には様々な変状がみられ、法面崩壊の発生頻度は経過年数の多い法面で多く、法面崩壊は法面の劣化と関係していることが示唆された。3.法面崩壊は日降雨量100mmを超えると発生しやすく、崩壊発生件数は連続降雨量が大きいほど増加する傾向が見られた。また、法面崩壊は南東、南、南西向きで湧水のある法面に多く発生する傾向があり、同一地区法面で複数箇所発生する傾向も見られた。これより法面崩壊には小断層等の不連続面の存在と雨水の浸透が強く関係していることが示唆された。4.施工後17年目に発生した法面崩壊では、切土による潜在不連続面が緩み、そこへの雨水侵入が促進され、不連続面と地表面からの風化の進行によるせん断強度の減少、大雨による不連続面の水圧増加など、複数の現象が発生して崩壊に至ったと想定された。5.維持管理方法として梅雨や台風等の長雨シーズンを前に排水機能等の法面の状態を点検し、異常が発見されれば早急に修復し、また、法面内の湧水の排水処理を行っておけば法面崩壊の発生を減らすことができると考えられる
偏極代数多様体族と小林・Hitchin対応

昨年度までの研究に引続き,偏極代数多様体の幾何学的不変式論の意味における安定性と定スカラー曲率Kahler計量の存在とが同値になるという予想,いわゆる「偏極代数多様体に対する小林・Hitchin対応」を中心に研究した.この予想をFano多様体と呼ばれる,反標準直線束が豊富な射影的代数多様体の場合に考えると,安定性とEinstein・Kahler計量の存在の同値性の問題となる.この観点から,TianはFano多様体に対してK安定性とCM安定性という二種類の安定性を導入し,Fano多様体がEinstein・Kahler計量を持つとき,K安定にもCM安定にもなるということを示した.一方,一般の偏極代数多様体に対しては,CM安定性はすぐに一般化することができるのだが,K安定性の方は技術的困難により,素朴には一般化することができない.しかしながら,昨年度までの研究成果に基き,K安定性の概念を一般の偏極代数多様体にまで一般化することができた.一方,Donaldsonもまた,K安定性を別の枠組みを用いて定義している.そこで,二つのK安定性を比較してみた結果,退化するファイバーが正規の時には二つの定義は一致することが解った.また,二つのK安定性を比較してみた結果,幾何学的不変式論の枠組みである,Hilbert点の意味での安定性との関連が深いことがわかった.さらに,これまでに得られた研究成果を見直し,満渕により導入されたChow点の意味での安定性に対する障害と板東・Calabi・二木指標が非常に密接な関係があることを考察し,二次元複素射影空間を一点でブローイング・アップした複素曲面は満渕の障害が消えないことを示した.昨年度までの研究に引続き,射影的代数多様体の幾何学的不変式論の意味における安定性と定スカラー曲率Kahler計量の存在とが同値になるという予想,いわゆる「偏極代数多様体に対する小林・Hitchin対応」を中心に研究した.この予想をFano多様体と呼ばれる,反標準直線束が豊富な射影的代数多様体の場合に考えると,安定性とEinstein・Kahler計量の存在の同値性の問題となる.この観点から,TianはFano多様体に対してK安定性とCM安定性という二種類の安定性を導入し,Fano多様体がEinstein・Kahler計量を持つとき,K安定にもCM安定にもなるということを示した.今年度の研究では,Tianにより導入された二種類のFano多様体に対する安定性(K安定性とCM安定性)の関係について詳しく考察した.その結果,K安定性やCM安定性の定義を少し適当に変更してやることにより,ある仮定の下でこの二つの安定性は同値な条件であることがわかったまた,トーリック多様体と呼ばれるある種の対称性の高い多様体の超曲面において,その二木指標について詳しく考察した.ここで二木指標はEinstein・Kahler計量の存在に対する障害として二木により導入された正則自己同型群の指標であり,K安定性と深い関係を持つものである.その結果,同変Chow群(または同変コホモロジー群)を用いて,トーリック多様体の超曲面の二木指標及びその一般化である板東・Calabi・二木指標は具体的に計算できることが解った.昨年度までの研究に引続き,偏極代数多様体の幾何学的不変式論の意味における安定性と定スカラー曲率Kahler計量の存在とが同値になるという予想,いわゆる「偏極代数多様体に対する小林・Hitchin対応」を中心に研究した.この予想をFano多様体と呼ばれる,反標準直線束が豊富な射影的代数多様体の場合に考えると,安定性とEinstein・Kahler計量の存在の同値性の問題となる.この観点から,TianはFano多様体に対してK安定性とCM安定性という二種類の安定性を導入し,Fano多様体がEinstein・Kahler計量を持つとき,K安定にもCM安定にもなるということを示した.一方,一般の偏極代数多様体に対しては,CM安定性はすぐに一般化することができるのだが,K安定性の方は技術的困難により,素朴には一般化することができない.ところが,昨年度までの研究により,Fano多様体に対するK安定性とCM安定性は,ある仮定の下や同値であることがわかっているので,CM安定牲を用いて,偏極代数多様体のK安定性を定義してみた.一方,Donaldsonもまた,K安定性の枠組みを用いて定義している.そこで,二つのK安定性を比較してみた結果,退化するファィバーが正規の時には二つの定義は一致することが解った.また,二つのK安定性を比較してみた結果,Donaldsonの定義はCM安定性とは無関係であるが,幾何学的不変式論の枠組みである,Hilbertスキームの意味での安定性との関連が深いことがわかった.よって,「偏極代数多様体に対する小林・Hitchin対応」を考えるときには,Donaldsonの考えている枠組みの方がより優れていることもわかった.昨年度までの研究に引続き,偏極代数多様体の幾何学的不変式論の意味における安定性と定スカラー曲率Kahler計量の存在とが同値になるという予想,いわゆる「偏極代数多様体に対する小林・Hitchin対応」を中心に研究した.この予想をFano多様体と呼ばれる,反標準直線束が豊富な射影的代数多様体の場合に考えると,安定性とEinstein・Kahler計量の存在の同値性の問題となる.この観点から,TianはFano多様体に対してK安定性とCM安定性という二種類の安定性を導入し,Fano多様体がEinstein・Kahler計量を持つとき,K安定にもCM安定にもなるということを示した.

一方,一般の偏極代数多様体に対しては,CM安定性はすぐに一般化することができるのだが,K安定性の方は技術的困難により,素朴には一般化することができない.しかしながら,昨年度までの研究成果に基き,K安定性の概念を一般の偏極代数多様体にまで一般化することができた.一方,Donaldsonもまた,K安定性を別の枠組みを用いて定義している.そこで,二つのK安定性を比較してみた結果,退化するファイバーが正規の時には二つの定義は一致することが解った.また,二つのK安定性を比較してみた結果,幾何学的不変式論の枠組みである,Hilbert点の意味での安定性との関連が深いことがわかった.さらに,これまでに得られた研究成果を見直し,満渕により導入されたChow点の意味での安定性に対する障害と板東・Calabi・二木指標が非常に密接な関係があることを考察し,二次元複素射影空間を一点でブローイング・アップした複素曲面は満渕の障害が消えないことを示した.
次世代シーケンサーを用いた大腸癌末梢血の抗EGFR抗体非侵襲的感受性診断の検討

進行大腸癌に対する抗EGFR療法の効果はRAS野生型の患者に限られているため、あらかじめ生検など癌組織の遺伝子検査により患者を選別する必要がある。RAS変異は抗EGFR治療中にも獲得され、獲得耐性の重要なメカニズムの一つである。血液中から低頻度の変異クローンを検出できれば、治療経過中変異を来した場合、無益な治療の継続を回避することが可能となり、治療成績・費用対効果の改善につながることが期待される。本研究により血液検体を用いた非侵襲性RAS変異検査を確立し、病勢モニタリングや耐性変異を標的とする新しい分子標的薬の適用決定の可能性が示唆された。進行大腸癌に対する抗EGFR療法のbenefitは野生型KRASの患者に限られているため、生検サンプルなどあらかじめ癌組織の遺伝子検査を行い、適用のある患者を選別する必要がある。KRAS変異は抗EGFR治療中にも獲得されることが認識され、獲得耐性の重要なメカニズムの一つとして提唱されるようになった。血液中から低頻度の変異クローンを検出できれば、原発巣が野生型の患者が治療経過中変異を来した場合、無益な治療の継続を回避することが可能となり、診断精度の改善および費用対効果の改善につながることが期待される。本研究では、従来の検査の感度を向上させることで血液検体を用いた非侵襲性KRAS変異検査を確立し、病勢モニタリングや耐性変異を標的とする新しい分子標的薬の適用決定など新しい用途の研究開発を行うことを目的とする。本年度は大阪大学と基幹関連施設での高度進行大腸癌の標本(原発巣、生検サンプル、全血)を集積・保管するシステムを構築した。次世代シーケンサーを用いた血漿中大腸癌由来変異DNA検出法の確立するため、実験系のバックグラウンドノイズを測定し、コマーシャルのゲノムDNAサンプルを用いて解析により条件設定を完了した。実際の臨床サンプル(原発巣、生検サンプル、血液)を対象としてKRAS変異の相同性について検証した。サンプルにより、組織、術前血漿でのmutationの割合が高く、術後の血漿においては、mutationが少なくなっていることが確認された。これらの結果は、薬剤感受性、病態などを予測するのに重要な情報を与えると考えられる。以上のように、血液中のcfDNA(セルフリーDNA)の解析により、大腸癌組織の変異を検出できる可能性が示唆された。これまでに大阪大学およびその基幹関連施設からなる臨床試験推進組織である大阪大学大腸疾患分科会をベースに、対象となる高度進行大腸癌症例の標本(原発巣、生検サンプル、全血)臨床病理所見データの回収・保管システムを構築した。また次世代シーケンサーを用いてPCR増幅したKRAS断片を10万回以上配列決定することにより、エラー率の低い血漿中大腸癌由来変異DNA検出法を確立した。さらに同一鋳型を逆方向から配列決定するオプション技術や、個々の塩基のエラー率を正確に調べることで配列読み取り精度を向上させることに成功した。平成27年度の実施計画項目として、遠隔転移を有する10例のサンプルを対象として、生検サンプルと血液サンプルの解析で同じKRAS変異が検証できた。ただし、薬剤耐性、感受性データが揃った症例での、組織サンプルと血漿サンプルのタイムコースを取得することに時間を要し、当初の予定症例の解析からやや遅れている。また、採取する場所の違いにより、異なる結果が出る場合があるため、血液中サンプルを用いた場合の感度の安定性を検証すると共に、生体サンプルを複数調べることにより、双方の結果の安定性の違いの検証も今後の課題である。現在、検出感度のスレッシュフォールド変化による一致率検討、単純相関検討、他技術による感度比較、薬剤応答情報を基にした生検サンプル、血液サンプルの感度、特異度の検討をすすめている。

血液中から低頻度の変異クローンを検出できれば、原発巣が野生型の患者が治療経過中変異を来した場合、無益な治療の継続を回避することが可能となり、診断精度の改善および費用対効果の改善につながることが期待される。本研究では、従来の検査の感度を向上させることで血液検体を用いた非侵襲性KRAS変異検査を確立し、病勢モニタリングや耐性変異を標的とする新しい分子標的薬の適用決定など新しい用途の研究開発を行うことを目的としており、昨年同様に札幌医科大学および大阪大学と基幹関連施設での高度進行大腸癌の標本を集積・保管するシステムを構築した。次世代シーケンサーを用いた血漿中大腸癌由来変異DNA検出法を確立するため、実験系のバックグラウンドノイズを測定し、コマーシャルのゲノムDNAサンプルを用いた解析により条件設定を完了した。また、実際の臨床サンプル(原発巣、生検サンプル、血液)を対象としてKRAS変異の相同性について検証した。サンプルから、組織、術前血漿でのmutationの割合が高く、術後の血漿においては、mutationが少なくなっていることが確認された。これらの結果は、薬剤感受性、病態などを予測するのに重要な情報を与えると考えられる。以上のように、血液中のcfDNA(セルフリーDNA)の解析により、大腸癌組織の変異を検出できる可能性が示唆された。これまでに札幌医科大学、大阪大学およびその基幹関連施設からなる臨床試験推進組織である大腸疾患分科会をベースに、対象となる高度進行大腸癌症例の標本(原発巣、生検サンプル、全血)臨床病理所見データの回収・保管システムを引き続き構築した。生検サンプルではKRAS変異と血液サンプルでのKRAS変異の相同性についてさらに症例数を増やして、生検と血液サンプル中とのKRAS変異結果の検証を続け、薬剤応答との比較により、その感度と特異度を調べている。組織サンプルも合わせて解析し、heterogeneityの検討と、その後の血漿サンプルのタイムコースを取得し、耐性変異の検出を目指すため、遠隔転移を有し、薬剤投与によって腫瘍は縮小したケース、一旦腫瘍縮小効果が得られたもののfailureして、腫瘍増大に転じたケースのサンプルを継続して収集している。また前回、ctDNAの収量が良くなかったサンプルについては、組織からのDNAを活用して、KRASとCancer Panel(他の遺伝子)で変異を調べるとともに、血漿サンプルについてPCRで増幅が可能であるかどうかを検討している。札幌医科大学へ異動後も、引き続きDNAチップ研究所と共同研究契約をし、札幌医科大学にてサンプルを収集し、解析を行っているが当初の予定より解析に時間がかかっている。進行大腸癌に対する抗EGFR療法の効果はRAS野生型の患者に限られているため、生検サンプルなどあらかじめ癌組織の遺伝子検査を行い、適用のある患者を選別する必要がある。RAS変異は抗EGFR治療中にも獲得されることが認識され、獲得耐性の重要なメカニズムの一つである。
生体内で変換・生成するビタミンK2(メナキノン-4)の生理的役割に関する研究

生体内で他のビタミンKから変換されるメナキノン-4(MK-4)の生理機能の解明、および、我々が見出したビタミンKによる抗炎症作用、テストステロン合成への関与について、その分子機構の解析を行い、次の知見を得た。1.動物の生体内でMK-4へと変換されない2',3'-ジヒドロフィロキノン(dK1)を無菌および通常ラットに給餌し、血液凝固不全を伴うビタミンK欠乏症を発症させることなく、肝臓以外の臓器でビタミンKを低下させたモデル動物を作出した。その表現形を解析したところ、骨形成マーカーである血漿オステオカルシン濃度がdK1給餌群で有意に上昇していた。一方、血漿カルシウムには変化が見られなかったことから、dK1給餌によって、骨の代謝回転が上昇したのではなく、骨芽細胞の分化が亢進していることが示唆された。2.ビタミンK欠乏時に見られる、テストステロン産生の低下が、直接的な精巣MK-4の低下に起因するか、否かについて、通常ラットにビタミンKを制限した食餌を与え、血液凝固不全などのビタミンK欠乏症を発症することなく、精巣のMK-4量を低下させたモデル動物を作製し、LPS投与後のテストステロン産生に及ぼす影響について解析を行った。その結果、LPS投与によるテストステロン産生の低下が、ビタミンKを制限した群において、より顕著に見られること、テストステロン合成の律速酵素であるCypllaのmRNA量、タンパク質量も有意に減少していたことから、精巣中のMK-4の低下により、炎症が促進したことに起因することが示唆された。3.マウス由来マクロファージ様細胞を用いて抗炎症作用の分子機構を解析した。LPS誘導のIL-1β,IL-6,TNFαmRNAをMK-4は有意に低下させた。この抑制効果の発現には、LPS刺激前に細胞をMK-4で前処理する必要があり、MK-4処理した細胞のコンディションメディウム中にも抑制活性が認められた。このことから、MK-4による抗炎症作用は、MK-4の代謝物やコンディションメディウム中に分泌される抗炎症物質によることが示唆された。これまで我々はビタミンK(K)の充足度の異なるモデル動物を作出し、各組織における遺伝子発現を網羅的に解析して、組織内におけるK類からメナキノン-4(MK-4)への変換の生理的意義の解明を試みてきた。その結果、Kが抗炎症作用を有すること、K欠乏時には精巣におけるテストステロン産生が減少することを明らかにしてきた。本研究では、抗炎症作用の分子機構の解明として、ヒト由来THP-1細胞を用いて解析を行った。また精巣中のMK-4がリポポリサッカライド(LPS)投与時のテストステロン産生減少に及ぼす影響を解析した。ヒトマクロファージ様細胞をLPSで処理した際に誘導されるインターロイキン-6(IL-6)の遺伝子発現量を指標として、Kの抗炎症効果の作用機序について解析を行った。K1、MK-4、ともに、LPS誘導のIL-6 mRNA上昇を抑制した。また、側鎖の長さの異なるK2同族体であるMK-3、MK-7によってもIL-6発現量が抑制された。一方、K類の側鎖構造体であるフィトール、ゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニルアセトンは、IL-6発現量を低下させなかった。このことから、KによるIL-

6発現抑制作用は、Kのナフトキノン骨格によるものと推定された。次に、LPS投与時のテストステロン産生の減少を精巣中のK(ほとんどがMK-4)が抑制する可能性について解析を行った。ラットにK無添加飼料(K-free食)を与え、精巣中のK含量を低下させた。これらの動物にLPSを投与し、テストステロン産生に及ぼす影響について解析を行ったところ、コントロール食を与えた動物に比べ、K-free食を与えた動物ではテストステロン産生が有意に減少した。以上のことから、精巣中のKはLPS誘導の炎症シグナルを阻害し、テストステロン産生低下を抑制することが示唆された。これまで我々はビタミンK(K)の充足度の異なるモデル動物を作出し、各組織における遺伝子発現を網羅的に解析して、組織内におけるK類からメナキノン-4(MK-4)への変換の生理的意義の解明を試みてきた。その結果、Kが抗炎症作用を有すること、K欠乏時には精巣におけるテストステロン産生が減少することを明らかにしてきた。本研究では、抗炎症作用の分子機構の解明として、マウス由来RAW264細胞を用いて解析を行った。また、生体内でMK-4へと変換されないK1誘導体(ジヒドロフィロキノン)をラットに給餌した場合の影響について解析を行った。マウスマクロファージ様細胞をLPSで処理した際に誘導されるインターロイキン-1β(IL-1β)の発現をMK-4は有意に低下させた。また、IL-6,TNFαなど他の炎症性サイトカインのmRNA発現量も有意に低下させた。これらの発現低下には、MK-4の前処理が必要であることが明らかとなったことから、MK-4処理した細胞のコンディションメディウムを調製し、LPS誘導性炎症性サイトカインの発現に与える影響を観察したところ、コンディションメディウムに抗炎症活性の存在が示唆された。ジヒドロフィロキノンを給餌したラットの表現形を解析したところ、種々の血漿脂質・糖質代謝パラメーターに変化は見られなかったが、血漿低カルボキシル化オステオカルシンやアルカリホスファターゼ活性の有意な上昇が観察された。一方、酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性や副甲状腺ホルモン濃度には変化が見られなかった。以上のことから、ジヒドロフィロキノン給餌によって骨中のMK-4含量が低下した場合、骨芽細胞の分化が促進し、その機能の亢進が示唆された。
ステロイドが与える免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍免疫応答への影響

自身の免疫を賦活化させてがんを駆逐するがん免疫療法が第4のがん治療として認知されつつある。しかしながら、一部の患者における強い抗腫瘍免疫応答と共に生じる免疫関連副作用(Immune related adverse event: irAE)のコントロール大きなが課題の一つとなっている。また、irAEの発生機序やirAEをコントロールするために投与される免疫抑制剤(ステロイド)が抗腫瘍免疫応答にどのような影響を与えるかなど不明な点があった。本研究ではマウスモデルを用いてステロイドが免疫チェックポイント阻害剤により誘導された抗腫瘍免疫応答にどのような影響を与えるのかを明らかにする。これまでに本研究代表者らは純系マウスモデルにおいて免疫療法後腫瘍拒絶をした個体にステロイドを投与すると腫瘍が増悪することを観察している。この結果からステロイドが賦活化された抗腫瘍免疫に対して何らかの影響を与えていることを示唆している。これまでの研究実績において、ステロイドの投与量・投与時期を比較検討したところステロイドの容量依存的に腫瘍の増悪が見られること・投与時期が後期になれば抗腫瘍免疫への影響がないことを見出した。当該年度においてはさらに、脂肪酸代謝経路を介してTCR親和性の低いがん抗原特異的CD8+T細胞のメモリー形成を抑制していること・細胞外フラックスアナライザーを用いた検討ではTCR親和性が低い場合にステロイド投与により酸素消費量が低下することを明らかにした。また、臨床検体において免疫チェックポイント阻害剤投与後のステロイド投与時期やmutation burdenでの生存率の比較検討を行ったところマウスモデルで得られた結果と相関しているというデータを得た。本研究代表者らは、すでに純系マウスモデルを用いた検討によりステロイド投与が免疫チェックポイント阻害剤により惹起された抗腫瘍免疫応答へ何らかの影響を与えるということを観察している。さらに、投与時期についての検討及び一部のマウスにおける腫瘍増殖を端緒としたメモリー形成への影響の検討・また、T細胞免疫応答の違いがTCR親和性に依存的かどうかOVAトランスジェニックマウスを用いた系で検討を行い、TCRの下流のシグナルのリン酸化に違いがあることを明らかにした。また、転写抑制のターゲットとなるのが脂肪酸代謝関連分子であることを突き止め、CD8+T細胞のメモリー合成阻害と関連していることを明らかにした。共同研究先より得られた臨床データをレトロスペクティブに解析を行ったところmutationburdenが少ない患者群つまりTCR低親和性ではステロイドの早期投与ではOSが低下し、mutation burdenが多い患者群つまりTCR高親和性ではステロイドの投与時期にかかわらずOSが維持された。ステロイドによるメモリーCD8+T細胞の合成が阻害されずに維持された結果であると推察される。マウスモデルでの検討により得られたデータと臨床データとの比較検討が行えた為、進捗状況は当初の計画以上に進展している。今回得られた検討結果が臨床での免疫チェックポイント阻害剤・ステロイド使用のレジュメを改善する一助となるように積極的に発信を行い、今後は得られたマウスデータ・臨床データをさらにブラッシュアップさせ論文投稿の準備を行う。また、必要に応じて論文投稿後の追加実験などを行う予定である。免疫を賦活化し自身の免疫によりがんを駆逐しようという免疫療法の一つである、免疫チェックポイント阻害剤は一部のがん患者で目覚ましい効果を発揮している。しかしながら、免疫チェックポイント阻害剤は体内での免疫恒常性のバランスを変化させることから重篤な副作用が生じるケースがあり、副作用のコントロールも重要な課題の一つである。特に自己免疫疾患関連副作用(immune related adverse event: irAE)が発症すると稀に劇症化する。irAEに対しては免疫抑制剤であるステロイドの投与がなされる。ところが、これまで免疫チェックポイント阻害剤が誘導した抗腫瘍免疫応答に対するステロイドの影響について詳細な検討は行われていない。本研究では、実臨床では漫然とステロイドの投与がされているものの、その効果ゆえに詳細な検討がなされてこなかったステロイドの抗腫瘍免疫応答に与える影響を明らかにする。本研究代表者はすでに純系マウスモデルにおいて、免疫療法(抗体投与)後腫瘍拒絶した個体へステロイド投与すると腫瘍が増悪することを観察している。これは、ステロイドが賦活化された抗腫瘍免疫に対してなんらかの影響を与えていることを示唆している。本研究では、さらに腫瘍局所に浸潤したリンパ球を詳細に検討し、ステロイドがどのように抗腫瘍免疫応答へ影響を与えているのかを明らかにする。当該年度においては、マウスモデルを用いてステロイドの投与量・投与時期を比較したところ、ステロイドを早期(腫瘍担がん後3日目)から投与した場合、ステロイドの容量依存的に腫瘍の増殖が観察された。一方で腫瘍担がん後17日目以降では、高容量・低容量でも免疫チェックポイント阻害剤により惹起された抗腫瘍免疫応答へ影響を与えないことが明らかになった。さらに、がん抗原特異的CD8陽性T細胞の誘導効率にも影響を与えていることも見出した。本研究代表者らは、すでに純系マウスモデルにおいて免疫療法(抗体投与)後腫瘍拒絶した個体へステロイドを投与すると腫瘍が増悪することを観察しており、この結果はステロイドが賦活化された抗腫瘍免疫に対して何らかの影響を与えていることを示唆している。当該年度では、ステロイドの投与量・投与時期を変えることによりステロイドが作用する時期(抗腫瘍免疫応答の誘導時期を鑑みて)を明らかにした。また、NY-ESO-1特異的CD8陽性T細胞の誘導効率も容量・時期に依存的であることも見出した。また、NY-ESO-1特異的CD8陽性T細胞の詳細な検討を行ったところCD127hiのメモリープレカーサーが特にステロイドの影響を受けている可能性を示唆する結果を得た。

今後は、ステロイドが特に影響を与えている細胞群・シグナル経路、また代謝経路の変化などマスサイトメトリーやフラックスアナライザーを用いて詳細に検討を行う。自身の免疫を賦活化させてがんを駆逐するがん免疫療法が第4のがん治療として認知されつつある。しかしながら、一部の患者における強い抗腫瘍免疫応答と共に生じる免疫関連副作用(Immune related adverse event: irAE)のコントロール大きなが課題の一つとなっている。また、irAEの発生機序やirAEをコントロールするために投与される免疫抑制剤(ステロイド)が抗腫瘍免疫応答にどのような影響を与えるかなど不明な点があった。本研究ではマウスモデルを用いてステロイドが免疫チェックポイント阻害剤により誘導された抗腫瘍免疫応答にどのような影響を与えるのかを明らかにする。これまでに本研究代表者らは純系マウスモデルにおいて免疫療法後腫瘍拒絶をした個体にステロイドを投与すると腫瘍が増悪することを観察している。この結果からステロイドが賦活化された抗腫瘍免疫に対して何らかの影響を与えていることを示唆している。これまでの研究実績において、ステロイドの投与量・投与時期を比較検討したところステロイドの容量依存的に腫瘍の増悪が見られること・投与時期が後期になれば抗腫瘍免疫への影響がないことを見出した。当該年度においてはさらに、脂肪酸代謝経路を介してTCR親和性の低いがん抗原特異的CD8+T細胞のメモリー形成を抑制していること・細胞外フラックスアナライザーを用いた検討ではTCR親和性が低い場合にステロイド投与により酸素消費量が低下することを明らかにした。また、臨床検体において免疫チェックポイント阻害剤投与後のステロイド投与時期やmutation burdenでの生存率の比較検討を行ったところマウスモデルで得られた結果と相関しているというデータを得た。本研究代表者らは、すでに純系マウスモデルを用いた検討によりステロイド投与が免疫チェックポイント阻害剤により惹起された抗腫瘍免疫応答へ何らかの影響を与えるということを観察している。さらに、投与時期についての検討及び一部のマウスにおける腫瘍増殖を端緒としたメモリー形成への影響の検討・また、T細胞免疫応答の違いがTCR親和性に依存的かどうかOVAトランスジェニックマウスを用いた系で検討を行い、TCRの下流のシグナルのリン酸化に違いがあることを明らかにした。また、転写抑制のターゲットとなるのが脂肪酸代謝関連分子であることを突き止め、CD8+T細胞のメモリー合成阻害と関連していることを明らかにした。共同研究先より得られた臨床データをレトロスペクティブに解析を行ったところmutation
多価不飽和脂肪酸により誘導されたマウス腹腔細胞の脂質代謝に関する研究

エイコサペンタエン酸(EPA)をマウス腹腔内に投与すると、2日後にはPMN(多形核白血球)が正常の100倍以上に増加し、さらにPMN中の構成脂肪酸に変化が生じ、投与したEPAが特異的に摂取されていることが判った。次にこの摂取されたEPAがアラキドン酸代謝にどのように関係しているかを検討するため、分析方法の検討を行なった。ラジオイムノアツセイ法ではTXB_2と6KF_<1α>の定量は可能であっても、他のアラキドン酸カスケードの生産物については、別の方法を考える必要がある。そこで、9ーナフタリルジアゾメタン(ADAM)を用い蛍光分析を行なったが成功せず、3ーbromomethylー6,7ーdimethoxy-1-methyl-2-(1H)quinoxalinoneを用い種々と検討した結果、完全ではないが分析できるようになった。一方マウスは通常、CEー2の固型飼料を用いて飼育し実験を行なうが、このCEー2の飼料中には、魚粉が不飽和脂肪酸の供給源として添加されている。このEPAの実験で、よりEPAの摂取及び効果を検討するために魚粉を添加していない飼料(無添加)群と普通食群について、血中及び肝でのリン脂質の組成およびその構成脂肪酸について分析を行なった。遊離脂肪酸量や構成リン脂質の割合には変化はなかったが、その構成脂肪酸には変動が認められた。例えば、無添加群については、肝のレシチン中の高度不飽和脂肪酸の割合や組成に変化が認められた。この群にEPAを投与すると、投与したEPAの存在も認められるがリノール酸からの脂肪酸代謝に変化が認められる結果であった。今後は、無添加食群にEPAを投与し誘導されたPMN中の脂質とアラキドン酸カスケードに関する解析をして行く予定である。
白色LED用Eu2+, Ce3+賦活蛍光体の温度消光原因の解明

Eu2+やCe3+イオン添加化合物は、白色LED用の蛍光体として広く利用されており、その消光プロセスを明らかにすることで高効率白色LEDの開発や新規光機能性材料への展開が期待されている。本年度は、Eu2+やCe3+イオンをはじめ、紫外励起緑色蛍光体として期待されているTb3+や赤色発光を示すCr3+の発光の温度依存性とその消光原因を明らかにした。さらには、その消光プロセスを利用し、長残光蛍光体や温度センサーへの展開も行った。具体的には、Eu2+添加Ba[Mg2Al2N4]にいおて、熱イオン化消光を利用して、近赤外長残光蛍光体の開発に成功した。本蛍光体は、赤色光において励起可能で、かつ、熱イオン化消光の存在のために、励起電子が伝導帯へ移動しトラップに捕獲される。よって、赤色蓄光が可能な近赤外長残光蛍光体となり、励起・発光ともに生体の窓に位置しているため、バイオ蛍光プローブとして期待される。Ce3+添加Sr2GdAlO5とSr3AlO4Fにおいて、消光プロセスが熱イオン化であることを明らかにし、フッ素置換することでバンドギャップを広げ、消光温度を向上させた。Tb3+添加GdHOにおいて、水素アニオン配位により5d励起準位エネルギーが低下するため、Tb3+:5D4準位からの緑色発光は、5d準位を介して消光することを明らかにした。Cr3+添加ZnGa2O4において、赤色発光を示す2E準位から熱クロスオーバープロセスにより、近赤外発光を示す4T2へエネルギーが移動することを利用し、二つの発光強度比の温度依存性から良い蛍光温度プローブになることを示した。以上より、蛍光体の温度消光プロセスの解明とその消光原因を利用した新規光機能性材料への展開に成功した。近年、白色LEDの高出力化に伴う発熱により、白色LEDに封止されている蛍光体の熱特性の向上、また、その熱消光の原因の解明が急務とされている。本研究は、白色LED用蛍光体、特に5d-4f発光を有するランタニドイオンにおいて、どのようなメカニズムで温度消光しているかを明らかにすることを目的としている。本年度は、主にCe3+添加ガーネット蛍光体における熱消光の原因の解明を明らかにした。Ce3+添加ガーネット蛍光体は、実用蛍光体に既に使用されている可視蛍光体であるが、消光原因については、未だに分かっていないことが多い。最も広く使用されているY3Al5O12:Ce3+ガーネット蛍光体のYサイトをLu、Gdに部分置換して、そのCe3+発光の消光プロセスをディレイ発光励起スペクトルと光音響スペクトルから考察した。既に我々は、Y3Al5O12:Ce3+については、Ce3+の電子が伝導帯に熱により移動する熱イオン化消光が生じることを明らかにしたが、Yサイトを別のランタニドイオンに置換しても、同様の熱イオン化消光が起きることが明らかになった。また、無輻射緩和プロセスは、直接観測することが難しいが、今回、光励起によって生成した熱を直接観測する光音響スペクトルを用いて、より深く無輻射緩和プロセスについて議論した。また、5d-4f発光の消光には、熱イオン化の他に熱活性化クロスオーバーによる消光がある。我々は、Pr3+を添加したY3Al5-xGaxO12において、Ga濃度を変化させることにより、消光プロセスが熱活性化クロスオーバーから熱イオン化に変化する非常に特異な系を見つけ、消光に関する活性化エネルギーについても明らかにした。本研究においては、実用白色LED用蛍光体、特に5d-4f発光を有するランタニドイオンにおいて、どのようなメカニズムで温度消光しているかを明らかにすることを目的としている。Ce3+添加Y3Al5O12ガーネット蛍光体は、最も広く使用されている実用蛍光体で、また、発光色の調整のために、ランタニドサイトをGdやLuで置換した蛍光体も開発されている。我々は、YサイトをGd,Luで部分置換したCe3+添加ガーネット蛍光体において、Ce3+の発光が熱イオン化によって、消光していることを明らかにしたころから、当初の目的は達していると言える。また、温度消光において主な原因となる熱イオン化と熱活性化クロスオーバーの二つの消光パスが共存し、その度合いを変化させることができる蛍光体を発見し、その消光特性に関して詳細な調査を行った。一連の消光原因の実験により、熱イオン化消光・熱活性化クロスオーバー消光を支配する要因についても解明しつつあり、蛍光体の消光原因を調査するという当初の計画以上に、高効率蛍光体の開発を可能にする材料設計指針の構築の段階に進んでいる。以上より、当初の計画以上に進展していると言える。本年度は、Eu2+添加CaAlSiN3赤色蛍光体における温度消光の原因を明らかにした。Eu2+添加CaAlSiN3赤色蛍光体は、実用蛍光体として既に白色LEDデバイスに使用されているが、その温度消光プロセスを解明した研究はなかった。

Eu2+添加CaAlSiN3は、640nm付近に5d-4f発光を示し、その発光強度の温度依存性を測定したところ、400K程度から徐々に温度消光を示し、発光強度が低温時の強度に比べ半分になる消光温度は、657Kであった。この温度消光プロセスを調べるために、熱ルミネッセンス(TL)グロー曲線測定を行った。室温で紫外線照射後TLグロー曲線を測定すると、300Kから600Kのブロードなバンドが観測されたが、Eu2+の最低5d準位を励起できる550nmを照射後、TLグロー曲線を測定したところTLグローピークは観測されなかった。これは、Eu2+の最低5d準位から伝導帯までの電子移動が生じなかったため、欠陥に電子が捕獲されずTLグローピークを示さなかったと理解できる。一方で、温度消光が始まる400Kにサンプル温度を上昇させて、550nmを照射後TLグロー曲線を測定したところ、TLグローピークが観測された。これは、熱エネルギーによって、最低5d準位の電子が伝導帯に移動したためであると考えられる。以上より、Eu2+添加CaAlSiN3赤色蛍光体における温度消光は、熱イオン化であると結論付けた。本研究においては、実用白色LED用蛍光体、特に5d-4f発光を有するランタニドイオンにおいて、温度消光メカニズムを解明することを目的としている。Eu2+添加CaAlSiN3蛍光体は、最も広く使用されている実用赤色蛍光体であり、その蛍光体において、温度消光メカニズムを明らかにしたことから、当初の目的は達していると言える。Eu2+やCe3+イオン添加化合物は、白色LED用の蛍光体として広く利用されており、その消光プロセスを明らかにすることで高効率白色LEDの開発や新規光機能性材料への展開が期待されている。本年度は、Eu2+やCe3+イオンをはじめ、紫外励起緑色蛍光体として期待されているTb3+や赤色発光を示すCr3+の発光の温度依存性とその消光原因を明らかにした。さらには、その消光プロセスを利用し、長残光蛍光体や温度センサーへの展開も行った。具体的には、Eu2+添加Ba[Mg2Al2N4]にいおて、熱イオン化消光を利用して、近赤外長残光蛍光体の開発に成功した。本蛍光体は、赤色光において励起可能で、かつ、熱イオン化消光の存在のために、励起電子が伝導帯へ移動しトラップに捕獲される。よって、赤色蓄光が可能な近赤外長残光蛍光体となり、励起・発光ともに生体の窓に位置しているため、バイオ蛍光プローブとして期待される。Ce3+添加Sr2GdAlO5とSr3AlO4Fにおいて、消光プロセスが熱イオン化であることを明らかにし、フッ素置換することでバンドギャップを広げ、消光温度を向上させた。Tb3+添加GdHOにおいて、水素アニオン配位により5d励起準位エネルギーが低下するため、Tb3+:5D4準位からの緑色発光は、5d準位を介して消光することを明らかにした。Cr3+添加ZnGa2O4において、赤色発光を示す2E準位から熱クロスオーバープロセスにより、近赤外発光を示す4T2へエネルギーが移動することを利用し、二つの発光強度比の温度依存性から良い蛍光温度プローブになることを示した。以上より、蛍光体の温度消光プロセスの解明とその消光原因を利用した新規光機能性材料への展開に成功した。これまでに、Ce3+単独添加ガーネット蛍光体において、深く研究してきた。今後は、同じく5d-4f発光を有し広く白色LED用蛍光体として用いられているEu2+蛍光体に焦点を当てて、消光原因の解明を行う。
クリニカルメタゲノミクスと病原体ゲノミクスの高感度化

本研究は、原因不明疾患の患者の臨床検体から網羅的かつ迅速な病原体の検出・同定を行い、感染症の原因を解明することを目的とする。取り組む次世代シークエンサーを用いたメタゲノム解析法(クリニカルメタゲノミクス)は、病原体ごとに異なる処理は必要とせず、臨床検体中の遺伝情報を網羅的に探索することで、すべての既知の病原体はもちろん、未知の病原体をも検出・同定し得るものである。さらに全核酸の配列をシークエンスしているので、病原体の検出と同時に病原体ゲノムの遺伝子型のタイピングも実施可能である。しかし、本手法では、臨床検体中の核酸配列を網羅的に解読するため、得られるデータ量は、検体中に存在する生物のゲノムサイズとそのコピー数の積に比例する。そのため、ゲノムサイズの小さなウイルスや細菌など病原性微生物由来の配列は、メタゲノムデータにおいて、その配列数がごくわずかとなる。また大量に得られるメタゲノムデータ中には、ライブラリ調製過程でのキメラ配列や試薬に由来する配列など不要な情報も多く含まれる。そこで本研究では、病原体の検出感度向上と低コスト化、解析の高速化に向けて、主に臨床検体中における病原体の濃縮法について開発を行う。本年度は、これまでに取得済みのデータを用いて解析の高速化に向けた解析パイプラインの最適化に取り組んだ。具体的には、NGSのライブラリ調製時に付加したアダプター配列がゲノムアセンブリの際にミスアセンブリにより組み込まれ、データベース上に誤登録されているものを検出したり、特定の試薬を用いた場合によく検出される病原体由来の配列断片を検出したりした。また、ゲノムとの類似性ゆえ誤検出されやすい(偽陽性となりやすい)配列もまとめあげ、それらをデータベース化することで、解析の最適化を実施した。本年度は、メタゲノム解析の高速化に向けたデータベースと解析手法の最適化に取り組んだ。メタゲノム解析の一般的な解析ワークフローとしては、得られた配列のトリミング、マッピングなどによるホスト由来核酸の除去、残る配列に対するデータベースとの相同性検索などであるが、最初の工程におけるトリミングの最適化を実施した。解析時に偽陽性となったり、データベース上へ誤登録されたりしている配列をまとめて、データベース化し、既存の解析パイプラインの初期工程に組み込んだ。具体的には、アダプタートリミングやクオリティトリミングの後に本工程を実施するようにした。不要な配列の除去方法としては、シークエンスによって得られた配列との相同性が高いため、bwaを用いたマッピングにより実施することとし、高速に処理ができるように整えた。病原体検出専用のデータベースを用いたマッピング解析と組み合わせて実施することで、計算時間のかかる相同性検索(BLAST検索)に要する時間を減らすことに成功した。臨床検体のメタゲノムデータ解析の高速化に向けた取り組みは、概ね順調に進めることができたが、実際にメタゲノムデータ中に含まれる病原体由来の核酸配列は0.1%を下回ることが多く、膨大なシークエンスデータ中の大部分が病原体由来配列ではないため、コストに無駄があるというだけでなく、不要なホスト由来核酸にリードが専有されるために感度が低いという課題が残っている。次年度以降は、高感度化を目指した病原体核酸の効率的なシークエンス方法の検討に取り組むこととする。これまでに実施してきたカラムによるウイルス濃縮方法を発展させ、より効率的な濃縮方法を検討すると共に、細菌・真菌・寄生虫といった他の病原性微生物に対する濃縮方法を検討していきたい。また同時に無駄なデータとなっているホスト由来の配列にも特徴づけを行いたい。特定の遺伝子が多くシークエンスされているのであれば、解析時にそれらをすばやく除去することは可能であるし、プローブを用いたり、配列の特徴性を活かしたりすることで、ライブラリ調製時にホスト由来の核酸を減らす方法を検討できる可能性がある。

本年度は、メタゲノム解析の高速化に向けたデータベースと解析手法の最適化に取り組んだ。メタゲノム解析の一般的な解析ワークフローとしては、得られた配列のトリミング、マッピングなどによるホスト由来核酸の除去、残る配列に対するデータベースとの相同性検索などであるが、最初の工程におけるトリミングの最適化を実施した。解析時に偽陽性となったり、データベース上へ誤登録されたりしている配列をまとめて、データベース化し、既存の解析パイプラインの初期工程に組み込んだ。具体的には、アダプタートリミングやクオリティトリミングの後に本工程を実施するようにした。不要な配列の除去方法としては、シークエンスによって得られた配列との相同性が高いため、bwaを用いたマッピングにより実施することとし、高速に処理ができるように整えた。病原体検出専用のデータベースを用いたマッピング解析と組み合わせて実施することで、計算時間のかかる相同性検索(BLAST検索)に要する時間を減らすことに成功した。臨床検体のメタゲノムデータ解析の高速化に向けた取り組みは、概ね順調に進めることができたが、実際にメタゲノムデータ中に含まれる病原体由来の核酸配列は0.1%を下回ることが多く、膨大なシークエンスデータ中の大部分が病原体由来配列ではないため、コストに無駄があるというだけでなく、不要なホスト由来核酸にリードが専有されるために感度が低いという課題が残っている。次年度以降は、高感度化を目指した病原体核酸の効率的なシークエンス方法の検討に取り組むこととする。これまでに実施してきたカラムによるウイルス濃縮方法を発展させ、より効率的な濃縮方法を検討すると共に、細菌・真菌・寄生虫といった他の病原性微生物に対する濃縮方法を検討していきたい。また同時に無駄なデータとなっているホスト由来の配列にも特徴づけを行いたい。特定の遺伝子が多くシークエンスされているのであれば、解析時にそれらをすばやく除去することは可能であるし、プローブを用いたり、配列の特徴性を活かしたりすることで、ライブラリ調製時にホスト由来の核酸を減らす方法を検討できる可能性がある。臨床検体由来の核酸配列から病原性微生物に由来する配列を濃縮するための手法について種々の検討を行う予定であったが、カラムによる濃縮条件の検討に想定以上の時間を要した。そのため、本年度実施予定であった、濃縮条件の最適化や次世代シーケンサーを用いた研究については次年度以降に実施する予定である。