hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
身体運動における質的研究方法の検討と構築

本研究の概要は、自己の主観的な体験記述の明証性ならびに他者の主観的な経験の体験記述における必当然的明証性を証明し、質的研究の正当性を確保することにある。客観的と解釈される数量的なデータによる研究とは異なる研究方法を哲学的に確立することで、様々な研究領域にこの方法論を波及させたい。そのために、質的研究の探究プログラムの構築し、モデルケースを幾つか提示することで、事例化する。このことにより、質的研究が使用可能なものとして研究実践の拡大に寄与することを目的とする。
葉芽を利用した染色体による広義トウダイグサ科の核型進化

以上、これまでに狭義トウダイグサ科を含めて、14科64属70種の染色体数を算定し、そのうち、6科19属20種の染色体数を初めて明らかにした。平成15年度は、広義トウダイグサ科に属する植物の採集を日本国内及び国外で行い、採集した葉芽を用いて染色体観察を行った。その結果、狭義のトウダイグサ科では、新たに20属22種の染色体数が明らかとなった。そのうち、属としての染色体数を新算定した数は4属であった:Adelia(2n=40),Omphalea(2n=32),Plukenetia(2n=60),Bulmeodendron(2n=22)。これまで観察していた属数と併せると、染色体数の新算定属は合計12属となり、狭義トウダイグサ科では35属38種の染色体数を明らかにした。また、6属6種でこれまで報告されている染色体数とは相違し、新たな染色体数を明らかにした:Alchornea (2n=72),Dalechampia (2n=88),Tragia (2n=42),Homalanthus (2n=154),Codiaeum (2n=128)。平成15年度は、広義トウダイグサ科27属29種の染色体数を明らかにし、これまでのデータと併せると、53属56種の染色体数が明らかとなった。平成15年度中に採集したが、まだ、染色体数の観察を行っていない(固定した材料は、冷凍庫にて保存中)属は、15属以上ある。今後、これらの属(種)の染色体の観察を継続して行って行く予定である。
無菌動物技術を用いた大豆イソフラボン類の保健効果におけるヒト腸内菌叢の役割の解明

大豆インフラボン類は腸内細菌の働きにより様々に代謝されるが、その代謝には大きな個体差がある。例えばダイゼインの代謝産物のひとつであるイコールはダイゼインやゲニステインよりも生理活性が強いが、イコールを活発に産生する個体としない個体があることがわかっている。本研究では平成17年度において、複数の個人から繰り返し糞便試料を採取してその大豆インフラボン類代謝活性を測定し、各種大豆インフラボンに対する代謝活性のパターンには個人によって特徴があり、その特徴は同一個体では安定していることを明らかにした。平成18年度には、これらの成果を基にし、特徴のある大豆インフラボン類代謝活性を持ったヒト糞便を無菌マウスに投与することにより、ゲニステインやダイゼインを代謝してイコールを産生する、ゲニステインやダイゼインを代謝するがイコールを産生しない、大豆インフラボン類に対してほとんど代謝活性を持たない、などの特徴のある代謝活性を持ったヒトフローラ定着(HEA)マウス群を確立することに成功した。これらのHFAマウス群は腸内菌叢による大豆インフラボン類の代謝の違いが生体におよぼす影響をin vivoで研究するための有用なモデルとなることが期待される。さらにイコールを産生するヒト腸内菌あるいは菌群を特定するため、各HFAマウス群の腸内菌叢構成を解析したが、イコールを産生するHFAマウスに特徴的な菌叢構成は特定できなかった。そこで、イコール産生HFAマウスの糞便を階段希釈してダイゼインと反応させたが、10^<-4>希釈ですでにイコール産生能はほとんど失われ、イコール産生菌(群)は比較的低い菌数で存在していることが示唆された。このことは、イコール産生菌(群)を特定し、分離・同定することが困難であることを示している。現在、各種抗生物質を含有する培地や異なる培養条件を用いてイコール産生菌(群)の特定を試みている。大豆イソフラボン類は体内で腸内細菌の働きにより様々に代謝されるが、その代謝には大きな個体差があることが知られている。例えばダイゼインの代謝産物のひとつであるイコールはダイゼインやゲニステインよりも生理活性が強く、大豆イソフラボン類の保健効果における役割が注目されているが、イコールを活発に産生する個体と産生しない個体があることがわかっている。本研究ではまず複数の個人から繰り返し糞便試料を採取し、その大豆イソフラボン類代謝活性を測定した。本研究では嫌気的に調整した糞便懸濁液にダイゼインとともにゲニステインも添加し、イコールの産生だけでなくこれらの大豆イソフラボン類の減少についても同時に解析した。その結果、イコールの産生は一部の個体でのみ求められ、採取回による若干の変動は見られたものの、ダイゼインやゲニステインの減少を含めた代謝活性の特徴は同一個体では試験期間を通して比較的安定していた。また一部の試料では、ダイゼインが大幅に減少しているにもかかわらずイコールの産生が認められない、イコールの生産があってもダイゼインの減少がわずか、ダイゼインは減少しないがゲニステインは減少するなど他の試料には見られない特徴のある代謝活性を示した。残念ながら、大豆イソフラボン類代謝の活性の違いと菌叢構成や水分含量その他の糞便の特性との間に相関を見出すことはできなかった。現在は平成19年度にかけ、これらの特徴のある代謝活性を持ったヒト糞便を無菌マウスに定着させたヒトフローラ定着(HFA)マウスを作製し、その活性がHFAマウス腸内に再現できるかどうかを確認する実験を準備中である。異なる特徴のある大豆イソフラボン類代謝活性を持ったHFAマウス群が確立されれば、腸内菌叢による大豆イソフラボン類の代謝の違いが生体におよぼす影響を研究するための有用なモデルとなることが期待される。

このことは、イコール産生菌(群)を特定し、分離・同定することが困難であることを示している。現在、各種抗生物質を含有する培地や異なる培養条件を用いてイコール産生菌(群)の特定を試みている。
口腔癌細胞の浸潤要制機構の解析

口腔癌の浸潤抑制を考えるため主として腺様嚢胞癌細胞ACCSを用いて口腔癌細胞の浸潤機構を検索した。得られた知見は以下のごとくである。1.腺様嚢胞癌細胞ACCSはウロキナーゼ(uPA)とゼラチナーゼ(MMP-2とMMP-9)を強く発現し、線維芽細胞や筋肉細胞の産生したECMを主としてuPA-プラスミンカスケードを介して強く分解する。2.ACCSはフィプロネクチン(FN)ラミニン(LAM)4型コラーゲン(COLL IV)を含む細胞外基質(ECM)を多量に産生する。そのECMはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターI型(PAI-1)を多量に有しており、癌細胞による分解をうけにくく、腫瘍周囲に蓄績される。5.コラーゲンゲル内浸潤と細胞外基質分解能、Boyden chamberでの細胞遊走能はEGFによって促進された。6.コラーゲンゲル内浸潤と細胞外基質分解能、Boyden chamberでの細胞遊走能はデキサメサゾン(DEX)の添加により著明に抑制された。EGFとDEXによる上記の変化の一部はプロテアーゼが重要な役割を担っており、EGF添加によってuPAが著明に分泌され、DEXの添加によりuPAの分泌は抑制され、PAI-1を発現した7.ECMによるACCS細胞の細胞遊走促進は抗インテグリンモノクロナール抗体(mAb)処理によって著しく抑制された。8.in vitro浸潤モデル下で癌細胞は線維芽細胞との混合培養によって浸潤が著明に促進されることから、線維芽細胞培養上清から癌細胞浸潤促進因子の精製を行い、現在そのアミノ酸配列を決定する準備を行っている。本研究は癌浸潤抑制治療法の確立のため、口腔癌特に、口腔扁平上皮癌と腺様嚢胞癌細胞の浸潤機構を明らかにするために行なわれており、現在までに得られた結果は以下のごとくである。口腔組織由来各種癌細胞のプロテアーゼの発現は多様性を示し、扁平上皮癌細胞株では強いウロキナーゼ(uPA)活性を示すがメタロプロテアーゼの発現は弱かった。一方、腺様嚢胞癌細胞はuPAに加えてゼラチナーゼ(MMP-2とMMP-9)を強く発現していた。コラーゲンゲルを用いた浸潤モデルにおける扁平上皮癌細胞の浸潤はuPAの発現と極めて相関し、上皮成長(EGF)によって促進されることがわかった。この実験系においてデキサメサゾンを添加すると癌細胞浸潤は著明に抑制され、その機序にuPAの抑制とプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターI型(PAI-1)活性の促進が関与することが明らかとなった。腺様嚢胞癌は細胞外基質を多量に産生する特性を持つ一方で、線維芽細胞や筋肉細胞の産生した細胞外基質を主としてuPA-プラスミンカスケードを介して強く分解する。腺様嚢胞癌細胞の産生した細胞外基質はPAI-1を多量に有しており、癌細胞による分解をうけにくく、周囲に蓄積され、ハプトタキシスとして癌細胞の浸潤を助けていることがわかった。さらに、腺様嚢胞癌細胞がモテイリテイ因子を自己分泌していることを示唆するデータを得、現在この因子を分離・精製中である。また扁平上皮癌細胞をコラーゲンゲル内で線維芽細胞と混合培養すると癌細胞浸潤が促進されることを見出し、この機序に線維芽細胞が産生するモテイリテイ因子の関与が示唆されたので、この因子についても分離・同定を試みている。

1.腺様嚢胞癌細胞ACCSはウロキナーゼ(uPA)とゼラチナーゼ(MMP-2とMMP-9)を強く発現し、線維芽細胞や筋肉細胞の産生したECMを主としてuPA-プラスミンカスケードを介して強く分解する。2.ACCSはフィプロネクチン(FN)ラミニン(LAM)4型コラーゲン(COLL IV)を含む細胞外基質(ECM)を多量に産生する。そのECMはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターI型(PAI-1)を多量に有しており、癌細胞による分解をうけにくく、腫瘍周囲に蓄積される。5.コラーゲンゲル内浸潤と細胞外基質分解能、Boyden chamberでの細胞遊走能はEGFによって促進された。6.コラーゲンゲル内浸潤と細胞外基質分解能、Boyden chamberでの細胞遊走能はデキサメサゾン(DEX)の添加により著明に抑制された。EGFとDEXによる上記の変化の一部はプロテアーゼが重要な役割を担っており、EGF添加によってuPAが著明に分泌され、DEXの添加によりuPAの分泌は抑制され、PAI-1を発現した。7.ECMによるACCS細胞の細胞遊走促進は抗インテグリンモノクロナール抗体(mAb)処理によって著しく抑制された。8.in vitro浸潤モデル下で癌細胞は線維芽細胞との混合培養によって浸潤が著明に促進されることから、線維芽細胞培養上清から癌細胞浸潤促進因子の精製を行い、現在そのアミノ酸配列を決定する準備を行っている。
主観的事態把握と対人関係的機能の発達に関する多言語研究

本研究では、懸垂分詞由来の表現が、新しく対人関係的機能を獲得していることを、個別の表現のケーススタディを通じて明らかにした。具体的には、(1) Supposingに始まる従属節が脱従属化して主節的に使われる、(2)granted節からgrantedだけが単独語彙化して応答機能を発達させている、(3)speaking of節からspeaking of whichという語彙化現象が生まれ、談話機能的に意味を変化させていくこと、の3つの言語現象について明らかにした。また共通して「対人関係的」変遷が見られること、それが現在分詞か過去分詞かによって意味変化の道筋が異なること、を最終的なまとめとした。本年度は英語の懸垂分詞節由来の表現の意味変化について、Supposing節の脱従属化現象と、Grantedの応答機能への変化のプロセスについて調査し、検討した。懸垂分詞節であるsupposing節がif節と同じような条件節として機能することは文法化理論でも指摘されていたことだが、本研究ではこのsupposing節がif節と同じように従属節単独で用いられる事例を対象とし、それが「構文化」と呼ばれる1つの独立した意味を担うようになるプロセスを概観した。また、supposing構文の補文への入力として、他人の発話をそのまま受けるというメタ言語的な性質のものが関わってくることを指摘、議論した。Grantedに導かれる懸垂分詞節については、時代を追う毎に従属節の主節化が見られると同時に、grantedで結びつけられる前後の文関係が論理的な逆接関係から単なる「異なる話題の方向性を持つ関係」へとゆるめられていくことを考察した。前者はイギリス認知言語学会で発表し、論文にまとめた。後者も論文として公刊され、近く国際学会で発表予定である。いずれの例も対人関係的な意味を発達させていることから、懸垂分詞節の構文化は対人関係化だとまとめられる可能性を示唆した。本年度は懸垂分詞表現の対人関係化に関するデータを広げ、その生起条件について詳細な検討を重ねた結果を2カ所の学会で発表を行い、論文を3本執筆した。扱ったデータは具体的にはGrantedとSpeaking (of which)である。Grantedについては過去分詞形から接続表現、そしてそこから単独でモダリティマーカーに変化するプロセスとその要因についてまとめ、成果を国際認知言語学会(イギリス)で発表し、フロアから好意的な反応とさらなる改良の余地についての指摘を受けることができた。また発表に先立ちこの内容を『日英語の文法化と構文化』(ひつじ書房)への寄稿論文として執筆、秋に刊行した。また懸垂分詞としてSpeakingが用いられる状況の言語的条件について検討を行い、speakingに後続する表現として許されるのが、主節にある発話内容と何らかの形で関わりのある要素のみであることを確認した。主語不一致の懸垂分詞構文と通常の分詞構文との間の線引きとなる条件を洗い出したことになる。この結果については日本英語学会のシンポジウム『構文変化と談話・情報構造ーデータと理論の融合を目指して』の招聘講師として発表し、学内プロジェクトに執筆を終了したところである。また、対照言語学的側面についても成果をあげることができた。フランス語学の渡邊淳也氏(筑波大学准教授)と英仏対照の共同研究をすすめており、その成果を『時制並びにその関連領域と認知のメカニズム』に共同執筆した論文を掲載することができた。英語とフランス語での懸垂分詞相当表現の分布とその意味変化傾向の間に乖離が見られることを指摘し、その理由の一つに認知モードに基づく自然な事態把握の差が関わっている可能性を示唆した。検討する言語現象をさらに増やすことができたのと、懸垂分詞構文と分詞構文とを分かつ条件を言語的側面からさぐるという新たな視点を用いての検討ができた。このことは複数の懸垂分詞事例にまたがって適用される条件への布石となる。また対照言語学的分析についてもフランス語との比較において一定の成果を挙げることができた。本年度は英語懸垂分詞Speakingの共起可能要素について、コーパス資料を用いて探った。その結果、主節における発話内容を何らかの形で修飾したり特定化したりする要素であれば、懸垂分詞として「適格に」機能できるとわかった。特にSpeaking of whichという特定の表現の意味の多様性と変化のプロセスを確認し、話題マーカーから話題転換の際に使われるマーカーとして機能をシフトさせていることを明らかにした。さらに、そのほかの懸垂分詞との共通性を考察する中で、多くの事例が話題転換へと談話上の使用意味を変化させていることがわかった。具体的には、Speaking of whichはTalking of whichなどとともに、会話冒頭にて話題をシフトさせる役割を発達させるのに対し、GrantedやHaving said thatなどの表現は、いったん相手の言ったことを認めてそれに譲歩する形で自分の意見を述べる、という機能から、相手の言う内容をいったんは受け入れておきながら、全く違う方向へと話題を変化させる、という機能へと、一律に変化をしている。道筋は異なるものの、いずれも話題転換にまつわるマーカーになっていくことを、構文化という考え方と絡めて説明付けようと試みた。本研究の内容の一部は、6月のOsaka Workshop on Usage-Based Modelにて、また7月の第5回英国認知言語学会(UK-CLA 5)にて発表した。更に、科研費支出とは直接関係しないが、科研費で得られた内容の一部を7月には広島大学で、10月には関西大学で、2月には奈良女子大学で、3月には第5回動的語用論研究会にて、それぞれ招待講演を行った。

懸垂分詞が談話標識化していると思われる事例について、大枠的に検討を加えることができているため。また、研究発表や講演も数多く行い、意見を交換することができ、研究の進展について充実したフィードバックをもらっている。最終年度では、懸垂分詞由来表現のうち、前年度まで調査を行い発表してきたSpeaking of whichとGrantedによる応答機能の出現についての論考内容をまとめた。Speaking of whichについてはもともと懸垂分詞表現であったものから、次第に、whichの指示内容が必ずしもそれまでの文脈の中に明示的には存在せず、逆に前の文脈全体を漠然と指す状況や全く無関係な内容へと推移することを考察し、[speaking of which]全体でチャンク表現を成していることを確認した。またgrantedについては直前の内容を一旦認めつつもそれに対立するとみなされる自分の意見を譲歩的に述べる用法が主であったが、そこから必ずしも「対立」という論理的な関係に限定されず、単に前段の内容と異なる路線の話へと展開する際に使われている例を考察し、対立関係が次第にゆるめられて単純な話題転換へと拡大されていくことを確認した。以上の内容は二本の論文として、それぞれひつじ書房からの『構文の意味と拡がり』および開拓社からの『現代言語理論の最前線』において、編者をつとめ、また個別の論文を執筆し、刊行することで成果の公表を行った。また、これまでの4年間で調査研究してきた言語現象(Speaking of which, GrantedおよびSupposing節の脱従属化現象)など)に共通して見られる言語変化およびそれに伴う現象について、国際認知言語学会(タルトゥ大学:エストニア共和国)にて発表した。その概要は、現在分詞を伴うものは話者による主観的な行動のなぞりを経由して、過去分詞を伴うものは譲歩の解釈を経由して、それぞれが異なる道筋を通って対人関係的な意味を会得していくことをまとめたもので、懸垂分詞表現がたどる構文化へのプロセスを示した。この内容については英語による論文化を進め、投稿準備中である。本研究では、懸垂分詞由来の表現が、新しく対人関係的機能を獲得していることを、個別の表現のケーススタディを通じて明らかにした。具体的には、(1) Supposingに始まる従属節が脱従属化して主節的に使われる、(2)granted節からgrantedだけが単独語彙化して応答機能を発達させている、(3)speaking of節からspeaking of whichという語彙化現象が生まれ、談話機能的に意味を変化させていくこと、の3つの言語現象について明らかにした。また共通して「対人関係的」変遷が見られること、それが現在分詞か過去分詞かによって意味変化の道筋が異なること、を最終的なまとめとした。事例研究を積み重ねるという当初の計画を2つ満たすことができており、順調に推移している。構文化という概念がどこまでこの現象に適用されるか、されるとすればどのような条件になるか、といった、複数の事例にまたがる制約を意味形式の両面から探っていく。
単分子電気伝導度測定に基づく導電性DNAナノワイヤー創製

金属イオンの一次元配列を内包したメタロDNA分子の結晶構造を決定した。なおこの結晶構造の重要な点として、一次元金属配列を内包したDNA分子が連続した二重らせん構造を結晶内で形成されていた。このことにより、結晶の端から端まで連続した金属イオンの一次元配列を作成することができたことを意味する。これまでこの分野で作成方法が探索されてきたが誰もなし得なかった、目視できる長さの一次元金属配列の作成に成功したことを意味する。今後、この結晶を利用して、一次元金属配列の導電性に関する電気物性を検証するための材料を世界に先駆けて報告することができた。申請者のこれまでのメタロDNA分子(金属の一次元配列を有したDNA分子)の研究とバンド理論(固体金属の導電性理論)に基づく考察より、金属イオンの一次元配列に物理・化学的変調を加えて導電性を付与する方法論が見いだされた。本研究課題では、メタロDNA分子および四重鎖DNA分子の内部に形成される金属イオンの一次元配列に着目した単分子電気伝導度の直接測定およびDNA分子を構造基盤とした導電性ナノワイヤー/分子磁性体創製を目指す。本研究課題は、分子の構造と物性に基づくボトムアップ的機能性分子創製の戦略をとっている。従って、メタロDNA分子および四重鎖DNA分子の構造および物性の理解のさらなる深化をめざして、当該分子の構造/物性解析も並行して行うことも本研究の目的である。なおメタロDNA分子および四重鎖DNA分子を導電性材料とするためには、長鎖の分子を作製する必要がある。したがって平成27年度は、メタロDNA分子および四重鎖DNA分子等(以下、メタロDNA分子と総称)の金属を内包した長鎖核酸分子の調製を目指した。なお長鎖メタロDNA分子の調製法について検討している過程で、共同研究者により、比較的長い金属配列を内包したDNA二重らせん分子の結晶構造が決定された。なお結晶構造によると、塩基対を組まずに外に出てしまっている核酸塩基も存在しており、金属イオンを結合して内包するのに関与する残基のみを残した単純なDNA配列を化学合成した。この合成したDNA分子を用いて、結晶外でも金属イオンを多数結合して金属配列をDNA分子内に形成できるかどうかを検討した。具体的には、NMR分光法を用いて当該配列に金属イオンを滴定したところ、期待通り多数の金属イオンが結合できることが判った。このようにナノワイヤーとして有望なDNA分子が見いだされた。メタロDNA分子はそのままの状態では半導体レベルの導電性しか示さないと報告されている(Isobe's group, Chem. Lett., 2011, 40, 318等)。従って、メタロDNAを導電性ナノワイヤーとするには、何らかの物理的摂動或は化学修飾により「導電性を付与する」という発想の転換が必要である。なお固体金属の導電性は金属原子が長く連なっていることが必須条件となっている。従って、長鎖メタロDNA分子を作製することが、DNA分子に導電性を付与するための第一ステップとなっている。その観点から、本研究課題の最初の実験として、長鎖メタロDNA分子の調製、及び、調製法の検討を掲げている。当初の予定では、金属を介した塩基対(メタロ塩基対: T-Hg(II)-T、C-Ag(I)-C等)からなるDNA分子や四重鎖DNA分子(四重鎖内腔に金属イオンの一次元配列を包含)を用いた長鎖メタロDNA分子の調製を考えていたが、共同研究者の結晶構造解析により、第三の候補配列が現れた。共同研究グループ内では最も長い金属配列が形成されていたため、こちらの新規配列についての解析を今年度は優先することとした。なお単に同じ配列を調製するだけでなく、結晶構造を参考に不要と思われる残基を除去した改変DNA配列も調製した。上述した通り、この改変DNA配列は、滴定実験の結果から多数の金属イオンを結合することがわかった。また、結晶構造解析が行われた配列自体も合成を行い、本配列のもつポテンシャルをさらに解析する準備を進めている。このように、本研究課題は順調に進行していると考えられる。本研究課題では、メタロDNA分子内部に形成される金属イオンの一次元配列に着目した電気伝導度の測定およびDNA分子を構造基盤とした導電性ナノワイヤー/分子磁性体創製を目指す。なおメタロDNA分子を導電性材料とするためには、長鎖の分子を作製する必要がある。したがって2015年度は、金属を内包した長鎖メタロDNA分子の調製を目指した。その過程で、連続した金属配列を内包したDNA二重らせん分子の結晶構造が共同研究者によって決定された。なお結晶構造をもとに、メタロDNA分子の形成に最適なDNA配列を設計した(余分な塩基を排除)。本DNA分子について、NMR分光法を行い、期待通り多数の金属イオンが結合できることが判った。

本結果を受けて2016年度は、メタロDNA分子形成に最適な配列をさらに詳細に検討を行った。結晶構造解析が行われた配列そのものでも、NMRによる構造解析を行い、メタロDNA分子形成に相当する高分子量の複合体形成が確認できた(DOSY等)。なお上記結晶構造の論文審査の過程で、溶液内でのメタロDNAワイヤー形成の証拠提出の要求があったため、本結果とあわせて論文化を目指している。メタロDNA分子はそのままの状態では半導体レベルの導電性しか示さないと報告されている。従って、メタロDNAを導電性ナノワイヤーとするには、何らかの物理的摂動或は化学修飾により「導電性を付与する」という発想の転換が必要である。なお固体金属の導電性は金属原子が長く連なっていることが必須条件となっている。従って、長鎖メタロDNA分子を作製することが、DNA分子に導電性を付与するための第一ステップとなっている。その観点から、共同研究者の結晶構造解析により、第三の候補配列が示された。本結晶構造中では連続した金属配列が形成されていたため、本配列についての解析を2015年度は行った。なお、結晶構造を参考に不要と思われる残基を除去した改変DNA配列も調製した。上述した通り、この改変DNA配列は、滴定実験の結果から多数の金属イオンを結合することがわかった。また2016年度は、結晶構造解析が行われた配列自体も合成を行い、NMRによる構造解析を進めた。一次元1H NMRスペクトルからは、三段階(一本鎖>二本鎖>オリゴマー(ワイヤー))の構造転移が観測された。さらにワイヤーの存在を証明するためにDOSYスペクトルも測定し、高分子量の分子種の存在を証明した。このように本配列のもつポテンシャルの解析を進めている。このように、本研究課題は順調に進行していると考えられる。申請者のこれまでのメタロDNA分子(金属の一次元配列を有したDNA分子)の研究とバンド理論(固体金属の導電性理論)に基づく考察より、金属イオンの一次元配列に物理・化学的変調を加えて導電性を付与する方法論が見いだされた。本研究課題では、メタロDNA分子の内部に形成される金属イオンの一次元配列に着目した単分子電気伝導度の直接測定およびDNA分子を構造基盤とした導電性ナノワイヤー/分子磁性体創製を目指す。本研究課題では、分子の構造と物性に基づくボトムアップ的機能性分子創製の戦略をとっている。なおメタロDNA分子を導電性材料とするためには、長鎖の分子を作製する必要がある。したがって2015年度は、金属を内包した長鎖メタロDNA分子の調製を目指した。その過程で、連続した金属配列を内包したDNA二重らせん分子の結晶が見いだされた。2017年度は上記研究を推し進め、金属イオンの一次元配列を内包したメタロDNA分子の結晶構造を決定した。この結晶構造の重要な点として、一次元金属配列を内包したDNA分子が連続した二重らせん構造を結晶内で形成していた。
自然免疫を介した宿主とウイルスの新たな相互作用の解明

エボラ出血熱や新型インフルエンザなどウイルス感染症は個人の健康と生命を損なうだけでなく社会の停滞やパニックの原因になる深刻な問題である。自然免疫は感染初期の生体防御に必須である。本研究では、この自然免疫に焦点をあて、その分子機構を研究することで、1)細胞内ウイルスRNAセンサーであるRIG-Iの活性制御に関与するDDX60分子の生体内での役割、2)DDX60分子をEGF受容体が制御するメカニズム、3)RIG-I下流のシグナル伝達機構、4)細胞外小胞が自然免疫応答に果たす役割、等について解明した。これらの成果は、今後、創薬の新たな分子標的の同定や新たな治療法開発の基礎基盤になると期待される。自然免疫はウイルスの抑制に必須である。しかし、その分子機構の全容はいまだ十分には解明されていない。我々は、これまでB型肝炎ウイルスやインフルエンザウイルス、あるいはC型肝炎ウイルスに対する自然免疫応答の研究を進め、この反応に関与する新規分子を同定してきた。なかでも、我々が同定したDDX60分子は、細胞内へと侵入してきた核酸に対する自然免疫応答の最も初期に働く分子であることを解明した。DDX60の生体内での役割を解明するために、DDX60ノックアウトマウスを作成し、ウイルス感染時の自然免疫応答に果たす役割について検討したところ、DDX60は水疱性口炎ウイルス感染時の生体防御に重要な役割を果たすこと、特に、マクロファージと線維芽細胞からのI型インターフェロン産生に関与することを発見した。また、このDDX60分子は細胞内のウイルスRNA認識センサーであるRIG-Iの上流で働くだけでなく、細胞内のウイルスRNAを分解するRNAエクソソームを介したウイルスRNA分解経路では働くことを発見した。これらのことからDDX60が細胞内のウイルス核酸に対する自然免疫応答の最前線で働くセンチネルの役割をすることを示唆している。また、細胞内ウイルスセンサーの一つであるMDA5分子はその異常な活性化が、自己免疫疾患の原因となることが示唆されている。我々は、このMDA5の活性化制御機構の研究を行い、MDA5のC末端にはRIOK3キナーゼ分子が結合すること、これがMDA5のC末端をリン酸化することで、MDA5のウイルスRNA上での重合を阻害することを発見した。また、細胞内DNAセンサーであるcGASの活性化についても研究を進め、cGAS分子と結合する分子を新規に同定した。同定した分子は、ウイルスDNAに対する自然免疫応答に関与することが知られているもののそのメカニズムはこれまでに解明されていない分子であったことから、この分子のノックアウトマウスを作成し現在研究を進めている。平成27年度に予定していた研究項目の「ウイルスに対する自然免疫応答におけるDDX60分子の生体内での役割の解明」について、1)DDX60ノックアウトマウス由来細胞を用いたウイルスに対する自然免疫応答、2)DDX60ノックアウトマウス個体へのウイルス感染実験、3)EGFによる自然免疫制御機構の解明、の3点に焦点を絞り研究を予定していた。これらの計画については予定どおり研究が進み、平成27年度中にCell Reports誌にその成果をまとめ発表を行った。二つめに予定していた研究項目である「MDA5リン酸化酵素による自然免疫制御機構の解明」について、まず、当初計画どおり、RIOK3によるMDA5抑制機構の解明に焦点をあて研究を進め、RIOK3がMDA5のC末端をリン酸化することで、MDA5のウイルスRNA上での重合を阻害するという結果を得た。この成果は平成27年度にCell Reports誌に発表した。また、この項目においては、RIOK3ノックアウトマウスの作成も計画していたが、これも当初の計画どおりノックアウトマウスの作成に取り組み、遺伝子改変技術をもちいたRIOK3ノックアウトマウスの個体を数匹えることができ、現在繁殖中である。三つ目の項目として予定していた「自然免疫で働く新規分子の探索」において、酵母two-hybrid法をおこない、細胞質内DNAセンサーであるcGASと結合する分子を同定した。この分子が、細胞質内DNAに対する自然免疫応答にどのように関与するのかについて現在研究を進めており、また、この分子のノックアウトマウスを作成し、その表現系を解析中である。自然免疫はウイルス感染時の生体防御において必須の役割を果たす。その詳細な分子機構を解明することは創薬の新たな分子標的の同定や新たな治療法の開発につながると期待される。我々は、この自然免疫機構の解析を行い、RIOK3などの新規因子を平成27年度までに同定し、その機能を培養細胞を用いた解析により明らかにした。平成28年度は、このRIOK3ノックアウトマウスを作成した。実験では、野生型マウスとRIOK3ノックアウトマウスより胎児由来線維芽細胞、樹状細胞、マクロファージなどを単離し、I型インターフェロンと炎症性サイトカインの産生量の違いなどについて詳細に解明した。DNAをゲノムにもつウイルスに対する自然免疫応答機構については、細胞質内のcGAS分子がウイルス由来DNAを認識し自然免疫応答を誘導することが報告されているが、その制御機構は十分には解明されていない。そこで、cGAS分子の活性を制御する因子を探索するために酵母two-hybrid法による解析を実施したところ、cGAS分子と結合する新たな分子を単離することに成功した。この因子は、ウイルスに対する自然免疫応答への関与については報告が無いが、細菌感染時の炎症性サイトカイン産生に重要な役割を果たすことが知られている分子である。cGASは細菌のゲノムDNAを認識することも知られていたことから、この同定した分子について着目し解析を進めた。

また、この分子の生体内での役割を解明するために、ノックアウトマウスを入手し、マウス個体でのウイルス感染実験についても現在実施している。平成27年度に予定していたDDX60分子のノックアウトマウスを用いた解析については、既に完了しており、その成果をCell Report誌に報告した(Oshiumi H et al Cell Reports 11: 1193-1207, 2015)。平成28年度は、RIOK3のノックアウトマウスの作成とその解析を予定していたが、当初予定どおりRIOK3ノックアウトマウスの作成を完了した。また、RIOK3によるMDA5のリン酸化部位の同定についても既に完了しており、その成果はCell Report誌に報告した(Takashima K et al Cell Reports 11:192-200, 2015 )。DNAウイルスに対する自然免疫応答に関与するcGAS分子の制御機構については、酵母two-hybrid法によるスクリーニングにより既に候補分子を同定しており、試験管内の解析からcGASの活性を制御することを発見している。また、この候補分子のノックアウトマウスについて既に入手しており、マウス動物個体へのウイルス感染実験についても既に実施している。これらは、当初予定していた計画に従って実験を実施し得られた成果であり、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。ジカ熱やエボラ出血熱など、ウイルスが原因となる感染症は個人の生命と健康を損なうだけでなく、社会の停滞やパニックを引き起こす重要な問題である。その解決は強い社会的要請がある。自然免疫はウイルス感染初期の生体防御に必須の役割を果たす。特に強い抗ウイルス作用を示すI型インターフェロンの産生は重要である。本研究計画では、この自然免疫応答に着目し、その詳細な分子機構を解明するために、感染症に対する新たな治療薬開発の分子標的の同定に必要な基礎基盤を確立することを目的として研究を進めた。細胞質内のウイルスRNAセンサーであるRIG-IやMDA5は、ウイルス由来の二重鎖RNAを認識するとI型インターフェロンの産生を誘導する。このRIG-IやMDA5のシグナルを制御する因子を探索し、Zyxin分子を新たに同定し、これが、RIG-IやMDA5によるミトコンドリア外膜上に存在するMAVSアダプター分子の重合を促進することを解明した(Kouwaki T et al Scientific Reports 2017, 7: 11905)。細胞のエンドソーム内にはToll様受容体が存在し、I型インターフェロン産生を含め様々な自然免疫応答を誘導する。興味深いことに我々はTLR3が活性化すると細胞から放出される細胞外小胞内のmiR-21の発現量が上昇することを解明した。これは、miR-21はIL-12の産生を抑制することが知られており、これは、自然免疫の新たなネガティブフィードバックループとして働き、過剰な免疫応答を収束させる役割をすることが示唆された(Fkushima Y etal BBRC in Press)。
高放射線環境下での素粒子実験用電子回路の動作保証技術の研究

前年度に開発された、被爆による誤動作や性能劣化を測定するための装置を用い、各種半導体素子に対する放射線の影響を調査した。放射線の影響としては大別して(1)放射線損傷が蓄積しトランジスタの暗電流の増加等による積分的性能劣化の効果、(2)単発の放射線の影響によりレジスターの状態が変化するソフト的効果や、ラッチアップ、ハード的障害を発生するシングルイベントエフェクト(SEE)と呼ばれる効果がある。前者についてはガンマ線や中性子線を持続的に照射しその間アナログ的性能測定を行う。後者についてはディジタル的動作を照射中継続してモニターしSEEの発生を確認する。前年度に定めたサンプル素子ホールダーの仕様に従い、いくつかの素子用ホールダーを製作した。また、照射中にサンプルの性能を測定するためのデータ収集装置およびそのためのソフトウエアの改良を行った。開発されたシステムを用いて実際に照射試験を行い、機能等について検証を行った。まず、積分的性能劣化の効果を測定するため、東京大学原子力総合センターにおいてコバルト60線源を用いた照射試験を行った。数十kradまでの照射を行い、電源電流やリングオッシレータの発信周波数などアナログ量の測定を行い、使用したサンプルでは約50krad程度から損傷の効果が観測された。また、東北大学サイクロトロンRIセンターの陽子ビームを用い、SEE測定を行った。この場合、SEEと同時に積分的劣化も観測された。照射したサンプルに対し、SEE発生断面積を求めることができた。SEE照射試験において、レジスターの内容の変更、あるいはラッチアップ現象の発生に対しては直ちに復旧措置を自動的に行うことが効率的に試験を進める上で重要であることがわかった。SEEからの復旧機構について検討を進めることとした。まず、任意の半導体素子に放射線を照射し、被爆による誤動作や性能劣化を測定するための装置を開発した。それらの両方に対応できるサンプル素子ホールダーの仕様を決め、いくつかの素子用ホールダーを製作した。また、照射中にサンプルの性能を測定するためのデータ収集装置およびそのためのソフトウエアを開発した。
新領域光センシングシステム

光センシングの新手法にシステム側からアプローチを図る研究であり、要素技術の有機的結合という点を強調している。光センシングの特徴である非接触性が有効に活用しうる生体計測を重点目標としており、本年度の成果の概要は次の通りである。1)細胞レベルでの生体光センシングシステムユニークな光学顕微鏡CT手法を提案すると共に、顕微鏡とミニコンで構成されたシステムを試作し、アオミドロやウニの卵の内部立体構造の再構成に2um立方の分解能で成功している(南,内田)。また細胞内屈折率分布の立体再現を目標とする位相型顕微鏡CT手法を提案し、その実現を図るためのレーザ干渉顕微鏡を試作して基本特性を検討中である(村田)。これらと並行して細胞工学用蛍光顕微鏡システムが試作され、制ガン剤を取込んだガン細胞からの蛍光測定により細胞内濃度分布の詳細なマッピングが行われた(稲場)。2)組織・器官レベルでの生体光センシングシステム主として血流計測を目標に研究が行われ、レーザスペックル及び最適化空間フィルタを利用する斬新な手法が試みられている。前者では光ファイバプローブの検出特性についての基礎実験が終り、そのシステムが試作された後血流信号の解析が始っている(朝倉)。後者では電子的な合成レティクルを用いる点を特徴としており、システム試作とレティクルの検討が行われた(山崎)。3)器官・個体レベルでの生体光センシングシステムArレーザーと超音波偏向を用いた走査型眼底カメラの理論的検討を行なった。後システムを試作し、従来の方法に優る多くの特徴を確認した。高感度蛍光検出機能は安全な検査法の確立に大きく寄与する(大頭)。内視鏡のカラー画像処理について、特にファイバ構造除去の前処理が検討され、また体腔内表面形状の3次元計測に成功した(辻内,本田)。
荷電コロイド結晶を用いた不純物粒子拡散素過程の視覚化

結晶内における不純物拡散の解明には、不純物が作る格子欠陥近傍の1原子/分子のミクロな拡散過程の理解が必要であるが、その直接観察は困難であり、これまで結晶のマクロ特性から拡散機構が推定されてきた。一方、荷電したコロイド微粒子が形成する「コロイド結晶」は、一粒子のその場・実時間観察が可能なモデル系である。本研究では、不純物粒子添加によりコロイド結晶に格子欠陥を作り、その近傍の粒子の拡散過程を光学顕微鏡観察した。これにより、不純物粒子の拡散素過程の一例である空孔機構等の一粒子観察に成功した。粒子の軌跡解析により格子内における不純物の拡散の場合と移動距離が一致した。金属や半導体など結晶材料の諸特性は、結晶中の不純物の種類や量により著しく影響される。特に、不純物原子/分子の材料中での拡散は、材料の変形や酸化、成分の析出などに影響する。不純物拡散の解明には、不純物が作る格子欠陥近傍の1原子/分子のミクロな拡散過程の理解が必要であるが、その直接観察は困難であり、これまで結晶のマクロ特性から拡散機構が推定されてきた。一方、荷電したコロイド微粒子が水媒体中で静電反発により形成する「コロイド結晶」は、一粒子のその場・実時間観察が可能なモデル系である。そこで、不純物粒子添加によりコロイド結晶に格子欠陥を作り、その近傍の粒子の拡散過程を光学顕微鏡観察し、マクロな不純物の挙動と比較検討することを目的とし、本研究を行った。今年度は、エマルジョンフリー乳化重合法で合成したポリスチレン粒子/水分散系に対して、不純物として蛍光粒子を少量添加した系を対象として観察を行った。蛍光顕微鏡にハイスピードカメラを接続して粒子運動の動画を取得した。対物レンズは油浸対物レンズ(100×)を用いた。得られた動画を、二次元動画解析ソフトにより解析した。ポリスチレン粒子と蛍光粒子は混晶を形成し、格子振動を示した。格子振動においては、結晶格子の平衡位置の周りで微小な振動のみが観察されるため、通常蛍光粒子の位置は時間によらずほぼ一定であった。しかしながら粒子濃度など実験条件を選ぶことで、結晶中の不純物粒子が拡散する様子を一粒子単位で観察することに成功した。今年度は、マクロな不純物排除挙動の検討を行うため、以下の検討を行った。1、試料精製・キャラクタリゼーション:コロイド結晶格子を形成する粒子として、市販の粒径500nm前後のポリスチレン粒子を、また不純物粒子として粒径300600nmのポリスチレン粒子(共にThermo社)を用いた。粒子は透析・イオン交換法により精製し、電気伝導度法、ゼータ電位法により粒子表面電荷数を決定した。また、動的光散乱法により粒径を測定した。2、結晶化検討:コロイド結晶化の駆動力である静電反発力は、粒子濃度、系のイオン濃度によって調節できる。結晶化相図を粒子濃度、塩濃度の関数として決定した。粒径が大きくなると結晶構造が観察できる塩濃度が限定されるため、実験が困難であった。今後は、結晶格子を形成する粒子のサイズの最適化を検討する必要があることが明らかになった。3、不純物添加系の観察系の作成:倒立型顕微鏡にモノクロのハイスピードカメラを接続した観察系を作成した。各項目に関する達成度は以下の通りである。しかしながら、次項に記載した通り、観察しやすい大きさのコロイド粒子は不純物イオンに対して、非常に敏感であり、目的とする構造が形成されないことがある。

そのため、さらに様々なサイズの粒子を検討するべく、今後も引き続き試料精製およびキャラクタリゼーションを行う必要が有る。さらに、蛍光粒子に比べて消光速度が遅い量子ドットを使用した微粒子の合成を行った。非常に明るい粒子である為、観察には非常に向いているが、未だ安定した粒子を合成するには至っていない。2、結晶化検討:コロイド結晶化の駆動力である静電反発力は、粒子濃度、系のイオン濃度によって調節できる。結晶化相図を粒子濃度、塩濃度の関数として決定した。粒径が大きくなると結晶構造が観察できる塩濃度が限定されるため、実験が困難であった。このため、結晶格子を形成する粒子のサイズを検討する必要があり、引き続き結晶化検討を行う。3、不純物添加系の観察系の作成:倒立型顕微鏡にハイスピードカメラを接続した観察系を作成した。粒子径が大きい場合、粒子の動きも遅くなる為、より観察のしやすい蛍光粒子を用いた通常の顕微鏡用デジタルカメラによる観察が可能であった。前項に記した通り、引き続き、不純物添加系の観察系を確立する。観察の容易さおよび特性時間により、用いる粒子を決定した後に、マクロな不純物排除挙動と一粒子観察によるミクロな拡散挙動の観察を行う。観察は光学顕微鏡および共焦点レーザースキャン顕微鏡による直接観察のほか、ファイバー型分光器などを利用することにより、結晶構造に起因する回折ピークの半値幅などの光学的性質も利用する。不純物排除が観察された系においては、順次、結晶内の不純物粒子分布の時間変化に対して、拡散方程式を用いてモデル計算を行いマクロな拡散定数を決定する。さらに、次年度は研究計画の最終年度であることから、結晶における不純物の拡散に対する知見を利用することで、コロイド結晶内部における不純物拡散の過程を理解することを目的とし、鋭意検討を続ける。該当なし
血管機能と構造をターゲットとした食品由来因子による糖尿病治療戦略の開発

本研究では,肥満型2型糖尿病における骨格筋インスリン刺激性糖取り込み障害の改善を目的に,血管機能と血管構造の破綻を治療ターゲットとした抗酸化物質アスタキサンチンの効果及び作用メカニズムを検証した.検証の結果,アスタキサンチンは肥満型2型糖尿病に伴う骨格筋微小血管障害を抑制することを明らかにした.共焦点レーザー顕微鏡を用いた3次元構造解析,及び組織切片を用いたAlkalinephosphatase染色の結果から,肥満型2型糖尿病の発症に伴い,微小血管の容積・直径,さらに赤血球が通過可能である2.5μm以上の機能的毛細血管割合が減少した.一方で,アスタキサンチンの摂取がそれらの微小血管障害を抑制することを明らかにした.また,組織切片を用いたSDH染色,及びCS活性の結果から,肥満型2型糖尿病モデルラットへのアスタキサンチン投与はミトコンドリア代謝を活性化することを明らかにした.アスタキサンチンの作用メカニズム検証を目的に実施した糖尿病モデルラットによる検証では,アスタキサンチンが糖尿病に伴う筋萎縮や微小血管障害を抑制することを明らかにし,その作用機序としてBaxの発現抑制を介したアポトーシスの抑制が関与していることを確認した.Baxは酸化ストレスにより誘導され,ミトコンドリア障害を介したアポトーシスを促すタンパク質である.糖尿病では活性酸素種の産生に伴う酸化ストレス,及び高血糖曝露による血管内皮細胞アポトーシスが微小血管障害を引き起こすと言われている.本研究で認めたアスタキサンチンによる微小血管障害抑制機序には,アスタキサンチンが,酸化ストレス及び高血糖曝露によるミトコンドリア障害や血管内皮細胞アポトーシスを抑制したことが考えられる.一方で,糖取り込み障害の改善効果については,非肥満型糖尿病モデルでは血糖コントロールが可能であったが,肥満型については効果が限定的であった.【内容】本研究では,肥満型2型糖尿病における骨格筋インスリン刺激性糖取り込み障害の改善を目的に,血管機能と血管構造の破綻を治療ターゲットとした食品由来の抗酸化物質アスタキサンチンの効果検証と作用メカニズムの解明を目指す.H27年度の具体的な研究内容は,1アスタキサンチンが2型糖尿病モデルラットの耐糖能異常に与える効果を明らかにするため,糖尿病発症後からアスタキサンチンを投与し,経時的に経口糖負荷試験を実施した.結果,8週間投与での血糖値改善効果は認められなかった.22型糖尿病モデルラットによる骨格筋内微小血管の3次元構造変化に対するアスタキサンチンの効果を検証するため,蛍光造影剤を還流させた筋サンプルを作製し,共焦点レーザー顕微鏡を用いて3次元画像を構築した.結果,アスタキサンチン摂取により血管容積減少予防に有効であることを確認した.今後,微小血管の直径・蛇行性・吻合血管数,アポトーシスを測定し,構造的な解析を進める.3アスタキサンチンが血管新生シグナルに与える影響を分子生物学的な解析により明らかにするための筋サンプルを作製し,現在解析を進めている.【意義】2型糖尿病患者に対して治療・予防プログラムとして運動療法が推奨されているが,高齢者や肥満者では効果的な運動継続が困難な場合が多い.従って,摂取することで治療効果が期待できる食品由来因子を用いた糖尿病治療法の確立は臨床的意義が強いと考える.【重要性】骨格筋は糖取り込み,及びエネルギー代謝における最大の器官である.アスタキサンチンによる酸化ストレス抑制を介した骨格筋内微小血管構造の改善,及び内皮型血管拡張因子合成酵素発現誘導による血管拡張能の改善を介した骨格筋インスリン刺激性糖取り込み障害の改善により,糖尿病患者の糖取り込みやエネルギー代謝を改善する可能性が高く,本研究課題は重要であると考えられる.2型糖尿病モデル動物として,肥満,インスリン抵抗性,レプチン受容体異常症を呈するとされるHos:ZFDM-Leprfa (ZFDM)ラットを5週齢より飼育し,体重及び血糖値測定を実施した.全モデルラットにおいて14週齢で非絶食時血糖値が400mg/dl以上を示し,骨格筋の萎縮,及び骨格筋内微小血管障害発症を確認した.一方で,8週間のアスタキサンチン投与では血糖値改善には至らなかったが,血管容積減少予防に有効であることを確認した.従って,現在は共焦点レーザー顕微鏡にて骨格筋内微小血管の構造的解析,Western blotting法にて血管新生/新生抑制シグナル(VEGF/VEGFR, ANG-1 and -2/Tie2, TSP-1)解析を進めている.本研究では,肥満型2型糖尿病における骨格筋インスリン刺激性糖取り込み障害の改善を目的に,血管機能と血管構造の破綻を治療ターゲットとした抗酸化物質アスタキサンチンの効果及び作用メカニズムを検証している.検証の結果,アスタキサンチンは肥満型2型糖尿病に伴う骨格筋微小血管の退行性変化を抑制することが明らかとなった.共焦点レーザー顕微鏡を用いた3次元構造解析,及び組織切片を用いたAlkaline phosphatase染色の結果から,肥満型2型糖尿病の発症に伴い,微小血管の容積・直径,さらに赤血球が通過可能である2.5μm以上の機能的毛細血管割合が減少した.一方で,アスタキサンチンの摂取がそれらの微小血管障害を抑制することを明らかとした.また,組織切片を用いたSDH染色,及びCS活性の結果から,肥満型2型糖尿病モデルラットへのアスタキサンチン投与はミトコンドリア代謝を活性化することを明らかとした.アスタキサンチンの作用

メカニズム検証を目的に実施した糖尿病モデルラットによる検証では,アスタキサンチン投与が糖尿病に伴う筋萎縮や微小血管障害を抑制することを明らかとし,その作用機序としてBaxの発現抑制を介したアポトーシスの抑制が関与していることを確認した.Baxは酸化ストレスにより誘導され,ミトコンドリア障害を介したアポトーシスを促すタンパク質である.糖尿病では活性酸素種の産生増加に伴う酸化ストレス,及び高血糖曝露による血管内皮細胞アポトーシスが微小血管障害を引き起こすと言われている.本研究で認めたアスタキサンチンによる微小血管障害の抑制作用には,アスタキサンチン投与が,酸化ストレス及び高血糖曝露によるミトコンドリア障害や血管内皮細胞のアポトーシスを抑制し,微小血管を構造的・機能的に維持できたと考えられる.これらの研究結果は,関連の学会及び国際誌にて発表準備中である.申請時に予定していた解析項目1骨格筋内微小血管の構造的解析,2血管新生/新生抑制シグナルに関する分子生物学的解析,3アスタキサンチンによるインスリン抵抗性改善作用におけるeNOS依存性作用の検証(血管の機能的解析)の内,12の解析項目については計画通り進展し,結果が得られている.一方で,3については,アスタキサンチンによる微小血管構造の維持に成功したにも拘らず,仮説に反して,糖取り込み能の改善に至らなかった為,現時点では3の検証には至っていない.従って,研究達成度はやや遅れていると思われる.産前産後の休暇及び育児休業の取得に伴い所属機関を休職したため,平成29年度は全期間において研究活動を中断した.従って,平成29年度は「研究実績無し」である.研究中断期間:2017年4月3日2018年3月25日研究再開予定:2018年4月1日産前産後の休暇及び育児休業による中断のため,平成28年度の研究実施状況報告書より進展なし.本研究では,肥満型2型糖尿病における骨格筋インスリン刺激性糖取り込み障害の改善を目的に,血管機能と血管構造の破綻を治療ターゲットとした抗酸化物質アスタキサンチンの効果及び作用メカニズムを検証した.検証の結果,アスタキサンチンは肥満型2型糖尿病に伴う骨格筋微小血管障害を抑制することを明らかにした.共焦点レーザー顕微鏡を用いた3次元構造解析,及び組織切片を用いたAlkalinephosphatase染色の結果から,肥満型2型糖尿病の発症に伴い,微小血管の容積・直径,さらに赤血球が通過可能である2.5μm以上の機能的毛細血管割合が減少した.一方で,アスタキサンチンの摂取がそれらの微小血管障害を抑制することを明らかにした.また,組織切片を用いたSDH染色,及びCS活性の結果から,肥満型2型糖尿病モデルラットへのアスタキサンチン投与はミトコンドリア代謝を活性化することを明らかにした.アスタキサンチンの作用メカニズム検証を目的に実施した糖尿病モデルラットによる検証では,アスタキサンチンが糖尿病に伴う筋萎縮や微小血管障害を抑制することを明らかにし,その作用機序としてBaxの発現抑制を介したアポトーシスの抑制が関与していることを確認した.Baxは酸化ストレスにより誘導され,ミトコンドリア障害を介したアポトーシスを促すタンパク質である.糖尿病では活性酸素種の産生に伴う酸化ストレス,及び高血糖曝露による血管内皮細胞アポトーシスが微小血管障害を引き起こすと言われている.