hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質・核酸分子の機能調節スイッチとして働く人工加水分解酵素の開発

それらの水溶液中での安定性,加水分解触媒としての活性や基質であるペプチドや核酸分子との相互作用をNMR測定により検討した。その結果,生理条件下で特定の核酸塩基配列を認識し,核酸分子の二重らせん構造を解離させることのできる新規低分子亜鉛化合物を作り出すことに成功した。さらに,亜鉛酵素モデルとチオールやリン酸化物質との錯体の安定性についても検討を行った。実用的な生体分子加水分解触媒はまだ得られていないが,本研究成果により新しい人工機能性分子(遺伝子情報制御分子,自己集積型の水溶性超分子,フォスフォプロテオーム解析試薬など)を開発することができた。現在,それらの市販化についても検討中である。生体分子を加水分解する酵素と同様の機能をもつ低分子化合物は,生体機能の人工的な制御や,外来性タンパク質の除去などと関連して,現在世界的に注目され,早期開発が期待されている機能性分子の一つである。本研究では,生理条件下で水酸化物イオンを捕捉し,強い求核剤となる部分構造と,弱酸性分子(チオールやフェノールなど)をアニオンとして強く捕捉する部分構造を併せもつ分子を開発し,特定のアミノ酸や核酸分子を認識し,かつその近傍の化学結合を加水分解する人工加水分解酵素を開発することを目的とした。それらのデザイン・合成に必要な反応場(酵素活性中心類似の環境)の性質を調べる目的で亜鉛のルイス酸としての性質を検討できる数種類の亜鉛酵素モデルを合成した。新らたに合成した人工亜鉛酵素モデルの溶液内構造を,pH滴定法,NMR測定などにより調べた。その結果,生理条件下で特定の核酸塩基配列を認識し,核酸分子の二重らせん構造を解離させることのできる新規低分子亜鉛化合物を作り出すことに成功し,効率的な遺伝子多形分析システムを開発した。実用的な生体分子加水分解触媒はまだ得られていないが,本研究成果により新規の人工機能性分子(遺伝子情報制御分子,自己集積型の水溶性超分子,フォスフォプロテオーム解析試薬など)を開発することができた。
下垂体のユニークな細胞死における分子発現とオルガネラ形態の時系列解析

持続的ストレスを与えたラットでは、下垂体ホルモン分泌細胞の一つであるメラノトロフの一部に、ユニークな細胞死が起こる。この細胞死のメカニズムを明らかにするために、メラノトロフの細胞死の過程で、細胞内小器官の微細形態とこれに関連した分子発現がどのように変化するのかを中心に、時系列に基づく解析を行った。その結果、1)少なくとも3種類の細胞死が存在するが、2)いずれ細胞死の過程にも細胞内タンパクや小器官の分解・リサイクルシステムに異常が見られること、3)3つの細胞死像には細胞膜の破綻という共通点があることを明らかにした。本研究の目的は、持続的ストレスを与えたラットの下垂体中間葉Melanotrophに起こるユニークな細胞死の分子メカニズムを微細形態の視点から解明すること、その過程で発現する転写因子CHOP (C/EBP homologus protein)の関与を明らかにすることである。本年度の成果としては、ラットおよびマウスモデルの透過電顕による解析から、Melanotrophは小胞体ストレスを経てネクローシス様の細胞死を起こしていることが新たに明らかになった。細胞変性から細胞死に至る細胞内小器官のダイナミックな形態変化を解析する手段として、オスミウム-マセレーション法による走査電顕観察の手法を習得した。これにより3次元的観察が可能となり、より多くの情報が得られるようになった。本研究のもう一つの目的である転写因子CHOPのMelanotrophにおける機能解析については、細胞死との関連について重要な情報が得られた。持続的ストレス負荷ラットの経時的な解析から、CHOPの発現よりも早期に、ネクローシスに結びつく変性細胞が出現することが明らかになった。また、CHOPノックアウトマウスMelanotrophの解析を集中的に行った結果、野生型マウスやラット同様にネクローシスが起こることが明らかになった。以上の成果から、CHOP分子は、少なくともMelanotrophのネクローシスの進行には直接関与していないものと考えられ、今後の研究遂行の方向性が明確になった。これまでCHOPの機能解析を行う上で、CHOP発現細胞がきわめて限局的であることが問題となっていた。本年度、ストレス負荷方法を変えたモデルの検討を行った結果、CHOPの核集積を起こす細胞が飛躍的に増加し、これまでわかっていなかったCHOP発現細胞の微細形態がある程度明らかになるなど、より効率的な解析が可能となった。本研究の目的は、持続的なストレスを負荷したラットの、下垂体中間葉Melanotroph(MT)に生じるユニークな細胞死の分子メカニズムを、微細形態学的視点から解明し、さらにこの過程で発現する転写因子C/EBPhomologus protein (CHOP)がどのように関与するかを明らかにすることである。本年度の研究により、異なる過程を経た少なくとも3種類の細胞死が混在することを明らかにした。また、細胞変性から細胞死の過程を透過型電子顕微鏡により時系列的に解析することで、3種類の細胞死の経過を細胞内小器官の変化としてとらえることができた。また、一連の形態学的変化と免疫組織染色により得られた結果より、3種類の細胞死がいずれも、細胞内のタンパクおよび小器官の分解・リサイクルに関わる異常と関連していることが明らかになった。CHOP分子の直接の関与に関しては明らかではないが、これらのうち1種類の細胞死との接点が見いだされた。本研究全般を通して、持続的ストレス下でMTに起こる細胞死は以下の経過によるものと推察された。持続的ストレスにより過度に活性化したMTが、まず直面する小胞体ストレスを回避するためにユビキチン-プロテアソーム系を活性化させるが、一部のMTはこの過程で細胞死に陥り、次いでオートファジー系を活性化するMTが現れるが、この過程でさらに別の形態を示す細胞死が起こるものと考えられた。このように、MTはストレス回避反応の異なる段階を起点として異常を生じ、これによって異なる形態の細胞死が存在するものと結論された。本研究では、長時間のストレスに曝された生体内で形態の異なる細胞死が次々と生じる、というユニークな細胞死メカニズムが存在することを明らかにした。本研究により、ストレスとこれによって生じる生体機能の異常との関連を知る上で重要な、細胞生物学的知見が得られた。本研究は、持続的ストレスを与えたラットの下垂体中間葉Melanotrophに引き起こされるユニークな細胞死の分子メカニズムを解明することを目的としている。ラットに持続的ストレスを負荷すると、Melanotrophは小胞体ストレスマーカーとして知られる転写因子GADD153 (CHOP)を発現し、やがて一部の細胞が細胞死に陥る。一般に、CHOPの発現を阻止することで細胞死が防御されることが知られているが、その機能については不明な点が多く残されている。そこで、本年度は、このラットモデルを用いた解析を行うとともに、CHOPノックアウトマウスを用いた解析に先立ち、野生型マウスによる基礎的データの収集を行った。ラットモデルの解析では、Melanotrophの細胞変性過程で生じる、細胞内小器官の形態学的変化を、免疫組織

化学と透過電子顕微鏡を用いて時系列的に観察した。これにより、細胞内小器官の機能後退を示す変化としては、小胞体の形態変化が先行して起こり、その後にゴルジ体形態の顕著な変化へ波及するものと考えられた。ラットモデル解析の最終目的としては、一連の細胞内小器官の変化のどの時点で、CHOPをはじめとする関連分子が発現するのかを明らかにすることである。次年度以降行う分子発現と関連づけた微細形態の観察は、この時系列的観察により得られた情報を基盤として行う。マウスモデルの解析としては、野生型マウスを用い免疫組織化学、透過電子顕微鏡による微細形態観察およびRT-PCRによる分子発現解析により、基礎的データを収集した。マウスの中間葉Melanotrophも、持続的ストレスによりCHOP分子を発現することを確認した。一方で、ストレスによる細胞内小器官の形態変化には、ラットとは異なる点が見いだされ、CHOPの機能解析を行ううえで、重要な手がかりとなると考えられた。持続的ストレスを与えたラットの下垂体中間葉Melanotrophに起こるユニークな細胞死の分子メカニズムを微細形態の視点から解明することを目的の一つとしている。本年度は、ラットおよびマウスモデルの主に透過電顕による解析から、Melanotrophに起こる細胞死がネクローシスであることが明らかにできた。さらに、本年度は当初計画していたオスミウム-マセレーション法による走査電顕観察の手法を習得した。免疫染色との同一細胞観察については、設備上の問題がクリアできなかったため断念したが、細胞内小器官の3次元的観察が可能となった。これにより来年度中に微細形態の時系列解析が終了できる見通しである。もう一つの目的であるCHOP分子の機能解析の点では、これまでCHOP発現細胞が小数かつ限局的であることがネックとなっていたが、本年度モデルの改変を行ったことにより高頻度のCHOP発現系が実現し、効率的な解析が可能となった。CHOP発現細胞の細胞内小器官の形態を含めた表現形が観察できるだけでなく、CHOPの関連分子の解析に有用であり、CHOPノックアウトマウスを用いた解析にも応用できるものと考えている。ラットモデルとCHOPノックアウトマウスを用いた解析から、CHOP分子の発現が直接的には、Melanotrophのネクローシスに関与していないことが示唆され、その分子機能を知るための実験系を組む上で重要な手がかりとなった。以上の理由により、総合的にはおおむね計画通りに進んでいると判断した。初年度に計画していた研究のうち、ラットモデルを用いた解析はほぼ予定通りに行うことができた。また、次年度に予定していた免疫電顕観察の予備実験として固定条件の検討を行った。マウスモデルの解析については、動物実験施設にて生じた感染事故の影響により、予定していたCHOPノックアウトマウスを用いた解析を行うことができなかった。
光学プランクトン観測システムによる動物プランクトン生産力の定量評価（国際共同研究強化）

2018年3月19日2019年3月17日にかけて米国ウッズホール海洋研究所にて滞在研究を行った。滞在時の研究テーマとして、北極海の氷上定点において、1996年10月-1997年9月にかけて10-14日間隔で行われた、海表面から水深3500 mまでを最大8層に分けた30回の鉛直区分採集により採集されたホルマリン固定試料中に出現する、中層性カイアシ類の生活史解析を行った。肉食性種のParaeuchaeta glacialisは初期発育段階(C1)と雌雄成体(C6F/M)は主に500 m以深の深海に分布するが、中後期の発育段階では水深100 m以浅に分布する、特徴的な発育に伴う鉛直移動を持つことが明らかになった。各発育段階の鉛直分布は、重量での脱皮間成長と関係があり、浅い層に分布する発育段階ほど脱皮間成長が大きく、深層に分布する発育段階の脱皮間成長は小さかった。同様の現象は親潮域の同属(P. elongata)にも知られており、産卵数の少ないParaeuchaeta属は抱卵成体や初期発育段階の時には捕食を避けるために深海に分布するが、遊泳力のついた中後期発育段階では、より大きな成長を成し遂げるために、餌の豊富な表層に上昇移動した結果と解釈された。その他には中層性粒子食性種のScaphocalanus magnusの生活史を解析し、雌雄で発育速度が異なり、雌は成体(C6F)の状態で長い時間を過ごすのに対し、雄成体は口器付属肢が退化し、その寿命は短いことが明らかになった。中層性の粒子食性カイアシ類においてC6Fでの滞留時間を長くすることは、餌供給量が増加・好転した際に、速やかに再生産に移れる点で有利な生活史戦略であるといえる。これら2つの研究内容はいずれも帰国前に英文の論文原稿をまとめ、受け入れ研究者のAshjian博士による校閲を受けた。他に関連する論文7報を発表した。内定年度:2015本年度は、訪問する渡航先の海外共同研究者それぞれと、共同研究や打ち合わせを行った。2017年3月14日15日には、米国大気海洋局シアトル支所のJanet Duffy-Anderson博士と、新しく動物プランクトン担当として着任したDavid Kimmel博士とアラスカアンカレッジで開催された国際会議の途上、研究内容についての打ち合わせを行った。現在、滞在先の3研究機関の受け入れ研究者と研究内容の打ち合わせが済み、実際の訪問(2018年3月から1年間を予定)に向けて、ビザや住居の手配などを行い、かつ不在中の学務に支障の無いように手配準備中である。予備的な内容として、訪問先研究者の1名(米国アラスカ大学フェアバンクス校のRussell Hopcroft教授)とは、共著で一件の学会発表を行った。これは訪問前の状況としては、概ね順調に推移していると言える。今年度は受け入れ研究機関の一つである、米国アラスカ大学フェアバンクス校のRussell R. Hopcroft教授が主宰する、砕氷船「Sikuliaq」号を用いた研究調査航海「ASGARD-2017」に乗船し、北極海(チャクチ海)における動物プランクトン採集と飼育実験を行った。期間は2017年6月9日29日で米国アラスカ州ノーム出入港であった。航海中はHipcroft教授との共同研究の一環として、彼の研究チームが行う、動物プランクトンを対象とした飼育実験作業を行った。また同時に行った動物プランクトン採集では、目合い150 μmの動物プランクトン試料の分割試料(1/2)の譲与を受けた。その後、同様の海域を対象とする日本の2航海:北海道大学附属練習船おしょろ丸(7月3日8月1日:ダッチハーバー函館)、海洋研究開発機構海洋地球研究船みらい(8月19日10月2日:ダッチハーバー八戸)にて、同様の目合いでの動物プランクトン採集を行い、時系列での経時的な動物プランクトン試料を確保した。研究打ち合わせと試料解析のために、8月2229日にかけて、アラスカ大フェアバンクス校のHopcroft教授の研究室を訪問した。また、米国滞在のJ-1ビザ申請のために9月2425日にかけて米国大使館を訪問した。受け入れ研究者の米国ウッズホール海洋学研究所のCarin J. Ashjian主幹研究員と相談し、2018年3月19日2019年3月16日にかけて滞在研究をすることとし、上記予定に沿って移動し滞在研究を開始した。滞在中は北極海の氷上ステーションで1年を通して採集された動物プランクトン試料(SHEBAサンプル)の解析を行う予定で、既に数試料の解析を済ませている。今年度はまた、関連する研究成果について論文発表や学会発表の成果発表を行った。今年度の重要な成果として、受け入れ研究者であるアラスカ大学フェアバンクス校のRussell R. Hopcroft教授の主宰する研究調査航海に乗船し、共同研究の一環として彼の動物プランクトン飼育実験の一端を担い、また動物プランクトン試料の譲与を得られたことが挙げられる。

従来、日本とアメリカではそれぞれ動物プランクトン採集に用いていた網の目合いが異なっていたが、同じ基準で比較を行うために、研究対象海域である北極海での試料数が多いことから、アメリカが標準として用いている目合い150 μmを採用し、日本の2隻の船(北大のおしょろ丸と海洋研究開発機構のみらい)でも、この目合いでの動物プランクトン採集を行った。これらを可能にするために、従来2連で行っていたプランクトン採集(Twin NORPAC net)ではなく、4連のプランクトン採集枠を開発し(Quad NORPAC net)、この採集効率に関する研究にも着手した。滞在先の主な研究機関である米国ウッズホール海洋学研究所のCarin J. Ashjian主幹研究員とは、滞在中に解析する試料についての詳細なメール打ち合わせを行い、2018年3月19日に訪問滞在を開始した時も、準備が十分であったために、実にスムーズに試料解析を進めることが出来た。成果発表としては、対象海域である北極海を中心とした関連海域の動物プランクトンに基づく研究成果論文を査読つき国際誌に6編、査読無し英文誌に1編発表することが出来た。また関連する国内外での口頭およびポスター発表も積極的に行い、Hopcroft教授が共著者に含まれる、指導する大学院生による学会口頭発表が、優秀発表賞を受賞した(第5回青田昌秋賞、2018年2月)。これらのことは、本研究課題の進捗状況がおおむね順調であることを示している。2018年3月19日2019年3月17日にかけて米国ウッズホール海洋研究所にて滞在研究を行った。滞在時の研究テーマとして、北極海の氷上定点において、1996年10月-1997年9月にかけて10-14日間隔で行われた、海表面から水深3500 mまでを最大8層に分けた30回の鉛直区分採集により採集されたホルマリン固定試料中に出現する、中層性カイアシ類の生活史解析を行った。肉食性種のParaeuchaeta glacialisは初期発育段階(C1)と雌雄成体(C6F/M)は主に500 m以深の深海に分布するが、中後期の発育段階では水深100 m以浅に分布する、特徴的な発育に伴う鉛直移動を持つことが明らかになった。各発育段階の鉛直分布は、重量での脱皮間成長と関係があり、浅い層に分布する発育段階ほど脱皮間成長が大きく、深層に分布する発育段階の脱皮間成長は小さかった。同様の現象は親潮域の同属(P. elongata)にも知られており、産卵数の少ないParaeuchaeta属は抱卵成体や初期発育段階の時には捕食を避けるために深海に分布するが、遊泳力のついた中後期発育段階では、より大きな成長を成し遂げるために、餌の豊富な表層に上昇移動した結果と解釈された。その他には中層性粒子食性種のScaphocalanus magnusの生活史を解析し、雌雄で発育速度が異なり、雌は成体(C6F)の状態で長い時間を過ごすのに対し、雄成体は口器付属肢が退化し、その寿命は短いことが明らかになった。中層性の粒子食性カイアシ類においてC6Fでの滞留時間を長くすることは、餌供給量が増加・好転した際に、速やかに再生産に移れる点で有利な生活史戦略であるといえる。これら2つの研究内容はいずれも帰国前に英文の論文原稿をまとめ、受け入れ研究者のAshjian博士による校閲を受けた。他に関連する論文7報を発表した。平成29年度には、訪問先研究者との共同研究を更に発展させる予定である。まず2017年6月9日6月29日のアラスカ大学所属の砕氷船Sikuliaq号の北極海-ベーリング海航海に乗船し、受け入れ研究者の米国アラスカ大学フェアバンクス校のRussell Hopcroft教授と共同研究を行う。
自然免疫活性化によるB型肝炎ウイルス特異的T細胞応答の誘導

本研究ではB型肝炎ウイルス(HBV)特異的T細胞応答を誘導するために、実質細胞による内因性抗原提示と骨髄由来細胞による外因性抗原提示のどちらがより重要かを検討した。肝臓内でHBVを発現するトランスジェニックマウス(HBV-Tgマウス)を利用し、MHC class Iの発現が実質細胞、または骨髄由来細胞上で欠如するHBV-Tgマウスを作成した。これらマウスにHBV特異的T細胞を養子移入し、その応答性を解析した結果、骨髄由来細胞による外因性抗原提示がHBV特異的T細胞の最適な増殖に必要であるが、実質細胞による内因性抗原提示がT細胞の増殖と細胞傷害能の誘導においてより重要という結果が得られた。B型肝炎ウイルスはエンベロープで覆われた不完全二本鎖DNAウイルスであり、急性または慢性肝炎の原因となり、B型慢性肝炎の多くは肝硬変、さらには肝細胞癌へと進行する。HBVの排除には感染細胞を選択的に破壊することの出来るHBV特異的CD8+T細胞応答が必要不可欠である。実際、HBV特異的CD8+T細胞はB型急性肝炎患者の抹消血中には多数存在し、抗ウイルス作用の要となるインターフェロンガンマ(IFN-γ)産生能を有するのに対し、B型慢性肝炎患者の抹消血中では著明に減少し、ほとんどの場合でIFN-γ産生能の低下が認められる。従って、機能的なHBV特異的CD8+T細胞応答の誘導が、B型慢性肝炎の治療の一環として重要と考えられているが、そのようなT細胞応答がどのような機序で誘導されるのかは明らかにされていない。申請者らの研究から、HBV特異的T細胞が肝細胞表面に提示された抗原を認識することにより、それらの機能が抑制されること、さらに、特殊抗原提示細胞である樹状細胞を活性化することにより、この機能抑制を解除できるということが示された。本研究は、活性化樹状細胞が、どのような分子学的機序でHBV特異的免疫寛容を克服し、機能的なHBV特異的T細胞応答の誘導するのかを明らかにするとともに、機能的HBV特異的T細胞応答を誘導するために効果的な自然免疫シグナル伝達経路を同定することを目的とする。これらの研究は、自然免疫の活性化がどのようにHBV特異的T細胞応答の誘導につながるのかを解明するのみならず、B型慢性肝炎に対する新しい免疫治療の開発を促進するものと期待される。実際、HBV特異的CD8+T細胞はB型急性肝炎患者の末梢血中には多数存在し、抗ウイルス作用の要となるインターフェロンガンマ(IFN-γ)産生能を有する。一方で、B型慢性肝炎患者の末梢血中ではHBV特異的CD8+T細胞数は著明に減少し、ほとんどの場合でIFN-γ産生能の低下が認められる。平成27年度は骨髄由来細胞による抗原提示が、HBV特異的T細胞応答の誘導に十分であるかを検討するため、肝臓内でHBVを発現するHBVトランスジェニックマウス(HBV-Tgマウス)をMHC class Iを発現しないβ2-マイクログロブリン(β2m)欠損マウスと交配し、MHC class Iを実質細胞上に発現しないHBV-Tgマウスを作成した。これらのマウスにX線照射を施し、野生型のB6マウスから単離した骨髄細胞を移入し、骨髄由来細胞上でのみMHC class Iを発現する骨髄キメラHBV-Tgマウスを作成した。これらのマウスをαCD40で刺激し、HBV特異的CD8+T細胞受容体を発現するT cell receptor (TCR)トランスジェニックマウス(TCR-Tgマウス)から単離したCD8+T細胞を養子移入し、レシピエント中のHBV特異的CD8+T細胞応答を解析した。HBV特異的CD8+T細胞は、骨髄由来細胞のみでMHC class Iを発現するHBV-Tgマウスにおいても、野生型HBV-Tgマウスとほぼ同程度、活性化の指標であるCD69を発現していた。

このことは骨髄由来細胞が肝細胞で産生されたHBVを取り込み、外因性抗原提示機序により、HBV特異的CD8+T細胞を活性化することを示している。このような活性化にもかかわらず、HBV特異的CD8+T細胞は骨髄由来細胞のみでMHC class Iを発現するHBV-Tgマウスにおいては全く増殖せず、IFN-γ産生能や細胞傷害能といった機能分化も示さなかった。以上の結果から、骨髄由来細胞による抗原提示は機能的HBV特異的CD8+T細胞応答の誘導に十分でなく、肝細胞による抗原提示が細胞の増殖と機能分化、特に細胞傷害能の誘導に必須であることが示された。B型肝炎ウイルスはエンベロープで覆われた不完全二本鎖DNAウイルスであり、急性または慢性肝炎の原因となり、B型慢性肝炎の多くは肝硬変、さらには肝細胞癌へと進行する。HBVの排除には感染細胞を選択的に破壊することの出来る機能的なHBV特異的CD8+T細胞応答が必要不可欠である。しかしながら、そのようなT細胞応答がどのような機序で誘導されるのかは明らかにされていない。申請者らの研究から、HBV特異的T細胞が肝細胞表面に提示された抗原を認識することにより、それらの機能が抑制されること、さらに、特殊抗原提示細胞である樹状細胞を活性化することにより、この機能抑制を解除できるということが示されていた。この過去の研究をふまえ、本研究では、活性化樹状細胞が、どのような分子学的機序でHBV特異的免疫寛容を克服し、機能的なHBV特異的T細胞応答の誘導するのかを明らかにするとともに、機能的HBV特異的T細胞応答を誘導するために効果的な自然免疫シグナル伝達経路を同定することを目的とした。この3年間の結果から、機能的HBV特異的T細胞応答の誘導には、骨髄由来細胞による抗原提示が必要であるが、骨髄由来細胞による抗原提示は機能的HBV特異的CD8+T細胞応答の誘導に十分でなく、肝細胞による抗原提示が細胞の増殖と機能分化、特に細胞傷害能の誘導に必須であることが示された。肝臓はこれまで免疫寛容を誘導する臓器と考えられてきたが、本研究の結果から、肝臓はウイルス特異的T細胞が増殖するためにも必要な臓器であることが初めて示された。これらの研究は、自然免疫の活性化がどのようにHBV特異的T細胞応答の誘導につながるのかを解明するのみならず、B型慢性肝炎に対する新しい免疫治療の開発を促進するものと期待される。本研究ではB型肝炎ウイルス(HBV)特異的T細胞応答を誘導するために、実質細胞による内因性抗原提示と骨髄由来細胞による外因性抗原提示のどちらがより重要かを検討した。肝臓内でHBVを発現するトランスジェニックマウス(HBV-Tgマウス)を利用し、MHC class Iの発現が実質細胞、または骨髄由来細胞上で欠如するHBV-Tgマウスを作成した。これらマウスにHBV特異的T細胞を養子移入し、その応答性を解析した結果、骨髄由来細胞による外因性抗原提示がHBV特異的T細胞の最適な増殖に必要であるが、実質細胞による内因性抗原提示がT細胞の増殖と細胞傷害能の誘導においてより重要という結果が得られた。平成26年度は本基盤研究の初年度にあたる。本研究に必要な様々なトランスジェニックマウスを個体化するため、米国スクリプス研究所から肝臓内でHBVを発現するHBVトランスジェニックマウス(HBV-Tgマウス)、HBV特異的T細胞受容体を発現するT cell receptor(TCR)トランスジェニックマウスの凍結配偶子を受領し、その配偶子を用いた体外受精によって個体化に成功した。
新戦略を用いた遺伝子導入技術の開発と成体海馬における「細胞競合仮説」の検証と解析

遺伝子導入技術は極めて重要な基盤技術の一つであり「ライフサイエンス技術の扇の要」である。しかしながらこれまで自在性のある「遺伝子導入技術」を開発するのは困難であった。本研究課題の第一の目的は、新たな戦略を用いて、自在性のある「遺伝子導入技術」を開発することである。そして第二の目的は、この新戦略技術を活用し、「局所脳領域において神経活動依存的な細胞競合によって神経回路やシナプスが精錬され調節される」という有力な仮説の検証を成体マウス海馬領域において行うことである。これにより成体海馬における場所細胞の場所受容野形成、精錬における“神経活動依存的な細胞競合"の役割の解明を行う。
高分子材料内の3次元配向分布可視化法の検討と熱伝導性制御への応用

昨年度に引き続き、赤外分光イメージング法を用いた高分子材料中の3次元分子配向評価法について検討を行った。昨年度までは実験設備の都合上、透過光学系による測定・評価を行っていたが、この光学系では原理上フィルム状試料の面内方向の分子配向しか評価を行うことができなかった。そこで本年度は当初の研究計画で提案していた減衰全反射(ATR)法の光学系で評価を行った。ATR法の光学系と赤外分光イメージングを組み合わせたATRイメージング法と、研究代表者がこれまでに取り組んできた偏光解析技術を1組み合わせることで3次元分子配向の可視化技術が実現できるかを、特徴的なバンド構造を有するポリ-(R)-3-ヒドロキシ酪酸(PHB)の球晶をモデル試料として検証を行った。昨年度までに使用してきた赤外分光イメージング装置と本年度に使用した装置では、同じ透過法の光学系であっても検出器や移動ステージの有無といったイメージング計測の原理が異なったため、これまでに用いてきた偏光解析技術が利用できるか、再現性の確認をまず行った。PHB球晶中の分子配向の面内分布にっいて研究代表者が以前提案した4偏光法を用いて評価を行ったところ、過去の結果と同様の結果が得られ、解析法の信頼性を確認することができた。続いてATRイメージングの光学系に偏光を組み合わせた実験を試みた。従来法で用いられてきたp-偏光、s-偏光だけでなく、それらの中間の偏光状態においてPHBバンド球晶の測定を行った際にどのような赤外吸収像が得られるかを調べた。その結果、面内方向の分子配向状態に従って、各偏光における吸光度分布に変化が観察された。またバンド構造は判然としなかったが、偏光依存性のみを抽出するデータ処理を行ったところ、バンド構造に対応する変化が観察されることが確認できた。さらに詳細に各偏光状態における試料表面での電場の3次元異方性について解析を行うことで、高分子球晶のATRイメージが示した偏光依存性の解釈を行うことができた。(抄録なし)高分子材料中の3次元的な分子配向の不均一性を定量・可視化する手法の一つとして,赤外分光イメージング法を応用することを試みた.この手法に赤外分光法の測定・解析手法を応用することで,化学構造や結晶性,分子鎖の配向状態などの分布を定量的に評価することが可能になる.この手法を用いて高分子材料中の各種構造不均一性を定量的に可視化し,熱伝導性への影響を考察することで,微小領域中における熱物性制御の指針を見出すことを目標としている.本年度において,周期的な構造分布を有する高分子バンド球晶について赤外分光イメージング法を応用し,その構造について詳細に評価を行った.偏光顕微鏡下で,特定の高分子球晶を観察すると,数十μmの幅を有する同心円状のバンド(帯)構造が観察されることが知られでいる.バンド球晶中では分子鎖が試料面外に配向した領域と面内に配向した領域が交互に現れるため,それに対応して試料厚さ方向の熱伝導性が周期的に大きく変化することが知られている.バンド球晶について赤外分光イメージング法により分子配向解析を行うため,新たに多重偏光法という解析法を提案した.ポリ-L-乳酸(PLLA)のバンド球晶では,赤外分光イメージング法から計算した分子配向度,分子鎖の配向方向の二次元分布と複屈折イメージング法から求めたリタデーション,遅相軸の方向の二次元分布と非常によく一致することがわかった.これはPLLAが一軸性の屈折率楕円体を有するためである.一方,ポリヒドロキシ酪酸(PHB)は二軸性の屈折率楕円体に由来する二重バンド構造を偏光顕微鏡下で示すことが知られているが,赤外分光イメージングを用いて分子配向分布を可視化したところ,全く異なるバンド構造が発現することがわかった.評価に用いる吸収ピークによって2種類の正反対な単純バンド構造が観察され,これらはそれぞれPHB結晶軸のb軸とc軸の配向に由来している可能性を見出した.昨年度に引き続き、赤外分光イメージング法を用いた高分子材料中の3次元分子配向評価法について検討を行った。

従来法で用いられてきたp-偏光、s-偏光だけでなく、それらの中間の偏光状態においてPHBバンド球晶の測定を行った際にどのような赤外吸収像が得られるかを調べた。その結果、面内方向の分子配向状態に従って、各偏光における吸光度分布に変化が観察された。またバンド構造は判然としなかったが、偏光依存性のみを抽出するデータ処理を行ったところ、バンド構造に対応する変化が観察されることが確認できた。さらに詳細に各偏光状態における試料表面での電場の3次元異方性について解析を行うことで、高分子球晶のATRイメージが示した偏光依存性の解釈を行うことができた。顕微ATR測定による3次元的な配向分布可視化法の検討を行う予定であったが,現在の研究環境において使用出来る装置では試料が破壊されてしまうことがわかった.したがって,3次元的な分子配向の不均一性を有するモデル試料の作成方法の検討や,従来法の改良を先に行った.3次元分子配向測定を非破壊で行うため,ATRクリスタルを接触させたままイメージング測定を行う,ATR-FT-IRイメージング法に注目した.この手法を用いた3次元的な分子配向評価手法について取り組むため、イギリスのImerial College LondonのProf. Kazarianの研究室にて研究を行う予定である.Prof.KazarianはATR-FT-IRイメージングに関する第一人者であり、先進的な研究を数多く報告している.これまで取り組んできた偏光解析手法を応用することで,分子配向,化学構造,結晶状態などの3次元的な分布の可視化を試みる.(抄録なし)
天然物由来癌転移抑制物質の研究

癌転移には標的組織の血管内皮細胞と癌細胞との細胞接着因子あるいは転移巣での新生血管等が重要な役割を果たしている。我々は土壌微生物培養液より細胞接着を特異的に阻害する接着阻害物質macrosphelide A (MSA)を単離した。一方、新生血管形成阻害を指標とした血管新生阻害物質の探索により、staurosporine-thiocarbonylimidazole誘導体(Str.TI)にVEGF阻害に基づく強力な血管新生阻害作用を見出した。本研究ではこれらの化合物の癌転移阻害機序を解明すると共に動物癌を用いて臨床応用への可能性を検討した。先ず細胞接着因子の解析を行った結果、LPS活性化4時間後のヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)へのB16/BL6細胞の接着はMSA及びSLe^x抗体処理により有意に抑制された。しかしながら、ICAM-1抗体、LFA-1抗体処理では抑制されず、また、MSAとSLe^x抗体の併用処理による効果はみられなかった。B16/BL6細胞のマウス肺転移モデルにおいて、隔日でMSAを5-50mg/kg腹腔内投与すると、体重減少を示すことなく肺への転移結節数は用量依存的に抑制された。Str.TIはdosal air sack法による背部皮下での癌性血管新生を抑制し、さらに転移モデルにおいてもStr.TI 10-100mg/kgの投与において用量依存的な転移結節数の抑制を示した。次に、Str.TI 100mg/kgとMSA 50mg/kgを併用した結果、B16/BL細胞移植14日目における転移結節数は90%以上抑制され、著しい転移抑制効果が認められた。MSAの作用機序はB16/BL6メラノーマ細胞上に存在するSLe^xとHUVEC上に発現したELAM-1との結合阻害による細胞接着阻害であり、一方、Str.TIの血管新生阻害作用はVEGF阻害による血管内皮細胞の増殖阻害であった。細胞接着阻害物質MSAと血管新生阻害物質Str.TIとの併用により肺転移が顕著に抑制されたことは、これら化合物が有用な医薬品素材となる事を示唆すると共に血管新生阻害剤と細胞接着阻害剤との併用療法という新たな治療概念を提示したと思われる。
ストレス刺激に応答するmiRNAと口腔内への分泌の解明

マウス骨芽細胞様細胞株(MC3T3-E1細胞)への圧縮応力負荷(CF)により発現が変動するmiRNAを同定した。CFとCFにより発現上昇するmiR-494-3pの過剰発現はMC3T3-E1細胞の増殖を抑制した。MC3T3-E1細胞でのmiR-494-3pの標的がFgfr2、Rock1であり、それらの発現抑制が細胞増殖を抑制することを確認した。以上より、MC3T3-E1細胞における圧縮応力誘導性miR-494-3pは、Fgfr2とRock1の発現抑制を介して細胞増殖を阻害することが示された。今回同定した圧縮応力誘導性のmiRNAの唾液中分泌について継続的に検討していく。近年、メカノバイオロジーは歯科補綴学領域において非常に重要な分野とされている。当教室でもインプラント周囲骨に対するストレス刺激の影響を検討するためマウス骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)への圧縮力負荷に対する作用機序を解明する研究を行っており、以前にERK経路を介するHsp25発現の上昇を報告した。しかし、いまだ未知の部分が多数あり、ここにmicro-RNAなどのエピジェネティクスな遺伝子調節経路が関与している可能性は高い。今回、各種ストレス処置を行った細胞のRNAを抽出しマイクロアレイ解析を行ったことで、特定のストレス刺激条件下でのmiRNAの発現変化を網羅的に確認することができた。今回は、この中で特にメカノバイオロジーにおいて重要な、圧縮力の負荷で変化するmiRNAを検討した。変化したmiRNAについては、ヒト・マウス間にて保存されているもの選択したことで、より臨床状態へ近づけ、qRT-PCRでは、マイクロアレイ解析での発現の変化を再確認した。miRNAの標的候補としては、3種のデータベースで検索し、共通して得られるものを選択するとともに、臨床に即するためヒト・マウス間で共通の標的とした。検索にて、圧縮力の負荷で上昇するmiR-494-3pの標的候補にfibroblast growth factor receptor 2(FGFR2)が得られた。FGFR2は骨芽細胞の増殖・分化・生存に関わってくる遺伝子であり、圧縮力負荷の下mRNA、タンパク質レベルともに低下することより標的遺伝子である可能性が高く、実際にレポーターアッセイ等で標的遺伝子であることが確認できた。これより、MC3T3-E1への圧縮力の負荷によるFGFR2の低下には、miR-494-3pの制御が関与しており、これが細胞の増殖・分化・生存等へ関与している可能性は高いと考えられる。前年度実験より、マウス骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)において294 Paの圧縮応力負荷によりmiR-494-3pが発現上昇し、Fgfr2を標的遺伝子としてmRNAレベルおよびタンパク質レベルで発現を抑制することが確認できた。本年度での実験では、miR-494-3pにおける他の標的遺伝子の検討とMC3T3-E1の細胞増殖への影響の検討を行った。3種のデータベースを用いたin silico解析により、miR-494-3pのヒト・マウス間で共通の標的候補を検索しRock1が比較的上位の候補遺伝子として挙げられた。Rock1は294 Paの圧縮応力負荷およびmiR-494-3p mimic処理においてmRNAレベルで発現低下が認められ、レポーターアッセイの結果からも標的遺伝子であることが示された。また、MC3T3-E1において294 Paの圧縮応力負荷またはmiR-494-3p mimic処理ではMTT assayより細胞増殖能の低下が確認できた。加えて、標的候補であるFgfr2、Rock1はともに細胞増殖に関与する報告が多く認められることより、MC3T3-E1においてsiRNAを用いてFgfr2、Rock1をノックアウトしたところ同様に細胞増殖能の低下が認められた。また、両者をノックアウトした場合には相乗的に細胞増殖が低下することが認められた。これより、294 Paの圧縮応力負荷で発現上昇するmiR-494-3pの標的として新たにRock1が同定され、miR-494-3pはFgfr2およびRock1を標的遺伝子として発現低下させることにより細胞増殖能の低下に関与していることが明らかとなった。歯科補綴学MC3T3-E1に対し、TNF-α、Hypoxia、圧縮力を加えた後、RNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。圧縮力を負荷した細胞で、1123種のmiRNAの内、55種のmiRNAで1.5倍以上の発現上昇、57種のmiRNAで1.5倍以上の発現低下が認められた。

発現上昇が認められたmiRNAのうち、ヒト・マウス間で保存されているものを、qRT-PCRによって検証したところ4種のmiRNA (miR-494-3p、miR146a-5p、miR-210-3p、miR1247-3p)でマイクロアレイと同様の結果が得られた。発現上昇するmiRNAの内、高発現のmiR-494-3pについてTargetScan、MicroRNA.org、MIRDBで標的の検索を行ったところ、ヒト・マウス共通して比較的上位に位置する標的候補としてFGFR2が予測された。FGFR2は圧縮力の負荷によって、qRT-PCRでmRNAレベルの発現低下、ウェスタンブロットでタンパク質レベルの発現低下が認められた。miR-494-3pの標的遺伝子として予想されたFGFR2が実際に標的であることを検証するため、FGFR2の3'-UTRをルシフェラーゼ遺伝子の下流に組み込んだレポーターベクターにてレポーターアッセイを行った。これらをmiR-494-3pmimic又はinhibitorとともにコトランスフェクションするとmimicによるルシフェラーゼ活性の低下が認められた。加えて、3'-UTRのmiRNA結合部位2カ所へ変異を加えた変異型ではルシフェラーゼ活性の低下は認められなかった。inhibitorの添加は、有意差は認められなかったがルシフェラーゼ活性の上昇傾向が示された。一方、miR-494-3pをmimicし、ウェスタンブロットを行ったところ、タンパク質レベルでFGFR2の発現低下が認められた。今回の実験において、マイクロアレイ解析およびqRT-PCRによって圧縮力負荷により変動するmiRNAを特定し、miR-494-3pがFGFR2を標的としてmRNAレベル・タンパク質レベルで抑制することが確認できた。しかし、実際に細胞に対してどのような影響が生じるかは確認できていない。また、miR-494-3pの発現やFGFR2下流シグナルへの影響を検討することも必要であると考えられる。今後は、MC3T3-E1へのmiR-494-3p発現上昇の影響を検討するため、MTT Assayなどで細胞増殖、Caspase Assayなどでアポトーシスに関する実験を行うとともに、共焦点レーザー顕微鏡により細胞の形態やタンパクの局在に対して観察する。また、ウエスタンブロットでmiR-494-3p発現やFGFR2下流のシグナルについても検討を行う。同様に、マイクロアレイ解析、qRT-PCRにて発現の上昇または低下が認められる他のmiRNAについても、データベースにて標的候補を予測し、このシグナル経路にどのように関与する可能性があるか調査していく予定である。一方、細胞レベルで圧縮応力で変化するmiRNAについて、バイオマーカーとして臨床応用するために実際の唾液中miRNAについて検討する。今回マイクロアレイ解析とqRT-PCRによって得られた圧縮力により細胞レベルで変化するmiRNAについて、qRT-PCRにて唾液中に比較的多く認められるか検討する。両者に多く認められたmiRNAには、加えて研究計画通りエクソソームに含まれることを検討した後、歯周病・インプラント治療によってどのように変化するかを確認する予定としている。あわせて、研究施行のための情報収集と意見交換を行う。今年度の実験において、メカニカルストレスに応答して変動するmiRNAを同定し、その中でmiR-494-3pがFGFR2を標的とすることが確認できた。
遺伝子不安定性陽性膵癌のフレームシフト変異由来ペプチドに対する免疫応答

2010年12月を起点として2013年度までの通常型膵癌で膵切除症例(100例)を抽出した。23年度は40例、24、5年度は60例の膵癌症例に対して臨床病理学的所見をデータベースを構築して解析し、MSI解析を行った。文献によると5-10%にMSI陽性膵癌が含まれるとのことであったが結果は100例ともMSS(microsatellite stable)であるとの結果であった。本研究における解析中早期膵癌(PanIN-3:上皮内癌に相当)の症例が1例抽出されたため、免疫染色や病変のマッピングを詳細に行いClinical Cancer Research誌に発表した。2010年12月以降の膵切除症例を起点に通常型膵癌症例を抽出した。平成23年度は40例のMSI解析を行った。平成24年度は引き続き研究母集団を拡大、さらに60例の解析を進めた。当科で切除された通常型膵癌患者検体のうち、60例でマイクロサテライト解析に必要と思われる癌部分・正常(膵)組織部分について、病理診断に使用した以外のパラフィン包埋組織を入手して薄切切片を作成した。癌細胞及び正常細胞それぞれの切片からDNA抽出キットを使用してDNAを抽出し精製した。23年度と同様過去文献から推奨される解析のための5種類のマイクロサテライト領域(MSIマーカー:BAT25, BAT26, D17S250, D2S123, D5S346)プライマーを作成し上記で得られたDNAを鋳型としてPCR法で増幅した。それらをオートシークエンサーで解析し遺伝子配列の同定とピークパターンを比較してマイクロサテライト不安定性の陽陰性を判定した。判定基準は陽性マーカー数がMSS(MS stable)が0、MSI-L(MSI-Low)が1、MSI-H(MSI-High)が2以上、である。結果は60例の解析で全てが安定(MSS)でありマイクロサテライト不安定性を示す例はこの中には存在しなかった。MSI陽性膵癌は全体の5-10%存在するとされるが、現時点まででMSI陽性膵癌は検出されていない。なお、本研究においては、解析に使用した症例の病歴、検査所見、画像所見、病理所見などをデータベース化する作業も進めており、「予後良好な膵癌」との本研究の目的に合致して、早期膵癌(PanIN)の症例を臨床データとして解析しつつある。これに関しても解析を進めていく予定である。前年度までの研究実績概要にも記した通り、2010年12月を起点として通常型膵癌で膵切除症例を抽出した。平成23年度は40例の膵癌症例に対して臨床病理学的所見をデータベースを用いて解析し、同時にMSI解析を行った。結果は40例ともMSS(microsatellite stable)であった。平成24年度は更に解析症例を拡大し60例の解析を行った。判定方法は5種類のマイクロサテライト領域(MSIマーカー:BAT25, BAT26, D17S250, D2S123, D5S346)プライマーを作成し上記で得られたDNAを胃型としてPCR法で増幅、それらをオートシークエンサーで解析して遺伝子配列の同定と、ピークパターンを比較してマイクロサテライト不安定性の陽陰性を判定した。判定基準は陽性マーカー数がMSS(MS stable)が0、MSIーL(MSI-Low)が1、MSI-H(MSI-High)が2以上である。いずれもMSSであった。5-10%にMSI陽性膵癌が含まれるとされるが、23年度と24年度の合計100例中全例がMSSの診断であり、次の解析に進める症例は存在しなかった。平成25年度にも症例集積・病理所見の検討を続けたが、既解析例と比較してMSI陽性を示唆する症例は存在しなかった。平成24年度から25年度にかけて、本研究における症例・標本解析中に早期膵癌(PanIN-3:上皮内癌に相当)の症例が抽出されたため、本研究の目的である「予後が良好な膵癌」の範疇に入ると判断して病理組織を再検討し、病変の病理学的マッピングを詳細に行い、各種免疫染色を再施行、臨床所見も再検討を加えて、症例報告の形でClinical Cancer Research誌に発表した(CJG 2013, Vol6,164-168)。なお、平成25年度には本解析で使用した100例について臨床所見・病理所見を再度詳細に検討しデータベース化した。MSI陽性症例は存在しなかったが現在並行して進行している腹水洗浄細胞診陽性症例の検討などに応用していきたいと考えている。当該研究について東北大学倫理委員会に諮り、承認を得た。

当科にて通常型膵癌と診断され、なおかつ根治切除を受けて病理学的にも膵癌と診断されたものを2010年12月を起点に遡って抽出した。これにより研究母集団を確保に努めた。この抽出した膵癌患者検体のうち、40例でマイクロサテライト解析に必要と思われる癌部分・健常(膵)組織部分を、パラフィン包埋組織を入手して薄切切片を作成した。癌細胞及び正常細胞それぞれの切片からDNA抽出キットを使用してDNAを抽出し精製した。過去の文献から推奨される解析のための5種類のマイクロサテライト領域(MSIマーカー:BAT25, BAT26, D17S250, D2S123, D5S346)プライマーを作成し上記で得られたDNAを鋳型としてPCR法で増幅した。それらをオートシークエンサーで解析し遺伝子配列の同定とピークパターンを比較してマイクロサテライト不安定性の陽陰性を判定した。判定基準は陽性マーカー数がMSS(MS stable)が0、MSI-L(MSI-Low)が1、MSI-H(MSI-High)が2以上、とした。結果は40例の解析で40例全てが安定(MSS)でありマイクロサテライト不安定性を示す例はこの中には存在しなかった。また当初の膵癌検体集積予定症例は合計100例であるため、逐次症例の集積も進めている。なお、本研究に該当した膵癌根治切除全症例は臨床検査・画像所見・病理所見・病期臨床病期ごと、及び病理学的所見ごとに分類し予後調査を行って臨床データとしての集積も同時に進めた。2010年12月を起点として通常型膵癌切除例を抽出した。また研究期間内に新たに膵切除術によって得られた標本を検討し、通常型膵癌例であればパラフィン切片から癌部分と正常部分を抽出した。平成23年度は40例を解析し、24年度は60例を解析した。癌部分・正常部分のパラフィン切片を薄切し、DNAを抽出して5種類のマイクロサテライトマーカーに対してPCR法で増幅、正常部と癌部分でピークパターンを比較した(委託)。結果は60例中全例がマイクロサテライト不安定性を示さない判定(MS stable)であった。マイクロサテライト不安定性解析は目標症例数に達したが、MSI陽性例が(確率的には低い:5-10%)抽出されなかったため、その後の解析には未だ至っていない。なお、膵癌組織病理検索過程で、稀な早期膵癌(PanIN-3)切除例が存在し、それは当研究の主たる目的の一つである「予後良好な膵癌」のカテゴリーに入るため当該研究で派生させて検討を加えた。平成23年度は倫理委員会に概要を提出して審査を行い、本研究について本学の倫理委員会に諮り通過した。その後2010年12月を起点として遡り通常型膵癌切除例を抽出した。本来であれば50例のMSI解析が初年度の目標であったが実際に癌部分と正常部分を集積できたたのは40例であった。40例の癌部分・正常部分をそれぞれパラフィン切片を薄切し、DNAを抽出して上記の5種類のマイクロサテライトマーカーに対してPCR法で増幅、正常部と癌部分でピークパターンを比較した。結果は40例中40例全てがマイクロサテライト不安定性を示さない判定(MS stable)であった。目標には届かなかったものの、マイクロサテライト解析はほぼ計画通り測定まで至ることができた。MSI陽性膵癌は全体の5-10%とされているが、当科の通常型膵癌症例を検索した限りでは現時点まででMSI陽性症例は確認されなかった。検索方法の再検討をしつつ、MSI陽性膵癌を検出できるよう追加検索を行う方針で臨みたい。
海中構造物周辺の底質浮遊・洗掘機構の解明と波浪・土砂・地形の相互作用系の統合解析

洋上風力発電の円筒形基礎を想定した模型を砂地盤に設置し,暴浪の発生から終息までの波浪を造波水槽内に再現して実験を行った.波の不規則性や変動性が構造物周辺の洗掘地形の発達・埋戻しに及ぼす影響を究明するとともに,その変動過程を捉えられる数値解析モデルを開発した.また,波による海底砂の移動限界条件を正確に与える実験式を考案し,数値解析に利用した.波および流れによる砂漣の発生・変形過程,および海中の円筒構造物周りの洗掘現象の解析を行った.その結果,砂漣から構造物スケールの海底面の変動現象を良好に捉えられる解析手法を構築することができた.海の波による海底砂の移動とそれに伴う海底面の地形変化の過程を厳密に再現可能な数値解析モデルの開発,および数値解析の際に必要な砂の移動限界条件を正確に与えられる新たな実験式の考案を行った.数値解析モデルは3次元流体解析モデルを乱流解析に対応するためLES化して,浮遊砂と掃流砂の底質輸送モデル及び海底地形変動モデルを連成的に組み込んで高度化した.本モデルの妥当性を調べるため,波による砂連の形成過程の再現計算を行った結果,本モデルは十分発達した砂連の特徴を良好に再現できること,その再現性は周期の異なる波でも維持されること,それらは計算範囲の設定に関係ないことを確認し,本モデルは流体・底質輸送・地形変化の相互作用の過程を精度良く解析可能なことを検証した.また,海底砂の移動限界条件の設定を変えると,浸食・堆積速度の変化と共に,平衡状態に達した砂連地形も変化するため,移動限界条件を正確に与えることが重要であることが分かった.海底砂の移動限界条件を簡単な方法で正確に評価できるように,従来実験と自前の実験の結果をできるだけ多く収集・分析した.その結果,移動限界のShields数は移動限界の波高水深比の関数で表されること,移動限界の波高水深比は粒径・水深・波長を用いた無次元パラメータで関係付けられることが分かった.また,それらの関係に基づいて,細砂の移動限界のShields数・流速・波高を正確に求められる陽的で簡単な代数式を考案し,その適用性を検証した結果,大規模実験の移動限界Shields数を精度良く推定すると共に,移動限界流速を従来方法に比べて正確に推定でき,計算が容易で実用性に優れることを示した.さらに,広域的な沿岸海浜地形の変化を考慮した海中構造物の設計の重要性に着目して,海浜変形問題を考える上で重要になる河川からの土砂供給量や関連する河道地形の長期的な変動特性を究明した.洋上風力発電の円筒形基礎を想定した模型を砂地盤に設置し,暴浪の発生から終息までの波浪を造波水槽内に再現して実験を行った.波の不規則性や変動性が構造物周辺の洗掘地形の発達・埋戻しに及ぼす影響を究明するとともに,その変動過程を捉えられる数値解析モデルを開発した.また,波による海底砂の移動限界条件を正確に与える実験式を考案し,数値解析に利用した.波および流れによる砂漣の発生・変形過程,および海中の円筒構造物周りの洗掘現象の解析を行った.その結果,砂漣から構造物スケールの海底面の変動現象を良好に捉えられる解析手法を構築することができた.着床式洋上風力発電施設の円筒形基礎を想定した模型を砂地盤に設置し,暴浪の発生から終息までの一連の波浪変動パターンを造波水槽内に再現して,構造物模型周辺の波,流況,砂の移動と底面地形の変化過程を詳しく計測・観測した.現地波浪データを利用して暴浪時の波高・周期と再現期間を統計解析し,現地状況の再現性を考慮して強度別に4段階の波浪条件を選定した.波の強度を段階的に増加・減少させることで暴浪イベントを模擬し,波の不規則性や変動性が構造物周辺の洗掘地形の発達・埋め戻りの過程に及ぼす影響を詳しく調べた.その結果,浸食・堆積の地形パターンや砂の移動形態はイベント中に遷移すること,各段階の洗掘地形は同じ強度の波浪が長時間続いて平衡状態に達したものと一致すること,各地形パターンの発生条件は波浪・構造物・底質の条件から求められるKC数とShields数によって推定可能であること,各パラメータの算出に有義波高・周期を用いると規則波による地形パターンの発生条件や最大洗掘深と良く整合すること等を明らかにした.基礎根元の底面高は暴浪がある程度発達した段階で一時的に上昇し,さらに発達すると低下して暴浪ピーク段階で根元の洗掘深が最大に達する.暴浪減衰段階になると埋戻しにより根元付近の底面高さは急速に上昇するものの,最終底面高は初期に比べ低く,完全には回復しない.最終的な洗掘深は最大洗掘深に比べると約1/3と小さいこと,埋戻しは根元付近の限られた範囲のもので,ピーク段階で生じた洗掘孔全体を埋めるには十分でなく,暴浪減衰期も基礎周辺の底質量の回復はほとんど見込めない場合があることが分かった.これらの知見は,海中構造物周辺の洗掘機構の解明および洗掘対策工の設計等に資する重要な研究成果であり,次年度予定している波浪・構造物・底質・地形変動の統合解析モデルの開発・検証に役立つ.前年度開発したモデルおよび海底砂の移動限界の実験式を用いて,様々な波および流れによる砂漣の発生・変形過程,および海中の円筒構造物周りの洗掘現象を対象にした数値解析を行った.