hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気管支喘息および好酸球性鼻副鼻腔炎におけるセマフォリンの関与

セマフォリンは神経ガイダンス因子として同定された分子であるが、神経系以外にも自己免疫やアレルギーなど免疫系で働くことも報告されている。本研究の目的は、気管支喘息と関連の深い疾患である好酸球性副鼻腔炎におけるセマフォリンの関与につき調べることである。今回、手術加療を行った好酸球性副鼻腔炎10症例(うち、喘息合併8例)及び非好酸球性副鼻腔炎患者5症例の鼻茸を採取し、セマフォリン3Aおよびセマフォリン7Aの濃度をELISA法により測定した。セマフォリン3Aについては、好酸球性副鼻腔炎患者において有意に増加していた。セマフォリン3Aが好酸球性副鼻腔炎の病態に関与している可能性が示唆された。本年度は、本研究における初年度にあたる。本年度は研究計画に沿って、マウス鼻副鼻腔におけるセマフォリン分子の発現解析を行い、さらに継続中である。まず、マウス鼻腔および嗅球からのtotal RNAを採取し、RT-PCR法によるセマフォリンファミリーに属する分子の発現の解析をおこなった。これらの解析において、いくつかのセマフォリン分子の発現を実際に確認することができた。これらの成果のうちいくつかは、鼻副鼻腔における発現が知られていないものがあり、新しい知見である。今後後続の検討を追加した上で、論文発表をおこなっていく予定である。また、セマフォリンファミリー分子は多数あるため、今年度検討できていないその他のセマフォリンファミリー分子についての発現解析も、次年度に継続して追加して行っていく予定となっている。また、さらに上記の遺伝子発現解析における知見を踏まえて、遺伝子の発現部位、発現している細胞の特定に向けた、マウス鼻腔の凍結切片の作成および免疫染色を現在鋭意行っている。まずは、マウス鼻副鼻腔の非脱胚組織の凍結切片の作成をおこなった。現在は、共焦点蛍光顕微鏡と蛍光標識抗体を用いた免疫組織化学染色に取り組んでいる。免疫組織染色にもちいる抗体や蛍光標識二次抗体の濃度条件の特定を進めて現在これらの解析を行っている最中であり、今後遺伝子発現が確認できたセマフォリン分子の発現部位、発現細胞が詳細に特定されることが期待される。セマフォリンは神経ガイダンス因子として同定された分子であるが、神経系以外にも器官形成や血管新生、癌の悪性化、自己免疫、アレルギーなどその働きは多岐に渡り報告されている。本研究の目的は、気管支喘息とも関連のある疾患である好酸球性副鼻腔炎における免疫セマフォリンの関与につき調べることである。今回の研究では、セマフォリン3Aおよび7Aに着目した。セマフォリン3AにはT細胞のIL-10産生促進、免疫担当細胞の浸潤抑制等の働きが知られ、さらに気管支喘息患者の喀痰、および喘息モデルマウスの肺胞洗浄液等において蛋白濃度が上昇しているとの報告がある(Expression of semaphorin 3A and neuropilin1 in asthma.JKorean Med Sci.2013)。今回、手術加療を行った好酸球性副鼻腔炎10症例(うち、喘息合併8症例)および非好酸球性副鼻腔炎患者5症例の鼻茸を採取し、ホモジナイザーを用いて抽出液を作製し、鼻茸中のセマフォリンの濃度をELISA法により測定した。その結果、鼻茸中のセマフォリン7Aについて、好酸球性副鼻腔炎と非好酸球性副鼻腔炎の間に有意差は認められなかったが、セマフォリン3Aについては好酸球性副鼻腔炎患者において有意に増加していた。以上の結果から、セマフォリン3Aが好酸球性副鼻腔炎の病態へ関与している可能性が示唆された。今後更なる検討が必要と考える。遺伝子発現解析については、当初予定していた免疫セマフォリンファミリー分子についての解析は終了している。さらに、発現部位、発現細胞同定に向けた免疫染色についても条件設定が終了している。耳鼻咽喉科学研究計画における2年度目の研究計画を引き続き行っていく。また、初年度の実験についての、追加の検討項目についても引き続き検討を行っていく予定である。ごくわずかな端数の金額である。特に変更はない。
高リン食投与ラットモデルを用いた主要臓器におけるリン恒常性調節機構解明とその応用

ラットを通常食(C群)および高リン食(HP群)で24日間飼育した後、腎臓・肝臓・白色脂肪組織(WAT)を摘出し、RNAを抽出してDNAマイクロアレイ解析を行なった。その結果、両群の遺伝子発現プロファイルは大きく異なり、腎臓ではHP群においてナトリウム依存性リン酸共輸送体であるNaPi-IIbが顕著に発現上昇していた。肝臓では、HP群において脂肪酸β酸化の亢進、アミノ酸異化の抑制が認められた。WATについては、肝臓同様、HP群での脂肪酸β酸化の亢進が認められた。以上の結果は、高リン食摂取がリン恒常性に影響するだけでなく、様々な代謝パスウェイの変化を引き起こすことを示している。リンは、骨などを形成するのに必須なミネラルであるが、近年、インスタント食品や清涼飲料水などに含まれるリンによる過剰摂取が問題となっている。過剰摂取による症状としては骨成長不良や副甲状腺機能の異常亢進などが知られている。しかしながら、意外なことにリン過剰摂取時の遺伝子発現レベルでの解析は数例の報告があるのみで、網羅的解析は行われていない。そこで本研究では、1)高リン食負荷をかけた際のラットモデルを用いて、主要な臓器における遺伝子発現変動を網羅的に解析することによるリン恒常性調節機構の遺伝子発現レベルでの統合的な解明、2)リン過剰摂取を早期に反映する血中バイオマーカーの探索、の2点を目的とし、現代的な食生活で起こりうるリン過剰摂取の問題への対処を目指した。本年度は、1)について研究を行った。4週齢Wistar系雄性ラットを1週間の予備飼育後、2群に分け、AIN93G食をベースにした通常含有量のリンを含む飼料(0.3%P:通常食群)と、高リン飼料(1.2%P:高リン食群)で3週間飼育した。最後の一週間は、代謝ケージを用いて、糞、尿の採取を行い、リンの出納試験を行った。飼育修了後、腎臓・肝臓等を摘出し、RNAを抽出してDNAマイクロアレイ解析を行なった。その結果、腎臓においては、高リン食摂取によってナトリウム依存性リン酸共輸送体であるNaPi-IIbが顕著に発現上昇することを明らかにした。タンパク質レベルの解析で、高リン食群においてNaPi-IIbは尿管上皮細胞の基底膜側に多く発現していることが示唆され、リンの積極的な排泄に関わると考えられた。現在、肝臓のマイクロアレイ解析を行なっている。リンは骨などを形成するのに必須なミネラルであるが、近年、インスタント食品や清涼飲料水などに添加物として含まれるリンの過剰摂取が問題となっている。25年度は24年度に取得した高リン食摂取ラット白色脂肪組織(WAT)について、マイクロアレイ解析を行った。その結果、脂質代謝関連、炎症関連、細胞形成関連遺伝子が高リン食摂取によって発現変動していることが明らかとなった。とくに脂質代謝関連では、肝臓の場合と同様、脂肪酸β酸化の亢進が認められた。さらに、WATに蓄積したトリアシルグリセロールから脂肪酸を遊離させるリパーゼをコードする遺伝子の発現上昇が認められた。これらは、高リン食摂取によるWATの重量低下という表現型の変化を裏付けるものであった。また、高リン食摂取によって、炎症メディエーターであるプロスタグランジン生合成及びロイコトリエン生合成に関わる遺伝子の発現低下、免疫細胞浸潤を示す遺伝子の発現低下も認められた。これらは高リン食摂取によって起こった蓄積脂肪の減少に伴う相対的な結果であると考えられたが、さらなる検討が必要である。WATの解析からも、高リン食摂取が代謝の変化をはじめとする様々な生体応答を引き起こしていることが明らかとなった。

そこで本研究では、1)高リン食負荷をかけた際のラットモデルを用いて、主要な臓器における遺伝子発現変動を網羅的に解析することによるリン恒常性調節機構の遺伝子発現レベルでの統合的な解明、2)リン過剰摂取を早期に反映する血中バイオマーカーの探索、の2点を目的とし、現代的な食生活で起こりうるリン過剰摂取の問題への対処を目指した。24年度は1)および2)について、並行して研究を行った。23年度同様、4週齢Wistar系雄性ラットを1週間の予備飼育後、2群に分け、通常含有量のリンを含む飼料(0.3%P:通常食群)と、高リン飼料(1.2%P:高リン食群)で3週間飼育した。肝臓のマイクロアレイ解析の結果、高リン食摂取による脂肪酸β酸化の亢進、アミノ酸異化の抑制が明らかになった。さらに、脂肪酸合成は抑制される一方で、不飽和化やアシル鎖の延長に関与する遺伝子の発現上昇が認められたため、肝臓中の脂肪酸組成をメタボローム解析で調べた結果、高リン食群でω3、ω6脂肪酸が有意に高い値を示した。また、肝臓中の発現変動遺伝子中に、これらの鍵となる因子であるFGF21の発現上昇を見いだした。そこで、FGF21タンパク質の血中濃度を測定したところ、高リン食群で高値となる傾向を示した。現在、FGF21の標的臓器のひとつである白色脂肪組織について解析中である。これまで腎臓での働きがほとんどわかっていなかったリン酸共輸送体のNaPi-IIbが、高リン食摂取時のリン排泄に働いている可能性を初めて示すことができ、投稿論文として発表することができた。これは、リン恒常性調節機構の一端を明らかにしたことになる。さらに、生体の高リン状態と代謝の関係を明らかにすべく、高リン食摂取時の肝臓のDNAマイクロアレイ解析に既に着手していることがその理由である。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまで生体の高リン状態とエネルギー代謝の関係についてはほとんど報告がなかった。今回、高リン食摂取時の肝臓のDNAマイクロアレイ解析によって、エネルギー代謝が影響を受けることを明らかにした。さらに、メタボローム解析によって遺伝子発現解析の結果が一部検証された。またこれらの変化の鍵となる分子としてFGF21を見いだした。これらのことより、高リン食摂取による生体の変化の新しい側面が明らかになったことが主な理由である。また、マイクロアレイ解析の結果から代謝物や血中のタンパク質の量的変化をある程度予測でき、バイオマーカー探索のアプローチとして妥当であることが確認できたことももうひとつの理由である。現在行なっている高リン食摂取肝臓のマイクロアレイ解析をさらに進め、肝臓で起こっている遺伝子発現変動からどのような代謝の変化が起こっているかを予測する。分泌タンパク質の変動だけでなく、代謝物の変化も視野にいれ、必要に応じてメタボローム解析も行なう。副甲状腺、甲状腺については解剖学的に採取が困難であったため、一旦保留とし、詳細なデータがとれている腎臓と肝臓を中心に今後研究を進めていく予定である。3週間の高リン食摂取の影響に関する解析を進めつつ、より短期の高リン食摂取で起こる変化について同様にマイクロアレイ解析を用いて捉える。現在行なっている高リン食摂ラット取白色脂肪組織のマイクロアレイ解析をさらに進め、肝臓での代謝の変化とのクロストークについて検討する。
非クラマース結晶場基底状態をもつ重い電子化合物の 高磁場NMRによる研究

大きな有効質量を持つ重い電子系においては,磁場効果の実験は重い電子状態を調べる上で重要な手法である.電子状態が4f1電子状態である典型的な重い電子化合物CeCu6と5f2電子状態であるUBe13およびPrOs4Sb12について強磁場NMR実験を行った.CeCu6ではNMRから求められた準粒子磁化率は磁場によって抑制されることが分かり,共鳴近藤モデルによって説明できる.一方,UBe13では磁場によるナイトシフトや緩和率の抑制は10%程度と小さく,観測された磁化率の約90%近くがヴァンブレック磁化率であることがわかったf2電子状態を持つ重い電子の準粒子磁化率はf1電子状態を持つ重い電子と異なることが明らかとなった.大きな有効質量を持つ重い電子系においては,磁場効果の実験は重い電子状態を調べる上で重要な手法である.電子状態が4f1電子状態である典型的な重い電子化合物CeCu6と5f2電子状態であるUBe13およびPrOs4Sb12について強磁場NMR実験を行った.CeCu6ではNMRから求められた準粒子磁化率は磁場によって抑制されることが分かり,共鳴近藤モデルによって説明できる.一方,UBe13では磁場によるナイトシフトや緩和率の抑制は10%程度と小さく,観測された磁化率の約90%近くがヴァンブレック磁化率であることがわかったf2電子状態を持つ重い電子の準粒子磁化率はf1電子状態を持つ重い電子と異なることが明らかとなった.本研究ば、核磁気共鳴(NMR)を主たる研究手段とし、Pr化合物やU化合物などのf^2非クラマース結晶場基底状態をもつ重い電子化合物および重い電子超伝導について、結晶場や軌道自由度とその重い電子状態との相関を明らかにし、これらの系で発現する重い電子の起源にせまることを目的とする。本年度は重い電子超伝導体PrOs_4Sb_<12>,UBe_<13>について単結晶強磁場精密NMR測定により、局所スピン密度を解析することで、f^2電子状態に起因する重い電子状態および重い電子超伝導状態を調べた。PrOs_4Sb_<12>では、磁場を[001]軸方向に印加し、Sb-NMRの核スピン格子緩和率1/T_1とナイトシフトの磁場・温度依存性を測定した。9テスラの磁場でSbの局所スピン密度を決定し、ナイトシフトの異方性がバンド計算より指摘されているa_u対称性と一致することを明らかにした。また、常伝導状態の超微細結合定数およびNMR緩和率の磁場依存性がf^2結晶場準4重項状態に特徴的な八極子を考慮することで説明可能であることを明らかにし、多極子揺らぎによる重い電子状態が実現されている可能性を指摘し、新しいタイプの重い電子機構へ手がかりを得た。UBe_<13>では、重い電子状態を明らかにするためにBe-NMR緩和率の磁場依存性を17テスラまでの磁場範囲で測定した。7テスラの磁場までは1/T_1はキュリーワイス的な温度依存性を示し、2テスラ以下で重フェルミ流体状態であるコリンハ則がみられる。一方、16.5テスラでは5K付近でキュリーワイス的な温度依存性からずれはじめコリンハ則に近づくことが明らかとなり、この系での重い電子状態に近藤効果が重要であることが微視的な観点から明らかとなった。そのほか超伝導関連物質としてFe系超伝導の研究も行った。f2非クラマース結晶場基底状態をもつ重い電子超伝導について核磁気共鳴に(NMR)より、重い電子状態と結晶場や軌道自由度との相関を明らかにし、重い電子の起源にせまることを目的とした。(1)単結晶強磁場精密NMR測定により、f2電子状態とf1電子状態に起因する重い電子状態の違いを明らかにし、(2)角度分解NMR実験により、結晶場縮重度と四極子(高次多極子)自由度と重い電子状態の関係を明らかにし、重い電子状態に関する知見を得るために、以下の実験を実施した。PrOs4Sb12ではシフトや緩和率の磁場依存性から、結晶場励起を通した重い電子状態が実現していることを明らかにし、特に磁気八極子揺らぎがNMR緩和率やシフトの磁場依存性と関係していることを明らかにした。UBe13は常伝導状態の緩和率のBeサイトIおよびサイトIIにおける温度依存性を測定し、単純な磁気構造による磁気形状因子では説明できない温度依存性を明らかにした。また、NMR緩和率の磁場依存性を17テスラまで高磁場まで測定し、磁場依存性がほとんど見られないことを見いだした。f2系との比較物質として典型的な近藤効果による重い電子状態を示すCeCu6のCu-NMR実験を行った。超微細相互作用を決定し、ナイトシフトの磁場依存性から、重いフェルミ流体状態であることを示唆する結果を得た。本研究では、核磁気共鳴に(NMR)より、f2電子状態とf1電子状態に起因する重い電子状態の違いを明らかにし、角度分解NMR実験により、結晶場縮重度と四極子(高次多極子)自由度と重い電子状態の関係を明らかにすることである。本年度は以下の結果を得た。f2に対する比較物質としてf1系重い電子化合物CeCu6の強磁場でのNMRシフト、緩和率、磁化率測定した。

磁場印加によりCe 4f1の近藤1重項状態が破壊される近藤共鳴モデルで説明できることを示し、重い電子状態が近藤一重項形成によるものであることを微視的に明らかにした。UBe13においてBeサイトIIに磁場を印加した場合のナイトシフトおよびNMR緩和率の磁場依存性を17テスラまで測定した。UBe13では近藤温度が6 K程度で約1000mJ/molK2に相当するナイトシフトや緩和率の増大が観測される。17テスラの磁場では近藤状態が破壊されるため、ナイトシフトや緩和率の絶対値が強く抑制されると考えられたが、その抑制は予想の10分の1程度であった。このことは、U系の電子状態がf2であり、重い電子形成の起源が通常の磁気的近藤効果ではなく、Coxらによって予測されている四極子近藤効果であるか、もしくは、三宅らによって予測されているf2系に特有の結晶場一重項と近藤一重項の競合による効果であると考えられる。超伝導状態では、ナイトシフトは超伝導転移温度Tc以下T*まではすべての磁場方向でナイトシフトが変化しないことを明らかとなり、奇パリティ超伝導状態であることがわかった。一方T*で表面インピーダンス測定やナイトシフトに異常が現れることから、T*以下で磁束格子のピニングもしくは超伝導電子密度の変化が起きている可能性が高い。以上より、重い電子形成の起源はf電子の状態がf1状態かf2状態かに強く依存することを明らかにした。これまで、PrOs4Sb12のシフトや緩和率の磁場依存性から、混成が少ない場合のf2電子状態が明らかとなり論文として掲載された。一方、UBe13は常伝導状態のシフトおよび緩和率の磁場依存性より、重要な成果が得られたが、極低温実験については、学内・研究基盤センターのヘリウム液化機の故障により、液体ヘリウムを十分に入手できず、やや遅れた。液化機はH23年12月に故障した原因は、ヘリウム精製機へのオイルミストの混入による故障で、復旧には高圧ガス関連法令に従った設備変更が必要であり、完全復旧までH24年7月頃まで要した。H23年12月H24年3月まで、外部業者より液体ヘリウムを購入してきたが、欧米のヘリウムガス輸出事情のためとの理由で、購入が極端に難しくなったため、広島大学との共同研究により磁化測定を行うなどして、研究を遂行した。24年度が最終年度であるため、記入しない。ウラン化合物は、法律により、試料の移動が容易ではない。一方、CeCu6などの希土類化合物では、比較的容易であるため、広島大学・先端物質科学研究科・世良研究室との共同研究により、強磁場磁化測定を行い比較対象物質であるCeCu6のf1系の研究を推進し、対応した。復旧後は、速やかに、UBe13のナイトシフトの測定を開始する。
Germanene on Insulators: Towards the realization of a 2D topological insulator

本研究課題は、理論的に予測されるそのトポロジカルな性質を測定可能なGe製グラフェン様二次元材料「ゲルマネン」の作製を目的としている。そのために必要なのは、ゲルマネンを成長するための適切な基板を見つけることである。平成29年度は、ZrB2上シリセンを基板としてGeを蒸着し、ゲルマネン作製を試みた。その過程で、シリセンの格子にGe原子が取り込まれたシリセン-ゲルマネン原子層混晶が形成され、Geの固溶量は、Si原子5に対してGe原子1のときに飽和することが走査トンネル顕微鏡(STM)観察と内殻光電子分光測定により明らかとなった。この原子層混晶に関して、角度分解光電子分光(ARPES)を用いて、Ge固溶量をパラメータとした電子状態変化を測定したところ、シリセン由来のバンドの分散幅がGe量に応じて増大する様子が観察された。ダイヤモンド構造のバルクSi-Ge混晶と同様、蜂の巣格子においても混晶によるバンドエンジニアリングが可能であることが実証された。Ge蒸着量を、固溶限を超えて増やすと、シリセンに代わって様々な別の二次元構造が表面を覆う様子がSTMにより観察された。これらの構造の詳細は現時点では不明であるが、結晶の回転対称性がゲルマネンと異なることが明らかとなった。また、ZrB2上に形成された絶縁性原子層六方晶窒化ホウ素(hBN)上にGeを蒸着し、ゲルマネンの形成を試みた。室温で蒸着したところ、アモルファス層が形成され、蒸着後に加熱したところ、hBN層に欠陥が生じた。この不安定性から、ZrB2上hBNは基板として適当ではないと結論した。以上のゲルマネン作製の試みと並行して、トポロジカルな性質をより高温で観測できることが期待されるスタネンの作製を試みた。InSb(111)ウェハを基板としてSnを蒸着したところ、結晶性に優れた一原子層、二原子層厚みのSn層を成長できた。SiとGeからなる混晶蜂の巣格子を作製し、その電子状態が混合比に応じて変化することを実験的に明らかにしたことは、注目すべき成果である。現在、論文を作成中である。また、シリセン、および、hBNをバッファ層としたZrB2上へのゲルマネンの成長は、期待できないことが明らかとなった。ゲルマネンとの格子整合性に優れた半導体層状物質であるInSeの薄膜を成長する準備として、pBNるつぼを購入し、カルコゲナイド薄膜の成長に利用している超高真空分子線エピタキシー装置の既設置のKセルにInを導入した。Se用のKセルは既に導入されているため、これでInSe薄膜の成長が可能となった。トポロジカルな性質を測定するためには、ゲルマネンの表面を不活化し、酸素との反応を抑制する必要がある。水素終端を一つの方策として考えており、現在ゲルマネンの成長とSTM観察を行なっている超高真空装置に原子状水素源を導入し、条件出しを終えた。次年度は、Si(111)上にInSe薄膜をエピタキシャル成長する実験を進める。表面が平坦、かつ、結晶性に優れた薄膜が得られる条件を見出す。その後、最適化されたInSe薄膜を、ゲルマネンの成長を行なっている超高真空チャンバーに移送してGeの蒸着を行い、STMにより評価する。ゲルマネンである可能性がある二次元状Ge層を成長することができたら、放射光施設において同様の蒸着実験とARPESによる電子状態測定を行い、自立したゲルマネンについて理論で予測されるのと同様のバンド構造を有するのか、を明らかにする。また、並行してInSe上のGe層と、InSb上のSn層の大気中での安定性を調べ、特に後者の安定性が確認されたら、放射光施設におけるARPES測定を行う。大気中で酸化されてしまうようであれば、水素終端による不活化、および、酸化物による保護膜の作製に取り組む。平成30年5月にカナダで、6月にオランダで開催される国際会議で招待講演を行うための旅費を確保するために、平成29年度予算の一部を平成30年度に移行した。また、ゲルマネンの成長に使用しているSTM装置の一部の機能が故障し、業者に不具合を確認してもらったところ、部品の調達に時間がかかり、修理が完了するのはどうしても平成30年度になる、ということだったので、修理費用として平成29年度予算の一部を平成30年度に移行した。
魚類NK細胞が担う細胞性免疫機構解明と細胞性免疫を誘導する免疫賦活剤の開発

魚類養殖において、細胞内に侵入し増殖する細胞内寄生細菌やウイルスによる感染症が大きな問題となっている。特にブリ類のノカルジア症は、国内で発生する魚病被害額の1530%に匹敵するほどの甚大な経済損失をもたらしており、対策が求められている。これら病原体に対する感染防御に重要な役割を担うリンパ球として、ナチュラルキラー(NK)細胞が知られているが、魚類におけるNK細胞の特性や機能は不明である。本研究では、これら感染症におけるNK細胞の役割やその免疫機構解明を目指す。さらに、NK細胞の活性化を指標とした細胞性免疫誘導性の免疫賦活剤開発を行い、養殖魚の感染症被害軽減を目指す。
免疫機能を付与した小腸オルガノイドによる次世代バイオモデル開発研究

多能性幹細胞は、その極めてユニークな性質から基礎生命科学のみならず、再生医療、創薬、薬剤毒性検定等次世代の医療開発へ貢献している。しかし、現行の培養方式では分化誘導体に生理活性の機能性を持たせることは極めて困難である。申請者らは、培養ディッシュ内で蠕動様運動、吸収や分泌能などのヒト腸管の機能を有する立体組織(ミニ小腸)の創成に世界で初めて成功した。このミニ小腸は、LGR5陽性腸管上皮幹細胞、腸内分泌細胞、Paneth(パネート)細胞、杯(ゴブレット)細胞やM細胞など生体腸の上皮系細胞を備えるだけでなく、平滑筋細胞、カハール介在細胞や腸管神経叢も有するヒト小腸組織構成に類似した組織構造をもつ。本研究では、この独自性の高いミニ小腸基盤技術を応用し、ヒト腸の発生を可視化できるシステムとして小腸幹細胞(LGR5陽性)と腸管神経叢の成熟化(PHOX2B,SOX10等陽性)を経時的に観察するバイオリソースを開発する。今年度は、小腸幹細胞/神経叢成熟可視化モデル構築として、小腸上皮組織のみならず粘膜以外の間質部分も成熟化し機能性も獲得した超機能化ミニ小腸を作製するために、小腸幹細胞のマーカーであるLGR5と腸管神経のマーカーPHOX2Bの発現が同時に別色素で可視化できる多能性幹細胞を作製した。ミニ小腸の分化誘導過程では、LGR5陽性(緑色蛍光)とPHOX2B(赤色蛍光)のダブルポジティブ動態を確認することが出来た。神経堤細胞の発生からフォローアップできる系を初めて構築することが出来た。発生学的にヒト腸管発生を解析する非常に有用なバイオツールとなり得る。当初予定通り、LGR5とPHOX2Bのデュアル可視化モデルを構築することが出来た。ミニ小腸分化誘導過程でも機能することを確認し、小腸発生とともに神経堤細胞の成熟も可視化できる系を初めて構築した。免疫系細胞の含有として、疾患動態にも大きく関与する組織マクロファージの導入を行っていく。(理由)試薬の納品が年度内に間に合わなかったため。(使用計画)残金は、消耗品費として使用する。
選択的核内受容体調節薬による遺伝子選択的発現調節機構の解明

核内受容体は様々な生理作用に関与し、内分泌疾患、代謝疾患、がんなど様々な疾患に関与していることが明らかとなってきている。核内受容体の生理機能及び活性の制御機構の解明は、核内受容体を分子標的とした治療薬の開発に非常に重要である。中でも選択的核内受容体調節薬(SNRM)として作用する医薬品が臨床で使用され、作用機構に遺伝子選択的発現調節が関与していることが示唆されているが、分子メカニズムはほとんど明らかとなっていない。本研究はその分子メカニズムを明らかにすることにより新たな創薬の基盤になる知見を見出すことを目的としている。
がん抑制遺伝子FBXW7の子宮筋における機能と子宮肉腫との関わりについての解析

がん抑制遺伝子として注目される遺伝子Fbxw7の婦人科腫瘍における発現について検討を行った。婦人科悪性腫瘍で大きな死因の一つとなっている卵巣癌では、良性卵巣腫瘍、境界悪性腫瘍に比べてFbxw7の発現が低く抑えられていること、卵巣癌の中でも進行期が進むとFbxw7の発現が低下することが明らかとなった。この結果から、卵巣悪性腫瘍の形質獲得とその進展にFbxw7の発現を抑制する機構が関わっている可能性が示唆された。Fbxw7は近年、種々のがんで変異が報告され注目されつつある分子である。本研究では、この細胞周期を制御するがん抑制遺伝子Fbxw7の子宮平滑筋、および子宮肉腫における発現について解析を行った。Fbxw7の3つのアイソフォーム(α、β、γ)のうち、γは筋組織特異的な発現を示し、子宮平滑筋の増殖、分化への関与が期待されたが、本研究により実際には子宮平滑筋での発現はなく、αアイソフォームの機能が子宮平滑筋で重要であることが示唆された。また、婦人科腫瘍で大きな死因となっている卵巣癌におけるFbxw7の発現解析を行い、良性卵巣腫瘍、境界悪性腫瘍に比べてFbxw7の発現が低く抑えられていること、卵巣癌の中でも進行期が進むとFbxw7の発現が低下することを明らかにした。さらに、子宮におけるFbxw7の生理学的役割を解析する目的で、子宮特異的なFbxw7ノックアウトマウスを作製した。当該年度においては、Fbxw7コンディショナルノックアウトマウスを交配して増やし、子宮特異的に遺伝子をノックアウトするため、Cre recombinaseを発現するアデノウイルスを作製し、このウイルスが機能することを培養細胞で確認した。ノックアウトマウスの解析に関しては、当初の予定通り、平成22年度に行う予定である。本研究では、この細胞周期を制御するがん抑制遺伝子Fbxw7の子宮平滑筋、および子宮肉腫における発現について解析を行い、Fbxw7の3つのアイソフォーム(α、β、γ)のうち、筋組織特異的な発現を示すγの子宮平滑筋の増殖、分化への関与が期待されたが、実際には正常子宮平滑筋での発現は認めなかった。さらに、子宮におけるFbxw7の生理学的役割を解析する目的で、子宮特異的なFbxw7ノックアウトマウスを作製を行っており、Fbxw7コンディショナルノックアウトマウスを交配して増やし、子宮特異的に遺伝子をノックアウトするため、Cre recombinaseを発現するアデノウイルスを作製している。今後、このノックアウトマウスの解析を行うことが今後の研究課題である。
総合的画質定量評価法に基づく歯科用デジタル画像診断システムの至適画像表示法

近年医用画像のデジタル化が加速しており、一般歯科開業医においても、従来のフィルムに替えてデジタル診断システムを導入する機運が高まっている。しかしながら、デジタル画像の至適画像表示法については一定の見解が得られておらず、デジタル画像に含まれる豊富な情報量が、診断・治療に反映されているとは言い難い。そこで、まず、独自に開発した総合的画質定量評価用ファントムを用いて、フィルムと各種デジタルシステムにおける低コントラスト検出能を評価した。次に、同じ検出系と同じ観察者を用いて、抜去歯の隣接面齲蝕診断能について評価した。相関分析を行ったところ、低コントラスト検出能と齲蝕診断能には強い相関があることがわかった。フィルムと各種デジタルシステムの診断能には有意差は認められなかったが、線量変化に伴う変化を各モダリティ毎に比較した場合、フィルムとデジタルシステムには大きな相違が見られ、デジタルシステムでは線量変化に伴う低コントラスト検出能変化、齲蝕診断能変化が大きいことがわかった。ただし、自動線量補償機構を備えたデジタルシステムでは、このような線量に伴う変化はわずかであった。このような現象がなぜ生じるのかを解明するために、画像コントラストを詳細に分析したところ、デジタルシステムの画像コントラスト特性がフィルムの画像コントラストと全く異なっており、低線量域での画像コントラストが、フィルムに比較して著しく低下していることが判明した。そこで、低線量域の画像コントラストを強調し、高線領域の画像コントラストを抑制する画像表示法を開発し、実際の画像に適用してみた。その結果、全体的にコントラストの改善が見られ、特に低線量域の画質が向上し、フィルムと同様のコントラストが得られた。このような画像表示法は汎用性があり、今回検討の対象としなかった他の歯科用デジタルシステムにも応用可能と思われた。デジタル画像の至適処理法を始めとする画像表示法については一定の見解が得られておらず、画像処理法、画像表示法については各使用者が好みに応じて種々に運用しており、そのためデジタル画像に含まれる豊富な情報量が、診断・治療に反映されていない。本研究は、研究代表者らがこれまで蓄積してきた歯科用デジタル画像の物理的、臨床的特性に基づき、疾患の種類に応じてその診断能を最大にする至適画像表示法を開発することを目的とし、平成17年度は以下について検討を行った。1.各種デジタルシステムの物理的性能評価各種デジタル画像診断システムの物理特性として、コントラスト特性、解像度、感度について、研究代表者らが開発した独自の分析システムを用いて定量的に性能評価した。2.各種デジタルシステムの心理物理特性評価次に、2種類の低コントラスト視覚評価用ファントムを開発し、上記システムより得られた画像を観察者に提示し、Perceptibility Curveテストにてシステムの心理物理特性を評価した。3.観察者の齲蝕診断能の評価上記デジタル画像診断システムを用いて、抜去歯のデジタル画像を取得した。それらの画像を観察者に提示し、ROC解析にて齲蝕診断能を評価した。4.システムの物理特性と心理物理特性および診断能との相関1.にて得られた3種類の物理特性と2.にて得られた心理物理特性、および3.にて得られた齲蝕診断能との相関について、回帰分析にて評価した。その結果、システムのコントラスト特性と心理物理特性および齲蝕診断能に強い相関が見られた。これらの結果を用い、次年度は最大の診断能が得られる至適画像表示法の開発を進める予定である。

そこで、まず、独自に開発した総合的画質定量評価用ファントムを用いて、フィルムと各種デジタルシステムにおける低コントラスト検出能を評価した。次に、同じ検出系と同じ観察者を用いて、抜去歯の隣接面齲蝕診断能について評価した。相関分析を行ったところ、低コントラスト検出能と齲蝕診断能には強い相関があることがわかった。フィルムと各種デジタルシステムの診断能には有意差は認められなかったが、線量変化に伴う変化を各モダリティ毎に比較した場合、フィルムとデジタルシステムには大きな相違が見られ、デジタルシステムでは線量変化に伴う低コントラスト検出能変化、齲蝕診断能変化が大きいことがわかった。ただし、自動線量補償機構を備えたデジタルシステムでは、このような線量に伴う変化はわずかであった。このような現象がなぜ生じるのかを解明するために、画像コントラストを詳細に分析したところ、デジタルシステムの画像コントラスト特性がフィルムの画像コントラストと全く異なっており、低線量域での画像コントラストが、フィルムに比較して著しく低下していることが判明した。そこで、低線量域の画像コントラストを強調し、高線領域の画像コントラストを抑制する画像表示法を開発し、実際の画像に適用してみた。その結果、全体的にコントラストの改善が見られ、特に低線量域の画質が向上し、フィルムと同様のコントラストが得られた。このような画像表示法は汎用性があり、今回検討の対象としなかった他の歯科用デジタルシステムにも応用可能と思われた。
液体炭化水素燃料のデトネーション起爆に関する研究

燃焼速度が通常の燃焼の約1000倍にもおよぶ爆発的な燃焼の一形態であるデトネーションの応用例の一つとして,間欠的にデトネーションを発生させ推進力または動力を高効率に得るパルスデトネーションエンジン(PDE)がある.液体燃料は可運性が高く取り扱いが容易でPDEの実用化にはその利用が不可欠である.しかし液体燃料・空気混合気の起爆には困難が伴う.本研究では液体燃料・空気混合気を効率的に起爆するため,起爆に対する影響因子を明らかにする.17年度は,プレデトネータ出口近傍の形状が起爆特性に及ぼす影響を調べた.プレデトネータ出口近傍の形状は,連続運転を行うためには死水領域が無いコーン形状の推力壁が適しているため,コーン形状と従来の急拡大形状の推力壁で起爆状態を比較した.その結果,コーン形状は,急拡大形状に比べてプレデトネータに充填する爆発性の強い混合気が多く必要であることが明らかになった.次に,コーン形状と急拡大形状の推力壁を用いて,プレデトネータと推力壁の距離を変化させて起爆実験を行った.コーン形状では,プレデトネータとの距離に対して起爆状態に変化が見られなかったのに対し,急拡大形状では,距離を近づけると爆に必要な爆発性の強い混合気の量が減り,起爆しやすくなった.これらの結果から類推すると,急拡大形状の推力壁は起爆を促進する効果があるのに対し,コーン形状にはこの効果が小さいと考えられる.したがって,起爆しやすい形状と連続運転に適した形状はトレードオフの関係にある可能性がある.このトレードオフの詳細を明らかにし,これを改善すべく更なる研究が必要である.燃焼速度が通常の燃焼の約1000倍にもおよぶ爆発的な燃焼の一形態であるデトネーションの応用例の一つとして,間欠的にデトネーションを発生させて推進力または動力を高効率に得るパルスデトネーションエンジン(PDE)がある.液体燃料はエネルギー密度が大きく扱いが容易でありPDEの実用化には不可欠である.しかし液体燃料・空気混合気を起爆するには困難が伴う.本研究では液体燃料・空気混合気を効率的に起爆するため,起爆に対する影響因子を明らかにする.本年度は液体燃料を作動燃料とするPDEを用いて,液体燃料・空気混合気を安定に起爆する方法およびその条件を調べた.酸化剤を空気とした場合,アセチレン,エチレン等の非常に起爆性の高い燃料を除いて炭化水素燃料のデトネーションを発生させるのは容易ではない.このため本装置では,燃料・酸素混合気を充填した比較的体積の小さなイニシエータ内でデトネーションを発生させ,これを主燃焼室の燃料・空気混合気に伝播させてこれを起爆する方法を用いた.また燃料にはホワイトガソリンを用いた.イニシエータを用いた燃料・空気混合気の起爆において最も重要な支配要因は,イニシエータから主燃焼室に溢れ出した燃料・酸素混合気の体積であることが明らかになった.すなわち起爆の成否はイニシエータ体積に因らない.デトネーションは小さな領域から大きな体積に伝播する際,適当な条件が整っていない場合には減衰し伝播することができない.イニシエータから主燃焼室に溢れ出た燃料・酸素混合気はイニシエータ出口でのデトネーションの減衰を低減する.したがって,イニシエータから溢れ出る混合気体積が十分である場合には,デトネーションは減衰することなく,主燃焼室内の燃料・空気混合気を起爆することができる.今後は液体燃料の蒸発状態がデトネーションの起爆および特性に及ぼす影響を調べるべく研究を行う.燃焼速度が通常の燃焼の約1000倍にもおよぶ爆発的な燃焼の一形態であるデトネーションの応用例の一つとして,間欠的にデトネーションを発生させ推進力または動力を高効率に得るパルスデトネーションエンジン(PDE)がある.液体燃料は可運性が高く取り扱いが容易でPDEの実用化にはその利用が不可欠である.しかし液体燃料・空気混合気の起爆には困難が伴う.本研究では液体燃料・空気混合気を効率的に起爆するため,起爆に対する影響因子を明らかにする.16年度は,起爆に及ぼすイニシエータ出口形状の影響を明らかにするべく装置の改良を行った.従来の装置ではイニシエータ出口部分の形状変更が困難であったため,装置全体をモジュール化し,形状を自由に変更できるようにした.イニシエータ近傍の主燃焼室形状は,PDEの連続運転に不可欠な既燃ガスの掃気に対しても影響するため,イニシエータ出口近傍の形状はデトネーションの起爆と既燃ガスの掃気のいずれにも最適である必要がある.研究の結果,デトネーションの起爆には推力壁とイニシエータ出口の距離に関係する傾向が見られた.この距離は,ある程度まで短くすることで起爆の安定性が増す傾向にあつた.しかし,既燃ガスの掃気の観点からは推力壁とイニシエータがある程度離れていた方が掃気の短時間化に対する対策を取りやすい.このためデトネーションの起爆と既燃ガスの掃気は,その対策がトレードオフの関係にある可能性が出てきた.燃焼速度が通常の燃焼の約1000倍にもおよぶ爆発的な燃焼の一形態であるデトネーションの応用例の一つとして,間欠的にデトネーションを発生させ推進力または動力を高効率に得るパルスデトネーションエンジン(PDE)がある.液体燃料は可運性が高く取り扱いが容易でPDEの実用化にはその利用が不可欠である.

しかし液体燃料・空気混合気の起爆には困難が伴う.本研究では液体燃料・空気混合気を効率的に起爆するため,起爆に対する影響因子を明らかにする.17年度は,プレデトネータ出口近傍の形状が起爆特性に及ぼす影響を調べた.プレデトネータ出口近傍の形状は,連続運転を行うためには死水領域が無いコーン形状の推力壁が適しているため,コーン形状と従来の急拡大形状の推力壁で起爆状態を比較した.その結果,コーン形状は,急拡大形状に比べてプレデトネータに充填する爆発性の強い混合気が多く必要であることが明らかになった.次に,コーン形状と急拡大形状の推力壁を用いて,プレデトネータと推力壁の距離を変化させて起爆実験を行った.コーン形状では,プレデトネータとの距離に対して起爆状態に変化が見られなかったのに対し,急拡大形状では,距離を近づけると爆に必要な爆発性の強い混合気の量が減り,起爆しやすくなった.これらの結果から類推すると,急拡大形状の推力壁は起爆を促進する効果があるのに対し,コーン形状にはこの効果が小さいと考えられる.したがって,起爆しやすい形状と連続運転に適した形状はトレードオフの関係にある可能性がある.このトレードオフの詳細を明らかにし,これを改善すべく更なる研究が必要である.
長期連続観測のためのコイルファイバー導波路/ポルフィリン薄膜科学センサーの開発

過酸化水素によるこれらチタンを含んだ有機薄膜の収スペクトルの変化を観察した。Ti(4-Py)Pの薄膜を約1.5%の過酸化水素溶液にひたして吸収スペクトルを測定したところ、吸収スペクトルに変化はなく、吸光度にも変化は見られなかった。また市販の30%過酸化水素溶液においても顕著な膜の色調は観察されなかった。また、膜は過酸化水素溶液に触れるとその機械強度が低下し、こするとすぐはがれ落ちてしまった。溶液中ではTi(4-Py)Pは過酸化水素によってSoret帯、Q帯ともに吸光極大波長が1015nmほどレッドシフトしており、今回の薄膜の結果とは対照的であった。Ti(4-Py)Pの吸光スペクトルが過酸化水素によって変化する機構として中心金属のチタンと過酸化水素の作用が考えられてているが、薄膜にすることによって、ポルフィリン環の中心のチタンに他の共存物質または近接するポルフィリン自体が配位することによって過酸化水素によるスペクトルの変化が見られないのであると思われる。TiPcにおいても同様に過酸化水素による吸光度スペクトルの変化は見られなかった。本研究ではまずTiT(4-Py)Pを用いて、過酸化水素によるTiT(4-Py)Pの吸収スペクトル変化を観測した。2.1mgのTiT(4-Py)Pに1mlの塩酸と5.6mlの硫酸を加え100mlに定容した溶液を作成し、この溶液を適当に希釈し吸収スペクトルを測定し、その溶液に過酸化水素を少量加え吸収スペクトルを測定した。その結果、433nmのSoret帯のの吸収極大が過酸化水素で442nmに、562nmのQ帯は577nmにそれぞれレッドシフトしていた。過酸化水素を作用させないときの酸溶液中の吸光極大波長とメタノール中のそれぞれの吸光極大波長は異なっており、酸溶液中のほうが35nmほどレッドシフトしていた。次にプラスチック光ファイバーにTiT(4-Py)Pを吸着させるための実験を行っている。光ファイバーの外側のクラッドはフッ素樹脂であるため、薬品安定性が高く、TiT(4-Py)Pを安定に修飾できないと考え、クラッドの表面に薬品処理することで凹凸をつけた上で有機溶媒に溶解した色素溶液を塗布する方法を検討中である。一方で平面型の導波路を作成し光を通す実験を行った。導波路は400420°Cで溶融した硝酸カリウム中にスライドガラスを24時間つけてイオン交換法で作成した。導波路にジブロムメタンをカップリングオイルとして用いた高屈折率プリズムで光導入を試みたが、スライドガラス全体に光が浸透し、作成された導波路のみに光を通すことに成功していない。今後は光ファイバーへのTiT(4-Py)Pの修飾、平面導波路の作成とその導波路表面へのTiT(4-Py)Pの修飾を行い、これらの過酸化水素に対する応答特性の評価を行っていく。
ウイルスベクターを用いたレスキューマウス作出による遺伝子機能解析法確立とその応用

Staggererマウスの解析:Staggererマウスは、転写因子であるRORαのリガンド結合ドメインの欠損による転写障害が原因である。RORαは脳内ではプルキンエ細胞に豊富に発現している。Staggererマウスで見られるRORαの転写障害は、遺伝性脊髄小脳変性症1型(SCA1)と共通していることが報告されているため、Staggererマウスの小脳異常をスライスパッチクランプ法で解析し、SCA1の病態理解を深めることを目的とした。Staggererマウスのプルキンエ細胞ではmGluR1を介する遅いEPSC及び、mGluR1を介するシナプス前抑制が全く観察されなかった。変異ataxin-1発現プルキンエ細胞の解析:レンチウイルスベクターを用いて変異ataxin-1を野生型マウスの小脳プルキンエ細胞に発現させた。その結果、プルキンエ細胞の形態、早いシナプス伝達、短期シナプス可塑性に異常は見られなかったが、mGluR1を介する遅いEPSC振幅の有意な減弱が観察された。さらにシナプス可塑性(LTD誘導)の障害も見られた。以上より、SCA1プルキンエ細胞では形態的及び通常のシナプス伝達に障害が見られる前に、mGluR1機能が障害され、これにより小脳失調を引き起こす可能性が考えられた。INPP4A欠損マウスの線条体神経細胞死のレスキュー:脱リン酸化酵素INPP4Aを欠損するマウスは、線条体ニューロンが神経細胞死を起こして脱落する。そこでレンチウイルスベクターを用いてINPP4A遺伝子を線条体ニューロンに供給し、神経細胞死を防ぐことを目的とした。生後2日のINPP4A欠損マウスの線条体に、INPP4A発現レンチウイルスベクターを接種し、3週間後に観察したところ、ウイルス感染細胞において神経細胞死がほぼ完全に抑制されていた。ウイルスベクターを用いた「遺伝子レスキューマウス」作出による解析は、ポストゲノム時代において汎用性の高い効果的な研究手法となる可能性がある。しかし、そのためにはウイルスベクターを細胞特異的に効率的に感染させ、その細胞で遺伝子発現を効率的に制御できる必要がある。レンチウイルスベクターは神経細胞に比較的親和性があり注目を集めていたが、その性質については多くのことが不明であった。そこで本研究では、以下の項目を目的とした。(1)レンチウイルスベクターの改良と評価(1)標的遺伝子とマーカー(GFPなど)遺伝子の2つの遺伝子の発現を可能にする(2)5kb以上の遺伝子を発現可能な高力価ベクターを開発する。(3)レンチウイルスが細胞選択的に感染する機構を解明する。(2)レスキューマウス作出による遺伝子機能解明と臨界期の検討自然発生(Hotfoot5Jなど)、人工(遺伝子ノックアウト)の運動失調マウスにレンチウイルスベクターを用いて野生型遺伝子を発現させ運動失調のレスキューを試みる。また細胞レベルでは何がどの程度レスキューされているのかを形態学的、電気生理学的に調べる。この実験を通してそれぞれの遺伝子の機能、シグナル伝達様式、臨界期について明らかにする。ウイルスベクターを用いて神経細胞に遺伝子発現させ,その影響を小脳スライスパッチクランプ法で調べるには,標的遺伝子に加えて蛍光マーカーも同時に発現させることが必要となる。2つの遺伝子の同時発現には,2つのプロモーターを用いる方法と,IRES配列を用いる方法があるが,これまでの研究ではレンチウイルスベクターを用いた場合は,いずれの方法もうまくいかなかった。そこで,標的遺伝子とGFPの間にself-cleaving2Aペプチド(P2A)配列を挿入する方法を検討した。P2A配列,D(V/I)EXNPGPはPicornavirus由来で,細胞内でG(グリシン)とP(プロリン)の間で自然に切断される。GFPと目的遺伝子の間にP2A配列を挿入した融合コンストラクトをレンチウイルスベクタープラスミドに組み込んだ。ウイルス粒子を作製後,マウス小脳に接種し1週間後に小脳を調べたところプルキンエ細胞にGFPの発現が観察された。Western blotにてGFPと目的遺伝子産物が切り離されているのも確認した。このようにレンチウイルスベクターを用いた系においても,P2Aを介してGFPと目的たんぱく質を同一細胞に発現させることが可能であることが明らかとなった。この方法を用いて,Staggererマウスの障害回復を試みるため,Staggererマウスを入手し交配させて数を増やしているところである。homozygousのStaggererマウスは生後30日あまりで死亡するため,繁殖には使用できない。そこでheterozygousのStaggererマウスを野生型とかけ合わせており,数も増え,2世代下のマウスまで得られている。本研究課題では、ウイルスベクターを用いてin vivoの小脳のプルキンエ細胞,顆粒細胞,抑制性介在ニューロンあるいはバーグマングリア特異的に,しかも広範囲に長期間にわたって遺伝子発現させる技術を確立し,これまで技術がないために解明されずにいた神経科学の難問の解明にとりくむことを目的とした。今年度は、まずMSCVプロモーターがプルキンエ細胞選択的に働くことを明らかにし報告した。さらに、これまで報告されている細胞特異的プロモーターに関して、プルキンエ細胞特異的プロモーター領域の同定、バーグマングリア特異的プロモーター領域の同定を行った。これらのプロモーターを組み込んだレンチウィルスベクターを用いて、遺伝性運動朱調マウスに外来遺伝子を導入することで、運動失調を改善させることに成功した。とくにデルタ2グルタミン酸受容体においては、細胞外アミノ末端ドメインが機能に重要であることを明らかにした。

小脳疾患の遺伝子治療を考えた場合、導入した遺伝子がどの程度発現しているのか非侵襲的に検査できれば有用である。そこで、ドーパミンD2受容体遺伝子をレポーターとし、末梢から静注した放射性薬剤(IBF)が、小脳プルキンエ細胞に発現させたD2受容体を認識できるのかを検討した。その結果、オートラジオグラフィにて、小脳のD2受容体遺伝子発現部位に一致してIBFの特異的結合が観察された。レポーターとしてはD2受容体全長である必要ではなく、IBFと結合する領域だけで十分と考えられる。このように、IBFと結合するD2受容体遺伝子領域は、脳疾患の遺伝子治療においてレポーターとなり得ると考えられ論文発表を行った。これまでにレンチウイルスベクターをもちいて、小脳の各種細胞に特異的に遺伝子発現させる技術を確立した。今年度はプルキンエ細胞特異的に遺伝子発現させる技術をもちいて、自然発生運動失調マウスの運動障害をレスキューできるのかを検討した。生後6日の運動失調マウスに欠損する遺伝子を導入したところ顕著な運動障害の回復が観察された。パッチクランプ法をもちいて小脳シナプス伝達及びシナプス可塑性を調べたところ、運動失調マウスで見られた異常はすべて回復していた。本研究成果は、自然発生の運動失調マウスを生後に遺伝子導入することで回復させたはじめての例である。第3世代レンチウイルスベクターは安全性が高く、細胞障害性もほとんどないと言われているが、本当に何の毒性もないのかは詳細に検討されていない。そこで、GFPを発現する高力価レンチウイルスベクターを、生直後のマウス小脳に接種し本当に神経細胞への毒性をもたないのかを検討した。生後0日でレンチウイルスベクターの接種を受けたラットのプルキンエ細胞を生後21日の時点で観察した。樹状突起を詳細に解析したところ、ウイルス感染したプルキンエ細胞の樹状突起の長さは約10%短かった。次にウイルス感染したプルキンエ細胞をパッチクランプ法で調べたところ、シナプスの成熟に有意な異常が見られた。これらの異常はウイルス感染による直接的な影響以外に、プルキンエ細胞の発達期にGFPを過剰発現させた結果である可能性もある。これら2つを見分けるために、極めて弱いL7プロモーターを組み込んだレンチウイルスベクターを用いて同様の実験を行った。その結果、シナプスの成熟異常は認められなかった。ただ、樹状突起の枝分かれや全体的な形態に軽度ではあるが有意な異常が観察されたことから、レンチウイルスベクターの感染自体が、わずかではあるが毒性をもつことが示唆された。Staggererマウスの解析:Staggererマウスは、転写因子であるRORαのリガンド結合ドメインの欠損による転写障害が原因である。RORαは脳内ではプルキンエ細胞に豊富に発現している。
表面増強ラマン散乱(SERS)の電子的発現機構に関する理論的研究

表面増強ラマン散乱(SERS)とは、特定の金属表面上で吸着分子のラマン強度が通常の10^6倍も大きくなる現象である。本研究では、このSERSの電子的発現機構を量子化学的なアプローチにより解明することを目指した。(1)遷移金属表面に吸着したCO,NO分子の電子状態:SERSの発現機構は、表面-分子間の相互作用と密接な関係があり、吸着分子の基底状態及び励起状態の電子構造が反映されると考えられる。そこで本研究では、遷移金属Ag,Pt表面に吸着したCO(下),NO(下)分子に対し、クラスターモデルを用いてHF/SE-CI法あるいはSAC/SAC-CI法によりその基底状態及び励起状態の電子構造を調べた。その結果、Ag_2,Pt_2表面にCO,NO分子が吸着している場合、クラスターの二電子励起状態と相互作用していることが示された。Ag_2表面ではその二電子励起状態はかなり不安定であり、結果として吸着安定化は得られないことがわかった。一方、Pt_2表面ではCO,NO分子ともに吸着安定化がみられた。そして、自由なCO,NO分子の最低励起エネルギーがそれぞれ8.5,5.5eV程度であるのに対し、Pt_2表面に吸着した系では2.5,1.8eVとかなり小さくなっていることが示された。これは、SERSの発現機構の一つと考えられている共鳴効果を容易にしていることを表している。一方、吸着系の電荷はCO,NOがそれぞれ+0.27,+0.31と比較的小さく、電磁気的効果は小さいことを示唆している。(2)吸着分子のラマン散乱強度の計算:気相及び吸着CO分子のラマン散乱強度を、時間依存ハートリーフォック(TDHF)法を用いて計算した。その結果、気相CO分子では入射光が1eVから6eVに変化するにしたがって次第に増加することが示された。しかし、7eV以上では計算が発散し、この方法では解が得られなかった。同様に、吸着CO分子の場合は1eVですでに発散が起こった。そこで本研究では、中間状態の寿命に対応する項を加えた計算をし、その寿命がゼロである極限値を用いる方法を提案した。
消化管粘膜細胞機能分化と酸性糖脂質

消化管粘膜を構成する細胞群の機能分化に応じた膜脂質構成の変化については既に報告しているが,種を越えて胃粘膜に硫糖脂質が富んでいること、これが酸加水分解に抵抗性であることから粘膜防御機構に関与している可能性を報告した。また粘膜障害に伴って膜構成脂質の変動が認められるか否かを検討し,リン脂質のうち特にPC(フォスファチジルコリン)の減少が着明であること,ガングリオシドの減少も有意であることなどを報告した。さらに外国性に投与じた硫糖脂質含有リポソ-ムがエタノ-ル・塩酸による実験潰瘍形成を有意に抑制することを見出した。このような動物実験に加え,ヒト消化管粘膜の系統的脂質分析を行い特に硫糖脂質については構造解析も行いその成果を現在論文として報告する予定である。さらに最近胃炎ならびに胃潰瘍の成因の一つとして注目されているHelicobacter pyloriが胃粘膜の酸性糖脂質を認識していることを見出し,平成3年度の日本消化器病学会に発表を予定している。このようなさまざまな成果に加え,酸性糖脂質の機能的意義を明らかにするため,酸分泌細胞である壁細胞においてその基本的反応機構をまず検討する必要から幾つかの基礎検討による実験結果を発表した。今后このような生理反応に対する酸性糖脂質の影響を調べていく予定である。また粘膜細胞の増殖や分化に対する酸性糖脂質の影響を調べる目的で種々の粘膜細胞の初代培養系の作成,株細胞の増殖動態の検討も開始している。