hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水溶性ペリレン誘導体を主骨格とする蛍光プローブの開発と細胞内イメージングへの応用

蛍光を利用した分析法は、操作が簡便であり選択性にも優れた分析法である。蛍光センサープローブは生体分子の挙動解析において極めて有用なツールであり近年広く研究が行われている。蛍光センサープローブの開発において、蛍光基の選択はセンサー自体の性能を左右する問題である。ペリレンビスイミドは従来、材料分野で主に用いられてきた蛍光化合物であるが、ペリレンビスイミドの優れた蛍光特性は、蛍光センサーの主骨格としても有用であると考えられる。この優れた蛍光特性は、マイクロフロー分析システムを用いた微量のアスコルビン酸の検出においても有用であることが期待できる。特にアスコルビン酸は生体内神経伝達物質であり、採取可能試料量が限られていること、またタンパク質などの高分子量のマトリックス中に存在することから、マイクロダイアリシス試料採取法とマイクロフロー分析法はアスコルビン酸の分析には適した方法と言える。そこで本年度の研究では、マイクロチップを用いたフローシステムを構築し、マイクロダイアリシス法を組み合わせることにより、複雑なマトリックス中におけるアスコルビン酸の蛍光検出を目指した。マイクロチップ上に作製したマイクロ流路に試薬溶液を送液し、アスコルビン酸との反応で生じた蛍光を共焦点蛍光顕微鏡で観察し、流路内での流れ挙動を調べた。その結果、流路深さ方向の中央の位置に顕微鏡の焦点を合わせることにより、流路壁面に吸着した試薬からの蛍光の影響を受けることなく、アスコルビン酸との反応で生じた蛍光を検出できることを明らかにした。さらに、マイクロチップへの試料導入法としてマイクロダイアリシスプローブを用いた試料採取法を組み合わせることにより、高分子量物質を含む試料からの微量試料の採取に応用可能なことを示している。以上の結果から、本検出法は微量のアスコルビン酸の検出においても有用であることが期待できる。ペリレン誘導体を骨格とした蛍光試薬の分析化学的応用性を示すことは出来たが、最終的な目的であった細胞内イメージングに関しては行うことが出来なかったため。蛍光プローブの反応部位として、これまでに用いたニトロキシルラジカルのような特異的反応性を有する分子を用いることで、新たな標的分子に対する蛍光プローブの開発が期待できる。例えば、カルシウムイオン(Ca2+)と選択的に反応するBAPTAなどのキレート性化合物を反応部位として用いることで金属イオンに選択的な蛍光プローブの開発が期待できる。また、NHSエステルやマレイミドなどの反応性基を導入することでタンパク質などの生体分子中のアミンやチオールの標識試薬として利用可能になると考えられる。ペリレン誘導体は従来、太陽電池などの材料分野で主に用いられてきた蛍光化合物である。しかし、申請者らの研究により、これらが蛍光プローブの主骨格としても極めて有用であることが明らかとなってきた。しかしながら、現時点では、蛍光プローブ自体は疎水性であり、細胞内の疎水部位である細胞膜でのセンシングへの適用、有機溶媒中での使用など、限定された応用しか達成できていない。そこで本研究では、水溶性を有するペリレン誘導体の合成とこれを主骨格とする蛍光プローブの開発を目指す。本年度は、新規水溶性ペリレン誘導体の合成とその蛍光特性の評価について検討を行った。水溶性ペリレン誘導体の合成として、まず、ペリレンテトラカルボン酸二無水和物を出発原料とし、ジブロモペリレンビスイミドの合成を行った。次いで、この化合物に水溶性置換基としてピリジニウム基を導入し、目的とした化合物を得た。得られた化合物の吸収・蛍光スペクトル測定から、基礎的蛍光特性の評価を行った。極大励起・蛍光波長はいずれも500nm以上の可視光領域に存在していることが確認された。また、水中での蛍光特性の評価を行ったところ、水中においても高い蛍光量子収率を示すことが明らかとなった。このことから、合成を行ったペリレン誘導体は、蛍光プローブの蛍光基として有用であると考えられる。今後は、本年度の成果を踏まえ、ペリレン誘導体を骨格とした蛍光プローブの開発とそのバイオ分析への応用が進展することが期待できる。

さらに、マイクロチップへの試料導入法としてマイクロダイアリシスプローブを用いた試料採取法を組み合わせることにより、高分子量物質を含む試料からの微量試料の採取に応用可能なことを示している。以上の結果から、本検出法は微量のアスコルビン酸の検出においても有用であることが期待できる。本研究の目的であるペリレン誘導体の水溶化とそのバイオイメージングへの応用である。現段階では、生細胞内への導入については未検討であるが、水溶性化合物の開発は各種評価を行うことができているため、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。ペリレン誘導体を骨格とした蛍光試薬の分析化学的応用性を示すことは出来たが、最終的な目的であった細胞内イメージングに関しては行うことが出来なかったため。水溶性ペリレン誘導体の合成に関して、現在のピリジニウム基と異なった置換基を導入し、蛍光特性の比較を行い、これらの化合物の細胞内導入について順次検討を行う予定である。その後、目的に応じた反応部位を導入した蛍光プローブの開発を行なっていく。蛍光プローブの反応部位として、これまでに用いたニトロキシルラジカルのような特異的反応性を有する分子を用いることで、新たな標的分子に対する蛍光プローブの開発が期待できる。例えば、カルシウムイオン(Ca2+)と選択的に反応するBAPTAなどのキレート性化合物を反応部位として用いることで金属イオンに選択的な蛍光プローブの開発が期待できる。また、NHSエステルやマレイミドなどの反応性基を導入することでタンパク質などの生体分子中のアミンやチオールの標識試薬として利用可能になると考えられる。
配糖体型イソキノリン及びインドールアルカロイド類の合成化学的研究

配糖体イソキノリンアルカロイド・インドールアルカロイド類の合成研究と分光学的研究を行った。(I)配糖体イソキノリンアルカロイドの合成研究生合成前駆体と考えられるドーパミンのセコロガニンの縮合反応、C環ラクタム化、続くメチル化によりMethylalangiside,Methylisoalangisideを約7:2の比率で合成した。また、イソバニリンを出発原料としたイソキノリンアルカロイドの合成を検討した。イソバニリンの2位あるいは6位にBr基を導入した後、ドーパミン誘導体とした。AcOH条件下、6-ブロモドーパミン誘導体とSecologanin tetraacetateとの縮合を行い、低収率ながらイソキノリン体を得、さらに2段階にてNeoalangisideを初めて合成することができた。2-Br体を用いた縮合反応については検討中である。(II)二糖結合型アルカロイドの合成研究(III)配糖体アルカロイド類の分光学的研究3位にβ-水素を有するVincoside lactamtetraacetateの^1H-NMRにおいて4本のアセチルメチルのケミカルシフトが2ppm付近にすべて観測されるのに対して、3位にα-水素を有するStrictosamide tetraacetateでは、1本だけ特異的に高磁場に観測される。NMRの詳細な解析によりこの高磁場シフトするアセチルメチルが糖部2'位のアセチル基に相当すること、さらに糖部分を含むD環部のコンフォーメーションを明かとし、3α-HのStrictosamide誘導体においては2'位アセチル基がAB環部の上に位置することによりそのアニソトロピー効果によって高磁場シフトすることを明かとした。
マクロファージTLR9を介した新しいインスリン抵抗性発現メカニズムの解明

糖尿病の発症には、脂肪組織の慢性炎症が関与するが、その機序の解明は不十分である。本研究では肥満脂肪組織に生じる肥大脂肪細胞の細胞死に関連して、肥満個体では細胞デブリスのひとつである遊離核酸断片(cfDNA)が増加し、核酸断片受容体であるTLR9によって認識されることでマクロファージを活性化し、脂肪組織の炎症を惹起すること、さらに、TLR9の遺伝的欠損や特異的阻害薬により、肥満誘導性の糖尿病の発症が減弱することを見出した。これらの結果は、cfDNA-TLR9シグナルが肥満誘導性の脂肪組織の慢性炎症と糖尿病の発症の新規治療標的になる可能性を示唆している。インスリン抵抗性は、脂肪組織でのマクロファージを中心とする慢性炎症が原因で生じるが、炎症が誘導される原因やマクロファージが脂肪組織に動員される理由については、十分明らかではない。本研究では、toll-like receptors (TLRs)の一つであるTLR9が脂肪組織における炎症を惹起するという仮説に従い、研究を行っている。これまでのところ、マウス腹腔内マクロファージにTLR9のアゴニストを作用させることで、MCP-1などの炎症性物質の発現が増えることや、TLR9欠損マクロファージや、野生型マクロファージにTLR9のアゴニストとアンタゴニストを同時作用させる系では、炎症性物質の発現増加が認められないことを確認した。さらに、マクロファージにおけるTLR9の活性化は、炎症の惹起に重要な系であるNF-kB経路を活性化させることを見出した。以上から、TLR9はマクロファージにおける炎症反応を誘導する可能性が考えられた。また、in vivoにおいて、野生型マウスに高脂肪食を投与し、肥満状態を誘導することで、脂肪組織におけるTLR9の発現が増加することが分かった。さらに野生型マウスとTLR9欠損マウスに高脂肪食負荷を行ったところ、脂肪重量に差を認めないが、TLR9欠損マウスでは、内臓脂肪におけるMCP-1などの炎症性物質の発現が減少し、インスリン感受性に関与するアディポネクチンなどの発現が上昇することが分かった。実際に、TLR9欠損マウスは、同じ高脂肪食負荷を行っても、野生型マウスに比べてインスリン感受性が悪化しにくいことが分かった。インスリン抵抗性の発現には、脂肪組織におけるマクロファージを中心とした慢性炎症が重要な役割を果たしている。本研究は脂肪組織の炎症におけるToll-like receptor (TLR)9の役割を検討することである。昨年度までに高脂肪食負荷を行ったTLR9KOマウスにおいて、インスリン抵抗性の発現が抑制されるという結果を得ており、骨髄移植実験を行い、マクロファージTLR9の役割を検討した。TLR9KO骨髄を移植されたマウスは、高脂肪食負荷条件下でのインスリン抵抗性の発現が抑制されることが分かった。脂肪組織の炎症の惹起にはマクロファージの極性変化が関与しており、TLR9KOマクロファージは、抗炎症的なM2マクロファージが多いことが分かった。また、生体内でTLR9を活性化しうるリガンドの候補についての検討を行っている。Toll様受容体(TLR)は、主にマクロファージなどの免疫担当細胞に発現し、病原体センサーとして、生体防御に重要であるが、脂肪組織の炎症におけるTLR9の役割は明らかではない。TLR9は、主にマクロファージなどの免疫担当細胞が発現し、外来生物由来のDNAを認識することで生体防御に重要な役割を果たす一方、障害を受けた細胞から遊離する遊離核酸断片cell free DNA, cfDNA)をも認識し、自己免疫疾患に関わる慢性炎症を誘導することが報告されている。本研究では、「マクロファージにおけるcfDNA-TLR9シグナルが脂肪組織の慢性炎症を惹起し、インスリン抵抗性を誘導する」という仮説を立て、in vivoとin vitro実験で検証を行った。TLR9の活性化により、マクロファージから脂肪組織の炎症に重要な役割を果たすMCP-1やTNF-αなどの炎症性物質の発現が増強することが分かった。また、肥満マウスや肥満患者の血中のcfDNA濃度は、痩せた個体に比べて高いことや、脂肪細胞から遊離するcfDNAがTLR9を介してマクロファージの活性化することを見出した。これらの結果をin vivoで検証するため、TLR9欠損マウスに高脂肪食を与えて肥満を誘導したところ、野生型マウスに比べて脂肪組織の炎症やインスリン抵抗性の発症が軽度であった。また、TLR9の特異的阻害薬の投与により、肥満マウスにおけるインスリン抵抗性の発現は抑制されることが分かった。以上の結果から、肥満によって障害された脂肪細胞から遊離するcfDNAがTLR9を介してマクロファージを活性化することで、脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性の発症に関与することが分かった。

現在は骨髄移植実験が終了し、解析段階であり、リガンドの解析の結果を踏まえて論文投稿を行う予定としている。また、インスリン抵抗性発現にマクロファージが重要な役割を果たすのと同様に、動脈硬化病変の形成や、虚血後の血流回復にもマクロファージが重要な役割を果たしていることから、動脈硬化モデルや、下肢虚血モデルにおいてもマクロファージTLR9の役割の検討を開始し、様々な方向で研究が発展している。循環器・代謝性疾患生体内でTLR9を活性化しうるリガンドについての検討と、骨髄移植実験の解析を行い、最終的なデータを整理し、学会報告を行いながら、論文投稿に向けて準備する。今回の研究課題の仮説を誘導するにあたったマクロファージ活性化におけるTLR9の役割をin vitroで明らかにすることができた。さらにTLR9の作用を、TLR9欠損マウスを用いたin vivo実験で、ある程度明らかにすることができた。これまでの研究で、TLR9が脂肪組織のケル炎症反応の惹起に関与することが示されたので、今後は、以下の項目を中心に検討を進めたい。1.脂肪組織において、TLR9が活性化されるメカニズムを詳細に検討する。2.TLR9が脂肪組織の炎症に対する治療対象になる可能性。3.TLR9の内因性リガンドの検討
放射光X線の診断への利用-利用技術の開発と評価-

冠状動脈造影は虚血性心疾患の直接的診断法として現在最も信頼性が高いとされているが侵襲性が高いため靜注法による低侵襲性の、放射光を用いて、造影剤ヨウ素のK吸収端差分法によるエネルギー差分法が線源としては最もすぐれた方法と考えられる。このシステムの定用化には以下の問題点が存在する。すなわち1.高エネルギー研(KEK)放射光実験施設(PE)で得られる放射光は幅のせまいビームであるためヒト心臓をカバーする大きさ150mm×150mmが必要である。2.超高速(たとえば2ms)にK吸収端の上側下側の2つのエネルギーを切り換える必要がある。と同時に高速画像取り込み可能な撮像システムの開発が必要ある。今年度は1に対し、KEKのARリングを用いて検討を行った。ARリングはトリスタンMRリングへの入射リングであり、電子の加速エネルギーが大であるためより強いX線を得ることが出来る。現在までDFスタッフにより設計上水平方向10mradの拡がりの放射光ビームが得られるテスト実験用のビームラインが建設されつつあり、このビームラインを使って犬を用いた動物実験を行った。すなわち静脈系にカテーテルを挿入し右室からヨウ素造影剤をボーラス注入し、右心ならびに左心室の造影を行った。この時ビームサイズは発光点から15mの地点で縦5mm,横140mmであった。2に関しては撮像管を2本用いた高速画像取り込みに関し、2本の撮像間や、それぞれの光学シャッターに関する同期の問題、【II】-TV系のS/Nの評價、分解能の評價などを行った。1)エネルギー切り換え装置および拡大照射野K吸収端のすぐ上(Kabove)およびすぐ下(Kbelow)エネルギー切り換えを最終的には2msオーダーの前段階として、今回は125msで行った。Si(311)面の【O_B】6.5°、非対称反射のためのα5°結晶面はカーボランダムで研磨した。結晶の回転はAIDACS300/FDFS-30でコントロールした。E33.17KeV,ΔE130evであり、結晶被写体間隔1.8mであった。非対称反射で得られた拡大照射野は60mm×54mmでねこおよび犬の心臓をカバーしうる面積であり、かつ血管造剤の差分像を得ることができた。2)検出系7′′I.I.(東芝)、TV(浜松フオトニックス)C1800、ビデオレコーダ(ソニー)VO-5850を用いて2次元画像をリアルタイムで得ることができた。この2次元儉出系は米、独、ソ連が一次元儉出系で進んでいるのに対し本部独自の方法である。理論的及びフアントム実験で造影左室に重った冠状動脈を識別し得たので犬を用いた静注法を行った結果、冠状動脈を認めることができた。上記実儉は静注法で冠状動脈造影を行う可能性があることを示したが本研究をひとに応用するためには照射野が15×15【cm^2】源量が十分であること、画像とりこみ及び画像処理が超高速で可能であるなどの諸点が解決されなくてはならない。次年度はトリスタンARの光源で、行う予定である。
大学入試における実技・面接・小論文等の評価に関する研究

3年計画の最終年度として、新たに以下のような研究を行うとともに、それらの成果も含めて、最終報告書の作成を行った。(実技)(1)筑波大学では、美術系を対象として、留学生に対するインタビュ-及び文献等に基いた諸外国における実技試験の実体調査を行い、わが国との比較検討を行った。(2)東京芸術大学では、実技試験採点処理にともなう問題点、特に評価者間の評価のずれについて分析を行い、それを処理する方法について検討を加えた。(面接)(1)山梨医科大学では、さらに平成2年度のデ-タを加えて、面接結果と入学後の成績との関連を分析した。また、面接を実施している複数の医科大学と面接評価に関する研究会を実施し、面接評価にともなう問題点等について意見交換を行った。(2)千葉大学では、推薦入学者(面接・小論文のみを実施)と一般入学者との教養成績の比較を行い、面接・小論文による選抜の効果を間接的に評価した。(小論文)(1)名古屋大学では、平成元年度に引き続き、論述的学力検査の予測的妥当性について検討を加えた。また、平成元年度から論述的学力検査の評価法が修正されたので、その影響についても検討を加えた。(2)大学入試センタ-では、主として文献・資料に基づき、大学入試における小論文評価の意義についての考察、小論文の方法論的な問題に焦点を当てた内外の主要な研究のレビュ-、さらに各大学で実施された小論文の試験問題の整理・分類を行った。(実技)(1)公表されている入試要項等から、実技実施校を検出し、入学定員に対する実技試験入学者の比率、入試配点比率等をグラフ化した。(2)(1)に基づき、実技試験、科目、内容評価に関する調査票を作成した(平成元年度入試終了後に発送)。(面接)(1)山梨医科大学で行なわれた面接の評価についての追跡調査の結果、始めてから3年目に、1人の受験生に対する3人の教員による評価がよく一致するようになったこと、学力試験の成績とはあまり相関がないこと、しかし、あらかじめ共通1次の成績を知って面接に臨んだ場合には、それから大きな影響を受けること、入学後の成績の良くない者を面接の時点である程度予測できるのではないかということ、などが分かった。(2)兵庫教育大学で採用している入学者選抜方法を検討するため「入学形態別〈推薦(面接評価がかなりのウエイトを占める)合格、推薦不合格で2次試験合格、2次試験合格〉と入学後の学内成績との関連調査」を行った。結果として、推薦入学者の優位性が認められるが、その優位性が面接で適性をみたと解釈すべきか、推薦入学という存在感がそうしたのかなど細部ついては不明であり、今後の課題とされている。(小論文)(1)名古屋大学教育学部において、与えられた資料を読み解き表現することを狙った「論述的学力検査」の採点の信頼性と問題間の得点の相関を過去4年分の資料について検討した。また、教養部での成績との関連を2年分の資料について検討した。(2)学部へ進学後の学生の諸特徴を教官に評定してもらうために適切な方法を開発するために予備的データを収集・分析中である。(1)筑波大学では教育系の大学・学部に実技試験の実態に関する調査票を送付し72.8%の回収率を得た。入試の多様化により、実技入試の比率は増加するものと予測を得た。(2)山梨医科大学で5段階評価の面接が導入されてから5回の入試があり、入学後の成績との関連を調べてきた。60、62年度については面接の評価が入学後の成績の上位者及び下位者、特に留年者を有意に予測することが明らかになった。63年度入学者についても面接の評価の有効性が示された。(3)名古屋大学における教養部の成績と入試関連科目、調査書等との関連の分析により「論述的学力検査」は入学後の成績との関連が他の1次、2次のどの教科より高い傾向が認められた。同時に、教官による学生の評定に関するデ-タを、論述的学力検査実施以前の学生について収集し分析中である。(4)兵庫教育大学では、推薦入学者(面接を課している)の優位性が認められている。これに関連して、面接評点と調査書、推薦書の成績との影響度について、および面接評点と入学後の成績との関連について調査研究を行った。

(2)大学入試センタ-では、主として文献・資料に基づき、大学入試における小論文評価の意義についての考察、小論文の方法論的な問題に焦点を当てた内外の主要な研究のレビュ-、さらに各大学で実施された小論文の試験問題の整理・分類を行った。
胆汁酸修飾タンパク質を標的分子とする疾患プロテオミクスに関する基礎的研究

本研究では、初めに胆汁うっ滞や大腸癌と関連して重要視されるリトコール酸(LCA)修飾タンパク質の捕捉と構造解析を目的として、まず、LCAのステロイド核に相補的で高い特異性を有する抗体を創出し、これによるラット肝細胞内LCA修飾タンパク質の捕捉とMSによる構造解析を試みた。その結果、LCAとRab関連タンパク質との共有結合付加体が存在し,これが肝疾患と深く関わることを示した。引き続き、ヒト主要胆汁酸5種のグルタチオン(GSH)抱合体標品を化学合成するとともに、これらのLC/ESI-MSnによる高感度直接一斉分析法を構築し、本法によってラット肝における胆汁酸のin vitro並びにin vivo GSH抱合体への変換を実証し、胆汁酸のGSH抱合という新規代謝経路の存在を明らかにした。また、胆汁酸修飾タンパク質の生成とGSH抱合への変換を統合的に解析する上で、鍵を握る代謝活性中間体(アシルアデニレートやCoAチオエステル)の生成を触媒する胆汁酸のCoAリガーゼ(rBAL並びにhBAL)を発現する大腸菌並びにHEK293細胞株の樹立にも成功した。これらの実績と経験を基に肝毒性や大腸癌発症のプロモーターとして知られるLCAを不溶性担体に固定化して用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、LCAに親和性を持つラット肝細胞内の疾患関連タンパク質の捕捉と構造解析を試み、LCAに親和性を持つ各種酵素タンパク質の存在を明らかにし、LCAの肝毒性を考える上で極めて興味ある新たな知見を加えることができた。さらに、LCAをリガンドとするGタンパク質共役型受容体の発現亢進が、各種の癌と深く関わることが想定されることから、分子生物学的手法によって調製した組み換え型GPCRを免疫抗原としてモノクローナル抗体を作成し、これを用いるウエスタンブロットによって大腸菌細胞由来WiDrのみならず食道癌細胞にも発現していることを明らかにした。近年、最も脂溶性の高い胆汁酸であるリトコール酸(LCA)が肝臓内のタンパク質や大腸細胞内核ヒストンと付加体を形成することが指摘され、前者では胆汁うっ滞、後者では癌を誘発することが推測されている。このため、肝障害をはじめとする各種疾患と関連して組織、細胞内における胆汁酸とタンパク質との共有結合付加体の生成機構と毒性発現との関連を明らかにすることが強く求められている。そこで、胆汁酸のアミノ酸抱合におけるアシルアデニレートやアシルCoAが反応性に富む活性代謝物であるというこれまでの知見を基に、今年度は以下の研究を行った。まず、LCA結合タンパク質(LBA)が分子表面にLCAのステロイド核を露出しているものと推測されることから、本ステロイド核に相補的で高い特異性を持つ抗LCA抗体を調製した。引き続き、これを分子標的機能性機材として用い、胆管結窄ラット肝細胞内のLBAを抗LCA抗体を用いる免疫沈降法によって捕捉後、二次元電気泳動によって展開・分離し、differential displayによって目的とするLBAを特定した。さらに、還元アルキル化とトリプシン消化後のペプチド混合物をMALDI-TOFMS分析に付し、ペプチドマスフィンガープリント法によって解析した。その結果、特定したタンパク質がRab関連タンパク質であり、これらのリシン残基にLCAが結合している可能性があることを明らかにした。そこで、これらの研究成果を基にLBAの血中への漏出の可能性を追求した。

すなわち、ヒト血清中に大量に存在することが知られるヒト血清アルブミンとIgGを、ヒト血清前処理用キットを用いるイムノアフィニティー抽出によって除去した後、固定化抗LCA抗体を加え、捕捉されたタンパク質を脱着後、SDS-PAGEと抗LCA抗体を用いるイムノブロットによってLBAを追跡した。その結果、正常ヒト血清中にはLBAは漏出されないことが窺われた。また、胆汁酸アシルアデニレートやアシルCoAの生成を触媒する酵素の発現変動とLBAとの関連を細胞レベルで追及すべく、ヒト胆汁酸CoAリガーゼ(hBAL)の遺伝子をクローニングするとともに、本遺伝子をHEK293細胞に導入し、発現した酵素の活性をCoAチオエステルの生成を指標としてLC-ESI-MS^2によって解析した。その結果、期待通りhBAL強制発現細胞が酵素の活性を保持していることが判明した。胆汁うっ滞や大腸癌はじめとする各種疾患の病因・病態を解明する上で、胆汁酸の活性代謝物による異常タンパク質の生成と毒性発現との関連のみならず、グルタチオン(GSH)抱合による解毒排泄機構を明らかにすることが強く求められている。そこで、前年度の研究成果を基に、以下の検討を行った。まず、ESI-MSによるGSH抱合型胆汁酸の高感度測定法の開発を目指し、ヒト主要胆汁酸5種のGSH抱合体標品を合成するとともに、これらの正及び負イオン検出CIDスペクトルにおける特徴的イオンの生成に吟味を加えた。その結果、いずれの抱合体もグリシンやグルタミン酸部が脱離したイオンとともに、これらより水14分子が脱離した数多くの構造上の特徴をよく反映するイオンを生成し、本法がGSH抱合型胆汁酸の高感度分析に有用なことが判った。そこで、コール酸(CA)のCoAチオエステル(CA-CoA)とアシルアデニレート(CA-AMP)をGSHとリン酸緩衝液中37°Cで1時間インキュベートし生成物をLC/ESI-MS^2分析に付し、いずれの基質からもグルタチオン抱合体に変換されるばかりか、本反応がグルタチオン-S-トランスフェラーゼによって触媒されることを明らかにした。一方、GSH抱合型胆汁酸を解析する上に、本抱合体のin vivo生成を明らかにすることが重要となる。そこで、肝機能改善薬として賞用されるウルソデオキシコール酸をラットに投与し、LC/ESI-MS^2を用いて胆汁中GSH抱合体の存在を実証し、胆汁酸代謝に新たな知見を加えることができた。また、これらの実績と経験を基に肝毒性や大腸癌発症のプロモーターとして知られるLCAを不溶性担体に固定化して用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、LCAに親和性を持つラット肝細胞内の疾患関連タンパク質の捕捉と構造解析を試み、LCAに親和性を持つ各種酵素タンパク質の存在を明らかにし、LCAの肝毒性を考える上で極めて興味ある新たな知見を得た。現在、GSH抱合体のメルカプツール酸への新たな代謝経路の存在に検討を加えており、これらの研究成果は、各種疾患の病因・病態を解明する上で大きく役立つものと期待される。
ヒトパピローマウイルスによる発がんの解析

子宮頚癌やEV患者の皮膚癌とヒトパピローマウイルス(HPV)との関係を明らかにすべく、本年度は、主としてHPVのtransforming遺伝子の機能解析と子宮頚癌組織中での活性化がん遺伝子の検索を行い、以下の結果を得た。I.HPVの遺伝子機能:レトロウイルスベクター(pZipneoSV(X)1)に各種HPV typeのDNAを挿入し、HPVの持つ遺伝子機能の解析を行った。その結果、i)HPV16のE6E7ORF(open reading frame)は株化細胞のtransformationに関与しており、E6ORFがヌードマウスでの造腫瘍性を決定していること、ii)初代培養細胞(ラット胎児)はF7ORFによって不死化(immortalize)するが、同細胞は株化細胞と異なり、E6E7ORFで直ちに完全なtransformationが起こらないこと、iii)E6E7ORFによりimmortalizeした細胞は長期間、継代培養を繰り返すことによって完全なtransformed細胞にprogressし、同細胞中でc-Ki-ras遺伝子のmRNAが有意に増加していること、をそれぞれ明らかにした。また、HPV16以外にla、6、17、52a型を用いて、これらtype間のtransforming遺伝子の機能を比較検討し、用いたすべてのHPVに不死化能を決定する遺伝子が存在するが、株化細胞のtransform能に関しては各type間で差異が認められ、HPV16が最も強いtransform能を持つことを明らかにした。II.子宮頚癌組織中のtransforming遺伝子の検索:子宮頚癌組織中で活性化されているがん遺伝子を明らかにすべく、52側の子宮頚癌組織を用いて、同組織由来DNA中、NIH3TS細胞に対し、transform能を示すDNAの検索を行った。その結果、子宮頚癌由来のHPV16/18DNAとc-ras特にc-Ki-rasDNAがtransformしたNIH3T3細胞中に、同時にまた高率に存在していることを明らかにした。以上の結果は、子宮頚癌の発生にHPVと共に他の要因(ras遺伝子など)の関与が必要なことを示唆している。
TNF-αのリプログラミング効果を応用した新規覆髄剤の開発

申請者が発見した歯髄細胞に対するTNF-αのリプログラミング効果(幹細胞化)のメカニズム解明と、これに関与している因子を同定することを目的に実験を行った。実験に同意の得られた患者から提供を受けた抜去歯牙の歯髄から、Gronthosらの方法に準じて歯髄細胞の分離・培養を行い、これまでと同様に培養できること、TNF-α(10ng/ml)による刺激を加えても培養などに問題がないことを確認した。その後TNF-αにより刺激した歯髄細胞と、無処理の歯髄細胞からタンパクを回収し抗体アレイを用いて、解析を行ったところ、TNF-α刺激により、p38MAPK、TRAF1などの発現が亢進していた。申請者が発見した歯髄細胞に対するTNF-αのリプログラミング効果(幹細胞化)の作用メカニズムを解明し、歯髄細胞のリプログラミングに関与している因子を同定することを目的に実験を行った。まず、徳島大学にて実験を開始するために、研究環境の整備を中心に行った。研究に関しては徳島大学病院臨床研究倫理審査委員会の承認を得た。実験に同意の得られた患者から提供を受けた抜去歯牙の歯髄から、Gronthosらの方法に準じて歯髄細胞の分離・培養を行った。得られた歯髄細胞がこれまでと同様に培養できること、TNF-α(10ng/ml)による刺激を加えても培養などに問題がないことを確認した。歯髄細胞を培養して、TNF-αで刺激した細胞と無処理の細胞からそれぞれ蛋白質を回収し、抗体アレイ実験を行った。抗体アレイには、TNF-αのシグナル経路に関与する因子を45種類選択し、メンブレン上に配置したAntibodyArrayを使用した。メンブレンに配置された各抗体に対する蛋白質が捕捉され、目的蛋白質と複合体を形成している蛋白質に対する標識抗体を用いることにより検出を行った。TNF-α刺激により、p38MAPKやTRAF1などの発現が亢進していた。リプログラミング効果を持たないIL-1βでの抗体アレイとの比較については現在検討中である。なお、これまでの研究結果に関して、Journal of Oral Health and Biosciencesにて総説を発表した。今年度は研究環境の整備や、実験に使用する歯髄細胞の採取・培養・保存に時間を費やした。1)細胞の分離・培養:研究に関して徳島大学病院臨床研究倫理審査委員会の承認を得た。実験に同意の得られた患者から提供を受けた抜去歯牙の歯髄から、Gronthosらの方法に準じて歯髄細胞の分離・培養を行い、これまでと同様の条件で実験を行えることを確認した。2)プロテインアレイ法を用いたシグナル経路の網羅的検討:TNF-αおよびIL-1βにてそれぞれ刺激した歯髄細胞よりタンパク質を採取し、プロテインアレイ法を用いて、どのシグナル経路がTNF-α刺激により特異的に活性されているかを網羅的に検討するため、現在準備を進めている。2014年8月26日に日本再生歯科医学会学術大会にて発表を行った。歯科補綴学歯髄細胞において,TNF-α刺激により誘導されるシグナル経路をプロテインアレイ法を用TNF-α刺激により誘導されるシグナル経路を抽出する為に、TNF-α、IL-1βで処理した歯髄細胞と無処理の歯髄細胞から蛋白質を回収し、プロテインアレイを用いて網羅的に解析、検討する予定である。細胞のリプログラミングの関与が予測されるシグナル経路に関して、そのシグナル経路促進剤または阻害剤を細胞に作用させ、シグナル経路の制御がうまくいっているかを,Western blotting法にて確認する。加えて、マウス露髄モデルを用い同定したシグナル経路の阻害剤もしくは活性剤が修復象牙質形成能を有しているか形態学的、組織学的に検討したいと考えている。今年度は研究環境の整備や、実験に使用する歯髄細胞の採取・培養・保存に時間を費やしたため、今年度内に購入・使用予定であった試薬などが購入できていないことが理由である。引き続き培養細胞を用いた分子生物学実験の為に培養関連の試薬、消耗品およびリコンビナントタンパクを購入する。また、同定された因子の動物への効果を検討するため免疫不全マウスの購入も予定している。加えて国内の学会に参加し最新の知見を得るとともに積極的な成果発表を行う為の旅費としても使用する。
mdxマウスの筋細胞膜異常に関する研究

DMDのモデル動物であるmdxマウスと、コントロールマウスであるB10マウスの骨間筋細胞の電気生理学的性質の差異を明らかにする事を目的として実験を行った。方法は、組織学的に、筋細胞が再生筋で置き換わっていると思われる4週齢のX-linked muscular dystrophy (mdx) miceと、同週齢のC_<57>BL10/Sc(B10) miceを対象とした。各対象の下肢骨間筋を取り出し、collagenaseを用いて1時間インキュベートし、単一筋細胞を単離した。倒立顕微鏡下で単離した細胞に対しガラス管微小電極を密着させて、パッチクランプ法による測定を試みている。しかし、細胞電極間のシールが不完全な為、未だ正確な電極測定は出来ていない。しかし、B10マウスに比べ、mdxマウスでは、機械的刺激(主に吸引)に伴う異常なチャンネル電流が多く観察されるように思われた。これは、以前より報告されているmechano-sensitive channelの増加によるものなのか、単にdystrophin欠損に伴う、筋細胞膜の細胞骨格の脆弱性による二次的な減少なのかは鑑別不可能であった。今後は、手技的問題を解決し、安定したチャンネル電流の測定が可能となるようにした上で、各種チャンネル阻害剤下での、機械的刺激に伴う異常なチャンネル電流を測定し、イオンチャンネルの同定を行う。さらに、刺激を加えない状態での自発チャンネル電流も測定し、mdxマウスにおける各種チャンネルの異常の有無を検討し、筋細胞膜骨格であるdystrophin欠損により特定のイオンチャンネルの異常が生じるのか否かを検討してゆく予定である。
SWAP-200の日本語版作成と日本における有用性の検証研究

本研究は、米国で開発された臨床家の専門的観察を基に患者のパーソナリティ障害を査定できるShedler-Westen Personality Assessment-200(通称SWAP-200)の日本語版作成を目的としたものである。SWAP-200の原著者であるShedlerの承諾及び協力を得て日本語訳を作成した。その後、時間的安定性及び評定者間での一致度を確認することで、その信頼性の確認を行った。また研究活動を通して、日本犯罪心理学会シンポジウムや学会誌(精神分析学研究)などにおいて、本査定ツールの特徴や有用性を発信してきた。本研究は、米国で開発されたThe Shedler-Westen Assessment Procedure-200 (以下、SWAP-200)の日本語版を作成し、日本の精神保健領域における有用性の一部検証を行うことを目的としている。近年、日本では(広くは世界の動向として)統計的手段を用いた実証的研究とナラティブ・アプローチのような「主観」を対象とした研究とをバランスよく実践に取り入れていこうとする動きがある。SWAP-200は臨床家の観察を統計的に分析することによってシステマティックに臨床で利用するためのツールであり、諸外国では上記のような社会的ニーズへの応え方の一つとなってきている。本研究では、日本語版を作成した後、既存の類似したパーソナリティ検査との相関の確認や描き出される臨床像の収束性や弁別性の確認を行い、日本語版の信頼性・妥当性の検証を行うことを計画している。本年度はその最初の段階である、日本語版の作成に着手した。その手順は、1.研究者が原版SWAP-200の日本語訳を作成し、2.それを日本人翻訳家が再度英訳し、back-translationを作成。3.SWAP-200の作成者の一人であるDr. Jonathan Shedlerと彼の研究チームが原版と日本語版のback-translationの比較検討を行い、4.指摘を受けた両者の相違点を基に、さらに日本語版を修正していくというものである。現在、上記プロセスが二往復している段階であり、言葉の一致度はもとより、表現に多義語や偏りが含まれていないかなどを確認しながら、どのようなバックグラウンドをもつ臨床家でも利用できるような、非常に細かな訳出を行っている最中である。本研究は、ShedlerとWesten(1999)が米国にて開発し、現在欧米を中心に翻訳され使用されているパーソナリティ障碍のアセスメントツールSWAP-200の日本語版の作成を目的としている。平成26年度は、前年度に引き続き、研究者が原版SWAP-200の200項目の英訳を行い、それを第三者(米国で生活をしていた翻訳家と米国で修士までの学位を取得し、米国と日本の両国のカウンセラーの資格を有する臨床心理士)に逆翻訳を行ってもらい、英訳が適切に原版を反映しているかを作成者であるShedlerに検討してもらった。この過程はすべての項目が承認されるまで繰り返された。いくつかの点にて、英語と日本語の言葉の構造の違いや米国と日本の文化の違いが日本語訳作成の過程で浮き彫りになっており、今後パーソナリティと文化の関連性を検討する際の起点となりうることが示唆された。また、本アセスメントは日本ではあまり知られていなかったため、同じくパーソナリティ障碍のアセスメントで使用されるDSM-IV II軸との違いや臨床でどのように活用可能かを論文や学会発表を通して紹介した。完成した日本語版は、Shedlerの研究チームによりsoftware programに組み込まれ、今後の調査におけるデータ収集に使用できるようになっている。SWAP-200の公式サイトでも日本語版が翻訳されている旨の情報が掲載されている。本年度は、第一に原版SWAP-200の日本語訳を、作成者であるDr. Jonathan Shedlerの確認を得ながら完成させた。SWAP-200の項目はその作成過程で、さまざまな学派・領域にまたがって臨床家に活用してもらえるよう、その表現の機微を大切にしている。そのため、研究者が翻訳したものは第三者によって逆翻訳され、それをDr. Shedlerが確認することによって、項目内容の正確さや細かなニュアンスを担保するという手続きを取った。次に、原版作成過程と同じように収束的妥当性と弁別的妥当性を確かめるべく、完成した日本語訳のパーソナリティ項目を用いて、臨床経験3年以上を有する専門家(精神科医や臨床心理士)を対象に、パーソナリティ障碍を有する、よく知った患者ないしクライエントをアセスメントしてもらった。対象者が専門家であるのは、SWAP-200が、パーソナリティ障碍の診断において、DSM-IV II軸で見られるようなカテゴリカル方式ではなく、ディメンショナル方式を採用しており、その中でも臨床家が「患者」と「特定の原型」との相似性や類似性を全体的に評価するプロトタイプ・マッチングアプローチがとられているためである。今年度は、学会でワークショップを行ったり、心理臨床の専門家で構成される研究会や県臨床心理士会をはじめとした専門家のメーリングリストで協力依頼を行うなど、80名の心理臨床の専門家にご協力いただいた。次年度も引き続きデータの収集を行う予定である。また、本年度は信頼性の検証研究として、評定者間のアセスメントがどれだけ一致するかを確認するため、モデルケースを用意し、複数の臨床家に日本語版SWAP-200の項目を用いて評価をお願いしている。こちらも現在データ収集の最中であり、次年度も引き続き行われる予定である。

本研究は、臨床家の専門的観察を対象としているが、その専門家が3年以上の臨床経験を有していること、パーソナリティ障碍の治療経験やアセスメント面接を有していること、回答方法がQソート法という協力者にあまり馴染みのない手法を採用していること、そして何より、回答そのものにも12時間程度の時間を要してしまうことが、予想以上に協力者の制限や負担になっており、データが集めにくくなっている。米国で、DSM-IVII軸の代替アセスメントとして開発されたShedler-Westen Personality Procedures(通称SWAP-200)の日本語版作成を目的としている。SWAPは欧米を中心に12か国語で翻訳されており、近年本ツールでの数値を基にパーソナリティ障害について論じることが増えてきている。そうした背景からも本ツールの日本語版があることは、グローバル水準でパーソナリティ障害を論じるにあたり有用な手段となりえ、この種の研究領域にとっては有益なことだと思われる。SWAPとDSM-IVII軸の診断プロセスにおける大きな違いは以下のような点が挙げられる。1)DSMが患者の自己申告を診断材料にするのに対し、SWAPは診断者/臨床家の専門的観察を基盤にしている。2)障害の特徴を診断する項目もDSMが各障害につき10項目前後であるのに対して、SWAPでは200項目を要する。3)DSMと異なりSWAPの項目はすべて日常語(非専門用語)で表現されている。4)特性の有無を尋ねるDSMと異なり、SWAPはパーソナリティの傾向を測定している。5)症状や行動に焦点を当てているDSMと異なり、SWAPは行動や症状の背後にある動機や理由についても焦点を当てている、など。こうした特徴から、診断者には広く深い専門的観察が求められており、本研究ではオリジナルの研究に沿って臨床経験3年以上を要件としている。本年度は、臨床経験3年以上の臨床家(臨床心理士および精神科医)に、日本語版SWAPを用いて実際の担当患者を表現してもらうという調査を昨年度に引き続き行った。具体的には調査対象者が多く登録する複数の研究会のメーリングリストへ調査を呼び掛けたり、海外でSWAPが活用されている司法領域(研究会および矯正管区)への調査依頼や研究内容の説明を行った。本調査は、高度な専門知識を提供してもらう必要があるため、調査対象者を精神科医、臨床心理士など精神的健康に携わる専門職に限定している。また、施行には200項目をQソートで振り分けるという作業が必要であるため、通常12時間を割いてもらう必要がある。こうした調査対象の限定と協力負担の多さから、調査協力者を得ることそのものに時間がかかり、年々時間がおしている状況である。本研究は米国で開発されたDSM-IV II軸の代替アセスメントツールShedler-Westen Assessment Procedure-200(通称SWAP-200)の日本語版作成とその有用性についての調査を行うことを目的としたものである。本年度は、日本語訳されたSWAP-200の活用可能性について、日本犯罪心理学会のシンポジウム及び、日本精神分析学会の学会誌にて発表を行った。
数学科と理科を総合したデジタルコンテンツの開発とその利用に関する実証的研究

数学科と理科を総合した教材としてデジタルコンテンツを作成し,これを用いた実践授業を実施した。扱った学習単元は力の合成・分解である。実践授業は小,中,高等学校で実施した。実践授業のための学習指導案は授業実施校の先生方と検討した。小学校や中学校では導入で綱引きの実演を見せ,その上でばねばかりを用いた力のつり合いの実験を実施した。その結果,小学校でも力の合成・分解の学習が可能であることが明らかになった。高等学校では実験のプロセスをデジタルコンテンツで理解させた上で三角比やベクトルの学習とも関連させた学習を実施した。教科を横断した学習指導は,高等学校の学習においても有効に機能することが明らかになった。本研究では,数学科と理科を総合した教材としてデジタルコンテンツを作成し,これを用いた実践授業を行い,デジタルコンテンツを用いた実践授業の意義を実証的に明らかにする。平成25年度は力の合成・分解に関する学習指導案を作成し,小学校と中学校で実践授業を実施した。実践授業に当たっては学習指導案の検討を各学校で行い,修正学習指導案に沿った授業を行った。その結果,力の合成・分解の実験シートに改良すべき点があることが明らかになり,さらに修正した学習指導案を作成した。小学校と中学校の授業導入では2人綱引きと3人綱引きを実際に見せて綱引きが釣り合う様子について考察することを伝えた。さらに,デジタルコンテンツの1つである実験VTRを視聴させて実験に取り組ませた。実践授業における児童・生徒の活動は活発で,彼らが持つ既有知識・技能等を横断的,総合的に活用して力が釣り合うことの理解を深めていたことが明らかにできた。このことから,力の合成・分解に関する授業が小学校から中学校にかけて実施できることが確信できた。力の合成と分解の教具については,事前の計画通りにばねばかりを利用することで対応できることが判明した。ただし当初のワークシートではなかなか実験データが正確に取り出せなかったことからこれを改善し,より正確に実験データが取り出せるように改善した。またデジタルコンテンツの開発にあたっては,力の合成と分解に関する中学校3年の学習内容や高等学校物理基礎における力のつり合い,数学Bにおけるベクトルに関する学習内容をできる限り平易に記載する工夫をした。本研究の目的は,数学科と理科を総合した教材としてデジタルコンテンツを作成し,これを用いた実践授業を行い,デジタルコンテンツを用いた実践授業の有用性を実証的に明らかにすることである。扱った学習単元は,力の合成・分解である。平成25年度は小学校と中学校で実践授業を実施し,平成26年度は高等学校で実践授業を実施した。実践授業に当たっては,小学校,中学校,高等学校の先生方と,各学校段階に応じた学習指導案を検討し,修正指導案を作成するとともに,修正指導案に沿った授業を実施した。小・中学校では2人綱引きと3人綱引きを授業で演示し,綱引きでつり合う様子を教室で共有してから,デジタルコンテンツを用いて,ばねばかりを用いた3力がつり合う実験データの収集作業を行った。また高等学校では,つり合う様子や実験の具体的作業など,小・中学校よりもデジタルコンテンツを多く利用して実験に取り組むようにした。実践授業を通して,力の合成;分解に関する授業が小学校段階でも十分可能であることが判明した。また高等学校では,数学で学習する三角比やベクトルの具体的な利用場面として有用な教材が提供できることが判明した。そして,デジタルコンテンツを用いることによって,学習者が学習内容を的確にとらえ,正確な実験データを収集しようとすることも明確になった。授業の展開の流れやワークシート,デジタルコンテンツなどは,児童生徒の発達段階や既有知識を十分に考慮するべきであるが,児童生徒の日常的な経験を利用して,力の合成・分解の指導が,それぞれの学校段階に応じて実施できることが明確になった。実施した学年は小学校6年,中学校2年,高等学校1,2年であったが,実践授業を通して,力の合成・分解の学習単元が学習指導要領で提示されている学年以外でも,数学と理科を総合することで,児童生徒心を十分にひきつける授業にすることができることがわかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。科学教育,教科教育学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は当初の研究目的に沿って実践授業を実施し,教材・教具の改善を図ることができた。力の合成・分解に関する数学科と理科の学習内容についても精査し,小学校から高等学校の児童・生徒にとってわかりやすい内容になるよう工夫することもできた。小学校・中学校での実践授業によって改善された教材・教具を用いて力の合成・分解に関する実践授業を高等学校で実施する。また高等学校での実践授業を受けてさらに教材・教具の改善点を明らかにするとともに,デジタルコンテンツ(完成版)を作成し,これを用いた実践授業も実践する。
チョウ目昆虫におけるゲノム対立と繁殖戦略の進化

日本各地から収集した6集団、および諸外国から収集した3系統のスジコナマダラメイガのうち、これまでに4集団について、ボルバキアの感染率と集団内のメスの交尾頻度の関係を調べた。その結果、スジコナマダラメイガの集団によってボルバキアの感染率には有意な違いが見られることがわかった。またメスの交尾頻度についても有意な集団間での差が見られた。今年度は、4集団のみの解析であるため、集団レベルでのボルバキアの感染率とメスの交尾頻度との関係については、有意性があるのか否か識別するまでにはいたっていない。そこで、これまでにすでに収集したほかの5系統の集団について、今後、ボルバキアの感染率とメスの交尾頻度についてさらに調査を行い、両者の関係性について明らかにする。スジコナマダラメイガにおいては、ボルバキアの感染がオスの精子数を減少させることがわかっているので、ボルバキア感染集団では、メスは不妊を避けるために、より多くのオスと交尾する性質が進化するはずである。つまりボルバキアによるが雌雄の利害の対立を強化させる系として注目されると考られる。今後、集団サンプル数を増やすことで、両者の関係が明らかになれば、ボルバキアの感染がメスの乱婚性に及ぼすメカニズムについて特定できると考えられる。本研究では、このほかにノシメマダラメイガを用いて、発育期間に対する人為選抜をかけて、その相関反応としての交尾率や繁殖形質を調査する予定である。すでには発育期間に対する人為選抜は、8世代を経過しており、今後、相関反応の調査に入る予定である。このほかに、ノシメマダラメイガのミュータント系統を用いて、栄養条件が本種の精子間競争に及ぼす影響についても実験を行い、栄養条件がP1値およびP2値に影響を及ぼすというデータも得られている。
ヘリコバクター・ピロリの慢性感染に与る宿主・病原体関係の解析

ヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)はヒトの胃に慢性感染して、慢性胃炎、胃がん、あるいはMALTリンパ腫を引き起こす。病原体の病原因子については、詳細に解明されてきたが、宿主要因がどのように病害形成に関与するのかは不明であった。当該研究課題では、慢性胃炎の主要な浸潤細胞である好酸球に照準を川わせ、どのようなメカニズムで炎症が惹起され、その炎症が病原体排除に寄与するかを検討した。その結果、胃粘膜上皮細胞が恒常的に産生するタンパク質であるIL-33が好酸球性炎症に深く関わり、且つ、ピロリ菌の排除そのものにも関与することが判明した。ピロリ菌感染に対しては、抗菌剤やプロトンポンプ阻害剤を用いた除菌が標準治療として浸透している。しかし、薬剤耐性菌や再感染が臨床上大きな問題となっている。これらの問題を克服するために、IL-33を標的とした治療が有望かもしれない。ヘリコバクター・ピロリ菌はヒトや実験動物の胃に慢性感染して、胃潰瘍・慢性萎縮性胃炎を誘起するだけではなく、胃ガンの原因細菌と考えてられます。これまで、ヘリコバクター・ピロリ菌の病原因子、特に上記疾患の関連因子については、集中的に解析され、多様な因子の役割が明らかにされてきました。しかし、同菌の排除に関わる宿主側の因子については解明が未だに進んでおりません。当該研究の目的は、慢性感染のメカニズムを宿主応答から解明するものです。今年度は、宿主のヘリコバクター・ピロリ菌に対する初期生体防御応答メカニズムについて解析致しました。特に、宿主の重要な生体防御因子の一つであるInterleukin(IL)-18やIL-1βの分泌メカニズムについてマウス感染モデルを用いて検討致しました。その結果、IL-18やIL-1βの分泌には、カスパーゼ1酵素の活性化と、それに必要なNalp3インフラマゾームを構成するASCタンパクが重要であることが明らかになりました。事実、ASCを欠損したマウスにヘリコバクター・ピロリ菌を経口接種すると、野生型マウスに比べて、感染4ヶ月後の胃における細菌数は有意に高値でした。更に、胃の多核白血球やリンパ球などの浸潤度は、逆に、軽減していました。一般に、IL-18は細菌の排除に必須のインターフェロンγ(IFN-γ)の産生を誘導し、IL-1βは好中球の遊走や活性化を促進します。ASC欠損マウスでは、血清中あるいは胃局所におけるこれらのサイトカインの発現・分泌が低下していました。そればかりでなく、感染胃局所におけるIFN-γの発現も低下していました。以上の結果から、ヘリコバクター・ピロリ菌に感染すると、宿主はASCを用いてカスパーゼ1を活性化して、同菌の排除に必要なIL-18やIL-1βを分泌し、局所に多様な白血球の遊走とこれらの細胞の活性化を誘導し、その結果殺菌に至る可能性が示唆されました。Helicobactor pyloriはヒトの胃の粘膜に感染し、慢性萎縮性胃炎や胃潰瘍、ひいては胃ガンを引き起こす癌原性細菌である。H.pyloriは、その感染初期には胃組織内には浸潤しない。このことから、胃粘膜上皮細胞が、H.pyloriの慢性感染に重要な役割を果たすと予想される。この慢性感染に関わる宿主因子を解明する目的で、マウスの感染モデルを用いて検討してきた。特に、胃上皮細胞が発現するサイトカインの役割に照準を合わせた。Interleukin-33はアレルギー応答に関わる可能性が高いサイトカインで、腸管寄生性蠕虫の感染時に、腸管上皮内で発現上昇することが知られている。しかし、IL-33の胃における発現あるいは、その細胞内局在は不明である。既に、I133をHEK293細胞に強制発現すると、IL-33タンパクは細胞質ではなく核内に局在することを明らかにした。そこで、マウスの胃における、IL-33発現細胞の同定と、IL-33の細胞内局在を明らかにする目的で、胃凍結切片を用いて共焦点レーザー顕微鏡で、またIL-33mRNAをリアルタイムRT-PCRを用いて検討した。その結果、野生型マウスの胃は恒常的にIL-33mRNAを発現し、特に、胃粘膜上皮細胞核における恒常的なIL-33タンパク発現が明らかとなった。さらに、胃から分離した初代胃上皮細胞はIL-33mRNAを恒常的に発現することも明らかにした。