hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体性感覚野の神経回路形成における神経細胞多様性の役割

複数のクラスター型プロトカドヘリン(c-Pcdh)変異マウスおよびコンディショナルノックアウトマウス(cKO)を用いて、大脳皮質体性感覚野のバレル構造形成におけるc-Pcdhの役割について解析をおこなった。その結果、Pcdh-alpha、Pcdh-beta、Pcdh-alpha-beta欠損マウスでは、バレル構造形成に異常は認められなかった。Pcdh-gamma欠損マウスは生後1日以内に死亡するため、cKOマウスを用いて解析したところ、バレル構造形成に変化が認められた。これらの結果を受け、CRISPR/Cas9システムを用いて新たなc-Pcdh遺伝子改変マウスの作製をおこなった。細胞接着分子クラスター型プロトカドヘリン遺伝子群はα、β、γの3つのクラスターからなり、マウスでは計58種類のアイソフォームがある。この多様化した遺伝子群は、個々の神経細胞で複数の遺伝子を異なる組み合わせで発現する事で、神経細胞に莫大な多様性を生みだす。一方、マウス大脳皮質体性感覚野の第4層には、バレルと呼ばれる樽状の特徴的な構造があり、生後にヒゲからの刺激入力を受けることで形成される。本研究では、この神経活動に依存したバレル構造の形成に、クラスター型プロトカドヘリン遺伝子群が及ぼす影響を遺伝子改変マウスを用いて解析する。αクラスターを欠損したマウスを解析した結果、バレル構造は正常に形成されていることが明らかとなった。また、βクラスターを欠損させたマウスでも同様にバレル構造は正常に形成されていた。一方、γクラスターを欠損するとマウスは生後1日以内に死亡することが明らかとなっている。そこで、クラスター型プロトカドヘリン遺伝子群の遺伝子数をさらに減少させたマウスの作製をおこなった。効率的に作製するため、近年急速に発展しているCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術の導入を試み、変異を導入したマウスの作製がこれまでより短時間で作製することが可能となった。現在、CRISPR/Cas9システムを用いてクラスター型プロトカドヘリン遺伝子群の遺伝子数が減少したマウスの作製をおこなうとともに、遺伝子欠損によりマウスが死亡してバレル構造の解析ができないことを回避するため、loxP配列の導入により脳の特定の領域で時期特異的に欠損できるマウスの作製をおこなっている。クラスター型プロトカドヘリン遺伝子群は58種類のアイソフォームからなり、個々の神経細胞で複数のアイソフォームを異なる組み合わせで発現する事で神経細胞に莫大な分子的多様性を生み出す。しかし、現在のところ脳神経系におけるクラスター型プロトカドヘリンの役割は十分に明らかとはいえない。マウス大脳皮質体性感覚野には、生後1週間かけてヒゲからの刺激入力を受けることで形成されるバレルと呼ばれる樽状の特徴的な構造体がある。本研究では、この神経活動に依存した神経回路の形成過程を一つのモデルとしてクラスター型プロトカドヘリン遺伝子群の機能解析をするため様々な遺伝子欠損マウスの作製をおこなっている。本年度は、これまでに作製したクラスター型プロトカドヘリン遺伝子群の一部が欠損したマウスを用いて、残っているアイソフォーム数を更に減少させたマウスの作製をおこなった。作製方法として、昨年度はCRISPR/Cas9システムの導入を行なったが、本年度は更なる効率化のため受精卵にCRISPR/Cas9およびsgRNAをエレクトロポレーション法で直接導入する方法を取り入れた。また、遺伝子欠失によりバレルが形成される生後7日以前にマウスが死亡することを避けるため、コンディショナルにプロトカドヘリン遺伝子群を欠失させる必用があったが、CRISPR/Cas9システムを用いることでloxPを目的の領域に効率よく挿入することが可能となった。これらの技術を用いて作製したマウスは、クラスター型プロトカドヘリンの多様性が持つ神経系における役割を解析するために有用である。本研究では、遺伝子改変技術を用いて多様化した遺伝子群の多様性を減少させた様々なマウスを作製する必用があった。本年度は、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術を改良するこで昨年度よりマウス作製の効率化を図ることができ、当初計画したマウスの作製が可能な状況になったため。クラスター型プロトカドヘリン(c-Pcdh)遺伝子群は、Pcdh-alpha、-beta、-gammaの3つのクラスターからなり、マウスでは計58種類の遺伝子からなる。一つの神経細胞には、異なる種類のc-Pcdh遺伝子が複数発現しており、その種類は個々の神経細胞で異なることが明らかとなっている。また、一つの神経細胞に発現された複数のc-Pcdhタンパク質は、ホモフィリックな接着活性を示すことが報告されている。しかし、現在のところ脳神経系におけるクc-Pcdhの役割は明らかとはいえない。

本研究では、この神経活動に依存した神経回路の形成過程を一つのモデルとしてc-Pcdhの機能解析をするため様々な遺伝子改変マウスの作製をおこなってきた。本年度は、CRISPR_Cas9システムにより昨年度に作製した変異、あるいはloxPを挿入したマウスを交配によりホモ化した。これらのマウスをもとに、さらに変異、あるいはloxPを挿入することでクラスター型プロトカドヘリン遺伝子群の多様性を減少させたマウスの作製をおこなった。また、これまでに作製したマウスを用いて体性感覚野でc-Pcdhの多様性が減少したマウスの解析から、c-Pcdhがバレル形成に寄与することが明らかになってきており、本研究によりバレル形成過程を一つのモデルとしたc-Pcdhの機能を解析する系をつくることができた。本研究では、遺伝子改変技術を用いてc-Pcdh遺伝子群の多様性を減少させた様々なマウスを作製する必用があった。本年度は、昨年度に作製したマウスをもとに、さらに多様性を減少させたマウスの作製をすることができた。また、遺伝子改変マウスを用いた解析によりc-Pcdhがバレル形成に寄与することが明らかになってきており、おおむね順調に進展していると言える。58種類の遺伝子からなるマウスのクラスター型プロトカドヘリン(c-Pcdh)遺伝子群は、Pcdh-alpha、-beta、-gammaの3つのクラスターからなる。一つの神経細胞には、異なる種類のc-Pcdh遺伝子が複数発現しており、その種類は個々の神経細胞で異なる。また、一つの細胞に発現する複数のc-Pcdhタンパク質は、その種類が一致した場合にホモフィリックな接着活性を示すことが報告されている。しかし、現在のところ脳神経系におけるc-Pcdhの役割は明らかとはいえない。本研究では、神経活動に依存した神経回路形成過程の一つである大脳皮質体性感覚野のバレル形成をモデルとしてc-Pcdhの機能解析をするために、c-Pcdhの遺伝子数を減少させた様々なマウスの作製と解析を進めてきた。本年度は、CRISPR_Cas9システムにより昨年度に作製したc-Pcdhの遺伝子数を減少させたマウスのホモ化を進めた。また、作製したマウスの脳をバレルが形成される生後7日目に摘出し、バレル形成異常の有無を解析した。次に、ホモ化した雄の精子と野生型の卵子の受精卵に対して、さらに、CRISPR_Cas9システムにより変異を加えることで、全てのc-Pcdh遺伝子群を無くすことのできるマウスの作製に成功した。作製したマウスは、c-Pcdh遺伝子群の一部をCre/loxPシステムにより欠失させる必要があるため、終脳領域の興奮性神経細胞特異的にCreを発現するマウスとの交配をし、体性感覚野のバレル形成に異常がないかの解析を進めた。本研究では、多様化した遺伝子群を対象として遺伝子改変マウスを用いた研究をおこなうため、ゲノム編集技術の導入が不可欠であったが、本年度に導入することができ、以前より短期間で効率よく遺伝子改変マウスを作製できるようになったため。
水の水素結合ネットワークの微視的理解に向けた真空紫外光電場イオン化分光法の開拓

水クラスターのサイズ選別振動分光に向けて、真空紫外光を用いた電場イオン化法開発のため、高電圧パルス発生用の電源を自作し、飛行時間型質量分析計へ導入した。また水クラスターをイオン化できる短波長の真空紫外光を発生するため、希ガスおよび水銀蒸気用のセルを作製した。それらを用いた試行実験として、水クラスターのモデルとして、水の酸素原子を硫黄原子に置換した硫化水素のクラスターの赤外分光を行った。それにより硫化水素のSH結合のプロトン供与性について微視的知見を得た。以上の結果は、本課題目標の分光法開発およびその分光原理を実証した結果である。今後開発した分光法を、水クラスターの分光研究に応用していく。本研究課題では、水クラスターのサイズ選別振動分光研究に向けて、その分光原理および真空紫外光を用いた電場イオン化法を開発するのが研究目標であり、それに向けた装置開発およびレーザー分光研究を行った。真空紫外光を用いて電場イオン化できる高電圧パルス発生用のスイッチャーを自作し、飛行時間型質量分析計へパルスの加速電圧として導入した。また水クラスターを一光子イオン化できる短波長(高エネルギー)の真空紫外光を発生できる希ガスセルおよび水銀セルを作製した。それらの作製したセルを用いた試行実験として、アセトン、ジエチルエーテル、トリメチルアミンなどの非プロトン性分子の中性クラスターとクラスター正イオンの赤外分光研究を行った。その結果、それらの非プロトン性分子クラスターのイオン化において、CH結合からプロトン移動が起こることが見出された。また水クラスターのモデルとして、酸素原子を硫黄原子に置換した硫化水素のクラスターの赤外分光研究を行った。それによりこれまで気相孤立系において研究困難であった硫化水素のクラスターにおける、SH結合のプロトン供与性について微視的知見を得た。以上の結果は、本研究課題提案の分光原理を実証した結果である。さらに作成した高電圧パルス源とガスセルを組み合わせて用いることにより、真空紫外光を用いた電場イオン化法を開発した。今後、本研究課題で開発した真空紫外光電場イオン化法を、水クラスターの分光研究に応用していく。真空紫外光電場イオン化法開発に向けて、高電圧パルス電場発生用のパルススイッチャーを自作しその動作をテストした。さらにその自作したパルススイッチャーを高電圧電源に組み込み高電圧パルスの発生に成功した。この高電圧パルスを飛行時間型質量分析計の加速電極に導入し、アセトン分子を対象として高電圧パルスによってアセトンイオンが観測されるのを確認した。また水クラスターの光イオン化に向けて、水二量体より大きなクラスターをイオン化できる短波長領域の真空紫外光発生用の水銀セルや光学系の作成および組立を行なった。次年度に、上記の高電圧パルスと水銀を媒体として発生する真空紫外光を用いて真空紫外光電場イオン化法の開発を行う。また水クラスターの真空紫外光イオン化検出に基づくレーザー分光研究を最終目標とした第一段階として、現有の希ガスセルで発生できる真空紫外一光子でイオン化できるアセトン単体とアセトン二量体に対象として、振動分光およびイオン化ダイナミクス研究の新しい研究手法を確立した。この研究法は、水クラスターへも応用する予定である。本研究課題における真空紫外光電場イオン化検出に基づくレーザー分光法の開拓において、高電圧パルスと水クラスターを一光子でイオン化できる短波長域の真空紫外光発生システムが必要である。高電圧パルスを発生できるパルススイッチャーを自作し高電圧電源に組み込み、電場イオン化に必要な立ち上がりの鋭い高電圧パルスの発生を確認した。さらに現有の真空紫外光源でアセトン分子に高電圧パルスを適用し、飛行時間型質量分析計によってアセトンイオンの観測に成功している。また水二量体までイオン化できる短波長領域の真空紫外光を発生できる水銀セルのシステムを構築した。このように本研究課題遂行に必要な高電圧パルス発生システムと真空紫外光源が開発され、本研究課題は順調に進行していると考えている。水銀セルを媒体として短い波長領域の真空紫外光を実際に発生し水クラスターを光イオン化する。さらに電場イオン化法を導入し、光電場イオン化法の有効性を示す。同時に、水分子を光イオン化できるさらに短波長の真空紫外光を発生できる希ガスジェットのシステムを開発し、水単体からクラスターまでの系統的なレーザー分光研究を目指す。構築した全システムを相補的に用い、水単体、水クラスターの振動分光研究を行い、本研究課題で提案する研究手法の有効性を示すとともに、水の水素結合結合ネットーワーク理解に向けた分光研究を行うことを目標とする。水分子を光イオン化できる短波長領域の真空紫外光を発生できる希ガスジェット用の真空チャンバーを開発および改良する。

また本研究課題提案の分光法に開発に向けて必要な光学部品や電圧導入端子等の電子部品を購入し、分光システムを構築する。さらに得られた分光データの解析まで含めた、分光法開発に基づく新しい分光研究手法を確立する。
高次元信号復元のための構造化畳み込みネットワーク

計測技術の発展と共に多様かつ膨大な物理データの取得が可能となった.同時に,信号復元の高性能化への要求が高まっている.高性能な信号復元の実現には,対象となる物理データを効果的に表現できる生成モデルが必要である.ただし,既存の生成モデルには領域知識を反映し難い課題が残されている.そこで本研究では,フィルタ・バンク理論を適用し,最適化理論の研究成果と組み合わせた新たな構造化畳み込みネットワークモデルを創出する.提案法により,物理的に解釈が容易な構造設定を可能とし,設計や実装を効率化する.多様な実データに対して,領域知識を反映する畳み込みネットワークを実現し,提案手法の有効性と汎用性を実証する.計測技術の発展と共に多様かつ膨大な物理データの取得が可能となった.同時に,信号復元の高性能化への要求が高まっている.高性能な信号復元の実現には,対象となる物理データを効果的に表現できる生成モデルが必要である.ただし,既存の生成モデルには領域知識を反映し難い課題が残されている.そこで本研究では,フィルタ・バンク理論を適用し,最適化理論の研究成果と組み合わせた新たな構造化畳み込みネットワークモデルを創出する.提案法により,物理的に解釈が容易な構造設定を可能とし,設計や実装を効率化する.多様な実データに対して,領域知識を反映する畳み込みネットワークを実現し,提案手法の有効性と汎用性を実証する.
AIによるテーラーメイド型スポーツスキル計測・改善システムの開発

卓球スキルを研究モデルとして選び、“主観的な認識・評価装置である人(指導者)"に一切依存せず、“アスリート毎にスキル計測と計測結果の分析、分析結果に基づく弱点やくせの検出、それらを修正するための練習・訓練メニューの提供と効果の検証"までの全プロセスをAIが行う“テーラーメイド型指導者フリー・運動スキル計測・改善システム"を開発し、その効果を検証する。
マイクロギャップの位置と荷重負荷量の違いがインプラント周囲骨の動態に及ぼす影響

雄性ニホンシロウサギの左右脛骨にインプラント体を埋入し各インプラント体に荷重負荷を行った.実験群は荷重負荷しないコントロール群の他に20N群,40N群,60N群の計4群とした.組織標本を作製し形態計測学的検討を行った.また,ウサギ脛骨のCTデータから3DFEMモデルを作成し骨内応力や骨内ひずみについて解析を行った.長管骨に埋入したインプラントにおいては,インプラント周囲骨は過大な応力に対する生体反応として補償的な骨量の増加を行うことが示唆された.しかしさらに大きな荷重が負荷された場合には骨の増加が起こらなかったことより,この反応には応力あるいはひずみによる閾値が存在する可能性が示唆された.歯科インプラントの失敗の原因の一つとして,過大な応力負荷によるインプラント周囲骨の吸収が知られている.この現象は,「骨にはメカニカルストレスを感知して骨量を調節し,骨強度との平衡状態を保つ生理的フィードバック機構がある」というFrostのMechanostat theoryにより説明されているが,これは主にメカニカルストレスによる骨添加に関する理論であり,骨吸収については十分には説明できていない.この点を踏まえ,本研究ではオッセオインテグレーション獲得後のインプラント周囲骨への荷重量の相違が,骨の補償的な増量あるいは骨吸収という異なった結果をもたらすという仮説のもと,ラビット脛骨を用いた3DFEMによる骨内ひずみのシミュレーションを行い,負荷された荷重の多寡による骨内での応力分布の相違を評価した.26年度では,ラビット脛骨のCTのDICOMデータを元に骨内の骨梁などの微細な骨形態を再現した3次元有限要素モデルを作成した.そのモデルに対し、市販のインプラント体と同じ形状のインプラントCADデータを作成、埋入し20N,40N,60N負荷時の骨内応力の分布,最大応力値および最大ひずみを解析した.その結果,すべての群において応力はインプラント体ネック部付近の皮質骨に集中しており,最大応力値,最大ひずみは20N負荷で93MPa,2600με,40N負荷で186MPa,5300με,60N負荷で280MPa,8000μεであった.当初の予定通り、骨のCTのデータから3次元有限要素モデルを作成することができ、また、インプラントモデルとの埋入、その他技術的な面もクリアし、本実験の最終目標であった骨内部に発生する応力の分布を知ることが出来たため。歯科インプラントの失敗の原因の一つとして,過大な応力負荷によるインプラント周囲骨の吸収が知られている.この現象は,「骨にはメカニカルストレスを感知して骨量を調節し,骨強度との平衡状態を保つ生理的フィードバック機構がある」というFrostのMechanostat theoryにより説明されているが,これは主にメカニカルストレスによる骨添加に関する理論であり,骨吸収については十分には説明できていない.この点を踏まえ,本研究ではオッセオインテグレーション獲得後のインプラント周囲骨への荷重量の相違が,骨の補償的な増量あるいは骨吸収という異なった結果をもたらすという仮説のもと,ラビット脛骨を用いたin vivo荷重負荷試験を行い,CTおよび組織標本を用いて応力の相違によるインプラント周囲骨の反応の相違を評価した.7ヶ月齢,平均体重3.7kgの雄性ラビット8羽の脛骨にΦ4.0×7.0mmのインプラント体を埋入し,6週の治癒期間を経た後,インプラント体に取り付けた高さ10mmのアバットメントに対して、荷重負荷装置を用いて、それぞれ20N,40N,60Nの繰り返し動的荷重負荷(2times/week,1Hz,3600cycle,3weeks)を行った.インプラント体周囲の骨接触率を測定し,負荷した荷重が40Nの場合に骨接触率は最大となり,骨形成が有意になされていることがわかった.60N群ではコントロールよりも骨接触率は高いものの,40N群よりも有意に低かった.この結果を昨年度に行った3次元有限要素解析モデルと称号すると,ある一定の応力の幅で骨の動態が変化していることが示唆された.雄性ニホンシロウサギの左右脛骨にインプラント体を埋入し各インプラント体に荷重負荷を行った.実験群は荷重負荷しないコントロール群の他に20N群,40N群,60N群の計4群とした.組織標本を作製し形態計測学的検討を行った.また,ウサギ脛骨のCTデータから3DFEMモデルを作成し骨内応力や骨内ひずみについて解析を行った.長管骨に埋入したインプラントにおいては,インプラント周囲骨は過大な応力に対する生体反応として補償的な骨量の増加を行うことが示唆された.しかしさらに大きな荷重が負荷された場合には骨の増加が起こらなかったことより,この反応には応力あるいはひずみによる閾値が存在する可能性が示唆された.H27年度には3次元有限要素法と同じ条件で実際に模型、動物等で実験を行い、生物学的観点から応力に対する骨反応を見ることとしている。27年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴学27年度が最終年度であるため、記入しない。
二枚貝における産卵誘起フェロモンの決定と一斉産卵機構の解明

本研究は二枚貝の産卵誘起フェロモンを決定し、一斉産卵という同調行動の内分泌学的基盤の解明を目的とする。複数の二枚貝を用いた解析の結果、産卵誘発フェロモンを介した同調的産卵システムが二枚貝類に広く共通する機構である可能性が示唆された。また、イガイ科の二枚貝を用いて、産卵誘発活性を示す物質の単離・精製を試みた。二枚貝類にみられる高度に同調的な一斉産卵現象の内分泌学的基盤解明に向けた産卵誘発物質の探索を実施した。二枚貝類では1個体が放卵・放精を開始すると他個体も産卵行動が誘発され、結果として一斉産卵へと発展する。この一斉産卵の同調メカニズムとして我々は二枚貝の放卵・放精液中に他個体の産卵行動を誘発するフェロモン様物質が含まれるという仮説を立て、平成27年度はイガイ科の二枚貝であるムラサキイガイおよびムラサキインコガイの精巣から産卵誘発物質の単離・精製作業を行った。産卵期のムラサキイガイおよびムラサキインコガイの成熟オス個体約150個体と約500個体からそれぞれ精巣を摘出・破砕し、超遠心分離と限外ろ過による粗精製作業を経た精巣抽出液を得た。まず、この精巣抽出液を用いて各種成熟個体に対するバイオアッセイを行い、産卵行動の誘発作用の有無を検定した結果、およそ80%の処理個体において産卵行動の誘発が確認された。そこでこの抽出溶液をHPLCによる精製に供したところ、強い産卵誘発活性を示す画分が複数確認された。バイオアッセイでみられた産卵誘発活性を指標として、活性を示した画分についてHPLCによる産卵誘発物質の単離・精製を進めており、現在までに両種ともに3段階目の精製産物においても強い産卵誘発活性を示す画分が得られている。今後は活性を示した画分の更なる精製を行うとともに、質量分析計などによる産卵誘発物質の構造決定を開始する計画である。平成27年度は2種のイガイ類を用いて産卵誘発物質の抽出と精製を行い、順調な成果を得た。一点、問題として本計画ではアサリを当初研究対象とする予定であったが、イガイ類同様に生殖巣抽出物による産卵誘発は生じるものの、産卵最盛期の個体でなければ産卵誘発率が極端に低下するという結果が得られた点があげられる。イガイ類のように低温海水中で産卵最盛期の成熟個体を維持飼育した場合でも産卵誘発率の低下が生じるため、バイオアッセイ実施にむけた産卵可能個体の長期維持飼育が行えず、本研究での本種の利用は困難である。他方、我々の調査によりムラサキイガイにおいて、東北地方の一部集団で産卵期が4月以降であることが判明した。この発見により、当初1ー3月であったムラサキイガイの解析可能期間が1ー6月と長期化し、単離・精製作業の想定以上の進展が期待される。以上のように、アサリが利用できなくなった期間をムラサキイガイの解析にあてられるようになったことから、全体としておおむね順調に進展していると評価した。二枚貝類にみられる高度に同調した一斉産卵現象の内分泌的基盤するため、二枚貝類の放卵・放精液が他個体の産卵誘発する機能に着目し、二枚貝の産卵誘発フェロモンの探索を行った。平成28年度は産卵誘発フォロモンの単離・精製作業と産卵誘発フォロモンの異種間感受性についての検証を実施した。産卵期のムラサキイガイ(約80個体)とムラサキインコガイ(約150個体)の成熟オス個体より精巣を摘出し、これを破砕後、超遠心分離と限外濾過により10kDa以下の低分子物質のみを粗精製した。この粗精製液を逆相カラムによるHPLCにて精製し得られた画分を産卵誘発実験に供したところ、両種ともに産卵誘発率90%を超える強い活性を示す画分が得られた。この活性を示した画分について3段階目のHPLC精製までは80%以上の高い産卵誘発率を示す画分が得られたが、4段階目の精製画分からは最高でも50%程度と産卵誘発率の顕著な低下がみられた。これはおそらく画分中の産卵誘発物質の濃度が精製を繰り返す中で低下したためであることが推測される。また産卵誘発フェロモンの異種間感受性を検証するため、近縁種間での感受性検証系として同じイガイ科に属するムラサキイガイの産卵期成熟個体(n = 20)にムラサキインコガイの放精液を、また遠縁種間での感受性検証系として目レベルで系統の異なるアカガイの産卵期成熟個体(n = 10)にマガキの放精液を、それぞれ与え産卵誘発実験を試みた。その結果、ムラサキイガイ×ムラサキインコガイの近縁種間系では約40%の個体で産卵が誘発されたのに対し、アカガイ×マガキの遠縁種間系では90%の個体で産卵が誘発された。平成28年度は2種のイガイ科二枚貝(ムラサキイガイとムラサキインコガイ)について産卵誘発物質の単離・精製作業を、強い産卵誘発能力を維持しつつ順調に進めることができた。HPLCによる精製を進める過程でおそらく産卵誘発物質の濃度低下による産卵誘発率の低下が生じ、質量分析などの構造決定作業には至らなかったものの、来年度は精巣摘出に用いる個体数を大幅に増量することで問題は解決可能であると予測する。本実験に用いている2種の二枚貝はいずれも全国に多産する普通種であり、大量の個体を容易に採集することができるため、使用個体数の増加は実験を進める上での問題とはならない。

また産卵誘発フェロモンの異種間感受性実験の結果からは系統的に近縁な種間よりむしろ遠縁な種間において強い産卵誘発活性を示すことが明らかとなった。これは近縁種間ほど感受性が高くなるという当初の予測に反する結果であったが、たとえば近縁種間の交雑を予防する仕組みの一つとして近縁種間での産卵誘発は抑制的に機能するという可能性は一斉産卵現象を理解する上では興味深い現象であるといえる。この異種間感受性の検証については、実験種数および個体数を増やしてのさらなる追試が必要であるものの、産卵誘発フェロモンの単離・精製実験と併せた研究全体としては概ね順調に進展していると評価した。二枚貝類にみられる高度に同調した一斉産卵現象の内分泌的基盤するため、二枚貝類の放卵・放精液が他個体の産卵誘発する機能に着目し、二枚貝の産卵誘発フェロモンの探索を行った。平成29年度は昨年度に引き続き産卵誘発フェロモンの単離・精製と各種二枚貝におけるフェロモン様物質による産卵誘発の共通性について検証を実施した。産卵期のムラサキイガイとムラサキインコガイの成熟オス個体より精巣を摘出し、これを破砕後、超遠心分離と限外濾過により10kDa以下の低分子物質のみを粗精製した。この粗精製液を逆相カラムによるHPLCにて精製し得られた画分を産卵誘発実験に供した。しかし昨年度同様に4段階目の精製画分からは産卵誘発率の顕著に低下したため、それ以上の精製は行うことができなかった。本年度は誘発物質の精製実験に加え、生殖巣に含まれると考えられるフェロモン様物質による産卵誘発機構が二枚貝類において普遍的にみられる現象であるかどうかを検証するため、系統的に異なる分類群に属する二枚貝5種(マガキ・アサリ・アカガイ・ウバガイ・ヤマトシジミ)を用いて、精巣破砕液による産卵誘発実験を行った。その結果、全ての種において精巣破砕液処理区では無処理区より有為に高い産卵誘発率を示した。一方で誘発率には種によってばらつきが見られ、例えばアカガイでは誘発率50%と比較的高い感受性がみられたのに対し、アサリでは誘発率7%と感受性が低かった。また種によっては破砕液による産卵誘発率は飼育期間が長くなるにつれて低下する傾向が見られ、個体のコンディションが感受性に大きく影響する可能性が示唆される。本研究は二枚貝の産卵誘起フェロモンを決定し、一斉産卵という同調行動の内分泌学的基盤の解明を目的とする。複数の二枚貝を用いた解析の結果、産卵誘発フェロモンを介した同調的産卵システムが二枚貝類に広く共通する機構である可能性が示唆された。また、イガイ科の二枚貝を用いて、産卵誘発活性を示す物質の単離・精製を試みた。平成27年度に引き続き、ムラサキイガイおよびムラサキインコガイの2種を用いて、HPLCによる精巣からの産卵誘発物質の単離・精製を行う。また物質の精製を終え次第、質量分析計を用いた構造決定作業に着手する予定である。さらに精製されたイガイ類の産卵誘発物質が他の二枚貝に対しても産卵誘発作用を持つかどうかを検証するため、まず近縁種であるムラサキインコガイとムラサキイガイに対して、他方の産卵誘発物質を処理し異種間での産卵誘発作用の有無を検証する。ここで産卵誘発活性が示された場合、アサリやアカガイなどさらに離れた分類群との交差反応性についての検証実験を行う。平成29年度は、昨年度に引き続きムラサキイガイとムラサキインコガイを用いて成熟した精巣からの産卵誘発フェロモンの単離・精製と産卵誘発実験による産卵誘発能力の検証作業を実施する。精製過程で産卵誘発率が低下するという問題を解決すべく、本年度は両種ともに精巣摘出に用いる成熟オス個体数を300個体程度に増やし、抽出・精製実験を行う。
大脳皮質内神経回路操作法の樹立と神経細胞移動障害による大脳回路機能変異の解明

我々は「軽微な脳形成不全(細胞配置異常)とそれを原因とする機能不全の少なくとも一部は、大脳皮質形成時の細胞移動を検討することで明らかにできる」との仮説をたて、実験を行っている。そこで、目的とする系において遺伝子導入を正確に行い、細胞移動や回路形成の変化による神経細胞の機能変化を、簡便に解析できれば、大脳皮質細胞移動異常とそれによる脳機能やひいては疾患との関連をより明瞭に解明できると考えた。そして、そのため、次の項目について研究を進めた。(1)簡便に大脳皮質内局所回路を評価できる手法(動物)の開発と、その応用による脳機能・脳回路の変化の検討回路の評価・改変の手法として、光刺激を想定し、光刺激システムの確立を進めた。セットアップに時間を費やしたが、22年1月になり、その光刺激システムの確立ができた。さらに、大脳皮質からの投射路形成に係る系(皮質橋路)を対象とし、遺伝子操作により回路の変化を観察する系の確立に成功した。すなわち、in utero electroporation法により、橋核にほぼ特異的に遺伝子を導入する方法を確立した。そして、この方法を用い、幾つかのノックダウンベクターを導入し、その形成・神経回路の様子の観察を進めた。残念ながら、皮質橋路に特徴的な側枝形成の変化は観察できなかったが、その機構解明に向けた、いわゆるアッセイ系の樹立はできた。さらに以下の予定実験に対し、一定の成果を得た。予定実験(2)細胞移動等に係わるLL5のノックダウンによる脳機能の変化の検討。LL5のノックダウンによりシナプス形成に変化が起きることを観察した。予定実験(3)ノックダウンした細胞が受ける活動電位の変化をモニターできる系の確立。本学工学部との共同研究となるが、新たな観測機器の導入などもあり、その観察ができる系を確立できた。我々は「脳の疾病には、軽微な脳形成不全(細胞配置異常)とそれを原因とする機能不全がある場合があり、それらの少なくとも一部は、大脳皮質形成時の細胞移動を検討することで明らかにできる」との仮説をたてた。本研究では、その仮説の実証を図ることを目的としている。その前段階として、遺伝子導入した神経細胞の機能を、簡便に解析できる方法があれば、大脳皮質細胞移動異常とそれによる脳機能やひいては疾患との関連をより明瞭に解明できると考えた。そこで、当該年度は、「光照射により大脳皮質内局所回路における神経伝播を可視化できる系の開発」を目的とし、実験系のセットアップを行った。Channelrhodopsin-2は単細胞生物由来のタンパクであり、光感受性のcation channel分子である。そのN端側の315アミノ酸は光の感受、チャンネル活性発現には十分であり、その遺伝子を導入すると、動物の培養海馬神経細胞では安定に発現したと報告されている。rhodopsinの性質を持つため、青い光刺激により、刺激後50μs以内に発火する(内向き電流が生じる)。すなわち、この分子を発現させた神経細胞を光刺激することで、ほぼ任意の頻度で細胞を発火させることができる。そこで、この遺伝子を、神経細胞のみに発現させるプロモーター特性の発現ベクターを用い、疾患に関わると想定される遺伝子に対するRNAiベクターと同時に大脳皮質脳室帯の神経細胞に導入する。そして、しかるべき日数の後、脳をとりだしスライスとし、遺伝子導入細胞を光刺激し、その刺激の結果生じる神経活動の様子を観察、検討する系の確立について実験を進めた。当該年度は、遺伝子導入法を確立することができた。さらに、時期特異的に働くRNAiの開発を進めた。同時に光刺激用機器の準備を進めた。
北海道における港湾の背後圏に関する研究

1,港湾に関する統計のデータベース化北海道内の港湾貨物流動に関する統計のうち、平成5年10月に実施された『陸上出入貨物調査』のデータをパーソナルコンピュータを用いてデータベース化した。現在、各貨物ごとに集計した結果の図化を行っている。2,港湾貨物流動に関する聞き取り調査各港湾を管轄する官庁を中心に港湾貨物流動に関する聞き取り調査を実施した。聞き取りの対象とした港湾は釧路港・根室港・石狩港新港・留萌港・稚内港である。また背後圏の特性を明らかにするため、釧路港の背後圏に属する阿寒町および標茶町において主として石炭・木材・農産物の流動に関しての聞き取り調査を行った。3,貨物輸送統計および輸送ネットワークに関する試料の収集港湾背後圏の形成過程を明らかにするために、大正と昭和初期の輸送の輸送ネットワークに関する資料と港湾および鉄道取扱貨物に関する資料の収集を行った。2,の聞き取り調査とともに分析の結果の一部は人文地理学研究XXにおいて“釧路港を中心とする輸送ネットワークの形成過程"として発表する。4,港湾および周辺地域の土地利用図作成釧路港と根室港を対象に土地利用調査を行い、土地利用図を作成した。港湾都市という観点から港湾を捉えたため、調査は港湾だけでなく、港湾の周辺地域も対象とした。今後は収集したデータの分析と図化を行うとともに、得られた結果を順次発表していく。
E2_1型金属間化合物Co_3AlCを析出相としたCo基耐熱合金の合金設計

本研究の目的は、現在のNi基実用耐熱合金におけるLl_2型金属間化合物Ni_3Al析出相に対応する析出相をCo基耐熱合金に導入することで、より優れた耐熱性を付与することである。高融点の析出相として主にCo基合金に導入を図ったのは、E2_1型金属間化合物Co_3AlCで、Ni基耐熱合金の析出強化相Ni_3Alの結晶構造であるLl_2型規則構造に炭素(C)が侵入した形態を有している。Co-Al-C系の状態図は不確定であったため、まずCo近傍のCo-Al-C三元状態図を確定することに努めた。Ar雰囲気中で非消耗型アーク溶解装置によって種々の合金を溶製し、X線、示差熱分析、光学顕微鏡等による組織観察などを行い、既存の状態図に修正を施した。修正した状態図に基づいていくつかの合金を選定し、その高温変形強度を測定した。また、隣接相であるB2型金属間化合物CoAlも同時に導入を試み、Co-Co_3AlC2相及びCo-Co_3AlC-CoAl3相合金の比較も行った。その結果、B2型金属間化合物CoAlを含むものは、必然的にAl量も多く、耐酸化性、比重などの点で有利と考えられるが、高温における強度の点では2相合金の方が有望であることが判明した。修正した状態図から、Co合金中のCo_3AlC量はNi基超合金中におけるNi_3Alほど多くすることは困難であると考えられるが、わずかな量のCo_3AlCをCoに導入することで、Ni基超合金に比肩する高温強度を得ることができる可能性が示された。さらに、いくつかの合金については室温大気中で圧延を試みた。その結果、いくつかの組成で、10%以上の圧延が可能であった。
女が戦争を語るとき―ライフ・ヒストリーのなかの世界大戦―

本年度は「ライフヒストリーのなかの大戦」をテーマに両大戦期を生きた女性の経験に焦点をあて、1930年代、50年代、70年代を画期とする語りの変遷をたどることで、個人の経験が歴史化されていく過程を明らかにした。「書く女性(writing women)」に焦点をあてた研究は2000年代以降さかんにおこなわれているが、銃後に留まることなく戦場に赴いた「普通の女性」に関する研究は極端に少ない。女性たちが帝国戦争博物館や陸軍博物館に寄贈した未刊行の回想録については、これまでエピソード的に触れられることはあっても、体系的な分析はなされてこなかった。そこで本研究では、銃後にとどまった女性とも、戦時組織を率いたエリート女性とも区別される陸軍女性補助部隊の末端を占めた女性たちに焦点をあて、1930年代から80年代にかけて執筆された未刊行の回想録を網羅的に分析した。執筆の動機やきっかけ、語りの内容・特徴に注目しながら、彼女たちが何を書き留めたい、書き留めなければならないと考えたのか、自らの大戦経験を時代やライフストーリーのなかにいかに位置づけようとしたのかを明らかにした。男性の語りやエリート女性の語りとは異なる彼女たち独特の語りからは、支配的な大戦観やジェンダー観とは区別される「軍隊のなかの女性」」としての自己意識や、どのような社会情勢とも折り合いをつけながら「大戦の記憶」とともに生きる姿が浮き彫りになった。以上の研究成果を「語りとジェンダー「小さな物語」のなかの戦争体験ー」(山室信一編『人文学宣言』ナカニシヤ出版、2019年)にまとめた。また、2019年3月23日に開かれた「イギリス史研究会(第46回例会:専修大学神田キャンパス)」において、口頭発表「軍隊のなかの女性たちー回想録から読み解く第一次世界大戦の記憶ー」をおこなった。本研究は、第一次世界大戦(以下、WWI)と第二次世界大戦(以下、WWII)を、戦間期を含めた一連の社会変動ととらえることで、大戦がジェンダー構造に与えたインパクトを長期的視野からさぐることを目的としている。本年度は、まず、WWIIに関する近年の研究動向をおさえた上で、二つの大戦の比較検討をおこなった。とくに従来のジェンダー概念から逸脱する要素をもつ女性軍事組織(陸海空軍の女性部隊)に焦点をあて、リクルートの方法や対象、命令系統(統率方法)、任務内容、給与、昇進、懲罰などハード面の比較をおこなうことで、両大戦の連続性と断絶性を明らかにした。WWIにおいては、女性はこれらの組織に「登録する(enrol)」形をとったが、WWII期になると「軍籍を得る(enlist)」までに変化する。このように、女性に軍隊の構成員としての地位が与えられたこと、WWIの経験を生かして組織の発足およびリクルートがスムーズに進行したこと、防空を担う高射砲隊への配属など女性の軍事的役割が増大したことがWWII期の大きな特徴である。イギリスはWWII期に女性を徴兵法の適用対象とした唯一の国として知られる。いわゆる「女性徴兵法」はいかなる必要性のもとに導入されたのか。当事者である女性を対象に実施された意識調査と庶民院議事録を史料に、同法が成立するまでの議論のプロセスをたどることで、いかなる正当化の論理がもちいられたかを明らかにした。WWII研究の動向を二次文献を網羅することによっておさえたあと、WWIとWWIIを接合する上で有効な論点の抽出をおこなった。その一つが「徴兵法(the national service act)」の女性への適用をめぐる問題である。今年度は、WWII期に戦時社会調査委員会が実施した意識調査と、徴兵法制定過程での庶民院における議論をもとに、当初の研究計画通り、2編の論文を発表することができた。よって、研究はおおむね順調に進展していると判断する。本研究は20世紀の二つの大戦を、戦間期を含む一連の社会変動ととらえることで、大戦がジェンダー構造に与えた影響を長期的視点からさぐることを目的としている。本年度は両大戦の連続性と断絶性を明らかにするために、(1)二つの大戦を通して女性軍事組織を率いた女性指導者と、(2)戦間期(1930年代)に元軍人を名乗って男装し、偽誓罪で裁判にかけられた女性に関する事例研究を試みた。(1)に関しては、第一次および第二次世界大戦中に陸軍の女性(補助)部隊の最高責任者を務めたヘレン・グウィン=ヴォーンを取り上げた。軍や政府関連の公文書だけでなく、日記や書簡といった私文書を含む網羅的な史料分析をおこなうことによって、二つの大戦が彼女のライフ・ヒストリーのなかでどのように位置づけられていたのかを探った。とくに二次大戦期に彼女が事実上、更迭されるまでの経緯を追うことで、二つの大戦期の「断絶(変化)」に迫った。(2)に関しては、女性による軍服の着用が一種の異性装ととらえられた戦間期に、男装して女性との結婚を試みたことで偽誓罪に問われたヴァレリー・バーカーという女性に注目した。裁判記録や新聞のインタビュー記事をもとに、ヴァレリーが自らの経験をどう語り、社会がこれをどのように受けとめたのかを分析することで、戦争とジェンダー、あるいはセクシュアリティとの関係について考察した。

以上の研究成果を、「大戦・ファシズム・同性愛ー戦間期における異性装の解釈学ー」(志村真幸編『異端者たちのイギリス』共和国、2016年)、および「女が大戦を語るとき」(藤原辰史編『第一次世界大戦を考える』共和国、2016年)の2編にまとめ、公刊した。今年度は、(1)両大戦の連続性と断絶性、(2)戦間期への着目という二つの観点から、両大戦期に女性軍事組織で責任者をつとめた女性幹部と、ジェンダー秩序を攪乱した女性異性装者に関する事例研究をおこなった。当初予定していた軍隊内レズビアニズムに関しては、研究には着手したものの、予想以上に史料が膨大であったため、論文にまとめるには至らなかった。しかし、上記(1)(2)の二つのテーマに沿った研究成果をあげることができたため、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。本研究は20世紀の二つの大戦を戦間期を含む一連の社会変動ととらえることで、大戦がジェンダー構造に与えた影響を長期的視点からさぐることを目的としている。本年度は「軍隊と性」をめぐる問題を(1)駐留軍のセクシュアリティ、(2)軍隊内レズビアニズムという二つの観点からさぐった。(1)に関しては、まず、両大戦期のフランスやドイツに考察の対象を拡大することで比較史の視点をとり入れながら、軍とセクシュアリティをめぐる先行研究を批判的に摂取した。また、さまざまな国の軍隊が駐留したフランスのルーアンの事例をとりあげ、軍隊に属する多国籍(他人種)、多職種の男性たちが地域住民と取り結んだ関係をセクシュアリティの観点から考察した。(2)に関しては、第二次世界大戦期のイギリス陸軍で秘密裏に作成された軍隊内レズビアニズムへの対処マニュアルの分析を通して、軍が組織内の同性愛(とりわけレズビアニズム)をめぐる問題にどのように対処しようとしていたかを分析した。著名な女性医師が作成にかかわったこのマニュアルは、軍隊という特殊な場(その閉鎖的で不自由な環境、および女性に与えられる通常社会とは異なるステイタス)が女性同士の同性愛を助長しているとの危機意識に貫かれていた。兵士同士のホモソーシャルでホモセクシュアルな関係性についてはすでにすぐれた研究が存在するが、こうした軍隊内の性をめぐる問題にジェンダーという変数を組み込むことの重要性が明らかになった。以上の研究成果を、「セクシュアリティ研究の現在」(『女性とジェンダーの歴史』第4号、2017年)および、「書評レギーナ・ミュールホイザー著(姫岡とし子監訳)『戦場の性ー独ソ戦下のドイツ兵と女性たち』」(『女性とジェンダーの歴史』第5号、2018年)の2編にまとめ、公刊した。本年度は「軍隊と性」をめぐる問題を(1)駐留軍のセクシュアリティ、(2)軍隊内レズビアニズムという二つの観点から掘り下げた。計画段階では、第二次世界大戦期イギリスにおける軍隊内同性愛をめぐる問題のみを扱う予定であったが、軍の「そと」と「うち」という二つの側面から分析する必要を感じたため、比較史の視点をとり入れつつ駐留軍が地域社会と取り結んだ性的関係にも考察の対象を広げた。そのため、とくに(1)に関しては、まだ論文にまとめる作業が残っているものの、(1)(2)のテーマに沿った研究成果をあげることができたため、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。本年度は「ライフヒストリーのなかの大戦」をテーマに両大戦期を生きた女性の経験に焦点をあて、1930年代、50年代、70年代を画期とする語りの変遷をたどることで、個人の経験が歴史化されていく過程を明らかにした。「書く女性(writing women)」に焦点をあてた研究は2000年代以降さかんにおこなわれているが、銃後に留まることなく戦場に赴いた「普通の女性」に関する研究は極端に少ない。
圧力下ミュオンスピン回転緩和法による強相関有機物質の磁性研究

高圧下で高い超伝導転移を示す反強磁性有機絶縁体β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2についてミュオンスピン回転緩和法実験を行い、有機伝導体において初めての圧力下ミュオンスピン回転信号の検出に成功した。回転周波数と信号強度の温度・圧力変化により0.7GPa近傍で圧力誘起磁気相転移が生じていることが示唆された。また、非フェルミ流体的振る舞いを示す有機超伝導体κ-(BEDT-TTF)_4Hg_<2.89>Br_8についてミュオンスピン緩和実験を行い、超伝導転移に伴い内部磁場の変化が生じないことを見いだした。平成20年度は、まず研究の予備段階として試料合成に力を注いだ。通常の有機物質単結晶の質量は1mg程度であるのでミュオンスピン回転緩和実験には莫大な量が必要となる。これまでに有機反強磁性絶縁体であるβ'-(BEDT-TTF)2ICl2(ICl2塩と略記)とβ'-(BEDT-TTF)(TCNQ)については各々2グラム程度の試料を得ていたが,β'-(BEDT-TTF)IBrCl(IBrCl塩と略記)について新たに試料合成を試み、約1グラムの試料を得ることに成功した。IBrCl塩については平成20年度に国内で運転が開始された大強度陽子加速器施設(J-PARC)にて常圧下のミュオンスピン回転緩和実験を行い、反強磁性転移に伴うミュオンスピン回転信号の検出に成功した。ICI2塩とIBrCl塩は常圧において22K及び20Kにおいて反強磁性転移を示めし転移温度はIBrCl塩の方が低いにもかかわらず、反強磁性状態におけるミュオンサイトでの内部磁揚はICI2塩よりIBrCl塩の方が大きいことが明らかになった。また、β'-(BEDT-TTF)2ICl2についてはカナダ・トライアムフ研究所にて最大圧力1.8GPa、最低温度2.7Kの条件で圧力下ミュオンスピン回転緩和実験を行った。得られた回転周波数と信号強度の圧力変化を解析することにより、0.6GPa近傍において圧力誘起磁気相転移が起こっていることを強く示唆する結果が得られた平成21年度は、反強磁性絶縁体であるβ'-(BEDT-TTF)_2IBrClを中心に研究を行った。前年に引き続き試料の大量合成を行い合計1.5グラムの試料を得ることに成功した。これは圧力下も含めてミュオン実験を行うのに十分な量である。常圧下におけるミュオンスピン回転・緩和法実験は国内で運転が開始された大強度陽子加速器施設(J-PARC)にて行い、反強磁性転移に伴うミュオンスピン回転信号の検出に成功した。その結果の詳細な解析を行い、β'-(BEDT-TTF)_2IBrClの実験結果は同じ結晶構造を有するβ'-(BEDT-TTF)_2ICl_2の結果と類似していることを明らかにした。また、β'-(BEDT-TTF)_2IBrClについてはカナダ・トライアムフ研究所にて圧力下ミュオンスピン回転緩和実験を行おうと試みたが、研究所の加速器の不調により実験を行うことが出来なかった。最終年度に再実験を行う予定である。22年度はD8-κ-(BEDT-TTF)_2Cu[N(CN)_2Br(D8-κ-Brと略記)についてμSR実験を行った。κ-BrはBEDT-TTF系では常圧で最も高い転移温度を持つ有機超伝導体であるが、BEDT-TTF分子の外側にある4つの炭素についている計8つの水素を重水素に置換したD8-κ-BrはMott転移のごく近傍に位置し、反強磁性絶縁相と超伝導相が相分離を起こしていると考えられている。また、試料の冷却速度を速めることにより超伝導の体積比を減少させることが可能である。D8-κ-BrはMott転移を研究する上で最適な物質と考え、μSRにより磁性と超伝導の競合(もしくは共存)を調べるた。実験は英国理研RALミュオン施設にて行った。急冷・徐冷いずれ場合においてもμSRスペクトルに急激な緩和と小さな回転が確認でき、反強磁性秩序をμSRで捕らえることができた。また、冷却速度を上げることにより緩和率が増大することも分かった。今後は急冷によるdisorderの効果、類似物質κ-(BEDT-TTF)_2Cu[N(CN)_2]Clとの比較などを行いMott転移近傍の状態を明らかにしたい。また、23年度はNiCrAl合金を用いた圧力容器の作成を行った。本容器ではこれまでの容器に較べて壁の厚みをやや薄くすることにより、発生最高圧力は1GPa程度と低めではあるが、よりSN比の高い測定が可能になることを目指したものである。
ゼブラフィッシュにおける性決定・分化の分子メカニズム

ゼブラフィッシュは発生研究の生物モデルとして広く用いられているが、生殖腺の性分化メカニズムに関する研究は遺伝的性の不安定さが原因で殆ど進んでいない。本研究では、ゼブラフィッシュの性分化メカニズムを明らかにするとともに、現在動物における性分化研究でもっとも注目されているDMドメイン遺伝子の機能についても解析する。本年度は、DMRT1遺伝子に焦点を絞り、性分化時における発現、さらには標的遺伝子の探索を行った。1)性分化時におけるDMRT1遺伝子の発現:孵化後のいろいろな時期(060日)における個体毎のDMRT1遺伝子の発現をRT-PCRで調べたところ、05日までは全ての個体でDMRT1の発現が少量認められたが、1015日では約50%の個体で発現が更に上昇した。その後も同様に約50%の個体でDMRT1遺伝子の発現が高く、残りの約50%の個体での発現は低かった。また、in situ hybridizationを用いた解析からDMRT1の発現は生殖腺に限定されていることが分かった。ゼブラフィッシュではこれまで生殖腺の雌雄が形態学的に区別できるのは孵化後20日以降と考えられてきたが、本研究の結果から遺伝的にはもっと早く雌雄が決定されている可能性が強く示唆された。2)DMRT1の標的遺伝子の探索:DMRT1の標的遺伝子はまだ不明である。そこで本研究では、セルトリ細胞が発現していないゼブラフィッシュのセルトリ細胞株にDMRT1遺伝子を強制発現させることで新たに発現する遺伝子を解析した。その結果、アンドロゲン合成酵素を含む4種の遺伝子がDMRT1により特異的に発現を促進されることが分かった。これらの遺伝子はDMRT1遺伝子の下流に働く精巣分化カスケードにある遺伝子の有力候補と考えられるので現在更にゼブラフィッシュの性分化における発現パターンを解析している。
炎症性腸疾患におけるサーファクタントプロテインD（SP-D）の臨床応用

サーファクタントプロテインD (SP-D)をコードするSFTPD遺伝に注目し、UCにおけるSP-Dの役割について検討した。大腸炎モデルマウスは対照群に比して血中のSP-D濃度および、大腸粘膜におけるSP-Dタンパクレベルの上昇を認めた。さらに、SP-Dノックアウトマウスにおいて大腸炎モデルマウスを同様に作成したところ、通常の大腸炎モデルマウスに比して腸炎が軽減される傾向を認めた。SP-DがUCの発症・重症化に関与していることが示唆され、治療薬や発症の予防などに応用が期待される。本研究では、Surfactant protein-d (SP-D)と炎症性腸疾患との関連性を明らかにすることを目的とする。まず、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を一週間飲料水に混ぜてC57Bl/6の野生マウスに与え、DSS誘発性炎症性腸疾患モデルマウスを作製した。同時に通常の飲料水を与えたマウスをコントロールとした。sacrifice後に、それぞれのマウスより、大腸を摘出し、さらに血液を採取した。SP-Dは主に肺の2型肺胞上皮細胞にて産生され、通常、大腸の粘膜上皮にはほとんど産生されない。そこでまずは、このDSSマウスの腸粘膜において、本当にSP-Dの発現が上昇しているかを免疫組織染色法にて確認することとした。抗SP-D抗体をいくつか購入し、先ずはマウス肺をコントロールに適切な濃度設定を行い、その濃度をもとにDSSマウスおよびコントロールマウスの大腸切片の免疫染色を行った。予想通りDSSマウスの腸粘膜にSP-Dが多く産生されている印象があり、現在その評価を行っている。これと平行して、血中のSP-Dの発現をELISA法にてやはり、DSSマウスとコントロールマウスで比較検討する予定である。仮説では、炎症性腸疾患においては、SP-Dが産生され、さらに腸粘膜血管バリアの破綻により血中に多く漏出することが予想される。さらに、漏出するSP-Dは3量体か多量体かを検出しわけるために抗体のエピトープの異なるものを用意する予定であり、現在これについて検証中である。潰瘍性大腸炎(UC)は直腸から連続的に大腸粘膜に慢性の炎症を引き起こす原因不明の疾患であり、その発症には遺伝子異常の関わりが示唆されている。その感受性遺伝子として報告された複数の遺伝子領域がsurfactant protein D (SP-D)をコードするSFTPD遺伝座の近傍であることが注目されており、その一塩基多型がUCの早期発症に関与することが知られている。今回、UCにおけるSP-Dの役割を明らかにするため、デキストラン硫酸ナトリウム溶液による大腸炎モデルマウスを作成して、大腸炎の重症度を評価した。具体的には、C57BL/6マウスによる大腸炎モデルマウス(SP-D (+) DSS群)を作成し、コントロール群(SP-D (+) control群)と比較して血清SP-D濃度、SP-Dの免疫染色について比較した。さらに、同週齢のC57BL/6 SP-Dノックアウトマウスを使用した大腸炎モデルマウス(SP-D (ー) DSS群)において、大腸炎の重症度(臨床的・肉眼的所見、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性、Interleukin(IL)-6濃度)を比較検討した。結果、血清SP-D濃度はSP-D (+) DSS群でSP-D (ー) control群に比較して有意に高値であり、大腸の免疫染色においてもSP-D (+)DSS群においてSP-Dが高発現しており、大腸炎におけるSP-Dの関与が示唆された。さらに、大腸炎の重症度評価においては、臨床的・肉眼的所見ではSP-D (ー)DSS群ではSP-D (+)DSS群に比較して有意に軽減しており、さらにMPO活性定量、IL-6濃度定量においても軽減している傾向を認めた。UCにおいて、SP-Dがその発症・重症化に関与していることが示唆された。今後、その分子的なメカニズムなどを明らかにすることで、治療薬や発症の予防などに有用となる可能性がある。大腸外科まずは、炎症性腸疾患においては、腸粘膜に多くのサーファクンタントプロテインd (SP-D)が産生されていることが確認された。現在、SP-Dノックアウトマウスを入手完了しており、DSSを投与し、炎症の変化などを確認していく予定であり、概ね予想された仮説が段階を経て立証されており、また実験計画も順調に進んでいると思われる。DSS誘発性炎症性腸疾患マウスモデルの血漿中のSP-D値をコントロールマウスと比較し、その上昇および3量体と多量体の比の検討を行う。SP-DノックアウトマウスにDSSを投与し、局所(大腸)および全身での炎症反応の変化をコントロールマウスと比較する。さらに腸粘膜血管バリアの破綻の程度やあるいは腸内細菌の変化なども検討する予定である。

マウスの入手において、検疫や入手先の都合により年度末にかかったために、一部の費用が次年度に繰り越しになったため。上記の理由のためであり、計画通りに使用できると考えている。