hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
仕上げ面の断面曲線による工作機械の性能評価

旋盤及びフライス盤を研究の対象として,仕上げ面の断面曲線及び工具と工作物との相対変位の解析を行った結果,次のような成果が得られた.1.外丸削りをした円筒状工作物の軸方向断面曲線に現われる不規則な曲線は,主に主軸の半径方向運動誤差が転写されたものであり,端面削りにおいては,その影響がほとんど無いために表面粗さは小さくなる.2.主軸の半径方向運動誤差は軸受の転動体の運動及び構造系の固有振動数に左右され,それが円筒面の断面曲線に現われる.3.旋盤とフライス盤の2種類の機械を使った端面切削においては,主軸の軸方向運動誤差は小さく,影響が少ないが,面振れを起こすような機械ではその影響は大きく現われる.また,主軸の軸方向運動誤差意外に主軸の熱膨張の影響が大きく現われる.4.フライス削りにおいては,1刃当たりの送り量が大きいときに断面曲線に見られる前刃で切削したときの切り込み量と後ろ刃で切削した時の切り込み量との差からテーブルの直角度を評価できる.5.規則的な断面曲線の送りピッチから送り速度をレーザー干渉測長器と同等の精度で評価できる.以上の2年間の研究をとおして,工作精度試験において表面の断面曲線を測定することによって,工作機械の幾何学的的精度のうち,主軸とテーブルとの直角度,主軸の回転精度がわかっただけでなく,送り速度,主軸の熱膨張などの幾何学的精度以外の精度も評価できることがわかり,工作精度の新たな評価項目を体系付けることができた.旋盤及びフライス盤を研究の対象として,仕上げ面の断面曲線及び工具と工作物との相対変位の解析を行った結果,次のような成果が得られた.1.外丸削りをした円筒状工作物の軸方向断面曲線に現われる不規則な曲線は,主に主軸の半径方向運動誤差が転写されたものであり,端面削りにおいては,その影響がほとんど無いために表面粗さは小さくなる.2.主軸の半径方向運動誤差は軸受の転動体の運動及び構造系の固有振動数に左右され,それが円筒面の断面曲線に現われる.3.旋盤とフライス盤の2種類の機械を使った端面切削においては,主軸の軸方向運動誤差は小さく,影響が少ないが,面振れを起こすような機械ではその影響は大きく現われる.また,主軸の軸方向運動誤差意外に主軸の熱膨張の影響が大きく現われる.4.フライス削りにおいては,1刃当たりの送り量が大きいときに断面曲線に見られる前刃で切削したときの切り込み量と後ろ刃で切削した時の切り込み量との差からテーブルの直角度を評価できる.5.規則的な断面曲線の送りピッチから送り速度をレーザー干渉測長器と同等の精度で評価できる.以上の2年間の研究をとおして,工作精度試験において表面の断面曲線を測定することによって,工作機械の幾何学的的精度のうち,主軸とテーブルとの直角度,主軸の回転精度がわかっただけでなく,送り速度,主軸の熱膨張などの幾何学的精度以外の精度も評価できることがわかり,工作精度の新たな評価項目を体系付けることができた.本研究は,工作機械の微視的,巨視的な運動誤差は,必ず加工された工作物の表面に転写されると考え,仕上げ面の表面粗さ,うねり等を詳細に分析することによって,工作機械の精度を評価する方法を提案したものである。本年度は,工作物が回転し切削する旋盤による外丸削り及び端面削りを行って,微視的な運動誤差及び巨視的な運動誤差がどのように転写されているかを表面粗さ計及び真円度測定機を使用して測定し,そのデータをコンピュータに取り込んで,分析した。また,その一方で,静電容量形微小変位計を使用して,旋盤に取り付けたテストバーと刃物台との相対変位を切削した条位件と同じ条件で測定し,同様に分析した。その結果,次のような事実が明かとなった。(1)工作物に転写された工作物の真円形状には主軸系の半径方向の運動誤差が含まれるが,それは,転がり軸受の転動による誤差と主軸系の振動による誤差がある。旋盤によってはそのどちらかが支配的になる。(2)円筒状工作物の軸方向の表面粗さを調べた結果,送り量を小さくし,バイトをシャープなものにしても,ある一定値以上に表面粗さが改善されない。これは,転がり軸受の転動による半径方向の運動誤差または振動による工具と工作物の相対変位に起因するものであって,その値を小さくしなければ,それ以上の精度を望めないことを意味している。(3)端面の表面粗さは,軸方向の表面粗さの数分の一と小さく,調査したほとんどの旋盤では軸方向の主軸の動きは認められなかったが,主軸軸受の発熱よって端面は中低く形状に加工されることがわかった。以上の結果から,旋盤で加工した工作物の円周方向及び軸方向の断面曲線を測定することによって,主軸の回転精度を評価できることが明らかとなった。

昨年度は,旋盤系の工作機械を利用して,切削された表面の断面曲線を分析したところ,主軸の半径方向運動誤差が表面に転写され,それが最高工作精度試験における限界仕上げ面粗さを決定していることを理論及び実験の両面から実証した.本年度は,旋盤系とフライス盤系の2種類の工作機械を取り上げ,主軸の軸方向運動誤差が工作物の表面にどのように転写されるかを明らかにして,断面曲線から工作機械の性能評価方法を明らかにすることを目的として研究を行った.その研究成果の概要は以下のとおりである.(1)旋盤とフライス盤の2種類の機械を使って,主軸の軸方向運動誤差を測定するとともに旋盤では端面切削を,フライス盤では主軸に工作物を取り付けて端面切削を行って,仕上げ面の断面曲線と主軸の軸方向運動誤差との関係を調べたところ,主軸の運動誤差だけでなく,主軸の発熱による伸びが転写されている.(2)フライス削りにおいては,1刃当たりの送り量が大きいときに断面曲線に見られる前刃で切削したときの切り込み量と後ろ刃で切削した時の切り込み量との差からテーブルの直角度を評価できる.(3)1刃当たりの送り量が大きいときに現われた規則的な断面曲線の送りピッチからテーブルの送り速度をレーザー干渉測長器と同等の精度で評価できる.以上の2年間の研究をとおして,工作精度試験において表面の断面曲線を測定することによって,工作機械の幾何学的精度のうち,主軸とテーブルとの直角度,主軸の回転精度がわかっただけでなく,送り速度,主軸の熱膨張などの幾何学的精度以外の精度も評価できることがわかった.
分子標的解析に基いたガン温熱療法の新規有用性に関する基盤研究

ガン温熱療法の作用分子機構を含めた新規有用性を提唱する目的で,培養ヒトガン細胞(線維肉腫細胞HT1080)を使用しガンの転移・浸潤と関わるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)産生能およびマトリゲル浸潤能に対する熱ショック(温熱療法の代用として42°Cにて一定時間培養後37°Cに戻してさらに培養)の作用を検討した.その結果,以下のようなの成果を得た。(1)熱ショックはガン細胞に特異的に膜型MMPであるMT1-MMP mRNAの減少とその産生を抑制し、さらに活性型ゼラチナーゼA・MMP-2の減少を誘導した。逆にMMPの内因性インヒビターであるTIMP-2の細胞からの遊離が促進された。(2)熱ショックによる上記作用の発現機序を検討し、熱ショックタンパク質の誘導とは関係がなく、熱ショックにより細胞内cAMPの一時的な上昇おこること,さらにcAMP上昇試薬異であるforskolinやdibutyryl cAMPにより上記現象が再現できることが判明した.加えて,熱ショックおよびこれらの試薬は,マトリゲルを使用した浸潤能解析においてもガン細胞の浸潤活性を抑制することが判明した。したがって,熱ショックによる細胞内cAMPの増加がガン温熱療法におけるガン細胞の浸潤能抑制に重要であることが判明した.(3)熱ショヅクによりガン細胞の産生し血管新生と密接に関わる血管内皮細胞増殖因子(VEGF)121,VEGF165およびVEGF189)の産生が,そのmRNAの減少を伴い抑制されることも判明した.以上、ガン温熱療法の有用性は,単にガン細胞への殺ガン作用に起因したものではなく,ガン転移・浸潤抑制作用といった新規有用性をもった治療法であることが判明した。ヒトガン細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)産生能およびガン細胞のマトリゲル浸潤能に対するガン温熱療法(熱ショック)の作用機序を生化学的・分子生物学的に評価すると共に、これら知識に基づいたガン温熱療法の新規有用性について検討し、以下の成果を得た。(1)ヒト線維肉腫細胞HT1080および扁平上皮細胞A431の培養系において、転移・浸潤活性と最も関係が深く、プロゼラチナーゼA/proMMP-2活性化酵素でもある膜結合型MMP(MT1-MMP)の発現に対する熱ショック(42°Cにて培養後37°Cに戻してさらに培養)の影響をタンパク質およびmRNAの両面から検討した。その結果、熱ショックはMT1-MMPはmRNAの減少を伴ってその産生が抑制されると共に、活性型ゼラチナーゼA/MMP-2の減少が誘導された。逆にMMPの内因性インヒビターであるTIMP-2の産生放出が促進された。また、これらの作用は熱ショックの殺細胞作用や細胞毒性に起因したものではなく、さらに正常線維芽細胞では観察されずガン細胞に特異性が高いことも判明した。(2)熱ショックのガン細胞の浸潤能に与える影響をマトリゲルインベージョン解析により検討し、熱ショックがin vitroのガン細胞の浸潤活性を上記現象に起因し抑制することが判明した。(2)熱ショックの機能発現機序を検討し、上記浸潤活性抑制に熱ショックタンパク質の誘導とは関係のないこと、さらに熱ショックによる細胞内cAMPの一時的な上昇が密接に関わることが明らかとなった。以上、ガン温熱療法においてガン転移・浸潤抑制作用といった新規有用性を明らかにした。本研究成果の一部はClin.Expt Metastas.18(2):131-138(2000)に発表した。ガンの温熱療法の作用

分子機構を含めた新規有用性を提唱する目的で,培養ヒトガン細胞(線維肉腫細胞HT1080)を使用しガンの転移・浸潤と関わるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)産生能およびマトリゲル浸潤能に対する熱ショック(温熱療法の代用として42°Cにて一定時間培養後37°Cに戻してさらに培養)の作用を検討した.その結果,以下のようなの成果を得た。(1)熱ショックは膜型MMPであるMT1-MMP mRNAの減少と共にその産生を抑制し、さらに活性型ゼラチナーゼA/MMP-2の減少を誘導した。逆にMMPの内因性インヒビターであるTIMP-2の産生が促進された。また、これらの作用は正常線維芽細胞では観察されずガン細胞に特異性が高いことも判明した。熱ショックは,ガン細胞のマトリゲルインベージョン能をも抑制することが判明した。(2)熱ショックの機能発現機序を検討し、上記浸潤活性抑制に熱ショックタンパク質の誘導とは関係のないこと、さらに熱ショックによる細胞内cAMPの一時的な上昇が密接に関わることが判明した。(3)熱ショックによりガン細胞の産生する血管内皮細胞増殖因子(VEGF)121,VEGF165およびVEGF189)の産生が,そのmRNAの減少を伴い抑制されることも判明した.すなわち,熱ショックは,ガン組織への栄養補給ならびに血行性転移ルートとなる血管新生を抑制することも判明した.以上、ガン温熱療法の有用性は,単にガン細胞への殺ガン作用に起因したものではなく,ガン転移・浸潤抑制作用といった新規有用性をもった治療法であることを示唆した。本研究成果の一部はConnective Tissue,33(1): 59-65(2001)およびBr. J. Cancer(投稿中)に発表した。
網羅的血清糖ペプチドピークと人工知能を用いた卵巣癌早期診断法の開発

卵巣癌は早期診断も難しく発見時には進行癌であることが多く予後不良である。予後改善のためには早期診断への新たな発想・技術の導入が不可欠である。申請者らは臨床的に最も汎用されている卵巣癌マーカーCA125よりも有意に子宮内膜症性嚢胞と明細胞腺癌を鑑別する血清糖ペプチドマーカーFS-C4BPを液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)による網羅的血清糖ペプチドスペクトラ解析(CSGSA法)により同定した(特許出願番号PCT/JP2015/068390)。本研究では、従来の単一分子の血清腫瘍マーカー測定では卵巣癌早期診断は不可能であることからその古い概念を打ち破り、究極のCombination Assayと思われる網羅的血清糖ペプチドピーク(約20000ピーク)と人工知能を用いた卵巣癌早期診断の開発(CSGSA法を用いた深層学習(人口知能)による診断)を目標としている。本研究はすでに方法論はほぼ確立していることから、その診断精度を上げるために多くの患者血液(卵巣癌、子宮内膜症性嚢胞、良性卵巣腫瘍、健常人)を必要とする。そこで本年度は日本中の血液バイオバンクより血清の収集を行う。卵巣癌は、前癌病変が分かっているタイプI型とde novo発生のタイプII型があり、健常人、前癌病変患者、卵巣癌各タイプ型・各進行期(I-II期XIII-IV期)患者の血液の組み合わせを変えることで、それぞれのカテゴリ-を選別する判別法としての確率(新たな腫瘍マーカーの概念:単一分子のマーカー値でない)が計算される(例、子宮内膜症性嚢胞の経過観察に有用な子宮内膜症性嚢胞例X卵巣明細胞腺癌I-II期例の組み合わせ、卵巣癌検診に生かすための卵巣癌I-II期X健常人の組み合わせ、など)。多数例を用いた検討で、各組み合わせの判別のためのAUSが99%を超えるようになるまでの診断システムの向上を目標に症例数の追加、分析、検討を重ね、そこが可能になることを確認の上、全国規模の臨床試験に進みたい。あるいは海外機関との共同研究に持ち込みたい。人工知能に関するテクノロジーの発展も早いことから、米国の人工知能専門家にも解析の依頼を行っており、我々の2次元バーコード化してDeep learningを行い分離する方法と比較検討を行い、さらなる精度の改善をはかる。初年度は、すでに研究計画申請承認前よりも前に行っていたパイロット研究の結果の分析・検討とサンプルの収集を中心に行っていたために経費が予想よりも少なくて済んだ。次年度には採集されたサンプルを用いた分析、論文投稿費用、学会報告を行うことに繰越金を充当する予定である。
反応誘起・単一ピコリットル液滴/溶液抽出-顕微吸光法による超微量その場分析

本研究は,溶液中に存在する微小場への物質供給は速やかに起こること,疎水性相互作用,吸着などにより微小場に溶質を濃縮できること,局所分析に顕微分析法が有効であることに基づいて,単一ピコリットルの微小場に溶質を抽出し,顕微分析できる手法開発を行い,抽出機構解析を目的とした。先ず,マイクロキャピラリー操作法で単一油滴(微粒子)を水相に注入し,この油滴の顕微吸収・電気化学検出できる手法を開発した。この手法を用いて水相から微小油滴(溶媒抽出),または微粒子に抽出される(固相抽出)過程の速度論的議論を行った。微小油滴/水系においては,イオン対抽出過程を検討した。界面に吸着しない(フェロセニルメチル)トリメチルアンモニウムまたはメチレンブルーとPF_6^-系においては,抽出は非常に速いことがわかった。一方,アニオン性界面活性剤の典型的な定量法である,メチレンブルーとドデシル硫酸イオンについて測定したところ,抽出過程は誘導期をもった連続ステップで解析でき,ドデシル硫酸イオンの界面吸着が抽出過程において重要であることが油滴サイズ依存性から明らかとなった。微粒子/水系においては,カチオン性色素がシリカゲルに収脱着される過程を検討した。ローダミン6Gの収脱着過程は,微粒子内拡散が律速で進むことがわかった。一方,メチレンブルー,アクリジンオレンジは微粒子内拡散と固/液界面における脱着速度が非常に遅く,これらの過程が律速になることが微粒子サイズ依存性から明らかとなった。本手法は微小液滴,微粒子の超微量分析法として,またこれらへの抽出過程を速度論的に解析できる手法として極めて有用であることを明らかにした。溶液中に存在する微小場への物質供給は速やかに起こること,親水性-疎水性,吸着,イオン交換などにより微小場に溶質を濃縮できること,微小場の定量分析に分光法が有効であることに基づいて,本研究は単一ピコリットルの微小場に溶質を抽出し顕微吸光法で超微量その場分析できる手法開発を行い,抽出機構を解析することを目的とした。先ず,吸光分析用の可視プロープ光を光学顕微鏡に導入し,23μmに集光できる光学系を自作した。単一微小場を透過したプローブ光をマルチチャンネル光検出器で検出し吸収測定できる装置を製作した。顕微吸収システムの性能は色素を含む油滴をゼラチンフィルムに分散して油滴のサイズと色素濃度を変化させて吸光分析が定量的に行えることを確認した。次に,単一ピコリットルの微小場への抽出-顕微吸光法の性能を調べるため,シャーレ中の溶液に単一シリカゲル微粒子を添加し,溶液中の色素が固相抽出される過程の経時変化を測定した。また,抽出平衡に達した後,色素を含まない溶液に同じ微粒子を添加し脱着する過程を観測した。ローダミン6Gは微粒子内の拡散が律速で収着・脱着するが,メチレンブルーは脱着速度が律速でこれらの過程が進むことを明らかにした。単一微粒子への固相抽出とともに,単一液滴への溶媒抽出の機構解析を顕微分光法に基づいて速度論的に行っている。今後,キレート反応等で生成した化合物が,微小場に抽出される過程を検討する。本研究は,溶液中に存在する微小場への物質供給は速やかに起こること,親水性-疎水性相互作用,吸着などにより微小場に溶質を濃縮できること,局所分析に顕微分析法が有効であることに基づいて,単一ピコリットルの微小場に溶質を抽出し,顕微分光・電気化学法で超微量その場分析できる手法開発を行い,抽出機構を解析することを目的とした。

前年度までに開発したマイクロキャピラリー操作-顕微吸光-電気化学装置を用いて,水溶液相から微小油滴(溶媒抽出),または微粒子に抽出される(固相抽出)過程の速度論的議論を行った。微小油滴/水系においては,イオン対抽出過程を検討した。界面に吸着しない(フェロセニルメチル)トリメチルアンモニウムとPF_6^-では抽出は非常に速く,水相中の拡散速度と同程度であることがわかった。一方,アニオン性界面活性剤の典型的な定量法である,メチレンブルーとドデシル硫酸イオンについて測定したところ,抽出過程は誘導期をもった連続ステップで解析でき,ドデシル硫酸イオンの界面吸着が抽出過程において重要であることが,油滴サイズ依存性から明らかとなった。微粒子/水系においては,カチオン性色素がシリカゲルに収脱着される過程を検討した。ローダミン6Gの収脱着過程は,微粒子内拡散が律速で進むことがわかった。一方,メチレンブルー,アクリジンオレンジは微粒子内拡散と固/液界面における脱着速度が非常に遅く,これらの過程が律速になることが微粒子サイズ依存性から明らかとなった。本手法は微小液滴,微粒子の超微量分析法として,またこれらへの抽出過程を速度論的に解析できる手法として極めて有用であることを明らかにした。
微生物高分子の生合成過程における多次元構造制御および発現構造・機能の精密解析

(1)生合成過程における多次元構造制御ε-ポリリジンおよびγ-ポリグルタミン酸の生合成機構の解明と重合遺伝子のクローニングを行った。これらの研究の発展として、ε-ポリリジンの重合度を決定する因子を明らかにし、高重合度化を検討した。また、γ-ポリグルタミン酸についてはD体とL体の共重合を規制する因子を明らかにし、高立体規則性D体あるいはL体ポリマーの生合成を検討した。一方、ポリリジン合成酵素の酵素化学的研究並びにポリリジン分解酵素のタンパク質及び遺伝子化学的研究も行い、酵素レベルでの構造制御を追求した。セルロース合成酵素を大腸菌または酵母で過剰発現させ、セルロースのin vitroでの合成を検討した。また、セルロース合成酵素の2次元結晶化とその構造解析を行い、天然に存在しないナノ繊維構造体の構築を検討した。一方、酢酸菌を用い、生活廃棄物などを炭素源として新規セルロース系多糖の生合成の可能性を追求するとともに、セルロースの分子集合体形成に及ぼす物理化学的因子を明らかにし、分子集合状態の構造制御を検討した。(2)発現構造・機能の精密解析(1)で合成された各ポリアミノ酸の精密な構造解析を溶液NMRにより行い、生合成過程の構造制御に反映させた。また、種々の状態におけるポリアミノ酸の分子集合状態、ダイナミックスを固体高分解能NMRにより精密に解析した。ポリグルタミン酸ゲルの高吸水性機構の分子論的解明や水構造の振動分光学的研究を行うとともに、ポリグルタミン酸ゲルの架橋過程の粘弾性と破断強度の解明も行い、高機能性材料開発のための基礎的知見を得た。バクテリアセルロースの分子集合状態の電顕観察およびミクロ電子回折解析を行い、繊維化をはじめナノ構造の制御を検討した。キチン質加水分解酵素を用いた真菌類細胞壁多糖の分子集合状態の解析も行った。
高分子ミセルベクター(人工ウィルス)による遺伝子導入法の確立と関節疾患への応用

1)ベクターの細胞内動態の観察:二重蛍光標識したDNAを用いて,細胞へのベクターの取り込み,DNA releaseをレーザー共焦点顕微鏡で観察したところ,直鎖状ポリエチレンイミンで,投与後早期の取り込み,細胞質内でのDNA release (decondensation)が観察され,遺伝子発現との相関が確認された.即ち,ポリエチレンイミンの持つエンドソーム溶解能が,細胞質内でのDNA挙動に有効に機能することが強く示唆された.2)新規ブロック共重合体合成:化学構造的にエンドソーム溶解能を持つことが想定されるカチオンをブロック共重合体化し,その物性を系統的に確認した.いずれの共重合体にても,DNAとのコンプレックス化により,外郭をPEGで覆われ,内核にカチオンとDNAが凝縮する高分子ミセル構造を取ることが確認された.ただ,その凝縮の程度や粒径はカチオンによって大きく異なり,カチオンの分子設計によってこれら諸性質を自在にコントロールし得ることが明らかとなった.3)生物学的機能評価:上記共重合体を用いて,培養細胞への遺伝子導入を行ったところ,DNAの良好な凝縮が得られるミセルにおいて,クロロキン等のエンドソーム溶解試薬は必要とせずに,非常に良好な遺伝子発現が得られた.この機能評価により,生体内環境での安定性,細胞内での効率的なDNA輸送能を併せ持つシステムという,当初の目的に適う分子構造が決定された.また,このシステムにより,軟骨細胞,滑膜細胞の初代培養株細胞に対しても,効率よい遺伝子導入が確認された.さらに,ミセル外郭にラクトースリガンドを導入したミセルにより,ラクトースレセプターを持つ肝由来細胞株に対して,著明な取り込み増加,遺伝子発現増加の得られることが確認された.さらにRGD,葉酸等のリガンド導入が現在進行中である.1)ベクターの細胞内動態の観察:二重蛍光標識したDNAを用いて,細胞へのベクターの取り込み,DNA releaseをレーザー共焦点顕微鏡で観察したところ,直鎖状ポリエチレンイミンで,投与後早期の取り込み,細胞質内でのDNA release (decondensation)が観察され,遺伝子発現との相関が確認された.即ち,ポリエチレンイミンの持つエンドソーム溶解能が,細胞質内でのDNA挙動に有効に機能することが強く示唆された.2)新規ブロック共重合体合成:化学構造的にエンドソーム溶解能を持つことが想定されるカチオンをブロック共重合体化し,その物性を系統的に確認した.いずれの共重合体にても,DNAとのコンプレックス化により,外郭をPEGで覆われ,内核にカチオンとDNAが凝縮する高分子ミセル構造を取ることが確認された.ただ,その凝縮の程度や粒径はカチオンによって大きく異なり,カチオンの分子設計によってこれら諸性質を自在にコントロールし得ることが明らかとなった.3)生物学的機能評価:上記共重合体を用いて,培養細胞への遺伝子導入を行ったところ,DNAの良好な凝縮が得られるミセルにおいて,クロロキン等のエンドソーム溶解試薬は必要とせずに,非常に良好な遺伝子発現が得られた.この機能評価により,生体内環境での安定性,細胞内での効率的なDNA輸送能を併せ持つシステムという,当初の目的に適う分子構造が決定された.また,このシステムにより,軟骨細胞,滑膜細胞の初代培養株細胞に対しても,効率よい遺伝子導入が確認された.さらに,ミセル外郭にラクトースリガンドを導入したミセルにより,ラクトースレセプターを持つ肝由来細胞株に対して,著明な取り込み増加,遺伝子発現増加の得られることが確認された.さらにRGD,葉酸等のリガンド導入が現在進行中である.1)レーザー共焦点顕微鏡によるベクターの細胞内動態の観察ポリエチレンイミン(PEI)を対象に、fluorescence resonance energy transfer(FRET)を用いる手法により、その遺伝子発現に至る細胞内メカニズムを解析したところ、特に直鎖型PEIにおいて、エンドソームからのescape後、細胞質内でのDNAのベクター粒子からのdissociation、DNA decondensationが迅速かつ効率的に起こり、高い遺伝子発現と密接に相関することが観察された。一方、構造異性体である樹状型PEIでは、ベクター粒子からのDNA dissociationに乏しく、遺伝子発現も低かった。これは動的光散乱等にて評価される粒子の構造的特徴とよく関連した(投稿中)。2)ブロック共重合体合成遺伝子ベクターに求められる機能として、このカチオンからのDNA dissociationの起こりやすさ、生体内環境での安定性にはやや相反する要素があり、これを解決する手法として、カチオンのブロック共重合体により形成される高分子ミセルの可能性がさらの認識された。そのため、PEI同様のエンドソーム溶解機能、および構造的安定性を併せ持つカチオンをベースとしたブロック共重合体を10種以上新規に合成し、現在その物性、生物学的機能を解析中である。3)生物学的機能評価蛍光標識DNAを用いた検討で、高分子ミセルの細胞への取り込みは非常に星好であった。さらに、ミセルによる遺伝子導入では、他のベクターと比べ長時間持続的に高い遺伝子発現が得られ、ベクター粒子の細胞内外での安定性、および細胞毒性の低さと密接に関連することが分かった。1)ベクターの細胞内動態の観察:二重蛍光標識したDNAを用いて,細胞へのベクターの取り込み,DNA releaseをレーザー共焦点顕微鏡で観察したところ,直鎖状ポリエチレンイミンで,投与後早期の取り込み,細胞質内でのDNA release (decondensation)が観察され,遺伝子発現との相関が確認された.即ち,ポリエチレンイミンの持つエンドソーム溶解能が,細胞質内でのDNA挙動に有効に機能することが強く示唆された.2)新規ブロック共重合体合成:

化学構造的にエンドソーム溶解能を持つことが想定されるカチオンをブロック共重合体化し,その物性を系統的に確認した.いずれの共重合体にても,DMAとのコンプレックス化により,外郭をPEGで覆われ,内核にカチオンとDNAが凝縮する高分子ミセル構造を取ることが確認された.ただ,その凝縮の程度や粒径はカチオンによって大きく異なり,カチオンの分子設計によってこれら諸性質を自在にコントロールし得ることが明らかとなった.3)生物学的機能評価:上記共重合体を用いて,培養細胞への遺伝子導入を行ったところ,DNAの良好な凝縮が得られるミセルにおいて,クロロキン等のエンドソーム溶解試薬は必要とせずに,非常に良好な遺伝子発現が得られた.この機能評価により,生体内環境での安定性,細胞内での効率的なDNA輸送能を併せ持つシステムという,当初の目的に適う分子構造が決定された.また,このシステムにより,軟骨細胞,滑膜細胞の初代培養株細胞に対しても,効率よい遺伝子導入が確認された.さらに,ミセル外郭にラクトースリガンドを導入したミセルにより,ラクトースレセプターを持つ肝由来細胞株に対して,著明な取り込み増加,遺伝子発現増加の得られることが確認された.
精神障害者の親をもつ子どもの青年期の生活状態に関する研究

精神障害者の親をもつ子どもの生活実態の把握を目的に該当の子ども8名と学校教員9名に面接調査を行った。子どもは親の疾患について説明を受けず、親の症状に巻き込まれ、その経験がトラウマとなっていた。また、世話をされることが少なく、自分で生活していく難しさを抱えていた。教員は、連携しながら子どもと親に関わり、状況を理解しようと努め、彼らをサポートしていた。教員のニーズとして親子への関わり方の理解が挙げられた。一方、ドイツでは、1地域で関係機関のネットワークをつくり該当の子どもの発見、2心理士による家族面談の実施、3子どもの気持ちの表出とストレス緩和を目的としたセラピーの実施等を行っていた。本研究は、精神障害者を親にもつ子どもの青年期の生活実態を明らかにし、必要な支援を検討することを目的としている。1.ドイツをはじめとした国外の先行研究の把握:関連する文献をPubMedおよびPsycINFOより62件抽出し精読した。また、ドイツで「精神障害者を親にもつ子ども」に関する書籍、子ども向け絵本を購入し、特に学術論文も報告している著者の書籍“Kinder mit psychisch kranken Eltern:Klinik und Forschung"(Wiegand-Grefe S.2011)の要約を行った。さらに、絵本“Sonnige Traurigtage"(Schirin Homeier. 2009)に関しては、子どもだけでなく周囲の大人が読むことで子どもの理解につながると考え、翻訳出版できるように出版社と打ち合わせを行っている。2.現地視察:平成25年9月に7日間、“CHIMPs" (Children of mentally ill parents)への支援プロジェクトを展開しているドイツ・ハンブルク州のUniversity Clinic Hamburg-Eppendorfおよび他2箇所の団体や行政を訪問し、知見に関する資料の収集、支援の実際を見学し情報交換を行った。ドイツでは各地で子ども向けの取り組みを行い支援者相互に連携していることが明らかになった。3.国内学会での報告:1.2.の調査結果をまとめ、第2回日本公衆衛生看護学会学術集会(小田原)で報告し、さらに京都精神障害者家族連盟に加盟している家族会で報告した。先進的な取り組みについて国内で報告できたことは、本テーマの発展に向けて意義があったと考える。4.国内のフィールドワーク:精神障害者での親をもつ子どもの会等に参加し現状の把握を行っている。今後対象者への調査を検討していく。1.研究報告平成25年度に、精神に障害のある親とその子どもへの支援が進んでいるドイツを訪問した際に得た知見の一部を第73回日本公衆衛生学会(2014年11月開催)にて報告した。その後、論文としてまとめ、佛教大学保健医療技術学部論集(2015年3月発行)に投稿し掲載された。2.調査経過精神に障害のある親をもつ子どもへの支援を検討するために2つの方向から現状の課題を調査している。【研究1・精神に障害のある親をもつ成人の就学以降に必要とした支援】子どもの頃に精神に障害のある親をもっていた経験のある成人8名に半構造化面接を行った。質問内容は小学校入学以降の「生活や気持ち」、「助けとなった家族内外の関わり」、「必要とした支援」等である。【研究2・精神に障害のある親をもつ子どもへの支援】学校の教員や養護教諭9名に半構造化面接を行った。内容は該当するケースへの支援内容や支援を進めるために必要な工夫、教員研修等で知りたい点等である。調査を通して、精神に障害のある親をもつ子ども達は、親の状況や家庭生活、子ども自身の困っていること等を家族以外の人に話すことはほとんどなく、食事や衣類の準備、保清、学校の準備等、手探りの中で行っていた。そのため、家事全般や人とのコミュニケーション等が社会で通用するものなのか自信がもてないまま成人している人もいた。一方、そうした子ども達に接する学校の教員は、子どもの困りごとに関心があり、どのようなサポートを子ども達は必要としているのか知りたいとのニーズが明らかにされた。今後、研究1、研究2ともに、得られたデータを質的帰納的に分析し、支援者研修会等で報告する予定である。本研究は、精神障害者を親にもつ子どもの生活や気持ちを明らかにし、必要な支援を検討することを目的としている。1.研究成果:平成25年度は国外の先行研究結果をまとめ、支援の進んでいるドイツの都市を視察した。これらの調査結果から地域支援ネットワークの重要性や具体的な行政の役割について、学会で報告した。国内では本テーマに関する報告は少なく、海外の研究成果や取組を紹介することは、本テーマの発展に向けて意義があったと考える。平成26年度はドイツで成果を上げている家族面談について学会発表および論文で報告した。調査として「研究1.精神障害者の親をもつ成人の就学以降に必要とした支援」では、子どもの頃に精神障害を患う親と暮らした経験のある成人に、「研究2.精神障害のある親をもつ子どもへの支援」では、学校の教員に半構造化面接を行った。調査結果の一部を精神保健福祉関係職員の研修会で報告した。平成27年度は前年度の研究1の調査結果から、精神障害者の親と暮らす子どもの経験として「世話をされない生活を子どもがなんとかするしかない難しさ」「疾患説明をされず親の症状に巻き込まれる恐怖とトラウマ」「親からの愛情を感じず、子ども自身の発達を阻害される生活」が明らかになり、それらを学会および論文で報告した。

また、小学校の教員研修会で、子どもの状況を報告し、教員間で意見交換を行った。参加者の84%から「とても参考になった」との評価を得た。子どもの身近な存在である教員が、こうした子どもの状況を理解し、対応していくことは、困難な生活を強いられている子どもの支援につながり、意義が大きいと考える。2.今後の展開:これまでの調査結果をまとめ、論文として報告すると共に、教員研修会を開催し、こうした子どもや家庭の理解につなげていく。また、国際学会(8月スイス開催)でも報告し、他国の研究者と意見交換を行う予定である。精神障害者の親をもつ子どもの生活実態の把握を目的に該当の子ども8名と学校教員9名に面接調査を行った。子どもは親の疾患について説明を受けず、親の症状に巻き込まれ、その経験がトラウマとなっていた。また、世話をされることが少なく、自分で生活していく難しさを抱えていた。教員は、連携しながら子どもと親に関わり、状況を理解しようと努め、彼らをサポートしていた。教員のニーズとして親子への関わり方の理解が挙げられた。一方、ドイツでは、1地域で関係機関のネットワークをつくり該当の子どもの発見、2心理士による家族面談の実施、3子どもの気持ちの表出とストレス緩和を目的としたセラピーの実施等を行っていた。当初、平成26年度は高校生を対象に、精神障害のある親をもつ子どものQOLについて調査する予定であったが、未成年を対象にした調査は倫理的に難しいため、子どもの身近にいる教員を対象に質的調査を行った。その後、インタビューで得られた音声データの逐語録作成まで終了した。平成26年度中にデータ分析終了を予定していたため、この点が未達成であり「やや遅れている」とした。公衆衛生看護1.調査結果の分析と報告:【研究1・精神に障害のある親をもつ成人の就学以降に必要とした支援】および【研究2・精神に障害のある親をもつ子どもへの支援】に関して、逐語録より質的分析を行い、結果を学会や学術誌で報告していく。2.支援者研修会の実施:1.でまとめた結果を教員研修会で報告し、精神障害のある親とその子どもの理解を促す。本研究課題に関して先進的な取り組みを行っているドイツを訪問し、結果を国内に報告できた。しかし、結果のとりまとめや文献レビューに時間を要したため、国内への対象者への調査に関してはフィールドワークに留まった。今回、国内でフィールドワークを行った結果、他の研究者が精神障害者の親をもつ子どもの生活実態を把握しており、国内での報告数も増えていることがわかった。また、実態把握も重要だが、周囲の支援者への理解促進を進め、早急に支援の展開に結び付けていく必要があることが明らかになった。そこで、当初予定していた子どもの生活実態の量的調査は行わず、支援に着目した研究を推進していく。まず、子どもが必要としている支援については十分に調査されていないため、子どもへの質的調査を行う。また、周囲の大人や専門職の理解を促進するための絵本の出版や支援者に向けた研修の検討を行っていく。研究を遂行するために、近畿圏の同じ研究テーマに取り組む研究者達と連携していく。
公共政策系「専門職」大学院の戦略的発展に関する研究

わが国の公共政策系「専門職」大学院においては他の専門職大学院と異なり資格試験等との直結がない。しかしそれゆえに独自性あるプログラム構成が可能である。今後の育成方針、カリキュラム戦略等の差別化によって特にそれはビジネススクールやロースクールを想定した個々の競争力の確保が必要である。そのためにも得意とする、評判が得られるような専門領域を強化することが重要である。本年度は、日米における公共政策系「専門職」大学院の情報収集を行い、今後の調査研究の方向性を明らかにし、今年度実施した米国の公共政策系「専門職」大学院への訪問調査における具体的な研究設問等を設定した。調査研究活動にあたっては、本年度2月に米国東海岸にある計13のMPAもしくはMPPプログラムのDirectorもしくは当該プログラムを有する大学院のDeanもしくはAssociate Deanに対するインタビュー調査を実施するとともに、その予備調査として、日本人の現役留学生および留学経験者とのグループ・インタビューを実施した。それらの結果、日米「専門職」大学院の相違、カリキュラムの志向、キャリア・ディペロップメント等において各大学院の特色ある傾向、知見等を得ることができた。今後は、これらの知見を基に米国でのインタビュー調査の結果を総括し、また日本における専門職大学院インタビュー調査に着手し、その比較において我が国の公共政策系「専門職」大学院の発展に寄与する知見等を導出したい。なお訪問した米国の専門職大学院は以下のとおりである。(ニューヨーク州)コーネル大学シラキュース大学ニューヨーク州立大学オルバニー校ニューヨーク市立大学コロンビア大学ニューヨーク大学(マサチューセッツ州)ハーバード大学(ニュージャージー州)ラトガース大学プリンストン大学(メリーランド州)メリーランド大学(ワシントンDC)ジョージタウン大学アメリカン大学ジョージメーソン大学前年度実施した米国公共政策系大学院へのインタビュー調査(計13大学院)結果を取りまとめ、当該大学院全体の成功的要因や今後の展望、さらには各大学院の課題等を明らかにするなど近年の当該動向を整理した。また当該調査結果にかかる発表報告を2010年度開催の米国行政学会(American Society for Public Administration)へ申請し、受理された。また、米国調査のプレ調査として実施した米国公共政策系大学院の現状把握および日本人留学生に対するインタビュー調査について、2009年度に開催された日本高等教育学会にて発表報告を行った。また、米国事例との比較分析を行うため、カナダにおける公共政策系大学院についてインタビュー調査(計4大学院)を行った。2010年度においてはわが国における公共政策系大学院へのインタビュー調査を行い、米国等との比較分析を予定している。その前段階として、米国における調査では、大学院プログラムにおける実践もしくは社会情勢への即応性(環境問題や国際開発、テロ対策などの講義の新設等)、他の専門職大学院(ロー・スクールやビジネス・スクール)との競合性の問題、さらには各プログラムにおける専門職職業人の考え方の相違(社会におけるリーダーか組織におけるマネジャーの育成か)等を踏まえ、その傾向を体系的に整理できたこと、また米国とは異なり比較的学術性を尊重するカナダの大学院プログラムの特徴等が明らかになったことで、わが国でのインタビュー調査の分析視角をより深めることができた。(1)2009年2月に実施した米国公共政策系大学院へのインタビュー調査(計13大学院)結果を取りまとめ、米国公共政策系大学院の成功的要因、今後の展望さらには各大学院の課題等を明らかにするなど近年の当該動向を整理し、2010年4月開催の米国行政学会(American Society for Public Administration)でその成果を報告した。(2)2009年11月に実施したカナダにおける公共政策系大学院へのインタビュー調査(計4大学院)結果及び上記米国の結果を考察し、2010年5月開催の日本高等教育学会でその成果を報告した。(3)2010年には9月から11月にかけてわが国における公共政策系大学院へのインタビュー調査(計13大学院)を実施し、日米公共政策系大学院の比較分析を行った。その内容については2011年5月29日開催予定の日本高等教育学会で報告する。一部概要は以下のとおり。(1)立地条件、学位のネームバリュー等、重視されるもしくは課題とされる要因は比較的類似、大学院としての基本的(外形的)枠組に際立った差はみられない。(2)米国の特徴としては、ポリシー・スクールから公務職へのキャリアパスについて、ビジネス・スクールやロー・スクールからの公務員および非営利職員志望者や増加し、行政経営、NPO経営のサティフィケート等を提供するビジネス・スクールが新設する傾向がみられることから、日本とは異なる意味で公共政策系プロフェッショナル・プログラムとしての優位性確保が挙げられる。(3)また、米国は政策分析、マネジメント系といったスキル系に時代の自然環境やセキュリティ問題といったといった時代のトレンドを強く意識した個別政策系の科目提供を積極的に展開している傾向がある。
工業英語教育のための音声付CAI教材の開発研究

平成2年度から3年間、金沢工業大学英語研究室の5名の教員は音声付CAI教材作成のため研究と開発を行った。平成2年度には、電気科・電子科の先生方に頼んで、工科系の学生が必要とする電気分野の内容を教えて頂き、6月から教科書の作成に取りかかった。7月末までに1-2章音声(札野寛子)3-4章英文法(登美博之)5-13章(松原洋・札野順・丸尾和美)から成るTechnical English for Electrical and Electronic EngineeringStudentsを作成した。9月初めにその本を本学の出版局から発行した。その教科書を後学期から、「英語6」の授業の中で、2年電気科4クラス(208名)の中で使用した。研究代表者は当年の研究を「工科系大学における英語教育の一方法」(金沢工業大学研究紀要32巻1991年)の中に纒めた。平成3年度前半には、前年作った教科書の内容をCAI用の教材「工業英語(4)」として使うためのプログラミングを終了した。後半には、2年電気科(47名)、電子科(42名)と機械科(47名)の中で、授業とCAIの両方で電気の内容を英語で指導した。後学期中3回のテストを実施し、学期末にはアンケートを採った。私達は教材の内容をもっと増大したいと考えたが、プログラミングに費用と時間が掛かり過ぎることから、これ以上増やさないことに決めた。研究代表者は専門分野の内容を英語で教える場合、どのような教科書を作成し、どのような方法で教えた方が良いかについて考察した論文「工科系大学における英語教育の一方法(2)」(金沢工業大学研究紀要33巻1992年)を執筆した。平成4年度には、音声付CAI教材「工業英語(4)」のプログラミングを行うことにした。音声付教材を作成するため、教材内容をアメリカ人教員にテープに吹き込んでもらったものを、音声評価システムに変換するため、2名の学生を名古屋に出張させた。音声用の教材作成は現時点では学生には不可能なのでCAI室の教員の指導の下に9月末7章までプログラミングを終えた。ところが、平成5年4月から、本学で従来使っていた機器富士通16ベータが音声用の富士通FMR-70HLZに変更になり、音声評価システムを使わなくても音声を利用できることから、経費削減のためにも8章以降はプログラミンブしないことにした。後学期には、電気科(45名)、電子科(23名)、機械システム科(38名)そして土木科(52名)の授業の中で「工業英語(4)」を使用した。研究代表者は3年間の研究成果を「工業英語教育のための音声付CAI教材の開発研究」に纒めて文部省に提出し、更に9月私立大学情報教育協会において「音声付CAIと工業英語教育」を発表する予定である。

研究代表者は3年間の研究成果を「工業英語教育のための音声付CAI教材の開発研究」に纒めて文部省に提出し、更に9月私立大学情報教育協会において「音声付CAIと工業英語教育」を発表する予定である。私達は、昭和62年から3年間、工科系の学生に工業英語の普及を図りたいとの目的を持って、2冊の教科書(開隆堂)と、3冊のCAI教材を作成した。平成2年からは、学生にとっては最も困難で、時間のかかる英語の聴取力を養成するための教材を準備することにした。工科系大学の1・2年生に適し、また日本工業協会主催の工業英語検定試験3・2級に合格する実力をつけるための教科書と、CAI教材を作成する計画した。教材の内容については、本学の電気工学科主任教授の協力を頂けることから、2年生の電気・電子学科に英語で専門の内容を教える教材を作ることにした。平成2年から3年間をかけて、授業用教科書Technical English for Electrical and Electronic Engineering StudentsとCAIで利用出来る音声付「工業英語4」を作成することにした。平成2年6月から、共同研究者はそれぞれ分担を決め、1・2章音声(札野寛子)、3・4章文法(登美博之)、5ー13章電気英語(松原洋札野順丸尾和美)として、パソコンやワ-プロを使って、7月末日までに執筆を終え、9月始め教科書(金沢工業大学出版局)を発行した。一方、CAIの音声付教材「工業英語4」は、2名の学生をプログラマ-として頼み、8月始めから作成に取り掛かった。7月末2人のアメリカ人教員に吹き込んでもらったテ-プをフロッピ-に変換するため、CAI教員と2名のアルバイト学生とを名古屋に出張させ、半分だけ変換した。残りの半分は平成3年8月頃変換する予定である。現在、音声付CAI教材「工業英語4」は、13章のうち11章までプログラムを終えている。平成3年度中に、現在の教材に主に電子科用の内容を8章分増補する計画である。なお、英語の聴取力をつけさせるため、授業に使う英語書き取り用テ-プは、本学の非常勤講師に吹き込みをして頂いた。平成2年からは、学生にとって最も困難で、時間を要する英語の聴取力を養成するための教材を準備することにした。教材の内容については、本学の電気・電子工学科主任教授の協力を得て、主に2年生の電気・電子学科の学生に英語で専門の内容を教える教材を作ることにした。平成2年度は、授業用教科書Technical English for Electrical and Electronic Engineering Studentsを作成して、後学期授業で使用した。また、電気・電子学科で教えるためのCAI教材「工業英語(4)」の一部を作った。研究代表者は、平成3年6月には、前年度実験的に試みた電気・電子の内容を英語で教えることによって得られた成果と反省を中心にまとめた研究論文「工科系大学における英語教育の一方法」を執筆した。9月末までにCAI教材「工業英語(4)」の13章までのプログラミングを終え、後学期には、主に2年電気・電子学科の学生を対象として、その教材をCAIにおいて使用した。平成4年度は、従来の「工業英語(4)」の教材に電子関係の内容を中心とした6章分を追加し、音声をも利用できるようプログラミングをしたい。
脳腫瘍を特異的に標識する新規蛍光プローブの開発

神経膠腫の安全かつ最大限の摘出には、術中蛍光プローブが有効で、5-アミノレブリン酸が保険収載され汎用されている。しかし偽陽性・偽陰性、再投与不可等の限界があるため、5-ALAを補完する局所噴霧にて診断可能な、脳腫瘍を特異的に標識する新規蛍光プローブの開発を行った。当科の神経膠腫の手術症例を用い、Hydroxymethyl rhodamine greenを蛍光母核に種々のアミノ酸を付加した約320種の蛍光プローブライブラリーから、凍結検体のホモジェナイズサンプルでスクリーニングを行い、さらに新鮮腫瘍検体に直接噴霧して蛍光強度の経時的変化を解析し、膠芽腫において有望な蛍光プローブを7種類選定した。神経膠腫の手術において、不明瞭な腫瘍境界の剥離により術後神経症状の悪化を来す危険性があり、安全かつ最大限の摘出を目指すにあたり術中蛍光プローブによる腫瘍の可視化は有効である。現在5-アミノレブリン酸が悪性神経膠腫手術において保険収載され汎用されているが、偽陽性・偽陰性、術前内服投与・再投与不可などの限界がある。それゆえ5-ALAを補完する局所噴霧にて診断可能な蛍光プローブの開発を目指した。まず、悪性神経膠腫患者から摘出された腫瘍検体の一部を用いて、プローブスクリーニングを行った。腫瘍とその周囲脳との比較を複数のプローブで行ったところ、いくつかのプローブで腫瘍>周囲脳の蛍光性が見られた。しかし全ての症例で腫瘍選択的に蛍光が見られたプローブはなかった。したがってさらに症例を蓄積したうえでの検討が必要と思われた。また、悪性神経膠腫の高い浸潤性から当然ではあるが、病理標本の検討では周囲脳に腫瘍細胞の混在が認められた症例も複数あり、やはり病理所見との比較検討が重要と考えられた。プローブスクリーニング可能な腫瘍検体の数は限られていることから、正常の(に近い)周囲脳に対して蛍光性を持たないプローブを選出し優先的に検証を行うことも有用と思われた。そこで、複数の正常脳の(に近い)周囲脳を対象に経時的にも蛍光性をほとんど持たないプローブを選定した。今後同様の手法でさらに多くのプローブをスクリーニングすることが有用であると思われた。凍結検体および新鮮生標本を用いた腫瘍選択性の評価で、腫瘍検体により腫瘍選択性の高い(腫瘍>周囲脳となる)プローブの種類が異なった。また、この評価検討は手術症例の多寡に依存するが、H27年度は例年よりも症例数が少なかった。以上が要因の一部となり、有望なプローブを選定するに至らず、研究にも4か月程度の遅延が生じた。現在5-アミノレブリン酸(5-ALA)が悪性神経膠腫手術において保険収載され汎用されているが、偽陽性・偽陰性、術前内服投与・再投与不可などの限界がある。初年度に続き、悪性神経膠腫患者から得られた腫瘍検体を用いてプローブスクリーニングを行った。具体的には新鮮生標本および凍結検体ホモジナイズサンプルを用いて、治療上周囲の正常脳の切除が必要な症例では正常脳とのペアで、蛍光強度の時間的推移を解析し、腫瘍に特異性の高いプローブの選定を試みた。検体の腫瘍性・正常性を検証するため、使用した検体をパラフィン固定し、病理組織学的検討を加えた。初年度に使用した複数のプローブに加え、生体情報学教室で新たにライブラリーに追加された複数のプローブも適宜検討に加えた。正常脳で蛍光強度が上昇してしまうプローブを除外するべく、複数の正常脳の凍結検体ホモジナイズサンプルから正常脳ミックスを作成し解析を行った。悪性神経膠腫に特異的なEGFRvIII変異に関して、同タンパクに対する抗体医薬が変異を有する再発膠芽腫に対して有効であった。EGFRvIII変異を有する悪性神経膠腫を特異的に同定しうる蛍光プローブは診断および手術に有用であるため、U87細胞株を用いてin vitro実験を行った。U87にEGFRvIII変異を遺伝子導入した細胞株U87ΔEを用い、臨床検体の解析で有用性が示唆されたプローブをdishに加え、蛍光強度を観察した。さらにU87とU87ΔEのライセートを用いて蛍光強度の時間的推移を解析し、有意な差が見られるプローブを検索した。初年度の症例蓄積が予想を下回り、今年度も悪性神経膠腫患者から得られた腫瘍検体を用いて解析を続ける必要があったため、研究に遅延が続いた。今年度の下半期の手術症例数がまた通年を大きく下回ったため、有用と思われるプローブ候補のさらなる絞り込みができなかった。また、前述のEGFRvIII変異を有する悪性神経膠腫を特異的に同定しうる蛍光プローブを選定すべく、in vitro実験を新規に行ったため、研究に34ヶ月の遅れを生じた。神経膠腫の手術において、不明瞭な腫瘍境界の剥離により術後神経症状の悪化を来す危険性があり、安全かつ最大限の摘出を目指すにあたり、術中蛍光プローブによる腫瘍の可視化は有効である。現在5-アミノレブリン酸(5-ALA)が悪性神経膠腫手術において保険収載され汎用されているが、偽陽性・偽陰性、術前内服投与・再投与不可等の限界がある。

それゆえ本研究では、5-ALAを補完する局所噴霧にて診断可能な、脳腫瘍を特異的に標識する新規蛍光プローブの開発を目指した。まず、凍結した神経膠腫患者のホモジェナイズサンプルから、腫瘍ごとのミックスサンプルを作成した。次に、生体情報学教室で作成されたHMRGを蛍光母核とする、300種類を超えるペプチダーゼプローブライブラリーを用いて、腫瘍部位と周辺部位の蛍光強度を経時的に計測し、差異の大きいものから上位10%程度を有望なプローブとして選定する、というプローブスクリーニングを行った。また、昨年度までにはなく今回新規に作成されたプローブと、初年度・昨年度で選定したプローブとを合わせて、手術で得られた生検体へのスプレー実験を行った。なお、腫瘍の不均一性を鑑み、実験に用いた検体の細胞密度や壊死組織の有無を検証するため、生検体をパラフィン固定し、免疫組織化学染色を含めた病理組織学的検討を加えた。その結果、膠芽腫に対して有効なHMRGプローブとして7種類を選定した。さらに、安全性等を確認するための動物実験モデル作成のため、膠芽腫の細胞株U87を使用しSCIDマウスの同所性異種移植モデルを作成した。形成された腫瘍のホモジェナイズサンプルを用いて、先にヒト臨床検体を用いた実験で選定されたプローブの蛍光強度の推移を測定した。神経膠腫の安全かつ最大限の摘出には、術中蛍光プローブが有効で、5-アミノレブリン酸が保険収載され汎用されている。しかし偽陽性・偽陰性、再投与不可等の限界があるため、5-ALAを補完する局所噴霧にて診断可能な、脳腫瘍を特異的に標識する新規蛍光プローブの開発を行った。当科の神経膠腫の手術症例を用い、Hydroxymethyl rhodamine greenを蛍光母核に種々のアミノ酸を付加した約320種の蛍光プローブライブラリーから、凍結検体のホモジェナイズサンプルでスクリーニングを行い、さらに新鮮腫瘍検体に直接噴霧して蛍光強度の経時的変化を解析し、膠芽腫において有望な蛍光プローブを7種類選定した。さらに症例を蓄積し、様々なプローブで腫瘍選択性の評価を行い、スクリーニングする。スクリーニングするプローブの種類もさらに増やすことにより、有用なプローブの早期選定を目指す。また、ヒト腫瘍検体のみでのプローブスクリーニングでは検体数に限界があるため、U87やグリオーマ幹細胞株を用いたin vitroの実験も併せて行っていく。悪性神経膠腫に対し有用と思われる蛍光プローブ候補はいくつか選定されたため、今後の手術症例で前方視的検証を行っていく。どのプローブにしても、全症例で正常脳との対比において腫瘍を特異的に認識するわけではなく、それぞれのプローブについてそれが有用であった症例と有用でなかった症例とを分け、臨床情報の比較検討を行う必要がある。標的酵素タンパクが同定されているプローブに関しては、腫瘍検体での活性をウェスタンブロッティング等で検証する。低悪性度神経膠腫あるいは退形成性神経膠腫にはIDH遺伝子変異を高率に認めるが、これらに対しては5-ALAが総じて無効である。U87にIDH1変異を遺伝子導入した細胞株を用いて、低悪性度神経膠腫を認識しうる蛍光プローブの検索を行う。脳神経外科学腫瘍検体を用いたプローブスクリーニングは必須なプロセスではあるが、手術症例数に完全に依存してしまう。例年より症例数がやや少なかったことから、研究に4か月程度の遅延が生じ、細胞株を用いた実験などに遅延が生じた。