hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地震性断層運動に伴う炭素物質の生成・改変と炭素物質による断層強度弱化過程の解明

試験後の分析から,断層面上にグラファイトが生成していることが明らかとなった,このことは,高速摩擦に起因した高温の気相反応によってグラファイトが無機的に生成したことを示す.本実験結果は,断層深部で推定される還元環境下での地震時の現象を理解する上で先駆けとなる.以上の研究は,複数の作用によって断層内部にグラファイトが濃集しうること,10vol%以上に濃集したグラファイト(例えば跡津川断層系)によって断層の強度が顕著に低下しうることを明確に示した.同時に,様々な造構場における国内外の断層からもグラファイトの存在が見いだされており,本研究で明らかにしたグラファイトの濃集とそれによる断層強度低下は,世界中の断層の地震地質学的理解に影響を及ぼすものと考えられる.
モチリン受容体のリガンド結合部位の同定に関する研究

【目的】モチリンおよびモチリン受容体は,消化管運動機能に重要な役割を果たしている。申請者は,モチリンのPhe^1がモチリン受容体の第一,第二細胞外ループに結合すること,第二細胞外ループのうちのperimembranousなVal^<179>,Leu^<245>,Arg^<246>に結合することを明らかにしてきた。今回,photoaffinity labeling法およびreceptor mutagenesis法を用いての解析,またヒト消化管におけるモチリン受容体の発現様式の解析から,リガンド-受容体結合機構のさらなる解明を行った。【方法】(1)モチリンのPhe^5をphotolabileなBpa^5に置換したモチリンアゴニストを用いた受容体結合部位の同定,(2)モチリン受容体のN末端枝,第一,第三細胞外ループの変異受容体を用いた結合部位の同定,(3)ヒト消化管におけるモチリン受容体mRNA発現をreal time RT-PCR法で,蛋白発現を特異的ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学法で解析した。【結果】(1)Bpa^5-モチリンは受容体の第三細胞外ループのPhe^<332>に結合した。(2)モチリン受容体のN末端枝のCys^<25>,Cys^<30>,第一細胞外ループのCys^<111>,第二細胞外ループのCys^<235>はモチリンおよびエリスロマイシン作用発現に必須であり,またperimembranousなGly^<36>,Pro^<103>,Leu^<109>,Phe^<332>はモチリン結合および作用発現に必須であった。(3)下部食道から遠位側大腸までの全消化管においてlong form typeのモチリン受容体が筋層の筋細胞および筋層間神経叢に強く発現していた。【結論】モチリン受容体のすべての細胞外ドメインはリガンド結合に必須であること,ヒト全消化管にモチリン受容体は発現しており,モチリン受容体アゴニストが消化管運動機能異常症の治療に応用できることを明らかにした。(目的)モチリンおよびモチリン受容体は,消化管運動機能に重要な役割を果たしている。申請者は,モチリンのN末端のPhe^1がモチリン受容体の第一,第二細胞外ループに結合すること,モチリンのPhe^5が第三細胞外ループに結合すること,第二細胞外ループのうちperimembranousのVal^<179>,Leu^<245>,Arg^<246>がモチリン結合に重要であること,を明らかにしてきた。今回,モチリン受容体におけるリガンド結合部位のさらなる同定を目的として,第二細胞外ループ以外の細胞外ドメインの解析を行なった。(方法)モチリン受容体のN末端枝,第一細胞外ループ,第三細胞外ループの1ないし6アミノ酸残基を連続性に欠失させた変異受容体,あるいは1アミノ酸残基をAlaに置換した変異受容体を作成し,COS細胞に一過性に発現させ,モチリン結合能を131-I標識モチリンの競合的結合解析で,またモチリンあるいはエリスロマイシン刺激による細胞内カルシウム濃度変化をFURA-2-AM系で,測定した。

(結果)モチリン受容体のN末端枝ではCys^<25>,Cys^<30>,Gly^<36>が,第一細胞外ループではPro^<103>,Leu^<109>,Cys^<111>が,第三細胞外ループではPhe^<332>が,それぞれ変異した受容体において,モチリンとの結合能が低下し,モチリン刺激による細胞内カルシウム反応が低下した。これらのアミノ酸残基が変異した受容体のうち,Cys以外のアミノ酸残基の変異はエリスロマイシンの作用発現には関与しなかった。(結論)モチリンはモチリン受容体のN末端枝,第一,第二,第三細胞外ループのperimembranousのアミノ酸残基に結合すること,モチリン受容体のN末端枝内の2個のCys残基と第一,第二細胞外ループ内のCys残基は,機能発現に重要であること,ペプチドリガンドのモチリンと非ペプチドリガンドのエリスロマイシンの結合部位は異なることが明らかになった。(目的)モチリンおよびモチリン受容体は,消化管運動機能に重要な役割を果たしている。申請者は,モチリンがモチリン受容体のN末端枝,第一,第二,第三細胞外ループのperimembranousのアミノ酸残基に結合すること,モチリン受容体のN末端枝内の2個のCys残基と第一,第二細胞外ループのCys残基は機能発現に重要であること,ペプチドリガンドのモチリンと非ペプチドリガンドのエリスロマイシンの結合部位は異なることを明らかにしてきた。今回,ヒト消化管におけるモチリン受容体のmRNA発現と蛋白発現を解析し、リガンド-受容体結合の機構のさらなる機構の解析を行った。(方法)研究への同得の得られた手術患者あるいは病理解剖が施行された患者19例を対象に,全消化管から一部は全層,一部は粘膜層と筋層に分離して組織を採取した。モチリン受容体特異的なprimerを設定し,real time RT-PCRで定量を行った。またモチリン受容体の第二細胞外ループを認識するポリクローナル抗体を作成後,酵素抗体間接法にて消化管組織の染色を行った。(結果)下部食道から遠位側大腸までの全消化管において,モチリン受容体は,long form typeのみが発現し,short form typeは発現していなかった。全消化管において,部位による発現差異は見られなかったが,筋層では粘膜層に比べて10-100倍多く発現していた。筋層内では,筋細胞の細胞膜,細胞質とともに筋層間神経叢にも強く発現していた。(結論)全消化管にモチリン受容体は発現しており,モチリンが全消化管運動に関与していること,モチリン受容体アゴニストが全消化管機能異常症の治療に応用できることを明らかにした。
スイッチング電源解析用高速CADシステムの開発

本研究の目的は、スイッチング電源解析用CADシステムを構築することであり、成果は以下の通りである。まず、コンピュータ用のアルゴリズムを導出した。従来の方法とは全く異なる独自のスイッチング電源専用のアルゴリズムを採用したため、従来のSPICE系シミュレータと比較して数十倍から数百倍の高速性を実現している。次に、シミュレータプログラムを作成した。このとき、スイッチング電源解析用には独自の汎用ライブラリを構成し、ユーザーインターフェース部には市販のライブラリを利用した。これらの、ライブラリ,シミュレータはオブジェクト指向を導入しており、このことにより、将来、プログラムの変更,改良が容易に行えるようになっている。これらのライブラリ,シミュレータについては、別記のとおり研究報告を行い、論文としても電子情報通信学会に投稿中である。次に、このシミュレータを利用して、実際にスイッチング電源の解析を行い、実験データと比較してその妥当性を確認した。さらに、現在、研究中のスイッチング電源に適用し、その過渡応答に関して新しい知見を得たので別記のとおりPESC国際学会に投稿し、発表を本年6月に行うことが確定している。最後に、このシミュレータをいくつかの企業,大学に配布し、意見やバグ報告を行ってもらい訂正を行った。このシミュレータは、まだ、拡張すべ点があり、現在これらの改良に取り組んでいる。
出産・育児期における離職および育児休業を含む休業形態選択に関する男女比較

本研究では、(1)男性における育児のための休業形態の選択、(2)子の看護のための休業形態の選択、(3)出産・育児期における女性の離職率の分析の3分析を行う予定である。平成30年度は、(2)の研究に関する予備分析を行い、その後、執筆していた論文「子の看護休暇の取得要因に関する分析」が完成し、査読論文として『阪南論集社会科学編』に掲載された。また、(3)の研究に関する予備分析を行い、執筆していた論文「育児休業取得後の復職率に関する分析」が、査読論文として『経済政策ジャーナル』に掲載された。(1)と(3)の研究に関しては、育児中の男女を調査対象とし、聞き取り調査を複数回実施した。様々な職種、育児環境の人を調査対象としているため、聞き取り調査の内容をグループ分けして整理する作業を行っている。調査により得られた情報は、分析の変数および分析方法の決定に有益なものであった。しかしながら、(1)の研究は男性の育児環境に関する分析を予定しており、事例が多くはない。データの単純集計の結果においても、今のところ有意なものが得られていない。本研究では(1)男性における育児のための休業形態の選択、(2)子の看護のための休業形態の選択、(3)出産・育児期における女性の離職率の分析の3分析を行う予定であるが、今年度は全般的に遅れ気味となった。平成30年度に入ってから、同居家族が2度に渡り入院し、その介護のために当初の予定より研究に遅れが生じてしまったことと、30年度から副学長の任に就き、その職務遂行に時間をとられたことが理由である。こうした複合的な理由により研究に遅れが生じてしまったため、1年間、補助事業期間を延長した。次年度は、(2)子の看護のための休業形態の選択の分析結果をまとめ、執筆を完成させたい。また(3)出産・育児期における女性の離職率の分析については、集計結果をまとめ、執筆へと進展させる予定である。一方、(1)男性における育児のための休業形態の選択の研究に関しては、集計結果が予想とは異なるものが算出されており、今後、聞き取り調査等を行って分析方法や用いる変数の見直しを図っていく。本研究では、(1)男性における育児のための休業形態の選択、(2)子の看護のための休業形態の選択、(3)出産・育児期における女性の離職率について実証分析を順に行う予定である。平成26年度は、(1)の研究において、厚生労働省が委託調査した『平成23年度育児休業制度等に関する実態把握のための調査』の労働者アンケート調査票の個票データを用いて、末子妊娠時に育児休業、年次有給休暇、配偶者出産休暇のそれぞれを取得する男性の企業属性や就労環境、育児支援策の利用状況などを検証する予定であったが、その分析に先だって、予備研究として、厚生労働省が実施した『平成20年度雇用均等基本調査』の個票データを用い、男性労働者の配偶者出産休暇の取得を促す規定や支援は何かを実証分析によって明らかにし、求められる制度のあり方について考察した。分析によって明らかになったのは以下の4点である。第一に、配偶者出産休暇を有給または一部有給で取得できる場合、配偶者出産休暇の取得を促し、その効果は大きい。第二に、取得可能日数が6日以上と比較して、15日の場合において配偶者出産休暇の取得が促される。第三に、育児休業中に会社や共済会等から一時金等が支給される場合、配偶者出産休暇の取得が抑制される。第四に、所定外労働が免除される場合、配偶者出産休暇を取得しない傾向がある。以上の分析結果をもとに論文を作成し、現在、研究雑誌へ投稿中である。また、(2)の研究で用いる『平成20年度両立支援に係る諸問題に関する総合調査』の個票データは現在、利用申請中である。入手後は速やかに分析に着手する予定である。当初は、(1)の研究から行う予定であったが、(2)の研究から着手している。(2)の研究は厚生労働省が委託調査した『平成20年度両立支援に係る諸問題に関する総合的調査』の個票データを用いて、子どもが病気にかかり仕事を休む必要が生じたときの休業形態の選択要因を探るというものである。データからは家計に関する情報を得ることができる。よって、子の看護休暇以外の年休や欠勤も含めた休業形態の選択を視野に入れて分析することが可能になる。現在、(2)の研究で用いる個票データを入手し、変数作成と変数加工を終了し、変数の分布の確認作業に入っている。具体的には、子の病気時に本人が休んだ場合の休業形態別グラフをはじめとしたグラフ作成や記述統計量などを算出している。また、並行して、(2)の研究の予備研究として、厚生労働省が実施した『平成20年度雇用均等基本調査』の個票データを用いて「子の看護休暇の取得要因に関する分析」を行い、その分析結果を取りまとめ、現在、執筆中である。さらに、(3)の研究に関連して、「介護離職ゼロはどうすれば実現できるか」というタイトルで原稿を執筆し、日本評論社の『経済セミナー2016年4・5月号』に掲載された。なお、この原稿は、日本経済新聞(2016年4月24日朝刊)の「経済論壇から」に取り上げられた。

本研究では、(1)男性における育児のための休業形態の選択、(2)子の看護のための休業形態の選択、(3)出産・育児期における女性の離職率の分析の3分析を行う予定で、すでに(2)の分析に用いるデータを取り寄せてデータの加工を終了している。現在、そのデータの分布を確認しているが、予想以上に各変数が複雑に関連しており、方向性を見出すのに時間を要している。よって到達度からみると、やや遅れているといえる。本研究では、(1)男性における育児のための休業形態の選択、(2)子の看護のための休業形態の選択、(3)出産・育児期における女性の離職率の分析の3分析を行う予定である。28年度は、主として(2)の研究を行っている。(2)の研究は、厚生労働省が委託調査した『平成20年度両立支援に係る諸問題に関する総合的調査』の個票データを用いて、子どもが病気にかかり仕事を休む必要が生じたときの休業形態の選択要因を探るというものである。現在、(2)の研究は基礎的な集計と分析結果の検証は終了し、論文執筆に取りかかっている。また、(2)の研究と関連して、厚生労働省が実施した『平成20年度雇用均等基本調査』の個票データを用いて「子の看護休暇の取得要因に関する分析」の論文も現在、執筆中である。子の看護休暇の取得率や取得日数に影響を与える要因について、勤務時間に関する制度・措置や、有給かどうか、また子の看護休暇の規定があるかどうかなどに特に着目して分析している。さらに、(1)の研究の予備研究である「配偶者出産休暇の取得を促す要因分析」が、『阪南論集社会科学編』第52巻、第1号に掲載された。本稿では、厚生労働省が実施した『平成20年度雇用均等基本調査』の個票データを用い、男性労働者において配偶者出産休暇の取得を促す規定や支援は何かを実証分析によって明らかにし、求められる制度のあり方などについて考察している。本研究では、(1)男性における育児のための休業形態の選択、(2)子の看護のための休業形態の選択、(3)出産・育児期における女性の離職率の分析の3分析を行う予定で、すでに(2)の分析は集計結果、分析等は終了し論文の執筆に入っている。また、(1)の予備研究である「配偶者出産休暇の取得を促す要因分析」も論文として掲載されるに至ったが、全体的にみた到達度からすると、やや遅れているといえる。29年度は、(2)と(3)の研究を主として行った。(2)の研究の予備分析として、「子の看護休暇の取得要因に関する分析」を行った。厚生労働省が実施した『平成20年度雇用均等基本調査』の個票データを用い、被説明変数には小学校就学前の子を持つ労働者における子の看護休暇取得者割合を用いてトービット・モデルにより推定を行った結果、看護休暇中の賃金が有給または一部有給の場合、取得率が上昇し、取得日数も多くなるなどのことが明らかとなった。現在は論文の執筆を終了し、査読論文として投稿中である。また、(3)の研究の離職率に関連する予備分析として、「育児休業取得後の復職率に関する分析」を行った。予定通り職場復帰を果たせる労働者が多い企業の職場環境や導入している育児支援策を明確にし、休業取得後にスムーズに職場復帰するための制度や政策を探ることを目的としている。
グラフ構造の分布情報とグラフ項の論理プログラムによる形式グラフ言語学習理論の研究

本研究課題では、形式グラフ言語の分布学習アルゴリズム技術の基盤整備のために、形式グラフ言語の質問学習と正例からの帰納推論について研究を行った。本年度は、グラフ言語のサブクラスである木言語に対して、その表現クラスである項木パターンクラスのパターン照合問題に関する計算量理論的階層構造の解明と線形時間質問学習アルゴリズムの設計と解析に関する研究を行い、次の成果を得た。無順序項木パターンとは、任意の無順序木を代入できる構造的変数を内部に持つ無順序木構造である。本研究課題では、無順序項木パターンと無順序木が与えられたとき、前者が後者に照合するか否かを判定する問題について、無順序項木パターンに現れる多次元変数の次元に関する計算量理論的考察を与え、変数が定数次元のときに多項式時間で動作するパターン照合アルゴリズムを提案し、アルゴリズムの正当性の証明と計算時間の解析を行った。計算論的学習理論における学習モデルの一つに質問学習モデルがある。この質問学習モデルにおいて、正則パターン言語のクラスは、1つの正例から多項式回数の所属性質問を用いて質問学習可能であることが示されている。この結果を拡張し、本研究課題では、1つの正例と線形回数の所属性質問を用いて正則パターン言語のクラスを同定する質問学習アルゴリズムを提案し、その正当性を証明した。応用課題として、グラフ構造化データからの知識獲得に関する結果を得た。ブロック保存型外平面的グラフパターンは、構造化変数を有するグラフ構造パターンであり、外平面的グラフとしてモデル化されたグラフデータの特徴的なグラフ構造を表すのに適している。そこで、特徴的なグラフ構造を具体的に表現するために、正と負の外平面的グラフデータから、グラフパターン集合を個体とした2段階進化学習法によりブロック保存型外平面的グラフパターンの特徴セットを求める学習法を提案した。平成30年度の研究計画では、形式グラフ言語のグラフ理論的グラフクラスの階層構造における位置づけの解明を行うこととしていた。本年度は、この計画に沿って、グラフパターン照合問題等、グラフ学習における重要な計算問題に焦点をあてた計算量理論的階層構造の解明を行なった。さらに、計算論的学習における主要な学習モデルの一つである質問学習モデルを用いて、順序木パターンクラスの効率的な学習に適用可能な基礎的アルゴリズム技術の開発を行なった。したがって、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。文脈自由な形式グラフ体系およびその拡張形式グラフ体系に対する多項式時間機械学習の研究を研究代表者・研究分担者が分布学習の観点から共同で推進する。また、正例からの帰納推論と質問学習を並行して議論することで、形式グラフ言語の学習アルゴリズムの設計に必要な技術を明らかする。これらに加え、グラフマイニングにおける重要な計算問題に焦点をあてた計算量理論的階層構造の研究を行いつつ、一方で計算量理論的な効率の良さにこだわらず、積極的に確率的・近似的・発見的手法を取り入れ、実社会で使える技術の構築を目指す。本研究の目的は、文脈自由言語の学習における分布学習を、文脈自由グラフ言語を含む形式グラフ言語に拡張して、グラフ構造の分布情報とグラフ項の論理プログラムを用いる形式グラフ言語学習理論を構築することである。本年度は、順序木言語を生成する形式グラフ体系の質問学習、効率的正準表現を持つグラフ言語の正例からの帰納推論の2つのテーマで研究を展開し、次の成果を得た。プリミティブ形式順序木体系(pFOTS)とは、ラベル付き順序木言語を定義する形式体系であり、1階述語論理の項の代わりに構造的変数を持つ木構造パターンを用いた論理プログラミングシステムである。pFOTSプログラムは、確定節であるグラフ書き換えルールの有限集合として定義される。そのため、pFOTSプログラムは順序木言語の背景知識の表現に適している。質問学習モデルは、計算論的学習理論における質問を用いた学習の数学的モデルである。本研究では、pFOTSプログラムによる背景知識と1つのグラフ書き換えルールで定義される順序木言語のクラスが、1つの正例と多項式回の所属性質問を用いた質問学習モデルにより学習可能となる背景知識の条件を示した。Cographとよばれるグラフクラスは、複数の頂点から2つのグラフ操作を再帰的に適用してグラフを構成して得られる。そのグラフ構成手順は、2つのグラフ操作を頂点ラベルとする根付き木として表現できる。本研究では、Cographが正例から多項式時間帰納推論可能であることを厳密に証明した。また、Cographを拡張したいくつかのグラフクラスに対する正例から多項式時間帰納推論可能性を研究した。平成29年度の研究計画では、形式グラフ体系の分布学習モデルの設計と計算論的学習の評価のための理論展開と基盤整備を行うこととしていた。本年度は、この計画に沿って、順序木言語を生成する形式グラフ体系の質問学習、効率的正準表現を持つグラフ言語の正例からの帰納推論の2つのテーマで研究を展開し、研究成果を発表した。

本研究課題では、無順序項木パターンと無順序木が与えられたとき、前者が後者に照合するか否かを判定する問題について、無順序項木パターンに現れる多次元変数の次元に関する計算量理論的考察を与え、変数が定数次元のときに多項式時間で動作するパターン照合アルゴリズムを提案し、アルゴリズムの正当性の証明と計算時間の解析を行った。計算論的学習理論における学習モデルの一つに質問学習モデルがある。この質問学習モデルにおいて、正則パターン言語のクラスは、1つの正例から多項式回数の所属性質問を用いて質問学習可能であることが示されている。この結果を拡張し、本研究課題では、1つの正例と線形回数の所属性質問を用いて正則パターン言語のクラスを同定する質問学習アルゴリズムを提案し、その正当性を証明した。応用課題として、グラフ構造化データからの知識獲得に関する結果を得た。ブロック保存型外平面的グラフパターンは、構造化変数を有するグラフ構造パターンであり、外平面的グラフとしてモデル化されたグラフデータの特徴的なグラフ構造を表すのに適している。そこで、特徴的なグラフ構造を具体的に表現するために、正と負の外平面的グラフデータから、グラフパターン集合を個体とした2段階進化学習法によりブロック保存型外平面的グラフパターンの特徴セットを求める学習法を提案した。平成30年度の研究計画では、形式グラフ言語のグラフ理論的グラフクラスの階層構造における位置づけの解明を行うこととしていた。本年度は、この計画に沿って、グラフパターン照合問題等、グラフ学習における重要な計算問題に焦点をあてた計算量理論的階層構造の解明を行なった。さらに、計算論的学習における主要な学習モデルの一つである質問学習モデルを用いて、順序木パターンクラスの効率的な学習に適用可能な基礎的アルゴリズム技術の開発を行なった。したがって、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。文脈自由な形式グラフ体系およびその拡張形式グラフ体系に対する多項式時間機械学習の研究を研究代表者・研究分担者が分布学習の観点から共同で推進する。また、質問学習と正例からの帰納推論を並行して議論することで、形式グラフ言語の学習アルゴリズムの設計に必要な技術を明らかする。これらに加え、グラフマイニングにおける重要な計算問題に焦点をあてた計算量理論的階層構造の研究を行う。また、正例からの帰納推論と質問学習を並行して議論することで、形式グラフ言語の学習アルゴリズムの設計に必要な技術を明らかする。これらに加え、グラフマイニングにおける重要な計算問題に焦点をあてた計算量理論的階層構造の研究を行いつつ、一方で計算量理論的な効率の良さにこだわらず、積極的に確率的・近似的・発見的手法を取り入れ、実社会で使える技術の構築を目指す。物品費、国際会議の旅費・参加費及び論文投稿料等、おおむね計画通りに使用している。
増分伝達マトリクス法と動的応答実験を併用した計算システムに関する研究

本研究の実績を要約すると以下のようになる〔1〕増分伝達マトリクスの数値計算上の安定性と誤差評価研究ではまず増分伝達マトリクスの安定性を調べた。大マトククス法では既に論じられている遂次積分法の安定性が伝達マトリクス法の併用で受ける影響に重点を置き調べた結果、数値計算上の安定性は大マトリクス法の場合のそれと差異の無いことが判明した。次に実験値で得られた応答を計算に使用するために、測定誤差による精度の評価を行った。その結果、測定誤差の計算への混入は、見かけ上の高周波の振動を応答上に重畳することが見出され、その対策として、時間ステップの適切な選択と軽減衰の使用の二つの方法提案し、いずれも大きな効果があることが確認された〔2〕増分伝達アトリクス法と応答実験結果を併用した解析法の確立解析が困難あるいは不利な機械構造の一部に対して、接続部分とその部分構造の境界条件を考慮して、変位もしくは加速度の測定点の数を定め、その応答実験値を増分伝達てマトククス法に採り入れて計算を行う方法を新たに提示し、計算プログラムを作成した。作成したプログラムで各種の計算を行いその妥当性と有効性を確認した。この解法によれば、幾何学的に複雑な形状を有する構造部分や塑性などの非線形性を有する構造部分も、その解析を直接行わないで、接続点、近傍の応答実験値を用いることで精度の高い解析を行うことができる。〔3〕提示した方法の適用と計算システムの開発上記〔2〕で提示した方法をさらに多くの構造モデルに適用し、計算効率、入出力の整備などの改良を加え、二次元骨組構造用の動的応答を計算する汎用プログラムを完成させた。本研究の成果は、日本機械学会の論文集に論文Aとして掲載されている。
齧歯類切歯のエナメル上皮幹細胞と歯乳頭間葉系幹細胞を用いた歯胚の再生

マウス形成端におけるエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞のnicheの構築において,間葉系幹細胞が発現する線維芽細胞増殖因子-10(Fgf-10)とエナメル上皮が発現するFgf-9の細胞増殖因子による相互作用が重要な働きをしていることが明らかとなった.切歯形成端の前頭断連続切片ではapical bud内のエナメルノット様構造物にFgf-9の発現が観察され,切歯の持続的成長と形態を制御するための新しい組織構造を見出した.Fgf-9の機能解析に,マウス形成端由来の不死化間葉細胞を数種類作製した.この細胞に対してFgf-9は強力な細胞増殖活性を示すと同時に細胞の分化を抑制することが明らかとなった.以上から,Fgf-9が切歯形成端間葉系幹細胞の維持に働いている可能性が示唆されたが,実際にはin vitroで切歯のエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞を維持するにはこれらの因子だけでは不十分であった.我々は様々な因子を検討した結果,切歯形成端の細胞をin vitroで維持する培養条件には,EGFとFGF2が必要であり,これらの因子を用いた無血清培地による不死化細胞樹立に成功した.エナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞の培養細胞あるいはsingle cellsuspensionをコラーゲンスポンジによって再構築して,腎被膜下に移植する実験を行った結果,良好な歯の形態は作り出すことができなかった.そこで,この材料に対してEGFとFGF2,FGF10,FGF9を徐放するゼラチンビーズを組み込んで腎被膜下に移植するとエナメル上皮の増殖を誘導することが可能となり,その結果切歯の再生に成功した.最終的には再生歯における形態や大きさをいかにして調整をするかについては現在も研究の進行中であり,今後の課題としたい.マウス形成端におけるエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞のnicheの構築において,間葉系幹細胞が発現する線維芽細胞増殖因子-10(Fgf-10)とエナメル上皮が発現するFgf-9の細胞増殖因子による相互作用が重要な働きをしていることが明らかとなった.切歯形成端の前頭断連続切片ではapical bud内のエナメルノット様構造物にFgf-9の発現が観察され,切歯の持続的成長と形態を制御するための新しい組織構造を見出した.Fgf-9の機能解析に,マウス形成端由来の不死化間葉細胞を数種類作製した.この細胞に対してFgf-9は強力な細胞増殖活性を示すと同時に細胞の分化を抑制することが明らかとなった.以上から,Fgf-9が切歯形成端間葉系幹細胞の維持に働いている可能性が示唆されたが,実際にはin vitroで切歯のエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞を維持するにはこれらの因子だけでは不十分であった.我々は様々な因子を検討した結果,切歯形成端の細胞をin vitroで維持する培養条件には,EGFとFGF2が必要であり,これらの因子を用いた無血清培地による不死化細胞樹立に成功した.エナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞の培養細胞あるいはsingle cellsuspensionをコラーゲンスポンジによって再構築して,腎被膜下に移植する実験を行った結果,良好な歯の形態は作り出すことができなかった.そこで,この材料に対してEGFとFGF2,FGF10,FGF9を徐放するゼラチンビーズを組み込んで腎被膜下に移植するとエナメル上皮の増殖を誘導することが可能となり,その結果切歯の再生に成功した.最終的には再生歯における形態や大きさをいかにして調整をするかについては現在も研究の進行中であり,今後の課題としたい.マウス形成端におけるエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞のnicheの構築において、間葉系細胞から分泌される線維芽細胞増殖因子-10(Fgf-10)が重要な働きをしていうことは既知のことである。しかし、現在のところ、Fgf-10の発現に関わる上皮の因子については不明であり、上皮-間葉相互作用を人工的に構築するためには、上皮からの因子解明は不可欠である。そこで、我々の樹立したエナメル上皮幹細胞株HAT-7とマウス下顎切歯apical bud(エナメル上皮幹細胞の存在場所)における遺伝子発現を網羅的に解析したところ、WntシグナルファミリーではWnt3a,-4,-5a,-5b,-7a,-7b,-10b,-11の7種類、FgfファミリーではFgf-1Fgf-4,Fgf-6,Fgf-8,Fgf-9の4種類が考えられた。そこで、これらのリコンビナントタンパクや強制的発現細胞の培養上清を用いて歯乳頭組織の器官培養系におけるFgf10の発現を検討した。この結果と過去の研究から、Fgf-9が最も有力な因子として考えられた。次に、apical bud周囲の歯乳頭由来の1次培養細胞にFgf-10プロモーターとβ-galをつないだベクターを遺伝子導入し、Fgf-10の発現に対するFgf-9の効果を検討した。その結果、Fgf-9はコントロール(ウシ血清)に比べて7倍、Fgf-2に比べて1.5倍のFgf-10発現細胞を誘導した。以上より、Fgf-10の発現には上皮組織からのFgf-9の分泌が重要な働きをしていることが明らかとなった。現在、Fgf-9の組織での発現の再確認、Fgf-10のレポーターアッセイ、中和抗体を用いた実験などによりさらに詳細に検討を進めている。また、Fgf-9を結合させるスキャホールドの検討して上皮-

間葉の相互作用を構築するとともに、Fgf-10とFgf-9の発現に関わる相互作用の詳細を検索する予定である。マウス形成端におけるエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞のnicheの構築において、線維芽細胞増殖因子-10(Fgf-10)が重要な働きをしている.昨年度の本研究課題の成果として,Fgf-10の発現に関わる上皮因子についてはFgf-9が最も有力な候補として考えられた。そこで,本年度Fgf-9の発現について免疫組織学的方法とin situ hybridization法によって検討した.その結果,上皮幹細胞の存在するapical budの基底細胞ならびに内エナメル上皮に発現を認めた.切歯形成端の前頭断連続切片ではapical bud内のエナメルノット様構造物にもFgf-9の発現が観察され,切歯の持続的成長と形態を制御するための新規の組織構造としての新しい知見を見出した.Fgf-9の機構を解析するために,マウス形成端由来の不死化間葉細胞を数種類作製した.この細胞に対してFgf-9は強力な細胞増殖活性を示すと同時に細胞の分化を抑制することが明らかとなった.これらの結果から,Fgf-9が切歯形成端間葉系幹細胞の維持に働いている可能性が示唆された.しかし,これらの細胞株はFgf-10の発現を維持していなかった.そこで、Fgf-10の発現制御機構を調べるため,Fgf-10上流の様々な長さのDNAにβ-galをつないだベクターを遺伝子導入したLacZトランスジェニックマウスの解析を現在行っている.一方、Fgf-10の発現にはFgf-9と共にWntシグナル系も重要な働きをしていることが知られているので,形成端に発現するWnt3aとWnt5aについてその機能を調べた.Wnt5a遺伝子欠損マウスは,極めて小さな切歯が形成され,Wnt5aが切歯の成長に重要な働きをしていることが明らかになった.しかし,切歯形成端のapical budは正常に形成されているのでFgf-10の発現を直接制御する因子とは考えられなかった.次年度は,Wnt3aの機能を解析も予定している.マウス形成端におけるエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞のnicheの構築において、問葉系幹細胞が発現する線維芽細胞増殖因子-10(Fgf-10)とエナメル上皮が発現するFgf-9の細胞増殖因子による相互作用が重要な働きをしていることが明らかとなった.切歯形成端の前頭断連続切片ではapical bud内のエナメルノット様構造物にFgf-9の発現が観察され,切歯の持続的成長と形態を制御するための新しい組織構造を見出した.Fgf-9の機能解析に,マウス形成端由来の不死化間葉細胞を数種類作製した.この細胞に対してFgf-9は強力な細胞増殖活性を示すと同時に細胞の分化を抑制することが明らかとなった.以上から,Fgf-9が切歯形成端間葉系幹細胞の維持に働いている可能性が示唆されたが,実際にはin vitroで切歯のエナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞を維持するにはこれらの因子だけでは不十分であった.我々は様々な因子を検討した結果,切歯形成端の細胞をin vitroで維持する培養条件には,EGFとFGF2が必要であり,これらの因子を用いた無血清培地による不死化細胞樹立に成功した.エナメル上皮幹細胞と間葉系幹細胞の培養細胞あるいはsingle cell
抗生物質の骨格構造を構築する新規ヘム酵素の触媒機構の分光学的・結晶構造学的解析

インドール含有抗生物質の骨格構造を決定する蛋白質について結晶構造解析を用いて研究を進めた。本年度は、ビオラセイン型骨格形成を行う酵素VioEの結晶構造解析と、トリプトファン代謝物からのビオラセイン型骨格とスタウロウスポリン型骨格両方の基となる産物を作るヘム蛋白質StaD及びそのホモログの結晶化に向けての発現・精製条件の検討を行った。酵素VioEは良好な結晶を得ることに成功し、SPring8のビームラインを用いて2.0Åでの構造解析に成功した。VioEは結晶構造中でダイマーを形成しており、それぞれのサブユニットは主に11本のβストランドで構成され、それらは野球グローブのような形の、一層の逆平行βシートを形成していることが明らかになった。各サブユニット中央には正電荷をもつポケットが存在していた。基質アナログとの複合体結晶構造解析と共同研究者による変異体解析結果から、この正電荷をもつポケットがVioEの活性部位であることを明らかにした。さらにドッキングシミュレーションを行い、その結果からVioEの酵素反応メカニズムを提唱した。酵素StaDはこれまで大腸菌による発現系を用いて作製していたが、本年度は共同研究者より提供された放線菌での発現系を用いて発現を行った。放線菌での発現と精製条件を検討した結果、放線菌の発現系で生産した蛋白質は、ヘムの含有量が大腸菌で発現させたものより高く、非特異な分解の程度も少ないので、結晶化サンプルとしてより適していることがわかった。これらのサンプルを用いた結晶化には残念ながら成功していない。これらのサンプルを用いた結晶化には残念ながら成功していないが、今後は、放線菌発現系を用いたStaDホモログ蛋白質の生成条件検索も合わせて行い、結晶化を目指していく。
空間の収束理論の視点による非正曲率空間の幾何構造の研究

本年度は昨年度に引き続き,非正曲率距離空間の構造の研究に取り組んだが,新たに得られた研究成果は以下の通りである.(1)1次元CAT(1)空間の直径剛性の研究.測地的完備な1次元CAT(1)空間でその直径が最小のπであるような空間の等長類を距離的に完全に分類した.本研究は局所的にR樹木の構造を許容するような1次元CAT(1)空間も捉えている所が特に新しい.尚,本研究内容は国内の複数の研究会で発表済みであり,研究論文(2)CAT(0)空間の放物的等長変換の固定点集合の研究.藤原氏(東北大・理)及び塩谷氏(東北大・理)と共同で,固有CAT(0)空間上の放物的等長変換の固定点集合の半径の評価と中心集合を研究した.尚,本研究内容は国内の複数の研究会で発表済みであり,研究論文を現在投稿準備中であり,その最終段階にある.(3)概最大階数2次元CAT(0)空間の構造の研究.本研究は現在進行中であるが,概最大階数2次元CAT(0)多面体の構造の超ベキ収束の観点からの研究成果を国内の研究会で発表した.研究論文としての執筆は次年度以降の予定である.最後に年度を通して国内での研究成果発表や研究者交流を積極的に行ったことを報告する.本年度の研究成果は以下の通りである.:まず今までの非正曲率距離空間の収束理論に関する研究成果が,研究論文2編として別記の通り,今年度出版の学術雑誌に掲載されたことを報告する.加えて本年度は,未解決であったあるリーマン多様体に対するコンパクト化の問題に対して,猿子氏(佐賀大.理工)と大塚氏(九大・数理)と共同で肯定的に完全に解決した.その中で得られた主な定理は次である定理.動径的に断面曲率がおよそ非負な完備,開Riemann多様体の漸近錐は点付きGromov-Hausdorff極限として存在する.さらに:(1)そのようなRiemann多様体は半直線の漸近関係を用いてコンパクト化可能であり幾何学的理想境界を持つ.(2)そのようなRiemann多様体の漸近錐は元の多様体の理想境界上のEu-clid的錐と等長的である.また年度を通して,国内の研究調査や研究者交流を積極的に行った.さらに,海外渡航として,本年度はサンクトペテルブルク(ロシア)で開催された国際研究集会「Second Russian-Geman Geometry Meeting」.に出席し研究打ち合わせを行った.本年度は昨年度に引き続き,非正曲率距離空間の構造の研究に取り組んだが,新たに得られた研究成果は以下の通りである.(1)1次元CAT(1)空間の直径剛性の研究.測地的完備な1次元CAT(1)空間でその直径が最小のπであるような空間の等長類を距離的に完全に分類した.本研究は局所的にR樹木の構造を許容するような1次元CAT(1)空間も捉えている所が特に新しい.尚,本研究内容は国内の複数の研究会で発表済みであり,研究論文(2)CAT(0)空間の放物的等長変換の固定点集合の研究.藤原氏(東北大・理)及び塩谷氏(東北大・理)と共同で,固有CAT(0)空間上の放物的等長変換の固定点集合の半径の評価と中心集合を研究した.尚,本研究内容は国内の複数の研究会で発表済みであり,研究論文を現在投稿準備中であり,その最終段階にある.(3)概最大階数2次元CAT(0)空間の構造の研究.本研究は現在進行中であるが,概最大階数2次元CAT(0)多面体の構造の超ベキ収束の観点からの研究成果を国内の研究会で発表した.研究論文としての執筆は次年度以降の予定である.最後に年度を通して国内での研究成果発表や研究者交流を積極的に行ったことを報告する.
回虫における酸素分圧応答蛋白群のプロテオーム解析

1.回虫成虫体壁および自活性線虫C.elegansのミトコンドリア蛋白のプロテオーム解析(1)大気圧下の好気的環境に生息する自活性線虫C.elegansと、宿主の腸腔という酸素分圧の低い環境に生息するブタ回虫の体壁から、高純度のミトコンドリアを単離する方法を確立した。(2)C.elegansとブタ回虫体壁からのミトコンドリア蛋白を二次元電気泳動で展開し、そのパターンを比較したところミトコンドリア蛋白の組成が両者間で著しく異なっていた。特に分子量45および31kDa付近において顕著な相違がみられた。C.elegansの蛋白の主要スポット18を切り出し、In-gel digestion後、質量分析計により解析した。C.elegans由来と確定された14スポットのうち11が、ミトコンドリアに局在する蛋白として同定された。そのうちわけをみると、ATP合成酵素のサブユニット(atp-2)、ヒートショックプロテイン(hsp-60)、プロピオニルCoAカルボキシラーゼのα、βサブユニット、TCA回路の構成酵素であるリンゴ酸脱水素酵素およびアコニターゼ、グルタミン酸脱水素酵素であった。また、ミトコンドリア外膜に局在するポーリン様の蛋白も見いだされている。2.回虫呼吸鎖複合体および酸化還元蛋白の分子特性解析(1)回虫成虫体壁のシトクロムb5前駆体を大腸菌で発現させたところ、native蛋白と同一な性質を有した蛋白がペリプラズムに輸送された。本蛋白はワンステップのイオン交換クロマトで精製され,大量調製に適した発現系である。(2)回虫L3複合体II CybSサブユニットの分子クローニングを行ったところ、成虫のものとは異なったものであることが明らかとなった。3.今後の展望:計画した項目は一部未達成であるが、上述のように、比較的少量の材料から高純度のミトコンドリアを調製する方法を確立し、ミトコンドリア蛋白を一部マッピングできたことの意義は大きく、今後,回虫成虫と幼虫の解析を飛躍的に進めたい。本研究ではブタ回虫を用い、酸素分圧に応答する蛋白群、とくにエネルギー生成系や、酸素代謝に直接関与する酸化還元系蛋白の発現制御を包括的に解析することによって、好気から嫌気的代謝への転換の分子機構を解明するのが目的である。そのため、エネルギー生成系の中心的オルガネラであるミトコンドリアと重要な酸化還元蛋白を対象とし、本年度は、1.回虫成虫体壁のプロテオーム解析2.感染幼虫と宿主肺から回収した幼虫のミトコンドリアのプロテオーム解析を立案した。以下に項目番号順に進行状況と実績概要を述べる。1.回虫成虫体壁(クチクラ層除去)のホモジェネートを作製し、未破砕の組織や核をふくむ分画を2800rpm,10minの遠心で除去したあと、その上清をさらに超遠心機をもちいて33000rpm 1hr遠心、顆粒分画と可溶性分画を得た。研究分担者らが開発した、凍結融解によって作製されるNycodenzの密度勾配遠心法により、顆粒分画をミクロゾームとミトコンドリアにさらに分画することを試みたところ、電顕形態的にほぼ均一な分画を得ることに成功した。

2.については感染幼虫の細胞分画を1.と同様な方法で行なったが、強靱なクチクラ層の存在のために組織破砕が十分でなく、成功するには至っていない。現在、微小な幼虫からクチクラ層をマイルドな条件で剥離する方法を検討中である。プロテオーム解析に必須なランドマーク蛋白であるシトクロムb_5の大腸菌による発現系については、論文が受理され印刷中である。本研究ではブタ回虫を用い、酸素分圧に応答する蛋白群、とくにエネルギー生成系や、酸素代謝に直接関与する酸化還元系蛋白の発現制御を包括的に解析することによって、好気から嫌気的代謝への転換の分子機構を解明するのが目的である。そのため、エネルギー生成系の中心的オルガネラであるミトコンドリアと重要な酸化還元蛋白を対象とし、本年度は、1.昨年度に確立したNycodenz密度勾配遠心法によって得られた、回虫成虫体壁ミトコンドリアを用いてのプロテオーム解析、および昨年度から引き継いだ2.感染幼虫と宿主肺から回収した幼虫のミトコンドリアのプロテオーム解析を計画した。以下に項目ごとに実績概要を述べる。1.回虫成虫体壁ミトコンドリア蛋白を一次元の等電点電気泳動(pH3-10Linear,11cm,22.5kVh)、二次元目のSDS-PAGE(10% gel,16.5x16.5cm,48mA-5hr)で展開し、分離した蛋白を銀染色で検出した。2.については感染幼虫の細胞分画を1.と同様な方法で行なったが、強靱なクチクラ層の存在のために組織破砕が十分でなく、成功するには至らなかった。そこで当初の計画を変更し、大量培養が可能で回虫感染幼虫と同様に好気的代謝を行う自活性線虫C.elegansを用いて細胞分画の条件を検討したところ、高純度のミトコンドリア分画を得ることに成功した。本分画をもちいて1.と同様な条件で二次元電気泳動をおこない、主要な蛋白スポットを選びin-gel digestion、質量分析計によってミトコンドリア蛋白の同定とマッピングを行った。C.elegansミトコンドリア蛋白の二次元電気泳動パターンは回虫成虫ミトコンドリアと比較して著しく異なっていることが明らかとなった。また、C.elegans由来であることが確定できた14スポットのうち11はミトコンドリアに局在する蛋白と同定できた。これまで解析したC.elegans由来の蛋白のうち、約80%がミトコンドリア局在の蛋白といえる。現在、他の主要なスポットを順次解析中である。
血液分析用MEMS型微小化学分析システムの構築

本研究では、血液ガス(O_2、CO_2、pH)分析用モジュール、血液電解質(K^+、Na^+、Cl^-)分析用モジュール、参照電極モジュールを積層し、血液分析目的とした微小化学分析システム(μTAS)の構築を行った。これらのセンシング機能を備えたシステムを単一基板上に実現するのは難しいが、モジュールに分けることにより、容易に高性能、高機能なシステムを実現した。特筆すべき点は、微小銀/塩化銀参照電極の構造、動作方式に検討を加え、耐久性を各段に高めた点である。銀薄膜全域をポリイミド層で覆い、使用中に連続的に塩化銀を成長することにより、従来に比べて2,000倍も寿命を延ばし、約300時間参照電極として機能させることができた。また、これを用いて液絡を有する汎用的な参照電極を作製した。これにより現実的な環境下で電位基準として使える参照電極が実現され、pHの他、K^+、Na^+、Cl^-などのイオンの測定が、この微小システム中だけで、独立して行えるようになった。これらのイオン電極の電位を、この参照電極モジュールと市販のマクロな参照電極を用いて測定し、比較したところ、最大でも数mV程度のずれしか認められなかった。また、酸素、二酸化炭素についても、明瞭な応答と、広範囲で直線性を有する検量線が得られた。これらのモジュールを用いて組み立てた微小システムを用い、上記の6つの項目をオンライン式に測定することができた。本研究では、これらのセンシングモジュールと並行し、送液用マイクロポンプの開発も進めた。電気化学的に水素ガスを発生・収縮させ、その圧力で、微小流路内のサンプル溶液の送液を行う。実際に可逆的にサンプル溶液を吸引・排出し、しかも送液速度を変えることができた。微小化学物質分析システム(μTAS)の有望な応用例として血液分析が考えられるが、高機能なシステムを実現するための現実的な手段として、その構成要素をモジュール化する方法が有力である。本年度は、血液ガスの測定を目的とし、Clark型酸素電極、Severinghaus型二酸化炭素電極、pH電極を集積化したモジュールを試作した。ガラス基板上にフォトリソグラフィーにより電極パターンを形成した。内部電解液用容器は、シリコン基板上に異方性エッチングにより形成した。これらのセンサの特性を評価したところ、酸素電極の出力電流値と酸素分圧、および二酸化炭素電極電位と二酸化炭素分圧の対数の間に直線的な関係が認められ、これらのマイクロセンサを用い、実際に酸素分圧、二酸化炭素分圧が測定可能であることが確認された。pH指示電極電位のpH依存性を調べたところ、Nernst的な関係が認められ、問題なくpH測定が行えることが示された。本研究で構築するμTASでは、液絡付き銀/塩化銀参照極を別のモジュールとする。本年度はここで使われる薄膜状銀/塩化銀の長寿命化についての検討も行った。塩化銀層の溶解を抑制するために、銀パターン全面をポリイミド層で被覆し、中央部のピンホールから薄膜内部に塩化銀を成長させた。また、塩化銀層は作製工程中で形成するのではなく、微小電流を流し続けるか、スタンバイ状態で使用直前に形成することとした。これにより、保存安定性に優れ、飽和KCl中でも長時間安定した電位を得ることができるようになった。

特筆すべき点は、微小銀/塩化銀参照電極の構造、動作方式に検討を加え、耐久性を各段に高めた点である。銀薄膜全域をポリイミド層で覆い、使用中に連続的に塩化銀を成長することにより、従来に比べて2,000倍も寿命を延ばし、約300時間参照電極として機能させることができた。また、これを用いて液絡を有する汎用的な参照電極を作製した。これにより現実的な環境下で電位基準として使える参照電極が実現され、pHの他、K^+、Na^+、Cl^-などのイオンの測定が、この微小システム中だけで、独立して行えるようになった。これらのイオン電極の電位を、この参照電極モジュールと市販のマクロな参照電極を用いて測定し、比較したところ、最大でも数mV程度のずれしか認められなかった。また、酸素、二酸化炭素についても、明瞭な応答と、広範囲で直線性を有する検量線が得られた。これらのモジュールを用いて組み立てた微小システムを用い、上記の6つの項目をオンライン式に測定することができた。本研究では、これらのセンシングモジュールと並行し、送液用マイクロポンプの開発も進めた。電気化学的に水素ガスを発生・収縮させ、その圧力で、微小流路内のサンプル溶液の送液を行う。実際に可逆的にサンプル溶液を吸引・排出し、しかも送液速度を変えることができた。
ペルオキシレドキシンIノックアウトマウスによる口腔癌リンパ節転移の解析

当該研究期間において、本研究では以下のような結果を得た。1)ジーントラップ法により得られたPrx I欠失ES細胞からPrxIノックアウトマウスを完成させた。これらをPCRによる選択と交配を繰り返し、C57BL/6とのバッククロスを進めた。2)マウスメラノーマ由来癌細胞株のB16細胞の系を用いて、マウスフットパッドに腫瘍細胞1×10^5個ずつを移植し、Prx Iノックアウトマウスとワイルドタイプマウスの転移実験の比較をおこなったところ、Prx Iノックアウトマウスでは、ヘテロタイプ、ワイルドタイプとPrxIの発現が消失していく順に腫瘍細胞は生育せず、腫瘍の消失する現象が見られた。3)これらの結果を確認するためC57BL/6とのバッククロスを5代以上繰り返しマウスのゲノムのバックグラウンドをそろえ、確認実験を行ったところ腫瘍は浸潤性に増殖しリンパ節へ転移し、6週間後には肺に転移が見られたが、Prx Iノックアウトマウスとワイルドタイプマウスの間には有意な差が認められなかった。4)細胞株をLLC細胞に変え、3×10^6個ずつ、それぞれワイルドタイプ、ノックアウトヘテロタイプ、ホモタイプマウスに移植し、移植部の腫瘍の大きさ、膝のリンパ節転移、肺への転移の数を5週後に測定したが、明らかな差がみられなかった。5)マトリゲルに混入したB16細胞をマウスの皮下に移植し、血管増生能をしらべたところ、血管増生能には明らかな差が見られなかった。6)一方、Prx Iと同じNrf2制御下でまたA170などのストレスタンパク質の動態をユビキチン化の観点からの検討を加え、Prx Iマウスの実験の基礎とした。7)また、Prx Iノックアウトマウスが赤血球に異常を生じることから、同様に血球の変異が現れるGATA-1転写因子についても、トランスジェニックマウスを用いての検討をおこなった。本年度は以下の要領で研究を進めた。ジーントラップ法によりMolony白血病ウイルスベクターを介して遺伝子内のエクソンにランダムに挿入されたクローンの選択をオムニ社のデータベース上で検索をおこなったところ、その中でMSP23=マウスペルオキシレドキシンI(Prx I)のエクソン3と4の間に部分に変異の入ったES細胞が存在することが確認された。このクローン(OST4226)を選択し、交配後のメスマウスの子宮から取り出したブラストシストにインジェクションをおこない、偽妊娠させたICRマウスの子宮内にシストブラストを移植しキメラマウスを得た。このオスのキメラマウスにOYC-22マウスをかけ合わせ、ヘテロマウスを製作した。これらをかけ合わせ、ノックアウトホモマウスを完成させた。さらに、C57/B6マウスへのバッククロスを開始し、バックグラウンドの統一を始めた。ジェノタイプの決定はPCRでおこなうこととし、次年度からの実験に使用するノックアウトマウスについては、おおよその準備が整った。一方、Prx Iノックアウトマウス誕生までの間を利用して、Prx Iマウス誕生後の解析の基礎的実験として、すでに誕生している、Prx Iの上流に存在する転写因子Nrf2によって同時に制御をうけているストレスタンパク質A170のノックアウトマウスのフェノタイプの検索をおこなった。フェノタイプは30週過ぎから高率に脂肪組織が見いだされることを発見した。またA170などのストレスタンパク質の動態をユビキチン化の観点からの検討を加え、Prx Iマウスの実験の基礎とした。前年度までにジーントラップ法により得られたESクローンについてPrxIノックアウトマウスを完成させた。