hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生不良性貧血発症に関わる細胞傷害性T細胞が標的とする自己抗原の同定

ペプチドをパルスしたHLA-B*40:02発現K562はB10-CTLで認識されたが、患者の体内にこのペプチドを認識するCTLが確かに存在するか検討した。OS91-11ペプチドをパルスした患者樹状細胞(2, 3回目は自己活性化T細胞芽球)を用いて患者の末梢血T細胞を刺激したところ、3回刺激後に急激なT細胞の増殖を認めたが、ELISAアッセイにおいてOS91-11抗原を提示する細胞に対してIFN-γ産生を示さなかった。そこで再生不良性貧血の病態の場となっている患者の骨髄細胞をペプチド単独で刺激後、ペプチドパルス自己活性化CD4+ T細胞芽球で2回刺激後に得られたT細胞株は、オリジナルのB10-CTLよりも弱いながらHLA-B*40:02拘束性にK562細胞を傷害できた。以上より、患者の骨髄にはOS1-11抗原を認識するCTLが存在し、病態を形成していた可能性が高いと考えられた。当初検討を予定していた重症再生不良性血患者由来のCTLクローン(A6-CTL)よりTCRα/β遺伝子をクローン化し、健常人の末梢血T細胞にTCRを導入してもHLA-B*40:02発現K562を傷害できたので、これを引き続きプローブとして用いた。新たにK562細胞株から完全長のcDNAを作成し、昨年度までアッセイしてきた平均長1.2Kb程度のライブラリに対し、平均長2.75KbのプールからcDNAライブラリを作り、のべ9.6万クローンをアッセイしたが陽性は認められなかった。さらに完全長で短いプール(平均長1.46Kb)からもライブラリを作り、のべ1.9万クローンをアッセイした段階では陽性結果は得られていないため、引き続きアッセイを行っている。再生不良性貧血の2患者において病態への関与が示唆された患者由来のHLA-B*40:02拘束性の細胞障害性T細胞(CTL)が認識する抗原の同定を試みた。CTLがHLA-B*40:02導入K562を傷害したため、K562よりcDNAライブラリを作成、CTLからのIFNの発現を誘導できるcDNAクローンを単離したところ、1例から樹立したCTLが認識する抗原はOS9で、エピトープは11アミノ酸からなるMAAETLLSSLLであった。OS9はERに局在し低酸素ストレスに関わるとされ、病態への関与が推測された。2例目から樹立されたCTLは11万クローンまでアッセイしたが同定に至らず更に検討を進めている。研究方針について当初からの変更はない。今後同定を進めて抗原エピトープが再生不良性貧血の病因となる抗原と確定出来れば、予定通りテトラマー試薬を作成し、複数のHLA-B*40:02陽性再生不良性貧血患者の血液についてCTLの存否の検討を進めていくとともに、NOGマウスを用いたin vivoでのモデル実験を実施する。なお、HLA-B*40:02陽性の新たな患者が登録されず、新たなCTLクローンを樹立する案件は現時点で患者リクルート状態となっている。研究方針について当初からの大きな変更はない。慢性骨髄性白血病から再生不良性貧血を続発した患者より樹立したCTLでは標的となる遺伝子・エピトープの同定を達成出来ているので、現在作成中のより平均長の長いcDNAライブラリが完成次第、スクリーニングに移行する。
鉄筋コンクリート造梁部材における材端ヒンジ回転限界の評価法構築に関する研究

本研究では,鉄筋コンクリート造(RC)梁部材における回転限界(靭性能評価法・せん断設計法)について評価する手法を構築することを目的としている.平成20年, 21年度は実大の1/21/3スケールである梁部材の曲げ・せん断実験を実施し,平成22年度は梁端部のヒンジ部分をモデル化した部分実験を実施した.その結果, RC梁部材における回転限界を評価するには,梁端部におけるヒンジ領域長さを確定する必要があり,コンクリート強度,配筋状況(複筋比,せん断補強量およびせん断補強筋間隔)に大きく影響を受けることを確認した.評価方法は,梁せん断耐力の曲げ耐力による余裕度による評価が妥当であるが,梁端ヒンジ領域が広がらずに応力が集中した場合には,回転限界が早期に決定されることを考慮する必要があることを提案した.本研究では,鉄筋コンクリート造(RC)梁部材における回転限界(靭性能評価法・せん断設計法)について評価する手法を構築することを目的としている.平成20年, 21年度は実大の1/21/3スケールである梁部材の曲げ・せん断実験を実施し,平成22年度は梁端部のヒンジ部分をモデル化した部分実験を実施した.その結果, RC梁部材における回転限界を評価するには,梁端部におけるヒンジ領域長さを確定する必要があり,コンクリート強度,配筋状況(複筋比,せん断補強量およびせん断補強筋間隔)に大きく影響を受けることを確認した.評価方法は,梁せん断耐力の曲げ耐力による余裕度による評価が妥当であるが,梁端ヒンジ領域が広がらずに応力が集中した場合には,回転限界が早期に決定されることを考慮する必要があることを提案した.本研究では、RC造梁部材におけるヒンジ回転限界(靭性能評価法・せん断設計法)について評価する手法を構築することを目的としている。ここでは、梁端に降伏ヒンジを形成する構造物を想定し,その降伏ヒンジが曲げモーメントとせん断力を維持したまま変形する性能(靭性能)について検討した。試験体は、申請者らがこれまでに行っている実大の約1/21/3の大きさである梁断面が230×360mm、試験区間長さL=1440mmのスタブ梁を有する連続梁形式とし、曲げ・せん断実験を5体実施した。実験は、1)複筋比、2)せん断余裕度を実験要因とし、既往の研究結果も併せて、圧縮側コンクリートの負担状況の差異、コンクリートの圧縮拘束状況と主筋座屈長さの差異を調べた。実験方法は、圧縮主筋を引張主筋よりも小さくすることで、曲げ降伏後の圧縮側コンクリートの圧壊を顕著にさせ、曲げモーメントの維持または、せん断力の維持が困難となる性状も顕在化することを意図した。本実験範囲内において以下の知見を得た。(1)複筋比が1.0未満の梁部材においても、せん断補強量を増加して、せん断余裕度を大きくすることにより、曲げ降伏後の主筋座屈を防止することができ、複筋比が1.0と同等の靭性能を確保できることが確認された。(2)RC梁部材の靭性能は、複筋比の違いに関係なく、ヒンジ領域のせん断余裕度を用いることにより評価可能であることが確認された。本研究では、RC造梁部材におけるヒンジ回転限界(靭性能評価法・せん断設計法)について評価する手法を構築することを目的としている。平成20年度の研究等により、複筋比(γ)が1.0未満の梁部材は、複筋比1.0の梁部材よりもコンクリートの圧壊を早期に誘発し、主筋の座屈を誘発していることを把握している。このため、材端ヒンジの回転限界を1)材端ヒンジ部のせん断破壊によりヒンジ回転限界が決定される場合(主としてγ=1.0)、2)材端主筋の座屈によりヒンジ回転限界が決定される場合(主としてγ<1.0の場合,またはせん断補強筋間隔が広い場合)、の2つで決定される場合に分類して、評価方法の構築を行う。試験体および実験方法は、平成20年度と同一とし、曲げ・せん断実験を3体実施した。実験要因は、複筋比(γ)0.5で、せん断補強筋間隔およびせん断補強筋比(Pw)を実験要因とし,せん断補強筋強度(wσy)を変化させることにより,せん断補強量(Pw・wσy)を同一とした。既往の研究結果も併せて、圧縮側コンクリートの負担状況の差異、コンクリートの圧縮拘束状況と主筋座屈長さの差異を調べた。(1)複筋比が1.0未満の梁部材において、せん断補強量が同程度の場合であっても、せん断補強筋間隔が大きい場合、主筋の座屈長さの違いおよび主筋の圧縮力負担の違いの影響により、早期にヒンジ回転限界が決定される。(2)複筋比が1.0未満の梁部材においても、せん断耐力にせん断補強筋間隔の影響を考慮した評価式を用いたせん断余裕度によってヒンジ回転限界を評価することが可能である。本研究では、RC梁部材におけるヒンジ回転限界(靭性能評価法・せん断設計法)について評価する手法を構築することを目的としている。平成22年度は、平成20年度、21年度に実施した梁の曲げ・せん断実験結果、および申請者らが蓄積している同様の梁の曲げ・せん断実験結果(コンクリート強度:21150N/mm^2程度、使用補強鉄筋が2951275N/mm^2)を併せて分析と解析を行った。

また、ヒンジ部分に影響を及ぼすと思われるせん断補強筋の拘束効果をモデル化した実験を行った。実験要因は、せん断補強筋のフック形状(135゚フック,溶接閉鎖型)であり、フック部分の定着力を調べるための試験である。試験体は2体(1体の試験体に3組のせん断補強筋を定着)であり、フック部分をコンクリートに埋込み、1組のせん断補強筋を引張することにより、フック部分の定着力を把握するとともにコンクリートの拘束効果を確認した。実験により、以下の知見を得た。(1)せん断補強筋のフック部の定着力は、フック形状には関係なく、同程度の耐力を示した。(2) 135゚フックの抜出し量は、溶接閉鎖型に比べて多くなっており、フック部の余長部分がコンクリートのかぶり部分を支圧することにより割裂ひび割れが発生し、急激に剛性が低下する結果となった。このことより、ヒンジ部分の回転限界に影響を及ぼすと考えられる。3年間の実験研究により、材端ヒンジ回転限界の評価方法を構築するに至ったが、ヒンジ領域の設定方法に関して、追加検討する必要がある。
神経膠腫におけるp14ARFの異常と臨床的悪性度に関する研究

神経膠腫を含む多くの腫瘍で染色体9p21領域の欠失が認められる。INK4a遺伝子は同部位に存在し、p16をコードする。60-80%の悪性グリオーマにおいてINK4a遺伝子のhomozygous deletion, point mutationそしてDNA methylationが認められ、p16蛋白の機能が失われている。我々はINK4a遺伝子がコードするもうひとつの蛋白質であるp14ARFについて検討した。p14ARFはMDM2と直接結合し、p53がユビキチンによって分解されるのを防いでいる。93例の神経膠腫組織を対象にp16INK4a, p14ARF, MDM2,p53の免疫組織化学的検討を行った。またINK4a遺伝子変異をSouthern blottingおよびDNA sequenceにて検討した。50-60%の症例でp16INK4aの発現が欠除していたが、それらの症例ではp14ARFも同様に欠除していた。細胞質にp16INK4aの蓄積が認められた症例はanaplastic astrocytoma 12.8%,gliblastoma 31.5%であり、そのうちの2例でpoint mutationが認められた。またこれらの症例のうち10%がp14ARFも細胞内に蓄積し、残りの90%は欠失していた。以上の結果より、神経膠腫においてはINK4a遺伝子の異常はp16INF4aとp14ARFの両方の蛋白質発現に異常をきたしていることが明らかとなった。また一部の症例ではpoint mutationによりp16INK4aとp14ARFの核内移行が障害されることが重要であることが確認された。39例のanaplastic astrocytoma(AA),54例のglioblastoma(GB)について,p16,p14,MDM2,p53の発現を免疫染色により解析した.INK4a遺伝子の構造異常についてSouthern blot解析とsequence解析を行った.(結果)AAの23/39(59%),GBの27/54(50%)でp16,p14は共に発現していなかった.AAの5/39(13%),GBの12/54(32%)でp16の細胞質内蓄積を認めた.その一部でpoint mutation(83His→Tyr)(54Met→Thr)が検出され,その領域はp16の核移行シグナル配列である可能性が考えられた.AAの11/39(28%),GBの10/54(19%)でp16,p14の核内での発現を認めた.P14の核内発現を認める21例中13例ではp53遺伝子異常を伴っていたが,残る8例ではp53は正常であった.これらの症例では,p53経路のうち,p53,p14以外の分子の異常が腫瘍化に関与していることが考えられた.(結論)p16の発現異常が見られる症例では同時にp14の発現異常を伴っていた.INK4a遺伝子の核移行シグナル配列のpoint mutationがp16,p14の細胞質内蓄積に関与していること考えられた.神経膠腫の約60%において染色体9q21に異常を認め、p16/p14ARFの発現異常が見られる。神経膠腫の悪性化にp16とp14ARFのいずれかがより関与しているかを明らかにすることにより、新たな治療を開発するための標的分子を明確にすることができる。

テトラサイクリンにて誘導可能なp14ARE, p16発現ベクターを作製し、U87MG(p16欠失、野生型p53)、U251(p16欠失、変異型p53)そしてU373MG(野生型p16、野生型p53)にそれぞれ遺伝子導入し、p14ARFとp16のいずれが増殖抑制効果を有するかを判定した。p16遺伝子導入による増殖抑制効果がp14ARFのそれよりも高かった。膠芽腫手術摘出標本をp14ARF,p16,p53それぞれの遺伝子異常に基づき、遺伝子プロファイリングを行い、いずれがより強い悪性形質をもたらしているかを明らかにする研究をスタートさせている。
新生膜形成の時空制御とリン脂質結合ドメインの生理生化学機能

I.リン脂質結合ドメインの生理生化学機能II.新生膜形成の制御機構新生する膜構造の全く異なる2つのペキソファジー経路、ミクロペキソファジーとマクロペキソファジーについて、そのスイッチングに関する制御機構について解析したところ、細胞内ATPレベルと深い関連を示すことを明らかにした(Biosci.Biochem.Biotechnol. 2005)III.植物病原菌感染時におけるペキソファジーの解析および脂肪顆粒の動態についてウリ類炭疽病菌ATG26破壊株は、植物体への侵入段階に欠損を有していることを明らかにした。ペルオキソーム動態を調査したところ、ウリ類炭疽病菌の感染過程においては、ペルオキソーム分解が顕著に進行しており、ATG26破壊株においてはこの分解の遅延が見出され、本遺伝子が感染器官内でのペルオキソーム分解に関与していることが示唆された。また感染過程においては、急激な脂肪顆粒の分解が観察されるが、PEX6破壊株においては、その分解が抑制されており、感染樹立過程における脂質代謝系とペルオキシソームの密接な関係が示唆された。メタノール資化性酵母ペキソファジー過程におけるPpAtg24の局在、遺伝子破壊株の性質、野生株を用いた膜動態解析から、ペキソファゴソームと液胞の融合が、従来、考えられていたような一点で起こるのではなく、"面"で起こることを初めて明らかにした。PpAtg24は、この面で起こる膜融合反応を制御し、vertex領域と呼ばれるミクロドメインに局在していた。PXドメインはPI(3)Pに特異的結合を示したが、PpAtg24はPI(3)Pへの結合能により膜融合を制御していることを明らかにした。II.PpAtg26の新生膜形成における機能解析とGRAMおよびPHドメインの生化学機能GRAMならびにPHドメインがPI(4)Pに特異的に結合することを生化学的に証明した。さらにPI4キナーゼ遺伝子を3種類クローン化し、破壊株・変異株の取得に成功した。現在、これらの変異株やドメイン欠失変異株における新生膜合成を追跡することで、PI(4)PとAtg26の新生膜形成における生理機能を明らかにするための実験が進行中である。III.植物病原菌の感染樹立過程におけるペキソファジーとシグナル経路植物病原菌Colletotrichum lagenariumにおけるペルオキシソーム動態を解析した結果、胞子内で発達していたペルオキシソームは、侵入器官細胞において顕著に分解されていた。現在までにC1ATG26が本菌の植物感染に必要であることがわかり、ペルオキソーム分解の植物感染時における生理機能が示唆された。現在、ドメイン欠失株等を用いてさらなる検証を行っているところである。一方、分裂酵母において液胞膜ダイナミクスへの関与が示されているStyl MAPキナーゼ相同遺伝子の解析を行った結果、本MAPキナーゼ経路が、殺菌剤であるフルジオキソニルに対する感受機構に関与していることを示した(Mol.Microbiol., 2004)。
日本人小学生の英語音声の音韻的特徴と音声知覚の追跡的分析

日本人小学生の英語音声について,身体的・知能的な発達,学習プログラムとの関係性を明らかにするため,数十名規模かつ継続的な英語音声収録を実施するとともに,まず英語単母音の発音に焦点を当て,フォルマント周波数と継続時間長の分析を行った.また,新しい韻律評価指標として参照付き母音継続時間長比の発案に至った.英語音声収録については,6月に同志社小学校6年生全90名の音声を収録し,同じ児童に対する18ヶ月間の追跡的なデータ蓄積に至った.12月には音声収録第2ラウンドを開始し,同校の1年生全90名の英語音声を収録した.一方,同志社小学校を卒業した中学1年生についても追跡的音声収録を継続するため,中学校と交渉を進めている.小学4年生から5年生までの3期12ヶ月,約40名分の小学生の英語音声について,母音区間のフォルマント周波数と継続時間長を分析した.その結果,成人の英語学習者と同様に,iyとih,uwとuh,aaとah等の似た音素の発音を調音で区別するのは難しいが,継続時間長により概ね区別できていることが分かった.また,追跡的に分析すると,平均的には発音の区別は進むが,発音の異化が進む児童と同化が進む児童が居ることが分かった.継続時間長の分析を通じて,韻律自動評価向けの指標として参照付き母音継続時間長比の発案に至った.小学生音声に適用する前に,大学生の英語音声に適用した結果,5段階の主観評価値と客観評価値との相関係数を有意に改善した.2018年度の学会発表は日本音響学会の1件であるが,小学生英語音声の分析について音声学の代表的な国際会議ICPhS 2019,第2言語音声獲得の国際会議New Sounds 2019の2件,韻律評価指標について信号処理の代表的な国際会議IEEE ICASSP 2019の1件,計3件の採録通知を受けており,2019年度の発表が確定している.英語音声収録については,2016年12月の収録以来,同じ児童に対して18ヶ月間の追跡的英語音声データを蓄積した.収録した音声データに対して,正しい発声,読み誤り,復唱などの粗い分類を行うとともに,正しい発声に対して音素境界時刻を記録し,音素セグメンテーションデータとして整備した.英語ネイティブ話者による発音評価作業も一部実施し,2019年度に本格的に実施する予定である.音声の分析については,3期12ヶ月,約40名分の母音区間について計測したフォルマント周波数と継続時間長を元に,同年齢の英語ネイティブ話者との比較,時期差比較を行った.それらの結果は査読付き国際会議に2件採録され,2019年度の発表が確定している.継続時間長の分析を通じて発案に至った韻律評価指標については,まず日本人大学生の英語音声を用いて有効性を検証した.その結果は査読付き国際会議ICASSP 2019に採録されている.適用性の拡大を図るため,多様な音声データを用いた有効性検証と理論拡張の両面を予定している.英語音声収録については,第2ラウンドとして同志社小学校2年生の音声を収録予定である.また,小学校に引き続き同志社中学校1年生の音声も収録予定である.音声の分析については,単母音のフォルマント周波数,継続時間長,個人の変化それぞれについて,より多数の小学生の18ヶ月全期にわたる収録音声を対象とすることで分析結果の統計的信頼性を高め,2019年度中に論文化する予定である.2020年度以降は取り組み規模を広げる予定である.韻律評価指標については,1)日本人以外の英語学習者の音声を用いた有効性検証,2)ネイティブ音声参照からアクセント辞書参照による簡便化,3)単語発声評価から文発声評価への理論拡張,の3つを進める予定である.日本人小学生の英語音声について,身体的・知能的な発達,学習プログラムとの関係性を明らかにするため,数十名規模かつ継続的な英語音声収録を実施するとともに,まず10種類の英語単母音の発音に焦点を当て,フォルマント分析を行った.英語音声収録については,2017年6月と12月に同志社小学校の5年生全90名から英語音声を収録した.2016年12月の収録に引き続き,同じ児童に対する12ヶ月間の追跡的英語音声データを蓄積したことになる.2016年12月と2017年6月の2期,約40名分の日本人小学生の英語音声について母音のフォルマント分析を行い,同年齢の英語ネイティブ児童との比較,日本人小学生の日本語母音と英語母音の比較,時期差の比較を行った.その結果,日本人小学生は母語の日本語の影響により第2フォルマントに現れる舌の前後の動きが英語ネイティブ話者に比べて小さいことが分かった.母音別に見るとaeの発音はaaやahと区別できているがaaとahの区別が難しいこと,さらにiyとih,uwとuhなど緊張母音と弛緩母音の発音の区別が難しいなど日本人の英語音声について指摘される特徴が観測された.また,日本語にないerの発音が出来ている児童と,日本語の「あ」に近くなる児童がおり,英語ネイティブ話者との距離を測るとerの音の距離と全10母音平均の距離との相関が高いことがわかった.日本音響学会2017年秋季研究発表会において英語音声コーパスの構築について1件,日本音響学会2018年春季研究発表会においてフォルマント分析について2件,研究発表を行った.英語音声収録については,2016年12月の収録に引き続き,同じ児童に対して12ヶ月間の追跡的英語音声データを蓄積したことになる.収録した音声データに対して,正しい発声,読み誤り,復唱などの粗い分類を行うとともに,正しい発声に対して音素境界時刻を記録し,音素セグメンテーションデータとして整備した.

英語ネイティブ話者による発音評価作業が遅れているが,2018年度に実施する予定である.音声の分析については,2期,約40名分の母音について計測したフォルマントを元に,同年齢の英語ネイティブ話者との比較,時期差比較などが出来ており,さらに分析対象人数と時期を拡大することで,より信頼性の高い分析結果が得られると考えている.日本人小学生の英語音声について,身体的・知能的な発達,学習プログラムとの関係性を明らかにするため,数十名規模かつ継続的な英語音声収録を実施するとともに,まず英語単母音の発音に焦点を当て,フォルマント周波数と継続時間長の分析を行った.また,新しい韻律評価指標として参照付き母音継続時間長比の発案に至った.英語音声収録については,6月に同志社小学校6年生全90名の音声を収録し,同じ児童に対する18ヶ月間の追跡的なデータ蓄積に至った.12月には音声収録第2ラウンドを開始し,同校の1年生全90名の英語音声を収録した.一方,同志社小学校を卒業した中学1年生についても追跡的音声収録を継続するため,中学校と交渉を進めている.小学4年生から5年生までの3期12ヶ月,約40名分の小学生の英語音声について,母音区間のフォルマント周波数と継続時間長を分析した.その結果,成人の英語学習者と同様に,iyとih,uwとuh,aaとah等の似た音素の発音を調音で区別するのは難しいが,継続時間長により概ね区別できていることが分かった.また,追跡的に分析すると,平均的には発音の区別は進むが,発音の異化が進む児童と同化が進む児童が居ることが分かった.継続時間長の分析を通じて,韻律自動評価向けの指標として参照付き母音継続時間長比の発案に至った.小学生音声に適用する前に,大学生の英語音声に適用した結果,5段階の主観評価値と客観評価値との相関係数を有意に改善した.2018年度の学会発表は日本音響学会の1件であるが,小学生英語音声の分析について音声学の代表的な国際会議ICPhS 2019,第2言語音声獲得の国際会議New Sounds 2019の2件,韻律評価指標について信号処理の代表的な国際会議IEEE ICASSP 2019の1件,計3件の採録通知を受けており,2019年度の発表が確定している.英語音声収録については,2016年12月の収録以来,同じ児童に対して18ヶ月間の追跡的英語音声データを蓄積した.収録した音声データに対して,正しい発声,読み誤り,復唱などの粗い分類を行うとともに,正しい発声に対して音素境界時刻を記録し,音素セグメンテーションデータとして整備した.英語ネイティブ話者による発音評価作業も一部実施し,2019年度に本格的に実施する予定である.音声の分析については,3期12ヶ月,約40名分の母音区間について計測したフォルマント周波数と継続時間長を元に,同年齢の英語ネイティブ話者との比較,時期差比較を行った.それらの結果は査読付き国際会議に2件採録され,2019年度の発表が確定している.継続時間長の分析を通じて発案に至った韻律評価指標については,まず日本人大学生の英語音声を用いて有効性を検証した.その結果は査読付き国際会議ICASSP 2019に採録されている.適用性の拡大を図るため,多様な音声データを用いた有効性検証と理論拡張の両面を予定している.英語音声収録については,同じ児童の6年生時の音声も継続して収録する予定である.2019年度には同じ話者の中学生時の音声収録にも拡大する予定である.
メガリンを基盤とするα-klotho、FGF23による新規リン代謝調節機構の解明

1.細胞外全長型(可溶型)α-klothoが、血中あるいは糸球体濾過過程でKL1およびKL2断片に分断される機構の検証。蛍光標識体を用いて生体内におけるklothoの形態を検証する。2.培養近位尿細管細胞を用いたリン取り込みに関する解析。培養細胞を用いて各種klothoの形態によるリン代謝調節へ与える影響を検討する。3.培養近位尿細管細胞を用いたメガリン/NaPi2a/α-klotho/FGF23の複合体形成の解析。リン輸送体とklothoやFGF23が複合体を形成する可能性を検討する。4.メガリン/NaPi2a/α-klotho/FGF23相互結合性の詳細の検討。複合体の立体構造解析。
ミトコンドリアにおける新たな脂肪酸輸送・代謝機構の解明

カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT1)は、細胞質中のアシルCoAをアシルカルニチンへと変換することにより長鎖脂肪酸のミトコンドリア内への輸送を行う酵素である。CPT1はミトコンドリア内への長鎖脂肪酸の輸送および引き続くβ酸化の律速酵素として働き、エネルギー代謝制御の中心的な役割を担うことから同酵素の哺乳動物における欠損は胎生致死をもたらす。昆虫は現存する動物種の90%以上を占め、その進化の過程で極めて多様かつ優れた生理システムを獲得して来ている。申請者らは、ミトコンドリア内への脂肪酸輸送に必須と考えられていたカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT1)を完全欠損したショウジョウバエが、脂質・エネルギー代謝に全く異常を示さないことを見出した。この観察を契機に、CPT1経路を代替するミトコンドリアへの新たな脂肪酸輸送経路を探索するスクリーニング系を確立し、約80の候補遺伝子より輸送基質が未知のミトコンドリアトランスポーターであるSLC25-FATを同定した。本年度、ミトコンドリア内でのSLC25-FATの局在を明らかにする目的で、ミトコンドリアマトリクスに発現させたAPEX2タンパク質によりミトコンドリア内膜タンパク質を特異的にビオチン化修飾することにより、SLC25-FATのミトコンドリア内での局在を評価した。その結果、同タンパク質はミトコンドリア内膜に存在することが明らかとなった。さらに、CPT1を欠損したショウジョウバエ培養細胞株を樹立し、単離ミトコンドリアへの蛍光標識脂肪酸アナログの輸送測定により行なった結果、SLC25-FATはCPT1に依存しないミトコンドリアへの脂肪酸の輸送に関わること、そしてその輸送にはミトコンドリアの正常な膜電位が必要であることが示された。当初の計画通り、SLC25-FATのミトコンドリア内での局在を明らかにし、さらにCPT1欠損培養細胞株を用いることにより脂肪酸輸送の基質特異性および輸送機構を明らかにすることが出来た。昨年までの研究により、ショウジョウバエの分子遺伝学的手法を駆使して、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT1)を介さずにミトコンドリア内に脂肪酸輸送を行う候補遺伝子としてSLC25-FATを同定した。昨年度の成果により、ショウジョウバエ細胞においてSLC25-FATはミトコンドリア内膜に局在し、ミトコンドリ内への脂肪酸輸送・代謝に関する予備的な知見が得られた。本年度は、1)SLC25-FATの細胞内脂肪酸代謝における役割を明らかにすべく、SLC25-FATおよびCPT1欠損ショウジョウバエ培養細胞を用い、脂肪酸代謝を蛍光標識脂肪酸および質量分析計により詳細に解析する。2)SLC25-FATの個体での脂肪酸代謝における役割を明らかにすべく、SLC25-FATおよびCPT1欠損遺伝子改変ショウジョウバエ個体を用いて解析を進める。具体的には、哺乳動物の肝臓・脂肪組織に相当する脂肪体および筋組織での当該遺伝子の発現抑制により個体の体重、寿命、飢餓耐性、脂質・エネルギー代謝に及ぼす影響を詳細に解析する。一般に、炭素鎖12までの短・中鎖脂肪酸はCPT1非依存的にミトコンドリアへ輸送されるとされるが、その輸送機構の詳細及び制御機構は明らかではなく、またミトコンドリアの脂肪酸代謝とその制御機構についても未だ数多くの不明な点が残されている。昆虫は現存する動物種の90%以上を占め、その進化の過程で極めて多様かつ優れた生理システムと環境適応能力を獲得して来ている。例えば、ショウジョウバエが飛翔する際の単位重量あたりの代謝率はヒト運動時の10倍以上にも達し、その主なエネルギー源は脂質代謝によることから、極めてエネルギー効率の高い脂肪酸代謝機構を獲得したと想定されるが、その実体は不明である。この観察を契機に、CPT1経路を代替するミトコンドリアへの新たな脂肪酸輸送経路を探索するスクリーニング系を確立し、約80の候補遺伝子より輸送基質が未知のミトコンドリアSolute carrier (SLC)トランスポーターであるSLC25-FATを同定した。ショウジョウバエの分子遺伝学的手法を駆使することにより、ミトコンドリアへの新たな脂肪酸輸送に関わるタンパク質を同定することに成功した。当該タンパク質をコードする遺伝子の一塩基多型は肥満との相関が報告されており、同分子が哺乳動物における脂肪酸代謝にも深く関与すると考えられる。

申請者らは、ミトコンドリア内への脂肪酸輸送に必須と考えられていたカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT1)を完全欠損したショウジョウバエが、脂質・エネルギー代謝に全く異常を示さないことを見出した。この観察を契機に、CPT1経路を代替するミトコンドリアへの新たな脂肪酸輸送経路を探索するスクリーニング系を確立し、約80の候補遺伝子より輸送基質が未知のミトコンドリアトランスポーターであるSLC25-FATを同定した。本年度、ミトコンドリア内でのSLC25-FATの局在を明らかにする目的で、ミトコンドリアマトリクスに発現させたAPEX2タンパク質によりミトコンドリア内膜タンパク質を特異的にビオチン化修飾することにより、SLC25-FATのミトコンドリア内での局在を評価した。その結果、同タンパク質はミトコンドリア内膜に存在することが明らかとなった。さらに、CPT1を欠損したショウジョウバエ培養細胞株を樹立し、単離ミトコンドリアへの蛍光標識脂肪酸アナログの輸送測定により行なった結果、SLC25-FATはCPT1に依存しないミトコンドリアへの脂肪酸の輸送に関わること、そしてその輸送にはミトコンドリアの正常な膜電位が必要であることが示された。当初の計画通り、SLC25-FATのミトコンドリア内での局在を明らかにし、さらにCPT1欠損培養細胞株を用いることにより脂肪酸輸送の基質特異性および輸送機構を明らかにすることが出来た。5 kDa程度の分子を透過するミトコンドリア外膜と比較して、ミトコンドリア内膜の透過性は低い。このため、脂肪酸のβ酸化が行われるミトンドリア内部(マトリクス)へ脂肪酸を輸送するためには、脂肪酸がミトコンドリア内膜を通過することが重要である。このため、SLC25-FATの脂肪酸代謝における役割を明らかにするためには、SLC25-FATのミトコンドリアにおける局在を明らかにする必要がある。ショウジョウバエ培養細胞から単離したミトコンドリアの内膜と外膜をショ糖密度勾配遠心で分画した解析により、SLC25-FATは主にミトコンドリア内膜に局在することが強く示唆されている。そこで、本年度はミトコンドリアマトリクスに発現させたAPEX2タンパク質によりミトコンドリア内膜タンパク質を特異的にビオチン化修飾することにより、SLC25-FATのミトコンドリア内での局在を評価する。前年度に、CRISPR/Cas9システムを用いてCPT1を欠損したショウジョウバエ培養細胞株を樹立した。パルミトイルCoAを基質とした酵素活性評価により、このCPT1欠損細胞がCPT1活性を完全に欠失していることを確認している。そこで、本年度はCPT1欠損細胞を用いてSLC25-FATに依存した脂肪酸輸送活性および基質特異性の評価を行う。前者の解析は前年度に樹立した単離ミトコンドリアへの蛍光標識脂肪酸アナログの輸送測定により行う。後者はβ酸化に依存した酸素消費量を脂肪酸の分子種ごとにフラックスアナライザーを用いて解析することにより、SLC25-FATの脂肪酸種ごとの脂質代謝への寄与を明らかにする。
化学発光反応を利用する微量タンパク質の分離・定量法の開発

上記の研究課題につき昭和63平成2年度中に下記の成果を得た。1.化学発光検出器の開発に関するもの(1)ルミノ-ル音響化学発光反応を利用する微量タンパク質のフロ-インジェクション分析法の開発〔日化欧文誌,61,2996(1988)〕(2)化学発光反応を用いる微量タンパク質のフロ-インジェクション分析法の改良〔分析化学,38,T100(1989)〕2.タンバク質分離カラムと化学発光検出器との接続に関するもの(1)化学発光検出器を用いる微量タンパク質のメタルキレ-トアフィニティ-クロマトグラフィ-の開発〔日本欧文誌,61,2779(1988)〕(2)ゼオライトカラムー化学発光検出系による微量タンパク質の分離・定量法の開発〔日化欧文誌,62,1501(1989)〕(3)イオン交換クロマトグラフー化学発光検出器系によるタンパク質の高感度検出〔日化欧文誌,63,770(1990)〕3.化学発光反応を利用する免疫センサ-の開発に関するもの(1)合成金属錯体を標識剤とする化学発光免疫センサ-の試作〔日化欧文誌,62,2844(1989)〕4.その他(1)1,10ーフェナントロリンー過酸化水素ー銅(II)系を用いるタンパク質の化学発光検出に関する実験的考察〔日化欧文誌,63,2423(1990)〕(3)金属錯体触媒を用いる生体成分の化学発光分析〔日本分析化学会欧文誌,6,797(1990)〕(4)以上のほか同志社大学理工学研究報告に2件上記の研究課題につき昭和63平成2年度中に下記の成果を得た。1.化学発光検出器の開発に関するもの(1)ルミノ-ル音響化学発光反応を利用する微量タンパク質のフロ-インジェクション分析法の開発〔日化欧文誌,61,2996(1988)〕(2)化学発光反応を用いる微量タンパク質のフロ-インジェクション分析法の改良〔分析化学,38,T100(1989)〕2.タンバク質分離カラムと化学発光検出器との接続に関するもの(1)化学発光検出器を用いる微量タンパク質のメタルキレ-トアフィニティ-クロマトグラフィ-の開発〔日本欧文誌,61,2779(1988)〕(2)ゼオライトカラムー化学発光検出系による微量タンパク質の分離・定量法の開発〔日化欧文誌,62,1501(1989)〕(3)イオン交換クロマトグラフー化学発光検出器系によるタンパク質の高感度検出〔日化欧文誌,63,770(1990)〕3.化学発光反応を利用する免疫センサ-の開発に関するもの(1)合成金属錯体を標識剤とする化学発光免疫センサ-の試作〔日化欧文誌,62,2844(1989)〕4.その他(1)1,10ーフェナントロリンー過酸化水素ー銅(II)系を用いるタンパク質の化学発光検出に関する実験的考察〔日化欧文誌,63,2423(1990)〕(3)金属錯体触媒を用いる生体成分の化学発光分析〔日本分析化学会欧文誌,6,797(1990)〕(4)以上のほか同志社大学理工学研究報告に2件1.新しい化学発光検出器の開発(1)ルミノール音響化学発光反応を利用する微量タンパク質のフローインジェクション分析法の開発〔日化第56春季年会(東京)発表;日化欧文誌、61、2996(1988)掲載〕。(2)無脈流ポンプと高性能光田市増倍管を用いてのフローインジェクション分析法の改良〔日化第58春季年会(京都)発表予定;「分析化学」投稿中〕。2.タンパク質分離カラムと化学発光検出器との接続(1)化学発光検出器を用いる微量タンパク質のメタルキレートアフィニティークロマトグラフィーの開発〔日化欧文誌、61、2779(1988)掲載〕。(2)ゼオライトカラム-化学発光検出系による微量タンパク質の分離・定量法の開発〔第49分析化学討論会(滋賀)及び分析化学会第37年会(札幌)発表;日化欧文誌印刷中〕。(3)化学発光検出器を用いる微量タンパク質のイオン交換クロマトグラフィーの開発〔第50分析化学討論会(島根)発表予定〕。3.化学発光検出器に利用される反応の基礎的検討(1)ルミノール-H_2O_2Co(III)化学発光反応におけるCo(III)-ウシ血清アルブミン錯体生成反応についての基礎的検討〔日化第56春季年会(東京)発表;同志社大学理工学研究報告、29、1(1988)掲載〕。(2)1,10-フェナントロリン-H_2O_2-Cu(II)化学発光の反応機構についての基礎的検討〔分析化学第37年会(札幌)発表、日化第58春季年会(京都)発表予定〕。(3)消光剤/1,10-フェナントロリン-H_2O_2-Cu(III)の発光強度の経時変化の検討〔日化第58春季年会(京都)発表予定〕。

4.化学発光反応を利用する免疫センサーの試作(1)合成金属錯体を標識剤とする化学発光免疫センサーの試作〔日化第56春季年会(東京)発表〕。1.新しい化学発光検出器の開発(1)無脈流ポンプと高性能光電子増倍管を用いてのフロ-インジェクション分析法の改良〔日化第58春季年会(京都)発表;分析化学、38、T100(1989)〕。2.タンパク質分離カラムと化学発光検出器との接続(1)ゼオライトカラム-化学発光検出系による微量タンパク質の分離・定量法の開発〔日化欧文誌、62、1501(1989)〕。(2)化学発光検出器を用いる微量タンパク質のイオン交換クロマトグラフィ-の開発〔第50分析化学討論会(島根)発表;日化欧文誌印刷中〕。3.化学発光検出器に利用される反応の基礎的検討(1)1、10-フェナントロリン-H_2O_2-Cu(II)化学発光の反応機構についての基礎的検討〔日化第58春季年会(京都)発表〕。(2)消光剤/1、10-フェナントロリン-H_2O_2-Cu(II)の発光強度の経時変化の検討〔日化第58春季年会(京都)発表;日本分析学会第38年会(宮城)発表〕。(3)化学発光触媒活性抑制法によるタンパク質定量における実験的考察〔日化欧文誌投稿中〕。4.化学発光反応を利用する免疫センサ-の開発(1)合成金属錯体を標識剤とする化学発光免疫センサ-の試作〔日化第58春季年会(京都)発表;日化欧文誌、62、2844(1989)〕。5.新しい化学発光反応系を用いる生体成分の定量(1)Cu(II)-H_2O_2-酒石酸カリウムナトリウム系におけるL-トリプトファンの化学発光〔日化速報誌投稿中〕。1.キャピラリ-電気泳動と化学発光検出器との接続ここ数年来,急速に浮上し注目されているキャピラリ-電気泳動(CZE)法は優れた分離能を示すが,最大の欠点は感度の悪いことである。そこでCZEと,高感度な化学発光検出器(CLD)の接続を考え,ヘミン標識ウシ血清アルブミンほかを調製し,それらをCZE法で分離,CLDで検出した。単一タンパク質成分であるにもかからわず複数ピ-クを与えた。この結果は,蛍光検出の結果と同じで,重要な結論であった。この結果に基づき,現在全く新しい方法を展開中である。2.新しい化学発光反応系の開発とそれに基づく化学発光検出器の高感度化および簡素化タンパク質を構成するアミノ酸のうち,トリプトファンが特に強い化学発光を示することを見い出した。触媒系は,銅(II)ーH_2O_2ー酒石酸塩系で,反応系の最適化を行った。反応開始後,最大発光強度に達する時間は約3.5時間であったが,適量の鉄(II)を加えることにより約5分に短縮できた。なお本系に適当に有機溶媒を加えることにより前記時間を1分以内に,また検出感度を約3000倍に向上できた。既にトリプトファンのFIA分析を確立し,また同様の系で5ーヒドロキシインド-ル酢酸(ガンマ-カ)の化学発光分析にも成功している。3.1,10ーフェナントロリンーH_2O_2ーCu(II)化学発光における反応機構の検討各種の方法を用いる詳細な検討を行ったが,中間体が不安定で反応機構を正確に決定するに至らなかった。4.実試料への応用
ドミノ移植関連医原性FAPのアミロイド伝播機構解明と予防法の確立

家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)患者の肝臓を移植肝として利用するのがドミノ肝移植である。このドミノ肝移植のレシピエントにおける最大の問題は、移植後に生じる伝播性アミロイド(伝播性FAP)である。本研究ではこの伝播性アミロイドの(超)早期病変を、病理学的・生化学的に解析し、伝播性アミロイドの伝播機構の解明を主な目的としている。現時点で、9名のドミノ移植レシピエントの、アミロイド沈着のモニタリングで施行された胃・十二指腸生検組織について、コンゴレッド染色を施行しアミロイド沈着を確認後、レーザーマイクロダイセクション(LMD)を用いて、アミロイド沈着部を切削・回収。検体をZwittergent溶液中で可溶化、トリプシンを用いて断片化した後、LC-MS/MSで、沈着アミロイドの生化学的組成を解析した。9名のレシピエントの内訳は、男性5名、女性4名で、移植時の平均年齢は約52.3歳であった。解析結果であるが、病理学的検索では、8名でアミロイド沈着が同定されており、最短では移植後1年で、アミロイド沈着が陽性であった。生化学的検索は8名で施行しており、全例で変異型TTR比率が60%以上と、野生型TTRに比べて変異型TTR比率が優位に高い結果であり、ドミノ肝移植関連伝播性アミロイドーシスにおける早期病変は主に、変異型TTRがシードを形成することから始まっている可能性が示唆された。また4例で、アミロイド関連蛋白について解析を行ったが、今のところFAP患者との相違は見られていない。現在アミロイド本体の解析はほぼ終了し、アミロイド関連蛋白の解析を行っている。今年度はアミロイド関連蛋白の解析とデータ解析が主体となり、おおむね計画通りに研究が進行している。今年度はアミロイド関連蛋白の解析とデータ解析が主体となり、結果については英文論文に発表予定である。本研究では、家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)患者の肝移植時に摘出された肝臓を移植する、いわゆるドミノ肝移植のレシピエントにおける、伝播性アミロイド(伝播性FAP)の(超)早期病変を病理学的・生化学的に解析し、伝播性アミロイドの伝播機構の解明を主な目的としている。検体をZwittergent溶液中で可溶化、トリプシンを用いて断片化した後、LC-MS/MSで、沈着アミロイドの生化学的組成を解析した(主にはトランスサイレチン(TTR)の野生型と変異型比率)。9名とも何らかの慢性肝疾患を有しており、6名が肝炎ウイルス関連の肝硬変や肝癌であり、ドナーのFAP患者のTTR遺伝子変異では、8名がVal30Met変異で、1名がVal30Leu変異であった。このうち3名が、肝移植後9-12年後に伝播性FAP発症している(末梢神経障害あるいは自律神経障害に起因する症状を発症)。生化学的検索は4名で施行しており、全例で、変異型TTR比率が70%以上と、野生型TTRに比べて、変異型TTR比率が優位に高い結果であり、今のところFAP患者における沈着アミロイド蛋白中の変異型TTR比率より、ドミノ移植関連FAP患者の変異型TTR比率の方が高い印象であり、早期病変は主に、変異型TTRがシードを形成することから始まっている可能性が示唆された。解析すべき検体は、ほぼ回収できており、現在、生化学的解析を継続して行っている。すでに移植後10年以上経過した患者が複数おり、同一患者での、沈着アミロイドも病理学的変化やアミロイド蛋白の生化学的組成の経時的変化の検索にも着手している。

生化学的検索は8名で施行しており、全例で変異型TTR比率が60%以上と、野生型TTRに比べて変異型TTR比率が優位に高い結果であり、ドミノ肝移植関連伝播性アミロイドーシスにおける早期病変は主に、変異型TTRがシードを形成することから始まっている可能性が示唆された。また4例で、アミロイド関連蛋白について解析を行ったが、今のところFAP患者との相違は見られていない。現在アミロイド本体の解析はほぼ終了し、アミロイド関連蛋白の解析を行っている。今年度はアミロイド関連蛋白の解析とデータ解析が主体となり、おおむね計画通りに研究が進行している。上術したように、解析すべき検体は、ほぼ回収できており、現在、生化学的解析を継続して行っている。また今後も、経過観察されている患者については継続して、アミロイド沈着のモニタリングがされているため、検体数を増やせる見込みがある。すでに移植後10年以上経過した患者が複数おり、今のところ5名については同一患者での、沈着アミロイドも病理学的変化やアミロイド蛋白の生化学的組成の経時的変化の検索を継続して施行する方針である。今年度はアミロイド関連蛋白の解析とデータ解析が主体となり、結果については英文論文に発表予定である。初年度は、消耗品や試薬などが以前の研究費で購入したものの残りで賄えたものがあったこと、実験器具も老朽化してはいるが、初年度はなんとか使用できたため、予算全額を使用せず、翌年度に繰り越した。しかしながら、消耗品や試薬などは、すでに使い切っており、今後徐々に新たなものを購入する予定。また老朽化した実験器具も、今後徐々に新しくしていく予定であり、遠心機やPCR器なども今年度の予算とあわせて購入する予定。当初購入する予定とした消耗品や試薬などが、昨年購入した物の残りで賄えたものがあったこと、実験器具も老朽化してはいるが、初年度はなんとか使用できたため予算全額を使用せず、翌年度に繰り越した。現在PCが老朽化しており、データ解析業務を円滑に行うため、本年度はPCを購入予定とした。また蛋白解析に使用する実験器具も老朽・破損があり、購入予定である。
CD9分子を介したヒト絨毛細胞浸潤抑制機構の解析

胚の着床および胎盤形成の過程では、ヒト絨毛細胞は子宮内膜上皮に接着した後、脱落膜組織に浸潤していく。その様式は癌細胞浸潤のそれと類似していることが知られているが、絨毛浸潤は癌浸潤と異なりその深度および時期に応じて浸潤能が強く抑制されている。このような、絨毛細胞の浸潤停止機構の解明は、絨毛性疾患、妊娠中毒症、癒着胎盤などの絨毛浸潤の異常に関連する疾患の病態解明において重要な課題であると考えられる。我々は、白血球分化抗原の一つであるCD9分子が、脱落膜と接して浸潤を停止しているExtravillous trophoblast(EVT)に特異的に強く発現しており、妊娠後期の卵膜から採取したETVの培養系に抗CD9抗体を作用させたところ、その細胞浸潤能が亢進することを観察した。本研究ではCD9分子の絨毛細胞の浸潤制御機構を更に検討すること目的とした。すなわち、妊娠後期の卵膜から採取したETV及び絨毛癌細胞株BeWoから得た蛋白に対し抗CD9抗体を用いた免疫沈降法を行い、共沈したCD9分子に結合する分子をWestern blott法により検討したところ、ETV及びBeWo細胞においてはIntegrinα3及びα5がCD9分子と結合していることが明らかとなった。次にBeWo細胞にIntegrin α3またはα5に対する中和抗体を添加したところIntegrin α3及びα5の機能を抑制することによりBeWo細胞の浸潤能が抑制された。さらに、抗Integrin中和抗体により浸潤能の抑制されたBeWo細胞に抗CD9抗体を添加すると抗Integrin α3抗体により抑制されたBeWo細胞の浸潤能が回復した。一方、抗Integrin α5抗体により抑制された細胞浸潤能は回復しなかった。以上の結果より、絨毛細胞の浸潤に深く関与するCD9分子はIntegrinα3及びα5&結合しており、CD9分子はIntegrinα5を介した浸潤抑制機構に関与していることが示された。胚の着床及び胎盤形成の過程では,ヒト絨毛細胞は子宮内膜上皮に一過性に接着した後、脱落膜組織に浸潤し、その様式は癌細胞浸潤のそれと類似していることが知られている。しかしながら通常の絨毛浸潤は母体子宮筋層近くの脱落膜組織内で停止し、妊娠初期に認められる絨毛細胞の浸潤能は妊娠中期以後の絨毛細胞でほとんど認められない。即ち、絨毛浸潤は癌浸潤と異なりその深度及び時期に応じて浸潤能が強く抑制されている。この様な絨毛細胞における浸潤停止機構の解明は、絨毛性疾患、妊娠中毒症や癒着胎盤などの絨毛浸潤の異常に関連する疾患の病態解明並びに治療を考える上で重要な課題であると考えられるが、その機構および制御因子に関してはほとんど解明されていない。最近我々は白血球分化抗原の一つであるCD9分子が脱落膜と接して浸潤を停止しているExtravillous trophoblast(EVT)に特異的に強く発現しており、妊娠後期の卵膜から採取したEVTの培養系に抗CD9抗体を作用させたところ、その細胞浸潤能が亢進することが観察された。本研究ではCD9分子の絨毛細胞の浸潤に対する作用機序を詳細に検討した。

まず妊娠後期の卵膜から採取したEVT及び絨毛細胞株BeWoから得た蛋白に対し抗CD9抗体を用いた免疫沈降法を行い、共沈したCD9分子に結合する分子をWestern blott法により検討したところ、EVT及び絨毛細胞株BeWoにおいてはIntegrinα3及びα5がCD9分子と結合していることが明らかになった。次にBeWo細胞にIntegrin α3或いはα5に対する中和抗体を添加したところIntegrin α3及びα5の機能を抑制することによりBeWo細胞の浸潤能が抑制されることが判明した(In vitro invasion assay)。更に、抗Integrin中和抗体により浸潤能の抑制されたBeWo細胞に抗CD9抗体を添加すると抗Integrin α3中和抗体により抑制されたのBeWo細胞の浸潤能が回復し、一方抗Integrin α5中和抗体により抑制された細胞浸潤能は回復しなかった。以上の結果より、絨毛細胞の浸潤に深く関与するCD9分子はIntegrin α3及びα5に結合しており、CD9分子はIntegrin α5を介して浸潤制御機構に関与していることが示された。現在、CD9分子発現陰性の絨毛細胞株にCD9cDNAを強制発現させることにより、CD9分子の絨毛浸潤における機能を解析中である。胚の着床および胎盤形成の過程では、ヒト絨毛細胞は子宮内膜上皮に接着した後、脱落膜組織に浸潤していく。その様式は癌細胞浸潤のそれと類似していることが知られているが、絨毛浸潤は癌浸潤と異なりその深度および時期に応じて浸潤能が強く抑制されている。このような、絨毛細胞の浸潤停止機構の解明は、絨毛性疾患、妊娠中毒症、癒着胎盤などの絨毛浸潤の異常に関連する疾患の病態解明において重要な課題であると考えられる。我々は、白血球分化抗原の一つであるCD9分子が、脱落膜と接して浸潤を停止しているExtravilloustrophoblast(EVT)に特異的に強く発現しており、妊娠後期の卵膜から採取したETVの培養系に抗CD9抗体を作用させたところ、その細胞浸潤能が亢進することを観察した。本研究ではCD9分子の絨毛細胞の浸潤制御機構を更に検討すること目的とした。すなわち、妊娠後期の卵膜から採取したETV及び絨毛癌細胞株BeWoから得た蛋白に対し抗CD9抗体を用いた免疫沈降法を行い、共沈したCD9分子に結合する分子をWestern blott法により検討したところ、ETV及びBeWo細胞においてはIntegrin α3及びα5がCD9分子と結合していることが明らかとなった。次にBeWo細胞にIntegrin α3またはα5に対する中和抗体を添加したところIntegrin α3及びα6の機能を抑制することによりBeWo細胞の浸潤能が抑制された。さらに、抗Integrin中和抗体により浸潤能の抑制されたBeWo細胞に抗CD9抗体を添加すると抗Integrin α3抗体により抑制されたBeWo細胞の浸潤能が回復した。一方、抗Integrin α5抗体により抑制された細胞浸潤能は回復しなかった。以上の結果より、絨毛細胞の浸潤に深く関与するCD9分子はIntegrin α3及びα5に結合しており、CD9分子はIntegrim α5を介した浸潤抑制機構に関与していることが示された。