hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
致死性心血管疾患を予防する食事・栄養素の探索研究

トリプトファンの代謝物を評価するため、高速液体クロマトグラフィー質量分析により、トリプトファンの代謝物の測定を試みている。その結果、ストレスや炎症などによるトリプトファンの代謝障害がACSの発症に関連している可能性が示唆された。現在、多数例での解析を実施しており、早々に第1報の論文を投稿予定である。現在まで急性冠症候群患者およびうっ血性心不全患者述べ358例の血中アミノ酸38分画および全脂肪酸分画の測定を行った。DHQLによる食事摂取頻度調査は155例で評価できた。一部の症例で比較検討ができており、現在第1報論文の執筆作業中である。本年6月までには第1報を投稿予定である。DHQLは全質問項目への回答が必須のため、脱落例が20%以上発生している。今後脱落例を減らすように、研究協力者の管理栄養士と対策を練っている。未測定の凍結血漿検体が200例以上あり、早期に測定に着手する。臨床データの収集作業と論文執筆作業が遅れている。初年度の調査で、急性冠症候群(ACS)患者は94人(男性83人)と健康男性25人を比較し、ACSで必須アミノ酸が有意に低く、特に、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンが有意に低値であった。脂肪酸組成では多価不飽和脂肪酸のアラキドン酸(AA)は両群で同等、ACSでエイコサペンタエン酸(EPA)とドコサヘキサエン酸(DHA)を併せたω3系多価不飽和脂肪酸濃度が有意に低値であった。必須アミノ酸が低値であったことから、食事摂取頻度調査票(DHQL)をACSと心不全の救急入院患者で実施した。必須アミノ酸および脂肪酸の一部の血中濃度の低下が1食事からの摂取不足によるものか代謝異常によるものかを評価することと2治療後の回復期に必須アミノ酸および脂肪酸がどのように改善しているかを評価することが本研究の目的である。そのためACSおよび心不全発症直前1ヶ月間のDHQLの結果と血中脂肪酸・アミノ酸濃度との相関を検討した。ω3系多価不飽和脂肪酸濃度は食事からの推定摂取量と有意な正相関を示した(EPA: ρ0.634, p<0.0001、DHA: ρ0.431, p<0.05)。一方、トリプトファンは食事からの推定摂取量とむしろ有意な負相関を示した(ρ-0.638, p<0.05)。従って、トリプトファンの血中濃度の低下は、必須アミノ酸としての摂取不足ではなく、むしろ代謝障害を示しているものと推察した。この知見を多数例での解析で確認することが本研究の概要である。この研究分野の情報収集を文献検索および国内外の学会で行った。本年度は前年度に引き続き発症時と治療6ヶ月後に血液検査とDHQLを実施した。現在までに急性冠症候群(ACS)患者およびうっ血性心不全患者述べ422例の血中アミノ酸38分画および全脂肪酸分画の測定を行った。DHQLによる食事摂取頻度調査はACS患者163例、心不全患者39例で実施したが、調査票の未記入による脱落例20例を除外したACS患者150例と心不全患者23例で分析した。この中の53例では6ヶ月後の回復期のDHQLを分析できた。臨床データとの照合作業が遅れており、DHQLの解析結果とアミノ酸分画、脂肪酸分画の比較作業を現在行っている。DHQLの脱落例防止対策を研究協力者の管理栄養士と行っているが、未だ脱落例を認めた。未測定の凍結血漿検体が100例あり、早期に測定に着手する。臨床データの照合作業と論文執筆作業が遅れており現在作業中である。
チオレドキシン類似インタエレメント酵素群の構造機能相関と分子進化

1.グルタチオントランスフェラーゼ(GST)の触媒部位のNMRによる解析のための大量発現系の構築大腸菌GSTの触媒機構で最も重要と推定される触媒基は,Cys10の主鎖アミドのNH基である.このNH基がグルタチオンのチオール基のpKaに及ぼす影響をNMRを用いて検討するために,Cys10の主訴アミドのNH基である.このNH基がグルタチオンのチオール基のpKaに及ぼす影響をNMRを用いて検討するために,Cys10のNを^<15>N標識を行う.そのためにCys合成遺伝子が欠損している大腸菌K-12株CBK286(thyA cysE::Tn5)に多コピープラスミドpUC18を用いて大腸菌gst遺伝子を導入し,M9最小培地にアミノ酸を補った合成培地で培養を行い,GSTの発現量を検討した.その結果,大量の発現タンパク質を得た.この発現系についてさらに培養条件や発現タンパク質の精製について検討を行ない,1Lの培養液から最終的に約30mgのGSTを精製することができた.この発現・精製系はCysを^<15>N標識したGST試料を調製する目的に充分適うものである.この発現系を用いてCysを^<15>N標識したGSTを調製し,NMRによるpH滴定などを行う.2.変異原性試験法を利用したGSTの機能解析系の構築GST機能改変による変異原性物質代謝酵素の作製を試みるために,復帰変異を利用した変異原性試験法を応用して大腸菌を用いたアッセイ系を構築することとした.まず,トリプトファン合成能および紫外線による復帰変異能を欠損した大腸菌変異株WP2uvrAのgst遺伝子を破壊したWP2uvrAgst株を作製した.このgst欠損株と,もとのgst発現株を比較することにより大腸菌GSTが処理能力を持つ変異原物質を検索することができ,その作業を進めている.この変異株に新たに別のGST分子,あるいは構造的な改変を施したGST分子をコードする遺伝子を導入して発現させることにより,特定の変異原性物質に対して高い活性を持つ酵素を検索することができる.1.グルタチオントランスフェラーゼ(GST)の触媒部位のNMRによる解析のための大量発現系の構築大腸菌GSTの触媒機構で最も重要と推定される触媒基は,Cys10の主鎖アミドのNH基である.このNH基がグルタチオンのチオール基のpKaに及ぼす影響をNMRを用いて検討するために,Cys10の主訴アミドのNH基である.このNH基がグルタチオンのチオール基のpKaに及ぼす影響をNMRを用いて検討するために,Cys10のNを^<15>N標識を行う.そのためにCys合成遺伝子が欠損している大腸菌K-12株CBK286(thyA cysE::Tn5)に多コピープラスミドpUC18を用いて大腸菌gst遺伝子を導入し,M9最小培地にアミノ酸を補った合成培地で培養を行い,GSTの発現量を検討した.その結果,大量の発現タンパク質を得た.この発現系についてさらに培養条件や発現タンパク質の精製について検討を行ない,1Lの培養液から最終的に約30mgのGSTを精製することができた.この発現・精製系はCysを^<15>N標識したGST試料を調製する目的に充分適うものである.この発現系を用いてCysを^<15>N標識したGSTを調製し,NMRによるpH滴定などを行う.2.変異原性試験法を利用したGSTの機能解析系の構築GST機能改変による変異原性物質代謝酵素の作製を試みるために,復帰変異を利用した変異原性試験法を応用して大腸菌を用いたアッセイ系を構築することとした.まず,トリプトファン合成能および紫外線による復帰変異能を欠損した大腸菌変異株WP2uvrAのgst遺伝子を破壊したWP2uvrAgst株を作製した.このgst欠損株と,もとのgst発現株を比較することにより大腸菌GSTが処理能力を持つ変異原物質を検索することができ,その作業を進めている.この変異株に新たに別のGST分子,あるいは構造的な改変を施したGST分子をコードする遺伝子を導入して発現させることにより,特定の変異原性物質に対して高い活性を持つ酵素を検索することができる.
安定同位体的手法及び微生物生態学的手法の併用による土壌圏におけるメタン動態解析

メタンの吸収源としてのみ評価されてきた森林土壌について、メタンを放出しうる湿潤な地点を含めてメタン吸収・放出能の評価を行った。その結果、比較的乾いた土壌では既往研究の報告と同様にメタン吸収が主だったが、斜面下部の湿潤な土壌では、特に夏期の高温時にはメタンの放出源として機能した。また、渓畔の湿地では夏期に非常に大きなメタン放出が観測され、メタンの生成過程が降雨条件等の水文条件に規定されることが示された。森林内部で水分不飽和な斜面土壌のメタン吸収・放出能についての評価と、断続的に飽和する渓畔湿地のメタン放出源としての評価を滋賀県の桐生水文試験地を対象に行った。水分不飽和な斜面土壌では、斜面上部や中部の比較的乾いた土壌においては、年間を通じてメタンの酸化(吸収)がみられ、メタンの吸収源として機能しており、その強度の年々変動は小さかった。一方で、斜面下部の湿潤な土壌においては、夏期の高温時にはメタン生成の増加により、メタンの放出源として機能し、特に梅雨や台風などの夏期降水量が大きい年で顕著に観測された。これらのことは夏に雨の多いようなアジアモンスーン域では、夏期の降雨によるメタン吸収の低下の影響を考慮して年間収支を算出することの必要性を示した(Itoh et al., 2009)。渓畔湿地においては、堆積した有機物などの嫌気的分解が進み、夏期にメタンの放出が増大することが既に報告されている(Itoh et al., 2007)が、本課題では、メタンやその基質の二酸化炭素の炭素安定同位体比に着日して観測を続けた。その結果、夏期の降水量の多寡に伴う、地下水位や地下水中溶存酸素濃度の変動を受け、地下部でのメタン生成の基質が季節的に変動することが明らかになった。特に、夏期に高温かつ湿潤な環境が維持されるような年には、非常に還元的な環境が形成され、他の時期に比べて酢酸由来のメタンの生成が突発的に増加し、それが、大きなメタン放出量につながっていることが示された(Itoh et al., 2008)。現在さらに微生物群集の活動にも着目し、解析を進めている。全国8県9地点の水田圃場においてメタンフラックス観測を行った。その際、日本の水田で慣行的に行われている中干しという水管理の期間や強度を変更することによるフラックスの変化について着目して観測を行った。9地点中8地点で中干期間の延長を行った栽培区で栽培期間中に放出されるメタンの量が慣行中干区で観測された期間メタン放出量に比べて削減され、慣行に比べて平均1.8倍の中干期間の延長でメタン放出が約26%削減される結果が得られた。この結果については国内外の学会で発表を行った。さらに、各地点でのメタン放出量に大きな差が見られた。その要因を解析するために全ての地点から採取した土壌に存在するメタン生成細菌の微生物群集構造解析を行った。その結果、土壌型によりメタン生成細菌の群集構造はグループ分けできる可能性が示唆された。また同時に土壌の培養実験を行い、その際に放出されたメタンと二酸化炭素の安定同位体比からメタン生成経路の地点間の違いを検出した。結果としてメタン生成細菌の群集構造とメタン放出量や、安定同位体比から推定できるメタン生成経路との関連性は低いことが示唆された。現時点で得られた結果は、今後様々な土壌でのメタン放出に関する微生物群集の解析や、それらとメタンフラックスなどの関係を調査していく上で重要な情報になると考えられた。また、森林の渓畔湿地で観測されたメタンの安定同位体と微生物群集構造の解析結果については、国際学会において発表を行った。
個人化する社会の「看取り」：その担い手と受け手の日仏比較研究

「ケアの受け手の個人化」特に、独居の増加(日仏)に関しては、フランスでは近年、「寄り添い(accompagnement)」と「連帯」の対象とみなされるようになり、「ユマニテ」の伝統が機能していること、日本では家族中心の介護のため、遠隔地介護による子の離職や老老介護などが明らかになった。「ケアの担い手の需要増加」に関しては、日本では過重労働(若年看護師の過労死、残業、10万人離職)がケアのジェンダー化に起因し、専門職化の一方で、女性役割への期待から待遇の問題として見えにくいと考えた。また、フランスではケアの細分化が行われ、単純労働を移民の子女が担当するなど条件悪化や質も問題となっている。当該年度は、大学ホームページの研究者ページから移行できるホームページを新たに作成したことによって、広く、当該研究の目的を知らしめ、協力を仰ぎ、内外からの研究協力者を募り、様々な意見を聴取することに努めた。とりわけ、今年度は、看護大学の研究者、現役の病院職員(医療職の中でも特に、医師職および看護職者ら)などをはじめとして、日本の調査協力者からのインタビューやアンケート調査などを行った。同時に、医療職、とくに、ケアに従事している看護職者の労働状況がいかなる理由で労働を継続することに困難があるのかについて、本研究によるアンケート・インタビュー調査結果だけでなく、日本看護協会の独自アンケートの記録や看護師派遣会社によるアンケート結果、また、厚生労働省の労働統計などを利用して分析を行った。その結果、前残業などの実施が常態化し、それらが、残業であるという認識を持たないまま(あるいは、持たせることを事業者がさせないまま)、労働状況を厳しいものにしていることが分かった。特に、中間管理職の負担が強く、こうしたことが、過酷な労働状況を当然視し、新人看護師の育成にも影響を与えていることが分かった。当該年度は、海外での調査、インタビュー、アンケート調査を企画し、調査協力者、協力病院なども決定しており、10月以降の実施を予定していたが、妊娠したため、海外渡航ができなくなったので、産前・産後休暇および育児休暇から復帰後の翌年度以降に実施したいと考えている。平成24年度当初、平成25年度において1年未満の中断予定であったが、年度のすべてを産前・産後休暇および育児休暇にあてたため、研究をおこなうことができなかった。しかし、平成24年度までの成果の一部がフランス社会の福祉の現状として(医療におけるケアなど)論文として刊行された。さらに、今後、26年度、27年度の計画を立て直した。24年度以降の本調査の予備調査として、はじめに、統計や文献講読による現状の把握と両国間の家族観、共同体への信頼と連帯についての意識比較、次に研究協力者である看護師や医療関係者、医療政策従事者などを中心にインタビュー調査を行ない、最後に、学会、研究会などの参加、議論などを通してさらなる問題点を明らかにした。まず、現状把握後のインタビューにおいては、日本人、フランス人に聞き取り調査を行ったが、昨年3月の大震災後、インフォーマントの一部が国外に避難・帰国したため、海外で行うことになった。日本におけるインタビューでは、大震災後の日本では、世代間、地域間に存在する「格差」が浮き彫りになり、社会の絆について考える契機となった一方、緊急災害時、また、復興において血縁・共同体のつながりや医療の現場での人間関係のあり方が模索されると同時に、本調査の主たる関心である「ケア」を行う看護職者の過労などもより大きな問題となっていることが分かった。また、医療の地域間格差がより広がっている。そして、このような状況では援助を行う職務への配慮は後回しになることが多い。他方、フランスでは、高齢化が進む中、ヨーロッパの金融危機がケアの状況にも大きな影響を与え、独居老人へのケア、医療従事者への労働環境の配慮などの問題を考えるべき時に来ているという。このような点が日本とも重なる点ではないか。さらに、研究会に参加することで、新たな問題点や次年度の本格調査への指摘なども得た。たとえば、東南アジアからの外国人ケアワーカーとの関係をどのように見るのかなどである。また、学会発表では、若手看護師の連続過労死という問題がほとんど認知されていなかったので、このような問題がなぜ起きたのか考えることによって、今の日本が若年労働者にとって、そして、その多くが女性であるがゆえに、女性労働者としての看護職者の姿を模索する契機としていきたい。大学のホームページ上に作ったサイトに、看護職の過労問題に関心の深い研究者、現役看護師、元看護師などの方からのアクセスがあり、この問題について広く関心がもたれるようになったと考えている。また、定期的に、看護職者の過労やワークライフバランスについての勉強会や関連テキストの読書会、討論会を実施し、広く意見を募り、インフォーマントを中心にこの問題についてどのような考察がされているのか考えることができた。インターネットを通じて過労問題について関心のある現役看護師と連絡を取り、問題関心を共有しながら、インタビューの応募していただいた研究協力者のもとに行き、現状と課題について伺った。そこでは、地方ごとによって看護職者の抱える問題(看護師不足の現状とあり方の違い)や病院組織としての取り組みも異なることに気付くことができたので新たな課題とすることができた。また、紙ベースのアンケートだけではなく、インターネット上のアンケートを行うに際してのシステム作りとアンケート項目の精査などについても検討を行った。さらに、これまでのマクロデータのまとめとインタビュー調査の結果を学会発表などを通して行ってきた事柄について、一つの論文としてまとめ、発表した。

それは、ケアを行う看護職員たちの病院での過労と離職の状況と10年後に最も懸念される2025年問題(後期高齢者の増加)に際して、ケアの担い手と受け手がどのように変化し、またシステムを構築するべきかについて考察したものである。これまでの研究に関する論文と発表は、以下のとおりである。論文:「2025年問題と看護師の過労・離職の現状」7月刊行『千葉経済論叢』第52号(PP. 1ー23)千葉経済大学(概要)2025年問題を踏まえて、これまで厚生労働省は、診療報酬の改定を行い、医療費の増大を抑えるべく取り組んできたが、離職看護師は減少せず、過労の状況が変わらない理由をデータから分析した。また、昨年、11月のテロ事件以降、フランスでの現地調査、フランスでの研究成果発表と現地での情報収集・交換などを断念せざるを得なかったが、その代わりに、日本のNHK技術研究所において、1月から2月にかけて、「超高齢社会と看護師の過労」と題する発表を行った。内容は、現在の日本の高齢化率(人口における高齢者の割合)が25%以上と世界1位で、かつ、平均寿命も男女ともに世界最高となっており、今後、高齢化を迎える多くの国々から注目されていることを念頭に置き、現在の日本の超高齢社会とケアのあり方について発表した。高齢者の増加は、平均寿命=健康寿命ではないため、とりわけ、看護師の行う看護は、病院から在宅医療・介護にシフトされている現在の日本において多くのニーズがある。ところが、2008年に日本看護協会が行った調査では、若手看護師が過労認定される事件が相次ぎ、全体において、多くの看護師が過労死危険レベルで働いていることが分かっている。このことを受けて、これらのケアの現場の現状を知ると同時に、高齢化社会の現状を考え、今後、どのように、ケアを担う看護師の方々が働けばいいのか考察を行った。また、本研究においては、一般の方々、とくに、看護師の働き方、ワークライフバランスについて考えている現役の看護師の方たちと「ソシオロジー研究会」の場でディスカッションを重ねてきた内容について、その意見なども紹介した。昨年、11月のフランス・パリでの同時多発テロ事件以降、文部科学省などからも渡航の自粛要請があったため、所属機関である千葉経済大学と協議のうえ、フランスでの現地調査、および研究成果発表と現地での情報収集・交換などを断念せざるを得なかった。また、研究自体も延長届の受理により、延長して頂いた経緯がある。しかし、その分、日本での研究成果発表などを行う機会を得ることができ、年度末に発表・展示を行い、多くの来場者に恵まれた。そこでは、日本の超高齢社会について研究する他分野の研究者とも意見交換をすることができ、フランスの研究発表では得られなかったであろう、成果を得ることができ、次年度に活かせることができると考えている。また、日本では、数回にわたって、一般の方々、とくに、看護師の働き方、ワークライフバランスについて考えている現役の看護師の方たちと「ソシオロジー研究会」の場でディスカッションを重ねてきた。これらは、ホームページなどの告知により、応募されてきた方を中心にした勉強会および意見交換会であるが、その内容について随時、意見などもまとめている。
ボタンの促成栽培に関する研究

1.予備冷蔵の有無と生育初期温度並びに栽培温度が促成ボタンの生育と切り花形質に及ぼす影響について調査した。予備冷蔵処理によって発芽期や開花期が促進された。しかし予備冷蔵処理区で生育初期温度が高い場合,開花率は著しく低下した。初期温度が低い場合には,予備冷蔵処理区も対照区と同様に開花率は高かった。中期促成において,発芽から開花までの平均温度が約17°Cの時,30日以内で開花した。平均温度が4°C下がれば15日間の開花遅延が生ずるものの,切り花形質は著しく向上した。1棟のハウスで,早期促成栽培から半促成栽培まで4作の作付けが可能であることが示唆された。2.予備冷蔵の有無がボタン品種の花芽の発育と促成開花に及ぼす影響について調査した。予備冷蔵処理によって花芽の発育が進み,花弁数は増加した。予備冷蔵終了時に,一部の品種で雄ずい分化や雌ずい分化中の個体が認められた。また花弁と雄ずいとの間に未分化部位が認められ,花弁と雄ずい分化を同時に進行させる時期の存在が考えられる。実用限界(開花率80%)を越えた各品種の草姿は,予備冷蔵処理がなくても茎葉の伸長は良好で,切り花の草姿に問題はなかった。3.予備冷蔵温度がボタン品種の花芽の発育と促成開発に及ぼす影響について調査した。12°Cや15°Cの予備冷蔵温度によって,花芽の発育が良好となった。切り花の花弁数は予備冷蔵処理によって減少傾向が認められ,一部の品種では激減した。予備冷蔵処理によって開花率が向上する品種,低下する品種及びあまり変化しないか変化しても差が少ない品種の3品種群に分類されることが明らかとなった。また、予備冷蔵適温は品種によって異なることが示唆された。花芽分化の早晩と促成能力の関係については一定の傾向を示さなかった。実験1:予備冷蔵温度が促成ボタンに及ぼす影響について実験を行った。供試品種は`花競'及び`花王'で、それぞれ接ぎ木二年生苗を用いた。予備冷蔵温度は8°C医12°C、15°C及び19°Cで、10日間処理した。別に無処理の対照区を設置した。12°Cや15°C区は対照区に比べ、花芽の発育が進む傾向を示した。しかし8°Cや19°C区では、逆に遅れる傾向を示した。発芽日や開花日は、花芽の発育が進んでいた12°Cや15°C区が早い傾向を示した。また`花王'の場合、12°C区の開花率は67%で最も高く、予備冷蔵温度と処理期間によっては、開花率が向上するものと思われ、有望である。一方`花競'については、予備冷蔵によって発芽や開花が促進されるものの、予備冷蔵温度が低くなるほど開花率は低下した。これは実験2で明らかになるように、生育初期温度がやや高く維持されたために生じたものであろう。実験2:予備冷蔵の有無と生育初期温度が、促成ボタン(品種`花競')に及ぼす影響について実験を行った。15°C10日間の予備冷蔵区と対照区を設定した。また苗植え付け後10日間、栽培温度を変えて促成を実施した。生育初期温度はH〔23°C(昼)-17°C(夜)〕、M(20°C-14°C)及びL(17°C-11°C)の3温度区であった。予備冷蔵によって花芽の発育が進んだ。

また予備冷蔵処理区は、発芽や開花が促進され、生育の初期温度が高いほどその効果は大であったが、開花率は激減した。対照区の場合、生育初期温度が開花率に及ぼす影響はに比較的少なかった。予備冷蔵区、対照区ともに、生育初期温度が低いほど開花率は向上した。予備冷蔵の有無にかかわらず、切り花形質はまずまずであった。以上の結果から、予備冷蔵によって開花が早くなり、`花王'については開花率も向上した。しかし`花競'の場合、予備冷蔵処理された苗は、開花率向上のために生育初期温度を低く維持する必要がある。1.数種のボタンの花芽分化と早期促成における促成能力との関係について調査した。7月下旬には,供試した大半の品種においてがくの分化が確認され,花芽分化が始まっていた。一部の品種については花弁の分化も確認された。9月下旬には全品種とも花弁の分化が確認された。予備冷蔵処理によって,花芽分化が促進する品種とあまり変化が認められない品種に分類された。一部の品種(“島大臣"や“墨流"など)では雄ずい分化や雌ずい分化が認められた。また花弁と雄ずいとの間に未分化部位が認められ,花弁と雄ずい分化を同時に進行させる時期が存在すると考えられる。開花率は,予備冷蔵処理によって向上する品種,低下する品種及びあまり変化の認められない品種の3群に分類されることが明らかとなった。採花時の草姿は、予備冷蔵処理がなくても茎葉の伸展が良好で,切り花の草姿に問題はなかった。予備冷蔵処理によって開花日は促進されるものの,品種(“墨流"など)によっては切り花の花弁数が激減した。花芽分化の早晩と促成能力の関係については,一定の傾向を示さなかった。2.中期促成において,栽培温度(高温区及び低温区)が開花期や切り花形質に及ぼす影響について調査した。“花競"の場合,発芽日については区間にほとんど差はなかったが,開花日については15日間の差が生じた。一方“八千代椿"の場合,発芽日,開花日とも区間に差が生じ,発芽日で5日間,開花日で15日間の差となった。高温区の場合,両品種とも発芽から開花までの日数は30日以内であった。開花率は両品種,両処理区とも100%であった。採花時の切り花形質は,両品種とも区間に差が生じ,低温区の切り花形質は高温区より優れた。とくに“花競"の場合,切り花形質の差は著しかった。以上の結果から1棟のハウスで,早期促成栽培から半促成栽培まで4作の作付けが可能であることが示唆された。
胎児期の脳に特有な新しい情報伝達機構の解析

ラット胎児脳に特異的に発現するタンパク質を我々が独自に開発したタンパク質マップ法により検出した後、これらを単離してアミノ酸配列分析を行うことにより1つ1つのタンパク質を同定した。これらの中には既に胎生期に優位に発現することが報告されているものも多かったが、いくつかの興味深いタンパク質も含まれていた。この中で、低分子量Gタンパク質の制御因子の一種と考えられる分子量30kDaのタンパク質、およびputative HLA-DR associated proteins PHAPIおよびPHAPIIのラットホモローグについてマウス胎児cDNAライブラリーからPCR法によるクローニングを行った。分子量30kDaの未知タンパク質についてはアミノ酸配列が決定できた領域がRhoGDIと非常に相同性が高かったため、作製したオリゴヌクレオチドブライマーの特異性が低く、現在のところクローニングに成功していない。一方、PHAPIおよびPHAPIIについてはマウスcDNAおよびgenomic DNAについてクローニングを完了した。これらの過程でPHAPIおよPHAPIIはいずれも単一のタンパク質ではなく、多くのisotypeを有することが明になった。PHAPIについては非常に相同性の高い2つの遺伝子が存在していた。これらのisotypeは2つの遺伝子から選択的スブライシングによって生じるらしいことが明かとなってきた。また、これらのタンパク質の生理機能を明らかにするため細胞内の標的タンパク質を探索する過程で、PHAPIをリン酸化する未知プロテインキナーゼを見出した。1.タンパク質の精製法の確立と機能活性の証明(1)申請者はこれまで一次構造解析を主眼におき、目的タンパク質を胎児脳可溶性画分よりイオン交換クロマトグラフィーによる部分精製と調製用電気泳動により単離してきたため、未変性の機能的活性を保持したタンパク質を得るため精製法を確立した。(2)得られた未変性タンパク質を用いて実際にGDI活性およびGAP活性を有するか否かを測定するためRanおよびRhoタンパク質の精製を行ったが、充分な量の精製標品を得ることが出来なかったので、現在、既に報告されているRanおよびRho cDNAの塩基配列をもとにcDNAをクローニングしてrecombinant proteinを調製している。2.特異抗体の作成既に得られている部分一次構造をもとに合成ペプチドを作成し、ヘモシアニンと架橋したものを抗原として、現在、ウサギを免役中であるが充分な抗体価を得られていない。3. cDNAをクローニング既に得られている部分一次構造をもとにオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、胎生17日目ラット胎児脳より調製したmRNAを鋳型にRT-PCRを行い得られた産物の塩基配列決定を行っている。現在、部分的なcDNAを得ている。分子量30kDaの未知タンパク質についてはアミノ酸配列が決定できた領域がRhoGDIと非常に相同性が高かったため、作製したオリゴヌクレオチドプライマーの特異性が低く、現在のところクローニングに成功していない。PHAPIについては非常に相同性の高い2つの造伝子が存在していた。これらのisotypeは2つの遺伝子から選択的スプライシングによって生じるらしいことが明かとなってきた。
排卵過程における卵巣内angiotensin II受容体の意義

(3)Northern blot解析:PMSG刺激後のラット卵巣の顆粒膜細胞よりmRNAを抽出し、ラットAT_2受容体cDNAをプローブとして、^<32>P dATPを用いたNorthern blot解析を行った。ラット卵巣内には3.5kbのAT_2受容体mRNAの発現が認められた。以上より、排卵過程における顆粒膜細胞および莢膜細胞にはAng II受容体が局在し、Ang IIに高親和性を示し、この受容体はAT_2受容体であることが明らかとなった。
渦状銀河における磁場の形状とその維持について

銀河のガスの乱流による磁場の散逸効果とダイナモ効果による磁場の再生作用、および銀河の差動回転による磁場の巻き込みを考慮した誘導方程式を解くことにより、渦状銀河の磁場の形状とその維持機構を調べてきた。その結果、渦状銀河の多くに観測される双対称渦状磁場(BSS磁場)が、銀河のかなりの領域において準定常的に維持され得ること、この磁場の維持には銀河面の厚みとダイナモ作用の強さが密接に関係していることが得られた。また、実際に観測されるいくつかの渦状銀河のガス円盤の厚みや差動回転の大きさ、乱流の強さ、ダイナモ作用の強さなどが、磁場の形状に与える影響を調べた結果、BSS磁場が優勢となる場合と軸対称の磁場が優勢となる場合に分かれ、この結果は実際に観測される銀河の磁場の形状と矛盾しないことがわかった。理論的に得られたBSS磁場の磁力線の形状は、大局的には腕に沿っているものの、その一部は隣の腕に銀河面内でつながり、そこから銀河面にほぼ垂直になってハローに抜け、ハロー領域をアーチ状に通り、再びもとの腕に戻ってくる。したがってハローとの境界では、磁力線は銀河面に対してほぼ垂直になる。この形状は渦状銀河の腕の部分に見られる銀河面に垂直な吸収帯の形状とよく似ており、理論的磁場形状を支持するものといえよう。このようなBSS磁場が渦状銀河に存在すると、銀河のガスは磁場によるローレンツ力を受ける。その結果、銀河のガスは磁場の渦状成分の強い部分に集中し、これが2本のガスの渦状密度波としてBSS磁場と同じ回転角速度で回転する。密度波は多くの波束の集まりであることから、維持機構がなければ時間とともに分散して消えてしまう。このことから、密度波の生成と維持機構として、BSS磁場のローレンツ力が重要な役割を果たしている可能性がきわめて強いといえる。ガスの乱流による磁場の散逸とダイナモ作用による磁場の再生,および銀河の微分回転による磁場の遷き込みを考慮した誘導・発電方程式を解くことによって、銀河の渦状磁場の形状とその維持機構を調べてきた。銀河の平均磁場を記述するこの誘導・発電方程式は、銀河の形状を考慮した大局的方程式をもとにし、その中の微小項を無視して得られたものであり、準大局的方程式と言える。この方程式の銀河面に対して対称な解を、様々な銀河の物理量について求め、その解の性質を調べた。その結果、渦状銀河の多くに観測される双対対称磁場(BSS磁場)が、銀河のかなりの領域において、宇宙の年齢程度の期間形を変えることなく、銀河の微分回転よりゆっくりと回転し得ること、それらの磁場を維持するための磁場の散逸係数,ダイナモ作用の強さ,ガス円盤の厚みなどの物理量は観測から得られる値と矛盾しないこと,この磁場の形状は、大局的には銀河の外側から内側へ入り込む磁場と、それとは逆に内側から外側へ出ていく磁場からなる渦状磁場であるが、部分的に見ると、銀河円盤とハローの間を出入りする螺線の形状をしていることなどが得られた。この内容の主要な部分はFujimotoand Sawa(1987)にまとめられている。また、このモデルを実際の系外銀河に観測される磁場の形状(M31などの軸対称磁場やM51などのBSS磁場)に適用し、その銀河の回転速度,ガス円盤の厚みなどの物理量と磁場の形状の比較を行なった。その結果、軸対称磁場となるのかBSS磁場になるのかの違いは、主としてその銀河の微分回転の大きさとガス円盤の厚みによって決まることが示され、このモデルによって実験の渦状銀河に観測される磁場の形状の違いをよく説明できることがわかった。この内容の主要な部分はLesch et.al.(1987)にまとめられている。

銀河のガス乱流による磁場の散逸効果とダイナモ効果による磁場の再生作用を考慮した誘導・発電方程式を解くことにより,渦状銀河の磁場の形状とその維持機構を調べた.その結果,渦状銀河の多くに観測される双対対称磁場(BSS磁場)が,銀河のかなりの領域において準定常的に維持され得ること,この磁場の維持にはガス円盤の厚みとダイナモ作用の強さが密接に関係していることが得られた(Fujimoto and Sawa 1987b).また,実際に観測されるいくつかの渦状銀河のガス円盤の厚みやダイナモ作用の強さなどの物理量を与え,それらの銀河でこのBSS磁場が準定常的に存在し得るかどうかについて調べた.その結果, M33, M81, M51, NGC6949にはBSS磁場が存在し得ること, M31とIC342には軸対称の磁場が優勢であることが得られ,この結果は観測されるこれらの銀河の磁場の形状と矛盾しないことがわかった. (Leshe et.al.1988).このBSS磁場の磁力線の形状については,大局的には腕に沿っているものの,その一部は隣の腕に銀河面内でつながり,そこから銀河面にほぼ垂直になってハローに抜け,ハロー領域をアーチ状に通り,再びもとの腕にもどってくること,この垂直磁場は,渦状銀河に見られる銀河面に垂直な吸収帯の形状とよく似ていることなどが得られた. (Sawa and Fujimoto 1987).さらに,このようなBSS磁場が渦状銀河に存在する場合,銀河のガスは磁場によるローレンツカを受け,その結果,ガスは渦状成分の強い部分の内側に集中することになる.このように,ガスは渦状磁場に沿って集中し, 2本のガスの腕を作る.このことから,渦状腕の生成に磁場が重要な役割を果たしている可能性が高いといえる(Fujimoto and Sawa 1987b).この後半の2つは,昨年フランスで行なわれた磁場に関する国際シンポジウムで発表されている.銀河のガスの乱流による磁場の散逸効果とダイナモ効果による磁場の再生作用を考慮した発電方程式を解くことにより、渦状銀河の磁場の形状とその維持機構を調べてきた。その結果、渦状銀河の多くに観測される双対称渦状磁場(BSS磁場)が、銀河のかなりの領域において準定常的に維持され得ること、この磁場の維持には銀河面の厚みとダイナモ作用の強さが密接に関係していることが得られている。この理論的に得られたBSS磁場が銀河系に存在するかどうかを調べるため、太陽近傍のパルサーの回転量度と分散量度の観測値を再現する磁場形状を最小二乗法によって求めた。その結果、太陽近傍にもBSS磁場の一部と思われる磁場の反転領域が銀河中心方向、数百パーセクの距離に存在すること、磁場の強さは数μG程度であることなどが得られた。これは、銀河系にもBSS磁場の存在を示唆する結果といえよう。さらに、このようなBSS磁場が渦状銀河に存在する場合、銀河のガスはBSS磁場によるローレンツ力を受ける。その結果、ガスの運動は円運動から乱される。このガスの運動の乱れにガス自身の自己重力が働けば、ガスはBSS磁場の形状と同様の2本の渦状に凝集する。このガスの凝集領域はBSS磁場と同じ回転速度で回転する。また、通常の渦状銀河のようにガス円盤が重力に対して不安定であると、ガスは磁場の渦状成分の強い部分に集中し、しかも密度のゆらぎは十分大きくなることがわかった。つまり、BSS磁場によって2本のガスの腕が形成されるのである。
超音波顕微鏡による音響的定量評価に基づく動脈硬化病変進展に関する研究

本研究の目的は、超音波顕微鏡による生物組織の音波伝播速度および超音波減衰量を計測することより動脈硬化度の定量的評価を行うことである。我々は剖検心より得られた冠動脈内膜の音響組織特性を定量解析することにより、病理組織学的な冠動脈粥状硬化の進展度との関連性を検討した。これによれば冠動脈内膜音速は、正常群1757.8【+-】90.4m/s,前期粥状硬化群1611.9【+-】53.0m/s,後期粥状硬化群2031.4【+-】145.0m/sであり、超音波減衰量は各々、2.5【+-】0.5dB,1.7【+-】0.6dB,5.4【+-】0.8dBであった。したがって冠動脈内膜硬度は形態学的な粥状硬化の進展に伴って直接的な増加を示すものではなく、粥状硬化初期の段階では病変部内膜は正常例よりむしろ軟化を示し、高度の線維化および石灰化を呈する合併病変の段階に至って硬度が増加すると考えられた。さらに冠動脈中膜の音響組織特性の定量評価を行った。この検討では正常群において音速は、内膜1785.5【+-】93.9m/s、中膜1797.3【+-】78.8m/sに対し、前期粥状硬化群においては、内膜1694.5【+-】64.0m/s、中膜1776.1【+-】61.8m/sであり、内膜音速に関しては前期粥状硬化群は正常群に比して有意に低値であったが(p<0.01)、中膜の音速には有意差を認めなかった。これは冠動脈中膜には動脈硬化の影響が波及しにくいことによるのではないかと考えられた。さらに現在は剖検心を対象として、各年齢層の健常例において心内膜側から心外膜側への音速分布および超音波減衰量を計測中である。加齢とともに左室拡張能が低下することは既に知られているが、この原因と考えられる心筋組織性状の変化については、未解明なことが多く、加齢、左室肥大、心筋虚血など左室拡張能が障害されて病態において、これらの因子が心筋組織性状に及ぼす影響について検討中である。動脈硬化を定量的に評価するためには、従来の病理組織学的方法では病変の病理学的程度や広がりは評価しうるが、壁局所の硬度に関する情報を得ることは困難であった。そこで本研究の目的は、超音波顕微鏡を用いて冠動脈、大動脈などの壁の音響学的特性を計測することにより動脈壁性状や壁硬度を定量的に評価し、動脈硬化進展に関する検討を行うことである。1.ヒト冠動脈組織特性の定量計測に基づく粥状硬化進展に関する検討:剖検心より得られた冠動脈切片を光学顕微鏡所見に基づいて正常群、前期粥状硬化群、後期粥状硬化群に分類した。超音波Cモ-ド像において粥状硬化病変の最も強い内膜領域に関心領域を設定し、減衰量を計測した。

音速計測は、Cモ-ド像を参照してXーZモ-ド法により干渉縞を抽出し、干渉縞ずれ量より算出した。(1)減衰量は、正常群では2.5±0.5dB、前期群では1.7±0.6dB、後期群では5.4±0.8dBであり前期群では他群に比し有意に低値であり、後期群では他群に比し有意に高値であった。(2)内膜音速は、正常群では1757.8±90.4m/s、前期群では1611.9±53.0m/s、後期群では2031.4±145.0m/sであり、前期群では他群に比し有意に低値であり、後期群では他群に比し有意に高値であった。以上より冠動脈内膜硬度は粥状硬化の進展に伴って直線的な増加を示すものではなく、粥状硬化初期の段階では病変部内膜はむしろ軟化し、高度の線維化および石灰化を呈する後期に至って硬度が増加すると考えられた。2.実験動物を用いた、薬物の粥状硬化進展と弾性特性に及ぼす影響に関する検討:主にWHHLウサギを用いて、高脂血症治療薬投与により動脈硬化の進展を病理組織学的に抑制し得た群と、し得なかった群とで大動脈の種々の部位で内膜音速を計測している。高脂血症治療薬投与方法、試料作成方法など試行錯誤を繰り返している。また、将来的には生の材料を対象とする予定で、固定方法を検討中である。本研究課題は、超音波顕微鏡により生物組織の音波伝播速度および超音波減衰量を計測することにより動脈硬化度の定量的評価を行うことである。昨年度までに我々は剖検心より得られた冠動脈内膜の音響組織特性を定量解析することにより、病理組織学的な冠動脈粥状硬化の進展度との関連性を検討した。これによれば冠動脈内膜音速は、正常群で1757.8±90.4m/s、前期粥状硬化群で1611.9±53.0m/s、後期粥状硬化群で2031.4±145.0m/sであることから、冠動脈内膜硬度は形態学的な粥状硬化の進展に伴って直線的な増加を示すものではなく、粥状硬化初期の段階では病変部内膜は正常例よりむしろ軟化を示し、高度の線維化および石灰化を呈する合併病変の段階に至って硬度が増加すると考えられた。本年度は引き続き冠動脈内膜のデータ蓄積をはかるとともに、冠動脈中膜の音響組特性の定量評価を行った。今回の検討では正常群で音速は、内膜1785.5±93.9m/s、中膜1797.3±78.8m/sに対し、前期粥状硬化群では、内膜1694.5±64.0m/s、中膜1776.1±61.8m/sであり、内膜に関しては前期粥状硬化群は正常群に比して有意に(p<0.01)音速は低値であったが、内膜では有意差を認めなかった。これは冠動脈中膜には動脈硬化の影響が波及しにくいことによるのではないかと考えられた。さらに現在は加齢、左室肥大など左室拡張能が障害される疾患において、剖検心を対象として、各年齢層の健常例、肥大心において心内膜側から心外膜側への音速分布および超音波減衰量を計測中であり、これからのデータを蓄積し、加齢および左室肥大が心筋組織性状に及ぼす影響について検討中である。
ＳＯＶ言語の文理解において記憶資源はどう使われるか～依存タイプから検証する

本研究は,母語話者が文における語と語の文法依存関係をリアルタイムで理解する際に,どのように記憶資源を利用するかを特にSOV言語に焦点をあてて解明することを目標とした。日本語については授与構文におけるゼロ代名詞解釈の実験やガ・ノ交替における読み時間研究,様態副詞に取り立ての助詞「ハ」が付いた擬似否定対極表現や「も」を伴う否定対極遊離量化詞(「一件も」)の処理が検証され,トルコ語については否定対極表現の理解について検証された。高レベル文法処理における記憶資源の利用の解明に一定の成果があがったが,これは記憶容量の大きい被験者や理解度の高い被験者により強く見られる傾向があることがわかった。本研究は,母語話者が文における語と語の文法依存関係をリアルタイムで理解する際に,どのように記憶資源を利用するかを解明するのが目標であるが,本年度は日本語とトルコ語に焦点を当てて研究が行われた。日本語においては,授与構文におけるゼロ代名詞解釈の実験やガ・ノ交替における読み時間研究などを行い,トルコ語においては否定対極表現の理解についての研究が行われた。実験手法は質問紙調査や自己ペース読文タスクが採用されたが,今回は特に作業記憶の個人差をオペレーション・スパン・タスクによって計測し,作業記憶容量の個人差がどのように読み時間と相関するかを調査した。その結果,特にトルコ語では,作業記憶容量が大きいほど,否定対極表現の主効果がみられるという結果が得られた。これは記憶容量の大きい者ほど複雑な文法関係の処理を正確に行おうとすることを示唆しているように思われるが,さらなる追試が必要である。日本語の関係節におけるガ・ノ交替においては,ノの場合においてのみ距離の効果(ノと述語距離が長いほど読み時間に遅延が生じたり,容認度が落ちる)が見られ,ガとノの統語構造が異なるという仮説を支持する結果となった。本研究は,母語話者が文における語と語の文法依存関係をリアルタイムで理解する際に,どのように記憶資源を利用するかを解明するのが目標であるが,本年度は日本語に焦点を当てて研究が行われた。日本語においては,様態副詞が最大にポジティブな意味を表している場合に取り立ての助詞「ハ」が付くと否定述語の後続が強く期待されるという事実(Hara, 2006, etc.)を利用し(擬似否定対極表現),文法依存関係の局所性と処理負荷の関係(局所性の効果)を自己ペース読文実験により検証した。その結果,副詞表現についても擬似否定対局表現においてのみ文法依存が局所的であることの処理促進効果が見られた。その効果は,理解度尺度において高得点の被験者においてより強く見られた。この成果は29th Annual CUNY Conference on Human Sentence Processingなどにおいて発表した。また,日本語の二重目的語構文における文理解の難易度について、直接目的語と間接目的語間の語順と、間接目的語の有生性を同時に操作した読み時間計測実験を行い、間接目的語の有生性もしくはその間接目的語に付与された意味役割によって、より基本となる語順が異なることを示唆する結果を得た。この成果を第150回日本言語学会で発表した。節境界の曖昧性を用いた主要部前処理のあり方について、名詞句の長さ(韻律構造)の影響を確認することを目的とした読み時間計測実験を行い、文頭名詞句の長さが、初分析における構文解釈に作用していることを示唆する結果を得た。この結果を日本言語科学会JSLS2016に投稿し採択された。研究代表者は平成27年度にカリフォルニア大学サンディエゴ校に在外研究に赴き,そこでは主に新しい知見を吸収することと,これまでの研究成果を現地の研究会やコロキアムなどで発表することに時間を費やした。反面,新しい実験執行については,異国の地という制約もあり,やや立ちおくれた。本研究は,母語話者が文における語と語の文法依存関係をリアルタイムで理解する際に,どのように記憶資源を利用するかを特にSOV言語に焦点をあてて解明するのが目標である。2014年度においては日本語とトルコ語に焦点を当てて研究が行われた。作業記憶容量が大きいほど,否定対極表現の効果が観察されるという傾向が見られた。2015年度は,様態副詞に取り立ての助詞「ハ」が付いた擬似否定対極表現の処理と局所性の関係が検証され,副詞表現についても文法依存が局所的であることの処理促進効果が見られた。そのほか,日本語の二重目的語構文における文理解の難易度,節境界の曖昧性を用いた主要部前処理における名詞句の長さの影響などが検証された。2016年度は「も」を伴う否定対極遊離量化詞(「一件も」)が制御群(「一件だけ」)に比して局所性による処理負荷を生み出すかが自己ペース読文実験によって検証されたが,これについては否定対極表現とそうでないものの間で違いは見られなかった。さらに全称量化詞「誰も」の処理が制御群「誰もが」と比較され,こちらは両方の場合に局所性の効果が見られた。

この全称量化師の結果は全称でない量化詞(「一件も」など)の場合と対照的であり,量化の処理と記憶資源の関係について新たな課題が見出されたと言える。その他,複合語の予測処理におけるアクセントの役割,日本人英語学習者の関係節に関する視線計測実験が行われたが,予測処理と記憶資源利用の関係についてはさらなる検証が必要である。本研究は,母語話者が文における語と語の文法依存関係をリアルタイムで理解する際に,どのように記憶資源を利用するかを特にSOV言語に焦点をあてて解明することを目標とした。日本語については授与構文におけるゼロ代名詞解釈の実験やガ・ノ交替における読み時間研究,様態副詞に取り立ての助詞「ハ」が付いた擬似否定対極表現や「も」を伴う否定対極遊離量化詞(「一件も」)の処理が検証され,トルコ語については否定対極表現の理解について検証された。高レベル文法処理における記憶資源の利用の解明に一定の成果があがったが,これは記憶容量の大きい被験者や理解度の高い被験者により強く見られる傾向があることがわかった。これまで先行研究ではなされなかったトルコ語の否定対極表現と距離効果についての実時間理解の実験を行うことができ,その発表の機会を持てた点では大きな進展があったと言える。ただし,仮説の予測や日本語の先行研究の報告に反し,否定対極表現が読み時間を遅延させるという方向で結果が出た。否定対極表現の頻度の低さがノイズになっている可能性があり,さらなる検証が必要である。日本語についてもトルコ語と合わせる形で再試が行われたが,分析がまだ未完である。平成28年度はこれまで得られた文法依存関係(主述関係,否定対極表現やwh疑問)についての知見を総合し,局所性と記憶資源の関係について,記憶引き出し(retrieval)の負荷という観点だけでなく,確率論に基づく期待の観点から総括し,実時間文処理の負荷とは何かということについての仮説を構築する。また,前年度の研究代表者の在外研究で得られた知見に基づき,特に語用論的推論が文の逐次処理の中でどのように行われるのか,それが文処理の実時間記憶資源利用とどのように関わるかについて検証できるような実験計画の構築を開始する。主語関係節と目的語関係節の相対的な処理負荷に関しては、様々な言語で検討がなされているが、主要部後置言語においては、これらの構造そのものに起因するコストと、構文の一時的な曖昧性(関係節であることを確実に示す統語情報が関係節の後まで得られない)の影響を分離することが難しいことが指摘されてきた。この問題に対処するため例えばIshizuka et al. 2006らは関係節の出現を強く予測させる先行文脈を用いた実験を行ったが、結果については検証の余地が残されている。この問題に改めて取り組みつつ、先行文脈の関係節の予測可能性そのものを操作要因に加えた(head nounが言及する指示対象の候補が1つの場合と2つの場合を設ける)デザインで実験刺激をH27年度から継続して制作中である。平成28年度には実際のデータ収集を行いその結果を分析する予定である。心理言語学平成27年度には研究代表者がカリフォルニア大学サン・ディエゴ校(UCSD)へ在外研究へ赴く。UCSDでは計算機心理言語学ラボに合流し,文理解におけるワーキングメモリーの役割を期待の蓋然性理論および局所性効果の観点などから検証し,新しい実験パラダイムや手法,および統計分析の方法を開発することを目標とする。
短時間の過酸化水素刺激による骨髄細胞の機能増強とそれに基づく血管新生療法の開発

自己骨髄細胞移植による血管新生治療は虚血性疾患に対する有望な治療法である。しかし、十分な細胞数の確保は難しく、細胞機能を増強する方法が模索されている。本研究では、低濃度の過酸化水素(H_2O_2)による短時間刺激によって骨髄細胞の血管新生能が増強するか否かを明らかとすることを目的とした。本年度は、H_2O_2刺激した骨髄細胞を移植することによって、血管新生治療の効果が向上するか否かについてin vivoでの検討を行った。C57BL/6マウスのConunon femoral arteryとその分枝を結紫して、下肢虚血モデルを作製した。その際に、(1)H_2O_2刺激した骨髄細胞(1 ×10^7)(H_2O_2刺激群)、(2)無処理の骨髄細胞(1 ×10^7)(無処理群)、(3)PBSのみ(PBS群)をそれぞれ下肢虚血部筋肉内に4箇所注入し、14日目観察した。なお、H_2O2刺激は、前年度のin vitroでの検討に基づいて、5μM H_2O_2で30分間とした。虚血下肢筋肉における移植細胞の生存(GFP陽性)と内皮分化(VE-cadherin陽性)を組織学的解析を行うと、無処理の骨髄細胞と比較して、H_2O2刺激骨髄細胞では共に増強していた(治療14日目)。アルカリフォスファクーゼ法にて毛細血管密度を評価すると、H_2O_2刺激群では他群と比べ有意に増加していた(Pく0.05;治療14日目)。また、レーザードップラー法にて測定した虚血下肢の血流回復率は、H_2O_2刺激群では他群と比べ有意に上昇していた(Pく0.05;治療7、14日目)。以上の結果から、H_2O_2刺激した骨髄細胞を移植することによって血管新生効果向上につながることが示唆された。短時間のH_2O_2刺激という本方法は、細胞移植治療に用いる骨髄細胞の機能を増強させる簡便かつ有用な手段と考えられる。自己骨髄細胞移植による血管新生治療は虚血性疾患に対する有望な治療法であるが,十分な細胞数の確保は容易ではない.一方,活性酸素である過酸化水素(H_20_2)が血管内皮増殖因子(VEGF)産生の増大や血管新生の過程に寄与するといった報告がある.本研究では,低濃度のH_20_2による短時間刺激によって骨髄細胞の血管新生能が増強するという仮説を立て,この仮説を明らかにすることを目的とした.本年度は,ex vivoで短時間H_20_2刺激することで骨髄細胞の機能増強が起こるか否かについて検討した.C57BL/6マウスの大腿骨から骨髄を採取し,比重遠心法にて単核球画分を分離した.単離した骨髄細胞をH_20_2で30分間刺激し,PBS洗浄後,以下の実験に用いた. H_20_2刺激を行わない骨髄細胞を対照群とした.至適なH_20_2刺激濃度を検討するために,24時間培養後のVEGFとVEGFレセプター2(Flk-1)のmRNA発現量をRT-PCR法にて解析した.低濃度のH_20_2刺激に応答したmRNA発現最の上昇が認められ,その上昇は5 μMの濃度で最も顕著であった(Pく0.01).また,対照群と比較して,5μMH_20_2で刺激した骨髄細胞では培養後の生存率も有意に高かった(P<0.01).以上より,至適なH_20_2刺激濃度を5μMと決定し,さらなる検討を行った.対照群と比較して,H_20_2刺激した骨髄細胞の培養上清(24時間後)中のVEGF量は有意に増加していた(P<0.001).さらに,Flk-1 (培養24時間後)およびVE-cadherin(培養7日後)抗体による免疫染色を行うとその陽性細胞率も有意に高く(P<0.05),内皮分化能の増強が示唆された.以上の結果より,低濃度(5pM)のH_20_2で短時間(30分)刺激することによって,骨髄細胞の血管新生能が増強することが示された.自己骨髄細胞移植による血管新生治療は虚血性疾患に対する有望な治療法である。

虚血下肢筋肉における移植細胞の生存(GFP陽性)と内皮分化(VE-cadherin陽性)を組織学的解析を行うと、無処理の骨髄細胞と比較して、H_2O2刺激骨髄細胞では共に増強していた(治療14日目)。アルカリフォスファクーゼ法にて毛細血管密度を評価すると、H_2O_2刺激群では他群と比べ有意に増加していた(Pく0.05;治療14日目)。また、レーザードップラー法にて測定した虚血下肢の血流回復率は、H_2O_2刺激群では他群と比べ有意に上昇していた(Pく0.05;治療7、14日目)。以上の結果から、H_2O_2刺激した骨髄細胞を移植することによって血管新生効果向上につながることが示唆された。短時間のH_2O_2刺激という本方法は、細胞移植治療に用いる骨髄細胞の機能を増強させる簡便かつ有用な手段と考えられる。