hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビオチン標識miRNAを用いたプルダウン法による食道癌関連遺伝子の同定と機能解析

標的遺伝子の同定法として、食道癌臨床検体および食道癌細胞株のプロファイリングから発現差のみられたmiR-XおよびmiR-Yのセンス鎖末端にビオチン標識した2本鎖miRNA(ds-miRNA)を合成し、このds-miRNAを細胞抽出液と混合することによりにmiRNA-標的mRNA 3'UTR複合体を形成させる。その複合体をストレプトアビジンでpull-downする方法を行った。細胞抽出用溶液と相互反応後の洗浄溶液の組成や反応条件等は検討の余地があるものの、本方法でいくつかの標的遺伝子候補が得られ、これら候補のうち幾つかのタンパク質の発現量の変化についてウエスタンブロット法で確認することができた。今後はこれら標的遺伝子候補とmiRNAの細胞内相互作用の再検証と、相互作用のみられた標的遺伝子に関して機能解析を行っていく予定である。miRNAの標的遺伝子の同定方法としてはまだ改良の余地はあるものの、本実験系においてmiRNA(miR-X,-Y)の標的遺伝子候補を得ることができた。これらの標的遺伝子候補について癌化に関わるか否かの機能解析にまで着手したかったが、今年度はそこまで到達することはできなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。非特異の少ないmiRNAの標的遺伝子の同定方法の改良を試みるとともに、今年度に得られた幾つかの標的遺伝子候補の機能解析を中心に進めて行く予定である。機能解析については、miRNAもしくはmiRNAのアンチセンス鎖を細胞に導入した際に標的遺伝子蛋白質の発現料変化と細胞の形態変化等を観察する。
ディジタルパノラマ撮影法の画像形成に関する基礎研究

回転パノラマ撮影法は歯科X線診断において重要な位置をしめ、その画像形成に関する理論的、実験的研究が多数ある。回転パノラマ撮影において、従来のフィルムにかわるX線検出系を用いたディジタルパノラマは、最近のディジタル化の流れに乗って注目されるようになった。このディジタルパノラマが実現すれば、画像形成ソフトウェアの変更によって、一回の撮影で任意の断層面を描出することが可能となる。さらに従来のパノラマ装置の欠点であった画像のボケ、障害陰影等を、コンピュ-タ画像処理によりとりのぞくことが期待できる。本研究では、ディジタルパノラマの基礎となる画像形成理論について以下のことを行った。(1)独自開発したイメ-ジインテンシファイアを用いるX線ビデオCTによってディジタルパノラマの投影デ-タを収集する。(2)収集した3次元投影デ-タをコンピュ-タ処理し、種々の断層位置の断層像を得る。(3)ディジタルパノラマとCTの画像再構成の理論的関係を明らかにする。これらの結果、次のことが明らかとなった。(1)ディジタルパノラマの画像形成は,不完全投影デ-タからの画像再構成として説明できる。(2)断層面の位置、断層厚は、全投影デ-タの部分集合のとり方によって変化する。(3)スキャノグラフィ、回転パノラマ、およびCTは、画像再構成に用いるX線束の数によって連続的に他に移行する。平成2年度においては備品としてマッキントッシュ用の大型カラ-ディスプレイ(1152×882ドット)、及び大容量光磁気ディスクドライブ(600メガバイト)を購入した。このうち、大型ディスプレイは従来使用していたPC9801用低解像度ディスプレイ(640×400ドット)に比べて約4倍の画像数を有する為、より高分解能表示が可能となった。また、従来の画像を同一画面上に4枚同時表示することも可能であり、種々の条件でディジタル合成したパノラマ像の同時比較観察が可能となった。また、従来は投影デ-タ等の大量の画像をフロッピ-ディスクに記録、保管していた為、1枚のフロッピ-ディスクあたり5枚の画像しか収録できず、デ-タ処理にも多くの手間を要した。今回導入した光磁気ディスクには1枚あたり2500枚以上の投影画像が収録できる為、極めて効率よくソフトウェア開発を行なえるようになった。デ-タ収集については、従来I.IーTV系のTV信号を一度ビデオテ-プに記録し、オフラインで1フレ-ムずつコンピュ-タに取込んでいたが、新たにディジタルフレ-ムレコ-ダが導入され、投影デ-タは直接フレ-ムメモリ上に記録することが可能となった。これにより、一度アナログに変換し、後にディジタル化する従来の方法よりもS/N比が向上し、デ-タ処理に要する時間も大幅に減少した。ソフトウェアについては従来のPC9801上にC言語で開発したものに改良を加え、特にユ-ザ-インタ-フェイスを向上させた。また、現在このソフトウェアをマッキントッシュ上にも移植中である。平成3年度においては、画像再構成に用いる3次元投影デ-タを効率よく収集する為にX線ビデオCTの各部の改良を行った。前年度に導入したディジタルフレ-ムレコ-ダは、パラレルインタ-フェイスによってマッキントッシュとつながり、大量の投影デ-タが、高速に収集できるようになった。また、今年度に新しく導入した高分解能ビデオカメラを従来のビデオカメラと置きかえることによって、空間分解能、およびS/N比の向上に努めた。以上の改良により、ディジタルパノラマ撮影法の画像形成に必要な投影デ-タの質の向上を行った。この投影デ-タを用いて、コンピュ-タにより、種々の断層面、断層厚でのディジタルパノラマ像を合成した。その結果、以下のことが明らかとなった。(1)回転パノラマ撮影の画像形成は、不完全投影デ-タからの画像再構成によって説明できる。(2)断層面の位置、およびその厚さはサイノグラム上の軌道、いいかえれば全投影デ-タの部分集合によって決定される。

(3)スキャノグラフィ、回転パノラマ撮影、およぴCTは画像再構成に寄与する線束の数によって連続的に他に移行する。画質を向上させる為には、検出系の分解能の向上、サンプリング間隔を多くすることの2点が極めて重要であることがわかった。
精神疾患例での脳神経回路の解析

統合失調症は、その症状から脳の神経細胞の変化が示唆される。しかし、その物理的基盤は明らかでない。本研究では、統合失調症例と健常例を対象に、SPring-8および米アルゴンヌ国立研Advanced Photon Sourceにおいて、ナノトモグラフィ法により前帯状回皮質の組織構造を解析した。得られた三次元像から神経細胞をトレースし、神経突起の曲率等を評価した。その結果、神経細胞の構造が個人間で異なり、統合失調症で顕著に変化することが明らかとなった。解析対象とした前帯状回は、意思決定等の精神機能を担う部位とされている。本研究で見出した構造変化は、統合失調症の精神症状を反映している可能性がある。ヒト脳の神経回路は、無数の神経細胞から構成されている。様々な精神疾患は、この神経回路の変化が原因である。ヒト脳の神経回路を健常例と疾患例で解析・比較すれば、疾患に特徴的な回路を明らかにできると考えられる。研究代表者は、これまでヒト脳神経回路を解析する研究を進めてきた。既に、X線マイクロトモグラフィ法を用いて、ヒト脳の神経回路が決定できることを報告している。本課題では、この方法を健常例および疾患例のヒト脳組織に適用し、神経回路を解析・比較することを目的とする。精神疾患に伴う回路変化を明らかにできれば、発症機構に基づいて治療法を確立するための重要な一歩となる。神経回路の解析を進めるにあたっては、ヒト脳組織標本を重元素で標識して回路解析に適した均一かつ精細な三次元像を得ることが、重要なポイントとなる。そこで本年度は、ヒト脳組織の精細なX線像が得られるように重元素標識法を最適化するなど、研究のベースとなる項目の確立を目標とした。実際に得られた検体については、マイクロトモグラフィ測定を行って解析像をフィードバックし、神経組織の可視化に適した測定試料を調製するための条件を決定した。また、実データから再構成計算を行うことで、画像処理を迅速に行う方法を確立した。解析像の観察では、物品費に計上した三次元レンダリングソフトウエアが有効活用できた。ヒト脳の神経回路を健常例と疾患例で解析・比較すれば、疾患に特徴的な回路を明らかにできる。神経回路の解析を進めるにあたっては、複数症例のヒト脳組織検体を重元素で標識して回路解析に適した均一かつ精細な三次元像を得ることが、重要である。そこで本年度は、主に疾患例を対象としてヒト脳組織の三次元解析像を得るため、測定実験を進めるとともに、複数の症例でネットワーク構造の解析を行うことを目標とした。それぞれの測定検体については、放射光施設でマイクロトモグラフィ測定を行ってX線像を得て、昨年度までに整備してきた計算機環境等を適用することで、迅速に構造解析を行うことができた。精神疾患は、この神経回路の変化が原因である。本課題では、この方法を健常例および疾患例のヒト脳組織に適用し、神経回路を解析・比較することを目的としている。そのような疾患例に特徴的な構造の抽出を行うにあたっては、複数症例のヒト脳組織検体を重元素で標識して、解析に適した均一かつ精細な三次元像を得ることとともに、それら構造をトレースして、神経ネットワークを解析することが重要である。そこで本年度は、比較検討に十分な症例数となるよう、引き続き測定検体を準備して測定実験を進めるとともに、これまで検討してきた専用のアルゴリズムを適用して三次元像の自動的な解析を行った。本年度は、複数症例での測定検体を準備して、放射光施設でのマイクロトモグラフィ実験を行うとともに、専用のアルゴリズムを組み込んだソフトウエアを用いて三次元構造を解析する研究を進めた。測定は6月と11月に実施し、コンピュータによる自動解析も応用段階に達している。年度前半には米国顕微鏡学会より研究全般に関して解説論文を書くよう依頼を受け、同学会誌Microscopy Today 2015年9月号でFeature Articleとしてこれまでの成果を発表している。精神疾患は、この神経ネットワークの変化が原因である。ヒト脳の神経ネットワーク構造を健常例と疾患例で解析・比較すれば、疾患に特徴的な変化を明らかにできると考えられる。研究代表者は、これまでヒト脳の神経ネットワーク構造を解析する研究を進めてきた。

本課題では、この方法を健常例および疾患例のヒト脳組織に適用し、神経ネットワーク構造を解析・比較することを目的とする。精神疾患に伴う変化を明らかにできれば、発症機構に基づいて治療法を確立するための重要な一歩となる。疾患例に特徴的な構造の抽出を行うにあたっては、複数症例のヒト脳組織検体を重元素で標識して、解析に適した均一かつ精細な三次元像を得ることとともに、それら構造をトレースして、神経ネットワークを解析することが重要である。そこで本年度は、当初計画にはなかったが、米国アルゴンヌ国立研究所Advanced Photon Source (APS)においてPrincipal Investigatorとして測定課題を取得して放射光実験を行い、X線像データから三次元像を得た。また、これまで利用してきたSPring-8においても同様に測定課題を実施した。これらはそれぞれナノメータースケールあるいはマイクロメータースケールでの可視化を目的としたものである。得られた三次元像をもとに、専用のアルゴリズムを適用することで、神経ネットワークや毛細血管の構造モデルを構築した。解析については前年度までのデータも含めて研究を進めた。本年度は、複数症例での測定検体を準備し、研究計画に沿って2016年6月に米放射光施設APSでナノトモグラフィ実験を行い、また、9月には国内のSPring-8においても実験を行った。得られたデータをもとに、専用のアルゴリズムを組み込んだソフトウエアを用いてワイヤーモデルを構築し、ヒト脳組織の三次元構造を解析する研究を進めた。関連する申請者らによる研究成果は、マサチューセッツ工科大学傘下の団体が発行するMIT Technology Review誌上において、記事として紹介された(2016.9)。ヒト脳の神経回路は、無数の神経細胞から構成されている。精神疾患は、この神経ネットワークの変化が原因と考えられる。したがって、ヒト脳の神経ネットワーク構造を健常例と疾患例で解析・比較すれば、疾患に特徴的な変化を明らかにできる。本研究課題では、主要な精神疾患である統合失調症をとりあげ、健常・疾患各剖検例の脳組織検体を用いて、神経細胞の三次元的なネットワーク構造を解析してきた。解析手法としては放射光X線によるナノトモグラフィ法を用い、大脳の前帯状回を主な解析対象とした。前帯状回は、統合失調症・注意欠陥多動性障害・強迫性障害等との関連が報告されている。この部位で精神疾患に伴う変化を明らかにできれば、発症機構に基づいて治療法を確立するための重要な一歩となる。本年度は、米国アルゴンヌ国立研究所Advanced Photon Source (イリノイ州)、および、SPring-8(兵庫県)において放射光実験を行い、X線像データから三次元像を得た。これまでのデータも含めて、統合失調症例4例と健常例4例で三次元像から構造モデルを構築し、それぞれデカルト座標系で記述された神経ネットワーク構造を決定した。その幾何学的解析から、神経突起の曲率が個人間で異なり、その差が統合失調症で顕著になることを見出した(https://arxiv.org/abs/1804.00404)。
沿岸湧昇流の季節的動態とその接岸がカジメ海中林に与える影響の解明

千葉県安房郡小湊地先から鴨川地先の沖5kmには水深200mを越える鴨川海底谷が南北方向に存在し,強風によってしばしば沿岸湧昇が生じて,海洋深層水が沸き上がっていることが知られている。しかし,この湧昇流の発生要因,発生時期,発生頻度,動態,沿岸生態系に与える影響についてはほとんど調べられていない。同地沿岸部では大型多年生褐藻のカジメ(コンブ目,コンブ科)が100ヘクタール以上の規模の大きな海中林を形成し,高い生産力を持つ主要な一次生産者であることがこれまでの私の研究によって明らかにされつつあり,沿岸部で最大の現存量を示すカジメを沿岸湧昇と沿岸生態系との関係を考察するためのモデル生物として研究対象に選んだ。小湊地先では鴨川海底谷由来の湧昇流が接岸すると水温が急激に低下することが知られており,同地のカジメの光合成,生長,そして生産力には湧昇流の低水温性や,富栄養性が関係していると考えられるが,そのような観点からの研究は皆無である。そこで,本研究では周年を通して鴨川海底谷から小湊地先までの栄養塩類の濃度と水温の分布を調べることによって,同地の湧昇流における発生要因,発生時期,発生頻度,動態を明らかにするとともに,カジメの生産力を調査し,沿岸湧昇の発生時期や頻度と比較し,さらに,湧昇域の海水等を用いてカジメの生長および光合成を調べることによって,湧昇流の沿岸生態系に与える影響について解明しつつある。千葉県安房郡小湊地先から鴨川地先の沖合には水深200mを越える鴨川海底谷が南北方向に存在し,しばしば沿岸湧昇が生じて,海洋深層水が沸き上がっていることが知られている。しかし,この湧昇流の発生要因,発生時期,発生頻度,動態そして沿岸生態系に与える影響についてはほとんど調べられておらず,小湊地先に生育する主要な一次生産者のカジメ(褐藻,コンブ科)に関しても知見が乏しい。本研究では周年を通してこの湧昇のメカニズムを調べ,カジメの生産力と沿岸湧昇の発生時期や頻度との関係を考察するとともに,湧昇域の海水等を用いてカジメの生長および光合成を調べることによって,濡昇流の沿岸生態系に与える影響について解明することを目的に研究を行っている。平成15年度は,鴨川海底谷上で4月より毎月深度別に水温・光強度を測定し,栄養塩類の分析用の海水を採水している。これらの解析により年間に生じる湧昇の頻度,範囲,および時期について明らかにしつつある。また8月(夏季)と2月(冬季)に海底谷上の表層水及び深層水を用いてカジメの光合成速度と呼吸速度の活性を比較した。これにより湧昇水がカジメの生理活性に与える影響を解明しつつある。さらに,毎日午前10時に測定されている小湊地先の風向および風力のデータと水温の4月からのデータを解析中である。これにより湧昇と風向と風方の因果関係を明らかにしつつある。また,5月に小湊地先のカジメ海中林内に連続水温計を設置し,通年の水温を1時間間隔で測定中である。このデータを解析することにより沿岸に到達する湧昇流の頻度,時期について明らかにしつつある。そして,カジメ群落内に永久コドラートを設置し,7月より毎月その枠内のカジメ約50個体の茎部や葉部の生長を測定している。このデータの解析によりカジメの生長における時期的な変化・湧昇流との因果関係を明らかにしつつある。
Ｃ線維選択的刺激誘発電位による神経障害性疼痛の中枢性感作の病態解析

神経障害性疼痛患者における病態評価として、表皮内電気刺激法を用いてAδ線維・C線維の選択的刺激を行い疼痛関連誘発電位を評価、その結果、神経障害性疼痛において有意なAδ/C振幅比の増大を認め、またAδ/C振幅比増大と疼痛症状の強さは関連を示し、Aδ線維からのC線維に対する抑制の減少が疼痛機序の一因となりうる可能性が示唆された。表皮内電気刺激法を用いた疼痛関連誘発電位は、神経障害性疼痛の病態機序の推定及び客観的評価に有用な手法となり得ると考えられた。神経障害性疼痛の特徴は、アロディニアを始めとする疼痛過剰反応及び、末梢中枢神経系の様々なレベルでの感作による病態機序の複雑化にあり、難治性慢性疼痛の一因となる。近年考案された表皮内電気刺激法は疼痛に関連する神経(Aδ線維及びC線維)を選択的かつ簡便に刺激することが可能であり、疼痛関連誘発電位による評価は中枢性疼痛機序に対する新たな電気生理学的評価手法として期待される。当研究は上記知見に基づき、神経障害性疼痛における中枢神経系での疼痛機序・異常反応を明らかにし、慢性疼痛の客観的評価および新規治療創出の為の基盤を構築する事を目的とした。本年度は、神経障害性疼痛患者において上記手法を用いて疼痛関連誘発電位を評価、健常群との比較により疼痛患群での特徴を解析・検討した。また疼痛症状との相関を評価し、上記手法において客観的疼痛指標となりうるパラメータの探索を行った。対象は非脱髄性末梢神経障害もしくは脊髄・脊椎疾患に伴う神経障害性疼痛患者13名と正常対照17名で、疼痛群では健常群と比較しAδ振幅では軽度低下傾向を認めるもC振幅は保たれる傾向にあった。また、Aδ刺激反応に対するC線維刺激反応(C/Aδ振幅比)は疼痛群で健常群と比べ有意に増大した。また、疼痛症状の強い群(VAS60以上)において、正常対照・軽症疼痛群と比較し、C/Aδ振幅比は有意に増大した。Aδ刺激に対するC線維刺激反応の増大の所見は、Aδ線維の脱抑制に伴うC線維反応の増大を示唆する可能性が考えられ、以上の結果から、表皮内電気刺激法を用いた疼痛関連電位検査は神経障害性疼痛の病態解析や疼痛の客観的評価に有用な可能性があると考えられた。本年度は健常者38名に対して、表皮内刺激電極を用いた疼痛関連誘発電位を上下肢刺激下で評価し、年齢・性別・身長等の背景因子による変化を解析した。結果、同検査における潜時・振幅等の各パラメータには、それぞれの背景因子に関連する有意差は認めなかった。また、神経障害性疼痛患者14名に対して、表皮内刺激電極を用いた疼痛関連誘発電位を評価し、健常者群38名との比較・解析を行った。神経障害性疼痛患者では有意な刺激閾値上昇・振幅低下を認め、またAδ・C線維の振幅比に異なる傾向が見られた。以上の結果を踏まえ、年齢層別の評価・正常値の検討、患者群における疼痛・非疼痛群での検討、疾患背景(基礎疾患・罹病期間・症状等)の影響等を考慮し、正常値の作成・疾患群での検査系の確立へと、今後研究を進めていく予定である。正常群・疼痛疾患群共に当初の目標人数を8割前後達成しており、検査手法・評価法における技術面の改善や安定性の向上もみられ、現時点の検査データによる中間解析おいても上記結果が得られており、本研究は概ね順調に進展していると考えられる。健常者における年齢層別解析に関しては、被験者の年齢層のばらつきが懸案課題となった為、今後は不足している中高齢健常者を主対象に絞って再度募集・評価予定である。患者群に関しては、引き続き、神経障害性疼痛患者の症例確保を図り、統計解析においては疼痛患者群での背景因子(基礎疾患・罹患歴・臨床症状・治療内容など)の均一化及びその影響を含めたサブ解析なども進め、最終的に研究成果を論文として公表する。該当なし
生物リズム低温停止現象の分岐理論を用いた理解

約24時間の生理的活性のリズムは概日リズムと呼ばれている。概日リズムは低温・強光下など環境条件を変えると、アリズミック(無周期)と呼ばれるリズム消失が起こることがある。「なぜリズムが見られないのか」という疑問に関して、遺伝学による解析は難しく分子的な機能と結びつけて議論する試みはあまり成功していない。このようなシステムの定性的変化に対して有効な理論が、非線形動力学の分野で知られている分岐理論である。この理論によれば、自律振動がみられなくなるタイプの分岐は主にHopf分岐とSNIC分岐がある。本研究では分岐理論を用いて低温下での「リズムがなくなる」現象を2種類に分類し、理解することを目的としている。昨年度、シアノバクテリア概日リズム試験管内再構成系が低温でHopf分岐のシナリオでリズム消失するという論文をまとめた。リズムがないと考えられてきた低温域でもわずかな昼夜の変化に共鳴してリズムが回復するという現象を見つけたが、これは試験管内再構成系でしか確認できていない。本年度はシアノバクテリア細胞のリズムの共鳴現象を解析した。低温で培養したシアノバクテリアは恒明条件では明瞭なリズムを示さなかったが、24時間周期の明暗サイクルを与えるとリズムが回復することが生物発光レポーターを用いた解析で確認できた。明暗サイクルの周期を変えると発光リズムのパターンが変化したため、シアノバクテリア細胞内でも共鳴によるリズム回復が起こっている可能性が示唆された。時計因子や関連因子のmRNAとタンパク質のリズムの検出を試みたが、低温ではシアノバクテリアの増殖が著しく遅く長期間の経時的サンプリングが難しかったため、培養装置や実験条件の改良を進めた。休暇取得のため、今年度の研究計画の一部は次年度以降に行うこととなった。また体調の変化に伴い進めにくい計画が生じ、順番を変更することがあった。そのため、やや遅れた進捗状況にあると判断した。シアノバクテリア細胞の共鳴によるリズム回復の解析を引き続き進め、概日時計がないと考えられてきた環境で生物が生理的な時計を使っていることを実証する。また概日時計を持つ生物は持たない生物よりも生存に有利であることが知られている。共鳴したリズムを持つシアノバクテリアの環境への適応度を評価するため、競合培養実験を行う。本研究は、アフリカツメガエルの細胞周期の低温停止現象も研究対象としている。本年度はアフリカツメガエルの卵割が低温でSNIC分岐のシナリオで停止することを示すデータの再現性がとれたが、無細胞系で観察されるリズムの低温での分岐を明らかにするまでに至らなかった。分岐の種類を明らかにした後、受精卵と無細胞系の細胞周期がそれぞれどの位相で停止しているか、停止する位相は一致するかを調べる。また既知のチェックポイントと同等のものかどうかを発現解析から確認し、低温を感知するチェックポイントの同定を試みる。このようなシステムの定性的変化に対して有効な理論が非線形動力学の分野で知られている分岐理論であり、自律振動がみられなくなるタイプの分岐は主にHopf分岐とSNIC分岐がある。私はシアノバクテリア概日リズム試験管内再構成系の低温域での振る舞いを調べ、19°C付近で周期は変わらないが振幅がゼロになる、つまりHopf分岐のシナリオでリズムが消失する可能性が高いことを示した。またリズムがないと考えられてきた低温(19°C以下)で試験管内リズムがHopf分岐の理論の通り減衰振動子となること、さらに16°C12時間/18°C12時間という低温かつわずかな差の温度サイクルで強制振動を起こすことを明らかにした。本年度は温度サイクルの周期を変えた実験を行い、強制振動の振幅に周波数特異性があることを示した。これは物理学で共鳴と呼ばれる現象である。これらの結果は、低温でも減衰振動子が昼夜のわずかな環境変化に共鳴して大きな振幅のリズムになることで生理的に機能する時計を作ることを示唆している。計算機シミュレーションを行いHopf分岐であれば低温下で共鳴が起こるが、SNIC分岐では起こらないことを確認した。低温でHopf分岐を介して減衰振動子になることは、概日時計を使える温度域を広げる生理学的意義がある。以上の結果を論文で報告した。また細胞周期をリズムとみなし「分岐理論」を切り口として解析した。アフリカツメガエルの卵割を様々な温度で調べ、低温で周期が著しく伸びる、つまりSNIC分岐のシナリオでリズムが停止する可能性が高いことを示した。昨年4月に発生した熊本地震で被災し、家庭生活に大きな影響があった。地震前とほぼ同じ生活に戻るまで研究に集中しづらい期間ができてしまったことを残念に思っている。本年度はシアノバクテリアの概日リズム低温停止現象について、特に減衰振動子の共鳴に関する研究が進んだ。この成果を論文にまとめて報告できたという点では評価できると思うが、アフリカツメガエルの細胞周期の低温停止に関する研究には少し遅れが出てしまった。

「なぜリズムが見られないのか」という疑問に関して、遺伝学による解析は難しく分子的な機能と結びつけて議論する試みはあまり成功していない。このようなシステムの定性的変化に対して有効な理論が、非線形動力学の分野で知られている分岐理論である。この理論によれば、自律振動がみられなくなるタイプの分岐は主にHopf分岐とSNIC分岐がある。本研究では分岐理論を用いて低温下での「リズムがなくなる」現象を2種類に分類し、理解することを目的としている。昨年度、シアノバクテリア概日リズム試験管内再構成系が低温でHopf分岐のシナリオでリズム消失するという論文をまとめた。リズムがないと考えられてきた低温域でもわずかな昼夜の変化に共鳴してリズムが回復するという現象を見つけたが、これは試験管内再構成系でしか確認できていない。本年度はシアノバクテリア細胞のリズムの共鳴現象を解析した。低温で培養したシアノバクテリアは恒明条件では明瞭なリズムを示さなかったが、24時間周期の明暗サイクルを与えるとリズムが回復することが生物発光レポーターを用いた解析で確認できた。明暗サイクルの周期を変えると発光リズムのパターンが変化したため、シアノバクテリア細胞内でも共鳴によるリズム回復が起こっている可能性が示唆された。時計因子や関連因子のmRNAとタンパク質のリズムの検出を試みたが、低温ではシアノバクテリアの増殖が著しく遅く長期間の経時的サンプリングが難しかったため、培養装置や実験条件の改良を進めた。休暇取得のため、今年度の研究計画の一部は次年度以降に行うこととなった。また体調の変化に伴い進めにくい計画が生じ、順番を変更することがあった。そのため、やや遅れた進捗状況にあると判断した。シアノバクテリア概日リズムの低温停止現象について、これまでは主に概日リズム試験管内再構成系を用いて解析を行ってきた。本年度に見つけた、これまでリズムがないと考えられてきた低温でも昼夜の環境変化に共鳴することによりリズムが回復するという現象が、シアノバクテリア細胞内でも再現できるかを明らかにする予定である。シアノバクテリアの概日時計はゲノムワイドに遺伝子発現を制御することが知られているので、細胞の生理活性のリズムまで回復するかどうか注目している。遅れているアフリカツメガエルの細胞周期の研究については、サイクリング抽出液で観察されるリズムの低温での分岐を調べるところから進める。シアノバクテリア細胞の共鳴によるリズム回復の解析を引き続き進め、概日時計がないと考えられてきた環境で生物が生理的な時計を使っていることを実証する。また概日時計を持つ生物は持たない生物よりも生存に有利であることが知られている。共鳴したリズムを持つシアノバクテリアの環境への適応度を評価するため、競合培養実験を行う。本研究は、アフリカツメガエルの細胞周期の低温停止現象も研究対象としている。本年度はアフリカツメガエルの卵割が低温でSNIC分岐のシナリオで停止することを示すデータの再現性がとれたが、無細胞系で観察されるリズムの低温での分岐を明らかにするまでに至らなかった。分岐の種類を明らかにした後、受精卵と無細胞系の細胞周期がそれぞれどの位相で停止しているか、停止する位相は一致するかを調べる。
選択的がん幹細胞毒性を指標とする新規抗がん剤シーズの探索研究

生薬約200種を用いて、がん幹細胞抑制活性を持つ生薬抽出液をスクリーニングした結果、ハンゲショウ(Saururus chinensis)、キカラスウリ(Trichosanthes kirilowii)、ヒメグンバイナズナ(Lepidium apetalum)に活性が見られた。ハンゲショウ(S. chinensis)より得たメタノールエキスをBioassay Guided Fractionation法により分画し、Tetrahydrofuran-type 4種, Carpanone-type, 8,4'-Oxyneolignan-type, Licarin-type各1種の計7種のlignan誘導体を得た。単離した化合物の内、Tetrahydrofuran-typeのlignanの中で、芳香環上に酸素官能基を多く持つ化合物に強い活性が認められた。さらに活性画分を精査し新たに3種のTetrahydrofuran-type lignanを単離している。現在、ソロモン諸島産植物など約20種の抽出物ライブラリーを作製済みで、今後活性スクリーニングを行う予定である。単離した化合物の作用機序に関しては、SC-6、SC-7特に強いmammosphere形成の抑制作用が認められた。またヒト乳がん幹細胞の指標であるCD44+/24-発現量はSC-7により抑制されることを確認している。昨年度に引続き、ハンゲショウ(Saururus chinensis)より得たメタノールエキスの活性画分をBioassay Guided Fractionation法に基づいて分画し、新たに5種の化合物を得た。これらの構造はNMRスペクトルなどの解析により、3種のtetrahydrofuran lignanおよび2種の8,4'-oxyneolignanであった。現在単離した化合物の乳がん幹細胞増殖抑制活性の測定を予定している。昨年度に引続き、ハンゲショウ(Saururus chinensis)より得たメタノールエキスをBioassay Guided Fractionation法により分画し、新たに5種の化合物を得た。これらの構造はNMRスペクトルの解析によりそれぞれtetrahydrofuran-type 3種およびその他2種の化合物であった。現在単離した化合物のがん幹細胞抑制活性を準備中である。また、植物抽出物ライブラリーの活性スクリーニングにおいて、生薬カロコンがヒト乳がん幹細胞増殖抑制活性を示した。活性成分として脂肪酸を単離した。脂肪酸の詳細な構造は解析中である。更にトウダイグサ科植物狼毒大戟(Euphorbia fischeriana)から単離した新規ent-Atisane型ジテルペノイドなどが、ヒト乳がんMCF-7細胞より誘導したがん幹細胞の増殖を抑制することを明らかにした。今後これらのジテルペノイド類縁体が、がん幹細胞を標的とした新規抗がん剤創製に寄与することが期待される。医歯薬学Saururuschinensisには、まだまだ多くの活性成分が含まれていることより、活性成分の単離をさらに進行させると共に、他の植物から単離した化合物についても乳がん幹細胞増殖抑制活性の測定を行う予定である。また、乳がん幹細胞増殖抑制活性の構造活性相関が明らかになり次第、リード化合物の構造に基づいて新規誘導体の合成を行う予定である。Saururus chinensisの活性画分には非常に多くの構造の似かよった成分が含有されており、活性成分の単離に時間を要しており、SC-7をリード化合物とする新規誘導体の合成は現時点ではまだ、進行していない。残金が633円であったため、次年度の助成金に回した。Saururus chinensisの活性成分の単離をさらに進行させると共に、他の植物よりがん幹細胞抑制活性を持つ成分の単離を試みる。また近年、STAT3ががん幹細胞の維持に関与しているとの報告があることより、STAT3活性に対するSC-7の影響を検討する予定である。全て消耗品として使用する。残金が1638円であったため、次年度の助成金に回した。全て消耗品として使用
汽水生沈水植物の保全を目的とした遺伝的集団構造解析

本研究は、汽水生沈水植物の遣伝的構造とその成立要因を明らかにしようとするものである。そのモデルとして、カワツルモ科カワツルモ属およびイトクズモ科イトクズモを用いた。これまでの分類から、全世界のカワツルモ(Ruppia matitima)とヨーロッパからアジア北部のネジリカワツルモ(R.cirrhosa)、北米及びアジア北部のR.occidentalis、南米の高山地帯のR.fillifolia、オセアニアのR.megacarpa、R.polycarpa、R.tuberolycarpa、R.tuberosaが認識できる。これを基に、アジア・オセアニア・ヨーロッパ・北米の材料を用いた葉緑体DNA及び核DNA(フィトクローム遺伝子群)分子系統解析からは、アジア北部に分布するネジリカワツルモとオセアニア南部に分布するR.megacarpaから成るクレードA,それぞれオセアニア南部に分布するR.tuberosa、R.polychrpaから成るクレードBとクレードC、そしてアジア・オセアニア・ヨーロッパ・北米に広く分布するカワツルモとR.occidentalisから成るクレードDの4つが支持された。また、クレードDには2倍体・3倍体・4倍体が含まれており、それぞれがサブクレードを形成した。これらの結果は、従来の分類学的研究をおおよそ支持しているとともに、外部形態形質からも同ー種の可能性が高い南北極地域に隔離分布となるクレードAや倍数性の見られたクレードDなど、新しい分類群の設立の必要性が生じた。以上より、染色体の倍数化と鳥媒介による広域散布によって現在のカワツルモ科の遺伝的構造が形成されたことが明らかになった。イトクズキ科イトクズモ属は、形態、染色体数、葉緑体DNAの解析から、国内にこれまで認識されていない2分類群が存在することが明らかになった。以上から,汽水生沈水植物では,散布範囲が広く広域分布種が多い一方で局所的な種分化が起きていることがわかった。これらの保全を考える際には,形態とDNA,染色体情報を用いた種の同定を行うことがまず必要である。さらに今後は,各分類群内の遺伝子流動を把握する必要がある。本研究は、汽水生植物カワツルモの日本国内における遺伝的集団構造とその成立要因を明らかにするために、国内での分布状況を調査し分類学的再検討を行った上で、新たに開発したDNAマーカーを用いて集団遺伝学的解析を行おうとするものである。カワツルモ科カワツルモ(Ruppia maritima L. ; Ruppiaceae)は汽水域に生育する多年生の沈水植物で、カモ類などの渡り性水鳥にその種子が捕食されることや、その排泄物中の種子が発芽することが多数報告されていること、また日本国内において、それら渡り性水鳥の渡り経路とカワツルモの分布域が重なっていることから、水生植物の広域分布と隔離された集団特性を明らかにする上で適した植物である。しかし、外部形態の変異が大きく識別形質に乏しいことから分類学的に十分整理されておらず、その自生状況も明らかでなかった。そこでまず、日本国内における自生状況の把握、分類学的な再検討を行った後に、集団遺伝学的解析を行うことにした。17年度は、文献や標本よりこれまでに生育が報告されている78地点のうち全国の43地点を調査した。その結果、28集団で生育を確認し、新たに1集団を確認できた。一方、15集団は絶滅したこともわかった。また分類学的形質の再検討として、葉端形状と果梗長とそのねじれ具合、染色体倍数性の変異を調査した結果、国内のほとんどの集団は典型的なカワツルモであるが、北海道と新潟県佐渡島には、特異な集団があることが明らかとなった。本研究は、汽水生沈水植物の日本国内における遺伝的集団構造とその成立要因を明らかにするために、国内での分布状況を調査し分類学的再検討を行った上で、新たに開発したDNAマーカーを用いて集団遺伝学的解析を行おうとするものである。カワツルモ科カワツルモ(Ruppia maritima L.;Ruppiaceae)は汽水域に生育する多年生の沈水植物で、カモ類などの渡り性水鳥にその種子が捕食されることや、その排泄物中の種子が発芽することが多数報告されていること、また日本国内において、それら渡り性水鳥の渡り経路とカワツルモの分布域が重なっていることから、水生植物の広域分布と隔離された集団特性を明らかにする上で適した植物である。そこでまず、日本国内における自生状況の把握、分類学的な再検討を行うことにした。18年度は、カワツルモの染色体数および葉緑体DNA塩基配列情報を調査した。その結果、佐渡のネジリカワツルモが2n=20、熊本・小笠原父島・沖縄本島・久米島のカワツルモが2n=40、石垣島・中国・海南島のカワツルモが2n=20であることが明らかとなった。このうち、ネジリカワツルモの2n=20、カワツルモの2n=20はアジアからの初記録となり、2n=40のカワツルモは、三重・愛媛・広島・韓国蔚山以外のものとなった。分子系統解析から、大きく2つのグループを認識でき、一方のグループにはさらに2つのサブグループを認識することが出来た。外部形態形質を評価すると、一方はネジリカワツルモに、他方はカワツルモに当たると考えられ、さらに後者に認められた台湾、香港などからなる一方のサブグループは、変種R.maritima

var.pacifica Fosberg & St.Johnと考えられた。さらに、イトクズモZannichellia palustrisについて、国内の生育状況を調査した。標本調査により、世界各地のRuppiaおよびZannichelliaの分布と変異を調査した。本研究は、汽水生沈水植物の遣伝的構造とその成立要因を明らかにしようとするものである。そのモデルとして、カワツルモ科カワツルモ属およびイトクズモ科イトクズモを用いた。これまでの分類から、全世界のカワツルモ(Ruppia matitima)とヨーロッパからアジア北部のネジリカワツルモ(R.cirrhosa)、北米及びアジア北部のR.occidentalis、南米の高山地帯のR.fillifolia、オセアニアのR.megacarpa、R.polycarpa、R.tuberolycarpa、R.tuberosaが認識できる。これを基に、アジア・オセアニア・ヨーロッパ・北米の材料を用いた葉緑体DNA及び核DNA(フィトクローム遺伝子群)分子系統解析からは、アジア北部に分布するネジリカワツルモとオセアニア南部に分布するR.megacarpaから成るクレードA,それぞれオセアニア南部に分布するR.tuberosa、R.polychrpaから成るクレードBとクレードC、そしてアジア・オセアニア・ヨーロッパ・北米に広く分布するカワツルモとR.occidentalisから成るクレードDの4つが支持された。また、クレードDには2倍体・3倍体・4倍体が含まれており、それぞれがサブクレードを形成した。これらの結果は、従来の分類学的研究をおおよそ支持しているとともに、外部形態形質からも同ー種の可能性が高い南北極地域に隔離分布となるクレードAや倍数性の見られたクレードDなど、新しい分類群の設立の必要性が生じた。以上より、染色体の倍数化と鳥媒介による広域散布によって現在のカワツルモ科の遺伝的構造が形成されたことが明らかになった。イトクズキ科イトクズモ属は、形態、染色体数、葉緑体DNAの解析から、国内にこれまで認識されていない2分類群が存在することが明らかになった。以上から,汽水生沈水植物では,散布範囲が広く広域分布種が多い一方で局所的な種分化が起きていることがわかった。これらの保全を考える際には,形態とDNA,染色体情報を用いた種の同定を行うことがまず必要である。さらに今後は,各分類群内の遺伝子流動を把握する必要がある。
脊椎動物の網膜色素変性症モデルにおける繊毛を介したオプシン輸送機構の解析

平成24年度は、ゼブラフィッシュ視細胞脱落変異体GEP360とGEP305の表現型解析を中心に行った。特にGEP360は、昨年度、原因遺伝子の同定に成功し、セントロソーム関連因子の異常によることが示唆される結果を得ている。本年度は、GEP360原因遺伝子産物の哺乳類ホモログを単離し、培養細胞での発現を解析した。この原因遺伝子産物がセントロソームに局在することを確認した。また、GEP360の視細胞の変性が通常のIFT変異体よりも緩やかに進行することが明らかとなり興味が持たれる。また、Makと相互作用する分子として、ショットガン法を用いたプロテオミクス解析により約500のペプチド断片を同定しており、これらの中からオプシン輸送に関与する因子の同定を進めている。Makを含めた繊毛キナーゼがモーター蛋白質をリン酸化することでオプシンをはじめとしたGPCRの輸送に関与する可能性を見出しており、研究の展開が期待される。さらに、Otx2の下流遺伝子から繊毛関連因子の同定をマイクロアレイ解析により進めている。これまでに、候補遺伝子を抽出し、いくつかの因子が培養細胞において繊毛に局在することを確認した。今後も、これらの因子の視細胞における機能の解析を継続する。2012年度の国際繊毛会議(ロンドン)などで発表を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、Makがオプシンの輸送機構に関与する可能性を調べる目的でオプシンの繊毛内輸送に関与すると予想される分子であるキネシンモータータンパク質Kif3aと微小管結合タンパク質RP1について、Makがこれらのタンパク質をリン酸化するか否か解析を行った。精製したMakをKif3aとRP1を基質として、in vitroキナーゼアッセイを行ったところ、これらのタンパク質をMakがリン酸化することが明らかとなった。また、その配列を解析し、Makがリン酸化する候補アミノ酸を見出した。これらのアミノ酸に変異を導入したコンストラクトを作製し、キナーゼアッセイを行ったところ、変異を導入したコンストラクトでは、リン酸化が見られなかったことから、Makがこれらのアミノ酸をリン酸化することがわかった。また、ゼブラフィッシュを用いた機能解析では、Kif3bがオプシンの輸送に重要であることを見出した。また、Kif3cはコーンオプシンの輸送に機能していることが明らかとなった。また、新たに見出したゼブラフィッシュIFT-A変異体の解析を行った。この変異体では、網膜だけでなく、内耳有毛細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓上皮細胞などの繊毛にも異常をきたすことがわかった。この変異体では、順行性IFTよりも、ゆっくりした速さで、視細胞の脱落が進行することが明らかとなった。順行性IFTだけでなく、逆行性IFTもオプシンの輸送に必須の役割を果たしていることがわかりつつある。繊毛キナーゼMakの機能解析については、MakがRP1をリン酸化するアミノ酸の同定に成功した。また、新たなターゲットとしてKif3aをMakがリン酸化することを見出している。更に、Makと相互作用する分子の同定を進めている。新規なゼブラフィッシュ変異体の機能解析も同時に進めている。逆行性輸送のIFTに異常をきたす変異体の解析から、逆行性輸送がオプシンの輸送に関与する分子メカニズムの解明を進めている。今後は、繊毛キナーゼMakと相互作用する分子の同定やリン酸化ターゲットの同定、更に、繊毛の長さ制御とオプシンの輸送機構の関係を見出すことにより、Makが網膜視細胞変性を引き起こす分子メカニズムの全体像を明らかにしていく。更に、新たに同定したゼブラフィッシュ変異体を用いて、逆行性輸送IFTとセントロソームタンパク質がオプシンの輸送に関与する分子メカニズムを免疫染色法、プロテオミクス解析などの手法を用いて解析を行っていく。
ヒト乳幼児およびチンパンジーにおける「心の理論」に関する実験的分析

他者にもいわゆる「心」があり、さまざまな欲求や信念等を持っていることを理解することは、発達的に視点からは極めて重要なポイントである。こうしたことは、「心の理論」研究として位置づけられ、発達心理学の中でも盛んになってきている。報告者は、英国サセックス大学のMartin Dohertyを研究協力者として、3歳児、4歳児を対象に、メタ言語と心の理論の関係を実験的に分析しており、現在継続中である。このデータが収集できれば、Dohertyのイギリスで収集したデータと直接比較が可能であり、クロスカルチュラルな研究となりうる。今回のおもな報告事項は、チンパンジーによる共感と、他者認知と深く拘る顔の認識について、その実績および成果を報告する。チンパンジーは、ヒトの身体的状況を弁別し、その状況に応じて異なる反応を示すだろうか。これが基本的な研究動機である。まず、グループケージのチンパンジーの前で、実験者が"指に怪我をした振り"をして見せる。これが実験条件である。統制条件は、通常の状態で陽気に声をかけながら、チンパンジーの前に立つ。このときのチンパンジーの行動観察をおこない、両条件に差異が見られるかどうかを検討した。その結果、実験条件の時のほうが、チンパンジーがよく集まった。さらに、水を口に含んで実験者にかけるという行動も抑制された。実験者の状況に応じて反応が変化したのである。次に5歳児と成人を対象として、コンピューター合成写真の性別判断に関する実験的な分析をおこなった。刺激となった写真は、男女混合の中性顔、男性、女性それぞれ100%、中性顔に男性性および女性性をある割合で合成したもの、中性顔に男女のパ-ツ(目、眉、鼻、口、および輪郭)を合成したもの、計21枚であった(森崎・乾1994)。判定の結果、成人は、目及び眉を手掛かりとして答えていたが、5歳児ではそのようなことは見られなかった。また、男性性、女性性が高くなるほど、成人も5歳児も、判断が容易であった。今後も詳細な分析をおこなう予定である。
コットンラット馴化麻疹ウイルスのモデル動物解析

馴化麻疹ウイルス株が自己複製ならびに宿主に対する免疫抑制に関して親株よりも優れているか、また馴化ウイルスがコットンラットに対し臨床症状を誘発するか否かを解析した。麻疹ウイルス親株(MV99Y)、コットンラット馴化株(MV99YC7)、ワクチン株(AIK)を3群に分けたコットンラットにそれぞれ筋肉内接種した。いずれのコットンラットも実験期間を通じ全く臨床症状を示さなかった。感染後2日、4日、6日、8日、10日目にそれぞれ血液、肺、気管、脾臓、大腿骨骨髄、脳、鼠径リンパ節、下顎リンパ節、腸間膜リンパ節を採取した。各臓器におけるウイルス量をリアルタイムPCR法により調べたところ、MV99YならびにMV99YC7接種群では2日目から8日目にかけて、鼠径リンパ節と下顎リンパ節からそれぞれウイルスmRNAが検出され、そのコピー数は4日目にピークを示した。AIK接種群では、4日目と6日目の鼠径リンパ節でのみウイルスmRNAが検出された。各群におけるウイルスmRNAの検出値についてみてみると、MV99YC7接種群はMV99Y接種群のそれと有意差はなかった。しかし、両群ともにAIK接種群の最大値よりも有意(P<0.01)に高い値を示した。このことから筋肉内接種された馴化株は、ウイルスの複製能力において親株とほぼ同じであることが分かった。また血中の抗体価の推移をみてみると、いずれの群も感染4日目以降に上昇しており、その値はMV99Y接種群とMV99YC7接種群とでは有意差がみられなかった。しかし、両群ともAIK接種群よりも有意(P<0.01)に高い値で推移した。次に感染コットンラット脾細胞をUV不活化ウイルスまたはConAで刺激した際に産生されるサイトカインをリアルタイムPCR法にて測定した。IL-4mRNAはConA刺激でのみ検出され、その値はMV99YならびにMV99YC7接種群ではAIK接種群よりも有意(P<0.05)に高かった。前者2群の間には有意差はなかった。また、IL-12mRNAは8,10日目の3群からいずれも検出されたが、各群間で有意差はなかった。IL-18mRNAは3群とも210日目に検出されたが、いずれも値は低く有意差はなかった。IL-10mRNAはいずれの群からも検出されなかった。コットンラット馴化麻疹ウイルス株MV99YC7について、筋肉内接種が経鼻接種よりウイルスの複製、体内分布、抗体誘導などの点で優れているかを解析するため、コットンラットを2群に分け、MV99YC7株を筋肉内接種または経鼻接種した。感染後1、2、3、4週にそれぞれ剖検を行った。肺、気管、脾臓、大腿骨骨髄、脳、鼠径リンパ節、下顎リンパ節、腸間膜リンパ節を回収し、各組織からRNAを抽出した。臓器中の麻疹ウイルス量測定のため、麻疹ウイルスのM遺伝子に対する定量的real-timePCR法を確立した。その結果、経鼻接種では、ウイルスは1週間後、肺と気管のみに存在したのに対し、筋肉内接種では1週間後、鼠径リンパ節と下顎リンパ節で検出された。このことから筋肉内接種は経鼻接種よりウイルスが全身に広がり易いことが示唆された。また、血液中の麻疹抗体価を測定した結果、筋肉内接種は経鼻接種より有意に高い抗体価(P<0.01)を示した。さらにIL4,IL10,IL12,IL18といったサイトカイン検出のため、脾臓よりマクロファージを分離し、コンカナバリンAで刺激した。その後、RNAを抽出し、各サイトカインに特異的なプライマーを設計し、RT-PCRを実施した。麻疹ウイルス研究において、コットンラットモデルは、最も人に近い動物モデルとされるサルと細胞培養レベルの実験のギャップを埋めるものとして有用と考えられる。経鼻接種によるコットンラットの麻疹ウイルス感受性は、病原性やワクチンの解析に役立つと思われるが、ウイルス複製が限局的であることが課題である。これまでの研究から、われわれはコットンラットへの馴化により、親株と比較してより高い増殖能をもつウイルスを得ることに成功している。本研究により、接種方法もウイルス複製、ウイルスの体内分布、抗体産生等に影響を与えることが示された。

しかし、両群ともにAIK接種群の最大値よりも有意(P<0.01)に高い値を示した。このことから筋肉内接種された馴化株は、ウイルスの複製能力において親株とほぼ同じであることが分かった。また血中の抗体価の推移をみてみると、いずれの群も感染4日目以降に上昇しており、その値はMV99Y接種群とMV99YC7接種群とでは有意差がみられなかった。しかし、両群ともAIK接種群よりも有意(P<0.01)に高い値で推移した。次に感染コットンラット脾細胞をUV不活化ウイルスまたはConAで刺激した際に産生されるサイトカインをリアルタイムPCR法にて測定した。IL-4mRNAはConA刺激でのみ検出され、その値はMV99YならびにMV99YC7接種群ではAIK接種群よりも有意(P<0.05)に高かった。前者2群の間には有意差はなかった。また、IL-12mRNAは8,10日目の3群からいずれも検出されたが、各群間で有意差はなかった。IL-18mRNAは3群とも210日目に検出されたが、いずれも値は低く有意差はなかった。IL-10mRNAはいずれの群からも検出されなかった。本研究の結果、筋肉内接種が経鼻接種よりウイルスの複製、体内分布、抗体誘導などの点で優れていることが示された。データの蓄積と、今後の研究のための定量的RT-PCR法の確立を行った。コットンラットに、馴化麻疹ウイルス株、親株、ワクチン株を筋肉内接種により投与する。ウイルスの複製、体内分布、抗体誘導、サイトカイン産生の動態を比較解析する。