hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「細胞外pHをセンスするG蛋白共役型受容体」を介した骨・関節の代謝調節機構の解析

細胞外pHの低下は、骨・関節機能に多大な影響を及ぼすことが知られている。関節炎・リウマチなどの炎症部位では細胞外pHが低下しており、これらの病態の進展に影響を及ぼしていると予想される。本研究では、これら病態の進展に大きな役割を果たすマクロファージの炎症応答に細胞外pHをセンスするG蛋白共役型受容体が関与することを示した。この成果は今後、上記病態の進展に対して新たな視点からの知識を提供するものである。関節炎・リウマチなどの炎症時には、感染した細菌由来の酸性物質や、周囲の細胞由来の乳酸によりpHが低下し、炎症応答が修飾される。細胞外のpH変化は種々の細胞機能を変化させるが、そのメカニズムの詳細は不明である。OGR1受容体ファミリー(OGR1,TDAG8,GPR4,G2A)には細胞外プロトン(pH)感知機構など従来のGPCRにはない新しい機能が存在することが我々を含む国内外のグループで明らかにされてきた。本研究では骨代謝・炎症応答を中心に、これらの機能制御におけるプロトン感知性受容体の役割とその作用機構を解析している。本年は、リウマチと関係が深い炎症性サイトカインの産生に対するOGR1受容体ファミリーの役割を中心に解析した。(1)マウスマクロファージにリポポリサッカライド(LPS)を作用させると炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6)産生が増加するが、この応答は細胞外pH低下によって抑制されるマクロファージではTDAG8、OGR1が多く発現している。そこで、TDAG8、OGR1受容体欠損マウス由来の細胞で同様の実験を行ったところ、細胞外pH低下による応答抑制はTDAG8欠損マウス由来のマクロファージでは作用が抑制されたが、OGR1欠損マウス由来の細胞では影響がなかった。(2)TDAG8の過剩発現細胞を用いた解析では細胞外pH低下はGsを介し、アデニル酸シクラーゼ/cAMP系を活性化する。そこで、cAMP誘導体、cAMPホスホジエステラーゼ阻害薬、アデニル酸シクラーゼを活性化するアゴニスト(プロスタグランジン、β-アドレナリンアゴニストなど)などでも同様にサイトカイン産生が抑制されるかどうかを調べたところ、cAMP増加がこの抑制作用を仲介していることが判明した。(3)Gs・に対するsiRNA、フロテインキナーゼA(PKA)阻害薬H89でも作用が抑制された。これらの結果から、細胞外pH低下による炎症性サイトカイン産生抑制はTDAG8/Gs/cAMP/PKAを介していると推定された。骨・関節形成やそれらの機能維持には、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスが重要である。アシドーシスや関節炎では組織、細胞外のpHが低下する。pHの低下は、骨や関節組織の細胞の機能を変化させるが、そのメカニズムの詳細は不明である。OGR1、GPR4、TDGA8、G2Aは細胞外プロトンを感知するユニークなGPCR群であることが我々のものを含め、報告されている(OGR1ファミリー)。我々はpHの低下に伴う骨・関節組織の機能変化に、このファミリーが関与するものと考えている。本年は、1.OGR1欠損マウスの骨密度を、頭数を増やして測定した。その結果、OGR1欠損マウスではコントロールマウスと比べ、骨量が高い傾向が観察された。また雌雄間で欠損マウスとコントロールマウスとの間で骨量の差に違いがある傾向が観察されている。しかしながら現在までに、はっきりとした結果は得られていない。継続して測定を行い、雌雄差も含め、差があるのかどうかを検討している。さらに本年度はGPR4欠損マウスの骨計測も行った。現在までにコントロールマウスとの間に有意な差は観察されていない。欠損マウス由来の骨芽細胞、骨髄由来の破骨細胞を用いた解析は細胞の分離条件、培養条件を含め、検討を続ける予定である。2.関節炎に対するGPR4の作用を解析するため、コラーゲン誘導性の関節炎実験を行う準備を進めている。現在、関節炎を発症しやすいDBAマウスとGPR4を欠損するDBAマウスを用いて、使用するコラーゲンや誘導、炎症評価方法の検討を続ける予定である。骨代謝は、骨・関節形成や機能を制御している。骨代謝はサイトカイン/受容体システムによって調節されていることがよく知られている。一方、アシドーシス時や関節炎他、炎症時に引き起こされる細胞外pHの低下に伴って骨や関節組織の細胞機能が変化することが知られている。しかしながら細胞外プロトンの感知機構の他、そのメカニズムの詳細は不明である。OGR1、GPR4、TDGA8、G2Aは細胞外プロトンを感知するユニークなGPCR群であることが我々のものを含め、報告されている,(OGR1ファミリー)。本年は、1.OGR1欠損マウスと正常マウスの骨密度を、頭数を増やして測定し比較した。

その結果、測定部位(骨端部、骨中心部)によって、両者の間の有意差があることが明らかとなったが、その差は小さなものであった。GPR4欠損マウスの骨密度が正常マウスのものとほとんど差がないという昨年の結果を考え合わせると、これらの受容体は、アシドーシスや関節炎など、緊急応答時に作用を発揮している可能性がある。実際、2.関節炎に対するGPR4の作用を解析するため、コラーゲン誘導性の関節炎実験を開始したところ、GPR4欠損マウスと正常マウス間で関節炎の進行度に差が存在するとの予備的な結果が得られつつある。実際にOGR1ファミリー受容体が炎症応答に関与する可能性は、酸性条件下におけるマクロファージからのTNFα産生のグルココルチコイドによる抑制応答においても、確認された。これらの結果を総合すると、骨、関節の形成・機能維持に関してOGR1ファミリーは炎症その他、緊急応答時に何らかの役割を担っている可能性が考えられた。
金ナノロッドのレーザー光励起過程の超高圧電子顕微鏡その場解析の展開

ナノ粒子のレーザー光照射に伴う構造変化過程を直接その場観察するために、超高圧電子顕微鏡に設置されたパルスレーザー光照射システム(波長はλ=1064, 532 nm,パルス幅は68 ns)の整備を行った。さらに、このシステムを用いて、特に近赤外光(λ=1064 nm)のパルスレーザー光照射による金ナノロッドの変形過程を中心に直接その場観察を行った。ナノロッドは最初の1パルス照射によって大きく変形するが、その後の追照射では変形があまり進まないことが示された。また、原子分解能での電子顕微鏡観察から、ナノロッドの内部は全体的に1ショット毎大きく原子配列が変化することが初めて明らかにされた。本研究では、パルスレーザー光照射機能を有する超高圧電子顕微鏡(HVEM)を用いて、レーザー光照射下での金属ナノ粒子の状態とその変化をその場観察を可能にする装置改良と実験技術の開発を行い、その成果を基に、可視光域ならびに近赤外域で集光素子として期待されている金ナノロッドのレーザー光(波長λ=1064, 532 nm)照射下の動的挙動のその場観察を進め、その励起過程と挙動を支配する因子を明らかにすることを目的としている。昨年度に装置の整備が進んだので、本年度はそれを用いてパルスレーザー光照射に伴う金ナノロッドの変形過程の「その場」観察実験を中心に研究を進めた。長軸50 nm、短軸10 nmの金ナノロッドを懸濁した液を、Arプラズマ中で親水化処理したQuantifoil炭素支持膜に滴下し、真空乾燥したものを試料とした。照射線束密度4.1×10E21 photons/m2/pulseの条件では、パルスレーザー光を1パルス照射すると金ナノロッドは球状粒子へと変形した。2.5×10E21 photons/m2/pulseの条件では、数pulseの照射により金ナノロッドのアスペクト比が減少し、球形へと変形する過程が観察された。また1.7×10E21 photons/m2/pulseでは一部の金ナノロッドは球形へと変形したが、ほとんどの金ナノロッドは照射初期にアスペクト比が減少するものの、その後パルスレーザー光の照射量を増加しても、変化は進行せずにアスペクト比は一定値に漸近した。また、凝集している粒子は孤立している粒子に比べて著しく変形し、合体する様子が観察された。また、波長532 nmのパルスレーザー光を照射した場合には、1064 nmレーザー光と比較して変形が遅く進む事が明らかになった。本研究では、パルスレーザー光照射機能を有する超高圧電子顕微鏡を用いて、レーザー光照射下での金属ナノ粒子の状態とその変化をその場観察によって解析可能にする装置改良と実験技術の開発を行い、その成果を基に、可視光域ならびに近赤外域で集光素子として期待されている金ナノロッドのレーザー光照射励起過程と挙動を明らかにすることを目的とした。最終年度となる平成25年度は、まず照射レーザー光の試料位置での偏光方向を確認するために、Si薄膜試料を用いて表面に形成されるリップル構造の観察を行った。その結果、表面には複雑な縞模様が形成され、レーザー光をHVEMに導くパスにおいて乱反射等の影響が含まれている可能性が示唆された。その原因については年度内に解明することができず、今後の課題として残った。さらに高分解能透過像その場観察を行い、ナノロッドの内部の原子構造の解析を進めた。照射前のナノロッドは、長軸方向が結晶の[001]方向に配向した単結晶であった。425 mJ/m2/pulseの強度で1パルス照射したとき、外形はアスペクト比が減少して球形に近づくが、内部の原子配列は照射前とは大きく変わり、多数の双晶界面や積層欠陥を含む構造へと変化する様子が観察された。さらに照射を進めると、パルス毎に内部の原子配列はすべての領域で完全に再結晶化が進み、原子が再配列している様子が観察された。一方、加熱ステージを単純な試料加熱のみでは、外形については同様にアスペクト比の減少が進むが、内部は単結晶状態を維持していることが明らかとなった。このように、本研究によってレーザー光照射下での金属ナノ粒子の状態変化を原子分解能でその場観察・解析する実験手法が確立され、ロッド内部ではレーザー光照射によって完全に原子配列を入れ替えながら形態変化が進むことが初めて明らかになった。本研究では、パルスレーザー光照射機能を有する超高圧電子顕微鏡(HVEM)を用いて、レーザー光照射下での金属ナノ粒子の状態とその変化をその場観察を可能にする装置改良と実験技術の開発を進める。その成果を基に、可視光域ならびに近赤外域で集光素子として期待されている金ナノロッドのレーザー光(波長λ=1064, 532 nm)

照射下の動的挙動のその場観察を進め、その励起過程と挙動を支配する因子を明らかにすることを目的としている。まず、超高圧電子顕微鏡内の観察試料に対して照射光の強度が10 mW/mm2レベルになるように、減光フィルターを挿入するとともに光学系を変更することによって照射領域の拡大をはかった。加えて、PINフォトダイオード素子を電子顕微鏡ホルダーに挿入した測定子により、電子顕微鏡内での光強度分布を測定して、観察領域の照射強度分布の定量化を行った。その結果、その場観察でのレーザー光照射条件を明確化することが可能になった。上記レベルの強度のレーザー光照射条件では、炭素薄膜(商品名Quantifoil)が分解能低下が少なく、試料支持膜として適当であることも判明した。このような準備を終えた後に、実際に金ナノロッドに対して波長λ=1064 nmの近赤外光を電子顕微鏡内で照射し、それぞれの形態変化を時間の関数として測定した。その結果、レーザー光照射によって金ナノロッドの形態変化が誘起されるには、0.8 mW/mm2以上の強度が必要であり、それより低い強度では形態は変化しないことが明らかになった。また、形態は照射初期に大きく変化し、その後徐々に球形に近づくことも明らかになった。レーザー光を照射しない単純な加熱実験では、金ナノロッド(長軸50 nm,短軸10 nm)は523 K以上の加熱によって形態が球形へ変化した。現在までに超高圧電子顕微鏡の試料室にパルスレーザー光を導入する事を可能にし、また試料室での光強度の測定も可能になっており、レーザー光照射による個々の金ナノロッドの動的挙動をその場観察する事ができている。本年度は、まず超高圧電子顕微鏡内に適切な強度のレーザー光を導入する実験条件を確立することを第一の目的とし、それはほぼ達成できて、実際に金ナノロッドの照射挙動のその場観察を進めることができ、当初に計画した内容はすべて終えることができている。超高圧電子顕微鏡の特徴を生かすために、原子レベルの高分解能観察に注力してく予定である。ナノロッドの外形変化に関わる内部の原子配列の挙動にsついての知見を得る。また、光に対するナノロッドの方位依存性、レーザー光の偏光依存性、基板の温度依存性についても検討を進める。初年度にレーザー光照射条件が確立したため、これを基に様々な条件での実験を行う。特に、ナノロッドの方位依存性、レーザー光の偏光依存性、基盤温度の3点を主要なパラメーターとして、光励起挙動を実験的に明らかにする予定である。該当なし主として実験に使用する消耗品と研究成果報告のための旅費、ならびに超高圧電子顕微鏡の使用料にあてる。
食事制限下におけるエネルギー代謝量:ヒトの適応過程としての検討

「適応能」は生理人類学の中心的概念の一つである。ヒトはその歴史のほとんどを自然環境の中で過ごし、その環境に適応してきた。その結果、様々な生理的多型性が生まれヒトは全世界に分布した。諸民族の問にエネルギー代謝の違いがあることが報告されている。動物性タンパクや脂肪摂取の多いイヌイットは高い代謝水準によって寒さを凌ぎ、食糧事情の悪いアンデス高地の住民は代謝増大をできるだけ抑え断熱型の反応をする。しかし、このような相違が遺伝的要因により決定されるものなのか、もしくは短期的な機能馴化によるものなのかは十分には解明されていない。今回我々は、短期的な絶食および食事制限がエネルギー代謝や他の生理機能にどのような影響をおよぼすかについて検討し、ヒトの環境適応の過程にについて考察した。労働者の健康増進を目的として、軽度肥満者や軽度高脂血症者または健常者に餌や運動指導を行っている企業がある。本研究は、この企業の健康増進活動に参加したものを対象として行われた。対象者を中等度摂取エネルギー制限群および軽度摂取エネルギー制限群の二群に分け、摂取エネルギー以外の健康指導は両群とも同じとした。呼吸商は、エネルギー制限により低下し、エネルギー源が経口の炭水化物から体脂肪に移行していることが示唆された。基礎代謝量も減少し、その程度は中等度制限群において軽度制限群より大きかった。また、この基礎代謝の変化は体重の変化よりも大きかった。このことからエネルギー制限により、基礎代謝は敏速に減少することが確認された。さらに動物を用いた実験系で検証した。その結果、短期の絶食により代謝系を含む生理機能が変化することが観察された。この研究成果は、国内および国際学会で報告し、国内および国際誌上に発表した。以上のごとく、本研究は目的を達成することができた。諸民族間にエネルギー代謝の違いがあることは昔から指摘されている。しかしこれまでに、このような相違が遺伝的要因に大きく決定されるものなのか短期的な機能馴化によるものなのか詳細は不明である。今年度は、短期的な摂取エネルギー制限が、ヒトのエネルギー代謝および他の生理機能にどのような影響をおよぼすかについて検討した。さらに、これらの影響についてげっ歯類を用いて確認した。大阪府内の某企業では、定期健康診断等で発見される軽度肥満者や軽度高脂血症者または健常者を対象に6日間の健康指導を企業内の健康センターで行っている。これまでの同センターでの健康指導は主として摂取エネルギー制限と運動指導が行われている。本研究は、同センターに不所した者のうち文書で同意が得られた者を対象とし、関西医科大学疫学倫理委員会の承認に基づいて行われた。対象者を無作為に中等度エネルギー制限群および軽度エネルギー制限群に分け、摂取エネルギー以外の健康指導は両群とも同じとした。摂取エネルギー制限等の健康指導により両群共に、体重・Body mass index・収縮期血圧・拡張期血圧の低下が観察された。ポータブルガスモニターを用いて測定した呼吸商も、両群ともにコース期間中に低下し、エネルギー源が炭水化物から脂質に移行していることが確認された。また、中等度制限群の基礎代謝量は軽度制限群より大幅に減少した。これらの結果から、ヒトのエネルギー代謝が食物摂取に影響を受けることが確認でき、諸民族間で観察されるようなエネルギー代謝の相違は、遺伝的要因だけでなく短期的機能馴化によることが示唆された。短期的な摂取エネルギー制限がヒトのエネルギー代謝および他の生理機能の状態にどのような影響を及ぼすかについて、平成15年度に引き続き、関西医科大学疫学倫理委員会の承認に基づいて、データ収集を重ねた。

大阪府内の某企業では、軽度肥満者や軽度高脂血症者または健常者を対象に、6日間の食事・運動指導コースを行っている。本健康センターに入所した者のうち文書で同意が得られた者を対象とし、対象者を無作為に中等度エネルギー制限群および軽度エネルギー制限群の二群に分けた。摂取エネルギー以外の健康指導は両群とも同じとした。両群共に、6日間の食事・運動指導コースにより体重・Body mass indexの低下が観察された。ポータブルガスモニターを用いて測定した呼吸商も、両群ともにコース期間中に低下し、エネルギー源が炭水化物から脂質に移行していることが確認された。基礎代謝量もコース終了時点において両群ともにコース期間中に減少した。さらにこの減少量は中等度制限群において軽度制限群より統計学的に有意に多かった。ヒトのエネルギー代謝が短期的な食事制限によって影響を受けることが強く示唆された。以上の内容は国際生理人類学会で発表した。また、消費エネルギーと関連すると考えられる組織の酸化的ストレスについても尿中8-OHdG排泄量を測定し検討したが、消費エネルギーと酸化的ストレスとの関係は確認できなかった。さらに、食事制限中の神経内分泌系・その他の生理機能の状態について動物実験を行い、食事制限に対する適応能力について再検証した。その結果の一部は日本生理人類学会英文誌に印刷中である。諸民族の間にエネルギー代謝の違いがあることが報告されている。動物性タンパクや脂肪摂取の多いイヌイットは高い代謝水準によって寒さを凌ぎ、食糧事情の悪いアンデス高地の住民は代謝増大をできるだけ抑え断熱形の反応をする。しかし、このような相違が遺伝的要因により決定されるものなのか、もしくは短期的な機能馴化によるものなのか十分には解明されていない。我々は平成15年度および平成16年度に、短期的な摂取エネルギー制限がエネルギー代謝およびその他の生理機能にどのような影響を及ぼすかについて検討する目的で、疫学研究(関西医科大学倫理委員会承認・関医倫第エ0301号)および動物実験を行い、データを収集した。平成17年度は、平成16年度に引き続き、短期的な絶食や食事制限中のエネルギー代謝・その他の生理機能の状態について検討し、環境適応におけるヒトの潜在能力について考察した。その結果、短期の絶食により代謝系を含む種々のmRNAの発現量が有意に変化し、また、種々のタンパク質において変動が観察された。さらに、基礎代謝量は4日間の短期の摂取エネルギー制限により敏速に変動し、この変化量は体重の変化よりも大きかった。摂取エネルギー制限によりひきおこされるであろう体重減少を、この著明な基礎代謝量の低下により最小限にとどめようとしているものと考えられた。以上の結果から、諸民族の間にエネルギー代謝の違いは遺伝的要因だけでなく、生活環境に短期的な機能馴化をした結果でもあることが示唆された。これらの研究成果は、学術論文として取りまとめ、国際誌上に発表し、研究期間内に目的を達成することができた。
MicroRNAによる薬物動態関連因子の発現調節

MicroRNA(miRNA)は標的mRNAと部分相補的に結合し、翻訳抑制もしくはmRNAの分解を引きおこす、タンパク質をコードしない小分子RNAである。肝臓は薬物、糖および脂質などの代謝反応において重要な組織であるが、miRNAによる遺伝子発現調節がどのような影響を与えるか明らかにされていない。本研究は様々な代謝酵素の発現を調節する転写因子ヒトhepatocyte nuclear factor 4α(HNF4α)に注目して検討を行った。ヒトHNF4αmRNAの3'非翻訳領域と相補的なmiRNAを探索したところ、miR-24およびmiR-34aが高いスコアで見出された。肝癌由来HepG2細胞にこれらのmiRNAを過剰発現させると、HNF4αのタンパク質発現量は顕著に低下した。また、レポーターアッセイによりmiR-24およびmiR-34aはそれぞれHNF4αの翻訳領域および3'非翻訳領域を認識して発現を抑制することが示唆された。また、胆汁酸合成酵素であるCYP7A1や糖新生関連酵素であるPEPCKなどのmRNA発現量がmiRNAの導入によって顕著に低下した。さらに、この制御が細胞の形態学的な変化を誘導し、S期の細胞を減少させることをFACSを用いて明らかにした。従って、miRNAによるHNF4αの発現抑制は肝臓における様々な代謝反応に影響を与えるだけでなく、肝細胞の分化、増殖にも影響を与えることが示唆された。一方で、これらのmiRNAの発現が胆汁酸によって活性化されるPKC/MAPK経路および活性酸素種の産生により発現が上昇することを明らかにした。以上、本研究により、胆汁酸が蓄積するとmiR-24およびmiR-34aの発現が上昇し、胆汁酸合成を促進するHNF4αの発現が低下するという一連の制御メカニズムを明らかにした。
RSPO1を用いた角膜再生医療の基盤技術開発

WntシグナルのリガンドであるRSPO1の遺伝子異常家系では両眼性の角膜混濁をおこす。平成29年度までの研究で、RSPO1ーKOマウスでは、遺伝子異常家系と同様に角膜混濁をおこし、角膜に炎症を惹起させ、創傷治癒を遅延させることを確認した。さらにこの角膜混濁は角膜上皮下を中心とした沈着物であり、この沈着物にはカルシウムを含むことを証明した。またRSPO1-KOマウスの角膜上皮のみを分離し、抽出したRNAを用いて遺伝子解析を行った結果、S100A8/A9の明らかな発現上昇を確認した。Realtime-PCR法の結果でも、著明な発現上昇を認め(S100A8は96.90倍、S100A9は141.96倍)S100A8/A9がRSPO1の発現に大きく関与していることが示唆された。このS100A8/A9はcalcium-binding proteinの一種で、カルシウムを含んでダイマーを形成する性質があり、ある報告ではタイトジャンクション(TJ)の破綻を生じるということもあり、RSPO1-KOで生じている角膜上皮下および角膜実質浅層への沈着物の発生機序として、TJの破綻により涙液のカルシウムが上皮下にまわりS100A8/A9と複合体を形成しているのではと考えられた。間接免疫染色法を用いて、RSPO1-KOマウス角膜でのS100A8/A9染色では、上皮下および角膜実質の沈着部位で陽性であった。今年度は、S100A9 transgenicマウスを入手し、同マウスでは長期経過により角膜混濁を起こすことを観察した。またこの角膜混濁は、角膜上皮下のカルシウム沈着が関与していることが明らかになった。このことから、S100A8/A9の発現上昇に伴い、タイトジャンクション破綻により涙液より上皮下にまわりこんだカルシウムとともに結合し複合体を形成したものが沈着しているとの仮説に矛盾しないものとなった。WntシグナルのリガンドであるRSPO1の遺伝子異常家系では両眼性の角膜混濁と手掌足底の過角化、難聴をおこす。平成27年度までの研究で、RSPO1-KOマウスで角膜混濁、角膜炎症、角膜上皮障害が徐々に出現することを確認した。角膜混濁の原因検索のための実験では、von Kossa法、電子顕微鏡により角膜上皮下へのカルシウム沈着、免疫組織染色と電子顕微鏡によりタイトジャンクションの乱れを証明し、何らかの機序でタイトジャンクションが破綻した結果、バリア機能が低下し涙液中の物質が上皮下に浸透し蓄積しているのではないかと考えられた。またRSPO1-KOマウスでは角膜上皮創傷治癒が遅延するため、RSPO1は本来創傷治癒時に創傷治癒を助ける役目があると思われた。平成28年度は、遺伝子異常による発現変化を調べるため、RSPO1-KOマウスより角膜上皮のみを分離し、抽出したRNAを用いて網羅的遺伝子解析を行った。その結果、カルシウムを含む沈着物や炎症を引き起こしうる物質として、S100A8,S100A9の発現上昇を発見した。このS100A8とS100A9は、炎症部位に発現するタンパクでもあり、一部の研究では、発現上昇によりタイトジャンクションを障害しうる、さらには、S100A8とS100A9がヘテロダイマーを形成してカルシウムとともにアミロイドを形成するとの結果が報告されており、RSPO1-KOマウスの角膜混濁の機序の仮説にあてはまる。創傷治癒に関しては、どのような炎症であるかを確認するため、種々の炎症細胞について免疫染色を行った。その結果、創傷1週間で明らかにマクロファージが多く浸潤していることを確認した。RSPO1は、S100A8またはS100A9の発現制御を行い、角膜上皮タタイトジャンクション構造の恒常性を維持し、また炎症を制御することで角膜透明性を保っていることが示唆された。当初予定していた、RSPO1-KOマウスにおいてのin vivoにおける細胞生物学的検討が行われ、その結果タイトジャンクション破綻が示された。またさらなる検索として、電子顕微鏡によりタイトジャンクション破綻と上皮下へのカルシウム沈着が証明された。これにより、RSPO1の角膜上皮タイトジャンクションへの関連が示唆された。さらに大きな発見として、RSPO1-KOマウスの角膜上皮の網羅的遺伝子解析の結果、S100A8とS100A9の明らかな発現上昇を認め、既報より、炎症、タイトジャンクション、カルシウム沈着にかかわる因子であることから、RSPO1がS100A8またはS100A9と関連していることが強く示唆され、これらを制御することにより角膜の透明性を維持していることが明らかとなりつつある。RSPO1の角膜透明性維持機構の解析において、この発見は非常に重要な発見であり、今後のさらなる機序解明への大きな柱となった。平成28年度までの研究で、RSPO1ーKOマウスにおいては、遺伝子異常家系と同様に角膜混濁をおこし、角膜に炎症を惹起させ、創傷治癒を遅延させることを確認してきた。さらにこの角膜混濁は角膜上皮下を中心とした沈着物であり、この沈着物にはカルシウムが含まれることを証明した。

またRSPO1-KOマウスの角膜上皮のみを分離し、抽出したRNAを用いて遺伝子解析を行った結果、S100A8およびS100A9の発現上昇を確認した。このS100A8/A9はcalcium-binding proteinの一種で、カルシウムを含んでダイマーを形成する性質があり、また、ある報告ではタイトジャンクションの破綻を生じるということもあり、RSPO1-KOで生じている角膜上皮下および角膜実質浅層への沈着物の発生機序として、タイトジャンクションの破綻により涙液のカルシウムが上皮下にまわり、S100A8/A9と複合体を形成しているのではと考えられた。今年度の研究では、RSPO1-KOマウスより角膜上皮のみを分離してRNAを抽出し、このS100A8およびS100A9の発現について、ワイルドタイプマウスと比較しての相対的発現量をRealtime-PCR法を用いて解析したところ、著明な発現上昇を認め(S100A8は96.90倍、S100A9は141.96倍)、S100A8およびS100A9がRSPO1の発現に大きく関与していることを示唆するものとなった。また間接免疫染色法を用いて、RSPO1-KOマウス角膜でのS100A8及びS100A9の染色を行ったところ、上皮下および角膜実質に生じている沈着部位において陽性であり、S100A8及びS100A9の発現上昇に伴い、タイトジャンクション破綻により涙液より上皮下にまわりこんだカルシウムとともに結合し複合体を形成したものが沈着しているとの仮説に矛盾しないものとなった。RSPO1にまつわる様々な役割が明らかになりつつあり、角膜混濁の原因に近づきつつある。前年度までの大きな発見として、RSPO1-KOマウスにおいての、角膜上皮の網羅的遺伝子解析の結果、calcium-binding proteinであるS100A8とS100A9の大幅な発現上昇が認められた。このS100A8とA9がどれほど発現上昇しているかを検証したところ、S100A8では96.90倍、S100A9では141.96倍というような、非常に大きな差をもって発現上昇していることが確認され、RSPO1の役割の大きな鍵となっていることが改めて示唆された。またS100A8とA9が実際に沈着物に存在していることが免疫染色により確認され、角膜混濁の発生に大きく関与していることが示された。WntシグナルのリガンドであるRSPO1の遺伝子異常家系では両眼性の角膜混濁をおこす。平成29年度までの研究で、RSPO1ーKOマウスでは、遺伝子異常家系と同様に角膜混濁をおこし、角膜に炎症を惹起させ、創傷治癒を遅延させることを確認した。さらにこの角膜混濁は角膜上皮下を中心とした沈着物であり、この沈着物にはカルシウムを含むことを証明した。またRSPO1-KOマウスの角膜上皮のみを分離し、抽出したRNAを用いて遺伝子解析を行った結果、S100A8/A9の明らかな発現上昇を確認した。Realtime-PCR法の結果でも、著明な発現上昇を認め(S100A8は96.90倍、S100A9は141.96倍)S100A8/A9がRSPO1の発現に大きく関与していることが示唆された。このS100A8/
エンドセリンB受容体を持つ腸管筋層間線維芽細胞様介在細胞の機能とネットワーク構築

腸管筋層間線維芽細胞様介在細胞(fibloblast-like interstitial cells:ICs細胞と略す)は自発興奮し、腸管の蠕動運動のペースメーカーの役割を果たしていることが明らかになってきた。しかし、生理的な諸性質や発生学的な起源、規則正しい網状構造の形成過程についてはほとんど明らかになっていない。ICs細胞は私たりの作製したモノクローナル抗体で小腸絨毛下線維芽細胞やアストロサイトと同様に染まること、形態も類似していることから、これらの細胞と同様にエンドセリンB受容体(ET_BR)を持つことが推測された。本年度の実験計画は、1)ICs細胞を分離、培養し、整理的、形態的諸性質を検討、2)ET_BRの一部欠損突然変異ラット(回腸、大腸の筋層間の神経叢が欠損しておりヒルシュスプラング病の症状を示す)を使って、ET_BRの機能がICs細胞のネットワーク構築に及ぼす影響を明らかにする、の2点を進めることであった。1)については、ICs細胞の培養に適したラットの週齢の決定、ICs細胞の収率など、最適の条件がまだ決定できていない。そこで、主に、2)について結果を述べる。ET_BR突然変異ラット及び同腹の正常ラットの十二指腸、空腸、回腸、大腸の各部位について、Myenteric Plexusに存在するICs細胞を各種の抗体で免疫組織化学を行い、形態や数を比較した。ICs細胞はわれわれの作製した8Elモノクローナル抗体と抗ビメンチン抗体でよく染まった。また、ET_BRのN末端に対する合成オペプチド抗体でも、うすく染まった。正常ラットではICs細胞は星状で細長い突起がつながって網状構造をなしているが、ET_BR突然変異ラットのICs細胞は扁平で細胞突起が太く短く、細胞間がつながっているようには見えなかった。細胞数については、十二指腸や空腸では正常ラットより突然変異ラットのほうが数が少し多かった。エンドセリンはギャップ結合の透過性を変えることが報告されており、アストロサイトや小腸絨毛下線維芽細胞、ICs細胞の細胞間連絡に正常と突然変異ラットで違いがあるか現在検討している。
日本人特有の感情不安・身体特性からみる発育期スポーツ教育方法の再考

特性不安の高い競技特性では、あがり条件によって生化学指標変動に相違(p<0.05)がみられ、練習内容や測定時期による精神負荷や身体的疲労に特異的傾向が示された。また、情緒不安定特性別による弁別・判断・選択時間の遅延(p<0.05)については、発育期世代では更にパフォーマンスに対して影響を与えることが示唆された。一方で個々の就寝時間を含めた生活時間、対人関係の改善を行うだけでも、行動や感情を適切に調節する効果的な指導となり、外傷・障害の第一予防に繋がると考えられた。まず気分評価票(BRUMS}を用いて、スポーツ活動において睡眠時間が普段の気分状態に関連があるか検討し直した。対象は、調査した小・中学生のうち中学生運動部所属の197名。結果、就寝時間は気分6尺度全てにおいて弱い相関があり、24時以降の群とそれ以外の群において有意差を認めた。次に、普段とあがり状態における実際の変化について信頼性を測るため青年期において調査した。対象は、通常5時間以上の練習がある競技特性の青年期46名(平均18.7歳)、そのうち状態・特性不安検査(STAI)を行えた21名を評価した。7ヵ月間に渡り心理・身体的変化を観察し、普段日と競技本番前にSTAIを実施。毎日練習にさらされている選手は、睡眠時間および状態不安が実際に気分変化と関連があるか検討した。今回の対象競技では日本の標準化数値よりも更に高い特性不安を持つ選手が81.0%(5段階評価で5は38.1%)を占めた。急激な練習環境、練習変化により、状態不安が相関変動する時期があり、気分不安定さとの関連もみられた。就寝時間による相違はなく、特性・状態不安群別にも気分評価を経時的に比較しても有意差はなかった。就寝時間の問題は発育期段階での成長要因の可能性はあるので、今後の課題検討とする。Case studyでみると、特性不安が高くとも状態不安が上昇しやすい訳ではなく、環境要因(時期)の影響が示唆された。状態不安は、環境や練習変化のある時期に顕著に関連があった。状態不安の変動が「あがり」に繋がっていると捉えられた。個々に対応する上で、このパターンを把握することがパフォーマンス力の維持、傷害予防指導が出来るのではないかと考える。本番数日前当日までの状態不安の変化を把握し、個人的指導に生かすかが重要課題である。現在、量的研究として実験的にあがり場面を実験条件として統制し、精神負荷課題と作業効率(集中練習)課題を施行。および精神系遺伝子多型解析を合わせて検討を進めている。あがりという感情状態は、内的および外的環境からの刺激や社会的要因によって生起するものであるが、特にスボーツにおいては練習試合をはじめ、公式大会等の本番で特に起きやすい。今年度は、普段とあがり状態の実際の変化について、短期的な身体・心理的負荷条件を設定し、生化学的指標と主観的ストレス反応との関連性から検討を行った。対象は通常5時間以上の練習を行う競技特性の9名。実験条件は、心理的要因の異なる通常練習日、集中練習日、公演間近日の3日間に設定した。結果として、主観的ストレス反応と気分評価で相関がみられたものの、実際の生化学的指標とは関連はあまりなかった。普段の主観的ストレスや気分は、短期的なストレスによってすぐに影響されていなかった。通常かなりの運動量を熟すので、練習内容や測定時期による精神負荷や身体的疲労には特異的な傾向が示された。よって対象は日々の精神的・身体的疲労のケアが重要であることが考えられた。今後は状態・特性不安や運動負荷量について検討を加える。また昨年度に引き続き、あがり条件を統制した環境条件における追加調査を行った。追加対象は同競技特性の19名(男性1名)、状態・特性不安調査、心理・身体的変化について36か月間に渡り調査を施行した。現在、普段の練習日、競技本番前の状態・特性不安の変動について、また不安高低群別、心理要因の異なる時期別による気分変動の相違について検討するとともに、精神系遺伝子多型解析を行うために、口内粘膜組織からのゲノムDNAの抽出と定量化を行い、PCRで変異領域を増幅しRFLPでその遺伝子型を決定する段階である。その他並行して、発育期児童生徒のスポーツ活動、ライフスタイルと気分変動の関連について成果発表を行い、一般青年期において気分評価票(BRUMS)を用いて、同様にスポーツ活動、睡眠時間と気分状態の関連について調査を進めている。昨年度までに得られたあがり条件下で行ったそれぞれの結果に基づいて、日本人特有の遺伝子多型との関連性について検討することをまず目的としていた。震災の影響により予定していた実験(公演)の機会が本年度に遅延していたが、実質条件が整わず本実験を組み直す必要となった。基礎実験として、127名を対象に実験条件を人前でみられているというストレス下に統制し、局所(指)の単純反応、選択反応、全身反応時間について左右別に測定を行い、性格特性として性格検査を行い精神不安定傾向の高低別に2群にわけ比較検討を行った。

結果、情緒不安定特性(抑うつ、気分変化、劣等感、神経質)において特に局所の弁別・判断・選択時間に有意差がみられた。よって、人前などのあがる条件下においては、性格特性で情緒不安定特性がある群では局所における弁別・判断・選択時間に差がみられ、何等かの中枢系の遅延が考えられた。また全身反応時間においても2群間に有意差がみられたため同様の結果が考えられた。発育期特に612歳においてはまだまだ神経系の発達が盛んな時期であるため、感情に関係した運動指令出力系での刺激伝導時間の遅延が更にパフォーマンスに対して影響を与えると考えられた。最終年度ではあったが試薬保管していた冷凍庫が電気工事事故に見舞われ、保管品の一部損壊により一から準備し直すという状況になった。そのため全精神系遺伝子多型解析と評価を行えきれず、現在DNAを一つ一つ定量化し直し、PCR法によるDNA増幅と電気泳動を行い写真撮影および解析を進めている。少し研究実施計画が前後することとなったが、ゲノム解析・評価は遅れを取り戻しつつ継続して成果をまとめることとする。生命倫理委員会(ヒトゲノム・遺伝子解析研究部会)の承認を得るまでに半年位時間が掛かり、実験内容も基礎に重点を当てた内容で承認されたため、実験プロトコルも区分けに進める必要があり、実験期間が当初計画より長期間掛かることが予測される。その間のH23年3月に起きた東日本大震災により、当初追加調査で計画していた被験者および実施調査日松演)が1年ずれ込むこととなり実質調査が行えなくなった。そのため、年度内に行える公演日のある被験者対象を探し直し調査を開始したので、当初の実施計画より遅れてスタートしたが、おおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今まで調査したデータ解析を進めることと並行して、DNA抽出および遺伝子多型解析を時間の許す限り早急に進め、少しでも後れを取り戻しながら一つ一つ正確な結果を出して行く予定である。
サルモネラ感染防御に関与する菌体成分を用いた宿主免疫応答の解析

これまでに、我々は、サルモネラに対する安全で高機能な新規のワクチン開発を目標とし、サルモネラ経口感染防御に関わる有効な菌体成分の精製に国内外の研究機関に先駆けて成功した。精製した菌体成分は、新規ワクチン開発に寄与することができる。しかしながら、菌体成分での免疫後に惹起される生体反応や菌の排除機構は、完全には明らかになっていない。そこで、本研究では、精製した菌体成分を介して惹起される免疫応答を解析し、菌体成分免疫後の生体反応や菌の排除機構を明らかにする。本年度は、血清型が異なる株を用いた解析を実施した。血清型O4群に属するSalmonella enterica serovar Typhimurium(S. Typhimurium)には、O5抗原保有株(O5+)とO5抗原欠損株(O5-)がある。これまでにS. TyphimuriumのO5抗原の有無により、O4抗原に対する抗体反応が異なることを明らかにした。O4抗原は我々が明らかにしたサルモネラ感染防御に関与する菌体成分の一つである。今年度は、このO4抗原に着目し、O4抗原を認識する抗体を用いてS. Typhimurium O5+株およびS. Typhimurium O5-株に対する感染防御能の比較をマウスin vivoレベルで実施したところ、O5-株に対しては感染防御能を示したが、O5+株には感染防御能を示さなかった。また、O4抗原を認識する抗体を用いたRaw264.7細胞(マウスマクロファージ)によるin vitro感染実験を実施したところ、O5-株がO5+株に比べて有意にRaw264.7細胞内に取り込まれることが明らかとなった。以上の結果から、O4抗原を認識する抗体による感染防御能は、O5抗原の有無により異なることが明らかとなった。本研究は、サルモネラ感染防御に関与する菌体成分を用いて、宿主の免疫応答を解析することを目的とする。得られた知見は、ワクチン投与により惹起する免疫担当細胞の活性化に必要な免疫賦活剤の検討や家畜を用いた臨床試験への応用が可能となり、実用化に向けた工程に寄与できる。これまでに、我々は、サルモネラ経口感染防御に関わる有効な菌体成分の精製に国内外の研究機関に先駆けて成功した。精製したサルモネラ菌体成分は、新規ワクチン開発に寄与することができる。しかしながら、菌体成分免疫後に惹起される生体反応や菌の排除機構など不明な点が多い。本年度は、感染防御に有効な菌体成分を免疫したマウス脾臓細胞により産生される各種サイトカインの定量および各種免疫担当細胞の増殖試験を実施した。感染防御に有効な菌体成分免疫後のマウス脾臓細胞は未免疫マウスの脾臓細胞と比較して、抗原刺激後のIFN-γおよびTNF-αの産生が上昇することを明らかにした。また、IFN-γおよびTNF-αが産生する細胞はCD8陽性T細胞およびCD4陽性T細胞から産生されていることを明らかにした。一方で、感染防御に有効な菌体成分を免疫したマウスに野生株を経口感染させた後の脾臓およびリンパ節内の免疫担当細胞の活性を検討したところ、未免疫マウスと比較して脾臓および各リンパ節内CD11b陽性細胞が増加していることを明らかにした。感染防御に有効な菌体成分を用いたin vitroによる免疫担当細胞の活性を検討する方法を確立させた。本研究は、サルモネラ経口感染防御に関与する菌体成分を介した感染防御機構を明らかにすることを目的とする。本年度は、感染防御に有効な菌体成分免疫後に増殖する免疫担当細胞の解析を実施した。サルモネラなどの細胞内寄生菌は、貪食細胞から殺菌を回避する機構がある。一方で、サルモネラを殺菌できるのも貪食細胞であることが考えらている。しかしながら、サルモネラを効率よく殺菌する貪食細胞は不明のままである。我々は、感染防御に関与する菌体成分を介して惹起された免疫担当細胞が貪食細胞を活性化させ、この活性化した貪食細胞がサルモネラを殺菌していると推測している。昨年度、我々は、感染防御に有効な菌体成分を免疫したマウス脾臓細胞により産生される各種サイトカインの定量を実施した。そこで、本年度は、産生されたIFN-γおよびTNF-αにより惹起されると考えられる貪食系の細胞の解析をマウス脾臓組織を用いて実施した。感染防御に有効な菌体成分免疫後のBALB/cマウスにサルモネラを100LD50経口感染させ、その後、経時的に脾臓内の免疫担当細胞を各種免疫担当細胞マーカー抗体にて免疫染色し、FACSにて解析した。感染防御に有効な菌体成分免疫マウスはサルモネラ感染後、CD11b、CD11c、Gr-1陽性細胞が未免疫マウスと比較して増加していることを明らかにした。感染防御に有効な菌体成分により増殖すると思われる免疫担当細胞をFACS解析により検出することができた。

これまでに、我々は、サルモネラに対する安全で高機能な新規のワクチン開発を目標とし、サルモネラ経口感染防御に関わる有効な菌体成分の精製に国内外の研究機関に先駆けて成功した。精製した菌体成分は、新規ワクチン開発に寄与することができる。しかしながら、菌体成分での免疫後に惹起される生体反応や菌の排除機構は、完全には明らかになっていない。そこで、本研究では、精製した菌体成分を介して惹起される免疫応答を解析し、菌体成分免疫後の生体反応や菌の排除機構を明らかにする。本年度は、血清型が異なる株を用いた解析を実施した。血清型O4群に属するSalmonella enterica serovar Typhimurium(S. Typhimurium)には、O5抗原保有株(O5+)とO5抗原欠損株(O5-)がある。これまでにS. TyphimuriumのO5抗原の有無により、O4抗原に対する抗体反応が異なることを明らかにした。O4抗原は我々が明らかにしたサルモネラ感染防御に関与する菌体成分の一つである。今年度は、このO4抗原に着目し、O4抗原を認識する抗体を用いてS. Typhimurium O5+株およびS. Typhimurium O5-株に対する感染防御能の比較をマウスin vivoレベルで実施したところ、O5-株に対しては感染防御能を示したが、O5+株には感染防御能を示さなかった。また、O4抗原を認識する抗体を用いたRaw264.7細胞(マウスマクロファージ)によるin vitro感染実験を実施したところ、O5-株がO5+株に比べて有意にRaw264.7細胞内に取り込まれることが明らかとなった。以上の結果から、O4抗原を認識する抗体による感染防御能は、O5抗原の有無により異なることが明らかとなった。次年度は、感染防御に有効な菌体成分免疫後に増殖する免疫担当細胞の詳細な解析を様々な細胞表面マーカー抗体を用いて解析し、免疫担当細胞の特徴などを検討する。次年度は、1)引き続き感染防御に有効な菌体成分免疫後に増殖する免疫担当細胞の詳細な解析を実施する、2)パイエル板または腸間膜リンパ節など他の組織を用いた解析を実施する、3)他の血清型などを用いた感染防御試験などを実施する予定である。抗体を購入予定であったが、在庫がなく納品が2017年3月31日までに間に合わないと連絡があり、抗体購入費分(45,227円)をキャンセルし、次年度に再度、発注をかけることにした。試薬購入時に発生した端数2017年4月1日に使用予定であった抗体購入費分(45,227円)を新たに発注する予定である。抗体が入り次第、優先的に抗体を用いた解析を実施して行く予定である。なお、本抗体の購入が若干遅れることになるが、実験計画に支障をきたすことはない。
精子運動性の制御に基づく運動精子選別システムの開発

今年度は以下の運動精子分離および精子機能評価に関する要素技術の検討を行った。直径0.05 mmのマイクロチャネル内では運動精子はらせん運動しやすくなることを我々は見出している。この現象を利用して、細孔アレイを有するフィルムを介して効率的に運動精子を回収できると考え、レーザー加工で細孔の直径を制御したフィルムを介した運動精子分離用デバイスを試作した。温度勾配をこのデバイス内で発生させるための検討を行った。別の機構として、dynamic lateral displacement (DLD)マイクロデバイスを用いた運動精子の分離を試みた。運動精子の分離は現在のピラー間隔(0.025 mm)では困難だった。ピラー間隔を小さくするか流速を上げることにより、粒子分離閾値を下げて水力学的粒子半径が相対的に大きい運動精子を分離できるか検討する。運動精子の運動能評価としては1 s間の運動速度だけではなく、数時間における精子運動距離も今後評価すべきと考えている。そのために、50度に傾けたガラスキャピラリ内を運動精子が泳ぎ上がるようにし、4時間処理時の運動性評価系を構築した。不運動精子だけを含む液にこのガラスキャピラリを挿入した場合、内部に精子は入らなかった。圧力負荷有無における精子運動評価に適用したところ、運動精子の最長距離は圧力負荷精子において有意に減少した。当実験系は精子内の解糖系や酸化的リン酸化活性と長時間精子運動との関連性の議論に貢献する。三次元デジタルホログラフィ顕微鏡を用いれば観察対象物の屈折率分布が得られるために、観察対象物の厚みに関する情報が得られる。今回、ブタ精子を観察し、頭部構造に着目して三次元画像構築と高さ情報の取得を行った。精子頭部に厚みのある三次元復元像が得られた。精子頭部の屈折率分布の違いからDNAのパッキングが分かる可能性が示唆された。・デバイスの構築と運動精子回収に関する評価が若干遅れ気味であるが、それ以外の部分はよく進んでいる。・キャピラリアッセイが長時間評価に使えそうということが分かり、酵素代謝の制御によって、人工授精効率を上げるアイディアを見出せるかもしれない。・デバイスの構成に関する検討、およびデバイスの運用、センサーやサーモグラフィーを用いた温度勾配の評価を今後検討する。・市販のマイクロデバイスを温度勾配や物質濃度勾配を発生させる形で運動精子評価を行い、運動精子分離におけるデバイスの有用性を比較できるようにする。・代謝系と長時間運動速度の評価も課題であると考え、エネルギー代謝に関わる添加物を加えた際の運動速度変化に関する実験系の構築を進める。国際学会に参加する想定であったが、平成30年度は国際学会に参加しなかったため、その分の旅費を執行しなかった。2019年度に国際学会に参加するのであれば、その参加費・交通費に充てることを検討する。そうでなければ、実験用試薬購入に充てる計画である。
簡易型高齢女性サーマルマネキンによる着装時の人体－被服間の空気層の計測

高齢女性の身体の形状および動作・知覚は、加齢により変化するため、若年時とは異なり、形状では体幹部の変化が著しく、したがって体幹部が高齢女性の特徴的形状といっても過言ではない。また、着装被服の最内に形成される空気層の温熱条件が、着用被服の着心地を決定することから、着装時の皮膚ー被服間に形成される空気層の位置・形状や大きさは、快適な衣環境を考える上で重要な要因である。そこで平成25年度は、平成24年度に試作した簡易型高齢女性サーマルマネキンのヌードを非接触三次元人体計測器を使用して撮影し、頚側点から恥骨結合点至るまでの体幹部の水平断面図を2.5mmピッチで作図した。次に夏季用被服(肌着、Tシャツ、カーディガン)を着衣させ、肌着、Tシャツそしてカーディガン、それぞれ1枚を着衣した場合のマネキンー被服間に形成される空気層の位置や大きさを検討するために、ヌードの場合と同様に、ヌードと同一位置での水平断面図を作図し、それぞれの被服着衣時のマネキンー被服間に形成される空気層の距離を計測した。さらに重ね着の場合の空気層を検討するために、肌着ーTシャツの2枚を着用、肌着ーTシャツーカーディガンの3枚を着用させ、水平断面図からマネキンー最外層被服間の間隙を計測した。さらに高齢者の身体形状と着装被服下に形成される空気層の関係をの特徴を明らかにするために、高齢女性サーマルマネキン同様の方法で、簡易型若年女性サーマルマネキンを試作した。実験補助者として予定していた人が7月中旬から体調を崩し、12月初旬まで入退院を繰り返し、予定通りの実験を行うことができなかった。そこで急遽、実験補助者を探し、お願することとなったが、この方は本実験に精通していないため、実験に慣れるまで少々時間が必要となり、予定よりやや遅れた。しかし、その後は補助者として予定していた人と同等かつ連続して実験が行えるため、当初の目的のための実験は遂行できると確信している。今後はまず簡易型若年女性サーマルマネキンを使用して、若年者の着装時における最内層に形成される空気層の位置・形状および大きさを非接触三次元人体計測器を使用して明らかにし、高齢女性と比較検討をする。次に試作した簡易型サーマルマネキンは改良すべき点を発見したので、これらを高齢女性用および若年女性用の両者に施し、完成品を制作する。そして25年度に実施する予定であった若年女性の体幹部における着衣の被服表面温度を点ではなく面として捕らえるため、サーモショットを使用して温度分布を測定する。高齢女性の場合も再度同様の実験を行い、両者を比較検討する。実験補助者の体調不良および12月初旬まで入退院を繰り返したため、簡易型若年女性サーマルマネキンの試作品の完成が遅れ、実験が可能になったのが1月であった。しかし、簡易型サーマルマネキンの改良点を発見したので、25年度に実施する予定であったサーモショットを使用して被服表面温度の温度分布を求める実験は、26年度に実施することと変更した。そのため簡易型高齢女性サーマルマネキンと非接触三次元人体計測器を使用して、被服着装時の被服下の空気層の実験を実施した。以上の実験計画の変更により、実験補助、データ処理および分析補助のための人件費、謝金の予定額を使用しなかった。さらに、実験結果の分析も進まなかったため、研究成果発表のための旅費、投稿費用など使用しなかったため、次年度使用額が生じた。平成26年度はマネキンー被服間に形成される空気層の位置、形状や大きさの高齢女性と若年女性での比較検討するため、簡易型若年女性サーマルマネキンに実験服(消耗品)を着装し、空気層を計測する。また試作簡易型サーマルマネキン2体にリボンヒーター、測温体、銅版、銅箔テープ等(消耗品)を使用して、改良し、完成品を作成する。さらに完成した2体の簡易型サーマルマネキンとサーモショットを使用して、被服最外層の温度分布を測定する。この際、マネキン表面温度や重ね着の場合の下層の被服表面温度などを多数の温度センサー(消耗品)を使用して測定する。これらの実験には実験補助やデータの分析補助(人件費、謝金、記録用品費)を依頼し、研究成果を所属学会において発表(参加費、旅費)や投稿(その他)する。