hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフトウエア無線に適したスペクトル変換型受信機構成法の研究

1.研究の目的本研究では新たなソフトウエア無線受信機アーキテクチャを提案する。周波数変換器により無線周波数(RF)信号を直流近傍の低IF(Intermediate Frequency)領域に変換する。その後、アナログ処理によるフーリエ変換の前処理を施した後にA/D変換を行うことを特徴とする。近傍に存在する大レベルの不要波信号に対応するフーリエ変換係数を強制的にゼロとすることで、一種のフィルタ処理を行う。2.具体的内容低IF構成受信機を採用し、機能シミュレータを用いてアナログ・フーリエ変換による信号選択、妨害波抑圧特性について定量的に検討した。具体的には、シングルキャリアを用いたBPSK(Binary Phase Shift Keying)では復調まで可能であることを示した。また、希望信号よりも強い妨害波に対する抑圧効果も確認できた。さらに、マルチキャリアを用いた変調ではサブキャリアの選択とその復調も可能であることを示した。さらに、アナログ・フーリエ変換に用いる正弦・余弦波の発振回路について、DDS(Direct Digital Synthesizer)を基に検討した。回路シミュレータを用いて、窓積分フィルタによるスプリアス抑圧効果を明らかにした。以上から、スペクトル変換法の低IF部のアーキテクチャ等について、基本構成の有効性を示した。本受信機構成では、希望信号近傍のスペクトルをモニタすることができるので、空きチャネルを探すことも容易となり、周波数の有効利用が可能になる。今後、RF回路構成と関連してイメージ抑圧処理を取り込んでいく。周波数変換器(ミキサ、サンプリング回路など)により無線周波数(RF)信号を直流近傍の低IF(Intermediate Frequency)領域に変換する。A/D変換器の入力は希望信号のフーリエ係数のみとなるので、A/D変換の分解能を必要以上に大きくせずに済み、低電力化に適する。さらに、希望信号近傍のスペクトルをモニタすることができるので、空きチャネルを探すことも容易となり、周波数の有効利用が可能になる。2.本年度の研究内容本年度は基本原理の確立と受信機構成の明確化を目的とした。机上検討により、アナログフーリエ変換を用いた受信機構成を明確にした。周波数変換器(ミキサ)により低IF領域に変換された信号は希望波信号と近傍の大信号である不要波信号を同時に含んでいる。通常の受信機ではバンドパスフィルタにより希望波信号のみを取出して復調に進む。しかし、本提案では無線信号処理の柔軟性を確保するために、低IF信号を一度アナログフーリエ変換することで、周波数軸上で分離できるようにする。不要波信号が存在するチャネルに関するフーリエ係数は元々ゼロにしておく。一方、希望波チャネルと今後使う予定のあるチャネルについてはフーリエ係数を常に計算する。アナログフーリエ変換を具体的に行うためには、マルチ周波数発振器、乗算器、積分器があればよい。このようにすることで、希望信号を受信しながらも、空いている無線チャネルを同時に探すことが容易になり、コグニティブ無線などに適している。来年度は原理確認のための実験を進める予定である。
骨格筋線維における収縮蛋白発現の多様性について

本研究は、正常なラット骨格筋から得た単一筋線維中に異なったミオシン重鎖分子種(MHC)が混在する筋線維が存在するかどうかまたどの程度存在するかについて、生化学的、組織科学的に筋の部位毎に検討した。5、10週齢のラットヒラメ筋の近位部、筋腹部、遠位部から単一筋線維を作成し(5週齢1772本、10週齢1341本)、MHC発現の部位差について検討した。さらに、近位部と遠位部について厚さ10μmの連続横断切片を200枚作成し、myofibrillar ATPase染色による組織化学的検討も行った。その結果、発現するMHCはIやIIaに加えIIdや新生児型のMHCも発現している筋線維が観察され、5週齢9種類、10週齢7種類のパターンが観察された。各部位で複数のMHCが混在する筋線維の比率は、遠位部(5週齢;36.2±8.1%、10週齢;27.7±4.5%)、筋腹部(5週齢;38.5±7.9%、10週齢;22.4±7.2%)、近位部(5週齢;26.7±7.8%、10週齢;19.6±2.7%)であり、近位部に比べ5週齢では遠位部と筋腹部で、10週齢では遠位部で有意(P<0.05)に高値であった。組織化学的に分類されたTypeI線維比は、遠位部(5週齢;60.6±2.3%、10週齢;71.3±0.8%)に比し近位部(5週齢;64.5±1.6%、10週齢;73.5±3.0%)で有意(P<0.05)に高い値であった。また、いずれの部位ともTypeI線維比率は、10週齢に比し5週齢の方が有意(P<0.05)に低い値であった。さらに、TypeIICと分類された筋線維の染色強度は、各部位とも一様ではない筋線維が多く観察された。本研究の結果は、ラットヒラメ筋の単一筋線維中にはミオシン重鎖分子種が混在する筋線維が多く観察され、さらにその程度は、週齢や筋の部位によって異なることを示す。本研究は正常ラットの骨格筋から得た単一筋線維中に異なったミオシン重鎖分子種の混在する筋線維が存在するかどうかまたどの程度存在するかについて生化学的、組織科学的に筋の部位毎に検討することを目的とした。10週齢の雄ラットヒラメ筋の近位部、腹筋部、遠位部から1341本の単一筋線維を作成し、ミオシン重鎖分子種(MHC)の発現の部位差について検討した。さらに、近位部と遠位部について厚さ10μmの連続横断切片を200枚作成し、myofibrillar actomyosin ATPase染色による組織科学的検討も行った。その結果、発現するMHCはIやIIaに加えIIdや新生児型のMHCも発現している筋線維が観察され、7種類のパターンが観察された。

各部位で2種類以上のMHCが混在する筋線維の比率は、遠位部(27.7±4.5%)、筋腹部(22.4±7.2%)、近位部(19.6±2.7%)であり、遠位部は近位部に比べ有意(P<0.05)に高値であった。また、組織化学的にType IIcと分類された筋線維の染色強度(Optical Density;OD)は各部位とも末梢側の方が高くなる(Type IIc-Type I、Type IIa→Type IIc)筋線維が多く観察されたが、中にはODが低くなる線維も見られた。ラットヒラメ筋は、発育に伴いType IIa線維比が減少しType I線維比が増加することが知られている。本研究の結果は、発育時に見られるラットヒラメ筋の筋線維タイプの移行は筋全体で一様に起こるものではないことを示唆する。5週齢の雄ラットヒラメ筋の近位部、筋腹部、遠位部から1772本の単一筋線維を作成し、ミオシン重鎖分子種(MHC)の発現の部位差について検討した。さらに、近位部と遠位部について厚さ10μmの連続横断切片を200枚作成し、myofibrillar actomyosin ATPase染色による組織化学的検討も行った。その結果、発現するMHCはIやIIaに加えIIdや新生児型のMHCも発現している筋線維が見られ、9種類のパターンが観察された。各部位で2種類以上のMHCが混在する筋線維の比率は、遠位部(36.2±8.1%)、筋腹部(38.5±7.9%)、近位部(26.7±7.8%)であり、遠位部と筋腹部は近位部に比べ有意(P<0.05)に高値であった。また、いずれの部位とも2種以上のMHCが混在する筋線維の比率は、前回報告した10週齢に対し5週齢の方が有意(P<0.05)に高い値であった。組織化学的に分類されたType I線維比は、遠位部(60.6±2.3%)に近位部(64.5±1.6%)で有意(P<0.05)に高い値であった。また、いずれの部位ともTypeI線維比率は、10週齢に比し5週齢の方が有意(P<0.05)に低く、Type IIa線維比は有意(P<0.05)に高い値であった。さらに、Type IICと分類された筋線維の染色強度(Optical Density;OD)は各部位とも一様ではない筋線維が多く観察された。以上の結果は、発育時に見られるラットヒラメ筋の筋線維タイプの移行は筋全体で一様に起こるものではなく、近位部の方から筋線維タイプの移行が起こることを示唆する。
別棟増築型小学校における現存校舎のマネジメント評価と長期更新手法に関する研究

大都市郊外の小学校では、高度成長期の児童数増加に伴い分棟校舎が増築されており、現在は建設年数の異なる複数の校舎で構成されている。児童数が減少し、最古校舎が更新時期を迎える中で、その建替えは将来の校舎の全体像を考慮しながら進める必要がある。そこで、本研究は別棟増築型小学校を対象に、1既存校舎の整備および教室転用等の利活用プロセス、2現在の教室利用と教室移動の特性を解明し、現存校舎を施設マネジメントの視点から評価する。さらに、学級教室配置と施設複合化を考慮した段階的な校舎更新モデルを提示し、更新手法として一般化する。
マイクロ・ナノ医療デバイス実装技術

人工臓器、バイタルセンサなど、小ささを活かした体内留置もしくは装着型デバイスなど、医療分野へのマイクロ・ナノ工学の大きな貢献が期待されている。しかし実用化に至った例は少ない。そこで我々は、実用化へのミッシングリンクとして、マイクロ・ナノ医療デバイスの実装技術を提言した。具体的には、デバイスと生体間の「界面」そして、治療法やUIまでを含んだ「システム」に関する技術である。本研究期間において、インプラント人工腎臓と、微小針電極を用いた脳波計測システムを例にとり、界面技術としての表面処理技術や評価方法、血管との接続機構から治療法、デバイス固定方法まで、実装技術を網羅的に抽出し、体系化した。本研究では、その小ささ、スケール効果を生かしたマイクロ・ナノ医療デバイスを実用化するための実装技術を、生体・デバイス間の界面、ならびにシステムの2点について実験的に調査し、体系化することを目的としている。平成28年度は、具体的には、ナノ多孔質ポリマ膜と金属マイクロ流路を積層した、インプラント人工透析装置を研究対象とし、その血液成分とのインタラクション、ならびに腎不全ラットを用いたin vivo実験による治療方法の検討を行った。まず血液成分とのインタラクションでは、電解エッチング、放電加工、機械加工など異なる加工方法により形成した金属表面上への血液成分の付着について評価を行った。表面粗さが小さいほど、血液成分の付着が低減できることが実験的に明らかになった。その成果を国内学会で発表、特許申請を行った。次に腎不全ラットを用いたin vivo実験について、ラット頚動脈ならびに大腿静脈をデバイスに接続する手術プロトコルを確立し、5時間の透析実験を行った。腎不全ラットは腎臓への血管を結紮している。人工透析装置は、透析液を用いない血液濾過モードでの実験である。その結果、濾液が血液成分と同じであり、かつアルブミンの流出は防がれていることが明らかになった。想定した濾液量が確保され、これは層数を変化させても同じであった。腎不全ラットにデバイスを接続しない場合は、クレアチニン濃度は単調に増加したが、デバイスを接続することによりクレアチニンの増加を大幅に低減できた。以上の成果を国際論文誌で発表した。ラットを用いたin vivo実験が順調に進み、デバイス性能評価が行え、かつ想定したとおりの性能を有することが明らかになった。平成28年度は、まずインプラント人工透析装置について、血液成分の流路壁面への付着について、流路形状ならびに加工方法に由来す表面粗さに注目し、実験的に解析した。よどみのない流路形状が最も血液付着が少なく、また表面粗さが小さい方が同じく血液付着が小さいことが明らかになった。生体適合性ステンレス材料に関して国際論文誌に投稿、採択されるとともに、材料をチタンに変更し、その加工方法、表面粗さ、表面への血液成分付着について検討を行った。平成27年度は、麻酔下のラットを用いたex vivo実験により、血液濾過を用いるインプラント人工透析装置の有効性を示した。しかし、麻酔下のラットでは、麻酔薬の摂取量により5時間程度の実験が限度である。そこで、平成28年度は覚醒下ラットでの実験を行うために、手術手法について検討し、プロトコルをほぼ確定させた。平成29年度において、覚醒下ラットを用いた週単位の中期実験を行い、生体・装置界面ならびに、システムの有効性を検証する。また、血液凝固には血小板が重要な役割を担っている。そこで、人工透析装置へ血液を導入する前段に、流体的に血球成分と血漿成分を分離する機構を考案し、検討を行った。10%から20%血球成分を減少させた状態で、人工透析装置へ導入することで、血液凝固を低減し、装置の使用可能年数を伸ばすことができると考えている。本技術に対して、国際シンポジウムで発表するとともに、特許出願を行った。平成28年度は、平成29年度のイヌを用いた長期実験に向けての下準備を整えることができた。まず、ラットに関しては覚醒下ex vivo実験に向けて、手術、実験プロトコルを確立した。実験中にラットがチューブを触らないように、血管、血管との接続部についての検討を実験的に行うことができた。In vitro実験は継続しており、特に、血球成分と血漿成分比を変える流体システムを取り付けた系を新たに確立した。本系により、血液凝固における血球成分の影響を評価することができる。国際論文誌、国際学会、国内学会での発表に加え、特許を1件申請しており、研究の進展度は概ね想定通りといえる。本研究では、その小ささ、スケール効果を活かしたマイクロ・ナノ医療デバイスを実用化するための実装技術を、生体・デバイス間の界面、ならびにシステムの2点について実験的に調査し、体系化することを目的としている。特に、透析患者のQOLを格段に改善するインプラント人工透析に関する研究に注力した。平成29年度は、まず、覚醒ラットへの抗凝固剤の最適投与量、タイミングを実験的に導出した。これにより、短期実験による血管と人工血管、人工血管と装置の界面における血液凝固を、ex vivo実験により詳細に検討できるようになった。また、将来的な装置の交換手術を簡易にするために、2本の人工血管の端面を裏返しにし、押し付けて接続、固定する機構を開発した。これにより、血液は生体適合性の高い人工血管内壁にのみ接触する。

接続部に段差が生じることによる血液凝固への影響について、in vitro実験により評価を行い、短期間においては問題がないことが明らかになった。今後、in vivo実験により、より長期の安定性について評価する。この成果を1件の国内学会で発表、2件の国際学会で発表予定、また1件の特許出願を行った。次に、装置の長期安定性に向け、透析膜への表面処理について検討を行った。まず、フッ素添加のダイアモンドライクカーボン(f-DLC)を透析膜に被覆した。親水処理により、膜の透水性は確保できたものの、f-DLCの成膜プロセス中に透析膜が破壊されてしまった。次に、生体適合性が高いMPCポリマの成膜を行い、in vitro実験により評価した。その結果、成膜量と透析性能の関係が実験的に明らかになり、良好な結果が得られた。最後に、イヌを用いた中期動物実験において、2週間の装置インプラントおよび取り出しに成功した。透析治療を行うまでは至っていないが、長期動物実験に向けた、界面ならびにシステムに関する知見が十分に得られた。人工臓器、バイタルセンサなど、小ささを活かした体内留置もしくは装着型デバイスなど、医療分野へのマイクロ・ナノ工学の大きな貢献が期待されている。しかし実用化に至った例は少ない。そこで我々は、実用化へのミッシングリンクとして、マイクロ・ナノ医療デバイスの実装技術を提言した。具体的には、デバイスと生体間の「界面」そして、治療法やUIまでを含んだ「システム」に関する技術である。本研究期間において、インプラント人工腎臓と、微小針電極を用いた脳波計測システムを例にとり、界面技術としての表面処理技術や評価方法、血管との接続機構から治療法、デバイス固定方法まで、実装技術を網羅的に抽出し、体系化した。in virto実験期間を90日まで延長し、金属流路表面、透析膜表面への血液成分の付着について評価する。特に血液への抗凝固剤や、抗血小板剤などを添加した場合の生体膜形成について実験的に評価する。壁面加工方法を含めたデバイス設計を確定し、中型動物実験の準備に入る。手術を含めた実験プロトコルの確立を行う。実用化に向けた評価項目、ならびにその評価手法を網羅できるよう綿密な検討を行う。平成28年度に確立したプロトコルに基づき、覚醒下ラットを用い週単位の中期ex vivo実験を遂行する。これにより、装置と生体(血液)との界面に関してより詳細に検討、生体物質の付着と透析性能の推移を実験的に検証する。また、実装技術のもう一つのシステムに関して、特に装置と人工血管との接続機構について開発を行い、特許を申請するとともに、国際論文誌に投稿する。In vitro系でもヒト血液を用いた長期実験を行うことで、特に血球成分、血漿成分比による装置性能の変化を評価する。インプラント透析システムに限らず、マイクロ・ナノ工学が真価を発揮する小型、インプラント型の人工臓器に対して有効なアプローチであることを証明する。最終的に、イヌ長期実験を行う。
シガトキシン右半球の合成とイオンチャネルに対する結合活性

シガトキシン類は南方海域で起こる食中毒シガテラの主要原因毒として構造が明らかにされたポリエーテル化合物であり、その特異な構造と極めて強力な活性から、現在最も注目されている海洋天然物の一つである。シガトキシンの極めて強力な毒性は、細胞膜の電位依存性ナトリウムチャネルの特異的部位に結合してチャネルを強力に活性化することにより発現するとされている。しかし、その特異的結合に要求される化学構造上の要因に関しては十分な理解が得られていない。本研究では、シガトキシンのナトリウムチャネルに対する高い親和性に必要な構造要因を明らかにすることを目的とした。すなわち、シガトキシン右半球に相当するGM環部分およびその類縁体の合成を行い、ナトリウムチャネルに対する結合活性の構造活性相関を行い、シガトキシン右半球に集中する官能基の結合活性に対する寄与を明らかにすることを目的とした。1.シガトキシンGH環部の立体選択的合成:GH環部合成において、G環上の水酸基の導入とそれに隣接する四級炭素の構築が合成上の問題点となる。糖質化合物を出発原料にして、不斉ヒドロキシル化反応と分子内7-endo選択的エポキシ開環反応によるG環構築を鍵反応として、GH環部フラグメントの立体選択的合成に成功した。2.GM環部モデルの合成:すでに立体選択的合成法を確立しているJKLM環部フラグメントから、F環を6員環としGHI環上の置換基を省略したFM8環性モデル化合物の合成を行った。3.ナトリウムチャネルに対する結合活性評価:シガトキシンの結合性が確立されているラット脳シナプトソームへのトリチウム標識ブレベトキシンを用いた結合阻害実験において、2.で合成したGM環部モデルフラグメントによる結合阻害はμMの濃度では観測されなかった。
腐生菌と菌根菌の比較生物地理:ヒメツチグリ目の起源と進化を探る

菌根菌に宿主植物の存在が必須であるのに対し、腐生菌の場合はそうではない。そのため、偶然に胞子が分散した先に適当な栄養分さえあれば、十分に定着する可能性がある。本研究では腐生菌の代表としてヒメツチグリ属を対象とし、近縁の菌根菌であるヒステランギウム類の生物地理パターンと比較した。その結果、腐生菌では南北両半球間の分散と定着が、菌根性のものに比べて頻繁に起こっていることが示唆された。標本庫を通じた標本入手:日本(国立科学博物館、北海道大学、千葉県立中央博物館)および海外(タイ、アメリカ、イギリス、スウェーデン、中国、オランダ、デンマーク、ベルギー、オーストラリア、アルゼンチン)の各地における標本庫・共同研究者より、対象分類群の標本をタイプ標本も含め計約500点入手した。この中にはアフリカ、エクアドルなど、これまでヒメツチグリ属の報告がきわめてまれな地域の標本も含まれる。この大部分はDNA用に利用する許可を得ているため、全世界的なサンプリングが可能になった。野外調査:日本各地(北海道、鳥取、岩手)および海外(ハワイ)における野外調査を行い、計約200点のサンプルを得た。特にハワイにおいては15種を確保することができた。これは現地から報告されているほぼ全種をカバーするものであり、ハワイにおけるヒメツチグリ属の起源がどこにあるのかを解析するために貴重なサンプリングである。その他、別プロジェクトを通じて行った野外調査により、日本各地および海外(タイ、台湾、ニュージーランド、アルゼンチン)より新鮮な状態のヒメツチグリ属サンプルを入手することができた。これらはすべてDNA用保存用のバッファーとともに保管されており、次年度以降のDNA研究に用いられる予定である。DNAデータ:今年度および以前に得られたサンプルのうち、約100点からはすでにDNAを抽出した。そのすべてにおいて菌類のDNAバーコーディングマーカーである核ITS領域の塩基配列を決定済みである。野外調査:日本各地および海外(カメルーン、オーストラリア、スウェーデン、スペイン、中国、ニューカレドニア)で野外調査を行い、計約150点の関連属菌のサンプルを得た。日本国内のサンプルについては、特に小笠原諸島父島および母島より計44点のサンプルを採集した。日本国内から記載されているヒメツチグリ属菌のうち小笠原産の種は大半が固有種と考えられており、生物地理を考察するうえで重要なサンプルである。その他沖縄から13点のサンプルを採集した。同じ離島からのサンプルであるが、大陸島である沖縄と海洋島である小笠原の菌は起源が異なると考えられる。海外調査ではカメルーンで30点の標本を得た。この中には日本に分布するものと共通種とされているものも多いが、DNAレベルでは明確に別種とすべきものも多く含まれていると考えられる。熱帯アフリカ産菌類と他地域の菌類の生物地理学的な関係については現在解析中である。ヨーロッパはタイプ産地が多く含まれることから、分類学的な考察をするうえで重要な地域である。今回の調査ではスウェーデンでTrichaster melanocephalusを9個体採集することができた。現在までのところ本種とヒメツチグリ属菌の関係については不明であり、本研究によって初めてDNAが解析されることになる。また、ニューカレドニアでは新種のSclerogaster属菌を採集した。新種記載については現在準備中である。DNAデータ:上記で採集された標本全点からすでにDNAを抽出し、菌類のバーコーディングマーカーである核ITS領域の塩基配列を決定した。また、複数種について特にエリマキツチグリ近縁種を集中的にサンプリングし、核ITSのほか核LSU,SSU,RPB2,atp6の複数遺伝子の塩基配列で解析した結果、エリマキツチグリ様の形態を持つ種の非単系統性が示された。この結果は複数の学会にて発表した。野外調査:日本各地のみで野外調査を行い、計約100点の関連属菌のサンプルを得た。日本国内のサンプルについては、特に小笠原諸島父島および母島より計30点のサンプルを採集した他、琉球列島(西表島、沖縄島、石垣島)より22点、大東諸島(南大東島)より10点のサンプルを採集した。海外調査は行わなかったが、共同研究者より提供された標本を基に形態観察とDNA実験を行った。熱帯アフリカ産菌類と他地域の菌類の生物地理学的な関係については現在さらなる解析を行っている。前年度の調査で採集されたスウェーデン産のTrichaster melanocephalusからDNA塩基配列を決定し系統解析を行ったところ、ヨーロッパ産のGeastrum triplexとほぼ同一の配列を示した,この結果は学術論文として出版された。

DNAデータ:上記で採集された標本全点からすでにDNAを抽出し、菌類のバーゴーデイングマーカーである核ITS領域の塩基配列を決定した。また、複数種について特にエリマキツチグリ近縁種を集中的にサンプリングし、核ITSのほか核LSU,atp6の複数遺伝子の塩基配列で解析した結果、エリマキツチグリ様の形態を持つ種の非単系統性が示された。この結果は複数の学会にて発表した他、学術論文として出版された。
創傷治癒モデルを用いた口蓋裂術後瘢痕形成を抑制する薬剤的アプローチ

唇顎口蓋裂患者では、口唇形成術、口蓋形成術の術後瘢痕組織の収縮が上顎骨の劣成長や上顎歯列弓の狭窄を引き起こすなど、上顎の成長発育に対して抑制的に働くことが知られている。また、創傷治癒過程において、TGF-β1を介した線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化は瘢痕の収縮をきたすことが報告されている。本研究では、創傷治癒過程における線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化メカニズムを検討し、薬剤的なアプローチにより瘢痕形成の抑制を行うことを目的とした。その結果、TGFβタイプI受容体阻害薬が創傷治癒過程における線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制し、瘢痕収縮を抑制する可能性が示唆された。創傷治癒過程においてTGF-β1を介した線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化が瘢痕の収縮をきたし、その分化には上皮ー結合組織の細胞間の相互作用が関与していると報告されている。本研究では、薬剤的なアプローチにより創傷治癒過程における瘢痕形成の抑制を行うことで、組織の恒常性を回復するような治療法の可能性を検討することを目的としている。そこで、我々はラット背部皮膚から採取した上皮細胞および線維芽細胞から構成される三次元細胞培養系を作成し、この三次元細胞培養系を用いてTGF-β3ならびにbFGFが線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化メカニズムに及ぼす効果と、TRPV4チャネルの関連性について検討している。現在、TGF-β3、bFGFならびにTRPV4チャネル拮抗薬が線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化に及ぼす効果をみるために、α-SMA発現を指標とした生化学的および免疫組織学的解析を行っているところである。健全な皮膚の維持や瘢痕形成には上皮ー結合組織間の相互作用が関与している。創傷治癒過程における線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化が瘢痕の収縮をきたし、その分化にはTGF-β1などの成長因子や周囲組織より受ける張力が関与していると報告されている。そこで、我々はラット背部皮膚から採取した上皮細胞および線維芽細胞から構成される三次元細胞培養系を作成し、この三次元細胞培養系を用いてTGF-β1の阻害剤が線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化メカニズムに及ぼす効果や、メカニカルストレスが筋線維芽細胞への分化に及ぼす影響ならびに筋線維芽細胞の収縮の解析として三次元培養コラーゲンゲルの収縮について検討した。その結果、TGF-β1の阻害剤が筋線維芽細胞の分化マーカーであるα-SMAの発現を抑制した。免疫染色法より、周囲組織から受けるメカニカルストレスを取り除いた環境下では、α-SMA陽性細胞が減少する傾向が認められた。また、TGF-β1の阻害剤によりコラーゲンゲルの収縮が抑制される傾向が認められた。このことから、TGF-β1の阻害が線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制する可能性が示唆された。今後の課題としては、b-FGFやTGF-β3など他のサイトカインによる瘢痕抑制効果や、機械的刺激により活性化されるカルシウム透過性チャネルのTRPチャネルの関連性についての検討を行っていく予定である。TRPV4チャネルに関しては、その発現の再現性が得られていないものの、当初の計画通りのin vitroの実験系の確立は行えているので。27年度が最終年度であるため、記入しない。歯科矯正学ラット瘢痕治癒モデルを用いたin vivoでの実験系を用いて、これまでのin vitroの実験系から得られた知見との対応付けを行う。実験動物として、生後20日齢雄性Wistar系ラットを用いる。control群(無処置)、sham群、TGF-β1投与群、TGF-β3投与群、bFGF投与群、TRPV4拮抗薬投与群の6群を設定し、生体吸収性ハイドロゲルに使用薬剤を含浸させて創部へ填入する。無処置(0日目)、または処置後3、7、14、あるいは21日目において標本を摘出し、形態学的ならびに生化学的に瘢痕組織の状態を評価することでTGF-β3、bFGFならびにTRPV4拮抗薬などを用いた薬剤的アプローチの瘢痕形成抑制の有効性を検証する。
糖鎖合成系酵素遺伝子群の発現モードと多型性の解析に基づく疾患病態の解明

複合糖質の糖鎖の多様性は、複雑な生命現象に深く関与している。近年の糖鎖合成酵素遺伝子群の単離とその操作実験は、具体的な生命過程における個々の糖鎖構造の意義を明らかにしつつある。本研究では、(1)糖鎖合成酵素遺伝子の多型性の同定と変異遺伝子の機能およびその疾患との関連の解析、(2)各種癌と正常組織における糖鎖合成酵素遺伝子の発現プロファイルのDNAチップによる検討とデータベースの作成により、糖鎖と発癌、病型、予後、薬剤感受性等との関連を明らかにする。(1)糖鎖合成酵素遺伝子の多型性解析については次のような結果を得た。単離したα1,4-ガラクトース転移酵素はGb3/CD77および血液型P^k合成酵素であり、大腸菌O157の毒素受容体である。p型(P^k-)における本遺伝子の変異を検討した結果、日本人でP251L、W261stop、スエーデン人でM183K、G187Dと、両国間で異なった変異が同定され、変異遺伝子の機能消失が確認された。missense変異部位は異種間で保存されていた。β1,4-galactosyltransferase VII(XGal-T1)はC.エレガンスsqv3のヒトホモローグであるが、Ehlers-Danlos症候群早老型患者の遺伝子変異を検討し、2種の機能喪失(または低下)変異を同定した。(2)糖鎖合成酵素遺伝子の発現プロファイルについては、糖転移酵素遺伝子チップの作成の為、約120種のヒト糖鎖合成酵素遺伝子の同定とクローン収集および塩基配列の確認を進めてきた。また、PCR産物のスポッテイングと検出法などの基礎的検討を進めている。
家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物の共通機構の解明と新規原因遺伝子の同定

遺伝性パーキンソン病(FPD)の病態には共通してドパミン反応性パーキンソニズムがある。従って共通した機構が存在していることが予想される。現在、孤発型PDと鑑別が依然これら遺伝子産物の詳細な機能は不明である。本課題ではparkinとPINK1の相互作用を検討し、両分子はミトコンドリア外膜で会合し、parkinはPINK1の安定性に関与していることが分かった。またFPDにおいては半数以上が、原因遺伝子が不明であり、新規原因遺伝子座を決定した。パーキンソン病(PD)の発症機序の解明に、単一遺伝子異常に伴う遺伝性パーキンソン病の遺伝子産物の機能からその全貌を明らかにすることを本課題の目標としている。現在のところ6個の原因遺伝子が同定されている。既にα-synucleinやparkinが脂質ラフトに局在していることが明らかにされている。脂質ラフトは、リン酸化など様々な反応の場として注目されている。本課題の成果として、Park8の遺伝子産物Lrrk2もまた脂質ラフトに局在していることが明らかにされた。共通機構として脂質ラフトの関与が推定される。更にPark9の遺伝子産物ATP13A2の変異解析を行い、わが国もPark9の表現型を持つ家系が存在することが明らかにされた。その機能解析では、タンパク分解系のautophagy-lysosomal pathwayに関わっていることが予想されている。我々が見出した変異は点変異であるが、変異型ではER内に留まっており、1ysosomeに移行できないことが,loss-of-function効果によるものと推定された。遺伝形式が劣性遺伝性であることよりER stressによるものは考えにくく、局在の変化が重要であると考えられた。ParkinとPINK1に関しては、parkinがPINKIの安定性に関わっていることが推定された。これはparkin変異患者剖検脳でもノックアウトマウスによる検討でも再:現された。Parkinの存在下では、PINK1のユビキチン化が抑制され、PI甑1のタンパク分解の遅延がおこることが予想された。これらの知見から遺伝子産物が共通カスケードを形成していることが予想された。一方、新規遺伝子探索に関しては晩発生PDの連鎖解析を行っており、遺伝子座と候補遺伝子を2つまでに絞り込んでいる。またアジア人特有のSNPも同定しており、危険因子も人種により異なることが推定された。パーキンソン病は多様性の高い疾患と言える。患者の殆どは家族歴のない孤発型である。しかしながら、最近単一遺伝子異常に伴う遺伝性パーキンソン病の病態が孤発型パーキンソン病の病態に直接的にリンクすることが推定されている。我々の研究室には約1900例のDNA検体があり、新規遺伝子の単離を目指して解析している。常染色体劣性遺伝性パーキンソン病を示す4家系について連鎖解析を行い、遺伝子座を決定した。一方、既知の遺伝子については詳細な検討を進めており、parkinとPINK1が共通機構を形成している可能性を見出した。ParkinとPINK1はミトコンドリア外膜に局在し、ミトコンドリアの機能を保持している可能性が分かった。またparkinは、PINK1と結合することで安定性に寄与していること示した。正常型Parkinは正常型PINK1の安定性に関与するが、変異型に関しては安定性機構を示さなかった。Parkin, PINK1変異型を示す患者は臨床的にも類似性が高いことから、両遺伝子産物が共通機構を示すことは重要な所見と言える。また機能解析では頻度こそ低いがDJ-1の機能解析も行っている。DJ-1の正常局在は細胞膜に存在していることが分かった。特にトランスフェリンと共局在することを示した。更にその局在は変異型だと膜との結合が劣化することが分かった。そして特にDJ-1の多量体形成に必須なアミノ酸部位を別のアミノ酸に置換すると膜への結合が著しく低下した。DJ-1の正常機能発現のためには膜への局在が必要と考えられた。Parkin, PINK1, DJ-1ともに若年発症の劣性遺伝性パーキンソン病の変員遺伝子であり、遺伝子改変モデルはドパミンの遊離低下など共通機構を示している。おそらくDJ-1もparkin, PINK1と共に共通機構を示していると推定される。これら共通機構が明らかにされれば、新規治療戦略も現実味を帯びてくる。
熱応答性磁性ナノ粒子を用いたクリプトスポリジウム遺伝子の高感度検出法の開発

我々はアビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子(Thermoresponsive magnetic nanoparticle: TMNP)とCryptosporidium parvumに特異的なビオチン化モノクローナル抗体を用いてオーシスト回収用の熱応答性免疫磁性ナノ粒子(Thermoresponsive immunomagnetic nanoparticle: TIMNP)を開発した。また、クリプトスポリジウムのオーシストから核酸を抽出する界面活性剤抽出処理(Surfactant extraction treatment: SET)とTIMNPの併用法(TIMNP-SET法)を用いたオーシスト18S rDNAの検出に成功している。平成29年度は、TIMNP-SET法を用いて河川水からのC. paruvumオーシストの回収およびDNAの検出条件を検討した。オーシストDNAの検出には、クリプトスポリジウム18S rDNAに特異的なプライマーセットとTaqManプローブを用いた。TIMNPの粒子濃度は4 mg/mLに調整した。C. parvumDNAとTIMNPを含む試料水に陰イオン界面活性剤SDS(終濃度0.1%)を添加した後、加熱処理(90°C、15分間)で核酸を抽出し、加熱処理後のTIMNPがリアルタイムPCRに及ぼす影響を評価した。その結果、TIMNP濃度1%由来のPCR阻害はTween20添加では抑制されないが、SDS処理のみで抑制されることがわかった。また、蒸留水750 μLにオーシスト100000個を添加してクリプトスポリジウム汚染水を調製し、TIMNP-SET法を用いてオーシストの回収およびリアルタイムPCR法によるDNAの検出感度を評価した。その結果、PCR試薬中のTIMNP濃度が1%でもPCR阻害が抑制され、オーシスト由来DNAを高感度に検出できることが確認された。我々はこれまでに界面活性剤のみを用いてクリプトスポリジウムのオーシストから核酸を抽出する界面活性剤抽出処理(Surfactant extraction treatment: SET)法を確立している。平成28年度は、アビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子(Thermoresponsive magnetic nanoparticle: TMNP)とCryptosporidium parvumに特異的なビオチン化モノクローナル抗体を用いてオーシスト回収用の熱応答性免疫磁性ナノ粒子(Thermoresponsive immunomagnetic nanoparticle: TIMNP)を作製し、オーシストの回収およびリアルタイムPCR法によるDNAの検出感度を評価した。DNAテンプレートを用いてTIMNPによるPCR増幅阻害を評価した結果、TIMNP(4mg/mL)の添加濃度0.5%でPCRを阻害した。しかし、その阻害は非イオン界面活性剤Tween20を添加することによって抑制できることが明らかになった。また、TIMNPとSETを併用したオーシストからのC. paruvum DNAの検出条件を検討した。オーシストが結合しているTIMNPを含む試料水に陰イオン界面活性剤SDS(終濃度0.1%)を添加した後、加熱処理(90°C、15分間)で核酸を抽出し、加熱処理後のTIMNPがリアルタイムPCRに及ぼす影響を評価した結果、TIMNP存在下でもTween20の添加によってPCR阻害が抑制され、18S rDNAを検出できることが確認された。計画どおりに研究を進めることができた。前年度に購入した核酸増幅関連試薬の一部を今年度に使用することができたため、今年度使用額は予定よりも少なくなった。補助事業の目的をより精緻に達成するための追加実験の実施や学会参加、論文投稿に使用する予定である。
根を対象とした3次元電場計測システムの開発

本システムは,3次元振動電極プローブ部,3次元プローブ走査系,新規購入したコンピュータ,既存設備であるロックインアンプを主たる構成要素とする.以下に,各開発要素の概要を示す.(1)振動電極プローブ電場ベクトルの3次元計測を可能とするため,電極先端部を3次元的に振動させる必要がある.本研究においては,いくつかの振動方法を検討の結果,水平面内における円軌道と上下振動を時分割で組み合わせる方式を採用した.まず,隣接する2辺をバイモルフ型の圧電アクチュエータ,残りの2辺をチタン製のリボンによる正方形リンク構造により水平面内での電極部の円軌道を実現した.さらに,本構造全体を積層型の圧電アクチュエータにより上下に振動させる構造とすることにより,電極部先端部を3次元で振動させることを可能とした.本プローブにより,振動周波数は80130[Hz](振動系の固有振動数に依存),圧電アクチュエータに1000[V_<p・p>]印加した場合,約50[μm]の振幅が得られることを確認した.(2)3次元プローブ走査系とソフトウェアまず,直径450[mm]回転テーブル上に上記プローブ,高さ方向,半径方向移動装置を設けて円筒座標系による走査系を構築し,さらに,これらをXYテーブルに搭載する構成とした.回転テーブルは,ド-ナツ形状となっており,その中心部に根を設置した水耕容器が設置される.また,すべての駆動部がコンピュータにより制御可能で,回転テーブルに搭載された2台のCCDカメラ画像より,根の形状や位置を画像処理により自動検出し,根の複雑な形状とその経時変化に追従して,電極先端部の衝突や,干渉を回避することを可能とする実験ソフトウェアを開発した.以上を統合することにより,根を垂直に静置した状態で,任意の高さにおいて,根の軸を中心とする極座標での3次元電場計測システムの構築に成功した.本システムは,3次元振動電極プローブ部,3次元プローブ走査系,新規購入したコンピュータ,既存設備であるロックインアンプを主たる構成要素とする.以下に,各開発要素の概要を示す.(1)振動電極プローブ電場ベクトルの3次元計測を可能とするため,電極先端部を3次元的に振動させる必要がある.本研究においては,いくつかの振動方法を検討の結果,水平面内における円軌道と上下振動を時分割で組み合わせる方式を採用した.まず,隣接する2辺をバイモルフ型の圧電アクチュエータ,残りの2辺をチタン製のリボンによる正方形リンク構造により水平面内での電極部の円軌道を実現した.さらに,本構造全体を積層型の圧電アクチュエータにより上下に振動させる構造とすることにより,電極部先端部を3次元で振動させることを可能とした.本プローブにより,振動周波数は80130[Hz](振動系の固有振動数に依存),圧電アクチュエータに1000[V_<p・p>]印加した場合,約50[μm]の振幅が得られることを確認した.(2)3次元プローブ走査系とソフトウェアまず,直径450[mm]回転テーブル上に上記プローブ,高さ方向,半径方向移動装置を設けて円筒座標系による走査系を構築し,さらに,これらをXYテーブルに搭載する構成とした.回転テーブルは,ド-ナツ形状となっており,その中心部に根を設置した水耕容器が設置される.また,すべての駆動部がコンピュータにより制御可能で,回転テーブルに搭載された2台のCCDカメラ画像より,根の形状や位置を画像処理により自動検出し,根の複雑な形状とその経時変化に追従して,電極先端部の衝突や,干渉を回避することを可能とする実験ソフトウェアを開発した.以上を統合することにより,根を垂直に静置した状態で,任意の高さにおいて,根の軸を中心とする極座標での3次元電場計測システムの構築に成功した.
肝細胞癌における不死化酵素の発現とその制御

研究業績の概要慢性肝炎から肝硬変患者に合併した肝細胞癌およびその前癌病変と考えられる肝内限局性病変を対象として針生検により標本を採取した。非癌部より採取された標品においてはテロメラーゼ活性は認められなかった。一方、腫瘍マーカーおよび画像診断より典型的な肝細胞癌と診断された症例から採取された標品においてはテロメラーゼ活性が認められ、肝細胞癌が疑われたが、組織学的に前癌病変と診断された症例では弱いながらも活性が認められる傾向にあった。これらのことより、肝細胞癌はその癌化過程において本酵素活性を獲得し、癌化が進むに従って活性が高まることが確認された。本検討では、得られた肝細胞癌の組織学的分化度が高分化型が大部分であったため、悪性度により酵素活性が変化することは明らかにされなかった。この点に関しては今後さらなる症例の追加により検討が必要であると考えられた。また、慢性肝炎から肝硬変への進展において本酵素活性の変化により発癌の潜在性が高まるか否かに関しては、高感度測定系の確立により検討する課題であると考えられた。研究業績の概要慢性肝炎から肝硬変患者に合併した肝細胞癌およびその前癌病変と考えられる肝内限局性病変を対象として針生検及び手術切除により標本を採取した。現在これらの標品におけるテロメラーゼ活性の測定を行っており、微量の標品におけるテロメラーゼ測定系を確立しつつある。(3)臨床検査成績と酵素活性との関係に関する検討肝細胞癌の組織学的分化度及び各種腫瘍マーカーや画像診断所見等の臨床検査成績とテロメラーゼ活性との関係を検討している。
骨格筋細胞における代謝変換誘導因子の探索

骨格筋は肥大・萎縮をする可塑性と共に,筋線維タイプ(遅筋・速筋)変換能を有し,それらは関連すると考えられるが,詳細なメカニズムは明らかではない.本研究では,全ての筋線維タイプを蛍光蛋白で識別できるマウス筋細胞を用いて,筋線維タイプ変換を惹き起こす生体内因子・薬剤を網羅的に探索した.その結果, in vivo及びin vitroで遅筋線維,或は速筋線維を誘導する因子を複数同定した.さらに遅筋化が進行する老齢マウスに対して速筋誘導因子を投与した結果,筋萎縮の予防・運動機能および筋代謝機能改善を認め,速筋誘導因子は加齢性筋萎縮を予防・改善効果がある可能性が示唆された.骨格筋は肥大・萎縮をする可塑性を有すると共に、質的な可逆変化つまり筋線維タイプ(遅筋・速筋)とそれに伴う代謝変換能(酸化系・解糖系)を有する。各種運動による筋肥大時、或は加齢や不活動に伴う筋萎縮の過程でも筋線維タイプ変換が生じるが、詳細なメカニズムは明らかではない。本研究では、全ての筋線維タイプを蛍光蛋白で生きたまま識別することができるマウスを用いて、筋線維タイプ変換を惹き起こす生体内因子・薬剤を網羅的に探索し、骨格筋線維タイプ変換メカニズムを明らかにする。さらに筋線維タイプ変換誘導因子を用いて加齢や不活動による筋萎縮に対する予防・治療法開発を目的とした。本年度は、作成したマウス由来の培養筋管細胞に対して、約100種類の生体内因子・薬剤を添加し、遅筋線維(Type I)あるいは速筋線維(Type IIb)を誘導する因子を複数同定した。筋線維タイプの変換は、定量PCRを用いたMyHC遺伝子発現(遅筋: MYH-7,速筋: MYH-2, -1, -4)においても確認した。さらに筋線維タイプ変換が代謝機能を伴う変換であるか否かを検討する為、細胞外フラックスアナライザーXFpを用い、酸素消費量を指標とするミトコンドリア活性能、或はpH値変化を指標とする解糖能の変化を検討した。過去文献ではC2C12筋細胞株を用いたXFpでの解析が主であったが、本研究ではマウス初代培養筋細胞を用い、解析条件を確立する事ができた。XFpを用いた解析の結果、遅筋(Type I)を誘導する因子は主にミトコンドリア代謝能が、速筋(Type IIb)を誘導する因子は主に解糖能が優位に機能している事が確認された。これらの結果を裏付けるため、ミトコンドリア特異的遺伝子(PGC-1α, NRF1, Tfam)発現を定量した結果、遅筋誘導因子はPGC-1α, NRF1, Tfamの各遺伝子発現を上昇させていた。平成27年度は、1作成したマウス由来の培養筋管細胞に対して、生体内因子・薬剤を添加し、網羅的に遅筋線維(Type I)あるいは速筋線維(Type IIb)を誘導する因子を探索する事、2筋線維タイプ変換が代謝変換(ミトコンドリア酸化系・解糖系)を伴うか否かを明らかにする事を目的としていた。これまでに約100種類の生体内因子・薬剤を添加し、遅筋線維(Type I)あるいは速筋線維(Type IIb)を誘導する因子を探索した結果、約10種類の遅筋あるいは速筋誘導因子を同定する事ができた。筋線維タイプの変換は、定量PCRを用いたMyHC遺伝子発現においても確認できた。さらに細胞外フラックスアナライザーXFpによる筋代謝機能を解析した結果、遅筋を誘導する因子は主にミトコンドリア代謝能が、速筋を誘導する因子は主に解糖能が優位に機能している事を確認でき、筋線維タイプ変換は筋代謝変換を伴うことを明らかにする事ができた。以上のように、これまで予想通りの研究結果が得られており、研究計画は予定通りに進行している。骨格筋は肥大・萎縮をする可塑性を有すると共に,筋線維タイプ(遅筋・速筋)とそれに伴う代謝変換能(酸化系・解糖系)を有する.各種運動による筋肥大時,或は加齢や不活動に伴う筋萎縮の過程でも筋線維タイプ変換が生じるが,詳細なメカニズムは明らかではない.本研究では, 1筋線維タイプ変換を惹き起こす生体内因子・薬剤を網羅的に探索し,骨格筋線維タイプ変換メカニズムを明らかにする事,さらに2筋線維タイプ変換誘導因子を用いて加齢や不活動による筋萎縮に対する予防・治療法開発を将来的目標としている.これまでに,全ての筋線維タイプを蛍光蛋白で生きたまま識別できるマウス筋細胞を用いて,筋線維タイプ変換を惹き起こす生体内因子・薬剤を網羅的に探索し,遅筋線維(Type I)或は速筋線維(Type IIB)を誘導する因子を複数同定した.さらに筋線維タイプ変換は,代謝機能を伴う変換であり,遅筋を誘導する因子は主にミトコンドリア代謝能が,速筋を誘導する因子は主に解糖能が亢進している事を明らかにしてきた.平成28年度は, In vitroで筋線維タイプ変換を確認した生体内因子・薬剤がin vivoにおいても同様に変化を誘導するか否かを確認する為,野生型マウスに対して筋線維タイプ変換誘導因子・薬剤の投与を行った.新規遅筋誘導因子をマウスに投与した結果,生体内においても遅筋を誘導し, In vitroで得られた結果は,生体内でも同様の現象が起こりうる事を示唆していた.さらにこの因子は,生体内においてSDH及びNADH活性を低下させる事が明らかとなった.筋線維タイプ変換に関わる新規シグナル経路を解明する為,筋線維タイプ変化を誘導する既知遺伝子(Sirt1, PGC-1α)を筋特異的に欠損したマウスを樹立した.

これらを用いた結果,新規遅筋誘導因子はSirt1を介して遅筋を誘導している事が明らかとなった.平成28年度は, 1In vitro実験系で得られた筋線維タイプ変換を誘導する生体内因子・薬剤がin vivoにおいても同様に誘導するか否かを確認する事, 2筋線維タイプ変化を誘導する既知遺伝子を筋特異的に欠損したマウスを樹立し,同定した筋線維タイプ変換誘導因子・薬剤を添加して,筋線維タイプ変換を誘導するシグナル経路を明らかにする事を目標としていた.マウスへの投与実験により, In vitroで得られた候補因子・薬剤は,生体内でも同様に筋線維タイプ変換誘導を惹き起こす事が明らかとなった.同時にSDH及びNADH活性も変化させ,骨格筋代謝機能にも影響を与え,予想通りの結果が得られた.また,筋線維タイプ変換を誘導する既知因子であるSirt1やPGC1αが骨格筋特異的に欠損した筋細胞株を樹立する事ができ,これらの細胞を用いる事で筋線維タイプ変換に関わるシグナルを明らかにしつつある.これまでに同定した新規遅筋誘導因子はPGC-1aよりもむしろSirt1を介して遅筋を誘導している事が分かった.更に現在では,筋線維タイプ変換誘導因子の欠損あるいは過剰発現マウスを購入・作成を行っており,随時解析を行う予定である.以上の通り,研究計画はおおむね予定通り進行している.骨格筋は肥大・萎縮をする可塑性を有すると共に,筋線維タイプ(遅筋・速筋)とそれに伴う代謝変換能(酸化系・解糖系)を有する.各種運動による筋肥大時,或は加齢や不活動に伴う筋萎縮の過程でも筋線維タイプ変換が生じるが,詳細なメカニズムは明らかではない.本研究では,筋線維タイプ変換メカニズムを明らかにし,筋線維タイプ変換誘導因子を用いて加齢や不活動による筋萎縮に対する予防・治療法開発を目標としている.これまでに,全ての筋線維タイプを蛍光蛋白で生きたまま識別できるマウスを作製した.そのマウス筋細胞を用いて,筋線維タイプ変換を惹き起こす生体内因子・薬剤を網羅的に探索した結果,遅筋線維(Type I)或は速筋線維(Type IIB)を誘導する因子を複数同定した.さらに新規遅筋誘導因子をマウスに投与した結果,生体内においても遅筋を誘導し,且つ代謝機能を低下させた.筋線維タイプ変換に関わる新規シグナル経路を解明する為,筋線維タイプ変化を誘導する事が予想される遺伝子を筋特異的に欠損したマウスを樹立した.これらマウスを解析した結果,新規因子の遅筋を誘導制御する機構を見出した.平成29年度は,同定した新規遅筋誘導因子,およびその下流シグナル遺伝子の過剰発現および欠損マウスをそれぞれ作製した.今後,これらマウスを解析する事で,筋線維タイプ変換のシグナル経路が明らかになると考えられる.さらに加齢性筋萎縮に対する筋線維タイプ変換誘導因子の効果を検討する為に,遅筋化が進行している老齢マウスに対して速筋誘導因子を投与した.その結果,筋萎縮の予防・運動機能および筋代謝機能改善を認めた.以上の結果から,速筋誘導因子には加齢性筋萎縮を予防・改善する効果がある可能性が示唆された.骨格筋は肥大・萎縮をする可塑性と共に,筋線維タイプ(遅筋・速筋)変換能を有し,それらは関連すると考えられるが,詳細なメカニズムは明らかではない.本研究では,全ての筋線維タイプを蛍光蛋白で識別できるマウス筋細胞を用いて,筋線維タイプ変換を惹き起こす生体内因子・薬剤を網羅的に探索した.その結果, in vivo及びin vitroで遅筋線維,或は速筋線維を誘導する因子を複数同定した.
血管内皮ＮＦ－κＢ経路の心血管病や寿命に及ぼす役割の解明

血管内皮細胞に特化したNF-κB経路が関わる酸化ストレスや炎症への関与についての検討は、ほとんどなされていないため、血管内皮細胞に焦点を絞り、NF-κB経路が全身代謝に及ぼす役割についての研究を開始した。リン酸化されない変異IκB蛋白を血管内皮細胞で過剰発現させることにより、NF-κBの核移行を抑制し、血管内皮細胞におけるNF-κB経路を遮断したトランスジェニックマウスを作製し、このマウスを用いて、解析を行った。
臓器間連関によるインスリン分泌制御機構の解明

本研究の目的は、インスリン分泌に及ぼす組織間の情報ネットワークの解明を目指すことである。肝臓への遺伝子導入を行ったマウスにおいて、遺伝子導入3日目に耐糖能の改善を認め、遺伝子導入16日目には膵インスリン含量の増加が認められた。さらにBrdU染色の結果からこの膵インスリン含量の増加は膵β細胞の増殖亢進によるものであることが示唆された。これらのことから、なんらかの機序を介した、肝臓から膵β細胞への臓器間連関機構が存在することが示唆され、その経路の同定を試みた。遺伝子導入を行った肝臓から単離したmRNAを用いて、microarrayによる遺伝子発現変化の網羅的解析を行った。その結果、膵β細胞機能、増殖に変化を及ぼすことが報告されている複数の分泌蛋白の発現が増加していることが明らかとなり、これらの遺伝子を組み込んだ組み換えアデノウィルスを作成した。現在、これらのアデノウィルスを用いて肝臓に遺伝子導入を行ったマウスにおいて、糖負荷試験による糖応答性インスリン分泌能の評価、膵組織のBrdU免疫染色による膵β細胞増殖における変化の検討などを行っている。肝臓と膵β細胞は全身の糖代謝においていずれも極めて重要な役割を有する。しかしこれら両臓器間における連関についてはこれまでほとんど報告されておらず、この連関経路を明らかにすることにより糖尿病の病態解明、あるいは新規治療に結びつくものであると考える。1.遺伝子導入ベクターの作製インスリンシグナル関連遺伝子を組み込んだ組み換えアデノウィルスの作製の作成を行った。マウスに対してこのアデノウィルスを静脈注射して、肝臓において目的の遺伝子が過剰発現されていることを確認した。2.肝臓、脂肪組織への遺伝子導入1で作製したアデノウィルスを用いて、マウスの肝臓に後天的に遺伝子導入を行った。3.肝臓への遺伝子導入による、膵ランゲルハンス島に対する影響の解析遺伝子導入3日目に糖負荷試験を施行したところ、遺伝子導入マウスではコントロールのマウスと比較して負荷後血糖が有意な低値を示した。同時に測定した血清インスリン値は、遺伝子導入マウスにおいて糖負荷後15分値で著明な増加を認めた。インスリン感受性試験では、両群間で有意な差は認めなかったことから、遺伝子導入マウスでは、糖反応性のインスリン分泌が亢進し、その結果、耐糖能が改善していることが示された。また遺伝子導入マウスにおける膵インスリン含量を測定したところ、遺伝子導入後16日目にはコントロールマウスの膵インスリン含量の2倍程度にまで増加していた。そこで組織学的検討を行ったところ、膵島の増大が認められた。さらにBrdU染色にて、遺伝子導入マウスにおいて膵島細胞中のBrdU陽性細胞比率の有意な増加が認められた。このことから遺伝子導入マウスの膵島ではβ細胞の増殖が促進し、その結果膵インスリン含量が増加している可能性が示された。