hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
認知症患者と介護者のレジャー活動への共同参加による介護者の負担感の軽減方法の開発

生命倫理審査委員会で承認を受けた後、研究協力者全員に本研究の概要を説明し協力を得た。ランダムに介入群と対象群に分け、介入群にはレジャー活動プログラム(30分/3回/週)を被介護者と共同参加して行い、対照群は通常の介護のみを実施している。本研究は、介入試験のベースライン、3カ月、6カ月の主評価・副評価指標の変化を観察中である。Voorrips et al(1991)の身体活動総量の下位尺度であるレジャー活動スコア分類の定義に従い、レジャー活動の身体活動量(1.52.5METsの範囲内)を実施している。介護者への介入では、主評価指標として介護負担感尺度(Zarit Burden Interview; ZBI)、副評価指標として、血液生化学データのカテコラミン3分画(アドレナリン・ノルアドレナリンなど)、コルチゾール、アルドステロン、レニンなどとした。これらの評価指標の介入試験前、介入後3ヶ月・6ヶ月の変化を観察し、レジャー活動が認知症介護者の介護負担感の軽減に効果がある方法なのかを検証する予定である。アルツハイマー型認知症患者と65歳以上の高齢の介護者のペアの登録を行い、介入群にはレジャー活動プログラム(30分/3回/週)を被介護者と共同参加して行い、対照群は通常の介護のみを実施しており、介入試験のベースライン、3カ月、6カ月の主評価・副評価指標の変化を観察した。対象者の追跡が順調に終了し、介入群はVoorrips et al(1991)の身体活動総量の下位尺度であるレジャー活動スコア分類の定義に従い、レジャー活動の身体活動量(1.52.5METsの範囲内の活動)を継続して実施できた。これらの評価指標の介入試験前、介入後3ヶ月・6ヶ月の変化を観察し、レジャー活動が認知症介護者の介護負担感の軽減に効果がある方法なのかを検証することができた。以上より、対象者を追跡・観察できデータの解析が部分的にできているため、おおむね順調に進展していると考える。アルツハイマー型認知症患者と65歳以上の高齢の介護者のペアの登録を行い、介入群にはレジャー活動プログラム(30分/3回/週)を被介護者と共同参加して行い、対照群は通常の介護のみを実施しており、介入試験のベースライン、3カ月、6カ月の主評価・副評価指標の変化を観察中である。対象者の追跡が順調にできており、介入群はVoorrips et al(1991)の身体活動総量の下位尺度であるレジャー活動スコア分類の定義に従い、レジャー活動の身体活動量(1.52.5METsの範囲内の活動)を継続して実施できている。以上より、対象者を追跡・観察できており継続してできているため、研究の目的の達成度としてはおおむね順調に進展していると考える。本研究の結果から介護者の健康状態に関連する因子について科学的な根拠について検討し、学術論文を作成、発表、投稿する予定である。また、介護負担感を軽減するための研究を開発する予定である。平成24年度は、前年度の調査に引き続き認知症介護者の健康状態を明らかにし、介護負担感の開発を目的とした研究を開発する。
非常時における化学物質の流出に伴う環境リスクのコミュニケーションツールの開発

気象条件の変化を考慮した漏洩事故の拡散シミュレーションを行い、工場周辺の地区が年間を通じて影響を受ける程度を把握する。さらに、各地区の人口分布を考慮することにより、事故時における工場周辺のリスク評価を試みた。具体的には、神奈川県内に位置する事業所を対象として、緊急時の有害物質の流出に伴う環境汚染により、年間を通じた影響レベルを推定し、人口の分布を考慮したリスク評価を行った。その結果、致死レベルの影響は1km程度の範囲で高くなっている一方、健康障害レベルでは周辺の地域も含めた形で影響が想定されることが示唆された。平成25年度においては、次の3点を中心に研究を進めた。まず、これまでの研究の実施過程で既に協力関係が得られている埼玉県や、工場の立地が集中し非常時に影響が大きいと考えられる東京湾沿岸で研究代表者が化学物質管理に関する検討会で委員として関与している東京都や神奈川県を中心として、本研究で扱うテーマに関連が深いと考えられる地域を検討し、神奈川県川崎市沿岸を中心に本研究の対象を絞り込むこととした。第二に、上記で選定した地域を対象に、化学物質を扱う事業所の基本データを収集した。具体的には、事業の種類や規模、所在地、取り扱う化学物質の種類や用途、事業所における取扱量などである。第三に、環境影響の推定を行う対象である非常時のシナリオの概要を設定した。ここでは、次のような3種類のケースを念頭に検討を進めた。すなわち、通常考えられる程度の事故のケースでは、各事業書が防災計画で扱っている事故や各自治体が防災計画を策定した際に想定している事故のレベルを扱った。第二のケースは、首都圏において想定されている大地震が発生した際の影響を考慮するケースとした。このケースでは、各地域の被害想定で用いられている想定震度に基づいて、推定される程度の把握に努めた。第三に、アメリカにおいて事業所を対象に設定しているワーストケースに基づくケースとした。ただし、第二のケースについては、首都圏における被害想定が変更されているため、この点を考慮したケースの選定に十分留意する必要があるため、より慎重な検討を進めることとした。本年度は事例対象を神奈川県川崎市内に所在する一つの施設に絞り、施設の種別や対象物質、貯蔵条件、施設の破損条件などを特定あるいは想定したうえで気象条件の年間を通した連続的なデータを基にシミュレーションを行い、リスク評価を試みた。消防庁のアセスメント指針が総体的な事故のリスクを概算で求めるのに対し、本研究では個別の事故のリスクを各施設の条件や気象条件を反映させて、一年間を通じたリスクの把握を行った。まず、防災アセスメント指針を参考に、リスク評価を目的とした場合の利用可能性を検討した。そのうえで、防災アセスメント指針の方法では実現できない個々の事例を対象に、リスク評価を行うための分析手法と手順を整理した。次に、神奈川県、横浜市、川崎市を対象に情報公開請求を行い、個々の施設において取扱いがある有害物質の情報について、可能な限り詳細に入手するよう努めた。これらの情報をもと、取り扱っている物質の種類や量とともに、周辺の土地利用状況を勘案し、特定の事例を選定した。その結果として、川崎市内に所在する工場を対象とし、物質はアクリロニトリルとした。さらに、事故時の拡散シミュレーションのソフトと地理情報システム(GIS)を用いて、年間を通じたリスクの把握を行うための手順を整理した。拡散シミュレーションには、米国EPAが開発したALOHAを用い、GISはArcGIS10.2を使用した。上記の条件のもとにシミュレーションを実施し、季節ごとの変化とともに、年間のリスクの分布を地図上で示し、比較的リスクが高い地区を特定した。これによって漏えいが発生した際の拡散の様相とリスクの分布状況を明らかにした。前年度の活動を通じて具体的な結果として得られた神奈川県川崎市の工場を対象にした非常時に生じうる化学物質の漏洩によって発生する周辺地域のリスク評価の結果を関係学会で発表し、質疑応答や発表後の意見交換を行った。その中で、急性ばく露に対する有害性の目安として用いたAEGL(急性ばく露ガイドラインレベル)の扱いや、シミュレーション結果の緊急時避難に対する有用性などの点で意見を交換した。特に、後者については、本研究において、シミュレーションの前提としている年間を通じたリスクという一定期間を対象にした見方と、事故が生じた場合の短期的な避難という見方の間に一定の乖離があることから、この点についてさらに検討すべきであることを認識した。本研究では、事故が発生する時点の特定が困難であるという観点から、居住地の総合的なリスクを表現することに力点を置いている。この点について工場周辺の環境管理に関心を有する市民団体に面接調査を行い、結果の有用性や課題を整理し、必要に応じて改善を加えることを考えている。また、リスク管理や影響評価に関連する国際学会等に参加し、関連する分野の動向について意見を交換した。特に、環境リスクにみられる慢性ばく露による影響と非常時を対象とした急性ばく露の関係や、非常時の影響を検討する際の年間を通じたリスクの考え方などについて、議論を深めた。これらを通じて、今後行う国内での面接調査や、外国での現状調査の際に留意すべき点を検討する材料が得られた。当初予定していた工場周辺の環境管理に関心を有する団体や個人を特定に時間を要していることに加え、本課題の分野に関連した国際学会の年次大会を2016年度に日本で開催することになり、研究代表者が事務局長を担当していることから、大会に向けた国内の準備やプログラム編成等のために時間を費やす必要が生じ、予定していた外国における現状調査の実施が遅延している状況にあるため。

本研究において実施したシミュレーションに基づき、年間を通じた工場周辺の年間の総合的なリスクの表現方法を精査するとともに、空間的なリスクの分布結果に基づいて、関係する地域での非常時におけるリスク管理体制の改善点や、結果の情報提供の有用性について検討した。また、アメリカで開催されたリスク管理に関連する国際学会(Society for Risk Analysis)に参加し、本研究の成果を発表した。具体的には本研究で開発した年間を通じた非常時のリスクの考え方、急性ばく露に対する有害性の目安として用いたAEGL(急性ばく露ガイドラインレベル)の扱い、シミュレーションの基本的な考え方、必要となる関連データとして、大気環境の情報、タンクからの有害物質漏洩の場合のシナリオ設定、さらに、施設内の有害物質特定のための情報公開請求の内容と、シミュレーションで対象とした工場の特定に至るプロセスなどである。特に、用いたソフトウェアが出力した1時間ごとのデータを年間のデータとして重ね合わせることにより、年間のリスクを算出方法について詳述した。これらの方法により、川崎市の工場を事例としたシミュレーション結果と地域的なリスクの分布の状況ならびに結果の考察について整理した。これらの内容の発表とともに関連する分野の動向について意見を交換した。特に、事故をはじめるとする非常時の情報提供の扱いや、非常時の影響を検討する際の年間を通じたリスクの考え方などについて、議論を深めた。気象条件の変化を考慮した漏洩事故の拡散シミュレーションを行い、工場周辺の地区が年間を通じて影響を受ける程度を把握する。さらに、各地区の人口分布を考慮することにより、事故時における工場周辺のリスク評価を試みた。具体的には、神奈川県内に位置する事業所を対象として、緊急時の有害物質の流出に伴う環境汚染により、年間を通じた影響レベルを推定し、人口の分布を考慮したリスク評価を行った。その結果、致死レベルの影響は1km程度の範囲で高くなっている一方、健康障害レベルでは周辺の地域も含めた形で影響が想定されることが示唆された。当初の予定であった非常時に生じる有害物質の拡散状況について、シミュレーションの事例を示すための手順を整理し、事例を通じて具体的なリスク分布を示すことができた。シミュレーションの対象となった事業所周辺の住民を対象にインタビュー調査を行うとともに、関係分野の海外の状況を把握するため、調査を実施する。環境計画・政策これまでに得られた結果を材料として、地域の市民団体を中心として個人またはグループを対象とした面接調査を行い、結果の利用可能性ととともに、改善点や追加すべき点などについて整理する。当初予定していたアメリカにおける非常時のリスク管理計画策定制度の現状調査を次年度に行うこととしたため。当初予定していた工場周辺の環境管理に関心を有する団体や個人を特定に時間を要していることに加え、予定していた外国における現状調査の実施が遅延している状況にあるため。当初予定していた海外調査を次年度に行うこととしたことが、次年度使用額が生じた主たる理由である。
糖鎖修飾変動に基づく心不全関連タンパク質の網羅的同定と新規心不全マーカーへの応用

心不全の治療法の開発には、重症度を定量的に評価することのできるバイオマーカーが必須である。本研究では、グライコプロテオーム解析により、既存マーカーと併用できる新規心不全マーカーの同定を目指した。まず、高血圧性心不全モデルラットの左心室において、心肥大および心不全の進行に伴い特徴的な変動を示す糖鎖構造を同定した。この解析から、糖鎖修飾の変動に寄与する糖脱離酵素の血中活性が新規の肥大マーカーとなる可能性が示された。さらに、同定した糖鎖修飾の変動を示す糖タンパク質を左心室組織および血漿から探索した結果、マーカー候補として40以上の心不全関連糖タンパク質を同定した。【目的】本研究は、心不全時にタンパク質の糖鎖修飾が変動するという仮説に基づき、グライコプロテオーム解析により心不全関連タンパク質を同定し、心不全マーカーへ応用することを目的とする。本年度は、心不全モデルラットを用いてこの仮説を検証するとともに、どのような糖鎖修飾が変動しているかを解析した。【方法】心不全モデルとして、Dahl salt sensitive (SS) ratを使用した。6週齢のオスラットに8% NaCl(HS群:心不全群)または0.3% NaCl(LS群:対照群)を含む固形食を与え、高血圧性心不全を発症させた。経時的に生理的基礎パラメータ(体重、血圧、心エコー)を測定し、12週齢(発症期)および16週齢(確立期)に組織および血漿を採取した。【結果】各群における血圧、心エコー、心重量、血漿ANP・BNP濃度の測定結果は、心不全の発症を明確に示した。定量PCRアレイにより、左心室組織における糖転移酵素の遺伝子発現を網羅的に解析したところ、HS群ではGALNT群をはじめとするO-Glycan合成酵素系、およびその他4種の酵素の発現上昇が認められた。一方、左心室組織ライセートを用いたレクチンアレイにおいて、LS群と比較してHS群では、ハイマンノース型N-glycanの減少、コアフコースの減少、シアル酸の減少などが認められた。この結果を踏まえ、再度、定量PCR法やウエスタンブロット法、ELISA法にて糖転移酵素のタンパク質発現量を解析した結果、O-Glycan合成酵素系を中心に7種の酵素において、12週から16週、LS群に対してHS群で有意な増加を示すことが確認できた。これらの結果から、心不全の発症・重症化に伴うO-Glycan付加が心室組織で一般的に起こる現象であることが示された。【背景・目的】心不全に対する治療法の開発には、成因が多様である心不全の病型を判別し、重症度を定量的に評価するバイオマーカーが必須である。心不全状態の心臓では、B型ナトリウムペプチド(BNP)の前駆体(proBNP)に対するO-型糖鎖の付加量が増加する。この知見をもとに、本研究では、心不全時のタンパク質への糖鎖修飾の変動に注目したグライコプロテオーム解析により心不全関連タンパク質を探索し、新規心不全マーカーの開発を目指す。【方法・結果】高血圧性心不全発症モデルのDahl食塩感受性ラットを使用し、高塩食群(心不全群)と低塩食群(対照群)の左心室組織について比較した。昨年度、糖転移酵素の遺伝子発現解析および左心室組織ライセートの糖鎖プロファイル解析により、心肥大および心不全状態の左心室組織では顕著に糖鎖量が変動することが見出された。そこで、本年度は、変動する糖鎖にどのような特徴があるかを解析した。その結果、心不全群では1)ムチン型O-型糖鎖(disialyl-T)の増加、2)N-型糖鎖コアフコースの減少、および3)O-GlcNAc修飾の変動が見出された。また、2)に関連し、コアフコース脱離酵素の血中酵素活性が心肥大マーカー候補となることが見出された。さらに、これらの糖鎖付加の変動をするタンパク質を同定するため、左心室組織および血漿を対象としたグライコプロテオーム解析を実施した。心不全群と対照群の左心室組織ライセートからレクチンアフィニティーカラムにより回収した糖タンパク質を、蛍光二次元電気泳動法(2D-DIGE)によって比較解析したが、有意な変動を示すタンパク質は見いだせなかった。一方で、総タンパク質を二次元電気泳動後、総タンパク質染色およびレクチンブロット解析により比較解析する方法では、顕著な糖鎖量変動を示すスポットが見出された。この方法により、左心室組織および血漿から20以上の心不全関連糖タンパク質を同定した。本年度の計画では、心不全モデルラットにおける心不全時糖鎖付加タンパク質の同定および心不全マーカー候補タンパク質の選別を予定していた。しかし、本年度は、予定を一部変更し、それらのタンパク質の同定よりも、心不全の発症・重症化に伴い変動する糖鎖構造の解析に焦点を絞った。糖転移酵素の発現解析やレクチンアレイの結果から、心不全時に変動する糖鎖構造を絞り込むことができた。

このことにより、組織の総タンパク質を対象とした場合と比較して、対象とするタンパク質が絞り込まれるとともに、回収に最適なレクチンが判明した。これらの結果から、より確度の高いグライコプロテオーム解析が行える条件が調ったといえる。また、心不全時に変動する糖鎖構造を絞り込んだことにより、既知の糖タンパク質から心不全関連タンパク質の候補分子を予測することが可能となった。このように、心不全マーカー探索および心不全発症の分子基盤の理解において重要な結果が得られたため、本年度の計画に相当する進展があったものと判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、これまでに得られた知見をもとに、(1)ラットにおける心不全関連タンパク質の同定、(2)ラットにおける心不全マーカー候補タンパク質の選別、の2項目を実施する。研究が順調に進んだ場合には、(3)ヒト組織での心不全マーカー候補タンパク質の評価、も実施する。各項目について、下記に詳細を示す。(1)ラットにおける心不全関連タンパク質の同定:ラットの左心室組織および血漿を試料とし、タンパク質総体およびレクチンやフェニルボロン酸ベース担体を用いて回収した糖タンパク質画分を用いて、プロテオーム解析を行う。プロテオーム解析は、2D-DIGEによるHS群とLS群とのディファレンシャル解析を主体とする。糖タンパク質の回収が困難である場合には、2D-PAGEとレクチンブロット法による糖タンパク質の網羅的解析を行い、その中からHS群とLS群とで糖鎖修飾に変動が認められるタンパク質を見出す。(2)ラットにおける心不全マーカー候補タンパク質の選別:ウエスタンブロット法、レクチンブロット法などにより、タンパク質量、糖鎖量の変動を評価する。変動が確認されたら、組織中や血漿中での濃度および発現の心臓特異性などを検討し、心不全マーカーとして妥当な候補タンパク質を絞り込む。(3)ヒト組織での心不全マーカー候補タンパク質の評価:(2)項に示した内容を拡張型心筋症剖検症例の左心室組織について実施し、心不全マーカーとして妥当な候補タンパク質を絞り込む。
陸上植物の性分化：遺伝的頑健性と可塑性のメカニズム

陸上植物は多細胞の配偶体世代nと胞子体世代2nを繰り返すという特徴がある(世代交代)。これまでに被子植物を材料として有性生殖の誘導や雌雄性分化の仕組みが調べられてきたが、これらは主に胞子体世代の器官分化を扱った研究であり、配偶体世代の有性生殖誘導の制御機構の解析は材料的な制約のために遅れていた。そこで、陸上植物進化の基部に位置する苔類のモデルであるゼニゴケを用いて、環境依存的な生殖細胞系列決定、可塑的な性分化、遺伝的頑健性を与える性決定機構に関する研究を進めた。ゼニゴケは実験室環境では遠赤色光補光により、有性生殖を誘導する。遠赤色光を必要としない機能獲得型変異体より、bHLH転写因子MpBONOBOを同定した。この因子が生殖細胞系列を決定するのに必要十分な因子であることを明らかにした。また、シロイヌナズナの相同遺伝子は、花粉における雄原細胞分化に必須な因子であることもわかった。つまり、陸上植物に共通した生殖細胞決定の機構を明らかにし、成果を論文として公表した。生殖細胞系列決定の下流には雌雄分化がある。雌性分化を制御する転写因子に注目し、逆遺伝学的に遺伝子の機能解析を進めた。雌特異的に発現するFGMYB遺伝子を破壊すると、遺伝的な雌株が雄器托と造精器を分化した。この遺伝子座には、アンチセンス長鎖非翻訳RNAであるSUFがコードされ、雄特異的に発現していた。この遺伝子の破壊雄株は、雄株であるにも関わらず、FGMYBが発現し雌器托と造卵器を分化した。本年度はFGMYBとSUFからなる性分化制御モジュールの機能解析のため、遺伝子のプロモーターや転写物の蓄積に関して実験を進めた。ゼニゴケは性染色体により遺伝的な性が決定する。ゲノム解析により明らかにされた性染色体上の遺伝子について、遺伝子の構造および発現特異性に関する解析を進め、ゲノム編集株の作出などの実験に着手した。初年度は10月末に採択が通知されたため研究期間が短かったが、研究代表者の研究内容は基盤研究Aを辞退し、本課題に引き継ぐことで研究課題間での連携が果たせた。基盤研究Aを分担していなかった研究者には研究の着手に遅れが生じた。特に形質転換植物を作成して解析する研究は解析するラインの確定に時間を要したため年度内に終了しなかった。このため、研究費の繰り越しを行ったが、その後は基本的に順調に研究が進行している。生殖細胞系列を決定する転写BONOBOに関する論文を公表することができた。この遺伝子は、配偶体世代の生殖細胞決定に関して陸上植物に保存された機能を有していたことから、遺伝子同定のインパクトは研究開始当初の予想を上回るものであった。ゼニゴケを用いた研究が被子植物研究に対してもブレークスルーとなることを示すことができた。ゼニゴケは代表者の研究室を中心としてモデル生物としての研究基盤が急速に整備されている。CRISPR-Cas9によるゲノム編集も極めて効率よく行うことができ、更にはgRNAで挟まれた領域の大規模欠失変異体の取得も容易となった。このため、従来では解析が困難であると予想されるようなアンチセンス長鎖非翻訳RNAであるSUFの機能解析もゲノム上で狙った位置で変異を導入することができるようになり、機能に必要な領域を予想よりもはるかに高精度に同定できた。論文化に必要なデータも順調に得ており、2018年度の論文発表が見込まれる。また、性染色体上の性決定因子の同定に向けた遺伝子破壊も順調にコンストラクトの作成と破壊の作成ができた。2018年度には表現型にもとづく性決定遺伝子の同定が見込まれる。陸上植物進化の基部に位置する苔類のモデルであるゼニゴケを用いて、環境依存的な生殖細胞系列決定、可塑的な性分化、遺伝的頑健性を与える性決定の機構に関する研究を継続する。環境依存的な生殖細胞系列決定に関しては、BONOBOの環境依存的な発現機構と転写制御標的の研究を推進する。発現制御に関しては、プロモーター領域に変異を導入して発現に対する影響を観察する。また、発現部位の重要性に関しては、組織特異的プロモーターを利用して機能的な観点から解析する。BONOBO転写制御の標的に関しては、これまでのFGMYBの発現制御機構の解析に加え、標的候補遺伝子として同定されたメチル基転移酵素遺伝子の破壊株が関連する表現型を示したため、有性生殖制御に関する未知の低分子化合物の関与の可能性も調査する。FGMYB-SUFの制御に関しては、長鎖非翻訳RNAであるSUFの機能発現をクロマチン動態制御の観点から解析する。FGMYBの制御標的に関しては、分担者を中心に候補遺伝子の絞り込みと遺伝子破壊による機能的解析を進める。代表者と分担者が連携し、雌の性染色体(U染色体)上にある遺伝子の破壊を継続する。遺伝的雌株を雄に転換する変異体を同定し、その原因遺伝子を解析する。変異体が得られた場合は、SUF遺伝子に関する制御機能について調べる。

そこで、陸上植物進化の基部に位置する苔類のモデルであるゼニゴケを用いて、環境依存的な生殖細胞系列決定、可塑的な性分化、遺伝的頑健性を与える性決定機構に関する研究を進めた。ゼニゴケは実験室環境では遠赤色光補光により、有性生殖を誘導する。遠赤色光を必要としない機能獲得型変異体より、bHLH転写因子MpBONOBOを同定した。この因子が生殖細胞系列を決定するのに必要十分な因子であることを明らかにした。また、シロイヌナズナの相同遺伝子は、花粉における雄原細胞分化に必須な因子であることもわかった。つまり、陸上植物に共通した生殖細胞決定の機構を明らかにし、成果を論文として公表した。生殖細胞系列決定の下流には雌雄分化がある。雌性分化を制御する転写因子に注目し、逆遺伝学的に遺伝子の機能解析を進めた。雌特異的に発現するFGMYB遺伝子を破壊すると、遺伝的な雌株が雄器托と造精器を分化した。この遺伝子座には、アンチセンス長鎖非翻訳RNAであるSUFがコードされ、雄特異的に発現していた。この遺伝子の破壊雄株は、雄株であるにも関わらず、FGMYBが発現し雌器托と造卵器を分化した。本年度はFGMYBとSUFからなる性分化制御モジュールの機能解析のため、遺伝子のプロモーターや転写物の蓄積に関して実験を進めた。ゼニゴケは性染色体により遺伝的な性が決定する。ゲノム解析により明らかにされた性染色体上の遺伝子について、遺伝子の構造および発現特異性に関する解析を進め、ゲノム編集株の作出などの実験に着手した。初年度は10月末に採択が通知されたため研究期間が短かったが、研究代表者の研究内容は基盤研究Aを辞退し、本課題に引き継ぐことで研究課題間での連携が果たせた。基盤研究Aを分担していなかった研究者には研究の着手に遅れが生じた。特に形質転換植物を作成して解析する研究は解析するラインの確定に時間を要したため年度内に終了しなかった。このため、研究費の繰り越しを行ったが、その後は基本的に順調に研究が進行している。生殖細胞系列を決定する転写BONOBOに関する論文を公表することができた。この遺伝子は、配偶体世代の生殖細胞決定に関して陸上植物に保存された機能を有していたことから、遺伝子同定のインパクトは研究開始当初の予想を上回るものであった。ゼニゴケを用いた研究が被子植物研究に対してもブレークスルーとなることを示すことができた。ゼニゴケは代表者の研究室を中心としてモデル生物としての研究基盤が急速に整備されている。CRISPR-Cas9によるゲノム編集も極めて効率よく行うことができ、更にはgRNAで挟まれた領域の大規模欠失変異体の取得も容易となった。このため、従来では解析が困難であると予想されるようなアンチセンス長鎖非翻訳RNAであるSUFの機能解析もゲノム上で狙った位置で変異を導入することができるようになり、機能に必要な領域を予想よりもはるかに高精度に同定できた。論文化に必要なデータも順調に得ており、2018年度の論文発表が見込まれる。また、性染色体上の性決定因子の同定に向けた遺伝子破壊も順調にコンストラクトの作成と破壊の作成ができた。2018年度には表現型にもとづく性決定遺伝子の同定が見込まれる。陸上植物進化の基部に位置する苔類のモデルであるゼニゴケを用いて、環境依存的な生殖細胞系列決定、可塑的な性分化、遺伝的頑健性を与える性決定の機構に関する研究を継続する。
BRINPファミリータンパク質の神経系における生理機能と病態における役割の解明

我々が発見した神経特異的新規遺伝子BRINPファミリーは,交感神経細胞の分化過程でTrkCと共に誘導されるBRINP1とこれに類似する2種類のタンパク質からなる.いずれのBRINPも細胞増殖抑制能を有する.さらに神経活動の昂進によってもBRINP1の発現が誘導されるため,神経回路形成や脳の高次機能における生理的役割が推定される.本研究の目的は,BRINPファミリーの生理機能を解明することと種々の病態における役割を解明することである.本年度は,BRINP1およびTrkC遺伝子の転写調節機構に注目して研究し,以下の成果を得た:2)悪性度の高い脳腫瘍の1種である髄芽種より得られたDaoy細胞において,この細胞の腫瘍化の重要な因子であるNRSFの異常な活性がBRINP1の発現を抑制していることを明らかにした.これらの結果より,髄芽腫におけるNRSFの異常な活性がBRINP1の発現抑制を引き起こし,細胞周期抑制が解除されて腫瘍化が起こる可能性を示唆した.3)交感神経節の発達過程における遺伝子発現を解析したところ,NRSFの機能を阻害するNRSFのスプライスバリアント,REST4の発現パターンとBRINP1,TrkCの発現パターンは相関性が高かった.初代培養下の交感神経細胞において,BMP2とRAはREST4の発現を強く誘導することを明らかにした.これらの結果より交感神経の初期分化においては,BMP2とRAが,REST4を誘導してNRSFの機能を阻害することにより神経特異的遺伝子の発現を誘導することが明らかになった.BRINPファミリーは,我々が最近発見した神経特異的新規遺伝子ファミリーであり,交感神経細胞の分化過程において誘導されるBRINP1(BMP/Retinoic acid-Inducible Neural specific Protein 1)とこれに類似する2種類のタンパク質(BRINP2,BRINP3)からなる.いずれのBRINPも神経系の多くの部位に特異的に発現する.さらに神経活動の昂進によっても神経細胞におけるBRINP1の発現が誘導されるため,神経回路形成や脳の高次機能における生理的役割が推定される.本研究ではノックアウトマウスの作製や発現系の構築を通じて,BRINPファミリーの生理機能を解明することと,種々の病態における役割を解明することを目的とする.現在までの成果として,以下の結果を得た:1)交感神経細胞の分化過程において,BRINP3からBRINP1への発現交替,その後の神経細胞成熟過程における,BRINP2の誘導などが明らかにされた.今後,神経細胞の分化ステージに対応した各BRINPの機能分担を解析する.2)BRINP1-exon2のノックアウトマウスを作製した.このマウスは,生存並びに繁殖可能である.このマウスについて,BRINP1蛋白質の発現状態,神経系の形成異常,学習記憶能力の変化,細胞増殖能の変化を解析する.3)さらにBRINP2およびBRINP3のノックアウトマウス作成のためのターゲテイングベクターを構築した.今後,BRINP2およびBRINP3のノックアウトマウスを完成させ,各BRINPの個体レベルでの生理機能やBRINP1との機能的相補作用を明らかにする.4)動物細胞株を用いた発現系を構築した結果,各BRINPはいずれもcDNAから予想される全長タンパク質として存在し,細胞質に分布することを明らかにした.今後,細胞増殖(神経細胞特異的細胞周期制御)に対する作用を解析する.我々が発見した神経特異的新規遺伝子BRINPファミリーは,交感神経細胞の分化過程でTrkCと共に誘導されるBRINP1とこれに類似する2種類のタンパク質からなる.いずれのBRINPも細胞増殖抑制能を有する.さらに神経活動の昂進によってもBRINP1の発現が誘導されるため,神経回路形成や脳の高次機能における生理的役割が推定される.本研究の目的は,BRINPファミリーの生理機能を解明することと種々の病態における役割を解明することである.本年度は,BRINP1およびTrkC遺伝子の転写調節機構に注目して研究し,以下の成果を得た:2)悪性度の高い脳腫瘍の1種である髄芽種より得られたDaoy細胞において,この細胞の腫瘍化の重要な因子であるNRSFの異常な活性がBRINP1の発現を抑制していることを明らかにした.これらの結果より,髄芽腫におけるNRSFの異常な活性がBRINP1の発現抑制を引き起こし,細胞周期抑制が解除されて腫瘍化が起こる可能性を示唆した.3)交感神経節の発達過程における遺伝子発現を解析したところ,NRSFの機能を阻害するNRSFのスプライスバリアント,REST4の発現パターンとBRINP1,TrkCの発現パターンは相関性が高かった.初代培養下の交感神経細胞において,BMP2とRAはREST4の発現を強く誘導することを明らかにした.これらの結果より交感神経の初期分化においては,BMP2とRAが,REST4を誘導してNRSFの機能を阻害することにより神経特異的遺伝子の発現を誘導することが明らかになった.
福島原発事故被災動物の歯・骨組織の被曝線量評価

福島第一原発事故に伴い拡散した放射性物質の生体への影響として、骨、歯についてのt核的な調査が行われた。今回、ウシ、ネズミ、サルの歯および骨について、X線写真、イメージングプレート、ゲルマニウム半導体検出器、ESRなどを用いて検討した。イメージングプレートの画像からウシでは形成期の歯および骨に放射性物質の取り込みが確認された。ゲルマニウム半導体検出器では形成期の異なる歯種で、放射性物質の取り込み量が異なることが明らかになった。アカネズミでは、空間線量の高い地域で歯への取り込みが多いことが明らかになった。サルの歯ではESRスペクトル調査で、高線量地域のサルの歯で明らかな高値を示すことが確認された。これまで収集された動物サンプルまた実験期間中に新たに収集された動物サンプルを使用して各種分析を行った。被災動物の歯のイメージングプレート像では明瞭な放射性物質の存在が認められた。警戒区域内で捕獲したウシ臼歯の縦断標本とそのIP像では、放射性物質が形成途中の歯や骨面に分布しており、形成が完了している歯の中にはほとんど認められなかった。これらのウシの歯の中に含まれる核種をゲルマニウム半導体検出器により同定したところ、γ線放出核種としてはCs-137,134のみが認められ、他の核種については有意の存在が認められなかった。測定環境で24時間測定での検出限界はCs-137で0.5mBq/g、Cs-134で0.7mBq/gであり、試料の種類には依存せず原則同じ値であった。同様にSr-90の測定限界は、われわれの測定環境で24時間測定の場合、0.8mBq/gとなった。これらのSr-90の値は、おそらく過去の核実験やチェルノブイリ原発事故に由来するものと考えられ、このレベルが、現時点での基準値(コントロール値)になると考えられた。いずれにしてもコントロール歯の値と、検出限界値には5-10倍以上の開きがあるので、十分に信頼性のある測定が可能と考えられる。動物が棲息する環境中の空間線量や土壌線量と歯の中の放射性物質の量には高い相関がみられた。高線量地域の野生アカネズでは、切歯中に含まれる放射性物質の濃度が高かった。一方、対照地区の切歯内にはCs-137は検出されなかった。また高線量地域で捕獲した被ばくニホンサルの歯と、コントロールサルの歯についてESRのシグナルを比較した結果、コントロールに比べて3ー5倍程度のラジカルが存在した。ヒトに近いサルの歯でこのような違いがみられることは、ヒトにおいても比較的低線量の違いを、歯を用いて検出できる可能性を示すものと考えられる。
マウス嗅覚系における神経活動に依存した高次回路形成機構の解明

マウス嗅覚系における、一次神経(OSN)と二次神経(M/T cell)の神経接続に関してOSN由来の神経活動が与える影響についての現象を見出し、その分子メカニズムを明らかにすることを目標とする。まずM/T cellの自律的発生を把握すべく一部のOSNが遺伝的に欠損した変異マウスを用い、M/T cellの発生を観察、その自律性とOSNとの相互作用の必要性を把握した。そして、OSNが与える影響の中で一次投射において重要であったOSNの神経活動の影響を、CNGチャネルのヘテロKOメスマウスを用い、同一ORを発現するがCNGの発現の有無で隣接した糸球に繋がるM/T cellの形態を単一細胞レベルで可視化した。M/T cellのdendriteの形態形成の基盤としてシナプスの形成に着目し、シナプスマーカーの染色や電子顕微鏡を用いてシナプス構造の観察も調べ、異常を見出し、神経活動が紳経接続に与える影響を把握した。そして、神経活動の下流で機能する分子としてOSNで発現するSemaphor in7Aに着目した。その発現がOR/activity依存的であること、シナプスに局在することを免疫電顕法を用いて調べ、Sema7AKOマウスにおいてシナプス形成の異常を見出した。また、特定の糸球に投射するM/T cellを単一細胞レベルで可視化、その異常も見出した。相互作用する相手分子をM/T cellで見出し詳細な発現解析も行った。あまり着目を受けていなかった、嗅覚系の主たる情報伝達を担うM/T cellの回路形成を発生期におけるM/T cellの可視化により回路形成機構を解明しようという試み自体が新しく、これらは今までOSNでなされた研究を一次神経の寄与を加味しつつより高次へ発展させるものである。また一次と二次神経それぞれに発現し、別の神経種をまたいで相互作用し、シナプス形成に関与する分子、機構に関する示唆も得られたという点で重要性は高い。これらの知見を踏まえ、また利用し、どのようにしてより高次な神経回路を一次神経からの初経活動に依存して精緻化していくのかを解明していきたい。この嗅覚系にとどまらず神経回路形成機構の解明という点で重要である。マウス嗅覚系において、神経活動が脳の高次神経回路形成に与える影響についての現象を見出し、その分子メカニズムを明らかにすることが目標であり、神経回路形成の普遍的な機構の解明がなされれば記憶や行動をつかさどるシステム解明にも役立つ。IdentityをもったOSNとM/Tcellのつながり方を考えるにあたってOSNで発現するSema7aに着目し、そのKOマウスにおいて特定の糸球に投射するM/Tcellの可視化、その異常を見出すことに成功した。また、そのメカニズムの基盤としてシナプスの形成に着目し、シナプスマーカーの染色や電子顕微鏡を用いてシナプス構造の観察も行ったところKOマウスにおいて形成の遅れがみられた。二次神経細胞を可視化しその回路形成メカニズムを解明しようという試み自体が新しく、これらは今までOSNでなされた研究をより高次へ発展させるものである。またそれに関わる分子、機構に関する示唆も得られたという点で重要性は高いと考えている。また、Sema7aと相互作用するといわれるレセプター分子が嗅神経細胞と結合して脳の高次領域へ投射する二次神経細胞で発現していることも見出した。よって、これらの分子の相互作用や機能解析を行うことで、一次神経細胞からの神経活動に由来する情報をもとに二次神経細胞との結合様式、投射への影響を調べることができると考えている。これらを用いて、高次である程度存在する神経回路を一次神経細胞からの神経活動に依存して、どう精緻な高次神経回路を構築していくのかを解明していきたいと考えている。この研究は学習や記憶など後天的な脳の神経回路形成にかんする有益な示唆を生むと期待している。

また一次と二次神経それぞれに発現し、別の神経種をまたいで相互作用し、シナプス形成に関与する分子、機構に関する示唆も得られたという点で重要性は高い。これらの知見を踏まえ、また利用し、どのようにしてより高次な神経回路を一次神経からの初経活動に依存して精緻化していくのかを解明していきたい。この嗅覚系にとどまらず神経回路形成機構の解明という点で重要である。
血液脳関門トランスポーターの分子機構と薬物の脳移行性制御

物質の脳移行性を制御をつかさどる血液脳関門の実体である脳毛細血管内皮細胞(BCEC)に備わるトランスポーターならびに膜動輸送機構に関して分子機構論的解析を行った。本研究によって得られた血液脳関門物質輸送機のは以下のものである。1) β-アミノ酸輸送系:β-アラニンやタウリンのようなβ-アミノ酸については、内皮細胞の脳側ならびに血液側細胞膜にNa^+イオンおよびCl^-イオン依存的なβ-アミノ酸特異的トランスポーターが存在することが、ウシ脳毛細血管内皮の初代培養細胞を用いた結果見いだされた。2)研究代表者等がこれまで報告してきた血液脳関門吸着介在型膜動輸送機構のペプチドデリバリーへの応用研究として、サイズ、脂溶性、荷電状態の異なる誘導体を合成し、至適構造の特徴付けを行った。3)乳酸などモノカルボン酸系化合物の血液脳関門輸送に働くことが示唆されていたトランスポーターの実体解析を行った。その結果、研究代表者らが遺伝子クローニングに成功したMCT1がBCEC内に発現しており、機能的にも重要であることを、種々培養細胞、in vivo血液脳関門輸送解析ならびに遺伝子発現測定により明らかにした。4)中枢移行性が副作用と関連するキノロン系抗菌薬の中にあって、その副作用がないニューキノロン系抗菌薬HSR-903について、その低移行メカニズムの解析した。その結果、P-糖タンパク、ならびにアニオン性化合物ににより阻害を受けるような実体が不明な排出型血液脳関門トランスポーターによる脳からの汲み出し機構の関与が示された。以上の研究成果は血液脳関門には物質の脳-循環血液間の物質移行に関わる様々なトランスポーターが存在していることを示すものであり、脳システム恒常性維持機構、ならびに薬物の脳移行性制御戦略に新たな情報と指針を与えるものである。薬物の脳移行性を制御する血液脳関門の物質輸送機能に関する研究を行った。対象物質としては、生理的物質のアミノ酸、モノカルボン酸系化合物、および塩基性ペプチドを用いた。このような化合物の血液脳関門輸送について、ウシあるいはラット脳毛細血管内皮細胞の初代培養脳毛細血管内皮細胞を用いた膜輸送実験、および分子生物学的手法による研究成果として以下の結果が得られた。血液脳関門には塩基性ペプチドの脳内移行にはたらくadsorptive-mediated endocytosis機構が備わっており、基質としては過度な塩基性度や脂溶性は本メカニズムを介した効率的な内在化に必ずしも適さないことが明かとなった。しかしその認識性は比較的幅広いものであり、ペプチドの塩基性化による脳内デリバリーの可能性が示唆された。弱酸性薬物については従来よりトランスポーターが介在することが示唆されていたが、その実体は明かではなかった。本研究では、研究代表者らがラット小腸から遺伝子クローニングに成功したモノカルボン酸トランスポーターMCT1が血液脳関門に存在することを、培養細胞を用いることにより明らかにした。すなわちRT-PCR法により本トランスポーターが血液脳関門に存在することが明かとなり、さらに乳酸などの物質輸送測定により、その機能発現も示された。アミノ酸には種々の輸送系が存在するが、ナトリウムおよびクロライド依存的なβアミノ酸輸送系が血液脳関門に存在することが機能的に確認できた。以上のような脳毛細血管内皮細胞に備わるトランスポーターの詳細について、遺伝子発現系などを用いた分子論的な解析、ならびに膜輸送機能のin vivoへ外挿によって、血液脳関門の生理機能解明が今後可能である。脳毛細血管内皮細胞によって形成される血液脳関門は脳ー循環血液中の物質交換を厳密に制御しているが、その制御機構は単なる密着結合による静的障壁のみならず、細胞膜透過に働くトランスポーターやエンドサイトーシス機能により、ダイナミックインターフェースとして物質移行制御システムを形成している。

しかしながら、血液脳関門機能を構成するトランスポーターなど分子的実体についてはほとんど明らかになっていない。平成10年度の成果として、従来から現象論的解析によって示唆されていたモノカルボン酸輸送系に着目し、トランスポーター分子の実態解明を行った。研究代表者は小腸よりモノカルボン酸トランスポーターとしてMCT1遺伝子のクローニングに成功しているが、その組織分布から血液脳関門における存在が考えられた。しかし、機能解析ならびに分子論的情報の豊富なラットの血液脳関門研究のin vitroモデルは不十分であった。そこで本研究では、まずラット脳毛細血管内皮の初代培養細胞を基にSV-40ウィルスベクターを用いた不死化細胞の樹立を行った。スクリーニングの結果血液脳関門機能を維持した細胞株RBEC1が得られた。初代培養ならびに不死化RBEC1細胞とも遺伝しレベルでのMCT1の存在が確認された。両in vitro血液脳関門モデルを用いた機能解析の結果、両細胞とも乳酸や安息香酸の輸送特性が一致し、さらにそれらは別途検討を行ったMCT1遺伝子導入細胞における輸送特性とも一致するものであった。また、in vivo BUI法による乳酸、安息香酸の脳移行特性とも良く対応した。RBEC1におけるMCT1の発現をアンチセンスDNAを用いて抑制したところ、安息香酸輸送は顕著に低下した。以上の結果より、従来より示唆されていた血液脳関門モノカルボン酸輸送系としてMCT1が重要な役割を果たしていることを明らかにできた。
バクテロイデス・ジンジバリスの産生する生物活性物質とその歯周病病原性

Bacteroides gingivalisは種々の生物活性物質を産生するが、これらのなかで病原性因子と考えられるプロテアーゼ、赤血球凝集因子、組織細胞凝集因子などについてその性質を調べるとともに、歯周組織細胞の一つである培養ヒト歯肉線維芽細胞を用いてその病原性を検討した。B.gingivalis菌の定着に関与すると考えられている赤血球凝集因子を分離精製し、その性質を調べたところ、本因子は赤血球膜上のバンド3をレセプターとし、その結合部位は糖鎖ではなくペプチド鎖のアルギニン残基であることを突き止めた。また、この凝集因子は細胞凝集活性とトリプシン様酵素活性を持っており、凝集の発現機序として酵集-基質複合体の形成が関与している可能性が示唆された。このトリプシン様酵素は他のプロテアーゼに比べて生物活性が最も強く、また、細胞毒性も強いことが判明した。本酵素はType Iコラーゲンを活発に分解するとともに、キニンの産生にも関与し、また、IgGやIgA等の免疫抗体を分解することから、歯周組織を直接破壊するだけでなく、局所での免疫防御機構をも障害すること可能性が示唆された。これらの物質は菌培養上清に分泌されるが、菌の膜成分構成物質である外膜、リポ多糖、外膜ベジクル(OM-V)のなかで培養ヒト歯肉線維芽細胞に対する細胞毒性はOM-Vが最も強く、その毒性物質は易熱性でプロテアーゼ活性に関連していた。以上の結果を総合すると、B.gingivalisの産生するトリプシン様酵素、赤血球凝集因子や細胞凝集因子などの病原因子はいずれもOM-Vに濃縮して局在し、それぞれの因子がトリプシン様酵素と同じ様な動態を示すことから、B.gingivalisが病原性を発揮する本体はトリプシン様酵素であり、赤血球凝集因子や細胞凝集因子などの生物活性の強い因子が、直接または間接に本酵素と関わりを持ちながら歯周組織を破壊していくのではないかと考えられる。嫌気培養したバクテロイデス・ジンジバリス(<B.gingivalis>___ー)を遠心により分離し、培養上清からカゼイン分解活性を有する三つの画分を分離精製した。赤血球凝集因子は同じく<B.gingivalis>___ーの培養上清より、ヒト赤血球より作製したゴ-スト細胞を用いて分離抽出した。カゼイン分解活性を有するプロテア-ゼは、それぞれPaseーA,ーB及びーCとし、それぞれの性質を調べた。三つのプロテア-ゼの至適pHはいずれも中性域に存在し、pH6.57.5の間に認められた。PaseーAはトリプシン活性測定用の人工基質には全く作用せず、セリンプロテア-ゼ阻害剤であるPSMF及びDiPFに強力に阻害された。一方、PaseーCはSHに対する依存性が非常に強いが、基質に対する特異性は牛膵トリプシンと全く同様で、ペプチド結合のアルギニンならびにリジンのC側に作用し切断する。トリプシンに比べれば、リジンに対する作用はアルギニンに対するよりも弱い。PaseーBのSH依存性はPaseーCと同様か、むしろ強い。しかし、ペプチド結合のアルギニンC側は切断するが、リジンのC側には作用しない。以上の性質はプロテア-ゼ阻害剤による検索でも顕著である。即ち、PaseーAは典型的なセリンプロテア-ゼであるが、完全に非トリプシン様である。PaseーBとーCはチオ-ルプロテア-ゼであるが、基質特異性からみるとPaseー

Cはトリプシン様であり、PaseーBは多少異なる。一方、赤血球凝集因子は、界面活性剤を用いないで赤血球ゴ-ストに対する親和性により抽出すると、トリプシン様の活性を残している。この物質は電子顕微鏡で観察すると、ベジクル様のものであり、トリプシン様の酵素がベジクル構成成分に存在するとの報告と一致する。PaseーCには赤血球凝集活性と、コラ-ゲン分解酵素が存在し、この物質と別に抽出した赤血球凝集因子との異同について今後明らかにしていきたい。本年度は、Bacteroides gingivalisの特徴的な性質の一つであり、病原因子として考えられている赤血球凝集因子(HA)を中心に研究を進めた。特に、HAに対する赤血球膜上のレセプタ-については全く知られていないため、レセプタ-蛋白を検索することを主目的とした。本研究に使用したHAは、B.gingivalis381の培養上清からアセトン分画、ゲル濾過及び緬羊赤血球ゴ-ストに対するaffinity adsorptionによって分離調製したものである。その結果、1)精製したHAの活性は、アルギニンやアルギニンを含むペプチドにより阻害を受け、アルギニン残基をフェニルグリオキサ-ルで修飾した赤血球は凝集能が低下した。2)HAそのものも強いトリプシン様酵素活性を示し、各種の合成ペプチドを用いた実験では、HAによりよく分解を受ける物質ほど強い凝集阻害を示す傾向が認められた。3)赤血球表面をHA、キモトリプシンで処理するとHA処理した赤血球は凝集能を失い、SDSーPAGE上で、バンド3が共通して消失していた。このことからバンド3がレセプタ-蛋白である可能性が示唆された。4)分取用SDSーPAGEにより精製したバンド3蛋白はHA活性を強く阻害し、さらに、本蛋白の菌体に特異的に結合した。スキャッチャ-ド分析により、解離定数は7.7×10-8M、菌体1個あたりの結合部位数は約9,000個と算出された。これらの結果から、バンド3蛋白がHAのレセプタ-蛋白になっていると考えられ、なかでも赤血球膜上のアルギニン残基が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。さらに、凝集発現機序として酵素ー基質複合体の形成が関与している可能性が示唆された。現在、B.gingivalisより精製した各種蛋白分解酵素やHA、その他の膜構成成分等の病原因子による歯周組織に対する直接的な傷害性ならびに毒性を検討中である。これまでにBacteroides gingivalisの産生する病原物質と考えられるもののなかで、3種のプロテアーをを抽出精製し、その性質を明らかにするとともに、赤血球凝集因子についても血球側の受容タンパクはバンド3である可能性を示した。今年度はこれらの物質の存在する菌体細胞構成成分を分離抽出し、その毒性に関して培養ヒト歯肉線維芽細胞を用いて検索するとともに、それぞれの毒性にどのような物質が関与しているかについて検討した。数種の黒色色素産生性Bacteroidesのなかで培養ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)に対して、B.gingivalisのみが明らかな細胞毒性を示した。この菌体の細胞膜成分を外膜(OM)、リポ多糖(LPS)、外膜ベジクル(OM-V)に分けて抽出精製し、その細胞毒性を調べたところ、OM-Vが最も強く、その毒性物質は易熱性でOM-Vのプロテアーゼ活性に関連していた。また、細胞毒性は本菌の産生するトリプシン様酵素の阻害剤によって消失、または減弱し、細胞毒性の発現に本酵素が強い関わりを持っていることが示唆された。
ニューラルネットワークを用いた自律移動ロボットの協調制御

本研究は、ニューラルネットワークによる逆モデリングのための学習アルゴリズムを用いることによって、自律移動ロボットの協調制御を行うとともに、ロボットの逆モデリングに適した学習アルゴリズムを考案することを目的としている。自律移動ロボットが効果的に働くためには、ロボットが自分自身の持っているセンサなどを利用して周囲の環境を認識しながら作業を進める能力が要求される。つまりロボットは、自分自身が持つセンサからの入力からなすべき作業を決定することになる。しかも、作業の結果の良否を判断するために得られる量もセンサから得られる周囲の環境の化を反映した値である。ここで、ロボットのコントローラは、作業の結果望ましい変化をした環境を表すセンサの値を入力として、そのようなセンサの値を得るためにロボットが行うべき作業を実現する命令を出力とするものとなる。つまり、コントローラはロボッドの逆モデルとなる。本研究では、ニューラルネットワークによる逆モデリングの手法の一つであるフィードバック誤差学習を利用して自律移動ロボットの協調制御のためのコントローラを作成した。逆モデリングの際には、フィードバックコントローラを利用するため、移動ロボットの目標出力は全て既知である必要があった。しかし、ロボットの置かれている環境の特性が未知であることを仮定しているため、全ての時点での目標出力は容易には得られない。そこで、逆モデリングの前にロボットの順モデルを作成することで、フィードバックコントローラの目標出力を推定した。さらに逆モデルのネットワークアーキテクチアとして、Hierarchical Mixtures of Expertsを用いることによって、未知の環境に対して、自らのとるべき行動を適切に選択するためのアルゴリズムを提案した。本研究は、ニューラルネットワークによる逆モデルの学習アルゴリズムを用いて、自律移動ロボットの協調制御を行なうとともに、ロボットの逆モデリングに適した学習アルゴリズムを作成することを目的としている。未知の環境を動き回る自律移動ロボットの逆モデリングを行なう際には、ロボットと環境のインタラクションを考慮しなければならない。そのため、作成されるべき逆モデルは、ロボットの物理量とともに、それが動き回る環境も含んだものでなければならない。このためには、従来の逆モデルの学習アルゴリズムに何らかの改良を加える必要がある。この研究では、逆モデルの学習アルゴリズムであるフィードバック誤差学習を改良した、自律移動ロボットのための新しい学習アルゴリズムを提案した。従来のフィードバック誤差学習は、フィードバックコントローラを利用するため、移動ロボットの各時点での目標出力値がすべて既知である必要があった。しかしながら、未知の環境を動き回る移動ロボットは、必ずしもこの要求を満たしていない。提案したアルゴリズムでは、対象とする自律移動ロボットの順モデルを利用することによって、フィードバックコントローラに与える目標出力を推定する。ここで利用される順モデルもニューラルネットワークを利用して容易に作成することができる。また、順モデルに用いて目標出力の推定を行なうことにより、従来のままでは、困難であったフィードバック誤差学習による自律移動ロボットの逆モデリングが可能になることを示した。さらに、この学習アルゴリズムは複数のロボットの制御に容易に拡張できる。