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高血圧の中枢性機序における骨髄由来細胞の役割の検討

中枢性機序による高血圧のモデルとしてアンジオテンシンII (Ang II)持続投与ラットを用いた。骨髄由来細胞を脳室内自家移植し、血圧と交感神経活動を評価した。Ang II持続投与でラットの血圧は有意に上昇し、神経節遮断薬投与による血圧降下度は増大した。骨髄由来細胞の脳室内自家移植で、両変化は抑制された。さらにAng II持続投与による脳内AT1受容体とTGF-βの発現増加は骨髄由来細胞の脳室内自家移植で抑制された。以上より脳内骨髄由来細胞はAng IIによる脳内レニン-アンジオテンシン系の亢進と炎症をおさえ、交感神経活動亢進と血圧上昇を抑制する可能性を見いだした。「脳への骨髄由来細胞の分布不全が脳内レニン-アンジオテンシン系(RAS)および酸化ストレスの抑制不全を引き起こし中枢性機序として高血圧の病態に関連している」という仮説のもと実験を行い、骨髄由来細胞の脳室内自家移植はAng II持続投与による交感神経活動の亢進をおさえ血圧上昇を抑制すること、また、骨髄由来細胞から分泌された液性因子がAng IIの交感神経活動亢進作用に拮抗した可能性が考えられる結果を得た。平成25年度は主にその作用機序を調べるため、使用した骨髄由来細胞の性質について検討を進めた。脳室内投与実験で用いた細胞と同じ条件で骨髄由来細胞の培養を行った。ラット腸骨を穿刺し骨髄液を採取した。赤血球を除去後プラスチックの培養皿に細胞をまき、付着した細胞を3週間培養した。培養液は10%FBSを含むDMEMを用いた。採取検体の約6割で細胞数が100万個以上に増え、3継代目の細胞を実験に用いた。培養骨髄由来細胞は間葉系幹細胞のマーカーのCD29と内皮のマーカーであるvWF、VEGFR2が陽性であった。また、一部の細胞にαSMアクチン共陽性を認めた。骨髄由来細胞のパラクリン作用を確認するため、骨髄由来細胞の培養上清を用い培養内皮細胞の増殖をみる実験を行った。培養内皮細胞への骨髄由来細胞培養上清の添加は内皮細胞培養上清の添加に比べ内皮細胞のBrdUの取り込みを52%増やした。また、RASの調節酵素であるアンジオテンシン変換酵素(ACE)とACE2の蛋白発現を調べた。骨髄由来細胞は内皮細胞に比べACEの発現が少なく、ACE2の発現が多いことがわかった。以上から、使用した骨髄由来細胞はパラクリン作用をもち抗炎症作用をもつとされる間葉系幹細胞を含み、ACE/ACE2比が低く局所RASに対し抑制的に働く可能性が示唆された。「脳への骨髄由来細胞の分布不全が脳内RASおよび酸化ストレスの抑制不全を引き起こし中枢性機序として高血圧の病態に関連している」という仮説のもと、次の実験を行った。中枢性機序による高血圧モデルとしてAng II持続投与高血圧ラットを用いた。対照液(生理食塩水)の持続皮下投与と培養液の脳室内投与(icv)を受けた群(V/M群, n=5)、対照液の持続投与と骨髄由来細胞のicvを受けた群(V/B群, n=3)、Ang II持続投与と培養液のicvを受けた群(A/M群, n=4)、Ang II持続投与と骨髄由来細胞のicvを受けた群(A/B群, n=5)の4群を作成した。Ang IIは浸透圧ミニポンプを皮下へ埋込み150 ng/kg/minで持続投与した。ミニポンプ埋込み1週間後に自家骨髄由来細胞(1×106個)または培養液のicvを行った。ミニポンプ埋込み3週後に大腿動脈にカテーテルを留置する手術を行い、無麻酔無拘束下に安静時血圧を測定した。また、ヘキサメソニウム(C6)を静注した際の血圧降下度より安静時交感神経活動を評価した。V/M, V/B, A/M, A/B群の平均血圧(MAP)はそれぞれ125±2, 116±2, 174±7, 134±8 mmHgでAng II投与でMAPは上昇し、骨髄由来細胞の脳室内投与でその上昇は抑制されていた。C6投与後の血圧降下度はV/M, V/B, A/M, A/B群でそれぞれ38±3, 46±6, 77±5, 48±1 mmHgでAng II投与で降下度は大きくなったが、骨髄由来細胞の脳室内投与でその降下度は縮小した。骨髄由来細胞の脳室内自家移植はAng II持続投与による交感神経活動の亢進をおさえ血圧上昇を抑制した。

骨髄由来細胞から分泌された液性因子がAng IIの交感神経活動亢進作用に拮抗した可能性が考えられた。「脳への骨髄由来細胞の分布不全が脳内レニン-アンジオテンシン系(RAS)および酸化ストレスの抑制不全を引き起こし中枢性機序として高血圧の病態に関連している」という仮説のもと実験を行い、骨髄由来細胞の脳室内自家移植はAng II持続投与による交感神経活動の亢進をおさえ血圧上昇を抑制すること、また、骨髄由来細胞から分泌された液性因子がAng IIの交感神経活動亢進作用に拮抗した可能性が考えられる結果を得た。また、昨年度(H25)は主に使用した骨髄由来細胞の性質について検討を進め、脳室内投与実験で用いた細胞と同じ条件で培養した骨髄由来細胞はパラクリン作用をもち抗炎症作用をもつとされる間葉系幹細胞を含み、ACE/ACE2の発現比が低く局所RASに対し抑制的に働く可能性が示唆された。本年度は培養骨髄由来細胞で確認できた細胞の性質が交感神経活動亢進の抑制機序と関連があるかについて、Ang II持続投与ラットの脳をもちいて検討を進めた。Ang II持続投与ラットの延髄および前脳では、TGF-βおよびAT1受容体の蛋白発現が増加していたが、骨髄由来細胞の脳室内自家移植でその増加は抑制されていた。IL-10の蛋白発現には変化を認めなかった。骨髄由来細胞の培養上清および脳脊髄液、脳組織におけるAng 1-7の濃度測定を試みたが、いずれの検体においても検出感度に達していなかった。以上より脳内骨髄由来細胞はAng IIによる脳内の炎症およびAT1受容体発現増加をおさえ、Ang II持続投与に伴う交感神経活動亢進を抑制する可能性がある。高血圧学「脳への骨髄由来細胞の分布不全が脳内RASおよび酸化ストレスの抑制不全を引き起こし中枢性機序として高血圧の病態に関連している」という仮説のもと、骨髄由来細胞は高血圧の中枢性機序を改善しうるか?という疑問点に対し、培養骨髄由来細胞の性質について検討を進めた。従来の骨髄由来細胞の報告の再現データを含め、RASを調節しうる可能性を示唆する結果が得られている。「脳への骨髄由来細胞の分布不全が脳内RASおよび酸化ストレスの抑制不全を引き起こし中枢性機序として高血圧の病態に関連している」という仮説のもと、骨髄由来細胞の脳内分布増加は中枢性機序による高血圧を改善させるか?という疑問点に対し、中枢性機序による高血圧モデルであるAng II持続投与高血圧ラットを用いて検討を行った。実験手技が安定し、比較的信頼性の高い結果が得られている。今回、中枢性機序による高血圧モデルであるAng II持続投与高血圧ラットでは、骨髄由来細胞の脳内分布増加が血圧上昇を抑制する可能性、および、骨髄由来細胞は高血圧の中枢性機序を抑制しうる可能性を示唆する結果を得ることができた。今後はAng II持続投与以外の中枢性機序による高血圧モデル動物および骨髄由来以外の間葉系幹細胞でも同様の抑制効果が確認できるか検討する必要があると考えられた。今回、中枢性機序による高血圧モデルであるAng II持続投与高血圧ラットでは、骨髄由来細胞の脳内分布増加が血圧上昇を抑制する可能性を示唆する結果を得ることができた。ただし、高血圧自然発症ラットでは同様の血圧上昇抑制効果は確認できなかったことより、他の高血圧モデルでも検討する必要があると考えられた。本年度は培養細胞の実験が中心であったため、76,645円の差額が生じた。Ang II持続投与以外の中枢性機序による高血圧モデル動物および骨髄由来以外の間葉系幹細胞でも同様の抑制効果が確認できるかの検討を開始する。
チャンネル蛋白に作用するシガトキシンとテトロドトキシンの化学合成と活性発現機構

シガトキシンのようにポリオキシエチレン鎖による多環構造は、syn/trans型の立体化学が繰り返され、アセチレンの化学は、コバルト錯体が中員環エーテル形成の立体選択的反応として有効に働き、その立体制御もsyn/trans型のみ生成させることはすでに確立している。中員エーテル環形成後は、アセチレンコバルト錯体は、ロジウムを用いた高圧水添法・スズヒドリドやケイ素ヒドリド法による還元的脱錯体化反応などを用いる。ヒドロシリル化反応もコバルトは触媒量的な当量関係で進行する。CTXは、左右の2大セグメント合成を終え、アセチリド求核剤とアルデヒド求電子剤間で左右両セグメントのカップリングについてモデル方法論を確立した。さらに、予想される副反応について予め対策を練ることもできたので、より直裁的なルートを確立するため、アセチレンコバルトを位置選択的にケトンに変換する方法論を樹立した。全合成の完遂を目前としている。テトロドトキシンについても、シグマトロピーを用いた糖質を出発する合成方法を2003に完成し、さらにDiels-AlderおよびOverman反応を機軸とした合成ルートで2004年にそれぞれ全合成を完成した。これらは、ナトリウムチャンネルに作用するテトロドトキシンとシガトキシンは、イオン流を停止する作用と開放する作用と、それぞれ反対の作用を示す両巨頭化合物である。^<13>Cアイソトープ標識化合物を合成し、活性を無くした天然テトロドトキシン代謝物の追跡実験が可能となる。すでに重水素原子を用いるナノLCMSによる追跡を開発しており、磯部の独特の手法によるものであって、基礎的な有機合成化学にきわめて多くの知見を与え、生物有機化学的・有機分析化学的な大きな進歩をも遂げることができた。シガトキシンのようにポリオキシエチレン鎖による多環構造は、syn/trans型の立体化学が折り返され、アセチレンの化学は、コバルト錯体が中員環エーテル形成の立体選択的反応として有効に働き、その立体制御もsyn/trans型のみ生成される手法を確立した。閉環後はロジウムを用いた高圧水添法・スズヒドリドやケイ素ヒドリド法による還元的脱錯体化反応などを用いた。ヒドロシリル化反応は触媒量的な当量関係で進行する方法を確率した。CTXは、左右の2大セグメント合成を終え、両者のカップリングによる全合成の完遂を目前としている。テトロドトキシンについても、糖質を出発する合成方法を確立し、その全合成を完成した。

これらは、ナトリウムチャンネルに作用するテトロドトキシンとシガトキシンは、イオン流を停止する作用と開放する作用と、それぞれ反対の作用を示す両巨頭化合物である。^<13>Cアイソトープ標識化合物を合成し、活性を無くした天然テトロドトキシン代謝物の追跡実験が可能となる。すでに重水素原子を用いるナノLCMSによる追跡を開発しており、磯部の独特の手法によるものであって、基礎的な有機合成化学にきわめて多くの知見を与え、生物有機化学的・有機分析化学的な大きな進歩をも遂げることができた。
膜電位測定による麻酔薬の微小循環血管拡張作用の細胞内レベルでの機序解明

本研究は、抵抗および容量血管である腸間膜動・静脈を用い、吸入麻酔薬(イソフルラン)がいかなる機序で微小循環系の血管平滑筋を弛緩させるのかを、NO-cGMP系に特異的な阻害薬(L-NAME、ODQ、cGMPS)およびPGI_2-cAMP系に特異的な阻害薬(SQ22536、Rp-cAMPS)を用い、in situで血管平滑筋静止膜電位を測定することにより明らかにする。ペントバルビタール基礎麻酔下に、剥離した腸間膜動・静脈を固定し、ガラス管微小電極を動・静脈壁に刺入し、微小電極増幅器を用いて静止膜電位を測定、記録した。イソフルランを気化器より吸気中に投与し、NO-cGMP系に特異的な阻害薬であるL-NAME、ODQ、cGMPSまたはPGI_2-cAMP系に特異的な阻害薬であるSQ22536、Rp-cAMPSのいずれかを血管外から適用し、その後静止膜電位を測定した。NO-cGMP系阻害薬およびPGI_2-cAMP系阻害薬はいずれも静止膜電位を有意に脱分極させた。イソフルランは静止膜電位を有意に過分極させた。このイソフルランによる過分極をPGI_2-cAMP系阻害薬は有意に抑制したが、NO-cGMP系阻害薬は抑制しなかった。これらの結果から、イソフルランによる血管平滑筋静止膜電位の過分極および血管拡張作用にPGI_2-cAMP系が関与するが、NO-cGMP系は関与しないことが示唆された。静脈麻酔薬であるプロポフォールを用いた同様の実験手法による研究(前年度に報告)では、プロポフォールによる血管平滑筋静止膜電位過分極作用は、NO-cGMP系及びPGI_2-cAMP系に関しては今回と全く反対の結果であった。即ち、プロポフォールとイソフルランでは、血管平滑筋細胞内での血管拡張作用機序が異なると考えられた。本研究は、抵抗および容量血管である腸間膜動・静脈を用い、静脈麻酔薬(プロポフォール)がいかなる機序で微小循環系の血管平滑筋を弛緩させるのかを、NO-cGMP系に特異的な阻害薬(L-NAME、ODQ、cGMPS)およびPGI_2-cAMP系に特異的な阻害薬(SQ22536、Rp-cAMPS)を用い、in situで血管平滑筋静止膜電位を測定することにより明らかにする。ペントバルビタール基礎麻酔下に、雄SDラットの大腿動・静脈にカニュレーションした(動脈圧測定および静脈路確保)。呼気ガスをモニターし、ベンチレーターにて呼気炭酸ガス濃度が一定となるように人工呼吸した。開腹後、実体顕微鏡下に腸間膜動・静脈を剥離した。実験チャンバー上に剥離した腸間膜動・静脈を固定し、PSS(physiological salt solution)を血管外から灌流した。ガラス管微小電極を動・静脈壁に刺入し、微小電極増幅器を用いて静止膜電位を測定、記録した。プロポフォールを大腿静脈内へ持続注入し、NO-cGMP系に特異的な阻害薬であるL-NAME、ODQ、cGMPSまたはPGI_2-cAMP系に特異的な阻害薬であるSQ22536、Rp-cAMPSのいずれかを血管外から適用し、その後静止膜電位を測定した。プロポフォールは静止膜電位を有意に過分極させた。このプロポフォールによる過分極をNO-cGMP系阻害薬は有意に抑制したが、PGI_2-cAMP系阻害薬は抑制しなかった。これらの結果から、プロポフォールによる血管平滑筋静止膜電位の過分極および血管拡張作用にNO-cGMP系が関与するが、PGI_2-cAMP系は関与しないことが示唆された。

静脈麻酔薬であるプロポフォールを用いた同様の実験手法による研究(前年度に報告)では、プロポフォールによる血管平滑筋静止膜電位過分極作用は、NO-cGMP系及びPGI_2-cAMP系に関しては今回と全く反対の結果であった。即ち、プロポフォールとイソフルランでは、血管平滑筋細胞内での血管拡張作用機序が異なると考えられた。
主として屋根面開口部による住宅の通風性能改善技術の開発研究

通風を効果的に利用できる窓の配置が設計段階で把握できることを目的として、住宅地を想定した実験とシミュレーションを行った結果、周りに建物が建っている場合でも、天窓を使うことで、涼しい外気を家の中により多く取り込めるようになることが明らかとなった。また、開ける窓の位置で室内の風の流れ方が変わり、特に天窓を風の出口に使用すると、室内に入った風が部屋全体で渦を巻き、より広い範囲で風が流れることで平均的な風速が高まることが明らかとなった。本研究は、密集地に建つ戸建て住宅を主たる対象に、シミュレーション技術を効果的に活用して、通風の有効のための最適設計法の確立を目指したものである。本年度は、密集市街地環境における建物周辺圧力環境のCFDを用いた高精度予測法の確立から着手した。その結果、Durbinリミタによる乱流タイムスケールの制約をかけてk-eモデルを適用すれば、建物風上正面などでの風圧係数の過大評価が大きく緩和され、予測精度の向上に繋がることを明らかにした。また、マルチブロック法の効果的な利用法について検討し、実際に近い複雑な住宅形状をハンドリングできること、高精度の圧力分布予測が可能なこと、また、サイクル境界条件に適用により、グロス建坪率の変化に伴う風圧力変化について高精度予測が可能なことを確認した。これらのCFD結果は全て風洞実験を新たに行って得られた実験データとの比較に基づくものである。また、天窓、壁面窓の組み合わせに対応する通風量の風洞実験データを取得し、天窓が開口面積の割に通風量を確保する上で、効果的な換気経路となることを見出し、建物周辺領域を含む室内領域の一括CFD解析を試みた。その結果、通風量が実験よりも過小評価となることを確認したが、これはk-eモデルの欠点が顕在化したためと考えられ、この問題については次年度に検討課題となった。また、実大建物の通風性能評価を想定した実測を試みたが、開口部の開放条件による室内通風環境の相違が顕著には認められなかった。この点については、実験施設の長期間計測による検討が必須であり次年度に再度実験を試みる予定である。一方、通風計画時において、期待される熱負荷削減効果を簡易に推定する手法の整備を目指し、建物の熱特性と通風条件、気候との適合性についてシミュレーションにより検討を行った。窓開放時の参照温度と窓閉時の参照温度の問に外気温が収まる時間割合(換気有効時間率)により、通風による冷房負荷削減量を定量的に予測できることを明らかにした。本研究は、密集地に建つ戸建て住宅を主たる対象に、シミュレーション技術を効果的に活用して、通風の有効利用のための最適計算法の確立を目指したものである。本年度は昨年度に引き続き、密集市街地環境にこける建物周辺圧力境界のCFDを用いた高精度予測法の確立を実施した。昨年度は対象建物の屋根形状を陸屋根と想定して検討を行ったが、本年度はこう配屋根(5寸、15°)や周辺のグロス建蔽率(10、20、40%)をパラメータとした検討を実施した。その結果、Durbinリミタを組み込んだ改良k-εモデルを用いることで、さまざまな屋根形状および建蔽率における市街地鉛直風速分布が再現でき、風圧係数分布についても高精度の予測が可能なことを確認した。これらのCFD結果はすべて風洞実験を新たに実施し、得られた実験データとの比較に基づくものである。また検討建物の周辺領域における屋外気流計算結果から、局所相似モデルに基づいて境界条件を取得し、検討建物の室内解析の実を実施する領域分割法を開発し、対象建物の外周部周辺領域を含む全域計算(従来法)と比較し、精度検証を実施した。その結果、風圧係数、接線方向動圧係数、通風量、室内気流分布について十分な予測精度を確認した。平成21年3月16日に海外から多数の研究者を招聘し、「第3回自然換気に関する国際ワークショップ」を主催した。国内外から多数の研究者や実務者が参加する中、本研究課題の成果である「領域分割法を用いた開口部位置の通風性能評価」について発表を行った。本ワークショップでは海外研究者と通風研究に関する情報交換ができ、今後の通風研究において意義のあるものとなった。本年度は屋根開口部の通風モデルにおいて、昨年度に引き続き実大建築の通風性能評価を想定した実測を実施し、開口部の解放条件による室内通風・気流環境の相違を把握した。また実測対象建物の周辺を含めたCFDを実施し、室内気流構造が実測とCFDで良好に対応することを確認した。またCFD計算の際、より計算負荷の小さい手法として提案した領域分割法について、これまでは従来の計算方法との比較のみを実施するに留まっていた。

本年度は風洞実験結果と比較することで領域分割法の予測精度検証を実施した結果、十分な予測精度を確認した。さらに領域分割法を適用したCFD解析を実施し、種々の開口条件における通風性能について、地域別・時間帯別の通風気流データベースを作成した。その後データベースをもとに、東京と大阪を例にとって通風性能評価を行い、室内気流分布や居住域平均風速の観点から最適開口部配置を検討した。その結果、居住域風速が最大となる開口部の組み合わせは地域・時間帯の影響を受けたが、開口部流入風速に対する居住域平均風速の比(風速比)の観点からは、地域や時間帯を問わず壁コーナー部分と天窓開口部の組み合わせが有効であることが確認された。
大学におけるＩＲの機能に関するエスノグラフィー　　－日本と米国・中国との比較

概ね研究計画に沿って、順調に研究が進展している。主に下記の4つの側面で調査、研究を行った。1所属の大学のIR担当者としての新入生調査・在校生調査・卒業時調査を行い、大学の既有の教学データと紐付け、インプットが学生の学習プロセス、及び学生の学習成果について分析を行った。2日本私立大学連盟による実施する「大学のインスティテューショナル・リサーチ(IR)に関するアンケート」のデータを用いて、二次分析を行った。3中国高等教育評価センター、中国、アメリカの大学の教育質保証、IRの現状について調査を行った。4上述の分析・研究成果を、日本高等教育学会大会、国際高等教育研究フォーラムなどで発表、講演を行った。また一部は2019年度の学会発表と予定されている。今年度の調査、分析を通じて、日本および中国とアメリカの質保証、情報公開に関する政策動向、またIRの位置付けと展開の状況を把握した。さらに、学生調査の分析、とりわけ学生の勉強時間及びアメリカ、中国との比較を行い、その差異と規定要因を分析した。その上で、学生調査の分析結果をいかに教育改善に結びつくかとの問題点を提示した。研究計画に沿って、概ね順調に研究が進んでいる。1日本の他大学の学生調査及び米国・中国の既存調査及び前年度中国で実施した学生調査との大学間の比較、ベンチマークを行う。2日本の5大学を選び、IRの関係者にインタビューし、継続的なエスノグラフィーを行う。そうすることによって、大学執行部および教職員に対して、具体的な改善の方向性、可能性を示すことをめざす。ハワイ大学などの調査は所属大学国際部からの依頼出張と合わせたため、また調査大学の都合で一部の調査は31年度に実施するとなっている。
地震時の脱線後の鉄道車両と線路構造間の連成振動・衝撃解析の数値計算法の開発

地震時の脱線後の鉄道走行車両と線路構造間の連成振動・衝撃現象を表わす効果的な力学モデルと数値計算法を明らかにし、地震時の編成車両の脱線後までの一貫した線路構造上の高速走行のシミュレーションが可能となった。また、地震時の脱線後の車両と線路構造間の激しい連成振動・衝撃現象を数値的に解明し、脱線しても軌道内を逸脱しないで走行する逸脱防止機能を有する新しい軌道構造の検討に役立てることができた。鉄道車両が高速走行中に大きな地震が発生すると、車両と線路構造間に複雑な連成振動・衝撃現象が生じ脱線となる。本研究は、脱線後の走行車両と線路構造間の連成振動・衝撃現象を表わす効果的な力学モデルと数値計算法を明らかにして、地震時の編成車両の脱線後までの一貫した線路構造上の高速走行のシミュレーションを可能にし、脱線後の複雑で激しい連成振動・衝撃現象を数値的に解明し、脱線しても軌道内を逸脱しないで走行する逸脱防止機能を有する鉄道構造の設計に学術的に役立てることを目的としている。その4ヵ年の研究計画は以下のとおりである。(1)平成20年度は、車両はMultibody Dynamics(MD)により、線路構造は有限要素法(FEM)によりその非線形運動方程式を誘導する。ここでは、地震時の脱線後の車両と逸脱防止機能(ガード)を持つ長大な軌道構造との連成振動・衝撃現象を効果的に表すため、MDとFEMを併用した効果的な力学モデルを明らかにする。(2)脱線後の車両と線路構造間の連成振動・衝撃現象は地震による構造全体の低周波振動に、車輪と軌道構造間の接触・衝撃による1kHz以上の高周波振動が加わるマルチスケール問題となることから、平成21年度は、この車両と線路構造のマルチスケール非線形運動方程式を数値的に解くための、筆者が提案のモーダル法と厳密積分法を応用したその安定した数値積分法を確立する。(3)平成22年度は、平成20、21年度の研究で明らかにした力学モデルと数値計算法に基づき、地震時の編成車両の線路構造上の脱線後を含む高速走行のシミュレーションプログラムの開発を行う。(4)平成23年度は、本法を逸脱防止ガードを設置した高架橋に適用し、地震時の高速走行車両とその線路構造間の脱線後の連成振動・衝撃現象を数値的に解明しその構造設計に利用できるようにする。本研究は、地震時の脱線後の鉄道走行車両と線路構造間の連成振動・衝撃現象を表わす効果的な力学モデルと数値計算法を明らかにして、地震時の編成車両の脱線後までの一貫した線路構造上の高速走行のシミュレーションを可能にし、脱線後の激しい連成振動・衝撃現象を数値的に解明し、脱線しても軌道内を逸脱しないで走行する逸脱防止機能を有する鉄道構造の設計に学術的に役立てることを目的とするもので、平成20年度はその初年度として以下を実施した。(1)地震時の脱線後の鉄道車両と線路構造間の接触衝撃現象では、軌道構造の断面内は微小変形で剛体移動するものと考えられることから、軌道断面はマルチボディダイナミックス(MD)により、また長手方向はFEM (梁、シェル要素)でモデル化し、脱線後の車輪と、逸脱防止ガードを有する長大な軌道構造間の接触衝撃現象を少ない自由度で表現する効果的な力学モデルを開発した。(2)走行輪は地震時に脱線後は、軌道面への落下衝突や、落下後軌道面を跳ねながらの接触走行や、逸脱防止ガードへの衝突や、逸脱防止ガードに衝突し跳ね返った後のレールへの衝突等の、脱線後の車輪と軌道構造間の接触衝撃現象を表す、MDとFEMを併用したシンプルで効果的な力学モデルと非線形運動方程式の定式化を行った。(3)このMDとFEMを併用した長大な軌道構造のモデル化は、超電導磁気浮上式車両のガイドウエイ上の高速走行のシミュレーションの研究で、ガイドウエイのモデル化のために筆者らが考案したものを応用し、脱線後の車輪と軌道間の接触衝撃の力学モデルを開発した。またこれらの定式化とテストプログラムの作成を行った。(4)この研究成果はWCCM8国際会議で発表し、また米国機械学会の国際ジャーナルで出版した。平成20年度に、地震時の脱線後の、走行輪の軌道面へ落下衝突や逸脱防止ガードへの衝突等の脱線後の車輪と軌道構造間の接触衝撃現象を表す、マルチボディダイナミックス(MD)とFEMを併用したシンプルで効果的な力学モデルが開発されその非線形運動方程式の定式化が得られたことから、平成21年度は、その高周波振動現象を含む非線形運動方程式を数値的に安定して解くための数値計算法の開発を以下のように行った。(1)地震による線路構造全体の低周波振動と、脱線後の車輪と軌道構造間の衝撃による1kHz以上の高周波振動が加わったマルチスケールの振動衝撃現象を表す非線形運動方程式を数値的に安定して解くためモーダル法と厳密積分を組み合わせた新たな数値積分法の定式化を行い、またテストプログラムの作成を行い脱線後の車輪と軌道構造間の衝撃による1kHz以上高周波振動が安定して解けることを確認した。

(2)この研究成果は、平成20年度の地震時の脱線後の車輪と軌道構造間の接触衝撃現象を表す力学モデルの成果と合わせて、地震工学と動力学の国際会議CompDyn2009と高速鉄道の国際会議CivilComp2009での論文発表や、第一線の研究者との国際的な討議を通して、妥当性を明らかにし国際的な評価を得ることができた。平成20年度と21年度に、地震時の脱線後の車輪の軌道面へ落下衝突や逸脱防止ガードへの衝突等の車輪と軌道構造間の接触衝撃現象を表すマルチボディダイナミックス(MD)とFEMを併用したシンプルな力学モデルが開発されその非線形運動方程式が得られた。また、脱線後の車両と線路構造間の、地震による構造全体の低周波振動に車輪と軌道構造間の接触・衝撃による1kHz以上の高周波振動が加わるマルチスケールの連成振動衝撃現象をあらわす車両と線路構造の強度の非線形の運動方程式を数値的に解くための、田辺(研究代表者)が提案のモーダル法と厳密積分法を応用した安定したその数値積分法が得られた。1)平成22年度は、この平成20年度と21年度の成果であるMDとFEMを併用した力学モデルと数値計算法に基づき、地震時の編成車両の線路構造上の脱線後を含む高速走行のシミュレーションプログラムの開発を行った。ここでは、田辺がすでに開発した、地震時の高速走行鉄道車両と線路構造の脱線にいたるまでの連成振動・衝撃解析プログラムと線路構造の衝撃解析プログラムを基にして、それらを活用・拡張し効果的に開発を行い、様々な例題を通して地震時の脱線後を含む新幹線車両と線路構造間の連成振動・衝撃解析が行われることを確認した。2)この研究成果は、平成20、21年度の成果と合わせて、計算力学の国際会議WCCM9とマルチボディダイナミックスの国際会議ACMD2010での講演(招待)と論文発表や、第一線の研究者との国際的な討議を通して、妥当性を明らかにし国際的な評価を得ることができた。平成20年度と21年度に、地震時の脱線後の車輪の軌道面への落下や逸脱防止ガードへの衝突等の脱線後走行における車輪と軌道構造間の接触衝撃現象を表す、マルチボディダイナミックス(MBD)とFEMを併用したシンプルな力学モデルを開発し、脱線後の車両と線路構造の非線形運動方程式が得られた。また、脱線後の車両と線路構造間の、地震による構造全体の低周波振動に車輪と軌道構造間の接触・衝撃による1kHz以上の高周波振動が加わるマルチスケールの連成振動・衝撃現象をあらわす車両と線路構造の強度の非線形運動方程式を数値的に解くための、モーダル法と厳密積分法を応用した安定したその数値積分法が得られた。平成22年度は、この力学モデルと数値計算法に基づき、地震時の編成車両の線路構造上の脱線後を含む高速走行のシミュレーションプログラムの開発を行った。平成23年度は、本法を逸脱防止ガードを設置した新幹線の実際の標準高架橋に適用して、新幹線車両の地震時の脱線を含む高速走行のシミュレーションを行い、地震時での車両と線路構造間の脱線後までの連成振動・衝撃現象の解析を行うことができた。また、本年度は本研究の最終年度であることから、平成23年度までに得られた成果をまとめて、内外の学会で論文発表と講演を行った。
生物多様性を規範とする革新的材料技術

「生物規範工学」の成果取りまとめの目的は、生物多様性のデータベース、とりわけ分類学・自然史学の研究の対象として扱われてこなかった走査型電子顕微鏡(SEM)画像や、第4次産業革命とも言われるIoT(モノのインターネット)や3Dプリンティングによるモノつくりにおいて今後の重要性が格段に増すと考えられるX線マイクロCT画像、などを中心としたデータジャーナル機能の構築と公開を促進するために、博物館や水族館などの本務である自然史財の収集・保管・調査に加え、それらがバイオミメティクスやナノテクノロジー、環境科学など様々な分野で有効に使われることについてタックスペイアーをはじめとするステークホルダーに周知し啓蒙することにある。北海道大学総合博物館、国立科学博物館、千歳水族館、美ら海水族館、高分子学会バイオミメティクス研究会、アスクネイチャー・ジャパン、ナノテクノロジービジネス推進協議会バイオミメティクス分科会などの協力のもと、下記の活動を行うとともに、わが国におけるネットワークセンターとしてのNPO法人バイオミメティクス推進協議会を設立した。(1)アウトリーチ活動:北海道大学総合博物館において毎月開催されるバイオミメティクス市民セミナー12回を共催。美ら海水族館における“サメ肌企画展"の企画(平成30年7月予定)。(2)学会活動:高分子学会バイオミメティクス研究会を協賛し、国立科学博物館において開催。日本化学会第98春季年会において“ATPセッション:生態系バイオミメティクスの新潮流:持続可能な社会を支える基盤技術"を企画開催。(3)国際会議: 6th Nagoya Biomimetics International Symposiumを開催。(4)国際標準化: ISO TC266 Biomimeticsにおいてバイオミメティクス知識基盤の技術報告書とりまとめ。(5)書籍出版:『持続可能性社会を拓くバイオミメティクス』(日本化学会編)を出版。29年度が最終年度であるため、記入しない。視点・論点、2017年11月6日(月)NHK総合4:204:30 NHKEテレ13:5014:00、下村政嗣「バイオミメティクス持続可能な技術革新」
認知症の神経変性機序における異常蛋白質重合と炎症反応の関与

我々は以前より内因性アポトーシス抑性因子IAPs (X- inhibitor to apoptosis proteins)とタウ蛋白、TDP-43、ジペプチドリピート蛋白との相互作用を検討し、両者が結合することを確認してきた。そこで、これら凝集性蛋白を凝集させ、各凝集体とIAPsとの結合性、およびCaspase-1との結合性をpull-down assayにて検討した。切断型のタウ、およびTDP-43を凝集させたサンプルにXIAP、およびcIAP1を添加したところ、XIAP、およびcIAP1両者とも凝集体に結合した。さらにこれらにCaspase-1を添加したところ、Caspase-1はcIAP1には結合するがXIAPには結合しないことが確認された(Caspase-1をリクルートするCARD領域がないため)。また、このとき、一定の条件下でCaspase-1の自己切断が確認できた。凝集性蛋白の抽出、およびその扱いに関して上手くいかない点があり、結果測定が遅れている。適切なdetergentによる回収、抽出を検討しており、問題が解決されれば進められるものと考えている。凝集性蛋白の抽出、およびその扱いに関して上手くいかない点があり、結果測定が遅れているため支出が遅れている。抽出が改善されれば次年度に支出できる。
大腸癌細胞クラスター形成機構の解明と新規抗癌転移治療法への応用

癌上皮細胞がEMTにより間葉系の細胞に分化することにより、細胞間の接着能が低下し、癌細胞が周辺組織により浸潤し易くなる。さらにEMT関連転写因子の強制発現を基にした主にin vitro実験系の結果より、EMT仮説は、癌浸潤・転移様式を理解する上で広く受け入れられている。しかしながら患者癌組織におけるEMTの存在は病理組織学的に確認が困難である。一方、癌細胞クラスターが細胞-細胞接着能を有したまま上皮系の形態を維持し、播種・転移することが最近重要視されている。EMTおよびクラスター形成をきたした癌細胞が転移に寄与しているか、患者癌を使用した動物モデルでの証明が必要である。本研究では、13例の患者大腸癌よりPDXモデルを樹立し、同所移植により新たな免疫不全NOGマウスに継代可能なラインを樹立した。さらにPDXよりtumor cellorganoid培養を樹立し、本研究に役立てた。tumor cellorganoidにE-cadherin-shRNAをレンチウイルスベクターにより導入したところ対照のshRNAの効果に比較して、癌細胞間の接着能が抑制された。また、これらのorganoidをマウスの脾臓に注入したところ、E-cadherin-shRNA群で有意に肝臓の転移が抑制された。以上結果より、患者大腸癌転移のコロニー形成にはE-cadherinで媒介される、細胞ー細胞接着が必須であることが示唆された。患者大腸癌転移のコロニー形成にはE-cadherinで媒介される、細胞ー細胞接着が必須であることが示唆された。本研究より、患者大腸癌転移のコロニー形成にはE-cadherinで媒介される、細胞ー細胞接着が必須であることが示唆された。しかしながら、E-cadherinの発現と共存することが可能であるpartial EMTのマーカーであるSnail, ZEB1などのEMT転写因子の関与も調査される必要がある。癌の浸潤・形成過程は癌医学上重要な問題であるが,いまだ未解明な面が大きい.とくに癌上皮細胞がepithelial-mesenchymal transition(EMT:上皮間葉移行)を介して単一細胞化し浸潤・転移能を獲得する(EMT仮説),あるいは癌細胞が細胞-細胞接着能を有した細胞集団(クラスター)を形成し浸潤・転移形成に寄与する,という2つの仮説をめぐりいまも論争が続いている.現在,EMT仮説が優勢であり認識度が高いものの,患者癌組織でのEMTの進行過程や程度には疑問も持たれている.一方,単一の癌細胞がEMTを介し転移形成能を持つという直接的証拠はない.研究代表者らはEMTを生じた単一細胞ではなく,むしろクラスター形成した癌細胞が浸潤・転移形成の要因として重要との仮説を立て,クラスター形成阻害の治療への応用を目指し本研究に着手した.本研究はこれまで治療標的として認識度が低かった「癌細胞クラスターの形成阻害」から転移抑制法の開発を目指す独創性の高いものであり,この成果は基礎から臨床への架け橋となるものである.合計13例の患者大腸癌組織をNOGマウスに移植しPDXモデルを作製した。その内少なくとも4例で、E-cadherin陽性の血中循環癌細胞クラスターの形成が確認された。また3例の患者大腸癌組織よりin vitroorganoid培養を施行しNOGマウスに同所移植したところ、同様にE-cadherin陽性の血中循環癌細胞クラスターの形成が確認された。そこで、本研究ではE-cadherinの中和抗体やshRNAを作製した。患者大腸癌由来PDXより培養大腸癌organoidを樹立し、これらのE-cadherin抑制剤を投与したところ、癌クラスター形成を有意に阻害した。さらにE-cadherinの癌クラスター形成能が転移形成に寄与しているか否かを検討した。対照群のランダム配列を認識するshRNAが導入された大腸癌organoidと比較して、shRNAでE-cadherinの発現が抑制された大腸癌organoidは、免疫不全マウスの門脈に注入された時、有意に肝臓における転移形成を抑制した。以上の結果よりE-cadherinは大腸癌organoidのクラスター形成に必須であり、転移のコロニー形成能を媒介することが示唆された。しかしながら、E-cadherinの抑制は正常上皮細胞の細胞ー細胞接着を媒介している可能が示唆されている故、重篤な副作用が危惧される。今後は、癌細胞特異的に細胞ー細胞接着を抑制するseedの取得が必要があると考えられる。患者大腸癌組織をNOGマウスに移植しPDXモデルを作製し,E-cadherin陽性の血中循環癌細胞クラスターの形成を確認した。患者大腸癌組織よりin vitroorganoid培養を施行しNOGマウスに同所移植したところ、E-cadherin陽性の血中循環癌細胞クラスターの形成が確認された。さらにE-cadherinの癌クラスター形成能が転移形成に寄与しているか否かを検討する実験を行った.対照群のランダム配列を認識するshRNAが導入された大腸癌organoidと比較して、shRNAでE-cadherinの発現が抑制された大腸癌organoidは、免疫不全マウスの門脈に注入された時、有意に肝臓における転移形成を抑制した。以上の結果よりE-cadherinは大腸癌organoidのクラスター形成に必須であり、転移のコロニー形成能を媒介することが示唆されており,本研究課題が順調に進捗していると判断した。

癌上皮細胞がEMTにより間葉系の細胞に分化することにより、細胞間の接着能が低下し、癌細胞が周辺組織により浸潤し易くなる。さらにEMT関連転写因子の強制発現を基にした主にin vitro実験系の結果より、EMT仮説は、癌浸潤・転移様式を理解する上で広く受け入れられている。しかしながら患者癌組織におけるEMTの存在は病理組織学的に確認が困難である。一方、癌細胞クラスターが細胞-細胞接着能を有したまま上皮系の形態を維持し、播種・転移することが最近重要視されている。EMTおよびクラスター形成をきたした癌細胞が転移に寄与しているか、患者癌を使用した動物モデルでの証明が必要である。本研究では、13例の患者大腸癌よりPDXモデルを樹立し、同所移植により新たな免疫不全NOGマウスに継代可能なラインを樹立した。さらにPDXよりtumor cellorganoid培養を樹立し、本研究に役立てた。tumor cellorganoidにE-cadherin-shRNAをレンチウイルスベクターにより導入したところ対照のshRNAの効果に比較して、癌細胞間の接着能が抑制された。また、これらのorganoidをマウスの脾臓に注入したところ、E-cadherin-shRNA群で有意に肝臓の転移が抑制された。以上結果より、患者大腸癌転移のコロニー形成にはE-cadherinで媒介される、細胞ー細胞接着が必須であることが示唆された。患者大腸癌転移のコロニー形成にはE-cadherinで媒介される、細胞ー細胞接着が必須であることが示唆された。効率的なスクリーニングを目指し、現在、安定して大腸癌organoids培養系の確立の為の条件検討を行ってきた.大腸癌organoids培養系を用いて、high through-putscreeningを計画している。3X102大腸癌organoidsを96 well plateにMatrigelコート上にまき、化合物ライブラリーを添加して、organoids形成の過程を生細胞イメージングシステムを用いてモニターする。すでにE-cadherinが大腸癌organoidのクラスター形成に必須であり、転移のコロニー形成能を媒介すること,E-cadherinの抑制が正常上皮細胞の細胞ー細胞接着を媒介している可能が示唆されている.今後は本研究で得た知見の臨床応用に向けて癌細胞特異的に細胞ー細胞接着を抑制するseedの取得も検討しつつ研究を進めていく。本研究より、患者大腸癌転移のコロニー形成にはE-cadherinで媒介される、細胞ー細胞接着が必須であることが示唆された。しかしながら、E-cadherinの発現と共存することが可能であるpartial EMTのマーカーであるSnail, ZEB1などのEMT転写因子の関与も調査される必要がある。上記の患者大腸癌検体の移植後のマウスにおける癌増殖の遅延や、血中循環癌細胞が非常に低頻度に検出されることにより、必要な免疫組織染色等の実験量が予想より増えため、時間を要した。使用予定のマウスの購入が先送りになった。
生殖系列の分子機構に関する基礎研究

重点領域研究「生殖系列の分子機構に関する基礎研究(領域番号040)」が昭和63年度から新に発足することが決定されたことに伴い,本研究が当初から最も効率的に遂行されることを主眼として以下に述べるような調査,研究を行った.すなわち,計画研究に予定される研究者が一堂に介して研究計画の概要を紹介し,研究領域のいたずらな重複を避けるとともに,小研究領域の各研究項目について,将来公募研究によって補充すべきことが期待される領域等についての活発な意見の交換を行うとともに,書面等で意見の交換を依頼した.これに前後して,小研究領域の研究代表者およびこれを補助する数人の研究者が頻繁に会合を重ね,発足時における研究体制,発足後の研究の統括などについて具体的な検討を重ねた.また,特に調整を要した分野については,個別の調査及び調整を行い遺漏なきを期した.その結果,各研究者の分担すべき領域,備品の配置,全体の研究の進め方などについて大筋の了解が得られた.特に,研究者相互間の密接な意見交換若手研究者の育成・生殖生物学領域の研究の格段の振興などに関しての具体的方策を策定することができた.重点領域研究「生殖系列の分子機構に関する基礎研究(領域番号040)」が昭和63年度から新に発足することが決定されたことに伴い,本研究が当初から最も効率的に遂行されることを主眼として以下に述べるような調査,研究を行った.すなわち,計画研究に予定される研究者が一堂に介して研究計画の概要を紹介し,研究領域のいたずらな重複を避けるとともに,小研究領域の各研究項目について,将来公募研究によって補充すべきことが期待される領域等についての活発な意見の交換を行うとともに,書面等で意見の交換を依頼した.これに前後して,小研究領域の研究代表者およびこれを補助する数人の研究者が頻繁に会合を重ね,発足時における研究体制,発足後の研究の統括などについて具体的な検討を重ねた.また,特に調整を要した分野については,個別の調査及び調整を行い遺漏なきを期した.その結果,各研究者の分担すべき領域,備品の配置,全体の研究の進め方などについて大筋の了解が得られた.特に,研究者相互間の密接な意見交換若手研究者の育成・生殖生物学領域の研究の格段の振興などに関しての具体的方策を策定することができた.
非線形光学効果を用いた有機ゾル・ゲル光変調デバイスに関する研究

本研究は、大きな非線形性を持つ有機材料の利点を生かしつつ、機械的なもろさを克服することのできる可能性のある有機・無機ゾル・ゲル薄膜を用いて非線形光学効果を利用した光変調デバイスを開発することである。そこで、本年度は、有機材料としてシアニン色素S120のLB膜に注目し、1.シアニン色素(S120)LB膜の電場変調吸収測定、2.シアニン色素(S120)LB膜の3次非線形感受率χ^<(3)>の波長分散の決定を行った。また、CS_2の負の時間応答非線形屈折率効果に着目し、3.CS_2液体ファイバーを用いた新規フェムト秒パルス圧縮法の提案を行った。・1.シアニン色素S120のLB膜を作製し、これらの電場変調吸収測定を行った。測定された電場変調スペクトルは、J会合することによる線形吸収ピーク(J-バンド)に対応した鋭い形状を有すること、また、形状が線形吸収スペクトルのエネルギー2階微分係数とほぼ相似であり、非線形性発現メカニズムは、Frenkel型excitonが寄与する1次のシュタルク効果(基底状態と励起状態の永久双極子モーメントの差で表される)により説明されることを明らかにした。・2.測定された電場変調吸収スペクトルとクラマ-ス・クロニヒ変換を用いた技法により、シアニン色素LB膜ののχ^<(3)>の波長分散を450-700nmにおいて決定した。この結果、シアニン色素LB膜は、共鳴域では|χ^<(3)>|=2.8×10^<-10>esu,非共鳴域においては|χ^<(3)>|=2.4×10^<-12>esuと大きな値を持つことが明らかとなり、高効率光変調デバイスへの応用が期待される。・3.正常分散域において負の時間応答非線形屈折率効果を用いたCS_2液体ファイバーによる新規フェムト秒光パルス圧縮法を提案し、その有用性を計算機実験により明らかにした。この方法は、従来の石英ファイバーを用いた圧縮法と同程度の圧縮効率を有し、かつ、外部位相補償を必要としないという利点を持つ。
偏極希ガスイオンビームの発生と、表面・界面磁性分析への応用

本研究では、磁気ヒステリシス測定等から、スピン偏極イオン散乱分光法による表面磁性分析の妥当性を確認した。さらにイオンビームでは初めて、非断熱遷移間での量子干渉をビーム偏極率の磁気振動として観測することに成功した。さらに、低速イオン散乱の衝突課程において、入射イオンの電子スピンに起因するスピン軌道相互作用を発見し、この相互作用を利用することで、電子スピンを有するイオンをスピン偏極出来ることが明らかとなった。表面・界面の磁性は、低次元系の電子相関を解明する上で重要な学術課題であり、またスピン素子開発等の応用分野でも重要である。本研究者はこれまでに「スピン偏極イオン散乱分光法(SP-ISS)」を開発し、これによって表面・界面の元素選別磁性分析が可能となることを実証した。本研究では、この手法による表面磁性分析の妥当性の検証や、標的磁性元素の質量に近い希ガスイオンの偏極ビームを世界で初めて発生させるための技術開発を行う。本年度では、SP-ISS測定の妥当性検証を目的として、i)イオンビーム照射による表面磁性変化と、ii)非断熱スピン遷移に関して調べた。まずi)に関しては、Fe(100)でのSP-ISSによる磁気ヒステリシスと、イオンビーム照射(2keVAr+イオン)との関係を調べた。イオンビーム照射により、(1)最表面の保持力が増大する、(2)磁気ヒステリシスの正方性が低下する、(3)最表面のスピン分極はほとんど変化しない、等の事柄が明らかになった。イオビーム照射によるこの磁性の変化は、表面に導入された欠陥などがピニングセンターとして働き、磁壁移動が妨げられた結果であることが明らかになった。またii)に関しては、イオンが非断熱スピン遷移を複数回経験すると、断熱遷移と非断熱遷移間で量子干渉が起こり、これがビーム偏極率の磁気振動として観測されると考えられる。しかしイオンビームに関しては、この量子干渉の報告がなかった。本研究では、平行と反平行にスピン偏極したHe+イオンの鉄からの散乱イオン強度を測定し、それを基に、スピン非対称性の磁場依存性を求めた。このスピン非対称性では、明瞭な磁気振動が観測され、イオンビームで初めて前記の量子干渉が観測され、SP-ISSは最表面磁性解析のみならず、非断熱遷移に関する原子物理においても新たな展開をもたらす計測手段であることが示された。具体的には、本研究者自身によって見出された散乱におけるスピン軌道相互作用を利用する希ガスイオンのスピン偏極について、散乱断面積のスピン依存性等の基礎的検討を行う。本年度では、SP-ISS測定の妥当性を検証するために、磁気ヒステリシス測定を行った。そこで試料周りに磁場掃引用のコイルを新たに設置し、これによって定義磁場と垂直方向に磁場を発生させることで、イオンのスピンの向きを断熱的に変化させながら磁気ヒステリシス測定を行った。この測定では、スピン非対称性が磁場掃引に対して変化する様子が観測されたが、その挙動は、磁場中のイオンスピンの向きと、磁化反転で説明された。したがってこの測定から、SP-ISSのスピン非対称性が、最表面スピンを反映していることが示された。また前年度までに明らかになった衝突過程におけるスピン軌道相互作用の解明に向けた実験を行った。具体的には、金の様な非磁性表面でのSP-ISSスピン非対称性の入射角度、出射角度、散乱角度、の各角度に対する依存性を調べた。これらの実験によって、スピン軌道相互作用によるイオンの電子スピン偏極を評価した。この基礎的検討から、非磁性の基板にイオンビームを照射すれば、散乱イオンは一般にスピン偏極していることが明らかとなった。このように本研究では、非磁性基板を使った散乱法により、希ガスイオンのスピン偏極に向けた見通しを得た。
プロテオームによるアルツハイマー病の病態解析法の開発

(1)ヒト脳の親水性タンパクについては、約800スポットをデータベース化し、主として質量分析装置を用いた同定を可能にした。疎水性タンパクについては独自に開発した可溶化条件で安定したプロファイリングが可能になり、約200のスポットをデータベース化したが親水性タンパクに比べ変動が大きかった。(2)正常対照群とアルツハイマー病群で脳タンパクの発現を比較し、親水性タンパク、疎水性タンパクとも有意に変動するスポットを確認し、質量分析法により同定している。(3)親水性脳タンパクの糖鎖付加を検討した。アルツハイマー病に特異的な変動は認めなかったが、さらに詳細な検討が必要である。(4)ヒト脳神経細胞・株(SHY-5Y)に家族性AD原因遺伝子産物であるpresenilin 1(PS1)遺伝子を組み込んだ系を確立した。課題として、(1)アルツハイマー病で変化を示した微量タンパクの同定、(2)膜タンパクの分離及びタンパクのリン酸化の検出には、さらに方法論的にいくつかの試行錯誤が必要である。(3)上記研究で行ったスポットごとの群間比較のみでなく、全体のタンパクネットワークの中でのアルツハイマー病での変化を抽出する解析が必要である。現在、ヒト正常脳タンパク質のプロテオームデータベースとして、水溶性タンパク質、疎水性タンパク質の分画ごとにタンパク質のプロファイリングは整備され、AD脳での変動タンパク質を同定する作業に取りかかり、一部はすでに終了した。また、神経系細胞(SH-SY5Y細胞)にAD関連PS1遺伝子の野生型および変異型をstableに発現させる系を確立し、PS1遺伝子により影響を受ける細胞内タンパク質の変動を網羅的に明らかにし、同定する準備が整った。
血管内皮細胞におけるアポトーシスの細胞内機構

血管内皮は免疫担当細胞の細胞障害作用の場として障害を受けやすい組織でありながら、その細胞死の機構については殆ど分かっていない。本研究は動物大動脈由来の内皮細胞初代培養標本を用いて細胞死の機構を検討することを企図し、以下の成績を得た。1.出血性ヘビ毒の内皮細胞障害作用ウシ大動脈由来の培養内皮細胞において、代表的出血性ヘビ毒であるガラガラヘビとハブ毒は時間濃度および温度に依存した細胞障害作用を示した。これらの作用は細胞内外からのCa^<2+>除去、蛋白合成阻害薬、ホルボールエステルなどの処置によって全く影響を受けなかった。ヘビ毒を56度全処置しただけで、障害作用は全く失われた。電顕によれば、ヘビ毒処置により、比較的早期に細胞膜が強く傷害され、核クロマチンの凝集が観察され、ミトコンドリアには強い作用は見られなかった。ヘビ毒処置細胞の低分子量DNAのアガロースゲル電気泳動より、DNAの強い断片化が検出されたが、その性状はアポトーシスに典型的なラダー状を示さなかった。これらは、ガラガラヘビおよびハブ毒に含まれる易熱性因子によりネクローシス様の血管内皮細胞死が起きることを示している。2.プロテインキナーゼ阻害薬スタウロスポリンによる内皮細胞障害作用プロテインキナーゼCなどいくつかのセリン/スレオニンプロテインキナーゼCに強力な阻害作用を持つスタウロスポリンはウシ、ブタの大動脈内皮細胞に濃度依存性の障害作用を示した。低分子量DNAのアガロースゲル電気泳動はアポトーシスに特徴的なラダー構造を示した。核染色によれば、スタウロスポリン処置細胞集団の半分程度がクロマチン凝集を示した。これらは内皮細胞においてスタウロスポリンがアポトーシスを起こすことを示す初めての観察である。プロテインキナーゼC阻害作用を持つH-7も同様に細胞死を起したが、K-252a、L-252bの作用はごく弱かった。また、チロシンキナーゼ阻害薬、カルモジュリンキナーゼ阻害薬、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬、環状ヌクレオチド依存性キナーゼ阻害薬は観察した濃度では全く細胞死を起さなかった。神経細胞などでスタウロスポリはセラミド代謝を増加することが報告されているが、C2-セラミドにより内皮細胞のアポトーシスが観察された。これらの成績より、スタウロスポリンはプロテインキナーゼC活性阻害以外の作用により血管内皮細胞のアポトーシスを起こすことが示唆される。今後この機構にセラミド代謝が関与するか否かについてさらに検討する予定である。