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がん化学療法における認知障害とリスク因子の解明

化学療法の発展に伴い長期的な予後が期待できるようになった一方、化学療法後に慢性的に中枢神経系有害事象(認知機能障害)が生じる可能性が指摘されるようになった。この認知機能障害はchemo-brainと総称される。しかし、認知機能障害と化学療法との関連性、その機序に関する検討は未だ途上である。そこでわれわれは、化学療法前後を通して、脳構造画像の変化を追跡し、その病態メカニズムを検討する研究計画を立案し、脳画像の測定技術を確立した。がん化学療法が進歩し、予後が期待できるようになった一方、化学療法後に慢性有害事象である認知機能障害を生じることが明らかとなってきた。認知機能障害は集中困難・抑うつなどの精神心理的苦痛を生じ社会復帰の障害や生活の質(QOL)の低下を生じるため、早期から適切な緩和ケアが提供されることが必要である。そこで本研究では、癌化学療法が脳および認知機能にどのように影響を及ぼすかを、磁気共鳴画像(MRI)を用いて形態および生化学的に検討することとした。抗悪性腫瘍薬の投薬前後での脳画像変化および認知機能、療養生活の質を評価するための対象と評価方法、評価時期、目標症例数などパラメータの設定をおこなうために、先行研究を概観した。その結果、28件の先行研究が抽出された。21件は乳がん、3件はlymphomaを2件は消化器系腫瘍を対象としていた。脳画像評価を行った研究はなかった。以上の概観から当施設での研究計画を立案した。また、国立がんセンター東病院臨床開発センターに導入された3T MRI (GE製SIGMA EXCITE 3.0T)で3次元構造MRIを撮像するための測定・解析システムの構築を進めた。ファントムを作成し、撮像のための最適条件を設定するためのシミュレーションをおこなった。撮像した構造MRIをもとに、SPM (Statistical Parametric Mapping)を用いた定量的評価(VBM : voxel-based morphometry)をおこなうための解析システムの構築を同時に進め、信頼性・妥当性の検証をおこなった。今後、上記の予備的検討に基づいて本調査に着手し、化学療法施行前後での脳画像変化の検討をおこなうとともに、認知機能障害の発症するメカニズムを検討する予定である。がん化学療法が進歩し、予後が期待できるようになった一方、化学療法後に慢性有害事象である認知機能障害を生じることが報告されている。この認知機能障害は、言語性記憶や視覚性記憶、精神運動速度の低下、実行機能の低下など多岐にわたり、総称して"chemo-brain"と呼ばれる。認知機能障害は、集中困難・抑うつなどの精神心理的苦痛を生じ社会復帰の障害や生活の質(QOL)の低下を生じるため、早期から適切な緩和ケアが提供されることが必要である。しかし、従来化学療法を評価する上で、急性の中枢神経症状である薬剤性白質脳症やせん妄には注意が払われていたものの、慢性的な有害事象は考慮されなかった。この慢性障害の病態を解明し、効果的な介入方法を計画するには、その発生機序や重症度、療養の質の低下の程度を縦断的に調査する必要がある。そこでわれわれは、さまざまな抗悪性腫瘍薬がまねく認知機能障害と療養生活の質の低下の程度、その機序を検討した。抗悪性腫瘍薬の投薬前後での脳画像変化および認知機能、療養生活の質を評価するための対象と評価方法、評価時期、目標症例数などパラメータの設定をおこなった。3テスラ強磁場MRI装置と高感度信号検出コイルを用いて、point resolved spectroscqpy (PRESS)法及びスペクトル編集法によりMRS測定を行った。PRESS法にて得られたN-acetylaspartate(NAA)等をLC (linear combination)modelソフトウェアを用いて解析し、creatine(Cr)信号に対する相対濃度をそれぞれ算出した。スペクトル編集法では、GABAのC4メチレン信号の検出を行った。また3Tesla MRIを用いたγアミノ酪酸の脳内分布の高精度定量に加えて、脳内白質の神経線維変化を測定する拡散テンソル解析の計測を計画した。
神経細胞遊走における細胞質ダイニン制御機構の解明

脳が高度な機能を発揮するためには綿密な神経細胞間のネットワーク構築が必要不可欠である。そのためには大脳皮質で生まれた各神経細胞が繊密に制御されたプログラムに従って正しく大脳皮質を移動し、正しい位置で停止する事が重要である。私はLis1、Ndel1、14-3-3ε等の分子が神経細胞の移動に重要であることを報告してきた。最近私は、Lis1とNdel1が異なる機能を有していることを明らかにした。そこで私は新たなNdel1の結合因子を探索した結果、カタニンp60を同定した。カタニンp60はチューブリンの剪断に重要な役割を担っていることが明らかにされており、Lis1、Ndel1、14-3-3ε等の分子が細胞質ダイニンの機能制御だけでなくチューブリンネットワークの構築にも重要な役割を担っていることが示唆された。本研究ではNdel1によるカタニンp60の制御機構、及び神経細胞の移動におけるNdel1及びカタニンp60の機能に関して以下のような結果を得た。1.Ndel1はカタニンp60と結合し、この結合はNdel1のリン酸化によって増強される。2.Ndel1欠損細胞ではカタニンp60の細胞内局在が変化する。3.移動中の神経細胞ではリン酸化Ndel1とカタニンp60は中心体に局在している。4.Ndel1及びカタニンp60の発現異常によって神経細胞の移動に異常が見られた。これらの結果はカタニンp60の正常な細胞内分布にリン酸化Ndel1が非常に重要であることを示している。また、神経細胞でもリン酸化Ndel1がカタニンp60の局在を制御することによって微小管の制御、ひいては神経細胞の遊走を制御していることを明らかにした。
氷晶テンプレート法による水質維持・管理用高効率デバイスの開発

水資源の水質を維持管理するためには、まず現状を正確に代表する検体を定期的にサンプリングし、サンプリングをした検体の成分を正確に分析し、その結果有害物質等が含まれていることが明らかとなれば、それを除去して浄化する手段を考えなければならない。本研究では研究代表者らが開発した氷晶テンプレート法を利用し、簡便な方法でサンプリングが可能な微量環境物質濃縮デバイス、流体に対する抵抗が低い分析や浄化に利用可能な吸着デバイスそして水質管理に利用可能なイオン交換デバイスを試作し、その高い性能を実証した。本年度は水質の維持管理に必要なデバイスの作製のために必要な要素技術の開発を行った。まずは、種々の有機ゲルに氷晶テンプレート法を適用し、前駆体ゲルのスクリーニングを行った。その結果、PVA等の保水力の高いゲルを前駆体に利用すると得られるマイクロハニカムの開口径が小さくなる傾向が確認できた。圧力損失と材料内拡散距離のバランス、ハニカムの強度、ミクロ/メソ/マクロ孔の大きさの制御性等の要素を考えると、前駆体となる有機ゲルとしてはレゾルシノール・ホルムアルデヒド(RF)ゲルが優れていることが確認できた。続いて、種々の用途に対応できる材料が提供できるように、シリンジ用針等の微小流路内、また比較的大きなカラム内でマイクロハニカムを作製する技術の確立を目指した。微小流路内でのマイクロハニカム作製を試みたところ、熱伝導度が比較的低いテフロン等の容器を使用した場合、大きな流路内で得られる構造と類似のマイクロハニカムが作製可能であることが確認できた。一方、金属など熱伝導度の高い材質の容器を使用すると材料のモルフォロジーが変化することが明らかとなった。さらに、従来の方法と異なり、前駆体が入った容器を槽内に固定し、そこに冷媒を一定速度で注入していく冷媒上昇型の氷晶テンプレート法を用いることで、大きなカラム内でマイクロハニカムが安定して作製可能であることが確認できた。有機-無機ハイブリッドマイクロバニカムの創製についても検討を行った。シリカゾルとRFゾルを混合してゲル化させたところ、それぞれのゾルを構成するナノ粒子が独立に成長して、比較的均一に混合された状態でゲル化が起きることが確認できた。本年度は昨年度に得られた知見を基に水質の維持管理に必要なデバイスを実際に試作し、その性能を評価した。試作を行ったデバイスは微量環境物質濃縮デバイス、低圧損型吸着デバイス、そして低圧損型イオン交換デバイスである。微量環境物質濃縮デバイスに関しては内径0.5mm、長さ85mmのシリンジ針内に、開発した氷晶をテンプレートとする方法を利用してシリカを合成し、デバイスを試作した。得られたデバイスは通気度が高く、これを利用することで短時間でのサンプリングが可能であることを確認した。また実際のサンプリングにおいて、酢酸エチルやイソブタノール等を高率で回収可能であることを確認した。よってこれを利用することで、微量環境物質の精度の高い環境分析が可能になるものと考えられる。低圧損型吸着デバイスに関しては、シリカ、炭素、ゼオライト等、吸着能の高い物質のマイクロバニカム状カラムを合成し、十分な吸着能を有していることを確認した。また流体通過時の抵抗も非常に低いことを確認している。低圧損型イオン交換デバイスに関しては強酸性カチオン交換樹脂を合成する際に、マイクロハニカム状に直接成型する方法によりデバイスの試作に成功した。得られたデバイスが高いイオン交換能を有し、圧力損失が非常に低いことを確認した。また、材料内の拡散距離が非常に短いため、比較的高い流速でもデバイス内の樹脂のイオン交換能力の95%以上を利用できることを確認した。
A群レンサ球菌の免疫回避機構の時空間的バイオイメージング解析

A群レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)感染の侵襲性症例では,感染部位に好中球の浸潤がほとんど認められない.そこで,S.pyogenesは補体や好中球の免疫システムを回避する病原因子を産生すると考えた.本研究では,S.pyogenesのプロテオーム解析を行い,補体に結合する分子およびNETs誘導因子やNETs分解酵素を同定した.さらに,種々のバイオイメージング機器を用いて,NETsリアルタイム観察系および補体分子のナノスケール観察系を構築し,S.pyogenesが免疫を回避する過程をリアルタイムかつナノスケールで解析した.A群レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)感染の侵襲性症例では,感染部位に好中球の浸潤がほとんど認められない.そこで,S.pyogenesは補体や好中球の免疫システムを回避する病原因子を産生すると考えた.本研究では,S.pyogenesのプロテオーム解析を行い,補体に結合する分子およびNETs誘導因子やNETs分解酵素を同定した.さらに,種々のバイオイメージング機器を用いて,NETsリアルタイム観察系および補体分子のナノスケール観察系を構築し,S.pyogenesが免疫を回避する過程をリアルタイムかつナノスケールで解析した.本研究課題では,材料工学の分野で応用利用されている高解像度のイメージング機器を感染症学分野においても取り入れ,組織内に侵入した微生物が免疫系を回避する機構について,経時的に解析を進めることを目的とし実験を進めた.具体的には,タイムラプス顕微鏡を利用した経時的な感染現象の解析,あるいは高速スキャン型原子間力顕微鏡を用いて,A群レンサ球菌の病原因子が宿主免疫分子を分解・阻害する過程を観察した.研究1.補体C3b分解酵素が好中球貪食能に及ぼす影響のタイムラプス顕微鏡分析寒天平板培地を用いたフレート実験法では,A群レンサ球菌の補体C3b分解酵素を欠失させると,末梢血液中での抗貪食能が低下した.しかしながら,この手法ではC3b分解酵素が,どのような細胞やいかなる液性(補体)成分に,いつ作用することで自然免疫系に影響を及ぼすのかを明らかにできなかった.そこで,タイムラプス顕微鏡下で,C3b分解酵素欠失株もしくは野生株と好中球および血清(補体)を混合し,経時的に観察した.その結果,C3b分解酵素欠失株と比較し,野生株では好中球による細菌捕獲が進まないこと,さらには,捕獲した細菌が好中球の食胞からエスケープする頻度の高いことが示された.研究2.細胞膜侵襲性補体複合体(MAC)形成を阻害するA群レンサ球菌由来分子の検索MACの構成成分である補体C6に結合するA群レンサ球菌由来のタンバクを同定した(C6BP).次に,高速スキャン型原子間力顕微鏡下で,補体成分C5bC9がMACを形成する過程を検鏡するための条件の至適化を行った.そして,C6BP添加した場合,MAC形成が阻害されることをタンパク分子レベルで経時的に撮影することに成功した.さらに,高速スキャン型原子間力顕微鏡を「研究1」に応用し,C3b分解酵素が補体C3bを分解する過程を分子スケールで解析した.1.NETs免疫システムを阻害するA群レンサ球菌の病原因子の検索平成21年度に至適化を進めた「リアルタイムの自然免疫観察モデル」を用いて,NETs発現過程を阻害するレンサ球菌の病原顕子のモニタリングとスクリーニングを行った.その結果,少なくともレンサ球菌のenolaseがNETs形成を誘導することを明らかにした.その他のNETs誘導因子については,次年度に申請する基盤研究で発展的に検索する計画である.次に,発現したNETs構造体を分解するA群レンサ球菌の病原因子の検索を行った.A群レンサ球菌の各種組換えタンパクをNETsに作用させ,分解作用を呈するタンパクをスクリーニングした結果,SpeBプロテアーゼを同定した.2.免疫システムを阻害するA群レンサ球菌の病原因子の一分子解析本年度計画の2項目目として,前年度に至適化した原子間力顕微鏡の撮影方法を用いて,培養細胞や活性型タンパク,さらには生菌等の湿潤試料をナノスケールで観察した.さらに,1秒間に10コマ以上の撮影能力を有するスキャナー増設し,A群レンサ球菌の病原因子が,好中球細胞表層の分子やNETsに結合あるいは分解反応を起こす過程を一分子ごとにリアルタイム画像で追跡し,超微細形態学的に解析した,この実験系により,A群レンサ球菌の新たな免疫回避分子を同定することができた(補体C6結合タンパク).3.結論以上の申請研究により,電子顕微鏡によるナノスケール解析や,タイムラプス蛍光顕微鏡を利用した経時的な感染現象の解析,あるいは共焦点レーザー顕微鏡を用いて三次元空間内での感染と免疫のせめぎ合いを観察することで,感染症研究に時空間的な検索を展開する基盤を確立できたと考える.
ホタテガイにおける麻痺性貝毒のチオールとの反応性に基づく代謝に関する研究

麻ひ性貝毒(PSP)はAlexandrium属などの有毒渦鞭毛藻の発生が原因となる致死率の高い貝毒である。PSPで毒化した貝類はしばしば長期に渡り毒性を維持するので、貝類養殖産業に与える経済的被害は深刻であり、貝に蓄積した毒を早期に除去する技術の開発が求められている。このような技術の開発には貝の体内における代謝の解明が必要であるが、このような研究はこれまで限られてきた。有毒渦鞭毛藻の発生時に貝に蓄積されたゴニオトキシン(GTX)群などの11位に硫酸エステルを持つPSP成分は、原因藻の消失後徐々に減少するとともに、その一部が11位が還元されたサキシトキシン(STX)群などの成分に変化する。筆者らはGTX群がメルカプトエタノールなど種々のチオールによりSTX群へ変換されること、およびこの反応には毒とチオールの複合体が安定な中間体として存在するヒとを明らかにし報告している。グルタチオン(GSH)は生体に最も豊富に分布するチオールであり、毒化貝体内での上述のPSP成分の変換に主体的に関与しているものと考えられる。我々はさらに、システイン(Cys)がGTX群に作用して生じるCys-STX複合体が不安定で速やかに複数の蛍光成分に変化すること、およびGS-STX複合体がγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γGTP)で消化されることにより、同様の蛍光成分を与えることを明らかにした。以上の結果は、複合体分子内のシステイン部分に遊離のアミノ基が存在すると、PSP骨格の酸化分解が誘発されることを意味する。以上の結果はまた、貝の体内でのGS-STX複合体の形成が、GTX群からSTX群への変換だけではなくPSP成分の分解にも関与していることを示唆する。本研究は、これらin vitroの結果から推定されたPSP成分の代謝分解機構が、貝の体内で進行していることを実証したものである。Alexandrium属等の渦鞭毛藻が発生すると二枚貝が麻痺性貝毒(PSP)により毒化する。貝に取り込まれた毒の代謝に関してはほとんど知見がない。筆者らは最近、in vitroでゴニオトキシン(GTX)群等の11位に硫酸エステルを持つPSP成分が還元型グルタチオン(GSH)などのチオールと複合体(GS-STXs)を形成し、さらに過剰のチオールによりサキシトキシン(STX)群に還元されることを報告した。この結果は同様の反応が毒化貝の体内で起きていることを示唆する。本研究は貝に蓄積した毒の代謝を生体内チオールとの関連で検討したものである。種々の貝類の肝膵臓のGSH濃度を測定し2mM前後の値を得た。同レベルのGSHを含む中性水溶液中で100μMのGTX2,3平衡混合物を37°Cで加温したところ、2日間で大部分がGS-STX複合体およびSTXに変換することを確認した。抽出時の試料由来の酵素による影響を考慮しつつ毒化ホタテガイ抽出物中のGS-STXの確認を試みたが、同複合体およびGSH以外のチオールとの複合体をほとんど認めることが出来なかった。この結果は毒化貝体内で形成されたGS-STXが貝の体内でさらに分解されることを意味する。このことはGS-STXがホタテガイ肝膵臓の膜タンパク画分により分解されること、この活性がセリン-ホウ酸緩衝液中で阻害されること、および中腸腺と同レベルのウシ製γGTP溶液中でGS-STXが速やかに分解されることから確認された。

PSPにチオールが結合した複合体は通常、メルカプトエタノール溶液中で加熱すると定量的にSTXを遊離する。しかしGS-STX複合体のγGTP分解物は同処理でSTXをほとんど遊離せず、複数のプリン体と思われる蛍光物質を与えた。以上からPSPが貝の体内でGSHとγGTPにより構造変化を伴う変換を受けることが明らかとなった。昨年度我々はゴニオトキシン(GTX)群等の11位に硫酸エステルを持つ麻痺性貝毒(PSP)成分がin vitroでグルタチオン(GSH)と反応してGS-STX複合体を形成すること、およびGS-STXをγGTPで消化すると分解物と考えられる複数の不安定な蛍光成分を与えることを確認した。この結果は貝が同様の機構でPSPを分解することを示唆する。ところで毒化したホタテガイのPSPをポストカラムHPLC法(Oshima,1995)で分析すると、しばしばGTX1にほぼ一致するretention timeを持つ未知の蛍光成分が認められる。無毒ホタテガイには本成分は認められないことから、我々は本成分がホタテガイ体内で上記の機構により生じたPSP分解物ではないかと考え、本年度以下の実験を行なった。まず本成分を毒化ホタテガイから単離して紫外部吸収およびマススペクトルを測定した結果、269nmおよび339nmに吸収を示し、163の分子量を持つことを確認した。次に毒化したホタテガイを部位別に分けて抽出し、単離した本成分をリフェレンスとして上記HPLC法で調べたところ、本成分が調べた全ての部位に分布すること、腎臓に特に高濃度で認められることが明らかとなった。無毒ホタテガイ各部位のホモジネート中でGTX2,3混合物、DS-STXおよびSTXをそれぞれインキュベートしたところ、腎臓や中腸腺、生殖腺等γGTP活性の高い部位でGS-STXの顕著な減少と、この減少に見合った量の本成分の生成が認められた。本成分はこれらのホモジネート中にGTX2,3混合物を加えた場合にも若干量生じた。これに対してSTXを添加した場合には、STXは全く減少せず、本成分も生じなかった。以上の結果は本成分が、ホタテガイの体内でGTX群からGS-STXを経て生じた分解産物であることを意味する。現在、本成分の構造を解析中である。麻痺性貝毒(PSP)原因藻の消失後には二枚貝に蓄積したPSP成分は徐々に減少するが、その減衰速度は貝の種類によって大きく異なることが知られている。前年度までの研究で我々は、ホタテガイPatinopecten yessoensisの体内で原因藻から取り込まれたGTX群がグルタチオン(GSH)と反応して生じたGS-STX複合体が、γ-グルタミルトランスペブチダーゼ(γGTP)により消化され、PSPの骨格が酸化されたと考えられる蛍光成分に変化することを見い出した。GSHおよびγGTPはいずれも生物に普遍的かつ豊富に存在するので、ホタテガイ以外の二枚貝においてもGTX群の代謝分解に主体的に関与しているものと考えられる。本年度我々は、ホタテガイに比べPSP含量が比較的速やかに減少するマガキCrassostrea gigasとイガイMytilus galloprovincialisにつき、これらの可食部のGSH濃度がホタテガイのそれを大きく上回ること、これら可食部のホモジネート中でGS-STXをインキュベートすると、GS-STXがホタテガイの場合よりも速く減少することを確認した。貝類にはいずれも体内で生じたGS-STXを速やかに消化するのに十分なγGTP活性が認められるので、二枚貝においてはGSHの濃度がPSPの減少速度を律速しているものと思われた。
外来通院中のがん患児のディフィシル感染予防に向けた教育プログラムの開発

平成25年度は、平成24年度に引き続き、入院及び外来通院中のがん患児を対象に長期的かつ継続的にC. difficile消化管保有及びClostridium difficile伝播の実態を明らかにするために、入院から外来通院中の患児の糞便からのC. difficileの検出を行った。対象者の入院が少なかったこと、治療期間の長期化により、在宅移行された患者が当初の計画より少なく、平成24年度からの継続患者をあわせ、合計5名となった。しかし、そのうち、在宅移行した患者は、プロトコール変更前の対象2名のみで、他4名は継続中である。また、これまでの研究結果を論文にまとめ、学術雑誌への投稿予定である。平成24年度は、まず三重大学医学部および近隣の関連機関において調査・分析できるように研究・実験環境の整備を行った。さらに、入院中・外来通院中の患児の調査及び試料提出方法を検討し、適切な時期に分析できるように準備を行い、実施しながら、よりよく実施できるように調整を行った。入院及び外来通院中のがん患児を対象に長期的かつ継続的にC. difficile消化管保有及びClostridium difficile伝播の実態を明らかにするために、入院から外来通院中の患児3名の糞便からのC. difficileの検出を行った。対象者の入院が少なかったこともあり、次年度も引き続き実施していく予定である。また、これまでの研究結果を論文にまとめ、学術雑誌への投稿準備を行っている。医歯薬学調査・分析環境の調整は、おおむね順調に進めることができた。しかし、対象者の入院患者数が少なかったこと、対象者の退院時期が年度末であり、外来通院中の検討が十分に行えていないため、やや遅れている。今後、継続して検討することで、十分、目標達成できると考える。平成24年度に引き続き、入院・外来通院中患者からの長期的かつ継続的なC. difficile消化管保有の実態を検討していく。研究協力者との連絡を密に取りながら、対象者の入院状況の把握に努め、対象者数を増やしていく予定である。1.平成24年度からの継続2.外来通院中の患児の療養場所の環境側面からのC. difficile検出状況の実態を明らかにする。試料の分析は、三重大学医学部、名古屋市立大学大学院看護学研究科及び国立感染症研究所、三重病院にて実施する。3.外来通院中の患児・家族が在宅において、実施している排泄ケアの実態調査を行ない、その問題点を明らかにし、いつ誰にどのような方法で教育を実施することが効率的かつ効果的であるかを明らかにする。4.これまでの結果をもとに、三重大学医学部において、在宅療養中の患児に関わる医療者及び患児とその家族を対象とした感染予防対策のひとつとして、環境整備や排泄ケア、患児生活指導内容を明らかにし、在宅で実施可能な排泄ケアの教育プログラムを開発に向け、検討する。
バイラテラル画像処理によるコンピュテーショナルフォトグラフィ

本研究では,次世代カメラシステムの中核技術として注目されているコンピュテーショナルフォトグラフィの基盤アルゴリズムの一つであるバイラテラル画像処理について,画像平滑化や鮮鋭化の多重画像への拡張やノンフォトリアリスティックレンダリングへの応用を開発し,実装した.バイラテラル画像処理法としては,色相保存バイラテラルフィルタ,バイラテラル包絡フィルタ,逆バイラテラルフィルタ,バイラテラルポアソンディスクサンプリング,バイラテラルボロノイ分割などを開発し,これらをモアレ画像,イスラム模様画像,貼り絵画像,砂絵画像,和紙画像などのノンフォトリアリスティックレンダリングに応用した.次世代カメラシステムの中核システムとして注目されているコンピュテーショナルフォトグラフィの基盤アルゴリズムの一つであるバイラテラル画像処理について,画像平滑化や鮮鋭化,およびノンフォトリアリスティックレンダリングへの応用を開発し,発表した.具体的には以下のような技法を開発して論文発表した.直交リサイジングによる線画ピクセルアート,紙片の明度順貼り付けとグラデーションによる貼り絵の立体感強調,非等方バイラテラル距離によるステンドグラス画像,カラーライン量子化によるスーラ風点描画の生成,誤差順の画素スキャンによる誤差拡散ハーフトーニング,逆バイラテラルフィルタを用いた墨絵風画像の生成,反復強調バイラテラルフィルタによる砂嵐風カラー画像の生成,バイラテラルフィルタによるチェッカーフラッグ風画像の生成,エッジ保存重心ボロノイ分割に基づくハーフトーニング,非等方Lpポアソンディスクサンプリングによる貼り絵風画像,モアレ風画像生成のためのバイラテラルフィルタのパラメータの検証,ローラ風画像とモアレ風画像の合成法,積分画像に基づくハーフトーニング,色の重要度に基づくピクセルアートの幾何学的平滑化,モアレ風画像への別モアレ模様の合成法,バイラテラルフィルタの段階効果を用いたラインアート風カラー画像の生成,係数シフトバイラテラルフィルタによるローラ風画像の生成,係数シフトバイラテラルフィルタによるラビリンス風画像の生成,バイラテラルフィルタによるモアレ風画像の生成,画素値順ポアソンディスクサンプリングによる点描画,サンドフィルタによる砂絵風画像の生成次世代カメラシステムの中核技術として注目されているコンピュテーショナルフォトグラフィの基盤アルゴリズムの一つであるバイラテラル画像処理について,画像平滑化や鮮鋭化の多重画像への拡張やノンフォトリアリスティックレンダリングへの応用を開発した.具体的には以下のような技法を開発して論文発表した.1.ノンフォトリアリスティックレンダリング技法の開発重心ボロノイ領域のスケーリングによるハーフトーニング,サンドフィルタによる砂絵風画像の生成,適応的ボロノイ分割によるステンドグラス画像の生成,2値画像からの閉曲線オプアートの生成,非等方ボロノイ分割による点描画から階調画像への変換,重み付き重心ボロノイ分割によるハーフトーニング,非等方重心ボロノイ分割による非写実的ハーフトーニング,竹編みで表現可能な2価画像,奥行き知覚に基づく画像リライティング多値化,非等方多値化によるスケッチ風イラスト画像の生成,画素値順ポアソンディスクサンプリングによる点描画,係数シフトバイラテラルフィルタによるローラ風画像の生成,係数シフトバイラテラルフィルタによるラビリンス風画像の生成,バイラテラルフィルタによるモアレ風画像の生成,サンドフィルタによる砂絵風画像の生成.2.バイラテラルフィルタの拡張インパルスノイズ除去能力を持ったバイラテラルフィルタ,値域分割平滑化フィルタによる画像の雑音除去,L∞バイラテラルフィルタによるアート風HDR画像の雑音除去,クロスバイラテラルフィルタによる雑音を抑制する画像強調,シフト荷重バイラテラルフィルタによる画像鮮鋭化,εフィルタの一設定法とそのバイラテラルフィルタとの類似性,ロバストバイラテラルフィルタによる混合雑音除去,更新クロスバイラテラルフィルタによる画像の雑音除去,逆バイラテラルフィルタによるジャギーエッジの平滑化.次世代カメラシステムの中核システムとして注目されているコンピュテーショナルフォトグラフィの基盤アルゴリズムの一つであるバイラテラル画像処理について,画像平滑化や鮮鋭化,およびノンフォトリアリスティックレンダリングへの応用について,以下のような技法を開発して論文発表した.制約付きバイラテラルフィルタによる色相コントラスト強調,モルフォロジカルフィルタを用いたラビリンス風画像の生成,色相を保存するバイラテラルフィルタによる画像平滑化と鮮鋭化,画像のハーフトーニングと逆ハーフトーニングの反復改善法,領域分割画像の2色テープ編みオプアート,最小全域木の重畳による和紙風画像の生成,直交テープ編みによる領域分割オプアート,バイラテラル最小値・最大値フィルタによるヘイズ除去,逆線集中度フィルタによる縞模様画像の生成,係数シフトカラーバイラテラルフィルタによるイスラム模様風画像の生成,非等方最小全域木による樹状線画と地形風NPR,直交リサイジングによる線画ピクセルアート,紙片の明度順貼り付けとグラデーションによる貼り絵の立体感強調,係数シフトバイラテラルフィルタと非等方ショックフィルタによるゼブラパターン画像の生成,非等方バイラテラル距離によるステンドグラス画像,カラーライン量子化によるスーラ風点描画の生成,バイラテラル最小値フィルタによる画像のヘイズ除去次世代カメラシステムの中核システムとして注目されているコンピュターショナルフォトグラフィの基盤アルゴリズムの一つであるバイラテラル画像処理について,画像認識,画像識別,画像融合,画像強調,色復元などの研究を行い,次のような研究成果を発表した:モアレ風画像への複雑な別モアレの合成法,多重解像度ウェーブレット解析による異種画像識別,逆線集中度平均フィルタによる石垣模様風画像の生成,バイラテラル包絡フィルタによるモアレ風画像の生成,情景観測モデルに基づく物体色復元,誤差拡散による竹編みハーフトーニング,バイラテラル最小値最大値フィルタによるストーン縞模様画像の生成,4分木分割と係数シフトカラーバイラテラルフィルタによるイスラム模様風画像の生成,逆アイリスフィルタによるチェッカー模様

画像の生成,逆ラプラシアンフィルタによるエッジハッチングオプアートの生成,一般化ガウス分布モデリングを用いた異種画像間識別,曲線延伸セル分割による貼り絵画像の生成,色相を保存するカラー画像の融合,円形ピクセルアート,バイラテラル包絡フィルタによる物体色の強調復元,局所射影明度による色相保存アンシャープマスキング,バイラテラルフィルタによる色相保存平滑化と鮮鋭化,制約付きバイラテラルフィルタによる色相コントラスト強調本研究では,次世代カメラシステムの中核技術として注目されているコンピュテーショナルフォトグラフィの基盤アルゴリズムの一つであるバイラテラル画像処理について,画像平滑化や鮮鋭化の多重画像への拡張やノンフォトリアリスティックレンダリングへの応用を開発し,実装した.バイラテラル画像処理法としては,色相保存バイラテラルフィルタ,バイラテラル包絡フィルタ,逆バイラテラルフィルタ,バイラテラルポアソンディスクサンプリング,バイラテラルボロノイ分割などを開発し,これらをモアレ画像,イスラム模様画像,貼り絵画像,砂絵画像,和紙画像などのノンフォトリアリスティックレンダリングに応用した.3年度では,21編の学術論文,8件の国際会議発表,22件の国内の研究会発表をし,当初計画していた画像処理技法の開発について,計画以上に多種多様な技法を開発し,発表することができた.このことから3年度は当初の計画以上に研究が進展したと考える.画像情報処理上記のように,3年度も当初の計画以上に研究を進めることができたので,引き続いて本年度(4年目:最終年度)も一層の進展を図る予定である.本年度の研究内容は当初の計画通りとし,更に充実した内容とする.昨年度は28編の学術論文,10件の国際会議発表,23件の研究会発表など,2年目の研究として当初計画していた画像処理技法の開発について,計画以上に多様な技法を開発することができた.このことから,2年度は当初の計画以上に研究が進展したと考える.昨年度は25編の学術論文,5件の国際会議発表,15件の研究会発表など,初年度の研究として当初計画していた基礎的技法の開発について,計画以上に多様な技法を開発することができた.このことから,初年度は当初の計画以上に研究が進展したと考える.上記のように,2年度も当初の計画以上に研究が進展したので,引き続いて本年度(3年目)も一層の進展を図る予定である.本年度の研究内容は当初の計画通りとし,更に充実した内容とする.上記のように昨年度は図書の計画以上に研究が進展したので,引き続いて今年度も一層の進展を図る予定である.今年度の研究内容は計画通りに進める予定である.該当なし
溶融塩-スラグ二液相系溶媒を用いた酸化物の高純度化

NaClとNa_2O-B_2O_3系融体間で鉄およびチタンの分配平衡実験を行った。実験は900°Cおよび1000°Cで310hr行い、雰囲気は大気、Arまたは脱酸Ar気流(100ml/min)とした。溶解には縦型抵抗炉を用いた。るつぼは高純度アルミナ質である。Na_2O-B_2O_3系融体組成は、NaCl-Na_2O-B_2O_3三元系状態図で二液相分離が生じる範囲、即ち、Na_2O-B_2O_3モル比が約2/3以下である。予備実験として、Na_2O-B_2O_3系融体中のFeおよびTiの溶解度を900°Cで測定した。その結果、Na_2O-B_2O_3濃度比の増加に伴っていずれの溶解度とも上昇し、例えばNa_2O・2B_2O_3組成では各々2.9%および4.6%であった。そこで本実験では、Na_2O-B_2O_3系融体中のFe、Tiの初期濃度を1%未満とした。NaClとNa_2O-B_2O_3系融体間のFeの分配比はNa_2O/B_2O_3濃度比の上昇に伴って増加し、このモル比が1/3付近で最大値を示した後、減少した。同一のNa_2O/B_2O_3比で比較すると、高温ほど、また、雰囲気が酸化性であるほどFeの分配比は大きくなった。一方、Tiの分配比はNa_2O/B_2O_3濃度比が上昇すると減少する傾向を示した。また、高温ほど大きな分配比となるものの、雰囲気の影響は顕著ではなかった。FeおよびTiをそれぞれ1.44.7%および1.42.2%と増加させた場合、同一Na_2O/B_2O_3濃度比おける分配比は低下した。アルミナるつぼを白金るつぼに代えて、Na_2OーB_2O_3系融体中のAl_2O_3濃度がFeおよびTiの分配比におよぼす影響を調べた結果、Al_2O_3濃度増加に伴ってこれら分配比が微かに減少することを見出した。同様の実験方法で、Mo鉱石の純化を目的として、Mo、SiおよびFeが共存する状態での分配比を大気下で求めた。その結果、例えば、Na_2O/B_2O_3モル比が1/3の場合、900°CではMoの1/3量、Siのほぼ全量、そしてFeの9/10量がNa_2OーB_2O_3系融体中に残ることがわかった。NaclとNa_2O-B_2O_3系融体間で鉄およびチタンの分配平衡実験を行った.

実験温度は900および1000°C,実験時間は310hr,雰囲気は大気,アルゴンまたは脱酸アルゴン気流(100ml/min)とし,溶解には縦型抵抗炉を用いた.るつぼは高純度アルミナ質のものを用いた.本実験におけるNa_2O-B_2O_3系融体組成は, Nacl-Na_2O-B_2O_3三元系状態図で二液相分離が生じる範囲,すなわちNa_2O/B_2O_3モル比が約2/3以下である.予備実験として, Na_2O-B_2O_3系融体中の鉄およびチタンの溶解度を, 900°Cで攪拌せずに96hr放置することにより測定した.その結果, Na_2O/B_2O_3濃度比の増加に伴って,鉄およびチタンの溶解度はいずれも上昇し,例えば, Na_2O・2B_2O_3組成ではそれぞれ2.9%および4.6%であった.そこで,本実験では, Na_2O-B_2O_3系融体中の鉄およびチタンの初期濃度を1%未満とした.NaclとNa_2O-B_2O_3系融体間の鉄の分配比は, Na_2O/B_2O_3濃度比の上昇に伴って増加し,このモル比が1/3付近で最大値を示した後,減少した.同一のNa_2O/B_2O_3濃度比で比較すると,高温ほど,また,雰囲気が酸化性であるほど,鉄の分配比は大きくなった.一方,チタンの分配比はNa_2O/B_2O_3濃度比が上昇すると減少する傾向を示した.また,高温ほど大きな分配比となるものの雰囲気の影響は顕著ではなかった.本研究結果より,低酸素分圧の雰囲気下で, Na_2O/B_2O_3濃度比の低いNa_2O-B_2O_3系スラグとNaclを用いることにより,鉄をスラグ(酸化物)相にとどめたまま,チタンをNacl中に抽出する精練法が考えられる.今年度の実験結果からはるつぼからNa_2O-B_2O_3系融体中に溶け込むAl_2O_3の,鉄およびチタンの分配比におよぼす影響を明らかにすることはできなかったため,次年度において検討する.NaClとNa_2O-B_2O_3系融体間での鉄およびチタンの分配平衡におよぼすNa_2O-B_2O_3系融体中のAl_2O_3の影響を求める実験を行った。実験温度は900°C、実験時間は310hr、雰囲気は大気とし、溶解には縦型抵抗炉を用いた。るつぼは白金るつぼを用いた。本実験において、Na_2O-B_2O_3系融体のNa_2O/B_2O_3モル比は、Na_2O-B_2O_3-NaCl三元系状態図で二液相分離が生じる範囲、すなわち、約2/3以下である必要があるため、1/3および1/5とした。また、Al_2O_3濃度は02%の間で変化させた。その結果、鉄およびチタンの分配比LM=(%M)slag/(%M)salt(M=Fe,Ti)はAl_2O_3濃度の増加に伴って減少することがわかった。しかし、Al_2O_3濃度の変化に伴う分配比の変化が微かであることから、Al_2O_3濃度をコントロールすることにより、鉄、チタンのどちらかを選択的にNaCl相中に移行させる現象を助長させることはできない。前年度は鉄およびチタンの分配平衡実験を行ったが、本年度はモリブデン鉱石の純化に着目し、モリブデン鉱石中に含まれる不純物の中でシリコンおよび鉄をとり上げた。すなわち、NaClとNa_2O-B_2O_3系融体間でモリブデン、シリコンおよび鉄が共存する場合の分配平衡実験を行った。実験温度は900°C、実験時間は15hr、雰囲気は大気とし、るつぼは高純度アルミナ質のものを用いた。モリブデン鉱石中のモリブデンはMoO_3として存在することが知られており、Na_2O-B_2O_3-MoO_3系状態図を考えれば、MoO_3のNa_2O-B_2O_3系融体中の溶解度は高い。Na_2O-B_2O_3融体中のMoO_3初期濃度は4060%、シリコンおよび鉄濃度はそれぞれ2%および1%とした。その結果、例えば、Na_2O/B_2O_3モル比が1/3の場合、Moの1/3量、Siのほぼ全量、そしてFeの9/10量がNa_2O-B_2O_3系融体中に残ることがわかった。実際のモリブデン鉱石を同様に処理したところ、ほぼ同様の傾向を示したが、銅の9/10量がNaCl相中に移行した。
頭頸部腫瘍における抗BrdUを用いたFCMによる細胞動態と抗癌剤の感受性の検討

癌治療を行う上で、癌細胞のDNA量を測定することは診断、治療にとって非常に有用であり、この目的のために、当教室ではフローサイトメトリー(以下FCM)が用いられている。しかし、cell cycleを解析するには、複雑な解析モデルが必要であり、抗癌剤等を作用させた場合ほとんど不可能となる。そこで臨床材料の分析と並行して、5-BrdUを取り込んだ、S期細胞を認識するモノクローナル抗体を用いたDNA/BrdU二重染色によって細胞動態の解析の確立、さらに、これを用いて、抗癌剤を投与した場合の細胞動態から抗癌剤の感受性について検討し、臨床における抗癌剤の有用性について研究した。1.各種口腔癌の培養:6検体から得られた扁平上皮癌細胞を、単層静置培養を行い、顎下リンパ節転移部より採取した扁平上皮癌細胞の株化に成功し、現在150代で継代中である。2.口腔癌のFCM分析:新鮮材料については口腔扁平上皮癌患者のうち、原発巣が舌、口腔底および歯肉の40例、バラフィン包埋材料については病理組織学的に扁平上皮癌と診断された顎口腔領域腫瘍の96例をDNA分析した。Aneupoid腫瘍はDiploid腫瘍に比して、転移能を有している事が示唆された。さらに、転移リンパ節では、原発巣より、DNA aneuploidyの出現頻度が低値であり、転移の初期には、DNA diploidyを示すcell lineが関与している可能性が示唆された。3.HCl処理によるBrdU染色能とヒストグラムの関係を検索し、HCl処理は30分が適当であることが判明した。4.CDDP投与による感受性検索:本学口腔病理学教室で継代培養されている、耳下腺由来腺様嚢胞癌株(ACC3)を用い、ACC3株に対するCDDPの効果が増殖曲線、病理組織、BrdUを用いた二重染色にて証明された。本年度は、今までの研究をさらに進めた。すなわち、現在継代培養されている頭頚部悪性腫瘍細胞株(舌癌2例、上顎癌、口底癌、下顎歯肉癌各1例)をさらに継代培養した。各細胞は一定した増殖傾向を示し、細胞株として安定してきたことが示された。培養細胞のFCM測定は、PI単独染色によるDNA量の測定をまず行い、その結果、明らかに腫瘍細胞としての特徴を持っていることが示された。すなわち正常細胞と比して、S期、G2M期の成分が多いヒストグラムがえられた。次に、培養中にBrdUを投与し、固定後、抗BrdU抗体染色を用いたPl/FITC二重染色の測定を開始した。この方法ではS期にある細胞がBrdUを取り込みFITCの蛍光を発することから、S期細胞の割合を測定することが可能であることが示されたがデ-タが少なく現在さらに測定を追加している段階であり、各細胞成分の割合を正確に算定でき、腫瘍細胞の性格、及び、抗腫瘍剤投与における細胞回転に及ぼす影響が正確に判定できるものと思われた。生検材料のPI単独染色によるFCMによるDNA量の測定は、継続して行っており、症例数を重ねている。摘出標本におけるBrdUを用いた2重染色は、培養細胞同様非常に有用であると思われるが、これは現在、その染色、測定法について、検討中である。現在継代培養されている頭頚部悪性腫瘍株(5株)の継代培養を続行し、さらに他の新しい臨床症例の材料を用いて細胞株を確立する予定である。

培養細胞のFCM測定により細胞動態を分析すると、腫瘍細胞は正常細胞と比して、S期、G2M期の成分が多く、すなわち増殖能が高い特徴を持っていることが示された。また種々の抗癌剤に耐性のある細胞株については、現在確立途中の段階であり、細胞株確立後はデ-タの分析を行い、臨床応用を予定している。現在培養中の確立された細胞株にBrdUを投与し、固定後、抗BrdU抗体染色を用いたPI/FITC2重染色後、FCM測定を行った。BrdUにより標識された良好なDNAヒストグラムが得られ、その細胞動態の分析は現在も続行中である。臨床応用については口腔扁平上皮癌60症例についてFCM測定を行い正常組織と比較検討した。それによるとDNA index、DNA ploidy、細胞動態の分析は悪性度の評価の指標になることが示された。また扁平上皮癌では病理組織学的悪性度と、核DNA量分析の結果に高い相関がみられた。今後この結果について雑誌等に投稿する予定である。生検材料についてもBrdUを投与、分散後、PI/FITCによる2重染色、FCM測定を行っているが、まだ実験途中でありデ-タ分析は今年度中に行う予定である。また生検材料に抗癌剤を投与すると、その作用により細胞動態の変化が認められているが、抗癌剤の作用機序及び抗癌剤感受性の判定については検討中である。現在継代培養されている頭頚部悪性腫瘍株(5株)の継代培養を続行し、さらに他の新しい臨床の材料を用いて細胞株を確立する予定である。培養細胞のPI単独染色による、FCMによる細胞動態の解析にて、正常細胞より増殖能が高い事が示され、現在、培養中の細胞株にBrdUを投与し、固定後、抗BrdU抗体染色を用いたPI/FITC二入染色後FCM測定を行った。細胞株によりBrdUに標識される、細胞が異なるため、その解析は難しいが、1つの細胞株にてBrdUがS期細胞成分に高度に取り込まれ、良好な2次元サイトグラムが得られた。このサイトグラムを用いてS期細胞の割合を正確に測定する事ができた。現在この細胞を用いて、抗癌剤を投与し、投与後各時期における細胞動態の変化を測定し、抗癌剤の作用機序及び抗癌剤感受性の判定について解析中である。臨床応用として頭頚部悪性腫瘍について、PI染色によるFCM測定を継続して行っており、短時間に細胞動態の分析を行える事から、補助診断としての重要性が示されている。生検材料についても、採取組織に高圧下にBrdUを投与後、分散し、PI/FITCによる二重染色によるFCM測定を行っているが、これも各標本によるBrdUの染色性が異なるため、標本個々の染色条件の設定が難しく細胞動態の解析が困難であるがさらに症例を増やして検討中である。
アポ蛋白E欠損症の遺伝子学的解析

III型高脂血症を発症した世界で3例目のアポ蛋白E(アポE)欠損症の患者の遺伝子解析を行ってきた。患者白血球由来のDNAからアポE遺伝子おクローニングし、アポEをコードする領域を含む約4700bpsの遺伝子配列を決定した結果、第2エクソンに一箇所、イントロンに十箇所の、野生型と異なる遺伝子配列を発見した。しかし、アポE遺伝子の発現調節に重要であると報告されている部位には配列異常は認めなかった。そこで、1)アポ遺伝子上流5kbpsをCATベクターに組み込んだベクターA、2)アポE遺伝子上流5kbpsを含み、かつアポE蛋白のほぼ全長の蛋白とCAT蛋白との融合蛋白を発現するベクターB、を作成しCAT活性にて発現量を調べた。ベクターAをマウスのモノサイト由来白血病細胞株THP-1細胞に導入した実験においては、野生型の遺伝子と比較して軽度の低下を認めたが、患者の病態を説明できる程度ではなく、またヒト肝芽腫細胞株由来のHepG2細胞を用いた場合には野生型との間にはほとんど差が認められなかった。ベクターBをHepG2細胞に遺伝子導入した結果、野生型ではCAT活性が存在するが欠損型ではCAT活性が全く消失していることを確認したため、欠損型と野生型のキメラを4種類作成し実験を行ったが、未だその責任領域を突き止めるところには至っていない。一方、第2エクソンの異常がこの患者にユニークなものか、単なる多型性によるものかを検索する目的で、正常日本人DNA15例と比較したところ、この異常は患者に特異なものであり、しかも患者においてはホモ接合体であることがほぼ確実となった。今後、1)アポE遺伝子をTHE-1細胞に導入し、発現するmRNA量をRT-PCR法にて野生型と比較し、また2)コスミドベクターを使用し更に上流部を含む遺伝子のクローニングを行ない、上流部の検索を行っていく予定である。
虚血性神経細胞傷害と鉄代謝に関する研究

虚血性神経細胞損傷には酸化的損傷が深く関係している。遷移金属は水酸化鉄のような細胞傷害用のあるフリーラジカルを発生する。従って、虚血性神経細胞損傷には遷移金属、とりわけ鉄が大きな役割を演じている可能性が極めて高い。一方、その鉄は鉄運搬蛋白であるトランスフェリンにより運ばれ、トランスフェリン受容体を介して細胞内に取込まれる。この際クラスリンが重要な役割を演じる。細胞内の余った鉄はフェリチンの形で貯蔵される。またこの系で細胞内に取込まれた鉄は、虚血性神経細胞損傷で新たに注目されている神経伝達物質CO(一酸化炭素)と関連するヘムオキシゲナーゼの産生、活性化と密接な関係を有している。従って、虚血脳における脳内の鉄の分布、代謝を追究することは虚血性神経細胞損傷の仕組を少なからず明らかにできる可能性があるので、ラットの局所脳虚血ならびに全脳虚血モデル、砂ネズミの前脳虚血モデルを使用し、虚血性神経細胞死に鉄がいかなる役割を演じているかに注目し各種の実験を行なった。ラット局所脳虚血(MCA閉塞)モデル、ラット心停止モデル、砂ネズミの両総頚動脈閉塞モデルによる脳虚血モデルでの鉄染色、免疫組織化学法によるクラスリン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、in site hybridization又はin situ RT-PCR hybridizationによるヘムオキシゲナーゼ1とヘムオキシゲナーゼ2の両mRNAなどの虚血脳における脳内の鉄の分布、代謝を検討したがコントロールと比較していずれも顕著な差が観察できなかった。これらの結果より鉄沈着、鉄代謝は我々が観察した期間では、神経細胞死に直接関与していないことが考えられる。心停止の時間を決める上で海馬CA1錐体細胞の脱落が全例で見られる時間を決定するのと心停止中の体温(脳温)の問題に労を要したが、この問題も解決して、中大脳動脈閉塞による局所脳虚血モデル、心停止による全脳虚血モデルを使用した脳虚血後6時間、1、3、7日に摘出しクリオスタットで虚血中心である大脳皮質並びに尾状核被殻を含む切片、海馬、視床を含む切片、黒質を含む切片を作製し、鉄染色、免疫組織化学、in situ hybridizationを行なった。鉄染色においては、局所脳虚血、心停止による全脳虚血後6時間、1、3、7日目まで鉄の沈着は見られなかった。また、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、クラスリンに対する免疫組織化学実験の結果、並びに、ヘムオキシゲナーゼI、IIに対するin situ hybridizationの実験結果においてもNの数が2と少ないため著しい差は観察できなかった。今後Nを5まで行ない綿密に検討し、差がなければ脳虚血後の時間を1ヵ月まで延長して同じ実験を行なう予定である。ラットにおける中大脳動脈閉塞による局所脳虚血、並びに、心停止による全脳虚血モデルを使用した脳虚血後1、2、4、8週間に脳を摘出し、クリオスタットで、虚血中心である大脳皮質並びに尾状核被殻を含む切片、海馬、視床を含む切片黒質を含む切片を作製し、鉄染色、免疫組織化学、in situ hybridizationを行なった。鉄染色においては、局所脳虚血、心停止による全脳虚血後1、2、4、8週間後まで鉄の沈着は見られなかった。また、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、スラクリンに対する免疫組織化学実験の結果、正常群と脳虚血群との間に差は観察できなかった。さらに、ヘムオキシゲナーゼI、IIに対するin situ hybridizationの実験結果においても正常群と脳虚血群との間に差は観察できなかった。

中大脳動脈閉塞による局所脳虚血、心停止による全脳虚血モデルを使用した脳虚血後1、2、4、8週間まで実験を行なったが、いずれの結果もnegative dataしか得られなかったので、脳虚血モデルを遅延神経細胞死(delayed neuronal death)の概念が確立している砂ネズミの前脳虚血に変更して、すなわち、砂ネズミの両総頸動脈を5分間クリップで結紮し、再開通6、24、48、72時間後、脳を取りだし、海馬を含む横断面切片を作成して、遅延神経細胞死に対する鉄代謝(鉄染色、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、スラクリンに対する免疫組織化学実験、ヘムオキシゲナーゼI、IIに対するin situ hybridizationの実験)に関することを、現在実施しているところである。昨年度、一昨年度の実験より、局所脳虚血、全脳虚血後6時間-8週までは、鉄沈着、クラスリン・トランスフェリン・トランスフェリン受容体抗体による免疫組織化学的方法、ヘムオキシゲナーゼのin situ hybridizationの結果は正常ラットと相違がなかった。従って、今年度は脳虚血モデルを遅発性神経細胞死(delayed neuronal death)の概念が確立している砂ネズミの前脳虚血に変更して、海馬を含む横断面について、正常砂ネズミと前脳虚血群(虚血後6時間、1、2、3、4日の5群)で、鉄沈着、クラスリン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体の抗体を使用した免疫組織化学的方法、ヘムオキシゲナーゼ1とヘムオキシゲナーゼ2のオリゴヌクレオチドを使用したin situ hybridizationとin situ RT-PCR hybridizationにより比較検討する事により虚血脳における脳内の鉄の分布ならびに代謝を調べた。砂ネズミの両総頚動脈閉塞モデルでの検討では鉄染色、免疫組織化学法によるクラスリン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、in site hybridizationとin situ RT-PCR hybridizationによるヘムオキシゲナーゼ1とヘムオキシゲナーゼ2のmRNAともコントロール(正常群)に比較して虚血群において、著しい差は検出できなかった。従って、砂ネズミの前脳虚血モデルによる脳虚血でも鉄沈着、鉄代謝は神経細胞死には直接関与していないと思われる。