hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体内核酸送達による骨再生法の開発に関する戦略的研究

本研究では、組織欠損部周囲の細胞への核酸送達による骨格組織修復療法の可能性を探り、その基盤技術を創出することを目的とした。核酸内包ナノミセルの最適化を行い、核酸内包ナノミセルを搭載した組織修復用機能性生体材料の作製を試みた。さらに、骨格形成関連因子の核酸を内包したナノミセルの投与により、骨格組織の変性の抑制や修復が誘導されることを、小動物における骨格組織変性モデルにより確認した。以上より、治療用遺伝子の核酸を内包したナノミセルが骨格組織修復を誘導できるコンセプトが示された。本研究は、骨形成性遺伝子を内包したナノミセルを用いた欠損部周囲の骨形成性細胞への核酸送達により骨形成を誘導する歯槽骨再生法の可能性を探り、その基盤技術を創出することを目的としている。1.歯槽骨再生のための骨形成性遺伝子内包ミセルの最適化歯槽骨再生に向けて、mRNAからのタンパク発現を最大化するための送達条件を最適化した。ポリエチレングリコールブロック共重合体とin vitroで作成したmRNAからなる高分子ナノミセルを用いて、培養細胞への遺伝子導入を行った。二つの骨形成性遺伝子を選択し、それらのmRNAの特異的な合成と品質をバイオアナライザーにて検証した。次に、予備検討から基本設計が決定された高分子ナノミセルにmRNAを搭載し、各骨形成性遺伝子(転写因子)のターゲットとなる配列によってルシフェラーゼ遺伝子の転写が活性化されるレポーターコンストラクトと共にNIH3T3細胞(マウス線維芽細胞株)に導入した。その結果、骨形成性遺伝子mRNA導入群でレポーター活性を認めたことから、導入されたmRNAから目的とする蛋白質が発現・機能していると考えられた。ウェスタンブロッティング法によっても、タンパク発現を確認した。以上より、間葉系細胞へ核酸を導入する基礎条件を決定することができた。2.骨形成性遺伝子のin vitro mRNA作製とmRNA内包ミセルの作製mRNA内包ミセル作製のためのin vitro mRNA作製法と作製したmRNAをミセルに内包する際の条件を確立することが本サブテーマの目的である。まず、レポーター遺伝子(クラゲ緑色蛍光蛋白質およびホタルルシフェラーゼ)のmRNAを用いて、in vitro転写によって効率的に、高品質なmRNAを合成する条件を見出した。次にin vitroで作成したmRNAを内包したミセルが、in vivoにおいて遺伝子発現を誘導できるかをマウス膝関節において検証した。レポーター遺伝子mRNA搭載ミセルをマウス膝関節腔内に注入すると、関節周囲の細胞に導入されることを確認した。最後に、proof-of-conceptスタディーとして、上記のマウス膝関節の実験系を用い、軟骨形成性遺伝子mRNAを搭載したミセルの関節腔内注射が軟骨の治癒を促進することを確認した。以上により、治療用遺伝子mRNA搭載ミセルが、骨格系において組織修復を誘導できるコンセプトが証明された。本年度は、in vitro mRNA作製とmRNA内包ミセルの作製の最適化が完了した。さらに、mRNA内包ミセルが骨格組織において遺伝子発現を誘導できること、さらには治療効果も有する可能性も確認できたことから、研究は順調に進展していると考えられる。申請者らは骨発生・再生に関する基礎研究を行う一方で、生体材料や遺伝子送達による組織再生に関する研究を進めてきた。そこで、これらの知見・技術シーズを組み合わせて、核酸送達による歯槽骨再生療法を開発することを目指して本研究は着想された。核酸送達システムを搭載した機能性生体材料を生体内に置くことで、欠損部周囲の骨形成性細胞への核酸送達により骨形成を誘導する歯槽骨再生法の可能性を探り、その基盤技術を創出することを目的としている。本年度はまず、核酸送達システムを搭載した骨再生用機能性生体材料の作製を試みた。前年度までの検討で骨格組織修復効果を確認した、骨格形成関連転写因子のmRNA送達システムを搭載したリン酸カルシウム微小人工骨の骨分化促進作用を細胞培養系でまず確認した。上記のmRNA送達システム搭載人工骨とともに培養した間葉系細胞における遺伝子発現解析を行ったところ、人工骨と組み合わせた際のmRNA送達効率についてはさらなる改善が必要であることが分かった。現在、人工骨への搭載量を中心に、種々の条件検討が進行中である。mRNA送達システム搭載型歯槽骨再生用材料の歯槽骨欠損モデルにおける検証のため、モデルの確立を試みた。ラット臼歯に絹糸を巻きつけることで、プラークの停滞による炎症性骨破壊が誘導されるモデルを検証した。ラットの上顎第二臼歯への絹糸結紮後に4週間待機したのち、絹糸を除去してさらに4週間観察した。放射線学的解析・組織学的解析により、絹糸除去4週目においても歯槽骨の破壊が認められたことから、本研究における歯槽骨再生効果の検証に妥当であることが確認された。mRNA送達システム搭載人工骨の最適化が終了次第、本モデルを用いた検討を開始したいと考えている。

さらに、骨格形成関連因子の核酸を内包したナノミセルの投与により、骨格組織の変性の抑制や修復が誘導されることを、小動物における骨格組織変性モデルにより確認した。以上より、治療用遺伝子の核酸を内包したナノミセルが骨格組織修復を誘導できるコンセプトが示された。間葉系細胞へ核酸を導入する基礎条件を決定することができたことから、おおむね順調に進展していると思われる。今後は、当初計画に従い、げっ歯類における骨欠損モデル・骨折モデルを用いて、治療用遺伝子mRNA内包ミセルの、骨再生・骨修復効果を検証する予定である。口腔外科学、再生医学今後は、核酸の品質と合成量が最大となる条件の基礎検討を骨形成性遺伝子で行うと共に、担体への搭載についても検討する。同一の性能で、当初予定よりも安価な試薬が存在することが判明し、物品費にかかる費用が抑えられたため。本年度は、遺伝子内包キャリアの最適化を計画していたが、予備検討からキャリアの基本設計についてはある程度有望なものが決定された。したがって、実験の規模を縮小し、キャリアの確認を生細胞において行うのみで当初の目的を達成できたため、次年度使用額が生じた。物品費にあてることを計画している。翌年度は、核酸の品質と合成量が最大となる条件の基礎検討を骨形成性遺伝子で行うと共に、担体への搭載についても検討する。そのため、当初予定していたものに加えて、複数のin vitro転写用の試薬や担体を検討することとする。
根粒共生における宿主細胞と根粒菌の相互認識機構の解析

マメ科植物と根粒菌の共生の成立には、「共生器官である根粒の発生」と「感染糸を介した根粒菌感染」が同調的に進行することが必要不可欠であることが知られているが、個々の事象の制御機構や、その同調性を制御する機構は未解明な点が多い。本研究は、根粒発生および感染糸形成の遺伝的制御機構を明らかにすることにより、根粒共生成立の基盤となる宿主細胞と根粒菌の間で行われる情報のやりとりの分子メカニズムを解明することを目的にしている。平成26年度は、前年度までに同定した感染糸中において発現する根粒菌遺伝子についてトランスポゾンのタグラインの表現型を解析した。その結果、いくつかの新規な遺伝子が根粒共生の関与することを見出した。また、Autoregulation of nodulation (AON)と呼ばれる制御系において働く、シュート由来の根粒形成抑制物質の同定を試みた。AONはマメ科植物において広く保存された、根とシュートを介して全身的に根粒数をコントロールする制御系である。ミヤコグサでは、根粒菌感染により発現が誘導される根由来のCLE-RS1/2ペプチドが、シュートにおいてそのレセプターであるHAR1によって受容されることにより、根粒形成抑制物質が生成され、それがさらに根に運ばれ、根粒形成を抑制すると考えられている。網羅的ホルモン定量解析により、シュートにおいて根粒菌感染およびHAR1依存的にサイトカイニン合成が促進されることがわかった。さらに、シュートに投与したサイトカイニンは実際に根へと移動しうること、根粒形成を抑制する活性をもつことが示された。繰越により平成27年度に実施した平成26年度の実績としては、根粒菌の感染過程に異常を示す新規なミヤコグサ突然変異体の原因遺伝子の同定を行った。ポジショナルクローニングとゲノムリシーケンスを併用し、原因遺伝子を特定した。27年度が最終年度であるため、記入しない。マメ科植物と根粒菌の共生器官である根粒の初期発生過程では、根粒菌感染によって宿主植物根の一部の皮層細胞が脱分化し、細胞分裂が誘導され根粒原基が形成される。その一方で、根粒菌は感染糸と呼ばれる管状の構造を介して宿主細胞に侵入することができる。根粒共生の成立には、「根粒の発生」と「感染糸を介した根粒菌感染」が同調的に進行することが必要不可欠であることが知られているが、個々の事象の制御機構や、その同調性を制御する機構は未解明な点が多い。マメ科のモデル植物ミヤコグサのvagrant infection thread 1 (vag1)変異体では、根粒の形成が不全となる一方で、感染糸の形成は一見正常に起こる。しかし、個々の感染糸は表皮上をさまようように伸長し、皮層細胞に侵入することができない。このことから、vag1変異体では、根粒発生プログラムの異常だけでなく、根粒菌を宿主細胞へと誘導する機構も破綻していると考えられる。VAG1は核内倍加の進行に関与するDNAトポイソメラーゼVIの構成因子をコードしており、また、根粒初期発生の詳細な観察から、根粒発生に向けて運命転換する皮層細胞ではVAG1依存的に核内倍加が起こることが示唆された。さらに、根粒初期発生過程における宿主・根粒菌双方の遺伝子発現プロファイルを取得することを目的に、根粒菌感染初期の野生型とvag1変異体それぞれにおいてRNAseqを行い、vag1変異体において特異的に発現変動する宿主・根粒菌それぞれの遺伝子群を同定した。

ポジショナルクローニングとゲノムリシーケンスを併用し、原因遺伝子を特定した。本研究課題の中心であるvag1変異体の原因遺伝子を特定することができ、機能解析も進んだため。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究により示唆された核内倍加と根粒形成の制御関係の詳細を多角的な視点から研究する。
アミロイド前駆体蛋白質APPThr668リン酸化によるシナプス可塑性制御機能解析

アミロイド前駆体蛋白質(APP)はアルツハイマー病患者脳に沈着するアミロイドベータの前駆体である。APP695は、膜1回貫通型受容体構造を持ち、細胞内ドメイン668番Threonine(Thr668)がCDK5等により神経系特異的にリン酸化を受ける。この様な構造から、APPは未知のリガンドと相互作用し、細胞内ドメインを介する情報伝達を制御している可能性が考えられる。本研究はAPPの生理機能の解明のため、Thr668を非リン酸化型のAlanine(リン酸化が起きない)に置換した変異(APP668A/A)マウスを作成した。APP668A/Aマウスは正常に発達し、脳構造およびAPPの局在に影響を与えない。ところが、週齢の増加(12-15ヶ月)に伴い、海馬CA1野におけるシナプス長期増強(LTP)が野性型と比べ有意に減少していた。APP668A/AマウスのLTPの低下は、GABA-A受容体阻害剤であるピクロトキシンにより消失した。さらにAPP668A/Aマウスではピクロトキシン感受性が著しく減少し、抑制性神経機能が低下していた。一方GABA作動性神経系の上位にあるコリン作動性神経系の関与について調べた所、ムスカリン受容体拮抗剤であるアトロピンによりLTPの異常が消失した。またM2受容体拮抗剤であるメトクトラミンによりLTPの異常が消失した。そこでAPP668A/Aマウスで認められるM2受容体の増加とGABA放出との関係を調べた所、メトクトラミンによりGABA放出機能の低下が消失した。以上の結果から、APP668A/A老化マウスではM2受容体機能が亢進し、M2受容体刺激により、GABAの放出が著しく抑制され、海馬シナプス可塑性機能が低下する事が分かった。本研究により、週齢の増加に伴う海馬、興奮生-抑制性の恒常性維持にAPPリン酸化が重要である事が明らかとなった。アミロイド前駆体蛋白質(APP)はアルツハイマー病患者の脳に沈着するアミロイドの前駆体蛋白質である。このAPPは、膜を1回貫通する受容体様構造を持ち、細胞質内ドメイン668番目のThreonine (Thr668)はCDK5などの酵素によりリン酸化を受ける事が分かっている。この様な構造から、APPは未知のリガンドと相互作用し、細胞内ドメインを介する情報伝達機構に関与している可能性が考えられる。そこで本研究はAPPリン酸化の生理機能を調べるため、APP695細胞質内ドメインリン酸化部位668番目のThreonineを非リン酸化型のAlanine(リン酸化が起きない)に置換した変異(APP668A/A)マウスを作成し、APP細胞内ドメインThr668のリン酸化の意義について検討してきた。その結果、非リン酸化マウスでは週齢の増加(12-14ヶ月)に伴い、海馬CA1野におけるシナプス長期増強(LTP)が野性型と比べ有意に減少し、その原因が抑制性ニューロンを介して入力する経路に異常がある事が分かった。またGABA作動性神経自身の異常ではなく、GABA作動性神経を介して投射しているコリン作動性神経系の機能が減少している事が分かった。またこのコリン作動性神経系の異常は、コリン作動性神経終末でのアセチルコリンの放出の異常では無く、アセチルコリン受容体の一つであるムスカリン受容体の機能が減弱している事が分かった。そこで今後の1年ではアセチルコリン以外の神経伝達調節因子であるアドレナリンやセロトニン、ドーパミン等の関与も調べ、興奮性神経やGABA作動性神経に及ぼす影響を調べる。またムスカリン受容体刺激後の細胞内情報伝達系とAPP細胞内結合蛋白質郡との関係を調べ、APPリン酸化によるシグナル伝達系を明らかにし、神経系におけるAPPの生理機能及びリン酸化の意義を検討する予定である。そこでAPP668A/A

マウスで認められるM2受容体の増加とGABA放出との関係を調べた所、メトクトラミンによりGABA放出機能の低下が消失した。以上の結果から、APP668A/A老化マウスではM2受容体機能が亢進し、M2受容体刺激により、GABAの放出が著しく抑制され、海馬シナプス可塑性機能が低下する事が分かった。本研究により、週齢の増加に伴う海馬、興奮生-抑制性の恒常性維持にAPPリン酸化が重要である事が明らかとなった。
超配向前駆体繊維からの高炭素収率を有する高性能炭素繊維作製

炭素繊維の前駆体であるポリアクリロニトリル(PAN)を用いて、低コスト・高性能炭素繊維作成につながるような、実験・研究を行った。はじめに、懸濁重合およびアニオン重合により立体規則性の異なる超高分子量PANを合成した。その結果、アタクチックおよびイソタクチック試料の合成が出来た。得られた超高分子量PAN粉末をもちいて、炭素繊維の物性を支配する工程、すなわち耐炎化工程の挙動を検討した。その結果、イソタクチックの立体規則性を有するPANの耐炎化反応(環化反応)が起こりにくくなると同時に、競争的に分子鎖切断反応が起こり、熱によって様々な構造に化学変化し、生成した低分子が気体になってしまうため、炭素収率が低下することがわかった。この原因について検討した結果、イソタクチック試料は一次構造としては、側鎖のニトリル基が同一方向に並んでいるため、環化反応が進行しやすいように見えるが、実際には3_1らせん構造を有するため、六員環が連なったラダーポリマー構造になりにくく、アタクチック試料は平面ジグザグ構造を主として有しているため、ラダーポリマー構造になりやすいことがわかった。このように、ラダーポリマー構造を形成しやすいコンフォメーションを前駆体として有することが、高炭素収率につながることを見出した。また、次年度に向けて超配向前駆体繊維の作製も行った。その結果、それぞれの試料で、延伸比50倍以上まで延伸が可能であり、超配向前駆体繊維の作製が出来た。次年度、この繊維を用いて炭素収率と性能を併せ持つ炭素繊維を作製する予定である。
着床による幹細胞の性質転換とＮｏｄａｌシグナルの多能性維持機能の獲得

初期胚における内部細胞塊としてES細胞を、原始外胚葉としてエピブラスト幹細胞(EpiSCs)をモデルとし、幹細胞の分化転換機構の解明に取り組んだ。E5.5原始外胚葉とEpiSCsの遺伝子発現を比較した結果、EpiSCsでは古典的Wntシグナル下流の中胚葉マーカーの発現が亢進していた。Wntシグナルの役割を調べるため、これを活性化するCHIR99021でEpiSCsを処理した結果、未分化を維持出来ず中胚葉への分化が認められた。逆に、これを抑制するXAV939処理では自発的分化が抑制され、未分化状態を維持できた。この様に、WntシグナルはEpiSCsの多能性維持に必須ではないことが明らかとなった。本計画研究では、初期胚発生過程の内部細胞塊として胚性幹細胞株を、原始外胚葉としてエピブラスト幹細胞株をモデル系として、生体において着床前後に生じる幹細胞の性質転換,胚体外・胚体内組織由来のシグナル因子に対する応答性の変化がどの様な分子機構によって成立するのか、そのメカニズムを分子・細胞レベルで明らかにすることを目標としています。特に、マウス初期胚発生において中心的役割を担っているNodal/Smad2シグナルに焦点を当て、着床後の幹細胞においてNodal/Smad2シグナルはどの様な分子機構で多能性維持の責任因子として機能を獲得しそれを実行するのか、標的遺伝子エピゲノムの変化とその制御に関連づけ明らかにしていきます。今年度はサブテーマ2「Smad2標的遺伝子のエピゲノム」に関して研究を実施しました。サブテーマ2「Smad2標的遺伝子のエピゲノム着床によってNodal/Smad2シグナルは幹細胞に対する多能性維持の責任因子として機能を獲得します。恐らくこの過程には何らかの機構により標的遺伝子のエピゲノムにも変化がもたらされている可能性が考えられます。例えば、エピブラスト幹細胞においてSmad2はNanog遺伝子を直接制御していますが、胚性幹細胞においてはその制御はありません。この様に、発生段階の異なる幹細胞において認められるNodal/Smad2シグナルの応答性の違いが、標的遺伝子のエピゲノムの変化に起因するかを明らかにするため、前年度に同定されたSmad2標的遺伝子のDNAメチル化およびヒストンメチル化の状態を調べました。現在、得られたデータを基にバイオインフォマティクスによる解析を進めています。本研究では、初期胚発生過程の内部細胞塊として胚性幹細胞を、原始外胚葉としてエピブラスト幹細胞(EpiSCs)をモデルとし、着床前後に生じる幹細胞の性質転換がどの様な分子機構によって成立するのか、その解明に取り組んだ。特にNodal/Smad2, Wnt, Fgfシグナルに焦点を当て、着床前後の幹細胞における多能性維持における役割を明らかにする事を目標とした。E5.5日の原始外胚葉とEpiSCsの遺伝子発現プロファイルを比較した結果、E5.5日に比べEpiSCsでは中胚葉・内胚葉マーカーの発現が高く、また古典的Wntシグナル下流の遺伝子群が多く発現していた。WntシグナルはマウスES細胞においてはその多能性維持の働きをしているが、胚発生においては原条形成・中胚葉誘導を担う重要なシグナル経路である。そこで、EpiSCsにおけるWntシグナルの役割を明確にするため、このシグナルを活性化するCHIR99021でEpiSCsを処理した結果、未分化マーカーの発現減少に伴い中胚葉への分化が認められた。逆に、Wntシグナルを抑制するXAV939で処理すると、EpiSCsはその自発的分化が抑制され、より均一な細胞集団として維持できた。次に、幹細胞株樹立時におけるXAVの効果を検討した。E6.5日胚の原始外胚葉からEpiSCsを樹立する際、Activin, Fgf2だけでは自発的分化を抑えきれず樹立・維持は困難であったが、XAVを添加することで樹立効率が飛躍的に改善した。XAV存在下で樹立・維持されたEpiSCsは、E6.5日胚に移植すると三胚葉に由来する細胞種に分化可能であり多能性を維持していることが確認された。この様に古典的Wntシグナルは、EpiSCsの多能性維持に必要で無い事が明らかとなった。Wntシグナルを阻害する低分子化合物を用いることで、EpiSCsと同じプライム型であるヒトES細胞やヒトiPS細胞の樹立・維持においてもその効果が期待される。本計画研究では、初期胚発生過程の内部細胞塊として胚性幹細胞株を、原始外胚葉としてエピブラスト幹細胞株をモデル系として、生体において着床前後に生じる幹細胞の性質転換,胚体外・胚体内組織由来のシグナル因子に対する応答性の変化がどの様な分子機構によって成立するのか、そのメカニズムを分子・細胞レベルで明らかすることを目標としています。

特に、初期胚発生において中心的役割を担っているNodal/Smad2シグナルに焦点を当て、着床後の幹細胞においてNodal/Smad2シグナルはどの様な分子機構で多能性維持の責任因子として機能を獲得しそれを実行するのか、標的遺伝子エピゲノムの変化とその制御に関連づけ明らかにしていきます。今年度は、サブテーマ(1)「Nodal/Smad2シグナルの標的遺伝子の同定」に関して研究を実施しました。(1)Nodal/Smad2シグナルの標的遺伝子の同定胚性幹細胞においては、Oct4, Sox2, Nanogといったコアとなる転写因子に加え、その発現を制御するLif/Stat3/Myc/Klf/Tbx3, Bmp/Smad1などのシグナル経路や転写因子が多能性維持に重要な役割を担っていますが、エピブラスト幹細胞においてはいまだNodal/Smad2の標的遺伝子としてはNanog以外に明らかではありません。そこで今年度は、エピブラスト幹細胞におけるSmad2のクロマチン免疫沈降(chromatin immunoprecipitation: ChIP)を行い、次世代シーケンサーによる解析を行うことでSmad2の標的遺伝子をゲノムワイドに同定しました。現在、得られたデータを基にバイオインフォマティクスによる解析を進めています。初年度に予定していたエピブラスト幹細胞を樹立する等の遅れを完全には取り戻せていないため、やや遅れている。今年度予定いていたエピブラスト幹細胞からのクロマチン免疫沈降は、胎生6.5日マウス胚からのエピブラスト幹細胞株の樹立が予想以上に困難であったこと、またクロマチン免疫沈降に用いる抗体の選別および種々の条件検討に思いのほか時間を要したことが研究の達成度に大きく影響を与えました。今後は、昨年度に引き続き着床前後における幹細胞の多能性維持機構解明に向け以下のサブテーマを実施します。一般にSmad2はDNAとの結合能が弱く、その転写制御にはFoxH1, Smad4等のパートナー分子との相互作用が必要です。しかし、これまでのノックアウトマウスの解析から、内部細胞塊、原始外胚葉の多能性維持や中胚葉誘導に対してFoxH1やSmad4は必須でないことが示唆されており、いまだ同定されていないパートナー分子の存在が考えられます。そこでこの様な分子を同定するために、(1)酵母two-hybridシステム、(2)組換えSmad2を固相化したアフィニティー精製による結合蛋白質の同定を行います。2Smad2パートナー、標的遺伝子、エピゲノムを変化させる因子とその制御機構ES細胞とEpiS細胞において発現している遺伝子プロファイルの結果から、数多くの遺伝子に発現変動が認められています。特に、ES細胞の多能性維持に必須であるとされる転写因子群がEpiS細胞では発現が減少もしくは消失していることが明らかになっています。そこでNodal/Smad2シグナルが多能性維持を獲得することと、これら遺伝子発現の変動が直接的に関与しているか、またその変動に胚発生において重要な役割を担うWnt, BMP, Fgf/Erkシグナル経路がどの様に関与しているのかを明らかにします。次年度は、着床前後における幹細胞の多能性維持機構解明に向け以下のサブテーマを実施します。(1)Smad
バイオポリマーの合成機構解明と遺伝子工学的手法を用いた新規機能性高分子の合成

セルロース生産菌Acetobacterxylinum由来のセルロース合成に関与するセルラーゼCMCaxの構造解析を目的として、酵素の単離精製、結晶化、および結晶構造解析を行った.この酵素は糖加水分解酵素のファミリー8(GH-8)に分類されており,すでに解析されていたGH-8に所属するセルラーゼCelA(Clostridium thermocellum由来)と相同な立体構造((α/α)6バレル構造)を形成していることが明らかになった.一方,糖鎖認識部はCelAにおいては6箇所の糖認識サブサイトを持つのに対して,CMCaxはひとつのチロシン残基が欠失していることからサブサイト+3が完全に消えており,この場所で認識クレフトが大きく開いていることが明らかになった.セルロース合成に関わる植物もしくは他のバクテリア由来のセルラーゼは,膜貫通ドメインをN末端側に持っており,膜にアンカーされた状態で細胞表面に存在すると考えられている.一方,CMCaxはN末端にシグナルペプチドを持つ細胞外分泌タンパク質であり,膜貫通ドメインは見られない.ところが,免疫染色法を用いた解析の結果,CMCaxも他のセルラーゼ同様に細胞表面に局在していることが明らかになった.これらの結果から,CMCaxは細胞表面において,合成され細胞から排出されるグルカン鎖と相互作用している可能性が示唆された.酢酸菌(Acetobacter xylinum)ATCC23769株のセルロース合成酵素遺伝子、およびATCC53582株のセルロース合成関連遺伝子のクローニング・シーケンシングを行った。両株におけるセルロース合成関連遺伝子の相同性を比較したところ、非常に類似していることがわかった。両菌株についてセルロース合成量を測定したところ53582株では23769株の約5倍の生産性を有していた。^<13>Cラベル化グルコースを用いた解析の結果、両菌株においてモノマー合成系に違いがあることが見いだされた。既にクローニング済みであるβグルコシダーゼ遺伝子断片を用い、相同性粗換えによってβグルコシダーゼ遺伝子欠損株を作製した。野生株、欠損株を用いてセルロース生産性、また合成されたセルロースの構造における比較を行った。βグルコシダーゼ遺伝子の欠損によってセルロース合成量が約3分の1に低下した。シャトルベクターを用いてβグルコシダーゼ遺伝子の相補を行ったところ、βグルコシダーゼは回復するもののセルロース生産能の回復は見られなかった。両菌株で合成されたセルロースの構造には大きな違いは見られなかった。これらの結果からβグルコシダーゼがセルロース合成に直接関与している可能性が高く、セルロース生産能の回復の為には他の因子が必要であることが示唆された。セルロース合成酵素遺伝子の上流に存在するエンドグルカナーゼ(CMCax)遺伝子をPCRによってクローニングし、大腸菌を用いてHisタグ融合タンパク質として大量調製を行った。精製タンパクを用いてキャラクタリゼーションを行った。CMCaxの分子量は35.6kDa、至適pHは4.5、最適温度は50°C、5糖以上のセロオリゴ糖を分解可能であり、反転型の水解機構を有していることが明らかとなった。昨年作製した酢酸菌(Acetobacter xylinum)ATCC23769株のβグルコシダーゼ遺伝子欠損株に対して遺伝子を導入し、相補試験を行った。その結果βグルコシダーゼ遺伝子以外の遺伝子がセルロース生産に関与していることが分かった。この遺伝子産物について相同性検索を行ったところ、機能は未知であるがセルロースを生産する他のバクテリアにもホモログが存在していることが明らかとなった。この遺伝子については現在さらなる検討を行っている。セルロース合成酵素遺伝子オペロンの上流に存在するORF2(CcpAx)遺伝子はセルロース合成に必須であることが示唆されており、ORF2遺伝子欠損株であるCel-1を用いてセルロース合成における機能を解析した。CcpAxの推定アミノ酸配列を用いて相同性検索を行ったところ、これまで機能が明らかとなっているタンパク質とはほとんど相同性がないことが明らかとなった。そこでCcpAxの存在箇所を調べるためにEGFPとの融合タンパク質の調製を行い、蛍光顕微鏡観察を行った。観察の結果、CcpAxは菌体の膜周辺に長軸に平行に直線的に存在していることが分かった。セルロース合成酵素複合体(TC)は菌体の長軸方向に直線的に存在していることが報告されており、CcpAxがこれらと相関して存在している可能性が示唆された。既にクローニング済みであるCMCax遺伝子断片を用い、Cel-1(CcpAx遺伝子欠損株、セルロース非生産性)株においてCMCax遺伝子欠損株を作製した。セルロース合成における機能について現在詳細な検討を行っている。セルロース生産菌Acetobacterxylinum由来のセルロース合成に関与するセルラーゼCMCaxの構造解析を目的として、酵素の単離精製、結晶化、および結晶構造解析を行った.この酵素は糖加水分解酵素のファミリー8(GH-8)に分類されており,すでに解析されていたGH-8に所属するセルラーゼCelA(Clostridium thermocellum由来)と相同な立体構造((α/α)6バレル構造)を形成していることが明らかになった.一方,糖鎖認識部はCelAにおいては6箇所の糖認識サブサイトを持つのに対して,CMCaxはひとつのチロシン残基が欠失していることからサブサイト+3が完全に消えており,この場所で認識クレフトが大きく開いていることが明らかになった.セルロース合成に関わる植物もしくは他のバクテリア由来のセルラーゼは,膜貫通ドメインをN末端側に持っており,膜にアンカーされた状態で細胞表面に存在すると考えられている.

一方,CMCaxはN末端にシグナルペプチドを持つ細胞外分泌タンパク質であり,膜貫通ドメインは見られない.ところが,免疫染色法を用いた解析の結果,CMCaxも他のセルラーゼ同様に細胞表面に局在していることが明らかになった.これらの結果から,CMCaxは細胞表面において,合成され細胞から排出されるグルカン鎖と相互作用している可能性が示唆された.
ガンダーラの植物文様の比較美術史的研究―ギリシア・ローマ的モチーフの仏教的受容―

今年度は、主に研究発表及びと資料調査を行うことによって研究を遂行した。また、資料調査については、2018年1月8日から1月17日にかけて、ギリシアのアテネ及びテッサロニキの博物館においてアカンサスなどの植物文を中心に作品の写真撮影を行った。アテネでは、古代アゴラ博物館、アクロポリス、国立歴史博物館などを見学し、植物文を中心に写真撮影を行った。テッサロニキでは、考古学博物館などを見学し、関連作品の写真撮影を行った。また、テッサロニキ近郊のヴェルギアナ、ペラに行き、博物館の見学及び作品の写真撮影を行った。その後、1月22日から1月24日にかけて、ベルリンに向かい、Altes博物館において、ディオニューソス神に関連する図像や植物文を中心に、関連作品の調査及び写真撮影を行った。当初の予定では、フランスのボルドーなどに行く予定であったが、ナポリで開催された学会で研究成果の発表を行う機会が得られたので、計画を変更して研究成果の発表を行った。この学会では、初年度に研究を進めてきた葡萄唐草文について、発表することができたため、予想外に研究が進展したと考えられる。また、本来では3年目にギリシアに行き、作品調査をする予定であったが、資金が十分に得られたので、計画を変更してギリシアのアテネとテッサロニキの博物館や遺跡を訪れた。この調査によって、今後の研究に必要な植物文を表現した作品の写真撮影のみならず、他の作品も実見し、写真撮影することができた。さらに、ベルリンの旧博物館において植物文だけでなく、ディオニューソス神と眷属を表現した石棺の作品調査及び写真撮影を行った。また、ケルンにおいて、植物文の図像の解釈に必要なディオニューオソス神のモザイクや他のコリント式の柱の上部を装飾していたアカンサス文の写真を撮影できた。これらの調査の成果から、現在まで研究が順調に進展しているといえる。3年目にギリシアにおいて調査を行う予定であったが、最終年となる今年度はその予定を少し変更して研究を遂行する。現在予定している調査地としては、トルコに行き、イスタンブールの考古学博物館においてアカンサス文などを中心に調査を行いたい。また、2018年度は欧州を中心に調査を行ったので、研究における課題として、ガンダーラの仏教彫刻の調査が2017年度に比べて不十分である。そのため、インドのニューデリーから、マトゥラーやチャンディガールなどの博物館を訪問し、ギリシア・ローマ美術の影響を受けたと考えられるインド美術や、ガンダーラの仏教彫刻の作品調査を行いたいと考えている。今後の研究を遂行するための推進策の一つとして、2019年の6月までミュンヘンに滞在する予定なので、当初の予定通り、ミュンヘン大学の西洋古典学科の図書室や国立図書館において、日本では手に入れることができないギリシア・ローマ美術の研究資料や文献の収集を行う。本研究の目的は、ガンダーラの仏教彫刻に表現された四種類の植物文ー葡萄唐草文、木蔦文、アカンサス、花綱ーが単なる装飾ではなく、仏教の来世観に関係深い象徴的な意味を有しているか否かをギリシア・ローマ美術との比較考察によって明らかにするものである。この研究を遂行するために、平成29年度においては、上記の四種類の植物文を次のように分類・整理を行った。1.文様が単独で表現されているか否か、2.他の人物像と共に表現されているか否か、3.上記の四種類の文様を表現した彫刻が、仏塔や仏塔階段のどのような場所にあったのかである。特に、上記の分類考察について、ガンダーラの仏教寺院は殆ど破壊されており、元来の仏塔建築を装飾していた彫刻が殆ど散逸してしまっているので、彫刻が元々存在した位置を把握することは困難である。それ故、その欠を補うために、今年度はインド博物館所蔵のバールフットの欄楯や、サーンチーの仏塔の調査を行い、植物文がどの場所を装飾していたかを調査した。この調査のために、CANON一眼レフ望遠交換EF100-400LIS2レンズ及びジッツオマウンテニア三脚GT3532+雲台GH3382QDキットを購入した。また、バールフットやサーンチーでは、植物文のみならず、今後の研究のために、これらの欄楯や仏塔を装飾していた彫刻を可能な限り全て、上記の望遠レンズと三脚を用いて、およそ4000枚ほどの写真を撮影した。さらに、ニューデリーの国立博物館やインド博物館内のガンダーラやインドの仏教彫刻も実見及び写真撮影を行った。この調査によって、バールフットの欄楯やサーンチーの塔門に、どのような植物文が表現されたのか考察することができ、またその意味を考察することができる。本年度の研究調査計画では、インド博物館所蔵のバールフットの欄楯や、サーンチーの仏塔の調査を挙げていた。サーンチーやインド博物館では、本来三脚を立てて写真撮影を行うことが本来禁止されている。しかしながら、今回の調査では、インド考古局(Archaeological Survey of India)に申請し、サーンチーの仏塔の周囲にある塔門彫刻の写真撮影を三脚を立てて行うことができた。これに加えて、インド博物館のバールフットの欄楯彫刻や同館所蔵のガンダーラ仏教彫刻も、館長と交渉し、三脚を立てて鮮明な写真を撮影することができた。

この写真撮影によって、インドの蓮華文などの植物文のみならず、葡萄唐草文などの考察が可能となり、ガンダーラの仏教彫刻に表現された植物文の整理・分類の作業を滞りなく進行することができたので、本年度の研究の進捗状況は、当初の研究計画通りに行われており、おおむね順調に進展しているといえる。今年度は、主に研究発表及びと資料調査を行うことによって研究を遂行した。また、資料調査については、2018年1月8日から1月17日にかけて、ギリシアのアテネ及びテッサロニキの博物館においてアカンサスなどの植物文を中心に作品の写真撮影を行った。アテネでは、古代アゴラ博物館、アクロポリス、国立歴史博物館などを見学し、植物文を中心に写真撮影を行った。テッサロニキでは、考古学博物館などを見学し、関連作品の写真撮影を行った。また、テッサロニキ近郊のヴェルギアナ、ペラに行き、博物館の見学及び作品の写真撮影を行った。その後、1月22日から1月24日にかけて、ベルリンに向かい、Altes博物館において、ディオニューソス神に関連する図像や植物文を中心に、関連作品の調査及び写真撮影を行った。当初の予定では、フランスのボルドーなどに行く予定であったが、ナポリで開催された学会で研究成果の発表を行う機会が得られたので、計画を変更して研究成果の発表を行った。この学会では、初年度に研究を進めてきた葡萄唐草文について、発表することができたため、予想外に研究が進展したと考えられる。また、本来では3年目にギリシアに行き、作品調査をする予定であったが、資金が十分に得られたので、計画を変更してギリシアのアテネとテッサロニキの博物館や遺跡を訪れた。この調査によって、今後の研究に必要な植物文を表現した作品の写真撮影のみならず、他の作品も実見し、写真撮影することができた。さらに、ベルリンの旧博物館において植物文だけでなく、ディオニューソス神と眷属を表現した石棺の作品調査及び写真撮影を行った。また、ケルンにおいて、植物文の図像の解釈に必要なディオニューオソス神のモザイクや他のコリント式の柱の上部を装飾していたアカンサス文の写真を撮影できた。これらの調査の成果から、現在まで研究が順調に進展しているといえる。今後は、今年度に分類・整理したガンダーラの仏教彫刻の四種類の植物文ー葡萄唐草文、木蔦文、アカンサス、花綱ーのどの植物文がギリシア・ローマ美術の植物文に対応するのか考察していきたい。ギリシア・ローマ美術では建築装飾以外にも陶器や金属工芸品、石棺などに、これらの植物文が表現されているので、それらの作品を分類・整理し、これらの植物文の象徴的意味を考察する。なお、葡萄唐草文については、平成29年度に収集した資料を用いて論考をまとめ、雑誌に投稿する予定である。また、引き続き、四種類の植物文について、資料収集のための実見調査及び作品の写真撮影を行う。3年目にギリシアにおいて調査を行う予定であったが、最終年となる今年度はその予定を少し変更して研究を遂行する。現在予定している調査地としては、トルコに行き、イスタンブールの考古学博物館においてアカンサス文などを中心に調査を行いたい。また、2018年度は欧州を中心に調査を行ったので、研究における課題として、ガンダーラの仏教彫刻の調査が2017年度に比べて不十分である。そのため、インドのニューデリーから、マトゥラーやチャンディガールなどの博物館を訪問し、ギリシア・ローマ美術の影響を受けたと考えられるインド美術や、ガンダーラの仏教彫刻の作品調査を行いたいと考えている。
重粒子線治療における高精度な照射位置リアルタイムモニター手法の確立

重粒子線治療において実際の炭素イオンビームの照射位置をモニターする新たな手法を開発した。まず、理論に基づいた計算により、治療時に発生する量が多い低エネルギーの光子が利用できることを明らかにし、測定装置を構築した。次に、実際に治療に用いられている炭素ビームを用いて実験を行い、本手法の実現可能性を実証した。本内容は医学物理のトップジャーナルに論文が掲載され、高い評価を受けた。制動輻射をプローブとした粒子線治療における飛程モニタリング手法の確立を目指し、初年度は制動輻射測定におけるバックグラウンドの寄与を定量した。バックグラウンドとしては、(1)「熱中性子由来のガンマ線」(2)「高エネルギーガンマ線の散乱線入射・コンプトンエスケープイベント」が考えられ、(1)及び(2)について、それぞれ実験及びシミュレーション計算による定量を行った。(1)の実験では、実際に粒子線治療に用いられている290MeV炭素ビームを水ファントムに入射し、高いエネルギー分解能をもつCdTe半導体検出器を用いて、検出器の周囲に熱中性子遮蔽材を設置した場合と設置しない場合について制動輻射/ガンマ線を測定した。その結果、両者の比較から熱中性子由来のガンマ線の影響はおおよそ200keV以上のスペクトルに現れた。観測対象とする制動輻射はおおよそ100keV以下のスペクトルに現れることから、制動輻射測定への影響はほぼ無視できることがわかった。(2)については、GEANT4を用いたモンテカルロシミュレーションにより推定を行った。この計算では、高エネルギーガンマ線の主要成分が破砕反応により生成された陽電子放出核種由来の陽電子消滅ガンマ線(511keV)であると考えられたため、その強度には上記実験系の実測値を用いた。この結果、散乱線入射・コンプトンエスケープイベントの量は制動輻射成分のおおよそ100分の1であると推量された。以上の結論として、制動輻射測定におけるバックグラウンドと予測される成分(1)及び(2)ともにプローブとして観測対象とする制動輻射と比較して十分小さい強度であり、本手法の実現の可能性を確固たるものにできた。制動輻射をプローブとした粒子線治療における飛程モニタリング手法の確立を目指し、平成23年度は、飛程位置測定手法の実験による検証を行った。粒子線治療で用いられている290MeV/uの炭素ビームを水ファントムに入射し、幅2mm鉛のスリットと5×5×0.5mmのCdTe半導体検出器を用いて、ビーム軸に対して90度方向に放出される制動輻射を測定し、発生量の入射深さに対する依存性(発生曲線)を得た。理論計算によると、飛程位置から上流側2.7mmの位置に、発生曲線の特徴点(傾きが急激に変化する点)が現れることが予測されており、本手法は特徴点から飛程位置を求める。実験では、理論計算とほぼ同じ位置(飛程位置から上流側6mm)に特徴点が観測され、これにより、本手法の実現可能性を示すことができた。溝1本の単純形状スリットを使用したため、測定時間は30分程度と長いが、多数本のスリット構造をもつコリメータと大面積検出器を組み合わせて使用することで、測定時間を数分程度に短縮できることから、現在、シミュレーションスタディによりこの検出系の検討を行っている。また、今回の実験で得られた発生曲線は、特徴点の位置に関しては理論計算とおおむね合致していたものの、曲線の形状は飛程位置から30mmほど上流側の位置において、理論計算との齟齬が生じていたため、理論計算方法の改善にも取り組んだ。これまでの計算では、制動輻射スペクトル形状として準自由電子制動輻射の式を近似的に使用していたが、実際の物理過程により即した二次電子制動輻射の式を用いて計算コードを構築し直した。これにより、実験と理論計算との齟齬が大幅に改善された。制動輻射をプローブとした粒子線治療における飛程モニタリング手法の確立のため、まず、水ファントムターゲット、検出器、コリメータ及び周囲物質での光子の散乱影響の評価をシミュレーションにより行った。この結果を基に測定系の検討を行い、幅4mm程度のスリットを連ねたコリメータ形状が検出効率及び位置分解能の向上のために適していることを確認できた。さらに、特性X線によるバックグラウンドイベントを低下するためコリメータの材質の選択が重要であることを見いだした。シミュレーションにより得られた結果を基に散乱影響の評価を行うために、スリット型コリメータを装着したプロトタイプ機の開発を行った。密封線源を用いて製作した装置の評価試験を実施し、想定した性能が得られることを確認した。また、光子収量を予測するモデルの考察、二次電子制動輻射による光子放出の計算プログラムの精密化を行った。

飛程よりおよそ3センチメートル前方において、予測値は実験値よりも数十パーセント程度小さな値となり実験結果を完全に再現することはできなかったが、本手法で重要となる飛程付近における光子収量の急激な変化については実験結果を再現し、本手法が飛程位置のモニタリングに有効であることが示された。今年度はさらに、これまでの研究開発で得た知見の一部を論文としてまとめ、医学物理分野におけるトップジャーナルであるPhysics in Medicine and Biologyに投稿し掲載された。また、本論文は、出版元である英国物理学会によってFeatured articleに選出され、高い評価を受けた。手法の実現可能性を実際の実験により示すことができたため、順調に進展していると判断できる。制動輻射の理論予測と実験結果との齟齬改善のため、計算コードの再構築に若干時間を要したが、実験データをより良く説明できるモデルが得られ、結果として、次年度の測定系検討促進に繋がるものとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。検証実験では測定条件をシンプルにするため、スリット溝1本のコリメータを使用し、30分ほどの測定時間を必要とした。最終年度にあたる平成24年度は、測定効率の高い測定系の検討、製作を行い、測定時間の短縮を実現することで、リアルタイムモニタリング手法の確立をめざす。
スクロール形状部品の実用的な高精度・高能率加工法の確立に関する研究

スクロール形状部品を通常の3軸制御工作機械を用いて,高精度・高能率に加工する実用的な方法を確立することを目的として,まず有限要素法による薄肉形状部品の加工誤差の解明を行った。その結果をまとめると次の通りである。(1)実験により求めた切削力に基づいて節点荷重の計算を行った。(2)(1)で求めた節点荷重による工作物および工具の変形量を切れ刃点で計算するとともに,切削の進行に伴って変化する荷重点のそれぞれの位置における両者の相対変位により加工誤差の予測値を求めた。(3)加工誤差の予測値は実験値にほぼ一致しており,加工誤差の予測値に占める工作物の変形の比率は,薄肉部の高さが15mm以上で50%を越えている。また,インボリュート曲線を補間誤差が0.2μm以下となるような高精度加工用プログラムを開発するとともに,スクロール内外面の高精度・高能率加工法に関する検討を行った。(4)ねじれ刃の切削機構に基づいて,スクロール内面の高精度加工法として,(i)半径方向切込みを制御する方法,(ii)送り速度を制御する方法および(iii)主軸回転数を制御する方法を提案した。(5)スクロール外面の高能率加工法として,送り速度を制御する方法を提案した。(6)提案した上記の方法により,スクロール内外面の加工精度は寸法および形状誤差はともにほぼ±10um以内である。また,外面に関しては送り速度制御法により加工精度を上記の値程度に維持しつつ,加工能率を約2倍向上させた。スクロール形状を、直交x-y座標系で指令を与える数値制御工作機械によって加工するためのプログラムの開発を行った。プログラムではスクロール形状を複数の円弧のつなぎあわせによって近似を行っており、円弧補間を用いた工具経路の誤差は最小設定単位の1/5(0.2μm)以下である。しかし、上記方法により得られた工具経路を用いてスクロールを加工すると、一定の仕上げ代を与えても、内面では切削面積の急激な増加が避けられず、外面ではその反対に切削面積が減少するため、スクロールの加工位置によって切削力は変化し、それぞれの位置で加工精度および加工能率を一定に保つことができない。そこで、基礎実験として薄肉の直線および円形状の切削を行い、切削力および加工精度の測定結果に基づいて、壁の誤差の最大誤差と最小誤差の差による形状誤差および平均値による寸法誤差がともに10μm程度となる切削条件を選定した。その条件は最大切削面積を0.014mm^2とする場合である。スクロールに沿って切削面積を上記の値に保つ加工方法には次の3つが考えられる。(1)送り速度制御方法(2)切込み制御方法(3)主軸回転数制御方法実験により、内面加工は(2)により加工精度が改善され、外面加工は(1)により加工能率を大幅に改善される。なお、今後有限要素法による工作物および工具の変形を計算するプログラムを完成させ、レーザ変位計による測定データとの比較を行うことにより、加工誤差に占める各種要因別比率を明らかにする予定である。

また,インボリュート曲線を補間誤差が0.2μm以下となるような高精度加工用プログラムを開発するとともに,スクロール内外面の高精度・高能率加工法に関する検討を行った。その結果をまとめると次の通りである。(4)ねじれ刃の切削機構に基づいて,スクロール内面の高精度加工法として,(i)半径方向切込みを制御する方法,(ii)送り速度を制御する方法および(iii)主軸回転数を制御する方法を提案した。(5)スクロール外面の高能率加工法として,送り速度を制御する方法を提案した。(6)提案した上記の方法により,スクロール内外面の加工精度は寸法および形状誤差はともにほぼ±10μm以内である。また,外面に関しては送り速度制御法により加工精度を上記の値程度に維持しつつ,加工能率を約2倍向上させた。
再生において元の形態を維持する細胞記憶の解明　ＤＮＡのメチル化に焦点を当てた解析

切断位置特異的な再生過程の解析として、これまでDNAメチル化および先行研究によって明らかとなっていたmTORC1経路についての解析を進めてきた。その結果、mTORC1経路では上流にアミノ酸の1種であるL-leucineから始まるリソソームの酸性化が尾ビレ再生過程に重要であることを明らかにした。さらに、アミノ酸の添加により、再生の活性化を行うことができ、位置特異的な再生過程は切断直後における、アミノ酸の取り込みの違いであることが予想できるようになった。これらの詳細なデータを今年度論文にまとめ、発表した。また、DNAメチル化の解析として、昨年度までにCRISPR/Cas9システムによって樹立した2系統のdnmt3aa変異体を用いて解析を行った。今年度は作製したdnmt3aa変異体を用いて全ゲノムバイサルファイト解析を行うことでdnmt3aaの標的遺伝子の同定を行うことを試みた。dnmt3aaは発生過程の受精後2日目胚(2dpf)で一番高く発現していることから、2dpfの胚を用いることでDNAメチル化の顕著な変化を確認できると予想し、解析を行った。さらに、遺伝子発現解析も同時に行うことで、特異的な遺伝子におけるDNAメチル化と遺伝子発現の相関性を示唆する結果を得ることができた。現在、詳細な解析を進め、目的の遺伝子の同定を行っている段階である。29年度が最終年度であるため、記入しない。最初に“細胞記憶"による再生制御が確認できる時期の特定を行った。私たちの研究室で既に報告している、細胞増殖制御因子であるmTORC1活性化マーカーのリン酸化S6K(p-S6K)抗体を用いて、凍結切片での免疫組織染色により解析を行った。その結果、尾ビレ再生過程において細胞増殖活性マーカーPCNA陽性細胞が確認できない尾ビレ切断後3時間より既にProximal-Distalで発現細胞の割合に差が見られることが明らかとなった。この結果は、切断後直後より位置特異的な再生制御が機能していることを示唆しており、細胞自身が“細胞記憶"に従い再生を誘導していることが予想できる。さらに詳細に解析するために、尾ビレ切断直後より発現が制御されていると予想される関連遺伝子(fgf20a, aldh1a2, atp6v1e1b等)の遺伝子発現変化を、リアルタイムPCR法を用いて確認した。その結果、遺伝子発現レベルにおいても切断後3時間よりfgf20a, aldh1a2, atp6v1e1bの3遺伝子で位置特異的な遺伝子発現を示すことが確認できた。その他様々な遺伝子においても同様に遺伝子発現の比較を行ったが、3遺伝子以外での位置特異的な遺伝子発現の変化は確認できなかった。以上の結果より、切断3時間以内で位置特異的な再生が誘導されていることが確認できた。また、再生芽特異的に発現しているDNAメチル基転移酵素(Dnmt3aa)のノックアウト個体を、CRISPR/Cas9システムを用いて作製を試みた。その結果、dnmt3aaのノックアウト個体作製に高効率な有効な配列を得ることができ、3系統をF1世代まで維持することに成功した。現在までに私は尾ビレ再生過程における元の形態を維持する細胞記憶の解明とDNAメチル化に焦点を当てた解析を行った。これらにおける解析は、当初の計画通りにそれぞれ免疫染色実験およびリアルタイムPCRを用いた遺伝子発現の解析を行うことにより、尾ビレ切断直後の切断後3時間目よりProximal-Distalで位置特異的な細胞増殖制御因子の活性および遺伝子発現の違いが確認できることを明らかにした。さらに、尾ビレ再生過程において再生芽特異的に発現しているdnmt3aaの変異体も、3系統の獲得に成功し、次世代を用いた尾ビレ再生過程の表現型を観察できる状態になっている。位置特異的な遺伝子発現の差を示した遺伝子について、薬剤スクリーニングを用いて発現量に変化を示した遺伝子発現を抑制する因子の探索を行った。その結果、これまで再生過程における機能がほとんど報告されていない新たな因子を発見した。この因子に対する阻害剤処理した個体では、Proximal側で切断した尾ビレの表皮において異常な細胞増殖を示すことを明らかにした。さらに、新規因子活性領域特異的な抗体を用いた免疫組織染色の結果から、新規因子の活性化が表皮特異的に確認できることより、位置特異的な再生には表皮からのシグナルが重要であり、発見した因子を介した経路が位置特異的な再生を誘導している可能性が予想された。この結果を踏まえ、次年度は表皮に焦点を当てた位置特異的な再生制御機構の解析を行うことを計画している。これより新規な位置特異的再生機構を明らかに出来ることが期待される事から、おおむね順調に進展していると評価する。昨年度にCRISPR/Cas9システムによって樹立したdnmt3aa変異体の解析を行った結果、2系統樹立したdnmt3aa変異体は発生過程および再生過程に異常を示さないことが明らかとなった。再生過程において複数回切断した後の再生尾ビレでは野生型においてもDNAのメチル化が顕著に減少することが明らかとなっている。このことから、dnmt3aa変異体に同処理を行うことにより、再生過程においてさらなるDNAメチル化の減少を誘導することができると考え、同様の実験を行い再生過程の観察・解析を行うことにした。その結果、dnmt3aa変異体において複数回切断すると、徐々に再生によって復元する尾ビレが有意に伸長することを明らかにした。