hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳癌進展における脂肪組織環境の果たす役割の解明

これらのことから脂肪細胞は乳癌存在下で、より未分化なプロファイルを示し、IL-6やMCP-1を含むサイトカインを分泌することで乳癌細胞の走化性増加に寄与することがわかり報告した(Fujisaki K, Fujimoto H et al. Breast Cancer Res Treat. 2015;150(2):255-63)。これらの未分化脂肪細胞と上皮間葉移行や乳癌増殖に寄与するエストロゲン産生への関わりについてさらに検討を進めている。本研究は乳腺環境を特徴づける豊富な間質である脂肪組織に着目し、癌進展における脂肪細胞の役割の解明を目指すものである。具体的には乳房全摘術症例より癌周囲および非癌部から脂肪組織を採取、コラゲナーゼ処理により単離された脂肪細胞をコラーゲン3次元培養することで、癌周囲脂肪細胞の解析を行ってきた。前年度までの研究において、癌部組織より得られた脂肪細胞(CAA)は、非癌部脂肪細胞(NBA)と比較してより未熟な形質を示し、IL-6やMCP-1を介して癌細胞の走化性を増加させる知見が得られた。本年度は走化性以外の癌細胞に及ぼす影響や癌部脂肪細胞のさらなる解析を行った。まず、これら未分化脂肪細胞の産生するエストロゲンが乳癌増殖に寄与する可能性を考え、エストロゲン合成酵素(アロマターゼ、ステロイドサルファターゼ及び17HSD)の発現比較を行った。アロマターゼの発現が非癌部とくらべ癌部脂肪細胞においてやや高い傾向が見られたものの、有意差を認めることはできなかった。また、未分化脂肪細胞が乳癌細胞株における上皮化間葉移行(EMT)に及ぼす影響について検討するため、E-cadherin、N-cadherin及びvimentinの発現比較を行った。結果、脂肪細胞培養上清によってコンディショニングされたエストロゲン依存性乳癌細胞株においてはE-cadherin発現の上昇及びvimentin発現の低下を認めた。非依存株においては有意差を認めなかった。さらに、癌環境下における脂肪細胞の脱分化とその癌細胞への影響を解明するため、RNAアレイを用いて癌部と非癌部脂肪細胞の発現比較、及びその培養上清にて刺激された癌細胞株の発現比較を行い、治療ターゲットや予後因子となり得る候補因子の同定を試みた。脂肪細胞は乳腺の重要な構成成分であるが、癌微小環境における脂肪細胞の特徴および働きは明らかではない。今回、我々は癌周囲および非癌部から脂肪組織を単離し、それぞれCancer associated adipocyte(CAA)及びNormal breast adipocyte(NBA)として培養、その形態学的特徴及び増殖性について比較検討を行った。CAAは成熟脂肪細胞で発現するC/EBPαの発現がNBAと比べて有意に低下しており、乳癌微小環境において脂肪細胞はより未分化な状態で存在することが分かった。また、脂肪細胞由来のIL-6やMCP-1は乳癌細胞の走化性やEMTに寄与することが分かった。癌部及び非癌部脂肪細胞の単離、コラーゲンゲル3次元培養を行う系を確立することができ、培養上清を用いた抗体アレイによるスクリーニング及び比較検討も可能であった。また、癌細胞と脂肪細胞のコラーゲンゲル3次元共培養も可能であり、観察が可能であった。研究当初は乳腺脂肪の特殊性と乳癌進展時における役割をマクロファージ動員の観点から着目していた。しかし、脂肪組織から脂肪細胞及びマクロファージの単離、培養を試みる過程で、マクロファージの単離・精製が難しい一方、脂肪細胞はCAAとNBAの形態学的相違が確認され、癌細胞の走化性を上昇させる直接効果も確認された。そのため以後の研究は癌環境下における脂肪細胞の脱分化とその癌細胞への影響に焦点を絞り研究を進めている。
胞子体世代の初期発生遺伝子から探る、陸上植物の世代交代進化機構の解明

一過的な遺伝子発現の影響を見るためにPpLFY1遺伝子のnu11変異体の作出を進めた。PpLFY1遺伝子のコード領域を薬剤耐性を付与するハイグロマイシンカセットで置き換えたコンストラクトを作製して、PEG法でヒメツリガネゴケに導入した。しかしこのコンストラクトは狙い通りにゲノムDNA領域に挿入された場合でも、形質転換体はハイグロマイシンを含む培地での生育が非常に悪い事が分かった。形質転換体は緑色はとどめていて死滅はしないが、大部分のものが数細胞の段階で成長がほぼ止まっていて、コロニーサイズが大きくならなかった。そこで形質転換体をハイグロマイシンフリーの培地に移植して解析を進めた。原糸体の段階では生育が悪い事を除けば野生株と比べて顕著な形態異常は観察されなかった。以前に作製した、PpLFY1遺伝子のコード領域中にハイグロマイシンカセットを挿入した変異体では、胞子体の形成に異常が見られたので、今回作出したnu11変異体もさらに先の発生段階まで観察を進める予定である。またPpLFY1遺伝子の標的遺伝子を同定するためのChIP実験のために、PpLFY1遺伝子の抗体が必要となる。抗原としてHisタグ組換えタンパク質を用いることとし、それを大腸菌で発現させて、抗原の精製を行った。組換えタンパク質の発現条件を最適化して効率よく抗原を回収しようと試みたが収量の大幅な増加は難しかったので、実験を繰り返す事で必要な量の抗原を集めた。PpLFY1遺伝子の標的遺伝子を同定するためのChIP実験のために、PpLFY1遺伝子の抗体が必要となる。まずPpLFY1遺伝子コード領域の全長cDNA配列をpET28(b)ベクターにクローニングして、配列確認を行った。コンストラクトを発現用ホストであるBL21-CodonPlus(DE3)-RILに形質転換して、組換えタンパク質の発現条件を、温度や時間、培地などの条件をふって検討した。その結果1mM IPTGでヒメツリガネゴケの生育温度である25度で、6時間発現誘導をかけるのがよいことが分かった。発現するタンパク質は可溶性画分に回収されるので、そのままニッケルカラムで精製することができた。また精製されたタンパク質の予想される大きさのバンドが確かにHisタグ組換えタンパク質であることをウエスタンブロット解析により確認した。ただし精製されるタンパク質は収量が低いので、実験を繰り返すことで抗原に必要なタンパク質量を集める作業を進めている。またこれまでに作出していたPpLFY遺伝子破壊株はコード領域の真ん中にマーカー遺伝子を挿入した物で、RT-PCRによりPpLFY遺伝子は5'側、3'側共に部分的に発現しており、表現型がleakyである可能性が考えられた。null変異体作出のためにコード領域を完全に欠失させたコンストラクトを作製して、ヒメツリガネゴケの形質転換を実施した。
ベトナム・インドネシアでの包括的健康教育システムの開発とアジアネットワークの構築

インドネシアのウダヤナ大学との共同研究により、ウダヤナ大学近郊地域のタバナン地域及びデンパサール地域にて、ISOを取得した日本の健康教育を展開した。歩数計を配布し、日々の活動量を計測し、本健康教育の前後で形態測定、脳機能測定、体力測定、血液検査を行いその効果を実証した。本研究成果は、2016年国際学会にて発表した。申請者らは、日本で若年シニアの育成を目的とした健康教育プログラムに認知症予防を取り入れ、取り組みの様子を図表化し、それを“見える化"することによって根拠に基づいた包括的な健康教育プログラムを実践し、対象者が健康になるようソーシャルキャピタルを重要視したコミュニティーネットワークを形成させてきた。本研究では、日本で行われている本健康教育プログラムを基盤とし、1中進国のインドネシアとフィリピンにおいて、当該地域の文化・社会的状況を考慮した援用的健康教育プログラムを開発し、その実践評価を行う。また、2高齢化問題に直面する、アジア諸国において、対象者が健康になるようソーシャルキャピタルを重要視したお互いが思いやりを持って努力できるコミュニティーネットワークモデルを形成し、アジア諸国に国際貢献していくことを目的とし、本研究を進めてきた。平成26年は日本の信州大学、フィリピンのセントラルフィリピン大学、インドネシアのウダヤナ大学に健康教育のための研究ネットワークを構築し、日本、フィリピン、インドネシアのそれぞれの文化的事情を考慮した、認知症予防を取り入れ、根拠に基づいた包括的健康教育のためのアジアネットワークの基礎構築を図った。平成26年は、インドネシアの健康教育の実態やニーズを把握し、そのインドネシアの2地域で行う健康教育のためのプログラム・カリキュラム及びテキストの作成を行い、平成27年2月14日に本研究プロジェクトスタッフ、ウダヤナ大学スタッフ、地域のボランティアスタッフと綿密なミーティングを持った。そして健康教育実施前に、受講生の形態・血圧測定、体力測定、脳機能検査、血液検査を行い、毎月活動量計の記録を行っている。健康教育実施後の調査は平成27年9月4日を予定している。1平成27年度6月から信州大学の公開講座として実施しているシニア健康講座にて、認知症予防講座を開講し、受講生70名に対して3カ月間実施した。その効果について脳機能検査として脳血流量(NIRS)実験及び脳機能検査(Go/No-Go課題)を行った。2平成27年度9月にインドネシアのウダヤナ大学との共同研究として、日本とインドネシアの共同研究者とバリ島の中にあるデンパサール地域の高齢者約70及びタバナン地域の高齢者約70名に対して、活動量計を配布し、形態測定、血圧測定、体力測定、脳機能検査、血液検査を実施した。3本健康教育は2014年10月に国際規格となるISO9001:2008を取得したが、継続審査が行われ、無事再承認された。2については、平成28年11月16-19にタイのバンコクにて開催される国際学会である" The 6th ISPAH International Congress on Physical Activity and Public Health"にて発表予定である。平成27年度9月にインドネシアのウダヤナ大学との共同研究として、日本とインドネシアの共同研究者とバリ島の中にあるデンパサール地域の高齢者約70及びタバナン地域の高齢者約70名に対して、活動量計を配布し、形態測定、血圧測定、体力測定、脳機能検査、血液検査を実施でき、結果は2016年11月タイのバンコク開催の国際学会にてその成果を発表予定。上記のように調査が実施でき、成果も報告できる状況であり、本研究はおおむね順調に進行しているといえる。研究代表者らは、日本で「地域行政と高等教育機関の連携により、若年シニアの育成を目的とした健康教育プログラムに認知症予防を取り入れ、取り組みの様子を図表化し、それを“見える化"することによって根拠に基づいた包括的な健康教育プログラムを実践し、対象者が健康になるようソーシャルキャピタルを重要視したお互いが思いやりを持って努力できるコミュニティーネットワークを形成させてきた。本研究では、日本で行われている本健康教育プログラムを基盤とし、1中進国のインドネシアにおいて、当該地域の文化・社会的状況を考慮した援用的健康教育プログラムを開発し、その実践評価を行う。また、2高齢化問題に直面する、アジア諸国において、対象者が健康になるようソーシャルキャピタルを重要視したお互いが思いやりを持って努力できるコミュニティーネットワークモデルを形成し、アジア諸国に国際貢献していくことを目的とした。そのため、日本の信州大学、インドネシアのウダヤナ大学に健康教育のための研究ネットワークを構築し、日本、インドネシアのそれぞれの文化的事情を考慮した、認知症予防を取り入れ、根拠に基づいた包括的健康教育のためのアジアネットワークの基礎構築を図った。そして、インドネシアの健康教育の実態やニーズを把握し、その地域で行う健康教育のためのプログラム・カリキュラム及びテキストの作成を行った。さらに、試験的に根拠に基づいた包括的健康教育をインドネシアの2地域で100名を対象に6ヶ月間の実施により国際比較を行い、アジア諸国への健康教育システムの援用運用の可能性と課題を検討した。平成28年度は上記の成果を日本のシニアを対象とした研究会、公開講座を開催し、健康教育への理解を促進させながら強固なアジアネットワークの基礎構築を行った。本研究課題の当初研究目的の達成度についてはやや遅れている状況である。

これは、計画当初ベトナムとインドネシアに本健康教育を実施していく予定であったが、ベトナムのホーチミン大学が研究協力要請の延期を申し入れてきたためである。このため申請者らは、現在フィリピンのセントラルフィリピン大学にて、本健康教育の導入を試みているところである。今後の研究の推進方策として、平成27年度9月にインドネシアのウダヤナ大学との共同研究として、日本とインドネシアの共同研究者とバリ島の中にあるデンパサール地域の高齢者約70及びタバナン地域の高齢者約70名に対して行ったISO健康教育を継続し、更に新たに2箇所を指定し、ISO健康教育の実施地域を開拓していく。健康教育平成27年2月14日に、インドネシアのタナバン、デンパサールの2地域地域にて健康教育を実施してきた。平成27年9月4日には、本研究プロジェクトスタッフ、ウダヤナ大学スタッフ、地域のボランティアスタッフと綿密なミーティングを持ち、受講生の形態・血圧測定、体力測定、脳機能検査、血液検査を行い、活動量計の記録を実施していく。そして本健康教育がインドネシアの地域に根付き、活用させていき、インドネシアの地域住民の方々に健康と幸せを提供して行きたい。また、フィリピンにおいても同様に実施して行きたいと考えている。インドネシア地域で健康教育の実施地域が2地域で行うことになり、人手及び解析量の増大により、次年度使用額が生じた。この状況に加え、健康教育の効果を詳細に分析するために、血液検査を加えたことも、次年度使用額が生じた理由である。インドネシアのバリ島にある、タバナン地域及びデンパサール地域にて、活動量計の計測、形態測定、血圧測定、体力測定、血液検査、脳機能検査を行い、この測定、検査、調査に関わる人員及びデータ解析について平成28年度請求額と合わせて使用していく計画である。
癌分化誘導療法におけるhedgehog情報伝達系の解明-消化器癌を中心に

Hedgehog(Hh)情報伝達系をはじめとした各種morphogenは、stem cellの維持・分化制御や消化管を含め各種臓器形成に関わっているだけではなく、上皮系細胞の癌化にも関わっていることが明らかになり近年注目を集めている。私達は、Hh関連因遺伝子群の一つであるGli-1に着目して遠隔転移との関連を調べ、遠隔転移を抑制する分子標的となりえるか否かに着目した。【方法】術前化学放射線療法(CRT)を施行された食道癌病理組織を用い、Hh情報伝達系の活性化を示すGli-1 nuclear expressionをimmunostainigで検討し、1・2・3年disease-freesurvivalとoverallsurvivalとの関連を統計学的に解析した。【結果】術前CRTを施行された食道癌においてHh情報伝達系が活性化している症例では早期に遠隔転移を起こして有意に予後が不良であることが明らかになった。【意義】これより、(1)術前CRT後のHh情報伝達系の活性化は術後早期再発のindicatorとなること、(2)'more aggressive'な特徴を示すCRT抵抗性cancer stem cellのsurface markerになりうること、が示唆された(2008年米国癌学会AACR発表、現在投稿中)。現在Gli-1を含め各種biomarkerを分子標的としたantagonistによる臨床応用を視野に入れて研究を進めている。近年cancer stem cell theoryに注目が集まり、転移・再発などの悪性度を規定する要因としてhedgehog(Hh)情報伝達系を始めとする各種morphogenの関与が示唆されている。私達は昨年度Hh関連遺伝子群の一つであるGli-1に着目して遠隔転移との関連を調べ、術前化学放射線療法(CRT)後の進行食道癌患者において遠隔転移を抑制する分子標的となりえることを明らかにした。本年度はそれに引き続きHh情報伝達系の下流に位置するpolycomb group (PcG)familyのBMI1およびp16^<INK4A>蛋白発現の臨床的意義について検討した。【方法】術前CRT施行後食道扁平上皮癌患者78例において免疫組織学的染色を行いBMI1およびp16^<INK4A>発現を検討し、3年生存率との関連を統計学的に解析した。【意義】Hh-PcG経路の活性化は、術後早期再発のindicatorとなり、また'more aggressive'な特徴を示すCRT抵抗性cancer stem cellを反映するsurface markerとなりうることが明らかになった。Hh-PcG経路については現在固形癌において分子標的薬剤の臨床応用が始まっている。この系の発現評価が、薬剤投与症例選択に有用であることが示唆される。
シミュレ-トされたアニ-リング模型によるマルテンサイト変態の研究

カ-とバリネロによって開発された,第一原理に基づく電子状態の計算と分子動力学を結びつける方法を,遷移金属系にも適用できる形にすることがねらいであった。実際に分子動力学を実行するには到らなかったが,確かな糸口をつかむことができた。マルテンサイト変態については,電子状態の第一原理的計算からのアプロ-チと,現象論的アプロ-チの2つの方向から,研究を進めた。以下に具体的な成果を要約する。(1)ポテンシャルに特別の対称性を仮定しないことが,分子動力学では重要である。このよすな一般のポテンシャルに対するKKR法(フルポテンャルKKR法)を効率良く実行するための手法を開発し,それが実際に高速で実行されることを示した。またそれを分子動力学と結びつける時に必要となる,ウィグナ-ガイツセルやボロノイセルを表現するための形状関数を決める方法等の開発を行なった。これを用いバンド計算を行なった結果より,もの10個程度の原子を単位胞に含む場合を想定して,分子動力学を実行したとすれば,1タイムスラップあたり1分程度のCPU時間が必要であると見積った。(2)Cu中に析出したrFeで見いだされた,磁気的構造と結合した格子歪を念頭に,空間的変調を受けたfcc第一種反強磁性とそれと同時に,現れる格子の斜方歪との関係を,ランダウの現象論に基づいて議論した。得られた自由エネルギ汎関数を極小化する解として,磁気的周期が格子歪の周期と同じものと2倍になるものとが存在することを示した。(3)FeーPd合金のPd30%は付近で見られるfccーfctーbcc遂次型マルテンサイト変態の微視的起源を明らかにする目的で,KKRーCPAーLSD法を用いた電子状態の計算をfccーbccのベイン変形の道筋に沿って行なった。その結果,Pd30%付近でfcc構造が不安定化すること,しかしfct構造は安定化されず,一次的にbcc構造に転移することを示した。当該年度より始まった研究である。今年度は、(1)シミュレートされたアニーリング模型(以下、DSAM)を遷移元素系に適用するための基礎的手法の開発を行なった。(現在も継続中)。どのような基底関数を用いるかがポイントであるが、DSAMを用いるためには、高速でハミルトニアンの行列要素を計算できること、イオン芯に働く力を精度良く計算できることが必要である。いくつかの候補を検討したが、いまのところ、擬ポテンシャル法に、局在化した(互いに重なり積分を持たない)軌道を補助軌道として導入する方法が最も有望であることがわかってきた。このような取扱で、遷移金属のバンド構造を実用的な数の平面波で表わすことができるか、現在テスト中である。また、それとは独立に、(2)マルテンサイト変態を起す種々の合金について、KKRーCPAーLSD(KKRーコヒーレントポテンシャル近似ー局所スピン密度法)法を用いて、電子状態の計算を行ない、基底状態での格子定数、磁気的状態、外力に対する応答を調べた。特にNiーFe系のインバー領域における、局所モーメントの形成、格子定数と実験との対応を詳しく調べた。一方現象論なアプローチとして、(3)fcc-fct変態にともない形成される長周期の双晶構造を念頭に置いて、Cu中に析出したFeの磁気構造と格子変調との関係についての議論を展開した。

これについては、一軸方向の圧力を加えることによって、周期が敏感に変化することが見つかっている。このような、変態の前駆現象ともいえる状態を現象論的に議論するとともに、その裏づけを得るために、電子状態の計算を進める必要がある。今年度はもっぱら手法の開発に勢力を注いだが、当初予定から少し進行が遅れている。現在DSAMのテスト中の段階であるが、次年度中に、簡単な系についてある程度の成果が上がるように努力している。動的にシミュレ-トされたアニ-リング模型(DSAM)を用いて遷移金属・合金のマルテンサイト変態の微視的機構を明らかにすることが目的である。DSAMは第一原理に基づいた電子状態の計算に分子動力学的学的手法を適用するものであるが、これまでもっぱら電子波動関数の平面波展開が能率良く行える系に対して用いられてきた。平面波展開の難かしい遷移金属にこの方法を適用するための理論的枠組みを整備することがまず必要であった。今年度は(1)シミュレ-トされたアニ-リング模型を遷移元素系に適用するための基礎的手法の開発を行ってきた。どのような基底関数を用いるかがポイントであるが、DSAMを用いるためには、高速で計算できることとイオン芯に働く力を計算できることが必要である。いくつかの候補を検討したが、最も可能性のある方法として、擬ポテンシャル法に(互いに重なり積分を持たない)局在軌道を補助軌道として導入することを行なってきた。このような取扱いで遷移金属のバンド構造を現実的な数の平面波で表わすことができることを示した。(2)別の可能性として従来のKKR法を用いる可能性を検討した。ポテンシャルの球対称からのずれを考慮する必要があり、それを摂動論的に取り扱う計算機コ-ドを前年度に引続き開発中である。これらとは独立に(3)マルテンサイト変態を起こす種々の合金についてKKR-CPA法を用いて電子状態の計算をおこない、基底状態での格子定数、生成熱、相の安定性、磁気的性質を調べた。得られた結果はいずれも実験と比較して妥当なものであり、CPAの意味での有効媒質が理論の良い出発点になっていることが明らかになった。これはまた、有効媒質中の原子対相互作用を考えることによって、第一原理に基づいて、結晶構造の安定性や熱力学的性質を議論しようとする方法への光鞭をつけるものでもある。カ-とパリネロによって開発された,第一原理に基づく電子状態の計算と分子動力学を結びつける方法を,遷移金属系にも適用できる形にすることがねらいの一つであった。実際に分子動力学を実行するまでには到達できなかったが,糸口をつかむことができた。マルテンサイト変態については,電子状態からのアプロ-チと,現象論的アプロ-チの2つの方向から,研究を進めた。以下に具体的な実績をあげる。(1)ポテンシャルに特別の対称性を仮定しない一般の形に対するKKR法(グリ-ク関数法)(以下フルポテンシャルKKR法と呼ぶ)を実行するための手法を開発し,それが実際に高速で実行されることを示した。またウィグナ-ザイツセルの形を表現するための形状関数を半解折的に計算することによって,精度よくこの関数を計算する手法を開発した。フルポテンシャルKKR法を効率良く用いた時10個程度の原子を単位胞に含む系について,分子動力学を行なうならば,1タイムステップあたり1分程度を見積った。(2)fccーfct変態にともない形成される長周期の構造をギンズブルック・ランダウ型の自由エネルギ-を用いて議論した。
選択的ミトコンドリア分解に働くタンパク質複合体の同定と機能解析

ミトコンドリアが正常に働き、恒常性を保つには、不要ミトコンドリアを分別・処理することが重要である。この選択的にミトコンドリアを丸ごと分解するしくみは「マイトファジー」と呼ばれ、重要な品質管理システムであるが、詳細な分子機構は未だ不明である。これまで我々は出芽酵母をモデルに、マイトファジーの特異的制御因子Atg32を同定した。本研究では、この因子と相互作用するタンパク質群を生化学的に探索し、新規因子群を同定することに成功した。【平成22年度】Atg32相互作用因子の生化学的探索まずはじめにAtg32精製のための発現系の構築とミトコンドリアの単離を試みた。マイトファジーに必須なタンパク質Atg32の精製用tag付きコンストラクト、Atg32-3xStrep-8xHisをAtg32欠損株において発現したところ、内在性のものと同等の機能を有することが確認された。また、大量培養条件におけるマイトファジー誘導条件下では、Atg32-3xStrep-8xHisが内在性のAtg32と同様に、一過的に発現のピークを迎えた後、すみやかに未知の分解メカニズムにより、自己分解されるという性質を伴うことが明らかとなり、タンパク質分解を阻害する精製条件下に加え、複合体として精製してくるためにさらなる工夫が必要であることが判った。一方で、Atg32を生化学的アッセイにより解析した結果、Atg32はリン酸化を受けており、それに重要であると思われる部位を一部マッピングした。また、マイトファゴソーム膜形成時には、オートファジーの場合と同様にAtgタンパク質群がマイトファジーに機能していると思われるが、その中でもキナーゼ活性をもつAtg1がAtg32のリン酸化に直接、あるいは間接的に関与していることを示唆するデータを得た。これらの結果に加え、蛍光顕微鏡を用いた網羅的スクリーニングにおいて、ミトコンドリア・オートファジーに特異的な異常が認められた変異株が得られている。以上の結果を足がかりに、今後は生化学的手法に加え、遺伝学的手法からもAtg32相互作用因子の探索を展開してゆけることが期待される。【平成23年度】ミトコンドリア分別マークタンパク質の新規相互作用因子の探索と解析出芽酵母の選択的ミトコンドリア分解に特異的に働くタンパク質Atg32にHAタグを付加し、これを発現した株から調製した細胞抽出サンプルにHA抗体アガロースを添加、免疫沈降で得られたタンパク質サンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。次にゲルを銀染色し、HAタグなしのAtg32を発現させたネガティブコントロールのサンプルと比較して、Atg32-HAに特異的なバンドを切り出し、質量分析によりタンパク質を同定した。その結果、Atg32自身と、我々が既に相互作用を明らかにしているAtg11が見出された。加えて、これまでにAtg32との相互作用が知られていなかったタンパク質が明らかとなった。その中には、タンパク質のリン酸化や分解に関与する因子や、ミトコンドリア内膜のタンパク質が含まれる。Atg32はミトコンドリア外膜タンパク質であり、ミトコンドリア分解が起こる際にリン酸化され、その後Atg32の発現量は減少してゆくが、その仕組みは不明である。また、Atg32はミトコンドリア外膜と内膜の間の膜間スペースにドメインを露出しているが、このドメインの機能はよくわかっていない。今回同定されたタンパク質は、これらの問題に関与する可能性が高いと考えられる。そこで、Atg32との相互作用を再確認する実験と、候補因子の欠損がミトコンドリア分解に及ぼす影響の解析を現在進めている。本研究で得られた知見から、ミトコンドリア分解を制御する仕組みの理解が一層深まるものと期待できる。前年度、マイトファジー誘導条件下でのAtg32-3xStrep-8xHisの精製条件の検討を行い、今年度はその確立した精製系で免疫共沈降されたサンプルを質量分析し、相互作用因子の同定を試みた。また、マイトファジーが起こらない条件下でのサンプルや、いくつかの変異体のコンストラクトの精製を繰り返し試みて、相互作用候補因子Aip (Atg32 interacting protein)の絞り込みを行った。その結果、約20のAip因子は特異的にAtg32-3xStrep-8xHisと共沈降しているとの結果が得られ、それらの因子の解析をすすめた。このAipのいくつかの遺伝子は破壊により、酵母は致死に至る(そのために、前回の遺伝学的スクリーニングではなく今回の生化学的手法によって新たに得られるという期待に一致)ため、まずはそのタンパク質にMYCタグを付けて、実際にin vivoでAtg32-HAとの相互作用を検証した。その中でも、ミトコンドリア上で機能する、あるABCトランスポーターである膜タンパク質において、共沈降を再度確認出来ており、これらのタンパク質間相互作用が示唆された。

興味深いことに、ミトコンドリア内での特異的な相互作用を示すデータとして、Atg32のC末端側ミトコンドリアの膜間スペースに面した側を欠失したコンストラクトとこの因子との共沈降がみられなくなる結果も得られている。今後は、生化学的手法によって得られているAip因子群の更なる機能解析をすすめることで、マイトファジーの活性化(または収束)のシグナリングにおいて、Atg32がどのように他のタンパク質群と協同して、機能しているのか、細胞内での他の現象とのクロストークを明らかにすることで詳細な機序の理解を深めることが期待される。免疫沈降法と質量分析による新規相互作用因子の探索の第1段階は終了し、候補因子との相互作用の再確認や欠損変異体の表現型解析などの第2段階に移行している。このような状況を考慮し、研究計画はおおむね順調に進展していると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。ミトコンドリア分別マークタンパク質Atg32と相互作用している可能性のある候補因子について、免疫沈降およびウェスタンブロッティングにより、結合を再確認する。また、候補因子を欠損する変異体を作製し、ミトコンドリア分解に対する影響を調べる。
離散型生産計画スケジュール問題の新解法に関する研究

生産計画スケジューリングは、従来から種々の生産システムにおいて重要な問題であったが、製造工程の自動化を目指しているFMSやさらにそれを発展させたCIMを構築するためには、今後ますます検討しなければならない基本的課題である。しかし、この問題は数理的には組合せ最適化の一種であり、NP完全な問題として知られている難解な問題である。本研究は、この離散型生産計画スケジュール問題に対する新解法を考察した。まず具体的事例として、組立加工ラインにおける製品投入順序問題を取り上げた。この問題では、機械の有休時間および作業者の待時間をなるべくゼロにすること、および生産目標を達成することの2つの目的を同時に考慮しなければならない。そのような問題に適用できるようにシミュレーティッドアニーリングおよび遺伝アルゴリズムの構成法を提案した。主要設備として購入したFAシミュレータを用いてこの事例のシミュレーションを行い、提案した解法の有効性を数値的に確認した。次の事例として、石油パイプラインにおけるオートラインアップ問題に対する基礎的考察を行った。石油コンビナート内のオフサイトプラントではパイプラインのネットワークを使って、多くの始点、終点のペア間で定められた時間内に異なる種類の石油製品を輸送するスケジュールを作成しなければならない。これは、多始点・終点対をもつ並列経路選択問題とスケジューリング問題が混合した新しい型の問題である。しかし、このような問題の解法は見当たらない。本研究ではこの問題に分解法と遺伝アルゴリズムを併用し、この問題に対する遺伝演算子の構成法を提案した。また、シミュレーションにより、アルゴリズムが有効が問題の規模を調べた。
高強度非球面金型の超精密切削を可能にするためのナノ粒子潤滑揺動切削法

ダイヤモンドバイト揺動切削法を提案し、高強度材である反応焼結SiCの超精密切削を試みた。バイトの揺動誤差を測定するために、白色干渉計を用いたバイト形状の機上測定システムを構築した。また、切削油剤として高粘性・高付着力のグリースを工作物の表面に塗布した。その結果、ダイヤモンドバイト摩耗が大幅に抑制され、表面粗さ4nmRaの延性モード加工が実現されていることを確認した。本研究では,高強度金型材料の超精密切削加工を可能にすることを目的としている.平成22年度では,提案した工具揺動切削法における揺動誤差の機上計測・NCデータ補正システムの開発および揺動速度の最適化実験を行った.具体的な研究内容および研究成果は次に示す通りである.1.揺動誤差の機上計測・NCデータ補正システムの開発:工具の揺動誤差をオンラインで測定するために,ダイヤモンドRバイト逃げ面を直接測定可能なレーザプローブ式非接触機上計測装置をメーカと共同で開発し,加工機に搭載した.また,機上で測定した揺動誤差データに基づいて切削加工用NCデータを自動的に修正するための補正プログラムを開発し,加工機B軸中心へのバイト曲率中心の設定誤差が存在しても加工精度に全く影響しない高精度加工が実現できるようにした.2.揺動速度の最適化実験:揺動切削法においてダイヤモンドバイトの揺動速度の制御が最も重要である.適正な揺動速度で切削を行うことによって,刃先の温度上昇が抑えられ,ダイヤモンドの酸化や拡散現象を抑制することが可能である.そこで,揺動速度090deg/minの範囲で変化させて切削実験を行った.その結果,揺動速度の増加につれてバイト逃げ面摩耗幅が飛躍的に減少することを明らかにした.一方,過大な揺動速度を用いると切削プロセスが不安定になるため,本研究では45deg/min前後を最適な揺動速度範囲とした.以上の成果は,今後の高強度金型材料の超精密切削加工機構の究明や加工プロセスの最適化などに有用な情報提供できると考えられる。本研究の目的は,高強度金型材料の超精密切削加工を実現させることである.平成23年度では,切削におけるナノ粒子複合潤滑の原理究明ならびにその最適化を行った。具体的には,下記の諸項目について検討を行った.(1)切削油剤作成および塗布技術の開発切削油剤として,高粘性・高付着力のグリースに金属ナノ粒子を混入させてバイトの表面に塗布した.バイトの揺動によりバイト表面に塗布された切削油剤が容易に切削点へ進入し,被削材とバイト表面との間に潤滑膜が形成されると考えられる.本研究では,グリースへの金属ナノ粒子の混合・攪拌方法,濃度制御およびバイト表面への塗布方法および塗布量の制御などについて検討を行った.(2)金属ナノ粒子の種類および濃度の最適化切削時に,金属ナノ粒子の塑性変形により被削材から切れ刃へ与える微小衝撃が緩和され,切れ刃のマイクロチッピングを抑制できる.また,金属ナノ粒子の優れた潤滑作用によりバイト・被削材間の摩擦係数が大幅に低減されるため,切削抵抗およびバイト刃先の摩耗も抑制できると考えられる.本研究では,数種類の金属ナノ粒子およびグラファイト粒子を用いて切削実験を行,粒子サイズと濃度を変化させて,最適な切削潤滑条件を特定した.(3)揺動切削における材料除去機構の研究本研究で提案した複合潤滑揺動切削法における材料除去機構を究明するために,高硬度材料である反応焼結SiCの揺動切削実験を行い,切りくずと切削面の観察を行った.その結果,流れ型の切りくずおよび延性モード切削面が確認できた.また,バインダーレス超硬合金(WC)の切削実験も行い,類似の加工現象を確認した.以上の成果は,今後の非球面レンズプレス成形用金型の超精密切削加工の実現に対して有用な情報提供できると考えられる。非球面ガラス光学素子のプレス成形において,超硬合金(WC)や炭化珪素(SiC)などの高強度金型材料が必要不可欠である.本研究は従来不可能とされてきた高強度金型材料の超精密切削加工を可能にすることを目的として行われた.これを達成するために,加工機のB軸回転テーブルを用いてダイヤモンドRバイトを揺動させ,切削点が切れ刃円弧上で常に移動する切削方法(以下“揺動切削法"と記す)を提案する.これにより,切削温度の上昇を抑制し,バイト摩耗を低減させる.また,切削油剤として,高粘性・高付着力のグリースに金属ナノ粒子を混入させてバイト表面へ塗布することにより,切削のときに発生する微小衝撃を緩和させ,切れ刃のマイクロチッピングを完全に防ぐ.最終的に,切削加工のみで表面粗さ30nmRy以下の超精密加工を実現するとともに,切削油剤による環境負荷を大幅に低減させる.平成24年度では,これまでのナノ粒子複合潤滑による揺動切削の研究成果を踏まえて,非球面などの曲面加工への応用を目的として研究を推進した。

具体的には下記の諸項目について研究を行った.(1)ナノ粒子複合潤滑による揺動切削法をガラス非球面レンズプレス成形用金型の切削加工へ応用し,バイト摩耗低減および加工精度向上への効果を確認した.また,実用化に向けての問題点として、工具中心合わせが重要であることとその実施方法を見出した.(2)有限要素法による切削領域の温度分布シミュレーションを行い,揺動切削におけるダイヤモンドバイトの摩耗低減機構を解明した.以上の成果は超硬合金や炭化珪素などの高強度金型材料の超精密切削加工技術に発展に有意義な知見を与えるものと考えられる.ナノ粒子潤滑剤の作成方法の研究や切削実験および実験現象の観察,加工機構の解明ならびに最適化など主要な研究内容は,ほぼ当初計画の通りに進んでいる.24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の推進方策として,まず,これまでの基礎研究成果をガラス非球面レンズプレス成形用金型の切削加工へ応用し,バイト摩耗低減および加工精度向上への効果を確認する.そして揺動切削の加工原理を解明するために有限要素法による切削領域の温度分布シミュレーションを行う予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
放射性皮膚障害に対する補完代替医療材料洗浄剤を用いたケア効果のメカニズム解明

今回の研究では抽出方法と濃度に課題があることが分かった。補完代替材料である物質成分を洗浄剤の中に入れる場合、効果のあるとされている物質であっても、その成分の抽出方法によっては効果をなさないことがわかった。また濃度もかなり高濃度にしないとその効果を判定できるまでには至らないことがわかった。研究者異動のため、新しい研究施設設備や実験場の確保、システムの違いなどと、倫理申請書を再度申請し直すことになり、新しい異動先ではまだ実験をできていない状況にある。そのため、一度予備的な実験として、補完代替材料の見直しも含めて追加実験を入れていく予定としている。洗浄剤だけでなく、地域特性を活かした米ぬか・酒粕などを取り入れられないか検討している段階である。本研究で使用する皮膚弾力計のデータを収集する際の力加減のコントロールが難しく、技術を要するため、事前に練習する必要がある。所属先変更となったため、新たな施設で動物実験の教育訓練や施設での実験場所等の確保の必要があった。また、倫理審査も新たに申請をすることからになり、開始するまでに至らなかった。本研究として使用する補完代替材料として洗浄剤にしているが、事前検討として、洗浄剤ではない形態でも予備実験を入れる予定とする。また、濃度や抽出方法などにも課題があることがわかったため、実験的に高濃度で作製したり効果を確実に確かめたうえで本実験に入りたい。論文投稿校正に対する費用が去年度分では不足していたため、本年度に持ち越した。そのためこの分を加算して使用する。
走運動における出・入力パワーと効率の発達

本研究では,走運動における力学的な出力パワーと,生理的な入力パワー(酸素消費量)および効率(出力/入力)について,発育・発達の視点から年齢の異なる中・長距離選手の特徴を明かにしようとした.このため,中学生の男子中・長距離選手4名(1315歳),大学生の男子中・長距離選手3名(1922歳)を被験者として,三段階の異ったスピード(245,268,290m/min)の等速度走を課し,出・入力パワーを測定した.出力パワーの測定は全天候トラックで行い,走路に埋没したフォースプレートの地面反力から外的パワー(身体重心を加速するパワー)を算出するとともに, 16mmシネカメラ(100コマ/秒)で撮影したフィルムから内的パワー(肢運動のパワー)を計算した.一方の入力パワーは,屋内トレッドミル走時の酸素消費量を定量することによって求め,出力パワーと合わせて次式により効率を算出した:効率=(外的パワー+内的パワー)/(入力パワー).その結果は概略次の通りである.1.出力パワー:外的出力パワーは,三種スピードのいずれにおいても,中学生より大学生選手の方が大きく,その差は体重当りにして0.61.0watt/kg(1016%)であった.しかし肢運動のための内的パワーにおいては,逆に大学生より中学生の方が大きく,その差は1.42.2watt/kg(3851%)の大差であった.このため総パワー(内的+外的)では〔中学生>大学生〕となった.2.入力パワー(エネルギー消費量)は,いずれのスピード条件下においても中学生の方が大きく,体重当りにして0.41.4watt/kgの差が認められた.3.効率:スピードの増加とともに中学生の効率値は高くなる傾向を示したのに対し,大学生では低くなり,このため,両年齢群の効率は最低スピードでのみ大学生が勝り,他の2スピードでは中学生の方が勝るという結果を示した.本研究では,走運動における力学的な出力パワーと,生理的な入力パワー(酸素消費量)および効率(出力/入力)について,発育・発達の視点から年齢の異なる中・長距離選手の特徴を明かにしようとした.このため,中学生の男子中・長距離選手4名(1315歳),大学生の男子中・長距離選手3名(1922歳)を被験者として,三段階の異ったスピード(245,268,290m/min)の等速度走を課し,出・入力パワーを測定した.出力パワーの測定は全天候トラックで行い,走路に埋没したフォースプレートの地面反力から外的パワー(身体重心を加速するパワー)を算出するとともに, 16mmシネカメラ(100コマ/秒)で撮影したフィルムから内的パワー(肢運動のパワー)を計算した.一方の入力パワーは,屋内トレッドミル走時の酸素消費量を定量することによって求め,出力パワーと合わせて次式により効率を算出した:効率=(外的パワー+内的パワー)/(入力パワー).その結果は概略次の通りである.1.出力パワー:外的出力パワーは,三種スピードのいずれにおいても,中学生より大学生選手の方が大きく,その差は体重当りにして0.61.0watt/kg(1016%)であった.しかし肢運動のための内的パワーにおいては,逆に大学生より中学生の方が大きく,その差は1.42.2watt/kg(3851%)の大差であった.このため総パワー(内的+外的)では〔中学生>大学生〕となった.2.入力パワー(エネルギー消費量)は,いずれのスピード条件下においても中学生の方が大きく,体重当りにして0.41.4watt/kgの差が認められた.3.効率:スピードの増加とともに中学生の効率値は高くなる傾向を示したのに対し,大学生では低くなり,このため,両年齢群の効率は最低スピードでのみ大学生が勝り,他の2スピードでは中学生の方が勝るという結果を示した.
血管内皮細胞膜上での血液凝固調節因子トロンボモジュリンの機能と発現調節機構の解析

正常な内皮細胞では血液凝固を抑制する因子を発現して血液の凝固を抑制し、血栓の発症を制御している。内皮細胞の膜表面に発現しているトロンボモジュリン(TM)はトロンビンと複合体を形成し、トロンビンが持つフィブリン形成能、血小板凝集能、そして血液凝固VおよびVIII因子に対する活性化能などの血液凝固を促進する機能を阻害し、加えて、その複合体にはプロテインC活性化能が誘導され、トロンビンの産生をも抑制する。すなわちTMはトロンビンの血液凝固能を抗凝固能に変えてしまう血液凝固抑制因子である。TMの上記のような作用および役割は純化精製したTM標品を用いた研究から導かれた示唆であり、実際の内皮細胞上で上記の様な作用および役割を果しているか、否かは明かでなく推測の域を出ていなかった。本研究では1.培養ヒト血管内皮細胞上のTMもトロンビンと複合体を形成し、プロテインC活性化能を示すこと、2.内皮細胞膜上でのTMのプロテインC活性化能は純化精製されたTMより1分子当りに換算して約10倍も高いことが観察され、内皮細胞膜上のTMは精製TMで考えられていたより強い抗凝固機能を持つことが明かになった。さらに、3.内皮細胞が腫瘍壊死因子(TNF)やインターロイキン-1などにさらされると、内皮細胞でのTM遺伝子の転写レベルが下がり、その産生は低下し、内皮細胞膜上でのプロテインC活性化能も低下すること、4.レチノイン酸(ビタミンA酸)にさらされると逆に遺伝子の転写レベルが高まり産生は増加し、プロテインC活性化能も高まること、さらに5.レチノイン酸はTNF処理で低下したTM産生を正常レベルまで回復させることが明かになり、悪性腫瘍時や炎症時に血栓症が発症しやすいことの一つの原因をTM発現の低下にあることを指摘した。また、上記疾患に於ける血栓発症を防ぐ糸口をレチノイン酸が切り開く可能性を提示した。トロンボモジュリンは血管内皮細胞の膜上に局在し血液凝固反応を制御する糖タンパク質である。組織から分離・精製されたトロンボモジュリンには、1)トロンビンによるプロテインC活性化能を促進する補酵素作用、2)トロンビンのフィブリン産生能を阻害する作用、3)アンチトロンビンーIII活性を促進する作用のあることが知られている。本研究によって血管内皮細胞膜上でも1)の作用を示すことが確かめられ、生理的にも機能していることが明かになった。しかし、2)および3)の作用に関しては内皮細胞膜上で検出することはできなかった。さらに検討を加えたい。一方、第2の研究課題であるトロンボモジュリンの発現調節においては大きな研究成果を得た。すなわち、血栓を発症しやすい炎症時やガン発症時に血液中で増加するサイトカイン(インタ-ロイキンー1や腫瘍壊死因子)によって、内皮細胞でのトロンボモジュリンの発現は遺伝子転写レベルでの抑制を通してその生合成が阻害せれていることを明かにし、炎症時やガン発症時において血栓が発症しやすい原因の一端を指摘することができた。さらに加うるに、ビタミンAの代謝物であるレチノイン酸がトロンボモジュリンの発現を増加させることを発見した。その機構はトロンボモジュリン遺伝子の転写レベルを上昇させることによりトロンボモジュリン生合成を増加するためであることを明かにした。しかも、レチノイン酸によるトロンボモジュリン遺伝子の転写レベル上昇はCycl icAMPによる転写レベルの上昇とその機構を異にしていることも明かにし、本タンパク質の発現調節の解明に大きく貢献することができた。

今後はレチノイン酸によるトロンボモジュリン発現増加の作用機構を5'ー非翻訳領域遺伝子の解析からさらに詳細に検討したい。内皮細胞の膜表面に発現しているトロンボモジュリン(TM)はトロンビンと複合体を形成し、トロンビンが持つフィブリン形成能、血小板凝集能、そして血液凝固VおよびVIII因子に対する活性化能などの血液凝固を促進する機能を阻害し、加えて、その複合体にはプロテインC活性化能が誘導され、トロンビンの産生をも抑制する。すなわちTMはトロンビンの血液凝固能を抗凝固能に変えてしまう血液凝固抑制因子である。TMの上記のような作用および役割は純化精製したTM標品を用いた研究から導かれた示唆であり、実際の内皮細胞上で上記の様な作用および役割を果しているか、否かは明かでなく推測の域を出ていなかった。当該年の研究では1.培養ヒト血管内皮細胞上のTMはトロンビンと複合体を形成し、プロテインC活性化能を示すことを明かにしたのに加え、2.内皮細胞膜上でのTMのプロテインC活性化能は純化精製されたTMより1分子当りに換算して約10倍も高いこと、すなわち内皮細胞膜上のTMは精製TMで考えられていたより強い抗凝固機能を持つことを明かにした。またTMの発現調節の研究では昨年度の研究成果に加え、レチノイン酸がTNF処理で低下したTM産生を正常レベルまで回復させることを明かにし、悪性腫瘍時や炎症時に発症する血栓症を防ぐ糸口をレチノイン酸が切り開く可能性を提示した。
微生物完全長ゲノムの大規模比較解析による適応的分子進化の解明

昨年度得た多数の近縁ゲノム間での自然選択強度のデータを整理し、特に水平移行の有無に関して着目しながら、機能と自然選択による進化の関係を明らかにした。これまでの研究で、水平移行した遺伝子では自然選択の緩和が生じている可能性(=同義置換数に対して非同義置換数が比較的多い)が示されていた。一方で、遺伝子の機能に関する考察から、量的に偏ってより多く水平移行している遺伝子のうち、細胞表面構造に関係するタンパク質の遺伝子などでは正の自然選択が示唆された。しかし、そのほかの大量移行の例では、例えば遺伝子発現の制御に関与する遺伝子のように、分子レベルでの生命活動に大きな変化をもたらす可能性は考えられるものの、水平移行と正の自然選択の関係は必ずしも明確ではない。そこで、近縁種(株)間のオルソログにおいて、水平移行した遺伝子とそうでない内在性のものとで、フレームシフトによるタンパクコード遺伝子の読み枠の破壊があるかどうかを比較した。すると、例えば大腸菌K-12株とO157の間では、内在性遺伝子では1.0%(34/3291)でフレームシフトによる偽遺伝子化が見られたが、一方で水平移行したものでは6.9%(23/332)と明らかに水平移行での遺伝子破壊が多かった。これは、水平移行したものではむしろ大部分で自然選択が緩和されているという考え方を指示するものである。本研究により、水平遺伝子移行によって大きな生命多様性がもたらされるが、自然選択という意味では重要度の高いものは小数に限られることが明らかになった。本研究に関しては一部を論文化するとともに国内外の学会等でも発表しており、また全ての結果をデータベース化し可視化するプログラムも作成したので、誰でも容易に大量解析の全情報を活用できるようになっている。本課題で購入したワークステーションにBLASTやFASTAをインストールし、基本的な生物解析環境を整備した。後述する水平遺伝子移行検出プログラムも導入した。また、完全長配列が入手可能な微生物ゲノムをDNAデータバンクからすべて入手した。rRNAを用いて分子系統樹を作成し、同義置換(アミノ酸置換を伴わない塩基置換)が飽和しておらず十分正確に推定可能と考えられるような近縁種の組を選定した。この結果、真正細菌で94組、古細菌で1組のゲノムを利用することができた。これらゲノムの全タンパク質配列間で総当りのBLSATP検索を実行し、相互ベストヒットの組を取ることによって直系遺伝子(オルソログ)を同定した。これらのゲノム内で、ベイズ推定とマルコフモデルに基づく方法により、水平移行したと考えられる遺伝子を予測した。また、直系遺伝子の組の間で同義・非同義置換を根井-五條堀の方法で推定した。同義置換はほぼ中立であると考えられるので、非同義置換と同義置換の比(非同義置換を同義置換で割った値)はアミノ酸置換に対する自然選択強度の指標となる。この比の全直系遺伝子の組の平均値を生物の系統間で比較したところ、非常に大きな差があり、大腸菌のような腸内細菌ではきわめて小さい(およそ0.1)即ち自然選択が強いのに対し、例えば髄膜炎菌では0.22、結核菌では0.18のように、他種では相対的に自然選択が弱い傾向を発見した。更に、直系遺伝子の組を水平移行遺伝子と非水平移行遺伝子に分類し、自然選択強度を比較したところ、水平移行のほうが非水平移行より値が大きい(自然選択が弱い)事を見出した。例えば大腸菌K12株とO157ではそれぞれ0.10と0.36、ピロリ菌では0.22と0.55である。これは、一般的に近年その重要性が強調されている水平移行において、むしろ進化的には重要度が低いという意外な結果を示している。
胚・造血幹細胞からのγδTリンパ球選択的分化誘導培養系の開発

マウスγδTリンパ球を選択的に分化誘導できる培養系を開発する目的で、まず、γδTリンパ球のリガンドとなりうるMHCクラスIb分子等のストローマ細胞上での発現を定量的に解析した。その結果から、T10/T22抗原を第一候補として、それぞれを過剰発現するストローマ細胞を樹立した。このストローマ細胞の単層上で、胚幹細胞からγδTリンパ球を誘導したが、T10/T22抗原がγδTリンパ球を優位に分化誘導し、レパートワ形成に影響を及ぼしている事実は今のところ認められていない。現在も解析中である。現在も解析中である。所属研究室の異動やそれに伴う研究環境の整備に時間を費やしたため、当初の予定よりも研究の進行が遅れたが、現在、問題なく研究は遂行されている。本研究の目的は、in vitroでγδTリンパ球が選択的に分化誘導できる細胞培養系を開発することである。平成21年度の研究においては、すでに報告されているマウスDelta-1を導入されたOP9 (OP9-D1)ストローマ細胞を用いた胚幹(ES)細胞からのTリンパ球分化誘導培養系を本研究室において確立し、本研究に必要な実験基盤の整備を最初に行った。次に、研究目的を達成するために、ストローマ細胞に導入するγδTリンパ球の抗原(リガンド)認識に関わる分子(MHC class Ib分子及びMHC class I様分子)の遺伝子クローニングと発現ベクターの構築を行っている。予備実験の結果、とくに有望な分子としてCD1d, T3/T18, T10/T22, Qa-1. Qa-2, Rae-1に絞った。すでに、一部の遺伝子に関しては、OP9ストローマ細胞に遺伝子導入し、安定な発現を有するストローマ細胞クローンを選別中である。OP9-D1を用いたES細胞からのTリンパ球分化誘導培養系へNotchシグナル阻害剤DAPTの添加の影響を調べた結果、濃度依存的にTリンパ球のみならずBリンパ球の発生・分化の抑制も認められ、γδTリンパ球の選択的分化の誘導は今のところ成功していない。さらに、阻害剤濃度および添加スケジュールの再検討が必要であると考えられる。平成21年度の研究においては、まず3種類のストローマ細胞株(OP-9,Tst-4,ST2)におけるMHCクラスI b分子およびMHC様分子の発現を定量的PCR法を用いて解析した。OP9は、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)と類似の遺伝子発現パターンを示すが、Tst-4はT22, M3, Q4, Q7の遺伝子発現のストローマ細胞より顕著に高く、また、ST2はT2, T23, M1, M4の遺伝子発現のストローマ細胞より顕著に高かった。このような特徴的な遺伝子発現パターンとγδT細胞のin vitroでの分化誘導とレパートア形成との関連をさらに調べていく必要がある。次に、胚幹(ES)細胞からのTリンパ球分化誘導培養系を用いて、骨髄および胎仔肝の造血幹細胞(HSC)からのγδTリンパ球の発生を解析した結果、生体の骨随意由来のHSCからは、出生以降の胸腺に出現するγδTリンパ球のレパートアワが検出されえるが、胎仔肝由来のHSCからは胎仔胸腺で認められる皮膚や肺に局在するγδTリンパ球のレパートアワが検出された。したがって、HSCの由来がγδTリンパ球のレパートアワ形成に重要であることが明確となった。現在、ES細胞から出現するγδTリンパ球のレパートアワを解析中である。上記3種類のストローマ細胞へDeltal, Delta4, T10, T22を単独ある有為は組合せで発現させた細胞はすでに樹立しており、それらを用いてTリンパ球分化誘導培養系での解析を行う予定である。また、上記以外の有望な遺伝子を発現させたストローマ細胞も現在作出中であり、これらに関しても樹立次第、解析を行う。本研究の目的は、in vitroでγδT細胞が選択的に分化誘導できる細胞培養系を開発することである。平成22度の研究において、引き続き3種類のストローマ細胞株(OP-9,Tst-4,ST2)におけるMHCクラスIb分子およびMHC様分子(Rae-1α,β,γ,δ,εおよびH60a,b,c)の発現を定量的PCR法にて解析した。その結果、Rae-1α,β,γの発現はTst-4において、Rae-1γの発現はOP-9においてそれぞれ選択的に高かったが、Rae-1εの発現はいずれの細胞株においても高く検出された。一方、H60a,bの発現はTst-4において選択的に高く、H60cの発現はいずれの細胞においてもほとんど認められなかった。