hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
森林の分断化が菌根菌の群集構造と遺伝的多様性に及ぼす影響の解明

森林は多くの動植物の生息場所として重要であるが人間活動によって断片化が進行し、生物多様性への影響が懸念されている。森林の主要樹木は菌根菌という土壌微生物と共生することで生きているが、森林の断片化が菌根菌に及ぼす影響については明らかにされていない。本研究では、最終氷期以降、高山に取り残される形で隔離分布しているハイマツを対象にして、共生する菌根菌の種組成を複数の山系で調べた。ハイマツと共進化したと考えられる新菌種を発見する等の成果が得られた。森林の分断化はそこに生育する多くの生物の消失につながる可能性があり、生物多様性の観点から世界的規模の問題となっている。森林の分断化に伴う動植物の消失に関する研究は多いが、直接観察が難しい微生物に関する研究はほとんど行われていない。本研究では、樹木の養分吸収の大部分を担っている重要な共生微生物である菌根菌に着目し、森林の分断化が菌根菌の種組成や多様性などに及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。本年度は、アジアと北米に隔離分布するトガサワラ属、高山に隔離分布するハイマツ生態系を分断化のモデルケースとして、菌根菌群集に関する解析を行った。さらに、我々が国内外各地の森林でこれまでに行ってきた菌根菌に関する調査データも含めて解析し、森林限界や島といった物理的隔離要因が菌根菌群集に及ぼす影響についても解析を行った。まず、各調査地から十分な数の土壌サンプルを採取し、そこに含まれる菌根を形態類別した後、DNA解析を行った。具体的にはrDNAのITS領域の塩基配列を調べ、国際塩基配列データベース上に登録された既存菌種の配列と比較することで菌種の同定を行った。得られた菌種の組成や各菌種の出現頻度をもとに、多様性解析、群集構造解析、分子系統解析などを行った。それぞれの調査地では現在樹木に共生して活動中の菌根菌の他に、バイオアッセイと呼ばれる手法によって菌根菌の埋土胞子(土壌中に休眠状態で存在する胞子)も調べた。調べた多くの調査地において、特定の宿主樹木にしか共生しない「宿主特異的菌根菌」が生息していることが確認された。このことはある程度の森林面積が維持されていれば、少なくとも一部の宿主特異的菌根菌も生き残れることを意味している。現在は、森林の物理的隔離が菌根菌群集全体に及ぼす影響の詳細について解析中である。人間活動により森林の減少と孤立化が世界各地で進行している。野生生物の重要な生息地である森林の分断化が、動物や植物の絶滅、遺伝的多様性の減少に繋がることはよく知られているものの、微生物に与える影響についてはほとんど分かっていない。樹木の根に共生する菌根菌は、樹木の養分吸収の大半を担い、その成長を支える重要な微生物群である。菌根菌の多様性減少や種組成変化は、樹木の成長に直接影響し、森林生態系全体の健全性にも影響する可能性がある。そこで本研究では、森林の断片化が菌根菌群集に及ぼす影響について基礎的知見を得ることを目的とする。研究対象としたのは、本州と北海道の高山帯に分布するハイマツである。ハイマツは、最終氷期以降の気温上昇とともに高山に退避した氷期遺存種である。長い年月、高山に隔離されてきたことから森林断片化のモデルケースとして選んだ。国内の代表的な山系で土壌サンプルを採取し、ハイマツの菌根からDNAを抽出した後、rDNAの塩基配列情報をもとに菌根菌の種を同定した。北アルプスや北海道といったハイマツが広く残存している場所では、ベニタケ科やイボタケ科、フウセンタケ科などの多様な菌種が見られたものの、北関東の小さな残存林分ではヌメリイグチ科の一部の菌種のみが優占しているなどの傾向が見られた。しかし、北アルプスの詳細な調査では、同じ地域でもハイマツの発達段階によって菌根菌種が大きく異なり、単生する小さなハイマツ個体ではヌメリイグチ科などが優占していた。これらの結果から、全国レベルの森林断片化の影響を見るにはさらに調査地を増やして包括的な知見を得る必要があると考えられる。また、本研究ではハイマツでしか確認されていない菌種も複数発見することができ、一部は菌株も単離することができた。このような菌種はハイマツの定着や保全に活用できる可能性があり、重要な成果といえる。森林微生物学ほぼ当初の計画通りに研究が進行しており、順調に研究成果が得られているため。当初の研究計画にそって粛々と研究を進める。すでに解析を外注している経費(DNA解析と安定同位体比解析)の請求が年度内に行われなかったため。外注先からの請求に対応して支払いを行う。
非対称直接接合ポリ酸－エチニル銀複合クラスターの創製と化学的刺激による発光制御

本研究において我々は、遷移金属元素と酸素からなる陰イオン性クラスター化合物であるポリ酸と、銀原子の集合体を複数のアセチレン誘導体が取り囲んで形成する陽イオン性クラスター化合物であるエチニル銀クラスターが直接接合した複合クラスター化合物を作り出すことに成功した。得られた化合物について、単結晶X線構造解析により、接合部の詳細な構造を明らかにするとともに、核磁気共鳴法などの溶液化学的手法を駆使して、得られた複合クラスターが溶液中でも構造を保っていることを明らかにした。さらに、それらがフォトルミネッセンスを示すことも見出した。本研究はエチニル銀クラスターとポリ酸とが直接接合した複合クラスターを合成し、構造制御に基づき複合クラスターの光学的性質を制御するものである。今年度は非対称ポリ酸[P2W15Nb3O62]9-を前駆体として得られる複合クラスター[Ag25{CCC(CH3)3}16(CH3CN)4(P2W15Nb3O62)]について、単結晶X線構造解析、31P NMR測定、エレクトロスプレー質量分析および超遠心分析の実験結果を総合して、構造及び生成機構を解明した研究を完成させ、その成果がInorganic Chemistryに論文が掲載された。また、類似前駆体である[P2W15V3O62]9-の合成に成功し、これについてもエチニル銀クラスターとの反応過程を、吸光度変化を利用して追跡することに成功した。その結果、[P2W15V3O62]9-は少なくとも二段階の反応を経てエチニル銀クラスターと反応していることが明らかになった。これは、超遠心分析により明らかにした[Ag25{CCC(CH3)3}16(CH3CN)4(P2W15Nb3O62)]の生成機構と整合する結果であり、吸光度測定により生成過程を追跡するという手法の妥当性が示された。さらに、5族元素のポリ酸である[Nb6O19]8-および15族元素の酸素酸である[PO4]3-についても、吸光度変化によりエチニル銀クラスターとの反応過程を追跡した。その結果、[Nb6O19]8-は少なくとも三種の、[PO4]3-は少なくとも二種の化合物を作ることが明らかになった。非対称ポリ酸[P2W15Nb3O62]9-を前駆体として得られる複合クラスター[Ag25{CCC(CH3)3}16(CH3CN)4(P2W15Nb3O62)]について、単結晶X線構造解析、31P NMR測定、エレクトロスプレー質量分析および超遠心分析の実験結果を総合して、構造及び生成機構を解明した昨年度に引き続き、今年度は非対称ポリ酸[SiW9Nb3O40]7-を前駆体として得られる複合クラスター[Ag42(CO3){CCC(CH3)3}27 (SiW9Nb3O40)]-について、単結晶X線構造解析、一次元及び二次元の1Hおよび13C NMR測定、29Siおよび183W NMR測定の結果を総合して、結晶及び溶液構造を解明した研究を完成させ、その成果をDalton Transaction誌に論文投稿した。当該論文は非常に高く評価され、同誌44巻44号の表紙を飾った。また、類縁前駆体である[H2W12O40]6-および15族元素の酸素酸である[PO4]3-についても、エチニル銀クラスターとの複合クラスターの合成を試みた。得られた結晶のX線構造解析の結果、[H2W12O40]6-については一種の、[PO4]3-については二種の複合クラスターが生成していることが明らかになった。また、[P2W15V3O62]9-、[Nb6O19]8-および[PO4]3-のエチニル銀クラスターとの反応過程を、吸光度変化を測定することにより追跡できることを示したことは、今後の新化合物合成の指針を与える成果である。ただし、これらを結晶化することに至っていないことが今後の課題である。無機化学[P2W15V3O62]9-を前駆体としたエチニル銀クラスターとの複合クラスターを、吸光度測定により示唆された中間体も含めて結晶化し、構造を明らかにすることをめざす。また、同族の[P2W15Ta3O62]9-を用いて同様の実験を行う。さらに、得られた化合物について発光特性の測定を行う。なお、平成26年度に当研究室に蛍光光度計が配置され、室温および液体窒素温度で発光特性を測定する環境が整っている。

本研究では、トルフルオロメタンスルホン酸銀(50gが32,000円)など、高価な試薬を使用する。年度末の残額が19,703円であり、その購入には不足していた。残額をそれ以外の試薬などの購入に充てるよりは、次年度に繰り越して高額試薬購入に充てることが、研究目的達成により多く貢献すると考え、次年度に繰り越すこととした。トルフルオロメタンスルホン酸銀(50gが32,000円)などの試薬の購入費用に充てる。
血液腫瘍患者に対するQOL向上に主眼を置いたリハビリテーションプログラムの開発

現在までの研究結果から,血液腫瘍患者のQOL向上には身体活動量向上が関係していることが示唆されている.また,先行研究より,身体活動量を向上させるためには行動変容アプローチが効果的である可能性が高いことが示されている.そこで我々は,平成28年度より入院して化学療法を実施している血液腫瘍患者に対して,毎日の身体活動量(一日平均歩数)の評価を行った.そして,週に1回運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度)の評価を行い,身体活動量および運動機能の推移を紙面上にグラフ化し,対象者に配布してフィードバックを実施した.また,リハビリ介入および退院時に運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度),身体精神症状(倦怠感、不安・抑うつ),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30 )の評価も合わせて行った.化学療法後2週間以内にリハビリ介入し、リハビリ実施期間が2週間以上であった13名を介入群とした。そして、平成27年度にリハビリ介入を行い、評価結果に関しては口頭での説明しか実施していない血液腫瘍患者12名を対照群として、身体活動量(一日平均歩数,低強度身体活動時間,中高強度身体活動時間),運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度),身体精神症状(倦怠感、不安・抑うつ),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30)のリハビリ介入時から退院時までの変化量を比較した。介入時の介入群と対照群の基本属性および評価結果には有意な差は認められなかった。解析の結果、介入群は対象群に対して、一日平均歩数および中高強度の身体活動量の変化量が有意に高値であった。一方、運動機能や身体精神症状,運動セルフエフィカシーおよびQOLの変化量においては2群間で有意な差は認められなかった.この結果は日本がんリハビリテーション研究会で発表済みであり、現在英語論文を執筆中である.平成27年度において,身体活動量を含めて評価が実施できたのは血液がん患者26名,固形癌患者16名の計42名であった.血液がん患者,固形癌患者それぞれの入院時および退院時の1日平均歩数と運動機能(握力,膝伸展筋力,10m歩行時間),ADL(mFIM),全身倦怠感(CFS),不安・抑うつ(HADS),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30)との相関関係について調査を行った.統計解析にはSpearmanの順位相関を用いて,有意水準は5%未満とした.入院時において,血液がん患者の1日平均歩数は,握力(p=0.0025,r=0.581),mFIM(p=0.0209,r=0.437)と有意な正の相関を認め,10m歩行時間(p=0.0001,r=-0.783),CFSの精神面(p=0.0296,r=-0.427)と有意な負の相関を認めた.固形癌患者の1日平均歩数は,mFIM(p=0.0121,r=0.671)とのみ有意な正の相関を認めた.また,退院時において,血液がん患者の1日平均歩数は,握力(p=0.0359,r=0.664),QOLの役割面(p=0.0467,r=0.600)と有意な正の相関を認め,10m歩行時間(p=0.0105,r=-0.809),CFSの精神面(p=0.0461,r=-0.601)および総合面(p=0.0133,r=-0.747)と有意な負の相関を認めた.固形癌患者の1日平均歩数は,他の評価項目と有意な相関関係は認められなかった.しかし,運動セルフエフィカシーにおいては,固形癌患者および血液がん患者両者とも,入院時・退院時の他の評価項目との相関関係は認められなかった.身体活動量の評価において,入院期間中に測定機器の装着し忘れや中止の希望が出現したため,評価が実施できた症例数は予定より減少している.しかし,評価できた症例数であっても,血液がん患者において,入院時および退院時の運動機能や全身倦怠感,精神症状が身体活動量低下の要因になっていること,そして,退院時において身体活動量の低下がQOL低下の要因になっている可能性が示唆された.一方,固形癌患者においては同様の傾向は認められず,血液がん患者においてのみ,身体活動量と運動機能や身体・精神症状およびQOLとの関連が明らかになっている.運動セルフエフィカシーとの関連性は認められなかったが,血液がん患者における身体活動量の重要性が推察されたため,平成27年度における本研究の目的は概ね達成できたと考えられる.平成28年度より,入院して化学療法を実施している血液がん患者に対して,毎日の身体活動量(一日平均歩数)の評価を行った。そして、週に1回運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度)の評価を行い、それらの結果を紙面上にグラフ化し、対象者に配布してフィードバックを実施した。また、リハビリテーション介入および退院時に運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度),身体精神症状(倦怠感、不安・抑うつ),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30 )の評価を実施している。

フィードバックを実施した血液がん患者を介入群とし、現在10名の介入が終了している。対照群は、平成27年度にリハビリテーション介入を行い、評価結果に関しては口頭での説明しか実施していない血液がん患者26名とした。介入群および対照群のリハビリテーション介入時および退院時の運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度),身体精神症状(倦怠感、不安・抑うつ),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30)を群間比較する予定としている。また、リハビリテーション介入時から退院時までの身体活動量(1日平均歩数,低強度活動時間,中等強度活動時間)も同様に群間比較する予定である。しかし、現時点ではまだ紙面上でのフィードバックを実施できた介入群の症例数が少なく詳細な解析までは実施できていない現状である。来年度,介入群の症例数を増加させて解析する予定としている。身体活動量計を装着されなかったり,毎週の運動機能評価を拒否される症例も多く,症例数は予定よりも増加していない.平成28年度に引き続き、入院して化学療法を実施している血液腫瘍患者に対して,毎日の身体活動量(一日平均歩数)の評価を行った。そして、週に1回運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度)の評価を行い、身体活動量および運動機能の推移を紙面上にグラフ化し、対象者に配布してフィードバックを実施した。また、リハビリ介入および退院時に運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度),身体精神症状(倦怠感、不安・抑うつ),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30 )の評価を実施している。上記の介入を行えた血液腫瘍患者33名のうち、化学療法後2週間以内にリハビリ介入し、リハビリ実施期間が2週間以上であった13名を介入群とした。そして、平成27年度にリハビリ介入を行い、評価結果に関しては口頭での説明しか実施していない血液腫瘍患者26名のうち、介入群と同条件の12名を対照群として、身体活動量(一日平均歩数,低強度身体活動時間,中高強度身体活動時間),運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度),身体精神症状(倦怠感、不安・抑うつ),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30)のリハビリ介入時から退院時までの変化量を比較した。介入時の介入群と対照群の基本属性および評価結果には有意な差は認められなかった。解析の結果、介入群は対象群に対して、一日平均歩数および中高強度の身体活動量の変化量が有意に高値であった。一方、運動機能や身体精神症状,運動セルフエフィカシーおよびQOLの変化量においては2群間で有意な差は認められなかった.上記の通り、条件設定等の問題で当初の予定より対象症例数は減少したものの、介入群と対照群との比較検討まで実施できている。しかし、その成果を学会および論文等で発表できていないため、進捗状況としては遅れていると判断した。現在までの研究結果から,血液腫瘍患者のQOL向上には身体活動量向上が関係していることが示唆されている.また,先行研究より,身体活動量を向上させるためには行動変容アプローチが効果的である可能性が高いことが示されている.そこで我々は,平成28年度より入院して化学療法を実施している血液腫瘍患者に対して,毎日の身体活動量(一日平均歩数)の評価を行った.そして,週に1回運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度)の評価を行い,身体活動量および運動機能の推移を紙面上にグラフ化し,対象者に配布してフィードバックを実施した.また,リハビリ介入および退院時に運動機能(握力・膝伸展筋力・10m歩行速度),身体精神症状(倦怠感、不安・抑うつ),運動セルフエフィカシー,QOL(EORTC QLQ c-30 )の評価も合わせて行った.化学療法後2週間以内にリハビリ介入し、リハビリ実施期間が2週間以上であった13名を介入群とした。
動物の環境応答行動を制御する光センシング機構とその個体成長での転換

動物は光環境への応答の一つとして、周囲の明暗や色に合わせて自身の体色を変化させる。真骨魚類ゼブラフィッシュを用いたこれまでの研究から、個体の成長とともに体色変化パターンが幼生型から成魚型へと転換すること、また、体色を制御する光センサーの存在部位が幼生と成魚では異なることがわかっている。本研究ではゼブラフィッシュを用いて、幼生型・成魚型それぞれの体色変化を制御する光センサー分子を特定する。さらにこの光センサー分子を起点とした光センシング機構を細胞個体レベルで明らかにし、成長過程での体色変化パターン転換との関連を検証する。
機械的伸展刺激が肥厚性瘢痕・ケロイドを発生させるメカニズムの解明

肥厚性瘢痕は皮膚創傷部位におけるコラーゲン線維の過剰な蓄積と炎症が特徴であり、関節、胸郭といった反復的な伸展・弛緩刺激を受ける部位に好発する疾患である。皮膚創傷のうち反復的な伸展・弛緩刺激を受ける部位に肥厚生瘢痕が生じるメカニズムは未だ不明であり治療法も確立されていない。近年、Ca channelの一種であるTranseient-Receptor-Potential(TRP)がCaイオンを流入させることで細胞への物理的機械的伸展刺激を生化学的細胞内シグナルに変換し、線維化を引き起こす可能性を示唆する報告が見られる。我々はこのTRP channelに着目し、まず皮膚における各TRPホモログの発現について調査を行った。TRP各ホモログのうち、肥厚性瘢痕ではTRPC3の発現が上昇していた。また、ヒト初代培養皮膚線維芽細胞を伸展するとTRPC3の遺伝子・蛋白発現が上昇していることも確認した。我々は、pMXs-IRES-GFPシステムを用いてTRPC3を過剰発現させたマウス由来線維芽細胞を作成し,培養細胞伸展刺激装置を用いて機械的伸展刺激を与えた。伸展下においてマウスTRPC3過剰発現線維芽細胞ではcontrolと比べ、IL-6の発現上昇及びNFκBのリン酸化を認めた。機械的刺激によりTRPを通して細胞質内Ca濃度が上昇、NFκBのリン酸化を引き起こし、promotor領域にNFκB結合部位を持つIL-6発現上昇がもたらされると推測された。IL-6は肥厚性瘢痕において発現上昇が認められているサイトカインであり、本研究より機械的伸展刺激が肥厚性瘢痕を引き起こすメカニズムの一部が解明されることが示唆された。
Smad制御による骨代謝制御機構の解明

骨の恒常性は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスにより維持されており、TGFβもその制御因子である。この因子は、シグナル促進に共有型のSmad4を介している。破骨細胞特異的にSmad4を欠失させたマウスを用い、破骨細胞におけるSmad4の役割について解析を行った。今回の解析から、TGFβ/Smad4を介したシグナルは、Smad4がPrdm1の発現を低下させ、Bcl6とIrf8の発現が上昇することにより破骨細胞の分化を抑制することで、骨量減少を阻害するために必須であると考えられ、骨吸収過剰状態においては今後の新たな治療標的である可能性が示唆された。骨の恒常性は、破骨細胞の骨吸収に始まり、骨芽細胞にシグナルを伝え吸収された骨を埋め戻すことで維持されており、この一連の行程は骨のカップリングと呼ばれる。骨基質内には、骨制御因子であるTGFβやBMPなどのTGFβスーパーファミリーに属するサイトカインが豊富に含まれており、これらのサイトカインが、破骨細胞の骨吸収により活性化され、周囲の細胞にそのシグナルを伝えることで、骨の吸収と形成のバランスが保たれている。そこで、申請者はcre loxPシステムを用いて、破骨細胞に必須の分化マーカーであるCtsk特異的にSmad4を欠失させ、破骨細胞におけるSmad4の解析を行っている。in vitroにおいて、野生型マウスの骨髄細胞を用いてSmad4にシグナルを送る因子でTGFβ1,2,3及びBMP2の破骨細胞への効果をみた。破骨細胞培養のTRAP染色では、TGFβ2およびBMP2は破骨細胞の形成を促進させ、TGFβ1および3では抑制することが分かった。この時のreal time PCRでのmRNAの発現量は、TGFβ1,3でctsk,NFATc1などの破骨細胞分化マーカーは上昇せず、破骨細胞分化抑制マーカーであるIRF8が上昇していることが分かった。Irf8 KOおよびBcl6 KOマウス由来の細胞では、TGFβ1による破骨細胞形成の抑制ががキャンセルされることが分かった。現在、Smad4 cKOマウスの骨密度減少のメカニズムを解析中である。そのメカニズムについて、申請者は当初Ca influxに影響がある可能性を考えていたが、Ca influxは野生型とSmad4 cKOの差を認めず、Ca経路に関しては否定的であることが考えられた。現在Bcl6, Irf8がSmad4を抑制している可能性が考えられ、解析中である。骨の恒常性は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスにより維持されており、骨組織に含まれる骨形成タンパク質2(Bone morphogenetic protein 2: BMP2)やトランスフォーミング増殖因子β(Transforming growth factor β: TGFβ)などもその制御因子である。これらの因子は、シグナル促進にそれぞれ特異型のSmad2/3もしくはSmad1/5/8と、共有型のSmad4を介している。骨芽細胞に発現するSmad4は骨の恒常性に重要であるという報告がこれまでされているが、破骨細胞における役割については報告がない。そこで、破骨細胞特異的にSmad4を欠失させたマウス(Ctskcre/+Smad4f/f)を用い、破骨細胞におけるSmad4の役割について解析を行った。Smad4 cKOマウスでは骨密度の低下が見られたことから、破骨細胞におけるSmad4は、生理的な環境下では破骨細胞を抑制していると考えられた。in vitroにおいて、野生型マウスの骨髄細胞を用いた破骨細胞培養系に、Smad4の上流の因子であるBMP2およびTGFβ1-3を添加したところ、BMP2とTGFβ2では破骨細胞分化の促進、TGFβ1と3では有意な抑制を認めた。そこで、破骨細胞分化の抑制はTGFβ1および3が主に作用していると考え、骨組織に豊富に含まれるTGFβ1に着目した破骨細胞分化の抑制はTGFβ1および3が主に作用していると考え、骨組織に豊富に含まれるTGFβ1に着目した。In vitroにおけるTGFβ1添加実験では、real time PCRの結果、破骨細胞の分化マーカーであるCtskやNFATc1のmRNAの発現低下と、抑制因子であるBcl6やIrf8の発現上昇がみられ、Smad4 cKOマウス由来の骨髄細胞ではその作用がキャンセルされることが分かった。そこで、Bcl6とIrf8の上流であり、これらの因子を抑制する転写因子であるPrdm1に着目した。ChIP-seq法を用いた結果では、TGFβ1を添加させた際、Smad2/3のPrdm1転写因子の転写開始点付近への結合が増加することが分かった。

そこで、破骨細胞特異的にSmad4とPrdm1を欠失させたマウス(Ctskcre/+Smad4f/fPrdm1ff/)の骨密度を解析したところ、Smad4による骨密度の低下がキャンセルされることが分かった。骨の恒常性は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスにより維持されており、骨組織に含まれるBMP2やTGFβなどもその制御因子である。これらの因子は、シグナル促進にそれぞれ特異型のSmad2/3もしくはSmad1/5/8と、共有型のSmad4を介している。骨芽細胞に発現するSmad4は骨の恒常性に重要であるという報告がこれまでされているが、破骨細胞における役割については報告がない。そこで、破骨細胞特異的にSmad4を欠失させたマウスを用い、破骨細胞におけるSmad4の役割について解析を行った。Smad4 cKOマウスでは骨密度の低下が見られたことから、破骨細胞におけるSmad4は、生理的な環境下では破骨細胞を抑制していると考えられた。in vitroにおいて、野生型マウスの骨髄細胞を用いた破骨細胞培養系に、Smad4の上流の因子であるBMP2およびTGFβ1-3を添加したところ、BMP2とTGFβ2では破骨細胞分化の促進、TGFβ1と3では有意な抑制を認めた。そこで、破骨細胞分化の抑制はTGFβ1および3が主に作用していると考え、骨組織に豊富に含まれるTGFβ1に着目した。In vitroにおけるTGFβ1添加実験では、real time PCRの結果、CtskやNFATc1のmRNAの発現低下と、抑制因子であるBcl6やIrf8の発現上昇がみられ、Smad4 cKOマウス由来の骨髄細胞ではその作用がキャンセルされることが分かった。そこで、Bcl6とIrf8の上流であり、これらの因子を抑制する転写因子であるPrdm1に着目した。ChIP-seq法を用いた結果では、TGFβ1を添加させた際、Smad2/3のPrdm1転写因子の転写開始点付近への結合が増加することが分かった。骨の恒常性は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスにより維持されており、TGFβもその制御因子である。この因子は、シグナル促進に共有型のSmad4を介している。破骨細胞特異的にSmad4を欠失させたマウスを用い、破骨細胞におけるSmad4の役割について解析を行った。今回の解析から、TGFβ/Smad4を介したシグナルは、Smad4がPrdm1の発現を低下させ、Bcl6とIrf8の発現が上昇することにより破骨細胞の分化を抑制することで、骨量減少を阻害するために必須であると考えられ、骨吸収過剰状態においては今後の新たな治療標的である可能性が示唆された。Smad4 cKOマウス由来の骨髄細胞では、野生型マウスでみられたTGFβ1,3による破骨細胞形成の抑制や、realtime PCRの解析でみられたCtskやNFATc1のmRNAの発現の低下、Bcl6やIrf8の発現上昇は、いずれもキャンセルされた。Irf8 KOおよびBcl6 KOマウス由来の細胞では、TGFβ1による破骨細胞形成の抑制ががキャンセルされた。また、同様にBcl6やIrf8の上流であるBlimpの発現においても、野生型マウスでみられたTGFβ1,3による発現抑制が、Smad4 cKOマウスでキャンセルされた。そこで、BlimpとSmad4を破骨細胞特異的に欠失させたマウスを現在作製し、解析予定である。
単クローン抗体を用いた細菌性およびウイルス性食中毒の迅速簡便な鑑別診断法の開発

食中毒を起こす細菌やウイルスを早期に(短時間で)、簡単に(検体を加えるだけで)しかも多検体検出・鑑別診断できることが、食の安全確保において、また予防・治療を行う上で重要である。この目的のために、種々の細菌およびウイルスに対する単クローン抗体を作製し、その抗体を利用してELISA法、イムノクロマト法あるいはプロテインチップ法などによる迅速・簡便診断法の開発を試みた。1.各種食中毒原因微生物に対する単クローン抗体の樹立現在までに、以下の微生物に対する単クローン抗体を得ることができた。(1)ベロ毒素に対する抗体:21クローンを得た。このうち5クローンはベロ毒素VT1およびVT2を認識する抗体であった。(2)大腸菌に対する抗体:13クローンを得た。うちひとつは毒素原性大腸菌の産生する易熱性毒素(LT)に対する抗体と考えられた。(3)サルモネラ菌に対する抗体:14クローンが得られたが,診断に有用な抗体ではなかった。(4)カンピロバクターに対する抗体:5クローンが得られた。菌体のある一部に対する抗体と思われるが、現在検討中である。(5)黄色ブドウ球菌に対する抗体:6クローンが得られたが,うち4クローンはエンテロトキシンに対する抗体と考えられた。(6)セレウス菌に対する抗体:2クローンが得られたが、ひとつは、セレウス菌由来のホスフォリパーゼCに対する抗体であった。この抗体はウエルシ菌由来のホスフォリパーゼCとも反応することが分かった。今後はセレウス菌およびウエルシ菌特異的な抗体を得る必要がある。上記未検討の抗体については現在解析中である。また、腸炎ビブリオおよびウエルシ菌については現在作成中である。2、迅速簡便診断法の開発ノロウイルスに対する抗体は樹立し、すでに迅速簡便なELISA法をすでに開発している。現在は、イムノクロマト法あるいはプロテインチップに応用できないか検討中である。今後、上記の樹立された抗体の有用性を確かめ、体系化された食中毒の鑑別診断法の確立する予定である。この目的のために、種々の細菌およびウイルスに対する単クローン抗体を作製し、その抗体を利用してイムノクロマト法による迅速・簡便診断法の開発を試みている。1、ベロ毒素に対する抗体の作製ベロ毒素(VT1=分子量70Kda、およびVT2=分子量46Kda)に対する2種の抗体を得ることができた。今後、さらに抗原的解析を行い、実用化の可能性を試みたい。2、ノロウイルスに対する抗体の作製すでにキット化されている方法に改良を加え、さらに特異性および感度をあげる試みを行った。現在までに、ノロウイルスの株間に幅広く交叉性を示す抗体をいくつか得ることができ、今後、実用化への試みを行う。3、イムノクロマト法の実用化イムノクロマト法の方法・技術を確立するために、すでに得られている抗体(抗牛痘ウイルス抗体)をモデルとして用いたところ、応用可能なことが示された。この方法を食中毒微生物の検出・診断法に応用する予定である。4、病原性大腸菌およびサルモネラ菌に対する抗体の作製病原性大腸菌およびサルモネラ菌に対する抗体の作製を試み、いくつかの抗体を得ることができた。

しかし、これらの抗体は抗原的解析には役立つと思われるが、診断の実用化には至らない抗体であった。5、免疫源の検討現在、病原性大腸菌、サルモネラ菌およびブドウ球菌に対するよりよい抗体を作製するため免疫源の検討を行っている。引き続き抗体の作製を試み、体系化された食中毒の鑑別診断法の確立に努めたい。食中毒を起こす細菌やウイルスを早期に(短時間で)、簡単に(検体を加えるだけで)しかも多検体検出・鑑別診断できることが、食の安全確保において、また予防・治療を行う上で重要である。この目的のために、種々の細菌およびウイルスに対する単クローン抗体を作製し、その抗体を利用してELISA法、イムノクロマト法あるいはプロテインチップ法などによる迅速・簡便診断法の開発を試しみている。1.各種食中毒原因微生物に対する単クローン抗体の樹立現在、以下の微生物に対する単クローン抗体を得ている。1)大腸菌(13種:うちひとつは毒素原性大腸菌の産生する易熱性毒素に対する抗体と考えられる)2)ベロ毒素(24種:い<つかはVT1およびVT2に対する抗体であることが分かっている)3)サルモネラ菌(28種)4)黄色ブドウ球菌(11種:このうちいくつかはエンテロトキシンに対する抗体と考えられる)5)カンピロバクター(8種)などが得られている。それぞれの抗体の詳細な解析は,現在進行中である。なお、セレウス菌およびウエルシ菌に対する抗体も現在作成中である。一方、サポウイルスに対する抗体もこれまでにいくつか得ており、現在解析中である。2、迅速簡便診断法の開発ノロウイルスに対する抗体を樹立し、迅速簡便なELISA診断法をすでに開発している。現在は、イムノクロマト法あるいはプロテインチップに応用できないか検討中である。今後、上記の樹立された抗体の有用性を確かめ、体系化された食中毒の鑑別診断法の確立に努めたい。食中毒を起こす細菌やウイルスを早期に(短時間で)、簡単に(検体を加えるだけで)しかも多検体検出・鑑別診断できることが、食の安全確保において、また早期予防・早期治療を行う上で重要である。この目的のために、種々の細菌およびウイルスに対する単クローン抗体を作製し、その抗体を利用してELISA法、イムノクロマト法あるいはプロテインチップ法などによる迅速・簡便診断法の開発を試みた。A.各種微生物に対する単クローン抗体の作製とその解析1)ウイルス性食中毒のうち、ノロウイルスに対する抗体ついてはほぼ確立している。そこで同科サポウイルスに対する抗体を4種作製したが、有効な抗体ではなかった。現在さらに20種ほど作製したので、今後解析予定である。また、現在までに細菌性食中毒の原因となる以下の微生物に対する単クローン抗体を得た。一部は解析が終わったが、多くは現在解析中である。さらに実際の診断に応用可能かどうかを検討する。2)大腸菌(13種:うちひとつは毒素原性大腸菌の産生する易熱性毒素に対する抗体と考えられた)3)ベロ毒素(24種:
ニュ-ラルネットワ-クの薬物の構造活性相関への応用

階層型ニュ-ラルネットワ-ク(NN)の分類及びFitting動作は従来方法に比べて柔軟性にとみかつ確実な動作であることが知られているが、その動作原理が明らかでなかった。私はNNの分類動作と従来から用いられている適応最小自乗(ALS)法、NNのfitting動作と、重回帰分析法との数学的関係を明らかにし、NNの動作はALS法及び重回帰分析法の非線形拡張であることを示し、NNはその動作に制限を加えることでALSおよび重回帰分析法を再現することを示した。NNでは入出力関係が明確ではないと言われているため、私はNNの情報の流れを数学的に検討し、NNでの入出力関係すなわち出力の強度を決定する入力因子を求める方法(相関指数)を提出した。相関指数は線形入出力関係のデ-タでは重回帰分析における相関係数に一致する量である。この研究において私はニュ-ロンの不飽和動作関数および逆伝播学習におけるニュ-ロン疲労の概念を導入した。当研究に用いたNNのシミュレ-ションプログラムを東京大学大型計算機センタ-内システムに登録し一般公開を手続き中である。大型計算機を用いてNNの学習特性を検討し、再構築学習法の提出に至った。すなわち、通常の逆伝播学習において形成した結合行列の一部を消去するような忘却効果を導入し、学習と忘却を繰り返しながら結合行列を生成させる。こうすることによって、シナプス強化則が適用され、小数のニュ-ロン間の結合は強固になり他のほとんどのニュ-ロン間の結合は無くなる。この結果.最小のネットワ-ク構成が定まり、入力と出力間の情報の流れが明確になった。この方法を薬物の構造活性相関のデ-タに適用し、ALS法の認識関数では分離できなかった情報経路を示した。
ゾウリムシの生物時計機構におけるエネルギー伝達系・情報伝達系間相互作用

本研究の実施年度内に、1)ゾウリムシ単一個体は、日中真っ直ぐ速く泳ぎ、夜間遊泳速度を減じ遊泳方向変換頻度を増大させる、2)cAMP・cGMP濃度は、共に日中濃くなり夜間は薄くなる(cAMP/cGMP比は、日中次第に増大し日没直後最大に達する)、3)ゾウリムシの静止膜電位は、日中陰極的で深く、夜間は浅くなる、4)原子吸光法を使用して、ゾウリムシの細胞内K^+イオンは、日中減少し、夜間増大する、5)電子顕微鏡を使用して、ミトコンドリアの形態は、日中球形をしているものが多くまたクリスタ構造が明確ではない、夜間は長形したものが多く時には分裂しているものがみられクリスタ構造もはっきりしている、6)protein kinase A及びprotein kinase CはほぼcAMPと平行して変動する、などを明らかにした。ゾウリムシにおいて、アデニル酸シクラーゼ(AD)がcAMPの合成酵素であると同時にK^+チャンネルとしての役割を果たしており、ADを通ってK^+イオンが細胞外に流出するとcAMP合成が促進されること、が報告されている。以上の結果を考え併せると、K^+イオンの細胞外流出による膜電位の過分極化の概日変化と、繊毛打の活性化及びcAMP合成促進の概日変化との間には直接的な関係が存在し、それらはADの活性の概日変化によって制御されていること、が示唆される。従って、【figure】の経路(closed loop)が、上記したゾウリムシの行動・電気生理・cAMP・cGMPの概日変化形成に重要な役割を果たしている、と考えることができる。生物時計には、周期は温度によらず一定であるという他の生物リズムとな異なる特有の性質、温度補償性がある。申請者は、この温度補償機構を生物時計の分子機構解明の鍵とみなして、温度上昇によって機能低下を起こす生化学的過程を、光情報伝達とエネルギ-獲得系の中に求る作業を行った。まず、光情報伝達系に関しては、ゾウリムシ単一個体の一日の行動様式の変化と関連付けて、下記のことを明らかにした。1)ゾウリムシに11ーcis型retinalが存在する。2)ゾウリムシ体内のcGMPは、明暗サイクル下では日の出とともに増加し、夕方から減少し始めた。そして夜間低くなり、明け方からは増加し始めた。この傾向は、恒暗条件でも維持された。3)ゾウリムシ静止膜電位は、日の出とともに陰性化し、夕方から陽性化し始めた。夜間最も陽性になった。4)ゾウリムシ単一個体は、昼は弱い刺激が与えられたときに電位依存性Ca^<2+>及びK^+電流によって発現するtypeIの行動(直進運動の一時停止)を示し、夕方になると比較的強い刺激が与えられたときCa^<2+>依存性Ca^<2+>及びK^+電流によって促進されるtypeII(1秒弱の後退運動)の行動を時折示すようになり、そして夜間はゾウリムシに強い刺激が与えられ細胞内へ流入する総和の電流が大きくなったために見られるtypeIII(数十秒間の後退運動)を行動を多く示すようになった。エネルギ-獲得系の調節機構に関しては、急激な温度上昇によって合成され、ミトコンドリアに移行してATP合成を低下させるhsp60ファミリ-蛋白質の機能を注目するに至った。そこでその蛋白質の経時変化を測定し、Q_<10>1となる生化学反応を検索するためのprotocolを作製し、予備実験を行った。1.従来使用してきたゾウリムシは、行動の概日リズムを示すが接合には概日リズムを示さない劣性株(acycler)で、加齢が進みリズムのcoherenceが悪くなっている。今後の分子生物学的研究のための適性材料を再評価するため、接合にも概日リズムを示す優勢株(cycler)の行動の概日リズムの性質を調べた。

cyclerの行動のリズムは、acyclerのそれと比較すると、リズムのcoherenceが良く、恒暗状態で自由継続リズムを長く記録できる、等の利点を持つこと、また自由継続リズムの周期(T)が短いという特徴を持つこと、を発見した。cyclerのリズムのcoherenceが良いことは、cyclerが生化学的研究材料として優れていると言える。また両株の_Tが異なることは、生物時計の分子機構を比較生理学的に研究するための優れた材料を提供すると言える。2.そのcyclerを使って、光情報伝達系に関与すると思われるopsin蛋白、cGMP、cAMP、PKCの概日変化、及び2時間の光刺激に対する応答を調べた:(1)opsinの分子量は5.5kbで、その濃度は概日変化を示さない、(2)cGMPは、日の出直後一過的な変動を示した後日中ゆっくり増大し、日没後一過的な変動を示した後、ゆっくり減少した。cAMPは、日の出・日没直後ー過的な変化を示したが、他の時間帯ではあまり変動を示さない、(3)PKCは、日中濃度が高く、夜間低いものと思われる。恒暗でのも基本的には同じ性質を示した。2時間の光刺激に対する応答から、cAMP・cGMP・PKCの順に活性が高くなることが確かめられた。3.ゾウリムシ・ミトコンドリアの明暗サイクル及び恒暗条件下での形態変化を調べた。日中まん丸な形態を示すミトコンドリアが多く、夜間は色々な形態をしたもの、中には分裂中のものも多い。またクリスタ構造も夜間はっきり見られる。形態からの所見では、日中盛んにATP合成を行っており、夜間はrestの状態であるものと思われる。1.生物時計によって制御されるゾウリムシの接合が、フィードバックして時計周期を変調すること、を明らかにした。接合は、細胞同士が直接接触する比較的強い相互作用であり、直接他の細胞の生物時計に影響を与える細胞間相互作用として始めて発見されたものである。これによって、従来考えられてきた生物時計における「入力系→自律振動系→出力系」と表される一方的な情報伝達流は誤りであることが明らかになった。このことは、時計周期に影響を与えるものが必ずしも時計の自律振動系に直接関与していないことを示唆するもので、生物時計の分子機構を考える上では重要なことである。2.前年度迄に確認はされていたが、(1)ゾウリムシ単一個体は日中真っ直ぐ速く泳ぎ夜間盛んに方向変換しながらゆっくり泳ぐこと、(2)cAMP(cGMP)濃度は日中濃くなり夜間は薄くなること、を組織的な研究によって明確なものにした。既に我々は、静止膜電位は日中深い陰極性を示し、夜間は浅い陰極性を示すこと、を明らかにしている。一方最近ゾウリムシにおいて、アデニル酸シクラーゼがcAMPの合成酵素であると同時にK^+チャンネルとしての役割も果たし、そのチャンネル部位を通過してのK^+イオンの細胞外流出がcAMP合成を促進するとすること、が明らかにされた。我々の測定結果を総合すると、アデニル酸シクラーゼ活性の概日変化が、ゾウリムシの行動・電気生理・cAMPの生化学を直接制御していること、が示唆される。3.そのほか、protein kinase Aの活性が、cAMP濃度とほぼ平衡して変化すること、蛍光色素INDO-1によって、ゾウリムシ細胞内Ca^<2+>イオンが日中は小胞体(液胞と考えられる)に濃縮されて存在し、夜間は薄くであるが細胞全体に分布していること、などを確かめた。
ムラサキツユクサ雄蕊毛による環境変異原間の相互作用機構の研究

環境制御した培養液循環(NSC)栽培装置内でムラサキツユクサBNL4430株(青/ピンクのヘテロ株)の若い花序をもつ根つきshootsを大量に育て、雄蕊毛におけるピンク色体細胞突然変異誘発頻度を指標として、異なる変異原間の相互作用機構の研究を行った。これまでに調査した5種類の単一作用型のアルキル化剤、メチルメタンスルホン酸(MMS)、硫酸ジメチル(DMS)、エチルメタンスルホン酸(EMS)、N-メチル-N-ニトロソウレア(MNU)、N-エチル-N-ニトロソウレア(ENU)のうち、MNUはX線と加算効果しか示さないが、他はすべてX線と明白な相乗効果を示し、X線との相乗効果とその現れ方がこれらアルキル化剤のSwain-Scott基質係数(s)、すなわち、MMS:0.88、DMS:0.86、EMS:0.67、MNU:0.42、ENU:0.26と必ずしも一致していなかった。そこでやはり単一作用型のアルキル化剤である硫酸ジエチル(DES)とX線との相乗効果を調査したところ、明白な相乗効果が見られたものの、その現れ方は、やはりs値とは一致しなかった。また、MMSとEMSの間では明白な相乗効果が見られたのに対して、MNUとEMSは単に加算効果しか示さなかった。一方、これまでに調査した3種類のプロミュータジェン、マレイン酸ヒドラジド(MH)、o-フェニレンジアミン(PDA)、N-ニトロソジメチルアミン(DMN)のいずれもが、X線照射後処理では明白な相乗効果を示したに対して、処理後X線照射では相殺効果を示し、ペルオキシダーゼ活性が、前者では高まるのに対して、後者では抑えられ、この酵素がこれらプロミュータジェンの活性化にかかわっていることが判明していた。ただし、DMN、PDA、MH処理中X線照射は、それぞれ相乗、加算、相殺効果を示していた。今回調査したプロミュータジェンでありかつ二作用型のアルキル化剤である1,2-ジブロモエタン(EDB)処理中のX線照射は明白な相乗効果を示したが、MHとEMSは常に相殺効果を示した。従来の結果と新たに得られた結果から、アルキル化剤、X線、および体内で活性化されて変異原となるプロミュータジェンが、DNA鎖切断、染色体切断など少なくとも部分的に共通の作用機構をもつ場合に相乗効果が現れ、そうでない場合には加算効果のみとなり、プロミュータジェンの活性化が他の変異原で阻害されると相殺効果を示すものと考えられる。環境制御した培養液循環栽培装置内でムラサキツユクサBNL4430株(青/ピンクのヘテロ株)の若い花序をもつ根つきshootsを大量に育て、雄蕊毛におけるピンク色体細胞突然変異誘発頻度を指標として、異なる変異原間の相乗効果など相互作用とその機構の研究を行った。

アルキル化剤である硫酸ジエチル(DES)がエックス線と明白な相乗効果を示すことを確かめ、さらにエックス線と明白な相乗効果を示すことがすでに判明していたエチルメタンスルホン酸(EMS)が、エックス線と加算効果しか示さないことがすでに判明していたN-メチル-N-ニトロソウレア(MNU)と、やはり加算的にしか働かないことを確かめた。DES、EMSとも、エックス線と同様に、DNA鎖や染色体をよく切断することが相乗効果を示す主因と考えられ、それに対してMNUがDNA鎖や染色体をあまり切断しないため、EMSと加算的にしか働かなかったものと考えられた。また、エックス線照射後にマレイン酸ヒドラジド(MH)処理を行うと明白な相乗効果を、逆にMH処理後にエックス線照射を行うと相殺効果を示すことがすでに判明していたため、エックス線と類似の作用をするEMSによる処理をMH処理前およびMH処理後に行ったところ、予期に反していずれの場合にも相殺効果が見られ、とくにEMS処理をMH処理前に行った場合には、MH単独処理よりも有意に低い突然変異頻度が得られた。プロミュータジェンであるMHの活性にペルオキシダーゼがかかわっていることがすでに判明していたことから、EMSがこの酵素またはその前駆体をエチル化し不活化したものと推察された。環境制御した培養液循環(NSC)栽培装置内でムラサキツユクサBNL4430株(青/ピンクのへテロ株)の若い花序をもつ根つきshootsを大量に育て、雄蕊毛におけるピンク色体細胞突然変異誘発頻度を指標として、異なる変異原間の相互作用機構の研究を行った。これまでに調査した単一作用型のアルキル化剤、メチルメタンスルホン酸(MMS)、硫酸ジメチル(DMS)、エチルメタンスルホン酸(EMS)、N-メチル-N-ニトロソウレア(MNU)、N-エチル-N-ニトロソウレア(ENU)のうち、MNUはX線と加算効果しか示さないが、他はすべてX線と明白な相乗効果を示し、X線との相乗効果とその現れ方がこれらアルキル化剤のSwain-Scott基質係数(s)、すなわちMMS:0.88、DMS:0.86、EMS:0.67、MNU:0.42、ENU:0.26と必ずしも一致していなかった。そこでやはり単一作用型のアルキル化剤である硫酸ジエチル(DES)とX線との相乗効果を調査したところ、明白な相乗効果が見られたものの、その現れ方は、やはりs値とは一致しなかった。また、MMSとEMSの間では明白な相乗効果が見られたのに対して、MNUとEMSは単に加算効果しか示さなかった。一方、これまでに調査したプロミュータジェンのマレイン酸ヒドラジド(MH)、ο-フェニレンジアミン(PDA)、N-ニトロソジメチルアミン(DMN)のいずれもが、X線照射後処理では明白な相乗効果を示したに対して、処理後X線照射では相殺効果を示し、ペルオキシダーゼ活性が、前者では高まるのに対して、後者では抑えられ、この酵素がこれらプロミュータジェンの活性化に関与していることが判明していた。ただし、DMN、PDA、MH処理中X線照射は、それぞれ相乗、加算、相殺効果を示していた。今回調査したプロミュータジェンでありかつ二作用型のアルキル化剤である1,2-ジブロモエタン(EDB)処理中のX線照射は明白な相乗効果を示したが、MHとEMSは常に相殺効果を示した。従来の結果と新たに得られた結果から、アルキル化剤、X線、および活性化されて変異原となるプロミュータジェンが、DNA鎖切断、染色体切断など少なくとも部分的に共通の作用機構をもつ場合に相乗効果が現れ、そうでない場合には加算効果のみとなり、プロミュータジェンの活性化が他の変異原で阻害されると相殺効果を示すものと考えられる。
植物病原性糸状菌および卵菌の病原性発現における活性酸素生成の役割

植物病原性、共生性糸状菌の生成する活性酸素が、植物への感染に必須であることが示されている。本研究では、糸状菌の活性酸素生成酵素Noxの制御因子の単離と機能解析を行った。その結果Nox制御因子であるNoxRと相互作用するRacA、BemA、Cdc24を単離し、さらにBemAと相互作用するCdc42を見出した。これら因子の遺伝子破壊株の表現型や細胞内局在性の解析から、Nox制御因子が植物感染時の細胞末端での活性酸素生成を制御し、細胞極性の確立に関与することが示唆された。1.活性酸素生成酵素NoxAの新たな制御因子の単離E. festucaeの活性酸素生成酵素NoxAとその制御因子NoxR、RacAが共生時の植物内での菌糸生育の制御に重要であることをこれまでに示している。NoxRは、RacAとの結合に必要なTPRドメイン、NoxA活性化ドメインをN末端側に保持し、C末端には機能未知なタンパク質相互作用ドメイン(PB1)を持つ。PB1ドメインは他のPB1ドメインと結合することが知られていることから、E. festucaeのゲノム配列から見いだされたPB1ドメインを持つ4つのタンパク質がNoxRのPB1ドメインと結合すると推定された。Yeast two hybrid法によりNoxR-Cdc24、Cdc24-Bem1、NoxR-NoxRの組み合わせで結合することが示され、Cdc24, Bem1が新たなNoxA制御因子として同定された。2.新規NoxA制御因子の細胞内局在性の解析新たに単離したNoxA制御因子Bem1、Cdc24およびこれまでに単離したNoxR、RacAとGFPの融合タンパク質をE. festucaeで発現したところ、これらタンパク質は菌糸先端に局在し、特にNoxRは菌糸が伸長時にのみ菌糸先端に局在化することが解った。この結果は、これらNoxA制御因子が菌糸先端での活性酸素生成に関与することを示唆した。3.新規NoxA制御因子のBem1の機能解析Bem1およびCdc24の遺伝子破壊ベクターを作製し、破壊株の単離を試みたところ、Bem1でのみ破壊株か単離された。この結果は、Cdc24が糸状菌の生育に必須である事を示していると考えられた。bem1破壊株を宿主植物であるペレニアルライグラスに接種したところ、noxA破壊株、noxR破壊株と同様に宿主植物の矮化が認められ、Bem1がNoxAの制御因子であり事が強く示唆された。1.活性酸素生成酵素NoxAの新規制御因子の機能解析E. festucaeの活性酸素生成酵素NoxAとその制御因子NoxR、RacAが共生時の植物内での菌糸生育の制御に重要であることをこれまでに示している。NoxRは、N末端側に存在するTPRドメインを介してRacAと結合し、C末端側に存在するタンパク質相互作用ドメイン(PB1)を介して、Cdc24、BemAおよびNoxR自身と結合することが解った。BemA、Cdc24およびNoxR、RacAとGFPの融合タンパク質をE. festucaeで発現したところ、これらタンパク質は菌糸先端に局在し、特にNoxRは菌糸が伸長時にのみ菌糸先端に局在化することが解った。E. festucaeの活性酸素生成は主に菌糸先端で検出されることから、これらNoxA制御因子が菌糸先端での活性酸素生成の制御に関与することが示唆された。bemA破壊株をE. festucaeの宿主植物であるペレニアルライグラスに接種したところ、noxA破壊株と同様に宿主植物の矮化が認められ、BemAがNoxAの制御因子であり事がさらに示唆された。2. RacAとCdc42の活性酸素生成における機能の解析NoxAの活性化因子であるRacAは、低分子量Gタンパク質である。E. festucaeのゲノム配列を解析したところ、RacAと極めて相同性の高いCdc42が見出された。RacAとCdc42が協調的に活性酸素生成や菌糸生育を制御している可能性が推定されたため、E. festucaeのRacAとCdc42の機能分化について調査した。Cdc42およびRacAとNoxA制御因子の相互作用をYeast two hybrid法により調べたところ、NoxR-RacA、BemA-Cdc42の特異的な結合が検出された。そこで、cdc42破壊株を作出し、活性酸素生成量を調べたところ、野生株と比較してcdc42破壊株では生成量の増加が認められた。racA破壊株では活性酸素生成量が低下することから、この結果より、NoxAによる活性酸素生成は2種類の相同性の高い低分子量Gタンパク質であるRacAとCdc42によって拮抗的に制御されていることが示唆された。