hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重度の低体重を示す神経性やせ症患者における二次性カルニチン欠乏の検討

神経性やせ症(AN)は女性に好発する難治性疾患であり、未だ十分な病態理解や標準的な治療法の開発には至っていない。再栄養に伴って発生する肝障害がしばしば臨床的な問題となるが、その病態理解は未だ不十分である。低栄養で枯渇しがちなカルニチンの欠乏により肝障害が生じるとの知見があり、低体重が続くAN患者においてもカルニチン欠乏と肝機能への影響が想定される。本研究ではAN患者におけるカルニチン欠乏の有無を同定し、そのリスク因子を再栄養開始からの前向き研究により探索する。更にカルニチン欠乏と肝障害や体重増加不良等の治療経過との関連を明確化し、肝障害発症の病態理解と新規治療法の導入に役立てることを目指す。
指図による占有移転の方法による即時取得の成否に関する総合的研究

指図による占有移転の方法による即時取得の要件は何か。この明瞭化が本研究の目的であった。その点については、ドイツ法、フランス法、英米法、さらにはローマ法の議論を参照することで、要件設定の際に考慮されるべき諸要素を析出したことが成果である。それを列挙すれば、日本の指図による占有移転の要件の沿革から見た欠陥の指摘、占有改定と指図による占有移転の方法が前提とする取引態様の定型的相違に着目すべきことの指摘、物権関係(所有権移転)と債権関係(賃貸借や寄託契約)の連携のあり方が絡むことの指摘、占有意思、とりわけ即時取得において占有意思変更を議論とすることの問題の指摘などである。研究計画に従えば、初年度(平成26年度)は、指図による占有移転の方法による即時取得をめぐる諸問題を民法の範囲に限定しつつ、その現況を日独の判例学説に照らし確認することであった。日本法に関しては、まず起草時の議論を検討した。日本民法一八四条が規定する指図と承諾という枠組が現実とずれているという違和感,問題意識が当初からあったからである。果たして、起草時の議論は、復代理構成と呼びうるものだが、構成が迂遠であり、議論の過程で異論の多いものであった。指図構成は、ドイツ民法第一草案を参照したものだが、ドイツ法はこの構成の非実際性を理由に、その後引渡請求権譲渡構成に変更し、民法典に至っている。また、近時の債権法改正に際しても、同様な問題意識から、寄託契約において、契約上の地位の移転と受寄者の承諾という提案が出されていたことも注目される。ドイツ法に関しては、部分草案から民法典に至る、観念的引渡し方法の規律の変化をトレースした。それは、普通法学説や商事法典からの影響を受けつつも、間接占有や善意取得制度の導入など、激しい評価変動をともなう過程であった。この中から、観念的引渡し、すなわち、占有改定と引渡請求権譲渡の規律を、動産取引の安全と原所有者保護の拮抗の中でどう行うかの議論が浮き彫りとなった。それは、法典成立後も、一見矛盾した規律のように見える二方法に対する条文の調和的理解をめぐって、判例と学説の展開を見ており、ここでも議論の深まりが見られる。この結果、日本法の目から見れば、今まで十分知られていない観点を多く掘り起こすことにつながった。以上の成果は、近日中に大学紀要に投稿する予定で執筆を進めている。平成27年度は、平成26年度の実績報告で注目した、債権法改正の中で提案された寄託契約における契約上の地位の移転の問題理解をさらに深める方向が目指された。既に、動産賃貸借や動産寄託に関して、ドイツ民法を参照して、占有移転が契約上の地位の移転をもたらすと解釈する学説があったが(我妻)、債権法改正における提案は、契約上の地位の移転を受寄者の承諾に依存させ、さらにそれによって占有の移転もセットで生ずるという内容であった。これらは、物権関係と債権関係のどちらに判断基準を置いて構成するかの違いがあるにせよ、占有移転(対抗要件具備)と債権関係(契約上の地位移転)という一般的問題を意識しつつ、寄託契約における、物権関係と債権関係の一体的移転を確保する必要性の意識からの提案といえる。ただ、ここに、民法184条の構成の不分明さの回避という課題が入り交じっていると言える。また、契約上の地位の移転の一般的基準と特則という観点からは、債権法改正で明文化される予定の、不動産賃貸借が注目される。ここでの特則を設ける根拠が問題となるが、動産寄託の場合との根拠の違いも問題となる(以上の成果は、紀要上で公表する予定)。もう一つの進展の方向は、占有の意義を法系を越えて検討することである。この素材としたのは、Law and Economics of POSSESSION,edited by YUN-CHIEN CHANG,Cambridge University Press 2015である。基本的に「法と経済学」学派と英米法の観点から、大陸法の占有法の諸問題を比較検討し、示唆を得るというものである。大陸法に属する日本法の解釈論に直接寄与するものではないが、間接的、一般的な問題提起、現代的な占有に関わる問題認識において参考となる。直ちに成果に結びつけることはできないが、本研究の最終段階において反映させる予定である。研究実績概要で記したように、契約上の地位の移転という問題との関連性を見いだせたことは、本研究にとって、大きな進展と思われる。紀要における公表時にはこの構造理解を深めることに留意したい。最終年度においては、問題をより歴史的にとらえることに重点を置いた。すなわち、指図による占有移転においては、常に代理占有者と本人の関係が問題とされる。とりわけ、直接占有者が元の間接占有者の信頼を裏切る形で紛争が生ずる場合に原権利者と譲受人の利益調整が模索され、そこで占有移転の成否や直接占有者の挙動の評価が問題とされる。日本民法で言えば、他主占有者の自主占有への変更を扱う185条並びに代理占有の喪失を扱う204条が関係し、いずれにおいても、代理占有者の意思変更が共通して出てくる。前者はフランス民法、後者はドイツ普通法にルーツが求められ、さらに古くは、時代の変化とともに規範内容が変化したと推測される、ローマ法の法範(regula)「何人も自ら占有原因を変更できない」に関係する。

実は、この点は、ドイツ法では、代理占有関係が複数並存しうるかという並存占有(Nebenbesitz)の問題に関わり、現代性を失っていない。この錯綜した文脈の究明を試みた(紀要に公表予定)。初年度において、問題の状況を日独の関連規定の成立過程、さらにその後の判例学説の展開の検討をした。ドイツ法では、立法過程において、間接占有や善意取得などの新たな概念や制度が導入され、占有概念の客観化、指図による占有移転方法の内容変更、など、大きな流れの中でこの問題を理解する必要を感じさせた。とりわけ、占有改定と指図による占有移転の場合の規律の整合性をめぐって、議論の深まりが感じられた。二年目は、契約上の地位の移転の規律が債権法改正に際して立法提案がなされた経緯を検討し、この問題と、占有移転の問題との関連理解を試みた。全体としては、指図による占有移転の場合の原権利者と譲受人の利害調整において考慮されうる諸要素がどのような諸構成を通してなされているかを析出し、今後の検討の素材を提供したことが成果である。指図による占有移転の方法による即時取得の要件は何か。この明瞭化が本研究の目的であった。その点については、ドイツ法、フランス法、英米法、さらにはローマ法の議論を参照することで、要件設定の際に考慮されるべき諸要素を析出したことが成果である。それを列挙すれば、日本の指図による占有移転の要件の沿革から見た欠陥の指摘、占有改定と指図による占有移転の方法が前提とする取引態様の定型的相違に着目すべきことの指摘、物権関係(所有権移転)と債権関係(賃貸借や寄託契約)の連携のあり方が絡むことの指摘、占有意思、とりわけ即時取得において占有意思変更を議論とすることの問題の指摘などである。日独の法制の微妙な差異等を考慮しなくてはいけないが、基本的には、本研究の対象の議論の前提の共通性を確認できる。ただ、ドイツ法においては、占有改定と、引渡請求権譲渡の二方法の善意取得との関連での有効性要件が条文で個別に明記されており、それゆえに、条文に即した議論の深まりがあり、日本法に見られないものである。これは、日本法において、同様の方法が即時取得成否においてどう評価されるべきかの基準を考える際に大きな示唆を与えるものである。それにもかかわらず今まで十分フォローされていなかった。条文上の規律の失敗が議論を混乱させているというようなマイナスイメージの受け取りがあったのではないだろうか。だから、占有改定の規律について、現実引渡しまでは即時取得を遅らせるというわかりやすい点だけを取り込んでいたのではないだろうか。そうではないということを理解できたことは大きい。当初の研究実施計画によれば、平成27年度は商事法分野の問題理解を深めることであった。この点が果たせていないので、最終年度(平成28年度)に果たしたい。合わせて、既に得られた成果を生かしつつ、最終的とりまとめに進みたい。民法学二年目(平成27年度)の研究課題は、前年度の課題を継続しつつ、商事法の分野での議論を、民事法での議論との最終的な総合を意識しつつ、把握することである。確かに、準備作業において、撤回可能時期など対抗要件具備が争点となる紛争の存在、慣行による書面や商法典に規律のある証券などによる譲渡方法との関係など、民事法と商事法で、問題状況・議論状況の差が看取できるところである。また、一年目において、債権法改正との関連で、寄託契約(民事・商事)における議論状況を合わせ考慮することの必要性が意識された。これらを検討していきたい。
歯槽骨吸収の病因と治療に関する基礎、臨床領域の共同研究

I.骨吸収の病態モデルに関する研究:1)colchicine投与による骨髄内異所性骨形成ー骨吸収モデルにより骨吸収相においてはosteopontin mRNAの発現が認められた.2)lathyrogenic agentsの連続注射により新しい実験的歯槽骨吸収モデルを作成することに成功した.このモデルにおいては糖尿とhydroxy-proline尿の併発が証明された.II.骨吸収に関与する細胞系の機能発現機構及び骨吸収の局所的因子に関する研究:1)単核の破骨細胞の存在を証明し,また移動中の破骨細胞の立体構造が明らかにされた.2)正常の破骨細胞の分化は骨髄微小環境の異常に起因するものと破骨細胞前駆細胞自身の異常によるものとの2通りあることが判明した.3)破骨細胞の形成には,stroma cellによりPGE_2・Aキナーゼ系を介した未知なる因子の産生と,さらにstroma cellとstem cellとが細胞接着分子を介して接着する必要のあることが判明した.4)破骨細胞の機能発現と共役している骨髄細胞においては,細胞環境のカルシウム濃度の低下に反比例して外部カルシウムの細胞内取り込みが増大することが判明した.5)扁平上皮癌細胞は種々のサイトカインを産生しており,これらが局所の骨吸収及び高カルシウム血症を引き起こしていることが示唆された.6)S180Aの骨吸収因子は,TGFαあるいはIL-1αであり,その骨吸収機構は骨芽細胞のホスファテジルコリン加水分解を伴うプロテインキナーゼCの活性化を介している可能性が示された.7)マウス頭蓋骨より分離した骨芽細胞は血小板活性化因子(PAF)受容体を有し,PAF刺激に対して細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させた.III.歯槽骨吸収の予防と治療法に関する基礎的研究:1)骨吸収抑制薬の効果は,その薬物を骨代謝の概日リズムのどの位相に与えるかによって大きく異なることが明らかにされた.2)歯肉溝滲出液(GCF)の中のosteocalcin(OC)濃度の増大は,歯周組織破壊の度合を反映していることが示唆された.3)骨形成能を有する物質(BMP)にアテロコラーゲンその他の徐放性因子を基剤として用いたところ,ラットにおいてBMPの骨形成能が促進された.4)全部床義歯装着患者の咀嚼時咬合力をテレメータリング・システムで検索し,歯槽骨吸収には力学的因子が無視できないことを示した.5)アスピリン投与は実験的な外傷性咬合下における歯槽骨の吸収を抑制することが示唆された.I.骨吸収の病態モデルに関する研究:1)colchicine投与による骨髄内異所性骨形成ー骨吸収モデルにより骨吸収相においてはosteopontin mRNAの発現が認められた.2)lathyrogenic agentsの連続注射により新しい実験的歯槽骨吸収モデルを作成することに成功した.このモデルにおいては糖尿とhydroxy-proline尿の併発が証明された.II.骨吸収に関与する細胞系の機能発現機構及び骨吸収の局所的因子に関する研究:1)単核の破骨細胞の存在を証明し,また移動中の破骨細胞の立体構造が明らかにされた.2)正常の破骨細胞の分化は骨髄微小環境の異常に起因するものと破骨細胞前駆細胞自身の異常によるものとの2通りあることが判明した.3)破骨細胞の形成には,stroma cellによりPGE_2・Aキナーゼ系を介した未知なる因子の産生と,さらにstroma cellとstem cellとが細胞接着分子を介して接着する必要のあることが判明した.4)破骨細胞の機能発現と共役している骨髄細胞においては,細胞環境のカルシウム濃度の低下に反比例して外部カルシウムの細胞内取り込みが増大することが判明した.5)扁平上皮癌細胞は種々のサイトカインを産生しており,これらが局所の骨吸収及び高カルシウム血症を引き起こしていることが示唆された.6)S180Aの骨吸収因子は,TGFαあるいはIL-1αであり,その骨吸収機構は骨芽細胞のホスファテジルコリン加水分解を伴うプロテインキナーゼCの活性化を介している可能性が示された.7)マウス頭蓋骨より分離した骨芽細胞は血小板活性化因子(PAF)受容体を有し,PAF刺激に対して細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させた.III.歯槽骨吸収の予防と治療法に関する基礎的研究:1)骨吸収抑制薬の効果は,その薬物を骨代謝の概日リズムのどの位相に与えるかによって大きく異なることが明らかにされた.2)歯肉溝滲出液(GCF)の中のosteocalcin(OC)濃度の増大は,歯周組織破壊の度合を反映していることが示唆された.3)骨形成能を有する物質(BMP)にアテロコラーゲンその他の徐放性因子を基剤として用いたところ,ラットにおいてBMPの骨形成能が促進された.4)全部床義歯装着患者の咀嚼時咬合力をテレメータリング・システムで検索し,歯槽骨吸収には力学的因子が無視できないことを示した.5)アスピリン投与は実験的な外傷性咬合下における歯槽骨の吸収を抑制することが示唆された.1.骨吸収細胞に関して次の新知見が得られた.1)破骨細胞は分化した単球,マクロファ-ジからもできること,およびそれらの破骨細胞への分化には骨芽細胞が密接に関与していることが判明した(須田).2)破骨細胞の形態は吸収期と非吸収期とでは全く異なることが明らかにされた(脇田)

.2.HEBPおよびAHーBuBPの簡易微量定量法を確立した(篠田).3.カテプシンDはリソゾ-ムに,カテプシンEは細胞質及び膜に限定して局在することが確認された(加藤).4.腫瘍細胞S180Aの骨吸収因子はTGF様及びILー1様活性を有するがPTH様活性はもっていないことが明らかにされた(山田).5.扁平上皮癌細胞Ca 9ー22 PFは,骨吸収促進物質としてILー1α,ILー1β,PTHγP,PDGFーAAを産生していることが明らかにされた(榎本).6.低カルシウム環境下における骨芽細胞では,細胞内のアルカリ性及び酸性フォスファタ-ゼ活性が低下していることが判明した(松本).7.培養骨芽細胞にカドミウムを作用させたところ,シクロオキシゲナ-ゼが誘導され,PGE2産生の促進が認められた(室田).8.pairfeeding法を応用した低カルシウム食飼育ラットによる歯槽骨吸収の病態モデルを確立した.(小椋).9.ラシロゼン物質(aminoacetonitrile)によりin vivoで強度の歯槽骨吸収を起こさせることに成功した(鈴木).10.亀山は実験動物の歯周組織に対するアスピリンその他の薬物の影響を検索中である.11.歯周炎患者に対する抗生物質製剤の局所投与の効果を臨床的,細菌学的指標を用いて解析中である(石川).12.病因除去と組織再生法(GTR)によって,臨床的にどこまで歯槽骨が再生したかを規格X線写真により検索した(野口).13.歯槽骨吸収が高度に進行した下顎堤表面形状,全部床義歯装着者の咀嚼時咬合力についての研究を続行中である(長尾).平成3年度は各研究プロジェクトについて以下の知見が得られた。I.歯槽骨吸収の病因解析に関する基礎的研究1)大理石骨病(op/op)マウスの破骨細胞形成障害は,op/opマウスの骨芽細胞のMーCSF産生障害に起因することが明らかとなった。2)カテプシンDは硬組織由来の細胞に広く分布しているがカテプシンDの局在はマクロファ-ジ以外に明確ではなかった。3)腫瘍細胞Sー180Aの骨吸収因子はTGFα,ILー1を含み,骨系細胞によるPGE_2,DNA合成を介して骨吸収を起こすことが判明した。4)完全合成無蛋白培地で維持されている扁平上皮癌株細胞Ca9ー22PFでは,ILー1α,ILー1β,PTHrP,PDGFーAA,TGFーα,TGFーβのmRNAの発現が認められた。5)TEMによる検索の結果,破骨細胞の機能の周期的変動に対応して波状縁と明帯の形態変化が起こることが判明した。6)New bisphosphonatesの骨吸収抑制作用に関する用量ー反応関係をin vivo,in vitroの実験系において検討した。7)低Ca環境下培養骨系細胞では[Ca^<2+>]が減少し,ALPase活性が経時的に亢進していることが認められた。II.歯槽骨吸収の病態的特徴に関する基礎的研究1)低Ca食飼育ラット歯槽骨における骨量減少は,実験初期には主に海綿骨を中心にして起こり,次第に海綿骨より皮質骨が吸収されるようになることが明らかとなった。2)骨芽細胞には,PGE_2に対する2つの異なったレセプタ-(ホスホリパ-ゼCリンクおよびアデニル酸シクラ-ゼリンク)が存在することを発見した。III.歯槽骨吸収の予防と治療法に関する基礎的研究
ゲノム解析に伴う大量知識情報処理の研究(総括班)

本研究では平成3年度から7年度まで5カ年計画で行われた重点領域研究「ゲノム情報」の成果取りまとめを行った。重点領域研究「ゲノム情報」は生物科学と計算機科学の融合の中から、ヒトを始めとした各種生物ゲノムがもつ様々な情報を解読するための方法論と実用的な技術を確立することを目的とした。とくに、(1)ゲノム解析がもたらす大量かつ多様なデータのデータベースの問題と、(2)実験によるゲノム解析の最終産物である配列データの生物的意味解釈の問題に新しい方法を確立することを目標とした。数々の研究成果は実用的なデータベースやソフトウェアとして実用化され、ゲノムネットデータベースサービスの形に取りまとめられ、インターネットを通じて国際的に提供されている。本研究ではまず8月22日と23日に「ヒトゲノム計画とインターネット」と題した講習会を開催し、高校の先生を対象として美宅成樹、高木利久、金久實がそれぞれゲノム計画、インターネット、ゲノム情報に関する解説をし、実際にゲノムネットのデータベース利用講習を行った。次に、5年間の研究成果を取りまとめた「研究成果報告書」を作成し、約400名の研究者に配布した。この報告書は主な発表論文51編と、10月21日に文部省で開かれた研究終了ヒアリングの資料をまとめたものである。なお、研究経費として本研究と直接のつながりはないが、重点領域研究「ゲノム情報」の研究内容は金久實(著)「ゲノム情報への招待」(共立出版)にまとめられ、また実用的な成果の内容は高木利久、金久實(編)「ゲノムネットのデータベース利用法」(共立出版)として出版されている。重点領域研究「ゲノム情報」総括班では、6月11日と2月26日に総括班会議を開催し、研究計画の取りまとめと調整、研究の進捗状況の対する助言、研究成果の評価を行った。生物系研究者と計算機系研究者の交流を図ることを目的とした総括班の定期的な活動として、今年度もチュートリアルとワークショップを開催した。チュートリアルは7月2日に賢島研修センターで開催し、6名の講師が講義を行った。続いて班員による研究成果発表会を公開で開催し、3泊4日の泊り込み合宿の参加者は約120名であった。冬のワークショップは12月1415日に横浜パシフィコで開催した。4件の招待講演、25件の口頭発表、17件のポスター発表、20件のワークステーション発表、それに民間企業による12件のデモンストレーションと2件の展示が行われた。ワークステーション発表は今回からの新しい試みで、自作のシステムを実際に目の前のワークステーションやインターネット上のマシンで動かし、発表と討論を行った。約370名の参名者があり大変盛会であった。さらに本領域研究の成果を既存の学会活動の中で公表していくために、11月6日に大阪で生物物理学会シンポジウムを、12月9日に京都で分子生物学会ミニシンポジウムを企画・開催した。その他の広報活動としては、ヒトゲノム計画の内容を広く一般社会に紹介するためのパンフレットを作成し、ゲノム情報ニュースレターの第3号と4号を発行した。ゲノム研究のインフラストラクチャ作りとして位置づけているコンピュータネットワークの整備としては、東京ー京都間のスピードアップ、九州への接続、専用線ならびにISDN公衆回線による東京地区、関西地区の接続が行われた。ゲノム研究の現場が必要とするデータベースに関しては、本領域が組織したデータベース研究会で仕様を作成し、ヒトゲノム解析センターの事業として実際の構築を行っている。重点領域研究「ゲノム情報」総括班では、6月24日と2月15日に総括班会議を開催し、研究計画の取りまとめと調整、研究の進捗状況に対する助言、研究成果の評価を行った。また本5カ年計画が終了後、ヒトゲノム計画の第2期の中で情報関連研究体制をどうするかについての討論も行った。総括班の定期的な活動として、まず生物系研究者と計算機系研究者の交流を図ることを目的としたチュートリアルは7月7日に福岡のホテル海の中道で開催し、10名の講師が講義を行った。

続いて班員による研究成果発表会を公開で開催し、3泊4日の泊り込み合宿の参加者は約120名であった。もう1つの公開行事であるゲノム情報ワークショップは12月1315日に横浜パシフィコで開催した。8件の招待講演、20件の口頭発表、24件のポスター発表、20件のワークステーション発表、それに15件の企業展示が行われた。今回からの新しい試みとして、口頭発表はすべて英語にしたこと、英語の投稿論文の査読を行い、Proceedings of Genome Informatics Workshop IVとして発行したことがある。参加者は約300名であった。学会関連活動としては、生物物理学会の年会にゲノム情報のセッションが設けられた。さらに、11月に神戸で開催された国際ヒトゲノム会議その他で、本領域がヒトゲノム解析センターとの協力の下に開発したシステムのデモンストレーションを行った。これまでのゲノム情報ニュースレターは、今年度よりA4版で一部英文のゲノム情報ニュースとして衣替えを行い、第1号を10月に発行して約1200名に配布した。ゲノム研究ネットワーク「ゲノムネット」の整備としては、東京-京都間を512KBPSへスピードアップを行った。ゲノムネットのデータベースサービスは安定して稼動しており、ホモロジー検索を中心に1カ月に約4000件の利用がある。重点領域研究「ゲノム情報」総括班では、6月23日と3月3日に総括班会議を開催し、研究計画の取りまとめと調整、研究の進捗状況に対する助言、研究成果の評価を行った。またヒトゲノム計画第2期の中で行われるゲノム情報の新しいプロジェクトの検討を行った。定期的な公開行事として、まずゲノム情報チュートリアルは毎年夏に泊り込み形式で行う勉強会で、今年度は7月69日に富山のインテック大山研修センターで開催した。これまでのチュートリアルではDNAやタンパク質分子の配列・構造の解析が中心であったが、今回は細胞におけるこれら分子の相互作用のネットワークを計算機で表現し解析することを考え、ゲノム情報プロジェクトの第2期へ向けた議論が行われた。第5回ゲノム情報ワークショップは12月1920日に、パシフィコ横浜会議センターで行われ、招待講演3件、口頭発表14件、ポスター発表29件、ワークステーション発表19件、企業展示14件という構成に加え、7月に亡くなられた瀬戸保彦氏の追悼講演があった。本領域5カ年計画の後期2年間で、総括班は実用的な研究成果の評価と普及に重点を置いた活動を行っている。第17回日本分子生物学会年会では本領域主催のシンポジウム「分子生物学データベースの新しい流れ」が12月13日に開かれた。4日間の学会期間中、本領域関係者が開発したシステムの紹介とゲノムネットデータベース利用講習会を行った。ゲノムネットデータベースサービスは世界50カ国以上から利用されるようになったが、カラーパンフレットとビデオテープを作成して国内の生物系研究者がより手軽に利用できるよう普及を図っている。ゲノム情報ニュースは年4回発行した。重点領域研究「ゲノム情報」総括
シクロデキストリン包接を基盤とする準安定結晶の選択的調製とその機構解明

シクロデキストリン(CyD)の包接作用を利用して、準安定結晶の調製や晶癖の制御を試み、以下の知見を得た。(1)クロルプロパミドを2-ヒドロキシブチル-β-CyD水溶液から再結晶するとCyD低濃度では準安定形Form III、高濃度では最も不安定なForm IIが選択的に析出した。(2)2-ヒドロキシブチル-β-CyD含有水溶液からアスピリンを再結晶すると晶癖は板状から針状結晶に変化した。2-ヒドロキシブチル-β-CyDは多形や晶癖制御剤として機能することが明らかとなった。本研究では、経口糖尿病薬クロルプロパミド(CPM)の結晶化に対するシクロデキストリン(CyDs)の影響を詳細に検討し、下記の結果を得た。1 CPM単独を水から再結晶すると安定形結晶Form Aが得られた。天然α-,β-,γ-CyDs、2-ヒドロキシプロピル-β-CyD添加の場合も同様に安定形Form A結晶が析出した。2一方、ジメチル-β-CyDあるいは2-ヒドロキシブチル-β-CyDを添加すると、CPMの準安定結晶であるForm IIあるいはForm III結晶が析出し、その効果はジメチル-β-CyDに比べて2-ヒドロキシブチル-β-CyDの方が大きかった。4その際、2-ヒドロキシブチル-β-CyD高濃度条件下では最も不安定なForm II結晶が得られ、低濃度条件下では2番目に不安定なForm III結晶が得られた。すなわち、2-ヒドロキシブチル-β-CyD高濃度下ではForm II→Form IIIへの転移が抑制され、低濃度下ではForm III→Form Aの転移が抑制されたものと推定された。これらの結果は、2-ヒドロキシブチル-β-CyD濃度を調節することにより、不安定な準安定結晶Form IIあるいはForm IIIを選択的に調製可能なこと示すものであり、溶液媒介性転移の制御剤としての2-ヒドロキシブチル-β-CyDの有用性が示唆された。本研究では、シクロデキストリン(CyDs)複合体形成を利用した薬物の晶癖(結晶の外形)の制御に関する基礎的検討を行った。具体的には、アセチルサリチル酸(アスピリン)の結晶成長・ホモロジーに対するシクロデキストリン(CyDs)の影響を検討し、下記の結果を得た。1.アスピリンを水溶液から結晶化すると板状結晶が析出した。一方、2-ヒドロキシブチル-β-CyD(HB-β-CyD)およびジメチル-β-CyD(DM-β-CyD)を添加すると針状結晶に変化した。針状結晶への変化はCyD濃度の上昇に伴い著しく増大した。2.振動写真の結果より、HB-β-CyDあるいはDM-β-CyD添加溶液から析出したアスピリン針状結晶はb-軸へ伸長していることが明らかとなった。3.結晶成長を観察した結果、HB-β-CyD添加溶液においてアスピリンはc-軸方向の結晶成長が著しく抑制されることが明らかとなった。以上の結果より、HB-β-CyDあるいはDM-β-CyDは晶癖の制御剤とした有用であることが明らかとなった。本研究では、糖尿病治療薬であるトルブタミドあるいは非ステロイド系抗炎症薬フルルビプロフェンの結晶化に及ぼす新規シクロデキストリン(CyDs)誘導体2-ヒドロキシブチル-β-CyD (HB-β-CyD)の影響を検討した。また、HB-β-CyDの多形転移抑制機構に関する知見を得るため、その物理化学的性質や包接特性について検討し、下記の結果を得た。1.トルブタミドを水溶液から結晶化すると安定形結晶であるForm Iが析出した。一方、HB-β-CyDを添加すると準安定形結晶であるForm IVが100%析出し、その効果は先に報告したジメチル-β-CyD (DM-β-CyD)に比べて著しく大きかった。2.フルルビプロフェンを水から再結晶すると水和物結晶が析出した。一方、HB-β-CyDを添加すると、無水物結晶が析出し、フルルビプロフェンに対してモル比1:1でHB-β-CyDを添加すると無水物結晶がほぼ100%析出した。3.HB-β-CyDの表面張力は、濃度の上昇および置換度の増加に伴い低下し、DM-β-CyDより高い界面活性作用を有することが明らかとなった。4.各種スペクトル法や溶解度法による検討結果より、HB-β-CyDは、フルルビプロフェンやビフェニル酢酸などのような細長い分子と強く相互作用することが明らかとなった。以上の結果より、HB-β-CyDの多形転移抑制には疎水性HB-β-CyDの結晶表面への吸着と高い包接作用が関与することが示唆された。
遺伝子改変オルガノイドを用いたヒト大腸がん遺伝子の機能的解析基盤の構築

近年の次世代シークエンス技術の進歩と大規模なシークエンス解析プロジェクトにより,大腸がんの網羅的ながん遺伝子変異同定が可能になった。我々は,大腸上皮組織の体外培養技術であるオルガノイド培養とCRISPR-Cas9ゲノム編集技術を組み合わせ,ヒト大腸上皮遺伝子変異導入オルガノイドによる,がん遺伝子変異の解析に成功した。作製された遺伝子変異オルガノイドは超免疫不全マウスを用いた異種移植系により,病理組織学的な評価と浸潤・転移能などの機能形質の解析が可能である。構築されるドライバー遺伝子機能解析基盤は汎用性が高く,様々な創薬スクリーニング応用が期待でき,高い社会的波及効果を併せ持つ。次世代シークエンス技術の進歩により,網羅的ながん遺伝子変異同定が可能になった.しかしながら,発がんに寄与するドライバー遺伝子変異の同定はバイオインフォマティクスによるin sillico解析に依存してきた.我々は,大腸上皮組織を体外でミニ組織化し,複数の遺伝子を同時に破壊する,ヒト大腸上皮ノックアウト技術を確立した.本技術を用い,大腸がんの3%程度以上に認める25個の遺伝子を様々な組み合わせでノックアウトまたは変異ノックインし,人工大腸がんの作製およびその細胞生物学的特性の解析を行う.構築されるドライバー遺伝子機能解析基盤は汎用性が高く,様々な創薬スクリーニング応用が期待でき,高い社会的波及効果を併せ持つ.次世代シークエンス技術の進歩により,網羅的ながん遺伝子変異同定が可能になった.しかしながら,発がんに寄与するドライバー遺伝子変異の同定はバイオインフォマティクスによるin sillico解析に依存してきた.我々は,大腸上皮組織を体外でミニ組織化し,複数の遺伝子を同時に破壊する,ヒト大腸上皮ノックアウト技術を確立した.本技術を用い,大腸がんの3%程度以上に認める25個の遺伝子を様々な組み合わせでノックアウトまたは変異ノックインし,人工大腸がんの作製およびその細胞生物学的特性の解析を行う.構築されるドライバー遺伝子機能解析基盤は汎用性が高く,様々な創薬スクリーニング応用が期待でき,高い社会的波及効果を併せ持つ.5個の大腸がんに高頻度に認められる遺伝子変異を標的としたCRISPR-Cas9ベクターと遺伝子変異ノックインドナーベクターの作製を行い,ヒト正常大腸オルガノイドに対するエレクトロポレーションによる遺伝子ノックアウトまたは遺伝子変異ノックインを行った.遺伝子変異はSurveyor assayおよびシークエンス解析により確認を行った.遺伝子改変オルガノイドは異種移植により腫瘍形成を認め論文報告を行った(Matano et al. Nature Medicine 2015).さらに,20個の遺伝子に対するCRISPR-Cas9ベクターの作製を完了し,ヒト大腸オルガノイドへエレクトロポレーション,Surveyor assayによる遺伝子ノックアウトを確認し,異種移植実験による浸潤・転移能の変化を検証している.現在までに,実験計画通り,順調に実験目標が達成されていると考えられる.近年の次世代シークエンス技術の進歩と大規模なシークエンス解析プロジェクトにより,大腸がんの網羅的ながん遺伝子変異同定が可能になった。しかしながら,発がんに寄与するドライバー遺伝子変異の同定はバイオインフォマティクスによるin sillico解析に依存しており,その生物学的な理解が追いついていない。我々は,大腸上皮組織の体外培養技術であるオルガノイド培養を開発し,これなで困難であったヒトの組織幹細胞の機能解析が可能となった。さらに,CRISPR-Cas9ゲノム編集技術を組み合わせることによるヒト大腸上皮遺伝子変異導入オルガノイドの作製により,ドライバー遺伝子と呼ばれるがん遺伝子変異を導入することに成功した。しかしながら,既知のドライバー遺伝子の組み合わせのみではがんの浸潤・転移能の獲得までには至らなかった。一方で,近年,Long tailと呼ばれるドライバー遺伝子より変異の頻度が少ないが,有意にがんに変異を認める遺伝子変異が注目されている。そこで,本研究では大腸がんの3%程度以上に認める25個の遺伝子を様々な組み合わせでノックアウトまたは変異ノックインし,人工大腸がんの作製およびその細胞生物学的特性の解析を行うこととした。5個の大腸がんに高頻度に認められる遺伝子変異を標的としたCRISPR-Cas9ベクターと遺伝子変異ノックインドナーベクターの作製を行い,ヒト正常大腸オルガノイドに対するエレクトロポレーションによる遺伝子ノックアウトまたは遺伝子変異ノックインを行った.遺伝子変異はSurveyor assayおよびシークエンス解析により確認を行った.遺伝子改変オルガノイドは異種移植により腫瘍形成を認め論文報告を行った(Matano et al. Nature Medicine 2015).さらに,20個の遺伝子に対するCRISPR-Cas9ベクターの作製を完了し,ヒト大腸オルガノイドへエレクトロポレーション,Surveyor assayによる遺伝子ノックアウトを確認した.現在までに,実験計画通り,順調に実験目標が達成されていると考えられる.

これまでの研究計画通りに研究は遂行されており,また,当該研究室でこれまでに蓄積されたオルガノイド技術のノウハウを有効利用することにより,順調に研究を推進できると考えている.28年度が最終年度であるため、記入しない。消化器内科学これまでの研究計画通りに研究は遂行されており,また,当該研究室でこれまでに蓄積されたオルガノイド技術のノウハウを有効利用することにより,順調に研究を推進できると考えている.28年度が最終年度であるため、記入しない。効率的な物品の調達を行った結果である。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究計画が効率よく遂行するよう、次年度適正に使用を行う予定である。
冬虫夏草の抗腫瘍性グルカンと免疫細胞グルカン受容体の相互作用と遺伝子構造の解析

キノコのβ-グルカンには免役賦活作用を示すものが報告されており、冬虫夏草の滋養強壮作用もβ-グルカンによるものであると考えられている。我々は冬虫夏草(サナギタケ)のβ-1,3-グルカン合成酵素について研究を行い、触媒サブユニット遺伝子(FKS1)と調節サブユニット遺伝子(RHO1)のクローニングに成功した。サナギタケβ-1,3-グルカン合成酵素の触媒サブユニットは1981アミノ酸から成る16回膜貫通型の膜内在性タンパク質であると推定され、調節サブユニットは194アミノ酸から成るRhoタンパク質であると推定された。両サブユニットとも他のβ-1,3-グルカン合成酵素と高い相同性を示した。触媒サブユニットの中央部には、触媒ドメイン(578アミノ酸)が存在している。この触媒ドメインを組換えタンパク質として発現させ、その詳細な結合特性を調べたところ、正確な基質結合糖衣性を示した。本研究は冬虫夏草など薬理効果を期待されるキノコのβ-グルカンの機能を科学的に解明しようとするものであり、サナギタケβ-1,3-グルカン合成酵素遺伝子のクローニングおよび組換え触媒ドメインの合成に成功したことは、組換え合成酵素を用いて安全性の高い純粋な抗腫瘍性β-グルカンを大量に合成する方法の開発につながる。人口合成した抗腫瘍性β-グルカンは抗癌剤の補助剤や免役賦活剤あるいは免疫力を高める機能性食品・健康食品・健康飲料・サプリメントとして利用できる。また、組換えヒト免疫細胞β-グルカン受容体(組換えヒトDectin-1)の作製にも成功し、in vitroの機能解析を行った。その結果、ある特定の構造を有するβ-グルカンだけに特異的に結合する特性を示したことから、この組換えタンパク質を利用してβ-グルカンによる免疫賦活作用のメカニズムを詳細に解明することが可能であると考えられた。マイタケのβ-グルカンが癌の治療に使われるなど,ある種のキノコ類のβ-グルカンは抗癌作用を有するが,一方で民間療法においてキノコのβ-グルカンの効果は誇張されることも多く,その薬としての評価を混乱させている。しかし,β-グルカンが免疫細胞を活性化し,免疫賦活作用,抗腫瘍性を有することは,多くの実験により証明されている。問題は抗腫瘍性β-グルカンが,どのように人間の免疫細胞を活性化するのかが,分子レベルで解明されていないことにある。今回,免疫細胞のβ-グルカン受容体の遺伝子クローニングおよび組換えタンパク質の発現を行い,β-グルカンによる免疫賦活作用の分子機構を明らかにすることを目的として研究を行った。市販のヒト白血球cDNAを用いて,マクロファージや樹状細胞のβ-グルカン受容体であるDectin-1のcDNAをクローニングした。次にグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質発現用ベクターにDectin-1 cDNAの細胞外領域(Neck領域およびβ-グルカン結合領域)を組み込み,可溶性の組換えタンパク質を無細胞系で合成することに成功した。この無細胞タンパク質合成は,本科学研究費補助金により購入したin vitro大量タンパク質発現装置(RTSプロテオマスター)を使用して行った。続いて,合成したGST-Dectin-1融合タンパク質をグルタチオン-セファロースを用いて精製し,結合活性を調べた。その結果,GST-Dectin-1はリケナンなどのβ-グルカンに特異的に結合したことから,このシステムはβ-グルカン受容体の糖結合特異性およびキノコなどのβ-グルカンの免疫賦活作用を調べるために有効であることが示された。本科学研究費補助金により購入したin vitro大量タンパク質発現装置(RTSプロテオマスター)を使用して無細胞系において組換えβ-グルカン受容体(GST-human dectin-1)を合成し,その精製に成功した。この組換えタンパク質の結合活性をゲル結合アッセイにより解析した結果,β-グルカンの一種であるリケナンには結合するが,他の多糖には結合しないことが明らかとなった。GSTにはリケナン結合能はなかった。また,GST-human decine-1のリケナンへの結合はβ-グルカンによって阻害されたが,α-グルカンによっては阻害されなかった。さらにグルコースオリゴマーによる阻害実験を繰り返し,本β-グルカン受容体のβ-グルカン結合特異性を決定した。サナギタケ(Cordyceps militaris)のβ-1,3-グルカン合成酵素のcDNAクローニングに成功し,触媒サブユニット遺伝子(FKS1)と調節サブユニット遺伝子(RHO1)の全塩基配列を決定した。続いて,上記と同様に無細胞系において組換えβ-1,3-グルカン合成酵素触媒サブユニット(GST-Fks1p)を合成し,その精製に成功した。この組換えタンパク質の結合活性をゲル結合アッセイにより解析した結果,受容体基質に類似した構造を持つβ-グルカンには結合するが,他の多糖には結合しないことが明らかとなった。また,供与体基質の一部であるUDPには結合するが,GDPには結合しないことも明らかとなった。このように膜タンパク質として存在する多糖合成酵素を可溶性の組換えタンパク質として機能を持った状態で発現させた例はこれまでになく,組換え多糖合成酵素を利用した多糖の人工合成が可能であると考えられた。我々は冬虫夏草(サナギタケ)のβ-1,3-グルカン合成酵素について研究を行い、触媒サブユニット遺伝子(FKS1)と調節

サブユニット遺伝子(RHO1)のクローニングに成功した。サナギタケβ-1,3-グルカン合成酵素の触媒サブユニットは1981アミノ酸から成る16回膜貫通型の膜内在性タンパク質であると推定され、調節サブユニットは194アミノ酸から成るRhoタンパク質であると推定された。両サブユニットとも他のβ-1,3-グルカン合成酵素と高い相同性を示した。触媒サブユニットの中央部には、触媒ドメイン(578アミノ酸)が存在している。この触媒ドメインを組換えタンパク質として発現させ、その詳細な結合特性を調べたところ、正確な基質結合糖衣性を示した。本研究は冬虫夏草など薬理効果を期待されるキノコのβ-グルカンの機能を科学的に解明しようとするものであり、サナギタケβ-1,3-グルカン合成酵素遺伝子のクローニングおよび組換え触媒ドメインの合成に成功したことは、組換え合成酵素を用いて安全性の高い純粋な抗腫瘍性β-グルカンを大量に合成する方法の開発につながる。人口合成した抗腫瘍性β-グルカンは抗癌剤の補助剤や免役賦活剤あるいは免疫力を高める機能性食品・健康食品・健康飲料・サプリメントとして利用できる。また、組換えヒト免疫細胞β-グルカン受容体(組換えヒトDectin-1)の作製にも成功し、in vitroの機能解析を行った。その結果、ある特定の構造を有するβ-グルカンだけに特異的に結合する特性を示したことから、この組換えタンパク質を利用してβ-グルカンによる免疫賦活作用のメカニズムを詳細に解明することが可能であると考えられた。
網膜色素変性症における小胞体ストレス誘発細胞死の関与および分子機構の解明

網膜色素上皮細胞およびゼブラフィッシュにおいて変異SEMA4Aは光照射、酸化ストレスおよび小胞体ストレスに対する脆弱性に寄与した。これらの結果から小胞体ストレスは網膜色素変性症の悪化に関与し、治療ターゲットの一つとなり得ることが示唆された。野生型SEMA4Aに報告されている変異(D345H、F350C、R713Q)を導入し、ヒト網膜色素上皮細胞由来細胞株であるARPE-19に過剰発現させ、細胞内局在を観察した。また、光刺激、酸化ストレスおよび小胞体ストレスに対する細胞の変化をウエスタンブロット法および核染色による細胞死の定量で検討した。野生型SEMA4Aを過剰発現させた細胞では主に細胞膜や細胞質に局在が認められ、一部ドット状の凝集体が観察された。一方、SEMA4A(D345H)を過剰発現させた細胞では、ドット状の凝集体が増加しており、さらに、小胞体の分子シャペロンであるGRP78と一部共局在が認められた。また、SEMA4A(D345H)をARPE-19に過剰発現させると、細胞死が惹起され、ツニカマイシンによる小胞体ストレスおよび過酸化水素による酸化ストレスに対して脆弱性を示した。さらに、SEMA4A(D345H、F350C、R713Q)を発現させたARPE-19では光刺激によりGRP78の増加が認められたが、野生型SEMA4Aを過剰発現させた細胞では認められなかった。SEMA4Aの変異は酸化ストレスに対して脆弱性を示し、さらに網膜色素変性症の増悪因子である光刺激により小胞体ストレスを惹起した。SEMA4Aの変異は酸化ストレスのみならず、光によるストレスを小胞体ストレスに変換して、網膜色素変性症を引き起こしている可能性が示唆された。野生型SEMA4Aに報告されている変異(D345H、F350C、D345H/F350C)を導入し、ヒト網膜色素上皮細胞由来細胞株であるARPE-19に過剰発現させ、細胞内局在を観察した。野生型SEMA4Aを過剰発現させた細胞では主に細胞膜や細胞質に局在が認められた。一方、SEMA4A(F350C、D345H/F350C)を過剰発現させた細胞では、小胞体の分子シャペロンであるGRP78と共局在が認められた。また、SEMA4A(D345H、D345H/F350C)をARPE-19に過剰発現させると、ツニカマイシンによる小胞体ストレスおよび過酸化水素による酸化ストレスに対して脆弱性を示した。さらに、SEMA4A(F350C、D345H/F350C)を発現させたARPE-19では光刺激によりGRP78の増加が認められたが、野生型SEMA4Aを過剰発現させた細胞では認められなかった。また、D345H/F350C変異体はD345HおよびF350Cのそれぞれの特徴を併せ持つことが明らかとなった。前年度までに変異型SE漁4A(F350C)が光照射時に小胞体ストレスを惹起することを明らかにしたことから、つぎに細胞の機能的変化について検討した。ARPE19細胞は光照射によりファゴサイトーシスが低下するが、変異SEMA4Aを過剰発現させた細胞ではコントロールと比較してファゴサイトーシスの低下が認められた。野生型SE融4Aおよび変異型SEMA4A(D345H,F350C,R713Q)をARPE19細胞に過剰発現させ、抗pan-cadherin抗体(細胞膜マーカー)または抗GRP78抗体(小胞体マーカー)を用いて二重染色して細胞内局在を観察したところ、野生型SEMA4Aは主に細胞膜に局在が認められたが、変異型(D345H,F350C)では小胞体への局在の変化が観察された。一方、R713Q変異体は細胞膜に局在が認められ、他の変異体のような変化は認められなかった。網膜におけるSEMA4Aの機能および小胞体ストレスの関与をin vivoで解明するために、ゼブラフィッシュを用いて検討した。ゼブラフィッシュにモルフォリノアンチセンスオリゴを用いてSEMA4Aのノックダウンを行った。SEMA4Aのノックダウンにより網膜組織の形成に異常が認められた。また、SEMA4Aのノックダウンにより小胞体ストレスのマーカーの一つであるXBP1のスプライシングが増加した。これらの結果より、変異SEMA4Aによる網膜色素変性症の発症に小胞体ストレスが一部関与している可能性が示唆された。
カドヘリンによる細胞間接着に起因するシグナルの核内移行機構

α-カテニン遺伝子に変異を持ちそのためα-カテニンの発現が陰性である紳胞(DLD-1細胞)とこの細胞にα-カテニンの発現ベクターを導入してα-カテニンを発現させた細胞を用いて実験を行ってきた。この細胞はE-カドヘリン遺伝子は正常であるので、α-カテニンに依存したカドヘリンからのシグナルを調べるのに最適である。細胞の増殖性を詳細に調べた結果、シャーレに接着させた場合には両者の間で差がなかったが、シャーレへの接着を抑えてやると、α-カテニン陰性細胞に比べてα-カテニン発現細胞の増殖性は著しく低下していることが判明した。抗体でカドヘリンの機能を抑えると、増殖の抑制は見られなくなった。このことは、浮遊状態の細胞ではカドヘリンからα-カテニン依存性のジグナルが出ていることを示している。そこでこの現象に関与するα-カテニン機能領域の同定を行った。その結果、カドヘリン依存性のコンパクションを引き起こすのに必要な領域と一致することが判明した。さらに、Rbファミリーのp130のリン酸化状態を調べたところ、α-カテニン陰性細胞では接着状態と浮遊状態とで差がなくどちらの条件下でもリン酸化を受けていたが、α-カテニン発現細胞では接着状態から浮遊状態へと変えることによりリン酸化の程度が著しく低下することが判明した。Rbタンパク質のリン酸化は細胞周期の進行と密接に関わっており、カドヘリンからのシグナルがRbタンパク質のリン酸化を抑えたという結果は大変興味深い。カドヘリンによる細胞間接着に起因するシグナルの核内移行機構を明らかにするため、本研究では、α-カテニン依存性のシグナル伝達とβ-カテニンの関与したシグナル伝達に分けて研究を遂行した。〔α-カテニン依存性のシグナルと核への伝達〕A.シグナル伝達に必要なα-カテニン上の機能領域の同定一連の欠失を導入したα-カテニンを、カドヘリン陽性でかつα-カテニン遺伝子に変異を持つためα-カテニン陰性である細胞(DLD-1細胞)で発現させ、細胞増殖抑制に必要な機能領域を同定した。DLD-1細胞にα-カテニンを発現させても細胞の増殖には変化はみられなかったが、α-カテニンの発現によりスフィンゴシンにより誘導される細胞のアポトーシスに対する抵抗性が増大することが判明した。そこで、一連の変異α-カテニンを同細胞で発現させ、この抵抗性増大に関与する領域の同定を行った。B.同定された領域に結合するシグナル伝達分子の同定並びにそのcDNAクローニング(状況)two-hybridsystemによるクローニングを鋭意行っているが、現在のところ目的のクローンは得られていない。〔β-カテニンの関与したシグナルと核への伝達〕A.β-カテニンのカドヘリンからの解離機構の解明β-カテニンは、カドヘリンからの情報を核へと運んでいる有力候補である。しかしながら、いかなるシグナルによりβ-カテニンがカドヘリンより解離するのかは十分にはわかっていない。そこで、β-カテニンとGFPの融合タンパク質をカドヘリン陽性細胞で発現させ、カドヘリンと複合体を形成させる。次に種々の刺激を細胞に与え、いかなる刺激・条件下でβ-カテニンの解離が起こるかを明らかにする。融合タンパク質のコンストラクトを作製し、これを安定に発現する細胞のクローンを先ずカドヘリン陰性細胞で得た。興味深いことに、この融合タンパク質は核には移行せず、β-カテニン単独で発現させた場合(核に移行)と異なる結果が得られた。カドヘリンによる細胞間接着に起因するシグナルの核内移行機構を明らかにするため、本研究では、α-カテニン依存性のシグナル伝達とβ-カテニンの関与したシグナル伝達に分けて研究を遂行している。[α-カテニン依存性のシグナルと核への伝達]カドヘリン陽性でかつα-カテニン遺伝子に変異を持ためα-カテニン陰性である細胞(DLD-1細胞)でα-カテニンを発現させた結果、細胞の増殖は変えずに、スフィンゴシンにより誘導される細胞のアポトーシスに対する抵抗性が増大することが判明した。さらに、α-カテニン発現によりサイクリン依存性キナーゼの阻害タンパク分子であるp27kip1の発現が増大することが判明した。α-カテニン非発現株で遺伝子導入によりp27kip1の量を増やしてやると同細胞株のスフィンゴシンによるアポトーシスに対する抵抗性が増大することからも、α-カテニンからのシグナルの下流にp27kip1が存在することが予想される。いかなる機構でα-カテニンの発現がp27kip1の量を増大させるのかは現在のところ不明である。[β-カテニンの関与したシグナルと核への伝達]β-カテニンの細胞内での動態を調べる目的で、アミノ末端側の領域を欠失させたβ-カテニン(β-カテニンΔ1-91)とGFPの融合タンパク質のコンストラクト(GFP-β-カテニンΔN1)を作製し、これを安定に発現する細胞のクローンを得た。その結果、GFP-β-カテニンΔNlは転写因子LEF-1発現細胞(LEF-1L細胞)では核内での存在が認められたが、親株のL細胞、あるいはβ-カテニン結合部位であるアミノ末端領域を欠失したLEF-1発現細胞(LEF-1ΔNL細胞)では、核への集積は認められるものの、LEF-1L細胞に比べてその程度が著しく低いことが判明した。

そこで核から細胞質への輸送機構のひとつを阻害するレプトマイシンBを使ったところ、L細胞あるいはLEF-1ΔNL細胞でもβ-カテニンの核内集積が部分的に認められたことから、これらの細胞ではβ-カテニンは核に移行しているのだが、そこに保持されず、核外に輸送されているものと考えられた。本研究では、α-カテニン依存性のシグナル伝達とβ-カテニンの関与したシグナル伝達に分けて研究を遂行した。[α-カテニン依存性のシグナルと核への伝達]カドヘリン陽性でかつα-カテニン遺伝子に変異を持ためα-カテニン陰性である細胞(DLD-1細胞)でα-カテニンを発現させると、アポトーシスに対する抵抗性を増大させることを発見した。このときいかなるシグナルが発せられているのかを明らかにする目的で実験を行い、次の事柄を明らかにした。1)α-カテニン機能領域の同定を行った。2)α-カテニンがシグナルを送っている時にカドヘリンによる細胞間接着は必要ないことが判明した。3)α-カテニンの下流にp27kip1が存在することが明らかになった。いかなる機構でα-カテニンの発現がp27kip1の量を増大させるのかは現在のところ不明である。[β-カテニンの関与したシグナルと核への伝達]β-カテニンとGFPの融合タンパク質のコンストラクト(GFP-β-カテニンΔN1)を作製し、これを安定に発現する細胞のクローンでβ-カテニンの細胞内での動態を調べた。その結果、GFP-β-カテニンΔN1は転写因子LEF-1発現細胞(LEF-1 L細胞)では核内での存在が認められたが、親株のL細胞、あるいはβ-カテニン結合部位であるアミノ末端領域を欠失したLEF-1発現細胞(LEF-1ΔN L細胞)では、核への集積は認められるものの、LEF-1 L細胞に比べてその程度が著しく低いことが判明した。核から細胞質への輸送機構を阻害するレプトマイシンBを使ったところ、これらの細胞でもβ-カテニンの核内集積が部分的に認められたことから、これらの細胞ではβ-カテニンは核に移行しているのだが、そこに保持されず、核外に輸送されているものと考えられた。本研究では、α-カテニン依存性のシグナル伝達とβ-カテニンの関与したシグナル伝達に分けて研究を遂行している。[α-カテニン依存性のシグナルと核への伝達]カドヘリン陽性でかつα-カテニン遺伝子に変異を持ためα-カテニン陰性である細胞(DLD-1細胞)とこの細胞にα-カテニンの発現ベクターを導入してα-カテニンを発現させた細胞の増殖性を詳細に調べてみた。その結果、シャーレに接着させた場合には両者の間で差がなかったが、シャーレへの接着を抑えてやると、α-テニン陰性細胞に比べてα-カテニン発現細胞の増殖性は著しく低下していることが判明した。抗体でカドヘリンの機能を抑えると、増殖の抑制は見られなくなった。このことは、浮遊状態の細胞ではカドヘリンからα-カテニン依存性のシグナルが出ていることを示している。そこでこの現象に関与するα-カテニン機能領域の同定を行った。その結果、カドヘリン依存性のコンパクションを引き起こすのに必要な領域と一致することが判明した。[β-カテニンの関与したシグナルと核への伝達]β-カテニンとGFPの融合タンパク質のコンストラクト(GFP-β-カテニン)を作製し、これを安定に発現するDLD-1細胞のクローンでβ-カテニンの細胞内での動態を調べた。