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アレルギー・自己免疫病におけるヒトＴｈ１７／Ｔｈ２１細胞の解析

アレルギー性気道炎症は通常Th2型の免疫反応であるが、好中球性気道炎症ではTh17型の免疫反応が重要な役割を担っている。MLRを用いて各種漢方処方・成分のTh17抑制活性をスクリーニングし、活性の強い成分についてはOVA TCRトランスジェニックDO11.10マウスを用いてOVAによって誘発された好中球性気道炎症を抑制するかどうかを評価した。中でも漢方成分であるオウゴニンはOVAによって誘発された好中球性気道炎症を有意に抑制した。このことから、オウゴニンはTh17分化の抑制を介して好中球性気道炎症を抑制するといえる。1)ヒト(Th17)/Th21細胞のクローニング混合リンパ球培養反応(MLR)を用いた。MLRで誘導されるT細胞はTh1やTh2細胞が主体であり、それが産生するIFN_γやIL-2はTh17の分化や増殖を阻害してしまう可能性があることを考慮し、極小マイクロプレートを用いてMLRを限界希釈の状態で誘導。さらにこれにより得られた細胞クローンは、MLRに用いた抗原提示細胞と特定のサイトカイン(IL-23等)の存在下で継代維持することが可能であることをも見出した。Th17細胞クローンの樹立にはサイトカインとしてTGFβとIL-6を用いるが、Th21細胞クローンの樹立にはIL-6(50ng/ml)とIL-21(20ng/ml)を用いれば有効であることをすでに確認している。これを用いて複数のヒトTh21細胞クローンを樹立した。2)ヒトTh17/Th21細胞のヘルパー機能の解明Th17クローンを用いたトランスクリプトーム解析により、Th17はCXCL13を特異的に産生していることが明らかとなった。CXCL13は強力なB-cell chemoattractantであると同時にTh17が細胞外で増殖する病原微生物に対する生体防御に関わっている。活性化Th17とB細胞の共培養によって産生されるIgG subtypeをELISAで定量することによりこれを検証した。Th21についても同じようにB細胞の活性化や抗体が関連する自己免疫疾患への関与が推測されているため、同様の手法で解析した。3)ヒトTh17/Th21細胞に特異的に発現する分子の解明ヒト(Th17)/Th21細胞クローンからmRNAを抽出してcDNAを調整し、DNAチップを用いた網羅的トランスクリプトーム解析を行った。ヒトTh17/Th21細胞のヘルパー機能の解明特定のIgG subtypeへのクラススイッチ圧が、IL-17/21とCD40刺激のGγ3、Iγ3発現に対する効果を検討し、クラススイッチ圧を分子レベルで証明した。また、B細胞におけるアポトーシス関連遺伝子の発現や寿命延長作用についても検討した。ヒトTh17/21細胞に特異的に発現する分子の解明22年度の作業を引き続き行った。同定された分子に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の両方を作成した。特異的に発現する分子の生理的機能の解明誘導相、維持相、B細胞への効果相の3つの相を解析した。DCとの相互作用によりナイーブT細胞がTh17/21細胞に分化する段階に標的分子に対する抗体を加えてその効果を観察。同様な解析は、一旦樹立されたTh17/21細胞を維持する段階、並びにT-B相互作用によるB細胞への効果が現れる段階でも行った。Th17病と考えられている、関節リウマチ、多発性硬化症。1型糖尿病、腎炎、好中球性喘息、の動物モデル、乾癬、SLE(Th21関連の可能性)モデルに更なる検討項目を加えて、標的分子に対する低分子物質の効果を検証をした。中でも今年度特筆すべきは、漢方薬を用いてモデルマウスへのアプローチを行った事である。アレルギー性気道炎症は通常Th2型の免疫反応であるが、好中球気道炎症では、Th17型の免疫反応が重要な役割を担っている。MLRを用いて各種漢方処方・成分のTh17抑制活性をスクリーニングした。活性の強い成分については、OVA TCRトランスジェニックDO11.10マウスを用いて、OVAによって誘発された好中球気道炎症を抑制するかどうかを評価した。半夏瀉心湯(HST)と黄連解毒湯(OGT)にTh17分化抑制作用があることを発見した。オウゴニンとベルベリンはHSTとOGTに共通する主要構成成分であり、ドーパミンD1受容体アンタゴニスト活性を示した。オウゴニンはOVAによって誘発された好中球気道炎症を有意に抑制した。また、オウゴニンは活性化Th17細胞には作用しないが、ナイーブT細胞のTh17への分化を抑制することが明らかとなった。オウゴニンはドーパミンD1受容体アンタゴニストでありTh17分化の抑制を介して好中球気道炎症を抑制する。

今年度はTh17病と考えられている、好中球性喘息のモデル動物作成、並びにその解析を中心に実験を行った。さらに乾癬(Th17病)モデル、SLE(Th21関連の可能性)モデルを加えて検討した。好中球性気道炎症を用いた研究により、漢方製剤の成分のひとつであるwogoninに以下の活性を見出した。1)Th17分化抑制活性があること、2)ドーパミンD1受容体のアンタゴニスト活性があること、3)樹状細胞に作用して、ナイーブT細胞の分化を偏向させること、4)経口投与によりDO11.10マウスにおけるOVA誘導性気道炎症が抑制されること。また、ヒトアロ反応性Th21クローンを樹立してそのトランスクリプトーム解析を行ったが、既存のTh1/2クローンとの著明な発現差を見出すことができなかった。乾癬モデルでは、Th17アジュバントのマウスへの投与により乾癬用皮膚炎を誘導することに成功したが、効率に問題があり、引き続き検討中である。申請者はヒトTh17細胞を世界に先駆けてクローニングした。この細胞を用いてさまざまな解析を行い、成果を発表してきた。1)ヒト(Th17)/Th21細胞のクローニング、2)ヒトTh17/Th21細胞のヘルパー機能の解明、3)ヒトTh17/Th21細胞に特異的に発現する分子の解明、4)特異的に発現する分子の生理的機能の解明、5)動物モデルでの解析、6)病気との関連の解析を通じ臨床応用への足掛かりを構築する事を目的としている。25年度が最終年度であるため、記入しない。動物モデル作成、並びにその解析を中心に実験を行った。乾癬(Th17病)モデル作成に至っては、経口投与から約45か月経過しないと皮膚所見が現れないことが判明した。当初の予想より、やや遅い進度となっているが引き続き十分な検討を行いたい。動物モデルの解析Th17病と考えられている、関節リウマチ、多発性硬化症、1型糖尿病、腎炎、好中球性喘息の動物モデルを稼働させている。さらに乾癬モデル、潰瘍性大腸炎、SLE、モデルを加えて、標的分子に対する抗体の効果を検証する。また抗体だけにとどまらず、標的分子の下流のシグナル伝達阻害剤、標的分子のノックアウトマウスを用いた解析も行う。病気との関連の解析前述(関節リウマチ、多発性硬化症、1型糖尿病、腎炎、好中球性喘息、乾癬(Th17病)、SLE(Th21関連の可能性))の疾患患者サンプル(主に血清とPBMC)を用いて、治療前後における標的分子の発現解析を行う。Wogoninの効果の解析好中球性気道炎症のみならず、乾癬、潰瘍性大腸炎のモデルマウスを用いてその効果を検討する。
太陽光紫外線によって生じる遺伝子の変化

太陽光近似の紫外線(UVB)を照射することによって生じたマウス皮膚腫瘍におけるp53遺伝子の変異の有無をPCR-SSCPを用いてスクリーニングしたところ12/20(60%)の突然変異の存在が疑われた。そこで本研究では日本人における露光部と非露光部に生じた皮膚腫瘍におけるp53遺伝子の変化を比較することによりヒトにおける太陽光特有の遺伝子変異がどのようなものであるかを検討した。日本人の露光部に発生した皮膚腫瘍30例(基底細胞上皮腫(BCC)16例、扁平上皮癌(SCC)14例)、非露光部に発生した皮膚腫瘍22例(BCC16例、SCC6例)についてホルマリン固定、パラフィン包埋切片標本より、顕微下で、できる限り腫瘍周辺組織が含まれず、腫瘍組織のみが含まれるように、DNAを抽出し、p53遺伝子のエクソン5-8についてPCR-SSCP(一本鎖高次構造多型解析法)を用いて突然変異の有無をスクリーニングしたことろ、露光部腫瘍の30%(9/30)、非露光部腫瘍の40%(9/22)に突然変異がうたがわれた。突然変異のうたがわれたものについて塩基配列を決定した。変異の種類をみてみると露光部の腫瘍では6/9例でピリミジン塩基の並んだ部位でトランジションがみられた太陽光による塩基置換が強く疑われた。一方、非露光部のものでは、ビリミジンの並んだ部位でのトランジションは、2/10例にしか見られず、トランスパーションが高率にみられることより、癌の発生の過程に変異p53遺伝子の関与はあるものの、変異の原因として、紫外線の関与は低いと推察される。症例数が少なく、統計的解析は行っていないが、露光部での腫瘍では、非露光部の腫瘍と比べると、トランジションがかなり多く、露光部に生じた腫瘍の発生に太陽光によるp53遺伝子の変化が関与していることが示唆された。
高強度レーザー場と高輝度X線を用いた真空の巨視的構造の探索

高強度レーザー場で真空を励起し、X線自由電子レーザー(XFEL)をプローブとして、真空複屈折・真空回折といったマクロな物理量として現れる真空偏極を探索している。真空偏極の大きさはレーザーのインテンシティに比例するため、レーザーを回折限界のμmサイズまで絞る必要がある。このため、デフォーマブルミラーを導入し、波面を整形することで3μmサイズまで集光することに成功した。また、真空回折において最大のバックグラウンド事象となるプローブX線のスリット端からの回折を抑制するため、Si製の透過型X線光学素子であるビームシェイパーを開発した。このビームシェイパーを用いることで、通常SACLAで用いられている集光レンズおよびスリットを用いた場合に比べ、約3桁バックグラウンドを抑制することができた。デフォーマブルミラーを導入することで、近赤外レーザーを回折限界に近い3μmまで集光する技術を確立した。また、X線ビームシェイパーを開発し、バックグラウンドが3桁抑制することが可能となるなど、おおむね順調に進展している。ただし、最終的に真空偏極を探索するために、X線偏光子と組み合わせたさらなるバックグラウンド抑制を考えているが、偏光子の開発についてはやや遅れている。2018年度中にデフォーマブルミラーにより0.6TWレーザーをμmレベルに集光する技術を確立した。今後、この技術を500TWレーザーにも適用する。また、バックグラウンド事象であるプローブ光由来のX線を抑制するため、X線偏光子の開発を行う。特に、Si単結晶の結晶面によって生じる複屈折が偏光子の性能(消光比)に与える影響について調査する。以上の開発が終わりしだい、X線プローブと高強度レーザーを組み合わせて世界最高感度での真空偏極の探索実験を行う。真空偏極の大きさはレーザーのインテンシティに比例するため、レーザーを回折限界のμmサイズまで絞る技術が極めて重要である。さらに、集光したレーザーとXFELを時間的・空間的にアライメントする手法も必須となる。まずはSACLAのXFELおよび同期レーザー(1mJ)を用いてプロトタイプ実験を行い、10μmレベルでの集光・アライメントを達成し、世界で初めて真空回折現象に対する制限を与えた。また、真空回折実験と同じセットアップでSPring-8でビームテストを行い、真空回折実験における最大のバックグラウンドがスリットの端でX線が回折されることによって生じることを突き止めた。これを抑制するため、従来にないX線光学素子(シェイパー)の設計・開発を行った。真空回折実験のバックグラウンド事象を特定し、バックグラウンドを抑制するための新たな光学素子(シェイパー)の開発をすすめた。また、SACLAのXFELおよび同期フェムト秒レーザー(0.25TW)を用い、10μmサイズでXFELとレーザーを衝突させて真空回折のプロトタイプ実験を成功させた。本研究では高性能X線偏光子が必須となるが、これまでに開発したX線偏光子は消光比が10のマイナス8乗程度と、世界最高性能のものより2桁性能が低かった。この原因として、性能評価に用いたビームラインのX線全反射ミラーでの散乱が考えられた。全反射ミラーが平成30年度に新たなものに交換されるまで待って再測定することとしたため、X線偏光子の開発についてはやや遅れている。X線の回折によるバックグラウンド事象を抑制するため、新たに開発したX線光学素子(シェイパー)をSPring-8のX線ビームを用いて性能評価を行う。また、真空複屈折探索に必要なX線偏光子についても同様に高輝度X線ビームを用いて性能評価を予定している。また、高強度レーザーの集光サイズは現在10μm程度であり、目標とする回折限界1μmより1桁大きい。これは、高強度レーザーの波面が揃っていないことによると考えられるため、デフォーマブルミラーを導入し波面を整形することでμmサイズの集光を目指す。まずは低強度のレーザーで波面整形技術を確立した後、SACLAの同期フェムト秒レーザー(10mJ)に適用する。

2018年度中にデフォーマブルミラーにより0.6TWレーザーをμmレベルに集光する技術を確立した。今後、この技術を500TWレーザーにも適用する。また、バックグラウンド事象であるプローブ光由来のX線を抑制するため、X線偏光子の開発を行う。特に、Si単結晶の結晶面によって生じる複屈折が偏光子の性能(消光比)に与える影響について調査する。以上の開発が終わりしだい、X線プローブと高強度レーザーを組み合わせて世界最高感度での真空偏極の探索実験を行う。
新規グルタミン酸阻害物質によるレセプターの動態解析

本研究代表者は日本に生息するジョロウグモ(Nephila clavata)の毒腺中にグルタミン酸レセプターの特異的な阻害物質を見出した。この毒素の精製を進めるとともに種々のグルタミン酸シナプスに対する作用をしらべた。ジョロウグモを大量に捕集し、毒液を抽出後ゲル瀘過、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴法等を用い精製を行った。この結果毒素(JSTX)は分子量約500600の耐熱性の物質で基本骨格はペプタイドあることが分った。精製したJSTXを用い、グルタミン酸シナプスの代表である甲殻類神経筋シナプスにおける阻害機構と作用部位をしらべた。エビ歩脚伸張筋シナプスにおいて興奮性シナプス後電流(EPSC)を記録しJSTXを与えると、EPSCの振巾は毒素の投与後ほぼ指数凾数的に減衰し、その連度定数は毒素の濃度に比例した。低濃度の毒素を与えた後標本を洗浄するとEPSCの減少は止まり、その後数時間にわたり洗浄しても振巾の回復は見られずJSTXの作用が実用上不可逆的であることを示している。この状態で膜電位を変化させEPSCの電圧電流関係をしらべると、対昭と同じく直線的であった。またEPSCの下降相は毒素の作用下でも対数軸上で単相性の減衰を示しこれは膜電位の変化によっても変らなかった。このことは毒素の作用部位がグルタメイトレセプター・イオンチャネル複合体ののうち、電流ゲートと離れた場所にあることを示している。
極相森林群集における樹冠発達と相互作用に対する最大樹高と枝の沈み込みの影響

若い二次林,中間的な二次林,極相林のブナの林冠木では,枝の位置の平均移動距離はともに10cm以下であった.移動距離に影響を与える要因をステップワイズ回帰分析で調べたところ,幹の根元からの水平的な枝の位置のずれが移動量と有意な相関を示したが(P<0.05),枝の太さや高さの効果は有意でなかった.幹の根元の位置から水平距離が離れるほど,枝の変形による空間位置の移動距離が大きくなった.樹高成長に相当する樹冠頂部の最大シュート長は,樹高が種の最大値に近づくにしたがって低下した.また,樹高が低い個体での(5m以下程度)この最大シュート長は,林冠に出現する種では極相種も遷移途中に出現する種も、暖温帯でも冷温帯でも,共通して約50cm程度であることが多かった.樹高が高くなって最大シュート長が低下するとともに,シュートの増加率λも低下した.ただし,胸高直径よりも最大シュート長に直接相関していた.樹冠相互作用のシミュレーションでは林冠上部に葉群と種が集中し,種の優占度は最大樹高の高い種で大きかった.これは照葉樹林の樹冠とほぼ同じパターンであった.熱帯多雨林と同じような,林冠の低い部分に種と葉群が多いパターンは得られなかった.最大樹高が大きく,耐陰性(低樹高時にλ=1となる光強度の低さ)の高い種が単独で優占種になる傾向があった.最大樹高の原因ではシュート長の低下が主要な要因であると考えられる.最も樹高が高く,最も耐陰性が強く,最も成長の早い種が出現して優占した.パラメータ間のトレードオフや地域のフロラを考慮してパラメータを与える必要がある.若い二次林,中間的な二次林,極相林のブナの林冠木では,枝の位置の平均移動距離はともに10cm以下であった.移動距離に影響を与える要因をステップワイズ回帰分析で調べたところ,幹の根元からの水平的な枝の位置のずれが移動量と有意な相関を示したが(P<0.05),枝の太さや高さの効果は有意でなかった.幹の根元の位置から水平距離が離れるほど,枝の変形による空間位置の移動距離が大きくなった.樹高成長に相当する樹冠頂部の最大シュート長は,樹高が種の最大値に近づくにしたがって低下した.また,樹高が低い個体での(5m以下程度)この最大シュート長は,林冠に出現する種では極相種も遷移途中に出現する種も、暖温帯でも冷温帯でも,共通して約50cm程度であることが多かった.樹高が高くなって最大シュート長が低下するとともに,シュートの増加率λも低下した.ただし,胸高直径よりも最大シュート長に直接相関していた.樹冠相互作用のシミュレーションでは林冠上部に葉群と種が集中し,種の優占度は最大樹高の高い種で大きかった.これは照葉樹林の樹冠とほぼ同じパターンであった.熱帯多雨林と同じような,林冠の低い部分に種と葉群が多いパターンは得られなかった.最大樹高が大きく,耐陰性(低樹高時にλ=1となる光強度の低さ)の高い種が単独で優占種になる傾向があった.最大樹高の原因ではシュート長の低下が主要な要因であると考えられる.最も樹高が高く,最も耐陰性が強く,最も成長の早い種が出現して優占した.パラメータ間のトレードオフや地域のフロラを考慮してパラメータを与える必要がある.鏡ヶ成周辺の極相林と隣接する2次林において,ブナ,ミズナラ,アズキナシ,イタヤカエデ,オオカメノキ,リョウブなどについて最大樹高を推定した.さらに被陰されていない状態の,さまざまな樹高の樹冠の最上部から枝を採取して樹高成長速度の変化を調べた.落葉広葉樹林帯に加えて,千葉県清澄山の常緑樹林帯のスダジイ,アカガシ,アラカシ,コナラ,ヤマザクラ,ヤブツバキ,モチノキなどについても同様な調査を行った.その結果,いずれの樹種も樹冠が成長して最大樹高に近づくとともにシュート伸長量が低下することがわかった.この結果は1997年3月に札幌市で行われる日本生態学会大会で口頭発表する予定である.落葉広葉樹林帯のブナでは,被陰されていない状態のさまざまなサイズの個体のシュートをマークしてシュートのpopulationの動態のパラメータの測定を開始した.また,枝の自重による沈み込みを実測する目的でさまざまなサイズのブナの個体にレーザー測距機能を持ったトータルステ-シヨン用のレフシートを貼り付け,空間的な位置の変化の測定を始めた.極相林での樹冠の発達と樹冠どうしの相互作用を考えるには,これまで考慮されてこなかった種特異的な最大樹高や,枝の横への広がりを制限すると考えられる重力による枝の沈み込みを考慮する必要がある.このため以下の点について研究を行った.(1)最大樹高は枯れ戻りによってもたらされるのか,あるいはシュート生長速度が鈍る事が重要なのか?方法:ブナ帯(大山)と照葉樹林帯(清澄山)において,他個体から被圧を受けない樹冠の最長部のシュートの成長から樹高成長を調べた.結果:全ての樹種で樹高が高くなると樹高成長が低下する.

その低下の仕方は直線的なもの(ブナ帯の多くの種),上に凸の曲線のもの(常緑広葉樹),不連続的に低下するもの(ブナ)などがある.幼樹の段階での樹高成長速度は多くの種で同じであるが,種の最大高の低い種では樹高成長量が急激に低下するのに対して,最大高の高い種では樹高成長量の低下が緩やかであった.これらの結果から,種の最大樹高の違いはシュート成長の低下によってもたらされていることが明らかになった.(2)重力による枝の沈み込みはどのていどあるのか?方法:ブナの枝にレフシートを張り付け,トータルステーションを用いて1年間隔で3次元的な位置の変化を調べた.結果:比較的太い枝では,自重による変形がもたらす枝の沈み込みはそれほど顕著ではない.樹冠の横方向の発達を制限する要因は,個体の成熟(樹高)によるシュート成長の低下によってもかなり説明できそうだ.(3)極相林の樹木におけるシュート群の動態のパラメータ測定方法:マ-キングによる方法と,サンプリングによる方法を比較した結果:樹高とともに頂芽優勢が低下する.シュートの分枝数は樹高とともに低下する種と,低下が顕著でない種とがある.
CCDマイクロスコープトライボシステムによるセラミックス薄膜の摩耗機構の解析

本研究の第1の目的は,研究代表者の開発したCCDマイクロスコープトライボシステムを用いてセラミックス薄膜の摩擦試験を行い,微視的摩耗過程の連続観察に基づき,幅広い荷重・すべり速度における微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を総合的に解明することである.本研究の第2の目的は,各摩耗形態の発生条件を理論的に解析することにより,セラミックス薄膜の摩耗形態図を世界で初めて明らかにし,耐摩耗摺動部材としてのセラミックス薄膜の使用基準を明らかにすることである.平成14年度は,DLC(ダイヤモンドライクカーボン)薄膜材料とダイヤモンドピンとの往復繰返し摩擦実験を行った.種々の荷重,すべり速度条件下で実験を行い,摩耗粒子の発生過程をCCD顕微鏡により,直接観察し,微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を明らかにした.得られた主な結果は以下の通りである.(1)見かけの接触圧力P_aが臨界接触圧力P_<c2>以上では,1回目の摩擦から被膜の剥離を生じる.(2)見かけの接触圧力P_aが臨界接触圧力P_<c1>以上かつP_<c2>未満では,繰返し摩擦後に被膜の剥離を生じる.(3)見かけの接触圧力P_aが臨界接触圧力P_<c1>以下では被膜の剥離は生じず,被膜自身の摩耗が生じる.(4)被膜自身の摩耗には,見かけの接触圧力と見かけのせん断応力の作用による大規模な脆性破壊型摩耗(Flake Formation)と,真実接触圧力と界面せん断応力の作用による局所的な脆性破壊によるマイルドな摩耗(Powder Formation)の2種類が存在する.本研究の第1の目的は,研究代表者の開発したCCDマイクロスコープトライボシステムを用いてセラミックス薄膜の摩擦試験を行い,微視的摩耗過程の連続観察に基づき,幅広い荷重・すべり速度における微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を総合的に解明することである.本研究の第2の目的は,各摩耗形態の発生条件を理論的に解析することにより,セラミックス薄膜の摩耗形態図を世界で初めて明らかにし,耐摩耗摺動部材としてのセラミックス薄膜の使用基準を明らかにすることである.平成14年度は,DLC(ダイヤモンドライクカーボン)薄膜材料とダイヤモンドピンとの往復繰返し摩擦実験を行った.種々の荷重,すべり速度条件下で実験を行い,摩耗粒子の発生過程をCCD顕微鏡により,直接観察し,微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を明らかにした.得られた主な結果は以下の通りである.(1)見かけの接触圧力P_aが臨界接触圧力P_<c2>以上では,1回目の摩擦から被膜の剥離を生じる.(2)見かけの接触圧力P_aが臨界接触圧力P_<c1>以上かつP_<c2>未満では,繰返し摩擦後に被膜の剥離を生じる.(3)見かけの接触圧力P_aが臨界接触圧力P_<c1>以下では被膜の剥離は生じず,被膜自身の摩耗が生じる.(4)被膜自身の摩耗には,見かけの接触圧力と見かけのせん断応力の作用による大規模な脆性破壊型摩耗(Flake Formation)と,真実接触圧力と界面せん断応力の作用による局所的な脆性破壊によるマイルドな摩耗(Powder Formation)の2種類が存在する.本研究の目的は,研究代表者の開発したCCDマイクロスコープトライボシステムを用いてセラミックス薄膜の摩擦実験を行い,微視的摩耗過程の連続観察に基づき,幅広い荷重・すべり速度における微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を総合的に解明することである.平成12年度は,現有のCCDマイクロスコープトライボシステムを用いて,TiN薄膜材料とダイヤモンドピンとの往復繰返し摩擦実験を行った.得られた主な結果は以下の通りである.(1)荷重Wが臨界荷重W_<c2>以上では,一回目の摩擦から被膜の剥離を生じる.(2)荷重Wが臨界荷重W_<c1>以上かつWc2未満では,繰り返し摩擦後に被膜の剥離を生じる.(3)荷重Wが臨界荷重W_<c1>以下では,被膜の剥離は生じず,被膜自身の摩耗が生じる.(4)被膜自身の摩耗には,見掛けの接触圧力と見掛けのせん断応力の作用による大規模な脆性破壊型摩耗(Flake formation)と,真実接触圧力と界面せん断応力の作用による局所的な脆性破壊によるマイルドな摩耗(Powder formation)の2種類が存在する.本研究の第一の目的は、研究代表者の開発したCCDマイクロスコープトライボシステムを用いてセラミックス薄膜の摩擦実験を行い、微視的摩耗過程の連続観察に基づき、幅広い荷重・すべり速度における微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を総合的に解明することである。本研究の第二の目的は、各摩耗形態の発生条件を理論的に解析することにより、セラミックス薄膜の摩耗形態図を世界で初めて明らかにし、耐摩耗摺動部材としてのセラミックス薄膜の使用規準を明らかにすることである。平成13年度は、アルマイト薄膜材料とダイヤモンドピンとの往復繰返し摩擦実験を行った。種々の荷重、すべり速度条件下で実験を行い、摩耗粒子の発生過程をCCD顕微鏡により直接観察し、微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を明らかにした。得られた主な結果は以下の通りである。(1)見かけの接触圧力が臨界接触圧力P_<c2>以上では、一回目の摩擦から被膜の剥離を生じる。(2)見かけの接触圧力が臨界接触圧力P_<c1>以上かつ_

<c2>未満では、繰り返し摩擦後に被膜の剥離を生じる。(3)見かけの接触圧力が臨界接触圧力P_<c1>以下では被膜の剥離は生じず、被膜自身の摩耗が生じる。(4)被膜自身の摩耗には、見掛けの接触圧力と見掛けのせん断応力の作用による大規模な脆性破壊型摩耗(Flake formation)と、真実接触圧力と界面せん断応力の作用による局所的な脆性破壊によるマイルドな摩耗(Powder formation)の2種類が存在する。本研究の第一の目的は、研究代表者の開発したCCDマイクロスコープトライボシステムを用いてセラミックス薄膜の摩擦実験を行い、微視的摩耗過程の連続観察に基づき、幅広い荷重・すべり速度における微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を総合的に解明することである。本研究の第二の目的は、各摩耗形態の発生条件を理論的に解析することにより、セラミックス薄膜の摩耗形態図を世界で初めて明らかにし、耐摩耗摺動部材としてのセラミックス薄膜の使用規準を明らかにすることである。平成14年度は、DLC(ダイヤモンドライクカーボン)薄膜材料とダイヤモンドピンとの往復繰返し摩擦実験を行った。種々の荷重、すべり速度条件下で実験を行い、摩耗粒子の発生過程をCCD顕微鏡により直接観察し、微視的摩耗形態の種類とそれらの機構を明らかにした。得られた主な結果は以下の通りである。(1)見かけの接触圧力が臨界接触圧力P_<c2>以上では、一回目の摩擦から被膜の剥離を生じる。(2)見かけの接触圧力が臨界接触圧力P_<c1>以上かつP_<c2>未満では、繰り返し摩擦後に被膜の剥離を生じる。4)被膜自身の摩耗には、見掛けの接触圧力と見掛けのせん断応力の作用による大規模な脆性破壊型摩耗(Flake formation)と、真実接触圧力と界面せん断応力の作用による局所的な脆性破壊によるマイルドな摩耗(Powder formation)の2種類が存在する。
狩猟風俗から見直す「和漢」の境界の再構成

本課題の目的は、室町時代以来議論されてきた「中国的なもの」と「日本的なもの」の区分、すなわち「和漢」の境界を見直すことにある。その研究対象として、中央アジアから伝わった狩猟風俗を基盤に再構成を試みる。和漢の境界をめぐっては、村田珠光『心の文』の一節を端緒とする厚い議論がある。これまで「中央アジア」の領域は「漢」の一部として認識されてきた。しかし、室町時代の人々は、中央アジア由来の狩猟風俗を、他の民族の狩猟風俗と区別して認識していたのである。この現象を出発点とし、本研究は、重層的な文化の集合体と考えられてきた「漢」領域から、中央アジアの領域を切り離し、「和漢」の境界を改めて構成する。
アミド基の立体特性に基づく芳香族多層分子の構築と機能

芳香族アニリド類の二級アミド結合は一般にトランス型をとるのに対して、アミド基窒素原子上にメチル基を導入して得られる三級アミド結合はシス型を優先する。この立体特性は芳香族ウレアや芳香族グアニジン類でも一般的に起こり、N,N'-dimethyl-N,N'-diphenylureaおよびN,N'-dimethyl-N,N'-diphenylguanidineは2つの芳香環が向かい合った立体構造をとる。これらシス型を優先するN-N'-dimethylurea基またはN,-N'-dimethylguanidino基を用いて複数の芳香環を連結することによって、芳香族多層構造を有する化合物を合成した。合成した化合物のうち、para置換およびmeta置換五層グアニジン体は水溶性を有し、DNAに強い親和性(Ultrafiltration AssayおよびCD tiration experimentにより算出したDNA結合定数が10^6-10^7 M^<-1 >)を有することがわかった。また、熱融解実験においても種々のDNAに対して顕著な融解温度の上昇をもたらした。構造的には末端芳香環を持たない化合物のDNA親和性が非常に弱いことから、芳香環五層構造が重要であることがわかった。また、^1H-NMRによりその結合構造を詳細に解析した結果、ドデカマー(CGCGAATTCGCG)_2に対して、そのマイナーグループに結合していることが示唆された。その結合位置は3^' CGAAT-5^'配列部位で、4つのグアニジノ基のうち2つがマイナーグループの中へ入り込んで核酸塩基と水素結合していると推測された。この結合様式は自動ドッキングスタディプログラムADAMを用いたシュミレーションによって計算化学的に導いた構造と良く一致していた。これらのグアニジン誘導体は既存の化合物とは全く構造の異なるマイナーグループ結合性分子として興味深い。この立体特性は芳香族ウレアでも一般的に起こり、例えば、N,N'-dimethyl-N,N'-diphenylureaは2つの芳香環が向かい合った立体構造をとる。本研究では、まずこの立体特性の一般化を追求し、ウレア基のカルボニル基のかわりにイミノ基をもつ芳香族グアニジン類の立体構造を詳細に解析した。その結果、芳香族グアニジン類もN,N'-dimethyl化により、芳香環が向かい合った結晶構造をとることが明らかとなった。このシス型構造は各種有機溶媒中および水中においても観測される。これらシス型を優先するN,N'-dimethylurea基またはN,N'-dimethylguanidino基を用いて複数の芳香環を連結すれば芳香族多層分子の構築が可能であると考え、芳香族テトラウレアおよび芳香族テトラグアニジンの合成を行った。これらの分子(meta体およびpara体の計4種)はいずれも結晶中で多層構造を有していた。特に、meta-ウレア誘導体は末端フェニル基が分子間でもサンドイッチ構造を有し、層状の芳香族芳香族相互作用が認められた。化合物4種のうち、meta体は軸不斉を有し、分子内のすべての軸不斉が同一の螺旋構造を示した。しかし、単位格子中には両エナンチオマーが1:1で存在し、ラセミ結晶として得られ、結晶化による分離はできなかった。芳香族多層グアニジン体は水溶性を有し、有機溶媒中ばかりでなく、水中においても結晶構造と類似の層状構造を持つ。この化合物はDNAに対して強い親和性を持ち、各種スペクトルの解析からマイナーグループに結合していると考えられ、既存のマイナーグループ結合性分子とは全く構造の異なる化合物として興味深い。
ヘテロ積層型半導体アンモニアガスセンサの設計

本研究では,半導体型アンモニアガスセンサの高感度化のためには,センサ材料表面の負電荷吸着酸素とアンモニアガスとの反応により生じた窒素酸化物をガス感度に無害なN_2に還元する能力の高い触媒材料をセンサ材料として用いることが重要であるというこれまでの実験結果に基づき,この還元反応を効率的に進める触媒層材料の探索を目的として研究を進め,以下のような知見を得た。触媒材料としてZrO_2,Al_2O_3,WO_3を用い,これにIrおよびAuを0.5wt%担持した粉末(例えば0.5Ir/ZrO_2と略す)を用いて,80%He+20%O_2混合ガス中,700°Cで前処理した後,この粉末に120°Cでアンモニアガスを吸着させ,室温まで冷却後,700°Cまで酸素共存下の300ppmのアンモニアガス流通下でTPD測定を行い,脱離ガス種をガスクロマトグラフィーマススペクトルメーターで分析した。この分析の結果,NO_×のNH_3による還元活性の一つの指標であるN_2の離脱量は,0.5Ir/WO_3で最も多いことがわかったが,この試料からは、同時にNO_2も多量に脱離することおよび,未反応のNH_3の脱離量も他の試料と比較して多いことがわかった。次に、これらの試料を用いて作成した単層型および二層型(検知層材料にはIn_2O_3-MgO(5mol%)粉末を使用した)センサ素子の300ppm NH_3に対するガス感度を測定した。測定した素子の中では、0.5Ir/WO_3を用いた素子が作動温度550°Cで最大ガス感度は約25と比較的高い値を示した。他の素子も500°C付近で最大ガス感度を示したが、その値は高々6前後あった。また、二層型のセンサでも単層型とほぼ同じ傾向を示した。以上の結果より、アンモニアの昇温脱離測定によりN_2脱離量の多い材料を探索する方法は、高感度半導体型アンモニアガスセンサ材料の探索に有効であることが示された。また、今年度探索した材料の中では、0.5Ir/WO_3粉末が半導体型アンモニアガスセンサとして最も適していることがわかった。しかし、この粉末では未反応のNH_3が残存することなどから、触媒担持量の最適化などが必要と思われる。
ストレスに対する魚類ホルモンの分泌と腸管上皮の動態に関する研究

コイの日周リズムの把握と環境要因のストレッサ-としての条件を検討するため、血中コルチゾ-ル分泌量の変動をラジオイムノアッセイで測定し調べた。同時に、走査電顕で腸管内面上皮の変動も調べた。コイに同調因子(周期的環境要因)である光と餌を与えた場合と与えない場合を比較した。その結果、同調因子を与えなくてもコルチゾ-ル分泌量は不規則ながらも1日を周期とするリズムが認められ,因子を与えた場合の日周リズムは顕著であるが,各種の条件下で様々な変動を示した。すなわち、同調因子の光と給餌は日周リズを形成するための重要な要因であると考えられる。環境要因のストレッサ-として絶食、飼育密度、アンモニア水,魚体の損傷,飼育水槽の色,複合条件(過密,過給餌,無換水)を選び、コルチゾ-ル分泌量の変動を調べた。結果1.最も高いコルチゾ-ル量を示したものは飼育密度によるものであった。しかし,ストレッサ-として音や振動は飼育密度よりさらに強い効果のあることが示唆された。2.魚体への損傷(1)コイを水中から取上げること自体が大きなストレスになる。(2)体表の粘液を除去するだけで相当なストレスになる。(3)鱗の抜取,切傷は程度に余り関係なく高いコルチゾ-ル量を示し,強いストレスであることが示唆された。3.アンモニア水中ではやや高いコルチゾ-ル量の分泌が認められたが,量の変動が大きく,厳密な結果が得られなかった。4.複合条件によるストレスの判定には,コルチゾ-ル量では判断できない重度のストレスがあり,コルチゾ-ル量以外のストレスの指標が必要と思われる。5.絶食は条件にもよるが,ストレッサ-としての働きは小さいと考えられる。6.走査電顕像ではわずかの差を認めることができたが,顕著な差異は認められなかった。
細菌感染症の抗菌化学療法に対する宿主細胞の影響の解析

ヒトの肺上皮細胞、単球/マクロファージなどの培養細胞が抗菌薬の活性に及ぼす影響を検討し、細胞を無血清培地で培養した場合、その培養上清がカルバペネム系抗菌薬の抗菌活性を著しく低下させる(失活させる)ことを明らかにした。また、寒天平板と薬剤ディスクを用いて多剤耐性緑膿菌に対する抗菌薬の併用効果を簡便に検討できる方法を確立した。Etest法、チエッカーボード法などの既存の方法と比べて、臨床分離菌に対する評価を行った。主として、ヒトマクロファージ様細胞株THP-1細胞を用いた感染実験モデルの確立に重点を置いた。細菌はMRSAを含むStaphylococcus aureus(SA)を用いた。1×10^6cell/mLのTHP-1に1×10^5CFU/mLのSAをRPMI+10%FCS中で感染させた後、抗菌薬存在下(アルベカシンジ200μg/mL)で3時間培養し細胞外のSAを極力取り除いた。その後、低速遠心と洗浄を繰り返し、グラム染色、アクリジンオレンシ(AO)染色(蛍光顕微鏡)鏡検上で、遊離した菌体はほとんどなく、多くは細胞に付着あるいは取り込まれた菌体(cell associated SA : CASA)という状態にした。無細胞で同様の処理を行った対照でのSAの菌数は02×10^2CFU/mLで、細胞(+)では0.51×10^5CFU/mLのSAが検出され、99%以上がCASAと考えられた。このCASAに対し、96穴マイクロプレートを用いた通常のMIC測定と同様の評価系で、cell associated MIC(CAMIC)測定法の確立を試みた。RPMIは本来細菌培養用の培地ではないが、血清無添加培地でMH培地と同程度の発育がみられた。CAMIC測定系に入るTHP-1は5×10^4cell/well程度で、その沈渣はCAMICの判定に影響しない。この評価系で様々なSA菌株の各種抗菌薬に対するCAMICを検討していたところ、ある種の抗菌薬ではMICに比べCAMICが極端に高いことが判った。特にカルバペネム薬では数100倍の値を示すことが判り、この原因の究明を試みた。その結果、一部のカルバペネム薬、ペニシリン薬ではTHP-1細胞と共培養すると数時間で抗菌活性を失うことが判明し、現在抗菌薬を失活させる細胞の種類、失活する抗菌薬の種類などを広く検討し、そのメカニズムの解明に研究の主眼を置いている。一昨年は主として、ヒトマクロファージ様細胞株THP-1細胞を用いたStaphylococcusaureus(SA)感染実験モデルの確立に重点を置き、細胞に感染あるいは付着した菌に対する抗菌薬の効果を評価するモデルを作成した。この評価系でSAの各種抗菌薬に対するCAMICを検討していたところ、カルバペネム系抗菌薬ではMICに比べCAMICが極端に高く、細胞が無い場合に比べ数100倍にも及ぶことが判った。この現象は細胞を無血清の細胞培養用培地中で培養した上清を回収し、この上清にカルバペネム薬を添加しても起こることが判った。すなわち上清中にある細胞由来の何らかの物質、または細胞がもたらす培養液の変質によってカルバペネム薬が失活することが、示唆された。その後THP-1細胞だけではなく、他のヒト培養細胞においても同様の現象が起こることが判り、昨年は主にヒト肺胞上皮細胞A549細胞を用いて、カルバペネム薬であるイミペネムに対する不活化活性を検討した。この結果、A549細胞を無血清の細胞培養用培地(RPMI1640、DMEM)中で3h培養した場合、(1)その上清はイミペネムを含むカルバペネム薬を不活化する、(2)不活化活性は時間依存的で1時間で抗菌活性が5%程度に落とす、(3)細胞培養用培地からアミノ酸を除くと不活化活性が消失する、(4)血清を添加して培養すると不活化活性が弱まる、といった知見が得られた。これらの細胞と抗菌薬の相互作用の研究に加えて、薬剤耐性菌に対する抗菌薬療法の評価系に関する研究として、多剤耐性緑膿菌に対する各種抗菌薬の協調作用を簡便に検討するin vitroの実験系の構築とそれを用いた臨床分離菌に対する有効な抗菌薬療法の評価にも取り組み、昨年及び本年に米国及び日本国内の学会で発表した。ヒト培養細胞を用いた黄色ブドウ球菌感染実験モデルで、各種抗菌薬に対する細胞存在下の薬剤感受性を検討したところ、上清中にある細胞由来の物質によってカルバペネム薬が失活することが判った。その後、この現象はヒト肺胞上皮細胞A549細胞で特に強いことが判り、主にA549を用いてカルバペネム薬であるイミペネムに対する不活化活性を検討した。検討方法は、希釈した培養上清中にカルバペネム薬を添加し、経時的にその濃度をbioassay法で検討した。

この結果、A549を無血清の細胞培養用培地(RPMI1640、DMEM等)の中で培養した場合、その上清は時間・濃度依存的にカルバペネム薬の活性を低下させること、この活性にはアミノ酸が必須であることなどの知見を得た。昨年は、この不活化活性の原因物質の探索を試み、培養上清をSDS-PAGE(やRP-HPLCなどで解析したが、原因物質を特定するに至らなかった。この実験を通じて、培養上清を分子量3kDの限外濾過膜に通しても不活化活性が無くならないことが判った。さらに培養上清を加熱処理し、1時間依存的、温度依存的に不活化活性が低下する、260°Cでは60分加熱しても殆ど影響を受けない、395°C、45分で90%以上活性が低下するなどの知見を得た。またRP-HPLCを用いて培養上清内でのイミペネムの変化を解析したところ、経時的にピークの高さが低下した。この結果はbioassay法での検討結果と良く一致していた。ヒト単球様細胞株THP-1では、培養上清のカルバペネム不活化活性はA549よりも明らかに弱いことが判った。さらにTHP-1をPMAで刺激して、マクロファージ様細胞に分化させた後に同様の検討をしたところ、不活化活性は明らかに増強した。これらの結果から、細胞種によってカルバペネム不活化活性に差があることが示唆された。本研究は、様々なヒト由来の培養細胞を用いて、簡便で再現性が高い試験管内感染実験モデルの作製及び薬剤耐性菌等の様々な細菌の増殖性や抗菌薬の効果の検討を当初の目的としていた。しかしこの検討の中で、ある条件で培養すると細胞培養液中の抗菌薬(カルバペネム薬)が失活することが判明し、現在この現象に対する研究を中心に行っている。このため当初の研究計画とは多少異なった方向に研究が発展しているので、「研究の目的」に対する達成度は低いとも考えられるが、(2)の区分とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年までの研究で、特定の条件で培養した細胞培養液の上清中ではカルバペネム薬が失活すること及びこの現象の大まかな挙動が明確になった。そのメカニズムの解明にも取り組んでいるが、現在までの検討で培養上清中に顕著なタンパク質やペプチドの新生は認められず、培養液のPHの変化もない。メカニズムの解明は難航するものと考えられ、現在抗菌薬を失活させる細胞、失活する抗菌薬の種類などの検討を優先的に行っている。今後培養液中のカルバペネム薬を経時的にHPLCを用いて解析することによって、カルバペネム薬が受けた影響を検討したいと考えている。これらの結果を解析し、学会・誌上で発表できるように総括する予定である。この他に多剤耐性緑膿菌に対する各種抗菌薬の併用効果を簡便に検討するin vitroの実験系についても、結果の解析・総括を行いたいと考えている。
歯周疾患活動性マーカーの迅速測定デバイスの開発

歯周疾患活動性マーカーとして現在は、IL-1b、コラゲナーゼやI型コラーゲン前駆体で骨形成マーカーであるI型プロコラーゲンC末端ペプチド(PICP)等が報告されている。しかしながらこれらのバイオマーカー測定は、ウェスタンブロット法やELISA法などで測定されているが、これらの測定法は大学など大規模な研究施設・機材を保有する施設でしか利用できず一般の歯科診療所などではバイオマーカーとして利用することは困難である。そこで環状ポリオレフィンを材料とする数センチ角のマイクロチップ基板上にマイクロ流路を形成したバイオチップを用いて迅速・省サンプル・簡易なバイオマーカー測定系を確立することで、一般歯科医院のチェアーサイドでも利用可能なバイオマーカー解析デバイスの構築を目指した。マイクロ流路表面をリン脂質による表面処理を行った後微小インクジェットを用いて流路表面に一次抗体として抗PICP抗体を固定を行い抗原抗体反応を用いたPICP検出系を構築した。二次抗体としてはペルオキシダーゼ標識抗PICP抗体を用いている。この結果、3.0μlのサンプル量で抗原導入から30分でPICP 0640ng/mlの濃度範囲で定量的な検出系の構築を行った。さらに血漿サンプルを用いた場合では、マイクロチップを用いて得られた結果と従来の臨床検査で用いられている96穴プレートを利用したELISA法から得られる値とでは統計的に有意な差は認められず、開発したバイオチップによるリアルサンプル中のPICP検出法は十分に臨床応用が可能とあると考えられる。インクジェットを用いることでマイクロ流路上には複数の抗体固定化が可能となるが、今後は他のバイオマーカーについても特異的抗体固定化を行うことで歯周病活動性マーカーのマルチ解析が期待できる。歯周疾患活動性マーカーとして現在、IL-1β、コラゲナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼさらには1型コラーゲンの前駆体である1型プロコラーゲンC末端ペプチド(PICP)が知られている。しかしながら、現状ではこれら活動性マーカーはウェスタンブロット法やELISA法などの免疫学的検出法を中心に研究室レベルでの利用に限られており、Point Of Care Testingに用いることは不可能である。そこで核酸の解析を中心に迅速・正確・省サンプルな解析が可能なマイクロチップ電気泳動をベースにして、これら活動性マーカーをマイクロチップ基板上に作製したマイクロ流路上での検出系の構築を行った。検出対象としてはPICPを用いており、一次抗体をマイクロ流路上に固定後ブロッキング操作を施し、PICPをマイクロ流路に導入しさらにペルオキシダーゼ標識二次抗体を反応させてマイクロ流路でサンドイッチELISA法を行った。流路を十分に洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質を加えてペルオキシダーゼ活性をCCDカメラで定量化することでPICP検出の定量性を検討した。その結果、PICP 10600 ng/mlの範囲で十分な定量性が確認された。PICPの基準値としては160ng/mlであり、この点からも今回マイクロチップ基板での測定範囲は十分な濃度と考えられる。さらに今回我々が構築したマイクロ流路での検出系は、抗原を流路に導入後わずか30分で結果が得られている。これは通常のELISA法が1時間以上であるのに比べ、検出時間の大幅な短縮が可能となっており、今後はこれらの方法を基礎として他のマーカー検出法の構築について検討を行う。歯周疾患活動性マーカーとして現在は、IL-1β,コラゲナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼやI型コラーゲン前駆体である1型プロコラーゲンC末端ペプチド(PICP)などが知られている。しかしながらこれらマーカー測定はウエスタンブロット法や肌ISA法などで測定されるのみで、大学病院などの研究室レベルでしか利用されず一般の歯科診療室レベルでバイオマーカーとして利用することは難しい。

そこでプラスチック基板上にマイクロ流路を作成したバイオチップを用いた迅速・省サンプルなバイオマーカー測定系を構築し簡易、迅速、省サンプルで一般歯科医院でバイオチップを利用したマーカー解析が可能なデバイスの構築を行っている。幅300μm、深さ100pmで長さ3cmのバイオチップ上のマイクロ流路表面をポリマー処理して、パルスインジェクトを用いて流路上に直径150μmのドット状に抗PICP抗体を固定して、抗原抗体反応を利用したPICP検出系を構築した。二次抗体としてはペルオキシダーゼ標識抗PICP抗体を用いている。この結果、3μlのサンプル量で抗原導入から発光検出までわずか30分で0600ng/ml PICP濃度範囲で定量的なPICPの検出系構築に成功している。さらに血液をサンプルとした場合、測定対象として既存の肌ISA法と比較して統計的に差がなく正確にリアルサンプル中のタンパク質を検出することを確認している。そしてPICP以外の複数のタンパク質についても正確な検出が可能となり、バイオチップを用いることで迅速・省サンプルそして簡易に血中タンパク質の測定が可能となった。現在、マイクロ流路上に前述の各種歯周疾患活動性マーカーの一次抗体をパルスインジェクトで固定し一本の流路上で複数の抗原検出が可能なマルチ解析系の構築を行っている。
ハイドロゲル表面の特異なナノ構造を利用した新規接着原理の構築

本研究では、ハイドロゲル表面間の接着力を、表面の特異なナノ構造と外部環境変化に伴う微細構造変化を利用して制御するための基礎研究を行なった。熱応答性のポリN-イソプロピルアクリルアミド、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコールからなる高分子ゲルの粘着・接着力の温度と含水率の影響をそれぞれ詳細に調べた。その結果、温度または含水率を適切に設定することにより、粘着・接着力を制御することが可能であることが示された。本研究は、ハイドロゲル間の接着力を、ゲル表面の特異な構造とゲルの外部環境変化に伴う表面の微細構造変化を利用して制御するための基礎ならびに応用研究を行うものである。当該年度の具体的な研究成果は以下の通りである。(1)ハイドロゲルの作製:熱応答性のN-イソプロピルアクリルアミド(主鎖)、N,N'-メチレンビスアクリルアミド(架橋剤)、重合促進剤を純水に溶かし、窒素ガス雰囲気の下で重合を開始し、ガラス管とシランカップリング剤で処理したガラス丸棒との間の隙間でゲル化させた。ポリアクリル酸ナトリウム溶液と無水水酸化アルミニウムAl(OH)_3を用い、ガラス管とガラス丸棒との間に室温で1週間静置して物理架橋ゲルを作製した。主鎖と架橋剤のモル濃度を変化させて、厚さと架橋密度の異なるゲルを多数作製した。(2)接着特性装置による接着力の測定:ガラス棒の周りに固着した試料を2つ準備し、それらが互いに直交するように十字点接触させ、一方を他方に押付け、垂直荷重W、押付けた状態での待機時間t_w、引き剥がし速度vを変化させ、接着力と剥離仕事に及ぼす、W、t_w、vの寄与を詳細に調べた。(3)接触面の形状観察:フィブリル(微小繊維)、またはゲルの破壊現象を観測するために、デジタルマイクロスコープを用いて接触面の動的なマクロ形態の変化を観察した。また、剥離前後の静的表面の微小領域(サブミクロン以下)の形態、ミクロドメイン構造の変化を観察し、マクロな形態変化と比較した。(4)接着力におよぼす内的・外的因子の検討:高分子鎖間の接触点を増加させ、アンカー効果を高めるための内的条件、(ゲルの厚さと硬さ)と外的条件(W、t_w、v)を明らかにした。ゲルの接着力の発現機構を、物理的な諸因子(表面ラフネス、相関長、相溶性を表わすxパラメータ,平均鎖長)を用いて検討した。ハイドロゲル間の接着力を、ゲル表面の特異な構造とゲルの外部環境変化に伴う表面の微細構造変化を利用して制御するための基礎ならびに応用研究を行なった。(1)ハイドロゲルの作製:前年度に引き続き、熱応答性のN-イソプロピルアクリルアミドゲル、ならびにポリアクリル酸ナトリウムゲルを作製した。これに加えて、ポリビニルアルコール(PVA)ゲルをキャストドライ法にて作製した。(2)ゲルの表面とバルクの性質の評価:ゲルの表面とバルクの物理・化学的性質の接着力に与える影響を検討した。ゲル化条件とゲル化後の外部環境に依存する表面の網目構造を、ATR法によるフーリエ変換型赤外分光分析(FT/IR)測定を行ない、表面の性質を検討した。接触面積、バルクの粘弾性特性、接触界面での水素結合形成に関係する分子構造を詳しく分析して、接着力を制御するためのバルクの硬さと分子間相互作用の選択方法を検討した。(3)接着特性におよぼすゲル表面のナノ構造の影響評価:前年度の実験は、平衡状態にある2つのハイドロゲル間の接着特性であり、外部環境が一定の下で測定を行なった。本年度は、接着時と剥離時の外部環境を変化させ、非平衡状態、もしくは非平衡状態からの緩和過程での接着特性の変化について検討し、表面の特異構造の役割を検討した。(4)接着特性制御と耐久性実験:点接触による静的/動的な接着特性を詳細に検討し、固体表面の接着特性制御に適した実験条件(内的・外的条件)を決定した。外部環境を繰り返し変化させて、接着-剥離の繰返し実験を行ない、長期の繰り返し動作によるハイドロゲルの寿命・耐久性の検討を行った。(5)研究の総括:ハイドロゲル表面間の接着特性の客観評価の結果から、実験上の影響因子として、垂直荷重、固着時間(静置時間)、引き剥がし速度、試料の曲率半径、ゲルの物質因子として、試料厚さ、硬さ(架橋密度)、総高分子濃度の影響をまとめた。以上の結果から、ハイドロゲルに固有の表面のナノ特性を利用した接着力制御の可能性を総括した。
マックスウェル視光学系のコンピュータ自動化システムの試作

マックスウェル視光学系は、眼球の瞳孔のサイズの変化とは独立に眼底網膜上に光パタンを集約入力する特殊な光学系であり、色光や白色光を用いた心理物理実験でよく利用される。しかし、レンズやミラーといった光学系を用いるためチャンネル間のビーム光の重ね合わせや光軸の調整に手間がかかったり、刺激光の時間的制御や色光の波長設定などに時間を要した。これらの手間は手として実験者が手作業で行ななう所から来ているので、今回の試作では、その手続をパーソナル・コンピュータにに行なわせることに主眼点をおいた。安価なパーソナル・コンピュータによる光学システムの自動化は今まで困難であった色光の自動設定、呈示時間の制御などを有機的に組み合わせてコントロールすることを可能にしたといえる。以下目的毎に成果を示す。(1)光学系への輝度補償回路を組み込み、そのデーターをパソコンのインターフェース回路で読み込むことによりフイールドバックループを形成することができ光軸の安定化をもたらすことができた。(2)光学系の色光生成器(モノクロメータ)の波長の設定スピードをパルスモーターで制御することにより最大走査速度を17nm/secまで上げることができ、780380nmの可視光を約24秒で走査することができるようになった。それに伴ない被験者の反応波長の読み込みなどもパソコンのI/Oボードを介してソフトウェア的に処理できるようになった。(3)同様に光学系に液晶シャッタを介在させ音のしない光路開閉スイッチをパソコンでコントロールすることが可能となった。同じ方法で高速電磁シャッターもコントロールすることが可能となり、呈示時間のソフトウェアによる制御が可能となった。以上、パソコンによるソフトウェア制御の方法がマックスウェル視光学系でも有効に適用できることが明らかとなった。(目的)マックスウェル視光学系による色光・白色光呈示とデータ収集の自動化の試みを、コンピュータ制御システムの導入により実現する。(本年度の実績)コントロール部のハード・ソフトの組み立てを行なった。(1)マックスウェル視光学系の組み立て(ベース、ベンチ、シラー、プリズム、ビームスプリッターなどの組み立て)。(2)組み上げた光学系に、シャッター、モーター、カウンタ回路などのハードウェアの組み込み(インターフェースの製作)。(3)コンピュータとのインターフェースを介した結合(一部分のみ)。以上を行ない、現在、61年度継続分として、コンピュータのソフトウェアの開発を中心に行なっている。