hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高密度ナノ有機半導体薄膜創製における等方加圧の最適化と層界面密着強度の改善

本研究の目的は、低分子・高分子有機半導体薄膜の等方加圧(IP)処理において、膜作製や加圧の条件を最適化して処理技術を確立することにある。すべての低分子膜は、IP処理によって高密度化、高強度化した。高密度率は、メタルフリーフタロシアニン膜の40%からペンタセン膜の8.4%の範囲で種類によって異なり、結晶粒形状と凝集状態から算出される空孔率とよく一致した。2つの高分子薄膜は、IP処理によって15%以上高密度化した。PMMA膜は、アズコートの押込み硬さ0.26 GPaがIP処理によって40%高くなった。PEDOT/PSS薄膜は、有機溶媒の添加によって高密度化した。平成26年度は、研究計画に従って、第一に、低分子有機半導体膜の包括的な等方加圧特性を調べた。第二に、高分子膜の加圧に先立ってコーティング試行を行った。低分子膜では、加圧による高密度化効果がすでに確認されたメタルフリーフタロシアニン(H2Pc)に加えて、Alq3、亜鉛フタロシアニン(ZnPc)、ペンタセンを調べた。その結果、加圧による高密度化率は、膜結晶粒の形状、粒径、および配向に依存して43%の範囲でばらついた。特に、キャリア移動度が高いペンタセンの膜厚減少は、その柱状結晶粒に依存して測定不可能なほど小さく、アズコートで十分高密度なことが分かった。低分子膜の力学的性質は、球/楕円体結晶粒であるH2Pc、Alq3、およびZnPcでは加圧によってヤング率が2.3倍に上昇した。今回調べた低分子膜のヤング率と硬さは、アズコートでは大きなバラツキを示したが、等方加圧処理後に概ね同じ領域にシフトしたことから、加圧によってほぼ100%まで高密度化されることが分かった。これらの知見は、等方加圧処理が低分子膜の密度と力学的性質改善に高い効果があることを示している。また、本研究に触発されたMatsushimaら(Appl. Phys. Lett.,105,243301,2014)は、等方加圧処理したH2Pc膜の正孔移動度が2,000倍高くなることを示しており、本研究が有機デバイスの実用化研究進展に大きなインパクトを与えたといえる。低分子膜の研究成果は、学術雑誌に掲載されると共に、学会で口頭発表した。高分子膜では、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)高分子膜をガラス基板上にスピンコーティング条件を適正化した。アセトン溶媒中に溶かしたPMMAをコーティングし、基板密着性が良く均一な膜を作製できることを確認した。平成27年度は、第一に、低分子有機半導体膜の等方加圧特性についての包括的な考察を行った。第二に、高分子膜のコーティング方法の最適化と加圧試験を試行した。加圧による低分子膜の密度上昇(膜厚減少)は、結晶粒形状と粒径のバラツキに起因すると結論づけられる。表面モルフォロジー観察と計算によって予測されるアズコート膜の空孔率は、粒径が一様な柱状結晶のペンタセンでは9.3%以下、粒径にバラツキがある球/楕円体状結晶の銅/亜鉛フタロシアニンでは22%以下、粒径が一様な球/楕円体状結晶のメタルフリーフタロシアニンとAlq3では36.447.6%である。加圧前後の膜厚測定から確認された膜厚減少率は、これらの値の範囲内にある。コーティングされた薄膜中に、結晶粒形状等に依存して高い比率で空孔が存在することや、加圧によって空孔が押し潰されることは本研究において初めて検証された。アズコート低分子膜の弾性率と硬さは、広範囲な4.915.2GPaと0.160.64GPaでバラツいていたが、加圧後のそれぞれの値は、8.011.4GPa、0.390.52GPaの範囲に収束した。この結果は、十分に高密度な等方性の低分子膜は概ね同じ力学的性質を持つことを示している。低分子膜の研究成果は、学術雑誌に掲載された。高分子膜の加圧では、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)について加圧特性を調べた。PMMA溶液は、アセトンを溶媒に用いた。加圧の膜厚依存性を比較するために、ドロップキャスト法とスピンコート法で作製したそれぞれの膜について等方加圧を行った。加圧前のスピンコート膜の膜厚は、460nmであったが加圧によって50%以上減少した。ドロップキャスト膜も同様に膜厚減少した。溶液を用いるPMMA膜においては、溶媒の蒸発によって膜内に空孔が形成されたと結論づけられる。平成27年度の研究計画は、低分子膜の包括的な等方加圧特性を総合的に考察すること、および、高分子膜のコーティング条件を適正化して加圧効果を調べることだった。低分子膜では、3種類(メタルフリー、銅、亜鉛)のフタロシアニン、Alq3、ペンタセンにおいて、膜の加圧特性はそれぞれの結晶粒形状と粒径のバラツキに起因するとの結論を得た。高分子膜では、コーティングのノウハウを蓄積したPMMAについて、ドロップキャスト法とスピンコート法で作製した膜について、等方加圧を行い、加圧による膜厚の減少(高密度化)を確認した。また、PEDOT/PSSについても、均質なスピンコート膜が作製できることを確認した。

その一方で、水溶液でコーティングするPEDOT/PSSは、ガラス基板との密着性が低かったことから、微量の界面活性剤を水溶液に添加することによって密着性を改善し均質な膜をコーティングすることとした。以上の理由から、27年度の研究計画を概ね達成したといえる。計画した課題を達成して研究が進展したことにより、高分子膜上に積層する低分子膜の加圧特性への影響を調べる研究を発展的に実施する必要が生じた。このため、平成28年度以降は、積層化した低分子膜の等方加圧を併せて試みる。平成28年度は、高分子系の電気絶縁膜と導電膜について等方加圧処理による高密度化の効果を検証した。ポリメタクリル酸メチル(PMMA)は、有機トランジシタのゲート絶縁膜に用いられる。押込み試験に適した厚膜化ができるようにアセトン溶液のスピンコート条件を最適化し、ガラス基板上にコーティングした。断面形状測定と押込み法による膜厚測定から、加圧処理によって20%以上高密度化されたことを確認した。加えて、押込み試験結果からは、加圧前後で膜の弾性率および硬さが、それぞれ30%以上高くなったことを確認した。これらの研究結果から、PMMA膜内部の空孔が等方加圧によって圧壊され、膜が高密度化・高強度化したと結論付けられる。ポリ(3,4ーエチレンジオキシチオフェン)/ポリ(スチレンスルホナート)(PEDOT/PSS)は、フルフレキシブルな有機デバイスの電極膜として期待される。2種類のPEDOT/PSS薄膜をガラス基板上にスピンコートして加圧特性を調べた。すなわち、PEDOT/PSS水溶液の基板への濡れ性を高めるために界面活性剤を添加した溶液を用いた膜(活性剤膜)と高沸点有機溶媒をさらに添加した溶液を用いた膜(溶媒膜)である。これらの膜について、加圧処理前後の表面観察と膜厚測定を行った。活性剤膜は加圧前後の変化がほとんど無かった一方、溶媒膜では、結晶粒が加圧によって押し潰されると共に、20%の高密度化が確認された。PEDOT/PSSは、導電性のPEDOTを親水性のPSSによって殻状に覆うことによって水溶液中に均一分散される。活性剤膜では、PSSが大気中の水分を膜中に吸収し加圧効果が得られなかった一方、溶媒膜では、有機溶媒がPSS殻を除去することによって膜中にある空孔への水吸収を防いだ結果、加圧によって空孔が圧壊されたと結論付けられる。本研究の目的は、低分子・高分子有機半導体薄膜の等方加圧(IP)処理において、膜作製や加圧の条件を最適化して処理技術を確立することにある。すべての低分子膜は、IP処理によって高密度化、高強度化した。高密度率は、メタルフリーフタロシアニン膜の40%からペンタセン膜の8.4%の範囲で種類によって異なり、結晶粒形状と凝集状態から算出される空孔率とよく一致した。2つの高分子薄膜は、IP処理によって15%以上高密度化した。PMMA膜は、アズコートの押込み硬さ0.26 GPaがIP処理によって40%高くなった。PEDOT/PSS薄膜は、有機溶媒の添加によって高密度化した。平成26年度の研究計画は、低分子膜の包括的な等方加圧特性を調べること、および、高分子膜の加圧に先立ってコーティング条件を適正化することだった。低分子膜は、有機エレクトロルミネッセンス(EL)の電子輸送層・発光層に用いられるAlq3、有機太陽電池のp型半導体層に用いられるZnPc、有機薄膜トランジスタに用いられるペンタセンについて加圧し、これらの膜の密度、力学的性質の変化を計画通り調べた。低分子膜の研究成果は、学術雑誌に掲載されると共に、学会で口頭発表した。
老年期精神障害における神経画像の背景病理に関する臨床神経病理学的検討

2017年に改定されたレビー小体型認知症(DLB)の診断基準では、幻視、パーキンソニズム、認知機能の変動に加えて、レム睡眠行動障害(RBD)が示唆的特徴から、第4の中核的特徴に格上げされた。また、示唆的特徴が廃止された一方で、基底核ドパミントランスポーターの取り込み低下、MIBG心筋シンチグラフィーの取り込み低下、睡眠ポリグラフ検査(PSG)によるREM sleep without atonia(RWA)の3項目が指標的バイオマーカーと定義された。DLBの神経変性の病態を示す神経画像とならんで、RWAが指標的バイオマーカーとなったことは、臨床病理学的研究の結果からRBDのDLBに対する疾患特異性の高さを反映していると考えられる。老年期精神障害とレビー小体病の鑑別診断において、PSGによるレム睡眠行動障害の診断が役立つことを示し、MIBG心筋シンチグラフィーの取り込み低下と相関することを明らかにした。とくにRBDの病歴聴取とMIBG心筋シンチグラフィーによる鑑別診断の可能性を示した。また、高齢発症のうつ病とレビー小体病の関係において、抗うつ剤とRWA所見(RBD症状を含む)の関連性を指摘して、RBDを手掛かりとして、老年期精神障害を再考する重要性を報告した。また、連続剖検脳を用いて、DLBの病理診断基準を満たした症例の初発症状を検討し、先行研究に基づいた3臨床亜型、すなわち軽度認知障害発症型、せん妄発症型、精神症状発症型に分類できることを確認した。黒質神経細胞脱落の程度は多様であり、パーキンソンニズムの有無との関与が示唆された。頭部CT/MRIの形態画像を含む臨床病理学的評価は、おおむね順調に進んでいる。しかし、精神科病院において入院加療を要し、剖検に至った症例が対象になるため、同施設内では、核医学検査は実施されていない。その結果、生前に123I-ioflupane(123I-FP-CIT)基底核ドパミントランスポーターシンチグラフィーや123I-MIBG(メタヨードベンジルグアニジン)心筋シンチグラフィーが実施された剖検症例数は数少ないのが問題点である。他院で神経画像検査はしばしば実施されるようになっているため、引き続き剖検症例の集積を継続していく予定である。精神科病院を基盤としたブレインバンクであるため、脳機能画像を実施している剖検数が限られているため、臨床情報を整理するうえで的確な症例選定と評価項目の設定に工夫を要すると考えられる。2017年に改定されたレビー小体型認知症の病理学的診断基準に基づき、病理学的亜型を再分類することで、標準化された病理学的分類に基づいた臨床病理学的検討が可能となる。この改訂された診断基準の中で黒質神経細胞脱落の半定量方法が導入されており、老年期発症の精神症状が主体となった症例における生前のパーキンソニズムの症状の有無との相関も行う予定である。また、アルツハイマー病理、とくに脳内アミロイド沈着と臨床経過を検討することで、近年知見が数多く蓄積されつつある認知機能低下とアミロイド沈着の関係を明らかにする予定である。抑うつ、不安、身体愁訴、妄想などの老年期発症の精神症状に注目し、神経画像や睡眠ポリグラフ検査による各検査所見より、背景病理との対応を検討した。臨床病理学的にレビー小体病に疾患特異性が高いレム睡眠行動障害(RBD)に注目し、睡眠ポリグラフ検査上のREM sleep without atonia (RWA)所見を呈し、初期臨床診断が身体症状症である5症例について検討した。最終的に3症例でレビー小体型認知症の臨床診断基準を満たし、1症例ではRBDの病歴を認めず、RWAのみ確認された。残りの2例では、RBDの病歴を認めなかったが、レビー小体病の臨床的特徴を一部示した。中高年発症の身体症状症患者において、RBDが顕在化していないが、RWA所見が背景のレビー病理を疑う契機となる可能性がある。また、身体不定愁訴を呈し、レビー小体型認知症の中核症状を認めない剖検例を臨床病理学的に検討し、軽度のアルツハイマー病理(神経原線維変化ブラークステージ0-2)を併発するTransitional Lewybody disease (TLBD)の病理学的診断であった。本症例の中脳黒質神経細胞脱落は軽度であり、パーキンソン症状が明らかでないことと合致していた。DLBの病理診断基準では、High-likelihoodに分類される病理カテゴリーであり、先行研究結果を踏まえ、likelihood分類の再考が必要性が示唆された。これらの結果は、身体不定愁訴が、レビー小体病の1臨床亜型である可能性があり、さらなる症例の蓄積が必要である。さらに初期の臨床診断は、アルツハイマー病であり、その後神経症状が顕在化し、病理学的には皮質基底核変性症であった症例を認めた。脳血流SPECTでは、アルツハイマー病の特徴を有しており、病初期の記憶障害を呈する皮質基底核変性症では、慎重な臨床診断が必要と考えられた。神経病理学的診断結果とともに、脳形態画像、脳血流SPECTなどの神経画像を中心とした検査所見を比較することで、各症例の神経基盤と神経画像についての臨床病理学的相関について検討した。脳血流SPECTをはじめとした脳機能画像は、病初期に施行されることが多いため、初期症状と臨床経過に着眼し、臨床病理相関について検討する必要があると考えられた。

双極性障害患者剖検脳に嗜銀顆粒病(AGD)が高頻度に認められることや、高齢期発症の精神病性障害患者剖検脳にコントロールと比較してレビー小体病(LBD)、皮質基底核変性症(CBD)、AGDの出現頻度が高いことが報告されている。しかし、精神疾患と神経変性疾患の関係についての報告は数少ない。系統的病理学的評価を終えた精神科ブレインバンクの49症例における神経変性疾患の出現頻度と臨床像について検討した。精神症状の発症年齢をもとに分類し、とくにAGDの出現頻度に注目した。全体でのAGDの出現頻度は25.5%であった。少なくとも経過の中期まで認知症を呈さなかった精神病性障害様の症例は、発症年齢が65歳以上では4例存在し、その内AGDは2例であった。双極性障害3症例では、AGDは認めなかった。アルツハイマー病(AD)についてはIntermediate-あるいはHigh-likelihood、LBDについてはlimbicあるいはneocortical subtype、AGDについてはSaitoステージIIあるいはIIIを有意に神経変性疾患ありと定義した場合、初診時年齢別の神経変性疾患の頻度は、40歳未満4/17、40歳代0/2、50歳代4/6、60歳代4/5、70歳以上15/19であった。50歳未満群では、AD(Intermediate-likelihood)が2症例、ハンチントン病が2症例であった。50歳以上群では、AD12症例(High-likelihood 7症例、Intermediate-likelihood 5症例)、LBD5症例(辺縁型4症例、大脳皮質型1症例)、CBD1症例、進行性核上性麻痺1症例、AGD7症例であった。50歳以上で初めて精神症状を呈する症例では神経変性疾患の関与を考慮すべきであり、一方50歳未満発症の精神疾患における神経変性疾患の関与は低いと考えられた。頭部CT/MRIの形態画像を含む臨床病理学的評価は、おおむね順調に進んでいる。しかし、精神科病院を基盤としたブレインバンクの剖検例が対象であり、同施設内においては、核医学検査は実施されていない。そのため、生前に123I-ioflupane(123I-FP-CIT)ドパミントランスポーターシンチグラフィーや123I-MIBG(メタヨードベンジルグアニジン)心筋シンチグラフィーが実施された剖検例が蓄積されていない。他院で神経画像検査は実施可能となっているため、引き続き剖検症例の集積を継続していく予定である。高齢化社会の到来とともに高齢の精神疾患患者数が増加し、精神疾患の発症年齢によって、病態や臨床経過、必要となるケアが異なる可能性が指摘されているが、それらの病理学的背景は明らかになっていない。単科精神科病院で剖検に至り、系統的病理学的評価を終えた精神科ブレインバンクの62症例を対象として、精神科初診時年齢別とともに50歳未満(平均発症年齢27歳)群、50歳以上(平均発症年齢70歳)群に分けて各神経変性疾患の頻度について臨床病理学的検討をおこなった。アルツハイマー病(AD)についてはIntermediate-あるいはHigh-likelihood、レビー小体病(LBD)についてはlimbicあるいはneocortical subtype、嗜銀顆粒病(AGD)についてはSaitoステージIIあるいはIIIを有意に神経変性疾患ありとした。
アルカリ性塩類耐性極強野生植物において耐性機構に関連する遺伝子の同定

前年度の研究の結果、中国東北部のアルカリ塩類集積土壌に野生するPuccinellia tenuifloraおよびChloris virgataにおける高度の耐塩性機構に関与する事が予想された遺伝子について詳細な解析を行った.特に、Na+/H+アンチポーター(NHA、NHX)、カリウムトランスポーター(HKT)、細胞膜PMP3タンパク質(PMP3)、DREBタンパク質およびカリウムチャンネルの遺伝子(cDNA)の全長を単離し、解析した.最初にそれぞれの遺伝子の環境ストレスに対する発現応答について調べた.多くの遺伝子は環境ストレス処理に応答して発現が変化する事から、ストレスに対する植物の応答に関与する事が考えられた.次にそれらの遺伝子を酵母発現用のベクターに組み込みこんだプラスミドを構築し、酵母(Saccharomyces cerevisiae)に導入した.その結果、酵母でそれらの遺伝子を高発現させる事により、酵母のストレス耐性(塩、高浸透圧等)が向上する事が明らかになった.そこで、それらの遺伝子をpBI121ベクターのCaMV35Sプロモーターの下流に挿入した植物形質転換用プラスミドを構築し、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナ(系統:Columbia)に導入した.その結果、ほとんどの形質転換シロイヌナズナの耐塩性、高浸透圧耐性、活性酸素発生薬品耐性、低温耐性、乾燥耐性が向上する事が確認できた.またNHAとNHXについてはpActNOSベクターのイネアクチンプロモーターの下流に遺伝子を挿入したプラスミドを構築し、イネ(品種:日本晴)に導入した.形質転換イネの耐塩性について現在解析を進めている.1.PuccinelliatenuifloraおよびChloris virgataの幼植物の水耕液に100mMの炭酸水素ナトリウムを加え1日ストレス処理を行った。また、イネ(品種:日本晴)の幼植物体を、50mMの炭酸水素ナトリウムを含む水耕液で1日培養することによるストレス処理を行った。2.ストレス処理を行ったPuccinellia tenuiflora、Chloris virgataおよびイネの幼植物体、対象に用いるストレス未処理の幼植物体をサンプリングし、サンプルからtotal RNAを抽出した。total RNAを鋳型として、cDNAの合成、Cy3またはCy5による蛍光ラベリングを行った。イネの22000遺伝子がスポットされたマイクロアレイ(横河アナリティカルシステム)とラベリングしたcDNAとをハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション後のシグナルをマイクロアレイスキャナで検出した。得られたデータをアイクロアレイデータ解析ソフトを用いて解析して、比較する材料問での遺伝子発現の差について明らかにした。それらのうち数種類の遺伝子についてはRT-PCRによって発現特性の確認を行った。3.植物体へのナトリウムの流入経路と考えられているカリウムトランスポーター遺伝子(PutHKT)、細胞外へのナトリウムの排出および液砲へのナトリウム隔離に関与するナトリウム/プロトンアンチポーター遺伝子(PutNHA、PutNHX)をPuccinellia tenuifloraから単離した。PutNHAおよびPutNHXを高発現する酵母において、耐塩性が向上する事を明らかにした。また、活性酸素の除去機構に関わるmetallothionein遺伝子(ChMT1)をOhloris virgataから単離した。ChMT1を高発現する酵母において活性酸素除去能力が向上し、それに伴い耐塩性、酸化ストレス耐性が向上する事、その効果はイネの遺伝子(OsMT1)よりも高い事を明らかにした。前年度の研究の結果、中国東北部のアルカリ塩類集積土壌に野生するPuccinellia tenuifloraおよびChloris virgataにおける高度の耐塩性機構に関与する事が予想された遺伝子について詳細な解析を行った.特に、Na+/H+アンチポーター(NHA、NHX)、カリウムトランスポーター(HKT)、細胞膜PMP3タンパク質(PMP3)、DREBタンパク質およびカリウムチャンネルの遺伝子(cDNA)の全長を単離し、解析した.最初にそれぞれの遺伝子の環境ストレスに対する発現応答について調べた.多くの遺伝子は環境ストレス処理に応答して発現が変化する事から、ストレスに対する植物の応答に関与する事が考えられた.次にそれらの遺伝子を酵母発現用のベクターに組み込みこんだプラスミドを構築し、酵母(Saccharomyces cerevisiae)に導入した.その結果、酵母でそれらの遺伝子を高発現させる事により、酵母のストレス耐性(塩、高浸透圧等)が向上する事が明らかになった.そこで、それらの遺伝子をpBI121ベクターのCaMV35Sプロモーターの下流に挿入した植物形質転換用プラスミドを構築し、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナ(系統:Columbia)に導入した.その結果、ほとんどの形質転換シロイヌナズナの耐塩性、高浸透圧耐性、活性酸素発生薬品耐性、低温耐性、乾燥耐性が向上する事が確認できた.またNHAとNHXについてはpActNOSベクターのイネアクチンプロモーターの下流に遺伝子を挿入したプラスミドを構築し、イネ(品種:日本晴)に導入した.形質転換イネの耐塩性について現在解析を進めている.
LRRとIgドメインを持つ分子の神経発生過程における機能解析

この研究において、leucine-rich repeats(LRR)とimmunoglobulin(Ig)ドメインを同時に持つヒトの分子を公共データベースから網羅的に検索し、得られた分子のアミノ酸配列の相同性とこれに基づいた系統関係やドメイン構造を詳しく解析した。また発生初期のマウス胚における相同遺伝子の発現パターンを詳細に調べ、得られた分子の発現プロファイルを作成した。公共データベースの検索の結果、合計35個のLRRとIgドメインを持つ分子を見いだすことができた。その大半の分子については研究の過程で何らかの形で報告され、現在では新規の分子と呼ぶことは難しい状況になったが、その発生過程における役割についてはほぼ全ての分子について未だほとんど明らかになっていない。この研究において詳細に発生過程における発現様式を解析した結果、いくつかの分子についてはその機能を仮説化することができ、現在解析中である。得られた35の分子について系統関係を調べた結果、LINGO/NGL分子からなるグループ、複数のIgドメインを持つ分子からなるグループ、LRRとIgドメインに加えてfibronectinドメインをさらに持つ分子からなるグループ、そしてAMIGO分子単独で構成されるグループの4つに大別できることが判った。発現様式については、大半の分子が神経系をはじめとする様々な組織において広範囲に発現していたものの、いくつかの分子については神経系特有あるいは神経系以外の組織に特有な発現様式を示した。このLRRとIgドメインを持つ分子の広範囲にわたる発現様式は、この分子が複数のドメインから構成されるという分子間相互作用における汎用性の高い分子構造を持つこと、すなわち発生過程において様々な分子と相互作用することにより、多面的な機能を果たしていることを反映しているものと考えられる。この研究は、leucine-rich repeat(LRR)とimmunoglobulin(Ig)ドメインを同時に持つ膜貫通型分子の、神経系の発生過程に果たす役割を調べることを目的としたものである。上記の2つのドメインを持つ分子は約30種類存在が知られているが、今年度はLINGO-1並びISLR-2と名付けられた2つの分子を中心に調べた。LINGO-1の発現をニワトリ胚においてin situ hybridization法を用いて調べた結果、boundary cap cellsと呼ばれる、脊髄前根に存在して運動ニューロン細胞体の脊髄からの脱出を抑制している細胞群に発現していることが判った。この細胞群は神経堤に由来することが知られており、実際に神経堤を微少手術で取り除くとLINGO-1の発現が消失し、運動ニューロン細胞体の脱出が起こることが判った。現在、神経堤を除去後、ウイルスベクターを使ってLINGO-1遺伝子を脊髄前根部に発現させ、この細胞体の脱出が抑制されるかどうかを検討している。ISLR-2の発現をニワトリ胚脊髄においてin situ hybridization法を用いて調べた結果、脊髄神経節からの一次球心性線維の投射領域を中心に発現が見られることが判った。分泌型に改変したISLR-2を発現するCOS細胞と脊髄神経節をコラーゲンゲル内で供培養すると、この分子は球心性線維の伸長を抑制することが判った。また、この改変した分子をin vivoでニワトリ胚脊髄に発現させると、DiIに標識された一次球心性線維の投射パターンに乱れが起こることが判った。現在、この分子の一次球心性線維の伸長や投射パターンの形成に果たす役割をin vitro並びにin vivoにおいてさらに詳しく調べている。この研究は、leucine-rich repeat (LRR)とimmunoglobulin (lg)ドメインを同時に持つ分子を公共データベースから網羅的に検索し、得られた分子の発現パターンを発生初期胚において調べ、興味深い発現様式を示すいくつかの分子について神経系の発生過程に果たす役割を調べることを目的としたものである。データベースの拡充に伴い、新たな検索の結果さらに5個の分子を得ることができ、前年度と併せて32個の分子を同定することができた。これら分子のアミノ酸配列を解析した結果、得られた分子はLRRドメインに加えて、単一もしくは複数個のIgドメインを持つものに大きく2分することができた。

単一のIgドメインを持つ分子は神経系を中心に発現が見られる一方で、複数個のIgドメインを持つ分子は神経系を含む幅広い組織における発現を示す特徴が存在した。本年度は、得られた分子の中でISLR2と名付けられた分子を中心に解析を行った。ISLR2はニワトリ胚脊髄において脊髄神経節からの一次球心性線維の投射領域を中心に発現が観察され、分泌型に改変したISLR2を発現するCOS細胞と脊髄神経節をコラーゲンゲル内で供培養すると、この分子は球心性線維の伸長を抑制することが判った。この抑制作用の機能ドメインマッピングを行なった結果、IgドメインのC末端側に存在するファイブロネクチン様のドメインにその作用があることが判った。ISLR2の抗体作製も行い、免疫組織化学によりISLR2タンパクの局在部位を調べた。当初細胞膜上に局在を予想したが、実際の染色様式は神経細胞内の小胞上の局在を示したことから、現在得られた抗体の性質を詳細に検討している。
新規マイクロニードルと物理的透過促進法を併用したバイオ医薬品皮膚透過促進法の研究

本研究課題の初年度である平成30年度は、生体適合性高分子を用いた射出成型により新規形状マイクロニードル(MN)アレイの作成を試みた。この新規形状MNアレイの満たすべき性能として、MNによる皮膚への穿刺孔深さを200μm以上、またMN表面への薬剤保持量を3mg以上とした。また射出成型技術により、多量に同一形状のMNを作成することを目指した。MNアレイの基本形状として、高さ1000μmで針の先端から500μmの溝を持つ烏口型のMNが直径8mmの円内に100本立つもの(MN1)を作成した。このMN1における薬剤保持量を検討したところ、1.77±0.02mgと要求性能の半分程度であった。そこで500μmの溝を700μmと深くしたMN2を作成した。このMN2における薬剤保持量は、3.20±0.21mgと要求性能を満たす事が出来た。また新生児ブタ皮膚にMNを適用し、ポータブル光干渉画像法(OCT)システムにより非接触・非破壊・非侵襲により穿刺孔深さを測定した。MN1およびMN2ともに200μm以上の穿刺孔深さであった。このMNアレイ2の優位性を確認するため、針に溝を持たないMNを作成している。新規形状MNの要求性能として、穿刺孔深さと薬剤塗布量を挙げた。医療用機器としてのMNでは、皮膚への穿刺性や穿刺孔深さを定量的に評価し、薬効成分などの動態を明らかにしなければならない。これは本研究で示したOCTシステムにより解明が可能であることを示す事が出来た。またMNの臨床利用における大きな問題として、投薬量が制限されており、利用できる医薬品が限られていることが挙げられる。これまでの多くの研究では、薬剤保持量は1mgを超える事が出来なかった。本研究成果では、薬剤保持量の限界をこれまでの3倍まで上げる事ができ、さまざまな医薬品、特にバイオ医薬品の経皮投与の可能性を示す事が出来た。本研究課題では、3つの達成課題を挙げている。1つ目はMNアレイ形状の最適化、2つ目はバイオ医薬品の皮膚内送達量の増大と皮膚透過速度制御、そして3つ目は実験動物を使用した新規形状MNの効果検証である。平成30年度では1つ目の課題であるMNアレイ形状の最適化を達成するために、新規形状MNアレイの満たすべき要求性能として、皮膚への穿刺性とMNへの薬剤保持量を挙げた。MN1では穿刺孔深さの要求性能を満たしたが、薬剤保持量を達成する事ができなかった。そこで穿刺性を損なわずに薬剤保持量を増やす目的で、MN2を作成した。このMN2は、要求性能である穿刺孔深さと薬剤保持量ともに満たす事ができた。したがって3つの達成課題の1つ目であるMNアレイ形状の最適化を達成する事ができた。しかしMN表面での薬剤保持量と皮膚内への送達量の関係は現在検討中であるため、おおむね順調に進展していると判断した。本研究課題で得られた成果を社会へ広めるため、烏口MNアレイの作成方法について、研究分担者である伊藤が2019年3月に開催された精密工学会2019年度春季大会において口頭発表を行った。そして発表内容に関して、学術雑誌へ投稿するため英語論文を執筆している。またMN2の研究成果について、引間は2019年7月に開催予定の第35回日本DDS学会学術集会で発表を行うため、準備を行っている。研究計画通りに達成課題の2つ目であるバイオ医薬品の皮膚内送達量の増大と皮膚透過速度制御を検討する。まず検討途中であるバイオ医薬品のモデル化合物であるフルオレセインイソチオシアナートデキストラン(FITC-D、分子量は1万から200万までを使用する)の皮膚内送達量を、新生児ブタ皮膚を用いて明らかする。また実際に臨床利用されているタンパク医薬品であるインスリンの皮膚送達量も検討する予定である。インスリンは3つ目の達成課題である実験動物における効果検証のため利用する予定である。皮膚透過量の増大と透過速度の制御には、物理的透過促進法である電場を用いる。これまで他の研究者による電場での医薬品の皮膚透過促進の成果として、電場は局所麻酔やオピオイド鎮痛剤などの経皮送達促進が挙げられる。これらの医薬品は分子量が数百程度と小さい。しかし本研究課題では、バイオ医薬品として分子量数百万程度までのタンパク質を想定しており、これまで他の研究者からバイオ医薬品の電場での送達促進の報告は無い。また高分子量の化合物は、電場による透過促進効果が低い事が予想できる。そこで電流の種類(直流と交流)、電流の向き、電流値などのパラメータと皮膚透過促進効果との関係を、FITC-Dやインスリンを用いて検討する。電場での透過速度制御の可能性が低い場合、他の物理的透過促進技術(超音波や磁場など)を併用し、皮膚透過促進技術の検討を継続する。

MNアレイの基本形状として、高さ1000μmで針の先端から500μmの溝を持つ烏口型のMNが直径8mmの円内に100本立つもの(MN1)を作成した。このMN1における薬剤保持量を検討したところ、1.77±0.02mgと要求性能の半分程度であった。そこで500μmの溝を700μmと深くしたMN2を作成した。このMN2における薬剤保持量は、3.20±0.21mgと要求性能を満たす事が出来た。また新生児ブタ皮膚にMNを適用し、ポータブル光干渉画像法(OCT)システムにより非接触・非破壊・非侵襲により穿刺孔深さを測定した。MN1およびMN2ともに200μm以上の穿刺孔深さであった。このMNアレイ2の優位性を確認するため、針に溝を持たないMNを作成している。新規形状MNの要求性能として、穿刺孔深さと薬剤塗布量を挙げた。医療用機器としてのMNでは、皮膚への穿刺性や穿刺孔深さを定量的に評価し、薬効成分などの動態を明らかにしなければならない。これは本研究で示したOCTシステムにより解明が可能であることを示す事が出来た。またMNの臨床利用における大きな問題として、投薬量が制限されており、利用できる医薬品が限られていることが挙げられる。これまでの多くの研究では、薬剤保持量は1mgを超える事が出来なかった。本研究成果では、薬剤保持量の限界をこれまでの3倍まで上げる事ができ、さまざまな医薬品、特にバイオ医薬品の経皮投与の可能性を示す事が出来た。本研究課題では、3つの達成課題を挙げている。1つ目はMNアレイ形状の最適化、2つ目はバイオ医薬品の皮膚内送達量の増大と皮膚透過速度制御、そして3つ目は実験動物を使用した新規形状MNの効果検証である。平成30年度では1つ目の課題であるMNアレイ形状の最適化を達成するために、新規形状MNアレイの満たすべき要求性能として、皮膚への穿刺性とMNへの薬剤保持量を挙げた。MN1では穿刺孔深さの要求性能を満たしたが、薬剤保持量を達成する事ができなかった。そこで穿刺性を損なわずに薬剤保持量を増やす目的で、MN2を作成した。このMN2は、要求性能である穿刺孔深さと薬剤保持量ともに満たす事ができた。したがって3つの達成課題の1つ目であるMNアレイ形状の最適化を達成する事ができた。しかしMN表面での薬剤保持量と皮膚内への送達量の関係は現在検討中であるため、おおむね順調に進展していると判断した。本研究課題で得られた成果を社会へ広めるため、烏口MNアレイの作成方法について、研究分担者である伊藤が2019年3月に開催された精密工学会2019年度春季大会において口頭発表を行った。そして発表内容に関して、学術雑誌へ投稿するため英語論文を執筆している。またMN2の研究成果について、引間は2019年7月に開催予定の第35回日本DDS学会学術集会で発表を行うため、準備を行っている。研究計画通りに達成課題の2つ目であるバイオ医薬品の皮膚内送達量の増大と皮膚透過速度制御を検討する。まず検討途中であるバイオ医薬品のモデル化合物であるフルオレセインイソチオシアナートデキストラン(FITC-D、分子量は1万から200万までを使用する)の皮膚内送達量を、新生児ブタ皮膚を用いて明らかする。また実際に臨床利用されているタンパク医薬品であるインスリンの皮膚送達量も検討する予定である。インスリンは3つ目の達成課題である実験動物における効果検証のため利用する予定である。皮膚透過量の増大と透過速度の制御には、物理的透過促進法である電場を用いる。
新しい光機能材料GeC/Si混晶のエピタキシャル成長技術とその光学特性の研究

Si系発光デバイス等を目指して、新しいバイオナノプロセスとトップダウン式のMBE法、SPE法、イオン注入法等を融合させ、Si基板上にGeC、β-FeSi_2、Siそれぞれのナノクリスタル(NC)の2次元精密配列(超格子)の形成技術を開発した。得られた新しい知見は次の通りである。(3)バイオナノプロセスによってSi(100)基板上に2次元配列したFe内包フェリチンのたんぱく質を0_3プラズマで除去し、PECVDチャンバ内でNH_3プラズマで還元したFeナノドットカラムを同一チャンバ内でa-Si薄膜を堆積・埋め込み、高真空中、800°C、1時間の固相エピタキシー法によって直径6.0±0.4nm、12nmピッチの均一なβ-FeSi_2 NCの2次元配列の形成とそのPLスペクトルの観測に成功した。[Appl.Phys.Lett.,91,2007]Si系発光デバイス等を目指して、新しいバイオナノプロセスとトップダウン式のMBE法、SPE法、イオン注入法等を融合させ、Si基板上にGeC、β-FeSi_2、Siそれぞれのナノクリスタル(NC)の2次元精密配列(超格子)の形成技術を開発した。(2)上記のSiナノマスクを介してSiO_2薄膜中に0.6keVでSiイオンを低加速注入(ドーズ量1×10^<16>cm^<-2>)し、Nd:YAGパルスレーザアニールを用いて直径3.0±0.3nm,間隔6nmのSi-NCの2次元超格子構造の形成に初めて成功し、波長600nmに強いPLピークを検出した。[Appl.Phys.Express,1,2008](3)バイオナノプロセスによってSi(100)基板上に2次元配列したFe内包フェリチンのたんぱく質を0_3プラズマで除去し、PECVDチャンバ内でNH_3プラズマで還元したFeナノドットカラムを同一チャンバ内でa-Si薄膜を堆積・埋め込み、高真空中、800°C、1時間の固相エピタキシー法によって直径6.0±0.4nm、12nmピッチの均一なβ-FeSi_2 NCの2次元配列の形成とそのPLスペクトルの観測に成功した。[Appl.Phys.Lett.,91,2007]本科研費補助金を受けてSiフォトニクス用発光デバイスの開発を目指し,分子線エピタキシー(MBE)法による新しいGeC/Si(100)ヘテロエピ混晶成長の研究を進めている。研究課題は(1)Ge, Cの非混和性克服と高品質GeC混晶の開発,(2)顕著なバンドボーイングの原因解明と直接遷移型バンドの形成,及び(3)親鉄球状蛋白質フェリチンの自己組織化による『バイオナノプロセス』を適用し,GeCナノ結晶の二次元超格子とSi/GeC/Si(100)DH構造作製による発光特性評価である。今年度の研究成果を次に示す。1)バイオナノプロセスを用いてフェリチンニ次元配列をsi(100)基板上に吸着後,400°C,10分のO_2雰囲気熱処理により蛋白質を除去し,Fe_2O_3ナノドットカラムを形成し,MBEによる1nm厚のSi極薄膜堆積と希塩酸によるFe_2O_3リフトオフにより直径6nm,密度10^<12>cm^<-2>の微小孔のSi極薄膜ナノマスク作製技術を開発。(H18/9応物学会発表)2)C分子線源に真空アークプラズマガンを用いて,S-KモードMBE成長によりSi(100)基板上に直径数10nmのGeCナノ結晶を作製し,微弱ながらPL光を観測した。さらに上記の極薄膜Siナノマスクを介してRIEでSiO_2薄膜の微小孔を形成し,MBE選択成長により7±2nm,10^<12>cm<-2>のGeCナノ結晶形成に成功。(H19/3応物学会発表)3)O_3プラズマによるFe内包フェリチンニ次元配列の蛋白質を除去後,PECVDチャンバ内でNH_3プラズマにより還元したFeナノドットを連続して堆積したa-Si薄膜に埋め込み,高真空中,800°C,1時間の固相エピタキシー(埋め込みSPE法)によって直径6.0±0.4nm,密度7.2×10^<11>cm^<-2>の均一なβ-FeSi_2ナノ結晶形成とPL光観測に成功。(H19/3応物学会発表)Si系発光デバイス等を目指して、新しいバイオナノプロセスとトップダウン式のMBE法、SPE法、イオン注入法等を融合させ、Si基板上にGeC、β-FeSi_2、Siそれぞれのナノクリスタル(NC)の2次元精密配列(超格子)の形成技術を開発した。(中間勇二君の博士論文)(3)バイオナノプロセスによってSi(100)基板上に2次元配列したFe内包フェリチンのたんぱく質をO_3プラズマで除去し、PECVDチャンバ内でNH_3プラズマで還元したFeナノドットカラムを同一チャンバ内でa-Si薄膜を堆積・埋め込み、高真空中、800°C、1時間の固相エピタキシー法によって直径6.0±0.4nm、12nmピッチの均一なβ-FeSi2NCの2次元配列の形成とそのPLスペクトルの観測に成功した。[Appl. Phys. Lett., 91,2007]
政治制度と市民的自己決定の間の齟齬-ベルギー型連邦制の脆弱性-

本研究は、ベルギーの連邦制度の問題点を明らかにするものである。ベルギー型連邦制は、しばしば多民族社会の統治手法として「モデル」と理解されているが、93年の導入以来、今もなおベルギーは様々な政治的・社会的問題から免れていない。本研究は、この問題が「モデル」とされた連邦制度自体に起因していることを指摘し、さらにその制度運用に当たる政治的リーダーの行動が重要であることを指摘した。1.本年は、まずベルギーの混乱と「移民問題」との関連をOECD資料、また関西圏の大学資料などによって検討し、聖学院大学総合研究所紀要に論文「ベルギーの移民事情試論-ワロン・フラマン対立の再燃と「過去の清算」-」を投稿した(42号掲載)。また、「国内人口移動」についてはデータを収集しつつあり、論文構想もまとまっている。この成果は(仮)「ベルギーブリュッセル問題と南北格差」として43号に投稿する予定である。2.2007年6月選挙以降のベルギーの政治的状況が不安定であり、新政権成立までに予想以上の時間を要したため、現地調査を次年度に延期することとした。そのかわり、博士論文研究では蓄積が希薄であったベルギーの「EU政策」に関する基礎的研究に重点を置いた。文献の購入、また特にカトリック政党の政策について名古屋大学などで資料収集を行った。これについては、20年度に研究発表、研究ノート、論文を各投稿予定である。3.さらには、こうした研究の過程で派生した他の知見から博士論文を見直すことができ、「ベルギーの国民統合とキリスト教民主主義政党」(ヨーロッパ地域問題研究会)として発表できたのは幸いであった。これも2008年度内の投稿を検討している。4.今後の研究成果発表の場として名古屋大「政治と社会」研究会に出席、議論し、理解を深めている。また、ベルギー(憲法)研究に力を入れておられる武居一正教授のご紹介により日本ベルギー学会に入会した。今後の研究発表および資料収集の場として活用する。本年度は、前年度の基礎的研究を土台にし、実際にベルギーへ出張し、現在「国家分裂危機」に陥ったベルギーの政治過程(200日に亙る政権交渉過程)について、現地新聞資料などを用いて調査した。ベルギーでは、93年以降連邦国家となったが、それ以降も市民が首都ブリュッセル近郊へ移住する傾向はやまず、それによってブリュッセル周辺地域の民族対立が再生産されていること、さらに、連邦化によって各民族が政治的自治を高めたが、しかし、それによって逆に主要政治アクターが民族主義的主張を高め、合意形成に時間を要し、政治不信を高めていることを明らかにした。そもそも我が国においてベルギー研究者が少ないなかで、さらに最近の動向を研究しようとするものは、ベルギーにおいても少なく、希少性という点でまず重要であった。特に93年に成立した連邦制度が、ベルギーの民族対立を一層あおっているとの申請者の見解は古典的なレイプハルトの主張に対する批判となる。
RNAiトラップ法によるマウス肝炎ウイルス抵抗性マウスの開発

アンチセンスRNAを発現させることにより、センスRNAと結合させ、その翻訳を抑制し、遺伝子機能を阻害できることが知られている。しかし、線虫やショウジョウバエの実験から、2本鎖RNAを発現させたほうが、遺伝子機能の阻害効果が強いことが示され、この現象をRNA interference(RNAi)とよぶようになっている。マウス肝炎ウイルスMHV)は、遺伝子改変マウスのやり取りが活発化している現在、実験用マウスの管理上最も厄介で汚染確率の高いウイルスである。これを防止するため、RNAi法の利用を考えた。これまで我々が開発してきた遺伝子トラップ法を行うと同時に、MHV耐性を付与するため、トラップ後に2本鎖RNAを発現させ、MHV抵抗性マウスを作製することを目的とした。この方法が有効かどうかを検定するために、ES細胞で発現している6種類の糖鎖関連遺伝子の2本鎖RNAを合成し、それをES細胞に導入し、発現が抑制されるかどうかを検討したところ、最も効果的なものでも20%の抑制であることが分かった。このことは、2本鎖RNAを直接導入しても、その効果は低いことを示唆している。我々の用いているトラップベクターは、レポーター遺伝子にbeta-geoを用い、その前後に変異lox配列を配置している。これにより、トラップクローン樹立後にbeta-geoを任意の遺伝子に置換することが出来る。まず、ES細胞内で発現させたヘアピン状の2本鎖RNAが機能するかどうか調べるため、既に樹立されてトラップされた遺伝子とトラップベクターの挿入位置が明らかになっているクローンを用い、beta-geoをトラップされた遺伝子のアンチセンス配列に置換してその効果を検討した。しかしながら、野生型アレル由来のmRNAは問題なく転写されていることがわかった。従って、少なくともこの系では、ヘアピン状2本鎖RNAは顕著なRNAi効果を示さなかった。今後は、ベクターの工夫により、有効に働くRNAiトラップベクターの構築をめざしたい。しかし、線虫やショウジョウバエの実験から、2本鎖RNAを発現させたほうが、遺伝子機能の阻害効果が強いことが示され、この現象をRNA interference (RNAi)とよぶようになっている。マウス肝炎ウイルス(MHV)は、遺伝子改変マウスのやり取りが活発化している現在、実験用マウスの管理上最も厄介で汚染確率の高いウイルスである。MHVは、細胞に感染後、(+)strand RNAをもとに(-)strand RNAが合成され、これから78種類の、(+)strand RNAが合成され、それぞれの蛋白が翻訳される。したがって、これまで我々が開発してきた遺伝子トラップ法を行うと同時に、MHV耐性を付与するため遺伝子トラップベクター内にウイルスの増殖に関与する蛋白を作るもととなる部分を組み込み、トラップ後に2本鎖RNAを発現させ、MHV抵抗性マウスを作製することを目的とした。この方法が有効かどうかを検定するために、すでにc-crk遺伝子をトラップしているESクローンを用いた。このクローンでは、lox71を含むベクターが挿入されているので、lox66を利用して、逆向きのc-crkを導入することができる。その結果、果たして2本鎖RNAが形成されるかを解析したところ、アンチセンス及びセンスプローブで検出されるRNA,すなわち2本鎖RNAが存在することを示唆する結果をえた。現在、c-crkの機能が疎外されているかどうかを検討中である。

しかし、線虫やショウジョウバエの実験から、2本鎖RNAを発現させたほうが、遺伝子機能の阻害効果が強いことが示され、この現象をRNA interference (RNAi)とよぶようになっている。マウス肝炎ウイルス(MHV)は、遺伝子改変マウスのやり取りが活発化している現在、実験用マウスの管理上最も厄介で汚染確率の高いウイルスである。これを防止するため、RNAi法の利用を考えた。MHVは、細胞に感染後、(+)strand RNAをもとに(-)strand RNAが合成され、これから78種類の、(+)strand RNAが合成され、それぞれの蛋白が翻訳される。したがって、これまで我々が開発してきた遺伝子トラップ法を行うと同時に、MHV耐性を付与するため遺伝子トラップベクター内にウイルスの増殖に関与する蛋白を作るもととなる部分を組み込み、トラップ後に2本鎖RNAを発現させ、MHV抵抗性マウスを作製することを目的とした。この方法が有効かどうかを検定するために、ES細胞で発現している6種類の糖鎖関連遺伝子の2本鎖RNAを合成し、それをES細胞に導入し、発現が抑制されるかどうかを検討したところ、最も効果的なものでも20%の抑制であることが分かった。このことは、2本鎖RNAを直接導入しても、その効果は低いことを示唆している。そこで、現在、ヘアピンループの2本鎖RNAが発現できるようにデザインした発現ベクターを構築し、それを導入することを試みている。
病原糸状菌エフェクターが起動する植物免疫スイッチの解析

アブラナ科植物炭疽病菌は,宿主細胞へ侵入する際にエフェクタータンパク質を分泌する.本研究では、炭疽病菌エフェクター候補の中から、植物の防御応答の指標として挙げられる細胞死を抑制する2種類の因子を同定した.その一方で,植物の細胞死を引き起こす新規の分泌タンパク因子も見出した.これらは,他のいくつかの植物病原糸状菌ゲノム中にも存在していたことから,Colletotrichum属を超えて共通の機能をもつエフェクターではないかと推察した.アブラナ科植物炭疽病菌は,宿主細胞へ侵入する際にエフェクタータンパク質を分泌する.本研究では、炭疽病菌エフェクター候補の中から、植物の防御応答の指標として挙げられる細胞死を抑制する2種類の因子を同定した.その一方で,植物の細胞死を引き起こす新規の分泌タンパク因子も見出した.これらは,他のいくつかの植物病原糸状菌ゲノム中にも存在していたことから,Colletotrichum属を超えて共通の機能をもつエフェクターではないかと推察した.植物病原糸状菌のアブラナ科植物炭疽病菌(以下、炭疽病菌)は、宿主細胞に侵入する際に低分子のペプチドタンパク質(エフェクター分子)を分泌することで、植物が発動する免疫システムを回避すると考えられている。しかしながら、その実体はよくわかっていない。そこで、炭疽病菌のエフェクターを同定し、その機能解析を行うことで、植物の免疫応答を制御する分子機構(植物の免疫スイッチ)を明らかにすることを目的として研究を行っている。本年度は、まず炭疽病菌エフェクターの同定と特徴づけを試みた。炭疽病菌由来の低分子の分泌性タンパク質をコードした遺伝子群(エフェクター候補遺伝子群)の中から、宿主の免疫応答を抑制する機能を持つものを、植物が病原菌エリシターによって誘導する過敏感細胞死の抑制効果を指標にして評価を行った。具体的には、エフェクター候補遺伝子を植物組織内で発現するように設計したバイナリーベクターに組み込み、アグロバクテリアの一過的発現系を利用して、モデル実験植物ベンサミアナタバコで発現を行った。その結果、エリシタータンパク質(NLP)によって誘導される細胞死を抑制する効果を示す複数の候補遺伝子を同定することに成功した。これらの遺伝子発現を調べてみると、炭疽病菌の感染過程で異なっていることから、炭疽病菌は宿主感染時にタイミングをずらして複数のエフェクター因子を分泌しているのではないかと考えられた。一方で、この評価法を用いてエフェクター候補遺伝子群のスクリーニングを行っていたところ、予想に反して、エフェクター単独で植物の防御応答(細胞死)を誘導する効果をもつ新規因子を見出した。今のところ、炭疽病菌の宿主感染における本因子の機能は不明である。植物病原糸状菌のアブラナ科植物炭疽病菌(以下、炭疽病菌)は、宿主細胞に侵入する際に低分子のペプチドタンパク質(エフェクター)を分泌するが、その機能はよくわかっていない。本研究課題では、炭疽病菌から分泌されるエフェクターが宿主への感染時に果たす役割について調べることで、植物の免疫応答をどのように制御しているのかを明らかにすることを目的とした。前年度には、炭疽病菌エフェクターの機能評価アッセイ系を確立し、複数のエフェクター候補の中から、植物の免疫応答の一つである細胞死の誘導を抑制する因子を同定した。その一方で、細胞死を誘導する新規タンパク質因子も見出した。そこで本年度は、それら因子が植物細胞のどこで作用するのか、また植物因子の何と相互作用することで植物の免疫反応が制御されているのかを調べた。その結果、炭疽病菌エフェクターには、植物細胞の外側(アポプラスト)で作用するものと、細胞内で作用するものがあることが明らかとなった。また、エフェクターと相互作用する候補因子を同定した。さらにエフェクターが過剰発現する炭疽病菌の作出に成功した。今後、それぞれの結果について、詳細な確認実験を行う必要がある。植物病理学当初の計画では、初年度にエフェクターと相互作用する植物因子の探索を行う予定であった。ところが、エフェクターの機能評価を行っている過程で、予測する機能とは異なる新規の因子を見出したことから、そちらの評価について詳しく調べることにした。その結果、当初の計画とは異なる予定で研究を進めることになった。しかしながら、総合しておおむね順調に進展しているものと判断した。1.植物の防御応答を抑制するエフェクター候補遺伝子計画に沿って、本因子と相互作用する宿主植物因子の同定を試み、植物の免疫応答を調節する因子の実態解明を行う。同定した因子を欠損したシロイヌナズナ変異体を取得し、それらの植物免疫応答を調べる。2.植物の防御応答を誘導するエリシター候補遺伝子エリシターによる植物の防御応答誘導メカニズムの詳細を明らかにする。また、エリシターを過剰発現する炭疽病菌変異株を作出し、接種実験を行うことで、本因子の感染における役割を明らかにする。