hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経-血管相互作用による血管ネットワーク形成に関わる遺伝子群の探索と病理機能

マウス後根神経節由来神経細胞との共存培養で活性化されるヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)の遺伝子を同定した。低酸素状態によりHMVECの可溶型VEGF受容体1(可溶型Flt-1,sFlt-1)産生が顕著に抑制され、それがmRNA選択的3'端プロセシングによる可溶型mRNA産生が減少するためであることを明らかにした。内在性アミロイドベータ蛋白デコイ受容体(esRAGE)の発現がアルツハイマー病患者脳で低下していることを見出した。HMVECではmiR-21を筆頭として約20種のミクロRNAが発現していることを見出した。マウス胎児の脳と皮膚にレンチウイルスベクターでの遺伝子導入を行った。esRAGE定量法とesRAGEトランスジェニックマウスの特許出願を行った。(1)神経-血管相互作用に関わる遺伝子を明らかにする(米倉分担)i)初代培養マウス後根神経節(DRG)の神経突起伸長系を確立した。ii)マウスDRG神経細胞の初代培養と初代培養ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)の共存培養がHMVEC遺伝子発現に及ぼす影響を、Affymetrix DNAミクロアレイで解析した。その結果、2回の独立した解析で再現性をもって1.8倍以上の発現誘導を受けた遺伝子(ESTを除く)を8遺伝子同定した。iii)同定した8遺伝子のHMVECでの発現をRT-PCR法により確認したところ、うち7遺伝子の発現が確認された。iv)Real-time RT-PCR法での検証の結果、解析を行ったすべての遺伝子が発現上昇を示していることが確認された。v)血管-神経相互作用に重要な役割を担っているVEGFの作用を調節する可溶型VEGF受容体のHMVECでの産生が低酸素状態により抑制されることを明らかにした。(2)血管で発現するミクロRNA種の実態を明らかにする(吉竹分担)i)大規模in vitro血管新生モデルを確立し、さらに管腔を形成した血管内皮細胞からRNAを分離する条件を確立した。ii)管腔を形成した血管内皮細胞と単層培養血管内皮細胞からそれぞれ分離したRNAより、ミクロRNAをクローニングし塩基配列を決定した。iii)以上の解析より、血管内皮細胞でmiR-21を筆頭として約20種のミクロRNAが発現していることが明らかとなった。ii)ミクロアレイ解析を行い管腔形成時に発現変動するミクロRNAの同定を行なった。(3)マウス子宮外発生系の皮膚血管への遺伝子・siRNA導入系の確立(八田、米倉分担)i)同定した遺伝子・ミクロRNAの個体レベルでの機能検定に備えて、レンチウイルスベクター系を確立した。(1)平成20年度にDNAミクロアレイ解析により同定したマウス後根神経節神経細胞とヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)の共存培養で発現上昇する遺伝子の発現をReal-time PCR法で検証した結果、解析を行ったすべての遺伝子が発現上昇を示していることが確認された。(2)上記遺伝子のうち、細胞内蛋白質(転写因子)であるJunBと細胞外蛋白質であるHARにつき、HMVECおよびマウス胎児への遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを作製した。作成したレンチウイルスベクターをHMVECに感染させ導入遺伝子の発現を解析したところ、大きな発現上昇を確認し、レンチウイルスベクターの有効性を確認した。(3)HMVECでの可溶型VEGF受容体(可溶型Flt-1)の産生が生体での主要な血管新生刺激である低酸素状態により顕著に抑制されることを明らかにした。また、ヒトFlt-1のミニ遺伝子を用いたmRNA 3'端プロセシング解析系により、可溶型受容体(可溶型Flt-1)と膜型受容体の産生比率を制御するmRNA前駆体上の配列を同定した。(4)平成20年度にクローニング法により同定した血管ミクロRNAのin vitro血管管腔形成(tube formation)過程における発現を、ミクロRNAアレイ法、RNAプロテクション法、ノーザン法、Real-time PCR法により解析を行った。その結果、発現変動が確認された3種のミクロRNAに焦点を当てて今後の解析を進めることとした。(5)同定した遺伝子・ミクロRNAの個体レベルでの機能検定に備えて、マウス胎児へのレンチウイルス投与を行って遺伝子導入効率を検証し、マーカーのGFPの発現を確認した。(1)血管-神経相互作用の結果、初代培養ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)で発現上昇する遺伝子のうち、細胞内蛋白質(転写因子)であるJunBと細胞外蛋白質であるHARにつき、過剰発現用のレンチウイルスベクターを作製してHMVECに感染させ、遺伝子発現変化を解析した。

その結果、血管分化や血管形成に関わることが報告されているsemaphorin、Neuropilin-1などの発現変化を確認した。(2)血管-神経相互作用での重要性が示唆されているVEGFの可溶型受容体(可溶型Flt-1)の発現制御機構につき、生体での主要な血管新生刺激である低酸素状態により血管内皮細胞での可溶型Flt-1の産生が顕著に抑制され、それがmRNA3'端プロセシングによる可溶型mRNA産生が減少することによることを明らかにした。(3)可溶型Flt-1の切断部位であるイントロン13を含むミニ遺伝子を用いて可溶型Flt-1mRNA産生を制御する配列を解析したところ、HMVECではイントロン13のU-rich regionが選択的3'端プロセシングの制御配列の1つとして機能していることが明らかとなった。(4)制御配列に結合するタンパク質をHMVECに過剰発現させると、可溶型Flt-1産生が減少することが示された。人工的な可溶型Flt-1産生制御の可能性が示された重要な成果であると考えられる。(5)マウスVEGF cDNAおよび可溶型Flt-1のcDNAを持つレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスを14日齢マウス胎児の脳と皮膚に注入し遺伝子導入を解析したところ、両方組織ともにレンチウイルスによる遺伝子導入が起こっていることが確認された。上記のレンチウイルスベクターを含めて、遺伝子導入による血管形成への影響の解析を行う。
超好熱古細菌ウイルスの増殖機構と環境応答：ウイルスエコスフィアの理解へ

土壌や水圏(淡水・海洋・温泉)など、我々の身の回りにありふれた天然(好気)環境では、全ウイルスのうち9割近くを二本鎖DNA型ウイルスが占めている。しかし近年、培養非依存的なメタゲノム法解析により、水圏底泥中などの酸素が枯渇した嫌気環境では一本鎖DNAウイルスが優占していることが見出されてきた。本研究では、嫌気性古細菌に感染する非二本鎖DNAウイルスの単離を試みるとともに、過去に培養に成功した90°Cで増殖する超好熱古細菌とそのウイルスを用い、宿主菌を様々な培養条件下で感染試験を行うことで、宿主菌の異なる代謝系がウイルスの感染能力に与える影響を培養法により評価する。
難消化性食品成分の志賀毒素の吸着性

これまでに、緑藻類ウスバアオノリ由来のラムナン硫酸が志賀毒素吸着性を示すことを明らかにしたが、他の食用緑藻類についても志賀毒素吸着性を検討した。ヒトエグサ及びスジアオノリから、同様にラムナン硫酸を精製し、志賀毒素吸着性と構造との関係を調べたところ、硫酸エステル含量がウスバアオノリ(18%)よりも多いヒトエグサ由来のラムナン硫酸(硫酸エステル含量32%)は志賀毒素吸着性が低く、硫酸エステル含量がウスバアオノリとほぼ同じスジアオノリはウスバアオノリと同等の志賀毒素吸着性を示した。ウスバアオノリ由来のラムナン硫酸を更に硫酸エステル化して、硫酸エステル含量を高めると、志賀毒素吸着性は低下することも確認した。一方、ポリγ-グルタミン酸の志賀毒素吸着性についても、各種市販納豆を用いて検討したところ、大豆を原料とする市販品は製造者に関わらず、精製したポリγ-グルタミン酸はいずれも志賀毒素を吸着した。今後、更に詳細な検討を行う予定である。また、志賀毒素吸着性を指標として、穀類(アマランサス、うるち米、大麦、キヌア、小麦、そば米、はと麦、ポップコーン、もちあわ、もちきび、もち黒米、もち米)、各種柑橘類並びに肉類のスクリーニングを平行透析法により行ったところ、肉類成分に志賀毒素吸着性が見られ、今後更に検討を行う予定である。納豆由来ポリγ-グルタミン酸の志賀毒素吸着性に関わる構造解析のため、固定化ポリγ-グルタミン酸を作製すると共に、構成成分であるグルタミン酸、並びに類縁物質のグルタル酸とポリアクリル酸を固定化した標品も作成し、志賀毒素吸着性を検討したところ、固定化ポリアクリル酸以外は、すべて志賀毒素吸着性を示したことから、結合に必要な構造はグルタリル基であることが判明した。計画していた全ての実験を行い、以下の有益な成果を得たため。ウスバアオノリ以外の食用緑藻類由来ラムナン硫酸を精製して志賀毒素吸着性を検討し、ヒトエグサ及びスジアオノリが志賀毒素吸着性を有することを明らかにすると共に、硫酸エステル含量が志賀毒素吸着性に影響を与えることを明らかにした。また、硫酸エステル含量を高めると、志賀毒素吸着性は低下することも確認した。また、各種市販納豆からポリγ-グルタミン酸を精製し、志賀毒素吸着性を有することを明らかにした。更に、志賀毒素吸着性を示すポリγグルタミン酸の結合部位を検討し、結合に必要な構造はグルタリル基であることを明らかにした。また、志賀毒素吸着性を指標として、各種食品のスクリーニングを行い、肉類成分に志賀毒素吸着性を見出した。ラムナン硫酸の更なる硫酸エステル化は志賀毒素吸着性を低下させたことから、脱硫酸化による活性の変化を検討する。脱硫酸化法としては、メタノリシス法並びにソルボリシス法を検討する予定である。なお、これらの方法は硫酸エステルの脱離以外に、一部グリコシド結合の切断による低分子化も予想されるため、実験条件の検討や低分子化したラムナン硫酸の除去も行う予定である。平均分子量が異なるポリγ-グルタミン酸とラムナン硫酸は、市販納豆由来の精製ポリγ-グルタミン酸、並びにウスバアオノリ由来の精製ラムナン硫酸を部分酸加水分解により、それぞれ調製する。市販納豆から精製したポリγ-グルタミン酸は、構成成分であるグルタミン酸のDL比が異なることを見出したため、市販納豆から精製したポリγ-グルタミン酸を用いて、DL比と志賀毒素吸着性との関連を検討すると共に、志賀毒素の結合性に与えるpH、イオン強度、共存物質、脂質環境等の環境因子についても検討する。また、ベロ細胞に対する志賀毒素の細胞毒性について、志賀毒素吸着性成分の保護効果も検討する。新たな志賀毒素吸着性食品については、各種食品のスクリーニング結果から、効果が見られた食肉類について今後更に検討を行う予定である。以上の志賀毒素吸着性物質の特性に基いて、納豆や緑藻の調理・加工法を検討し、新規機能性加工食品の開発についても検討を開始する。

納豆由来ポリγ-グルタミン酸の志賀毒素吸着性に関わる構造解析のため、固定化ポリγ-グルタミン酸を作製すると共に、構成成分であるグルタミン酸、並びに類縁物質のグルタル酸とポリアクリル酸を固定化した標品も作成し、志賀毒素吸着性を検討したところ、固定化ポリアクリル酸以外は、すべて志賀毒素吸着性を示したことから、結合に必要な構造はグルタリル基であることが判明した。計画していた全ての実験を行い、以下の有益な成果を得たため。ウスバアオノリ以外の食用緑藻類由来ラムナン硫酸を精製して志賀毒素吸着性を検討し、ヒトエグサ及びスジアオノリが志賀毒素吸着性を有することを明らかにすると共に、硫酸エステル含量が志賀毒素吸着性に影響を与えることを明らかにした。また、硫酸エステル含量を高めると、志賀毒素吸着性は低下することも確認した。また、各種市販納豆からポリγ-グルタミン酸を精製し、志賀毒素吸着性を有することを明らかにした。更に、志賀毒素吸着性を示すポリγグルタミン酸の結合部位を検討し、結合に必要な構造はグルタリル基であることを明らかにした。また、志賀毒素吸着性を指標として、各種食品のスクリーニングを行い、肉類成分に志賀毒素吸着性を見出した。ラムナン硫酸の更なる硫酸エステル化は志賀毒素吸着性を低下させたことから、脱硫酸化による活性の変化を検討する。脱硫酸化法としては、メタノリシス法並びにソルボリシス法を検討する予定である。なお、これらの方法は硫酸エステルの脱離以外に、一部グリコシド結合の切断による低分子化も予想されるため、実験条件の検討や低分子化したラムナン硫酸の除去も行う予定である。平均分子量が異なるポリγ-グルタミン酸とラムナン硫酸は、市販納豆由来の精製ポリγ-グルタミン酸、並びにウスバアオノリ由来の精製ラムナン硫酸を部分酸加水分解により、それぞれ調製する。市販納豆から精製したポリγ-グルタミン酸は、構成成分であるグルタミン酸のDL比が異なることを見出したため、市販納豆から精製したポリγ-グルタミン酸を用いて、DL比と志賀毒素吸着性との関連を検討すると共に、志賀毒素の結合性に与えるpH、イオン強度、共存物質、脂質環境等の環境因子についても検討する。また、ベロ細胞に対する志賀毒素の細胞毒性について、志賀毒素吸着性成分の保護効果も検討する。新たな志賀毒素吸着性食品については、各種食品のスクリーニング結果から、効果が見られた食肉類について今後更に検討を行う予定である。以上の志賀毒素吸着性物質の特性に基いて、納豆や緑藻の調理・加工法を検討し、新規機能性加工食品の開発についても検討を開始する。
北ケニア牧畜民の社会・生態学的適応機構に関する比較研究

平成元年度は、本研究の最終年度にあたるので、昭和61年度と同63年度に行った現地調査で得た資料を整理し、吟味し、研究成果の公表を行うと同時に、今後研究すべき内容も煮つめることに焦点を合わした。この目的を達成するために、本研究と関連性を持つ北ケニアの牧畜諸民族を研究した実績を持つ4人の研究者にも本研究への参加と協力をお願いした。上記の目的にそって、以下の3つの項目を吟味して、社会・生態学的視点にたった比較研究をおこなった。1.個々の牧畜社会の社会・生態学的適応機構の解析:本研究では、原子がガブラ族に関して、また河合がチャムス族に関して、それぞれ通時的視点から家族集団の構造変化と居住様式を分析した。そして、ガブラ族に関しては、家族集団が、家畜の遊牧飼養上の必要性のほかに、年齢体系に関わる諸儀礼を胞族の聖地に巡礼して行うために地域的な分散を行うこと、内部的には、男系近親者との共住よりも姻族との共住が強く指向され、さらに生活依存者をも幅広く糾合して自立的集落を構築してその采配をふるうことが強く指向されていることなどが判明した。チャムス族は、半農半牧の定着的生活を送っているが、一夫多妻家族内の夫婦間と父子間紐帯は極度に脆弱であり、妻の繁殖能力と彼女の息子の社会的成長に準拠して、母子単位ごとに速やかに分裂してしまう。この特徴は、マサイ系諸民族に共通に見られるものであるが、この点に関する要因論をも視野にいれた比較資料の収集は、今後に残された課題である。トウルカナ族(分担者:太田と北村)とレンディ-レ族(佐藤)に関しては、家畜の法的管理とその運用のあり方を社会関係との相互関連性の点から分析された。社会構造上の拘束の弱い前者の社会では、家畜は、贈与の形式で当事者間に授受されること、家畜は当事者間の個人的互酬感覚に依拠して授受されるのであって、社会の規範的制度に拘束されて授受されるのではないこと、このような社会では、個人の自力解決能力と獲得的な社会関係網を構築することが、生存する上での絶対的資質であるので、相手を容赦しない社会的相互交渉の手段がとられること、などが明らかになってきた。逆に、社会構造上の拘束の強い後者の社会では、社会・文化的価値を高く付与されたラクダは、家族集団の基本構造内でこそ贈与されることがあっても、それ以外の者には貸与の形式がとられること、ラクダの貸借関係は当事者だけでなくその長子息子にも継承されて通世代的に存続すること、ラクダの贈与や貸与に関する慣習上の運用規則には社会的構造の境界が明示されていること、このような社会では家畜に対する個人の法的所有権すらも共同体的社会交渉によって強い干渉を受けることなどが明らかになっている。2.社会・生態学的適応戦略の有効性に関する比較研究:佐藤は、牧畜社会に集団主義的なものと個人主義的なものの二つの対照的な適応戦略が認められることを指摘している。この仮説を検証するためには、家畜群と人口との通時的構造、家畜移譲体系、家畜文化複合などに関する詳細な資料の収集が必要とされる。本研究によって得た、トゥルカナとレンディ-レの社会における家畜移譲体系の対照的な特徴とガブラとチャムスの社会における家族集団の構造的特徴に関する新たな知見は、上記の仮説を支持するものである。3.牧畜社会の社会進化史的考察:本研究では、牧畜社会と狩猟採集民社会との比較を互酬原理と家畜群の放牧管理の点で行った。大崎は、本研究の第1次現地調査で得たハッザ族の互酬行動に関する知見とサン族の関連資料との比較研究を行い、彼らの社会に制度化されない互酬原理が根付いていることを明らかにした。この点、レンディ-レの家畜をめぐる互酬原理は、極度に制度化されたものであり、トゥルカナのは両者の中間に位置ずけられると考えられる。鹿野は、サンブル族の小型家畜群の放牧管理機構を動物社会学的視点から分析した。家畜群の凝集性が、家畜個体にそなわっている所属群全体に対する親和性と牧人からこうむる日帰り放牧による強制移動の体験に帰因することを明かにして、家畜化の起源として、群れ順化説よりも幼獣の個別順化説の方に妥当性があることを指摘した。本研究では、トゥルカナ族とレンディ-レ族を対極におき、他の北ケニアの牧畜社会をその中間に位置ずけるという社会・生態学的適応機構の系列を明かにすることができた。しかし、家畜文化複合に着目した地域文化誌や家畜の仲介商人の地域商業網と生業牧民との複合構造は、個々の共同体的社会の適応機構を包括的に解明する上で重要な課題として残されている。

そして、ガブラ族に関しては、家族集団が、家畜の遊牧飼養上の必要性のほかに、年齢体系に関わる諸儀礼を胞族の聖地に巡礼して行うために地域的な分散を行うこと、内部的には、男系近親者との共住よりも姻族との共住が強く指向され、さらに生活依存者をも幅広く糾合して自立的集落を構築してその采配をふるうことが強く指向されていることなどが判明した。チャムス族は、半農半牧の定着的生活を送っているが、一夫多妻家族内の夫婦間と父子間紐帯は極度に脆弱であり、妻の繁殖能力と彼女の息子の社会的成長に準拠して、母子単位ごとに速やかに分裂してしまう。この特徴は、マサイ系諸民族に共通に見られるものであるが、この点に関する要因論をも視野にいれた比較資料の収集は、今後に残された課題である。トウルカナ族(分担者:太田と北村)とレンディ-レ族(佐藤)に関しては、家畜の法的管理とその運用のあり方を社会関係との相互関連性の点から分析された。社会構造上の拘束の弱い前者の社会では、家畜は、贈与の形式で当事者間に授受されること、家畜は当事者間の個人的互酬感覚に依拠して授受されるのであって、社会の規範的制度に拘束されて授受されるのではないこと、このような社会では、個人の自力解決能力と獲得的な社会関係網を構築することが、生存する上での絶対的資質であるので、相手を容赦しない社会的相互交渉の手段がとられること、などが明らかになってきた。逆に、社会構造上の拘束の強い後者の社会では、社会・文化的価値を高く付与されたラクダは、家族集団の基本構造内でこそ贈与されることがあっても、それ以外の者には貸与の形式がとられること、ラクダの貸借関係は当事者だけでなくその長子息子にも継承されて通世代的に存続すること、ラクダの贈与や貸与に関する慣習上の運用規則には社会的構造の境界が明示されていること、このような社会では家畜に対する個人の法的所有権すらも共同体的社会交渉によって強い干渉を受けることなどが明らかになっている。2.社会・生態学的適応戦略の有効性に関する比較研究:佐藤は、牧畜社会に集団主義的なものと個人主義的なものの二つの対照的な適応戦略が認められることを指摘している。この仮説を検証するためには、家畜群と人口との通時的構造、家畜移譲体系、家畜文化複合などに関する詳細な資料の収集が必要とされる。本研究によって得た、トゥルカナとレンディ-レの社会における家畜移譲体系の対照的な特徴とガブラとチャムスの社会における家族集団の構造的特徴に関する新たな知見は、上記の仮説を支持するものである。3.牧畜社会の社会進化史的考察:本研究では、牧畜社会と狩猟採集民社会との比較を互酬原理と家畜群の放牧管理の点で行った。大崎は、本研究の第1次現地調査で得たハッザ族の互酬行動に関する知見とサン族の関連資料との比較研究を行い、彼らの社会に制度化されない互酬原理が根付いていることを明らかにした。この点、レンディ-レの家畜をめぐる互酬原理は、極度に制度化されたものであり、トゥルカナのは両者の中間に位置ずけられると考えられる。鹿野は、サンブル族の小型家畜群の放牧管理機構を動物社会学的視点から分析した。家畜群の凝集性が、家畜個体にそなわっている所属群全体に対する親和性と牧人からこうむる日帰り放牧による強制移動の体験に帰因することを明かにして、家畜化の起源として、群れ順化説よりも幼獣の個別順化説の方に妥当性があることを指摘した。本研究では、トゥルカナ族とレンディ-レ族を対極におき、他の北ケニアの牧畜社会をその中間に位置ずけるという社会・生態学的適応機構の系列を明かにすることができた。
ケニア西部の土地荒廃地域における地域環境の保全と地域文化に関する学際的研究

ケニア西部ビクトリア湖岸では1930年頃以降土壌侵食が起こっている。最近はガリーが深く、畑の端が突然崩れるなど住民の生活を脅かすまでに拡大してきている。この土壌はNa含量が高く、水を含むと分散しやすい性質である上に、放牧を生業としてきた住民ルオ族の人々が家畜の過放牧を行って裸地となり、強い降雨が発生すると、水が表面流去水となって一気に流れ込むことが侵食の原因と推測された。住民は農学的、農業土木的対策を試行しているが、個人レベルでの試みに限られていて面的な広がりになりにくい問題があるので、住民の組織化による対策が必要であることがわかった。ケニアでは、各地で土壌侵食が起こり、ひどい地域では、周辺住民の生活を脅かす大きな環境破壊になっている。本研究では、名古屋大学の星野らが、2003年から3年間、地質学的研究を中心に実態調査を行ったケニア西部の侵食進行地域を主な調査対象地として、以下(1)(4)の調査研究を行う。そして、土壌侵食、特にガリー侵食に対するヒューマンインパクトを明らかにし、土壌侵食の問題の緊急性と危険予測の指摘及び地域資源を有効に活用した保全農業方式を確立し、地域住民の側に立った地域環境管理方策を提言する。(1)土壌侵食メカニズムの解明と対策技術の検討(2)土地利用および植生被覆の現状と過去の変遷の解明(3)作付体系や農業技術等の現状と過去の変遷の解明および改善方策の検討(4)地域住民の社会組織・精神生活に関する調査ケニア西部ビクトリア湖岸では1930年頃以降土壌侵食が起こっている。ケニア西部ビクトリア湖岸で、土壌侵食が住民の生活を脅かす大きな環境破壊となっている地域を調査対象地とし、農学(土壌肥料、作物、農業経済)、地質学及び文化人類学の専門分野を異にする学際的な研究チームが、1)土壌侵食メカニズムの解明と対策技術の検討、2)土地利用及び植生被覆の現状と過去の変遷の解明、3)作付体系や農業技術等の現状と過去の変遷の解明および改善方策の検討、及び4)地域住民の社会組織・精神生活に関する調査を行う。土壌侵食に対するヒューマンインパクトを明らかにし、この問題の緊急性と危険予測の指摘及び地域資源等を有効に活用した保全農業方式を検討して、地域住民の側に立った地域環境管理方策を提言することを目的とする。平成20年度は、ケニア・マセノ大学のProf.J.C.Onyango(作物学)を中心とする土壌、農業経済研究者との共同研究体制を、また、ビクトリア湖岸地域の開発を業務とするビクトリア湖岸地域開発公社(LBDA)およびケニア国立農業研究所(KARI)キボス試験場と研究協力体制を築いた。全員が2組に分かれて現地調査に入り取り組む問題の共有を図った。土壌の特徴を調べるためKatok-Kodeyoに広がるガリー侵食断面から土壌試料を採取し予備的に化学分析して詳細分析につなぐ結果を得た。また土地利用の現状解析のためR/NIR光反射率で植生を分析し、他の手法での検討が必要なことが分かった。農家調査では、SonduタイプとAwachiタイプの2つの異なるガリー侵食が起こっている村落の農民を対象に事前調査を行い、自然的条件と社会的条件の両面に係わる今後の重点調査項目を明らかにした。それに基づいて約3ヶ月の滞在調査を行い過去57年間の降水量データの収集や家畜の放牧状況と村人の生活を観察した。その解析は次年度に行う。ケニア西部ビクトリア湖岸で、土壌侵食(ガリー侵食)が住民の生活を脅かす大きな環境破壊となっている地域を調査対象地とし、農学(土壌肥料、作物、農業経済)、地質学及び文化人類学の専門分野を異にする学際的な研究チームで調査研究を行った。カトクデオの深さ約10m、幅約20mのAwach型ガリー壁面の土壌の土性は土層によって異なるが、粘土1632%、砂4767%、シルト1024%で埴壌土または砂質埴壊土であった。ガリー底に近い土層の土壌はNa含量が高く、陽イオン(Ca+Mg+K+Na)に占めるその割合は20%以上で、侵食に対してもろい性格であることを示唆した。実際に、乾燥状態では固くても水分を与えると崩壊しやすかった。ガリー侵食を引き起こす営力の大部分は表面流によるものであるため、地形による表面流のパターンを標高データから求めたところ集水域にほぼ一致していた。緩斜面の斜面下部の流水経路を明らかにするため、QuickBird衛星写真から求めた平坦部の土地利用状況を判読したところ、民家の敷地の境界や耕作地の分布のほか、草本類の植生被覆の濃淡が認められた。この地域は家畜を放牧しているため、そのフットパスとの関連をさらに調べたい。農家に3ヶ月滞在して調査を行った。

この地域では国際機関、国立機関やNGOなどによる土壌侵食防止の活動が行われていたが、いずれも農民グループを介して間接的に対処方策を実施しており、その持続性に問題が認められた。また農民グループの援助に対する対応の仕方についてもある程度の理解が得られた。地域住民の人類学的および社会経済学的調査のためのクエスチョネアを作成し予備調査を行い、次年度予定の詳細調査のための対象農家を選定した。ケニア西部ビクトリア湖岸で、土壌侵食(ガリー侵食)が住民の生活を脅かす大きな環境破壊となっている地域を調査対象地とし、農学(土壌肥料、作物、農業経済)、地質学及び文化人類学の専門分野を異にする学際的な研究チームで引き続き調査研究を行った。1967年の航空写真を精査した結果、ガリー侵食が規模は小さいもののすでに起こっていることが確認できた。ガリー侵食の現地で互いに近傍に生育するユーカリの根がネット状に絡み合い、組織の一部が融合し、周囲の土壌が侵食を受けて根が裸になっても融合した近傍の個体から水分や養分の供給を受けて生育を続けている状況が観察された。ユーカリは生育が早く、侵食抑制に対する効果の検証が重要であることが分かった。ガリー侵食が起こる集水域で放牧家畜の往来によって作られるフットパスが降雨時に表面流去水の流水経路となることが観察されたので、表面流去の方向と集水域内にある圃場毎の傾斜度および土地被覆の状況から降雨時の土壌侵食予測マップ作成の可能性を追究することとした。地域住民に対する危険予報として提案することを考えている。流去水を畝のある水田(天水田)に貯留して土壌侵食を抑制し、同時に貯留水を有効に利用してイネを栽培する圃場試験を試みたが、天候不順のため降雨不足となり次年度に再試験することとした。社会経済的な調査の結果、住民ルオの社会には、現代のケニア社会が抱える問題の縮図が影を落としていることが観察された。すなわち、住民はコミュニティー意識や敬老の意識を失いつつあり、住民を一つにまとめることが難しい状況にあることが分かった。住民独自のルオ語と若者が教育を受ける英語というコミュニケーションツールの違い、その地に残る者と都会に働きに出る者の違いなどによって意識の違いが出てきているように思われた。そこで、本研究の結果を住民に報告し、土壌侵食対策をとる場合、住民のどの構成層を対象にすることが適切かと言えば、若者を対象とするのがよく、ジェンダーについては今後の検討として残された。また、調査対象地の集水域の中下流域にはルオ族が住んでいるが、上流域にはキプシギスがいるので、キプシギス地域から流去水が発生することを考えれば、両種族の関係を改善し、問題意識を共有させることが現実的には最も重要であるのではないかと推察された。根が絡み合い土壌侵食の抑制効果があると推察したユーカリの根は、周囲の土壌が流出しても互いに支え合っていることが確認されたが、根の組織の融合についてはまだ確証が得られていない。QuickBird衛星画像の解析から、2004年から2009年の5年間でガリー侵食集水域内の人工建造物が約1.6倍に増加し、等高線に沿った線状の裸地がより顕著になっていることが推察された。
網羅的ゲノム・エピゲノム解析による神経芽腫再発・治療抵抗性獲得のメカニズムの解明

高リスク神経芽腫の5年生存率は40%前後と不良である。初発時転移のある神経芽腫の7割は初回治療に反応し、一旦Complete remissionとなるが、その後やく半数が再発する。一旦再発した腫瘍は治療抵抗性を獲得することが多く、不幸な転帰をたどる。我々は初発時の腫瘍と再発時の腫瘍に明らかな治療反応性の差異があることに着目し、網羅的遺伝子解析により治療抵抗性獲得のメカニズムの解明を試みた。初発・再発の腫瘍がセットで存在する高リスク神経芽腫について、各々の腫瘍組織の全エクソーム解析をおこない、すでに報告のあるRas-MAPK経路以外の分子にあらたな体細胞遺伝子変異が生じることを明らかにした。本研究は、次世代シークエンサーを用いた網羅的解析により神経芽腫が再発に至るメカニズムを解明することを目的とする。初発時および再発時の検体がセットで存在する神経芽腫症例につき、2点間のゲノム・エピゲノムレベルの変化を解析することによりクローン進化の機序を明白にし、神経芽腫が再発に至るプロセスで鍵となる分子の同定を目指す。平成26年度は以下の研究を行った。1倫理審査承認:共同研究に参画する3施設でそれぞれ倫理審査承認を得た。その上で初発・再発の双方の検体がペアで存在する症例を選出し、患者または患者家族の同意を得られる場合には同意を取得した。2選出された症例の初発時サンプルに対し、従来行われてきた網羅的ゲノム解析法であるアレイCGH法を用いて神経芽腫の予後因子としてcriticalであるとされるMYCN遺伝子増幅の有無、DNA ploidy、1p loss、11q loss、17q partial gainを解析した。さらに236例の神経芽腫検体を元に作成されたgenomic signature(Tomiokaら、Oncoge 2008)を元に各症例の予後解析をおこなった。対象症例は6例あり、いずれもstage 4であった。4例はすでに腫瘍死しており、2例は再発生存中であった。MYCN増幅は5例にみとめた。Genomic signature解析は4例に対し行っており、1p lossは3例、11qLOHが2例、17q partial gainは2例に認められた。いずれも5年生存率30%以下と非常に予後の不良なグループに属する腫瘍であることがわかった。3エクソームシークエンス解析:倫理審査承認に時間を要し、今回対象とする検体の解析を行うに至らなかった。そのため既存の検体を用い条件調整を行った。本研究次世代シークエンサーを用いた網羅的解析により神経芽腫が再発に至るメカニズムを解明することを目的とする。初発時および再発時の検体がセットで存在する神経芽腫症例につき、2点間のゲノム・エピゲノムレベルの変化を解析することによりクローン進化の機序を明白にし、神経芽腫が再発に至るプロセスで鍵となる分子の同定をめざす。平成27年度は初発および再発神経芽腫での変異解析のために、次世代シーケンサーを用いた神経芽腫細胞株の全エクソーム解析にて条件検討を行った。細胞株から抽出したDNAをCovaris社DNA Shearingシステムで200bp程度に断片化し、これをAMPure XPビーズ精製した。クオリティチェックには電気泳動システムAgilent 4200TapeStationを用いた。Agilent社SureSelectターゲットエンリッチシステム、Human All Exon V5+UTRsを用いて全エクソーム領域のライブラリー調製を行った。シーケンサーにはIllumina社MiSeqを使用し、Reagent Kit v2, 7.5Gbを試薬として用いることで平均100 reads程度のdepthを得ることができた。得られたシーケンスデータはCLC Genomics workbenchを用いて参照配列(hg19)にマッピングし、変異解析を行った。Non-synonymous変異、細胞株であることから変異頻度が30%以上、多型頻度が1%未満、蛋白質の機能に影響すると予想される(PROVEAN, Polyphen, Shiftによる解析)変異や、これまでに腫瘍において報告されている変異を候補遺伝子とした。以上、全エクソーム解析に十分な解析結果を得ることができた。1年目の研究が倫理審査手続きに時間を要したために当初の研究計画より若干の遅れがあるが、今年度解析の予備実験はほぼ完了し、今後は症例数を増やして解析を行うことが可能となるため、挽回できる遅れであると考えている。本年度は初発凍結検体、再発凍結検体及びコントロールとして末梢血DNAが揃った2症例にて前年度に検討した条件にて、それぞれエクソームシークエンスを実施した。1症例はMYCN増幅腫瘍であり残りの1症例はMYCN非増幅腫瘍である。このうちMYCN非増幅腫瘍にてCLC Genomics workbenchを用いて参照配列(hg19)にマッピングし体細胞変異解析を行った。初発検体では26遺伝子で再発検体では77遺伝子でアミノ酸置換を伴う体細胞遺伝子変異を見出し、17遺伝子が初発再発両腫瘍で共通していた。このうち初発の14遺伝子および再発の21遺伝子は以前に腫瘍で変異が報告されている遺伝子であった。

これまでの報告から再発を呈する神経芽腫においてRAS-MAPKシグナルを活性化すると予測される遺伝子異常(ALK・NF1・PTPN11・FGFR1・NRAS・KRAS・HRAS・BRAF)が見出されているが、本症例においてはこれら遺伝子に変異は生じていなかった。従って、この症例はRAS-MAPKシグナルを活性化とは異なるメカニズムによって治療抵抗性を獲得し再発に至ったと考えられる。高リスク神経芽腫の5年生存率は40%前後と不良である。初発時転移のある神経芽腫の7割は初回治療に反応し、一旦Complete remissionとなるが、その後やく半数が再発する。一旦再発した腫瘍は治療抵抗性を獲得することが多く、不幸な転帰をたどる。我々は初発時の腫瘍と再発時の腫瘍に明らかな治療反応性の差異があることに着目し、網羅的遺伝子解析により治療抵抗性獲得のメカニズムの解明を試みた。初発・再発の腫瘍がセットで存在する高リスク神経芽腫について、各々の腫瘍組織の全エクソーム解析をおこない、すでに報告のあるRas-MAPK経路以外の分子にあらたな体細胞遺伝子変異が生じることを明らかにした。倫理審査手続きに若干予想を上回る時間を要したこと、過去の検体調整に時間を要したことが計画より遅れている原因となっている。今後挽回できる遅れと考えている。今後、凍結検体及びホルマリン固定パラフィン包埋検体(FFPE)を用いて初発・再発神経芽腫検体における全エクソーム解析を行う予定である。ライブラリー調製にはSureSelectターゲットエンリッチシステムにKAPA HTP Library Preparation Kitを組み合わせることで、FFPE由来の微量なゲノムDNAでも全エクソーム解析が可能なライブラリーの調製が期待できる。小児外科学当初の予定どおり次世代シーケンサーを用いたエクソーム解析およびエピゲノム異常解析を行う予定である。当該年度の研究に用いる試薬は不足なく購入できた。次年度は検体数を増やして本格的な解析を行う必要があり、これに充当するために残額210,405円を次年度に使用することにした。研究に用いる試薬を不足なく購入でき、次年度以降、本格的な解析を開始するにあたりより多くの予算が必要とされると判断したため、残額14971円を次年度に使用することにしました。サンプル調整試薬および学会での発表・論文校正などに用いる予定。サンプル調整試薬に用いる予定。
In-Situ反応制御プロセスによる高温対応エレクトロニクス実装部の形成

300°C以下の温度で実装でき、実装後には2次実装を想定した260°Cでも液相を生成しない高温対応エレクトロニクス実装部を実現するための接合プロセスの開発を目的とし、以下の2通りのプロセスについて検討を行なった。1.はんだ/めっき界面反応を利用した高融点化プロセスSn-3.5Ag共晶はんだとNi-Co/Auめっきとを反応させることで接合部に金属間化合物を形成し高融点化を行った。接合界面には(Ni, Co)Sn_2が反応層として形成し、この層を介してNiとCoがはんだ中へ高速拡散してSnと反応し、接合部の金属間化合物化が急速に進行した。その結果、リフロー温度240°Cにおいて接合部がIn-situに金属間化合物化し高融点化することが分かった。2.有機-Ag複合ナノ粒子を用いた接合プロセス有機-銀複合ナノ粒子(粒子径10nm)を用いた銅の接合では、大気中300°C以下で、有機殻分解による金属新生面の露出をトリガーとして、銀ナノ粒子同士と銀ナノ粒子と基板金属の接合がIn-Situに達成され、高い接合強度が得られることが分かった。その接合部は銀の緻密な多結晶構造でありバルク銀の特性を有することが示唆された。銅との接合継手に対して、接合パラメータの影響を系統的に検討した結果、適切なの接合条件では、最大50PMPaを超える接合強度が得られることが分かった。また、接合温度と加圧力が接合強度に大きな影響を及ぼし、加圧力を5MPaとすれば接合温度260°Cで高い強度が得られ、300°Cの接合温度では1PMaの低加圧力で接合可能であることが分かった。この結果に基づいて、高温対応エレクトロニクス実装に適用できる強度が得られる接合条件範囲を定量的に明らかにした。以上の結果から、本接合プロセスは、従来の鉛リッチはんだや金リッチはんだに対して十分代替可能であることが分かった。(1)はんだ/めっき面反応を利用した高融点化プロセスはんだには低温実装が可能なSn-3.5Ag共晶はんだを用い、リフロー過程で基板上のNi-Co/Auめっきと反応させることで接合部に金属間化合物を形成し高融点化を行った。その結果、めっきがNiのみあるいはNiとAuのみでは、界面にNi_3Sn_4層が形成し、この層中のNi拡散が遅いため、はんだ全体の化合物化には至らなかった。これに対してCoを添加したNi-Coめっきでは、界面に(Ni,Co)Sn_2が反応層として形成し、この層を介してNiとCoがはんだ中へ拡散してSnと反応した。このときのNi、Coの拡散反応が速いため、接合部の金属間化合物化が急速に進行した。その結果、Ni-Co/Auめっきを用いることでリフロー温度240°Cにおいて接合部が金属間化合物化し高融点化することが分かった。(2)有機-Ag複合ナノ粒を用いた接合プロセスナノ粒子の低温焼成機能を利用して低温で実装し、焼成後に接合部を高融点化する新しい接合プロセスの開発を行った。本プロセスでは有機殻で被覆された粒径10nm以下の有機-Ag複合ナノ粒子を用いた。

熱分析の結果、本ナノ粒子は200°C程度の温度で有機殻が分解しナノ粒子の機能を発現するためエレクトロニクス実装温度での適用が可能であることが分かった。Cu円板接合体を有機-Ag複合ナノ粒子を用いて接合した結果、接合温度300°C以下でナノ粒子の自己焼成とともにCuとの金属接合も達成されることが確認できた。また、得られた接合部は従来の高温はんだを用いた接合部と同等以上の接合強度を有しており、高温対応実装プロセスとして適応可能であることが分かった。300°C以下の温度で実装でき、実装後には2次実装を想定した260°Cでも液相を生成しない高温対応エレクトロニクス実装部を実現するための接合プロセスの開発を目的とし、有機-銀複合ナノ粒子を用いたプロセスの接合機構解明とエレクトロニクス実装への適用を検討した。有機-銀複合ナノ粒子(粒子径10nm)と通常の銀微粒子(粒子径100nm)を用いて大気中300°Cで銅を接合し、その接合強度を比較した結果、前者は40MPa以上の接合強度を示すが、後者の強度は5PMa程度と低強度であった。破面、破断経路の観察および接合界面の透過型電子顕微鏡による観察結果より、前者の接合部では銅と銀の金属接合が達成されているのに対して、後者の接合は単純なアンカー効果であった。この結果、有機-銀複合ナノ粒子による接合では、有機殻分解による金属新生面の露出をトリガーとして銀ナノ粒子同士と銀ナノ粒子と基板金属の接合がIn-Situに達成され、これが高い接合強度をもたらすことが分かった。また、得られて銀接合層は緻密な多結晶構造でありバルク銀の特性を有することが示唆された。銅との接合継手に対して、接合強度に及ぼす接合温度、接合時間、加圧力などの接合パラメータの影響を系統的に検討した結果、高温あるいは高加圧の接合条件では、最大50PMPaを超える接合強度が得られることが分かった。また、接合温度と加圧力が接合強度に大きな影響を及ぼし、加圧力を5MPaとすれば接合温度260°Cで高い強度が得られ、300°Cの接合温度では1PMaの低加圧力で接合可能であることが分かった。この結果に基づいて、高温対応エレクトロニクス実装に適用できる強度が得られる接合条件範囲を定量的に明らかにした。以上の結果から、本接合プロセスは、従来の鉛リッチはんだや金リッチはんだに対して十分代替可能であることが分かった。
ホーチミン市圏での航空機騒音曝露の大きな変化が住民の反応や健康状態に及ぼす影響

ベトナム政府はホーチミン市の東にロンタン(LT)空港を建設することを決定した。LT空港が開港されると、現在ベトナム最大の空港であるホーチミン市のタンソンニャット(TSN)空港の混雑を減らすことができる。LT空港が開港するとTSN空港周辺の住民への航空機騒音暴露量は減少すると予想される。一方、LT空港周辺の住民は騒音に暴露され、健康影響を及ぼす可能性が高くなる。本研究では、TSN空港周辺で2008年に調査を実施して以来、約10年ぶりにフォローアップ調査をするとともに、LT空港の開港前に住民の健康影響調査を実施する。TSN空港はstep-change研究に、LT空港はコーホート研究につながる。
光線力学療法の獣医腫瘍治療への応用:適応法と有効性

光線力学療法(PDT)は、腫瘍親和性の光感受性物質を腫瘍動物にあらかじめ投与し、その後に光励起することによって腫瘍を消退させる新しい治療法である。本研究では、組織透過性が高い690nmの吸収波長を有する第二世代の光感受性物質であるBPD-MAを動物の腫瘍に対するPDTに適応するため、基礎的および臨床学的研究を行った。腫瘍細胞に対するBPD-MAの光物理化学的反応について、げっ歯類の異なる4種類の腫瘍細胞を用いてin vitroで検討した結果、腫瘍細胞の種類、光感受性物質の濃度、あるいは照射光量を示すフルエンスなどの様々な要因の影響を受ける事が明らかとなった。In vivoでは、BPD-MA投与開始3時間後にPDTを実施した群に比べて、15分後にPDTを行う抗血管PDT群の方が血流の遮断とそれによる抗腫瘍効果がより強いことを示した。犬の臨床治療試験例において、血中のBPD-MA濃度の推移を検討した結果、BPD-MAは急速に代謝されるため、光照射を短時間で終了する必要があるものの、排泄が速くて蓄積性が低いため、繰り返してPDTを行うことが可能であると判断された。19症例の頭部腫瘍の犬に0.5mg/kgのBPD-MAを静脈内に10分間かけて投与し、投与開始15分後に光照射を実施する抗血管PDTの結果、従来の放射線療法や抗がん化学療法などに比べてより良好な治療結果を得た。さらに血管造影CT法は、腫瘍血管構築網を描写することができるため、抗血管PDTの適応症例の選択および治療効果の判定に極めて有用な方法になり得る事を明らかにした。以上の通り、小動物の悪性固形腫瘍の治療において、BPD-MAを用いた抗血管PDTは反復実施可能で顕著な副作用も少なく、治療効果の高い新しい治療法になり得ることを示した。さらに、血管造影CT法は、抗血管PDTの適応症例の選択と予後診断に有用な情報源となり得ることを明らかにした。本研究では、890nmの吸収波長の蛍光色素であるBPD-MAを用いた光線力学療法(PDT)を小動物腫瘍治療への適応法とその有効性を検討し、下記の成果を得た。1)薬剤のin vitro生理活性およびPDTの効果:BPD-MAの腫瘍細胞内取り込みおよびその局在について培養腫瘍細胞を用い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討したところ、腫瘍の種類の違いによる薬剤取り込みの差はあまりみられず、何れも細胞内ミトコンドリア周囲に局在するものと考えられた。さらに、培養細胞におけるPDT効果は腫瘍細胞による違いはみられなかった。2)マウス担がんモデルを用いたPDTの抗腫瘍効果:扁平状皮癌担がんモデルマウスに対して、薬剤を投与後、様々な条件で光エネルギーを付加してPDTを腫瘍の消長、あるいは病理組織学的に腫瘍に対する影響を検索した。その結果、薬剤投与後15分目または3時間目にPDTを実施した場合には何れの再発がみられたが、15分および3時間目の2回PDTを実施した場合には再発はみられなかった。15分目の照射は、腫瘍分布血管の遮蔽効果を、3時間目の照射は腫瘍細胞をターゲットにしていると考えられた。3)小動物腫瘍臨床例に対するPDT治療試験:犬におけるBPD-MAの臨床的投与量においては、臨床的、血液学的および血液生化学的所見から説くに問題となる影響はないと思われた。さらに、静脈内投与後の半減期は約56時間と思われ、旧来の薬剤と比べて短時間のため、遮光管理が容易と考えられた。

犬腫瘍臨床例にたいするPDTの治療効果については現在症例数を集積中である。本研究では、890nmの吸収波長の蛍光色素であるBPD-MA(カナダQLT社より供与)を用いた光線力学療法(PDT)の小動物腫瘍治療への応用を目的に、マウス腫瘍を用いた基礎試験ならびにイヌ腫瘍治療に対する適応法と有効性を検討する基礎試験を行っている。本年度は以下の結果を得た。1)臨床応用の対象動物である担がん犬における本薬剤の副作用の有無と体内動態を検討した。その結果、諸検査結果では血中アルカリフォスファターゼが有意に上昇したのみであった。これは本薬剤の代謝経路が胆汁中であることによるものと思われた。また、食欲・元気なども含めて身体検査に特に異常は認められないことから、本薬剤を犬の静脈内に投与しても副作用はないものと判断された。薬剤の血中濃度の半減期は、静脈内投与後8.14時間であり、35.13時間後には体内からほぼ消失した。したがって、体内からのクリアランスが速いことから、蛍光色素による光線過敏症の予防には半日程度の短時間の遮光でよいことが分かった。この成果は現在国際学術誌に投稿中である。2)犬に発生が多い肥満細胞腫に対するPDT効果を検討するために、マウス肥満細胞腫担がんマウスに対してPDTを行ったところ、腫瘍崩壊のために、肥満細胞の持つヒスタミンによるショック死を起こすことが判明した。したがって、肥満細胞腫犬に対するPDTは、腫瘍の大半を切除後PDTを行うなど特別の考慮が必要なことが判明した。3)犬臨床例の治療試験において、薬剤投与後3時間目の腫瘍細胞をターゲットにしたPDTと15分目の血管をターゲットとしたPDTとを比較したところ、後者では薬物の使用量が半量にもかかわらず、両者の効果に違いはないように思われた。マウスモデルでは、両者の併用はより効果が高いことが分かっている。4)血管をターゲットにしたPDTの場合、CT検査によって腫瘍内の血管構築を前もって把握することによって、当該腫瘍に対するPDT効果をある程度予測できる可能性が示唆された。本研究では、890nmの吸収波長の蛍光色素であるBPD-MA(カナダQLT杜より供与)を用いた光線力学療法(PDT)の小動物腫瘍治療への応用を目的に、マウス腫瘍を用いた基礎試験ならびにイヌ腫瘍治療に対する適応法と有効性を検討する基礎試験を行っている。1)BPD-MAを取り込ませた4種類の齧歯類腫瘍細胞に対するPDTの細胞障害作用を比較したところ、4種類の腫瘍細胞間に有意差が認められ、それらの細胞の光感受性の違いは、腫瘍細胞の大きさやコロニー形成効率などの腫瘍細胞の性質の違い、さらに感受性物質の濃度やレーザー照射量であるフルエンスなど、様々な要因に影響を受けていると考えられた。2)KLN205およびLM8腫瘍の2種類のマウス腫瘍モデルにおけるBPD-MAを用いた細胞標的PDT(3時間間隔PDT)あるいは血管標的PDT(15分間隔PDT)による抗腫瘍効果、血流動態の変化および低酸素状態を総合的に評価した。15分間隔PDT群では細胞死が主に傷害を受けた腫瘍血管の周囲に認められた。以上の結果から、15分間隔PDT群に比べて3時間間隔PDT群の方が、PDT後速やかに腫瘍組織内が低酸素状態になり、細胞死へと進行した。一方、3時間間隔PDT群に比べて15分間隔PDT群の方が血流の遮断とそれによる抗腫瘍効果はより強いことがわかった。
セルフクローン化法による凝集性アルコール高生産酵母の開発と実用化研 究

アルコール生産の発酵プロセスにおける凝集性酵母の利用は,固液分離の省力化,菌体の再利用,繰り返し回分発酵法による生産性の向上を可能にする。先ず、優れたアルコール発酵能を有する非凝集性工業用酵母Saccharomyces cerevisiae396-9-6V株を宿主とし,高木らによって単離されたシクロヘキシミド耐性遺伝子を選択マーカーとして用いる宿主・ベクター系を構築し,渡らによってクローン化され構造の解析が行われた凝集性遺伝子FLO1を導入した凝集性396-9-6V株を取得した。次いで、同じアルコール高生産酵母を宿主として染色体への組み込みによる形質転換を行い,実用上より適したセルフクローニング系の凝集性396-9-6V株の育種を行った。また,小スケールにおける発酵試験を行った。S.cerevislaeのADH1プロモーター支配化のFLO1を用いてURA3遺伝子を破壊したDNA断片を396-9-6V株に投与し,5-fluoroorotic acid耐性を指標にウラシル要求性の形質転換体を選択した.得られた形質転換株はS. cerevisiae以外の遺伝子を含まず,いずれも凝集性を示した。発酵試験では糖蜜倍地で親株に比べ生育は若干遅かったが最終的に親株と同等の発酵性能を示した。ウラシルを添加することによって発酵速度が向上した。現在さらに大きな発酵槽を用いた試験をすすめているが,本研究によって,他生物遺伝子を持たない実用凝集性酵母の遺伝子操作による開発の先鞭を付けることができたアルコール生産の発酵プロセスにおける凝集性酵母の利用は,固液分離の省力化,菌体の再利用,繰り返し回分発酵法による生産性の向上を可能にする。現在さらに大きな発酵槽を用いた試験をすすめているが,本研究によって,他生物遺伝子を持たない実用凝集性酵母の遺伝子操作による開発の先鞭を付けることができた本年度は先ず、NEDOより供給されるアルコール高生産酵母Saccharomyces cerevisiae 396-9-6V株(以下396株)におけるFLO1遺伝子の安定な高発現系を構築し、その凝集性とアルコール生産性を検討した。次いでS.cerevisiae由来以外のDNAを全く含まないFLO1形質転換株を構築を試みた。1.FLO1遺伝子の安定な高発現系の構築とその有効性の検証FLO1遺伝子(サッポロビール渡氏より入手)のタンパク質コード領域を切り出して、酵母の高発現プロモーターであるADH1遺伝子プロモーターにつないだ。これを選択マーカーとして酵母Candida maltosa由来のシクロヘキシミド耐性を与えるCYH^R遺伝子を有する、低コピーで安定なベクターYCpC(石田ら、未発表)に組み込んだ。さらに得られたプラスミドを396株に導入し、シクロヘキシミド耐性の形質転換株のうちから、凝集性と元の宿主と同様のアルコール生産性を示す株を得た。2.S.cerevisiae遺伝子以外を含まないFLO1形質導入株の作成上記ベクターはampR遺伝子などの大腸菌とC.maltosa由来の配列を含む。また、プラスミドに載せて酵母に導入することは安定性の点で問題がある。そこで、ADH1-FLO1を挿入したURA3遺伝子DNAを導入して、URA3領域の相同組み換えによってADH1-FLO1を396株染色体に組み込むこととした。CYH^Rを有する不安定なYRpプラスミドとの共形質転換により、まずシクロヘキシミド耐性で選び、ついでその中から凝集性を示す菌を沈降速度を指標に濃縮して選択した。ついで、5-フルオロオロチン酸耐性を指標として、2倍体である396株の2つのURA3遺伝子にFLO1を挿入した株を選択し、最終的にCYH^Rを有する不安定なYRpプラスミドを消去する予定である。

これまで優れたアルコール発酵能を有する非凝集性工業用酵母Saccharomyces cerevisiae396-9-6V株を宿主とし,高木らによって単離されたシクロヘキシミド耐性遺伝子を選択マーカーとして用いる宿主・ベクター系を構築し,渡らによってクローン化され構造の解析が行われた凝集性遺伝子FLO1を導入した凝集性396-9-6V株を取得した。今年度は同じアルコール高生産酵母を宿主として染色体への組み込みによる形質転換を行い,実用上より適したセルフクローニング系の凝集性396-9-6V株の育種を行った。また,小スケールにおける発酵試験を行った。S.cerevisiaeのADH1プロモーター支配下のFLO1を用いてURA3遺伝子を破壊したDNA断片を396-9-6V株に投与し,5-fluoroorotic acid耐性を指標にウラシル要求性の形質転換体を選択した。得られた形質転換株はS.cerevisiae以外の遺伝子を含まず,いずれも凝集性を示した。発酵試験では糖蜜培地で親株に比べ生育は若干遅かったが最終的に親株と同等の発酵性能を示した。ウラシルを添加することによって発酵速度が向上した。現在さらに大きな発酵槽を用いた試験をすすめているが,本研究によって,他生物遺伝子を持たない実用凝集性酵母の遺伝子操作による開発の先鞭を付けることができた。