hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
硬組織微量元素分析によるイトウの生息環境履歴の解読に関する研究

(1)鱗を用いた生息環境履歴の推定淡水及び海水の飼育実験で得られた個体の鱗を用い、鱗の成長線である隆起線に生息環境が反映されているかについて検証した。飼育期間における鱗縁辺部の隆起線のSr量は、淡水飼育個体に比べ海水飼育個体の方が有意に高く、鱗の隆起線のSr量がそれぞれの飼育環境を反映している可能性が示唆された。また、隆起線の局所定量化を行うために、薄切標準試料を作製した。作製した標準試料は、0-500ppmの濃度範囲で良好な検量線が得られ、淡水・海水飼育個体における隆起線のSr濃度を明らかにすることができた。これらの結果から、隆起線単位で生息環境を推定できる可能性が示唆された。(2)イトウの成長と食性イトウ成魚について、その短期的な食物源を解剖による胃内容物調査から明らかにするとともに、イトウとイトウの生息水域における主な餌生物の筋肉の炭素窒素安定同位体比分析から長期的な食物源も解析した。胃内容物分析から、降海型イトウはイカナゴ、ウグイ、サンマ、カレイ等を捕食していた。炭素窒素安定同位体比分析の結果からは降海型イトウは高い栄養段階(δ15N(%):14.5,δ13C(%):-19.1)に位置すること、また筋肉に反映されるまでの数週間数ヶ月間沿岸域の餌資源を利用していた可能性が明らかになった。一方、河川のイトウの胃からはドジョウが確認され、炭素窒素安定同位体比分析からはヤマメやスジエビ、ドジョウの寄与率が高いことが示された。降海型イトウと比較し、河川で生活していたイトウ成魚の肥満度は著しく低く、餌場・成育場としての沿岸域の重要性が示唆された。(3)同所的に生息するイトウとヤマメの食性同所的に生息するイトウ幼魚とヤマメ幼魚の食性を明らかにすることを目的として、ストマックポンプを用いた胃内容物調査を行った。同定分類群ごとに個体数と湿重量を計測し、各分類群の割合を分析するとともに、分類群を水生昆虫と陸生昆虫にまとめ比較した。IRI値の結果は、イトウ幼魚では水生昆虫であるカゲロウ目が52.3%と最も高く、ヤマメ幼魚では陸生落下昆虫であるチョウ目(幼虫)が61.4%と最も高いことが明らかになった。また、全体でもイトウ幼魚のIRI値の80%以上が魚類(イトウ稚魚,フクドジョウ)、甲殻類(ヨコエビ)、水生昆虫で占められていたのに対し、ヤマメ幼魚では95%以上が陸生落下昆虫であった。以上のことから、イトウは底生の餌資源が、ヤマメは河畔林から供給される餌資源が主であり、イトウとヤマメが資源分割しながら同所的に生息していることが明らかになった。今年度は、主に(1)イトウの淡水・海水飼育実験、(2)猿払沿岸イトウの耳石分析について研究を進めてきた。1.イトウの淡水・海水飼育実験淡水・海水下における飼育実験では、塩分濃度の異なる環境がイトウの耳石鱗にどのように反映されているかについて、微量元素分析を用いて明らかにした。本実験では、塩分濃度の異なる飼育環境がイトウの耳石のSr:Ca比に反映されている可能性が示唆され、また各飼育環境下での耳石Sr:Ca比レベルの違いが明らかになった。淡水・海水の耳石Sr:Ca比レベルは、実際にフィールドサンプル(猿払沿岸で捕獲されたイトウ)の回遊履歴を解析する際に基準となる重要な知見である。また、鱗についても耳石と同様に、淡水・海水の飼育環境がSr濃度として反映されることが示唆された。本研究の対象種であるイトウは絶滅危惧種であり、殺さずに摘出できる鱗によって回遊生態や生活史の推定が可能かどうかを検討することは、希少種への応用の面からも非常に大きな意義がある。今年度得られた結果は、鱗を用いた生息履歴の解析の第一歩であり、鱗の成長線である隆起線を用いた生息環境の推定が可能かどうか、またその精度はどの程度のものなのかについても検討していく必要がある。2.猿払沿岸イトウの耳石Sr:Ca比分析猿払沿岸で捕獲された(定置網にかかって死亡した)イトウ数個体の耳石をEPMAによりライン分析・面分析した。解析結果からは、イトウが淡水域と海水域もしくは汽水域を行き来していることが示され、また長期間にわたり生活史の大部分を海水域もしくは汽水域で過ごしている可能性が示唆された。イトウの保全策を検討する上では、イトウの産卵場である上流域から、重要な生息場であると推測された河口域もしくは沿岸域までの連続性を確保することが重要であると考えられる。本年度得られた成果は、イトウの保全策を考える上で不可欠な知見であり、また今後より詳細に回遊生態を推定するにあたって重要な知見となる。(1)イトウの回遊履歴の推定イトウの飼育実験(淡水,汽水,海水)において各塩分段階における耳石Sr:Ca比を把握し、この結果をもとに北海道猿払沿岸のイトウの回遊履歴を推定した。降海型イトウの多くは生活史の大部分を汽水・沿岸域に依存しており、また淡水、汽水、海水を行き来する個体も確認されたことから、産卵域である河川上流域から沿岸域にわたる広範な水域を回遊していることが示唆された。

以上の成果により、河川河口域及び沿岸域の保全、また移動の妨げとなる河川横断工作物についての検討及び改善がイトウの保全策の鍵になることを示すことができ、イトウの生態に関する基礎知見だけでなく、イトウの保護策の立案に寄与できたと考えている。(2)鱗を用いた生息環境履歴の推定淡水及び海水の飼育実験で得られた個体の鱗を用い、鱗の成長線である隆起線に生息環境が反映されているかについて検証した。飼育期間における鱗縁辺部の隆起線のSr量は、淡水飼育個体に比べ海水飼育個体の方が有意に高く、鱗の隆起線のSr量がそれぞれの飼育環境を反映している可能性が示唆された。また、隆起線の局所定量化を行うために、薄切標準試料を作製した。作製した標準試料は、0-500ppmの濃度範囲で良好な検量線が得られ、淡水・海水飼育個体における隆起線のSr濃度を明らかにすることができた。以上のことから、隆起線単位で生息環境を推定できる可能性が示唆された。イトウのような希少種においては、魚体へのダメージを最小限に抑える研究手法の開発が望まれており、本研究の成果は希少種研究の観点からも重要な知見である。(3)イトウの胃内容物調査H.22年度は、収集した降海型及び陸封型イトウについて、その胃内容物を調査した。胃内容物や食性に関する知見は少なく、特に海洋生活期の食性についての知見は皆無であり、本研究はイトウの食性に関し、重要な知見を示すことができたと考えている。昨年度に引き続き降海型イトウの回遊履歴を蓄積するとともに、本年度は主に(1)鱗隆起線の自然標識としての有効性(2)イトウ及びヤマメの胃内容物組成についての研究を行った。(1)鱗隆起線を用いた自然標識としての有効性の検討本年度は、淡水及び海水の飼育実験で得られた個体の鱗を用い、鱗の成長線である隆起線に生息環境が反映されているかについて検証した。また、淡水・海水環境下における鱗隆起線のSr:Ca比は、それぞれ耳石におけるSr:Ca比と同様の値を示し、隆起線単位で生息環境を推定できる可能性が示唆された。本手法は耳石による回遊履歴研究とは異なり、対象魚を解剖する必要がない点でイトウのような希少性の高い魚種の研究に有効である。(2)イトウ及びヤマメの胃内容物組成本年度は、降海型イトウ及びイトウ幼魚と、イトウ幼魚と同所的に生息するヤマメの胃内容物調査を行った。北海道猿払沿岸(オホーツク海)の定置網で混獲されたイトウを解剖し、海で採餌していることを確認するとともに、ウグイ、サンマ、イカナゴなど多様な海の餌生物を利用していることが明らかとなった。また、猿払沿岸流入河川の狩別川にて捕獲されたイトウの胃からは、フクドジョウが確認された。イトウ幼魚とヤマメの胃内容物はほとんどが昆虫類で占められていたが、イトウは底生水生昆虫を、ヤマメは陸生落下昆虫を主な餌資源にしていることが明らかになり、同所的に生息する両者は餌資源を分割している可能性が示唆された。食性の解明はイトウの生態を理解する上で不可欠であり、今後さらに詳細な調査・分析を続ける予定である。(1)鱗を用いた生息環境履歴の推定淡水及び海水の飼育実験で得られた個体の鱗を用い、鱗の成長線である隆起線に生息環境が反映されているかについて検証した。
心肺補助循環時の血小板減少症の機序解明と生理活性物質による予防法・治療法の開発

人工心肺を含む体外循環後に起こる血小板減少に関する機序についての研究を行った。人工心肺下心臓手術周術期の血小板において細胞内p38 MAPKリン酸化とBaxの亢進が観察された。そこで次にBaxノックダウンまたは、Bcl-xlノックダウン血小板様細胞を用いて、ずり応力及びトロンビン負荷を与える実験を行うと、Baxノックダウン血小板細胞は細胞死変化が抑制される一方で、Bcl-xlノックダウン血小板様細胞は細胞死変化が亢進した。また、血小板凝集能は血小板の細胞死変化と反比例して変化した。以上の結果から、血小板の細胞死が、体外循環後の血小板l機能低下及び血小板数低下に関与していることうが示唆された。また、レゾルビンDの投与によりこれらの変化が軽減したことから血小板減少の新しい予防法になる可能性が考えられた。(目的)今回我々は、1)Bax, Bcl-xl, P38α, Akt各々遺伝子ノックダウン血小板細胞にShear Stress又はトロンビン負荷を与えた場合の経時的細胞死変化を定量評価すること、2)細胞透過性ペプチド、生理活性ペプチドを用いて、今後の血小板保護に関する予防法、治療法の方向性を見いだすことを目的に研究を施工した。前年度に作成したヒト遺伝子ノックダウン血小板様培養細胞をBax,Bcl-xl,p38α,AktをターゲットにしたsiRNAを用いて作成した。細胞は巨核芽球培養細胞(MEG-01細胞)、またはヒトCD34+ Progenitor Cellを用いたが、MEG-01細胞がウィルスベクターを使用せず簡便に遺伝子導入ができ、短時間で血小板様細胞が作成でき、MEG-01細胞から降りした血小板様細胞が血小板機能を保持している可能性があったのでこれを使用した。(結果)1.Bax遺伝子ノックダウン血小板様培養細胞は、コントールの遺伝子を導入した細胞に比べトロンビン負荷またはずり応力付加による血小板刺激に対し活性化は同程度に観察できた。いずれの細胞においても、PAC-1, CD62Pの発現が同程度に上昇した。Bax遺伝子ノックダウン血小板様培養細胞は、コントールの遺伝子を導入した細胞に比べ細胞死の過程が抑制された。Bax遺伝子ノックダウン血小板様培養細胞において、ミトコンドリア内チトクロームCの低下およびカスパーゼ9,3の発現の上昇が、抑制された。2.一方で、Bcl-xL遺伝子ノックダウン血小板様培養細胞は、コントールの遺伝子を導入した細胞に比べトロンビン負荷またはずり応力付加による血小板刺激に対し細胞死が亢進した。3.生理活性物質のResolvin D2の前投与により血小板内Baxの発現が阻害されることで細胞死が抑制された。本研究を行うにあたり、研究代表者はすでにLPSまたはHMGB1刺激を血小板に与えることで細胞死の過程が進行(血小板内ミトコンドリア膜電位の低下と細胞内Bak, Bax発現の上昇、ホスファチジルセリン(Annexin V+)を表面発現するMicroparticle数の上昇)を解明している。人工心肺中において、HMGB1が上昇することが報告されていることから(Anesthesiology, ASA Meeting2010, A435)、これらの要因も関与することをふまえ、研究を行ってきた。また研究代表者はまた、若手研究(B)(H21H22,)miRNAによるRNA干渉効果を用いた新しい血小板遺伝子ノックダウン手法の開発、若手研究(B)(H19H20)RNA干渉法による心筋虚血再潅流後心筋障害のメカニズム解明と遺伝子治療への応用において分子生物学的手法に精通し、miR RNAi発現ベクターを用いた遺伝子抑制法により、遺伝子ノックダウン血小板細胞を開発してきているため、実験の遂行はスムーズであるがIn Vitroにおける血小板機能を調べる実験を介していないため、平成23年度研究実施計画に記した研究内容はやや遅れている。生理活性物質ResolvinD1, D2(Cayman社)、Ghrelin(Peptide研究所)の前投与により、細胞死変化が抑制されるかどうかを検討し、今後の血小板保護に関する予防法、治療法の方向性を検討する。レゾルビン(resolvin)は、主にω-3脂肪酸であるエイコサペンタエン酸(EPA)由来のEシリーズとドコサヘキサエン酸(DHA)由来のDシリーズに大別される抗炎症性脂質メディエーターファミリーであり、いずれもグレリンまたはアドレノメデュリン等の生理活性ペプチドと同じく細胞膜安定化作用があり、炎症性疾患への応用が期待される。

平成23年度にIn Vitro系で測定した細胞死変化を平成24年度はラットを用いたIn Vivo系で起こることを確認し、生理活性物質の投与ににより血小板の細胞死(アポトーシス)をコントロールし、人工心肺下心臓手術による血小板凝集能低下の予防治療の可能性を考えている。LPS負荷、又はHMGB-1負荷をすることで細胞死変化がコントロール群に比べ上昇し、またBax又はp38α遺伝子のノックダウン血小板細胞においては、逆に細胞死変化が軽減するとの仮説のもと、血小板機能及び蛋白発現の変化を調べる実験を行う。In Vitro系で測定した細胞死変化が人工心肺ラットを用いたIn Vivo系で起こることを確認し、人工心肺時間に対する血小板数の経時的変化を観察する。生理活性ペプチドResolvinD1, D2 (Cayman社)、Ghrelin (Peptide研究所)の静脈内前投与により、血小板凝集能低下または細胞死変化が抑制されるかを確認し、生理活性ペプチドの有効性を評価する。具体的な検査項目に関しては、In Vitro系で変化した項目を中心に検査する。このため、本研究に用いられる試薬(抗体、ペプチド、PCR関連品、インヒビター、ELISAキット、Nulcleofection法を用いた関連試薬、miRNA発現ベクター、培養関連品等)や、フローサイトメトリー用の抗体、ELISAキット、Nuleofectionキット、miRNA発現ベクターキットなど、1キット当たり5万円から20万円程度のものを使用し、1回の実験で2万円から5万円程度のコストを要する時もあるため、研究費は主に消耗品費として使用する。
QOLと経済面からみた血液腎透析と腹膜腎透析の比較研究

【目的】腎透析の医療は、技術進歩による療養期間の延長や合併症の複雑化、患者の高齢化に伴う痴呆症の発現や家族介護の負担、さらには医療財源の逼迫という深刻な課題に直面している。そこで、こうした環境の下での腎透析患者のQOLを多面的に把握するとともに、国により実施割合に大差のある血液透析(HD)と腹膜透析(PD)についてQOLと経済の両面から比較検討する。【対象と方法】地域の基幹4病院の腎透析患者158人(HD140人、PD18人)のQOL等を約2年間追跡するとともに診療報酬(レセプト)データを累積した。QOLは横断的調査に加え、自覚的健康度の経済的変化を患者、家族、医療者の3人からLinear analog scale等で把握した。【結果と考察】追跡期間の長いHD患者50人についてみると、透析前後で患者の健康度自己評価と看護婦からみた患者の健康度との間には正の相関関係がみられ(P<0.01)、看護婦は患者の健康状態をかなり的確に把握していることが明らかとなった。また、透析前の患者自身による健康度自己評価とレセプトとの間には負の相関関係がみられ(P<0.01)、患者の自覚的健康度が低いときにはレセプトの点数が上昇する(合併症などへの医学的対応が行われる)傾向が認められた(P<0.01)。横断的なQOL調査の対象は143人(HD127人、PD16人)で、男60.8%、女37.1%、平均年齢59.1歳、闘病期間12年2ヶ月、透析期間7年3ヶ月である。HDとPDを比較すると、HD患者ではだるさについてのばらつきが大きい(P<0.05)。HDに比べてPDの症例数が少なかったため十分な統計学的検討はできなかったが、PD患者でQOLが高くなる傾向にある【目的】腎透析の医療は、技術進歩による療養期間の延長や合併症の複雑化、患者の高齢化に伴う痴呆症の発現や家族介護の負担、さらには医療財源の逼迫という深刻な課題に直面している。HDに比べてPDの症例数が少なかったため十分な統計学的検討はできなかったが、PD患者でQOLが高くなる傾向にある【目的】透析患者を巡る社会経済環境は、高齢化の進行、合併症の複雑化、要介護や痴呆症の増加などにより、過去とは大きく様相を異にしている。このため、近年進歩の著しいQOL評価の手法を用いて、透析患者のQOLを多面的に検討することは極めて重要となっている。また、人工透析に投じられる医療費の総額は年間1兆円に達すると推計され、透析の経済分析は中長期的な腎不全対策を検討する上で欠かせない視点と考えられる。そこで、国により実施割合に大差のある血液透析と腹膜透析の優劣について、判断分析の手法を用いてQOLと経済の側面から比較検討し、両者のをどの様な時に選択すべきかの判断基準を明らかにする。【対象と方法】初年度は、診療録、レセプト、および独自に開発したQOL調査票を用いて、限られた施設と透析患者を対象に血液透析と腹膜透析の比較調査を実施し、患者の基本情報をもとに、QOL評価法と経済分析法を統合した結果の解析を試みた。すなわち、地域中核病院6施設の透析患者140名(血液透析、腹膜透析各70名)を対象に、調査を実施した。QOL調査は、21項目からなる横断的な調査に加えて、透析導入から約2年間にわたる健康状態を、患者、家族、主治医、看護婦の4者からLinear analog scaleで把握することとした。レセプト調査では、この観察期間の医療費を累積して費用便益分析を行い、血液透析、腹膜透析の優劣を比較した。【結果と考察】透析患者48名(血液透析38名、腹膜透析8名)の仮集計を行った。

QOLの横断調査では、仕事や日常生活での不安は、両者とも多く、「ある」「少しある」を合わせると各63.6%、62.5%であった。両者で有意な差を認めたのは、親身になってくれる友人の数で、血液透析で多い傾向がみられた(χ^2検定、P<0.001)。だるさについては、血液透析で様々であるのに対し、腹膜透析はすべてが「たまにある」であった。腹膜透析の患者7名について、約1月間の健康状態を毎日調査した結果では、100点標記(0が最悪、100が最良)で患者本人は67.29±15.71、透析介助にあたる家族からみた患者は71.14±13.19、家族自身は78.72±11.73であった。患者本人の評点と家族からの評点とは有意の差はなく、家族は患者の健康状態をかなり的確に把握していることが窺えた。【目的】透析医療は腎不全に対する医療として定着しているが、最近は患者の高齢化、合併症の複雑化などの新たな課題に直面している。また、医療財源の逼迫という経済環境にあって、年間1兆円と推計される人工透析に投じられる医療費について適正化対策が求められている。そこで、国により実施割合に大差のある血液透析と腹膜透析の優劣をQOLと経済の側面から比較検討するとともに、血液透析と腹膜透析の選択基準を明らかにする。【対象と方法】地域の基幹病院2施設の血液透析50名、腹膜透析8名の患者のQOL等を約8ヶ月追跡するとともにレセプトデータを累積した。QOL調査は横断的調査に加え、健康状態の変化を、患者、家族、医療者の3者からLinear analog scaleで把握した。そして、血液透析、腹膜透析の優劣を、QOLと経済の両面から比較検討した。【結果と考察】血液透析患者の健康状態の自己評価は、患者による個人差は大きいが、時期による差は小さいことが判明した。血液透析患者40名の約8ヶ月の健康状態のスコア(0最悪-100最良)の平均は、透析直前70.3±17.6、透析直後60.2±21.2である。看護婦からみた患者の健康状態は、同じく72.6±10.3、66.4±13.1であり、自己評価に近い値となっている。腹膜透析の患者7名の約1月間の健康状態を毎日調査した結果では、患者本人によるスコアは67.3±15.7、透析介助にあたる家族からみたスコアは71.1±13.2である。血液透析患者の医療費(保険点数)は、363件の月平均で、45,497.4±10,008.1である(変動係数0.220)。QOLの横断調査でみた体重の自己管理で、「うまくいっている」の割合は、血液透析68.4%、腹膜透析85.7%であるが、両者は有意の差ではない。仕事や日常生活での不安は、両者とも多く、「ある」「少しある」を合わせると各63.6%、62.5%である。【目的】腎透析の医療は、技術革新による療養期間の延長や合併症の複雑化、患者の高齢化に伴う痴呆症の発現や家族介護の負担、さらには医療財源の逼迫という深刻な課題に直面している。そこで、こうした環境の下での腎透析患者のQOLを多面的に把握するとともに、国により実施割合に大差のある血液透析(HD)と腹膜透析(PD)についてQOLと経済の両面から比較検討する。【対象と方法】地域の基幹4病院の腎透析患者158人(HD140人、PD18人)のQOL等を約2年間追跡するとともに診療報酬(レセプト)データを累積した。QOLは横断的調査に加え、自覚的健康度の経時的変化を患者、家族、医療者の3者からLinear analog scale等で把握した。【結果と考察】
分子生物学的アプローチによる口腔内細菌叢の動態調査

1ここ数年、齲蝕をはじめようとする口腔細菌性疾患や口腔細菌叢の解析手段として分子遺伝学的手法が広く用いられるようになった。本研究では、齲蝕の進行程度、進行速度の異なる3名の患者より象牙質試料、プラークを採取し、PCR-16SrDNA解析により、それぞれの細菌叢を調べた。解析の結果、どのサンプルからも、これまで口腔よりの分離報告例の少ないものや、あるいはデータベースに登録された既知細菌と相同性の低いものを含め極めて多様な細菌が検出された。浅在性の齲蝕からはStreptococcus,Actinomyces等の分離頻度の高い細菌をはじめ、広範な菌種が検出されたのに対し、象牙質に至る急性の深在性齲蝕からはLactobacillusが高頻度に検出された。一方、深在性の象牙質齲蝕ではあるが、進行速度の遅い、別患者の齲蝕部位からは、齲蝕原生細菌として、Actinomyces,S.oralis,S.cristatusといった菌種が検出された。齲蝕部位においても、その進行の程度や進行速度により細菌叢が大きく異なる結果が得られた。2特定細菌の検出を目的に、実習学生を対象に歯周病原細菌のPCR検出を行った。3年度にわたり、異なる学生集団について調査を行ったところ、培養法では分離できなかった若年性歯周病原細菌Actinobacillus actinomycetemcomitansが2030%という比較的高い検出率を示した。以上のように、分子生物学的アプローチによる研究手法は口腔菌叢についての新たな知見をもたらした。遺伝子学ならびに分子系統学的解析手法は、今後ますます口腔内細菌叢の解析に有効な手段として活用されてゆくものと期待される。従来より、分離・培養・同定に依存していた細菌叢の研究にも近年、分子生物学的な手法が取り入れられるようになり、様々な細菌叢についての理解が進んできている。中でも16S rRNAを標的とするPCR、塩基配列解析は簡便で、短期間に多くの情報を取得することができるため、細菌叢研究において、すっかりポピュラーなものとなった感がある。本年度の研究では、う蝕・非う蝕部位における口腔プラークを試料サンプルとし、16S rRNA遺伝子の増幅、塩基配列決定を行い、プラークを構成する細菌叢の解析を試みた。次年度以降では、更なる試料サンプルについて分析、検討を行う一方、Helicobacter pyloriをはじめとする特定細菌の検出を試み、口腔細菌叢の成立・変遷の詳細について解析を進める予定である。前年度に引き続き、齲蝕部位よりサンプリングを行い、溶菌、抽出した細菌DNAをテンプレートに、16SrDNA遺伝子を増幅、プラスミドベクターにライゲーション、クローニング、シークエンスを行った。今回のサンプルは22才男性、右下第2大臼歯咬合面の象牙質に達する齲蝕部位より採取した。シークエンスの結果、Streptococcus,Actinomyces,Eubacterium属に加え、CapnocytophagaやNeisseria、また、データベースに登録された既知細菌と相同性の低い細菌遺伝子などが検出された。Streptococcusについては、齲蝕原性の強いS.mutans,S.sobrinusではなく、S.oralisやS.cristatusが検出された。別の患者さんより採取した前年度のサンプル解析では、象牙質齲蝕から検出される細菌遺伝子はLactobacillusのものがほとんどであった。また、齲蝕の進行程度の違いにより検出される細菌叢も異なっていた。

歯周疾患をはじめとする口腔領域の細菌性疾患は複合要因からなるものであると言われているが、今年度の結果より、個人差も含め、齲蝕においても、いわゆる齲蝕原性と呼ばれるものも含め、多くの細菌が様々な形で疾患に関わっている可能性が想起させられた。次年度において、もういくつかの試料サンプルについて分析を進め、データの蓄積につとめ、これまでの総括を行うとともに、従来的な培養法を補完する形での、分子生物学的なアプローチによる口腔細菌叢の解析手法の確立について更なる検討を推し進めたい。1前二年のPCR-16SrDNA解析より、う蝕部位においてもその進行の程度により細菌叢が大きく異なる結果を得た。また象牙質に達する重度のう蝕であっても、患者により検出される細菌に大きな違いがあることがわかった。最終年度である本年度は若干の解析を加えるとともに、う蝕をはじめとする細菌性口腔疾患の全体像の掌握を目的に、蓄積された解析結果より研究の総括を行った。新たな解析からもこれまで同様、多様な細菌遺伝子が検出された。結果をまとめると、培養に依存しない遺伝子学的手法により検出された細菌は、これまで口腔よりの分離報告例の少ないもの、あるいはデータベースに登録された既知細菌と相同性の低いものを含め極めて多様であった。また、かなりう蝕の進行した試料から検出された細菌群は,Streptococcus mutnasやS.sobrinusといったう蝕原生の強いものではなかった。う蝕の発生機序は、口腔内細菌による糖の利用に伴う酸産生によるものとの理解が浸透しているが、そこにはこれまで考えられていた以上に様々な細菌が関与している可能性が示唆された。多因性、複合性疾患である歯周病に代表されるよう、約200種に及ぶ細菌が生息すると言われる口腔領域の細菌性疾患を考える際には、広く細菌叢全体を視野に入れる事が必要になるものと考えられる。今後も様々なう蝕細菌叢の解析、データの蓄積に努めたい。2特定細菌の検出を目的に、実習学生を対象に歯周病原細菌のPCR検出を行った。3年度にわたり、異なる学生集団について調査を行ったところ、培養法では分離できなかった若年性歯周病原細菌Actinobacillus actinomycetemcomitansが2030%という比較的高い検出率を示した。以上のように、分子生物学的アプローチによる研究手法は口腔細菌叢についての新たな知見をもたらした。遺伝子学ならびに分子系統学的解析手法は、今後ますます口腔内細菌叢の解析に有効な手段として活用されてゆくものと期待される。
酸化ストレスによる糖尿病腎糸球体異常の分子機構の解明とその制御

近年、糖尿病合併症の発症に酸化ストレスが関与している可能性が注目されているが、糖尿病腎症における酸化ストレスの役割は明らかではない。今回、糖尿病腎糸球体における酸化ストレスを明らかにするため、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットの腎糸球体における酸化ストレスの増強、抗酸化酵素の発現とその発症機構を検討した。糖尿病ラット腎糸球体における抗酸化酵素であるhome oxigenase-1(HO-1)の発現は有意に増加しており、インスリンおよび抗酸化剤であるビタミンE投与により抑制された。糖尿病ラットにおいて、酸化ストレスマーカーである8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG)の尿中排泄量と糸球体における8-OHdG免疫組織染色は増強しており、インスリン治療およびPKC-β阻害薬投与により抑制された。ルシゲニン法で測定した糸球体のスーパーオキサイド産生量は、糖尿病糸球体で増加しており、インスリン治療群およびPKC-β阻害薬投与群で抑制された。このスーパーオキサイドの産生はNADPHを基質としており、NADPHオキシダーゼの阻害薬であるdiphenylene iodonium (DPI)で抑制された。NADPHオキシダーゼの構成成分であるp47phoxとp67phoxの発現は糖尿病ラット糸球体で増加していた。p47phoxとp67phoxの膜分画への移行は糖尿病糸球体で増加しており、この膜移行はPKC-β阻害薬投与群で抑制された。PKC-β2を過剰発現させた培養メサンギウム細胞ではp47phoxとp67phoxの膜移行が促進され、細胞内酸化ストレスは増強していた。以上の研究から、糖尿病腎糸球体では酸化ストレスが増強していることが明らかとなった。またこの酸化ストレスの増強にはPKC-βの活性化を介したp47phoxとp67phoxの膜移行が重要であることが示唆された。最近、腎症を含む糖尿病合併症の発症に酸化ストレスが関与している可能性が注目されてきている。しかし、糖尿病における腎糸球体の酸化ストレスに関しては、脂質過酸化物の測定によりその存在が推察されているのみであり、酸化ストレスが実際に腎糸球体で生じているか否かは明確ではない。また、腎糸球体において、酸化ストレスが生ずる機構、酸化ストレスが腎糸球体異常を惹起する機構は未だ明らかにはされていない。そこで本研究は、酸化ストレスによる糖尿病腎糸球体異常の分子機構を解明し、その制御法を開発することを目的とした。本年度はストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットより単離した糸球体において、酸化ストレスが増加しているか否かを検討するとともに、活性酸素消去系酵素の発現を検討した。その結果、糖尿病ラットの腎糸球体において、1.DCFH-DAを用いた染色により活性酸素が増加していることを明らかにするとともに、2.活性酸素消去系酵素に関しては、catalase、glutathione peroxidase、superoxide dismutaseの発現は増加せず、heme oxygenase 1 (HO-1)の遺伝子および蛋白発現が有意に増加していることが明らかとなった。さらに、3.糖尿病ラットの糸球体におけるHO-1遺伝子発現増加は、インスリン治療および抗酸化薬により抑制されること、および4.HO-1発現は浸潤細胞ではなく糸球体細胞で増加していることが明らかとなった。これらの成績は、糖尿病の糸球体に酸化ストレスが生じていること、およびその消去系としてHO-1が重要な役割果たしていることを明確に示している。今後、HO-1を中心とした検討を継続する予定である。

しかし、糖尿病における腎糸球体の酸化ストレスに関しては、脂質過酸化物の測定によりその存在が推察されているのみであり、酸化ストレスが実際に腎糸球体で生じているか否かは明確ではない。また、腎糸球体において、酸化ストレスが生ずる機構、酸化ストレスが腎糸球体異常を惹起する機構は未だ明らかにはされていない。そこで本研究は、酸化ストレスによる糖尿病腎糸球体異常の分子機構を解明し、その制御法を開発することを目的とした。昨年度ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットより単離した糸球体において、酸化ストレスが増加していることを確認したので、本年度は酸化ストレスを生じる機構を解析した。その結果、糖尿病ラットの腎糸球体において、まず、1.活性酸素の産生は、NADPH oxidaseの阻害剤により抑制されたが、他の活性酸素産生系の阻害剤では抑制されないことが明らかとなった。2.NADPHoxidase活性は糖尿病ラット糸球体で亢進しており、3.そのサブユニットの中でp47phoxおよびp67phoxのmRNA発現が増強していた。4.さらに、p47phoxおよびp67phox蛋白の細胞質から細胞膜へのtranslocationも亢進していた。5.これらの変化はインスリン治療により完全に是正され、またPKC-β阻害薬によっても有意に抑制された。以上から、糖尿病ラット糸球体ではNADPH oxidase活性化により酸化ストレスが増強しており、この変化にPKC活性化が一部関与していると考えられた。近年、糖尿病合併症の発症に酸化ストレスが関与している可能性が注目されているが、糖尿病腎糸球体に酸化ストレスが生じているかは明らかではない。今回、糖尿病腎糸球体における酸化ストレスが関与しているか否かを明らかにするため、4週齢のストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットの腎糸球体における酸化ストレスの増強とその発症機構を検討した。酸化ストレスマーカーである8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG)の尿中排泄量は糖尿病ラットで有意に増加しており、その増加はインスリン治療群およびPKC-β阻害薬投与群で抑制された。糖尿病ラット糸球体における8-OHdG免疫組織染色は増強しており、インスリン治療およびPKC-β阻害薬投与群で同様に抑制された。次に、ルシゲニン法を用いて測定した糸球体のスーパーオキサイド産生量は、糖尿病糸球体で増加しており、インスリン治療群およびPKC-β阻害薬投与群で抑制された。このスーパーオキサイドの産生はNADPHを基質としており、NADPHオキシダーゼの阻害薬であるdiphenylene iodonium (DPI)で抑制された。NADPHオキシダーゼの構成成分であるp47phoxとp67phoxのmRNAおよび蛋白発現は糖尿病ラット糸球体で増加していた。さらにp47phoxとp67phoxの膜分画への移行は糖尿病糸球体で増加しており、この膜移行はPKC-β阻害薬投与群で抑制された。次に、PKC-β2を過剰発現させた培養メサンギウム細胞ではp47phoxとp67phoxの膜移行が促進され、細胞内酸化ストレスは増強していた。
HTLV-1プロウイルスのエピジェネティクス解析によるATL発症機序の研究

成人T細胞白血病-リンパ腫(ATL)の細胞株と患者検体の両方においてHTLV-1プロウイルスの3' LTR近傍にヌクレオソームフリー領域(NFR)を認めた。そのNFRにおいてエンハンサー領域に特徴的なヒストン修飾パターンが観察され、機能解析によって同領域に有意なエンハンサー活性があることを見出した。また転写因子のSRFとELK-1が同NFR配列に直接結合し得ることが確認された。以上より、このNFRがエンハンサーとして機能し、3' LTRからアンチセンスにコードされるHBZの転写活性に関与し、HTLV-1持続感染とATLの発症機序に寄与している可能性が考えられる。HTLV-1潜伏感染により発症する成人T細胞白血病-リンパ腫(ATL)の発症メカニズムの一つに、HTLV-1ウイルス抗原の発現抑制による免疫逃避機構が知られている。本研究ではクロマチン免疫沈降と次世代シークエンサー(ChIP-seq)を用いてHTLV-1プロウイルスのヒストン修飾パターンを明らかにし、さらに転写を制御する分子機構を同定する。1)末梢血単核球(PBMC)検体の収集:現在までにHTLV-1キャリア57検体、くすぶり型ATL 20検体、慢性型ATL 8検体を収集した。2)細胞株を用いたChIP-seq解析: HTLV-1キャリアのモデルとなるTBX-4B細胞株とATL細胞株であるEDを用いてChIP-seqを行い、HTLV-1プロウイルス全長のヒストン修飾パターンを観察した。TBX-4Bと比較してEDでは転写活性に関わるH3K4me3とH3K9Acのヒストン修飾は5'LTR側では少なく、3'LTR側では多くみられた。3)転写制御機構の同定:転写制御機構を明らかにするために、ヒストンメチルトランスフェラーゼであるMLL、EZH2、SETDB1、クロマチンリモデリング因子のBRG1、転写因子であるAML1の抗体を用いてChIP-seqを行った。TBX-4Bと比較してEDでは、5'LTR側でBRG1とAML1のシグナルが減少していることが確認できた。本年度は二つの細胞株を用いてChIP-seqを行い、ヒストン修飾パターンの比較、転写制御機構に関わる因子の同定を行った。本年度に集積した患者PBMC検体を用いて、次年度にこれらの解析を行う。プローブを用いたウイルスDNA濃縮法と次世代シークエンサーを組み合わせた高精度なプロウイルスのエピジェネティクス解析法を用いたエピジェネティクスなアプローチにより、HTLV-1持続感染、そして成人T細胞白血病-リンパ腫(ATL)発症に関わるプロウイルスの転写制御機構を明らかにする。MNaseシークエンスとChIPシークエンスによりHTLV-1プロウイルスに新規エンハンサー領域がある可能性が示された。3'LTRはマイナスにコードされるHBZのプロモーターであることが知られているため、このNFRはそのエンハンサー領域の可能性があると考えた。そこでルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、このNFRのエンハンサー機能を検討した。HBZのプロモーターである3`LTRをプロモーターとして使用したベクターを作製し、NFRを含む領域と含まない領域をベクターに挿入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。NFRを挿入したベクターでは、約3倍のエンハンサー活性を認めた。さらに、8つの細胞株と4例のHTLV-1キャリア、11例のATL患者のPBMCを用いて、同領域のDNA配列解析を行った。その結果、各細胞株及び症例で塩基配列が高度に保存されていることが確認された。エンハンサー領域における転写因子結合予測をデータベースにおいて検索し、候補となる転写因子のChIP-seqをATL細胞株で行った。そのうち、Serum Response Factor(SRF)とEts-like transcription factor(ELK-1)の同領域への局在が確認された。ATL患者の末梢血単核球におけるChIP-seqでも、同領域にSRFとELK-1の存在が観察された。NFRの配列をプローブとして用いて、SRFとELK-1のゲルシフトアッセイを行った。抗SRF抗体、抗ELK-1抗体を加えることによって、スーパーシフトバンドが観察された。非症候性HTLV-1キャリアとATL患者のPBMC検体を用いて、ChIP-seqを使ったプロウイルスのエピジェネティクス解析と転写制御機構に関わる因子の同定を行っていく。また、研究の幅を広げ、HTLV-1プロウイルスの転写制御とATLの発症メカニズムをより詳細に解析するためにRNA-seqを行う。以前我々が報告したプローブを用いたエンリッチ法をRNAに応用して、HTLV-1プロウイルスのトランスクリプトームをより高感度に観察することが可能となる(Miyazato P, Sci Rep, 2016)。

これを用いて、HTLV-1の転写制御パターンのみならず、トランスクリプトームをキャリアとATL患者で比較し、これらの疾患の発症メカニズムとの関連を明らかにする。血液内科本年度は患者検体を収集し、細胞株を用いてヒストン修飾パターンと転写制御の因子を同定するためにChIP-seqに用いる抗体の探索を行った。患者検体を用いたChIP-seqを行わなかったため、予定額よりも少ない支出となった。患者検体を用いたChIP-seqを行うため、クロマチン免疫沈降用抗体、クロマチン免疫沈降用試薬、次世代シークエンス関連試薬の購入費として使用する。特に次世代シークエンサー関連試薬は高価なため、前年度よりも多くの購入費が必要となる。そして、これまで得られた研究成果を学術論文として発表するための諸経費(論文校正、投稿料、掲載料など)として使用する。
DNA相同組換え修復機能を標的とした乳がんの新規合成致死療法の開発

BRCA変異陽性乳がんのPARP阻害剤による合成致死療法では、PARP阻害剤耐性獲得が問題となっている。そこで、DNA2本鎖切断の相同組換え修復機能(HR)の抑制による耐性克服療法を開発し、その一般乳がんへの展開を目的とする。頻度の高い耐性獲得機序に、BRCA変異細胞におけるHR機能の回復がある。そこで、HR関連分子を抑制、再度、HRを低下させ、感受性を回復させる。この治療法は、耐性獲得症例のみならず、最初からHRが維持されPARP阻害剤無効な多くの乳がんにも有効な可能性があり、この相同組換え修復機能を標的とした新規合成致死療法の開発は、がん治療に大きく貢献することが期待される。
動的分子認識による精密分離系の構築

1.セルロースやアミロースのシクロアルキルカルバメート誘導体がHPLC用キラル固定相として高い光学分割能を有することを見いだした。また、UV吸収を有していないこれら誘導体をTLC用のキラル固定相に用いたところ、光学分割とUV照射によるスポットの検出に成功し、実用的なキラルTLCプレートとなりうることを明らかにした。また、キチンを用いて新規キラル固定相の開発を行い、3,5-ジメチル、および3,5-ジクロロフェニルカルバメート誘導体が高い光学分割能を示すことを見出した。キチン誘導体は溶媒への溶解性が低く、セルロースやアミロース誘導体のカラムでは使用することのできないクロロホルムなどの溶媒を溶離液に添加した系で分析を行うことが可能であり、様々な溶媒が使用可能な、分割能・耐久性の優れた実用性の高いキラル固定相になることを明らかにした。さらに、セルロース誘導体のシリカゲルへの固定化による、多様な分離条件に使用可能な次世代型キラル充填剤の開発についても成果を得た。(岡本)2.単一官能基キラル分子の絶対配置を励起子カイラリティー法で決定する方法の検討を行った。CD補助基として2つの発色団を持つアキラルなCD補助基を開発し、これを単一官能基のキラル分子に結合させるとキラリティーの伝播が生じて2つの発色団がキラル立体配座をとり、そのCDスペクトルが励起子分裂型Cotton効果をとることを見出した。分子の立体配座解析の理論計算と、実測CDと比較することで、もとの単一官能基化合物の絶対立体化学を決定できる。また、1個の分子が機械として作動する「分子機械」の1つである「光動力キラル分子モーター」を世界で初めて開発した。「ツメ歯車効果」により回転方向の制御に成功し、回転方向は分子のキラリティーにより制御され、光照射を繰り返すことで連続回転する。これを円二色性スペクトルで実証でき、光エネルギーで一方向のみに回転する「分子モーター」の構築に成功した。(原田)1.セルロースやアミロースのシクロアルキルカルバメート誘導体がHPLC用キラル固定相として高い光学分割能を有することを見いだした。(原田)1.新規多糖誘導体として、セルロースやアミロースのシクロヘキシル及びノルボルニルカルバメート誘導体、及びキチンのフェニルカルバメート誘導体を合成し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用キラル固定相に用いてその光学分割能を評価した。その結果、いずれも高い光学分割能を有し、芳香環を有していないアルキルカルバメート誘導体では、薄層クロマトグラフィー用キラル固定相へも応用可能であることを見出した。また、多糖誘導体の中で最も高い光学分割能を有する誘導体の一つである、アミローストリス(3,5-ジメチルフェニルカルバメート)の構造解析を二次元NMRにより行い、分子モデリングを併用することにより、そのモデルを構築することに成功し、さらにその不斉識別機構について、HPLC及びNMRを用いて詳細に検討を行った。(岡本)2.分子キラリティー認識の新規円二色性法の開発と応用を目的に、単一官能基キラル分子の絶対配置を励起子カイラリティー法で決定する新規戦略を立て、その方法を次のように開発した。(1)CD補助基として2個の(1-ナフチル)基をもつアキラル系を設計。(2)このCD補助基を単一官能基のキラル分子にエステルあるいはエーテル結合で結合。(3)キラリティーが伝播し、2個のナフタレン発色団はキラル立体配座を取る。(4)ねじれに対して励起子分裂型コットン効果が観測。(5)分子力場計算などで配座解析し、発色団間のねじれを理論的に決定。

(6)実測CDと比較し、絶対配置を非経験的に決定できた。(原田)3.研究課題に関係して調整班会議を開催し、各研究者の進捗状況及び今後の研究の進め方について討論した。1.多糖誘導体の不斉識別機構について検討を行うために、様々な手法によりコンピュータシミュレーション行って多糖誘導体と光学異性体との相互作用エネルギーを計算し、HPLCの結果と比較・検討した。その結果、実験結果を支持する計算結果が得られ、コンピュータシミュレーションが機構解明を行う一つの手段となることを明らかにした。また、最近、高い光学分割能を有することを見いだした多糖のシクロアルキルカルバメート誘導体のTLCへの応用を試みたところ、光学異性体の分離能力が高く、かつUV照射により検出可能である実用的なキラルTLCプレートの調製に成功した。TLCによる光学分割の結果はHPLCとよく対応しており、このプレートを用いることでHPLCにおける分離条件を短時間で手軽に求めることが可能になると考えられる。(岡本)2.物質科学研究の究極の目的の一つは「分子機械」の開発である。そこでは1個の分子が機械として作動する。我々は分子機械である「光動力キラル分子モーター」を世界で初めて開発した。この分子モーターは光動力機構をもち、また「ツメ歯車効果」により回転方向の制御に成功している。我々は先にねじれたオレフィン化合物の化学を報告してきた。また、光トランス-シス異性化で異常な片道反応を見いだした。今回、トランス型分子の光反応に実は不安定な1次生成物が存在することを見いだし、これが安定なシス体に変化する。これが片道通行となり、「ツメ歯車効果」として逆回転を阻止する。シス分子も同様のことを繰り返して、結局一回転して原形にもどる。この際、回転方向は分子のキラリティーにより制御される。光照射を繰り返すことで連続回転し、その事はCDスペクトルで実証できた。(原田)3.研究課題に関係して公開シンポジウムを開催し、各研究者がこれまでに得られた結果について発表を行い、さらに今後の研究の進め方について討論した。1.高い光学分割能を有することを見出したセルロースやアミロースのシクロアルキルカルバメート誘導体の不斉識別機構について、NMRを用い検討を行った。特にバイナフトールとセルロースシクロヘキシルカルバメート誘導体の系については、二次元NMRでNOE相関ピークを観測するなど、分子レベルでの知見を得ることができた。また、シクロカルボキシレート誘導体の合成も行い、逆相系で高い光学分割能を有することを見出した。さらに、多糖誘導体が溶解・膨潤する溶媒を溶離液に使用することが可能な耐久性を有する固定相を調製するために、多糖誘導体にビニル基を導入し、シリカゲル上でスチレンとの共重合を行った。その結果、多糖誘導体の光学分割能を損なうことなく、シリカゲル上に多糖誘導体を固定化することに成功し、クロロホルムなどの溶媒を溶離液に添加することが可能な対溶媒性の高いキラル固定相を調製することができた。(岡本)2.単一官能基をもつ系の絶対配置を決定するために、CD励起子法を用いる新規方法の開発を行った。(1)種々のキラルなモノアミンに対して本法を適用した。CD補助基をもつアミド
出血性ショック時の静脈麻酔薬の薬物動態力学への影響

持続投与されたレミフェンタニル濃度は出血性ショックの進行に伴い上昇し、併用されるプロポフォール濃度の3倍速く上昇する。この結果は術前や術中に大きな出血を伴う症例ではプロポフォールに比較してレミフェンタニルを大きく減じる必要があることを示している。またレミフェンタニル濃度は麻酔深度やカテコラミン投与など術中さまざまな要因で変化する心拍出量に影響を受ける。この程度は出血性ショックでの結果とは異なり、併用されるプロポフォールと同程度であったが、両薬剤ともに心拍出量の上昇時より低下時に大きく影響を受ける。この結果は低心拍出量時には両薬剤とも予想される血液濃度より大きく増加していることを示している。本年度は科研申請時の平成25年度に計画した出血性ショック時にオピオイドが脊髄における感受性を変化させるかまず検討した。5例の実験結果では0.5MAC(約1%)のイソフルラン投与下でレミフェンタニルを大量投与してもクランプによる体動をはっきりと止めることができず実験続行不能と判断した。<動物準備>体重25kg前後のブタを4匹(予定では10匹以上)用いた。イソフルラン吸入により麻酔を導入し、気管切開、人工呼吸下にイソフルランを呼気終末濃度2%で維持した。大腿動脈に観血的動脈測定ライン(および脱血ライン)、右内頚静脈に肺動脈カテーテル(5F)、中心静脈カテーテル(18G)を留置した。<実験手順>まずブタのイソフルランの1MAC(約2%)を呼気終末濃度2%から四肢をクランプし体動の有無を観察し決定した。決定後、0.5MACのイソフルラン投与下にレミフェンタニルを5γで持続投与し、2分毎四肢をクランプ、体動消失までレミフェンタニルを投与した。次にブタを循環血液量40%の脱血により出血性ショックにして、ショック時の1MACshockを決定後、その0.5MACshock下で2γのレミフェンタニルを持続投与し2分毎四肢をクランプ体動消失までレミフェンタニルを投与した。それぞれクランプ直前にレミフェンタニル濃度採血をした。<結果>コントロールにおけるイソフルランのMACは2.2±0.2%であった。0.5MAC下でレミフェンタニルを5γで持続投与するも体動消失がみられず。投与量を20γまで増加したが、四肢クランプに反応するシバリング様の体動が消失しなかった。また血圧や心拍数の増加もみられ、この投与量では侵害刺激を抑制できていないと考えられた。今後この実験を継続する場合はレミフェンタニルの投与量をさらに高量にする必要があるが、現在検討中である。<実験概要>本年度は科研申請時の計画を変更し、新たに近年本邦の全身麻酔で頻用されるレミフェンタニルの薬物動態が術中さまざまな要因で変動する心拍出量の変化によってどのように影響を受けるか、その変化はレミフェンタニルと同時使用されることがきわめて多いプロポフォールと違いがあるのか、ブタにおいて検討した。<動物準備>体重25kg前後のブタを10匹用いた。イソフルラン吸入により麻酔を導入し、気管切開、人工呼吸下にイソフルランを1.5%で維持した。大腿動脈に観血的動脈測定ライン(および脱血ライン)、右内頚静脈に肺動脈カテーテル(心拍出量測定用)、中心静脈カテーテル(レミフェンタニルおよびプロポフォール投与ルート)を留置した。<実験手順>動物準備完了後、レミフェンタニルを0.5 microg/kg/minで開始し同時にプロポフォールを2 mg/kgボーラス投与後6 mg/kg/hで持続投与した。安定後に基準値(基準値1)を測定完了後、ドブタミン20 microg/kg/min投与およびイソフルラン中止により心拍出量を増加させ60分間維持した(高心拍出量状態)。次にドブタミンを中止およびイソフルランを再開し60分間維持し基準値に戻した(基準値2)。最後にイソフルランを3%に増加させ60分間維持し心拍出量を低下させた(低心拍出状態)。それぞれの状態で血行動態およびレミフェンタニル、プロポフォール濃度を測定した。<結果>心拍出量の増加または低下に伴いレミフェンタニル、プロポフォール濃度は低下または増加した。それぞれ濃度は以下の式で表された。レミフェンタニル濃度(ng/ml) = 17.5/心拍出量(l/min)+4.52;プロポフォール濃度(microg/ml) = 3.34/心拍出量(l/min)。両薬剤の心拍出量変化に対する濃度変化への影響は同程度であったが、心拍出量低下時に特に濃度への影響が大きかった。

本年度は科研申請時の平成24年度に計画した出血性ショック時のレミフェンタニルの薬物動態力学的検討を先に行った。<動物準備>体重25kg前後のブタを10匹用いた。イソフルラン吸入により麻酔を導入し、気管切開、人工呼吸下にイソフルランを呼気終末濃度2%で維持した。大腿動脈に観血的動脈測定ライン(および脱血ライン)、右内頚静脈に肺動脈カテーテル(5F)、中心静脈カテーテル(18G)を留置した。<実験手順>動物準備完了後イソフルランを中止し。プロポフォールを2 mg/kgボーラス投与し、以後6 mg/kg/hrの持続投与した。同時にレミフェンタニルを0.5 μg/kg/minで持続投与開始した。60分後より以後30分間隔で大腿動脈より以下の量を段階的に脱血した。60分後予想循環血液量の10 %(推定全循環血液量体重×70 mlで算定)脱血、90分後10%(合計20%)、120分後10%(30%)、150分後5%(35%)、180分後5%(40%)、210分後5%(45%)、240分後5%(50%)と死亡するまで次の脱血を始める直前に採血をして両薬剤の濃度測定をした。<結果>913±82mlの血液が脱血された。出血性ショックが代償期(体血管抵抗のピークまでと定義、以後を非代償期とみなした)にある状態ではレミフェンタニルの濃度上昇率(%)=2.1×総脱血量(%循環血液量)、プロポフォールの濃度上昇率(%)=0.7×総脱血量(%)で表され、非代償期ではレミフェンタニルの濃度上昇率(%)=27.4×総脱血量(%)、プロポフォールの濃度上昇率(%)=9.5×総脱血量(%)であった。<結論>進行する脱水から出血性ショックの過程においてレミフェンタニルはプロポフォールの約3倍濃度上昇が速い。またどちらも非代償期になると代償期の約15倍濃度が上昇することが判明した。昨年度の実験はプロトコールの再考の必要があるが、それ以外はおおむね順調である。平成23年度は科研申請時の平成24年度に計画した出血性ショック時のレミフェンタニルの薬物動態力学的検討を先に行ったが、平成24年度予定の研究が平成23年度内に完全に遂行でき、成果を海外誌に掲載することができた。平成25年度は平成23年度予定の研究を推進する予定。平成25年度の研究予定概略出血性ショック時のプロポフォールの鎮静、体動抑制効果を同時に調べた我々の以前の実験と同じプロトコールを用い、コントロール群(出血性ショックなし)、ショック後にヒドロキシエチルスターチで蘇生した群、ショック後に輸血(脱血した血液を返血)で蘇生した群でプロポフォールの効果を調べ、プロポフォールの薬物動態力学的変化を比較する。出血によって増強する効果を回復できるか検討する。<実験手順>上記3群のいずれかの病態を作成後、イソフルランを中止する。プロポフォールを中心静脈ルートより50mg/kg/h(すべての動物で侵害刺激に対する体動が消失する投与量)で持続投与を開始する。投与開始から2分毎に大腿動脈より採血し(濃度測定用)、以後ブタに自発的体動がみられるまで採血を2分毎繰り返す。同時に2分毎、上肢を鉗子でクランプし、体動がみられるか観察。もし体動がみられなくなったら、次の採血ポイントでプロポフォールの持続投与を中止する。この間、脳波の測定も記録し、脳波および侵害刺激に対する体動の両方の薬物力学的反応をプロポフォール濃度と解析する。