hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ノイズ電気刺激が前庭系の神経細胞に及ぼす影響についての機能解析

マウスにノイズ前庭電気刺激を与えるために、刺激電極を作製した。前庭神経核イメージングに最適化された遺伝子導入方法の検討を行った。ウイルスは、アデノ随伴ウイルス(AAV1-hSyn-GCaMP6s, AAV1-hSyn-GCaMP6f, AAV1-hSyn-GCaMP7f)を用いた。まず、マウスの頭部を水平に保つため、頭部固定装置と頭部固定プレートを改良し、安定して頭部を固定させた。マーキングの工夫を行い、前庭神経核に挿入する針先の挿入部位の後頭骨をスケルトナイズし、脳表を露出し針先を挿入した。適切なウイルス導入速度を検討し、前庭神経核内での感染陽性細胞が多くなるような条件で、前庭神経核への遺伝子導入が可能となった。前庭神経核は第四脳室に接するため、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスインジェクションの際に確実かつ最適量のウイルスを感染させなければ、前庭神経核に存在する神経細胞に遺伝子導入できないことが明らかとなった。前庭神経核に存在する神経細胞イメージング法として、GRINレンズを用いたところ、挿入後も全匹生存可能であった。今後は、ノイズ前庭電気刺激をしながら、2光子顕微鏡下にGRINレンズを用いて前庭神経核のin vivoイメージングを行い、神経応答の変化を確認する予定である。また、同時に、観察窓の最適化を検討し、スパインレベルの解像度でのin vivoイメージングの実現を試みる。小脳のイメージング法については、トランスジェニックマウスラインの導入を検討したいと考えている。前庭神経核の神経応答を確認するため、前庭神経核におけるin vivoイメージング系の確立を行った。前庭神経核細胞の広範囲スパースラベリング法としてAAV1-hSyn-GCaMP6s, AAV1-hSyn-GCaMP6f, AAV1-hSyn-GCaMP7fを用いた。前庭神経核内での感染陽性細胞が多くなるような、インジェクションの最適な条件を探索した。標識化された神経細胞の観察法として、前庭神経核直上にGRINレンズを挿入する手法を確立した。研究の進捗状況は、おおむね順調に進展していると判断した。ノイズ前庭電気刺激をしながら、2光子顕微鏡下にGRINレンズを用いて前庭神経核のin vivoイメージングを行い、神経応答の変化を確認する。また、同時に、観察窓の最適化を検討しスパインレベルの解像度でのin vivoイメージングの実現を試みる。小脳のイメージング法については、トランスジェニックマウスラインの導入を検討する。消耗品費への出費が、想定していた額よりも少なかった。消耗品費として、埋め込み電極、実験用動物飼育費、動物手術関連器具・試薬、イメージング関連器具・試薬、ウイルスベクター等への使用を検討している。
Gja1ノックアウトマウスを用いた低形成肺発生機序の解明に関する分子生物学的研究

Gja1(以下Cx43)ノックアウトマウスは、出生直後に肺低形成により死亡する。出生直後のCx43ノックアウト新生仔肺とコントロールの新生仔肺との比較検討の結果、ノックアウト群は病理組織学的に肺胞中隔の肥厚および末梢側肺胞腔の狭小化を認め、分泌腺様構造を呈していた。また、RT-PCRの結果、Cx43ノックアウトマウス群の新生仔肺では、Sp-C,AQP-5,α-SMAのmRNA発現は非ノックアウト群と比較して低下しており、免疫染色に関しても、ノックアウトマウス群はコントロール群と比べSp-C,AQP-5,α-SMA陽性細胞は少なかった。【内容】Connexin43(Cx43)は、Gap junctionを構成する膜貫通蛋白の一構成蛋白である。Cx43は細胞内のホメオスタシスの維持のみならず、近年の報告では、心や骨などの臓器の発達・成熟過程における形態形成や、細胞増殖・分化に関与しているとの報告がある。実際、Cx43ノックアウトマウスは、出生後数時間以内にチアノーゼを呈し、死亡する。今回、我々は、Cx43ノックアウトマウスの新生仔肺の肺成熟に関して、非ノックアウト群との比較検討を行ったので報告する。【方法】成獣Cx43ヘテロマウスを交配した。出生直後の新生仔マウスの尾を用いてタイピングし、ホモ、ヘテロ、ノックアウトの3群に分けた。仔マウス肺を摘出し、右肺からmRNAを採取し、左肺は、4%パラホルムアルデヒドで固定した。Surfactant protein-C(Sp-C), aquaporin-5(AQP-5), alpha-smooth muscle actin(α-SMA)のmRNA発現をRT-PCRにて検討するとともに、同マーカーについて免疫染色を行った。同時にヘマトキシリンエオジン(HE)染色も行った。【結果】HE染色の結果、ノックアウトマウス肺では、他の2群と比較して、肺胞中隔の肥厚および末梢側肺胞腔の狭小化を認め、分泌腺様構造を呈していた。また、RT-PCRの結果、Sp-C, AQP-5, α-SMAのmRNA発現は他の2群と比較して低下していた。免疫染色に関しても、ノックアウトマウス群では他の2群と比べsp-c, AQP-5, α-SMA陽性細胞は少なかった。【意義および重要性】今回の実験結果から、Cx43ノックアウトマウスの新生仔肺は、肺発生期の偽腺状期からから管状期初期の構造を呈しており、2型肺胞上皮細胞や1型肺胞上皮細胞、気管・血管における平滑筋細胞の細胞分化が、他の2群と比較して遅延しているものと考えられた。Cx43ノックアウトマウスは新たな低形成肺モデルと考えられ、更なる解析を行う事で、低形成肺治療に関する新たな知見が得られる可能性があるものと考えられた。【内容】Connexin 43 (Cx 43)は、Gap junctionを構成する膜貫通蛋白の-構成蛋白である。Cx43は細胞内のホメオスタシスの維持のみならず、心や骨などの臓器の発達・成熟過程における形態形成や、細胞増殖・分化に関与しているとの報告がある。我々は、Cx43ノックアウトマウスの新生仔肺の肺成熟に関して、wild type群とknockout群との比較検討を行った。【方法】成獣Cx43へテロマウスを交配し出生した新生仔マウスの尾を用いてタイピングし、ホモ、ノックアウトの2群に分けた。Surfactant protein-C (Sp-C)、aquaporin-5 (AQP-5), alpha-smooth muscle actin (α-SMA)のmRNA発現をRT-PCRにて検討するとともに、同マーカーについて免疫染色を行った。【結果】HE染色の結果、knockout群の新生仔肺では、wild type群と比較して、肺胞中隔の肥厚および末梢側肺胞腔の狭小化を認め、分泌腺様構造を呈していた。また、RT-PCRの結果、knockout群のSp-C, AQP-5, α-SMAのmRNA発現はwild type群と比較して有意に低下していた。免疫染色に関しても、knockout群はwild type群と比べSp-C, AQP-5, α-SMA陽性細胞が少ない傾向にあった。【意義および重要性】今回の実験結果から、Cx43 knockoutマウスの新生仔肺は、2型肺胞上皮細胞や1型肺胞上皮細胞、気管・血管における平滑筋細胞の細胞分化が、他の2群と比較して遅延しているものと考えられた。

では、このような低形成が生じる原因を検索することで低形成肺の発生機序に関する新たな知見が得られる可能性があるものと考えられた。【内容】Connexin43(Cx43)は、Gap junctionを構成する膜貫通蛋白の一構成蛋白である。Cx43は細胞内のホメオスタシスの維持のみならず、心や骨などの臓器の発達・成熟過程における形態形成や、細胞増殖・分化に関与しているとの報告がある。本年度は、前年度に得られた解析結果をもとに肺低形成モデルであるニトロフェンモデルラットを用いて低形成肺にIGFsを投与し、肺成熟効果の有無について検討した。【結果】real time RT-PCRの結果、コントロール群においてIGF-2投与群でTTF-1とT1-αのmRNAに優位な上昇を認めた。また、IGF-2投与群において形態学的に肺胞上皮細胞が立方上皮から扁平上皮細胞へと形態変化を起こしていたことがわかった。【意義および重要性】今回の実験結果から、Cx 43 knockoutマウスと同様にニトロフェン投与モデルマウスの新生仔肺は、2型肺胞上皮細胞や1型肺胞上皮細胞、気管・血管における平滑筋細胞の細胞分化が、他の2群と比較して遅延しているものと考えられた。IGF-2を投与することで低形成肺の成熟を促す効果が得られる可能性があるものと考えられた。
シンク・ソース能力から見た高温・乾燥耐性サツマイモ品種創出のための基礎的研究

本研究では地温上昇がサツマイモの塊根生産に及ぼす影響について検討するため,新旧20品種を異なる地温条件下で栽培し,高地温に対する耐性評価を行った.高地温耐性の指標とした上イモ生重の変動係数は,3.4173.2の範囲にあり,大きな品種間差が見られた.また,生育初期の植被率が高い品種ほど地温上昇が抑制され,上イモ生重の変動係数が小さいことが示唆された.さらに,高温条件下では,塊根への光合成産物の転流が抑制されることが確認された.以上の結果から,高気温・地温の環境下では,地上部の初期生育が旺盛で,早期に高い植被率を実現する形質を有することが安定した塊根生産を実現するために必要であると考えられる.2011年度の実験では,地温の変化に伴う収量の変動係数が小さい品種を高地温耐性のある品種として評価した.また,収量の変動係数と以前に調査した各品種の個葉葉面積との間には負の相関関係が認められた.それらの結果から,葉面積展開能力の優れた品種は早期に地表面を覆うことで地温の上昇を抑制し,安定した収量を実現しているものとの仮説を立てた.そこで,2012年度では植え付け約1か月後の植被率と地温および収量との関係性を明らかにすることを第一の目的として行った.前年度の収量の変動係数と個葉葉面積の結果から,数品種を選抜し,3種のマルチ資材を用いて圃場条件下で栽培を行った.その結果,植被率と地温との関係は明確ではなかったが,植被率と収量の変動係数との間には有意な負の相関関係がみられ,生育初期の植被率が高いほど地温が変化する条件でも安定した収量が得られることが示された.さらに,地温だけでなく気温,土壌水分と収量との関係を調査することを第2の目的として温度傾斜型チャンバー(TGC)内で栽培試験を行った.圃場試験で変動係数の小さかったベニアズマ,オキコガネ,ベニオトメを用いて実験をした結果,圃場では収量変動が小さい3品種でもTGC内では高温による塊根生産の有意な低下が見られた.TGCでの実験では地温と植被率との間には有意な負の相関関係が見られたが,植被率と収量の変動係数との間には負の相関は見られるものの有意ではなかった.以上の結果より,上記の仮説の検証を圃場試験またはTGC内の試験で行ったが,高い植被率と地温または収量の変動係数との関係は一部では有意な負の相関関係が認められたが,全て仮説通りの結果とはならなかった.今後,さらに詳細な解析を行うためには植被率の調査頻度等を検討する必要がある.圃場条件下および温度傾斜型チャンバー(TGC)内でマルチ資材による地温の変化を生じさせ,生育初期より植被率を定期的に測定することで,植被率と地温および上イモ生重の変動係数との関係を再検討し,高い植被率が地温上昇を抑制し安定した塊根生産につながるという仮説を立証することを目的に研究を行った.その結果,植被率と地温には有意な負の相関関係が見られ,圃場では一部の品種を除けば植被率と上イモ生重の変動係数にも有意な負の相関関係が見られた.これらの結果から,上述の仮説は概ね立証された.植被率が高く,地温に対する上イモ生重の変動係数が低い品種は`ベニアズマ',`パープルスイートロード',`オキコガネ'の3品種であったが,収量を考慮すると`ベニアズマ',`オキコガネ'が高地温耐性のある品種として有望であると考えられる.また,TGC内での実験において`ベニアズマ'を用いて,個葉光合成速度の測定と13Cを用いた炭素トレース実験を行い,気温および地温が光合成能力(ソース能力)と同化産物蓄積能力(シンク能力)に及ぼす影響について解析した.その結果,最大光合成速度および光-光合成曲線の初期勾配には気温または地温による明確な影響は確認されなかった.塊根への13C分配率は低気温条件下のほうが高気温条件下よりも高くなっており,地上部への13C分配率が高いほど塊根への13C分配率が低くなっていた.これらの結果から,気温・地温上昇に伴う上イモ生重の減少は,光合成低下による同化産物不足によるものではなく,塊根への光合成産物の転流が減少したためであるといえる.収穫後の塊根を用いて皮色および形状(幅長比)の測定を行ったが,気温や地温による影響は確認できなかった.また,糖度の測定と食味官能試験を行った結果,高温ほど糖度が高く,食味の評価も高いという結果が得られた.本研究では地温上昇がサツマイモの塊根生産に及ぼす影響について検討するため,新旧20品種を異なる地温条件下で栽培し,高地温に対する耐性評価を行った.高地温耐性の指標とした上イモ生重の変動係数は,3.4173.2の範囲にあり,大きな品種間差が見られた.また,生育初期の植被率が高い品種ほど地温上昇が抑制され,上イモ生重の変動係数が小さいことが示唆された.さらに,高温条件下では,塊根への光合成産物の転流が抑制されることが確認された.以上の結果から,高気温・地温の環境下では,地上部の初期生育が旺盛で,早期に高い植被率を実現する形質を有することが安定した塊根生産を実現するために必要であると考えられる.

現在,世界全体では人口増加に伴う今後の食料不足が懸念されている.また,同時に飼料およびバイオ燃料としての穀物需要の増加が見込まれている.一方で,国内では食料自給率の低下が問題となる中,バイオエタノール製造の増加も検討されている.このような現状を考慮すると,自給率が高くかつ飼料およびバイオエタノール原料にもなる作物の生産を向上させることが問題解決につながり,サツマイモは最適な作物と言える.一方,今後の地球温暖化による気温上昇は地温上昇と土壌水分低下を招くと予測され,収穫部位を地下部に形成するサツマイモにとって地温上昇と土壌乾燥は生育に大きく影響するものと考えられる.そこで本研究は,現存品種よりもさらに高い高温・乾燥耐性をもつ品種創出のための基礎的知見を得ることを目的とした.まず,現存の新旧品種から地温変化に伴う収量の増減が少ない品種または高地温条件下で多収となる品種を高地温耐性品種として選抜を試みた.サツマイモ新旧20品種を用い,3種のマルチ資材により地温を変化させ,栽培を行った.栽培期間中の平均地温は最大で地表面から5cmの地点では2.5°C,地表面から10cmの地点では2.8°Cの差が生じた.収量調査の結果,地温に対する反応には品種間差が見られた.各マルチ区の収量の変動,すなわち地温変化に伴う収量の変動が小さい品種を有望品種として選抜するため,各マルチ区の収量の変動係数を全ての品種で求めた.その結果,変動係数10%未満の品種が3品種(ベニアズマ,ダイチノユメ,オキコガネ),1015%の品種が4品種あった.また,変動係数の小さい品種が多収である傾向が見られた.そのため,前述した数品種は地温の変動に対して耐性のある品種であると考えられる.昨年度,手法の確立できなかった13C供与について,方法を再検討して実験を行った.しかし,結果として13Cの転流が検出できるほどの13C量が植物体内に同化されておらず,解析ができなかった.来年度は試薬量や方法を再度検討し,検出可能な手法を確立する.2012年度も高温であり,十分な高温ストレスをかけることが可能であったが,TGC内では厳しい高温ストレスに曝されたため,塊根が十分に肥大せず,個体間差も大きくなり塊根増加速度の解析ができず,さらに収穫後の糖含量や皮色の分析に供試する塊根も確保できなかった.来年度は気温等も考慮しながら潅水量,植え付け時期等を修正し,収穫後の分析が可能な程度まで生育できる環境を整える.土壌水分計の測定開始が機器の不調もあり大幅に遅れた.そのため,TGC内での実験では気温および地温の影響は検討できたものの,それに伴う土壌水分の影響は検討できなかった.また,地温測定に用いた温度記録計の不調や故障により一部では地温の計測ができない場合があった.このような計測機器の不調による欠測を防ぐ対策を早期に検討する必要がある.平成23年度に計画した実験内容の中で最も重要である「マルチ資材による地温制御条件下でのサツマイモにおける高地温耐性の品種間差異の検討」についてはほぼ計画通りに実施することができた.その結果から高地温耐性があると考えられる数品種を選抜することができ,来年度以降の実験に供試する品種の選定も可能となった.また,来年度から使用する温度傾斜型チャンバーとして既存のビニルハウスの改修を行った.しかし,チャンバー内でどの程度の温度勾配が実現できるのかは確認できていないため,今後確認する必要がある.また,13Cを用いた炭素トレース実験を平成24年度に行うにあたり,圃場条件下での13C供与法について予備実験を行った.
二酸化炭素ハイドレートの大規模火災用消火剤としての可能性

プール火炎を対象に,上部から二酸化炭素ハイドレート粉末を落下させ,その消火特性を実験的に検討した.比較対象として,氷,ドライアイスを用いた実験も行った.プール火炎の燃料としては,水よりも沸点の低いメタノール,エタノール,水とぼぼ同等の1-プロパノール,水より高い1-ヘキサノールを対象とした.消火に必要な最小の質量,消火限界質量は,水より沸点の低い燃料では,ドライアイスのほうが二酸化炭素ハイドレートより少なかったが,沸点が同等あるいは高い燃料では,二酸化炭素ハイドレートののほうが少なくなった.これは,沸点の高い燃料においては,水の蒸発が促進し,冷却効果が顕著になったためであると考えられる.二酸化炭素ハイドレートの大規模火災の消火に対する有益性を明らかにするために,実験的研究を行った.2013年度は,シャーレ小(Φ=50)及びシャーレ大(Φ=100)の2種類の大きさのプール火炎を対象に,メタノール(沸点64.7°C)と1-プロパノール(沸点97.4°C)の2種類の液体燃料の火炎を形成し,二酸化炭素ハイドレート及びドライアイスを投下し,消火実験を行った.その結果,メタノールはいずれの大きさの火炎でもドライアイスの方がより少ない質量で消火した.1-プロパノールのシャーレ小では二酸化炭素ハイドレートの方が少ない質量で消火した.また,シャーレ大の1-プロパノールではドライアイスの方がより少ない質量で消火したが二酸化炭素ハイドレートの消火質量とドライアイスの消火質量の比,MCO2/MDI値,はメタノール場合と比較すると小さくなっている.以上のことより1-プロパノールの方がメタノールよりも水の気化熱が有効に用いられたと考えられる.また,シャーレ径に対して投下した際の面積が大きい程,火炎全体に投下されるため,消火質量が少なくなると考えられる.以上のことより,液体燃料の沸点が二酸化炭素ハイドレートの消火に関して重要な影響を与えることが明らかになった.また,シャーレ径の拡大に伴って消火に成功した際の温度低下が小さくなり,二酸化炭素の必要量が大きくなった.これは,スケールの拡大に伴って,二酸化炭素の酸素遮断効果が水による温度低下効果よりも大きくなる事を示唆している.今後はシャーレ径200mmに拡大しての実験および灯油での実験を行い,実用的利用に対し沸点及びスケール効果の視点から更なる検討を加える.プール火炎を対象に,上部から二酸化炭素ハイドレート粉末を落下させ,その消火特性を実験的に検討した.比較対象として,氷,ドライアイスを用いた実験も行った.プール火炎の燃料としては,水よりも沸点の低いメタノール,エタノール,水とぼぼ同等の1-プロパノール,水より高い1-ヘキサノールを対象とした.消火に必要な最小の質量,消火限界質量は,水より沸点の低い燃料では,ドライアイスのほうが二酸化炭素ハイドレートより少なかったが,沸点が同等あるいは高い燃料では,二酸化炭素ハイドレートののほうが少なくなった.これは,沸点の高い燃料においては,水の蒸発が促進し,冷却効果が顕著になったためであると考えられる.本研究は,大規模火災の消火に対する二酸化炭素ハイドレートの有用性を明らかにすることを目的として,燃料の沸点の影響と浮力に着目した火炎のスケールの影響について実験的に検討を加えるものである.燃料の沸点の影響について:研究計画にそって,沸点が異なる燃料,メタノール(沸点67.4°C),エタノール(沸点78.4°C),1-プロパノール(沸点97.4°C)および1-ヘキサノール(沸点158°C)を用いて消火実験を行った.直径27.4mm,深さ15mmのステンレスシャーレに燃料を深さ8mmまで満たし,着火しプール火炎を形成する.その火炎に上部から消火剤を落下させ,消火の有無を調べる.消火剤としては,二酸化炭素ハイドレートのほか,比較対象として,氷とドライアイスを用いた.その結果,消火に必要な消火剤の最小の質量,消火限界質量,は燃料の沸点が高くなるにつれて少なくなることが分かった.氷の場合も同様に消火限界質量は沸点の高い燃料ほど少なくなったが,ドライアイスではほとんど変わらなかった.このことは,二酸化炭素ハイドレートおよび水の場合,沸点の高い燃料ほど,水の蒸発が増え,その結果蒸発潜熱による冷却効果が増大したものと考えられる.水の蒸発を有しないドライアイスの場合,消火限界質量は燃料の沸点にかかわらず,ほぼ一定であった.このことより,二酸化炭素ハイドレートの消火には水の蒸発が重要な役割を演じていることが明らかになった.火炎のスケールの影響について:沸点の影響に関する実験より,火炎のスケールは燃料によって大きく異なることが明らかとなった.また,沸点が100°C以上の燃料の場合,燃料表面で水が突沸するフラッシュオーバーが生じることがわかった.本研究は,大規模火災の消火に対する二酸化炭素ハイドレートの有用性を明らかにすることを目的として,(1)二酸化炭素ハイドレートの生成装置の設計・製作を行い,(2)燃料の沸点の影響と(3)浮力に着目した火炎のスケールの影響について実験的に考察するものである.(1)の二酸化炭素ハイドレート生成装置の設計・製作に関しては,当初計画通り製作した.(2)燃料の沸点の影響に関しては,燃料として当初予定していたメタノールだけでなく,二年目に予定していたエタノール,1-プロパノール,1-ヘキサノールを用い,消火剤としては二酸化炭素ハイドレート,氷,ドライアイスを用いた実験をすべて行うことができた.

その結果,二酸化炭素ハイドレートの消火には水の蒸発が重要な役割を演じていることが明らかになった.すなわち,本研究に関しては,次年度分についても前倒しで検討を加えることができ,当初の計画以上に進展していると判断することができる.(3)の火炎のスケールの影響に関しては,燃料により火炎のスケールが大きく変化すること,燃料の沸点が高くなるとフラッシュオーバーが生じることが明らかとなった.当初,フラッシュオーバーについては研究計画で深く考慮されていなかったため,フラッシュオーバーの影響を考慮した実験装置について再検討を加え,設計図を新たに作成した.したがって,実験装置を製作することはできなかったが,火炎のスケールの班化に関する検討についても,研究はおおむね順調に進展している判断することができる.以上述べたように,二つの課題を総合して考えた場合,本研究はおおむね順調に進展していると考えることができる.(1)前年度製作したハイドレート生成装置を用いて,CO2ハイドレートを作成する.(2)燃料の沸点の影響に関しては,2年度目の燃料を用いた実験もすでに行っており,当初の計画を1年目でほぼ達成している.(3)火炎のスケールの影響に関しては,フラッシュオーバーについて再検討したことから,当初計画していた実験装置の組み立てには至らなかった.そこで本年度は,(3)火炎のスケールの影響に関する実験を中心に研究を進める.具体的には,まず,火炎のスケールを大きくした場合にフラッシュオーバーが生じることを考慮し,当初計画に加えて,ハイドレート落下位置を調整可能とし,火炎の高さ,フラッシュオーバーによる火炎の膨張にも十分耐えうる装置を設計製作する.つぎに沸点の低い燃料から順に実験を行い,CO2ハイドレートを落下した時の火炎形状の変化,消炎過程をビデオカメラを用いて記録し,解析する.また,落下するCO2ハイドレートの量を徐々に増やしてゆき,消火に必要な最小限のCO2ハイドレート質量(消火限界質量)を明らかにする.これらの実験結果をもとに,CO2ハイドレートの大規模火災への有用性を明らかにする.本年度は,昨年度製作できなかった(3)火炎のスケールの影響に関する実験装置を製作する.その費用は昨年度当該実験装置を作成することができなかったために生じた未使用分を含め,約30万円程度である.また,大きな火炎の基部の複数の位置の温度測定を可能にするために,温度測定装置を購入する.その費用は40万円程度である.また旅費として,昨年度の成果を2013年5月に韓国慶州で行わる国際会議で発表するために,国外旅費20万円,12月に開催される燃焼シンポジウムでの発表のための国内旅費5万円を見込んでいる.そのほかは,データ整理のためのアルバイト代や消耗品費として,液体燃料,ハイドレート作成装置に用いるエチレングリコールなどの購入を考えている.
圧電MEMSと強誘電体ゲートFETの集積化素子による高感度超音波検出の実証

圧電MEMSトランスデューサと強誘電体ゲートFETの集積化により、超音波の高感度検出手法の確立に取り組んだ。チタン酸ジルコン酸鉛薄膜を用いて試作した圧電MEMSトランスデューサは、良好な超音波送信特性を示したが、受信感度の向上との両立には様々な課題があることが明らかになった。そこで高い圧電g定数を有する有機強誘電体薄膜を採用することにした。シミュレーションの結果、数μmの膜厚を有する有機強誘電体を用いることで、10倍程度の感度向上が期待できることを明らかにした。さらに、塗布法を用いて2μm程度の膜厚の試料を作製し、圧電特性評価を行った。詳細な作製条件の最適化の結果、融点直下で結晶化アニールを行うことにより、圧電特性が向上することを見出した。強誘電体ゲートFETについては、強誘電体が持つ負性静電容量の特性に起因した急峻スイッチングの発現機構について理論的に解析した。半導体の表面電荷の理論と強誘電体の分極反転モデルを組み合わせ、時間展開計算を行う手法を開発した。その結果、強誘電体の分極反転と半導体のキャリアの蓄積反転の時定数の違いにより、非定常状態が生み出され、それが定常状態に遷移する過程で急峻スイッチングが発現する新しい機構を見出すことができた。現状では、その急峻スイッチング特性には履歴があり、on時とoff時の閾値電圧が異なる。センシング応用には履歴のない急峻スイッチング特性の実現に向けて更なる研究が必要である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今日の医療において画像診断は欠かすことのできない手法となっている。その一つである超音波診断は、被爆の心配がなく、診療所レベルまで広く普及している。一方で、超音波診断装置には空間分解能が低いという課題がある。圧電MEMS超音波トランスデューサは、超音波の送受信部の機械的特性を生体に近づけることが可能で、この課題を克服できると期待される。しかし、強誘電体薄膜の圧電特性がバルク単結晶に遠く及ばないことなどの要因により実用化には至っていない。本研究では、高性能な圧電MEMS超音波トランスデューサの開発および強誘電体ゲート電界効果トランジスタによる高感度検出の実証を目的としている。圧電MEMS超音波トランスデューサの高性能化については、エピタキシャル成長技術による強誘電体薄膜の高品質化に取り組んだ。組成の異なる薄膜を一回の製膜実験で作製することが可能なコンビナトリアルスパッタ装置を構築し、組成の最適化を効率的に行えるようにした。さらにこのような薄膜の特性を短時間で解析できる手法を開発した。本格的な製膜条件の最適化は29年度に実施する計画である。また圧電MEMSトランスデューサの設計および作製プロセスの確立も行った。強誘電体ゲート電界効果トランジスタについても、CMOSプロセスに適合する強誘電体薄膜の成長を行ことができた。本年度は要素技術の確立と素子の設計が中心であったが、おおむね計画通りに進捗していると考えている。圧電MEMSトランスデューサの設計および作製プロセスはおおむね確立した。また強誘電体ゲートFETの作製についても目途がついた。強誘電体薄膜の成長に関しては下地の検討が中心になっているが、29年度中には本研究で必要な素子の試作が行える見込みである。圧電MEMS技術を用いた超音波トランスデューサは、超音波診断装置の高空間分解能化に寄与できると期待されるが、従来の送受信回路とは整合性が悪く検出感度が低下するという課題がある。本研究では急峻スイッチング特性を有することが期待できる強誘電体ゲート電界効果トランジスタを用いて超音波信号の高感度検出を実証することを目標としている。まず圧電MEMS超音波トランスデューサについては、要素技術である圧電体薄膜の高性能化と素子の試作に取り組んだ。前者においては、29年度に構築したコンビナトリアルスパッタ法を用いて、薄膜の成長条件の最適化をおこなった。薄膜組成に影響を及ぼす成長温度や製膜圧力を変化させても、本手法を用いることにより化学量論組成の薄膜を容易に得ることができた。さらに作製した薄膜の圧電特性微視的にかつ解析する評価方法の開発も行った。これらを融合させることにより、高い圧電特性を発電させるのに有利な分極ドメイン構造を明らかにすることができると考えている。MEMS素子については、有限要素法による素子の設計と特性シミュレーション、実際の素子の試作を行った。強誘電体ゲート電界効果トランジスタについては、負性静電容量による急峻スイッチング特性の発現の解明に向けて数値シミュレーション手法を確立した。動的な分極反転挙動を取り入れることにより、パルス信号に対するスイッチング特性の計算を可能にした。この手法を用いることで、センシング応用に適した強誘電体薄膜の特性や素子構造を明らかにできると考えている。圧電薄膜およびMEMS素子の作製および強誘電体ゲート電界効果トランジスタの急峻スイッチング特性について、ほぼ計画通りに実施できている。

シミュレーションの結果、数μmの膜厚を有する有機強誘電体を用いることで、10倍程度の感度向上が期待できることを明らかにした。さらに、塗布法を用いて2μm程度の膜厚の試料を作製し、圧電特性評価を行った。詳細な作製条件の最適化の結果、融点直下で結晶化アニールを行うことにより、圧電特性が向上することを見出した。強誘電体ゲートFETについては、強誘電体が持つ負性静電容量の特性に起因した急峻スイッチングの発現機構について理論的に解析した。半導体の表面電荷の理論と強誘電体の分極反転モデルを組み合わせ、時間展開計算を行う手法を開発した。その結果、強誘電体の分極反転と半導体のキャリアの蓄積反転の時定数の違いにより、非定常状態が生み出され、それが定常状態に遷移する過程で急峻スイッチングが発現する新しい機構を見出すことができた。現状では、その急峻スイッチング特性には履歴があり、on時とoff時の閾値電圧が異なる。センシング応用には履歴のない急峻スイッチング特性の実現に向けて更なる研究が必要である。強誘電体ゲートFETと圧電MEMS超音波トランスデューサの集積化に取り組み、その素子を用いた超音波の高感度検出の実証実験に取り組む。試作した素子の評価を行い、その結果を用いて素子の解析モデルと構築する。強誘電体ゲート電界効果トランジスタのしミューレションと誘導させることで、超音波信号の高感度検出の可能性について議論する。強誘電体ゲート電界効果トランジスタの試作と急峻スイッチング特性の評価にも取り組み、実験的検証も目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
次世代シンバイオティック乳酸菌の探索と生活習慣病予防に向けた機能性評価

現在まで、腸内からの独自に見出した選択法により乳酸菌単離培養を行い、100株近くの高効率菌体外多糖産生候補菌株ライブラリとしてストックを用意した。菌体外多糖を大量に生産するために、栄養源及び培養温度等の条件が菌体外多糖の生産に及ぼす効果を調べ、最適条件を見いだした。したがって、単離された高効率菌体外多糖産生候補菌の3種類を液体培地に培養し、菌体外多糖を生産した。本培養物より菌体外多糖の回収・精製のメソッドを立ち上げた上、それぞれの菌体外多糖の精製を行った。具体的に、菌体外多糖高生産株を適当な培地で培養し、培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養上清を濃縮した後冷却エタノールを2ー3倍量加えて多糖の沈殿生じさせ、遠心分離により沈殿を集めて乾燥させた。多糖構造を明らかにするために、菌体外多糖の加水分解及びUPLC-MS/MSにて糖組成解析のメソッドを立ち上げた。さらに、LCカラム温度、移動相の成分・比率、グラジエント勾配、イオン化法の選択、MS測定条件などを検討し、分離度や保持時間などを改善・最適化し、定量解析メソッドを作成した。したがって、精製された菌体外多糖を用いて、加水分解→UPLC-MS/MS分析の手順で菌体外多糖を構成している単糖の種類及び各々構成糖比を調べた。更に、菌体外多糖負荷によるプレバイオティクス機能性評価をするために、細菌叢のメタゲノミクスデータの解析、生体試料に対するメタボライト抽出・調製および質量分析法を活用したメタボローム解析メソッドを立ち上げた。
機能的血管内皮前駆細胞を用いた新規脳梗塞治療法の確立

本研究では、筑波大学で新規に開発した虚血に対する治療効果の高い血管内皮細胞(Alde-Low EPC)を、ラット脳梗塞モデルに投与する実験を行った。その結果明らかになったのは、本研究では、筑波大学で新規に開発した虚血に対する治療効果の高い血管内皮細胞(Alde-Low EPC)を、ラット脳梗塞モデルに投与する実験を行った。その結果明らかになったのは、実施実験:ラット一過性脳虚血モデルの作成と細胞の投与先端をシリコンコーティングした4-0ナイロン糸をラット内頚動脈から前大脳動脈に挿入することで中大脳動脈を閉塞。60分間の閉塞ののちに再灌流した。急性期脳梗塞に対する治療効果の検討のため、再灌流30分後に細胞(5x10^5 cells/0.5mlPBS)を内頚動脈から投与した。Alde・Low EPC (n=11), Alde-High EPC (n=10),コントロールとしてHUVEC(n=5), PBS (n=9)を投与した。投与細胞はGFP導入により可視化した。24時間後に神経症状と脳血流を測定の後に脳を摘出。脳梗塞体積を測定し、摘出脳の解析を行った。【結果】1.機能的EPCによる急性期脳梗塞抑制効果2.脳内に分布するGFP陽性細胞の観察と定量蛍光顕微鏡を用いて正常側を含む全領域を観察した。GFP陽性細胞はほとんどがαSMAで蛍光染色した血管に付着する形でlocalizeしていた。上記の細胞は抗GFP抗体でも染色され、観察している細胞が投与した細胞であることを確認した。正常側と梗塞側でGFP陽性細胞を定量したところ、Alae-Low EPC投与群の梗塞側でGFP陽性細胞が有意に多かった(P<0.01)。投与細胞は皮質や皮髄境界、基底核にも分布し、脳梗塞の範囲による局在は認めなかった。【背景】EPCは細胞治療のsourceとして期待されているが、急性期脳梗塞に対するデータは非常に少ない。一方、脳梗塞の治療sourceとして、EPCの他に神経幹細胞や間葉系幹細胞、ES細胞、iPS細胞などが研究され、一部臨床試験が進んでいる。本学では、aldehyde dehydmgenase(ALDH)活性の低いEPCのsubgroup(Alde-Low EPC)が、虚血性皮膚壞死に対する治療効果が高いことを発見した。本研究では、急性期脳梗塞に対するAlde-Low EPCの治療効果を検証し、その機序を解析することにより、より効果的なEPC療法を開発することを目的とする。【方法】ヒト臍帯血から単核球を分離培養し、CD45(-)/CD31(+)/Ac-LDL(+)の細胞をEPCと同定した。単離したEPCをAIDH活性により2つの細胞集団に分離して使用した。ラットー過性脳虚血モデルを作製し、再還流後30分で内頚動脈からGFPにより可視化した各細胞(HUVEC, Alde-High EPC, Alde-Low EPC;各n=10)を投与した。24時間後の脳梗塞体積や、投与細胞の脳内分布を経口免疫染色により観察・定量した。さらに、siRNAを用いてCXCR4の発現をdown regulationしたAlde-Low EPC(CXCR4si)を投与して解析した。【結果】脳梗塞体積はAlde-Low EPC投与群でのみ抑制され(p=0.005)、Alde-Low EPCは虚血領域に特異的に集積していた(P=0.05)。CXCR4siの投与では、虚血領域への集積能力は低下し(p=0.05)、脳梗塞抑制効果も減弱していた(p=0.05)。【考察】EPCの急性期治療メカニズムとして、angiogenesisによる血流改善作用よりも、EPCが産生するtrophic factorによる神経保護作用が働いていると考えられる。この治療効果は、EPCの虚血部位への特異的集積により発揮されているものと考えられ、その集積にSDF-1/CXCR4系が強く関与していることが示唆された。従って、特定のEPC subgroupによる細胞治療が急性期脳梗塞の有効な治療戦略となり得ると考えられた。脳梗塞は一度罹患すると多大な後遺障害を残し、患者本人だけでなく家族の生活も逼迫し、社会的損失も大きい。一度損傷を受けるとほとんど再生しない脳組織において、脳梗塞後遺症は急性期での脳損傷の程度により規定されるが、急性期脳梗塞に至っては有効な治療法は少なく、その効果や治療可能時間帯も限られているのが現状である。再生医療は、脳梗塞に対する新規治療法として期待されており、動物実験のデータが集約され、一部では臨床応用も開始されているが、どの細胞をどのように投与するのが最も効果的・効率的で安全かは、他の疾患に対する再生医療と同様、はっきりと分かっていない。本研究では、本学で新規に開発した虚血に対する治療効果の高い血管内皮細胞(Alde-Low EPC)をラット脳梗塞モデルに投与する実験を行った。その結果明らかになったのはの3点であり、Alde-Low EPCの治療効果やその機序を解析するにはさらなる研究の継続が必要と考えられるが、投与した細胞が急性期においても投与後24時間という短期間に梗塞巣に集積し、血管を構築する前に治療効果をすることが確認できたことは、今後の脳梗塞に対する再生医療の研究の一端に寄与できたのではないかと考える。

また、血管内皮前駆細胞の脳梗塞に対する治療因子を検討することは、必ずしも血管内皮前駆細胞の投与を必要としない脳梗塞治療法の新規開発(サイトカイン療法など)にも寄与できるものと考えている。
精神分裂病とそのモデルとしてのノックアウトマウスの総合的比較・分析

精神分裂病(以下分裂病)の病態の複雑さのため、まだ適切な動物モデルは確立されていない。近年、分子生物学の発展とその蓄積により、認知機能の発達・維持に関わる遺伝子のミュータントマウスが作製されており、分裂病関連候補遺伝子の評価をする事ができるようになった。そこで我々は、これら遺伝子のノックアウトマウスの音刺激驚愕反応を測定し、知覚フィルター機能を反映するとされ、分裂病患者において異常が報告されているプレパルスインヒビション;prepulse inhibition(PPI)と、分裂病において低下するとされる慣れ(Habituation)、驚愕反応の強度を指標にそれら候補遺伝子の分裂病への関与を検討した。Nf1・nNOS・B-raf・Kras・αCAMKII305D・αCAMKII305VA・Fragil X・Src・NT-3・BDNF・GAD65・GAD67・NMDAε1・mGluR1・Fyn・μopioid receptorのミュータントマウスを使用。音刺激驚愕反応は、SR-Lab System(San Diego Instruments)を用いて測定し、PPIは各プレパルスのトライアルの驚愕反応強度の平均を、パルス刺激に対する驚愕反応の強度の平均と比較した。結果、GAD65およびNf1のノックアウトマウスでPPIに有意な低下がみられた。その他のノックアウトマウスでは有意な差はみられなかった。PPIの低下がみられたノックアウトマウスのうち、GAD65でのみ驚愕反応の強度において上昇がみられた。nNOSとB-rafノックアウトマウスでは、PPIに有意な変化を示さなかったが、驚愕反応の増大がみられた。GAD65・nNOSおよびNf1はいずれも抑制性伝達物質であるγ-aminobutyric acid(GABA)の産生、もしくはその調整に関わっている分子である。GABA含有の抑制性神経は直接的な情報伝達だけでなく、神経回路の興奮を調節する事によって、中枢神経回路における精密な情報処理を行っている。今回の結果により、GABAの産生や機能修飾の異常は、PPIの低下にみられる知覚フィルター機能の異常を引き起こすことを示している。従って、分裂病の発症、もしくは病態に、GABAによる抑制性回路が深く関わっている事が示唆される。精神分裂病(以下分裂病)の分子メカニズムを解明する上で、ヒトで起こっている分子変化を据えると同時に、その分子の動物固体に与える影響について解析することが重要であり、発症原因に基づく動物モデルの構築にヒントを与えるものと考えられる。Fynは、脳に強発現するSrc familyのチロシンリン酸化酵素の一つであり、神経系の発達や可塑性形成に重要な役割を持つ神経栄養因子やその他の成長因子によって活性化される。また、Fyn欠損マウスは、成体の海馬において層構造の異常や行動学的な異常も報告されている。そこで今回我々は、神経発達障害仮説に基づき、Fyn欠損マウスが分裂病のモデルとして有用かどうかを検証する目的で、分裂病患者でもその異常が報告されている、prepulse inhibition (PPI)を、音刺激驚愕反応を指標に検討した。Fyn欠損マウスに対し、MK-801(0.1mg/kg,s.c.)投薬後のPPIについても検討した。同時に、Fyn欠損マウスにおける脳内シナプス関連タンパク量変化を坑NMDAR1,NMDAR2A/B、GluR1,GluR2/3およびGAD抗体を用いたウエスタンブロット法にて検討した。Fynホモ欠損マウスは、音刺激に対する驚愕反応が、その他の遺伝子型およびコントロール動物よりも高い傾向を示したが、PPIは障害されることなく、逆に増加していた。これは以前から報告されているFyn欠損マウスのストレスに対する感受性の高さによるものと考えられた。一方、MK-801の投薬により、Fynホモ欠損マウスはその他の遺伝子型およびコントロール動物に比べ驚愕反応がより増大し、PPIもより強く障害を受けた。以前我々は、生後間もなくのFyn欠損マウスの大脳皮質におけるグルタミン酸受容体タンパクの減少について報告しているが、今回の成体脳を用いた結果では有意義な変化は認められず、Fyn欠損マウスでみられたMK-801への感受性の違いは、皮質領域でのグルタミン酸受容体の量的変化が反映する可能性は少ないものと考えられた。以上の結果から、Fyn分子は分裂病の発症原因因子とはならないと考えられた。しかし、Fynの発現異常は過度のストレス負荷が引き金となり、病態発症におけるリスクファクターである可能性が示唆された。

音刺激驚愕反応は、SR-Lab System(San Diego Instruments)を用いて測定し、PPIは各プレパルスのトライアルの驚愕反応強度の平均を、パルス刺激に対する驚愕反応の強度の平均と比較した。結果、GAD65およびNf1のノックアウトマウスでPPIに有意な低下がみられた。その他のノックアウトマウスでは有意な差はみられなかった。PPIの低下がみられたノックアウトマウスのうち、GAD65でのみ驚愕反応の強度において上昇がみられた。nNOSとB-rafノックアウトマウスでは、PPIに有意な変化を示さなかったが、驚愕反応の増大がみられた。GAD65・nNOSおよびNf1はいずれも抑制性伝達物質であるγ-aminobutyric acid(GABA)の産生、もしくはその調整に関わっている分子である。GABA含有の抑制性神経は直接的な情報伝達だけでなく、神経回路の興奮を調節する事によって、中枢神経回路における精密な情報処理を行っている。今回の結果により、GABAの産生や機能修飾の異常は、PPIの低下にみられる知覚フィルター機能の異常を引き起こすことを示している。従って、分裂病の発症、もしくは病態に、GABAによる抑制性回路が深く関わっている事が示唆される。
ソーシャルメディアの情報統合によるエキスパート検索エンジンに関する研究

■ウェブマイニングのための検索APIを利用したサンプリング手法に関する研究サンプリングはウェブマイニングにおいて重要な問題であり,アプリケーション・プログラミング・インターフェース(以下,API)を通して効率的にサンプリングする問題を扱う研究が盛んにおこなわれている.本活動ではその中でも特に検索APIに着目したサンプリング問題に焦点を当て,Wikipediaのようなオントロジを活用した辞書ベースのサンプリング手法を提案する.実験では,Facebookからデータを独自にクローリングしたデータに基づき仮想的なAPIを構築し,ε-グリーディやε-ファーストなどの強化学習に基づく方策を比較する.■OSSコミュニティおよびクラウドソーシングの統合によるソフトウェア開発者の能力予測に関する研究クラウドソーシングサービスを対象に開発者の能力の推定が行われている.ソフトウェア開発プロジェクトの成功は,開発者の能力に依存するが,こうした能力を推定するのは自明な問題でない.一般に,クラウドソーシングサービスでは,能力はユーザによって評価付けされる.本活動では,オープンソースソフトウェア(OSS)コミュニティとクラウドソーシングサービスを統合することにより,ソフトウェア開発者の能力を推定することを目的とする.まず,能力の推定問題がOSSコミュニティからの素性生成の問題に帰着されることを示し,開発物に基づき開発者の能力を抽象化した値であるs-indexを提案する.具体的には,oDesk (クラウドソーシングサービス)およびGitHub (OSSコミュニティ)を統合し,oDeskから得られるデータを教師データする評価値予測モデルを構築する.実験結果では,s-indexを用いたモデルがnDCGの観点から用いないモデルよりも上回っていることを示す.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。人気度予測という観点から,ソーシャルメディア上における人物の属性をオントロジーを用いて予測する方法について考え,論文誌にまとめて投稿した.本論文では,あるエンティティに対応するアカウントがソーシャルメディア上に作られた場合に,そのアカウントが将来的に獲得する人気度を,意味的に関連するアカウントの特徴を用いて推定する手法を提案した.すなわち,ソーシャルメディア上のアイテム集合をセマンティックウェブの分野で広く用いられている知識データ上のエンティティ集合に統合することで,アイテムの背景にある意味的構造を用いた予測を行う.それによって,特定のエンティティがもつ人気度を,アカウントを設置する前に予測することができると同時に,異なる種類のエンティティにとって,異なる関係性がどのくらい人気に影響を与えているかを知ることができる.本研究では,ソーシャルメディアのひとつであるFacebookを対象に本手法を適用し,実験を行った. Facebookは, 2014年現在もっともユーザ数の大きいソーシャルメディアであり,他のソーシャルメディアと比べてバイアスが小さいと考えられる.実験では,著者らが独自にクローラを設計し, 2千万Facebookページと3百億Likeを収集し,これをオントロジーの一つであるDBpediaにマッピングすることで,人気度予測の問題を解いている.このデータセットは2012年7月時点で25.8%のFacebookページと60.5%のLike数を網羅しており,著者らが知る限りFacebookページに関する最も規模の大きなデータセットである.■ウェブマイニングのための検索APIを利用したサンプリング手法に関する研究サンプリングはウェブマイニングにおいて重要な問題であり,アプリケーション・プログラミング・インターフェース(以下,API)を通して効率的にサンプリングする問題を扱う研究が盛んにおこなわれている.本活動ではその中でも特に検索APIに着目したサンプリング問題に焦点を当て,Wikipediaのようなオントロジを活用した辞書ベースのサンプリング手法を提案する.実験では,Facebookからデータを独自にクローリングしたデータに基づき仮想的なAPIを構築し,ε-グリーディやε-ファーストなどの強化学習に基づく方策を比較する.■OSSコミュニティおよびクラウドソーシングの統合によるソフトウェア開発者の能力予測に関する研究クラウドソーシングサービスを対象に開発者の能力の推定が行われている.ソフトウェア開発プロジェクトの成功は,開発者の能力に依存するが,こうした能力を推定するのは自明な問題でない.一般に,クラウドソーシングサービスでは,能力はユーザによって評価付けされる.本活動では,オープンソースソフトウェア(OSS)コミュニティとクラウドソーシングサービスを統合することにより,ソフトウェア開発者の能力を推定することを目的とする.まず,能力の推定問題がOSSコミュニティからの素性生成の問題に帰着されることを示し,開発物に基づき開発者の能力を抽象化した値であるs-indexを提案する.具体的には,oDesk (クラウドソーシングサービス)およびGitHub (OSSコミュニティ)を統合し,oDeskから得られるデータを教師データする評価値予測モデルを構築する.実験結果では,s-indexを用いたモデルがnDCGの観点から用いないモデルよりも上回っていることを示す.26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書の記載の通り、必要なデータの収集を完了しており、分析を行い、論文誌投稿という形でアウトプットを行った。今後の研究の推進方針として、収集したエキスパートデータベースに含まれるエキスパートに対し、専門家スコア、信頼性スコアの算出を行う予定である。
糸球体足細胞の細胞膜ドメイン形成に関する細胞生物学的研究

糸球体足細胞は大きな細胞体とそこから延びだした多くの足突起を持つ高度に分化した細胞であり、糸球体濾過に重要な役割を演じている。これまでの我々の研究から、足突起間にあるスリット膜は細胞間接着装置に由来する構造であると考えられる。このスリット膜を境にして膜表面蛋白と膜の裏打ち蛋白の分布が異なり、スリット膜は膜ドメイン形成に役割を演じている。細胞極性決定に重要な役割を演じているASIPの局在を腎組織で調べ、この分子がタイト結合の端に局在し、細胞の境界を決定していることを見いだした。また、ASIPは幼弱な足細胞ではタイト結合に、成熟した足細胞ではスリット膜の基部に存在することが分かった。新潟大学腎研との共同研究により、新たにスリット膜分子としてラットポドシンをクローニングし、その局在が正常ではスリット膜にあり、病態時では癒合した足細胞間の細胞接着部位に局在することを明らかにした。さらに、細胞間接着装置のうちアドヘレンス結合に局在する分子p120カテニンが、未熟な足細胞の細胞間には発現するが、成熟した足細胞におけるスリット膜の形成には関与しないことを明らかにした。足細胞のユニークな形作りには細胞骨格系要素が重要な役割を演じていると考えられる。我々は糸球体足細胞足突起のアクチン線維構造を詳細に検討し、足突起のアクチン線維には2種類の構造が存在することを初めて見いだした。すなわち、足突起中心部分には長軸方向に大量のアクチン線維が束状に走行しており、膜直下には編み目状のアクチン線維のネットワークが存在している。これらのアクチン構造の成り立ちを調べるために足細胞に発現するアクチン結合蛋白の発現を発生過程を追って解析し、2種類のアクチン線維が異なるアクチン結合蛋白によって形成されることを明らかにした。さらに、足細胞の細胞体と一次突起に分布する中間径線維に結合する新しい分子Vmacを見いだした。糸球体足細胞の足突起間にある特殊な細胞間接着構造であるスリット膜はapical膜とbasolateral膜を境界する構造として、膜ドメイン形成に重要な役割を演じていると考えられるが、それに関わる分子群は明らかではない。本年度は、新たなスリット膜関連蛋白としてポドシンを新潟大腎研のグループとともに同定した。また、線虫で見出された極性蛋白par3の哺乳類ホモログであるASIPが、尿細管上皮細胞ではタイト結合の頂部側末端に位置し、apical膜の境を規定していることを見出した。さらに、このASIPが糸球体足細胞のスリット膜基部に発現しており、スリット膜を境とする膜ドメイン形成に中心的な役割を演じていることを明らかにした。また、塩野義研で見出された新規先天性ネフローゼラットの病態解析を行い、このラットがネフローゼを発症する初期に、スリット膜関連蛋白であるZO-1を安定して発現しているが、ネフリン、ポドシンおよびASIPの発現が著しく低下することを見出した。次に、温度感受性変異を入れたSV40T抗原遺伝子のトランスジェニックラットより単離した足細胞培養株の特徴づけを行い、得られた細胞が33度で突起形成能を有し、突起を近隣の細胞に延ばした状態で分裂をすること、その際、突起の結合部にはASIPが発現していることを見出した。また、37度で細胞増殖を止めた際に認められる足細胞特異的なマーカー蛋白の発現の変化を各クローンで詳細に検討し、足細胞の足突起に発現するアクチン結合蛋白シナプトポディンの発現が有意に増加し、またアクチン繊維とアクチン結合蛋白α-アクチニンの再配列が起こることを確認した。これは得られた多くのクローンで共通した性質であり、足細胞培養系での温度変化に伴う良い指標となると考えられる。

糸球体足細胞の足突起間にある特殊な細胞間接着構造であるスリット膜はapical膜とbasolateral膜を境界する構造として、膜ドメイン形成に重要な役割を演じていると考えられるが、それに関わる分子群は明らかではない。本年度は、新たなスリット膜関連蛋白としてタイト結合に局在するMAGI-1がスリット膜の基部に局在することを見いだした。ネフローゼの発症に伴いスリット膜は足突起間に形成される細胞間接着装置の上部に移行する。その際、MAGI-1は移動したスリット膜とともに細胞間接着装置の上部に移動し、足突起間に新たにできる細胞間接着装置の形成には関与しないことが分かった。蛋白尿が発症し、足突起の癒合が起こるに伴い、MAGI-1の発現の低下が認められたが、これはスリット膜の減少に一致しているものと考えられた。我々が確立した温度感受性のラット足細胞培養株では、足突起に相当する突起形成が37度で認められるが、その状態でMAGI-1は細胞の突起がかみ合った部分にもう一つのタイト結合蛋白であるZO-1と共局在していた。これらのことから、スリット膜の基部には、上皮細胞のタイト結合に局在する分子群が存在しており、この部分で膜ドメインの境をなしていることが理解できる。スリット膜関連分子の同定以外に足細胞の形態形成に重要な役割を演じる細胞骨格系の分子群についても検討を行った。その結果、足細胞の足突起の形成に重要な役割を演じているアクチン線維に2つの要素があることを明らかにした。すなわち、足突起のコアとなるアクチン線維束は主としてアクチニン分子が形成に関与しており、細胞膜の裏打ちのアクチンネットワークはコータクチン分子により形成されることを見いだした(J Histochem Cytochem51:1589-1600,2003)。さらに足細胞の細胞体と一次突起に分布する中間径線維であるビメンチンに結合する新規分子としてVmacを阪大医学部生化学の高井グループとともに発見し、報告した(BBRC in press)。