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太平洋の橋としての新渡戸稲造に見る英米文学の知識とその意義

英文Bushido(『武士道』)を著し、国際連盟の事務局で活躍した新渡戸稲造において、英米文学の知識がいかに大きな役割を果たしていたかを明らかにすることを目指して研究を行った。「太平洋の橋になる」との大志を抱いた青年時代の新渡戸は、英米文学の研究によってそれを実現できると考えた。最晩年の講演においても、「自分の本職は色々と変わったが、副業とも言うべき英文学への情熱は決して変わらなかった」と述懐している。このような新渡戸稲造の業績に対して、英文学の分野からどのような再評価を行いうるか、それをためす試みであった。この結果、これまで比較的閑却されてきた二つの点を明らかにすることができた。一つは、国際連盟における新渡戸稲造の活躍が、発足時の連盟の中心的スポークスマンとして、国際平和の理念に向けて世界をリードするというきわめて画期的なものであったこと。この成果は編著書、Nitobe Inazo : from Bushido to theLeague of Nations (Hokkaido University Press,2006)にまとめた。第二は、そのような平和思想と国際主義は、英文学を中心として西洋の文化を広く吸収し、それを生まれ育った日本的及び東洋的な文化と比較対照する過程ではぐくまれていったものだということ。この成果は、Joseph F.Kess and Helen Lansdowne(eds.),Why Japan Matters! (Centre for Asia-Pacific Initiatives University of Victoria,2005),Vol.IIに掲載の論文"A Japanese Internationalist : Inazo Nitobe's Knowledge of English Literature"にまとめた。新渡戸稲造が若い頃に「太平洋の橋になりたい」と言ったのは、彼が、農業経済学の専門の学業と平行して、英文学も学びたいと言ったときに、「なぜ英文学を?」と尋ねられてそれに答えて言った言葉である。本研究では、まず新渡戸の英文学の学識を明らかにするために、彼の英文著作の中の、英文学作品への言及を、英文学作品の電子テクストの検索機能を活用して、すべて洗い出すことを、基礎作業とした。ついで、彼の業績の中で、「太平洋の橋」と呼ぶにもっともふさわしいものは国際連盟事務局における活躍であったという観点に立って、国際連盟が発足するその前年、すなわち1919年ロンドンにおける新渡戸の足跡を、イギリスの研究者と共同して調べた。その結果、新渡戸が、国際連盟事務総長に就任する英国人エリック・ドラモンドと協力して、国際連盟のあるべき理念とヴィジョンを築き上げたその過程が明らかになった。国際連盟の中核は、各国代表が集まる総会や理事会ではなく、事務局であった。その事務局において、ドラモンドは実務的側面を担当し、新渡戸はそのスポークスマン、いわば連盟の顔という役割を果たしたことが、明らかになった。そのような重要な役割を果たすことができたその要因に、英文学を中心として広く西洋の思想や歴史に通じていた彼の学識があったことが推測された。これらの研究成果は、2004年10月、奇しくも新渡戸の終焉の地となったカナダ・ビクトリアにおいて、しかも新渡戸の命日に当たる10月15日に、カナダ日本研究学会の年次総会のパネラーとして、報告・発表した。そしてその発表原稿は、"Why Japan Matters?" : Proceedings from the Victoria JSACConferenceに掲載されることになっている。
河口感潮域の流れと拡散に関する数値計算法

感潮河川の河口域を対象に流れと拡散(特に塩分拡散)を解析するための数値解析法を検討した。解析モデルとしては、河川の横断方向には流れおよび塩分濃度が一様であると仮定した鉛直2次元モデルを採用した。拡散問題を取り扱う場合、水平および鉛直渦動拡散係数が重要となるので、数値解析モデルの構築に加えて、塩分濃度分布と渦動拡散係数の関係について室内実験による解析も行った。本研究で得られた結果をまとめると次のようである。1.数値解析モデルによって感核河川の塩分濃度分布を再現するには、境界条件の設定と水平および鉛直渦動拡散係数の評価が重要となる。2.境界条件でも、特に下流境界における塩分濃度分布をどのように与えるかが問題となる。塩水楔の水理条件で上部甘水層厚を求め、それ以下の水深は海水の塩分濃度とする境界処理方法を筑地川に適用した結果は河口域における塩分濃度分布を定性的には表現できたけれども、観測値との一致は十分でなかった。実際の河川の濃度分布を再現するためには境界条件により適切な処理に加えて、河幅方向を考慮したモデルに改良することが必要であろう。3.室内実験(潮汐のような周期的な流れでなく吹送流による塩分拡散実験)によれば、実験結果の濃度分布は、鉛直渦動拡散係数をリチャ-ドソン数の関数、水平渦動拡散係数は塩分濃度分布に関係なく一定、とした計算でほぼ再現することができた。なお、拡散係数は現象のスケ-ルと関連するので、室内実験の結果をそのまま実際の河川において適用できるわけではない。今後は以値解析モデルの改良と現地調査により、数値解析による再現塩分濃度分布と実測値がフィットする条件のもとで実河川の拡散係数を推定し、室内実験と実河川での拡散係数の関連を明らかにしていく必要がある。
脂質代謝におけるD-プロリンおよびプロリンラセマーゼの機能解析

マウスの諸組織中には、D-プロリン(Pro)が存在することが明らかにされているが、D-Proの生合成酵素であるプロリンラセマーゼをコードすると思われる遺伝子MPRが発現していることが明らかとなった。MPRは、脂肪組織に特異的に発現しており、脂肪組織ではタンパク質として翻訳されていることも確認された。さらに、高脂肪食を与えたマウスにおいては、発現量が低下するため、脂質代謝との関連性が示唆された。D型アミノ酸は、細菌類に特有のものであると考えられてきたが、近年、動物界においても、無脊椎動物から哺乳類に至るまで広く存在することが明らかになっている。マウスの脂肪組織においては、D-, L-プロリンの相互変換を触媒するプロリンラセマーゼをコードすると思われる遺伝子(MPR)が脂肪組織に特異的に発現している。そこで、本研究では、プロリンラセマーゼの機能解析を通じて脂肪組織でのD-プロリンの生理機能を明らかにし、D-プロリンおよびプロリンラセマーゼの脂質代謝における役割、さらには脂質代謝異常に関わる病態との関連性を明らかにすることを目的とした。MPRがプロリンラセマーゼをコードするかどうかを確認するために、マウスcDNAクローンから、大腸菌およびバキュロウィルスを用いて組換えタンパク質を産生し、プロリンラセマーゼ活性を測定した。酵素活性は、L-プロリンを基質として酵素反応を行い、生成物であるD-プロリン含量を測定した。D-プロリンは高感度化のためにNBD化し、HPLCを用いて測定を行ったが、酵素活性は検出されなかった。そこで、マウスの組織から粗酵素液を調製し、活性を測定することとした。まず、マウスにおけるMPRの組織分布を明らかにするためにウェスタンブロッティングを行った。抗体は、MPRの部分配列を用いた抗ペプチド抗体を作製した。その結果、脂肪組織、卵巣、副腎、腎臓においてMPRの発現量が高く、特に、脂肪組織の粗酵素液では夾雑タンパク質が少ないため、脂肪組織を用いて酵素活性を測定することとした。また、夾雑物に酵素反応の阻害剤が含まれている可能性が考えられるため、DEAE-TbyopearlおよびQ-Sepharoseカラムクロマトグラフィーを用いて粗精製を行った。来年度は引き続き、大量の脂肪組織を用いて粗酵素液を調製し、精製した後に酵素活性を測定する。近年、数種のD-アミノ酸が哺乳類においても見出されており、D-プロリン(Pro)は、マウスの諸組織中に存在することが明らかにされている。D-プロリンの生合成酵素であるプロリンラセマーゼは、細菌類や寄生虫に存在することが明らかにされているが、マウスにおいてもプロリンラセマーゼをコードすると思われる遺伝子(MPR)が発現していることが明らかとなった。MPRはマウスの諸組織中に発現がみられるが、特に、脂肪組織において高い発現量を示した。さらに、高脂肪食を与えたマウスでは、普通食を与えたマウスよりも、MPRの発現量が低下していることが明らかとなったため、脂質代謝との関連性が示唆された。このMPRがプロリンラセマーゼ活性を示すものであるか、マウスの脂肪組織から調製した粗酵素液と、大腸菌およびバキュロウィルスを用いて産生した組換えタンパク質を用いてプロリンラセマーゼ活性を測定したが、酵素活性は未だ検出できていないため、今後さらなる検討が必要である。MPRのタンパク質レベルでの発現についても、抗MPR抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認を行ったところ、脂肪組織、卵巣、副腎、腎臓において高い発現量がみとめられたため、MPRはタンパク質として翻訳され、脂肪組織において何らかの機能を示していることが予想された。寄生虫のプロリンラセマーゼの活性部位は、2つのシステイン(Cys)残基であることが同定されているが、MPRでは、この1つのCysが他のアミノ酸に置換されている。この変異により、MPRがプロリンラセマーゼ活性を示さない、他の機能を示すタンパク質である可能性も示唆された。
流体デバイスにより腸内細菌の維持・増殖を制御した腸管上皮細胞培養系の開発

多孔質膜に対して上下の二つの流路を有するマイクロ流体デバイスを作製した。そのデバイスには上下の流路に対して電極を設置して膜を介した電流の抵抗値を計測できるようにした。腸管上皮細胞をその膜状に播種し、上下に培地を流しながら、密着結合の形成をその抵抗値の上昇から確認することができた。さらに、嫌気条件を構築するために、そのデバイスを培養するための嫌気チャンバーを作製して、嫌気条件下でマイクロ流体デバイス中で腸管上皮細胞を安定的に培養できることを確認した。このデバイスの細胞側に対して上層(apical側)の培地から大腸菌を導入し、新鮮な培地を流し続けたところ、大腸菌と共に腸管上皮細胞も安定的に培養できることに成功した。さらに、腸管上皮細胞の下層に生体内と同様に免疫細胞であるマクロファージ細胞株を播種して大腸菌との共培養を行った。その結果、マクロファージが活性化し炎症性サイトカインの発現が上昇していることを示した。そして、その刺激を上皮細胞が受け取り炎症マーカー遺伝子の発現上昇、および密着結合の指標である電気抵抗値の低下によるバリア機能の崩壊が確認できた。この結果からマイクロ流体デバイス内で流速をかけた場合でも細胞間、細胞と細菌間のコミュニケーションがあることを確認した。1年目はデバイスを作製することと腸管培養組織を構築することを主としておこなったが、予想以上に成功し、大腸菌の共培養も成功し、さらには、マクロファージも共培養し、大腸炎モデルとしても応用できることが示せた。他の菌種も共培養し、人工便モデルを構築し、食料品、サプリメントなどの腸管吸収等を確認していく予定である。
本州弧における下部地殻の形成と進化

本州弧には白亜紀以降新生代間に活動した珪長質苦鉄質火成岩類が広く分布している。新生代火山岩中に下部地殻から由来した苦鉄質グラニュライト・はんれい岩、上部マントルから由来した超苦鉄質岩が捕獲されている。これらの岩石の岩石学、主要元素・微量元素組成、Sm-Nd・Rb-Sr、K-Ar年代学、ストロンチウム・ネオジム同位体比初生値を用いた研究から次ぎの点が明らかとなった。I本州弧、棚倉構造線より西側地域;(1)西南日本弧の領家帯(九州肥後帯を含めない)、山陽帯の一部、山陰帯西部、東北日本弧の足尾山地、筑波山地の下部地殻は古生代末中生代初め(250-200Ma)の頃、大陸性リソスフェアの溶融によって形成され、ソレアイト質化学組成をもっている。この地域に分布する白亜紀新第三紀初期の火成岩は、この下部地殻と上部マントルを起源としている。(2)九州、山陰西部地域をとおり東北日本弧の佐渡、朝日山地に至る地域(但し日本海中は不明)には(1)とは異なった歴史・特徴をもつ苦鉄質下部地殻上部マントルが分布している。(3)上の(1)と(2)に挟まれた一部の地域(山口県広島県・兵庫県)には(1)(2)両タイプの下部地殻上部マントル物質が混在して分布している。したがって、この地域の火成岩は(1)(2)の中間的特徴(特に同位体)をもつ。II.本州弧、棚倉構造線より東側地域;I.地域と異なるタイプの下部地殻マントルを起源としている可能性がある。この地域に分布する火成岩はこれらを起源としているが、北上山地の太平洋に沿った地域には下部地殻を起源としない、即ちサブタクトした海洋性プレートを起源とする珪長質火成岩が分布している。III.中新世中期以降;日本海形成と関連した新たに構築された下部地殻マントル物質が存在している。これらの物質は日本海側の火成岩の起源物質となった。しかしながら太平洋側の火成岩は中新世中期以前と同じ下部地殻上部マントル物質を起源としている。(1)西南日本弧領家帯には、はんれい岩類、変輝緑岩などの苦鉄質岩が分布している。生駒山はんれい岩体から採集された試料についてSm-Nd全アイソクロン法により年代を求め192Maが得られた。高松市近くの鷲ノ山中新世安山岩には地殻深所(恐らく下部地殻上部上部地殻下部)からもたらされたグラニュライト質岩が捕獲岩として産する。これについてもSm-Nd全岩アイソクロン法により年代測定を行い、244Maが求められた。ソレアイト質火山岩を源岩とする変輝緑岩と鷲ノ山グラニュライトとの間には主要・微量化学組成に関する類似性が見られる。

また、それらのSrおよびNd進化線中に後期白亜紀花崗岩類のSrおよびNd同位体比初生値がプロットされる。以上の事実は二畳紀末ジュラ紀初期に形成された変輝緑岩グラニュライトが後期白亜紀花崗岩類の起源物質となっている可能性を示しており、今後これら苦鉄質岩の溶融実験により実際に花崗岩質のメルトが形成されるのかどうかの検討を進める。また変輝緑岩と花崗岩類中には20億年の年代を有するジルコンが含まれている。これらも西南日本下部地殻の形成時期を解く重要な情報源の可能性が強く、その観点で研究を更に進める。以上のほか山陰、北九州から産出する下部地殻源物質についてSr、Nd同位体的研究を進めているが地表に分布する様々な珪長質火成岩類と、年代・同位体比に関する類似性がみられ、両者は成因的に密接に関連している事を示している。(2)東北日本弧については山形県温海、北部フォッサ・マグナの米山、海川の新生代火山岩から産出するはんれい岩質捕獲岩についてSrとNd同位体比測定を行ったが、母岩の火山岩と同位体的類似性も見られ、今後それらについての岩石学的・鉱物学的研究を進める予定である。(3)ゴンドワナ超大陸を構成する南極、スリランカ、インドの地殻の比較的深部で形成されたと思われるグラニュライトについてRb-Sr、Sm-Nd系年代に関する研究を進め、その結果は論文として公表している。今後、それら年代とSr、Nd同位体比初生値からその地域の下部地殻形成過程の解明を進める。平成7年度は西南日本弧の下部地殻源物質について主要・微量化学組成、Sr、Nd同位体比および地質年代学的研究を行ってきた。平成8年度においても西南日本弧の研究を引き続き行っており、その結果は鳥取県三朝町で行われた1996年度質量分析学会同位体比部会で発表した(大石祥之・加々美寛雄;西南日本弧下部地殻物質のSr、Nd同位体比とSm-Nd年代)。研究対象地域の山口県宇田島の下部地殻源岩石から得られた年代はジュラ紀末期の147Ma、古第三紀始新世末期の38Maと新生代後期(アイソクロンでは0Ma)であった。山口県千石岳からは後期白亜紀(96Ma)、また北九州黒瀬からは白亜紀後期(84-73Ma)、古第三紀始新世最末期(37Ma)の年代が得られた。ジュラ紀を除いたこれらの年代は西南日本弧における激しい火成活動の時期と一致している。この年代は下部地殻が激しい火成活動のため温度上昇した事と下部地殻自身がこれら火成岩類の起源となっている事の可能性を示している。この二つのいずれの可能性が高いかは鉱物学・岩石学的方法から現在検討中である。平成8年度の主要研究対象地域は東北日本弧である。試料採集地点は一ノ目潟(男鹿半島)、温海、北部フォッサ・マグナ、南北フォッサ・マグナのほぼ境に位置する八ケ岳、南部フォッサ・マグナの山梨県佐野川地域である。採集された捕獲岩の殆どははんれい岩である。一部のはんれい岩のSr、Nd同位体比は火山岩と一致しているが、また一部のものについては一致していない。前者については母岩との成因的関連性が暗示されるが、後者はそのような関係にない事を示している。後者について鉱物分離を行い同位体比を測定すると鉱物間に同位体比の差が認められる。この事はこれらはんれい岩が母岩の活動年代である新生代後期よりはるかに古く、これら火山岩の基盤となっている可能性を示している。しかし下部地殻源かどうかは今後の研究が必要となる。東北日本弧は、白亜紀から第四紀にかけ断続的にではあるが活発な火成活動がみられる。フォッサ・マグナ地域および東北日本弧日本海地域に活動した新生代火山岩類には、下部地殻上部マントル源苦鉄質超苦鉄質岩が捕獲されている。
単純ヘルペスウイルスの蛋白発現シャット・オフ機能の分子生物学的解析

単純ヘルペスウイルスUL41遺伝子産物はウイルス粒子のテグメントに存在する燐酸化タンパク質である。このタンパク質はウイルスが宿主細胞に感染後、mRNAの寿命を縮め宿主細胞の蛋白合成を抑制する,いわゆるシャット・オフ機能を担っていることが報告されている。しかし、このタンパク質がどの様にその機能を発現するのかその詳細は全く明らかにされていない。そこでUL41の作用を明らかにし、細胞のトランスクリプション後の蛋白合成調節機構を明らかにすることを目的にこの研究を開始した。まずPCRを用い、単純ヘルペスウイルス1型、2型のUL41遺伝子をクロニングした。この遺伝子産物を解析する目的で、バキュロウイルスの発現系の確立を試みている。即ち、UL41遺伝子をpBacPAK9ベクターにリクローニングし、Sf9細胞にバキュロウイルスDNAとコトランスフェクションした。現在、そこから得られたウイルスより、効率よくUL41を発現するウイルスのクローニングを行っている。またUL41が細胞の蛋白と相互作用して蛋白合成の抑制をしていることが予想されるので、酵母を用いたTwo-hybride systemで細胞側の蛋白を同定する試みを現在進めている。残念ながら今年度は結果を得るに至らなかったが、2つのアッセイシステムを開発することが出来たので、来年度研究の発展が期待される。
CYP2B P450誘導機構解明の新展開:誘導不全変異ラット遺伝子と転写因子の解析

CYP2Bサブファミリーに属するチトクロームP450(P450)はフェノバルビタール(PB)等の外来化学物質によって誘導されることが知られている。この誘導の機構についてはまだ多くが未解明である。本学動物実験施設で繁殖していたSD(Qdj : SD)ラットは、PB処理によってもCYP2B2の誘導が起こらない変異ラットである。本ラットはCYP2B P450の発現制御機構を解析する上で極めて貴重と考えられ、誘導不全の原因を解明できれば、問題の解決に資することが期待できる。そこで申請者はこのようなアイデアを基に本変異動物の遺伝子構造解析を中心にして解析した。その結果、Qdj : SDラットでの誘導不全の原因はエクソンでの塩基置換や欠失等に基づく変異タンパク質の生成によるものではないことを確認した。また、誘導に重要な役割を持つと言われている誘導剤応答性配列(PBREM ; Phenobarbital-Responsive Enhancer Module)を含む遺伝子上流の約4.7kbpにも重大と考えられる変異は認められなかった。PBREM結合性の転写因子の機能不全をも考え、ゲルシフトによる分析を行ったが、野生型ラットと同様のDNA-核抽出物結合が確認された。一方、Qdj : SDラットのCYP2B2 mRNA発現量を薬物未処理の野生型ラットと比較した結果、前者の発現量は1/10以下であった。これらの結果を総合して、Qdj : SDラットのCYP2B2が誘導剤に応答しない理由は、1)イントロン等の今回調査した以外の遺伝子領域に欠陥が存在するか、あるいは2)PBREM結合性のもの以外の転写制御因子の欠陥であることが明かであると考えられた。また、誘導不全は誘導剤に対する応答性というよりは、基礎発現の障害に起因することが強く示唆された。薬物代謝能の高い肝チトクロームP450のうち、CYP2Bサブファミリーはフェノバルビタール(PB)等の外来化学物質によって誘導されることが知られている。この現象は薬物の活性や毒性に深く関わることから、かなり研究されてきたが、誘導の機構についてはまだ多くが未解明である。一方、本学動物実験施設で繁殖しているSD(Qdj:SD)ラットは、phenobarbital(PB)処理によってもCYP2B2の誘導が起こらない変異ラットである(Hashimoto et al.,J.Biochem.,103:487,1988)。本ラットはCYP2BP450の発現制御機構を解析する上で極めて貴重と考えられ、誘導不全の原因を解明できれば、問題の解決に資することが期待できる。そこで申請者はこのようなアイデアを基に本変異動物の遺伝子構造を解析した。その結果、Qdj:SDラットでの誘導不全の原因はエクソンでの塩基置換や欠失等に基づく変異タンパク質の生成によるものではないことを確認した。また、誘導に重要な役割を持つと言われている遺伝子上流近位の誘導剤応答性配列(PBREM;Phenobarbital-Responsive Enhancer Module)にも全く変異は認められなかった。従って、Qdj:SDラットのCYP2B2が誘導剤に応答しない理由は、1)転写制御因子の欠陥かあるいは2)PBREM以外の遺伝子領域に欠陥であることが明かであり、問題点をかなり絞り込むことができた。現在、これらの可能性のうちどれが真実かを明かにするべく研究を継続している。本学動物実験施設で繁殖していたSD(Qdj : SD)

ラットは、PB処理によってもCYP2B2の誘導が起こらない変異ラットである。本ラットはCYP2B P450の発現制御機構を解析する上で極めて貴重と考えられ、誘導不全の原因を解明できれば、問題の解決に資することが期待できる。そこで申請者はこのようなアイデアを基に本変異動物の遺伝子構造解析を中心にして解析した。その結果、Qdj : SDラットでの誘導不全の原因はエクソンでの塩基置換や欠失等に基づく変異タンパク質の生成によるものではないことを確認した。また、誘導に重要な役割を持つと言われている誘導剤応答性配列(PBREM ; Phenobarbital-Responsive Enhancer Module)を含む遺伝子上流の約4.7kbpにも重大と考えられる変異は認められなかった。PBREM結合性の転写因子の機能不全をも考え、ゲルシフトによる分析を行ったが、野生型ラットと同様のDNA-核抽出物結合が確認された。一方、Qdj : SDラットのCYP2B2 mRNA発現量を薬物未処理の野生型ラットと比較した結果、前者の発現量は1/10以下であった。これらの結果を総合して、Qdj : SDラットのCYP2B2が誘導剤に応答しない理由は、1)イントロン等の今回調査した以外の遺伝子領域に欠陥が存在するか、あるいは2)PBREM結合性のもの以外の転写制御因子の欠陥であることが明かであると考えられた。また、誘導不全は誘導剤に対する応答性というよりは、基礎発現の障害に起因することが強く示唆された。
活性酸素による黄体退行制御機構の解明

本書は、平成21年度の3カ年にわたり科学研究金補助金を受けた基盤研究一般(C)の課題である「活性酸素による黄体退行制御機構の解明」の成果をまとめたものである。1)LECにおける一酸化窒素合成酵素(iNOSおよびeNOS)の発現に及ぼすPGFの影響ウシ中期黄体より単離した細胞がLECであることをFactor VIII(von Willebrand factor)抗体を用いて確認し、培養LECにおけるPGF receptor(FPr)mRNA発現を半定量的RT-PCR法,protein発現をWerstern blot法で,さらにウシ黄体組織におけるFPrの局在ならびに培養LECにおけるFPr発現を免疫細胞化学的に検討した。黄体組織切片におけるFPr抗体に対する陽性反応は,黄体細胞だけでなく血管内皮細胞にも認められ,また培養LECにもFPrの発現していることが明らかになった。培養LECのiNOSおよびeNOSのmRNAならびにprotein発現量とNOSキットでNOS活性に及ぼすPGFの影響を調べたところ、PGFは培養LECのeNOS mRNAおよびproteinの発現に影響を及ぼさなかったが、iNOS mRNAおよびprotein発現量を有意に増加させた。2)LECにおける活性酸素分解酵素(SOD)に及ぼすPGF、H_2O_2およびNONOateの影響ウシにおいてPGF投与直後に卵巣静脈中の酸素およびROSの一種である一酸化窒素(NO)が急増すること、またNOが黄体の機能的ならびに構造的退行に深く関与することを報告してきた。一方、SODは過剰に生産されたROSを分解する酵素として知られていることから、PGFは黄体内SODの発現ならびに活性を抑制し、ROSの分解が進まないことによって黄体退行が促進すると考えられる。本研究ではPGFの黄体退行機構におけるPGFとROSの関係を明らかにする目的で、ウシ中期黄体より単離したLECをコンフルエントになるまで培養し、液換と同時にPGF、過酸化水素(H_2O_2)およびNOのドナーであるNONOateを添加し、さらに2または24時間培養した後SOD mRNAおよびprotein発現、ならびにSOD活性を半定量的RT-PCR法、Western blot法またはSODキットでそれぞれ調べたところ、2時間培養したLECにおけるPGF、H_2O_2およびNONOateは培養LECのSOD mRNAおよびproteinの発現量ならびに活性を有意に増加した。一方、24時間培養したLECにおけるPGF、H_2O_2およびNONOateはSOD mRNAおよびprotein発現量を有意に抑制した。さらに、PGF産生に及ぼすH_2O_2、NONOateおよびSODの影響を検討した結果、ROSおよびSODはPGF産生を有意に増加した。ウシ培養黄体細胞においてNOはP_4分泌を抑制し、apoptosisを誘導することが示されおり、さらに本研究の結果と併せて考えると、子宮から分泌されるPGFはLECのNO合成を刺激することにより黄体細胞のP_4分泌を抑制し、黄体退行を促進する可能性が示された。さらに、PGFおよびROSはLECのSOD発現と活性を抑制することによって細胞内ROSが蓄積され、黄体細胞のapopotosisを誘導することが示唆された。また、ROSはLECのPGF分泌を刺激することから、LECにおいてPGFとROSの間にはポジティブフィードバック機構が存在し黄体退行を促進することが示唆された。

本研究ではPGFの黄体退行機構におけるPGFとROSの関係を明らかにする目的で、ウシ中期黄体より単離したLECをコンフルエントになるまで培養し、液換と同時にPGF、過酸化水素(H_2O_2)およびNOのドナーであるNONOateを添加し、さらに2または24時間培養した後SOD mRNAおよびprotein発現、ならびにSOD活性を半定量的RT-PCR法、Western blot法またはSODキットでそれぞれ調べたところ、2時間培養したLECにおけるPGF、H_2O_2およびNONOateは培養LECのSOD mRNAおよびproteinの発現量ならびに活性を有意に増加した。一方、24時間培養したLECにおけるPGF、H_2O_2およびNONOateはSOD mRNAおよびprotein発現量を有意に抑制した。さらに、PGF産生に及ぼすH_2O_2、NONOateおよびSODの影響を検討した結果、ROSおよびSODはPGF産生を有意に増加した。ウシ培養黄体細胞においてNOはP_4分泌を抑制し、apoptosisを誘導することが示されおり、さらに本研究の結果と併せて考えると、子宮から分泌されるPGFはLECのNO合成を刺激することにより黄体細胞のP_4分泌を抑制し、黄体退行を促進する可能性が示された。さらに、PGFおよびROSはLECのSOD発現と活性を抑制することによって細胞内ROSが蓄積され、黄体細胞のapopotosisを誘導することが示唆された。また、ROSはLECのPGF分泌を刺激することから、LECにおいてPGFとROSの間にはポジティブフィードバック機構が存在し黄体退行を促進することが示唆された。【目的】ウシにおいて、黄体退行時に大量の免疫細胞が流入することが知られており、免疫細胞より産生されるサイトカイン(腫瘍壊死因子;TNF、interferonγ;IFN)が黄体退行機構に関与することが示されている。また、一酸化窒素(NO)がウシ黄体細胞のプロジェステロン(P4)分泌を抑制すると共にアポトーシスをも誘導することが示されており、ウシ黄体退行機構におけるNOの重要性が明らかにされつつある。過去の報告において、TNFおよびIFNがマウス乳腺細胞のNO合成を刺激すること、炎症現象として考えられている排卵時に卵胞内膜細胞のNO合成量の増加することが示されている。これらのことから、サイトカインとNOが黄体退行機構において密接に関与することが考えられるが、その詳細は明らかではない。本研究では、黄体内で最も高いNO合成能を有する血管内皮細胞におけるNO合成調節機構を明らかにする目的で、2種類のNO合成酵素(誘導型;iNOS、血管内皮型;eNOS)mRNA、タンパク発現およびNO合成に及ぼすTNFとIFNの影響について検討した。さらに、ウシ黄体由来血管内皮細胞は、黄体により多量に合成されるステロイドホルモンであるP4およびエストラジオール17β(E2)に常に晒されており、これらのホルモンから何らかの影響を受けることが示唆されることから、iNOSおよびeNOSタンパク発現に及ぼすP4およびE2の影響についても併せて検討した。【方法】ウシ中期黄体(排卵後8-12日)より単離した血管内皮細胞を、10%子牛血清を含む培養液でコンフルエントに達するまで培養した。その後、0.1%BSAを含む培養液に交換すると同時にTNF(2.9nM)、IFN(2.5nM)、E2(10nM)またはP4(3.2μM)を添加し、さらに24時間培養を継続した。
超臨界二酸化炭素を用いる高速・高収率ポリ乳酸合成技術の開発

超臨界二酸化炭素中で有機分子触媒を用いた高速・高収率ポリ乳酸合成を試みた。有機分子触媒としてジアザビシクロウンデセン(DBU)及びN,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)を用いた。触媒濃度を対モノマー0.5wt%の条件において、反応時間1時間以内で収率が95%以上となる反応温度の下限は、DBU触媒では60°C、DMAP触媒では100°Cだった。この時の生成ポリ乳酸の重量平均分子量はDMAP触媒(約6000)<DBU触媒(約60000)となった。更にDMAP触媒を用いたポリ乳酸合成におけるポリ乳酸生成反応速度解析を行った結果、一次反応でL-ラクチドの開環重合を表すことが出来た。平成27年度は研究項目として、「有機分子触媒を用いたポリ乳酸合成反応特性の把握」、「超臨界二酸化炭素中でのポリ乳酸の合成反応機構の解析」を行った。一つ目の項目について、モノマーとしてL-ラクチド、触媒としてジアザビシクロウンデセン(DBU)を用いたポリ乳酸合成を行ったところ、6070°C、10MPaの条件において、反応時間1時間で95%以上の収率を得ることができた。しかし70°Cにおける合成では生成ポリ乳酸が黄色く着色しており、無着色なポリ乳酸を得るためには、60°Cが最適温度であることを明らかにした。また60°Cで合成した生成ポリ乳酸の重量平均分子量は、反応時間の経過と共に増加し、反応時間1時間で最大値の6.8万となった。それ以降は生成ポリ乳酸の分解も併発し、重量平均分子量は低下したが、反応時間全体において、生成ポリ乳酸の分散度は2以下となったことから、収率や重量平均分子量は反応時間に依存するが、分散度はあまり影響しないことが明らかになった。2つ目の項目について、クロマトグラフィックインパルス応答(CIR)法を用いて、3560°C、8.030.0MPaの超臨界二酸化炭素中のL-ラクチドの拡散係数の測定を行った。その結果、拡散係数はどの温度においても圧力の低下に伴って大きくなり、臨界点付近では急激に大きくなった。さらに温度と圧力をパラメータとした、超臨界二酸化炭素中のL-ラクチドの拡散係数の相関式を確立し、本式を用いることで拡散係数を良好に表すことができた。「有機分子触媒を用いたポリ乳酸合成反応特性の把握」については、当初予定していた収率95%以上、反応時間1時間以内で、無着色なポリ乳酸を安定して合成可能な反応条件を見出すことができた。また「超臨界二酸化炭素中でのポリ乳酸の合成反応機構の解析」については、超臨界二酸化炭素中でのモノマーと触媒の拡散係数の測定・推算を予定通り遂行することができたため。平成28年度は、モノマーとしてL-ラクチド、触媒としてN,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)を用いたポリ乳酸合成を行ったところ、100°C、10MPaの条件において、反応時間60分で90%、120°C、10MPaでは95%の収率を得ることができた。また100°C以上で合成した生成ポリ乳酸の重量平均分子量は、反応時間の経過と共に増加して反応時間160分で最大値を取り、それ以降は生成ポリ乳酸の分解も併発し、重量平均分子量は低下した。しかし反応時間全体において、生成ポリ乳酸の分散度は上昇傾向があるものの2以下となったことから、収率や重量平均分子量は反応時間に依存するが、分散度はあまり影響しないことが明らかになった。さらに100°C以上の条件において、超臨界二酸化炭素中にL-ラクチドが可溶化する様子を可視化し、大気圧下では固体だったL-ラクチドが、超臨界二酸化炭素が存在することによって可溶化することが確認された。また平成27年度に得られたジアザビシクロウンデセン(DBU)触媒を用いたポリ乳酸合成の測定結果を基に重合反応の速度解析を行い、反応初期においては超臨界二酸化炭素中でのL-ラクチドの重合速度はモノマー濃度の1次反応で表されることが明らかになった。ポリ乳酸合成反応については、DMAP触媒を用いた場合にも当初予定していた収率95%以上、反応時間1時間以内で、無着色なポリ乳酸を安定して合成可能な反応条件を見出すことができた。またDBU触媒を用いた反応速度解析を行うことができ、反応場の様子のin-situでの観測を予定通り遂行することができたため。超臨界二酸化炭素中でのポリ乳酸合成反応について、3種類の触媒について反応温度、反応時間等に対するポリ乳酸収率を比較した。ポリ乳酸収率は、生成ポリ乳酸中の残存モノマー量を測定することで求めた。その結果、モノマーであるL-ラクチド濃度を反応容器体積に対して20wt%、触媒濃度をモノマーに対して0.5wt%の条件において、反応時間1時間以内で収率が95%以上となる反応温度の下限は、従来のオクチル酸スズ(II)触媒を用いた場合は150°C、ジアザビシクロウンデセン(DBU)触媒では60°C、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)触媒では100°Cと、DBU触媒<DMAP触媒<スズ触媒の順となること、この時の生成ポリ乳酸の重量平均分子量はDMAP触媒(約6000)<DBU触媒(約60000)<スズ触媒(約230000)となることが明らかになった。

更にDMAP触媒を用いたポリ乳酸合成におけるポリ乳酸生成反応速度解析を行った。本実験ではポリ乳酸収率が反応時間経過に伴って増加する間は、生成ポリ乳酸の重量平均分子量も反応時間とともに増加していたことから、ポリ乳酸収率が増加している間は重合反応のみが進行すると仮定して反応速度解析を行った。解析に用いた反応温度は80°Cから120°C、反応時間は60分までの範囲である。その結果、昨年度のDBU触媒を用いた際の反応速度解析と同様に一次反応でL-ラクチドの開環重合を表すことが出来た。また重量平均分子量はポリ乳酸収率が一定になる60分以降も反応時間の経過とともに増加したが、ある時間以降では反応時間とともに減少したことから、L-ラクチドの開環重合によるポリ乳酸合成反応は、重合反応と生成ポリ乳酸の分解反応の平衡反応と考えられる。超臨界二酸化炭素中で有機分子触媒を用いた高速・高収率ポリ乳酸合成を試みた。有機分子触媒としてジアザビシクロウンデセン(DBU)及びN,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)を用いた。触媒濃度を対モノマー0.5wt%の条件において、反応時間1時間以内で収率が95%以上となる反応温度の下限は、DBU触媒では60°C、DMAP触媒では100°Cだった。この時の生成ポリ乳酸の重量平均分子量はDMAP触媒(約6000)<DBU触媒(約60000)となった。更にDMAP触媒を用いたポリ乳酸合成におけるポリ乳酸生成反応速度解析を行った結果、一次反応でL-ラクチドの開環重合を表すことが出来た。平成28年度は超臨界二酸化炭素中でN,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)を用いたポリ乳酸の合成反応実験を行い、反応温度、反応圧力、反応時間、モノマー濃度、重合開始剤濃度、触媒種、触媒濃度をパラメータとし、各条件で得られたポリ乳酸の収率、重量平均分子量、分子量の分散度の反応時間依存性を測定して、反応条件と収率及び重量平均分子量の関係性を明確にする。また平成27年度に取得したDBUを触媒として用いる反応条件に対する収率、重量平均分子量の関係のデータ等を基に、反応速度式の導出と反応速度解析を行う。また、ポリ乳酸中での超臨界二酸化炭素の拡散係数の測定・推算を行い、超臨界二酸化炭素中でのポリ乳酸合成の反応機構解明につなげる。平成29年度は超臨界二酸化炭素中でN,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)を用いたポリ乳酸の合成反応条件に対する収率、重量平均分子量の関係のデータ等を基に、反応速度式の導出と反応速度解析を行う。また、解析に不足しているデータが残っているため、必要な追実験を行う。更に超臨界二酸化炭素中でのポリ乳酸の粘度の測定・推算を行い、超臨界二酸化炭素中でのポリ乳酸合成の反応機構解明につなげる。化学工学
アジアにおける生きものがたり-生き物の生死をめぐる文化的対応に関する比較研究

本研究は、日本及び東南アジアにおいて、日常の中で人々が生き物の死をどのように受け止め、対処してきたかを考えることで、日本独自と言われてきた生きもの供養の相対化を目指してきた。そのために、(a)研究会、(b)国内合同調査、(c)日本及び東南アジアでの事例研究の調査、(d)海外フィールドでの合同調査と、4つの活動を組み合わせ、メンバー間で問題意識と視点の共有化を図りながら、それぞれが事例研究に取り組む体制で進めてきた。今年度(9月末日段階)は、(b)国内合同調査および、(c)事例研究調査を実施した。(b)国内合同調査・壱岐、唐津、平戸の玄界灘沿岸にて生き物供養と供養碑調査を実施9月1日4日の行程で、壱岐(はらほげ地蔵、芦辺・恵美須浦の鯨供養塔、勝本町の永取家・鯨供養塔、辰ノ島・イルカ供養塔、郷ノ浦の春一番の碑、有安触の亀塚など)、唐津・呼子(名護屋の古里神社・羽刺奉納の恵比須像やイルカ観音、呼子の石上山龍昌寺、西念寺・共同墓地にて鯨供養塔)、伊万里市(種ケ島にてイルカ大明神碑2基、釘島のイルカ大明神碑)、平戸(薄香港の慰霊碑、生月町博物館・島の館、生月魚籃観音、前津・長泉寺の鯨供養塔、最教寺の鯨供養塔、緑ヶ丘神社の鯨魂塚)を調査。(c)事例研究調査・ふぐ供養祭の参与観察調査(田口・川野・関)京都・霊山観音の本堂において、京都府ふぐ組合主催のふぐ供養祭に参加。京都府および各県のふぐ組合関係者などに、ふぐ業界による供養祭の歴史や業界内の諸問題などについて話をうかがう。・インドネシア調査(田口)インドネシアにおけるウミガメの保護活動および観光的活用事例について、現地調査を実施。・タイ調査(川野)・タイにおけるゾウの保護活動、水牛のタンブン(功徳を積む)、ダム建設に対する反対運動等について現地調査を実施。本研究は、日本および東南アジアの現状を、生き物の生死と人々の対応という視点から見直し、日常のなかで、人々が生き物の死をどのように受け止め、対処してきたかを考えることで、日本独自といわれてきた生き物供養の相対化を目指すものである。そのために、(a)研究会、(b)国内合同調査、(c)日本および東南アジアでの事例研究の調査、(d)海外フィールドでの合同調査と、4つの活動を組み合わせ、メンバー間で問題意識と視点の共有化をはかりながら、それぞれが事例研究に取り組む体制で進めている。本研究の初年度となる平成24年度の活動は、(a)研究会と(b)国内合同調査を中心とした。また(c)東南アジアでの事例研究調査の準備となる予備調査を行った。(a)研究会は、東海大学海洋学部内で実施しただけでなく、国立民族学博物館でも1度開催することができた。さらに研究会の拡大版として、2013年2月2日に、東京水産振興会との共催でシンポジウム「生き物のいのちと感謝のこころ-魚・草木・馬」を開催することができた。(b)国内合同調査では、広島(福山市、広島市の沿岸)および神奈川(横浜市、横須賀市、鎌倉市など)で生き物供養碑の所在確認調査を行った。(c)日本および東南アジアでの事例研究の調査では、田口がインドネシア、川野がタイで予備調査を行った。シンポジウム「生き物のいのちと感謝のこころ-魚・草木・馬」は、東京水産振興会・豊海おさかなミュージアムでの展示「お魚の供養碑」(2013年1月21日から1ヶ月)の関連行事として開催したものであり、展示とシンポジウムによって、これまでの国内調査の研究成果をまとめ、広く社会に公開する機会を得た。本研究は、日本および東南アジアにおいて、日常のなかで、人々が生き物の死をどのように受け止め、対処してきたかを考えることで、日本独自といわれてきた生き物供養の相対化を目指すものである。本年度は、(a)東海大学海洋学部にて研究会を3回実施した。(b)国内合同調査は佐渡・新潟にて、生き物供養碑の所在確認調査と生き物と信仰に関連した資料情報の収集を行った。(c)事例研究調査では、田口がインドネシア、川野がタイにて調査を行い、今年度が初回となる(d)海外での合同調査は、田口がコーディネーターとなり、インドネシアにて実施した。インドネシアでの海外合同調査に向け、参加者に訪問先の概要や生き物との関わりなどをレクチャーする目的で1回目の研究会を実施し、2回目の研究会にて、海外合同調査で得た知見を紹介し、今後の課題を議論した。3回目研究会では、各自が研究活動状況を報告し、平成26年度の活動計画について話し合った。海外合同調査は、メンバーの都合もあり、前半(川野・小林:スンバ島、バリ島)、後半(関・加藤:バリ島)と分けて実施した。スンバ島ではローカル競馬や、大型家畜の予防接種現場、屠畜場、伝統的な婚姻儀礼などの現場で家畜利用の調査を行った。バリ島ではウミガメの保護活動や、海洋生物を観光利用している諸現場を訪問見学した。

日本や東南アジアでの、環境保護や希少野生動物保護という世界的な潮流への地域側の対応と、自然との調和や自然保護の姿勢を示す「生き物を放す行為」について、その思想的な背景や歴史的な展開などに今後注目していくことを確認した。本研究は、日本及び東南アジアにおいて、日常の中で人々が生き物の死をどのように受け止め、対処してきたかを考えることで、日本独自と言われてきた生きもの供養の相対化を目指してきた。そのために、(a)研究会、(b)国内合同調査、(c)日本及び東南アジアでの事例研究の調査、(d)海外フィールドでの合同調査と、4つの活動を組み合わせ、メンバー間で問題意識と視点の共有化を図りながら、それぞれが事例研究に取り組む体制で進めてきた。今年度(9月末日段階)は、(b)国内合同調査および、(c)事例研究調査を実施した。(b)国内合同調査・壱岐、唐津、平戸の玄界灘沿岸にて生き物供養と供養碑調査を実施9月1日4日の行程で、壱岐(はらほげ地蔵、芦辺・恵美須浦の鯨供養塔、勝本町の永取家・鯨供養塔、辰ノ島・イルカ供養塔、郷ノ浦の春一番の碑、有安触の亀塚など)、唐津・呼子(名護屋の古里神社・羽刺奉納の恵比須像やイルカ観音、呼子の石上山龍昌寺、西念寺・共同墓地にて鯨供養塔)、伊万里市(種ケ島にてイルカ大明神碑2基、釘島のイルカ大明神碑)、平戸(薄香港の慰霊碑、生月町博物館・島の館、生月魚籃観音、前津・長泉寺の鯨供養塔、最教寺の鯨供養塔、緑ヶ丘神社の鯨魂塚)を調査。(c)事例研究調査・ふぐ供養祭の参与観察調査(田口・川野・関)京都・霊山観音の本堂において、京都府ふぐ組合主催のふぐ供養祭に参加。京都府および各県のふぐ組合関係者などに、ふぐ業界による供養祭の歴史や業界内の諸問題などについて話をうかがう。・インドネシア調査(田口)インドネシアにおけるウミガメの保護活動および観光的活用事例について、現地調査を実施。・タイ調査(川野)・タイにおけるゾウの保護活動、水牛のタンブン(功徳を積む)、ダム建設に対する反対運動等について現地調査を実施。当初の研究計画通り、(a)研究会、(b)国内合同調査、(c)日本および東南アジアでの事例研究調査のために、インドネシア、タイで予備的調査を行うことができた。さらに、東京水産振興会・豊海おさかなミュージアムでの「お魚の供養碑」の展示およびシンポジウム「生き物のいのちと感謝のこころ-魚・草木・馬」を実施したことで、研究成果を広く発信することができた。研究計画に沿って(a)研究会、(b)国内合同調査、(c)事例研究調査、(d)海外での合同調査と、4つの活動を組み合わせ、メンバー間で問題意識と視点の共有化をはかりながら、それぞれが事例研究に取り組むことができた。もっとも当初の計画では、平成25年度の合同調査で、国内が長崎(平戸、生月)、海外をタイとし、平成26年度に国内を佐渡・新潟、海外をインドネシアとしていたが、合同調査をコーディネートする担当者による現地との調整や準備状況および調査活動の効果を考慮して、平成25年度と平成26年度の訪問先を入れ替えて実施することにした。研究会や国内外での合同調査の機会に、調査地の概況やフィールドで得た知見などを議論することで、比較研究のために今後、各自が掘り下げるべき事例や方向性が見えてきた。それは、環境保護や希少野生動物保護という世界的な潮流に対する、地域側の対応であり、自然との調和や自然保護の姿勢を示す「生き物を放す行為」について、その思想的な背景や歴史的な展開などである。
極性タンパク質、PAR-1キナーゼの哺乳動物上皮細胞極性化過程における機能の研究

全体として、初期に設定した目標に対して十分満足のいく結果を生み出すことができ(下記参照)、こうした成果を最終的に論文として公表することができた(Curr.Biol.14:539-551,2004)。その点で、交付を受けた科学研究補助金を非常に有効な形で生かすことができたと自信を持って言うことができる。初年度である平成15年度には、哺乳動物PAR-1キナーゼのスレオニン595がaPKCによってvivo, vitroで特異的にリン酸化され、かつそのリン酸化によってPAR-1の上皮細胞側底膜への結合が阻害されることを生化学的に明らかとした。さらに平成16年度には、(1)このリン酸化により、PAR-1キナーゼと哺乳動物PAR-5ホモログである14-3-3タンパク質の結合が誘導されること、さらに、(2)極性化した上皮細胞内では可溶性のPAR-1のみがリン酸化を受け14-3-3と結合しており、膜画分に存在するPAR-1はリン酸化も結合も示さないことを明らかとした。さらに、このリン酸化部位をアラニンに変異させたPAR-1は側底膜のみならず、aPKCが存在する密着結合、さらには頂端膜ドメインにも侵入するようになることを発見した。以上の知見は、aPKCが密着結合部位においてPAR-1bをリン酸化し、14-3-3と協同してPAR-1の側底膜からの遊離を誘導していることを強く示唆した。重要なことは、この結果が、「いかにしてaPKCとPAR-1が正反対の細胞膜表層に相互排除的に局在するのか」というこれまでなぞであった現象の基礎となる分子機構を明確に示したことである。我々が論文を発表した後、ショウジョウバエ卵母細胞、線虫胚においてもこの進化的に保存されたPAR-1のスレオニン残基を利用して同様の極性タンパク質の分布制御機構が動いていることが証明された。我々の今回の研究成果が普遍的な極性制御機構の解明に大きく貢献したと言える。2)一方、この研究をさらに発展させるものとして、培養上皮細胞内でPAR-1と特異的に結合するタンパク質を検索し、非常に興味深いタンパク質の同定に成功し、今後の研究の発展の基礎も築いた。当初平成15年度に目的とした「aPKCによるPAR-1上の主要なりん酸化部位の同定」に成功し、この部位に対する特異的りん酸化抗体の作製も行った。そして、本抗体を用いることによって、試験管内で同定したこのサイトがMDCK培養上皮細胞内でもaPKCによって実際、内在的にりん酸化されていること、さらにこのりん酸化が脱極性化状態で亢進しており、上皮極性化の過程の遅い段階で急速に脱りん酸化によって消失することを見出した。以上の結果は、このaPKCによるPAR-1のりん酸化が上皮細胞の極性形成過程と密接に関連していることを強く示唆している。さらにこの結果は、線虫で遺伝学的に示されているaPKC-→PAR-1という細胞極性化シグナルが進化的に保存されていることを示し、かつ、遺伝学ではわからないその分子機構の実体を今後明らかにしうる可能性を開いた。

興味深いことに、極性化状態の上皮細胞にあっても、Protein Phosphatase2A(PP2A)の阻害剤であるオカダ酸の添加によってこのaPKCによるPAR-1のりん酸化が亢進することがわかった。すなわち、極性化した上皮細胞内において、PAR-1はaPKCによるりん酸化とPP2Aによる脱りん酸化の平衡状態にあると考えられる。さらに重要なことに、オカダ酸添加は、上皮細胞におけるPAR-1のbasolateral膜への非対称局在を阻害し、その細胞内への解離を誘導した。以上の結果は、aPKCによるリン酸化によってPAR-1の上皮細胞における局在が制御されていることを示唆している。現在、こうした結果を中心に、成果を論文として発表するべく、さらに実験を進めている。本年度は、昨年度の到達点を急速に発展させることに成功し、その結果、初期に目的とした課題に関する満足のいく論文を公表することができた。交付を受けた科学研究補助金を非常に有効な形で生かすことができたと自信を持って言うことができる。昨年度は、哺乳動物PAR-1キナーゼのスレオニン595がaPKCによってvivo, vitroで特異的にリン酸化され、かつそのリン酸化によってPAR-1の上皮細胞側底膜への結合が阻害されることを明らかとした。今年度は、(1)このリン酸化により、PAR-1キナーゼと哺乳動物PAR-5ホモログである14-3-3タンパク質の結合が誘導されること、さらに、(2)極性化した上皮細胞内では可溶性のPAR-1のみがリン酸化を受け14-3-3と結合しており、膜画分に存在するPAR-1はリン酸化も結合も示さないことを明らかとした。さらに、このリン酸化部位をアラニンに変異させたPAR-1は側底膜のみならず、aPKCが存在する密着結合、さらには頂端膜ドメインにも侵入するようになることを発見した。以上の知見は、aPKCが密着結合部位においてPAR-1bをリン酸化し、14-3-3と協同してPAR-1の側底膜からの遊離を誘導していることを強く示唆した。重要なことは、この結果が、「いかにしてaPKCとPAR-1が正反対の細胞膜表層に相互排除的に局在するのか」というこれまでなぞであった現象の基礎となる分子機構を明確に示したことである。我々が論文を発表した後、ショウジョウバエ卵母細胞、線虫胚においてもこの進化的に保存されたPAR-1のスレオニン残基を利用して同様の極性タンパク質の分布制御機構が動いていることが証明された。我々の今回の研究成果が普遍的な極性制御機構の解明に大きく貢献したと言える。
維管束植物の生殖器官の形態進化を形態形成遺伝子の進化として解明する

本研究では、被子植物の珠皮、心皮、花弁、ガク片などの花器官形成を制御している転写調節因子であるMADS遺伝子群に着目し、シダ類におけるこの遺伝子群のクローニング、遺伝子系統樹の作成、発現様式の解析を行った。その結果、シダ類では、少数のMADS遺伝子が、生殖器官に限らず、いろいろな組織で、細胞分裂活性を高め、形態形成に関与しているらしいことがわかった。そして、元来少数あったMADS遺伝子群が、遺伝子重複により数を増やし、増えた遺伝子がそれぞれ、発現場所を特定化し、機能分化することにより、被子植物の珠皮、心皮、花弁、ガク片などの花器官が進化してきたのではないかという仮説を提唱できた。イチョウ、グネツムは、被子植物のMADS遺伝子とほぼ同じグループのMADS遺伝子を持っていることから、裸子植物の段階では、MADS遺伝子の増加はおこっていたが、機能分化がおこっていなかったのではないかと推察できた。さらに、興味深いことに、MADS遺伝子の系統樹から、被子植物の花弁やガク片形成を制御しているAクラスのMADS遺伝子は、裸子植物と被子植物の共通祖先では存在していたのだが、裸子植物の系統で欠失、あるいは発現されなくなった可能性が高いことがわかった。裸子植物と被子植物の生殖器官の大きな違いの一つは、花被(花弁とガク片)の有無であり、Aクラス遺伝子の有無がこの違いを生み出しているらしいことがわかった。また、裸子植物LFY遺伝子の解析から、裸子植物と被子植物の共通祖先において、すでにLFY遺伝子はMADS遺伝子を誘導していた可能性が高く、被子植物における花の進化には、LFY遺伝子はあまり関係なかったのかもしれないことがわかった。このことから、LFY遺伝子で誘導された後におこる、MADS遺伝子のwhole特異的発現制御が花の進化に重要であったのではないかと推察している。1.MADS遺伝子は被子植物では花器官形成のマスター遺伝子として知られている。花器官の進化プロセスを推定するため、花器官を形成しないシダ類のリチャードミズワラビからMADS遺伝子を単離し、ノーザン解析により発現部位を特定した。また、in situハイブリダイゼーションで、より詳細な発現場所を特定した。その結果、リチャードミズワラビMADS遺伝子は被子植物とは異なり、特定の器官で発現するのではなく、植物体全体の栄養器官、生殖器官の両方で発現していることがわかった。また、被子植物では、MADS遺伝子は12ほどサブグループに分化しているが、シダ類では、3つにしか分化していないことがわかった。このことからリチャードミズワラビの持つ単純な形態の生殖器官から複雑な花への進化は、遺伝子重複によるMADS遺伝子の数の増加と機能分化によって引き起こされたのではないかという仮説をたて、論文にまとめた。2.コバノグネツムから4種類のMADS遺伝子(GNE1,2,3,4)を単離した。ノーザン解析によって、生殖器官である雌性胞子嚢穂と栄養器官である葉での発現量を比較したところ、GNE3は生殖器官で栄養器官より強い発現が確認されたが、それ以外の遺伝子については両器官で同様な発現が見られた。さらにGNE3の発現場所をin situハイブリダイゼーションによって調べると、カラーの辺縁部で発現が見られた。現在、他のGNE遺伝子についても実験中である。本実験で、裸子植物においても、被子植物で見られるように、生殖器官でのMADS遺伝子の特有の組織での発現が見られることがわかった。このことは、MADS遺伝子の機能分化が裸子植物でも見られることの始めての報告になるであろう。