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ファミリーホーム制度研究――家庭養護を中心とした新しい児童福祉体系の構築

本研究の目的は、ファミリーホーム(以降FHと記す)制度発展のための効果的実践方策を、FHの養育者における意識的要因と、FH制度に関する制度的要因において分析することである。今年度は制度的要因課題に関する分析をFHの養育者に対して実施した調査(以降本調査と記す)に基づき行い、次の2点の傾向を確認した。1)今年度実施した本調査における委託児童(n=79)の傾向については委託児童の平均年齢は11.1歳、53.2%の児童に発達障害等の障害があり、きょうだい児を委託するホームは14ホーム中11ホームであった。ここから、FH制度は特に1高年齢児、2障害児童、3きょうだい児の養育を行う制度として機能している点が指摘できる。2) FHの養育者は児童の養育に際し、経済的支援、人的支援をはじめ多様な支援を必要とすることが確認できた。経済的支援については、FHには高齢児が委託されることから、児童の学校生活関係費(通学費、部活動費、交際費等)に対する更なる経済支援のほか、特に進学希望の委託児童に対する長期的経済支援制度(18歳後の委託満了後も利用可能な制度で、大学入学金、授業料等を援助する)が不可欠である。人的支援については、補助者制度の一層の拡充である。一案として、FH人材登録制度を提案したい。これは補助者を必要とするFHと、補助者としての勤務希望者で、要保護児童の養育経験者とが人材登録する制度である。これにより、FHの養育者が、養育経験豊富な補助者を探すことが可能になる。今年度実施した本調査の概要について。1調査対象FHは14ホーム(個人型10ホーム、法人型4ホーム)、2調査対象者は主としてFHの専業の養育者、3委託児童総数は79人、1ホームあたりの平均委託児童数は約5.6人、4調査地域は、札幌市、北海道、和歌山県である。調査遂行においては、日本社会学会が定める倫理綱領を遵守し実施した。現在までの本研究の達成度としては、おおむね順調に進んでいる。今年度はFH制度発展のための効果的方策を「制度的要因」の観点から分析し、以下3点の結論を得た。1)FH制度は高年齢児、障害児など養育が極めて困難な児童が養育される傾向にある。法人型FHに委託されている要保護児童は法人本体からの支援が可能であり(例えば養育者が所属する法人のスタッフが必要に応じて養育者の養育を支援する等)、より養育困難な児童が委託される傾向にあることが確認できた。2)FHの養育者は児童の養育に際し、様々な支援を必要とする。例えば、レスパイト・ケア等、養育者の一時的な休息のための援助制度や、障害等を持つ児童の養育に関する専門的知識を得るための研修制度等である。レスパイト・ケアについては、本調査からは、FHの養育者は、一時的に児童の養育から離れ休息する制度を必要としていることが確認できた。現在、FH制度のもとでは補助者がいるという点で、レスパイト・ケアを利用することができない(里親制度のもとでは利用可能)。しかし、たとえ補助者がいる場合においても、補助者に児童の養育における全責任を負わせることは難しく、FH制度においても養育者の養育負担軽減のための休息援助制度の整備が急務である。また、研修制度については、FH制度に委託される児童は高年齢児、障害児の傾向にあることから、児童の養育に関する専門的知識が不可欠である点が指摘できる。3)家庭養護体系(養子制度、里親制度、FH制度から構成)におけるFH制度の位置づけを要保護児童の委託順という観点からとらえると、実親家庭復帰の見込みのない児童の処遇については、養子縁組が可能であれば養子縁組を行うことが望ましく、それが難しい場合は、児童の年齢に応じて里親制度(特に低年齢児を委託)ないしFH制度(特に高年齢児を委託)を活用することが望ましいことが指摘できる。今後の研究についてもおおむね研究計画通り進める。次年度は研究最終年度としてこれまでの研究成果の総括を次の2つの観点から行う。第一に、FH制度発展のための効果的方策を、養育者に対する本調査結果に基づき意識的、制度的側面から提言する。第二に、これまでの研究成果をもとに、児童に対し安定的、継続的な養育者及び養育環境を保障するパーマネンシー理念を提示し、本理念に基づき、家庭養護を前提とした児童福祉体系を構築する。その上で、本体系下にFH制度を位置づけ、その機能を示す。第一の点については、本研究ではFH制度発展のための効果的実践方策を、FHの養育者における意識的要因とFH制度に関する制度的要因において調査に基づき分析した。前者の分析からは、FHの養育者は、養育者になった動機が、a)要保護児童の福祉増進のため、という道徳的使命感に基づくことが示され、そのような使命感を持つ養育者においては、b)高年齢児や障害児の養育について理解が深く、c)養育者と補助者とのFHにおける役割を把握しており、FH制度を、要保護児童の社会化、という家族機能を遂行する制度として理解していることが明らかになった。しかし一方、d)委託児童数が多く、養育負担が少なからずあることが指摘できる。後者の分析からは、上述したd)の課題を克服するため、e)養育者ないし委託児童に対する、委託終了後も含めた経済援助等の支援制度を拡充する必要があることが確認できた。第二の点については要保護児童の養護目標として永続的、安定的な家族を児童に保障しようとするパーマネンシー理念を日本の児童福祉の理念的基盤として提唱する。

この理念に基づき家庭養護を前提とした児童福祉体系を構築し、本体系下におけるFH制度の位置づけを明確にする。本研究の目的は、ファミリーホーム(以降、FHと記す)制度発展のための効果的実践方策を、FHの養育者における「意識的要因」と、FH制度に関する「制度的要因」において分析し、提言することである。今年度は意識的要因課題に関する理論分析を、先行研究の検討を通して行い、次の3点の仮説を導いた。第一に、養育者になった動機が要保護児童の福祉増進のため、という道徳的使命感に基づく養育者は、高年齢児や障害児の養育について理解が深い。第二に、上記のような動機をもつ養育者は、委託児童数が多いにも関わらず、養育負担感が少ない。第三に、FH制度における養育者と補助者の役割を以下に述べるように認識している養育者は、FH制度を、要保護児童の社会化という家族機能を遂行する制度として理解する。FH制度における養育者の役割とは、要保護児童の社会化を、責任をもって行うことである。一方、補助者の役割とは、家事補助役割等、養育者の養育役割を補助することである。このような認識を持つ養育者は、FH制度を、要保護児童の社会化という家族機能を遂行する制度として理解する。上記の3点の仮説を証明するため、次年度以降はFHの(専業)養育者を対象にした聞き取り調査を行う。聞き取り調査の効果的な遂行に際し、調査対象者に対する事前の質問紙調査を実施する。今年度はこの調査票の作成を行った。本調査票における主な質問項目は、次の通りである。1FHの形態(法人/個人型、委託児童数、FHの家族構成等)、2補助者の状況(補助者の勤務状況、養育者との関係性、FHにおける役割等)、3委託児童の状況(委託目的、委託期間等)、4養育者の状況(FH開設の動機等)。本質問紙調査を既に調査協力を得ている札幌市里親会のFH養育者の方に配布し、次年度以降の聞き取り調査に備えた。現在までの本研究の達成度としては、おおむね順調に進んでいる。今年度は意識的要因課題に関する分析を、主に先行研究の検討を通して行い、次の3点の結果を得た。1)FHに委託されている要保護児童の傾向、2)FHの主要形態、FHの平均委託児童数、3)養育者と補助者のFHにおける役割。1)については、FHには、里親委託児、児童養護施設入所児に比べ、中学生以上で(28.7%)、障害があり(37.9%)、学業に遅れがある(39.2%)児童が委託され、約6割の児童に被虐待経験があることから、FHには養育困難な児童が委託される傾向にある。従って、FHの養育者は要保護児童(特に高年齢児、障害児、被虐待児)に対する高い理解度が要されるが、実際、FHの養育者の約7割は要保護児童の養育経験が10年以上であり、養育者は要保護児童に対し高い理解度を有していることが推察される。2)については、ファミリーホームの設置主体については、個人型ファミリーホームが主流であり、委託児童数は概ね6人である。FH制度は、従来多人数の児童を養育していた里親の養育形態を事業化した制度であることから、FHの委託児童数は多人数である傾向にある。3)については、養育者は50代後半の傾向にあり、児童の養育、家事、FH運営業務の全般において主要な役割を果たしている。一方、補助者については、補助者は40代前半であり、補助者には養育者の親族、実子、養子がなっている。
仮想ヒトゲノム二次元電気泳動法による疾患関連遺伝子の解明

ヒトゲノム2次元電気泳動法により各種癌細胞に特異的なDNA構造や遺伝子構造を解明するには従来法では多くの時間と費用と労力を必要とした.そこで,ヒトゲノムプロジェクトの成果を踏まえて仮想ゲノム2次元電気泳動法を開発し簡便にDNA変化を同定することを目指して,既に全塩基配列が決定されている大腸菌ゲノムを利用してこの様なアプローチが可能かどうかを証明した.「方法」既に全塩基配列が決定されている大腸菌よりDNAを抽出し,制限酵素により断片化したのち断端部をラジオアイソトープでラベルし第1次元目の電気泳動を行い,さらに第2番目の制限酵素を作用させ第2次元目の電気泳動を施行した.それぞれのスポットについて塩基配列を決定するためにはスポットを切り出しベクターに組み入れ大腸菌にてDNAを増幅して全塩基配列を決定した.仮想ゲノム2次元電気泳動法は,分子量Mの対数と相対移動度mとの関係が線形関係(M)=a-bMにあることからコンピューターを用いて計算し,プロフィールを得た.上記仮想および実体2次元電気泳動のプロフィール比較し同一スポットと考えられる3スポットについてその塩基配列を検討した.制限酵素の組合せは2種類について仮想および実体2次元電気泳動法を施行し比較検討した.「結果」仮想ゲノム2次元電気泳動法にても実体2次元電気泳動法とほぼ同様のプロフィールが得られた.しかも,制限酵素の組合せを変化させるとゲノム2次元電気泳動プロフィールは全く異なっていたが,特定の制限酵素組合せにより得られた仮想および実体ゲノム2次元電気泳動プロフィールは一致していた.仮想および実体ゲノム2次元電気泳動プロフィールで同一と考えられたスポット3個について塩基配列を決定し比較したところ3個とも100%と一致した.「結語」仮想ゲノム2次元電気泳動法は新しい疾患関連遺伝子を同定するのに有用な方法である可能性が示された.ヒトゲノム2次元電気泳動法により各種癌細胞に特異的なDNA構造や遺伝子構造を解明するには従来法では多くの時間と費用と労力を必要とした.そこで,ヒトゲノムプロジェクトの成果を踏まえて仮想ゲノム2次元電気泳動法を開発し簡便にDNA変化を同定することを目指して,既に全塩基配列が決定されている大腸菌ゲノムを利用してこの様なアプローチが可能かどうかを証明した.「方法」既に全塩基配列が決定されている大腸菌よりDNAを抽出し,制限酵素により断片化したのち断端部をラジオアイソトープでラベルし第1次元目の電気泳動を行い,さらに第2番目の制限酵素を作用させ第2次元目の電気泳動を施行した.それぞれのスポットについて塩基配列を決定するためにはスポットを切り出しベクターに組み入れ大腸菌にてDNAを増幅して全塩基配列を決定した.仮想ゲノム2次元電気泳動法は,分子量Mの対数と相対移動度mとの関係が線形関係(M)=a-bMにあることからコンピューターを用いて計算し,プロフィールを得た.上記仮想および実体2次元電気泳動のプロフィール比較し同一スポットと考えられる3スポットについてその塩基配列を検討した.制限酵素の組合せは2種類について仮想および実体2次元電気泳動法を施行し比較検討した.「結果」仮想ゲノム2次元電気泳動法にても実体2次元電気泳動法とほぼ同様のプロフィールが得られた.しかも,制限酵素の組合せを変化させるとゲノム2次元電気泳動プロフィールは全く異なっていたが,特定の制限酵素組合せにより得られた仮想および実体ゲノム2次元電気泳動プロフィールは一致していた.仮想および実体ゲノム2次元電気泳動プロフィールで同一と考えられたスポット3個について塩基配列を決定し比較したところ3個とも100%と一致した.「結語」仮想ゲノム2次元電気泳動法は新しい疾患関連遺伝子を同定するのに有用な方法である可能性が示された.
アメリカ資本主義と科学技術

19世紀から20世紀前半までのアメリカ南部の工業化過程についての研究が集約され、綿業を中心とした初期の産業興隆から装置産業の発展が注目されている。また19世紀後半からの機械工業、石油産業、ついで化学工業の展開について、イギリスをはじめとするヨ-ロッパからの技術移転、アメリカ的なエンジニアリングの成立過程が明らかとなった。とくに重点をおいて研究された問題点は以下のとうりである。(1)アメリカ機械工業における大量生産方式の発展に対する軍需の役割とそれが工作機械工業に与えた影響(2)アメリカン・システムの成立と生産管理及び労務管理の技術的な背景,とくにそこにおけるテ-ラ-に代表されるアメリカ機械技師協会(アメリカ機械学会)の役割(3)二つの世界大戦とそれが科学技術政策に与えた影響(4)ニュ-ディ-ラ-の経済政策と科学技術政策(5)軍事先導型の大型プロジェクト研究の成立(6)アメリカ議会の科学技術政策への関与また、近年の日米関係にかかわる問題として、先端技術部門でのアメリカの役割について、当初計画に加えて検討した。これらの結果、アメリカの科学技術上の業績の多くが、軍事研究開発とのつながりのなかで達成されたものであることが確認され、新しい国際関係のなかで、アメリカがどのように科学技術開発の体制を再構築していくかが大きな問題として残されていることが明らかになった。19世紀前半以前のアメリカ科学技術については、初期の北部における工業化から南部の開発への進展および機械工業と製鉄業の成立が注目される。また19世紀中期以降については、機械工業、石油産業、ついで化学工業が検討され、以下に記すような視点からの研究が進行している。(1)初期のアメリカ工業が植民地としての制約下にあった中での、イギリスの対植民地政策の役割(2)イギリスをはじめとするヨ-ロッパからの技術移転(3)アメリカ機械工業における大量生産方式の発展に対する軍需の役割とそれが工作機械工業に与えた影響(4)石油工業の成立とアメリカ的なエンジニアリングの成立、および工学の教育体制の成立これらの研究において、20世紀前半期に爆発的に発展するアメリカ資本主義のキ-となった科学技術の背景について問題点を整理している。また、次年度に集約することになる20世紀前半期の問題点につき、以下の諸点の研究に着手した。(5)アメリカン・システムの成立と生産管理及び労務管理の技術的な背景,とくにそこにおけるアメリカ機械技師協会(アメリカ機械学会)の役割(6)二つの世界大戦とそれが科学技術政策の成立に与えた影響(7)ニュ-・ディ-ラ-の経済政策と科学技術政策(8)軍事先導型の大型プロジェクト研究の成立(9)アメリカ議会の科学技術政策への関与なお、関連文献のデ-タベ-スについては約4500件を収録し、研究班内部において利用を試行している段階である。19世紀から20世紀前半までのアメリカ南部の工業化過程についての研究が集約され,綿業を中心とした初期の産業興隆から装置産業の発展が注目されている。また19世紀後半からの機械工業,石油産業,ついで化学工業の展開について,イギリスをはじめとするヨ-ロッパからの技術移転,アメリカ的なエンジニアリングの成立過程が明らかとなった。(1)アメリカ機械工業における大量生産方式の発展に対する軍需の役割とそれが工作機械工業に与えた影響(2)アメリカン・システムの成立と生産管理及び労務管理の技術的な背景,とくにそこにおけるテ-ラ-に代表されるアメリカ機械技師協会(アメリカ機械学会)の役割(3)二つの世界大戦とそれが科学技術政策に与えた影響(4)ニュ-ディ-ラ-の経済政策と科学技術政策(5)軍事先導型の大型プロジェクト研究の成立(6)アメリカ議会の科学技術政策への関与また,近年の日米関係にかかわる問題として、先端技術部門でのアメリカの役割について,当初計画に加えて検討した。
血管内視鏡を用いた微小血管吻合部の血栓形成に関する基礎的研究

血管吻合を用いた手術手技は現在広く利用されている手技である。この血管吻合を用いた手術の重大な合併症として血栓形成があり、この予防および除去は重要な問題である。今回微小血管吻合後の血栓形成過程を観察し形成原因を解明する目的で実験を行った。実験では径が0.5mmの血管内視鏡を用いて、実験動物において血管吻合を行った部分の血栓形成過程を経時的に観察した。使用した実験動物は、家兎およびラットであった。血管内壁の損傷が血栓形成に与える影響を調べる目的で、大腿動脈および静脈に縦方向に切開を加え同部分を縫合し、血管が部分的に狭窄するようにしたモデルを作成した。この結果では、静脈の縫合部分に血栓形成が、血行再開後20分で認められた。一方、動脈の縫合部分では血栓形成を認めなかった。同様に、血管内壁の横方向の部分的な切開縫合が血栓形成に与える影響についても、観察を行った。この実験では意図的に血管内壁に縫合する損傷が生じるようにした。この結果でも静脈では内腔に縫合後10分で血栓形成を認めたが、動脈では結成形成を認めなかった。血管吻合部分の血栓形成が生じやすくするために、吻合部分の内壁に一部損傷を加えた後、全周性に吻合したモデルを作成観察した。この結果では吻合10分後より動静脈ともに血栓形成が観察された。この過程において静脈の吻合部では、血栓形成は吻合部分より中枢部分に認められ、次第に抹消部分に拡大して行く状態が観察された。一方動脈吻合モデルの観察では、血栓形成は吻合部分より抹消部分に認められ、吻合部分より中枢部分には血栓形成を認めなかった。以上の実験結果より、吻合部分の血栓形成過程は、動脈の吻合、静脈の吻合それぞれにおいてその形成機序が同一ではなく。さらに、その内膜の損傷の程度や狭窄の状態によっても異なると考えられた。
アルツハイマー病関連蛋白プレセフィリンの機能解析と痴呆患者における突然変異検索

家族性アルツハイマー病の病因遺伝子として、プレセニリン(PS)の発見は大きな意義があったが、その生理的意義は未だ明らかでない。われわれは以前に、マウス脳ライブラリからYeast two hybrid法によりPS結合蛋白であるプレセフィリン(PSP)をクローニングした。これまでにPSPは6084塩基、2027アミノ酸からなる非膜結合性蛋白であること、脳特異的発現を示し、細胞質に発現していること、Src Homology 3(SH3)およびSH3結合ドメインを持つこと、免疫共沈降法によりPSのみならず、チロシンキナーゼ情報伝達系のアダプター蛋白であるCrk蛋白とも結合することなどを示し、PSおよびPSPのチロシンキナーゼ情報伝達系との関連を検討してきた。今研究では、ヒト脳ライブラリを用いてのプラーク・ハイブリダイゼーション法およびクロンテックMarathon-Readyヒト脳cDNAを用いた5'-RACE法を併用して、PSPのヒト・カウンターパートのクローニングを行った。得られたクローンはcoding regionが6093塩基で2030アミノ酸からなり、マウスのものと同様に5'末端に1つのSH3ドメイン、3'末端に2つのSH3結合ドメインを持つことが明らかとなった。マウスとのホモロジーはDNAで91.4%、アミノ酸で97.9%であった。このcDNAを手がかりにゲノムクローニングを行っており、現在進行中である。これまでにPSPは6084塩基、2027アミノ酸からなる非膜結合性蛋白であること、脳特異的発現を示し、細胞質に発現していること、Src Homology3(SH3)およびSH3結合ドメインを持つこと、免疫共沈降法によりPSのみならず、チロシンキナーゼ情報伝達系のアダプター蛋白であるCrk蛋白とも結合することなどを示し、PSおよびPSPのチロシンキナーゼ情報伝達系との関連を検討してきた。今年度は、ヒト脳ライブラリを用いてのプラーク・ハイブリダイゼーション法およびクロンテックMarathon-Readyヒト脳cDNAを用いた5'-RACE法を併用して、PSPのヒト・カウンターパートのクローニングを行った。また、現在このヒトPSPの一部をGST結合蛋白として作製し、これを用いてウサギ・抗ヒトPSPポリクローナル抗体を作成中である。
心不全患者の運動耐容能と細胞レベルでの乳酸移送蛋白発現量との関連に関する研究

MCT(Monocarboxylate transporter)蛋白は生体での乳酸移動に関与する重要な膜蛋白である。現在MCT familyとしてMCT1から8までがcloningされている。それぞれのisoformは体内分布や、乳酸取り込みや放出など機能的に特徴があると考えられているが、ほとんど解明されていない。最近トレーニングにより骨格筋のみならず心筋でもMCTの発現量が大きく変化することが報告された。心不全患者において血液や筋生検によりこの蛋白の発現量を検討することにより、運動時骨格筋pH低下の一因を説明できる可能性がある。我々はヒトMCT1に対するPolyclonal抗体を作成し、まず赤血球のMCT1と運動選手の運動能力子の関係について検討した。まず、ヒトMCT1のアミノ酸配列から、C末端の11塩基をペプチド合成し家兎に投与することでpolyclonal抗体を作製した。さらに抗体で検出した蛋白をアミノ酸分析することにより確かにMCT1であることを確認した。1)非運動群として医学生(n=6)を、運動群として中長距離走者(n=13)を対象とし、運動群の運動能力についてはOBLA(0nset of blood lactate accumulation)時の速度(km/h)で評価した。被検者の赤血球より膜分画を精製分離し、immunoblot法を用いてMCT1を検出定量した。結果は、i)赤血球のMCT1発現量は有意に運動群で高かった(P<0.05)。ii)運動群でのOBLA時の走行速度と赤血球のMCT1量はr=-0.73の逆相関を認めた(P=0.0066)。2)学生運動部員8人と心不全患者4人について、MCTと運動耐容能(peakVO2)との関係を調べた。結果はi)peakVO2と赤血球膜のMCT量の間には全体として、r=-0.87,P=0.0086の逆相関を認めた。ii)運動群単独のみでは相関はなく、心不全患者では、n=4のため有意ではないが、r=0.749 p=0.1355の正相関を認めた。このことから赤血球でのMCT1の発現は、運動能力と相関する可能性が示唆された。今後、赤血球膜のMCT発現量と心不全患者の運動耐容能との関係の検討、また筋生検などのデータから骨格筋でのMCT発現を検討し、心不全患者の運動耐容能低下のメカニズムが解明できる可能性があるものと考える。現在MCT familyとしてMCT2から7までがcloningされている。それぞれのisoformは体内分布や、乳酸取り込みや放出など機能的にも特徴があると考えられているが、ほとんど解明されていない。

我々はヒトMCT1に対するPolyclonal抗体を作成し、まず赤血球のMCT1と運動選手の運動能力の関係について検討した。ヒトMCT1のアミノ酸配列から、C末端の11塩基をペプチド合成し家兎に投与することでpolyclonal抗体を作製した非運動群として医学生(N=6)を、運動群として中長距離走者(N=13)を対象とし、運動群の運動能力についてはOBLA(Onset of blood lactate accumulation)時の速度(km/h)で評価した。その結果、1)赤血球のMCT1は有意に運動群で高かった(P<0.05)。2)運動群でのOBLA時の走行速度と赤血球のMCT1はr=-0.73の逆相関を認めた(P=0.0066)。このことから赤血球でのMCT1の発現は、運動能力と相関する可能性が示唆された。今後、赤血球膜のMCT発現量と心不全患者の運動耐容能との関係の検討、また筋生検などのデータから骨格筋でのMCT発現を検討し、心不全患者の運動耐容能低下のメカニズムが解明できる可能性があるものと考える。MCT(Monocarboxylate transporter)蛋白は生体での乳酸移動に関与する重要な膜蛋白である。現在MCT familyとしてMCT1から8までがcloningされている。それぞれのisoformは体内分布や、乳酸取り込みや放出など機能的に特徴があると考えられているが、ほとんど解明されていない。最近トレーニングにより骨格筋のみならず心筋でもMCTの発現量が大きく変化することが報告された。心不全患者において血液や筋生検によりこの蛋白の発現量を検討することにより、運動時骨格筋pH低下の一因を説明できる可能性がある。まず、ヒトMCT1のアミノ酸配列から、C末端の11塩基をペプチド合成し家兎に投与することでpolyclonal抗体を作製した。さらに抗体で検出した蛋白をアミノ酸分析することにより確かにMCT1であることを確認した。1)非運動群として医学生(n=6)を、運動群として中長距離走者(n=13)を対象とし、運動群の運動能力についてはOBLA(Onset of blood lactate accumulation)時の速度(km/h)で評価した。被検者の赤血球より膜分画を精製分離し、immunoblot法を用いてMCT1を検出定量した。結果は、i)赤血球のMCT1発現量は有意に運動群で高かった(P<0.05)。ii)運動群でのOBLA時の走行速度と赤血球のMCT1量はr=-0.73の逆相関を認めた(P=0.0066)。2)学生運動部員8人と心不全患者4人について、MCTと運動耐容能(peakVO2)との関係を調べた。結果はi)peakVO2と赤血球膜のMCT量の間には全体として、r=-0.87,P=0.0086の逆相関を認めた。ii)運動群単独のみでは相関はなく、心不全患者では、n=4のため有意ではないが、r=0.749 p=0.1355の正相関を認めた。
ターンオフサイリスタの安全動作領域の数理解析

電力用半導体デバイスとくに自己消弧形デバイスのスイッチング特性を数値解析する新しい手法を導くとともに,これらのデバイスの特性と素子構造の間の重要な関係を明らかにした.計算手法の独創性は, (1)不均一・可変メッシュの導入, (2)2次元モデルによる擬3次元解析の実行の二つに要約される.ともに半導体素子のスイッチング時の内部状態の変化に対する考察から,半導体素子の動作状態に対応し収束性が最も高いメッシュ構造と半導体内の位置が局限されると推定し不均一かつ可変のメッシュ構造を導入して解析することを行った.この結果計算時間は従来に比し,約40-50%短縮することが可能になり,スーパーコンピュータの利用により,合理的な計算費用の中でこのような解析手法が十分に設計支援に用いられることが示された.さらに3次元構造をもつデバイスであっても,素子製造プロセスと設計上の制約から特定の時点の現象は特定の内部状態で一様であるという性質を用いて, 2次元モデルをこれらに局限して適用し,それらを過渡現象の進行に応じて切換えれば擬3次元解析が可能となる.これらの手法は実際に静電誘導形サイリスタ(SITh)とアノード短絡形GTOに適用され,いくつかの実用上重要な知見がえられた.これらの中で代表的なものを列挙すれば(1)SIThの埋込電極内へのキャリヤの浸透(2)ターンオフデバイスのテイル期間およびテイル電流の大きさへのベース構造との依存性(3)アノード短絡サイリスタでの短絡とライフタイムのトレードオフ電力用半導体デバイスとくに自己消弧形デバイスのスイッチング特性を数値解析する新しい手法を導くとともに,これらのデバイスの特性と素子構造の間の重要な関係を明らかにした.計算手法の独創性は, (1)不均一・可変メッシュの導入, (2)2次元モデルによる擬3次元解析の実行の二つに要約される.ともに半導体素子のスイッチング時の内部状態の変化に対する考察から,半導体素子の動作状態に対応し収束性が最も高いメッシュ構造と半導体内の位置が局限されると推定し不均一かつ可変のメッシュ構造を導入して解析することを行った.この結果計算時間は従来に比し,約40-50%短縮することが可能になり,スーパーコンピュータの利用により,合理的な計算費用の中でこのような解析手法が十分に設計支援に用いられることが示された.さらに3次元構造をもつデバイスであっても,素子製造プロセスと設計上の制約から特定の時点の現象は特定の内部状態で一様であるという性質を用いて, 2次元モデルをこれらに局限して適用し,それらを過渡現象の進行に応じて切換えれば擬3次元解析が可能となる.これらの手法は実際に静電誘導形サイリスタ(SITh)とアノード短絡形GTOに適用され,いくつかの実用上重要な知見がえられた.これらの中で代表的なものを列挙すれば(1)SIThの埋込電極内へのキャリヤの浸透(2)ターンオフデバイスのテイル期間およびテイル電流の大きさへのベース構造との依存性(3)アノード短絡サイリスタでの短絡とライフタイムのトレードオフ本年度は前年度に導かれた数値解析モデルについて、特に不均一メッシュの位置の選択に対する計算時間の短縮の程度の検討と、各種のスイッチング条件を計算するメッシュの選択を一様にした場合と異なるメッシュを相互に接続して一連のスイッチングの計算をした場合の比較、さらにデバイスパラメータの演算の収束性に対する影響など、数理解析上の能率向上についてまず研究を行った。この結果、ターンオン時とターンオフ時のメッシュの配置を異なるものとすることにより、収束性と平滑性のよい解析が可能になり、特にターンオフ時の電流集中の状況がある程度正確に計算できるようになった。これにより局所的な損失分布が過渡的に与えられる。素子特性の解析面では、ゲートターンオフサイリスタと静電誘導サイリスタのスイッチング特性の解析を相互に比較しながらすすめた。計算のベースは実素子のデータに依存しているので全く同一条件下とはいえないが、特にオン損失の面を中心に静電誘導サイリスタの温度上昇面での優位性が明らかになったが、電流のチャネル部への集中が激しいために、熱ストレスその他の点から信頼性上配慮すべき点は少くない。静電誘導サイリスタではむしろターンオン時の電流集中が激しいが、スイッチの方法が在来形の素子に比して十分に確立されていない点もあり、今後さらに検討を加えたい。温度上昇のモデルは上で確立されたメッシュ構造と対応させて製作中であり、過度計算は次年度の課題となろう。また大形G-10サイリスタによる実験的な安全動作領域の評価についてはモデルコンバータユニットを作成している。計算手法との対応をとり、同時に限られた外部端子のデータを用いるための測定データの処理方式についても検討を加えている段階にある。
南極積雪中で変質する大気エアロゾル起源物質の構造及び挙動解明

本研究で開発したフロリナートによる液浸法を用いて、南極積雪中介在物の光学顕微鏡観察および顕微ラマン分光分析を行った。南極表面積雪の氷粒子内には、ミクロンオーダーのサイズを持つ微粒子はほとんど存在せず、微粒子から水溶性塩のラマンシグナルは検出されなかった。その一方で、氷化深度付近のフィルン内部では、無数のスーパーミクロン粒子が観察され、これらの組成は主に水溶性硫酸塩であることが明らかになった。これらの結果は、氷床表面にサブミクロンサイズの水溶性エアロゾルが沈着した後、積雪内部で化学成分の再分布・化学反応が生じ、深さとともにエアロゾル起源粒子の成長・変質が進んでいることを示唆している。顕微ラマン分光法による氷床表層試料分析方法の確立雪試料をそのまま分析にかけると、その複雑な表面形態のために光の乱反射が生じて、分析ターゲットである氷に介在している数ミクロンの微小不純物粒子に対して適切にレーザー照射、ラマン散乱集光することができない。この問題を克服するために、申請者は雪試料を圧密氷化させて測定する方法を開発した。低温室内でペレタイザー(熱プレス機用金型)と一軸圧縮機を使って雪試料を圧縮・氷化させた後に、試料表面に対してミクロトームによる平滑処理を施した。低温室の温度環境(ー15°C)においては、5MPa程度の圧力を数十分加えることで、ラマン分析に適した試料を形成できることが分かった。南極内陸調査(試料採取)申請者は第54次南極地域観測隊内陸旅行に参加して、本研究で用いる氷床表層試料を採取した。南極内陸部の4地点(ドームふじ、MD364、みずほ、H72)で積雪試料を採取する計画であった。ドームふじとみずほにおいては、予定通り試料を採取できた。MD364のかわりに、その近くのMD314でサンプリングを行った。H72については、天候不順等の理由で行動を中止した。また、当初予定されていなかった新ドームふじ基地候補地および80Sで試料を採取した。採取した積雪試料を、S30地点から昭和基地までヘリ輸送した。その後試料を基地沿岸に停泊していた砕氷船しらせの冷凍庫に搬入し、日本へ向けて発送した。1)顕微ラマン分光法による氷床表層試料分析方法の改良雪試料をそのまま分析にかけると、その複雑な表面形態のために光の乱反射が生じて、分析ターゲットである氷に介在している数ミクロンの微小不純物粒子に対して適切にレーザー照射、ラマン散乱集光することができない。当初は、雪試料を圧縮・氷化させることで乱反射を軽減し、測定を進めていたが、氷の変形によって試料内部に微小ボイドが大量発生し、観察を困難にするという新たな問題が生じた。そこで研究代表者は、雪試料を氷と屈折率が近い透明液体(フロリナート)に浸して観察する方法を開発した。液浸法で得られる雪試料内部の光学イメージは良好であり、またフロリナートのラマン散乱波長がターゲットとしている不純物のそれと重ならないために、ラマン分析も問題なく行える。2)南極積雪の顕微鏡観察およびラマン分光分析液浸法による南極積雪中介在物の顕微鏡観察およびラマン分光分析を行い、以下の結果を得た。1南極表面積雪の氷粒内には、ミクロンオーダーのサイズを持つ微粒子がほとんど見当たらない。2表面積雪に含まれる微粒子からラマンシグナルは検出されず(おそらく組成は塩化物)。3その一方で、氷化深度付近のドームふじフィルン内部では、無数のスーパーミクロン粒子が観察される。4ドームふじフィルンに含まれる微粒子の組成は、主に硫酸塩(Na2SO4・10H2O、CaSO4・2H2O等)。今後の課題は、氷床表面から氷化深度までの間に、水溶性塩微粒子が成長・粗大化するプロセスを明らかにすることである。積雪サンプルを顕微ラマン分析するための試料形成方法を開発した。南極内陸調査に参加して、氷床積雪試料をほぼ予定通り採取することができた。積雪試料は、平成25年4月に日本へ無事到着し、現在北海道大学低温科学研究所の冷凍室に保管されている。25年度が最終年度であるため、記入しない。先ずは、南極積雪試料を従来型のイオン・同位体分析することによって、積雪の基本的な物理・化学的特徴を把握する。続いて、イオン・同位体分析の結果をもとに、より詳細な分析が必要な試料(例えば、水溶性化学成分の急激な化学変化が予想される箇所)を絞り込み、本研究で開発したラマン分光(非融解)測定を行う。

本研究で得られた化学分析の結果を総合的に解析することで、氷床表層プロセスが氷コア化学シグナルの形成過程に与える影響を評価するとともに、氷床コア化学シグナルの解釈を試みる。25年度が最終年度であるため、記入しない。
新規なスクアリリウム系クロモフォアーの開発と会合制御に関する研究

色素分子間の会合や色素分子内の水素結合部位を制御した新規なクロモフォアーの開発を目的として、複素環部分を非対称成分とする近赤外吸収スクアリリウム色素の合成、フェロセン部位を架橋部とする新規なスクアリリウム系色素二量体の合成、非対称複素環成分を有するπ-共役系を拡張したビススクアリル系色素の合成を行い、溶液中での分子内、分子間会合について検討した。以下の結果が得られている。1.非対称アリル成分を有する近赤外吸収スクアリリウム色素として、ベンゾインドール、ベンゾピリリウムを複素環成分とする非対称型スクアリリウム系近赤外吸収色素を合成することができた。これらスクアリリウム色素は、いずれも希薄溶液中でも680780nmと740800nmの領域に二つの吸収帯を示し、それぞれのモル吸光係数は10^5程度あり、X線構造解析の結果から、溶液中でもJ会合型の会合が期待された。2.フェロセン部位を架橋部とする新規なスクアリリウム系色素二量体は、フェロセンのジエステル誘導体を経て、スクアリリウム中間体との縮合反応から合成することができた。これらスクアリリウム系色素二量体は、各種スペクトルとの測定から分子内H会合型ダイマー構造の形成が示唆された。3.πー共役系を拡張したビススクアリル系色素は、ビスクアリック酸のイソプロポキシド誘導体から合成した。この色素系でも、希薄溶液で従来認められなかった色素分子間の会合由来の吸収ピークが出現し、ビススクアリル系色素の複素環部分を非対称成分にすることで、この会合割合は大きく変化することが判った。
接着分子の糖鎖リモデリングの生物学的意義の検討

糖転移酵素の中でN-glycanにGlcNAcをβ1-4結合でbisectingの形で付加するβ1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III(GnT-III)を種々の癌細胞に遺伝子導入した。細胞形態の著明な変化およびEGF刺激後のβカテニンの局在の変化を認めたが、糖鎖付加によりβカテニンのチロシンリン酸化が低下したためであった。活性化c-srcの遺伝子導入によるβカテニンのチロシンリン酸化も低下していた。ツニカマイシン処理でこれらの変化がすべて消失したことから、E-カドヘリン・βカテニン複合体へのbisecting GlcNAcの付加で細胞内の情報伝達が抑制され、細胞の運動性や癌転移の阻害に働くことが示唆された。N-glycanにGlcNAcをβ1-6結合で付加するGnT-Vの種々の癌組織における発現を免疫組織化学的に検討した。正常組織ではGnT-Vの発現はほとんど見られないが、多くの癌組織や前癌病変、さらに炎症反応や再生性変化の激しい部位でGnT-Vが強く認められた。肝癌症例ではGnT-V高発現群で有意に良好な予後を示した。正常肝組織にはGnT-Vは認められず、肝炎、肝硬変と進行するに連れて、発現が亢進し、高分化中分化型肝細胞癌で最も高い発現を示し、低分化型肝細胞癌で減弱することから、GnT-Vは肝癌発癌の初期の過程に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。N-glycanのGlcNAcにフコースを付加するα1-6 fucosyltransferase(α1-6FucT)を肝癌細胞へ遺伝子導入して、転移における意義を検討した。α1-6FucTを発現した肝癌細胞株はマウス脾内注射による肝転移実験で、有意に転移の抑制が見られた。マウス肝細胞およびフィブロネクチンへの接着性が低下しており、インテグリンα5β1分子のα1-6フコシル化が著明であるためと考えられた。以上より、接着分子は糖鎖の修飾を受けることにより、機能が調節されていることが明らかにされた。
糖鎖シグナルを介した新生糖タンパク質の細胞内輸送調節

VIP36は高マンノース型糖鎖を認識する細胞内レクチンであり、新生糖タンパク質に結合し、細胞内輸送を行なうタンパク質である。これまでVIP36はラット唾液腺に多く発現されていることが判っており、唾液中に移行する糖タンパク質の輸送・分泌に関わることが示唆されていたが、詳しいメカニズムは不明であった。本年度我々はラット唾液腺細胞には2種類の比重の異なる小胞が存在し、軽い画分には高マンノース型糖鎖を有したα-アミラーゼとVIP36が共存しているが、重い画分には糖鎖をもたないα-アミラーゼが存在するのみでVIP36は含まれていないことを明らかにした。また免疫沈降実験:から前者でα-アミラーゼとVIP36が結合していることを示した。一方、高マンノース型糖鎖を遊離しうるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性は2種の小胞共に存在した。以上の結果から、ラット唾液腺におけるα-アミラーゼの細胞内輸送に関する一つの可能性として、新たに合成された糖鎖を持つα-アミラーゼはVIP36に結合して比重の軽い小胞中に蓄積された後、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの作用により糖鎖が除去されVIP36と解離し、新たな輸送小胞(比重の重い小胞)へ貯蔵され分泌されるというスキームが推測された。また平成16年度はVIP36,ERGIC53及びVIPLの糖結合領域のcDNAクローニングを行ない、大腸菌の発現系を利用してリコンビナントタンパク質を調製し、BIA-CORE法によって解析した。その結果、VIP36は我々が以前報告したとおりMan_<7-9>の高マンノース型糖鎖に結合することを確認した。またERGIC53及びVIPLも高マンノース型糖鎖を認識することが判った。また免疫沈降実験から前者でα-アミラーゼとVIP36が結合していることを示した。VIP36及びERGIC53は小胞体から細胞膜への新生糖タンパク質輸送に関与すると考えられている。近年両者にそれぞれ相同性の高いタンパク質(VIPL,ERGL)が見い出された。これらの細胞内タンパク質の機能を解析するにあたり、糖結合特異性を明らかにすることは重要である。本研究者らはVIP36,ERGIC53及びVIPLの糖結合領域のcDNAクローニングを行ない、大腸菌の発現系を利用してリコンビナントタンパク質を調製し、BLA-CORE法によって解析した。

その結果、VIP36は我々が以前報告したとおりMan_<7-9>の高マンノース型糖鎖に結合することを確認した。またERGIC53及びVIPLも高マンノース型糖鎖を認識することが判った。ERGLについてはリコンビナントタンパク質を調製することが難しく、現在引き続き検討を行なっている。
硝酸蓄積硫黄酸化細菌の機能と湖沼生態系における物質循環への関与の解明

本研究では、湖沼底泥中に生息する大型の糸状性硫黄酸化細菌Thioplocaの包括的な理解のため、系統解析および生態学的・生理学的特性の解明を目的とした。オコタンペ湖の試料から複数タイプのITS領域配列が得られたため、タイプごとの垂直分布を調査したが、生息地の深さによるITS領域配列タイプの違いは見られなかった。カンボジアのトンレサップ湖で採取されたThioplocaの糸状性生物の形態観察および系統解析を行った結果、Thioplocaが熱帯域にも分布していることが初めて示された。富栄養化が深刻であり物質循環に関する研究が求められるトンレサップ湖において、窒素、硫黄、炭素の循環に影響を与え得るThioplocaの存在が確認されたことは、重要な知見であると考えられた。プロテオーム解析によりThioplocaの生理学的特性の推定を行った。その結果、生息地において脱窒、ジメチルスルフォキシド(DMSO)呼吸および酸素呼吸活性を有し、炭酸固定を行っていることが推定された。また、細胞付近の酸素濃度の測定を行ったところ、細胞に近づくほど酸素濃度が低下する傾向がみられ、Thioplocaの酸素呼吸能が支持される結果が得られた。これらの結果は、これまで不明であったThioplocaの生理学的特性の理解を大きく前進させるものと考えられた。Thioplocaのシース付着菌の群集構造解析を行ったところ、糸状性のchloroflexi門の細菌がシースに大量に分布していることが示された。この細菌の近縁種には多糖類を分解して発酵を行う細菌が存在することから、この付着菌はThioplocaのシースを炭素源やエネルギーとして利用している可能性が考えられた。現在のところ、特異的付着菌の生理学的特性は不明であるが、硝酸蓄積硫黄酸化細菌の生存戦略の解明につながる結果であると考えられた。硝酸を細胞内に蓄積する硫黄酸化細菌は、環境中の窒素および硫黄の循環への寄与が大きいと考えられている。しかし、純粋培養が得られておらず、その寄与の正確な程度は明らかになっていない。また、淡水環境の硝酸蓄積硫黄酸化細菌に関する知見は少ない。本研究では、主に北海道千歳市に位置する淡水湖であるオコタンペ湖より採取した試料を用いて、Thioplocaの生理学的特性および物質循環への関与の解明を目指した。酸素呼吸能の検証では、Thioploca試料付近で大きな酸素濃度の減少が確認された。実験に用いた試料には他の生物が混入している可能性があるため、今後、得られた結果がThioplocaに由来することを証明する必要がある。硝酸還元の最終産物特定のため、分子状窒素への還元について検証を行った。アセチレン阻害法による実験では、用いた試料による分子状窒素への還元を示す結果は得られなかった。分子状窒素への還元経路に関わるnirS遺伝子のダイレクトシーケンスより得られた配列は、オコタンペ湖と琵琶湖の試料では系統的に異なり、Thioploca由来ではないと考えられた。硫黄酸化に関わるaprA遺伝子のDGGE解析およびクローニング解析から、Thioploca由来と考えられる配列が得られた。オコタンペ湖と琵琶湖に生息するThioplocaは、堆積物表面ほど現存量が多く、その現存量は非常に狭い範囲において2桁近く異なったが、同地点の間隙水および堆積物の特性に大きな変化は見られなかった。オコタンペ湖およびドイツの淡水湖であるコンスタンツ湖では、複数種のITS領域の配列を持つThioplocaが同所的に生息していることが明らかとなった。オコタンペ湖と他の湖沼に生息するThioplocaに付着しているバクテリアの間に共通性が見出され、Thioplocaと付着菌の間に何らかの相互作用が存在することが示唆された。

現在のところ、特異的付着菌の生理学的特性は不明であるが、硝酸蓄積硫黄酸化細菌の生存戦略の解明につながる結果であると考えられた。
臍帯血細胞を用いた心筋細胞の分化誘導

【目的】臍帯血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。【方法】(1)臍帯血よりauto MACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。【結果】(1)臍帯血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞はin vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)増殖曲線は一週間で3倍程度の増加速度であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。【結論】臍帯血細胞中には間葉系の幹細胞が存在した。この細胞が心筋細胞に分化するかはさらなる研究が必要と考えられた。1.臍帯血からの間葉系幹細胞の分離臍帯血を遠沈後、赤血球分画を除去し、それ以外の細胞成分の分画とヒト胎児血清を得た。細胞の分画をファイブロネクチンでコートした細胞培養皿上に初代培養した。この時、初期の培養細胞に対しては非働化したヒト胎児血清を培養液中に20%添加した。24時間の培養後、血球系の細胞は浮遊系であり、血管芽細胞あるいは間葉系の幹細胞は付着系であることより、血球系の細胞を除去し、付着系の細胞のみ培養した。一定量の細胞数に達したところで細胞をトリプシン処理し、パーコールグラジエント法により特定の比重の細胞を収集した。ヒト骨髄間質細胞由来の間葉系幹細胞は一定の比重をとることが、別のグループから報告されている。この分画の細胞をさらに培養し、充分量の細胞を得た。2.心筋への分化誘導法の確立得られた間葉系幹細胞に対し、DNAの脱メチル化剤である5-アザシチジン、レチノイン酸、DMSO等を投与し、細胞培養を持続した。これ以外の方法としては、心筋分化に重要な働きを持つことが知られている細胞増殖因子、サイトカインとしてアクチビン、BMP-2、TGF-β、FGF、IGF-1等を使用し、心筋分化に進むか否かを検討した。初年度である本年度の研究の到達段階として、心筋細胞の最も重要な表現型である自己拍動する細胞であるか否かをメルクマールに細胞をスクリーニングしているところである。臍帯血細胞にはさまざまな多分化能を持つ幹細胞が高頻度で含まれている。本年度の解析では臍帯血中に骨髄中に存在する心筋分化能を有する幹細胞と同様の表面抗原を持つ細胞の存在を確認した。臍帯血を培養皿に一定期間放置し、培養皿に接着する細胞を分離した。この細胞群より、MAC-1陽性のマクロファージをautoMAXにより除去した。分離した細胞を血清20%存在下で培養し、細胞数を増やした後、FACS解析した。この細胞は培養皿に接着する能力を有し、表面抗原としてCD29,CD44,CD73を有していた。一方、血球系マーカーであるCD13,CD45は発現していなかった。これらの細胞に対し、GFPを発現するレトロウイルスを感染させ、細胞をマーキングした。ラットの新生児心筋を初代培養した細胞の上に重層し、心筋細胞に分化するかどうかを観察した。心筋分化は抗心筋ミオシン抗体による免疫染色を用いて行ったが、細胞を重層させた状態では下層に存在する心筋細胞が蛍光を持つのか、上層に存在する臍帯血由来の幹細胞が蛍光を持つのかを断定することが出来なかった。現在、ヒト特異的遺伝子プライマーによる心筋特異的転写因子NKX2.5,GATA4,HAND1,HAND2遺伝子の発現のRT-PCR解析を行っており、これらの心筋分化能を改正中である。【結果】

(1)臍帯血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞はin vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)増殖曲線は一週間で3倍程度の増加速度であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。【結論】臍帯血細胞中には間葉系の幹細胞が存在した。この細胞が心筋細胞に分化するかはさらなる研究が必要と考えられた。
肺がん上皮間葉転換の代謝特性の解明および治療法の開発

本年度は、我々が見出した新規EMT関連代謝遺伝子(EMT-MGs)の発現が、どのような転写因子で制御されているか検討を行った。SNAIファミリー転写抑制因子、TWISTファミリーBHLH転写因子、及びジンクフィンガーEボックス結合ホメオボックスといったEMT誘導転写因子(EMT-TF)によって、EMT関連遺伝子の発現は制御されていることが知られている。TGF-β誘導性のEMT-MGsの発現が既知のEMT-TFsで調節されているか調べた。はじめに、EMTマーカー遺伝子(CDH1、CDH2、及びFN1)、EMT-MGs、及び主なEMT-TFs(SNAI1、SNAI2、TWIST、ZEB1)について、TGF-β刺激後短時間(0、2、4、8、12、24、48時間)での発現変化を調べた。EMT-TFsについては、TWIST以外の3遺伝子の発現がTGF-β刺激後2時間で、十分な発現誘導が起こるのに対し、EMTマーカー遺伝子およびEMT-MGsの発現は2時間から発現変化が始まり、24-48時間にかけて徐々にその変化が顕著になった。次に、TGF-β刺激条件においてSNAI1、SNAIまたはZEB1の発現をsiRNAで抑制し、EMT-MGsの発現を調べた。TGF-βで誘導されるEMT-MGsの発現がSNAI1 siRNAによって抑制された。一方で、SNAI2またはZEB1 siRNAsはEMTマーカーの発現は抑制したが、EMT-MGsの発現には影響しなかった。これらの結果から、我々が見出したEMT-MGsは主にSNAI1によって発現制御されていることが示唆された。本年度は、前年度に明らかになった新規EMT関連代謝遺伝子(EMT-MGs)の機能解析、およびEMTとアミノ酸代謝の関係性についての検討を行い、以下の結果が得られた。1.間葉系形質の肺がん細胞(A549、H460、SW1573)で、EMT-MGsの発現をsiRNAで抑制したところ、上皮系細胞マーカー(CDH1)の発現上昇、細胞移動能の減少が認められた。2.(前年度のメタボローム解析で)TGF-βでEMTを誘導した肺がん細胞において(細胞内の)アミノ酸バランスが顕著に変化することが判明していることから、アミノ酸がEMTに及ぼす影響を調べた。(RPMI培地をベースとして)1種類ずつアミノ酸を除去した培地でA549およびSW1573細胞を培養し,EMTマーカー遺伝子の発現を調べた。その結果、13種のアミノ酸(Arg,Cys,Gln,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Thr,Trp,Tyr,Val)それぞれを培地から除去した場合に、間葉系細胞マーカー遺伝子(CDH2・ZEB1)の発現増加および、上皮細胞マーカー遺伝子(CDH1)の発現減少が誘導され、EMT様の遺伝子発現変化が観察された。平成29年度は、前年度に明らかになったEMT-MGsの機能解析を行った。また、アミノ酸とEMTの関係性など、興味深い知見が得られている。実験の進捗は当初の計画通り進んでいる。1.本検討で着目する代謝変化と(EMTのマスターレギュレーターである)転写因子Snailの関係性について調べる。SnailをsiRNAによるノックダウンまたは発現ベクターで強制発現させたときに注目する代謝経路が変化するか検討する。年度当初の計画時よりも、研究に必要な物品等の調達を安価に行うことができたため、次年度に使用する研究費が生じた。