hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁気援用加工法を複合した固定砥粒研磨技術の開発

本研究では,高品位高能率加工が求められる難削材などに対して,微細磁性粒子ブラシによる精密仕上げと固定砥粒研磨法を融合させた新しい磁気援用固定砥粒研磨法を提案し,高精度と高能率の両立を図る.また,本手法は良好な精密仕上げ面と高能率除去との両立を可能とするだけでなく,既存の工作機械への適用も容易であることから,当分野に大きく寄与することも期待される.本研究で提案する磁気援用固定砥粒研磨法では,磁気ブラシの形成および分離・再生が適切に行われることが重要である.平成30年度にはまず磁気ブラシ形成及び作用条件を検討した.その結果,砥石寸法が直径10mm,高さ10mmの軸付電着砥石に対して砥石の上部にリング状のNd-Fe-B磁石を取り付けることにより磁石と反対側の工具端面に磁気吸引力が発生し,磁気ブラシが形成されることが確認された.形成された磁気ブラシは工具回転数が8000min-1に達しても遠心力によって分離することは無く,加工に十分な磁気吸引力が発生しているといえる.次いで,加工対象に応じた加工条件の最適化と難削材への適用を目的として実験的検討を行うため,研究代表者,研究分担者の双方で加工装置を試作した.試作した加工装置を用いて,それぞれ,アルミナセラミックス,Ti合金に対して本研究で提案する手法を適用しその効果を検証した.その結果,いずれの材料に対しても既存の手法に比べて高能率,高品位化が達成されることが示され,その効果は負荷荷重や磁性粒子径などの加工条件によって異なることが明らかとなった.また,これらの研究成果をまとめ,学会発表を行い、特許出願を予定している.平成30年度にはまず磁気ブラシ形成及び作用条件を解明することを目的とした.磁気ブラシに働く力は工具端面に磁気吸引力によって付着している磁性粒子が工作物表面と直接接触し,接線研磨抵抗と遠心力を受ける.吸引磁力が接線研磨抵抗と遠心力の和より大きければ,磁性粒子は工具端面に留まりながら工作物表面の加工に関与し続け,逆に小さくなると分離脱落する.磁気吸引力は永久磁石の磁気特性や磁性粒子サイズ,磁極形状等によって変化することから,磁場測定・解析を行い永久磁石の仕様,磁極形状を検討した.その結果,市販の直径10mm,高さ10mmの軸付電着砥石に対して砥石の上部にリング状のNd-Fe-B磁石を取り付けることにより磁気ブラシが形成されることを明らかにし,磁性粒子径が比較的小さい0.03mmの場合でも工具回転数が8000min-1に達しても遠心力によって分離することは無く,加工に十分な磁気吸引力が発生していることを確認した.さらに,磁気ブラシを工作物に対して適切に作用させるためには磁性粒子に対して十分に大きい砥粒突出し高さが必要であることから,#120の粗粒ダイヤモン粒を有する電着軸付砥石を用いた加工実験に着手した.この加工実験に先立ち,研究代表者,研究分担者の双方で加工実験装置を製作した.アルミナセラミックス,Ti合金に対して加工実験を行い,固定砥粒による高能率除去と磁気ブラシによる精密仕上げの複合作用が実現化されることを明らかにし,これらの研究成果をまとめ,学会発表を行い,特許出願を予定している.以上より,当該研究はおおむね順調に進展していると評価する.平成30年度の研究により固定砥粒による高能率除去と磁気ブラシによる精密仕上げの複合作用が一定の条件下で実現されることを明らかにすることができた.本手法の適用範囲を広げるためにはより詳細な検討が必要とされる.
β-カロチンの赤血球膜における抗酸化機能発現メカニズムの解明

β-カロチンの生体内抗酸化作用をみるため、9週令ddy系マウスにβ-カロチン(0.6%または3.0%)を含む食餌を1週間与えた。β-カロチンの投与は、血漿、赤血球膜、肝臓、肺のβ-カロチン量を有意に増加させると共に、赤血球膜の過酸化リン脂質(ホスファチジルコリンハイドロパーオキサイドとホスファチジルエタノールアミンハイドロパーオキサイド)量をβ-カロチンの摂取量に応じて有意に減少させたが、血漿や肝臓など他の組織では過酸化リン脂質量は減少しなかった。またβ-カロチンの投与により、赤血球膜と他の組織でβ-カロチンの異性体の組成に差が認められ、過酸化リン脂質の減少が認められた赤血球では、他の組織よりもシス型のβ-カロチンが比較的多く分布していたことから、β-カロチンが赤血球膜の主要な抗酸化因子であることが推察された。そこで、β-カロチンの赤血球膜での臓器特異的な抗酸化作用の発現機構を知るため、化学発光検出器を備えたHPLCを用いてヒト赤血球中に存在するβ-カロチン過酸化物の測定を試みた。その結果、ヒト赤血球ゴ-スト中に数種のβ-カロチン過酸化物が存在することを認めた。本過酸化物は、HPLCのクロマトグラムから、β-カロチンのペルオキシラジカルや一重項酸素との反応で生じる過酸化物と同一であることが明らかとなった。またスペクトル分析から、本過酸化物は既に知られているβ-カロチン過酸化物(エポキシドやカロテナ-ル)とは異なるエンドパーオキシドであると推定した。以上より、β-カロチンは、赤血球膜のリン脂質二重層内において、自らが活性酸素を捕捉して膜リン脂質よりも優先的に酸化されることで抗酸化作用を発現しているものと思われた。β-カロチンの生体内抗酸化作用をみるため、9週令ddy系マウスにβ-カロチン(0.6%または3.0%)を含む食餌を1週間与えた後、血液および組織のβ-カロチン、ビタミンA、E、および過酸化リン脂質濃度を測定した。β-カロチンの投与は、血漿、赤血球膜、肝臓、肺のβ-カロチン量を有意に増加させたが、ビタミンE量を減少させた。しかし、赤血球膜のビタミンA量は、β-カロチン投与による影響は見られなかった。一方、過酸化リン脂質量は、赤血球膜のホスファチジルコリンハイドロパーオキサイドとホスファチジルエタノールアミンハイドロパーオキサイド量が、β-カロチンの摂取量に応じて有意に減少したが、血漿や肝臓など他の組織では過酸化リン脂質量の減少は認められなかった。またβ-カロチンの投与により、赤血球膜と他の組織でβ-カロチンの異性体の組成に差が認められ、過酸化リン脂質の減少が認められた赤血球膜では、他の組織よりもシス型のβ-カロチンが比較的多く分布していたことから、β-カロチンが赤血球膜の主要な抗酸化因子であることが推察された。一方、健常成人の赤血球膜と血漿のβ-カロチン、α-トコフェロール、過酸化リン脂質量を測定したところ、赤血球膜の過酸化リン脂質とβ-カロチン量に弱い正の相関が、赤血球膜の過酸化リン脂質量と血漿のβ-カロチン量に弱い負の相関が見られたことから、過酸化されつつある赤血球膜では、血漿からβ-カロチンが移行しやすくなるものと思われた。

平成7年度では、マウスにβ-カロチン(0.6%または3.0%)を含む食餌を1週間与えたところ、赤血球膜の過酸化リン脂質(ホスファチジルコリンハイドロパーオキサイドとホスファチジルエタノールアミンハイドロパーオキサイド)量がβ-カロチンの摂取量に応じて有意に減少することを認めた。また赤血球膜では他の組織よりもシス型のβ-カロチンが比較的多く分布していたこと、並びに肝臓や肺など他の組織では過酸化リン脂質の減少は見られなかったことから、β-カロチンが赤血球膜の主要な抗酸化因子であると推察した。そこで本年度では、このβ-カロチンの赤血球膜での臓器特異的な抗酸化作用の発現機構を知るため、化学発光検出器を備えたHPLCを用いてヒト赤血球中に存在するβ-カロチン過酸化物の測定を試みた。その結果、ヒト赤血球ゴ-スト中に数種のβ-カロチン過酸化物が存在することを認めた。本過酸化物は、HPLCのクロマトグラムから、β-カロチンのペルオキシラジカルや一重項酸素との反応で生じる過酸化物と同一であることが明らかとなった。またスペクトル分析から、本過酸化物は既に知られているβ-カロチン過酸化物(エポキシドやカロテナ-ル)とは異なるエンドパーオキシドであると推定した。以上より、β-カロチンは、赤血球膜のリン脂質二重層内において、自らが活性酸素を捕捉して膜リン脂質よりも優先的に酸化されることで抗酸化作用を発現しているものと思われた。
学校教員のストレスマネジメントプログラムおよびその支援体制に関する研究

1)前年度までに収集された知見を基に、教職員のヘルスリテラシー向上のための介入プログラムを構築し、パイロット調査を実施した。介入プログラムは、睡眠の質の向上、同僚性の向上、リラクゼーション、アクションチェックリストによる参加型職場環境改善およびレジリエンス向上で構成されたプログラムを、オンサイトでの研修1回およびweb上での教育ツールとして開発し、介入群に提供した。その結果、中間評価の時点で介入群でのGHQスコアとピッツバーグ睡眠スコアの改善傾向が認められた。2)学校における産業保健活動ガイドライン構築の基礎資料の構築を目的として、前年度までの教育委員会調査を基に、産業保健活動が活発に実施していると考えられる自治体へのインタビュー調査およびグッドプラクティスの収集を行った。今年度は3自治体に訪問し、ストレスチェックの職場への効果的なフィードバック、教職員の健康にかかる啓発としての情報提供手段、退職後教員と地域医療との連携による早期介入システムなどの好事例の収集がされた。また、活動が活発な自治体の特徴として、産業保健業務にかかる実務や経歴を有する嘱託産業医がおり、教育委員会事務局への適切な助言がこれらのグッドプラクティスの基盤にあることが示唆された。3)東京医師会の協力の基に、学校教職員に対するの産業医活動の有無およびその実務内容にかかる調査を行なった。嘱託産業医資格を有する医師のうち、教職員の産業保健業務に関わっている医師は約15%(230人)であり、その多くは都立高校と特別支援学校の産業医と考えられた。また、実務内容で最も多かったのは定期健康診断結果の確認と事後措置であったが、多くの業務は実施率50%未満であり、民間事業場と比して低い実施率であり、学校職場における産業保健管理体制の再構築とそのためのガイドラインが必要であることが示唆された。本研究の第一の目的である介入プログラムの開発については、パイロット調査の開始が、調査フィールドとの調整結果から、当初の予定より遅れて平成30年度後期からの開始となりったことが、遅延の理由である。現在最終的な効果判定と介入プログラムの修正に係る作業を基に、本調査の準備を進めている。本研究の第二の目的である学校職場の産業保健管理に係るガイドラインについては、現在基礎資料は概ね分析がされているが、好事例の収集にかかるインタビュー調査にかかる時間の確保が不十分であった。次年度において好事例の収集及びその整理を中心に行う予定である。パイロット調査の検証を6月までに行い、学校繁忙期および夏季休暇を過ぎる9月以降の本調査の実施を企画している。本調査においては、現行のストレスチェックの標準問診票とともに教職員のストレスマネジメントに有効な調査項目の検証も予定する。なお、引き続き好事例収集に向けたインタビュー調査を継続し、現在作成中の「学校における産業保健管理のガイドライン」の内容向上を図る。教職員のメンタルヘルスおよび介入効果に関する文献調査を実施した。教職員のメンタルヘルスに関する研究はバーンアウト症候群を対象とした横断研究が1990年代初頭において多く実施され、その一部について縦断研究が実施されている一方、その後普及したDemand-Control-Support modelやEffort-Reward Imbalance model等によるストレス反応指標を用いた要因分析が近年進んでおり、労働時間等の量的指標と合わせて、学校環境における人間関係や教室運営といった質的要因との関連が示唆されている。教職員のヘルスリテラシーにかかる現状やその健康状態に対する影響に関する文献は見られなかった。全国の教育委員会(村部を除く。以下、教委)のうち、全ての都道府県および政令市(以下、県等)、市町では段階的無作為法で抽出した360教委に対し、学校教職員の健康管理体制およびメンタルヘルス対策に関する自記式調査票を郵送法により実施した。教職員の健康管理は4割で学校医が担当しており、県等では嘱託産業医が6-7割、専属産業医が1割強関わっていた。健診結果等に基づく保健指導実施率は県等8割強、市町4割弱であり、医師の意見聴取実施率はそれぞれその半数程度であった。教職員の健康管理を専門的に行う組織の設置率は県等4-5割、市町では殆どなかった。メンタルヘルス対策は殆どの項目で大企業と同等の実施率であり、「労働者・管理監督者への情報提供」が高い一方で「担当者の専任」が相対的に低い傾向であった。政令市で集団研修の機会が多い一方、都道府県ではリーフレット配布が高い傾向であった。教職員の健康管理は任命権者が都道府県であることから都道府県の管掌と考えられる一方で、医師からの意見聴取等の産業保健業務が十分にされていない事や、健康管理の実施主体が県等と市町村との間で明確ではない可能性が示唆された。自記調査票の回収率が4月30日時点で都道府県63.8%、政令都市30.0%、市町27.8%であることから、回収率の改善の為の督促が必要である。また、介入研究に必要なパイロット調査が平成28年度内で実施できなかった。この理由としては、教職員の介入研究に関する文献が少ないため、教職員以外の集団に対するメンタルヘルス対策の介入効果に関する研究の収集・分析に時間がかかっていること、および学校事業場の特性(分散事業場である事、組織のヒエラルキーが一般企業と異なること等)を考慮した介入方法に関する知見(ICTの利用を含む)の収集・分析が十分に進んでいないことが挙げられる。教職員のストレス要因に関する先行研究では縦断研究の知見に乏しいことから、介入プログラムのデザインに先立ち症例対照研究を行った。有効回答数は症例対照合わせて52例であった。曝露要因としては、発症時の業務状況・労働時間・職場の支援状況および一般向けヘルスリテラシー尺度(CCHL)を用いた。

その結果、発症時の症例のヘルスリテラシー尺度は対照群よりも有意に低く、睡眠時間・疲労の解消度合いの間・校務分掌の負担感に有意な関連を認めた。同僚の支援の有無と発症との間に有意な関連を認め(オッズ比(OR):4.5)、またヘルスリテラシー尺度と疾患発症との間に量的関係が認められた。また、ヘルスリテラシーの低い人は時間外労働によるORが高くなる傾向が示された。以上のことより、教職員のストレスマネジメントとして、横断研究による先行研究における「職場の支援」の有効性が示された一方で、ヘルスリテラシーの醸成が時間外労働の削減等を介して疾患の発症予防に寄与する可能性が高いことが示された。上記研究結果をもとに、介入プログラムの先行研究について文献調査を実施した。教職員を対象とした介入プログラムとして、オンサイトによるグループワークによるストレスママネジメント研修の効果を評価した研究が多くあるが、いずれも介入効果としては限られた結果であった、また、教育学の分野で学級経営自体に介入した研究などが認められた。なお、教職員を対象としたヘルスリテラシーの向上を目的とした研究結果は見当たらなかった。介入プログラムの実施に際して、そのフィージビリティや内容の修正を目的に、学校管理職に対するフォーカスグループインタビューを2回実施した。その結果、現在の働き方改革における職場環境の変化だけではなく、教育職員個々の変化の必要性とその手段としてのヘルスリテラシーの意義について、概ね合意が得られた。介入研究に際して、近年の「働き方改革」にかかる現場実態調査が、当該年度の学校現場に予想以上の負荷となったこと、また、介入プログラムと「働き方改革」との間に重複する施策がみられらたことより、効果測定の際のバイアスを避ける目的から、介入プログラムの見直しが必要と判断したため、介入プログラムの実施を延期した。1)前年度までに収集された知見を基に、教職員のヘルスリテラシー向上のための介入プログラムを構築し、パイロット調査を実施した。介入プログラムは、睡眠の質の向上、同僚性の向上、リラクゼーション、アクションチェックリストによる参加型職場環境改善およびレジリエンス向上で構成されたプログラムを、オンサイトでの研修1回およびweb上での教育ツールとして開発し、介入群に提供した。その結果、中間評価の時点で介入群でのGHQスコアとピッツバーグ睡眠スコアの改善傾向が認められた。2)学校における産業保健活動ガイドライン構築の基礎資料の構築を目的として、前年度までの教育委員会調査を基に、産業保健活動が活発に実施していると考えられる自治体へのインタビュー調査およびグッドプラクティスの収集を行った。今年度は3自治体に訪問し、ストレスチェックの職場への効果的なフィードバック、教職員の健康にかかる啓発としての情報提供手段、退職後教員と地域医療との連携による早期介入システムなどの好事例の収集がされた。
ホヤ胚における筋肉細胞分化機構の解明

ホヤの発生に伴って幼生尾部の左右両側に単核で横紋を持った筋肉細胞(ユウレイボヤで36個、マボヤで42個)が分化し、その系譜は完全に記載されている。本研究では、卵内に存在する母性筋肉決定因子macho1の分化トリガーとしての機能を明らかにし、下流遺伝子群の機能的側面からの解析を加えることで、筋肉細胞分化機構の全貌に迫ることを目標として研究を行っている。具体的には、macho1タンパク質の転写因子としての生化学的な機能解析と、macho1とその下流遺伝子の生体内での機能解析(下流遺伝子単離・発現調節機構・機能解析)を行ってきた。Ci-macho1機能阻害胚や過剰発現胚を用い,Ci-macho1の発現レベルによって初期胚で転写産物量が変化する転写因子およびシグナル伝達関連の因子をゲノムワイドに同定した。またオリゴチップやcDNAマクロアレイを用いた解析も行いCi-macho1の下流で発現を制御される遺伝子を同定した。一方、macho1およびZicL(別の研究から筋肉・脊索・神経の分化に関与することが示されたジンクフィンガー転写因子)がコードするタンパク質を精製し、SELEX法-ゲルシフトアッセイによってそれぞれが認識するDNA配列を決定し、直接的な転写制御という観点から上記のmacho1下流候補遺伝子群を解析した。なおZicLについては、これが脊索分化のマスター遺伝子Brachyuryを直接転写活性化する因子であることを明らかにした。ホヤの発生に伴って幼生尾部の左右両側に単核で横紋を持った筋肉細胞(ユウレイボヤで36個、マボヤで42個)が分化し、これらの筋肉細胞の系譜は完全に記載されている。本研究では卵内に存在する決定因子の機能機構、その下流因子の単離・発現調節機構・機能解析を含めて解析している。カタユウレイボヤとヤワラカユウレイボヤのmacho1(マボヤ卵において筋分化決定因子として機能することが示されたzincfinger転写因子)とzicL(別の研究から筋肉分化に関与することが示されたzinc finger転写因子)の産物タンパク質を精製し、SELEX法によってそれぞれが認識するDNA配列を決定した。ゲルシフトアッセイを用いてそれらの配列が認識されることを確かめ、さらに塩基対を変えて結合に重要な配列を解析した。macho1とzicLはどちらも5つのzincfingerモチーフを有するよく似たZICクラスの転写因子をコードしているが、両者の認識配列は異なっていた。一方で、Ci-macho1の機能機構を網羅的に解析するため、合成mRNA顕微注入によるCi-macho1過剰発現胚および特異的モルフォリノオリゴ顕微注入による機能阻害胚からRNAを抽出してサブトラクションを行い、約14000遺伝子由来のcDNAマクロアレイとリアルタイムPCRを用いてCi-macho1の下流で発現を制御される遺伝子を同定した。それらの遺伝子や既知の筋肉関連遺伝子の上流配列、さらにゲノム全配列中におけるmacho1やzicLタンパク質の認識配列の存在を解析中である。
準剛体回転流を利用した新方式多段分級の研究

1.準剛体回転流を用いた分級方式では,主な分級場はスチュワートソン層である.したがって,分級精度を左右するのはスチュワートソン層の流れ特性であり,これを明らかにすることが重要である.そこで,まずスチュワートソン層流れの数値解析を行うとともに、その結果を基にした理論解析を行って,スチュワートソン層の流れ特性について考察し、以下の主な知見を得た.(1)本研究の分級実験の範囲においては,準剛体回転流の条件が満足されている.(2)境界層補正の速度成分のエクマン数Eへの依存性を調べた結果,速度成分の特異摂動展開の因子をE^<1/12>と設定することができることが分かった.(3)円板・円柱形状の回転二重容器において,理論解と数値解は定性的に一致するが、定量的に若干異なる。しかし、新たに導入したパラメータを調整することにより,理論解を数値解に近づけることができる.2.これまでの研究では、フィード(原料粉体懸濁液)供給部において給水を行うことにより高い分級精度を得ていたが,給水量の分だけ処理量が少なくなるという問題があった.そこで,給水を行うことなく、高い分級精度を維持できる分級装置・方法について,流れ場および微粒子運動の数値計算を行って考察し、以下の主な知見を得た.(1)回転軸に近い内側にフィードと二つのファイン(細粉産物)、外側にコアース(粗粉産物)と二つのミーディアム(中間粉産物)を配するFOF-MCM型分級装置では,コアースへの微細粒子の混入を防止することができない.(2)回転軸に近い内側にフィードと二つのファイン、外側に二つのコアースと給水部を配するFOF-CWC型分級装置においては、外側に新たに二つのMediumの抽出部を設けることにより3産物分級を行うことができる.(3)考察したすべての分級装置において、分級径が大きくなると分級精度は向上する.(4)遠心効果パラメータを変えることにより、粒径範囲を自在に制御することができる.1.準剛体回転流を用いた分級方式では,主な分級場はスチュワートソン層である.したがって,分級精度を左右するのはスチュワートソン層の流れ特性であり,これを明らかにすることが重要である.そこで,まずスチュワートソン層流れの数値解析を行うとともに、その結果を基にした理論解析を行って,スチュワートソン層の流れ特性について考察し、以下の主な知見を得た.(1)本研究の分級実験の範囲においては,準剛体回転流の条件が満足されている.(2)境界層補正の速度成分のエクマン数Eへの依存性を調べた結果,速度成分の特異摂動展開の因子をE^<1/12>と設定することができることが分かった.(3)円板・円柱形状の回転二重容器において,理論解と数値解は定性的に一致するが、定量的に若干異なる。しかし、新たに導入したパラメータを調整することにより,理論解を数値解に近づけることができる.2.これまでの研究では、フィード(原料粉体懸濁液)供給部において給水を行うことにより高い分級精度を得ていたが,給水量の分だけ処理量が少なくなるという問題があった.そこで,給水を行うことなく、高い分級精度を維持できる分級装置・方法について,流れ場および微粒子運動の数値計算を行って考察し、以下の主な知見を得た.(1)回転軸に近い内側にフィードと二つのファイン(細粉産物)、外側にコアース(粗粉産物)と二つのミーディアム(中間粉産物)を配するFOF-MCM型分級装置では,コアースへの微細粒子の混入を防止することができない.(2)回転軸に近い内側にフィードと二つのファイン、外側に二つのコアースと給水部を配するFOF-CWC型分級装置においては、外側に新たに二つのMediumの抽出部を設けることにより3産物分級を行うことができる.(3)考察したすべての分級装置において、分級径が大きくなると分級精度は向上する.(4)遠心効果パラメータを変えることにより、粒径範囲を自在に制御することができる.多段分級方式の基本形である二段分級装置のバッチ式及び半連続式(2段目で中間粉産物の連続抽出を行う)を設計・製作して分級実験を行うとともに2段分級装置の設計法について研究した結果、以下の主な知見を得た。1.バッチ式、半連続式ともに、粒子に作用する流体抗力に対する遠心力の比を特徴づける遠心効果パラメータの増大に伴って、中間粉産物の質量中位径およぴ変動係数が小さくなり、微細粒径においてより均一な中間粉産物を得ることができる。また中間粉産物の質量中位径が小さくなる程、変動係数が小さくなり粒径が均一化する。2.抽出流量比が2段目の貫流量の40%以下の半連続式において、バッチ式よりも中間粉産物の質量中位径が小さくなり、変動係数がわずかに大きくなる。したがって、連続抽出を行えば、より微細な領域において中間粉産物の分級精度をほぼ維持したまま連続処理を行うことができる。3.バッチ式における各段の単段分級装置としての性能について、2段目においても1段目と同程度の分級精度が得られているので、段間接続部における給水システムが適切に働いていると考えられる。4.2段目において抽出を行うと、2段目の分級精度が1段目よりも少し悪化する。

5.バッチ式2段分級の数値計算により、各段の分級径は単段の実験効果と同様に遠心効果パラメータの一意的な関数として定まるスケール則が成立することが分かった。したがって、このようなスケール即を用いることにより、補正が必要であるが、多段の設計を行うことができる。6.バッチ式2段分級の数値計算により、1段目に対する2段目のコア半径の比を小さくすると生産性は低下するが分級制度は向上し、他方コア半径比を大きくすると分級制度は低下するが生産性が向上することが分かった。1.準剛体回転流を用いた分級方式では,主な分級場はスチュワートソン層である.したがって,分級精度を左右するのはスチュワートソン層の流れ特性であり,これを明らかにすることが重要である.そこで,まず数値解析を行うとともにその結果を基にした理論解析を行って,スチュワートソン層の流れ特性について考察し、以下の主な知見を得た.(1)本研究の分級実験の範囲においては,準剛体回転流の条件が満足されている.(2)境界層補正速度成分のエクマン数Eへの依存性を調べた結果,特異摂動展開の因子をE^<1/12>と設定することができることが分かった.3)円板・円柱形状の回転二重容器においては,理論解と数値解は定性的には一致するが、定量的に若干異なる。しかし、新たに導入したパラメータを調整することにより,理論解を数値解に近づけることができる.2.これまでの研究では、フィード(原料粉体懸濁液)供給部において給水を行うことにより高い分級精度を得ていたが,給水量の分だけ処理量が少なくなるという問題があった.そこで,給水を行うことなく、高い分級精度をできるだけ維持する分級装置・方法について,流れ場および微粒子運動の数値計算を行って考察し、以下の主な知見を得た.(1)回転軸に近い内側にフィードと一つのファイン(細粉産物)、外側にコアース(粗粉産物)と二つのミーディアム(中間粉産物)を配するFOF-MCM型分級装置では,Coarseへの微細粒子の混入を防止できない.(2)回転軸に近い内側にフィードと一つのファイン、外側に二つのコアースと給水部を配するFOF-CWC型分級装置において、外側に新たに二つのMediumの抽出部を設けることにより3つの分級産物を得ることができる.(3)考察したすべての分級装置において、分級径が大きくなると分級精度は向上する.(4)遠心効果パラメータを変えることにより、粒径範囲を制御することができる.
肥大型心筋症の病態形成における心筋エネルギー代謝異常の役割の解明と治療薬の検討

肥大型心筋症(HCM)は、心室中隔あるいは自由壁の肥厚、心筋細胞の錯綜配列と左心室の拡張障害を特徴とし、若年者およびアスリートにおける突然死の主な原因である。現在のところ、罹患率は200人に1人とされているが、従来の治療法はほぼ無効であるため、死亡率は依然として高くとどまっている。申請者らはマウス内在性心筋トロポニンTの特定部位に、ヒトHCMを引き起こすミスセンス変異S179Fを導入したノックインマウスを作製することに成功した。
マウスモデルを用いた消化器癌転移の研究

Aes (amino-terminal enhancer of split)が大腸癌の血行性転移を抑制すること、その機序として、AesがNotchシグナル抑制を介して癌細胞の血管内侵入を阻害することを、マウスモデルを用いて明らかにした.AESの発現消失はヒト大腸癌の肝転移とも相関していた.また、ケモカイン受容体CXCR3の阻害薬はメラノーマのリンパ節転移を抑制し、CXCR3がリンパ節転移の治療標的となる可能性が示された.Aes (amino-terminal enhancer of split)が大腸癌の血行性転移を抑制すること、その機序として、AesがNotchシグナル抑制を介して癌細胞の血管内侵入を阻害することを、マウスモデルを用いて明らかにした.AESの発現消失はヒト大腸癌の肝転移とも相関していた.また、ケモカイン受容体CXCR3の阻害薬はメラノーマのリンパ節転移を抑制し、CXCR3がリンパ節転移の治療標的となる可能性が示された.1.我々はこれまでに、DNAマイクロアレイを用いて32個の転移関連候補遺伝子を同定している。本年度は、それらの遺伝子をそれぞれ安定発現させたColon26マウス大腸癌細胞株を樹立した。また、発現させた遺伝子が転移の初期過程である癌細胞の浸潤に関与するかを調べる目的でin vitroのinvasion assayを行なった結果、4遺伝子が浸潤を促進し、5遺伝子が逆に浸潤を抑制することが分かった。また、DNAマイクロアレイの結果をさらに詳細に検討したところNotchシグナルに関与する分子の発現が原発巣に比べて転移巣で変動していることが分かった。2.Colon26細胞及びHCA7ヒト大腸癌細胞を使用し、Aes遺伝子の安定発現株を作成した。これらの細胞をマウス直腸に同所移植したところ、肝臓や肺への転移が有意に減少することが分かった。また、ルシフェラーゼレポーターを用いた解析により、AesがNotchシグナルを有意に抑制することを明らかにした。さらに、Colon26細胞を同所移植したマウスにNotchシグナルを遮断するγ-secretase阻害剤を投与すると転移が抑制されることが分かった。これらの結果からAes遺伝子はNotchシグナルを抑制することで大腸がんの転移を阻害することが明らかとなった。3.リンパ節転移を最も容易に観察出来るB16F10細胞を用いて転移先周辺組織の変化を検討した。癌をドレナージするリンパ節(B16F10を接種したC57BL/6マウスの膝下リンパ節)においてはリンパ節辺縁洞が拡張すること、これら拡張した辺縁洞内へ癌細胞が流入してくる事を見出した。また、この周囲のT細胞領域では正常リンパ節と比べCXCL9,CXCL10の発現が亢進することが分かった。さらに、これらCXCR3リガンドはマクロファージやリンパ管内皮細胞に発現すること、原発巣におけるマクロファージはこれらのケモカインを発現せず、リンパ節特異的な発現上昇である事が示唆された。リンパ節辺縁洞に流入したCXCR3発現癌細胞は、発現上昇したケモカインと接触することにより、生存亢進、増殖のシグナルが入る事が考えられた。(1)前年度までに、大腸癌細胞株にAes遺伝子を強制発現させると、Notchシグナルを抑制することで転移能が阻害されることを明らかにした。より生理的なAesの役割を解析するため、siRNAを用いてAesをノックダウンした大腸癌細胞株をマウス直腸に移植したところ、肝転移巣の数が対照細胞株に比べて有意に増加していた。一方で原発巣の大きさは変わらなかったことから、Aesは癌細胞の増殖抑制以外の機序によって転移を抑制する、新規の転移抑制遺伝子であることが分かった。また、このマウス直腸接種モデルの原発巣において、宿主側血管内皮細胞がNotchリガンドを、癌細胞がNotchレセプターを発現していたことから、これらの細胞間でのNotchシグナルの伝達が転移に重要である可能性が示唆された。さらに、臨床標本においても、肝転移巣におけるAESの発現は同一患者の大腸癌原発巣よりも有意に低下していた(52症例中29症例、56%)ことから、ヒト大腸癌においてもAESが遠隔転移を抑制していることが示唆された。(2)B16F10メラノーマ細胞をfootpadへ移植したマウスにTAK-779(武田薬品)、AMG-487(Amgen)を投与したところ、膝下リンパ節への転移が抑制されること、これらの薬剤が転移巣における癌細胞の増殖を抑制していることが示された。また、癌細胞を移植したマウスのリンパ節を詳細に解析した結果、リンパ節辺縁洞が拡張していること、癌細胞はその領域内へ流入することを明らかにした。また、その周囲のT細胞領域では癌細胞の発現するCXCR3リガンドであるCXCL9,10の発現が亢進することを見出した。これらのCXCR3リガンドは原発巣には発現していないことから、リンパ節特異的に発現上昇したケモカインがリンパ節辺縁洞に流入したCXCR3発現癌細胞の生存、増殖を促進している可能性が示唆された。
ヤムイモ遺伝資源の多様性に関する分子・細胞遺伝学的研究

「ヤムイモ遺伝資源の多様性に関する分子・細胞遺伝学的研究」を行った。また、主テーマのヤムイモ遺伝資源の多様性解析に関する研究に加え、「サトウキビとエリアンサスの属間雑種の農業形質および細胞遺伝学的特性解析」を行った。課題1ヤムイモ遺伝資源の多様性に関する分子・細胞遺伝学的研究ホワイトギニアヤム(Dioscorea rotundata)遺伝資源447系統を研究対象とし、SSRマーカー、倍数性、形態変異に基づいて、母集団の多様性をできるだけ保持しつつ品種・系統数を絞り込んだ、多様性研究材料セット(Diversity Research Set : DRS)を選抜した。選抜した106系統からなるDRSは、DNA変異(SSR多型)、倍数性および形態形質変異について母集団と同程度の遺伝的多様性を保持する集団であることがgene diversity等の解析データより明確に示された。DRSを用いることで、農業形質変異の詳細な解析が可能になり主要農業形質の効率的な評価方法のプロトコール作成の材料としても有用である。また、DNAレベルにおける詳細な変異解析を行い形質との連関を調べることで、有用形質の原因遺伝子(DNA領域)の同定が容易になることが期待される。課題2サトウキビとエリアンサスの属間雑種の農業形質および細胞遺伝学的特性解析干ばつや痩せ地等の不良環境への適応を目的に作出されたサトウキビとその近縁属植物エリアンサス(Erianthus arundenaceus)の属間雑種の細胞遺伝学的特性と農業形質を解析した。GISH法による雑種集団の染色体組成を解析した結果、サトウキビ由来の染色体は一定数であったのに対し、エリアンサス由来の染色体数は、系統により幅広い変異を示した。DNA量が安定している系統の農業形質と細胞遺伝学的特性の関連性を調査したところ、ほとんどの形質とエリアンサス由来の染色体数との間に正の相関がみられた。雑種におけるエリアンサス由来の染色体の数および組成はごく広い変異を示し、挙動も多様であることが示され、今後は、これらに注目し、農業特性との関係を検討する必要がある。447系統のヤム遺伝資源から、DNA変異、倍数性、形態形質変異の多様性を保持した少数の材料群を選抜することができ、将来的な分子育種を念頭に、形質とDNA変異との間の連関解析に向けた基盤を構築することができた。また、研究分担者の細胞遺伝学の専門性を生かし、サトウキビとエリアンサスの属間雑種における染色体の構成および形質との関連性に関しても成果を得ることができた。両課題とも論文化に向けた準備を進めている。(抄録なし)ヤムイモは西アフリカ地域において重要な主食作物であり、世界のヤムイモ生産量の約9割にあたる5000万トン/年がこの地域で栽培されている。品種改良によるヤムイモの生産性の向上には、ヤムイモ遺伝資源を効率的に維持・管理し、利用促進を図る必要がある。本研究課題では、ヤムイモ遺伝資源の効率的な利用に向けた基盤情報整備を目的とした遺伝的多様性解析を行っており、今年度の進捗状況を以下に報告する。課題1DNA多型解析によるヤムイモ遺伝資源の多様性解析本課題では、ヤムイモのうち西アフリカ地域において最も重要なホワイトギニアヤム(Dioscorea rotundata)を研究対象としている。本課題では、DNAマーカーの一種SSR(Simple Sequence Repeat)マーカーを用いて西アフリカのヤムイモ遺伝資源500系統のDNAレベルの多様性解析を行い、少数かつ多様な変異を持つ「多様性解析材料セット」の構築を目的としている。DNA多型解析には、植物体の乾燥葉からDNAを抽出し、ホワイトギニアヤムにおいて明確な多型を示す16セットのSSRマーカーによる解析を行った。得られたデータの多変量解析によりヤム遺伝資源の遺伝的構成や系統関係を調査した。課題2ヤムイモ遺伝資源の倍数性変異の解析ホワイトギニアヤムの種内には、倍数性変異があることが知られており、多様性を評価するうえで重要な形質のひとつである。本課題では、上述のホワイトギニアヤム系統の倍数性変異をフローサイトメーター(倍数性変異解析装置)を用いて解析した。まず、基準となる系統の根組織の顕微鏡観察により染色体数を決定し、その後フローサイトメトリーにより倍数性変異の解析を行った。DNA多型解析に用いた500系統のうち、473系統のフローサイトメトリーを行った。その結果、419系統(88.6%)は2倍体、54系統(11.4%)は3倍体であることが明らかになった。

選抜した106系統からなるDRSは、DNA変異(SSR多型)、倍数性および形態形質変異について母集団と同程度の遺伝的多様性を保持する集団であることがgene diversity等の解析データより明確に示された。DRSを用いることで、農業形質変異の詳細な解析が可能になり主要農業形質の効率的な評価方法のプロトコール作成の材料としても有用である。また、DNAレベルにおける詳細な変異解析を行い形質との連関を調べることで、有用形質の原因遺伝子(DNA領域)の同定が容易になることが期待される。課題2サトウキビとエリアンサスの属間雑種の農業形質および細胞遺伝学的特性解析干ばつや痩せ地等の不良環境への適応を目的に作出されたサトウキビとその近縁属植物エリアンサス(Erianthus arundenaceus)の属間雑種の細胞遺伝学的特性と農業形質を解析した。GISH法による雑種集団の染色体組成を解析した結果、サトウキビ由来の染色体は一定数であったのに対し、エリアンサス由来の染色体数は、系統により幅広い変異を示した。DNA量が安定している系統の農業形質と細胞遺伝学的特性の関連性を調査したところ、ほとんどの形質とエリアンサス由来の染色体数との間に正の相関がみられた。雑種におけるエリアンサス由来の染色体の数および組成はごく広い変異を示し、挙動も多様であることが示され、今後は、これらに注目し、農業特性との関係を検討する必要がある。500系統のヤム遺伝資源のSSRマーカーによるDNA多型解析が順調に進み、多様性を包含する代表系統「多様性解析材料セット」の候補系統を選出することができ、今後の詳細な表現型および遺伝子型の変異解析研究の基盤が整った。また,これまで情報に乏しかった倍数性変異についても明らかにすることができた。447系統のヤム遺伝資源から、DNA変異、倍数性、形態形質変異の多様性を保持した少数の材料群を選抜することができ、将来的な分子育種を念頭に、形質とDNA変異との間の連関解析に向けた基盤を構築することができた。また、研究分担者の細胞遺伝学の専門性を生かし、サトウキビとエリアンサスの属間雑種における染色体の構成および形質との関連性に関しても成果を得ることができた。両課題とも論文化に向けた準備を進めている。ヤム遺伝資源のDNA多型解析における欠損データの補完を行うとともに得られたデータの詳細解析を進め、論文化する。また、倍数性と表現形質およびDNA変異との関連について解析を進める。(抄録なし)
植物染色体機能部位単離法の開発

植物の染色体機能部位を単離するためには、酵母の人工染色体ベクターに作製した植物巨大DNAライブラリーを物理的せん断力を極力避け効率よく植物細胞に直接導入することが必要となる。そこでポリエチレングリコール(PEG)を介した細胞融合によるDNAの直接導入法の開発を行った。モデル系として、コード領域内に植物由来のイントロンを捜入したβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(イントロン-GUS遺伝子)を酵母の多コピープラスミドに連結してモデルプラスミドを作製した。このプラスミド上のイントロン-GUS遺伝子は、酵母内では発現せず、植物に導入されてはじめて高発現する。モデルプラスミドが酵母から植物細胞に導入されたことをGUSの活性によってモニターして条件設定を行った。その結果、酵母のスフェロプラストとアラビドプシスのプロトプラストをPEGと高pHかつ高Ca^<2+>濃度の溶液を用いて融合処理する方法によって再現性よく高いGUS活性の検出される条件が得られた。この反応系にマイクロコッカルヌクレアーゼを添加して細胞外にあるDNAを分解した条件下においても得られたGUS活性に影響がなかった。したがってこのDNA導入のプロセスは、酵母から細胞外に漏れ出たプラスミドDNAがアラビドプシスのプロトプラストに取り込まれたのではなく、酵母からアラビドプシスに直接的に導入されていることを示している。このように開発したDNA導入方法は、酵母内の植物巨大DNAライブラリーを植物細胞に導入することにも応用できると考えられる。将来の植物組変え技術に利用可能な人工染色体の構築を目指して、植物染色体機能部位単離法の開発を目的に本研究を行った。その結果、1、アラビドプシス巨大DNAの単離法を確立した。2、得られた巨大DNA断片をEco RIで部分で分解し、酵母人工染色体ベクター(pYAC誘導体)に挿入した後、酵母スフェロプラストに形質転換しライブラリー(挿入DNA断片長約200kb)を作製した。このような巨大なYACライブラリークローンを植物細胞に導入する方法は未だ報告がない。そこで、物理的せん断力を極力避け効率よく植物細胞ヘYACクローンを直接導入するために、まず酵母と植物細胞間のプロトプラスト融合による導入法確立を目指したモデル実験系の構築を行った。35Sプロモーターの下流に植物イントロンを挿入したβ-グルクロニダーゼ遺伝子(35S-IGUS遺伝子;酵母細胞中ではイントロンがスプライスされず従ってGUS活性は検出されないと予想される)を持つプラスミドに酵母での選択マーカーとしてURA3遺伝子、さらに2μoriを組込んだ酵母多コピープラスミドpIG-U-2μを作製した。本プラスミドをエレクトロポーレーション法によりアラビドプシスとタバコBY-2培養細胞のプロトプラストに導入したところ、両細胞共にGUS活性が検出され、特に前者で活性が高かった。一方酵母形質転換体細胞中でのGUS活性はバックグラウンドレベルであった。以上によりGUS活性を指標とした酵母と植物細胞のプロトプラスト融合をモニターする系が構築できた。この方法によるアラビドプシス培養細胞を用いた系で、pIG-U-2μを持つ酵母とのプロトプラスト融合におけるGUS活性が、対照プロトプラストYEp24を持つ酵母を用いた場合に比べ再現性よく明かに高い値を示した。従って現在この系を用いて、酵母と植物細胞のプロトプラスト融合条件の最適化を検討中である。そこでポリエチレングリコール(PEG)を介した細胞融合によるDNAの直接導入法の開発を行なった。モデル系として、コード領域内に植物由来のイントロンを挿入したβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(イントロン-GUS遺伝子)を酵母の多コピープラスミドに連結してモデルプラスミドを作製した。このプラスミド上のイントロン-GUS遺伝子は、酵母内では発現されず、植物に導入されてはじめて高発現する。

モデルプラスミドが酵母から植物細胞に導入されたことをGUSの活性によってモニターして条件設定を行なった。その結果、酵母のスフェロプラストとアラビドプシスのプロトプラストをPEGと高pHかつ高Ca^<2+>濃度の溶液を用いて融合処理する方法によって再現性よく高いGUS活性の検出される条件が得られた。この反応系にマイクロコッカルヌクレアーゼを添加して細胞外にあるDNAを分解した条件下においても得られたGUS活性に影響がなかった。したがってこのDNA導入のプロセスは、酵母から細胞外に漏れ出たプラスミドDNAがアラビドプシスのプロトプラスに取り込まれたのではなく、酵母からアラビドプシスに直接的に導入されていることを示している。このように開発したDNA導入法は、酵母内の植物巨大DNAライブラリーを植物細胞に導入することにも応用できると考えられる。
クロマチン構造を介した組換え反応の機能解析

1.研究の目的:真核生物の遺伝的組換えは、減数分裂期組換え、DNA傷害の修復、DNA複製時エラーの除去、遺伝子発現制御など多方面で機能して、生物の多様性と子孫の安定な保持において重要な役割を担っている。特に、組換えは減数分裂期で高頻度で起こり、出芽酵母では、これまで数十個の遺伝子が同定され、3つのグループに分けられている。即ち、組換えを制御するグループ(I)、組換えの開始である二本鎖DNA切断の導入に関与するもの(II)、相同DNAの検索、対合と交叉に働くもの(III)である。これら3つのグループの遺伝子産物は蛋白質複合体を形成することがTwo-Hybrid法、共同的免疫沈降法及び遺伝的解析から示唆されている。本研究では組換えを行う蛋白質複合体を分離、精製し、その構成及び各成分の機能解析と組換えを効率よく行う染色体構造の解析を目的とした。2.研究成果:酵母の遺伝学的研究から相同組換えの最初の反応である二本鎖DNAの切断に関与すると考えられているMRE11遺伝子のアミノ末端にflag-tag(Asp-Tyr-Lyc-Asp-Asp-Asp-Asp-Lyeの8個のアミノ酸)を付けたものを酵母で発現させflag-tagに対する抗体カラムを用いてMRE11蛋白質複合体を精製することに成功した。このMRE11蛋白質複合体は一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの切断活性を持つことが分かった。また、大腸菌を用いた組換え体MRE11蛋白質単独の活性を調べた結果、酵母から精製したMRE11蛋白質複合体と同様の活性が検出された。
神経炎症におけるエクソソーム上ヒストンの役割の解明

本研究は炎症時に存在する細胞外ヒストンの細胞障害性に関連して、エクソソーム上のヒストンがその役割の一部を担っている可能性を活性化ミクログリア由来のエクソソームを用いて明らかにすることを目的としている。今年度は以下の実験を行った。【LPS刺激によりエクソソームに発現誘導されるタンパク質の選抜と分子ネットワーク解析】昨年度のプロテオーム解析結果を再検討した。LPS、アミロイドβ、IL-4でそれぞれ処理したBV2細胞(マウスミクログリア細胞株)より培養上清中に放出されたエクソソームに発現誘導されたタンパク質の中から、共通して変化するタンパク質を除くことにより、LPS処理のみで変化するタンパク質を選抜した。その結果、増加するタンパク質として11個、低下するタンパク質として15個が同定された。それらについて、KeyMolnetによる分子ネットワーク解析を行い、関連するネットワークを同定した。【活性化ミクログリア細胞由来エクソソームのミクログリア細胞活性化能の検討】LPSにより活性化した細胞から放出されたエクソソームが細胞活性化作用を有するかを検討するために、LPS処理したBV2細胞由来のエクソソームを、無血清培地下でBV2細胞に加えた。翌日に培養液を回収し、培養液中のTNF-αを測定した。その結果、LPS処理細胞由来のエクソソームを添加したBV2細胞の培養上清ではLPS未処理細胞由来のエクソソームを添加したBV2細胞の培養上清よりTNF-α濃度が高くなっていた。このことからLPS刺激により放出されるエクソソームにはBV2細胞の活性化能があることが分かった。本研究は炎症時に存在する細胞外ヒストンの細胞障害性に関して、エクソソーム上のヒストンがその役割の一部を担っている可能性を活性化ミクログリア由来のエクソソームを用いて、細胞および動物レベルにおいて明らかにすることを目的としている。【1ミクログリア細胞エクソソームの単離】エクソソームフリーFBS添加培地で培養したBV2(マウスミクログリア細胞)にLPSを処理し、翌日に培養液を回収し、エクソソームを超遠心法により精製した。精製したエクソソームをウエスタンブロット解析し、LPS処理によりエクソソーム中のヒストンが増加することを確認した。【2マウス凍結脳エクソソームの単離】マウスの凍結脳を用いて脳組織内に存在するエクソソームの単離を試みた。2012年に報告された既報の方法で脳エクソソームを単離し、ウエスタンブロット解析でエクソソームマーカーなどを調べたところ、収量および純度が不十分であることがわかった。当研究室で開発した改良法を用いることにより十分量かつエクソソームの性状を持つ脳エクソソームの単離が可能になり、動物での脳エクソソーム解析を詳細に行うことが可能な状況となった。BV2細胞にLPSを処理し、翌日培養液を回収し、超遠心法にて単離したエクソソームをウエスタンブロットすることによりヒストン発現量の増加を確認している。また、マウスの凍結脳からのエクソソーム単離が可能になったことから、動物へLPSを投与した後に脳組織を採取し、エクソソームを単離することで脳内でのエクソソームがどのような変化を起こしているか解析が可能となった。以上のことから、神経炎症時の脳内におけるエクソソーム中のヒストン分子の役割を明らかにする本研究は、おおむね順調に進展していると考えた。【1活性化ミクログリア細胞株由来エクソソームのプロテオーム解析】無血清培地で培養したBV2(マウスミクログリア細胞株)にLPS、アミロイドβ、IL-4を処理し、翌日に培養液を回収し、エクソソームを超遠心法で精製した。精製したエクソソームをトリプシン消化後にiTRAQで標識し、標識ペプチドを定量プロテオーム解析にかけることにより約1000個のタンパク質を同定した。定量解析によりそれぞれの処理で発現量に差のあるタンパク質を選出した。【2マウス凍結脳エクソソームの単離】マウス凍結脳を用いて脳組織内に存在するエクソソームを単離する超遠心法の改良法を昨年度に報告した。今年度は超遠心法以外の方法を用いて、精製度の高い脳エクソソームを単離する目的で免疫沈降法による生成を試みた。その結果、免疫沈降法により回収した脳エクソソームにエクソソームマーカーを検出した。BV2細胞にLPSなどを処理し、翌日回収した培養上清から超遠心法で得られたエクソソームを定量プロテオーム解析することによりLPSなどによって発現変化を生じるタンパク質を見出している。また、マウス凍結脳からのエクソソーム単離では超遠心法ではなく、より精製度が高いと考えられる免疫沈降法による単離でもエクソソームマーカーを検出している。以上のことから、おおむね順調に進展していると考えた。

今年度は以下の実験を行った。【LPS刺激によりエクソソームに発現誘導されるタンパク質の選抜と分子ネットワーク解析】昨年度のプロテオーム解析結果を再検討した。LPS、アミロイドβ、IL-4でそれぞれ処理したBV2細胞(マウスミクログリア細胞株)より培養上清中に放出されたエクソソームに発現誘導されたタンパク質の中から、共通して変化するタンパク質を除くことにより、LPS処理のみで変化するタンパク質を選抜した。その結果、増加するタンパク質として11個、低下するタンパク質として15個が同定された。それらについて、KeyMolnetによる分子ネットワーク解析を行い、関連するネットワークを同定した。【活性化ミクログリア細胞由来エクソソームのミクログリア細胞活性化能の検討】LPSにより活性化した細胞から放出されたエクソソームが細胞活性化作用を有するかを検討するために、LPS処理したBV2細胞由来のエクソソームを、無血清培地下でBV2細胞に加えた。翌日に培養液を回収し、培養液中のTNF-αを測定した。その結果、LPS処理細胞由来のエクソソームを添加したBV2細胞の培養上清ではLPS未処理細胞由来のエクソソームを添加したBV2細胞の培養上清よりTNF-α濃度が高くなっていた。このことからLPS刺激により放出されるエクソソームにはBV2細胞の活性化能があることが分かった。今後の研究の推進方策は以下の通りである。1BV2細胞にLPSを処理して得たエクソソームを神経細胞モデルPC12細胞に投与し、神経細胞障害性を検討する。また、ヒストンの細胞障害性を抑制する物質でエクソソームを前処理し、神経細胞障害性が軽減するかを検討する。2BV2細胞にLPSを処理して得たエクソソームをマウス脳実質または脳室内に投与した後、脳を摘出し、凍結切片を作製する。染色により神経細胞の脱落、ミクログリアやアストロサイトの活性化を検出し、脳への細胞障害性を評価する。3マウスの脳実質または脳室内にLPSを投与した後、脳を摘出する。摘出脳からエクソソームを精製し、エクソソーム中のヒストンの存在を確認する。さらにミクログリア特異的エクソソームを精製し、ヒストンの発現変化を確認する。細胞レベルではBV2細胞にLPSなどを処理し、培養上清に放出されたエクソソームを回収し、それらエクソソームを神経細胞モデルPC12細胞やBV2細胞自身に投与し、細胞への障害性などの影響を見る。さらにヒストンの細胞障害性を抑制する物質やエクソソームの取り込みを阻害する物質の処理により細胞への影響が軽減されるかを検討する。動物レベルではアルツハイマー病モデルマウスより脳エクソソームを単離し、ヒストンの発現変化など、細胞実験レベルで得られた知見が動物でも同様にみられるか検討する。エクソソームに関する研究は本研究以外にも行っており、他の研究の試薬と共通するものが多く、使用期限を考慮して既に購入済みの試薬を先に使用するなど、予定の試薬の購入を遅らせる事態が発生したが、基金である利点を活用し、翌年分にスライドすることが可能であったため商品の重複購入を避けることにした。これからウエスタンブロットによる確認、初代培養、動物実験、組織染色などの実験があるため予算は無駄なく本研究のために執行できる予定である。