hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
四足動物の肩帯進化についての比較解剖学的および機能解剖学的研究

両生類のタイガーサラマンダーは,オオサンショウウオとほぼ同様の所見であったが,オオサンショウウオでは肩甲下筋の起始が肩甲骨の尾側縁に限局していたが,タイガーサラマンダーでは頭方に広く発達していた点が異なっていた,ほ乳類の追加所見としておこなったイワハイルカおよびブタ胎仔では,主に肩甲下筋枝,大円筋枝,広背筋枝の起始位置の詳細な解析を行うとともに,各筋枝の筋内分布を調べた.その結果,ブタ胎仔では,複数の肩甲下筋枝のうち近位のものは腕神経叢背側束の腹側から,筋の尾側部分に分布する遠位の枝は大円筋枝と同じく背側束の背面から分枝しており,ヒトでの報告と同様であった.一方で,イルカでは他の哺乳類で見られた近位の肩甲下筋枝が存在せず,すべての肩甲下筋枝は大円筋枝や広背筋枝と密接な関係を持っていた.これら結果から肩甲下筋の比較解剖学的な位置付けを行うことができた.昨年度まで観察を保留していた動物種(カメ類)に加え,新たに両生類(ウェスタンタイガーサラマンダー)やほ乳類(シワハイルカ,ブタ胎仔)で追加種を観察し,より詳細な考察を行うことができた.さらに,これらの観察結果から,肩甲下筋,大円筋,広背筋の比較解剖学的な関係も明らかにすることができ,肩帯筋の進化についてより広範囲な考察を行うことができるようになった.最終年度である本年度は,昨年度に続いて肩甲下筋の系統発生についての観察をおこなった.昨年度まで観察したハ虫類や両生類の所見と対応できる哺乳類の所見がイルカ1種とブタ胎仔1頭に限られていたため,今年度は霊長類(チンパンジー,フクロテナガザル,シロテテナガザル),食肉類(ネコ),有袋類(コアラ,フクロギツネ)の所見を加えて哺乳類全般の特徴を明らかにし,両生類から哺乳類にかけての肩甲下筋の系統発生学的な進化について明らかにした.哺乳類の肩甲下筋枝は腕神経叢後神経束から分枝する複数の枝からなり,その分枝する位置や層序により4つに区分できた.1後神経束近位の腹側面から分枝する枝,2後神経束の腹側面+中間層から分枝する枝,3後神経束の背面+中間層からの枝,4後神経束遠位の背側から分枝する枝.4の枝は大円筋枝と共同幹であった.4の枝と同じ層で分節の低い位置からは広背筋枝が分枝していた.前年度までの結果とあわせると,1の枝は両生類の肩甲上腕筋やハ虫類の肩甲下筋枝と相同,4の枝は両生類やハ虫類の広背筋枝のうち分節の高い成分と相同であった.また23の中間層の枝は,ハ虫類の後肩甲上腕筋枝と相同である.つまり,哺乳類の肩甲下筋は両生類の肩甲上腕筋,ハ虫類の肩甲下筋,後肩甲上腕筋,広背筋のうち分節の高い一部が合して形成されたものであることが明らかになった.さらに,哺乳類で出現する大円筋もハ虫類の広背筋の一部から形成されてものであることが分かった.平成2528年度の研究により,両生類から哺乳類にかけての烏口骨の退縮と肩甲棘の出現に伴う上腕屈筋群の変化,前鋸筋・肩甲挙筋などの背側肩帯筋群の変化,肩甲下筋・大円筋・広背筋の系統発生が明らかになり,それらを総合的に考察することにより陸上四足動物の肩帯進化の過程が解明できた.両生類から哺乳類にかけて機能的な要求に対応して大きく変化してきた肩帯,特に従来明らかではなかった肩帯筋の連続的な変化過程を明らかにして,肩帯進化の解明に寄与した.具体的には,3つの側面について観察した.1ハ虫類で発達していた烏口骨の退縮と肩甲棘の新生に伴った上腕屈筋群の分化過程を明らかにした.2四足動物で肩帯と体幹をつなぐ背側肩帯筋群の分化過程を明らかにするとともに,支配神経の詳細な解析によりこれらの筋群の体幹筋としての形態学的な位置づけを明らかにした.3従来議論のあった肩甲下筋・大円筋・広背筋の系統発生学的な分化過程を解明し,哺乳類の肩甲下筋の複数起源を明らかにした.予定通り両生類,ハ虫類について詳細な所見を得ることができた.また,ニワトリについてもかなり詳細な所見を得ることができた.また,当初の予定にはなかったが,予備調査でイルカの肩帯筋の一部を観察した結果興味深い結果が得られたので,今後の調査に加えることにした.27年度までで各動物種の観察はほぼ終了しているが,28年度ではこれらの観察結果を総合して肩帯進化についてまとめていく計画である.
新免疫寛容導入法の確立とメトロン遺伝子ゲノム内導入による移植腎永久生着の試み

ラット腎移植モデルにおいて3種類の抗体"改良型CTLA4-Ig"、"Anti-ICOS-Ig"、および"CD28-SA"を併用することにより免疫寛容を導入し、レンチウイルスをベクタを用いてMF-1遺伝子を移植腎組織に導入し、移植腎を長期的に保護することによって、移植腎を永久生着させることを目的としていたが、3種抗体投与においては、予想に反してCD28-SA単独投与群で最も高い生着延長効果がみられ、また、2匹のレシピエントに抗体投与によると思われる強い全身性の炎症反応を認めた。また、MF-1遺伝子導入については、MF-1発現は見られたが、3種類の抗体投与単独治療群と、3種類の抗体投与+MF-1遺伝子導入併用治療群の間に、有意な治療効果の増強(移植腎組織の改善、生着延長効果)を認めなかった。ラット腎移植モデルにおいて下記、1), 2)を同時に施行し移植腎の永久生着を目的とした。1) 3種類の抗体"改良型CTLA4-Ig"、"Anti-ICOS-Ig"、および"CD28-SA"を併用することにより免疫寛容を導入する。2) MF-1遺伝子を、レンチウイルスをベクタを用いて移植腎組織に局所的に導入し、移植腎を長期的に保護する。移植腎を永久生着させるためには、移植術後早期の強力な免疫抑制と長期にわたる維持免疫抑制療法が必要であるが、免疫低下による重症感染症や悪性腫瘍の発症が大きな問題となる。これを解決する最良の方法として免疫学的寛容の導入がある。これまでいくつかの動物モデルで免疫学的寛容導入の成功例が報告されているが、臨床応用における大きな問題点はその導入効率が最も高い方法でも80%程度で、100%に近い導入率を実現した報告はないことである。免疫寛容導入の際には、免疫抑制剤を使用することなく移植腎組織に対する特異的な免疫不応答を誘導するため、CD28-B7pathwayが確実に阻害されない場合には、激烈な拒絶反応を生じ移植腎は機能廃絶に陥る。このことは移植腎ドナーが数少ない本邦では、たとえ10-20%の確率でも臨床的な治療法として確立することは難しい理由である。これらのことから今回我々がラット腎移植モデルにてNeo CTLA-4-Ig + Anti-ICOS-IgによるCD28-B7pathwayに加えて従来の誘導方法とは全く異なるCD28SA Igによるsuppressor Tcell誘導による方法を併用することにより、非常に高率な免疫寛容の導入に成功したことは、今後移植腎の永久生着を可能にする上で飛躍的な進歩であると考えられる。2)改良型Neo CTLA4-Igの導入(安全な免容慣用の導入)。これまで我々はCTLA4-Igを用いた免疫寛容の導入を行ない成果を上げてきたが毒性が問題となり、臨床応用が遅れていた。今回Dr.Sayeghらのグループがより安全性を確立したNeo CTLA4-Igの作成に成功し我々がこれを導入することが可能となった。このことは今後の移植医療において非常に画期的である。3)アデノウイルス並みの使いやすさ、高い導入効率、そして目的の遺伝子を標的組織のゲノム内に入れることで半永久的な遺伝子発現を可能にする"レンチウイルス"をベクターとして腎組織への遺伝子導入に成功した。これまで、腎組織における遺伝子導入においては確立された手法は未だ報告されていなかったが、我々はアデノウイルス並みの使いやすさ、および導入効率を持ち、また、目的遺伝子が目的組織のゲノムに入ることで半永久的な遺伝子発現、および蛋白合成を可能にするレンチウイルスをベクターとして腎組織への遺伝子導入に成功した。このことは、遺伝子治療の領域では革命的な発展であり、今後の腎疾患に対する治療に大きく寄与するものと思われる。3)HGFとMacrophage stimulating Factor (MSP)のキメラであるMetron factor 1 (MF-1)は、HGF,およびMSPの持つ"アポトーシス抑制作用"をHGF、MSPそれぞれのfactorに比較して有意に強く認めるが、悪性腫瘍を誘発させる作用はほとんど認めない。我々はHGFが慢性拒絶反応の発症を防止することを既に報告したが、長期的なHGF全身投与は悪性腫瘍を誘発する危険性が示唆され、その臨床応用には充分な注意が必要である。この見地から今回Metron factor 1 (MF-1)の遺伝子導入を実現することは今後のCAN治療、さらには、慢性腎疾患の治療全般において非常に大きく寄与するものと思われる。1)新しい免疫寛容導入方法の確立これまでいくつかの動物モデルで免疫学的寛容導入の成功例が報告されているが、臨床応用における大きな問題点はその導入効率が最も高い方法でも80%程度で、100%に近い導入率を実現した報告はないことである。

免疫寛容導入の際には、免疫抑制剤を使用することなく移植腎組織に対する特異的な免疫不応答を誘導するため、CD28-B7pathwayが確実に阻害されない場合には、激烈な拒絶反応を生じ移植腎は機能廃絶に陥る。このことは移植腎ドナーが数少ない本邦では、たとえ10-20%の確率でも臨床的な治療法として確立することは難しい理由である。これらのことから今回我々がラット腎移植モデルにてNeo CTLA-4-Ig+Anti-ICOS-IgによるCD28-B7pathwayに加えて従来の誘導方法とは全く異なるCD28 SA Igによるsuppressor Tcell誘導による方法を併用することにより、非常に高率な免疫寛容の導入に成功したことは、今後移植腎の永久生着を可能にする上で飛躍的な進歩であると考えられる。2)安全な免疫寛容の導入方法の確立3)アデノウイルス並みの使いやすさ、高い導入効率、そして目的の遺伝子を標的組織のゲノム内に入れることで半永久的な遺伝子発現を可能にする"レンチウイルス"をベクターとして腎組織への遺伝子導入に成功した。これまで、腎組織における遺伝子導入においては確立された手法は未だ報告されていなかったが、アデノウイルス並みの使いやすさ、および導入効率を持ち、また、目的遺伝子が目的組織のゲノムに入ることで半永久的な遺伝子発現、および蛋白合成を可能にするレンチウイルスをベクターとして腎組織への遺伝子導入に成功した。長期的なHGF全身投与は悪性腫瘍を誘発する危険性が示唆され、その臨床応用には充分な注意が必要である。HGFとMacrophage stimulating Factor(MSP)のキメラであるMetron factor 1(MF-1)は、HGF,およびMSPの持つ"アポトーシス抑制作用"をHGF、MSPそれぞれのfactorに比較して有意に強く認めるが、悪性腫瘍を誘発させる作用はほとんど認めない。この見地から今回遺伝子導入を実現することは今後のCAN治療、さらには、慢性腎疾患の治療全般において非常に大きく寄与するものと思われる。「研究目的」ラット腎移植モデルにおいて下記、1),2)を同時に施行し移植腎の永久生着を目的とした。2)HGFとMSPのキメラであるMF-1遺伝子を、アデノウイルス並みの導入効率とゲノムに入ることで半永久的な遺伝子発現が可能なレンチウイルスをベクターとして移植腎組織に局所的に導入し、様々な組織障害因子から移植腎を長期的に保護する。[研究成果]1)下記6つの実験群を作成し(Gp1-Gp6)、3種抗体投与による治療効果(免疫学的寛容導入の有無、移植腎機能、病理組織、および、生着延長効果)について検討した結果、予想に反してCD28-SA単独投与群で最も高い生着延長効果がみられ、また、2匹のレシピエントに抗体投与によると思われる強い全身性の炎症反応を認めた。2)MF-1遺伝子発現は見られたが、3種類の抗体投与単独治療群と、3種類の抗体投与+MF-1遺伝子導入併用治療群の間に、有意な治療効果の増強(移植腎組織の改善、生着延長効果)を認めなかった。
病原因子としての莢膜多糖体の合成機構の遺伝学的解析

本研究ではKlebsiella pneumoniaeの病原因子としての莢膜多糖体の生合成に関与する遺伝子領域の構造と発現調節機構を明らかにすることを目的として,2年度にわたり研究を実施した。研究の実施期間中にK.pneumoniaeのK2型莢膜多糖体の産生に関与するcps領域全体のクローニングと全塩基配列の決定を終了することができ、この領域に存在する遺伝子の数や配置、それらの発現調節に関わる遺伝子などに関し多くの成果を得ることができた。現在、このcps領域に存在する遺伝子がどのような調節機構によって発現が調整されているのかを更に詳しく解析中である。本研究により、強毒株であるK2型株(Chodid株)のcps領域に存在する遺伝子のうち、ORF16と17は糖鎖の生合成に必要な前駆体であるGDP-マンノースの生合成に関与するcpsGとcpsB、ORF15は6-フォスフォグルコン酸脱水素酵素の遺伝子gnd、ORF1はa-D-グルコシル-1-燐酸ウリジルトランスフェラーゼの遺伝子galFであることが示唆されたが、残りの遺伝子に関してはその機能は不明である。多糖の生合成には複数の遺伝子が複雑に関与しているため、短期間にその全体像を明らかにすることは不可能であるが、今後は、それら機能の不明な遺伝子の働きを解析することを目的として研究を進める予定である。当該年度の研究目標であったKlebsiella pneumoniaeの莢膜多糖体の生合成に関与する遺伝子領域の全塩基配列の決定を終了し、遺伝子の位置と配置、転写の方向、シストロン構造の決定、プロモーターの位置等を推定することができた。その結果、この領域には少なくとも19個の遺伝子が存在し、特にその中の13個はポリシストロン構造を示すことが推定された。このポリシストロンのプロモータ部位には通常のσ70依存性のプロモータ以外にσ54やσ38に依存して転写が開始されると思われるプロモーター様配列が存在していることが明かとなった。また、プロモータ解析用ベクターによるプロモータ活性部位の検索、lac-トランスポゾン3を用いた転写ユニットの推定などを行なった結果、塩基配列より推定された結果と一致した。これらの結果は、1994年に開催された3つの国際学会において発表された。Klebsiellapneumoniae K2型株の莢膜多糖体の生合成に関与する遺伝子領域cpsの大まかな構造に関して,1995にJ.Bacteriology 177:1788-1796を発表して以降,この領域に存在する遺伝子の発現調節機構がどのようになっているかを解析しつつある。現在,cps領域の発現を正に調節する2つの調節因子RmpA2とRcsBが作用するプロモーターの位置を特定しつつある段階である。これらの2つの調節因子はcps領域に存在する異なるプロモーター部位に作用しそれぞれ独立にmRNAの転写を促進することが示唆されている。また,静止期(S期)における莢膜多糖の持続性の生合成は,ORF3の上流に存在するプロモーターからの転写がS期においても持続し続けることがその背景となっていることが示唆された。また,このプロモーターの上流に存在する遺伝子がS期における持続的発現に関与することが示唆されている。こららの研究成果は,1997年の米国微生物学会の総会で発表する予定である。一方,K.pneumoniaeの莢膜多糖体の生合成には多数の遺伝子が複雑に関与していることが示唆されており,cps領域に見出された遺伝子の個々の機能に関しては,今後の研究課題として継続する予定である。
肝虚血再潅流傷害に対する新たな遺伝子治療法の開発に関する研究

平成18年度は、冷虚血再潅流直後の肝臓におけるROS産生源はKupffer細胞ではなく肝細胞である可能性が高いとの結果を得た。平成19年度はDominant negative Rho-kinase(DNRhoK)をドナー肝細胞に導入し、Rho-kinaseを介した、ROS産生経路の存在を証明すると共に、肝細胞のRho-kinaseが虚血再潅流傷害の遺伝子治療のタ-ゲットになり得ることを証明した。1. DNRhoK、LacZ(control)をドナーラット肝細胞に導入後、レシピエントラットで再潅流直後のROSを測定したところ、DNRhoK導入群で有意に抑制された。さらに、これらのROSはNADPH oxydase inhibiorで有意に抑制された。よって、肝虚血再潅流傷害における再潅流直後のROSは肝細胞のRho-kinaseを介して、NADPH oxydase systemにより産生される可能性があると考えられた。3.ラット肝移植モデルにおける生存率の比較を行い、DNRhoK導入群で有意に良好であった。平成18-19年の研究結果より、肝移植後の虚血再潅流傷害を回避するために、ドナー肝へのDNRhoK導入により肝細胞NADPHoxydaseにおけるROS産生を抑制することが有効であることが証明された。肝細胞のRho/kinaseは肝虚血再潅流傷害のターゲットとして有用と考えられた。平成18年度は、冷虚血再潅流直後の肝臓におけるROSの産生源の解明についての研究を行った。動物実験モデルはラット肝移植とし、以下の方法を用いてROSの産生源について検討を行った。(方法)1.ドナーラットの肝組織中Kupffer細胞をCl2MDP-1iposome法を用いて消去した。Cl2MDP-liposomeを作成し、投与後48時間の肝組織をED-1により免疫染色して、Kupffer細胞が90%以上消去されている事を確認した。2.ドナー肝をコントロール群とKupffer細胞消去群の2群に分け、レシピエントへ肝移植し、再潅流直後のROS産生量を比較した。(結果)再潅流直後(15分後30分後)の肝組織におけるROS産生量は、コントロール群とKupffer細胞消去群で有意差は認められなかった。ただし、30分後45分後ではKupffer細胞消去群で有意にROS産生量が少ない結果であった。(考察)再潅流後のROS産生にKupffer細胞が強く関与していることは多くの研究報告があるが、経時的な変化を見た報告はない。本研究では再潅流後30分までのROSはKupffer細胞由来ではなく、30分以降のROSはKupffer細胞由来である事を示唆している。虚血再潅流直後(30分)のROSが炎症反応最初のスイッチとなる可能性があるため、本研究では30分までのROS産生源を遺伝子治療のターゲットとする予定である。
高温超電導体の浮上力の安定性とフラックスクリープ現象の解析

イットリウム系酸化物高温超電導体バルク材と強力な永久磁石を用いると、大きな浮上力と安定平衡が得られる。本研究では、超電導体バルク材の磁気ベアリング・フライホイール等への応用のために、高温超電導体に磁石を近づけた時の浮上力の特性と安定性の評価に関して、数値解析と実験を行った。まず、浮上力の垂直方向・水平方向の安定性の評価を行った。永久磁石と高温超電導体間の浮上力はヒステリシス特性を持つ。臨界電流モデルに基づいた解析コードを用いてヒステリシス特性を求め、浮上力曲線の傾きから垂直方向の安定性を評価した。ピン止め力による磁場凍結の仮定の下で、水平方向の安定性をマクスウェル応力から計算した。超電導体を冷やしてから磁石を近づけるゼロフィールドク-リングの場合より、磁石を近づけてから超電導体を冷やすフィールドク-リングの場合の方が復元力が大きいことを確認した。これは後者の方が磁束が超電導体に多く補足されているためと考えられる。次に、超電導体の結晶構造に着目した2次元薄板積層近似コードを用いて、バルク材の粒界やクラックの影響の評価を行った。同じ臨界電流密度を用いた場合、粒界を考慮しないものよりも粒界を考慮したモデルの浮上力が小さくなることを確認した。さらに、磁石を早い速度で超電導体に近づけた時、超電導体に誘起される総遮蔽電流の時間変化をロゴスキーコイルを用いて測定した。超電導体の浮上力の時間依存特性が、フラックスクリープ・フロー理論によって説明されることを示す実験結果を得た。今後はフライホイールへの応用のために、得られる浮上力と復元力が共に大きい様な磁石系の最適配位設計等の数値解析を行う予定である。
アサガオゲノムの解析

(1)突然変異系統の解析将来的な遺伝子クローニングに向けて、交配による遺伝学的解析や、バックグラウンドの置換を立田(MAPLE)遺伝子をはじめとするいくつかの変異体について行った。このような系統は通じて挿入しているトランスポゾン(Tpn1ファミリー)の転移が促進されるため、以下のSTD法による遺伝子クローニングなどの基質にも適していることがわかった。(2)突然変異体の原因遺伝子遺伝子の解析マルバアサガオの八重咲き変異体であるfpの原因遺伝子を解析した結果、C機能MADS-box遺伝子に、近年多くの生物のゲノムに多コピー存在するHelitronと関連したトランスポゾン(Helip1)が挿入していた。体細胞内でこのHellip1が頻繁に離脱するため表現型は不安定である。これまで実際に活性のあるHelitronは知られておらず、このマルバアサガオのfp変異体はHelitronを研究する上でも非常に有効な系だと考えられる。STD法によって獅子(fe)遺伝子のクローニングに成功した。獅子遺伝子は、側生器官の裏側で発現し、背軸側の特徴を決定しているシロイヌナズナのKAN1遺伝子ともっとも高い相同性を持っており、同様の機能を持つと予想された。(3)cDNAライブラリーの作製・ESTデータベースの構築これまで作製していた蕾の均一化・完全長cDNAライブラリーについては5万クローン以上におよぶ配列を決定し、データベースを構築して他の生物種の遺伝子との相同性等の解析を行っている。このライブラリーを解析した結果、カバーしていない遺伝子があることが明らかになったため、今年度は幼植物の均一化・完全長cDNAライブラリーを作製し品質のテスト等を行った。次年度以降このクローンについても配列決定・データベース構築を行っていく予定である。
慢性骨髄性白血病における炎症性ケモカインCCL3の病態生理学的役割の解明

昨年度までの研究成果として、慢性骨髄性白血病(CML)の発症初期過程において、CML白血病幹細胞から分化誘導する好塩基球様の白血病細胞が、骨髄内で増殖するとともに炎症性ケモカインCCL3を恒常的に産生し、正常造血幹・前駆細胞の増殖を選択的に抑制することでCML病態の増悪・進展に寄与していることを明らかにした。さらに、この分子・細胞機序を標的とした治療法の確立として、CML発症初期過程における好塩基球様の白血病細胞の選択的除去、もしくはCCL3の阻害剤マラビロクを経口投与することで、CMLの発症を効果的に予防できることを明らかにした。しかしながら、CML発症後における治療効果は限定的であった。最終年度は、これまでの研究成果を踏まえ、一般的な白血病の根治を目的とした治療法である、骨髄移植療法との併用の検討に着手した。骨髄移植治療の前処置として、異なる線量でX線を照射し、正常ドナーマウス由来の骨髄細胞を移植し、最適な治療条件の検討を行った結果、予想外にも長期的に生存したマウスにおいて、正常ドナーから新たに白血病が発症していることを見出した。本研究課題を遂行することで、CMLの病態生理に関わる新たな分子・細胞機序を明らかにしたため、十分な成果が得られたと考えられる。ただし、最終年度に見出した骨髄移植治療後の正常ドナー細胞の白血病化については、臨床的にもドナー細胞由来白血病として問題視されている。また、本研究課題で最終目標としている、白血病細胞と正常造血細胞との競合的相互作用を標的とした新たな治療法の確立において、正常ドナー骨髄細胞の白血病化の原因解明とその克服は急務であり、継続すべき研究課題として現在解析中である。慢性骨髄性白血病(CML)の発症初期過程における白血病細胞と正常造血システム間での相互作用を解明するために研究代表が開発した、BCR-ABL遺伝子を遺伝子導入したCML幹細胞をX線非照射マウスの骨髄内に直接移植し、正常造血系を維持した状態で白血病を発症させるCMLモデルを用いて、研究代表者はCML病態生理の解析を行った。その結果、CML発症初期過程において、炎症性ケモカインの一つであるCCL3が骨髄内においてCML幹細胞が維持・増殖するのに重要な役割を担っていることを明らかにした。これらの解析結果を踏まえ、本研究課題の初年度は正常造血系、さらには白血病性造血系におけるCCL3産生細胞の同定、さらには各造血過程における役割を検討することで以下の結果を得た。1正常造血系においては、骨髄内で分化した好塩基球が特異的にCCL3を産生していた。一方で、白血病性造血系では、CML幹細胞から分化して生じた多数の好塩基球様の白血病細胞が大量のCCL3を産生していた。2骨髄移植後の正常血球再構築過程で、CCL3シグナルを阻害、もしくはCCL3産生好塩基球を枯渇させると、骨髄内で正常造血幹・前駆細胞の増殖が亢進することで、過剰に各種血液細胞が再構築された。以上の結果から、正常・白血病性造血系において、好塩基球がCCL3を恒常的に産生し、正常造血幹・前駆細胞の増殖を負に制御する働きがあることを明らかにした。CML患者において特徴的に増加することが古くから知られている好塩基球様の細胞が、CML発症過程における白血病細胞と正常造血システム間での拮抗的相互作用において、中心的な役割を担っている可能性が示唆された。申請書の研究計画に記載した、28年度予定の正常造血系、さらには白血病造血系におけるCCL3産生細胞の同定については、骨髄内で分化する好塩基球が、特異的なCCL3産生細胞であることを明らかにしたため、予定通り遂行することができたと考えられる。さらに、29年度の研究計画で予定していた、正常造血過程におけるCCL3・CCL3産生細胞の役割についても、骨髄移植実験モデルにおける血液細胞再構築過程を観察することで、好塩基球から産生されるCCL3が、特異的レセプターCCR1・CCR5を発現している正常造血幹・前駆細胞の増殖を制御する働きがあることを明らかにしており、当初の予定以上に研究が進捗したと評価している。本研究課題の初年度において、BCR-ABL遺伝子を遺伝子導入したCML幹細胞をX線非照射マウスの骨髄内に直接移植し、正常造血系を維持した状態で白血病を発症させるCMLモデルを用いた解析を行った。その結果、CMLの発症初期過程において、CML幹細胞から分化誘導する好塩基球様の白血病細胞が、骨髄内で増加するとともに炎症性ケモカインCCL3を恒常的に産生し、正常造血幹・前駆細胞の増殖を選択的に抑制していることを明らかにした。すなわち、好塩基球様白血病細胞が産生するCCL3が、骨髄内の限られたスペースにおけるCML幹細胞の優先的な増殖を間接的にサポートすることで、CML病態の増悪に寄与している可能性が示唆された。本年度は、これらの知見を踏まえ、新たなCML治療法の確立の可能性を検証するために、マウスCMLモデルを用いて、CCL3あるいはCCL3産生好塩基球を標的とした際の治療・発症予防効果を検討し、以下の結果を得た。1CML発症初期過程において、CCL3の主な産生細胞である好塩基球様白血病細胞を選択的に除去した結果、CMLの進展・増悪が効果的に抑制された。

2CML発症初期過程において、CCL3の特異的レセプターCCR5との結合阻害剤であるマラビロクを経口投与した結果、CMLの進展・増悪が効果的に抑制された。以上の結果から、CML患者において特徴的に増加することが古くから知られている好塩基球様の白血病細胞、さらにはその細胞から産生される正常造血幹細胞抑制因子であるCCL3が、新たなCML治療における標的細胞・分子となる可能性が示唆された。29年度の研究計画に記載した、CCL3あるいはCCL3産生好塩基球を標的とした際の治療・発症予防効果の検討を予定通り遂行し、CMLに対する効果的な発症予防効果を実験的に立証したため、順調な進捗状況であると考えられる。その一方で、CML発症後において、CCL3活性阻害薬マラビロクの投与による治療効果は認められなかった。そのため、既存の治療法との併用療法の可能性を検討する必要があり、今後の新たな課題、さらには研究指針も明確になった。したがって、当初の予定以上に医学臨床への応用を視野に入れた基礎研究が遂行できていると評価している。昨年度までの研究成果として、慢性骨髄性白血病(CML)の発症初期過程において、CML白血病幹細胞から分化誘導する好塩基球様の白血病細胞が、骨髄内で増殖するとともに炎症性ケモカインCCL3を恒常的に産生し、正常造血幹・前駆細胞の増殖を選択的に抑制することでCML病態の増悪・進展に寄与していることを明らかにした。さらに、この分子・細胞機序を標的とした治療法の確立として、CML発症初期過程における好塩基球様の白血病細胞の選択的除去、もしくはCCL3の阻害剤マラビロクを経口投与することで、CMLの発症を効果的に予防できることを明らかにした。しかしながら、CML発症後における治療効果は限定的であった。最終年度は、これまでの研究成果を踏まえ、一般的な白血病の根治を目的とした治療法である、骨髄移植療法との併用の検討に着手した。骨髄移植治療の前処置として、異なる線量でX線を照射し、正常ドナーマウス由来の骨髄細胞を移植し、最適な治療条件の検討を行った結果、予想外にも長期的に生存したマウスにおいて、正常ドナーから新たに白血病が発症していることを見出した。本研究課題を遂行することで、CMLの病態生理に関わる新たな分子・細胞機序を明らかにしたため、十分な成果が得られたと考えられる。ただし、最終年度に見出した骨髄移植治療後の正常ドナー細胞の白血病化については、臨床的にもドナー細胞由来白血病として問題視されている。また、本研究課題で最終目標としている、白血病細胞と正常造血細胞との競合的相互作用を標的とした新たな治療法の確立において、正常ドナー骨髄細胞の白血病化の原因解明とその克服は急務であり、継続すべき研究課題として現在解析中である。28年度の研究から、好塩基球が骨髄内で恒常的に産生しているCCL3が、正常な造血幹・前駆細胞に対して特異的に増殖抑制作用を示すことを明らかにするとともに、CML発症初期過程における白血病細胞と正常造血システム間でのCCL3を介した拮抗的相互作用が、病態生理学的に重要な役割を担っている可能性が強く示唆する結果が得られた。したがって、今後の方針としては、申請書の29年度以降の研究計画に記載した通り、X線非照射マウスCMLモデルを用いて、CCL3、CCL3産生好塩基球を分子・細胞標的とした治療・発症予防効果の検討を行う。本研究計画を遂行するうえで必要な、CCL3遺伝子、CCL3レセプター遺伝子欠損マウスは、所属研究所動物実験施設で飼育維持している。さらに、好塩基球を特異的に除去することが可能な遺伝子改変マウス、CCL3阻害活性を示す低分子阻害剤マラビロクも、すでに入手済みである。
メカニカル・アロイ酸化物分散強化型超合金の高温破壊に関する研究

1.メカニカル・アロイイングによりイットリアを分散して強化したニッケル基超合金Inconel MA754長軸結晶材(二次再結晶により結晶粒を一方向へ伸張させた材料)の高温クリ-プ疲労き裂伝ぱ試験(大気中、900°Cおよび1000°C)を行った。試験片表面においてき裂先端が伝ぱ方向と垂直の粒界に近づくと、伝ぱ速度は著しく減速されて一時的な停留が観測された。すなわち、応力軸方向に伸張された結晶粒界がき裂伝ぱの障害として働いている事が明らかになった。しかし、板厚5mmの試験片でき裂前縁が約10結晶粒(約5mm)にわたると、局所的には結晶粒界によってき裂伝ぱは減速されるものの、全体としては停留等のない滑らかなき裂伝ぱ曲線が得られた。これは、き裂前縁での結晶粒界の効果が平均化された結果である。また、き裂伝ぱ速度は、き裂先端近傍のクリ-プひずみ速度場を代表する巨視破壊力学パラメ-タであるクリ-プJ積分と良い対応関係を示した。2.二次再結晶を施していないInconel MA754等軸結晶と酸化物を分散していない母材の組成に近いニッケル基超合金Nimonic75のクリ-プ疲労き裂伝ぱ試験(大気中、前者は800°C、後者は900°C)を行った。き裂はほぼ滑らかに伝ぱし、その伝ぱ速度はクリ-プJ積分と良い対応関係を示した。また、同関係は長軸結晶材のそれと一致し、三者のき裂伝ぱ抵抗に大きな相違がないことが明らかになった。ただし、負荷応力と温度条件は大きく異なり、高温では長軸結晶材の優位が明らかであった。3.材料微視組織の影響を受けて不規則な挙動を示すクリ-プ疲労微小き裂の発生・成長を確率変数を用いてモデル化した。同モデルに基づいて三次元クリ-プ疲労き裂発生・成長の計算機シミュレ-ションプログラムを開発した。本シミュレ-ション結果は、試験観察によって得られた微小き裂の発生・成長確率の結果と良い一致を示した。1.トランジスターインバータ式高周波発生装置(富士電波工機(株)製、10kW)を購入し、従来から使用している電気油圧サーボ疲労試験機に組み込んで、メカニカル・アロイODS材インコネルMA754の加熱に供することができるようになった。2.MA754については、中央き裂平板試験片を用いて温度1200°Cの高温クリープ疲労き裂伝ぱ試験を実施中であり、等軸結晶材(zone annealせず)との伝ぱ挙動の相違、長軸結晶材における応力軸方向粒界によるき裂伝ぱの阻止効果を観測している。3.一般に、き裂伝ぱに対してはき裂長さa.き裂先端非弾性(塑性およびクリープ)変形域寸法ω、および微視組織寸法(主として結晶粒径)Mの3つの量の組合せによってその材料学的、力学的性質が異なる。MA754のような粗大結晶、高強度材料では、a/M>5の巨視き裂については力学的に大きい(LEFMが適用できる)き裂か小さい(non-LEFM)き裂かの判明がまず重要である。

さらに重要なことは、a/M<5の微小き裂について、低応力下で力学的に大きいき裂として取りあつかえる領域が存在するか否か。高応力下では力学的に小さいき裂がどのような伝ぱ挙動を示すか、を明らかにすることである。4.2 1/4Crー1Mo鋼、18Crー8Ni鋼(SUS304)、Tiー5Alー2Snー2Zrー4Moー4Cr(Tiー17)の巨視および微小き裂の伝ぱ試験を行い、クリープ疲労条件下ではいずれも力学的に小さいき裂の挙動が支配的であって、巨視き裂についてはクリープJ積分による破壊力学的評価ができ、微小き裂については計算機援用モンテカルロシミュレーションによる確率論的評価あるいはクリープ疲労損傷モデルによる確率損傷力学的評価が有効であろうという結果を得た。1.メカニカル・アロイイングによりイットリアを分散して強化したニッケル基超合金Inconel MA754長軸結晶材(二次再結晶により結晶粒を一方向へ伸張させた材料)の高温クリ-プ疲労き裂伝ぱ試験(大気中900°Cおよび1000°C)を行った。試験片表面においてき裂先端が伝ぱ方向と垂直の粒界に近づくと、伝ぱ速度は著しく減速されて一時的な停留が観測された。すなわち、応力軸方向に伸張された結晶粒界がき裂伝ぱの障害として働いている事が明らかになった。しかし、板厚5mmの試験片でき裂前縁が約10結晶粒(約5mm)にわたると、局所的には結晶粒界によってき裂伝ぱは減速されるものの、全体としては停留等のない滑らかなき裂伝ぱ曲線が得られた。これは、き裂前縁での結晶粒界の効果が平均化された結果である。また、き裂伝ぱ速度は、き裂伝ぱ、先端近傍のクリ-プひずみ速度場を代表する巨視破壊力学パラメ-タであるクリ-プJ積分と良い対応関係を示した。2.二次再結晶を施していないInconel MA754等軸結晶と酸化物を分散していない母材の組成に近いニッケル基超合金Nimonic75のクリ-プ疲労き裂伝ぱ試験(大気中,前者は800°C,後者は900°C)を行った。き裂はほぼ滑らかに伝ぱし、その伝ぱ速度はクリ-プJ積分と良い対応関係を示した。また、同関係は長軸結晶材のそれと一致し、三者のき裂伝ぱ抵抗に大きな相違がないことが明らかになった。ただし、負荷応力と温度条件は大きく異なり、高温では長軸結晶材の優位が明かであった。3.材料微視組織の影響を受けて不規則な挙動を示すクリ-プ疲労微小き裂の発生・成長を確率変数を用いてモデル化した。同モデルに基づいて三次元クリ-プ疲労き裂発生・成長の計算機シミュレ-ションプログラムを開発した。本シミュレ-ション結果は、試験観察によって得られた微小き裂の発生・成長確率の結果と良い一致を示した。
精子品質管理による不妊治療の安全性向上-精子頭部空胞と DNA 損傷の関連性解析

新たに単一細胞DNA断片化を高感度に可視化するsingle cell pulse fieldgelelectrophoresis (SCPFGE)法を開発した。本法により、DNA断片化の初期段階を定量的に解析することが可能となった。SCPFGEを用いて空胞陽性率が高い検体と低い検体のDNA切断率を測定したが、相関は見られなかった。培養環境におけるDNA保護を検討した結果、高酸素環境下における培養ではDNA損傷率が上昇することを認めた。本年度は、固相上に固定した精子を融解した後に電気泳動を行い、分離されたDNA断片を直接顕微鏡観察する方法を開発することを目的とした。スライドグラス上に固定した精子を溶融アガロースで被覆、固化した。さらにトリプシン、DTT、ヘキサ6リン酸、ポリリン酸、トライトンX100を含む溶液に浸漬して細胞を融解した。予備的検討の結果、検出されるDNA断片の鎖長が広範囲に分布するため、単一の泳動条件では断片の網羅的解析が困難であることが確認された。そこで断片の鎖長別に2種の泳動法を開発した。すなわち、1セットの電極を有する単軸型電気泳動法、交差する2セットの電極を有するsingle cell pulse field gel electrophoresis(SCPFGE)を開発した。融解処理された精子はゲル内であたかもウニの刺状に周囲にDNA fiberが突きだした状態を示すものと、電圧を印加(電気泳動)しないにも関わらず周囲にDNA断片が拡散した像を示すものに大別された。電気泳動することなく周囲に拡散したDNA断片は、アガロースの網目構造を自由に通り抜けて拡散可能なレベルの短鎖DNAであり、高倍率で検鏡しても粒子としては観察できなかった。これらをSCPFGEで電気泳動すると、前者は原点からDNA fiberが伸張する像を示したが、後者では種々の長さのDNA断片が泳動される像を示した。SCPFGEにより引き出されたDNA fiberの先端を高倍率で顕微鏡観察すると、伸張したDNA fiberの先端より先に切断された長鎖DNA断片が観察されるものが存在した。長鎖DNA断片に関しては、電気泳動法によるDNA断片の分離(引抜き)は断片数の観察が可能であり、理論上は1本のDNA断片が観察可能である。1.単一細胞DNAの2重鎖切断測定に際し、従来汎用されてきたComet法、DNA断片ゲル内拡散試験(dispersion test)には実験条件の誤りがあり、さらに測定感度が低いことを明らかにし、投稿中(受理)である。核内でDNAを固定しているプロタミン、nuclear matrixの両者を酵素分解しないと偽陰性を生じる、非運動精子のほとんどはDNA切断陽性を示し、運動精子を選択的に分画して検査対象としないと、偽陽性を生じる。実験条件整備により、single cell pulse field gelelectrophoresis(SCPFGE)の高感度化に成功した。これまで精子DNA損傷と受精障害、流産、先天異常との関連解析は上述したComet法、dispersion testにより検討されてきたが、両者ともDNA断片化が高度に進行した細胞を検出していた。臨床的には断片化の初期段階を観察する必要があり、再検討が求められる。2.精子頭部空胞染色法は既に確立している。単一精子において、空胞を観察、記録した後、SCPFGEを施行し、空胞とDNA断片化の関連解析を行った。例数が少なく結論は出せないが、少なくとも一部の頭部空胞が確認された精子では断片化が認められ、両者に因果関係がある可能性が示唆された。さらに検討を続ける予定である。3。SCPFGE後の泳動像におけるDNA fiber先端がテロメアを有する正常端であるか、切断端であるかを検討した。まずFISHによる検出の基礎検討を行った。検出に際しては立体障害によるプローブの結合阻止を防ぐことが、定量性確保の最重要点であることが明らかとなった。さらにFISHにおける加熱がDNA fiber切断を人為的に誘発することが明らかとなり、条件検討を行なっている。単一細胞DNAの2重鎖切断測定に際し、従来汎用されてきたComet法、DNA断片ゲル内拡散試験(dispersion test)は実験条件に誤りがあるため測定感度が低いことを明らかにした。新たにDNA2重鎖切断の初期段階を定量的に検出し得るsingle cell pulse fieldgelelectrophoresis (SCPFGE)を報告した。核内でDNAを固定しているプロタミン、nuclear matrixの両者を酵素分解しないと偽陰性を生じる。非運動精子のほとんどはDNA切断陽性を示し、運動精子を選択的に分画して検査対象としないと、偽陽性を生じることが明らかとなった。Comet法はDNA鎖の片側開裂の検出にアルカリComet法を用いている。項目1で示した核内DNA固定タンパク質の酵素分解の有無で泳動挙動が全く異なり、Comet法で用いるアルカリ条件ではアーティファクトによる偽陽性が生じることを明らかにした。dispersion testは電圧を印加することなく、アガロース網目構造内を微小なDNA断片が拡散する現象を観察する。

このように高度に断片化が進行した精子はほとんどが非運動精子であり、感度設定に誤りがあることを明らかにした。これまで不妊治療において精子DNA損傷と受精障害、流産、先天異常との関連解析は上述したComet法、dispersion testにより検討されてきたが、両者ともDNA断片化が高度に進行した細胞を検出しているために臨床的意義が低く、SCPFGEを用いた高感度分析により全ての項目を再検討する必要がある。SCPFGEを用いた高感度分析により、培養環境の酸素濃度を厳密に管理することが細胞内DNA保護に重要であることを報告した。単一細胞DNAの2重鎖切断測定に際し、すでに標準法とされているComet法、dispersion testの問題点を明らかにし、問題点を改良した新規測定法を確立できた。本法は単一細胞のDNA切断の初期段階を再現性よく観察できた。本法は放射線、化合物等のDNA毒性検出の基盤技術であり、普及を図りたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。精子頭部空胞出現率、精子DNA断片化陽性比率は個体差が大きいことが明らかとなった。染色体(DNA)を収納する精子頭部における異常構造がDNA損傷、ひいては流産、先天異常とどのような関連性を有するかは、不妊治療の安全性確保の根幹であり、次年度はこの点を重点的に検討する。
ニュ-ロン及びグリアに局在する機能蛋白の遺伝子発現調節蛋白の分離と超微量分析

ニュ-ロンおよびグリアに局在する機能蛋白として、今年度はS100蛋白に焦点をしぼって研究を行なった。Ca結合蛋白として知られているS100蛋白は神経系において神経突起伸張作用の活性がある。このS100蛋白の神経系に於ける遺伝子発現を調節している超微量蛋白を分析するために、遺伝子をクロ-ニングし構造を解析した。S100蛋白遺伝子は全長6kbpで3コのエクソンから構成され第一エクソンは5'非翻訳領域のみからなっていた。βガラクトシダ-ゼをレポ-タ-遺伝子として用い、第一エクソンの一部と種々の長さの5'上流領域を結合したキメラ遺伝子を細胞に導入して、細胞特異的発現を観察した。その結果、S100蛋白産生培養細胞であるCa細胞では遺伝子発現に必要と思えるプロモ-タ-領域は転写開始点の上流-19625であった。この基本的なプロモ-タ-を含む5'上流と特異的に結合する蛋白が脳核抽出液中に存在するかを解析した。ゲル・シフト法によると、ラット脳核抽出液中にS100蛋白遺伝子の5'上流領域-131-25と特異的に結合する超微量に存在する蛋白因子を見出した。肝臓核及びHeLa細胞抽出液中にはこの因子は存在しなかった。次に、核蛋白をSDSーPAGEしニトロセルロ-スフィルタ-に移し上記の5'上流領域と特異的に結合する蛋白の同定を試みた。それによると、分子量6万で恐らく一種類の蛋白が直接結合に関与していると言う成績を得た。フットプリンティング法による分析から脳核蛋白との結合に必要と思える塩基を推定することができた。現在、このDNA結合蛋白が神経系に於けるS100蛋白遺伝子の組織特異的発現調節にどのように関連するかを検討している。
増殖シグナルの特異性と画像化によるがんの悪性度診断の研究

2)悪性脳腫瘍に対する高LET治療である中性子捕捉療法を行った一症例において10ケ月後脳浮腫を呈したために治療後の評価として^<18>F-FDGによるglucose代謝と^<11>C-DAGによる増殖シグナルの測定を行った。^<18>F-FDGでは陰性画像のために晩期反応によるradiation injuryと考えた。一方、同時に行った^<11>C-DAGによる増殖シグナルでは陽性画像を呈した。その後、患者の経過を追ったところ腫瘍のaccelerated repopulationと思われる急激な腫瘍体積の増加、浸潤を認めるに至り再発と診断した。以上、本研究によってポジトロンCTにより腫瘍組織の増殖シグナルに関連する画像を捉えることが可能になった。これは生体での腫瘍シグナル伝達活性をとらえた初めての成果である。
同期発電機内部磁束の状態と発電機定数並びに電力系統の安定性に関する基礎研究

同期発電機の内部磁束と発電機定数の観点から研究を行ない、次の成果を得た。1)さぐりコイルを埋め込んだ実験用小型同発電機を用いて、不平衡運転を行ない、内部磁束を測定した。次に、不平衡運転時の内部磁束を表現するモデルを、発電機の巻線構造と鉄心構造から作成し、実験と比較した。この結果、従来知られていなかった零相回路と逆相回路の相互作用を明らかにした。すなわち、発電機に突極性があり、かつ、電機子巻線が磁束密度分布の空間3倍波を生成する構造となっている場合、対称座標法の零相成分と逆相成分が独立とならないことが、実験・モデルの両面すら確かめられた。2)有限要素法を用いて、電機子歯部の磁束解析を行った。実験用発電機の電機子歯頭図に設けられている。さぐりコイルで観測される磁束は従来、空げき磁束のみであると考えられていた。しかし、有限要素法で解析した結果、さぐりコイルで観測される磁束は、電機子反作用の約一割の電機子もれ磁束を含むことが判明した。この結果をふまえて、1)で作成した不平衡時に対するモデルや、先に作成した平衡時に対するモデルを修正する予定である。3)発電機定数の一つである零相リアクタンスの物理的意味を明らかにするため、電機子巻線に零相電流を流した発電機内部で磁束が生じる過程を解明した。すなわち、電機子巻線によって磁束分布の空間高調波成分と電機子もれ磁束が生じる。空間高調波磁束は、回転子内部にうず電流を引き起こす。このうず電流から生成される磁束と、電機子巻線から磁束が総合して、零相電流による磁束となることを、実験とモデルの両面から明らかにした。
高血糖は歯周病菌由来lipopolysaccarideの動脈硬化作用を増強するか

脳梗塞,心筋梗塞などの心血管疾患の原因は動脈硬化であるが,その引き金として内皮細胞傷害が最も重要である.内皮細胞傷害の一つに単球走化性因子(monocyte chemoattract protein-1:MCP-1)の発現増強がある.MCP-1の発現が増強するとmonocyteの内膜下への集簇が促進される結果,動脈硬化が進展する.歯周病菌Porphyromonas gingivalis由来lipopolysaccaride(LPS)はMCP-1を発現させることが報告されている.また、糖尿病による高血糖もMCP-1の発現を増加するため,動脈硬化が促進することが知られている.しかしながら,高血糖がLPSによるMCP-1発現に影響するのかは検討されていない.そこで,臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いて,高濃度のglucose下でLPSを投与し,通常glucose濃度下で投与した場合と比べMCP-1の発現が増強するのか検討した.glucose濃度99mg/dL下で6時間の培養ではLPS濃度依存性にMCP-1 mRNAの発現が上昇した.12時間,48時間の培養時間でもLPS 10μg/mLでLPS未投与に比し有意に上昇した.180mg/dL,360mg/dLの高濃度glucoseで6時間から72時間まで培養したが,glucose濃度99mg/dLと比しMCP-1 mRNAの発現上昇はみられなかった.glucose濃度99mg/dL下でLPS 0.1μg/mLを投与し,12時間培養したところLPS未投与に比しMCP-1 mRNA発現の上昇はみられなかったが,glucose濃度を180,360mg/dLに増加するとMCP-1 mRNA発現はglucoseの濃度依存性に上昇した.このことから高濃度のglucoseはLPSのHUVECに対する作用を増強させていると考えられた.脳梗塞、心筋梗塞などの心血管疾患は動脈硬化が原因であるが、血管内皮細胞が産生する単球走化性因子(monocyte chemoattract protein-1: MCP-1)は単球の内膜下への集簇を促進するため動脈硬化が進展する。歯周病菌Porphyromonas gingivalis由来lipopolysaccaride(LPS)や糖尿病による高血糖がMCP-1の発現を増加するが、高血糖がLPSによるMCP-1発現に影響するのかは検討されていない。そこで、臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いて、高濃度のglucose下でLPSを投与し、通常glucose濃度下で投与した場合と比べMCP-1の発現が増強するのか検討した。HUVECのMCP-1 mRNAの発現は、2時間培養では通常の培養液中glucose濃度99mg/dLより180あるいは360mg/dLの高濃度glucoseで増加した。LPSを0.1、1.0、10μg/mLで投与し、2時間培養したところ、10μg/mLでLPS未投与よりMCP-1 mRNAの発現が増加した。LPS 0.1μg/mLで2時間培養時に培養液中glucose濃度を99mg/dLから180mg/dLあるいは360mg/dLに上げると360mg/dLの高濃度でglucose濃度99mg/dLよりMCP-1 mRNAの発現が増強した。LPSを0.1μg/mLとし、培養液中glucose濃度を99、180、360mg/dLに変え、2、6、12、24時間培養後の培養液中のMCP-1蛋白濃度を測定した。高濃度glucose 180mg/dLあるいは360mg/dLは6、12、24時間培養でLPS 0.1μg/mLによるMCP-1蛋白の産生をglucose濃度99mg/dLより増強した。このことから高濃度glucoseはLPSによるHUVECのMCP-1蛋白産生も増強させていると考えられた。【研究目的】動脈硬化に対する糖尿病と歯周病の相乗効果を検討するため、高濃度glucose下でlipopolysaccaride(LPS)を培養血管内皮細胞HUVECに投与し、動脈硬化促進因子であるmonocyte chemoattract protein-1(MCP-1)の発現を検討した。【平成25、26年度の研究成果】培養液中glucose濃度99mg/dL下でHUVECをLPS 0.1、1.0、10μg/mL、6、12、48時間刺激すると濃度依存性にMCP-1 mRNA発現が増強した。180、360mg/dLの高濃度glucoseは2時間培養でのみglucose濃度99mg/dLに比しMCP-1 mRNA発現が増強した。glucose濃度99mg/dL下でHUVECにLPS 0.1μg/mLを投与し、2、12時間刺激してもLPS未投与に比しMCP-1 mRNA発現の増強はみられないが、glucose濃度を180、360mg/dLに増加するとLPS未投与より濃度依存性にMCP-1 mRNA発現が増強した。MCP-1蛋白の発現に関しても、LPS濃度を0.1μg/mLとしglucose濃度を99、180、360mg/dLに変え、6、12、24時間培養すると、培養液中のMCP-1蛋白はglucose濃度99mg/dLに比し高濃度glucoseで増加した。【平成27年度の研究成果】

抗酸化剤ビタミンCとEを高濃度glucoseとLPSによる6時間刺激の1時間前に添加した。ビタミンC 100μMはglucose濃度360mg/dL下LPS 0.1μg/mLによるMCP-1 mRNAの発現を有意に抑制した。ビタミンE 50μM投与では抑制効果を認めなかった。【本研究成果の意義と重要性】高濃度glucoseによるLPSのMCP-1発現増強は酸化ストレスによる可能性が示唆された。また、糖尿病患者が歯周病に罹患すると高血糖であるほど動脈硬化が進展する可能性が示唆された。LPS濃度は0.1μg/mLとし、培養液中glucose濃度は99、180、360mg/dLの3つの濃度で2時間培養するという実験条件が、高濃度glucoseによるLPSのMCP-1 mRNA発現の増強を明らかにした。またMCP-1蛋白においても培養時間は違うが同様の実験条件で高濃度glucoseによるLPSのMCP-1蛋白の発現増強作用を明らかにできた。糖尿病高濃度glucoseによるLPSのMCP-1発現増強作用の機序の解明を行うとともに、高濃度glucoseによるLPSのMCP-1発現増強作用を抑制する物質の探索を行う。当初よりLPS濃度は0.1,1,10μg/mL,ブドウ糖濃度は99,180,360mg/dLで行う予定であったが,MCP-1 mRNAの発現ピークが不明であったためそれを確認するため培養時間の種類が多くなり、実験回数が予定より大幅に増えてしまった.このため平成25年度はLPSやブドウ糖によるMCP-1蛋白測定まで行う予定であったが,実施できていない.当該年度の終わりに1,006円と少額の残高となり、購入できる物品がないため、平成27年度の交付金と合わせて使用するため平成26年度はLPSやブドウ糖によるMCP-1蛋白測定を行い、MCP-1 mRNA発現と同様に高濃度のglucoseはLPSのHUVECに対する作用を増強させているのか蛋白レベルでの検討を行う.平成27年度の交付金500,000円と合わせて物品費として使用予定