hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大気化学輸送モデルと結合したインバースモデルによる排出源分布の推定手法の開発

最終年度となる本年度の研究では、東アジア地域の汚染物質の排出量マップと大気化学輸送モデル(CMAQ)を用いて、光化学オキシダントや炭化水素類を対象に、膨大な観測データから排出源インベントリーを補正するキャリブレーション手法を開発した。最初に、2004年の輸送・反応・沈着シミュレーションを実施して、その計算結果を常時観測点での連続データと比較して、モデルの再現性を確認した。また、対流圏オゾン濃度の増加に対する、大陸からの越境輸送の寄与を解析した。次に、2001年に実施されたTRACE-P航空機観測データを利用して、対流圏の一酸化炭素(CO)濃度に対する各国・各地域からの寄与解析を行うと共に、モデル計算と観測値の間の誤差を最小化するように各国・各地域の排出量のキャリブレーションを行った。その結果、中国からの排出量は当初設定した排出量の270%、その他の東アジア地域も平均で250%程度に増加する結果となった。これは、当初の設定が年平均であったのに対して、実際の観測期間が暖房需要のある3月であった事などによる差も含まれるものの、排出係数等の過小評価も大きく寄与しているものと考えられる。また、領域境界でのバックグラウンド濃度及び日々変動するバイオマス燃焼起源の排出量についても、同時にキャリブレーションを行ったところ、バックグラウンド濃度の日々の変動幅は2倍程度と大きく、粗い全球モデルによって領域境界濃度を得る必要性が高い事も分かった。これらの一連の手法によって排出源インベントリーの精緻化に、観測データを利用する有効性が確かめられた。全球的な気相物質・粒子状物質の大気中への排出量分布を求めることは、それらの対流圏大気化学プロセスを通した地球規模の気候変動や生態系への影響などを定量的に把握する上で重要である。しかし、従来の基礎統計資料を用いたボトムアップ的な排出量インベントリー解析は、膨大な情報を必要とする上、急激な社会変化に対応する事が難しく精度向上には限界がある。そこで、本研究では、地上観測網や航空機観測データなどから得られる大量の観測データからインバース的に排出源マップを作成し、従来のインベントリーを補完しうる手法を構築する事を目的とする。今年度は、まず既存の排出源インベントリーの収集と整理を行うと共に、本研究のモデル領域・解像度に合うように排出源データセットを作成した。また、2001年2月5月のTRACE-P/ACE-Asia観測をはじめとして、2001年2004年に実施された地上観測・航空機観測のデータを収集して、データベースとして格納した。さらに、これまで当研究室で開発してきた全球三次元大気化学輸送モデルを用いて、通年のシミュレーションを実行した。これによって3次元空間内のラジカル類を含む化学物質の濃度場および気象場、拡散係数、沈着量などのデータセットを作成することができた。さらに研究のベースとなるインバースモデルのプロトタイプを作成し、長寿命の化学種については、移流・拡散等の効果を反映して排出源分布の再構築ができる事を確認した。急速に経済発展が進む中国をはじめとした東アジア、東南アジア諸国から排出される大気汚染物質が日本を含む東アジア地域のみならず、北半球全域にわたって対流圏の大気組成を変えており、その生態系や気候変動への影響が無視し得ない状況となっている。本研究では、これら影響の定量的な評価に不可欠な三次元大気化学輸送モデルとその主たる入力情報である排出量インベントリーの精緻化を進めるために、大気化学輸送モデルと結合したインバースモデルによる排出源分布の推定手法の開発を構築している。本年度の研究では、2004年1月12月までの一年間の東アジアスケールでの大気汚染物質の輸送・反応・沈着シミュレーションを実施して、その計算結果を常時観測点での連続データと比較して、モデルのパフォーマンスを評価する手法を構築した。比較は生態系への影響が懸念されているオゾンを中心に行った。複数の観測地点のデータと比較することで、地点毎の再現性の違いや、モデルパフォーマンスの季節変化などを捉える事ができた。次に、バックトラジェクトリーによるインバース解析によって、それらのパフォーマンスの違いの原因を検討した。関東地方の観測点のデータを用いた比較では、冬季に中国北部を通過してきた気塊に大きな誤差がみられ、汚染物質の過小評価がその原因のひとつであると考えられた。さらに一酸化炭素についても同様の比較を行い、同様の結果を得たことから、これらの原因が燃焼起源の汚染物質である可能性が高いと推定された。

また、領域境界でのバックグラウンド濃度及び日々変動するバイオマス燃焼起源の排出量についても、同時にキャリブレーションを行ったところ、バックグラウンド濃度の日々の変動幅は2倍程度と大きく、粗い全球モデルによって領域境界濃度を得る必要性が高い事も分かった。これらの一連の手法によって排出源インベントリーの精緻化に、観測データを利用する有効性が確かめられた。
セルフオーガニゼーションを利用した高性能マルチスケールエネルギー材料の創製

超伝導体や熱電変換材料などのエネルギー材料内で生じるセルフオーガニゼーション(自己組織化)の制御技術を確立し、マクロスケールなエネルギー性能を飛躍的に向上させる、高性能マルチスケールエネルギー酸化物材料開発技術の創製を目的とした。成果として、REBa2Cu3Oy超伝導薄膜の作製条件によってBaMO3の自己組織化を制御し、世界最高クラスの超伝導特性が得られた。この自己組織化を数値シミュレーションによって再現するコードを開発し、自己組織化機構を明らかにした。超伝導体や熱電変換材料などのエネルギー材料はナノスケールの構造制御によってマクロスケールなエネルギー性能が向上するマルチスケールエネルギー材料である。超伝導では、ナノスケールの欠陥を意図的に導入することで臨界電流密度を飛躍的に向上させることができる。また、熱電変換材料では、結晶欠陥による熱伝導率の低下が熱電変換効率の向上に寄与することが期待できる。本課題ではセルフオーガニゼーション(自己組織化)の制御技術を確立することでエネルギー材料の性能を飛躍的に向上させる、高性能マルチスケールエネルギー酸化物材料開発技術の創製を目的としている。2013年度は、1酸化物エネルギー材料のエピタキシャル薄膜の成長、2下地表面ナノ修飾技術の確立とセルフオーガニゼーションに与える影響を明らかにすることを目的とした。1パルスレーザー蒸着(PLD)法を用いてSm-Ba-Cu-O超伝導エピタキシャル薄膜を作製した。また、これらの薄膜中にBaMO3 (BMO、M=Hf、Snなど)を添加することでBMOがナノロッド状に自己組織化することを確認した。2ナノ表面加工装置を本年度予算で導入し、CeO2中間層表面のスクラッチ加工(機械的加工)を試みたが、加工できなかった。そこで、同装置の一機能であるナノ電極リソグラフ(ナノリソ)を試みた。この手法は、試料と探針間に電圧を加えることで試料をナノレベルで局所的に酸化させる手法である。ナノリソのために中間層材料として酸化物エネルギー材料と格子不整合性が比較的良いTiNを選定した。TiN中間層をガラス基板上に作製し、ナノリソ加工を施したところ、印加電圧や探針走査スピードを最適化することで、TiNがTiO2に相変態しモル体積が増加した結果、幅100 nm、高さ数十nm程度の線や円を描画可能であることが明らかとなり、下地層表面のナノ加工技術の確立を行った。2014年度は、1BaMO3 (BMO)添加量やRE-Ba-Cu-O薄膜の成長温度によるBMOの自己組織化制御、2ナノ電極リソグラフによる表面加工技術の確立を目的とした。1パルスレーザー蒸着(PLD)法を用いて、BaHfO3 (BHO)添加量が08 vol.%のSm-Ba-Cu-O超伝導エピタキシャル薄膜を成長温度750920oCで作製し、BHO添加量や成長温度に対するBHOナノロッドの自己組織化について検討を行った。その結果、ナノロッドの数密度はBHO添加量に対して単調に増加するが、平均直径はほぼ一定であることがわかった。また、成長温度が高くになるに連れて、数密度は減少し平均直径は大きくなることがわかった。2スパッタ法で作製したNb超伝導薄膜表面にナノ電極リソグラフによってサブミクロンスケールで局所酸化パターンを描画する検討を行った。Nb薄膜はスパッタ法によって石英、サファイアそしてシリコン基板上に蒸着した。その結果、太さ100ナノのライン状酸化ニオブによって半径300 nm程度の円を300 nm周期で四角格子状に並べて描画することが可能なった。2015年度は、13次元に拡張した結晶成長シミュレーションコードを開発し、ナノロッドの成長機構や形状についてシミュレーションを行った。このシミュレーションの結果と実際の実験結果を比較することで、ナノロッドの自己組織化機構を明らかにすることを目的とした。また、2自己組織化やナノ電極リソグラフを用いて磁束ピンニングセンターをデザインし、超伝導特性を評価することも行った。1開発した3次元結晶成長シミュレーションによって、RE-Ba-Cu-O薄膜中でBaMO3(BMO)が自己組織化してナノロッドを形成する過程を再現することに成功した。このシミュレーションを用いることで成長温度と成膜速度に対するナノロッドの自己組織化形状に関する状態図を作成した。

2シミュレーションの結果に基づいて、低い成長温度でBMO添加RE-Ba-Cu-O薄膜を作製しその超伝導特性を測定したところ、4.2 Kにおいて巨視的ピンニング力密度1.6 TN/m3を得た。この値は世界最高クラスの値である。また、ナノ電極リソグラフによって意図した配置にピンニングセンターを入れることに成功し、ピンニングセンターの密度によって超伝導特性が変化することを確認した。超伝導体や熱電変換材料などのエネルギー材料内で生じるセルフオーガニゼーション(自己組織化)の制御技術を確立し、マクロスケールなエネルギー性能を飛躍的に向上させる、高性能マルチスケールエネルギー酸化物材料開発技術の創製を目的とした。成果として、REBa2Cu3Oy超伝導薄膜の作製条件によってBaMO3の自己組織化を制御し、世界最高クラスの超伝導特性が得られた。この自己組織化を数値シミュレーションによって再現するコードを開発し、自己組織化機構を明らかにした。研究計画に基づいて、BMOナノロッドの自己組織化について実験的に明らかにできた。また、ナノ電極リソグラフによる表面加工についても計画通りに遂行されたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。機能性材料工学2014年度の成果によって、BHO添加量や成長温度がSm-Ba-Cu-O薄膜中におけるBHOナノロッドの自己組織化に与える影響が明らかとなったため、今後は結晶成長シミュレーションなどを用いて微視的な自己組織化メカニズムを明らかにする。また、それと共に積極的にBHOナノロッドの自己組織化を制御し、磁場中における超伝導特性を評価する。ナノ電極リソグラフ技術を用いてNb薄膜に様々な酸化物パターンを描画し、パターン配置が超伝導特性に与える影響について明らかにする。薄膜が成長する下地表面をナノ加工する際に、CeO2層ではナノスクラッチ加工が出来なかった。また、他の酸化物材料も堅いため、ナノスクラッチ加工は困難であることが予想された。そこで、ナノ電極リソグラフ(ナノリソ)を用いて局所酸化させる方針に転換を行った。結果として、TiN層を用いることで下地層表面のナノ加工に成功した。しかし、ナノリソに最適な材料の選定やナノリソ条件の最適化などのため、本年度は下地層表面のナノ加工技術の確立に留まった。そのため、達成度はやや遅れていると判断した。下地層表面のナノ加工技術は確立されたため、次年度以降はこの基板上に酸化物エネルギー材料薄膜を成長させ、下地層のナノ加工がセルフオーガニゼーションに与える影響について明らかにする。それと平行して、Sm-Ba-Cu-O超伝導薄膜中でセルフオーガニゼーションしたBMOナノロッドについて、BMO添加量や成長温度などの成長条件がセルフオーガニゼーションに与える影響について検討を行う。
結核感染症に対するサイトカイン遺伝子導入樹状細胞を用いた細胞ワクチンの開発

本研究では,生体で最も強力な樹状細胞を用いて,結核菌感染症に対する細胞ワクチンを開発した.最初に,結核菌由来の防御蛋白であるAg85Aをコードする遺伝子を,レトロウイルスを用いて,マウス骨髄由来の樹状細胞に遺伝し導入にし,細胞ワクチンを作成した.次に,この樹状細胞ワクチンをBALB/cマウスに経静脈的に投与し,誘導される特異的免疫を解析した.樹状細胞ワクチンを接種されたマウスの脾細胞は,PPD特異的な細胞増殖と,IFN-γの産生を示した.さらに,Ag85A由来の既知の細胞障害性T細胞(CTL)エピトープに対するCTL活性が誘導され,同時にエピトープ特異的なIFN-γの産生が認められた.最後に,経静脈的に結核菌を接種するマウス結核感染症モデルを用いて,樹状細胞ワクチンの有効性を検討した.樹状細胞ワクチンを接種したマウスの臓器菌量は,ナイーブマウスに比べ有意に少なく,本細胞ワクチンが感染防御能を誘導することが示された.以上より,結核菌由来の乾癬防御蛋白Ag85Aを発現させた樹状細胞は,結核菌感染症に対して有用である可能性が示唆された.本研究では,生体で最も強力な樹状細胞を用いて,結核菌感染症に対する細胞ワクチンを開発した.最初に,結核菌由来の防御蛋白であるAg85Aをコードする遺伝子を,レトロウイルスを用いて,マウス骨髄由来の樹状細胞に遺伝し導入にし,細胞ワクチンを作成した.次に,この樹状細胞ワクチンをBALB/cマウスに経静脈的に投与し,誘導される特異的免疫を解析した.樹状細胞ワクチンを接種されたマウスの脾細胞は,PPD特異的な細胞増殖と,IFN-γの産生を示した.さらに,Ag85A由来の既知の細胞障害性T細胞(CTL)エピトープに対するCTL活性が誘導され,同時にエピトープ特異的なIFN-γの産生が認められた.最後に,経静脈的に結核菌を接種するマウス結核感染症モデルを用いて,樹状細胞ワクチンの有効性を検討した.樹状細胞ワクチンを接種したマウスの臓器菌量は,ナイーブマウスに比べ有意に少なく,本細胞ワクチンが感染防御能を誘導することが示された.以上より,結核菌由来の乾癬防御蛋白Ag85Aを発現させた樹状細胞は,結核菌感染症に対して有用である可能性が示唆された.樹状細胞(dendritic cell, DC)を用いたより強力な抗結核ワクチンを開発するために,結核菌由来の抗原蛋白と共にIL-1遺伝子を導入したDCワクチンを作製し,その有効性を初感染および再燃結核感染症モデルで検討し,さらに,この遺伝子導入DCワクチンの結核感染症に対する治療効果を確認し,MDR-TBを含む結核感染症の治療におけるDCワクチンの有用性を明らかにすることを目的として,研究を進行中であり,今年度は,まず,遺伝子導入DCワクチンの開発を行った.結核菌の主要な分泌蛋白であり,且つ感染防御誘導蛋白でもあるAg85A,Ag85B蛋白をコードするcDNAと(長崎大学から供与),また,マウスIL-12遺伝子のplasmid(ATCC)を入手し,IRESをもつpMX vectorに,IRESの前後に挿入した.さらに,これをリン酸カルシウム法を用いてレトロウイルスのpackaging cellであるPhoenix cellに遺伝子導入し,培養上清から前述の遺伝子を含んだレトロウイルス粒子を回収した.これを,マウスの骨髄から培養したDCに,spin infection法を用いて感染させ,Ag85A,Ag85B蛋白と共にIL-12遺伝子が導入されたDCワクチンを作製した.目的遺伝子の導入は,制限酵素を用いて確認した.次に,この遺伝子導入DCが,IL-12を産生することを確認するために,培養上清中のIL-12p70をELISAにて測定し,pg/ml orderのIL-12p70蛋白が産生されていることが明らかとなった.さらに,このIL-12p70が機能的にもintactであることを証明するために,IL-12依存性に増殖するPHA刺激T細胞を用いて増殖活性を検討したところ,遺伝子導入DCの培養上清には強い増殖活性があることが判明した.したがって,遺伝子導入DCはfunctional IL-12を産生することが確認された.本研究では,生体で最も強力な樹状細胞を用いて,結核菌感染症に対する細胞ワクチンを開発した。最初に,結核菌由来の防御蛋白であるAg85Aをコードする遺伝子を,レトロウイルスを用いて,マウス骨髄由来の樹状細胞に遺伝し導入にし,細胞ワクチンを作成した.次に,この樹状細胞ワクチンをBALB/cマウスに経静脈的に投与し,誘導される特異的免疫を解析した.樹状細胞ワクチンを接種されたマウスの脾細胞は,PPD特異的な細胞増殖と,IFN-γの産生を示した.さらに,Ag85A由来の既知の細胞障害性T細胞(CTL)エピトープに対するCTL活性が誘導され,同時にエピトープ特異的なIFN-γの産生が認められた.最後に,経静脈的に結核菌を接種するマウス結核感染症モデルを用いて,樹状細胞ワクチンの有効性を検討した.樹状細胞ワクチンを接種したマウスの臓器菌量は,ナイーブマウスに比べ有意に少なく,本細胞ワクチンが感染防御能を誘導することが示された.以上より,結核菌由来の乾癬防御蛋白Ag85Aを発現させた樹状細胞は,結核菌感染症に対して有用である可能性が示唆された.
高度の圧電特性を示すポリマナノ/マイクロ圧電ファイバの動作メカニズムの解明

研究代表者らのこれまでの研究により,フィルムでは通常圧電性を示さないポリマが,エレクトロスピニング法によるナノもしくはマイクロファイバ化により,高い逆圧電特性を発現することを世界に先駆けて明らかにした.しかし,この動作メカニズムは未だ解明されていない.そこで本研究課題では,「エレクトロスピニング法で作製したポリマナノ/マイクロ圧電ファイバの動作メカニズムの解明」を研究目的として研究を遂行する.具体的には,以下の2段階の目標を設定し研究を進める.[1]そもそもの「なぜ圧電性が発現したか?」の解明[2]高度の圧電特性(圧電d定数)が得られた原因の解明研究代表者らのこれまでの研究により,フィルムでは通常圧電性を示さないポリマが,エレクトロスピニング法によるナノもしくはマイクロファイバ化により,高い逆圧電特性を発現することを世界に先駆けて明らかにした.しかし,この動作メカニズムは未だ解明されていない.そこで本研究課題では,「エレクトロスピニング法で作製したポリマナノ/マイクロ圧電ファイバの動作メカニズムの解明」を研究目的として研究を遂行する.具体的には,以下の2段階の目標を設定し研究を進める.[1]そもそもの「なぜ圧電性が発現したか?」の解明[2]高度の圧電特性(圧電d定数)が得られた原因の解明
宇宙X線ボロメータ検出器の開発

Barkley研究所で製作された中性子照射型ゲルマニウム結晶をボロメータ素子として用い、素子固定器具、低温から常温までの配線、回路系、データ取り込み系を自作し、「動くX線ボロメータシステム」を作り上げた。冷却器には当研究室の^3Heデュワ-を使用し0.35Kで実験した。昨年度試作した回路系はノイズが設計値の100倍多かったが、今年度はその原因をつきとめ、2倍程度である3.5nV/√<Hz>にまで改良した。また自動バイアス調整回路を付け加え0.2Hz以下のDC成分はカットし、初段FETの動作電圧ドリフトが出力に現れないようにした結果、操作性が改善された。これにより計算上^<55>Feの5.9keVX線が検出できるメドが立ったので、液体ヘリウムを入れて実験を行い、^<133>Baの31,81keVX線の検出に成功した。しかし0.35Kに冷やすとノイズが常温の10倍に増えたため、5.9keVは検出できなかった。エネルギー分解能は33%FWHM(【.di-substituted left.】keV)と悪く、これはノイズの高さに起因する(△E=10keV)。ただしここでは波形処理を行っていないので、デジタルフィルタをかけたり波形フィッティングを行なうことにより、この数字は若千改善されるであろう。外づけフィルタ回路を取り換え、いろいろな周波数成分をサンプルした結果、このボロメータ素子からのパルスは減衰時間1msと250msの2つの成分からなっていることがわかった。0.2-100Hz、0.2-1kHz、10-1kHzの周波数帯ではS/Nはほぼ一定であった。
南西諸島における急性死亡の法医学的研究

「変死体」として取り扱われる事例のほとんどは急性死亡(急死)に由来するが、急死は法医学上、各種の問題を含んでおり、社会的にも影響が大きい。そこで、当法医学教室において、昭和57年度から同62年度の間に、取り扱った変死体982例(検案197、司法解剖499、行政解剖286)について、急死の原因およびその発生機序について検討した。成績を次に要約した。1.死亡を種類別に比較すると、内因死(病死)23.1%、自殺20.8%、他殺と交通事故がともに12.4%、事故災害9.8%、自過失8.5%、その他13.0%であった。これを性別にみると、男性74.7%、女性25.3%で男性が圧倒的に多い。2.自殺例を手段別にみると、縊死がもっとも多く、全自殺例の37.3%を占め、溺死19.6%がこれに次ぎ、飛び下り、中毒、焼死の順であった。3.他殺例を手段別にみると、鋭器によるものが圧倒的に多く(37.7%)、鈍器によるものがこれに次ぐ(24.5%)。他殺例を年令別にみると、20才代がもっとも多く、10才未満と60才以上がこれに次ぐ。さらに近親犯による被害者の年令をみると、10才未満がもっとも多く、しかも加害者が精神障害者であることが多い。一方、精神障害者による他殺は、全他殺例の21.3%であった。4.交通事故例における歩行者と自動二輪車の事故は68%、自動二輪車運転事故死の65%は10才代の男性であった。5.疾病による急死例では、急性心疾患が約4割、脳血管系疾患、消化器系疾患、呼吸器系疾患がこれに次ぎ、全国的傾向と一致する。しかし、消化器系疾患による急死の大半は肝臓疾患(肝硬変症)であり、これは東京や大阪の約2倍の比率に達しているのが特徴的で、この原因としてアルコール飲料との関係が示唆された。この問題については、今後検討を要する。一方、当地域は亜熱帯に属するが、凍死(低湿による全身機能障害)が10例見出された。成績を次に要約した。いわゆる「変死体」として取り扱われる事例のほとんどは急性死亡(以下急死と略記)に由来するが,急死は法医学上,各種の問題を含んでおり,社会的にも影響が大きい.そこで,当法医学教室において,昭和57年度から同61年度の間に取り扱われた変死体839例(検案184,司法解剖387,行政解剖268)について,急死の原因およびその発生機序について検討した.1.死亡を種類別に比較すると,内因死(病死)24.6%,自殺21.6%,他殺11.2%,自過失12.0%,事故災害15.6%,その他15.3%である.2.これを性別に比較すると,男性74.7%,女性25.3%であるが,他殺では女性43.0%である.3.他殺例を手段別に比較すると,鋭器によるものが圧倒的に多い(約40%)4.他殺例を年令別に比較すると, 20才代が多く, 10才未満と60才以上とがこれに次ぐ

.5.近親犯による被害者の年令をみると, 10才未満と60才以上が多い.しかも,母殺しの約7割,子殺しの母の約3割は精神障害者である.さらに,精神障害者による他殺は,全他殺例の22%に達している.6.交通事故例は,全検案数の約11%.歩行者と自動二輪車の事故が全体の約2/3.自動二輪車事故の約70%は10才代の男性により占められている.7.疾病による急死(内因性急死)例では,急性心疾患が約4割を示し,脳血管系疾患,消化器系疾患,呼吸器系疾患がこれに次ぐ.8.消化器系疾患による急死の大半は肝臓疾患(肝硬変症)であり,これは東京や大阪の約2倍の比率を示しているのが特徴的で,この原因としてアルコール飲料との関係が示唆される.前年度に引き続いて、昭和62年度に取り扱われた変死体143例(司法解剖112例、行政解剖18例、検案13例)を新たに加えて、急死の原因およびその発生機序について検討した。本年度は、前年度まで自過失または事故災害に含まれていた交通事故を別個に取り出して検討した。その結果、死亡を種類別に比較すると、内因死(病死)が最も比率が高く23.1%、次いで自殺20.8%、他殺と交通事故がともに12.4%、事故災害9.8%、自過失8.5%、その他13.0%の順であった。このように、事故災害や自過失のトップを占める交通事故については、今後、社会医学的見地から、その発生要因の究明が問われよう。これは、本地域における消火器系疾患による急死の大半は肝臓疾患であり、その原因として、アルコール飲料との関係が示唆されるところから、当地域における交通事故と飲酒運転との因果関係は、無視し得ないと考えられる。内因死(病死)の種類別発生比率、交通事故の種類別発生比率、近親者による犯罪比率および精神障害者による犯罪比率などは、前年度の成績とほぼ同様であった。
親と環境が早産児の高次脳機能発達を促す機序の近赤外分光法と行動指標による研究

出生率が増加している早産児は、高次脳機能障害を発症するリスクが高く、小児医療において大きな課題である。早産児が高次脳機能障害を発症する原因として、出生後に早産児が入院する新生児集中治療室では、本来胎児が母胎内で影響を受けるべき正常な親や環境からの作用の欠如が注目されているが、その機序は明らかでない。近年、非侵襲的脳機能測定法である近赤外分光法や視線・吸啜行動などの生体信号を用いた新生児の高次脳機能の研究が可能となってきた。本研究の目的は、NIRSと生体信号などを用いて早産児の高次脳機能障害の発症機序を明らかにし、新たな診断・治療法を確立することである。
統一的に記述した原子核間相互作用を用いた不安定核反応の系統的解析手法の構築

メルボルンの研究グループが開発した現代的な原子核内2核子有効相互作用を用いて、核子-原子核の弾性散乱を純理論的に記述する試みを継続して行った。前年度の研究成果により、弾性散乱を簡便に記述する近似法の精度と有効適用領域が判明したため、今年度は実際にこの手法を用い、不安定原子核と陽子の弾性散乱の記述を行った。研究対象とする不安定原子核は、ニッケル同位体、^<58,68,78,88>Niとした。これらの原子核の密度分布は、九州大学の清水良文准教授の協力を仰ぎ、最新の核構造計算であるハートリーフォックーボゴリューボフ法によって求めた。分析の結果、陽子とニッケル同位体の弾性散乱から、ニッケル同位体の密度分布(拡がり)が確かに抽出できることを確認した。次に、重陽子とニッケル同位体の散乱の分析を行った。陽子-ニッケルおよび中性子-ニッケルの相互作用を、上述の方法で理論的に求め、3粒子系(陽子+中性子+ニッケル)の動力学は、九州大学が約20年前に開発した離散化チャネル結合法を用いて記述した。分析の結果、重陽子-ニッケルの弾性散乱は、陽子-ニッケルのそれと比較して、有意の付加情報を与えることができない一方で、重陽子が陽子と中性子に分解した状態(それらの放出方向が揃っている状態)を観測・解析することによって、ニッケル同位体中の陽子と中性子の密度分布の差を引き出し得ることが明らかになった。陽子と中性子の密度を選択的に引き出す手法の構築は、不安定原子核の研究の推進にとって極めて有用である。本研究により、核子と原子核の弾性散乱(及び相互作用)を理論的に記述する試みと、伝統ある反応計算法との有機的な結合が、不安定核研究にとって本質的に重要な成果へと結実したと考えられる。メルボルンのグループによる、2核子散乱を正しく記述する最先端の複素型有効相互作用を用いて2重畳み込み(double-folding)ポテンシャルを計算するに先立ち、この相互作用の正当性に対するさらなる検証を行った。具体的には、この有効相互作用の重ね合わせによって標的核が連続状態に励起する陽子入射反応を記述し、スピン偏極量A_yの計算を行い、実験データを再現することに成功した。この物理量は、これまで4半世紀もの間誰も再現できなかったものであり、今回の成果は、メルボルンの有効相互作用だけでなく、研究代表者が構築に携わった反応模型の信頼性を如実に示すものと考えられる。一方、不安定核反応の解析における畳み込み(folding)模型の重要性を示すべく、天体核物理学の分野で重要な課題である^8B生成反応断面積の精密決定にこれを応用した。太陽ニュートリノ問題とも密接に関わるこの断面積を精密に決定するためには、正確な反応理論と、反応粒子間の信頼できる光学ポテンシャルが必要となる。研究代表者はfolding模型を用いて光学ポテンシャルの計算を行うことで、^8B生成反応断面積を決定する際に問題となる、光学ポテンシャルの不定性を実質上排除することに成功し、この断面積の正確な決定を行った。この成果はPhysical Reviewで出版され、また、2005年に東京大学で開かれた宇宙物理学の国際シンポジウムOMEG05の招待講演に選定された。平成17年度の研究により、メルボルンの有効相互作用が実際の様々な反応解析で機能すること、不安定核反応において本研究計画が提唱する微視的光学ポテンシャルの重要性が明確に示されたと考えられる。メルボルングループによる複素型2核子有効相互作用を用いた、陽子-原子核間の微視的光学ポテンシャルを高精度かつ簡便に計算する手法の開発に着手した。計算は歴史のあるBrieva-Rook(BR)流の畳み込み模型に基づき、まずこの手法の有効性を陽子一安定核散乱の分析によって検証した。BRの畳み込み模型では、核子の反対称化に起因する交換項(非局所項)の取り扱いについて、いくつかの近似を行っている。それらの近似の正当性を個々に分析したところ、陽子の入射エネルギーが約60MeV200MeVの範囲では、模型が有効に機能することが明らかになった。特に、この畳み込み模型に適用可能なエネルギーの上限があることは、本研究で得られた新しい知見である。有効相互作用以外に、光学ポテンシャルの構築に必要なものとして、原子核の密度分布があるが、本研究では、実験を用いて現象論的に密度を決定できない、不安定核の領域にも適用可能な、平均場模型(Hartree-Fock計算)によってこれを求めた。すなわち、純理論的に求めた核密度と2核子有効相互作用を用いて陽子一原子核弾性散乱の記述を行った。その結果、断面積の理論計算値は、入射エネルギーが約60MeV200MeVの範囲で、陽子-安定核の実験データを非常に良く再現することが確かめられた。この結果を受け、反応データが存在しない、陽子-不安定核の弾性散乱についても計算を行い、断面積の理論的予言を行った。また、その結果を分析することによって、将来の弾性散乱実験の詳細な解析から、不安定核の半径の情報が引き出せることを示した。

これらの原子核の密度分布は、九州大学の清水良文准教授の協力を仰ぎ、最新の核構造計算であるハートリーフォックーボゴリューボフ法によって求めた。分析の結果、陽子とニッケル同位体の弾性散乱から、ニッケル同位体の密度分布(拡がり)が確かに抽出できることを確認した。次に、重陽子とニッケル同位体の散乱の分析を行った。陽子-ニッケルおよび中性子-ニッケルの相互作用を、上述の方法で理論的に求め、3粒子系(陽子+中性子+ニッケル)の動力学は、九州大学が約20年前に開発した離散化チャネル結合法を用いて記述した。分析の結果、重陽子-ニッケルの弾性散乱は、陽子-ニッケルのそれと比較して、有意の付加情報を与えることができない一方で、重陽子が陽子と中性子に分解した状態(それらの放出方向が揃っている状態)を観測・解析することによって、ニッケル同位体中の陽子と中性子の密度分布の差を引き出し得ることが明らかになった。陽子と中性子の密度を選択的に引き出す手法の構築は、不安定原子核の研究の推進にとって極めて有用である。本研究により、核子と原子核の弾性散乱(及び相互作用)を理論的に記述する試みと、伝統ある反応計算法との有機的な結合が、不安定核研究にとって本質的に重要な成果へと結実したと考えられる。
労働時間の短縮=弾力化と大企業ホワイトカラー労働者(副題)フレックスタイム制の導入とその結果

労働時間の短縮策として法的に認められ,大企業ホワイトカラーを中心に急速に進められる弾力化が,「合理化」策の一環として各企業で進められてきていることを明らかにした。大企業ホワイトカラーに対する労働時間の短縮=弾力化策が,(1)現実には,「合理化」の一環として行われていること,(2)しかも,この労働時間制度の変更が,単に労働時間にとどまらず賃金管理を大きく転換することを実証的に明らかにしてきた。不況下で厳しい雇用調整がホワイトカラーにも及び,相対的に賃金の高い中高年労働者の雇用を削減する今日,この層の人件費抑制策として,労働時間の弾力化を利用して強力に推進されているのである。ホワイトカラーの労働時間弾力化がみなし労働時間制を利用して行われようとしていることは,主として上級管理職を中心に現在導入が進められている年俸制を下級ホワイトカラーにまで広げる動きとして注目された。未だ組合員でもある多くのホワイトカラー労働者に対して,残業手当の不払い合法化により,人件費を負担せずに労働させることができる。労働者の意識と行動を益々労資一体的にできるという点で同制度は企業にとってメリットがあるが,労働者サイドにとっては深刻な労働問題を惹起している。この点で,ホワイトカラーに対する時短政策・施策を考えるうえでも,弾力的な労働時間制度のありかたを再検討する必要がある。
土壌中６価クロムの拡散初期の還元プロセスの解明

本研究は、土壌中の6価クロム(Cr(VI))還元反応について、土壌中で主となる還元剤である2価鉄(Fe(II))と腐植物質の寄与について着目し、Cr(VI)がどのように還元されていくのか、その還元過程を高時間分解能で明らかにすることを目的としている。本年度は、Feと腐植物質量が既知の土壌試料を用いてモデル実験を行い、土壌中のCr(VI)還元プロセスの評価について重点的に研究を実施した。土壌試料には、屋久島、金精峠、東京都、上海(中国)で採取した表層土壌を用いた。Cr(VI)の価数別定量には、X線吸収微細構造(XAFS)法のQuick-XAFSモードを適用し、Cr(VI)拡散直後からの還元反応を数時間連続でリアルタイムに近い時間軸でトレースし、還元挙動を評価した。その結果、金精峠を除く3試料では、Cr(VI)還元反応は拡散後速やかに始まった。一方で、金精峠土壌では反応開始2時間が経過してもCr(VI)還元反応は観測されなかった。金精峠土壌は、Fe含有量、腐植物質量が共に極めて乏しく、そのためCr(VI)還元反応は観測されなかったといえる。また、Cr(VI)還元反応中におけるpHの変化についても同様の時間分解能でトレースしたところ、還元反応進行中にpHの変化は起こらず、還元挙動に反応系内のpHは依存していないことがわかった。土壌中のFe(II)によるCr(VI)還元反応は鉱物からのFe(II)イオンの溶出に依存する。還元剤を添加していない土壌のCr(VI)還元反応は腐植物質が大きく寄与する。その一方、Fe(II)が存在すれば、Fe(II)はCr(VI)還元に直接的に寄与し、さらに土壌中の腐植物質がFe(III)をFe(II)に還元し、Cr(VI)還元を促進すると期待できる。Cr(VI)汚染土壌の修復にはFe(II)が有効であることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。土壌中の6価クロム(Cr(VI))の還元反応について、土壌中で主となる還元剤である2価鉄(Fe(II))と腐植物質の寄与に着目し、還元過程のプロセスを高時間分解能で解明することを目的とし、今年度は、Fe(II)試薬、腐植物質としてフミン酸標準物質を用いた実験室系(単純系)におけるCr(VI)還元プロセスの解明に焦点を絞り、研究を実施した。Cr(VI)還元反応の高時間分解能での観測に、シンクロトロン放射光を用いたX線吸収微細構造(XAFS)法のQuick-XAFS(QXAFS)モードを適用した。これにより、Cr(VI)還元反応を30秒刻みという従来の16倍の時間分解能での測定を実現でき、速い還元反応をCr(VI)拡散直後から秒単位でリアルタイムに近い時間軸でトレースすることを可能にした。還元剤としてFe(II)のみ、フミン酸のみ、Fe(II)とフミン酸が両方含まれる試料の3種類についてCr(VI)還元挙動の観測、比較を行った結果、Fe(II)とフミン酸を同時に適用することがCr(VI)還元反応に有効であることが明らかになった。また、Cr(VI)還元反応中に起こるFeの化学種の変化をメスバウアー分光法を用いてトレースし、Cr(VI)還元反応により生成したFe(III)は、フミン酸により出発物質と同じ化学種のFe(II)に還元されることを明らかにした。Fe(II)とフミン酸では、Cr(VI)還元反応に対し異なる寄与の仕方をし、フミン酸よりもFe(II)の直接的寄与の方が大きいことが明らかになった。一方で、フミン酸は、Fe(II)再生能力を持ち、Cr(VI)還元反応中に生成したFe(III)を出発物質と同じFe(II)に再生する、すなわち、フミン酸はFe(II)によるCr(VI)還元反応の促進剤として機能していることを明らかにした(Hori et al., 2015)。

土壌中のFe(II)によるCr(VI)還元反応は鉱物からのFe(II)イオンの溶出に依存する。還元剤を添加していない土壌のCr(VI)還元反応は腐植物質が大きく寄与する。その一方、Fe(II)が存在すれば、Fe(II)はCr(VI)還元に直接的に寄与し、さらに土壌中の腐植物質がFe(III)をFe(II)に還元し、Cr(VI)還元を促進すると期待できる。Cr(VI)汚染土壌の修復にはFe(II)が有効であることが示唆された。QXAFS法を用いて、これまでにない高時間分解能で速いCr(VI)の還元反応の観測を達成できた。また、Fe(II)とフミン酸によるCr(VI)還元プロセスを明らかにでき、この研究成果を国際誌に公表した。以上のことより、研究はおおむね順調に進展しているものと考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。実際の土壌におけるCr(VI)還元反応の観測を行い、土壌pH、腐植物質の有無やその含有量等、土壌に対して細かく評価を行い、還元プロセスを評価する。Cr(VI)の人為的汚染が少ないとされる土壌を国内の複数の地点(主に、山間部、離島など)で採取を実施する予定である。土壌中Cr(VI)拡散初期の還元挙動が明らかになることで、Cr(VI)汚染土壌の修復法を導けると考えられる。また、得られた結果を国際誌に公表および関連する学会にて発表を行い、議論を深める。
仮骨延長時の顔面骨骨髄における骨系細胞動員ならびに分化誘導に関する研究

平成14年度におけるin vitroでの実験では、大きく分けて2つの事象が観察された。1つは、骨細胞はメカニカルストレスに対して、'細胞内にカルシュウムを流入させ器質化を強める役割を行っていて、実際に骨延長では、その主役は未分化な間質細胞とそれらが分化した骨芽細胞であることが判明している。そして、超音波刺激のような、低出力でHSP72を上げることなく、細胞に刺激を与える系では、骨芽細胞がその刺激に対してアナボリックな反応を起こすことが観察された。もう一つは、細胞へのメカニカルストレス付与時のCOX-2mRNAの上昇である。NS398のようなCOX-2のブロッカーを用いた場合、骨芽細胞の超音波刺激に対するアナボリックな反応が消失したことから、COX-2PGE2産成の系が、骨芽細胞の骨形成(増殖または分化)効果に大きな影響を与えていることが推測された。骨延長においも、緩徐に仮骨延長していく過程が、COX-2の上昇をみることからPGE2合成系の影響と、各種成長因子との関係を調べることが重要と考え、平成15年のin vivoの実験計画として、高齢COX-2ノックアウトマウスの延長前仮骨の治癒過程について、組織学的に追跡した後、骨延長実験を行った。その結果、高齢COX-2ノックアウトマウスの延長前仮骨治癒は、Wild-Typeに比べて遅延し、さらに超音波刺激による骨形成効果の観察が全くみられないという結果が得られた。すなわち、各種成長因子の枯渇した高齢マウスはCOX-2PGE2合成系によっての骨形成にバックアップされるのみで、さらにCOX-2PGE2合成系は機械的刺激の骨形成効果としてのシグナルを伝達する重要な役割を果たすことが判明した。そしてさらに、超音波照射によるCOX-2PGE2合成系による骨形成効果は、骨髄由来の骨芽細胞と、骨膜由来の骨芽細胞のどちらに作用しているかという実験では、骨髄細胞においても、免疫染色でOsteocalcin抗体の上昇をみたことから、骨髄内における細胞分化促進による骨化に、効果があることが判明した。今後は、機械的刺激のシグナリングであるCOX-2PGE2合成系を調節することで、BMPなどの骨形成蛋白による骨化シグナルが影響を受けるかについて調査していく予定である。1、骨髄からの未分化間質細胞の採取、単離と培養生後6週後のウィスターラットを用いて、下顎骨を正中で離断洗浄。顎関節部は除去する。α-MEM培地を用いて海綿骨部を洗い流した。繰り返しのピペッティングのあと浮遊細胞を得る。これを2週間培養し70%コンフルエントになったところで、0.25mMのアスコルビン酸またはDexamethasone(1×10 M froma 1-M stock solution in ethanol)を加え、その後実験に使用した。2、未分化間質細胞に対する機械的外力の負荷機械的外力はフレクサーセル社製の細胞伸張装置(神奈川歯科大学に設置)を用い(Endocrinology vol.137及びB.B.R.C. vol.264)、培養皿の底のコラーゲンコートしたシリコン膜の上に細胞を移し、接着培養する独自の方法を採っている。

伸張刺激の強度は、細胞の等倍延長を1E(ストレイン)として、0.4%の延長すなわち4000μEとした。これはサイクル数が一定で有ればこのくらいまでの延長では変化率に比例して骨の断面積が増加すること、ヒトなどの運動に伴う生理的な変形は20003000μEであること、骨折レベルの変形は25000μEと大きいことなどを考慮している。負荷後の時系列的な変化を観察する。また様々な負荷周期と強度による応答の差についても検討する予定である。また、帝人社製低出力超音波パルス装置(神奈川歯科大学に設置)を用い(B.B.R.C.vol.268)、20分間超音波刺激を与え、刺激前、刺激開始後15分、6時間、24時間後の細胞の応答を観察する。3、未分化間質細胞に対して機械的外力が及ぼす影響の検討骨系細胞が機械的外力の負荷された状態で示す増殖、基質合成や石灰化の変化は、既に報告した方法(J. Bone Miner. Res. Vol.10及びCalcif. Tissue Int. vol.57)で基本的には調べた。その結果、下顎骨骨髄は、未分化な間質細胞のうちは超音波刺激に応答して分化を促進させ、分化の進んだ線維性仮骨の段階で骨芽細胞に伸張刺激を加えると、細胞内カルシュウム濃度を上昇させることが判明した。さらに、骨系のマーカーを用いて、RT-PCRをおこなった結果、COX-2の上昇がみられ、また、ALPも軽度に上昇したことから、骨髄細胞から骨芽細胞への分化にCOX-2が関与していることが示唆された。平成15年度の実験は、前年度の結果を受けて大筋の実験系は変更せず、若干の予備的調査を加えた。平成14年度におけるin vitroでの実験では、大きく分けて2つの事象が観察された。1つは、骨細胞はメカニカルストレスに対して、細胞内にカルシュウムを流入させ器質化を強める役割を行っていて(J.Biol.Chem.,275)、実際に骨延長では、その主役は未分化な間質細胞とそれらが分化した骨芽細胞であることが判明している(Ishigame M.et al.J.B.M.R 2002)。そして、超音波刺激のような、低出力でHSP72を上げることなく、細胞に刺激を与える系では、骨芽細胞がその刺激に対してアナボリックな反応を起こすことが観察された。もう一つは、細胞へのメカニカルストレス付与時のCOX-2 mRNAの上昇である。NS398のようなCOX-2のブロッカーを用いた場合、骨芽細胞の超音波刺激に対するアナボリックな反応が消失したことから(J.B.M.R 2003)、COX-2PGE2産成の系が、骨芽細胞の骨形成(増殖または分化)効果に大きな影響を与えていることが推測された。骨延長においても、緩徐に仮骨を延長していく過程が、COX-2の上昇をみることからPGE2合成系の影響と、各種成長因子との関係を調べることが重要と考え、平成15年のin vivoの実験計画として、高齢COX-2ノックアウトマウスの延長前仮骨の治癒過程について、組織学的に追跡した後、骨延長実験を行った。その結果、高齢COX-2ノックアウトマウスの延長前仮骨治癒は、Wild-Typeに比べて遅延し、さらに超音波刺激による骨形成効果の観察が全くみられないという結果が得られた。
潜在的産肉能力の開拓による高品質赤肉産生・肉用牛資源の造成

本研究では、わが国の肉用牛(黒毛和種牛、褐毛和種牛、日本短角種牛)の産肉特性、肉質特性、繁殖性、放牧適性、飼料効率性等に関する能力を調査し、その潜在的産肉性を評価し、次世代型の高品質赤肉生産・肉用牛資源を造成するための戦略的な調査研究を行う。本研究では、肉用牛の評価のために、下記の国際シンポジウム、国内シンポジウム、ワークショップを開催し、肉用牛の第一線で活躍する研究者を招待して、それらの研究成果と肉用牛資源開発の調査、検討を行った。1)シンポジウム:「ルミノロジーの基礎と応用」(平成18年11月5日):「ルミナントバイオロジーの新展開」(平成18年3月28日)3)ワークショップ:高品質赤肉を効率的に生産する肉用牛資源の造成-骨格筋形成抑制因子、ミオスタチンの作用機構と産肉への応用-(平成18年1月13日):肉用牛の現状と展望(平成18年1月20日)また、企画会議(5月)と調査評価会議(8,2月)を開催し、高品質の赤肉を効率的に生産する肉用牛造成のための候補牛の資質の解析と評価を行い、その成果を資源開発に役立て、さらの東北アジアの肉用牛資源開発に資するため、次年度の「東北アジア地域の肉用牛遺伝資源の開拓とその活用技術の基盤形成に関する調査研究」(基盤研究(B)(海外学術):H1820)に研究課題として発展させた。
コラーゲン特異的ストレス蛋白質HSP47の発現調節

コラーゲン特異的分子シャペロンHSP47の発現調節機構を解明するため、ニワトリおよびマウスのゲノム遺伝子のクローニングを行い、その解析を行った。マウスHSP47のゲノム遺伝子構造に関しては、Gene誌に発表を行った。この遺伝子は、6つのイントロンと5つのエクソンからなる全長約7.5kbの遺伝子である。転写制御領域に関しては、いくつかの特徴的な配列がみられた。この領域の解析にあたっては、二つの観点i)コラーゲンの発現量に呼応した発現を制御する領域と、ii)ストレスによる誘導を制御する領域に分けてその同定及び解析を進めている。熱ショックによる遺伝子の発現は、転写開始点の上流約100bpに存在する熱ショックエレメントによって制御されていることをすでに明らかにした。本研究の主要なテーマであるコラーゲンの発現に呼応した発現を制御する領域の検索は、現在その解析を進行中である。転写開始点の上流3.0kbにおよぶ領域をレポーター遺伝子であるCATの上流につなぎBalb/c 3T3細胞に導入後そのCAT活性を測定した。ストレスによる誘導に関しては、上述のように熱ショックエレメントが重要な働きをしている。定常的な発現に関しては、その検出が出来ず、欠損変異の導入により転写調節領域の解析を進めている。定常的な発現に関しては、-150から3'領域をもつプラスミドにわずかの活性が観察されるのみであった。定常レベルでの発現が検出できない理由については、1)細胞がすでにHSP47をfullに発現しており、あらたな発現の誘導に必要な因子が補給されない、2)転写調節領域がさらに上流あるいは、第一イントロンに存在するなどが原因として考えられる。このような点を考慮にいれ、定常状態での発現を検出できるよう、遺伝子導入細胞の検索、さらに上流あるいは、第一イントロンを含んだプラスミドの構築を行い、定常状態での発現を同定しうるシステムの構築をおこなっているところである。
ビフィズス菌-ヒト共生システムの理解を目指した系統的遺伝子破壊株の作製とその解析

我々が開発したビフィズス菌の遺伝子破壊法を用い、ビフィズス菌の腸内環境に対する適応戦略に関わる可能性のある遺伝子群の系統的遺伝子破壊コレクションの作成を行った。ビフィズス菌の二成分制御系のレスポンスレギュレーター(RR)遺伝子9つの破壊株を取得し、そのトランスクリプトーム解析を行った。結果、一つのRR遺伝子が70個以上の遺伝子の発現調節に関与していることがあきらかになった。これらは、酸素耐性、酸耐性、胆汁酸耐性、浸透圧に関与することが示された。ビフィズス菌は、ヒトの健康に大きな意味を持つ共生細菌である。近年、多くのビフィズス菌株のゲノム解析が行われたが、大腸菌や枯草菌の遺伝子の相同性でアノテーションされただけで、実験的に機能が解析された例はごく僅かであり、40%は相同性を示さず機能推定さえもなされていない。本研究では、この問題をブレイクスルーするため、新たに高効率な実用的遺伝子破壊法を構築し、ビフィズス菌の遺伝子破壊株コレクションを作成する。本研究では、ビフィズス菌に特有のオリゴ糖の代謝酵素とそのトランスポータ、調節タンパク質遺伝子の破壊株コレクションを作製し、これらの機能をメタボロミクスおよびタンパク質化学的手法によりシステマティックに明らかにすることで、ビフィズス菌-ヒト共生システムの分子機構の統合的理解を目指す。これまでに、温度感受性プラスミド、pyrE遺伝子による正負両方向のマーカー遺伝子を用い、ひとつのベクターを作成した後、1目的の遺伝子を破壊するためのベクター構築2形質転換3ダブルクロスオーバー組換えによる遺伝子破壊、4セルフクロスオーバー組換えによるマーカー遺伝子の削除を行う事で、連続的に複数の遺伝子を破壊する方法が確率できた。ころを用いて、本年度は、2成分制御系のレスポンスレギュレーターを中心に20株の破壊株の作成に成功した。また、メタボローム解析による変異株の代謝メカニズム解析を会わせておこない、変異株の機能解析系の構築を行っている。ビフィズス菌は、ヒトの健康に大きな意味をもち共生細菌である。近年多くのビフィズス菌のゲノム解析が行われたが、大腸菌や枯草菌との相同性で書く遺伝子の機能が推定されただけで、実験的に機能が解明されたれいは著しくすくない。約4割は相同性も示さず機能推定さえされていない。本研究では、この問題をブレークスルーするために、新たに高効率の遺伝子破壊法を構築し、ビフィズス菌の遺伝子破壊株コレクションを作成する。本研究ではビフィズス菌に特有のオリゴ糖に代謝酵素とそのトランスポータ、調節タンパク質の遺伝子に破壊株コレクションを作成し、これらの機能をメタボロミクスおよびタンパク質科学的手法によりシステマティックに明らかにすることで、ビフィズス菌ヒト共生システムの分子機構の統合的理解を目指す。これまでの研究では、1特にヒトミルクオリゴ糖(HMO)に利用に関する変異株を対象として多くの変異株を作成し、HMOの取り込みメカニズム、細胞内での利用に関わる遺伝子について、変異体を作成した。これらは、現在、in vitroでの機能の解析を行っている。2B. longum105-A株の細胞外多糖合成に関する遺伝子クラスタを見出し、これらの遺伝子の変異体を作成した。3細菌の環境適応において重要な役割を果たしていると考えられる二成分制御系について系統的な変異体作成を行った。B.longumにおいては、10セットに2成分制御系の遺伝子があるが、これらがどのような環境因子に応答しどのような遺伝子群を調節しているかはほとんど知られていない。これらについて、レスポンスレギュレーターの遺伝子を破壊した変異株を作成した。我々が開発したビフィズス菌の遺伝子破壊法を用い、ビフィズス菌の腸内環境に対する適応戦略に関わる可能性のある遺伝子群の系統的破壊を試みた。ビフィズス菌は大腸下部に到達するまでに、酸素や低pH、胆汁酸、浸透圧など様々な環境に適応することが考えられる。ビフィズス菌の環境適応能を解明するために、私たちは環境適応に必要とされる二成分制御系に着目した。本研究では、二成分制御系のRR遺伝子の破壊株を取得し、トランスクリプトーム解析を行うことで、Bifidobacterium longum NCC2705株の環境応答メカニズムを明らかにすることを目的とした。9つのRR遺伝子の上流配列と下流配列それぞれ約1 kbの間にスペクチノマイシン耐性遺伝子となる配列を温度感受性プラスミドpKO403に組み込み、NCC2705 pyrEへ形質転換した。プラスミドと染色体上で2回相同組換えを起こし、RR遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子と置き換わることで破壊株取得を試みた。得られた破壊株を用いて、低pH、胆汁、高浸透圧環境下における生存率を比較した。トランスクリプトーム解析は、MRS培地で生育した破壊株およびコントロール株のmRNAを用いて行った。NCC2705株にコードされている9つのRR遺伝子のうち7つの破壊株が取得できた。このうち、ΔBL0005株は73個の遺伝子の発現を一挙に変動させた。この中には8つの転写因子が含まれていた。この変異株は、酸素耐性、酸耐性、胆汁酸耐性、浸透圧耐性といった菌が経口摂取された後、大腸に定着するまでに必要な一連の機能を失ったことから、BL0005遺伝子はビフィズス菌が腸内に定着するために必要だと考えられる環境適応を統括してコントロールするマスタースイッチで有ると結論した。

我々が開発したビフィズス菌の遺伝子破壊法を用い、ビフィズス菌の腸内環境に対する適応戦略に関わる可能性のある遺伝子群の系統的遺伝子破壊コレクションの作成を行った。ビフィズス菌の二成分制御系のレスポンスレギュレーター(RR)遺伝子9つの破壊株を取得し、そのトランスクリプトーム解析を行った。結果、一つのRR遺伝子が70個以上の遺伝子の発現調節に関与していることがあきらかになった。これらは、酸素耐性、酸耐性、胆汁酸耐性、浸透圧に関与することが示された。遺伝子破壊株の作成に時間がかかっている。当初200遺伝子を対象としたが、現在のとこと、60遺伝子程度が達成できている。対象とした変異が、1ビフィズス菌にとって必須な遺伝子であること、2相同組換えがが起こりにくい領域が存在することが、予想された。現在のところ相同領域の長さを長くすることにより対処可能であることがわかってきた。27年度が最終年度であるため、記入しない。応用微生物学遺伝子破壊株の作成に思いのほか時間がかかってしまったため、当初の計画からは若干の遅れを見せているが、現在、目的とした変異株の作成にめどがついたため、今年度はその機能解明を進める。機能解析については、順次行う予定である。現在までに、約20の遺伝子の破壊実験を行った。この中で、3つに関し安定した遺伝子削除株が得られす、必須遺伝子であると考えられた。現在、調節可能なプロモータを導入して必須性の検討を行っている。このため、進行がやや遅れているが、今後も必須遺伝子の解析が必要であると考え実験系の確率を先行して行った。破壊株作成に関しては、複数の遺伝子フラグメントを効率よく連結する改良型ゴールデンゲート法を開発したため、破壊効率が格段に改善させることに成功したため、この方法を用いて当初の約200遺伝子の破壊株作成とその機能解析を目指す。H25年度の消耗品費として予定していた菌学が計画より172,162円少なく済んだ、実験計画の遂行上合成DNA購入に必要な金額が若干少なかったためである。H26年度の研究計画の中で、会わせて使用したい。