hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノウイルスベクター及びCRISPRを用いた受精卵における遺伝子組換えの効率化

しかし、ES細胞の性質の違いにより、この方法は、マウス以外で行うことが不可能であるため、現在、マウス以外の動物でノックインを行う場合、CRISPRとドナーDNAを受精卵に導入することにより行われている。非ヒトモデル動物であるマーモセットは、得られる卵子の数が少ないため、ノックイン動物を作製するためには、外来遺伝子のノックイン効率を上昇させる必要がある。そこで、ヒトES/iPS細胞において組換え効率を上昇させることが知られているヘルパー依存型アデノウイルスベクターを用いることにより、マーモセットの受精卵においてもノックイン効率を上昇させることができるのではないかと考え、試してみることにした。まず、マーモセットのES細胞に、ドナーDNAとCas9およびsgRNAを発現する遺伝子カセットをのせたヘルパー依存的アデノウイルスベクターを感染させたところ、それぞれをリポフェクション法で導入するより23倍高いノックイン効率が認められた。しかし、受精卵に導入する際、近年、Cas9はタンパク質にsgRNAを結合させた形で導入することが主流であること、ウイルスでドナーDNAを導入すると核に入るまでに時間がかかることなどから方針を変更した。アデノウイルスには、細胞においてゲノムDNAが切断された際の修復機構である、非相同末端結合を阻害する遺伝子が存在する。この遺伝子を発現させることによりドナーDNAの相同組換え効率が上がることを期待し、ドナーDNA、Cas9、sgRNAの発現カセットとともにマーモセットES細胞に導入したところ、ノックイン効率が23倍上昇した。将来的には、この結果をマーモセット受精卵で試す予定である。従来、ノックイン動物を用いる際はES細胞にターゲッティングベクターを導入し、ノックインされたことにより薬剤耐性になったものを選択することにより選別する方法が採用されてきた。しかし、ES細胞の性質の違いにより、この方法はマウス以外の動物では不可能であるため、CRISPRとドナーDNAを受精卵に導入する方法が採用されている。非ヒト霊長類モデル動物であるマーモセットは、得られる受精卵の数が他の動物と比べて非常に少なく、ノックイン効率を上昇させる必要性が高い。そこで、マーモセットES細胞を用いて組換えの頻度を上昇させる遺伝子の探索を行った。まず、受精卵にインジェクションする予定であるドナーDNAにネオマイシン耐性遺伝子を導入した後、このドナーDNAをCRISPRとともにマーモセットES細胞に導入し、組換えがおこることを確認する。同様の実験を、ヒトおよびマウスのドナーDNAおよびCRISPRを用いて行う。細胞は、それぞれ、ヒトiPS細胞およびマウスES細胞を用いる予定である。次に、組換えを更新させる方法を、マウスES細胞およびヒトiPS細胞を用いて探索する。ヘルパー依存型アデノウイルスベクターが感染することにより、組換え効率が良くなることが報告されている(Suzuki et al., PNAS, 2004)ので、まずこれについて試す予定である。
脳局所神経回路における回路トポロジーの自己組織的制御メカニズム

本研究では,急性脳スライス標本を用いた電気生理学実験と数理モデリング・シミュレーションを組み合わせることにより,局所神経回路活動のダイナミクスと自己組織化過程を解析した.その結果,自発活動によって生じる准安定的なニューロン集団ダイナミクスの遷移に伴い,回路構造が自律的に変化する様子を明らかにした.また,自己組織化の際にはシナプス結合強度の分布にある程度の頑健性があることが示唆された.従来それぞれ独立して研究されてきた,神経回路のトポロジー,神経回路のダイナミクス,及びシナプス可塑性を,脳のスライス標本を用いた電気生理学実験と数理モデル・シミュレーション研究を有機的に連携することによって統合的に研究し,これらの間の機能的連関を明らかにする.本研究では,急性脳スライス標本を用いた電気生理学実験と数理モデリング・シミュレーションを組み合わせることにより,局所神経回路活動のダイナミクスと自己組織化過程を解析した.その結果,自発活動によって生じる准安定的なニューロン集団ダイナミクスの遷移に伴い,回路構造が自律的に変化する様子を明らかにした.また,自己組織化の際にはシナプス結合強度の分布にある程度の頑健性があることが示唆された.本研究は,脳の局所神経回路の回路トポロジーを解析し,脳情報処理における機能的意義を明らかにすることを目的として計画された.その実現のために,局所神経回路トポロジーの計測システムを構築するとともに,実験データに基づいた脳局所神経回路のモデリング,シミュレーションをおこなっている.平成19年度においては,局所神経回路トポロジーの計測において中心的役割を果たす,多重電極を用いた複数のニューロンの活動の同時記録・解析法の改良をおこなった.本研究の実施において重要なポイントとして,ニューロン活動の記録時に解析のターゲットとするニューロンを定め,その活動を安定して記録することにある.そのために,これまでわれわれが提案してきた,周波数領域独立成分分析を用いたニューロン活動弁別アルゴリズムを,ディジタル信号プロセッサを有する小型コンピュータに実装し,リアルタイム処理できる装置を開発した.次に,神経組織内の回路モデルの骨格となる3次元神経組織モデルを構築した.これは,神経電極で記録される細胞外電位のゆらぎを解析した結果と,解剖学研究によって報告されている細胞密度等のデータに基づいて構築したもので,細胞外記録電極を刺入したときに観測される複数のニューロンの細胞外活動電位の時系列信号や振幅分布,パワースペクトル密度などを再現することができる.現時点では,ニューロン間の結合がないベースモデルであるが,神経活動の相関解析等に基づき,ニューロンの3次元的な結合トポロジーを導入することによって,現実の神経組織に近づけていく予定である.本研究は,脳の局所神経回路の回路トポロジーを解析し,脳情報処理における機能的意義を明らかにすることを目的として計画された.その実現のために,局所神経回路トポロジーの計測システムを構築するとともに,実験データに基づいた脳局所神経回路のモデリング,シミュレーションをおこなっている.平成20年度においては,くし型多重電極を用いて海馬CA3領域の複数ニューロン活動記録実験を行った.この電極は,記録点が直径およそ100μmの範囲に4つの記録点が配置された4重電極(テトロード)を100400μmで28本並べた電極である.このくし型くし型テトロードを用いて1電極あたり約6個のニューロン活動を同時に記録することができた.同時記録された個々のニューロン間において,単シナプス性,および多シナプス性結合の有無を修正スパイク相互相関解析法に基づいて判定した.その判定果に基づき, CA3領域の結合マップを作成した.その結果,自発活動時に機能しているニューロンの機能的結合は,解剖学的に知られている結合の半分程度に過ぎないことが明らかになった.従来のスパイク相互相関解析に基づく結合判定法では,シナプス結合強度を推定できないという問題があった.そこで,同時に記録されたニューロンの活動電位発生時系列からシナプス結合強度を推定するための新しい手法を開発した.これはニューロンの入出力特性の確率モデルに基づく方法であり,従来の修正スパイク相関解析法の自然な拡張となっている.海馬CA3領域で記録された実験データへ本手法を適用することによって,その有用性を明らかにした.本研究は,脳の局所神経回路の回路トポロジーを解析し,脳情報処理における機能的意義を明らかにすることを目的として計画された.そのために,局所神経回路トポロジーの計測システムを構築するとともに,実験データに基づいた脳局所神経回路のモデリング,シミュレーションをおこなっている.平成21年度においても,脳内の神経回路のトポロジーの計測実験と数理モデルのシミュレーション研究を行った.実験では,大脳新皮質および海馬において複数ニューロン活動記録とシナプス伝達特性の解析を行った.同時記録された個々のニューロン間において,単シナプス性,および多シナプス性結合の有無を修正スパイク相互相関解析法に基づいて判定した.モデル化・シミュレーションでは,中枢ニューロン回路の自己組織化において重要な役割を果たしていると考えられる,スパイクタイミング依存性シナプス可塑性(STDP)を組み込んだスパイク発生型神経回路モデルを構築し,自己組織化のプロセスを解析した.すでに報告されているように,全結合型STDP神経回路モデルをランダムノイズで駆動すると,ニューロンが同期的に活動する3つ程度のグループに分離し,それぞれが決まった順序で興奮を繰り返す同期発火連鎖が生じることが知られている.ニューロンが3つのグループにまとまってゆくプロセスを観察した.

その結果,類似した結合パターンをもつニュニロンが徐々にグループ化され,さらに類似した結合パターンを持つグループ同士が,階層的に統合されて最終的に3つ程度に集約されることを見出した.また,脳内においてはシナプス伝達に要する時間を要することに着目し.この遅延時間が同期発火連鎖の形成にどのように影響するかを調べた.その結果,最終的に形成されるグループ数に影響していることが明らかになった.大脳皮質神経回路におけるニューロンのダイナミクスと神経回路トポロジーの相互作用による自己組織化現象を明らかにするために,皮質神経回路モデルを構築し計算機シミュレーションによりその特性を解析した.皮質は興奮性細胞層と抑制性細胞層からなる2層構造とした.層内結合と層間結合のトポロジーを規定し,興奮性細胞間の結合にのみスパイクタイミング依存性シナプス可塑性(STDP)を導入した.ネットワークの構造は次のようにして構築した.まず,ニューロンを2次元平面上にランダムに配置し,軸索投射の空間分布に基づいてシナプス結合の有無を規定する構造(配線トポロジー)を与えた.配線トポロジーは,近傍結合構造を基にし,結合を確率pでランダムにつなぎ換えることにより回路のランダムさを連続的に制御した.皮質神経回路モデルをランダムノイズで駆動し,ニューロンの活動パターンと,STDPに基づいて自己組織化される神経回路構造(機能トポロジー)の時間経過を解析した.シミュレーションの結果,興奮性細胞層内のつなぎ換え確率をp<<1としたとき,皮質上を周期的に発生する興奮波が一方向的に伝播する回路が自己組織化された.p≒1にすると,散発的な興奮がみられるだけで,興奮波伝播は生じなかった.pを中間的な値にすると,20Hz程度の同期的興奮を呈するニューロン集団がクラスター状に形成されるようになり,pの値に依存して,帯状の興奮パターンや,クラスター間の散発的同期によって生じるUP/DOWN状態の交代現象が観察された.自己組織化の進行に伴って,ニューロン活動の同期の強さが変化し,引き続きネットワークのクラスター係数が追従する傾向がみられた.以上の結果は,遺伝プログラムによって規定された神経回路構造の上にシナプス可塑性メカニズムによって機能的回路が構築されるプロセスの一端を明らかにしたものであると考えられる.
微弱な遷移の検出に重点をおいたテラヘルツ域高精度分子分光

本研究では,テラヘルツ領域(1-6THz)の分光計(炭酸ガスレーザー差周波型波長可変遠赤外分光計)を用いて、測定のむずかしい分子カチオン、分子アニオンについてテラヘルツ域高精度分光測定を進めた。以下のように分子分光学における先鞭的なデータを得ることができた。1.OD^-イオン分子の回転スペクトル測定以前に測定したOH^-アニオンの同位体であるOD^-の測定を行い、新たに4本の純回転スペクトル線の周波数を精密測定することができた。これにより、従来、赤外スペクトルだけから算出されていた回転定数を2桁改良することができた。これについては論文を作成中である。2.分子イオンH_2D^+の分光測定星間分子で基本的な役割を演ずるH_3^+型の分子の同位体であるH_2D^+のスペクトル線を検出し、周波数測定を行った。このほかに数本の測定候補があり、測定をすすめるとともに論文作成の準備中である。3.イオン分子の測定法の改良イオン分子を感度良く測定できるように、extended negative glow方式の放電ができるようにした。これにより、これまでよりずっと容易にイオン分子の分光測定が進められるようになった。N_2H^+イオンで試験データが得られ、今後多くのイオン分子を対象に研究を展開できると期待している。本研究では、テラヘルツ領域(1-6THz)で高精度の分光計測を行なってきたわれわれの分光計(炭酸ガスレーザー差周波型波長可変遠赤外分光計)を用いて、世界に先駆けてさまざまな分子・イオンを対象に、テラヘルツ域高精度分光測定を進めること、特に、これまで進めてきた計測のうちでも難度の高かった分子カチオン、分子アニオン、高振動励起状態などの測定対象について微弱なスベクトル線の検出を達成し、分子分光学における先鞭的なデータを得ることを目的としている。今年度は以下のような研究の進展があった。1.分子イオン(H_2D^+およびD_2H^+)の分光測定まずはH_2D^+のスベクトル線を感度良く測定できるように、試料放電セルの改良を行った。このために、従来の液体窒素冷却セルにさらに直流磁場を加えてextended negative glow方式の放電ができるように準備した。セル全体に300ガウスの磁場がかけられるコイルを製作し、N_2H^+イオンのスベクトルでテストしたところ1桁以上イオンの生成量が増加し、検出感度が上昇することが確認できた。このセルを用いることによりH_2D^+のスベクトルも検出しやすくなるはずであるが、まだ、ガス混合比の最適値を探す実験をしているところである。また、この放電セルに適した放電電源を備品として購入することにした。2.OH^-イオンの同位体イオンの分光測定OH^-アニオンの同位体であるOD^-を測定するために、OH^-の測定で使っていた水冷試料セルを、液体窒素冷却セルに置き換えることにし、そのためのセルを製作準備した。1.OD-イオン分子の回転スペクトル測定以前に測定したOH-アニオンの同位体であるOD^-の測定を行い、新たに4本の純回転スペクトル線の周波数を精密測定することができた。

これにより、これまでよりずっと容易にイオン分子の分光測定が進められるようになった。N_2H^+イオンで試験データが得られ、今後多くのイオン分子を対象に研究を展開できると期待している。
Znフィンガータンパクによる外胚葉分化決定の分子機序

本研究では、哺乳類初期胚における神経外胚葉への分化の制御機序を明らかにするため、多能性幹細胞の試験管内分化系を用いて、この過程を制御する2つのZnフィンガータンパクの機能を解析した。まず、XFDL156のマウスのホモローグであるmZfp12を単離し、mZfp12の強制発現が、ES細胞からの中胚葉分化を抑制し、神経分化を促進することを明らかにした。さらに、新規のスクリーングでZfp521を単離し、これが未分化外胚葉から神経前駆細胞への分化に必須の遺伝子であることを証明した。本研究は、我々がアフリカツメガエルのアニマルキャップ実験系を用いて同定した未分化胚性細胞から外胚葉細胞への分化決定を制御するmultiple Zinc-finger protein XFDL156を中心とした分子発生学的解析により初期胚の神経外胚葉の発生制御機序を明らかにすることを目的としている。H21年度は、1つの重要な問題であるXenopusとマウスでの胚葉形成の分子機構の比較を中心に解析した。そのためにマウスES細胞からの試験管内分化系を用いて、哺乳類細胞における外胚葉形成でのXFDL156相同遺伝子の役割を詳細に解析した。マウスでの相同遺伝子としてZfp12があるが、我々が以前に開発した選択的神経分化誘導法(SFEB法)を用いて解析したところ、未分化ES細胞から神経外胚葉に分化する過程で発現が誘導されることが明らかとなった。一過性のプラスミッド発現系を用いてZfp12の強制発現を行ったところ、神経外胚葉への分化が促進された一方、中胚葉遺伝子マーカの発現は抑制されることが明らかとなった。具体的には、Activinや血清処理条件下に分化中のES細胞に誘導される初期中胚葉マーカ(Tなど)の発現をmZFP12の強制発現は抑制したが、逆にこれらの処理で抑制されるはずの神経分化マーカSox1などの発現効率はmZFP12の強制発現で上昇した。中胚葉以外の非神経系細胞(表皮外胚葉など)への分化に対する影響を現在解析中である。本研究は、未分化胚性細胞から外胚葉細胞への分化決定を制御するmultiple Zinc-finger proteinsを中心とした分子発生学的解析により初期胚の神経外胚葉の発生制御機序を明らかにすることを目的としている。前年度までに、両生類外胚葉形成に必須のmultiple Zinc-finger protein XFDL156の哺乳類細胞における役割相同遺伝子Zfp12があきらかにし、その強制発現が未分化ES細胞から外胚葉に分化する過程を促進することが判ったが、外胚葉から神経外胚葉への分化は別の因子が関与している可能性が示唆された。そこで、マウスES細胞を試験管内でSFEB法を用いて分化させ、その神経分化のごく初期に活性化させる遺伝子をスクリーニングしたところ、別のmultiple Zinc-finger proteinであるZfp521がその候補として同定された。Zfp521は、BMP4や血清などの神経分化の強い抑制因子の存在下でも、強制発現によりES細胞に高効率で神経分化を誘導することが判った。さらに、逆に、Zfp521をshRNAでノックダウンしたES細胞はSFEB法で分化培養しても、神経分化が起こらず、epiblastの状態に長く留まっていた。Zfp521をshRNAでノックダウンしたES細胞をblastocystに注入して、キメラ胚を作成した場合も、それらの細胞は脳領域への貢献が得意的に抑制されていた。これらのことは、Zfp521がES細胞の神経外胚葉への分化に必要な神経分化促進因子であることを示した。さらに、クロマチン共沈降法により、Zfp521はSox3などの神経初期遺伝子に結合すること、またそれらの遺伝子にp300を集積されることが確認され、Zfp521は初期神経前駆細胞特異的遺伝子の発現を正に制御する転写活性化因子であることが明らかとなった。本研究では、初期胚における中枢神経系発生の最も初発段階であるが、未だに不明な点の多い「多能性細胞から未分化外胚葉を経て、神経外胚葉(神経前駆細胞)へ分化する過程」の分子制御機序の解明を目指し、その過程を制御する分化決定因子の解析を行なった。そのため、まず、多能性細胞(マウスES細胞)の試験管内分化系を用いて、神経分化のごく初期に発現しだす転写因子をシステム生物学的手法で探索し、ZnフィンガータンパクZfp521を同定した。このZnフィンガータンパクは核内因子で、ES細胞分化系のみならず、in vivoのマウス初期胚でも神経前駆細胞に特異的な発現を示した。Zfp521の強制発現はES細胞の培養系で神経分化を強く促進し、さらに通常は神経分化が強く抑制されるBMP4存在下でも神経分化を惹起することが明らかとなった。

逆に、BMP4存在下では、Zfp521の内因性の発現は強く抑制されていた。さらにshRNA法により、その機能を阻害すると、ES細胞からの神経分化が強くされたが、内胚葉や中胚葉などの他の細胞種への分化は正常に起こることがわかった。これらにより、Zfp521が未分化外胚葉から神経前駆細胞への分化を推進するのに必須の制御因子であることが明らかとなった。Zfp521が、なぜ神経外胚葉特異的な発現をするのかについては不明であったが、その上流因子の制御メカニズムに、Oct6などのepiblastで発現する転写因子群との関係が強く示唆された。また、下流候補遺伝子についても、これまでにSox3はその直接的な下流遺伝子の一つであることが明らかとなったが、その発現誘導にはp300/CBP活性が必要であった。これらにより、Zfp521は未分化外胚葉から神経前駆細胞へ分化する際に働く転写活性因子であり、神経外胚葉への初発分化段階の制御をp300などとともに行なう役割を持つことが明らかになった。さらにZfp521の機能を理解するために、Zfp521のノックアウトES細胞を作製し、遺伝子破壊マウスの産生に着手した。
都市住民を対象とした食事指導のコレステロール低下効果に関する無作為化比較研究

方法:大阪市A地区と大阪府A-I地区において、4069歳で住民健診の血清総コレステロール(以下、TCH)が230mg/dl以上で279mg/dl以下の者を対象にTCHのスクリーニング検査を行ない、230mg/dl以上で非服薬者を本研究の対象者とした。血液検査、身体計測、食事調査、問診を含む第1回検査の後、無作為配置により2群に分け介入群(I群)と対照群(C群)とした。I群には第1回検査の約2週間後から2ヶ月間隔で3回の個人別食事指導を行った。この間C群は特別な指導を受けなかった。第1回検査から6ヶ月後に同様の内容で第2回検査を両群に実施した。A地区では66名を対象に平成9年5月に、A-I地区では26名を対象に平成10年6月に第1回検査を行なった。本研究は交互法による無作為化比較試験であるため、第1回検査の前に検査内容や指導方法を説明して書面によりインフォームドコンセントを得た。各検査項目の第1回検査時平均値と第2回検査時平均値の差をI群とC群別に求め、(I群の差)-(C群の差)を指導による正味の効果とした。第1回検査のTCHが230mg/dl以上であった75名について解析した。結果:TCHはI群第1回検査時256.5mg/dlが第2回検査時231.9mg/dlと24.6mg/dl低下したが、C群も256.6が252.7と3.9低下したので、指導による正味のTCH低下量は20.7mg/dlであった。HDL-CHはI群67.4が70.4と3.0の上昇、C群も68.0が72.2と4.2の上昇で、正味の低下量は1.2mg/dlであった。一方LDL-CHはI群164.8が140.6と24.2の低下、C群も165.8が158.0と7.4の低下により指導による正味の低下量は16.8mg/dlであった。食事指導によってTCHは低下するが、それはLDL-CHの低下によることが示された。大阪市A保健所管内の住民で、1997年5月以前の6ヶ月の間に測定された血清総コレステロール(以下、TCH)が230mg/dl以上で279mg/dl以下、かつHDLコレステロール(以下、HDL-CH)が90mg/dl未満の者で、年齢は40歳以上69歳以下の男女66名を対象に1997年5月に第1回検査を行った。検査項目は、血液検査、身体計測、食事調査、問診とした。この検査でTCHが300mg/dlを超えていた者、血中コレステロールに影響を与える薬を服用していることが判明した者、TCHが正常範囲を示した者を除外し、59名を参加適格者とした。適格者をランダム配置により前期介入群(以下、前期群。女性26名、男性4名、計30名)と後期介入群(以下、後期群。

女性26名、男性3名、計29名)とした。前期群は初回検査後約2週間の時点で初回検査の結果を用いて食事指導を実施した。その後2ヶ月間隔(7月と9月)で合計3回の個別指導を行った。この間、後期群は全く介入を行わない観察期間とした。初回検査から6ヶ月後(1997年12月)に1回目と同じ内容で2回目の検査を前期群と後期群の両群に実施した。TCHは前期群1回目245.9mg/dlが2回目230.1になり24.8低下したが、後期群も1回目256.0が2回目250.3となり5.7低下したので、食事指導によるTCHの正味の低下は19.1mg/dlであった。HDL-CHは、前期群1回目67.5mg/dlが2回目73.6と6.1上昇したが、後期群も1回目67.2が2回目73.2と6.0上昇したので、HDL-CHの正味の変化はほぼ0であった。一方LDL-CHは前期群1回目163.1mg/dlが2回目138.9と24.2低下したが、後期群も1回目165.8が2回目158.0と7.81低下したので、LDL-CHの正味の低下は16.4mg/dlとなった。食事指導によるTCHは低下するが、それはLDL-CHの低下によることが示された。方法:今年度は大阪府A-I地区において、昨年度の大阪市A地区と同じ方法で無作為化比較試験を行なった。4069歳で住民健診の血清総コレステロール(以下、TCH)が230mg/dl以上で279mg/dl以下の者を対象にTCHのスクリーニング検査を行なった。その結果230mg/dl以上で非服薬者を本研究の対象者とした。血液検査、身体計測、食事調査、問診を含む第1回検査の後、無作為配置により2群に分け介入群と対照群とした。介入群には第1回検査の約2週間後から2ヵ月間隔で3回の個人別食事指導を行った。この間対照群は特別な指導を受けなかった。第1回検査から6ヵ月後に同様の内容で第2回検査を両群に実施した。26名を対象に平成10年6月に第1回検査を、平成10年12月に第2回検査を行なった。各検査項目の第1回検査時平均値と第2回検査時平均値の差を介入群と対照群別に求め、(介入群の差)-(対照群の差)を指導による正味の効果とした。A-I地区の対象者のみでは例数が少ないため、解析はA地区とA-I地区とを合計して第1回検査のTCHが230mg/dl以上であった75名について行なった。結果:TCHは介入群第1回検査時256.5mg/dlが第2回検査時231.9mg/dlと24.6mg/dl低下したが、対照群も256.6が252.7と3.9低下したので、指導による正味のTCH低下量は20.7mg/dlであった。HDL-CHは介入群67.4が70.4と3.0の上昇、対照群も68.0が72.2と4.2の上昇で、正味の低下量は1.2mg/dlであった。一方LDL-CHは介入群164.8が140.6と24.2の低下、対照群も165.8が158.0と7.4の低下により指導による正味の低下量は16.8mg/dlであった。食事指導によってTCHは低下するが、それはLDL-CHの低下によることが示された。
胎仔肺組織移植によるブレオマイシン誘導肺線維症修復の試み

<線維症モデルの作成>ブレオマイシン誘導型肺線維症モデルを作製した。近交系Lewis(LEW)ラット(810週齢)を用いた。麻酔下に気管切開を行い,細径チューブを気管内に挿入し,背側皮下に誘導留置し固定した。気管内カテーテル留置後3日目に,ブレオマイシンを経気道的に投与した。0.3%ブレオマイシン溶解液を作成し4.5mg/kgまたは3mg/kgを4分割で2時間ごとに投与した。投与に際しては,4% Halothanによる吸入麻酔下に自発呼吸を温存した状態で,両側肺に均等に散布されるように適宜体位変換をおこないながら投与した。コントロール群には0.9%生食を投与した。ブレオマイシンもしくは生食投与後1,2,4,8,12,16週後に犠牲死させ,H&EとMasson Trichrome染色にて肺線維症の評価を行い,ブレオマイシン投与群での肺線維症の形成を確認した。肺線維症の程度はAshcroft scoreを用いて評価した。<胎仔肺移植>ドナーとして胎齢17日のGFP-LEW胎仔肺組織を用い,ブレオマイシン投与後34週の肺線維症LEWに胎仔肺組織移植を行った。胎仔肺移植はこれまでに我々が行ってきた方法によった(J Thorac Cardiovasc Surg 2006;131;1148-53)。ドナーのGFP蛋白に対するレシピエントの抗原反応を抑制するためにCyclosporinを投与した(10mg/kg i.m.day 0,以後は隔日で漸減投与した)。コントロールとして生食投与ラットをレシピエントとして用いた。移植後1,2,4,8,12後にレシピエントラットを犠牲死させた。レシピエント肺をen-blockに摘出後,GFP陽性胎仔肺組織移植部位をUVライトで確認し,凍結切片を作成した。標本は蛍光顕微鏡下に観察した後に,H&E染色を施した。肺線維症肺内においてもGFP陽性の胎仔肺組織の生着が確認できた。また,移植後経時的に胎仔肺組織から肺胞上皮等への分化が形態的に観察され,移植肺由来の肺胞に含気が認められた。ブレオマイシン誘導型肺線維症モデルを作製中である。具体的には,近交系Lewis(LEW)ラットにブレオマイシンを経気道的に投与し,肺線維症モデルを作成しているが,従来の気道内への当該物質の単回投与では薬剤により形成される肺線維症の局在は偏在性となる場合がほとんどである。そこで,より均等に薬剤を肺内に散布するため,ブレオマイシン投与3日前に,気管に細経チューブ(polyethylene tube 0D 0.5mm)を挿入し,背側皮下に誘導留置して,自発呼吸下に数回投与している。Naive LEWへの胎仔肺組織移植は再現性をもって行えることを確認した。胎齢17日のラットをドナーとして顕微鏡下に両肺を摘出し,DMEM培地内にて肺を細切する。ドナーは気道内挿管し,GOE麻酔下に人工呼吸を行う。

左開胸し,18Gサーフロー針を用い胎仔肺組織を肺内に注入する。経時的にレシピエント肺内で移植肺を組織学的に検討した。胎仔肺はnaive LEW肺に生着し,増殖・分化すること,および移植肺組織は肺胞レベルで,レシピエントの気道,血管系と連絡を有することを確認した。今後は,上記方法で作成したブレオマイシン誘導型肺線維症LEWに対して,LEW胎仔肺組織の移植を行う予定である。コントロールとして,生食の気道内投与LEWを用いる。当初は,ドナー由来細胞の同定のためにラットのY染色体を特異的に染色する標識抗体を用いてFISH法により肺組織内のドナー由来組織を同定する(レシピエントには雌性ラットを用いる。)ことを考慮し試みたが,うまく行かなかった。現在GFP LEWラットを導入して,今回の実験系におけるドナー由来細胞の同定を試みる準備を進めている。<線維症モデルの作成>ブレオマイシン誘導型肺線維症モデルを作製した。近交系Lewis(LEW)ラット(810週齢)を用いた。麻酔下に気管切開を行い,細径チューブを気管内に挿入し,背側皮下に誘導留置し固定した。気管内カテーテル留置後3日目に,ブレオマイシンを経気道的に投与した。0.3%ブレオマイシン溶解液を作成し4.5mg/kgまたは3mg/kgを4分割で2時間ごとに投与した。投与に際しては,4% Halothanによる吸入麻酔下に自発呼吸を温存した状態で,両側肺に均等に散布されるように適宜体位変換をおこないながら投与した。コントロール群には0.9%生食を投与した。ブレオマイシンもしくは生食投与後1,2,4,8,12,16週後に犠牲死させ,H&EとMasson Trichrome染色にて肺線維症の評価を行い,ブレオマイシン投与群での肺線維症の形成を確認した。肺線維症の程度はAshcroft scoreを用いて評価した。<胎仔肺移植>ドナーとして胎齢17日のGFP-LEW胎仔肺組織を用い,ブレオマイシン投与後34週の肺線維症LEWに胎仔肺組織移植を行った。胎仔肺移植はこれまでに我々が行ってきた方法によった(J Thorac Cardiovasc Surg 2006;131;1148-53)。ドナーのGFP蛋白に対するレシピエントの抗原反応を抑制するためにCyclosporinを投与した(10mg/kg i.m. day 0,以後は隔日で漸減投与した)。コントロールとして生食投与ラットをレシピエントとして用いた。移植後1,2,4,8,12後にレシピエントラットを犠牲死させた。レシピエント肺をen-blockに摘出後,GFP陽性胎仔肺組織移植部位をUVライトで確認し,凍結切片を作成した。標本は蛍光顕微鏡下に観察した後に,H&E染色を施した。肺線維症肺内においてもGFP陽性の胎仔肺組織の生着が確認できた。また,移植後経時的に胎仔肺組織から肺胞上皮等への分化が形態的に観察され,移植肺由来の肺胞に含気が認められた。
放射線誘発オートファジーによる細胞死回避システムの解明

平成30年度は、BJ-5ta細胞(不死化ヒト正常線維芽細胞)を用いて、X線照射後に細胞の増殖が停止しているのかどうかを、チミジンのアナログであるEdUがDNA合成期に細胞内に取り込まれる割合を調べることにより判定した。EdUの取り込み率は細胞が対数増殖期にある場合45%程度であるが、20GyX線を照射すると、照射2日後にはほぼ0%となり、照射後15日経過しても増加は認められなかった。この結果と前年度のβ-Gal染色との結果を合わせて、BJ-5ta細胞はX線20Gy照射により細胞周期が停止し、老化が誘導されたことが明らかとなった。また、X線照射後老化が誘導される細胞ではDNA損傷が残存しているのか否かを明らかにするため、DNA二本鎖切断の指標となるγ-H2AX fociについて、X線20Gy照射後のフォーカス数を経時的に調べた。照射30分後には100個以上のフォーカスが観察でき、その後は急激に減少したが24時間後は30個程度のフォーカスが残っていた。照射6日後には10個程度まで減少したが、30日経過した後も各細胞で7個程度のフォーカスが残存していることから、修復されていないDSBが残っていることが明らかとなり、その結果DNA損傷応答(DDR)が長期間持続していることが示唆された。次に、X線照射後のオートファジー活性の経時的な変化を明らかにするため、LC3タンパク質の発現をwestern blottingで調べた。またオートファゴソームを特異的に染色するCyto-ID試薬を用いて、オートファジー活性のモニタリングを行った。現在は、これらの実験の再実験と、異常タンパク質がオートファジーにより分解されるために必要なアダプタータンパク質のp62、NBR1の発現をwestern blottingにより調べている。おおむね順調に進展しているが、オートファゴソーム膜に結合するLC3タンパク質のwestern blottingの結果が安定していない。オートファジーには様々な因子が関与することから、LC3等のwestern blottingの結果を評価するためには、オートファゴソームのリソソームによる分解を阻害することが必要と考えられる。そのため、令和元年度はこの実験を実施することを検討している。引き続き、X線照射後のオートファジーの活性をCyto-IDによる免疫染色により調べ、LC3やアダプタータンパク質のp62やNBR1、オートファジー経路の上流に位置するULK1のwestern blottingを行う。照射後の老化の誘導や細胞周期停止の持続、DDRの持続などを示すデータはすべて取り終えているため、オートファジー活性を調べたデータを加えて取りまとめ、論文として投稿する予定である。ヒト正常線維芽細胞BJ1-hTERTを用い、X線10Gyおよび20Gy照射後に老化様状態が誘導されることをβガラクトシターゼ染色により確認した。また細胞周期もG1期で停止し、停止期間は30日を超えることから、不可逆的な細胞周期停止状態が誘導されたことも確認した。さらに、オートファゴソームを特異的に染色するCyto-ID試薬を用い、X線20Gy照射後に誘導されるオートファジーをCyto-IDの輝度を測定することにより調べた。その結果、X線20Gyを照射された細胞では、オートファジーが徐々に誘導され、照射24時間後には未照射細胞の3倍量のオートファジーが誘導されることがわかった。照射細胞で誘導されたオートファジーは24時間以降は徐々に減少したが、照射4日目には再び上昇した。照射24時間後のオートファジーの亢進は照射により増加した異常なタンパク質を処理するためと考えられ、また照射5日目の再亢進は照射により生じた異常な細胞小器官(特にミトコンドリア)を除去するための作用であると考えられる。平成27年の5月中旬から妊娠のため体調が悪く実験があまりできなかった。また12月以降から出産のため休暇を取得し、研究を中断したため。H28年度は育児休業を取得したため、研究は行っていない。H27年11月末からH28年3月末まで産前産後休業、および育児休業を取得していたため、当初の予定より非常に遅れている。H27年度はX線照射により長期細胞周期停止状態(老化様増殖停止)に入った細胞のX線照射後のオートファジー活性をCito-ID試薬を用いて、蛍光強度として検出した。これにより、X線照射後に24時間でオートファジー活性が高まることを明らかにした。その後は産前産後休業、および育児休業に入ったため、研究は進んでいない。平成29年度は、不死化したヒト正常線維芽細胞であるBJ-5ta細胞を用い、X線照射を受けた線維芽細胞で老化並びにオートファジーが誘導されるか否かについての実験を行った。まず、X線照射後のBJ-5ta細胞の増殖曲線を作成した。X線10Gyでは照射後7日間は細胞数の増加がみられなかったが、その後急激に増殖した。一方、X線20Gyでは7日以降も細胞数の増加がみられなかったことから、細胞周期が停止していることが推測された。続いて、X線20Gy照射後の細胞周期が停止した細胞で老化が誘導されているか否かをβガラクトシターゼ染色にて調べた。照射後4日目では老化が誘導された細胞は全細胞の30%程度であったが、8日後には照射を受けたほぼすべての細胞で老化が誘導されていることを確認した。さらに、この状態で30日以上生存し続けることも確認した。

さらに、照射によりオートファジーの活性が上昇するか否かを調べる実験を行った。まずはじめに、バキュロウイルスを用いてオートファジー誘導時に発現が増加するLC3遺伝子を細胞内に導入し、オートファゴソーム自身を発光させることでオートファジーのモニタリングを行う方法を試みたが、BJ-5ta細胞では細胞内にバキュロウイルスが導入されず、オートファゴソームの発光を検出することができなかった。そのため、オートファゴソームを特異的に染色するCyto-ID試薬を用いてオートファジーのモニタリングを行った。さらに、X線照射後のLC3タンパク質の発現をウェスタンブロッティングにて調べる実験も合わせて行い、現在も継続して照射後のオートファジー活性を調べている。X線未照射でのオートファジー活性が非常に高く、薬剤を用いてオートファジーを誘導させた場合と同程度の活性を示したことから、未照射時のオートファジーの活性を下げるための条件の検討に時間がかかり、計画よりもやや遅れてしまった。平成30年度は、BJ-5ta細胞(不死化ヒト正常線維芽細胞)を用いて、X線照射後に細胞の増殖が停止しているのかどうかを、チミジンのアナログであるEdUがDNA合成期に細胞内に取り込まれる割合を調べることにより判定した。EdUの取り込み率は細胞が対数増殖期にある場合45%程度であるが、20GyX線を照射すると、照射2日後にはほぼ0%となり、照射後15日経過しても増加は認められなかった。この結果と前年度のβ-Gal染色との結果を合わせて、BJ-5ta細胞はX線20Gy照射により細胞周期が停止し、老化が誘導されたことが明らかとなった。また、X線照射後老化が誘導される細胞ではDNA損傷が残存しているのか否かを明らかにするため、DNA二本鎖切断の指標となるγ-H2AX fociについて、X線20Gy照射後のフォーカス数を経時的に調べた。照射30分後には100個以上のフォーカスが観察でき、その後は急激に減少したが24時間後は30個程度のフォーカスが残っていた。照射6日後には10個程度まで減少したが、30日経過した後も各細胞で7個程度のフォーカスが残存していることから、修復されていないDSBが残っていることが明らかとなり、その結果DNA損傷応答(DDR)が長期間持続していることが示唆された。次に、X線照射後のオートファジー活性の経時的な変化を明らかにするため、LC3タンパク質の発現をwestern blottingで調べた。またオートファゴソームを特異的に染色するCyto-ID試薬を用いて、オートファジー活性のモニタリングを行った。現在は、これらの実験の再実験と、異常タンパク質がオートファジーにより分解されるために必要なアダプタータンパク質のp62、NBR1の発現をwestern blottingにより調べている。おおむね順調に進展しているが、オートファゴソーム膜に結合するLC3タンパク質のwestern blottingの結果が安定していない。オートファジーには様々な因子が関与することから、LC3等のwestern blottingの結果を評価するためには、オートファゴソームのリソソームによる分解を阻害することが必要と考えられる。そのため、令和元年度はこの実験を実施することを検討している。平成28年度は育児休暇を取得しているために研究を中断する。そのため、29年度以降から研究を再開する予定である。
新型医薬品の創製を志向した求電子的不斉フッ素化試薬の開発

1.新型のフッ素化試薬の分子設計にあたり,高い面選択製が期待される5員環構造に着目して,電子求引性のカルボニル基を選んだ.光学活性体の入手が容易な(R)-フェニルグリシンおよび(R)-システインエチルエステルから1および2を,また,メルカプト酢酸とベンズアルデヒドおよび炭酸アンモニウムを反応させる方法で化合物3を合成した.13に対して,フッ化過クロリルもしくはフッ素ガスを反応させることによりN-フルオロ体46の合成を試みたものの,目的物の存在を確認するには至らなかった.この結果から,窒素にカルボニル基を隣接させたアミド構造を断念し,次にスルホンアミド構造の化合物を検討した.2.アラニンおよびフェニルグリシンのエステルを原料として化合物7および8を合成し,フッ素ガスを用いてフッ素化を行ったところ,目的のN-フッ素化体9および10を得た.しかし,それらの単離収率は非常に低いものであった.次に,(S)-(-)-α-フェネチルアミンを原料として11を合成した.11に対してフッ化過クロリルを用いるフッ素化反応を試みた結果,N-フッ素化体12を収率52%で得た.12を数種の化合物に対するフッ素化に適用したところ,目的するモノフルオロ体を得たが,それらの不斉収率を測定するには至らなかった.3.そこで,サッカリンより誘導した13をカンファースルホンイミド体へと誘導し,二種のジアステレオマ-を分離する方法で13の光学活性体を得た.次に13にフッ素ガスを作用させて14を合成した.光学活性の14を用いて種々のエノラートとの反応を検討し,最も良い結果として,(+)-14をα-テトラロン誘導体に対するフッ素化に適用した場合に,不斉収率74%,化学収率42%で目的のモノフルオロ体を得るに至った。新型のフッ素化試薬Aの分子設計にあたっては次のことを考慮した.先ず,その平面性の故に高い面選択性が期待される5員環構造に着目し,窒素原子に隣接する電子求引基としてカルボニル基を選んだ.また出発原料としては,対応する光学活性体の入手が容易であることからα-アミノ酸を選択した.(R)-フェニルグリシンおよび(R)-システインエチルエステルにホスゲンを作用させて1および3を得た.これらのアミド体をNaHで処理して対応する塩とし,フッ化過クロリル(FClO_3)を導入する方法によりN-フルオロ体2および4の合成を試みたものの原料回収であった.NaH処理の段階で水素の発生が確認できたことから,これらのフッ素化が不成功に終った原因は窒素原子上の電子密度が低すぎた点にあると考え,次にラジカル様式のフッ素化を検討した.1または3のCFCl_3/CHCl_3=1の溶液中に,-78°Cにて10%F_2/Heガスを導入する方法によりフッ素化を試みたが,多数の成績体の中に目的物の存在を確認するには至らなかった.そこで窒素上の電子密度がより高いと考えられる化合物5に着目し,メルカプト酢酸とトベンズアルデヒドを反応させる方法で5を合成した。5に対してフッ化過クロリルまたはフッ素ガスを用いるフッ素化を試みたものの,この場合も目的のフッ素化体6は得られなかった.以上の結果,窒素にカルボニル基を隣接させたカルボアミド構造ではフッ素原子の導入が困難であると結論付けた.現在,他の電子求引基が導入された系でのN-フッ素化を検討中である.1.アラニノール

およびフェニルグリシノールをアセチル化して化合物1a,bを得た.-78°Cにてフッ素ガスによるフッ素化を1a,bに施してN-フッ素化体2a,bを得た.しかし,これらは安定性に欠けるため,クロマトグラフィーによる精製後の単離収率は非常に低いものであった.2.光学活性体の入手が容易な(S)-(-)-α-フェネチルアミンに塩化トシルを反応させてトシル体3とした.3に対するフッ素化反応は微妙な反応条件の検討を必要としたが,最終的にはフッ化過クロリルをフッ素化剤として用いることで,N-フッ素化体4を収率52%で得た.なお,4は室温でも或る程度安定に存在することが明らかとなった.4のフッ素化能を調べるために,数種の活性メチレン化合物に対するフッ素化を行ったところ,基質や反応条件によってまちまちながらも,目的とするフッ素化体を得ることができた.しかしながら,ここで得たモノフルオロ体の不斉収率を測定するには至らなかった.3.サッカリンに二種の異なる有機金属試薬を順次反応させることで5a,bを合成した.これらのカンファースルホンイミド体経由による光学分割を試みたところ,5aのみに関して対応する光学活性体を得た.そこで光学活性5aにフッ素ガスを反応させて光学活性フッ素化体6aを合成した.6aと種々のエノラートとの反応を検討した結果,6aをα-テトラロン誘導体のフッ素化に適用した場合において,不斉収率が74%,化学収率が42%で対応するモノフルオロ体の不斉合成に成功した.
精神分裂病におけるオンコジーンc-fynの分子生物学的および遺伝学的研究

平成12年度は、まず昨年度行ったc-fyn mRNAの定量を精神分裂病と健常対照群の前頭前野および海馬で行った。その結果、c-fyn mRNAは分裂病群の前頭前野Brodmann area9で有意に増加しており、その他の部位では有意差は認められなかった。さらに本年度は11年度と同様の対象群を用い、radioactive immunohistochemistryによるc-fynの免疫活性の比較定量を行った。c-fynの免疫活性の分布は、前頭前野では皮質の第II層からVI層にかけてほぼ均一に認められ、これは昨年度実験したmRNAの分布と一致した。興味深いことに海馬においては、mRNAの分布が豊富に認められたdentate gyrusに免疫活性はほとんど認められず、その他のCA4-1およびparahippocampal gyrusに認められた。この結果は、c-fynのmRNAは細胞分裂などが活発な顆粒細胞層に著しいが、その蛋白質発現は神経成長に関連する分子層に著しいという、c-fynのオンコジーンおよび神経成長因子としての特徴をよく反映していると思われた。さらにこれらfilmautoradiogramの結果を、画像解析機器Seescan(UK)を用いて免疫活性を定量し、それを分裂病群と対照群で比較したところ、前頭前野のBrodmann area10でfynの免疫活性が分裂病群で有意に増加していた。しかしながら、その他の前頭前野の部位(Brodmann area9、11)及び海馬では、分裂病群と対照群で有意差は認められなかった。本年度と昨年度の結果をまとめると、精神分裂病患者の前頭前野では、神経の成長や神経伝達に関連する物質であるc-fynの遺伝子および蛋白質発現に障害が生じている可能性が示唆された。
閉鎖性内湾の物質循環に及ぼす非制御系栄養塩の影響解析

閉鎖性内湾の水質は陸域起源の負荷ばかりではなく、外洋起源や底泥起源、さらには大気起源など、人為的制御の及ばない物質動態に大きく依存していると考えられる。本研究では、大阪湾を対象にそのような非制御系栄養塩に着目し、外海起源の栄養塩の湾内への流入や、降雨による海面への直接的な栄養塩の供給等を、観測データと数値シミュレーションにより定量的に解析し、その影響を明らかにした閉鎖性内湾の水質は陸域起源の負荷ばかりではなく、外洋起源や底泥起源、さらには大気起源など、人為的制御の及ばない物質動態に大きく依存していると考えられる。本研究では、大阪湾を対象にそのような非制御系栄養塩に着目し、外海起源の栄養塩の湾内への流入や、降雨による海面への直接的な栄養塩の供給等を、観測データと数値シミュレーションにより定量的に解析し、その影響を明らかにした本研究は、大阪湾に流入する外洋起源栄養塩等の動態解析と、大阪湾における既往の水質・底質データの収集・分析、および、各負荷要素のモデル計算により、大阪湾の物質収支に及ぼす非制御系負荷の影響を明らかにすることを目的としている。本年度は、大阪湾阪南港周辺海域と淀川下流域において流況・水質・底質の現地調査と分析を行うとともに、陸域(大阪府内3地点)において降水の採取と栄養塩の分析を行った。また、現地観測と並行して多年にわたる水質・底質データの収集と解析もあわせて行った。・阪南港周辺海域において流況・水質測定と採水を行うとともに、底質分析のための採泥を行った。採水・採泥は、阪南港の沖合と全面浚渫窪地において行い、その特性の差異も解析した。その結果、浚渫窪地では周辺に比べて底層の貧酸素化が長期におよび、栄養塩の溶出とともに硫化物の溶出が認められた。・出水時の流入負荷量を捉えるために、淀川下流部において橋上から採水を行い、栄養塩の分析を行った。観測期間に1,000ton/secを超える出水が2度観測され、最大流量は3,120ton/secであった。観測結果を基にL-Q式を構築し、淀川からの流入負荷量の算定を行った。・大気からの窒素供給量を把握するために、雨水を捕集し分析を行った。捕集ビンを大学構内を含む大阪府内3地点に設置し、降水の採取・回収と分析を行った。その結果、降雨による大阪湾への栄養塩供給量は、大阪湾への流入負荷量の10%以下ではあったが、窒素制限の働く海域においては降雨時に一次生産が増加する可能性が示唆された。・既往の観測結果と水質・底質分析結果の整理解析を行うとともに、1990年以降の大阪湾を含む周辺海域と流入河川の水質データの収集と解析を行った。本研究は、大阪湾に流入する外洋起源栄養塩等の動態解析と、大阪湾における既往の水質・底質データの収集・分析、および、各負荷要素のモデル計算により、大阪湾の物質収支に及ぼす非制御系負荷の影響を明らかにすることを目的としている。本年度はデータの収集・解析とあわせてシミュレーションによる栄養塩の動態解析も行った。・河口域の底泥性状を明らかにするために採泥し室内分析を行った。・降水による大阪湾海面への栄養塩負荷の年総量と季節変動を明らかにするために、雨水の捕集と分析を継続して行った。・河口沿岸域の懸濁有機物質の分解過程を明らかにするため、大阪湾奥部において植物プランクトンの採取を行い、室内にて分解・沈降実験を実施した。・観測データと収集した資料データを基に、淀川からの流入負荷量の再解析を行い、より精度の高い流入負荷量の算定を行い、既往の手法による算定結果との比較・検討を行った。・水質・底質モデルのパラメータ同定を行い、栄養塩溶出および酸素消費の定量化を行った。・降雨により負荷された栄養塩が大阪湾の一次生産に及ぼす影響を明らかにするために、境界条件として海面負荷を与えた3次元流動水質シミュレーションを実施し、その影響を明らかにした。・大阪湾全域の栄養塩の動態を明らかにするために、本研究成果を取り込んだ3次元流動水質シミュレーションを実施し、紀淡海峡より侵入した外洋起源の栄養塩の動態とその影響について定量的評価を行ったた。・水素と酸素の同位体分析を行い、大阪湾を含む周辺海域の海水の起源推定を行った。
日本・中国・韓国民族社会の基礎構造に関する比較研究

日本・中国・韓国民族社会の基礎構造に関する研究会を7回開催し、研究課題に関する文献研究および理論、作業仮説の検討を行った。各々の研究会における発表者と発表内容は以下のとおりである。5/16:柿崎京一「日・中・韓の比較研究の一視点」,6/27:堀口健治「2年間の房干村調査・中間報告」,7/12:黄元淳「韓国の両班同族村における生業戦略の変化」,林在圭「宜寧南氏忠壮公派門中の構造と機能」,11/7:松川昭子「山東省における計画生育政策の現状-房干村の事例研究」,柿崎京一「房干村における養取慣行について」,12/12:金弼東「門中の形成と変動ー韓国忠清南道桃李里南氏宗族の事例ー」,12/28:林在圭ほか「韓国調査の中間報告」。また、11/7には北京大学社会学系教授王思斌氏を招き、「社会転換期における家族の福祉機能」という演題で講演会を開催した。8月には柿崎京一が中国に出向し、中国側研究者と今後の研究計画および98年7月に開催予定の国際シンポジウムに関する打ち合わせを行った。また、8月からは早稲田大学の訪問学者として来日している韓国忠南大学校社会科学大学教授金弼東氏と、随時研究の遂行にあたっての打ち合わせを行ってきた。現地調査は日本村落を対象とし、岐阜県大野郡白川村における伝統的な民俗慣行「ユイ・コウリャク」、「生業の諸形態」、「大家族制」等について調査を実施した。また、中国・韓国の調査対象村落についても、これまでの調査で得られた蒐集資料の整理・分析作業を進め、その結果にもとづいて今後の調査計画・内容について調整をはかった。