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Lys63結合型ポリユビキチン鎖を検出する分子プローブの開発とその応用

脱ユビキチン(Ub)化酵素AMSHは、Lys63結合型ポリUb鎖を選択的に切断する酵素である。我々はこれまでに、AMSHの触媒ドメインの酵素活性欠失変異体がLys63結合型Ub鎖と安定な複合体を形成することを具出している。本研究では、酵素活性を欠失させたAMSHの触媒ドメインをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオン・ビーズを用いて精製した。そして、このGST融合タンパク質をLys63結合型Ub鎖を特異的に認識する分子プローブとして利用することができないか、以下の2つの実験により検討した。1.固定しpermeabilizeしたHeLa細胞をAMSH-GST融合タンパク質とインキュベートし、細胞内のLys63結合型Ub化されたタンパク質と結合させた。未結合のGST融合タンパク質を除いた後、抗GST抗体による免疫染色でLys63結合型Ub化された細胞内タンパク質の局在の同定を試みた。しかし、コントロール細胞と比べて強く染色される細胞内部位を見出すことはできなかった。用いるGST融合タンパク質の濃度やインキュベーションの温度、時間などの条件を細かく検討する必要が示唆された。2.精製したAMSH-GST融合タンパク質をグルタチオン・ビーズにコンジュゲートし、HeLa細胞のライセートを加えてインキュベートした。ビースを洗浄後、結合タンパク質をSDSで溶出し、電気泳動後、抗Ub抗体でイムノブロッティングした。その結果、Ub化タンパク質のスメアーが検出された。このスメアーは、コントロールのGSTタンパク質によってはプルダウンされなかった。AMSH触媒ドメインはLys63結合型Ub鎖に特異的に結合することから、このドメインがHeLa細胞中でLys63結合型Ub化されたタンパク質をプルダウンできることが示唆された。引き続き、この系をスケールアップして大量のLys63結合型Ub化タンパク質を調製し、プロテオーム解析によりそれらの網羅的同定を試みたい。脱ユビキチン化酵素AMSHは、Lys63結合型ポリユビキチン鎖を選択的に切断する酵素である。我々はこれまでに、AMSHの触媒ドメインの酵素活性欠失変異体がLys63結合型ポリユビキチン鎖と安定な複合体を形成することを見出している。そこで、酵素活性を欠失させたAMSHの触媒ドメインをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオンビーズを用いて精製した。精製したAMSH触媒ドメインをグルタチオンビーズにカップルし、そこにHeLa細胞のライセートを混ぜてインキュベートした。ビースを洗浄後、結合したタンパク質をSDSで溶出し、電気泳動後、抗ユビキチン抗体によるイムノブロッティングを行った。その結果、ユビキチン化タンパク質のスメアーが検出された。AMSH触媒ドメインがLys63結合型ポリユビキチン鎖を特異的に認識して結合することから、AMSH触媒ドメインがHeLa細胞中でLys63結合型ポリユビキチン化されたタンパク質をプルダウンできることが示唆された。今後、このプルダウン系をスケールアップして大量のLys63結合型ポリユビキチン化タンパク質を調製し、それらをプロテオーム解析で同定することにより、細胞内でLys63結合型ポリユビキチン化をうけるタンパク質を網羅的に同定していく予定である。
昆虫で初めて同定されたサイトカイン・その活性化機構と多機能性に関する研究

発育阻害ペプチド(Growth-blockingpeptide, GBP)は、昆虫の発育を調節する生理活性ペプチドとして同定された。最近の研究により、GBPは昆虫の発育調節のみならず、細胞増殖活性や血球活性化作用などの多機能性を有するサイトカインであることが明確になった。さらに、GBPは、主に脂肪体や中枢神経組織で分子量約1.5KDaの前駆体の形で合成されプロセッシングを受けて活性化することが明らかになっている。本研究においては、主にこの活性化に関与するプロセッシング酵素に着目し、さらに、限定加水分解によって活性化された後のGBPの細胞性免疫作用への関与を考察することが当初の目的であった。ProGBPプロセッシング酵素の単離については、GBP発現量の多い脂肪体を精製出発材料に用い疎水カラムクロマトグラフィー,ゲルろ過カラムクロマトグラフィー,イオン交換カラムクロマトグラフィー、最後にもう1度ゲルろ過カラムクロマトグラフィーという全部で4段階のカラムクロマトグラフィーによって精製を完了した。精製されたプロセッシング酵素の分子量は、約38KDaと計算された。精製されたこの酵素が間違いなくGBP前駆体プロセッシングに関わっていることは、前駆体GBPと反応させることによってGBPのアミノ末端アミノ酸の前で限定加水分解が起ることから証明した。また、各種合成ペプチドを基質に用いてその特異性を調べたところ、哺乳動物の血液凝固反応に関与するファクターXaに似たセリン型プロテアーゼであることが明らかになった。一般的に昆虫においては血液凝固反応がほとんど見られない。今回精製されたproGBPプロセッシング酵素が一次構造の面でもファクターXaに類似性をもち、さらに、昆虫サイトカインのプロセッシングに関与していることが明らかになれば哺乳動物の血液凝固系の分子進化を考える上で特に興味深い。発育阻害ペプチド(Growth-blockingpeptide,GBP)は、昆虫の発育を調節する生理活性ペプチドとして同定された。最近の研究により、GBPは、分子量約1.5KDaの前駆体の形で合成されプロセッシングを受けて活性化することが明らかになっている。今年度は、この活性化に関与するプロセッシング酵素の精製を試みた。GBPは、主に、脂肪体と神経組織で合成されることが分かっているので脂肪体を精製の出発材料とした。脂肪体抽出物質からPhenyl-Toyopearl疎水クロマトカラム,Superose12ゲルろ過カラム,HiTrapQイオン交換カラム、最後に、Superdex75ゲルろ過カラムという全部で4段階のクロマトグラフィーによって精製を完了した。精製されたプロセッシング酵素の分子量は、約58KDaと計算された。精製されたこの酵素が、間違いなくGBP前駆体プロセッシングに関わっていることは、前駆体GBPと反応させることによってGBPのアミノ末端アミノ酸の前で限定加水分解が起ることから証明した。また、各種合成ペプチドを基質に用いてその特異性を調べたところ、哺乳動物の血球凝集反応活性化に関与するファクター10に似たセリン型プロテアーゼであることが明らかになった。昆虫においては血球凝集反応系の解析が進んでいないこともあり、この点は特に興味深い結果である。現在、このタンパク質一次構造を決定すべく、上記精製過程のスケールアップを試みている段階であり、少なくとも1ヶ月以内にアミノ末端20残基程度のアミノ酸配列は決定できるものと確信している。

最近の研究により、GBPは、分子量約1.5KDaの前駆体の形で合成されプロッセッシングを受けて活性化することが明らかになっている。今年度も、昨年度に引き続きこの活性化に関与するプロセッシング酵素の精製を試みた。GBPは、主に、脂肪体と神経組織で合成されること確認しており、発現量の多い脂肪体を精製の出発材料とした。脂肪体抽出物質から疎水カラムクロマトグラフィー,ゲルろ過カラムグラフィー,イオン交換カラムクロマトグラフィー、最後にもう1度ゲルろ過カラムクロマトグラフィーという全部で4段階のカラムクロマトグラフィーによって精製を完了した。精製されたプロセッシング酵素の分子量は、約58KDaと計算された。精製されたこの酵素が、間違いなくGBP前駆体プロセッシングに関わっていることは、前駆体GBPと反応させることによってGBPのアミノ末端アミノ酸の前で限定加水分解が起ることから証明した。また。各種合成ペプチドを基質に用いてその特異性を調べたところ、哺乳動物の血球凝集反応活性化に関与するファクター10に似たセリン型プロテアーゼであることが明らかになった。昆虫においては血球凝集反応系の解析が進んでいないこともあり、この点は特に興味深い結果である。さらに、ペプチドマッピングを行い、ペプチドフラグメントの部分的アミノ酸配列を決定することができた。現在、得られた全ペプチドフラグメントについて一次構造の決定を目指すと共に、cDNAクローニングの準備を進めている。発育阻害ペプチド(Growth-blockingpeptide, GBP)は、昆虫の発育を調節する生理活性ペプチドとして同定された。最近の研究により、GBPは昆虫の発育調節のみならず、細胞増殖活性や血球活性化作用などの多機能性を有するサイトカインであることが明確になった。さらに、GBPは、主に脂肪体や中枢神経組織で分子量約1.5KDaの前駆体の形で合成されたプロセッシングを受けて活性化することが明らかになっている。本研究においては、主にこの活性化に関与するプロセッシング酵素に着目し、さらに、限定加水分解によって活性化された後のGBPの細胞性免疫作用への関与を考察することが当初の目的であった。ProGBPプロセッシング酵素の単離については、GBP発現量の多い脂肪体を精製出発材料に用い疎水カラムクロマトグラフィー,ゲルろ過カラムクロマトグラフィー,イオン交換カラムクロマトグラフィー、最後にもう1度ゲルろ過カラムクロマトグラフィーという全部で4段階のカラムクロマトグラフィーによって精製を完了した。精製されたプロセッシング酵素の分子量は、約38KDaと計算された。精製されたこの酵素が間違いなくGBP前駆体プロセッシングに関わっていることは、前駆体GBPと反応させることによってGBPのアミノ末端アミノ酸の前で限定加水分解が起ることから証明した。また、各種合成ペプチドを基質に用いてその特異性を調べたところ、哺乳動物の血液凝固反応に関与するファクターXaに似たセリン型プロテアーゼであることが明らかになった。一般的に昆虫においては血液凝固反応がほとんど見られない。
アルツハイマー病発症機構における脂質フリッパーゼの役割の解析と予防・治療法の開発

アルツハイマー病(AD)発症機構として、脳内にアミロイドβペプチド(Aβ)が増加・蓄積することが原因とするアミロイド仮説が有力である。一方、アミロイド仮説に基づいた根治療法の開発は頓挫を続けている。その理由として、Aβの蓄積時点では副次的な細胞障害が起こっているため、アミロイド仮説による治療法のみでは有効でない可能性が考えられている。そのため、Aβの蓄積以前に起こる小胞輸送障害をAD発症原因とする「交通渋滞」仮説が注目されている。これまでに、Aβの前駆体であるβCTF(βセクレターゼ切断性カルボキシ末端断片)が患者脳に蓄積し、小胞輸送を障害することが要因として示唆されているが、その詳細な機構は未解明であった。当研究グループはβCTFと結合し、小胞輸送障害を誘導する因子としてTMEM30Aを同定している。TMEM30Aは、リン脂質の脂質二重膜における不均衡性を維持する脂質輸送酵素フリッパーゼの構成分子であり、小胞輸送の制御に関わる事が知られている。本研究ではβCTFによるリピッドフリッパーゼの活性変化に着目し、AD病態とリピッドフリッパーゼ活性の相関性、AD特異的輸送障害を改善できる新たな治療ターゲットの創出を目標として解析を行っている。本年度は、1βCTFに特異的な領域であるAβ配列が、βCTFの産生・局在を制御する重要な領域であること、2またTMEM30AがAβ領域を介してβCTFと結合することにより小胞輸送障害を誘導することを見出し、それぞれ海外学術誌に発表した。さらに解析を進め、リピッドフリッパーゼの活性測定法、小胞輸送障害を定量的に解析する手法を開発するとともに、TMEM30AのAβ結合領域由来のペプチドTRAPが小胞輸送障害を改善しうることを明らかにした。これらの成果により小胞輸送障害のメカニズム解明・治療法開発に寄与できると考えている。TMEM30AとβCTFによる小胞輸送障害について明らかにし、海外学術誌に発表を行った。さらに研究を進め、リピッドフリッパーゼの活性や、小胞輸送の効率をSplit luciferase法により定量的に測定する技術の開発に成功しており、今後AD発症メカニズムにおけるリピッドフリッパーゼ活性関連性の解析が効率的にできるようになった。本技術はリピッドフリッパーゼ活性の関与する多くの関連疾患の治療にも有用であると考えている。海馬切片培養を用いた輸送障害モデルの開発の進行が遅れており、今後、現在同定した遺伝子・化合物のAD治療効果について明らかにする必要があるが、解析系の効率化を進めることができたことから、概ね申請時の計画通りに進行しており、順調に進展していると考えている。リピッドフリッパーゼ解析系のさらなる評価を行い、さらにAβの産生・神経機能への影響の解析を進め、リピッドフリッパーゼとAD発症メカニズムの関連性の解明を行う。またリピッドフリッパーゼ以外のメカニズムが関与するのか、輸送小胞においてβCTFと結合する新たな因子のスクリーニングを行う。脳の構造を反映した検討が可能である海馬切片培養系を用いて、開発したリピッドフリッパーゼ活性・小胞輸送障害測定系の応用により、AD病態を反映したモデル系の確立に注力するとともに、AD特異的な輸送障害を改善できるペプチド製薬・小分子化合物の探索を行う。一方、アミロイド仮説に基づいた根治療法の開発は頓挫を続けており、その理由として、Aβの蓄積が始まっている時点では副次的な炎症反応などの細胞障害が起こっているため、アミロイド仮説による治療法のみでは有効でない可能性が考えられている。そのため、Aβの蓄積以前に起こる小胞輸送障害をAD発症原因とするTraffic jam(交通渋滞)仮説が注目されている。これまでに、Aβの前駆体であるβCTF(βセクレターゼ切断性カルボキシ末端断片)が患者脳に蓄積し、小胞輸送を障害することがTraffic jam仮説の要因として示唆されているが、その詳細な機構は未解明であった。これまでに、TMEM30AとβCTFの発現により小胞輸送障害が誘導され、輸送小胞の巨大化が観察されること、そしてこれらの細胞系を利用したAD特異的な輸送障害を観察できるモデル系の構築を行い、TMEM30AとβCTFの結合を抑制できる小分子化合物の同定に成功している。TMEM30AとβCTFの結合領域について明らかにし、その複合体の形成を阻害できるペプチド配列、また小分子化合物を見出した。また、エンドソームにおけるリピッドフリッパーゼ活性を基質であるホスファチジルセリンに結合するタンパク質の膜結合性で評価できる実験系を構築した。AD特異的な小胞輸送障害に関わる分子のスクリーニングも開始しており、順調に進展していると考えている。

一方、アミロイド仮説に基づいた根治療法の開発は頓挫を続けている。その理由として、Aβの蓄積時点では副次的な細胞障害が起こっているため、アミロイド仮説による治療法のみでは有効でない可能性が考えられている。そのため、Aβの蓄積以前に起こる小胞輸送障害をAD発症原因とする「交通渋滞」仮説が注目されている。これまでに、Aβの前駆体であるβCTF(βセクレターゼ切断性カルボキシ末端断片)が患者脳に蓄積し、小胞輸送を障害することが要因として示唆されているが、その詳細な機構は未解明であった。当研究グループはβCTFと結合し、小胞輸送障害を誘導する因子としてTMEM30Aを同定している。TMEM30Aは、リン脂質の脂質二重膜における不均衡性を維持する脂質輸送酵素フリッパーゼの構成分子であり、小胞輸送の制御に関わる事が知られている。本研究ではβCTFによるリピッドフリッパーゼの活性変化に着目し、AD病態とリピッドフリッパーゼ活性の相関性、AD特異的輸送障害を改善できる新たな治療ターゲットの創出を目標として解析を行っている。本年度は、1βCTFに特異的な領域であるAβ配列が、βCTFの産生・局在を制御する重要な領域であること、2またTMEM30AがAβ領域を介してβCTFと結合することにより小胞輸送障害を誘導することを見出し、それぞれ海外学術誌に発表した。さらに解析を進め、リピッドフリッパーゼの活性測定法、小胞輸送障害を定量的に解析する手法を開発するとともに、TMEM30AのAβ結合領域由来のペプチドTRAPが小胞輸送障害を改善しうることを明らかにした。これらの成果により小胞輸送障害のメカニズム解明・治療法開発に寄与できると考えている。TMEM30AとβCTFによる小胞輸送障害について明らかにし、海外学術誌に発表を行った。さらに研究を進め、リピッドフリッパーゼの活性や、小胞輸送の効率をSplit luciferase法により定量的に測定する技術の開発に成功しており、今後AD発症メカニズムにおけるリピッドフリッパーゼ活性関連性の解析が効率的にできるようになった。本技術はリピッドフリッパーゼ活性の関与する多くの関連疾患の治療にも有用であると考えている。海馬切片培養を用いた輸送障害モデルの開発の進行が遅れており、今後、現在同定した遺伝子・化合物のAD治療効果について明らかにする必要があるが、解析系の効率化を進めることができたことから、概ね申請時の計画通りに進行しており、順調に進展していると考えている。これまでに明らかになったTMEM30AとβCTFの結合を阻害できる化合物について、AD特異的な小胞輸送障害を改善できるか、構築したモデル系を用い解析を進める。また、βCTFがフリッパーゼ活性を実際に阻害しているのか、ホスファチジルセリン結合性たんぱく質の結合性、および、in vitro評価系の構築により解析を行う。動物モデルでは小胞輸送障害の長期的な評価が困難であるため、蛍光ラベルをおこなったAPP、TMEM30Aの発現系をラットの海馬切片培養に応用した小胞輸送障害解析モデルの樹立に注力する。リピッドフリッパーゼ解析系のさらなる評価を行い、さらにAβの産生・神経機能への影響の解析を進め、リピッドフリッパーゼとAD発症メカニズムの関連性の解明を行う。
低分子化合物が植物に誘導する全身獲得抵抗性の誘導機構に関する研究

クロロイソニコチン酸誘導体NCIはイネにイネいもち病抵抗性を誘導することが報告されているが、そのメカニズムは明らかでなかった。タバコとアラビドプシスを用いてその効果を検討した結果、NCIはこれらの植物でも病害抵抗性を誘導し、SARのマーカー遺伝子であるPR遺伝子の発現も誘導した。この抵抗性はNahG形質転換植物でも誘導されたことからNCIはサリチル酸の合成を必要とせずに抵抗性を誘導することが示された。また、アラビドプシスではnpr1欠損株では抵抗性が誘導されなかったことから、NCIの作用点はサリチル酸とNPR1の間にあることが明らかとなった。バリダマイシンA(validamycin A)あるいはバリドキシルアミンA(validoxylamine A)100ppmの茎葉散布は、Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiciが起こす土壌伝染性維管束病であるトマト萎凋病の発病抑制効果を示した。この活性は薬剤処理3週間後でも残存しており、BTH、PBZ等の茎葉散布に比べて高い抑制効果を示した。両化合物はF. oxysporumに対する抗菌活性を持たないことから、この効果は茎葉散布による抵抗性誘導によることが推測された。両化合物を処理したトマトでは、PR遺伝子の発現とサリチル酸の蓄積が見られたことから、この抵抗性の誘導はトマトにSARが誘導された結果であることが示唆された。植物ステロイドホルモンであるブラシノステロイドがタバコ、イネに病害抵抗性を誘導することを明らかにした。PR遺伝子の発現が見られず、SARとは異なるメカニズムによることが示された。この抵抗性はアラビドプシスでも誘導され、NPR1が必要であることが明らかとなった。SARマーカー遺伝子を指標にして、新たなSAR誘導化合物の探索を行った。アラビドプシス、タバコを用いて検討行った結果、NCIは様々な病原菌に対する抵抗性とPRタンパク質の発現を誘導した。NahGトランスジェニック植物においても同様の効果を示したことから、NCIはサリチル酸合成を伴わずにSARを誘導する化合物であることが判明した。バリダマイシンA(VMA)はFusarium oxysporum f. sp. lycopersiciが起こす土壌伝染性維管束病であるトマト萎凋病の発病抑制効果を示すが、VMAはトマトにおいてサリチル酸の蓄積とPRタンパク質の発現を誘導することが明らかとなった。植物ホルモンブラシノステロイド(BR)が、イネにいもち病菌、白葉枯れ病菌に対して、タバコにおいてもTMVや野火病菌に対して抵抗性を誘導することを明らかにした。タバコおよびアラビドプシスを用いて、BRの抵抗性誘導効果を解析した結果、サリチル酸を必要とせずに抵抗性を誘導し、またPRタンパク質の発現を伴わないことが明らかとなった。SAR誘導化合物ベンゾイソチアゾールをアラビドプシスに処理することにより誘導される遺伝子をディファレンシャル・ディスプレイ法により検索し、P450と推定される遺伝子をクローニングした。
ヒト神経芽腫の平滑筋細胞への分化・成熟の機序の解明

神経冠は,末梢神経細胞,Schwann細胞メラノサイトと大血管を含む外胚葉性中胚葉細胞に成長・分化する。神経冠由来の腫瘍である神経芽腫細胞株には2つの形態学的に異なる細胞成分,すなわちneuroblastic(N)細胞と扁平上皮細胞成分であるsubstrateーadhesive(S)細胞が存在する。我々は,17種の神経芽腫細胞株を,種々の細胞骨格蛋白に対するモノクロ-ナル抗体を用いて,間接蛍光抗体法で解析した。その結果3種の細胞株(KPーNーSI,KPーNーYNとSMSーKCN)では,αーsmooth muscle actinが陽性であった。また1株(KPーNーSI)では,desminが陽性であった。ついでこれらの3親株より,NまたはS型細胞から成る8種のクロ-ン株を樹立した。各クロ-ン株の親株由来は,マ-カ-染色体の存在によった。αーsmooth muscle actinとdesminの陽性は,2次元Western blot法でも確認された。またS型クロ-ン神経芽腫株では,ヒトαーsmooth muscle actinに特異的なcDNA probe(pSH αーSMAー3'UT)を用いたNorthern blot法でαーsmooth muscle actin mRNAがみられた。以上の結果より,神経芽腫は神経細胞,Schwann細胞とメラノサイトの他に,平滑筋細胞マ-カ-を持つ細胞に分化する可能性が示された。神経芽腫(NB)は,神経冠より発生する小児固形悪性腫瘍である。我々は,in vitroでNBの神経やSchwann細胞への分化をすでに明らかにしてきた。今回NB細胞が,平滑筋のマ-カ-を有することを始めて明らかにした。我々の研究室で継代培養中の17種のうち3種のNB株は,紡錘形の神経細胞のみならず,flatーepithelial(別名S)細胞を混ずる。このS細胞は,平滑筋細胞に特異的とされるαーsmooth muscle actinと,心筋,平滑筋と骨格筋に特異的とされるdesminを持つことを,間接蛍光抗体法や二次元Western blot法で証明した。さらにS細胞は,Northern法でαーsmooth muscle actinmRNAを有することを明らかとした。平滑筋マ-カ-を持つNB細胞の存在は,発生学的に神経冠は大血管の平滑筋細胞に成長・分化するとした,LeDouarinらの報告と一致する。またNBが何らかの培養条件で平滑筋細胞に分化する能力を持っていることを示唆する。神経芽腫は,1)臨床経過中分化と成熟がおこり,腫瘍の自然退縮がみられる。2)1歳以下の進行性NB(病期IVS)は,1歳以上の進行性NB(病期IV)と異なり,予後が明らかに良い。しかし分化・成熟と退縮の機序は,よく分かっていない。NBが平滑筋マ-カ-を持つ(平滑筋細胞と考えられる)細胞に,どうしてinterconversionするかを明らかにすることは,臨床上ユニ-クなNBの特性を解明するうえに役立つと考えられる。今後TGF,FGF,PDGFなどの中胚葉分化因子を用いて,in vitroでNB平滑筋への分化を誘導し,その機序を明らかにしていきたい。神経冠は,末梢神経細胞,Schwann細胞メラノサイトと大血管を含む外胚葉性中胚細胞に成長・分化する。神経冠由来の腫瘍である神経芽腫細胞株には2つの形態学的に異なる細胞成分,すなわちneuroblastic(N)細胞と扁平上皮細胞成分であるsubstrateーadhesive(N)細胞が存在する。

αーsmooth muscle actinとdesminの陽性は,2次元Western blot法でも確認された。またS型クロ-ン神経芽腫株では,ヒトαーsmooth muscle actinに特異的なcDNA probe(pSH αーSMAー3'UT)を用いたNorthern blot法でαーsmooth muscle actin mRNAがみられた。以上の結果より,神経芽腫は神経細胞,Schwann細胞とメラノサイトの他に,平滑筋細胞マ-カ-を持つ細胞に分化する可能性が示された。
近代日本における中国語教育の成立・展開とその教員養成システムに関する研究

1本年度は、最終年度でもあり、配分された金額を勘案して、これまでの研究において不十分である個所の補充調査と、報告書の執築に時間を割いた。2不十分な個所として重点的に調査を行ったことは、中国語教育に携わった教員の養成システムの解明に係わることである。具体的には、以下のとおりである。(1)中等教員の無試験検定指定学校であった東京外国語学校と大阪外国語学校を卒業した学生の進路についての調査。(2)中等教員の無試験検定許可学校であった天理外国語学校を卒業した学生の進路についての調査。(3)中等教員の試験検定の「支那語」合格者に関するデータの調査3そのほか補充調査を行ったことは、以下のとおりである。(1)戦後の中国語教育に大きな足跡を残した倉石武四郎の業績目録を作成するための著作の調査。(2)『文検受験生』『文検世界』以外の中国語学習雑誌に掲載された「文検支那語」の受験情報の収集。(3)拓殖大学や早稲田大学で中国語の教鞭をとっていた宮原民平に関する研究、および宮原の著作の収集。(4)このテーマにおいて欠かすことのできない研究者である六角恒廣、安藤彦太郎、竹内好の著作の収集。(5)戦前、民間で盛んに行われた様々な中国語講習会における中国語教育の実態、および昭和10年代以降、日本放送協会によって放送されたラジオ中国語講座に関する調査1本年度は、最終年度でもあり、配分された金額を勘案して、これまでの研究において不十分である個所の補充調査と、報告書の執築に時間を割いた。(5)戦前、民間で盛んに行われた様々な中国語講習会における中国語教育の実態、および昭和10年代以降、日本放送協会によって放送されたラジオ中国語講座に関する調査1本年度は初年度として、北京を中心とする現地調査と、中国語教育に関する基本資料の収集に力点を置いて活動を行う予定であったが、SARSの思わぬ流行のため、現地調査を取り止めざるを得なかった。次年度に実施する予定である。2したがって基本資料の収集が中心となった。以下はその具体的な活動の概要である。(1)戦後の中国語教育に大きな足跡を残した倉石武四郎の業績目録を作成するための著作を収集した。(2)『文検受験生』と『文検世界』を中心として、文検支那語の受験参考雑誌記事を収集した。(3)明治期の早い段階から中国語教育に力を入れていた拓殖大学と早稲田大学の歴史に関する著作の収集を行った。(4)不二出版が手掛けている中国語の教材集成を購入した。(5)このテーマにおいて欠かすことのできない研究者である六角恒廣と安藤彦太郎の著作を収集した。(6)『支那語』をはじめとする戦前発行されていた中国語の学習雑誌収集を行った。1 2年目を迎える本年度は、申請時の予定どおり中国語教育に携わった教員の養成システムの解明に重点を置いて研究を行った。具体的には、以下の通りである。(1)中等教員の無試験検定指定学校であった東京外国語学校と大阪外国語学校における中国語教育の教育内容と卒業生の進路についての資料を収集するとともに、その分析作業を行った。(2)中等教員の無試験検定許可学校であった天理外国語学校における中国語教育の教育内容と卒業生の進路についての資料を収集するとともに、その分析作業を行った。(3)中等教員の試験検定の「支那語」に関するデータを収集するとともに、その分析作業を行った。2昨年度に行った基本資料の収集を引き続き行った。(2)『文検受験生』『文検世界』『受験と学生』を中心として、「文検支那語」の受験情報の収集を行った。(4)高等商業学校における中国語教育に関する資料の収集を行った。(5)『支那語』をはじめとする戦前発行されていた中国語の学習雑誌収集を行った。3このテーマにおいて欠かすことのできない研究者である六角恒廣、安藤彦太郎、竹内好の著作を収集するとともに、その内容の検討を行った。1前年度までを引き続き、戦前に発行された中国語教育関係の雑誌の収集、整理を行った。とくに『支那語』(外国語学院出版部)『支那語雑誌』(春陽堂)『支那語学報』(支那語学会)

『支那語研究』(天理外国語学校崑崙会)などの収集に力を入れた。2植民地統治の観点から実施された、外務省書記生試験および通訳のための資格試験の中で問われた中国語の試験問題の収集と分析を行った。3陸軍士官学校および陸軍大学校において行われた中国語教育の実態について若干の調査を行った。4戦前、中国語教育に力を入れた数少ない私立大学、外国語学校、高等商業学校、商業学校、中学校などで使用された中国語教科書の収集、および内容についての比較的分析を行った。5戦前の中国語教育を担った教員たちに関する人物研究を行った(例えば(1)独学で中国語を学び、文部省の中等教員検定試験を経て、教員になった者。(2)外国語学校の出身者(3)東亜同文書院の関係者などに、分類して代表的な人物を取り上げて考察を行った)6戦前、民間で盛んに行われた様々な中国語講習会の中国語教育の実態、および昭和10年半ば以降、日本放送によって放送されたラジオ中国語講座の内容について若干の調査を行った。1本年度は、最終年度でもあり、配分された金額を勘案して、これまでの研究において不十分である個所の補充調査と、報告書の執筆に時間を割いた。2不十分な個所として重点的に調査を行ったことは、中国語教育に携わった教員の養成システムの解明に係わることである。具体的には、以下のとおりである。(1)中等教員の無試験検定指定学校であった東京外国語学校と大阪外国語学校を卒業した学生の進路についての調査。(2)中等教員の無試験検定許可学校であった天理外国語学校を卒業した学生の進路についての調査。(3)中等教員の試験検定の「支那語」合格者に関するデータの調査。3そのほか補充調査を行ったことは、以下のとおりである。(1)戦後の中国語教育に大きな足跡を残した倉石武四郎の業績目録を作成するための著作の調査。(2)『文検受験生』『文検世界』以外の中国語学習雑誌に掲載された「文検支那語」の受験情報の収集。(3)拓殖大学や早稲田大学で中国語の教鞭をとっていた宮原民平に関する研究、および宮原の著作の収集。(4)このテーマにおいて欠かすことのできない研究者である六角恒廣、安藤彦太郎、竹内好の著作の収集。(5)戦前、民間で盛んに行われた様々な中国語講習会における中国語教育の実態、および昭和10年代以降、日本放送協会によって放送されたラジオ中国語講座に関する調査。
霊長類網膜における色情報抽出神経構構の研究

網膜における色情報抽出の神経機構を解明するため、錐体視細胞を免疫組識化学的に解析した。これまで同定が極めて困難であった霊長類の網膜を始め、多くの脊椎動物の錐体を比較系統的に調べた。初年度は3種の碓体を認識する抗体を作製した。ヒト錐体オプシンのN端アミノ酸配列を合成し、これを抗原としてウサギ及びマウスに免疫してポリクローナル抗体を得た。赤及び緑錐体オプシンのアミノ酸配列はほぼ相同であるため、両者を識別する抗体は出来なかった。さらにロドプシンのN端を抗原とする抗体も作製し、比較検討のためロドプシンの188-202番目に抗原決定基を有するモノクローナル抗体(MAb15-18)を用いて、錐体を形態学的に同定出来るカメ網膜を解析した(発表済み)。次年度はヒト青錐体オプシン及び赤/緑錐体オプシンを認識する抗体(PAb Hu-BNとPAb Hu-R/GN)を用いて、これまで顕微分光法や細胞内記録などで解析されてきた、種々の脊椎動物の錐体視細胞を調べた。得られた抗体は、カエル・カメ・トリ・サル・ヒトなど、両生類以上の脊椎動物の錐体外節を例外なく認識したが、魚類には全く免疫反応を示さなかった。この結果は、これまで色覚の研究に大きな貢献をしてきた魚類の錐体オプシンが、両生類からヒトまでの錐体オプシンと大きく異なっていることを示唆する重要な所見である。(論文準備中)。これらの新しい知見をもとに、ニホンザル及びアカゲザルの錐体を解析した結果、1)これまで網膜の中心かには青錐体が存在しないと考えられてきたが、極めて小数の青錐体の存在が確認された。2)報告されている青錐体の格子状の配列はごく一部に限局されており、赤/緑錐体と同様にランダムな配列を示した。以上の研究成果はヒトの色覚の神経機構の解明に大きく貢献する重要な発見である。(論文準備中)。研究計画に従って、本年は以下の3つの研究成果をあげた。1.錐体視物質のアミノ酸配列の一部を合成し、これを抗原としてマウス及びウサギから抗体を得た。得られた抗体の免疫特異性を生化学的に解析した後、種々の脊椎動物の網膜を用いて錐体外節の免疫反応を検索した。この結果、錐体視物質の抗体は全ての脊椎動物と反応したことから、錐体視物質の相同性が明らかになった。現在、他の抗体も検索中であり、来年度も研究を継続する。2.ヒト杆体オプシンを認識するモノクロ-ナル抗体MAb15ー18は、冷血動物のある種の錐体外節と結合することが報告されている。そこでこの錐体の種類を同定するため、細胞内記録及び細胞内染色の解析から3種類の錐体を形態的に同定出来るカメ網膜を用いた。この結果、MAb15ー18はカメ網膜の杆体の他に、緑錐体と結合することが明らかになった。これは杆体オプシンが昆虫からヒトまで構造がかなり保存されているのに比べて、緑錐体オプシンは脊椎動物内でも種特異性があることを示す重要な発見である。研究成果は公表・発表した。3.このように脊椎動物の錐体は、視物質の抗体を用いて識別できる。一方、カメの錐体視細胞は油滴により一義的に同定可能であることから、錐体にHRPを細胞内染色し錐体間結合を電顕解析した。

この結果、これまで細胞内記録などで報告されている錐体間の結合をシナプスレベルで明らかにした。本年度は当初計画以上の研究成果をあげた。次年度はこの研究成果を元にさらに視物質の系統進化の問題も解析する。研究計画に従って、本年は以下の研究を行った。1)オプシンのポリクロ-ナル抗体の作製ヒトの杆体オプシン(ロドプシン)と3種類の錐体オプシンのアミノ酸配列の一部を合成し、これを抗原にしてウサギ及びマウスを用いて、以下の4種類のポリクロ-ナル抗体を作製した。RhーN(ロドプシンのN端を認識する)、Rhー188(ロドプシンの188ー202番目)、R/GーN(赤・緑錐体オプシンのN端)、BーN(青錐体オプシンのN端)。これらの抗体の免疫反応性はELISA法で確認した。2)視細胞外節の免疫組織化学的解析上記の抗体を用いて、まず比較生物学的解析を行った。これまで主にモノクロ-ナル抗体も用いて、種の異なる脊椎動物の視細胞の研究が行われてきた。しかし、抗原決定基の解析が不十分なため、得られた研究成果の評価が不明確であった。そこで本研究では、様々な脊椎動物の網膜の免疫反応性を比較生物学的に解析した結果、杆体および錐体オプシンの構造に、魚類とそれ以上の脊椎動物では大きな違いがあることが明らかになった。これは現在解析が進んでいる、視物資オプシンの系統進化の問題に関する重要な知見である。次にニホンザル網膜を用いて、中心窩網膜における青錐体の存在を直接解析した。従来の心理物理学的研究では、ヒトの中心窩網膜に青錐体が存在しないと考えられている。しかし、今回の免疫組織化学的解析により、ニホンザル網膜の中心窩にはR/GーNで標識される赤・緑錐体の他に、BーNの抗体で標識された小数の錐体外節が確認された。この結果は、ヒト網膜の中心窩にも青錐体の存在を示唆する重要な所見である。さらにこれらの研究成果を発展させるべく、現在視細胞と二次ニュ-ロンとの神経回路を解析中である。
粘弾性管内の新しい波束の伝搬速度の定義に基づいた測定に関する研究

柔軟性のある管の内側を音波が伝搬すると,音速が周波数に依存して変化する速度分散現象が生じる.このような速度分散領域において,従来の定義による群速度は,壁面振動の共振周波数付近で発散してしまい,本来の物理的意味を失ってしまう.そこで本研究は,電磁波の分野において新たに定義された群速度の理論に基づき,粘弾性管内の音波の群速度について理論的な検討を行い,実験を通して理論解析の妥当性の検証を行った.平成9年度には,管内音波の群速度の理論的な検討を行い,シリコーンゴム管を用いた実験により,管内媒質が空気の場合の波束の伝搬速度を測定した.その結果,実験値は理論解析の値と比較的よく一致した.平成10年度には,まず,シリコーンゴム管の弾性定数を簡易かつ高精度に求めるため,TSP(Time-Stretched Pulse:時間引き延ばしパルス)を管内に伝搬させ,音波の位相速度及び吸収係数の測定を行い,その結果を用いて管壁の動的弾性率及び動的粘性率を算出した.そして,求めた弾性定数をもとに,管内での音波伝搬の数値シミュレーションを行った.また,管内媒質が水の場合の音波伝搬実験を行い,管壁面の弾性振動が支配的に働く管壁モード,内部の流体が支配的に働く流体モードを分離して測定した.その結果,位相速度は管壁モードの方が速く,音波吸収は流体モードの方が大きいことがわかった.しかしながら,両モード共に,速度分散領域においては,音波吸収が著しく大きな値を示し,波束の伝搬速度を測定することが困難であった.今後は,速度分散領域での波束の伝搬速度の測定精度を向上させるため,駆動源および受波センサについて検討する必要がある.柔軟性のある管の内側を音波が伝搬すると音圧により菅の壁面が振動する.その壁面振動は管内の気体の圧縮性に影響を与え,管内での音速は変化する.一般に,壁面振動には周波数依存性があるため,音速も周波数に依存して変化する速度分散といわれる現象が起こる.このような速度分散領域において,従来の定義による群速度は,壁面振動の共振周波数付近で発散してしまうため,本来の物理的意味を失ってしまうことが知られている.そこで本研究は,電磁波であるアルヴェン波において実証された新しい群速度の理論解析の手法を管内音波の速度分散現象に適用し,粘弾性管内の音波の群速度について理論的な検討を行い,実験を通し理論解析の妥当性を検討した.実験では,内径12mm,内厚1.8mm,密度1,180kg/m^3の市販のシリコーンゴム管を用いた.管内を伝搬させる波束としては,任意波形発生器により作成したガウス変調パルスを用い,音源であるドライバユニットから管内に伝搬させた.受波は,マイクロホンに装着したプローブチューブを管壁面に作った小穴に差し込んで行った.そして,伝搬に伴う波形変化および群速度を測定した.また,受波信号をA/D変換し,伝搬に伴う中心周波数の変化についても調べた.その結果,多少のばらつきはあったものの,実験値と理論値はほぼ同様な傾向を示した.今回は,マイクロホンによる管内音波の測定を対象としたが,今後は,管壁面の振動の測定も同時に行うことで,管内音波とのカップリングについても検討する予定である.柔軟性のある管の内側を音波が伝搬すると,音速が周波数に依存して変化する速度分散現象が生じる.このような速度分散領域において,従来の定義による群速度は,壁面振動の共振周波数付近で発散してしまい,本来の物理的意味を失ってしまう.そこで本研究は,電磁波の分野において新たに定義された群速度の理論に基づき,粘弾性管内の音波の群速度について理論的な検討を行い,実験を通して理論解析の妥当性の検証を行った.平成9年度には,管内音波の群速度の理論的な検討を行い,シリコーンゴム管を用いた実験により,管内媒質が空気の場合の波束の伝搬速度を測定した.その結果,実験値は理論解析の値と比較的よく一致した.平成10年度には,まず,シリコーンゴム管の弾性定数を簡易かつ高精度に求めるため,TSP(Time-Stretched Pulse:時間引き延ばしパルス)を管内に伝搬させ,音波の位相速度及び吸収係数の測定を行い,その結果を用いて管壁の動的弾性率及び動的粘性率を算出した.そして,求めた弾性定数をもとに,管内での音波伝搬の数値シミュレーションを行った.また,管内媒質が水の場合の音波伝搬実験を行い,管壁面の弾性振動が支配的に働く管壁モード,内部の流体が支配的に働く流体モードを分離して測定した.その結果,位相速度は管壁モードの方が速く,音波吸収は流体モードの方が大きいことがわかった.しかしながら,両モード共に,速度分散領域においては,音波吸収が著しく大きな値を示し,波束の伝搬速度を測定することが困難であった.今後は,速度分散領域での波束の伝搬速度の測定精度を向上させるため,駆動源および受波センサについて検討する必要がある.
Cre/Pseudo loxP系による形質転換動物作出法の開発と利用

生殖系列に遺伝子を導入する際に利用されるDNA顕微注入法は、DNAの注入が前核でのDNA複製の開始が後に行われた場合、生産されたTg個体にはしばしばモザイクとなる。もし、外来遺伝子を保有する細胞が生殖細胞に分化していないと、外来遺伝子は子孫へ伝達されないためTg動物は一代限りのモザイクTg動物となる。DNA顕微注入法を利用してモザイクTg動物が作出されないように外来遺伝子を宿主ゲノムのpseduolox部位に組み込ませるためには、前核期胚でDNA複製前に注入したCre遺伝子の発現があり、この酵素の作用により外来pseudoloxp部位をもつ遺伝子と宿主ゲノム内のpsedoloxp部位との間で組み換えが起こることである。そこで、1)前核に注入したCre発現ベクターと両側にpseudoloxp部位をもつLaxZプラスミドを前核に注入したところ、DNAの複製前にCre酵素の発現とpseudoloxp部位での組み換えが生じたことが確認された。2)前核期に注入したCre酵素が発現し、宿主ゲノム内に存在するpseddoxp部位を認識して組み換えを起こすかを検証した。CMV/loxP/CAT/loxP/LacZ遺伝子が導入されたTgマウス(大阪大学医学部宮崎純一教授より供与)を通常のマウスと交配して採取した受精卵にDNA顕微注入法によりCAG/Cre発現ベクターを注入し、体外で桑実胚あるいは胚盤胞まで発生させた結果、DNA複製前で組み換えに組み換えが起ることが判明し、さらに、内在loxp部位で高い頻度で組み換えの起ることを見い出した。DNA顕微注入法により外来遺伝子を導入する方法では、DNAの注入が前核でのDNA複製の開始が後に行われた場合、得られたTg個体にはしばしばモザイクとなる。この場合、外来遺伝子を保有する細胞が生殖細胞に分化していないと、外来遺伝子は子孫へ伝達されないためTg動物は一代限りのモザイクTg動物となる。本方法を利用してモザイクTg動物が作出されないように外来遺伝子を宿主ゲノムのpseduolox部位に組み込ませるために重要なことは、前核期胚でDNA複製前に注入したCre遺伝子の発現があり、この酵素の作用により外来pseudoloxp部位をもつ遺伝子と宿主ゲノム内のpsedoloxp部位との間で組み換えが起こることである。2)次に、前核期に注入したCre酵素が発現し、宿主ゲノム内に存在するpsedoloxp部位を認識して組み換えを起こすかを検証した。遺伝子が導入されたTgマウス(大阪大学医学部宮崎純一教授より供与)を通常のマウスと交配して採取した受精卵にDNA顕微注入法によりCAG/Cre発現ベクターを注入し、体外で桑実胚あるいは胚盤胞まで発生させた結果、内在loxp部位での組み換え頻度ならびにDNA複製前で組み換えの起こったことが確認できた。外来遺伝子を導入する際主に利用されるDNA顕微注入法は、DNAの注入が前核でのDNA複製の開始が後に行われた場合、生産されたTg個体にはしばしばモザイクとなる。

2)前核期に注入したCre酵素が発現し、宿主ゲノム内に存在するpsedoloxp部位を認識して組み換えを起こすかを検証した。CMV/loxP/CAT/loxP/LacZ遺伝子が導入されたTgマウス(大阪大学医学部宮崎純一教授より供与)を通常のマウスと交配して採取した受精卵にDNA顕微注入法によりCAG/Cre発現ベクターを注入し、体外で桑実胚あるいは胚盤胞まで発生させた結果、DNA複製前で組み換えに組み換えの起ることが判明し、また、内在loxp部位で高い頻度で組み換えの起ることが確認された。
Saccharomyces酵母を用いたペルオキシソームタンパク選別輸送の解析

我々はアルカン生育Cardida酵母の細胞内にペルオキシソーム(Ps)が多数発達することを世界で初めて発見し,栄養源である炭素化合物を変えることで,この発達を自在にコントロールできることを明らかにしてきた。このPs局在酵素をコードする遺伝子を単離し解析したところ,酵母のPaタンパクの輸送シグナルとして,最近一部のPs酵素の輸送シグナルであろうと推定されているC末のSKL配列とは異なったいくつかのグループが存在することが予測された。Psへの輸送にいくつかのpathwayや関与するいくつかの因子が考えられることから,より扱い易い系の採用が望まれるが,我々はPsの誘導発達条件の選択が難しかったSaccharomyces酵母でPaの誘導発達条件をすでに見い出した。そこで,この取り扱い易い酵母を用いてCandida酵母のPsタンパクの選択輸送の分子レベルでの解析系,いわゆるPs膜透過輸送のmachinery系を解析する系を確立することを目的とした。本年度得た成果は次のような点である。1.Saccharomyces酵母内の高発現タンパクのコドン選択がCandida酵母のPsタンパンのそれと同じであることから,Candida酵母のPsタンパクをコードする遺伝子(ここでは,イソクエン酸リアーゼ(ICL)を発現させたところ,細胞質可溶タンパクの30%を越える高発現がみられるとともに,Saccharomyces酵母内に発達させたPs内にこのICLタンパクを取り込まることに成功した。これにより,Paの発達の研究に最適のCandida酵母の系を遺伝子解析の容急なSaccharomycesの系とをin vivoでもin vitroでも相互に乗り入れて扱うことができ,今後の研究の大いなる進展の基盤ができた。2.ICLのC末AKVを欠損させた改変ICLタンパクを用いて選別輸送実験を行ったところ,改変タンパクもPsを選別認識することがわかったが,分解を受けやすいところからC末の立体構造への寄与が示唆された。
遺伝子導入による血管内皮細胞制御と虚血性疾患の遺伝子治療への展開

研究計画に基づいて、血管内皮細胞特異的に発現させるためにPAI-1プロモーターの下流にマーカー遺伝子、血管内皮増殖因子遺伝子、抗血栓性因子遺伝子などを搭載したウイルスベクターを作成し実験をおこなった。in vitroで分化誘導し、血管内皮細胞のマーカーを発現するES細胞にレトロウイルスベクターをもちいてGreen Fluorescent Protein(GFP)遺伝子と血管内皮増殖因子を導入した。遺伝子導入したES細胞をSCIDマウスへ移植し生体内においてES細胞由来の細胞による血管新生がおこるかを検討したところ、一部にGFP陽性で、内部に赤血球などの血球細胞を認める管腔構造を確認できた。PAI-1プロモーター、あるいはCytomegalovirus(CMV)プロモーターの下流にLac Z遺伝子、凝固因子遺伝子を搭載したType 1アデノ随伴ウイルス(AAV1)ウイルスベクターを作成し、マウスへ骨格筋に投与し遺伝子発現を検討したところ、CMVプロモーターを用いたときには、骨格筋内に遺伝子産物が検出されたが、PAI-1プロモーターにより遺伝子を発現したときには、骨格筋ではなく、血管内皮細胞のマーカーの一つであるPECAM-1の発現と一致する導入遺伝子の発現が骨格筋周囲にあり、血管内皮細胞に特異的に遺伝子導入を行えたことが確認できた。さらに、マウス血液中にヒト凝固因子遺伝子を導入したときは、ヒト凝固因子がマウス血液中に検出された。さらに、抗血栓性因子遺伝子を搭載したベクターを投与したときには虚血を軽減することが示された。以上の結果から、ウイルスベクターを用いて細胞機能を制御し血管新生、血管病変治療を行いうる可能性が示唆された。血管内皮細胞の機能、増殖を制御することで血管病の遺伝子治療を目指し、血管新生に関わる生理活性物質のVascular endothelial growthfactor(VEGF),Angiopoietin 1(Ang 1),Prostacyclin合成酵素、各遺伝子をAAVベクターへくみこみマウスの骨格筋に投与し血管新生の有無を検討した。AAVベクターでは血清型により臓器、細胞での遺伝子導入発現効率がことなるため、発現効率を各血清型AAVでマーカー遺伝子や凝固第IX因子遺伝子などをもちいて検討すると筋肉で導入遺伝子発現効率はAAV1がもっとも良いことがわかった。そのため、AAV1ベクターへこれらの遺伝子を組み込みマウスの下肢筋肉に投与し、血管新生を比較した。VEGFのみを発現させたマウスでは筋繊維間の血管の増加が認められたが、VEGFとAng1を発現させたマウスでは正常にてみとめられる筋繊維間の毛細血管以外に、束状に特殊な新生血管が形成された。この新生血管は血管内皮細胞のマーカーであるフォンビルブランド因子、VE-Cadherinが陽性の血管内皮細胞の周囲を、壁細胞と思われる細胞がかこんでおり、強固な血管新生と考えられた。また、この新生血管は筋肉内のみならず筋肉外組織にも認められ、新たな血管形成の可能性が示された。VEGF、Ang1に加え、Prostacylin合成酵素を発現させると血管新生はさらに増強しており、種々の血管新生に関わる生理活性因子を発現させることで虚血に対しての遺伝子治療のあらたな可能性が示唆された。in vitroで分化誘導し、血管内皮細胞のマーカーを発現するES細胞にレトロウイルスベクターをもちいてGreen Fluorescent Protein (GFP)遺伝子と血管内皮増殖因子を導入した。PAI-1プロモーター、あるいはCytomegalovirus (CMV)

プロモーターの下流にLac Z遺伝子、凝固因子遺伝子を搭載したType 1アデノ随伴ウイルス(AAV1)ウイルスベクターを作成し、マウスへ骨格筋に投与し遺伝子発現を検討したところ、CMVプロモーターを用いたときには、骨格筋内に遺伝子産物が検出されたが、PAI-1プロモーターにより遺伝子を発現したときには、骨格筋ではなく、血管内皮細胞のマーカーの一つであるPECAM-1の発現と一致する導入遺伝子の発現が骨格筋周囲にあり、血管内皮細胞に特異的に遺伝子導入を行えたことが確認できた。さらに、マウス血液中にヒト凝固因子遺伝子を導入したときは、ヒト凝固因子がマウス血液中に検出された。さらに、抗血栓性因子遺伝子を搭載したベクターを投与したときには虚血を軽減することが示された。以上の結果から、ウイルスベクターを用いて機能遺伝子を導入することで内皮細胞機能を制御し血管新生、血管病変治療を行いうる可能性が示唆された。
小児ウイルス感染症制御に向けてのsiRNAおよびmiRNAによるアプローチ

母乳にはマクロファージ、リンパ球、形質細胞、導管上皮細胞などの細胞成分があり、乳児への感染防御の働きが示唆されている。この細胞成分は、個体あるいは、母体の状態によって割合が大きく異なることが知られている。一方、細胞内には細胞種に特有の、20-25塩基ほどの1本鎖RNAで、他の遺伝子の発現を調節する機能を有するmiRNAが存在する。母乳細胞にどのようなmiRNAが存在し,母体の状態に関連した、診断が可能であるか興味が持たれる。ここでは褥婦の母乳中に存在するmiRNAを調べるために、褥婦の末梢血単核球のmiRNAと母乳細胞のmiRNAを比較することにより母乳中に有意に存在するmiRNAの意義を検討した。母乳および末梢血から細胞を分離し、存在するmiRNAをMicroarrayを用いて調べた。その結果、let-7,miR200,miR30,miR20が母乳細胞で高いシグナルを示し、末梢血単核球に比較して、母乳中で、2倍以上高く発現していることが判った。さらに、これまで組織特異的なmiRNAとして報告されている、miR200、miR107、miR141が高いシグナルを示していることが明らかになった。これらのmiRNAは免疫系の細胞では、発現が低いことが知られており、免疫系以外の母乳細胞由来であることが示唆されている。今後、これらの母乳細胞特異的なmiRNAに着目し、RT-PCR等により、発現の確認を行うと共に、発現量の個体差等を調べることにより、母体の新しい診断法開発の可能性について、検討していく予定である。アデノウイルス2型は呼吸器感染症として知られているが、一方アデノウイルス5型とともにウイルス療法のベクターとして臨床応用するという観点から研究されている。しかし、これらのウイルスはアポトーシスを含む炎症反応を起こすことが知られており、現実的な使用のためには限界がある。そこでここではRNA干渉を利用してアデノウイルス2型によるアポトーシス経路を研究した。small-interfering RNA(siRNA)発現ベクターのライブラリーを用いて、アポトーシスに関わる遺伝子のスクリーニングを行った。そこでMAPKとPKCαの関係、及びこれらのキナーゼがアポトーシスにどのように関わるかを調べた。その結果、MAPKはアデノウイルス感染によりMAPKカスケードを通して活性化されること、アデノウイルスはMAPK familyの代表的なkinaseのひとつであるERKを通してNF-κBを活性化することがわかった。NF-κBの活性化によりサイトカイン産生などの炎症反応が誘導することが知られている。また、PKCαによるアポトーシス経路の活性化にはEPKや他のMAPK経路を介さないことがわかった。