hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小循環系に応用可能な小口径人工血管の開発

進行性悪性腫瘍に対する放射線療法、化学療法、手術など集学的治療が発展している。これに伴いとくに拡大手術によって広範囲の組織欠損が生じる症例に対する再建外科が求められる機会が増加している。形成外科による再建外科は多くの場合、顕微鏡下血管吻合術を伴う遊離組織移植術でなる。遊離組織は皮膚、皮下脂肪、筋膜、筋肉から構成される微小循環系であり、そこを流れる血流量は極めて微量であり、かつ、血管茎も極めて細い。このような微小循環系に応用可能な小口径人工血管を開発することが本発明の目的である。本研究で使用した小口径人工血管の材質はポリウレタンであり、これを押し出し成型法で、内径3.0mm、外径4.0mm、長さ25mmに加工し、その内面に抗血栓性高分子材料のポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)-ポリスチレンブロック共重合体(HSと略記)と抗トロンビン剤であるアルガトロバン(Argと略記)でコーティングした。前者は血小板の粘着活性化を抑制し、後者は選択的にトロンビンを阻害する。家兎下大静脈を用いた人工血管移植モデルで比較検討した。第1群:非コーティングチューブ(n=9)、第2群:HSコーティングチューブ(n=9)、第3群:ヘパリンコーティングチューブ(n=9)、第4群:HS/Argコーティングチューブ(n=9)に実験群を分類した。1週間の開存性では第1群が0%、第2群が56%、第3群が67%、第4群が100%であった。HS/Argコーティングチューブが有意に良好な開存成績であった。HSとArgの組み合わせで抗血栓性が実現されることがわかった。しかし、人工血管と下大静脈が接触する吻合部に内膜肥厚が発生し、微小血栓形成の原因となっており、人工血管の断端形状および吻合法の更なる改良が必要と考えられた。そこで、上記のポリウレタン製人工血管の断端を丸みを帯びるように加工し、内径1.4mm、外径1.9-2.1mm、長さ15mmとさらに小口径のものを作成し、家兎腹壁皮弁移植モデルで遊離皮弁の血管茎である大腿動静脈それぞれに小口径人工血管を挿入し、腹腔内の腎動静脈へ遊離組織移植を行った。17羽の家兎に1週間埋め込んだ結果、動静脈双方の人工血管が開存したものが3例認められた。例数は少ないものの、1-5ml/minの微量血流量で1週間動静脈双方が開存したことは注目に値する。HS/Argが極めて高い抗血栓性を示唆しているものと考えられる。
極低温におけるクラスターイオンの生成とダイナミックス

イオンの気相溶媒和反応により生じるクラスターイオンの生成のダイナミックスおよびその物理化学的性質に関する研究は,基礎および応用分野に重要な情報を提供する.この分野では比較的小さなクラスターイオンの研究に主力が注がれ,とくに小さなエネルギーから成る大きなクラスターイオンに関する研究は殆ど試みられていない.本研究では,極低温冷凍機を用いる測定法を開発し, 85025Kの広い温度領域において小さなサイズから大きなサイズに到るクラスターイオンの生成およびダイナミックスを研究し,測定可能な低温極限のデータを集積することを目的とする.極低温用小型冷凍機に純銅製のイオン源を取りつける.イオン源の温度はヒーターおよび温調機の使用により, ±0.1Kの精度で一定温度を設定できる. 25Kまで冷却可能である.イオン源を有するチャンバーをターボ分子ポンプで排気する.平衡反応の平衡定数の温度依存性を測定することより、反応の熱力学的諸量を求めるこきができる。△G^0=-RTlnK=△H^0-+△S^0。H_3^+DのH_2分子による溶媒和測定において、クラスタ-イオンH_3^+D(H_2)_nのn=3、6、8でクラスタ-がshell構造を形成することが分かった。これより、H_3^+(H_2)_nの構造に関する知見を得た。N_2^+...N_2が共有性結合を有することを見出した。反応のエントロピ-変化が小さいので、N_4^+中のN_2分子が大きな運動の自由度を有することが分かった。N_4^+は、N_2分子によって静電的に溶媒和される。N_4^+(N_2)_nはn=1D1までとくに安定なshell構造をもたない。N_3^+(N_<2_)_<n>は、n=3でshell構造を形成する。O_<2>^+(N_<2>)_<n>では、n=4でshell構造を形成する。これは、O_<2>^+の4つのπ^+軌道のlobeににN_2>分子が配位するためである。正および負イオンともに、酸素分子よりイオンの気相溶媒和反応により生じるクラスターイオンの生成のダイナミックスおよびその物理化学的性質に関する研究は,基礎および応用分野に重要な情報を提供する.この分野では比較的小さなクラスターイオンの研究に主力が注がれ,とくに小さなエネルギーから成る大きなクラスターイオンに関する研究は殆ど試みられていない.本研究では,極低温冷凍機を用いる測定法を開発し, 85025Kの広い温度領域において小さなサイズから大きなサイズに到るクラスターイオンの生成およびダイナミックスを研究し,測定可能な低温極限のデータを集積することを目的とする.極低温用小型冷凍機に純銅製のイオン源を取りつける.イオン源の温度はヒーターおよび温調機の使用により, ±0.1Kの精度で一定温度を設定できる. 25Kまで冷却可能である.イオン源を有するチャンバーをターボ分子ポンプで排気する.平衡反応の平衡定数の温度依存性を測定することより、反応の熱力学的諸量を求めるこきができる。正および負イオンともに、酸素分子より
自己寛容をコントロールする新しい転写因子FOXP3の胸腺における機能の解明

1)sfマウス新生児幼若マウス胸腺(♂:sf/Y)を1.35mMdeoxyguanosineで57日培養したものを、まずeuthymicであるB6.Thy1.1マウスに移植したところ、皮膚病変・脾腫・リンパ節腫脹などを認めなかった(生存率5/6;83%)。フローサイトメトリーの結果、移植片の胸腺フレームワークから持ち込まれたと考えられるThy1.2^+ T細胞は存在したが、自己免疫病態は示さなかった。一方B6-nu/nuの腎被膜下に移植した場合においても、一部のマウスで移植早期に一過性の著しい皮膚の紅潮を来したマウスが出現したが、いずれもself-limitingであった。9ヶ月後の生存率は7/9(78%)で、生残宿主においてはscurfyに認められるような落屑性皮膚炎症状などは認められなかった。以上の胸腺移植実験から、Tregは胸腺上皮細胞により選択され分化する亜群であるが、sfマウス由来胸腺上皮細胞が積極的にT細胞に自己反応性を賦与するような機構は存在しないことが判明した。2)sfマウスにおいてNK1.1^+TCRαβ^+分画は、胸腺・脾臓において割合が増加していた。特に、胸腺においては、対照0.1%に対し2.6%と著明に増大していたが、これは主にCD4^+8^+細胞分画の減少(85%→30%)による相対的な変化と、delectionへの抵抗性などが考えられた。Tregの機能不全が存在する状態で、NKT細胞が自己免疫病態に対してどのような影響を及ぼしているかは引き続き解析が必要であり、B6.CD1d^<-/->とB6.Cg-foxp3^<sf>との交配を行ってfoxp3^<sf>/CD1d^<-/->を作製、自己免疫病態がどのような影響を受けるかを検索中である。scurfy(sf)の形質は、sf胸腺により教育された自己反応性T細胞によって生じていると考えられる結果(Godfrey, V. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5528-32,1991)が発表されていた。本研究の1つの目的はsf胸腺によるT細胞分化異常を明らかにすることであった。sf胸腺上皮細胞に異常があるとすれば、Foxp3の発現が無いために生じる遺伝子発現の異常に起因するものである。そこで野生型(C57BL/6;B6)胸腺上皮細胞株(国立感染症研究所笠井博士より供与)数種を用いてFoxp3の発現について検索した。その紳果、調べたいずれのクローンにおいてもFoxp3の増幅バンドは検出されなかった。すなわち、Foxp3が胸腺上皮に発現しないことが、sf胸腺による寛容誘導異常に直接関連するか否かは現在のところ不明である。このことを証明するためには、sf胸腺移植実験による自己免疫誘導実験が必要であるが、マウスの供給不良と動物施設のマウス肝炎ウイルスによる長期間の閉鎖によって未了である。マクロファージ遊走阻止因子(MIF)は、最初に生物活性が明らかとなったサイトカインである。MIFはグルココルチコイドにより発現増強するなど、免疫寛容・抑制などとの関連が推測された。MIFと調節性T細胞機能の関連を解析する目的で、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)トランスジェニックマウス(Tgm)由来のCD4^+25^+T細胞の抑制活性を調べた。野生型(B6)の(CD25T細胞を反応細胞として抗CD3抗体とX線照射B6脾細胞を培養する系に一定の比で、野生型・TgmのCD4^+25^+T細胞を添加して増殖抑制能を比較したところ、Tgm由来CD4^+25^+T細胞の抑制活性がやや低下していた。GITRに関しては発現が増加しており、抑制活性低下と相関しているものと考えられた。

特に、胸腺においては、対照0.1%に対し2.6%と著明に増大していたが、これは主にCD4^+8^+細胞分画の減少(85%→30%)による相対的な変化と、delectionへの抵抗性などが考えられた。Tregの機能不全が存在する状態で、NKT細胞が自己免疫病態に対してどのような影響を及ぼしているかは引き続き解析が必要であり、B6.CD1d^<-/->とB6.Cg-foxp3^<sf>との交配を行ってfoxp3^<sf>/CD1d^<-/->を作製、自己免疫病態がどのような影響を受けるかを検索中である。
翼手目由来感染症リスクの対応戦略構築のための疫学的基礎データの収集

本研究の目的はフィリピン及び台湾で翼手目(コウモリ)を捕獲し、それらのコウモリが持っている細菌、ウイルス、原虫等の微生物の疫学調査を実施し、気候変動によって将来日本で問題となる可能性のあるコウモリ由来感染症に関する情報を整理し、その対応戦略を作成するための基礎データを構築することにある。2017年度はフィリピンでのコウモリ捕獲調査ができなかったので、2018年度はその分を挽回するようにしたいと考え、フィリピンのカウンターパートであるマサンガイ教授と相談し、捕獲調査の計画を立てた。2019年1月23日30日のスケジュールでフィリピンのルソン島ナガ市周辺でコウモリの捕獲調査を行った。日本からは研究代表者の久和、分担者の大松、宇根、加藤、また研究協力者として渡辺(岡山理科大獣医学部)が参加し、その他東大、農工大の大学院生がそれぞれ1名参加した(合計7名)。また、フィリピンメンバーはフィリピン大学ロスバニョス校のマサンガイ名誉教授、自然史博物館のエジソン研究員ら8名が参加した。フィリピン国内の移動に時間がかかり、実質3日間の捕獲調査であったがオオコウモリ、ココウモリ併せて約70頭を捕獲することができた。フィリピンメンバーの協力を得て、現地でサンプルを冷凍保存し、それらのサンプルとともに帰国した。今後はそれらのサンプルを用いて、細菌、ウイルス、原虫等の微生物について、次世代シーケンサー、PCRあるいは血清学的検査等により疫学調査を実施する。2018年度は2019年1月23日30日の日程でフィリピンのルソン島ナガ市周辺においてコウモリの捕獲調査を行った。日本からは研究者・大学院生併せて7名、フィリピンメンバー8名が参加し、約70頭のコウモリを捕獲することができ、今後それらを用いた解析を行う。2019年1月23日30日にフィリピンのルソン島ナガ市周辺においてコウモリの捕獲調査を行い、約70頭のコウモリを捕獲することができた。今後、それらサンプルを用いた細菌、ウイルス、原虫等の疫学的解析を行う。また、2019年度のコウモリ捕獲調査の計画を早急に決定し、それを実行する。2017年度は、主に(1)台湾での予備調査と、(2)フィリピンでのコウモリの捕獲調査を予定していた。(1)台湾での予備調査: 2017年10月14日16日の3日間、Chen博士(台湾、中原大学)に案内していただき、研究分担者である大松博士と一緒に台湾の台南、台中地区のコウモリ捕獲候補地を回り、現地の状況(交通・宿泊・治安・捕獲の難易、サンプリングの難易)、コウモリの状況(種・数量)などを確認した。交通・宿泊・治安などは全く問題無いことが分かったが、サンプリング可能なコウモリの種は限定され、またその数量も多くは望めないことが明らかになった。(2)フィリピンでのコウモリの捕獲調査:当初、我々のグループがこれまでコウモリの捕獲調査を実施していないパラワン島での捕獲調査を視野に、調整を行っていた。しかしながら、パラワン島でのコウモリ捕獲調査の許可が下りないこと、現地の案内役のマサンガイ博士の都合、気候的な要因(台風、雨季など)などが重なり、年度内に捕獲調査を実施することが難しくなり、最終的に捕獲調査を諦めた。そのため、研究費の一部を次年度に繰り越すことにした。台湾での予備調査は予定通り実施できたが、台湾でコウモリサンプルを大量に集めるのは難しいことが分かった。

一方、フィリピンでのコウモリの捕獲調査に関する許可が得られないなどの理由から捕獲調査を実施できなかったので、2017年度にはコウモリを新たに捕獲することができず新たなサンプルを得ることができなかった。2019年1月23日30日にフィリピンのルソン島ナガ市周辺においてコウモリの捕獲調査を行い、約70頭のコウモリを捕獲することができた。今後、それらサンプルを用いた細菌、ウイルス、原虫等の疫学的解析を行う。また、2019年度のコウモリ捕獲調査の計画を早急に決定し、それを実行する。本研究はフィリピン及び台湾で翼手目(コウモリ)を捕獲し、それらのコウモリが持っている細菌、ウイルス、原虫等の疫学調査を実施し、気候変動によって将来日本で問題となる可能性のあるコウモリ由来感染症に関する情報を整理し、その対応戦略の基礎データを構築することにある。当初はフィリピンと台湾の両方で捕獲調査を行うことを目論んでいたが、2017年度に実施した台湾の予備調査の結果を踏まえ、今後はコウモリのサンプルを多く集めることができるフィリピンを中心に捕獲調査を進めて行く予定である。
植物無細胞翻訳システムを用いたＲＮＡウイルスのキャップ構造非依存的翻訳機構の解明

ウイルスはリボソームや翻訳開始因子などの翻訳に必要な因子を宿主のmRNAから奪い取り、自らの遺伝子発現に利用する。ウイルスの遺伝子発現制御機構の解明には宿主の翻訳機構の知見が必要不可欠であるものの、植物細胞での知見は非常に乏しい。本研究では、二分節のゲノムRNA (RNAtとRNA2)のいずれにもキャップ構造とポリA配列を持たない植物ウイルスであるRed clover necrotic mosaic virus (RCNMV)をモデルとして用い、通常の真核生物mRNAとは異なるウイルスのキャップ構造非依存的翻訳機構を解明することを目的とする。前年度は種々の翻訳開始因子遺伝子に変異を持つシロイヌナズナを用いた解析を行い、RNA1とRNA2のキャップ構造非依存的翻訳には異なる翻訳開始因子が必要であることが示唆された。本年度は、以下の3つの観点から研究を行った。1)タバコ培養細胞由来の試験管内翻訳系と翻訳開始因子のリコンビナントタンパク質を用い、試験管内でRNA1とRNA2それぞれの翻訳の再構成を行った。前年度得られた結果と合わせ、RNAIの翻訳にはe1F4Fが、RNA2の翻訳にはelFiso4Fがそれぞれ必要であることが強く示唆された。2)RNA複製とリンクした翻訳機構の解明に向け、RNA2の翻訳に必要なRNA因子の同定を試みた。種々の変異体RNA2をシロイヌナズナプロトプラストに接種して調べた結果、RNA2の複製には影響せず翻訳のみに影響するRNA因子の同定に成功した。3)eIF4FあるいはeIFiso4F遺伝子に変異を持つシロイヌナズナ植物体にRCNMVを接種した結果、いずれの変異体でもRCNMVの感染性が低下していた。以上の結果から、RCNMVは分節ゲノムRNA間で異なる翻訳開始因子を用いて翻訳を行うという他に類を見ない特徴を持つことが明らかとなった。当初の予定通り、本年度は試験管内翻訳系を用いた解析を行い、RCNMVのそれぞれのゲノムRNAの翻訳に必要な翻訳開始因子を同定できた。また、種々の翻訳開始因子の遺伝子に変異を持つシロイヌナズナ変異体を用いたRCNMVの感染性の調査も問題なく行うことができた。試験管内翻訳系を用いてアフィニティー精製と質量分析を行い、RNA1の翻訳に必要な因子を新たに同定することはできなかったが、そのかわり、当初予定していなかったRNA2の翻訳に必要なRNA因子の絞り込みを行うことができた。これらの点から、本研究はおおむね順調に進展していると言える。今後は、試験管内翻訳系あるいはプロトプラストを用いてRNA2と翻訳開始因子の相互作用を調べる。また、RNA1とRNA2のキャップ構造非依存的翻訳に必要な翻訳開始因子の要求性の違いを生む要因を探るため、RCNMV感染プロトプラストをショ糖密度勾配遠心法により分画し、RNAIとRNA2、それぞれの局在を調べる。そして、それぞれの解析を進めながら、これまでの結果をまとめ、国際誌への投稿を準備する。ウイルスはリボソームや翻訳開始因子など翻訳に必要な因子を宿主のmRNAから奪い取り,自らの遺伝子発現に利用する.ウイルスの遺伝子発現制御機構を解明するためには宿主の翻訳機構の知見が必要であるものの,植物細胞における翻訳機構の知見は非常に乏しい.本研究では,二分節のゲノムRNA(RNA1とRNA2)の両方にキャップ構造とポリA配列を持たない植物ウイルスであるRed clover necrotic mosaic virus(RCNMV)をモデルとして用い,通常の真核生物mRNAとは異なるウイルスのキャップ構造非依存的翻訳機構を解明することを目的とする.本年度はRCNMVのキャップ構造非依存的翻訳に必要な翻訳開始因子の同定を試みた.1)候補遺伝子のクローニングこれまでの研究から,RNA1の翻訳には翻訳開始因子複合体であるelF4Fまたはその植物特異的なアイソタイプであるeIFiso4Fが必要であることが示唆された.そこでシロイヌナズナおよびタバコBY-2細胞からeIF4F,eIFiso4Fを構成する遺伝子のクローニングを行い全長のcDNA配列を得た.2)RNA1の3'端非翻訳領域(3'UTR)と相互作用する翻訳開始因子の同定試験管内翻訳系を用いてRNAプルダウン実験を行い,eIF4E,eIF4GおよびeIFiso4GがRNA1の3'UTRと相互作用することを示した.3)RCNMVの翻訳に必要な翻訳開始因子の同定種々の翻訳開始因子の遺伝子が欠損したシロイヌナズナ変異体由来のプロトプラストを用いてRNA1およびRNA2の翻訳を調べた.その結果,RNA1の効率よい翻訳にはeIF4Fが,RNA2の効率よい翻訳にはeIFiso4F1がそれぞれ必要であることがわかった.以上の結果から,RCNMVは分節ゲノム間で異なる翻訳開始因子を用いて効率良く翻訳を行うというユニークな特徴を持つことを明らかにした.ウイルスはリボソームや翻訳開始因子などの翻訳に必要な因子を宿主のmRNAから奪い取り、自らの遺伝子発現に利用する。

本年度は、以下の3つの観点から研究を行った。1)タバコ培養細胞由来の試験管内翻訳系と翻訳開始因子のリコンビナントタンパク質を用い、試験管内でRNA1とRNA2それぞれの翻訳の再構成を行った。前年度得られた結果と合わせ、RNAIの翻訳にはe1F4Fが、RNA2の翻訳にはelFiso4Fがそれぞれ必要であることが強く示唆された。2)RNA複製とリンクした翻訳機構の解明に向け、RNA2の翻訳に必要なRNA因子の同定を試みた。種々の変異体RNA2をシロイヌナズナプロトプラストに接種して調べた結果、RNA2の複製には影響せず翻訳のみに影響するRNA因子の同定に成功した。3)eIF4FあるいはeIFiso4F遺伝子に変異を持つシロイヌナズナ植物体にRCNMVを接種した結果、いずれの変異体でもRCNMVの感染性が低下していた。以上の結果から、RCNMVは分節ゲノムRNA間で異なる翻訳開始因子を用いて翻訳を行うという他に類を見ない特徴を持つことが明らかとなった。当初はRNA1の翻訳に関わる翻訳開始因子の同定および機能解析を行う予定であった.しかしシロイヌナズナ変異体を用いて解析を行うことにより,RNA1だけでなくRNA2の翻訳に関わる翻訳開始因子を新たに同定することに成功した.また,RNA1とRNA2の翻訳機構を同時に研究することにより,分節ゲノムを持つウイルスがゲノム間で異なる翻訳開始因子を用いて翻訳を行うという興味深い現象を見いだすことができた.当初の予定通り、本年度は試験管内翻訳系を用いた解析を行い、RCNMVのそれぞれのゲノムRNAの翻訳に必要な翻訳開始因子を同定できた。また、種々の翻訳開始因子の遺伝子に変異を持つシロイヌナズナ変異体を用いたRCNMVの感染性の調査も問題なく行うことができた。試験管内翻訳系を用いてアフィニティー精製と質量分析を行い、RNA1の翻訳に必要な因子を新たに同定することはできなかったが、そのかわり、当初予定していなかったRNA2の翻訳に必要なRNA因子の絞り込みを行うことができた。これらの点から、本研究はおおむね順調に進展していると言える。今後は,様々な翻訳開始因子を除いた試験管内翻訳系(タバコBY-2培養細胞もしくはシロイヌナズナMM2d培養細胞由来)と大腸菌で発現させ精製した翻訳開始因子のリコンビナントタンパク質を用い,RCNMVの翻訳に必要な翻訳開始因子を調べる予定である.また,試験管内翻訳系でのアフィニティー精製と質量分析を組み合わせて行うことにより,RNA1の翻訳に必要な翻訳開始因子を新たに同定する予定である.今後は、試験管内翻訳系あるいはプロトプラストを用いてRNA2と翻訳開始因子の相互作用を調べる。また、RNA1とRNA2のキャップ構造非依存的翻訳に必要な翻訳開始因子の要求性の違いを生む要因を探るため、RCNMV感染プロトプラストをショ糖密度勾配遠心法により分画し、RNAIとRNA2、それぞれの局在を調べる。そして、それぞれの解析を進めながら、これまでの結果をまとめ、国際誌への投稿を準備する。
MBTポリコームによるエピジェネティカルな発癌制御

ゲノム遺伝子のエピジェネティカルな制御の異常とそれに伴うゲノム安定性の破綻は、重要な発癌の分子機構として近年注目されている。エピジェネティクスに重要な分子の中に、ポリコームグループ分子(PcG)があるが、この分子群は、発生過程における細胞の分化・増殖の制御、あるいはES細胞の分化全能性の保持に極めて重要な役割を果たしている。本研究課題では、新しいPcGタンパク質であるMBTファミリー、特に骨髄増殖性疾患の原因遺伝子の可能性を示唆されているL(3)MBTによるゲノム安定性制御のメカニズムを、生化学的・分子生物学的に解明することと、コンディショナルノックアウトマウスの作製・解析による様々な組織における発癌との関連性を解析することを目標として行った。1. L(3)MBTの標的遺伝子を見つけるために行ったChIP on chip解析で得られた標的遺伝子の候補についてL(3)MBTがその遺伝子のプロモータ領域に結合していることをChIP-PCRによって確かめた。また、その領域がL(3)MBT欠損ES細胞においてはヒストン修飾(ヒストンH4のモノメチレーション)が減少していることを発見した。2. L(3)MBT欠損ES細胞を用いて胚様体に分化させたところ、分化に伴い発現する正常な遺伝子発現(三胚葉の分化マーカの発現)が見られず、多くの細胞がアポトーシスに陥った。そのため、L(3)MBTが細胞分化に必要であることが判明した。また、L(3)MBT欠損ES細胞をヌードマウスに移植したところ、形成されるテラトーマが野生型ES細胞のものに比べて大きく、また未熟な細胞が多く含まれていた。このとこからもL(3)MBTは細胞の分化に必要であり、L(3)MBTの機能破綻が細胞癌化に関連する可能性が示された。3.コンディショナルノックアウトマウス作製のためのターゲティングベクターが相同組換えをおこしたES細胞を用いてキメラマウス作製を行った。L3MBTにGFPを付加したタンパク質を強制発現するHela細胞を作製し、抗GFP抗体を用いてChlP on chip解析を行うことにより、L3MBTが標的とする遺伝子部位の候補を得ることができた。その中の一部について、実際にES細胞やES細胞を分化させたEmbryoid Body (EB)細胞を用いてChIP-PCRを行うことにより、細胞の分化過程におけるL3MBTの結合を確認した。L3MBTの欠損が細胞分化に与える影響を解析するために、L3MBTノックアウトES細胞を作製した。それをEBへ分化させ、分化の際の遺伝子発現の変化等をコントロールES細胞と比較した。ノックアウトターゲティングベクターの設計・構築を行い、ES細胞で相同組み換えを行った。相同組み換えを起こしたES細胞のクローンを数種得ることができた。
ヘミアセタールエステル化反応を利用する自己重付加型高分子の設計と合成

本研究の目的は、ヘミアセタールエステル構造を有する自己重付加型高分子の創製とそれを利用する樹枝状高分子の合成、更には得られた高分子の機能評価に関してその方法論を確立することである。重合の素反応として用いるヘミアセタールエステル化反応は、無触媒系では全く反応が進行せず、触媒の添加によりはじめて反応を開始する。この特徴を利用すると自己重付加型モノマーを安定な形で合成することが可能である。今年度、分子内にビニルエーテル部位とカルボン酸部位を有するモノマーを種々のヒドロキシカルボン酸を出発原料として合成した。得られたモノマーの自己重付加反応により対応するポリ(ヘミアセタールエステル)の合成を検討した。昨年度に得られた結果に基づきAB2およびAB2タイプのモノマーを合成し、PPTS(p-トルエンスルホン酸ピリジニウムを触媒を用いて行いることで、対応するハイパーブランチ構造を有するポリ(ヘミアセタールエステル)を合成に成功した。また、アルコキシアレンより誘導したヘミアセタールエステル骨格を持つモノマーの重合挙動に関して検討を行い、アニオン重合およびラジカル重合という重合モードの違いにより得られるポリマーの構造が異なることを明らかにした。今年度、分子内にビニルエーテル部位とカルボン酸部位を有するモノマーを合成し、その自己重付加反応により対応するポリ(ヘミアセタールエステル)の合成を検討した。またへミアセタールエステル骨格を持つポリマーの熱解離挙動についても詳しく検討した。自己重付加型モノマーとして、ヒドロキシカルボン酸を出発原料として、カルボキシル基を保護した後、水酸基側をクロロメチルビニルエーテルを用いてビニル基の導入を行い、塩基性条件下で脱保護反応を行うことで行った。得られたモノマーの自己重付加反応は、無触媒下ではほとんど進行しないが、PPTS(p-トルエンスルホン酸ピリジニウムを触媒を用いて行いることで、対応する主鎖型ポリ(ヘミアセタールエステル)が高収率で得られることが明らかにした。また、モノマーの融点以上に加熱し、溶融重合を行った場合でも重付加反応の進行が確認された。またその構造はいずれも対応する主鎖型のポリ(ヘミアセタールエステル)であることが明らかにした。また、ヘミアセタールエステル骨格を持つポリマーの熱解離挙動に関して検討を行い、共重合等の手法により熱解離温度を精密に制御できることを明らかにした。
ラン藻におけるマルチジーンファミリーを利用したDnaK,DnaJの特異的相互作用

シアノバクテリアに見い出した3つのDnaKのうち、DnaK2とDnaK3の2種は生育に必須であることを明らかにした。このことは少なくともこの2種は異なる機能を持っており、役割分担があることを示している。DnaK3はチラコイド膜への局在が顕著であったが、この蛋白質の膜結合に必須な領域を同定したところ、一般に基質認識ドメインと呼ばれている領域であった。しかし、生育の必須性に関しては、DnaK3のATPaseドメインを他のDnaKと置換えたキメラDnaKはDnaK3の変異を相補することができず、DnaKの正しい機能発現には全体の構造が必要でドメインごとの機能は独立したものではないことを明らかにした。dnaK3とオペロンを構成すると思われるdnaJ遺伝子産物はどのDnaKに対してもそのATPase活性を促進する効果があり、この機能に関してはDnaK-DnaJのパートナーシップに特異性は見られなかった。一方、Two-Hybrid解析を行った結果では、唯一DnaK3との間でのみ有為な相互作用が見られ、シャペロンの特異的な機能発現の仕組みを明らかにする上で貴重な手がかりを得た。また、DnaK3のC末端ドメインおよびDnaJのJドメインの変異により温度感受性になった株を得た。さらに各々からサプレッサー変異株を得られた。シアノバクテリアにおける温度感受性変異株の報告はなく、こうした遺伝的手法を確立すると共に、DnaKの特異的機能の同定に道を開いた。
物理的な伸縮を利用した新規な細胞培養表面基材の開発

新規な温度応答性高分子である、p(NMANPIproDAP)をPDMS表面に固定化したNMANPIproDAP-PDMSを使い細胞培養評価を行った。その結果、基材を伸展(伸展率:20%)させることで細胞接着性が向上することを確認した。接触角の値は、伸展時の表面濡れ性は伸縮時(伸展前)よりも疎水性であることが示された。伸展における細胞接着性向上は、基材表面の接触角測定の結果と同様な傾向を示した。さらに、伸展状態および非伸展状態の基材において細胞は増殖しコンフルエント状となり、温度を20°C付近に低下させることで、細胞をシート状で剥離することに成功した。ポリジメチルシロキサン(PDMS)表面への高分子固定化法について検討を行い、目的の高分子であるPNNACPM系の高分子がPDMS表面にブラシ状で導入可能かどうかを確認した。具体的にはモノマー濃度および反応時間を変化させながら、FT-IT/ATRで導入された高分子量を定性的に見積もることが可能かどうかを検討する一方で、光開始重合剤であるチオキサントン(TX)基のPDMS表面への導入方法についても検討した。光開始重合剤の固定化に関しては、酸性条件下での反応であることから、PDMS基材への影響もあることが確認できた。高濃度硫酸条件下で、70°C程度の温度での処理反応ではPDMS基材が分解されるような現象も見られた。反応条件については、その最適化が必要ではあるが、フェニル基を含むPDMS表面を利用した限りにおいては、光化学重合開始剤であるTX基の導入が示唆される結果が得られている。具体的には、仕込みのサリチル酸濃度、反応条件(温度、時間)、さらには使用する硫酸の濃度を変化させることで、TX基量の定性的な変化が確認できた。また、副反応生成基として、硫酸基が導入されることも確認した。固定化反応の継時的な変化により、表面物性が変化したことから、高分子の固定化量が反応時間によって変化していることも示唆された。簡単な細胞接着性の評価から、PDMS表面と比較すると高分子の固定化による細胞接着性や接着面積が向上、増大することが示唆された。副反応で生成する硫酸基が細胞接着にどのような影響を与えるかについては、今後の検討課題としたい。専用の伸縮デバイスの作製の開発について着手し、モーター駆動型の一軸方向への伸展デバイスを試験的に作製した。xyの二軸方向に伸縮可能なデバイスの作製も検討し、試作機を作製したが、細胞培養へ応用した場合、基材形状が複雑化するため、一軸方向のみに伸展可能なデバイスを用いて研究を推進することにした。チオキサントン系の開始剤を固定化した表面に関して、光照射によって温度応答性高分子を固定化し市販の伸展デバイスを用いながらX線電子分光法(XPS)、表面接触角測定、走査型電子顕微鏡(SEM)で表面の物性を評価した。温度応答性高分子を固定化する前のPDMS表面に濃硫酸存在下において、チオサリチル酸の導入をXPSで確認した。S 1sのスペクトルから硫酸基とチオキサントン基が3:4の割合で表面に存在することが確認できた。さらに、触媒となるアミンを含むモノマー水溶液を光開始重合剤が固定化された、PDMS表面に塗布し、光照射を行うことで目的とする高分子が固定化されたことをXPSで確認した。SEMによる、表面観察および断面の観察から、数百ナノメートルの高分子層が形成されていることが示唆された。また、基材の伸展・収縮刺激によってクラッキングが極めて起こりにくいことも示唆された。高分子固定化後のPDMS表面の接触角は110°から80°付近に減少した。また、伸展デバイスにより高分子固定化表面の接触角を測定した所、基材を伸展させることで接触角の優位な上昇が確認できた。さらに、細胞培養による評価から、伸展させた基材の方がより効率的な細胞接着が確認できた。これらの結果から、目的とするチオキサントン基がPDMS表面に導入され、光照射により光重合開始剤として機能し、さらに目的とする高分子がPDMS表面に固定化されていることが明らかとなった。AFMによる表面物性の評価を計画していたが、装置故障のため本年度は断念し、代替としてSEMによる表面物性の評価を行った。本年度は目的とする温度応答性高分子を固定化した基材の作製条件の最適化を図り、これを達成した。さらに、作製した基材の物性評価から固定化した高分子の物性が伸展により変化し、細胞接着性に影響を与えることが示唆された。一方、基材の伸展・収縮デバイス開発は当初の計画通りに進行し、モーター駆動型の伸展デバイスを作製した。昨年、開発した一軸方向に伸展可能なデバイス開発の知見を基に、xyの二軸方向に伸縮可能なデバイスの作製を行った。作製したデバイスはx軸方向を固定化しながら、y軸方向を固定化し、その後、デバイスを各軸方向に伸展するデバイスとなった。しかしながら、手動での伸展機構を取り入れた点、また、扱うサンプルのサイズが1.5cm各の正方形のサンプルをターゲットとしたため、複雑な機構となり、目的のサンプルを伸展することは可能であったが、細胞培養や伸展しながらのAFM、FI-IR/ATRやXPSなどの表面物性評価には適さないデバイスとなった。

その点を改良するために、3Dプリンターで把持部を作製しステッピングモータ機構を取り入れたxy軸方向に伸展・伸縮可能なデバイスを改めて作製した。本デバイスにより細胞培養が可能な伸展デバイスを作製することができた。また、把持部だけを利用することで伸展させたまま、FT-IR/ATRでの評価が行えることを確認した。新規な温度応答性高分子、p(N-methacryoyl-N`-isopropynoly-1,3-diaminopropane)(NMANPIproDAP)をPDMS表面に固定化したNMANPIproDAP-PDMSを使い細胞培養評価を行った。使用する細胞はウシ血管内皮細胞を使用した。伸展前後における細胞培養評価の結果、基材を伸展(伸展率:20%)させることで細胞接着性が向上することを確認した。伸展における細胞接着性向上は、基材表面の接触角測定の結果と同様な傾向を示した。さらに、伸展状態および非伸展状態の基材において細胞は増殖しコンフルエント状となり、温度を20°C付近に低下させることで、細胞をシート状で剥離することに成功した。さらにNIH3T3細胞を利用し、NMANPIproDAP-PDMS基材表面上での伸展・収縮培養への応用も試みた。新規な温度応答性高分子である、p(NMANPIproDAP)をPDMS表面に固定化したNMANPIproDAP-PDMSを使い細胞培養評価を行った。その結果、基材を伸展(伸展率:20%)させることで細胞接着性が向上することを確認した。接触角の値は、伸展時の表面濡れ性は伸縮時(伸展前)よりも疎水性であることが示された。申請書に記載した研究項目の課題はすべて実施し、当初の計画はほぼ達成した。一軸方向に伸展可能なデバイスの開発から、xyの二軸方向に伸縮可能なデバイスの作製を行うにはより、複雑な基材形状が求められることが明らかとなり、一軸方向に伸展可能なデバイス開発をメインとして進める。当初の二軸方向のデバイス開発は中断となるが、基材の伸展による高分子層の物性変化の影響は一軸方向の伸展でも十分に評価できることから、当初の研究目的には変更はないと考えている。平成27年度の結果を踏まえ、最終年度では、作製した基材が接着でき、かつ、培地を添加させた状態で伸展可能なデバイスの設計を行い、その作製を試みる。さらに、作製した温度応答性高分子固定化PDMS基材を使い、伸展率を変化させた際の細胞接着性、温度変化による剥離性の変化や細胞シートの作製への応用を行う。この際、セルライン化された細胞をはじめ、細胞シート化が難しい、小動物等の組織から採取したプライマリー細胞を使い、細胞シート作製のための伸展培養方法についても研究を行う。バイオマテリアル再生医療次年度では専用の伸縮デバイスの作製の開発について着手する。また、光固定化反応に重要な反応容器の開発についても併せて行う。伸縮デバイスの開発では、一軸方向に伸展可能なデバイスの開発から、xyの二軸方向に伸縮可能なデバイスの作製を行う。近年、伸展培養用のデバイスに関するデバイスの報告が幾つか報告されており、これらの報告を参考にして、デバイスの設計に着手する。
バリ島の「障害」のある役者たちの演劇実践―遊戯性・あいだ性・日常との連続性

本年は、(a)「健常者」の役者による「障害」の模倣表現の特徴整理と、演劇上の効果の分析、そしてそこに表れるバリの身体観を考察すること、(b)現地調査を実施し、実際に障害のある芸能家たちを取り巻く社会的状況と実際の演技内容を明らかにすること、(c)バリ芸能の現代的展開に関してこれまでの自身の研究を発表すること、の3点を行った。現地調査は合計で約5週間行った。(a)に関しては、国内の学会で、仮面舞踊劇トペンを事例に、口頭発表を行った。障害を模倣する演技の特徴について(1)観客は役柄を演じ分ける演者の腕前を楽しんでおり、欠損の表現がdisabilityというよりも演者のabilityとして楽しまれていること(2)年寄り、異教徒、女、方言など、人間の他の特徴と同列に扱われ、欠損が障害というよりも差異や多様性の表現となっていること(3)観客たちにとって身近な登場人物にのみ現れること、の3点を指摘した。その上で、道化を共同体の外からやってくる「異形の者」ととらえた山口昌男の論と対比し、バリ演劇の、身体の欠損を笑いものにするジョークが、異常な他者を描くものでなく、自分たち自身の多様な身体性を楽しむ遊戯であることを指摘した。この内容については英語論文も執筆中である。(b)に関しては、視覚障害のある歌手D、構音障害のある女優N、肢体障害のある者たちの作業所兼寄宿舎Sを中心に、上演やその前後に続く日常生活をみせていただいた。また、介助者や共演者など、健常者でありながら、障害のある者たちと共に舞台に立つ人々に対するインタビューも行い、彼らの意図や経験について語ってもらった。なお首都ジャカルタにも短期間滞在し、バリ芸能に関する資料収集を行った。(c)に関しては、トペンの研究を単著本として出版した。その他、バリ芸能のグローバル化について国際学会で口頭発表した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
白色腐朽菌によるセルロース生分解機構の解明に関する研究

白色腐朽菌Phanerochaete crysosporiumにおけるセルロース生分解機構を明らかにする目的で、セロビオース脱水素酵素(CDH)の機能、セルロース分解系でのその発現と局在性、セルラーゼとの相互作用について実験を行い、以下のような結果を得た。CDHのセルロース表面への吸着挙動から、本酵素はセルロースの結晶構造の分解に関与しているのではなく、セルロースのアモルファス構造の分解あるいはセルラーゼに対する補助的な役割を果たしていることを示した。P.crysosporiumの静置培養系では、CDH活性のほとんどは菌糸と複合体を形成しているセルロース上に存在しており、顕微鏡観察ではCDHは特にセルラーゼの作用によって生成したと考えられるセルロース表面の亀裂部分に局在していることが観察された。したがって、セルロース分解培養系においてCDHがセルラーゼと共役的に作用していることが示唆された。P.crysosporiumのセルロース分解振とう培養系に仔牛血清を添加すると、CDHの生産性が著しく向上することを示した。この原因を調べるために、培養系におけるRT-PCR法を用いたmRNA定量の実験系確立し、CDH産生遺伝子の発現レベルを測定することを試みた。結晶性バクテリアセルロース(BMCC)を用いて、P.crysosporium由来セロビオヒドロラーゼI(CBHI)によるその分解挙動をCDHの酸化還元系の共存下と非共存下で比較した。その結果、CBHIによるBMCCの分解がCDHの酸化還元系の共存により促進されることを明らかにした。また、その機構はCDHによるセロビオースの酸化に基づく阻害解除で説明することができた。CDHにおけるフラビンからヘムへの電子の受け渡しのpH依存性が、フラビンを補欠分子族とするドメインのタンパク質構造の変化に基づく現象であることを示した。白色腐朽菌Phaneerochaetechrysosporiumによるセルロース生分解過程でのセルラーゼ系およびセロビオース脱水素酵素(CDH)との関わりを明らかにするためにいくつかの実験を行った。まず,液体培養系におけるセルロース分解過程でのセルラーゼならびにCDHの菌体外液への分泌について,振とう培養系ならびに静置培養系についてそれぞれ調べた。その結果,いずれの酵素とも振とう培養系では菌体外液へ良く分泌されるが,静置培養系ではセルロース分解ならびに菌糸の生長は振とう培養系とほぼ同様であるにもかかわらず,静置培養系ではほとんどの酵素活性は菌体外液に分泌されず,菌糸とセルロースとの複合体状に存在することを明らかにした。さらに,菌糸とセルロースの複合体形成には,β-(1,3)-グルカンが重要な働きをしていることを示した。したがって,菌体外液へのセルロース分解酵素の分泌は極めて人為的な現象であり,白色腐朽菌によるセルロース生分解には菌糸が菌体外へ生産するβ-(1,3)-グルカン層とその中での分解酵素の局在性が極めて重要であることが示唆された。また,CDHはセルラーゼとともにセルロース基質に直接作用する酵素であり,特にセルロース状のアモルファス構造領域あるいはセルラーゼの作用によって形成されたアモルファス領域に特異的に吸着し,作用する酵素であることを免疫電子顕微鏡的ならびに吸着特性の定量的な解析により明らかにした。次に,本菌が生産する主要なセルラーゼであるセロビオヒドロラーゼI(CBHI)とCDHの相互作用について調べた。その結果、CBHIはセルロースに作用し生成してくる産物であるセロビオースによって著しく阻害を受けやすい酵素であり,CDHによるセロビオースのセロビオノラクトンへの効率的な変換を共役させることが,CBHIを効率的にセルロースに作用させるために必要であることを示した。さらに,セルラーゼ分解酵素系の発現機構を調べることを目的とする液体振とう培養系の確立を試みた。

その結果,基本培地に炭素源としてコハク酸を添加し,培養期間中に仔牛血清をさらに添加する培養系で,少なくとも現象的にはセルラーゼ分解系のOFF-ONをコントロールできる培養系を構築することができた。今後は本培養系からセルロース分解酵素発現に関与するmRNAのスクリーニングを試みる。白色腐朽菌Phanerochaetechrysosporiumによるセルロース生分解過程でのセルラーゼ系およびセロビオース脱水素酵素(CDH)との関わりを明らかにするために、平成9年度の実績に基づき以下の実験を行った。P.chrysosporiumのCDHは生成物阻害の解除機構を通して本菌由来のセルラーゼであるセロビオヒドロラーゼI(CBHI)に対して活性化をする働きを有するが、その一方においてCDHはTrichoderma viride由来のCBHIの活性化に対しては何らポジティブな効果を示さないことを明らかにした。このことから、P.chrysosporiumのセルロース分解系においてはCDHとCBHIの間には生化学的に特別な関係にあることが強く示唆された。さらに、CDHとCBHIのタンパク間相互作用を検討するために、CDHを固定化したゲルの調製を試みたが、実験目的に対して満足のできるアフィニティーゲルを得るには至らなかった。P.chrysosporiumによるセルロース分解系におけるCDHの酵素機能を明らかにする目的で、CDHの活性中心に含まれる2つの補欠分子族、すなわちCDH分子内のFADおよびヘムの酸化還元電位を測定し、そのpH依存性にpH3-9間ついて明らかにした。その結果、CDH内での電子伝達には両者における酸化還元電位ではなく、pHに依存した酵素分子のコンフォメーションの変化に基づく両者の位置関係が重要であることが示唆された。セルロース分解系におけるCDH生産を遺伝子の発現レベルで調べるためにRT-PCR法を適用することを試みた。セルロース分解系のP.chrysosporiumからCDH遺伝子をcDNAとしてクローニングし、そこで得られたCDH遺伝子配列の情報をもとにプライマーを作成した。このプラーマーを利用したRT-PCRによるmRNA定量法を確立するために、mRNAの抽出条件ならびに遺伝子の複製・増幅条件について検討した。
肝移植の新規マーカー;抗肝アルギナーゼ自己抗体定量による移植評価の有効性の検討

生体部分肝移植の経過と予後を簡単に表現できる指標は現在のところなく、モニタリングは現用の臨床マーカーとバイオプシーの組み合わせでおこなわれているのが現状である。我々は既に、肝実質細胞障害に伴い抗肝アルギナーゼ自己抗体が上昇することを見いだしているが、免疫抑制剤使用下の生体部分肝移植recipientにおいても、術後の抗肝アルギナーゼ自己抗体が移植後一時的に上昇し、予後が良好な場合は、この抗体価が時間と共に正常化するのに対し、恢復が遷延するケースや死亡例では、肝移植後の抗肝アルギナーゼ自己抗体が異常低値、または高値のまま推移することを明らかにした。すなわち、本自己抗体の推移で肝移植の経過を評価できると考えられた。平成11(1999)年春から当附属病院でおこなわれた肝移植全例で固相化マイクロプレートを用いたELISA法により本抗体を検索した。その結果、1.AAAは、免疫抑制剤の使用下でも移植肝の肝細胞破壊に反応して高値をとる。2.AAAは5U以下の低値では、敗血症等の免疫抑制によるリスクが高くなる。この変動は血清IgG値と平行するものではない。3.術後の良好な予後が期待できるAAAの回帰領域としてCritical Zone(525U)を定めることにより、AAA値を術後コントロールの臨床指標として活用可能と考えた。このように血中の抗肝アルギナーゼ自己抗体測定により、肝移植後の経過を的確に捉え、更にはbiopsyなど患者負担の大きい検査を軽減出来る可能性が示唆された。生体部分肝移植はすでに国内に定着し、今後、脳死肝移植、心臓死肝移植へと拡大していくものと思われる。この様な状況の中で、生体部分肝移植recipientの術後の経過を反映する血清臨床マーカーとして抗肝アルギナーゼ自己抗体の測定が本研究代表者らによって提唱された。そして良好な経過の成人症例では移植後一時的に上昇するが時間と共に正常化するのに対し、恢復が遷延するケースや死亡例では、肝移植後の抗肝アルギナーゼ自己抗体が異常低値、または高値のまま推移することがわかった。すなわち、本自己抗体の推移で肝移植の経過を評価できる見通しが付いた。そこで、当大学の生体部分肝移植症例についても同様の検索をより詳細におこなった。その結果、本自己抗体が肝移植の予後を判断する指標になるのみならず、免疫抑制剤投与を加減する判断材料になるという実用的な知見が得られるに至り、実際の肝移植例に応用中でありこれにつき現在論文を執筆中である。また、肝移植例以外にa)炎症性肝疾患b)自己免疫性疾患c)肝以外の各種疾患を中心に血中抗肝アルギナーゼ自己抗体の測定をおこなった結果、慢性肝疾患で本抗体の抗体価が高く、自己免疫性肝疾患では極めて高値を示す事実が明らかにされ、自己免疫性肝疾患の有用なマーカーとして国際誌に第一報を報告することができた。現在、酵素免疫測定法(ELIZA法)による抗肝アルギナーゼ自己抗体の検索を生体部分肝移植の日常の臨床検査法として確立することを目指して研究継続中である。

その結果、1.AAAは、免疫抑制剤の使用下でも移植肝の肝細胞破壊に反応して高値をとる。2.AAAは5U以下の低値では、敗血症等の免疫抑制によるリスクが高くなる。この変動は血清IgG値と平行するものではない。3.術後の良好な予後が期待できるAAAの回帰領域としてCritical Zone(525U)を定めることにより、AAA値を術後コントロールの臨床指標として活用可能と考えた。このように血中の抗肝アルギナーゼ自己抗体測定により、肝移植後の経過を的確に捉え、更にはbiopsyなど患者負担の大きい検査を軽減出来る可能性が示唆された。
パーフェクトサンプリングを用いたマルコフ連鎖モンテカルロ法の構築

パーフェクトサンプリングを用いたマルコフ連鎖モンテカルロ法の構築確率的PERTネットワークに対し,クリティカルパスの平均長を計算する,FPRASの構築に成功した。この解法では,新たに開発した,CFTP法に基くパーフェクトサンプリング法を用いている.開発したサンプリング法はサンプルを得るまでの推移回数が多項式時間であることが保障されている。これを実装して計算実験を行ったところ,推移回数は経験的には23回程度しか必要としない非常に高速な解法であることが分かった.本研究は、マルコフ連鎖モンテカルロ法(MCMC法)を用いた全多項式時間乱拓近似スキーム(FPRAS)の構築を行うことを目的としている。またMCMC法において必要となるサンプリング法として、coupling from the past法(CFTP法)に基づくパーフェクトサンプリング法(所望の確率分布に厳密に従うサンプリング法)を構築する。対象とする具体的なモデルとして、確率的PERTネットワークを予定している。確率的PERTネットワークに対しては、クリティカルパスの平均長の計算法の構築を行うことを目的とする。確率的PERTネットワークに対し,クリティカルパスの平均長を計算する,FPRASの構築に成功した。これを実装して計算実験を行ったところ,推移回数は経験的には23回程度しか必要としない非常に高速な解法であることが分かった.クリティカルパスの平均長を計算するFPRASは,問題サイズを再帰的に縮小する構造を取り入れることで求解時間の多項式性を確保している。また,問題を縮小するためのネットワーク枝の選択基準を導入し,さらなる高速化を図った。上記のFPRASを実装し,計算機実験を行った。問題サイズが大きな場合は,前列挙に比べ高速であることが人できた。しかしながら問題サイズが小さな場合は,全列挙の方が高速となることが確認された。そこで,再帰的に問題祭を縮小する際に,解法を全列挙に切り替えることで,より高速な解法の構築を行った。また,計算機実験によって,解法の切り替えのタイミングの導出を行った。これを実装して計算実験を行ったところ,推移回数は経験的には23回程度しか必要としない非常に高速な解法であることが分かった.本研究では,マルコフ連鎖モンテカルロ法(MCMC法)を用いた全多項式時間乱拓近似スキーム(FPRAS)の構築を行う.またMCMC法において必要となるサンプリング法として,coupling from the past法(CFTP法)に基づくパーフェクトサンプリング法(所望の確率分布に厳密に従うサンプリング法)を構築する.現在までに,医療統計等において重要な『正確検定』を行う際に必要となる分割表を生成するCFTP法の構築に成功している.この成果は,申請者による,2行分割表を生成するCFTP法を繰り返し用い,棄却法と組み合わせることで,一般の行数の分割表を生成するものである.提案手法について詳細な計算実験を行い,その成果を論文としてまとめた.さらに,確率的ネットワークにおける最長路問題(確率的PERT問題)に対し,CFTP法に基づいたパーフェクトサンプリング法と,これを用いたFPRASの構築に成功している.現在はこの手法の性能を確認するための計算実験を計画している.本研究の目的は、マルコフ連鎖モンテカルロ法(MCMC法)を用いた全多項式時間乱拓近似スキーム(FPRAS)の構築である.特にMCMC法において必要となるサンプリング法として、coupling from the past法(CFTP法)に基づくパーフェクトサンプリング法(所望の確率分布に厳密に従うサンプリング法)を構築することを目標としている.現時点において,分割表に対する新たなパーフェクトサンプリング法の構築と,その計算実験を終了し,結果をまとめた論文の投稿を行った.また,確率的ネットワークにおける最長路問題(確率的PERT問題)に対し,CFTP法に基づいたパーフェクトサンプリング法と,これを用いたFPRASの構築に成功している.現在,確率的ネットワークにおける最長路問題(確率的PERT問題)に対し,CFTP法に基づいたパーフェクトサンプリング法と,これを用いたFPRASの構築に成功している.この手法について,その性能を確認すべく,計算実験を計画している.現時点において,予備的な計算実験は終了しているが,まだ十分な計算速度が無いため,更なる改良が必要であることが判明しており,パーフェクトサンプリング法の改良と,解法で得られる解の精度の算定の改善も同時に行っている.計算機実験において,マルコフ連鎖モンテカルロ法で得られた解の精度の確認には,サイズの小さな問題に対し,厳密な解の算定が必要である.予備的な計算実験において,この厳密な解の計算に,予想以上に膨大な計算時間がかかることが判明している.計算時間の短縮のために,速度の速い計算機の購入,あるいは高速な大型コンピュータの使用を計画している.またこれに必要なプログラミングを行う人材の雇用を計画している.また,夏期に開催される予定の国際会議OR2012(ドイツ,ハノーバー)において,共同研究者との参加し,結果の発表を予定しており,このための出張費用の支出が予定されている.