hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
対タイ宣伝活動の諸相とタイ側の反応：戦時期日本の東南アジア関与とその変化

成果の公開については、学会はもちろん、一般市民への公表にも取り組み、また国際的にも「大東亜」戦争期における日本の対タイ宣伝に関する論文を中国語で公表できたことは、国際的研究活動を拡大する上で大きな一歩となった。今次研究では、多岐にわたる対タイ宣伝活動を分野横断的に分析し、戦時期日本の対タイ宣伝の意図と性格を浮彫にするとともにタイ側の反応をも明らかにしようとした。その結果、日本は対タイ宣伝を非常に重視していたこと、映画・写真宣伝の主対象としては華僑を重視していたこと、冊子宣伝の主対象としてはタイ人女性を重視していたこと、宣伝の内容としては、日本紹介や芸能の活用に重点を置いていたことなどがわかった。これらの宣伝に対するタイ側の反応としては、タイの人々の関心を一定程度集めることに成功したが、タイ政府の対日不信・不満の原因となり、タイ側の国内文化政策高揚を促進することになったことがわかった。平成27年度に実施した日本の対タイ宣伝の全体像に関する研究を基盤とし、また平成27年度に収集した史資料を中心としてプロパガンダ誌・ラジオ放送・映画・写真等の各個別分野の宣伝工作に関する具体像を研究していく。また、イギリスやオーストラリア等における公文書館等における史料収集を展開し、より広範囲に史資料を入手することによって、立体的な対タイ宣伝工作像を模索する。こうした研究に併行して、タイ以外の地域に対する宣伝工作との比較対照研究も継続することにより、日本の対タイ関与の一般性と特殊性について考察を深める。平成29年度については、計画当初に予定していて実施できていないオーストラリアにおける資料収集活動を完了させ、所期の成果を着実にあげることが、資料収集面での課題である。史料分析は、アメリカやイギリスにおいて収集できた史料の分析をさらに進め、より多角的に「大東亜」戦争期の日タイ関係を、宣伝活動の面から進めていくことにしたい。この成果は、7月の日本タイ学会研究大会等において学会発表を実施し、他の研究者とも共有していく予定である。分野としては、平成28年度に、「大東亜」戦争期の日タイ間の映画戦に関する研究が立研究者によって発表されているが、こうした研究者との情報交換・共有等を学会のパネル等において実施し、より総合的な観点から、立体的に当時の日タイ関係を浮かび上がらせることを目標とし、本研究計画終了時にその成果を著書の形にして公表できるように努めたい。東洋史国外への出張を計画していた8月に、別の研究課題に関する国外出張が組み込まれたため、本課題に関する国外出張が実施できなかったことによる。計画をしていた海外出張について、初年度に予定していたイギリス出張が2年度目にずれ込んだことにより、2年度目に計画していたオーストラリア出張を実施することが出来ておらず、その出張費分について差異が生じている。本研究課題による国外出張を、平成28年89月に実施することにより、所期の史料収集を展開する。今年度は、昨年度に予定されていたオーストラリア出張を実施する。
資本市場法の研究

平成元年度は、資本市場の各部分市場に関する基礎的研究を昭和63年度に引き続き行うとともに、複数の部分市場にまたがる法的問題につき、市場参加者、取引対象ならびに取引行為に対する規制のあり方という見地から検討を加えた。企業の資金調達については、証券取引法の昭和63年改正によって導入された新しい開示制度を、改正にあたり参考にされたアメリカ法と比較し、その影響の強さを改めて認識したが、他方、第三者割当増資の場合は、主に商法の問題として、関係者の利益調整の面で日本独特の解釈手法が見られる。なお、上記の証券取引法改正によって設けられた内部者取引規制についても検討したが、刑罰を手段とする規制の限界が、諸外国の場合に比べてもより顕著に見出された。資本市場の仲介機関およびそれらが扱う商品については、金融機関制度のあり方を論じた金融制度調査会の報告書等を中心に、外国の制度と比較しつつ、証券取引法65条の間題も含めて検討するとともに、昭和63年に制定された金融先物取引法の構造を、証券取引法および商品取引所法との対比において研究した。さらに、各種の短期金融市場についても、実態および規制の歴史に遡り、主要国の制度と比較しながら研究を行った。金融その他の経済活動の国際化が進展するのに伴い、資本市場の各部分市場間の障壁は低くなりつつあるとはいうものの、それを維持しようとする力も日本には相当強くあり、ことに先物取引の市場が三つに細分されているのは他に例を見ないところである。このような現状を踏まえ、全体としての資本市場が効率的に機能しうる法的枠組を探るのが今後の課題である。資本市場の各部分市場について以下のような研究を行った。証券市場に関しては、証券取引法の昭和63年改正にかかる、企業内容開示制度、証券先物取引・オプション取引、および内部者取引を中心に、外国との比較をしながら新制度の検討を行った。先物市場に関しては、同じく昭和63年に制定された金融先物取引法について、証券先物および商品先物と比較しつつ、同法の特色を探る研究を行った。金融市場に関しては、金融と証券の分離ならびに専門金融機関制度、国際化との関連における金融業務の変化などについて研究を行った。企業の資金調達に関しては、社債制度ことに発行限度および受託会社のあり方の問題、ならびに優先株制度ことにその発行規制および株主相互間の利益調整の問題、さらに従業員持株制度について検討を加えた。これらの研究の成果は一部公表済または公表予定であるが、さらに検討を加えて本年度または来年度に公表することにしている問題も多く残している。本研究の計画においては、従来主として各部分市場ごとの研究がなされるにとどまっていた問題を、資本市場という上位概念の下に総合的にとらえ、相互の関連性を究明することを企てた。まだ1年足らずの研究にすぎないので明確には示しえないが、上記の研究のみによっても、各部分市場間の相互関連が予想以上に強いことが判明しつつある。法的規制のあり方もそれに応じた総合的なものを目指すベきか、理論体系の問題にとどめるべきか、このことを含めて研究を継続する予定である。
シアリルラクトースの摂取による記憶学習能の維持・改善メカニズム解明に関する研究

本研究では、母乳に多く含まれ神経成長期に摂取するシアリルラクトースを高齢期に摂取することによる脳機能への影響とその作用機序を解明することを目的とした。高齢ラットまたは加齢促進モデルマウスに、シアリルラクトースを含む食餌を14日間摂取させることで、血中のコレステロール濃度の変化および脳組織のドーパミン、セロトニン等の神経伝達物質の増加や神経栄養因子の増加が観察された。また、加齢促進モデルマウスでは、記憶学習に関する行動が改善された。これらの結果は、シアリルラクトースの摂取が脳機能の維持、改善に効果がある事を示唆する。シアリルラクトース(SL)は、N-アセチルノイラミン酸を主としたシアル酸にラクトースが結合した物質で、乳製品に含まれる。シアル酸を含む様々な糖鎖は細胞膜表面上のシグナル伝達を調整しており、脳神経伝達においても重要な働きをしている。そこで本研究課題では、シアリルラクトースを栄養学的に摂取する事による高次脳機能への影響、特に記憶学習能への影響を観察する事を目的とした。今年度の研究ではまず、培養神経細胞を用い、細胞周辺のSL濃度を変化させた時の影響を観察した。まず始めに、神経細胞株であるPC-12を用いたMTTアッセイを行い、神経細胞の増殖に影響を及ぼさない100uM以下のSL濃度で実験を行う事を決定した。次に、SLをPC-12培養培地に添加した時にミエリン形成シグナル因子であるTACE、BACE1、NRDcの発現を観察した。その結果、SL添加によりTACEおよびBACE1mRNAの発現に変化が起こる事が観察された。次に、神経支持細胞腫であるラットのC6細胞をオリゴデンドロサイトに分化誘導し、SLを培養培地に添加する事でオリゴデンドロサイトのミエリン形成シグナル因子であるErbB4の発現へ与える影響を観察した。その結果、SLの添加はErbB4mRNA発現には有意な影響を及ぼさない事が示唆された。現在、同培養細胞のタンパク質を抽出し、SLが神経支持細胞の神経栄養因子分泌へ及ぼす影響を測定中である。細胞培養実験については概ね計画通りに実施しており、採取したサンプルの測定を行う状態にあるが、実験計画にあるガングリオシドの測定条件を決定できていない。動物実験実施のための食餌条件の検討が遅れているため、早急に検討する必要がある。そこで本研究課題では、シアリルラクトースを栄養学的に摂取する事による高次脳機能への影響、得に記憶学習能への影響を観察する事を目的とした。本年度は、記憶学習能低下モデル動物である加齢促進SAMP8マウスを用い、シアリルラクトースの摂取が記憶学習能に及ぼす影響を観察した。2週間シアリルラクトースを摂取させたSAMP8マウスを用い、記憶学習行動試験である新規物質探索試験を実施した。実験では、通常食を摂取した健常加齢SAMR1マウス群、通常食を摂取したSAMP8マウス群、および1%のシアリルラクトースを含む食餌を摂取したSAMP8マウス群の3群を設けた。その結果、健常対照群として用いたSAMR1マウス群に比べ、通常食を摂取したSAMP8マウスでは新規物質探索試験のスコアが有意に低下し、記憶学習能が低下する事を示した。一方で、シアリルラクトースを含む食餌を摂取したSAMP8マウス群では、SAMR1群と同等の行動試験スコアを示した。これらの結果から、シアリルラクトースの摂取は、記憶学習能の低下を抑制する可能性が示された。今後の研究では、行動試験で用いた動物から摘出した脳を用いて、シアリルラクトースの記憶学習能低下抑制に関連する因子の測定を実施する予定である。今年度までに、記憶学習能低下モデル動物を用いた記憶学学習行動試験を実施する事で、シアリルラクトースの摂取が、記憶学習能の低下を抑制する可能性を示すことができたが、そのメカニズムについては明らかではない。行動実験で使用した動物から採取した脳組織を保有しているので、それらの脳組織中の記憶学習に関連する因子について解析を行う必要がある。また、当初予定していた脳内ガングリオシドの解析については、測定方法の確立に必要な時間および予算の確保が困難であるため、これにかわり、神経栄養因子発現量の測定や、神経伝達物質量の測定に重点をおき、詳細な分析を検討する。

実験では、通常食を摂取した健常加齢SAMR1マウス群、通常食を摂取したSAMP8マウス群、および1%のシアリルラクトースを含む食餌を摂取したSAMP8マウス群の3群を設けた。その結果、健常対照群として用いたSAMR1マウス群に比べ、通常食を摂取したSAMP8マウスでは新規物質探索試験のスコアが有意に低下し、記憶学習能が低下する事を示した。一方で、シアリルラクトースを含む食餌を摂取したSAMP8マウス群では、SAMR1群と同等の行動試験スコアを示した。これらの結果から、シアリルラクトースの摂取は、記憶学習能の低下を抑制する可能性が示された。加えて、行動試験で用いた動物から摘出した脳を用いて、シアリルラクトースの記憶学習能低下抑制に関連する因子の測定を実施した。本研究では、母乳に多く含まれ神経成長期に摂取するシアリルラクトースを高齢期に摂取することによる脳機能への影響とその作用機序を解明することを目的とした。高齢ラットまたは加齢促進モデルマウスに、シアリルラクトースを含む食餌を14日間摂取させることで、血中のコレステロール濃度の変化および脳組織のドーパミン、セロトニン等の神経伝達物質の増加や神経栄養因子の増加が観察された。また、加齢促進モデルマウスでは、記憶学習に関する行動が改善された。これらの結果は、シアリルラクトースの摂取が脳機能の維持、改善に効果がある事を示唆する。概ね当初の実験計画通りに実施する予定であるが、実験計画にあるガングリオシドの測定条件について引き続き検討する必要がある。あるいは、これと同等の研究成果・知見を得るための代替案を試案する必要がある。現在保有している、動物の脳組織サンプルを用い、記憶学習能に関連する因子の変化について、タンパク質発現あるいは遺伝子発現の変化を分析する予定である。栄養学実験の進捗状況がやや遅れ気味であり、次年度の実施に持ち越したため。生化学分析において、特に遺伝子解析装置の交換の必要性があり、その交換期間および装置の測定手技の取得期間が必要となったため、一部の測定項目について遅延が生じた。実験計画通り、27年度に実施予定であった動物実験の実施のために使用する。当初の実験計画に沿って、新しく導入した機器を用い、遺伝子解析等の生化学分析を実施する。
層状チタン酸塩の合成とインターカレーション電池への応用

1.層状の結晶構造をもつチタン酸塩は、イオン交換体やインターカレーションのホストとして古くから研究されてきた物質である。我々は先に、レピドクロサイト型の層状構造をもつチタン酸塩Cs_xTi_<2-x/4>O_4がインターカレーション電池の正極材料として応用可能であることを明らかにした。層状構造をもつチタン酸塩は、優れた正極材料となりうるポテンシャルを持つものと考えられる。本研究では、層状構造をもつ種々のチタン酸塩の合成を行い、イオン交換反応を用いて、層間にリチウムがインターカレーションできるスペースを作った。この層間へのリチウムのインターカレーション・デインターカレーションを電気化学的に行い、層状チタン酸塩のリチウム二次電池正極への応用の可能性について検討した。2.本研究では、物質探索の結果、層状チタン酸塩として、Cs_xTi_<2-x/2>Mg_<x/2>O_4、K_xTi_<2-x>Fe_xO_4、CsTiNbO_5およびCsTi_2NbO_7を取り上げた。これらの化合物の層間に存在するセシウムイオンとカリウムイオンは、層間のスペースのほとんどを占有しているため、これに直接リチウムをインターカレーションすることは不可能である。このため、層間のアルカリ金属イオンをリチウムイオンや水素イオンとイオン交換することを試みた。いずれの場合も水溶液中の反応により容易にイオン交換反応が進行することがわかった。なお、このイオン交換と同時に、層間には水分子が存在するようになったが、これは加熱により取り除くことができた。インターカレーション電池を組み、充放電特性を調べたところ、リチウムイオン交換生成物や水素イオン交換生成物は、正極材料として有用であることが明らかとなった。これらの正極材料は環境に優しいという性質ももつ。以上のことから、本研究の当初の目的はほぼ達成されたものと考えられる。レピドクロサイト型構造を持つ一連の層状チタン酸塩を、リチウム二次電池の正極材料へ応用する研究を進めている。これら層状チタン酸塩は、現在リチウムイオン電池の正極として広く使われているコバルト酸リチウムと同様、インターカレーション電池の正極に用いることが可能であると考えられる。本年度は、層内のチタンサイトの一部を、マグネシウムイオンで置き換えた構造をもつCs_xTi_<2-x/2>Mg_<x/2>O_4(x=0.70)について調べた。この化合物の合成には、炭酸セシウム、アナターゼ型二酸化チタンおよび酸化マグネシウムを用いた。所定比の混合物を、800°Cで20時間、2回加熱した。次いでこの化合物の層間のセシウムイオンをリチウムでイオン交換した。試料を1M LiNO_3中に分散し、60°Cで3日間反応させた。リチウムイオン交換生成物のXRD図は単一相として指数付けすることができた。セシウム、リチウムおよびマグネシウムは原子吸光分析により定量した。チタンはクペロンを用いる重量法により定量した。イオン交換反応により取り込まれた層間水の量はTG-DTA測定により求めた。層間のセシウムイオンは83%が溶出し、73%がリチウムとイオン交換したことがわかった。このリチウムイオン交換生成物を真空中180°Cで加熱すると、層間水は取り除かれ、層間距離が0.86nmから、0.66nmに小さくなった。この層間水を取り除いた試料をリチウム二次電池の正極として、充放電特性を調べた。初回のサイクルでは、1.5-4.2V間で、120mAh/g程度の充放電容量を示した。

20サイクル後も容量は75%程度を保つことがわかった。本試料はインターカレーション電池の正極として優れた特性をもつことが明らかとなった。また、試料中の重金属はチタンのみであるため、環境調和型正極材料としても有用であると考えられる。レピドクロサイト型構造を持つ一連の層状チタン酸塩を、リチウム二次電池の正極材料へ応用する研究を進めている。これら層状チタン酸塩は、現在リチウムイオン電池の正極として広く使われているコバルト酸リチウムと同様、インターカレーション電池の正極として、応用可能であると考えられる。本年度は、層内のチタンサイトの一部を、鉄(III)イオンで置き換えた構造をもつK_xTi_<2-x>Fe_xO_4(x=0.80)について調べた。合成は、炭酸カリウム、アナターゼ型二酸化チタンおよびα-酸化鉄を用いた。所定比の混合物を、1100°Cで20時間、2回加熱した。次いでこの化合物の層間のカリウムイオンを水素イオンで交換した。試料を0.05M硫酸中に分散し、室温で3日間反応させた。水素イオン交換生成物のXRD図は単一相として指数付けすることができた。カリウムおよび鉄は原子吸光分析により定量した。チタンはクペロンを用いる重量法により定量した。イオン交換反応により取り込まれた層間水の量はTG-DTA測定により求めた。層間のカリウムイオンは99%が溶出し、水素イオンに交換された。この水素イオン交換生成物を110°Cで1時間加熱すると、層間水は取り除かれ、層間距離が0.910nmから、0.750nmに減少した。この層間水を取り除いた試料をリチウム二次電池の正極として、充放電特性を調べた。電流密度は1.0mA/cm^2とし、1.5-4.2V間で放電後、充電を行った。放電容量はおおよそ100mAh/gであった。これは、組成式あたり0.62のリチウムイオンがインターカレーションすることに相当する。充電容量は70mAh/gであり、組成式あたり0.43のリチウムイオンがデインターカレーションすることに相当する。本研究で合成した試料は、インターカレーション電池の正極として優れた特性をもつことが明らかとなった。また、試料中の金属はチタンと鉄のみであるため、環境調和型正極材料としても有用であると考えられる。層状の結晶構造をもつチタン酸塩を、リチウムニ次電池の正極材料へ応用する研究を進めている。層状チタン酸塩は、現在リチウムイオン電池の正極として広く使われているコバルト酸リチウムと同様、インターカレーション電池の正極として、応用可能であると考えられる。本年度は、層内のチタンサイトの半数を、ニオブ(V)イオンで置き換えた構造をもつCsTiNbO_5について調べた。合成は、炭酸セシウム、アナターゼ型二酸化チタンおよび酸化ニオブ(V)を用いた。所定比の混合物を、800°Cで20時間、2回加熱した。次いでこの化合物の層間のセシウムイオンをリチウムでイオン交換した。試料を1.OM LiNO_3中に分散し、60°Cで9日間反応させた。イオン交換生成物のXRD図は単一相として指数付けすることができた。セシウムおよびリチウムは原子吸光分析により定量した。チタンおよびニオブは重量法により定量した。
マウスのサルモネラ腸炎モデルを用いたTLR5の機能解析

Toll-like receptor(TLR)は様々な病原体の構成成分を認識し自然免疫応答を誘導する。TLRファミリーのうち、TLR5は鞭毛の構成タンパクであるフラジェリンを認識することがin vitroの解析により示された。しかしながら、生体におけるTLR5の役割はいまだ十分に解析されていなかった。我々はTLR5KOマウスを作製しin vivoにおけるTLR5の役割を検討した。まず我々はフラジェリンをTLR5欠損マウスに投与し、血中の炎症性サイトカイン産生が完全に消失していることを確認した。これによりフラジェリンがTLR5の真のリガンドであることが分かった。しかしながら、in vivoでフラジェリンを投与した際にどのような細胞群がこの炎症性サイトカインの産生に関わるかは不明であった。他のTLRファミリーメンバーと異なり、TLR5はマクロファージや、脾臓やGM-CSFで誘導した樹状細胞には発現していなかった。そこで、様々な臓器におけるTLR5の発現をしらべたところ、小腸において高発現していることが分かった。過去の報告に従い、まず腸管上皮(IECs)におけるTLR5の役割を検討した。予想に反してIECsはフラジェリンに対して炎症性サイトカインも誘導しなかった。TLR5のIECsにおける発現は小腸全体におけるTLR5の発現よりもはるかに低かった。小腸から様々な細胞を単離しTLR5の発現量を検討したところ、CDl1c+腸管粘膜固有層の細胞(LPCs)にTLR5が特異的に発現していることが明らかになった。CDl1c^+LPCsはフラジェリンに対して炎症性サイトカインを産生した。CDl1c^+LPCsはTLR5を介して病原性の有鞭毛細菌を感知し炎症反応を誘導することが明らかになった。脾臓の樹状細胞とは異なり、CDl1c^+LPCsはTLR4を発現していなかった。腸管内の常在菌はグラム陰性菌が多いが、TLR4を発現してないことが常在菌に対する過剰な反応を起こさないことに寄与していることが考えられた。TLR5は有鞭毛細菌に対して免疫応答を誘導したので、TLR5KOマウスにおいてSalmonella typhimuriumの経口投与を行い、感染におけるTLR5の役割を検討した。予想に反してTLR5KOマウスはS.typhimuriumの経口感染に抵抗性であった。粘膜固有層から腸間膜リンパ節へのS.typhimuriumの輸送が障害されおり、感染4日後の脾臓や肝臓での菌量も著名に少なかった。S.typhimuriumは細胞内寄生菌であり、遊走するマクロファージや樹状細胞などに寄生してリンパ節や他の臓器で感染を拡大していく。鞭毛を持つS.typhimuriumはTLR5を介してCDl1c^+LPCsを活性化させ腸間膜リンパ節へ移動させ、2次感染巣を形成させていることが示唆された。以上の結果より、CD1c^+LPCs上のTLR5は鞭毛を持つ細菌の認識を行うが、細胞内寄生菌のS.typhimuriumには感染の拡大に逆に利用されていることが分かった。以上の結果は、研究期間内に得られ、その成果は学術雑誌に報告し掲載された1)。TLR5遺伝子欠損マウスは樹立に成功し、C57/BL6へのバッククロスも完了した。TLR5欠損マウスを用いて、in vitroの実験によりリガンドとして同定されたフラジェリンに対する反応性を細胞レベル、個体レベルで解析することを試みた。まず、TLR5欠損マウスにフラジェリンを腹腔内に投与すると、野生型で認められたTNF-・やIL-6といった炎症性サイトカイン産生は完全に消失していた。これより、フラジェリンがTLR5のリガンドであることが証明された。次に細胞レベルでのフラジェリンに対する反応の解析を試みた。ところが、マウスでは、TLR5は、他のTLRファミリーメンバーが好発現している腹腔マクロファージや脾臓の樹状細胞、さらに骨髄細胞をマウスGM-CSF存在下で培養し単離した樹状細胞にも発現していなかった。最近、TLR5は腸管上皮に高発現していることが報告された。このため、野生型とTLR5欠損細胞から腸管上皮細胞を単離し、TLR5の発現及びフラジェリンに対する反応性を検討した。予想に反してTLR5の腸管上皮での発現は非常に低く、フラジェリンに対する反応性も非常に弱かった。腸管全体では、他の臓器に比べTLR5の発現が非常に高かったため、腸管の様々な細胞を分離し、TLR5を高発現する細胞群の同定に成功した。この細胞群を用いて、フラジェリンによるサイトカイン産生を調べた。また、野生型の細胞とTLR5欠損細胞をフラジェリンで刺激してRNAを単離し、DNAチップにより遺伝子発現を網羅的に検討した。さらに、フラジェリンを持つ有鞭毛細菌であるサルモネラによる感染実験を行い、サルモネラ感染におけるTLR5の役割を解析した。

まず我々はフラジェリンをTLR5欠損マウスに投与し、血中の炎症性サイトカイン産生が完全に消失していることを確認した。これによりフラジェリンがTLR5の真のリガンドであることが分かった。しかしながら、in vivoでフラジェリンを投与した際にどのような細胞群がこの炎症性サイトカインの産生に関わるかは不明であった。他のTLRファミリーメンバーと異なり、TLR5はマクロファージや、脾臓やGM-CSFで誘導した樹状細胞には発現していなかった。そこで、様々な臓器におけるTLR5の発現をしらべたところ、小腸において高発現していることが分かった。過去の報告に従い、まず腸管上皮(IECs)におけるTLR5の役割を検討した。予想に反してIECsはフラジェリンに対して炎症性サイトカインも誘導しなかった。TLR5のIECsにおける発現は小腸全体におけるTLR5の発現よりもはるかに低かった。小腸から様々な細胞を単離しTLR5の発現量を検討したところ、CDl1c+腸管粘膜固有層の細胞(LPCs)にTLR5が特異的に発現していることが明らかになった。CDl1c^+LPCsはフラジェリンに対して炎症性サイトカインを産生した。CDl1c^+LPCsはTLR5を介して病原性の有鞭毛細菌を感知し炎症反応を誘導することが明らかになった。脾臓の樹状細胞とは異なり、CDl1c^+LPCsはTLR4を発現していなかった。腸管内の常在菌はグラム陰性菌が多いが、TLR4を発現してないことが常在菌に対する過剰な反応を起こさないことに寄与していることが考えられた。TLR5は有鞭毛細菌に対して免疫応答を誘導したので、TLR5KOマウスにおいてSalmonella typhimuriumの経口投与を行い、感染におけるTLR5の役割を検討した。予想に反してTLR5KOマウスはS.typhimuriumの経口感染に抵抗性であった。粘膜固有層から腸間膜リンパ節へのS.typhimuriumの輸送が障害されおり、感染4日後の脾臓や肝臓での菌量も著名に少なかった。S.typhimuriumは細胞内寄生菌であり、遊走するマクロファージや樹状細胞などに寄生してリンパ節や他の臓器で感染を拡大していく。鞭毛を持つS.typhimuriumはTLR5を介してCDl1c^+LPCsを活性化させ腸間膜リンパ節へ移動させ、2次感染巣を形成させていることが示唆された。以上の結果より、CD1c^+LPCs上のTLR5は鞭毛を持つ細菌の認識を行うが、細胞内寄生菌のS.typhimuriumには感染の拡大に逆に利用されていることが分かった。以上の結果は、研究期間内に得られ、その成果は学術雑誌に報告し掲載された1)。
赤外線放射加熱を利用した青果物の表面殺菌に関する研究

本年度は冷殺菌の一つである紫外線(UV)照射を併用し、殺菌効果と貯蔵期間の延長を試みた。実施内容は、1)ステンレス表面に塗布した糸状菌に対する殺菌効果の検討、2)1)で使用した糸状菌をカンキツ表面に塗布し、その殺菌効果および貯蔵期間の延長効果の検討、である。1)については、ウンシュウミカンより分離した糸状菌を用い、IRとUVの併用殺菌を試み、PDA培地による平板培養法によって評価した。その結果、IR感受性が高いグループ、UV感受性が高いグループに大別できた。また、組み合わせ処理した場合、IR感受性種、UV感受性種ともに、効果的な殺菌が可能であった。すなわち、IR感受性、UV感受性問わず、IRあるいはUVのどちらを先んじて照射処理を施しても、前者ではIR単独処理の効果、後者では、UV単独処理の効果と同等、あるいはそれ以上の効果を示す場合も見られた。また、同時に処理を施しても、高い殺菌効果が得られた。このメカニズムに関しては、今後詳細な検討が必要であるが、IRの殺菌機構、UVの殺菌機構それぞれが、お互いの長所を阻害することなく影響を及ぼした可能性が高い。以上のように、組み合わせることによって、農産物や食品等、試料表面あるいは試料表面付着微生物の特性に応じ、熱および紫外線負荷を低減し得る処理法の開発が期待できる。今後、詳細なメカニズムの解明とともに、様々な試料に対して、種々の組み合わせを検討する予定である。次に2)では、糸状菌について、表面に針キズをつけたウンシュウミカンに接種し、IRおよびUV処理による腐敗防止効果を検討した。その結果、無照射サンプルと比較して、IRとUVを組み合わせた場合、一週間以上の腐敗遅延効果を示したが、IRのみの処理では、60秒程度の処理でも表面にヤケを生じて商品性を失ったことから、UVの割合を上げる等、処理方法に工夫が必要であると考えられた。赤外線加熱を利用した青果物の表面殺菌の可能性を見極めるため、平成17年度は、1)表皮が比較的強固な青果物であるカンキツ(ハッサク)の表面殺菌および殺菌後の貯蔵期間の延長、2)ハッサク表面より分離した糸状菌(属種未同定)およびPenicillium属菌(P.digitatum, P.italicum)に対する赤外線の殺菌効果を検討した。ハッサクの表面殺菌効果は室温静置状態での腐敗果の発生程度を外観観察によって評価した。また、分離および指標菌に対する殺菌効果は、カンキツ表面の水分活性環境で平衡させた殺菌対象菌の分生胞子に対して直接赤外加熱処理した(水和状態ではない)後、ポテトデキストロース寒天培地を用いた平板培養による菌数測定によって評価した。950nmにエネルギーピークを示すヒータによって30秒間処理することで、腐敗の発生を約3週間遅延させることが可能であったが、60秒以上処理すると、ヤケに起因すると思われる変敗の発生が顕著であることが示された。以上の結果から、適当な照射条件を見極めることで、カンキツ等、比較的強固な表皮構造である青果物の表面殺菌に赤外加熱は有用である可能性が示された。また、更なる貯蔵期間の延長は、他の殺菌技術・静菌法との併用によって目指すことが可能と思われる。一方、分離・指標いずれの菌に対しても、1518秒程度で90%以上死滅させることが可能であった。この場合、高い水分活性で平衡させた分生胞子は赤外加熱に対する抵抗性が高くなる傾向を示したが、ヒータから放射される赤外線のエネルギーピークの違いが抵抗性の変化に及ぼす影響は明確ではなかった。
ALS発症に関与する新たなシナプス蛋白質の病態機序解明研究

当研究室は既報でFUS機能喪失マウスモデルを用い、FUSのSynGAP mRNA安定化機構の破綻がシナプス形態異常を引きおこし、認知行動障害を引き起こすことを明らかなにした。この機構が筋萎縮性側索硬化症の病態生理に関係しているかどうかを調べるべく、JaCALSデータベースからSynGAP3'UTRの新規変異を発見し、ヒトモデルでの確認を行うために、iPS細胞から分化誘導した運動神経でその変異の機能解析を行った。今年度は共同研究者と共にiPS細胞株(201B7)から運動神経に分化誘導する技術を習得し、安定して培養できる環境を確立した。また表現型解析を行うためにシナプス形態を観察できる条件検討を行い、後述する新規変異モデルの解析が可能な状態になった。データベースから見出した点変異を有するモデルiPS細胞を作成するため、CRISPR/Cas9を用いた遺伝子編集を行った。通常はCas9が変異を有するテンプレートを切断しないようにするために目的の変異以外にアミノ酸配列が変化しないような変異をテンプレートに導入したり、導入後にCre-loxPなどのrecombinationして配列を作成する場合には使用するloxP配列などが残存することがあるが、今回は1点変異の機能を解析するために、foot-print freeに点変異を導入する技術を用いた。これによりiPS細胞株(201B7)に新規変異を導入し、運動神経に分化誘導が可能であることを確認し、表現型解析が可能なモデルの作成に成功した。foot-print freeの点変異を導入は技術的に難易度が高く、条件検討に時間を要したが、表現型解析を遂行できる変異導入iPS細胞が確立できたため、今後予定していた表現型解析へと研究を進展できる状態であるため。新規変異モデルiPS細胞を確立できたため、今後はこれらを運動神経に分化させ、シナプス形態を主とした表現型解析を行う。シナプス障害が再現されれば、それらを是正する治療薬ターゲットを、表現型に伴うメカニズムを明らかにしたうえで探索する。(理由)購入予定していた試薬を無償譲渡で賄うことができたため、未使用額が発生した。(使用計画)未使用額については令和元年度に行う表現型解析など解析費に使用する予定である。
大学の公開する情報における定義に関する研究-大学IRに活かす情報公開-

情報公開に焦点を当て、大学職員のもつノウハウを活かして、大学情報をどのような定義(算出方法)で収集・共有すべきかを検証するとともに、集積され発信された大学情報を大学の職員組織の改善に活用する方法を模索することで、情報公開を大学の改善活動(IR)に資することを目的とする。【研究方法】1文献調査:国内外における大学の数値情報の定義について、国外は文献や各種ランキング、国内は各媒体からのアンケート等をもとに調査(2015年7月10月)。2国内インタビュー調査:国内大学2校(IR関連部署)に対して、学内での情報収集・蓄積、学外への発信、意思決定への活用等関連業務に関する調査(2015年10月11月)。3アンケート調査:全国の私立大学(大学院大学を除く)のIR担当部署の担当者に対して、郵送により調査(2016年2月3月。配付数: 582,回答数: 201,回答率: 34.5%)。【研究結果】英国では大学の基礎的な情報がHESA(英国高等教育統計局)を通じて学外に提供されており、1つの定義に則った情報が活用されるため、標準的・統一的な大学情報を利用することができる。また各大学も統一的な指標をもって自らの立ち位置を比較し、戦略を立てることができる。これに対して日本では各種媒体が個々の大学に調査を行うため、調査ごとに定義が異なり、各大学や対応部署の判断によって左右される可能性がある。そのためステークホルダーのみならず、大学内で情報を活用する際に、定義の異なる情報を利用してしまう危険性がある。今後は、各大学内で共有する情報のみならず、各大学の提供する情報の定義を統一化する必要があり、情報を学内外に対して戦略的に活用する方策が求められる。そのためには、様々なデータ処理がある中で、各部署が効率的に正確な情報を集約し取りまとめて集積し、部署間で連携するしくみづくりが必要である。
COCH遺伝子プロモーターを用いた新たな内耳特異的遺伝子治療法の開発

「はじめに」内耳に遺伝子を発現させてそれを治療に応用する際に最も重要な点は、その標的特異性にある。遺伝子が、周囲組織の中枢神経系などに発現した場合予想できない副作用が生ずる。遺伝子治療に用いる標的特異性は一般に2つの方法によってもたらされる。一つは特定の細胞に遺伝子を発現させる方法(転写調節によるターゲティング)、一つは特定の細胞に遺伝子を導入する方法(細胞ターゲティング)である。今回我々はCOCH遺伝子プロモーターを用いた、転写調節による内耳ターゲティングをおこなうことを最終目標にしている。「目的」・COCH遺伝子発現の2つの特異性、つまり組織特異性、発生過程の時期特異性の検討・COCH遺伝子転写の制御エレメント、プロモーターとエンハンサーを明らかにする・このプロモーターを内耳遺伝子治療に応用する「結果」その1 COCH遺伝子発現の組織特異性を検討した。その結果からCochlinは、他の遺伝性難聴原因蛋白とは異なり、その発現の内耳特異性が非常に高い遺伝子であることが判明した。その2 COCH遺伝子発現の発生過程の時期特異性を検討した。染色は主にラセン板縁およびラセン靭帯に認められた。コルチは弱く、ラセン神経節、血管条は染色されなかった。またラセン板縁は成長を通じ、染色の強さはあまり変わらなかったが、ラセン靭帯は24日以降の内耳で強く染まるようになった。その3 COCH遺伝子の発現特異性を担うプロモーター領域の解析を行った。ヒトゲノム解析の結果を参考にしながら、ヒトgDNAにおけるCOCH遺伝子上流の遺伝子配列800bp程度を決定し、クローニングしたトランスフェクションを行う繊維芽細胞プライマリカルチャーを行っている。「考察」COCH遺伝子の発現制御の研究およびプロモーターのクローニングは内耳の遺伝子治療に新たな道を開く重要なアプローチと考えられる。本年度の研究目的は、COCH遺伝子発現の2つの特異性、つまり組織特異性、発生過程の時期特異性の検討である。先ず動物臓器蛋白を用いて、ウェスタンブロッティングにより臓器別のCochlin発現レベルの検討を行った。抗Cochlin抗体で陽性の臓器は内耳、大脳、小脳、脾臓、胸腺の5個であった。内耳以外の臓器に発現している蛋白は、内耳に発現しているCochlinアイソフォームの分子量とは異なっており、これらの臓器にはCochlinと相同性の高い配列を持つ蛋白が発現していると考えられる。また、内耳以外の臓器での抗Cochlin抗体陽性蛋白の発現量は、内耳の10から100分の1程度であった。これらの結果からCochlinは、他の遺伝性難聴原因蛋白とは異なり、その発現の内耳特異性が非常に高い遺伝子であることが判明した。さらに、内耳でのCochlin発現を検討するため、我々は抗Cochlin蛋白抗体を用いて免疫染色を行い内耳発現の局在を検討した。ラット過牛の染色ではアイソフォームp60はコルチ器を含めたより末梢側、p40は蝸牛軸まで及ぶより中枢側に発現を認めた。各アイソフォームごとの発現部位を前庭系を含めて更に詳細に検討している。対象組織としてラット、ヒト内耳を用いている。ヒト内耳組織切片は共同研究者であるスウェーデン・ウプサラ大学のRask-Andersen博士から供与され現在免疫染色は順調に進んでいる。さらに、今後COCH遺伝子の時期特異的発現の検討を行う。つまりラットを用いてその発生過程におけるCochlinの発現を免疫組織学的に検討する。

本年度の研究目的は、COCH遺伝子発現の発生過程の時期特異性の検討である。ヒトは胎生2025週で内耳はほぼ成人と同様の形態となるが、マウスやラットの内耳は出生直後まだ未成熟であり、生後1014日頃に完成することが知られている。今回はすべての抗Cochlinアイソフォーム特異的抗体の中でも、p63,44,40の全てのアイソフォームを認識する抗体(anti-vWF-A1 antibody, antigenic peptide;19-mer(KADIAFLIDGSFNIGQRRF)residues 163-181 in the vWF-A1 domain of Cochlin)を用い、ラットの蝸牛におけるCOCH蛋白の発現を生後3日目から成獣まで比較する免疫組織学的研究を行なった。使用動物;ウィスターラット、それぞれ生後3日目、6日目、10日目、24日目および成獣のラットを使用した。方法;固定は4%パラフォルムアルデヒドで(一晩)し、10%EDTAで脱灰処理を行なった(35日)。パラフィン包埋したブロックを作成、2μmの薄切切片を作成した。anti-vWF-A1antibodyを1次抗体としてABC法(DABによる発色)で免疫染色を行なった。結果;染色は主にラセン板縁およびラセン靭帯に認められた。コルチは弱く、ラセン神経節、血管条は染色されなかった。またラセン板縁は成長を通じ、染色の強さはあまり変わらなかったが、ラセン靭帯は24日以降の内耳で強く染まるようになった。また基底回転ほど濃く染色された。ラセン板縁、ラセン靭帯が染色されるという結果は従来の報告にあるDFNA9患者の側頭骨病理での変性部位と同様であり、やはりDFNA9の発症においてラセン板縁、ラセン靭帯が重要な箇所であると考えられた。今後COCH遺伝子の発現特異性を担うプロモーター領域の解析を行う。ヒトゲノム解析の結果を参考にしながら、ヒトgDNAにおけるCOCH遺伝子上流の遺伝子配列800bp程度を決定し、クローニングした。現在、転写に重要なエンハンサーの同定を行うため、トランスフェクシヨンを行う対象とする細胞の培養を行っている。Grabskiら(Cell Biology,アラバマ大学)はHeLaを用いて,Robertsonら(Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Harvard大学)は,293T(human embryonic kidney cells)を用いた。その結果,それぞれ細胞内には,63kDa,60kDaの1種類の蛋白のみしか検出されなかった。さらに遺伝子導入細胞lysateのみならず,その培養液の免疫沈降反応を行いかなり詳細に検討している。その結果得られたCochlin様蛋白は,それぞれ60,50kDaと69kDaであった。これらの結果は、我々がウシやヒトの内耳組織、外リンパを用いて解析した結果とは大いに異なる結果であった。
ミエロイド系樹状細胞とリンパ球系樹状細胞

本研究では、生体防御応答において獲得免疫ならびに自然免疫の誘導活性化における樹状細胞(DC)サブセットの機能とそれらの機能的成熟に関する検討を行い、以下の結果を得た。1)皮下あるいは皮内に蛍光標識したラテックス粒子を投与し、経時的に局所ならびに所属リンパ節における標識細胞の局所に誘導された貧食性細胞は単球であり、大半がそのまま皮内に残りマクロファージへと分化したが、約25%は所属リンパ器官のT細胞領域へと移動し、抗原提示機能を有するDCへと分化した。これらが炎症性応答により誘導された探究に由来し、表皮ランゲルハンス(LC)細胞由来でないことも確認された。2)ヒト末梢血にはCD11c/CD1の発現で区別される3種のDCが存在するが、そのうちCD11c^+CD1^+未熟DCはTGF-β1の天下により速やかにLCへと分化することが示された。3)リンパ球系DC前駆細胞であるCD11c^-CD2^-細胞が産生するIFN-α/βは、自らの分化を制御するだけでなく、ミエロイド系DCの活性化を抑制することが示された。また、IFN-α/β処理されたリンパ球系DはT細胞の活性化に際してIFN-γだけでなくIL-10産生を増強することが明らかになった。4)骨髄由来未熟ミエロイド系DCの外来性抗原のプロセッシングと提示には、活性化刺激が必須であり、活性化により速やかにMHC-ペプチド複合体がCD80/86などの共刺激分子と供に細胞表面へと輸送されることが示された。5)LCの定常状態におけるターンオーバーは他のDCに比べて遥かに緩やかであるが、それでも基底膜を通過して所属リンパ器官へと絶えず移動していることが明らかになった。6)リンパ器官T領域に分布するDCは定常状態においては、末梢免疫寛容を誘導することにより生体の恒常性維持に関与することが示された。強力な抗原提示細胞として知られる樹状細胞は、前駆細胞からの培養系が確立された結果、その分化に関して精力的な検討がなされており、分化経路や抗原提示細胞としての機能的成熟に関して多くの知見が蓄積されてきている。それに対して、生体内に分布する樹状細胞に関しては、樹状細胞として同定されるものについては、その機能や成熟段階に関して解析が進められているのみで、未熟な前駆細胞がどの様に誘導され、樹状細胞へと分化し、機能を獲得して行くのかに関してはあまり知られていない。そこで、本年の研究においては、マクロファージと同じ前駆細胞に由来するミエロイド系樹状細胞に焦点を当て、生体内での炎症応答に伴う誘導と機能に関する研究を行い、次に様な結果を得た。皮下あるいは皮内に蛍光標識したラテックス粒子を投与し、経時的に局所ならびに所属リンパ節における標識細胞の性状を検討したところ、局所に誘導された貪食性細胞は単球であり、大半がそのまま皮下に残りマクロファージへと分化することが示された。しかし、貪食細胞の約25%が所属リンパ器官のT細胞領域へと移動し、抗原提示機能を有する樹状細胞へと分化した。T領域に見られる標識細胞が局所から移動してきたものであり、粒子そのものが直接リンパ節に入りマクロファージによって捕食されたものでないことは異なる蛍光で標識したラテックス粒子を別の領域に投与することにより確認された。

また、炎症性応答により誘導された単球に由来することは、単球が減少しているop/opマウスや粒子投与直後に切り離した局所組織中に比較的多数の粒子を貪食す細胞が出現しないことにより、また、もっぱら組織内の未熟な樹状細胞にのみ由来するものでないことはFITC塗布によるリンパ節へと移動したランゲルハンス細胞との異動ならびに種々の細胞表面抗原の検討から示され、比較的未熟な細胞であることも明らかになった。樹状細胞は骨髄幹細胞に由来することが明かであり、それらはその前駆細胞からリンパ球系とミエロイド系という大きく2つの分化経路をもつと考えられている。本年は、マウス樹状細胞に加え、ヒト樹状細胞の機能にも注目し、それらの免疫応答における役割と性状を検討した。マウス樹状細胞はそのCD8陽性の細胞はリンパ球系に由来すると考えられており、実際に脾CD8陽性樹状細胞にはCD8mRNAが検出された。ところが、FITCを塗布した表皮ランゲルハンス細胞に由来するリンパ節樹状細胞もCD8を発現することが示された。また、GM-CSF存在下で誘導される骨髄由来樹状細胞においてもCD8蛋白の発現は認められなかったものの、mRNAが検出された。しかも、LPS投与によって赤脾髄樹状細胞が急速にT領域へと移動することが知られているが、これらの細胞にもCD8の一過性の発現上昇が認められた。一方、骨髄前駆細胞をFLT-3リガンド存在下で誘導される樹状細胞にはかなりに比率でCD8の発現が検出されるが、同時にGM-CSFを添加するとCD8の発現は消失した。これらの結果は、CD8の発現が必ずしも細胞分化の由来を示すものでないことを示唆していると考えられる。一方、ヒト末梢血樹状細胞はCD11cの発現によりそのサブセットが判定され、CD11c陰性の樹状細胞はTh2をCD11c陽性の樹状細胞はTh1を誘導することが明らかにされいる。また、前者はウイする感染に際し、多量のI型IFNを産生することが示されているが、本研究によりI型IFNは自らの成熟を抑制し、T細胞にIL-10の産生を誘導することに加え、CD11c陽性樹状細胞のCD40LやIFN-γによるT細胞応答のTh1への変更を阻害し、IFN-γだけでなく同時にIL-10をも産生する制御性T細胞への分化を促進することが明らかになった。これまでの多くの研究により強力な抗原提示細胞として知られる樹状細胞は、特異的免疫応答の誘導において必須の細胞であることが明らかである。接触過敏応答の誘導においても、表皮ランゲルハンス細胞が塗布されたハプテンを結合し、所属リンパ節へと移動し特異的免疫応答を誘導することが知られている。しかし、これまでの研究では、蛍光標識された樹状細胞に注目してきたため、表皮ランゲルハンス細胞と真皮樹状細胞がそれぞれどのような役割を担うのかが明らかではなかった。しかも、表皮ランゲルハンス細胞はリンパ球系樹状細胞との関連が、真皮樹状細胞は単球系(ミエロイド系)樹状細胞との類縁関係が推測されている。そこで、本研究では、表皮ランゲルハンス細胞に特異的に発現されるLangerinの発現を指標に、FITC塗布後の樹状細胞について、そのサブセットの存在を確認すると供にそれらの機能を検討することを目的に研究を行った。FITC塗布後、所属リンパ節に出現する陽性細胞の数的変化を検討した結果は、これまでの結果を確認するものであった。しかし、それらの表現型を調べたところ、CD11bの発現により大きく2つのサブセットが存在することが示された。しかも、CD11b弱陽性の集団はさらにLangerinの発現により2つの集団からなることが明らかになった。
中性アミノ酸トランスポーターの制御分子開発と機能解析

中性アミノ酸トランスポーターの一種であるアラニン、セリン、システイン輸送機構(alanine-serine-cysteine transporter, ASCT1,2)の阻害剤スクリーニングのためのハイスループットアッセイ系の開発のために、内因性のASCT1,2が高発現していないホスト細胞を検索した。そこでCHO細胞、HEK293細胞、3T3細胞等を用いて遺伝子レベル、タンパクレベルでの実験を実施したが、内因性のASCT1,2の発現量が高く、ASCT1,2のアッセイ用のホスト細胞としては不向きであることがわかった。しかしヒト型、ラット型ASCT1,2の遺伝子をクローニングし、哺乳類及びアフリカツメガエル卵母発現系に使用できるベクターに組み込みを完了した。中性アミノ酸トランスポーターは薬理学的に数多くの種類に分類できることが知られているが、その実体や輸送の詳細と制御機構には不明な部分が多い。しかし、アラニン、セリン、システイン輸送機精(alanine-serine-cysteine transporter,ASCT)については、比較的早い時期に2つのサブタイプ遺伝子(ASCT1,ASCT2)が単離されEAATとスーパーファミリーを形成していることが知られていた。しかしその生理的役割については、特異的阻害剤、作動物質が開発されていないことから未だ謎が多い。そこでASCT1,ASCT2のアッセイ系の確立のために、オレゴン健康科学大学のDavid Kabat教授、スペインナバラ大学Lostao教授からヒトASCT1,2のクローンを、横浜市立大学山本敏文准教授からラットASCT1,2のクローンをそれぞれ供与していただいた。遺伝子配列を確認したところ、David Kabat教授から供与されたヒトクローンはC末端側に欠損が認められた。Lostao教授から頂いたヒトASCT1については報告されている遺伝子配列であった。山本敏文准教授から頂いたラットのクローンについては遺伝子配列や動物細胞での発現がすでに報告されていたことから、まずラットASCT1,2のクローンを用いることにした。このクローンを阻害剤アッセイ系に用いるためには、内因性のASCT1,2が高発現していないホスト細胞を選ぶ必要がある。そこでガン化された培養細胞を用いてASCT1,2の発現を調べたところ、HEK293細胞には内因性のASCT1,2が比較的高い発現していることが認められ、発現用のホスト細胞には不向きであることが判明した。中性アミノ酸トランスポーターの一種であるアラニン、セリン、システイン輸送機構(alanine-serine-cysteine transporter, ASCT1,2)の阻害剤スクリーニング等のためのハイスループットアッセイ系の開発のためには、内因性のASCT1,2が高発現していないホスト細胞を選ぶ必要がある。平成19年度はガン化されたヒト細胞であるHEK293細胞を用いてASCT1,2の発現を調べたところ、HEK293細胞には内因性のASCT1,2が比較的高く発現していることが認められ、ASCT1,2の阻害剤スクリーニング系のホスト細胞には不向きであることが判明した。そこで最適なホスト細胞系を新たに探索するために、平成20年度はチャイニーズハムスターの培養細胞であるCHO細胞等を用いて実験を実施した。しかし、昨年度と同様に、いずれの培養細胞でも内因性のASCT1,2の発現量が高く、ASCT1,2のアッセイ用のホスト細胞としては不向きであることがわかった。そこで今後、(1)内因性のASCT1,2の発現量が低いホスト細胞の探索を継続して実施すること。(2)トランスフェクションしたラットASCT1,2のクローンの各種哺乳類細胞での発現量を確認すること。(3)アフリカツメガエル卵母細胞等のprimary細胞でのアッセイ系の検討。(4)電気生理学的なアッセイ系の検討等を継続して実施する必要がある。中性アミノ酸トランスポーターの一種であるアラニン、セリン、システイン輸送機構(alanine-serine-cysteine transporter, ASCT1, 2)の阻害剤スクリーニング等のためのハイスループットアッセイ系の開発のためには、内因性のASCT1,2が高発現していないホスト細胞を選ぶ必要がある。平成19年度、20年度はチャイニーズハムスターの培養細胞であるCHO細胞やHEK293細胞等を用いて実験を実施したが、内因性のASCT1,2の発現量が高く、ASCT1,2のアッセイ用のホスト細胞としては不向きであることがわかった。そこで平成21年度は、3T3細胞等で実験を行ったが、やはり内因性の中性アミノ酸の取り込み量が多かった。そこで実際にASCT1,2の発現量を調べるために、ASCT1,2のペプチド断片を化学合成し、抗体を作成しウエスタンブロットを行い内因性のASCT1,2の発現量を調べた。

その結果、CHO細胞、HEK293細胞、3T3細胞もいずれもタンパクレベルで内因性のASCT1,2の発現が認められ、ハイスループットアッセイ系には残念ながら用いることができないことが判明した。唯一、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いてASCT1,2のアッセイは用いることができるので、今後電気生理学的アッセイ系を併用してスクリーニングを実施する必要がある。さらに本年度、生物機能化合物ライブラリーからランダム化合物ライブラリーの供与を受け、スクリーニング実施に向けてインフラ整備を行った。