hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属ホウ化物中間相を利用した粉末冶金的手法による熱電ホウ素化合物の開発

本研究課題は、反応ホウ化焼結法を利用した粉末冶金的手法を通してホウ素系材料を作製し、添加元素に伴うホウ素との共晶現象ならびに金属-ホウ素中間相を利用した材料相組織構造制御および熱電特性の高性能化に取り組む。本年度は添加金属の選定ならびに金属ホウ化反応の制御を中心に実施した。また、炭化ホウ素系材料においては、炭素ホウ素の組成比と添加金属量ならびにホウ化機構について実施した。炭化ホウ素系材料においては、ホウ素と共晶反応が生じるMn, Fe, Co, Niを中心に金属ならびに金属ホウ化物を添加し、放電プラズマ焼結を利用して焼結体を作製した。X線回折ならびに走査型電子顕微鏡(SEM)の他に、押し込み硬さ試験(ビッカース硬さ試験等)を用いて、焼結体の評価を行った。また、ゼーベック係数ならびに電気伝導率の測定を行い、熱電特性の評価を行った。金属添加に伴い、試料の相対密度も増加し、NiやMnを添加した試料においては、相対密度が95%を超える試料も作製された。ビッカース硬さにおいても、金属ホウ化物中間相が存在しているにも関わらず3000HV2を超える試料もあり、高強度高密度な炭化ホウ素焼結体の作製に成功した。またMn添加試料においては、共晶液相から起因したと推察される微細な層状組織も観察された。更に高分解能SEMを用いた組織分析ならびに元素分析を進めるとともに、熱伝導率の測定も行っていく予定である.金属アルミノボライド(MAlB14型化合物)においては、ZrやSi等の元素添加を実施した。Si添加に関して、微量な添加にも関わらず、室温近傍から500度近傍にかけて、電気伝導率が大幅に向上した。金属アルミノボライド中へのSiの拡散固溶は見られなかったが、電気伝導率が大幅に増加したため、SiへのBの固溶状態等、現在その原因を調査中である。炭化ホウ素系材料において、これまでに、金属ホウ素系中間相を利用することで、放電プラズマ焼結時の温度の低減に成功し、低い焼結温度にも関わらず、高密度かつ高硬度な炭化ホウ素焼結体の作製に成功した。また、炭化ホウ素は広い組成域を有し、ホウ素含有量が増加するにつれて難焼結性が増すが、ホウ素含有量の多い領域も同様に金属や金属ホウ化物を用いた焼結を実施した。得られた焼結体の相組織観察ならびに硬さ試験を行い、炭化ホウ素の生成過程と金属ホウ化物中間相の影響について調査を行なっており、金属ホウ化物の添加量、共晶液相の生成温度を加味することで、ホウ素含有量の多い領域においても緻密な焼結体が得られた。また、一部の添加金属においては、サブミクロンサイズの微細な組織状態を有する試料も得られており、熱伝導率の低減が期待できる結果が得られている。金属アルミノボライドに関しても、複数の金属ならびに金属ホウ化物の添加を行い、焼結体を作製した。Si添加試料において、高温域(700度以上)においては性能に差はなかったものの、100度200度の領域においては電気伝導率が0.1(S/m)から10100(S/m)へと大幅に向上した。Siとのコンポジット化によるものと推察しているが、Siへのホウ素の固溶状態を含めて、材料の複合化と伝導に関して調査中である。引き続き、金属ホウ化物を中間相として利用したホウ素系熱電材料の作製を実施する。炭化ホウ素系材料については、添加した金属ホウ化物によってサブミクロンスケールの微細な層状組織が観察された。微細組織の発生要因を調べるために、様々な焼結条件にて試料の焼結を行い、相組織観察を行っていく。また、熱電特性に関しても微細向上の導入に伴う格子散乱の向上が見込まれるため、電気伝導率ならびにゼーベック係数での評価に加え、熱伝導率の評価も行っていく予定である。また、炭化ホウ素合成時における金属のホウ化反応において、焼結条件と相状態の知見が得られたため、メカニカルミリング等を用いて金属ホウ化物の分散状態を変更し、相組織状態の制御を試みていく。金属アルミノボライドにおいては、金属ホウ化物中間相の導入に加え、新たな金属の導入ならびに物質の熱分解を利用したホウ素系中間相の生成ならびに組織の微細化を試みていく。中間相の存在が熱電特性に大きく影響を与えることから、これまでに作製した金属ホウ化物中間相を導入したホウ素系材料において、高温下における構造安定性や中間相の熱安定性の評価を行う。

金属添加に伴い、試料の相対密度も増加し、NiやMnを添加した試料においては、相対密度が95%を超える試料も作製された。ビッカース硬さにおいても、金属ホウ化物中間相が存在しているにも関わらず3000HV2を超える試料もあり、高強度高密度な炭化ホウ素焼結体の作製に成功した。またMn添加試料においては、共晶液相から起因したと推察される微細な層状組織も観察された。更に高分解能SEMを用いた組織分析ならびに元素分析を進めるとともに、熱伝導率の測定も行っていく予定である.金属アルミノボライド(MAlB14型化合物)においては、ZrやSi等の元素添加を実施した。Si添加に関して、微量な添加にも関わらず、室温近傍から500度近傍にかけて、電気伝導率が大幅に向上した。金属アルミノボライド中へのSiの拡散固溶は見られなかったが、電気伝導率が大幅に増加したため、SiへのBの固溶状態等、現在その原因を調査中である。炭化ホウ素系材料において、これまでに、金属ホウ素系中間相を利用することで、放電プラズマ焼結時の温度の低減に成功し、低い焼結温度にも関わらず、高密度かつ高硬度な炭化ホウ素焼結体の作製に成功した。また、炭化ホウ素は広い組成域を有し、ホウ素含有量が増加するにつれて難焼結性が増すが、ホウ素含有量の多い領域も同様に金属や金属ホウ化物を用いた焼結を実施した。得られた焼結体の相組織観察ならびに硬さ試験を行い、炭化ホウ素の生成過程と金属ホウ化物中間相の影響について調査を行なっており、金属ホウ化物の添加量、共晶液相の生成温度を加味することで、ホウ素含有量の多い領域においても緻密な焼結体が得られた。また、一部の添加金属においては、サブミクロンサイズの微細な組織状態を有する試料も得られており、熱伝導率の低減が期待できる結果が得られている。金属アルミノボライドに関しても、複数の金属ならびに金属ホウ化物の添加を行い、焼結体を作製した。Si添加試料において、高温域(700度以上)においては性能に差はなかったものの、100度200度の領域においては電気伝導率が0.1(S/m)から10100(S/m)へと大幅に向上した。Siとのコンポジット化によるものと推察しているが、Siへのホウ素の固溶状態を含めて、材料の複合化と伝導に関して調査中である。引き続き、金属ホウ化物を中間相として利用したホウ素系熱電材料の作製を実施する。炭化ホウ素系材料については、添加した金属ホウ化物によってサブミクロンスケールの微細な層状組織が観察された。微細組織の発生要因を調べるために、様々な焼結条件にて試料の焼結を行い、相組織観察を行っていく。また、熱電特性に関しても微細向上の導入に伴う格子散乱の向上が見込まれるため、電気伝導率ならびにゼーベック係数での評価に加え、熱伝導率の評価も行っていく予定である。また、炭化ホウ素合成時における金属のホウ化反応において、焼結条件と相状態の知見が得られたため、メカニカルミリング等を用いて金属ホウ化物の分散状態を変更し、相組織状態の制御を試みていく。金属アルミノボライドにおいては、金属ホウ化物中間相の導入に加え、新たな金属の導入ならびに物質の熱分解を利用したホウ素系中間相の生成ならびに組織の微細化を試みていく。中間相の存在が熱電特性に大きく影響を与えることから、これまでに作製した金属ホウ化物中間相を導入したホウ素系材料において、高温下における構造安定性や中間相の熱安定性の評価を行う。
垂直細孔配列メソ多孔体膜付着グラフェンナノ複合体／複合膜の創製

本研究者らは高い電気伝導性を持つグラフェン表面に規則構造性メソ細孔シリカが垂直に配向成長した高電導・不導体ナノ接合体の創製に成功したが、その生成機構は未解明である。本研究では、グラフェン酸化物、界面活性剤、無機酸化物源の三元分散系における自己組織化メカニズムを、合成条件による複合構造の変化や界面ミセル構造についての直接解析から解明して、サンドイッチ複合構造の厚みとポアサイズを制御した垂直細孔配列メソ多孔体・グラフェン複合体・膜の合成法を探索した。今年度において主に研究項目「合成手法の確立」に従事した。この研究項目においてメソポアのサイズ制御、PMS膜の厚み制御などを主たる目標とした。長鎖アルキル四級アンモニウム界面活性剤の鎖長を変化する(アルキル基の炭素数を変化する)ことによりメソポアのサイズ制御が可能であることが明らかとなった。反応温度、時間、組成比などの諸条件の中、反応時間が主にPMS膜の厚みに影響を与え、反応温度が3時間から1週間を変えることにより、膜厚が12nmから40nmまで制御可能であることが分かった。このように複合体の構造解析と共に垂直ポア配列が実現できる最適条件を探り出すことができるようになった。これまでは(当研究の開始する前に)高い電気伝導性を持つグラファイト(G)表面に規則性構造メソ細孔シリカ(PMS)が垂直に配向成長した高電導・不導体ナノ接合体の創製に成功したが、その生成機構が未解明のために、今年度において主に形成メカニズムに関する研究を遂行した。グラファイト酸化物(GO)に異なる温度で水熱処理を施し、異なる表面状態を制御した前駆体を得た。GOの表面状態の変化をUV-Vis、FT-IR、XPSなどの分析手段を駆使して解明すると同時に、PMSとの複合体の構造との関係を調べた。その結果、高温で処理するほど、次第に垂直配列ポア構造が失われ、代わりにGOの表面にメソポーラスシリカナノ粒子が大量に沈着した。このように垂直配列ポア構造が炭素層の表面状態と密接関係することが分かった。溶液in-situ小角X線散乱法を用いて、GO分散系と界面活性剤の混合系の構造を調べた結果、シリカ源(TEOS)を加える前に、すでに界面活性剤の集合体構造ができていることをはっきりと確認した。このことから、垂直配列ポア構造が吸着界面活性剤のミセル構造を鋳型に形成している可能性を示唆した。昨年度において長鎖アルキル四級アンモニウム界面活性剤の鎖長を変化することによりメソポアのサイズ制御が可能であることが分かったが、本年度において昨年度の結果を鑑みてポアサイズ制御の最適条件を精査する上で、研究項目「膜形成手法の確立」を試みた。C8C18の鎖長である界面活性剤をそれぞれ合成に用いると、いずれの場合でも最適条件下において比表面積1000m2/g前後のサンドイッチ型複合構造体が得られ、ポアサイズが2.2-4.8nmの間で調節可能であることに成功した。しかし、C12以上の鎖長の場合、ポア垂直配向する、従来のメソポラースシリカ・グラフェンサンドイッチ複合構造が得られるのに対し、C8、C10など鎖長が短いと鎖長が短くなるにつれ、グラフェン表面にメソポーラスシリカのナノ粒子がたくさん載るような構造がだんだん増えてきた。合成溶液中にあるGOナノ粒子の表面電位測定から、この複合構造の違いがGOの表面に界面活性剤集合体形成の容易さに関係していると結論した。一方、「膜形成手法の確立」に関しては、種々の方法と条件を精査した結果、クエン酸などの有機スペーシスとの混合スラーリ系を用いればスピンコート法やドクターブレード法で成膜可能であることが分かった。膜の電気伝導度測定から、単独な複合体粒子より成膜したものが充分な電気伝導性を示すことが困難であり、有意な電気伝導性を与えるのにはグラフェン成分と更なる混ざり合いが必要であることが明らかとなった。混合比率など種々の成膜条件を最適化し、得られた複合膜のセンシング効果を試みることができた。吸着、ナノ材料、触媒他の研究エーフォートと兼ねて研究活動を進行しているが、当該研究について計画通りに実施できた。ほぼ当初の計画通りに進行しているが、液相AFM観察など、外国研究者との協力研究の内容は時間調整の都合上来年度に実施することとした。平成26年度において去年度研究成果を鑑みてポアサイズ制御の最適条件を更に確定する上で、研究項目「膜形成手法の確立」を推進する。異なる鎖長の界面活性剤の混合ミセルを適用することによりメソポアサイズを制御する。膜形成手法の確立として、まずは基板上にグラフェン層の被覆膜を作れるように、スピンコーテイングなどの手法を検討する。ここで、異なるタイプの基板を用い、基板の前処理条件、GOの溶液濃度などを検討し、基板上に広範囲にわたり均一に膜形成できる最適条件を決定する。

また、GO溶液濃度や反復コーテイングなどの方法によりGOの厚みを制御する。次いで、グラフェンコーテイング基板上に界面活性剤と有機シリカ源の混合溶液を滴下し、直接スピニング、板挟み成長法を適用して、或いは基板を粉末合成溶液中に浸入することにより、グラフェン上に垂直ポア配列PMM膜を成長させる。ここでも組成比や反応温度・時間などを検討し最適な条件を探る。また、得られたグラフェン・垂直ポア配列PMM複合膜の電気伝導性などの物性解析も行う。平成25年度において主に研究項目「合成手法の確立」を従事する。この研究項目においてメソポアのサイズ制御、PMM膜の厚み制御及びシリカ以外の酸化物複合体の適用をテーマとした。メソポアのサイズ制御は長鎖アルキル四級アンモニウム界面活性剤の鎖長を変化する(アルキル基の炭素数を8から18に変化)ことにより行う。界面活性剤が変化するとGO表面上の吸着ミセル構造や形成条件も変化すると予想されるため、垂直ポア配列が実現できるような最適条件を探り出すように努める。PMM膜の厚みは反応温度、時間、組成比などと関係するため、これらの条件を検討し、複合体の構造解析と共に、PMM膜の厚みが調節可能な条件を探索する。また、このような合成手法を確立すると共にチタニア、マンガン酸化物など、他の酸化物複合体への合成手法の適用も検討する。平成26年度のおいて主に研究項目「膜形成手法の確立」を従事する。この研究項目において、まずは基板上にグラフェン層の被覆膜を作れるように、スピンコーテイングやデイップコーテイングなどの手法により検討を行う。ここで、異なるタイプの基板を用い、基板の前処理条件、GOの溶液濃度などを検討し、基板上に広範囲にわたり均一に膜形成できる最適条件を決定する。雇用予定の研究補助員の雇用費用の大部分は他の予算で賄うことができたために、次年度使用額が生じた。研究協力員の雇用費用、解析装置の作製・改修費用、構造解析ソフトウエアの購入費用などに使用する計画次年度がマンパワーを増強することを計画しており、次年度使用枠はそのための研究補助員の雇用費用に使用する予定である。
野球の投球ボールの回転と手指運動の同時精密測定

野球の投手が投じるボールの回転は投球のパフォーマンスに大きく影響すると考えられるが,これを決定する身体動作は明らかになっていない.そこで申請者は高速度ビデオカメラを用いて手,指の動作とボール回転を同時に測定するシステムを開発し,手,指の動きとボール回転との関係,ボールの"ノビ"を表す物理的性質について検討した.その結果,リリース直前に指の動作は,直球の回転速度に強く影響することが分かった.また“ノビ"が良いとされる投手の投じる直球は回転速度が高く,回転軸角度が純粋なバックスピンに近いものであった.野球の投手が投じるボールの回転は投球のパフォーマンスに大きく影響すると考えられるが,これを決定する身体動作は明らかになっていない.そこで申請者は高速度ビデオカメラを用いて手,指の動作とボール回転を同時に測定するシステムを開発し,手,指の動きとボール回転との関係,ボールの"ノビ"を表す物理的性質について検討した.その結果,リリース直前に指の動作は,直球の回転速度に強く影響することが分かった.また“ノビ"が良いとされる投手の投じる直球は回転速度が高く,回転軸角度が純粋なバックスピンに近いものであった.野球の投手が投ずるボールの回転は投球のパフォーマンスに大きく影響するが,測定の難しさから解析はほとんど進んでいない.最近申請者はボールの回転数,回転軸方向を算出する測定系を開発し,その有効性を確認した.一方,ボールの回転はボールリリース直前の手,指の動きによって決まると考えられる.特に指の動きは重要だが,指の動きは素早く,通常のビデオ映像では細かい動きはとらえられない.本年度は、すでに開発したボール回転速度・軸角度の解析方法を用い、大学生野球投手のフォーシームストレート(以下ストレート)における飛翔軌道と回転速度・軸角度の関係を明らかにする。また、回転軸に対する縫い目の通り方がストレートと異なるツーシームストレート(以下ツーシーム)と、普段とは異なるプロ野球公認球でのストレート(以下「プロストレート」)も同時に検証し、縫い目の向きやボールの違いとの関係も明らかにする。大学現役硬式野球部員投手7名を被験者に1球種あたり3球ずつ投げさせ、その様子を4台のハイスピードカメラにより撮影した。この映像から、動作解析ソフト(Frame-DIASIV)を用い飛翔軌道の3次元座標値を算出し、初速度や投射角度、そこから予想される軌道と実際の軌道を算出し、その到達点差ΔX・ΔZを算出した。また回転速度と回転軸角度θ(仰角)、φ(方位角)を求め、そこからSpとその垂直方向(Spver)、水平方向への成分(Sphor)を算出した。全投球において、θとΔZに負の相関関係が認められ、またSpverとΔZについても正の相関関係が認められた。同様にφと血、SphorとΔXにも、正の相関関係が認められた。またツーシームも、ストレートと同様に有意な相関が認められたものの、縫い目に関する特異な結果は認められなかった。「プロストレート」にはストレートとの明確な違いは見られなかった。野球の投手が投ずるボールの回転は投球のパフォーマンスに大きく影響するが,測定の難しさから解析はほとんど進んでいない.最近申請者はボールの回転数,回転軸方向を算出する測定系を開発し,その有効性を確認した.一方,ボールの回転はボールリリース直前の手,指の動きによって決まると考えられる.特に指の動きは重要だが,指の動きは素早く,通常のビデオ映像では細かい動きはとらえられない.そこで,申請者は高速ビデオを3台用いて手,指の動きをミリメートル単位,ミリ秒単位の精度で測定するシステムを開発中である.本研究ではこのシステムを完成させるとともに,1)手,指の動きがどのようにボールの回転速度,回転軸に影響するか?,2)ボールの"キレ","ノビ","重い・軽い"といった表現は実際にはどのような物理的性質を表すか?,の2つの問題を検討する.プロ野球、大学野球の投手15人が直球を投げるときのボールの回転、回転軸方向、スピード、指・手の動きを測定した。その結果、直球のスピードとボールの回転数には相関が認められた。しかし、同じスピードでも回転数には個人差がある。さらに回転軸の方向が個人で大きく異なる結果が得られた。"キレ"がよいといわれている投手では1)スピードが速いばかりでなく、2)回転数が高い、さらに3)地面に平行、またボールの進行方向に垂直に近い回転軸の向きを有していた。これらはいずれもボールを上向きに動かす力を生ずる。また回転数の高いピッチャーほど、バックスピンの回転を与える時間が長かった。
キラルポリラジカルの合成と光磁気機能

本研究では、ポリラジカルとキラルポリマーを組み合わせた、新物質系としてのキラルポリラジカルの合成法、物性および機能について探索することを目的としている。具体的には、以下の手順で実施している。(1)置換アセチレンモノマーを中心に、モノマーの合成手順および重合法を検討することで、キラルポリラジカルの合成法を確立する。(2)キラルポリラジカルの磁気的性質、光学的性質および磁気光学効果について知見を得る。本年度は、t-ブチルニトロキシドおよびフェニルガルビノキシル残基を有するフェニルアセチレンモノマーについてキラル触媒を用いたらせん選択重合を実施し、キラルポリラジカルの合成法およびその誘導体の諸物性について以下のように基礎的な知見を得た(1)t-ブチルニトロキシド残基を有するキラルポリラジカルの合成と性質メタ位にt-ブチルヒドロキシアミノ基およびヒドロキシメチル基を有する置換アセチレンモノマーを合成し、これを光学活性なフェニルエチルアミン存在下ロジウム錯体触媒で重合して光学活性ならせん構造を有する置換ポリアセチレンを合成した。このポリマーを二酸化鉛で酸化することで対応するポリラジカルが得られた。ESRから算出したスピン濃度は0.20spin/unit程度であったが、室温下の溶液で1日以上安定であり、CDスペクトルも酸化前後でほぼ変わらぬ強度でコットン効果が認められた。(2)キラル触媒を用いたヒドロガルビノキシル置換ポリ(フェニルアセチレン)の合成とらせん安定性光学活性なフェニルエチルアミンを溶媒兼助触媒とし、(4-エチニルフェニル)ヒドロガルビノキシルをロジウム錯体触媒で重合した。CDスペクトルからは、配位子のノルボルナジエンをシクロオクタジエンに変えるだけで、得られるポリマーのらせん方向が反転することが明らかとなった。また、得られたポリマーのCDおよび紫外可視吸収はサーモクロミズムおよびソルバトクロミズムを示すことを、左右のらせん構造の生成エネルギーが等しいポリマーで初めて明らかにした。(1)置換アセチレンモノマーを中心に、モノマーの合成手順および重合法法を検討することで、キラルポリラジカルの合成法を確立する。本年度は、トリフェニルアミン骨格を有するキラルフェニルアセチレンモノマーの重合およびキラル触媒を用いたアキラルフェニルアセチレンモノマーの重合を実施し、キラルポリラジカルの合成法について以下のように基礎的な知見を得た(1)キラルモノマーを用いたキラルポリラジカルの合成光学活性なジメチルピナニルシリル基を有するトリフェニルアミン置換アセチレンモノマーを合成し、これを重合して光学活性ならせん構造を有する置換ポリアセチレンを合成した。このポリマーにヨウ素やDDQをわずかにドーピングするだけでCDスペクトルが大きく変化し、主鎖のらせん構造あるいは、側鎖の励起子相互作用に影響を与えていることが明らかとなった。しかしながら、ESRからはそのポリラジカルを検出できず、シリル基の脱離などにより、ラジカルが不安定であることが示唆された。(2)キラル触媒を用いたキラルポリラジカルの合成水素結合可能な水酸基を2つ有するアキラルな置換アセチレンモノマー、3-ヒドロキシメチル-5-(N-t-ブチル-N-ヒドロキシアミノ)フェニルアセチレンを合成した。これを光学活性なフェニルエチルアミンおよびロジウム錯体から調製されるキラル触媒を用いて重合し、ポリマーを得ることに成功した。また、このモノマーに二酸化鉛を作用させ、ラジカルモノマーを合成し、これも同様の触媒系で重合し、ポリマーを得た。

CDスペクトルからは、配位子のノルボルナジエンをシクロオクタジエンに変えるだけで、得られるポリマーのらせん方向が反転することが明らかとなった。また、得られたポリマーのCDおよび紫外可視吸収はサーモクロミズムおよびソルバトクロミズムを示すことを、左右のらせん構造の生成エネルギーが等しいポリマーで初めて明らかにした。
XPA及びp53遺伝子欠損マウスを用いたDNA修復異常による神経細胞死の機構解析

ニューロン死の細胞内メカニズムの解明は、形態形成期に見られる神経系の構築機構のみならず、様々な神経疾患や脳機能障害の治療法をデザインする上でも極めて重要である。これまで我々は、マウス中枢ニューロンの分散ならびに切片培養系を確立し、ジーンターゲッティングマウスより得られた中枢ニューロンのin vitroでの解析を可能にした。これにより、DNA鎖切断によって誘導されるポストマイト-ティックな小脳ニューロンのアポトーシスに癌抑制遺伝子p53が関与していることを明らかにした(Enokido,et al.,Neurosci.Lett.,1996;Enokido,et al.,Eur.J.Neurosci.,1996)。すなわち、γ線等のDNA鎖切断刺激により、生後15日齢正常マウスの小脳ニューロンはアポトーシスによって死んでいくのに対し、p53欠損マウスのそれでは、ほとんどニューロン死は観察されなかった。一方、脱分極刺激除去によるニューロン死はどちらのマウスでも同様にニューロン死が観察された。さらに、A群色素性乾皮症遺伝子(XPA)ノックアウトマウス由来の中枢ニューロンでは、紫外線照射によってアポトーシスの促進が観察されるのに対し、ニューロンの興奮性低下にともなうアポトーシスは正常マウスとで差が見られないことを明らかにした(Enokido,et al.,J.Neurochem.,reviced)。以上の結果は、DNA傷害がポストマイト-ティックな中枢ニューロンのアポトーシス誘導の引き金となるだけでなく、p53やXPA遺伝子がニューロンの生と死、ならびにその機能維持に深く関わっていることを示唆している。今後、様々な神経疾患や脳機能障害へのこれら遺伝子の関与をin vivo、in vitroにおいて解析していくことも重要である。
代謝・マイオカイン・腸バリアに着目した骨格筋と腸の臓器相関に関する体力科学的研究

骨格筋は多くのエネルギーを消費する代謝臓器であり、運動能力を支持するとともに体脂肪量、血糖値を制御する重要な役割を果たす。また、生理活性物質マイオカインを分泌する分泌臓器としての役割を有し、全身の臓器を制御することがわかってきた。一方、腸内における細菌の働きや免疫制御機構が解明されはじめ、生体最前線においてバリア機能を果たす腸が、管腔内から血液中への物質透過を制御することで全身に影響を及ぼすことが明らかになってきた。本研究は、骨格筋における代謝・分泌機能と腸における細菌叢・バリア機能の相互作用について検討することを目的とする。複数のLeaky gutモデルマウスを作成し、腸バリア機能の低下が骨格筋のエネルギー代謝能に及ぼす影響について検討した。その結果、バリア機能の低下したマウスでは、血中インスリン濃度の上昇、骨格筋のインスリンシグナル伝達系の低下がみられ、インスリン感受性を減弱させることを観察した。バリア機能低下マウスでは、走運動時におけるグリコーゲン利用が促進され、運動時の筋代謝能を損なう可能性が示唆された。また、走運動トレーニングを負荷したマウス(ドナーマウス)から採取した便から腸内細菌叢のメタゲノム解析を行い、菌叢プロファイルの結果を得た。さらに、ドナーから得た便を投与したマウス(レシピエントマウス)の便の腸内細菌叢を測定し、複数の特徴的な細菌が便の移植により定着することを観察した。腸バリア機能の低下が骨格筋代謝を減弱させることを観察した。しかし、どのような機序を介しているのかについては不明であり、血液中の制御因子について検討する必要がある。また便移植試験では、ドナーマウスの腸内細菌叢がレシピエントマウスに伝播することを明らかにすることができた。今後、レシピエントマウスの代謝能にどのような影響を及ぼすか検討していく。Leaky gutモデルマウスにおいて、腸バリア機能の低下が骨格筋代謝能を低下させるメカニズムについて明らかにする。また、骨格筋代謝能の減弱したマウスの腸バリア機能についても評価し、腸内環境に及ぼすマイオカインの効果についても検討していく。さらに、トレーニングを行ったドナーマウスの便を移植したレシピエントマウスの臓器重量、血中・骨格筋における代謝関連指標を測定し、安静ドナーマウスの便を移植したレシピエントマウスと比較する計画である。
高速レーザースペックル法による発熱反応にともなうレーリーテーラー不安定性の解明

高さ100mm×幅50mm×奥行き1mmのHele-Shaw Cellを用いて中和反応実験を行った.Hele-Shaw Cellは,2段に分かれており,まず,下層側に,所定のモル濃度(C=10.0,8.0,6.0,4.0mol/l)のNaOH水溶液を注入し,上層側を少しずらして,所定のモル濃度(C=1.0mol/l)のHC1水溶液またはCH3COOH水溶液を注入した。上層溶液および下層溶液の初期温度を20±0.5°Cで一定とし,上部のアクリルを元の位置に戻して中和反応を起こさせた.密度分布測定は次のように行った.アルゴンイオンレーザーをすりガラスに照射し,レーザースペックルパターンを生成させ,そのパターンを平凸レンズにより平行光にし,Hele-Shaw Cellを通過させた.そのスペックルパターンを別の平凸レンズにより集光させ,高速度カメラで撮影した.反応開始後30分間の動画を撮影し1秒間隔で静止画に編集した.次に,これらの連続静止画像から,PIV法を用いてスペックルパターンの移動量分布を求め,フェルマーの定理を用いて,屈折率分布に変換した.さらに,予備実験で得た屈折率-密度相関式を用いて液相内の密度分布を求めた.なお,本手法により,0.01kg/m3レベルの密度変化までとらえることが可能である.本実験の妥当性については,反応がない系において,理論による密度分布と比較した結果,相対誤差が1%以下で一致することがわかった.本年度は,レーザースペックル法を利用して,液相反応中の密度分布の時系列データの取得に成功した高さ100mm×幅50mm×奥行き1mmのHele-Shaw Cellを用いて中和反応実験を行った.Hele-Shaw Cellは,2段に分かれており,まず,下層側に,所定のモル濃度(C=10.0,8.0,6.0,4.0mol/l)のNaOH水溶液を注入し,上層側を少しずらして,所定のモル濃度(C=1.0mol/l)のHC1水溶液またはCH3COOH水溶液を注入した。上層溶液および下層溶液の初期温度を20±0.5°Cで一定とし,上部のアクリルを元の位置に戻して中和反応を起こさせた.密度分布測定は次のように行った.アルゴンイオンレーザーをすりガラスに照射し,レーザースペックルパターンを生成させ,そのパターンを平凸レンズにより平行光にし,Hele-Shaw Cellを通過させた.そのスペックルパターンを別の平凸レンズにより集光させ,高速度カメラで撮影した.反応開始後30分間の動画を撮影し1秒間隔で静止画に編集した.次に,これらの連続静止画像から,PIV法を用いてスペックルパターンの移動量分布を求め,フェルマーの定理を用いて,屈折率分布に変換した.さらに,予備実験で得た屈折率-密度相関式を用いて液相内の密度分布を求めた.なお,本手法により,0.01kg/m3レベルの密度変化までとらえることが可能である.本実験の妥当性については,反応がない系において,理論による密度分布と比較した結果,相対誤差が1%以下で一致することがわかった.本年度は,レーザースペックル法を利用して,液相反応中の密度分布の時系列データの取得に成功した
看護職の国家間移動と太平洋沿岸諸国における看護職の労働実態に関する調査

看護職のマンパワー不足は、日本ばかりでなく世界的規模で拡大しており、看護職の労働実態に関する国際共同研究は、重要性を増している。8カ国の産業看護研究者を招聘し、2007年、2008年に2回の国際会議を開催し、新卒看護職に対する5年間の追跡調査を開始した。2年間の研究成果は、(1)研究の枠組みと共通の質問紙の作成と検討、(2)参加各国でのパイロット調査、(3) Web上でのデータの共有化、(4)産業看護研究者による国際的ネットワーク化の礎となるコアグループの形成である。経済のグローバル化による看護労働への影響と太平洋沿岸諸国における看護職の労働安全衛生に関する実態調査を目的として,第1回産業看護国際ワークショップを開催した。研究課題達成のために,オーストラリア,フィリピン,タイ,韓国,香港,米国,イギリスの計7カ国,12名の産業看護研究者を招聘した。国際共同研究導入に当たって,日本を含む8カ国の研究者が,それぞれの文化、社会背景に基づく保健医療の動向,看護教育制度,看護師の雇用、離職動向,労働環境とその健康影響について報告した。その結果,英、米では,国内での看護師の不足を補う為に新興国で教育を受けた看護労働者を多く受け入れていること,逆に,フィリピンでは看護師を中東、英、米諸国に送り出していること等が明らかにされた。そして,8カ国どの国においても,看護師不足と労働環境の悪化,看護ケアの質低下,燃え尽き症候群,過重労働による疲労、メンタルヘルスの低下,作業関連疾患への罹患(腰痛),化学物質、感染性微生物への暴露,職場でのハラスメント、暴力等が共通した問題として浮上した。これらの共通問題を踏まえ,研究の方向性として,人手不足や労働環境の悪化に伴う看護職の身体、精神面への影響,患者ケアの質,及び経済的損失等,さらに患者安全への影響等について調査すること。研究計画では,国際共同研究の構築の方略,5年間の新卒看護師の追跡調査の為の理論的枠組み,各国研究メンバーの役割,質問紙の内容、項目及び必要時母国語への翻訳と妥当性の検討,共同研究を進めるに当たっての倫理申請を含む約束事等について意見交換し,それぞれの達成目標を確認して3日間のスケジュールを終了した。【目的】国際化の進展、及び、経済のグローバル化による看護職の越境労働の増加に伴い、看護の労働実態等に関する国際共同研究は、ますますその重要性が高まっている。昨年度に引き続き、太平洋沿岸諸国における看護職の労働実態調査を目的として、6カ国9名の研究者を招聘し、第2回目の産業看護国際ワークショップを開催した。【方法】調査方法は各研究者の所属する大学卒業生に対する5年間の追跡調査とする2008年度は昨年度のワークショップで構築した研究の背景や理論的な枠組み及び調査方法について更なる検討を加えた。調査用紙(原案)は、1.予測因子として所属組織、集団としての看護組織体、看護職の個別的要因に関する項目、2.看護職独自の労働環境として機能・空間・物理的状況と人間関係、看護ケアの実行を妨げる要素等に関する項目、3.看護職個々の問題として生じるバーンアウト、抑うつ、作業関連疾患や労災事故、筋骨格系障害に関する項目、4.組織的なアウトカムとして、患者安全の指標、看護スタッフの病欠や離職意図、人的な不足状況等に関する項目である。【結果】これら各国共通で使用する質問紙(原案)について、日本で行なったパイロット調査に基づき、基本的属性について各国の制度や社会・文化的背景の違いによる調査項目の変更、さらに、所属組織・病院等の機関、職場環境、雇用主と職務、患者及び看護職自身の安寧について討議し、加筆・修正を加え、完成させた。また、今後の各国における調査計画、研究協力可能な教育機関等について進捗状況の確認をした。今後の計画について検討し、データの収集方法については、サンフランシスコ州立大学で開発されたDIVAを用いてのWeb上での質問紙の掲載と研究者間でのデータの共有方法について共通理解を図った。【考察/結論】2008年度国際ワークショップで作成された調査用紙を用いて太平洋沿岸7カ国で看護職の労働に関する実態を調査し、国際的な雇用実態、離職意図、看護職の安寧に関するの貴重なデータを得られるものと考える。
細胞内シグナル伝達の一過的な制御を目指した新規RNA変異導入技術の開発と応用

本研究は、RNA編集機構を利用した部位特異的RNA変異導入技術の開発を通して、細胞内タンパク質機能をRNAレベルで制御する新たな方法論を確立することを最終目標と研究を行なった。本研究ではこれまでに、RNA編集酵素である二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ(ADAR)の編集活性を目的部位に誘導し、標的部位に特異的なA-to-I RNA編集(アデノシンをイノシンに変換する)を導入することができるガイドRNA(編集ガイドRNA: AD-gRNA)を構築している。本年度は、昨年度に引き続き、従来のよりも短鎖で機能する新たなAD-gRNAの構築を行なった。AD-gRNAは、標的RNAと塩基対を形成するアンチセンス領域と、編集活性を目的部位に誘導するADAR誘導領域で構成される。本研究では、ADAR誘導領域のRNA配列を段階的に削除もしくは変異することで、機能領域を特定した。従来型のAD-gRNA(グルタミン酸受容体mRNA前駆体配列を用いて構築)は、標的RNAと塩基対を形成するアンチセンス領域と、編集活性を目的部位に誘導するADAR誘導領域の機能領域で構成される。そこで、従来型のAD-gRNAを基盤として、ADAR誘導領域の各種欠損変異体gRNAを設計し、それぞれに対してin vitroにおける編集誘導能評価を実施した。その後、機能領域のみで構成される短鎖型AD-gRNAを構築し、新たな短鎖型AD-gRNA配列設計を確立した。また、短鎖型AD-gRNAは、ADAR発現細胞内においてもRNA編集誘導活性を示し、RNA変異導入による標的遺伝子発現制御に適用できることを明らかにした。以上の結果より、本研究では、短鎖型AD-gRNAの設計基盤および機能を明らかにし、新たなRNA変異導入技術の基盤的方法論を開発することに成功した。本研究は、細胞内タンパク質機能をRNAレベルで制御する方法の開発を最終目標とし、部位特異的RNA変異導入技術の開発を行っている。これまでに、A-to-I RNA編集機構を利用したRNA変異導入技術の基盤的方法論を構築している。本RNA変異導入法は、RNA編集酵素である二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ(ADAR)の編集活性を目的部位に誘導するガイドRNA(編集ガイドRNA: AD-gRNA)を設計し、それをADAR発現細胞内に導入することで合目的なRNA変異導入を達成する。本年度は、グルタミン酸受容体mRNA前駆体配列を基に構築したAD-gRNAを基盤に、各種変異体gRNAを設計・合成し、in vitro編集解析を通して、効率的かつ特異的にRNA編集を誘導することが可能なAD-gRNA配列の探索を行った。結果、AD-gRNAは、ADAR誘導領域の5'側にアンチセンス領域配置することで、高い編集誘導活性と特異性を示すことを明らかにした。また、5'側にアンチセンス領域もつAD-gRNAは、3'側にアンチセンス領域を有するものとは、ADAR2の編集誘導メカニズムが異なることを明らかにした。さらに、培養細胞内での編集誘導活性を評価する実験系を構築し、これまでin vitroで得られたAD-gRNAが、ADAR2発現細胞において標的RNA編異導入が可能であることを証明した。平成28年度は、従来のAD-gRNA配列を改変した複数のガイドRNAを新たに設計した。その中から、in vitro及び培養細胞内において、部位特異的な編集誘導活性有する新たなAD-gRNAを構築することができた。また。上記実験で得られた結果から、AD-gRNA配列をさらに精密に設計できるようになった。加えて、ADAR2だけではなく、ADAR1の編集活性を誘導するガイドRNAの基盤配列を構築した。平成28年度に行った研究及び、それにより得られた研究成果は、申請当初の研究計画と大きな違いはなく、本研究はおおむね順調に進展している。本研究は、細胞内タンパク質機能をRNAレベルで制御する方法の開発を最終目標とし、RNA編集機構を利用した部位特異的RNA変異導入技術の開発を行っている。本研究ではこれまでに、RNA編集酵素である二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ(ADAR)の編集活性を目的部位に誘導可能なガイドRNA(編集ガイドRNA: AD-gRNA)を設計・構築している。また、編集ガイドRNAをADAR発現細胞内に導入することで、標的RNAに変異導入が可能であること及び、そのRNA変異導入により目的遺伝子の機能発現制御が可能であることを実験的に証明している。AD-gRNAの機能領域は、標的RNAと塩基対を形成するアンチセンス領域と、編集活性を目的部位に誘導するADAR誘導領域である。本年度は、AD-gRNAのADAR誘導領域の短鎖化を行なうことで、編集誘導メカニズムの解析を進めると共に、更なる高機能なAD-gRNAの設計方法を確立することを目的とした。そこでまず、グルタミン酸受容体mRNA前駆体配列を用いて構築したAD-gRNAを基盤として、各種欠損変異体gRNAを設計・合成し、in vitroにおける編集誘導能を評価した。得られた結果から、編集誘導に必要な領域を特定し、短鎖型AD-gRNAを構築した。得られた短鎖型AD-gRNAは、従来型のAD-gRNAと比較して遜色のない機能を示した。また、短鎖型AD-gRNAは、ADAR発現細胞内においても、従来型と同様に編集誘導活性を示し、標的遺伝子発現の制御が可能であることが明らかになった。

以上の結果より、当該年度では、短鎖型AD-gRNAを用いた新たなRNA変異導入技術の基盤的方法論を確立することに成功した。平成29年度は、従来のAD-gRNA配列を基盤として、短鎖型AD-gRNAの設計方法を確率し、それを用いた新たなRNA変異導入技術の基盤的方法論を確立した。得られた成果により、より高効率かつ特異的なガイドRNAの設計が可能になった。加えて、平成30年度で研究予定である、RNA変異導入による内在性遺伝子の制御技術の確立及び人工核酸の導入実験において、短鎖型AD-gRNAは重要な基盤分子となる。以上より、平成29年度に行った研究及び、それにより得られた研究成果は、申請当初の研究計画と大きな違いはなく、本研究はおおむね順調に進展していると言える。本研究は、RNA編集機構を利用した部位特異的RNA変異導入技術の開発を通して、細胞内タンパク質機能をRNAレベルで制御する新たな方法論を確立することを最終目標と研究を行なった。本研究ではこれまでに、RNA編集酵素である二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ(ADAR)の編集活性を目的部位に誘導し、標的部位に特異的なA-to-I RNA編集(アデノシンをイノシンに変換する)を導入することができるガイドRNA(編集ガイドRNA: AD-gRNA)を構築している。本年度は、昨年度に引き続き、従来のよりも短鎖で機能する新たなAD-gRNAの構築を行なった。AD-gRNAは、標的RNAと塩基対を形成するアンチセンス領域と、編集活性を目的部位に誘導するADAR誘導領域で構成される。本研究では、ADAR誘導領域のRNA配列を段階的に削除もしくは変異することで、機能領域を特定した。従来型のAD-gRNA(グルタミン酸受容体mRNA前駆体配列を用いて構築)は、標的RNAと塩基対を形成するアンチセンス領域と、編集活性を目的部位に誘導するADAR誘導領域の機能領域で構成される。そこで、従来型のAD-gRNAを基盤として、ADAR誘導領域の各種欠損変異体gRNAを設計し、それぞれに対してin vitroにおける編集誘導能評価を実施した。その後、機能領域のみで構成される短鎖型AD-gRNAを構築し、新たな短鎖型AD-gRNA配列設計を確立した。また、短鎖型AD-gRNAは、ADAR発現細胞内においてもRNA編集誘導活性を示し、RNA変異導入による標的遺伝子発現制御に適用できることを明らかにした。以上の結果より、本研究では、短鎖型AD-gRNAの設計基盤および機能を明らかにし、新たなRNA変異導入技術の基盤的方法論を開発することに成功した。平成29年度は、申請時の研究計画に従い、構築したAD-gRNAを用いたRNA変異導入法をより汎用性の高い技術として確立することを目的とする。そのため、設計した各種AD-gRNAの培養細胞内での機能評価を重点的に行う。まず、AD-gRNAの編集誘導活性のより詳細な解析を可能にするため、改変型ルシフェラーゼレポーターRNAを用いて、新たな評価方法を確立する。これにより、培養細胞内でのRNA変異導入によるタンパク質発現量変化を定量的に解析できるようになる。
固形癌に対するRI標識抗体治療の細胞殺傷メカニズムの解明と作用増強因子の探索

培養細胞または担癌マウスに対して^<90>Y-抗体を負荷し、治療効果およびそのメカニズムについて検討を行った。培養細胞において^<90>Y-抗体の負荷により細胞死が観察され、少なくともその一部でアポトーシスが認められた。担癌マウスでは腫瘍縮小効果が観察された腫瘍を摘出し染色を行ったところ、^<90>Y-抗体投与早期よりアポトーシスが起こっていた。以上より、放射免疫療法による細胞致死作用がアポトーシスに起因することが明らかとなった。近年、治療用のRIを結合した抗体を体内に投与し体内からがんを治療する『放射免疫療法』が注目されており、イットリウムー90(90Y)結合CD20抗体は悪性リンパ腫に対する優れた治療薬として臨床の現場で使用されている。一方、固形癌に対する放射免疫療法は、種々の検討が行われているにもかかわらず大きな成果をあげられていない。その原因の一つとして、悪性リンパ腫に比べて固形癌の放射性感受性が低いことが指摘されている。そこで、固形癌に対する放射免疫療法の治療効果を向上させることを最終目標として、放射免疫療法による細胞殺傷メカニズムを解明し、治療効果を増強するような因子を探索することを計画した。まず、RI標識抗体による殺細胞効果のメカニズムを検討する目的で、培養した癌細胞に90Yを加えて実験した。しかし培養液にかなりの放射能を加えないと細胞死が起こらなかった。これは、in vivoにおいては癌細胞が立体的に密集しており、周囲に結合した抗体からの放射線による効果も期待できるが、培養系の場合は平面であり、放射線による治療効果がでにくいためと考えられ、実験系として不適であると考えられた。そこで、細胞を立体的に密集させるために、細胞を剥がして高濃度で懸濁させた溶液に90Yを添加し、一定時間後に90Yを除去後プレートに播いた。その結果、培養液に加えた場合よりも、低濃度、短時間で細胞死が起こすことができた。今後はこの実験系を用いて細胞死のメカニズムを検討する予定である。また担癌マウスに90Y結合抗体を投与し、経時的に腫瘍を摘出して免疫組織学的に検討を行ったところ、時間経過とともにアポトーシスが起こっていることが確認できた。今後は培養細胞によるアポトーシスの確認およびメカニズムの解析を行い、RI標識抗体の作用を増強する化合物を探索する予定である。近年、治療用のRIを結合した抗体を体内に投与し、体の内側からがんを治療する『放射免疫療法』が注目されており、臨床において悪性リンパ腫の治療薬として高い奏効率を示している。一方で、固形癌に対する放射免疫療法は、現在のところ顕著な治療効果を得るには至っておらず、固形癌に対する効果的な放射免疫療法の開発が望まれている。治療効果が得られない原因の一つとして固形癌の放射性感受性が低いことが考えられることから、放射免疫療法による細胞殺傷メカニズムを解明することにより放射線による細胞死を効率的に起こさせるような治療法を開発することを計画した。滑膜肉腫細胞および大腸癌細胞を移植した担癌マウスに^<90>Y結合抗体を投与し、腫瘍の大きさを経時的に計測したところ、滑膜肉腫では腫瘍縮小効果が認められ、ほとんどのマウスにおいて腫瘍が消失したのに対し、抗体の腫瘍集積量がより多かった大腸癌では増殖抑制効果は認められたものの、腫瘍の縮小には至らなかった。腫瘍を摘出して免疫組織学的に検討を行ったところ、滑膜肉腫においては投与早期からアポトーシスが起こっていた。またin vitroの実験として滑膜肉腫細胞および大腸癌細胞培養し、^<90>Y抗体を加えたところ、マウスを用いた治療実験結果と同様に、滑膜肉腫細胞の方が低放射能において細胞死が認められた。このことから癌細胞の放射線感受性が治療効果に大きく寄与していることが示唆された。さらに培養細胞実験でアポトーシスが起こっているかどうかを検討したところ、両細胞とも細胞死が起こる線量の放射能を加えた群においてアポトーシスが起こっていることが明らかとなった。担癌マウスおよび培養細胞においてアポトーシスを確認することが出来、本研究の成果は今後の放射免疫療法の研究の進展に寄与するものと期待される。
造血幹細胞の細胞内代謝・増殖・分化制御と白血病原因遺伝子が及ぼす影響に関する研究

1.RUNX1のC末端の変異体がGadd45aの発現を抑制してDNA修復能を低下させることを見出した。2.FIP1L1-PDGFRAが造血幹細胞からの好酸球系前駆細胞'EoP)の発生を増加させるのみでなく、他の系統の前駆細胞からもEoPを産生させることを明らかにした。3.BCR-ABLおよびその下流のRas/MAPKが骨髄系細胞を増殖させる一方で、p21^<WAF1>を介して赤血球造血を抑制することを見出した。活性型チロシンキナーゼによる造血細胞の腫瘍化機構を明らかにするために、特発性好酸球増加症/好酸球性白血病の原因遺伝子FIP1L1/PDGFRα及びその変異体を造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、骨髄単球系前駆細胞、赤巨核球系前駆細胞などに導入し、これらの細胞の系統決定、増殖、生存、腫瘍化に及ぼす影響を検討した。その結果、FIP1L1/PDGFRαは、いずれの細胞に導入された場合もサイトカイン非依存性の増殖を可能にするが、造血幹細胞に導入された場合のみ永続的な細胞増殖を伴う腫瘍化をもたらし、前駆細胞レベルに導入した場合には腫瘍化をもたらさないことが明らかとなった。さらにin vitroのreplatingアッセイでFIP1L1/PDGFRαは造血幹細胞の自己複製能を増強するが前駆細胞には骨髄系共通前駆細胞などの前駆細胞には自己複製能を付与しないことが明らかとなった。また、リンパ系共通前駆細胞、赤巨核球系前駆細胞などに導入した場合、通常の造血発生の機構では起こらない好酸球への分化が誘導された。これらの結果から、FIP1L1/PDGFRαの異常は造血幹細胞レベルでおこり、好酸球系細胞への分化を選択的に誘導することが明らかとなった。また、この機構としてFIP1L1/PDGFRαの下流分子Ras/MAPK系とp38MAPKが、c/EBPαやGATAファミリー転写因子群などの造血細胞の系統決定に関わる分子の発現や機能を制御し、好酸球への分化を誘導することをRT-PCR法、ルシフェラーゼアッセイなどを用いて明らかにした(J Biol Vhem, in press)。造血細胞の増殖・分化において重要な役割を担うRUNX1のC末端の変異(RUNX1-dC)は急性骨髄性白血病(AML)や骨髄異形成症候群(MDS)の一部において認められる。これらの造血器腫瘍の多段階の悪性化の過程におけるRUNX1-dCの役割について検討を行った。RUNX1-dCをマウスの細胞株32Dに導入したところUVやγ線の照射によって引き起こされるDNA損傷に対するヌクレオチド除去修復能の低下がみられた。RUNX1-dC導入32D細胞において、DNA損傷の修復に関わる遺伝子の発現変化をスクリーニングしたところGadd45aの発現低下が認められた。この細胞にGadd45aを発現させるとヌクレオチド除去修復能が回復した。また、マウスの未熟な造血細胞にRUNX1-dCを導入してもGadd45aの発現が低下した。さらに、野生型RUX1がGadd45aのイントロン3に存在するRUNX1結合配列を介して、Gadd45aの転写を制御していることをクロマチン免疫沈降法、ルシフェラーゼアッセイを用いて明らかにした。実際、RUNX1-dCを有するAML、MDS症例においては、この変異を有さない症例と比較してGadd45aの発現低下が認められることも確認した。これらの結果から、RUNX1-dCの変異はヌクレオチド除去修復能を低下させ、二次的な遺伝子異常の誘因になることが明らかとなった(Blood,投稿中)。エネルギー代謝についてはSIRT1のノックアウトマウスの造血幹細胞を単離し、自己複製能などの機能をin vitro、in vivoで解析した。造血幹細胞ヒバルにBCR-ABLの遺伝子変異がおこると慢性骨髄性白血病(CML)を発症し、JAK2V617F変異がおこる真性多血症(PV)を含む骨髄増殖腫瘍を発症する。いずれの分子も活性型チロシンキナーゼとしてSTATs、Ras/MAPK、PI3K/Aktなどの共通したシグナル伝達分子を活性化するが、CMLでは貧血、PVでは多血症となる。本研究では活性型チロシンキナーゼによって異なる病態が引き起こされる分子機能を解析した。マウス骨髄より単離したKIT+Sca-1+Lin-(KSL)細胞にJAK2V617Fを導入すると、赤芽球系、顆粒球系のいずれのコロニー数も増加した。一方、BCR-ABLを導入すると顆粒球系コロニーは増加したが、赤芽球系コロニーは減少した。

この機構として、BCR-ABLはJAK2V617Fと比較すると、下流のRas/MAPKをより強く活性化し、Ras/MAPK経路が赤芽球系コロニーの抑制に関わることを明らかとした。さらに、骨髄系コロニーと比較して赤芽球系コロニーのみが減少する理由として、赤芽球系特異的転写因子GATA-1がRas/MAPKの上流分子MEKと直接結合し、Ras/MAPKの増殖シグナルを阻害することを見出した。また、赤芽球系の増殖抑制にはサイクリン依存性キナーゼ阻害分子のうち、p16INK4Aではなく、p21WAF1が必須であることをノックアウトマウスを用いて証明した(J Biol Chem 31774-82, 2010)エネルギー代謝についてはSIRT1のノックアウトマウスの造血幹細胞を単離し、自己複製能が障害されていることをin vitro、in vivoで明らかとした(論文投稿中)。
筋萎縮性側索硬化症におけるグルタミン酸受容体のCa透過性の異常に関する研究

筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病因は解明されていないが、AMPA/カイニン酸受容体チャネルが選択的な運動ニューロンの細胞死に関わっており、AMPA受容体を介するCa流入が亢進することが細胞死につながるとされている。昨年度、この受容体のCa透過性を亢進させる分子変化がALSのGluR2サブユニットmRNAに生じている(発現量の低下、編集率の低下)ことを示した。本年は、症例数を増やしこのことを確認したとともに、ALS脊髄前角に特異的に生じていたGluR2 mRNA編集率の低下が、他の神経変性しっ神野病的部位には見られないかどうかを検討した。ALS、正常対照、疾患対照の、剖検時凍結保存した脊髄の前角・後角・白質3部位および他の神経変性疾患脳の病理所見の強い部位につき、AMPA受容体各サブユニット(GluR14)に対するRT-PCRを施行した。GluR2の転写後編集率はGluR2のPCR産物を制限酵素で消化した結果得られた断片の定量的分析により検討した。疾患対照とALSの脊髄前角でGluR2 mRNAの発現量、ALS脊髄前角で転写後編集率が、統計的に有意に低下していた。また、Alzheimer病・Pick病大脳皮質、Huntington病線条体、脊髄小脳変性症(MJD,DRPLA,多系統萎縮症)小脳ではGlur2 mRNA編集率はほぼ100%であったことより、GluR2のRNA編集率の低下はALS脊髄前角に部位・疾患特異的であるといえる。このことは、GluR2のRNA編集率低下が孤発性ALSの直接の病因になっているか、もしくはALSの病因が同時にGluR2 RNA編集率を低下させることでAMPA受容体のCa透過性を亢進させ神経細胞死を促進させていることを示唆している。GluR2 RNA編集率低下が運動ニューロンに生じているかどうかを確認するため、単一運動ニューロン組織を用いて検討している。筋萎縮性側索硬化症でみられる選択的運動ニューロン変性の病因は解明されていない。病因仮説として、AMPA/カイニン酸受容体チャネルを通じたCaイオン透過性の亢進が有力視されている。本研究ではこの受容体にCa透過性の変化を引き起こす分子変化が生じているかどうかを調べた。剖検脊髄を用いてALSにおけるAMPA受容体のCa透過性を促進させる分子変化(GluR2サブユニットmRNA発現量の低下、GluR2 RNA編集率の低下)の有無を検討した。ALS 10例、正常対照9例、疾患対照7例の、剖検時凍結保存した脊髄を前角・後角・白質の3部位に分け、それぞれからRNAを抽出し、AMPA受容体各サブユニット(GluR14)およびG3PDHに対するRT-PCR法を施行した。mRNA発現量は、G3PDH RT-PCR産物に対する各サブユニットRT-PCR産物の比として算出した。GluR2の転写後編集率はGluR2のPCR産物を制限酵素で消化した結果得られた断片長の分析により検討した。ALS脊髄前角ではGluR2 mRNAの発現量および転写後編集率のいずれもが、統計的に有意に低下していた。これらの変化はAMPA受容体のCa透過性を亢進させ、また神経細胞死を引き起こすことが動物実験から知られていることから、ALS脊髄前角細胞の神経細胞死を促進させるものであると考えられる。