hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域中小企業経営における雇用・人事システムの実態と課題に関する調査研究

国際比較の観点から行った外国調査では日系企業が多く進出しているタイ王国の製造業中小企業の成長を考察したが、製造業大企業からのスピンアウト組が少なく、日本の発展段階と大きく異なっており、雇用安定機能は大企業に依存しているといえる。本年度は地域における中小企業の雇用・人事システムの特徴と課題を把握するため、既存資料の収集・情報交換および昨年度のヒアリング調査をもとに地域企業へのアンケート調査を行った。アンケートは大分市内に本社をおき従業員規模10名以上の地域企業1409社に対して行い、うち397社からの有効回答をえた。回収率は28.2%であった。調査では地域企業の人事評価制度、採用・教育、賃金、人事管理上の課題について質問を行い、地域企業の人的資源管理の現状を調べた。まず、人事評価制度の実施では正社員規模に比例して実施企業が増加する傾向がみられ、地域企業では定期的な人事評価制度の実施は少ないものの、不定期な人事評価はかなり行われている。また、地域企業における人事評価制度の過去5年における変化は、処遇格差の拡大や業績・成果ウエイトの上昇という傾向がみられ、業績主義化の方向がみられるが、改革は行わない企業も評価制度をもつ企業の4分の1を占め、方向性は一様ではない。採用では過去3年増加傾向にあったが、今後社員を採用しない企業が増加し、雇用吸収力の低下がみられる。また、採用計画未定の企業が多く、経済の先行き不透明感は地域企業においても採用意欲を鈍らしている。これは正規だけでなく非正規雇用でも同様である。一方で、定年制の延長など高年者の活用が積極的に行われ、新規採用を控えるなかで高齢者=経験者の活用が進んでいる。能力開発では必要に応じて行う企業が多く、組織的・計画的な実施は少ない。賃金では人事評価と連動し、現在の職務遂行能力から仕事の業績ウエイトを上げる傾向がみられる。人事管理の課題では採用抑制を反映して、高齢化問題や従業員の能力開発といった既存の人的資源をいかに活用するかといった課題が重視されていく傾向にある。最終年度ではこれら4項目の相互の関連性について明らかにしていく。本年度は、昨年度に実施した大分市内の企業の人事・雇用管理に関するアンケート調査を分析し、それを公表した。そこでは、次のような人事管理の特徴が明らかになった。何らかの職能資格制度を設けている企業は約半数にすぎず、人事評価についても定期的に行っている企業は3分の1程度と少ない。人事評価を行っている場合、そこで重視されている点は、「仕事上の能力」がもっとも多く、「仕事上の業績、成果」、「仕事への取り組み姿勢」がそれに続いている。業績評価の指標については、「適当な数量指標がない」とする企業がもっとも多いが、次いで多いのは「個人別売上げ」「目標達成度」である。評価結果は、昇給・賃金の決定、ボーナスの査定に用いている企業が多い。最近の人事考課制度の変化では「処遇格差を大きくした」「能力のウェートを下げ、業績・成果ウェートを上げた」「具体的な数量目標を活用」「評価結果を本人に説明」の4項目が中心になっている。採用管理の面をみると、30歳以上の中途採用の労働市場が活性化していることがうかがえる。ただし、規模の大きな企業では新卒採用が中心であり、中途採用は新卒採用の補完的な役割にとどまる。
都市型水害軽減化のための地域の時空間情報技術活用に関する研究

本研究では、土地の被災危険性を把握し事前・事後対策に役立てるため、地域の水害に対する脆弱性を明らかにし、情報技術を活用し都市型水害を誘発する時空間情報のデータ整理・解析・表示手法の検討を行った。本年度は、引き続き、横浜市において2004年10月台風22号による水害履歴の時空間情報化を行った。これまでに対象とした横浜駅西口、保土ヶ谷区今井川周辺に加え、本年度は、栄区の柏尾川・いたち川合流地点付近を中心とした浸水エリアを地図化し、航空レーザー測量による高精度の標高データを用いて微地形を把握し、浸水被害との関連性を分析した。また、地域住民や自治体へのヒアリング等をふまえ、浸水危険箇所の地図化手法、危険情報の収集・提供手法のあり方、これらの情報を用いた災害時要援護者支援手法について検討するとともに、各種標高データ精度を比較した。さらに、道路冠水図や浸水住家リストなど水害に関する行政資料をGISデータ化し、浸水箇所の地形的特性を解析した。一方、保土ヶ谷区民を対象としたワークショップ方式の災害履歴調査を実施し、具体的な経験に基づく風水害情報の集約を試み、その有効活用手法を提案した。情報は居住地周辺に偏在し、地域全体を把握している住民は少なく、地域に長く滞在している住民が詳しい傾向があるが、本調査を通し、地域コミュニティに現存する災害情報の多様性・可能性を確認できた。また、住民は詳細な情報が防災対策に広く活用されることを望んでいることがわかった。また、研究発表会等に参加し、分野横断的・地域的視点から都市型水害軽減化のための地域の時空間情報技術に関する知見を得た。さらに、水害以外に土砂災害、地震・津波災害等も対象に、行政機関等における災害情報共有システム、ハザードマップの整備状況や各種データ等の技術開発・社会動向調査を行い、GISを用いた地域時空間情報提供システムの可能性について検討した。本研究では、土地の被災危険性を把握し事前・事後対策に役立てるため、地域の水害に対する脆弱性を明らかにし、情報技術を活用し都市型水害を誘発する時空間情報のデータベース化・解析・表示手法の検討を行う。本年度は、GIS(地理情報システム)上で航空レーザー測量による高精度の標高データにより微地形を把握し、浸水被害との関連性の分析を行った。まず、水害履歴の地図化を行うため、床上・床下浸水住家の住所記録を元に標高を考慮し浸水エリアを推定する手法を検討した。次に、微地形を考慮し集中豪雨による浸水シミュレーションを行った結果、被害地点を街区レベルで再現でき、市街地の水害対策における高精度DEMデータの利用可能性が高いことがわかった。今後きらに、雨量、河川・下水道整備状況、河川ポンプ処理能力、遊水地等の貯留容量や都市開発状況等の社会的背景を考慮し、土地条件図や古地図等の既存の地図情報も参照する。また、2004年10月に台風22号で浸水した横浜駅西口周辺を対象に浸水高の実測調査と住民へのヒアリング調査を元に浸水エリアを地図化した。これらの水害履歴、地形(2.5m、10m、25m、50mメッシュ各標高データ)、雨量観測点と雨量、土地被覆、建物、雨水処理施設等のデータをGIS上で一元化し、本研究の中で最も重要な時空間データベースの構築を進めた。今後これらのデータを利用し、水害履歴や危険エリア抽出に必要なデータ精度、汎用性についてさらに検討を行う。さらに、2004年7月には福井水害の現地調査を行うとともに、新潟水害や豊岡水害等、今年度、各地で発生した水害の情報収集を行った。また、行政や公共公益機関における災害情報収集・提供システム、ハザードマップの整備状況や各種データ等の技術開発状況について情報収集を行った。本年度は、昨年度に引き続き横浜市において2004年10月に発生した台風22号による水害履歴の時空間情報化を行った。昨年度、対象とした横浜駅西口周辺に加え、本年度は、保土ヶ谷区今井川周辺の浸水被害エリア(床上浸水73棟、床下浸水23棟)について地図化し、航空レーザー測量による高精度の標高データを用いて微地形を把握し、浸水被害との関連性を分析した。また、地域住民や自治体へのヒアリング等をふまえ、ミクロスケール(街区レベル)での浸水危険箇所の地図化手法、危険情報の収集・提供手法のあり方、デジタルアーカイブの利用可能性について検討した。さらに、既設の雨量観測点と台風22号に関する雨量データを整理した。今後、これらのデータを利用し、河川・下水道整備状況、河川ポンプ処理能力、遊水地等の貯留容量や都市開発状況等の社会的背景も考慮し、土地条件図や古地図等の既存の地図情報も参照しながら、水害履歴や危険エリア抽出に必要なデータ精度、汎用性についてさらに検討を行う。また、建築学会、土木学会、地域安全学会等の研究発表会に参加し、分野横断的視点・地域的視点から都市型水害軽減化のための地域の時空間情報技術に関する知見を得た。さらに、水害以外に土砂災害、地震・津波災害、高潮災害なども対象に、行政や公共公益機関における災害情報収集・提供システム、ハザードマップの整備状況や各種データ等の技術開発・社会動向調査を行い、GISを用いた地域時空間情報提供システムの可能性について検討を行った。

本研究では、土地の被災危険性を把握し事前・事後対策に役立てるため、地域の水害に対する脆弱性を明らかにし、情報技術を活用し都市型水害を誘発する時空間情報のデータ整理・解析・表示手法の検討を行った。本年度は、引き続き、横浜市において2004年10月台風22号による水害履歴の時空間情報化を行った。これまでに対象とした横浜駅西口、保土ヶ谷区今井川周辺に加え、本年度は、栄区の柏尾川・いたち川合流地点付近を中心とした浸水エリアを地図化し、航空レーザー測量による高精度の標高データを用いて微地形を把握し、浸水被害との関連性を分析した。また、地域住民や自治体へのヒアリング等をふまえ、浸水危険箇所の地図化手法、危険情報の収集・提供手法のあり方、これらの情報を用いた災害時要援護者支援手法について検討するとともに、各種標高データ精度を比較した。さらに、道路冠水図や浸水住家リストなど水害に関する行政資料をGISデータ化し、浸水箇所の地形的特性を解析した。一方、保土ヶ谷区民を対象としたワークショップ方式の災害履歴調査を実施し、具体的な経験に基づく風水害情報の集約を試み、その有効活用手法を提案した。情報は居住地周辺に偏在し、地域全体を把握している住民は少なく、地域に長く滞在している住民が詳しい傾向があるが、本調査を通し、地域コミュニティに現存する災害情報の多様性・可能性を確認できた。また、住民は詳細な情報が防災対策に広く活用されることを望んでいることがわかった。また、研究発表会等に参加し、分野横断的・地域的視点から都市型水害軽減化のための地域の時空間情報技術に関する知見を得た。さらに、水害以外に土砂災害、地震・津波災害等も対象に、行政機関等における災害情報共有システム、ハザードマップの整備状況や各種データ等の技術開発・社会動向調査を行い、GISを用いた地域時空間情報提供システムの可能性について検討した。
圧負荷による心肥大の細胞内情報伝達経路及び心筋細胞に特異的な成長因子の同定と解析

我々は、心筋細胞に伸展刺激を加える独自の装置を用いて心筋細胞肥大に関与する細胞内情報伝達経路を解析し、これまでに、伸展刺激により、Cキナーゼ(PKC)、extracellular signal-regulated kinases(ERKs)の活性化がおこり、核内癌遺伝子の発現や、蛋白合成が増強されることを明らかにしてきた。しかし、伸展刺激によるERKの活性化に至る経路は未だ不明である。そこで、新しい手法を用いてERKの上流について検討した。強力な心肥大作用のあるノルアドレナリン(NA)は,心筋細胞のα1及びβ受容体に結合後,それぞれPKC,PKAを活性化し心肥大を惹起すると考えられるが,その詳細は不明である。また,心筋細胞以外の細胞では,活性化したPKAは,PKCとは逆に,Raf-1キナーゼ(Raf-1)/MAPキナーゼ(MAPK)カスケードを制御し,細胞の増殖分化を抑制する。このことは,心筋細胞独自の細胞内情報伝達経路を示唆している。そこで,心筋細胞におけるNAの細胞内情報伝達経路を解析し,その特異性を明らかにした。ラット新生仔培養心筋細胞にNA刺激を加え,Raf-1,MAPK活性を解析した。また,実際の心肥大の指標としてフェニルアラニンの取り込みを解析した。さらにα1及びβ受容体の阻害薬プラゾシン,プロプラノロールで前処置後NA刺激を行い,同様に解析した。その結果,Raf-1,MAPKが,それぞれNA刺激2分,8分をピークに一過性に活性化し,24時間後のフェニルアラニンの取り込みも1.95倍に上昇した。さらに,受容体阻害薬による前処置実験から,NAはα1及びβ受容体の両者を介して心肥大のシグナルを伝達し,NAのα1またはβ受容体単独刺激では,NAによる心肥大シグナル全体の2646%,2537%に過ぎなかった。また,α1及びβ受容体の特異的刺激薬フェニレフリン,イソプロテレノール刺激でMAPK活性がそれぞれ約3.5倍,3.0倍,両者の併用で約9.0倍に上昇した。以上より,NAによる心筋細胞肥大の情報伝達経路にはα1及びβ受容体の両者が関係し,そのいずれもRaf-1/MAPKカスケードを活性化させ,さらに,両受容体を介したシグナルが相乗的に作用して肥大を引き起こすことが判明した。このことは,複数の情報伝達経路のクロストークの存在を示している。また,β受容体→PKA→Raf-1/MAPK→心肥大は,心筋細胞特異的な細胞内情報伝達経路である。
高耐久性永久型枠のコンクリート接合面の最適化に関する研究

耐震性、耐久性、耐火性に優ぐれている鉄筋コンクリートの建物を、省力化、省資源化、さらに工期短縮して建設できる施工法の実現を目的として、高耐久性永久型枠の開発を研究した。セメントを主原料とする高強度で高耐久性の素材に着目し、コンクリートとの接合性能に優れた内面形状をした永久型枠の作成を試み、コンクリートの打設後は取り外すことなくそのままコンクリートと一体化し構造体の一部とした場合に、永久型枠とコンクリートの接合が十分に保たれているかどうかを試験により調べた。セメント、硅砂、シリカヒュウム、減水剤、炭素繊維、耐アルカリガラス繊維を用いて、水セメント比を小さくした調合で混練成形したものを素材とすることにより、現場コンクリート打ちに用いる型枠材としての加工やハンドリングに十分に耐える強度をもち、ひびわれの発生が少なく中性化が極めて遅いので鉄筋の防錆性能に優れた永久型枠を得ることができることが明らかになった。さらに亜鉛メッキ金網を半分埋め込んだ内面形状と、蟻足型の凹みを設けた内面形状の永久型枠を作成し、これらを用いた試験体の部分圧縮試験により永久型枠とコンクリートの接合面に応力が作用したときのひずみを計測し、試験体に生じる部分的な損傷を観察し、接合面に生じる応力の分布と部分的な剥離を弾塑性解析により解明した。断塑性解析においては、型枠に生じるひずみの変化率を示すコンプライアンスを用いて接合面の応力伝達の状態を評価したことにより、有用な知見が得られた。これらの知見をもとに、型枠とコンクリートの接合面の性状を、すべり発生面積、すべり発生時の伝達応力および剥離発生面積で指標化し、型枠ボードの表面に付けた凹みの形状または半分埋め込んだ金網の形状と接合性能の相関を明らかにした。打込み型枠工法による鉄筋コンクリート構法において、高耐久性を有する耐アルカリガラス繊維補強セメントパネルを打込み型枠に適用するのに必要であるパネルとコンクリートの接合性能について研究した。解析と実験から型枠パネルとコンクリートの接合面の強度と耐久性を調べ、最適な接合面を得るための型枠の材質と形状を明らかにした。解析と実験の具体的な内容は以下である。蟻足状に加工したリブを設置して表面に凹みを付けたパネルと、亜鉛ひき亀甲金網を半分埋め込んだパネルを打込み型枠とした鉄筋コンクリートの試験体を作製し、部分圧縮試験により型枠パネルとコンクリートの接合面に応力が作用したときのひずみを計測し、試験体に生じる部分的な損傷を観察した。試験体の型枠パネルとコンクリートの表面のひずみの計測結果と、試験体の局部的な損傷の観察結果から、接合面に生じる応力の分布と部分的な剥離を弾塑性数値計算により解析した。接合面の応力伝達の状態は、型枠パネルに生じるひずみの変化率を示すコンプライアンス、すべり発生面積、すべり発生時の伝達応力、剥離発生面積で指標化し、型枠パネルの表面に付けた凹みの形状または半分埋め込んだ金網の形状との相関を明らかにした。この結果から、接合性に優れる型枠パネルを用いることにより鉄筋コンクリートの部材を、建築構造物の躯体に適用した場合に、構造設計上の許容応力度の範囲において接合面の体性が保たれることを明らかにした。

セメント、硅砂、シリカヒュウム、減水剤、炭素繊維、耐アルカリガラス繊維を用いて、水セメント比を小さくした調合で混練成形したものを素材とすることにより、現場コンクリート打ちに用いる型枠材としての加工やハンドリングに十分に耐える強度をもち、ひびわれの発生が少なく中性化が極めて遅いので鉄筋の防錆性能に優れた永久型枠を得ることができることが明らかになった。さらに亜鉛メッキ金網を半分埋め込んだ内面形状と、蟻足型の凹みを設けた内面形状の永久型枠を作成し、これらを用いた試験体の部分圧縮試験により永久型枠とコンクリートの接合面に応力が作用したときのひずみを計測し、試験体に生じる部分的な損傷を観察し、接合面に生じる応力の分布と部分的な剥離を弾塑性解析により解明した。断塑性解析においては、型枠に生じるひずみの変化率を示すコンプライアンスを用いて接合面の応力伝達の状態を評価したことにより、有用な知見が得られた。これらの知見をもとに、型枠とコンクリートの接合面の性状を、すべり発生面積、すべり発生時の伝達応力および剥離発生面積で指標化し、型枠ボードの表面に付けた凹みの形状または半分埋め込んだ金網の形状と接合性能の相関を明らかにした。
軌道自由度を考慮したスピンホール効果の理論

スピンホール効果の発現機構について興味が持たれ、現在も盛んに研究されている。特に、発現機構の中でも内因性または外因性機構のどちらが如何なる条件下で優位に働くかの発現条件に古くから注目が集まっている。しかしこれについては未だ理解が進んでいない。具体的には、低抵抗領域においてはスキュー散乱項が不純物濃度の逆数に比例して増大するため、不純物濃度に依存しない内因性項を凌駕すると考えられている。しかしその具体的な条件、すなわち定量的な不純物濃度や不純物ポテンシャルの具体的な表式等が理解されていない。そのような中で、本研究では先行研究に基づき内因性及びスキュー散乱項に対して同じ条件で理論計算を実行した。ここで用いた模型としては、以前遷移金属において内因性項を計算した強束縛模型に基づき線型応答理論を用いて計算を行った。その際、不純物散乱効果として局所不純物に由来するT行列に基づき計算を行い、低抵抗領域でスキュー散乱項が内因性項を凌駕する条件を調べた。結果的に先ずPtにおいては、スキュー散乱項が内因性項を凌駕するのは不純物濃度n_<imp>が1.5×10^<-3>以下であるという条件が求まった。すなわち、局所不純物に由来するスキュー散乱機構が内因性機構に比べて優位に働くのは不純物濃度が非常に小さい条件のみであり、このような品質の高い資料を作成するのが極めて困難であると考えられるため、実験で用いられる現実的な試料では内因性機構が支配的である。またPt同様、その他の遷移金属に対しても理論計算を行ったところ、スキュー散乱項が内因性項を凌駕する不純濃度に差はあるが、多くの物質に対して1%以下という非現実的な条件下のみでの優位性が明らかとなった。内因性項同様、スキュー散乱項及びサイドジャンプ項両方ともにスピン軌道偏<I・S>を用いて表現できる。そのため大きな内因性機構を示した遷移金属を不純物として用いる事で、それに由来して大きな外因性機構が発現すると考えられる。このように軌道自由度を有する不純物に由来する外因性機構に基づきより巨大なスピンホール効果及び高効率なスピン変換効率を持つ物質・合金の更なる研究が期待される。スピンホール効果の発言機構の中でも外因性機構に関して理解が遅れたいた。そのような中で我々は遷移金属不純物に由来するスキュー散乱項及びサイドジャンプ項を単一不純物Anderson模型に基づき理論解析する事に成功した。結果として内因性項同様、外因性項もスピン軌道偏極<I・s>を用いて表現できる事が明らかになった。この事実に基づき、内因性及び外因性項を同様の観点から比較することができる。また導出した外因性項の表式に基づき解析を行うと、Cu等の単純金属中のdiluteなPtに由来するサイドジャンプ項の寄与は、Pt単体の内因性項の寄与と同程度である事がわかった。これとは対照的に、スキュー散乱項は大きくない。スピンホール効果同様、異常ホール効果の起源及び発言機構に関する議論は長年の未解決問題である。今回、M.-H.KimらがCa_xSr_<1-x>RuO_3におけるAC異常ホール伝導度を測定することに成功し、この系における異常ホール効果の起源を理解するため、内因性項の理論計算と比較した。本研究を通して、DCに限らず有限のωにおけるσ_<xy>(ω)の振る舞いを通して異常ホール伝導度を解析する事で、発現機構に関する長年の未解決問題を解決する糸口になると期待される。以前の我々の研究から、Berry曲率項では準粒子減衰率γ→0に限り正しくACを解析するには不十分である事がわかっていた。従って、本研究で有限のγにおける正しい内因性項の表式に基づく理論解析と実験とを比較し、内因性か外因性機構かを見極めた。結果として、σ_<xy>(ω)及びσ_<xx>(ω)を再現する事に成功し、実験結果は本質的に内因性機構で説明できる事がわかった。また内因性項の中で、Berry曲率項はγ→0の近似式であるため説明できず、これとは対照的にFermi surface項が本質的役割を果たす。

すなわち、局所不純物に由来するスキュー散乱機構が内因性機構に比べて優位に働くのは不純物濃度が非常に小さい条件のみであり、このような品質の高い資料を作成するのが極めて困難であると考えられるため、実験で用いられる現実的な試料では内因性機構が支配的である。またPt同様、その他の遷移金属に対しても理論計算を行ったところ、スキュー散乱項が内因性項を凌駕する不純濃度に差はあるが、多くの物質に対して1%以下という非現実的な条件下のみでの優位性が明らかとなった。内因性項同様、スキュー散乱項及びサイドジャンプ項両方ともにスピン軌道偏<I・S>を用いて表現できる。そのため大きな内因性機構を示した遷移金属を不純物として用いる事で、それに由来して大きな外因性機構が発現すると考えられる。このように軌道自由度を有する不純物に由来する外因性機構に基づきより巨大なスピンホール効果及び高効率なスピン変換効率を持つ物質・合金の更なる研究が期待される。研究の進展が遅れていたスピンホール効果における外因性機構に対して理論解析に成功し、その中のサイドジャンプ項と内因性項と間の非自明な関係性が明らかになった。この事に加えて、AC異常ホール効果に対して実験家との共同研究をさせて頂いている。DCではなく有限のωにおける振る舞いを通して発現機構の解明をする糸口になると考えられるため、本研究を通してCa_xSr_<1-x>RuO_3における異常ホール効果の起源の解明を試みた。結果的に、実験結果が内因性項で再現でき、内因性機構で説明できる事がわかった。近年、Yb系における化合物を作成できるようになったので、これら重い電子系おける異常ホール効果が実験で測定する事ができるようになってきた。この系における異常ホール効果の理論的研究はFertらの外因性機構に限られていたが、これらの理論解析では実験を十分に説明できない等の問題があった。また、今までの理論解析は有効模型に基づく物のみで、重い電子系における現実的な模型に基づく理論解析はなされてない。そこで本研究では初めに現実的な模型を構築し、その模型に基づき内因性項を理論計算する。その結果と実験と比較する事で、重い電子系における異常ホール効果の発現機構に対する理解を試みる。
時計遺伝子による分娩発来の制御機序の解明

適期の分娩発来を促す機序の解明は、早産や遅産を防止する手法の開発につながり、家畜とともに、ヒトの分娩時の母子の安全を守る上でも有用である。本研究では、適期の分娩発来に関わる機序の一環として、睡眠など、特定の時刻(時期)に起こる生命現象を制御する時計遺伝子と、分娩発来の時期との関係を明らかにする。今年度は時計遺伝子と分娩開始時刻との関連を明らかにするため、野生型マウス(WT)同士、及び時計遺伝子を人為的に欠損したマウス(KO)同士の雌雄を交配させ、得られた妊娠雌マウスの分娩開始時刻を調査した。一方、特定の時間(時期)に起こる生命現象は、時計遺伝子の他、環境からの時間を告げる刺激(昼と夜のような環境の時間的変動)の影響も受ける可能性がある。そのために本研究では、分娩が開始する交尾後18日目以降、12時間の点灯と消灯の繰り返し(明暗条件)、及び終日消灯(恒暗条件)とした動物室にて、それぞれWT同士及びKO同士の交配から得た妊娠雌マウスを飼育し、分娩時刻制御における時計遺伝子の作用と環境の明暗の作用の両方の検出を試みた。その結果、恒暗条件下のWT同士の交配にて、交尾後19日の午後から20日の夜明けに分娩開始が集中する傾向を認めた。一方、恒暗条件下のKO同士の交配では、分娩開始は特定の時期に集中せず、交尾後19日の午後から21日にかけ分散していた。この結果に基づき、今後は交尾後19日の分娩開始直前に、WT同士、及びKO同士の交配の雌マウスから血清や卵巣を採取し、分娩誘起に関わるホルモン濃度や、その分泌組織である卵巣黄体などにおけるホルモン合成関連の遺伝子発現を比較する。一方、明暗条件下のWT同士の交配では、恒暗条件下のWT同士の交配に比べ、分娩時期が0.5日程度有意に早まっており(P<0.05)、分娩直前の時期の環境の明暗が、分娩時期の決定に関わる新要因として提示された。分娩誘起に関わるホルモン制御などの生理機構と時計遺伝子との関連を調べるためには、分娩直前の時計遺伝子を人為的に欠損したマウス(KO)と野生型マウス(WT)から血清などのサンプルを採取し、ホルモン濃度を比較するなどの検討が必要である。そのためには、WTとKOの分娩時刻の詳細を調べ、あらかじめサンプル採取に最適なタイミングを決定する必要がある。また、分娩時の環境の明暗の繰り返しが分娩時刻に与える影響を明らかにしておくことにより、時計遺伝子の分娩時刻への関与について、より詳細な解析が可能となる。今年度はこれらの検討を全て終了することができ、すでに血清サンプルの回収を開始している。以上から、本課題はおおむね順調に進展していると判断した。時計遺伝子と分娩時刻との関連を解析するために、WT同士の交配、及びKO同士の交配の雌マウスから血清や卵巣を採取し、プロジェステロンや、その分解度を示す20α-ジヒドロプロゲステロンといった血中のホルモン濃度や、ホルモン分泌組織である卵巣黄体などにおけるホルモン合成関連の遺伝子発現を比較する予定である。また今年度は分娩直前の明暗の繰り返しが分娩時刻を早めることも明らかにしており、例えば、その明暗の長さの変更や、照明の照度などが分娩時刻に影響する可能性も検討していく予定である。

分娩誘起に関わるホルモン制御などの生理機構と時計遺伝子との関連を調べるためには、分娩直前の時計遺伝子を人為的に欠損したマウス(KO)と野生型マウス(WT)から血清などのサンプルを採取し、ホルモン濃度を比較するなどの検討が必要である。そのためには、WTとKOの分娩時刻の詳細を調べ、あらかじめサンプル採取に最適なタイミングを決定する必要がある。また、分娩時の環境の明暗の繰り返しが分娩時刻に与える影響を明らかにしておくことにより、時計遺伝子の分娩時刻への関与について、より詳細な解析が可能となる。今年度はこれらの検討を全て終了することができ、すでに血清サンプルの回収を開始している。以上から、本課題はおおむね順調に進展していると判断した。時計遺伝子と分娩時刻との関連を解析するために、WT同士の交配、及びKO同士の交配の雌マウスから血清や卵巣を採取し、プロジェステロンや、その分解度を示す20α-ジヒドロプロゲステロンといった血中のホルモン濃度や、ホルモン分泌組織である卵巣黄体などにおけるホルモン合成関連の遺伝子発現を比較する予定である。また今年度は分娩直前の明暗の繰り返しが分娩時刻を早めることも明らかにしており、例えば、その明暗の長さの変更や、照明の照度などが分娩時刻に影響する可能性も検討していく予定である。今年度は学会への参加費や旅費としての執行を予定していた。しかし学会発表の要旨登録の期日までに実験のデータがそろわなかったため、参加・発表をとりやめた。そのため次年度使用額が生じた。学会発表は次年度に行うこととし、次年度使用額はそのために使用する。
蛋白尿発症原因分子ネフリンを指標とした診断法の確立

糸球体上皮細胞足突起間のスリット膜は係蹄壁の蛋白透過を防ぐバリアーとして機能していると考えられている。本研究課題では、ネフリンなど糸球体上皮細胞スリット膜関連分子を指標とした診断法の確立を企図して研究を行った。初年度(平成13年度)にネフリンの性状についての基礎検討、昨年度(平成14年度)は、各種病態での糸球体におけるネフリンの動態についての検討を行った。一連の検討で、蛋白尿発症時、nephrinなどスリット膜構成分子の発現が早期から低下していること。病変早期から尿中にnephrinが検出されることを明らかにした。本研究課題最終年度である今年度(平成15年度)は、スリット膜関連分子を指標とした診断法確立に向け、より具体的な検討を行った。臨床材料を用い、スリット膜関連分子発現と病勢、予後との関連についての検討を行なった。小児科症例を用いた検討で、(1)予後の悪いIgA腎症症例では、初期からネフリン、ZO-1などのスリット膜関連分子の発現が低下している事。(2)糸球体上皮細胞の細胞膜頂部のマーカーであるポドカリキシンの尿中の発現量がIgA腎症の病勢と相関がある事などを明らかにした。また、内科症例の生検材料を用いた検討を行い、糖尿病性腎症、巣状糸球体硬化症症例でネフリン、ポドシンなどのスリット膜機能分子の発現が低下することを確認した。一連の検討は国内症例での検討だけでなく、共同研究を行っている韓国、オーストラリア、ドイツ、オランダなどの施設での症例を用いて検討した。一連の研究成果は、腎臓病学分野のトップジャーナルであるJ Am Soc Nephrol誌、Kidney Int誌などの論文にまとめ、米国腎臓学会、国際腎臓学会などで口頭報告した。本研究課題の一連の研究成果は、スリット膜機能分子を指標とした診断法の実用化、普及に寄与するものと確信している。蛋白尿発症原因分子であるnephrinを指標とした診断法の確立を企図して研究を行なった。初年度(平成13年度)は,(1)各種実験モデルにおげるnephrin並びにnephrin関連蛋白であるpodocin, CD2AP, ZO-1の動態の詳細な解析。(2)これら蛋白の発現低下と増殖性糸球体病変進行との関連についての検討。(3)腎生検材料における、これら蛋白の発現についての解析を行った。(1)微小変化型ネフローゼ症候群のモデルであるPAN腎症、膜性腎症のモデルであるHeymann腎炎、メサンギウム増殖性腎炎のモデルであるThy1腎炎におけるnephrin並びにnephrin関連蛋白の糸球体での発現を、免疫組繊学的方法、RT-PCR法を用いて検討した。また、尿中でのこれら蛋白の発現はWestern blot法で解析した。nephrin, podocinは、正常糸球体では、係蹄壁に沿った微細顆粒状の連続したパターンで観察されるが, PAN腎症、Heymann腎症において、蛋白尿発症時nephrin, podocinは、粗大顆粒状の不連続なパターンとして観察された。これらの病態で、蛋白尿発症時、尿中にnephrinが排泄されていることを確認した。これら研究結果の一部は、平成13年10月米国サンフランシスコにおいて開催された世界腎臓学会にて報告した。また,Heymann腎炎を中心とした解析結果は、平成14年日本腎臓学会総会にて報告予定である。(2)微量のPAN投与では、蛋白尿を惹起し得ないが、nephrin発現を低下させることを観察した。

nephrin発現を低下させた群ではThy1腎炎は進行し、不可逆性の病態となることを証明した。これらの研究結果はKidney Internatial誌2001年12月号にまとめた。(3)微小変化型ネフローゼ症候群症例の部でnephrin発現が低下していることを証明した。これら一連の研究結果は, 2002年9月開催の第4回糸球体上皮細胞に関する国際シンポジウムにて報告予定である。蛋白尿発症原因分子ネフリンを指標とした診断法の確立を企図して研究を続けている。初年度にネフリンの性状についての基礎検討を行なったが、本年度(平成14年度)は、各種病態での糸球体におけるネフリンの動態についての検討、尿材料におけるネフリン出現の動態の検討を行った。微小変化型ネフローゼ症候群、フィンランド型先天性ネフローゼ、膜性腎症、メサンギウム増殖性腎炎のラット実験モデル材料を用いての検討でメサンギウム増殖性腎炎モデル以外の病態では、発症初期、蛋白尿が顕在化する以前にネフリンのmRNA発現が低下し、蛋白尿発症時、ネフリンの局在が不連続になることを確認した。また、Western blot法での検討で、ネフリン分子の発現量自体が低下していることを確認した。この事実はネフリンが尿中に分泌されている可能性を示唆すると考え、尿中でのネフリン発現を経時的に観察した結果、糸球体でのネフリン発現の低下にともなって尿中ネフリン量が増加していくことを確認した。これらの一連の検討は、平成14年10月米国フィラデルフィアにて開催された第35回米国腎臓学会にて報告した(共同研究も含め13演題)。実験モデルでの検討と平行し、臨床症例におけるネフリン発現についての検討も行い、急速に進行する小児症例におけるネフリン発現に関する検討をPediatric Nephrology誌2002年8月号にまとめた。また、メサンギウム増殖性腎炎においては、慢性期にネフリン発現の低下が観察され、ネフリン発現の低下をともなう糸球体上皮細胞機能の低下が予後を悪化させる事実をつきとめた。この一連の研究結果はKidney International誌2001年12月号に発表した。また、各種薬剤治療時におけるネフリン発現の動態についての検討も行い、J hypertension誌などに報告している。現在は診断法確立のために必要となる、より正確な定量法の確立のための検討を行っている。糸球体上皮細胞足突起間のスリット膜は係蹄壁の蛋白透過を防ぐバリアーとして機能していると考えられている。本研究課題では、ネフリンなど糸球体上皮細胞スリット膜関連分子を指標とした診断法の確立を企図して研究を行った。初年度(平成13年度)にネフリンの性状についての基礎検討、昨年度(平成14年度)は、各種病態での糸球体におけるネフリンの動態についての検討を行った。本研究課題最終年度である今年度は、スリット膜関連分子を指標とした診断法確立に向け、より具体的な検討を行った。まず、臨床材料を用い、スリット膜関連分子発現と病勢、予後との関連についての検討を行った。小児症例を用いた検討で、予後の悪いIgA腎症症例では、初期からネフリン、ZO-1などのスリット膜関連分子の発現が低下していることを観察した。
特発性肺線維症への肺がん併発現象におけるDCLK1の機能解析

本年度はまず、DCLK1の過剰発現がDNA損傷修復機構を阻害するという結果について論文報告を行った(Lu et al. Biochem. Biophys. Rep. 16 130-7)。実験面では、DCLK1によるDNA損傷修復抑制機構の詳細な分子機構検討と、特発性肺線維症肺組織におけるDCLK1発現誘導機構の解析に力点を置いた。加えて、DCLK1をタモキシフェン依存的に発現誘導できるマウスの作製を開始した。1) DCLK1によるDNA損傷修復抑制機構の解析DCLK1過剰発現はRNF168のDNA損傷依存的核内foci形成を阻害する。そこで、DNA二重鎖切断損傷に際して誘導されるRNF8依存的ヒストンH1ユビキチン化と、引き続くRNF168集積に対する影響を検討した。ヒストンH1としてH1.2を用いて検討したところ、DCLK1過剰発現によるユビキチン化H1.2量の減少は観察されなかった。一方で、DCLK1とRNF168、DCLK1とH1.2が相互作用することを見出した。さらに、in vitro binding assayにより、DCLK1がRNF168とH1.2の相互作用を阻害することを示唆する結果を得た。以上の結果は、過剰量のDCLK1はRNF168-H1.2相互作用系に介入して下流のDNA損傷修復プロセスを阻害する可能性を示唆している。2) DCLK1発現誘導機構RAW264.7細胞の培養上清をH1299細胞に処置することでDCLK1タンパク量の増加を誘導できる結果を得ていたことから、炎症性サイトカイン依存的なDCLK1発現誘導機構の存在を想定した。そこで、可能性のあるサイトカインをH1299細胞に逐次処置してDCLK1タンパク量増加が観察できるか否かを検討したところ、Lymphotoxin alphaがDCLK1タンパク量増加作用を有していることを見出した。DCLK1によるDNA損傷修復抑制機構について、DCLK1がH1.2-RNF168の相互作用に介入している可能性を見出すことができた。DNA損傷修復のシグナル伝達は多段階に渡る複雑なものであり、その複雑なメカニズム中において標的となりうる素過程を見出だせたことは大きな進歩であると考えている。また、DCLK1の発現を誘導できるサイトカインとしてLymphotoxin alphaを見出すことができた。Lymphotoxin alphaは特発性肺線維症における炎症成立に関与している可能性を指摘する先行研究もあり(da Silva Antunes et al. J. Immunol. 195 2429-41)、特発性肺線維症肺においてDCLK1が高発現するメカニズムを説明できる可能性がある。上記に加えて、本年度はDCLK1がDNA損傷修復を抑制する結果を論文発表することができた。以上の進捗が見られたことから、本年度において本研究はおおむね順調に進展していると判断した。引き続き、培養細胞系を用いてDCLK1によるDNA損傷修復抑制機構の生化学的解析を進めていく。主に本年度に標的過程として見出したH1.2-RNF168相互作用に対するDCLK1の影響の解析を中心とするが、その周辺の素過程であるRNF168依存的H2Aユビキチン化に対する影響なども検討予定である。また、Lymphotoxin alphaによるDCLK1発現誘導機構についても解析を行う。Lymphotoxin alphaはalternative NF-kB経路の活性化を誘導すると報告されており、主にそのシグナル伝達経路の関与を検討していく予定である。また現在、タモキシフェン依存的にDCLK1発現誘導を行うことができるマウスを作製している。本マウスに経気管的にタモキシフェンを投与することで、肺においてDCLK1過剰発現をpatchyに誘導することが出来る。この実験系を用いて、肺におけるDCLK1過剰発現が肺がん成立に対して十分性を持つか否かを検討する予定である。早急に当該マウスの樹立を目指したい。2) DCLK

1発現誘導機構RAW264.7細胞の培養上清をH1299細胞に処置することでDCLK1タンパク量の増加を誘導できる結果を得ていたことから、炎症性サイトカイン依存的なDCLK1発現誘導機構の存在を想定した。そこで、可能性のあるサイトカインをH1299細胞に逐次処置してDCLK1タンパク量増加が観察できるか否かを検討したところ、Lymphotoxin alphaがDCLK1タンパク量増加作用を有していることを見出した。DCLK1によるDNA損傷修復抑制機構について、DCLK1がH1.2-RNF168の相互作用に介入している可能性を見出すことができた。DNA損傷修復のシグナル伝達は多段階に渡る複雑なものであり、その複雑なメカニズム中において標的となりうる素過程を見出だせたことは大きな進歩であると考えている。また、DCLK1の発現を誘導できるサイトカインとしてLymphotoxin alphaを見出すことができた。Lymphotoxin alphaは特発性肺線維症における炎症成立に関与している可能性を指摘する先行研究もあり(da Silva Antunes et al. J. Immunol. 195 2429-41)、特発性肺線維症肺においてDCLK1が高発現するメカニズムを説明できる可能性がある。上記に加えて、本年度はDCLK1がDNA損傷修復を抑制する結果を論文発表することができた。以上の進捗が見られたことから、本年度において本研究はおおむね順調に進展していると判断した。引き続き、培養細胞系を用いてDCLK1によるDNA損傷修復抑制機構の生化学的解析を進めていく。主に本年度に標的過程として見出したH1.2-RNF168相互作用に対するDCLK1の影響の解析を中心とするが、その周辺の素過程であるRNF168依存的H2Aユビキチン化に対する影響なども検討予定である。また、Lymphotoxin alphaによるDCLK1発現誘導機構についても解析を行う。Lymphotoxin alphaはalternative NF-kB経路の活性化を誘導すると報告されており、主にそのシグナル伝達経路の関与を検討していく予定である。また現在、タモキシフェン依存的にDCLK1発現誘導を行うことができるマウスを作製している。本マウスに経気管的にタモキシフェンを投与することで、肺においてDCLK1過剰発現をpatchyに誘導することが出来る。この実験系を用いて、肺におけるDCLK1過剰発現が肺がん成立に対して十分性を持つか否かを検討する予定である。早急に当該マウスの樹立を目指したい。予め想定していた物品額よりも実際は安価に購入できたことにより誤差が生じた。次年度での物品費に繰越して使用する予定である。
食べるワクチンの抗原蛋白貯蔵量増加を目指した代謝亢進組換えイネとの交雑種作出

作物の可食部位に病原体抗原蛋白を生産させ、摂食により経粘膜(経口)免疫を行う、いわゆる"食べるワクチン"は、安価・安全で非侵襲型の新しい免疫方法として注目されている。我々は、ブタ回虫第3期仔虫の感染防御抗原(As16)遺伝子をイネに導入し、As16産生組換えイネを作出し、その種子における蛋白発現を確認した。組換え種子における抗原蛋白蓄積最の増加を目指し、As16遺伝子組換えイネと、米国ワシントン州立大学(WSU)のKu博士が開発したトウモロコシの光合成に関わる酵素を導入した代謝改善イネと交配することを計画した。しかし、平成16年度にAs16遺伝子導入イネ(tgRICE/CTBAs16)を栽培したところ、第2世代種子におけるAs16産生量は第1世代種子とほぼ等しく,高産生を維持していたが、第3世代種子におけるAs16蛋白産生量は,第1、2世代種子に比べ,十分の一程度に減少していた。また。平成17年度に、WSUのKu博士が移動したことにより、代謝改善イネの輸入が困難となったため、ブタ回虫As16遺伝子コドンの穀類への最適化により、抗原産生量の増加が見込めるかどうかを検討した。コムギ胚芽無細胞蛋白合成系により検討したところ、コドン変換遺伝子を用いた場合は,非変換遺伝子を用いた場合の2倍程度のAs16蛋白が産生され,コドン最適化の植物におけるAs16蛋白産生効率化への効果が示された。また、平成18年度には、交雑により導入遺伝子産物の産生低下が回復することを期待し、tgRICE/CTBAs16を非組換え米等と交雑させたが、ホモ接合体とヘテロ接合体の間にCTBAs16蛋白産生量の差は認められず、本組換え体における導入遺伝子産物産生底下は、交雑により解除されるようなサイレンシングによるものではないことが考えられた。本結果を踏まえ、さらなる抗原産生量の改善が望まれる。また。本年度は,まず我々の作出したAs16遺伝子導入イネを栽培し,その第1世代の種子(遺伝子導入したカルスより再分化した組換えイネに実った種子,T1種子)と第2,第3世代の種子(T2及びT3種子)における蓄積ブタ回虫抗原蛋白量を比較した.その結果,T2種子におけるAs16産生量はT1種子とほぼ等しく,高産生を維持していた.それに対し,T3種子におけるAs16蛋白産生量は,T1種子及びT2種子に比べ,十分の一程度に減少していた.組換えイネにおけるサイレンシングが誘導された可能性も考えられるが,同時に栽培した全T3ラインにおいて種子におけるAs16蛋白産生量が減少していたこと及び追肥を行わなかったことなどから,何らかの栽培条件のために産生量が低下した可能性もある.次年度は,T2種子のAs16産生パターンの解析により,今年度にホモ接合体であることが確認されたT1種子を用いて,As16遺伝子挿入部位のクローニング及びそのゲノム領域の活性化状態を,メチル化を指標として解析する必要がある.T2種子を,粘膜アジュバントであるコレラトキシン(CT)とともに経口投与したマウスにおいて,ウェスタンブロット解析によりAs16特異抗体の産生が確認され,また,それらのマウスでは,ブタ回虫成熟卵の感染が抑えられていることが示された.

このことより,As16蛋白産生組換え種子の経口投与により防御免疫の誘導が可能であることが明らかとなり,さらに組換え種子のみの投与では抗体産生は誘導されなかったことから,組換えAs16産生の効率化等の課題が明らかとなった.次年度に,追肥等の栽培条件を改善しつつ,Ku博士の作出したC4光合成関連遺伝子導入イネと交雑し,光応答性のAs16蛋白産生の増強が認められるかどうかを検討する.本年度の実験計画では,これまでに作出した,ブタ回虫As16遺伝子導入イネを,トウモロコシ由来C4光合成酵素を過発現する代謝改良組換えイネを交配し,交雑種において,高光量照射条件でのAs16蛋白産生量の増強が認められるかどうかを検討することを予定していた.しかし,ワシントン州立大学のKu博士の移動により,本年度における代謝改善イネの輸入が困難となり,本年度内に,As16産生イネと交配させることができなかった.次年度6月にワシントン州立大学を訪問する際に,組換えイネ種子を譲渡してもらえるように考えている.また,前年度に我々が作出したAs16遺伝子導入イネの第3世代種子におけるAs16産生量は,その原因は不明であるが,第1,2世代種子に比べ十分の一程度に減少していた.作出したAs16産生は,ブタ回虫のコドンをそのまま用いており,コドンを植物型に変換することにより,植物におけるAs16蛋白産生量の向上および安定した産生が期待できると考えた.タバコ,イネ,コムギなどの植物におけるコドン使用頻度を参考とし,PCR法を用いて,ブタ回虫As16遺伝子のコドンを植物型に改変した.植物コドン変換As16遺伝子の植物における発現効率を,コムギ胚芽無細胞蛋白合成系により検討した.作製した遺伝子および変換前の遺伝子をそれぞれ発現用プラスミドに挿入し,RNA転写および翻訳を行ったところ,コドン変換遺伝子を用いた場合は,非変換遺伝子を用いた場合の2倍程度のAs16蛋白が産生され,コドン最適化の植物におけるAs16蛋白産生効率化への効果が示された.また,コムギ胚芽無細胞蛋白合成系により,大腸菌蛋白産生系に匹敵する90μg/mlものAs16蛋白が産生された.次年度は,代謝改善イネとAs16産生イネを交配させることに加え,このコドン変換As16遺伝子をイネに導入することも計画している.平成18年6月および平成19年2月にワシントン州立大学を訪問し、Ku博士の作出したトウモロコシ由来C4光合成酵素を過発現する代謝改良組換えイネの行方を調べたが、不明であり、また研究試料譲渡体制も整っていなかったため、入手は断念した。今年度当初は、日本にあるストレス耐性組換えイネとの交雑を計画したが、我々の作出した豚回虫As16抗原をコレラ毒素Bサブユニット(CTB)との融合蛋白(CTBAs16)として産生する組換え米(tgRICE/CTBAs16)は、第3世代に導入遺伝子産物の産生量が第2世代に比べて、GM1結合能で10%以下まで低下しており、交雑種におけるAs16蛋白検出が困難となることが予想された。組換え植物では、導入遺伝子産物の産生低下が、交雑により回復する例があることから、tgRICE/CTBAs16を非組換え米および、As16と異なるがAs16と同様に豚回虫由来感染防御抗原であるAs14をCTBとの融合蛋白として産生する組換え米(tgRICE/CTBAs14)と交雑することにより、CTBAs16蛋白産生量に変化があるかどうかを検討した。その結果、tgRICE/CTBAs16と非組換え米との交雑では、ホモ接合体とヘテロ接合体の間にCTBAs16蛋白産生量の差は認められなかった。
iPS細胞由来樹状細胞とオートファジー誘導分子搭載ウイルスによる膵癌免疫療法

癌治療用遺伝子組換え単純ヘルペスウイルス(T-01)の基本骨格に外来配列を直接組み込むことで,特殊機能を有し,かつ胃癌治療に臨床応用可能な遺伝子組換えウイルスの開発研究を施行した.我々がスクリーニングした分子であるサイトカインシグナリング3抑制(SOCS-3)発現癌治療用ヘルペスウイルスを作成して評価し,高い治療効果を実験モデルにおいて確認した.将来の臨床応用を見据えた膵癌治療用ヘルペスウイルス療法の基礎開発が進んだと考えられる.また,iPS細胞由来樹状細胞を癌治療用ウイルスの腫瘍微小環境下に用いることで腫瘍免疫能が強化された。1.抗血管新生作用を搭載した腫瘍溶解型ヘルペスウイルスの作成Thrombospondin-1(TSP-1)は腫瘍の増殖および腫瘍血管新生を特異的に抑制する新規標的タンパクである。殺細胞性ヘルペスウイルスに搭載することで、殺細胞効果のbystander effectが期待できると考え実験を行った。まず、bacterial artificial chromosome systemを用いて、TSP-1を搭載した腫瘍溶解性herpes simplex virus (HSV)を作成した。次いで、まずTSP-1との関連が証明されている胃癌細胞株を用いて、治療実験を行った。結果、腫瘍溶解性HSVの直接的な殺細胞効果に加えて、TSP-1による血管新生抑制効果により、殺細胞効果が促進されることを証明した。この結果については、論文にて報告した。2.オートファジーを誘導するヘルペスウイルスの開発オートファジー関連分子として、bcl-2結合タンパク質として同定されたBeclin-1に注目した。Beclin-1は,PI3K複合体を形成してオートファジーに関与するとされ、癌抑制作用を有するとされている。まず前実験として、Beclin-1発現とオートファジーとの関連性を種々の細胞株を用いて確認した。結果、多くの細胞株や臨床切除標本においてBeclin-1は発現しており、またオートファジーとの関連性も確認された。3.iPS細胞由来樹状細胞の誘導マウスiPS細胞を使用し、OP9細胞(正常なM-CSF遺伝子を欠損したop/opマウスに由来する骨髄ストローマ細胞株)をフィーダー細胞として用いてDCへの分化誘導に成功した。平成26年度は前年度より引き続き、オートファジーを誘導するヘルペスウイルスの作製を行った.Beclin-1遺伝子導入ヘルペスウイルスの作成および機能解析に成功した.その後にiPS細胞研究に移行した.マウスiPS細胞からの樹状細胞への分化誘導にはすでに成功しており論文発表した(Int J Cancer 2014;134:332).当初はiPS細胞にLC3遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて導入する予定であったが,未分化能の維持が困難になるなど問題が生じたため、iPS-DCへ直接LC3を導入する手法へと変更した.LC3発現iPS-DCをC57BLマウスに投与し、2週後に脾細胞を採取し、in vitroでCTLを誘導した.このCTLがLC3特異的抗腫瘍活性を発揮することをCr-release assayならびにLDH assayを用いて検討した.さらにCTL populationの増加をテトラマーassayにて確認した.現在はBeclin-1ヘルペスウイルスを感染させたマウスメラノーマB16細胞をTargetとした細胞障害活性の解析を行っている.現在の研究結果で良好な結果で得られれば、作業仮設である「腫瘍細胞にBecklin-1ヘルペスウイルスを感染させ、細胞内オートファジーを介してLC3が発現する.このLC3を標的としたiPS-DCワクチン療法の実現可能性」が立証される.平成27年度は前年度より引き続き、オートファジーを誘導するヘルペスウイルスの作製に再現性の実験を行った。ウイルス作成の再現性を確認した後に、Beclin-1遺伝子導入ヘルペスウイルスの作成および機能解析に成功した。もうひとつの実験系であるiPS細胞研究にについては、マウスiPS細胞からの樹状細胞への分化誘導はすでに論文発表した(Int J Cancer 2014;134:332)ものの、iPS細胞にLC3遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて導入する実験系は、分化能の維持が困難になるなど問題が生じたため、iPS-DCへの遺伝子導入は合理的でないと判断した。そこで、担癌マウスを用いて、腫瘍内にウイルスを注入後にiPS-DCをC57BLマウスに投与し、2週後に脾細胞を採取し、in vitroで細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導し、このCTLが特異的抗腫瘍活性を発揮することをCr-release assayならびにLDH assayを用いて検討したが、その誘導能は従来の系と比較しても顕著ではないことが判明した。さらにCTL populationの増加をテトラマーassayにて確認したが同様の考察となった。現在はBeclin-1ヘルペスウイルスを感染させたマウスメラノーマB16細胞を標的とした細胞障害活性の解析を行い、ヒト膵癌モデルでの検証をほぼ終えたところである。現在の研究結果で良好な結果で得られれば、研究代表者の作業仮設である「腫瘍細胞にBecklin-1ヘルペスウイルスを感染させ、細胞内オートファジーを介してLC3が発現し、このLC3を標的としたiPS-DCワクチン療法の実現可能性」が立証されると期待している。癌治療用遺伝子組換え単純ヘルペスウイルス(T-01)の基本骨格に外来配列を直接組み込むことで,特殊機能を有し,かつ胃癌治療に臨床応用可能な遺伝子組換えウイルスの開発研究を施行した.