hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T細胞特異的CNOT3欠損マウスにおけるT細胞分化・機能異常と自己免疫疾患発症

CCR4-NOT複合体はmRNAを脱アデニル化するmRNA分解系酵素複合体である。この複合体のサブユニットの一つCNOT3をT細胞特異的に欠損させると、胸腺中におけるT細胞の分化異常が観察された。これは正の選択異常によるもので、細胞死シグナルの亢進が認められた。Map3k5(Ask1)はこの複合体の標的遺伝子であることが分かり、ASK1タンパクの発現増加が正の選択に寄与していると明らかとなった。mRNAのpoly A配列を分解するデアデニレーションは、適切なmRNA発現やタンパク合成に関与し、動物の発生や分化制御に重要な役割を果たす。CCR4-NOT複合体は酵母から哺乳類まで高度に保存されたmRNA分解系酵素複合体でありCNOTタンパク(CNOT1, CNOT2, CNOT3, CNOT6 or CNOT6L, CNOT7 or CNOT8, CNOT9, CNOT10)により構成されている。この複合体は、mRNAのpoly A配列をデアデニル化するが、デアデニル化されたRNAはエクソソームにより分解を受けると考えられている。今回、申請者はT細胞特異的に発現するLck-Cre、およびCd4-Creマウスを用いて、CNOT3遺伝子をT細胞特異的に欠損するマウスを作製した(T-CNOT3⊿マウス)。T-CNOT3⊿マウスにおいては、成熟T細胞への分化が阻害され、それはポジティブセレクションにおける異常によるものであることが明らかとなった。さらに、CCR4-NOT複合体はMAP3Kファミリーの一つASK1のタンパク発現を制御することで、TCR刺激による異常なJNKおよびp38の活性化を抑制していることが分かった。T-CNOT3⊿マウス由来の胸腺細胞はTCR刺激非存在下では細胞死を起こさないが、TCR刺激存在下では細胞死が誘導された。これらより、CCR4-NOT複合体はASK1の発現制御を介しTCR刺激による細胞死シグナルを抑制していることが明らかとなった。今回の研究において、我々はCCR4-NOT複合体によるpoly(A)鎖の長さ調節がT細胞のポジティブセレクションに関与するという新規メカニズムの一端を解明した。現在行っている研究は既に論文投稿中であり、CCR4-NOT複合体がT細胞において重要な役割を持つということを明らかとした。これは、世界で初めての報告であり未だpoly(A)鎖の長さが標的遺伝子の発現制御に重要であり、かつ生理学的意義を持つということも報告されていない。2014年よりプロジェクトを開始し、現状論文投稿まで至っていることからもおおむね順調に進展していると考えられる。しかし、そのRNA分解機構の詳細に関しては、未だ明らかとなっていない。今回申請者はT細胞特異的に発現するLck-CreおよびCD4-Creマウスを用いてCNOT3遺伝子をT細胞特異的に欠損するマウスを作製した(T-CNOT3⊿マウス)。T-CNOT3⊿マウスを解析したところ、胸腺における成熟T細胞分化に異常が見られそれはポジティブセレクションにおける異常であることが明らかとなった。さらにCCR4-NOT複合体はMAP3Kファミリーの一つであるASK1のタンパク発現を制御することで、TCR刺激による異常なJNKおよびp38の活性化を抑制していることが分かった。T-CNOT3⊿マウス由来の胸腺細胞はTCR刺激非存在下では細胞死に変化は見られなかったが、TCR刺激存在下において細胞死が強く誘導された。また、T-CNOT3⊿マウスにおけるASK1タンパク発現増加を抑制するためASK1KOマウスをT-CNOT3⊿マウスと交配しT-CNOT3, ASK1doublKOマウスを作製した。このマウスにおいては、p38およびJNKの異常なリン酸化が抑制され成熟T細胞分化が部分的ではあるが回復した。この研究成果は現在論文投稿中である。CCR4-NOT複合体によるpoly(A)鎖長の制御に関してはまだ不明な点が多い。各臓器においても様々な特異的な標的遺伝子が存在することから、T細胞における標的遺伝子を同定することが重要である。また、既にあるCCR4-NOT複合体のサブユニットの一つが自己免疫疾患との関連性を示唆するデータを見出していることから、疾患治療につながる研究を目指す。今後はT細胞における自己免疫疾患に関与する遺伝子群の発現制御がCCR4-NOT複合体により制御されるのかどうかを探索する。

免疫学、分子生物学当初行う予定であった実験を実験マウスが間に合わなかったため、予定を変更した。また、購入予定だった消耗品が納期に間に合わないこともあり、次年度へと繰り越した。延期した実験に予定通り使用する。
低温ならびに低栄養環境下に生育する硝化細菌の分離とその応用

化学合成独立栄養性硝化細菌は、地球環境における硝化作用および元素循環、特に窒素と炭素において重要な役割を果たすことが古くから知られている。しかしながら、本菌におけるこれら反応系の内容については、多くの未解明の部分が残されており、その応用面における利用の問題も極めて困難な状態が生じている。その最大の理由は、現在もなお難しい培養と純粋分離に起因しており、研究用菌株は極限られた数株にすぎない。生態系における硝化細菌の役割の解明と応用のためには、様々な環境から分離した菌株を得る必要がある。本研究はこのような目的に立脚して実施された。以下にその概要を記載する。1.硝化細菌の純粋分離a)低栄養亜硝酸酸化菌(平成6年度実績)一国内各地土壌150検体を試料として10^<-1>-10^<-6>の段階的希釈培地により集積培養を行い、基本培地では生育阻害を受けるが、10^<-3>-10^<-4>希釈培地では良好な生育を示す培養が得られた。これらの培養から、著者らが考案したgellan gum平板培地に塗抹培養を行い、コロニー形成の良好な低栄養性菌を純粋分離した。本菌の菌学的諸性質を調べた結果から、Nitrobacter sp.と分類し、N.sp. TH21と命名した。b)低温性アンモニア酸化菌(平成7年度実績)-関東以北500カ所の土壌を分離源とし、5°C、30日間の集積培養を行った。亜硝酸生成能の良好な培養についてさらに温度別(5-30°C)培養を実施し、10-20°Cで生育の良好な培養を選択した。本培養についてa)項と同様の方法によりコロニーを形成させ、20°Cを至適温度とする低温性菌株を純粋分離した。菌学的諸性質の検討結果から、Nitrosovibrio属に分類され、N.sp. TYM9と命名した。a)項については、Soil Microorganisms(土と微生物),No.45,61-65(1995)に掲載され、b)項については、日本微生物生態学会(1995)において口頭発表を行った。2.分離菌の応用上記のとおり、低栄養および低温の各硝化細菌が取得されたが、初期の計画どおり進行しなかったため、廃液処理系等への応用実験の実施には至らなかった。低温および低栄養性硝化細菌の分離について現在までに下記のとおりの研究実績が得られたので、その概要を報告する。1.低温性硝化細菌の分離-国内の各地寒冷地土壌(170検体)を試料として集積培養を、5、10、15、20°Cで行い、亜硝酸生成と酸化能を経時的に測定し、より低温で活性を示す培養の選択を行った。その結果、10°Cで低温耐性を示す5つの培養がアンモニア酸化および亜硝酸酸化能について得られたことから、現在、集積培養を同温度で繰り返し実施し、安定に低温性を維持する培養の取得を行っている。

2.低栄養性硝化細菌の分離-国内各地の土壌(150検体)を試料として基本培地の10^<-1>-10^<-6>の段階的希釈培地をもちいて集積培養を行った。その結果、亜硝酸酸化菌の培養において、基本培地では亜硝酸酸化能の阻害を受けるが、10^<-3>-10^<-4>希釈培地による培養では活性を有する培養が得られた。これらの培養液を同希釈倍率からなるgellan gumplate上に塗抹培養を行い、コロニー形成の良好な菌株を純粋分離した。本菌はグラム陰性、桿菌でサイズは0.5-1.0×1.0-2.0μmであり、独立栄養性、絶対好気性を示し、極鞭毛を有していた。細胞の生育は出芽法により行われ、Nitrobacter特有の増殖法を示した。DNAのGC含量は61.0mol%であった。本菌のエネルギー源である最適亜硝酸濃度は基本培地(7mM)の1/2以下であった。以上の諸性質から、本菌株は低栄養性を示し、Nitrobacter sp.TH21と命名した。以上の結果から、平成7年度は、1.項については引き続き優良株の取得を実施し、2.項についてはTH21株の大量培養法の確立を行い、さらに著者らがすでに標準株Nitrobacter agilis ATCC14123株について明らかにしている各種酵素活性について比較検討を行う予定である。低温および低栄養性硝化細菌の分離について当該年度において、下記のとおりの研究実績が得られたのでその概要について報告する。本年度は、低温性アンモニア酸化菌の純粋分離に成功したので、その研究結果について記す。関東以北500ヵ所の土壌を分離源とし、その1gを10mlのHEPES培地に添加し、5°C、30日間の集積培養を行った結果、約30検体において良好な亜硝酸生成能を認めた。そこでこれらの培養について温度別(5,10,20,30°C)培養を行ったところ、20 >10 >30>5°Cの順で生育の良好な低温性菌株を選択した。このうち、亜硝酸生成能の最も高い1菌株を、すでに我々が確立したgellan gum平板培地を用いた方法により純粋分離し、TYM9株(長野県白馬村土壌)とした。TYM9株の菌学的・生理的諸性質について検討した。培養30日後の亜硝酸生成量は、40μg/ml(30°C)、200μg/ml(10°C)、400μg/mlであり、本菌は生育温度20°Cを示す低温性アンモニア酸化菌であった。グラム染色性は陰性であり、電子顕微鏡観察から形態は、Slender curved rods,サイズは、0.1-0.2×1.0-1.5μmであり、基準株ATCC25978株に見られるラメラ様細胞内膜組織は存在しなかった。ベン毛は観察されず、運動性はなかった。G+C(mol%)含量は、53.0%と測定された。これらの結果から、TYM9は、Bergey' s ManualによるとNitrosovibrio属と極めて類似していることから、本菌をNitrosovibrio sp. TYM9と命名した。本菌の生育の至適pHは7.8-8.0であり、培地中の緩衝剤としては、Good' s bufferが適していた。以上の結果から、初期に計画した低温性のアンモニア酸化菌は得られたが、応用的利用への具体化までは至らなかった。なお、これらの結果については、1995年度日本微生物生態学会において発表した。現在、関係学会への論文投稿のため原稿を執筆中である。
脂肪細胞の細胞周期制御機構を治療標的とした肥満症治療法の確立とその応用

1.定量的脂肪細胞増殖評価法の確立と肥満ヒト患者での評価細胞増殖マーカーであるOCNAやKi67を指標としてヒト肥満患者の皮下脂肪組織での発現とBMIおよび内臓脂肪量との関連を検討した結果、相関関係が認められOCNAやKi67の発現を指標に脂肪細胞増殖の評価が可能であることを証明した。2.CDK2ノックアウトマウスの作出と解析CDK2遺伝子の第2、第3エクソンの欠損するCDK2ノックアウトマウスの作成に成功した。このマウスの解析から、肥満発症時には脂肪細胞の増殖にCDK2が関与することを明らかとした。3.脂肪細胞特異的CDK2ノックアウトマウスの作出と解析CDK2遺伝子の第2、第3エクソンの両端に、1oxP配列を挿入した変異CDK2遺伝子を有するCDK2floxマウスと、脂肪細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するaP2-Creマウスとの交配により、脂肪組織特異的にCDK2を欠損するマウスの作成に成功した。このマウスの解析から、肥満発症時には脂肪細胞でのCDK2は関与しないことを明らかとした。以上の結果より、肥満治療として細胞周期制御因子であるCDK2を治療標的とした肥満症治療の可能性が推定されたことより、CDK2阻害剤の効果を検討した。4.CDK2阻害剤およびCDK2阻害ペプチドの抗肥満効果CDK2阻害剤およびCDK2阻害ペプチドは遺伝的肥満モデルdb/dbマウスや高脂肪食給餌肥満モデルマウスに対して、抗肥満効果・抗糖尿病効果を有することを見出した。すなわち、今回の研究課題により、脂肪細胞の細胞周期制御機構を治療標的とした肥満症治療法の確立のための基盤確立ができた。1.脂肪細胞分泌性増殖制御因子の培養細胞での機能解析とトランスジェニックマウスの作製高脂肪食を負荷したC57BL/6マウスにおいて、経時的に脂肪組織よりmRNAを単離し、発現遺伝子をDNAマイクロアレイ解析にて検討したところ、脂肪細胞が増殖する時期に特異的に発現誘導される分泌性因子として、繊維芽増殖因子であるFGF13、Wntの抑制因子であるsFRP-5 (secreted-frizzled related protein-5)、アクチビンβ-Bの3遺伝子を同定した。2.定量的脂肪細胞増殖評価法の確立と肥満ヒト患者での評価細胞周期のG1/S期を直接制御するcyclin dependent kinase (CDK)のキナーゼ活性測定や細胞増殖マーカーのKi-67やPCNAの発現をヒト脂肪組織で比較検討し、肥満ヒト患者で脂肪細胞が増殖していることを見出し、その定量的評価法を確立した。3.脂肪細胞特異的CDK2ノックアウトマウスの作製CDK2遺伝子の第2、第3エクソン両端に、loxP配列を導入した変異CDK2遺伝子(CDK2floxアリル)を有するCDK2floxマウスと、脂肪細胞特異的にCreリコンビナーゼ活性が発現するaP2-CreERマウスとの交配を実施し、脂肪細胞特異的にCDK2をノックアウトしたマウスを作製した。4.Skp2の肥満形成における役割p27^<Kip1>の発現を蛋白レベルで抑制するユビキチンリガーゼSkp2の欠損マウスでは、脂肪細胞数の減少がエネルギー過剰状態での生体の糖代謝悪化や肥満形成に抑制的に作用することを明らかとした。さらには、Skp2が膵β細胞の増殖において、細胞周期制御分子の発現を制御する必須の分子であることを明らかとした(J Biol Chem. 2007)。
非接触電極法による有機分子薄膜の誘電率およびD-E測定

1.PVDFや(VDF/TrFE)共重合体などの有極性有機分子を試料として、真空蒸着薄膜の構造制御を試みた。基板に付着直後の不安定な分子に直流高電界を印加することにより、強誘電性の薄膜の作製が可能であることが判明した。また、非接触電極を有する測定セルを用い、D-E測定や誘電率の測定を行った結果、ヒステリシス曲線や誘電率のピークが観測され、強誘電の電気物性を調べる有効な手段となることが確かめられた。2.高分子強誘電体を真空蒸着法で単結晶基板上に成膜し、FT-IRを用いて結晶構造、相転移挙動ならびに分子配向性を調べた。NaCl基板上に作製した試料は、昇温時の相転移温度はスピンコート膜に較べて著しく(約20°C)低下し、降温時では一致するヒステリシス・ループを示した。また、蒸着に伴う試料の熱分解、すなわち、分子量の低下は相転移挙動に影響しながらも、分子本来の機能性は保持されることが確かめられた。3.PVDFの低分子量試料でオリゴマーの一種であるVDFテロマー薄膜の構造および分子配向評価をX線回折ならびにFT-IRにて行った。その結果、バルク状態ではIII型結晶と同じ構造を安定相としてとる事が明らかになった。また、真空蒸着膜ではII型結晶を形成し、その分子配向は基板に対して分子鎖が垂直に配向した長周期構造をとることが確かめられた。本研究では、有極性超薄膜の分子配向制御の手法の確立、ならびに、非接触型の電極を用いた超薄膜の電子物性の評価技術の確立を目的とした。試料として強誘電性のP(VDF/TrFE)などを用い、有機超薄膜の作製法としては真空蒸着法により行なった。極性物質では、その機能を発現させるためには双極子配向が必須である。そのため、基板に蒸着直後でまだ不安定な分子に最大で30MV/m程度の直流高電界を印加することにより、配向制御を試みた。また、蒸着膜のように膜厚(最大で400nm)が薄くなると、試料の上に電極を蒸着する際に電極間の短絡が生じ、その電子物性を調べることは困難である。そこで、超薄膜用に設計した非接触型の電極を購入したイオンスパッタリング装置を用いて構築した。電子物性の評価法としては、LCZメータによる誘電率の温度変化の測定および強誘電性の判定の手段の一つであるD-ELステリシス曲線の測定により行なった。(永守)また、側面的にFT-IRを用いて結晶構造、相転移挙動ならびに分子配向性を調べた。(石崎)D-E測定法により、抗電界の絶対値は得られなかったものの、高電界を印加して蒸着した試料のみヒステリシス曲線が観測された。また、誘電率の測定結果からも同様に、電界印加の試料のみキャストフィルム試料とほぼ同じ温度で強誘電・常誘電相転移を示すピークが観測された。これにより、電界による配向制御が確認され、非接触電極構造を使う本測定法が電子物性を調べる有効な手段となることが確かめられた。また、FT-IRの結果からは、強誘電性相転移はNaCl、CaF_2基板などの基板の種類により影響を受けていることが確かめられた。基板に付着直後の不安定な分子に直流高電界を印加することにより、強誘電性の薄膜の作成が可能であることが判明した。

2.高分子強誘電体を真空蒸着法で単結晶基板上に成膜し、FT-IRを用いて結晶構造、相転移挙動ならびに分子配向性を調べた。NaCl基板上に作製した試料は、昇温時の相転移温度はスピンコート膜に較べて著しく(約20°C)低下し、降温時では一致するヒステリシス・ループを示した。また、蒸着に伴う試料の熱分解、すなわち、分子量の低下は相転移挙動に影響しながらも、分子本来の機能性は保持されることが確かめられた。3.PVDFの低分子量試料でオリゴマーの一種であるVDFテロマー薄膜の構造および分子配向評価をX線回折ならびにFT-IRにて行った。その結果、バルク状態ではIII型結晶と同じ構造を安定相としてとる事が明らかになった。また、真空蒸着膜ではII型結晶を形成し、その分子配向は基板に対して分子鎖が垂直に配向した長周期構造をとることが確かめられた。
組織特異的な遺伝子発現を調節する因子

解糖系律速酵素ピルビン酸キナーゼは哺乳動物においては、L型、R型、M_1型、M_2型の4種のアイソザイムが存在し、組織特異的に発現している。本研究は本酵素の組織特異的な遺伝子発現を制御する因子の同定を目的とし、以下の点を明らかにした。1.L型とR型はL遺伝子から異なるプロモーターを使って、組織特異的に転写されるが、この転写を制御するシス作用領域をCATアッセイにより調べた。その結果、L型の転写制御領域は転写開始点上流に存在することが判明した。すなわち、-185bpから-152bpまでには正の制御領域が存在し、これは組織特異的発現に係わるエンハンサーとしての機能を有していた。このエンハンサーが働くためには下流の-94bpから-62bpまでの領域が必要であつた。この2つの領域をさらに調べると各々の領域内にある約18bpのバリンドローム構造の配列が重要と考えられた。一方、R型の転写制御領域はR型の転写開始点上流-108bpから-79bpまでに存在することが示唆された。2.M_1型とM_2型はM遺伝子から転写産物のスプライシングの違いで生成することを明らかにし、1と同様な方法で転写の制御領域を調べた。その結果、-358bpから-286bpまでに負の制御領域が、-286bpから-68bpまでに正の制御領域が存在することが示唆された。解糖系律速酵素ピルビン酸キナーゼは哺乳動物においては, L型, R型, M_1型, M_2型,の4種のアイソサイムが存在し,組織特異的に発現している.本研究は,ピルビン酸キナーゼアイソザイムの組織特異的発現を制御する因子の同定と精製を行うことを目的とし,今年度は以下の点を明らかにした.1.M_1型とM_2型をコードするM遺伝子の第1エクソンとその上流を含むクローンを単離して,転写開始点およびプロモーター領域の塩基配列を調べた.2.M遺伝子の転写開始点は複数存在するが,これらはM_1型とM_2型で同様に使われていた.この結果はM_1型とM_2型のnRNAがM遺伝子からの同一転写産物のスプライシングの違いで精製するという,これまでの仮説を支持するものである.3.M遺伝子のプロモーター領域はGCに富み, GCボックスが数個存在していたが, TATAボックスは認められなかった.4.CAT検定法によりM遺伝子発現の制御領域を調べたところ,転写開始点から上流約1.8kb内に存在することが示唆さた. 5.一方, L型とR型のアイソザイムはL遺伝子から,転写開始点の違いで精製するが, L型発現の制御領域をCAT検定法により調べた.その結果, L型の転写開始点から上流約1.5kb内に存在することが示唆された.解糖系律速酵素ピルビン酸キナーゼは哺乳動物においては、L型、R型、M_1型、M_2型の4種のアイソザイムが存在し、組織特異的に発現している。これらのアイソザイムは2種類の遺伝子から合成される。すなわち、M_1型とM_2型のmRNAはM遺伝子の転写産物のスプライシングの違いにより、またL型とR型はL遺伝子から転写開始点の違いにより生成する。本研究はこのような遺伝子の組織特異的発現を制御するシス及びトランス作用因子の同定を目的とし、今年度は以下の点を明らかにした。1.L遺伝子からL型とR型の転写を制御するシス作用領域の同定をCATアッセイにより行った。L型の制御領域は転写開始点の上流-185bpまでに存在していた。このうち、-185bpから-152bpまでには正の制御領域が存在し、これは組織特異的発現に係わるエンハンサーとしての機能を有していた。

このエンハンサーが仂くためには下流にある-94bpから-62bpまでの領域が必要であった。この2つの領域をさらに欠換させて調べると、各々の領域にある約18bpのパリンドローム構造の配列が重要と考えられた。一方、R型の転写制御領域はR型の転写開始点上流-108bpから-79bpまでに存在することが示唆された。2.1と同様にM遺伝子の転写制御領域を調べた結果、-358bpから-286bpまでに負の制御領域が、-286bpから-68bpまでに正の制御領域が存在することが示唆された。
心臓再生のための心筋分裂・増殖メカニズムの研究

本研究の目的は、心筋分裂誘導因子を見出し、哺乳類の心臓を心筋細胞分裂によって再生することである。哺乳類の心筋細胞の大半は生後まもなく分裂を停止する。成熟後も心筋細胞の分裂が起こると報告されたが、心臓機能を回復するだけの心筋細胞の再生は不可能であると考えられている。一方、魚類や両生類の心臓は心筋細胞の分裂によって再生可能である。そのため、小型魚類をモデルに心筋分裂の基本原理を理解することで心筋分裂誘導による哺乳類の心臓再生のヒントを得られると考えた。私たちは成熟心筋でも分裂による再生が可能なゼブラフィッシュに着目し、如何なる因子が細胞分裂を調節するかを捉えることにした。このため、「分裂している心筋」と「分裂の停止している心筋」を区別するべく、心筋特異的にFucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator)を発現するトランスジェニック個体を作製し、「分裂している心筋」(S/G2/M期)ではmVenus、「分裂の停止している心筋」(G0/G1期)ではmCherryを発現させた。mVenus陽性細胞とmCherry陽性細胞とをFACSで分取しRNAシークエンスにて遺伝子発現解析を行った結果、心筋分裂誘導因子の候補として「分泌因子M」を見出した。「分泌因子M」はゼブラフィッシュ発生時の心筋細胞数を増加させ、マウス初代培養心筋細胞のDNA合成を促進したことから、心筋細胞の分裂促進効果があると考えられた。浸透圧ポンプにて「分泌因子M」の持続投与したマウスでは、心筋梗塞後7日目のPhosphohistone-H3陽性心筋細胞数が増加し、生体内でも「分泌因子M」による心筋細胞分裂促進効果が見られた。さらに、「分泌因子M」の持続投与によって心筋梗塞後4週目でのリモデリングが抑制され、心臓機能が改善された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、心筋分裂促進因子を見出し、哺乳類の心臓を心筋細胞分裂によって再生することである。哺乳類の心筋細胞の大半は生後分裂を停止するために、成熟後の心筋細胞分裂による心臓再生は不可能である。一方、魚類では既存の心筋細胞の分裂によって心臓再生が可能である。既存の心臓再生研究では、機能を障害した心臓に、細胞周期調節因子を発現させ心筋細胞分裂を誘導し心臓再生を目指す研究が試みられてきたが、心臓の再生には至っていない。私たちは、細胞周期調節因子以外の心筋分裂の鍵となる因子を見出すために、心臓再生の可能であるゼブラフィッシュをモデルに、分裂している心筋細胞に発現する遺伝子を解析した。細胞周期調節因子(サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ)を機能不全に陥った心臓の心筋細胞に発現しても、低下した心機能を改善するまでの効果はなかった。哺乳類とは異なり、魚類や両生類の心臓は心筋細胞の分裂によって再生可能である。私たちは成熟心筋でも分裂による再生が可能なゼブラフィッシュの心臓発生に着目し、如何なる因子が細胞周期を調節しているかを捉えることにした。このため、「分裂している心筋」と「分裂の停止している心筋」を区別するべく、心筋特異的にFucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator)を発現するトランスジェニック個体を作製し、Myl7 (myosin, light polypeptide7, regulatory)プロモーター依存性に「分裂している心筋」(S/G2/M期)ではmVenus、「分裂の停止している心筋」(GO/G1期)ではmCherryを発現させた。分裂増殖の盛んである3日目胚からmVenus陽性細胞とmCherry陽性細胞をそれぞれFACSで分取しRNAシークエンスにて遺伝子発現解析を行った。細胞周期関連遺伝子以外の分泌因子に着目した結果、心筋分裂誘導因子の候補として「分泌因子M」を見出した。心筋細胞への分裂促進効果を調べたところ、「分泌因子M」は発生時のゼブラフィッシュにて心筋細胞数を増加させた。また、マウス初代培養心筋細胞のDNA合成を促進し、哺乳類の心筋細胞の分裂促進効果があると考えられた。さらに、浸透圧ポンプにて「分泌因子M」を持続投与したマウスでは、冠動脈結紮による心筋梗塞作成後の生存率が向上した。

このため、「分裂している心筋」と「分裂の停止している心筋」を区別するべく、心筋特異的にFucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator)を発現するトランスジェニック個体を作製し、「分裂している心筋」(S/G2/M期)ではmVenus、「分裂の停止している心筋」(G0/G1期)ではmCherryを発現させた。mVenus陽性細胞とmCherry陽性細胞とをFACSで分取しRNAシークエンスにて遺伝子発現解析を行った結果、心筋分裂誘導因子の候補として「分泌因子M」を見出した。「分泌因子M」はゼブラフィッシュ発生時の心筋細胞数を増加させ、マウス初代培養心筋細胞のDNA合成を促進したことから、心筋細胞の分裂促進効果があると考えられた。浸透圧ポンプにて「分泌因子M」の持続投与したマウスでは、心筋梗塞後7日目のPhosphohistone-H3陽性心筋細胞数が増加し、生体内でも「分泌因子M」による心筋細胞分裂促進効果が見られた。さらに、「分泌因子M」の持続投与によって心筋梗塞後4週目でのリモデリングが抑制され、心臓機能が改善された。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定した通りに、心筋細胞中にFucciを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製し、「分裂している心筋」、「分裂の停止している心筋」に発現する遺伝子を網羅的に解析して心筋分裂促進因子の候補を見出すことが出来たため、おおむね順調に進展していると考える。分泌因子M」が発生時のゼブラフィッシュ心筋細胞数を増加させることを確認し、「分泌因子M」を発現するトランスジェニック(Tg)ゼブラフィッシュを樹立した。また、マウス初代培養心筋細胞に対して「分泌因子M」が分裂促進効果を持つことを確認した。「分泌因子M」を発現するTgマウスは現在樹立中であるが、心筋梗塞マウス個体に「分泌因子M」を投与して効果を検討することが出来たため、おおむね順調に進展していると考える。分泌因子Mの発現が、発生時のゼブラフィッシュ心筋細胞数を増加させるか明らかにする。また、成魚の心臓にて、分泌因子Mの発現誘導が心筋細胞増殖や再生を促進するか検討するために、薬剤添加依存的にMを発現出するTgゼブラフィッシュを作製する。Mが哺乳類心筋細胞の増殖を促進するか、マウス初代培養心筋細胞を用いて検討する。哺乳類の心筋細胞の増殖を促進する場合、Mの発現誘導によって心筋細胞数が増えるか、あるいは心臓再生が可能になるかを検討するために、Tgマウスを作製する。「分泌因子M」が心筋細胞の分裂を促進することで、心臓再生に寄与するか検討するために、「分泌因子M」を発現するTgゼブラフィッシュを使用して成魚の心筋細胞増殖や再生を促進するか検討する。「分泌因子M」投与による心筋梗塞後の生存率向上が心筋細胞分裂促進によるものであるか、免疫組織化学染色法で分裂マーカーを染色し検討する。また、「分泌因子M」が心臓形成に必要であるのかをノックアウトゼブラフィッシュおよびマウスを樹立し検討する。
鳥類の視覚処理に自己運動が与える影響

鳥類の動的環境知覚に関連して、運動視差と視覚運動に関する研究を行った。ヒトは眼球の回転により視線移動を行うが、鳥類は頭部運動によって視線移動を行う。3次元的な視線移動により、視覚的奥行き手がかりの1つである運動視差が生じると想定される。鳥類が頭部運動による運動視差を利用するか調べるため、ハトの頭部運動に同調し運動するヴァーチャル刺激をモニタに提示し、それに関する弁別実験を2件行った。1件目では運動視差によって、物体の主観的な大きさが変化するかどうか調べた。結果、ハトの大きさ判断に運動視差の影響はみられず、大きさの恒常性は確認されなかった。一方、弁別対象の刺激に対するつつき運動には運動視差の効果がみられ、運動視差が遠い条件の刺激に対してモニタからの視距離が近くなった。2件目では、ハトが運動視差を意識的に知覚するか調べるため、運動視差の弁別を訓練した。結果、3cm程度の奥行き差があればハトは運動視差を弁別できた。これらの研究から、ハトは頭部運動によって生じる運動視差を、運動制御や奥行き知覚など幅広い用途に利用することが確認された。ヒトの視覚運動処理は、輝度依存のシステムからより複雑な特徴に基づく運動検出まで、階層構造を持つことが知られているが、これが視覚依存の種に共通する処理構造かは明らかでない。鳥類の視運動処理の階層性を調べるため、ヒトの知覚研究に用いられるBarber-pole錯視とPlaid刺激を用い、ハトに対して運動方向弁別課題を訓練した。結果、ハトは両刺激に対しヒトとは異なる方向に運動を知覚することが示唆された。ヒトの知覚が2次元的な特徴に基づいた運動方向に従うのに対し、ハトはより単純な1次運動に基づく方向に反応した。これらの結果は、ヒトの運動処理が環境中の運動を検出するための唯一の方式ではなく、運動視の方式には脊椎動物間で多様性があることを示している。29年度が最終年度であるため、記入しない。ニワトリにおける歩行時の頭部運動の機能を検討した。トレッドミルを歩行中のニワトリに対しオプティックフローを模した視覚運動刺激を提示し,歩行速度と刺激速度それぞれの頭部運動への影響を調べた。頭部運動は視覚運動刺激に対してそれと同方向に生じ,また刺激速度が上昇するにつれて頭部運動速度も上昇した。歩行速度は頭部運動速度に影響を与えなかった。トレッドミルが静止した状態では視覚運動刺激に伴う頭部運動は生起しなかった。これらの結果から,ニワトリが歩行中に示す頭部運動は自己運動に伴う視覚運動に対して生起し,視野のぶれを補正する視運動性反応の一種だと考えられる。また,静止時には頭部運動がみられなかったことから,歩行のオンセットによってそうした視運動性反応が誘発されるメカニズムがあり,歩行時と休息時で視覚処理の様式が異なることが示唆される。奥行情報が物体の大きさ知覚に影響を与える「大きさの恒常性」を利用し,ハトにおいて運動視差手がかりと絵画的奥行手がかりが物体の大きさ判断に影響を与えるか調べた。格子模様の回廊上に様々な大きさのターゲットを提示し,ハトはキー押しによってそれを大・小に分類する課題を学習した。背景とターゲットが運動視差を含むよう左右運動する条件(運動条件)と背景とターゲットが静止した条件(静止条件)が設定された。これらの訓練後,絵画的奥行手がかり,運動視差手がかりを変化させた刺激を提示するテスト試行を挿入した。静止条件,運動条件ともに奥行手がかりが遠いターゲットを過大評価する傾向が見られ,ハトで回廊錯視が生じることが示された。また,絵画的奥行手がかりと運動視差奥行手がかりが不一致の条件では,絵画的奥行手がかりに従った錯視を示し,ヒトが示す大きさの恒常性と類似の傾向を示した。これらの結果から,ハトが示す大きさの恒常性のメカニズムがヒトのそれと類似することが示唆される。ニワトリの歩行分析,ハトの奥行き情報利用の心理物理実験ともに当該年度において一定の成果が得られた。研究1では奥行情報が物体の大きさ知覚に影響を与える「大きさの恒常性」を利用し,ハトにおいて運動視差手がかりと絵画的奥行手がかりが物体の大きさ判断に影響を与えるか調べた。絵画的奥行手がかりが遠いターゲットの大きさを過大評価する傾向が見られ,鳥類においてヒトと同様の回廊錯視が生じることが示された。一方で,運動視差奥行手がかりの操作は大きさ判断には影響を与えなかった。ヒトを対象に同じ刺激を用いて錯視を調べたところ,ハトと同様に大きさ恒常性における絵画的奥行手がかりの優位性が示された。本研究は霊長目以外の種における大きさの恒常性を統制された実験環境で示した初の研究であり,当該機能が多くの動物種で共有されていることを示唆する。さらに,奥行手がかりの選択性が共通していたことは,ハトとヒト両種において大きさの恒常性のメカニズムが類似していることを示唆する。研究2ではハトの頭部位置をリアルタイムでトラッキングし頭部運動に同期した運動視差を含む視覚刺激を提示し,視覚的大きさ判断と刺激に対するつつき運動の制御に与える影響を調べた。ハトの後頭部にマーカーを貼り付け,2台のカメラでその3次元位置を追跡した。運動視差の操作はハトの大きさ判断に影響を与えず,研究1と同様に運動視差による大きさの恒常性は示されなかった。一方で,課題遂行中のハトの頭部運動を分析したところ,運動視差が奥のときにつつき運動直前の刺激からの視距離が短くなった。

この結果からハトは動的な視覚処理である視覚運動制御に運動視差手がかりを用いる一方で,より静的な処理である大きさ知覚にはそれを用いないことが示された。鳥類における自己運動に関連した視覚処理を検討するために,頭部位置をリアルタイムで追跡する装置を開発した。これにより,従来の心理物理実験と比べ,より動的な環境知覚の様相を調べることが可能になった。また,オペラント条件付けによる行動データに加え頭部位置のオフラインでの解析も可能になり,寮類の視覚処理に関して知覚と運動の両面から検討することも可能となり,採用2年度目での進捗としては十分なものと考えられる。鳥類の動的環境知覚に関連して、運動視差と視覚運動に関する研究を行った。ヒトは眼球の回転により視線移動を行うが、鳥類は頭部運動によって視線移動を行う。3次元的な視線移動により、視覚的奥行き手がかりの1つである運動視差が生じると想定される。鳥類が頭部運動による運動視差を利用するか調べるため、ハトの頭部運動に同調し運動するヴァーチャル刺激をモニタに提示し、それに関する弁別実験を2件行った。1件目では運動視差によって、物体の主観的な大きさが変化するかどうか調べた。結果、ハトの大きさ判断に運動視差の影響はみられず、大きさの恒常性は確認されなかった。一方、弁別対象の刺激に対するつつき運動には運動視差の効果がみられ、運動視差が遠い条件の刺激に対してモニタからの視距離が近くなった。2件目では、ハトが運動視差を意識的に知覚するか調べるため、運動視差の弁別を訓練した。結果、3cm程度の奥行き差があればハトは運動視差を弁別できた。これらの研究から、ハトは頭部運動によって生じる運動視差を、運動制御や奥行き知覚など幅広い用途に利用することが確認された。ヒトの視覚運動処理は、輝度依存のシステムからより複雑な特徴に基づく運動検出まで、階層構造を持つことが知られているが、これが視覚依存の種に共通する処理構造かは明らかでない。鳥類の視運動処理の階層性を調べるため、ヒトの知覚研究に用いられるBarber-pole錯視とPlaid刺激を用い、ハトに対して運動方向弁別課題を訓練した。結果、ハトは両刺激に対しヒトとは異なる方向に運動を知覚することが示唆された。ヒトの知覚が2次元的な特徴に基づいた運動方向に従うのに対し、ハトはより単純な1次運動に基づく方向に反応した。これらの結果は、ヒトの運動処理が環境中の運動を検出するための唯一の方式ではなく、運動視の方式には脊椎動物間で多様性があることを示している。当該年度に行った研究を土台に,新たな動物認知研究方法を実現する。ニワトリの歩行訓練と,オペラント学習による知覚実験を組み合わせ,「歩行中の鳥類の知覚世界」を明らかにする実験・訓練方法を確立する。具体的には歩行運動が運動知覚,空間注意にどのような影響を与えるか調べる。ハトの頭部位置をオプティカルトラッキングによって追跡,それに応じて刺激を変化させることで,「自己運動に伴う動的な知覚変化の利用」を調べる。具体的には自己誘発性の運動視差が大きさの恒常性,奥行知覚,運動調節にどのような影響を与えるか調べる。当該年度までに行った実験方法を用い,鳥類の運動視,奥行視についてより詳細な検討を行う。
文学表現と〈身体〉―ドイツ文学の場合

本研究は,科研費による研究「文学表現と<メディア>-ドイツ文学の場合」(平成7-9年度)の成果を踏まえ,メディア論との密接な関連において新たな身体概念を提示することを目的として遂行された。その成果は以下の3点に要約される。1.技術メディアの発達段階が身体の編成を深く規定していること。たとえば,ロマン主義期の文学に頻出する眼鏡や望遠鏡のモチーフは,これらが目と対象の間に介在することによって知覚のあり方を根本から変化させたことを物語っている。また活版印刷は,身振りを交えた朗読を孤独な書斎での黙読に代えることによって,読書をもっぱら精神的な営みとし,他方,写真においては機械の「目」が人間的認識パターンの外にあるものを捉え,提示した。この二つのメディアの作用を,ロゴス中心主義とその相対化の兆候として解釈することができる。2.身体は従って歴史的に可変であり,それゆえに権力的操作の対象でもあった。たとえば啓蒙主義期の文学においては,理性の名による性欲のコントロールが繰り返し主題化され,かつそれが男性的徳として称揚される。またロマン主義期には文学と精神医学の相互接近が認められるが,それは一方では身体と宇宙との感応を志向しつつ,他方では対象=患者を意のままに支配しようとする欲望を宿してもいた。3.身体は,それが無垢な自然として表象されうる限りにおいては,解放運動のフォーカスとしても機能した(たとえばモダンダンス)。そうした素朴な信頼が失われたとき,文学と芸術が関心を向けるのはむしろ,一個の人格の下に統合される以前の身体であり,いわば「人間における物質的なもの」であるように思われる。(たとえばパウル・ツェランの詩に頻出する身体断片。)なお平成15年度からは,本研究の成果を引き継いで,「記憶」を主題とする新たな研究が行われる(「文学表現と<記憶>-ドイツ文学の場合」平成15-18年度)。本研究は、ドイツ文学研究の立場から身体概念の深化に貢献するとともに、身体論的視座からドイツ文学史の再評価を図ることを目的として始められた。4年間の研究の初年にあたる本年度は、3回の研究会を開催した。参加者は、「身体」のテーマとの関連において、それぞれの専門領域の問題を掘り下げた結果を発表し、活発な議論が展開された。本年度の第一の課題である、メディア論と身体論の内的関連の考察として、研究代表者平野は、キルケゴールからカフカに至る、超越者を体感するありようの変化が、メディアの変遷と密接に関わるとする論を提出した。この論を踏まえ、中世から現代に至るまでのドイツ文学を対象に、さまざまな角度からの発表および討論がなされた。主なものとしては、ゲーテやムージルの文学作品に表現された多様な登場人物の身体の交錯によって生み出されるテクストの多層性の検討といった基礎的研究のほか、シュティフター、ヘルマン・ブロッホのテクストにおける書き手・語り手の身体の問題や、身体性と精神性を兼ね備えたメタファーとしての「心」という形象の中世から現代に至るまでの歴史的変遷、といったテーマが集中的に検討された。また、リヒテンベルクのコルセット批判、海水浴推奨、反観相学などにあらわれた身体の解放・解体の試み、フランツ・ヘッセルを中心に見た都市の遊歩者の系譜といった、文化史的観点からのアプローチもなされた。

今年度の第二の課題である、身体論と他の問題群との関連を探る試みとしては、舞踏論、言語論、翻訳論、読書行為論、アウラ論、人形論、マゾヒズム論、神秘体験論、空間体験論など、多様な問題圏との接点が指摘され、来年度以降の研究の足がかりとなった。本研究は、ドイツ文学研究の立場から身体概念の深化に貢献するとともに、身体論的視座からドイツ文学史の再評価を図ることを目的として始められた。4年間の研究の2年目にあたる本年度も、昨年度同様3回の研究会を開催し、合計21の研究報告を受けて活発な議論が展開された。本年度の研究の重点はまず第一に、言語論、アウラ論、舞踏論、空間体験論など、さまざまなトピックを取り上げることによって身体論的問題の広がりを把握することにあった。これについては以下のようなテーマが検討された。-媚薬の作用による愛への耽溺と、名による自己同一性の(擬似的)回復(『トリスタンとイゾルデ』)。/中世女性神秘思想における身体的な宗教体験。/徒歩旅行と読書、「見ること」を通した身体性の回復(カール・フィリップ・モーリッツ)。/18-19世紀文学におけるピグマリオン=人工身体のモチーフ。/アウラ的空間体験と無意志的記憶(ベンヤミン)。/規範化された身体イメージからの脱却と「踊り」(ムージル)。/アスコナの芸術家コロニーと、身体文化運動。/記憶痕跡のありかとしての脳の底部と都市の地下空間の表象との重なり合い(ドゥルス・グリューンバイン)。また、第二の重点、すなわち身体論とメディア論の交錯については、以下のような報告をもとに詳細な討論が交わされた。-16世紀末における音読・朗読から黙読への読書姿勢の転換と、身体から切り離された思考の成立。/写真論:あらかじめ意識された視線によって被写体の身振りと視線が規定されること、およびそのような視線の権力に服さない被写体(たとえば盲者)(アウグスト・ザンダー)。/古典古代から中世を経てモデルネへといたる、西洋文化における「眺め/眺められる」こと=視線の組織化の歴史。4年間の研究の3年目にあたる本年度も、これまでと同様3回の研究会を開催し、合計21の研究報告を受けて活発な議論が展開された。本年度の研究の重点はなによりも、身体論とメディア論の交錯を具体例に基づいて考察することにあった。これについては、一方では近代的技術が登場する以前には、習慣(ハビトゥス)を身体化した知性・知性化した身体と捉える系譜があったこと。他方では近代にいたって気球などの飛行手段が生み出されると、重力に逆らって空中を飛行しようとする欲望が生じること、またそれが経験的主体をいわば上空から見下ろす超越論的主体の成立とも通底していることが指摘され、人格統合の近代以前的あり方と近代的あり方の相違が、身体および技術の問題として論議された。また、18世紀末から19世紀にかけての文学的ディスクールと精神医学のディスクールの絡み合いについて複数の報告を受けた。その中で自然の原理を反応過剰Sthenieと反応過小Asthenieのバランスから説明し、それを人体にも応用したロマン主義医学の見解と、それを換骨奪胎し、最高度の刺激感応を組織することによって計算された狂気と理性的カオスを生み出そうとした初期ロマン主義作家たちの目論見が紹介された。
植物性エストロゲンを用いた新たな統合失調症の発症制御

中枢神経系のニューロンやグリアにはエストロゲン受容体が発現しており、出産や閉経に伴うエストロゲンレベルの変動が統合失調症の発症や病態に関連している可能性が指摘されているが、その詳細は不明である。本研究で我々は、マウスに銅キレート剤であるクプリゾンを摂取させ、白質障害モデルを作出し、植物由来エストロゲン類縁体(ゲニステイン)の海馬グリア細胞への作用を形態学的・分子生物学的に検討した。クプリゾンを5週間と長期にわたって摂取させたマウスの脳梁および海馬CA1領域では、成熟型オリゴデンドロサイトの密度が減少していたことから、白質障害が起こっていることが明らかになった。アストロサイトの空間分布密度は、クプリゾン摂取並びにゲニステイン投与によって変化がなかったが、GFAPの染色強度はクプリゾン摂取によって増強した。これはゲニステインによって抑制されなかった。ミクログリアの空間分布密度は、クプリゾン摂取によって増加したがゲニステイン投与によって抑制されなかった。一方で、貪食性ミクログリアのマーカー分子であるケラタン硫酸陽性ミクログリアの空間分布密度はゲニステイン投与によって減少した。フローサイトメトリーと定量PCRを用いた解析では、ゲニステイン投与はクプリゾンによって上昇する炎症関連遺伝子群に対して大きな変化を与えなかった。一方で、海馬組織から得られたRNAと定量PCRを用いた解析では、クプリゾンによって引き起こされるミエリン関連遺伝子の低下が総じて抑制されることが明らかとなった。これらの結果から、ゲニステインはオリゴデンドロサイト上のエストロゲン受容体を介して成熟オリゴデンドロサイトの細胞死を抑制している可能性があると考えた。本研究の成果はToxicology and Appliedpharmacology誌に既に受理された。前年度までは、炎症関連のグリア細胞であるミクログリアとアストロサイトについては分離して検討していたが、ゲニステインによる抗炎症効果は予想以上に弱かったことから、上記の論文にデータを組み込む形で発表した。5週間のクプリゾン摂取によって引き起こされる脱髄は、統合失調症における脱髄と比べると劇的なものであったことから、現在は2週間のクプリゾン摂取モデルを新たに作出し、脳内の変化を組織学的・分子生物学的に調べている。既に海馬内において、グリア細胞の活性化や神経新生の抑制などの効果を認めている。さらに所属研究室内に動物行動実験システムを導入したことで、本モデルが不安障害、驚愕抑制の異常などの統合失調症様の表現型を示すことを確認した。今後は2週間のクプリゾン摂取モデルを統合失調症モデルとして使用し、神経炎症仮説に基づく薬理学的介入実験や、神経新生抑制仮説に基づく薬理学的介入実験を行う予定である。また、動物行動実験システムを使用して、本モデルが示す統合失調症様の表現型が改善されるかどうかを検討する。本研究で我々は、マウスに銅キレート剤であるクプリゾンを摂取させ、白質障害仮説に基づく統合失調症モデルを作出し、植物由来エストロゲン類縁体(ゲニステイン)の海馬グリア細胞への作用を形態学的・分子生物学的に検討した。クプリゾン摂取マウスの海馬では、オリゴデンドロサイト前駆細胞・成熟型オリゴデンドロサイトの空間分布密度に変化は見られなかった。一方でCA1領域の網状分子層ではミエリン塩基性タンパク質(MBP)の染色性が低下したが、ゲニステインの腹腔内投与によってMBPの変化は抑制された。また同層ではクプリゾン摂取によってミクログリア・アストロサイトの空間分布密度、およびミクログリア上の貪食性マーカーであるケラタン硫酸糖鎖抗原の発現が上昇したが、ゲニステイン投与によって部分的に抑制された。フローサイトメトリーと定量PCRを用いた解析では、クプリゾン摂取によって上昇するミクログリア貪食性マーカーCD68、および炎症性サイトカインIL-1βの発現レベルをゲニステインが選択的に抑制する傾向が見られた。一方で、抗炎症性サイトカインIL-4の発現レベルはクプリゾン摂取によって上昇するものの、ゲニステインによる抑制効果は認められなかった。さらにクプリゾン摂取によって、一部の個体においてプレパルス抑制の障害が見られたが、ゲニステイン投与によって障害が回復する傾向が見られた。以上のことから、ゲニステインはミクログリアの貪食能・炎症能を選択的に抑制することによって、統合失調症における白質障害を抑制する可能性が示唆される。統合失調症の病態形成過程における神経炎症の評価と、ゲニステインの抗炎症効果については、ミクログリア・アストロサイトいずれに対しても効果が認められており、特にミクログリアについてはそのメカニズムについても明らかになりつつある。さらに、その抗炎症効果が神経回路特異的であること、ミクログリアの特定の活性化ステップを抑制することが明らかになってきたのは大きな進捗である。一方で、アストロサイトに対する抗炎症効果はそのメカニズムが未だ不明であること、抑制性ニューロンに対する効果が特段観察できていないことは今後の課題とされる。

クプリゾンを5週間と長期にわたって摂取させたマウスの脳梁および海馬CA1領域では、成熟型オリゴデンドロサイトの密度が減少していたことから、白質障害が起こっていることが明らかになった。アストロサイトの空間分布密度は、クプリゾン摂取並びにゲニステイン投与によって変化がなかったが、GFAPの染色強度はクプリゾン摂取によって増強した。これはゲニステインによって抑制されなかった。ミクログリアの空間分布密度は、クプリゾン摂取によって増加したがゲニステイン投与によって抑制されなかった。一方で、貪食性ミクログリアのマーカー分子であるケラタン硫酸陽性ミクログリアの空間分布密度はゲニステイン投与によって減少した。フローサイトメトリーと定量PCRを用いた解析では、ゲニステイン投与はクプリゾンによって上昇する炎症関連遺伝子群に対して大きな変化を与えなかった。一方で、海馬組織から得られたRNAと定量PCRを用いた解析では、クプリゾンによって引き起こされるミエリン関連遺伝子の低下が総じて抑制されることが明らかとなった。これらの結果から、ゲニステインはオリゴデンドロサイト上のエストロゲン受容体を介して成熟オリゴデンドロサイトの細胞死を抑制している可能性があると考えた。本研究の成果はToxicology and Appliedpharmacology誌に既に受理された。前年度までは、炎症関連のグリア細胞であるミクログリアとアストロサイトについては分離して検討していたが、ゲニステインによる抗炎症効果は予想以上に弱かったことから、上記の論文にデータを組み込む形で発表した。5週間のクプリゾン摂取によって引き起こされる脱髄は、統合失調症における脱髄と比べると劇的なものであったことから、現在は2週間のクプリゾン摂取モデルを新たに作出し、脳内の変化を組織学的・分子生物学的に調べている。既に海馬内において、グリア細胞の活性化や神経新生の抑制などの効果を認めている。さらに所属研究室内に動物行動実験システムを導入したことで、本モデルが不安障害、驚愕抑制の異常などの統合失調症様の表現型を示すことを確認した。ミクログリアに対する抗炎症効果については、現在論文投稿準備中であり引き続き追加実験を進める。アストロサイトに対する抗炎症効果についてはGFAP、pSTAT3、S100βなどの各種マーカー分子との共染色を用いて、その効果を定量的に評価する。近年はアストロサイトエンドフィートによるシナプスの機能調節にも注目が集まっていることに着眼し、シナプスマーカーとの共染色によってトリパータイトシナプスの構造的な変化も解析する予定である。一方で、平成29年度までに進捗が得られなかった抑制性ニューロンに対する効果については、ゲニステイン以外のエストロゲン様化合物(ダイゼイン、エストラジオールなど)を用いて追加検討する予定である。今後は2週間のクプリゾン摂取モデルを統合失調症モデルとして使用し、神経炎症仮説に基づく薬理学的介入実験や、神経新生抑制仮説に基づく薬理学的介入実験を行う予定である。