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Cキナーゼ阻害剤で誘導されたヒト免疫寛容樹状細胞による自己免疫疾患治療への展開

以前我々はヒトの未熟樹状細胞の成熟過程において、Cキナーゼ阻害剤(PKCI)を用いて、炎症環境下でも安定性のある強い免疫寛容能を持つ免疫寛容樹状細胞(tDCs)が誘導出来ることを報告した。PKCI-tDCsと他のtDCsを誘導する物質にとの比較により、PKCI-tDCsが最もtDCsとして優れていることが示された。また、膠原病患者(シェーグレン症候群、関節リウマチ)の末梢血からもPKCI-tDCsが誘導することができた。上記結果から、PKCI-tDCsは、臨床応用において有用である可能性を示し得た。樹状細胞は、自己免疫疾患やアレルギー疾患などの発症制御に大きく関わっており、免疫寛容を導く点においても重要な役割を果たしている。我々は以前プロテインキナーゼC阻害剤(PKCI)を加えることで、安定性のある免疫寛容樹状細胞(tDCs)を誘導している。前年にほかの各種誘導物質との比較を行っている。すなわち、PKCI、IL-10、TGF-beta、vitamin D3、dexamethazone、rapamycin、PPARgamma+retinoic acidの6種類の比較を行った。Tr1誘導能、T細胞増殖抑制能、Treg誘導能などの比較から単独ではPKCIが有用である結果であった。次に、シェーグレン症候群(SS)とMPO-ANCA関連血管炎(AAV)を対象として、PKCI-tDCsが誘導できるかを検討した。これらの2つの疾患を対象にしたのはHLADRB1 alleleとそれに対応するT細胞エピトープが判明しているためである。8例すべてのAAV末梢血からPKCI-DCsは誘導できなかった。これは、対象患者においてステロイドなどが投与されており、単球、リンパ球の数や増殖が悪いためと考えられた。一方で、SS患者の9割からはPKCI-DCsが誘導できた。引き続いてSS患者数の総数を増やすとともに、一部の患者でM3R T細胞エピトープの解析を行っている。SS患者の9割からはPKCI-DCsが誘導できた。樹状細胞は、自己免疫疾患,アレルギー疾患などの発症と制御に大きく関わっており、獲得免疫に関して重要な役割を持っているが、免疫寛容を導く点においても重要である。上記の疾患の分野では、副作用が少なく寛解を維持できる可能性のある抗原特異的な免疫寛容樹状細胞(tDCs)が注目されている。我々は、以前プロテインキナーゼ阻害剤(PKCI)を加えることで、安定性のあるtDCsが誘導できたことを報告した。既報告の6種類の誘導物質で比較検討したところ、T細胞増殖抑制能、Treg誘導能、誘導能などからPKCI-tDCsが最も有力である結果を得た。さらに臨床的に有用かを確認するため、患者末梢血を使用して、PKCI-tDCsが誘導できるかを検討した。前年報告したシェーグレン症候群(SS)、MPO-ANCA関連血管炎(AAV)に加え、関節リウマチでも検討した。SS患者においては、前年から引き続いて検討をすすめ、約20名のSS患者の末梢血からPKCI-tDCsが誘導できた。関節リウマチの患者9名からもPKCI-tDCsが誘導が確認できた。AAVに関しては、ステロイドの投与の影響か誘導が困難であったが、今後初回発症の患者の血液で誘導できるかを検討している。また、SS患者において、M3RT細胞エピトープの解析を行っており、その候補エピトープをパルスし自己抗原特異的なTregの誘導について解析を行っている。上記のとおり、抗原特異的免疫抑制療法の確立のための研究をすすめることが出来たと考えている。上記物質を用いて誘導したtDCsについてT細胞増殖抑制能、制御性T細胞誘導能についても比較検討できた。SS患者のHLA-DRB1にばらつきがあり、現在SS患者数の総数を増やしており、SS患者の一部の患者において、M3R T細胞エピトープの解析を行っており、これを推進する。また、効率の良いヒト抗原特異的制御性T細胞の誘導を目指すリウマチ膠原病学in vivoでの有効性を比較検討するため、マウスを用いた実験の準備を進めていく。ANCA関連血管炎患者末梢血から誘導したPKCI-tDCsを用いて、PR3-ANCAもしくはMPO-ANCAに対する抗原特異的Treg細胞の作成をex vivoで行っているが、現時点では十分できていない。患者末梢血サンプルの多くはステロイドや免疫抑制剤を用いており、リンパ球の数や増殖が悪いためと考えられ、今後実験方法、細胞について検討していく予定である。引き続いてSS患者のM3R T細胞エピトープの解析を継続していく。また、マウスを用いた実験が遂行できていない。このため、一部の研究費を次年度に繰り返す。ANCA

関連血管炎患者末梢血から誘導したPKCI-tDCsを用いて、PR3-ANCAもしくはMPO-ANCAに対する抗原特異的Treg細胞の作成をex vivoで行っているが、現時点では十分できていない。また、マウスを用いた実験が遂行できていない。このため、一部の研究費を次年度に繰り越す。次年度も引き続いて、研究計画書に沿って、研究費を使用し研究を遂行していく予定である。繰り越した研究費は、試薬や培養液に充当予定繰り越した研究費は、試薬や培養液に充当予定。次年度も研究計画書に沿って、研究費を使用し、研究を遂行していく予定である。
鉄筋コンクリート造壁体の鉄筋による乾繰収縮ひび割れ制御

通常のコンクリートを用いる限りの鉄筋コンクリート(以下RCと略記する)部材における乾燥収縮によるひび割れの発生を防ぐことは困難であり、RC壁のひび割れ対策としては誘発目地による集中、または鉄筋による分散が図られている。また,コンクリートの乾燥収縮そのものを縮減する取り組みも行われている。しかし,適切な誘発目地間隔の計算や、鉄筋のひび割れ制御効果の定量的な予測、収縮低減の効果の定量的な評価が行えるまでには到っていない。その理由は、壁の収縮ひび割れの幅や本数を予測できないことにある。本研究では鉄筋コンクリート部材において乾燥収縮の拘束によって生じるひび割れの幅と本数の予測法として、付着解析を用いた収束計算法を提案し、平成17-18年度は2つの実験を実施し、その適合性を確認した。次にこの計算法を用いて、鉄筋比、鉄筋の径、コンクリート強度、乾燥収縮量などの要因のひび割れ幅と本数に及ぼす影響を調べ、その影響度合いを定式化して、簡単で実用的なひび割れ幅と本数の算定式を誘導した。この式によって、鉄筋比や乾燥収縮量のひび割れ挙動に及ぼす影響の定量的な評価が可能となり、コンクリートの乾燥収縮低減によるひび割れ幅制御、鉄筋を用いたひび割れ分散によるひび割れ制御、および誘発目地を用いたひび割れ集中によるひび割れ制御を合理的に行うことができる。1.鉄筋コンクリート壁の収縮ひび割れの幅と間隔の実用算定式の誘導鉄筋コンクリート(RC)壁の乾燥収縮による収縮ひび割れ幅の付着解析による算定法及び等価喪失長さを用いた略算法を既に提案している。これらの算定法は略算法でも収束計算を行わなければならない煩雑さがあり,より簡単な算定法が求められる。そこで、付着解析によって鉄筋比,鉄筋径,コンクリート強度,壁長さ,拘束率,乾燥収縮量及びクリープ係数のひび割れ幅などへの影響を調べ,簡単なひび割れ幅やひび割れ間隔の算定式を提案した。2.収縮ひび割れに及ぼす鉄筋比の影響に関する拘束ひび割れ試験鉄筋D10を2本から5本埋設した試験体長2000mm,幅350mm,厚さ100mmの試験体(鉄筋比0.411.02%)の拘束ひび割れ試験を行い,鉄筋比の収縮ひび割れへの影響を調べるとともに先に提案したひび割れ予測法による予測値と実験値との比較検討を行った。その結果,実験値と予測値にはひび割れ発生時期,ひび割れ本数及びひび割れ幅等のひび割れ性状について良好な対応が得られた。すなわち、びび割れは材齢30日(乾燥日数23日)から68日にかけて,鉄筋比が最小(0.41%)の試験体で1本,最大(1.02%)の試験体で3本発生し、解析結果とほぼ一致している。また、材齢68日におけるひび割れ幅は、鉄筋比0.41の試験体で0.40mm、0.6%で0.19mm,0.8%で0.18mm,1.02%で0.12mmと鉄筋比に応じてひび割れ幅は制御され、付着解析は大略実測値の傾向を捉えている。18年度は,鉄筋コンクリート壁の収縮ひび割れ幅に関する実験的検討を行い,17年度に提案した付着解析によるひび割れ予測法ならびに,ひび割れ幅と本数の実用算定式の適合性を調べた。RC壁の乾燥収縮ひび割れ性状(ひび割れ幅,本数)を調べ,付着解析によるひび割れ予測法の適合性を検討することを目的とし,鉄筋を2本(W1:鉄筋比0.4%)と3本(W2:鉄筋比0.6%)埋設した試験体長2500mm(拘束2000mm),幅350mm,厚さ100mm,拘束材の断面250×250mm(鉄筋比:0.5,0.6%)のRC壁を模した収縮拘束試験体を製作した。実験では,埋設鉄筋とコンクリートのひずみ分布,ひび割れ数及びひび割れ幅の経時変化を測定した。なお,提案したひび割れ幅や本数の算定式の適合性も検討した。その結果,試験体W1,W2のいずれも1本貫通,ひび割れが発生した。付着解析による鉄筋とコンクリートのひずみ分布は実験結果とほぼ一致し,試験体W1,W2のひび割れ幅の付着解析による解析値も実測値とほぼ一致している。なお,提案したひび割れ幅や本数の算定式や既往の算定式(Base&Murry式,Gilbert式,修正Base&Murr式)による計算結果を比べた結果,既往の3つの式は提案式よりもひび割れ幅を小さく評価し,Gilbertの式はひび割れ数をかなり多めに評価している。
19-20世紀転換期におけるプランクとデュエムの物理学研究

Max Planckは1890年前後にそれまでの平衡熱力学の研究から非可逆過程の物理学的研究に移る.熱電気現象と電解質溶液間の電位差に関する研究がそれであるが,本研究において,その移行の具体的な流れが明らかにされた。これは,非平衡状態から非可逆過程を経て定常状態へと移行する物質系を対象としていることから,その過程を担う物質的な要素的過程,その分子論的描像その過程を記述する方程式系の定式等の点で,Planckにとっては従来の理論展開の方法と対象の捉え方からの重要な転換であった。このことを明らかにすることによって,1890年代半ばに開始されたPlanckの熱輻射研究ーエネルギー量子仮説の導入による輻射エネルギー分布の導出という画期的成果に到るーが,この1890年前後の研究上の転換ー非可逆過程の物理的研究への転換の流れの中に位置づけられることが具体的に解明された。一方,Pierre Duhemは1900年代に平衡熱力学の研究から非可逆過程の熱力学の定式化を試みる方向へと研究を移行させていくが,それは熱力学第2法則を非平衡状態を含む系に対して等式で表現することであった。この研究上での移行の過程が明らかになったが,彼の定式化は現代における非平衡熱力学の端緒的成果として位直づけられる。このようにPlanckとDuhemの物理学研究は多くの類似点を持っているが自然・物質観,科学観,方法論に関して,とりわけ20世紀以降対立した側面を持つようになる。こうした両者に見られる物理学研究と科学思想との関連について,エネルゲティーク対アトミスティークの論争との関わりを含めて,幾つかの局面が明らかにされた。これらの研究成果は,2編の論文として近々学術誌に投稿の予定である。1. Planckによる1890年前後における非平衡・非可逆過程に関する物理学的研究,とりわけ非一様な濃度の二つの電解質溶液間の電位差(いわゆる液体電池の液間電位差)の研究について,(1)Planckの研究は,188889年のNernstのこの分野における先駆的研究を踏まえて行なわれ,それをより一般的な場合へ拡張したものであること,(2)この仕事は,Planckの従来の研究方法,すなわち熱力学の第1,第2法則からの演繹的導出という方法と違って,濃度勾配という非平衡状態から定常状態に到る過程を流体力学と静電気宇の方程式を使って導出するという方法で行われたものであったこと,(3)この物理的過程の考察に当たって,Planckは,電解質の希薄溶液では分子がイオンに完全に解離しているとするArrheniusの考え方を採用し,分解されて生じた原子に電気が付着したものとしてのイオンが拡散するとする物理的な要素的過程を想定していたこと,(4)この研究を通じて,彼はそれまでの平衡熱力学の研究から非平衡状態に関わる非可逆過程の研究の重要性を把握したこと,(5)このことが,1890年代半ばから開始された熱輻射研究の課題設定と方法の選択に非常に重要な契機となったと推定されること,が明らかになった。2. Duhemについては,19世紀末から20世紀10年代にいたる化学熱力学から非可逆過程の熱力学への研究の展開過程を調べることによって,彼独特の物理学観,すなわち熱力学ポテンシャル論による物理学全体の統合という観点が重要な意味をもっていたことが明らかになりつつある。この点はさらに詳細な検討が残されている。なお,Planckに関する上述の研究成果について,現在論文を準備中である。

Max Planckは,1890年前後にそれまでの平衡熱力学の研究から非可逆過程の物理学的研究に移る.熱電気現象と電解質溶液間の電位差に関する研究がそれであるが,本研究において,その移行の具体的な流れが明らかにされた。これは,非平衡状態から非可逆過程を経て定常状態へと移行する物質系を対象としていることから,その過程を担う物質的な要素的過程,その分子論的描像,その過程を記述する方程式系の定式等の点で,Planckにとっては従来の理論展開の方法と対象の捉え方からの重要な転換であった。このことを明らかにすることによって,1890年代半ばに開始されたPlanckの熱輻射研究-エネルギー量子仮説の導入による輻射エネルギー分布の導出という画期的成果に到る-が,この1890年前後の研究上の転換-非可逆過程の物理学的研究への転換-の流れの中に位置づけられることが具体的に解明された。一方,Pierre Duhemは,1900年代に平衡熱力学の研究から非可逆過程の熱力学の定式化を試みる方向へと研究を移行させていくが,それは熱力学第2法則を非平衡状態を含む系に対して等式で表現することであった。この研究上での移行の過程が明らかになったが,彼の定式化は現代における非平衡熱力学の端緒的成果として位置づけられる。このように,PlanckとDuhemの物理学研究は多くの類似点を持っているが,自然・物質観,科学観,方法論に関して,とりわけ20世紀以降対立した側面を持つようになる。こうした両者に見られる物理学研究と科学思想との関連について,エネルゲティーク対アトミスティークの論争との関わりを含めて,幾つかの局面が明らかにされた。これらの研究成果は,2編の論文として近々学術誌に投稿の予定である。
糖感受性アスパラギン合成酵素の2型糖尿病発症における機能解析

【研究目的】Asparagine synthetase (Asns)は肝細胞内での糖代謝、およびマウスの血糖調節に関与する可能性がこれまでの実験結果から示唆されている。本研究は肝細胞においてAsnsと、糖代謝及びインスリンシグナルに関わる遺伝子群との相互作用メカニズムを明らかにすることを目的としている。【研究方法】マウス肝細胞由来Hapel-6細胞を用いて、Asns遺伝子の発現が亢進する低グルコース培養条件下(5、10mM)でAsns遺伝子ノックダウン実験を行った。リポフェクション法を用いてHepal-6細胞にAsnsに対するsiRNAを導入し12時間培養後、培地を5、10、25mMのグルコース含有培地に置換しさらに24時間培養した。各培養条件におけるGlucokinase (GCK)の遺伝子発現変動をリアルタイムPCR法で定量し(研究実施計画・実験(1))、GCKの蛋白量およびインスリンシグナル伝達系の主要因子であるAkt、JNKのリン酸化蛋白量の変化をウエスタンブロッティング法で検出した(研究実施計画・実験(2))。【研究成果】Asnsのノックダウン効率は平均して約54%であった。現在までのところ、いずれの実験条件においてもGCKの安定した遺伝子発現定量の結果は得られていない。その理由としてHepal-6細胞ではGCKの発現量が低いことが考えられる。同様にGCK蛋白量についても各実験条件の間で変化は見られていない。一方、Asnsノックダウン時の低グルコース培養条件においてリン酸化Akt蛋白量が増加し、また低グルコース培養条件単独でリン酸化JNK蛋白量を増加させる可能性のあることが、ウエスタンブロッティング法による実験結果から示唆された。この結果は、細胞中のAsns蛋白量や培地中のグルコース濃度の変化がAktとJNKのリン酸化調節に影響を及ぼす可能性を示すものである。現在までにAsns遺伝子が肝臓でのインスリンシグナル伝達に関与するとの報告はなく、今回の実験結果はAsns遺伝子と糖代謝やインスリン抵抗性との関わりを考える上で、新規かつ重要な知見である。今後は、実験の再現性や条件を詳細に検討して研究を進める予定である。
生体成分由来低分子生理活性物質のマクロファージ活性化に及ぼす影響

本研究はトキソプラズマ原虫感染耐過牛の過免疫血清から得られたオビオアクテン、その活性ペプチド成分の合成ペプチドであるオビオペプチド-I(Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu)、すなわち生体成分由来低分子生理活性物質のマウスマクロファージ活性化に及ぼす影響について平成34年の2年間検討し、以下の結果が得られた。1.in vitroにおける検討:マウスマクロファージに上記2種の物質を添加培養したところ、糖値質量ならびに活性酸素の産生量が有意に増加した。またトキソプラズマ感染マクロファージのトキソプラズマ増殖抑制活性も増加した。さらに形態学的にラッフル形成が認められ、これら物質はin vitroにおいてマクロファージを活性化することが判明した。2.in vivoにおける検討:マウスにオビオペプチド-Iを筋肉内投与(100μg/マウス)し、マクロファージのリソソーム酵素(酸性フォスファターゼ、β-Nアセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ)活性、走化性を検討したところ、脾腺内マクロファージの貧食能、ならびにIa抗原陽性細胞数に変化は認められなかったが、膜腔マクロファージのリソゾーム酵素活性は著しく増加した。また免疫抑制剤であるサイクロフォスファマイド投与したマウスに筋肉内投与した場合においても腹腔内マクロファージのリソゾーム酵素活性は無処置対照マウスに比較して高値を示した。さらにオビオペプチド-Iの添加は10^<-7>Mの限度で最も高いマクロファージの走化性を誘導し、走化性にも影響を及ぼすことが認められた。一方、サイクロフォスファマイドならびにカラギナ処理マウスにおける細菌接種でオビオペプチド-I投与マウスは各種細菌感染に対して抵抗性を示した。以上の結果からオビオアクテンあるいはオビオペプチド-Iはマクロファージを活性化することで宿主の免疫能を増強、とくに免疫不全状態の場合に増強するものと推測された。マクロファ-ジを活性化する物質としては細菌,寄生虫などに感染した生物の感作Tリンパ球より産生されるリンホカインや,感染微生物に由来する低および高分子化合物が種々知られている。本研究では分担者鈴木らの見出したトキソプラズマ感染耐過牛血清由来のオビオプペチドーI(GlyーGluーGluーGluーGluーGlu)(以下OPー1と略)および菌類や甲殻類の構成成分であるキチンの分解物の一つのキトヘキサオ-ス(以下GlcNAc_6と略)の2種の生物応答修飾物質(BRM)のマクロファ-ジに対する影響を基礎的に検討することを目的とした。1.OPー1をマウスに投与し,経時的に脾臓マクロファ-ジを分離して,その貪食能およびIa抗原陽性細胞数を調べた結果,無投与群との差は認められなかった。2.OPー1およびGlcNAc_6を筋肉注射によりマウスに投与し,脾臓および腹腔のマクロファ-ジのリソゾ-ム酵素(酸性ホスファタ-ゼ,βーグルクロニダ-ゼおよびβーNーアセチルグルコサミニダ-ゼ)活性を測定したところ,OPー1投与群の腹腔マクロファ-ジの酵素活性が無投与群およびGlcNAc_6投与群に比べ高い値を示した。3.サイクロフォスファミド投与による免疫抑制マウスにOPー1を投与して脾臓および腹腔マクロファ-ジのリソゾ-ム酵素活性を測定した結果腹腔において無投与群に比べ高い値を示した。

4.ボイデン法によりマウス脾臓および腹腔マクロファ-ジのOPー1に対する走化性を調べたところ共に10^<-7>Mの濃度において最も走化性を示した。マクロファージを活性化する物質としては細菌、寄生虫などに感染した生物の感作Tリンパ球より産生されるリンホカインや感染微生物に由来する低および高分子化合物が種々知られている。本年度は前年度に引き続きトキソプラズマ感染耐過牛血清由来のオビオアクチンならびにその活性ペプチドを合成して得た数種の合成ペプチドのうちオビオペプチド-I(GlyーGluーGluーGluーGluーGlu)のマウスマクロファージに対する影響を検討した。1.マクロファージ活性化に対するオビオアクチンおよびオビオペプチドIの影響(河野・小野):マウスマクロファージを最終濃度5.0mg/mlでオビオアクチンと、0.5mg/mlでオビオペプチド-Iと48時間培養し、その糖消費量を測定したところ、いづれの場合にも無添加対照に比較して有意な増加が認められた。また同時に観察した活性酸素の産生量もオビオアクチンあるいはオビオペプチド-I添加で増加する傾向が認められ、これら2種の物質を投与するとマクロファージが活性化することが判明した。2.トキップラズマ殺〓効果に及ぼす影響(鈴木):トキソプラズマ感染マクロファージにオビオアクチンあるいはオビオペプチド-Iを添加して培養するとマクロファージ内のトキソプラズマ虫体数は減少し、これら物質にマクロファージのトキソプラズマ殺〓作用の増強効果のあることが判明した。3.マクロファージの形態学的変化(小野):マウスマクロファージにオビオアクチンあるいはオビオペプチド-Iを添加して48時間培養し、その形態学的変化を相差電子顕微鏡で観察したところ、これら物質を添加したマクロファージはラッフル形成が著明で形態学的に活性化していることが判明した。
デザインプロセスに着眼した日本独自のデザイン保護法の立法提言

本研究は、意匠法をゼロベースで再検討し、日本におけるデザイン保護法の具体的な立法提言のとりまとめを通じ、デザインプロセスの理解に基づくデザイン保護法の理論の創出を目的とする。米国および欧州法の比較法的見地からの分析と、主要なデザイン哲学の一つである人間中心デザインを軸としてデザインの現場における活動プロセス(デザインプロセス)と法的保護の関係の分析という2つのアプローチから検討する。法のデザインの定義、保護要件、及び侵害判断基準を明らかにすることを通じ、デザインプロセスの理解に基づくデザイン保護法の理論を明らかにする。
特異なバンド構造と電子相関の協力効果による新奇量子伝導現象に関する理論的研究

量子力学によって支配される粒子である「電子」は波としての性質を持ち、その周波数と波長(あるいは逆数である波数)の間には一定の関係(分散関係)がある。波の分散関係は一般にそれが伝わる媒質によって異なるが、物質中では電子の分散関係が「バンド構造」となって現れ、物質の性質に重要な影響を及ぼす。一方、物質中には多くの電子が存在し、お互いに反発力(相互作用)を及ぼしあいながら運動している。本研究課題においては、物質が持つ「特異なバンド構造」と電子間の「相互作用」が協力しあうことで生み出される興味深い電子の伝導現象について、その起源と、そこで得た知見をベースにした新機能性物質開発のための設計指針についての理論的研究を行った。(1)層状窒化物超伝導層状窒化物MNC1 (M=Hf, Zr)に対して第一原理計算のバンド構造を再現する有効模型を構築し、スピン揺らぎ媒介によるd波超伝導の可能性を提唱した。ギャップのバンド・フィリング依存性を議論し、実験との対応を検証しつつある。(2)鉄ニクタイド超伝導新しく発見された鉄ニクタイド超伝導体に対して、第一原理計算を元に5バンドの有効模型を構築し、非連結フェルミ面を有効に利用したスピン揺らぎ媒介メカニズムを提唱した。この有効模型はその後、国内外の多くの理論グループに用いられている。(3)新規超伝導探索銅酸化物、鉄ニクタイド化合物以外のd電子系高温超伝導体を探索するため、既存物質以外の第一原理計算に基づく有効模型構築に着手した。(4)熱電効果LiRh_2O_4, CuRhO_2, LaRhO_3の大きな熱起電力の起源をバンド構造の観点から明らかにした。また、LaCoO_3, SrTiO_3の大きな熱起電力の起源についても、研究に着手した。(1)層状窒化物超伝導層状窒化物MNCI(M=Hf,Zr)に対して第一原理計算のバンド構造を再現する有効模型をもとに、スピン揺らぎ媒介によるd波超伝導の可能性を提唱した。ギャップのバンド・フィリング依存性を議論し、実験との対応を検証した。(2)鉄ニクタイド超伝導鉄ニクタイド超伝導体における結晶構造の効果を調べた。第一原理計算を元に構築した5バンドの有効模型を用い、鉄の面から図ったニクトゲンの高さに応じて超伝導ギャップにおけるノードの有無、臨界温度の高低が変化することを示した。(3)銅酸化物および類似の電子状態を持つ物質の理論探索銅酸化物における臨界温度の物質依存性に関する研究を開始した。同じ一層系に分類されるLa_2CuO_4とHg_2BaCuO_4において臨界温度が大きく異なる起源として、バンド構造の違いがあることを見出しつつある。また、前年度に引き続いて、銅酸化物と類似の電子状態を持ちうる物質の理論探索を進めた。(4)熱電効果SrTiO_3の大きな熱起電力の起源について、第一原理バンド計算をもとにした研究を行い、バンド縮退の効果とバンド形状効果を議論した。また、K_xRhO_2の大きな熱電効果の起源の研究に着手した。さらに、τ型と呼ばれる有機導体の熱電効果についてもバンド形状から理解できることを示しつつある。(1)熱電効果SrTiO_3の大きな熱起電力の起源について、第一原理バンド計算をもとにした研究を行い、バンド縮退の効果とバンド形状効果を議論した結果を論文にまとめた。また、K_xRhO_2の大きな熱電効果の起源をバンド形状と電子相関の観点から定量的に説明できることを示した。さらに、CaMnO_3の高スピン状態における大きな熱電効果の起源について、スピン偏極を考慮した第一原理計算を用いた解析を行った。(2)層状窒化物超伝導体層状窒化物超伝導体MNCl(M=Hf,Zr)においてこれまでの研究で提唱してきたd+id超伝導状態について、超流動密度を計算した。実験で観測されている超流動密度のキャリアードーピング依存性が理論的に理解できることを示した。(3)銅酸化物高温超伝導体の臨界温度の物質依存性銅酸化物のうち、一層系に分類されるLa_2CuO_4とHg_2BaCuO_4において臨界温度が大きく異なる起源を理解するために第一原理計算から構築した2軌道模型を導入した。軌道間のエネルギー差の違いによって、フェルミ面形状と臨界温度の物質依存性が理解できることを示した。(4)鉄系超伝導フェルミ面の3次元性が超伝導ギャップ構造に及ぼす効果、並びに、鉄-ヒ素-鉄の結合角がフェルミ面の枚数と臨界温度の高低に及ぼす影響を研究し、実験結果に対する理論的解釈を与えた。
台湾における民主化の進展と台湾軍の国軍化との関係に関する意識調査

台湾軍(中華民国国軍)の国民党軍から国軍への変容を台湾における政治的民主化との関係を探る上で,平成19年度は事前準備の年と位置づけて,台湾における資料収集および研究者との面談を行った。資料収集は,(1)台湾の国立図書館(國家圖書館)における先行研究(博士論文・修士論文・書籍)の調査,(2)日本・台湾・米国・中国で公刊された資料の購入を行った。中国については,いまだ党軍と規定されている中国人民解放軍との比較を行う意味から,公刊資料を精力的に購入した。研究者との面談に関しては,国家安全会議Y研究員,国防大学H教授,同M副教授,国立政治大学L教授,国立中興大学C副教授との面談を行った。これらの作業により,国民党政権の李登輝総統がイニシアチブを発揮して、国防関連組織の制度化と法制化を推進することで台湾の民主化を推進したこと、および、政権交代を成し遂げたものの特筆すべき成果をもたらさなかったと一部からは酷評される民進党政権の誇れる成果として,軍隊の国軍化があげられるとの高い評価を得ていることが了解できた。一部の研究者からは面談の折に,市場には出回らない資料(機密に属するものではない)の提供も受けた。しかしながら、その一方で本研究の申請当初考えていた台湾軍現役将官へのインタビューについては,現役軍人から政治評価を聞くことは難しいとのアドバイスが複数からあったため,現在では退役した軍高官へのインタビューを実施することを考えて準備に入っている。
特定健診における動脈硬化性疾患ハイリスク者抽出効率のCART応用による改善の試み

地域一般住民健診受診者コホートのデータに基づき、将来の高血圧、糖尿病、心血管疾患罹患を予測する決定木モデル(CART)の作成を行った。高血圧の予測モデルにおいては感度68.2%、特異度71.1%であり、メタボリックシンドロームと予備群を除外した対象での検討においては感度65.3%、特異度84.2%となった。糖尿病の予測モデルにおいては感度54.2%、特異度96.3%であり、心血管疾患の予測モデルにおいては感度7.4%、特異度99.3%であった。決定木モデルを作成して健診受診者集団から将来の生活習慣病罹患ハイリスク者を効率的に抽出できる可能性が考えられた。本研究は、継続中の地域一般住民コホート研究のデータを用い、断面および縦断的検討により、健診結果に基づいてClassification and Regression Tree (CART)という決定木アルゴリズムを応用することで積極的な介入が必要と考えられる高血圧や糖尿病などの生活習慣病および虚血性心疾患や脳卒中などの動脈硬化性疾患の罹患に対するハイリスク者の抽出効率を改善することが可能となるかを検討することを目的としている。平成25年度はこれまで蓄積している健診データを用いて、将来の高血圧罹患者を効率良く予測するモデルについてCART法を用いて検討した。1994年の健診受診者を2007年まで追跡したデータベースを用いたこれまでの検討で、加齢、肥満、高血圧家族歴、空腹時血糖高値、γ-GTP高値が高血圧罹患の危険因子となることが確認できた。年齢≧50歳、Body mass index (BMI)≧25、高血圧家族歴あり、空腹時血糖値≧100mg/dl、γ-GTPが男性≧25IU/L、女性≧16IU/Lの保有数が多い対象ほど将来の高血圧罹患リスクが高いことも確認できた。よってこれらの5項目に正常高値血圧(収縮期血圧130-139mmHgかつまたは拡張期血圧85-89mmg)を加えて、将来の高血圧罹患者を判別するCART法によるモデルの作成を行った。年齢、50歳以上、正常高値の有無、γ-GTP高値、血糖値高値の順で分けることにより、将来の高血圧罹患者を感度68.2%、特異度71.1%で判別できることが確認できた。またこうした縦断的な検討を行う上では対象者を前向きに追跡してイベント発生を確認していく必要があり、本年度も過去受診者の生活習慣病罹患状況についてのアンケート調査も行っている。平成26年度は、平成25年度に作成した高血圧予測CARTモデルの構成要素や寄与度、各構成要素のカットオフ値の検討、および初年度の異なる集団における妥当性の検証を行った。高血圧罹患者を判別するCARTモデルでは、年齢50歳以上、正常高値の有無、γ-GTP高値、血糖値高値の順で分けることにより、将来の高血圧罹患者を感度68.2%、特異度71.1%で判別できた。男女別に検討すると、男性は年齢、血圧値、γ-GTP高値、血糖高値の順で、女性では血圧値、年齢、γ-GTP高値、血糖高値の順で関与しており、男性で感度69.2%、特異度67.0%、女性で感度73.7%、特異度70.2%で判別可能であり、男女で各項目の寄与に若干の順序の違いはあるものの、同様の構成要素で判別できることが確認された。また上記の高血圧予測CARTモデルは1994年を初年度とした集団での検討であるが、2002年を初年度とする集団に本モデルを使用した場合の妥当性を検討すると、感度72.2%、特異度35.6%となり、特異度の低下を認めた。CARTによる各カットオフ値は、年齢が45.5歳、γ-GTPが男性24.5、女性16.5、空腹時血糖値が男性90.5、女性99.5、収縮期血圧が男性で121.5、女性129.5といった値であり、保健指導の現場で使用する判定値に近い数値となり得る可能性が考えられた。本研究は、継続中の地域一般住民コホート研究のデータを用い、健診結果に基づいてClassification and Regression Tree (CART)という決定木アルゴリズムを応用することで積極的な介入が必要と考えられる高血圧や糖尿病などの生活習慣病および虚血性心疾患や脳卒中などの動脈硬化性疾患の罹患に対するハイリスク者の抽出効率を改善することが可能となるかを検討することを目的としている。平成27年度は、平成25,26年度に作成した高血圧予測CARTモデルに加えて、特定健診・特定保健指導の場での使用を考慮し、メタボリックシンドローム該当および予備群該当者は面談や保健指導対象であり、それら該当者を除外した集団における高血圧発症ハイリスク者の決定木を検討した。1994年の男女合わせた対象では、年齢、収縮期血圧(SBP)、喫煙、空腹時血糖値(FPG)、body mass index (BMI)、トリグリセリド(TG)、γ-GTPの要素からなるCARTモデルにて、感度65.3%、特異度84.2%で予測できた。

男女別に検討を行うと、男性では年齢、SBP、γ-GTP、FPG、からなるCARTモデルにて感度75.0%、特異度73.3%で予測可能となり、女性ではSBP, age, BMI,喫煙、総コレステロール(TC)、TG、FPG、γ-GTPからなるモデルにて感度80.3%、特異度81.2%で予測可能であった。特定健診・特定保健指導の場では面談や保健指導の対象とならない者においても、今回作成したモデルによって高血圧発症に該当する者については積極的な高血圧予防介入を行うことが重要と考えられる。さらに2002年を初年度とするデータにおいて、高感度CRP屋空腹時インスリン値、アディポネクチンも候補要因として加えてCARTモデルの作成を試みたが、SBP、年齢、BMI、アディポネクチン、インスリン値、FPGからなるCARTモデルで感度12.3%、特異度98.9%と感度が非常に低い結果となった。要因に加えて、追跡期間の短さが影響する可能性も考えられた。本研究は、継続中の地域一般住民コホート研究のデータを使用した縦断的検討により、特定健診・特定保健指導においては情報提供レベルにとどまるメタボリックシンドローム非該当者においても、通常の健診項目の組み合わせや炎症性マーカーやアディポサイトカイン、酸化ストレスマーカーなどの新しいリスクマーカーを組み合わせ、さらにClassification and Regression Tree (CART)という決定木アルゴリズムを応用することで積極的な介入が必要と考えられる高血圧や糖尿病などの生活習慣病の罹患に対するハイリスク者の抽出効率を改善することが可能となるかを検討することが最終目的としている。平成25年度には将来の高血圧罹患を予測する決定木モデルの作成を行い、感度68.2%、特異度71.1%で判別できることが確認できた。平成26年度は、その作成したモデルの男女別の構成要素や判別能の違いについて検討を行い、またCARTによって導かれるカットオフ値と地域保健事業で使用する場合の簡便さ等も考慮した分類基準についての検討も行った。さらにこれまで蓄積されているデータに基づいて、初年度の異なる集団に当てはめた場合の妥当性の検証を行うことができた。平成27年度は特定健診・特定保健指導においては情報提供レベルにとどまる対象者での高血圧発症予測モデルを作成し、男女とも感度・特異度ともに80%前後で予測できることが示された。本研究は、継続中の地域一般住民コホート研究のデータを用い、断面および縦断的検討により、健診結果に基づいてClassification and Regression Tree (CART)という決定木アルゴリズムを応用することで積極的な介入が必要と考えられる高血圧や糖尿病などの生活習慣病および虚血性心疾患や脳卒中などの動脈硬化性疾患の罹患に対するハイリスク者の抽出効率を改善することが可能となるかを検討することを目的としている。期間を延長した平成28年度は、平成2527年度に作成した高血圧予測CARTモデルに加えて、糖尿病と心血管疾患(CVD)をアウトカムとした決定木分析を行った。糖尿病発症をアウトカムとしたCARTモデルにおいては1994年の男女合わせた対象で、年齢、性別、収縮期血圧(SBP)、喫煙、飲酒歴、空腹時血糖値(FPG)、body mass index (BMI)、総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、HDLコレステロール、γ-GTP、糖尿病家族歴の候補要素とすると、感度54.2%、特異度96.3%で予測の予測能となった。
明恵関係聞書類を主資料とする鎌倉時代の言語規範と言語変種に関する実証的研究

口語資料の欠乏する鎌倉時代において、書写年代の明確な聞書資料への期待は大きいが、同資料群の一般的性格は、大半が漢文体か、平安時代以来の漢文訓読文体の影響下にある強い文語性を示す。この中にあって、明恵房高弁(1173-1232)関係の聞書類は平安時代以来の書記言語規範から逸脱する要素を多く含む特異な存在である。しかし、これらの言語徴証は資料間や内部要素によって濃淡が著しい。本研究は、その要因の解明を企図し、多様な明恵関係聞書類の性格を分析して「言語変種」とその「制約条件」とを客観的に帰納し、各条件下で言語比較を繰り返すことによって、鎌倉時代の書記言語に見る規範と弛緩との実態を実証的に記述する。
Ｄ－アスパラギン酸含有蛋白質に特異的な分解酵素とその基質の起源、機能進化の解明

我々が哺乳類より発見したD-アスパラギン酸エンドペプチダーゼ(D-Aspartyl Endopeptidase: DAEP)は、変性したD-アスパラギン酸(D-Asp)含有タンパク質を特異的に分解する品質管理機構であると考えている。様々な生物種におけるDAEP活性を調べたところ、アフリカツメガエルやバフンウニでは、生殖巣や未受精成熟卵での活性が高いことが明らかになった。また、その局在を調べたところ、ミトコンドリアに分布することが示唆された。従って、これらの水生動物ではDAEPが初期発生に重要な機能を発揮していると考えられた。研究代表者は、ラセミ化したアスパラギン酸残基(D-Asp)を含むタンパク質に対する特異的な分解酵素を哺乳類から発見し、これをD-Aspartyl Endopeptidase: DAEPと名付け、その生理機能、構造等の解明に取り組んできた。これまで考えられてきたDAEPの生理的な位置づけは、加齢によって不意に生じたD-Asp含有タンパク質が有害に作用する前にこれを認識・排除する品質管理システムであったが、アフリカツメガエルの生殖巣から非常に高いDAEP様活性が検出されたことにより、その合目的性を再考するに至った。卵巣や未受精成熟卵におけるDAEP様活性は魚類やウニでも検出されたことから、原始的なDAEPの生理機能は、受精や初期発生に関わるものと推測している。そこで、これら水生動物のDAEPを精製し、その機能について哺乳類DAEPと比較検討したところ、阻害剤に対する感受性や基質特異性が非常に良く似ていることが明らかになった。研究代表者は、ラセミ化したアスパラギン酸残基を含むタンパク質に対する特異的な分解酵素を哺乳類から発見し、これをD-Aspartyl Endopeptidase: DAEPと名付け、その進化的な原型を求めて様々な生物種におけるDAEPホモログのスクリーニングを行った。その結果、哺乳類以外では、アフリカツメガエル(両生類)、バフンウニ・ムラサキウニ(棘皮動物)などの水生生物でその活性が認められた。阻害剤に対する感受性や基質特異性が哺乳類DAEPに非常に良く似ていることから、そのホモログと考えられたが、植物におけるDAEPの分布は不明であった。そこで、ハツカダイコン、マイクロトム(矮性トマト)を水耕栽培し、各組織におけるDAEP活性を測定した。その結果、ハツカダイコン根とマイクロトム果実においてDAEP活性が検出された。これらのDAEP比活性は、アフリカツメガエルやバフンウニのそれと比べると1/10程度であったが、活性の分布として果実という点が非常に興味深い。水生生物DAEPの分布が生殖巣や成熟未受精卵において顕著であり、DAEPの原初的な生理的機能は初期発生にあったのではないかと考えられることから、今後は生殖器官としての花卉におけるDAEP活性を調査し、植物の初期発生におけるDAEPの関与について考察したい。哺乳類DAEPの基質となるD-Asp含有タンパク質は、加齢の進行や酸化ストレスの亢進とともに非酵素的(=化学的)に各臓器中で増加すること、またDAEPの細胞内局在が、酸化ストレスの主たる産生拠点であるミトコンドリアであることなどから、哺乳類DAEPの生理機能は、加齢によって不意に生じたD-Asp含有タンパク質が細胞にとって有害に作用する前にこれを認識・排除することであると考えられた。しかしながら、哺乳類のように体温が高く、好気的な条件下で長く生きる生物にとってはDAEPのようなシステムが必要であっても、体温が低い、または寿命の短い生物にとってはその有用性は必ずしも高くないはずである。そこで、様々な生物種におけるDAEP活性の測定を行った。その結果、アフリカツメガエルの生殖巣では、非常に高いDAEP様活性が検出された。その分子量や阻害剤に対する感受性などを検討したところ、哺乳類DAEPと同様であったことから、アフリカツメガエルから検出されたDAEP様活性は、哺乳類DAEPホモログに由来するものと考えられた。一方、アフリカツメガエルの至適生息温度は20°C前後であり、その臓器分布は哺乳類が肝臓で高いことに対し、肝臓では微量であり生殖巣に集中していることから、アフリカツメガエルDAEPの生理機能は、哺乳類のようにD-Asp含有タンパク質に対するスカベンジャーではなく、受精や初期発生に能動的に作用するものと推測している。DAEP様活性は魚類やウニでも検出され、現在、それらの性質や受精に対する機能的寄与について検討中である。今年度は、主としてアフリカツメガエルとウニよりDAEPを精製し、その機能について調べることができたので。

東日本大震災の影響により、(1)状況によっては交付決定通知書に記載された額にかかわらず減額される可能性があったことから、計画を一部見直し、予算の対応を慎重に行ったこと、(2)ウニ類、ホヤ類などの生物材料の調達先・調達予定先が被災し、それぞれの成熟時期に合わせて購入する量ができなかったり著しく少なくなってしまったことや、新たな調達先を見つけるのに時間がかかったこと、などが大きな理由である。上記のように、今年度はアフリカツメガエルとウニよりDAEPを精製し、その機能について調べることができた。しかしながら、それらの構造を明らかにすることはできなかった。その一番の理由は、精製収率が非常に低かったからである。水生動物のDAEPも哺乳類DAEPと同様にミトコンドリア内膜に局在する膜結合型の高分子複合体であり、初期の試料調製で行うミトコンドリア内膜からの可溶化が、収率のボトルネックとなっている。したがって、今後はDAEP活性を落とさずに、より収率を上げるための界面活性剤の選定や精製ステップの再考を行い、水生動物DAEPの構造を明らかにするために十分な量のDAEPを確保したいと考えている。進化的に上流に位置する生物種の生殖巣からからDAEPが発見されたことにより、DAEPの機能進化の起原が生殖に関係していることが強く示唆された。したがって今後は、東日本大震災の影響により見直した研究計画のうち、経費が掛かるとして一時的に先送りした遺伝子工学的実験を行い、ウニやアフリカツメガエルの受精や初期発生におけるDAEPの機能的役割を明らかにすること、アフリカツメガエルDAEPの生理的な基質となるべきD-Asp含有タンパク質を未受精卵より同定することを行う予定である。水生動物DAEPの精製法を確立するため、ウニ等の生物材料の調達費、界面活性剤やタンパク質精製用のカラム・担体の購入費が主になると考えている。また、アフィニティー精製のための基質ホモログリガンド、すなわちD-Aspを含むポリペプチドの合成を想定している。「11.現在までの達成度」で述べたように、東日本大震災の影響により計画を一部見直し、予算の対応を慎重に行ったことと生物材料の購入が限定されたことが、当該研究費が生じた状況である。24年度は、その遅れを挽回すべく先送りした計画を実施するとともに、新たに受精・初期発生時の酸化ストレスとDAEP活性の関係について調べるための研究計画を整備中である。具体的には、生物材料の調達費、アンチセンスオリゴヌクレオチドやペプチド性阻害剤の合成費、受精・初期発生時のミトコンドリアの呼吸能を測定するための酸素電極の購入費などを想定している。
気液混相暴風波浪下の波-構造物間インパクトモデル

平成20年度までの研究により,水塊ジェットや実験室スケールの砕波ジェットが着水したときに放出される二次ジェットが水面下の三次元渦構造との相互作用を経由してフィンガー形状及び飛沫へと分裂するメカニズムについて明らかにしたと共に,砕波ジェットのボイド率(体積率)分布を,ジェットの着水条件から予測する為のモデルを構築した.このジェットのボイド率はジェット-壁体衝突時の圧力応答を決定する重要なファクターとなる.フィンガーのサイズや飛沫の生成量等を決定する砕波ジェットの着水条件は,沿岸域における波浪条件により規定され,生成した飛沫の陸域への飛散量や沿岸域における波浪条件は海上の気象条件に依存する.そこで本年度我々は,メソスケール数値気象モデルによる沿岸域気象場の再現を行うと共に,その時の砕波飛沫の生成,輸送,拡散過程の数値計算法の開発を行った.数値気象モデルとして用いたのは近年よく用いられているWeather Research and Forecasting(WRF)を用いた.本モデルにより大量の砕波飛沫が生成された2009年台風18号通過時の気象場の追算を行い,計算結果の沿岸域海上気象場(気圧,風速,風向等)を観測結果と比較し,その再現性を確認した.今後,気象モデルを波浪推算モデルとリンクさせれば,荒天時の波浪場の再現を行う事もできる.また,飛沫の飛散過程は,飛沫濃度の移流拡散方程式を解く事により求めた.沿岸域の飛沫濃度分布を現地観測した既往研究の結果と数値計算結果とを比較し,濃度分布の再現性を確認した.砕波ジェットのモデルである二次元シート状のジェットを水槽内の静水面上に着水させた時の水面を水槽上部に設置した高感度カメラにより撮影し,二次ジェットの跳ね上がりから飛沫の生成に至る過程を可視化した.また,水面における力学的相互作用を評価する事が可能な高精度数値計算法を用いて,砕波ジェットモデルとして設定した二次元水塊ジェットを静水面に着水させた時のジェットから飛沫への分裂過程を再現した.次に示す可視化実験及び数値計算により得られた主な研究成果は,砕波に伴う気液混相乱流場の形成過程について新たな知見を与えると共に,砕波に伴い発生する飛沫の飛散を予測する場合の初期条件を決定する際に有用である.1,ジェットの着水に伴い瞬間的に薄いシート状のジェットが高速で噴出すると共に微小スケールの飛沫群が発生する.これに続いて発達するより大規模なジェットは内部の速度差によりジェット進行方向に強く伸張されフィンガー状に分裂するが,これは更なる分裂を経て着水初期の微小飛沫群よりサイズの大きな飛沫を生成する.この様にジェットの着水過程において二つの異なる飛沫生成機構が存在する事を明らかにした.2,ジェットの波峰方向の断面長さをジェットの分裂サイズとして定義し,そのサイズ分布を求めた.時々刻々のサイズ分布はあるピークサイズと分散をもつ対数正規分布により近似可能である事を明らかにした.また,ジェットの分裂サイズのピーク及び分散の時間的遷移がウェーバー数に依存する事を明らかにした.3,ジェットの本体から先端にかけての軸に沿ったジェット流体の存在確率(ジェットの体積率)をジェットの進行と共に分散が増加するガウス分布を確率密度とする累積分布関数で近似した.この時の分布の中央位置及び分散をフルード数とウェーバー数によりモデル化可能である事を示した.沿岸域において砕波に伴い発生する飛沫は特に暴波浪時に大量に陸域へと飛来し沿岸構造物等の塩害の原因となる他,砕波ジェットの構造物への衝突に伴う越波飛沫は人的・物理的被害をもたらす原因となる為,沿岸域の安全性を確保する為には飛沫の生成量や飛散範囲を予測法を確立する必要がある一方,その為の研究は十分に行われていない.そこで,巻き波砕波発生時の飛沫生成機構を明らかにすると共に,飛沫生成量について統計的に特徴化する為に,砕波ジェットの着水過程を三次元Large Eddy Simulationにより数値的に再現した.ジェット着水に伴う水面の局所変形を正しく計算するために,表面張力の作用等の自由水面における力学的境界条件を厳密に与え得る事が確認されている数値計算法を用いた.勾配を有する水路内で造波境界において初期擾乱を含む波浪を与える事により数値試行実験を行い,ジェットの水面形遷移の結果として生じる飛沫について統計的特徴を調べた.本研究により得られた主な結果を以下に示す.1.砕波に伴う飛沫の生成機構を解明した.即ち,砕波ジェット着水に伴い放出される二次ジェットは,内部に含まれる波向き方向に軸を持つ交互交代縦渦の作用により変形していき,先端がフィンガー状に分裂する.フィンガーはその後長く伸張されていき,表面張力不安定を経て分裂する事により飛沫が生成される.2.フィンガーから飛沫への分裂確率を,ジェット流体の加速度により特徴化できる事が明らかとなった.二次ジェットからフィンガーへの分裂確率については既にモデル化を行っており,本結果と統合する事により砕波に伴う飛沫の最大発生量を予測し得る.平成20年度までの研究により,水塊ジェットや実験室スケールの砕波ジェットが着水したときに放出される二次ジェットが水面下の三次元渦構造との相互作用を経由してフィンガー形状及び飛沫へと分裂するメカニズムについて明らかにしたと共に,砕波ジェットのボイド率(体積率)分布を,ジェットの着水条件から予測する為のモデルを構築した.

このジェットのボイド率はジェット-壁体衝突時の圧力応答を決定する重要なファクターとなる.フィンガーのサイズや飛沫の生成量等を決定する砕波ジェットの着水条件は,沿岸域における波浪条件により規定され,生成した飛沫の陸域への飛散量や沿岸域における波浪条件は海上の気象条件に依存する.そこで本年度我々は,メソスケール数値気象モデルによる沿岸域気象場の再現を行うと共に,その時の砕波飛沫の生成,輸送,拡散過程の数値計算法の開発を行った.数値気象モデルとして用いたのは近年よく用いられているWeather Research and Forecasting(WRF)を用いた.本モデルにより大量の砕波飛沫が生成された2009年台風18号通過時の気象場の追算を行い,計算結果の沿岸域海上気象場(気圧,風速,風向等)を観測結果と比較し,その再現性を確認した.今後,気象モデルを波浪推算モデルとリンクさせれば,荒天時の波浪場の再現を行う事もできる.また,飛沫の飛散過程は,飛沫濃度の移流拡散方程式を解く事により求めた.沿岸域の飛沫濃度分布を現地観測した既往研究の結果と数値計算結果とを比較し,濃度分布の再現性を確認した.
shRNAを搭載したアデノ随伴ウイルスによるマウス肺特異的な遺伝子抑制系の確立

我々はアデノ随伴ウイルス血清型2/5ベクターにshort hairpin RNAを搭載し,マウスの肺胞上皮由来のLA-4細胞にトランスダクションし,Tgfβ1遺伝子を抑制することに成功した.この結果により遺伝子導入が従来困難であった肺胞上皮細胞へ任意のsiRNAを発現させることが可能となることが予想され,呼吸器疾患の解析に寄与すると思われる.我々はアデノ随伴ウイルス血清型2/5ベクターにshort hairpin RNAを搭載し,マウスの肺胞上皮由来のLA-4細胞にトランスダクションし,Tgfβ1遺伝子を抑制することに成功した.この結果により遺伝子導入が従来困難であった肺胞上皮細胞へ任意のsiRNAを発現させることが可能となることが予想され,呼吸器疾患の解析に寄与すると思われる.我々は本研究を開始するにあたり,マウスのTgfβ1遺伝子に対するshort hairpin RNA (shRNA)をアデノ随伴ウイルス2/5型(AAV2/5)に搭載し,これをマウス由来の線維芽細胞である3T12-3細胞に投与してTgfβ1をタンパクレベルで抑制することに既に成功していた.本年度は条件の最適化を行った.まず,shRNAを発現するにはRNA polymerase IIIプロモーターを用いるのが一般的であるが,RNA polymerase IIIプロモーターの方が良いとする知見が複数報告されているのを受け,両プロモーターの比較を行った.その結果,Tgfβ1タンパクの発現抑制に有意差は認めなかった.その過程において上記AAVをマウス肺胞上皮由来の細胞株であるLA-4に投与する実験を行った.その結果,3T12-3細胞と比較して2%のウイルス量で同等の遺伝子導入効率が得られた.そのため,我々は当初の計画にあった動物実験を延期し,in vitroの実験を継続する方針とした.その結果,上述の遺伝子導入効率の違い以外に下記の結果が得られた.(1)LA-4と3T12-3では遺伝子導入効率が50倍異なるものの,shRNAによるTgfβ1タンパクの抑制効率は約50%とほぼ同等であった.(2)Tgfβ1に対するmRNAの発現を抑制する効果はLA-4では認められたが,3T12-3では認められず,同じshRNAの配列であっても細胞によってmRNAの切断と翻訳抑制など,タンパクの発現レベルを抑制するメカニズムが異なる可能性が示唆された.(3)Tgfβ1の抑制によりLA-4の細胞増殖は促進され,3T12-3は抑制された.我々はshRNAを搭載したAAV2/5を用いて肺胞上皮由来の細胞株に発現する遺伝子を抑制し得た.この結果より我々は次に動物実験に移行する予定であったが,その前段階としてこの系の有効性を調べる方針とした。まずは我々の系とlipofection法の遺伝子導入効率を比較した.その結果,AAV2/5はLA-4細胞においてはほぼ100%の効率を認めるのに対し,lipofection法では約50%にとどまり,毒性も高かった.また,AAV2/5を用い,肺癌培養細胞H23とH1975に対する遺伝子導入実験を行った.その結果,H23細胞への遺伝子導入効率は高かったが,H1975細胞では低かった.また,AAV5の細胞侵入経路はplatelet derived growth factor receptor(PDGFR)であるとする報告があるため,各細胞のPDGFRaとbの発現を調べたところ,導入効率とPDGFRの発現量の間に相関は認められなかった.さらには,肺胞マクロファージ由来の培養細胞であるMH-Sに対するAAV2/5の遺伝子導入効率を調べたところ,3T12-3と同等であり,LA-4と比較して約100倍低かった.以上より,我々はin vitroで肺胞上皮細胞に遺伝子を導入するにはlipofectionと比べてAAV2/5が優れていることを見出した.また,in vivoにおいてAAV2/5は肺胞マクロファージと比べて肺胞上皮細胞へ遺伝子を導入する確率が高いものの,肺胞上皮由来の細胞であっても病的状態にあるものは効率が相対的に低下する可能性があり,その遺伝子導入効率を予測することは困難であることを見出した.