hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
含ケイ素生理活性物質の創製

ケイ素は炭素と同じ周期表の14族に属すことから、創薬化学においてケイ素を炭素の代替元素として利用することが試みられている。炭素をケイ素に置換する効果として、分子サイズ・結合角の変化、脂溶性の向上、電気陰性度の違い(電荷の偏り)により、活性、選択性、体内動態等の変化・改善が期待される。また、ケイ素に置換することで化合物の特許上の新規性が得られる可能性もある。まず、ジフェニルシラン骨格を利用した例として、私はステロイドスルファターゼ(STS)阻害剤の創製に着手した。ビスフェノール型STS阻害剤の報告例がすでにあったが、代謝物がエストロゲン状態(ER)αアゴニスト活性を有することから乳がん治療薬としては問題があった。そこで、本研究ではケイ素を用いた構造展開を行い、STSを阻害した後、ERαアンタゴニストとして機能するジフェニルシラン誘導体を見出した。続いて、長鎖脂肪酸中のシスオレフィンをケイ素リンカーで置換した際の生理活性の変化を、内因性の脂肪酸アミドであるOEAを用いて検討した。ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体(PPAR)αアゴニストとしても知られるoleoylethaolamide(OEA)は構造中にシスオレフィンを有する。OEAのシスオレフィンをケイ素リンカーで置換した際の生理活性の変化を、PPARα/δ/γに対する転写活性を指標として評価した。その結果、ケイ素リンカーへの置換と炭素鎖長の最適化によりPPARαアゴニストOEAからPPARδアゴニストの創製に成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。私は以前の研究で、化学的に不安定なシスオレフィン構造を有するチューブリン重合阻害剤コンブレタスタチンA-4のシスオレフィンをケイ素リンカーに置き換えることで、安定でかつコンブレタスタチンA-4と同等の抗腫瘍活性を有するケイ素化合物を見出した。そこで本研究では、コンブレタスタチンのようなスチルベン骨格以外の構造を有するシスオレフィン化合物でもケイ素リンカーによる代替が可能であるかを検討することとした。リード化合物として長鎖脂肪酸構造中にシスオレフィンを有するオレオイルエタノールアミンを選定し、ケイ素を用いた構造展開を行った。オレオイルエタノールアミンは脂肪酸代謝等に関わる核内受容体であるPPARαのアゴニスト、すなわち作動薬であり、当研究室でPPARαアゴニスト活性をみるための評価系がすでに構築されているのもオレオイルエタノールアミンをリード化合物として選んだ理由の1つである。合成では、シスオレフィン部分をジメチル、ジエチル、ジ-n-プロピル、ジ-n-ブチルシランに置き換えた化合物及び、リード化合物から引き継いだ構造部分の炭素鎖長を変換した化合物を合成した。ケイ素の導入は、末端アルキンをリチオ化し、ジアルキルジクロロシランと反応させることで達成した。得られた種々のケイ素化合物について、当研究室保有のアッセイ系にてPPARα、δ、γアゴニスト活性を評価した。その結果、ケイ素の導入によりαと比較してδに対する選択性が高くなることがわかった。一方で、αに対する活性に着目すると、リード化合物と比較して減弱した。本研究の結果、先のチューブリン重合阻害剤の創製研究とは異なる結果が得られたが、ケイ素の導入により選択性の変化が期待できることが示唆された。このことから、創薬化学においてケイ素の導入は有用な選択肢の1つになり得ると考えられる。研究を遂行する上で幸い大きな問題は起きず、予定どおりに進んだ。シラトランの利用:シラトランはアトラン(Atrane)と呼ばれる化合物群の1つであり、窒素原子の渡環相互作用により形成された3つの5員環を持つことが特徴である。ゲルマニウムやホウ素など、いくつかの原子がアトランを形成することが知られているが、ケイ素を含むアトランをシラトランと呼ぶ。シラトランは三方両錘の立体を有しているが、これはスルファターゼによる脱硫酸化の反応遷移状態の立体と同等である。そこで、本研究では、シラトランを有する化合物が、スルファターゼの反応遷移状態アナログ(TSA; Transition State Analog)型阻害剤として機能し得るかを検討することとした。既知のジフェニルシラン型STS阻害剤のスルファメート部位をシラトランに変換した化合物を合成することを目指し、まず合成が簡便な化合物をデザインし、その合成を計画した。いくつかの中間体の合成を行い、最終目的物の合成に向けて条件検討を行っている。STS阻害剤の合成:修士課程で行ったSTS及びERαに対する二重阻害剤の創製について新たな化合物データを補完し、さらなる考察を行うことを目指す。過去に、ジフェニルシラン、ジフェニルメタン骨格を有する種々の化合物を合成しそのSTS阻害活性及びERアンタゴニスト活性を測定し、STS及びERαに対する二重阻害剤を見出した。そこで、本研究では新たにデザインした化合物群を合成し、活性評価及び物理化学的性質を明らかにし、ジフェニルメタン骨格の二重阻害剤としての有用性の拡充を目指す。幾つかの最終体の合成、活性評価まで終えている。シラトラン化合物の合成に難航しているが、並行して行っているSTS阻害剤の創製については合成・活性評価共に予定通りに進んでいる。

炭素をケイ素に置換する効果として、分子サイズ・結合角の変化、脂溶性の向上、電気陰性度の違い(電荷の偏り)により、活性、選択性、体内動態等の変化・改善が期待される。また、ケイ素に置換することで化合物の特許上の新規性が得られる可能性もある。まず、ジフェニルシラン骨格を利用した例として、私はステロイドスルファターゼ(STS)阻害剤の創製に着手した。ビスフェノール型STS阻害剤の報告例がすでにあったが、代謝物がエストロゲン状態(ER)αアゴニスト活性を有することから乳がん治療薬としては問題があった。そこで、本研究ではケイ素を用いた構造展開を行い、STSを阻害した後、ERαアンタゴニストとして機能するジフェニルシラン誘導体を見出した。続いて、長鎖脂肪酸中のシスオレフィンをケイ素リンカーで置換した際の生理活性の変化を、内因性の脂肪酸アミドであるOEAを用いて検討した。ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体(PPAR)αアゴニストとしても知られるoleoylethaolamide(OEA)は構造中にシスオレフィンを有する。OEAのシスオレフィンをケイ素リンカーで置換した際の生理活性の変化を、PPARα/δ/γに対する転写活性を指標として評価した。その結果、ケイ素リンカーへの置換と炭素鎖長の最適化によりPPARαアゴニストOEAからPPARδアゴニストの創製に成功した。本研究課題については現在までで一区切りとし、新たな研究テーマとしてシラトラン化合物の合成に着手する。シラトランはケイ素を中心とした三方両錐の構造をとっており、これはスルファターゼによる脱硫酸化の反応遷移状態と同一の立体である。そこで、本研究ではシラトラン構造を有する化合物がスルファターゼの遷移状態型アナログとして機能し得るかを検討する。シラトランの創製については合成の条件検討を引き続き行っていく。STS阻害剤の創製については、さらに多くの新規化合物を合成し、活性評価をしていく。アッセイ系については当研究室保有の方法を利用することで迅速に遂行する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
インテグリンシグナルと脂質ラフトによる細胞分裂軸制御機構の解明

哺乳類の接着性培養細胞は、接着する細胞外基質に対して水平に分裂するための制御機構が存在することがが、この制御には、PtdIns(3,4,5)P3が必要であり、インテグリンを介した細胞接着がPtdIns(3,4,5)P3を作るのに必要な酵素であるPI3Kの活性化に必要である。申請者は、この制御に低分子量Gタンパク質の一つCdc42が重要な役割を果たしていることを明らかとした。Cdc42をsiRNAで発現抑制すると、分裂期においてPI3Kの活性化が抑制された。さらに、PAK2がCdc42の下流で機能していることを突き止めた。さらにPAK2が紡錘体配向制御にどのようにして関与しているかを様々な変異体を導入して検討したところ、(1)Cdc42との直接的な相互作用が重要である、(2)PAK2のキナーゼ活性は必要ではない、(3)betaPixと呼ばれるタンバク質と相互作用することが重要である、ことが分かった。さらに、Cdc42-PAK2-betaPixの経路はCdc42-PI3K経路とは独立に機能し、前者が細胞膜表層のアクチン骨格の制御を通して、また後者はPtdIns(3,4,5)P3の生産を通して、星状微小管を制御するダイニンーダイナクチン複合体の局在を制御していることを明らかとした(Mol.Cell Biol.,10,2816-2827(2009))。さらに申請者は、M期におけるアクチンダイナミックスを明らかにするためGFP融合アクチンを作成し、タイムラブス顕微鏡により観察した。その結果、M期の始まりにおいてアクチン繊維の塊が一か所に集積し、その塊が、細胞膜に沿って回転運動することを見出した。この運動の特徴を詳しく調べてみると、等速運動であること、また、運動方向は細胞-細胞外基間接着面に対して水平方向に起こることが分かった。また、この回転運動はCdk1の活性に依存していることを明らかとした。さらに、この新規の現象を分子レベルで解析し、M期の新規アクチンダイナミクスに局在する分子を複数同定し、さらにこの現象に必須であると考えられる分子を同定することに成功している。また、繊維状アクチンの塊内におけるアクチンのターンオーバーをFRAPやphotoconversionといった実験を行い詳細に解析した。哺乳類の接着性培養細胞は、接着する細胞外基質に対して水平に分裂するための制御機構が存在することが、この制御には、PtdIns(3,4,5)P3が必要であり、インテグリンを介した細胞接着がPtdlns(3,4,5)P3を作るのに必要な酵素であるPI3Kの活性化に必要であることを明らかとした(Dev Cell,2007)。さらに申請者は、この制御に低分子量Gタンパク質の一つCdc42が重要な役割を果たしていることを明らかとした。Cdc42をsiRNAで発現抑制すると、紡錘体が細胞接着面に対して水平に配置されず、その原因の一つが、分裂期においてPI3Kの活性化が抑制されることがわかった。また、Cdc42は細胞膜の限局された領域で活性化していることが分かった。さらに、Cdc42の下流因子を探索したところ、PAK2という標的因子が関与していることを突き止めた。PAK2もCdc42とともに細胞膜の限局した領域に局在したが、Cdc42を抑制するとPAK2の局在が抑制された。さらにPAK2が紡錘体配向制御にどのようにして関与しているかを様々な変異体を導入して検討したところ、(1)Cdc42との直接的な相互作用が重要である、(2)PAK2のキナーゼ活性は必要ではない、(3)betaPixと呼ばれるたんぱく質と相互作用することが重要である、ことが分かった。さらに、Cdc42-PAK2-betaPixの経路はCdc42-PI3K経路とは独立に機能し、前者が細胞膜表層のアクチン骨格の制御を通して、また後者はPtdIns(3,4,5)P3の生産を通して、星状微小管を制御するダイニン-ダイナクチン複合体の局在を制御していることを明らかとした。以上の結果をまとめ、現在論文投稿中である。申請者はさらに、脂質ラフトの主成分であるコレステロールを細胞から引き抜くことで紡錘体の配向が乱れることを明らかとし、この現象はコレステロールを再添加することで回復されることを明らかとした。さらには脂質ドメインの一つであるカベオラの主成分であるカベオリンもまた、分裂期において細胞膜上で限局した局在を示すことを明らかとした。現在、インテグリンによる細胞接着シグナルがいかにして細胞膜内に伝えられるかを検討中である。哺乳類の接着性培養細胞は、接着する細胞外基質に対して水平に分裂するための制御機構が存在することがが、この制御には、PtdIns(3,4,5)P3が必要であり、インテグリンを介した細胞接着がPtdlns(3,4,5)P3を作るのに必要な酵素であるPI3Kの活性化に必要であることを明らかとした(Dev Cell,2007)。

さらに、Cdc42の下流因子を探索したところ、PAK2という標的因子が関与していることを突き止めた。PAK2もCdc42とともに細胞膜の限局した領域に局在したが、Cdc42を抑制するとPAK2の局在が抑制された。さらにPAK2が紡錘体配向制御にどのようにして関与しているかを様々な変異体を導入して検討したところ、(1)Cdc42との直接的な相互作用が重要である、(2)PAK2のキナーゼ活性は必要ではない、(3)betaPixと呼ばれるタンパク質と相互作用することが重要である、ことが分かった。さらに、Cdc42-PAK2-betaPixの経路はCdc42-PI3K経路とは独立に機能し、前者が細胞膜表層のアクチン骨格の制御を通して、また後者はPtdIns(3,4,5)P3の生産を通して、星状微小管を制御するダイニン-ダイナクチン複合体の局在を制御していることを明らかとした。以上の結果をMolecular and Cellular Biology誌に投稿し、受理された(2009年3月)。申請者はさらに、M期におけるアクチンのダイナミックスを明らかにするためGFP融合アクチンを作成し、タイムラプス顕微鏡により観察した。その結果、M期のアクチンは非常にダイナミックに変化していることが明らかとなった。現在、M期のアクチンダイナミクスにどのような分子が関与しているか、また、その生理的な意義について詳細な検証を行っている。哺乳類の接着性培養細胞は、接着する細胞外基質に対して水平に分裂するための制御機構が存在することがが、この制御には、PtdIns(3,4,5)P3が必要であり、インテグリンを介した細胞接着がPtdIns(3,4,5)P3を作るのに必要な酵素であるPI3Kの活性化に必要である。申請者は、この制御に低分子量Gタンパク質の一つCdc42が重要な役割を果たしていることを明らかとした。Cdc42をsiRNAで発現抑制すると、分裂期においてPI3Kの活性化が抑制された。さらに、PAK2がCdc42の下流で機能していることを突き止めた。さらにPAK2が紡錘体配向制御にどのようにして関与しているかを様々な変異体を導入して検討したところ、(1)Cdc42との直接的な相互作用が重要である、(2)PAK2のキナーゼ活性は必要ではない、(3)betaPixと呼ばれるタンバク質と相互作用することが重要である、ことが分かった。さらに、Cdc42-PAK2-betaPixの経路はCdc42-PI3K経路とは独立に機能し、前者が細胞膜表層のアクチン骨格の制御を通して、また後者はPtdIns(3,4,5)P3の生産を通して、星状微小管を制御するダイニンーダイナクチン複合体の局在を制御していることを明らかとした(Mol.Cell Biol.,10,2816-2827(2009))。さらに申請者は、M期におけるアクチンダイナミックスを明らかにするためGFP融合アクチンを作成し、タイムラブス顕微鏡により観察した。その結果、M期の始まりにおいてアクチン繊維の塊が一か所に集積し、その塊が、細胞膜に沿って回転運動することを見出した。この運動の特徴を詳しく調べてみると、等速運動であること、また、運動方向は細胞-細胞外基間接着面に対して水平方向に起こることが分かった。また、この回転運動はCdk1の活性に依存していることを明らかとした。さらに、この新規の現象を分子レベルで解析し、M期の新規アクチンダイナミクスに局在する分子を複数同定し、さらにこの現象に必須であると考えられる分子を同定することに成功している。
高機能並列ストレージシステムにおけるコンテンツの特徴と性能要件を考慮した自律管理

本研究の目的は,高機能ストレージノードのネットワーク結合により構築される大規模並列ストレージシステムにおいて,格納されたコンテンツの利用傾向の特徴を利用し,システム利用者から与えられた性能要件を考慮した自律的なストレージ管理機能を実現することである.本年度は,自律的ストレージ管理機能である動的データマイグレーションによる負荷均衡化に対し、性能要件との両立について、これまでの提案手法をさらに改良し、より一般的な利用環境下においても上記両立が達成された。具体的には、以下の研究成果について、発表を行った。(1)他のノードに配置した複製データを用い、性能要件を考慮したアクセス回送制御、データマイグレーション経路制御を行うことで負荷均衡化と性能要件保持の両立を達成する提案手法Replica-assisted Migrationについて、Zipf分布を用いた人工的ワークロード、大規模WEBサイトから抽出した現実的読み出しワークロードを用いた実験により性能保持効果を確認した。(2)高頻度かつ予測しづらい変化をし、更新リクエストを含むアクセスに対応を行った。格納されたコンテンツの利用特徴を考慮し,マイグレーション経路の適応的制御、隣接ノードのファイルキャッシュ書き込み更新制御を行うことで、現実的なアクセス下でもReplica-assisted Migrationによりデータマイグレーションによる負荷均衡化と性能要件保持の両立を達成した。Zipf分布ワークロード及び、大規模ファイルサーバを基にした現実的ワークロードによる実験により性能保持効果を確認した。これにより、前年度のコンテンツ利用特徴の抽出に関する研究成果と併せ、目的とするコンテンツの特徴と性能要件を考慮した自律的なストレージ管理機能実現方式を明確化した。本研究の目的は,高機能ストレージノードのネットワーク結合により構築される大規模並列ストレージシステムにおいて,コンテンツの特徴と性能要件を考慮したストレージ管理機能を実現することである.本年度は,コンテンツ特徴からストレージ管理ルール発火までと,ルールから実際のストレージ管理手法までの両側から次のような研究を行った.(1)コンテンツの特徴としてライフサイクル管理に着目し,各コンテンツの明示的ライフサイクル情報と動的に取得したコンテンツ利用傾向を融合し管理を行うフレームワークに関して検討を行った.複製データの増減管理への応用により手法の可能性に関して知見を得た.(2)格納されたコンテンツごとにストレージ管理ルールが付与された状態を想定し,爆発的に増大する管理ルールを効率よく現実時間内に評価・発火するためのデータ構造を提案した.提案手法ではルール発火条件のうち事前評価可能な部分を抽出しそれにより構築した弁別ネットワークを用いて評価対象ルールの選別を行う.(3)性能要件を維持しつつデータマイグレーションによる負荷均衡化を実現するため提案している手法レプリカアシストについて,より詳細な管理ルールを用いた制御を行うための詳細評価・改良を行った.内部動作まで再現した精巧なストレージシミュレーションプログラムを構築し,現実の複数のシステムから取得されたワークロードを用いた実験を行い,手法動作の詳細制御のための知見を得た.その応用の一端として,手法の適応的制御を提案し,その結果マイグレーション時間の削減といった効果を確認した.本研究の目的は,高機能ストレージノードのネットワーク結合により構築される大規模並列ストレージシステムにおいて,格納されたコンテンツの利用傾向の特徴を利用し,システム利用者から与えられた性能要件を考慮した自律的なストレージ管理機能を実現することである.本年度は,自律的ストレージ管理機能である動的データマイグレーションによる負荷均衡化に対し、性能要件との両立について、これまでの提案手法をさらに改良し、より一般的な利用環境下においても上記両立が達成された。
卵巣癌・子宮体癌・子宮頚癌における遺伝子・染色体異常についての解析-FISH法、CGH法を用いた新たな診断法の開発と細胞診への応用-

2色FISH法により、個々の癌細胞における染色体変化や特定遺伝子の増幅または欠失を検索することできる。昨年までに、我々は子宮頸癌において癌抑制遺伝子の存在する第1・第17染色体短腕(1p,17p)の数的・構造的異常を2色FISH法を用いて検索することが、頸部腺癌症例細胞診の補助的診断法として有用であることを報告した。本年は、組織型により悪性度が異なるもののHE標本上組織型の診断が時に難しい卵巣癌に対し、1p、17pの数的・構造的異常の各組織型における差異について2色FISH法にて検索し、診断上の有用性について検討した。卵巣癌31例(漿液性腺癌9例、明細胞腺癌9例、粘液性腺癌6例、類内膜腺癌7例)より標本を作製し17p13.3と17cenのDNA probeを、または1p36と1q12のDNA probeを用い、2色FISH法を行った。短腕とセントロメアのsignal数により、腫瘍細胞をD(disomy)、M(monosomy)、DL(disomy+loss)、PL(polysomy+loss)、PP(polysomy)などに群別し、M、DL、PL3群を1p(17p)欠失を示す細胞群(欠失群)とした。1p欠失は症例の65%(20/31)に、17p欠失は84%(16/19)に認められた。欠失頻度は組織型で異なり、高頻度であったのは、漿液性腺癌の1p(9/9)、17p(6/6)、明細胞腺癌の17p(6/6)であった。また異常群の出現パターンも組織型で異なり、漿液性腺癌では1pのPL群、17pのDL群、M群、明細胞腺癌では1pのPP群、PL群、17pのPL群の出現頻度が高かった。以上より、卵巣癌、特に漿液性腺癌では1pと17pの欠失率が高く、また組織型間で異なる数的・構造的変化が染色体レベルで生じており、この差異が組織型の鑑別に有用であることが確認できた。発癌過程の初期では一つの腫瘍細胞がモノクローナルに増殖するが、途中からは新たな染色体・遺伝子異常が加わり、より増殖能・悪性度が亢進した癌細胞が他の癌細胞の増殖を凌駕し、major subpopulationへ移行していくと考えられる。今回我々は、婦人科悪性腫瘍、特に子宮頸癌およびその初期病変にける第1、17染色体それぞれの短腕(p)、セントロメアのDNA probeを用いた2色FISH法にて、個々の癌細胞における遺伝子・染色体異常を検索し、以下の結果を得た。1. 17p欠失を示す細胞群の異常増加はFISH法では浸潤癌の59%に認められ、また腺癌で高頻度(82%)に認められた。腺癌が扁平上皮癌に比べ予後不良である事実、およびP53蛋白の異常蓄積を示す症例においてFISH異常群が出現する頻度が高い事実を考え併せると、l7pの異常出現と子宮頸癌の悪性度との間に何らかの関連があると推測し得る。また第17染色体polysomy等の異常なminor subpopulationの出現が初期子宮頸癌である上皮内癌または微小浸潤癌において認められた。第17染色体のpolysomy所見は頸癌の発生ならびに初期進展に関与する変化であり、さらに浸潤癌へ進展するのに伴い17p欠失が加わるという可能性が考えられる。2.浸潤癌における1p異常に関しては、polysomyが高頻度(46%)に見られ、さらに腺癌では1p欠失が、扁平上皮癌では1p転座を示唆するパターンが認められた。扁平上皮癌と腺癌では染色体異常の出現頻度と出現パターンが異なり、染色体変化の差異が組織型、悪性度と関連している可能性が示唆された。3.高分化型腺癌はHE標本による病理学的検査では悪性の診断確定に苦慮することがあるが、今回の検討により子宮頸部腺癌に関して、その病理学的診断を行う上で2色FISH法は有益な情報が得られる検査法であることが判明した。一つの悪性腫瘍の中で悪性度の異なる腫瘍細胞が混在する場合は、ダブルターゲットFlSH法を用いて、その悪性度に関連する染色体変化や特定遺伝子の増幅または欠失を個々の癌細胞について検索することにより、個々の細胞の悪性度を推定することができる。昨年度、我々は、婦人科悪性腫瘍、特に子宮頸癌およびその初期病変にける第1、17染色体それぞれの短腕(p)、セントロメアのDNAprobeを用いた2色FISH法にて、個々の癌細胞における遺伝子・染色体異常を検索し、17p欠失を示す細胞群の異常増加は浸潤癌の59%に、特に腺癌では高頻度(82%)に出現し、P53蛋白の異常蓄積を示す症例においてFISH異常群が出現する頻度が高いことを確認した。本年度は、細胞診・組織診上、診断に苦慮することが多いとされている頸部腺癌症例の捺印細胞診標本を用い、1p,17pに関する2色FISH法を行い、実際に細胞診の補助的診断法として応用を試みた。頸部腺癌10症例を対象として検討を行ったところ、17p欠失は90%(9/10)に、1p欠失は40%(4/10)に認められ、全例において17p欠失あるいは1p欠失のいずれかが認められた。さらにFISH

異常群の出現パターンは、1pはpolysomy with loss of short arm群またはpolysomy群が5/10に、また、17pはpolysomy with loss of short arm群または、disomy with loss of short arm群が9/10に出現していた。細胞診上で異型の判定が困難とされているきわめて高分化な腺癌である悪性腺腫の1例においても17p欠失が確認され、17pおよび1pに関する2色FISH法が、頸部腺癌の細胞診の補助的診断法として有用である可能性が示唆された。2色FISH法により、個々の癌細胞における染色体変化や特定遺伝子の増幅または欠失を検索することできる。昨年までに、我々は子宮頸癌において癌抑制遺伝子の存在する第1・第17染色体短腕(1p,17p)の数的・構造的異常を2色FISH法を用いて検索することが、頸部腺癌症例細胞診の補助的診断法として有用であることを報告した。本年は、組織型により悪性度が異なるもののHE標本上組織型の診断が時に難しい卵巣癌に対し、1p、17pの数的・構造的異常の各組織型における差異について2色FISH法にて検索し、診断上の有用性について検討した。卵巣癌31例(漿液性腺癌9例、明細胞腺癌9例、粘液性腺癌6例、類内膜腺癌7例)より標本を作製し17p13.3と17cenのDNA probeを、または1p36と1q12のDNA probeを用い、2色FISH法を行った。短腕とセントロメアのsignal数により、腫瘍細胞をD(disomy)、M(monosomy)、DL(disomy+loss)、PL(polysomy+loss)、PP(polysomy)などに群別し、M、DL、PL3群を1p(17p)欠失を示す細胞群(欠失群)とした。1p欠失は症例の65%(20/31)に、17p欠失は84%(16/19)に認められた。欠失頻度は組織型で異なり、高頻度であったのは、漿液性腺癌の1p(9/9)、17p(6/6)、明細胞腺癌の17p(6/6)であった。また異常群の出現パターンも組織型で異なり、漿液性腺癌では1pのPL群、17pのDL群、M群、明細胞腺癌では1pのPP群、PL群、17pのPL群の出現頻度が高かった。以上より、卵巣癌、特に漿液性腺癌では1pと17pの欠失率が高く、また組織型間で異なる数的・構造的変化が染色体レベルで生じており、この差異が組織型の鑑別に有用であることが確認できた。
電力貯蔵磁気軸受フライホイール電気自動車の研究

本研究開発は,電気自動車用の小型高性能な電力貯蔵磁気軸受フライホイールバッテリを開発し,実際に電気自動車に搭載して電気自動車の性能向上を目指すと同時に,ブレーキ時のエネルギー回生を効率良く行うことで省エネ効果を飛躍的に高める.とくに,本研究では道路から印加される外乱に対して磁気軸受系がタッチダウンしないための制御系を構築する.具体的には適応制御理論である単純適応制御を適用することにより.外乱印加時はバイアス制御系で,かつ,強いばね定数としてタッチダウンを防止し,外乱が印加しない際はゼロバイアス制御系として磁気軸受での電力消費を抑制する新しい制御系を構築した.本研究における研究課題は,(1)小型で高密度・大出力,防振性能に優れた省電力型の電気自動車用電力貯蔵磁気軸受フライホイールの研究開発,(2)加速減速や路面等から印加される外乱に耐えうる非接触軸受の制御方式の2点について集中的に研究を実施し,当初の目標を達成した.本研究開発は,電気自動車用の小型高性能な電力貯蔵磁気軸受フライホイールバッテリを開発し,実際に電気自動車に搭載して電気自動車の性能向上を目指すと同時に,ブレーキ時のエネルギー回生を効率良く行うことで省エネ効果を飛躍的に高める.とくに,本研究では道路から印加される外乱に対して磁気軸受系がタッチダウンしないための制御系を構築する.具体的には適応制御理論である単純適応制御を適用することにより.外乱印加時はバイアス制御系で,かつ,強いばね定数としてタッチダウンを防止し,外乱が印加しない際はゼロバイアス制御系として磁気軸受での電力消費を抑制する新しい制御系を構築した.本研究における研究課題は,(1)小型で高密度・大出力,防振性能に優れた省電力型の電気自動車用電力貯蔵磁気軸受フライホイールの研究開発,(2)加速減速や路面等から印加される外乱に耐えうる非接触軸受の制御方式の2点について集中的に研究を実施し,当初の目標を達成した.本研究開発は,有害な重金属などを含有する鉛蓄電池に代わる電気自動車用の小型高性能な電力貯蔵磁気軸受フライホイールバッテリを開発し,実際に電気自動車に搭載して電気自動車の性能向上を目指すと同時に,ブレーキ時のエネルギー回生を効率良く行うことで省エネ効果を飛躍的に高ぬ,この結果,温室効果ガスの抑制を図る.とくに,2050年までに温室効果ガスを半減するという「Cool Earth-エネルギー革新技術計画」に技術的に貢献することである.研究課題は,(1)小型で高密度・大出力,防振性能に優れた省電力型の電気自動車用電力貯蔵磁気軸受フライホイールの研究開発,(2)加速減速や路面等から印加される外乱に耐えうる非接触軸受の制御方式,(3)超低損失で高効率な充放電ユニットの開発,(4)総合効率80%以上の電力貯蔵磁気軸受フライホイール用モータ・発電機および電気自動車用モータ・発電機の最適化制御システムの開発,(5)電気自動車用電力貯蔵磁気軸受フライホイールの有効性の実証,(6)鉄道や大型バス・長距離トラックなど大型重車両用ハイブリッドシステムの電力貯蔵磁気軸受フライホイール設計論の確立である.
炎症部位でのリンパ管新生におけるCLEC-2の役割を解明する

炎症部位でのリンパ管新生におけるCLEC-2の役割を検討するため、3% Dextran Sulfate Sodium(DSS)誘発大腸炎モデルマウスを作成し検討した。CLEC-2の発現は、抗CLEC-2抗体を腹腔内投与する手法を用いて完全に抑制した。大腸炎の病像、炎症の程度、大腸重量、炎症部位のリンパ管密度はCLEC-2発現の有無による差異は認められなかった。炎症部位の血管密度はCLEC-2発現抑制マウスで有意に低下していた。炎症部位に於ける血管密度とリンパ管密度にCLEC-2発現の有無で差異が認められることから、炎症部位での脈管新生にCLEC-2が何らかの役割を担うことが予想される。H26年度は以下の検討を行った。1.腹膜炎モデルとして、注射器を用いてマウス腹腔内にチオグリコネートを単回投与した。これにより腹膜炎が惹起され、腹水の貯留と腹水への炎症性細胞浸潤を認めた。炎症を惹起する方法としては問題ないと判断された。ただし腹膜炎により、腹膜や腹腔内臓器に炎症性リンパ管形成が惹起されている確認は、次年度以降で組織標本を作成して検討べき課題である。2.マウスにアルブミン液を静脈内投与し感作させた後、鼻腔内にアルブミン液を投与する方法で気道に慢性炎症を惹起し、気管支炎症モデルを作成する計画だったが、これらについては実験が実施できなかった。次年度中に早期にモデルを作成する。3.マクロファージ上のCLEC-2だけを欠損させたコンディショナルマウスの作成は、実施できなかった。そのため既に構築されている、血小板膜上のCLEC-2を欠損させたコンディショナルマウスと、全身で欠損したマウスでの検討を先行させる計画へと変更する。1.これまでは化学的に炎暑を惹起する方法を検討し、チオグリコネートの腹腔内投与による腹膜炎惹起モデルを作成した。しかし惹起される炎症の程度が様々であり、定量的な評価が困難となる可能性が予想される。そこで、このほかにも惹起される炎症が比較的一定で、作成が容易な炎症モデルの作成を試みる事とした。腫瘍細胞の増殖と腫瘤形成は、接種する腫瘍細胞の数により比較的一定の経過が期待できる。また、腫瘍の増殖と形成された腫瘤の存在は、周囲の組織への炎症を惹起する。この現象を利用し、腫瘍による炎症惹起がリンパ管新生を引き起こすか評価した。マウスの腹壁皮下に一定数に懸濁したマウス由来皮膚癌細胞B16F10腫瘍細胞を接種し、2週間後に安楽死の上、腫瘍部分の組織標本を作製した。次にリンパ管内皮細胞のマーカー蛋白であるLYVE-1を免疫組織染色した。主要内部や周辺組織にLYVE-1陽性の脈管構造が形成されている像が期待されう。しかし陽性コントロールの肺組織ではLYVE-1陽性に染色される部分が確認できるのに対し、腫瘍接種部位にはLYVE-1陽性に染色される部分が確認出来なかった。腫瘍増力による炎症性リンパ管新生の評価は困難であると判断し、以後の検討は中止とした。腹膜炎モデルでの検討を中心に研究を進める事とした。2.オボアルブミン惹起気管支炎モデルは検討する事ができなかった。安全管理部へ移動となり、病院感染制御に関わる業務を専任医師として行っており、研究時間の確保に難渋している。当初計画した炎症巣に於けるリンパ管新生の役割について、炎症性腸疾患モデルを作成して検討を行った。炎症性腸疾患マウスは、7日間連続でデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)3%含有水を飲水させることで作成した。ストレスに伴う噛みつきなどの問題から、1ケージに1匹の飼育を行った。CLEC-2欠損マウスについては、骨髄キメラマウスの作成より簡便な抗CLEC-2抗体静注によるCLEC-2 depletionマウス(Dep)を用いた。Depの作成は、実験開始4日前と実験開始後3日目に、コントロールIgG又は抗CLEC-2抗体(2A2B10)又はPBSを尾静脈より投与することで作成した。実験開始7日間後に各マウスを殺処分し体重をコントロールマウス(Con)と比較し、その大腸を用いてHE染色、PAS染色による炎症像の差異、Lyve-1染色によるリンパ管面積の差異、EvG染色による血管面積の差異について、病理所見の解析を行った。殺処分時の体重はDepで少ない傾向が見られたが有意差はみられなかった。大腸の炎症の程度や杯細胞数、潰瘍長もCLEC-2発現の有無による有意な差異は認められなかった。リンパ管密度も若干Depで低い傾向が見られたが有意な差異は認められなかった。一方新生血管の密度はDepで有意に低かった。抗CLEC-2薬が炎症性腸疾患の病像に大きな影響を与える事は否定的と思われる。しかし当初の予想に反して炎症部位でのリンパ管密度はDepでも保たれて、一方で炎症部位での新生血管密度はDepで低くなっており、炎症部位での血管リンパ管新生に血小板CLEC-2が役割を担っている事が推察された。

大腸炎の病像、炎症の程度、大腸重量、炎症部位のリンパ管密度はCLEC-2発現の有無による差異は認められなかった。炎症部位の血管密度はCLEC-2発現抑制マウスで有意に低下していた。炎症部位に於ける血管密度とリンパ管密度にCLEC-2発現の有無で差異が認められることから、炎症部位での脈管新生にCLEC-2が何らかの役割を担うことが予想される。安全管理部へ移動後、感染制御に関わる業務を専任医師として行っており、研究時間の確保に難渋した。オボアルブミンの気管内投与による慢性気管支炎モデルについては、実験時間の確保の点から困難が予想されるため行わない方針とする。腫瘍によるリンパ管新生については腫瘍細胞の増殖が比較的不均一であり評価が困難であるため、行わない方針とする。チオグリコネートの腹腔内投与による腹膜炎モデルでの検討を中心に、CLEC-2欠損マウスと野生型マウスを用いて比較検討を行う事とする。内科学アルブミンの気管内投与による気管支炎症モデについては、同様の実験モデル作成の経験を持つ研究分担者に支援を仰ぐ。早急に実験モデルを作成する事で昨年の遅延を解消する。また、マクロファージ特異的CLEC-2欠損マウスの作成には相当な時間を要するため、既に構築できているCLEC-2欠損骨髄キメラマウス(血小板及びマクロファージ上のCLEC-2が共に欠損している)と血小板特異的CLEC-2欠損キメラマウス(血小板でのみCLEC-2が欠損している)の2モデルで、腹膜炎モデルでの検討を行う。安全管理部へ移動し病院感染制御に関わる業務を専任医師として行っており、研究時間の確保に難渋している。実験計画の遅延にともない次年度繰り越し金が発生した。次年度使用額については、チオグリコネートの腹腔内投与による腹膜炎モデルマウスの作成維持管理と解析にかかる費用に充てる。
線虫とヒトに共通の新規Ras,Rap1Aエフェクター候補の機能解析

3.Ce-PLC-εの機能:Ce-PLC-ε遺伝子ノックアウト線虫は不妊表現型を示すが、それが生殖器体細胞の収縮障害によることが判明した。同遺伝子は生殖器体細胞以外にも、神経細胞でも幼虫期から強い発現が認められた。Ce-PLC-ε遺伝子ノックアウト線虫で化学走性などの神経機能に関係する表現型が認められ、現在検証を進めている。興味深いことに、PLC-εのマウスホモログも胎生期に神経細胞で発現していた。申請者らは線虫C.elegansからRas,RaplAに結合する新規phospholipase C(Ce-PLC-εと名称変更)と新規GDP/GTP exchange factor(Ce-RA-GEF)を見い出した。本研究ではこれらのヒトホモログのクローニングと機能解析、線虫分子についての遺伝学的解析を行っている。(3)Hs-RA-GEF-IのRAドメインがGTP型Rap1Aに選択的に結合すること、GEFドメインがRap1Aに対し強い活性を示すことから、Hs-RA-GEF-IはGTP型Rap1Aに結合して膜に移行し、膜上のGDP型Rap1Aに対し作用する可能性がある。実際、RAドメインを欠く変異体では、試験管内GEF活性は保たれていたが、細胞内GEF活性(細胞内Rap1AのGDP/GTP交換)は著明に減少していた。Hs-RA-GEF-IIもRap1Aに対し強い活性を示したが、両者の組織発現パターンは異なっていた。また、両者は共にcNMP結合ドメインを持つが、cAMP結合活性は認められなかった。1.Hs-PLC-εの制御機構:Rasのdominant active変異体との共発現のみならず、細胞増殖因子(EGF)刺激によってもHs-PLC-εが細胞質から細胞膜へ移行することを明らかにした。この細胞膜移行は、Rasのdominant negative変異体により阻害された。従って、EGF刺激はRasの活性化によりHs-PLC-εを細胞膜へ移行させると考えられる。細胞膜にはHs-PLC-εの基質(PIP2)が存在するので、Rasとの結合による細胞膜移行そのものがHs-PLC-ε制御機構の本態である可能性が高い。これを検証するため、PIP2を含むリポソームに翻訳後脂質修飾を受けたRasを取り込ませ、Hs-PLC-εを加えてPIP2の加水分解を測定した。その結果、リポソームにGTP型Rasが存在する時はPIP2の加水分解が促進されるが、GDP型Rasでは殆ど促進されないことが判明した。一方、Hs-PLC-εはRap1とも結合するが、Rap1は主に核周辺のGolgi体に局在する。実際、Hs-PLC-εはRap1のdominant active変異体との共発現により核周辺に移行した。また、Rap1を強制発現した細胞ではHs-PLC-εはEGF刺激により核周辺に移行した。2.Hs-RA-GEF-I、HS-RA-GEF-IIの標的分子:ともにRap1のみならずRap2に対してもGEF活性を示すこと、Hs-RA-GEF-IIがHs-RA-GEF-Iより強いGEF活性を持つことが判明した。
口形を併用する音声認識と文理解

本研究は口形を音声認識の一つの有効な情報として用いることにより、音声認識の性能向上を図ろうとするものである。そのため、本年度は以下の各項目について研究を行った。1.ニューロネットワークによる口形併用音声認識母音を発声したときの口形画像および音声特徴を共に同一ニューロネットに入力し、五つの母音の認識実験を行った。特に不特定話者の音声に対して、音声情報のみによる場合の51%の認識率を口形と音声情報を組み合わせることにより79%に向上できた。2.エネルギー関数による口形輪郭の抽出口形輪郭は抽出しにくいことが多い。これは、不十分な輪郭情報しか画像内に存在しないことによる。このようなとき、先験的知識をエネルギー関数の形で表現し、不十分な輪郭情報から輪郭復元を行う正則化プロセスについて考案した。これにより、口紅等をつけない自然な状態のもとで、口形輪郭の抽出が可能となった。また、口唇運動の画像計測の可能性が確かめられた。高雑音下における口形併用音声認識の能力実用化の可能性を探るために、モーターの回転音など高騒音下における口形併用音声認識の能力について研究を行った。この場合、処理の高速化のため口形情報は45度前方からのX-Yトラッカーにより得た。雑音の影響により音声情報のみによる認識の正解率はかなりばらついている。特に、発音が近い単語の認識は強い雑音に乱され、認識がほとんどできない状態になっている。そのような状況において、口唇の画像情報を加味すると認識率の向上がはっきり見られた。
受精における糖鎖認識機構の解析

配偶子間の相互作用には複数の糖鎖認識機構が働いているものと思われる。このような考えを証明する一環としてブタの卵透明帯糖タンパク質の糖鎖の構造情報を基盤として、配偶子間の相互作用に関与する卵側の糖鎖リガンドや精子側の認識分子について解析し、以下の結果を得た。1.フェツインとその糖鎖修飾体をビーズに結合させたものを擬似卵として、ブタの精子の結合能を調べ、シアリルラクトサミンやラクトサミン構造が精子によって認識されることを示した。2.卵透明帯上のLewis X構造を有する糖鎖に着目し、種々のフコース含有糖鎖プローブを結合させたビーズに対するブタ精子の結合の観察から、Lewis X構造が強い精子結合活性を有することを明らかにした。一方、シアリルLewis X、Fuc-GlcNAc、タイプ2H型糖鎖等への精子の結合は、微弱あるいは皆無であった。3.Lewis X構造を認識する精子の反応は、これまで明らかにしてきたシアリルラクトサミンやラクトサミンを認識する反応とは異なるものであることを、それぞれの糖鎖を結合したビーズへの精子の結合に対する可溶性糖鎖プローブによる阻害実験から明らかにした。4.卵に対する精子の結合が、シアロオリゴ糖、アシアロオリゴ糖、Lewis Xオリゴ糖などの多価糖鎖ポリマーによって阻害されることを観察した。5.多価糖鎖プローブのビオチン標識体を独自に開発した方法で調製し、これらを精子表面上の糖鎖認識分子を検出するプローブとして用い、シアロオリゴ糖、アシアロオリゴ糖、Lewis Xオリゴ糖等の糖鎖プローブによって、受精能を獲得した精子の頭部が蛍光染色され、一方、先体反応を誘導した精子頭部は染色されなかった。以上より、受精には精子側の数種の糖鎖認識分子と卵側糖鎖の相互作用が関与していることが示唆された。卵透明帯を構成する糖タンパク質に含まれる糖鎖の構造多様性には、受精の一連の過程における配偶子間の相互作用には複数の、互いに協調した糖鎖認識機構が働いていることに対応した積極的な意味合いがあるものと思われる。このような考えを証明する一環として、卵側の糖鎖リガンドや精子側の認識分子について解析し、以下の結果を得た。1)複合型糖鎖を含むフェツインとその糖鎖修飾体をセファロースに結合させたものを疑似卵として、ブタの精子の結合能を調べたところ、精子は、フェツイン-セファロースに強く結合するのに対し、アシアロフェツイン-セファロースには弱く、またアガラクトフェツイン-セファロースには殆ど結合しないことが分かった。叉、ブタの卵への精子の結合が、フェツインやその糖ペプチドの添加によって阻害されること等が分かった。以上のこと等から、卵表面のシアロ糖鎖が精子との結合に関与している可能性が示唆された。2)精子側の糖鎖認識分子を探るための試薬として、種々のN-結合型糖鎖を酸化デキストランに導入した多価オリゴ糖プローブを合成し、更にこれらの蛍光標識体やビオチン標識体を作製した。これらを用いた組織化学的方法により、精子の染色の有無を調べた結果、ブタの精子頭部がシアロオリゴ糖を含む糖鎖プローブで強く、またアシアロオリゴ糖のプローブでは弱く染色されるのに対し、アガラクト糖鎖プローブでは染色されないことが判明した。従って、精子側にはシアロ糖鎖を認識する分子が存在することが示唆された。

配偶子間の相互作用には複数の、互いに協調した糖鎖認識機構が働いているものと思われる。このような考えを証明する一環として、前年度に明らかにしたブタの卵透明帯糖タンパク質の糖鎖の構造情報を基盤として、卵側の糖鎖リガンドや精子側の認識分子について解析し、以下の結果を得た。1.卵透明帯の糖タンパク質に含まれるLewisX構造を有する糖鎖に着目し、種々のフコース含有糖鎖プローブをビーズに結合させ、これらビーズに対するブタ精子の結合の観察から、LewisX構造が強い精子結合活性を有することを明らかにした。一方、シアリルLewisX、Fuc-GlcNAc、タイプ2H型糖鎖等への精子の結合は、微弱あるいは皆無であった。2.LewisX構造を認識する精子の反応は、これまで明らかにしてきたシアリルラクトサミンやラクトサミンを認識する反応とは異なるものであることを、それぞれの糖鎖を結合したビーズへの精子の結合に対する可溶性糖鎖プローブによる阻害実験から明らかにした。3.卵に対する精子の結合が、シアロオリゴ糖、アシアロオリゴ糖、LewisXオリゴ糖などの多価糖鎖ポリマーによって阻害されることを観察し、配偶子間の結合には、複数の糖鎖認識機構が働いていることが示唆された。4.種々の多価糖鎖プローブのビオチン標識体を独自に開発した方法で調整し、これらを精子表面上の糖鎖認識分子を検出するプローブとして、蛍光標識アビジンと組み合わせて用いた。その結果、シアロオリゴ糖、アシアロオリゴ糖、LewisXオリゴ糖等の糖鎖プローブによって、受精能を獲得した精子の頭部が蛍光染色され、一方、先体反応を誘導した精子頭部は染色されないこと等が明らかとなり、数種の糖鎖認識分子の存在が示唆された。
新規蛍光プローブの開発に基づく、がんの特異的in vivoイメージング

がんは1981年より日本人の死因第1位となっている疾患であり、その死因の90%はがんの転移によると言われている。これらの治療法の1つとして病変の切除といった外科手術があり、より多くの病変を的確に切除することにより術後の5年生存率が高くなることが知られている。転移した病変を精度良く簡便に検出する手法は広く望まれ、本研究ではがんを特異的に光らせる蛍光プローブの開発に基づき、実際のがん診断への応用を念頭に病変の検出を目指した。採用第3年度の計画は「蛍光内視鏡を利用したがん検出法の開発」であったが、本計画は前年度までに前倒しで達成している。本年度では、蛍光プローブのさらなる高感度化を行い、蛍光プローブ投与数分後という早い時間でがんを検出することを目指した。具体的には、がんの転移形態の1つである腹膜播種を標的とし、前年度に酵素活性が亢進していることを見出した、β-ガラクトシダーゼを分子標的として蛍光プローブの開発を行った。蛍光プローブの蛍光OFF/ONスイッチである分子内スピロ環化反応を制御し、パックグラウンド蛍光を極めて小さくすることにより、酵素反応前後で1400倍以上蛍光増大する蛍光プローブを開発した。本蛍光プローブを腹腔内投与(0.6mg/kg)することにより、腹膜播種モデルマウスにおいて投与5分後から1mm以下の病変まで検出することに成功した。本手法はこのような早いタイムコースからがんの検出が行えるため、がんの切除後にがんの取り残しがないかどうか手術中に確認することも可能である。また、投与1時間後では、がんにおける蛍光はより明るく、肉眼で検出可能であり、がんをリアルタイムに識別しながら摘出することも可能であった。このように、開発したがん検出法は、がんの外科手術の精度を向上させる手法として、がんの取り残しを防ぐなど医学への応用が期待できる。がんは1981年以来日本人の死因第1位の疾患であり、微小がんの正確な検出法の開発は医療における喫緊の課題となっている。今までにMRI、PETあるいは超音波などを用いた検出法が報告されてきたが、微小のがん組織を確実に捉えることは難しく、技術開発が望まれていた。光を用いる検出法は0.1mm以下の生体組織も見ることができるなど他の方法に比べ優位な点が数多くあり、新たな検出法として注目されるが、がん細胞に対する特異性に難点があった。これまで生体内のがん細胞の検出を試みた場合、がんに集積性を持つイメージング剤が用いられるが、全てががんに集積するわけではない。そのため、血中や正常組織などのがん以外の部分に残っているイメージング剤もまたシグナルを発し、がん細胞だけを特異的に検出することは困難であった。そこで、蛍光発光制御原理(PeT機構)に基づいて新たな酸性環境検出蛍光プローブを開発し、Herceptinなどの分子標的薬にラベルして適用することにより、がんの特異的な検出に成功した。この分子標的蛍光プローブは血中や正常組織では蛍光を発しないが、がん細胞に取り込まれ、その細胞内に入った時に初めて強い蛍光を発する機能を有している。すなわち、がん細胞内に取り込まれたプローブはがん細胞の環境を感知して蛍光性化合物に変化し、その結果、がん細胞が特異的に可視化検出できるようになる。この技術により、これまで肉眼で観察が困難であったがんもリアルタイムで確認しながら治療を進めることができ、微小がん細胞の取り残しによる再発を防ぐ事が期待できる。がんの転移の1つとして腹膜播種が知られ、腹膜播種は卵巣がん患者で高頻度に認められ、致死性が高い。治療法として病変の切除といった外科手術がよく選択され、治療の成果を向上させる上で病変を精度良く簡便に検出する手法の開発が望まれている。本研究では、がんの特異的検出法の開発に基づき、実際のがん検出・診断への応用を念頭に、外科手術を志向した開腹下での病変の検出および蛍光内視鏡による病変のリアルタイムでの検出を目指した。当初の計画では、採用第2年度目は採用第1年度目で達成したがん検出手法の改良を行う予定だったが、新たな戦略でのがん検出を試みた。まず、SHIN3、SKOV3細胞をはじめとしたヒト卵巣がん由来細胞において、β-galactosidase活性が亢進していることを見出した。本酵素はレポーター酵素としてよく用いられ、一般的に通常の哺乳動物細胞においてその活性は低いと考えられている。そこで、Rhodolを母核とした新規β-galactosidase蛍光プローブを開発し、各種卵巣がん腹膜播種モデルマウスに腹腔内投与にて用いた(0.6mg/kg)。投与1時間後にマウスを開腹してイメージングを行い、また、蛍光内視鏡を用いて麻酔下のマウスにおける病変のリアルタイムイメージングも行った。各種卵巣がん腹膜播種モデルマウスにおいて、蛍光によるがんの検出が可能であった。特筆すべき点として、蛍光プローブ投与後の早い時間(10分未満)から病変の検出が可能であり、また、病変における蛍光を肉眼で観察することも可能であった。今回開発した手法によって当初の計画では為し得なかった、"より早く、より明るい"がんの検出が可能となった。

これらの治療法の1つとして病変の切除といった外科手術があり、より多くの病変を的確に切除することにより術後の5年生存率が高くなることが知られている。転移した病変を精度良く簡便に検出する手法は広く望まれ、本研究ではがんを特異的に光らせる蛍光プローブの開発に基づき、実際のがん診断への応用を念頭に病変の検出を目指した。採用第3年度の計画は「蛍光内視鏡を利用したがん検出法の開発」であったが、本計画は前年度までに前倒しで達成している。本年度では、蛍光プローブのさらなる高感度化を行い、蛍光プローブ投与数分後という早い時間でがんを検出することを目指した。具体的には、がんの転移形態の1つである腹膜播種を標的とし、前年度に酵素活性が亢進していることを見出した、β-ガラクトシダーゼを分子標的として蛍光プローブの開発を行った。蛍光プローブの蛍光OFF/ONスイッチである分子内スピロ環化反応を制御し、パックグラウンド蛍光を極めて小さくすることにより、酵素反応前後で1400倍以上蛍光増大する蛍光プローブを開発した。本蛍光プローブを腹腔内投与(0.6mg/kg)することにより、腹膜播種モデルマウスにおいて投与5分後から1mm以下の病変まで検出することに成功した。本手法はこのような早いタイムコースからがんの検出が行えるため、がんの切除後にがんの取り残しがないかどうか手術中に確認することも可能である。また、投与1時間後では、がんにおける蛍光はより明るく、肉眼で検出可能であり、がんをリアルタイムに識別しながら摘出することも可能であった。このように、開発したがん検出法は、がんの外科手術の精度を向上させる手法として、がんの取り残しを防ぐなど医学への応用が期待できる。
昆虫類の基部分岐での受精様式の多様性―昆虫類の初期進化のさらなる洞察のために－

昆虫類の「陸上進出」にあって強靭な卵膜である「卵殻」は大いに役立ったが、受精にとっては大きな障害となった。この問題は、昆虫の大部分を占める有翅昆虫類においては卵門を獲得することで解決されたが、原始的な無翅昆虫類では、シミ目が有翅昆虫類の卵門の初原とも考えられる卵殻開口部が見出されるものの、他群では、「卵殻形成前に受精が行われる」、「卵殻が硬化するまでの間に精子が卵内に侵入する」などの可能性が認められるのみである。本研究の目的は、無翅昆虫類各群の初期卵を組織学的に詳細に検討することで受精様式の多様性を明らかにし、昆虫類での受精様式の進化的変遷を構築、昆虫類の初期進化を議論することにある。