hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糞線虫寄生世代メスの単為生殖における精子非依存性極性形成機構の解明

動物寄生性線虫である糞線虫の宿主寄生ステージは単為生殖によって発生する。すなわち、卵が精子を用いずに発生を進行させることが可能である。申請者は、単為生殖を行う卵が精子を用いずに卵内の極性を形成するメカニズムの解明を目的とした研究を行った。まず、C. elegansの卵でanterior側またはposterior側に局在することが知られているProtein kinase C (PKC)-3やPartitioning defective protein (par) -6と相同性の高い分子を糞線虫ゲノム情報から見出した。これらの分子を蛍光標識し、その動態を追うことで極性形成のモニタリングが可能であると考えた。そこで、CRISPR/Cas9系を用いた遺伝子組換え系の確立を試みた。核酸の導入は、自由生活世代メスへのマイクロインジェクション法により行うこととした。糞線虫自由生活世代は、糞感染ラットの糞便を寒天培地上で;培養することによって得られるが、感染ラットの維持が困難であることから、in vitro培養によって自由生活型世代虫体を得ることを試みた。C. elegansの感染型幼虫誘導阻害物質であるdelta7ダファクロン酸(d-DA)を有性生殖後に発生する卵に加えて培養することで、感染型虫体への成長が阻害され次世代の成虫体が得られると考えた。有性生殖後に発生する卵をd-DA(500 nM)を添加した糞便融解液中で培養したところ、培養2日後体長1 mm体幅50 μmの虫体が見られた。この虫体は腸管及び生殖腺が発達しており、産卵口の形成も見られた。これらは自由生活世代雌の特徴と一致していた。一方で、d-DAを加えない培養では全ての虫体が感染型幼虫に発育した。以上の結果から、糞線虫のin vitro培養の可能性が示唆された。糞線虫の宿主寄生ステージはメスしか存在せず、その卵は単為生殖によって発生する。申請者は、単為生殖において、精子を用いずに卵内の極性を形成するメカニズムの解明を目的としている。有性生殖において、精子由来の核は卵内での極性形成に必須であることが知られており、精子由来の核を中心とした微小管の形成、さらにそれに沿って物質が移動することにより、細胞の運命が決定される。一方で、糞線虫の単為生殖においては精子核に依存しない極性の形成が起こっていることが予想されるが、その過程は全く明らかになっていない。そこで本研究では、C. elegansで明らかになっている極性関連因子の糞線虫における相同分子の動態を追うことで、単為生殖における極性形成過程を観察する。C. elegansの卵でanterior側またはposterior側に局在することが知られているProtein kinase C (PKC)-3やPartitioning defective protein (par) -6と相同性の高い分子を糞線虫ゲノム情報から見出している。現在、これらの分子を標的としたCRISPR/Cas9法を用いた蛍光タンパク質の導入を試みている。遺伝子導入に用いるマイクロインジェクション法の手技は獲得済みである。糞線虫は動物寄生性線虫であり、動物への感染による継代が欠かせない。動物実験申請・設備の立ち上げに想定以上の時間を要した。現在すでに定期的に十分量の虫体を確保する環境を整えることができたため、以後計画通りに研究を進行する。本研究は糞線虫の単為生殖卵における極性形成機構を解明することを目的とし、その上で有用と考えられるCRISPR/Cas9系を用いた遺伝子組換え法の確立を試みた。それぞれCas9タンパク質とguideRNAおよび相同組換え断片を発現するプラスミドを、マイクロインジェクション法によって導入することによって遺伝子組換えを誘導することを計画した。マイクロインジェクションを行う対象は、C. elegansと形態が類似している自由生活型世代メスを用いた。糞線虫自由生活世代は糞線虫感染ラットの糞便を寒天培地上で培養することによって得られるが、設備の制限上感染ラットの維持が困難であることから、in vitro培養によって自由生活型世代虫体を得ることを試みた。通常、自由生活世代における有性生殖後に発生する卵はC. elegansの休眠体と類似した感染型虫体に発育することが知られている。そこで、C. elegansの休眠体誘導阻害物質であるdelta7ダファクロン酸(d-DA)を有性生殖後に発生する卵に加えて培養することで、感染型虫体への成長が阻害され次世代の成虫体が得られると考えた。この方法はすでにヒト糞線虫で確立されていたが、本研究で用いたネズミ糞線虫では試みられたことがなかった。有性生殖後に発生する卵をd-DA(500 nM)を添加した糞便融解液中で培養したところ、培養2日後体長1mm体幅50 μmの虫体が見られた。以上の結果から、d-DAの添加により、ラットによる継代を必要としない糞線虫のin vitro培養の可能性が示唆された。in vitro培養によって自由生活型世代虫体を得ることを試みたが、現在の時点では成功に至っておらず、十分な材料の確保が困難であったため。動物寄生性線虫である糞線虫の宿主

寄生ステージは単為生殖によって発生する。すなわち、卵が精子を用いずに発生を進行させることが可能である。申請者は、単為生殖を行う卵が精子を用いずに卵内の極性を形成するメカニズムの解明を目的とした研究を行った。まず、C. elegansの卵でanterior側またはposterior側に局在することが知られているProtein kinase C (PKC)-3やPartitioning defective protein (par) -6と相同性の高い分子を糞線虫ゲノム情報から見出した。これらの分子を蛍光標識し、その動態を追うことで極性形成のモニタリングが可能であると考えた。そこで、CRISPR/Cas9系を用いた遺伝子組換え系の確立を試みた。核酸の導入は、自由生活世代メスへのマイクロインジェクション法により行うこととした。糞線虫自由生活世代は、糞感染ラットの糞便を寒天培地上で;培養することによって得られるが、感染ラットの維持が困難であることから、in vitro培養によって自由生活型世代虫体を得ることを試みた。C. elegansの感染型幼虫誘導阻害物質であるdelta7ダファクロン酸(d-DA)を有性生殖後に発生する卵に加えて培養することで、感染型虫体への成長が阻害され次世代の成虫体が得られると考えた。有性生殖後に発生する卵をd-DA(500 nM)を添加した糞便融解液中で培養したところ、培養2日後体長1 mm体幅50 μmの虫体が見られた。この虫体は腸管及び生殖腺が発達しており、産卵口の形成も見られた。これらは自由生活世代雌の特徴と一致していた。一方で、d-DAを加えない培養では全ての虫体が感染型幼虫に発育した。以上の結果から、糞線虫のin vitro培養の可能性が示唆された。CRISPR/Cas9を用いた遺伝子組換え系を確立するため、強制発現により効率のよいプロモーター配列を決定する。また、糞線虫をin vitroのみで培養する方法も現在検討中である。これらの工夫によって効率の良い遺伝子組換え系を確立し、精子核に依存しない極性の形成過程を詳細に観察するための環境を整備する。d-DAの添加のタイミングや濃度、その後の培養条件の検討を行い、ラットによる継代を必要としない糞線虫のin vitro培養を確立する。購入予定物品の価格が想定よりも低かったため。少額であるため、次年度以降の物品購入費に補填する。
生物における管のネットワークのダイナミクスの数理的研究

中垣らは、真正粘菌変形体が迷路を解いたり、最短経路探索問題を解く能力があることを、2000年にNatureに発表した。我々は真正粘菌変形体がどのようにこれらの問題を解いているのかを観察し、それを数理的に記述することにより、グラフ上の最短経路探索問題を解く新しいシステム□Physarum Solver-を開発した。各エッジに長さが与えられた連結無向グラフにおいて2つのノード間の最も短いパスを見いだすのが、最短経路探索問題であるが、迷路の問題はこのような形で記述される。グラフを水道管のネットワークとみなし、2つのノードの一方から水を流し込み、他のノードから水が流れ出るという状況を考えると、水の流れの様子はネットワーク上のPoisson方程式を解くことで求めることができる。粘菌では原形質流動の流量に対し管の太さが適応的に変化するという性質があり、このことが迷路を解くことを可能にしていると考えられる。これに倣って、流量に対し管の太さが適応的に変化するようにモデルを構成すると、ある管は時間とともに太くなり、ある管は細くなるといった変化が生じる。そして、最終的に残った管が迷路の解を与えるのである。いずれの場合も、袋小路の部分は直ちに消えるが、適応的な変化を与える関数形によって、競合的なパスの漸近挙動は異なる。関数が線形である場合には、どのような初期値に対しても必ず最終的に最短経路が得られることが、シミュレーションにより確認された(簡単なグラフの場合には数学的証明も可能)。このPhysarum Solverでは計算時間がノード数の約1.32乗に比例しており、最短経路探査苦悶を解くアルゴリズムとしてはかなり速いものであり、しかも必ず最短経路に到達できるという長所がある。カーナビゲーションやインターネットにおける経路探索への応用が考えられる。本年度は主に、真正粘菌の変形体をモデル生物として、管のネットワークの形成や、それが物質の移動と情報処理において、どのような役割を果たしているかを、実験的手法と数理モデリングを用いて研究した。変形体は化学反応によって駆動される振動子の集合体であるとみなすことができる生物である。従来、結合振動子系による数理モデルがいくつか提唱されて来たが、いずれも変形体の運動を記述するには不十分であり、何より情報処理の観点が欠落していた。それに対し我々は、保存量を一つ持つ(これは原形質ゾルの総量に対応)結合振動子系を、2-Channels Modelという形で表現し、様々な実験事実を再現し解釈を行った。2-Cahannel Modelの2つのチャネルとは、十分に発達した管の構成する速い輸送チャネルと、シート構造部分の多孔性媒質の構成する遅い輸送チャネルのことである。変形体はシート部分が収縮フェーズにある時に力を出し、速い輸送チャネルを主に使って、原形質ゾルを輸送することで、物質の移動(より長いスケールでは変形体自身の移動)を行うという仮定の下で、モデリングを行った。実験では、細胞融合実験を行い、厚み振動の位相分布を計測し、周辺部位相反転と弱結合部位相反転の2通りの位相反転が起こっていることを発見した。また、外科的操作による細胞の部分分離実験によっても、これら2つの位相反転が起こることが確認された。我々は2-Channels Modelを用いて、上記の実験事実を再現することに成功した。その過程で、周辺部位相反転が起こるのは、シート構造が周辺部で柔らかいということが原因であることが示唆され、このことは実験的にも検証されつつある。また、弱結合部位相反転は、位相拡散による位相の均一化傾向と、保存則による同期振動の忌避的傾向の妥協の結果であることがシミュレーションによって示された。また、真正粘菌変形体にとって重要な快・不快の情報は、第一義的にはシート構造の硬さにコードされ、それを用いて快な場所へ近づき不快な場所から逃げているという仮説を提出した。
動学応用一般均衡モデルによる温暖化防止のための国際協調のあり方

京都議定書では、削減方法として削減義務国間排出権取引が導入されている。本研究は、削減義務国の削減費用を試算するために、応用一般均衡モデルを構築し定量分析を行った。旧ソ連は、現状の二酸化炭素排出量が京都議定書で定められた排出枠を下回っており「ホットエア」とよばれる達成余剰分を所有している。そこで、本研究は、旧ソ連が排出権市場において価格支配力を行使し、排出権収入を最大にするように独占的に排出権を供給すると仮定し、それが排出権供給量と各国の削減費用に及ぼす影響を分析した。さらに、京都議定書は、クリーン開発メカニズム(CDM)とよばれる、削減義務国が非削減義務国において技術移転により削減した排出量を削減義務国の新たな排出枠として計上する削減方法も導入している。そこで、このCDMを日本が中国と実施することで、旧ソ連が吊り上げた削減費用をどの程度低減させうるかについても分析を行った。CDM実施量については、中国のエネルギー技術進歩率を改善させることで、中国における二酸化炭素排出量を3千万二酸化炭素トン削減させる場合と6千万二酸化炭素トン削減させる場合を考慮した。さらに、日中間のCDMは日中間の排出権取引として記述し、日本はCDMで得られた排出権を排出権市場で決定される価格で支払うものとした。主要な結果は以下のとおり。(1)旧ソ連が排出権を独占的に供給する際、その量はホットエアの41%程度で、排出権価格はll.93ドル/二酸化炭素トン。(2)これに対し、日本は中国とのCDMにより排出権価格を低下させ得るが、その大きさは、0.350.98ドル/二酸化炭素トン程度。(3)EUは新規加盟国を統合し拡大することにより限界削減費用を低下させうる。(4)旧ソ連が排出権供給量を決定する際の目的変数を排出権収入から、社会厚生、GNI、GDPへそれぞれ変更した場合も結果は同程度である。1.京都議定書により一部の先進国は二酸化炭素の削減を行うことになったが、削減に成功している国は少ない。しかし、英国は、2002年には90年比でGDPを30.8%増加させていながら90年比6.6%の二酸化炭素を削減している。英国が90年代に二酸化炭素の削減に成功した要因をIEAのレポート・データなどを参考に明らかにした。英国の二酸化炭素排出量の削減には、硫黄酸化物と窒素酸化物の排出規制とエネルギー市場(天然ガス市場と発電市場)の自由化政策と、エネルギー事業(石炭、天然ガス、電力)の民営化によって、発電部門の燃料が石炭から天然ガスへと転換したことが大きく寄与している。90年代の英国のエネルギー市場の自由化とエネルギー事業の民営化は、サッチャー政権の新自由主義の経済政策として、公共事業・サービスを見直すために講じられた政策であった。しかし、本政策は、発電部門の燃料転換を進め、英国に二酸化炭素排出量の削減という副次的便益をもたらした。2.京都議定書に批准した附属書B締約国の一部は、経済活動の低迷などの理由により二酸化炭素排出量が減少し、京都議定書の目標排出枠に達成余剰分(以下、「ホットエア」)が存在する。特に、ロシア、ウクライナを含む旧ソ連は大量のホットエアを所有しているので、旧ソ連がホットエアを国際排出権取引市場で独占的に供給し、利益を得ようとすることが予測されている。また、日本は国際排出権市場での排出権の獲得以外に、中国とクリーン開発メカニズム(CDM)を行って二酸化炭素の削減コストを低減させようとする可能性がある。そこで、静学的応用一般均衡モデルを構築し、旧ソ連の排出権独占的供給と日本・中国間のCDMのシミュレーションを行った。日本は、排出権取引以外に中国とCDMを行うことで削減費用を減少することが可能だが、その大きさはそれほど大きくない。
シャーガス病の創薬標的探索に資する遺伝子改変手法の開発

近年、CRISPR/Cas9の活用によりトリパノソーマ原虫においても遺伝子ノックアウトが簡便に行えるようになってきた。トリパノソーマには化学的トランスフェクション試薬が有効でないため、エレクトロポレーションによる核酸導入が現状唯一のgRNA導入手法として使われている。しかし、致死性のノックアウトが発動した場合はそれ以上原虫が増えないため、スケールアップが難しいエレクトロポレーションでは分子生物学的な解析のための大量のサンプルを回収できないという問題がある。また、宿主細胞内に寄生する原虫には直接gRNAを導入できないという問題もあった。そのため、大量に原虫を増殖させた後、あるいは原虫を宿主に寄生させた後にCas9発現を誘導できるノックアウトシステムを確立することが解決策として考えられる。2018年度は、まず既存のノックアウト手法を利用し、モデル遺伝子として使用できる必須遺伝子を選定した。また、当初予定していたアプローチではないが、宿主寄生ステージの原虫を一定期間宿主外で培養できる条件を発見し、これにより宿主感染ステージの原虫において標的遺伝子の必須性を確認することができるようになった。Cas9発現を誘導するノックアウトシステムの構築については、tetリプレッサーによるon/off制御を試みた。tetリプレッサーやT7 RNApolemeraseをプラズミドで導入した原虫を作製し、テトラサイクリンによるGFPシグナルの誘導を観察したところ、制御の精度は原虫による個体差が激しいことが判明した。そのため、作製した原虫株のクローン化などの対策が必要であると考えられる。Cas9発現を誘導するノックアウトシステムの構築については、原虫間の個体差が激しく、当初予定していたようなon/off制御を行うところまでは到達していない。しかし、宿主細胞内に寄生する原虫に直接gRNAを導入できなかった問題を、当初の予定にはない方法で解決することに成功した。このため、全体としてはおおむね順調に進展していると考える。原虫の個体差が新たに課題として浮上したことを踏まえ、構築した株のクローン化を試みる。また、宿主細胞内ステージにおいて原虫のノックアウトが可能になったことから、一次スクリーニングで得られた必須遺伝子が原虫の全感染ステージで必須であるかを検証し、真のドラッグターゲットとなる遺伝子を選定する。tet誘導株の作製に関して当初の想定にはなかった問題が浮上し、それに関連する実験が予定より遅れているため次年度使用額が生じた。問題が解消され次第、合成核酸など関連試薬の購入に充てる。
p65-scaffoldを中心とするタンパク質集合体による感染防御機構

細菌リボ多糖(LPS)刺激や貧食反応によって,マクロファージ中でリン酸化されるタンパク質として,申請者が同定したp65/L-plastinは,calcium(Ca), calmodulin, β-actin結合部位を有する多機能タンパク質で,リン酸化と細胞内Caによって,細胞骨格(p65-scaffold)の構築に関与している。TLR4の機能欠損のためLPSに不応答なマウスでは,p65がリン酸化されず,p65-scaffoldの構築やその後のintegrinを介した細胞接着の亢進がおこらず,易感染性になると考えられる。最近,p65/L-plastinのノックアウトマウスでは,細胞接着依存的な活性酸素の産生がおこらず,細菌に対し易感染性であることが明らかにされ(Chen H, Immunity 2003),我々の仮説を支持している。本研究は,これまでの成果を基礎とし,p65-scaffoldを中心に形成されるタンパク質集合体について解析する。p65と直接・間接的に分子集合することが示唆されているタンパク質との関連について解析し,p65-scaffoldを足場とすることが想定されるintegrinやNADPHoxidase分子群との関連を明らかにする。菌体認識-p65-scaffoldの構築-細胞エフェクター機能を軸とする感染防御機構ユニットの解明を目指す。LPS刺激によって活性化され,p65/L-plastinをリン酸化するキナーゼについて性状を明らかにした。Plastinタンパク質ファミリー中のp65/L-plastinを特異的に認識し,T-plastinは認識しないモノクローナル抗体を樹立した。これによって,組織中でのp65/L-plastinの検出が可能になった。これらを用いて,菌体刺激や生菌感染によって誘導される細胞内p65/L-plastin局在変化(p65/L-plastin-scaffold構築),およびそれを中心とするタンパク複合体について解析した。得られた知見は論文発表ないし投稿中で,今後さらに解析を進めて,白血球細胞骨格のダイナミクスに基づく感染防御機構について明らかにしたいと考えている。1.p65-scaffold複合体の検出:マクロファージや樹状細胞を菌体成分で刺激し,細胞内p65の変化を,前年度に樹立した抗p65モノクロを用いて免疫組織学的に観察した。P65がactinファイバーと共存し,特徴ある構造体(p65-scaffold)を形成した。この系で,抗grancalcin抗体や抗WASP抗体を用いて検討し,grancalcinやWASPが,p65-scaffoldと共存することが観察された。2.接着分子integrinとp65-scaffoldとの関連について:integrinの機能欠損(白血球接着異常症)は易感染性であり,p65-scaffoldはintegrinを介した細胞活性化に関与していることから,両者の関連について調べた。菌体で刺激しintegrin媒介性に接着したマクロファージのp65細胞内分布を共焦点レーザー顕微鏡で解析すると,接着面で斑状に集積し,podosome構造と一致して局在すると考えられた。3.NADPHoxidaseとp65-scaffoldとの関連について:p65/L-plastinノックアウトマウスの食細胞は,細胞接着依存性の活性酸素生成が阻害されるので,NADPH

oxidaseとp65-scaffoldとの関連が示唆されるが,詳細は不明である。菌体で刺激され,p65-scaffoldの再構成を起こったマクロファージを可溶化し,細胞骨格分画を分離して,NADPH oxidaseの細胞質要素であるp47^<phox>との結合を定量すると,刺激マクロファージでは有意に結合が増強することが明らかになった。4.以上の知見は論文発表ないし投稿中で,今後さらに解析を進め,白血球細胞骨格のダイナミクスに基づく感染防御機構について明らかにしたい。
共役系オリゴマーの超分子配列を用いた革新的ナノリソグラフィー法の開発

情報の高密度化、非常に効率のよいエネルギー変換、精緻な分子認識などの革新的機能には、ナノメートルスケールの構造の精密制御は欠かせない。その一方で、我々の実生活に寄与する材料は、目で見えるような大きさのバルクな素材であることが多い。我々の生活に革命をもたらすような新機能材料の開発は、これら相異なる二つの要素を盛り込んだ物質・材料をデザイン・作製することが必須となる。つまり、精緻なナノ構造の特徴を生かしたまま目で見えるような大きさの素材を組み上げることである。そのための有力な方法論の確立を目指して、我々は、硬い共役結合を持った分子やそのオリゴマーが、定まった形を持つことの着目し、それらが基板上に形成するパターンを鋳型としたナノリングラフィー法の開発に取り組んでいる。上記研究課題の第一段階として、現在、いくつかの二次元パターンを作製することに成功した。tert-ブチル基を有するテトラフェニルポルフィリンが作るパターンでは、ヘキサゴナル相とスクエア相を可逆的に転移することが観測された。これらの相は、基板上でのコンフォメーション変化に依存している。また、別条件下や作られた相では、相境界を分子自らのコンフォメーション変化で補っていることが確かめられた。立体障害の少ないメチル基を持つ誘導体を持つ化合物を用いた場合には、水酸基間の水素結合が可能となり、カゴメパターンが得られることが明らかとなった。これらのユニット分子を用いた分子メモリーシステムの検討や、無機の超階層構造によるドラッグデリバリーシステムの開発なども手がけた。そのための有力な方法論の確立を目指して、我々は、硬い共役結合を持った分子やそのオリゴマーが、定まった形を持つことの着目し、それらが基板上に形成するパターンを鋳型としたナノリソグラフィー法の開発に取り組んでいる。また、別条件下で作られた相では、相境界を分子自らのゴンフォメーション変化で補っていることが確かめられた。現在分子構造とパターンとの間の関係の解明とともに、気-水界面などの別の界面で得られる集合体の構造転写などを検討している。
BCR-ABLのDNA修復機構における分子生物学的意義の解析

紫外線によるDNA修復障害を有するハムスター27-1細胞はXPBの発現でこれを復元できる(27-1/XPB細胞)が、恒常的活性化型ABLであるBCR-ABLの同時発現(27-1/XPB/BCR-ABL細胞)でこの復元効果が抑制される。同様な生物学的現象は、紫外線(UV)以外にDNA損傷性抗腫瘍剤cisplatinでも確認されたが、H2O2では認められなかった。UV、cisplatinによるDNA損傷がTFIIHを主体とするnucleotide excision repair(NER)という修復機構で修復されるのに対し、H2O2によるそれはbase excision repair(BER)という別の修復機転でなされることを考えるこの事実はBCR-ABLの特異的なDNA修復阻害が確かなものであることを支持する。DNA損傷の誘導でTFIIHの構成員p44がTFIIH,特にXPB沈降産物に時間依存性に結合してくることを観察した。しかもこの効果は、温度感受性BCR-ABL変異体を用いた解析で、BCR-ABLのチロシンキナーゼ活性依存性に抑制された。フランスIGBMC/INSERM/ULPのJean-Marc Egly博士との共同研究で、同研究室に直接赴き、大量培養と抗p44抗体を利用した方法でTFIIHの純化精製法を修得した。27-1/XPB細胞及び27-1/XPB/BCR-ABL細胞からTFIIHを精製し、in vitro上DNA修復活性、転写活性を検討した。転写活性はBCR-ABL発現細胞で約2倍の上昇を認めたが、cisplatin処理で引き起こしたDNA損傷に対する修復活性は5-10%程度しか低下を認めず有意とは判断できなかった。XPBと結合能力を有するBCR-ABLそのものも純化したTFIIHに含まれないことから、高度に精製すると相互作用する分子も複合体から乖離してしまい、抑制が解除される可能性を考えたが、その抑制分子はBCR-ABL以外の分子も想定している。ヒト慢性骨髄性白血病CMLの急性転化の最大の特徴はゲノム不安定性であるが、これを統一的に十分説明する分子生物学的根拠は確立されていない。TFIIH複合体は転写、DNA修復、アポトーシスなどに関与することから、その活性のBCR-ABLによる修飾はDNA修復のみならず転写を介して慢性骨髄性白血病細胞にmutator phenotypeを付与するのではないかと考えられる。
メタラ環状化合物を経る軸不斉ビアリール類の触媒的不斉合成

我々はジナフトヘテロ環化合物の開環反応を利用したグリニャールクロスカップリング反応で光学活性軸不斉2-メルカプト-2′-アルキルまたはアリール置換-1,1'-ビナフチルの合成にはじめて成功した.基質にはP-フェニルジナフトホスフォールとその酸化体であるP-フェニルジナフトホスフォールオシキドおよびジナフトチオフェンを用いた.ホスフォールおよびホスフォールオキシドの反応では,期待されたグリニャールカップリング生成物は得られなかった.ホスフォールを用いると未反応で原料が回収されるのみであったが,ホスフォールオキシドではメチルマグネシウムブロミドのリン原子への求核攻撃により生成するP-メチル化ビナフチルのみが得られた。それに対して,ジナフトチオフェンにニッケル触媒および種々のグリニャール試薬を反応させて検討したところ,ビナフチル炭素-イオウ結合の切断が起こり,目的とする光学活性カップリング体が得られた.反応条件調査の結果,触媒前駆体に3mol%のNi(cod)_2,不斉配位子としてNiの1.5倍量の(S)-iPr-Phoxを用いるp-トリルマグネシウムブロミドとの反応でTHF中,O°C,12時間で目的の2-メルカプト-2′-トリル-1,1′-ビナフチルが94%収率,95%eeで得られることを見出した.また,アルキルグリニャール試薬であるメチルマグネシウムブロミドとの反応では単座不斉ホスフィン配位子H-MOPを用いたとき,THF中,10°C,24時間で相当する2′-メチル体が97%収率,68%eeで得られた.今後,他のジナフトカルコゲンを基質とする反応に展開するとともに,得られた光学活性軸不斉チオールの様々な変換反応の検討を行う.我々はジナフトヘテロ環化合物の開環反応を利用したグリニャールクロスカップリング反応で光学活性軸不斉2-メルカプト-2′-アルキルまたはアリール置換-1,1'-ビナフチルの合成にはじめて成功した.基質にはP-フェニルジナフトホスフォールとその酸化体であるP-フェニルジナフトホスフォールオシキドおよびジナフトチオフェンを用いた.ホスフォールおよびホスフォールオキシドの反応では,期待されたグリニャールカップリング生成物は得られなかった.ホスフォールを用いると未反応で原料が回収されるのみであったが,ホスフォールオキシドではメチルマグネシウムブロミドのリン原子への求核攻撃により生成するP-メチル化ビナフチルのみが得られた。それに対して,ジナフトチオフェンにニッケル触媒および種々のグリニャール試薬を反応させて検討したところ,ビナフチル炭素-イオウ結合の切断が起こり,目的とする光学活性カップリング体が得られた.反応条件調査の結果,触媒前駆体に3mol%のNi(cod)_2,不斉配位子としてNiの1.5倍量の(S)-iPr-Phoxを用いるp-トリルマグネシウムブロミドとの反応でTHF中,O°C,12時間で目的の2-メルカプト-2′-トリル-1,1′-ビナフチルが94%収率,95%eeで得られることを見出した.また,アルキルグリニャール試薬であるメチルマグネシウムブロミドとの反応では単座不斉ホスフィン配位子H-MOPを用いたとき,THF中,10°C,24時間で相当する2′-メチル体が97%収率,68%eeで得られた.今後,他のジナフトカルコゲンを基質とする反応に展開するとともに,得られた光学活性軸不斉チオールの様々な変換反応の検討を行う.
コンピューター画像処理を用いた顔面神経麻痺の程度の早期診断に関する研究

顔面神経麻痺患者における麻痺の評価には、顔面神経研究会提唱の10項目40点法やHouse & Brackmannのgrading systemなどがよく普及している。しかしこれらの検査は、検者の主観に頼っているために、検者の経験によって多少異なる評価になったり、また客観性と再現性に問題があることは否めない。そこで我々は、顔面の動きをパーソナルコンピューターに取り込み解析することで、これらの問題の解決をはかってきた。その結果40点法と本法がよく相関し、さらに本法は40点法と比べ微細な動きに対しても評価が行える点で優っていた。さらに簡略化を行う目的で、測定点を顔に貼り付けた20点の中で最もよく動く点に限定することを試みた。その結果、閉眼運動、開眼運動では眉毛最上点と眉毛内側点、微笑み運動、口笛運動においてはいずれも口角交点の外側1cmの点が最もよく動く点であることが分かった。つぎに測定点を限定することによりさらに再現性の検討が必要であると考え検討を行った。今まで表情運動の評価において、検者間の評価のばらつきについての報告はあるが、正常の表情運動について努力の差による差異や検査日の違いによる差異などの報告はほとんど見あたらない。そこで今回、これらについて検討を行った結果、最大限の努力を行っても多少は動きに差が出てくるので表情運動を詳細に評価するには、数回(最低でも3回)は同じ運動を行わせてその平均を取る必要があることが解った。また正常人においても検査日によっては顔の動きの良い日と悪い日を認めたが、左右比を考慮する限りにおいて再現性に問題はなかった。我々の研究の最終目標は、神経刺激時における顔面表情運動の解析を行い、麻痺の程度の早期診断を行うことである。そのために、本年度は上述のごとく正常者において顔面表情運動の解析の簡便化、再現性に関する詳しい検討を行ってきた。
神経軸索変性疾患モデルとしてのshamblingマウスの病態解析と評価

有髄神経のランビエ絞輪パラノード部に局在する膜タンパクCasprの遺伝子に変異を持つ突然変異マウス(shambling;shm)の中枢ならびに末梢神経系を生後早期から老齢期において研究し、マウスの進行性の病変との関連を検討した。神経症状の発症した直後の生後早期には、パラノード部におけるパラノードジャンクションの欠失や構成タンパクの局在・発現減少がみられた。しかしながら、神経症状が重篤となった加齢期のマウスでは、パラノード部の異常のみならず、神経線維軸索内の封入体形成、さらに小脳プルキンエ細胞の消失が観察された。従って、Caspr遺伝子の変異は生後早期にはパラノード構造の異常をもたらし、これが月齢とともに進行して、神経線維軸索の異常や細胞死をもたらすことが明らかとなった。shamblingマウスは、有髄神経線維のランビエ絞輪パラノード部に局在するCasprタンパクの遺伝子に変異を持つことから、本年度は、中枢(視神経)と末梢(坐骨神経)の有髄神経線維でその異常を解明することを目的として以下の研究を行った。マウス:運動失調や後肢の突っ張りなどの症状が明らかとなる生後2週から2ヶ月齢のマウスを研究に用いた。坐骨神経、視神経の電子顕微鏡観察:有髄神経線維のミエリン(髄鞘)形成に正常との違いは見られなかった。しかしながら、パラノード部でミエリンループと軸索膜の間に形成されるパラノードジャンクションが欠失していた。さらに、視神経ではミエリンループの形成も異常であった。また絞輪部位の軸索細胞質内には、肥大したミトコンドリアなどの細胞内小器官の異常な蓄積が観察された。坐骨神経の免疫組織細胞化学法:Casprの細胞外領域を認識する抗体を用いた免疫染色では、パラノード部位における染色が著しく減少していた。さらに、パラノードジャンクション形成の分子基盤となるパラノード複合体を構成する他のタンパクもCasprと同程度にパラノード部位における局在が減少していた。ウェスタンブロット法によるCasprタンパクの発現量の解析:小脳、大脳の組織から取り出したタンパクで検討したところ、shamblingマウスで産生されているCasprタンパクは発現量が著しく低下しており、分子量も減少していることが明らかとなった。以上の研究結果は、本研究の連携研究者による電気生理学的な解析で、shamblingマウスでは、坐骨神経の興奮伝導速度や大脳皮質視覚野の活動電位が低下していることが示されたが、その形態的、分子的な原因を示していると考える。今年度の成果は、北米神経科学会(別記)で発表した。有髄神経線維のランビエ絞輪パラノード部に局在するCasprタンパクに遺伝子変異を持つshamblingマウスは、月齢ともに後肢の突っ張り麻痺などの症状が進行する。本年度は、生後1年齢のマウスで中枢と末梢神経系における有髄神経線維の異常を解析する以下の研究を行った。1:電子顕微鏡観察による観察末梢神経系では坐骨神経、中枢神経系では小脳の白質で有髄神経線維を観察したところ、両者ともにパラノードジャンクションの欠失がみられた。さらに小脳では、軸索内に異常なミトコンドリアや、変性した細胞内小器官を含む封入体が観察された。このことから、生後23ヶ月齢で観察されたパラノードやランビエ絞輪部の異常が軸索内部へも進行していると考えられた。2:神経細胞の変性と細胞死の検討上記の観察により有髄神経線維軸索の異常が進行していることが明らかとなったことから、神経細胞体についてその変性や細胞死の有無を検討した。生後1年齢のshamblingマウスの小脳では、多数のプルキンエ細胞の消失がみられた。TUNEL法による解析では、プルキンエ細胞の細胞死はアポトーシスではないことが示唆された。が、抗ユビキチン抗体を用いた免疫組織化学法により、プルキンエ細胞の変性と細胞死には、ユビキチン化が関与していると考えられた。昨年度の成果は、米国神経病理学会の機関誌に投稿し掲載された(別記)。また、本年度の成果は、22年度に開催される国際神経病理学会で報告する予定である。有髄神経線維のランビエ絞輪パラノード部に局在するCasprタンパクに遺伝子変異を持つshambling (shm)マウスで、神経系の異常を解析する研究を行っている。本年は、後肢の不全麻痺が進行しほとんど不動になった老齢shmマウスで、中枢ならびに末梢神経系にどのような異常がみられるのかを注目して以下の研究を行った。1:脳、脊髄、坐骨神経の形態学的研究:生後13ヶ月から20ヶ月のshmマウスの大脳運動野と基底核、小脳、脊髄、坐骨神経のパラフィン、樹脂包埋標本を作成して光学顕微鏡レベルの観察を行った。

それぞれの組織構築に異常は観察されなかった。しかしながら、脊髄白質には変性細胞が、坐骨神経に変性した神経線維が存在した。2:有髄神経線維の異常を、その構成タンパクMyelin Basic Protein (MBP)を指標とした形態観察とタンパク発現の解析で行った:抗MBP抗体を使用した免疫組織染色では、小脳で陽性神経線維の減少が観察された。それ以外の部位では、正常マウスに比べると染色性の低下傾向が観察されたが、有髄神経の減少、消失は明らかではなかった。Western blot法によりタンパク発現を解析したところ、小脳での有意な低下がみられた。本研究の成果は、第17回国際神経病理学会(別記)で発表し、優秀学会賞(ポスター賞)を受賞した。
暑熱ストレスが引き起こすROS過剰産生機構の解明とその制御法の開発

夏季などの暑熱環境下において、鶏は「酸化ストレス」状態に陥る。これにより、生産性が著しく低下すると考えられるが、酸化ストレスの発現機序は未だ明らかでなく、また、有効的な飼養技術も確立されていない。本研究では、急性暑熱時の酸化ストレス誘導因子であるミトコンドリア活性酸素種(mitROS)の過剰産生機構を明らかにするとともに、酸化ストレスを低減する機能性栄養資材を探索することを目的とする。本年度は、後者すなわち機能性資材コエンザイムQ_<10>(CoQ_<10>)を給与し、暑熱時の酸化ストレスに対する緩和効果を調べた。CoQ_<10>は、ROSを捕捉する抗酸化物質であり、ミトコンドリア電子伝達鎖の構成因子でもある。このため、CoQ_<10>給与により、抗酸化のみならずmitROS過剰産生抑制の面からも酸化ストレス低減効果が期待できる。実験では、CoQ_<10>添加飼料(40mg/kg飼料)を10日齢より11日間、雄肉用鶏に自由摂取させた後、25°Cを対照区として34°C、12時間急性暑熱曝露した(暑熱区)。酸化ストレスマーカーであるマロンジアルデヒド(MDA)およびカルボニル化タンパク質含量を調べた結果、暑熱曝露によって、血漿MDA含量ならびに浅胸筋カルボニル化タンパク質含量は、通常飼料区では有意に増加したが、CoQ_<10>飼料区ではほとんど変化しなかった。血漿中の総抗酸化能は、暑熱感作およびCoQ_<10>給与のいずれによってもほとんど変化しなかった。これに対し、浅胸筋のmitROS産生量は、FADH_2供給時において暑熱によって著しく増加したが、CoQ_<10>給与によりこの増加は抑えられた。以上の結果より、急性暑熱時において、CoQ_<10>は鶏骨格筋mitROS過剰産生を抑制し、酸化ストレスを低減することが実証された。したがって、CoQ_<10>は暑熱時の酸化ストレス緩和において有効な栄養資材になり得る可能性が示された。暑熱環境下における肉用鶏生産では、成長・肉質といった生産性が低下する。この低下には暑熱によって引き起こされる「酸化ストレスの増大」が関与している可能性がある。本研究の目的は、急性暑熱曝露にともなう(1)ROS過剰産生メカニズムの解明と、(2)その栄養制御法の確立であり、本年度は(1)を重点的に行った。酸化ストレスは、過剰な活性酸素種(ROS)によって誘導される。ROSの生成は、スーパーオキシド(O_2^<・->)に端を発しており、ミトコンドリアはこの産生が多い器官の一つである。ミトコンドリアにおけるO_2^<・->の産生は、ミトコンドリア膜電位と誘導型プロトンリーク反応に依存する。1年目にあたる本年度では、暑熱時のミトコンドリア反応グループの個別解析を行い、暑熱にともなうO_2^<・->の産生増大を招くメカニズムの一端を明らかにした。すなわち急性暑熱によって、(1)ATP合成に利用される膜電位が、電子伝達鎖における基質酸化反応の増大によって誘導されることにより、O_2^<・->産生が増大すること、(2)暑熱にともなう脱共役タンパク質(UCP)の発現の低下が、誘導型プロトンリーク反応の低下をもたらすことを明らかにした。これら暑熱誘導メカニズムは、今後、栄養制御法を確立する上での重要なターゲットになると考えられるが、暑熱下におけるこれらの生理的意義は未だ明らかにされていない。そこで、2年目以降はこれらの意義を明らかにするために、(1)については、その構成タンパク質分子の発現挙動を網羅的に解析し、また(2)については、同反応の低下と膜電位およびO_2^<・->産生の3者の関係を調査する予定である。これまでの研究により、この低下には暑熱環境下で亢進する「酸化ストレス」が大きく関与すると考えられている。本研究の目的は、急性暑熱曝露にともなう(1)活性酸素種(ROS)産生メカニズムの解明と、(2)その栄養制御法の確立であり、計画の2年目にあたる本年度は、(1)を重点的に行った。酸化ストレスは、ミトコンドリアにおいて過剰に産生されたスーパーオキシ(O_2^<・->)によって誘導され、このO_2^<・->産生量は、ATP合成に利用されるミトコンドリア膜電位(ΔΨ)に依存する。これまでに、暑熱環境下ではO_2^<・->が過剰に産生することが明らかにされており、前年度は、(1)O_2^<・->過剰産生がΔΨ上昇によってもたらされること、そして(2)ΔΨ上昇は、ΔΨ-生産者である「電子伝達鎖の基質酸化能の増加」および(3)ΔΨ-消費者である「avUCP介在型プロトンリーク反応の低下「が関与していることを明らかにした。本年度の研究目的は、「タンパク質の多元解析によるミトコンドリアタンパク質分子の挙動の網羅的解析とその相互関連付け」であり、これを達成するため、まず遺伝子の網羅的解析(DNAマイクロアレイ)を行い、'電子伝達鎖の基質酸化能の増加'の原因となる候補分子のスクリーニングを行った。

その結果、複合体Iに関連する遺伝子(NDUFS1、NDUFS4、NDUFA5、NDUFA7、NDUFA12、NDUFB2、NDUFV2)発現が、約35-85%低下していること、また複合体IIに関連する遺伝子(SDHD、SUCNR1)発現が、約80-150%増加していることが明らかとなった。本研究成果は、今後実施するタンパク質の網羅的解析を効率的に行う上で、重要なヒントを与えるものとなった。夏季などの暑熱環境下において、鶏は「酸化ストレス」状態に陥る。これにより、生産性が著しく低下すると考えられるが、酸化ストレスの発現機序は未だ明らかでなく、また、有効的な飼養技術も確立されていない。本研究では、急性暑熱時の酸化ストレス誘導因子であるミトコンドリア活性酸素種(mitROS)の過剰産生機構を明らかにするとともに、酸化ストレスを低減する機能性栄養資材を探索することを目的とする。本年度は、後者すなわち機能性資材コエンザイムQ_<10>(CoQ_<10>)を給与し、暑熱時の酸化ストレスに対する緩和効果を調べた。CoQ_<10>は、ROSを捕捉する抗酸化物質であり、ミトコンドリア電子伝達鎖の構成因子でもある。このため、CoQ_<10>給与により、抗酸化のみならずmitROS過剰産生抑制の面からも酸化ストレス低減効果が期待できる。実験では、CoQ_<10>添加飼料(40mg/kg飼料)を10日齢より11日間、雄肉用鶏に自由摂取させた後、25°Cを対照区として34°C、12時間急性暑熱曝露した(暑熱区)。酸化ストレスマーカーであるマロンジアルデヒド(MDA)およびカルボニル化タンパク質含量を調べた結果、暑熱曝露によって、血漿MDA含量ならびに浅胸筋カルボニル化タンパク質含量は、通常飼料区では有意に増加したが、CoQ_<10>飼料区ではほとんど変化しなかった。血漿中の総抗酸化能は、暑熱感作およびCoQ_<10>給与のいずれによってもほとんど変化しなかった。これに対し、浅胸筋のmitROS産生量は、FADH_2供給時において暑熱によって著しく増加したが、CoQ_<10>給与によりこの増加は抑えられた。以上の結果より、急性暑熱時において、CoQ_<10>は鶏骨格筋mitROS過剰産生を抑制し、酸化ストレスを低減することが実証された。したがって、CoQ_<10>は暑熱時の酸化ストレス緩和において有効な栄養資材になり得る可能性が示された。
大脳皮質内に部位差を形成する新たなメカニズムの発生工学的手法を用いた解析

発生期の大脳皮質で一過性に強い発現を示す新規遺伝子として研究代表者らが同定した遺伝子の一つ(便宜的に「KI遺伝子」と称する)は、発現強度に前後軸に沿う部位差がみられた。本研究はこの遺伝子の解析を通じて大脳皮質に部位差が形成されるメカニズムを明らかにしようとするものである。その後の研究により、このKI遺伝子産物は大脳皮質形成時の細胞移動に必須のアクチン結合蛋白質Filamin 1に結合しその分解を促進することによって細胞移動を負に制御する新たな因子であることが示唆された。本研究は追加で採択が決定されたために研究開始が半年以上遅れたが11年度にはKI遺伝子産物に対する抗体作成に着手しており、12年度は引き続き抗体作成を完了するとともにそれを用いて遺伝子産物の解析を行った。その結果、当抗体によるウエスタン解析によりKI遺伝子産物にはこれまでから予想されていた蛋白質に加え、altemative splicingにより生ずると考えられるもう1つの分子種が存在すること、大脳皮質における遺伝子発現は胎生後期には減弱するのに対し遺伝子産物は生後数日の間検出されること、発生途中の大脳皮質では新たに同定されたKI遺伝子産物が以前から予想されていたものに比べて量的に優位に存在していることが明らかになった。さらに新たに同定された遺伝子産物に対応する遺伝子を単離し機能を検討したところFilamin 1の分解を誘導する活性がより大きく、その存在量と合わせ大脳皮質内では新たに同定された遺伝子産物が主に機能していることが示唆された。現在、KI遺伝子産物の組織分布にも部位差が見られるかを解析するため、作成した抗体を用いた免疫組織化学染色法を検討中である。研究代表者らはこれまでに、各発生段階の大脳皮質に優勢・あるいは特異的発現を示す新規遺伝子を数種類同定してきた。それら遺伝子の一つ(以下では便宜的に「KI遺伝子」と呼ぶ)は、発生期の大脳皮質において発現の前後軸に沿う部位差がみられた。本研究は、このKI遺伝子発現の強度勾配を解析することによって大脳皮質に部位差が形成されるメカニズムの一端を明らかにしようとするものである。年度後半に追加で採択が決定されたために研究開始が年末近くまで遅れたが、今年度は当初の計画のうちKI遺伝子産物に対する抗体の作成を中心に行った。KI遺伝子の塩基配列から予想されるKI遺伝子産物のアミノ酸配列を検討し、この一部分のアミノ酸配列をもつペプチドを抗原としてウサギを免疫したところ、得られた抗血清はELISA法では抗原ペプチドと反応することが確認されたが、ウエスタンブロット解析上発生期大脳皮質由来の蛋白質とは明確な反応を示さなかった。そこでKI遺伝子産物中上記とは異なる部分に相当する組換え蛋白を大腸菌を用いて作成し、それを抗原としてマウスを免疫してモノクローナル抗体を作成する試みを現在行っているところである。
iPS細胞由来5-HT受容体発現神経細胞による睡眠時咀嚼筋筋活動の発生機序の解明

睡眠時ブラキシズム(SB)の原因究明のためにSB患者特異的iPS細胞から5-HT2A受容体発現GABA作動性神経細胞の誘導に成功した。さらに分化誘導した神経細胞において電気静学的解析(パッチクランプ)を行い電気生理学的応答が得られた。現在は電気生理学的応答をSB患者とコントロールで比較するためのパラメータを探索している。iPS細部から神経細胞を誘導するが毎回同じ状態の神経細胞ができるわけではないため、電気生理学的応答のパラメータを探索するのに時間がかかっている。さらに、5-HT2A受容体発現GABA作動性神経細胞を特定するためのベクターの作製に時間がかかっているためやや遅れている。まずはSB患者とコントロールを比較検討するために、電気生理学的応答のパラメータを探索する。さらにベクターを作製し標的となる神経細胞を特定する。また、パッチクランプにて差異が認められた場合は、それを回復する化合物のスクリーニングを行う。顎口腔系に破壊的な作用をもたらす睡眠時ブラキシズムは補綴歯科治療の予後を左右する重要なリスクファクターであるが、その発症メカニズムは明らかでない。本研究では、研究代表者が過去に示した遺伝子多型リスクアレルを指標に、睡眠時ブラキシズム特異的iPS細胞を樹立して神経細胞を誘導してその表現型の電気生理学的特性を明らかにすることを目的としている。2017年度までの時点で、セロトニン2A受容体遺伝子(HTR2A)のrs6313(T102C)の一塩基多型(SNP:single nucleotide polymorphism)の解析を行い、睡眠ポリグラフ(PSG)検査を用いた睡眠時ブラキシズムの診断とリスクアレルであるC alleleの有無が合致する被験者(睡眠時ブラキシズム群3名、コントロール群3名)を選定してiPS細胞から神経細胞を分化誘導した。さらに,それらの誘導した神経細胞の中からセロトニン2A受容体発現神経細胞を識別するため、Venusを挿入したレポーターレンチウイルスを作成して浮遊培養開始後12日目に神経細胞に感染させた。その結果、レポーター蛍光反応を示す細胞が識別可能であることを確認した。さらに、電気生理学的検討を行っていくために、睡眠時ブラキシズム患者由来の神経細胞と、コントロール群由来の神経細胞からそれぞれ、前述の方法にてセロトニン2A受容体発現神経細胞を選択し、ホールセルパッチクランプを行った。その結果、生体の神経細胞と同様の、静止膜電位と、電圧負荷をかけた際の活動電位の発生を確認した。レポーターレンチウイルスにより、目的とする神経細胞を識別可能であることが確認できたが、iPS細胞から誘導した神経細胞のうち、目的とするセロトニン2A受容体神経細胞の割合が低く、また、蛍光の強さも弱かったため、そのまま電気生理学的な機能解析に移行するのが難しい状況であり、神経細胞誘導法およびレポーターレンチウイルスの調整を行う必要が生じたため、遅れが生じた。電気生理学的な機能解析を進め、睡眠時ブラキシズム群由来とコントロール群由来の神経細胞間での反応性の差異について、明らかにし、また、その成果については、広く公表していく予定である。iPS細胞から誘導した神経細胞のうち、セロトニン2A受容体を発現する神経細胞の割合が低かったため、そのまま電気生理学的な機能解析に移行するのが難しい状況であり、神経細胞誘導法およびレポーターレンチウイルスの調整を行う必要が生じたため、遅れが生じ、次年度使用額が生じた。これらは、iPS細胞および電気生理学的解析のための試薬と、研究成果の発表のために今後使用していく予定である。
造血器腫瘍の増殖と分化におけるInterleukin-10の役割

小児における造血器腫瘍細胞とそれらの主たる増殖の場である骨髄のstroma細胞の両面からIL-10の造血器腫瘍の増殖,分化に対する役割について調べた.【方法と結果】白血病細胞株17種,白血病及び悪性リンパ種の臨床検体70例の腫瘍細胞を用いてRTPCR法によりIL-10,IL-10receptor(R)の発現を調べたところ,それぞれ1種,9例,2種,14例で発現が見られた.また造血器腫瘍細胞の増殖部位である骨髄stroma細胞ではIL-10のみ発現がみられた.IL-10発現例についてはELISA法にても細胞からのIL-10の分泌を確認し,これはTPA刺激により増強された.次に,IL-10,IL-10Rが発現している一部の細胞株を用いて,IL-10,抗IL-10中和抗体と共培養したときの腫瘍細胞の増強,分化,及びstroma細胞への接着(PKH26蛍光色素による生体染色)について検討したがIL-10は増殖,分化に直接的な影響は及ぼさず,stroma細胞への接着に関してはIL-10にて抑制,抗IL-10中和抗体添加にて増強を認めた.【結論】IL-10は腫瘍細胞の増殖,分化には関与を認めず,stroma細胞との接着に影響を及ぼすと考えられた.小児における造血器腫瘍細胞とそれらの主たる増殖の場である骨髄のstroma細胞の両面からIL-10の造血器腫瘍の増殖,分化に対する役割について調べた.【方法と結果】白血病細胞株17種,白血病及び悪性リンパ種の臨床検体70例の腫瘍細胞を用いてRTPCR法によりIL-10,IL-10receptor(R)の発現を調べたところ,それぞれ1種,9例,2種,14例で発現が見られた.また造血器腫瘍細胞の増殖部位である骨髄stroma細胞ではIL-10のみ発現がみられた.IL-10発現例についてはELISA法にても細胞からのIL-10の分泌を確認し,これはTPA刺激により増強された.次に,IL-10,IL-10Rが発現している一部の細胞株を用いて,IL-10,抗IL-10中和抗体と共培養したときの腫瘍細胞の増強,分化,及びstroma細胞への接着(PKH26蛍光色素による生体染色)について検討したがIL-10は増殖,分化に直接的な影響は及ぼさず,stroma細胞への接着に関してはIL-10にて抑制,抗IL-10中和抗体添加にて増強を認めた.【結論】IL-10は腫瘍細胞の増殖,分化には関与を認めず,stroma細胞との接着に影響を及ぼすと考えられた.
多重水素結合による精密な反応場構築を志向した新規キラル有機分子触媒の開発

金属を含まないキラル有機分子触媒の化学は、低環境負荷型プロセスが望まれる昨今、最も注目が高まっている研究領域の一つとなっている。これまでに世界中で活発に研究が行われ、工業規模での実用化にも耐えうる有用な触媒が開発さてれてきた。しかしながらその一方で、その触媒活性という面では金属触媒に及ばず、基質の適用範囲が狭い場合が多いことなどの問題を抱え、より力強い触媒系の開発による汎用性の拡大が望まれている。研究代表者は、「多重水素結合」を基盤として、反応活性種であるアニオン種を高い精度で制御できる「精密な反応場の構築」を念頭に、新たなアニオン認識型有機イオン対触媒を創製することに加え、その潜在機能を引き出すことにより挑戦的分子変換反応の開発につなげ、当該分野における新たな領域を拓くことを目的として研究を行っている。今回、新たな触媒系の構築を目指す端緒として、新規キラルビスグアニジノプロトンスポンジを触媒の基本構造として取り上げ、その設計開発を行った。具体的には、母骨格となるプロトンスポンジに対し、様々なキラルグアニジン構造を組み合わせることで、多様な触媒ライブラリの構築及び、その効率的合成法の確立に成功した。また、合成した触媒の基礎的知見を収集すると共に、本触媒の特徴である超強塩基性を利用した、エステルの直載的不斉アルドール反応への適用を目指し、その可能性の追求を図った。しかし、現在のところ有効な反応系の構築には至っていない。今回得られた基礎的知見は、今後の反応系開発において非常に重要であり、今後更なる触媒の構造変換を行い、本触媒の潜在能力を引き出すことで、従来適用が困難であった結合形成反応への適用が期待される。(抄録なし)金属を含まないキラル有機分子触媒の化学は、低環境負荷型プロセスが望まれる昨今、最も注目が高まっている研究領域の一つとなっている。申請者は、「多重水素結合」を基盤として、反応活性種であるアニオン種を高い精度で制御できる「精密な反応場の構築」を念頭に、新たなアニオン認識型有機イオン対触媒を創製することに加え、その潜在機能を引き出すことにより挑戦的分子変換反応の開発につなげ、当該分野における新たな領域を拓くことを目的として研究を行っている。また、合成した触媒の基礎的知見を収集すると共に、本触媒の特徴である超強塩基性を利用した、エステルの直截的不斉アルドール反応への適用を目指し、その可能性の追求を図った。実際の反応系への適用には至っていないが、今回合成した多様な触媒ライブラリから得られた基礎的知見は、今後、新規反応系を構築する上で必要不可欠な情報であるため。今後、アニオンを水素結合により捕捉する中心部位における孤立電子対の重なり効果によるプロトン受容能のさらなる向上を図ることで、より強い塩基性の獲得を目指す。

また、X線による三次元構造解析に加え、分子軌道計算を用いた触媒構造のモデリングを行うことで、より精密かつ合理的な反応設計に基づく研究開発を進めていく予定である。(抄録なし)