hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎生初期発生の造血系におけるHβ58遺伝子の役割

マウス胚におけるHβ58遺伝子の発現をRT-PCRおよびnorthern blot hybidization法により検出した。また、免疫染色法とin situ hybridyzation法を用いてHβ58の発現部位を特定した。遺伝子欠損胚の形態異常はwhole mountでの構造観察と切片のHE染色により検出した。着床前は未受精卵から96hまでの全ての胚でmRNAの存在が認められ、着床後も胎子を含む4.5-19.5日目までの全ての妊娠子宮でmRNAの発現が認められた。3.5-9.5日目胚の免疫染色では、3.5日目以降の栄養膜細胞系(TE、EPC)、6.5日目以降の胚外内胚葉(卵黄嚢)、そして7.5日目のしょう膜、羊膜にシグナルが認められた。8.5-9.5日目には胎盤とそこに局在する血球細胞にもシグナルが検出された。In situ hybridizationでも同様の発現が検出された。次に、遺伝子欠損胚の発生異常を検出した。遺伝子欠損マウスは胎生7.5日目より10.5日目にかけて形態異常を示し、致死となる。胚は形態上は6.5日目まで正常だが、7.5日目には胚性外胚葉の成長遅滞と漿膜の過剰成長が見られた。8.5日目以降の発生はほとんど停滞し、体節の形成や神経溝の融合、turningの不全が観察された。Hβ58遺伝子は母体側の組織・体液と接する胚子側の栄養膜細胞や胚外膜(胎盤、卵黄嚢)に強く発現していたことから、Hβ58は細胞内を経由した母体-胚子間の物質交換に関与している可能性がある。実際in vitroでは、Hβ58を含む複合体retromer complexの他の構成因子が、トランスフェリン受容体をはじめとする様々な受容体と結合することが報告された。このことから遺伝子欠損胚では、栄養膜や卵黄嚢といった物質交換の場においてその能力が低下し、胚子の成長・発生が遅滞して胎生致死になる可能性が考えられた。Hβ58遺伝子の細胞内局在とにおける機能とを明らかにするために以下のような研究を並行して行った。まず、胎生初期胚での発現組織を特定するため免疫染色を行った。妊娠4日目から10日目の子宮では、子宮内膜・脱落膜に常にHβ58の発現がみられ、特に胚周辺の脱落膜細胞と血管系の細胞に強いシグナルが認められた。胚でのHβ58の発現は子宮に比べて低かったが、胚発生が進むにつれてシグナルは強くなる傾向が見られた。栄養膜細胞への発現は妊娠4日目から継続的に見られた。妊娠7.5日目胚では胚外中胚葉系の胎膜と胚性外胚葉の表面に、妊娠8.5日目から9.5日目の胚では、栄養膜巨大細胞、胎子血球、卵黄嚢の核に強いシグナルがみられた。これより、Hβ58遺伝子は栄養膜-胎盤系列の組織に発現が強いことが示された。次に、細胞内におけるHβ58の局在を調べた。マウス胎児由来の線維芽細胞であるNIH-3T3細胞を免疫染色したところ、細胞質内にドット状の分布が認められ、その局在はリソソームやゴルジ体とは重ならなかった。GFP融合Hβ58タンパクを発現させた場合にも同様の局在性が認められた。一方妊娠8.5日目の脱落膜細胞を免疫染色したところ、核に比較的強いシグナルが認められた。しかし、Hβ58の核移行等のシグナル配列を除去した場合には細胞内局在に変化は見られなかった。また細胞周期とHβ58の局在の変化との間には関連性は見いだせなかった。以上の結果から、Hβ58は細胞質では初期エンドソームや後期エンドソームなどの細胞内小器官に局在して細胞内輸送に関わっている可能性と、核内に局在して何らかの機能を果たしている可能性とが示された。

Hβ58遺伝子は母体側の組織・体液と接する胚子側の栄養膜細胞や胚外膜(胎盤、卵黄嚢)に強く発現していたことから、Hβ58は細胞内を経由した母体-胚子間の物質交換に関与している可能性がある。実際in vitroでは、Hβ58を含む複合体retromer complexの他の構成因子が、トランスフェリン受容体をはじめとする様々な受容体と結合することが報告された。このことから遺伝子欠損胚では、栄養膜や卵黄嚢といった物質交換の場においてその能力が低下し、胚子の成長・発生が遅滞して胎生致死になる可能性が考えられた。
呼吸器感染症生体応答機構、特に転写応答機構の解明とその治療への応用

呼吸器感染症の重症化を防御する因子について研究した。Nrf2は感染時の酸化ストレスや炎症性タンパク産生を抑制する転写因子で、Nrf2を欠く個体ではインフルエンザの肺炎症が増悪することを明らかにした。p62は酸化ストレスで誘導される多機能タンパクである。レジオネラ感染時のマクロファージでp62はインフラマゾームの活性化、それに引き続く炎症性タンパク産生を抑制し、肺炎症増幅を防御することを明らかにした。非結核性抗酸菌症の重症化にはリンパ球亜集団(Th1/Th17)のバランスが重要であることを示した。転写因子T-betの欠損はTh17偏移を導き、菌増殖、肺炎症亢進をもたらすことを明らかにした。同じ病原菌に感染してもその重症度は個人差があるように、呼吸器感染症の感受性には宿主側因子が重要である。宿主応答が特に重要と思われる細胞内寄生菌のうち、頻度が高く難治化、重症化しやすい非結核性抗酸菌、レジオネラ菌に的を絞り、その応答機構を個体および細胞レベルで解析した。代表的な非結核性抗酸菌であるMAC症の感染防御、宿主応答における、転写因子T-betの役割を検討した。T-bet欠損マウスでは、野生型マウスに比べ肺組織におけるMACの増殖が顕著であり、MAC感染による肺炎症の程度も高度であった。感染後肺組織におけるインターロイキン17の著明な増加が見られた。一方、T-bet高発現マウスでは、MAC感染後の菌増殖は軽度であり、肺炎症の程度も野生型マウスに比べ微弱であった。肺組織ではインターフェロンγ濃度が顕著に増加していた。以上より、T-betにより制御されるTh1/Th17バランスはMAC感染後の菌増殖や肺炎症の程度を決定する重要な宿主因子であることが明らかとなった。転写因子Nrf2の標的分子であり、オートファジー関連因子LC3のアダプター分子であるp62/A170はマクロファージに発現し、環境応答に関与する。p62/A170のレジオネラ感染における役割を検討した。p62欠損マクロファージではレジオネラ感染後のインフラマゾーム活性が亢進し、炎症性サイトカインの産生が亢進した。p62はNLRC4インフラマゾームに直接結合し、同活性を低下させることが明らかになった。p62欠損マウスではレジオネラ感染後の肺炎症が高度であり、肺組織における炎症性サイトカインレベルが増加していた。以上より、p62/A170はインフラマゾームの抑制を介し、レジオネラ感染後の肺炎症を制御する宿主因子であることが明らかとなった。代表的な非結核性抗酸菌であるMAC症の感染防御にはTh1型の免疫応答が重要とされている。転写因子T-betはTh1細胞分化のマスター制御因子である。T-betの欠損(T-bet-/-)マウス、およびT-bet高発現(T-bet-tg)マウスにMACを経気道感染させた肺MAC症モデルを作成し、それぞれのマウスでMACに対する感受性や肺組織におけるサイトカイン応答を解析した。T-bet-/-マウスは野生型マウスに比べ肺組織におけるMACの増殖が顕著であり、肺炎症の程度も高度であった。MAC感染後の肺組織ではインターロイキン17の著明な増加が見られた。一方、T-bet-tgマウスではMAC感染後の菌増殖は軽度であり、肺炎症の程度も野生型マウスに比べ微弱であった。以上より、T-betの高発現は肺にTh1偏移(インターフェロンγ増加)をもたらし、MACに防御的に作用すると考えられた。一方、予想に反し、T-bet欠損はMAC感染後の肺組織にTh2ではなくTh17偏移をもたらし、肺炎症を亢進させるものと思われた。レジオネラ菌はマクロファージに貪食され、オートファゴゾームで処理を受ける。p62/A170は、転写因子Nrf2により発現制御される、オートファジー関連因子LC3のアダプター分子である。p62を欠損するマウスではレジオネラ感染後の肺炎症が顕著に高まることが明らかになった。次年度研究ではT-betやp62による感染後宿主応答機構を分子レベルで明らかにしたい。

呼吸器感染症の発症、重症化は宿主側因子に規定されることが多い。病原微生物に対する宿主応答は受容体刺激による転写因子活性化を介した遺伝子発現系である。本研究では、宿主因子の影響が大きい細胞内寄生菌感染のうち頻度が高い非結核性抗酸菌(NTM)感染症における宿主応答の役割を転写因子中心に検討した。細胞内寄生菌に対する感染防御の中心はTh1反応であり、同反応は転写因子T-betで制御されている。T-bet欠損マウスはNTM感染後の臓器菌量や肺炎症が野生型マウスに比べ顕著であった。感染後の肺組織ではTh1反応の減弱とともに強いTh17偏移を認めた。NTM感染症の感受性形成には、従来考えられていたTh1/Th2バランスではなく、Th1/Th17バランスが重要であることが示唆された。同仮説を証明するために、Th17分化を司る転写因子RORγtの高発現マウスをNTMに感染させたところ、T-bet欠損マウス同様にTh17偏移とともに肺炎症亢進、抗酸菌増殖の亢進を認めた。T-betはTh1/Th17バランスを制御することで感染感受性を規定する、細胞内寄生菌感染防御の際の重要な宿主因子であることが示された。T-betをT細胞特異的に高発現したマウスを作成し、NTM感染に対する感受性を調べた。同マウスではインターフェロンγが強く誘導されており、NTM感染後の臓器菌量、肺炎症ともに軽微であった。マクロファージでは一酸化窒素合成酵素等の発現が亢進しており、インターフェロン誘導性抗菌/防御分子の誘導が増強したものと思われた。一方でT-bet高発現マウスを長期飼育すると、骨髄レベルでの単球系成熟障害や肺胞マクロファージの亜集団変化による肺サーファクタント処理能力低下が生じることが示された。T-betによるサイトカインバランスの制御は感染防御だけでなく、肺の恒常性維持にも重要であることが明らかとなった。呼吸器内科学研究の目的に沿って平成24年度、25年度に計画した研究は基本的に終了し、最終年度を待たずして非結核性抗酸菌に関する研究、レジオネラ肺炎に関する研究ともに論文化できたことより、当初計画以上に進展しているものとと自己点検した。平成24年度の研究計画のうち、マウスに臨床分離株のMACを経気道的に感染し、肺MAC症モデルを作成することは年度初めに達成された。MAC症に対する個体の反応(死亡率、体重減少、肺炎症)も経時的に測定し、データを採取した。肺組織のTh1/Th2/Th17サイトカイン濃度も十分量のマウスで測定し、データを採取した。転写因子T-bet,GATA3,RORγTの発現も各マウスで解析した。ヒトレジオネラ肺炎の起因菌であるLegionella pneumophilaを用いたレジオネラ肺感染モデルの作成も年度初めに達成された。同モデルを使用し、感染後の個体反応(死亡率、体重減少、肺炎症)も経時的に測定し、データを採取した。肺組織やマクロファージにおける各種検討(TLRsの発現解析、Nrf2活性化、NF-κB活性化、TNF-α,IL-1β,IL-12,IL-18の各発現、およびCasapse1の活性化など)も当初予定通り施行した。研究計画は3年であるが、次年度中に当該の研究目標を達成し論文作成まで達成できる可能性も出てきた。T-
ヒト歯周組織由来細胞の化学走化性について

歯周組織再生にとって最も重要と考えられているヒト歯根膜由来線維芽細胞(HPLF)の培養上清(HPLF-CM)中に、HPLFの接着、伸展を増強させる因子の存在を明らかにしてきた。本研究ではHPLF-CMに対しヒト歯周組織由来細胞であるHPLF、ヒト歯肉由来線維芽細胞(HGF)、ヒト歯槽骨由来細胞(HABC)、ヒト歯肉上皮細胞(HGE)ならびに、ヒト末梢血由来多形核白血球(PMN)の化学走化性について検索し、化学走化性物質の存在を明らかにした。HPLF-CMは2)HGFに対しHPLFと同程度の強い化学走化活性と、分子量70kDaを中心として認められた。3)HGEは歯肉上皮をトリプシンとEDTAの混合液で処理後、KGM培地にて培養し、敷石状の上皮細胞を得た。4)HABCに対しては(x100)HPLF-CMでは化学走化活性は認められず、100%のHPLF-CMに化学走化活性があった。5)HGEに対しては20%HPLF-CMでpositive controlの50μg/ml lamininより有意に高い化学走化活性を示した。6)PMNsに対しては50、100%HPLF-CMには走化活性の存在を認めなかった。7)ヒト歯周組織由来細胞に対し20%HPLF-CMで高い接着、伸展を示した。これらのin vitroでの結果は、歯周外科処置後に歯根面への結合組織性の付着を得るために重要と考えられる物質を、歯周組織の再生にとって欠かすことのできない歯根膜組織由来線維芽細胞が産生することを示唆する。平成5年度においてはヒト歯根膜由来線維芽細胞(HPLF)、ヒト歯肉由来線維芽細胞(HGF)の確立とHPLF-CMの全分画の採取について計画しており、現時点で実現できている。同時に、HPLF.HGFのHPLF-CMに対する化学走化性能について検索し、以下のような結果を得ている。線維芽細胞に対するpositive controlとしてfibronectin(FN)を選択し、それの適性濃度を選択するために0.4,0.8,1.2,2.4,3.6mug/mlを比較し、1.2mug/mlに有意(p<0.05)に高い値を示した。以上の結果をもとに、全HPLF-CMに対する化学走化性試験においてはpositive controlとして1.2mug/mlのFNを選択し、negative controlとしてはMCDB107(serum free)を用いた。その結果、全HPLF-CMに対しHPLFは45.8±12.7cells/HPF,HGFは45.7±6.1cells/HPFであり1.2mug/ml FN(15.4±1.4)と比較して約3倍もの高い値(p<0.001)であった。歯周組織由来線維芽細胞の化学走化性試験の確立、つまり、使用するpolycarbonate膜のpore size(8mum)の決定、およびpositive controlの選定を完了した。歯周外科処置後の結合組織性の再付着に重要と考えられるヒト歯根膜由来線維芽細胞(HPLF),ヒト歯肉由来線維芽細胞(HGF)の確立をし、両細胞のHPLF-CMに対する化学走化性能が示唆された。平成5年度の研究計画のうち、多形核白血球(PMN)のHPLF-CMに対する化学走化性能については検索中である。今後、他の歯周組織由来細胞である歯肉由来上皮細胞(HGE),ヒト歯槽骨由来細胞(HABC)を確立し、HPLF-CMに対する化学走化性について検討を加える。歯周組織再生にとって最も重要と考えられているヒト歯根膜由来線維芽

細胞(HPLF)の培養上清(HPLF-CM)中に、HPLFの培養、伸展を増強させる因子の存在を明らかにしてきた。本研究ではHPLF-CMに対しヒト歯周組織由来細胞であるHPLF、ヒト歯肉由来線維芽細胞(HGF)、ヒト歯槽骨由来細胞(HABC)、ヒト歯肉上皮細胞(HGE)ならびに、ヒト末梢血由来多形核白血球(PMN)の化学走化性について検索してきた。平成5年度までは、HPLFおよびHGFに対しHPLF-CMに化学走化活性の存在することを報告した。平成6年度においてはHABC、HGEの確立とHPLF-CM中に各細胞に対する化学走化活性および接着、伸展促進させる物質の存在を明らかにした。1)HABCは過剰埋伏智歯抜去時の歯槽骨片を1.5%コラゲナーゼ処理し、得た。HGFと比較し、培養14日目に有意に高いALPase活性を示した。2)HGEは歯肉組織片を0.4%dispaseII処理し、得られた上皮をトリプシンとEDTAの混合液で処理後、KGM培地にて培養し、敷石状の上皮細胞を得た。4)HGEに対して20%HPLF-CMでpostive controlである50μg/ml lamininより有意に高い化学走化活性を示した。5)PMNsに対しては50、100%HPLF-CMには走化活性の存在を認めなかった。6)ヒト歯周組織由来細胞に対し20%HPLF-CMで高い接着、伸展を示した。これらのin vitroでの結果は、歯周外科処置後に歯根面への結合組織性の付着を得るために重要と考えられる物質を、歯周組織の再生にとって欠かすことのできない歯根膜組織由来線維芽細胞が産生することを示唆するものである。
女性外来と連携した尿失禁症状を有する中高年女性に対する遠隔指導システムの開発

1.遠隔指導を実施予定の市町村の保健師と遠隔指導についての会議をもち,地域住民への女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会の実施,尿失禁症状を有する中高年女性に対する遠隔指導の案内と実施計画の検討を行った。調整中に西日本豪雨災害がおこり,連携していた瀬戸内市の保健師が災害対応に追われたため計画が一時中断となった。その後,地域住民への女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会の実施計画,遠隔指導の実施計画についての再検討を行った。2.講演会開催:2018年12月11日(火)瀬戸内市長船町土師277-4ゆめトピア長船3.講演会時に,尿失禁症状を有する中高年女性で,骨盤底筋体操の遠隔指導の希望者を募り,泌尿器科女性専門外来と連携して遠隔指導を行った。予定より希望者が多かったため1か月後の指導を2回実施することになった。遠隔指導前に毎回,保健師と事前打ち合わせのための遠隔会議を行った。また,遠隔指導前には機器の調整を行い,毎回指導終了後に映像チェックと機器の再点検を実施した。1初回指導(2018年12月25日)21か月後指導(2019年1月29日,2月5日),33か月後指導(2019年3月19日)参加者は当初36人であったが,全て参加した者は26人であった。結果については対象者の尿失禁症状の評価を元に報告書を作成し,保健師を介して対象者に報告を行った(2019年4月)。4.本取り組みと昨年度までの成果について,関連の学会で発表を行った。1.遠隔指導を実施予定の市町村の保健師と遠隔指導についての会議をもち,地域住民への女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会,尿失禁症状を有する中高年女性に対する遠隔指導の実施を計画していたが,調整中に西日本豪雨災害がおこり,連携していた瀬戸内市の保健師が災害対応に追われたため計画が一時中断となった。その後,地域住民への女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会の実施計画,遠隔指導の実施計画についての再検討し年度内に実施することが出来た。2.遠隔指導の実施が遅れたが,対象者の骨盤底筋体操の実施状況と尿失禁の自覚症状の変化等を評価し,対象者毎に報告書を作成し保健師を介して対象者に報告が次年度の4月以降になった。以上の経緯から研究期間の延長申請を行った。3.昨年度までの成果について,関連学会で発表した。今年度の実施した対象者のテータと今まで実施したデータを合わせて,体操の実施状況と尿失禁の自覚症状の変化について分析する。研究グループ内で,骨盤底筋体操の遠隔指導プログラム及び岡山県内での支援システムの検討を行う。1.尿失禁の症状を有する中高年女性で骨盤底筋体操についての遠隔指導の希望者を募るために,女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会(「遠隔医療連携岡山大学病院と地域で行う骨盤底筋体操」)を,岡山県内の地域包括センター及び市町村の保健師を対象に,岡山大学病院内で平成28年9月21日(水)13時15時に開催した。2.本研究を実施するにあたり,大学研究科内の倫理審査委員会に研究計画書を提出し,承認を得た。遠隔指導で使用する機器の選定を行ない,遠隔通信試験を実施した。3.遠隔指導を実施予定の市町村は,今年度は総社市で女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会を地域住民を対象に実施した。その後,遠隔指導を実施予定の総社市地域包括支援センターの保健師を介して,尿失禁症状を有する中高年女性で,骨盤底筋体操の遠隔指導の希望者を募った。4.総社市地域包括支援センターの保健師と遠隔指導の実施計画について,1初回指導,2指導1か月後,3指導3か月の日程調節などの打合せを行った。そして,総社市地域包括支援センターで,尿失禁の症状を有する中高年女性14人に対して,泌尿器科女性専門外来と連携して遠隔指導の初回指導を行った。初回指導時に質問紙調査を行ったので,尿失禁の自覚症状の程度について検討した。1.尿失禁の症状を有する中高年女性で骨盤底筋体操指導の遠隔指導の希望者を募るために,女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会を,岡山県内の地域包括センター及び市町村の保健師を対象に岡山大学病院で平成28年9月21日(水)に開催した。2.本研究について倫理審査委員会の承認を得た上で,今年度の遠隔指導は総社市と連携して行うことになった。3.女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会を総社市にて地域住民を対象に開催し,遠隔指導を実施予定の総社市地域包括支援センターの保健師を介して,尿失禁症状を有する中高年女性で,骨盤底筋体操の遠隔指導の希望者を募った。

そして,総社市地域包括支援センターで,尿失禁の症状を有する中高年女性14人に対して,泌尿器科女性専門外来と連携して遠隔指導の初回指導を行い,指導前の現在の尿失禁の自覚症状の程度の検討を行った。1.遠隔指導を実施予定の総社市地域包括支援センターの保健師を介して,尿失禁症状を有する中高年女性で,骨盤底筋体操の遠隔指導の希望者を募り,1初回指導(平成29年3月),2指導1か月後(平成29年4月),3指導3か月後(平成29年6月)の日程調節と遠隔指導の実施計画を立て,尿失禁の症状を有する中高年女性に対して,泌尿器科女性専門外来と連携して遠隔指導を行った。2.対象者の骨盤底筋体操の実施状況と尿失禁の自覚症状の変化について分析した。また,結果については対象者の尿失禁症状の評価を元に報告書を作成し,保健師を介して対象者に報告を行った。3.尿失禁の症状を有する中高年女性で骨盤底筋体操についての遠隔指導の希望者を募ること,女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会(「遠隔医療連携岡山大学病院と地域で行う骨盤底筋体操)」を,岡山県内の地域包括センター及び市町村の保健師を対象に岡山大学病院で平成30年3月14日(水)13時15時を企画し,開催した。講演会開催にあたりチラシと案内文を作成し,岡山県内の保健センターと地域包括支援センターに郵送し,広報活動を行った。4.遠隔指導を実施予定の市町村の保健師と,次年度に向けての計画の会議をもち,地域住民への女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会の計画,尿失禁症状を有する中高年女性に対する遠隔指導の実施計画の検討を行った。1.遠隔指導の実施するために,総社市地域包括支援センターの保健師を介して,尿失禁症状を有する中高年女性で,骨盤底筋体操の遠隔指導の希望者を募り,1初回指導,2指導1か月後,3指導3か月の計3回遠隔指導を実施した。2.遠隔指導に参加した対象者について,体操の実施状況と尿失禁の自覚症状の変化について分析した。3.体操の実施状況と尿失禁の自覚症状の変化を評価し,対象者毎に報告書を作成し保健師を介して対象者に報告した。4.尿失禁の症状を有する中高年女性で骨盤底筋体操指導の遠隔指導の啓蒙と希望者を募るために,女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会を,岡山県内の地域包括センター及び市町村の保健師を対象に岡山大学病院で平成30年3月14日(水)に開催した。5.今までの成果について,関連学会で発表した。1.遠隔指導を実施予定の市町村の保健師と遠隔指導についての会議をもち,地域住民への女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会の実施,尿失禁症状を有する中高年女性に対する遠隔指導の案内と実施計画の検討を行った。調整中に西日本豪雨災害がおこり,連携していた瀬戸内市の保健師が災害対応に追われたため計画が一時中断となった。その後,地域住民への女性泌尿器科疾患や骨盤底筋体操の広報と遠隔指導を行うための講演会の実施計画,遠隔指導の実施計画についての再検討を行った。2.講演会開催:2018年12月11日(火)瀬戸内市長船町土師277-4ゆめトピア長船3.講演会時に,尿失禁症状を有する中高年女性で,骨盤底筋体操の遠隔指導の希望者を募り,泌尿器科女性専門外来と連携して遠隔指導を行った。予定より希望者が多かったため1か月後の指導を2回実施することになった。遠隔指導前に毎回,保健師と事前打ち合わせのための遠隔会議を行った。また,遠隔指導前には機器の調整を行い,毎回指導終了後に映像チェックと機器の再点検を実施した。1初回指導(2018年12月25日)21か月後指導(2019年1月29日,2月5日),33か月後指導(2019年3月19日)参加者は当初36人であったが,全て参加した者は26人であった。
Instructional designに基づく新しい内視鏡手術教育システム

本研究は,外科系各分野で発展している内視鏡手術に対するアウトカムbasedの新しい合理的なトレーニングコースを作成するものである.現在の手術教育システムは,修得すべきアウトカムから必要な技術を分析して作成した理論的,効率的方法とは必ずしも言えず,ボックストレーニング,VR手術シミュレータ,動物ラボなどが,どちらかいうと,訓練法開発の歴史的経緯で使い分けられ行われている.こうした現状に対し,instructional designの考え方を導入し,各術式が必要とする技術に分解し,細分化された構成単位に対してそれぞれ必要なモジュールを作成し,これらを再構成した新しい手術教育システムを作成する.具体的には,必要タスクに応じたモジュールを組み合わせた各術式の訓練コースと,タスクを縦断したテーマ別コース(エナジーデバイス・コースなど)を作成し,教育システムを二次元展開することを構想した.術式別トレーニングコースの代表として,消化器外科医が最初に修得する腹腔鏡下胆嚢摘出術のコース,テーマ別コースとして腹腔内吻合とエネルギーデバイスに関するトレーニングコースを設計した.胆嚢摘出術コースは,炎症が少ない待機的胆嚢摘出術を自力で行えるというアウトカムを設定し,テキスト事前配布を行い,セミナー時には,講義を最小限にして,シミュレータを題材にtraineeと指導医が考えるコースとした.評価表は,自己評価と,シミュレータのスコア,指導医モニタリングからなるものを作成し,プレテストとの比較に基づき,コースの効果について評価を行う手法を作成し,実際に講習会を行って,デブリーフィング方法の改善に取り組んでいる.また,テーマ別コースでは,複数のタスクにおいて臓器モデルとトレーニングボックスを使用するが,市販のボックスは多くの問題点があり,新しいボックスを設計,作成している.構成単位のモジュール作成は,腸間膜モデルを作成したが,ボックス・トレーナやトロッカー挿入シミュレータは未だ開発途上である.ボックス・トレーナは,本研究期間中に完成し検証がある程度可能と考えているが,トロッカー挿入シミュレータは,もうすこし時間を要する見込みである.術式別トレーニングコースの雛型となる腹腔鏡下胆嚢摘出術のコースは,手術トレーニングコースを設計,実施し,その評価にもとづき改良するというPDCAサイクルに入っており予定通りの進捗である.これに対し,テーマ別コースの腹腔内吻合とエネルギーデバイスに関するトレーニングコースは,現在のVRシミュレータでは,血管シーリング装置が採用されていない,超音波凝固切開装置(USAD)のfidelityが不足,という問題があり,臓器モデルとボックス・トレーナを利用したモジュールを作成する必要がある.しかし,市販のボックスは,透明で中が直接見える,画面の解像度が不良,という大きな問題点があり,新しいボックスの製作を開始した.プロトタイプを作成したが,ボックスの疑似腹壁面の彎曲,ホールの位置や,スコープの支持装置など,いくつかの改良点があり,これらを設計し直し,改良版が完成したのが,今年の3月である.このボックスを使用した手術トレーニングを開始したが,スコープの支持装置が重量に耐えられずに保持を維持できないなどの問題点が依然解決されず,現在,まだ改良を加えているところである.今後,改良を進めながら,PDCAサイクルでトレーニングコースのブラッシュアップを行う予定である.構成単位のモジュールのトロッカー挿入手技シミュレータ開発は引き続き進める.術式別トレーニングコースの代表として設計した腹腔鏡下胆嚢摘出術トレーニングコースは,既に実施しながらPDCAサイクルで検討,改良を加えている.このコースを雛型に他術式コースも設計していくが,胆嚢摘出術コースは,バーチャル・リアリティ(VR)シミュレータのモジュールを中心に設計している.しかし,一般的には各コースのモジュールにおいてVRシミュレータのモジュールの有効性は高くないので,胆嚢摘出術コースにおいてもティッシュ(ウェット)モデルを組み込んでいるが,他術式については一層VRシミュレータ以外のモジュールも重要なので,臓器モデル(と必要に応じて対応するボックスも)の開発もあわせて行う.評価システムは,現在,Kirkpatrickのレベル2までしか十分評価できていないが,レベル3にふみこめるよう改良を進める.以上のような各術式のコース(横軸)の作成に加え,共通のタスクを縦断したテーマ別コースとして,腹腔内器械吻合とエネルギーデバイスのトレーニングコースを設計している.特に,エネルギーデバイス操作に関しては,現在のVRシミュレータは超音波凝固切開装置(USAD)の切離感を再現しているとはいいがたく,血管シーリング装置(VSS)は,VR化されていない.このため,ボックスと模型,ティッシュを使用するモジュールを作成しており,評価システムも設計する.外科系各分野で内視鏡手術が発展しているが,トレーニングの問題がある.本研究は,アウトカムbasedの新しい合理的なトレーニングコースを作成するものである.現在の手術教育システムは,修得すべきアウトカムから必要な技術を分析して作成されたもので,理論的,効率的方法とは必ずしも言えない.また,シミュレータなどドライな訓練方法のみでは不十分と考えられていて,動物訓練など,時間,コスト,動物愛護,評価などの点で問題が多いウェットな手法がいまだに多く行われているという問題点がある.こうした現状に対し,instructional designの考え方を導入し,各術式が必要とする技術に分解し,細分化された構成単位に対してそれぞれ必要なモジュールを作成し,これらを再構成し新しい手術教育システムを作成する.各術式の訓練コースを,必要タスクに応じたモジュールを組み合わせたものとすると,タスクを縦断したテーマ別コース(エナジーデバイス・コーズなど)を,訓練者の効率や興味も考慮して作成し,教育システムを二次元展開する.これまでのところ,各手術術式が必要とする技術の最少単位を定め,既存のモジュールを再評価した.術式別トレーニングコースでは,まず,消化器外科医が最初に修得する腹腔鏡下胆嚢摘出術のコース

設計を行った.上腹部手術後や胆嚢炎が強い,という難度が高い症例ではなく,炎症が少ない待機的胆嚢摘出術を自力で行えるというアウトカムを設定し,Merrillの二次元マトリックスにおけるRememberレベルをできるだけ少なくし,シミュレータを題材にtraineeと指導医が考えるコースとした.作成したトレーニングコースを実際に外科医師対象に行い,事後アンケートにより,手術実施状況などコースの効果について評価を行った.また,エナジーデバイス・コース作成のためにサーモグラフィーでデバイス試験を行い基礎的なデータを収集した.各手術術式が必要とするタスクの分析は,新たな教育モデルとしてアウトカムから再検討した.消化器外科にとって基本的な胆嚢摘出術においては,上述のようなアウトカムを設定し,そこから必要なタスクを抽出し,Merrillの二次元モデルの各層に当てはめてみた.一方,現有の教育リソースとして,現在,我々が保有するVRシミュレータ(Lap-SIM, LAP Mentor II, LapVR,ProMIS, LapX Hybrid)や臓器モデルのタスクを再検討して,必要スキルと対応させ,従来の教育法では比較的多くの時間がとられていたRememberレベルを少なくし,実技に重みをおいたシステムを構築できた.さらに,当初の計画では構想していなかったが,指導医をシステムに組み入れる方法を,アウトカムから検討して着想するなど,予定と違った展開もできた.さらに3年目に行う予定であったテーマ別コースについても,エナジーデバイスに関して,デバイスの発熱実験など行いコース作成のための基礎的知見を得た.外科系各分野で内視鏡手術が発展しているが,トレーニングの問題がある.本研究は,アウトカムbasedの新しい合理的なトレーニングコースを作成するものである.現在の手術教育システムは,修得すべきアウトカムから必要な技術を分析して作成した理論的,効率的方法とは必ずしも言えない.ボックストレーニング,VR手術シミュレータ,,動物ラボなどが,どちらかいうと,訓練法開発の歴史的経緯で使い分けられ行われているこうした現状に対し,instructional designの考え方を導入し,各術式が必要とする技術に分解し,細分化された構成単位に対してそれぞれ必要なモジュールを作成し,これらを再構成し新しい手術教育システムを作成する.
前立腺体積簡易計測インデックスの考案

前立腺体積の評価が臨床的に重要であることは周知の通りである。前立腺体積はPSA densityの算出目的に必須であり、前立腺肥大の病勢の評価が可能である。本研究においては前立腺体積を求める計算式の簡略化と検査の迅速化を目標として、即座に前立腺体積を把握できるシンプルで精度の高いインデックスを考案した。超音波検査症例を積み重ねてきた経験から直交する3軸の長さの和が11cm以上になる症例では、最も一般的に使用されている直方体法を用いて算出すると前立腺の体積が25mL以上になる事から、これを基に精度の高い経直腸的超音波断層診断装置で測定した症例結果と比較して、精度を重視した測定方法と同等のデータを把握する事が可能か否か、新たな簡易指標となるかを検討した。超音波検査を用いた前立腺体積の計測時に、横断像で腹背側径と左右径を、縦断像で頭尾側径を3軸が直交するように描出した場合の3軸の和をGrade Prostate Index (G.P.I.)として、G.P.I.と実際の計測値の関係を示した。前立腺体積が25mL以上の症例の中でG.P.I.値が11以上である感度は99.2%、25mL未満の症例の中でG.P.I.値が11未満である特異度は97.5%、G.P.I.値が11以上の症例の中で25mL以上である期待陽性率は97.7%、G.P.I.値が11未満の症例の中で25mL未満である期待陰性率は99.1%と最適の数値を示した。同様に前立腺体積が15mLではG.P.I.値が9.4とすると感度、特異度、期待陽性率、期待陰性率はそれぞれ、99.0%、90.9%、97.4%、96.2%でした。前立腺体積が20mLにおいては、G.P.I.値が10.4の時の感度、特異度、期待陽性率、期待陰性率はそれぞれ、97.5%、97.8%、98.7%、95.7%でした。前立腺体積が30mLではG.P.I.値が12とすると特異度、期待陽性率がそれぞれ99.4%、98.7%と高値を示し、感度は89.2%と他よりはやや低値ではあるが精度は良好であると考えられた。これらの結果から、煩雑な手法を用いなくても3つの数の和を求めるだけで、精度の高い方法と同様な結果が把握できることが分かった。G.P.I.値が9.4未満、10.4未満、11未満、12以上の時、前立腺の体積はそれぞれ15mL未満、20mL未満、25mL未満、30mL以上であるという新しいG.P.I.が臨床現場での簡易指標として検査の迅速化に貢献できる事を期待する。

G.P.I.値が9.4未満、10.4未満、11未満、12以上の時、前立腺の体積はそれぞれ15mL未満、20mL未満、25mL未満、30mL以上であるという新しいG.P.I.が臨床現場での簡易指標として検査の迅速化に貢献できる事を期待する。
胎児後部器官群の協調的発生における細胞移動、血管・神経系組織の影響に関する研究

泌尿生殖系器官など胎児後端の器官群は、隣接する器官群が相互に関連して発生・成り立っていると考えられる。これはいくつかの先天性疾患で複数の器官群に同時に症状が現れることからも推察されるが、そのメカニズムは殆ど明らかになっていなかった。本研究では、臍帯下部領域から外生殖器上部領域への細胞移動現象の存在を器官培養実験により示した。Hhシグナル関連遺伝子改変マウスでは、この過程に異常を呈する可能性を示唆した。これらの結果は、臍帯下部領域が細胞を供給することによって外生殖器や膀胱、腹壁といった広範囲の協調的器官形成に寄与し、またその破綻が先天性疾患へとつながる可能性を示唆する。胎児期の器官形成は、隣接する器官群が相互に影響を及ぼしあいながら進んでいくと考えられる。いくつかの先天性疾患において、隣接する複数の器官群が同時に異常を呈することからも胎児器官群の協調的な発生の重要性が示唆されるが、そのメカニズムは殆ど明らかとなっていない。本研究の目的は、胎児後部領域の器官群に注目し、細胞の移動、及び器官周辺の血管・神経系組織形成が器官群の形成に与える影響を解析することで、協調的発生のメカニズムの一端を明らかにすることである。現在までに得られた研究結果として、器官培養系を用いた組織標識実験により、臍帯下部領域から外生殖器上部領域への細胞移動の存在を示唆した。さらに条件付き遺伝子組換え(Cre-loxP)システムを応用した細胞系譜解析を行なった結果、同領域の細胞群は膀胱組織にも寄与しうる結果を得た。また、血管内皮細胞マーカー遺伝子の発現解析からも臍帯下部と外生殖器上部の関連が示唆された。Shh、Alx4、Gli3遺伝子の複合遺伝子改変マウスの表現型解析から、細胞増殖因子ヘッジホッグ(Hh)シグナルが胎児後部領域器官群の異常に関連する事を示した。Hhシグナル機能獲得型変異マウスの解析から、Hhシグナルが過剰に導入されることが細胞移動を阻害する結果、発生異常につながるという可能性が示唆された。これらの結果は、臍帯下部領域は胎児後部器官群に細胞を『供給』する領域であること、また同領域にHhシグナルの過剰導入などの異常が生じることによって外生殖器や膀胱、腹壁といった広範囲に同時に影響が生じる可能性が示唆された。胎児期の器官形成は、単独の器官の発生・成長に加え、隣接する器官群が相互に影響を及ぼしあいながら協調的に進んでいくと考えられる。胎児後部領域においても、臍帯ヘルニア等の先天性発生異常の患者は近接する複数の器官群が同時に症状を呈すことが知られている。本研究の目的はこのような協調的器官発生のメカニズムを解明することである。本年度は、泌尿生殖器官群の形成における細胞移動の重要性について解析を行なった。まず正常マウス胚を用いて、臍帯下部領域の細胞を蛍光標識する実験を行なった。その結果、胎児の成長に伴い臍帯下部領域に存在する細胞が外生殖器原基上部側に向かって分布する様子が観察された。また、臍帯下部領域の組織を切除した状態での器官培養実験を行ない、培養の結果、外生殖器上部側が低形成となることを見出した。これらの結果から、臍帯下部領域から外生殖器上部領域への細胞移動現象が存在することが示唆された。次に、同様の細胞標識実験を細胞増殖因子ヘッジホッグ(Hh)シグナル関連遺伝子であり胎児後部領域に異常を示すAlx4遺伝子変異マウスにおいて行ない、同変異マウスは細胞移動に異常を呈することを見出した。Alx4遺伝子変異マウスにおいては、外生殖器内胚葉性上皮におけるShh遺伝子の発現が亢進しており、下流標的遺伝子であるPtc1の発現領域も拡大していた。Ap2α、Pitx1、Mab21l1といった遺伝子(これらの遺伝子の改変マウスは臍帯ヘルニア、外生殖器発生異常あるいは骨盤形成異常を呈する)の発現が減少していた。加えて、細胞外マトリックスの構成成分であり、細胞移動に重要な役割を果たすFibronectinの発現が減少していた。これらの結果は、Hhシグナル系と細胞移動現象の胎児後部器官群発生過程への関与を示唆し、先天性発生異常発症メカニズム解明の一助となると考えられた。胎児期の器官形成は、隣接する器官群が相互に影響を及ぼしあいながら進んでいく。しかし、その発生現象の複雑さからこのような観点での発生メカニズム解析は殆ど進んでおらず、器官群がどのように関連しているか等を示した知見は少ない。本研究の目的は、胎児後部領域に位置する泌尿生殖系器官群、それらを取り巻く腹壁や骨盤に注目し、器官形成において細胞の移動、血管走行や神経走行が果たす役割を明らかにすることである。

平成26年度に得られた結果として、遺伝学的細胞系譜解析、またBrdUパルスチェイス解析から胎齢9.5日の総排泄腔上皮、胎齢11.5日の尿生殖洞・後腸上皮において、背側-腹側で性質に違いがある可能性を示唆した。また、総排泄腔分割異常を呈する遺伝子改変マウスにおける血管走行、神経走行を可視化した結果、早期血管形成不全による虚血による器官形成異常ではないことを示唆した。研究期間全体を通しての結果を総括すると、臍帯下部領域から外生殖器上部領域への細胞移動現象の存在を器官培養系を用いた組織標識実験により示唆した。この細胞移動過程に異常を呈するAlx4遺伝子変異マウスにおける臍帯下部領域の遺伝子発現を解析した結果、Ap2alpha、Pitx1、Mab21l2といった腹壁形成に重要であると考えられる遺伝子群の発現が低下していた。また、Alx4・Shh・Gli3複合遺伝子改変マウスの解析から、細胞増殖因子ヘッジホッグ(Hh)シグナルが胎児後部領域器官群の異常に関連する事を示した。さらに、Hhシグナル機能獲得型変異マウスを作製した結果、Hhシグナルが過剰に導入されることが腹壁部の異常と外生殖器背側の低形成につながる可能性を示唆した。これらの結果は、臍帯下部領域が胎児後部器官群に細胞を供給することによって外生殖器や膀胱、腹壁といった広範囲の協調的器官形成に寄与している可能性を示唆した。発生医学研究項目のうち細胞移動の影響の解析に関しては、多くの新規知見を得ることができ先天性疾患発症メカニズムの一端を示唆できていると考えられる。研究計画のもう1つの柱である血管・神経系組織の器官形成に及ぼす影響の解析に関しては、一部の遺伝子改変マウスにおける神経走行の異常を見出しているが、主に正常マウスにおける血管内皮マーカーの発現解析等、基本的な解析に留まっている。原因としては、平成24年度末にアメリカより導入した遺伝子改変マウス(Cre組換え酵素の発現依存的に細胞を死滅させることができるマウス)の妊孕性が低く、通常交配を続けたが産仔を得られなかったことにある(同マウスは平成25年9月に体外受精によって産仔を得るに至った)。マウスコロニーの拡大と、実験に使用する複合遺伝子改変マウスの作製を行なっているが、年度内に解析、及びその結果を発表することが出来なかったため、研究に遅れが生じていると言える。本年度、研究項目のうち細胞移動の影響の解析を主として行なった結果、多くの新規知見を得ることができ先天性疾患発症メカニズムの一端を示唆するに至った。研究計画のもう1つの柱である血管・神経系組織の器官形成に及ぼす影響の解析に関しては、一部遺伝子改変マウスにおける神経走行の異常を見出しつつあるものの、解析に使用できる遺伝子改変マウス数が十分ではないため、現在はマウスコロニーを拡大している段階にある。達成度に記述した通り、遺伝子改変マウスが十分に確保できなかったことが原因で、当研究計画の2年目に予定していた解析が遅れており、それらの解析を本年度に行なう予定である。すなわち、昨年度体外受精によって継代したRosa26-DTAマウスを用いて、胎児組織の遺伝学的除去実験を行なう。臍帯下部領域、及び神経系、血管系組織に発現するCreドライバーマウスを用いた解析を予定している。また、Hhシグナル関連遺伝子群の遺伝子改変マウス胚を神経新生因子、血管新生因子存在下で培養し、その影響を解析する。
ナノバブルと超音波を用いた新しいワクチン接種システムの開発

本研究の目的は、ナノバブルと超音波を用いた新しいワクチン接種法のためのドラッグデリバリーシステムを開発し、これまで治療が困難であった感染症などの予防や治療に貢献することである。これまで我々は、ナノバブルの体内分布の超音波画像でのモニタリングや生体細胞への遺伝子導入効率、さらには、超音波照射とナノバブル破砕時の組織障害の程度、それにともなう炎症性細胞浸潤の程度などを検討した。その結果、静脈注射によりナノバブルがリンパ節に流入し、リンパ節内の樹状細胞に抗原タンパクや遺伝子の導入が可能であること、ナノバブル破砕時の超音波の強さを調節することにより、照射部に適度な炎症性細胞の集簇を促し、ナノバブル破砕によるアジュバント効果が期待できること、ナノバブル表層への抗体の組み込みが可能なこと、バブル内への抗原タンパクや遺伝子、あるいはアジュバント分子の封入が可能であることなど、本研究を推進する上で極めて重要な知見を得ることができた。しかし、ナノバブルと超音波を用いた分子導入法においては、導入効率の低さが問題になる可能性が考えられた。そこで、1回のトランスフェクションで100日以上もタンパク発現が可能な長期発現プラスミドDNAをナノバブルと超音波を用いて導入するシステムを開発し、従来の分子導入法の導入効率の低さの問題を解決することが可能となった。しかしその一方で、生体内での持続的なウイルス抗原の産生は、高グロブリン血症や免疫複合体病等の誘発の可能性も考えられることから、今後は、タンパク発現量の増大のみならず発現タンパクの制御法の検討も必要かと思われる。ワクチン開発に応用できるナノバブルの優れた特質は、ナノバブルに標的細胞に特異的な抗体やリガンドを組み入れ、かつ抗原分子や抗原遺伝子をバブルに内包させることにより、細胞標的性を持ったドラッグデリバリーシステムの担体として利用できる点と、非ウイルス性の遺伝子導入ベクターとして利用できる点にある。さらに、ナノバブルは構造的コンプライアンスから、副刺激分子や共刺激モジュレーター等を抗原分子や抗原遺伝子とともに運搬することが可能である。平成19年度においては、強力な抗原提示細胞である樹状細胞に対して標的性をもたせるために、バブル表層に抗CD11c抗体などを組み込み、,ワクチン誘導のための抗原タンパクや遺伝子を封入した機能性標的型バブルの作製を想定したバブルモデルを作製した。また、このバブルの体内分布の超音波画像でのモニタリングや生体細胞への遺伝子導入効率、さらには、超音波照射とバブル破砕時の組織障害の程度、それに伴なう炎症性細胞浸潤の程度などを検討した。その結果、静脈注射によりバブルがリンパ節に流入し、リンパ節内の樹状細胞に抗原タンパクや遺伝子の導入の可能性であること、バブル破砕時の超音波の強さを調節することにより、照射部に適度な炎症性細胞の集簇を促し、バブル破砕によるアジュバント効果が期待できること、ナノバブル表層への抗体の組み込みが可能なこと、バブル内への抗原タンパクや遺伝子、あるいはアジュバント分子の封入が可能であることなど、本研究を推進する上で極めて重要な知見を得ることができた。これまで我々は、強力な抗原提示細胞である樹状細胞に対して標的性をもたせるために、バブル表層に抗CDllc抗体などを組み込み、ワクチン誘導のための抗原タンパクや遺伝子を封入した機能性標的型バブルの作製を想定したバブルモデルを作製した。

その結果、静脈注射によりバブルがリンパ節に流入し、リンパ節内の樹状細胞に抗原タンパクや遺伝子の導入が可能であること、バブル破砕時の超音波の強さを調節することにより、照射部に適度な炎症性細胞の集積を促し、バブル破砕によるアジュバント効果が期待できること、ナノバブル表層への抗体の組み込みが可能なこと、バブル内への抗原タンパクや遺伝子、あるいはアジュバント分子の封入が可能であることなど、本研究を推進する上で極めて重要な知見を得ることができた。しかし、ナノバブルと超音波を用いた分子導入法においては、導入効率の低さが問題になる可能性が考えられた。そこで、平成20年度においては、1回のトランスフェクションで100日以上もタンパク発現が可能な長期発現プラスミドDNAをナノバブルと超音波を用いて導入するシステムを開発し、従来の分子導入法の導入効率の低さの問題を解決することが可能となった。しかしその一方で、生体内での持続的なウイルス抗原の産生は、高グロブリン血症や免疫複合体病等の誘発の可能性も考えられることから、今後は、タンパク発現量の増大のみならず発現タンパクの制御法の検討も必要かと思われる。
前鰓類におけるレチノイドX受容体の機能解析:雄性生殖器の分化・成長との関係

前鰓類におけるRXRの機能解析を雄性生殖器の分化・成長との関係に着目して実施した。フィールドでの定期採集によりRXR遺伝子発現と雄性生殖器の発達の季節変化を示し、室内実験によりTBT曝露に伴うペニス形成部位の形態変化とRXR遺伝子発現の経時変化を示した。免疫染色によりRXRが前鰓類に広く分布することを示した。筋肉注射試験の結果、9-cisレチノイン酸の効果にも種差は見られないと考えられた。生殖輸管の分化・形成機序を組織学的に解析した。有機スズ汚染が比較的軽微な茨城・平磯で2006年4月2007年3,月まで毎月イボニシを採集し、雄のペニス長、精巣重量及び頭部神経節重量を測定し、相対ペニス長(RP)、精巣重量指数(GSI)、相対頭部神経節重量(RG)を算出して季節変動を調べた。また組織標本を作製し、HE染色及びRXR抗体を用いた免疫染色を施した。4個体分のペニス、精巣及び頭部神経節の各組織をcomposite sampleとして、それぞれ5検体(20個体分)についてRXR遺伝子発現量(RXR gene)を定量的RT-PCR法を用いて測定した。雄のRPは47月に増大したが、8月に3分の1程度に急減し、910月に回復して、以後、概ね横ばいに推移した。一方、GSIは46月まで増大したが、7月から減少に転じて9月に最低水準となり、123月に徐々に回復した。HE染色した組織標本でも、ほぼ同様の組織の発達と退行が観察された。平磯のイボニシは78月に交尾・受精し、産卵すると考えられた。RGでは明瞭な経月変化が観察されなかった。一方、ペニスのRXR geneは48月に上昇し、9月に横ばいとなり、10月に再上昇して、以後、3月まで漸減した。精巣及び頭部神経節のRXR geneはペニスにおけるそれの1/101/5程度であり、経月変化は不明瞭であった。イボニシ以外の種(レイシガイ、ヨーロッパチヂミボラ及びヨーロッパアラムシロガイ)のペニス、精巣、卵巣、消化腺及び頭部神経節にHE染色とRXR抗体による免疫染色を施し検鏡した結果、程度の差はあったが、いずれの種もイボニシと同様にRXR抗体で染色された。RXRは前鯉類の種に広く分布し、共通の機能を有していると考えられた。今後、輸精管の形成機序との関係や種差などについて検討を進める。本研究では、RXRの機能解析を、雄性生殖器の分化・成長との関係に着目して実施した。具体的には、1)TBT曝露に伴うイボニシのペニス形成部位の形態観察及び遺伝子発現の経時観察、2)イボニシにおけるペニスの成長や退縮に関わる遺伝子の探索、3)全生活環での飼育技術が確立されているバイにおける生殖輸管形成機序の観察、4)バイにおけるRXRの組織内分布の検討並びにイボニシとの比較、5)ヨーロッパチヂミボラ及びヨーロッパアラムシロガイに対する9-cis溶レチノイン酸(9CRA)の効果を検討した。1)と2)については、佐渡産イボニシに対するTBTの筋肉注射試験を実施し、1,2及び4週間後に取り上げて採材(雌では右触覚後部のペニス形成部位から陰門に至る部位を4分割、雄ではペニスから摂護腺に至る同部位を4分割)して、ペニス及び輸精管の分化・成長過程におけるRXR遺伝子発現の経時変化を追跡し、解析した。また、イボニシ試料を用いた他の核内受容体、RXR標的遺伝子、下流に存在すると見られるペニス成長因子などの検索も進めた。3)について、鳥取県栽培漁業協会のご好意・ご協力を得て、2007年級群について孵化後半年毎にバイ種苗の提供を受け、継続して成長の追跡と性分化過程の解析を進めた。その結果、イボニシと異なり、バイでは生殖器官の分化がかなり遅いことが明らかとなった。4)について、バイにおいてもイボニシなどとほぼ同様の結果を得た。5)について、ポルトガル・アベイロ大学との共同研究として、ヨーロッパ産前鰓類2種(ヨーロッパチヂミボラ及びヨーロッパアラムシロガイ)に対する9CRAの筋肉注射試験を実施し、両種ともに陽性と見られる結果を得た。