hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内シグナル伝達に働く膜電位制御機構の解明

この実験系を用いた計測により、さまざまなイオンの流れによって引き起こされる膜電位変化が、cAMPシグナルリレーを直接的に調節していることが強く示唆された。本研究で確立したイメージングや光操作技術は、細胞性粘菌の研究だけではなく、原核生物から真核生物に至るまでの幅広い研究に応用できるものであると考えている。本研究課題では、細胞性粘菌のcAMPに対する走化性シグナル伝達機構をモデルとして、分子生物学的手法とオプトジェネティクスを用いた生物物理学的手法により、真核生物のシグナル伝達における膜電位の重要性を明らかにすることを目的とした。研究結果から、細胞性粘菌の集合期における周期的なcAMPシグナル伝達に追従したリズミックな膜電位変化が自発的に発生していることを、本研究で確立した高感度な蛍光イメージング手法によって明らかにした。また、膜電位の光操作により、複合的なイオンの流れによって引き起こされる膜電位変化が、cAMPシグナルリレーを直接的に調節していることが強く示唆された。これまでの研究によって、膜電位の高感度なイメージングと光操作手法を確立することができた。今後はこれらの技術を用いて、細胞性粘菌の変異体等において計測実験を行うことにより、走化性シグナル伝達における膜電位変化の役割を分子レベルで明らかにすることを目指す。膜電位などの細胞内シグナルの高感度なイメージングと光操作手法を行なうことができるようになってきた。今後はこれらの技術を用いて、細胞性粘菌のシグナル伝達に関与すると考えられる変異体を用いた計測実験を行なうことにより、走化性シグナル伝達における膜電位変化の役割を分子レベルで明らかにすることを目指す。また、本課題で確立した技術やシグナル伝達のモデルを他細胞へと適用することも検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ケトン類の不斉水素化機構の解明

有機合成における触媒とは、「化学量論的変化に現れずに化学反応を促進する物質」を指す。優れた触媒は同じ反応促進作用を何十万回も繰り返すことができる。しかし、そのような高活性触媒はわずかに知られているだけである。この事実は触媒に高い活性を賦与する科学的原理が不足していることを意味する。本研究者の開発した光学活性ジホスフィン、2,2'-ジフェニルホスフィノ-1,1'-ビナフチル(BINAP)と1,2-ジフェニルエチレンジアミン(DPEN)を配位子とするルテニウム錯体触媒は単純ケトン類の水素化に対して極めて高い活性と立体選択性を示す。この触媒反応の機構を明らかにすることはこれまで知られていなかった一つの原理を導くことになり、化学の発展に大きく貢献するものと考え検討を行った。効率的に活性種を発生する触媒前駆体trans-RuH(η^1-BH_4)(binap)(dpen)を用いて速度論的および構造化学的解析を行うことにより、本水素化反応機構の全容をほぼ明らかにすることができた。すなわち、RuH(η^1-BH_4)型の錯体は容易にBH_4部を解離し、カチオン性錯体[RuH(binap)(dpen)]^+を発生することが質量分析および核磁気共鳴スペクトル分析により明らかとなった。この錯体と分子状水素から得られる18電子ジヒドリド活性種RuH_2(binap)(dpen)は速やかにケトンを還元して光学活性アルコールを放つとともに16電子のルテニウムアミド錯体となる。さらにこのものはアルコールにより容易にプロトン化され、カチオン性錯体を再生し、触媒サイクルが完成する。この反応機構を基にBINAPと光学活性1,4-ジアミンを配位子とする新規ルテニウム錯体を考案し、触媒として用いることにより、縮環構造をもつため、これまで効率的に水素化することのできなかった1-テトラロン類を最高99%の光学収率で1-テトラロール類に変換することに成功した。有機合球における触媒とは、「化学量論的変化に現れずに化学反応を促進する物質」を指す。この触媒は原料となる化合物に作用し、寿命の極めて短い幾つかの中間体を経た後に生成物を放出し、もとの構造に戻る。したがって、優れた触媒は同じ反応促進作用を何万回、何十万回も繰返すことができる。しかしながら、そのような高活性触媒はわずかに知られているだけである。この事実は、触媒に高い活性を賦与する科学的な原理が不足していることを意味する。本研究者の開拓した光学活性ジホスフィン2,2'-ビスジフェニルホスフィノ-1,1'-ビナフチル(BINAP)と1,2-ジフェニルエチレンジアミン(DPEN)を配位子とするルテニウム錯体触媒は、単純ケトン類の水素化に対して極めて高い活性と立体選択性を示す。触媒回転数は240万回に達する。この触媒反応の機構を明らかにすることは、これまで知られていなかった一つの原理を導くことにつながり、化学の発展に大きく貢献できるものと考え検討を行った。

すなわち、RuH(η^1-BH_4)型の錯体は容易にBH_4部を解離し、カチオン性錯体[RuH(binap)(dpen)]^+を発生することが質量分析および核磁気共鳴スペクトル分析により明らかとなった。この錯体と分子状水素から得られる18電子ジヒドリド活性種RuH_2(binap)(dpen)は速やかにケトンを還元して光学活性アルコールを放つとともに16電子のルテニウムアミド錯体となる。さらにこのものはアルコールにより容易にプロトン化され、カチオン性錯体を再生し、触媒サイクルが完成する。また、この反応の特性を活かしてα-アリール置換シクロアルカノン類から、対応するシスアルコールを極めて高い光学収率で合成することに成功した。有機合成における触媒とは、「化学量論的変化に現れずに化学反応を促進する物質」を指す。優れた触媒は同じ反応促進作用を何十万回も繰り返すことができる。しかし、そのような高活性触媒はわずかに知られているだけである。この事実は触媒に高い活性を賦与する科学的原理が不足していることを意味する。本研究者の開発した光学活性ジホスフィン、2,2'-ジフェニルホスフィノ-1,1'-ビナフチル(BINAP)と1,2-ジフェニルエチレンジアミン(DPEN)を配位子とするルテニウム錯体触媒は単純ケトン類の水素化に対して極めて高い活性と立体選択性を示す。この触媒反応の機構を明らかにすることはこれまで知られていなかった一つの原理を導くことになり、化学の発展に大きく貢献するものと考え検討を行い、所期の目的を達成した。本触媒の高活性を生み出す重要な要因の一つにDPENがNH_2部をもつことがあげられる。これにより反応活性種はH^<δ->-Ru^<δ+>-N^<δ->-H^<δ+>の1,4-双極子をもつことになり、これがケトン基質の1,2-双極子(C^<δ+>=O^<δ->)と相互作用し、ペリ環状型の六員環遷移状態を経て速やかに水素化が進行する。従来の触媒と異なり、基質が中心金属と直接相互作用することのない外圏で反応する。BINAPとDPENにより形成される不斉環境は外圏の反応を効果的に制御し、高い光学収率で生成物を与える。本触媒は多様な構造をもつケトン類の不斉水素化に適用できるが、1-テトラロンに代表される環状芳香族ケトン類の水素化に対しては高い活性と立体選択性を示さない。この原因を上記の反応機構に照らし合わせて考察した結果、縮環構造をもつテトラロンはBINAPとDPENによる反応場に適合しないことがわかった。剛直な縮環構造をもつテトラロンに対しては、基質の構造に対して柔軟に適応できる光学活性1,4-ジアミン配位子が有効であると推測し検討を行った結果、1-テトラロン類を最高99%の光学収率で水素化することに成功した。
自閉症スペクトラム障害の超早期スクリーニング

本研究の目的は,自閉症スペクトラム障害(ASD)を乳児期に超早期発見を行うために,発達徴候を抽出し,その後の自閉症関連特性との関連を探究することでスクリーニング指標を作成することである。本研究で得られた「ASD超早期スクリーニング尺度(SASSA)」は,生後4ヶ月時に「視線」,「表情」,「微笑」,「姿勢」,「リーチング」に関する非特異的発達徴候で感度優位のスクリーニングを行い対象を定め,11ヶ月時に「視線」,「表情」,「微笑」,「運動」,「指さし」,「模倣」に関する感度優位のスクリーニングと特異行動に着目したスクリーニングを重複させて絞り込みを行い,ASDの超早期診断の対象とする。本研究は,1,2歳という現在の自閉症スペクトラム障害(ASD)の早期発見の時期よりも,さらに以前の乳児期に超早期発見を行うために,障害特性が明確になる段階より以前の非特異的乳児期発達徴候を抽出して,自閉症関連特性との関連を調査し,さらに,健診事後教室における行動観察により乳児期発達徴候の変移の調査を行うことで,スクリーニング指標を作成する目的をもつ。平成25年度は,平成24年度の研究結果を基に,乳児期非特異的発達徴候を「視線異常」,「表情異常」,「微笑異常」,「姿勢異常」の4項目に絞り込み,4ヶ月児健診において非特異的発達徴候を示した児26名を対象として調査を行い,2歳まで発達フォローを行って,自閉症関連特性を確認したところ,以下の結果を得ることができた。14ヶ月児健診において全4項目に異常が認められた児は14名(男10名,女4名)であり,各項目の異常発現率は65.4%から76.9%の範囲だった。211ヶ月から2歳までに自閉症関連特性が認められた児は16名(男9名,女1名)であり,発現率は38.5%(男35.3%,11.1%)だった。全例において常同的行動が認められた。また,限局的・反復的行動の発現率は38.5%(男52.9%,女11.9%),感覚異常は34.6%(男35.3%,女33.3%)だった。3乳児期非特異的発達徴候と自閉症関連特性の関連を統計学的に検討すると(peasonのχ二乗検定),「視線異常」と「姿勢異常」が有意差を示した。本結果から,4ヶ月児健診では上記4項目にて感度中心のASDのスクリーニングを行えば出生数の約20%をフォローすることになり,「視線異常」と「姿勢異常」を示した児を中心に約5%がASDの疑いであることが2歳の時点で想定されることが示された。本研究は,自閉症スペクトラム障害の1,2歳という早期発見の時期よりさらに以前の乳児期からの超早期発見において,障害特性が明確になる前段階の特異的乳児期徴候を抽出して,自閉症関連特性との関連性を調査し,スクリーニング尺度を作成する目的を有する。平成24年度は実施計画に沿って,発達的異常を示唆する乳児期徴候の調査,および,健診事後教室における行動観察による乳児期発達徴候の変移の調査を行った。総出生数167名に対して,生後4ヶ月から乳児期徴候のスクリーニングを行い,特異的乳児期徴候を有する46名を対象にして詳細な発達行動学的分析を経時的に行った。46名を1歳時点で要療育群と経過必要群に分けて分析したところ,14ヶ月児健診で異常発現において有意差が認められた指標は,「対象への手出しがない」「発声が出ない」「定頸していない」「姿勢異常」であった。211ヶ月児相談で異常発現が多かった指標は,「表情に乏しい」「人見知りがない」「共有ができない」「模倣をしない」「呼名に反応しない」「移動発達が遅れている」であった。3自閉症関連特性は7ヶ月以降という乳児期後期より明らかになるが,乳児期前期から生理的困難や視線異常,応答異常を示し,自閉症的特異行動を示す児が出生数の4.2%存在した。本結果からは,自閉症関連特性は乳児期前期には明確ではなかったが,複数の特異的乳児徴候を同定することができ,その徴候を元にして陰性的中率を重視した早期スクリーニングが行えることが示唆された。また,11ヶ月時相談では出生数の4.2%の児が自閉症的特異行動を示し超早期療育の対象となることから,陽性的中率を重視したスクリーニングを行えることが示唆された。

本研究は,1,2歳という現在の自閉症スペクトラム障害(ASD)の早期発見の時期よりも,さらに以前の乳児期に超早期発見を行うために,障害特性が明確になる段階より以前の非特異的乳児期発達徴候を抽出して,自閉症関連特性との関連を調査し,さらに,健診事後教室における行動観察により乳児期発達徴候の変移の調査を行うことで,スクリーニング指標を作成する目的をもつ。平成26年度は,平成24年度、25年度の研究結果を基に,自閉症スペクトラム障害(ASD)の超早期スクリーニング尺度の開発を行った。本尺度は,4ヶ月児健康診査において,「視線異常」,「表情異常」,「微笑異常」,「姿勢異常」,「リーチング異常」の非特異的発達徴候をもって感度優位のスクリーニングを行う。11ヶ月発達相談においては,「視線異常」,「表情異常」,「微笑異常」,「運動異常」,「指さし異常」,「模倣異常」をもって感度優位のスクリーニングとして,「視線を逸らす」,「前言語発達異常」,「常同的行動」をもって特異度優位のスクリーニングとして,超早期診断の対象とする。1歳6ヶ月児健診においては,「前言語発達異常」,「常同的行動」,「関心限局行動」をもって特異度優位のスクリーニングとして,早期診断の対象とする。2歳児歯科健診においては,「前言語発達異常」,「常同的行動」,「関心限局行動」,「想像性の障害」をもって特異度優位のスクリーニングとして,早期診断の対象とする。本スクリーニングにおいて,4ヶ月児健診では上記5項目にて感度中心のASDのスクリーニングを行えば出生数の約20%をフォローすることになり,2歳の時点で約5%をASDの早期診断できることが期待される。近年急増している発達障害である自閉症スペクトラム障害は,現在では1,2歳という早期に発見することができるようになりました。本障害は,さらに早期の乳児期から視線異常や表情異常,さらに,運動面や生理面での軽微な異常を示すことが知られています。本研究は,乳幼児健康診査や発達支援教室を通じてハイリスク児の行動を詳細に観察し,本障害に関連する乳児期発達徴候を明らかにし,新しいスクリーニング尺度を作成します。児童青年精神医学本研究は,自閉症スペクトラム障害(ASD)の超早期発見のためのスクリーニング開発を目的としている。該当地域保健師や研究協力者による強力な連携を得て,当該年度の計画である,乳児前期でのスクリーニング用の乳児期発達徴候の特定を行い,2歳児における自閉症関連特性との関連性についての統計学的研究を行うことができた。想定していた結果に近いデータが得られており,最終年度におけるスクリーニング項目とスクリーニング方法の作成に向けた基礎データを揃えることができた。本年度は,鹿児島小児保健学会,日本乳幼児医学・心理学会,カロリンスカ大学,ストックホルム児童精神医療部で研究に関する発表を行うことができた。また,昨年の研究をまとめて論文を作成することができた。本研究は,自閉症スペクトラム障害の超早期発見のためのスクリーニング開発を目的としている。該当地域保健師や研究協力者との強力な連携において,当該年度の計画である,発達的異常を示唆する乳児期発達徴候の探索と,健診事後教室における行動観察による乳児期発達徴候の変移の調査は計画通り行うことができた。想定していた結果に非常に近いデータが得られている。対象とする乳児期発達徴候の絞り込みも行うことができた。予備研究の成果は,日本小児心身医学会で研究発表を行い,学術論文を投稿中である。乳児期発達特徴に関する先行研究を実証可能な形でのデータ収集が行え,さらに,詳細な項目に関しての調査数は順調に増えている。さらに,本調査を元にした研究結果は,ストックホルム児童精神医療部で発表を行い,先端研究者と先端臨床実践家とディスカッションを行うことができた。次年度予定していた関連発達徴候の抽出およびスクリーニング方法の作成にも予定を繰り上げて着手を行い,信頼性に関する仮検討を進めているところである。
癌細胞の転移を制御する内因性リガンドと病原体センサーの役割

TLR4の内因性リガンドとして(1)存在証明:SAA3ペプチドと受容体TLR4/MD-2の結合部位の決定。(2)ホメオスタシスへの寄与:SAA3発現クララ細胞の癌肺転移への影響。(3)癌以外の病態の解析:DNA結合タンパク質C1DはTLR9の新規内因性リガンド。慢性骨髄性白血病の分子標的薬耐性にTLR4が関与。(4)臨床応用への試み:低分子化合物セラストラマイシン結合タンパク質(mTOC)の同定。ヒトSAA3特異的抗体によるSAA3濃度測定。ADAM12の阻害剤(KB-R7785)と誘導体の転移実験。(5)ホメオスタシス解明の為の上記欠損マウスの樹立。の結果を得た。の結果を得た。癌が転移を起こす前に、将来転移する予定になっている臓器で遺伝子変化を解析し、肺を例にとって転移前微小環境形成に関与するケモカインS100A8とSAA3を同定した。これらの受容体がTLR4であることも証明した。VEGFやTNFなどの原発癌由来増殖因子による内分泌刺激によってS100A8は血管内皮細胞とマクロファージで、SAA3は肺においてS100A8による傍分泌刺激によって血管内皮細胞とマクロファージで、SAA3は肺上皮細胞において自己分泌刺激によって、さらにSAA3は肺上皮細胞とマクロファージに対して傍分泌刺激によって、それぞれ発現を亢進させることを明らかにした。TLR4を発現する免疫担当細胞が骨髄から肺に動員されることから、このネットワークはこれら傍分泌系によって増幅されるだけでなく、当初原発巣に依存していたTNFによる刺激は不必要になり転移微小環境は独立性を強めていくことになる。以上の論理を白血球が病原体の存在する感染巣に動員される機構に準えて考察し、古くから提案されているDanger signalをも包括する自然炎症という概念で転移前微小環境を説明した。すなわち、病原体による組織破壊、また組織自然免疫機構による病原体の殺傷などはTLR4の外来性リガンドであるエンドトキシンの発生に起因し、免疫担当細胞の動員を誘発する。これに対して、癌が転移する前に内因性リガンドであるS100A8やSAA3が発現上昇すれば、生体は外来微生物の襲来と誤認し、同様の細胞移動を招く。TLR4が癌細胞に発現していれば、この機構によって癌細胞そのものも動員されることになり、これが転移巣で再度増殖すれば転移が成立する。このような自然炎症説を多くの諸外国の学会で招待講演し、また総説を執筆することで広めることに努めた。我々のグループの担当は、がん転移においてTLR4の内因性リガンドS100A8およびSAA3が、生体内で文字通り内因性リガンドとして機能している様式を解明することを目的とする。TLR4はこれまで外来性であるエンドトキシン(LPS)の受容体として理解されてきたため、第一に実験に使用する内因性リガンドがその調整過程でLPSを誤って含有することを除外することから開始した。厳密にこれを施行するため、微生物ではなく哺乳類細胞で発現させ精製したもの、合成ペプチドにように化学合成したものを使用した。マウス個体おける反応性や細胞運動などの生物学的事象を惹起できることを確認した。第二に、転移臓器である肺におけるこれら内因性リガンドの発現ネットワークの詳細を解明した。SAA3は肺特異的クララ細胞で発現の自己増幅を起こしているだけでなく、肺臓器内のマクロファージ、血管内皮細胞、クララ細胞以外の肺胞上皮細胞にも作用し、それぞれ特定の増殖因子やケモカインの発現を誘導した。このクロストークによって転移土壌が形成されることを明らかにした。明らかにしたネットワークの様式は、LPSを投与したとき、すなわち外来性に微生物が経気道性に襲来したときと類似の刺激でも、同様の様式を呈した。すなわち、肺炎とならないように間断ない微生物の襲来を防御している肺ホメオスターシスの破綻が転移土壌の形成に寄与していることが強く示唆された。第三に、癌だけでなく白血病細胞の骨髄からの動員モデル系としてTLR4を発現する骨髄系細胞の白血病モデルBCR-ABLの研究、第四に、DNAやRNAに結合し、そのホメオスターシスに関与する分子で自己免疫疾患の抗原としても知られるC1Dの研究、これら大きく関連する内容も今後検討すべき課題として成果を発表した。下記の2つの到達目標からなる。1)転移を自然炎症から見た臓器特異性の問題。肺転移モデルにおいて、TLR4の内因性リガンドであるS100A8およびSAA3の発現を肺における種種の細胞で検討した結果、肺特異的に在住するクララ細胞でSAA3の自己増幅が起こっていることを見出した。

肺胞上皮細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、それぞれにおいて、TNF,S100A,SAA3の誘導性発現パターンの詳細を明らかにした。肺の気道感染において、LPSで代表される刺激によってこれらの細胞でおこる傍分泌カスケードと同じものが肺転移でも発生していた。微生物の侵入が低レベルであるほどホメオスターシスに近い。このメカニズム、すなわち生理的レベルの炎症の仕組みの破綻がこの肺転移モデルの機序であると結論した。2)TLR4の蛋白質内因性リガンドはほんとうに存在するか否かの問題。多くの研究がリガンド候補の蛋白質を大腸菌で発現させ精製し、そのLPS濃度を一定の方法で測定して使用している。そこでLPSの混在を論理的に完全に排除するため、哺乳類細胞で発現させ精製した。また試験管内で化学合成した。この2つの方法によって得られたリガンドを、TLR4との物理的結合、TLR4依存性の生物学的系にかけて、その活性を検討した。その結果、両者の方法によって得られたS100A8、SAA3でも活性があることがわかった。ペプタイドのTLR4内因性リガンドは存在すると結論した。TLR4の内因性リガンドとしてがん促進活性をもつS100A8と血清アミロイドA3(SAA3)を中心に、(1)存在証明、(2)ホメオスタシス(恒常性維持機能)への寄与、(3)癌以外の病態の解析、(4)臨床応用への試み、(5)ホメオスタシス解明の為の上記欠損マウスの樹立の5点を目標とし研究を行った。(1) SAA3とその受容体TLR4/MD-2の結合様式をSAA3ペプチドを用いて調べ、SAA3(20-86)はMD-2に結合することが分かった。また東京大学分子細胞生物学研究所の北尾教授の協力により、S100A8はTLR4の中央ドメインとMD-2に結合した状態が最もエネルギー的に安定であることが分かった。(2)癌の肺転移を成立させうる生体の反応については、SAA3を発現する肺のクララ細胞が、癌肺転移に影響を与えていることを明らかにした。(3)他の内因性リガンドとして、DNA結合タンパク質C1DがTLR9の新規内因性リガンドであることを見出した(投稿準備中)。また慢性骨髄性白血病において、原因蛋白BCR-ABLの分子標的薬による抑制効果は、TLR4刺激によって阻害されることを見出した(投稿準備中)。(4)計画班班員である東北大学薬学部・倉田祥一郎教授との共同研究で肺転移を抑制する低分子化合物セラストラマイシン結合タンパク質(mTOC)を同定した(投稿中)。またSAA3の遺伝子解析を行い、ヒト特異的配列に対し抗体を作成し、培養細胞上清でのSAA3濃度を測定した(投稿中)。担癌マウスの血清中の切断型ephrin-A1の上昇の発見により、ephrin-A1の切断酵素であるADAM12の阻害剤(KB-R7785)と誘導体の転移抑制効果を検討中である。(5)SAA3とS100A8の遺伝子欠損マウスを作製し、癌形成時の宿主側の炎症様変化の関与を解析中である。本研究の目的は、病原体センサーTLR4の内因性リガンドS100A8およびSAA3のがん転移における意義を解明することである。2つのリガンドのうちSAA3についてがん転移を促進するメカニズムを解明した。
脳形態画像と高次脳機能による強迫性障害における行動療法の治療反応性の検討

この研究では、VBM法(脳形態画像解析)を用いた頭部MRI解析方法と高次脳機能の解析により、強迫性障害の行動療法治療反応者と非反応者の差異に関する病態解明を目的とした。行動療法の治療反応者と非反応者では、ベースライン時における一部の注意・実行機能に有意な差異があった。行動療法の治療非反応者では、治療反応者に比較して、右前頭葉眼窩部と右帯状回などの灰白質体積や左帯状束などの白質体積が有意に減少していた。行動療法の治療非反応者では、行動療法において中心的役割を果たす前頭葉機能の一部に脆弱性があり、これらの脆弱性が神経心理検査やVBMによる脳形態画像により明らかになった。(背景)強迫性障害の病態形成には、前頭前野と皮質下をむすぶ神経ネットワークの異常の関与が想定されている。近年の脳画像研究は、前頭葉眼窩部と前頭葉内側面が、行動療法の治療効果に関して中核的役割を果たすことを示した。しかし、行動療法の治療反応者と非反応者の脳形態画像および高次脳機能の差異に関しては、検討されていない。そこで、この研究では、VBM法を用いた頭部MRI解析方法と高次脳機能の解析により、治療反応者と非反応者の差異に関する病態解明を目的とした。(対象と方法)名古屋市立大学精神科にて、SCID-Pにて強迫性障害と診断された患者で適格基準を満たす患者24名を対象とする。行動療法のオープントライアルを開始し、治療開始前と開始3ヶ月後に治療効果を検討し、治療反応者と非反応者に分ける。同時に、名古屋市立大学病院のMRI装置にて、全脳をカバーする3次元収集T1強調画像の撮影方法で、頭部MRIおよび高次脳機能検査のデータ収集を治療開始前に施行する。治療反応の基準は、Y-BOCSの総得点が35%以上の改善を行動療法が有効であると判定する。画像データ解析はSPM2により解析をおこなった。(結果)行動療法の治療反応者(12名)と非反応者(12名)では、ベースライン時におけるStroop課題、Trail Making Testなどの注意・実行機能に有意な差異があった。行動療法の治療反応者では、治療反応者に比較して、前頭葉眼窩部と前頭葉内側面の灰白質体積が有意に減少していた。(考察)行動療法に反応しにくい強迫性障害の患者は、注意・実行機能不全があると推測される。行動療法の治療非反応者では、行動療法において中心的役割を果たす前頭葉機能の一部(前頭葉眼窩部と内側面など)に脆弱性があるのかもしれない。今後、症例数を増やしての検討が必要である。(対象と方法)名古屋市立大学精神科にて、SCID-Pにて強迫性障害と診断された患者で適格基準を満たす患者39名を対象とする。治療反応の基準は、Yale-Brown Obsessive-Compulsive Scale(Y-BOCS)の総得点が35%以上の改善を行動療法が有効であると判定する。画像データ解析はSPM5により解析をおこなった。(結果)行動療法の治療反応者(24名)と非反応者(15名)では、ベースライン時におけるTrail Making Testなどの注意・実行機能に有意な差異があった。行動療法の治療非反応者では、治療反応者に比較して、前頭葉眼窩部と内側面の灰白質体積や帯状束の白質体積が有意に減少していた。(考察)行動療法の治療非反応者では、行動療法において中心的役割を果たす前頭葉機能の一部(前頭葉眼窩部と内側面など)に脆弱性があると想定される。これらの脆弱性が、高次脳機能やVBMによる脳形態解析により明らかになった。これらの成果の一部を学会にて報告し、英文論文として準備中である。分担研究者の古川は今後、連携研究者として協力していく予定である。(背景)

強迫性障害の病態形成には、前頭前野と皮質下をむすぶ神経ネットワークの異常の関与が想定されている。近年の脳画像研究は、前頭葉眼窩部と前頭葉内側面が、行動療法の治療効果に関して中核的役割を果たすことを示した。しかし、行動療法の治療反応者と非反応者の脳形態画像および高次脳機能の差異に関しては、検討されていない。そこで、この研究では、VBM法を用いた頭部MRI解析方法と高次脳機能の解析により、治療反応者と非反応者の差異に関する病態解明を目的とした。(対象と方法)名古屋市立大学精神科にて、SCID-Pにて強迫性障害と診断された患者で適格基準を満たす患者39名を対象とする。行動療法のオープントライアルを開始し、治療開始前と開始3ヶ月後に治療効果を検討し、治療反応者と非反応者に分ける。同時に、名古屋市立大学病院のMRI装置にて、全脳をカバーする3次元収集T1強調画像の撮影方法で、頭部MRIおよび高次脳機能検査のデータ収集を治療開始前に施行する。治療反応の基準は、Yale-Brown Obsessive-Compulsive Scale(Y-BOCS)の総得点が35%以上の改善を行動療法が有効であると判定する。画像データ解析はSPM5により解析をおこなった。(結果)行動療法の治療反応者(24名)と非反応者(15名)では、ベースライン時におけるTrail Making Testなどの注意・実行機能に有意な差異があった。行動療法の治療非反応者では、治療反応者に比較して、右前頭葉眼窩部と右帯状回などの灰白質体積や左帯状束や左外包などの白質体積が有意に減少していた。(考察)行動療法の治療非反応者では、行動療法において中心的役割を果たす前頭葉機能の一部(前頭葉眼窩部と帯状回など)に脆弱性があると予想される。これらの脆弱性が神経心理検査やVBMによる脳形態画像により明らかになった。
神経内分泌ニューロン終末の動的制御機構

正中隆起にはタニサイト及びアストロサイト、下垂体後葉には下垂体細胞と呼ばれるグリア細胞が存在する。それぞれ、視床下部神経内分泌ニューロン由来の軸索末端を取り囲み、ホルモン分泌を制御するとされている。しかし、これらの細胞が、神経終末の動的機能制御を行なう機構は全く不明であった。研究代表者は、これまでに、正中隆起、下垂体後葉のグリア細胞に特異的に発現する分子Na_xが細胞外Na濃度の上昇に応じて細胞内Na濃度をダイナミックに変える能力を持つことを明らかにした。本研究では、Na_xが神経終末の動的機能制御に関与する可能性について検討した。2光子励起顕微鏡を用いて、急性脳スライスにおいて、血管壁細胞と神経内分泌ニューロンの終末、または血管壁細胞とグリア細胞突起終末を同時にイメージングし、タイムラプス観察により動的形態変化を観察する実験系を構築した。脳室に脂溶性色素を注入することにより、第3脳室底面に並ぶタニサイトを特異的に染色することができた。また、正中隆起に投射する弓状核のGABA作動性ニューロンに緑色蛍光蛋白質GFPを発現するマウスを用いて、神経内分泌ニューロンの神経終末を蛍光観察した。同様に血管内に別の波長の脂溶性色素を注入し、血管壁を染色した。2つの色素を同時に励起し、ダイクロイック・ミラーを介してそれぞれの蛍光を別々の光電子増倍管により捉え、同時観察した。マウスに強制遊泳等のストレスを与えた時の血中ACTH濃度や、脱水状態においた時の血中バソプレッシン量及びNa濃度、尿量を測定した。これらの実験において野生型とNa_x遺伝子ノックアウトマウスを比較した。
レンサ球菌の代謝と生体内物質との関係

レンサ球菌(Streptococcus)属菌は、生体内から病原体または常在菌としてのみ分離され、環境中からは殆ど分離されない。これは、本属菌の生態が生体内の物質と密接な関わりを持つことを示しており、生体内のおける本属菌の生態を解明することは極めて重要である。本研究では、我々が以前に明らかにしたS. pyogenesとS. agalactiaeに存在する酸素を利用する代謝経路を中心に、生体内に存在すると考えられる物質とこれらの菌の代謝経路の関係を解析した。その結果、S. pyogenesは自らが作り出した乳酸のみならず外界の乳酸もATP産生に使うことが可能であると思われる知見を得た。また、S. agalactiaeでは生体内で本菌の持つ溶血素を使うことで利用可能になると思われるhemeを外界から取り込み、電子伝達系を活性化できることを示した。これらの研究成果は、本属菌が生体内の物質と密接に関連した生態を持つことを示しており、生体内に常在することで能率的にATPを産生し、その結果病原性を発揮することにつながることを示しており、本属菌の生態を理解する上で重要な知見を与えると思われる。化膿レンサ球菌はLactate oxidaseを利用し自らが産生した乳酸を再利用しATP産生に寄与していることは我々が以前報告しているが、酵素そのものについての基本的データの報告もなく、病原性との関連も明らかでない。病原性との関連はこの酵素の変異株を作成し動物実験で確認することを検討していたが、本酵素を持つ細菌は少ないため本酵素についての文献等情報に乏しく、我々は本酵素と病原性との関連を確認する前に、本酵素を精製し人為的に加えた乳酸を基質としうるかどうか、分子量など基本的なデータを得なければならないと考え、本酵素の精製を行った。現在では大腸菌に発現させたタンパクにHisタグを付け精製する方法が主流であるが、本酵素にHisタグを付けた場合、活性は保たれるもののニッケルカラムに吸着せず、この方法では精製できないことが判明した。このことからHisタグを隠してしまうような立体的な構造が予想された。陰イオン交換、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより本酵素を単一なタンパクとして精製することに成功した。過酸化水素産生株、非産生株由来のlactateoxidaseを比較すると、非産生株由来の酵素は活性を殆ど失ってしまっていることも明らかとなった。ゲル濾過の結果より本酵素の分子量は200kDa強であり、遺伝子配列から推測される分子量(43kDa)の数倍であることを見出した。このことから、本酵素はサブユニット46個から成る数量体であることが判明した。この結果はHisタグを用いて精製が不可能であった事実と一致する。現在oxidase活性、monooxigenase活性、活性中心の同定、また変異株を作成し病原性との関連を検討している。本年度は、実験計画の通りに、まず本菌の過酸化水素産生に関与すると考えられる酵素であるlactate oxidaseが、本菌が自ら産生した乳酸だけでなく外界から加えた乳酸を使用して過酸化水素を産生できることを示す実験を行い、外界から加えた乳酸も利用しうることを示した。また、同時に乳酸をピルビン酸に変換し、さらに酢酸を産生することによりATPを得ていることも示した。次に、lactateoxidase変異株の作成を行い、変異株ではグルコースから乳酸を産生するものの、再利用する能力を失っていることを示した。細菌の遺伝子はオペロン構造をとっていることが多いが、lactateoxidase遺伝子はオペロン構造をとっておらず、単一のORFに独自のプロモータとターミネータを持ち、強力なカタボライトリプレッションの制御下にあることを示した(従ってlactateoxidase変異株作成に伴う遺伝子操作によりlactate oxidase以外の遺伝子の発現には影響ないものと結論した)。なお、我々は化膿レンサ球菌には過酸化水素産生株と非産生株があることを示しているが、非産生株にもほぼ完全なlactate oxidase遺伝子が存在することを明らかにした。しかしながら、非産生株由来のlactate

oxidaseは産生株由来のものとはアミノ酸配列に違いがあり、312番目のアルギニンがトリプトファンに置き換わっていることにより活性を失っていることが我々の研究により明らかになっている。また過酸化水素産生株と非産生株とそれらが分離された病態(使用している菌株は全て臨床分離株である)には明確な関連性が認められないが、野生株(過酸化水素産生株及び非産生株、それらのLactate oxidase変異株を含めた動物実験を行うことにより、Lactate oxidaseが病原性とどのように関与しているか明らかになるものと思われ、その研究にすでに入っている。本年度は最終年度に該当するため、レンサ球菌で我々が提唱した酸素を使う代謝経路と生体内の物質との関係を確立できるよう実験を遂行した。S.pyogenesでは、我々が発見した酸素を使う代謝経路はlactate oxidase(LCT)を用い酸素を使いながらH2O2を発生し乳酸からピルビン酸を産生、これを酢酸にすることでグルコース枯渇後のATP産生に関与することを見出していたが、この酵素の活性を持つ株と持たない株に分けられることは既に明らかにしていたし395アミノ酸で構成される本酵素のうち、312番目のアミノ酸がアルギニンであることが重要であることを見出していた。本年度新たな変異体作成により、96番目のアミノ酸がヒスチジンであることも本酵素の活性を維持する上で重要である知見を得た。また多くの臨床分離株を調査し、96番目のアミノ酸がチロシンに変異している株が存在することも見出しこれらはH2O2非産生株であることも明らかになった。また、本菌のうちH2O2産生株、すなわち活性型LCTを持つ株は自らが作り出した乳酸のみならず人為的に加えた乳酸も利用し、外来の乳酸を利用可能であることも明らかにした。これは生体内で発生する乳酸を本菌が利用する可能性を大きく肯定する結果である。もうひとつの対象菌種S.agalactiaeについて、グルコース枯渇後にグリセロールを利用できることを示していたが、遺伝学的に厳密なカタボライトリプレッションの制御下にあることをつきとめた。また、生体内では電子伝達系が機能していることを確認し、hemeを取り込んでいる知見を得た。またこれまでの他研究者の報告とは対照的にmenaquinone合成能が本菌に存在することを確認し、その経路を明らかにすることが今後の検討課題として残ったが、総じて生体内物質とレンサ球菌の生態との関係を大きく明らかにすることが出来たと考えている。研究実施計画に記入した実験計画はおおむね順調に実施することが出来た。ただ、本年度は本研究に関するサーバーを立ち上げ研究成果を随時公開する予定であったが、年度初めに予算削減の可能性があるとの連絡を受けたため、研究成果を公開するサーバーの立ち上げは翌年度に延期することにした。この点が当初の予定より遅れているが、研究の推進を第一に遂行することを重要と考えての決定であるため、研究課題の遅れとは考えていない。また、予算は最終的に満額使用することが出来ることになったため、予算面での問題も解決している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、Lactate oxidaseのmRNAの発現について検討をするとともに、動物実験でLactate oxidaseと病原性との関連を明らかにすることを第1の目標とする。
ヒト化抗c-erbB-2モノクローナル抗体に対する抗癌剤の効果増強作用

【材料および方法】c-erbB-2癌遺伝子蛋白高発現株としてヌードマウス可移植性のヒト胃癌細胞株4-1STを用いた。抗癌剤は、CDDP(シスプラチン)ETP(エトポシド)、MMC(マイトマイシンC)を用いた。約3mm^3の腫瘍片をSCIDマウス皮下に移植し腫瘍が100-300mm^3腫瘤に発育した時点で、抗癌剤あるいは抗体をマウス尾静脈より静注し週2回腫瘤径を測定し21日間観察した。次に、同様の担癌マウスを抗体投与群と非投与群にわけ、CDDPを投与して血中および腫瘍内Pt濃度を経時的に測定した。【結果】rhu4D5とCDDPを併用した場合には相乗的な増殖抑制が認められた。またETPあるいはMMCについても同様に単独投与に比較して併用により著しい腫瘍増殖抑制効果が認められた。この間マウス体重の減少やマウスの衰弱は認められなかった。さらにrhu4D5とCDDPの投与時期を3時間前後して投与して抗腫瘍効果を比較した。CDDPを先に投与した場合に比べ、rhu4D5を先に投与した方が、同じ投与量にもかかわらず、明らかに強い腫瘍増殖抑制効果が見られた。【考察】c-erbB-2癌遺伝子産物に対するヒト型化mAbと抗癌剤を併用することによりヒト固形癌に対するin vivoにおける抗腫瘍効果を増強することをヒト腫瘍SCIDマウス移植系を用いて明らかにした。今後は、この実験系を用いてマウス体内や腫瘍内におけるrhu4D5や抗癌剤のpharmacokineticsを解析し、この効果増強作用のメカニズムをさらに明らかにしたい。【材料および方法】c-erbB-2癌遺伝子蛋白高発現株としてヌードマウス可移植性のヒト胃癌細胞株4-1STを用いた.また,抗癌剤は,CDDP(シスプラチン)を用いた.腫瘤形成後の腫瘍に対する抗腫瘍効果をみるために約3mm^3の腫瘍片をSCIDマウス皮下に移植し腫瘍が100-300mm^3腫瘤に発育した時点で,rhu4D5 18mg/kg単独,CDDP3.5mg/kg単独,あるいはrhu4D5 18mg/kg投与後1時間後にCDDP 3.5mg/kgをマウス尾静脈より静注し週2回腫瘤径を測定し21日間観察した.皮下腫瘍の大きさをヒトIgG1 18mg/kg投与対照の腫瘍の大きさに対する相対腫瘍増殖率(T/C%)により抗腫瘍効果をもとめた.【結果】CDDPあるいはrhu4D5単独投与でも腫瘍は対照に比較して増殖率が明らかに減少したが,rhu4D5とCDDPを併用した場合には相乗的な増殖抑制が認められた.この間マウス体重にはほとんど変化がみられなかった.【考察】c-erbB-2癌遺伝子産物に対するヒト型化mAbとCDDPを併用することによりヒト固形癌に対するin vivoにおける抗腫瘍効果を増強することをヒト腫瘍SCIDマウス移植系を用いて明らかにした.今後は,この実験系を用いてマウス体内や腫瘍内におけるrhu4D5やCDDPのpharmacokineticsを解析し,この相乗効果のメカニズムを明らかにしたい.【材料および方法】c-erbB-2癌遺伝子蛋白高発現株としてヌードマウス可移植性のヒト胃癌細胞株4-1STを用いた.

抗癌剤は,CDDP(シスプラチン)ETP(エトポシド),MMC(マイトマイシンC)を用いた.約3mm^3の腫瘍片をSCIDマウス皮下に移植し腫瘍が100-300mm^3腫瘤に発育した時点で,抗癌剤あるいは抗体をマウス尾静脈より静注し週2回腫瘤径を測定し21日間観察した.【結果】rhu4D5とCDDPを併用した場合には相乗的な増殖抑制が認められた.またETPあるいはMMCについても同様に単独投与に比較して併用により著しい腫瘍増殖抑制効果が認められた.この間マウス体重の減少やマウスの衰弱は認められなかった.さらにthu4D5とCDDPの投与時期を3時間前後して投与して抗腫瘍効果を比較した.CDDPを先に投与した場合に比べ,rhu4D5を先に投与した方が,同じ投与量にもかかわらず,明らかに強い腫瘍増殖抑制効果が見られた.【考察】c-erB-2癌遺伝子産物に対するヒト型化mAbと抗癌剤を併用することによりヒト固形癌に対するin vivoにおける抗腫瘍効果を増強することをヒト腫瘍SCIDマウス移植系を用いて明らかにした.今後は,この実験系を用いてマウス体内や腫瘍内におけるthu4D5や抗癌剤のpharmacokineticsを解析し,この効果増強作用のメカニズムを明らかにしたい.【材料および方法】c-erbB-2癌遺伝子蛋白高発現株としてヌードマウス可移植性のヒト胃癌細胞株4-1STを用いた.抗癌剤は,CDDP(シスプラチン)を用いた.約3mm^3の腫瘍片をSCIDマウス皮下に移植し腫瘍が100-300mm^3腫瘤に発育した時点で,抗癌剤あるいは抗体をマウス尾静脈より静注し週2回腫瘤径を測定し21日間観察した.次に,同様の担癌マウスを抗体投与群と非投与群にわけ,CDDPを投与して血中および腫瘤内Pt濃度を経時的に測定した.【結果】rhu4D5とCDDPを併用した場合には相乗的な増殖抑制が認められた.この間マウス体重の減少やマウスの衰弱は認められなかった.血中Pt濃度は,抗体投与群と非投与群とで差を認めなかったが,腫瘍内Pt濃度は抗体投与群で有意に高かった.【考察】c-erbB-2癌遺伝子産物に対するヒト型化mAbと抗癌剤を併用することによりヒト固形癌に対するin vivoにおける抗腫瘍効果を増強することをヒト腫瘍SCIDマウス移植系を用いて明らかにした.ヒト型化mAbとCDDPの相乗効果のひとつの機序として腫瘍内Pt濃度の上昇が考えられた.今後は,この実験系を用いてマウス体内や腫瘍内におけるrhu4D5や抗癌剤のpharmacokineticsを解析し,この効果増強作用のメカニズムをさらに明らかにしたい.
細胞分化過程の解明のための遺伝子ネットワーク解析技術の開発

複数の細胞分化系列にまたがる遺伝子制御の関係を表現する数理モデルを、遺伝子制御のネットワークに基づいて作成した。この数理モデルをもとに、実際にマウスの脂肪細胞・骨芽細胞の分化にまたがる制御遺伝子を探索できた。この探索は、複数の細胞分化過程を考慮するため膨大な時間がかかるため、マルチCPU・マルチコアの計算サーバを多数利用する並列実行方式を開発し、処理時間の大幅な短縮を達成した。本研究では、細胞分化の過程での遺伝子ネットワークの構造変化とそれを制御する遺伝子を検出することで、細胞分化過程での分化能の消失が生じる時期を推定し、細胞分化の機構、さらには体細胞のリプログラミングを説明できる数理モデルを作成することを研究目的としている。平成22年度に実施した研究内容は次の通りである。1.ネットワークモチーフ探索による遺伝子ネットワーク構造変化時期の推定細胞分化の各時期での遺伝子ごとの発現量の変化を適当な時間間隔で求め、各時間間隔で遺伝子間に現れる典型的な制御関係の組合せであるネットワークモチーフを探索し、各時間隔遺で見つかるモチーフの時間間隔ごとの違いを調べることで、遺伝子ネットワークに大きな構造変化が生じている可能性のある時期を推定した。さらに、複数の細胞分化の遺伝子ネットワークを推定し、それらに共通して出現するクロストーク遺伝子を求める手法を開発した。2.動的シードベイジアンネットワークによる遺伝子ネットワーク推定時系列データ間での因果関係を統計的に求める手法である動的ベイジアンネットワーク法をベーズに、1.で求めた遺伝子ネットワークの構造変化が起きる前後における、遺伝子間の制御関係の時間変化を求める方法を開発した。細胞分化では、遺伝子の発現量は分化の進行に伴って単調に増減するのではなく、複雑に変動していることから、このような複雑な量的変化を取り扱えるS-systemを遺伝子ネットワークのモデルとして使用した。この方法を、大腸がんの進行度合い(ステージ)ごとの遺伝子発現量の解析に適用し、ステージごとの予後を予測する手法を開発した。本研究は、細胞分化の過程での遺伝子ネットワークの構造変化とそれを制御する遺伝子を検出することで、細胞分化の機構を説明できる数理モデルを作成することを研究目的としている。本年度は次の研究を実施した。1.細胞分化の制御遺伝子の探索および数理モデルの作成複数の細胞分化系列にまたがるクロストーク遺伝子を表現するための数理モデルを作成し、実際にマウスの脂肪細胞・骨芽細胞それぞれの分化の時系列発現プロファイルにそのモデルを適用することで、クロストーク遺伝子を探索した。その研究成果について論文発表を行った(吉澤,2011)。また、遺伝子制御ネットワークの推定手法で、可能な候補ネットワークの中からより精度の高いネットワークを探索する手法として、免疫アルゴリズムによる探索手法(Nakayama,2011)と、ベイジアンネットワークにおいて3遺伝子からなる部分ネットワークを探索しその結果を組み合わせてより大きなネットワークを探索する手法(Watanabe,2012)を開発し、それぞれ論文発表を行った。2.全体処理の並列実行パイプライン化昨年度に開発した動的シードベイジアンネットワークによるネットワーク推定で、特に大規模な統計的サンプリングによる高精度のネットワーク推定を、マルチCPU・マルチコアの計算サーバを多数利用する並列実行パイプラインを構築し、処理時間の大幅な短縮を図った。このパイプラインでは、多数のCPUおよびコアを使って並列化効率を上げるため、動的な負荷分散を行うスケジューラを備えている。実際にマウスの脂肪細胞分化での遺伝子制御ネットワークの推定を、「京」コンピュータの試験利用を使って実施した結果、12,228CPU(97,824コア)での実行において97%と極めて高い並列化効率を達成した。この研究成果について学会発表を行った(松田,2012)。本年度の研究実績は次の通りである。(1)複数の細胞分化過程を考慮した遺伝子制御関係の数理モデルの作成とそれに基づく遺伝子制御ネットワークの推定:昨年度の研究実施計画の結果から、細胞分化過程での遺伝子制御ネットワーク中の各転写因子および被制御遺伝子について、複数の細胞分化過程に対応した遺伝子ネットワークを推定する数理モデルを開発した。この数理モデルでは、複数の細胞分化過程に共通する遺伝子制御関係と、個々の分化過程に特有の遺伝子制御関係を区別する点が特徴である。この数理モデルに基づいて、実際に、マウスの間葉系幹細胞から脂肪細胞と骨芽細胞といった複数の細胞に分化する過程について、遺伝子制御ネットワークの推定を行ったところ、従来手法である、複数の分化過程を考慮せず個別に細胞分化の遺伝子制御ネットワークを推定する場合と比べて、推定精度の向上が見られた。(2)全体処理の並列実行による効率化:前述の(1)の処理は、複数の細胞分化過程を考慮して行うため、逐次的に実行すると膨大な時間がかかる。そこで、マルチCPU・マルチコアの計算サーバを多数利用する並列実行方式を開発し、処理時間の大幅な短縮を図った。具体的には、東京大学情報基盤センターのデータ解析拠点クラスタの720コアの計算機資源を使って、マウス脂肪細胞分化過程における60時点の時系列遺伝子発現プロファイルで、26857個もの遺伝子による大規模ネットワークを推定できるツールを開発した。並列処理では、360コアで43069秒かかっていたものが、720コアで23044秒と短縮され、速度向上比1.87,並列化効率は93.4%と良好な加速を達成できた。

細胞分化クロストークの数理モデルの作成と、それによるクロストーク遺伝子の探索の研究成果が認められ、情報処理学会山下記念研究賞を受賞した。また、ベイジアンネットワークにおいて部分ネットワークの探索結果を統合して精度の高いネットワークを推定する手法についての論文発表は、国際会議APBC2012において高い評価を得てBest Paper Awardを受賞した。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度までに得られた、細胞分化過程での遺伝子ネットワークの推定結果を、時系列発現プロファイルとの照合により時間軸上に写像し、細胞分化での遺伝子ネットワークの構造変化を解析することで、分化過程を表現する数理モデルのさらなる詳細化・精密化を図る。これにより、分化能の消失時期を推定や、細胞のリプログラミングに対する知見を得る。また、マルチCPU・マルチコアの計算サーバを利用する並列実行パイプラインの、さらなる大規模並列化による効率化を達成する。以上の研究成果を、最終年度である平成24年度の成果報告として取りまとめる。
NOTCH-FABP経路は心臓毛細血管内皮細胞の脂肪酸能動輸送を制御する

エネルギー代謝とその異常は臓器を形成する実質細胞にのみ焦点が当てられてきたが、本研究では筋型毛細血管内皮細胞に焦点を当てた。筋型毛細血管内皮細胞にはFABP4/FABP5が発現し、経内皮的脂肪酸輸送において重要な役割を担う。また、筋型毛細血管内皮細胞にはNotchシグナル構成因子やPPAR・が発現し、FABP4の発現誘導を介して経内皮的脂肪酸輸送を制御する。本研究では、経内皮的脂肪酸輸送機構の概念を提唱し、新たな治療戦略の可能性を示した。心臓はボンプ機能を維持するために大量のエネルギーを必要とする臓器であり、その主要なエネルギー基質は脂肪酸である。心筋細胞が脂肪酸を取り込みエネルギー基質として利用するメカニズムは詳細に検討されているが、血中脂肪酸がどのようにして毛細血管内皮細胞を通過し心筋細胞間質に到達するか、という機序はまったくといっていいほど知られていない。申請者らは膳肪細胞の最終分化マーカーfatty acid binding protein4(FABP4)が内皮細胞特異的なNotchシグナルの標的因子であり、心臓毛細血管内皮細胞特異的に発現していることを見出した。FABPファミリーのうちFABP5も、同様にNotch刺激で誘導され毛細血管内皮細胞特異的に発現していた。特筆すべきことに、FABP4/5のダブルノックアウトマウスの心臓では脂肪酸取り込みが著明に減少し、相対してグルコース取り込みが劇的に上昇するのを確認した。以上より、脂肪酸は血中より一旦内皮細胞へ取り込まれ、細胞内でFABP4/5と結合し能動輸送により内皮細胞を通過して心筋間質に放出されるのであろう。本研究では心筋細胞のエネルギー代謝を心臓毛細血管内皮の機能から解明することを目的とする。さらに毛細血管内皮細胞の正常の生理機能の解明に加えて、病的状態(肥大心・虚血心やメタボリサヅクシン粗ドロームなど)での代謝メカニズムの変化をも明らかにする。毛細血管内皮細胞の正常な生理機能や病的状態での変化の解明は、心血管病の発症メカニズムの理解や将来の治療戦略の発案にとっても重要な事項となると考えている。lnvitroの実験でNotchがFABP4の発現を誘導する機序が明らかになりつつある。心臓はポンプ機能を維持するために大量のエネルギーを必要とする臓器であり、その主要なエネルギー基質は脂肪酸である。申請者らは脂肪細胞の最終分化マーカーfatty acid binding protein4(FABP4)が内皮細胞特異的なNotchシグナルの標的因子であり、心臓毛細血管内皮細胞特異的に発現していること、類似タンパクFABP5も毛細血管内皮細胞特異的に発現することを明らかにした。以上より、脂肪酸は血中より一旦内皮細胞へ取り込まれ、細胞内でFABP4/5と結合し能動輸送により内皮細胞を通過して心筋間質に放出されると考えられる。次にFABP4の発現調節のメカニズムを検討した。まず、Notchシグナルの構成因子Notch1(レセプター)とDll4(リガンド)がin vivoで心臓毛細血管内皮に強力に発現すること、Dll4刺激によりFABP4が誘導されることを観察した。Notchシグナルのドミナントアクティブフォーム(NICD)を過剰発現すると、心臓毛細血管内皮細胞(HCMEC)でFABP4が誘導された。このHCMECにNICDを過剰発現しさらにPPAR-γるの合成リガンド(ピオグリタゾン)を添加すると、FABP4発現は劇的に上昇し、PPAR-γ阻害薬であGW9662を加えると、ピオグリタゾンにより上昇した分だけ完全に抑制された。また、脂肪細胞特異的と考えられていたPPAR-γ2がNotch刺激により誘導され、PPAR-γ1は誘導されないことを確認した。以上より、Dll4により刺激をうけたNotchシグナルは、一部PPARγ依存的に、一部はPPARγ非依存的にFABP4を誘導することが明らかになった。申請者らは、血管内皮細胞におけるNotchシグナルの標的因子候補として脂肪酸結合タンパク質(fatty acid binding protein)であるFABP4(aP2)とEABP5(mall)を同定した。FABP4とFABP5が同時に欠損するマウス(EABP4/5 DKOマウス)では、高脂肪食負荷によるメタボリックシンドローム様症候(肥満、インスリン抵抗性、糖尿病)が著しく減弱することが報告されたがそのメカニズムは不明であった。本研究ではFABP4/5が脂肪細胞以外では心臓・骨格筋・脂肪組織の毛細血管内皮細胞に強く発現していることを見出した。

FABP4/5DKOマウスの抗メタボリックな表現系と筋型毛細血管内皮細胞に特異性の高い発現を認めることから、経内皮的脂肪酸輸送の概念に至った。この作業仮説をin vivoで裏付けるために、^<125>I-BMIPP(脂肪酸アナログ)と^<18>F-FDG(グルコースアナログ)を用いて各臓器における脂肪酸と糖の取り込みを評価した。DKOマウスの心臓ではBMIPP取り込みが約60%に減少し、相対してFDG取り込みが約20倍上昇するのを確認した。脂肪酸を主なエネルギー源とする赤筋では心筋と同様のBMIPPの取り込み減少とFDGの取り込み増加が認められたが、グルコースを主なエネルギー源とする白筋では著明な変化は認められなかった。脂肪組織ではBMIPP取り込みがDKOマウスで野生型の30%にまで減少したが、FDGの取り込みに変化は認められなかった。以上より、脂肪酸が循環血液中から実質組織間質に到達するのに毛細血管内皮細胞内を通過すること(経内皮的脂肪酸輸送)、毛細血管内皮を通過する際にFABP4とFABP5が必須の担体であること、脂肪酸輸送が障害されると代償的にグルコース代謝が亢進することが明らかとなった。