hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プレクチン2遺伝子構造と発現調節機構

ある自己免疫性水疱症患者の血清が認識した450-kDaヒト表皮自己抗原のcDNAの全塩基配列を決定し、その蛋白質の一次構造をあきらかにした。その結果5,065個のアミノ酸からなり、推定分子量は552kDaであった。以前報告したようにこの蛋白質は、プレクチン、デスモプラキンとホモロジーが認められ、これらの蛋白質と同じプラキン・ファミリーに属するものであったが、以下の点で他のプラキン分子と大きく異なっており、エピプラキンと命名を変更した。即ち(1)デスモプラキンのカルボキシ末端に見られるBドメイン類似のドメインが13個直列にほぼ均等の間隔で繋がっていた。(2)このうちカルボキシ末端側5個のドメインとその連結部分はホモロジーが特に高く殆ど同-配列が認められた。(3)通常のプラキン分子に見られる棒状ドメインやアミノ末端ドメインは見られず、二量体構成モチーフも見られなかった。このことはエピプラキンがこれまでに知られていたプラキン・ファミリー分子とはカテゴリーの異なる分子に属することを意味し、今後の機能の解明が注目される。ライブラリーのスクリーニングに用いた患者血清が認識するエピトープをペプチド・ブロット法、ELISA法、ペプチド吸収法で決定したところ、エピプラキンに特異的な部位に存在することが明らかになった。ノーザン・ドットブロットでは、エピプラキンは、皮膚以外に胎盤、肝臓、胃、小腸、大腸、虫垂、唾液腺、脳などに発現していた。エピプラキン特異配列に対する単クローン、もしくは多クローン抗体を用いた免疫組織染色では、皮膚ではほぼ全層が陽性であり、汗腺の一部と毛包も陽性であった。食道粘膜上皮も全層が陽性で、唾液腺、胃、大腸粘膜も陽性に染色された。今後はアンチセンス法、ドメインの強制発現、共焦点レーザー顕微鏡観察、免疫沈降法などを用いて、その機能を探りたい。近年我々は、表皮基底細胞に発現しプレクチン・ファミリーに属する450-kDa分子を見い出し、プレクチン2と命名した。しかし、その遺伝子構造および転写調節機構は不明であるため、それを明らかにする目的で本研究を開始した。また染色体上のマッピングも行った。この抗原特異的なcDNA配列を蛋白質発現ベクターに組み込み特異抗体を作製した。cDNAクローンを5'上流に求め、全長(約14kb)のcDNAを単離した。さらに以前から3末端側には、1.6kbからなる繰り返し構造があることが判明していたが、3末端側からのプライマー伸長法の結果、4回の繰り返し構造であることが、明らかとなった。またこのcDNAを支配する遺伝子クローンも5個単離し解析した結果、翻訳領域にはイントロンが認められなかった。この結果プレクチン2は、従来のプレクチンと遺伝子レベルでも、大きく異なる分子であることが明らかとなった。スプライシングの違いによるポルモルフィズムの可能性は無くなったが、細胞内蛋白分解酵素による分子量の異なる分子が存在する可能性は残され、新たな検討課題となった。転写開始点を決定するため、現在5'RACE法を実施し、また5'上流非翻訳領域を海蛍由来ルシフェラーゼベクターに組み込み、そのプロモーター活性を検討中である。ノーザンフロットの結果から皮膚、腎、肺以外に、胃、唾液腺、虫垂、肝臓などの消化管にも発現していることが明らかとなり、現在特異抗体を用いて、組織分布を検討している。

以前報告したようにこの蛋白質は、プレクチン、デスモプラキンとホモロジーが認められ、これらの蛋白質と同じプラキン・ファミリーに属するものであったが、以下の点で他のプラキン分子と大きく異なっており、エピプラキンと命名を変更した。即ち(1)デスモプラキンのカルボキシ末端に見られるBドメイン類似のドメインが13個直列にほぼ均等の間隔で繋がっていた。(2)このうちカルボキシ末端側5個のドメインとその連結部分はホモロジーが特に高く殆ど同一配列が認められた。(3)通常のプラキン分子に見られる棒状ドメインやアミノ末端ドメインは見られず、二量体構成モチーフも見られなかった。このことはエピプラキンがこれまでに知られていたプラキン・ファミリー分子とはカテゴリーの異なる分子に属することを意味し、今後の機能の解明が注目される。ライブラリーのスクリーニングに用いた患者血清が認識するエピトープをペプチド・ブロット法、ELISA法、ペプチド吸収法で決定したところ、エピプラキンに特異的な部位に存在することが明らかになった。ノーザン・ドットブロットでは、エピプラキンは、皮膚以外に胎盤、肝臓、胃、小腸、大腸、虫垂、唾液腺、脳などに発現していた。エピプラキン特異配列に対する単クローン、もしくは多クローン抗体を用いた免疫組織染色では、皮膚ではほぼ全層が陽性であり、汗腺の一部と毛包も陽性であった。食道粘膜上皮も全層が陽性で、唾液腺、胃、大腸粘膜も陽性に染色された。今後はアンチセンス法、ドメインの強制発現、共焦点レーザー顕微鏡観察、免疫沈降法などを用いて、その機能を探りたい。
農村景観整備のための計画手法の開発

農村地域の総合的整備の重要な要素である「景観」は、単に「視覚的風景」にとどまらない重要な意味をもっている。農村地域景観のもつ基本的機能は、次の3つの観点に大別できる。すなわち、(1)自然環境および国土保全の観点、(2)地域住民のアメニティ保全・向上の観点、(3)都市圏など地域外住民のニ一ズ(農村・都市交流、グリーン・ツーリズム)からの観点、である。本研究は、これらそれぞれの観点からの分析を加えることにより、今後有効となると考えられる地域整備手法のための計画指針を示すことを目的とするものである。本研究の目的を達成するために、研究期間を3年間(平成9年度11年度)とした。第1年度(平成9年度)は、この研究を遂行するための研究手法について十分な論議を行ない、共通の基本認識を得た。第2年度(平成10年度)は、これを踏まえて、各自のテーマについて研究の展開を行った。さらに、最終年度(平成11年度)は、取りまとめについての基本方針を確認し、これらの検討を基に、各調査事例を対象として、それぞれの研究対象テーマに基づいて調査と分析を行うとともに、研究報告書を取りまとめた。本研究で得られた知見および成果は、次の項目から成る。(1)農村景観の評価、(2)生産基盤の景観、(3)レクリェーションとしての里山保全管理活動、(4)街路樹の景観と評価、(5)景観条例の施行と評価農村地域の総合的整備の重要な要素である「景観」は、単に「視覚的風景」にとどまらない重要な意味をもっている。すなわち、(1)自然環境および国土保全の観点、(2)地域住民のアメニティ保全・向上の観点、(3)都市圏など地域外住民のニーズ(農村・都市交流、グリーン・ツーリズム)からの観点、である。本研究は、これらそれぞれの観点からの分析を加えるとともに、それらの結果を有機的に体系化して、地域整備手法のための計画指針を示すことを最終的な目的とするものである。本研究の目的を達成するために、初年度(平成9年度)は、まず研究手法について十分な論議を行ない、共通の基本認識を得た。さらに、想定される取りまとめについての基本方針を確認した。これらの基礎検討の上で、各調査事例を対象に、それぞれの研究対象テーマに基づいて調査と分析を行った。地域景観の分析および評価の手法は、(1)SD法による評価、(2)空間構成要素分析、(3)スカイライン分析、(4)アイストップ解析、(5)色彩構成分析などとした。現在、これらの調査結果の基本分析を行っている段階である。なお、次年度(平成10年度)は、次のような対象課題を分担して研究を行う予定である。(1)森林自然環境の景観とその評価(市原恒一)、(2)レクリェーション機能の分析とその評価(伊藤太一)、(3)圃場・水利施設等生産基盤の景観とその評価(佐久間泰一)、(4)住宅・公共施設等生活基盤の景観とその評価(瀬能誠之)併せて、各種の評価手法による評価結果の総合的分析の開始を試みる。すなわち、(1)自然環境および国土保全の規点、(2)地域住民のアメニティ保全・向上の観点、(3)都市圏など地域外住民の二ーズ(農村・都市交流、グリーン・ツーリズム)からの観点、である。本研究は、これらそれぞれの観点からの分析を加えるとともに、それらの結果を有機的に体系化して、地域整備手法のための計画指針を示すことを最終的な目的とずるものである。本研究の目的を達成するために、本年度は、昨年度(平成9年度)の研究成果を踏まえて展開を行った。すなわち、研究手法について十分な論議を行ない、共通の基本認識を得た上で、さらに想定される取りまとめについての基本方針を確認した。

これらの基礎検討を基に、各調査事例を対象として、それぞれの研究対象テーマに基づいて調査と分析を行った。なお、当初の研究組織から、研究分担者1名が退職のために協力を得られなくなったことにより、研究計画のー部を変更・修正すろこととした。次年度(平成11年度)は最終年度であることから、次のような対象課題を分担して研究を行う予定である。(1)レクリェーション機能の分析とその評価(伊藤太一)、(2)圃場・水利施設等生産基盤の景観とその評価(佐久間泰ー)、(3)住宅・公共施設等生活基盤の景観とその評価(瀬能誠之)併せて、各種の評価手法による評価結果の総合的分析を試みる。農村地域の総合的整備の重要な要素である「景観」は、単に「視覚的風景」にとどまらない重要な意味をもっている。農村地域景観のもつ基本的機能は、次の3つの観点に大別できる。すなわち、(1)自然環境および国土保全の観点、(2)地域住民のアメニティ保全・向上の観点、(3)都市圏など地域外住民のニ一ズ(農村・都市交流、グリーン・ツーリズム)からの観点、である。本研究は、これらそれぞれの観点からの分析を加えるとともに、それらの結果を有機的に体系化して、地域整備手法のための計画指針を示すことを最終的な目的とするものである。本年度(平成11年度)は、最終年度であることから、次のような過程で研究を展開した。まず、昨年度までの研究成果を踏まえて各自の研究展開を行った。すなわち、研究手法について十分な論議を行ない、共通の基本認識を得た上で、さらに想定される取りまとめについての基本方針を確認した。これらの基礎検討を基に、各調査事例を対象として、それぞれの研究対象テーマに基づいて、対象分担研究課題について調査と分析を行った。研究報告書として取りまとめの項目は次のように予定している。(1)農村景観の評価(瀬能誠之)、(2)生産基盤の景観(佐久間泰一)、(3)レクリェーションとしての里山保全管理活動(伊藤太一)、(4)街路樹の景観と評価(瀬能誠之)、(5)景観条例の施行と評価(瀬能誠之)
東京・東北部の住宅地域の再開発手法に関する研究-スペインの都市モデルと東京カタログを用いた京島2丁目地区の再生計画

この研究は、東京都墨田区京島2丁目という具体的な地域を対象としたもので、その住環境に対する調査・分析と再生のための提案である。同地区は、元々は江戸近郊に広がる農地であったが、明治から昭和初期にかけての時期、とりわけ関東大震災以降に、工場労働者向けの棟割長屋として開発された地域である。第二次大戦の戦災を免れたために、当時の社会構造が、物理的にも地域社会的にも今日まで遺っている。建物は、現在は家内工場や零細アパートに転用されている。この地域は未区画整理地域で、細街路や路地が多いが、この複雑に入り込んだ街路網に面して住民が草花を飾るという習慣があり、下町風情が色濃く遺っている。その一方で、この地区では近年、家屋の老朽化や住民の高年齢化が進み、地震や火災に対する危険性が高まり、都内で最も防災上危険な地域に指定されている。本研究は、東京大学の大学院で行なった都市の改変に関する研究を進めたもので、同地区を対象に詳細な調査と分析に基づき、都市再生の具体的なプランを提示している。2年間に渡る研究の成果は五冊の報告書(総頁数約4000)としてまとめられている。これらの成果は、報告書としてまとめると共に、東京都や墨田区を始めとする各種行政機関や住民組織、開発主体、学会などの場で公表され、さまざまな立場からの意見の収集を試みている。この研究で得られたカタログは、同地区の再開発などに携わる計画主体や行政が計画案を作成するに際して参照すべきガイドラインとなるもので、単にフィジカルな建物の更新に関する指針になるだけでなく、社会的なインフラストラクチャの保全策・改善策としても有効なものになっている。
家族性パーキンソン病の病因遺伝子ネットワークの解明

本研究では我々はまず、家族性パーキンソン病(PD)PARK6とPARK13の遺伝子産物であるPINK1、Omi/HtrA2がレビー小体に局在することを見出した。PIMK1、Omiはともにミトコンドリア蛋白質であり、ミトコンドリアがレビー小体形成に何らかの役割を演じていることが示唆された。また、ParkinはPARK2の病因遺伝子産物となるユビキチンリガーゼであり、小胞体ストレスや酸化的ストレスによる細胞死を抑制することが示されている。我々はさまざまな神経芽腫由来の細胞株を用いて、Parkinの小胞体ストレスによる転写制御を検討した。β-メルカプトエタノール(β-ME)とツニカマイシン処理で、Parkinの発現はSH-SY5Y(H)細胞、Neuro-2a細胞、Goto-P3細胞で上昇したが、SH-SY5Y細胞とIMR32細胞では増加は見られなかった。同様の発現増加がParkinとプロモーターを共有するPACRG/Glupでもみられたが、プロモーターのルシフェラーゼアッセイでは、小胞体ストレスによる発現上昇は認められなかった。これらはParkinとPACRG/Glupが細胞特異的に小胞体ストレスによって、コアプロモーター以外の部位で発現が制御されていることを意味している。さらにPINK1がHsp90、Cdc37/p50と細胞内で複合体を形成することを見出した。PINK1はHsp90の阻害剤ゲルダナマイシンとノボビオシン処理で不安定となった。ゲルダナマイシン処理でPINK1のユビキチン化が亢進し、ユビキチンプロテアソーム系による分解が促進された。さらにPARK6の原因となるPINK1のミスセンス変異L347PはHsp90、Cdc37/p50と結合せず、分解が亢進した。以上の結果より、Hsp90、Cdc37/p50がPINK1の安定性を高める役割を持っていることが判明した。α-synuclein (α-Syn)遺伝子3重複により発症する家族性のパーキンソン病(PD)であるPARK4では、α-syn陽性封入体の形成やドーパミン細胞死など孤発性PDに類似した所見を認める。PARK4 mouse model作製のため、human α-synpromoterを用いたtransgenic mouseを作製した。方法として、α-syn遺伝子とその遺伝子発現調節領域を含む約190kbpの領域を、BAC transgenesisの手法を用いて挿入した。Western blottingでは、中枢神経・末梢組織において、本来のα-syn発現部位に16kDaのヒトα-synに相当する挿入遺伝子の発現を認め、マウスの内因性α-synとほぼ同じ量の発現が確認された。免疫染色では、嗅球、大脳皮質、中脳などに高発現を認め、ヒトのα-synとほぼ同様の発現パターンを示し、本来のプロモーターが働いていることが推察された。また遺伝子ノックアウト法が確立した小型魚類であるメダカにおいてPARK6の原因遺伝子のミトコンドリアに局在するキナーゼであるPINK1ノックアウト個体の作製を行った。PCRとRACEを用いてメダカPINK1をクローニングした。メダカPINK1は577アミノ酸のたんぱく質でヒトオルソローグと50%identityを示した。N-エチル-N-ニトロソウレアによって変異導入した5771個のメダカ凍結保存精子のライブラリーをスクリーニングし、一個のナンセンス変異個体を得た。変異個体のウエスタンブロットで、よく保存されているキナーゼドメインを欠損したtruncated formが観察された。

PINK1のホモ接合体のメダカは見かけ上野生型を変わらなかった。今後行動学的、組織学的解析を予定している。本研究ではパーキンソン病モデルとして約200Kbの遺伝子調節領域を含むヒトα-シヌクレインの遺伝子のBACクローンを導入したトランスジェニックマウスを作成した。このマウスでは内因性のα-シヌクレインが発現する大脳皮質、線条体、黒質、末梢組織の副腎、交感神経節にトランスジーンの発現が確認された。またヘテロ接合型マウスでは内因性のシヌクレインの約2倍、ホモ接合型では約4倍の量のヒトα-シヌクレインが発現していた。神経病理学的には1年齢のマウスでは神経細胞死、封入体形成ともに観察されなかった。しかし同時期にオープンフィールド試験で中心部にとどまる時間が長いなどの「不安が減少する」(reduced anxiety)の表現型が観察された。一方、PINK1とParkinに関しては、新たなパーキンソン病動物モデルを作製する目的で精子をENUで処理して点突然変異を誘発する方法でノックアウトメダカを作製した。Parkin、PINK1ともヒトの病的変異に類似した変異体が得られた。1年齢までの目高に関して解析しているが、神経病理学的にはドーパミン細胞の脱落は観察されなかった。行動学的にも、めだった表現型は今のところ捕捉できていない。しかし、HPLCによるカテコールアミン測定ではParkin,PINK1変異体ともに脳ドーパミンの増加が観察され、これはParkinノックアウトマウスの結果と共通していた。以上より、メダカは家族性パーキンソン病モデル動物として有用である可能性が示された。
全身性強皮症の病態で転写因子Fli1の発現異常が自然免疫系に及ぼす影響の検討

全身性強皮症は皮膚、内臓諸臓器などの線維化、血管系の異常、および自己に対する免疫応答をはじめとする免疫の異常、を特徴とする膠原病である。本疾患の病態の根本的なメカニズムは明らかになっていないが、遺伝子発現を制御する分子である転写因子の一種、Fli1の発現の異常と、全身性強皮症の関連が過去の研究から明らかになってきている。今回我々は、Fli1の発現異常が全身性強皮症の免疫異常、特に自然免疫系の異常に対して何らかの寄与を果たしているのかを明らかとすることを目的として研究を開始し、今回の検討によってそのメカニズムの一部が明らかとなった。本年度はFli1+/-マウス由来細胞におけるTLRシグナリング経路分子についての検討を行った。具体的には、Fli1の発現低下が各種TLRの発現量あるいはそのシグナリングに影響を及ぼすかどうかについて、線維芽細胞、B細胞をFli1+/-マウスより単離し、野生型マウス由来のそれらの細胞に比較することにより評価を行った。各細胞の単離に当たっては、線維芽細胞については1ー2日齢のマウス皮膚を全層で剥離、採取し洗浄したあとディスパーゼ、コラゲナーゼ処理により分離する、B細胞についてはマウス脾臓から脾臓細胞を単離しさらにCD19抗体を用いてMACSにより単離する、ことによって行った。これらの細胞で、各種TLRの発現量をreal-time PCR法および免疫ブロット法を用いて比較検討したところ、全身性強皮症の病態においてそのシグナリングの異常活性化が重要な役割を果たすとされるTLR4の発現がFli1+/-マウス由来の上記細胞で上昇していることが明らかになった。さらに野生型あるいはFli1+/-マウスから単離したこれらの各種の細胞をin vitroでLPSを添加し、培養上清中の代表的な炎症性サイトカインIL-6の濃度を比較したところ、Fli1+/-マウス由来細胞の培養上清中の濃度は、野生型マウス由来細胞の培養上清中の濃度に比較して高値であることが明らかとなった。さらに、ヒトのcell lineでのin vitroでの実験も開始している。ヒトの培養細胞株であるヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞をFli1siRNAあるいはコントロールとしてscrambled non-silencing RNAで処理しmRNAを回収し、各種TLRの発現を比較したところ、上記での知見と併行するように、Fli1siRNAで処理した線維芽細胞はコントロールと比較してTLR4の発現が上昇していることが明らかとなった。当初本年度の実験として計画したFli1+/-マウス由来細胞におけるTLR分子の解析については、TLR4とFli1の関連について、線維芽細胞とB細胞を用いて明らかにすることができ、その成果が得られている。また、cell lineを用いたin vitroの実験も予定通りに実施し、すでに線維芽細胞については上記のin vivoでの結果を支持する結果を得ている。本年度の実験計画として予定していた内容を実施しておおむね成果が順調に得られていると考えられる。全身性強皮症の病態において転写因子Fli1の発現低下が自然免疫系に及ぼす影響についての検討を継続した。昨年度までの本研究での検討および過去のこれまでの我々の検討から、線維芽細胞、免疫細胞など各種の細胞におけるFli1の発現低下がそれぞれの細胞において全身性強皮症に関連した表現型を呈することが判明したことから、各々の細胞種におけるFli1の発現低下が自然免疫系に与える影響をより詳細に検討するため、Fli1flox/floxマウスを用いてLoxp-Cre系により各種の細胞種特異的にFli1の発現をノックアウトしたマウスを作成し、それらのマウスにおける自然免疫系の異常の有無について検討を行なったところ、特にケラチン14発現細胞特異的にFli1をノックアウトしたマウスにおいてマウス血清IL-6濃度の有意な上昇がみられたほか、自然免疫系における代表的な受容体であるTLR4のリガンドLPSでの刺激によって、本マウスから単離されたB細胞からのIL-6産生がコントロール群に比較して有意に高いことが観察された。さらなる検討で、本マウスはケラチン14が豊富に発現している胸腺の異常を介して免疫系の異常に関与していることが示され、このことは表皮を含む上皮系の細胞におけるFli1の発現の低下が全身性強皮症での免疫系の異常に特に関与している可能性を示唆するものと考えられた。これまでの全身性強皮症についての研究においては上皮系の細胞の病態への関与、また特に免疫系の異常への関与について研究した既報告に乏しく、全身性強皮症の病態解明の上でも新しい重要な視点を与えるものと考えられた。

転写因子Fli1とTLRシグナリング系の相互作用が強皮症の病態において果たす役割についてさらに検討するため、我々の保有しているマウスを交配し2重欠失マウスを作成してその表現型についてのin vivoでの解析を行う。具体的には、Fli1+/-とTlr4-/-マウスを交配させることでFli1+/-;Tlr4-/-マウスを作成し、野生型マウスとFli1+/-マウス、およびFli1+/-;Tlr4-/-マウスにおいてブレオマイシン(BLM)誘発強皮症モデルマウスを作成、線維化を誘導し、皮膚と肺に生じる変化の違いについて、病理組織学的かつ分子生物学的に検討する。病理組織学的検討では、HE染色および免疫染色により1皮膚の厚さ・肺線維症の程度の違い2炎症細胞浸潤の違いなどについて検討する。分子生物学的には、皮膚組織、肺組織において、2Col1a1,Col1a2などの線維化関連遺伝子のmRNAの発現量や、各種サイトカインのmRNAの発現量について検討する。さらに血清中および気管支肺胞洗浄液中における各種サイトカインの発現量をELISAで測定するほか、気管支肺胞洗浄液においては、フローサイトメトリーを用いてマクロファージの極性やB細胞等リンパ球のサブセットの違いについて検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。全身性強皮症28年度が最終年度であるため、記入しない。
伝播類型の視点からみた日本語形成史の試論的研究

『方言文法全国地図』の意志・推量、条件表現、敬語類などの言語地理学的研究に、国語史の知見、また特に近世期地方方言文献を探索・考察した研究により、およそ5種の伝播類型を見出し、それによる日本語形成史を試論的に考察した。『方言文法全国地図』の主要文法図の解釈を,言語地理学的・方言文献学的方法により,その伝播類型を探り,日本語形成史の試論とする『方言文法全国地図』の意志・推量、条件表現、敬語類などの言語地理学的研究に、国語史の知見、また特に近世期地方方言文献を探索・考察した研究により、およそ5種の伝播類型を見出し、それによる日本語形成史を試論的に考察した。1.尊敬語の分布の史的解釈『方言文法全国地図』6巻の271-273図「書きますか」を対象に分布の解釈を行い、合わせて国語史の尊敬語表現史の成果を参照し、これと対比してその歴史的な解釈をした。結果は、オーニナル形式は都市部を中心に全国にあり、近畿と東京から発信されたとは思われるものの、共通語として広く各地に飛び火していること、ナサル系の形式が近畿中央部は早くナハル・ハル化し、西日本では各地にナサル・ナルなどがあること、中国地方にはテジャ(ヤ)などがあること、既に指摘はあるが東日本はいわゆる無敬語地帯であり、西日本の土佐地方もこれに類することなどが明らかになった。しかし、敬語の使用は任意的であり、文法論的なものが特定の使用を強制されるのと違う点があり、解釈に難しさが感じられた。2.伝播類型の視点では、『方言文法全国地図』の意志・推量、原因・理由、仮定条件、順体助詞などの諸図から幾つかの伝播類型について試論的な論をなした。『方言文法全国地図』に各地の過去の方言文献を対照させる形で文法事象の日本語史面を考察し、かつての中央語であった近畿地方からの伝播類型を求めようとしたものである。その背景として、中央語としての国語史が各地方言に影響を与える一方で、方言側に独自の趨勢もあり、これら各地方言をふくめた総体としての日本語の歴史を検討したいという立場である。本年は予定通りの下の3.までに4.を加えて行った。1.待遇表現の述部、対称代名詞、文末詞事象の地理学的、国語史的な研究2.格助詞関係についての同様な研究3.推量表現についての同様な研究4.加えて東海・東山地方の勧誘表現研究の予定であった過去表見、使役表現などには及ばなかった。その成果は次のようである。1.では国語史での主要事項が周圏論分布をなすものの、この待遇事象は都市部に主要形式の集中する模様、また一方で古い語彙が温存される傾向があった。待遇語彙が文法的に強制されるものでなく、随意の文体的な側面をもつことの現れであろう。この点で伝播類型の型として1型を設けるべきものと考える。2.の格助詞についても綺麗な分布でなく、周圏論的な視点で解けない。この点はすでに指摘されている。私見によれば九州、東北・北陸はかつての国語史の知見で解けるが、やはり新たな視点が求められる。今後は1.も含めて、周圏的伝播以外の型の整理が必要と考えるに至った。3.4.では研究対象地図の中で特に問題になる形式の多い東海・東山地方の文法事象を考察した。2つの事象を通して、日本語史上の当該地域の特色が「近畿からの影響が及ぶ東側の地域であり、一方で東国方言と対峙し、ここに国語史の古態的な形式が吹き溜まり状態で重層する」模様があることを考察した。中部地方以西の西日本での方言周圏的な分布模様に対し、東日本は固有の分布模様をもつことがこの間の実証的な研究で明らかになってきたと感じている。(なお、上の研究を含めた著書の用意のため、個別論文の成果は乏しい結果となった)今年度は,意志・推量表現について,追加的な研究をし,また,仮定条件,逆接条件,および待遇表現を研究した。意志・推量表現については,東海,ナヤシ(長野・山梨・静岡)地方の一部に,ダラ・ズラ・ラなど古態かつ方言化した形式があること,同じく,この地方の勧誘表現についても,似た性格があることを述べた。これらは,西部日本の周辺部としての当地域の特色であることを考えた。条件表現については,逆接確定表現が,仮定条件法の分布様態と似て,方言周圏論的な分布をすること,またその伝播模様について考察した。待遇表現においても,国語史の模様と比較し,よく対応することを見た。この研究はこれらの地図の解釈をとおして,伝播類型をさぐること,それをとおして日本語の形成史研究の手始めとすることである。これらの点については,以下のような点が現れた。中央語で比較的歴史の古い意志・推量,条件法などの諸形式は,全国分布型をとり,近畿から西日本には新しい形式が比較的すみやかに,東日本へは日本海側への伝播が早く,太平洋側には遅く,従って太平洋側には古い形式の方言化した模様が見られる。また,東西両端の九州西部・南部と東北地方には古態的な模様とその方言化の模様が強い。

これに対し,中央で比較的新しい時代に成立した準体助詞,逆接条件のうちのケレドモ類,敬語のうちのアナタ,オーニナルなどの形式は,近畿から西日本へ,次に飛び火して江戸・東京からも放射され,上方と江戸の東西の2中心地から放射され,今まで東西方言として二分されていたものが,西部方言の内部でも近畿が中央で九州と中部地方が周辺部,東日本でも関東中央部が中心となり関東西部と東北が周辺部,そしてこの場合の東部方言では新しい形式が日本海側よりも太平洋側を北上する模様があるように思う。このような東・西ごとの方言周圏論的な伝播模様とその経路の違いのあることが分かってきた。この研究は、『方言文法全国地図』の言語地理学的な解釈を、国語史の知見および近世期方言文献の模様と照らし合わせて、各種文法事項の歴史を考察し、そこに方言形成に関連する伝播類型を求めようとするものである。本年度は、次のような事項を考察した。1-意志・推量の助動詞の模様(既存研究)と関連する中部地方の勧誘表現法2-逆接条件法の分布と歴史3-上記2も含む各種条件法4-敬語事象のうち対称代名詞および尊敬語述部の分布と歴史その成果を研究目的である「伝播類型」と関係させて述べると、次のようになる。1-勧誘表現は、古く「否定+カ」「マイカ」「ウズ」、新たに「ウ・ヨウ」の歴史があり、中部地方は「マイカ」「ウズ」の古態の形式がよく分布する。国語史(中央語史)の地理的反映があり、西日本地域の東限の位置にあるためと考えられた。/2では日本の両端に(1)ドモ・バトテ類、その一段階中央寄りにガ、中央に(2)ケレドモの周圏論的分布が顕著であり、ケレドモは上方と江戸の2中央地域から放射が見られた。3-各種の条件法でも、(1)周辺には「未然形/已然形+バ」型、中央には(2)近世期に新しく発達したナラ・タラ、ケレドモ等は(2)東西方言別のそれぞれ中央に発達しやはり周圏論分布があった。従来伝播類型は、東西対立、周圏論的模様、上方語が日本海を北上すること、古代語が東部方言で方言化することなどから考えられているが、今期の研究では、加えて東西地域ごとの周圏的分布と近世期の発達にかかわる事象の上方・江戸の2大中心地からのそれぞれの放射などの知見が得られたと考える。これに対し、4も同様であるが、新形式は社会的な層のあつい都市部に伝播しやすく、いわゆる「地を這う」伝播とちがう点が注意された。
高齢者の長期間水中運動の実践とトレーニング効果に関する研究

本研究は、高齢者の長期的な水中運動の影響を明らかにすることを目的としている。平成29年度から3年間のトレーニングによる筋力、バランス能力、持久力、柔軟性等の体力および動脈スティフネスの変化を確認する。また、トレーニングが日常の歩数や身体活動レベルに及ぼす影響も確認する。平成28年度の準備・調査期間を経て、平成29年5月初旬から水中群と陸上群に分かれて週2回、1回45分間のトレーニングを開始した。両群とも持久的運動(水中:アクアビクスと水中歩行、陸上:エアロビックダンス)を行っている。トレーニング各回の運動前後に血圧測定を実施しており、現在、詳細を分析中である。平成29年3月に行ったトレーニング試行(1ヶ月;水中群6回、陸上群7回)の結果、短期間の集団エクササイズプログラム(6,7回)への参加は、高齢者の体力レベルを有意に高め、動脈スティフネスにも好影響をもたらすことが明らかとなった。その後、平成29年5月から3年間のトレーニングを開始し、平成31(2019)年2月中旬まで半年毎に計4回の体力測定ならびに血圧脈波伝播速度測定を実施した。これらの測定を完遂している各群24名の被験者における動脈スティフネス(平均値)は、平成29年4月のプレ値と4回目測定値(平成31年2月)と比較して、両群とも差がない(平均値±標準編差:トレーニングプレ値平成29年4月水中群1775±544,陸上群1811±383,平成31年2月4回目測定値水中群1893±466,陸上群1925±327 cm/sec)。また各群で増加傾向は見られるものの、有意な上昇は認められていない。同様に半年毎の測定のみを行っている非トレーニング群(9名)との比較においても有意な差は認められていない。今後、トレーニング群における実際のトレーニング回数や体力測定値との関連を分析していく予定である。2年目のトレーニングは、施設において地震の影響があったものの、概ね順調に進んだ。参加人数の追加を適宜行い、水中群、陸上群とも35名の登録で、現在、進行している。しかし、年齢が高齢であるため、病気、体調不良、ケガ、家庭の事情、など、不可避の要因で1ヶ月以上の中断を余儀なくされるケースが平成30年度も数件発生している。長期離脱の影響を別途分析していく予定である。水中群は、利用している茨木市民プール(西河原市民プール)が平成30年の大阪北部地震の影響で6月18日から10月初旬まで使用不可となり、7月から10月初旬まで別の市営プール(五十鈴市民プール)を利用した。そのため、約2週間の非トレーニング期間が生じた。五十鈴市民プールでは、インストラクターの一斉指示によるトレーニングを行うことができず、水中歩行による自主トレーニングのみを行った。その後、平成30年10月から現在の令和元年5月までは、週1回のインストラクター指導によるアクアビクスと週1回の自主トレ水中歩行(いずれも1回45分)を基本として、週2回のトレーニングプログラムを予定通り実施している。陸上群においても、研究代表者が所属する追手門学院大学の体育館の損傷により、6月18日から7月1日の間、トレーニングを中断した。その間を除き、週に2回、インストラクターの下で約45分間のエアロビックダンスプログラムを行っている。体力および動脈スティフネスの測定については、平成29年度に続き、平成30年度も8月と翌年2月に測定を実施した。平成29年8月から、体力測定の時期に合わせて実施している日常の歩数や身体活動レベルの測定・調査も順調に実施しており、今後分析結果の集計を行う予定である。本研究は、茨木市老人クラブ連合会、茨木市市民文化部スポーツ推進課、同市健康福祉部地域福祉課の協力をいただきながら、進めている。また、プール指定管理者であるシンコースポーツ(株)にも引き続き、プールでのインストラクター担当などで協力を依頼する。また、追手門学院大学のスポーツ研究センターとの協力体制を継続し、今後も験者等の人的な協力を依頼する予定である。被験者に関して、3年間のトレーニング継続に支障となる個別要因が生じた場合、長期離脱後に復帰できる場合には、個人のディトレーニングの影響を可能な限り、確認する。トレーニング場所におけるケガやアクシデントはこれまでに発生していないが、令和元年度も引き続きスポーツ傷害保険に加入し、併せて陸上、水中の各トレーニング場所やプログラム展開での安全管理を図って研究を遂行する。平成31年春(2月)の測定を経て、約2年間のデータが蓄積された。各指標の変化を統計分析し、各群の比較を行い、今後、関連の学会に成果を発表していく予定である。また、残り1年間のトレーニングと半年毎の各指標測定を令和元年度も進めていく。本研究では、長期的な水中運動の影響を明らかにすることを目的としており、具体的には、3年間のトレーニング期における筋力、バランス、持久力等の体力、動脈スティフネス、日常の歩数や身体活動レベルに及ぼす影響を確認する。平成28年度は、準備・調査期間とし、水中運動・トレーニングに関する情報収集と全国の運動型健康増進施設を対象としたアンケート調査を実施した。92施設から回答を得て、分析の結果、高齢者の水中運動プログラムは、アクアエクササイズ系(音楽に合わせて動作を行う)が多く、頻度は週に2、3回、1回約40分で実践されていた。

また、水泳・水中運動が運動型健康増進施設の重要なプログラムとして認識されており、今後の高齢社会において介護予防に向けた実践・活用が促進される可能性が示唆された(日本生涯スポーツ学会第18回大会にて発表11/5)。平成28年度は、水中運動の強度測定とトレーニング試行(水中運動群15名/71.5±4.3歳、陸上運動群19名/72.2±5.6歳)も行った。強度測定では、水中運動の基本となる普通歩行、大股、横、後ろ、前方キック、ツイスト、シザース動作(その場で左右交互に前後開脚)、ジョグ(水中でのジョギング動作)の8つを、休憩を挟みながら行った。各動作中の心拍数を計測し、「220ー年齢」を基準とした推定最高心拍数に対する相対運動強度を測定した。ジャンプ系のシザースとジョグが70%を超え、他は6268%の強度であった。また、高齢のシンクロナイズドスイマー(20名、平均70歳、女性)の測定では、3分半の演技中、112拍/分を維持し、80%強度となっていた。ジョグ系運動やスカーリング動作を伴うシンクロは、高齢者にとって高強度運動となることが明らかとなった。トレーニング試行(水中群6回、陸上群7回)では、水中と陸上とも筋力(上体起こし)と持久力(6分間歩行)における有意な改善効果が認められた(p<0.05)。トレーニング部分に関しては、調査と情報収集、ならびにトレーニング試行を通して参加高齢者が可能なエクササイズをプログラミングできている。インストラクターの確保についても順調である。被験者数の目標を各群30名としていたが、水中運動群については、25名に止まっているため、早い段階で数名の追加を行いたい。水中運動は、茨木市のプールを借用しているため、時間設定や都度の利用で若干の不便さがあるものの、市及びプール指定管理会社の協力を得て、各回の運営が可能になっている。平成29年の7,8月は、一般客が多く、集団での専用利用ができないため、指定プログラムによる自主練習のみとなる。また、9月は、プールの改修工事が予定されており、当該プールの利用ができない。そのため、現在、市内の他の公共温水プールと9月の利用調整を進めている。陸上運動については、所属大学の体育館を利用しており、利用上の不都合な状況は発生していない。両群とも週に2回、1回45分のエアロビックエクササイズを基本としている。各指標の測定について、体力測定は、文部科学省の新体力テストのプロトコルに基づいて、握力、上体起こし、10m障害物歩行、6分間歩行、開眼片足立ち、長座体前屈の6項目について測定を行っている。現在、トレーニング試行の事前測定(2月末)と事後測定(3月下旬)のデータ、ならびに5月初旬(水中運動群5/12開始,陸上運動群5/8開始)から始まったトレーニング期の事前測定のデータ(4月下旬)を採取し、順調に測定を進めている。血圧脈波による動脈スティフネスの測定も順調に進んでいる。平成29年の3月に行ったトレーニング試行の短期間でも、陸上運動群において血圧脈波の測定値(baPWV値)が有意な低下を示した(陸上:1894→1742cm/sec,水中:1873→1850 cm/sec)。日常生活強度の測定は、機器を準備中であり、近日中に実施する予定である。
スパースモデリングによる電顕単粒子構造解析の迅速・高分解能化

我々生体内の機能分子の主役は様々な種類のタンパク質である。そのため、薬はタンパク質に結合してその機能を調整することで働くものが多い。創薬には、タンパク質構造を解明して、薬との結合ポケットの形を決定することが重要なステップの一つである。近年、様々な向きの電顕像から構造決定する単粒子解析法が進歩し、一部のターゲットで原子分解能に到達した。しかし、分解能が低いことも多い。向きの偏りは大きな理由の一つである。ここでは、向きの偏りを、負染色法ではカーボン膜の電荷を調整することで改善し、疎な投影角度の問題はスパースモデリング(SpM)・ベイズ法を応用した画像処理法開発を進めた。負染色法を用い、構造未知なタンパク質の構造決定に関して、北大の前仲グループと共同し、免疫寛容の形成に重要な、HLA/MHCの特殊型(50kDaほど)の初めての構造決定に成功しJournal of Immunology誌に発表した。本研究をさらに進めることは、アレルギー・自己免疫疾患など様々な免疫系の疾患の克服に貢献すると思われる。また、巨大な複合体形成の細胞内観察のために、免疫電顕のための系開発として、院内感染菌の一部と神経初代培養細胞をラベルできる条件を開発した。また、さらなる高分解能に向けてクライオ電顕自体の開発としては、電子線検出で最高感度を有する電子線直接検出カメラを収差補正機Cs correctorと組み合わせインストールすることに成功した。また、DNA折り紙の足場中のイオンチャネルが作用薬と結合することにより、ダイナミックに構造変化する様子をAFMで撮影した。さらに、その構造変化を、画像情報処理によって可視化しAngewandte Chemie誌に発表した。今後は、本開発を基に更なる解析ソフト開発によって、決定される分解能の向上に努めたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。我々生体内の機能分子の主役は様々な種類のタンパク質であるため、薬はタンパク質に結合してその機能を調整することで働くものが多い。タンパク質構造決定で最も一般的な方法は、X線結晶解析である。しかし、創薬ターゲットタンパク質の結晶作製は一般に難しい。近年、結晶なしに様々な向きの電顕像から構造決定する単粒子解析法が進歩し、原子分解能に到達した。理由は、タンパク質粒子の柔らかさと向きの偏りである。ここでは、向きの偏りを、負染色法の条件を検討することでし、また疎な投影角度が多い問題は本領域内の情報学グループと協力することでスパースモデリング(SpM)を応用した画像処理法開発を進めている。負染色での向きの偏りは、カーボン膜の電荷を調整することで改善した。負染色法を用い、構造未知なタンパク質の構造決定に関して、北大グループと共同しタンパク精製条件を開発しながら、免疫機構に重要な、HLA/MHCの特殊型の初めての構造決定に成功しJournal of Immunology誌に発表した。また、巨大な複合体形成の観察のために、免疫電顕のための抗体ラベル法開発として、病院内感染菌MRSAと神経初代培養細胞をラベルできる条件を決定して、それぞれをScientific reports誌に2報発表した。また、さらなる高分解能に向けて、クライオ電顕自体の開発としては、電子線検出で最高感度を有する電子線直接検出カメラのインストールにも成功し、金粒子を標準サンプルとして原子が明解に見える高い分解能の像を得ることに成功した。領域内で本プロジェクトに興味があるグループにも提供してSpMを応用して解析法開発を進めている。負染色法を用いて、構造未知なタンパク質の構造決定に関して、北大グループと共同してタンパク質の精製条件を開発しながら、免疫機構に重要な、HLA/MHCの特殊型の初めての構造決定に成功しJournal of Immunology誌に発表した。また、巨大な複合体形成の観察のために、免疫電顕のための抗体ラベル法開発として、病院内感染菌MRSAと神経初代培養細胞をラベルできる条件を決定して、それぞれをScientific report誌に2報発表したため。また、クライオ電顕自体の開発としては、電子線検出で最高感度を有する電子線直接検出カメラの電顕へのインストールにも成功し、金粒子を標準サンプルとして原子が明解に見える高い分解能の像を得ることに成功したため。さらに、タンパク質のクライオ電顕像を領域内で本プロジェクトに興味があるグループにも提供してSpMを応用した解析法開発を共同で進めているため。

また、巨大な複合体形成の細胞内観察のために、免疫電顕のための系開発として、院内感染菌の一部と神経初代培養細胞をラベルできる条件を開発した。また、さらなる高分解能に向けてクライオ電顕自体の開発としては、電子線検出で最高感度を有する電子線直接検出カメラを収差補正機Cs correctorと組み合わせインストールすることに成功した。また、DNA折り紙の足場中のイオンチャネルが作用薬と結合することにより、ダイナミックに構造変化する様子をAFMで撮影した。さらに、その構造変化を、画像情報処理によって可視化しAngewandte Chemie誌に発表した。今後は、本開発を基に更なる解析ソフト開発によって、決定される分解能の向上に努めたい。単粒子解析法では、一度ターゲットタンパク質の構造が決まれば、薬の結合構造の決定も比較的容易であり、薬結合ポケットの解明は創薬の方向性を示唆する。薬改良にも大きく貢献する。しかし、これまでの解析で原子分解能に到達したのは分子中の一部分であり、全く届かないことも多い。理由は、タンパク質粒子自体の持つ柔らかさと粒子の向きの偏りである。そのため、分解能向上の要点は、揺らいでいる構造から、Major構造の投影像のみを選びだす分類・3次元再構成等の画像解析法の改良と向きの偏りを補正することにある。そのため、さらなる分解能向上を目指して、Cs補正エネルギーフィルター付200kV He stage極低温電子顕微鏡に最高感度の電子線直接検出カメラを組み合わせることでモデルタンパク質を撮影し最適化する。さらに、これまでの開発を基に、SpMの導入と階層化による更なる改良を試みる。また、分類の特徴空間の次元を、SpMによって必須なもののみに絞り込む。2次元平均化は粒子の向きが特定の角度に偏っている傾向を逆手に取って重ね合わせしS/N比を向上する手法であり、逆にその間は疎である。そのため、本テーマとSpMを組み合わせて、領域内のグループと協力してアルゴリズム開発を行う。また、これらの手法を組み合わせて生理的に重要な新規タンパク質のさらなる構造解析を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
脳腫瘍における低酸素細胞の増殖能と糖およびアミノ酸代謝に関する研究

今年度はラット可移植性腫瘍株(C6,RG2,W256)について10%FBS添加MEMを用いて単層培養し,SigmaScan Proで計測された任意の3視野内の細胞数に基づいて細胞密度を算出して細胞増殖曲線を作成し,細胞増殖期が定常期であることを確認した.細胞増殖期が定常期と判定された腫瘍細胞への各トレーサーの取り込みは培養液から細胞内へのトレーサーの流入を示す速度定数K_1と細胞内流入が測定時間内に平衡状態に達するトレーサーについては細胞内集積量を反映するVolume distribution(Vd)で評価した.10%FBS添加MEMを三重標識したアミノ酸欠乏10%FBS添加MEM(^<14>C標識チミジン,^<99m>Tc標識DTPA,^3H標識フルオロデオキシグルコース(^3H-FDG)あるいは^3H標識メチオニン)に交換し,5分から60分にわたって細胞と培養液を経時的に採取して細胞内および培養液中の各トレーサー濃度を液体シンチレーションカウンターで測定した.採取による障害細胞および細胞外腔へのトレーサーの集積は^<99m>Tc標識DTPAの集積を用いて補正し,真の細胞/培養液濃度比から速度定数K_1とVdを算出し,増殖能と糖代謝およびメチオニン集積の関連を解析した.^<14>C標識チミジンの集積速度(増殖能)はいずれの細胞株においても低酸素状態(2および5%酸素)で24時間目には常酸素細胞(20%酸素)の30%以下に低下し,5%酸素で6日間培養されたRG2とW256の増殖能は低値であったが,C6は常酸素細胞と同程度まで回復していた.^3H-FDGの集積速度(糖代謝)はいずれの細胞株でも5%酸素で4時間目に有意に増加し,C6とW256では24時間目に常酸素細胞と同程度まで低下したが,RG2では6日目でも増加していた.2%酸素ではいずれの細胞でも糖代謝は低下していた.メチオニン集積はいずれの酸素濃度下でもRG2とW256では4時間目に増加し,C6では変化がなかったが,5%酸素で6日目にはいずれの細胞でも増加した.慢性的低酸素状態(5%酸素)における低酸素負荷(2%酸素への変更)では増殖能と糖代謝はいずれの細胞でも有意に低下し,メチオニン集積もW256で低下したが,C6とRG2では有意に増加した.低酸素負荷によりいずれの腫瘍細胞も増殖能は低下したが,^3H-FDGおよびメチオニン集積の変化は細胞株により異なることが判明し,低酸素細胞における糖・アミノ酸代謝および膜輸送の変動が示唆された.グリオーマ細胞株(U87,Hs683,C6)は10%FBS添加MEMを用いて単層培養し,Sigma Scan Proで計測された任意の3視野内の細胞数に基づいて細胞密度を算出して細胞増殖曲線を作成し,細胞増殖期が定常期であることを確認した.細胞増殖期が定常期と判定された腫瘍細胞への各トレーサーの取り込みは培養液から細胞内へのトレーサーの流入を示す速度定数K_1と細胞内流入が測定時間内に平衡状態に達するトレーサーについては細胞内集積量を反映するVolumedistribution(Vd)で評価した.10%FBS添加MEMを四重標識したアミノ酸欠乏10%FBS添加MEM(^3H標識チミジン:0.1μCi/ml,^<18>F標識フルオロデオキシグルコース(^<18>F-FDG):0.5μCi/ml,^<99m>Tc標識DTPA:3μCi/ml,^<14>C標識合成アミノ酸:0.15μCi/ml)に交換し,5分から60分にわたって細胞と培養液を経時的に採取して細胞内および培養液中の各トレーサー濃度を液体シンチレーションカウンターで測定した.採取による障害細胞および細胞外腔へのトレーサーの集積は^<99m>Tc標識DTPAの集積を用いて補正し,真の細胞/培養液濃度比から速度定数K_1とVdを算出し,増殖能と糖代謝および合成アミノ酸トレーサーの集積の関連を解析した.^3H標識チミジンの集積速度はいずれの細胞株においても低酸素状態(2および5%酸素)で常酸素細胞(20%酸素)と比較して4および24時間目に低下したが,^<18>F-FDGの集積速度は4時間目に常酸素細胞の25倍まで著しく増加し,24時間目では常酸素細胞の2倍程度までの増加にとどまっていた.^<14>C標識合成アミノ酸の取り込みはU87とHs683でいずれも低下したが,C6では4時間目に常酸素細胞の24倍まで増加し,24時間目でも常酸素細胞の2倍程度まで増加していた.

低酸素負荷によりいずれの腫瘍細胞も増殖能は低下し,^<18>F-FDGの集積は増加したが,^<14>C標識合成アミノ酸の取り込みは増加する細胞(C6)と減少する細胞(U87,Hs683)があり,低酸素細胞における糖・アミノ酸代謝および膜輸送の変動が示唆された.今年度はラット可移植性腫瘍株(C6,RG2,W256)について10%FBS添加MEMを用いて単層培養し,SigmaScan Proで計測された任意の3視野内の細胞数に基づいて細胞密度を算出して細胞増殖曲線を作成し,細胞増殖期が定常期であることを確認した.細胞増殖期が定常期と判定された腫瘍細胞への各トレーサーの取り込みは培養液から細胞内へのトレーサーの流入を示す速度定数K_1と細胞内流入が測定時間内に平衡状態に達するトレーサーについては細胞内集積量を反映するVolume distribution(Vd)で評価した.10%FBS添加MEMを三重標識したアミノ酸欠乏10%FBS添加MEM(^<14>C標識チミジン,^<99m>Tc標識DTPA,^3H標識フルオロデオキシグルコース(^3H-FDG)あるいは^3H標識メチオニン)に交換し,5分から60分にわたって細胞と培養液を経時的に採取して細胞内および培養液中の各トレーサー濃度を液体シンチレーションカウンターで測定した.採取による障害細胞および細胞外腔へのトレーサーの集積は^<99m>Tc標識DTPAの集積を用いて補正し,真の細胞/培養液濃度比から速度定数K_1とVdを算出し,増殖能と糖代謝およびメチオニン集積の関連を解析した.^<14>C標識チミジンの集積速度(増殖能)はいずれの細胞株においても低酸素状態(2および5%酸素)で24時間目には常酸素細胞(20%酸素)の30%以下に低下し,5%酸素で6日間培養されたRG2とW256の増殖能は低値であったが,C6は常酸素細胞と同程度まで回復していた.^3H-FDGの集積速度(糖代謝)はいずれの細胞株でも5%酸素で4時間目に有意に増加し,C6とW256では24時間目に常酸素細胞と同程度まで低下したが,RG2では6日目でも増加していた.2%酸素ではいずれの細胞でも糖代謝は低下していた.メチオニン集積はいずれの酸素濃度下でもRG2とW256では4時間目に増加し,C6では変化がなかったが,5%酸素で6日目にはいずれの細胞でも増加した.慢性的低酸素状態(5%酸素)における低酸素負荷(2%酸素への変更)では増殖能と糖代謝はいずれの細胞でも有意に低下し,メチオニン集積もW256で低下したが,C6とRG2では有意に増加した.低酸素負荷によりいずれの腫瘍細胞も増殖能は低下したが,^3H-FDGおよびメチオニン集積の変化は細胞株により異なることが判明し,低酸素細胞における糖・アミノ酸代謝および膜輸送の変動が示唆された.