hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極低温干渉計で挑む重力波の初観測

平成29年度は、サファイア鏡を完成させ、これをKAGRAに装着する作業が進められた。これまでにトンネル部分の湧水対策および中央・両端エリアのクリーン化は完了しており、高性能ミラーを扱える環境が整っていた。まず、本物のサファイア鏡を吊る前に、サファイアのダミーを低温懸架系に吊して、強度試験及び冷却テストが実行された。サファイア鏡はサファイアワイヤーで吊られるが、その接触点には「耳」と呼ばれるサファイア製のプリズムが接着され、それと懸架系上段に取り付けられたサファイア製の板バネの間にサファイアワイヤーがかけられた。この作業は、追加配分で購入したクリーン服を利用して行っており、クリーン作業に寄与している。その懸架状態で冷却テストが行われ、予想どおりもしくはそれ以上の冷却スピードが得られたことは特筆すべきことである。これは今後の低温と常温を繰り返して行われるコミッショニング期間を短縮するのに大きく寄与することになる。また低温懸架系の上段となる多段防振系も2基が完成した。年度末には、この2つの装置(低温懸架系および多段防振系)を合体させたシステムに、本物のサファイア鏡が吊るされ、KAGRA防振・懸架系がついに組み上がった。現在は、この高さ14mにもおよぶ巨大な低温鏡システムの動作試験が行われており、マイケルソン干渉計を構成した状態での低温運転が開始された。一方、KAGRAに装着されるサファイア鏡4個についても最終的な製作が進められた。残念ながら1個については研磨が終了したところで年度末となったが、3つのサファイア鏡は仕様通りに仕上がったことが確認されており(LIGOの計測ラボに持ち込んで測定した)、KAGRAがそのパイオニアとなっている低温レーザー干渉計の時代が始まったことになる。残る1個も平成30年夏にはコーティング作業が終わってサファイア鏡となり、これら4個の高性能サファイア鏡は順次KAGRAに装着されていき、平成30年度末までにはリサイクリング機能を組み込んだ低温レーザー干渉計が誕生する予定である。以上の干渉計構築作業と並行して、国際共同観測ネットワーク参加の取り組みも進められた。まず、平成29年11月に開催した国際ワークショップでは、LIGOやVirgoから現場作業を行っている研究者を多数招聘し、KAGRAのコミッショニングについて意見交換した。また、平成30年3月に行われたLIGOとVirgoのコラボレーション会議に数名を派遣し、次回の国際共同観測への参加表明を行った。すでに先方からは、ネットワーク参加のための具体的な作業指示が来ており、これらを準備して、KAGRAの観測体制を整えていくことになる。平成29年度はサファイア鏡の常温でのテストとその冷却、その後の年度内の本格運転が予定されていた。サファイア鏡については、KAGRA直近の富山大学にそれを扱うためのクリーンルームが設置され、そこでサファイアワイヤー固定用のサファイア部品の接着が行われた。その後、最初のサファイア鏡がKAGRAサイトに搬入されて、無事に装着された。この状態での低温運転についても順調に準備が進んでおり、低温レーザー干渉計が稼働開始している。以上のように、若干の遅れはあるものの本研究は順調に進んでいると判断できる。重力波望遠鏡KAGRAの共同研究者は既に国内外合わせて300人を超える規模になっている。特に海外からの若手研究者(学生を含む)が増えており、また、本研究により雇用される外国人ポスドクも増えている。これは国際研究拠点をめざすKAGRAとしてはとても良い状態であり、今後も活発な若手研究者を惹きつけることが大事だと考えている。本研究では最先端研究基盤事業及び概算要求による施設整備費により整備された装置を出発点とし、その迅速な運転開始及び標準量子限界をも超える高度化のための先進的技術を開発することを目指している。それらの技術を備え付けた最先端装置のコミッショニングとその安定動作を迅速に行い、できるだけ早い時期に重力波の観測を開始することが目標である。この目標を本研究期間内に確実に達成するため、いくつかのマイル・ストーンを設定している。まず、常温の鏡を用いたシンプルな干渉計を動作させ、3kmという大型レーザー干渉計を動作させるというマイルストーンについては平成27年度中に達成することができた。この経験をもとにシステムに改良を加えることは平成28年度に実現した。今後、この巨大なレーザー干渉計に、光のリサイクリングシステム、干渉信号中のノイズ除去を加え、更には鏡も極低温で動作させて、重力波観測を行うことを目標としている。これらの技術を盛り込んだ干渉計の動作を平成30年度中に実現したいと考えている。その後にLIGOやVirgoとの国際共同観測に参加することを目指している。大型低温重力波望遠鏡KAGRAの低温ミラー懸架系は約200kgの質量を持ち、内側輻射シールドは約500kgの質量をもっている。観測を行うためにはこれら全体を20Kに冷却する必要があり、装置の修正をしては観測を繰り返すと予想される初期の段階では冷却速度の改善は極めて重要である。我々は既にダイアモンド・ライク・カーボン(DLC)のコーティングが表面の放射率を0.6程度まで向上させ、超高真空中で使用可能な黒化処理であるとの結果を得、初期冷却に要する時間を短縮できるとの試験結果を得た。この結果は博士課程の大学院学生の博士論文としてまとめられた。これによりKAGRA本体で迅速な運転立ち上げと稼働率向上につなげることができるとの結論を得た。また、DLC(ダイヤモンド・ライク・カーボン)より更に放射率の高いコーティング材料も探している。

懸架系高性能化に関してはまず構成要素に関する試験(サファイア・ファイバ強度、熱伝導率、機械的Q値の測定)、低温における制御モデル構築とシミュレーションを行った。これらをもとに懸架装置実証機を作成している段階に進んでおり、今後は既存のクライオスタット等を用いて、懸架系の冷却試験、機械特性試験と制御試験を行う予定である。また、高度なディジタル制御系を集中的に構築中であるとともに、光学系としては、出力モードクリーナーの制御実験が開始され、マイケルソン干渉計の高周波雑音を低減することに成功した。平成27年度は、KAGRAの試験運転に向けた神岡での準備を進めた。まず最初に、レーザーをはじめとする入射光学系の調整およびその周波数安定化システムの構築が行われた。特に、懸架されたミラーで構成されるモードクリーナーの設置が完了し、これを用いたレーザーの周波数安定化に成功した。これは大出力レーザーの周波数安定化実験を兼ねたものとなった。次に、折り返し鏡とその防振装置を真空容器内に設置した。また、レーザー干渉計の制御のための電子回路類と制御用のコンピュータシステムを設置・調整した。ここにおいて特筆すべき点は、ガーディアンと呼ばれる統合ソフトウェアの組込をLIGO研究者と共同して行ない、それが見事に稼働したことである。これにより、レーザー干渉計の運転を非常にスムーズにエレガントに実行することが可能となった。ここまでの一通りの設置・調整が済んだところで、レーザー光を干渉計本体に導入し、少しずつ調整をしながら基線長3kmのマイケルソン干渉計全体をシステムとして稼働させ、2016年3月25日から3月31日まで試験運転を実行した。この際には干渉計の運転のみならず、データを取得して、データ解析まで全体を通してシステムとして稼働させることに成功した。以上の当初研究計画に加え、平成27年11月から調整金等交付分により超精密干渉計制御システムの構築に着手した。具体的には干渉計制御回路を製作し、それに対応する光学系の整備を行った。試験運転で得られた結果については、現在、まとめているところである。平成27年度に達成すべき目標であったKAGRAの試験運転に向けた準備を着々と進め、それを実行できたということで、本研究はおおむね順調に進展していると言える。平成28年度の研究内容としては、まず平成27年度末に実行したKAGRAの試験運転の見直しを行い、より良い状態でレーザー干渉計の運転を行うことから着手した。これについては格段の改善がみられ、特にレーザー干渉計の運転率(安定性)が85%から90%以上へと向上した。これは今後のコミッショニングにとって非常に重要なことで、デジタル制御系が順調に動いていることを実証するものである。この後、レーザー干渉計を一旦解体し、低温鏡の装着に向けた準備を進めた。最初に実験室からトンネルに続く扉を閉め、エアフィルターを全て稼働させて、クリーン度を上げた。また、研究者は基本的にクリーンスーツを着用して作業を行っている。
肺胞上皮細胞における低酸素誘導性因子の機能解析と肺傷害治療開発に向けた基盤研究

急性呼吸促迫症候群(ARDS)では肺胞上皮細胞がミトコンドリア障害によりエネルギー代謝不全に陥ることで,傷害が引き起こされる.本研究ではARDS実験モデルを用いて,酸素センサー分子プロリルヒドロキシラーゼを薬理学的に阻害することが,低酸素誘導性因子-1経路を介して解糖系を亢進させることで,ARDSにおける肺胞上皮細胞のエネルギー代謝不全を改善し,肺胞上皮細胞傷害を軽減させることを明らかにした.肺胞上皮細胞においてHIFを活性化する方法として,臨床応用の可能性を考えてプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤を用いることとした.プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤としては,今までに多数の報告があり,また,当研究室にて使用実績のあるジメチルオキサリルグリシン(DMOG)を用いた.まず最初にin vitroで肺胞上皮細胞に対するプロリルヒドロキシラーゼ阻害の効果を調べるために,in vivoにおける肺傷害にrelevantだと考えられるin vitro肺胞上皮細胞傷害モデルの構築を行った.当初,マウス肺胞上皮細胞細胞株のMLE12,MLE15細胞にLPSを投与することで細胞死が生じるか確かめたが,MLE15細胞において高濃度のLPS投与(100μg/ml)を行った際に軽度の細胞死が見られるのみであった.肺傷害における組織障害には好中球が関与することが知られていることから,マウスから単離した好中球をLPSで刺激することで肺胞上皮細胞傷害を引き起こすモデルの構築に切り替え,MLE12細胞と単離好中球を共培養し,LPSで刺激することでMLE12細胞の生存率が大きく低下するモデルを構築することができた.このLPS刺激された好中球によるMLE12細胞傷害モデルにおいて培地に予めDMOGを加えておくと,濃度依存的に細胞死が抑制できた.さらに,MLE12細胞にsiRNAをトランスフェクションすることでHIF-1α,HIF-2αをノックダウンした所,HIF-1αノックダウンによってDMOGの細胞死抑制効果が消失することが示された.当初の計画ではウイルスベクターの構築をするとしていたが,臨床応用の観点からプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤DMOGを用いて肺胞上皮細胞保護が出来ないか検討を行うこととした結果,スムーズに実験が進められている.in vivoでの肺傷害にrelevantだと考えられるin vitro肺胞上皮細胞傷害モデルの構築に成功し,DMOGがそのモデルにおいて肺胞上皮細胞の細胞死を抑制することを明らかにできた.また,この肺胞上皮細胞保護効果がHIF-1依存的であることをsiRNAを用いた実験によって明らかにできた.これらの結果が示されたことは本研究の「低酸素誘導性因子を用いた肺胞上皮細胞保護による肺傷害治療法の開発」という目標に向けて順調に進展している状況だと考えられる.前年度に確立したin vitroでのLPS+好中球による肺胞上皮細胞傷害モデルを用いた研究を行った.前年度までに低酸素誘導性因子(HIF)を活性化させるプロリルヒドロキシラーゼ(PHD)阻害剤DMOGを投与することで,HIF-1依存的に細胞生存率の低下を抑制できることを明らかにした.本年度はまずこのモデルにおいて1細胞生存率の低下が本当に細胞死によるものなのか2細胞死機構がアポトーシスなのかネクローシスなのか3細胞死の背景においてATPの低下が生じているのか検討すると共に,4DMOGによってHIF依存的な酸化的リン酸化から解糖系への代謝リプログラミングが生じるのか?5DMOGの細胞保護効果は代謝リプログラミングを介しているのかという点についてそれぞれ検討を行った.細胞死の有無についてはフローサイトメトリーを用いて,肺胞上皮細胞の細胞膜が破綻していることを明らかにした.また,細胞死機構についてはcaspase 3/7阻害剤では細胞死が抑制されなかたものの,necroptosisの阻害剤necrostatin-1やcyclophilin D依存的なネクローシスの阻害剤cyclosporine Aによって細胞死が抑制されたことから非アポトーシス性の細胞死であることが示唆された.また細胞死と同時に細胞内のATPが低下していることを明らかにした.DMOGによるPHD阻害は肺胞上皮細胞の乳酸産生を増加させ,培地のpH,グルコースを低下させたことから酸化的リン酸化から解糖系へ代謝リプログラミングが生じていることが明らかになった.さらに,DMOGはATPの低下を抑制し,2-デオキシ-D-グルコースによって解糖系を阻害することでDMOGの保護効果が消失したことから,代謝リプログラミングをPHD阻害によるHIFの活性化が代謝リプログラミングを介して肺胞上皮細胞を保護することが示された.プロリルヒドロキラーぜ阻害剤を用いた低酸素誘導性因子の活性化によってエネルギー代謝をシフトさせることで肺胞上皮細胞を細胞死から保護することができることをin vitroの系を用いて明らかにすることができており,当初の計画目標はある程度達成できていると考えている.しかしながら,1動物実験においてDMOGが肺胞バリアーの保護効果をもつことは明らかにできている一方,細胞死や組織ATPに対して同様の保護効果が見られるのかを明らかにすることが出来ていないこと,さらに2論文作成,投稿がまだできていないということから進捗状況としてはやや遅れていると考えられる.昨年度までに,1培養細胞を用いた好中球+LPSによる肺胞上皮細胞傷害モデルにおいてプロリルヒドロキシラーゼ阻害薬DMOGがHIF-1を介した解糖系の亢進により細胞保護効果をもたらすこと,2LPS誘導性肺傷害モデルマウスにおいてDMOGの気管内投与が肺胞バリアー透過性の亢進を抑制することが明らかになっていた.

これを踏まえ,本年度はLPS誘導性肺傷害モデルマウスにおいてプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤DMOGの気管内投与が細胞死抑制効果をもつことを気管支肺胞洗浄液中の上皮細胞死マーカー,サイトケラチン18の濃度をELISA法にて測定することで明らかにした.また,LPS誘導性肺傷害モデルにおいてDMOGの投与により肺組織中の解糖系関連タンパクの増加が見られたことから,培養細胞実験と同様に肺組織中の解糖系がDMOGによって亢進されることが示唆された.さらにLPS投与による肺組織ATPの低下をDMOGの気管内投与により抑制できることを明らかにし,エネルギー代謝の改善が細胞保護効果につながっている可能性があることが示唆された.ついで,DMOG投与がLPS誘導性肺傷害における生化学的なマーカーのみならず,臨床的なアウトカムを改善する可能性があるか明らかにするために生存率を調べる実験をおこなったが,LPS誘導性肺傷害だけでは死亡する動物がいなかった.そのため,代替アウトカムとして動脈血ガス分析を行うことで,DMOGの気管内投与により動脈血酸素分圧の低下を軽減できることを明らかにし,予後を改善する可能性があることを明らかにした.以上の結果から,肺胞上皮細胞におけるプロリルヒドロキラーぜ阻害は解糖系の亢進によるエネルギー代謝の改善を介して,ARDSの新規治療アプローチになりうることが明らかにされた.これらの結果をまとめ論文を作製,投稿し,出版した.急性呼吸促迫症候群(ARDS)では肺胞上皮細胞がミトコンドリア障害によりエネルギー代謝不全に陥ることで,傷害が引き起こされる.本研究ではARDS実験モデルを用いて,酸素センサー分子プロリルヒドロキシラーゼを薬理学的に阻害することが,低酸素誘導性因子-1経路を介して解糖系を亢進させることで,ARDSにおける肺胞上皮細胞のエネルギー代謝不全を改善し,肺胞上皮細胞傷害を軽減させることを明らかにした.今後,同様にLPS刺激好中球による肺胞上皮細胞傷害モデルを用いて,プロリルヒドロキシラーゼ阻害による細胞死抑制メカニズムについて検討を行う.細胞死のメカニズムを明らかにするとともに,低酸素誘導せ因子による代謝リプログラミングに着目し,メカニズムの解析を行う.また,肺胞上皮細胞保護効果が動物モデルにおいても見られるのか,予後改善効果があるのかといった観点から動物実験を行う.LPS誘導性肺傷害マウスにおいてDMOG投与により肺胞上皮細胞死が抑制されること,またATP低下が抑制されることを明らかにする.さらに,研究成果について学会発表,及び論文の作成,投稿を行う.集中治療医学当初計画していたウイルスベクター作成ではなく,プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤の効果を検討したために,当該年度の使用額が予定よりも少なかった.動物実験においてプロリルヒドロキシラーゼ阻害が肺傷害における肺組織ATP濃度,肺胞上皮細胞死にどのような影響をあたえるのかについての検討が終わらなかったため.また,論文の作成,投稿が終わらなかったため.プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤による細胞保護効果のメカニズムについて今後研究をしていく.
人体筋肉量をカリウム-40で測定する際の体格補正の為のシミュレ-ションの開発

東大原子力センタ-の全身放射能測定装置は、大面積のプラスチック・シンチレ-タ-を検出器としている。高感度なので10分で測定できるので小児でも全身カリウム量が測れるが、同時にエネルギ-分解能が低い。箱型人体模型で校正するが、人体と模型との差はNaI検出器よりも大きな誤差となる。人体模型を多数作る代わりに、被測定者の体格と同じ模型が与えるカリウム量を、シミュレ-ションで求めるのが本研究の目的である。昭和63年度で整備が終わったシミュレ-ション・コ-ドEGS-4を使用して、次の研究を行った。1.校正に使っている箱型模型の実測値を用いて、EGS-4コ-ドのベンチマ-ク試験を行った。試験内容は、箱型模型の中に^<40>Kの水溶液があると仮定し、それを大型プラスチック・シンチレ-タ-で計数率とエネルギ-スペクトルを求めるというシミュレ-ションである。そしてシミュレ-ションによる計算値と実測値を比較し、コ-ドの妥当性と問題点を検討した。2.人体模型の設計及びシミュレ-ションを行った。幼稚園児から50歳台までの約10人が原子力研究所、動力炉・核燃料開発事業団、放射線医学総合研究所、及び長崎大学医学部でカリウム量の測定を受けた。各施設間の差は小さい。MIRD模型に従い、身体計測値から模型を設計し、シミュレ-ションを行った。(1)まず簡単のために、模型内はKが均一に分布すると仮定する。この結果は各施設での実測値から大きく離れることはないが、多少の差は残る。東大での実測値よりはよい。(2)次に体内にカリウム量の異なる臓器が存在する人体模型を設計しシミュレ-ションを行った。この結果は(1)よりも良いものと期待されるが、性別・年齢別・臓器別の重量、形状及びカリウム濃度がすべては揃っていないので若干問題は残るが、広く利用できる目途がついた。1シミュレーションで用いる数学的人体モデルの作成,このモデルとしてMIRD模型を利用するが,どんな日本人にも使えるように(1)日本人の体格や臓器の測定値を文献により求め,(2)継続して全身放射能測定を行っている小児から成人までの十余名の被検者について多くの変数を選んで身体計測をくり返し,データを得た。これにより箱型ファントムの大きさ,形にとらわれずに,被検者自身の身体値によるカリウム量の計算がシュミレーションにより可能になった。2体内カリウム分布カリウムは一様に分布していると仮定して作られた同一濃度のカリウム溶液を入れた箱型ファントムで校正を行っているが,これも誤差を大きくする原因の一つであろう。そこで筋肉などのカリウム量を文献で調べた。たとえば胸部では心筋や骨格筋にはカリウムが多く,肺にはほとんど無いので,量と立体的関係をシミュレーションにとり入れれば,精度の向上に大きく貢献するであろう。3シミュレーションの目標値となる全身カリウム量の精密測定,わが国での精密測定ができる放医研(千葉市),原研・東海(茨城県東海村),動燃・東海(同),長崎大学(長崎市)で数名がカリウムの測定を受けた。各施設間に大差は見られず,これで目標値が求められた。4シミュレーション・コードの整備(1)上記1で求めた人体モデル中のカリウムからのガンマ線が検出器に入射するまでの挙動を追う三次元モンテカルロ輸送コード並びに(2)このガンマ線に対する検出器のエネルギー応答関数を作成するガンマ線カスケード・モンテカルロ計算コードの整備はほぼ完成した。予定通りシミュレーションにより,被検者と同じ体格とカリウム分布をもち,カリウム量既知のファントムが与えるであろうカウント数と,被検者の実測カウント数とから,性・年齢・体格によらずに正確なカリウム量を求める準備がすべて整った。

東大での実測値よりはよい。(2)次に体内にカリウム量の異なる臓器が存在する人体模型を設計しシミュレ-ションを行った。この結果は(1)よりも良いものと期待されるが、性別・年齢別・臓器別の重量、形状及びカリウム濃度がすべては揃っていないので若干問題は残るが、広く利用できる目途がついた。
神経障害性の痛みの遺伝子治療を目指した非ウイルスベクターの創製

病気の際のみではなく、手術後においても、痛みは患者にとって大きな苦痛となっている。痛みのコントロールの臨床的意義の大きなことは言うまでもない。しかしながら、わが国では、この痛みに対する研究はあまり活発に行われていない。本研究の目的は、末梢神経特異的な遺伝子導入および発現効率の高い非ウイルス性遺伝子キャリアを研究開発し、痛みをコントロールする遺伝子やsmall-interfering RNA (siRNA)を神経細胞特異的に末梢から逆行性に導入する技術を確立することである。本年度は、昨年度の研究で得られた、末梢神経細胞への遺伝子発現効率が最も高い非ウイルス性遺伝子キャリア(カチオン化プルラン)を用いて、動物実験を行い、神経細胞体への逆行性の遺伝子導入について検討した。カチオン化プルランとルシフェラーゼをコードするプラスミドDNAとからなるポリイオンコンプレックスをラットの下肢、フットパットより投与し、その遺伝子発現部位を調べた。その結果、フットパット、末梢神経の後根神経節、および坐骨神経での発現を検出することができた。また、緑色蛍光蛋白質(GFP)をコードするプラスミドDNAを用いた同様の実験において、GFPの発現を免疫組織化学染色により検出できた。遺伝子発現の増強を目的として、核移行シグナル分子およびレクチンなどを組み込んだカチオン化プルランの作製を試みたが期待通りのものを作製することはできなかった。カチオン化プルランとルシフェラーゼをコードするプラスミドDNAとからなるポリイオンコンプレックスは、骨髄(MSC)および脂肪由来間葉系幹細胞(ASC)に対しても高いルシフェラーゼ発現を示した。得られたルシフェラーゼ発現MSCをくも膜下腔内へ投与したところ、MSCは脊髄へ生着し、ルシフェラーゼを発現することがわかった。病気の際のみではなく、手術後においても、痛みは心にとってきな苦となっている。本研究の目的は、末梢神経特異的な遺伝子導入および発現効率の高い非ウイルス性遺伝子キャリアを研究開発し、痛みをコントロールする遺伝子やsmall-interfering RNA(siRNA)を神経細胞特異的に末梢から逆行性に導入する技術を確立することである。本年度は、神経細胞に特異的に発現している物質を認識する分子を利用した遺伝子キャリアの開発、および、in vitroならびにin vivoにおける末梢神経に対する遺伝子発現パターンを評価した。ゼラチン、デキストラン、プルランなどの水溶性高分子に対して、エチレンジアミンあるいはスペルミンなどを化学導入したカチオン化高分子を調製することによって、プラスミドDNAあるいはsiRNAと物理化学的に相互作用することができる非ウイルス性遺伝子キャリアを創製した。得られた非ウイルス性遺伝子キャリアとプラスミドDNAとのポリイオンコンプレックスの分子サイズならびに表面電位を動的光散乱法ならびに電気泳動光散乱法を利用して評価した。さらに、得られたポリイオンコンプレックスを利用して、動物から単離した末梢神経細胞への遺伝子導入を行った。また、ラットの下肢、フットパットよりポリイオンコンプレックス投与し、末梢神経における遺伝子発現パターンについて、生化学的、および、組織学的に評価した。その結果、用いるプルランの分子量、カチオン性残基の導入率、ならびに非ウイルス性遺伝子キャリアと遺伝子との混合比を変化させることにより、ポリイオンコンプレックスのサイズと表面電位が変化することがわかった。また、ポリイオンコンプレックスの物理化学的性質がin vitroならびにin vivoにおける遺伝子発現パターンに影響をおよぼし、負に帯電するポリイオンコンプレックスを用いることにより、末梢神経の後根神経節で高い遺伝子発現を得ることができた。
北米干ばつ地帯におけるフィールド調査に基づく耐乾燥性エネルギー作物の開発

1.米国イリノイ大学および北海道大学等で実施された国際共同研究に基づいて選定されたススキ属(Miscanthus spp.)のコア集団、計60系統が、海外共同研究者のイリノイ大学EJ Sacks博士から、ユタ州に位置するブリガムヤング大学のJR Stewart博士にMTAを取り交わし、材料の送付が前年度に行われた。そこで、本年度からススキ系統に関して形態的調査が開始された。2.土壌センサーと電磁弁制御による最適な耐乾性評価手法を前年度に確立したが、本年度は降雨を遮断した施設でススキコア集団系統について同方法により、再度、耐乾性に関する特性の調査を実施した。その結果、同手法の安定性を明らかすることができ、耐乾性に優れる系統として、Miscanthus sinesis 'UI10-00020'と'UI10-00024'を選抜することができた。両系統とも葉の幅が狭い形態的特徴があった。植物光合成総合解析システム(Li-6400XT)を用いて、干ばつ条件で光合成能特性関連のパラメーターの計測を行った。その結果、耐乾性に優れる両系統は干ばつ条件でも高い光合成能を示すことを明らかにすることができた。耐乾性に優れる系統は一般には葉の細いものが多いが、中には幅が広い系統もあり、次年度に、その系統を含めながら、耐乾性に優れる系統と耐乾性に劣る系統間で、生化学的成分の違い及び遺伝子発現の特性を明らかにする。3.ススキ(Miscanthus sinensis)およびオギ(Miscanthus sacchariflorus)とサトウキビとのそれぞれの雑種であるミスケーン植物体を養成した。次年度、耐乾性に関する特性調査や遺伝子発現等に関して実験を実施する。4.ブリガムヤング大学でアガベの耐乾性特性調査が開始された。2年間の研究から、土壌センサーと電磁弁制御による耐乾性評価手法は安定した手法であることが明らかにでき、耐乾性に優れるススキ系統を選抜することができ、また、干ばつ条件での光合成能が優れていることを明らかにできた。ブリガム大学での評価も順調に経過している。1.北米ユタ州に位置するブリガムヤング大学の調査結果と北大での土壌センサーと電磁弁制御による耐乾性評価手法による結果を最終的に比較する。2.耐乾性に優れる系統と耐乾性に劣る系統間で、生化学的成分の違い及び耐乾性関連遺伝子における遺伝子発現の違いを明らかにする。3.ススキ(Miscanthus sinensis)およびオギ(Miscanthus sacchariflorus)とサトウキビの親系統とその雑種の耐乾性を比較するとともに遺伝子発現の比較を行う。4.アガベ系統の耐乾性に関する順位付けを行う。1.「北米ユタ州ブリガムヤング大学野外フィールドにおけるススキ属耐乾性評価」の研究課題:研究代表者らはこれまで国際共同研究の中で、中国、韓国および日本などから収集されたススキ属遺伝資源系統を含む約1,200遺伝子型に関してSNPマーカー約2万個以上を用いて多型解析を行った。遺伝構造解析の結果に基づき選定したススキ属コア集団、計60系統が、米国イリノイ大学および北海道大学でそれぞれ保管されている。日本からはススキ属植物体を植物検疫上の問題で米国には送付できないので、海外共同研究者のイリノイ大学EJ Sacks博士から、ブリガムヤング大学のJR Stewart博士にMTAを取り交わして送付が行われた。今年度は手続きに時間を要し、圃場への移植はできなかったが、次年度から調査を開始する。研究代表者らは平成30年2月にブリガムヤング大学に訪問して、調査法の確認を行った。2.北海道大学における施設を利用したススキ属耐乾性評価法の確立:北大の農場内に降雨を遮断したハウス施設を設置し、ススキ属コア集団60系統を用いて、潅水制御による乾燥耐性の評価試験を行った。一次選抜として、60系統から25系統を選抜した。さらに、第二次選抜として、乾燥耐性に優れる8系統、弱い2系統を選抜した。また、ブリガムヤング大学のStewart博士の協力で、土壌センサーと電磁弁制御による最適な耐乾性評価手法を、平成30年度に確立する予定であったが、前倒しで確立できた。3.北米に自生しているアガベ遺伝資源収集:平成30年2月に北米の乾燥地におけるアガベの遺伝資源収集を実施した。合計で10点の遺伝資源系統を採取し、植物体はブリガムヤング大学で保管されている。北限の材料であるので、低温耐性を示す遺伝子型として期待される。「北米ユタ州ブリガムヤング大学野外フィールドにおけるススキ属耐乾性評価」の課題については、MTAの関係で試験が遅れた。しかしながら「北海道大学における施設を利用したススキ属耐乾性評価法の確立」では、土壌センサーと電磁弁制御による最適な耐乾性評価手法を、平成30年度に確立する予定であったが、前倒しで、平成29年度に確立できた。よって、本研究課題としては、おおむね順調に進展していると判断した。

2.土壌センサーと電磁弁制御による最適な耐乾性評価手法を前年度に確立したが、本年度は降雨を遮断した施設でススキコア集団系統について同方法により、再度、耐乾性に関する特性の調査を実施した。その結果、同手法の安定性を明らかすることができ、耐乾性に優れる系統として、Miscanthus sinesis 'UI10-00020'と'UI10-00024'を選抜することができた。両系統とも葉の幅が狭い形態的特徴があった。植物光合成総合解析システム(Li-6400XT)を用いて、干ばつ条件で光合成能特性関連のパラメーターの計測を行った。その結果、耐乾性に優れる両系統は干ばつ条件でも高い光合成能を示すことを明らかにすることができた。耐乾性に優れる系統は一般には葉の細いものが多いが、中には幅が広い系統もあり、次年度に、その系統を含めながら、耐乾性に優れる系統と耐乾性に劣る系統間で、生化学的成分の違い及び遺伝子発現の特性を明らかにする。3.ススキ(Miscanthus sinensis)およびオギ(Miscanthus sacchariflorus)とサトウキビとのそれぞれの雑種であるミスケーン植物体を養成した。次年度、耐乾性に関する特性調査や遺伝子発現等に関して実験を実施する。4.ブリガムヤング大学でアガベの耐乾性特性調査が開始された。2年間の研究から、土壌センサーと電磁弁制御による耐乾性評価手法は安定した手法であることが明らかにでき、耐乾性に優れるススキ系統を選抜することができ、また、干ばつ条件での光合成能が優れていることを明らかにできた。ブリガム大学での評価も順調に経過している。1.北米ユタ州ブリガムヤング大学野外フィールドにおけるススキ属耐乾性評価:遺伝構造解析の結果に基づき選定したススキ属コア集団、計60系統について、ブリガムヤング大学野外フィールドにおいて、耐乾性に関する特性調査を行う。バイオマス重量と各種特性との関連性を明らかにするとともに、最終的には、コア集団系統における耐乾性の順位付けを行う。2.北海道大学における施設を利用したススキ属耐乾性評価法の確立:前年度に確立した土壌センサーと電磁弁制御による耐乾性評価手法を用いて、ススキ系統の耐乾性の評価を行うとともに耐乾性に関する特性調査を行う。ユタでの圃場のデータとの関連性を明らかにする。また、次年度のトランスクリプトーム解析のために、耐乾性に優れる系統、弱い系統を選抜する。3.北米に自生しているアガベ遺伝資源の特性評価:研究代表者らが前年度に収集した10系統に、ブリガムヤング大学で保管されているアガベ系統50系統を加えて、計60系統について耐乾性に関する特性評価を行い、耐乾性の順位付けを行う。1.北米ユタ州に位置するブリガムヤング大学の調査結果と北大での土壌センサーと電磁弁制御による耐乾性評価手法による結果を最終的に比較する。2.耐乾性に優れる系統と耐乾性に劣る系統間で、生化学的成分の違い及び耐乾性関連遺伝子における遺伝子発現の違いを明らかにする。3.ススキ(Miscanthus sinensis)およびオギ(Miscanthus sacchariflorus)とサトウキビの親系統とその雑種の耐乾性を比較するとともに遺伝子発現の比較を行う。4.アガベ系統の耐乾性に関する順位付けを行う。
水素ガス吸入による網膜虚血再灌流障害抑制効果の検討

網膜の虚血再灌流モデルを作成するため、マウスを用いて前房内に生理食塩水のボトルに接続した30ゲージ針を刺入し、眼圧を110mmHgになるように維持した。術中に眼圧上昇による痛みのため覚醒したり、眼圧上昇がうまくいかないなどがあり、モデル作成に時間を要した。さまざまに工夫を行い、何とかモデル作成を行うことができた。虚血再灌流障害後7日目にマウスを安楽死させ、眼球を摘出し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン切片を作成した。視神経を通る断面で作成した切片をHE染色し、組織学的に検討した。手術操作を容易に行えて、さらに安定したモデルを作成するため、ラットを用いて同様のモデルを作成することも検討していく予定である。水素ガス吸入の準備も行っており、組織学的検討を行う予定である。マウスで網膜の虚血再灌流障害モデルを作成していたが、眼球が小さいため扱いが難しい場合もあった。モデル作成はできたが、できれば扱いがより容易と思われるラットの眼球で同様の虚血再灌流障害モデルを作成するほうが良い可能性がある。ラットについては、今後検討する予定である。マウスとラットの網膜の虚血再灌流障害モデルを比較検討した後、本モデルを用いて水素学吸入による効果を組織学的、生化学的に検討していく。
動的な機能関係を持つ複雑なシステムの故障分析

システムの機能構造が時間ともに変化する複雑なシステム、フェーズドミッションシステム(PMS)では、その各作業段階での故障発生原因は目的機能とともに変化し、また故障確率も断続的に変化する。また故障が発生した時にはその原因候補を推定するのに故障発生前のフェーズとの機能関係を考慮して、潜在的故障原因を検討する必要がある。本研究では、このような特徴を有するPMSの故障分析方法の確立を試みる。システム故障分析ではまずシステム機能達成条件を定義する必要がある。一般的には、システムの要求機能毎に達成条件を定めて、それらの要求機能がすべて満たされるときシステム機能が達成されると考える。しかし、機能関係が時間的に変化するフェーズドミッションシステムでは、フェーズに応じて要求機能が異なり故障条件も変化する。本研究では、機能関係が動的に変化するフェーズドミッションシステムの故障分析方法の確立を目的とする。本年度は、あるフェーズでシステム故障が初めて発生する条件を導出する方法を開発した。ある時刻における要素状態をその時点での要求機能が満たされているかどうかを表す二値変数で表現し、要素変数の論理関数で各フェーズでのシステム故障発生状態を表現する。これは、あるフェーズにおけるシステム故障を表す要素故障の組み合わせ(最小カットセット)による定性的表現に相当する。ただし、各フェーズでの機能要求が異なるので二値変数の表す故障の内容は異なり、各要素に対して複数の故障モードを考慮する必要がある。要素iは時刻tで故障モードjにある時に1をとる二値変数を用いて複数故障モードを取り扱い、システム故障条件を求める論理演算を簡便化する。あるフェーズでのシステム故障発生は、そのフェーズの終了時点で最小カットセットの発生状態で表現できる。したがって、あるフェーズで初めてシステム故障が発生する条件は、{それ以前のフェーズでシステム故障が発生しない}と{想定するシステム故障がそのフェーズで発生する}との論理積で表される。前者の条件は各フェーズの終了時点で最小カットセットが発生していない状態(発生状態の否定)の論理積で、後者は最初カットセットの発生状態でそれぞれ表現できる。あるフェーズでのシステム故障発生条件は、要素状態を表す排他的な二値変数の論理演算により得られる。本年度は、昨年度に構築した、時間的に機能構造が変化するフェーズドミッションシステム(PMS)に対する各フェーズで初めて故障する発生確率を評価する枠組みの改良を行った、PMSではフェーズが切り替わる瞬間に潜在的に存在していたシステム故障発生要因が顕在化することがある。事故に至らないようにするためには、システム状態の推定方法について検討した。システムの進展とどもに逐次得られる情報を用いてシステム状態推定確率を更新するために、ベィジアンネットワーク(BN)をシステムモデルツールとして採用した。これにより、従来のフォールトツリー分析では、故障診断と故障予測を個別に実施する必要があったが、同一モデル上で簡単に行える。また、過去に得られている故障情報や定量的データを用いてモデルが更新が行いやすい特徴がある。BNに基づく方法は時間軸に沿って前向きに推定を行うのが基本であるが、異常な兆候が現れた時は時間を遡って原因推定が可能である。また、従来の信頼席解析では要素に対しては単一故障を仮定することが多かったが、PMSでは機能構造が変化するので、要素に要求される機能も異なるので複数故障モードを考慮しなければならない。そこで、要素故障モデルとして複数の各故障モードが独立に進展してその1つのみが故障に至るという競合モデルを採用した。各故障モードが指数分布に従い、故障発生率が時間に依存しない場合は解析的に解が得られ、BNを用いて分析する場合も計算が簡単化される。これにより、PMSの故障推定と故障原因同定を行う枠組みを確立した。
オピオイド受容体に対する麻酔薬、鎮痛薬の作用解析

モルヒネやフェンタネストなどのオピオイドと吸入麻酔薬の相互作用は不明である。アフリカツメガエル卵母細胞発現系を利用し、オピオイド受容体に対する麻酔薬の作用を電気生理学的に解析した。現在までの検討で、これらのGq/GiキメラG蛋白結合μオピオイド受容体の高率の発現を示し、麻酔薬ハロセンなどはμオピオイド受容体に影響することを明らかにした。現在までハロセンは多くのG蛋白結合受容体をリン酸化酵素プロテインキナーゼC(PKC)によって抑制することが報告されているため、μオピオイド受容体の機能にも燐酸化酵素によって影響があるかどうか検討している。これらの結果をもとにμオピオイド受容体への麻酔薬の作用の全貌を明らかにしたいと考えている。モルヒネやフェンタネストなどのオピオイドは吸入麻酔薬のMACに影響することが知られているが、その相互作用にどのようなメカニズムがあるのかは不明である。最近、麻酔薬がムスカリンtype2受容体(M2)を始めとしたGi蛋白結合受容体も多く存在し、これらの受容体にも麻酔薬が関与しているという報告がなされてきた。オピオイド受容体も脊髄、中枢神経に分布しているGi蛋白結合受容体で麻酔薬の作用に関与しているという報告がなされているが、オピオイド受容体への麻酔薬の作用について詳しい検討は全くなされていない。今年度の研究においては、麻酔薬の直接的なオピオイド受容体への影響を明らかにするため、(1)Gq/GiキメラG蛋白とμオビオイド受容体を分子生物学的に結合させたμオピオイド受容体(Gq/GiキメラG蛋白結合μオピオイド受容体)をアフリカツメガエル卵母細胞発現系に発現させ、μオビオイド受容体に対する麻酔薬(ハロセン、イソフルラン、セボフルラン、エンフルラン、ケタミン、プロポフォール、トラマドール、デクサメヂトミジン)の作用を電気生理学的に解析し、現在までの検討で、これらのGq/GiキメラG蛋白結合μオピオイド受容体の高率の発現を示し、麻酔薬ハロセンなどはμオピオイド受容体に影響することを明らかにした(2)現在までハロセンは多くのG蛋白結合受容体をリン酸化酵素プロテインキナーゼC(PKC)によって抑制することが報告されているため、μオピオイド受容体の機能にも燐酸化酵素によって影響があるかどうか検討している。オピオイドは吸入麻酔薬のMACに影響するが,その相互作用にどのようなメカニズムがあるのかは不明である。本研究ではオピオイド受容体に対する麻酔薬の直接的な影響を明らかにするため,Gq/iキメラG蛋白とμオピオイド受容体(pOR)を分子生物学的に結合させたpオピオイド受容体(Gq/iキメラG蛋白共役型pオピオイド受容体,μOR-Gqi)をアフリカツメガエル卵母細胞発現系に発現させ,μORに対する麻酔薬の作用を電気生理学的に解析した。また,μORの機能にもリン酸化酵素の影響があるかどうかを検討した。さらに,μORのノックアウトマウスを用いて麻酔薬がどのように影響するかを行動薬理学的に比較検討するために以降の実験を行った。まず,アフリカツメガエル卵母細胞発現系におけるGq/iキメラG蛋白とμオピオイド受容体を分子生物学的に結合させたpオピオイド受容体(Gq/iキメラG蛋白共役型μオピオイド受容体,pOR-Gqi)への麻酔薬の薬理学的解析した。その結果,麻酔薬ハロセン,イソフルランは臨床使用濃度において,pORに影響を持つことを確認した。現在,μOR-Gqiに対する麻酔薬の効果と細胞内リン酸化酵素の関係を解析していたが,本年度は解析に至らなかった。現在は細胞内リン酸化酵素の作用部位を遺伝子変換させたpORに対する麻酔薬の効果との関係を解析しており,さらに,上記でμOR-Gqiに対する麻酔薬の効果に細胞内リン酸化酵素が関与していると考えられた場合はμオピオイド受容体のリン酸化酵素部位である,セリン-スレオニンの部位を他のリン酸化を受けないアミノ酸に配列を変換し,これらのRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入発現させ,DAMGOで刺激し,それらに対する麻酔薬(ハロセン,イソフルラン,セボフルラン,エンフルラン)の作用をリン酸化酵素存在下で解析する予定である。

オピオイド受容体も脊髄、中枢神経に分布しているGi蛋白結合受容体で麻酔薬の作用に関与しているという報告がなされているが、オピオイド受容体への麻酔薬の作用について詳しい検討は全くなされていない。今回の研究においては、麻酔薬の直接的なオピオイド受容体への影響を明らかにするため、(1)Gq/GiキメラG蛋白とμオピオイド受容体を分子生物学的に結合させたμオピオイド受容体(Gq/GiキメラG蛋白結合μオピオイド受容体)をアフリカツメガエル卵母細胞発現系に発現させ、μオピオイド受容体に対する麻酔薬(ハロセン、イソフルラン、セボフルラン、エンフルラン、ケタミン、プロポフォール、トラマドール、デクサメヂトミジン)の作用を電気生理学的に解析し、現在までの検討で、これらのGq/GiキメラG蛋白結合μオピオイド受容体の高率の発現を示し、麻酔薬ハロセンなどはμオピオイド受容体に影響することを明らかにした。(2)現在までハロセンは多くのG蛋白結合受容体をリン酸化酵素プロテインキナーゼC(PKC)によって抑制することが報告されているため、μオピオイド受容体の機能にも燐酸化酵素によって影響があるかどうか検討している。これらの結果をもとにμオピオイド受容体への麻酔薬の作用の全貌を明らかにしたいと考えている。
悪性中皮腫における癌幹細胞CD44アイソフォームの解析と下流シグナル経路の解明

悪性中皮腫は、アスベストに関連し発症する予後不良の疾患である。中皮腫では胸水中にヒアルロン酸が過剰に分泌されているため、我々は樹立した中皮腫細胞株を用いて、ヒアルロン酸の受容体であり癌幹細胞の表面マーカーでもあるCD44の発現およびバリアント解析を行った。またヒアルロン酸分泌の原因遺伝子の探索、CD44の下流シグナル経路の解明に向けた統合解析を行った。その結果、一部の中皮腫細胞株でヒアルロン酸の過剰分泌と、その原因遺伝子としてHAS2の高発現を確認した。さらにHAS2高発現の中皮腫細胞株では、CD44バリアントv2ーv7の発現が上昇していることを明らかにした。我々は癌幹細胞表面マーカーである接着分子CD44に着目し、悪性胸膜中皮腫におけるバリアントアイソフォームの解析をするとともに、中皮腫細胞においてヒアルロン酸に結合するLinkファミリー蛋白としての機能について分子レベルで解明をすすめている。これまでに愛知県がんセンターと協力して、悪性胸膜中皮腫の検体を集め、主に胸水から細胞株樹立に着手してきた。日本人由来の中皮腫細胞株を含む約20株を用いてCD44の発現をWestern blot法やFACS (fluorescence activated cell sorting)法を用いて確認した。その結果、ほとんどすべての中皮腫細胞株でCD44が高発現しており、さらにバリアントを含め比較的均一でhomogeneousな細胞集団を形成している細胞株から、発現レベルも様々なheterogeneousな細胞株まで様々であった。バリアントアイソフォームに関しては、PCRを主体に解析を進めており、細胞株によって異なったバリアントアイソフォームを確認している。CD44はアイソフォームの数が多く、細胞株によってその発現が多岐に及ぶと解析が困難にはなるため、現状の細胞株数では一定の見解を得難く、さらなる細胞株の樹立が必要と考えられる。今後の予定としては細胞株の樹立に着手しつつ、現在までの解析結果をもとに下流のシグナル経路との関連についても検討を加える予定である。また実臨床では、上皮型の悪性中皮腫では胸水中に多量のヒアルロン酸が確認されるため、ヒアルロン酸の受容体としてのCD44の機能をバリアントアイソフォームの違いの観点から追及したい。我々は癌幹細胞表面マーカーである接着分子CD44に着目し、悪性胸膜中皮腫におけるバリアントアイソフォームの解析をするとともに、中皮腫細胞においてヒアルロン酸に結合するLinkファミリー蛋白としての機能について分子レベルで解明をすすめてきた。バリアントアイソフォームに関しては、PCRを主体に解析を進め、細胞株によって異なったバリアントアイソフォームを確認した。CD44はアイソフォームの数が多く、細胞株によってその発現が多岐に及ぶと解析が困難にはなるため、現状の細胞株数では一定の見解を得難く、さらなる細胞株の樹立が必要と考え樹立を試みてきた。またヒアルロン酸の分泌過剰の一因としてHAS2の発現が上昇しており、さらにその受容体であるCD44の発現も上昇していることを明らかにした。HAS2・CD44のKnockdownでは有意な差を認めなかったことから、治療標的としては課題の残る結果であったが、FACS法によりこれらの細胞株のCD44の発現は非常にHeterogeneityが強いことも確認した。今後の検討方針として、フローサイトメトリーを用いCD44の発現の高い細胞をソーティングすることで、治療標的としての効果判定を追加検討するほか、下流のシグナル経路についてもexpression array・LC/MSを用いて、mRNA・プロテインレベルでの統合解析を予定している。呼吸器外科学中皮腫細胞株の樹立スピードとしては、症例数の割合からすると一定の成果が出ているが、CD44のバリアントアイソフォーム数は多彩であり、これまでの解析で発現パターンが多岐に及んでいたため、組織型による分類など臨床情報と照らし合わせても特定の方向性を示す見解は得られなかった。同じ上皮型由来の中皮腫細胞株でも、想定以上にバリアントが多様であったことが、機能解析にまで着手できていない理由である。今後さらに関連病院との連携を深めることで、中皮腫検体を収集に力を入れ樹立する細胞株の数を増やしていく予定である。また細胞株の樹立についても、メディウムの種類や量・plateの種類など様々な手法を検討することで、より効率のいい方法に到達できればと考えている。研究計画に大きな変更はないが、解析する視点を臨床情報や組織型との関連だけでなく、Hippo pathwayといった下流のシグナル経路との関係に加えて、最近他癌種で報告されたシスチントランスポーターxCTとの関連についても中皮腫細胞株で解析する予定である。

さらにヒアルロン酸のレセプターとしての観点から、ヒアルロン酸の分泌促進シグナルとの関連についても検討を加えることで、本研究計画における一定の成果を出したいと考えている。急患により出張を取りやめたため次年度の出張充てる予定
触媒的不斉芳香族アミノ化反応を利用する光学活性含窒素化合物の効率的合成

触媒的不斉芳香族アミノ化反応(触媒的不斉Buchwald-Hartwig amination)を利用して炭素-窒素不斉軸を有する種々のアトロプ異性アニリド誘導体を高エナンチオ選択的に合成した.また,アトロプ異性アニリド生成物をキラル分子として用いる不斉反応の開発にも成功した.さらに,触媒的不斉N-アリル化反応を利用したメソ型ジアミン誘導体の触媒的不斉非対称化も見いだした.触媒的不斉芳香族アミノ化反応(触媒的不斉Buchwald-Hartwig amination)を利用して炭素-窒素不斉軸を有する種々のアトロプ異性アニリド誘導体を高エナンチオ選択的に合成した.また,アトロプ異性アニリド生成物をキラル分子として用いる不斉反応の開発にも成功した.さらに,触媒的不斉N-アリル化反応を利用したメソ型ジアミン誘導体の触媒的不斉非対称化も見いだした.平成18年度は,触媒的不斉芳香族アミノ化反応を利用したアトロブ異性アニリドの高エナンチオ選択的合成と得られたアニリド生成物の不斉反応への応用について検討した結果,以下の知見を得た.1,触媒的不斉芳香族アミノ化反応を利用するアトロプ異性アニリド誘導体の高エナンチオ選択的合成申請者は既に,アキラルなオルトtert-ブチルNHアニリドと4-ニトロヨードベンゼンの芳香族アミノ化反応を(R)-DTBM-SEGPHOS-Pd(OAc)_2触媒存在下行なうと,高エナンチオ選択的にアトロブ異性アニリドが得られることを見いだしている.今回,反応の適用と限界を明らかにする目的で種々の基質を用いて詳細な検討を行なった.その結果,本反応は種々の直鎖ならびに分枝脂肪族カルボン酸アミドに適用が可能であり,いずれも高いエナンチオ選択性(88-95%ee)でアニリド生成物が得られることを見いだした.また,アルケニル,アルキニル,エーテル,アセタール官能基等を有するカルボン酸アミドの反応も好収率ならびに高エナンチオ選択的に進行した.2,アトロプ異性アニリド生成物の立体配座解析アニリド生成物をキラル分子(キラル補助基)として利用するために,低温NMR測定,NOESY実験,X線結晶解析等を行ないその優先立体配座について検討した.その結果,オルトtert--ブチルフェニル基がアミドカルボニル酸素とトランスの関係にあるE配座を優先することが明らかとなった.このE配座優先性は一般性があり,種々のアニリド基質で観察されている.3,アトロプ異性アニリド生成物を利用した不斉反応の開発アトロプ異性アニリド生成物の合成化学的利用という観点から,不斉エノラート化学への適用について検討を加えた.すなわち,触媒的不斉芳香族アミノ化反応により高エナンチオ選択的に得られたN-(4-ニトロフェニル)-オルト-tert-ブチルアニリド生成物をN-フェニル体に変換し,n-BuLiを用いてリチウムエノラートを調製した.このエノラートにおいても上述したE配座優先性が生じており,種々のハロゲン化アルキルとの反応は高ジアステレオ選択的に進行し,α-アルキル化生成物を与えた.平成19年度は,触媒的不斉分子内芳香族アミノ化反応を利用したアトロプ異性ラクタムの高エナンチオ選択的合成と得られたラクタム生成物の有用化合物への変換反応について詳細に検討した結果,以下の知見を得た.1,触媒的不斉分子内芳香族アミノ化反応を利用する光学活性アトロプ異性ラクタムの合成申請者は,先に見いだした触媒的不斉芳香族アミノ化反応を分子内反応へ適用することにより,光学活性アトロプ異性ラクタムの合成を試みた.すなわち,分子内にヨードフェニル基を有する種々のオルト-tert-ブチル-NH-アニリドの反応を(R)-SEGPHOS-Pd(OAc)_2触媒存在下行なうと,高エナンチオ選択的(93-98%ee)にアトロプ異性ラクタムが得られることを見いだした.また,得られたアトロプ異性ラクタムのラセミ化の回転障壁は先に報告したアニリド誘導体よりもかなり高く,キラル分子として十分に利用可能であることも明らかにした.2,光学活性アトロプ異性ラクタムを用いる生理活性化合物の合成高エナンチオ選択的に得られたアトロプ異性ラクタムを用いて,ノルエピネフリントランスポーター阻害剤(NET阻害剤)として知られている化合物への変換反応を検討した.まず,ラクタムより調製したリチウムエノラートと臭化アリルとの反応により,高ジアステレオ選択的にα-アリルラクタムを得た.次いで,アリル基部位の官能基変換,ならびにretro-Friedel-Crafts反応による脱tert-ブチル化により,NET阻害剤の合成中間体として知られている化合物の不斉合成に成功した.本年度は、昨年度開発した触媒的不斉芳香族アミノ化反応により高エナンチオ選択的に得られた光学活性アトロプ異性ラクタムの化学的性質、ならびに当該ラクタムを用いた不斉反応について検討した結果、以下の知見を得た。1、アトロプ異性ラクタムで観察された過剰エナンチオマーの分離現象光学活性アトロプ異性ラクタム(70%ee)の過剥エナンチオマーが、アキラルなシリカゲルカラムを用いる中圧の液体クロマトにより効率良く分割できることを見出した。

すなわち過剰に存在する一方のエナンチオマーが回収率45%、エナンチオ過剰率99%eeで分離された。このような分離現象は他のキラル化合物でも報告されているが、炭素-窒素軸不斉化合物では最初の例となる。2、光学活性アトロプ異性ラクタムを用いるα-置換ラクタムの高選択的立体分岐合成昨年度申請者は、光学活性アトロプ異性ラクタムから調製したラクタムエノラートを用いて高立体選択的なα-アルキル化反応の開発に成功している。今回、α-アルキルラクタム生成物からエノラートを調製し、さらにアルキル化やプロトン化を行なうことで、α-アルキルラクタムやα,α-ジアルキルラクタムの立体分岐合成を行なった。その結果、プロトン化およびアルキル化のいずれもが高ジアステレオ選択的に進行することを見出した(プロトン化は90%de、アルキル化は98%de)。これにより、α-置換ラクタムならびにα,α-二置換ラクタムの両ジアステレオマーが高選択に合成可能となった。