hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
政府間財政関係の政治経済学的分析

また、平成27年度と平成28年度の税制改正にて、地方税である事業税の外形標準課税の税率が引き上げられた。この外形標準課税の拡大がもたらす経済効果について、動学的一般均衡モデルを用いシミュレーション分析を行った。その結果、事業税付加価値割は労働所得を抑制する効果があることを明らかにした。政府間財政関係を、共有資源問題として捉え、理論的分析と計量的分析を連携して行った。理論的分析では、地方政府がリスク回避的な場合には、複数の地方政府による群集行動が生じ、革新的な政策によって促されると期待される経済成長が実現しないことを明らかにした。計量的分析では、日本の市町村の政策決定に群集行動があることが、各種予防接種に対する市町村の助成を計量分析することで確認された。また、国税と地方税が同じ課税標準である点で共有資源と捉え、法人税改革の効果をシミュレーション分析したところ、法人税改革の全体の効果は労働所得を増やすが、地方税の外形標準課税の拡大の効果では労働所得を減らすことを明らかにした。市町村の長期時系列データを用いた動学的分析は順調に行われたが、財政健全化の分析については一般会計・特別会計・普通会計等の会計区分が複雑で、予算と決算のデータが散在しているため、データの整備に時間を要している。さらに、社会保障制度におけるわが国の国と地方の財政関係について、地域医療構想の策定を踏まえた分析の枠組みを構築し、おおむね順調に進捗している。これまでの理論モデル分析から導かれる示唆に基づいて、我が国の国庫補助金制度等、国からの資金援助が抱える問題をより良く再現できるように、前年度に構築したモデルに、地方政府の公共投資に関する意思決定を導入する。このようなモデルの拡張によって、国が共通財源から各地方に予算を配分する制度を有することが、地方による非効率な公共投資に結び付く機序を、より明確に考察することができる。統計の整備が進んでいる都道府県を対象とした分析を先行させて進める。公衆衛生分野での政策決定のあり方の分析については学会発表等を通じてさらに検討を深める。28年度が最終年度であるため、記入しない。財政学平成26年度に構築した基本モデルは完全情報を仮定しているが、平成27年度は基本モデルを修正し、プリンシパル(中央政府)とエージェント(地方政府)の間に情報の非対称性が存在することを想定する。基本モデルを2期間モデルに拡張してエージェントによるシグナリングの効果を分析し、地方政府に革新的な政策を行わせるインセンティブとなるような、地域間財政調整制度を設計することが可能かどうかについて、考察を深める。また、市町村と比較するとサンプルサイズも少なく、統計の整備も進んでいる都道府県に焦点を当てて、引き続き財政健全化の分析に必要なデータの整備に努める。このデータ整備は、地域医療構想の策定、さらには病床再編による医療費適正化が財政面に与える影響を分析する際にも役立つものである。データ収集・入力のためのアルバイト謝金を使用する予定だったが、作業にふさわしいアルバイトを見つけることができなかったため使用できなかった。
hTERT発現制御における新規の治療標的の解明と臨床応用

1.hTERT発現制御遺伝子の新規同定と機能解析肝細胞癌細胞株において、レンチウイルスshRNAライブラリを用いたスクリーニングにより、hTERTプロモータ活性を促進する遺伝子2つ(C15orf55およびC7orf43;計画調書における遺伝子EおよびFに該当)を同定した。これらの遺伝子の、hTERTプロモータ上での機能を調べるために、hTERTプロモータの応答領域を同定しそこより、関連する転写因子の同定を試みた。すると、C15orf55はSP1-binding site(すなわちGC motif)に、C7orf43はETSファミリー(具体的にはGABPAとEGR)の結合領域に応答することが明らかとなった。これより上流を推測するに、C15orf55はSP1のGC motifへのリクルートを活性化することが示唆され、また、C7orf43はHippoシグナル経路のエフェクター因子であるYAP1を活性化することが示唆された。実際に、C15orf55を過剰発現させるとSP1のhTERTプロモータ上への結合が増加した。C7orf43の過剰発現でYAP1の核内移行が促進していた。またsiRNAによりSP1をノックダウンするとC15orf55により、あるいは、YAP1をノックダウンするとC7orf43により引き起こされるhTERTプロモータ活性化がキャンセルされた。すなわち、C15orf55はSP1を介してhTERT転写を促進し、C7orf43はYAP1を介してhTERT転写を促進していることが明らかとなった。2.新規因子C15orf55とC7orf43の臨床的意義と肝細胞癌スクリーニング系の確立研究者の所属施設で取得されたヒト肝細胞癌組織よ遺伝子発現を定量化することで新規因子が予後と関連していることを示した。これらの手法を用いて肝細胞癌の予後不良患者のスクリーニング系を確立した。網羅的スクリーニングにより得られたhTERTプロモータ領域を介してhTERT転写を促進する遺伝子2種(C15orf55およびC7orf43;特許出願等の事由により申請書ではそれぞれ遺伝子E、Fと記載)の機能解析と、臨床検体における発現の確認を行った。機能解析を行た。C15orf55は、hTERTプロモータ上流の-58bpから+36bp間に応答領域が存在した。さらに詳細に検討し、この領域に複数存在するGC motifを介して転写を促進していることを明らかにした。GC motifは転写因子Sp1の結合サイトであるから、C15orf55によるSp1を介したhTERT転写促進が示唆された。実際にSp1阻害剤を用いるとC15orf55によるhTERT発現上昇効果が消失した。ついで検討したC7orf43の応答領域は-169から-58bp間に存在していた。この領域をさらに再分割し検討したところ、C7orf43はERG1結合領域とGAPBA結合領域とを介してhTERTの転写促進していた。文献を参照すると、C7orf43、ERG1およびGABPAに共通するカスケードとしてHippoシグナル経路が明らかとなった。実際にC7orf43過剰発現株においてHippoシグナル経路のエフェクターであるYAPが活性化していることが示された。以上の様に、C15orf55およびC7orf43は各々、別の機構を介してhTERT発現を上昇させることが示された。続いて臨床検体における発現を確認した。いずれの遺伝子も、正常肝臓にくらべHCCにおいて強く発現していた。またHCC患者の背景肝(肝硬変、慢性肝炎)においても発現していることが明らかとなった。これら2種の遺伝子発現とhTERTの発現強度は相関関係にあることが明らかとなった。機能未知の遺伝子を対象に機能解析を行ったが、当初より推定していた機能に近かった。そのため初年度に予定していた実験計画は網羅することが出来た。2.新規因子C15

orf55とC7orf43の臨床的意義と肝細胞癌スクリーニング系の確立研究者の所属施設で取得されたヒト肝細胞癌組織よ遺伝子発現を定量化することで新規因子が予後と関連していることを示した。これらの手法を用いて肝細胞癌の予後不良患者のスクリーニング系を確立した。初年度において遂行不十分であった実験を優先して行う。まず、遺伝子過剰発現株での癌幹細胞性の検討をおこなう。とくにスフェア形成能などの細胞表現型の検討は動物実験に進むうえで非常に重要であると考えられる。続いて、臨床検体の症例数を充実させ、長期予後の検討も行う。さらに、動物実験を行い、遺伝子過剰発現細胞株が、コントロールにくらべ生命予後を短縮する事を確認する。次年度使用繰り越しが生じた理由は、本年度に遂行すべき実験の一部(細胞表現型の確認実験など)を次年度に繰り越し行うためである。全体の使用については、先に述べた実験の消耗品の購入と、研究成果報告のための出張費2回分(日本肝臓学会、日本癌学会)および論文投稿料に充てる予定である。
看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント自己評価尺度の開発

本研究の目的は病棟勤務看護師が行う看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント自己評価尺度を開発することである。本年度は共同研究3年目であり、最終年度である。1年目は質的研究によりタイムマネジメントをする際の思考要素を明らかにし、2年目は抽出された思考要素をもとに、暫定的なタイムマネジメントの調査項目を作成し、プレテストを実施した。また、関連研究も実施した。それらの活動は学術学会において発表した。今期は研究最終年度で、プレテスト結果を踏まえて、作成した調査項目を一般化し尺度化するべき全国調査の準備と実施をした。詳細は次の通りである。1)学会発表:昨年、本研究の関連研究として平成30年度日本看護管理学会学術集会においてテーマ「病棟勤務看護師が認知するタイムマネジメントの阻害要因」を発表した。分析の結果、看護師が困難を感じていた事柄は8カテゴリー21サブカテゴリーが抽出され、本人の努力のみでなく、組織の支援が必要であることを明らかにした。2)全国調査に向けた事前調査:暫定的に作成された質問項目を一般化するための全国調査への協力を得るために、日本の政令都市のうち日本病院協会会員名簿から病床規模300床以上の病院212病院へ調査協力の依頼をした。結果、22病院から承諾が得られた。3)全国調査:平成31年1月に全国調査を開始した。具体的には事前に調査協力が得られた22病院の看護部責任者に調査用紙を郵送し、経験3年以上の看護師30名への調査を依頼した。結果419名の調査用紙が回収された(63.4%)。現在データ入力を終え、今後結果の分析をし、最終的に本研究課題である「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント自己評価尺度の開発」に向けた尺度項目を精選し、公表する予定である。科学研究費助成期間は今年度で終了であるが、尺度の基準作成等の研究を継続していく予定である。本研究の目的は医療機関に働く看護師の看護実践力の向上を意図して、「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント自己評価尺度」を開発することである。共同研究1年目である本年度は予定どおりの活動と、新たに一調査を加えた。行った活動は次のとおりである。1)先行研究で探索したタイムマネジメントの思考要素を関連文献及び理論の検討により枠組みを再検討した。結果、経営学のマネジメントサイクル(PDCA)の活用および「時間管理の原則」「業務の組織化」「組織立てた行動」「リフレクション」の4つの概念枠組みを作成した。2)研究計画の変更(追加)として、調査対象者を増やし(A県の臨地実習指導者講習会受講生、臨床経験3年以上53名)調査用紙への記入を求める留め置き調査を実施した。研究対象者を増やした理由は、先行研究の質的研究において対象者に偏りがあり(脳神経外科看護師)、対象者数も8名と少なかったためそれを補う必要性を認識した為である。3)1)・2)の結果をもとに先行研究の枠組みを再検討した結果、新たに2カテゴリー、10サブカテゴリーが追加され、看護師が行うケア活動における幅広く多様な項目が抽出された。これらの結果から看護師が自らの役割を遂行するために患者や臨床現場の状況に応じて様々な思考をしながらタイムマネジメントを実施していることが判明した。4)データの追加と枠組みの再検討により、「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント思考要素Vr.2」を作成した。5)4)の結果から自己評価尺度の原案となる具体的な質問項目を作成した。作成にあたっては思考要素を具体的な仕事の仕方・進め方として行動や考え方が自己評価できる表現とするよう留意した。次年度の一次調査に繋がるものとなった。研究計画の当該年度の予定通り研究活動を遂行できている。また、追加調査をしたことで研究目的の尺度開発に必要なデータが充足でき、次年度の調査につながる貴重な資料となった。本年度は共同研究2年目であり、行った活動は学会発表、作成された質問項目原案のプレテスト、関連研究の分析及び一次調査である。1)学会発表:昨年、新たに研究対象者を追加して幅広い対象層から得られたデータの追加と枠組みの再検討結果を学会で発表した。具体的には平成29年度第27回日本看護教育学会学術集会において発表し、テーマは「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント思考要素探索」ー思考要素の再検討ー」であった。分析結果を「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント思考要素Vr.2」とした。2)質問項目のプレテスト:初年度に作成された質問項目の原案を、あらかじめ本学心理学教授の指導を受けた。次にリーダー格の看護師5名にプレテストを依頼し、表現の不足及び不明確な部分を2か所修正した。その結果、作成された質問項目原案は8カテゴリー60項目となった3)関連研究:看護師のタイムマネジメントに関連する調査として、初年次調査と同時に行った「タイムマネジメントの計画、及び業務調整において困難なこと」の53名のデータを整理分析し、「病棟勤務看護師が認知するタイムマネジメントの阻害要因」としてまとめた。阻害要因は8カテゴリー21サブカテゴリーが抽出された。結果は平成30年度「日本看護管理学会」で発表予定である。4)一次調査:作成された8カテゴリー60項目の質問項目の妥当性を確認するための調査として、協力が得られた地域中核病院看護師150名に調査を依頼し、データ収集を終了した。現在分析中である。

研究の進捗状況としては概ね良好であるが、当初1年目の計画になかった対象者の数と層を広げたことで、2年目の一次調査の分析がやや遅れている。しかし今後遅れの修正は可能であり、3年目には予定通り全国調査の実施を計画している。本研究の目的は病棟勤務看護師が行う看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント自己評価尺度を開発することである。本年度は共同研究3年目であり、最終年度である。1年目は質的研究によりタイムマネジメントをする際の思考要素を明らかにし、2年目は抽出された思考要素をもとに、暫定的なタイムマネジメントの調査項目を作成し、プレテストを実施した。また、関連研究も実施した。それらの活動は学術学会において発表した。今期は研究最終年度で、プレテスト結果を踏まえて、作成した調査項目を一般化し尺度化するべき全国調査の準備と実施をした。詳細は次の通りである。1)学会発表:昨年、本研究の関連研究として平成30年度日本看護管理学会学術集会においてテーマ「病棟勤務看護師が認知するタイムマネジメントの阻害要因」を発表した。分析の結果、看護師が困難を感じていた事柄は8カテゴリー21サブカテゴリーが抽出され、本人の努力のみでなく、組織の支援が必要であることを明らかにした。2)全国調査に向けた事前調査:暫定的に作成された質問項目を一般化するための全国調査への協力を得るために、日本の政令都市のうち日本病院協会会員名簿から病床規模300床以上の病院212病院へ調査協力の依頼をした。結果、22病院から承諾が得られた。3)全国調査:平成31年1月に全国調査を開始した。具体的には事前に調査協力が得られた22病院の看護部責任者に調査用紙を郵送し、経験3年以上の看護師30名への調査を依頼した。結果419名の調査用紙が回収された(63.4%)。現在データ入力を終え、今後結果の分析をし、最終的に本研究課題である「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント自己評価尺度の開発」に向けた尺度項目を精選し、公表する予定である。科学研究費助成期間は今年度で終了であるが、尺度の基準作成等の研究を継続していく予定である。次年度(平成29年度)の予定は次のようである。1)作成した暫定的な尺度『看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント自己評価尺度」の内容を経験5年以上の病棟勤務スタッフ看護師5名に内容の現実性、妥当性及び表現の明確さの確認を得る。その後、2)プレテストとして一次質問紙調査を実施する。対象者は300床以上の協力が得られる地域中核病院の病棟で働く看護師300名とする得られたデータの統計処理を行い因子構造の検討等を経て尺度作成にとって有用な項目を選定する。3)選定した項目を暫定的な自己評価尺度として完成させ、次年度の本調査に繋ぐ。次年度(平成30年度)の予定は次のようである。1)一次調査において収集したデータの分析をし、暫定的に作成した「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント思考要素」抽出のための質問項目の妥当性を検討する。2)1)の結果を踏まえて全国調査を行い、分析を経て共通する「看護ケア遂行過程におけるタイムマネジメント思考要素」の抽出をする。
葉緑体形質転換に利用するためのアグロバクテリウム菌の改変

葉緑体DNAに外来遺伝子を組込む葉緑体形質転換法は有用タンパク質の高生産に適している。葉緑体形質転換にはパーティクルガンが使用されているが、本研究では一般的な植物の形質転換に使用されているAgrobacterium tumefaciens法で葉緑体形質転換が可能となるようにA tumefaciensのT-DNAを植物の核へと輸送するVIRD2, VIRE2タンパク質を葉緑体へ輸送するように改変した。VIRD2、VIRE2タンパク質の核への局在性を不活化させるために、NLS配列に変異を導入した。これらの遺伝子の推定アミノ酸配列からNLSを比較したところC58株のvirD2遺伝子で明らかにされているbipartite NLSと一致する部位にLBA4404株の遺伝子ではNLSを検出できたが、EHA101株の遺伝子ではC58株でNLSが存在する部分にあるNLSは不完全な形であり、約60アミノ酸上流に完全な形のNLSが存在していた。これらのNLSのコンセンサスアミノ酸配列K(K or R)X(K or R)にPCR法で変異導入し、AAXAのアミノ酸配列となるように改変した。昨年度の研究で、T-DNAを植物の核へ輸送するタンパク質VIRD2、VIRE2の遺伝子をこの3種の菌のTi plasmid DNAからPCR法によってクローニングし、これらのタンパク質の有する核局在化シグナル(NLS)のコンセンサス配列K(K or R)X (K or R)にPCR法により変異を導入しAAXAとなる変異遺伝子を作成した。本年度はこの変異タンパク質の植物細胞内での局在性を確認するために、まずgfp遺伝子をこれらの変異vir遺伝子のC末端側に結合させたレポーター遺伝子を作成した。このレポーター遺伝子をアグロバクテリウム法でタバコBY-2細胞に形質転換した。野生型VIRD2、VIRE2とGFPの融合タンパク質は核に輸送され、変異型のvir遺伝子のレポータータンパク質は細胞質に局在した。現在、サツマイモのポリフェノールオキシダーゼの葉緑体移行シグナル(PTS)をクローニングし、変異型VIRD2、VIRE2タンパク質のN末端側にPTSを融合した融合遺伝子の作成をこれらの変異遺伝子を発現させるために必要なA.tumefaciens virD2、virE2遺伝子欠損株の作成を行っている。
高品位成膜技術による酸化物半導体メモリデバイスの創成とその高性能化

ゾル・ゲル法によるSrTiO_3(以下STO)薄膜の高品位成膜においては、基板にサファイアc面を用い、1400°Cで焼成する条件が最も有効であった。このときSTOはほぼ(111)方向に高度に配向していることをX線回折法(XRD)で確認され、STO薄膜が高品位に成膜されていることがわかった。次に、導電性の発現のためLaやNbをドープしたSTOを前記最適化条件で作製し、その結晶性及び電気的特性の評価を行った。その結果、ドープ量の増加に伴いSTO(111)のXRD反射強度が低下すると伴に配向性も低下し、結晶性が低下していることがわかった。特にNbドープでは1at%以上のドーピングによりその結晶性が大きく低下した。またこの試料について電気的評価を行ったところ、多くの試料において10^<12>Ω・cm程度の極めて高い抵抗率を示したが、Laでは0.5at%、Nbでは1at%の試料のみ10^9Ω・cm台と比較的低い抵抗率を示した。そこで、0.5at%Laドープ及び1at%Nbドープした試料について、2%のH_2雰囲気(N_2バランス)において還元処理しより一層の低抵抗化を図った。その結果、Nbドープの若干の抵抗率の低下が確認されたものの大きな低抵抗化は見られなかったが、一方、Nbドープにおいては抵抗率が10^4Ω・cm台まで低下し、還元処理がSTOの低抵抗化に有効であることを見出した。しかしながら、今回の結果はまだFeFETを作製するには不十分であり、FeFETの作製までは至らなかった。現在、今回の知見をより高品位な成膜手法、例えばMOCVDやPLD、に適用し、STO薄膜を単結晶化することを計画しており、これよりFeFETの高性能化を図ることができると考えられる。今回の成果は、国際会議2件、国内学会1件で発表するとともに、1報の論文を現在投稿中である。酸化物薄膜を用いたメモリデバイス作製を目的として18年度では酸化物薄膜の高品位化開発を行った。成膜方法にはランタンドープチタン酸・ジルコン酸鉛(PLZT)の高品位成膜で実績のあるゾルゲル法を用いた。またメモリデバイスに用いる酸化物導体としてはPLZTチタン酸ストロンチウム(SrTiO3、以下STOと記す)を選択し、そのサファイア基板上への高品位成膜条件を検討した。その結果、PLZTの場合とはなり、700°C程度の結晶化温度ではSTOの結晶化が不十分で、結晶性も低いものとなった。そのため高温対応の焼結炉を用いて1400°Cまでの結晶化温度の検証を行った。その結果、1100°C以上の温度において結晶化が大きく進行し、1300°C以上において良好な結晶化が確認された。こ結晶化を促進するため、サファイアR面上へのSTOのスパッタ作製でシード層として実績のある(CeO2薄をシード層に用いた。しかしながらゾルゲル法による3TO成膜の場合にはシード層による結晶化促進の効果は確認できなかった。現在、PbTiO3など他の酸化物による結晶化促進手法について検討を行っている段階である。一方、STO薄膜の半導体化については、LaならびにNbのドーピングについて検討を行った。現在1300ド以上の焼成条件で良好な結晶化が進行していることを確認しており、これを用いた半導体デバイスの試作検討を進めている段階である。以上のように、18年度においては主にSTO結晶化条件の探索を中心に研究を進めてきた。その結果良好な結晶性を持つ酸化物薄膜の形成に成功した。19年度では本高品位成膜手法をさらに推進するとともに、実際に酸化物半導体を用いた能動素子を作製し、メモリテバイス動作の検証を行う予定である。

しかしながら、今回の結果はまだFeFETを作製するには不十分であり、FeFETの作製までは至らなかった。現在、今回の知見をより高品位な成膜手法、例えばMOCVDやPLD、に適用し、STO薄膜を単結晶化することを計画しており、これよりFeFETの高性能化を図ることができると考えられる。今回の成果は、国際会議2件、国内学会1件で発表するとともに、1報の論文を現在投稿中である。
炭素－酸化シリコン界面の深紫外励起反応に基づく新規二次元マテリアルの創製

電子デバイス応用に向けたグラフェン系材料の大量生産方法として,酸化グラフェン(graphene oxide,GO)を再還元させる手法が盛んに研究されている.われわれはこれまで、172 nmにピーク波長をもつXe2エキシマランプを用いた真空紫外(vacuum ultraviolet,VUV)光照射(以下VUV_Xe)によるGOの還元,構造回復および電気伝導特性向上について報告してきた.しかしVUV_Xe光によって還元したGOには未だ構造欠陥が残存しており,その電気伝導特性は熱や化学還元したGOに比べ23桁低いという問題があった.本課題ではGOのさらなる構造修復のために,ピーク波長を126 nmと160 nmにもつ重水素ランプ(VUV_D2)を用いた光還元を行った.本年度は,VUV_D2光を用いたGOの還元について,調査を行なった.X線光電子分光測定(XPS)およびラマン分光測定の結果より,VUV_Xe光を用いた還元よりもGOを還元,構造修復していることが示された.また,原子間力顕微鏡(AFM)による表面構造分析の結果から,VUV_D2によってGOが還元されるだけではなくSiO2が改質されることが判明した.さらに,電気特性評価の結果,VUV_Xe光還元したGOと比べ,VUV_D2光還元したGOの方が電気伝導率は2桁ほど高い結果となった.この結果は,VUV_D2光による光還元の大きな可能性を示すものである.まずはGOの光還元に対し,XPS,ラマン分光,AFM,および電気測定などを通してVUV_D2光の有効性を十分に示すことができた。これらの結果は今後の研究につながるものであり,研究は順調に推移していると言える.VUV_D2光源は126 nmと160 nmの二つのピーク波長をもつ.そこでまず,どちらの波長の光がGOの還元に有効に働いているのかを明らかにする.また,高分解能STMやAFMなどを用いることで,VUV_D2光還元されたGOの構造や局所物性を明らかにする.加えて,SiO2以外の基板についても実験を行うことで,GO-基板間の光化学反応についても詳細に調査を行う.電子デバイス応用に向けたグラフェン系材料の大量生産方法として,酸化グラフェン(graphene oxide,GO)を再還元させる手法が盛んに研究されている.われわれはこれまで、172 nmにピーク波長をもつXe2エキシマランプを用いた真空紫外(vacuum ultraviolet,VUV)光照射(以下VUV_Xe)によるGOの還元,構造回復および電気伝導特性向上について報告してきた.しかしVUV_Xe光によって還元したGOには未だ構造欠陥が残存しており,その電気伝導特性は熱や化学還元したGOに比べ23桁低いという問題があった.本課題ではGOのさらなる構造修復のために,ピーク波長を126 nmと160 nmにもつ重水素ランプ(VUV_D2)を用いた光還元を行った.本年度は,VUV_D2光を用いたGOの還元について,調査を行なった.X線光電子分光測定(XPS)およびラマン分光測定の結果より,VUV_Xe光を用いた還元よりもGOを還元,構造修復していることが示された.また,原子間力顕微鏡(AFM)による表面構造分析の結果から,VUV_D2によってGOが還元されるだけではなくSiO2が改質されることが判明した.さらに,電気特性評価の結果,VUV_Xe光還元したGOと比べ,VUV_D2光還元したGOの方が電気伝導率は2桁ほど高い結果となった.この結果は,VUV_D2光による光還元の大きな可能性を示すものである.まずはGOの光還元に対し,XPS,ラマン分光,AFM,および電気測定などを通してVUV_D2光の有効性を十分に示すことができた。これらの結果は今後の研究につながるものであり,研究は順調に推移していると言える.VUV_D2光源は126 nmと160 nmの二つのピーク波長をもつ.そこでまず,どちらの波長の光がGOの還元に有効に働いているのかを明らかにする.また,高分解能STMやAFMなどを用いることで,VUV_D2光還元されたGOの構造や局所物性を明らかにする.加えて,SiO2以外の基板についても実験を行うことで,GO-基板間の光化学反応についても詳細に調査を行う.今年度は主に現有装置により研究を遂行できたため、支出額が予定よりも少なくなった。次年度は重水素ランプ光源やキセノンランプ光源などの購入が必要となるため、予算をこれらに当てる計画である。
光合成細菌の分泌するモリブデン酵素のフォルディング中間体の解析

脱窒光合成細菌のペリプラズム局在ノリブデン酵素、dimethyl sulfoxidereductase(DMSOR)のフォルディング機構を調べた。1、まず,in vitroで、精製DMSORを塩酸処理で補欠分子族のモリブデンコファクターをはずし、変性させた後のネイティブ構造へのフォルディングを調べた。変性タンパク質は未変性ゲル電気泳動で2本のバンドに分かれ、1本は完全還元型、もう1本はジスルフィドがランダムに形成されたものであった。この変性DMSORは不安定で、2時間後にはaggregationするせいか電気泳動上では認められなくなった。この系に大腸菌の分子シャペロンであるgroEL,groESを存在させると安定化され電気泳動上で認められた。この安定化作用はペリプラズム画分にも存在した。2、groEL,groES存在下でdithiothreitol(DTT)を添加すると、ランダムに形成したジスルフィド結合は完全還元型へ変換され、かつ、変性DMSORはネイティブ構造へ変換された。3、モリブデンコファクター欠損株から調製したスフェロプラストによって培地中に分泌されたDMSORは、ネイティブ構造とアンフォルド構造の二つが認められたが(J.Bact. 1994)、このアンフォルド構造は完全還元型であり、この分泌系では分子シャペロン様タンパク質も分泌されるせいか、このアンフォルド構造は安定で、groEL,groESを添加しても効果は無かった。4、以上の結果から、ペリプラズムに分子シャペロンと同様の働きをするタンパク質があり、ペリプラズムはジスルフィド結合を形成するために酸化的と考えられているがむしろ還元状態で正しいフォルディングが起こること、細胞膜から分泌されるときのDMSORは完全還元型であることを推定した。
老化に伴う口腔感覚機能の低下と咀嚼能力との関係

口腔の感覚機能評価のひとつである口腔立体認知能(Oral Stereognosis Ability:OSA)について,高齢者を対象に疫学調査を行い,咀嚼機能との関係を検討した.被験者は,研究の参加に同意が得られた高齢者(121名,男性51名,女性70名,平均年齢67.1±4.2歳)である.口腔感覚機能の評価には,口腔立体認知能(OSA)試験を用いた.OSA試験には,6種類(円,楕円,半円,正方形,長方形,正三角形)の形態の試験片を使用した.各試験片は,被験者の視野に入らないように舌背中央に乗せ,図を示した上で直ちに自由に形態を判別させた.試験順序はランダムとし,各形態・寸法の試験片につき,それぞれ2回,合計12回行った.回答は,3段階(正解=2,近い答え=1,不正解=0)で評価し,合計点数をOSAスコア(満点24点)とし,12回の回答に要した時間の総計をOSA時間とした.OSAスコアの平均は18.4(SD:3.8),OSA時間の平均は119(SD:51)秒であった.被験者全体では,OSAスコアならびにOSA時間は性別によって有意な差はみられず,年齢,残存歯数,咬合力,唾液分泌速度ならびに咀嚼能率との間には,有意な相関がみられなかった.しかし,Eichner A群(n=25)では,OSAスコアと咀嚼能率との間には,有意な負の相関(r=-0.465,P=0.019)がみられ,逆にEichner C群(n=15)では,OSAスコアが高いほど,咀嚼能率が高くなる傾向がみられた(r=0.403,P=0.136).今後,被験者数を増やし,更に詳細に検討を加える必要がある.口腔の感覚機能評価のひとつである口腔立体認知能(Oral Stereognosis Ability : OSA)について,高齢者と若年者,高齢有歯顎者と全部床義歯装着者,全部床義歯装着者の義歯装着時と非装着時のそれぞれの間で比較検討を行った.被験者は,研究の参加に同意が得られた全部床義歯装着者(男性8名,女性6名,平均年齢73.9±5.9歳),個性正常有歯顎者(高齢者群:男性7名,女性1名,平均年齢67.1±3.2歳,若年者群:男性7名,女性7名,平均年齢25.9±1.9歳)である.口腔感覚機能の評価には,口腔立体認知能(OSA)試験を用いた.OSA試験に用いた試験片の形態は,6種類(円,楕円,半円,正方形,長方形,正三角形)であり,各形態につき大小2種類の寸法の計12種類の試験片を使用した.各試験片は,被験者の視野に入らないように舌背中央に乗せ,直ちに自由に形態を判別させた.試験順序はランダムとし,各形態・寸法の試験片につき,それぞれ2回,合計24回行った.回答は,3段階(正解=2,近い答え=1,不正解=0)で評価し,合計点数をOSAスコアとし,24回の回答に要した時間の総計をOSA時間とした.統計的分析方法には,一元配置分散分析およびFisher's PLSDを用いた.若年有歯顎者と比較して,高齢有歯顎者のOSAスコアは有意に低く,OSA時間は有意に長かった(p<0.01).一方,高齢有歯顎者と全部床義歯装着者との間に,OSAスコア,OSA時間ともに有意差を認めなかった.また,若年者において,実験床による口蓋の被覆はOSAを低下させたが,全部床義歯装着者において,義歯装着時は非装着時と比較して,OSA時間に有意差を認めなかったものの,OSAスコアは有意に高くなった(p<0.05).以上の結果から,義歯は咀嚼や発音などの機能を回復する役割のほかに,口腔の感覚機能の回復にも寄与することが示された.口腔の感覚機能評価のひとつである口腔立体認知能(Oral Stereognosis Ability:OSA)について,高齢者を対象に疫学調査を行い,咀嚼機能との関係を検討した.被験者は,研究の参加に同意が得られた高齢者(121名,男性51名,女性70名,平均年齢67.1±4.2歳)である.口腔感覚機能の評価には,口腔立体認知能(OSA)試験を用いた.OSA試験には,6種類(円,楕円,半円,正方形,長方形,正三角形)の形態の試験片を使用した.各試験片は,被験者の視野に入らないように舌背中央に乗せ,図を示した上で直ちに自由に形態を判別させた.試験順序はランダムとし,各形態・寸法の試験片につき,それぞれ2回,合計12回行った.回答は,3段階(正解=2,近い答え=1,不正解=0)で評価し,合計点数をOSAスコア(満点24点)とし,12回の回答に要した時間の総計をOSA時間とした.OSAスコアの平均は18.4(SD:3.8),OSA時間の平均は119(SD:51)秒であった.被験者全体では,OSAスコアならびにOSA時間は性別によって有意な差はみられず,年齢,残存歯数,咬合力,唾液分泌速度ならびに咀嚼能率との間には,有意な相関がみられなかった.

しかし,Eichner A群(n=25)では,OSAスコアと咀嚼能率との間には,有意な負の相関(r=-0.465,P=0.019)がみられ,逆にEichner C群(n=15)では,OSAスコアが高いほど,咀嚼能率が高くなる傾向がみられた(r=0.403,P=0.136).今後,被験者数を増やし,更に詳細に検討を加える必要がある.
レーザーアブレーションプラズマを光源とする真空紫外吸収分光計測システムの開発

本研究は,レーザーアブレーションプラズマを光源とする真空紫外吸収分光法により反応性プラズマ中の原子状ラジカル密度を測定する方法を確立することを目的としている。昨年は,アブレーションプラズマの発光スペクトル分布を飛行時間発光分光計測により推定し,その結果を元に永久磁石型ヘリコン波ラジカル源中の窒素ラジカル密度を決定した。本年度は,イメージインテンシファイアつきCCDカメラを用いてアブレーションプラズマの画像計測を行い,発光スペクトル分布を推定した。本年度の実験では,アブレーションターゲットにポリエチレンを採用し,アブレーションプラズマからのH_α発光空間分布をイメージインテンシファイア付のCCDカメラで撮影した。イメージインテンシファイアは50nsの時間幅でゲート動作しており,アブレーション後ある時間経過した後にゲート撮影された発光空間分布を元にアブレーション粒子の運動速度分布を算出できる。その結果から,アブレーションプラズマの発光スペクトル分布を求めた。実験の結果,アブレーションプラズマ中の水素原子の速度分布は空間的に等方的であることがわかり,レーザーアブレーションのメカニズムを解明する観点からも有用な情報が得られた。このようにして発光スペクトル分布が推定されたレーザーアブレーションプラズマを永久磁石型ヘリコン波ラジカル源に取り付けた。ラジカル源で水素プラズマを生成し,得られる水素ラジカルの絶対密度を算出した。真空紫外吸収分光法で信頼性の高いラジカル密度測定を行うには,光源の発光スペクトル分布の評価が最も重要である。本研究により,光源にレーザーアブレーションプラズマを用いれば,光源の発光スペクトル分布が推定可能であり,信頼性の高い測定が可能であることが実証された。本年度は以下の順序で主に実験的検討を行い,当初の計画どおりの成果を得た。本年度は,本研究室で開発中のコンパクト窒素ラジカル源で得られる窒素原子密度を測定の対象とし,光源のアレブレーションプラズマ生成に用いるターゲット材の選定から研究に着手した。樹脂系材料とセラミックス系材料の二つに関して検討したが,AIN(セラミックス)をターゲット材して用いたとき,アブレーションプラズマの真空紫外発光スペクトルには連続スペクトル成分が無く,また発光強度も十分で,光源として適した特性を有することがわかった。次に,飛行時間型(可視)発光分光測定を行い,その結果からアブレーションプラズマの発光スペクトル線型(Line Shape)を評価するモデルを構築した。実験の結果によると,アブレーションプラズマの発光スペクトル線型は雰囲気ガス(Arを使用)の圧力によって制御可能であり,アブレーションプラズマを光源として用いる利点の一つ(可制御性)が実証された。以上の結果を元に,レーザーアブレーションプラズマをコンパクト窒素ラジカル源に取り付け,吸収信号の測定を試みた。結果として,吸収信号は容易に検出され,モデルに基づいて推定した発光スペクトル線形を用いて窒素原子密度の絶対値を算出することに成功した。来年度は,測定された絶対密度の妥当性について検討を行うとともに,他の原子状ラジカル(例えば水素原子)密度測定を試みる予定である。
哺乳類のメス生殖細胞におけるpiRNA/PIWIの機能解析を目指した挑戦的研究

ブタ卵には少なくともPIWIL1とPIWIL2の2種のPIWI m RNAが存在し、これらのタンパク質発現を抑制すると高cAMP濃度で減数分裂が再開されることから、PIWIの卵巣内卵の減数分裂停止への生理的関与が示唆された。このPIWI機能はcyclinBの蓄積抑制を介しており、cyclin B mRNA量および翻訳制御に働くAuroraAやCPEBに変化が無いことからcyclin B分解系のAPC機能への関与が考えられる。本研究では、我々の遺伝情報を後代へ伝える生殖細胞のゲノムが、いかにして寄生遺伝子レトロトランスポゾン(TE)の脅威を免れているかという観点から、オス生殖細の維持に必須であるPIWIのTE抑制機能が、卵でも機能している可能性をブタ卵を用いて探った。マウス卵ではPIWIの多くが存在しないが、RNA解析からブタ卵ではPIWIL1とPIWIL2の2種のmRNAの存在を確認し、予備実験からPIWIL2の抑制が卵の減数分裂を早めるとの示唆を得ていた。そこでこの点を先ず確認してこの結果を確定すると共に、PIWIL1の遺伝子クローニング、発現抑制ベクター構築を行い、PIWIL1の抑制でも卵の減数分裂が正常では起こり得ない早い時間に開始することを見出した。これらの結果から、メスでもPIWIが重要な機能を果たすことを示唆できた。加えてmiRNAや内在性siRNAを介したRNAサイレンシング機構に働くdicerについても遺伝子クローニング、発現抑制を行った結果、PIWIと同様に減数分裂が早期に開始することを明らかとし、これらは互いの機能を補償し合っている可能性も示唆した。以上は減数分裂の開始を促す培養系を用いた実験結果であるが、生体内で減数分裂を停止している状態をin vitroで再現する培養系を用いたところ、PIWIやdicerの抑制で減数分裂が開始してしまうことが示された。このことはTEの抑制が生理的に哺乳類卵の卵巣内での減数分裂停止に寄与していることを示唆しており興味深い。減数分裂の開始は成熟/M期促進因子(MPF)の活性に依存するためMPFサブユニットや、この制御因子の変動を調べることを予定していたが実験の遅れから、これらの解析は未だ十分には進んでいない。しかし、現在までにPIWIやdicerの抑制でCyclin Bの合成が早まるとの予備的な結果を得ている。マウス卵ではPIWIの多くが存在しないが、RNA解析からブタ卵ではPIWIL1とPIWIL2の2種のmRNAが減数分裂過程を通して存在することを確認した。そこでこれらの遺伝子をRT-PCRによりクローニングしRNA合成用のベクターを構築した。PIWIL1およびPIWIL2のアンチセンスRNAをブタ卵に注入し発現を抑制したところ、卵の減数分裂が正常では起こり得ない早い時間に開始することを見出した。加えてmiRNAや内在性siRNAを介したRNAサイレンシング機構に働くDICERについても遺伝子クローニング、発現抑制を行った結果、PIWIと同様に減数分裂が早期に開始することを明らかとし、これらは互いの機能を補償し合っている可能性も示唆した。以上は減数分裂の開始を促す培養系を用いた実験結果であるが、生体内で減数分裂を停止している状態をin vitroで再現する培養系を用いたところ、PIWIやDICERの抑制で減数分裂が開始してしまうことが示された。減数分裂の開始は成熟/M期促進因子(MPF)の活性に依存するためMPFサブユニット、さらにMPFの制御因子の変動を調べたところ、MPF制御サブユニットであるCyclin Bの蓄積が早まることを見出し、これが減数分裂の早期開始や停止解除の原因であると考えられた。PIWIやDICERの抑制によりCyclin Bの蓄積が早まる機構を解明すべくPIWIやDICER抑制時のCyclin B RNA量の変化、Cyclin Bの翻訳に働くAurora A、CPEBの変化を調べたが、これらには変化は見られなかった。したがってCyclin Bの分解が抑制されている可能性があるが、本実験では検討できなかったので、今後はCyclin Bの分解に関与するAPCなどに注目して研究を進める必要がある。またPIWIやDICERの抑制が実際にTE量に変化をもたらしているかをブタのHNE1とLTRトランスポゾンについて半定量RT-PCRで調べたが、今回調べた限りにおいてはTE量に変化は見られなかった。したがってSINEなど今回調べた以外のTEについて検討する必要がある。あるいはTE抑制以外の機構を介している可能性も考えられる。

当初、2ヶ月で修了すると予定していた、PIWIおよびdicerのクローニングとベクター構築のうち、dicerについては問題なく修了したが、PIWIL1、PIWIL2の全長配列およびFlagタグ付きのベクター構築など一部の実験がうまく進まずに時間がかかり、それに伴いその後の解析のスタートが約1.5ヶ月予定より遅くなった。そのため本来は平成23年度で終了する予定の実験が平成24年度へずれ込む結果となり、科研費の期間延長を余儀なくされた。そこで、当初の予定であったこれらの遺伝子の全長配列のクローニングは後回しとし、得られている部分配列を用いた発現抑制実験を中心に研究を進め、研究実績の概要に記したとおり、これらの解析を通して一定の結果を得ることは出来たと考えている。しかし上記の通り、PIWIやdicerの作用機序にまでは迫ることが出来ておらず、本年度の研究目的の達成度の評価としては(3)やや遅れているとした。本年度は、昨年やり残しているPIWIとdicerの作用機序について解析する。具体的には次の2点について検討する予定である。すなわち、(1)PIWIやdicerが実際にTEを抑制することを通して作用しているのか、あるいは全く別の機能を介しているかを、TEの一種であるLTR-TEやLINE1等の配列に対するRT-PCRにより検討すること、(2) PIWIとdicerの抑制によりMPFサブユニットのCyclin B合成時期が早まるという予備的な結果を既に得ているので、この点を確認すると共に、さらに当研究室ではブタ卵の減数分裂過程におけるCyclin B合成にRNA結合因子のCPEBとこれをリン酸化するAurora Aが関与すること、また最近、別のRNA結合因子であるMusashiが関与する可能性を得ているので、PIWIとdicerの機能がこれらを介しているかをウエスタンブロットや免疫染色により解析する。以上の実験を本年度の上半期中に終了する計画である。上記の実験を遂行するための研究材料となるブタ卵は屠場(東京芝浦臓器:品川)より購入した卵巣(1個280円)より採取する。本実験には1000個程度(280,000円)を使用すると見込んでいる。培養機材および解析のための材料費としてブタ卵母細胞の培養、RT-PCR、ウエスタンブロット、免疫染色、酵素活性測定の試薬が、またキットとしてRNA抽出、アンチセンスRNAのin vitro合成、ウエスタンブロットのバンド検出などが必要になる。さらに、ウエスタンブロット、免疫染色のための抗体として、減数分裂の状態を調べるための細胞分裂関連因子、およびタグに用いるFLAGに対する免疫ブロット用、免疫染色用の一次抗体、および検出用の二次抗体が必要である。プラスチック器具はチップ、各種チューブ、培養シャーレ、ろ過滅菌フィルター、注射筒、ポリ手袋等で、多くは使い捨てとせざるを得ず、大量に消費する。これらの物品費として200,910円程度を使用する。昨年度得られた結果に本年度の結果を加えて学術誌に公表することを考えており、投稿料として約50,000円を予定している。以上を合計し残金の530,910円を使用する予定である。
時系列情報から産出規則を抽出する聴覚系のはたらき:鳥類の歌をモデルとした研究

本研究課題の目的は、小鳥をモデルとした時系列情報の聴覚情報処理機構の解明にある。本年度は昨年度得られた電気生理データをもとに、さらにオペラント条件付けを組み合わせた電気生理実験を行った。ジュウシマツ雌個体の聴覚野周辺部での神経活動1:オペラント課題を経験した個体による電気生理実験ジュウシマツなど多くの鳴禽類はオスのみが歌をうたい、メスはこれを聴いてオスの資質を判断する。そのため、歌の受け手であるメスには高次の聴覚認知機構が必要であると考えられてるが、その神経処理機構についてはこれまで十分な研究が行われてこなかった。本研究では、歌弁別に関する行動レベルでの証拠を得るため、オペラント課題をメスのジュウシマツに行わせ聴覚経験を統制した上で、それらの課題で経験した歌がメスの聴覚神経系にどのようなに表現されているかを電気生理に手法を用い、神経レベルでの実在を追求した。その結果、8羽のジュウシマツのメス全てにおいて、異なる2羽のオスの歌を弁別でき、さらにこれら雌個体の聴覚野局辺領域(field Lとそこから入力を受けるcHV領域)に聴覚経験のあったオスの歌に対して選択的に反応するニューロン群が形成されていることを電気生理実験により確認した。さらに、オペラント課題では餌による強化が行われたGO刺激の歌と餌がもらえないNOGO刺激の二つの歌を同数聴かせていたのであるが、聴覚野の中でも特にL2b領域とcHV領域においてGO刺激に対してより強く反応する領域のあることがニューロンの発火傾向から証明された。本実験により、雌の聴覚野では聴覚経験のある雄の歌を小鳥の聴覚野の経路の中でも最も求心性の領域にあるこの二つの領域において、神経細胞の応答特性としてコーディングしていることが示された。ジュウシマツ雌個体の聴覚野周辺部での神経活動2:オスと同居させた個体を用いた電気生理実験約1ヶ月間にわたり、特定のオス個体と同居させ、聴覚経験を統制したメス個体を用い、上記と同様の聴覚野および周辺部での電気生理実験を行った。その結果、オペラント経験個体のときと同様L2bおよびcHV領域において、同居オスの歌に対して強い選択性反応を示すニューロン群が形成されていることが確かめられた。さらに、この実験ではオスの歌に含まれる音素の時間順序を変えてしまうと、その選択性反応が消失することから、これらの領域において時間組み合わせ選択性ニューロンの形成が確認された。
キラルメタボロミクスによる疾病バイオマーカーの探索

本年度は前年度のアルツハイマー病患者脳脊髄液におけるキラルメタボロミクスにより得られた、バイオマーカー候補の構造同定、及び液体クロマトグラフィー-三連四重極タンデム質量分析計による定量分析法の再構築を通じた性能評価について検討を行った。まず初めに抽出されたバイオマーカー候補の試薬誘導体に関して、精密質量、MS/MSフラグメント、保持時間の情報を精査し構造を同定することを目指した。結果、およそ半数のピークについて構造を一義的に決定できた。加えて以前の研究で開発したキラル抽出法を適用することで取得された、光学異性体可能性の情報も併せ、構造中の不斉炭素の有無を判定でき精密な同定が可能であることが明らかとなった。アルツハイマー病患者試料について、半数もの有意変動ピーク由来代謝物を決定された事は、前年度開発したキラルメタボロミクスの有用性を補強した。さらに、代謝物構造の決定を自動化するソフトウェアの開発にも成功した。ただしPCスペックに依存した解析速度の違いも観察されたため、汎用化していくためには速度を考慮したアルゴリズム・プログラムを構築する必要がある。構造決定された代謝物の内、バイオマーカーとして特に高い性能を示し、かつ過去の研究から精神疾患との関与が考えられているKynurenineの関連代謝物について標準品を用いた定量分析を実施した。前者では有意変動しているピークがD-Kynurenineであることを新たに見出した。さらに近年、再度注目されているD-アミノ酸酸化酵素が、活性変動している可能性も示唆された。またGlyceric acidという代謝物に関しても光学異性体分析法を構築し、検体群間で比較を行ったところ、L体において非常に高い有意差を検出した。本代謝物異性体について、対象疾患における分離分析事例は初であり、バイオマーカーとして有望だと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。不斉炭素を有する生体内低分子代謝物はその異性体間で、異なる生理活性や疾患時の濃度変動を示すことが知られており、新たなるバイオマーカー候補として注目されている。一方で、このような異性体を網羅的に分析する、いわゆるキラルメタボロミクスは分離、検出感度の問題から困難であり、一部の標的分子についてのみしか行われていない。そこで本研究では、キラル誘導体化LC-MS/MS測定法に基づく官能基特異的なノンターゲットキラルメタボロミクス及び統計的キラル抽出法を開発することを目的とした。29年度の研究では、目的を達成する上で不可欠となる誘導体化試薬の開発に注力した。具体的には、カルボン酸、アミン標的試薬について、その立体配置のみを反転させた統計的キラル抽出法用試薬、13Cあるいは重水素による安定同位体標識試薬の開発を完了した。なお、これらの合成品に関しては先行研究で開発した試薬同様の確認試験を実施し、誘導体化に伴う測定妨害がないことを確認済みである。続く研究では、提唱したキラルメタボロミクスが生体試料分析に応用可能か評価した。具体的には、血清をモデルとして、キラル化合物のDL比を作為的に変えた溶液を添加し、このサンプルに本法を実施した際、その変動を検出可能か確かめた。結果、その総量は変わらないにも関わらず、多変量解析によってキラル化合物のDL比変化に応じて検出が可能であった。さらに、統計的キラル抽出法についても検討を行った。本法は、光学配置のみを反転させた一対のRS反転試薬を併用し、キラル化合物のみが溶出位置反転を生じることを利用した、キラル・アキラルの判別法である。モデルとしてキラル化合物のL体のみをプール血清に添加し、これらのみを検出可能か評価した。その結果、添加したL化合物のみを検出可能であった。以上から、提唱した官能基特異的キラルメタボロミクス及び統計的キラル抽出法の有用性が示された。本年度、実施計画として制定した各標的キラル誘導体化試薬の開発を完了した。また、そのほかの標的試薬も現在開発中であり、良好に進展している。さらに、提唱したキラルメタボロミクスの方法論が生体試料分析に応用可能であることも証明し、今後のキラル代謝物分析における有用な方法を開発できたといえる。さらに、統計的キラル抽出法についても提唱、評価を行うことが出来た。以上から、当初の計画通りおおむね順調に進展していると考えられる。我々が先に開発した三連四重極型質量分析に従うキラルメタボロミクスは,特に低強度なピーク領域の変動を正確にとらえる事,得られるm/zの確度が低く,誘導体のm/zから代謝物本体の構造を推定する事が困難であった.本年度の研究ではこれらの点を解決すべく,開発した安定同位体導入試薬と,LC-Qtof-MSのデータ依存型MS/MS分析の適用を考え検討を行った.本法では各試料を通常の誘導体化試薬で,プール試料を標識体で誘導体化し混合したものを測定する.これにより,安定同位体標識の内標準物質が全測定存対象について存在するかのような測定が実現され,マトリックス効果等の測定誤差を低減した高精度な比較解析が可能となる.同時にMS/MSスペクトルが取得可能なため,その情報から構造同定を進めることが出来,マーカー探索の効率化につながる.本法の有用性を検証する目的で,キラル化合物標準品のD/L比を,0/100-2/100と微量に変化させた溶液のヒトプール血清添加試料を分析した.主成分分析の結果,変動は極めて微量にも関わらず,その差異を明確に認識した.

さらに,多種の解析対象ピークの中から,添加した微量D-エナンチオマーのみを変動化合物として抽出可能であった.従って本法は,キラルな代謝物の網羅的解析に高い有用性を示すことが明らかとなった.続いて,キラル化合物に関する知見がほとんどないアルツハイマー病患者の脳脊髄液解析に本法を応用した.健常者の試料と比べ大きな差はみられなかったが,30種程度のマーカー候補を発見でき,約半数がキラルな化合物の候補であることが示唆された.このことも本法の有用性を補強した.結果が示唆する通り,生体内には多数のキラルな代謝マーカー候補が存在するため,多領域において分析は必須となると考えられる.その意味で今回開発した方法が,マーカー探索研究を推進する強力なツールとなる事が期待できる.本年度実施計画として制定した安定同位体導入誘導体化を併用するキラルメタボロミクスの開発と検証を完了することが出来た.同時に,本法を用いてアルツハイマー病患者試料のバイオマーカー探索を行うことで,数十種の候補代謝物をピックアップすることに成功した.さらに,この内キラル化合物候補が何種あるかも明らかとすることが出来た.これらの結果は本法のキラルメタボロミクスにおける高い有用性を示唆するものであり,今後のキラル代謝物研究を推進する技術であると言える.またチオール検出用試薬についても合成を完了させ検討段階に入っている.以上から当初の計画通りおおむね順調に進展していると考えられる.本年度は前年度のアルツハイマー病患者脳脊髄液におけるキラルメタボロミクスにより得られた、バイオマーカー候補の構造同定、及び液体クロマトグラフィー-三連四重極タンデム質量分析計による定量分析法の再構築を通じた性能評価について検討を行った。まず初めに抽出されたバイオマーカー候補の試薬誘導体に関して、精密質量、MS/MSフラグメント、保持時間の情報を精査し構造を同定することを目指した。結果、およそ半数のピークについて構造を一義的に決定できた。加えて以前の研究で開発したキラル抽出法を適用することで取得された、光学異性体可能性の情報も併せ、構造中の不斉炭素の有無を判定でき精密な同定が可能であることが明らかとなった。アルツハイマー病患者試料について、半数もの有意変動ピーク由来代謝物を決定された事は、前年度開発したキラルメタボロミクスの有用性を補強した。さらに、代謝物構造の決定を自動化するソフトウェアの開発にも成功した。ただしPCスペックに依存した解析速度の違いも観察されたため、汎用化していくためには速度を考慮したアルゴリズム・プログラムを構築する必要がある。構造決定された代謝物の内、バイオマーカーとして特に高い性能を示し、かつ過去の研究から精神疾患との関与が考えられているKynurenineの関連代謝物について標準品を用いた定量分析を実施した。前者では有意変動しているピークがD-Kynurenineであることを新たに見出した。さらに近年、再度注目されているD-アミノ酸酸化酵素が、活性変動している可能性も示唆された。またGlyceric acidという代謝物に関しても光学異性体分析法を構築し、検体群間で比較を行ったところ、L体において非常に高い有意差を検出した。本代謝物異性体について、対象疾患における分離分析事例は初であり、バイオマーカーとして有望だと考えられる。