hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高血圧ワクチン実用化に向けたミニブタでの薬効評価-降圧治療の質的改善を目指して-

次世代医療としてワクチンを生活習慣病治療へ応用し、安全性の高い高効率な治療ワクチンの基盤技術開発・実用化を目的とする。我々は高効率に抗体産生を誘導する新規ワクチンシステムを開発しており、マウス・ラットにおいてアンジオテンシンIIを標的とした高血圧ワクチンの効果を明らかにしている。液性免疫主導の高血圧ワクチンを最初のテーマとして実用化を目指し、自治医大の先端医療技術開発センターでミニブタを用いた薬効評価・ワクチンに最適な無針注射器の開発を産学連携体制で行う。アンジオテンシンII(AngII)ワクチンにより高血圧ラットでの血圧の有意な低下、血中AngII濃度の低下、マウスへのAngIIの持続注入に対して心重量の低下・血管周囲の繊維化抑制が確認できている。マイクロミニブタを用いた2kidney1clip Goldblatt型腎性高血圧モデルでの検討を行った。ブタの麻酔下で腹部を切開し左腎動脈を剥離露出し、腎動脈に血流量測定用のプローブを装着し、矩形波電磁血流量計を介して腎動脈血流量を測定した。腎動脈にシルバークリップを装着し、腎動脈血流量を確認しながらシルバークリップ装着前より約90%減少するまで狭窄の程度を調整した。同時に頸動脈に送信機を埋め込み、1ヶ月間24時間血圧で観察したところ、高血圧の状態が維持できており、さらに日内変動の解析に必要な連続256心拍データが安定して取得できることが分かった。デバイスに関しては、株式会社ダイセルが開発中のプロトタイプのガス制御式無針注射器は、火薬の量を調節することによりマウス・ラットなどの小動物においても皮内・皮下・筋肉などの標的箇所に正確な薬液量を注入可能なデバイスである。それぞれ深さに到達できる設定の無針注射器を用いてマウス皮膚および筋肉にLuciferase遺伝子を局所発現させたところ、皮内投与設定での皮膚で最も効率よく遺伝子を発現させることができた。同様の結果はGFP遺伝子でも確認できた。今後は薬液量・濃度・火薬量を調整することで最適な無針注射器へと改良させていく。老年病、遺伝子治療
マーモセット運動ニューロンを用いたALS2原因遺伝子産物の分子機能解析

本研究は、ヒト及びヒトに類似性の高い霊長類の運動ニューロンを用いて作製したALS2タンパク質欠失細胞を用いてALS2タンパク質の機能を明らかにし、ALS2タンパク質機能喪失による神経細胞死や機能異常の分子背景を解明することを目的とする。そのための第一歩として、マーモセットALS2遺伝子を同定し、マーモセットALS2遺伝子を発現抑制するマーモセットESクローンのクローニングを行った。本研究は、ヒトに類似性の高い霊長類の運動ニューロンを用いて作製したALS2タンパク質欠失細胞を用いてALS2タンパク質の機能を明らかにし、ALS2タンパク質機能喪失による神経細胞死や機能異常の分子背景を解明することを目的とする。そのために本年度は、1.マーモセットES細胞の培養方法の確立、2.マーモセットES細胞の神経幹細胞及び神経細胞への分化誘導方法の確立、3.マーモセットALS2遺伝子のクローニング、4.マーモセットALS2遺伝子に対するノックダウンベクターの構築、を試みた。理化学研究所バイオリソースセンターより入手したマーモセットES細胞を用い、先行研究[Sasaki et al., Stem Cells. 2005]に従って、マーモセットES細胞の培養を行った。また、それらES細胞を用いて、ヒトES細胞を用いた神経幹細胞誘導方法を参考に、神経幹細胞の誘導方法を確立した。神経幹細胞からの各種神経細胞への分化誘導方法についても現在検討中である。次に、ES細胞から得たmRNAを鋳型に、マーモセットALS2遺伝子のcDNAクローニングを行った。cDNAクローンの配列決定を行い、マーモセットALS2遺伝子のコーディング領域についてDNA配列を決定した結果、マーモセットALS2遺伝子は、ヒトALS2遺伝子と同じく1657アミノ酸残基をコードし、そのアミノ酸配列は、ヒトALS2タンパク質のアミノ酸配列と98%一致していることが明らかとなった。さらに、pSingle-tTet-shRNA vectorを基本骨格として用いて、マーモセットALS2遺伝子を特異的に発現抑制するノックダウンベクターを構築した。現在、このベクターを用いてマーモセットALS2遺伝子をテトラサイクリン依存的に発現抑制することの可能なES細胞株の樹立に着手している。本年度は、1.マーモセットALS2遺伝子に対するノックダウンベクターの構築、2.マーモセットES細胞へのプラスミドベクターの導入方法の確立、3.プラスミドベクターのALS2遺伝子発現抑制効果の確認、4.マーモセットALS2遺伝子発現抑制ESクローンのスクリーニングを試みた。昨年度までに取得したマーモセットALS2遺伝子のコーディング領域のDNA配列情報をもとにpSingle-tTet-shRNA vectorを基本骨格として用いて、マーモセットALS2遺伝子を特異的に発現抑制するノックダウンベクターを構築した。pSingle-tTet-shRNAvectorの骨格にIRES配列の下流で、蛍光タンパク質mCherryを発現するDNAフラグメントを挿入し、ベクター骨格を改造した後に、現在ヒトALS2遺伝子に対して効果的に発現抑制効果を発揮するALS2遺伝子上の21bpと相同領域を挿入した。次に、プラスミドベクターをES細胞の導入するために、種々のトランスフェクション試薬を用いて、ベクターの細胞への導入条件を決定した。さらに、このベクターが蛍光タンパク質mCherryを発現し、さらには、ALS2の発現抑制効果を持つことを、構築したベクターをマーモセットES細胞に導入した後に、回収した細胞から抽出したタンパク質サンプルを用いたウエスタンブロット解析によって解析した。その結果、プラスミド導入効率が低いことに依存して、mCherryの発現及びALS2遺伝子の発現抑制効率は低かったものの、プラスミドベクターの導入によって、内在性ALS2タンパク質の存在量の減少が認められた。よって、今回構築したプラスミドベクターは、ALS2遺伝子に対する発現抑制効果を持つことが明らかとなった。現在、この改変を加えたプラスミドベクターを用いてマーモセットALS2遺伝子をテトラサイクリン依存的に発現抑制するES細胞株のスクリーニングを行っている。本年度は、前年に引き続き、1.マーモセットALS2遺伝子に対するノックダウンベクターの改変と構築、2.プラスミドベクターのALS2遺伝子発現抑制効果の確認、3.マーモセットALS2遺伝子発現抑制ESクローンのスクリーニングを試みた。昨年度までに構築したpSingle-tTet-shRNA vectorを基本骨格としたマーモセットALS2遺伝子を特異的に発現抑制するノックダウンベクターに加え、新たに、psiRNA-DUOを用いてノックダウンベクターを構築した。次に、このベクターが蛍光タンパク質EGFPを発現し、さらには、ALS2の発現抑制効果を持つことを、構築したベクターをマーモセットES細胞に導入した後に、回収した細胞から抽出したタンパク質サンプルを用いたウエスタンブロット解析によって解析した。その結果、EGFPの発現及びALS2遺伝子の発現抑制効果が認められた。

現在、このプラスミドベクターを用いてマーモセットALS2遺伝子をテトラサイクリン依存的に発現抑制するES細胞株の選定とそれらの細胞を用いた機能解析を行っている。
スポット冷却の高効率化に関する研究

1.3種類のノズル径(d=12,24,36mm)の自由噴流特性を測定し、従来の結果と一致することを確認した。いずれのノズルもコア領域は、ノズル径の約5倍であった。2.ターゲットになる円板は、9分割され、それぞれ独立のヒーターで等温条件になるように調節された。基準となる軸対称円形衝噴流熱伝達率は、従来の結果とよく一致した。3.以上の基礎実験の後、高さ41.9mm、底面半径7mmの円錐を岐点に設置し、噴口速度及びノズル円盤間距離を変化させて、局所熱伝達率を測定した。(1)円錐底面積に相当する平均岐点熱伝達率は、円錐の無い場合に比して約2.3倍の値を示した。(2)円錐端部以後では、熱伝達率は急激に減少し、平滑な円板の値の約1.1倍の値で相似な分布となる。(3)ノズル径が大きくなる程、円錐の効果は減少する。(4)ノズル円板間距離による円錐の効果は、大きくなく、若干距離が大きくなると低下する傾向を示す。4.円錐まわりの流れの状況を把握するため、壁面静圧分布を測定した。軸対称物体まわり特有の岐点近傍加速流れの影響によって、円錐母線上静圧は、円錐のない場合に比して逆の正の圧力勾配を示す。また円錐端部で、再び負の圧力勾配となる。これは、実測していないが、円錐端部でのはく離とそれに伴ううず形成を示唆するものである。現在円錐形状を変化させた実験を行っている。この実験終了後、円錐にフィンを取付けた実験を行い、最終的なまとめに入る予定である。
在日フィリピン人の労働・女性化・市民権――パブリック人類学と市民社会の可能性

今日のグローバル経済と日本の少子高齢化に伴う人口減少下、専門職・技術職の外国人人材の流入が提唱される文脈で、1在日と日比経済連携協定で来日するフィリピン人が、再生産労働に集中する状況を分析した。また、在日組の多くは夜の水商売で稼働したため負のレッテルが張られ二級市民扱いされることが多い。そこで、2そうした状況から脱却し社会上昇や市民権を得るための彼女・彼ら自身の活動と、彼女・彼らに対する国内外の非政府組織や市民社会の支援活動やその陥穽、および移民を取り巻く法や制度についても考察した。21年度の目的は大きく分けて二つあり、1.移住者のおかれた状況についての文献・資料収集と、(2)既知のインフォーマントと接触し、現在在日フィリピン人がおかれた社会経済状況についての知識を刷新すること、またそれと同時に、新たな支援団体・個人との接触することであった。(1)は、本調査に最も有用だと思われるフィリピン(アジア)系アメリカ人関係の資料収集ができ、加えて2月にフィリピン共和国でフィールドワークを行った際に、現地でしか調達が難しい資料を収集した。1.についても、今後協力を求められると思われるフィリピン人支援者・団体の拡大を図った。現在はこうした団体から調査協力が得られるようラポートづくりをしている。また、経済連携協定で来日した介護福祉士候補者で東京で日本語教育を受けたものについては、滞在先を訪問することができ面識ができたので、今後の接触への足がかりとなるよう引き続きコンタクトを続ける予定である。22年度は1の資料を分析しつつ、新たに接触が叶ったフィリピン人コミュニティへの浸透を試みる。本年度は、数的にはまだ多くはないが、介護者ならびに英語教師を中心にインタビューと一部社会経済生活に関する参与観察を行い、彼女・彼らが抱えている問題を掘り起こすことができた。また、近年上昇している在日フィリピン女性のフィリピンからの連れ子、あるいは2008年の国籍法改正により来日しはじめたフィリピン人同士と、フィリピン人の母と日本人の父から生まれた子ども・若者の動向についても参与観察を行った。来年度以降は、このような接触を進化させる予定である。これ以外の調査では、10月末から11月初めにかけ、アテネ市で行われた世界各地からの移住者が一堂に会した会議で発表し、意見交換・情報収集を行った。2月にはフィリピン共和国マニラ市とセブ市を訪問し、日本への移住あるいは移住労働を目指す人およびその支援者にインタビューを行った。2009、2010年度は、フィリピン人移住者に関する文献資料収集と、研究者・移住者の支援者との意見交換を国内各地と、韓国、台湾、米国、ギリシャで行った。ギリシャでは、フィリピン人を中心とした移住者の支援者や研究者が世界中から集まり(g-c-7-2学会発表11参照)、多様な視点に接触する機会を得た。2010年からは、同様の調査をしている高畑幸氏(広島国際学院大学)を共同研究者として迎え、日本各地で展開しているフィリピン人雇用の状況把握のためのデータ収集を拡充できるようにした。国内のフィールド調査は、主として英語教師、介護者(在日及び経済連携協定=EPA)と、後者の支援者・雇用者を中心にインタビュー、参与観察、ラポール形成を行った。介護者に関しては、多様な受入れ経路についての知見を得られ、また、在日と来日の日本の国家資格取得に向けた方策について情報を得ることができた。とりわけEPAの受入れについては、関西圏の受入れ先が積極的に支援をしていることが判明し、こうした団体との一定のラポール形成ができた。福祉業界の閉鎖性が指摘される中で、このラポール形成は重要である。EPAは現在進行中であり、今後もこうした団体とそこで研修中の介護者の実態について、より詳細なデータ獲得の努力を続ける。また、EPAとは別にフィリピンから日系人や在外日本人を介護者・一般労働者として呼び寄せる動きが活発化していること分かったので、こうした動きにも注目していく。英語教師については、首都圏で長期にわたり言語指導・教材販促に関わるフィリピン人と接触することに成功した。こうしたリーダー的存在が英語教師養成の牽引者となっていることが判明したので、今後もこれらの人物と連携しながら調査を進める。また、在日フィリピン人の子どもが多数フィリピンから来日・就労していることが明らかになってきているので、今後はこうした子どもの労働にも着目していく予定である。23年度の中心的な調査は、在日フィリピン人介護者および日比経済連携協定(EPA)で研修中の介護福祉士候補者に加え、英会話教師当事者と関係者の動向を把握することにあった。在日介護者について聞き取り調査を行うとともに、EPAの介護者については、契約上や個人的な問題が表面化し出しており、本人への状況の確認や雇用者に対しても聞き取りを行った。また、毎月行われているEPAでフィリピン人を雇用している福祉施設及び(専門)日本語教育担当者による研究会に参加し、情報収集にあたった。EPAを途中辞退した介護福祉士候補者とも接触をした。

在日の介護者については、状況にあまり進歩がみられず、むしろ離職が目立ち始めている。フィリピン人は「介護に向いている」と一般に表象されているが、そうではない実態を把握でき、考察を深める材料となっている。英語教師については、3.11の震災以降いわゆるネイティブ・スピーカーが大量に帰国したことに伴い、フィリピン人を雇用する機関が増え、当事者同士の研修やNPO設立なども活発化している。教員へのインタビューはまだあまり出来ていないが、連絡先や勤務先の状況は把握できたので、今後調査を進めていく。家事労働者については、家庭内での従事のため接触が難しいので、今後も引き続き接触に努力する。以上の他に、近年は在日フィリピン人女性の子ども(連れ子)が来日するケースが増加していることが明らかになり、こうした若年者の就労や就労のための教育や研修の状況なども今後調査していく予定である。平成25年度の調査概要は、これまでの調査に加え、第三世界出身の女性に貼られ、移住女性の就労や「女性化(周縁化)」を強化し「二級市民」化を図る負のラベルの軽減、阻止、改善することに尽力する市民社会、とりわけ同胞支援者に注目し、支援の内容や方向性、問題点について聞き取り調査を行った。本年度は、2011年3月の東日本大震災の被災者となったフィリピン人住民に対し、活発に行われてきた同胞支援者の活動(英語教育)と移住者の動向を中心にデータを収集した。また、在日フィリピン人の実子で、日本人またはフィリピン人の父を持つ子ども世代の中で、近年来日した者への接触も試みた。この中でも日本人の父を持つ子どもの来日は2008年の法改正と連動していることが多いが、この流れに加え、戦前の日本人移民の末裔で日系人(2世、3世、あるいは「世代格上げ」による2世、3世)と認定される者の流入が加速しているように思われることから(統計には反映されないため現場知による)、これまでよりも歴史的な連続性に着目した日系人の労働状況や自立、日本国籍・市民権について、同胞支援者を含む移住者の受け入れ側と移住者自身の認識が同様なのか、また、移住者自身の考えに照らし「女性化」あるいは「市民権」という概念や分析枠組みが妥当性なのかを測ることを試みた。上記以外では、経済連携協定で来日した第1陣の介護福祉士候補者について、24年度末の国家試験をもって一区切りとなるため追跡調査を試みた。さらに、25年度は最終年度であることから、研究協力者とともに該調査者にとって最も適切な知の還元のあり方についても検討した。2012年度の目的は、2011年の東日本大震災後の在日フィリピン人社会の変化を含む動きならびに震災とは別の新たな潮流を含めたデータ収集を行うことにあった。その理由としては、在日フィリピン人社会(市民社会)の支援活動が、これらで堅調にみられたことに柔軟に対応するためである。国内のフィールド調査では、フィリピン人移住者の中で、継続して英語教師、介護者(在日及び経済連携協定=EPA)と、後者の支援者・雇用者と接触し、データの拡充を行った。特筆すべきは、3.11震災後にフィリピン人コミュニティが同胞被災者への就業支援が活発化したことを受け、当事者と同胞市民社会の動きを視野に入れつつ調査を行った。
中国語のディスコースに関する基礎的研究

本研究は、将来的な中国語デイスコース論の構築のために、基礎的な作業と理論的な検討を進めることを目的にスタートした。デイスコース("談話"とも称される)という観点からの言語研究は、文レベルの文法研究(統語論)の形式主義、抽象主義による限界を見極めた上で近年盛んになった研究分野であり、言語主体のありかた(思考、主観)、言語環境(文脈)、言語使用の背景(文化・社会)などへも目を向けて言語を捉えようとする立場である。中国語でも近年、デイスコース研究への関心が増しているが、本格的な研究はこれからといった段階である。当該期間中に行われた本研究の実際とその成果は以下のようにまとめることができる。本研究ではデイスコースを、表現内容の上でまとまりをもつ複数の文の集合体と捉え、その使用実態と機能を観察した。実際の発話からデータ(音声データおよびそれを文字化したデータ)を収集し分析するという実証的な方法をとった。まず、デイスコースというまとまりを成立させる代表的な手段として、連接語について観察した結果、ごく限られた連接語(因果、逆接など)の目立った多用があり、さらに因果関係を表す連接語の調査を進め、作用域の広さ、多重的な因果関係、表現類型の選択使用と話題の展開のしかたとの関わりを分析、さらには、本来の意味(因果関係の表示)を失い、発話を単に繋いだり終結させたりする機能が見られた。このように実際のデータの中での連接語は、談話の継続、展開、終結などに密接に関与していることから、デイスコース標識として再認識されるべきであろう。本研究ではまた、シナリオのせりふにおける人称代名詞の使用実態を調査し、登場人物間のコミュニケーションのありかたと人称代名詞の選択使用の相互関係を明らかにした。また、声調という音声的特性について、そのピッチの変動を、個別言語、発話主体という両者の面から観察・分析した。なお、残された課題も多い。特に、デイスコースと「視点」の関係性、主題展開の方式につての研究が成果を出せぬまま現在に至ったことが残念である。今後は、これらのテーマについて研究を継続していく計画である。本研究は、中国語のディスコース論の本格的な構築を目指しながら、そのための基礎的作業および理論的検討を進めることを目的としている。本年度は、購入した『当代北京口語語料』(102名のモノローグ録音データ及びその文字化データ)の文字化データの中からディスコースを単位として抜き出して、その確定作業を進めた。それから、ディスコースの結束性の調査の一環として、前後の節(文)を論理的に関係づける連接成分について、その形式と分布状況を調査した。中国語は特に口頭語において連接成分の使用が少ないと言われているが、収集したデータを見ると、限られた連接成分(特に因果、転折などを表すもの)は、予想外に多用されていた。さらにこれらの成分の出現については、たとえば因-果-因のように、何らかの反復パターンをとりやすいことや、情報の新・旧の差との一定の対応が認められることなど、ディスコースの視野からの観察による特有の性質が見られた。本調査はデータの整理を終え、目下投稿準備中である。また、ディスコースの中の照応現象について、シナリオのせりふの中の人称代名詞の使用特性を調査して発表した。

一方、音声分析では、声調言語のピッチ変動について、言語間の差と個人差という二通りの個別性に着目した論考を発表したが、来年度はこの成果をふまえて、本研究で談話文法分析を経たデータについて音声分析を加え、両分析の結果をつきあわせて、照応、関連を調べる。談話文法分析の立場からは来年度は、主題の設定・展開を中心に分析を進め、あわせて、清代北京語語料『紅桜夢』を用いての通時的な調査に入る予定である。本研究は、中国語デイスコース論の構築を目標に、基礎的な作業および理論的検討を進めることを目的としている。昨年来、自然な発話を収録した『当代北京語口語語料』(102名の発話の録音データと文字化データ)を材料として、デイスコースの結束性に焦点をあてて連接語の抽出・整理を進め、その形式と分布状況を調査したが、本年度はその結果の一部を論文にまとめて発表した。その概要は、中国語(特に口語)では使用が少ないと従来言われてきた連接後が、実際の自然な発話では予想外に多用されていること、その中でも逆説、因果などを表す限られた種類が目立って多いことを指摘した。そして因果を表す代表とされる“因為"と“所以"をとりあげて、その提示順序の違いによって表現類型を整理し、それぞれの型(原因・理由ー>結果・帰結型と、結果・帰結ー>原因・理由型)が談話の中で選択使用される要因を明らかにした。特に、後者の型は、談話の流れの予測に反するような内容や、話し手の判断、評価、意見などが提示されたときに選択されやすい型であることを例証した。また、因果句の中には、その内部で因果関係を完結しているものばかりでなく、その前後の句との間にさらにもう一つ別の因果関係を形成しているようないわば二重の因果句が広く見られるなど、文脈を取り込んだ視点から因果句を見直した。今年度はこのほか、次の(1)、(2)の項目についてデータの抽出と整理を進めた。(1)“只〓"(“只听")について、時間・空間・知覚の三者の結合による語りの標識という観点からデイスコースにおける機能を考察する。(2)“〓"“〓"“〓"など提題化の機能をもつ助詞をとりあげ、デイスコースの文節化について調査する。現在、両項目ともデータの整理はほぼ完了し、投稿の準備にかかっているところである。本研究は、中国語ディスコース論の構築を目標としながら、そのための基礎的な作業および理論的な検討を進めることを目的としている。昨年は、ディスコース(談話)の結束性という観点から連接語を取り上げ、中でも使用頻度の顕著に高い"因為"と"所以"の呼応表現の諸類型について、それらの選択使用の要因を明らかにした。本年度は、昨年度の研究を発展させるかたちで、"所以"が単独使用される場合を取り上げ調査した。その結果、"所以"の使用範囲の広さ(隣接句から相当隔たった句までを作用範囲とする)、及び、因果関係の重層性(二重、三重等の因果関係)という顕著な特徴が見られた。また、"所以"には、主張・判断・推論などの根拠を導く、話題終結の前触れとして働く、単に発話を繋いでいくなどの派生的機能が広く見られた。このように、広い作用域を有し、談話の階層性に適合し、談話の継続や終結を導く機能をもつ等の諸特徴から考えると、"所以"は、従来論じられてきたような狭い範囲内での連接標識であることを超えて、より談話的な標識として再確認されるべきであろう。
組織における血液型の生合成に関する研究

我々は、組織に於ける血液型物質の生合成に関する研究を行い次の結果を得た。1)ホルマリン固定後パラフィン包埋したヒトおよび動物組織に存在する血液型物質の糖鎖構造をエクソ・グリコシダ-ゼおよびエンド・グリコシダ-ゼを用いたレクチン染色法および免疫学的染色方法で決定した。組織切片におけるA,BおよびH物質の分布を既述の方法で決定した。2)血液型物質の生合成は癌化した大腸組織において極めて活性が高かった。しかし、癌化した扁平上皮細胞および腺細胞は全く血液型物質を産生しなかった。これらの結果は、AおよびB遺伝子が内因子および外因子によって不活性化されていることを示すものである。3)我々は血液型物質のモザイクおよびキメラ現象を証明する実験モデルをつくった。そのモデルを使うことによって、組織内における異なった血液型物質の存在と分布のパ-セントを調べた。我々はこのモデルを用いることによって組織の分化の間にどのステップで異常なクロモゾ-ムが生じたのかを知ることが出来る。4)我々の方法は異型輸血の診断に有役である。
ヒト膵癌における転移と抗癌剤耐性獲得メカニズム：多光子励起蛍光顕微鏡による解析

本研究は、抗癌剤耐性を示し悪性度が高い膵癌に関して、転移・再発過程における腫瘍の動態、遺伝子発現の経時的変化を多光子励起蛍光顕微鏡によるイメージング技術をもとに解析を行うものである。膵癌関連遺伝子(hTERT, SAMD4/DPC4,k-rasほか)、抗癌剤Gemcitabineに対する代謝・transporter蛋白のイメージング発現解析、ならびに腫瘍溶解性組み換えウイルスによる抗癌剤感受性増強を目的に遺伝子導入を試み、膵癌動物モデルを作成。プラスミッドDNAをトランスフェクションし、膵臓癌細胞株においてのHPCコンストラクトのプロモーター活性の増強後、遺伝子治療のためのヒト膵癌標的腫瘍溶解性組換えOncolytic poxvirus (poxvirus-GFP/PRFコンストラクト)の構築を行った。プラークアッセイによる組み換えウイルス力価の評価で、ベクターによる蛍光タンパクの発現を確認した。ヒトhTERTをプロモーターとするアデノウイルスベクターにGFPを組み合わせ腫瘍特異的に発現するベクターを作成。本ベクターを使用したin vitroでの検討で膵癌細胞に効率的に発現することを確認した。新規バイオマーカーとしてCirculating tumor cells (CTCs)、CTCs由来の遺伝子変異の測定を試みた。当科で行った膵癌に対する膵頭部切除105例に関し、血漿中の腫瘍細胞由来KRAS遺伝子変異をdroplet digital PCRを用いて検出。31%(33例)からctDNAを検出し、ctDNA陽性例は、有意に予後不良(MST 13.6 vs 27.6M)であった。膵癌動物モデルにおいて、転移プロモーター候補のGene chip解析を行い、いくつかの候補遺伝子を特定しているin vivoモデルにおいて多光子励起蛍光顕微鏡での解析により、転移形成の過程を描出できた。本研究は、ヒト固形がんの中でも特に抗癌剤耐性を示し悪性度が高い膵癌に関して、転移・再発過程における腫瘍の動態、遺伝子発現の経時的変化を多光子励起蛍光顕微鏡によるイメージング技術をもとに解析を行うものである。平成26年度は、膵癌関連遺伝子(hTERT, SAMD4/DPC4)、抗癌剤Gemcitabineに対する代謝・transporter蛋白のイメージング発現解析、ならびに腫瘍溶解性組み換えウイルスによる抗癌剤感受性増強を目的に遺伝子導入を試み、膵癌動物モデルを作成することを目的とした。初年度研究計画に従い、プラスミドDNAをトランスフェクションし、膵臓癌細胞株においてのHPCコンストラクトのプロモーター活性の増強後、ヒト膵癌標的腫瘍溶解性組換えOncolytic poxvirus (poxvirus-GFP/PRFコンストラクト)の構築を行った。プラークアッセイによる組換えウイルス力価の評価を行い、ベクターによる蛍光タンパクの発現を確認している。これまでの当研究室では、アデノウイルスベクターを使用した特定の遺伝子導入の実験を行っているが、今回、ヒトhTERTをプロモーターとするアデノウイルスベクターにGFPを組み合わせ腫瘍特異的に発現するベクターを作成した。現在、本ベクターを使用し、膵癌細胞株にGFP/RFP遺伝子に導入するin vitroでの検討を行っている。平成26年度当初研究計画では、膵癌マウスモデルの作成まで行うこととしていたが、GFP腫瘍特異的ベクターの作成に時間を要したため、in vivoモデル作成にまで至っていない。また、動物モデルを使用した、転移プロモーター候補のGene Chip解析が未施行の状況である。in vivoモデルについては、これまでの当研究室のノウハウがあるため、平成27年度中に研究全工程は終了可能と考えている。平成26年度に使用予定であった、膵癌動物モデルの転移プロモーター候補のGene Chip解析を施行。多光子励起蛍光顕微鏡を利用したin vivoモデルでの転移巣形成イメージング解析を行う。

可能であれば、ヒトhTERTをプロモーターとなるアデノウイルスベクターにてGFPまたはRFPを腫瘍特異的に発現させ、腫瘍の血管内での移動・生着をイメージング解析を行う。また、異なる種の癌細胞株を利用し、転移巣形成の差異、特に転移・再発におけるclonalityを検討、血中に遊離している蛍光ラベルした腫瘍細胞(CTCs: circulating tumor cells)を測定し、生存率・抗腫瘍効果、転移形成能との関連を解析、血中CTCの測定が転移再発の早期診断のバイオ・マーカーとなるか検討する。ヒトhTERTをプロモーターとなるアデノウイルスベクターにGFPを組み合わせ腫瘍特異的に発現するベクターを作成に時間を要し、当初予定していた遺伝子導入した膵癌細胞株の移植による膵癌動物モデルの作成が行えなかったため。次年度分として生じた使用額については、平成26年度計画としていた膵癌動物モデルの作成に充てる。Gene Chip microarray法と定量RT-PCR法により、転移プロモーター候補の探索、抗癌剤耐性化に関連するgemcitabine代謝・transporter gene (hENT, TS, DPTなど)の発現状況について解析を行う。
学外学位とマルチメディア遠隔高等教育の統合的発展に関する総合的研究

本研究では,日本及びアメリカを中心とする欧米における学外学位制度及びマルチメディア遠隔教育の発展動向について検討し,特に欧米で起きている両者の融合事例について,その背景,制度,システム,発展可能性の分析を行い,その分析を通じて特にその統合的な発展がもたらす接近の容易性(アクセシビリティ)と高い質の両立の可能性,及びその条件について研究した。研究では,日本及び欧米の学外学位制度とマルチメディア遠隔高等教育の展開について,特に両制度の融合の点で注目すべき事例であるアメリカにおける学外学位機関であるトーマスエジソン大学やリージェント大学のインターネット活用学位課程,西部諸州の協力によって構築中のバーチャル・ユニバーシティであるウエスタンガバナーズ大学,カリフォルニア州のバーチャル・ユニバーシティ構想,通信衛星を利用したナショナル・テクノロジカル大学,成人をターゲットに全米最大規模の大学に成長しているフェニックス大学,有力大学が本格的な情報技術の遠隔教育利用に乗り出したことで注目を集めているスタンフォード大学の工学プログラム,イギリスにおける公開大学のマルチメディア利用,ロンドン大学学外プログラムの遠隔学習の導入,カナダのバーチャル・ユニバーシティ構築ソフト等について調査を行った。また,アメリカの学外学位課程実施大学について,そのマルチメディア利用の進展状況等を把握するためのアンケート調査を実施した。この間,専門分野や文化的社会的背景による特徴,制度システムと理論的状況について研究会を開催するとともにインターネットによる研究用ウェブサイトを通じて情報交換を行い,資料収集と分析を進めた。このように,本研究では,学習評価とメディア教育の両領域において具体的な事例研究を行うことにより,おのおのの領域における理論的,実証的な研究を展開したものである。本研究では日本とアメリカを中心とする欧米における学外学位制度及びマルチメディア遠隔教育の展開動向について検討し,特に欧米で起きている両者の融合事例についてその背景,制度,システム,発展可能性の分析を通じて,特にその統合的な発展がもたらす接近の容易性(アクセシビリティ)と高い質を両立の可能性およびその条件について研究することを目的としている。平成9年度は、3年計画の1年目として、日本及び欧米の学外学位制度とマルチメディア遠隔高等教育の展開について全般的な把握を行うとともに、特に両制度の融合形態に注目し、最も理論的及び実践的で発展可能性のある事例を抽出する作業を行い、注目すべき事例としてアメリカにおける学外学位機関であるトーマスエジソン大学やリ-ジェント大学のインターネット活用学位課程、西部諸州の協力によって構築州のバーチャル・ユニバ-シティであるウエスタンガバナ-ズ大学、カリフォルニア州のバーチャル・ユニバ-シティ構想、イギリスにおける公開大学のマルチメディア利用、ロンドン大学学外プログラムの遠隔学習の導入等をみいだした。特にウエスタンガバナ-ズ大学については能力分析理論と標準テストが、イギリス公開大学については認知理論がその展開に貢献していることから、今後の研究の重点として浮かび上がってきた。また、研究用のウェブサイトを構築し、メディアを活用した資料収集、研究交流、調査の条件を整え、平成10年度の本調査の基礎を確立した。本研究では日本とアメリカを中心とする欧米における学外学位制度及びマルチメディア遠隔教育の展開動向について検討し,特に欧米で起きている両者の融合事例についてその背景,制度,システム,発展可能性の分析を通じて,特にその統合的な発展がもたらす接近の容易性(アクセシビリティ)と高い質の両立の可能性およびその条件について研究することを目的としている。平成10年度は、3年計画の第2年度として、日本及び欧米の学外学位制度とマルチメディア遠隔高等教育の展開について全般的な把握を行うとともに、特に両制度の融合形態に注目し、最も理論的及び実践的で発展可能性のある事例について、アメリカにおける学外学位機関であるトーマスエジソン大学やリージェント大学のインターネット活用学位課程、百部諸州の協力によって構築中のバーチャル・ユニバーシティであるウエスタンガバナーズ大学、カリフォルニア州のバーチャル・ユニバーシティ構想、通信衛星を利用したナショナル・テクノロジカル大学,成人をターゲットに全米最大規模の大学に成長しているフェニックス大学,有力大学が本格的な情報技術の遠隔教育利用に乗り出したことで注目を集めているスタンフォード大学の工学プログラム,イギリスにおける公開大学のマルチメディア利用、ロンドン大学学外プログラムの遠隔学習の導入,カナダのバーチャル・ユニバーシティ構築ソフト等について調査を行った。

また研究用のウェブサイトを構築し、メディアを活用した資料収集、研究交流条件を整え、またアメリカの学外学位機関に対するアンケート調査の準備を行った。本研究では日本とアメリカを中心とする欧米における学外学位制度及びマルチメディア遠隔教育の展開動向について検討し、特に欧米で起きている両者の融合事例についてその背景、制度、システム、発展可能性の分析を通じて、特にその統合的な発展がもたらす接近の容易性(アクセシビリティ)と高い質の両立の可能性およびその条件について研究することを目的としている。平成11年度は、3年計画の最終年度として、日本及び欧米の学外学位制度とマルチメディア遠隔高等教育の融合の可能性について総括となる調査研究を行うことを目的とした。10年度までに蓄積された、アメリカのトーマスエジソン大学、リージェント大学などの学外学位機関でのインターネット活用学位課程、西部諸州が共宰するウェスタン・ガバナーズ大学やカリフォルニア・バーチャル・ユニバーシティといったバーチャル・ユニバーシティの展開状況、通信衛星を利用したナショナル・テクノロジカル大学、あるいはイギリスにおける公開大学のマルチメディア利用、ロンドン大学学外プログラムの遠隔学習の導入等に関する情報から得られた総合的な知見をもとにアメリカの学外学位機関に対するアンケートを行い、学外学位プログラムそのものの現状と、それらプログラムにおけるメディア利用の状況を調査した。またこの調査に当たっては10年度に構築した研究用のウェブサイトをさらに展開させ、情報の収集と提供にあたった。
肺切除術が骨髄由来細胞を介して代償性肺再生、創傷治癒に影響する機序の解明

左肺全摘術により末梢血中に動員された骨髄由来細胞(BMC)が創部に集積し、術後早期の創面積の縮小・創間距離の短縮に寄与したことがわかった。そのメカニズムとしては、BMCが筋線維芽細胞や血管内皮細胞に分化した可能性が考えられる。また、左肺全摘後の残存肺に集積した骨髄由来細胞は、肺胞上皮細胞、血管内皮に分化する、もしくは骨髄由来細胞によるパラクライン効果により、肺組織再生に寄与していることが推測される結果であった。また、代償性肺成長肺には肺損傷の機序が存在することが推測され、骨髄由来細胞は代償性肺成長時の残存肺に集積し組織修復に関与している可能性も考えられた。C57BL/6マウスを用いて左肺全摘により残存肺に代償性肺成長を誘導した。左肺全摘後7日目の残存肺において肺胞壁面積や肺胞密度に有意な変化を認めなかったが、肺乾燥重量比、肺容量比、肺湿乾重量比の有意な増加を認めた。術後7日目の代償性肺成長肺の組織変化として、肺実質の増加、肺胞密度の上昇、肺浮腫が示唆された。GFP陽性骨髄細胞を移植した骨髄キメラマウスを用いて代償性肺成長時のGFP陽性細胞の関与を評価した。左肺全摘により残存肺へのGFP陽性細胞の集積増加を認めた(Sham開胸と比して2.1倍,P=0.001)。それらのGFP陽性細胞のうち、肺胞上皮細胞様に形態変化しているものが有意に集積をしていた(P<0.0001)。左肺全摘後の残存肺組織内のSDF-1α濃度を経時的に測定したところ、左肺全摘後7日目の残存肺のSDF1α濃度はSham開胸群と比べ1.4倍に上昇した(P<0.05)。骨髄由来細胞の残存肺への集積抑制の目的にCXCR4アンタゴニスト(AMD3100)を術後7日目まで持続投与し、代償性肺成長に対する影響を評価した。投与(AMD3100持続投与)すると、骨髄由来細胞の集積が有意に抑制された(P<0.05)。また投与群は非投与群(PBS持続投与)と比較すると、術後14日目での肺乾燥重量比が10%の低下することを認めた(P<0.05)。今回の研究では、集積した骨髄由来細胞は、肺胞上皮細胞、血管内皮に分化する、もしくは骨髄由来細胞によるパラクライン効果により、肺組織再生に寄与していることが推測される結果であった。本年度は肺切除が骨髄由来幹細胞を介して創傷治癒に関与しているか否かを検証した。C57BL/6マウスに対して左肺全摘術を行い、骨髄由来幹細胞(BMSC)であるc-kit陽性細胞は術後24時間で有意に増加していた(P<0.05)。続いて、GFP骨髄キメラマウスを作製し、その8週間後に左肺全摘術を行った。左肺全摘を行った群をSurgery群、開胸のみを行った群をSham群とし、創傷治癒モデルとしてマウスの背部に3mm大の円形皮膚切除を行った。BMSC集積阻害薬であるAMD3100を投与したものと、対照としてPBSを手術前後に合計3回の腹腔内注射を行った。創面積を隔日で測定し、術後3・7・14日目に創部を採取し、組織学的評価を行った。術後3日目に創部に集積したBMSCはSurgery+PBS群はSham+PBS群と比較して有意に増加し(P<0.05)、Surgery+AMD群はBMSCの集積が阻害されていた(P<0.05)。創面積に関しては、Surgery+PBS群は手術後3日目に他の群と比較して有意に縮小していた(P<0.05)。創傷治癒に関与する線維化に関わる筋線維芽細胞をαSMA陽性細胞、血管新生に関わる血管内皮細胞をCD31陽性細胞として評価したところ、術後14日目においてBMSCが各々の細胞に分化していた。今回の研究では、左肺全摘術により末梢血中に動員されたBMSCが創部に集積し、術後早期の創面積の縮小・創間距離の短縮に寄与したことがわかった。そのメカニズムとしては、BMSCが筋線維芽細胞や血管内皮細胞に分化した可能性が考えられる。創傷治癒に関しての実験は終了し、代償性肺再生の実験を開始している平成24年度の研究は、肺切除後の代償性肺再生時に骨髄由来肝細胞が関与するか否かを解明することを目的とする。

1)骨髄由来細胞の残存肺に対する集積についてケモカインの同定、並びに残存肺へのGFP陽性細胞の集積の有無について評価する。2)CXCR4拮抗薬であるAMD3100を用いて、骨髄由来幹細胞の肺への集積を抑制し、残存肺の肺重量測定、代償性肺成長に関わる因子を組織学的に評価する。
在沖縄米軍基地跡地利用に関する研究：地域経済社会の持続可能な内発的発展を視座に

沖縄県の中南部都市圏に所在する大規模な米軍基地で返還が予定されている。他方、返還後の跡地利用を円滑に進めるには、1)地権者の経済的不安、2)跡地利用計画の不在、3)沖縄県全体のマクロビジョンの中での跡地の位置づけ、4)国による財政支援の基本的枠組み、5)当該自治体の役割、6)地権者の合意形成の困難、など課題が山積する。本研究では、次の2箇所の大規模跡地における再開発を中心に跡地利用の手法を検証した。第1は、北中城村に所在する旧アワセゴルフ場跡地である。第2は、浦添市に所在するキャンプキンザーの一部で始まった再開発である。従来型の跡地利用開発との比較から持続可能な発展モデルを見出すことを試みた。平成26年度は、沖縄本島中南部都市圏で行われた旧米軍基地における跡地利用の実態調査を行った。平成22年に返還された北中城村に所在する旧米軍施設アワセゴルフ場の跡地に、平成27年4月、大手流通資本が県内最大規模の大型商業施設を建設し、跡地利用の主要な再開発プロジェクトが完了した。沖縄県によると、これまで沖縄県内で行われた過去の基地跡地利用では、返還から再開発完了までに平均20年の歳月が費やされているが、旧アワセゴルフ場の跡地では、返還から5年でこれらの事業が行われた。再開発事業の主体となった地権者は、「地権者利益の確保」を最優先課題として当該事業を計画、推進した。その結果、地権者が再開発のパートナーとしたのは、資金力があり、従来の沖縄にはない大規模な商業施設を作ることができる大手流通資本であった。この開発過程からは、基地跡地での再開発における地権者の負担の大きさなど、跡地利用における構造的な問題が浮かび上がってくる。他方、北中城村に隣接する沖縄市や北谷町などの既成商業地は、直線距離5km以内に大型商業施設が登場するために、それぞれの地域特性を活かした対策を取り始めたが、客足が落ち込むことは必至で影響の大きさは計り知れない。この事例は、本研究の目的である、1)中南部都市圏で行われた商業型の跡地利用の実態を把握する、2)当該跡地利用によって地域社会がいかに変容したかを読み解く、等の諸点を明らかにし、基地跡地で行われる大規模な再開発における公共政策の課題を浮き彫りにした。平成27年度は平成26年度に引き続き、沖縄本島中南部都市圏に所在する旧米軍基地の跡地で行なわれた再開発を調査対象とした。主な対象期間は196070年代とした。当時、日本本土は高度経済成長期にあり成長著しかったことに比して、米軍統治から本土復帰へと移行した沖縄では、生活空間を再建するための社会インフラ整備が必要であった。こうした時代背景もあり、この時期に中南部都市圏で返還された米軍基地の跡地では、返還後の土地を住宅地として活用した例が比較的多いことが明らかになった。このような事例から、研究対象とした時期が、基地跡地利用が始まった初期の段階であったと位置づけた。この結果から、本研究の目的の一つである、「当該跡地利用によって地域社会がいかに変容したかを読み解く」他の諸点を確認することができた。平成27年度は、6月に新しい所属機関に移籍し、着任大学で新設される計画が進んでいたライティングセンターの運営委員として新しい組織の立ち上げを任ぜられた。このため、通常の業務に加えて、ライティングに関する先進的な取り組みを行なう国内外の大学の視察や、同センターの運営管理システムを構築するという業務に取り組まなければならず、業務に忙殺された。その結果、研究計画の着実な遂行が想定を越えて困難となり、予定していた実態調査や関係者からのヒアリングを十分に行なうことが出来なかった。他方、本研究課題と関連の深い研究会へは出来うる限り積極的に参加し、有用な示唆を得ることができた。また、196070年代に作成された行政資料や書籍の収集については、昨年度の遅れを一定程度取り戻すことができた。全体として計画通りの遂行が難しく遅れが生じたが、研究成果の一部は大学紀要(査読付)に掲載された。平成28年度は、那覇市と浦添市を主な対象地とした。那覇市おもろまち地区は通称那覇新都心と呼ばれ、基地返還後に県都那覇市の新しい中心市街地となった空間である。那覇市のベッドタウンとして発展してきた浦添市もまた、大規模な米軍基地(キャンプ・キンザー)を抱えるが、2015年に日米によって2025年以降の全面返還が決まった。1980年代以降に沖縄県の人口と産業が集中する沖縄本島中南部都市圏で行われた基地跡地利用の特徴は、都市部に出現した広大な空間に、外部資本による大型商業施設を誘致する再開発の手法を取ったことである。その代表例が那覇市おもろまち地区の跡地利用である。沖縄県の試算によると、那覇市おもろまち地区の返還後の直接経済効果は、返還前の52億円から返還後は1634億円となり32倍に拡大した。他方、返還が決まっている那覇市の北西に隣接する浦添市に所在する米軍基地(キャンプ・キンザー)は、那覇市おもろまち地区と同じ商業圏内にあり、返還後は大規模な商業型開発が行われることが計画されている。

ヒアリング調査の結果、先のおもろまち地区の地権者達は、同じ商業圏内で同様の再開発が行われることによって、当該地区が空洞化する恐れがあると大きな不安を抱えていた。そのため、県全体の長期のマクロビジョンとしての米軍基地跡地利用計画が不在であるとして、県および地元自治体による計画的な公共政策の必要性を指摘する。また、これから再開発が始まる浦添市でも、返還後の地域への効率的な経済波及効果を生み出すためには、どのような跡地利用計画が持続可能であるのかを模索していることが明らかとなった。那覇市、浦添市で行った今年度の調査から、都市部で行われる大規模な再開発計画における公共政策の困難さが浮き彫りとなった。平成28年度は、所属大学に新設された学習支援施設であるライティングセンターの運営を担当することとなったため、同センターでの教育活動が中心となった。このため学期期間中は、同センターの組織づくりなどの運営業務に忙殺された。また、春期、夏期の大学が長期休業する期間は、同センターで活動するチューター育成を行わなければならず、調査等のためにまとまった時間を確保することが困難であった。その結果、予定していた実態調査や資料収集を十分に行うことが出来なかった。他方、米軍基地に関するシンポジウムではコーディネーターを務め、研究成果の一部を紹介することができた。沖縄県の人口と産業が集中する中南部都市圏に所在する、大規模な米軍基地の返還が予定されている。他方、返還後の基地跡地利用を円滑に進めるには、1)地権者の経済的不安、2)跡地利用計画の不在、3)沖縄県全体のマクロビジョンの中での跡地の位置づけ、4)国による財政支援の基本的枠組み、5)当該自治体の役割、6)地権者の合意形成の困難、など課題が山積する。H29年度は、県都那覇市に隣接する浦添市で行われる大規模返還を見越した再開発を調査した。その結果、浦添市では、従来型の大型商業施設を中心とする再開発の手法を取りつつも、周辺の自然環境を保護するために全国初の海浜条例を制定するなど、市民力を活かした新しい手法がとられていた。また、返還される跡地のみならず、跡地を中心とする市の西部一帯を活性化する視点から将来ビジョンが描かれていることも、これまでの跡地利用モデルから更に発展した持続可能なまちづくりのモデルを構築しようとしていることが確認された。その他、県内で行われた跡地利用に関する資料収集および海外の事例調査として、ハワイ州の海軍基地跡地であるBarbers Pointの再開発を調査し、当該地で行われた環境対策と市民参加の跡地利用の手法を検証した。沖縄県の中南部都市圏に所在する大規模な米軍基地で返還が予定されている。他方、返還後の跡地利用を円滑に進めるには、1)地権者の経済的不安、2)跡地利用計画の不在、3)沖縄県全体のマクロビジョンの中での跡地の位置づけ、4)国による財政支援の基本的枠組み、5)当該自治体の役割、6)地権者の合意形成の困難、など課題が山積する。本研究では、次の2箇所の大規模跡地における再開発を中心に跡地利用の手法を検証した。第1は、北中城村に所在する旧アワセゴルフ場跡地である。第2は、浦添市に所在するキャンプキンザーの一部で始まった再開発である。従来型の跡地利用開発との比較から持続可能な発展モデルを見出すことを試みた。平成26年度は、7月に勤務先が変更になったために、当初計画の遂行が難しい状況が少なくなかった。このため、研究実施計画の順序を一部入れ替えて変更し、平成27年度以降の実施を予定していた内容を平成26年度に行うなどして調整した。調査対象地での現地調査は深く行うことができた。
合成化学と構造生物学で解明するユニークなテルペン合成酵素の反応機構

放線菌の生産するジテルペン,サイクロオクタチンの生合成機構について明らかにした。特に環状骨格形成段階を担うジテルペン環化酵素CotB2の反応機構について,安定同位体で標識した基質を用いたin vivoとin vitro実験により反応機構の解析を行うとともに,量子化学計算を用いてカチオン中間体や遷移状態の知見を得ることで,環状骨格構造の変化を伴わない炭素ー炭素結合の組換えという特異な環化反応過程の詳細を明らかにした。また,CotB2の結晶構造についても基質の初期構造を含めて解明することに成功した。特異なテルペン合成酵素であるシクロラバンデュリル合成酵素も同定し生化学的性質を明らかにした。本研究課題では、特徴的な放線菌由来のテルペン合成酵素として、本申請者らが見出したcyclooctat-9-en-7-ol合成酵素(CotB2)、4環性ジテルペン炭化水素合成酵素(SCLAV_p0765)、cyclolavandulyl diphosphate合成酵素(CLDS)、carbazole骨格に対するプレニル基転移酵素(CarPTase)を研究対象として選抜し、テルペン化合物の構造多様性創出機構の一端を明らかにしようというものである。これらのうち、平成26年度は、CotB2の反応機構の解明に主に取り組み、CotB2の特異的な環化反応の解明に成功した。具体的には、重水素標識した基質、geranylgeranyl diphoshateを合成し、CotB2と反応させることにより、その重水素の位置を特定することで、2回の1,5-ヒドリド転移、1回の1,3-ヒドリド転移、1回の炭素-炭素結合の組換えにより、立体化学が制御されながら反応産物が合成されるという精巧な反応機構を明らかにすることができた。この成果をドイツの化学系の学術誌であるAngewandte Chemie International Editionに掲載することができた。この成果は、生物が進化の過程で獲得したテルペン合成酵素の複雑で精巧な反応機構を明らかにしたものであり、今後のテルペン環化酵素の論理的なデザインに向けた研究の基礎となりうる。また、CLDSについては、その推定反応機構を提唱し、米国の化学系の学術誌であるJournal of the American Chemical Societyに掲載することができた。さらに、計画以上に進行してCLDSの結晶化にも成功した。現在、CLDSのX線結晶構造解析に精力的に取り組んでいる。平成27年度には、シクロオクタチン生合成のためのテルペン環化酵素CotB2の活性中心ポケット中で環化反応に重要な役割をしていると考えられるアミノ酸残基に変異を導入した変異酵素を作製した。具体的には、基質結合に重要と考えられるD110、D111、D113、反応カスケードの最終段階でカチオン消去のために水酸基を導入するのに重要な役割を果たすと考えられるS84、N103、T106や、カチオンの安定化に寄与すると考えられる芳香族アミノ酸残基のF107、F149、F185、W186、W288に変異を導入した変異酵素25種を作製した。これらの作製した変異酵素の活性測定を実施し、また、新たに生成物が検出された場合には、それらを精製して構造決定を行うことで、CotB2による立体選択的テルペン環化反応機構を当初の予定通り説明することができた。さらには、そのCotB2反応機構は、密度汎関数理論を用いた量子化学の計算によっても支持されることを示すことができた。放線菌由来cyclolavandulyl diphosphate合成酵素(CLDS)については、予定より進行し結晶化ができたのでX線構造解析に進み、解像度は高くはないながらもその全体構造を解くことができた。カルキノスタチンとラバンデュキノシン生産放線菌のドラフトゲノム解析を行いゲノム配列を得た。それらの配列を比較することにより、それぞれの生合成遺伝子クラスターを同定することに成功した。さらには、それぞれの遺伝子クラスターからカルバゾール骨格にプレニル基を転移するプレニルトランスフェラーゼを同定し、大腸菌を用いて組換え酵素の調製にも成功した。また、本組換え酵素がカルバゾールとカルバゾール2-アルコールにプレニル基を付加することを明らかにすることができた。本研究課題では、テルペン合成酵素として、いずれも放線菌由来のCotB2、CLDS、SCLAV_p0765、CarPTaseを研究材料に用いて、合成化学と構造生物学を利用してユニークな反応機構の解明を目指している。平成27年度までに当初の計画通りCotB2の結晶構造を高い解像度で解明することができ、さらに変異酵素を作製して解析することで、最終年度に向けてより詳細な反応機構の提示に近づきつつある。CLDSについては、解像度は高くはないものの予定通り全体の結晶構造を解くことができた。今後、さらに結晶化条件をスクリーニングすることでより解像度の高い構造を提唱することができると考えている。また、変異酵素のレパートリーを増やし、それらの変異酵素が与える生産物の構造解析を行うこと、さらには合成した安定同位体標識基質を用いることで、より詳細な反応機構に迫ることができると考えている。CarPTaseについては遺伝子の同定が完了し、大腸菌を用いた組換え酵素の調製も可能になったことから、予定通り生理的基質の同定に進むことができる。テルペン合成酵素SCLAV_p0765については、大腸菌を用いて組換え酵素を調製できるものの安定性に難があり、結晶化スクリーニングにおいて沈殿が生じやすい状況にあり、現在までにその安定化に取り組んではいるが良好な結晶化条件は見出せておらず、本酵素に関してのみやや遅れている。