hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生困難なタンパク質の普遍的高濃度再生法の確立

私たちは以前尿素のような可溶化剤の濃度勾配的除去により、タンパク質の効果的な再生方法を確立した。しかし、この方法は不安定なタンパク質には効果的ではなかった。そこで、不安定なタンパク質が凝集体を形成しない可溶化剤濃度のもとで相当量の再生タンパク質を得るために、安定化剤を加える方法を開発した。多くの安定化剤を試した結果、最も良い安定化剤であった40%グリセロール存在下で、高濃度(2.5mg/ml)の不安定タンパク質の60%を再生することができた。この方法は不安定タンパク質の再生に対して、広く適応可能である。この年度では安定化剤を用いた不安定タンパク質の再生効率の向上に焦点を絞って研究を進めた。基本的には申請者が既に確立している、8M尿素から徐々に尿素濃度を薄めてゆく、透析法を土台として、研究を行った。不安定なタンパク質としてはニワトリ卵白リゾチーム(HEL)の4個あるSS結合の一番外側のSS結合(Cys6-Cys127)1個だけを切断してカルボキシメチル化した6,127CM-HELを調製して用いた。この誘導体はHELに比べて24度も変性移転温度が低下しており、7.2kcal/molも不安定になっている。尿素濃度の低下に応じて、安定化剤濃度が上昇するような工夫を取り入れ、種々安定化剤を用いてその効果を検討した。可溶化剤として8M尿素または5Mグアニジン塩酸塩を用い、安定化剤として種々濃度のグリセリン、蔗糖、サルコシン、硫安、アルギニン等で検討した。現在までの結果では、可溶化剤として8M尿素を用い安定化剤としてグリセリン(40%)を用いたときに最も良い再生率の60%を得た。この値は安定化剤を用いないときの再生率の30%に比べて格段の向上である。かくして、かなり不安定なタンパク質を高濃度(2.5mg/mL)で効率よく再生する方法が確立できた。これまでの結果をまとめて報告した[Refolding of an unstable lysozyme by gradient removal of a solubilizer and gradient addition of a stabilizer.J.Biochemistry, 143, 427-431 (2010)]。現在は、更なる高収率再生を求めて、再生初期構造に影響を与える諸条件を検討する研究を推し進めている。この年度では更なる高収率再生を求めて、再生初期構造に影響を与える諸条件を検討した。透析法では、時間がかかることより、新たに希釈法を用いて、リゾチーム、3SSリゾチーム、リボヌクレアーゼの再生を行った。まずリゾチームに関して、グリセリンでは40%添加したとき65%という収率を得た。一方、凝集抑制効果があることから、再生に期待されたアルギニンはゆっくりと再生していくが、収率はスタンダードより悪くなっていた。水に溶けにくい物質の影響を調べた。有機溶媒であるアセトニトリルを利用した結果、5%添加で約69%の収率を得ることができた。アセトニトリルを利用し脂肪酸の溶解を試みたが、パルミチン酸ナトリウム0.01Mはアセトニトリル50%添加しても溶けることはなかった。インドール酢酸0.01Mは10%添加で完全に溶けたが、収率43%とスタンダードとほぼ一緒であった。緩衝液の影響も調べた。リン酸緩衝液は15%と悪く、ホウ酸緩衝液は0.1Mで67%という収率を得た。しかし、時間とともにタンパク質の凝集と思われる白い浮遊物が確認された。イミダゾール0.15Mにグリセリン40%添加したときに収率が80%に達した。現在は、不安定なタンパク質としては4個あるSS結合の1個だけ切断してカルボキシメチル化した3SSリゾチームを用い、また、その他のタンパク質として、リボヌクレアーゼを用いて、様々な安定化剤と緩衝液の影響、透析への巻き戻しへの影響、pHや温度も考慮しながら初期構造への影響を解析している。今年度では更なる効率再生を求めて、再生初期構造に影響を与える諸条件を検討した。透析法では、時間がかかることより、新たに希釈法を用いて、3SSリゾチーム、リボヌクレアーゼ、完全還元リボヌクレアーゼの再生を行った。3SSリゾチームの再隼は8M尿素及び2-メルカプトエタノールで変性還元状態にし、様々な添加剤を含む溶液を用い100倍希釈で行った。添加剤なしの場合、再生収率は約10%と低かったが、グリセリンを10%、30%、40%、50%のいずれの濃度で添加した場合、再生収率を向上させることができた。40%の濃度で添加したとき、最も高い再生収率30%を得ることができた。スクロースの場合においても1膿度添加したとき約25%の再生

収率を示し、0.25M、0.5M添加でも約20%であり、無添加より約2倍上昇した。それ以外のサルコシンやアルギニンは顕著な上昇は認められず有害な影響を及ぼした。一方、アセトニトリルは5%添加で約4%の上昇を示したことより、水に不溶な化合物の影響を調べられることが期待できる。緩衝液の影響を調べた結果、リゾチームの実験で良く用いられているリン酸緩衝液では有害な影響を示した。イミダゾール塩酸緩衝液では、0.15Mで約4%の上昇を示し、さらに、40%グリセロールを含む0.15Mイミダゾール塩酸緩衝液を用いて再生を試みたところ、今回の実験で最も高い再生収率47%を得ることができた。現在は、リゾチーム以外のリボヌクレアーゼ、完全還元リボヌクレアーゼを用いた再生実験を行っている。今後は高分子量のタンパク質やサブユニット構造をもつタンパク質に広げていき、普遍的な方法を確立していきたい。
腫瘍関連マクロファージの標的化による効率的表現型転換を基盤とした革新的癌免疫療法

増殖/再発/転移といった難治性癌に対する新規治療法戦略として、腫瘍関連マクロファージ(TAM)が注目され、TAMをM1様細胞へ表現型転換する悪性化微小環境の改善と、M1様細胞による癌細胞死を誘導する"TAMのre-education"療法が有望視されている。本研究では、TAM表面に高発現するCD206を選択的に認識する組換え型アルブミンをTAM標的化担体として開発し、これにアルブミン工学を駆使してM1誘導剤を付加した結合体を創製した。本結合体は優れたTAM認識能を保持しており、担癌マウスの腫瘍組織におけるM1様TAMの効率的な増加を介して抗腫瘍効果を発揮した。増殖/再発/転移といった難治性癌に対する新規治療法戦略として、M2マクロファージ様細胞である腫瘍関連マクロファージ(TAM)が注目され、TAMをM1様細胞へ表現型転換することで、癌細胞を取り巻く悪性化微小環境の改善と、M1様細胞による癌細胞死を誘導する"TAMのre-education"療法が有望視されている。この戦略を実現するには、治療効果の向上や副作用の軽減の観点から、TAM(M2)に効率良く送達するための担体が必要不可欠である。本研究では、我々が独自に開発した遺伝子組換型マンノースHSAをTAM表面に高発現するCD206標的担体のシーズとして採用した。本年度は、1) rMan-HSAを基盤としたTAM標的化担体を設計・作製し、2)それらのin vitro及びin vivoにおける動態特性を解析した後、3) M1誘導剤を修飾することでin vivoで機能するナノM1誘導体の候補物質の調製を到達目標とした。まず、種々のrMan-HSAのPEG化を試みたところ、分子量の異なるPEGをCys34に対して特異的に修飾することができた。これらはいずれもTAM様細胞に高い認識能を有していた。担癌マウスを用いたin vivo実験により、PEG化rMan-HSA誘導体の中でも、PEG化rMan-HSAダイマーが最も高い腫瘍集積性と低い肝移行性を示した。したがって、TAM標的化担体としてPEG化rMan-HSAダイマーを適用することとした。最後に種々のM1誘導体をPEG化rMan-HSAダイマーに結合・修飾してin vivoで機能するナノM1誘導体の候補物質の調製に着手した。今回取り組んでいる能動的送達システムにより、TAMの表現型転換を効率良く実現できれば、治療抵抗性、転移や再発といった難治性癌に対する革新的な免疫治療戦略の道を拓くことが大いに期待される。本研究では、TAMをM1様細胞へ表現型転換することで、癌細胞を取り巻く悪性化微小環境の改善と、M1様細胞による癌細胞死を誘導する"TAMのre-education"療法の実現に向けてin vivoで機能するナノM1誘導体の開発を最終目的としている。本治療戦略において重要な鍵を握るのはTAM標的化担体の創製である。本年度の到達目標は、1) rMan-HSAを基盤としたTAM標的化担体を設計・作製し、2)それらのin vitro及びin vivoにおける動態特性を解析した後、3) M1誘導剤を修飾することでin vivoで機能するナノM1誘導体の候補物質を調製することであった。これらの課題に対して、ほぼ予定どおりの進捗状況を達成することができた。すなわち、1)種々のrMan-HSAのPEG化を試みたところ、分子量の異なるPEGをCys34に対して特異的に修飾することができた。2)これらはいずれもTAM様細胞に高い認識能を有していた。3)最後に種々のM1誘導体をPEG化rMan-HSAダイマーに結合・修飾してin vivoで機能するナノM1誘導体の候補物質の調製に着手した。以上の進捗状況からおおむね順調に進展していると評価した。本研究では、TAM表面にマンノース受容体が高発現していることに着目し、より効率的な“re-education"療法を実践すべく、マクロファージ表面のCD206を選択的に認識する高マンノース糖鎖含有組換え型アルブミンをTAM標的化担体として用い、これにアルブミン工学を駆使してM1誘導剤を付加した結合体を創製することを企図した。昨年度は、平成27年度に作製したrMan-HSA-M1誘導剤のM1誘導能をin vitro実験系でスクリーニングした。その結果、M2化マクロファージ及びTAM様細胞に対して、rMan-HSA-M1誘導剤はM1誘導能を有していることが判明した。次に、rMan-HSA-M1誘導剤の体内動態特性を担癌マウスで検討したところ、腫瘍への優先的な分布が確認された。

さらに、rMan-HSA-M1誘導剤投与群では、TAM様細胞の減少とM1様細胞の増加が認められ、それに伴い腫瘍サイズの縮小と肺への転移抑制が観察された。rMan-HSA-M1誘導剤を繰り返し投与しても体重や生化学的及び血液学的パラメータへの影響は認められなかった。これらの結果から、rMan-HSA-M1誘導剤はTAMの極性転換により腫瘍組織の微小環境を改善する“re-education"療法を実現するユニークな抗癌剤としての可能性を見出すことができた。増殖/再発/転移といった難治性癌に対する新規治療法戦略として、腫瘍関連マクロファージ(TAM)が注目され、TAMをM1様細胞へ表現型転換する悪性化微小環境の改善と、M1様細胞による癌細胞死を誘導する"TAMのre-education"療法が有望視されている。本研究では、TAM表面に高発現するCD206を選択的に認識する組換え型アルブミンをTAM標的化担体として開発し、これにアルブミン工学を駆使してM1誘導剤を付加した結合体を創製した。本結合体は優れたTAM認識能を保持しており、担癌マウスの腫瘍組織におけるM1様TAMの効率的な増加を介して抗腫瘍効果を発揮した。本年度は、1)昨年度着手したM1誘導体のPEG化rMan-HSAダイマーへの結合・修飾によるナノM1誘導体(rMan-HSA-M1誘導剤)の作製を行う。次いで、2)それらのM1誘導化能をマクロファージ細胞を用いたin vitro実験系で比較検討する。その際、コントロールとして、HSAダイマー、rMan-HSAダイマー及びM1誘導剤を用いる。この中で、M1誘導能が最も強力なrMan-HSAダイマー-M1誘導剤を数種類選別する。次に、常法により採取したマウス腹腔マクロファージを、腫瘍細胞の培養液上清で培養し、TAM類似のフェノタイプを示すM2様マクロファージを作製する。この系に、2)で選択したrMan-HSAダイマー-M1誘導剤を添加し、TAMに対するM1誘導効果を再評価する。得られた結果の中から、M1誘導能が強力なrMan-HSAダイマー-M1誘導剤を選別する。このrMan-HSAダイマー-M1誘導剤の体内動態特性を正常及び担癌マウスを用いて検討する。最後に、rMan-HSAダイマー-M1誘導剤を担癌マウスに投与して、in vivoでのM1様誘導化能、抗腫瘍効果及び有害事象の有無を総合的に検討する。薬剤学
前立腺癌細胞の増殖における性ホルモンと成長因子受容体のクロス・トーク

PC-3にwild-type FGFRlllbを導入し,得られたFGFR2lllb安定発現株は,in vitroにおいてcontrolと比較し有意に,増殖が抑制されており.LigandのFGF-7添加によりさらに増殖抑制効果が認められた.ヌードマウスを用いた造腫瘍能の検討でもcontrolと比較し有意に造腫瘍能は低下していた.FGFR2lllb安定発現株はcontrolやparentでみられていた紡錘形の形態や長く伸びた樹枝状の形態は弱まり,細胞は敷石状に近い形態を示した.ヒト前立腺癌組織では分化度が低くなるに従いlactoferrinの産生は低下する,FGFR2lllb安定発現株はcontrolに比べlactoferrinの発現は増加していた.サイトケラチンの産生は正常前立腺上皮,肥大症組織,前立腺癌組織,前立腺癌細胞株で発現パターンが変化する.Pancytokeratine抗体を用いた検討ではFGFR2lllb安定発現株ではcontrolに比べ発現の増加がみられ現在,各cytokeratine抗体を用いて詳細を検討中である.Ligandが結合し活性化されたFGFRの細胞内ドメインのリン酸化はFRS2,ドッキングプロテインGRB2らとcomplexを形成しシグナルが伝達される.FGFRlll安定発現株とcontrolをそれぞれFGF-1,FGF-7で刺激し,タンパクを回収,抗GRB2抗体を用いて免疫沈降を行い得られた蛋白をSDS-PAGEしたのちトランスファーし,抗リン酸化チロシン抗体でウェスタンブロッティングを行った.FGFR2lllb安定発現株ではcontrolと比較しFGF-1,FGF-7刺激で90kDaのバンドの減弱が認められFGFR2lllbのシグナルはFGFR下流のシグナルにおいてアダプター蛋白のリン酸化を抑制する可能性が示唆され解析中である.ラットwildtype FGFRIIIbをクローニングし、発現ベクターpIRES neo2FGFR2IIIbを作成した.電気穿孔法にてPC-3細胞に,リポフェクション法にてDU145にそれぞれ導入しG418にてセレクションしFGFR2IIIb安定発現株とコントロール株を樹立した.2.FGFRIIIbによる増殖抑制、分化誘導の分子生物学的機構の追及(アンドロゲン受容体関連性)PC-3株においてはノーザンブロット法でFGFR2IIIb mRNAを高発現している細胞株では対照のFGFR2IIIb非発現細胞に比較して無血清培養下での倍加時間は22%延長し、MTT assayでも増殖抑制効果を認めた。またFibroblast Growth Factor 7(FGF-7)添加でFGFR2IIIb発現回復株の細胞増殖はさらに抑制された.ヌードマウス皮下へ移植実験では8週後にFGFR2IIIb発現回復株で形成された腫瘍容積はFGFR2IIIb非発現株の腫瘍容積の47%まで低下していた。また,プロモーターにAndrogen Responsive Element(ARE)を組み込んだルシフェラーゼレポーター遺伝子とAndrogen Receptor(AR)発現遺伝子(pSG5AR)をリポフェクション法によってトランスフェクトしてFGF-7,DHT存在下でのルシフェラーゼ活性を測定すると,FGFR2IIIb非発現株ではFGF-7の添加によりARを介するトランスアクチベーションを検出しなかったが,FGFR2IIIb発現回復株ではFGF-7添加によってインダクション効果を認め,FGF-7とARのクロストークが存在すると考えられた.PC-3にwild-type FGFRlllbを導入し,得られたFGFR2lllb安定発現株は,in vitroにおいてcontrolと比較し有意に,増殖が抑制されており.LigandのFGF-7添加によりさらに増殖抑制効果が認められた.ヌードマウスを用いた造腫瘍能の検討でもcontrolと比較し有意に造腫瘍能は低下していた.FGFR2lllb安定発現株はcontrolやparentでみられていた紡錘形の形態や長く伸びた樹枝状の形態は弱まり,細胞は敷石状に近い形態を示した.ヒト前立腺癌組織では分化度が低くなるに従いlactoferrinの産生は低下する,FGFR2lllb安定発現株はcontrolに比べlactoferrinの発現は増加していた.サイトケラチンの産生は正常前立腺上皮,肥大症組織,前立腺癌組織,前立腺癌細胞株で発現パターンが変化する.Pancytokeratine抗体を用いた検討ではFGFR2lllb安定発現株ではcontrolに比べ発現の増加がみられ現在,各cytokeratine抗体を用いて詳細を検討中である.Ligandが結合し活性化されたFGFRの細胞内ドメインのリン酸化はFRS2,ドッキングプロテインGRB2らとcomplexを形成しシグナルが伝達される.FGFRlll安定発現株とcontrolをそれぞれFGF-1,FGF-7で刺激し,タンパクを回収,抗GRB2抗体を用いて免疫沈降を行い得られた蛋白をSDS-PAGEしたのちトランスファーし,抗リン酸化チロシン抗体でウェスタンブロッティングを行った.FGFR2lllb安定発現株ではcontrolと比較しFGF-1,FGF-7刺激で90kDaのバンドの減弱が認められFGFR2lllbのシグナルはFGFR下流のシグナルにおいてアダプター蛋白のリン酸化を抑制する可能性が示唆され解析中である.
「家」成立史における父権の確立過程について

本研究の目的は日本古代王権における父権の確立過程を明らかにすることであり、1平安初期における父権の萌芽とその限界、2摂関政治期における父子関係の展開について考察を行うことになっている。本年度は、上記1の考察を行うため、年度当初の予定通り、奈良・平安初期における父子関係について、当時の母子関係との違いから検討をした。その結果、平安初期までの天皇のキサキは、天皇の「妻」ではなく、天皇の子の「母」として多大な経済的待遇を得ていたが、平安初期の後宮再編策によって、内裏後宮での天皇との同居が始まり、子との同居が解消され、「母」としての経済的待遇は大幅に削減された。その一方、子への経済支援が「父」である天皇によって開始され、天皇の「父」としての側面が強まるかに見えたが、天皇は子とは同居せず、実際の皇子女の養育は「母」の実家である外戚に委ねられたことで、天皇と子の父子関係は間接的なものに留まり、かえって外戚の影響力を高めることとなった。近年、平安前期における内裏内での天皇と母后との同居が、摂関政治の起点として注目されているが、本研究によって、この母后の内裏居住と摂関政治の開始は、母后の「母」としての強さよりもむしろ、キサキの地位転換による天皇や母后の後見としての外戚の役割の高まりによってもたらされたものだと考えられるのである。以上の結果は、現在執筆中の新書『日本の後宮』(中央公論新社、刊行予定)の第3章第3節および第4章第1節としてまとめ、公表する予定である。また、あわせて次年度以降行う2の考察に必要な平安中・後期における関係資料の収集も行った。2の考察結果についても、上述の新書第4章としてまとめ、公表する予定となっている。本年度当初の予定である1平安初期における父権の萌芽とその限界について考察し、上記のような結論が得られたため。次年度以降は、残る2摂関政治期における父子関係の展開について考察を行い、上述の新書の執筆を完了させ、公表する。ただし、2019年度は9月から産休に入るため、研究期間を1年度延長する予定のため、産休前までにある程度の結論を出し、産休明けには新書執筆を進め2020年度中の刊行を目指す。本研究の目的は日本古代王権における父権の確立過程を明らかにすることであり、1平安初期における父権の萌芽とその限界、2摂関政治期における父子関係の展開について考察を行う。本年度は上記2点の研究に必要な資料の収集に専念した。使用した資料は、六国史および法制資料(『令義解』『令集解』『類聚三代格』『延喜式』)、儀式書(『儀式』『内裏式』『西宮記』)、で、収集に際しては、既にキサキの分析で用いた4つの視角(1品階の有無、2経済的待遇、3居住形態・生活基盤、4父天皇死去後の処遇)によって分類を行った。本来であれば『宇多天皇宸記』・『醍醐天皇宸記』・『貞信公記』(藤原忠平)・『御堂関白記』(藤原道長)・『小右記』(藤原実資)・『権記』(藤原行成)などの古記録、『平安遺文』所収の古文書からも資料を収集する予定であった。これらの史料そのものの購入等は行えたが、第2子出産のため2月から産休に入ったこともあり、本年度は資料の収集・分類が途中までしか行えなかった。また、妊娠中のため、現地調査も思うように行うことができなかった。ただし、限られた資料ではあるが、収集・分類した資料からは、平安初期において、皇子女への天皇の関与があまりないのに対して、キサキ(母)を通じた外戚による関与はいくつか確認することができた。これによって、1に関しては当初の見通しを裏付ける資料の確認ができ、残りの資料調査によって、さらにこの見通しを裏付けていきたい。上述のように、妊娠・出産のため、当初予定していた資料の全てを調査することができなかった。ただし、収集した資料からは1の見通しを裏付ける内容もみられ、今後の考察への展望が開けている。本研究の目的は日本古代王権における父権の確立過程を明らかにすることであり、1平安時代初期における父権の萌芽とその限界、2摂関政治期における父子関係の展開について考察を行う。本年度は、昨年2月の出産に伴う育児休業取得のため、3月末まで研究中断をした。そのため、本格的な研究活動を行っていない。中断以前において、妊娠・出産のため資料の収集・調査を予定通り終えることができていなかった。中断中に少し進展させたが、育児中のため思うようには進んでいない。

その一方、子への経済支援が「父」である天皇によって開始され、天皇の「父」としての側面が強まるかに見えたが、天皇は子とは同居せず、実際の皇子女の養育は「母」の実家である外戚に委ねられたことで、天皇と子の父子関係は間接的なものに留まり、かえって外戚の影響力を高めることとなった。近年、平安前期における内裏内での天皇と母后との同居が、摂関政治の起点として注目されているが、本研究によって、この母后の内裏居住と摂関政治の開始は、母后の「母」としての強さよりもむしろ、キサキの地位転換による天皇や母后の後見としての外戚の役割の高まりによってもたらされたものだと考えられるのである。以上の結果は、現在執筆中の新書『日本の後宮』(中央公論新社、刊行予定)の第3章第3節および第4章第1節としてまとめ、公表する予定である。また、あわせて次年度以降行う2の考察に必要な平安中・後期における関係資料の収集も行った。2の考察結果についても、上述の新書第4章としてまとめ、公表する予定となっている。本年度当初の予定である1平安初期における父権の萌芽とその限界について考察し、上記のような結論が得られたため。本年度2月から産休に入り、次年度は丸1年育休を取得している。そのため、計画変更によって研究期間を1年間延長する予定である。上記で記したように資料収集は若干遅れているが、育休明けの研究再開後は、資料収集と並行しながら、当初の計画通り、1の考察を行い、奈良時代における父子関係のあり方、およびそれを変質させようとした平安初期の試みとその挫折の過程を明らかにする予定である。そのため、育休期間中にも資料収集などの作業を少しずつ行いながら、育休明けにスムーズに研究が再開できるようにする。本年度は一年中断したため、研究期間を1年延長し、本年度行う予定であった平安初期におおける父子関係の萌芽についての検討を来年度、来年度行う予定であった摂関政治期における父権の進展過程については再来年度に行うこととする。次年度以降は、残る2摂関政治期における父子関係の展開について考察を行い、上述の新書の執筆を完了させ、公表する。ただし、2019年度は9月から産休に入るため、研究期間を1年度延長する予定のため、産休前までにある程度の結論を出し、産休明けには新書執筆を進め2020年度中の刊行を目指す。年度末に、大学生協においてカタログでの物品購入を行ったところ、カタログ表示価格よりも安く購入することができたため。昨年度末に大学生協において、カタログで物品注文したところ、カタログの値段より安く購入できたため。翌年度の書籍購入に充てる。当初の計画では研究期間は本年度までだったが、出産育児のため2016年度末から1年2ヶ月中断したため、本年度研究を再開し、研究期間も1年延長した。ただし、延長の申請手続きの前に本年度予算の請求手続きを行ったため、本年度が最終年度という当初の計画通り、全額請求したが、研究期間は1年残っているため、次年度も使用できるように計画的に予算を残した。なお、次年度も5ヶ月ほどで産休育児のために研究中断し、1年延長するため、物品購入や出張など計画的に使用する予定である。次年度物品費として、書籍の購入に使用する予定である。
電子記録カードを用いた療育システムの確立と脳障害形成の予防に関する研究

1、コンピューターシステムの確立と改良と使用マニュアル作成(2)、診療データの表示:Webブラウザーで表示し、MRI, CTなどの複雑な医療画像はパブリックドメインにあるNIHのImage-Jを使用し表示。(3)、診療データの入力:療育機関でデータを収集するインターフェースは、Webブラウザーからのフォーム入力を行い編集。データの入力プログラムを改良し、医師の負担の軽減。(4)、携帯性メディア:データをUBSで受け取り、データを追加して、渡せるようになった。実用化した。(5)、診療データのプライバシーの保護:診療データをパスワードで解凍し使用。データのセキュリティに関してlD等の信頼性がある方式・技術の実用化。2、データベースの作製と心身障害児への応用(1)、診療データ項目のプロトコールの作成:患者様の出生前、出生時、新生児期の臨床所見、画像等の検査および治療内容を入力して、実用化した。(2)、共同研究施設間で、簡単な病歴や画像情報をやりとりし、医療の向上に役立った。(3)、退院時の情報が正確に伝達され、鮮明な画像の経過が伝達され、障害児の病態形成を把握するのに役立った。(4)、個人情報保護は十分に配慮。情報カードは個人または保護者に保持させた。問題点は更に検討中。3、脳障害の予防画像や脳病理を用いた研究では、脳内の神経伝達の発達と年齢依存性てんかんの発生機序に関して研究し、GABAやチャンネルなどの抑制系の発達との関連を明らかにした。コンピューターシステムを用いた脳障害予防に関する企画は症例の追跡を開始したが、更に継続したい。実用化した。問題点は更に検討中。A.コンピューターシステムの確立2.診療データの表示:Webブラウザーで表示し、MRI,CTなどの複雑な医療画像はパブリックドメインにあるNIHのImage-Jを使用し表示。3.診療データの入力:療育機関でデータを収集するインターフェースは、Webブラウザーからのフォーム入力を行い編集。現在、既存データの収集が容易に出来るように、メニューを活用したインターフェースを開発した。医療従事者の負担の軽減を目指して改良中。4.携帯性メディア:容易に第3者に書換えられないCD-Rのメディアを使用して、プロトタイプデータを作成配布して、実用性テスト中。5.診療データのプライバシーの保護:現在、圧縮された診療データを本人のパスワードで解凍し使用する方式である。更に適切な暗号化や認証方式を検討中であり、データのセキュリティに関して信頼性がある方式・技術の実用性の実験中。B.データベースの作製と心身障害児への応用1.診療データ項目のプロトコールの作成:出生前、出生時、新生児期の臨床所見、画像等の検査および治療内容を入力して分かりやすいように、データ項目を作成、改善中。2.共同研究施設のネットワーク計画:心身障害診療施設を、モデルとして、福岡県の西部地区から選択した。3.データベースを備えたパソコンを使用し、患者情報伝達を開始する。4.個人情報保護は十分に配慮。情報カードは個人または保護者に保持させる。C.脳障害の予防画像や脳病理を用いた研究を継続中。現在は、画像のコピーをみて、臨床研究中である。並行して、病理形態学的研究を継続中である。1、コンピューターシステムの確立と改良と使用マニュアル作成(2)、診療データの表示:Webブラウザーで表示し、MRI,CTなどの複雑な医療画像はパブリックドメインにあるNIHのImage-Jを使用し表示。実用化した。データのセキュリティに関してID等の信頼性がある方式・技術の実用化。

2、データベースの作製と心身障害児への応用(1)、診療データ項目のプロトコールの作成:患者様の出生前、出生時、新生児期の臨床所見、画像等の検査および治療内容を入力して、実用化した。(2)、共同研究施設問で、簡単な病歴や画像情報をやりとりし、医療の向上に役立った。(3)、退院時の情報が正確に伝達され、鮮明な画像の経過が伝達され、障害児の病態形成を把握するのに役立った。(4)、個人情報保護は十分に配慮。情報カードは個人または保護者に保持させた。問題点は更に検討中。3、脳障害の予防画像や脳病理を用いた研究では、脳内の神経伝達の発達と年齢依存性てんかんの発生機序に関して研究し、GABAやチャンネルなどの抑制系の発達との関連を明らかにした。コンピューターシステムを用いた脳障害予防に関する企画は症例の追跡を開始したが、更に継続したい。
DNA塩基配列の多型性を利用した遺伝子腫瘍の研究

1.研究目的、代表的な慢性遺伝性腫瘍である多内分泌腫瘍症2A型(MEN2A)を主な研究対象として、この疾患の原因遺伝子の染色体上の座位を明らかにし、さらに原因遺伝子を単離して発癌機構を解明することを目的とする。2.研究方法、(1)連鎖分析:DNA多型性(RFLPs)マーカーを用い、わが国のMEN2A家系の連鎖分析を行いMEN2A遺伝子の座位を明らかにする。(2)腫瘍におけるヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity)の検討:MEN2Aの成分疾患である甲状腺髄様癌と褐色細胞腫につき、種々のDNAマーカーを用いて腫瘍で欠失している遺伝子を探す。3.研究成果、(1)RBD3をマーカーとして連鎖分析をした結果、組換え率D=0において最大のlod scoreは5を超え、日本人のMEN2Aの原因遺伝子が白人と同様に第10染色体の動原体近傍に座位することが明らかになった。(2)loss of heterozygosityの検討では、第10染色体に座位するDNAマーカーを中心にallele lossを調べた。結果、RBP3で散発性甲状腺髄様癌1例にのみlossがみられたが、その他の第10染色体のDNAマーカーでは認められなかった。また、他の染色体のDNAマーカーを用いた検討では、第1染色体のD1S7においてAllele lossが確認された。以上より、MEN2Aは網膜芽細胞腫とは異なった機構で発症するものと考えられる。すなわち、MEN2A座位を占める正常遺伝子の一つだけの以上が本症の発生に十分であると考えた方が妥当であると思われる。今後さらに多くの症例を用いて、第10染色体の動原体近傍でのDNA異常について検討する予定である。(3)この他の腫瘍におけるloss of heterozygosityの検討:胃癌では第13染色体長腕で41%の症例でAllele lossが確認された。また、髄膜腫においても、第22染色体長腕においてAllele lossを認めた。
無症候性脳梗塞の有無とn-3系不飽和多価脂肪酸の関係についての研究

無症候性脳梗塞(以下SCI)は症候性の脳梗塞のpreliminary stageとして捉えられており,脳血管障害の予防的な観点から注目されている病態である。今回,脳ドック受診者249名(男性204名,女性45名)を対象として,年齢,性別,アルコール摂取,喫煙,運動,睡眠時間,家族歴,血圧,血糖値,総コレステロール値,中性脂肪値とSCIの有無との関連を検討した。SCIの頻度は全体で71名(28.5%)であった。単変量解析(Woolf法)では,血圧(OR4.49,95%CI2.49-8.09)と年齢(OR4.84,95%CI2.45-9.52)がSCIと有意な関連を認めた。多重ロジスティックモデルにおいても,血圧(OR3.32、95%CI1.69-6.53)と年齢(OR4.14,95%CL1.80-9.53)が有意に選択された。血圧は年齢の影響を排した多変量解析においても独立した要因として選択されており,SCIとの関連の深さが再確認された。また,年齢は高齢の群になる程SCIの頻度が高い傾向が認められた。高血圧や加齢による脳細小動脈硬化を基礎とした病態とSCIとの強い関連性が示唆された。この両要因は症候性脳血管障害の危険因子でもあり,高齢者の血圧管理の重要性があらためて再確認された。男性,飲酒週5日以上,喫煙者,運動,睡眠6時間未満,家族歴(高血圧,糖尿病,脳卒中),耐糖能障害,高コレステロール血症,高中性脂肪血症は有意ではなかった。一方,n-3系不飽和多価脂肪酸との関連については,簡単な食習慣調査(魚介類)では明らかに出来なかった。現在,測定した脂肪酸の結果を解析中であり,平成9年度に報告する予定である。
消化管術後におけるIL-22産生ナチュラルキラー細胞の機能解析と臨床的意義

上部消化管吻合ラットモデルを作成し、吻合部bursting pressure、腹壁創skin woundbreakingstrengthを測定すると、著しい個体差を認めた。フローサイトメトリーでリンパ球解析を行ったところ、経口摂取不能なラットでは肝還流液中リンパ球数の著しい低下ならびにフェノタイプ変化を認め、個体差には免疫反応変化も関与していると思われた。絶食環境下(3日間)における免疫応答反応変化をマウスで検討した。絶食によりNKT細胞分画は増加、NK細胞では分画に変化は認めなかったがTRAILやCD69の活性化マーカー発現増加を認め、絶食により自然免疫反応増強が引き起こされることが明らかとなった。近年EBMにより外科周術期管理は激変し、術後早期経口摂取が推奨されている。下部消化管術後では早期経口・経腸栄養開始が吻合部創傷治癒に好影響を与えることが判明したが、上部消化管術後に対しては吻合部に罹る負担が懸念され、その報告は少ない。今回我々は上部消化管術後ラットモデルを作成し、術後早期経口・経腸栄養開始が吻合部や腹壁創の創傷治癒に与える影響を検討した。また消化管粘膜に存在するIL-22産生NK細胞の創傷治癒に与える影響を検討している。1.上部消化管切除・吻合ラットモデルの確立ならびに評価方法の確立ラットを全身麻酔下に開腹し、トライツ靭帯から約2cmの部位で空腸切除・吻合を行う。その後CVカテーテル(16G)を用い胃瘻を造設し閉腹。頸部操作ではCVカテーテル(16G)を内頚静脈に留置。中心静脈カテーテル・胃瘻チューブを固定しネックカラーを用いて術後管理を行う。術後犠牲死させ吻合部bursting pressure、腹壁創skini woundbreaking strengthを測定。術後3日目、5日目、7日目に犠牲死させ検討し、術後5日目が最も測定に適していることが分かった。現在投与栄養内容・経路の違いが創傷治癒に与える影響を検討中である。2.創傷治癒におけるIL-22産生NK細胞の役割の解明現在腸管粘膜を潰しフローサイトメトリーでIL-22産生NK細胞を検出している。今後は上記ラットモデルの吻合部ならびに正常腸管粘膜を使用し、吻合部創傷治癒に与える影響・役割を解明する。3.腸管吻合部の創傷治癒を促進させる周術期栄養管理の検討上記ラットモデルを使用し、アルギニン・グルタミンなどアミノ酸の添加が創傷治癒にどのような影響を与えるか検討中である。現在の外科周術期管理においては術後早期経口摂取が推奨されている。下部消化管術後とは異なり上部消化管術後では吻合部に罹る負担が懸念され報告は少ない。我々は上部消化管術後ラットモデルを作成し、術後早期経口・経腸栄養開始が吻合部や腹壁創の創傷治癒に与える影響の解析を行った。また消化管粘膜に存在するIL-22産生NK細胞の創傷治癒に与える影響の解明を予定している。1.上部消化管切除・吻合ラットモデルの確立ならびに評価方法の確立前年度までの研究で上部消化管切除・吻合ラットモデルの確立を行い、術後犠牲死させ吻合部bursting pressure、腹壁創skin wound breaking strengthの測定時期は術後5日目が最適と判明した。しかし実験を重ねていくに従い手術手技や標本摘出手技により著しく結果が異なることが明らかとなった。現在も手技の安定化に努めている。2.創傷治癒におけるIL-22産生NK細胞の役割の解明フローサイトメトリーを使用し腸管粘膜からNK細胞を検出すると同時に肝還流液内リンパ球の解析も行ってきた。腸管粘膜からのNK細胞検出は腸管粘膜が菲薄化し十分なリンパ球採取が困難であり、現在も採取法など改良を重ねている。しかし一方で実験経過中に3日間絶食となったラットの解析を経験し、肝還流液中リンパ球の著しい減少ならびにフェノタイプの変化を認めた。絶食による免疫応答反応変化を検討する目的にマウスを用い、絶食・非絶食下での肝還流液中NK細胞・NKT細胞の発現変化を確認した。結果、絶食(3日間)によげNKT細胞分画は増加しまたNK細胞では分画に変化はないがTRAILやCD69の活性化マーカー発現増加を認め、絶食により肝内の自然免疫反応の増強が引き起こされることが明らかとなった。3.腸管吻合部の創傷治癒を促進させる周術期栄養管理の検討絶食による自然免疫の増強を正常化させる栄養素として、アルギニン・グルタミンなどアミノ酸に着目した。今後は絶食マウスに対してアルギニンなどのアミノ酸を投与することにより、自然免疫反応の変化を確認していく予定である。
グローバル化時代のシティズンシップ―日本における「民」の再定義に向けて―

本研究は、チームの中で現場検証、制度的検討、思想的考察をつなぎ合わせながら、グローバル化時代の「民」イメージを柔らかく再検討する試みであった。業績は順調に出た。遠藤乾と柄谷利恵子による『グローバル・コモンズ』に加えて、明石純一『「グローバル人材」をめぐる政策と現実』など書籍も刊行され、英語による発表なども数多く、眞壁仁による論考「日本における「民」の政治思想史」をメンバー全体で共有できた。また、代表者自身が進めた共訳書『軽いシティズンシップー市民、外国人、リベラリズムのゆくえ』(クリスチャン・ヨプケ著)とそれに伴う解説を通じて、学界に対しても一定の問題提起できた。本研究の目的は、グローバル化時代における「民」のあり方を再検討することにある。具体的には、国民、市民、庶民、移民等のあり方をシティズンシップ概念と実践との関連で構成し直し、米欧東アジア諸国の国際的な動向に照らして、日本の土壌に再定位することを目指している。これは、代表者がこれまで取り組んできたグローバル・ガバナンスやEUの研究をさらに発展させ、チームの中で経験的知見と思想的考察をつなぎ合わせながら、日本における「民」のあり方の再考へ接続する(国際)政治学的な試みとなるはずである。初年度は、本プロジェクトのインフラを構築し、基本的問題枠組と発見的・探索的論点の共有を図った。また、調査対象として、特定の政策現場(例えば、外国人介護士を受け入れた特養)、概念(「公民」「市民」「国民」等)を選び、調査・研究に着手しはじめた。具体的には、夏には科研メンバー全員が集まり、問題意識の擦り合わせを行うとともに、共同研究の方向性を話し合った。本研究の目的に合わせ、理念と実証の双方の研究を交錯させていくことを確認した。そののち、各班・各自で、国民・市民・移民に関する研究に従事し、それぞれにおいて若手のリクルートを試み、共同研究の世代的拡張を図るとともに、次年度秋に予定している国際ワークショップに向けて、クリスチャン・ヨプケ教授(ベルン大)とコンタクトを取り、同氏の主著の翻訳を進めるとともに、ネットワーク構築に努めた。これは、代表者がこれまで取り組んできたグローバル・ガバナンスやEUの研究をさらに発展させ、チームの中で経験的知見と思想的考察をつなぎ合わせながら、日本における「民」のあり方の再考へ接続する(国際)政治学的な試みとなる。初年度のプロジェクトインフラ構築に引き続き、本年度は基本的問題枠組と発見的・探索的論点の共有を図りながら、論点の深堀りに努めた。とくに今年度に力を入れたのは、「市民」「市民権」「シティズンシップ」概念の再検討である。具体的にいえば、9月の日本政治学会(および慶応大学ヨーロッパ研究会)において、計画通り、クリスチャン・ヨプケ教授をベルン大学から招聘し、科研メンバーとともに、現代のシティズンシップについて、理念・実践両面にわたり討議した。さらにヨプケ教授の主著Citizenship and Immigrationの翻訳を完成し、岩波書店から『軽いシティズンシップー市民、外国人、リベラリズムのゆくえ』(翻訳者:報告者本人、佐藤崇子、井口保宏、宮井健志)を公刊し、上記ワークショップ等で議論を深め、日本の読者に問題提起を試みた。これは、研究代表者がこれまで取り組んできたグローバル・ガバナンスやEUの研究をさらに発展させ、チームの中で経験的知見と思想的考察をつなぎ合わせながら、日本における「民」のあり方の再考へ接続する(国際)政治学的な試みとなる。初年度のプロジェクトインフラ構築に引き続き、基本的問題枠組と発見的・探索的論点の共有を図りながら、論点の深堀りに努めていたが、2年目に力を入れたのは、「市民」「市民権」「シティズンシップ」概念の再検討であった。3年目の今年は、現在進行形の日本における移民の実質的な導入の動きとそうした概念的検討のつなぎである。具体的にいえば、現状班が引き続き送り出し国としてのヴェトナムやインドネシア、受け入れ国としての日本・台湾の調査をする一方、理念班が多文化主義の現況を整理し、「民」の日本における概念史を跡付けた。それらの成果の発表としては、メンバーによる論文の公刊とともに、10月の日本政治学会においてクリスチャン・ヨプケのシティズンシップ研究にもとづいた英仏イタリア比較のセッションについて議論を試み、その上で、2月にメンバー間の研究合宿を開催し、現状と概念との双方を討議した。さらに、研究レヴューを受けるため、欧州大学院大学にてボーベック教授との研究打ち合わせを実施した。本研究は、グローバル化時代における「民」のあり方を再検討するものであった。具体的には、国民、市民、庶民、移民等のあり方をシティズンシップ概念と実践との関連で構成し直し、米欧東アジア諸国の国際的な動向に照らして、日本の土壌に再定位することを目指した。

これは、申請者がこれまで取り組んできたグローバル・ガバナンスやEUの研究をさらに発展させ、チームの中で経験的知見と思想的考察をつなぎ合わせながら、日本における「民」のあり方の再考へ接続する(国際)政治学的な試みとなった。最終年度となる今年は、いわば成果の刈取りのような一年となった。初年度の基本的問題枠組と発見的・探索的論点の共有、それ以降の特定の政策現場(例えば、外国人介護士を受け入れた特養、送り出し国のトレーニング施設)の調査、概念(「公民」「市民」「国民」等)の探求、そして国際的なハブ形成が実を結んだ形となり、代表者・分担者によるさまざまな業績につながった(研究発表欄参照)。とりわけ、遠藤と柄谷は、『グローバル・コモンズ』(日本の安全保障シリーズ第8巻、岩波書店、304P)のプロジェクトに、それぞれ編者・執筆者として参加し、グローバル化時代における「民」の在り方について、理論と実践の両面から考察を深めた。そこでは、感染症や移民、あるいは越境するケア労働者の具体的事例から、「民」の安全をめぐって、国家対民衆でもなく、市民対市民、民対民の対立が起きうる局面を検討し、グローバル化時代の「民」がひとくくりにできず、深刻な亀裂を含む概念存在であることが明らかにされたことが特筆に値しよう。本研究は、チームの中で現場検証、制度的検討、思想的考察をつなぎ合わせながら、グローバル化時代の「民」イメージを柔らかく再検討する試みであった。業績は順調に出た。遠藤乾と柄谷利恵子による『グローバル・コモンズ』に加えて、明石純一『「グローバル人材」をめぐる政策と現実』など書籍も刊行され、英語による発表なども数多く、眞壁仁による論考「日本における「民」の政治思想史」をメンバー全体で共有できた。また、代表者自身が進めた共訳書『軽いシティズンシップー市民、外国人、リベラリズムのゆくえ』(クリスチャン・ヨプケ著)とそれに伴う解説を通じて、学界に対しても一定の問題提起できた。研究代表者・分担者・協力者とともに海外から招聘したクリスチャン・ヨプケ氏と綿密に討議を行い、理論枠組みを咀嚼したうえ、問題関心の共有を深めた平成25年度に続き、今年度はとくにその上で、若手の関係研究者にも参画してもらい、メンバー間で現状と概念双方のつなぎを意識した合宿を開き、さらに外国との交流・人的ネットワーク形成を推進した。具体的には、すでに密に交流しているC. Joppke(スイス・ベルン大学教授)と引き続き共同研究に従事し、R. Baubeck(イタリア・ヨーロッパ大学院大学)との接触を深めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。国際政治平成27年度は、夏をめどにワークショップを開催し、成果を確認したい。まず、シティズンシップということばが日本語になじまず、それをどのように土着化していくのかを課題として、思考を重ねるとともに、日本についての現状研究とのすり合わせを意識して、いっそうメンバー間の交流を進めてゆきたい。またヨーロッパだけでなく、アジアにも拡大した調査を、日本を土俵とする理念・現状研究を交錯させ、あたらしいシナジーを成果に落とせるか見極めたい。立ち上げ期に当たる夏の段階で、2目間にわたり研究分担者全員が綿密に討議を行い、理論枠組みを咀嚼したうえ、問題関心の共有をはかった。
結核菌感染部位で機能する活性天然物の探索とその標的分子解析

既存の抗結核剤に抵抗性を示す潜在性結核菌に有効な新しい抗結核物質の創出を目的として、結核菌感染部位での菌の特性に着目して構築したスクリーニング方法を用いて探索研究を実施した。その結果、海洋生物の抽出物または海洋由来微生物の培養抽出物ライブラリーから、医薬シーズとして期待できる、数種の新規化合物を含む複数の活性天然物を見出した。さらに、ゲノムDNAライブラリー形質転換微生物を用いる手法、遺伝子変異解析または合成したプローブ分子を用いて見出した抗菌物質の標的分子を解析し、潜在性結核菌に対する新しい薬剤標的を開拓した。本年度は、結核菌感染部位とその微小環境での菌の特性(低酸素環境、低pH環境、炭素源要求性変化およびバイオフィルム形成)に着目した4つのスクリーニング系を用いて、独自に保有する海綿などの底生海洋生物の抽出エキスおよび海洋由来微生物の培養抽出物ライブラリーを対象に活性物質の探索を開始した。その結果、抗結核薬イソニアジドに対して抵抗性を示す低酸素環境でも抗菌活性を示す化合物として、海綿由来のジテルペンアルカロイドagelasine類を見出すとともに、新規環状ペプチドneamphamide Bを発見した。また、ある種の海綿由来のアルカロイドが、低酸素環境選択的に抗菌活性を示すことを見出した。さらに、いくつかの海綿抽出物および海洋由来真菌の培養抽出物に、低pH環境選択的な抗菌活性、バイオフィルム形成阻害活性を見出し、現在その活性物質の精製を進めている。、一方、見出した抗菌物質の作用メカニズム解析についても、ゲノムDNAライブラリーを利用する方法を中心に実施した。その結果、agelasineDの標的分子がdioxygenaseと予想されるBCG3185cタンパク質であることを強く示唆する知見を得ることに成功した。また、これまでの研究で見出していた、海洋由来真菌が産生する新規アミノリポペプチドtrichoderin Aについては、結核菌のATP合成酵素を構成するAtpEタンパク質およびAtpHタンパク質を標的としていることを示唆する知見を得た。さらに現在、海洋由来放線菌の二次代謝産物であるnybomycinの標的分子の解析についても、同様な方法を用いて検討を進めている。前年度から継続して、結核菌感染部位とその微小環境での菌の特性(低酸素環境適応、低pH環境適応、炭素源要求性変化およびバイオフィルム形成)に着目した4つのスクリーニング系を用いて、独自に保有する海綿などの底生海洋生物の抽出エキスおよび海洋由来微生物の培養抽出物ライブラリーを対象に活性物質の探索を進めた。その結果、抗結核薬イソニアジドに対して抵抗性を示す低酸素環境でも抗菌活性を示す化合物として、海洋由来真菌の培養抽出物からphomaligol Aを見出した。また、低pH環境選択的に抗菌活性を示す化合物として、インドネシア産海綿からBr化脂肪酸を単離した。さらに、プロピオン酸を炭素源とする培養環境選択的に抗菌活性を示す化合物して、海綿由来のテトラミン酸melophlin類を見出すことに成功した。現在もいくつかの海綿抽出物および海洋由来真菌の培養抽出物から活性物質の精製を進めている。一方、見出した抗菌物質の標的分子についても解析を実施した。海綿由来のジテルペンアルカロイドagelasine Dについては、前年度の検討でagelasine Dの標的分子候補として見出した、dioxygenaseと予想されるBCG3185cリコンビナントタンパク質を調製して、これが、agelasine Dと直接結合することを明らかにした。また、海洋由来放線菌の二次代謝産物nybomycinの標的分子についても解析を進め、特定のタンパク質と結合するのではなく、DNAと結合することを示唆する知見を得た。さらに、前年度見出した、低酸素環境選択的に抗菌活性を示す海綿由来のアルカロイド化合物について、その全合成およびアナログ化合物合成を開始した。研究計画に従い、前年度から継続して、結核菌感染部位とその微小環境での菌の特性(低酸素環境適応、低pH環境適応、炭素源栄養要求性変化およびバイオフィルム形成)に着目した4つのスクリーニング方法を用い、独自に保有する海綿を中心とする底生海洋生物の抽出エキスおよび海洋由来微生物の培養抽出物ライブラリーを対象に、活性物質の探索を進めた。その結果、海洋由来真菌の培養抽出物から数種のナフトピロンを単離した。また、海綿抽出物からは、複数のブロモフェノールを単離した。そしてこれらが、低酸素環境に適応させた潜在性結核菌に有効であることを明らかにした。一方、前年度見出した、海綿由来のテトラミン酸誘導体については、遺伝子変動解析やM. bovis BCG由来のゲノムDNAライブラリーを使用した形質転換株ライブラリーでの標的分子解析を行った。その結果、化合物の結合タンパク質候補を6つのタンパク質に絞ることに成功した。そして、さらなる検討を進めるために、6つの標的候補タンパク質の遺伝子クローニングを行い、これを終えた。同様に前年度見出した、海綿由来の新規アルカロイドについては、構造活性相関研究のための数種のアナログ化合物の合成に成功した。さらに、活性発現に重要な部分構造を明らかにした。また、構造活性相関の知見を基にして、標的分子解析に向けた化合物のプローブ化についても検討を開始した。

さらに、ゲノムDNAライブラリー形質転換微生物を用いる手法、遺伝子変異解析または合成したプローブ分子を用いて見出した抗菌物質の標的分子を解析し、潜在性結核菌に対する新しい薬剤標的を開拓した。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物有機化学研究計画通り4つの評価系を用いるスクリーニングを実施し、新規化合物を含む3種類(化合物数としては10個)の活性物質の単離に成功している。またゲノムDNAライブラリーを利用する標的分子の解析方法を中心に、その作用メカニズム解析を進め、順調に見出した抗菌物質の標的分子の同定が進んでいる。研究計画通り4つの評価系を用いるスクリーニングを実施し、3種類の活性物質を見出すことに成功した。また、前年度見出したagelasine Dについては、その結合タンパク質の同定にも成功し、新しい薬剤標的分子の開拓に繋げた。さらに、見出している他の抗菌物質についても、ゲノムDNAライブラリーを利用する標的分子解析法を中心に検討を進めており、順調にその成果が得られつつある。今後もスクリーニングによる新規医薬シーズの創出を目指した検討を進めるとともに、見出した抗菌物質の標的分子の同定を行い、結核に対する新規薬剤標的分子の開拓を図る。次年度も継続してスクリーニングを進め、新規医薬シーズの創出を目指した検討を進める。また見出した抗菌物質の毒性評価やin vivoでの評価を実施する。一方、見出した抗菌物質の標的分子解析については、プロピオン酸を炭素源とする培養環境選択的に抗菌活性を示すmelophlin類の結合タンパク質を明らかにすることを目指す。さらに、全合成およびアナログ化合物合成を開始した海綿由来のアルカロイド化合物について、合成化学的な検討を早期に終了させ、医薬シーズとしての有用性の検証ならびに標的分子の解析を実施する。Nybomycinおよびtrichoder in Aは、研究代表者が生産菌を培養して継続的に化合物を確保している。今年度は、培養回数を減らし活性物質の標的分子解析を優先的に進めたため、培養予算を一部執行しなかった。次年度の研究に向け化合物の確保は必須であるため、本未執行予算は、次年度、生産菌培養予算として執行する予定である。研究計画では、海洋由来放線菌の二次代謝産物であるnybomycinの標的分子解析を進めるにあたり、研究補助者として大学院生の協力を仰ぎ、必要な遺伝子のクローニングおよび形質転換株の作成などを実施する予定であった。また、これに伴う謝金や物品費を計上していた。しかし今年度の研究過程で、nybomycinが特定のタンパク質ではなく、DNAを標的にしていることを示唆する知見が得られたため、予定していた遺伝子クローニング等を一時中断して、得られた知見を確認するための基礎検討を研究代表者が実施する必要が生じた。このために予定の予算を一部執行しなかった。