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冠循環の神経性調節に関する基礎研究

冠循環の神経性調節に関する基礎研究として3つの面から統合的に行った。1)冠血管内径の計測技術の確立とその応用現在小動物の冠動脈内径を計測する技術はなく、従って神経調節による内径変化については不明であった。そこで、新しい軟X線装置を開発し、これを応用(ネコ冠動脈)した。静止している血管では理論通りの空間分解分能と人工的に動かした場合35H_2までの時間分解能(300H_2)で血管の動きを無視して計測することが出来たが、実際にネコ心臓に応用すると理論通りの成果を得ることが出来なかった。2)冠周囲交感神経活動の計測技術の確立前下行技冠動脈に沿って走っている冠周圍神経束を分離する技術を開発するためネコおよび犬を用いた。ネコの冠周圍神経束は100μ以下と小さく動いている心臓表面での記録は困難であった。犬では比較的太く,冠周圍神経束から心臓交感神経活動を記録することが出来た。心拍に同期したリズム放電を行い、かつ血圧受容器反射により抑制されることが判明した。この様な神経活動が胸髄の支配をどの様に受けているかについて検討した。その結果、主として第3および第2胸髄の支配下にあることが明らかとなった。3)心筋組織間ノルエピネフリン濃度の計測動いている心臓から直接組織間ノルエピネフリンを計測する技術の開発が望まれていたのでこれに挑戦した。新しいプロ-ブの開発により心筋組織間ノルエピネフリン濃度を計測する技術を確立した。正常時心筋組織間ノルエピネフリン濃度は血中濃度と大体等しい値であったが、交感神経活動が増加すると約2倍に増加し、局所循環が減少すると比例的に濃度は上昇することを明らかにした。冠循環の神経性調節を解明するため、本年度はまず2方向より、新しい技術の開発にとりかかった。1)麻酔・開胸下の露出心臓における冠動脈内径の軟X一線による計測と光顕による外径の計測の比較:時間分解能が3ミリ秒に、空間分解能が20μに設計され、開発した新しい軟X線TVシステムの特性について検討した。モデル(ファントム)実験で設計通りの性能が得られることを確認した。次いで、ネンブタ-ル麻酔下のネコを用い、左側開胸後心臓表面を露出した。右総頸動脈よりX線造影用カテ-テルを冠動脈開口部へ尊き、造影を試みた。この造影技術は予想していた通り極めて困難である。その第1は冠動脈口径が非常に細く、冠カテ-テルを選択的に操入できないことである。その第2は、開発した軟X線システムを実際の冠血管造影に適用した場合、良好な画像を得るためには非選択的に大量の造影剤を使用することが必要となった。そのため造影剤の直接作用により心拍数、心電図、血圧、冠血流の変化が起った。造影剤の直接作用を除去するためには小量の造影剤使用が不可欠であった。しかし小量の造影剤を用いるとネコ心臓の動きが速いため充分な分解能を得ることができない。本年度は、一応ネコ心臓、冠動脈の内徑300μまで造影し、計測することに成功した。2)前下行肢冠動脈に沿って走っている冠周囲神経束を分離する技術の確立を計った。ネコの冠動脈は細く、更に神経束は約100μ以下と細いことが判明した。他方、イヌの前下行肢は太く、冠周囲神経束も比較的容易に分離でき、中枢切断端から交感神経活動を記録できる技術を確立した。ネコでも、細い神経束の分離技術と神経活動計測技術の確立に引き続き努力している。

冠循環の神経性調節を解明するため、前年度に引き続き2方向より、新しい技術の開発とその改良にとりかかった。1.麻酔・開胸下の露出心臓における冠動脈内経の軟X線による計測法の開発と確立.時間分解能が3ミリ秒に、空間分解能が20μに設計され、開発した新しい軟X線TVシステムの特性について検討した。前年度,モデル(ファントム)実験では設計通りの性能が得られることを確認したので、直接ネンブタ-ル麻酔下のネコを用い、左側開胸後心臓表面を露出し、左前下行枝の造影を試みた。この造影技術は予想していた通り極めて困難で、経験によっても成功率の上昇が低い。その第1は、冠動脈口径が1mm以下と非常に細く、透視下で冠カテ-テルを選択的に操入出来ない。出来た例でも局所に虚血が発生し、2次的に生理的條件から病的條件へと移行した。その第2は、造影剤の冠血管及び心筋への直接作用を軽減するために、小量の造影剤を用いるとネコの心臓表面の収縮に伴う血管移動が大きくかつ速いため充分な分解能を得ることが出来ない。造影剤の注入量と注入速度を色々と組合せて実験を繰返しているが、前年度に到達した内径300μより更に小さい冠動脈の造影は出来るが、その信頼性が低いことを知った。そこで、動物をラットか犬に変えることを検討中である。2.前下行枝冠動脈に沿って走っている冠周囲神経束を分離し、その中枢切断端から交感神経活動を記録する技術の確立を前年度に引き続き継続した。ネコで、上行大動脈と肺動脈の中間部で、左冠動脈開口部に比較的太い神経を発見出来たので、これについて検討中である。3.軟X線TVシステムの時間分解能を約3倍増加する(1ミリ秒)こと並びにX線画像処理ソフトの改良を行った。冠循環の神経性調節を解明するために、前年度に引き続き2方向より冠動脈内径を計測する技術の確立に務めた。しかし、ネコではどうしても信頼にたる時間および空間分解能の画像をとることが出来なかった。その理由は、軟X線TVシステムの精能の問題よりも生物学的問題があるとの結論に達した。その第1は、冠血管内での造影剤の分布が不均等となることであった。小さい冠動脈へのカテ-テル操入の影響が残った。第2は、造影剤の冠血管および心筋への影響を除くことが出来なかった。そこで、心筋組織内のカテコ-ルアミンを正確に計測出来る技術の確立に多くの時間を費やした。そして、これに成功した。1.心筋組織間ノルエピネフリン濃度の測定技術冠血管周囲の心筋組織間ノルエピネフリン濃度は心筋収縮性のみでなく、冠血管平滑筋収縮性にも重要な働きをしている。そこで、局所の生体内心臓の局所交感神経活動を推定するため局所の組織間ノルエピネフリン濃度を計測した。Dialysis技術を用い、新しくデザインしたプロブ(50,000mol wt cut off出来る18×0.31mmの長さと内径)を用い、動いている心臓(左心室)から毎分5eelのリンゲル液で潅流し、潅流液中ノルエピネフリン濃度から組織間のノルエピネフリン濃度を推定した。左星状神経節の電気刺激(4H_2)で82pg/mlと約2倍に増加した。潅流液中ノルエピネフリン濃度は高速液体クロマトグラフィで行った。recovery rateは約30%であった。麻酔下ネコ左心室の潅流液中カテコ-ルアミン濃度は定常状態で41pg/mlであった。2.冠循環を局所時に停止すると局所の心筋組織間ノルエピネフリン濃度は冠血流量に逆比例して増加することを見出した。(1)の成果はAm,J,Physiolに発表し、2の成果は投稿中。
イネステイグリーン遺伝子の育種利用への分子基盤構築

老化時も葉の緑色を保つ突然変異体はstay-green突然変異体と呼ばれる。これまでの研究でdelayed yellowing1(dye1)の原因遺伝子は光化学系Iアンテナタンパク質LHCIのサブユニットの一つLhca4であることを明らかにしている。dye1におけるLhca4機能欠損によるアンテナサイズの減少は光化学系Iの機能低下を引き起こすと考えられるが、意外なことにdye1におけるバイオマスの減少や炭酸固定速度の低下は観察されなかった。このことはdye1において光化学系Iの活性低下を補償する作用が働いていることを示唆する。そこで光化学系Iの活性調節に働くシステムとして知られているステート遷移と長期的光順化について検討した。PAM蛍光法によりステート遷移活性を測定したところdye1ではステート遷移活性が極めて低かったことから、光化学系IIから光化学系IへのLHCIIの移動は補償作用として働いていないと考えられた。また、シロイヌナズナの長期的光順化では光化学系I活性に対し光化学系II活性が過剰な条件下で光化学系Iコアタンパク質mRNAの転写が増大するが、dye1では光化学系Iコアタンパク質量がやや増加したものの、転写量の増加は見られなかった。dye1では光化学系Iコアタンパク質量の増加に加え、LHCII量が顕著に増加していた。LHCIIはステート遷移の関与がなくても光化学系Iのアンテナタンパク質として機能できることが知られていることから、LHCII量の増大も光化学系I活性の補償に働いている可能性がある。また、dye1においてクロロフィル含量が高まっているのはこれらクロロフィル結合タンパク質量が増加しているためと考えられた。29年度が最終年度であるため、記入しない。葉の老化制御は葉菜類・観葉植物の品質上重要であるとともに、バイオマスの増大を通して地球温暖化防止にも役立つ可能性を秘めている。申請者の研究室では自然老化時にも葉が緑色を保つstay-green突然変異体fsg1, fsg2, fsg3を単離している。本研究は、これらの突然変異の原因遺伝子の単離・機能解析を進め、葉老化制御の遺伝子ネットワーク・分子メカニズムを明らかにすることでバイオマス増産への基盤とすることを目指す。fsg1とコシヒカリ-カサラス部分置換系統とのF2および後代、約3000個体用いたファインマッピングによりFSG1遺伝子を探索した。その結果、原因遺伝子は第8染色体の約40kbの領域に存在することが明らかになった。次に、次世代シーケンサーで突然変異体の全ゲノム塩基配列を決定した。その結果、候補領域に生じた変異は光化学系構成タンパク質のサブユニットに1か所あるのみであった。そこで、逆遺伝学的なアプローチのTILLING法によりFSG1の対立遺伝子を単離した。表現型を観察した結果、この系統はstay-green形質を示したことから、この遺伝子がFSG1であると考えられた。fsg2とコシヒカリ-カサラス部分置換系統とのF2および後代、約1600個体用いたファインマッピングによりFSG2遺伝子を探索した。その結果、候補領域の中を第7染色体の約120kbの領域に限定することができた。次に次世代シーケンサーで突然変異体の全ゲノム塩基配列を決定した。この候補領域中のCDSに生じた変異は1か所のみであったため、この遺伝子を候補遺伝子と考えた。次年度は形質転換による相補性試験を行うとともにTILLING法により対立遺伝子の単離し、表現型の観察を行う予定である。ファインマッピングによりfsg1とfsg2の候補遺伝子を単離することができた。しかしながら、交配に失敗したためfsg13の2重突然変異体を得られなかったことから、計画を変更して次年度に行う。老化時にも葉の緑色が保たれる突然変異体はstay-green突然変異体と呼ばれる。stay-green形質の研究は葉の老化メカニズムの研究に有用なだけでなく、葉菜類の品質保持や光合成能の維持によるバイオマス増大など多くの有用な特性に結びつく可能性がある。前年度はポジショナルクローニングにより、dcd1(delayed chlorophyll degradation 1)の原因遺伝子は光化学系Iのアンテナタンパク質(LHCI)のサブユニットの一つLhca4をコードすることを証明した。本年度はdcd1の表現型をより詳細に解析した。dcd1は自然老化時にstay-green表現型を示すが、この時、葉の機能が維持されるかを調べた。炭酸固定能、RubisCOの蓄積量及び老化誘導性遺伝子の経時的な変化を調べたところ、何れのパラメーターも野生型とdcd1で差がなく老化が誘導された。つまり、dcd1は老化時に見かけ上緑色を保つが、葉の機能低下は生じるnon-functional型であると考えられた。dcd1の原因遺伝子が光化学系Iのアンテナタンパク質であることから、その欠損が光化学系の構造に影響を与えている可能性が考えられた。BN-PAGEにより光化学系の構成変化を調べたところdcd1は光化学系IとLHCIの複合体のバンドが消失し、低分子側に野生型には見られない2つのバンドが現れた。二次元電気泳動により解析したところ、高分子側のバンドは光化学系I-LHCI複合体からLhca4がはずれたもの、低分子側のバンドは光化学系Iのコアタンパク質であることが考えられた。BN-PAGEの結果はLhca4の欠損が光化学系の構成変化に影響を与えていることを示しており、これがdcd1がstay-

greenになる原因である可能性が考えられる。dcd1のstay-green表現型の詳細は分かっていなかった。本年度は光合成能の測定やリアルタイムPCRを用いた発現解析によりdcd1のstay-greenメカニズムについて明らかにすることができた。これらの成果は国内学会にて発表を行ったため、おおむね順調に進展していると判断した。老化時も葉の緑色を保つ突然変異体はstay-green突然変異体と呼ばれる。これまでの研究でdelayed yellowing1(dye1)の原因遺伝子は光化学系Iアンテナタンパク質LHCIのサブユニットの一つLhca4であることを明らかにしている。dye1におけるLhca4機能欠損によるアンテナサイズの減少は光化学系Iの機能低下を引き起こすと考えられるが、意外なことにdye1におけるバイオマスの減少や炭酸固定速度の低下は観察されなかった。このことはdye1において光化学系Iの活性低下を補償する作用が働いていることを示唆する。そこで光化学系Iの活性調節に働くシステムとして知られているステート遷移と長期的光順化について検討した。PAM蛍光法によりステート遷移活性を測定したところdye1ではステート遷移活性が極めて低かったことから、光化学系IIから光化学系IへのLHCIIの移動は補償作用として働いていないと考えられた。また、シロイヌナズナの長期的光順化では光化学系I活性に対し光化学系II活性が過剰な条件下で光化学系Iコアタンパク質mRNAの転写が増大するが、dye1では光化学系Iコアタンパク質量がやや増加したものの、転写量の増加は見られなかった。dye1では光化学系Iコアタンパク質量の増加に加え、LHCII量が顕著に増加していた。LHCIIはステート遷移の関与がなくても光化学系Iのアンテナタンパク質として機能できることが知られていることから、LHCII量の増大も光化学系I活性の補償に働いている可能性がある。また、dye1においてクロロフィル含量が高まっているのはこれらクロロフィル結合タンパク質量が増加しているためと考えられた。形質転換による相補性試験でfsg1およびfsg2の原因遺伝子を確定する。並行して、fsg13の突然変異体の表現型解析を行う。具体的には生殖成長時と栄養成長時の葉における老化誘導性の遺伝子の発現パターンの変化、葉緑体タンパク質の量的な変化を調べる。また、Fv/Fm値、光合成能などの生理的パラメーターについて解析を行う。fsg1, fsg2,fsg3各突然変異体間の二重変異体を作成し、表現型観察を行う。また、シロイヌナズナのオーソログの表現型を解析する。FSG3の単離には、MutMap法を用いる。光化学系Iのアンテナタンパク質LHCIはLhca14の4つのサブユニットから構成される。dcd1のstay green表現型を示す原因はLhca4の欠損により特異的に生じる現象であるか、あるいはLHCIの機能不全により生じる現象であるかという2つの仮説が考えられる。
ヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の細胞内局在の調節と心不全治療への応用

本研究では長寿蛋白ヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の心不全での機能について検討し,一部の結果を既に報告した(J Biol Chem,2007)。さらに,その活性化薬レスベラトロールの心不全への効果をin vitro,in vivoの両面で検討中である。(1)SIRT1による細胞死の抑制EGFPにて標識した野生型SIRT1(WT),SIRT1の核移行シグナルに点変異を挿入することにより細胞質に局在するよう改変した変異体(mtNLS),または脱アセチル化酵素不活性変異体(H355Y)を作成し,親近し亜房に導入した。WT(核型)はアンチマイシンAやアンジオテンシンIIといった酸化ストレスによる細胞死を抑制するのに対して,この細胞保護効果はmtNLS(細胞質型)またはH355Yが導入された細胞では細胞保護効果は認められなかった。(2)SIRT1が酸化ストレスによる細胞死を抑制する機序WT(核型)およびmtNLS(細胞質型)をC2C12細胞に導入し内因性の酸化ストレス消去酵素の発現レベルを解析したところ,WT(核型)を導入した場合のみMnSODの発現が亢進した。またsiRNA法でMnSODの発現を抑制すると細胞死の抑制効果が消失した。(3)SIRT1活性化薬レスベラトロールの心不全に対する効果レスベラトロールを遺伝的拡張型心筋症の動物モデルであるTO2ハムスターに投与し,明らかな心不全が発症する生後35週齢の時点で通常の食餌のみを与えた個体と,心重量/体重比,左室心筋線維化,心筋BNPのmRNA発現,心エコーにより測定した左室駆出率を比較検討した。いずれの結果もレスベラトロールが心不全の重症度を軽減していた。NAD^+依存性ピストン脱アセチル化酵素Sir2は酵母や線虫で長寿をもたらす。本研究ではほ乳類のホモログであるSIRT1の心不全での機能について検討し、一部の結果を既に報告した(J Biol Chem,2007)。(1)SIRT1の不全心での細胞内局在正常対照成体心ではSIRT1は主に細胞質に分布したが、ラット心筋梗塞後や拡張型心筋症のモデルであるTO-2ハムスターおよび剖検で得たヒト拡張型心筋症患者の不全心では核に局在するSIRT1の割合が有意に増加していた。(2)SIRT1の細胞内局在変化の機序ヘテロカリオンアッセイにてSIRT1の核細胞質問シャトルを証明した。また、シャトルに寄与するSIRT1の核移行シグナル(NLS)、核外移行シグナル(NES)を同定した。(3)核局在するSIRT1の機能EGFPにて標識した野生型SIRT1(WT)を作成しC2C12骨格筋芽細胞に導入したところ、核のみに局在した。さらに、核移行シグナルに点変異を挿入することにより細胞質に局在するよう改変した変異体(mtNLS)を作成した。WT(核型)あるいはmtNLS(細胞質型)をC2C12細胞に導入し細胞死を解析することにより、核に局在するSIRT1のみが酸化ストレスによる細胞死を抑制することがわかった。(4)SIRT1が酸化ストレスによる細胞死を抑制する機序WT(核型)およびmtNLS(細胞質型)をC2C12細胞に導入し内因性の酸化ストレス消去酵素の発現レベルを解析したところ、WT(核型)を導入した場合のみMnSODの発現が亢進した。(5)SIRT1の細胞内局在を制御する機構次にNLSおよびNESの機能の修飾にリン酸化が関与する可能性について検討し、PI3K/Akt活性がSIRT1の核移行を促進することを見いだした。
高圧赤外法を利用した二酸化炭素資源化用触媒の設計

1.反応器の試作と運転初年度には、10気圧・600Kを目標に高温・高圧で赤外吸収スペクトルを測定できる反応器を設計・試作し試運転を行った。二酸化炭素の水素化によるメタノール合成を行い、本反応器が所期の性能を発揮すること及び実際に反応条件下で得た担持銅触媒のスペクトルを解析し、銅上に生成した蟻酸種が、反応中間体であるとする我々の説を支持する結論を得た。この内、反応器の設計及び試作と操作上の要点を化学工学誌において公表した。2.メタノール合成用触媒の設計平成7年度は、実際の触媒設計への応用として、銅上の蟻酸種の反応性を制御する目的で、メタノール合成への担体効果を検討した。銅の電子状態を過剰にすると、中間体の数が増加し、一方電子不足にすると、銅上の蟻酸酸種が不安定性となり水素化を受けやすくなるとの作業仮説に基づき、さまざまな酸・塩基性質を有する担体の効果を系統的に検討した。チタニア担体が優れた効果を発揮し、この場合チタニア上の蟻酸塩も反応に関与する可能性を指摘した。こうした成果はRes.Chem.Intermed.誌において公表した。3.二酸化炭素水素化の生成物分布の制御前項の結果、銅上の蟻酸種の制御が設計に有用である事を示した。さらに広範囲に生成物の分布を制御すべく、(1)酸・塩基成分の添加、両性成分の添加など助触媒の設計によるメタノール生成活性・選択性の向上(2)炭素鎖形成能を有する金属や水素可能を有する金属などの添加による二元機能の設計による、高炭素鎖生成物やエタノールなど含酸素化合物の合成などを試み、その可能性を見いだした。これらの成果を第76回触媒討論会にて公表した。1.反応器の試作フーリエ変換赤外分光器(日本分光製FT/IR-300)を購入し、同器に設置可能な常圧用ガラス製および高圧用ステンレス製反応器を試作した。いずれも反応器の両側面にKBr製の窓板を配置し、反応中も赤外光が透過できるように工夫するとともに、試料部にヒーターを設置し、300°Cまで加熱出来るようにした。後者は、反応器出口に背圧調製弁を設け、反応中の圧力を10気圧まで昇圧出来る加圧流通型反応器とした。反応器出口は試料採取コックを介してガスクロに直結し、反応ガスの成分分析を行った。2.触媒の選定通常のメタノール合成触媒の主成分である銅の焦点を絞り、各種担体の効果を検討した。シリカ・アルミナの様な酸性担体では活性は低くジメチルエーテルが生成した。中性担体のシリカゲルや塩基性担体のマグネシアでは活性も低く一酸化炭素の生成が主であった。両性担体のアルミナ、チタニア、ジルコニアではメタノールへの活性が高かった。このようにメタノール合成では担体は単に表面積を増加させる物理的な作用に加え、活性・選択性に影響を与える化学的な効果もあることがわかった。3.in situ赤外スペクトル上述の担体効果を反応機構の面から解明するため、反応中の赤外吸収スペクトルを測定した。各触媒とも銅上にギ酸種を生成し、反応条件の変化に応じて表面濃度が変化し、かつ反応成績と対応した。従って銅表面上に生成したギ酸種が反応中間体であるとする、反応機構に関する我々の従前の作業仮説を裏付けることが出来た。現在酸・塩基の効果についての検討が進行中である。これらの結果はResearch on Chemical Intermediates誌に掲載予定である。1.反応器の試作と運転初年度には、高温・高圧で赤外吸収スペクトルを測定できる反応器を試作し、試運転を行った。

二酸化炭素の水素化によるメタノール合成触媒の動作条件下でのスペクトルから銅上に生成した蟻酸種が、反応中間体であるとの知見を得たため、この系の詳細を検討した。これらの経過を化学工学誌において公表した。2.メタノール合成用触媒の設計銅上に生成した蟻酸種の反応性を制御することでメタノール合成に適した触媒を設計することとし、担体の効果を検討した。このため、銅の電子状態を過剰にすると、中間体の数が増加し、一方電子不足にすると、銅上の蟻酸種が不安定性となり水素化を受けやすくなるとの作業仮説に基づき、さまざまな酸・塩基性質を有する担体の効果を検討した。チタニア担体が優れた効果を発揮し、チタニア上の蟻酸塩も反応に関与する可能性を指摘した。こうした成果はRes.Chem.Intermed.誌において公表した。3.二酸化炭素水素化の生成物分布の制御前項の結果をもとに、さらに広範囲に生成物の分布を制御すべく、(1)酸・塩基成分の添加、両性成分の添加など助触媒の設計によるメタノール生成活性・選択性の向上(2)炭素鎖形成能を有する金属や水素可能を有する金属などの添加による二元機能の設計による、高炭素鎖生成物やエタノールなど含酸素化合物の合成どを試み、その可能性を見いだした。これらの成果を第76回触媒討論会にて公表した。
S.mutansの蛋白質の抗原エピトープを用いたマルチプルペプチドワクチンの免疫原性

う蝕ワクチンの候補として注目されているS.mutansの菌体表層線毛様構造物である分子量19万の蛋白質抗原(PAc)を用いたう蝕ワクチン開発において、より安全で有効性の高いペプチドワクチンが検討されるようになった。そこで申請者は、このPAcを用いてより最小単位で免疫原性の強く安全性の高いう蝕予防用ワクチンを開発することを目的とし実験を行なった。PAcと唾液成分との結合に最も関係深いとされるPAc分子中アラニンの豊富な繰り返し領域に着目し、その領域をすべてカバーするアミノ酸残基4個をオーバーラップしたアミノ酸残基19個のペプチドを合成し、その合成ペプチドに存在するT,B細胞エピトープの検討をB10コンジェニックマウスを用いて行なった。その結果、PAc(アミノ酸残基番号,226-244),PAc(301-319),PAc(331-349)PAc(407-425),PAc(264-282),PAc(279-297)にT,B両細胞エピトープが、PAc(241-259),PAc(2710289)PAc(346-364),PAc(391-409),PAc(436-454),PAc(219-237)にT細胞エピトープ、PAc(316-334),PAc(361-379),PAc(421-439),PAc(451-469),PAc(355-373)にB細胞エピトープが存在していた。これらペプチドから数種類選びだし免疫原性について検討すると、PAc(301-319),PAc(361-379),PAc(391-409)において優位にrPAcおよび免疫した自己ペプチドに対する抗体を誘導できることが認められた。特にPAc(361-379)は5種のコンジェニックマウスにおいて強い免疫原性を有し、その誘導された抗体はrPAcと唾液の結合を40%阻害することが認められた。さらにこのPAc(361-379)のT,B両細胞エピトープは少なくともPAc(361-377)に存在していることが部分ペプチドを用いて認められた。よってこのペプチドにヒトを用いた解析から認められたT細胞エピトープ[すでにHLA-DR8におけるT細胞エピトープは、PAc(316-334)に存在していることを認めている。]を連結することにより、マルチプルなペプチドワクチンの作製が可能となると考えられる。今後より詳細な数種のHLA-DRタイプにおけるヒトT細胞エピトープとアグレトープの解析を行なう予定である。
植物遺伝子発現の柔軟性とシグナル応答の分子機構

体勢上レンガ積み構造に例えられる植物体に発達された内・外的刺激に独特の応答反応を示す現象の分子機構の解明を目的として立案された本研究組織において、研究期間終了にあたって次のような成果が得られた。まず、植物ホルモンのうち作用が最も広範かつ劇的ゆえ重要とされるオーキシンについて発現制御をする遺伝子を探索して得られた遺伝子は、グルタチオンS-トランスフェラーゼをその翻訳産物と同定したが、これはオーキシン制御の遺伝子で機能の同定された最初であった。また、やはりオーキシン制御の遺伝子で細胞増殖に関っていると推定されるGタンパク質のβ-サブユニット様の遺伝子も同定したが、これは植物で初めてのGタンパク質関連遺伝子であり、タンパク質Cキナーゼを介する新しい信号伝達経路の展開を予測させたが、同様な展開は蔗糖により誘導されるβ-アミラーゼでも、Ca依存タンパク質キナーゼの介在を予測させ、斯界に本邦発の情報として貢献できたといえる。また、植物ホルモンが形態形成に果たす役割についても遺伝子の同定がなされた。一方、植物への病原菌の感染に伴う応答機構については、エリシターに対応する受容体の同定、中間で作用するホスホイノチド代謝経路の推定もなされ、病原菌抵抗性植物の再生も試みられた。さらに、植物ウイルスであるタバコモザイクウイルスの感染に関しては、ウイルスの複製酵素領域が抵抗性を支配していること、またウイルスの細胞間移行に関する30kDaタンパク質のリン酸化が抵抗性に関与していることも示された。なお、本研究グループで広く用いられたタバコ培養細胞株BY-2は、高度な同調化が可能ということで世界18ヶ国で使われるにようなったが、その流布にあたっていは本研究グループが大いに貢献してた。本重点研究は二年目であり、順調に飛躍を遂げる筈であったが、前領域代表者を中途で喪い、領域代表者の交代という試練を受けることとなったが、幸い班員一同の協力を得、ひどいダメージを受けることなく所定の成果を得ることができた。研究をより推進し、相互の研究連絡を密にするために、8月24日より27日まで札幌で、北大およびポールスター札幌で班会議を開いたが、A班およびB班共通な話題が多いので合同会議とし、併せて公開シンポジウム、公開議演会を催したが、いずれも活発に、時に激しく行なわれ、結果的に相互の協力が密に図れたことは有意義であった。また、やや視点を変え、研究班の研究協力者の若手を中心に11月22- 24日に泊り込みで八王子セミナーハウスで技術論に関するワークショップを行なったが好評であり、研究手法の向上を図るために是非来年もという声が高かったので十分考慮することとした。これらの班会議、ワークショップの内容は植物遺伝子応答ニュースとして全員に配付したが、ニュースは、この2件をあわせ全部で7号発刊し、重点研究の潤滑油として機能した。具体的研究成果としては、植物ホルモンの内植物の発生成長分化に広範に影響を及ぼすオーキシンやアブシジン酸で誘導される遺伝子が5ケ単離されたが、その内3ケについて機能が同定されたがこれはこれまで全くそのような例がなかったので特に強調できる内容といえる。また、乾燥による誘導される遺伝子、カビの感染により誘導される遺伝子でも新しい成果が得られたので、最終年度へ向け全員に一層の努力を呼びかけた。まず研究成果の内から主なものを取り上げると、植物ホルモンであるオーキシンの制御を受けるGタンパク質の関連のGβ_-様の遺伝子が高等植物で初めて見出されたこと、分子サイズの小さいGタンパク質が光に応答して発現することなどで、情報伝達で国際的にも先駆的な成果が得られた。また、この他班員のそれぞれが取り組んだ現象と関わって、いくつかのタンパク質のリン酸化に関係する遺伝子が同定された。また、カビ病の感染と関連して誘導される遺伝子によるトランスジェニック植物が耐病性を示したなどの成果もあった。

植物の特徴の可塑的分化転換に関する遺伝子が仮導管要素の分化過程で単離されたことも重要な点である。なお、この活性化のバロメーターは班員による原著論文であるが、1993年度は140編で、班員数は前年度より減ったが、論文数は40%増しであった。総括班としての最も大規模な企画は、1993年7月27-28日の合同班会議で、併せて公開講演会も催した。そこでは、上記の話題も含む研究班の最新の話題が話されたが、十分な議論と評価を厳正にするよう努めた。また、1993年10月28-29日に八王子セミナーハウスで組織に関係する若手を対象に手法を中心としたワークショップを行ったが、極めて活発であった。このほか、ニュースレターを刊行し、班員間での意志の疎通を図った。これらの企画の中心に総括班および総括班の幹事会があり、特に幹事会は必要に応じてk開催し、組織の運営の円滑化と大方針の策定に関わった。本年度は、研究実行班の期間は終了し、本研究組織の課題は専ら研究の収束を見守ることと、成果の公刊であったが、興味ある研究成果は期間とはある意味で関係なく得られるので、その例を挙げる。植物ホルモンであるオーキシンにより発現誘導されることで単離されていたparBに関して、転写制御のシスエレメントを同定でき、トランスの因子も推定できたが、これは従来信じられていたオーキシン応答エレメントを完全に覆すものであった。また、やはりオーキシン応答遺伝子として単離されていたarcAは、真核細胞に広く分布するC-キナーゼの受容体である可能性が極めて高くなり、今まで知られていない信号伝達の経路が見えてきた。一方、蔗糖により誘導されるβ-アミラーゼの発現誘導には、Ca^<2+>依存タンパク質キナーゼが介在し、カビの感染に関しても、やはりある種のタンパク質キナーゼが関与しているというように細胞内信号伝達系の解明の糸口の提示が本研究グループの終結を飾ってくれた。また、本研究グループで盛んに研究されたタバコ培養細胞BY-2は、国際的にも広く認知されるようになり、世界18ケ国で主として細胞周期の同調の目的で使用されるようになり、日本発信の情報にも本研究グループが貢献した。このような成果を反映して、班員による論文の公刊は、班員数は減っているにもかかわらず、1991年98編、1992年94編、1993年99編、1994年134編で、投稿中60編と順調な上昇を示した。単純な数だけでは、研究の評価は計れないが数もある指標を現しているであろう。取りまとめの作業としては、研究成果を下に一般にも関心をひくような内容の書籍の公刊を企画し、期限内に公刊の運びとなった。これに関連して、総括班幹事会を3度開くとともに、関連の集まりは適宜持った。
細胞内カルシウム動態からみた心筋虚血プレコンディショニング効果の加齢性変化

麻酔プレコンディショニングや虚血プレコンディショニングを行うと、心筋梗塞サイズが減少したり、虚血再灌流中の回復が促進するとされる。このプレコンディショニング効果が加齢性に変化することが最近指摘されたが詳細は不明である。本研究は年齢の異なるラットから摘出した心臓標本を用いて、プレコンディショニング効果の加齢性変化のメカニズムを検討することを目的とした。成熟ラットの摘出心臓においては、イソフルランによる抗再灌流不整脈作用とフリーラジカル発生抑制が認められ、KATPチャンネルの関与も示された。次に、イソフルランによるプレコンディショニング効果の加齢性変化を検討した結果、イソフルランの抗再灌流不整脈作用は加齢により減弱し、これには再灌流時の心筋内カルシウム濃度の上昇抑制が関わっていることが判った。しかし、フリーラジカル発生に関しては加齢性変化を認めなかった。以上の結果から、加齢による麻酔プレコンディショニング効果の減弱にはフリーラディカルではなく心筋細胞内カルシウム動態の加齢性変化が関与していることが判明した。最後に、虚血プレコンディショニングの加齢性変化について同様に検討した。虚血プレコンディショニングにより、若年群では再灌流不整脈が抑制されたが、高齢群では抑制されなかった。再灌流時の心筋細胞内カルシウム上昇は、若年群において虚血プレコンディショニングにより抑制された。フリーラジカルの発生に関しては、加齢による影響を認めなかった。以上の結果から、虚血プレコンディショニングによる抗再灌流不整脈効果は加齢性に減弱し、機序として再灌流時の心筋細胞内カルシウム動態との関連が認められたが、麻酔プレコンディショニングと同様にフリーラジカル発生との関連はなかった。今後の研究の展開として、麻酔・虚血プレコンディショニング効果の加齢性変化を、KATPチャンネルの面からも検討したい。心筋虚血の前に虚血プレコンディショニング(短時間の虚血をあらかじめ負荷)や吸入麻酔薬によるプレコンディショニングを行うと、心筋梗塞のサイズが減少したり虚血後の心機能の回復が促進するとされるが、その効果は一定ではない。この原因の一つとして患者の年齢差が考えられるが、加齢によるプレコンディショニング効果への影響は十分に解明されていない。そこで、本研究は幼若・成熟・老齢ラットから摘出した心臓標本を用いて、プレコンディショニング効果の加齢による変化のメカニズムを解明することを目的とした。平成14年度は、幼若、成熟、老齢ラットから摘出した心臓において、吸入麻酔薬(イソフルラン)によるプレコンディショニング効果が加齢によりどのように影響を受けるかを検討した。222bpmのペーシング下での10分間の心筋虚血と再灌流を行った際の、再灌流不整脈発生・心機能回復・心筋内カルシウム濃度変化・冠灌流液中と心筋内DHBAs濃度を比較した。その結果、2.2%イソフルランの虚血前投与により幼若ラットでは再灌流不整脈の発生が抑制される傾向があるが、成熟・老齢ラットではイソフルランによる再灌流不整脈の抑制は認められず、プレコンディショニング効果が加齢により減弱することが示唆された。これには虚血再灌流時の心筋内カルシウム濃度の上昇抑制が関わっているようである。再灌流時の心機能・心筋酸素消費に関しては、不整脈の影響が大きかったためか有意差は認められなかった。

DHBAsは液体クロマトグラフィーで現在測定中である今後の研究の展開としては、研究年度内には測定できなかったDHBAs産生量について幼若、成熟、老齢ラットで比較して、フリーラディカル発生の面からも検討を加えたい。また、虚血プレコンディショニングの加齢性変化についても心筋細胞内の筋小胞体機能の面から更に検討を進める予定である。プレコンディショニングを行うと、心筋梗塞サイズが減少したり、再灌流中の心機能回復が促進するとされる。プレコンディショニング効果は年齢によって変化することが指摘されているが詳細は不明である。本研究は幼若・成熟・老齢ラットから摘出した心臓標本を用いて、プレコンディショニング効果の加齢性変化のメカニズムを解明することを目的とした。平成15年度は、幼若、成熟、老齢ラットから摘出した心臓において、イソフルランによるプレコンディショニング効果が加齢によりどのように影響を受けるかを、再灌流不整脈データに加えて、心筋内カルシウム動態とフリーラディカル発生量の両面から更に検討を行った。イソフルランの虚血前投与により、幼若ラットでは虚血再灌流不整脈の発生時間が短縮されたが、成熟・老齢ラットでは再灌流不整脈発生時間は変化しなかった。これには虚血再灌流時の心筋内カルシウム濃度の上昇抑制が関わっていることが判った。すなわち、再灌流中に拡張期心筋内カルシウム濃度が上昇したが、イソフルラン虚血前投与により幼弱ラットのみで拡張期心筋内カルシウム濃度の上昇が抑制(1.07±0.35→0.79±0.19)された。冠灌流液中のDHBAsを液体クロマトグラフィーで測定することによりフリーラディカル発生量を検討できる。本研究では、虚血再灌流5分後における冠灌流液中のDHBAsを測定した。その結果、全年齢群においてDHBAsは虚血前と比較して上昇したが、イソフルラン虚血前投与を行っても変化しなかった。以上の結果から、加齢によりイソフルランのプレコンデイショニング効果が減弱し、その機序としてはフリーラディカルではなく心筋細胞内カルシウム動態の加齢性変化が関与していることが判明した。今後の研究展開としては、短時間虚血によるプレコンディショニング効果の加齢性変化について、心筋細胞内カルシウム動態の面から検討する予定である。虚血プレコンディショニングや麻酔プレコンディショニングを行うと、心筋梗塞サイズが減少したり、虚血再灌流中の心機能回復が促進するとされる。本研究は年齢の異なるラットから摘出した心臓標本を用いて、プレコンディショニング効果の加齢性変化のメカニズムを解明することを目的とした。平成16年度は、若年と高齢ラットから摘出した心臓において、短時間虚血(1分間×3回)によるプレコンディショニング効果が加齢によりどのように影響を受けるかを、再灌流不整脈データに加えて、心筋内カルシウム動態とフリーラディカル発生量の面から更に検討を加えた。虚血プレコンディショニングにより、若年群では再灌流不整脈(VF/VT)が抑制されたが、高齢群では抑制されなかった。再灌流時の心筋細胞内カルシウム上昇は、若年群において虚血プレコンディショニングにより抑制された。
スペクトル情報に基づくデジタル映像の色再現に関する研究

本研究では、高解像度3バンド画像と低解像度スペクトル情報から、高解像度のスペクトル画像を生成する、複合解像度型分光イメージング手法を提案し、有効性を示してきた。今年度は、複合解像度型の手法で分光画像を取得する原理を整理し、誤差なく分光画像を取得できる条件を明らかにした。また、イメージセンサの各画素に異なる多色のカラーフィルタを配したマルチスペクトルフィルタアレイ(MSFA)方式のセンサで取得できるデータを、低解像度スペクトル情報とみなし、RGBイメージセンサと組み合わせて、複合解像度型イメージングを実現する方法を提案した。さらに、単板のイメージセンサに、RGBのカラーフィルタと16色のカラーフィルタを異なる密度で配置して画像を取得し、16バンドの画像を復元する手法へも発展させた。この成果により、4板単板のイメージセンサによりリアルタイムのマルチスペクトルイメージングの実現可能性が示された。また、低解像度スペクトル画像を収集するデバイスとして、ファイバータイプの低解像度スペクトルイメージングセンサを試作した。空間方向の画素数は68画素と少ないが、各画素における可視域のスペクトルを動画として取得できる。さらに、ハイダイナミックレンジ(HDR)画像入出力の技術を、マルチスペクトルイメージングに応用し、特に金属光沢に対して、視覚的な忠実性の向上の可能性について検討した。6バンドHDR画像を取得して、各種トーンマッピングを適用して表示した画像に対して、質感や光沢感などの再現性について主観評価実験を実施した。その結果、マルチスペクトルで正確な色情報を取得すると共に、HDR技術を導入して光沢を適切に表現することで、金属光沢の再現性が向上することが示された。以上の成果により、新しい小型のマルチスペクトル映像入力手段を示すと共に、色再現のみならず質感再現の向上にも寄与することを明らかにした。本研究課題では、既存の3バンドカメラに、低解像度のスペクトル画像センサを組み合わせて用いることで、小型で高精度なスペクトル映像収集技術を確立すること、および、マルチスペクトル映像収集における汎用性や操作性を向上させる技術を確立することを目的としている。今年度は、3バンド画像と低解像度スペクトル画像から、高解像度のスペクトル画像を生成する基本技術を確立した。またこの手法を、スペクトル映像表現・圧縮符号化へ応用する方法を整理し、6バンド映像の符号化における有効性を確認した。さらに、提案手法をGPUを用いて実装することにより、汎用のPCレベルの装置で、スペクトルに基づく色再現処理をリアルタイムに実現できることを実証した。現実の様々な撮影環境において、高品質なマルチスペクトル映像収集を実現するためには、カメラと処理において適切な設定をするこが必要である。今年度は、これまで高品質な映像収集が困難であった、光沢等の光輝度部や、高彩度色を精度よく取得するために、カメラの非線形階調特性を利用する方法を明らかにし、その効果を確認した。また、病理スライドの顕微マルチスペクトル画像や皮膚病変部のマルチスペクトル画像に対する解析を行い、医用分野においてマルチスペクトル情報が有用である例を示した。スペクトル映像収集技術については、今年度は手法の高精度化を検討し、効果を実証した。これにより、これまでよりも幅広い対象について、高精度な画像データ収集が可能となった。また、ファイバータイプの小型の低解像度スペクトル画像センサを試作した。マルチスペクトル映像収集における汎用性や操作性の向上については、小型の多点スペクトルセンサを用いて、画像処理に必要となる照明光スペクトルを簡易に取得する方法について検討し、効果を確認した。これにより、簡易な装置での照明光スペクトル計測の実施が可能となる。さらに、スペクトル映像の利用分野拡大に向け、以下を実施した。・高彩度色を含む対象の色情報を精度よく取得可能であることを示し、広色域映像取得技術としての有用性を示した。・ステレオカメラで取得される画像データへ提案手法を適用することで、6バンドの3次元画像取得が可能であることを確認した。・スペクトル画像に基づく色再現画像において、ハイダイナミックレンジ画像処理を組み合わせることで、光沢等をもつ被写体における質感再現性が向上することを示した。・病理画像診断、リモートセンシングにおけるスペクトル画像の利用方法について検討を行った.本研究では、高解像度3バンド画像と低解像度スペクトル情報から、高解像度のスペクトル画像を生成する、複合解像度型分光イメージング手法を提案し、有効性を示してきた。

その結果、マルチスペクトルで正確な色情報を取得すると共に、HDR技術を導入して光沢を適切に表現することで、金属光沢の再現性が向上することが示された。以上の成果により、新しい小型のマルチスペクトル映像入力手段を示すと共に、色再現のみならず質感再現の向上にも寄与することを明らかにした。
マーモセット低侵襲脳梗塞モデルを用いた脳梗塞に対する細胞療法・神経再生治療の開発

コモンマーモセットを用いた、開頭を必要としない低侵襲脳梗塞モデル作成法が確立された。統一した手技によって信頼度の高い確率でモデル作成が可能となった。本モデルは大脳基底核を中心とした広範囲な脳梗塞を呈し、病巣と反対側の半身運動麻痺を来たす。本モデルにおいてはこのような神経学的異常所見を客観的に評価するための行動学的解析や、MRI、PETを含めた放射線学的解析が可能であり、げっ歯類に比べ、よりヒトに近い脳梗塞モデルであると考えられる。さらに神経新生などの評価のための組織学的検討のみならず、定位的脳手術による細胞移植も可能であり、今後の脳梗塞治療研究に非常に有用なモデルであると考えられる。マーモセット脳梗塞モデルの樹立後、従来のMRIによる梗塞巣評価に加え、PET(Positron Emission Tomography)による梗塞巣の脳代謝評価が、移植治療に適した時期の決定や、霊長類における脳梗塞の病態把握に極めて有用と考えた。PETは、小動物用のPET、サイクロトロン並びにホットラボを持つ、浜松ホトニクスにて行った。PETに用いた核種は、従来のFDG(18F-fluorodeoxy glucose)ではなく、ミトコンドリアのComplex1での酸化的リン酸化を評価するBMS747158-02、中枢および末梢性ベンゾジアゼピン受容体のリガンドであるRo15-1788、PK-11195の3核種を用いて脳梗塞を評価した。全身麻酔を必要とする小動物実験では、入眠時に糖代謝が落ちるためFDGでは正確な評価が困難だからである。結果は、BMS747158-02が最も鋭敏に脳梗塞を反映し、術前は基底核を中心に集積が高く、術後1週間後に右中大脳動脈灌流領域で集積が低下し、血流低下(脳浮腫)あるいは壊死を表すと考えられた。4週間後には集積低下がみられた領域がやや縮小した。したがってこの回復が見られた領域は脳浮腫の改善を表し、一方集積が低下したままの部位が脳梗塞のコアを表すと考えられた。これまでのMRIでの結果とほぼ同様であった。Ro15-1788は大脳皮質での脳梗塞を反映していることが示され、PK11195は、炎症性アストログリアを反映することが示された。現在BMS747158-02と同化合物であり、より感受性の高いBCPP-EFを用い、さらに検討中である。PETの集積低下率と、MRIおよび組織像に相関があることが検出可能である。このように脳梗塞モデルの作成と評価方法がほぼ確立できたと考えている。さらに次段階である脳梗塞モデルに対する細胞療法を検討する予定である。これまで報告してきた通り、霊長類(コモンマーモセット)を用い、継続的に安定した脳梗塞モデルが作成できるようになった。特に術中酸素投与量を減量することで、大脳皮質、基底核を網羅し得る広範囲な脳梗塞作成が可能となった。また脳梗塞モデルの運動学的解析において、高速ビデオ撮影などを用い、歩行路上の患側の前後肢の運肢の遅れや、ハシゴの昇降時の患側の踏み外しなど、肉眼では分かり難かった高速の巧緻運動も含めたより詳細な評価が可能となり、行動学的解析がより正確に行えるようになった。さらに同モデルのPET解析を試みた。まずマーモセット脳梗塞の評価をするための至適核種を選定。心筋の評価で使われている特殊な核種が脳にも使用できることが分かった。同核種を用い脳梗塞前後でのPET撮像が容易となり、梗塞巣の代謝を中心とした生理学的検討も可能となった。本年度は本モデルを用い、脳梗塞に対する細胞療法の可能性について検討を始めた。共同にて研究を行っている岡野研より、マーモセット胎児脳由来の神経幹細胞を供与して頂き、ニューロスフェア法にてターシャリニューロスフェアを形成させ、この段階での細胞を準備した。症状の残る脳梗塞モデルを作成し、亜急性期に、基底核および皮質のペナンブラ領域を同定し移植を行った。現在移植モデルについての放射線学的、また病理学的解析を行っている最中である。以上、本研究の目的であった、マーモセットを用いた低侵襲脳梗塞モデル作成は確立され、統一した手技によって信頼度の高い確率で作成が可能となった。また同モデルは詳細な行動学的解析、放射線学的解析が可能であり、霊長類としての評価に耐え得る、よりヒトに近い脳梗塞モデルであると考えられる。同モデルに対し細胞移植も可能であり、今後の脳梗塞治療を含めた基礎研究に、非常に有用なモデルであると考えている。

マーモセット脳梗塞モデルの樹立後、従来のMRIによる梗塞巣評価に加え、PETによる梗塞巣の脳代謝評価を行うことで、移植に適した時期の決定や、霊長類でありながらヒトより早い回復のメカニズムを知ることが今後の治療にとって重要であると考えた。PETは、小動物用のPETとサイクロトロン並びにホットラボを持つ施設である浜松ホトニクスにて行った。PETに用いた核種は、従来のFDGではなく、ミトコンドリアのComplex1での酸化的リン酸化を評価するBMS、中枢性および末梢性ベンゾジアゼピン受容体のリガンドであるRo15-1788およびPK-11195の3核種を用いて脳梗塞を評価した。全身麻酔を必要とする小動物実験では、入眠時には糖代謝が落ちるためFDGでは正確な評価が困難だからである。結果は、BMSが一番鋭敏に脳梗塞を反映し、術前は基底核を中心に高く、1週間後に右MCA領域で低下、血流低下(脳浮腫)と壊死を表し、4週間後に低下した領域がやや縮小し、脳浮腫が改善し、低下部位が脳梗塞を示した。これまでのMRIでの結果とほぼ同様であり、MRIを用いない評価も可能と考えられた。Ro15-1788は、術前では大脳皮質中心に取り込み高値で、神経細胞を反映し、1週間後に右MCA領域で低下し、脳浮腫と神経細胞の壊死を反映し、4週間後に脳浮腫は改善し、大脳皮質での脳梗塞を反映していることが示された。焦点を皮質に絞る場合に有用なリガンドとなると考えられた。PK11195は、グリア細胞を反映するため、梗塞巣が生じた際の炎症のピークを調べるのに有用と考えたが、術後1週間後と4週間後の撮影では炎症を確認するに至らなかった。炎症のピークをコントロールすることが、適切な細胞移植には必須であり、撮影時期の決定が今後の課題である。[中大脳動脈(MCA)閉塞モデル作成および改良]これまでの方法を踏襲し作成した。術後経時的に頭部MRI、行動学的解析を施行。また神経組織再生を評価するためにBrdUを腹腔内投与。術後6ー8週後に灌流固定後脳を摘出し組織学的検討を行った。特に霊長類でも神経再生が起こる可能性について検討したが、げっ歯類とは異なり、神経幹細胞の新生は極めて限られることが判明した。行動学的解析方法では、現行の評価方法に加え、巧緻運動評価も追加した。すなわち前肢に左右を使い分けさせる器具を開発し検討した結果、麻痺が改善しても巧緻運動障害がのこる個体、もしくは全く患側を使用しようとしない『不使用の学習』という状態を発見した。これらの病態把握のため、PETによる画像評価(後述)を行った。細胞療法研究に適した脳梗塞モデル作成という観点から、これまでのモデルでは6週間後の運動機能障害が軽度であるために、治療前後の効果の判定が比較的困難と考えられた。そのため、障害がより重度に残存するようなモデル作成ができないか検討した。その結果、術中の麻酔方法を変えることで、より重度の障害を後遺するモデル作成が可能となった。本方法では虚血時間の延長は必要ない。現在データを収集検討中である。[MCA閉塞モデルのPET評価](株)浜松ホトニクスPETセンターにて行った。これまでマーモセットでの脳梗塞PET検査の報告がなく、使用する核種の選定から検討が必要であった。今回は3種の核種について検討を行った結果、BMS747158-02が最も鋭敏に脳梗塞を検出できることが分かった(「研究実績の概要」を参照のこと)。さらに感受性を増したBCPP-EFという核種を浜松ホトニクスが開発した。
HN-1融合蛋白とSCCAプロモーターを導入した食道癌特異的治療ベクターの開発

食道癌で特異的に発現する遺伝子を同定し、治療遺伝子の標的とすることを目的としておこなったスクリーニングにおいてRCAS1遺伝子、Caveolin-1遺伝子が明らかとなった。一方、扁平上皮癌特異的遺伝子のプロモーターとしてSCCAプロモーターを導入したアデノウイルスベクター導入用シャトルベクターを構築した.まず胎児腎細胞株293細胞よりPCR法でクローニングしたSCCAプロモーターをpGL3ベクターに導入し,緑色発光遺伝子(GFP)と赤色発光遺伝子(DsRed)をレポーターとして挿入したベクターおよびKLAKLAK2遺伝子を治療遺伝子として挿入したベクターを構築,これらを制限酵素で切り出してシャトルベクターpAdTrackに導入した.これらのベクターと大腸菌を用いた相同組み換えの系を用いて3種類のアデノウイルスベクター(Ad-Mock,AdSCCA-Red,AdSCCA-KLAKLAK2)を構築した。AdSCCA-Red,AdSCCA-KLAKLAK2)とSCCA産生のあらかじめ分かっている扁平上皮癌細胞株LK2とLC1およびSCCA産生のない腺癌細胞株A549とABC-1,正常細胞株SAECを用いて発現実験および治療実験を行った.AdSCCA-Redを用いた検討ではA549,ABC-1,SAECではDsRedは発現しなかったのに対しLK2,LC1で強い発現が確認された。AdSCCA-KLAKLAK2を用いた遺伝子治療実験ではA549,ABC-1,SAECに対しては細胞毒性を示さなかったのに対し,LK2,LC1でアポトーシスが誘導された。以上のことから,このベクターを用いることによって,正常組織では副作用のない遺伝子導入系をつくることができることが証明された.この治療効果および正常細胞への安全性はヌードマウスの癌移植モデルにおいても確認された.(論文投稿中)食道癌で特異的に発現する遺伝子を同定し、治療遺伝子の標的とすることを目的としておこなったスクリーニングにおいてRCAS1遺伝子、Caveolin-1遺伝子が明らかとなった。一方、扁平上皮癌特異的遺伝子のプロモーターとしてSCCAプロモーターを導入したアデノウイルスベクター導入用シャトルベクターを構築した.まず胎児腎細胞株293細胞よりPCR法でクローニングしたSCCAプロモーターをpGL3ベクターに導入し,緑色発光遺伝子(GFP)と赤色発光遺伝子(DsRed)をレポーターとして挿入したベクターおよびKLAKLAK2遺伝子を治療遺伝子として挿入したベクターを構築,これらを制限酵素で切り出してシャトルベクターpAdTrackに導入した.これらのベクターと大腸菌を用いた相同組み換えの系を用いて3種類のアデノウイルスベクター(Ad-Mock, AdSCCA-Red, AdSCCA-KLAKLAK2)を構築した。AdSCCA-Red, AdSCCA-KLAKLAK2)とSCCA産生のあらかじめ分かっている扁平上皮癌細胞株LK2とLC1およびSCCA産生のない腺癌細胞株A549とABC-1,正常細胞株SAECを用いて発現実験および治療実験を行った.AdSCCA-Redを用いた検討ではA549,ABC-1,SAECではDsRedは発現しなかったのに対しLK2,LC1で強い発現が確認された。