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防御から共生への受容体機能変換の生化学的機構

植物の防御応答・共生応答を制御するCERK1/NFR1型の受容体キナーゼは、そのキナーゼドメインのYAQ配列の有無によって下流の共生応答の誘導の可否が左右される。キナーゼドメインのアミノ酸配列のわずかな差異が下流の細胞応答の切り替えにどのようにしてつながるかを検討した結果、YAQ配列の有無による自己リン酸化部位には差異が認められなかった。このことは、この配列の導入によるわずかな立体構造の違いが下流のシグナル伝達因子などとの相互作用に大きな影響を及ぼしていることを示唆している。シロイヌナズナのキチン受容体CERK1のキナーゼドメインは、自己リン酸化を介して下流の免疫応答を制御していることが知られている。一方、われわれはこのキナーゼドメインにわずか3アミノ酸配列(YAQ)を導入することによって、下流のシグナル伝達経路を共生シグナル伝達系に変換できることを示している(Nagagawa et al., 2011)。本研究ではこうしたシグナル伝達系の変換がどのようにして可能になったかを明らかにすることを目指している。本年度においては大腸菌で発現したCERK1キナーゼドメインおよびそれにYAQ配列を導入したものを用いて、この配列の導入が自己リン酸化部位の変化に結び付いているかを検討した。その結果、意外なことに自己リン酸化部位には有意な変化が認められなかった。このことは、YAQ配列の導入が自己リン酸化部位の変化を通じて下流の応答に影響しているのではなく、この配列の導入による構造変化そのものが下流の応答の切り替えにつながっていることを示唆している。実際に、YAQ配列の挿入部位をCERK1細胞内ドメインの分子モデリングにより検討した結果、この配列がキナーゼの基質認識部位近傍に位置することを示唆する結果が得られた。また、自己リン酸化部位特異的変異を導入した形質転換体やin vitroリン酸化実験などによる解析から、自己リン酸化部位の中には下流のシグナル伝達系因子との相互作用に影響する部位があることも示唆されている。今後、こうした点も踏まえながら、YAQ導入によるキナーゼドメインの構造変化と下流のシグナル伝達系制御の関連についてさらに検討していく予定である。シロイヌナズナのキチン受容体CERK1のキナーゼドメインは、自己リン酸化を介して下流の免疫応答を制御している(Miya et al., 2007)。一方、われわれはこのキナーゼドメインにわずか3アミノ酸配列(YAQ)を導入することによって、下流のシグナル伝達経路を共生応答経路に変換できることを示している(Nakagawa et al., 2011)。昨年度は大腸菌発現タンパクを用いた検討の結果、YAQ配列導入によって自己リン酸化部位は変化しないことが分かった。このことは、YAQ配列の導入は自己リン酸化部位の変化を通じてではなく、この配列の導入による構造変化そのものが下流の応答の切り替えに重要であることを示唆している。こうした構造変化を原子レベルで明らかにするため、野生型およびYAQ配列導入変異体CERK1の細胞内ドメインの構造解析をめざし、異種発現系を用いた大量発現と精製法の検討を行った。様々な発現系とタグを付加した融合タンパクを利用した大量発現、精製条件を検討した結果、マルトース結合タンパク質融合型CERK1細胞内ドメインを大腸菌で発現することにより、高純度の融合タンパク質を培養液1Lあたり8mg程度調製することに成功した。現在、タグの除去と精製、結晶化を目指して実験を進めている。一方、CERK1細胞内ドメインの自己リン酸化と下流のシグナル伝達系因子の活性制御の関係を検討した結果、自己リン酸化部位の一部が下流のシグナル伝達系因子の特異的なリン酸化、活性制御に関わることを示唆する結果を得た。細胞内ドメインの立体構造解析とこうした生化学的解析の結果を総合することにより、CERK1を介した免疫応答と共生応答の制御機構を分子・原子レベルで理解できることが期待される。YAQ配列導入による下流の応答の制御は自己リン酸化部位の変化ではなく、キナーゼドメインの構造変化に起因することを示唆する結果を得ており、今後の研究の焦点が絞られてきた。また、本課題に関連する重要な論文を発表した。生物学、植物分子・生理化学、植物・微生物相互作用・共生YAQ配列の導入によるCERK1キナーゼドメインの構造変化を明らかにするため、異種発現系による大量発現と結晶化、構造解析を目指す。CERK1がリン酸化する共生関連シグナル伝達系因子についても解析を進めたい。初年度における自己リン酸化部位の解析とその機能解析は、学内共同研究の利用やこれまでに確立したシステムの利用により、大きな支出を伴わなかった。一方、結晶化を目指した異種発現系による目的タンパク質の大量発現に関しては、コドンを合わせた人工遺伝子合成などの高額支出が次年度になったため、この面でも支出が抑えられた。予算的には2年度目に比重を置いた支出計画となる。

次年度においては目的タンパク質の大量発現と精製・結晶化に関して、特殊高額試薬や外注に関わる支出を計画している。また、関連する研究成果の学会発表、論文発表の経費を見込んでいる。
分泌蛋白質の品質管理機構としての小胞体内蛋白分解メカニズムの解析

新規に合成された分泌タンパク質のうち、遺伝的変異、サブユニットの会合異常、あるいは薬物誘導などが原因で、新生ペプチド鎖が不適切にフォールディングされるものは、分泌経路から除外され、小胞体内で速やかに分解されることが知られている。この現象は、小胞体における「新生タンパク質品質管理機構」と呼ばれ、近年特に注目されている。昨年までの本重点領域研究でこの小胞体内での異常タンパク質の選択的分解には、プロテアソーム様酵素が関与されていることを明らかにした。そこで、本年度は、(1)小胞体プロテアソーム様酵素の精製と性状解析を行うと共に、(2)遺伝的変異が原因で分泌異常となったアンチトロンビン変異体とヒスチジンリッチ糖タンパク質Tokushimaを哺乳類培養細胞中に発現し、その細胞内分解を解析した。(1)小胞体プロテアソーム様酵素の精製と性状解析--ラット肝ミクロソーム画分から、分子量約60万で、SDS-PAGE上では、細胞質プロテアソームと同じサブユニットパターンを示すプロテアソーム様酵素(R2プロテアーゼと仮命名)の単離に成功した。本酵素と細胞質プロテアソームの諸性質を比較したところ、塩濃度感受性や至適pH、さらにカゼインを基質として用いた場合の分解パターンや二次元ゲル電気泳動によるサブユニットパターンの比較などに若干の差異が認められたので、今後さらに検討する。(2)アンチトロンビンおよびヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRG)変異体の細胞内分解の解析--アンチトロンビン欠乏症の原因となったGlu313欠失変異体(ΔGlu313)およびPro429が停止コドンとなった変異体(P→stop)をそれぞれBHK細胞に発現させ、各々の細胞内動態を解析した。その結果、両変異体ともほぼ正常に生合成されるものの、細胞外への分泌は野生型に比して5%以下であり、細胞内での分解が示唆された。さらに、各種プロテアーゼインヒビターによる分解阻止効果を調べた結果では、いずれの変異体も、LLL(carbobenzoxy-leucyl-leucyl-leucinal),LLnV(carbobenzoxy-leucyl-leucyl-norvalinal)およびlactacystinなどのプロテアソームインヒビターによって分解が強く阻止されたことから、プロテアソームによる分解が示唆された。また、HRG欠乏症の原因となったGly85Glu置換体(HRG-徳島と命名)をBHK細胞に発現し、細胞内分解を確認した。
走査型プローブ顕微法による金属表面の微細加工

本研究では、微細加工を目的としたAFMユニット及びこのユニットの制御・画像処理システムの構築を行う。さらに、種々の純金属表面に対する微細加工試験を行ない、加工条件と加工分解能(精度)の関係を把握するとともに、加工メカニズムの究明を行い、ナノスケール分解能を得るための加工方法を確立する。これまでに微細加工用AFMユニットの開発、このユニットの制御・画像処理システムの構築及びこれを用いた純金属表面の大気中での微細加工試験は計画通り進捗しており、下記の研究成果が得られている。Ni、Cu、AlおよびAuの蒸着膜および機械研磨バルク材に対して、種々の加工条件の影響について調べた結果、探針荷重および走査送り幅に大きく依存し、走査幅および走査速度にほとんど依存しないこと、さらに、この加工が同じメカニズムで繰り返されることが明らかとなった。これにより、本加工のメカニズムが把握されるとともに面スクラッチ1回あたり数nm数十nmの深さの平面加工が再現性良く制御できることが示された。現在、以上のf.c.c.系の純金属に加えて、Mn、Mo、TiおよびW等の他の結晶系の純金属について検討を続けている。さらに、加工中の探針及び試料表面の雰囲気を制御して、加工分解能及び加工能率に与える表面状態の影響について検討するため、微細加工用SPMユニット全体を包含できる雰囲気コントロール装置の設計・製作を完了した。これにより、湿度(3080%)制御による探針と試料の接触状態に及ぼす吸着水膜の影響、及びガス置換(不活性、活性)による酸化膜や物理吸着膜の影響を調べ、加工分解能の向上を目指す。これと並行して、微細加工の限界と密に関連する極軽荷重摩擦、さらにゼロ摩耗摩擦等に関するマイクロトライボロジへの展開を計る。これまでに微細加工用AFMユニットの開発、このユニットの制御・画像処理システムの構築及びこれを用いた純金属表面の大気中での微細加工試験は計画通り進歩しており、下記の研究成果が得られている。Ni、Cu、AlおよびAuの蒸着膜および機械研磨バルク材を加工した結果、Cu、Alでは、加工除去された材料の凝着に起因する起状が観察され、この挙動はAuではさらに顕著となった。一方、Niでは、深さ550nmの平坦な角穴が得られ、この深さは深針荷重にほぼ比例することが明らかとなった。また、Niについて、種々の加工条件の影響について調べた結果、探針荷重および走査送り幅に大きく依存し、走査幅および走査速度にほとんど依存しないこと、さらにこの加工が同じメカニズムで繰り返されることが明らかとなった。これにより、本加工のメカニズムが把握するとともに、面スクラッチ1回あたり数nm数十nmの深さの平面加工が再現性良く制御できることが示された。現在、以上f.c.c系の純金属に加えて、Mn、Mo、TiおよびW等の他の結晶系の純金属について検討している。さらに新たな研究課題として、本装置に、雰囲気コントロール機構及びパルスレーザ照射による試料表裏クリーニング機構を導入し、深針と試料の接触状態や加工特性に及ぼす湿度の影響や試料表面の酸化膜・物理吸着膜の影響を調べる予定である。

これまでに微細加工用AFMユニットの開発、このユニットの制御・画像処理システムの構築及びこれを用いた純金属表面の大気中での微細加工試験は計画通り進捗しており、下記の研究成果が得られている。Ni、Cu、AlおよびAuの蒸着膜および機械研磨バルク材に対して、種々の加工条件の影響について調べた結果、探針荷重および走査送り幅に大きく依存し、走査幅および走査速度にほとんど依存しないこと、さらに、この加工が同じメカニズムで繰り返されることが明らかとなった。これにより、本加工のメカニズムが把握されるとともに、面スクラッチ1回あたり数nm数十nmの深さの平面加工が再現性良く制御できることが示された。現在、以上のf. c. c.系の純金属に加えて、Mn、Mo、TiおよびW等の他の結晶系の純金属について検討を続けている。さらに、加工中の探針及び試料表面の雰囲気を制御して、加工分解能及び加工能率に与える表面状態の影響について検討するため、微細加工用SPMユニット全体を包含できる雰囲気コントロール装置の設計・製作を完了した。これにより、湿度(3080%)制御による探針と試料の接触状態に及ぼす吸着水膜の影響、及びガス置換(不活性、活性)による酸化膜や物理吸着膜の影響を調べ、加工分解能の向上を目指す。これと並行して、微細加工の限界と密に関連する極軽荷重摩擦、さらにゼロ摩耗摩擦等に関するマイクロトライボロジへの展開を計る。
高感度な表面磁気光学カー効果測定装置の開発と表面ラシュバ系のスピン伝導の研究

本研究の目的は非磁性体表面で大きなスピン分裂を示すバンド構造(Rashba効果)を持つ系の運動量・スピンロッキング由来のスピン伝導現象を測定することである。そのためにまず左右円偏光のレーザーを試料に照射し、試料両端に生じる起電力を測定した。Bi(111)表面とAg(111)√3×√3-Bi表面に対して円二色性が観測できたが、Rashba効果がないSi(111)7×7表面でも円二色性が見られた。第二の実験として、試料に電流を印加しながらスピン偏極ヘリウムイオンの散乱によって表面Rashba系の電流誘起のスピン偏極を検出することを試み、スピン軌道相互作用に由来するスピン依存の散乱を検出した。本研究では高感度の表面磁気光学カー効果測定装置を開発し、光学的手法を用いてRashba分裂した表面状態によるスピン伝導測定を行うことを目的にする。近年スピン軌道相互作用を利用して電場でスピンを制御し、電荷の移動を伴わないスピンの流れである"スピン流"の研究が半導体界面やバルクで盛んに行われている。一方表面系でもRashba効果によりスピン分裂したバンド構造を持つ状態が数多く見つかり、申請者はこれまで電気伝導測定手法によりこのようなスピン流の検出を試みてきた。そこで本研究ではこれを発展させ、より表面敏感性の高い光学的手法を用いた表面状態スピン流の研究の開拓を試みる。初年度である平成25年度は円偏光の光をRashba表面系に照射したときに期待されるスピンガルバーニ効果の検出を目指した。試料はBiをAg(111)に1/3原子層蒸着して形成される、Ag(111)r3xr3-Bi表面であり、これまで報告されている系の中で最大級の表面Rashba効果を示すことが分かっている。4/λ板を回転して直線偏光の光の偏光を変調して試料両端に蓄積される電圧を測定した結果、回転角と発生電位の間に明確な対応関係が見られた。また磁場を面内・面直に印加したが、印加磁場と発生電位についても対応が見られた。今後さらにデータを蓄積し、解析を行うことで実際にRashba効果に由来するシグナルであるかを検証していく。これとは別にスピン偏極ヘリウムイオン散乱を用いたRashba表面系(Bi(111)表面)における電流誘起スピン偏極の測定も行った。試料ホルダーを回転して入射ヘリウムイオンのスピンと試料に誘起されるスピン偏極との相対角度を振ったところ、系統的に変化するデータと変化しないデータが得られた。現在この解釈を議論中である。平成26年度は前年度に引き続き、円偏光の光をRashba表面系に照射したときに期待されるスピンガルバーニ効果の検出を目指した。試料としてははBiをAg(111)に1/3原子層蒸着して形成される、Ag(111)r3xr3-Bi表面、Bi(111)表面、そして参照試料(スピンガルバーニ効果が出ないと予想される試料)としてSi(111)-7x7表面を測定した。λ/4板を回転することで直線偏光の光の偏光を変調し、試料両端に蓄積される電圧を測定した結果、全ての試料において回転角と発生電位の間に明確な対応関係が見られた。さらに入射するレーザーのエネルギーを変えて同じ測定をするとシグナルの大きさが変わることも分かった。参照試料でもシグナルが得られているので目的としている、スピン分裂したバンド構造によるスピンに依存した励起ではない現象を観測している可能性があり、今後さらに光エネルギーを変えることで測定しているシグナルの期限を解明していくつもりである。研究最終年度の平成27年度は前年度に引き続き、超高真空下でラシュバ分裂したバンド構造を示す表面超構造に円偏光したレーザー光を照射し、左右円偏光の違いで試料の両端に生じる起電力が変化するかを系統的に調べた。使用した試料はシリコン基板上に作成したビスマス(Bi)薄膜とシリコン基板上の銀(Ag)薄膜上にBi原子を1/3原子層吸着した系(Bi/Ag薄膜)である。前年度から問題点はラシュバ効果によってスピン分裂していないバンド構造を持つ試料(例えばSi(111)-7x7)でも起電力に左右円偏光で違いが出ることであったが、この問題はレーザーの波長や入射角度依存性などを詳細に調べることで本来見たいシグナルとは別の起源で発生していることが明らかになった。Bi薄膜およびBi/Ag薄膜では色々な条件での測定の結果、ラシュバ効果由来のシグナルと考えても矛盾しないデータが得られていたが、他の起源である可能性を完全に排除することができなかった。確信を持ってスピン分裂したバンド構造由来の円二色性を観測したと言うには光学励起が起きている非占有状態の情報が必要であり、現在実験では明らかにされていないため第一原理計算に頼る必要があるが、本年度中にそこまでは至らなかった。

今後理論家と協力しバンド構造および光学遷移課程を選択則を考えて計算することで本研究で目指した磁気二色性のシグナルが確かに検出できたか検証する予定である。本研究の目的は非磁性体表面で大きなスピン分裂を示すバンド構造(Rashba効果)を持つ系の運動量・スピンロッキング由来のスピン伝導現象を測定することである。そのためにまず左右円偏光のレーザーを試料に照射し、試料両端に生じる起電力を測定した。Bi(111)表面とAg(111)√3×√3-Bi表面に対して円二色性が観測できたが、Rashba効果がないSi(111)7×7表面でも円二色性が見られた。第二の実験として、試料に電流を印加しながらスピン偏極ヘリウムイオンの散乱によって表面Rashba系の電流誘起のスピン偏極を検出することを試み、スピン軌道相互作用に由来するスピン依存の散乱を検出した。当初の計画通り実験は遂行できている。解釈の面でまだ議論の余地があるが、目的としているシグナルはきちんと得られていると考えているのでこのような判断とした。表面・界面物理実験データの詳細な解析を理論計算とともに行い、得られたシグナルの物理的解釈を深めていく。さらに磁場を試料に印加したときのシグナルの変化から、スピンが歳差することでスピンガルバーニ効果がどう影響されるかを検証していく。当初は表面磁気光学カー効果測定を用いて実際にRashba表面の電流誘起のスピン偏極を測定する予定だったが、装置改良に時間がかかると判断したので2年目以降に予定していたスピンガルバーニ効果実験を先に行った。測定データは実際に得られており、後は解析するのみであることから、このように判断した。当初予定していたよりも室温での測定に時間がかかり、冷媒の使用が少なかったため、次年度使用額が生じた。まず測定したスピンガルバーニ効果のデータ解析を行っていく。さらに当初の計画通り、装置の改良を行うことでRashba表面に電流を流した際に誘起されるスピン偏極を測定していく。平行してスピン偏極イオン散乱を用いても同様な測定を行っていきたい。平成27年度は冷媒を用いて試料を冷却して研究を進める。冷媒(液体窒素)の購入費に使用予定である。当初研究計画を若干変更し、二年目以降行う実験を先に行ったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額と本来支給されるべき額を合わせて装置改良を行い、当初計画の一年目に行うべき実験を遂行していく。
タイト結合構成蛋白クラウディンの機能についての分子解剖学的研究

タイト結合(TJ)構成蛋白claudin-1(CL-1)は、N末とC末を細胞質側に向け細胞膜を4回貫通している。また、TJの裏打ち蛋白であるZO-1は、CL-1のC末と結合している。(1)CL-1のC末にmyc-tagを付けて、MDCK細胞で過剰発現した。その結果、transepithelial electrical resistance(TER)値が上昇し、FITC-dextranによる細胞間透過性が減少した。このことから、CL-1の過剰発現によりMDCK細胞のバリア機能が亢進することがわかった。この結果はEuropean Journal of Cell Biology 78(12):849-855,1999に発表した。(2)CL-1のZO-1結合ドメインと考えられているC末端領域を除去してMDCK細胞で発現した。これをΔCmycと呼ぶ。その結果、本来TJがない細胞の側面膜に、TJ様の構造ができることがフリーズフラクチャーの観察でわかった。フラクチャーラベルにより、このTJ様のストランドはΔCmycで構成されていることがわかった。このことから、CL-1はZO-1との結合非依存性にTJ様のストランドを形成できるが、このストランドがTJへ局在化するためにはZO-1との結合が関与していることが示唆された。ΔCmycの発現によりTER値はやや上昇するが、FITC-dextranによる細胞間透過性はほとんど変化しなかった。タイト結合(TJ)構成蛋白claudin-1(CL-1)は、N末とC末を細胞質側に向け細胞膜を4回貫通しており、2つの細胞外ループE1およびE2を持っている。CLはE1ループに2つの保存されたシステイン残基を持っている。その結果、transepithelial electrical resistance (TER)値が上昇し、FITC-dextranによる細胞間透過性が減少した。(2)E1ループに2つの保存されたシステイン残基をアラニンに置換すると、CL-1は細胞内に局在しTJを含む細胞膜には輸送されなくなった。非還元条件でのイムノブロットの結果CL-1は、鎖間ジスルフィド結合は形成しないと考えられた。システイン残基をアラニンに置換すると、CL-1の折畳みがうまくいかず、結果として細胞膜への輸送が障害されると考えられた。(3)ZO-1と結合するCL-1のC末領域を除去してMDCK細胞で発現した。CL-1はC末が無くてもlateral membraneに輸送された。フリーズフラクチャーで観察すると、本来のTJよりもbasal側にTJ特有のstrandが認められた。このstrandはC末を欠失したCL-1により形成されていると考えられた。現在、これらの変異体についてさらに詳しく検討しているところである。
InAlGaN4元混晶を用いた紫外域高輝度発光ダイオードの開発研究

波長250nm-350nm帯の紫外高輝度発光ダイオード(LED)、半導体レーザ(LD)は、半導体白色光源、高密度光ディスク、殺菌等の医療、化学工業、公害物質の高速分解処理等、さまざまな分野での応用が大変期待されている。しかし、波長360nm以下の高効率LED・LLは、高輝度紫外発光材料の欠如、ならびにワイドバンドギャップP-型窒化物の欠如のため、未だ実現していない。本研究は波長300-360nmの紫外領域の高輝度発光ダイオードを実現することを目的とする。そのため、ワイドバンドギャップAlGaNにInを加え、4元混晶内でのIn組成変調効果を用いることにより、300nm帯紫外常温高効率発光、および、高濃度P型ドーピングを実現し、それらの技術を用いて300-350nm帯高効率LEDを実現する。本研究では、まず、InAlGaN4元混晶の高品質結晶作製および量子井戸構造最適化を行い、波長280-380nmの広い紫外波長域において内部量子効率10%以上の室温高効率発光を実現した。特に、波長330nm帯では、青色発光と同様の内部量子効率50%以上を達成し、紫外LED、LDへの応用の重要性を実証した。InAlGaNを発光層に用いた波長308-312nm(国内最短波長)の紫外LEDを作製し、室温においてサブミリワットの高輝度発光を得た。さらに、貫通転位の少ない高品質GaN基板上にInAlGaN量子井戸LEDを作製し、波長352m、室温CW出力7.4mWの高出力紫外LEDを実現した。このLEDからは、350nm帯表面出射型LEDとしては最高の外部量子効率1.1%が得られた。これらの結果から、InAlGaN4元混晶が発光層としてAlGaNよりも優れている事が実証され、今後、高効率紫外LED、LDの発光層として大変重要である事を明らかにした。しかし、波長360nm以下の高輝度LED・LDは、高輝度紫外発光材料の欠如、ならびにワイドバンドギャップp-型窒化物の欠如のため、未だ実現していない。そのため、ワイドバンドギャップAlGaNにInを加え、4元混晶内でのIn組成変調効果を用いることにより、300nm帯紫外常温高効率発光、および、高濃度p型ドーピングを実現し、それらの技術を用いて300-350nm帯後期度LEDを実現する。平成14年度は、InAlGaN4元混晶からの高効率発光と、ワイドバンドギャップ領域AIGaNへのp型ドーピングを追及した。その結果、InAlGaN4元混晶量子井戸波長から、発光波長350nmにおいて、内部量子効率15%を室温において得た。この値は、同基板上に作製したAlGaN量子井戸と比較して2けた程度高い値である。また、パルスガス供給法を用いた結晶成長を行ない、ワイドバンドギャップAlGaN結晶の高品質化を試みた。フォトルミネッセンス測定により、結晶の高品質化を確認した。パルス供給法により、ワイドバンドギャップAlGaNへのp型ドーピングを行ない、Al組成53%の高い組成において、世界で初めてホール伝導を得ることに成功した。InAlGaN

4元混晶を活性層に、ワイドバンドギャップp型AlGaNをホール注入層に用いた深紫外LEDを試作した。4元混晶の組成を変えることにより308-314nmのシングルピーク発光を得た。紫外に対し透明なサファイア基板上に作製し、紫外光の高い取り出し効率を実現した。深紫外出力は、室温パルス測定において、0.4mW(314nm LED)、0.8mW(314nm LED)が得られた。波長250nm-350nm帯の紫外高輝度発光ダイオード(LED)、半導体レーザ(LD)は、半導体白色光源、高密度光ディスク、殺菌等の医療、化学工業、公害物質の高速分解処理等、さまざまな分野での応用が大変期待されている。しかし、波長360nm以下の高輝度LIED・LDは、高輝度紫外発光材料の欠如、ならびにワイドバンドギャップp-型窒化物の欠如のため、未だ実現していない。本研究は波長300-360nmの紫外領域の高輝度発光ダイオードを実現することを目的とする。そのため、ワイドバンドギャップAlGaNにInを加え、4元混晶内でのIn組成変調効果を用いることにより、300nm帯紫外常温高効率発光、および、高濃度p型ドーピングを実現し、それらの技術を用いて300-350nm帯後期度LEDを実現する。平成15年度は、InAlGaN4元混晶を用いたLEDの高効率化を追及した。InAlGaN4元混晶はフォトルミネッセンス発光では高輝度発光が得られるが、LED構造とし電流注入を行うと、貫通転位の影響によるリーク電流のため、発光強度が低下する。そこで、貫通転位密度が少ないGaN基板上にLEDを作成し、高効率化を図った。GaN基板上LEDにおいて、コンタクト吸収層の除去、電子ブロック層の挿入、InAlGaN発光層の高温成長、GaN基板上バッファー構造の最適化等の構造改善を行うことにより、高出力紫外LEDを実現した。紫外出力は、室温CW動作において6.3mW(358nmLED)、および3.2mW(351nmLED)が得られた。しかし、波長360nm以下の高輝度LED・LDは、高輝度紫外発光材料の欠如、ならびにワイドバンドギャップp-型窒化物の欠如のため、未だ実現していない。平成16年度は、平成15年度に引き続きInAlGaN4元混晶を用いたLEDの高効率化を追及した。貫通転位の大変少ない高品質GaN基板上において、波長352nm、室温CW出力7.4mWの高出力紫外LEDを実現した。このLEDからは、350nm帯表面出射型LEDとしては最高の外部量子効率1.1%が得られた。この結果から、高品質GaN基板使用の有効性が明らかになるばかりでなく、InAlGaN4元混晶が発光層としてAlGaNよりも優れている事が証明された。
蜘蛛糸の固化する前の分泌腺内における液体の物理化学的研究

最近、遺伝子工学的手法を用いてヤギのミルクからクモの糸を作ることか可能になってきたことから、クモの糸はストッキング・防弾チョッキ、縫合糸などへの応用面で注目を浴びている。しかし、遺伝子工学手法から作られるクモの糸は、現実のクモの糸の特徴をすべて反映しているとは考えられない。興味深い非晶性のクモの糸の性質を知るには、分泌腺内での液状の性質を理解することが不可欠と考えられる。ところが、クモの小さな体内の解剖は人間より難しく、悪戦苦闘の末、やっと、分泌腺内の物質を分離することが可能になった。また、解剖には微妙なテクニックが必要であり、また、分子量を測定する条件が確立できるようになってきた。今回の実験から、分子量が約27万であることが分かったのは大きな成果である。本研究では、分子量測定の条件の確立とともに、クモの糸の弾性率の決定および糸に対する紫外線照射による影響、さらに、クモの糸との関連でミノムシの糸の弾性率を決定することができた。ジョロウグモおよびオオジョロウグモの解剖を行い、蜘蛛糸の固化する前の分泌腺内における液状物質の物理化学的性質を調べることを試みた。なお、劣化の観点からも、固化した糸と内部分泌液との比較検討も行った。1.奈良、高知、沖縄等に出向き、ジョロウグモおよびオオジョロウグモを採集した。2.蜘蛛の適切な保存方浩を探すべく、冷凍保存に関して種々の条件を設定し、その条件における分泌液の分子量を測定した。3.光学顕微鏡を用いて蜘蛛の解剖が可能な条件を探した。4.解剖を実践し、分泌腺の分離採取を可能にした。5.蜘蛛の体内における各種分泌腺の解剖学的同定を行った。6.糸腺から液状物質の採取を試み、その採取条件を調べた。7.採取した液状物質の溶媒を探索し、分子量測定を試みた。ただし、現在のところ、固化したクモ糸の適切な溶媒を探索するのに悪戦苦闘している状態である。ジョロウグモの解剖を行い、蜘蛛糸の固化する前の分泌腺内における液状物口の分子量を調べることを試みた。1.ジョロウグモの成長度合いは、時期と場所によって異なるため、解剖に適切な時期を選ぶべく、奈良、大阪、和歌山、高知、沖縄におけるジョロウグモを採集した。2.10月にはいなくなることから、11月以降は暖かい和歌山や高知まで出向いてジョロウグモを採取した。3.光学顕微鏡にて蜘蛛の解剖を行った。4.解剖の際に適した液体を探すべく選別テストを行った。5.クモ体内から分泌腺の採取を行った。6.分泌腺を電気泳動にて分子量分布の測定を試みた。7.解剖の方法によって劣化する傾向が見られたので、何回もの繰り返しで、劣化の原因を探った。8.分子量は、解剖の微妙なテクニックおよび蜘蛛の採取時期に大いに依存することが判った。9.現在のところ、ジョロウグモの分子量として27万近い測定値を示すことが判った。
動的最構成ロジックを用いたロータリエンコーダ誤差測定システムの研究

ソフトウェアの柔軟性とハードウェアの高速性を同時に達成する技術として動的再構成ロジック(Reconfigurable Logic)の研究を進めてきた。この技術をロータリエンコーダ校正装置用誤差測定システムの高精度化と自立型二足歩行ロボットの制御に応用した。ロータリエンコーダ校正装置については、機構部の改良と併行して、主要な構成要素の一つである誤差測定回路部の改良を担当し、分解能の向上、最大40個のエンコーダの同時測定機能、内挿誤差測定機能を追加し、256MB SDRAMを搭載した新しい誤差測定回路ボードと、その測定ソフトを開発した。全体として、最大で6700万点の角度目盛の誤差測定が可能となり、かつ校正精度0.001"オーダの高精度校正装置実現の見通しを得た。また、動的再構成ロジックを応用した、複数の画像処理を連続で行う画像処理システムを設計した。FPGAを2個搭載した画像処理ボートで、一方のFPGAで他方のFPGAのコンフィギュレーションを制御し、後者上の画像処理回路をダイナミックに書き換えることにより、画像処理を連続的に行うことを可能にしたものである。更に、JPEGの構造や使われている様々な圧縮技術を調査し、基本DCT方式のJPEGのデコーダーを画像処理プログラムに組み込み、JPEGからの画像処理を可能とした。複数の画像処理メニューを組み合わせ、画像の色情報から障害物の認識と抽出を行う仕組みを構築した。これは、ロボットに搭載することを想定して作ったもので、今後は回路化を進め、両者をドッキングして、障害物を避けて自動走行する自立型二足歩行ロボットの開発を行っていく。1.新ロータリエンコーダ校正システム機構部の試作・市販エンコーダの高精度化に伴い、ロータリエンコーダ校正システムにおいても、微小角測定の高分解能化と高精度化が必要である。・エンコーダの測定において,検出ヘッドを多数取り付け,それぞれの測定データを平均化することにより高精度化を図れる.これまでは3つ載っているエンコーダの内の1つを8ヘッドにしただけだったが,今回、3つのエンコーダ全てに8個の検出ヘッドを搭載し、全体で32個とした新校正システムの機構部を試作した.・検出ヘッドをこれまでの8個から32個と大幅に増加させ、32個の信号を平均化することによって、信号のばらつきの低減と、無視することが限界にきているピッチ誤差の低減が可能になった。2.上記機構部に対応した新しい誤差測定回路ボードの試作・652ピンDSP内蔵FPGA1個、168ピン256MBDIMM1個、4Mbの高速SRAM×6個(合計3MB)、50ピンコネクタ1個を搭載した、新しい誤差測定回路ボードを試作した。・大容量・低速のメモリであるDIMMと、低容量(1Mb)・高速のメモリであるFPGA内蔵メモリの速度差を埋めるため、高速FIFO(First-in First-out)の設計が鍵となった。・ボードの設計を工夫し、メインクロック周波数を50MHz→100MHzと2倍高速にしても動作するように改良した。3.所期の目標を達成・メインクロック周波数を2倍高速にした結果,分解能が0.001秒に向上した.・本ボードを新ロータリエンコーダ校正システム機構部に取り付け、実試験を行った結果、所期の性能を確認した。・エンコーダ信号入力本数最大40、内挿誤差信号数最大6700万点を仕様とする新しい誤差測定回路を実現することが出来た。1.新ロータリエンコーダ校正システムの継続評価・昨年度開発したシステム機構部のノイズ発生はその後も続き、現在もノイズ発生原因の究明と対策の検討を続けている状態である。(益田)・回路系に関しては、二枚作った誤差測定回路ボードの一枚を使って、「擬似ロータリエンコーダ信号発生回路」を設計・試作した。このため、機構系なしでも誤差測定回路ボードの評価が出来るようになり、本ボードの性能評価と性能改善を進めることが出来た。これは動的再構成ロジックの特長を生かした電子回路の活用法である。

(玉真)2.USB2.0インターフェース回路の検討・測定用PCとのインターフェース回路としてUSB2.0制御回路を検討した。・ロータリエンコーダの出力パルス数をカウントすることにより、回転数、回転速度、回転加速度を計測できる専用ボードを設計・試作した。Cypress社のUSBコントローラLSIであるCY7C68013一個と、データ処理回路開発用に3万ゲートのFPGA1個を搭載した。本LSIは、USBコントロールモードとしてPIO、GPIF、スレーブFIFOの3つを提供している。コマンドの送出には簡易なPIOモードを用い、測定データの読取りには高速のGPIFモードのバースト・リード動作を用いた。3.二足歩行ロボットの制御・ロータリエンコーダの高精度化により、ロボット等の制御をより精密に行わせることが出来る。・市販の二足歩行ロボット2体とロボットアーム1台を購入し、ロボット制御の検討を開始した。他にも、センサ付トーイロボット数台を購入し、各種センサの働きと性能を評価した。・上記USBインターフェース回路付ボードを用い、FPGA上に画像処理回路とモータ制御用パルス幅変調(PWM)回路を書込んで、二足歩行ロボットの障害物回避自律走行を可能にするシステムを構築した。1.ロータリエンコーダ校正システムの継続評価(益田)・本体のノイズの原因は等速回転制御用ACサーボモータのドライバであった。外部に設置した減速機付きDCモータとゴム製ベルトを使って回転させる方式に切り換え、ノイズの低減効果を確認した。相対角位置誤差の標準偏差を0.01"0.025"から0.001"に大幅に改善した。・2つの基準エンコーダにセンサヘッドを等間隔に10個ずつ取り付け、個々のヘッドの角度位置誤差を平均化することで校正精度の向上を図る。基準エンコーダBに於いて、B1と対角位置のB6ヘッドを比較基準として、残りの8個のセンサヘッドの同時測定を繰り返した。この結果を基に、エンコーダA、Bに10ヘッドを使った時の相対角位置誤差の標準偏差を約0.0015"と推定した。更にA相B相を用いてばらつきを少なくすることにより、標準偏差0.0013"達成の見通しを得た。2.エンコーダ応用技術(玉真)・トレーニング用自転車エルゴメータを使ってスポーツマンの運動能力を測定する「パワー測定器」2号器を開発した。1号器はすでにオリンピックレベル選手の体力測定に使われている。スケート選手のトレーニング用に、ペダルの総回転数を設定でき、到達時間や途中の詳細な速度変化を記録できる機能を追加するため、エルゴメータの速度をエンコーダのパルス数として0.05秒間隔で測定し、メモリに格納する機能を搭載した測定回路ボードを開発した。・二足歩行ロボット(市販ROBONOVA-I)を音声で制御する方式を考え、各種イベントでデモに使える「大道芸ロボット」を開発している。同ロボットの赤外線リモコンと同じ波形を発生するUSBインターフェース付赤外線送信器をPICマイコンを使って試作した。
分子三脚単分子膜による超高感度、高選択性金属イオンセンサーの開発

アダマンタン骨格をコアとする三脚形トリチオール(分子三脚)に、金属イオン配位能をもつデアザプリンと電気化学活性なフェロセンを結合した分子の自己組織化単分子膜をAu基板上に作製した。この単分子膜中のフェロセンの酸化還元電位はPb2+, Zn2+, Hg2+の存在下で正電位側にシフトするが、Cu2+, Na+存在下ではシフトしないことが確認された。また、この方法によって極めて低濃度(1.0E-9 M)のPb2+を検出できることが示された。以上、分子三脚の単分子膜を用いて、イオン選択性を有する超高感度イオンセンサーが構築できた。本研究では、アダマンタン骨格をコアにもつ分子三脚がAu基板表面に強固に3点吸着して垂直配向を保ちながら自己組織化単分子膜を形成することに基づき、膜中の三脚分子の上部に金属イオン配位能をもつリガンドと電気化学活性なフェロセンを結合することにより、電気化学挙動に基づくイオンセンサーを開発する。平成27年度はこの目的で研究を進め、以下の成果を得た。1.アダマンタン三脚-デアザプリン-フェロセン連結分子の合成イオンセンサー機能ユニットであるフェロセニルデアザプリンに薗頭カップリングの継ぎ手であるエチニル基を結合した分子を合成した。ここへ以前我々が開発した、アダマンタン骨格の上部にヨードフェニル基をもつ三脚形トリチオアセテートを連結し、水素化アルミニウムリチウムでトリチオールに変換することにより、センサー単分子膜の構成要素となる標記の3成分連結分子を合成した。2.自己組織化単分子膜の形成と膜構造の確認1.で合成したトリチオールのAu(111)基板上への自己組織化単分子膜をを溶液浸漬法により形成した。サイクリックボルタンメトリーで硫黄原子の還元的脱離を観測することにより、高密度単分子膜が形成されたことを確認した。さらに、イオン配位応答特性の基準となる、基板上フェロセンの酸化還元が可逆的に観測できた。ボルタモグラムのピーク形状から、顕著な隣接分子間の相互作用が認められ、分子の密集による静電反発の存在が示唆された。アダマンタン三脚-デアザプリン-フェロセンの3者連結分子の合成と単分子膜の作製を当初の計画通り行い、単分子膜上でのフェロセンの酸化還元を観測することにより、イオンセンサー機能を検討する準備が完了した。イオンセンサー単分子膜のもうひとつの作製法として、あらかじめAu基板上に作製したヨードフェニル基をもつ三脚形トリチオールの単分子膜に、基板上でフェロセニルデアザプリンのカップリングを行うことを計画していたが、これについての検討は現在進行中である。本研究では、アダマンタン骨格をもつ三脚形トリチオールがAu基板表面に強固に吸着して自己組織化単分子膜を形成することに基づき、三脚分子の上部に金属イオン配位能をもつリガンドと電気化学活性なフェロセンを結合した単分子膜を作製することにより、電気化学的挙動に基づくイオンセンサーを開発することを目的とする。平成27年度にセンサー膜の構成分子であるアダマンタン三脚-デアザプリン-フェロセン連結分子を合成し、自己組織単分子膜の作製を行ったため、平成28年度はこの単分子膜のセンサー機能の確認を中心に検討を進めた。1.イオンセンサー機能の検証膜構成分子中のフェロセン部分の酸化還元に由来する可逆波が電解質溶液にPb[2+]塩を添加することにより、正側へ約0.10 Vシフトすることを確認した。微分パルスボルタンメトリーを用いることにより、Pb[2+]の濃度が極めて低い場合(1.0E-9 M)でもシフトを確認することができた。この結果は、得られた単分子膜が高感度のPb[2+]センサーとして働くことを示しており、デアザプリン-フェロセン連結体の溶液中での蛍光変化によるPb[2+]イオンの検出限界(1.3E-8 M)よりも低濃度のPb[2+]を検出可能であることが確認できた。2.基板上でのクロスカップリングによるセンサー単分子膜の作製上部にヨードフェニル基を持つ三脚形トリチオールの単分子膜に対して膜上で薗頭カップリングを行い、フェロセン-デアザプリン結合型分子ユニットを結合した。これにより得られた単分子膜上のフェロセニル基がPb[2+]に対して上記と同様の電気化学的挙動を示すことを確認した。このように、カップリング反応と膜作製の順序を入れ替えても同様のセンサー機能を持つ単分子膜を作製可能であることが示された。アダマンタン三脚-デアザプリン-フェロセン連結分子の単分子膜の酸化還元電位が極めて低濃度のPb[2+]イオンの存在下でもシフトすることが確認でき、当初の狙いである高感度が実現できた。ただし、Pb[2+]の濃度変化に対する電位シフトの応答は緩慢であり、数分以上の時間を要することが明らかとなった。これは実用センサーとしては望ましくないため、時間応答性の高い単分子膜の作製を現在検討中である。平成28年度までにアダマンタン三脚-デアザプリン-フェロセン連結分子の自己組織化単分子膜のイオンセンサー機能が確認された。29年度は以下の研究を実施し、研究期間3年の総括を行った。1)応答速度の改善---これまでに得たセンサー単分子膜はPb[2+]に対して高感度でフェロセン酸化還元電位のシフトを示したが、応答は遅く、数十分を必要とした。

これは、単分子中にデアザプリンが密集しているためにPb[2+]の配位が空間的に困難になるためと考えられた。この問題の解決策として、(1)デアザプリンを結合しないアダマンタン三脚を共吸着させてデアザプリンの密度を下げること、(2)上部にヨードフェニル基を持つ三脚形トリチオールの単分子膜に対して膜上で薗頭カップリングによりデアザプリンを低密度で結合すること、を検討した。その結果、(1)では応答速度の改善が見られなかったが、(2)ではPb[2+]の濃度変化の直後に応答を示すことが確認できた。以上の結果、時間応答性を改良したイオンセンサーを得ることができた。2)イオン選択性の検討---当初の目標である高いイオン選択性を確認するために、上記のPb[2+]の他にZn[2+], Hg[2+], Cu[2+]によるフェロセンの酸化還元電位の影響を調べた結果、Zn[2+], Hg[2+]の存在下では電位シフトを観測したがCu[2+]存在下ではシフトは観測されなかった。このことから、本研究のイオンセンサーは単一のイオンにのみ応答するものではないが、応答の有無が金属イオンの種類により明確に変化することが確認された。以上、本研究課題の実施期間に分子三脚単分子膜による高感度、高速応答性、イオン選択性を有するイオンセンサーを得ることに成功した。アダマンタン骨格をコアとする三脚形トリチオール(分子三脚)に、金属イオン配位能をもつデアザプリンと電気化学活性なフェロセンを結合した分子の自己組織化単分子膜をAu基板上に作製した。この単分子膜中のフェロセンの酸化還元電位はPb2+, Zn2+, Hg2+の存在下で正電位側にシフトするが、Cu2+, Na+存在下ではシフトしないことが確認された。また、この方法によって極めて低濃度(1.0E-9 M)のPb2+を検出できることが示された。以上、分子三脚の単分子膜を用いて、イオン選択性を有する超高感度イオンセンサーが構築できた。得られた単分子膜上におけるフェロセンの酸化還元電位が、デアザプリンに対する金属イオンの配位の有無により変化することを確認する。配位金属の選択性が電位のシフトに反映されると予想されるため、特定のイオンを検出するセンサーとしての機能すると期待される。イオン検出の感度を評価し、高感度を得る条件を検討して行く。Pb[2+]イオンへの応答が遅い原因は、単分子膜上でセンサー分子が密集していることにより、デアザプリン部分へイオンが配位する際にデアザプリンの配座が変化する必要があるためと考えられる。これを解決するために、膜上のデアザプリンの密度を低くすることを次の二つの方法により検討する。1)膜上でのカップリングによりセンサー分子の結合を行う際に、反応の進行度を100%以下に調整する。2)アダマンタン三脚-デアザプリン-フェロセン連結型トリチオールとデアザプリン構造を持たないチオールの共吸着により、表面のデアザプリンの密度を下げる。また、デアザプリン以外の各種リガンドを用いたイオンセンサー膜を作製してイオン検出能を調べるとともに、各単分子膜のイオン選択性を明らかにする。物理有機化学三重大学大学院工学研究科有機機能化学研究室ホームページ
遺伝性脳変性疾患の遺伝子病態並びに遺伝子治療に関する研究

グルコセレブロシダーゼ遺伝子異常で発症する47例の日本人ゴーシェ病の遺伝子変異をPCR法とSSCP法で同定したところ約85%の遺伝子変異が同定できたが、神経型と非神経型とを遺伝子型で鑑別することは不可能であった。また、日本人ゴーシェ病35例の臨床症状を検討し欧米人に比較し重症度が高いことを明らかにした。急性神経型ゴーシェ病の酵素補充療法の効果を病理学的に検討するとともに、水頭症、心弁膜症などの特異な臨床症状を呈する神経型ゴーシェ病の遺伝子変異解析をおこなった。アリルスファターゼA欠損によって発症する異染性白質変性症の日本人症例11例の遺伝子変異分布を解析し、G99D変異が日本人に多く認められることを明かにするとともに2つの新しい遺伝子変異を同定した。さらにムコ多糖体異常症のうち中枢神経症状を呈するスライ病(グルクロニダーゼ欠損症)の動物モデルを用いて遺伝子治療の中枢神経症状の治療の可能性を検討した。グルクロニダーゼ遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて経静脈的に導入したところ肝、脾での酵素活性の上昇を認めたが脳においては酵素活性の上昇は認められなかった。そこで、側脳室内への直接導入法を試みたところ脳の酵素活性は正常の30%まで上昇した。酵素は上衣細胞と脈絡叢に主に認められたが、一部は脳の間質にも発現していた。また、スライ病の動物モデルに対してレトロウイルスベクターにグルクロニダーゼを組み込み、ヒト臍帯血より分離、精製した造血幹細胞(CD34陽性細胞)を標的臓器として遺伝子治療を試みた。導入効率はCFU-GMで平均66.8%、LTCIC(long-term culture initiating cell)では20%と50%であった。グルクロニダーゼ活性は5週間正常レベルを維持していた。以上の遺伝子治療に関する基礎的実験データは遺伝性脳変性疾患における遺伝子治療の可能性を示唆するものであった。本年度は遺伝性脳変性疾患のうちゴ-シェ病について検討を加えた。本症を遺伝子治療していくうえでどの程度の蛋白発現量(酵素量)が必要かを同定することは根本的に重要である。そこで酵素補充療法をおこなっている日本人11例について酵素投与量と臨床的効果について検討を加えた。すなわち60U/kgを継続的に投与した長期投与群(3例)、60U/kgを6ヶ月間投与しその後30U/kgを1年間、そして15U/kgを維持療法として投与した中間群(5例)、60U/kgを6ヶ月以内に減量し、維持療法に移行した短期投与群(3例)の臨床効果を比較した。長期投与群に比べ中間投与群、短期投与群においてはヘモグロビン値、血小板増加率、酸性フォスファターゼ値、身長増加率の改善度は統計学的有意差をもって劣っていた。さらに短期投与群3例全例において治療にもかかわらず酵素量の減量に伴って骨合併症を生じていた。また骨髄移植を施行した3例のうち1例では不完全生着のため残存酵素活性は30%程度しか上昇せず、骨髄移植後骨合併症を生じていた。これらの酵素補充療法および骨髄移植療法の治療効果の検討から、ゴ-シェ病の遺伝子治療においてはCD34陽性細胞に導入したグルコセレブロシダーゼ遺伝子の十分な発現が得られなければ臨床的効果は十分に得られないことが考えられた。遺伝性脳変性疾患の遺伝子病態並びに遺伝子治療に関する今年度の研究として日本人リソゾーム病、特にゴーシェ病の遺伝子変異と臨床症状との相関、酵素補充療法の神経症状に対する効果及び異染性白質変性症の遺伝子変異について検討した。またスライ病の遺伝子治療に関する基礎的検討を行った。

日本人ゴーシェ病においては軽微な臨床症状を呈するN370変異が全く存在しないため欧米人に比較し重症度が高いことを明らかにした。急性神経型ゴーシェ病の酵素補充療法の効果を臨床的、病理学的に検討したところ酵素療法は神経症状の改善には効果がなく、治療例でも広範な神経細胞の脱落が認められることを明らかにした。アリルスファターゼA欠損によって発症する異染性白質変性症の日本人症例11例の遺伝子変異分布を解析し、G99D変異が日本人に多く認められることを明かにするとともに2つの新しい遺伝子変異を同定した。スライ病の動物モデルに対してレトロウイルスベクターにグルクロニダーゼを組み込み、ヒト臍帯血より分離、精製した造血幹細胞(CD34性細胞)を標的臓器として遺伝子治療を試みた。導入効率はCFU-GMで平均66.8%、LTCIC(long-term culture initiating cell)では20%と50%であった。グルクロニダーゼ活性は5週間正常レベルを維持していた。以上の遺伝子治療に関する基礎的実験データは遺伝性脳変性疾患における遺伝子治療の可能性を示唆するものであった。
脳内オピオイドペプチドの高選択的高感度HPLCの開発

生体内に極微量存在する多種類のモルヒネ様(オピオイド)ペプチドを一斉に定量できる簡便な分析法を開発する目的で、まず、当研究代表者らが開発したN末端チロシン含有ペプチド類に極めて特異的なヒドロキシルアミンーコバルト(II)ーホウ酸塩試薬を用いる蛍光反応をHPLCのプレカラム蛍光誘導体化反応に適応した。その結果、エンケファリンを含むN末端チロシン含有オリゴペプチドはそれぞれ単一の蛍光体に誘導され、しかもそれらは逆相HPLCによって一斉に分離し得ることが分かった。この蛍光検出HPLCは140ー310fmol(HPLC注入量)の検出限界(S/N=2)を示し、生体中のエンケファリンの定量に十分な感度を有していることが分かった。次に、脳試料の前処理法を検討し、従来の方法よりも簡便かつ迅速に、しかも少量(0.1ー0.5g)の試料を用いてラット脳組織(大脳皮質、線条体、視床下部)中のメチオニンエンケファリン(MEK)およびロイシンエンケファリン(LEK)を一斉に定量できる実用的な蛍光検出HPLCを開発した。しかし、この方法に用いたHPLC用カラム(TSKgel ODS-120T、シリカゲル担体)では、エンケファリン(分子量約500)よりも高分子量のオピオイドペプチドの蛍光体はカラムから容易に溶出しなかった。そこで、比較的高分子量のオピオイドペプチドも分離し得るHPLCの諸条件を検討した結果、合成硬質ポリマーを担体とする逆相カラムを用いることによって、分子量2000までのオピオイドペプチドの蛍光体の溶出および分離が可能となった。このHPLCにより、ラット脳の線条体中のオピオイドペプチドを検出した結果、LEK、MEK、MEK-Arg-PheおよびMEK-Arg-Gly-Leuの一斉定量が可能になった。また、開発した選択的蛍光プレカラムHPLCを利用すれば、生体内のオピオイドペプチドを種々のペプチダーゼの酵素分解によって容易に同定できることも明らかにした。内因性モルヒネ様(オピオイド)ペプチドは,アミノ酸配列のN末端にチロシル残基を有する.本研究において,研究代表者らが既に見い出しているN末端チロシン含有ペプチド類に極めて高選択的な新しい蛍光反応をHPLCのプレカラム蛍光誘導体化反応に適用し,蛍光検出・逆相HPLCによって脳内に存在するロイシンエンケファリン(LEK)及びメチオニンエンケファリン(MEK)の定量を可能にした.開発した分析法は次の操作からなる.1.脳試料の調製:脳組織を0.1MHClでホモジネートする.過塩素酸を加え除蛋白し,得られる上清をNaHCO_3で中和したのち, EDTA・2Naを加え逆相分配型のミニカートリッジに試料を注ぐ,カートリッジは,酸性及びアルカリ性並びに極性の低い物質を溶出除去するために,アルカリ及び酸性の水溶液及びジクロロメタンで洗浄する.エンケファリン類はメタノールで溶出する.2.蛍光誘導体化反応とHPLC:ペプチドの水溶液50μlに0.4Mホウ酸塩緩衝液(pH8.5)25μl, 5mMシュウ酸ヒドロキシルアミンー0.5mM酢酸コバルトの混液25μlを加える. 100°Cで3分間加熱したのち, 20mMβ-メルカプトエタノール25μlを加え,反応液100μ

lをHPLCに付す.生成したエンケファリン蛍光体の分離は, TSKgel ODS-120Tカラムを用い,溶離液に0.1Mホウ酸塩緩衝液(pH8.5)及び10mMテトラーハーブチルアンモニウム塩をそれぞれ45%及び15%含むアセトニトリル混液を選択し,アセトニトリルの2-26%グラジエント溶離によって行う.流速は1ml/minで,蛍光検出は励起波長340nm及び発光波長435nmで行う.上記の方法により,ラット脳内のLEK及びMEKを260-270fmol/HPLC注入量の検出限界(S/N=2)で簡便にかつ迅速に一斉定量することが可能となった.少量(0.10.5g)の脳組織(線条体,大脳皮質,視床下部)中のLEK及びMEKを内標準物質として〔Ala^2, Ala^3〕MEKを用いて定量した場合,他の報告結果とほぼ一致する値が得られた.1.試料の調整:脳組織を0.1M HCLでホモジネートする、HC10_4を加え除蛋白し、得られる上清を逆相分配型のミニカートリッジに注ぐ、カラムに保持されたオピオイドペプチドをメタノール-0.2Mホウ酸塩緩衝液(pH8.5)(8:2,v/v)で溶出し、減圧下溶媒を留去する。2.蛍光誘導体化反応とHPLC:ホウ酸塩緩衝液(pH8.5)を含むペプチド試料60μlに5mMシュウ酸ヒドロキシルアミン-0.5mM酢酸コバルト(II)溶液を加え、100°C3分間加熱する。生成したペプチドの蛍光体を逆相HPLC〔カラム、Asahipak ODP-50(150X6mmi.d.、粒径5μm):溶離液、10mMホウ酸塩緩衝液を含むアセトニトリル;溶離、2-50%(v/v)アセトニトリルのグラジェント勾配;流速、1.0ml/min;検出、励起波長340nmおよび発光波長435nm〕により分離・検出する。14種の標品オピオイドペプチド(分子量500-2000)の蛍光体はシリカゲル担体の逆相カラムより合成硬質ポリマー担体の逆相カラムにより良好に分離・溶出し得ることが分かった。この蛍光検出HPLCにより、ラット脳の線条体中のLEK、MEK、MEK-Arg-PheおよびMEK-Arg-Gly-Leuの一斉定量が可能になった。また、開発した選択的蛍光プレカラムHPLCを利用すれば、生体内のオピオイドペプチドを種々のペプチダーゼの酵素分解によって容易に同定できることも明らかにした。