hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト心筋細胞移植療法実現へ向けた患者移植用iPS細胞株の樹立および選抜法の最適化

将来的な移植治療に向けて、GMPレベルの培養条件内で完結可能な心筋細胞分化用iPS細胞樹立プロトコールを確立すること、さらにiPS細胞樹立後の各種の未分化性と安全性の評価プロトコールを最適化し、移植用としてふさわしくない細胞株を排除し、移植に適するiPS細胞株を短期間で選抜する体制を確立すべく、研究を行った。具体的には、まずGMPレベルへ移行可能な培養系を確立するため、動物由来成分の含有が最小限であり、かつ生物由来原料基準をクリアできる培養系の確立を試みた。また、iPS細胞の品質管理に用いる遺伝子マーカーを同定するため、公開データを含めた多数の発現データから核型を推定し統計的に解析を行うことで、臨床用に適さないiPS細胞株を迅速に見分ける方法の確立を試みた。センダイウイルスベクターによる山中因子導入、及びStemFitAK02培地、培養基剤としてiMatrix-511を用いることにより、従来の培養条件よりも高効率な樹立方法の確立に成功した。当該方法はGMP基準へ移行可能な試薬のみを用いており、ヒトへの移植ができる培養条件内で完結可能である。さらに、樹立後の選抜マーカーとして、700個のヒト多能性幹細胞のマイクロアレイデータの解析から、ヒトiPS細胞の最頻度の核型異常である12トリソミーを簡便に見分けるマーカーとしてGTSF1を同定した。当該マーカーを用いることで、iPS細胞培養において最頻度の核型異常である12トリソミーを有する細胞株を遺伝子発現の確認のみで排除することが可能となった。異常なiPS細胞は偶然によって出現することから、実験対象を得られるまでの時間が予測できず、当初の予定より検証に時間を要している状況である。選抜マーカーに関しては、現在のところiPS細胞の樹立における細胞株の選抜方法は非常に限られており、現実でのスクリーニングでの有用性の検証を進めることで有用な方法となると考えられる。また、さらに実際の細胞株からのデータ収集を進め、さらなる有用な選抜プロトコールの作成を進める。
コンピューターを利用したシーンのネットワークによる建築・都市空間の表現法の開発

シーンのネットワークを、特に立体化した都市空間の特性を表す表現法とするために、他の表現法と並行して具体的な対象に適応しつつ検討した。ここでいうシーンのネットワークは、対象地を撮影したビデオ画像をコンピュータを利用して編集し、動きにつれ展開するシーンを網状につなぎ合わせたもので、一部をコンピュータ内に実現し、その概念モデルを模型として実現した。この他に比較に用いた表現法は、雑誌等の印刷メディアに掲載された写真と文章による表現、コンピュータを利用して合成や変形を加えた写真や組写真、ビデオで撮影し編集した数分の映像である。いずれも対象空間の特性をできるだけ表すように表現したものである。対象とした都市空間は、東京の東急文化村(渋谷)、フロムファーストビル(表参道)、代官山ヒルサイドテラス、銀座4丁目交差点、地下鉄乃木坂駅入口周辺、渋谷宮下公園十陸橋、池袋メトロポリタンプラザの合計7箇所であるその結果、都市空間の特性によって有効となる表現法が異なることがわかった。中でもシーンのネットワークは、立体的な視線のやり取りを含んだ複雑な空間の表現に有効であった。さらに、人の動線と相互にやり取りされる視線との絡み合った結節点を複数含んだ都市空間では、ネットワークが特徴的なねじれを示すことがわかり、そのような場合に中間のシーンを省略して簡潔にする方法を探ったこれらを通して、シーンのネットワークを空間デザインの方法として展開する可能性が示唆されたシーンのネットワークをコンピュータ上で実現するには、オーサリングツールを用いて空間体験者がシーンの中で次の場面を選択しながら仮想空間を移動する方法に可能性があることが確認された。その完全な実現は今後の課題となっている。
ユビキチン化封入体を形成する神経変性疾患におけるヒストンジアセチラーゼ4の役割

ヒストンジアセチラーゼ4がユビキチン化封入体を形成とそれに関連する神経変性過程に直接関与することを示す成果は得られなかったが、ユビキチン化核内封入体を形成する難治性遺伝性神経変性疾患、脊髄小脳失調症7型(SCA7)の新たな治療戦略開発の標的となる新規分子として、small ubuquitin modifier(SUMO)と、アミロイド前駆蛋白ファミリー蛋白amyloidprecursorlike protein 2(APLP2)を同定した。加えてSCA7の発症に関連する可能性のある分子を網羅的に検索し、病態解明に向けて今後の研究対象となる分子群を同定した。本研究はヒストンジアセチラーゼ4(HDAC4)が細胞の核-細胞質間を移行し細胞骨格蛋白の発現を調節する機能に注目し、HDAC4が細胞質内、核内双方のユビキチン化封入体形成に関与する過程を機能的に解析することを目的とする。本年度は研究の基盤を固めるため、対照となる細胞モデルのユビキチン化封入体形成について検討した。ユビキチン化封入体を形成する神経変性疾患の細胞モデルとして、テトラサイクリン制御システムを利用した脊髄小脳失調症7型(spinocerebellar ataxia type7 : SCA7)の細胞モデル(PC12)、およびプロテアソーム阻害による神経変性細胞モデル(SH-SY5Y)を用いた。SCA7の細胞モデルにて分化誘導、非分化誘導下において変異蛋白の発現を誘導した後、3週間経時的に観察したところ、分化誘導下では核内に、非分化誘導下では核内と細胞質内にユビキチン化封入体が観察された。細胞質内に形成された封入体の一部がHDAC4陽性であったが、陽性頻度は低かった(<1%)。プロテアソーム阻害による神経変性細胞モデルでは核内と細胞質内にユビキチン化封入体封入体が形成されたが両封入体にHDAC4陽性像は見られなかった。以上の結果より、両細胞モデルにおいて内在性HDAC4はユビキチン化封入体との積極的な関与が少なく今後の解析が困難と考えた。現在はHDAC4の発現ベクターを用いて細胞内にHDAC4を強制発現し、その動態を検索中である。平行して、SCA7細胞モデルを用いユビキチン化封入体に関与する新たな因子を検索した。結果、アミロイド前駆蛋白様蛋白(APLP)が変異蛋白発現下において核内へ移行すること、またプロセッシングを受けたAPLPが核内のユビキチン化封入体に関連していることを見いだした。今後、APLPのプロセッシングとSCA7における神経細胞死の関係について更に検討を加える。本研究はユビキチン化封入体を形成する神経変性疾患の発症に関わるメカニズムを新たに解明する事を目的としている。ユビキチン化封入体を形成する神経変性疾患の細胞モデルとして脊髄小脳失調症7型(spinocerebellar ataxia type7:SCA7)の細胞モデル、およびプロテアソーム阻害による封入体形成細胞モデルを用いた。これらのモデル細胞にて、強制発現したヒストンジアセチラーゼ4(HDAC4)とユビキチン化封入体との関連を検索した。HDAC4の細胞質内、核内への輸送を阻害する実験を行ったが、ユビキチン化封入体の形成過程との直接的な関係を見いだすことはできなかった。その為、SCA7の細胞モデルを用いての疾患の発症メカニズムに関与する他の因子を同定することを試みた。昨年度までにSCA7においてアミロイド前駆蛋白類似蛋白(APLP)が、SCA7のユビキチン化核内封入体形成に関連することを解明したが、更にSCA7においてAPLPがcaspase-3によるプロセッシングを受け、神経細胞死を誘導しうる事を明らかにした。アルツハイマー病の発症に関与するAPLPが他の神経変性疾患の発症にも関連することを新たに見いだした点に意義がある。また、ユビキチンモチーフ蛋白であるsmall ubiquitin modifier(SUMO)蛋白がSCA7の原因遺伝子産物であるataxin-7に結合し、蛋白凝集過程に影響を与える可能性があることを新たに見いだした。更に、SCA7の細胞モデルから抽出したmRNAを用いて、マイクロアレイによる遺伝子発現解析を行い、SCA7の原因となる異常蛋白の発現に連動して、発現が促進ならびに抑制される蛋白を同定した。本研究はユビキチン化封入体を形成する神経変性疾患の発症に関わるメカニズムを解明し、その治療に結びつく新たな知見を得ることを目的とする。ユビキチン依存性蛋白分解に抵抗性である蛋白が凝集し、ユビキチン化封入体が形成される神経変性疾患の一つである脊髄小脳失調症7型(SCA7)の病態解析を行った。SCA7は有効な治療法のない、進行性の小脳失調、網膜変性を特徴とする遺伝性神経変性疾患である。SCA7の原因

遺伝子産物である変異ataxin-7は異常に伸長したグルタミン鎖を持ち、病態下で発現した難溶性の変異ataxin-7は神経細胞の核内で凝集しユビキチン化封入体を形成する。神経系細胞においてユビキチン依存性蛋白分解を阻害した場合に形成される核内封入体がユビキチンモチーフ蛋白であるsmall ubiquitin modifier(SUMO)蛋白のうちSUMO1/2の両アイソフォームを含有する知見を得たことから、SUMO結合による翻訳後修飾(SUMO化)が異常ataxin-7の分解過程に影響を与えると仮定し、SUMO化部位に変異を導入した変異ataxin-7の細胞内強制発現実験を行った。結果、ataxin-7にはSUMO1/2の両蛋白が結合し、それによってataxin-7の分解が促進されることを新たに見いだした。SUMO化の促進により変異ataxin-7の細胞内蓄積を抑制することが、SCA7の新たな治療戦略に結びつく事を示した重要な知見である。加えて、SCA7細胞モデルの遺伝子発現解析を行い、異常ataxin-7の発現に連動して、網膜に特異的なカルシウムチャンネル蛋白の発現が抑制されることを見いだした。SCA7の重篤な症状の一つである網膜変性の病態に関連する新しい分子標的を同定したことは、SCA7を含めた難治性の網膜変性を伴う疾患の病態解明に大きく寄与すると考えられる。
女性の積極的スポーツ行動を促す調整力・交渉力の検討

レジャー志向の違いから潜在的なスポーツ実施者を探索することを目的とした。2070歳の男女1128名を対象、郵送法による調査を実施。因子分析の結果、第1因子「長期展望・向上因子」、第2因子「外出・対人関係志向因子」、第3因子「身体活動因子」、第4因子「利他主義因子」、第5因子「主導性因子」をとした。因子得点を性別、年代別、職業形態別で比べた結果、身体活動因子は女性、20代、パートタイマーが有意に低い。女性や20代は外出・対人関係志向因子が高く、友人と外出を伴うスポーツの提案が有効。スポーツを実施する調整力は女性の得点が低く、男性よりも自助努力や費用・時間等を捻出する家庭や社会との調整が重要。本研究は、女性を余暇に対する意識・考え方(志向)をいくつかに分類し、「Constraint Negotiation概念」(Julie,2008:Daniel,2007)を用いて余暇志向別に余暇実現のための社会的調整力や交渉力を評価し、それとスポーツ活動との関連を検討することを目的としている。平成24年度は平成23年度に作成した調査票の配付および回収を行なった。調査票は、1個人の余暇に対する考え方(余暇志向性)、2日常におけるスポーツの実施状況、3家族を含めた周囲の人々に対する説明・説得能力、すなわち個人のスポーツ活動実現に向けた調整力・交渉力の評価、4スポーツ活動をする際の阻害要因、5フェイスシート(性別、年齢、結婚の有無、家族構成、末子の年齢、スポーツ活動費、余暇活動費)、以上の項目によって構成されている。調査対象は、滋賀県栗東市に在住する20歳以上の男女4,000名とし、それら対象者は無作為に抽出した。調査票は郵送法を用いて配付・回収を行ない、調査時期は平成25年3月2日4月15日に渡って行なった。調査票回収後、データの入力を行ない、回収率は約3割である。データ入力後はデータのクリーニング作業を経て分析を行なっており、現在、平成25年度の結果公表に向け、分析中である。本研究の意義・重要性は、スポーツ活動を社会的調整力・交渉力との関連から明らかにした研究は国内では殆ど見られず、さらにその対象を女性に限定した研究で言えば国内外を問わず皆無という点があげられる。また本研究により、わが国において心理的制約に阻まれスポーツに接近できない女性に対して、個々の状況にあったスポーツの提案を可能にする。すなわち、このことが潜在的な女性の生涯スポーツ実施者を掘り起こし、女性のスポーツ実施率を押し上げる契機になる。本研究は、余暇に対する意識・考え方(志向)で女性を分類し、「Constraint Negotiation」概念を用いて余暇志向別に余暇実現のために社会的調整力や交渉力を評価し、それとスポーツ活動との関連を検討することを目的としている。平成25年度は、平成24年度におこなった調査データの分析を行なった。結果として、レジャー志向尺度から、「長期展望・向上因子」「外出・対人関係志向因子」「身体活動因子」「利他主義因子」「主導性因子」を抽出した。因子得点を性別で見ると、身体活動因子および主導性因子の得点は女性が有意に低く、外出・対人関係因子得点は女性が有意に高かった。一方、スポーツを志向する身体活動因子得点は女性の得点は有意に低く、女性のスポーツ活動を促進することを考えるならば、友人と連れだって行なうスポーツの提案が有効だと考えられる。因子得点を職業別に見ると、身体活動因子得点がパートタイム・アルバイトにおいて有意に低いことが分かった。パート・アルバイトについては、時間の確保が難しいことが考えられ、短時間に効率よく実施できるスポーツの提案が有効であろう。次に、余暇においてスポーツを実施するためには、家族や友人を含め周囲との調整や交渉等は必須である。そうした社会における調整力や交渉力を検討するため「調整力因子」「自助努力因子」「説明・交渉力因子」「責任感因子」を抽出した。因子得点を性別で比較した結果、調整力因子および自助努力因子において女性の得点が有意に低かった。このことから、女性の余暇生活を充実させるため、さらにはスポーツを実施するためには、男性以上にそれを実現するための自助努力や費用や時間等を捻出するための家族や社会との調整が必要であると言える。また、本研究では明らかにできなかったが、上述のような女性の自助努力や調整力を引き出すための社会的エンパワメントも併せて必要であろう。平成23年度は主に調査票作成のために文献研究を中心に行なった。

調査票作成に時間を費やした理由として、本研究は、女性を余暇に対する志向別に分類し、「Constraint Negotiation概念」(Julie,2008:Daniel,2007)を用いて余暇実現のための社会的調整力や交渉力の程度をグループごとに評価し、それとスポーツ活動との関連を検討することを目的とし、これまでにない視点からのアプローチを試みようとしている。すなわち、先行研究において具体的な調査項目の提示は殆ど見られず、それらを吟味し、妥当な質問項目を起す必要があった。本調査票により、これまで女性のスポーツ活動において阻害要因として挙げられてきた家事・育児による時間の制約という結論から脱却でき、さらに今後の女性のスポーツ活動の実施率を押し上げるための政策提案にも繋がると考える。調査項目については、次の通りである。「女性の余暇活動に関する調査」として、(1)個人の余暇に対する意識や考え方(余暇志向性)、(2)日常におけるスポーツ活動の実施状況、(3)家族を含めた周囲の人々に対する説明・説得能力、すなわち個人のスポーツ活動実現に向けた交渉力の評価、(4)スポーツ活動に必要な余暇時間を捻出する能力、すなわち個人を取り巻く社会状況に対応する社会的調整力の評価、(5)フェイスシート(性別、年齢、結婚の有無、家族構成、末子の年齢、スポーツ活動費、余暇活動費)、以上を軸に調査票を作成した。また、滋賀県体育協会を介して県内での調査実施を目指し、関係者に対して調査内容や調査実施によるメリット等について説明を行なった。交渉を開始した時期が年度末でもあったため了承にまで至らず、平成24年現在も引き続き交渉を行なっている。滋賀県での大規模調査により、幅広い女性の余暇志向とスポーツ活動との関連を示すデータ入手が可能となる。平成24年度(1)調査票の配布および回収:申請時の計画では調査期間を日常的なスポーツ活動を調査するため、長期休暇を除いた10月に調査を実施する予定であった。しかしながら、4,000名もの調査対象者の住所一覧の入手方法や無作為抽出の方法について調査地である自治体との交渉に予想以上の時間を有した。そのため平成24年度末の実施に計画を変更せざる得なかった。(2)調査データの入力:先の通り調査時期が遅れたため調査データの入力作業も時期も遅れざる得なかったが、入力作業それ自体は概ね順調に進んだと言える。入力に際しては作業補助を使いながら実施したが、その際情報漏えいに細心の注意を払うため、1データ入力は決められた場所で作業を行ない、2データは決まった記録装置(フラッシュメモリ)に保存した。調査対象者の住所一覧については、調査実施後、直ちに調査地である自治体に返却した。(3)調査データの分析および検討:(2)調査データの入力と同様、調査時期が予定より遅れたため調査データの分析および検討作業も遅れた。現在、入力済みのデータを用いて分析を行なっている最中である。また、平成25年度の研究成果公表に向け、データ分析と共にその検討を随時行なっている。平成24年度の研究計画において計画通りに進行しなかった最大の理由は、調査地である自治体との交渉に時間を要したことである。その交渉内容とは調査対象者の住所録の入手方法や無作為抽出方法に関するものであった。自治体は調査をすることには協力的であったが、計画を遂行する際に必要な手続き(書類作成等)が予想を上回る量であったことが計画を遅らせた原因と言える。今後は、こうした手続きの煩雑さを考慮に入れ、調査計画を立てる必要がある。
ヒトの大脳聴覚野の音声処理に関する脳磁気学的研究

本研究では音声刺激による誘発脳磁界の精密解析を行い、ヒトの聴覚野の神経活動と音声処理との関わりを明らかにすべく研究を行い以下の様な成果を得た。1.脳磁界信号の発生源、すなわち活動神経群の3次元的な位置と活動度(電流双極子モーメントおよびその向き)を推定する新しいアルゴリズム(パラメータ探索法)を開発した。本方法は最大4個までの複数電流双極子の推定が可能であり、低いS/Nの磁界信号においても発散することなく安定に解を得ることができる。2.近年の技術的推展が著しい多チャネルSQUID磁束計による脳磁界計測に対応すべく、同時多点計測データの解析法について検討した。誘発信号における雑音となる自発性脳磁界(Brain Noise)のもつ空間的な特性も明らかにし、さらに、Brain Noiseによる活動源推定の誤差と、正確な推定に必要な同時多点計測データのS/N値を求めた。3.周波数の異なる純音や母音、子音-母音からなる単音節音声を用いて多チャネル脳磁界計測を行い、さらに活動源推定を行って双極子パラメータの時空間特性を調べた。その結果、刺激界に依存する聴覚皮質内での変化に富んだ神経活動が明らかとなった。4.高次聴覚機能の異常と考えられる耳鳴疾患と聴覚神経活動との関連について誘発脳磁界を指標として調べた。電流刺激による耳鳴治療効果と脳磁界信号成分との間には正の相関が認められ、耳鳴の低減にともなう皮質神経活動の増加が明らかとなった。本年度は脳磁界応答の解析方法の確立と,純音および単音節音声を刺激とした誘発脳磁界応答の計測と磁界発生源の解析に関する研究を行い,以下のような結果を得た.1.新たな磁界発生源の推定法(パラメ-タ探索法)を開発した.この方法では最大4個までの磁界発生源を推定することが可能であり,S/Nが低い場合においても発散することなく安定に解を得ることができる.また,潜時毎の磁界分布から磁界発生源を推定することにより脳磁界発生源の時空間的解析法を確立し,磁界発生源としての神経活動領域の中心を動的に調べることを可能とした.2.フォルマントおよびピッチ領域の周波数(170Hz,400Hz,1kHz,2.5kHz)の純音を刺激とした誘発脳磁界応答を計測し,パラメ-タ探索法による磁界発生源の時空間的解析を行うことにより,磁界発生源の時空間的な振る舞いが刺激音周波数により変化することを明らかにした.また,4名中2名の被験者では潜時約100msに現れる脳磁界応答で磁界発生源の位置変化(後変から前変)がみられたが,他の2名ではみられず,磁界発生源の時空間的な振る舞いに被験者による差異があることを示した.3.単音節母音/a/に対する脳磁界応答を計測し,純音刺激と同様な時空間的解析を行うことで,純音刺激に比べて顕著な磁界発生源位置の変化(後方から前方)を見いだした.このような純音と音声刺激による脳磁界応答の解析から,磁界発生源の動的な変化が聴覚野内の神経活動による音声処理過程を反映している可能性を示した.4.以上の結果より,純音に対する聴覚野内の神経活動および音声処理機能の解明における磁界発生源の時空間的解析法の有効性を示した.本年度は音声刺激による誘発脳磁界の精密解析を行い、ヒトの聴覚野の神経活動と音声処理との関わりを明らかにすべく研究を行い以下の様な結果お得た。1.精密解析に先立ち、多点同時計測された誘発脳磁界において雑音となる自発性脳磁界(Brain Noise)の空間的な規則性を明らかにし、さらに、そのノイズが脳磁界信号源推定の精度に及ぼす影響を定量的に評価した。また、この結果から多点同時計測データに必要とされるS/N比を明らかにした。2.高次聴覚機能の異常と考えられる耳鳴

疾患と聴覚神経活動との関連について誘発脳磁界を指標として調べた。電流刺激による耳鳴治療効果と脳磁界信号成分との間に正の相関が認められ、耳鳴の低減にともなう皮質神経活動の増加が明かとなった。3. 4個の異なる単音節音声刺激/a/,/ka/,/ha/,/na/に対する脳磁界応答を計測し、前年度の研究により確立した脳磁界発生源の時空間的解析法を用い、脳磁界信号源の動的変化に関する検討を行った。その結果、単音節音声刺激による脳磁界信号源の動的な位置変化は、被験者や刺激に強く依存していることが分かった。ただし、/a/と/na/の刺激に対する信号源の位置変化には前方・内側・下方という被験者間で相反しない傾向がみられることが分かった。このような単音節音声刺激の結果と、前年度の純音刺激により得られた結果から、ヒトの聴覚皮質では音響構造が神経活動の時空間変化として表現されていることが推察された。
慢性関節リウマチにおける活性化T細胞による破骨細胞形成の機序の解明-『免疫系』による『骨代謝系』への関与-

関節リウマチ(RA)における関節破壊において、活性化T細胞におけるどのような分画が破骨細胞形成に関与しているのか解明を試みた。健常人末梢血のT細胞をin vitroでIL-2およびPHAにより刺激したところIFNγ産生T細胞において可溶性RANKLおよび膜結合型RANKLの発現が亢進進していた。これはmRNAにおいても同様であった。flow cytometry法によりIFNγ産生CD4陽性T細胞のほとんどが膜結合型RANKLを発現していることが示された。このIFNγ産生CD4陽性T細胞はIL-4を産生しておらず、いわゆるTh1細胞であった。M-CSFのみの存在で、このT細胞と健常人末梢血由来単球の共存培養を行うと破骨細胞形成が誘導された。この作用はosteopretegerinの添加により完全に抑制され、逆に抗IFNγ抗体の添加により促進された。以上の結果より、活性化T細胞におけるいわゆるTh1細胞が破骨細胞の形成を直接的に誘導していることが示された。さらにRA患者および変形性関節症(OA)患者の末梢血中のCD4陽性T細胞中におけるIFNγ及びRANKLの両者を産生しているT細胞の比率をflow cytometry法により定量した。その結果、RAにおいてこのT細胞の比率は有意に増加していた。したがって、RAの末梢血においては破骨細胞の産生を直接促進する作用を有しているT細胞が増加していることが示された。今回我々の検討によりRAの病態においてT細胞による直接的な破骨細胞形成促進の機序の解明がさらに進んだ。今後、この研究結果は、新たなRAの関節破壊および骨粗鬆症治療法の開発にとって有効な知見となる可能性がある。今回、我々は、in situ hybridization法を用いて観察し、RA患者関節滑膜組織において多数増殖が認められる線維芽細胞およびCD3陽性の活性化Tリンパ球にRANKL mRNAおよび蛋白の発現を認めた。また、RA患者の関節液中の可溶性RANKL濃度をELISA法によって測定し、RA患者の関節液中には、変形性関節症、外傷、痛風患者と比較して、可溶性RANKLが高濃度含まれていることを明らかとした。一方、RA患者のOPG濃度は低値を示しており、変形性関節症または痛風患者と比較すると、RA患者の関節液における可溶性RANKLとOPG濃度の比は有意に高値を示した。このようなRANKLとOPGの相対比の上昇が、RAにおける骨破壊を惹起している可能性が示された。実際、活性化されたTリンパ球がRANKLを発現し直接破骨細胞の分化を促進する実験結果も我々は得ている。我々は免疫染色によりRA滑膜組織における紡錘型の滑膜細胞及びCD4陽性T細胞がRANKLを発現していることを示し、さらにin situ hybridization法によりRANKL mRNAの発現も滑膜組織において証明した。また、活性化T細胞を破骨細胞前駆細胞と共存培養すると破骨細胞が誘導される実験結果が得られた。さらに、可溶性RANKLはRA患者の関節液中には変形性関節症患者にくらべ高濃度存在すること、RA患者の関節液中ではRANKL濃度のOPG濃度に対する比が変形性関節症あるいは痛風と比較して有意に高値であることも明らかとなった。このことより、活性化T細胞は可溶性RANKLを産生し、直接、破骨細胞の分化を誘導することが明確に証明された。研究計画で、平成14年度以降の3)で記載した研究項目であるが、我々が確立したin vitroの破骨細胞形成系をbaioassayとして用い滑膜組織よりタンパクを抽出精製し、新規の破骨細胞形成抑制因子を見い出す、という研究は現在、N末配列が確定し新規物質として同定され、物質の質量分析も完了した。
M期とS期のカップリングの機構

通常の体細胞型細胞周期においてはM期とS期の交互交替が保障されているのに対し、減数分裂ではM期が連続して起こり、その後の受精でS期が創設される。こうした卵細胞に特異的なS期開始の調節機構を手がかりとして、M期とS期の共役機構を解明することが本研究の目的であり、本年度は以下の成果を得た。1.減数分裂周期:アフリカツメガエル卵抽出物由来の、無細胞系で減数分裂周期を再現できるmeiotic cycling extractsを開発して解析した。その結果、この無細胞系では、卵抽出物を単に希釈するだけで減数分裂期間にS期をもたらすことができると判明した。減数分裂期間におけるS期の抑制にはMos-MAPキナーゼ・カスケードの関与が示唆されているので、N末を欠いたSTE11(MAPKKK)蛋白質によってMAPキナーゼを構成的に活性化させたが、無細胞系を希釈したとき、あるいは無細胞系にMosの中和抗体を加えたときにもたらされるS期を抑制することはできなかった。現在、構成的に活性型であるMAPK-γ-Sを作製して、Mosの下流はMAPキナーゼだけかどうかを検討中である。2.受精によるS期開始:ヒトデ卵のPCNAのcDNAをクロン化しその抗体を得て、受精によるS期開始機構を解析した。その結果、PCNAは成熟未受精卵においてもすでに核内に局在しているが可溶性であり、受精するとDNAに結合するようになると判明した。このPCNAの核内局在の調節は受精によるS期開始の鍵と考えられ、現在その分子機構を検討中である。
高リポプロテイン(a)血症の遺伝子治療用のリボザイム・アンチセンスベクターの開発

アポ(a)遺伝子の多型性がリポ(a)血中濃度を規定しているので、高リポ(a)血症症例のリポ(a)濃度を安全域まで低下させるにはそれぞれのアポ(a)遺伝子のハプロタイプに対応したテーラーメイドの遺伝子治療をするのが望ましい。そこで、(1)それぞれのタイプの発現活性を調べるために、711個の(TTTTA)nリピート(5種類)とA-Dタイプ(4種類)を組み合わせたハプロタイプ(20種類)をルシフェラーゼベクターに挿入して発現ベクターを作製し、それぞれの組み合わせを持つベクターの発現活性を、哺乳類肺癌細胞に導入して測定したところ、(TTTTA)nリピートの数は遺伝子発現効率に影響を与えないことが分かった。(3)上述したベクターを導入した培養細胞に、ヒトで血中Lp(a)濃度を低下させることが知られている薬剤を投与して、その発現効率の変化を調べたところ、Mgイオンやニコチン酸アミドはA,B,Dタイプの発現を有意に抑制した。ところが、Cタイプは他のタイプと比べて薬剤抵抗性で、高濃度の薬剤存在下のみで発現活性の低下を示した。(4)また、アポ(a)遺伝子の発現を特異的に抑制する為に、数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製し、培養細胞における発現活性の変化を上述のAタイプベクターを用いて調べたところ、培養液中におけるオリゴヌクレオチドの濃度が不足していたせいか、有意な抑制は認められなかった。今後はアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度のみならず長さや塩基配列を変更して、発現に影響を与えるものをデザインする必要がある。(5)アポ(a)翻訳領域を標的とするリボザイムの発現ベクターを細胞内に導入した細胞より抽出されたRNAについて、RT-PCRでアポ(a)mRNAの変動を調べたところ、標的部位が繰り返し配列であったためか、RNA量の変動の判別が難しかった。今後はこの判別システムの改良が必要と思われる。(1)アポリポプロテイン(a)[アポ(a)]遺伝子5′発現調節領域の遺伝的多型性3ケ所について、異なる蛍光色素を標識した複数のプライマーを用いた増幅不応性変異検出システム(ARMS)を利用してDNAを増幅し、その産物をキャピラリー電気泳動によって半自動的にタイプを判定する方法を開発した。また、この方法を用いて症例のアポ(a)5′タイプを判定して、従来法との相違がないことを確認した。虚血性心疾患の症例は、コントロール群に比べて、AD群の割合が異なることが分かった。即ち、虚血性心疾患群でCタイプが多く、Dタイプが少ないことが確認された。また、Cタイプの人はDタイプの人よりリポプロテイン(a)[リポ(a)]血中濃度が高かった。リポ(a)濃度は、アポ(a)分子量と逆相関するので、C、Dタイプの症例のデータをプロットしたところ、Cタイプのホモ接合体の回帰直線の傾きは、Dタイプのそれより大きいことが明らかになった。(2)アポ(a)遺伝子の多型性がリポ(a)血中濃度を規定しているので、高リポ(a)血症症例のリポ(a)濃度を安全域まで低下させるにはそれぞれのアポ(a)遺伝子のハプロタイプに対応したテーラーメイドの遺伝子治療をするのが望ましい。そこで、それぞれのタイプの発現活性を調べるために、711個の(TTTA)nリピート(5種類)とA-Dタイプ(4種類)を組み合わせたハプロタイプ(20種類)をルシフェラーゼベクターに挿入して発現ベクターを作製した。予備実験では、上記の相互の組み合わせにより、発現活性が大きく変化することが分かった。今後、特に発現活性の高いハプロタイプに対するリボザイムベクターをデザインし、構築する予定である。
プローブ不要で高い寸法・位置制御性をもつ一括近接場光ナノ加工法の研究

【研究目的】本研究は次の三つの原理に基づく。【1】ナノ物質寸法に依存して共鳴的に近接場光を吸収させ、堆積と脱離との釣り合いにより寸法精度の高いナノ寸法物質を形成。【2】基板に微細パターンを予め作りつけて伝搬光を照射し、パターン端部に近接場光を発生させる。これによりプローブやフォトマスクを不要とする。【3】上記【1】と【2】の組み合わせにより寸法制御されたナノ物質が形成されるが、これを繰り返し、高い寸法および位置精度にてナノ物質配列を自己組織的に形成させる。本研究では【1】の脱離開始の引き金となる機構を解明し、さらに【2】と【3】を実施して大面積一括加工可能なナノ光加工法を開発する。【研究方法】(1)金属ナノ微粒子を基板に堆積、脱離を行う。(2)プローブやフォトマスクを排除するために、基板の一部に微細パターンを予め作製し、伝搬光照射によりそのパターンに近接場光を発生させる。シミュレーション計算により近接場光の強度の空間分布、その空間的勾配などを推定する。(3)上記(2)の結果にもとづき、石英やシリコンの基板に微細パターンを加工するプロセスを最適化する。(4)第一段階としてスパッタリングにより金属を(3)の基板に堆積し、寸法依存光共鳴吸収、脱離を引き起こし、ナノ寸法の金属微粒子列を形成する。【研究成果】SiO_2基板に幅100nm・深さ30nmの溝を作製し,レーザー光を照射しながら金属をスパッタリングにより堆積した。Al堆積時にレーザー光を照射したところ、溝に沿って直径100nm程度のAl微粒子が等間隔で直線状に連なる結果が得られた。この微粒子列は長さ300μmという広範囲に渡って形成されていた。入射光の波長や堆積する金属を変えて実験し、形成された微粒子列の微粒子の幅と間隔を比較した結果、入射する波長が短くなると微粒子のサイズが小さくなり、また同じ波長でも金属が異なる(Au・Pt)ことでもサイズが変化することが分かった。微粒子列の形成箇所の金属膜を除去し、その前後のAFM測定結果を照合することで、溝のエッジ部に微粒子列が形成されたことが分かった。この像を元に、レーザー光照射時の近接場光強度分布を有限差分時間領域法によるシミュレーションで計算したところ、微粒子列形成箇所の光強度が最も強くなっており、金属微粒子列形成に寄与していることがわかった。

本研究ではまず【1】の脱離開始の引き金となる機構を解明し、さらに【2】と【3】を実施して大面積一括加工可能なナノ光加工法を開発する。形成される寸法精度の限界、一括加工可能な面積最大値を見極める。さらに加工可能な形状の多様化、適用可能な材料の多様化について検討する。【研究方法】【1】我々の開発した湯川理論とシミュレーションで、物質の近接場光吸収断面積の値、その光子エネルギー、物質寸法への依存性、ナノ物質寸法と形状を明らかにする。【2】金属ナノ微粒子を基板に堆積、脱離を行う。【3】プローブやフォトマスクを排除するために、基板の一部に微細パターンを予め作りつけ、伝搬光照射によりそのパターンに近接場光を発生させる。シミュレーション計算により近接場光の強度の空間分布、その空間的勾配などを推定する。【4】上記(3)の結果にもとづき、石英やシリコンの基板に微細パターンを加工するプロセスを最適化する。【5】第一段階としてスパッタリングにより金属を(4)の基板に堆積し、寸法依存光共鳴吸収、脱離を引き起こし、ナノ寸法の金属微粒子列を形成する。この寸法、形状を測定評価し、特に近接場光の光子エネルギー、強度勾配などへの依存性を定量的に評価する。【研究成果】基板にあらかじめ凹凸等の構造を持たせておき,そこにレーザーを照射することで発生する近接場光の効果により,堆積する金属を制御した。SiO_2の基板に100nm程度の幅の溝を作製し,レーザー光を照射しながら金属をスパッタリングした。することで行った.Al堆積時にレーザー光照射し、溝に沿って直径100nm程度のAl微粒子が直線状に連なっている様子が分かる.この微粒子列は長さ300μmという広範囲に渡って形成されていた。入射光の波長や堆積する金属を変えて実験し,形成された微粒子列の微粒子の幅と間隔,その標準偏差σを比較した結果、入射する波長が短くなると微粒子のサイズが小さくなり,また同じ波長でも金属が異なることでもサイズが変化することが分かった。微粒子列の形成箇所の金属膜を除去し,その前後のAFM測定結果を照合することで、基板の突出部の上に微粒子列が形成されたことが分かった.この像を元に,レーザー光照射時の近接場光強度分布を有限差分時間領域法によるシミュレーションで計算したところ,微粒子列形成箇所の光強度が最も強くなっており,金属微粒子列形成に寄与していることがわかった。【研究目的】本研究は次の三つの原理に基づく。【1】ナノ物質寸法に依存して共鳴的に近接場光を吸収させ、堆積と脱離との釣り合いにより寸法精度の高いナノ寸法物質を形成。【2】基板に微細パターンを予め作りつけて伝搬光を照射し、パターン端部に近接場光を発生させる。これによりプローブやフォトマスクを不要とする。【3】上記【1】と【2】の組み合わせにより寸法制御されたナノ物質が形成されるが、これを繰り返し、高い寸法および位置精度にてナノ物質配列を自己組織的に形成させる。【研究方法】
教授理論における技術教育と美術教育との関連問題史の研究

我が国の手工教育論では、モデルとしてスロイド手工とフランス手工の教育書が参考にされ、スロイド手工は一般陶冶の目標から、フランス手工は職業陶冶の目標から我が国の手工教育の目標が論じられる傾向があった。手工講習会における上原六四郎の手工教育論では参考にされた手工教育書は、スロイド手工とフランス手工を比較したベルギーの手工教育書が主であったことが示すように、当時、世界的に問題とされていた手工教育の教育目標の論議、すなわち一般陶冶と職業陶冶の目標の関係を初等教育における手工教育がどのように位置づけたらよいかの問題が主なテーマであった。したがって、一般陶冶の目標からはスロイド手工の教育書が多く参考文献として取り上げられ、職業陶冶の目標からはフランス手工の教育書が多く取り上げられた。手工教育の内容については手工教育の実質陶冶の目標を強調するフランス手工の内容の文献が参考にされ、主として手工教育の目標はスロイド手工に、内容はフランス手工から影響を受けて、我が国の手工教育が成立したといえよう。
三次元実空間情報の完全取得再現に関する研究

本研究では、実用性(低コスト、簡便性)を考慮した上で、視聴者に可能な限り高密度5次元光線情報の再生を実現するためのシステムを構築することを目的とする。具体的には、はじめに視差間隔1mmの超多眼ディスプレイを設計、試作する。これにより5次元情報のうち4次元情報を支援することができる。続いて、本システム上に提示するコンテンツを3DCG映像に限定した上で、無知覚視差法と呼ぶ方式に基づき、微量の運動視差をコンテンツ側で生成するソフトウェア技術を開発する。以上の技術を組み合わせることにより、1視点限定、提示コンテンツが3DCG限定ではあるが、5次元光線情報を完全再現することを可能とする。具体的には、はじめに視差間隔1mmの超多眼ディスプレイを設計、試作した。続いて、本システム上に提示するコンテンツを3DCG映像に限定した上で、無知覚視差法と呼ぶ方式を提案し、微量の運動視差をコンテンツ側で生成するソフトウェア技術を開発した。以上の技術を組み合わせることにより、1視点限定、提示コンテンツが3DCG限定ではあるが、5次元光線情報を完全再現することを可能となった。平成24年度は、本研究最終年度であり、前年度の設計をもとにシステム試作、システム評価を行った。まず、前年度の成果をもとに3D交線情報を高密度に表示するシステムについて、試作を行った。本試作システムは、市販プロジェクタ24台を用いながら、1mm未満の間隔で提示する超多眼システムとして構成した。市販プロジェクタを用いた構成により、低コスト化、システム柔軟性、故障耐性などの多くのメリットがある。続いて、この24眼超多眼システムにおいて、無知覚視差法と呼ぶ新しいコンテンツ提示方式を提案し、実装した。無知覚視差法とは、3DCGコンテンツを対象に、人間が明示的に知覚できない間隔で微量の視差を作り出す表示技術である。本研究では、この技術により、人間の3D知覚特性が大幅に改善できることを実証した。我々が日常生活している3D実空間で光線は5次元情報f(x,y,z,θ,φ)として記述できるが、3D映像技術においてこれまで検討されてきた技術は3次元もしくは4次元の光線情報を扱うのみであった。本研究では3D実空間の5次元光線情報を完全に再現するための研究開発を行う。これにより、3D実空間そのものを別の場所で再現したり、博物館の展示物やデパートの商品等を世界中どこでも完全再現できたり、さらには、3DCGで制作された仮想空間を3D実空間上に完全再現したりすることが可能となる。本研究では、高密度に5次元光線情報の再生を実現するための理論構築を行うものであり、また、その結果は簡易実験を通じて実証する。以上の成果は将来の超臨場感通信分野においてあらゆる応用に適用可能な極めて有益なものである。本研究では、提示コンテンツとして主に3DCG映像を対象とすることとし、「5次元光線情報を完全に再現する表示系」を研究開発することが目標である。予算的・時間的制約から簡易システムによる試作段階までの研究に取り組む予定である。また、3DCG映像を実写映像のシミュレーションと位置づけ、3D映像技術のためのComputational Photography技術についても取り組む予定である。以上の成果は、教育、エンターテインメント、デジタルサイネージ等をはじめコンテンツ分野全体において多様な応用が可能とするものであり、将来の超臨場感通信通信の基幹技術となりうるものである。本年度は試作システム構築に向けた理論構築、システム設計を行った。来年度の試作システム構築に向けて当初の目標を達成できている。本年度の理論構築、システム設計に基づき試作システムを構築する予定である。試作の結果、若干の仕様変更もありえるが、研究計画全体として大きな変更は伴わないことが期待できるため、当初の計画通り研究を遂行する予定である。試作システム構築にあたり、システム設計に基づき光学系は研究代表者らが試作を行うが、システム筐体の製作を外部専門業者に発注する予定である。
ミュ粒子触媒核融合(μCF)サイクルにおける不純物の影響

高エネルギー加速器を利用して生成したミュ粒子(μ)を水素同位体中にいれるとミュ粒子水素分子が生成し、重水素一重水素、重水素一三重水素等の核融合反応をが起こる。これらミュ粒子をはじめパイ中間子等エキゾチックな粒子の分子原子への捕獲の素過程およびエキゾチック粒子の移行過程について調べた。実験は、高エネルギー物理学研究所12GeV陽子シンクロトロンを用いて行った。パイ中間子を固体あるいは気体ターゲットに入射し、パイ中間子捕獲にともない発生するX線を真性ゲルマニウム検出器で測定して、原子番号Z>2への遷移確率を求めた。水素への捕獲は、πの荷電交換反応で生じる【π^8】の2光子崩壊を鉛ガラスチェレンコフ検出器を用いて測定した。エキゾチック粒子は、物質中で静止すると、直接原子軌道に捕獲されるもののほかに一部分子上の中間子分子軌道に捕まるものもある。この分子軌道に捕まったエキゾチック粒子は、オージェ過程を経て、構成原子の原子軌道に落ちる。この原子軌道への遷移確率は、分子内の構成原子が有する有効電荷に依存する。従って、逆に、エキゾチック粒子の捕獲確率から分子内原子の有効電荷が導出できることが判明した。水素ガス中に不純物気体を混入した場合、水素にエキゾチック粒子が捕獲されてできるpX-粒子は中性であるため不純物気体に容易に接近でき、そこでエキゾチック粒子を重い原子に移行する。これまで希ガス等化学的に不活性な気体について実験がなされてきたが今回の分子気体についての実験結果では、移行過程は混合気体分子の分子構造に強く依存することが判明した。得られた成果は、イオン固体相互作用の素過程とも強く関連している。今後はそれらとも連携をはかり、原子力分野における新素材の開発にも役立てていく所存である。
マレック病ウイルス新規ワクチンの開発：宿主免疫抑制機構の緩和による効果増強

近年マレック病ウイルスは、野外において病原性の増強が報告されている。そこで、より防御効果の高い新たなワクチン開発を行うために、免疫抑制因子であるPD1とPD-L1の機構に着目した。分泌型PD-1遺伝子を挿入した組換え生ワクチンを作製し、宿主が持つPD1/PD-L1による免疫抑制能を競合的に緩和させ、より強い細胞性免疫が誘導できるワクチン開発を行った。その結果、既存のワクチンと比較して、新規組換えワクチンを接種した鶏由来の末梢血単核球は、MDV抗原に対する高いインターフェロンγ産生能を示し、本組換えワクチンがより効果的な細胞性免疫応答を誘導する能力を持つことが示唆された。本研究ではニワトリに悪性リンパ腫をひき起こすマレック病(MD)に対する新規ワクチンの開発を行う。現在、MDは弱毒生ワクチンによってほぼ制圧されているが、野外においてマレック病ウイルス(MDV)は病原性が増強する傾向にある。そのため、より効果の高い抗MDワクチンの開発をするため、既存のワクチンに比べ生体内での高い増殖率を持ち、さらに免疫抑制及び免疫応答の終結に機能するProgrammed death-1 (PD-1)とProgrammed death-ligand 1 (PD-L1)の結合を阻害させることにより、既存のワクチンより高い免疫誘導能を有するワクチン作製を目指す。今年度は、まず新規抗MDワクチン(組換えMDV)の作製を行った。組換えMDVの作製には、生体内での増殖を改善するため、MDV強毒株(RB1B株)に由来する感染性クローンを用いた。PD-1遺伝子細胞外領域をクローニングし、ウサギ免疫グロブリンの定常部と連結させ(PD-1-Ig)、En Passant Mutagenesis法によりRB1B株のmeq遺伝子と置換させた。meq遺伝子はMDVによる病態形成に必須であるため、meq遺伝子をノックアウトすることでMDVの病原性は損なわれる。得られたクローンのうち、PD-1-Ig遺伝子を持ち、meq遺伝子を持たないクローンをRFLP、PCR及び遺伝子解析により確認し、meq遺伝子とPD-1-Ig遺伝子を置換させた感染性クローン(RB1B/PD-1/ΔMeq)を複数得た。また、作製したRB1B/PD-1/ΔMeqを培養細胞に導入し、組換えウイルスとして再生させた。次いで、ワクチン効果検討に用いる強毒MDVの作製を行った。MDVの病原性はmeq遺伝子の多型と関連することが知られている。そこで、RB1B株感染性クローンのmeq遺伝子と既知の強毒MDV株のmeq遺伝子をEn Passant Mutagenesis法により置換させた感染性クローンを作製した。また、強毒組換えMDVクローンを培養細胞に導入し、Cre-lox/Pシステムによりベクター配列(pBeloBAC-11)を除いた組換えウイルスを再生させた。本研究ではニワトリに悪性リンパ腫をひき起こすマレック病(MD)に対する新規ワクチン開発を行った。MDには弱毒生ワクチンが使用されているが、マレック病ウイルス(MDV)は病原性が増強する傾向にあり、より効果の高い抗MDワクチンの開発が求められる。そこで、免疫応答の調節(免疫抑制機構)に関与するProgrammed death-1 (PD-1)とProgrammed death-ligand 1 (PD-L1)の結合を阻害させ、既存のワクチンより高い免疫誘導能を有するワクチン作製を目指した。昨年度は、MDV強毒株(RB1B株)のmeq遺伝子をPD-1遺伝子細胞外領域とウサギ免疫グロブリンの定常部と連結させたPD-1-Ig、およびPD-1遺伝子全長にmycエピトープタグを付加させたPD-1-mycと置換させ、組換えワクチンを作製した。今年度は、作製した抗MD組換えワクチン(PD-1-IgおよびPD-1-myc)と既存のワクチン(CVI988)との性状を比較した。まず、再生した各組換えワクチンにおけるPD-1の発現を確認した。次いでそれぞれのワクチンのin vitroにおける増殖能について検討を行ったところ、どのワクチンにも差は認められなかった。以上より、作製した組換えワクチンはPD-1を産生し、組換えMDV自体の増殖に影響は無いと考えられた。次に初生ヒナに各組換えワクチン、CVI988、強毒株を接種し、末梢血より経時的にウイルスゲノムを定量した結果、強毒株のみが検出され、CVI988および各組換えワクチンゲノムは検出されなかった。ワクチン接種後56日目に末梢血単核球を採取しMDV抗原で刺激したところ、PD-1-Ig接種鶏においてサイトカイン産生能が高くなる傾向が見られた。このことよりPD-1-Igについては、効率の良い細胞性免疫誘導能を持つことが期待された。今後、より詳細なウイルス動態やサイトカイン発現解析を検討し、MDVに対する予防効果を既存のワクチンと比べ、将来的なウイルスベクターとして応用可能か評価する必要がある。

獣医伝染病学本研究計画では、平成25年度に抗MD組換えワクチンの作製及びワクチン効果判定に用いる強毒MDVの作製を行い、平成2526年度に組換えワクチンの性状解析、平成26年のワクチンの効果判定を実施する予定である。現在の進捗状況として、組換えワクチンの作製及強毒MDVの作製は、組換えウイルスの再生を含めてすでに終了しており、in vitroにおける組換えワクチンの性状解析について現在進めている。以上のように、当初計画と比べて概ね順調に進展していると考える。今年度に作製した抗MD組換えワクチンのin vitroにおける性状を解析し、そのワクチン効果をin vivoにて検討を行う。まず、RB1B/PD-1/ΔMeqのin vitroにおける増殖能についてプラークアッセイにより検討し、in vivoについてはRB1B/PD-1/ΔMeq接種鶏から経時的に末梢血を採材し、既存のワクチンを接種した鶏群とreal-time PCR法によるウイルスゲノムの定量を行い比較する。次いで、RB1B/PD-1/ΔMeqの生体への安全性(臨床症状の観察)の確認を行い、さらに細胞性免疫誘導能についてサイトカインの発現をreal-time PCR法またはELISA法により定量し検討する。最後にワクチンの効果判定試験を、MD感受性鶏を用いた感染実験により、生存率および腫瘍形成率を既存のワクチン接種鶏群と比較することで検討する。通常ワクチン接種は1,000Uで行われるが、本研究では、より明確に効果判定を行うため、通常より少ないドーズで接種を行い、ワクチン効果を比較する。初生ヒナにRB1B/PD-1/ΔMeqまたは既存のワクチン株を接種し、3日後に強毒MDV感染性クローンを接種し、約2ヶ月間経過を観察し生存率を比較する。また、観察期間中に発症しなかったヒナについては、腹腔内に腫瘍の形成が認められるか観察する。今年度は新規抗MD組換えワクチン(RB1B/PD-1/ΔMeq)の作製を行った。作製した組換えワクチンの性状解析を行うために必要な試薬(抗体)をすでに発注済みである。しかし、受注生産品であるため納期が次年度となり、その試薬代(約48万円)を次年度の使用とした。また、研究遂行のために必要で、3月に発注を行った試薬・消耗品類(約26万円)と合わせて、その総額を次年度の使用とした。次年度使用額のうち、約48万円については、研究遂行上必要な試薬(抗体3点)をすでに発注しているが、受注生産品で納期に時間がかかり次年度納品となることから、その支払いに使用する。残りについては研究遂行のため必要であり、3月に発注を行った試薬・消耗品類(約26万円)の支払いに使用する。
腎臓の幹細胞単離及び再生医療応用への基礎的検討

GFP(Green Fluorescent Protein)を全身組織に構成的に発現するトランスジェニックラットを用い、骨髄由来細胞のみがGFPを発現するキメララットを作成した。キメララットを用いて、急性糸球体腎炎後のメサンギウム再生には骨髄由来幹細胞が関与することを明らかにした。in vitroにおいても骨髄細胞がメサンギウム細胞に分化しうることを確認した。In vivoならびにin vitroの両方において、PDGF-Bが骨髄由来メサンギウム細胞の分化に関与することを明らかにした。骨髄細胞分画からメサンギウム細胞の前駆体となりうる細胞を、不織布型細胞分離フィルターを用いて簡便に精製する方法を確立した。成熟ラット腎臓からSP細胞を精製し、その性質を解析した。その結果、腎実質にSP細胞は存在するものの、それらは骨髄由来メサンギウム細胞や尿細管上皮細胞の前駆体・幹細胞の本態ではないという結論に至った。ネフロン発生に関わる遺伝子を明らかにする目的で、新生ラット腎臓と成熟ラット腎臓のRNAを用いたSuppression Subtractive Hybridization法による差異発現遺伝子の解析を行い、また、ネフロン新生部分から特異的かつ高品位にRNAを抽出する方法を確立した。得られた遺伝子の中からレチノイン酸産生酵素であるretinaldehyde dehydrogenasetype 2 (RALDH2)に着目して解析を行い、retinaldehyde dehydrogenase type 2 (RALDH2)を介したレチノイン酸濃度の調節が、糸球体上皮細胞の分化と成熟後のintegrity維持に重要であることを明らかにした。特に、糸球体上皮細胞に特異的な膜蛋白質ネフリンの転写がレチノイン酸によって制御されていることを明らかにした。我々は、平成13年度に、骨髄由来幹細胞がin vivoにおいて、メサンギウム細胞に分化する事を確認し、論文化した。この骨髄由来幹細胞からミサンギウム細胞への分化能をさらに詳細に検討し、かつ、分化に必要な条件を検討するために、骨髄細胞全分画から未分化幹細胞を粗生成する方法を、細胞外基質への親和性を利用することによって確立した。その結果、4型コラーゲンならびに高濃度の血小板由来増殖因子(PDGF-BB)、レチノイン酸の存在が重要な役割を担っていることが明らかとなった。実際に、4型コラーゲンを発現している正常糸球体局所において、強制発現によりPDGF-Bの量を増加させてやると、骨髄由来幹細胞がメサンギウムに遊走し、メサンギウム細胞へと分化することが明らかとなった。現在、基質への親和性を利用して、さらに簡便・高速に骨髄幹細胞を濃縮する方法を開発・応用中である。また、平成13年度に、我々は、ネフロン発生に関わる遺伝子を明らかにする目的、でネフロン新生部分のRNAを、特異的かつ高品位に抽出する方法を確立した(トルネード抽出法)。この方法を基礎に、いくつかの興味深い遺伝子情報を得ており、幹細胞から特定の腎構成細胞に分化誘導するために有用な分子を発見すべく、我々の開発したin vitroの系を利用して検討を行っている。また、幹細胞のマーカーは、いまだに得られていないものの、Hoechst色素による核染色を利用した幹細胞精製法(sp細胞)を併用し、腎臓に駐在する幹細胞の特性について解析を行っているところである。ヒトおよび齧歯類の骨髄細胞では、Hoechst 33342色素による生細胞染色を行うことによりSP細胞という幹細胞分画を得ることが可能である。我々は、この方法をラット腎臓に応用し、腎臓に存在する幹細胞分画を取得し、その性質を解析した。その結果、成熟ラットの腎臓には一定の割合でSP細胞が存在し、少なくともその一部が骨髄由来であることを明らかにした。移植実験により、腎臓由来のSP細胞は、肝臓・骨格筋・血球系細胞などへの多分化能を示したが、腎臓から精製したにも関わらず腎臓への特異的遊走や腎臓構成細胞への分化は認められなかった。

すなわち、少なくとも腎臓中のSP細胞は生理的な腎幹細胞ではないと考えられた。我々は、既に、骨髄由来細胞が糸球体メサンギウム細胞の再生に関与することを見いだしている。今回、臍帯血から造血幹細胞を精製・濃縮するために開発された不織布フィルターが、腎修復に寄与する骨髄細胞分画の精製に応用できるか否かを検討した。精製後のin vivoへの移植実験により、ラット骨髄細胞をこのフィルターで精製した細胞分画の中には、糸球体メサンギウム細胞に分化する細胞が高濃度に含まれていることが明らかとなった。糸球体硬化の発生・進展の原因には糸球体上皮細胞の傷害が関与している。一方、その解剖学的位置から、外的に投与した幹細胞によって糸球体上皮を置換・再生するアプローチは困難と言わざるを得ない。我々は、糸球体上皮細胞が、傷害ストレスに対抗して自己のintegrityを維持するための機構を初めて明らかにした。すなわち、傷害を受けて足突起退縮とスリット膜構造破壊が生じた場合、糸球体上皮細胞は、レチノイン酸合成酵素の発現上昇を介して細胞内レチノイン酸濃度を上昇させることにより、ネフリンなどの重要構成蛋白質の転写を促進することが明らかとなった。