hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MHC遺伝子導入を用いたミクロキメリズムによる移植肝免疫寛容導入

【目的】ドナー由来の骨髄を臓器移植前に投与し、レシピエントとドナーの抗原が共存する状態(キメリズム)を作ると、その後移植臓器に対して免疫寛容が誘導される。しかし骨髄細胞の投与は常にGVHDの危険があるため臨床応用に対する障壁となっている。したがってキメリズム導入に必要なドナー遺伝子をレシピエントの骨髄細胞に導入して移植臓器に対する免疫寛容を誘導する。この実験の前段階の実験として、ドナー骨髄移植を用いた免疫寛容導入の実験を計画した。【材料・方法】【結果】コントロール群に比較してSC/CP群は有意に生存率が延長した。したがって本プロトコールにより臓器特異的な免疫寛容導入は可能であった。【実験結果及び今年度の目標】1.マウス肝移植モデルマウス同所性肝移植の手技はすべて顕微鏡下にておこなった。鎌田らのラット肝移植のカフ法を用いた。門脈と肝下部下大静脈はカフ法で吻合し、肝上部下大静脈は10-0 nylonにて連続縫合した。肝動脈は再建しなかった。胆管にはステントを挿入結紮固定した。マウスはレシピエントにB10.AKM、ドナーにB10.MBRを用いたところ、免疫抑制剤の投与なしでも移植肝は拒絶されず生着した。primateの免疫機構とrodentの免疫機構に若干の差を認め、実験モデルの変更を余儀なくされた。その結果、本実験のモデルとして免疫抑制剤の投与なしでは自然生着しないマウスの皮膚移植モデルを用いて実験を継続していく予定である。2.移入細胞拒絶のメカニズムの解析抗TCR-αβ抗体、放射線低線量照射、および骨髄移入を用い、MHCみマイナー抗原も異なるマウスfully-alloの組合せにおいて、皮膚移植片の永久生着をみ、ドナー特異的免疫寛容を誘導できた。自己の細胞でも異なるMHC抗原を細胞表面上に遺伝子導入した場合、拒絶されてしまう可能性がある。そこでまず、寛容誘導初期のメカニズムについて解析した。その結果、移入細胞拒絶には従来いわれていたT細胞のみならず、B細胞が関与ししていたことがわかった(現在論文執筆中)。レシピエント由来の細胞にドナーMHC抗原を発現させた細胞を用いてまずin vitroでの反応性をMLRを指標に検討する予定である。3.遺伝子導入実験レトロウイルスベクターを用いる前にpreliminaryにHVJリポソーム法にて骨髄細胞に遺伝子導入を試みたが、導入効率が悪くほとんど導入されなかった。現在、Adenovirusをベクターにしてリンパ球に遺伝子導入を試みている。
精神病態脳における大規模2光子解析法の開発

高速3次元で神経細胞およびシナプスの活動を捉えることのできる2光子イメージング法の改良を行った。これまでのピエゾを用いた焦点走査に代えて、超音波変調型GRINレンズを用いることで、さらに高速(>100kHz)な焦点走査を可能にした。これによって、縦方向に100umに伸びた点拡がり関数をもつ2光子励起を実現し、幅200um、高さ200um、深さ100umの体積内に存在する、神経細胞およびシナプスの活動を捉えることが可能となった。一方、広範囲における神経活動観察のために、低倍の対物レンズを導入し、1mm四方の範囲を観察可能にした。さらに、高速走査に伴って低下するシグナル強度を補償するために、高輝度かつ高感度な新規カルシウムプローブ分子を用いることで、体積内における単一スパインの反応を高いS/N比で観察することが可能となった。これにより、覚醒状態におけるマウス体性感覚野第2/3層錐体細胞の樹状突起において、自発活動および感覚刺激に対する応答が、近傍に位置するスパインで同期して入力することを明らかにした。また、少数のスパインへの入力によって、樹状突起において顕著にカルシウム上昇が起こる例が観察されたが、これらは樹状突起局所における情報処理過程を示していると考えられる。このように、開発した顕微鏡およびカルシウムプローブを用いることで、疾患モデル動物の神経・シナプス活動を高速かつ大規模に観察しその病態解明に貢献できることが期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。1.精神病態脳における神経回路・シナプス活動の大規模解析法の開発:高速3次元で神経細胞およびシナプスの活動を捉えることのできる2光子イメージング法を確立した。128X128ピクセルの解像度で100Hzの速度で2次元走査できる共振ミラー型2光子イメージングとピエゾスキャナを用いた高速焦点走査により、500 (x) X500 (y) X150 (z)マイクロメートルの体積をz方向に10平面、8Hzの速度で観察できる2光子顕微鏡システムを構築した。また、構築した顕微鏡を用いて覚醒行動中のマウス大脳および小脳における神経活動およびシナプス活動を観察できることを確認した。さらに、覚醒動物におけるイメージングで問題となる揺れ補正について、連続画像の2次元相関を用いて補正する方法を確立するとともに、ピクセル輝度値の相関を計算することによる関心領域(ROI)の自動抽出法を実現した。2.精神病態脳における複数脳領域の同時イメージング技術の開発:精神病態モデルマウスの脳領野間連関を解析することを目的とした、複数脳領域の同時イメージングおよび2光子イメージングー光刺激顕微鏡を開発する。今年度は複数顕微鏡による2光子イメージングー光刺激顕微鏡を行った。通常の2光子顕微鏡に近接してレーザー走査型の光刺激顕微鏡を構築し、大脳を光刺激しながら同時に小脳の2光子カルシウムイメージングまたは小脳光刺激ー大脳2光子イメージングが可能なことを確認した。当初予定していた顕微鏡の開発は順調に進んでいる。今後、3次元イメージングのさらなる高速化に取り組むとともに、複数脳領域同時イメージング顕微鏡を完成させることを目指す。さらに、これらの顕微鏡を用いた精神病態モデルマウスの解析に着手する。
ニホンアマガエルの多体系発声行動に関する数理物理学的および生物行動学的研究

平成22年度は、主にアマガエル3体系に関する実験・数理研究を行い、査読付き学術論文として公表した(Phys.Rev.E, 83, 031913 (2011))。我々は先行研究において、オスのニホンアマガエル2匹は交互に逆相同期して鳴く傾向があることを報告している。本論文においては、まずアマガエル2体系の逆相同期発声行動を説明する2次の高調波の影響を考慮した振動子モデルを導入し、それを3体系に拡張することでアマガエル3匹の同期発声行動を理論的に予測した。この際、2次の高調波の影響の大きさを表すパラメーターと3組の内1組のカエル同士の相互作用の大きさのパラメーターの2つを変化させて、振動子モデルにおける同期状態の変化を調べる分岐解析を行った。次に、3匹のアマガエルを使った行動実験を行い、理論的に予測された三相同期状態や1:2逆相同期状態が実際に観測されることを示した。この際、録音データに対して独立成分分析法を用いた時系列データ解析を行うことで、個々の同期状態の安定性を定量的に解析した。他方で、音声可視化デバイス「カエルホタル」を用いたフィールド調査を行い、実際の水田でアマガエルの空間配置と発声タイミングを検出できることを示した。今後の課題としては、このフィールド調査方法の拡張およびアマガエル多体系の振動子モデルとしての理論解析を予定している。これらの研究成果を査読付き上述の学術論文1件の他、国内会議9件および国際会議2件におけるポスター・口頭発表として公開した。平成20年度は、ニホンアマガエル3匹の発声行動に関する理論的研究を中心に進めてきた。ニホンアマガエルの場合、2匹では交互にほぼ逆位相πで同期して鳴くため(I.Aihara et.al.IEICE TRANSACTIONSon FUNDAMENTALS(2007))、3体系ではフラストレーションが内在することになり、その振る舞いは自明ではない。我々は2体系における逆相同期発声行動を定性的に説明する数理モデルを3体系に拡張し分岐解析およびリアプノフ関数解析を行なうことで、その振る舞いを数値的・理論的に調べた。その結果、2体1の逆相同期状態、3相同期状態や非同期状態を含む様々な同期現象が実際に観測されうることを示した。また、研究成果は未発表ではあるものの、2匹のアマガエルの発声行動における非同期状態の時系列データを元に相互作用関数を直接推定する研究に挑戦し、予備的な成果を得た。これは位相モデルの枠組みで、アマガエルの発声行動を理解する上で重要な成果であり、平成21年度も継続して実験およびデータ解析を行っていく。アマガエル3体系の理論研究については、査読付き学術論文として英文誌「Mathematical Biosciences」にて研究成果を発表した。また、学会発表についても後述の通り、査読付き国際会議(DDAP5)での口頭発表を含む10件を行ない、(社)音響学会関西支部第11回若手研究者交流研究発表会においては最優秀賞を受賞した。申請者が昨年度までに実験的に発見したニホンアマガエルの発声行動における同期現象に関する理論研究を行った。具体的には、位相振動子モデルにおける相互作用関数に2次の高調波および位相シフトパラメーターの影響を取り入れることで、実験的に観測した逆相同期状態および同相同期状態の共存現象をモデル内における双安定平衡状態として定量的に説明できることを示した。本研究成果は査読付き学術論文としてPhysical Review E誌に公表した。他方で、フィールドにおけるアマガエル多体系発声行動を明らかにするために、音声視覚化素子"カエルホタル"を用いた音源定位システムを開発した。"カエルホタル"は、マイクロフォン、LED、可変抵抗などから構成される簡単な電気回路であり、ある閾値以上の大きさの音声入力があると取り付けたLEDが発光する点が特徴である。申請者らは、同素子、数十個を少数のアマガエルの周囲に並べ、その発光の様子をビデオカメラで撮影する実験を行った。その結果、室内実験とフィールド調査の両方において、発声中のアマガエルの音源定位および発声タイミング検出が可能であることを示した。さらに、アマガエル発声行動の位相応答関数推定に関する数理モデル研究を行った。具体的には、平成20年度に予備的に推定した位相応答関数を時間遅れ結合振動子系としてモデル化することで、実験結果を定性的に説明できること及びアマガエルの聴覚応答時間を推定できる可能性を示した。振動子モデルを用いて脳の情報処理機構に言及した先行研究はなく、新規性の高い研究成果である。

この際、録音データに対して独立成分分析法を用いた時系列データ解析を行うことで、個々の同期状態の安定性を定量的に解析した。他方で、音声可視化デバイス「カエルホタル」を用いたフィールド調査を行い、実際の水田でアマガエルの空間配置と発声タイミングを検出できることを示した。今後の課題としては、このフィールド調査方法の拡張およびアマガエル多体系の振動子モデルとしての理論解析を予定している。これらの研究成果を査読付き上述の学術論文1件の他、国内会議9件および国際会議2件におけるポスター・口頭発表として公開した。
制癌剤のスクリーニング

既存の制癌剤を種々組合わせて投与しても、ほとんど効果の見られない難治性の癌にも有効な制癌剤は、化学構造がこれまでのものとはかなり異なる可能性も考えられる。本研究においけては構造的にも新しい制癌性物質をランダム・スクリーニングにより選別することを目的とする。このため対象とする化合物も、合成、天然由来を問わず、また元来制癌剤以外の目的で合成あるいは抽出されたものも含め、広く国内の各研究機関より収集した。1年間に25施設より350検体の提供を受けた。検定は主としてマウス白血病P388を用い、延命効果で評価した。合成物368個、天然由来物質22個をテストし、それぞれ98個(27%)および2個(9%)が有効と判定された。この内既存の制癌剤の誘導体は30個以下で、残りは外国などで類似品を検討中の場合もあるが、新しい構造を有していた。動物実験には供し得ない微量検体については、ヒト癌由来KB細胞に対する増殖抑制作用をin vitroで検定した。179検体の内、97個が50%.増殖抑制濃度4ug/ml以下で有効となった。一次の検定はすべて無償で実施した。一部の検体についてはマウス固形癌を用い、二次スクリーニングも実施した。臨床的に有効な制癌剤の選別にはヒト癌由来細胞を用いるべきという最近の考え方に対応して、4系の胃癌培養株に対する増殖抑制活性をMTT法によりin vitroでしらべた。今年度は376検体の検定を行った。全体的にみればP388の感受性が最も高いが、中には一部胃癌細胞の方により強い活性を示す物質もあり、今後はヌードマウスに移植したヒト癌に対する治療実験を行うことも計画している。当センターで継代中のマウス腫瘍またはヌードマウス移植ヒト腫瘍の分与も希望に応じて89件行った。
バイオバンキングを利用した市場メカニズム導入のための実証研究

欧米で生物多様性バンキング制度が確立しているのは,それを支える法的枠組みが整備され,開発業者やバンカー(生息地の保全・販売を行う専門業者)などの役割,保全対象種や保全行為などが細部まで定められていることに起因することがわかった。次に,生物多様性バンキング制度が我が国に導入された際の生物多様性の指標として,鳥類・昆虫類を中心に農村で保全したい優占種を20種選定し,それらの生息場所および観測季節の目安を提示した。最後に,生物多様性オフセット活動は一部地域で見られるが,現時点では生物多様性バンキング制度を全国的に導入するには法制度の確立,クレジット市場の創設など克服すべき課題が多いと結論付けられた。日本におけるバイオバンキング制度の導入可能性を検討するにあたり,既に同制度を導入し,オフセット用地やクレジットの売買が盛んな米国カリフォルニア州の制度について,現地行政機関および関係企業にヒアリング調査を行った。その結果,主に以下が明らかとなった。1生物多様性バンキング制度が成立している背景には,法的な枠組みがきちんと整備されており,生物の保全やレクリエーション,開発といった関連機関の役割が明確にされていることが明らかとなった。2生物多様性の指標生物の多くが絶滅危惧種(例:Elderberry Longhorn Beatle)であり,生物多様性の指標生物として明確なものとなっていた。但し,絶滅危惧種のみで生物多様性の指標としている点には問題がある。3生物多様性バンキングのクレジット化に際しては,指標生物の生息地面積1acreを1クレジットとして取引が行われていた。4指標生物の生息地(バンク)の生物多様性の評価・認可・登録は,専門の行政機関が担当している。5バンカー(仲介企業)はクライアントである開発業者のニーズに応じてオーダーメイドのバンクを開発するケースが多い。また,予めニーズのありそうな場所を見つけバンクを設置しているとのことであった。6視察したバンクでは,手つかずのまま保全されている場所,環境保全型農業を行う農家に貸し出している場所など,明確な目的ごとにゾーニングが行われ,管理・保全がなされていた。生物多様性バンキング制度の行政手続きや生物多様性の評価方法については,これまでの先行研究では十分明らかにされていなかった。これらの点を明らかにしたことは,我々研究チームが成し得た平成23年度における大きな成果と言える。また,国内学会や研究機関において調査結果や事例報告を報告するなど,次年度の研究に向け専門家らとの間で有益な意見交換を行うことができた。本研究課題は,農用地を利用し生物多様性の保全および向上を図る手法の一つとして諸外国で広く活用されている生物多様性バンキング制度に注目し,海外ではどのような制度・枠組みの下で実施されているのか詳細に調査し,社会科学および自然科学の両見地から我が国に適したバイオバンキング制度の導入が可能か否か,そして可能であるならば,どのような制度が望ましいのか検討するものである。最終年度となる2013年度の主な成果は次のとおりである。1国内に設けた実験圃場や都市近郊の農用地において,バンクの生物多様性を示しうる生物種を調査し,国内でバイオバンキングを導入した際に農業・農村で保全したい農地性生物を保全対象生物として鳥類・昆虫類を中心に20種選定し,それらの生息場所および目標とすべき保全数の目安を示した。2海外での制度調査やヒアリング調査の結果を踏まえ,欧州では農業環境政策の中で生物多様性をどのように位置づけ評価しているのか,また自然科学的な(特に生態学的な)見地に基づき,環境保全型農業を通じた生物多様性保全の必要性を論じるなど,学術研究論文および口頭発表を通じて対外的に成果を公表した。3諸外国では法的な枠組みを整備することでバイオバンキング制度を確立させ運用していたのに対し,わが国では法的な裏付け,整備がなされておらず,生物多様性バンキング制度の国内への導入は現時点では困難な側面が多いとの結論に至った。とはいえ,農業環境政策を通じて生物多様性を保全していく必要性は高いこと,また昨今の財政難から政府の補助金頼みの農業環境政策による支援には限界があることを考慮し,補助金に依存しない市場メカニズム活用型で,かつ生物多様性の保全に資する農業環境政策に関連する取り組み事例について調査・分析した結果をまとめている。それらは出版物として刊行する予定である。本課題は,農地を活用した生物多様性保全策の一つであるバイオバンキング制度をわが国でも導入可能か検討するものである。2012年度は農地を活用した環境保全に積極的な英国で,行政機関や同事業に参加する農家に対してバイオバンキング・パイロット事業を中心に聞き取り調査を行った。以下,その成果である。1英国では2011年からバイオバンキング・パイロット事業を開始。国内6箇所をパイロット事業地とし,生物多様性の評価を実験的に開始。クレジットの売買は調査時点では未実施。

2英国農業農村環境省(DEFRA)では開発事業者向け,土地所有者向け等のtechnical paperを発行し,その中で希少性や植生状態別に高・中・低の3段階に分けて得点化されている3実際に英国の農業環境,生物多様性保全プログラムに参加している農家にヒアリング調査を行い,別途,報告書にまとめている。また,海外制度調査とは別に,4日本国内に設けた実験圃場において,農地における生物多様性評価に資する指標種の捕獲・選定作業や,生態学的管理手法の妥当性やその効果についても検証作業を行った。平成23年度の主要な課題であった海外におけるバイオバンキング制度については,海外での詳細なヒアリングを行い,クレジット化の手法等が明らかとなった。また,同調査の結果を踏まえ,国内における生物多様性の指標生物の選定および生態学的管理方法の検討の端緒を得るに至った。一方,生物多様性の経済的価値評価に関しても国内の複数の調査地を事例とした研究が進行している。以上のように,我々の研究における4チーム各々が順調に進行していると言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに欧州および米国のバイオバンキング,生物多様性オフセット制度について現地ヒアリング調査を行い,欧米の制度比較を実施できる段階にある。また,国内の圃場で生態学的管理手法を実践し,その効果を計測し,生物多様性の指標としてどのような種が適当なのか,そのためのオプションには何が良いのか結論づけるのに十分な材料を準備できたため。研究2年目となる平成24年度における各チーム研究の方向性は,以下のとおりである。(1)海外制度調査チームは,農地を活用したバイオバンキング制度が始動した英国において海外制度調査を今夏に実施する。(2)制度設計チームは,国内の農業関係機関と連携しつつ,生物多様性の指標となる生物の選定および生態学的管理手法の提案に向け,国内の圃場を利用した実証実験を実施する。また,海外制度調査の結果を踏まえ,日本の農地を活用した日本版バイオバンキング制度の青写真を描く。(3)コンセンサス会議チームは,NPO等の協力を仰ぎ,生物多様性の保全に資する農地管理の在り方や地域農業・地域経済の活性化についてコンセンサス会議を企画実施する予定である。(4)政策評価チームは,平成23年度に引き続き生物多様性の経済評価を実施すると共に,農業関係者やNPOなどを対象とし,バイバンキングや生態学的管理への関心・協力など意向調査を検討している。研究最終年度となる平成25年度は,研究期間全体のとりまとめも見据え,各研究チームの取り組みの方向性は以下のとおりとする。1海外制度調査チームは,米国および英国における農地を活用したバイオバンキングをはじめとする生物多様性保全のための制度の特徴や欠点をまとめる。2制度設計チームは,海外のバイオバンキング制度の利点などを参考に,日本に適したバイオバンキング制度あるいはそれに類似する制度や,それを構築するための必要条件などを提示する。
神経膠芽腫における各種遺伝子異常の統計的解析と選択的治療法の確立

我々は脳腫瘍に対する選択的治療法を確立するため、各種脳腫瘍、特に悪性脳腫瘍(神経膠芽腫)におけるさまざまな遺伝子異常を検討し、統計的に解析し、その解析結果を脳腫瘍患者の臨床的特徴と比較検討する作業を行ってきた。特に各種脳腫瘍のさまざまな遺伝子異常の解析においてアレイシステムを利用することを最終目的として、その基礎実験を進めてきた。本研究期間において以下の結果を得た。1)神経膠芽腫においてアポトーシスと関連する遺伝子デコイレセプター3が高頻度に遺伝子増幅されており、本遺伝子の増幅頻度は悪性度と相関して高くなっていた。この事象は神経膠芽腫がアポトーシス経路から回避され、不死化(悪性化)する原因のひとつであると考えられた。2)中枢神経系悪性リンパ腫において、細胞周期関連遺伝子であるINK4aの相同的欠失が約6割において認められ、相同的欠失を認めるものにアポトーシス関連因子であるbcl-2が高頻度に高発現していた。またこれらの患者群は本遺伝子異常を有しない患者群にくらべ有意に予後が不良であった。3)欧米人に比べ日本人に有意に高率に発生する頭蓋内杯細胞性腫瘍において、リンパ腫や奇形腫の発症に関連するといわれているbcl-10の特異なSNP(single nucleotide polymorphisms)が有意に高率に認められた。本SNPが日本人における胚細胞腫に発生に関与している可能性が示された。以上の結果をもとに、更にアレイシステムを利用し、他の遺伝子群の発現との関連および臨床的特徴との関連を現在検討中である。我々は当教室に保存されている脳腫瘍標本より、約150例のDNAを抽出し、DNAバンクを設立した。DNA数に関しては今後も増加予定である。またパラフィンより抽出された各DNAがどれくらいの精度を有し、どのような酵素反応に適しているかに関してもPCR反応を含め、様々な実験により確認している。これらのDNAを利用し、神経膠芽腫および悪性リンパ腫の代表的な遺伝子異常に関してDNA解析中である。たとえば神経膠芽腫に関しては約60例の腫瘍サンプルより得られたDNAを用いて特殊な遺伝子増幅を検討中である。その中でも、デコイレセプター遺伝子(DcR3)に関しては神経膠芽腫の約20%に遺伝子増幅を認めた(投稿中)。また約20例の悪性リンパ腫においては悪性腫瘍に多く認められるTP53遺伝子やMDM2遺伝子の異常は認められず、INK4a/ARF遺伝子の欠失を認め、予後との相関を示した(投稿中)。今後はされにこれらの遺伝子異常を他の悪性脳腫瘍にて検討すると同時にDNAマイクロアレイを用いて今回の結果を検証することによりアレイの信頼性を確認し、更なる規模の大きな遺伝子異常のスクリーニングスタディを行う予定である。我々は脳腫瘍に対する選択的治療法を確立するため、各種脳腫瘍、特に悪性脳腫瘍(神経膠芽種)におけるさまざまな遺伝子異常を検討し、統計的に解析し、その解析結果を脳腫瘍患者の臨床的特長と比較検討する作業を行ってきた。1)神経膠芽種においてアポトーシスと関連する遺伝子デコイレセプター3が高頻度に遺伝子増幅されており、本遺伝子の増幅頻度は悪性度と相関して高くなっていた。この事象は神経膠芽種がアポトーシス経路から回避され、不死化(悪性化)する原因のひとつであると考えられた。

3)欧米人に比べ日本人に有意に高率に発生する頭蓋内杯細胞性腫瘍において、リンパ腫や奇形種の発症に関連するといわれているbcl-10の特異なSNP(single nucleotide polymorphisms)が有意に高率に認められた。本SNPが日本人における胚細胞種に発生に関与している可能性が示された。以上の結果をもとに、更にアレイシステムを利用し、他の遺伝子群の発現との関連および臨床的特徴との関連を現在検討中である。
骨系統疾患治療薬の開発に向けた内軟骨性骨化促進系の分子メカニズムの解明

ナトリウム利尿ペプチドファミリーは内因性の3種類のリガンドであるANP、BNP、CNPおよびその受容体GC-A、GC-Bから構成される。研究代表者らはこれまでに、そのうちのCNP-GC-Bシステムの強力な内軟骨性骨化による骨伸長促進作用と、軟骨無形成症モデルマウスにおけるCNPによる劇的な治療効果を証明した(Nat.Med 2004)。更にCNPは、FGFシステムのMAPKシグナル伝達系を介した基質産生抑制を回復することにより、骨伸長障害を改善することを証明してきた。当該研究においては、CNP-GC-BシステムとFGFシステムの細胞内シグナル伝達系の相互作用をさらに検討した。まず、FGFシステムは成長板軟骨において(1)MAPK系およびSTAT1系を介して作用するが、CNPはSTAT1系には影響を及ぼさないこと、(2)PI3キナーゼ/PKBを介するシグナル伝達系があり、CNPはそれを抑制するが、生体環境に近いと考えられるヘパリン存在下ではPI3キナーゼ/PKB系そのものが抑制されていること、を証明した。逆に、FGF2添加によるFGFシステムの賦活化は、CNP-GC-Bシステムのセカンドメッセンジャーである細胞内cGMP産生を濃度依存的に抑制したことから、成長板軟骨におけるCNP-GC-BシステムとFGFシステムの細胞内シグナル伝達系の相互作用が明らかとなった。一方、CNP-GC-Bシステムは様々な修飾を受けてその作用が調節されているが、そのうちのひとつであるCNPのクリアランス系に関して検討し、成長板軟骨において局所CNP濃度を調節するクリアランス系の存在と、その骨伸長調節作用の存在を示して、骨伸長促進系としてのCNP-GC-Bシステムの調節機構の一端を明らかとにした。研究代表者らはこれまでに、CNP-GC-Bシステムの強力な内軟骨性骨化促進作用と、軟骨無形成症モデルマウスにおけるCNPによる劇的な治療効果を証明した(Nat.Med 2004)。当該研究において、CNP-GC-BシステムとFGFシステムの細胞内シグナル伝達系の相互作用を検討し、CNP-GC-Bシステムの内軟骨性骨化促進作用の分子メカニズムの更なる解析をおこなった。まず、ex vivo成長板軟骨組織培養系におけるMAPK系以外のFGFシステムのシグナル伝達系の有無を検討したところ、FGF2の添加により著明なSTAT1の、また中等度のAktのリン酸化を認めたが、PLC-γおよびp38のリン酸化はほとんど認めなかった。次にFGF2添加によるSTAT1およびAktのリン酸化に対するCNPの効果を検討したところ、前者にはほとんど影響を与えなかったが、後者ではその作用を著明に抑制した。さらに、ヘパリン添加によってFGF2に対するAktのリン酸化は著明に抑制された。以上より、FGFシステムは成長板軟骨において(1)MAPK系およびSTAT1系を介して作用するが、CNPはSTAT1系には影響を及ぼさないこと、(2)PI3キナーゼ/PKBを介するシグナル伝達系があり、CNPはそれを抑制するが、生体環境に近いと考えられるヘパリン存在下ではPI3キナーゼ/PKB系そのものが抑制されていること、が証明された。逆に、FGF2添加によるFGFシステムの賦活化は、CNP-GC-Bシステムのセカンドメッセンジャーである細胞内cGMP産生を濃度依存的に抑制した。以上より、成長板軟骨におけるCNP-GC-BシステムとFGFシステムの細胞内シグナル伝達系の相互作用が明らかとなった。

更にCNPは、FGFシステムのMAPKシグナル伝達系を介した基質産生抑制を回復することにより、骨伸長障害を改善することを証明してきた。昨年度の当該研究において、CNP-GC-BシステムとFGFシステムの細胞内シグナル伝達系の相互作用を検討し、CNP-GC-Bシステムの内軟骨性骨化促進作用の分子メカニズムの更なる解析をおこなった。今年度はCNPの局所調節機構としてのクリアランス系に関して検討し、成長板局所におけるクリアランス受容体(C受容体)のCNP局所濃度調節作用が内軟骨性骨化による骨伸長に及ぼす効果を、器官培養を用いて検討した。方法としては、野生型およびCNP欠損マウス胎仔脛骨器官培養系を用いて、C受容体のアゴニストであるC-ANFを添加し、解析をおこなった。まずRT-PCRにて培養脛骨成長板軟骨においてC受容体の遺伝子発現が確認された。C-ANFは濃度依存的に野生型成長板軟骨におけるCNP/GC-BシステムのセカンドメッセンジャーcGMPを増加させ、野生型マウス培養脛骨の全長、および組織学的解析による成長板軟骨層の伸長を促進した。一方C-ANFはCNP欠損マウス培養脛骨の伸長は促進しなかった。以上より、成長板軟骨において局所CNP濃度を調節するクリアランス系が存在して内軟骨性骨化による骨の伸長を調節していることが示され、骨伸長促進系としてのCNP-GC-Bシステムの調節機構の一端が明らかとなった。
外分泌機転におけるプロテアーゼ活性化型受容体2に着目した形態機能解析

Protease-activated receptor(PAR)は、特定のプロテアーゼによって活性化されるGタンパク共役型7回膜貫通型受容体である。最近の研究では、PARは分泌など種々の細胞機能に関わっているとの報告がある。本研究では、ラット耳下腺を用いてPAR-2の機能をカルシウムイメージング法を用いて検討した。耳下腺においてPAR-2受容体の発現が強く認められた。PAR-2アゴニストのSLIGRL-NH_2の投与によって[Ca^<2+>]_iの上昇を認めた。これは細胞外のCa^<2+>除去によっても消失せず、Gd^<3+>投与によっても同様であった。また、NOのdonorの投与でこの流入は増強した。これらのことから、PAR-2は細胞内ストアを刺激して[Ca^<2+>]_iの上昇を引き起こし、続くCa^<2+>濃度の上昇は、non-capacitative calcium entry(NCCE)によるものと示唆された。また、PAR-2APによる[Ca^<2+>]_iの上昇は、一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤のL-NAME投与によって部分的に抑制され、リアノジン受容体抑制剤のテトラカイン存在下やADPリボシルサイクラーゼを抑制しても同様な部分抑制が見られた。これに対し、calmodulin kinase IIを抑制することによって[Ca^<2+>]_iの上昇完全に阻害された。その他各種キナーゼ阻害剤使用によって[Ca^<2+>]_i上昇に変化は認められなかった。また、calmodulinを抑制した場合も同様に完全抑制が見られた。以上から、PAR-2受容体刺激による[Ca^<2+>]_iの上昇にNOS、リアノジン受容体が関与していることが示唆され、これらの上流にCalmodulinやCAM kinase IIが存在していることが示唆された。外分泌機構でのプロテアーゼ活性化型受容体2の役割の解明を企図して、ラット耳下腺の細胞内カルシウム濃度([Ca^<2+>]_i)変動をモニターし、反応機構を解析する実験をはじめた。表記の研究に関する研究成果はまだ論文発表に至っていないが、現在までわかったことを列挙すると、1. [Ca^<2+>]_iに対するプロテアーゼ活性化型受容体2の影響を調べるため、合成ペプチドであるSLIGRL-NH_2(PAR2-AP)の投与による実験を行った。PAR2-AP投与により、耳下腺腺房細胞の[Ca^<2+>]_i上昇を認めた。これらのことから、PAR-2は細胞内ストアを刺激して[Ca^<2+>]_iの上昇を引き起こし、続くCa^<2+>濃度の上昇は、non-capacitative calcium entry (NCCE)によるものと示唆された。2.上記機序についてさらに検討したところ、PAR-2APによる[Ca^<2+>]_iの上昇は、一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤のL-NAME投与によって部分的に抑制され、リアノジン受容体抑制剤のテトラカイン存在下やADPリボシルサイクラーゼを抑制した状態でも同様な部分抑制が見られた。以上から、PAR-2受容体刺激による[Ca^<2+>]_iの上昇にNOS、リアノジン受容体が関与していることが示唆された。今後、更なる受容体の作用機序を検討する予定である。

外分泌機構でのプロテアーゼ活性化型受容体2の役割の解明を企図して、ラット耳下腺の細胞内カルシウム濃度([Ca^<2+>]_i)変動をモニターし、反応機構を解析する実験をはじめた。表記の研究に関する研究成果はまだ論文発表に至っていないが、現在までわかったことを列挙すると、1.プロテアーゼ活性化型受容体2の合成ペプチドであるSLIGRL-NH_2(PAR2-AP)の投与によって、耳下腺腺房細胞の[Ca^<2+>]_i上昇を認めた。この上昇は細胞外のCa^<2+>除去によっても消失せず、Gd^<3+>存在下でも同様に消失しなかった。また、NO(一酸化窒素)donorの投与で細胞外のCa^<2+>流入は増強した。これらのことから、PAR-2はまず細胞内ストアを刺激して[Ca^<2+>]_iの上昇を引き起こし、それに続くCa^<2+>濃度の上昇は、non-capacitative calcium entryによるものと示唆された。2.上記機序についてさらに検討したところ、PAR-2APによる[Ca^<2+>]_iの上昇は、NO合成酵素(NOS)阻害剤のL-NAME前投与によって部分的に抑制され、リアノジン受容体抑制剤のテトラカイン存在下やADPリボシルサイクラーゼを抑制した状態でも同様な[Ca^<2+>]_iの上昇の部分抑制が見られた。以上から、PAR-2受容体刺激による[Ca^<2+>]_iの上昇にNOS、リアノジン受容体が関与している可能性が示唆された。3.上記の反応に対し、calmodulin kinase II(CAMK II)を抑制することによって[Ca^<2+>]_iの上昇は完全に阻害された。また、calmodulinを抑制した場合も上記と同様に完全抑制が見られた。その他各種キナーゼ阻害剤存在下にて[Ca^<2+>]_i上昇に変化は認められなかった。以上から、PAR-2受容体の[Ca^<2+>]_iの上昇反応において、NOSやリアノジン受容体の上流にcalmodulinやCAMK IIが存在していることが示唆された。上記3つの結果を踏まえて来年度さらなる考察を加え、国際雑誌に発表することを目標とする。PAR-2アゴニストのPAR-2AP(SLIGRL-NH_2)の投与によって[Ca^<2+>]_iの上昇を認めるが、この機構について今までに得られている結果についてさらに検討を重ねた。PAR-2APによる[Ca^<2+>]_iの上昇は、NOS阻害剤のL-NAME投与によって部分的に抑制された。一酸化窒素(NO)の関与する機構が働いていると示唆され、リアノジン受容体やADPリボシルサイクラーゼについても検討した。これら双方をテトラカインやDHABを用いて抑制しても、NOS阻害と同様な部分抑制が見られた。各種キナーゼの関与についても検討した。、calmodulin kinase II(CAMK II)を抑制することによってこの[Ca^<2+>]_iの上昇が完全に阻害された。その他各種キナーゼ阻害剤使用によって[Ca^<2+>]_i上昇に変化は認められなかった。また、calmodulinを抑制した場合もCAMKIIの場合と同様に完全抑制が見られた。
幼樹開花性を利用したCRISPR/Cas9システムの果樹での展開および評価

本研究では、花成抑制機能をもつFT/TFL1ファミリー遺伝子群にCRISPR/Cas9システムにより変異を導入し、早期開花を誘導するとともに、その後の交雑により組換えDNAが除かれた個体を選抜することで、狙った位置に組換えをおこし、かつ組換えの痕跡を残さない個体を果樹で作出することを目標としている。当初想定した研究材料であるカンキツに加えて、幼木相が比較的短くかつ年複数回開花性をもつブルーベリーや早期開花性をもつ亜熱帯果樹を実験対象として新たに加え、幼木相が短く年数回開花性をもつ果樹の探索や情報収集をおこなった。ハイブッシュブルーベリーのうち一部の品種は、台湾など日長が短く温暖な低緯度地域では春季に加えて秋季にも開花することを確認した。特に`ブルーマフィン'は環境条件にかかわらず夏から冬にかけて連続開花し、台湾では常緑性で周年開花することも確認した。これらを材料として用いることで研究が進展すると考え、ブルーベリーを材料に実験をおこなった。花成抑制遺伝子であるCEN遺伝子をターゲットとしたCRISPR/Cas9ベクターを4種類作製し、計約3000枚リーフディスクに対しアグロバクテリウム法により遺伝子導入を行った。GFP発現およびカナマイシン耐性により形質転換体を選抜した。PCRで外来遺伝子の挿入を確認した形質転換体13系統中7系統でT7E1 assayにより変異が検出された。シークエンス解析によりそのうち数系統でCEN遺伝子内に1塩基の欠損が見られた。しかしながら研究期間内において、顕著な表現型の変化は観察されなかった。本研究は、幼樹開花性をもつカンキツを対象として、人工ヌクレアーゼを使ったゲノム編集技術を今後果樹に応用するための知見を得ることを目的としている。すなわち、幼樹開花性をもつグレープフルーツを研究対象として、花成抑制遺伝子であるTFL1を標的遺伝子とした欠損変異の創成を目的としている。早期開花を促すことで次世代における遺伝やオフターゲットの発生頻度の調査を目標としている。当該年度は、幼樹開花率上昇を目的としてグレープフルーツの実生を供試して低温処理ならびにジベレリン処理をおこない、幼樹開花率を調査した。多胚性のカンキツであるグレープフルーツ`マーシュシードレス'とナツダイダイ、ならびにブンタン`土佐文旦'果実を供試した。これらの果実より成熟種子をとりだし、外皮をむいて25°C環境下で発芽を誘導した。内皮を除去し、多胚性種子においてはそれぞれの胚を分離させて、園芸培土に播種した。半数の個体の展開葉数が7枚以上となった時点で、低温処理(15°C以下)あるいはジベレリン処理(GA3 100ppm)をおこなった。各処理区につき9-19個体を供試した。冬季は低温障害を回避するために、12月から3月にかけてガラス温室内で育成した。その結果、ブンタンおよびナツダイダイでは着蕾が観察されなかったが、グレープフルーツではいくつかの処理区で着蕾が観察された。秋期の低温は幼樹開花率を上昇させること、ジベレリン処理は処理時期によって開花に対して正あるいは負の影響があることを明らかにした。すなわち、低温処理(9-11月)と11月ジベレリン処理を組み合わせて幼樹開花個体の獲得率を向上させることが可能であるため、この条件でゲノム編集個体の早期開花を促す予定である。安定して幼樹開花を誘導できる条件をみつけることができおおむね順調に進展している。現在ターゲット配列の選定と組織培養体の維持を続けており、ベクターを構築後ゲノム編集個体を得る予定である。本研究では、花成抑制機能をもつFT/TFL1ファミリー遺伝子群にCRISPR/Cas9システムにより変異を導入し、早期開花を誘導するとともに、その後の交雑により組換えDNAが除かれた個体を選抜することで、狙った位置に組換えをおこし、かつ組換えの痕跡を残さない個体を果樹ではじめて作出することを目標としている。前年度までに高い幼樹開花率を示すグレープフルーツを供試して、幼樹開花率を上昇させるための技術開発をおこなった。当該年度はCRISPR/Cas9ベクター構築のため、グレープフルーツにおけるFT/TFL1ファミリー遺伝子の系統解析と配列特定をおこない、発現解析より花成制御における役割推定をおこなった。クレメンティンのゲノム配列を元に解析をおこなった結果、FT/TFL1ファミリーに属する遺伝子はCEN, TFL1, BFT, FT, MFTクレイドに分けられることが明らかとなった。このうち先行研究よりFTとMFTはシロイヌナズナと同様カンキツ属においても花成促進機能をもつことがわかっている。CEN, TFL1, BFTはシロイヌナズナにおいて花成抑制機能をもつことがわかっているがカンキツ属では詳細な解析がおこなわれていない。そこでこれら3つの遺伝子群について、幼樹開花性をもつグレープフルーツと幼樹開花性をもたないナツダイダイの珠心胚由来実生よりクローニングをおこない配列比較をおこなった。両種とクレメンティンにおいて大きな配列の違いは認められなかった。一方発現解析の結果、TFL1とCENの発現量は両種で大きな差異はなかったものの、BFTは秋季のナツダイダイで高発現していた。そこでBFTに変異を挿入することで幼樹開花を誘導できる可能性を考え、BFTをターゲットとするCRIPR/Cas9ベクターの構築を進めた。当該年度までにCRISPR/Cas9ベクターを構築する予定であったが、ターゲットとなる遺伝子の配列特定に時間を要し、構築できなかった。近年、Cas9ベクターに改変を加えた改良型ベクターの開発が進んでいるため、ベクターの最適化にも時間を要した。

本研究では、花成抑制機能をもつFT/TFL1ファミリー遺伝子群にCRISPR/Cas9システムにより変異を導入し、早期開花を誘導するとともに、その後の交雑により組換えDNAが除かれた個体を選抜することで、狙った位置に組換えをおこし、かつ組換えの痕跡を残さない個体を果樹で作出することを目標としている。前年度までにカンキツを材料として解析と遺伝子組換え個体の作出に挑戦していたが、カンキツの培養個体の作出と安定的に形質転換体を作出する技術の確立に困難を要した。そこで本年度は、幼木相が比較的短くかつ年複数回開花性をもつブルーベリーを実験対象として新たに加えた。ブルーベリーのうち、ノーザンハイブッシュブルーベリーは遺伝的に年1回開花性をもつ一方で、サザンハイブッシュブルーベリーは環境条件によって年複数回開花性をもつ。このうち、`オニール'は日長が短く温暖な低緯度地域では春季に加えて秋季にも開花する一方、`ブルーマフィン'は環境条件にかかわらず夏から冬にかけて連続開花し、低緯度地域では落葉がおこらず周年開花する。FT/TFL1ファミリー遺伝子の遺伝子発現について季節変動を調査した結果、花成抑制遺伝子のひとつであるCEN遺伝子が、年1回開花性と年複数回開花性の違いを説明する因子としてもっともふさわしい発現変動を示した。そこでCEN遺伝子に着目して現在ノックアウト個体を作出するためのCRISPR/Cas9ベクターを作成中である。一方、年複数回開花性品種であるブルーベリー`ブルーマフィン'から培養個体を作出し、マーカー遺伝子を用いた形質転換実験をおこなった。その結果、マーカー遺伝子であるGFP遺伝子を組み込んだ形質転換体を得ることに成功した。今後は、作成したベクターを用いた形質転換実験を試みる。研究実績の概要でも触れたように、当初カンキツを用いたゲノム編集検証実験を計画していたが、培養個体の作出と安定的な遺伝子導入技術の習得に困難をきわめた。そこで、培養が比較的容易で、かつ幼木相の短い他果樹種を用いた研究へと計画を変更した。ゆえに当初の目標を達成するうえでは現在の進捗状況はやや遅れている。当初想定した研究材料であるカンキツに加えて、幼木相が比較的短くかつ年複数回開花性をもつブルーベリーや早期開花性をもつ亜熱帯果樹を実験対象として新たに加え、幼木相が短く年数回開花性をもつ果樹の探索や情報収集をおこなった。ハイブッシュブルーベリーのうち一部の品種は、台湾など日長が短く温暖な低緯度地域では春季に加えて秋季にも開花することを確認した。特に`ブルーマフィン'は環境条件にかかわらず夏から冬にかけて連続開花し、台湾では常緑性で周年開花することも確認した。
迅速X線回折法によるポリ酸塩結晶からの非構造水脱離初期過程の解明

本研究は結晶の風解現象つまり結晶溶媒脱離現象は、結晶内での物質移動にほかならないことに着目し、非常に風解性の強い結晶を迅速X線回折装置を用いて構造解析することにより結晶溶媒脱離の初期過程を解明することを目的とする。本年度の研究ではまず、有機溶媒中から生成する3価のランタンとモリブデン酸との複合体結晶について検討を加えた。X線構造解析の結果、この系ではランタン1原子当たりモリブデンの8量体が2つ会合したものと、逆にモリブデンの8量体1つに対しランタンが2原子会合した2種類の錯体が存在することが明らかとなった。両錯体とも非常に速やかに結晶溶媒のアセトニトリルを放出し、結晶が崩壊するために通常の四軸型自動回折計を用いた数日から数週間単位のタイムスケールでの測定では構造決定は不可能であるが、迅速X線回折装置を用いた数時間程度での測定を行うことにより、結晶が崩壊する前に構造を決定した。この結果についてはActa Crystallographica誌Section A,Vol52,page C-319(1996)に発表した。また、結晶水分子の放出を検討するために、デカバナジン酸イオンと種々の4級アンモニウムイオンとの結晶を合成した結果、テトラメチル、テトラエチルアンモニウム塩では結晶水を取り込んだ結晶が生成するが、テトラプロピル、テトラブチルアンモニウム塩では結晶水を取り込まない結晶が生成することがX線構造解析の結果から明らかとなった。前者2種の結晶について結晶中からの溶媒脱離現象について詳細に検討中である。
ｍｉｃｒｏＲＮＡが関与する翻訳抑制機構の素過程の解析

cap構造の認識から開始される翻訳開始複合体の形成は翻訳の律速段階であり、タンパク質合成を調節するうえでこの過程を制御することは効率がよく、翻訳開始因子群のリン酸化を担うシグナル伝達因子を中心に実例も数多くある。そしてこれまでにmiRNAによる翻訳抑制の標的は翻訳の律速段階である開始であることが強く示唆されている。したがって翻訳を下方修正する手段としてmiRNAによる翻訳開始の抑制は効率的であるといえる。しかしながら、高等真核生物におけるmiRNAによる翻訳開始過程の抑制の素過程は、精力的に研究されているmiRNAが触媒するmRNAの分解過程とは異なりその詳細が明らかにされていない。そこで、miRNAによる翻訳開始抑制時に、翻訳開始過程のどのステップが標的とされているのか、またどのような因子を標的としているのかを申請者が有する生化学的技法を駆使して、明らかにすることを試みた。その結果、miRNAによる翻訳抑制機構は、翻訳開始因子の1つを標的としていることを明らかにした。25年度が最終年度であるため、記入しない。独自の無細胞翻訳系を様々な哺乳類の細胞を用いて構築し、翻訳過程、特に翻訳開始過程を詳細に検証できる系の構築を行った。具体的には既に構築済みのluciferase mRNAにmicroRNAの標的配列を付加したレポーターRNAを用いて、microRNAの存在下および非存在下でのレポーターの発現を無細胞翻訳系で検証した。microRNAはmiR-1を用いた。さらに、λファージのNタンパク質に由来するペプチドをGSTと融合し、Nタンパク質によって認識される15ヌクレオチドのヘアピン型RNAであるBoxB配列を、レポーターmRNAの3'非翻訳領域に挿入したmRNAを構築し、このmRNAを用いたin vitro翻訳系においてGST融合Nタンパク質を用いたGST-pull down実験によりmRNP pull-down実験を実施した。この系において、cap構造の違いやmicroRNA存在下および非存在下におけるmRNP上の構成成分を詳細に解析した。その結果、microRNA存在下および非存在下におけるmRNP構成の重要な違いを発見した。これまでに、HeLa細胞抽出物を用いた無細胞翻訳系では判定が難しかったmiRNAによる翻訳制御を観察する系が、別の細胞を用いることで劇的に進展した。また、その結果、遂行が困難であると思われたmRNA-pull dwonによる構成成分の違いを明確に判定することが可能になった。研究計画通りに進行している。今後、翻訳開始機構に対するmiRNAマシナリーの抑制効果と、翻訳開始を活性化させる翻訳開始因子のリン酸化、そして申請者がこれまで研究していたHuDをはじめとするRNA結合タンパク質が、翻訳開始複合体形成時にお互いどのように影響をおよぼすかを検証する。具体的には、in vitro翻訳系における競合をレポーター遺伝子の発現を指標に検証し、そのときに形成される翻訳開始複合体およびポリソーム画分に含まれる因子を詳細に解析する。
半乾燥熱帯アフリカにおけるルーピンを用いた土壌難溶性リン利用技術の開発

サブサハラアフリカに分布する強風化土壌では、土壌リンの多くはFe・Al酸化物と結合した通常の植物が利用できない形態(=難溶性リン)で存在する。本研究では、この難溶性リンを効率的に利用可能な植物として注目を浴びている、White lupinを始めとした3種のマメ科作物を対象に、タンザニアに分布する熱帯強風化土壌を用いてポット試験を行い、根圏土壌における難溶性リンの可給化能を評価し、その特性を解明した。この結果、White lupinのみが難溶性無機態リンを多く可給化すること等を解明し、難溶性リン可給化技術の開発に必要な知見が得られた。実験初年度に相当する今年度は、国外よりルーピンの種を購入した上で、日本国内での室内実験において、自作した根箱(1L)を用いたルーピン栽培試験と、タンザニア・ソコイネ農業大学内において、自作したポット(4L)を用いたルーピン栽培試験(90日)を実施した。これらの実験により、まず熱帯地域におけるルーピン栽培に必要な基礎的知見を得るとともに、ルーピンの根近傍土壌を根圏土壌として、それ以外の土壌をバルク土壌として植物体とともに採取した。次年度以降、採取した土壌・植物体の分析を進めることで、ルーピンが難溶性リンを可給化するメカニズムに関して検討を行う。また、当初予定していた粘土質土壌に加え、土壌条件の大きく異なる砂質土壌も実験に用いることができた。これによりルーピンによる難溶性リン可給化メカニズムについて、土壌環境ごとに異なる知見が得られることが期待でき、ひいては得られる成果の適用範囲を拡大できることが期待される。また、ルーピンの比較対象として、現地でもっとも栽培されているマメ科植物のキマメとカオピーについても同様のポット試験を行った。一方で、栽培期間が50日を越えた段階から、多くのルーピンに、過湿が原因で繁殖したと思われる病気が発生し始めたことから、将来的な普及を実現するためには、適切な栽培環境の特定が必要であることも判明した。今年度は、昨年度タンザニア・ソコイネ農業大学内において実施した、ポット(4L)を用いたルーピン栽培試験により得られた、土壌試料および植物体試料の分析ならびに解析を主に実施した。また、ルーピンの難溶性リン可給化能を現地でよく利用されているマメ科作物と比較するために、新たに2種のマメ科作物(カオピーとピジョンピー)も、同様の方法で現地においてポット試験を実施し、土壌試料および植物体試料を採取し、必要な分析および解析を実施した。この結果、マメ科作物3種に共通して観測される特徴として、可給度が比較的高い画分の無機態リンを全てのマメ科作物が利用・吸収していることが判った一方で、ルーピンのみに観測された特徴として、可給度が比較的低い(難溶性リンに相当する)画分のリンが多く可給化されていることが判った。さらに、このルーピンにのみ観測された難溶性リン可給化能の特性は、粘土質土壌と砂質土壌の両方において観測された。このことは、土壌環境によらず、ルーピンが他のマメ科とは異なる形で難溶性リンを可給化・利用していることを示唆している。また、既存の研究では効果があるとされていた窒素施肥に伴うマメ科作物の難溶性リン可給化能の向上は、今回の試験では3種全てにおいて顕著な効果は観測されなかった。このことから、当該地域におけるマメ科作物の難溶性リン可給化能は、窒素ではない他の要因により律速されていることが示唆された。今年度は、過去2年間でタンザニア・ソコイネ農業大学内において実施した、ポットでのルーピン栽培試験により得られた、土壌試料および植物体試料の分析ならびに解析を実施し、その成果をまとめたものを国際誌(Biology and fertility of Soils, IF=3.4)において公表するとともに、アフリカでの国際学会および国内学会において、その成果を広く公開した。本研究で新規に発見したことは、強い難溶性リン可給化能を持つとされていたが、アフリカ特有の気候・土壌環境下ではその能力が未知数であったシロバナルーピンが、当該地域で一般的に栽培されているマメ科作物2種(カオピーとピジョンピー)と比較して、酸化鉄・アルミニウムと結合した無機態リン(難溶性リンに相当)をより多く可給化している、ことである。これに加えて、マメ科作物3種に共通する特徴として、可給度が高い画分の無機態リンの増加も発見し、ある程度のリン可給化能はマメ科作物が有していることも示した。また、マメ科作物が持つ難溶性リン可給化能は、窒素施肥の多寡にかかわらず同一であったことから、少なくとも生育初期の条件化において、窒素施肥はマメ科作物が持つ難溶性リンの可給化能を促進しないことが明らかになった。加えて、土壌中の難溶性リンが多い粘土質土壌と、難溶性リンが少ない砂質土壌とで比較した結果、粘土質土壌でマメ科作物によるリン可給化・吸収が顕著に観測されたことから、今後、シロバナルーピンを始めとするマメ科作物を利用した難溶性リンの利用技術を開発・普及する際には、対象地域の土壌環境も非常に重要であることを示した。また、これらの結果は、無機態リンであり溶解度が低いために利用効率が低いとされ使用が敬遠されてきたリン鉱石資源を、マメ科作物の栽培とあわせて使用することで、リン鉱石の利用効率改善につながることも示唆している。サブサハラアフリカに分布する強風化

土壌では、土壌リンの多くはFe・Al酸化物と結合した通常の植物が利用できない形態(=難溶性リン)で存在する。本研究では、この難溶性リンを効率的に利用可能な植物として注目を浴びている、White lupinを始めとした3種のマメ科作物を対象に、タンザニアに分布する熱帯強風化土壌を用いてポット試験を行い、根圏土壌における難溶性リンの可給化能を評価し、その特性を解明した。この結果、White lupinのみが難溶性無機態リンを多く可給化すること等を解明し、難溶性リン可給化技術の開発に必要な知見が得られた。当初計画していた通り、現地の気候・土壌環境下でのルーピン栽培試験を達成し、現地のマメ科作物が持つリン可給化能とルーピンが持つリン可給可能を比較することができ、当該地域における難溶性リン可給化技術に必要な広範な知見を獲得することができた。加えて、同実験を、計画段階で予定していた1種類の土壌だけでなく、土壌条件が異なる、粘土質な土壌と砂質な土壌の2種類を用いて遂行することができたため、ルーピンを含むマメ科作物各種が持つ難溶性リン可給化能について、土壌環境が及ぼす影響も明らかにすることができた。環境土壌学本研究課題は現在のところ予定通り進んでいる。今年度はルーピンなどのマメ科作物残差を、有機資材として利用するための培養実験を行うとともに、これまでに得られた研究成果の公表を進める。当初計画していた通り、現地の気候・土壌環境下でのルーピン栽培試験を達成することができたため、計画は概ね予定通り進んでいるといえる。また、当初予定していた1種類の土壌を用いたポット試験を行うのではなく、土壌条件が異なる、粘土質な土壌と砂質な土壌の2種類を実験に供することができた。これによりルーピンの難溶性リン可給化メカニズムに関して、土壌環境ごとに異なる知見が得ることが可能となり、得られる成果の適用範囲が拡大することが期待される。また、現地で栽培されているマメ科植物も同実験に組み込んだことで、現地植物のリン可給化能とルーピンのリン可給可能を正確に比較・検討することが可能になったことから、当該地域における難溶性リン可給化技術に必要な知見の広範な獲得が期待できる。本研究課題は現在のところ予定通り進んでいるが、ルーピンを適切に栽培するための環境特定のためのポット試験を新たに実施する。