hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
琉球語の言語バラエティに基づくヴォイス体系の記述とその歴史的変異の研究

・琉球語内のヴォイス構造、意味、形式の発展の考察を行った。1年目は現代日本語と首里方言のヴォイス特徴に基づいた統一の調査票を作成し、調査を実施したが、1年目の調査結果や成果をふまえながら調査票を改訂した。具体的には、個別方言の記述を進めていくなかで、調査に漏れが見つかる、あるいは、新しく確認すべき事象や追加しなければならない項目が発生したため、調査票に追加し、与論島、平安座島にて再調査を行った。また、新たに設定した調査地点(伊平屋島)では、方言学習のための教材がなかったため、上記の調査分析と並行して、現地の方と相談・協力しながら、これまでに関わってきた方言教材作成の経験を活かして方言テキストを作成しはじめている。このことによって、地域への研究成果の還元を図っている。さらに、研究データとして利用可能な談話資料(民話や語り、話者同士の会話)が存在する場合は収集した。調査で得たデータをもとに、方言個別の分析・記述を行いながら、それぞれのヴォイス体系をまとめた。類型論的あるいは琉球語内での対照において重要となる点や言語理論への貢献が見込まれる点については、適宜、研究会・学会等で報告し、その方言や分野を専門とする研究者と議論することでフィードバックを得た。特に受入研究者とは定期的に勉強会等を行い、申請者の分析や記述を検討していただいた。今年度は、特にヴォイスの受影性に関する分析を深化させた。与論島では、受動動詞の接辞-aariに、文法化の帰結として受動化以外の機能が備わっていることがわかった。具体的には、-aariが別の動詞接辞-tiと共起し、通常の受動化に伴う文法交替を行わずに受影的意味を付加するのである。同構文を<受影構文>と呼び、その統語・意味的性質を明らかにし、機関誌へ投稿し、受理されている。個別方言の言語現象をふまえた追加調査票の作成と調査:1年目の成果をふまえながら、調査票を改訂する。個別方言の記述を進めていくなかで、調査に漏れが見つかったり、わからないところが生じたりすることが考えられるため、確認すべき事象や追加しなければならない項目を調査票に追加し、再調査を行う。例えば、新しい文法事象を発見した場合は、その現象について調査分析を進めた上で、他の方言でもその文法事象に関する調査を実施する。方言相互の比較と考察と報告:各方言を見渡しながら、方言相互の類似点・相違点をふまえることによって、方言個別のより細かい記述に努める。また、比較対照をすることによって、琉球語内におけるヴォイスの構造や意味、形式の発展の過程、そして、言語差をひきおこした要因について、その歴史的経緯を日本語も含めて考察する。ここでも研究成果は研究会や学会等で随時発表し、記述の精度を高める。学会発表での議論をふまえて、トピックを絞って国内外の学術雑誌に投稿する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
大規模時系列ネットワークデータに対する3次元情報可視化および探索技術の研究

本研究では、大規模時系列ネットワークに対する汎用的3次元可視化基盤技術を実現し、同時に、可読性向上技術、およびインタラクティブな情報探索技術を確立した。3次元空間を利用することにより、時系列変化(ネットワーク構造変化+値変化+情報の流れ)を大規模ネットワーク上に同時に可視化可能にする点を大きな特色とする。本研究では、大規模時系列ネットワークに対する汎用的3次元可視化基盤技術を実現し、同時に、可読性向上技術、グラフレイアウト高速化技術、およびインタラクティブな情報探索技術を確立することを目的とする。研究期間全体を通じて、以下のように研究を進めた。(1)可読性の高い大規模時系列ネットワーク表示技術の確立:複雑で巨大なネットワークに対して時間軸を考慮しつつ可読性を高める手法を確立した。(2)時系列情報量変化およびフロー可視化基盤技術の拡張:時系列情報量変化の可視化基礎技術の拡張を行った。主に時間軸方向のノードの属性値および、エッジの属性値変化の可視化手法の開発を行った。(3)探索インタフェース基盤技術の確立:(1)(2)で確立した可視化手法の上でのインクリメンタルな情報探索、ブラッシング・アンド・リンキング操作などの複数可視化結果の連携機能等の技術を確立した。(4)高速レイアウト技術の確立:GPGPUを用いた並列計算技術等を応用した高速グラフレイアウト計算技術に関する有効な計算手法の検討を行った。(5)課題(1)(2)(3)および(4)により確立された技術の応用:確立された技術を大規模ウェブ情報のマイニングシステム、小規模時系列情報探索例として歴史史料解析データに対するインタラクティブ時系列探索システムへ具体的に応用し、本手法の有効性を検証した。最終年度には、前年度に引き続き(1)ー(4)の技術検討および実装を行い、(5)においてこれらの技術を具体的に応用し、本手法の有効性を検証した。当該年度では、以下のように研究を進めた。1.可読性の高い大規模時系列ネットワーク表示技術の確立:大量のノードおよびエッジを持つグラフ描画における要素の重なり、表示要素が複雑になることによる可読性の劣化を解決するための技術の確立を行った。具体的には、表示要素の属性値等に基づく描画要素の制御技術の拡張、入れ子表示およびLebel of Detail技術基盤導入の検討を行った。2.時系列情報量変化およびフロー可視化基盤技術の拡張:時系列情報量変化の可視化基礎技術の拡張を行った。3.探索インタフェース基盤技術の確立:課題1および2で確立した可視化手法の上でのインクリメンタルな情報探索、複数可視化結果の連携機能等の時系列ネットワークにおける情報探索のための汎用的基盤技術の開発を行った。4.高速レイアウト技術の確立: GPGPUを用いた並列計算技術等を応用した高速グラフレイアウト計算技術に関する有効な計算手法の検討を行った。1.可読性の高い大規模時系列ネットワーク表示技術の確立に関して、入れ子表示およびLebel of Detail技術基盤導入の検討を行ったが、前半期における電力不足における開発時間の減少の影響により、技術基盤としての確立には至っていない。また、4.高速レイアウト技術の確立に関しては、GPGPUを用いた並列計算技術等を応用した高速グラフレイアウト計算技術に関する有効な計算手法の検討を行ったが、交付決定額確定時期の遅れに伴う開発環境導入の遅れにより、開発に着手できていない。1.可読性の高い大規模時系列ネットワーク表示技術の確立に関して、次年度はエッジ表示に関して、Edge bundlingや代表ノード(Exemplar)のみにエッジを張る技術等を比較検討し、時系列ネットワークにおけるエッジ可読性向上に最適な技術を確立する。3.探索インタフェース基盤技術の確立に関して、次年度は課題5の応用例に用いる解析手法との連携技術を確立する。4.高速レイアウト技術の確立に関して、高速グラフレイアウト計算技術の実装を行う。5.課題1、2、3および4により確立された技術の応用に関して、課題14により確立された技術を大・中規模時系列データ探索例としてウェブ、ブログおよびツイッターデータの時系列探索システム、中・小規模時系列情報探索例として歴史史料解析データに対するインタラクティブ時系列探索システムへと具体的に応用し、本手法の有効性を検証する。物品費に関して、基盤技術開発及び応用システムの実行・評価を行うための、高度3次元グラフィック性能をもつ3次元大規模時系列グラフ可視化結果表示用クライアントPCを購入する。応用システムの実行・評価を行うにあたり専門分野の研究者らと意見交換を行うためにラップトップ型PCとする。旅費に関して、主に、国際会議(Information Visualization (IV)), IEEE Information Visualization Conference (IEEE InfoVis), Pacific Vis, Euro Vis)における成果発表および情報収集に充当する。
三次元半導体デバイス積層システムにおける高信頼性実装材料,構造設計指針の確立

システムLSIの実装を中心として三次元フリップチップ実装構造の採用が加速している.この三次元フリップチップ実装構造において,我々は,チップとバンプ層接続界面近傍に周期残留応力分布が発生し,この周期残留応力の主要構造因子及び応力発現メカニズムを明らかにした.このような残留応力によりトランジスタの特性変化やチップの割れ等が発生し,製品の信頼性を損なう危険性がある.製品の信頼性を確保するためには,三次元実装構造の設計指針を明確にすることは不可欠である.そこで,本研究では三次元フリップチップ実装構造の実用化を目指し,応力・ひずみに関する課題について有限要素法解析・ひずみセンサを用いて検討し,高信頼性実装を実現する三次元フリップチップ実装設計指針を提案した.具体的には,有限要素法解析結果で得られたメモリスタック構造の最表面チップと下段チップ内の周期応力分布の相違を,ゲージ長2μmのひずみゲージを搭載したセンサチップにより実測することにより,有限要素解析の妥当性及び応力発現メカニズムの妥当性を明らかにした.また,応力・ひずみによりNMOSトランジスタの特性が10%/100MPa,MOSコンデンサのゲート絶縁膜に採用されているHfO_2膜の比誘電率が約4%/1%-strain変動することを実証したことから,三次元フリップチップ実装構造内の実装設計指針の確立の必要性を明確にした.以上の結果から,有限要素法解析から得られた主要構造因子を最適化することにより,実装応力を低減する設計指針を提案した.具体例として,チップ厚さ50μmのメモリスタック構造において,Si基板,バンプ径50μm,バンプピッチ100μmに実装構造を最適化することにより積層チップ内の残留応力の平均値と最大振幅をトランジスタの特性変化1%以下である50MPa以下に低減できることを示した.システムLSIの実装を中心として三次元フリップチップ実装構造の採用が加速している.この三次元フリップチップ実装構造において,我々は,チップとバンプ層接続界面近傍に周期残留応力分布が発生し,この周期残留応力の主要構造因子及び応力発現メカニズムを明らかにした.このような残留応力によりトランジスタの特性変化やチップの割れ等が発生し,製品の信頼性を損なう危険性がある.製品の信頼性を確保するためには,三次元実装構造の設計指針を明確にすることは不可欠である.そこで,本研究では三次元フリップチップ実装構造の実用化を目指し,応力・ひずみに関する課題について有限要素法解析・ひずみセンサを用いて検討し,高信頼性実装を実現する三次元フリップチップ実装設計指針を提案した.具体的には,有限要素法解析結果で得られたメモリスタック構造の最表面チップと下段チップ内の周期応力分布の相違を,ゲージ長2μmのひずみゲージを搭載したセンサチップにより実測することにより,有限要素解析の妥当性及び応力発現メカニズムの妥当性を明らかにした.また,応力・ひずみによりNMOSトランジスタの特性が10%/100MPa,MOSコンデンサのゲート絶縁膜に採用されているHfO_2膜の比誘電率が約4%/1%-strain変動することを実証したことから,三次元フリップチップ実装構造内の実装設計指針の確立の必要性を明確にした.以上の結果から,有限要素法解析から得られた主要構造因子を最適化することにより,実装応力を低減する設計指針を提案した.具体例として,チップ厚さ50μmのメモリスタック構造において,Si基板,バンプ径50μm,バンプピッチ100μmに実装構造を最適化することにより積層チップ内の残留応力の平均値と最大振幅をトランジスタの特性変化1%以下である50MPa以下に低減できることを示した.
中世後期日明関係の展開と構造に関する基礎的研究-入明記の史料学的検討を中心

本年度においては、第一に、昨年度に引き続き、入明記諸本の検索を行ない、可能であれば原本調査を行なうとともに、その写真を入手し、伝来を含めた書誌情報の確定に努めた。この作業の結果、入明記の悉皆調査はほぼ完了し、良質な写真の入手あるいは撮影にっいても、修理中・貸出中であったものを除いては完了することができた。第二に、『笑雲瑞訴入明記』(1453年に明に渡った遣明船の記録)について、数種類の写本の伝来を確定し、各写本の字句の異同を全て確認のうえ、翻刻を完成させた。加えて、この翻刻の読み下しを作成し、昨年度・本年度の現地調査の成果をも盛り込んだ詳細な注釈を施した。以上の成果は解題を付し、単行本として出版すべく具体的に準備している(出版社決定済)。また本研究で得られた史料学的な成果については、「『笑雲瑞訴入明記』の書誌的検討」と題し、2008年7月に浙江工商大学日本文化研究所で行なわれる国際シンポジウム「東アジア文化交流-人物往来」で報告予定である。第三に、日明関係に深く関与し、入明記の伝来とも関係の深い大内氏についての基礎的な研究を進め、その成果の一部を公表した。現地調査としては、まず韓国沿海部・島嶼部の日・明・朝関係史跡の踏査を行ない、また中国北京市の中国第一歴史档案舘を訪問して中国の史料保存の実態に触れるとともに、第一歴史档案館が所在する故宮の見学をし、入明記に記載される一つ一つの門・建物を詳細に確認した。これら現地調査の結果は直接的には、『笑雲瑞訴入明記』の注釈という形でまとめられ、間接的には、現在進めているほかの入明記の内容分析に活かされている。本年度においては、第一に入明記諸本の検索を行ない、可能であれば原本調査を行なうとともにその写真を入手し、伝来を含めた書誌情報の確定作業につとめた。この作業の過程で、入明記のみならず、入明記の記主の文集にも多くの日明関係史に関わる情報があり、入明記と同様に近世期に多く筆写されていることに気づき、この種の文集も含めて調査・収集活動を行なった。第二に、上記の作業は、準備や写真の撮影・焼付などに多く時間を有するため、来年度に予定していた作業である、入明記の翻刻ならびに内容に踏み込んだ分析、現地調査なども平行して行なった。15世紀中葉の遣明使の記録である『笑雲入明記』の翻刻は8割方終了し、書誌情報もほぼ確定することができた。翻刻が終了次第、解題とともに公表したいと考えている。現地調査としては、中華人民共和国舟山市・寧波市・杭州市・南京市に赴き、入明記の記述と現地の景観とを対応させるという作業を行ない、文意が揺れたり不明だったりしたところを現地調査の成果から確定していった。なお研究代表者は、日本史出身であり中国での調査や中国語に不案内なため、この現地調査には中国人留学生の協力を仰いだ。この現地調査や入明記の内容分析に不可欠な中国の研究書・史料集・地図などの収集にも意を注いだ。また遣明船は航海中しばしば漂流し、朝鮮沿岸にも辿り着くことがある。したがって韓国史料における遣明船の記事も入明記を理解するうえでは不可欠のものとなる。この点に鑑み、韓国の史料状況の理解も兼ねて韓国の国史編纂委員会を訪問した。
デスフルランはなぜ術後認知機能低下を防ぐのか：高齢者の細胞骨格関連遺伝子の解析

吸入麻酔薬が術後認知機能の原因となりえるか検討した。ヒトにおいてデスフルランはセボフルランと比較して術後認知機能検査所見が改善する傾向が示唆された。ニューロンの細胞骨格を維持するために重要な遺伝子であるMAPT遺伝子、APP遺伝子についてヒトでは認知機能検査所見と関連する遺伝子多型は発見できなかった。マウス海馬ニューロンにおける全mRNA解析を行った結果、幼若マウスにおいてはLhx9遺伝子の発現が最も減弱する一方で、成熟マウスにおいてはLhx9遺伝子の発現は増大する傾向が示唆された。Lhx9遺伝子の発現量は術後認知機能障害のバイオマーカーとなりえる可能性が示唆された。平成25年度の研究経過として、1.80歳以上で術前に明らかな認知症のない予定開腹術を受ける患者を対象に,デスフルランまたはセボフルランで全身麻酔を行い,術前後24時間,術後1週間時点で神経学的テスト(MMSE)を用いてPOCDの評価を行った。結果として術後24時間時点にMMSEの低下が認められる臨床的な因子は検出できなかった。2.患者全血からDNAを抽出し、POCDのリスクとなる原因遺伝子について、細胞のアポトーシスに関与するとされるcasp8遺伝子についてdbNSFPを用いて有害性の高いCDS内のSNPsを検討した結果、rs1045485、rs3769823-SNPsはPOCDと関与する可能性が示唆された。3.マウス脳を用いて、レーザーマイクロダイセクションによるニューロンの単離、mRNA発現量の定量を行う実験系を確立した。平成26年度の研究経過として、臨床課題として術前認知機能障害のない65歳以上で4時間以上の比較的長時間手術が予定された患者を対象として術前、術後1日目の高次脳機能テスト(MMSE)を行ったところ、デスフルランで麻酔を受けた群はセボフルランと比較してMMSEの点数が良好である傾向が指摘された。このことから、吸入麻酔薬ごとに術後高次脳機能に与える影響が異なる可能性が示唆された。その分子生物学的な機序を探索するため、特に記憶に関与するとされる海馬を標的とし、マウス海馬ニューロンにおいて包括的なmRNA発現解析(=トランスクリプトーム解析)を行う実験系を確立した。その結果Rtn4rl2遺伝子の発現が増大し、LIM-homeodomain family遺伝子群の発現が抑制されることを発見した。Rtn4rl2遺伝子はNogo受容体をコードしており、樹状細胞のミエリンの接着に関与するとされているが、吸入麻酔薬は海馬において樹状細胞のミエリンへの接着を誘導している可能性が示唆された。またLIM-homeodomain family遺伝子群は神経幹細胞の分化を誘導する因子として知られるが、これらが抑制されることにより、幼年期における吸入麻酔薬の曝露は神経幹細胞からニューロンへの分化を抑制する可能性が示唆された。今後はこれらの実験結果に基づき、行動学的な解析を加え、さらに吸入麻酔薬と記憶の回路に関する影響についての機序についてより詳細な検討を加える予定である。申請者らは本研究を通じて、臨床課題として術前認知機能障害のない65歳以上の患者を対象とし、比較的長時間手術におけるセボフルランおよびデスフルランの術後認知機能障害の発症についての検討を高次脳機能テスト(MMSE)を行うことで実施した。デスフルランで麻酔を受けた群ではセボフルランで麻酔を受けた群と比較してMMSEスコアが良好である傾向が示された。その分子生物学的な機序を探索するため、マウス海馬ニューロンにおける全mRNAの発現変化を一元的に解析した(トランスクリプトーム解析)。その結果、8週齢のマウスでは吸入麻酔薬曝露はRtn4rl2遺伝子が最も発現が増大しLIM-homeodomain family遺伝子群が最も抑制されることが示された。吸入麻酔薬曝露は神経幹細胞の誘導に影響を与える可能性が示唆された。さらに35週齢以降のマウスについての海馬ニューロンにおける全mRNA解析を追加し、週齢による遺伝子発現の変化を検討した。その結果、35週齢のマウスにおいてLIM-homeodomain familyの一つであるLhx9遺伝子が最も発現が増大傾向を示し、Epyc遺伝子が最も抑制された。週齢の差によってLIM-homeodomain familyの発現が大きく異なることは、これまで基礎的に幼若期の吸入麻酔薬曝露による神経炎症だけが良く研究されていた分野であったことに対し、成熟した脳においても別の機序で術後認知機能障害を引き起こしているのではないかと示唆するものである。ヒトにおいて術後認知機能障害の差異が麻酔薬に起因する可能性を検討できた。脳内の遺伝子発現について検討できた。麻酔科学マウスにおける術後認知機能障害モデルの確立を目指す。ヒトにおいてPOCDのリスクとなる原因遺伝子のin silico analysisは順調に推移しており、マウス脳において検証を行う実験系を確立した。今後はcasp

8遺伝子とPOCDとの関係について、さらに行動学的モデルを作製し、検証を行う。平成26年度はマウスによるPOCD行動モデルを作製し、casp遺伝子群の発現との関係について検証を行うこととする。平成25年度の予算の執行状況はほぼ予定通りであり、残額は34536円と少額である。分子遺伝学実験試薬および実験器具購入資金として充当する予定である。
精巣におけるアクチンと制御分子、微小管、水チャンネルの局在と精子形成への関与

精子細胞の変態過程では著しい形態変化と体積減少が起こる。前者にはアクチンや微小管、後者には水チャンネル(Aquaporin, AQP)の関与が指摘されている。本研究では免疫組織化学、電子顕微鏡、KO-マウス(KO-M)を用いてこれらの精子形成への関与を解析した。(1)AQP7,8,11の精上皮における局在AQP7と11は造精細胞にAQP8はSertoli細胞に局在することが示唆された。従って7と11は補償し合う可能性が高い。ホモ個体半数の円形精子細胞の核にsignet-ring状パターンを示す濃縮異常が認められた。これはAQP7が精子形成過程で核の濃縮(核の内から外への水の移動)に関与することを示唆する。GOPC(ゴルジ装置関連PDZ-コイルドコイルモチーフ含有タンパク質)欠損マウスでは頭部が丸く鞭毛が頭部に巻き付いた異形精子が形成され不妊になる。精子変態初期にacroplaxome(アクチンが主成分で、先体を核膜に接着する)が形成される。-/-では先体胞の核表面への集合や融合不全がみられ、形態異常がドミノ式に誘導された。すなわち先体胞の消失⇒先体の縁に形成されるperinuclear ringの形成異常⇒manchette(微小管の腰蓑状構造物)の形成異常⇒後輪の形成不全や細胞質の核周囲への残存などである。従って精子形成でもアクチンや微小管の形態形成への関与が示唆される。鞭毛は一見正常に形成され、精子が精巣上体頭部に入るまで維持された。しかし、精巣上体頭部を通過中に、鞭毛が頭部に残った細胞質の中に移動して核に巻き付いた。これは+/+精子で細胞質小滴が頸部から末端側に移動する場所と一致するので、鞭毛の巻き込みには細胞質小滴移動機構が関与すると推測される。水チャンネルAquaporin(AQP)は膜内外の浸透圧差に従って水を双方向に移動させ得る。精巣にはAQP7と8の存在が知られている。我々は光顕レベルでAQP7が伸長した精子細胞の細胞質と細胞膜に局在することを報告し、この分子が精子の完成期に起こる急激な体積減少に水の流出路として機能する事を示唆した。(1)電顕レベルでのAQP7のラット精上皮内局在AQP7のC末合成ペプチドを抗原として抗体を作成し免疫組織化学法により、成熟ラットの精上皮におけるAQP7の局在を観察した。その結果、陽性反応は伸長した精子細胞の細胞質と細胞膜に局在することが電顕レベルでも確認された。(自治医科大学・薬理学・石橋賢一との共同研究)(2)光顕レベルでのAQP8のラット精上皮内局在市販のaffinity purifiedAQP8抗体を用いて(1)と同様に光顕レベルの観察を行った。その結果、陽性反応は精上皮内に限定され、セルトリ細胞と密に接している全造精細胞の周辺に認められた。陽性反応の強弱にはステージ特異性が見られ、離出直前の精子細胞の頭部近辺がもっとも濃染した。セルトリ細胞陽性の根拠としては(1)造精細胞を欠く直精細管のセルトリ細胞が陽性である。(2)濃縮精子細胞頭部周辺にセルトリ細胞特異的形状を示す星形濃染部が見られる。これらの事実はAQP8がセルトリ細胞に発現し、精細管内腔液の生産に関与する事を示唆する。

造精細胞に発現している可能性も否定出来ないので、電顕レベルでの観察を続行中である。精子形成の過程にはアクチン線維・微小管・ミオシンなどの細胞骨格群が関与する。GOPC(ゴルジ装置関連PDZ-コイルドコイルモチーフ含有タンパク質)ノックアウトマウス(GOPC-KO-M)は、頭部が丸く尾部が頭部に巻き付いた異形精子を形成し不妊となる。今回GOPC-KO-Mの精子形成と精巣上体内精子成熟の課程を形態的・細胞化学的に解析した。正常マウスではGOPCはパキテン期の精母細胞から伸長期の精子細胞のゴルジ装置に局在していた。KO-Mでは先体胞は形成されるが、途中で消失した。またManchette(微小管の縄暖簾状構造物)と同時に数十本の微小管の束(Ectopic manchette)が形成され、核に侵入して深い窪みを残した。精巣内では尾部は正常に形成され、精巣上体起始部に達した精子の尾部は直線状であった。精巣上体通過に伴って尾部は後輪(頭・尾間の括れ)の欠損部を通過して中片部・主部の順に頭部に入り込み核に巻き付いた。尾部と頭部の結合部はしばしば乖離していた。ミトコンドリア(MT)は一旦MT鞘を形成したが、尾部の巻き込みに伴い、MT相互の接着を保ちつつ粗大線維から遊離して重なり合い、核周辺で重層MT鞘を形成した。その結果、他の中片部ではMT鞘が不足し、粗大線維が露出した。今回GOPC-KO-Mに見られた異常は次の構造物間の接着力不足に起因すると推測される。⇒以後はその結果起こる形態的異常を示す;1)先体内膜と核膜(βアクチンとケラチンを介する)⇒先体の消失。2)後輪部の細胞膜と核膜⇒尾部の核周辺への巻き付き。3)尾部結合部と核膜の陥凹⇒尾部・頭部間結合の乖離。4)MTと粗大線維⇒重層MT鞘の形成と粗大線維の露出。これらの観察結果は、膜と細胞骨格や膜同士の接着の維持に必要な物質の輸送にGOPCが関与する事を示唆する。(1)GOPCノックアウトマウス(GOPC-KO-M)を用いた異形精子形成過程の解析GOPC(ゴルジ装置関連PDZ-コイルドコイルモチーフ含有タンパク質)-KO-Mでは頭部が丸く尾部が頭部に巻き付いた異形精子が形成されて不妊になる。今回精子形成過程にある精子細胞と精巣上体内成熟過程にある精子を形態的に調べ、これらの異常の形成過程を解析した。精子変態の初期にacroplaxome(アクチン線維とケラチン線維を主成分とするシートで先体と核を接着)が形成されるが、-/-では先体胞の核表面への接着や先体胞同士の融合の不全がみられ、その結果と考えられる形態異常がドミノ式に誘導された。すなわち、先体胞の消失⇒先体の縁に形成されるperinuclcear ringの形成異常⇒manchette(微小管の腰蓑状構造物)の形成異常⇒後輪の形成不全や先体の消失による細胞質の核周囲への残存などである。従って精子形成過程にもアクチン線維・微小管等の細胞骨格群が関与すると推察される。他方、軸糸・外側粗大線維・線維鞘・ミトコンドリア鞘・後輪等の尾部の構造は、一見正常に形成され、精子が精巣上体頭部に入るまで維持された。しかし、精巣上体頭部を通過中に精子の尾部が頭部に残存する細胞質の中に移動して核周辺に巻き付いた。
「研究指導能力自己評価尺度－看護系大学院修士論文指導用－」の開発と有効性の検証

看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験を表す概念の創出に向け、修士論文指導に携わっている教員を対象に半構造化面接を行い、収集したデータを質的帰納的に分析した。また、研究開始に先立ち、国内外の先行研究を概観した。その結果、海外では、研究指導に対する大学院生の知覚や、研究指導の重要な側面とそれに影響する要因などが既に解明されていた。また、文献や専門家の意見に基づき、教員の研究指導に対する大学院生による評価尺度も開発されていることを確認した。一方、わが国の修士課程の教育に関する先行研究の多くは、大学院生の理解に資する研究や「授業」に関わる研究であり、「研究指導」に焦点を当てた研究は皆無であり、本研究の独自性と価値を確認した。1.看護系大学院の修士論文指導に携わる教員を対象に半構造化面接の実施研究者らのネットワークを活用し、研究対象者である修士論文指導に携わる看護学教員を探索した。全国の看護系大学院に就業し、修士論文指導に携わっている教員11名に半構造化面接を実施し、修士論文の指導経験を聴取した。11名の面接を終了した時点で、新たな性質を持つ回答が存在しない、すなわち面接内容の飽和化を確認したため、データ収集を終了した。研究対象となった11名の教員の職位や専門領域、修士論文指導経験年数、博士論文指導経験の有無と経験年数、指導した研究などは多様であった。面接時間は平均約60分であった。2.半構造化面接法により収集したデータの質的帰納的分析半構造化面接法により収集したデータを分析フォームを用いてデータ化した。また、データ化と並行してコード化を行った。精度の高いコードの作成に向け、共同研究会議を合計6回開催し、研究者間で繰り返し検討しコードの洗練に努めた。313コードを作成した時点でコードの飽和化を確認した。これら313コードは確実性、信頼性、確証性を確保している。平成30年度は、看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験を表す概念の創出を目標としていた。この目標を達成するため、当初、約20名の看護学教員への面接を計画していた。研究方法論に則り、収集した面接データに持続比較のための問いをかけ、研究指導経験の性質を比較しながらデータ収集と並行して分析を進めた。その結果、11名の面接を終了した時点で面接内容が飽和化していることを確認したため、一旦、面接を終了した。これは、修士論文指導経験の概念化に必要な多様な性質を包含するデータを収集できたことを意味する。続いて、データ収集と並行して、収集したデータに持続比較のための問いをかけコードを作成した。また、精度の高いコードの作成に向け、研究方法論の開発者である研究分担者から繰り返しスーパービジョンを受け、作成したコードを洗練した。さらに、類似したコードが頻繁に出現してくる状況、すなわちコードの飽和化を確認したためコード化を終了した。その結果、修士論文指導経験を表す合計313コードを作成した。これらの過程は、コードの確実性、信頼性、確証性を確保するために必要な手続きであり、作成したコードが確実性、信頼性、確証性を確保していることを確認した。今後、「看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験」を表す概念の創出に向け、作成した313コードをもとにカテゴリ化を行う予定である。以上より、当初の研究計画に沿っておおむね順調に進んでいる。次年度(令和元年)は、看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験を表す概念を基盤に、考察を通して修士論文指導に必要な能力を導く。まず、作成した313コードを用いてカテゴリ化を行う。このカテゴリ化は、研究方法論の開発者である研究分担者からスーパービジョンを受けながら、複数回実施する予定である。この過程を通して、カテゴリの置換性、信頼性、確証性の確保に努める。以上の過程を経て「看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験」を表す概念を創出し、概念の考察を通して、修士論文指導に必要な教員の研究指導能力を導く。これまで、概念の考察を通して能力を導くことに成功した先行研究は存在するが、その方法は成文化されていない。そのため、本研究により概念の考察を通して能力を導くための方法を成文化できれば、研究方法論の進展にも寄与する。このようにして導かれた修士論文指導に必要な能力に基づき、尺度の質問項目を作成し尺度化する。続いて、作成した尺度の内容的妥当性を次のように検討する。複数の看護系大学院に就業し修士論文指導に携わっている教員約5名を構成員とする専門家会議を開催し、作成した質問項目の適切性や回答の容易さ、追加する質問項目の有無などを検討する。その後、専門家会議の結果に基づき修正、洗練した尺度を用いて、便宜的に抽出した教員約50名を対象にパイロットスタディを実施する予定である。パイロットスタディの実施に向け、職位や専門領域、修士論文指導経験年数など、可能な限り多様な背景を持つ教員から協力を得られるよう研究者らのネットワークを駆使して協力者を募る。

また、文献や専門家の意見に基づき、教員の研究指導に対する大学院生による評価尺度も開発されていることを確認した。一方、わが国の修士課程の教育に関する先行研究の多くは、大学院生の理解に資する研究や「授業」に関わる研究であり、「研究指導」に焦点を当てた研究は皆無であり、本研究の独自性と価値を確認した。1.看護系大学院の修士論文指導に携わる教員を対象に半構造化面接の実施研究者らのネットワークを活用し、研究対象者である修士論文指導に携わる看護学教員を探索した。全国の看護系大学院に就業し、修士論文指導に携わっている教員11名に半構造化面接を実施し、修士論文の指導経験を聴取した。11名の面接を終了した時点で、新たな性質を持つ回答が存在しない、すなわち面接内容の飽和化を確認したため、データ収集を終了した。研究対象となった11名の教員の職位や専門領域、修士論文指導経験年数、博士論文指導経験の有無と経験年数、指導した研究などは多様であった。面接時間は平均約60分であった。2.半構造化面接法により収集したデータの質的帰納的分析半構造化面接法により収集したデータを分析フォームを用いてデータ化した。また、データ化と並行してコード化を行った。精度の高いコードの作成に向け、共同研究会議を合計6回開催し、研究者間で繰り返し検討しコードの洗練に努めた。313コードを作成した時点でコードの飽和化を確認した。これら313コードは確実性、信頼性、確証性を確保している。平成30年度は、看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験を表す概念の創出を目標としていた。この目標を達成するため、当初、約20名の看護学教員への面接を計画していた。研究方法論に則り、収集した面接データに持続比較のための問いをかけ、研究指導経験の性質を比較しながらデータ収集と並行して分析を進めた。その結果、11名の面接を終了した時点で面接内容が飽和化していることを確認したため、一旦、面接を終了した。これは、修士論文指導経験の概念化に必要な多様な性質を包含するデータを収集できたことを意味する。続いて、データ収集と並行して、収集したデータに持続比較のための問いをかけコードを作成した。また、精度の高いコードの作成に向け、研究方法論の開発者である研究分担者から繰り返しスーパービジョンを受け、作成したコードを洗練した。さらに、類似したコードが頻繁に出現してくる状況、すなわちコードの飽和化を確認したためコード化を終了した。その結果、修士論文指導経験を表す合計313コードを作成した。これらの過程は、コードの確実性、信頼性、確証性を確保するために必要な手続きであり、作成したコードが確実性、信頼性、確証性を確保していることを確認した。今後、「看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験」を表す概念の創出に向け、作成した313コードをもとにカテゴリ化を行う予定である。以上より、当初の研究計画に沿っておおむね順調に進んでいる。次年度(令和元年)は、看護系大学院の修士論文指導に携わる教員の研究指導経験を表す概念を基盤に、考察を通して修士論文指導に必要な能力を導く。まず、作成した313コードを用いてカテゴリ化を行う。
弱免疫マウスに移植したヒト皮膚による発汗機能解析

(1)本実験課題では、イオント・フォレシスを用いたQSART(定量的軸索反射性発汗テスト)法により、交感神経節後線維末端と汗腺局部におけるニコチン作用及びムスカリン作用に注目してアドレナリン、アセチールコリン、ニコチン、ピロカルピン、VIPの適量をイオント・フォレシスで前腕皮膚浸透させ、局所発汗誘発の有無を発汗カプセル法を用いてアナローグ解析した結果、VIPを除きアドレナリン、アセチルーコリン、ニコチンでは軸索反射性発汗(++)を示した。(2)軽度の身体運動により体温不変、皮膚温軽微上昇の条件下では上記(2)のVIP(-)はVIP(+)となり、皮膚局所で新たなる神経化学伝達物質分泌又は炎症類似反応が生じた事を示す結果となった。(3)交感神経末端からのアセチールコリン分泌は発生学上では胎生期においてLIF(白血病抑制因子)などの分泌による遺伝子転換発現による新しい神経化学伝達物質(タンパク質)が分泌されると推論され、今後の研究を待ちたい。(4)『マウスの腎臓・肝臓等のin vivo NMRマイクロイメージング』を試み、当該分野導入のNMR-MRIを使用して下記の実験を実施した。【結語】高磁場マイクロイメージング法が、マウス腎の生理学的病理学的研究を行うに十分な能力を持つことが明らかとなった。また、そのために、ルーチンに使用できる測定条件の設定を行うことができた。ヒトの汗腺支配神経は交換神経節後線維が汗腺にシナップスしていて、かつその末端からはアセチールコリン等のコリン作動性で謂わば二重神経支配の様相を呈している。1980年Nature誌に発表されたVIP(vasoactiveintestinal peptide)が交換神経線維末端から分泌され汗腺に直接・間接(血管拡張による二次作用)に作用するとの報告結果は発汗メカニズムの研究者に少なからずImpactを与えた事は事実である。発汗学上、今日尚謎とされている汗腺の神経支配(交感神経支配でコリン作動性)につき其の解明を目的として弱免疫マウスに移植したヒトの胸部皮膚による発汗機能解析を実施している。(1)上記弱免疫マウスに移植した皮膚の生着を確認後、移植皮膚にアドレナリン、ピロカルピン(アセチールコリンの代用薬)、アトロピン(アセチールコリン拮抗薬)、VIP(vaso-intestinal polypeptide)を夫々適量、局所注入し、発汗誘発抑制の動向をヨード・デンプン反応のミノール法を用いて顕微鏡下で観察記録した結果ではアドレナリン(+)、ピロカルピン(+++)、アトロピン・ピロカルピン混合(±)、VIP(-)を示し、従来報告されている結果と一部相異が認めれてた。即ちVIPで発汗誘発が認められるNature(1980)の報告と異なる結果を示した。(2)本実験課題では、イオント・フォレシスを用いたQSART(定量的軸索反射性発汗テスト)法により、交感神経節後線維末端と汗腺局部におけるニコチン作用及びムスカリン作用に注目してアドレナリン、アセチールコリン、ニコチン、ピロカルピン、VIPの適量をイオント・フォレシスで前腕皮膚浸透させ、局所発汗誘発の有無を発汗カプセル法を用いてアナローグ解析した結果、VIPを除きアドレナリン、アセチルーコリン、ニコチンでは軸索反射性発汗(++)を示した。(3)軽度の身体運動により体温不変、皮膚温軽微上昇の条件下では上記(2)のVIP(-)はVIP(+)となり、皮膚局所で新たなる神経化学伝達物質分泌又は炎症類似反応が生じた事を示す結果となった。(4)交感神経末端からのアセチールコリン分泌は発生学上では胎生期においてLIF(白血病抑制因子)などの分泌による遺伝子転換発現による新しい神経化学伝達物質(タンパク質)が分泌されると推論され、今後の研究を待ちたい。
ココナッツ油を利用したトラフグ初回成熟の早期誘発

多くの中・大型魚は初回成熟までに長い期間を要し、飼育環境下で雌の成熟が雄より遅れるため、なるべく短期間の飼育で小型の成熟個体を得る技術開発が期待されている。トラフグでは、雄は2年、雌は3年で成熟するが、雌の初回成熟を制御できれば、多くの有用魚種での早期成熟促進技術への応用が考えられる。昨年度までの研究でココナッツ油を未成熟雌トラフグ腹腔内に投与することにより、血中テストステロン(T)上昇を導くことが明らかにした。今年度はさらにT→ジヒドロテストステロン(DHT)変換酵素である5αリダクターゼ(5AR)を阻害するノコギリヤシ抽出物および競合阻害剤(フィナステロイド)投与区を比較することにより、ココナッツオイル効果の確証実験を行った。脳型アロマターゼ(cyp19a1b)はプロモータ領域にエストロゲン受容体応答配列をもち、Tの連続的な配給下では自己増幅し局所的なエストロゲンの合成を行うことが知られている。そこで、下垂体へのTフィードバック活性は、黄体形成ホルモン(LH)細胞に発現するT→E2(エストロゲン)変換酵素であるアロマターゼ(CYP19a1b)のmRNA量を定量PCR法によって検出し評価した。また卵濾胞の発達はパラフィン切片観察と卵径測定により解析した。生殖腺を切除した個体に関しても同様の実験を行った結果、上昇したテストステロンは卵巣由来であることが明らかになった。昨年までの結果と総合すると、未成熟トラフグへのココナッツ油の投与は、哺乳動物で知られるT→DHT阻害効能をもつ薬剤やサプリメント成分と同様の働きをもつと考えられた。またココナッツ油は魚類では卵濾胞の発達に伴うTフィードバックを活性化させ、下垂体CYP19/LH細胞の増殖を誘導することで早期成熟を促進する効果をもつと期待できた。動物の性成熟時には性ステロイドホルモンのフィードバックが引き金となり、生殖腺の急激な発達や性行動を引き起こすことが知られている。しかし実験により過剰な性ホルモン投与により引き起こされた現象がどの程度信頼がおけるものかは明らかでない。本研究では中鎖脂肪酸に富む食用油(ココナッツ油)が下垂体へのTフィードバックの活性化に有効であることを示した。下垂体では局所的なエストロゲン合成が起きることで、ホルモン産生細胞の増殖や機能が調整されることが予想できた。ココナッツ油の投与により1歳魚トラフグ未成熟卵巣で合成されるテストステロンが上昇することが明らかになった。しかし0歳魚では雌雄ともにほとんど効果が見られなかった。これは生殖腺の発達段階での5AR活性の違いと予想された。トラフグから3種類の5AR遺伝子(srd5a1,a2,a3)cDNAのクローニングを行い、その発現パターンを調査した結果、srd5a1,a2は全ての組織で発現していたが、srd5a3は卵黄形成前の未成熟卵巣にのみ顕著な発現が見られた。srd5a1-3は哺乳動物にも保存されているが、srd5a3は5AR活性は持たないことが報告されている。しかし魚類では研究例が乏しく明確な結論が出ていない。そこでトラフグsrd5a3のの5AR活性を詳細に調査する必要が生じた。トラフグsrd5a3が5AR活性持つならば、卵巣内でTの上昇を抑え長期間成熟を抑制する原因遺伝子である可能性がある。2019年度はトラフグへの植物油脂の腹腔内投与実験で得られた結果をin vitroで再現する細胞培養アッセイ系を構築する。トラフグ5AR遺伝子(srd5a1,a2,a3)cDNAを哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1へクローニングし、COS1細胞で発現させ5AR活性の有無を明らかにする。ELISA法により細胞抽出物に含まれる5AR活性(Tを基質としたDHT変換活性)を測定する。またラウリン酸を代表とする中鎖脂肪酸を細胞抽出物混合し5AR活性の阻害効果を確認する。これらの実験によりココナッツ油のどの成分が5ARを阻害するかが明確になる。生体への投与実験の解析には限界があるため、現在多検体でフィードバック効果の解析を行う下垂体スフェロイド培養系を開発中である。開発後、脂肪酸投与個体等の血清を用い均一なスフェロイドを培養することでアロマターゼや他のホルモン遺伝子の発現に有効な植物油の脂肪酸組成を明らかにしていく。最終段階としては、成熟までに費やす期間の長い有用魚種(クロマグロ、チョウザメ等)の早期成熟誘導に効果的な中鎖脂肪酸構成を含む飼料デザインが可能となると期待できる。中・大型養殖対象魚は初回成熟までに数年を要するため(クロマグロ5年、シロチョウザメ10年等)、生産効率を高める早期成熟技術の開発が求められている。初回成熟(精子形成、卵黄形成)の開始年齢は肥満度(脂肪蓄積度)との相関が知られる。トラフグは年1回産卵型の魚種であり、飼育実験環境下では雌雄共に3年目で初回成熟を迎えるが、一部の雄では2年目で成熟する個体も現れる。晩秋から厳冬期にかけて生殖腺は急速に発達し、雌雄共に血中テストステロン(T)濃度の著しい上昇をともない黄体形成ホルモン(LH)の大量合成と放出によって最終成熟(排卵・排精)が起こる。

トラフグ下垂体ではT→エストロゲン(E2)への変換を行うチトクロームP450酵素である脳型アロマターゼ(CYP19a1b)がLH細胞に高い活性で存在し、これら2つの蛋白質の共役が成熟に重要と予想されたので、下垂体へのTフィードバック回路の活性化機構を調査した。Tは脂質代謝(エネルギー産生)と密接に関係し、ヒトではTの低下は内臓脂肪肥満症の原因としても知られる。しかし魚類では生殖腺以外のT産生組織やその代謝調節機構に関して不明な点が多い。中鎖脂肪酸(炭素を結ぶ鎖の数が6-12個の飽和脂肪酸)はココナッツ油に代表される植物性油脂に多く含まれエネルギー効率が良くTの増加を促す作用があり、魚類でもT代謝経路の調節に利用できると考えた。本年度はココナッツオイルを代表とする植物性脂肪酸およびサプリメントとして市販されている中鎖脂肪酸油を未成熟トラフグ(♀)腹腔内へ投与後、Tフィードバック回路への影響を検証した。また生殖腺切除個体を準備し同様に解析した結果、性別、年齢や個体差はあるものの、ラウリン酸の含量が多いココナッツ油およびパーム核油で血中T濃度の増加する個体が出現し、それにともない下垂体でのアロマターゼ・LH細胞の発現領域の増加が確認できた。I:未成熟期(♀20ヵ月齢)トラフグに植物性油脂を腹腔内へ投与し2ヵ月間飼育した。(鉱物油)ミネラルオイル、(植物油)ヒマワリ油、パーム油、パーム核油、ココナッツ油、および無処理の計6区(N=3)でTフィードバック回路の活性化を検証したココナッツ油およびパーム核油でT濃度の上昇を確認したが、現在までに卵黄蓄積は起らず早期成熟誘導までには至っていない。中鎖脂肪酸含量の多い植物油は過剰に生体投与した場合、ホルモンバランスを崩す内分泌攪乱作用を持つことが示唆された。この結果は、魚類の生体内では中鎖脂肪酸がホルモン合成のメッセンジャーとしての役割を担っていることを示唆している。現在0歳魚(雌雄)からのココナッツ油およびMCTオイル投与群を継続して飼育しており1歳魚での早期成熟促進効果について解析を行っている。II生殖腺切除個体(未成熟期♂/♀20-23ヵ月齢、10-12ヵ月齢)を準備後、ココナッツ油を投与しTフィードバック機構に関する生殖腺の役割について解析した。各個体でELISA法による血清T濃度の測定とISHとIHCを併用した組織化学法を用いて、各種下垂体ホルモン遺伝子(gh, cga, tsh-b, fsh-b, lh-b, cyp19a1b)のmRNA分布、共焦点顕微鏡を用いた蛍光強度測定による蛋白質(CYP19, LH)の発現量の解析を行い、Tフィードバック回路の活性化を評価した結果、同年齢・同重量の個体でも雌雄でその反応が異なることが明らかになった。20-23ヶ月齢の卵巣切除個体ではココナッツ油の投与はTの上昇およびLHの合成はなかったが、精巣切除個体ではTの上昇およびLHの合成が確認できた。以上の結果よりココナッツ油による精巣以外の組織でTの合成誘導が示された。一方雌では卵巣がT合成の主要組織であり、成熟開始に重要な役割を担っていると考えられた。多くの中・大型魚は初回成熟までに長い期間を要し、飼育環境下で雌の成熟が雄より遅れるため、なるべく短期間の飼育で小型の成熟個体を得る技術開発が期待されている。トラフグでは、雄は2年、雌は3年で成熟するが、雌の初回成熟を制御できれば、多くの有用魚種での早期成熟促進技術への応用が考えられる。昨年度までの研究でココナッツ油を未成熟雌トラフグ腹腔内に投与することにより、血中テストステロン(T)上昇を導くことが明らかにした。今年度はさらにT→ジヒドロテストステロン(DHT)変換
ＤＮＡメチル化によるＴ細胞系列への運命制御機構の解明

細胞の分化・系列決定過程における系列状態の維持にはクロマチンの修飾やDNAのメチル化などのエピジェネティック制御機構が深く関与している。しかしその詳細は明らかでない。本研究により、DNAのメチル化に重要な働きをするNp95がT細胞分化に必須であることを我々は見いだした。Np95のT細胞分化における機能を調べるために、T細胞特異的Np95欠損マウスを作成し解析したところ、T前駆細胞段階で分化が顕著に阻害されていた。このT前駆細胞では本来発現するはずのない遺伝子の発現が誘導されていた。このことから、DNAメチル化はT細胞分化過程において特にT前駆細胞の運命維持に重要であることが示唆された。我々は最近、DNAのメチル化に重要な働きをするNp95がT細胞分化に必須であることを見いだした。そこで本研究では、Np95のT細胞分化における役割を解析することによって、T細胞系列への運命決定・維持にNp95を含めたDNAメチル化修飾がどのように関わっているのかを明らかにすることを目的とする。本年度は研究計画に基づき、Np95欠損マウスのT細胞分化の解析、およびNp95標的遺伝子のスクリーニングを行った。胸腺細胞各分画におけるNp95のmRNAの発現パターンを調べたところ、CD4-CD8-(DN)→CD4+CD8+(DP)→CD4+CD8-(CD4SPIあるいはCD4-CD8+(CD8SP}と分化が進むにつれて発現が減少することが明らかとなった。DNの中でも特にDN3とDN4でNp95の発現が高いことから、T細胞系列への決定およびその運命維持に重要な働きをしていることが示唆された。そこで、Np95のT細胞分化における標的遺伝子を調べるために、LckCre-Np95fl/flマウスおよびコントロールのNp95fI/fIマウス胸腺からDN3細胞をソーティングし、RNA-seqを行った。その結果.Gfi1b,IRF7,IRF9などの発現が有意に上昇していた。DNAメチル化の減少によって異所性にこれらの遺伝子発現が誘導されることにより、T細胞分化が傷害されると考えられた。さらにDnmt1とNp95のDKOマウスの胸腺細胞を解析したところ、それぞれ単独のKOマウスよりも更に丁細胞分化が停滞していた。このことはDnmt1とNp95が協調して丁細胞分化を促進していることを示唆している。EBF1欠損造血前駆細胞をTSt-4/DLL1ストローマ細胞と共培養し、T細胞へ分化誘導を行った。ここへDnmt1の特異的阻害剤であるRG108を添加した。6日後に細胞を回収しFACSにより表面抗原マーカーを調べたところ、コントロールのDMSOを加えた細胞はDN2への分化が認められた。一方、RG108を加えた細胞もコントロールと同程度にDN2細胞が生成された。細胞数にも影響はなかった。このことは少なくとも多能前駆細胞からDN2へのT系列への決定過程においてDnmt1は必須でないことを示唆している。この分化誘導系でMeDIP-chip解析を行ったところ、どの遺伝子座においてもDNAメチル化はそれほど変化していなかった。Lckcre-Tgマウスを用いてT細胞特異的Dnmt1欠損マウスを作成したところ、DN3からDP段階へのT細胞分化過程に異常が認められた。従って、DNAメチル化はDN2までの運命決定には必須ではないが、それ以降の分化に重要であることが示唆された。本年度は研究計画に従い、Np95のT細胞分化における標的遺伝子の探索、およびT細胞特異的Dnmt1, Np95ダブル欠損(DKO)

マウスの解析を行った。正常なマウスおよびNp95欠損マウス胸腺からT前駆細胞を採取し、RNAの発現をマイクロアレイを用いて網羅的に解析したところ、Dtx1, Irf7およびIrf9の発現が有意に上昇していた。これらの発現上昇は定量的RT-PCRを用いて確認された。また、クロマチン免疫沈降を用いて胸腺T前駆細胞におけるヒストンH3K27me3修飾を調べたところ、Np95欠損マウスではこれらの遺伝子座において優位に減少していた。このことから、Np95はIrf7, Irf9などの発現を抑制することによってT細胞分化を促進していることが示唆された。一方、Dnmt1, Np95 DKOマウスの胸腺を解析すると、細胞数はそれぞれ単独の欠損マウスと比べてさらに細胞数が1/3程度に減少していた。正常な胸腺細胞と比べると約1/20に激減していた。また、T細胞分化はCD4-CD8- (DN)の段階で停滞していた。DN段階をさらに詳しく調べると主にDN3の段階で分化が停止していた。これらの結果からDnmt1とNp95は互いに協調しながらT細胞分化を促進していることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究計画にある、Np95欠損マウス胸腺の解析、および網羅的な遺伝子発現解析(RNA-seq)を予定通り行った。このRNA-seq解析により、Np95の標的遺伝子の候補が明らかとなり、Np95によるT細胞分化制御機構が明らかになりつつある。本年度の研究計画通り、in vitroの培養系やT細胞特異的Dnmt1欠損マウスを用いてT細胞分化におけるDNAメチル化の役割を解析した。この解析により、Np95を含めたDNAメチル化機構がDN3以降のT細胞分化に重要であることが明らかとなった。研究はほぼ実験計画通りに進んでいる。今後は論文にまとめることを念頭に必要な実験を行なっていきたい。昨年度は研究室の共同使用試薬を用いることができたことで予想より試薬類の購入費が少なくなったので、次年度に合わせて使用することにした。次年度の研究費は予定通り、主に物品費や消耗品費として使用する予定である。平成25年度は研究計画に基づき、MeDIP-seqを行い網羅的なDNAメチル化解析を行う予定であったが、予想外の困難に遭遇し、実験のセットアップに時間がかかり、すべての解析を終えることができなかった。MeDIP-seqによる解析とNp95のT細胞分化における標的遺伝子の同定、およびその成果発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費にあてることとしたい。