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生物トキシンの基礎的研究とその医学生物学への応用

本特定研究は第3年次の研究計画を達成するために総括班と課題研究班5班をおいた。総括班は、この課題研究の総括をはかり、研究全体を掌握指揮して有機的かつ強力な研究を推進させることを目的としている。この総括班のなかに研究成果の評価と研究計画実施の大網に対する助言を求めるため、関連分野の学識経験者13名による評価班も設けた。昭和60年度の本特定研究実施運営方針を決めるため、総括班・評価班会議を昭和60年6月7日竹橋会館(東京)で開き、主に合同班会議、各班会議及び公開シンポジウムの内容について審議し、有益な助言を得た。また、総括班研究費の使用方針についても討議した。その企画通りに、合同班会議を昭和60年10月4日から6日までの2泊3日間、富士教育研修所(静岡県裾野市)で開き、班員相互の知識情報交換と研究成果の一層の充実と発展をはかった。公開シンポジウム『生物トキシンと生体機能-医学生物学への応用』は昭和61年1月23日、野口記念会館講堂(東京)で、飯田広夫、小谷尚三が司会者となってシンポジウム抄録をもとに参加者、約150名が活発な討論をして盛会であった。総括班は生物トキシンのうち、蛋白質性トキシン(溶血毒素,ロイコシジン,エンテロトキシン,ボツリヌストキシン,ジフテリアトキシン,破傷風トキシン)および化学合成エンドトキシンやコードファクターの量産を班員に依頼し、それに消耗品費をあてた。作製された生物トキシン試料を班員に分譲して課題研究の集中的な発展をはかった。とくに、ロイコシジン、エンテロトキシン及びジフテリアトキシンは、その分子構造と標的細胞受容体の結合、活性情報の伝達機構を明らかにしたことや世界ではじめて化学合成に成功した(芝ら)エンドトキシン・リピドAの生物活性を多くの班員によって明らかにしたことは国際的にも高く評価されている。
制度変革下における新たな大豆ビジネスモデルの成立条件に関する研究

日本の大豆生産流通に関わる諸問題を消費者行動、加工企業の戦略、品質評価、技術、経営の観点から解析し、品種や栽培条件など多数の要因が影響して収量水準の低位不安定がもたらされている、大豆生産者と加工業者には原料大豆の品質評価に不整合がある、助成金への依存度が高く、面積拡大や収量向上へのインセンティブが機能しない等の問題点を指摘し、大豆の安定供給に向けてはフードシステム全体を通した再編が求められることを明らかにした。大豆の高位安定生産に寄与すると期待される地下水位制御システム(FOEAS)の効果を農家圃場において検証した。また、水田経営所得安定対策の下での大豆作経営の収益性を分析し、経営全体の収入に占める各種の政策的支援の割合は、大規模水田作2事例について見ると、3744%に達し、その金額は農業所得をも上回るものとなっていることを明らかにした。さらに、大手納豆メーカーと納豆小粒大豆に関する直接取引を行っているJAの担当者に聞き取り調査を実施し、相対的に高価格な国産大豆使用商品への消費が低迷する中で、原料大豆の供給と調達に関わる直接取引のみでは、当該商品販売実績が伴わず原料購入それ自体も抑制されることを指摘した。加えて、大豆生産者と加工メーカーの連携による地産地商の事例として三重県松阪市にある豆腐メーカーと、そこに原料大豆を供給している営農組合への聞き取り調査を実施した。その結果、国産大豆の生産拡大においては、地域ブランドの確立を図ることを通して、地域で生産された大豆を使用しているという付加価値を付けた地域固有の商品(豆腐)としての消費拡大を図っていくことが重要となることを明らかにした。そして、これらの結果を踏まえ、大豆産地と実需者の連携によるビジネスモデルは、(1)取引の目的、(2)事業規模、(3)形態、および、(4)連携の密度の相違を視点として、製品差別化型、生産者・実需者連携型、地域ブランド確立型の3つのタイプに類型化が可能であることを指摘した。海外の大豆生産状況を把握するために、米国イリノイ州の大豆生産者、大豆協会、大豆研究者等に対する聞き取り調査を2回実施し、中国の家畜飼料用大豆需要の増加から国際的な大豆需給の逼迫が予想されることや、日本向けのN-GMO大豆のプレミアムの水準が15%程度であることとその形成要因、イリノイ州やミネソタ州で大豆高単収の要因としての品種更新や有機物施用の効果、米国での大豆品質評価、さらに、N-GMO大豆の生産費水準等について明らかにした。日本における大豆低収の要因として、多収品種の育成と実需者が求める加工適性確保の両立の困難さや、茎疫病等の病害に対する抵抗性品種育成や適用薬剤登録の遅れ、有機物施用の少なさ、さらに、増収に対する農業者のインセンティブが弱いといった技術的、制度的問題点を明らかにするとともに、それへの対策としての品種育成戦略や、土壌水分制御を核とした根粒活用技術の開発等の必要性を指摘した。政権交代に伴う農業者戸別所得補償制度の導入効果を試算し、畑作物の所得補償による数量払の実施は、農業者に対して増収による収益増大の効果をより高めること、また、2万円/10aの面積払が早い時期に行われることは、大豆作経営の資金繰りにとって有効に機能することを明らかにした。さらに、大豆作を行う集落営農組織と豆腐店が直接取引を実施しつつ、地域のブランド化を図り、商品よりも、消費者や雰囲気を楽しめる場所を提供し、そこで一種の物語を付けながら大豆関連商品を販売するというビジネスモデルの構築に向けた取り組みの特徴や有効性を提示した。大豆に関するフードシステムを対象に,大豆加工品の消費動向,大豆加工企業の製品戦略,流通構造,大豆生産技術,大豆作経営の経営対応等の観点から検討を行った.まず,消費及び製品開発に関しては,商品購買時に原料に注意を払う消費者とそうでない者があるため,国産大豆使用商品の消費拡大には業界団体等による積極的な売り場提案が必要となることや,大豆加工メーカーは,製品そのもののプロモーションよりも,消費者の健康意識や伝統食・食育への働きかけを通して市場の拡大を目指していることを明らかにした.また,大豆の品質評価に関しては,国の検査制度と加工業者の意識の間に不整合があり,その改善に向けては,豆腐の堅さや糖度などの成分情報の把握・表示が求められることを指摘した.一方,大豆作技術に関わって,単収が日本では横ばい傾向にあるが米国ではそれが着実に増収している要因を検討し,品種育成において,米国の多収に対して日本は加工適性が最優先課題とされていることや,米国では作付け品種は12年で交代するので収量性がより改善された品種が直ぐに導入されること,全般に早播化傾向にある米国に対して日本の播種時期は全般的に遅いなど,米国は,品種改良だけでなく,作期,栽植様式,病害虫・雑草・土壌水分・肥培管理,農業機械の改良など総合的な取り組みによる増収を達成していることを明らかにした.

さらに,大豆作に係わる制度変化と経営展開の方向を整理し,大豆作収入が助成金次第で決まるという収支構造にあること,また,それは生産者の増収や品質向上へのインセンティブを低下させ,市場志向的生産対応を抑制することを明らかにし,今後の水田大豆作経営の展開においては,転作対応としてではなく,水田作経営の基幹部門の一つとして経営内に大豆作を位置付けていくことが重要であり,そのためには,大豆作の一層の生産性の向上が重要となることを指摘した.
副腎髄質細胞のTASKチャネルの分子実体と機能：ノックアウトマウスを用いた研究

マウス副腎髄質(AM)細胞におけるTASK1チャネルの静止膜電位形成への関与を調べるために、穿孔パッチクランプ法を用いて全細胞電流を記録した。-50 mVに膜電位を保持した際の全細胞電流レベルは、TASK1遺伝子をノックアウトしても全く変化しなかった。さらに、TASK1遺伝子ノックアウトの静止膜電位への影響を、アンペロメトリー法によりカテコールアミン分泌を記録することにより検討した。静止時の分泌は、野生型およびTASK1遺伝子ノックアウトマウスのAM細胞において、ともに静止時には分泌はほとんど誘発されなかった。これらの結果は、ノックアウトによるTASK1チャネルの欠損の影響は、他のKチャネルにより代償されることを示唆する。マウスAM細胞の静止膜電位形成には、TASK1チャネルばかりでなく、内向き整流Kチャネルも関与する。そこで、静止膜電位近傍そして-90mVから-110mVの膜電位領域のslope conductanceを測定した。前者はリークKチャンネル、後者は内向き整流Kチャネルのチャネル活性を主に反映していると考えられる。両slope conductanceとも、TASK1チャネルのノックアウトにより影響を受けなかった。これらの結果は、TASK1チャネルの欠損は、リークKチャネルの一種の2PKチャネルにより代償されていることを示唆する。TASK1遺伝子ノックアウトのAM細胞では、外液のpHを8.2、9.0とアルカリにすると、著名な外向き電流が誘発された。このアルカリにより誘発される電流の逆転電位はKの平衡電位の-80mVであり、さらに外液に1mMBaを加えると、可逆的に抑制された。これらの結果は、TASK1チャネルの欠損は、2PKチャネルファミリーの中のTALK2チャネルにより代償されることを示唆する。これまでの研究結果の一部は、すでに学会誌に論文として報告した。マウスAM細胞においてムスカリン受容体刺激による細胞興奮は、TASK1チャネルの抑制と非選択的カチオン(NSC)チャネルの活性化による。TASK1チャネルおよびNSCチャネルは、それぞれbupivacaineおよびquinineにより抑制される。TASK1のノックアウトマウスAM細胞では、ムスカリン受容体刺激により、NSCチャネル活性化による脱分極だけが起こることが予想され、ムスカリン受容体刺激によるNSCチャネル活性化の詳細な機序が明らかになることが期待される。最後に、TASK1チャネルの生理的役割を行動実験により明らかにする。野生型、TASK1ノックアウト、そしてTASK3ノックアウトのマウスをトレッドミルを使い運動持続能を測定する。TASK1ノックアウトマウスでは、運動持続能が低下していることが明らかになる可能性がある。アシドーシスを感知するTASKチャネルの分子実体を明らかにするために、野生型、TASK1ノックアウト、そしてTASK3ノックアウトマウスの副腎髄質(AM)細胞から全細胞電流を記録して、外液pH低下にたいする膜電流応答を調べた。保持電位-50 mVにおいて、野生型AM細胞では、外液pHを7.4から6.0まで、0.3または0.4のステップで減少させると、TASKチャネルの抑制により内向き電流が可逆的に発生した。そのEC50は約pH7.1であった。TASK1遺伝子をノックアウトすると、この外液pH低下による内向き電流は完全に消失したが、TASK3遺伝子のノックアウトでは影響を受けなかった。次に、アンペロメトリー法によりカテコールアミン分泌を測定して、外液pH低下により誘発される分泌に対するTASKチャネルノックアウトの影響を調べた。野生型AM細胞では、調べた細胞の33%でpH6.8により分泌が誘発されたが、TASK1ノックアウトAM細胞では調べた細胞すべてで分泌は誘発されなかった。一方、TASK3ノックアウトAM細胞では23%の細胞で分泌が誘発された。TASK1とTASK3の両方が発現しておりば、TASK1のノックアウトにより、TASK3は二量体のチャネルを形成することが予想される。そこで、この可能性をruthenium redにより内向き電流が発生するかを調べることにより、検討した。10 uMruthenium redの投与は、野生型及びTASK1ノックアウトAM細胞において内向き電流を発生させなかった。この結果はAM細胞では、TASK3がほとんど発現していないことを示唆する。実際、免疫染色においてTASK1様免疫反応は、強く細胞辺縁に観察されたが、TASK3様免疫反応はほとんど確認されなかった。これらの結果より、AM細胞におけるTASK1チャネルの発現が明らかになった。上述した結果をもとに論文を作成し、現在投稿中である。

これらの結果は、TASK1チャネルの欠損は、リークKチャネルの一種の2PKチャネルにより代償されていることを示唆する。TASK1遺伝子ノックアウトのAM細胞では、外液のpHを8.2、9.0とアルカリにすると、著名な外向き電流が誘発された。このアルカリにより誘発される電流の逆転電位はKの平衡電位の-80mVであり、さらに外液に1mMBaを加えると、可逆的に抑制された。これらの結果は、TASK1チャネルの欠損は、2PKチャネルファミリーの中のTALK2チャネルにより代償されることを示唆する。これまでの研究結果の一部は、すでに学会誌に論文として報告した。TASK1チャネルがマウスAM細胞に発現し、静止膜電位の形成に寄与していることが、明らかになったが、TASK1のノックアウトによっても、静止膜電位は変化しなかった。この結果は、TASK1の欠損は、他のKチャネルにより代償されていることを意味する。そこで、TASK1のノックアウトにより、upregulationされるKチャネルを明らかにする。次に、AM細胞では、TASK1様免疫反応物は、おもに細胞膜、または細胞辺縁に局在し、細胞質には存在しなかった。この結果は、AM細胞の不死化細胞であるPC12細胞にTASK1チャネルを強制発現させても、再現された。これらの結果は、AM細胞では、TASK1チャネルを細胞膜に効率よく輸送する機序が存在することを示唆する。そこで、その機序を明らかにする。最後に、TASK1チャネルの生理的役割を行動実験により明らかにする。激しい運動をすると、副腎髄質からのアドレナリン分泌が促進される。このアドレナリン分泌には、AM細胞のTASK1チャネルがアシドーシスにより抑制されることが関与している可能性がある。この可能性をトレッドミルを用いた行動実験により検討する。マウスAM細胞においてムスカリン受容体刺激による細胞興奮は、TASK1チャネルの抑制と非選択的カチオン(NSC)チャネルの活性化による。TASK1チャネルおよびNSCチャネルは、それぞれbupivacaineおよびquinineにより抑制される。TASK1のノックアウトマウスAM細胞では、ムスカリン受容体刺激により、NSCチャネル活性化による脱分極だけが起こることが予想され、ムスカリン受容体刺激によるNSCチャネル活性化の詳細な機序が明らかになることが期待される。野生型、TASK1ノックアウト、そしてTASK3ノックアウトのマウスをトレッドミルを使い運動持続能を測定する。
音-流れ複合場によるマイクロスフィアのサイズセンシングと反応の動的評価

マイクロ粒子表面で起こる反応を利用して、マイクロ粒子の物性を変化させ、それを超音波放射力によって計測した。マイクロ粒子上での反応に必要な物質量はわずかであり、それを物理量の変化として捉えれば新たな微量分析の開発が可能である。平均粒径4.4μmの単分散エポキシ粒子を調製し、表面にアビジン就職を行った。これとビオチン結合した金ナノ粒子を結合させることで、マイクロ粒子の密度を大きくした。この変化を超音波-重力複合場での浮揚位置として捉えた。これにより、zmolレベルの物質を計測できる新手法を確立した。音と流れの複合場を用いるサイズセンシングのための材料合成について検討を進めた。主な成果は次の用に要約できる。表面反応を起こすことによるサイズセンシングを想定しているので、表面修飾が容易でかつ大きさのそろった単分散のマイクロスフィアが必要である。市販品ではポリスチレンラテックスがこの目的に適すると判断していたが、音響物性(密度と圧縮率)にばらつきがあることが判明したため、ジビニルベンゼンとグリリシジルメタクリレートから新たな樹脂を合成することにした。多孔性のポンピングコネクターを用いてエマルジョンを作製し、その後重合することを想定し、種々の条件を最適化した結果、10μm前後で単分散のマイクロスフィアを調製することに成功した。この粒子の密度を、ポリタングステン酸水溶液を用いる平衡密度法で計測し、その値を用いて研究代表者らが確立した超音波-重力複合場内での粒子挙動から圧縮率を決定した。密度は、1.304 g cm-3、圧縮率は2.366×10-10 Pa-1であった。また、合成したマイクロスフィアは表面にエポキシドが出ており、これを利用してタンパク質などを化学結合できるよう設計した。アビジンを用いて表面修飾が可能であることを確認したので、次段階として金ナノ粒子などを表面に結合させることができると考えている。さらに、ソフトマイクロスフィアとしてアルギン酸粒子の調製を検討した。マイクロチップを用いて検討を行い、数十μm以下の液滴を作ることに成功した。液滴をある程度のかたさに変化させ、ソフトマイクロスフィアとするための条件の最適化を試みたが、成功には至らず引き続き検討中である。市販品では不可能な表面修飾が容易で、単分散のポリマー粒子の調整法を確立した。また、表面化学結合によるタンパク質の固定が可能であることを確認した点で、最も困難な課題の一つを克服することができており、検討を進めることが可能な状況にある。前年度に合成に成功したエポキシ樹脂粒子を用いて、超音波-重力複合場における浮揚位置変化から微量分析の可能性を検討した。その結果以下のことが明らかになった。1.エポキシ樹脂粒子にアビジンを共有結合により導入することに成功し、フルオレセインラベルしたビオチンを利用して表面に結合したアビジン量を定量した。その結果、一粒子当たり平均で9400分子のアビジンが結合していることがわかった。2.アビジン-エポキシ樹脂粒子とビオチン結合金ナノ粒子間の結合により、密度変化を誘起することを検討した。50 nmと100 nm二種類の金ナノ粒子を用いてアビジン-ビオチン結合を起こし、金ナノ粒子結合エポキシ樹脂粒子を調整した。この粒子の超音波-重力複合場における浮揚位置は金ナノ粒子を結合していないものに比べて明らかに下に移動することがわかった。また、エポキシ樹脂粒子1つ当たり50 nm金ナノ粒子は4000個、100 nm粒子は1000個まで結合することがわかった。これは、金ナノ粒子同士が隣のアビジンサイトを妨害している可能性を示唆した。結合する金ナノ粒子の数は少ないが、密度変化の点からは100 nm金ナノ粒子を用いる方が有利であるので、その後の検討には100 nm金ナノ粒子を用いた。3.エポキシ樹脂粒子に結合する金ナノ粒子の数を変化させ、超音波-重力複合場内での浮揚位置と結合金ナノ粒子数の間の関係を求めた。両者の間には直線関係があり、これから結合した金ナノ粒子数を決定できることがわかった。金ナノ粒子の結合による圧縮率の変化は小さく、浮揚位置は基本的に密度により決まる。密度と浮揚位置の間には直線関係があることが計算からも明らかであり、実験と計算が一致することがわかった。エポキシ樹脂粒子一つ当たり、200個の金ナノ粒子を検出することが可能であった。表面にタンパク質を結合できる高分子粒子の調製法を確立したので、これを用いた表面反応の評価を行うと共に、流れを利用したサイズセンシング用のマイクロスフィアの調製を行う。具体的にはアルギン酸のマイクロ粒子の調製を行い、反応によるサイズ変化を超音波により追跡する予定である。

分析化学単分散で、表面化学修飾が可能な本研究の目的に合ったマイクロスフィアを調製することに注力したため、その後の反応に用いる生体物質や生体物質で修飾された金ナノ粒子などある程度高価な薬品類を購入して反応を検討する段階には進まなかった。しかし、想定以上のマイクロスフィアが調製できることがわかったため、次年度にこれらを購入して当初の目標を達成する予定である。生体物質や生体物質で修飾された金ナノ粒子などある程度高価な薬品類を購入して、マイクロスフィアでの表面反応の検討を行う。
p21強制発現による軟骨肉種の分化誘導および治療

我々はp21が軟骨細胞の分化にどのように関与しているかを確認する目的で、豚の成長軟骨におけるp21の発現とparathyroid hormonerelated-peptide(PTHrP)の関連につき検討した。p21は成長軟骨帯のやや下方の肥大軟骨細胞に陽性を認め、PTHrPは増殖細胞層と連続する上方の肥大軟骨細胞に陽性を認めた。また培養軟骨肉腫細胞SW1353を使用し、PTHrPによるp21の発現への影響を確認すると、PTHrPを添加することにより、p21mRNAの発現量が抑制されることを確認した。また摘出軟骨肉腫におけるp21発現とin vitroでのp21発現の変化についてinsulin-like growth factor-1(IGF-1)による影響を検討し、軟骨肉腫の分化におけるp21の働きにつき推察した。軟骨肉腫14例の組織切片上でのp21の発現は、分化の良いgrade1の6例中4例にその発現を認め、特にlacunaeを形成する細胞に発現を認めた。逆に分化の低いgrade2,3の症例では8例全例にp21の発現は認められなかった。次にSW-1353にIGF-1を各種濃度で添加すると、100ng/mlにて分化の指標となるsulfateの取り込みが増強された。またIGF-1添加による細胞のp21の発現をmRNA、蛋白レベルで確認すると、その発現量が濃度依存性に増強された。IGF-1が細胞の分化を促進するメカニズムの詳細は明らかではないが、この作用にp21が関与していることが示唆された。このように軟骨細胞と軟骨肉腫細胞の分化にp21の発現が影響を与えていることが推察され、軟骨肉腫の未分化な細胞にp21を強制発現させることにより、腫瘍の分化を促進し腫瘍の悪性度を低下させる可能性も考えられた。近年、癌抑制遺伝子の一つであるp21が細胞の分化に関与することが明らかとなってきている。今回、軟骨肉腫のp21発現とIGF-1による分化誘導におけるp21発現の変化について検討し、軟骨肉腫の分化におけるp21の働きにつき推察した。軟骨肉腫14例の組織切片上でのp21の発現は、分化の比較的良いgrade1の6例中4例にその発現を認め、特にlacunaeを形成する分化の良い細胞に発現を認めた。次に培養軟骨肉腫細胞であるSW-1353にIGF-1を各種濃度で添加すると、100ng/mlにて分化の指標となるsulfateの取り込みが増強された。同様に基質の破壊に関与するmatrix metalloproteinase-1,-3の産生量も増強された。またIGF-1添加による細胞のp21の発現をmRNA、蛋白レベルで確認すると、その発現量が濃度依存性に増強されることが確認された。このように軟骨肉腫の分化にp21の発現が影響を与えていることが推察され、軟骨肉腫の未分化な細胞にp21を強制発現させることにより、腫瘍の分化を促進し腫瘍の悪性度を低下させる可能性も考えられた。今後はin vivoにおいて実際にp21を強制発現させた軟骨肉腫が分化を示すか検討していく予定である。

p21は成長軟骨帯のやや下方の肥大軟骨細胞に陽性を認め、PTHrPは増殖細胞層と連続する上方の肥大軟骨細胞に陽性を認めた。また培養軟骨肉腫細胞SW1353を使用し、PTHrPによるp21の発現への影響を確認すると、PTHrPを添加することにより、p21mRNAの発現量が抑制されることを確認した。また摘出軟骨肉腫におけるp21発現とin vitroでのp21発現の変化についてinsulin like growthfactor-1(IGF-1)による影響を検討し、軟骨肉腫の分化におけるp21の働きにつき推察した。軟骨肉腫14例の組織切片上でのp21の発現は、分化の良いgrade1の6例中4例にその発現を認め、特にlacunaeを形成する細胞に発現を認めた。逆に分化の低いgrade2,3の症例では8例全例にp21の発現は認められなかった。次にSW-1353にIGF-1を各種濃度で添加すると、100ng/mlにて分化の指標となるsulfateの取り込みが増強された。またIGF-1添加による細胞のp21の発現をmRNA、蛋白レベルで確認すると、その発現量が濃度依存性に増強された。IGF-1が細胞の分化を促進するメカニズムの詳細は明らかではないが、この作用にp21が関与していることが示唆された。このように軟骨細胞と軟骨肉腫細胞の分化にp21の発現が影響を与えていることが推察され、軟骨肉腫の未分化な細胞にp21を強制発現させることにより、腫瘍の分化を促進し腫瘍の悪性度を低下させる可能性も考えられた。
超微細加工におけるナノトポグラフィ機構の解明と制御

本研究では、全レジストパターン形成過程におけるナノ空間スケールで起こる現象を完全に解明するために、これまで明らかにしてこなかった脱保護過程と現像過程における反応を調べた。そして、実験で得られた各々のパラメータを使って、シミュレーション解析を行い、実際に形成された微細パターンと比較することで超微細加工におけるナノトポグラフィ形成機構の解明を行い、次世代リソグラフィとして最有力候補であるEUVレジストの開発指針を得ることができた。本研究では、全レジストパターン形成過程におけるナノ空間スケールで起こる現象を完全に解明することを目的としている。最終的には、実験で得られた各々のパラメータを使ってシミュレーション解析を行い、実際に形成された微細パターンと比較することで超微細加工におけるナノトポグラフィ形成機構を解明する。超微細加工におけるナノトポグラフィ形成機構が解明されると、次世代リソグラフィとして最有力候補であるEUVレジストの開発指針を得ることができ、半導体業界で問題になっている感度、解像度、ラインエッジラフネス(LER)のトレードオフの問題を打開するレジスト指針を得ることが考えられる。本年度は全レジストパターン形成過程のうちの酸触媒過程におけるナノ空間スケールで起こる現象を解明するために、FT-IRを用いて、数種類のレジスト薄膜の脱保護反応へのポリマー構造効果について調べた。特に、EUV露光した数種類のレジスト薄膜の脱保護反応速度と活性化エネルギーを求め、脱保護反応の活性化エネルギー(拡散の活性化エネルギー+反応活性化エネルギー)は保護基の種類だけでなく、保護率によっても変わることを明らかにした。また、ガラス転移温度以下の温度では、tert-ブチルとエトキシエチル基を用いた場合、保護率とともに脱保護(拡散)の活性化エネルギーは減少した。一方、ナフトキシ基を用いた場合、脱保護(拡散)の活性化エネルギーは増加した。このことから、小さな保護基では保護率の活性化エネルギー依存性は小さいのに対して、バルキーな保護基に対しては保護率の活性化エネルギー依存性が大きいことが明らかになった。超微細加工におけるナノトポグラフィ形成機構が解明されると、次世代リソグラフィとして最有力候補であるEUVレジストの開発指針を得ることができ、半導体業界で問題になっている感度、解像度、ラインエッジラフネス(LER)のトレードオフの問題を打開するレジスト指針を得ることができると考えられる。本年度は21年度に引き続き、脱保護反応解析を行うとともに、100nmの薄膜でも測定ができる現像解析装置を用いて脱保護反応解析に用いた数種類のレジストの現像過程でのナノ空間現象を調べ、シミュレーションに必要なパラメータを求めた。また、溶解特性への保護率や保護基の種類の効果について調べた。すべての保護基について、保護率が増加するにつれて溶解コントラストが増加し、感度の減少がみられた。また、保護率が増加するにつれて、溶解阻害効果が増加した。これは、ヒドロキシル基の数が増加するにつれて、アルカリ現像液のレジストの浸透が増加し、現像速度に違いが出たと考えられる。また、溶解速度について、最大溶解速度の違いが見られた。これは副生成物の量の違いが影響していると思われる。このように、ポリマーの保護率と保護基は溶解速度と感度に影響されるので、レジスト設計が非常に重要であることを明らかにした。本年度は21年度と22年度に引き続き、数種類のレジストの脱保護反応解析を行うとともに、100nmの薄膜でも測定ができる現像解析装置を用いて現像過程でのナノ空間現象を調べた。得られた結果からシミュレーションに必要な脱保護反応速度定数や現像パラメータを求め、得られたパラメータを用いてPROLITHというリソグラフィシミュレーションを使用してレジストプロファイルのシミュレーションを行った。その結果、ターシャリーブチルで保護したポリヒドロキシスチレンでは露光量20mJ/cm^2で膜厚70nmにおいて50nmのライン&スペースが形成可能できることがシミュレーションによって示唆された。このレジストを使って、電子線描画装置で実際にパターン形成を行ったところ、50nmライン&スペースが作製することができた。このように、実験で求めたレジストパラメータを使ってシミュレーションすることで、微細パターンが形成可能であるかどうかを予測できることが明らかにした。
リン制限下の山間地湖沼における非点源負荷特性と水質項目の消長過程に関する研究

第一は湖への負荷源の同定と負荷量の推定,そして湖内における栄養塩類の収支に関するものである。負荷原単位法を用いた集水域の負荷の推定と湖内負荷との比較を行い,全窒素とBODは流域内での自然汚濁と湖内での内部生産量が大きいこと,時として成層化された夏期の深水層において硝酸態窒素が発現する非点源負荷の効果を見いだした。ついで,本課題以前の計測データを加え流動層と深水層における負荷量の推移を検討した。その結果,1993年は成層期の微流動層においてアモニア態窒素に加えて硝酸態窒素が発現していたが,その後時間経過と共に深水層における硝酸態窒素の発現量は小さくなり,1997年からは秋期の微流動層において硝化が認めらた。1993年は上流域にスキー場が開場した翌年であり,斜面や法面が植生で覆われて開発の影響が少なくなるの4年程度を要することが認められた。第二は底泥からの栄養塩の溶出と輸送機構の検討で,容器に底泥と湖沼水を封入し,湖底条件にて保存したバッチ試験を実施した。湖沼水を注入すると底泥は一時的に酸化されアンモニア態窒素と硝酸態窒素が発現するが,その後,酸化還元電位の低下にしたがってアンモニア態窒素の発現量が増加し,硝酸態窒素が減少傾向する成層期の湖底と同様の過程を確認した。また,成層期の湖底におけるアンモニア態窒素の発現量を与え,深水層におけるアンモニア態窒素分布を鉛直一次元拡散方程式によりモデル化した。さらに,夏期の湖底における硝酸態窒素の発現を降雨による密度流によるものと仮定し,還元中に流入する硝酸態窒素濃度の減衰に対する時間特性から脱窒素速度に関係する係数を算定した。第三に,湖内流動と水温計測から湖内における数年間の熱収支を検討した。成層期の降雨時には小野川流域からの負の移流熱により水温が低下するが,本湖では桧原湖からの正の移流熱が卓越するために流動層を通じて速やかに排熱されること,またそのことが擾乱した成層状態の回復に大きく寄与することなどの成果を得た。実施計画に基づき(a)底泥からの栄養塩の溶出機構と輸送過程の検討と(b)負荷原単位の同定並びに栄養塩の湖内収支の検討を実施した。(a)は継続研究として,湖内の最深部における栄養状態の経時変化機構の調査検討を行った。その結果,7年間に渡る深水層における栄養態の推移は,1996年から湖底においては成層形成期に明確な脱窒状態が観察され,安定期にアンモニアが高い発現を示す過程が,さらに循環期には明確な消化作用が観察された。このことは,湖沼の交換率の低い湖沼における傾向であり,小野川湖においては近年の特性である。これより以前においては夏季に高い硝酸や亜硝酸の発現が湖底で観測されている。この発生要因を出水に伴う流域からの硝酸の輸送によるものとモデル化して,発現量に対する時間的な推移を求めて脱窒速度を算定した。これにより,成層期の湖底における栄養状態のモデル化の可能性を与えた。(b)については,栄養塩の湖内収支の検討に際して基本となる,湖内の水温構造のモデル化に関する検討を行った。まず,鉛直一次元熱輸送モデルにより,熱輸送に関わる影響因子の検討を行った。

その結果,小野川湖の表水層においては流入と流出に伴う熱輸送の効果が大きなことを示し,量的な評価が可能となった。これにより湖面における熱収支が精度良く算定された。今後は,このモデルに流動計測から得た移流項を加味した2次元モデルとすること,さらにDO濃度の推定に関する検討を行う予定である。さらに,来年度は流域からの負荷量の算定と湖内への物質の蓄積量の評価検討すべく,雪解け出水を対象とした計測を準備中である。本研究は清廉な水質からわずかに汚濁が進行した山間地湖沼について流域の汚濁負荷と湖内における負荷機構の検討を行い,山間地の閉鎖性水域における水環境の保全に寄与することを目的として調査検討を実施した。研究対象は磐梯朝日国立公園裏磐梯地区の小野川湖であり,水質は中栄養で,リンを汚濁の制限因子としている。上流には湖容量が約11倍の桧原湖があり,流域と桧原湖の流下水量が本湖へ流入するため,湖沼水の回転率は22回/年程度の高い値となっている。しかし本湖は夏期に明確な成層を形成すること,さらに底泥からの栄養塩溶出による内部負荷量が大きいことが特徴であり,山間地における成層型湖沼の一典型を示している。検討の第一は湖への負荷源の同定と負荷量の推定,そして湖内における栄養塩類収支に関するものであり,負荷原単位法を用いた負荷量の推定と湖内負荷との比較を行い,全窒素とBODは湖内における内部生産が大きいことを示した。また,本課題以前の計測データを加えて流動層と深水層における負荷量を推定した。その結果,1993年には流動層における硝酸態窒素濃度が高く,成層期の微流動層においてもその発現がみられているが,その後発現量は小さくなり,1997年からは秋期にかけての微流動層における硝化反応が明確となった。1993年は上流域にスキー場が開場した年であり,開発の影響が少なくなるのには4年程度を要することが認められた。第二は底泥からの栄養塩の溶出機構と輸送機構の検討であり,微流動層におけるアンモニア態窒素を鉛直一次元の拡散式によりモデル化した。さらに,現地データをもとに脱窒速度を評価した。第三には湖内流動と水温計測から湖内の熱収支を検討し,本湖では桧原湖からの移流熱量が卓越するが,成層期は流動層を通じて速やかに排出されること,また擾乱した成層状態の快復に大きく寄与することを示した。
多孔質に閉じ込めたネマチック液晶の示すガラス的挙動の解明

ディスプレイなどに用いられるネマチック液晶を多孔質に閉じ込めると、ガラス的な遅い緩和が現れる。我々はこの現象の物理的起源を明らかにするために、多孔質の構造をあらわに扱ったモンテカルロシミュレーションを行った。その結果、緩和には液晶の弾性に由来する早い緩和と、欠陥の組み換えによる遅い緩和が現れることを明らかにした。また、多孔質の構造を制御することで、その遅い緩和を抑えることができることを見出した。液晶性物質は、一般に温度をトけることで、アイソトロピック相-ネマティック相-スメクチック相と対称性の低い相へと転移していく。この液晶を狭い空間に閉じ込めることにより学術的にも興味深く、またディスプレイ材料として知られるように工業的にも非常に重要な振る舞いを示す。本研究は、主に数値シミュレーションを用いて、多孔質に閉じ込められた液晶の示すガラス的挙動、またはそれに起因するメモリ一効果についてその物理的メカニズムを明らかにすることを目的としている。不規則な多孔質にネマティック液晶を閉じ込めると、局所的に配向場は様々な方向を向き、系全体としては等方的になる。この状態に外場を印加すると、配向場を制御することができ、ある決まった方向に揃えることができる。ここで外場を切ると、配同場は別の状態へと変化していくが、本研究によって、その変化の様式にいくつかの緩和モードがあることが分かった。初めに現れる早い緩和モードは液晶の弾性に起因するものであり、液晶ディスプレイに用いられる原理と基本的に同じものである。ここでは、多孔質閉じ込めに由来する配向欠陥の組み換えは見られない。二つめの遅いモードは、配向欠陥の組み換えを伴うものである。液晶の弾性場が緩和するためには局所的に高いエネルギー障壁を越えなければならず、結果として活性化型の緩和を示すことが分かった。これらの2つの緩和は、それぞれ温度・平均孔サイズなどに対して異なる依存性を示す。大きな孔を持つ多孔質を用いれば、遅い緩和の強度を抑制することができ、より高いメモリー効果を生み出すことが示された.さらに、規則的な構造を持つ適当な多孔質を用いれば、遅い活性化型緩和をなくすことができることが分かった。多孔質に閉じ込められた系や不純物を含む凝縮系では、純粋な系に比べて様々な相転移現象が抑制されることが知られている。液晶における等方-ネマティック転移においても、多孔質中では不連続な一時転移を起こさなくなることが分かっている。しかしながら、液晶相は弾性的であり空間束縛を受けることにより弾性エネルギーが増大し配向欠陥が形成されるため、一般的な議論が用いることができない。例えば、この系では、外場によって平均的な配向方向を制御することができ、外場を除いた後もそれが保持されることが報告されている。これまで、不純物という形で閉じ込め効果を扱った研究した例はいくつかあったが、多孔質の構造そのものに注目したものはなく、どのように配向欠陥が束縛を受けるかなど明らかになっていない点も多く残っている。我々は様々な構造を持つ多孔質を用意し、それと配向欠陥のトポロジカルな構造との関係に着目し、メモリー効果を中心にその振舞いを調べた。相分離モデルを用いて双連結構造を用意し、その片方の相にLebwohl-Lasherポテンシャルで相互作用するスピンを導入し、モンテカルロシミュレーションを行った。また、図1は、双連結構造とその中に封入したネマティック液晶の配向欠陥を図示したものである。十分にアニールしても、液晶相の配向欠陥は消失せず残ったままであった。この配向欠陥は一意に決まるものではなく、様々な配置状態を取りうるが、それらが熱的に状態遷移することはない。大きな外場を与えると、異なる欠陥構造を持つ局所安定状態に遷移するが、その後、外場を消しても配向欠陥のトポロジーは保持されるため、一時的に印加した外場の情報を「記憶」できることが分かった。また、キュービック相など秩序度の高い多孔質を用いることで、メモリー効果の効率が高くなることも示された。
自然景観シミュレーションのダイナミックスモデルに関する研究

本研究は、初年度の平成4年度ではコンピュータグラフィックス(CG)を用いて3次元画像の生成と視点移動のためのプログラムが稼働可能な状態にし、平成5年度では地域レベルの景観解析事例として丘陵地開発に伴う景観インパクトの評価に係わる研究と空間構成レベルにおける景観解析事例として都市河川の空間整備に伴う景観形成手法に係わる研究を進めた。最終年の平成6年度では、前年度までの成果を踏まえて景観シミュレーションのダイナミックスモデルを用いた景観解析事例として都市河川の空間整備に伴う景観形成手法に係わる研究を進めるとともに、ダイナミックスモデルを用いた景観シミュレーション手法をまとめた。具体には、都市河川の護岸形態、水際形態と建物際緑化形態を操作したシミュレーションモデルをCGを用いて作成し、ビデオレコーダを用いて橋上から約180°視線を振ったアニメーションモデル、水上をモーターボ-トで移動したアニメーションモデル、堤頂部から水際まで垂直移動したアニメーションモデルを出力し、アニメーションモデルを刺激媒体とする心理実験を通じて都市河川の空間整備に伴う景観形成手法を探った。その結果、ダイナミックスモデルを用いることによって従来までの静止画像を用いた景観シミュレーションでは評価し難かった景観の全体性や連続性を的確に評価することが可能となることを明らかにするとともに、橋上景観ではマクロな景観構造、水上景観ではシークエンシャルな景観構造、水際景観ではミクロな景観構造が重要となることを明らかにした。さらに最終成果として、景観計画レベル、敷地計画レベル、デザインレベルの3レベルでのCGを用いた景観シミュレーション手法の有用性と課題をまとめた。本研究は、平成4年度から助成を受け、3年計画で研究を進めているものである。平成4年度においては、自然景観シミュレーションのダイナミックスモデルに関する研究の研究方法の細部検討、シミュレーションモデルの検討、入力データの収集、システム開発の4課題を中心に研究を実施した。研究方法の細部検討に関しては、ケーススタディを通じてシステム開発やシミュレーションモデルの開発を行うといった方法論を設定した。ケーススタディとしては、1980年代以降、急速な都市化の進行が見られる大阪府内の南河内地域をスタディエリアとして、メッシュアナリシス(単位メッシュ:1辺250m)によって1980年、1990年の地形及び植生情報をデータ化し、10年間の地形や植生の改変状況を分析し、その改変状況を視覚モデル化するとともに改変以前の復元モデルの構築を試みた。その結果、ワークステーションをCPUとするコンピュータグラヒックシステムを応用して、地形情報を3次元画像として表現するための3次元地形レンダリングのためのシスムを構築するとともに地形の3次元画像に植生情報を書き込むためのシステムを構築した。さらに、地形や植生の改変が認められた区域をスケールアップし(単位メッシュ:1辺50m)、改変以前の地形を視覚モデル化し、その3次元画像上に立面上(2次元)の植生情報を書き込むためのシステムを構築し、景観復元モデルの作成に成功した。また、植生情報の中の樹種に対応した年次変化や季節変化に係わる視覚データの収集を実施している。平成4年度では、コンピューターグラヒックスシステムを応用して、地形情報を3次元画像として表現するプログラム、地形の3次元画像に樹木情報を書き込むためのプログラムや視点移動のためのプログラムが稼働可能な状態にすることができた。平成5年度では、上記のプログラムを用いて、1980年代以降、丘陵地の開発が顕著に認められる大阪府南河内地域をスタディエリアとして、地域レベルから地区レベル、地点レベルにおける自然景観シミュレーションモデルを構築し、シミュレーションモデルを刺激媒体とした景観評価を試み、景観評価手法の構築を行った。具体には、地域レベルでは、13km四方の空間を対象として、解析精度を250mメッシュに設定し、地域空間構造を規定する植生、地形と開発地をコンピューターグラヒック上スオーバーレイ解析するとともに、シュミレーション画像を用いて開発地の可視状況を検索することを試みた。地区レベルでは、開発地を含む3.5km四方の空間を対象として、解析精度を50mメッシュに設定し、シミュレーション画像の景観の再現性を高める手法を開発するとともに、視点移動に伴う景観インパクトの変化を明らかにした。

地点レベルでは、開発地内の主要施設を含む0.5km四方の空間を対象として、解析精度を10メッシュに設定し、シミュレーシヨン画像のリアリティ感を高めるための検討を行うとともに、樹木の成長や性状の差異による景感インパクトの変化を明らかにした。以上のように、平成5年度においては、静止画像レベルのモデル構築や景観評価手法の構築が達成できた。本研究は、初年度の平成4年度ではコンピュータグラフィックス(CG)を用いて3次元画像の生成と視点移動のためのプログラムが稼働可能な状態にし、平成5年度では地域レベルの景観解析事例として丘陵地開発に伴う景観インパクトの評価に係わる研究と空間構成レベルにおける景観解析事例として都市河川の空間整備に伴う景観形成手法に係わる研究を進めた。最終年の平成6年度では、前年度までの成果を踏まえて景観シミュレーションのダイナミックスモデルを用いた景観解析事例として都市河川の空間整備に伴う景観形成手法に係わる研究を進めるとともに、ダイナミックスモデルを用いた景観シミュレーション手法をまとめた。具体には、都市河川の護岸形態、水際形態と建物際緑化形態を操作したシミュレーションモデルをCGを用いて作成し、ビデオレコーダを用いて橋上から約180°視線を振ったアニメーションモデル、水上をモーターボ-トで移動したアニメーションモデル、堤頂部から水際まで垂直移動したアニメーションモデルを出力し、アニメーションモデルを刺激媒体とする心理実験を通じて都市河川の空間整備に伴う景観形成手法を探った。その結果、ダイナミックスモデルを用いることによって従来までの静止画像を用いた景観シミュレーションでは評価し難かった景観の全体性や連続性を的確に評価することが可能となることを明らかにするとともに、橋上景観ではマクロな景観構造、水上景観ではシークエンシャルな景観構造、水際景観ではミクロな景観構造が重要となることを明らかにした。さらに最終成果として、景観計画レベル、敷地計画レベル、デザインレベルの3レベルでのCGを用いた景観シミュレーション手法の有用性と課題をまとめた。
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の導入による多価不飽和脂肪酸分解過程の解明

多価不飽和脂肪酸の12位のシス二重結合が存在する場合に、ジエノイル-CoAレダクターゼ活性がその不飽和脂肪酸のβ-酸化において重要な働きを担うことが明らかになっている。リノール酸とα-リノレン酸は9位と12位のシス二重結合を有する点で共通することから、α-リノレン酸のβ-酸化活性の阻害と代謝におけるジエノイル-CoAレダクターゼ活性の必要性の高さは15位の二重結合の存在に由来することが示唆された。ペルオキシソーム・ターゲティング・シグナル1(PTS1)をコードする塩基配列を緑膿菌Pseudomonas aeruginosaのポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子(phaC)の3'末端に付加した後に酵母-大腸菌シャトルベクターp415GPDと連結したプラスミド、p415PTS1phaCを出芽酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742株に導入しポリヒドロキシアルカン酸合成酵素(PhaC)がペルオキシソームに局在化する組み換えS. cerevisiae株を育種した。得られた組み換え株を炭素数18の飽和ならびに不飽和脂肪酸を基質に培養したところ、いずれの基質においてもポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の蓄積が認められた。脂肪酸を添加しない条件においてもPHAの蓄積が確認されたが、これはS. cerevisiaeの脂肪酸合成系から流れてきた脂肪酸がβ-酸化を受けた結果生成した3-ヒドロキシアシル-CoAを基質にPHA合成が行われたためであると考えられた。組み換えS. cerevisiae株の菌体PHA含量を比較するとC18脂肪酸の二重結合の数が0から3に段階的に増えるにつれPHA含量が減少する傾向が認められた。これは外部から添加した不飽和脂肪酸のβ-酸化による分解が律速となり、脂肪酸合成系からの内生的な脂肪酸中間体を含めた脂肪酸の分解過程が阻害された結果であると推察される。得られた結果を基に、今後は本研究で用いた組み換えS. cerevisiae株を用いて多価不飽和脂肪酸のβ-酸化による分解を担う遺伝子の探索を行う予定である。出芽酵母Saccharomyces cervisiaeにおいて,炭素数18の脂肪酸のうち食用油に豊富に含まれるステアリン酸,オレイン酸,リノール酸,リノレン酸を唯一の基質とした増殖,およびポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子導入酵母を用いた脂肪酸β-酸化活性の解析を行った。分子内に3つの不飽和結合を有するリノレン酸では, S. cervisiaeは増殖できず,またβ-酸化活性が阻害されることを見出した。酵母を含む真核生物では脂肪酸β-酸化は,細胞小器官の一種であるペルオキシソームで行われる。ペルオキシソームの形成を促すことが知られているオレイン酸に対して馴化したS.cervisiaeでは,リノレン酸を基質とした増殖が認められた。リノレン酸などの多価不飽和脂肪酸は分子内に複数のシス不飽和結合を有する。このため,分子がβ-酸化による分解を受ける構造になるためには,β-酸化の主反応以外にシス不飽和結合に対する異性化反応や還元反応が必要とされる。また,トランス脂肪酸の一つであるエライジン酸においても, S. cervisiaeは増殖できなかった。しかしながら,オレイン酸に対して馴化したS. cervisiaeでは増殖が認められた。オレイン酸で順化した後にリノレン酸やエライジン酸で増殖が認められた原因として,リノレン酸やエライジン酸では、ペルオキシソームに局在する特定の酵素活性の誘導が不十分である,ペルオキシソーム自体の形成誘導が不十分であるといった可能性が考えられた。今後はリノーレン酸やエライジン酸の代謝において,どのような酵素活性が重要な働きを担うのか,そしてそれら酵素活性の発現調節のメカニズムを明らかにする予定である。脂質は重要な栄養素であるが、過剰に摂取することで生活習慣病のリスクファクターにもなり得る。本研究では、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いて多価不飽和脂肪酸のβ-酸化代謝に関係する遺伝子の発現誘導や機能について新たな知見を示した。分子内二重結合数が三のα-リノレン酸は、その代謝に関与する遺伝子群の発現を誘導しないこと、β-酸化が行われる細胞小器官であるペルオキシソームの形成を分子内二重結合数が一のオレイン酸ほどは誘導しないこと、そして、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を導入した菌株を用いた解析においてβ-酸化活性を阻害することを示した。一方、一度オレイン酸で順化した細胞を、α-リノレン酸を唯一の炭素源として培養した場合には、野生株では速やかに増殖が認められたが、ジエノイル-CoAレダクターゼ遺伝子破壊株では増殖が認められなかった。この結果から、α-リノレン酸がβ-酸化により分解されるためには、ジエノイル-CoAレダクターゼが必須であることが示された。

一度オレイン酸で順化した細胞を、分子内二重結合数が二のリノール酸を唯一の炭素源として培養した場合には、野生株では同様に増殖が認められ、ジエノイル-CoAレダクターゼ遺伝子破壊株でも増殖が遅いながら認められた。この結果から、α-リノレン酸のβ-酸化代謝においては、リノール酸の代謝においてよりもジエノイル-CoAレダクターゼへの依存度が高くなることが示唆された。これまでの知見から12位の二重結合が存在する場合に、ジエノイル-CoAレダクターゼ活性が重要な働きを担うことが明らかになっているが、リノール酸もα-リノレン酸も9位と12位の二重結合を有する点で共通することから、本研究で認められたジエノイル-CoAレダクターゼへの依存度の違いは15位の二重結合があるか否かに由来することが示唆された。
分子動力学計算による膜タンパク質立体構造予測

重要な機能を持つ膜タンパク質の立体構造をアミノ酸配列から理論的に予測する方法が強く望まれている。本研究では、構造形成機構を以下の様に考え、それに沿って膜貫通ヘリックスの相互配置を予測した。まず極性相互作用により膜平面内でのヘリックスの並進配置と配向角度が決まり、次に各種相互作用(主にファンデルワールス力)によりヘリックス自体のねじれ、相互の傾きなど詳細な構造が決まる。まず、膜貫通ヘリックスの並進配置と配向角度を予測するため、膜に垂直なヘリックスを仮定し、分子力学計算から極性相互作用領域をヘリックス表面に割り振り、そこから2本のヘリックス間の結合力を求めた。膜平面での配置は、ヘリックス同士の結合力が強く、間のループの残基長が短いほど有利になるように予測した。また、配向角度は全てのヘリックスを長軸周りに同時に回転させ、極性相互作用の総和が最小になるように予測した。このとき補欠分子レチナ-ルの効果を計算に組み入れた。この方法で、バクテリオロドプシン(bR)の構造を予測したところ天然構造と良く一致した。次に、詳細構造の予測を行った。膜に垂直なヘリックスを上記で得たbRのヘリックスの配置と向きに配置し、棒状のレチナ-ルを膜面に平行に入れ、初期座標とし、分子動力学計算を行った。膜の系をあらわに計算に取り込むのは困難なので、以下の近似を行った。(1)膜内を、誘電率24の一様な空間とし、脂質分子は考慮しない。(2)ループ部分は切り離し、膜中ヘリックス部だけで計算する。(3)膜環境に相当する束縛をかけた。以上の条件で100ピコ秒のシミュレーションを行ったところ、極性領域が少ないヘリックスが大きく傾き、レチナ-ルは細胞外側に傾いた。各原子間の平均二乗距離はまだ数Aと大きいが、定性的な構造は天然のbRと良く似ており、より詳細な構造を予測できる可能性が示された。
生体膜リン脂質合成不全による筋ジストロフィーの病態解明と治療法開発

この研究は、遺伝的なホスファチジルコリン合成酵素異常による「ミトコンドリアの巨大化を伴う筋ジストロフィー」の病態機序解明と治療法開発を目指したものである。1.CHKBの相同遺伝子であるchkbにnull変異を持つマウスは、ヒト筋ジストロフィー同様ミトコンドリアの巨大化を示す。このマウスの骨格筋ではホスファチジルコリン含量が低下しているが、その脂肪酸分子種プロファイルをマススペクトロメとリー解析により調べたところ、骨格筋および骨格筋より単離したミトコンドリアにおいてドコサヘキサエン酸を含むホスファチジルコリンが著減していることがわかった。これは、ドコサヘキサエン酸を含むホスファチジルコリンによる治療に役立つ可能性を示唆している。2.このマウスの骨格筋では、ミトコンドリアからの活性酸素産生が増加し、過酸化脂質が増加していることを見いだしている。酸化ストレスはミトコンドリア機能低下や骨格筋の変性に関わっていると考えられている。抗酸化薬であるトロロックスをモデルマウスに与え、治療効果を検討した。骨格筋において酸化ストレスの指標である過酸化脂質の減少がみられたが、ミトコンドリア形態には大きな変化は見られなかった。3.このマウスの骨格筋では、ミトコンドリアが選択的に自己貪食され、病気の進行にしたがい、経時的に消失していくことを見いだした。この疾患の特徴であるミトコンドリアの形態異常にミトコンドリア選択的オートファジーが関わっている可能性を示唆した。これは、ホスファチジルコリン合成酵素異常によって引き起こされるミトコンドリアの巨大化を伴う筋ジストロフィーの病態機序解明と治療法開発を目指したものである。1.ヒトにおけるホスファチジルコリン合成酵素遺伝子変異の探索において、15例の先天性筋ジストロフィー患者で、ホスファチジルコリン合成の第一段階を担うコリンキナーゼ遺伝子CHKBに、11種類の機能喪失変異を見出すことができた。ホスファチジルコリンに代表されるリン脂質のde novo合成酵素の遺伝子変異によるヒト疾患は、これが始めての報告であることは大変意義深いと考えられる。これらの変異を持つ患者の臨床症状について詳細に調査し、すべての患者で骨格筋ミトコンドリアの巨大化、知能障害など比較的均一な臨床像を示すことを見出した。2.CHKBの相同遺伝子であるChkbに変異を持つマウスは、ヒト筋ジストロフィー同様ミトコンドリアの巨大化を示す。このマウスのミトコンドリアではホスファチジルコリン含量が低下し、呼吸鎖酵素活性が低下していることが予備的研究で明らかになっていた。単離ミトコンドリアにリポソーム融合実験を行い、呼吸鎖酵素活性が回復するかどうかを調べたところ、ホスファチジルコリンと陰性荷電リン脂質であるカルジオリピン混合リポソームは、ミトコンドリア内膜と融合し、呼吸鎖酵素活性を軽度回復させることが示された。リポソームを用いたミトコンドリアへのリン脂質補充は、コリンキナーゼ欠損によるミトコンドリア異常の治療に役立つ可能性を示した。