hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナ要素技術の研究

衛星放送の簡易モバイル受信に必要なフレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナ実現に向けて、その要素技術開発を目的とした。フレキシブルな有機フィルムから成るマイクロストリップ線路をベースに、電磁界シミュレーションによるデバイス考案と設計、低コストな印刷法によるプロトタイプの試作により、低損失な新しいフレキシブル・プリンタブルな可変移相器およびパッチアンテナと組み合わせたアンテナユニットの特性を明らかにした。また、上記デバイス設計法の改善とそれらのデバイスに適応する給電方式およびアレイ化基本方式について動作シミュレーションを行い、フレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナ実現の見通しを得た。高周波帯で用いる指向性の高いフレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナ実現に向けての要素技術の開発にあたり、H25年度は、当初計画の(1)可変容量デバイスの開発、(2)可変インダクタンスデバイスの開発の他、(3)新しい可変移相方式の探索を進めた。(1)可変容量デバイスの開発では、誘電率可変材料および誘電率可変機構探索の一環として、フレキシブルなポリマーについてガラス転移点の制御や外部刺激方法などの新しい基本技術の検討を進めた。また、これらを基に材料構造や動作機構および製造プロセスに関する設計を行った。(2)可変インダクタンスデバイスの開発では、フレキシブルなポリマーフィルム基板をベースとした相互インダクタンスデバイスを考案し、電磁界シミュレーションによりその基本特性解明を進めた。しかし、デバイスサイズが大きくなり、他の可変容量デバイスとの混載など基板への実装効率が低くなるなどの課題があることが判明した。(3)新しい可変移相方式の探索では、フレキシブルなマイクロストリップ線路を応用した新しい方式を考案し、電磁界シミュレーションによりその基本機能を実証した。さらに、印刷法によりデバイスの一部を試作してその特性を評価した結果、設計した移相可変機能をほぼ実現していることを実証した。この可変移相方式は、これまでに例のない新しい方式で、フレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナ用として有望で、(1)の誘電率可変機構との組み合わせ技術も考えられる。H26年度は、基本的にはH25年度に策定した計画に沿って研究を進めた。(1)可変容量デバイスについては、電磁界シミュレーションによるデバイス構造設計を進化させるとともに、関連のデバイスの試作・評価を行った。しかし、現状のデバイスでの容量可変域は小さく、基板への実装効率が低い難点があることが判明した。選択した材料は塗布法による作製は可能である。今後も容量可変範囲の拡大、低損失化、省電力化等の機能・性能の改善は継続する。(2)H25年度に原案を考案した新しい可変移相器方式は、基本となるマイクロ波の分配回路と位相制御機構の組み合わせによるものである。前者の回路については従来の設計手法による精度が不十分で、所定の周波数特性の実現が困難であることがわかった。このため、電磁界シミュレーション用いて新しい設計手法を考案した。これにより、高精度な周波数特性を実現できることが明らかになった。位相制御機構については、これまで実現されていない新しい機構で、その具体的デバイス試作に向けて、デバイス構造、材料の選定とその組み合わせ、印刷法による作製技術等の検討を進め、プロトタイプデバイスの試作とその動作実証実験に成功した。これらにより、新しい可変移相器方式の実現に見通しをつけることができた。(3)個々のアンテナ素子と新しい可変移相器を組み合わせたフェーズドアレイアンテナユニットについては、その基本構造の設計を行った。(4)これらのアンテナユニットをアレイ化した小規模なプロトタイプ・フレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナのパネル構造についても考案・設計を行った。(5)計画した可変コンダクタンスデバイスの開発については、シミュレーションでデバイス構造の最適化を進めたが、有望な構造を得ることができなかった。高周波帯で用いるフレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナ実現に向けての要素技術の開発にあたり、H26年度は、H25年度に考案した新しい可変移相器の基盤技術の開発を進めた。この可変移相器は、フレキシブルな有機フィルムを誘電体とするマイクロストリップラインから成るマイクロ波分配回路と、ポリマーアクチュエータによる可変移相機構を組み合わせるもので、挿入損失、位相可変範囲、フレキシビリティ、印刷製造可能などの点で当初の容量可変ダイオード方式より優れているものと期待している。H26年度は基本デバイスのシミュレーションによる設計とスクリーン印刷法による試作を行い、基本的な可変位相機構の動作の実証に成功した。H27年度は、マイクロ波分配回路のさらなる高精度設計とスクリーン印刷の諸条件の最適化による作製技術の改善を進めるとともに、ポリマーアクチュエータの構成材料の選択と作製法の改善を行った。それらにより、可変移相器としての位相可変範囲、可変速度等の性能改善を進めた。また、この新しい可変移相機構の詳細を明らかにした。さらに、H27年度は、上記の可変移相器を用いた4個のパッチアンテナ素子から成るフェーズドアレイ・アンテナ・ユニットについてのシミュレーションにより、挿入損の小さい集電方式と回路構成を見出すとともに、高指向性利得で大きな指向性走査が可能であることを明らかにした。以上のように、本研究では、高周波数帯に適用できるフレキシブルで印刷製造可能な可変移相器の考案、シミュレーションによる設計技術開発、スクリーン印刷法による作製技術開発、試作デバイスの可変移相特性解明、4個のパッチアンテナ素子から成るフェーズドアレイ・アンテナの動作シミュレーションなどを行い、提案する可変移相器・アンテナの実用化の可能性を明らかにした。これらにより、本研究の主要な要素技術研究の目的を達成することができた。

フレキシブルな有機フィルムから成るマイクロストリップ線路をベースに、電磁界シミュレーションによるデバイス考案と設計、低コストな印刷法によるプロトタイプの試作により、低損失な新しいフレキシブル・プリンタブルな可変移相器およびパッチアンテナと組み合わせたアンテナユニットの特性を明らかにした。また、上記デバイス設計法の改善とそれらのデバイスに適応する給電方式およびアレイ化基本方式について動作シミュレーションを行い、フレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナ実現の見通しを得た。H26年度までに実施した(1)可変容量デバイスの開発では、フレキシブルで印刷製造可能なポリマーの可変誘電率デバイス構造の考案と関連デバイスの試作を進めた。誘電率可変は外部からの電圧印加によるもので、液晶とほぼ同程度の電圧で誘電率が変化する機能を認めたが、試作したデバイスは可変範囲が狭く、挿入損失も大きい難点があることが判明した。(2)新しい可変移相器方式では、基本となるマイクロ波分配回路の精密な高周波特性が実現できる新しい設計手法を電磁界シミュレーションで考案した。これにより可変移相器として設計できる高周波域が明らかになった。また、この回路と組み合わせて用いる位相制御機構デバイスについては、デバイス構造、用いる有機材料の選定とその組み合わせ、および作製技術を検討してその試作及び動作原理実証実験に成功した。この可変移相可変方式は当初計画の可変容量デバイス方式に比べて、一層の低挿入損失、フレキシビリティ、印刷可能などのメリットを有するものと期待できる。ただし、まだ動作の安定性、高速化、低消費電力化などの課題が残されている。従って個々の可変移相器はその実現に向けて順調に進捗している。(3)個々のパッチアンテナと(2)の新しい可変移相器を組み合わせたフレキシブル・フェーズドアレイ・アンテナユニットについて検討を進め第一次設計を行った。(4)上記アンテナユニットをアレイ化した小規模なフェーズドアレイアンテナについてもシミュレーションによる検討を行い、各アンテナユニットからの出力の合成において、一層高効率な合成方法が必要であることがわかった。(5)これまでは基本回路の作製法としてスクリーン印刷法を用いてきたが、より高導電度が期待できる他の印刷法、たとえばインクジェット法などを用いた試作については次年度の課題となった。以上、全体として概ね順調に進捗している。総合理工H26年度の成果を踏まえ、今後は以下のように研究を進める。(1)可変容量デバイス方式については、有機デバイスの高速化の検討に注力することとして、デバイス設計試作は中断する。(2)新しい可変移相器方式で、位相制御デバイスについて、有機材料種の選定・組み合わせ、デバイス構造、作製技術の改良・最適化等をさらに進めてその性能向上を図る。
全ゲノムシーケンス法による放射線誘発突然変異率の計測

本研究において、次世代シーケンサーHiSeq2500を用いて放射線がゲノムDNAに与える損傷の種類と頻度を直接計測することを試みた。HT1080細胞1細胞に84 mGy, 390 mGy, 1885 mGyのγ線照射を行いその細胞を培養して増殖させてからDNAを抽出し全ゲノムシーケンスを行った。ラージデリーションについては検出数自体がほとんどなく線量が増加しても差は見られなかったが、1塩基置換や挿入・欠失の数は1885 mGyにおいて増加していることが確認された。放射線による変異導入頻度の測定を行うため、ヒト繊維肉腫細胞HT1080を用いることとした。細胞を一度クローン化し、均一な細胞集団を形成させ、これらの細胞を96ウェルプレートにFACS Ariaを用いてソーティングを行い1細胞/ウェルの状態にした。137CS γ線源放射照射装置を使用して放射線照射群・非照射群を作成した。放射線照射群の線量はγ線照射2.5 Gy・500 mGy・100 mGy・20 mGyとしそれぞれのγ線照射細胞を得た。これらの細胞の全ゲノムシーケンスを行うために細胞を分裂増殖させた後にPCRフリーの系にてシーケンス用サンプル調整を行い、HiSeq2500を用いて全ゲノムシーケンスを行った。現在シーケンスデータを得て計算機による解析を行っている。放射線照射を行う細胞の準備から放射線照射を行い、シーケンスサンプルの調整、全ゲノムシーケンスまで進んでおり、現在データの解析中である。初年度ではシーケンスを行うあたりまでを計画していたのでおおむね順調に計画は進捗ている。次世代シーケンサーを用いて、放射線がゲノムDNAに与える損傷の種類と頻度を直接計測することを試みた。1細胞に84 mGy, 390 mGy, 1885 mGyのγ線照射を行いその細胞を培養して増殖させてからDNAを抽出し全ゲノムシーケンスを行った。解析の結果、10 kbp以上の大きな欠失は数個に限られ線量依存的な増加も見られなかった。1塩基置換では390mGy,1885mGyのγ線照射で置換に増加傾向が見られており、1885mGyとコントロールを比較すると1Gyあたり0.6個/Mbp程度の増加が推定された。小さな挿入欠失は1885mGyで増加傾向にあった。細胞への突然変異実験としてリンパ球細胞に放射線照射をしてHPRT遺伝子座の変異を見る実験が知られており、変異頻度として14.25 x 10-6 mutants/Gy (Mognato M et al. 2001)や12.35x 10-6 mutants/Gy (Kumar PR et al. 2006 )などと報告されている。HPRT遺伝子座のサイズ(1415 bp)からすると10-8bpオーダーでHPRT遺伝子が機能欠失の変異が入っていると推定される。我々の系では機能欠失に関連しない変異がほとんどであることや細胞系の違いなどから直接の比較は難しいが、エクソン上の変異の内1/10程度が機能欠失に関与したとすれば近い値となると推定された。また、塩基置換の種類についてはMasumura et al. 2002らの報告ではG,C →T, Aに変異するtransversionがγ線照射変異の特徴とされているが、我々のデータからはそういった傾向は見られなかった。放射線照射を行った細胞からDNAを抽出し全ゲノムシーケンスを行っておりシーケンスデータの解析中であるが、解析方法も決まった方法があるわけではなく必要にあわせて自分でプログラムを組んで解析する場合が出てきている。これらの解析を組み合わせることで詳細な変異導入頻度を測定に努める方針である。分子生物学全ゲノムシーケンスとして次年度に繰り越したシーケンスが存在するため。全ゲノムシーケンスを行い現在解析を行っているが、実験データの再現性を確認するために同じ系を繰り返し確認を行う。
メマンチン術前経口投与の脊髄虚血後対麻痺に対する予防効果の検討

胸腹部下行大動脈手術後の重篤な合併症である脊髄虚血・対麻痺の薬剤予防投与の可能性についてウサギ脊髄虚血モデル(腹部大動脈遮断による虚血誘導)を用いて検討した。薬剤はNMDA受容体拮抗薬であるメマンチンを採用した。投与経路はる経口投与を計画したがより安定していると考えられる皮下投与へ変更した(180mg/7日間)。脊髄虚血中の血行動態(血圧・脈拍、動脈硬化、心拍出量)に対するメマンチン前投与の影響は認めなかった。手術終了後の脊髄組織病理所見(HE染色)でも特記すべき所見は認めなかった。以上より、メマンチン前投与が脊髄虚血中に循環動態及び脊髄の質的変化を与える影響は最小限である可能性が予想された。本研究では、胸部および胸腹部下行大動脈手術後の重篤な合併症として脊髄虚血による対麻痺の予防策として簡便なNMDA(N-メチル-D-アスパラギン酸)受容体拮抗薬であるメマンチンの術前経口投与による予防効果を検証することを目的としている。初年度の目標はウサギをメマンチン予防投与量・方法に応じて群分けし、全身麻酔下での腹部大動脈遮断による脊髄虚血再還流実験を行い予防効果を検証することを目標としていた。但し、研究代表者の所属機関が本年度、研究分担者の所属機関が昨年度変更となったため(齋藤:2014年5月1日付、本村:2014年2月1日付)、動物実験を開始する基盤作りから改めて開始しているところである。具体的には東邦大学において動物実験を行うためのセミナー受講および実験室の確保であるが、薬学部(習志野)においてウサギを用いた動物実験が可能であることが確認できている。動物搬入・全身麻酔・手術に必要な器具の手配については26年度内に準備が整い、実際試験的に腹部大動脈遮断実験が行えることを確認した。26年度の腹部大動脈遮断実験については27年度に持ち越した上で計画を遂行する予定である。本研究では、胸部及び胸腹部下行大動脈手術後の重篤な合併症として脊髄虚血による対麻痺の薬剤投与による予防策について動物実験により検討することを目的としている。使用薬剤としてはNMDA(N-メチル-D-アスパラギン酸)受容体拮抗薬であるメマンチンを前投与しウサギ脊髄虚血モデル(腹部大動脈単純遮断)を用いて脊髄保護効果を検証することを行った。予備実験(コントロールn=5)としてウサギ脊髄虚血モデルにおける血行動態の変化について、上腕動脈及び右腎動脈の動脈圧及び中心静脈圧、脈拍数、心拍出量、血管弾性をモニターし循環動態の観測を行った。輸液管理を十分に行った上で動脈遮断中には上腕動脈血圧上昇が、遮断解除には急峻な血圧低下が確認できた。本実験では、当初はメマンチンの経口投与による効果を観測することを目標としていたが経口摂取量が不安定であったため投与方法を変更した。即ち、メマンチンの錠剤を粉砕し生食に溶解し(180mg/NS)osmotic pump(alzet OSMOTIC PUMP MODEL2ML1, DURECT Corp., CA, USA)に納め、ケタミン+キシラジン投与下にウサギ背部皮下に植え込みを行った(n=3)。Osmotic pumpは内容液を7日間で溶出する型を用いた。1週間後に腹部大動脈遮断による脊髄虚血実験を施行。コントロールと同様に操作前後の血圧、脈拍数、心拍出量、血管弾性を計測した。計測後はペントバルビタール+KCl投与による犠牲死とし、採血及び脊髄組織摘出を行った。また背部に植え込みしたosmotic pumpも回収し溶液の溶出状況を肉眼的に確認した。血液検体は血清分離の上-20度下で冷凍保存した。脊髄組織は10%ホルマリン固定の上プレパラート作成を行った(HE染色)。平成26年は研究代表者及び分担者の勤務先移動に伴い実験環境整備に時間を要した。平成26年12月より動物実験を稼動し始め、手術手技や周辺機器の運用が安定するまである一定期間を要した。平成27年度には予備実験から開始した。まずコントロールデータの収集より開始し、更に本格的に課題実験に着手し急性期実験として血行動態変化に関するデータ及び脊髄虚血の器質的変化を確認するための検体を収集することが出来た。血管弾性については全体としては約半年ほどの遅れを生じている状態と判断する。予備実験(コントロールn=5)としてウサギ脊髄虚血モデルにおける血行動態の変化について、上腕動脈及び右腎動脈の動脈圧及び中心静脈圧、脈拍数、心拍出量をモニターし循環動態の観測を行った。本実験では、メマンチンを粉砕し生食に溶解し(180mg/NS)osmotic pump(alzet OSMOTIC PUMP MODEL2ML1, DURECT Corp., CA, USA)に納め、ケタミン+キシラジン投与下にウサギ背部皮下に植え込みを行った(n=3)。

1週間後に腹部大動脈遮断による脊髄虚血実験を施行。コントロールと同様に操作前後の血圧・脈拍数・心拍出量を計測した。計測後はペントバルビタール+KCl投与による犠牲死とし、採血及び脊髄組織摘出を行った。また背部に植え込みしたosmotic pumpも回収し溶液の溶出状況を肉眼的に確認した。血液検体は血清分離の上-20度下で冷凍保存した。脊髄組織は10%ホルマリン固定の上プレパラート作成を行った(HE染色)。組織学的に明らかな細胞形状の変化などは観察されなかった。ウサギ脊髄虚血モデルにおけるメマンチン前投与の硬化について検討中である。動物実験自体は概ね完了したが血清検体の検査(血清メマンチン濃度測定)の受注先が定まらず(検査受注終了していることが殆ど)引き続き検体処理方法について検討中である。同時に行っていた生理学的検査については現在学会発表及び論文作成中である。また、研究者が臨床業務と並行して実験を行っており時間的采配が十分取れていない現状も影響している。本研究では、胸部及び胸腹部下行大動脈手術後の重篤な合併症として脊髄虚血による対麻痺の薬剤投与による予防策について動物実験により検討することを目的とした。NMDA(N-メチル-D-アスパラギン酸)受容体拮抗薬であるメマンチンを前投与しウサギ腹部大動脈遮断による脊髄虚血操作における脊髄保護効果を検証した。コントロール(n=5)について脊髄虚血誘導時の血行動態は、上腕動脈圧・右腎動脈圧・中心静脈圧・脈拍数・心拍出量・Cardio-Ankle Vascular Index(CAVI、動脈硬化指標)をモニターした。次に、メマンチンを粉砕し生食に溶解(180mg/NS7)、7日間溶出型osmotic pump(alzet OSMOTIC PUMP MODEL2ML1, DURECT Corp., CA, USA)に納め、ウサギ背部皮下に移植した(n=3)。1週間後に脊髄虚血実験を施行。コントロールと同様のparameterについて腹部大動脈遮断操作前後の変化を計測。終了後はペントバルビタール+KCL投与により犠牲死を得、採血(血清保存)及び脊髄組織摘出、osmotic pumpを回収した。脊髄組織は10%ホルマリン固定の上HE染色を行った。結果:メマンチン前処置有無に関わらず腹部大動脈遮断に際し体血圧上昇及び血管弾性の増加を認め、遮断解除後は体血圧の速やかな低下及び速やかな血管硬化の増強を認めた。HE染色による脊髄組織の変化は、メマンチン前処置の有無に関わらず明らかなapoptosisなどの不可逆的な組織変化像は認めなかった。血清メマンチン濃度の測定は測定環境が整わず検査・確認することが不可能であった。以上の結果より、メマンチン皮下投与による前処置を行ったウサギと行わなかったウサギで明らかな虚血変化に対する応答の循環導体的な差異は認めず脊髄の質的変化も来たさなかったことが確認された。胸腹部下行大動脈手術後の重篤な合併症である脊髄虚血・対麻痺の薬剤予防投与の可能性についてウサギ脊髄虚血モデル(腹部大動脈遮断による虚血誘導)を用いて検討した。薬剤はNMDA受容体拮抗薬であるメマンチンを採用した。投与経路はる経口投与を計画したがより安定していると考えられる皮下投与へ変更した(180mg/7日間)。
細胞外小胞を介した幹細胞相互作用による組織修復機構の解明と被ばく医療への応用

細胞に対するMSC由来細胞外小胞(MSC-EVs)の生物学的作用を解明するとともに、種々の放射線惹起性臓器障害に対するMSC-EVを用いた新たな組織再生治療法を開発することを目的としている。前年度のマウスモデルを用いた研究において、骨髄由来のMSC-EVが造血細胞移植後の移植片対宿主病の改善に寄与するとともに、全身放射線照射後に発症する消化管の粘膜障害を修復し得ることが確認されたため(Fujii S, et al. Stem Cells 2018)、今年度は特にMSC-EVが全身被ばく後の造血免疫系の再構築に与える影響の解明に向けて研究を深化させるため、非致死線量の全身放射線照射を用いた動物モデルの検討に着手した。また、本研究に付随する共同研究として、β2ミクログロブリン欠損マウスを用いて、骨髄のみならず脂肪組織由来MSCにも主要組織適合性抗原非依存的な免疫抑制活性が存在することを確認し(Masuda J, et al. Exp Ther Med 2018)、その作用が主にインターフェロンγの産生の抑制を介していることを報告した。所属研究機関の異動に伴う研究分担者の変更等により、全体の研究計画を見直す必要が生じ、当初に予定していた6種類の研究課題のうち、MSC自体への放射線照射がEVsの放出に与える影響の検討およびGMP基準にしたがったEVsの調整法の開発には着手することができなかったが、それ以外の4つの課題には研究開始前には未知であった新知見が得られているため、概ね順調に進捗していると自己評価する。放射線障害に対するMSC-EVsを用いた造血免疫系の修復を目指した研究をさらに推進するため、新たにマウスモデルを用いた免疫系全体の解析に習熟し、多くの実績を有する研究分担者を追加する。また、EVを活用した創薬の礎とするため、特に骨髄あるいは脂肪組織由来MSCの培養上清から分離調整したMSC-EVのセクレトームの解析を継続する。申請者らは、急性放射線症候群を含む放射線惹起性臓器障害に対する新しい細胞治療法として、間葉系幹細胞(MSC)と造血幹細胞の共移植法の開発を目指しているが、これまでその有効性を高めることを目的としてMSCの機能を薬理学的に賦活化するための基礎的研究を行ってきた(Miura Y, Chimerism 2013; Yoshioka S, Stem Cells 2014; Yao H, StemCells 2014; Sugino N, Biol Biochem ResCommun 2016)。本研究では、さらにその成果を発展させ、放射線損傷を受けた組織幹細胞に対するMSC由来細胞外小胞(MSC-EVs)の生物学的作用を解明するとともに、種々の放射線惹起性臓器障害に対するMSC-EVを用いた新たな組織再生治療法を開発することを目的としている。本年度の研究では、まずヒト骨髄MSCから高純度でEVを分離する方法を確立し、マウスモデルを用いて、MSC-EVが造血細胞移植後の移植片対宿主病の改善に寄与するとともに、全身放射線照射後に発症する消化管の粘膜障害を修復し得ることを確認した。また、この効果はヒト繊維芽細胞由来のEVでは再現されず、EVに含まれるマイクロRNAの網羅的比較解析の結果、MSC-EVにおいて含有量が多い特定のマイクロRNAがこれらの作用に関連している可能性を示唆する国際的にも新知見となる研究成果が得られた(Fujii S, et al. Stem Cells 2018)。また本成果は、MSCが分泌する生体ナノ粒子であるEVが、細胞間のコミュニケーションツールとして働き、免疫担当細胞の機能を系統的に制御していることを初めて明らかにしたものであり、MSC-EVを利用した新しい免疫調節療法の臨床開発への道を開くことが期待される。本研究では、放射線損傷を受けた組織幹細胞に対するMSC由来EV(MSC-EVs)の生物学的作用の分子機構を網羅的手法により解明するとともに、急性放射線症候群を含む種々の放射線惹起性臓器障害に対するMSC-EVを用いた新たな組織再生治療法を開発することを目的としているが、当初の研究計画通り、ヒト骨髄由来MSC-EVの高純度分離法を確立し、動物モデルを用いて消化管粘膜障害に対するMSC-EVの生物学的作用を確認できたことは大きな進捗であった。実際、この成果のインパクトを示すものとして、今年度に公開した論文の概要が全国版の新聞紙面においても報道されたことが挙げられる。

所属研究機関の異動に伴う研究分担者の変更等により、全体の研究計画を見直す必要が生じ、当初に予定していた6種類の研究課題のうち、MSC自体への放射線照射がEVsの放出に与える影響の検討およびGMP基準にしたがったEVsの調整法の開発には着手することができなかったが、それ以外の4つの課題には研究開始前には未知であった新知見が得られているため、概ね順調に進捗していると自己評価する。平成29年度に開始したMSC-EVsと組織幹細胞の相互作用を解明するための基礎的研究を継続するとともに、放射線障害に対するMSC-EVsを用いた新たな組織再生治療法の臨床開発を目指したin vivoモデルを用いた研究をさらに推進する。具体的には、各臓器に特異的な放射線障害に対する局所的あるいは全身的なMSC-EVs輸注の安全性と有効性を確認・検証するための動物実験を行うとともに、その作用に関与する物質をセクレトーム解析等の方法で同定し、創薬への展開を目指す。また、実際の臨床使用に向け、MSC培養上清から臨床使用が可能な品質のEVsを高純度で分離調整するためのGMP基準にしたがった調整法を確立するとともに、凍結や長期保存によるMSC-EVの機能の変化等についても検討を行う。放射線障害に対するMSC-EVsを用いた造血免疫系の修復を目指した研究をさらに推進するため、新たにマウスモデルを用いた免疫系全体の解析に習熟し、多くの実績を有する研究分担者を追加する。また、EVを活用した創薬の礎とするため、特に骨髄あるいは脂肪組織由来MSCの培養上清から分離調整したMSC-EVのセクレトームの解析を継続する。
microRNAによる軟骨細胞分化制御の分子メカニズムの解析

Micro RNAは、短鎖noncording RNAの一つであり、messenger RNAの分解などを介し、様々な細胞の機能や器官の発育を制御する。i本研究では、胎生期マウス下顎隆起におけるメッケル軟骨などの一次軟骨、および顎角隆起や下顎頭軟骨などの二次軟骨の発育に対するmiR-200aの果たす役割を検討した。2015年に下顎頭軟骨形成にmiR200aが関与していることを報告した。今回すすめている研究では、そのmiR200aが具体的にどのRNAに直接関わって、軟骨形成のどの段階で作用しているかを明らかにしようとしている。2つの方向から研究をすすめている。一つは既に他の報告でも上がっている軟骨形成に関与するRNAがmiR-200aの作用を受けているのではないかと、仮説をたて、RNAレベル、タンパクレベルで解析を進めている。こちらは進んできている。しかし、下顎頭軟骨形成開始段階のE10のマウス下顎隆起の段階からmiR200aがどのように作用しているのか、進めている方の研究が予定に対して少し遅れている。E10はまだ下顎隆起自体が形成が不十分で個体差が大きく、ばらつきが大きい。数を増やし、傾向を見ていく必要がある。Micro RNA(miRNA)は短鎖noncording RNAの一つであり、messenger RNAの分解などを介し、様々な細胞の機能や器官の発育を制御する。本研究では胎生期マウス下顎隆起におけるメッケル軟骨などの一次軟骨、および顎角軟骨や下顎頭軟骨などの二次軟骨の発育に対するmiR-200aの果たす役割を検討する。胎齢9日から14日ICRマウス胎仔より下顎隆起を摘出し、miR200aの発現を定量的PCRにより検討した。また、胎齢13、14日の下顎隆起におけるmiR-200a mimicの遺伝子導入を行い、アルシアンブルー染色により一次軟骨および二次軟骨の形成の変化を検討した。下顎隆起におけるmiR-200aの発現量は胎齢9日から14日にかけて徐々に増加した。また、胎齢13日の下顎隆起では、メッケル軟骨、下顎骨、歯胚にこう発現を認め、胎齢14日ではこれらの部位に加え、下顎頭軟骨原基となる間葉系幹細胞の凝集部に高発現を認めた。さらにmiR-200a mimicの導入を下顎隆起の前外則に行った群では、対照群に比べ顎角-下顎頭軟骨複合体の形成が減少した。これらの結果より、miR-200aは下顎隆起の一次軟骨、二次軟骨双方で発現するが、二次軟骨の形成に選択的に抑制に働く可能性が示唆された。これらの結果より、miR-200aは胎生期マウス下顎隆起において、二次軟骨の発育に抑制的に働くことが示唆された。現在結果のまとめを行っている。相補的な配列をもつmRNAの翻訳抑制により発生や分化などで重要な役割を果たすマイクロRNA(miRNA)に注目し、胎生期顎顔面領域における網羅的解析を行っています。これまで、miRNA-200aがマウス胎生期の下顎頭軟骨における細胞増殖や分化を制御することを明らかにしました。今後は2つの研究を進めていくが、今年度は最初の研究結果をまとめ、E10のマウスを使った実験では、アルシアンブルー染色での軟骨形成阻害は認められているが、これからは、その分子レベルでの定量的解析をすすめていく。本研究は今年度まとめに入る予定としている。発生学実験の進みが当初の予定より遅れていること、新規の実験であるため、手法を確立することに集中し、実際の方法が決まったところで一気にすすめる予定である。28年度に、RIP-Assayを行いmiRNA-200aの標的mRNAの同定を行い、その結果を基にルシフェラーゼレポーターアッセイを行うとともにシンポジウムにおいて発表する予定であったが、RIP-Assayの結果が間に合わなかったため、、計画を変更し未使用額が生じた。フェノタイプが生じることがわかったので、それら器官を切り出し、3D構築を今年度の一番すすめていく予定の実験である。このため、ルシフェラーゼレポーターアッセイの解析とシンポジウムでの発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
眼球運動-前庭系相互作用を利用した新しい平衡リハビリテーションの開発

慢性期の末梢前庭障害の治療において、薬物治療のエビデンスは乏しく、平衡リハビリテーションの重要性が近年提唱されている。身体の平衡感覚は、前庭覚、視覚、深部知覚の3つの感覚情報が入力され、小脳・脳幹といった中枢で統合されることにより保たれており、これら3つの情報の協調が重要となる。特に、前庭覚と視覚は頭部回転時の前庭動眼反射に代表されるように密接な関連がある。本研究は前庭系と眼球運動系の相互作用を利用した新しい平衡リハビリテーションを開発することを目標としている。平成30年度は、平成29年度の引き続き、video Head Impulse Test(vHIT)を末梢前庭障害患者に施行し、3つの半規管すべての機能評価をvHITで行えることを確認した。メニエール病患者においてはvHITでは異常が検出されにくい等、疾患による差異も確認され、平衡リハビリテーションを行う対象疾患にも考慮が必要と考えられた。vHITは聴神経腫瘍症例の半規管機能評価には有効と考えられ、症例を蓄積した。その結果、前半規管は他の半規管に比べ障害を受けにいこと、半規管障害は腫瘍径とは相関しないが、難聴の程度と相関することが明らかとなった。慢性期の末梢前庭障害の治療において薬物治療のエビデンスは乏しく、平衡リハビリテーションの重要性が近年提唱されている。身体の平衡は、前庭覚、視覚、深部知覚の3つの平衡感覚情報が入力され、小脳・脳幹といった中枢で統合されることで保たれており、これら3つの情報の協調が重要となる。特に、前庭覚と視覚は頭部回転時の前庭動眼反射(VOR)に代表されるように密接な関連が有り、VORが十分に働かないことで頭部運動時のふらつきが誘発される。本研究は前庭系と眼球運動の相互作用を利用した新しい平衡リハビリテーションを開発することを最終目標としている。平成28年度は末梢前庭障害患者の前庭機能を評価するためにvideo Head Impulse Test(vHIT)を施行可能な機器を導入し、そのセットアップを行った。導入までに時間を要したためまだ症例数は少ないが、vHITにより末梢前庭障害患者における半規管機能の低下が検出可能であることがこれまでに確認されている。同様に半規管機能を評価できるカロリックテスト、耳石器機能を反映するとされる前庭誘発筋電位(VEMP)と合わせて、末梢前庭障害患者における平衡機能の評価を詳細に行うことが可能となった。今後は平衡リハビリテーションの前後において、前庭機能に変化が認められるのか、検証していく計画である。また、視覚刺激と回転による前庭刺激を組み合わせた新しい平衡リハビリテーションにも次年度以降で取り組んでいく予定である。vHITを施行可能な機器が本邦では保険診療として用いる機器として承認されておらず、当院の自主臨床研究委員会の承認を得た後に、輸入手続きを行う予定であった。自主臨床研究委員会の承認が得られるまでに予想を上回る期間を要し、実験の開始が遅れた。身体の平衡覚は、前庭覚、視覚、深部知覚の3つの平衡感覚情報が入力され、小脳・脳幹といった中枢で統合されることにより保たれており、これら3つの情報の協調が重要となる。特に、前庭覚と視覚は頭部回転時の前庭動眼反射(VOR)に代表されるように密接な関連があり、VORが十分に働かないことで頭部運動時のふらつきが誘発される。平成29年度は、実際にvideo Head Impulse Test(vHIT)を末梢前庭障害患者に施行し、そのデータ集積を行った。従来の半規管機能検査としてカロリックテストが用いられてきたが、水平半規管のみの評価であった。vHITを用いることで、カロリックテストでは評価できなかった垂直半規管機能を評価し、その低下が検出可能であることを確認した。特に、聴神経腫瘍症例に着目し、垂直半規管障害の頻度および腫瘍径や罹病期間、難聴の程度等のパラメーターとの相関を検討した。前半規管は後半規管に比べ、異常が検出される頻度は低く、半規管の機能低下は難聴の程度と有意な相関を認めた。また、vHITを同一症例に複数回施行し、半規管機能の経時的変化の観察を行っている。平成30年度は、視覚刺激と回転による前庭刺激を組み合わせた新しい平衡リハビリテーションにも取り組んでいく予定である。末梢前庭障害患者におけるvHITのデータは徐々に集積できているが、健常者の眼球運動記録がまた行えていない。ボランティアの募集を行い、データの集積を行っていきたい。

平成30年度は、平成29年度の引き続き、video Head Impulse Test(vHIT)を末梢前庭障害患者に施行し、3つの半規管すべての機能評価をvHITで行えることを確認した。メニエール病患者においてはvHITでは異常が検出されにくい等、疾患による差異も確認され、平衡リハビリテーションを行う対象疾患にも考慮が必要と考えられた。vHITは聴神経腫瘍症例の半規管機能評価には有効と考えられ、症例を蓄積した。その結果、前半規管は他の半規管に比べ障害を受けにいこと、半規管障害は腫瘍径とは相関しないが、難聴の程度と相関することが明らかとなった。症例数を増やして、末梢前庭障害患者においてvHITを含めた前庭機能の評価を行う。眼球運動との相互作用を利用した平衡リハビリテーションを行い、前庭機能の変化が認められるか評価していく。引き続き、末梢前庭障害患者におけるvHITのデータ集積を行うとともに、眼球運動との相互作用を利用した平衡リハビリテーションを行い、その前後において、半規管機能評価を行う。当該財源にて購入予定であった高額機器を別財源で購入でき、機器購入に充てる予定だった予算が未使用となったため。当該財源にて購入予定であった高額機器を別財源で購入でき、予定よりも支出額が少なくなっている。研究成果発表のための国際学会参加や論文作成のための費用に充てる予定である。海外学会参加の旅費に充てる予定である。
戦後沖縄の思想 「反復帰・反国家」論の射程

本年度は日米安全保障条約の改定から50年という節目に当たり、この期に「60年安保を問いなおす」というシンポジウムを開いた(2010年7月10日)。私は当時の安保闘争などから抜け落ちていた「沖縄」を軸にして、当時の沖縄の政治・言論の状況を報告した。当時の日本では国会議事堂前での大規模な民衆デモが行われ、アイゼンハワー米大統領の訪日阻止が行われたが、同日アイゼンハワー大統領は沖縄に降り立つ。60年の安保改定において日本のデモの中にも国会審議に中にも沖縄の問題は扱われておらず、この米大統領の沖縄訪問は、60年安保がデモ隊にとっても国会にとっても沖縄の外部化によって成立していた政治状況であったことを、その後の日米一体化や密約問題をからめながら論じた。それにより、従来、余論じられていなかった戦後思想史の中の沖縄の位置づけを再確認し、日本の戦後思想が外部化していた安保改定のなかの沖縄の問題を浮き彫りにした。また、沖縄大学地域研究所の依頼による『地域研究』vol.8への書評論文では、田仲康博著『風景の裂け目』(みすず書房、2010)を論じた。そこでは、米軍占領下の沖縄における、主客の構築する「風景」の外在性と拘束性の問題と、田仲の筆致における新たな叙述の可能性を論じた。風景という外部を論じることが翻ってその人間を主体化する。そこから戦後の沖縄の風景の変遷が軍事植民地の主体化の実践であったことを論じた。また田仲による一人称の記述方法を「他者」の問題として捉えなおしポストコロニアルにおける歴史記述の方法の可能性について考察した。上述した研究内容は、日米によって外部化された沖縄が、日米間の戦後の政治史における位置づけを明確にし、さらにそのかなで沖縄を論じることの新たな可能性を示している。2008年度の研究実績は、「戦後沖縄の思想」のなかでも特異な位置を占めている「反復帰・反国家」論の再検討を行った。その成果は主に、『沖縄・問いを立てる』の第6巻『反復帰と反国家』の最終章にまとめられている。具体的に論じたのは、「反復帰・反国家」論の主要論客である新川明と岡本恵徳における「沖縄人」という名称を巡る問題と、新川の述べる「声にならぬつぶやき」という表明をめぐる問題である。前者は「集団自決」における暴力の問題を念頭に、新川が吉本隆明らの論をバックボーンに「異族」としての「沖縄人」を日本に対置するのに対して、岡本が「異族」としての「沖縄人」が国民国家的な回路を避けえないとして批判していることを論じた。後者(「声にならぬつぶやき」)に関しては、国家による主体化の強制(日本人/沖縄人)に抗する技法として新川の言説を論じている。新川は「君は日本人か?」という問いかけにおいて、沖縄の人びとはそのとき声にならないつぶやきとして「わたしは沖縄人だ」という言葉が垣間見えるという。この「声にならぬつぶやき」としてしか表明できない-瞬の戸惑いを、「声にならぬ」という否認と「つやき」としての承認として分節しつつ、その分裂したみぶりにおいてのみ国民国家の主体化の要請である呼びかけに抗する思想として抽出した。そのことで、施政権返還がせまる70年前後の沖縄でどのような思想的営為が、日米の継続する軍事・植民地占領の思惑に抗していたのかを明らかにした。本年度の研究成果は、近刊予定の『(仮)占領のまなざし』(田仲康博編著、せりか書房)に収録された「兵士たちの武装放棄」にまとめられている。その内容は、「沖縄の施政権返還/祖国復帰」の時期に、ベトナム戦争の前線基地として機能した沖縄で、住民運動やアメリカ本国の黒人解放運動、そしてベトナム反戦運動が複雑にリンクし、沖縄駐留の米兵による反戦運動があったことを、USCAR(琉球米国民政府)公安部の資料や、ベ平連などの資料を用いて解明したことにある。日本においては、ベ平連をはじめとする日本側の脱走兵支援に関する研究は、近年或る程度の成果をだしているが、駐留していた兵士たちによる「反戦運動」については、手つかずであった。特に、米軍の軍事占領下にあり、ベトナムへの出撃の最前線基地であった沖縄での活動はほとんど知られていない。本研究によって、1968年70年ごろの米軍基地周辺の米兵の反戦運動を、彼らが発行した地下新聞などの資料をもとに描き出し、沖縄の労働者との連帯や沖縄で黒人運動を学習、吸収していった経緯などを明らかにした。本研究によって、「反復帰・反国家」論が、日本対沖縄の構図の中だけで語られてきたこれまでの研究に、占領者としてのアメリカ軍とそれに抵抗する反戦兵士という別の参照軸を加えることが可能となった。本研究は、そのような意味で、「戦後」という空間における沖縄のアメリカ占領を多角的に考察する重要な研究となっている。

60年の安保改定において日本のデモの中にも国会審議に中にも沖縄の問題は扱われておらず、この米大統領の沖縄訪問は、60年安保がデモ隊にとっても国会にとっても沖縄の外部化によって成立していた政治状況であったことを、その後の日米一体化や密約問題をからめながら論じた。それにより、従来、余論じられていなかった戦後思想史の中の沖縄の位置づけを再確認し、日本の戦後思想が外部化していた安保改定のなかの沖縄の問題を浮き彫りにした。また、沖縄大学地域研究所の依頼による『地域研究』vol.8への書評論文では、田仲康博著『風景の裂け目』(みすず書房、2010)を論じた。そこでは、米軍占領下の沖縄における、主客の構築する「風景」の外在性と拘束性の問題と、田仲の筆致における新たな叙述の可能性を論じた。風景という外部を論じることが翻ってその人間を主体化する。そこから戦後の沖縄の風景の変遷が軍事植民地の主体化の実践であったことを論じた。また田仲による一人称の記述方法を「他者」の問題として捉えなおしポストコロニアルにおける歴史記述の方法の可能性について考察した。上述した研究内容は、日米によって外部化された沖縄が、日米間の戦後の政治史における位置づけを明確にし、さらにそのかなで沖縄を論じることの新たな可能性を示している。
トロポニンTミューテーションの心筋収縮に及ぼす影響

家族性心筋肥大症はトロポニンTやβ-ミオシン重鎖などの心筋のサルコメアを形成するタンパク質のミューテーションにより惹き起こされることが、報告されている。本研究ではそのうちトロポニンTの二つのポイントミューテーション、Ile79→ArgとArg92→Gluのそれぞれをもつヒト心筋トロポニンTミュータントを遺伝子工学の技術を用いて発現・精製し、その生理学的性格をワイルドタイプのヒト心筋トロポニンTと比較検討した。ミューテーションをもつそれぞれのタンパク質はワイルドタイプと同様にウサギ心筋から精製したトロポニンの他のサブユニット,トロポニンI,Cと結合し3量体を形成した。次にトロポニンTミューテーションの心筋の張力に及ぼす影響を検討するために、ウサギ摘出心臓の左心室肉柱より調整したスキンドファイバーを弱酸性、高イオン強度下に過剰量の人工的に調整したトロポニンTにより処理するという既報の方法によってウサギ筋繊維中のネイティブのトロポニンTをヒト心筋ワイルドタイプ、Ile79Arg,Arg92Gluの3種のトロポニンにそれぞれ置き換えた。これらの再構成されたファイバーを用いて張力測定を行ったところ、ミュータントタンパク質で再構成されたスキンドファイバーではワイルドタイプで再構成されたものと比較して張力を発生させる際のCa^<2+>への感受性が高いことが判明した。このことは、これらのミューテーションによる心筋肥大症の裡患者に多発する突然死の原因を解明する糸口となるかもしれない。
難治性外眼筋疾患の簡易診断法の開発とデータベース構築

斜視手術は外眼筋の手術治療によって一般的には良好な成績を修めているが、慢性進行性外眼筋麻痺(CPEO)のように手術治療によっても予後不良の疾患を含んでいる。CPEOの確定診断には筋肉の生検により病理学的に行われているが、侵襲が大きく外来診療の中で行うことは容易ではない。ミトコンドリアDNA(mtDNA)の欠失を伴うことも多いが、白血球からは欠失が検出されることは少なく、口腔粘膜からのDNA検査が注目されている。われわれはCPEOの疑われる患者において、遺伝子診断を試みて、簡易診断の可能性について報告している。本研究は、症例数を増やし、口腔粘膜、白血球、外眼筋等、種々の検体に対して簡易に診断可能な遺伝子診断法の開発を行う。前年度までは口腔粘膜由来DNAを抽出するために症例の両頬を綿棒で擦過してDNAを抽出していたが、得られたDNAは精製度が低く収量が均一ではなかったためにPCR増幅の再現性が悪かった。正確なCPEOの遺伝子診断を行うためには精製度の高い口腔粘膜由来DNAを均一量得ることは非常に重要である。そこで本年度は患者から唾液検体を頂き唾液由来DNAを用いてCPEOの遺伝子診断が可能かどうかを検討した。唾液由来DNAの多くは白血球由来DNAであるが口腔粘膜由来DNAも存在しており、唾液検体からCPEOの遺伝子診断が可能である事が分かれば患者の侵襲をより少なくして検査が可能である。浜松医科大学を受診したCPEOが疑われる2症例から血液と唾液を頂き遺伝子診断を行った。結果、両症例の血液検体からはmtDNAの欠失は検出されなかったが、唾液検体から欠失を検出した。来年度は更に症例数を増やして唾液検体でCPEOの遺伝子診断を検討する。また、過去に実施したCPEOの遺伝子診断でmtDNAの欠失が検出されなかったCPEOが疑われた患者に対しても唾液検体による遺伝子診断を再検討する。正確なCPEOの遺伝子診断を行うためには精製度の高い口腔粘膜由来DNAを均一量得ることが非常に重要である。本年度は口腔粘膜細胞からのDNA抽出が現手法ではDNAの収量が少なく精製度が低い為、患者から唾液検体を頂き唾液由来DNAを用いてCPEOの遺伝子診断が可能かどうかを検討した。当初、既にミトコンドリアDNA(mtDNA )の欠失が検出されている患者の唾液検体を頂き、コントロールとしてmtDNAの欠失が検出できるかどうかを検討する予定であったが、検体が得られなかったため今年度新たに浜松医科大学を受診したCPEOが疑われた2症例の唾液と血液検体でCPEOの遺伝子診断の検討を行った。インフォームドコンセントの上で、血液と唾液からそれぞれDNAを抽出した。血液の場合は7ml採血し、QIAamp DNA Blood Midi Kit(QIAGEN社)を用いてDNAを抽出した。唾液の場合は唾液1mlをOragene (DNA genotek社)に採取してDNAを抽出した。各患者のDNA約20ngをロングPCR法に用いた。今年度は唾液検体を用いてCPEOの遺伝子診断が可能かどうかを検討する事が出来た。来年度は更に症例数を増やして唾液検体でCPEOの遺伝子診断を継続して検討する。収集する検体は明らかにCPEOの疑われる症例のみでなく、眼瞼下垂が比較的軽度な症例を含めて検討する。検体は可能な限り血液と唾液の両検体の収集を試みる(斜視手術を実施した症例については外眼筋検体も収集する)。今年度の検討で確定診断が得られた2症例は細隙灯顕微鏡検査、眼底検査の他、眼位、眼球運動、立体視について更に詳細に検査を行う。唾液検体から欠失を同定出来なかった症例については原因変異を同定する為、既報告のCPEOの原因変異遺伝子(POLG、TWNK、SLC25A4など)について変異解析も検討する。斜視手術は外眼筋の手術治療によって一般的には良好な成績を修めているが、慢性進行性外眼筋麻痺(Chronic Progressive External Ophthalmoplegia:以下、CPEO)のように手術治療によっても予後不良の疾患を含んでいる。ミトコンドリアDNAの欠失を伴うことも多いが、白血球からは欠失が検出されることは少なく、口腔粘膜からのDNA検査が注目されている。本年度は浜松医科大学を受診したCPEOが疑われる12症例に対して検体(口腔粘膜細胞または血液)を提供頂き、ロングPCR法によりミトコンドリアDNAの欠失の有無を検討した。結果、1例よりミトコンドリアDNAの欠失を検出した。

確定診断の得られた1症例については細隙灯顕微鏡検査、眼底検査の他、眼位、眼球運動、立体視について詳細な検査を行う。欠失を同定出来なかった症例については原因変異を同定する為、既報告のCPEOの原因変異遺伝子(POLG、TWNK、SLC25A4など)について変異解析を検討する。また、口腔粘膜細胞からのDNA抽出については現手法ではDNAの収量が少なく精製度が低い為、新たな抽出法も検討する。当院にて斜視手術を希望した内転障害と眼瞼下垂を伴う斜視患者を対象とした。明らかにCPEOの疑われる症例のみでなく、眼瞼下垂が比較的軽度な症例を含めて検討した。インフォームドコンセントの上で、口腔粘膜細胞または血液からそれぞれDNAを抽出した。血液の場合は7ml採血し、QIAamp DNA Blood Midi Kit(QIAGEN社)を用いてDNAを抽出した。口腔粘膜細胞の場合は頬粘膜を擦過しBuccal Cell DNA Extraction Kit (TrimGen社)を用いて口腔粘膜細胞からDNAを抽出した。各患者のDNA約20ngをロングPCR法に用いた。ミトコンドリアDNAの塩基配列はGenbankのアクセッション番号NC_012920を参照した。ミトコンドリアDNAの欠失領域(m.8470-m.13447, m.9649-m.15983)を含むm.4621-m.16449領域を増幅するプライマー、Forwardプライマー: 5`- GTTCCACAGAAGCTGCCATCAAGT -3'(m.4621-m.4644)Reverseプライマー: 5`- GAGGAGAGTAGCACTCTTGTGCG -3'(m.16427-m.16449)を使用し、ミトコンドリアDNAの欠失の有無を検討した。結果、12症例の内、1例よりミトコンドリアDNAの欠失を同定した。斜視手術は外眼筋の手術治療によって一般的には良好な成績を修めているが、慢性進行性外眼筋麻痺(CPEO)のように手術治療によっても予後不良の疾患を含んでいる。CPEOの確定診断には筋肉の生検により病理学的に行われているが、侵襲が大きく外来診療の中で行うことは容易ではない。ミトコンドリアDNA(mtDNA)の欠失を伴うことも多いが、白血球からは欠失が検出されることは少なく、口腔粘膜からのDNA検査が注目されている。われわれはCPEOの疑われる患者において、遺伝子診断を試みて、簡易診断の可能性について報告している。本研究は、症例数を増やし、口腔粘膜、白血球、外眼筋等、種々の検体に対して簡易に診断可能な遺伝子診断法の開発を行う。前年度までは口腔粘膜由来DNAを抽出するために症例の両頬を綿棒で擦過してDNAを抽出していたが、得られたDNAは精製度が低く収量が均一ではなかったためにPCR増幅の再現性が悪かった。正確なCPEOの遺伝子診断を行うためには精製度の高い口腔粘膜由来DNAを均一量得ることは非常に重要である。そこで本年度は患者から唾液検体を頂き唾液由来DNAを用いてCPEOの遺伝子診断が可能かどうかを検討した。唾液由来DNAの多くは白血球由来DNAであるが口腔粘膜
ヒストンメチレーションからアプローチする病態分子診断法の開発

ヒストンメチレーションがストレス状態によって変化しうることが明らかとなった。フローサイトメトリーを用いたリンパ球の解析から、ホストのストレス状態を把握できる可能性があり、診断法開発への基盤となる成果が得られたといえる。1.ヒストンメチル化レベルの評価得られた臨床材料のヒストンメチル化レベルを解析した結果、ウエスタンブロット法による血液細胞全体のメチル化は著変なく、有意な差異は認められなかった。フローサイトメトリー法を用いて各細胞群における比較をすると、リンパ球、単球、B細胞T細胞などの各細胞種で異なった挙動を示していた。現在、これが分化プロセスと、どのような関連性があるかを詳細に分析中である。2.ヒストンメチル化の染色体マッピングヘテロクロマチン領域を含めて、染色体上のヒストンメチル化レベルの違いを検討した。HP1は、メチル化ヒストンに結合する蛋白であり、これを用いたマッピングでは、非特異的シグナルが少なく、メチル化レベルの違いを評価できた。これまでのところ、明らかな疾患関連領域は特定されていない。また、他のヒストンメチル化に対する抗体を用いた解析では、非特異的反応が強く、その評価は困難な状況である。3.ChIPアッセイによる特異的ヒストンメチル化領域の証明ChIPアッセイを用いて、特定の遺伝子領域のヒストンメチル化を解析した。リボゾームDNAは、複数の染色体上に数百コピー存在していることから、この領域に着目し、ChIPアッセイを行った。放射線照射によって、ある種のヒストンのメチル化が変化することが判った。この点に着目し、放射線感受性との関連性について、検討中である。しかし、この領域を含めて、ChIPアッセイの結果と関連する疾患に結びつく結果は得られていないため、さらに、領域を増やしてゆく予定である。1.ヒストンメチル化レベルの評価ヒストンメチル化レベルは、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡及び、ウエスタンブロット法によって解析した。患者様のサンプルは、主にフローサイトメトリーを用いて解析した。サンプル間の誤差や、採血してからの時間など、安定した結果を得ることは困難であった。一方、細胞株を用いた解析では、ある種のストレスでヒストンメチル化が亢進することが判明した。ストレスとクロマチン高次構造との関連性を示唆するものであり興味深い。現在、投稿準備中である。2.ヒストンメチル化酵素のsiRNAヒストンメチル化酵素(ヒストンメチルトランスフェラーゼ)の中で、SuvH20に着目して解析を進めた。この遺伝子をターゲットするsiRNAをトランスフェクトし、その発現を抑制し、ストレス応答への影響をみた。複数のsiRNAの中で高率に転写を抑制するものが得られ、現在、詳細にその生物学的意義を解析中であり、その結果を報告する予定である。3.酸化ストレスの調節機構にXBP1が関与している同時に進行している酸化ストレスに関する研究成果は、まとまって既に発表したところである。すなわち、小胞体ストレス応答に関わるXBP1が酸化ストレス応答にもかかわり、両者のストレスから守っているらしいことを突き止めた。ヒストンメチル化とリンクしたマイクロRNA(発現抑制)を特定し、そのターゲット分子を明らかにする。すなわち、一つのマイクロRNAはおよそ100前後のターゲット分子をもつことから(Sanger WEBサイトで検索可能)、病態と関連する分子を選択しウエスタンブロット及びFACSを用いて解析する。同定されたターゲット分子の発現抑制をsiRNAによって、同時に機能抑制をインヒビターによって行い、その分子の重要性を評価する。