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ナノインプリントにおけるナノ離型メカニズムに関する研究

ナノインプリントモールドは一般的に離型膜で覆われており、ナノインプリント離型メカニズムを解明するためには離型膜の評価が必要不可欠である。現在、離型特性評価法として主に用いられているのが接触角測定である。しかし、接触角測定ではマクロスケールの離型特性しか評価することが出来ない。そこでナノスケール離型特性評価法である走査型プローブ顕微鏡(SPM)による付着力、摩擦力評価を接触角測定と併せて行う事で、より詳細な離型特性評価をナノインプリント離型膜に対して行った。ナノインプリント離型膜として主に用いられているのがフッ素含有自己組織化膜(F-SAM)である。ただ、デバイスによってはフッ素を含んでいる離型膜は敬遠され、フッ素を含んでいない離型膜が要求される。そこで着目したのがブロックコポリマーリソグラフィーに用いられるフッ素を含まないポリジメチルシロキサン(PDMS)薄膜である。PDMS薄膜をマクロスケール離型特性評価法である接触角測定とナノスケール離型特性評価法であるSPMによる付着力、摩擦力測定を行い、F-SAMとの比較評価を行った。F-SAMはOPTOOL HD-1100TH(ダイキン工業(株))を用いて成膜した。まず各離型膜に対する水滴接触角を測定した。その結果、F-SAMは115°、PDMS薄膜は106°であった。F-SAMに比べるとPDMS薄膜の方が約10°低く、マクロスケール離型特性はF-SAMの方が優れていると言える。次にSPMによる付着力と摩擦力測定をF-SAM、PDMS薄膜に対して行った。測定の結果、PDMS薄膜の付着力はわずかにF-SAMの付着力より高いことが確認された。一方摩擦力測定では、F-SAMでは摩擦力が検出されたのに対し、PDMS薄膜ではほとんど検出できず摩擦力がほとんどない、という非常に興味深い結果が得られた。摩擦力はナノインプリント離型時に関係する重要な要素であり、ナノスケール離型特性はPDMS薄膜の方が優れていると言える。上記実験結果から、マクロスケール離型特性評価だけでは十分な離型特性評価を行ったとは言えず、ナノスケール離型特性評価も合わせて評価することが非常に重要であることを実証した。局所領域における特性を調べるために有用な手法である走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いて、離型膜と光ナノインプリントレジストとの相互作用評価を行った。今回は化学構造が既知である離型剤FAS-3[CF_3-CF_2-C_2H_4-Si(OCH_3)_3]、FAS-13[CF_3-(CF_2)_5C_2H_4-Si(OCH_3)_3]、FAS-17[CF_3-(CF_2)_7C_2H_4-Si(OCH_3)_3]を用いてSiカンチレバー表面に離型膜を成膜し測定を行った。レジストには一般的な光ナノインプリントレジストであるPAK-01-200(東洋合成工業(株))を用いた。これまでの測定では硬化したレジストと離型膜との間で測定を行ってきた。しかし、離型メカニズムを解明するためにはレジスト硬化過程での相互作用も調べる必要がある。そこで今回はその場UV照射可能なSPMを用いて実験を行った。評価方法としてフォースカーブ測定を用いた。カンチレバーのたわみ量をプロットすることでフォースカーブが得られ、吸着力が測定できる。PAK-01-200はラジカル系重合レジストであるため酸素により重合が阻害される。測定手順を下記に示す。(1)まずUV照射前のレジストのフォースカーブ測定を行う。(2)次に15Paまで真空引きしUV照射を行う。UV波長と照度は365nm、8mWcm^2である。(3)大気解放後、再度フォースカープ測定を行う。(2)と(3)を繰り返すことでフォースカーブ形状の変遷を調べた。離型処理無しSiカンチレバーを用いた測定結果から真空中で0.1秒間UV照射を行うことにより、レジストは硬化していることが確認された。また、FAS-13とFAS-17で離型処理したカンチレバーの場合はSiカンチレバーの場合に比べ、吸着力が減少することが確認された。一方で、FAS-3の場合、UV照射前レジストではフォースカーブを得ることが出来ず、UV照射後測定を行うとSiカンチレバーの場合に比べ、吸着力は増大していることが確認された。この結果からFAS-3とPAK-01-200の間では吸着力が減少するどころか強い吸着力が発生し、局所領域測定における観点からナノインプリントにおいてFAS-3を離型膜として利用することは不適切であることが明らかとなった。ナノインプリントにおけるナノ離型メカニズムを解明するためには、レジストの特性評価を行う必要がある。UV硬化レジストは主にラジカル重合系樹脂とカチオン重合系樹脂に分類される。ラジカル重合系樹脂の特徴は、硬化速度が速いが酸素存在下では硬化速度が遅くなることが挙げられる。一方、カチオン重合系樹脂は、酸素阻害はないが硬化速度が遅いという特徴がある。今回、その場UV照射可能な走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いて局所領域におけるラジカル重合系樹脂とカチオン重合系樹脂に対する酸素阻害の影響を調べた。本実験ではラジカル重合系レジストとしてC-TGC-02(東洋合成工業(株))を、カチオン重合系レジストとしてNICT103(ダイセル化学工業(株))を使用した。

測定手順を下記に記す。(1)まず、UV照射前のレジストのフォースカーブ測定を行う。(2)そして、大気中、もしくは15Paまで真空引きしUV照射を行う。UV波長と照度は365nm、39mW/cm^2である。(3)大気解放後、再度フォースカーブ測定を行う。(2)と(3)を繰り返すことでフォースカーブ形状の変遷を調べた。大気下UV照射では酸素が存在し、真空下UV照射ではほとんど酸素が存在しないため、これらを比較することで樹脂に対する酸素の影響を調べることができる。C-TGC-02の場合、大気中では80秒間のUV照射によって硬化した。一方、真空中ではわずか0.1秒間のUV照射によって硬化することが確認された。これらの結果から酸素阻害によって硬化速度に約800倍の差が現れることを実証した。次に酸素阻害が無いNICT103(カチオン重合系樹脂)について同様の測定を行った。測定の結果、大気中では9秒間のUV照射によりNICT103は硬化した。一方、真空中では2秒間のUV照射で硬化した。カチオン重合系樹脂には酸素阻害はないにもかかわらず、硬化速度が4.5倍ほど速くなった。アルカリの存在によってカチオン重合系樹脂の硬化反応が影響を受けると報告されているが、現在詳細を調べている。ナノインプリントモールドは一般的に離型膜で覆われており、ナノインプリント離型メカニズムを解明するためには離型膜の評価が必要不可欠である。現在、離型特性評価法として主に用いられているのが接触角測定である。しかし、接触角測定ではマクロスケールの離型特性しか評価することが出来ない。そこでナノスケール離型特性評価法である走査型プローブ顕微鏡(SPM)による付着力、摩擦力評価を接触角測定と併せて行う事で、より詳細な離型特性評価をナノインプリント離型膜に対して行った。ナノインプリント離型膜として主に用いられているのがフッ素含有自己組織化膜(F-SAM)である。ただ、デバイスによってはフッ素を含んでいる離型膜は敬遠され、フッ素を含んでいない離型膜が要求される。そこで着目したのがブロックコポリマーリソグラフィーに用いられるフッ素を含まないポリジメチルシロキサン(PDMS)薄膜である。PDMS薄膜をマクロスケール離型特性評価法である接触角測定とナノスケール離型特性評価法であるSPMによる付着力、摩擦力測定を行い、F-SAMとの比較評価を行った。F-SAMはOPTOOL HD-1100TH(ダイキン工業(株))を用いて成膜した。まず各離型膜に対する水滴接触角を測定した。その結果、F-SAMは115°、PDMS薄膜は106°であった。F-SAMに比べるとPDMS薄膜の方が約10°低く、マクロスケール離型特性はF-SAMの方が優れていると言える。次にSPMによる付着力と摩擦力測定をF-SAM、PDMS薄膜に対して行った。測定の結果、PDMS薄膜の付着力はわずかにF-SAMの付着力より高いことが確認された。一方摩擦力測定では、F-SAMでは摩擦力が検出されたのに対し、PDMS薄膜ではほとんど検出できず摩擦力がほとんどない、という非常に興味深い結果が得られた。摩擦力はナノインプリント離型時に関係する重要な要素であり、ナノスケール離型特性はPDMS
マイクロバブルの急蒸発とその射出・崩壊挙動に関する研究

本研究の目的は,液滴の加熱面衝突時において遷移沸騰域で認められる多数の微小な液滴が大気圧雰囲気中へ激しく飛散する微細化現象を明らかにすることにある.特に液滴と加熱面間に生成された薄い蒸気膜が崩壊して固液接触を起こし,そこで発生する微小気泡(マイクロバブル)の発生挙動をとらえ,微細化の機構と関連づけようとするものである.これまでに使用した石英加熱面では核沸騰的な挙動が高温域まで続き,激しい微細滴の飛散現象が顕著に認められなかったため,サファイア円板,ガラス面に薄く導電性皮膜を施したITO(Indium Tin Oxide:酸化インジウムスズ)皮膜面及び石英面に薄くクロム皮膜を施した面を加熱面として使用し,それぞれの面上での沸騰挙動を各裏面から高速度カメラでとらえ,石英面と比較した.1.ITO皮膜面及びクロム皮膜面での核沸騰域(加熱面と液膜とが十分に濡れた状態下の沸騰)の蒸発寿命特性は石英面でのデータと類似している.これに対して熱物性値が石英の4.9倍に相当するサファイア面では加熱面温度範囲は低温側に移行し,金属面での寿命特性に接近している.2.ITO皮膜面上での沸騰挙動に関して,核沸騰域では,液膜内に微小な蒸気泡の発生とみなされる白い斑点が多数観察された.これらの白い点は液膜の中央部から放射状に周辺部へ速い速度で移動しているのが判明した.3.サファイア面上での沸騰挙動に関しは,加熱面温度が320°C以下では,激しい核沸騰的な比較的大きい蒸気泡の発生が認められたが,370°C以上では薄い蒸気膜が生成されその上に液滴が存在すると言った状況が確認でき,液膜の表面から放射状に微小な液粒子の速い飛散が認められた.4.クロム皮膜面では450°Cを越えると,分裂した液滴の一部が加熱面と薄い蒸気膜を介して接触を保つようになり,その蒸気膜の崩壊時に爆発的な微小液粒子の飛散が生ずることが確認できた.これを誘起するものはマイクロバブルであり,これは薄い蒸気膜崩壊に伴う固液接触時に生ずることが判明した.本研究の目的は,液滴の加熱面衝突時において遷移沸騰域で認められる多数の微小な液滴が大気圧雰囲気中へ激しく飛散する微細化現象を明らかにすることにある.特に液滴と加熱面間に生成された薄い蒸気膜が崩壊して固液接触を起こし,そこで発生する微小気泡(マイクロバブル)の発生挙動をとらえ,微細化の機構と関連づけようとするものである.これまでに使用した石英加熱面では核沸騰的な挙動が高温域まで続き,激しい微細滴の飛散現象が顕著に認められなかったため,サファイア円板,ガラス面に薄く導電性皮膜を施したITO(Indium Tin Oxide:酸化インジウムスズ)皮膜面及び石英面に薄くクロム皮膜を施した面を加熱面として使用し,それぞれの面上での沸騰挙動を各裏面から高速度カメラでとらえ,石英面と比較した.1.ITO皮膜面及びクロム皮膜面での核沸騰域(加熱面と液膜とが十分に濡れた状態下の沸騰)の蒸発寿命特性は石英面でのデータと類似している.これに対して熱物性値が石英の4.9倍に相当するサファイア面では加熱面温度範囲は低温側に移行し,金属面での寿命特性に接近している.2.ITO皮膜面上での沸騰挙動に関して,核沸騰域では,液膜内に微小な蒸気泡の発生とみなされる白い斑点が多数観察された.これらの白い点は液膜の中央部から放射状に周辺部へ速い速度で移動しているのが判明した.3.サファイア面上での沸騰挙動に関しは,加熱面温度が320°C以下では,激しい核沸騰的な比較的大きい蒸気泡の発生が認められたが,370°C以上では薄い蒸気膜が生成されその上に液滴が存在すると言った状況が確認でき,液膜の表面から放射状に微小な液粒子の速い飛散が認められた.4.クロム皮膜面では450°Cを越えると,分裂した液滴の一部が加熱面と薄い蒸気膜を介して接触を保つようになり,その蒸気膜の崩壊時に爆発的な微小液粒子の飛散が生ずることが確認できた.これを誘起するものはマイクロバブルであり,これは薄い蒸気膜崩壊に伴う固液接触時に生ずることが判明した.本研究の目的は,衝突液滴沸騰系において,初期個液接触内(濡れ面内)で発生する微小気泡の発生挙動と接触面の形成から薄蒸気膜の形成に至り,次にこの蒸気膜を介しての固液接触時(蒸気膜が崩壊されて起こる固液接触時)に発生するマイクロバブルの発生挙動との違いを捕らえることにある.そこで本年度は加熱された石英レンズ面(初期熱面温度180°C520°C)上に3.5mmの水滴を落下させ,そこでの固液接触沸騰挙動を石英レンズの背面からポログラフィ干渉法用いて高速度ビデオカメラで撮影した.その情報に基づいて,微小蒸気法の発生数に及ぼす石英加熱面の温度と液滴衝突後の経過時間の影響について定量した.また現像撮影では,固液接触面内での微小蒸気法の合体挙動と乾燥部の発達模様を鮮明にとらえた.

なおこの加熱実験にさきがけて,非加熱状態下での液・液接触(シリコン油液面への水滴の衝突)での水滴の表面流動模様の可視化をおこなった.以上の実験より得られた結果を要約すると,1.シリコン油液面への水滴衝突の場合,大きな空洞を持つ半球状の水膜が自由界面下に形成され,その水膜は半球状の先端に集結し,水滴上へと発達する.2.加熱石英レンズ面上に衝突する水滴の場合,加熱面温度の増加につれて発泡点(気泡の付着部である乾燥斑点として認識できる)の数を増し,発泡点は液摘衝突初期に多く現われる.衝突初期の斑点の大きさは小さいが,数の減少とともに斑点の大きさは増す.また加熱面温度の増加とともに斑点の大きさも増す.3.石英加熱面温度の上昇につれ,乾燥部の発達模様として,蒸気泡同士が合体したと見られる比較的広い乾燥部が出現する.液膜の周辺部から乾燥部は発達し易く,その結果,液相部は中央部に小さな円形状に存在する.そしてこの円形部の中心に乾燥斑点が現われ,それが広がり,液相部が消滅する.本研究の目的は,液滴の加熱面衝突時において遷移沸騰域で認められる多数の微小な液滴が大気圧雰囲気中へ激しく飛散する微細化現象を明らかにすることにある.特に液滴と加熱面間に生成された薄い蒸気膜が崩壊して固液接触を起こし,そこで発生する微小気泡(マイクロバブル)の発生挙動をとらえ,微細化の機構と関連づけようとするものである.これまでに使用した石英加熱面では核沸騰的な挙動が高温域まで続き,激しい微細滴の飛散現象が顕著に認められなかったため,サファイア円板,ガラス面に薄く導電性皮膜を施したITO(Indium Tin Oxide:酸化インジウムスズ)皮膜面及び石英面に薄くクロム皮膜を施した面を加熱面として使用し,それぞれの面上での沸騰挙動を各裏面から高速度カメラでとらえ,石英面と比較した.1.ITO皮膜面及びクロム皮膜面での核沸騰域(加熱面と液膜とが十分に濡れた状態下の沸騰)の蒸発寿命特性は石英面でのデータと類似している.これに対して熱物性値が石英の4.9倍に相当するサファイア面では加熱面温度範囲は低温側に移行し,金属面での寿命特性に接近している.2.ITO皮膜面上での沸騰挙動に関して,核沸騰域では,液膜内に微小な蒸気泡の発生とみなされる白い斑点が多数観察された.これらの白い点は液膜の中央部から放射状に周辺部へ速い速度で移動しているのが判明した.3.サファイア面上での沸騰挙動に関しは,加熱面温度が320°C以下では,激しい核沸騰的な比較的大きい蒸気泡の発生が認められたが,370°C以上では薄い蒸気膜が生成されその上に液滴が存在すると言った状況が確認でき,液膜の表面から放射状に微小な液粒子の速い飛散が認められた.4.クロム皮膜面では450°Cを越えると,分裂した液滴の一部が加熱面と薄い蒸気膜を介して接触を保つようになり,その蒸気膜の崩壊時に爆発的な微小液粒子の飛散が生ずることが確認でき,この要因である薄い蒸気膜崩壊に伴う固液接触時に生ずるマイクロバブルの正体がつかめた.
廃用性筋萎縮抑制効果の長軸部位別検証による臨床視点的プログラムの構築

骨格筋には解剖学的に起始と停止部があり、全体として作用する臨床視点から、本研究では長軸部位による萎縮抑制効果の相違を検証した。廃用性筋萎縮に対するストレッチ介入および温熱刺激による効果を検証後、その併用効果を確認した。さらにストレッチ介入による筋線維タイプ別反応および経時的変化を長軸部位別に検証した。廃用性筋萎縮対策には、介入方法、筋線維タイプおよび長軸部位を考慮する重要性が示唆された。骨格筋には解剖学的に起始と停止部があり、全体として作用する臨床視点から、本研究では機能的作用を鑑み、長軸部位(近位・中央部・遠位部)による萎縮抑制効果の相違を検証することが主目的である。平成25年度(2年目)は、当初計画どおりに、温熱刺激に焦点を当て研究を進めた。まず、臨床応用可能な温熱刺激方法を確立し、次段階として温熱単独介入による萎縮抑制効果を長軸部位別に検証した。対象はWistar系雄ラットとし、以下3群:通常飼育する対照群、後肢懸垂によりヒラメ筋に廃用性筋萎縮を惹起させる後肢懸垂群、後肢懸垂に加え1日1回60分の温熱を負荷する後肢懸垂+温熱負荷群とした。温熱負荷方法として麻酔下で、両側下腿部に市販用カイロを使用した。予備実験として筋内温度変化を計測し、60分間以上筋表在温を約41°Cに保つように温度調節した。右側ヒラメ筋は線維横断面積を計測した。左側ヒラメ筋は筋血流量分析に使用した。筋血流量は、ヒラメ筋摘出の30分前にThallium-201 (201 Tl)を腹腔内投与しヒラメ筋摘出後、Autowell Gamma Counter用の試料とした。試料凍結後、25%部位、50%部位、75%部位で切断し、50μm厚に薄切後、Autoradiographyの試料とし、201Tl取り込みの分布をBAS-5000IP readerを用いて画像化・分析した。筋線維断面積は部位と群の交互作用を認めた。同部位間比較では、すべての部位で対照群>温熱負荷群>後肢懸垂群の順に高値を示し有意差を認めた。後肢懸垂群を基準とした温熱負荷群の部位ごとの変化率は、近位部123%、中央部122%、遠位部119%と近位ほど高値であった。温熱負荷による血流量増加部位と萎縮抑制効果は一致せず、萎縮抑制効果の相違は筋血流量以外の要因関与が推察された。骨格筋には解剖学的に起始と停止部があり、全体として作用する臨床視点から、本研究では機能的作用を鑑み、骨格筋全体として効果的に機能を発揮できることが重要と考え、長軸部位(近位・中央・遠位部)による萎縮抑制効果の相違を検証する。平成24年度は廃用性筋萎縮に対するストレッチ介入による萎縮抑制効果を長軸部位別に検証した。対象はWistar系雄ラットとし、以下3群:通常飼育する対照群、後肢懸垂によりヒラメ筋に廃用性筋萎縮を惹起させる後肢懸垂群、後肢懸垂に加え、1日1回20分の間歇的ストレッチを負荷する後肢懸垂+ストレッチ群とした。実験期間は2週間とした。右側ヒラメ筋の起始部より25%を近位、50%を中央、75%を遠位部として凍結切片を作成した。HE染色を実施し、筋線維横断面積の計測を行った。さらに、Alkaline phosphatase染色にて再生線維と血管(密度)分析を実施した。筋血流量は、筋摘出の30分前にThallium-201 (201 Tl)を腹腔内投与し、Autowell Gamma Counter用の試料とした。試料を凍結後25%、50%、75%部位で切断、Autoradiographyの試料とし、201 Tl取り込みの分布をBAS-5000IP readerを用いて画像化した。断面積の群別比較では、懸垂群・ストレッチ群で部位間に有意差を認め、遠位部>中央部>近位部の順であった。断面積の部位別の比較では、全部位において対照群>ストレッチ群>懸垂群で、ストレッチ介入による萎縮抑制効果を認めた。断面積や血管数の結果から、近位部が後肢懸垂やストレッチの影響を受けやすいこと、血流動態の結果から、介入による部位間の血流動態が変化する可能性があること、さらに血管数・断面積と血流動態の関連は小さいことが示唆された。骨格筋には解剖学的に起始と停止部があり、全体として作用する臨床視点から、本研究では機能的作用を鑑み、骨格筋全体として効果的に機能を発揮できることが重要と考え、長軸部位(近位・中央部・遠位部)による萎縮抑制効果の相違を検証することが主目的である。初年度は廃用性筋萎縮に対するストレッチ介入による萎縮抑制効果を長軸部位別に検証した。次年度は温熱刺激に焦点を当て研究を進め、臨床応用可能な温熱刺激方法を確立し、次段階として温熱単独介入による萎縮抑制効果を長軸部位別に検証した。平成26年度は「ストレッチ介入」と「温熱刺激」の萎縮抑制効果知見を基に、臨床的効率を考慮した併用効果に焦点を当て研究を進めた。

ラットを対象とし、対照群、一週間の後肢懸垂を行う群、後肢懸垂とともに温熱負荷を与える群、後肢懸垂とともに筋伸張を行う群、後肢懸垂とともに温熱負荷と筋伸張を同時に行う群を作成した。温熱負荷は、前年度確立した市販カイロ法にて60分間、下腿深部温約38°Cで毎日一回実施した。筋ストレッチは、初年度作成した伸張装置を用い体重の1/3の負荷量で足関節を背屈方向へ持続的に60分間毎日一回実施した。実験期間終了後、右ヒラメ筋を摘出し、筋の起始部より25・50・75%部位の筋線維横断面積(CSA)、酸化系酵素(SHD)活性、毛細血管数を計測した。結果、後肢懸垂により近位部優位なCSAの低下と遠位部優位なSDH活性の低下を認めた。毛細血管数は遠位部と中間部にて後肢懸垂により減少した。各介入により遠位部に対する近位部のCSAの増加と近位部に対する遠位部のSDH活性、毛細血管数の増加を認め、その効果は併用群が最も大きかった。以上より、不活動や温熱負荷・ストレッチによるCSAやSDH活性、毛細血管数への影響は筋長軸方向で異なること、さらに温熱負荷と筋ストレッチの併用による筋長軸方向部位差の軽減効果を明らかにした。骨格筋には解剖学的に起始と停止部があり、全体として作用する臨床視点から、本研究では機能的作用を鑑み、骨格筋全体として効果的に機能を発揮できることが重要と考え、長軸部位(近位・中央部・遠位部)による萎縮抑制効果の相違を検証することが主目的である。初年度は、廃用性筋萎縮に対するストレッチ介入による萎縮抑制効果を長軸部位別に検証した。次年度は、温熱刺激による萎縮抑制効果を長軸部位別に検証した。平成26年度は、ストレッチ介入と温熱刺激の「併用効果」を検証し、筋線維横断面積、酸化系酵素活性および毛細血管数への影響は筋長軸方向で異なること、さらに併用による筋長軸方向部位差の軽減効果を明らかにした。平成27年度は3年間の研究結果を踏まえ、ストレッチ介入による筋線維タイプ別反応の相違および経時的変化を長軸部位別に検証した。8週齢のラットヒラメ筋を対象とした。対照群、後肢懸垂処置にて廃用性筋萎縮を作製する群および後肢懸垂期間中に1日5分間の間歇的ストレッチを毎日実施する群とし、各群を実験期間3・7・10・14日時点に分けた。全群の筋腹中央部、さらに、各群7日および14日群では近位部(筋長の25%部位)および遠位部(筋長の75%部位)の凍結横断切片を作製した。HE染色およびATPase染色を実施し顕微鏡画像をもとに筋線維断面積を分析した結果、廃用性筋萎縮の影響は、タイプI・II線維の長軸部位別に相違を認めた。また筋萎縮抑制効果は、ヒラメ筋で優位なタイプI線維の遠位部で顕著であった。以上より、廃用性筋萎縮対策としての「臨床的視点的プログラム」構築には、介入方法を工夫し、筋線維タイプおよび長軸部位を考慮する重要性が示唆された。骨格筋には解剖学的に起始と停止部があり、全体として作用する臨床視点から、本研究では長軸部位による萎縮抑制効果の相違を検証した。廃用性筋萎縮に対するストレッチ介入および温熱刺激による効果を検証後、その併用効果を確認した。さらにストレッチ介入による筋線維タイプ別反応および経時的変化を長軸部位別に検証した。廃用性筋萎縮対策には、介入方法、筋線維タイプおよび長軸部位を考慮する重要性が示唆された。平成24年度(初年度)は、研究実施計画に従い、廃用性筋萎縮に対するストレッチ介入による萎縮抑制効果を長軸部位別に検証した。筆者らは、臨床で多用されており、比較的容易で再現性のある体重量をもとにストレッチ負荷量を規定できる伸張装置を開発した。具体的には、ラットの股関節、膝関節を90°に固定し足関節のみを背屈することにより、ヒラメ筋を選択的に伸張できた。
超高速ネットワークを用いた遠隔共同研究支援環境の構築及びその効率利用

本研究では、研究開発用ギガビットネットワーク(JGN)を利用して、各研究機関に設置されている複数のサーバを用いたマルチメディア分散処理を可能とする通信方式の確立に向けて実験的に検証を行う。更に超高速ネットワークを介した遠隔共同研究支援環境の構築に向けたアプリケーションの開発及び通信品質に関する評価実験を行って問題点を明確化し、その効率利用を行うための新しい技術について検討を行った。平成14年度は、以上の内容について研究を進め、以下の成果が得られている。(1)ギガビットネットワーク上での次世代仮想研究室環境の構築実世界では異なる組織に所属し、地理的にも離れた研究機関間において、超高速ネットワークを介した仮想研究室環境を構築し、新しい型の次世代コミュニケーション支援環境の実現に向けた研究を行った。本研究では、各研究機関において超高速ネットワーク網に接続し、ストリーミングアプリケーションを用いて各研究機関の映像を24時間配信し、またネットワークを介したミーティング環境を構築し、インフォーマルなコミュニケーションの可能性について、様々な観点から検討を行った。さらに、コミュニケーション支援システムを独自に開発し、本システム上で運用し、性能評価や機能拡張を行う上での必要なネットワーク計測情報の収集を行った。(2)遠隔地間における大規模データのリモート可視化の効率化に関する検討遠隔地間で行う大規模数値データのリモート可視化について、計算サーバから数値計算データを効率的に可視化クライアントへ転送し、クライアント側で可視化処理を行い、さらにパラメータ変更等による数値計算の再処理、計算中止なども自由に行えるリモート可視化システムを構築し、その効率化について検討した。本研究では、通信・放送機構により提供されている研究開発用ギガビットネットワーク(JGN)を利用して、各研究機関に設置されている複数の大規模サーバを用いたマルチメディア分散処理を可能とする通信方式の確立に向けて実験的に検証を行う。更に超高速ネットワークを介した遠隔共同研究支援環境における各ネットワークレベル接続の流量やエンドユーザにおける伝送遅延や損失等の通信品質に関する評価実験を行って問題点を明確化し、その効率利用を行うための新しい技術の確立を目指す。平成13年度では、以下の研究計画に従って研究を進め、所望の成果が得られている。1.各サイトにおける端末の構内LAN環境への接続及び調整本実験に使用する遠隔研究支援システム端末を各サイトにおいて設置し、各種サーバ等が接続されている構内LAN(ATM回線)への接続、及び機器間において調整を行った。2.各サイトとJGNとの接続及び設定JGN(研究開発ギガビットネットワーク)にネットワーク利用申請を行った後に、学内に設置されているJGNのアクセスポイントにシステム端末を構内LANを経由して接続し、実際に通信できるように機器の調整設定を行い通信環境を確立した。次に両端の端末間でJGN経由の通信を設定し、構内LANにおいて基本的な通信品質等の確認等を各研究機関との協力を得て実施し、実験環境を構築した。3.遠隔研究支援システムを用いた通信品質に関する基礎実験JGNを経由した接続された各サイトにおける端末より、マルチメディア情報のアクセスとスーパーコンピュータの分散可視化処理の基本動作を確認し、また各レベルのネットワーク接続の流量や品質評価に関する実験を継続的に行った.本研究では、研究開発用ギガビットネットワーク(JGN)を利用して、各研究機関に設置されている複数のサーバを用いたマルチメディア分散処理を可能とする通信方式の確立に向けて実験的に検証を行う。
放散虫類は古生代・中生代境界で絶滅したか-三畳紀最前期放散虫化石の古生物学的研究

古生代末のペルム紀-三畳紀境界(P-T境界)には,地球の生命史上で最大の大量絶滅事件が起こったことが知られている.当時の主要なプランクトンである放散虫類も,P-T境界付近で古生代型の放散虫が絶滅してしまうことから,当時の海洋環境の激変が考えられている.しかし,三畳紀最前期の放散虫に関する報告が従来ほとんどなかったため,P-T境界における放散虫群集の変遷は不明であった.本研究ではこの時代のチャート層が世界で唯一見出されているニュージーランド北島のアローロックスにおいて,三畳紀最前期の放散虫群集の古生物学的研究を行い,P-T境界における変遷史を考察した.三畳紀最前期のInduanについては約10層準から比較的保存良好な放散虫化石が産出し,約40種以上を識別した.そのうち約20種を記載・報告し(Takemura and Aono,2007;Takemura et al.,2007a),他の10数種についても記載論文を投稿準備中である.結果として,これら三畳紀最前期の放散虫化石は,古生代後期に見られるEntactinaria, Latentifistularia, Albaillellariaを含み,中生代型のNassellariaなどは含まない.Nassellariaを含むのはInduan後期になってからであり,古生代型のものと混在する(Kamata et al.,2007).すなわち放散虫化石はP-T境界で多くが絶滅せず,三畳紀最前期のInduanにかけて,漸移的に変化していることが判明した.本研究ではこの他,共同研究者とともにアローロックスに露出するオルアテマヌ層の総合的な層序研究を行い,ニュージーランド核地質研究所のモノグラフとして出版した(Sporli et al.,2007).それによるとオルアテマヌ層はペルム紀から三畳紀のチャート,珪質泥岩層からなり,三畳紀最前期に2回の海洋無酸素事件が識別された.これらの海洋での長期の環境変動が,放散虫群集の変遷と密接に関連していると考えられる.昨年から本年度の調査で,Induan上部の放散虫群集がさらに得られた.この群集の解析によって,今後三畳紀最前期における放散虫群集の変遷がより詳細に解明できると考えられる.古生代末のペルム紀-三畳紀境界(P-T境界)には,地球の生命史上で最大の大量絶滅事件が起こったことが知られている.当時の主要なプランクトンである放散虫類も,P-T境界付近で古生代型の放散虫が絶滅してしまうことから,当時の海洋環境の激変が考えられている.しかし,三畳紀最前期の放散虫に関する報告が従来ほとんどなかったため,P-T境界における放散虫群集の変遷は不明であった.本研究ではこの時代のチャート層が世界で唯一見出されているニュージーランド北島のアローロックスにおいて,三畳紀最前期の放散虫群集の古生物学的研究を行い,P-T境界における変遷史を考察した.三畳紀最前期のInduanについては約10層準から比較的保存良好な放散虫化石が産出し,約40種以上を識別した.そのうち約20種を記載・報告し(Takemura and Aono,2007;Takemura et al.,2007a),他の10数種についても記載論文を投稿準備中である.結果として,これら三畳紀最前期の放散虫化石は,古生代後期に見られるEntactinaria, Latentifistularia, Albaillellariaを含み,中生代型のNassellariaなどは含まない.Nassellariaを含むのはInduan後期になってからであり,古生代型のものと混在する(Kamata et al.,2007).すなわち放散虫化石はP-T境界で多くが絶滅せず,三畳紀最前期のInduanにかけて,漸移的に変化していることが判明した.本研究ではこの他,共同研究者とともにアローロックスに露出するオルアテマヌ層の総合的な層序研究を行い,ニュージーランド核地質研究所のモノグラフとして出版した(Sporli et al.,2007).それによるとオルアテマヌ層はペルム紀から三畳紀のチャート,珪質泥岩層からなり,三畳紀最前期に2回の海洋無酸素事件が識別された.これらの海洋での長期の環境変動が,放散虫群集の変遷と密接に関連していると考えられる.昨年から本年度の調査で,Induan上部の放散虫群集がさらに得られた.この群集の解析によって,今後三畳紀最前期における放散虫群集の変遷がより詳細に解明できると考えられる.ニュージーランド北島北部の小島アローロックスには,三畳紀最前期のGriesbachianからDienerianの層状チャートがいくつかのセクションに露出している.このうち,今年度は昨年度までに採取したARFおよびARHセクションの試料を用い,放散虫化石の抽出と電子顕微鏡による写真撮影を行なった.ARFセクションでは,Dienerian下部に当たる5.9m層準の試料より最も保存の良い放散虫化石が得られた.この試料からの放散虫化石は,ほとんどがペルム紀のものに類似のEntactiniidae科の球形の放散虫であるが,それ以外に古生代に特徴的なLatentifistulidae科の新属も産出した。これは中央の小球から三本のチューブが伸び,その周囲に三角形の殻が発達するもので,殻の形状より少なくとも二種が含まれている。さらに少数ではあるが,ペルム紀後期のAlbaillella属に含まれる種も産出している。

これらペルム紀型放散虫について現在、電子顕微鏡観察と新種の記載を行なっている.ARHセクションはGriesbachianからDienerian下部に当たり,以前に採取したチャート試料のうち約10試料から保存良好な放散虫化石を得た.これらの放散虫は,大部分がペルム紀後期と共通のEntactiniidae科やLatentifistulidae科であり,属・種レベルでも多くが共通である.また上部のDienerianの試料からはARHセクションに共通のものも見られている.これらの放散虫についても電子顕微鏡観察を行なっており,また産出報告に関する論文を作成中である.昨年11月から12月にはアローロックスの現地調査を行ない,ARHセクションに加えARHやARJセクションの試料採取を行なった.しかし,悪天候とARFセクションが海浜礫に埋まっていたこともあり,全ての層準の試料は採取できなかった.ニュージーランド北島北部のアローロックスには,三畳紀最前期のGriesbachianからDienerianの層状チャートがいくつかのセクションに露出している.このうち今年度は昨年度に引き続いて,ARFおよびARHセクションから得られた放散虫化石の抽出と電子顕微鏡による写真撮影を行い,それらの分類学的検討と記載を行なった.これらの放散虫化石は少なくとも30種以上が識別できるが,記載を行ったのは6属11種で,そのうち1属は新属,5種は新種である.これらはAlbaillellaに属するAlbaillella属,EntactiniidaeのEntactinosphaera属とHegleria属,Triaenosphaera属,そしてLatentifistulideaのCauletella属と新属としたOruatemanua属である.これらのグループはすべてペルム紀型の放散虫であり,ペルム紀のものと同種のものも含まれる.従ってペルム紀の放散虫がすべてP/T境界で絶滅したわけではないことは確実である.これらの成果は現在編集中のアローロックス研究論文集に投稿中であり,研究代表者はこの論文集の編集にもたずさわっている.さらにアローロックスからのペルム紀,三畳紀の放散虫化石の概要についても,それぞれこの論文集に投稿中である.この論文集は来年度中にニュージーランド地質核科学研究所のモノグラフとして出版予定である.また,その他の放散虫化石についても現在,分類および生層序学的検討を進めている.これらの成果は平成18年3月にニュージーランドで開催される国際放散虫研究集会と,そのアローロックスでの巡検で発表・報告する予定である.集会後にはアローロックスを訪れ,昨年度果たせなかったARJとARFセクションの調査をする予定である.古生代末のペルム紀-三畳紀境界(P-T境界)には,地球の生命史上で最大の大量絶滅事件が起こったことが知られている.当時の主要なプランクトンである放散虫類も,P-T境界付近で古生代型の放散虫が絶滅してしまうことから,当時の海洋環境の激変が考えられている.しかし,三畳紀最前期の放散虫に関する報告が従来ほとんどなかったため,P-T境界における放散虫群集の変遷は不明であった.本研究ではこの時代のチャート層が世界で唯一見出されているニュージーランド北島のアローロックスにおいて,三畳紀最前期の放散虫群集の古生物学的研究を行い,P-T境界における変遷史を考察した.三畳紀最前期のInduanについては約10層準から比較的保存良好な放散虫化石が産出し,約40種以上を識別した.
非平衡結晶のエピタキシャル成長とその励起子スペクトルの研究

1.真空蒸着薄膜作成装置の改良(平成10年6月-8月期):平成9年度に構築した真空蒸着薄膜作成装置を更に改良した。主な改良点は、排気系の能力を上げて高真空を実現し、より清浄な結晶面を得ることが出来るようにした事である。2.試料の作成(平成10年8月-平成10年12月期):NaCl型のRbB単結晶を(100)面に真空中で劈開しそれを基板にして、CsCl型構造をもつCsl薄膜結晶を育成に成功した。また、NaCl型のRbl単結晶基板上に、NaCl型構造をもつCsl薄膜結晶を育成にも成功した。育成された薄膜結晶の膜厚は、水晶振動子を用いて測定し、ほぼ5nm程度であることが確かめられた。出来上がった薄膜結晶の品位が、真空度、基板の清浄度等の実験的条件に強く左右されることがわかった。3. Nd:YAGレーザを用いた発光測定の実験(平成10年10月-平成11年3月期):HOYAコンテニュアムから購入したQスイッチNd:YAGレーザの発振特性を調べ、それが安定に作動することを確認した。また、それを用いて幾つかの半導体及びイオン結晶を励起し、結晶からの発光を観測するとともに、既存のオシロスコープを用いて発光寿命の測定を行った。4.フッ化鉛の励起子スペクトルの測定(平成10年4月-平成10年10月期):立方晶と斜方晶の二つの異なる結晶構造をもつフッ化鉛(PbF_2)の励起子反射スペクトル及び発光スペクトルを詳しく調べた。その結果、励起子の緩和形態が結晶構造の違いに強く依存することがわかった。得られた成果を論文にまとめ、J.Phys:Condens.Mattter誌に投稿し、平成11年1月末にそれを掲載可するとの連絡を受けた。次の項目を実施した。1.真空蒸着薄膜作成装置の構築(平成9年6月-10月期):既存の真空槽を改良して、新たに真空蒸着薄膜作成装置を構築した。2.試料の作成(平成9年10月-平成10年2月期):NaCI型のアルカリハライド単結晶基板上に、NaCI型構造をもつセシウムハライド薄膜のエピタキシャル成長を試みた。今後この点の改善と改良が課題になると思われる。3.Nd:YAGレーザの整備(平成9年11月-平成10年3月期):HOYAコンテニュアムからQスイッチNd:YAGレーザーを購入し、その発振特性を調べた。また、それを用いて幾つかの半導体及びイオン結晶を励起し、結晶からの発光を既存の分光器で観測した。4.フッ化鉛の励起子スペクトルの測定(平成9年9月-平成10年3月期):立方晶と斜方晶の二つの異なる結晶構造をもつフッ化鉛(PbF_2)の励起子反射スペクトル及び発光スペクトルを詳しく調べた。

2.試料の作成(平成10年8月-平成10年12月期):NaCl型のRbB単結晶を(100)面に真空中で劈開しそれを基板にして、CsCl型構造をもつCsI薄膜結晶を育成に成功した。また、NaCl型のRbI単結晶基板上に、NaCl型構造をもつCsI薄膜結晶を育成にも成功した。育成された薄膜結晶の膜厚は、水晶振動子を用いて測定し、ほぼ5nm程度であることが確かめられた。出来上がった薄膜結晶の品位が、真空度、基板の清浄度等の実験的条件に強く左右されることがわかった。3. Nd:YAGレーザを用いた発光測定の実験(平成10年10月-平成11年3月期):HOYAコンテニュアムから購入したQスイッチNd:YAGレーザの発振特性を調べ、それが安定に作動することを確認した。また、それを用いて幾つかの半導体及びイオン結晶を励起し、結晶からの発光を観測するとともに、既存のオシロスコープを用いて発光寿命の測定を行った。4.フッ化鉛の励起子スペクトルの測定(平成10年4月-平成10年10月期):立方晶と斜方晶の二つの異なる結晶構造をもつフッ化鉛(PbF_2)の励起子反射スペクトル及び発光スペクトルを詳しく調べた。その結果、励起子の緩和形態が結晶構造の違いに強く依存することがわかった。得られた成果を論文にまとめ、J.Phys:Condens.Mattter誌に投稿し、平成11年1月末にそれを掲載可とするとの連絡を受けた。
適度な自発運動は、炎症性大腸炎を予防できるか？

本研究では、炎症性大腸炎(IBD)の運動による予防効果とその抑制の仕組みをタンパク質レベルで解明することを目的とする。IBDは、国から難病指定されている慢性疾患であり、その発症機序の解明と治療法の確立は喫緊の課題である。最近、運動によって炎症性疾患が抑制されるという報告がなされたことを受け、本研究では、IBD誘発モデルマウスを用いて、タンパク質の量及び質的(タンパク質修飾)な変化から、IBD発症の仕組み、さらには運動によるIBD予防効果の仕組みを明らかにする予定である。
運動神経の特定機能単位選択的に働く新規遺伝子群の解析

我々は運動神経をモデル系とし、その経路選択・標的認識機構を、こうした過程に関与しうる因子を探索し解析することから明らかにしていこうとしている。本年度は、LMCm運動ニューロンに選択的に発現する因子として新たに単離した因子FY29について、その基本的な性質を明らかにした。FY29は複数のIgドメインをもつ未解析の細胞外タンパクであり、その細胞外分泌性を検討したところ、GPI付加を受け、細胞膜上にとどまることが明らかとなった。また、遺伝子の構造から、GPI付加シグナルを欠いた分泌型の存在が予測された。この因子の結合する領域を調べたところ、軸索の走行する領域にheterophilicに強く結合し、そのふるまいに何らかの影響をおよぼすことが推測された。そこで、explantを用いたin vitro assayをおこなった結果、軸索の運動の方向性には影響を与えないが、そのfasciculationを阻害することが明らかとなった。また、in ovoで表在神経系に強制発現させると、そのfasciculation、path findingに異常が見られ、また、commissure neuronのdorsalmarginal zoneへの集合を阻害することから、この因子は、fasciculationの調節になどに関わる新規のaxon guidance moleculeであることが強く示唆された。さらに解析を進めた結果、この因子は運動神経の標的である筋肉とも強く結合し、その標的認識過程にも深く関与していることが推測された。
国際ヒバクシャ医療情報ネットワークの活用による地域発展基盤の整備

調査・企画の研究実績としては、旧ソ連邦の放射線被ばく地域における医療情報インフラの実情を調査し、画像診断を中心に、遺伝子資源の活用の可能性を調査した。特にソフト開発を支援し、医学教育機材の導入を行った。WHO、IARCとの遠隔医療診断支援共同プロジェクト開発計画を構築し、地域密着型のヒバクシャ医療活動を開始し、その成果として、がんの早期発見、治療に貢献した。特にデジタル医療画像情報交換システムのためにソフト開発を行い、患者データの通信を完成させた。現在、チェルノブイリおよびセミパラチンスクから毎週細胞診画像などが長崎へ転送され、診断支援を開始している。このプログラムはWHO-SMHFの遠隔医療支援教育プロジェクトへと引き継がれている。細胞診、病理診断の画像をデジタル情報化し、客観的な診断基準の定量性のある共通プロトコールを開発し、貴重な生体試料の現地(ミンスク、キエフ、オブニンスク)センターを確立し、レーザー顕微鏡を用いた病理学的遺伝子診断の方法論を確立した。今後、国内の原爆被爆者への生体資料保存のプロトコール作成から、そのバンク化実現が課題ではあるが、この2年間での成果はたいへん大きいと国内外から評価されている。(1)調査・企画の研究実績:旧ソ連邦の放射線被ばく地域における医療情報インフラの実情を調査し、画像診断を中心に、遺伝子資源の活用の可能性を調査した。ソフト開発を支援し、医学教育機材の導入を行った。WHO、IARCとの遠隔医療診断支援共同プロジェクト開発計画を構築し、地域密着型のヒバクシャ医療活動を開始した。(2)医療画像転送、情報解析開発の研究実績:デジタル医療画像情報交換システムのためにソフト開発を行い、患者データの通信を完成させた。(3)衛星通信を用いた医学研究、医療支援プログラム開発の実績:甲状腺超音波画像診断、細胞診、病理診断の画像をデジタル情報化し、客観的な診断基準の定量性のある共通プロトコールを開発した。レーザー顕微鏡を用いた病理学的遺伝子診断は現在方法論を確立中である。本案件における倫理問題の解決について検討中であり、国内の原爆被爆者への生体資料保存のプロトコール作成を行っている。以上、一年間の研究実績は海外での情報インフラ整備に貢献し、地域との密着性と情報支援を可能としている。(1)調査・企画の研究実績;チェルノブイリ周辺地区の貴重なヒバクシャ試料の保存・活用を目的とした腫瘍組織保存バンクの設立のために、WHO、ECなどと共同で尽力し、今後の試料活用の指針を作成した。また、現地の研究者を招聘し、国際統一プロトコールに基づく遺伝子抽出の研修を行った。(2)医療情報画像の転送、情報解析の研究実績;チェルノブイリ、セミパラチンスクへの診断支援システムの構築のため、遠隔医療診断支援システムを確立し、これまで約1000例あまりの甲状腺の診断支援を行い、そのうち約20例を甲状腺がんと診断した。また、この画像転送のためのソフト開発を行い、送受信した医療情報のバンク化を行った。(3)衛星通信を用いた医学研究、医療支援プログラム開発の実績;現在WHOのテレメディシンプロジェクトに参画し、チェルノブイリにおける新たな診断支援システム、すなわちベラルーシ国内における診断システム構築のためのプロトコール作成に参画した。(4)病理学的遺伝子診断;レーザー顕微鏡を用いた微小組織からの遺伝子抽出・解析を確立し、各種の遺伝子解析に応用中である。また、SNPSシステムを用いた遺伝子多様性の解析については、甲状腺細胞のミトコンドリアDNAに着目し、甲状腺がんにおける遺伝子多様性について解析を行った。違法の研究実績は、海外での情報インフラ整備に貢献し、地域と密着した情報の支援を可能とした。
酵母遺伝学を利用したウイルス粒子形成出芽過程の宿主因子の同定

我々は既に酵母細胞でHIV-1の粒子形成過程が再現できることを明らかにしている。本研究では、HIV粒子主構造蛋白であるGag蛋白の細胞内輸送経路と関与する宿主因子を解明する目的で、1)近年関与が示唆されているエンドソーム経路の輸送蛋白質欠損酵母株を用いたGag蛋白細胞内輸送経路の網羅的解析、2)HIV-2 Gagに固有の粒子形成領域の同定、3)酵母CytoTrap two-hybridsystemを用いたGag蛋白細胞内輸送の新規責任宿主因子の単離・同定を試みた。1)Gag蛋白細胞内輸送における経路のエンドソーム輸送経路の解析エンドソーム経路輸送蛋白質欠損酵母株を用いてHIV-1Gag蛋白細胞内輸送を解析し、初期/後期エンドソームt-SNARE(Tlg1,Tlg2,Pep12)をその責任宿主因子として特定した。ヒト細胞において、これら宿主因子のヒトホモログをRNA干渉法でdepleteしたところHIV粒子産生の低下が、逆にover-expressionさせると粒子産生量が増加した。以上の結果より、これら宿主因子はHIV-1Gag蛋白細胞内輸送の責任宿主因子と結論された。酵母細胞ではHIV-2/SIVmacのGag粒子形成過程が再現できないことを見出した。この原因を調べたところ、i)その責任領域はGag蛋白アミノ末端領域であり、ii)Gag蛋白の細胞内輸送及び形質膜targetingに異常は認められないものの、iii)低張液における膜親和性は著しく低下し、iv)その結果として粒子出芽の段階で阻害されることを明らかにした。3)Gag蛋白細胞内輸送の新規責任宿主因子の単離・同定我々は既に酵母細胞でHIV-1の粒子形成過程が再現できることを明らかにしている。3)Gag蛋白細胞内輸送の新規責任宿主因子の単離・同定我々は既に、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)をモデルウイルスとして、そのウイルス主構造蛋白であるGag蛋白を発現させた酵母細胞からのウイルス様粒子産生系を確立するとともに、この酵母からの粒子産生系が高等真核細胞からの粒子産生系と酷似することを明らかにしている。本研究では、1)エンドソーム経路の輸送蛋白質欠損酵母株を用い、Gag蛋白の細胞内輸送経路を網羅的に解析するとともに、2)HIV-2に固有の粒子形成領域を同定した。1)エンドソーム輸送経路酵母のエンドソーム経路輸送蛋白欠損株及びエンドソーム小胞形成及び輸送欠損/変異株を用いて解析した。形質膜からのエンドソーム小胞形成に関与する蛋白質群の欠損あるいは変異(end3,4,5,6)株では、Gag蛋白は細胞内の膜画分にmis-sortingし、粒子産生量は減少した。初期及び後期エンドソームのt-SNAREs(Tlg2,Pep12)の欠損株においても、Gag蛋白はmis-sortingされ、粒子産生が低下した。しかしながら、リソソームのt-SNARE(Vam3)欠損株ではGag蛋白輸送及び粒子産生は正常に進行した。後期ゴルジ体から後期エンドソームへの輸送蛋白質Vps10、逆に、後期エンドソームから後期ゴルジ体への輸送蛋白質群(Vps35,29)、また、後期エンドソームにおいて腔内への膜陥入に関与する輸送蛋白質Vps23(TSG101ホモログ)は、本細胞系でのGag蛋白形質膜輸送には不要であった。これらの結果から、Gag蛋白は、後期エンドソームから上流に位置する輸送経路を経て形質膜に輸送されると考えられた。HIV及びSIVはその系統樹から、HIV-1/SIVcpz,HIV-2/SIVmac,SIVmnd,SIVagmの4つに大別される。我々は既に、酵母細胞ではHIV-2/SIVmacのGag粒子が形成できないを観察している。この原因を調べたところ、Gag蛋白の細胞内輸送及び形質膜targetingや膜親和性に異常は認められないものの、粒子出芽の段階で阻止されていること、その責任領域はGag蛋白アミノ末端のMA領域であることを見いだした。

本申請に先立ち、我々はヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)Gag蛋白を発現させた酵母細胞によるウイルス様粒子産生系を確立している。本研究では、1)エンドソーム経路の輸送蛋白質欠損酵母株を用いたGag蛋白細胞内輸送経路の網羅的解析と、2)HIV-2に固有の粒子形成領域の同定を行った。1)エンドソーム輸送経路酵母のエンドソーム経路輸送蛋白欠損株及びエンドソーム小胞形成及び輸送欠損/変異株を用いて解析した。形質膜からのエンドソーム小胞形成に関与する蛋白質群の欠損あるいは変異(end3,4,5,6)及び、初期/後期エンドソームt-SNARE(Tlg1,Tlg2,Pep12)の欠損では、粒子産生が低下した。しかしながら、後期エンドソームより下流、あるいは、後期ゴルジ体⇔後期エンドソームの輸送蛋白質(TSG101ホモログであるVps23を含む)は本細胞系でのGag蛋白形質膜輸送には不要であった。細胞内小器官マーカー蛋白との共局在・免疫電顕・細胞内膜分画法により、粒子産生が低下した細胞では、Gag蛋白がエンドソームにmis-targetingし形質膜にまでsortingされていないことが判明した。現在、これらの同定した宿主因子との結合を解析している。HIV及びSIVはその系統樹から、HIV-1/SIVcpz, HIV-2/SIVmac, SIVmnd, SIVagmの4つに大別される。我々は既に、HIV-2/SIVmacのGag蛋白発現の酵母細胞ではウイルス様粒子が産生されないを見いだしている。この原因を調べたところ、i)その責任領域はGag蛋白アミノ末端領域であり、ii)Gag蛋白の細胞内輸送及び形質膜targetingに異常は認められないものの、iii)低張液における膜親和性は著しく低下し、iv)その結果として粒子出芽の段階で阻害されることを明らかにした。低張液における膜親和性低下は、Gag蛋白と形質膜との電気的結合低下を示唆するものである。我々は既に酵母細胞でHIV-1の粒子形成過程が再現できることを明らかにしている。本研究では、HIV粒子主構造蛋白であるGag蛋白の細胞内輸送経路と関与する宿主因子を解明する目的で、エンドソーム経路の輸送蛋白質欠損酵母株を用いたGag蛋白細胞内輸送経路の網羅的解析を行うとともに、酵母CytoTrap two-hybridsystemを用いてGag蛋白細胞内輸送の新規責任宿主因子の単離・同定を試みた。1)Gag蛋白細胞内輸送における経路のエンドソーム輸送経路の解析エンドソーム経路輸送蛋白欠損酵母株を用いてGag蛋白細胞内輸送を解析し、初期/後期エンドソームt-SNAREをその責任宿主因子として特定した(昨年度)。本年は、これら宿主因子が真のGag輸送の責任宿主因子か、ヒト細胞で検証した。これらのヒトホモログをRNA干渉法でdepleteしたところHIV粒子産生が低下した。逆に、それらをover-expressionさせると粒子産生量が増加した。以上の結果より、これら宿主因子はHIV-1 Gag蛋白細胞内輸送の責任宿主因子と結論された。また、これら宿主因子のN末端あるいはC末端半分の共