hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
物理的・心理的補聴器フィッティング法の確立

補聴器フィッテングにおいて、実用特性を測定する事は重要である。現在、国内外の多数のメ-カ-から、コンピュ-タを用いた測定装置が発表されている。今回の研究で、実耳特性を測定する上で、ブラインドに鼓膜面上にプロ-フチュ-ブを固定することは、危険を伴い易く、常に同一測定値を得るには、熟練を要することが判明した。伝声管は古くから使用されている道具である。電気特性では多くの共振点が存在し、周波数特性上、2KHz以上は急峻な減衰がある。然しながら、難聴者の殆どの人は電気補聴器に比較し、伝声管は聞きとり易い点で、評価された。淡音節受明瞭度は、電気補聴器の方が良い結果となったが、複音節、文章明瞭度等ではよい結果をえているので、更に検討を要する。ノイズインパルス聴力検査は、補聴器装洋状態の結果判定をより定量的に判定でき、補聴器調整が容易になった。この機種の検査音は、会話に準じたノイズを使用し、環境騒音付加下の快適域比較方である。補聴器調整は各個人の使用環境、使用目的を考慮することが最も必要といえる。3DM補聴器フィッテング方法は、3つのダイナミックレンジ(入力音、補聴器、聴覚)を基本とした方法である。総合的な満足度は75%と高い評価を得た。現在数多くの補聴器フィッテング方法がある。3DMは新しい調査法であり、他施設での追試が望まれる。本研究で2年間に渡って補聴器装用効果判定用のアンケ-トを作製し、実施した。最終硬化判定は装用者自身の感覚によるものである。32問からなる質問で最も高い満足度を反映する質問は「講演会での話が聞こえるか」という項目であった。難聴者が補聴器に期待することは、騒音下での話が理解できるということであろう。今後、騒音下での語音聴取能力を更に検討する必要がある。1.難聴者に対する"きんえ"についてアンケートを作製した.生活の全場面での詳細な項目にて,補聴器装用前,装用時について,アンケートを実施した.装用時における効果の判定は,装用者にとって様々であり,補聴器フィッティングの決定的な方法は,特に見い出なかった.この効果判定は,最終的には被装用者の感覚によるものであり,被装用者の難聴の程度,種類,年齢,使用環境及び補聴器に対する期待が異なっていたと考えられる.今年度はアンケートを整理し,被装用者の聴覚機能を中心に考え,レベル,周波数,雑音,過渡音,レクルート,時間分解能,コミュニケーション能力の各項目に分類し,補聴器装用評価法を確立する.2.難聴者に補聴器を仮調整し,音場検査とプローブチューブによる挿入利得を測定した結果, 50Hz,500Hzにて両者間に510dBの差を認めた.これはイヤモールドの密閉効果と考えられる.今後更に症例を増し,傾向を分析する必要がある.3.プローブチューブは太さ,外耳道内の固定位置によって耳内音圧に35dBの差が生ずる.挿入利得測定上無視できないレベルであり更に固定を工夫する必要がある.今後我々は,難聴者の時間分解能に関する基礎的検討,背景雑音下での語音聴取能力を検討する予定である.1.32問からなる補聴器装用効果判定用のアンケートを作製し、2年間に渡って実施した。補聴効果の最終判定は装用者自身の感覚によるものであるか、装用効果の満足度を最も反映する項目は、ある程度の騒音下での会話が理解できるかどうかの質問であった。

今後、騒音下での語音聴取能力の検討、異なった状況下における補聴器の使い分けを検討する必要がある。2.難聴者に補聴器を仮調整し、プローブチューブマイクによる挿入利得の測定、裸耳利得の測定は、危険を伴い、常に同一測定値を得るには、極めて熟練を要することが判明した。3.伝声管は周波数特性上、多くの共振点が認められ、2KH_z以上は急峻な減衰がある。電気補聴器に比較し、特性上は劣るが、聞き取り易い点で、評価された。単音節受聴明瞭度は、電気補聴器の方が良い結果となったが、複音節、文章明瞭度等では良い結果を得ている。今後、検査音リストでコンパクトディスクを使用して検討したい。4TR-60ノイズインパルス聴力検査は、補聴器装用状態の効果判定をより定量的に評価でき、補聴器調整は容易になった。検査音は、会話に準じたノイズを使用し、環境騒音下での快適域値比較方である。補聴器装用は、各個人のニーズに合わせ、機種選択、調整する必要がある。今後補聴器は動的に特性変化する機種を開発する必要がある。5.3DM補聴器フィッティング法は、3つのダイナミックレジン(入力音、補聴器、聴覚)を基本とした方法である。75%と高い装用満足度を得たフィッティング方法の1つである。新しい方法であり、今後更に他の施設での追試を期待したい。
機動的翻訳速度制御とtRNAレパートリー

意図された翻訳の停止/再開、すなわち機動的翻訳制御は新生鎖の機能化に関わる普遍的現象であることが、最近の研究で示されつつある。この制御は各tRNA種の濃度や量比、即ちtRNAレパートリーの影響下にあると考えられるが、tRNAレパートリーの変化が翻訳に及ぼす影響や、一時停止した翻訳の解除機構には不明な点が多い。本研究では、これらの点について、出芽酵母を用いた研究を進めた。まず我々は、各tRNA種の絶対量の新規定量法を開発した。これにより、富栄養培地で対数増殖中の酵母のtRNA種が、0.0300.73 pmol/μg RNAの範囲で存在することを明らかにした。酵母のtRNA量は各tRNA種の遺伝子数と高い相関を示すが、遺伝子当たりの発現量はtRNA種間で最大5倍の開きがあった。また、単位RNA当たりのtRNA量は定常期になると対数増殖期のおよそ1.63.8倍に増えていた。こうした事から、数倍程度という狭い幅で、生育環境に応じたtRNA種特異的な発現制御の存在が示された。次に、tRNAレパートリーの人為的制御を目的として、誘導型CRISPRiを利用したtRNAノックダウン系を構築した。tRNA-LeuUAGに対してこれを適用し、完全に対応したコドンのデコードよりゆらぎによるデコードの方がtRNA量低下に敏感であることを明らかにした。他方、機動的に翻訳されるmRNAとして近年明らかとなったモノソーム画分に集積する傾向のあるmRNA群のうち、特にミトコンドリアへ局在するタンパク質をコードしたmRNAに着目して解析を進めた。このうち、pumilioファミリーのRNA結合タンパク質Puf3依存にミトコンドリア表面に移行するmRNAでは、PUF3遺伝子の欠失でモノソーム集積が強まり、モノソーム状態から正常に翻訳が進むポリソーム状態への移行にPuf3が関わる事が示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。近年のribosome profiling等の網羅的解析で、意図された翻訳停止/再開、すなわち機動的翻訳速度制御は新生鎖の機能化に関わる普遍的現象である事が示されつつある。こうした新生鎖の伸長速度制御は、isodecoder tRNAの濃度や量比、即ち“tRNAレパートリー"の影響下にあると考えられる。しかし、真核細胞のtRNAレパートリーがin vivoでの翻訳に及ぼす影響を系統的に解析した例は無い。また、翻訳停止の機構はある程度明らかになっているが、停止した翻訳の解除機構にはまだ不明な点が多い。さらに、正常な翻訳停止状態が、No-Go Decay品質管理の対象となる異常な翻訳中断とどう区別されるかも判っていない。そこで、新生鎖の機能化に関わる機動的翻訳速度制御について、tRNAレパートリーという視点を含めた具体的研究目標を設定し、出芽酵母を用いた研究を展開する。本年度は1tRNAレパートリーの改変酵母株の作出と解析手段の構築、2モノソーム集積型mRNAの解析を中心に研究計画を進めた。1については、CRISPRiを利用したtRNA-Leu isoacceptorの条件ノックダウン系の構築と反復コドンレポーター系を用いた翻訳状態の解析、温度感受性tRNA変異の単離、系統的tRNA-TrpCCA同義遺伝子欠失変異株群の構築を進め、tRNAレパートリーの異なる様々な酵母株群を作出した。また、新規tRNA定量法によって、出芽酵母のtRNAレパートリーが培養条件(炭素源や生育ステージ)で変化する事を明らかにした。2については、モノソーム集積型と予想されたmRNAのうち、AIM17、MRPL16は、モノソームや少数のリボソームが結合した翻訳状態にあることを確認した。さらには、機動的翻訳停止状態にあるHAC1 mRNAの翻訳抑制に、細胞質エキソソームが関わる事を明らかにした。当初予定した様々なtRNAレパートリーをもつ酵母株が作出できており、また、解析対象であるtRNAに関わるコドン反復レポーター系も多数構築できている。ただし、tRNAのノックダウン条件下や温度感受性tRNA変異の制限温度下では、総タンパク質の発現パターンに影響が出ているものの、翻訳低下を単なるコドン反復レポーターでは敏感に検出し難いことが判った。対応するtRNA量の低下した状態での特定のコドンのデコードはmRNAのコンテクストに敏感である可能性がある。また、モノソーム集積型と予想されたmRNAについても、モノソームだけに集積していると言うより、mRNA長からは予想される数に比べてごく少数のリボソーム(13個)に依存した翻訳状態がある事が判った。こうした研究の進捗に伴い明らかになった事実は、以降の研究計画に生かして研究展開を図る。酵母のtRNA

量は各tRNA種の遺伝子数と高い相関を示すが、遺伝子当たりの発現量はtRNA種間で最大5倍の開きがあった。また、単位RNA当たりのtRNA量は定常期になると対数増殖期のおよそ1.63.8倍に増えていた。こうした事から、数倍程度という狭い幅で、生育環境に応じたtRNA種特異的な発現制御の存在が示された。次に、tRNAレパートリーの人為的制御を目的として、誘導型CRISPRiを利用したtRNAノックダウン系を構築した。tRNA-LeuUAGに対してこれを適用し、完全に対応したコドンのデコードよりゆらぎによるデコードの方がtRNA量低下に敏感であることを明らかにした。他方、機動的に翻訳されるmRNAとして近年明らかとなったモノソーム画分に集積する傾向のあるmRNA群のうち、特にミトコンドリアへ局在するタンパク質をコードしたmRNAに着目して解析を進めた。このうち、pumilioファミリーのRNA結合タンパク質Puf3依存にミトコンドリア表面に移行するmRNAでは、PUF3遺伝子の欠失でモノソーム集積が強まり、モノソーム状態から正常に翻訳が進むポリソーム状態への移行にPuf3が関わる事が示された。前述の様に、特定のtRNA量の低下に基づく翻訳状態の検出法について改善が求められることに加え、モノソーム集積型と予想されたmRNAについて、むしろ、リボソームのローディングが極端に遅いmRNAと捉えて、解析を進める必要が明らかとなっており、この点を考慮して研究計画を進める。ただし、こうした事実に伴う大きな研究計画の変更は必要ではなく、新たな特定のコドン翻訳レポーター系の設計・構築を除けば、当面、所定の計画を進めることで、tRNAレパートリーが機動的翻訳制御を通じてプロテオーム形成にどう影響するかの検討を推し進める。また、H30年度に新たに加わる第3点目の研究項目である機動的翻訳とmRNAの品質管理との関係に関しても、H29年度に構築したtRNAレパートリー改変株などを有効に利用して予定通りプロジェクトを進行させる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
単原子膜合成技術の新開発と導電性原子膜材料の創製

ナノシートは、特異な2次元ナノ構造に起因する高い比表面積や、面内方向の高伝導性、電極反応の高速性などを有し、最も注目される材料群である。中でも、金属や金属酸化物ナノシートはグラフェンには無い様々な機能を有する魅力的な伝導性材料になりうる。研究代表者は単層ナノシートをボトムアップ合成する手法を独自に開発しており、従来の層状化合物の剥離手法の適応が困難な材料のナノシート化に成功している。本研究では、この手法を高い導電性を発現することが期待される金属や導電性酸化物に適応し、単層ナノシート化を狙う。これにより、グラフェンには無い機能を有する導電性ナノシートを創出し、ナノシートの新しい潮流を生み出す。
森林資源の持続的利用技術と基盤整備

天然林択伐施業の現地を調査し,施業方法と収穫規正、収穫作業方法および,蓄積、成長量などの林況を調査した。森林の林内気象を調査し、林況の違いが気象環境に及ぼす影響を把握した。択伐収穫作業モデルを検討した。作業のバラエティーを表現することを検討した。林況の違いによる、収穫作業が林況に与える影響の違いを表現するモデルについて検討した。作業に使用する車両の大きさと、林況に及ぼす影響について調査検討した。森林を利用する基盤としての林内路網のあり方について、施業実験を通して実証的に検討した。天然林における択伐素材生産作業システムを,森林資源の持続的利用を可能とする条件について,作業仕組み,路網の整備の仕方・量的な基準について検討した。とくに、全幹状態で集材する作業システムでは、集材作業のきめ細かな設計と管理によって,林況の撹乱程度を抑え,残存木の支障を少なくすることが必要であると考えられた。適切に車両作業を設計管理することによって、車両が中型ほどの大きさであっても、森林の攪乱は小さく抑えることができ、さらに車両のグラップル機構によって作業能率も向上させうることがわかった。作業林地の傾斜程度に対応した、適切な作業規制について検討した。緩傾斜地、急傾斜地においては、小径後継樹の消失が多く、車両走行路の適切な誘導、規制方法が必要であると考えられた。人工林においても、機械作業技術を基にした森林利用基盤の整備を展開することによって、森林の質を効率的に向上することが期待できる。天然林施業の現地を調査した.施業方法と収穫作業方法及び,蓄積などの林況を調査した.林況、作業方法の異なる森林を見いだし調査した.調査結果に基づいて,森林収穫モデル,収穫作業モデルを作製した.モデルを用いて,林況,作業方法の違いによって創成される林況の違いを検討した.現地調査によると,択伐率が小さい場合には,土場当りの集積材積を適切にしないと集材対象林地が大きくなって、長距離の集材作業による立木の損傷が大きくなり,きめ細かな森林資源の利用と林況の保全を目指した森林施業が,結果として森林を大きく撹乱する場合があることが把握された.すなはち,森林の持続的利用における施業では,森林の自律的な更新,保全能力と,立木資源の収穫量や収穫される立木の質,位置とを適切に妥協させることはもちろん,収穫作業における林況の撹乱程度を考慮した作業システムやその規模に関しても妥協させることが必要である.調査地においては,高密度に林道が開設整備されているところもあったが,森林資源利用の基盤としての林道も,資源利用作業における森林環境,状況への影響を抑えるように利用されることが必要であって,林道網の機能として,素材生産作業においていかなる作業システムが構築可能であるかということはもちろん,林況の保全のために適切な作業システムにおいて有効な林道網の密度(量)と配置(質)について検討する必要があると考えられた.森林の持続的な利用には,立木蓄積などの量的水準での評価のみならず,健全な森林の更新機能の維持という観点からの質的水準の高さを維持することが必要であり,資源利用技術としての択伐作業と利用基盤としての林道ならびに作業システムが,環境撹乱の許容量範囲内のおいて,森林の成長,更新を可能とするように協調実現されることが必要である.これらの数量的な把握とモデル化を継続して進める.天然林施業の現地を調査し,施業方法と収穫規正,収穫作業方法および,蓄積,成長量などの林況を調査した.林況,作業方法の異なる林分において,追加調査した.森林成長モデルを検討し,修正・改良した.再現性や森林の種の多様性を表現することを検討した.収穫作業モデルを検討し,修正・改良した.再現性を高めると同時に作業のバラエティーを表現することを検討した.仁多見,山本,小林が共同して現地調査を行った.仁多見は収穫作業モデルを修正した.

森林成長モデルと収穫作業モデルによる模擬実験を行うとともに,モデルの評価,作業と林況について評価検討した.山本は森林成長モデルを修正した.小林はシステムの異なる作業に対して適切な作業道の整備の仕方について数値模擬実験によって検討した.天然林における素材生産作業システムを,森林資源の持続的利用を可能とする条件について,作業仕組み,路網の整備の仕方・量的な基準について検討した.とくに,全幹状態で集材するシステムでは,集材作業のきめ細かな設計と管理によって,林況の攪乱程度を抑え,残存木の支障を少なくすることが必要であると考えられた.天然林択伐施業の現地を調査し,施業方法と収穫規正、収穫作業方法および,蓄積、成長量などの林況を調査した。林況、作業方法の異なる林分において、追加調査した。択伐収穫作業モデルを検討し,修正・改良した。再現性を高めると同時に作業のバラエティーを表現することを検討した。林況の違いによる、収穫作業が林況に与える影響の違いを表現するモデルについて検討した。作業に使用する車両の大きさと、林況に及ぼす影響について調査検討した。天然林における択伐素材生産作業システムを,森林資源の持続的利用を可能とする条件について,作業仕組み,路網の整備の仕方・量的な基準について検討した。とくに、全幹状態で集材する作業システムでは、集材作業のきめ細かな設計と管理によって,林況の撹乱程度を抑え,残存木の支障を少なくすることが必要であると考えられた。適切に車両作業を設計管理することによって、車両が中型ほどの大きさであっても、森林の撹乱は小さく抑えることができ、さらに車両のグラップル機構によって作業能率も向上させうることがわかった。作業林地の傾斜程度に対応した、適切な作業規制について検討した。緩傾斜地、急傾斜地においては、小径後継樹の消失が多く、車両走行路の適切な誘導、規制方法が必要であると考えられた。
水を電子源とした二酸化炭素の還元反応のための高品質微結晶光触媒の開発

地球環境維持と代替炭素資源確保の観点から,二酸化炭素を有用な化学物質に変換できる人工光合成を実現させることは重要である.我々は銀添加酸化ガリウム光触媒を用いて水を電子源として二酸化炭素を一酸化炭素に還元することに成功したが,さらなる高効率化のため以下の作業仮説を立てた.すなわち,半導体の光励起により結晶内部に生成する正孔電子対が別々にある特定面に向かい移動すれば,正孔電子対の再結合が抑制され,還元・酸化反応の逆反応もより抑制され,さらには,それぞれの反応場に適した助触媒が選択的に添加されていればより高効率に反応を進行させられると考えた.そこで,特定の結晶面が露出し酸化面・還元面が区別される高品質な微結晶を合成し,それぞれに適した助触媒を添加した高度に構造制御された光触媒を設計することとした.その手段として,形状制御された単結晶の合成に使われる溶融塩法(フラックス法)を利用した.本年度は,チタン酸ナトリウムやチタン酸カリウム,チタン酸カルシウムを様々な条件で合成し,条件を選べば,チタン酸ナトリウムやチタン酸カリウムでは角柱状微結晶,チタン酸カルシウムでは多面体微結晶を得ることができることがわかった.これらの微結晶光触媒に銀助触媒を添加し,微結晶や助触媒の構造・状態と光触媒活性を比較検討した結果,これらの系で共通して,微結晶の大きさが大きいほど光触媒活性が高いことを見出し,助触媒となる銀の添加率が高いほど一酸化炭素生成速度が高いことが見いだされた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。環境・資源の観点から,二酸化炭素を有用な化学物質に変換できる人工光合成は重要である.申請者らは銀添加酸化ガリウムを用いて水を電子源とした二酸化炭素の光触媒還元反応において,一酸化炭素と水素と酸素に変換することに成功した.さらなる高効率化のための作業仮説として,半導体の光励起により結晶内部に生成する励起電子と正孔がそれぞれにある特定面に向かい移動すれば再結合が抑制され,還元・酸化反応の反応場が物理的に分離されていれば逆反応も抑制でき,それぞれの場に適した助触媒が選択的に添加されていればさらに高効率に反応が進行すると考えた.そこで表面が特定の結晶面で構成され酸化面・還元面を明白に区別できる高品質な微結晶を合成し,それぞれに適した助触媒を添加した高度に構造制御された光触媒を設計することを目的として,形状制御された単結晶合成に使われる溶融塩法を応用した方法で,チタン酸ナトリウムやチタン酸カリウム,チタン酸カルシウムを合成した.その結果,条件を選べば,チタン酸ナトリウムやチタン酸カリウムでは六角柱状結晶,チタン酸カルシウムでは多面体結晶といったように,それぞれに目的のような形状制御された微結晶を得ることができた.これらの半導体光触媒に銀助触媒を添加し,微結晶や助触媒の状態と光触媒活性を比較検討し,構造活性相関に関する知見を得た.特に,微結晶の表面構造は,銀助触媒の安定性に関与し,長時間の触媒活性の維持に役立つことが示された.地球環境維持と代替炭素資源確保の観点から,二酸化炭素を有用な化学物質に変換できる人工光合成を実現させることは重要である.我々は銀添加酸化ガリウム光触媒を用いて水を電子源として二酸化炭素を一酸化炭素に還元することに成功したが,さらなる高効率化のため以下の作業仮説を立てた.すなわち,半導体の光励起により結晶内部に生成する正孔電子対が別々にある特定面に向かい移動すれば,正孔電子対の再結合が抑制され,還元・酸化反応の逆反応もより抑制され,さらには,それぞれの反応場に適した助触媒が選択的に添加されていればより高効率に反応を進行させられると考えた.そこで,特定の結晶面が露出し酸化面・還元面が区別される高品質な微結晶を合成し,それぞれに適した助触媒を添加した高度に構造制御された光触媒を設計することとした.その手段として,形状制御された単結晶の合成に使われる溶融塩法(フラックス法)を利用した.本年度は,チタン酸ナトリウムやチタン酸カリウム,チタン酸カルシウムを様々な条件で合成し,条件を選べば,チタン酸ナトリウムやチタン酸カリウムでは角柱状微結晶,チタン酸カルシウムでは多面体微結晶を得ることができることがわかった.これらの微結晶光触媒に銀助触媒を添加し,微結晶や助触媒の構造・状態と光触媒活性を比較検討した結果,これらの系で共通して,微結晶の大きさが大きいほど光触媒活性が高いことを見出し,助触媒となる銀の添加率が高いほど一酸化炭素生成速度が高いことが見いだされた.26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画したとおり,溶融塩法を応用した合成方法で,形状制御された微結晶光触媒を得ることに成功し,構造と光触媒活性との相関は整理されつつあるため.今後は,光触媒の合成のパラメータをさらに検討し高活性化めざしつつ,構造活性相関をさらに整理する.また,表面修飾による塩基性の付与なども試みる.
フィンガ-プリント法による有機塩素化合物の地下水汚染源分布図の作成

1.汚染分布図の作成予備調査で特定したテトラクロロチレン(以下TCE)による地下水汚染地区10mメッシュに区切り、123ヵ所に活性炭の特製ガスコレクタ-を地下30cmに埋設し、1週間後に回収、分析した。(1)原発汚染源と思われる地点から地下水流に沿って高い捕集量を示す地点が散在する詳細な汚染分布図を作成することができた。(2)TCEの滞留地点は極めてスポット的であった。(3)地下水脈中TCEは揚水ポンプの稼動によって引き寄せられているようであった。2.地下水中TCE濃度とガスコレクタ-による捕集量との相関(1)汚染井戸12ヵ所について夫々の周辺34ヵ所にガスコレクタ-を埋設し、TCEの捕集量と井水中濃度の相関をみた結果、両者に有意の相関がみられた。(2)従って特定井戸についてこの両者の関係をみておけば、他の地点における捕集量からその地点の地下水濃度ひいては滞留場所の特定、相対的な滞留程度を推定することが可能であることが分った。3.捕集法の検討土壌ガスの直接採取法、土壌のヘッドスペ-スガスクロマトグラフ分析法を検討したが、今回の活性炭吸着法が感度、濃度変動の平均化等種々の面で優れていると思われた。なお、水中底土に集積したTCEを測定するにはヘッドスペ-ス法が優れていた。
高分子結晶工学に基づく分子設計ならびに高分子構造制御

1,3-ジエンモノマーのトポケミカル重合に都合のよい分子配列をデザインし、ポリマーの分子量や分子量分布および立体規則性などの一次構造だけでなく、結晶構造の制御も含めたトポロジー的に制御された高分子材料の設計を目指した。まず、重合設計を行なうために、モノマー結晶のX線構造解析の結果より、重合に最適の条件を導き、結晶中での分子間相互作用の影響を調べた。水素結合によるネットワークやCH-π相互作用などの弱い相互作用が分子配列にどのような影響を及ぼしているかの考察を行ない、得られた結果をもとに、分子間相互作用を積極的に利用し、重合に適した分子配列の設計を行ない、二次元や三次元に構造制御されたラダーポリマーやダイヤモンド型ポリマーの構築を試みた。さらに得られたポリマーはこれまでに見られない特性や物性があると期待できることから、キャラクタリゼーションや固相反応機構の考察を試みた。重合に最適な条件を導くことによって、結晶中での分子配列をデザインし、高次元に構造制御されたポリマー合成試みた。まず、2D構造を持つポリマーの構築を行なった。すでに、二官能モノマーであるジソルビン酸ジアンモニウムによるラダーポリマーを得ることに成功していることから、さらにシートポリマーのような2Dポリマーの設計を行なった。反応部にムコン酸を用いリンカー部としてジアミンを用いることによって、多官能なアンモニウム塩モノマーの構造を分子設計し、トポケミカル重合によって二次元に構造制御されたシートポリマーを合成した。また、モノマー分子の分子間相互作用を利用し、結晶中における反応部位のスタッキング様式をデザインした。EZ-ムコン酸誘導体の並進型スタッキングと交互型スッタキングしたモノマー結晶のトポケミカル重合によって、それぞれ、新たな立体規則性ポリマーを合成した。これにより、ムコン酸誘導体の重合によって得られる可能な4種類すべてのポリマーの立体規則性ポリマーを得た。1,3-ジエンモノマーのトポケミカル重合に都合のよい分子配列をデザインし、ポリマーの分子量、分子量分布、立体規則性などの一次構造だけでなく、結晶構造の制御も含めたトポロジー的に制御された高分子材料の設計を行なった。水素結合ネットワークやCH-π相互作用などの弱い相互作用が分子配列にどのような影響を及ぼしているかの考察を行ない、得られた結果をもとに、分子間相互作用を積極的に利用し、重合に適した分子配列の設計を行ない、二次元や三次元に構造制御されたラダーポリマーやダイヤモンド型ポリマーの構築を試みた。さらに、得られるポリマーはこれまでに見られない特性や物性があると期待できることから、キャラクタリゼーションや固相反応機構の考察を試みた。ジエンモノマーであるソルビン酸アンモニウム誘導体の固相反応において、トポケミカル重合に都合のよいモノマー分子のスタッキングの条件を導きだし、分子配列を意図的にデザインすることを目的として、モノマーの単結晶X線構造解析の結果をもとに詳しい考察を行なった。反応部であるソルビン酸部分の炭素-炭素間距離や分子のスタッキング距離、また二方向から見た分子の傾きから重合するのに最適な条件を導いた。さらに、結晶工学の観点から水素結合が分子の配列に及ぼす影響を探求するため、水素結合パターンを分類し、重合に適した水素結合ネットワークを構築するための最適な官能基を導入した分子構造を設計し、ナフタレン環などの芳香環のスタッキングに際して、CH-π相互作用が重要であることを指摘した。また、重合反応の設計に欠かせない重合過程の反応機構を解明するため様々な条件下で重合を試み、光重合だけでなく熱による重合開始も可能であることを新たに見出した。EZ-ムコン酸誘導体の並進型スタッキングと交互型スッタキングしたモノマー結晶のトポケミカル

重合によって、それぞれ、新たな立体規則性ポリマーを合成した。これにより、ムコン酸誘導体の重合によって得られる可能な4種類すべてのポリマーの立体規則性ポリマーを得た。
運動による認知症予防メカニズムの解明

認知症は、超高齢社会の本邦において大きな社会問題の一つであるが、根本的治療法は解明されていないため、いかにして認知症発症を防ぐか、あるいは進行を抑制するかが重要である。特に生活習慣病との関連性は疫学研究でも明らかとなっており、発症前の生活習慣改善は認知症予防に多いに有効と考えられる。申請者はこれまで、運動による認知症予防メカニズムを、運動に伴い発現が促進するタンパク質に着目し、アルツハイマー病原因タンパク質のアミロイドβに対して抑制効果を発揮する事を明らかにする。更に動物を用いて、運動が認知症病態に対して予防、抑制効果を与える根拠、それに基づく早期運動介入やスクリーニングの意義を明らかにする。認知症は、超高齢社会の本邦において大きな社会問題の一つである。しかしその根本的治療法は解明されていないため、いかにして認知症発症を防ぐか、あるいは進行を抑制するかという早期治療に重点が置かれている。特に生活習慣病との関連性は大規模疫学研究でも明らかにされており、発症前からの生活習慣改善は認知症予防に多いに有効と考えられる。申請者これまでに、運動による認知症予防メカニズムを、分子生物学的手法を用いて検討してきた。その中で、運動に伴い発現が促進するタンパク質に着目し、このタンパク質がアルツハイマー病原因タンパク質のアミロイドβに対して抑制効果を発揮する事を明らかにした。このメカニズムを動物、さらにはヒトにも発展させることで、運動が認知症病態に対して予防、抑制効果を与える根拠、またその根拠に基づいた早期運動介入やスクリーニングの意義を明らかにする事を目的とする。これまでの培養細胞を用いた研究結果より、着目した運動関連タンパク質XはAD病理に対して抑制効果を発揮した。申請者はこの研究結果をマウス、ヒトに発展させて検証する。一つ目は、ADモデルマウスに対してAD病理変化を呈する前に運動負荷を行い、原因タンパク質に対する抑制効果を対照群と比較する。また空間学習記憶に対する効果についても比較検証する。本研究で着目しているタンパク質Xは細胞膜貫通型タンパク質であり、酵素切断を受ける事で分泌型となって血中へと放出される。そこで、バイオマーカーとしての有用性を検討するために、AD患者や健常者の血液サンプルを用いて比較検討を行う。更に、既存のADバイオマーカーや、運動習慣を始めとした患者の生活習慣に関わるデータとの相関関係についても検証する。本研究では、マウスの使用、ヒト検体を用いることとしており、複数の群で比較検討することから、必要なn数を集めるために時間を要する。特にマウスの実験に関しては、適切なジェノタイプを持つマウスをセレクトする必要があり、行動実験による認知機能を適切に評価できるよう、条件検討に時間を要した。昨年度の条件検討において、最終的な条件を概ね決定することができたと考えている。ヒトの検体を用いた実験では、n数を多く集めることができたが、AD群と対照群との間に、目的タンパク質の有意な差は見られなかった。しかしその根本的治療法は解明されていないため、いかにして認知症発症を防ぐか、あるいは進行を抑制するかという早期治療が重要である。中でも運動の効果は近年非常に注目されている。運動は認知症に限らず、脳機能そのものに対してポジティブな効果を発揮することが報告されており、あらゆる生活習慣の中でも認知症予防度と最も相関率が高いことが、疫学調査で示された。申請者は、運動による認知症予防メカニズムを、分子生物学的手法を用いて検討した。運動に伴い発現が促進するタンパク質に着目し、アルツハイマー病原因タンパク質のアミロイドベータに対して抑制効果を発揮する事を明らかにした。これは培養細胞系を用いた実験によって明らかにされた。この現象が動物においても確かであることを証明する必要があり、また運動という非薬剤療法の特徴を生かした方法でも同様の現象が見られるのかを確認する必要がある。そこで、このメカニズムを動物やヒトに発展させることで、運動が認知症病態に対して予防、抑制効果を与える根拠、それに基づく早期運動介入やスクリーニングの意義を明らかにする検討を行っている。現在は、マウスに運動介入を行うことで、認知機能障害やアルツハイマー病理にどのような変化が起こるのかを検討している最中である。マウス実験をメインに進める予定である。アルツハイマー病は、正確にその病態を反映できているモデルマウスがまだ作製されていないこともあり、脳内での分子的変化と、表現型として現れる認知機能変化や行動異常等にばらつきがあるモデルもある。

本実験で使用するモデルマウスには、認知機能障害を呈するとされる時期に生活習慣介入を行っても、認知機能や行動異常といった最も検討したい項目で差が見えづらいため、悪い生活習慣(今回は高脂肪食摂取で検討)を組み込むという条件で実験を行い、生活習慣の改善による効果を評価していく予定である。使用するADモデルマウスは、生後4.5ヵ月齢で脳実質のAβ沈着を認める事が知られている。よって申請者は、生後2ヵ月齢から高脂肪食負荷を開始し、介入終了後にマウス脳のAβ沈着量の定量化を行う。この実験から、運動介入という生活習慣の改善によってAβ蓄積に対する予防効果が発揮されるかどうかを検証する。以上の1.2.の実験より、運動により変化するタンパク質XのレベルとAβ沈着の定量的データを求め、両者の相関関係を検討する。上記の条件で介入を行った上で、通常ならばADモデルマウスが学習記憶障害を呈する時期(7ヵ月齢)に行動解析を行う事で、運動介入による学習記憶障害の予防効果を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。在宅医療看護学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒトパピローマウイルス感染と発がん　―臓器横断的解析ー

中咽頭扁平上皮癌(OPC)は、HPV関連がんと喫煙や飲酒などによるHPV非関連がんに大別され、HPV関連がんの方が放射線療法や化学療法の感受性が高く予後良好なことが判明した。近年では、HPV関連がんのバイオマーカーであるP16免疫組織化学(IHC)結果が陽性か陰性かで異なる病期分類が用いられている。生検と手術検体のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック(FFPE-B)が揃っている36例のOPCを1生検、2手術検体のFFPE-BからのTMA(2mm径、1か所)、および3TMAに用いた元のFFPE-Bの3群とし、P16 IHC、HPV DNA検査、P53IHC、p53変異(exon510)を検索した。P16IHCは、34/36例(94.4%)で3群間が一致し、陽性38.9%、陰性55.6%。1と3が一部陽性で2が陰性2.8%。1が一部陽性で2と3が陰性2.8%であった。P53IHCでは、35/36例(97.2%)で3群間が一致し、陽性33.3%、陰性16.7%、Wild type44.4%、核と細胞質に弱陽性2.8%。1が陽性で2と3がWild type2.8%であった。1と2で施行したHPV ISHは全例で一致し、陽性27.8%、陰性72.2%。ISH陽性の10例は全例P16IHC陽性、ISH陰性の26例は76.9%がP16IHC陰性。3検体を用いたp53は34例で変異検索ができ、IHCで核に陽性の8/10例、陰性の2/6例で変異を認め、斑状所見のWild type判定の16/16例では変異は認めなかった。核と細胞質が弱陽性の1例には、ナンセンス変異を検出した。OPCのがん組織内では、P16、P53IHCは均一な例が大半を占め、TMAによる採取部位の差異は生じ難い(ヘテロは約5%)。P53IHC判定は上記の3分類とすることが肝要である。【方法】MSCC119例を対象として、年齢、男女比を調べた。HPVの検出と型判定は、生検パラフィンブロックを用いてLAMP法(クリニチップHPV)とNested PCR法(HPV16型と18型のHPV E6を検出)、およびISH法で局在を確認し総合的に判定した。また、HPV陽性がんに共通した病理組織学的特徴を調べた。【結語】MSCCの62%がHPV+がんで16型の検出率が高く85%を占めていた。ECACはHPV陽性がんの極めて有用なバイオマーカーとなる。平成27年度科学研究費助成事業の追加採択分として新たに交付内定通知が、平成27年10月21日付でいただきました。さらに研究代表者は、内定通知受理以前の平成27年9月1日付で所属する研究機関が公益財団法人がん研究会がん研究所病理部より北里大学医療衛生学部に変更になったため、早急に体制を整え研究実施始動に尽くしましたが、このような止むを得ない事情により、進捗状況区分は「やや遅れている」となりました。【方法】MSCC 119例を対象として、年齢、男女比を調べた。HPVの検出と型判定は、生検パラフィンブロックからDNAを抽出し、Loop-Mediated Isothermal Amplification法(クリニチップHPV)、HPV16型と18型のHPV E6を検出する各プローブを用いたNested PCR法、およびHPV DNAプローブを用いたin situ hybridization法で局在を確認し総合的に判定した。【結果】MSCCのHPV陽性がんは74例62%、HPV陰性がんは45例38%であり、HPV陽性がんは男性が女性の3.9倍、HPV陰性がんでは14倍であった。平均年齢はHPV陽性がんは、男性58歳、女性69歳であるのに対し、HPV陰性がんでは男性65歳、女性67歳であった。検出されたHPV型は、16型:85%、35型:5%、18型:4%、58型:3%、33型:1%、および複数型:2%であった。特殊な異常核分裂像であるEctopic chromosome around centrosome (ECAC)は、HPV陽性がんの70%に認め、HPV陰性がんでは0%であった(P<0.001)。【結語】MSCCの62%がHPV陽性がんで、16型が85%を占めていた。ECACは、HPV陽性がんの極めて有用なバイオマーカーとなる。【今後の展開】臓器横断的に解析を進めていく。平成27年年度科学研究費助成事業の追加採択分として、平成27年10月21日付で交付内定通知をいただき、また研究代表者の所属機関が、平成27年9月1日に公益財団法人がん研究会がん研究所病理部から北里大学医療衛生学部に異動した状況であったため、体制を整え研究を開始したのが平成28年度の中旬となった関係で、進捗状況は「やや遅れている」という状態です。

子宮頸部病変の病理組織診断は、これまでの扁平上皮内病変の3段階診断が、2017年7月発刊の子宮頸癌取扱い規約第4版で、扁平上皮内病変(Squamous intraepithelial lesion:SIL) Low-grade (軽度異形成)とHigh-grade (中等度異形成上皮内癌)の2段階分類となった。診断の一致率は向上する反面、過剰診断・治療が危惧される。判定基準の曖昧な異型未熟扁平上皮化生や萎縮扁平上皮異型病変にもHPVが関与しているが、高リスク型のHPV感染病変および進行する病変の特徴を踏まえた診断が望まれる。長期経過観察結果からは、高リスク型HPV病変に特異的に出現する傍中心体異所性染色体(Ectopic chromosome around centrosome:ECAC)と核分裂像数が、進行リスクの高い病変の良い指標になることを検証しつつある。浸潤癌では、神経内分泌癌が腺癌より更に18型の検出率で高いことを明らかにした。中咽頭癌は、HPV関連がんは、非関連がんよりも治療感受性が良いことが、我々の研究および国内外から報告され、現在ではHPV関連がんのバイオマーカーであるp16免疫染色が病理組織診断に取入れられるようになった。119例の解析では、62%がHPV関連がんで、男性のHPV関連がんの平均年齢は58歳で非関連がんよりも7歳若かった。また男性の非喫煙者の扁平上皮がんは全てHPV関連がんであった。眼とその近傍部原発の扁平上皮がん24例を解析した。HPV関連がんは、約20%で全てにECACを認めた。眼科領域のがんは稀少ではあるが、HPV関連がんの治療感受性が中咽頭がんと同様に高いことが予測される。強度変調放射線治療(IMRT)と化学療法で、眼の機能温存・QOLの向上を目指すために、HPV関連がんの判別が重要となる。2015年(平成27年)度の科学研究費助成事業の追加採択分として、2015年(平成27年)10月21日付で交付内定通知をいただき、また研究代表者(古田玲子)が2015年(平成27年)9月1日に公益財団法人がん研究会がん研究所病理部から北里大学医療衛生学部に異動したため、研究体制を整えて実際に研究を開始したのが2016年(平成28年)度の中旬となった関係で、最終年の2017年(平成29年)度までの実質研期間が2年足らずとなり、研究を遂行するための期間延長が必要となりました。現在、計画通り研究が進んでおり1年延長で研究成果が得られる見込みです。中咽頭扁平上皮癌(OPC)は、HPV関連がんと喫煙や飲酒などによるHPV非関連がんに大別され、HPV関連がんの方が放射線療法や化学療法の感受性が高く予後良好なことが判明した。近年では、HPV関連がんのバイオマーカーであるP16免疫組織化学(IHC)結果が陽性か陰性かで異なる病期分類が用いられている。生検と手術検体のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック(FFPE-B)が揃っている36例のOPCを1生検、2手術検体のFFPE-BからのTMA(2mm径、1か所)、および3TMAに用いた元のFFPE-Bの3群とし、P16 IHC、HPV DNA検査、P53IHC、p53変異(exon510)を検索した。P16IHCは、34/36例(94.4%)で3群間が一致し、陽性38.9%、陰性55.6%。1と3が一部陽性で2が陰性2.8%。1が一部陽性で2と3が陰性2.8%であった。P53IHCでは、35/36例(97.2%)で3群間が一致し、陽性33.3%、陰性16.7%、Wild type44.4%、核と細胞質に弱陽性2.8%。1が陽性で2と3がWild type2.8%であった。1と2で施行したHPV ISHは全例で一致し、陽性27.8%、陰性72.2%。ISH陽性の10例は全例P16IHC陽性、ISH陰性の26例は76.9%がP16
テレマイクロサージェリにおける操作者の意図理解と情報変換型操作環境伝送の研究

本研究では本年度は、約700km離れた場所にオペレーション・ルームとサージェリ・サイトとを置き、遠隔操作によって直径約1mmの人工微細血管の縫合を試みた。具体的には、東京大学をオペレーション・ルームとし、岡山県に存在する国際会議場の一室をサージェリ・サイトとして実験を行った。両サイト間はプロバイダの提供するインターネットで結合され1.5Mbpsのスルー・プットを有する。術者が操作する左右両手用のマスタ・マニピュレータに入力された位置、および、角度情報はリアルタイムOSを搭載した実時間制御用コンピュータからル-タ、インターネット、サージェリ・サイト側のル-タ、実時間制御用コンピュータを介し、左右両手のスレーブ・マニピュレータに送られる。一方、サージェリ・サイトに存在する可動型顕微鏡からの映像はコ-デック、サブネット、ル-タ、インターネット、オペレーション・ルーム側ル-タ、コ-デックを介して可動型液晶ディスプレイに送られる。また、スレーブ・マニピュレータの先端鉗子部に組み込まれた多軸力センサからの情報は聴覚情報に変換され、上記の映像情報と同じルートを介してオペレーション・ルームのスピーカに送られる。さらに、可動型液晶ディスプレイの上部に設けられた小型CCDカメラからの情報に基づき術者の姿勢の変化によって顕微鏡の視線方向、および、拡大率を制御する。また、術者が常に可動型液晶ディスプレイを正面から見ることができるようにディスプレイの姿勢が制御される。構築したシステムを用い、整形外科医師の数回の試行による学習の結果、一針を縫うのに要した時間は5分10分であった。これは、顕微鏡下で術者が手で行なうのに要する時間と同程度から数倍程度である。インターネットによる画像伝送の遅れは約600ミリ秒であった。また、制御信号の時間遅れをUNIXのpingコマンドで測定したところ、応答時間は約10ミリ秒であった。
緩和ケアへの移行と実施の円滑化に向けた研究:診療ガイドラインと

がん診療ガイドライン作成者と緩和ケア臨床家へのインタビュー調査と、海外がん診療ガイドラインの内容分析から、緩和ケアのエビデンス構築、完治を目指す治療から緩和ケアへつなぐ情報、緩和ケア記載量と執筆者属性、および患者中心の医療等の診療ガイドライン作成の方針を明示することが課題として示唆された。一般の人々を対象とした全国調査から、「QOL」の認知度は約2割であった。緩和ケア患者用のQOL評価票であるEORTCQLQ-C15-PAL日本語版を検証した。そのQOL評価票を用いて、多施設共同前向き研究を実施し、緩和ケアにおけるQOLスコアの臨床で意味がある最小の差(MID)を検討した。緩和ケアへの移行と実施の円滑化を1.診療ガイドラインと、2.QOL評価の課題から3年間で検討する。初年度は、1.がんの完治を目指した積極的治療から緩和ケアへ円滑に移行する方略を、関連する診療ガイドラインの作成方針、記述内容、臨床判断への影響の視点から検討した。がん診療ガイドラインの作成者と緩和ケア臨床家を対象とした面接調査を倫理委員会承認後に開始し、収集した記述データを順次継続比較法を用いて分析中である。また海外(英語圏)のがん診療ガイドラインの文献調査の結果、作成者の属性と緩和ケアに関する記載内容に関連がみられることが示された。引き続き、海外がん診療ガイドラインの記述内容分析に着手した。2.緩和ケアの目標であるQOL評価の臨床的有用性の検証に向けて、多施設共同前向き研究を実施している。QOL評価の最小重要差(MID)を明らかにする目的で、MID調査票をデルファイ法にて作成し、参加各機関の倫理委員会承認後、緩和ケア患者の協力を得てデータを収集中である。また、QOL評価の臨床での活用に向けたMIDの文献研究結果を関連学会で発表した。医学、看護学、心理学の探索エンジンを使い検索し、分析対象とした患者の主観による変化を基準としたMID研究の文献は32本であった。対象疾患は完治が目指せない慢性疾患やがんが多かった。わが国で「QOL」という語がどのように認識されているのかを検討する目的で、社会調査を実施し、データの解析中である。本研究から、がんの治療が奏効しない困難な臨床状況で、診療ガイドラインを介した患者と医療者の情報共有により、意思決定の円滑化が考えられる。また、患者のQOL評価を臨床で活用することにより、患者と医療者のコミュニケーションを促進し、緩和ケアの実施を円滑化することも考えられる。緩和ケアのQOL評価結果が診療ガイドラインの新たなエビデンスへと循環し、将来的に、診療ガイドラインに患者の視点を反映させることに繋がると予測される。緩和ケアへの移行と実施の円滑化を1.診療ガイドラインと2.QOL評価から検討した。1.がんの完治を目指した積極的治療から緩和ケアへ円滑に移行する方略を、関連する診療ガイドラインの記述内容、臨床判断への影響の視点から検討している。がん診療ガイドラインの作成者と緩和ケア臨床家を対象とした面接調査を実施し、収集した記述データを順次継続比較法を用いて分析中である。また海外(英語圏)のがん診療ガイドラインの文献調査結果の一部を学会で発表。現在、主に海外の肺癌診療ガイドラインの推奨文の内容分析に着手した。2.緩和ケアの目標であるQOL向上のアウトカムとして、QOL評価の臨床的有用性を検証し、公表準備中である。多施設共同前向き研究では、参加各機関の倫理委員会承認後、データを収集中である。緩和ケアの重篤ながん患者が調査対象であることから、サンプル数確保が問題となった。あらかじめ計画実施計画書で想定したように協力施設を12と増やし、倫理委員会で変更を承認された。QOL評価の一部評価結果を関連学会で発表した。わが国で「QOL」という語がどのように認識されているのかを明らかにする社会調査結果を国際学会で発表し、情報を収集した。本研究から、がんの完治を目指した治療が奏効しない臨床状況で、診療ガイドラインを介した患者と医療者の情報共有により、意思決定の円滑化が考えられる。緩和ケアへの移行と実施の円滑化を1.診療ガイドラインと、2.QOL評価から検討することを目的とした。1.がんの完治を目指した積極的治療から緩和ケアへ円滑に移行する有用な情報の一つとして、関連する診療ガイドラインの記述内容を、臨床判断への影響の視点から検討した。わが国のがん診療ガイドラインにおける緩和ケアに関する記述の内容分析結果の一部を学会発表した。

がん診療ガイドライン作成者15人に作成時の課題と緩和ケアの記述に関するインタビュー調査を実施した。前年度に収集した緩和ケア臨床家14人のインタビュー記録とともに、継続比較法による記述データの分析に着手した。患者中心の医療の観点から、海外(英語圏)で公表された肺癌診療ガイドラインの内容分析を進めた。本研究から、1.わが国のがん診療ガイドラインの問題点を検討し、緩和ケアへの移行における意思決定を円滑化する情報提供の課題が考えられる。2.わが国で使用可能な緩和ケア患者用のQOL評価票とMIDの検討により、患者のQOL評価の臨床活用が促進され、緩和ケアの実施を円滑化すると考えられる。緩和ケアのQOL評価結果が診療ガイドラインの新たなエビデンスへと循環し、将来的に、診療ガイドラインに患者の視点を反映させることに繋がると予測される。
プラスチド局在ピルビン酸輸送装置の分子実体の同定と生理解析

細胞内のオルガネラ(ミトコンドリアやプラスチド)にはその内部での代謝に必要なピルビン酸輸送体の存在が示唆されているが、その分子実体は不明のままである。申請者は、C4植物においてプラスチドでのピルビン酸輸送活性が強化されているという既知の知見に基づき、C3植物種とC4植物種との間でのトランスクリプトーム解析によって、候補となる遺伝子BASS2とNHD1を単離し、その生化学的活性を求めた。本年度は、機能獲得型の実験により、候補遺伝子としてすでに単離している新規輸送体タンパク質のピルビン酸輸送能を生化学的に証明することを目的とした。実験方法の異なる二つの実験を並行的に進めた。(1)組換え体酵素をリポソーム再構成実験系に供し、輸送能を調査する。(2)組換え体タンパク質を発現させた大腸菌を用い、付加された輸送活性を求める。(1)のアプローチではプロテオリポソームへのピルビン酸の受動的輸送により、うまく評価することができなかった。これは、ピルビン酸の物質的性状に依存すると考えられ、このアプローチには限界がある。一方(2)の取り組みにより、ナトリウム依存的なピルビン酸の取り込みを大腸菌全体を用いることで見いだすことに成功した。これにより本年度の目的を十分に達成したものと思われる。また、共同研究者のデュッセルドルフ大学のアンドレアスウェーバー博士により、もう一つ新規な候補選伝子として、プラスチド局在のプロトン/ナトリウム交換輸送体機能をもつと推察されるタンパク質をコードする遺伝子が単離された。我々が既に解析しているピルビン酸輸送体に加えて、この遺伝子翻訳産物が協同的に働くことで、ピルビン酸の取り込みによって生じるナトリウムイオンの蓄積をうまく解消しながら継続的なピルビン酸輸送を達成する分子機構が存在するのではないかという仮説を導くことができた。この仮説は、植物のプラスチドにおける物質輸送の全く新規な輸送メカニズムの存在を示しており、この協同仮説を引き続き検証する必要がある。これまでに我々は細胞内オルガネラに存在するとされるが分子実体が不明であったピルビン酸輸送体の責任分子を同定するべく、C3光合成とC4光合成の機能的違いに着目したトランスクリプトーム解析を行ってきた。ピルビン酸輸送体候補として、新規輸送体タンパク質(BASS2)とこれと非常によく似た発現パターンを示すプラスチド局在プロトン・ナトリウム交換輸送体(NHD1)の単離に成功している。本年度は、BASS2タンパク質を組換え体タンパク質として大腸菌内に発現させた。この大腸菌を用いて放射標識ピルビン酸の取り込み活性を測定し、BASS2がナトリウム依存的輸送活性を担う責任分子であることを証明した。また、同じトランスクリプトーム解析から単離されていたもう一つの遺伝子、プラスチド局在プロトン・ナトリウム交換輸送体(NHD1)とのカップリングにより、ナトリウム勾配を維持しつつピルビン酸を輸送し続ける輸送機構が存在する可能性が示唆された。そこでこれを実証するために、大腸菌内で二種類のタンパク質を共発現し、大腸菌膜内外にプロトン勾配を作出することで、外部ナトリウムに依存しない輸送活性が認められることを示した。この一連の実験により、葉緑体包膜に局在するナトリウム依存性ピルビン酸輸送機能が、二つの分子BASS2とNHD1とのカップリング反応で説明できるという全く新しい知見を得ることができた。生化学的な輸送速度論解析を行う第一歩として、時間依存的輸送活性を測定し、15秒以内の短時間であるが、時間依存的な輸送活性を示すことのできる測定条件を求めることができた。
舌下神経切断後の神経細胞死の新たな抑止法の開発

本研究の目的は、損傷された神経細胞がどのような経過をたどり、神経細胞死へと向かうのかを分子組織化学的に解析するとともに、人為的にその神経細胞死を阻止することができるかを検討することである。そのために神経軸索切断モデルを経時的に作製し、神経細胞を免疫組織化学、分子組織化学的手法をもって神経細胞死に関与する遺伝子群の検索を行った。1)ラット舌下神経切断モデルの作成オスWistar系ラット(7週齢)を腹腔内麻酔し、顎下部皮膚を切開、右舌下神経を露出。神経再生が起こらないように舌下神経を5mm切断除去し創部を縫合。神経切断後1,2,3,7,14,28日のラット延髄を屠殺、潅流固定後、摘出し、パラフィン標本を各3匹ずつ作製した。2)免疫組織学化学的検索そこで軸索切断された舌下神経がどのような経過をたどるのか経時的に免疫組織化学的検索を行った。細胞死関連遺伝子蛋白に関して、BCL-2ファミリーのBADに着目した。最近の報告によるとBADのリン酸化による影響が、神経栄養因子阻害による神経細胞死に深く関わっている。その他現在神経細胞死に関与すると言われている遺伝子ced-3/ICE系、Rasを免疫組織化学的手法およびin situ hybridyzation法を用いて検討した。現在のところ、一部条件整わずに未だデータがそろっていない。条件がそろった時点で、あらかじめそれらの関連蛋白の抗体を舌筋に注射し、軸索輸送に乗って延髄に取り込ませる。その後、神経軸索を切断して、形態的、TUNEL法により神経細胞死を検索する。神経細胞死が抑制されたかを検討することとしている。そのために神経軸索切断モデルを経時的に作製し、神経細胞を免疫組織化学、分子組織化学的手法をもって神経細胞死に関与する遺伝子群を検討することとした。明らかになった時点で、それらを抑制させる、または拮抗する遺伝子蛋白を局所投与し、神経細胞死が抑制できるかを明らかにする実験を行う。1)ラット舌下神経切断モデルの作製オスWistar系ラット(7週齢)を腹腔内麻酔し、顎下部皮膚を切開、右舌下神経を言出。2)免疫組織学的検索細胞死関連遺伝子蛋白に関して、BCL-2ファミリーのBADに着目した。最近の報告によるとBADのリン酸化による影響が神経栄養因子阻害によるに深く関わっている。そこで軸索切断された舌下神経がどのような経過をたどるのか経時的に免疫組織化学的検索を行った。結果:切断後3日の切片にて切断側に陽性像が見られたが、その他の切片に対しては、免疫組織科学的にに条件が整わないため、現在そのプロトコールの改変を行っている。またBADリン酸化について、加えてその他の細胞死関連遺伝子群のカスケードについて、文献的検索を行っている。