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外部刺激によりアンチセンス活性を制御可能な塩基部修飾人工核酸の開発

アンチセンス医薬品は有効な治療法のない疾病の効果的な医薬品になり得る。2017年にはバイオジェン社、IONIS社により開発された脊髄性筋萎縮症に対する世界初の治療薬であるSPINRAZAがアンチセンス医薬品として日本で初めて承認されるなど今後も更なる本研究分野の隆盛が期待される。しかし、投与されたアンチセンス医薬品が特定の組織や病変部位のみで薬効を示すことは未だ困難であり、対象疾病の制限や副作用の発現といった問題を抱えている。このような弁上を打破するために、外部刺激に応答し自身の構造及び性質を変化させる人工核酸の開発に着手した。過酸化水素応答性を付与した人工核酸についてホスホロアミダイト法へ簡便に適応可能なチミジン、デオキシグアノシンそれぞれの誘導体の核酸塩基部へのフェニルボロン酸骨格を持つ修飾基の導入位置を精査した。その結果、N-ベンジル型の修飾についてはヌクレオシドレベルで過酸化水素応答性が認められず、従来のO-ベンジル型の修飾が最適であるという知見を得た。また、デオキシグアノシン誘導体について2位アミノ基の保護基を適切に選択することで光延条件に付した際に生成されるアルキル化デオキシグアノシンの修飾位置を制御可能であることが確認された。なお、過酸化水素応答性を持つアンチセンス核酸の開発について平成27-29年度に得られた結果は、論文として取りまとめ、査読付き学術誌に掲載されている。29年度が最終年度であるため、記入しない。アンチセンス医薬品は有効な治療法の無い疾病の効果的な医薬品になり得る。しかし、投与されたアンチセンス医薬品が特定の組織や病変部位のみで薬効を示す事は未だ困難であり、対象疾病の制限や副作用の発現といった問題を抱えている。このような現状を打破するために、外部刺激に応答し自身の構造及び性質を変化させる人工核酸の開発に着手した。光応答性核酸:これまでにフォトクロミック分子であるアゾベンゼンを塩基部5位に導入した2'-デオキシウリジン誘導体(dUAz)を開発し、dUAzが相補鎖RNAとの二重鎖安定化能を光制御可能であることを見出している。1)光刺激に伴うdUAzの二重鎖安定化能の差異の増大、2)アゾベンゼン部位のシス型からトランス型への熱異性化の抑制の両方を満たす為にdUAzに対し化学修飾を加えたアナログを種々合成し、オリゴヌクレオチド鎖中へと導入し、光異性化能や熱安定性、二重鎖安定化能の評価を行った。その結果、元々のdUAzよりも高い熱安定性を持つもの、光異性化能を持つものをそれぞれ見出した。過酸化水素応答性核酸:がん細胞においては代謝の増大やミトコンドリアの変異、酸化ストレスの増大等の要因により正常細胞と比べ、過酸化水素の産生量が増大することが知られる。がん細胞特異的に活性を発現するアンチセンス核酸の開発を目指し、過酸化水素特異的に反応して水素結合能を回復するケージド核酸類を開発した。更に、その他の活性酸素種とはほぼ反応せず、優れた過酸化水素特異的な応答性を示したチミジンアナログを用いてアンチセンス核酸を合成し、過酸化水素産生量の異なる二種類の培養細胞に対し投与した。その結果、過酸化水素産生量の多い細胞において特異的に高いアンチセンス活性を示すことを確認した。光応答性核酸:電子的、立体的に異なる様々な置換基をアゾベンゼン骨格p位に導入し、オリゴヌクレオチド上で光異性化能および熱安定性の評価を行った。優れた光異性化能を持つアナログについては相補鎖RNAとの二重鎖形成における熱力学的パラメーターの解析を行い、紫外線照射によりシス型へと異性化させた条件下においてより安定な二重鎖形成が可能であることを明らかにした。また、得られた結果の一部を国外の学会で発表した。過酸化水素応答性核酸:過酸化水素に応答し、天然の核酸へと変換される4種のヌクレオシドアナログについて合成を達成し、過酸化水素に対し優れた応答性を有することを試験管内において確認した。特に、チミジンアナログについてはその他の活性酸素種に対する応答性も併せて確認することで過酸化水素に対する特異性を確認した。チミジンアナログを導入したアンチセンス核酸を用いて過酸化水素を多く産生する培養細胞において特異的に高いアンチセンス活性を示すことを確認した。以上の得られた結果の一部を国内の学会で発表した。光応答性核酸:昨年に引き続き、電子的、立体的に異なる置換基を有するアゾベンゼン誘導体を塩基部5位に導入した2'-デオキシウリジン誘導体(dUAz)を開発した。また、5位よりアルキンリンカーを介して置換基を導入したデオキシチミジン誘導体が容易に蛍光性を示すデオキシシチジン誘導体へと変換可能であることに着目し、2種の新規人工核酸を合成し、これらをオリゴヌクレオチド鎖中へと導入した。今後、光応答性核酸としての物性測定を予定している。

また、光以外の外部刺激に対する応答性についても精査し、新たな外部刺激応答性人工核酸の開発を予定している。過酸化水素応答性核酸:過酸化水素応答性核酸の導入数が異なるアンチセンス鎖を合成し、試験管内で過酸化水素に対する応答を確認した。合成した各種アンチセンス鎖を用いて培養細胞中の標的mRNAノックダウン活性をRT-PCR法により確認し、人工核酸の導入数を最適化した。また、同様の化学構造を抗癌活性を示すヌクレオシドアナログへと導入することで既存薬剤のプロドラック化を検討している。得られた結果の一部は国際学会で発表した。光応答性核酸については2環性のpyrolo-dC誘導体も含めて更に多様な骨格をもつヌクレオシドアナログの合成を達成しており、今後オリゴヌクレオチド鎖中で物性評価を行うことで興味深い特性を示すことが期待される。また、過酸化水素応答性核酸については培養細胞レベルにおいてはその特性を確認できており、今後in vivoでの実験やヌクレオシド製剤としての応用も検討しており順調に進展しているといえる。アンチセンス医薬品は有効な治療法のない疾病の効果的な医薬品になり得る。2017年にはバイオジェン社、IONIS社により開発された脊髄性筋萎縮症に対する世界初の治療薬であるSPINRAZAがアンチセンス医薬品として日本で初めて承認されるなど今後も更なる本研究分野の隆盛が期待される。しかし、投与されたアンチセンス医薬品が特定の組織や病変部位のみで薬効を示すことは未だ困難であり、対象疾病の制限や副作用の発現といった問題を抱えている。このような弁上を打破するために、外部刺激に応答し自身の構造及び性質を変化させる人工核酸の開発に着手した。過酸化水素応答性を付与した人工核酸についてホスホロアミダイト法へ簡便に適応可能なチミジン、デオキシグアノシンそれぞれの誘導体の核酸塩基部へのフェニルボロン酸骨格を持つ修飾基の導入位置を精査した。その結果、N-ベンジル型の修飾についてはヌクレオシドレベルで過酸化水素応答性が認められず、従来のO-ベンジル型の修飾が最適であるという知見を得た。また、デオキシグアノシン誘導体について2位アミノ基の保護基を適切に選択することで光延条件に付した際に生成されるアルキル化デオキシグアノシンの修飾位置を制御可能であることが確認された。なお、過酸化水素応答性を持つアンチセンス核酸の開発について平成27-29年度に得られた結果は、論文として取りまとめ、査読付き学術誌に掲載されている。光応答性核酸:引き続き、dUAzの類縁体の合成および評価を行う。また、今年度のスクリーニングにおいてアゾ骨格を持つにも関わらず水中で全く光異性化能を持たないアナログも見つかっている。こちらについては光刺激以外の外部刺激に応答する人工核酸としての展開を検討している。過酸化水素応答性核酸:ケージド核酸の導入とアンチセンス活性との相関をより詳細に検討するために同一配列を標的とした、ケージド核酸導入数の異なるアンチセンス核酸を種々合成し、アンチセンス活性を精査する。光応答性核酸:合成したオリゴヌクレオチド鎖について各種物性の評価を行う。また、蛍光特性や異なる外部刺激に対する応答性も確認し、プローブ分子として有用な化学構造の設計へと繋げる。過酸化水素応答性
Ｎ－Ｈａｌｆオステオポンチンを介した動脈硬化プラーク破裂機構の解明と新規治療戦略

【目的】オステオポンチン(OPN)は細胞増殖、細胞浸潤やアポトーシスなどを誘導する炎症性サイトカインである。OPNは組織内でトロンビンによって切断され、N-Half OPNに変換される。N-Half OPNもまた生理活性を有し、強力な炎症作用を発揮する。動脈硬化プラークの破綻と血栓形成がアテローム血栓性脳梗塞の一因と考えられているがその機序は不明である。本研究ではOPN及びN-Half OPNがマウスプラーク破裂機構に関与しているかを検討した。【方法】OPN-/-マウス、ApoE-/-マウス、OPN-/--APOE-/-マウス、WTマウスの右総頸動脈を結紮し、結紮4週間後にポリエチレンカフを装着した。カフ装着4日後に還流固定を行い、摘出した右総頚動脈を用いて組織学的に検討した。【成績】動脈硬化病巣面積はWTマウスに比べてApoE-/-マウスで有意に大きく、ApoE-/-マウスに比べてOPN-/-マウス、OPN-/--APOE-/-で減少していた。プラーク内出血及び破裂率はApoE-/-マウスと比較してOPN-/--APOE-/-マウスでは減少していた。血中コレステロール値は両群間で有意差は認めなかった。OPN-/--APOE-/-マウスの動脈硬化巣はAPOE-/-マウスの動脈硬化巣に比して、Oil red O染色陽性領域の減少を認め、DHE染色では酸化ストレスの抑制を認めた。APOE-/-マウスの動脈硬化巣においてはF4/80発現陽性マクロファージが認められ、OPN-/--APOE-/-マウスではその発現が抑制されていた。【結論】免疫組織学的染色でAPOE-/-マウスの動脈硬化巣においてOPN及びN-Half OPNの発現が認められたことから、OPN及びN-Half OPNがAPOE-/-マウスの動脈硬化巣の形成ならびにプラークの不安定性に関与している可能性が考えられた。今後、N-Half OPN中和抗体を用いた動脈硬化プラーク破裂を抑制できるか検討する予定である。アテローム血栓性脳梗塞の一部は、動脈硬化プラークの破綻と血栓形成を引き金に発症すると考えられている。細胞増殖、細胞浸潤やアポトーシスなど多彩な機能を有する炎症性サイトカイン・オステオポンチン(OPN)は、血液凝固系の活性化や組織炎症を引き起こす。またOPNは組織内でトロンビンによって切断され、切断OPN(N-Half OPN)もまた生理活性を有し、強力な炎症作用を発揮する。これら一連の病態において、トロンビンにて活性化されたN-half OPNが、様々な機能を発揮している可能性が考えられる。本研究において、動脈硬化プラーク破綻におけるOPN及びN-Half OPNの役割とその抑制効果を明らかにすることである。生後9週齢のApoE KO、ApoE/OPN DKOマウスの総頸動脈の分岐部直下を結紮4週後、結紮した総頸動脈の近位部に内径0.58 mm、長さ2 mmのポリエチレンカフを留置することで、プラーク破綻モデルを作成した。結果、ポリエチレンカフ留置後7日目において、ApoE KOマウスでは新生内膜の増殖と高率にプラーク破綻を認めた。一方でApoE/OPN DKOマウスでは新生内膜増殖とプラーク破綻が抑制される傾向にあった。またoil red O染色による脂肪染色、F4/80抗体を用いたマクロファージの免疫染色について、AopE KOマウスではその脂肪染色領域の増加とマクロファージ発現が増加するのに対して、ApoE/OPN DKOマウスでは、それらが抑制されていた。今後は、不安定プラーク内で脆弱な新生血管からの微小出血によってトロンビンが活性化され、トロンビンにより組織OPNが切断された結果発現したN-Half OPNが、プラーク内で炎症、アポトーシス、酸化ストレスなどを惹起しプラーク破綻を引き起こす可能性について検討する予定である。プラーク内出血及び破裂率はApoE-/-

マウスと比較してOPN-/--APOE-/-マウスでは減少していた。血中コレステロール値は両群間で有意差は認めなかった。OPN-/--APOE-/-マウスの動脈硬化巣はAPOE-/-マウスの動脈硬化巣に比して、Oil red O染色陽性領域の減少を認め、DHE染色では酸化ストレスの抑制を認めた。APOE-/-マウスの動脈硬化巣においてはF4/80発現陽性マクロファージが認められ、OPN-/--APOE-/-マウスではその発現が抑制されていた。【結論】免疫組織学的染色でAPOE-/-マウスの動脈硬化巣においてOPN及びN-Half OPNの発現が認められたことから、OPN及びN-Half OPNがAPOE-/-マウスの動脈硬化巣の形成ならびにプラークの不安定性に関与している可能性が考えられた。今後、N-Half OPN中和抗体を用いた動脈硬化プラーク破裂を抑制できるか検討する予定である。動脈硬化プラーク破裂モデルの作製は順調であり、現在そのモデルから得た大動脈を用いて、様々な解析を行っているところである。1.プラーク破綻、脂肪沈着:HE染色、Oil red O染色により、プラーク破綻率、脂肪沈着を評価する。2.酸化ストレス:組織内のO2-の産生をジヒドロエチジウム染色により評価する。3.炎症性サイトカイン、ケモカイン、MMPsの産生:蛋白後、炎症性サイトカイン(OPN、N-Half OPN、IL-6など)、ケモカイン(MCP-1)、MMPs(MMP-2、MMP-9など)のmRNA及び蛋白発現をそれぞれreal-time PCRとWestern blot法によって検出、定量評価する。4.免疫組織化学染色による評価:プラーク内における血管平滑筋細胞とマクロファージは、それぞれα-SMA抗体、CD68抗体を用いて同定する。また炎症性サイトカイン(OPN、N-Half OPN、IL-6など)、ケモカイン(MCP-1)、MMPs(MMP-2、MMP-9など)の局在をそれぞれの特異抗体を用いて評価する。本年度は動脈硬化プラーク破裂モデルの作製が主となり、そのサンプルの解析を開始したところで、今後抗体やELISA等の試薬の購入が必要となる。実験用動物・飼料20万円、分子生物学的試薬類80万円、抗体・サイトカイン定量キット30万円、プラスティック器具10万円、ガラス器具10万円、計150万円
メゾスコピック化学のための方法論開発と探索の研究

初年度は、メゾスコピックをキーワードにして、分子科学、有機材料科学の最近の研究展開について意見交換を行うとともに、方法論の開発とそれによる探索について討議した。2年目は、数十nmから光の波長オーダーのメゾスコピック領域の構造、物性、機能を分子レベルで理解することを目的に、異なる視点から総合的に研究調査した。とくにクラスター形成、水素結合ネットワーク、高分子のからみ合い等構造的側面にとどまらず、分子拡散、対流、溶液の極性や粘性、pHの勾配のゆらぎ等メゾスコピック領域の反応も含めた動的側面に着目した。従来にないこのようなアプローチを可能とするためには、微小領域の時間分解計測、分光法、分析法の開発が必要不可欠であり、その視点を導入してメゾスコピック新現象の探索解明をはかった。おもな成果は以下の通りである。(1)メゾスコピック光反応の解析として、高分子吸着状態における光電荷分離、再結合過程の解析、表面反応、固液界面層反応、クラスターとメゾスコピック分子集合体の光反応を取り上げ、問題点を整理した。(2)メゾスコピック反応の開発として、微小領域における光異性化、光誘起振動反応、単一高分子微粒子の作製、レーザー分子注入による表面層電荷移動反応に注目し、その最近の進歩と可能性についてまとめた。(3)メゾスコピック機能の制御の例として、近視野光学顕微鏡による微小光化学、STMによる固液表面反応の制御、高分子表面ラフネスのSTMによる制御、有機分子結晶のサイズと光機能と相関について討論した。(4)メゾスコビック化学現象の探索と解明の総括を目的に2回研究会を行った。成果として研究報告書を出版した。メゾスコピック領域の化学現象は、その空間の大きさ、起こるタイムスケール、さらにはその理解のレベルも各分野ごと研究者ごとに異なっている。本研究では、数10nmから光の波長オーダーのメゾスコピック領域における新しい化学現象の探索を目的とした計測法、分光法、分析法の開発、調査研究を行った。研究代表者、分担物を含めた参加者19名の研究会を平成8年1月8、9日に執り行い、情報交換、討論をした。研究会では、各班員のこれまでの研究成果をもとにした発表と、それに対する質疑、応答の形式で討論を行った。光学、表面化学、電気化学学、クラスター化学、光化学など様々な研究領域から異なる視点で、メゾスコピック領域の化学反応の計測法、分析法ならびにその意義、目的について議論し、中間報告書をまとめた。その成果は以下の通りである。光の波長以下の空間分解能を持つ近視野顕微鏡の精度の向上と、それを用いた分光の有効性が確認された。単一微小液滴のための微量分析法の応用とその有効性が示された。表面・界面層のための反射型非線形分光法は極めて有効である。STM、AFMによる表面構造解析による化学機能の分析への展開が示された。クラスター、微結晶のための分光分析法の精度があがりバルクなみの情報を得ることが可能となってきた。また、メゾスルコピック計測の開発を通して、例えば、近視野顕微鏡、STM等糖による微小領域の反応制御の可能性や、界面、界面相における液体分子の特異な振る舞いなど、新しいメゾスコピック化学現象の探索、開発に向けての手掛がかりりとなる現象や物質系もいくつか見出された。数十nmから光の波長オーダーのメゾスコピック領域の構造、物性、機能を分子レベルで理解することを目的に、異なる視点から総合的に研究調査した。

従来にないこのようなアプローチを可能とするためには、微小領域の時間分解計測、分光法、分析法の開発が必要不可欠であり、その視点を導入してメゾスコピック新現象の探索解明をはかった。おもな成果は以下の通りである。(1)メゾスコピック光反応の解析として、高分子吸着状態における光電荷分離、再結合過程の解析、表面反応、固液界面層反応、クラスターとメゾスコピック分子集合体の光反応を取り上げ、問題点を整理した。(2)メゾスコピック反応の開発として、微小領域における光異性化、光誘起振動反応、単一高分子微粒子の作製、レーザー分子注入による表面層電荷移動反応に注目し、その最近の進歩と可能性についてまとめた。(3)メゾスコピック機能の制御の例として、近視野光学顕微鏡による微小光化学、STMによる固液表面反応の制御、高分子表面ラフネスのSTMによる制御、有機分子結晶のサイズと光機能と相関について討論した。(4)メゾスコピック化学現象の探索と解明の総括を目的に2回研究会を行った。成果として研究報告書を出版した。
細胞の分化決定2次メッセンジャーの検索

細胞の分化と増殖の切り替えのメカニズムを明らかにするため、PC12という細胞を用いて、NGFやEGFの効果を解析している。PC12細胞はNGFで刺激すると神経突起を伸張して神経様細胞に分化するが、このときホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)の活性化が報告されている。この意味を解析するため、P13Kの阻害剤と考えられるWortmannin(WT)を用いて検討した。この結果、WTはNGF受容体などのチロシンキナーゼ活性を阻害しないこと、ホスフォリパーゼCやp21^<ras>などの活性化にも影響を与えないことが明かとなった。PC12細胞の神経突起の伸張の過程を注意深く観察すると、NGFを作用させた後、形態変化は見られるものの、神経突起が伸張しない前期(initiation)と実際に神経突起が伸張する後期(elongation of neurites)とにわけられ、前期にも後期にもNGFが存在しないと神経突起の伸張が起こらないことが分かる。このとき、前期にWTを存在させても神経突起の伸張には影響がなく、従ってPI3Kの活性は必要ないが、神経突起の伸張時にWTを存在させると神経突起の伸張は即座に停止することから、PI3Kの活性が神経突起の伸張に必要なことがわかった。また、最近別の研究でPC12細胞株から血清存在下では神経突起の伸張が抑えられる変異株を分離した。このことは血清中にこの細胞株の神経突起の伸張を抑制する物質のあることを示唆している。この物質は酸に対して不安定で、60%飽和の硫酸アンモニウムで沈殿した。この物質の活性が若干弱くはあるがPC12野生株にも有効なことから、一般的に神経突起伸張の調節に関与する因子の可能性が考えられ、精製しその実体を明らかにしたいと考えている。
大脳基底核による行動選択のメカニズム

自発的な運動のタイミングを制御する大脳基底核の役割について研究を行っている。サルに一定の遅延の後に目発的なタイミングでゴールに目を向けることが要求される課題(Self-timed課題)と、運動の開始が課題内で指示される課題(Triggered課題)を訓練した。先行研究かち、自発的な運動の制御には大脳基底核のドーパミン制御系が重要であることが示唆されているが、基底核のどの経路で情報処理が行われているのかについては不明である。そこで、課題中に尾状核にドーパミンD1およびD2受容体の作動薬または拮抗薬を微量注入し、間接経路、直接経路の相対的な信号強度を薬理学的に操作することで、それらの機能を検証した。注入実験に先んじて、尾状核の単一神経細胞の活動を記録したところ、自発的なサッカードに先立って徐々に増加する活動が確認された。この記録部位に、ドーパミンD2受容体の拮抗薬(Eticlopride、n=7)を注入したところ、Triggered課題と比べてSelf-timed課題で大きく反応時間が短縮した。一方で、ドーパミンD1受容体の作動薬(SKF38393、n=4)やドーパミンD1受容体の拮抗薬(SCH23390、n=3)、またはドーパミンD2受容体の作動薬(Quinpirole、n=6)では一貫した結果は得られなかった。これらの結果は、ドーパミンD2受容体が関与している間接経路で自発的な運動のタイミングが調節されていること示している。本年度では1頭目からデータをほぼ取り終わるまでに至った。神経活動記録の結果の一部は、総説論文で発表している。来年度には、注入実験の結果をまとめて平成24年9月に開催される日本神経科学学会で発表する予定である。今年度は、自発的な運動のタイミングを制御する情報処理機構の研究で大きな進展があった。まだ実験数は少ないが、大脳基底核の間接経路が適切な運動のタイミングの調節に関与していることを示すデータを得ている。また、2頭目のサルのトレーニングも完了しており、来年度にはさらにデータを増やすことが期待される。2頭目のサルからデータをとり、すべての実験を完了させる。また、データの解析を進めていく。積極的に国内外の学会で発表を行い、他の研究者からフィードバックをもらうことで研究を深めていく。これらと並行して論文の作成を行う。
アミノ基転移酵素の基質認識と活性発現機構の理解をめざして

X線結晶解析が完成したアスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)の蛋白質工学を中心に,芳香族アミノ酸(AroAT),分岐鎖アミノ酸(BrAT)の各アミノ基転移酵素についての研究を加えて,基質特異性や効率的な反応進行に働いている分子設計をさぐってきた。得られた成果を以下に記す。AspAT:1.Asp222,補酵素ピリドキサール燐酸(PLP)をつなぎ留め,同時にそのピリジン環Nの正荷電を安定化してPLPの「電子溜め」効果を強めている。2.Asn194,基質のα-COOH基を結合するArg386を適正な位置に固定するとともに,Arg386からPLPの3′-(0)へと続く水素結合網を形成することによって電子分布を調節し,トランスアルジミネーションを効率よく行わす役を演じている。3.Arg292とArg386,Arg292は基質ジカルボン酸のω-COOH基を認識している。この2残基に基質が結合すると,活性中心を外界から遮閉するように酵素分子のコンホメーションが変化し,さらにArgの正電荷が中和されることによって,近傍の触媒基であるLys258の塩基性が高まり,後続の反応(トランスアルジミネーション)の進行に都合の良い環境ができる。AroAT:大腸菌体内で酵素の大量生産系を確立。精製酵素の性質を調べた。AspATと基質特異性が重複,酸性アミノ酸に対しては〓度,芳香族アミノ酸に対しては三桁高い活性を示す。芳香環の認識部位はArg292の近傍で,より疎水性で〓。Arg386とAsn194はAspATにおけるのと同じ役割を果たしている。BrAT:X線結晶解析が重原子置換を行える段階にきた。基質のα-プロトンの引き抜きの過程での立体特異性がD-アミノ酸アミノ基転移酵素と同じであり,その他のアミノ基転移酵素とは異るグループに分類されるという,興味深い結果が得られた。X線結晶解析結果にもとづいて、活性中心のアミノ酸残基に変異を導入し、変異酵素と野生型酵素の比較から、活性中心残基の役割を明らかにすることが本研究の目的である。前年度より引き続いて行ってきた大腸菌アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)のAsp222についての研究を完成し、新たにAsn194の変異酵素の研究を開始した。Asp222は補酵素ピリドキサル燐酸(PLP)のピリジン環Nと水素結合しているので、補酵素の電子分布に影響を与えていることが予想される。これをGluに置換した場合、活性が1020%に低下するのみで、他の諸性質は野生型酵素と類似していた。しかし、Asn、Alaへの置換によってPLPの結合定数は三桁低下し、PLP型酵素アミノ酸間の反応効率も34桁低下した。逆反応のPMP型酵素-2オキソ酸間の反応効率の低下はそれほど大きくなかった。吸収スペクトルの解析から、PLPとアポ蛋白質の間で形成される「内アルジミン」のpKが大きく上昇しており、PLPの「電子溜め」効果が発揮できなくなっていることがわかった。以上の結果より、222位には負電荷が必要で、PLPをつなぎとめるとともに、ピリジンNの正電荷を安定化してPLPの「電子溜め」効果を強めていることが明らかになった。Asn194はすべてのAspATに保存された残基であるがその役割についてほとんど注目されていない。

Ala194酵素を調べた結果、Asn194は基質の結合部位であるArg386を正当な位置に固定するとともに、PLPの3'(0)との水素結合を通じて電子分布を調節して触媒に関係していることを明らかにしつつある。大腸菌芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素については、基質認識機構の解明を目指してArg292の変異酵素を解析中である。アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)と芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素(AroAT)(ともに大腸菌酵素)の比較研究を進めた。両酵素は一次構造上40%の類似性があり、活性中心残基の空間配置には共通のものが多い。先ず、AroATを大腸菌体内で大量に生産する系を遺伝子組み換えで確立し、精製酵素の性質を調べた。両酵素は基質特異性が重なり合っており、酸性アミノ酸に対しては同程度であるが、芳香族アミノ酸に対してはAroATが三桁高い活性を示す。反応動力学的解析によって両酵素とも同じ機構で反応が進行することを明らかにした。基質アナログの反応性の比較により、AroATの芳香環の認識部位はすでに知られている酸性基質のomega-カルボキシル基認識部位(Arg292)の近く、あるいはそれと重なり合っていることを示唆することができた。両酵素ともArg292とArg386(基質のalpha-カルボキシル基結合部位)が、補酵素ピリドキサル燐酸(PLP)とLys258の間に形成される内アルジミンのNのpKを下げており、基質アミノ酸の結合によってそのpKが上がることが、反応の進行に必要なアルジミン転移を容易に進めると予想されている。基質アナログと部位特異的変異を用いて系統的に解析し、AspATではArg292は部分的にそれに関係しているが、Arg386はより大きな影響を与えており、Asn194がArg386ならびにPLPの間で水素結合をつくっていることがその原因であることを明らかにした。AroATではArg292にはそのような効果はなく、Arg386-Asn194-PLPの間の水素結合網のみが働いていることを明らかにした。保存残基であるAsn194はPLPあるいはPLP-基質複合体に於ける電子の分布状態を、効率的な触媒作用の進行に都合のよいように調節する役割と、Arg386を正しい位置に保つことによって基質の結合にも重要であることを明らかにした。以上、本年度得られた結果は、アミノ酸基質の認識について、alpha-カルボキシル基の結合と続いて生じるtransaldiminationを効率的に進行させることについてアミノ基転移酵素に共通の初期の反応機構を説明するものである。酵素がその効率的かつ特異的な触媒能と極めて優れた基質選択性を発揮するために,酵素タンパク質にどのような分子設計が必要とされているかという基本的テーマを,大腸菌の三種のアミノ酸アミノ基転移酵素(アスパラギン酸アミノ基転移酵素AspAT.芳香族アミノ基転移酵素AroAT,分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素BCAT)を対象として研究してきた。今年は,3年間の最終年度であり、過去2年間で得られた結果の確認、証明とそのとりまとめを主として行った。1.AspATにおいてArg386(基質アミノ酸のα-カルボキシル基の結合残基)-Asn194-補酵素ピリドキサル燐酸につらなる水素結合ネットワークが,反応の初期段階で基質アミノ酸を触媒活性を行える状態へ効果的に位置ずけるのに重要な役割をしていることを証明することができた。AroATにおいても同様な機構が働いていることを明らかにし,すべてのアミノ基転移酵素の共通の分子設計である可能性を確認することができた。
ストレスによる脳内カテコールアミンニューロンの機能とサイトカインの関わり

ウィスター系雄ラットに拘束ストレスを1日4時間、3日間負荷し、最終ストレス負荷から30分後に断頭した。視床下部と中脳を取り出し、この組織を用いて、インターロイキン-6(IL-6)受容体mRNAの発現について、PCR法を用いて検討した。この結果、IL-6受容体mRNAがストレスによって低下することが認められた。30分、1時間の短期ストレスでも低下がみられた。また、ストレス解除後の断頭時間を変えて検討した結果では、概ね時間経過にともなってIL-6受容体mRNAの発現の低下がみられたが、一部では一時的な増加もみられた。現在同様のPCR法を用いて、IL-6自体の遺伝子発現についてストレスの影響を検討している。また、カテコールアミンなどの既知の神経伝達物質の受容体についても、ストレスによる遺伝子発現の変化について検討中である。IL-6mRNAの発現は、短期ストレスによっていったん低下したあと増加に転じることがうかがわれている。こうした変化は、IL-6と視床下部下垂体一副腎皮質系などの内分泌系との関わり、IL-6の神経栄養因子として作用と関連があるのではないかと考えられる。反復ストレスによる変化については検討中である。PCR法、およびPCR産物を電気泳動してエレクトロニックオートラジオグラフィーにて測定する技術については、安定した技術を得ていて、今後さらに脳内サイトカインの役割や脳内カテコールアミンニューロンの機能と脳内サイトカインの関係について解明をすすめる予定である。ウイスター系雄ラットに拘束ストレスを1日4時間、3日間負荷し、ストレス群とした.最終ストレス負荷から30分後に断頭し、視床下部を取り出した.この組織を用いてインターロイキン6(IL-6)およびIL-6レセプター、さらに癌遺伝子c-fosのmRNAの発現についてPCR法を用いて検討した。ストレス群、およびストレスを負荷していない対照群のいずれでも、視床下部におけるIL-6のメッセージがわずかに検出された.IL-6レセプターのメッセージの発現については、ストレス群において有意に多く認められた.また、ストレス群の視床下部においては、c-fosのメッセージも確認された.これらの結果は、ストレス反応の経過にIL-6および癌遺伝子が何らかの役割を果たしていることを示唆している.今後は、インターロイキン-1、2、10についても同様に検討を行ない、さらに、従来からストレス反応に関係が深いことが報告されているアドレナリンやオピオイドレセプターについて、その発現様式とインターロイキン-1、2、6、10の関係について検討を進めていく予定である.また、c-fosなどの癌遺伝子についてもストレスによって視床下部にmRNAの存在を確認したことから、癌遺伝子と神経伝達物質に対するレセプターとの関わりについても検討を行なう予定である.拘束ストレスについては負荷期間を変えて検討を行ない、他のストレスについても検討を加えたい.組織については脳内神経核レベルまで細分化したいが、RNAを保全したままこうした操作を行なえる実験環境の整備が難しく、現在検討中である.ウィスター系雄ラットに拘束ストレスを1日4時間、3日間負荷し、最終ストレス負荷から30分後に断頭した。また、ストレス解除後の断頭時間を変えて検討した結果では、概ね時間経過にともなってIL-6受容体mRNAの発現の低下がみられたが、一部では増加もみられた。これらの結果から、IL-6受容体mRNAの発現は、ストレス負荷中だけではなく、負荷解除後もかなり長期間にわたって変化が持続すると考えられる。IL-6は視床下部下垂体一副腎皮質系などの内分泌系を駆動するための情報伝達に働くこと、およびストレスによってニューロンやグリア細胞が何らかの障害を受け、IL-6が神経栄養因子として作用していることが推定される。

また、カテコールアミンなどの既知の神経伝達物質の受容体についても、ストレスによる遺伝子発現の変化について検討中である。PCR法、およびPCR産物を電気泳動してエレクトロニックオートラジオグラフィーにて測定する技術については、安定した技術を得ていて、今後さらに脳内サイトカインの役割の解明をすすめる予定である。
18世紀イギリス公共圏におけるトラヴェルライティングと感受性に関する歴史的研究

近年のトラヴェルライティング研究の分野では、【1】分析の対象に散文による旅行記のみならず、個人の旅程表や各種地図、旅をテーマに作られた絵画や映画、ドキュメンタリー等を含める傾向にある。これは様々なテクスト間、メディア間のアダプテーションを考察することを意味している。ここでのアダプテーションはいわゆる「翻案」とは異なり、オリジナル/コピーといった二項対立を想定しない。したがって、トラヴェルライティングが描き出す「主体」と「他者」はつねに入れ替わる可能性を有しており、「異質な世界」は「日常世界」へと変化しつつ、その逆転もまたあり得る。本年度研究では、小説作品を主たる研究対象とするが、「アダプテーション」=「テクストを横断して形式の変化をもたらすもの」という定義にしたがい、個々のトラヴェルライティングが「共感」を軸に先行テクストを書き換えているという前提に立って、公共圏で無限に断片化し、商品化されるトラヴェルライティングがいかに消費されてきたのかを様々な作品読解を通して検討した。【2】文学における感受性研究の分野では、例えばセジウィックの研究を基礎に、「感情に触れる身体」といった新たな批評の様式が注目されている。そこで、抑圧/解放、自然/文化、現存/不在という二項対立の再活性化にどう立ち向かうかといった21世紀的問題について海外の研究者とディスカッションを重ねてきた。これらの作業を通して、先にみたアダプテーション理論がつねにオリジナルへの忠実性を前景化してしまう理由を検証し、理論の再構築をはかる必要性を明らかにした。予定していた研究会を十分に活用することができなかったが、学会発表、論文発表によりおおむね初年度の計画(基礎的文献の整理と考察に関する部分)を達成できた。長い18世紀の転換点に位置する『センチメンタル・ジャーニー』を対象とし、この作品を感情の転回という視点から分析しつつ、スターンが世紀前半のテクスト群をいかに〈アダプト〉しているか次の3点に絞ってさらに検証する。A旅行者の身体/精神の相互関係を文学史に沿って明らかにするため、心身の変調に対する医学言説、生死をめぐる感覚論を精査する。道徳哲学では、「良心」をめぐる議論を取り上げ、共感に関する論考(ヒューム、スミス)と唯物論的機械論(ラ・メトリ)を検討し、世紀後半において、感受性の身体的重要性が高まっていく理由を明らかにする。B聖職者スターンの『説教集』を参照しつつ、旅行者の分類(外交官、商人、観光客等)の政治的意味を明らかにする。また、感受性文学研究には不可欠な熱狂の議論をメソディズムの流行と批判を軸に考察する。さらに、説教、パンフレット、書簡で用いられる語りのレトリックを分析し、スターンが提示する「事実」の虚構性を明らかにする。C国内外における旅行者の移動がもたらす経済的諸問題を整理する。旅行者の分類は、貿易、戦争、階級と密接に関係するが、さらには人種、国籍、都会/田舎、ジェンダー、セクシュアリティの問題へと広がっていく。こうした多様な問題意識を背景として抱える旅行者の感受性が「書く」ことによっていかに変容するのか、そして旅先で出会う異質な他者の感受性がいかにして共感されるのかを明らかにする。上記3点を軸に研究の方法論を早い段階で確立し、9月に渡米し、スタンフォード大学で共同研究会を開催する。そのための事前打ち合わせを現在、ジョン・ベンダー教授と行っている。その成果は、学術論文として発表し、併せて国内でのシンポジウムを企画する。

道徳哲学では、「良心」をめぐる議論を取り上げ、共感に関する論考(ヒューム、スミス)と唯物論的機械論(ラ・メトリ)を検討し、世紀後半において、感受性の身体的重要性が高まっていく理由を明らかにする。B聖職者スターンの『説教集』を参照しつつ、旅行者の分類(外交官、商人、観光客等)の政治的意味を明らかにする。また、感受性文学研究には不可欠な熱狂の議論をメソディズムの流行と批判を軸に考察する。さらに、説教、パンフレット、書簡で用いられる語りのレトリックを分析し、スターンが提示する「事実」の虚構性を明らかにする。C国内外における旅行者の移動がもたらす経済的諸問題を整理する。旅行者の分類は、貿易、戦争、階級と密接に関係するが、さらには人種、国籍、都会/田舎、ジェンダー、セクシュアリティの問題へと広がっていく。こうした多様な問題意識を背景として抱える旅行者の感受性が「書く」ことによっていかに変容するのか、そして旅先で出会う異質な他者の感受性がいかにして共感されるのかを明らかにする。上記3点を軸に研究の方法論を早い段階で確立し、9月に渡米し、スタンフォード大学で共同研究会を開催する。そのための事前打ち合わせを現在、ジョン・ベンダー教授と行っている。その成果は、学術論文として発表し、併せて国内でのシンポジウムを企画する。海外での研究者との打ち合わせが双方の都合により延期されたため。次年度は実現の可能性が大きい。
KL-6発現マウスを用いた膠原病肺モデルにおける新規バイオマーカーの動態解析

KL-6は様々な間質性肺疾患の診断や病勢の判断に有用であるが、不明な点が多い。KL-6を測定可能な動物モデルがなかったため研究の障壁になっていた。我々はヒトMUC1Tgマウスを用いた肺障害モデルでKL-6がバイオマーカーとして働くことを見出した。一方、膠原病診療では間質性肺炎は重要な合併症であるが、KL-6を測定可能な動物モデルはまだない。また最近開発されたLRGは新規炎症性マーカーであるが間質性肺炎での評価やKL-6との差はまだ明らかではない。そこで、本研究ではKL-6がバイオマーカーとなる膠原病肺モデルの作製を試み、肺障害におけるKL-6とLRGのバイオマーカーとしての違いを検討する。
セラミックス表面の親水性に及ぼす固体階層構造と表面水膜の影響の解明

各種酸化チタンとプローブ顕微鏡システムを用いて、紫外線照射により酸化チタンに生じる高度な親水性表面での水分子の吸着状態や、材料の形態、組織等が親水性に与える影響を検討した。ルチルセラミックスを用いた検討から、紫外線照射での親水化の初期は吸着有機物の酸化分解が、高度な親水化には水分子の光吸着が、それぞれ親水化に関与していることが明らかになった。また粒界の影響は少なく、表面に形成される水膜の厚さは概ね2-3 nm程度であることが示唆された。さらにブルッカイトにヘテロポリ酸を組み合わせた系が光誘起親水性とその暗所維持性が優れることを見出し、親水点が表面に点在した構造の効果であることが考えられた。密度が同等のルチルセラミックスを作製し、表面を鏡面研磨したのち、アニールを行うことで歪みを取り除き、表面での紫外線照射による摩擦力の変化を調査した。その結果、セラミックスを形成する個々の粒子で紫外線照射による摩擦力の変化の様子が異なり、摩擦力が短時間に変化するものと、なかなか変化しないものがあることが判った。また長時間光照射を行うと、摩擦力が極大値を示した後に下がってくる傾向があることも判った。光照射による摩擦力の変化は表面の親水化と関係付けられることが過去の研究から明らかになっているが、粒子毎の変化や、摩擦力が極大値を示した後に下がってくる傾向は、これまで報告されていない。実験に用いたルチルセラミックスの微構造を反映した特徴である可能性があり、現在電子後方散乱回折を用いて、個々の粒子の指数付けを行い、摩擦力変化の挙動と結晶面方位との関係について解析を進めている。また原子間力顕微鏡にファンクションジェネレータを取り付け、動的摩擦力測定の高さ依存性から水膜の厚さと粘性を調査する実験を開始し、実験条件は概ね把握できつつある。さらに親水表面の接触角の液滴径依存性から、微小液体では線張力の効果がみられること、通常の計測に用いる直径1-2mm程度の液滴では静水圧の効果が線張力に勝ること、表面エネルギーの変化により親水から撥水に移行するのに伴い、線張力の符号が逆転していくことなどが明らかになった。これらを通じて、液滴の大きさと、固体表面との相対的な大小関係が濡れの計測に与える影響について基礎的な知見が得られた。市販のルチル粉末を一軸加圧成形し、1100°C、2時間で常圧焼結して緻密な焼結体を作製した。得られた焼結体に対し、鏡面研磨、洗浄、熱エッチングを行い、測定試料とした。紫外光照射に伴うルチル多結晶体表面の摩擦力変化をFFMにて各種の雰囲気下(大気、ドライ窒素、ドライエア中)で評価した。また、同条件での紫外光照射による接触角の変化を測定した。ルチル多結晶体表面に大気中で紫外線を照射したところ、はじめ表面摩擦力の増加が見られ、その後減少に転じた。この間、接触角は低下した。さらに紫外線を照射し、水接触角が低下して飽和値に達したあたりから摩擦力が微増していく様子が確認された。摩擦力の増加は表面吸着有機物の酸化分解によるものであるという仮定のもと、各結晶粒の摩擦力の変化から表面エネルギーの変化を概算し、各粒子が各照射時間で示す接触角と紫外線照射時間との関係をプロットしたところ、摩擦力の増加領域では、実測値と概ね一致し、親水化の初期は吸着有機物の酸化分解によるものであることがわかった。このことはドライエア雰囲気下の紫外線照射で摩擦力が増加したが、減少しなかったことからも支持された。また、ドライエア雰囲気下で紫外線を照射し、高度に清浄化した表面に、水蒸気を導入したところ、摩擦力が減少し、さらに紫外線を照射したところ、摩擦力が増加した。このことから高度な親水化には水分子の光吸着が関与していることが明らかになり、単結晶(100)面を用いたフォースカーブ測定から、その表面には2-3nm程度の水膜が生成していることが示唆された。昨年のルチル焼結体に続き、本年はブルッカイトの薄膜を用いて光誘起親水性とその後の親水性の暗所維持性との関係について、構造面と組成面から調査した。ブルッカイト薄膜は交互積層法により作製し、最表面にはタングステン系のヘテロポリ酸(PW12)を配置した。表面でのWとTiの原子比は約5atom%であり、表面粗さ(Ra)は約9nmであった。300°Cで熱処理を行うことによりPW12の安定性が向上し、水に溶解しにくくなった。

PW12を最上層に配置した薄膜(TTP)は、配置しない薄膜(TT)に比べ、紫外線照射下での気相中の2-プロパノールの分解活性が向上し、その程度はPW12を配置する位置により違いがみられたことから、ブルッカイトの励起電子に対するPW12のスカベンジャー効果が寄与していることが判った。またTTP薄膜は、TT薄膜に比べ、紫外線照射下での親水化速度が向上し、併せて親水化後の状態の暗所での維持性にも優れていた。高い親水化速度は分解活性の向上によるものと考えられた。TTP薄膜は紫外線照射後に、(1)ケルビン力顕微鏡により得られる表面電位がマイナス方向に移動すること、(2)還元されたPW12の比率が上昇していることがXPSで確認されること、(3)相対湿度10%の窒素雰囲気では同じ湿度のエアー雰囲気より暗所維持性が優れること等から、ブルッカイトからの電子を蓄えて還元状態になっているPW12が存在していることが示唆され、そこに水が吸着しているために暗所維持性が得られることが考えられた。PW12の大きさから考えて約1nm程度の親水点が表面に点在している構造となっていることが予想され、このような構造が酸化物の親水性維持に対して効果的であることが示された。またこのような親水点は表面での水滴の移動にも影響を与え。その効果は移動開始時と移動中とでは異なることも明らかにした。
松果体細胞におけるグルタミン酸の入出力機構とメラトニンの分泌制御

約24時間の周期を持つ生物リズムはサーカディアンリズム(概日リズム)とも呼ばれ、動物はもとより植物や単細胞生物に至るまで広く見られる現象である。哺乳類の場合、概日リズムの中枢は視交叉上核と呼ばれる神経細胞集団にあり、この活動シグナルが交感神経を通じて松果体に伝えられる。松果体はこのシグナルをメラトニンという液性情報に変えて血中に放出する。放出されたメラトニンは受容体を介して時間情報を細胞に伝達する。従って、松果体は時間情報の変換器とも考えられ、メラトニンの合成・分泌機構を明らかにすることは概日リズムを理解するために極めて重要な課題である。我々は、松果体におけるメラトニンの合成・分泌が交感神経により正の制御を受ける他に、負に制御する機構を内在していることを見いだした。すなわち、松果体細胞は神経の化学伝達と類似した機構により興奮性アミノ酸であるグルタミン酸を蓄積し、分泌している。これが隣接する松果体細胞に伝達され、メラトニンの分泌が抑制される。本班研究において、我々はこの新規な内分泌制御機構の全貌を解明することを目的とする。本年度は以下の成果を修めた。(1)メラトニンの合成・分泌を抑制するシグナル伝達系を解析した。クラスII型の代謝型受容体(mGluR3)が松果体細胞に発現しており、抑制性cAMPカスケードによりメラトニン合成酵素活性が抑制されることを見いだした。(文献1)これは分泌細胞で代謝型グルタミン酸受容体が機能していることを示した初めての例である。(2)グルタミン酸を濃縮する顆粒・マイクロペジクルの構成蛋白に関する研究を推し進め、マイクロペジクルにsynaptivvesicle protein 2Bが発現していることを見いだした。(文献2)(3)松果体細胞がグルタミン酸を開口放出させるin vivoにおける刺激につき探求した。アセチルコリンがニコチン性受容体を介してマイクロベジクルの開口放出をトリガーすることを見いだした。(文献3)これは、グルタミン酸によるメラトニン合成分泌阻害がさらに上位中枢により副交感神経を介して行われていることを示唆する結果である。(4)松果体細胞は哺乳類の細胞としては最も高濃度のDアスパラギン酸を含んでいる。松果物におけるDアスパラギン酸の生理作用と由来につき研究した。その結果、Dアスパラギン酸はLグルタミン酸よりも強いメラトニン合成抑制作用を示すことが判明した。その作用機構はLグルタミン酸のそれと少なくとも一部共通であった。(文献5)さらに、このDアスパラギン酸が細胞内で生合成されている証拠を見いだした。これは動物におけるDアスパラギン酸合成酵素活性の初めての検出例である。PC12細胞にも同様の合成酵素活性が存在することを見いだした。(文献4)約24時間の周期を持つ生物リズムはサーカディアンリズム(概日リズム)とも呼ばれ、動物はもとより植物や単細胞生物に至るまで広く見られる現象である。
グリコサーマル法による熱力学的に不安定な複合酸化物の合成

当報告者らが開発し,種々の酸化物微結晶の合成法であることを明らかにしているグリコサーマル反応が,準安定相複合酸化物の一般的な合成法となり得ることを示すことを目的として研究を行った。平成9年度は,希土類酢酸塩と鉄アセチルアセトナートの反応で生成し準安定相の複合酸化物である六方晶LnFeO_3の生成過程を詳細に検討した。配位子の熱安定性が原料の反応性を支配していること,高温になるほど六方晶LnFeO_3の不安定性が増加し,溶解度が増加するので反応温度の増加とともに結晶径が大きくなること,反応系に他のガーネットを種結晶として添加した場合には,希土類鉄ガーネットが生成することなどを見出した。グリコサーマル反応で中間体として生成するグリコキシドの熱力学的不安定性が最終的に準安定相生成の要因になっていると結論した。平成10年度はインジウムアルコキシドと希土類酢酸塩,アルミニウムイソプロポキシドとガリウムアセチルアセトナート,チタニウムアルコキシドとケイ酸テトラエチルの反応などを検討した。最初の反応では希土類酸化物ー酸化インジウム固溶体が生成し,構造未知の複合酸化物も副生することを見出した。2番目の反応では極めて高い表面積を持つγ-アルミナー酸化ガリウム固溶体を得ることができた。最後の反応でも,熱力学的には不安定なアナタースにケイ素が固溶した生成物が得られ,この反応の場合にも,反応温度を低下させることにより極めて高い表面積を持つ生成物が得られた。このような検討の過程で,金属セリウムを2-メトキシエタノール中で直接反応させると250°Cで20A程度も粒径を持つセリアの超微粒子を含む透明コロイド溶液が直接得られることを見出した。この系でも金属セリウムが酸化されるという非常に大きな反応の推進力を持っていることが,この特異な生成物を与える要因と考えられた。当報告者らが開発し,種々の酸化物微結晶の合成法であることを明らかにしているグリコサーマル反応が,準安定相複合酸化物の一般的な合成法となり得ることを示すことを目的として,まず,結晶構造決定を終えている新規な準安定相の複合酸化物である六方晶LnFeO_3の生成過程を詳細に検討した。この生成物は希土類酢酸塩と鉄アセチルアセトナートの反応で生成するが,クエン酸鉄等を用いると,マグネタイトが生成し,また希土類アセチルアセトナートを用いると希土類鉄ガ-ネットが生成した。この結果は,グリコサーマル条件下では,配位子の熱安定性が原料の反応性を支配していることにより説明できた。次に,生成物の形状を検討し,反応温度が低くなるほど粒子径が小さくなることを見出した。この結果は,グリコサーマル反応による希土類アルミニウムガ-ネット等の合成の場合には,反応温度により粒子径は大きく変化しないことと好対照をなす。この違いは,六方晶LnFeO_3の場合,高温になるほど相対的に不安定性が増加し,溶解度が増加するので,臨界核発生濃度も増加し,結晶核発生頻度が低下するためと考えられた。また,この系でガ-ネットが生成しないのは,六方晶LnFeO_3の結晶核発生温度が低いためと考えられた。この系に他のガ-ネットを種結晶として添加した場合には,希土類鉄ガ-ネットが生成した。これはグリコサーマル反応では核発生が困難であるが,熱力学的に不安定なアルコキシドの熱分解が直接結晶成長に関与しているので,結晶成長には大きな推進力を持つためと考えられた。また,種結晶上に成長した六方晶LnFeO_3の結晶中に刃状転移位認められた。

グリコサーマル法では容易に欠陥が発生するが,この場合,種結晶と生成結晶間の格子定数の違いによる歪みを解消する役割を持っているものと考えられた。当報告者らが開発し,種々の酸化物微結晶の合成法であることを明らかにしているグリコサーマル反応が,準安定相複合酸化物の一般的な合成法となり得ることを示すことを目的として,本年度はインジウムアルコキシドと希土類酢酸塩,アルミニウムイソプロポキシドとガリウムアセチルアセトナート。チタニウムアルコキシドとケイ酸テトラエチルの反応などを詳細に検討した。前者の反応では希土類酸化物-酸化インジウム固溶体が生成するが,構造未知の複合酸化物も生成することを見出した。2番目のの反応ではγ-アルミナ-酸化ガリウム固溶体が生成し,反応温度を低下させることにより,極めて高い表面積を持つ生成物を得ることができた。最後の反応でも,熱力学的には不安定なアナタースにケイ素が固溶した生成物が得られ,この反応の場合にも,反応温度を低下させることにより極めて高い表面積を持つ生成物が得られた。このような高表面積酸化物は,表面エネルギー分だけ,通常の結晶より不安定であり,このような生成物が得られるのは,原料のアルコキシドが熱力学的に極めて不安定であり,このアルコキシドの不安定性が生成物の結晶化に直接利用され,反応が大きな推進力を持っているためと考えられた。また,このような検討の過程で,金属セリウムを2-メトキシエタノール中で直接反応させると250°Cで20A程度も粒径を持つセリアの超微粒子を含む透明コロイド溶液が直接得られることを見出した。この系でも金属セリウムが酸化されるという非常に大きな反応の推進力を持っていることが,この特異な生成物を与える要因と考えられた。
模擬低酸素状態下での持久的トレーニングが骨格筋酸素供給系に及ぼす影響

本研究は、常圧・低酸素環境下の持久的トレーニングが骨格筋酸素供給系の適応性変化に及ぼす影響について解明することを目的とした。実験には12週齢のwistar系雌ラットを用い、それぞれ、対照群(Cnt)、トレーニング群(TR)、コバルト投与群(Cob)、およびコバルト投与中にトレーニングを行う群(CoTR)の4グループに分けた。塩化コバルトは0.01%の濃度で飲水中に混ぜて5週間投与した。トレーニングは小動物用トレッドミルを用いて5週間負荷した。Hb濃度はCob群及びCoTR群でCnt群に比べ約25%有意に増加した。Cob群では、横隔膜だけで全毛細血管密度及びC : F比の有意な増加が観察された。TR群ではヒラメ筋と足底筋において毛細血管数の有意な増加と細動脈側毛細血管数の増加および細静脈側毛細血管数の減少が観察された。CoTR群でもこれと同等の変化が観察されたが、足底筋においてはTR群よりも毛細血管数が有意に増加していたVEGFに陽性反応を示す毛細血管の密度(VEGF-cap)には有意な差はみられなかった。代謝酵素活性ではTR群とCoTR群でほぼ同等の変化を示し、有酸素代謝系酵素の有意な活性増加と無酸素系代謝酵素の僅かな低下が観察された。次に、この実験結果を踏まえ、トレーニング初期段階におけるVEGF発現を観察した。コバルト投与開始6、10日後にVEGF-capがヒラメ筋において有意に増加し、10日後にはC : F比が有意な増加を示した。CoTR群のヒラメ筋では、VEGF-capの値が3日後に69%、6日後に44%、10日後には60%有意に増加したが、足底筋では10日後に有意な増加が観察された。TR群では、ヒラメ筋でVEGF-capが6日後、10日後に有意に増加したが、足底筋では有意な増加は観察されなかった。ヒラメ筋ではTR群及びCoTR群でC : F比が6日後と10日後に有意な増加が観察されたが、足底筋ではCoTR群だけ10日後に有意な増加が見られた。以上の結果から、コバルトによるoxygen-sensing mechanismの活性化によって、下肢骨格筋の毛細血管内皮細胞でのVEGF発現が促進され、毛細血管網の再構築が助長されることが示唆された。本研究は、常圧・低酸素環境下の持久的トレーニングによる骨格筋酸素供給系の適応性変化について解明することを目的とした。実験には12週齢のWistar系雌ラットを用い、それぞれ、対照群(CNT)、トレーニング群(TR)、コバルト投与群(Cob)、およびコバルト投与中にトレーニングを行う群(CoTR)の4グループに分けた。トレーニングは小動物用トレッドミルを用いて、25m/minで20%勾配、週5日の走運動を1日10分間から開始し、3min/dayの割合で運動時間を漸増し、5週間負荷した。