hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子改変マウスを用いたマウス胎仔皮膚再生の解明

創傷を作成した胎仔をその後OCTコンパウンドに包埋し、急速冷凍し-80°Cで保存した。凍結標本から厚さ7μmの凍結切片を作成した。または、パラフィンで包埋し、パラフィン切片を作成し、7μmの組織切片を作成した。72時間後の標本から形態変化を観察したが、全身的なうっ血と浮腫を呈する個体が多く発生した。途中の経過を組織学的に検索したが、リンパ管の形成不全を有する個体が存在した。このため、皮膚再生の有無の判定が困難であった。このため、これまで当研究室で行ってきた免疫不全マウス背部への表皮細胞との混合移植で、混合移植で皮膚の再構築を試みた。胎生17日から新生仔のマウスを回収し、homoとwildtypeのそれぞれ表皮と真皮を分離して、scid mouseに混合移植を行った。そうすると、wild typeどうしの組み合わせでは、完全な皮膚が再生したが、homoどうしの組み合わせでは全く毛包が再生せず、homoとwildの組み合わせでは、一部に毛包が再生したが、ごく一部の再生にとどまった。ノックアウトマウスから採取した、胎生13日、15日の真皮線維芽細胞を培養し、in vitroでの遺伝子ノックアウトによる機能評価を行った。Scratch assay,MTT assayなどで細胞増殖能、遊走能を確認した。計画書に則って、研究を遂行してゆく。当初の研究計画に従って、絞り込んだ遺伝子の中から、皮膚再生に関わっているものに対しての解析を進めてゆく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ブロック共重合体ミセル形成時の鎖長識別現象に基づく新規ホスト-ゲスト系の構築

(1)種々組成の荷電を有するブロック共重合体及び単独重合体の合成:片末端に1級アミノ基を有するポリエチレングリコール(PEG)を開始剤として用い、β-ベンジル-L-アスパルテートN-カルボン酸無水物(BLA-NCA)あるいはε-ベンジルオキシカルボニル-L-リシンN-カルボン酸無水物(Lys(Z)-NCA)を開環重合させた後、側鎖の保護基を除去することによってPEGとポリアスパラギン酸(P(Asp))あるいはポリ-L-リシン(P(Lys))のブロック共重合体(PEG-P(Asp),PEG-P(Lys))を得た。また、n-ブチルアミンを開始剤として用いることによってP(Lys)も得た。これらの重合及び構造の確認はGPC測定及び^1H-NMR測定により行い、P(Asp)重合度が18,37,78のPEG-P(Asp)、P(Lys)重合度が18,35,78のPEG-P(Lys)、重合度20,45,82のP(Lys)が合成されたことを確認した。(2)ポリイオンコンプレックス(PIC)ミセルの特性解析:上記のようにして得られたPEG-P(Asp)とPEG-P(Lys)あるいはP(Lys)を水溶液中で電荷を中和することによってPICミセルが調製された。得られたミセルについて25°Cにおいて動的及び静的光散乱測定により、流体力学半径(R_h)や見かけの重量平均分子量(M_<w,app>)が決定された。P(Lys)/PEG-P(Asp)では、M_<w,app>は異なるもののR_hはすべての組み合わせについてほぼ一定の値(25nm)であったが、PEG-P(Lys)/PEG-P(ASp)では、R_hが荷電連鎖の重合度の増加に伴い、30nmから40nmまで変化した。M_<w,app>からコア半径及びPEG連鎖の会合数を決定し、これらの値からコアとシェルの界面におけるPEG連鎖の密度を算出した結果、PICミセル形成では、コアとシェルの界面におけるPEG密度が重要な因子であり、この値がブロック共重合体の荷電連鎖の重合度によって依存していることが確認された。この界面におけるPEG密度の違いが、外殻層の厚さ等の違いを導き、R_hの違いを導いていることが示唆された。
双極性障害に対する認知リハビリテーションと集団認知行動療法の有効性に関する研究

この2つのプログラムを組み合わせた気分障害回復活性化統合プログラムを平成30年度は2クール、計11名の患者に実施し、プログラム開始前後での評価を行い、データを集積した。プログラム開始前後での評価は全症例で実施でき、各種評価尺度や質問紙のほか、認知機能検査も実施した。平成29年度にプログラムを実施した9症例に対しては1年後評価として同様に各種評価尺度や質問紙、認知機能検査を実施した。またチームメンバーの集団認知行動療法や認知リハビリテーションのスキルを維持するために集団認知行動療法研究会や認知機能リハビリテーション講習会などへ参加した。プログラム前後の評価尺度を解析した結果、抑うつ症状や全般的機能、自動思考、QOLなど多くの領域で有意な改善を認めた。一方、スキーマの尺度は有意な改善は認めなかった。性別や年齢、罹病期間、IQ、診断は効果を予測しなかったが、開始時の認知機能検査を一部がプログラムの効果を予測し、特に言語記憶検査が主観的抑うつや自動思考、全般的機能の改善と相関ししていた。このように予測因子を同定した先行研究はなく、この結果は第9回集団認知行動療法研究会学術総会で発表した。平成30年度では11名の患者をリクルートできたが、予定の3クールは実施できず、2クールにとどまった。プログラムの適応となる候補者はいるものの、病状の悪化や患者の社会復帰のタイミングとの時期のずれなどのためにプログラムに適切なタイミングで参加できないケースが多く、症例数が伸び悩んだ。プログラムの運営自体は安定してきており、院内外への周知もされてきており、今後症例数を増やすためにより効果的なアナウンス方法を検討していく予定である。平成31年度は気分障害回復活性化統合プログラムをできるだけ早い時期に3クール実施し、少なくとも12名の双極性障害患者をリクルートする。プログラム前後で評価、データ集積も確実に実施していく。プログラム終了患者の追跡も継続し、1年後評価も随時行っていく。症例を増やすために、適応となる可能性のある患者を抽出した上で効果的にアナウンスし、院外の関連施設に対する周知も繰り返していく。集積されたデータは随時中間解析を行い、集団認知行動療法研究会などで発表し、年度の後半で論文投稿する予定である。平成28年度は、双極性障害患者の回復活性化統合プログラムを開始するための多職種チームを速やかに立ち上げた。医師2名と臨床心理士1名、精神保健福祉士2名、精神科作業療法士3名でのチームを作り、集団認知行動療法学会や地域の認知行動療法ワークショップ、認知リハビリテーションの講習会などに参加することで、集団認知行動療法のスキルアップを行った。また、集団認知行動療法のプログラムで使用するテキストを作成した。テキストは当科でうつ病患者に対して実践していたプログラム用のテキストを双極性障害患者用に改変した(ライフチャートの作成、早期警告サインの同定と対処、目的志向性の活動のコントロールなどを追加)。集団認知行動療法では医師(研究代表者)がリーダーを務め、もう一人の医師、臨床心理士、精神保健福祉士が随時コリーダーを務め、週1回90分で12回に渡って行われた。このような準備を行った上で、回復活性化統合プログラムを開始し、2クール、計5名の双極性障害患者に実践した。12週間のプログラムは予定通り実施され、前後での各種評価尺度と認知機能検査も行いデータを集積した。症例数が予想よりも下回ったが、5名全員が集団認知行動療法への出席率100%とプログラムへの適応は良好であった。効果を検討するためのデータは集積しているが、解析はまだ実施しておらず、平成29年度中に中間解析を行う予定である。プログラム開始のための準備として、多職種チームの立ち上げ、集団認知行動療法のテキスト作成は終了した。各種評価尺度や認知機能検査を実施するシステムも構築され、収集したデータを入力するデータベースも作成された。平成28年度で治療群3クール、15例を目標としていたが、実際には2クール、5例にとどまった。プログラム開始までの準備に時間を要したことと、症例のリクルートが当初進まなかったことが理由として挙げられる。平成28年度末の時点では、プログラムは順調に稼働しており、参加者からの評価も良好であり、プログラムへの参加希望者も増えてきているため、今後は症例数が増えていくものと予想される。平成28年度に立ち上げたチーム(医師2名、臨床心理士1名、精神保健福祉士2名、精神科作業療法士3名)による集団認知行動療法を継続し、同様に医師1名、臨床心理士1名、精神科作業療法士2名(うち認知矯正療法士2名)からなるチームで認知リハビリテーション(NEAR: Neuropsychological educational approach to cognitive remediation)も継続した。この2つのプログラムを組み合わせた気分障害回復活性化統合プログラムを平成29年度は3クール、計9名の双極性障害患者に実施し、プログラム開始前後での評価を行い、データを集積した。平成28年度にプログラムを実施した5症例に対しては1年後評価として同様に各種評価尺度や質問紙、認知機能検査を実施した。平成29年度で予定の3クールは実施できたが、目標としていた15例には届かず、9例にとどまった。

プログラムの適応となる候補者は多く挙げられるものの、病状の悪化や患者の社会復帰のタイミングとの時期のずれなどのためにプログラムに適切なタイミングで参加できないケースが多く、症例数が伸び悩んだ。プログラムの運営自体は安定してきており、院内外への周知もされてきており、今後症例数を増やすためにより効果的なアナウンス方法を検討していく予定である。この2つのプログラムを組み合わせた気分障害回復活性化統合プログラムを平成30年度は2クール、計11名の患者に実施し、プログラム開始前後での評価を行い、データを集積した。プログラム開始前後での評価は全症例で実施でき、各種評価尺度や質問紙のほか、認知機能検査も実施した。平成29年度にプログラムを実施した9症例に対しては1年後評価として同様に各種評価尺度や質問紙、認知機能検査を実施した。またチームメンバーの集団認知行動療法や認知リハビリテーションのスキルを維持するために集団認知行動療法研究会や認知機能リハビリテーション講習会などへ参加した。プログラム前後の評価尺度を解析した結果、抑うつ症状や全般的機能、自動思考、QOLなど多くの領域で有意な改善を認めた。一方、スキーマの尺度は有意な改善は認めなかった。性別や年齢、罹病期間、IQ、診断は効果を予測しなかったが、開始時の認知機能検査を一部がプログラムの効果を予測し、特に言語記憶検査が主観的抑うつや自動思考、全般的機能の改善と相関ししていた。このように予測因子を同定した先行研究はなく、この結果は第9回集団認知行動療法研究会学術総会で発表した。平成30年度では11名の患者をリクルートできたが、予定の3クールは実施できず、2クールにとどまった。プログラムの適応となる候補者はいるものの、病状の悪化や患者の社会復帰のタイミングとの時期のずれなどのためにプログラムに適切なタイミングで参加できないケースが多く、症例数が伸び悩んだ。平成29年度には確実にプログラムを3クール実施し、15例以上の症例を集める予定である。自施設内での希望者も増えてきているが、関連施設へのアナウンスを強化し、適応となる患者を紹介してもらう予定である。また、これまでプログラムを終了した患者のフォローアップも行い、1年後の評価も行う。当初の計画では、平成30年度はフォローアップを行い、1年後評価のみを実施する予定であったが、平成29年度末の時点での症例数が不十分であれば、平成30年度もプログラムを継続して症例の蓄積を図る計画である。平成29年度中に症例が計10例を超えた時点で中間解析を行う予定である。解析結果の内容を学会や地域の研究会などで報告し、症例のさらなるリクルートの強化につなげる予定である。平成30年度も気分障害回復活性化統合プログラムを3クール実施し、少なくとも10名の双極性障害患者をリクルートする。プログラム前後で評価、データ集積も確実に実施していく。プログラム終了患者の追跡も継続し、1年後評価も随時行っていく。
自閉症教育におけるVOCAの活用と被活用の者コミニケーションの展開に関する研究

通常の活動において、発語のある軽度の生徒群と発語のない重度の生徒群は相互に主体的に関わろうとする機会は非常に少ない。特に軽度群から重度の生徒に対しての関わりは支援的な関わりが多く、それらは指導者からの働きかけがきっかけになっていることが多い。そこで、発語のない重度群にVOCAや絵カードによるコミュニケーションなどの指導を行うことで発語のない生徒からの主体的な関わりを増やし、発語のある軽度群にはSSTで適切な関わり方を指導し、両者間の関わりの質の変化を追った。発語の無い生徒群では、VOCAの使用が困難であった生徒については、録音する声の質を変える事で活用できるケースが出てきた。絵カードによるコミュニケーションを行っていた生徒については、徐々に発音が明瞭になってきた事もあり、絵カード無しでも要求の表出や意思の伝達が出来るようになって来たケースもある。これらより、発語のない生徒群からの音声による意思伝達の機会が増え、軽度群との関わりの機会が増える結果となった。発語のある軽度群はVOCAや本人の音声による意思表出で、絵カードなどによる直接的な関わりを求められなくても関心をひかれることが増えた。その結果、自ら関わろうとする機会が増え、自ら働きかけることで何らかの反応が返ってくることに気づく事となった。挨拶等でも相手への適切な働きかけ方をSST等で学ぶ事でコミュニケーションが成立しやすくなり、指導者の支援がない場面でも互いに関わりを持つケースが増えてきている。また、指導者への聞き取りからも、挨拶や協力の必要な活動などでの双方からの要求表出や、休み時間での関わりなどが増えたとの報告があった。何よりも双方の関わりについて指導者の側が意識して取り組むようになったことが、非常に大きな成果として挙げられ、その事で、学習集団内での相互の関わりについて意識する事の重要性を再認識する結果となった。
歯周組織破壊におけるサイトカインの役割りに関する実験病理学的研究

LPSによって惹起される歯周組織破壊過程における腫瘍壊死因子(TNF)-αの役割を明らかにする目的で,7週齢ウィスター系雄性ラットの上顎臼歯咬合面上に5mg/ml濃度のLPS (E.Coli由来)溶液を浸した綿棒を1時間にわたって静置することにより,歯肉溝からのLPSの浸透投与を図り,投与開始後7日目までの第1・第2臼歯口蓋側辺縁歯周組織でのTNF-αmRNAの局在をオリゴヌクレオチドによるin situhybridization (ISH)法を用いて検討した。ISH法はPLP固定-EDTA脱灰クリオスタット切片を用い,キャピラリーアクション法を利用したFisher社のマイクロプローブ・システムにて行った.また,未処置材料でも同様に観察した.その結果,正常組織では,歯槽骨外縁の骨芽細胞細胞質に弱い反応がみられた.口腔歯肉上皮(OGE)や口腔歯肉溝上皮(OSE)の有棘層では,一部の細胞に非常に弱い反応が観察される程度で,接合上皮(JE)は陰性であった.投与1時間後,OGEの有棘層全層が弱く染まり始めた.3時間後,基底層を含むOGE・OSE全層が強い陽性反応を示した.JE細胞もTNF-αmRNAを発現するようになり,中にはJE全体が強く染色されるものもあった.歯肉や歯根膜上方部線維芽細胞の細胞質にも弱い陽性反応がみられ.歯槽頂部骨芽細胞の反応性は増強した.1日目,各上皮の反応は減弱する傾向を示したが,歯根膜線維芽細胞や骨芽細胞の反応性は逆に増強していた.また,JE直下結合組織の拡張した毛細血管周囲の浸潤細胞も陽性を呈した.セメント芽細胞,象牙芽細胞や破骨細胞にも陽性反応がみられた.投与2日目には,染色性の減弱が進み,中には正常とほぼ同様の所見を呈するものも観察された.以上,LPS投与後の歯周組織では各上皮細胞,歯肉・歯根膜線維芽細胞,骨芽細胞や浸潤細胞などがTNF-α産生に関わっていた.LPS刺激後,宿主細胞から一過性に産生されるTNF-αがLPSの辺縁歯周組織破壊に重要な役割を担うことをin vivoの実験系において明らかにができた.LPSによって惹起される歯周組織破壊過程における腫瘍壊死因子(TNF)-αの役割を明らかにする目的で,7週齢ウィスター系雄性ラットの上顎臼歯咬合面上に5mg/ml濃度のLPS (E.Coli由来)溶液を浸した綿棒を1時間にわたって静置することにより,歯肉溝からのLPSの浸透投与を図り,投与開始後7日目までの第1・第2臼歯口蓋側辺縁歯周組織でのTNF-αmRNAの局在をオリゴヌクレオチドによるin situhybridization (ISH)法を用いて検討した。ISH法はPLP固定-EDTA脱灰クリオスタット切片を用い,キャピラリーアクション法を利用したFisher社のマイクロプローブ・システムにて行った.また,未処置材料でも同様に観察した.その結果,正常組織では,歯槽骨外縁の骨芽細胞細胞質に弱い反応がみられた.口腔歯肉上皮(OGE)や口腔歯肉溝上皮(OSE)の有棘層では,一部の細胞に非常に弱い反応が観察される程度で,接合上皮(JE)は陰性であった.投与1時間後,OGEの有棘層全層が弱く染まり始めた.3時間後,基底層を含むOGE・OSE全層が強い陽性反応を示した.JE細胞もTNF-αmRNAを発現するようになり,中にはJE全体が強く染色されるものもあった.歯肉や歯根膜上方部線維芽細胞の細胞質にも弱い陽性反応がみられ.歯槽頂部骨芽細胞の反応性は増強した.1日目,各上皮の反応は減弱する傾向を示したが,歯根膜線維芽細胞や骨芽細胞の反応性は逆に増強していた.また,JE直下結合組織の拡張した毛細血管周囲の浸潤細胞も陽性を呈した.セメント芽細胞,象牙芽細胞や破骨細胞にも陽性反応がみられた.投与2日目には,染色性の減弱が進み,中には正常とほぼ同様の所見を呈するものも観察された.以上,LPS投与後の歯周組織では各上皮細胞,歯肉・歯根膜線維芽細胞,骨芽細胞や浸潤細胞などがTNF-α産生に関わっていた.LPS刺激後,宿主細胞から一過性に産生されるTNF-αがLPSの辺縁歯周組織破壊に重要な役割を担うことをin vivoの実験系において明らかにができた.
DNAメチル化による、精巣幹細胞に必須な転写因子を介した幹細胞分化制御機構の解明

これまで、精巣幹細胞の自己複製、増幅、分化制御のメカニズムについて、ゲノム修飾の視点から解析を行って来た。幹細胞領域においては、その絶対的な数の少なさから、十分に純化されていない材料を用いた研究が多い。本研究では、GFPが精巣幹細胞、前駆細胞に発現する遺伝子改変マウスを用い、高度に純化した細胞を材料に実験を行って来た。特に、申請者が見出した、Kit陰性と陽性の境目で、様々なエピゲノムの変化が起こることから、その前後で細胞を純化し解析した。既に得られていた全ゲノムレベルでのDNAメチル化解析の結果を俯瞰しても、メチル化のみでは細胞の特性を醸し出す複雑な遺伝子制御機構を説明することは困難であることに気がつき、これに他のゲノム修飾、遺伝子発現を重ね合わせて、総合的に判断する必要があると考えられた。本研究で、これまでに、遺伝子発現活性性、抑制性、両方の様々なヒストン修飾をゲノムワイドに同定した。それをパネルかすることにより、Kit陰性の細胞がKit陽性化する時に変化する、様々なヒストン修飾の変化をゲノムワイドに捕まえることができた。その中には、予定していたSuper enhancerも含まれる。さらに、DNAメチル化が、Kit陰性の幹細胞分画の細胞が、Kit陽性の幹細胞活性を喪失する分画へ移行する際に、DNAメチル化が上昇する遺伝子に分類し、それぞれの代表例についてFISH法にて、核内配置の変化を解析したところ、遺伝子発現が上昇する場合は、その領域が核の内側へ、逆に発現が下降する場合は、核の外側へ移動することが観察できた。このことより、DNAメチル化は、ゲノム領域の核内配置になんらかの影響をもたらすことが示唆された。平成27年度は、成体精巣からGDNF受容体α鎖陽性/膜型チロシンキナーゼc-Kit陰性精原細胞(精巣幹細胞)、および、Neurogenin3陽性/膜型チロシンキナーゼc-Kit陽性精原細胞(精巣前駆細胞)のヒストン修飾を、クロマチン免疫沈降を用いて解析した。計画では、Super enhancerをマークするヒストン修飾のH3K4me1とH3K27Acと、幹細胞の多能性や分化進行に伴う幹細胞独特の遺伝子発現制御システムに重要なH3K4me3とH3K27me3修飾、さらに我々が、幹細胞から前駆細胞への脱出時に強くゲノムに修飾が入れられることを見いだしたH3K9me2修飾を、ゲノムワイドに調べることを計画した。本年度は、最初に、上記2分画の細胞をセルソーターで分取した。次に、これまで報告のあるES細胞を用い、集まった精巣幹細胞数、前駆細胞数で再現性高い結果が得られるか検証を行った。その結果、セルソーターで分取した細胞数で再現性のある実験が可能であることが予測された。そこで、その結果を受け、実際にH3K4me1, H3K27Ac, H3K4me3, H3K27me3の修飾をゲノムワイドにクロマチン免疫沈降法により解析した。現在、実験データの質、どのような領域にどのような修飾が入っているか、それからどのようなことが予測されるか、他の研究者から公表されているES細胞などのモデル細胞のデータとも比較しながら解析を行なっている。本年度に計画したゲノム修飾の多くの解析を終了することができた。この数年次々と少数の細胞で行える方法論が開発されてきた遺伝子発現解析、シトシンメチル化解析の2つの領域と比較すると(論文的には1個の細胞でも可能)、クロマチン免疫沈降実験の領域は、細胞数を減らした報告はあるものの、より正確な結果を得るためには、まだ多くの細胞数を必要とする。慎重な予備実験の結果、今後詳細な解析の結果を待たないと正確なことは言えないが、一部の領域の結果から推測すると、最終的に多くのクロマチン免疫沈降実験で良好な結果が得られたものと考えられる。唯一未達成だったH3K9me2修飾領域の検索には、今回準備した細胞数では不足であると考えられ、現在、繰り返し上記2つの幹細胞、前駆細胞分画の純化実験を行い、細胞を収集しているところである。クロマチン免疫沈降実験自身は問題なく動いており、かつ、H3K9me2修飾を特異的に認識し、クロマチン免疫沈降法に使用可能な抗H3K9me2抗体も用意に入手可能であるため、細胞が集まり次第、十分実施可能である。本研究領域において、これまでは、精巣幹細胞の特性についての解析は、細胞表面マーカーや幹細胞特異的に発現する分子に着目して研究が行われてきた。我々は、幹細胞のゲノム修飾の特徴から、幹細胞らしさが特徴付けられないか、研究を行ってきた。その結果、膜型チロシンキナーゼc-Kitが発現する前後で、幹細胞を含む精原細胞において、大きくゲノム修飾が変化する分化段階が存在することを初めて見つけた。そこで、その前後の精原細胞を、GFPがノックインされたマウスを用い純化し、目的の細胞を取得することにより、より正確なゲノム上の修飾情報を得ることを行なっている。ゲノム修飾に関する実験においても、独立した少なくとも2回のクロマチン免疫沈降実験と次世代シークエンサーを用いた解析を行う必要があり、本年度は、昨年度に引き続き、c-Kitが発現される前後の精原細胞のマウスからの純化実験を行いつつ、昨年度末までに行なったスーパーエンハンサーをマークすると言われているH3K9ac、H3K4me1の修飾の結果解析を行なった。

さらにこの結果を、個々の遺伝子発現、H3K4me3、H3K27me3修飾、DNAメチル化との関連づける解析を行なっているところである。特に、幹細胞と、幹細胞活性を喪失した前駆細胞の比較に置いて、エンハンサーマークがどのように変化するのか、それがES細胞を代表される多能性幹細胞とどのように違うのかに焦点を当てている。次世代シークエンサーの解析は、大量のデータを解析する必要があるとともに、その解析支援体制が十分とは言えない状況であるため、試行錯誤しながらの解析とならざるを得ないが、学内外との情報交換を進めながら行なっている。次世代シークエンサーから得られたデータの結果の解析には、最初に予想した以上に時間がかかっている。この領域では、解析の閾値の設定や、統計処理、処理用ソフトの選択などについては統一された方法論はなく、どれかに決めて使いこなせるようになる必要があるため、最初の解析パイプラインの設定に大変時間がかかった。データ解析の結果、幹細胞と前駆細胞で、スーパーエンハンサーの使われ方に違いがあることがわかった。DNAメチル化は、現在用いている処理条件では、あまりこのような事象とは関連が無いと思われる。現在、幹細胞と前駆細胞の間で違いがあったスーパーエンハンサー領域の配列の比較や、近傍の遺伝子の発現との関連などを検索中である。さらに、Plzf、Sall4の全ゲノム上での結合領域が、これらスーパーエンハンサーの領域とどのように関わるかも検索中である。これまで、精巣幹細胞の自己複製、増幅、分化制御のメカニズムについて、ゲノム修飾の視点から解析を行って来た。幹細胞領域においては、その絶対的な数の少なさから、十分に純化されていない材料を用いた研究が多い。本研究では、GFPが精巣幹細胞、前駆細胞に発現する遺伝子改変マウスを用い、高度に純化した細胞を材料に実験を行って来た。既に得られていた全ゲノムレベルでのDNAメチル化解析の結果を俯瞰しても、メチル化のみでは細胞の特性を醸し出す複雑な遺伝子制御機構を説明することは困難であり、これに他のゲノム修飾、遺伝子発現を重ね合わせて、総合的に判断する必要があると考えられた。本研究で、これまでにエンハンサー、シードエンハンサーなどを同定するために、H3K4me1, H3K27Ac, H3K4me3などの修飾部位を同定してきた。これに加えて、抑制性ヒストン修飾のH3K9me2の修飾も、マウスから純化した精巣幹細胞、前駆細胞を用いて行い解析を進めつつある。H3K9me2修飾は、ゲノム上に台形上に修飾が入れられていた。このことは、H3K9me2の抑制領域は、一定以上の連続した長さで意味のあるゲノム上の領域に修飾を加えており、一部は幹細胞と前駆細胞で領域が異なった。このような修飾パターンは、これまでの研究から、核内配置の決定に関わる可能性が高いと考えられた。これに加えて、これまで当教室では経験がなかったDNA-FISHを行う予定であったが、その遺伝子座に存在する遺伝子の発現も観察する必要があるため、DNA-FISHに加えて、RNA-FISHも同時に行うこととした。幹細胞分化制御に必須と考えられる遺伝子領域2箇所を対象としてプローブを作成し系を立ち上げた。本研究でH3K9me2の修飾状況は、既にデータを取得しゲノム上での修飾部位の同定が進んでおり、ES細胞で報告されているように台形状の修飾となっていることが確認され、H3K9me2のクロマチン沈降実験そのものは上手くいっていると考えている。
看護技術熟達化のための教育方法の開発および評価に関する研究

本研究は、基礎看護技術における人の認知と行動の特性を検討し、看護技術熟達化に向けたロボットシステムを開発しその効果を検証することを目的とした。看護実践能力を高めるためにロボットに必要な機能を検討し、生体模擬ロボットを試作し、生体模擬ロボットによる技術演習の効果を分析した結果、生体模擬ロボットを使用した方が、腕モデルによる学内演習よりも学習効果が高く、有効であることが示唆された。平成18年度は、身体侵襲を伴う看護技術(採血)の看護動作によって生じる患者の身体反応動作を分析することを目的として、以下のとおり採血場面の看護動作のデータ収集と分析を実施した。1.21人の採血場面を3方向からビデオ撮影し対象者の身体動作や表情、看護者の身体動作を分析した。採血時間は採血手順に沿って10区分とした。撮影方向(1)は場面の全体像、撮影方向(2)は、実施者の手と被験者の肩から指先まで、撮影方向(3)は被験者の顔の表情とした。1回の採血時間は126199秒で平均161秒であり、採血部位の変更により2回採血に要した時間は321475秒で平均411秒であった。顔の表情による苦痛・不安の表現(眼球運動・表情・頭部運動・四肢運動)試行中の身体の反射運動(手の動き・腕の動き・痛覚・圧覚)看護者の安全確認の方法など(視線・顔の位置)が確認できた。2.対象者から得た採血時の痛みや感覚などの自由記述から生理・心理的データを分析した。採血手順の10段階で、不安、恐怖、痛み、痺れの感じ方に変化があった。緊張感は、物品準備時47.6%であったが、血液採取時に消失し安心感に変化した。痛みは駆血帯使用時に始まり針の刺入時に52.4%の人がピークになり、その後5%に低下するが、抜針時に再度19%と上昇した。3.観察者から得た採血時の看護実践能力を高める看護動作の自由記述データを分析した。データ総数は239場面であった。看護実践能力を高める看護動作として抽出されたカテゴリーは、血管弾力・血管走行・逆血・神経損傷・止血・固定・疼痛・普段の採血状況などの「繊細な確認」が95場面(39.7%)、こころの準備・アイコンタクト・笑顔などの「リラックスと安心」が69場面(28.9%)、物品や身体の角度の調整などの「環境調整」が42場面(17.6%)、皮膚の伸展・駆血帯の使用方法・時間の短縮・迅速な抜針など「苦痛への配慮」20場面(8.4%)行動説明及び準備・枕の位置確認など「予測的行動」13場面(5.4%)の5つに分類された。平成19年度は、身体侵襲を伴う看護技術(採血)の看護動作によって生じる患者の身体反応動作を分析し、生体模擬ロボットのシステム評価実験を繰り返し実施し、その有効性を検証した。1.生体模擬ロボットによる採血実験の結果生体模擬ロボットの実験では、腕モデル、人形(患者ロボットは動かない)、固定(感情の閾値が固定)、カオス(感情の閾値がカオスで変化)の4パターンのロボットタイプに対して、規定の採血手順に基づいて看護学生8名に採血を実施した。実験時には、看護学生の緊張度の指標として心拍数を測定した。腕モデルとは、人間の腕だけを模したモデルのことであり、学内演習時に、使用頻度の高いモデルである。人形とは、生体模擬ロボットを全く動作させない状態のことで、人間の全身を模したモデルである。固定とは、生体模擬ロボットの感情の閾値を固定したものである。カオスとは、感情の閾値がカオスで変化し、笑顔・怒り・痛みの表情が表現されたものである。実験の結果、カオスを利用したときだけ、採血行為(注射器を持つから抜く)区間の看護学生の心拍数が変化し、看護学生が緊張感をもって演習できたことが明らかとなった。2.実験前後の看護学生のアンケート結果対象は、採血実験に協力の得られた看護学生39名(女性32名、男性7名)である。アンケート内容は、「生体模擬ロボットが人体に近いか」「生体模擬ロボット使用した演習による学習効果」を問う内容とした。結果は、人体に近いと回答した学生が約87%であり、腕モデルよりも学習効果があがると回答した学生が89.7%であった。このことより生体模擬ロボットを使用した方が、腕モデルによる学内演習よりも学習効果が高く、有効であることが示唆された。平成20年度は、身体侵襲を伴う看護技術(採血)の看護動作によって生じる患者の身体反応動作を分析し、看護実践能力を高めるためにロボットに必要な機能を検討し、看護教育学会と看護科学学会で成果を発表した。1.本研究では、生体模擬ロボットの感情表現が変化したとき、採血行為区間の学生の脈拍数が変化したことから緊張感をもって演習できていることが示唆され、また、生体模擬ロボットは、腕モデルによる演習よりも人体に近く、学習効果が高いことが示唆された。

しかし、学生は生体模擬ロボットの表情や身体反応は観察しているが、その反応に対する対応ができていないと感じていることから、表情や身体反応から対処が可能となるシステムの開発が課題であることが明確になった。2.看護実践能力を高めるためにロボットに必要な機能としては、「繊細な確認が可能な機能」として、血管の弾力、深さ、血管の走行が人体に近いこと、確実な穿刺を逆血で確認できること、患者の表情から苦痛が確認できること、「リラックスと安心のための機能」として、アイコンタクトによって表情が変化する機能、リラックスさせるための笑顔の自然さ、「環境調整をキャッチする機能」として、やりやすくスムーズにできる体勢、枕の位置を調整、導線を考えた位置に物品を配置、「苦痛への配慮の有無で反応する機能」として、皮膚をしっかり伸展、手早く流れるような動き、駆血帯が直接皮膚にあたらない、両手のバランスで時間を短縮、「予測的行動のための説明で反応する機能」として次の行動がわかりやすい説明、次の行動を実際にやってみせる、戸惑う前に現状を伝える。以上の機能の精度をさらに高める必要性が確認できた。
NGFにより誘導されるPC12細胞該内のユビキチンおよびユビキチン化蛋白

本研究では,神経細胞の分化過程におけるユビキチン蛋白質の働きについて明らかにするための第一段階として、神経細胞分化時の細胞内ユビキチン蛋白質の変動について調べた。まず、神経細胞分化時のユビキチン蛋白質の細胞内変動についてin vivoでの検討を行った。材料にはラットの胎児の後根神経節を用いた。後根神経節細胞をユビキチンに対する抗体により免疫染色を用い、ユビキチン様物質の存在を調べたところ、胎生16日頃から後根神経節細胞の核がユビキチン免疫陽性となり、その後細胞核の免疫陽性が高まり、胎児19日から出産後3日でピークとなることがわかった。次に、生化学的解析のし易い株化細胞を用いてユビキチン蛋白質についての解析を行った。NGFを作用させたPC12h細胞にユビキチン抵抗を用いて免疫染色を行ったところ、後根神経節で観察されたのと同じく、細胞核がユビキチン免疫陽性となった。一方、NGFを作用させていない対称群の細胞では、核も細胞質もうっすらと免疫陽性、であるのみだった。細胞内のユビキチン蛋白質の大部分は、遊離型のユビチキンとして存在するか、もしくは、鎖状結合型ユビキチン蛋白質が増加するかを、ELISA法とRIA法を用いて調べた。その結果、NGF添加により、細胞核内では、鎖状結合型のユビキチンが増加し、遊離型ユビキチンが減少していることがわかった。このことから、神経分化時に核内で標的蛋白質を鎖状にユビキチン化する過程が加速されているか、もしくは鎖状にユビキチン化された標的蛋白質の分解速度が遅くなっているか、あるいは、その両方の現象が起きていることが予想された。今回の結果は、すべてユビキチン-プロテアソーム蛋白分解系と神経分化との密接な関係を示唆するものと思われる。今後研究を進めることにより、神経分化とユビキチン蛋白分解系の関わについて更に明らかにされることと期待される。中枢神経および末梢神経系、PC12細胞での発生・分化過程におけるユビキチン(Ub)の出現を免疫組織化学法を用いて、これまでに調べたところ、神経系においては種々の部位で発生の異なる時期に一過性に細胞核内のUbが増加すること、PC12細胞においてもNGF添加後一定の日数を経て核内にUbが増加することが明らかになった。これらの結果は、Ubが神経細胞核内で発生・分化の過程に何らかの役割を担っていることを示唆する。また、これまでの解析から核内で増加するUbは、遊離型ではなく、Ub結合蛋白質であることが、EIAの結果などからわかっている。そこで、本年度は、PC12細胞核内に、NGFにより増加するUb化蛋白質がどのような分子量であるかを、ウェスタン解析法により調べた。方法としては、NGF添加群と対照群から、核を集め、水溶性核分画と尿素溶性核分画に分け、ウェスタン解析法によりUb化蛋白質を調べた。その結果、NGFにより、水溶性核抽出液中の高分子量Ub化蛋白質が増加することがわかった。一方、尿素溶性核抽出液中のUb化蛋白質には、NGFによる一定の傾向は認められなかった。以上の結果から、NGF添加によりPC12細胞の神経分化が誘導される時に、細胞核内の水溶性の高分子量Ub化蛋白質が増加していることがわかった。

このことから、神経分化過程に、核蛋白質のユビキチン蛋白分解系に何らかの変化が生じることが明らかとなった。本研究では,神経細胞の分化過程におけるユビキチン蛋白質の働きについて明らかにするための第一段階として、神経細胞分化時の細胞内ユビキチン蛋白質の変動について調べた。まず、神経細胞分化時のユビキチン蛋白質の細胞内変動についてin vivoでの検討を行った。材料にはラットの胎児の後根神経節を用いた。後根神経節細胞をユビキチンに対する抗体により免疫染色を行い、ユビキチン様物質の存在を調べたところ、胎生16日頃から後根神経節細胞の核がユビキチン免疫陽性となり、その後細胞核の免疫陽性が高まり、胎生19日から出産後3日でピークとなることがわかった。次に、生化学解析のし易い株化細胞を用いてユビキチン蛋白質についての解析を行った。NGFを作用させたPC12h細胞にユビキチン抗体を用いた免疫染色を行ったところ、後根神経節で観察されたのと同じく、細胞核がユビキチン免疫陽性となった。一方、NGFを作用させていない対照群の細胞では、核も細胞質もうっすらと免疫陽性であるのみだった。細胞内のユビキチン蛋白質の大部分は、遊離型のユビキチンとして存在するか、もしくは、鎖状結合型のユビキチンとして存在するかである。そこで、NGF添加時にどちらの型のユビキチン蛋白質が増加するかを、ELISA法とRIA法を用いて調べた。その結果、NGF添加により、細胞核内では、鎖状結合型のユビキチンが増加し、遊離型ユビキチンが減少していることがわかった。このことから、神経分化時に核内で標的蛋白質を鎖状にユビキチン化する過程が加速されているか、もしくは鎖状にユビキチン化された標的蛋白質の分解速度が遅くなっているか、あるいは、その両方の現象が起きていることが予想された。今回の結果は、すべてユビキチン-プロテアソーム蛋白分解系と神経分化との密接な関係を示唆するものと思われる。今後研究を進めることにより、神経分化とユビキチン蛋白分解系の関わりについて更に明らかにされることと期待される。
職業集団のプロフェッショナル化による企業評価の効果に関する実証研究

本研究では、第1に、職業集団によるプロ化推進を、教育・訓練と仕事の自律性という2要因の観点から、企業評価という具体的指標に基づき実証した。その結果、2要因ともに拡大・増加しするにつれて、職業集団によるプロ化は推進されていることが判明した。第2に、職業集団が製薬各社に及ぼす効果を分析した。その結果、利益率の高い製薬会社がより多くのMRを雇用し、教育の制度が充実していることが判明した。本研究では、職業集団がMRのプロ化を促進することによって、MRが所属する企業評価を向上させるという結果を予想した。その結果、製薬会社の大手企業ではそのようなMRが企業評価に貢献すること見出すことができた。職業集団のプロフェッショナル化に関する企業評価の研究を継続して行っている。1年間の研究を進めていく中で、医薬品業界の中でも特にジェネリック医薬品に注目し、この業界を対象に研究を進めている。その研究の中で、ジェネリック医薬品に関する業界団体という職業集団がプロ化していく中で、企業活動を円滑化するサポートとしてこれまでとらえてきたものの、必ずしもそうではないことを発見しつつある。つまり職業集団は一方で企業活動を円滑化し、他方、顧客の公正な情報提供を行う。職業集団はこのような両側面の活動の中でその地位を確立していることを、このジェネリック医薬品の業界団体という職業集団において証明しつつある。しかしながら、研究の当初の問題点でもあるが、今後の研究ではいくつか問題を抱え、その解決策を模索している。その1つは企業評価の測定に関することである。企業評価を最も単純に測定することは売上高、経常利益などいくつかの方法が考えられるものの、必ずしもそれらがすべての評価とは言えない。ただしこの評価の測定方法を確立しなければ、研究が一定の成果にならないため、困難性を抱えていると言うことができるだろう。そこで本研究では、カテゴリ研究の知見を最大限に活用したいと考えている。カテゴリは企業、そして顧客をつなぐ認知的な枠組みである。その中にどのように職業集団が媒介しているのかを研究していくことによってその果たしている役割が明確になるだろう。具体的にはテキストマイニングを利用してカテゴリの生成を研究していくことによって、企業評価と結びつけていきたい。本研究は、職業集団のプロフェッショナル化が企業評価に与える効果に関して実証することを目的にしている。そのために製薬業界を対象にし、この効果を実証してきた。具体的には、製薬業界の職業集団である製薬協と営業部門の育成機関であるMR認定センターのプロフェッショナル化を検討してきた。そしてそのような職業集団のプロフェッショナル化が製薬会社の業績など、社会からの評価に与える影響を検討してきた。研究の当初では、職業集団のプロフェッショナル化を促すために、仕事の自律性と長期的な訓練の必要性を理論的に導き出したものの、各社の営業人材育成担当者からのインタビュー結果によれば、職業集団のプロフェッショナル化を促したのは国公立をはじめとする大病院の製薬会社の方針(特にMRに対する方針)であり、大病院がMR認定資格を持つ製薬会社の営業担当者のみを入構できるという方針であった。そのため製薬会社はMRの資格を持つことは営業部門にとって必須の条件となり、製薬会社は特に新入社員のMR認定資格の取得に対して注力していることが分かった。その意味においてこの資格を認定する職業集団は製薬会社に対して一定の役割を担っているものの、ほとんどの営業担当者がこの資格を1年から2年以内に取得していることから、長期的な訓練を必要とせず、医療用医薬品を評価する立場にいる医師(もしくは病院)という外圧によって職業集団の形成がなされたことから仕事はいまだ自律性を獲得しているとは言いがたい状況にある。それゆえ、この業界の営業部門では職業集団のプロフェッショナル化が進展しないという結論に達している。科研費により製薬会社および職業集団及び業界団体などへのインタビューを着実に行っている。一部の製薬会社はではインタビューを断られたケースも存在するものの、粘り強く交渉することによって、大企業および中堅企業、内資および外資を問わずに実施することが出来、上記のような結果を得ることができた。しかしながらここ2,3年の間に製薬業界が急速に変化している。ジェネリックの台頭がもっとも業界に採ってインパクトが大きく、この動向をふまえた研究が必要になっており、その成果を論文としてまとめている。本研究は職業集団のプロフェッショナル化が企業の評価に与える影響に関する研究であり、本助成にまつわる事前の研究も含め、5年間にわたって研究している。特にこの主題を扱う対象として製薬業界を取り上げている。これまで大手から中堅製薬各社へのインタビューなどを中心に、企業評価という客観的な情報とインタビューから得られた質的な情報を組み合わせながら研究を行ってきた。その成果は一部、論文という形で国内国外の学会誌などに成果を報告している。本研究の最終年度である今年度は、これまでの研究成果を、国内の研究者だけでなく、国外の研究者にも広く周知するように、国際学会での報告を行い、海外ジャーナルの論文の執筆を行ってきた。研究成果を報告する中で、これまでの他の国際的な研究との接合を目指しており、この点に関して一定のめどを付けることができたことが最終年度の成果ということができる。特に成果の一部は製品カテゴリー研究と批評家研究に位置づけることが出来、この研究のベースになっている制度化理論研究および社会経済研究など、今回の研究成果との整合性をつけつつ、これら既存研究の中で一定の成果をあげることができた。本研究の具体的な成果は医薬品におけるジェネリックというカテゴリーの実証研究の中で、ある製品カテゴリーから排他された企業が、別なカテゴリーで他の企業を排他するプロセスを見出したことにある。

この結論は製品カテゴリーをめぐる研究に一定の成果をもたらしたということができる。本研究では、第1に、職業集団によるプロ化推進を、教育・訓練と仕事の自律性という2要因の観点から、企業評価という具体的指標に基づき実証した。その結果、2要因ともに拡大・増加しするにつれて、職業集団によるプロ化は推進されていることが判明した。第2に、職業集団が製薬各社に及ぼす効果を分析した。その結果、利益率の高い製薬会社がより多くのMRを雇用し、教育の制度が充実していることが判明した。本研究では、職業集団がMRのプロ化を促進することによって、MRが所属する企業評価を向上させるという結果を予想した。その結果、製薬会社の大手企業ではそのようなMRが企業評価に貢献すること見出すことができた。研究当初の目的では職業集団という存在を、企業の側から研究をとらえていたのに対して、現在では、顧客の側からもとらえていく必要性を十分に把握している。これらの両側面がとらえられてこそ、職業集団の役割が本質的に明確になっていくと考えることができる。それゆえ研究当初考えてきた内容だけでは捉えきれなくなくなっているという現状があり、当初の研究目的の限界が見てていると言うことができる。その意味において研究は進展しているということができるだろう。今後の研究の推進方策は、部分的には補足的なインタビューを行う必要があるものの、これまでの2年間のインタビュー及び調査結果をもとに、1つの研究成果としてまとめることに注力することである。特に職業集団と企業評価の関係について検討していくことを目的とし、あたらな研究の方向を見出していくことも検討する。経営組織論本研究の研究当初も含め、これまでの研究では、職業集団の役割を、企業から捉えることが多かった。それに対し、本研究を進める中で、職業集団が自律性というプロフェッションの要件を備えるためには、職業集団が企業活動を促進するだけでなく、顧客や政府の活動を促進することが必要であることを把握しつつある。そこでこの研究をより円滑に進めるために、新たにキーワードとしてカテゴリを加え、カテゴリの形成に、企業、政府、顧客、職業集団が、どのような関わりを持つのか、そしてその中で職業集団がいかにしてプロ化していくのかと言うことを、医療、保険、証券などを対象にして研究を進める。アルバイトを雇うことによってデータの収集と分析を部分的に補助してもらう予定であったが、アルバイトを雇わずに自力で行うことによって、研究が効率化すると考え、そのように行ったためである。また国際学会の参加費を他の予算で捻出したため、残額が生じた。国際学会に参加し、報告をする費用は次年度で使用する予定である。物品の購入として予定していた約30万円程度のデータブックを利用する権利が、データブックを制作している会社の許可をいただき、無料で提供を受けることができた。このことが初年度に残額が生じた主な理由である。
核移行シグナルペプチドによって活性化されるGRP94キナーゼの同定と解析

蛋白質の核移行は特定のアミノ酸配列が核移行シグナルとして認識されて起こる。また、核移行がリン酸化によって制御される例が転写因子等で報告され、リン酸化と蛋白質の細胞内局在の興味深い関係が示唆される。SV40ラージT抗原の核移行シグナル(PKKKRKVEDP)に相当するペプチド(以下NLS)を合成し、培養細胞の粗抽出液に加えて内在性のキナーゼによる蛋白質のリン酸化をNLSの有無で比較した。分子量約100k,80k,50k,45k等の複数の蛋白質のリン酸化がNLSによって顕著に促進された。細胞内での蛋白質の局在の制御には分子シャペロン(ストレス蛋白質)が深く関与することから、NLSによってリン酸化の亢進する蛋白質と分子シャペロンとの関係を調べた。その結果、分子量約100kの蛋白質はGRP94の抗体によって免疫沈降され、GRP94であることが示された。従って、NLSによって活性が促進され、GRP94を基質とする内在性のキナーゼが存在することが示唆された。そこで、GRP94をキナーゼフリーにまで精製し、NLS存在下に精製GRP94をリン酸化する活性を指標としてL5178Y細胞の抽出液からResourceQ(陰イオン交換カラム),POROS-Heparin, Hydroxylapatite, MonoQの各カラムクロマトグラフィーによって目的のキナーゼを精製した。但し、精製の終段階でこのキナーゼはNLSに依存せずにGRP94をリン酸化するようになった。精製されたキナーゼは銀染色で分子量約43kと27kの2本のバンドからなり、この分子量はカゼインキナーゼII(CKII)のそれと一致した。改めて各カラムクロマトグラフィー上でのCKII活性を特異的な基質ペプチドを用いたアッセイによって追跡すると、両キナーゼの各カラムクロマトグラフィー上での挙動はほぼ一致した。また、別にブタの精巣から完全精製したCKIIはGRP94をNLSに依存せずに良くリン酸化した。更に、部分精製したNLS依存性のキナーゼによるGRP94のリン酸化部位と、精製したCKIIによるGRP94のリン酸化部位は、V8によるペプチドマップでは同じであった。以上のことから、細胞の粗抽出液中ではCKIIがNLS依存的にGRP94をリン酸化していること、またこのNLS依存性はCKIIそのものの性質ではなく、NLSは細胞粗抽出液に存在して精製CKIIには含まれない何らかの抑制性の制御因子を介してGRP94に対するCKIIの活性を制御していることが判った。現在この因子の同定と精製を進めている。
神経変性疾患の発症に関する脳内・内因性神経毒性物質仮説ー特にパ-キンソニズムを中心とした研究ー

合成の麻薬であるメペリジンを自家製成する過程で誤って出来たMPTPなる物質を自己注射した結果、パ-キンソン病に酷似した症状が発生した。これをきっかけに、自然界(たとえば、飲食物),または胎内・内因物質がパ-キンソン病を発症させる可能性が高くなり、その候補物質として、テトラヒドロイソキノリン(TIQ)が取上げられた。我々は、TIQ(20mg/Kg)を最長104日間、連日リスザルに皮下投与した。その結果、行動止,パ-キンソニズムに類似した障害を作り出すことができた。ヒトのパ-キンソン病に有効なLーDOPAを投与すると,この運動障害は顕著に改善した。一方、これらのサルの脳の生化学的検索の結果、パ-キンソン病の際に減少する,ド-パミン,チロシン水酸化酵素(TH),總ビオプテリンなどが、黒質において低下していることも見出された。形態学的検索の結果、THの免疫組織化学染色を行こなうと、黒質ド-パミンニュ-ロンでのTH陽性細胞が、コントロ-ルに比して、約半減していた。しかしながら,クレシル・バイオレット染色を行うなうと、細胞体自体は死減していなかった。TIQ類縁体のNーメチルーTIQの投与を行こなうと、急性期に短時間、運動量の低下などが認められたが、100日間の投与で、慢性の症状は示さなかった。今后,NーメチルーTIQイオン,ノルサルソリノ-ルなどの投与を行こなう予定である。麻薬であるメペリジンの不法合成の際生じたMPTPが,ヒトでパ-キンソニズムを発生させることが知られて以来,自然界に存在する物質や,脳内内存性物質がパ-キンソニズムを発症させるのではないかとの仮説に基いて,各種の研究を行なった。その代表的物質であるテトラヒドロイソキノリン(TIQ)を20頭のリスザルに最長104日間皮下投与した。その結果,投与したサルすべてに,パ-キンソニズムに類似する症状の発現をみた。ヒトパ-キンソン病治療薬であるLーDOPAを投与したところ,TIQ投与サルでの症状は,劇的に改善した。またチロシン水酸化酵素,テトラヒドロビオプテリン,ド-パミンなどの脳内濃度を測定した結果,TIQ投与サルの線条体で,コントロ-ルに比して,有意な減少をみた。現在当面している問題点は,この様な変化を裏付けるための黒質神経細胞の死を見い出せないことである。老令のサルを用いて検討が必要である。また,さらにin vitroでより強いド-パミン細胞に対する毒性を有するNーメチルーTIQを,2頭の老年サルに100日間投与したが,黒質神経細胞死を見い出すに至っていない。in vitroでの結果との違いを検出するためには,MPTPでみられたと同様の,神経終末でのTIQ,NーメチルーTIQなどの再取り込み機構の存在を証明しなければならない。この機構を通して,少量の物質でも,黒質神経細胞死に至らしめる事が予想されるからである。MPTPがヒトでパ-キンソニズムを発症させることが明らかとなって以来、パ-キンソン病が少なくとも一部外因毒物により発症する可能性が高まっている。このことから、MPTPに類似の構造を有し、食物等に含まれるテトラヒドロイソキノリン(TIQ)が候補物質との仮説にもとづき、TIQ(20mg/kg)を最長104日間リスザルに投与(皮下注)した。その結果、行動上の異常を引きおこすと共に、通常臨床的に抗パ-キンソン薬として使用されるLーDOPAを投与すると病状の改善をみた。一方脳の生化学的分析の結果、線条体でのド-パミン、チロシン水酸化酵素、総ビオプテリンなど、パ-キンソン病で著減する諸物質がTIQ投与サルでも減少していた。

しかしながら、最も重要な所見である黒質ド-パミンニュ-ロンの脱落はこれまでの所、形態的につかまえることが出来ていない。ただ、チロシン水酸化酵素活性を免疫組織化学的に染めると、同陽性細胞は、コントロ-ルの約半分以下に減少していた。なお、TIQと関連しているNーメチルーTIQも、約100日間、老化サル(赤毛)に皮下注を試ろみたが、この場合には、一過性の急性にみられる行動異常が注射直後にみとめられたのみで、明らかな慢性的変化は認めなかった。
STM分光による酸化物高温超伝導体の研究

前年度に引き続き、酸化物超伝導体Bi_2Sr_2CaCu_2O_8における超伝導電子対波動関数の対称性をSTM分光測定により調べた。また、交流磁化率の測定により磁場侵入長の温度変化からも超伝導状態を詳しく調べた。これらの測定はCuのサイトをNiで置換した試料についても行い、超伝導発現の機構の解明を目指した。測定装置に関しては、より精度の良いSTM分光のデータを得るために、STM装置の除振系を改良するとともに、信号測定系のプリアンプを工夫した。交流磁化率測定についても、磁気シールドをより完全にすること等を試み、測定ノイズの低減を図った。Bi_2Sr_2CaCu_2O_8(T_c=87K)単結晶において得られたトンネル微分コンダクタンスは、ゼロバイアス付近でほぼゼロにまで減少し平坦な領域を示した。また、このコンダクタンス曲線において、ノーマル状態と超伝導状態における電子状態密度の保存則が確かめられた。この微分コンダクタンスより、超伝導ギャップは大きな異方性を持つがフェルミ面全体にわたり有限であることが明らかになった。したがって、超伝導電子対波動関数の対称性は純粋なd-波的異方性では説明できず、s-波の寄与が相当大きいことが結論される。さらに、交流磁化率から求めた磁場侵入長の温度依存は熱活性化型を示し、STM分光の結果を強く支持した。Bi_2Sr_2CaCu_<2-x>Ni_xO_y(T_c=75K)のSTM分光測定において得られたトンネルスペクトルは、ゼロバイアス付近で有限の微分コンダクタンスを残し、明確な超伝導ギャップ構造を示さなかった。この結果は、Niのもたらすrandomnessの効果によるものとも理解されるが、一方で試料の不均一性の問題も否定できないため、さらに精密な測定を継続している。また、磁場侵入長の温度変化は低温の広い温度域でT^2に比例することが見出された。このことは、超伝導ギャップがgaplessになっていることを示唆するが、厳密な結論にはSTM測定を含めた今後のさらなるデータの蓄積が必要と考えられる。