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細胞骨格による骨代謝制御の分子機構－Ｎｃｋの骨の細胞機能調節に於ける役割の解明－

骨粗鬆症は、現代の超高齢化社会において急速に増加しており人口の約一割の患者数が罹患すると推定され、大腿骨の頸部骨折や脊椎の骨折を起こし、重症例では骨折の後の死亡率の高い重要な疾患である。しかし、骨粗鬆症の根幹である骨量減少がどのようなメカニズムで病態を引き起こすのかについて、未解明の点が多い。そこで、骨芽細胞の細胞遊走(運動)の検討を行った。近年、骨芽細胞の遊走に遺伝子が関わることが、骨量減少との関連は不明であり、骨粗鬆症を引き起こすメカニズムの上で詳細は解明されていませんでした。骨は絶えずリモデリングをくりかえしており、まず破骨細胞が古い骨を吸収して吸収部ができ、その後で、骨芽細胞ならびに前駆細胞がこの部分に遊走しかつ増殖をして正確にこの場所でかつ必要量のみの骨を形成することにより欠損部が充填され、古い骨が新生骨に置換しかつ元の骨の量が保たれるメカニズムにNckが関与することを明らかにした。すなわち骨リモデリングにおける骨芽細胞の遊走による骨形成の仕組みを明らかにするために、細胞の骨格と細胞遊走を制御する遺伝子であるNckを骨芽細胞で特異的に破壊してその影響を調べた。Nckは細胞のシグナルのうち細胞骨格を制御するアダプター分子であり骨の代謝との関連は不明であったが本研究の結果、Nckを欠失すると骨芽細胞の遊走を抑制すること,細胞シグナルが変化すること、骨量が低下すること、骨形成速度が低下すること、さらに骨の生体内での修復が抑制されることが明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究の目的骨粗鬆症においては骨を形成する骨芽細胞と骨を吸収する破骨細胞、さらにこれらをコントロールする骨基質に埋め込まれた骨細胞の連携に基づく骨形成と骨吸収の平衡の維持が重要な要素となる。本研究は、これまで全く困難であったNck1およびNck2の二つの細胞骨格制御因子を同時にダブルノックアウトすることに加え、それぞれのノックアウトを骨代謝の維持に重要な三つの主要な細胞である骨芽細胞、破骨細胞ならびに骨細胞のそれぞれで特異的にノックアウトするという現在のマウス遺伝学の上で高度な技術を用いて解析にあたることを提案するものであり、従来得られなかった全く新しい知見を得ることが期待できる。研究実施Nckの役割を明らかにするため、ノックアウトマウスについての検討を行う。Nck1およびNck2のダブルノックアウトは胎生致死であるためコンディショナルノックアウトを2.3kベースのI型コラーゲンのcreを用いてNck2を条件的に骨芽細胞特異的なノックアウトを行い、このマウスをNck1の完全ノックアウトのバックグラドで作成する。Nck12のダブルノックアウトと対照を検討し、骨量をマイクロCTで計測すると共に骨梁幅、骨梁数を検討した。メカニカルストレスは、骨量を規定する重要なシグナルである。非荷重によって誘導される骨粗鬆症は、寝たきりの患者や宇宙飛行士において、重大な問題点である。これまでに、多くの分子が骨においてメカニカルストレスの感知に関与することが示唆されてきたが、この減少に関わるメカニズムは、完全には理解されていない。Nck1は、細胞膜の活性化受容体からアクチン細胞骨格リモデリングを制御する細胞質エフェクターへのシグナルを仲介することが知られているアダプタータンパク質である。Nck1は、小胞体ストレスなどの細胞応答にも関連している。試験管内では細胞ストレスの際にアクチン細胞骨格が崩壊するが、そのような場合には、Nck1が細胞の核に移行して核のアクチン重合を仲介することが報告されている。しかしながら、生体内でのメカニカル刺激への骨の応答におけるNck1の役割は知られていない。本研究の目的は、生体において非荷重によって誘導される骨減少におけるNck1, Nck2の役割を検討する事である。そのために、Nck1, Nck2の骨芽細胞特異的な欠失マウスを作成した。本マウスを用いてマイクロCTによる検索を行い形態学的はパラメータをBV/TV, trabecular number, trabecular thickness, trabecular spacingについて明らかにした。さらにカルセインラベルを行い動的な骨形成指標への影響を解析した。

Nckは細胞のシグナルのうち細胞骨格を制御するアダプター分子であり骨の代謝との関連は不明であったが本研究の結果、Nckを欠失すると骨芽細胞の遊走を抑制すること,細胞シグナルが変化すること、骨量が低下すること、骨形成速度が低下すること、さらに骨の生体内での修復が抑制されることが明らかになった。Nck1, Nck2の骨芽細胞特異的な欠失マウスを作成し、本マウスを用いてマイクロCTによる検索を行い形態学的はパラメータをBV/TV, trabecular number, trabecular thickness, trabecular spacingについて明らかにすると共に、さらにカルセインラベルを行い動的な骨形成指標への影響を解析したことは順調な経過であることを示している。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は遺伝子発現を解析すると共に動物より得られた細胞を用いて細胞の動きを動的に解析する。特に血清や細胞の増殖因子に対して細胞が移動する機能をwound assay , double chamberassayを用いて解析する。二重ノックアウトマウスの破骨細胞の数、表面のレベル、についても形態学的に酒石酸耐性酸性フォスファターゼの染色を脱灰標本の切片を用いて計測することにより骨のリモデリングの全体像を明らかにする。Nck1及びNck2の骨代謝ならびに骨形成に関わる役割を明らかにするために、コンディショナルノックアウトマウスを作成し、骨芽細胞における機能の解析が進められた。特に骨のマイクロCTによる計量化、骨のエレメントに関する解析、さらには組織学を用いた解析が進展した。カルセインのインジェクションによりダイナミック・ヒストモルフォメトリーによって骨形成速度、石灰化速度および石灰化面積を計測する。一方、破骨細胞については、脱灰切片を用いてTRAPの染色により破骨細胞数、破骨細胞表面の面積を計測し形態計測的なパラメーターとする。
ハロ酸脱ハロゲン化酵素の酵素反応機構解析とその有害物質分解と有用物質生産への応用

本申請課題では、有害物質分解や有用物質生産に利用できる可能性のあるハロ酸脱ハロゲン化酵素L-DEX YLについて、その反応機構を分子動力学(MD)計算や量子化学計算により分子レベルで解明し、得られた知見を基に、より高機能な酵素をデザインすることが可能であるか検討することを目的としている。昨年度の方法では、L-DEX-YLの典型的な基質である2-クロロプロピオン酸(CPA)のカルボン酸部分を解離させていない構造を用いて、L-DEX YLとCPAとの複合体構造のMD計算を行っていたため、実験系を反映しておらず計算結果が信頼できない可能性があった。そこで、今年度はまずこの部分をカルボン酸イオンにした基質の量子化学計算から、MD計算に必要なパラメータを算出しそれを用いてMD計算を行った。そして、その結果から複合体の平衡構造を決定し、フラグメント分子軌道(FMO)法を用いて、平衡構造における基質や触媒水と、酵素との相互作用エネルギーを算出し、どのアミノ酸残基が基質や触媒水と相互作用しているのか推測した。その結果、Lys151とAsp180がCPAと特に強い相互作用を示した。また、Asp180は酵素の中で触媒水と最も強く相互作用していた。さらに、Lys151とAsp180はお互いに非常に強く相互作用していた。これら2つの残基が活性に重要であることは既に実験で報告されでいる。そこで、これらの残基の役割をさらに調べるため、変異体(Lys151Ala、Asp180A1a)をコンピュータ上で作成し、MD計算、FMO計算により解析した。計算結果から、Lys151は基質の固定、活性部位内の電荷のバランス調整に関与していることが示唆された。また、Asp180については触媒水の固定と、基質へ求核攻撃を行うAsp10がLys151と近づきすぎるのをブロックする役割があるのではないかと考えられた。本年度は、Pseudomonas sp. YL由来のハロ算脱ハロゲン化酵素(L-DEX YL)とそも典型的な基質であるL-2-クロロプロピオン酸(L-CPA)との基質-酵素複合体をドッキングシミュレーションにより作製し、分子動力学計算によりその複合体の構造変化を追跡した。その結果、活性部位の入口付近に存在して活性部位の入り口の開閉に関与していると思われる41番目のアルギニンが、44番目のグルタミンによって制御されているかのような計算結果が得られた。グルタミンをアラニンに置換した変異体では、分子動力学計算による2000ps後の構造において、41番目のアルギニンが44番目のグルタミンの制御を受けなくなったことで、活性部位の入口を閉じる状態から開く状態へと変化した。このことから、このグルタミンをアラニンに置換した変異体では、酵素活性が大きく減少することが考えられる。以前の研究でL-DEX YLについて様々な残基の役割が変異体導入実験により示唆されているが、今回の44番目のグルタミンの役割については、初めての報告になる。現在、このグルタミンを置換した変異体を作製して酵素活性を測定し、実験による確認を行っている。また、活性部位付近にする177番目のアスパラギンの役割について、同様に分子動力学計算から考察したところ、アスパラギンをアラニンに置換した変異体の計算結果では、反応に関与する触媒水の位置が本来の位置から大きく移動することが明らかになった。このことから177番目のアスパラギンが触媒水の固定に関与している可能性が示唆された。こちらの方は、いくつかの変異体による実験結果が報告されているので、それらの知見も考慮しながらより詳細な実験、もしくは計算を行っていきたいと考えている。

また、Asp180については触媒水の固定と、基質へ求核攻撃を行うAsp10がLys151と近づきすぎるのをブロックする役割があるのではないかと考えられた。
リン酸化シグナルを介した神経系細胞の形態制御、及び水頭症発症の分子基盤の解明

Fynチロシンキナーゼを介した神経細胞の形態制御の分子基盤の解明を目的として、Fynの基質として同定した新規分子TCGAPの機能解析を行った。その結果、(1) TCGAPは細胞の輸送系を制御していること(2) TCGAPはspineのみならずdendriteの形成も制御していること(3) TCGAP欠損マウスでは種々の行動に異常が見られること、が明らかになった。以上の結果から、Fynを介したシグナリングによる脳高次機能制御、及びその破綻による疾患の分子基盤を明らかにすることができた。本年度は、Fynを介した神経系細胞の形態制御の分子基盤を明らかにすることを目的として、申請者がFynの基質として最近同定した新規Rho GTPase-activating protein (GAP)分子であるTCGAP(中澤とLiuら、J Biol Chem 2006)に注目して解析を行った。まず、実際の脳内におけるTCGAPの機能を明らかにするために、TCGAP欠損マウスを作製し、解析を行った。TCGAP欠損マウスは、外見は正常であり交配も可能であった。TCGAPが高発現している脳に注目して解析を行ったところ、初代培養神経細胞の系ではTCGAPノックダウン細胞の形態には大きな異常が見られなかったが、TCGAP欠損マウスの脳組織における神経細胞の形態には異常が観察された。形態異常を示した神経細胞の細胞骨格系に異常が観察されたことから、TCGAPは細胞骨格を制御することによって神経細胞の形態を制御していることが明らかになった。昨年度の解析によって、TCGAPの会合分子を複数同定していたが、それら会合分子による細胞骨格の制御についても解析を行い、受容体分子とTCGAPの相関関係を併せて明らかにした。TCGAPはFynによってリン酸化されることによってその活性が低下することを明らかにしているが、本年度の研究によって、細胞表面の受容体、Fyn、及びTCGAPを含んだ経路による神経細胞の形態制御のメカニズムの一端を明らかにすることができた。本年度は、Fynキナーゼを介した神経細胞の形態制御の分子基盤の解明をさらに推進することを目的として、申請者がFynキナーゼの基質として最近同定した新規Rh GTPase-activating Protein(GAP)であるTCGAP(中澤、劉ら、J Biol Chem,2006)に注目して解析を行い、以下の結果を得た。(1)TCGAPは外界からの様々な刺激によってチロシンリン酸化されることを明らかにした。(2)TCGAPは脳・神経系細胞に発現している受容体様分子の細胞膜への輸送を制御していることを明らかにした。(3)TCGAPはspine形態のみならずdendriteの形態も制御していることを明らかにした。また、その分子基盤の解析を推進した。(4)TCGAP欠損マウスは外見上顕著な異常は観察されない。TCGAP欠損マウスの行動解析を行ったところ、精神疾患関連の行動に異常がみられることが明らかになった。(5)TCGAPはそのN末端に、タンパク質輸送に関連しているPX領域を持つユニークなRhoGAPである。PX領域をもつvariant、PX領域をもたないvariantをin uteroエレクトロポレーションを用いて、発達期の神経細胞に発現させることによってPX領域の機能解析を行い、その機能の一端を明らかにした。(6)TCGAPのホモログであるp250GAPとTCGAPとの関連性の解析を推進し、神経細胞の形態形成では、一部分overlapした機能を持つことを明らかにした。本年度の研究によって、Fyn/TCGAPシグナリングによる神経細胞の形態制御の分子メカニズム、及びTCGAPが脳高次機能を制御していることを明らかにすることができた。
両親媒性分子の自己組織化の大規模コンピュータシミュレーション

両親媒性分子の自己組織化機構を分子レベルで解明するため、我々は溶媒分子(水分子)と溶質分子(両親媒性分子)を共に粒子として顕わに扱う分子動力学シミュレーションを行った。シミュレーションモデルとして、以下の粗視化モデルを用いた。両親媒性分子は1つの親水性粒子と1つの疎水性粒子からなり、直線状に等間隔に並んだ剛体棒であるとした。溶媒分子は1つの親水性粒子でモデル化した。親水性粒子と疎水性粒子の間の相互作用は、ソフトコア・ポテンシャルで表し、親水性粒子同士及び疎水性粒子同士の間の相互作用は、レナード-ジョーンズ・ポテンシャルで表した。シミュレーションのアルゴリズムとして、かえる跳び法を用いた。アンサンブルとしてNVTアンサンブルを用い、系の温度を一定に保つため速度スケーリング法を適用した。シミュレーションの時間刻みはΔt^*=0.0025とし、相互作用ポテンシャルのカットオフ距離はr_c^*=3.0とした。また、周期境界条件を用いた。ここでは、全粒子数を5832とし、数密度を0.75とした。最初に、高温(T^*=10.0)においてランダムな両親媒性溶液を準備した。その後、T^*=1.3において急冷を行い、中間相形成過程の解析を行った。様々な両親媒性分子濃度(c_s=0.10.9)で形成される構造を解析した結果、濃度の増加とともに、ミセル溶液からヘキサゴナル相へと変化し、さらにラメラ相へ変化することが分かった。さらに、両親媒性分子の自己会合を支配する主要な力は、疎水基-溶媒界面における疎水性引力と親水基の親水性斥力であるが、ヘキサゴナル相が形成されるためには親水性斥力が重要な役割を果たすことが明らかになった。それに対して、ラメラ相の形成には、疎水性斥力の効果が重要であることが分かった。両親媒性分子の自己組織化機構を分子レベルで解明するため、我々は溶媒分子(水分子)と溶質分子(両親媒性分子)を共に粒子として顕わに扱う分子動力学(MD)シミュレーションを行った。シミュレーションモデルとして、Goetz等(独・マックスプランク研究所)のモデルを拡張した粗視化モデルを用いた。親水基は一つの粒子として扱い、疎水基は二つの粒子が連結した鎖状分子として扱った。また、両親媒性分子はまっすぐな剛体棒、溶媒分子は一つの粒子として扱った。親水基と疎水基の間の相互作用は、ソフトコア・ポテンシャルで表し、親水基同士および疎水基同士の間の相互作用は、レナード-ジョーンズ・ポテンシャルで表した。さらに、親水基と溶媒分子および溶媒分子同士の間の相互作用は、レナード-ジョーンズ・ポテンシャルで表し、疎水基と溶媒分子の間の相互作角は、ソフトコア・ポテンシャルで表した。MDシミュレーションのアルゴリズムとして蛙飛び法を用い、系の温度を一定に保つため速度スケーリング法を適用した。粒子密度は一定であり2/3とした。また、境界条件として周期境界条件を用い、初期配置はランダムな配置とした。様々な両親媒性分子濃度でMDシミュレーションを行い、分子集合体の形成過程を分子レベルで解析した。その結果、両親媒性分子濃度が比較的希薄な場合、初期においてランダムな配置をとっていた両親媒性分子は、両親媒性分子同士の相互作用および溶媒分子との相互作用により、いくつかの、ミセルに凝集することが分かった。また、ミセルは合体と分裂を繰り返し、時間の経過とともにダイナミックに変化することが分かった。両親媒性分子は1つの親水性粒子と2つの疎水性粒子からなり、直線状に等間隔に並んだ剛体棒であるとした。MDシミュレーションのアルゴリズムとして、かえる跳び法を用いた。ここでは、全粒子数を5832とし、両親媒性分子濃度c_sをc_s=0.05とした。最初に、高温(T^*=10.0)においてランダムな両親媒性溶液を準備し、その後、T^*=1.3において急冷を行い、ミセル形成過程の解析を行った。様々な数密度(ρ^*=0.60.85)で形成されるミセルの構造を解析した結果、以下の結果が得られた。(1)低密度では、ミセルの合体・分裂が繰り返される。(2)密度が増加すると、ミセル形状が円筒状から平面二分子層に変化する。(3)高密度では、ポテンシャルエネルギーが段階的に減少し、ミセルの慣性半径の隆起が見られる。(4)親水性斥力が大きくなると、ミセルの大きさが小さくなり、平面二分子層から円筒状ミセルに変化する。

両親媒性分子の自己組織化機構を分子レベルで解明するため、我々は溶媒分子(水分子)と溶質分子(両親媒性分子)を共に粒子として顕わに扱う分子動力学シミュレーションを行った。シミュレーションモデルとして、以下の粗視化モデルを用いた。両親媒性分子は1つの親水性粒子と1つの疎水性粒子からなり、直線状に等間隔に並んだ剛体棒であるとした。溶媒分子は1つの親水性粒子でモデル化した。親水性粒子と疎水性粒子の間の相互作用は、ソフトコア・ポテンシャルで表し、親水性粒子同士及び疎水性粒子同士の間の相互作用は、レナード-ジョーンズ・ポテンシャルで表した。シミュレーションのアルゴリズムとして、かえる跳び法を用いた。アンサンブルとしてNVTアンサンブルを用い、系の温度を一定に保つため速度スケーリング法を適用した。シミュレーションの時間刻みはΔt^*=0.0025とし、相互作用ポテンシャルのカットオフ距離はr_c^*=3.0とした。また、周期境界条件を用いた。ここでは、全粒子数を5832とし、数密度を0.75とした。最初に、高温(T^*=10.0)においてランダムな両親媒性溶液を準備した。その後、T^*=1.3において急冷を行い、中間相形成過程の解析を行った。様々な両親媒性分子濃度(c_s=0.10.9)で形成される構造を解析した結果、濃度の増加とともに、ミセル溶液からヘキサゴナル相へと変化し、さらにラメラ相へ変化することが分かった。さらに、両親媒性分子の自己会合を支配する主要な力は、疎水基-溶媒界面における疎水性引力と親水基の親水性斥力であるが、ヘキサゴナル相が形成されるためには親水性斥力が重要な役割を果たすことが明らかになった。それに対して、ラメラ相の形成には、疎水性斥力の効果が重要であることが分かった。
表面ポラリトン励起ラマン分光法による膜成長機構の研究

本研究では、赤外吸収およびラマン散乱の測定に基づいて、ラフネスの存在する銀表面あるいは島状銀薄膜表面に誘起される表面プラズモンポラリトン(SPP)によって、表面電磁場が増大し、よって微量に存在する表面化学種の結合状態、形態など分子レベルの知見が容易に得られることを実証した。SPPについては、既に多くの理論的研究があるが、本研究で行ったようにSPPをプローブとして、表面における化学種の反応(吸着)、析出、薄膜形成の過程を明らかにする試みはほとんどなされていない。SPPの励起はSERS(表面増強ラマン散乱)の一つの原因ではあるが、原理的には電場の増大のみを伴うため、通常のSERSとは異なり化学種を問わずその適用が可能である。この特長を利用して、本研究では以下の研究を行った。(1)鉄ペンタカーボニル、Fe (CO)_5、からのFe析出過程に関連して、その紫外光照射や基板加熱による反応をラマンスペクトルから明らかにした。特に表面が粗い銀基板上ではSPPの励起によるラマン散乱強度の増加が確かめられた。また、紫外光照射による鉄ペンタカーボニルの分解や構造の異なる鉄カーボニルの生成を示唆する新たなラマンバンドを明確に検出することができた。さらに、この光分解は特定の基板温度で生ずることもスペクトルから確認できた。(2)セルフアッセンブリー膜を形成することで知られる、パラアミノチオフェノール(PATP)について、島状Ag膜表面への吸着形態および吸着量の時間変化を明らかにした。測定されたラマンバンド強度の時間変化よりPATPの単分子層吸着が拡散律速に基づくことが確認できた。これは赤外透過測定によっても実証された。(3)電気化学的に酸化-還元処理を行った銀電極表面におけるCO_2の還元反応生成物を検出した。他方赤外反射分光法によりジメチルアルミニウムハイドライドとアモルファスシリコンとの反応に基づくAlの析出過程およびWF_6からのWの析出過程をその場測定により明らかにした。以上のように、本研究で用いた手法によって表面における化学種の吸着反応や膜成長機構に関する分子レベルの考察が可能であることが示された。CCD光検出器を装着したラマン測定装置を用いて,アルゴンイオンレーザーによる銀および白金上の鉄ペンタカーボニル,Fe(CO)_5,の低温薄膜のラマン散乱を測定した。1×10^<-7>Torrに排気した容器にFe(CO)_5ガスを導入し50nm以下の厚さの固体膜を136Kの銀あるいは白金蒸着膜上に形成させた。Fe(CO)_5は熱や光により分解してクラスター,Fe_x(CO)_y,を形成すると言われているが,その構造は明らかではない。本研究では上記の薄膜の温度変化および可視レーザー,紫外光照射に伴うラマンスペクトルの変化についてまず明らかにした。136KのAg表面上に形成したFe(CO)_5膜のラマンスペクトルにはCO伸縮振動に基づくバンドが2110,2030,1995,1985cm^<-1>に,またFe-CまたはFe-COの曲げ振動によるバンドが423,455,485,562cm^<-1>に観測された。

これらのバンドはいずれも膜の温度上昇と共に強度が直線的に減少し,253Kでほとんど消失した。同様の結果がPt表面の膜についても得られたが,温度上昇に伴うバンド強度の減少は指数関数的となった。これらのバンド強度減少は,Fe(CO)_5の熱分解によってクラスターとなったか,あるいはFeとCOを生成したためと思われる。Pt表面における急速なラマンバンドの減少はPtがAgと比較して活性であることを示している。基板を136Kに保持したままレ-ザ-光(λ=514.5nm)を照射し続けるとAg,Ptいずれにおいても2030,1995,1985cm^<-1>のバンド強度が相対的に減少し,新たに1865cm^<-1>に弱いバンドが観測された。このバンドは,振動数から判断してクラスター中に存在するFe-Fe構造の二つのFe原子にまたがって結合したCOの伸縮振動に帰属できると思われる。またAg上でのラマン強度はPt上と比べて一般に強いことからAg表面では表面増強ラマン散乱(SERS)が生じている可能性がある。紫外光照射によるスペクトル変化の詳細について現在実験を進めている。表面プラズモンポラリトン(SPP)励起により、表面化学種からのラマン散乱強度を増大させることが可能となる。Fe(CO)_5の光・熱分解によりFeが析出することが知られているが、その過程の詳細は明らかにされていない。本研究は、この過程をラマン散乱の測定により明らかにしようとするものである。SPPの励起が起こると予想した入射角の近傍において低温の銀回折格子上でのFe(CO)_5薄膜のラマン測定を試みたが、回折格子の冷却が十分行なえなかったので、シリコンウエハ-に蒸着した銀の島状膜上でのラマンスペクトルを測定した。この基板を140Kまで冷却した後、Fe(CO)_5ガスを試料室に導入して薄膜とし、270Kまでの温度上昇に伴うラマンスペクトルの変化をCCD検出器により測定した。しかし、ラマンピーク強度は加熱により減少するのみで、新たなピークは検出されなかった。従って、加熱に伴う重合反応Fe(CO)_5→Fe_2(CO)_9やその他のクラスター形成反応は起こらないことがわかった。これは昨年度の光照射の結果とやや異なる。比較的平坦なAg表面におけるFe(CO)_5薄膜のペクトルは極めて強度が弱く、バンドの同定を行なうことが困難であった。他方、上記の島状蒸着Ag表面では、解析に十分な強度のラマンスペクトルが測定できた。このラマン強度の増大には島状粒子の局所的表面プラズモンの励起が大きく寄与していると考えられる。この場合には回折格子表面でのSPPとは異なり、表面から数nm程度までの領域にある分子からのラマン散乱が増大することが報告されている。それゆえ、上記の結果もその範囲にある分子に基づくものと推察される。今年度の成果として、この局所的なプラズモンの利用が膜成長過程の初期段階であるとされる表面吸着の形態あるいは結合状態を明らかにする手段として有効であることが実証された。表面プラズモンポラリトン(SPP)は自由電子気体モデル金属の粗い表面や島状粒子、球状粒子表面に局在する振動であり、このSPPの光励起によって表面吸着種などの微量化学種の赤外吸収やラマン散乱スペクトルを高感度で測定することができる。平成7年度においては、この特長を利用して、セルフアッセンブリー(self-assembly:以下SAと略す)
予想PERの将来利益予測能力に対する技術集合バイアスの影響に関する研究

本研究は、1技術集合と予想PERの関係に関する分析、2技術集合に基づく企業グルーピングと将来利益成長の関係に関する分析、3特許企業グルーピングと予想PERの将来利益予測精度の関係に関する分析の三つから構成される。1では、既存業界内における技術集合の変化とPERの分散の関係にかかる長期的変化について分析することを目指す。2では、同質的な技術集合を有する企業グループの将来利益成長の近似性について検討する。3では、同一技術グループ企業の予想PERの分散を分析しグループ内での予想PERの分散が大きくなるか、そして技術集合の多様性のうちどういった側面が予測精度に影響を与えるのかを明らかにする。
哺乳類蝸牛における有毛細胞再生に関する研究

1)主にアデノウィルスベクターを用いてモルモット内耳に遺伝子導入を行った。内リンパ嚢経由や蝸牛中央階投与でコルチ器に遺伝子発現が得られた。また新たに確立した内耳whole mount培養法では蝸牛・前庭・半規管ともに有毛細胞・支持細胞に遺伝子発現できた。蝸牛窓経由の侵襲の低い遺伝子投与法も開発した。2)アデノウィルスベクター反復投与による免疫反応から生じる内耳毒性は副腎皮質ホルモン投与で予防できることを示した。3)Math1遺伝子組み込みアデノウィルスベクターをモルモット蝸牛に投与することで蝸牛支持細胞から有毛細胞への変化が得られた。この細胞に向かって神経線維が伸びていくことも観察した。4)カナマイシンとエタクリン酸でモルモットを聾にし、BrdUを連日投与してその取り込みを調べた。薬剤投与後3日目から蝸牛コルチ器内にBrdUの取り込みがみられ、3-5日目が最も取り込みが多いことが判明した。このBrdU陽性細胞の三分の一は明らかに分裂しており、免疫組織化学の検討でダイテルス細胞であることが示された。また透過電顕での観察でアポトーシスの所見がなく、1ヵ月後も観察できることから、この細胞は死にゆく細胞では無いことを確認した。3)4)の結果は大きなbreak throughであり、支持細胞増殖能亢進が得られればMath1遺伝子治療との併用などで、多数の有毛細胞再生が得られる日も近いと思われる。モルモットの蝸牛explant組織培養法を用い、神経繊維・有毛細胞の変性の程度、tissue integrity、支持細胞の構造の変化などの違いについてsurface preparationによる光学顕微鏡的観察および透過電顕による観察を行った。この結果、通常の培養法では神経繊維は24時間以内にほぼ消失し、有毛細胞は過半数が変性することが判明した。一方支持細胞は24時間では約8割は形態が保たれていたが、透過電顕でみると多くはnecrosisの初期であり、一部にapoptosisを疑わせる所見が得られた。3日後には過半数の標本で感覚上皮は壊死し、残存する場合も支持細胞が融合して明らかな細胞形態を保持していないことが判明した。この24時間後の標本におけるアポトーシスの有無について、免疫組織学的検討および分光高度によるcaspase3の定量を現在行っている。免疫組織学的にはtunel法で陽性細胞が見られているが、caspase3抗体染色ではまだ結果が得られておらず、引き続き検討を行っている。またcaspase3の定量も現在まで計測結果が一定しておらず、計測系の再検討中である。蝸牛explantの培養液中にグルタチオンエステル、DFO、caspase inhibitorを加えて細胞障害の予防効果については検討を開始したところであり、現在初期実験のデータ解析中である。1)蝸牛神経切断の解剖学的特性を理解するため、モルモットを灌流固定し、頭蓋骨を摘出し、脱灰固定ののち、脳の連続切片を作成した。またモルモットを用いて開頭による蝸牛神経切断を確実に行う方法の確立を試みた。手術はケタミン・ザイラジン投与下に清潔操作で行い、抗生剤投与を行ったが、まだかなりの術後死がある状態であり、今後引き続き、手術方法を確立する予定である。2)蝸牛神経を切断し、1ヶ月生き残った動物では灌流固定ののち、蝸牛神経および内耳の組織検索を行った。神経断端は瘢痕組織様になっており、再生の所見はまったくなく、これをコントロールとして用いることとした。神経賦活因子の投与による効果の検討は開始した段階である。内耳は血行不良のため変性が著しく、またラセン神経節も広範に変性していた。3)蝸牛神経への神経賦活因子投与のため、頭蓋底に開頭し、浸透圧ポンプを行う手技を確立した。

これにLacZ遺伝子組み込みアデノウイルスベクターを注入し、その遺伝子発現を調べているが、今のところ脳表に発現がとどまっており、drug delivery systemとしての利用にとどまる可能性が高い。今後に浸透圧ポンプからの投与を行う。1)蝸牛有毛細胞の経時的な障害の程度を評価するため、ゲンタマイシンを投与して数日おきに断頭し、surface preparationで有毛細胞におけるアポトーシス細胞のカウントを行った。この結果アポトーシスは2,3日以内がピークとなることが判明し、現在論文にまとめている。2)Math1を組み込んだadenovirusベクターを内耳障害モルモットの蝸牛内に投与したところ、一部の支持細胞が有毛細胞に変化し、聴毛もきれいに再生することが判明した。この細胞に向かって求心性神経線維が伸びていくことも明らかとなった。しかしABRでの聴力回復は残念ながら得られなかった。浸透圧ポンプで各種神経賦活因子も投与したが、明らかな影響はなかった。3)エタクリン酸およびカナマイシン投与による高度有毛細胞障害をモルモットで作成し、その後BrdUを連続投与し、蝸牛内の細胞分裂の状態を調べた。この結果、投与後3日目から支持細胞に分裂が見られるという、極めてセンセーショナルな結果を得た。現在有毛細胞への自然変化および増殖因子による細胞分裂能の亢進を調べている。またMath1をretrovirusに組み込んだベクターの投与を準備している。4)そのほか、音響外傷の影響・治療効果、新しい遺伝子投与法の開発・副作用予防については論文に掲載されている。
CVD法による超薄層担持触媒の調製

本研究では、CVD法により原子単位で厚みを調整した超薄層構造を持つ担特【V_2】【O_5】触媒を調製することを目的として以下の研究を行った。1.超薄層触媒の調製真空系と流通系を結合したCVD装置を用いて、気相VO【Cl_3】分子と担体(【Al_2】【O_3】)表面水酸基との反応および加水分解を行うことにより担体表面に【V_2】【O_5】を蒸着した。また、この操作をくり返して担持【V_2】【O_5】層の厚みを調整した超薄層担持【V_2】【O_5】/【Al_2】【O_3】触媒を調製した。2.触媒構造の測定上で調製した触媒のキャラクタリゼーションを以下のように行った。(1)化学分析による蒸着【V_2】【O_5】量の測定.(2) XPSによる表面【V_2】【O_5】濃度の測定.(3) BET法による全表面積の測定.(4) NO-【NH_3】矩形パルス法による【V_2】【O_5】活性表面積および【V_2】【O_5】層数の測定.3.超薄層構造の確認以上を総合して超薄層担持【V_2】【O_5】/【Al_2】【O_3】触媒の構造に関して次の結論が得られた。(1) 1回の蒸着-加水分解のサイクルでは単原子層の厚みの超薄層構造が得られるが、担体表面すべてをおおいつくすことはできない。(2)サイクルを2回くり返すことにより、【V_2】【O_5】単原子層の担体表面上での広がりは飽和に達つする。(3)サイクルをさらにくり返すことにより、【V_2】【O_5】層の厚みを調整することができる。
組織幹細胞の自己複製制御の仕組みの解明

加齢などによって見られる組織の機能低下や枯渇の原因を探るため、ほ乳類の白毛化(白髪)に着目し、『色素幹細胞の自己複製制御の仕組みとその破綻のメカニズムを解明』することを目的とした。本研究で3つの遺伝子が色素幹細胞の維持に重要な役割を持つことが明らかになった。1つ目は酸化ストレス耐性に重要な遺伝子であるNrf2であり、その欠損によって色素幹細胞が枯渇しやすくなることがわかった。このことは酸化ストレスが幹細胞維持に関わっていることを示唆するものであり、今後は酸化ストレスがDNAダメージを介して幹細胞の枯渇を引き起こすのか、もしくは別の経路を介して引き起こすのかについて明らかにしていく必要がある。2つ目の遺伝子として、様々な生物で寿命との関わりが証明されてきたSirt1について、その欠損により色素幹細胞が枯渇しやすくなることもわかった。Sirt1は様々な遺伝子に影響を与えることから、メカニズムについてはまだ未知の部分も多いが、DNA修復への関与が明らかになりつつある。最後に、DNA修復応答について中心的な役割を担うATR遺伝子について、その色素幹細胞特異的な欠損は、生まれた時からの色素幹細胞の枯渇を起こす結果となった。このことは、発生においてATR遺伝子が色素幹細胞の維持に必須であることを示している。次に、タモキシフェンを投与することによってCreを発現し遺伝子を欠損させることのできるCreERマウスを使って、生育後に色素幹細胞特異的にATRを欠損させたマウスについて調べたが、こちらは野生型マウスと比較して優位な差が見られなかった。このことはATR遺伝子が修復に関わるDNA損傷(一本鎖切断など)は単独では色素幹細胞の枯渇を引き起こさないことを示唆するものであるが、今後はどのDNA損傷が重要なのかを明らかにしていく必要がある。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
多脚型アンカー基をもつレドックス活性分子を起点とした分子配線の構築と電子機能

多脚型アンカー基により分子を多点吸着で固体表面に固定し、垂直および水平配向の制御を行い、(1)基板表面上での多点吸着による微小ナノ空間の作成(2)金表面と金ナノ微粒子間に挟まれた錯体積層系の錯体分子の電気伝導性について検討した。具体的には、(1)としては3座配位子であるターピリジン基を3個もちD_<3h>対称の架橋配位子および6個のアルキルチオール酸基をもつ三座配位子およびこれらの配位子をもつルテニウム三核錯体を新規に合成し、金電極基板への錯体の自己組織化膜の作製を行ない、接触角測定から分子の吸着により基板が疎水化されることを明らかにした。この錯体修飾ITO基板の電気化学測定において、ジチオフルバレンが固定された錯体内の小空間に内包されること、薄層分光電気化学の測定から固定された錯体膜はエレクトロクロミック性を示すことを明らかにした。(2)としては金電極上にチオール基で固定し、ルテニウム中心イオンを挟んでチオール基あるいはホスホン酸基をもつ垂直配向型ルテニウム錯体の電気伝導性を電導性原子間力顕微鏡(AFM)による電流電圧(1-V)曲線測定から検討した。チオール基をアンカーにもつ錯体を金表面に固定し、そのSAM膜上に金ナノ微粒子を疎らに固定し、金ナノ粒子と分子とがアンカー基による(金電極)-(錯体分子SAM膜)-(金ナノ微粒子)を作製し、その分子アンカー基とナノ粒子間の相互作用が電導性にどのように関与しているかを調べた。両端がチオール基の場合と片側がチオール、他がホスホン酸の場合を比べると後者が10倍近く伝導度が下がること、またこのホスホン基にZr(IV)イオンを挟んで上部をチオール基とすると伝導度は下がるがホッピング伝導性が見られることがわかった。単一層での電導性測定は最近たくさんあるが多層化による測定例は少なく、今回の例は新しい測定系をあたえるものである。さらに、4脚型ホスホン基をもつルテニウム錯体はシリコン基板上への集積化についてXPSにより詳細に調べ論文とした。多脚型アンカー基により分子を多点吸着で固体表面に固定、垂直および水平配向の制御を行い、(1)基板表面上での基質取り込み空間の作成(2)電位印加による表面錯体内へのイオンの蓄電能について検討した。具体的には、(1)としては3座配位子であるターピリジン基を3個もちD_3h対称の架橋配位子および6個のアルキルホスホン酸基をもつ三座配位子およびこれらの配位子をもつルテニウム三核錯体を新規に合成し、ITO電極基板への錯体の自己組織化膜の作製を行ない、接触角測定から分子の吸着により基板が疎水化されることを明らかにした。(2)としてはホスホン酸基をもつ垂直配向型ルテニウム錯体を合成し、それをITO電極に表面固定し、錯体が垂直配向をしていることを原子間力顕微鏡(AFM)から明らかにした。レドックス活性であるRu錯体が、酸化される+1Vをパルス電位として印加し、OVに戻った後に錯体が吸収をもつ光照射(500nm)を行うと、カソード過渡電流が観測されるが、逆に負方向(OV⇔-1V)のパルスをかけた後に同様に光照射すると反対のアノード過渡電流が観察された。錯体がない場合にはこのような応答性は観察されないことから、錯体の酸化されるパルス電位の正負の方向をメモリー(メモリ機能)していると考えられる。これまでにないまったく新しいメモリデバイスとしての駆動方式であることを明らかにした。

両端がチオール基の場合と片側がチオール、他がホスホン酸の場合を比べると後者が10倍近く伝導度が下がること、またこのホスホン基にZr(IV)イオンを挟んで上部をチオール基とすると伝導度は下がるがホッピング伝導性が見られることがわかった。単一層での電導性測定は最近たくさんあるが多層化による測定例は少なく、今回の例は新しい測定系をあたえるものである。さらに、4脚型ホスホン基をもつルテニウム錯体はシリコン基板上への集積化についてXPSにより詳細に調べ論文とした。
マントル深部由来の炭素と揮発性成分の検出

炭素を含む揮発性成分の地球表層とマントルの間の循環過程はよく分かっていない。マントルに地球表層由来の炭素が存在するかどうかを検証するために、火山岩に含まれる炭素濃度と同位体を分析する技術開発を行った。二酸化炭素は火山岩が噴出するときに容易に脱ガスするため、ガスを保持していると考えられる海底噴出急冷ガラス試料を対象とした全岩分析と、火山岩中の斑晶に含まれるメルト包有物を対象とした局所分析を行った。この手法をマントル深部由来の海洋島玄武岩に応用した結果、一部の海洋島玄武岩には地球表層由来の炭素が含まれている可能性が示唆された。平成26年度は当初計画通り、火山岩試料から揮発性成分を抽出・分離する装置の構築、超微量の二酸化炭素の同位体分析法の改良、次年度目以降に測定を行う火山岩試料の準備を行った。揮発性成分を抽出・分離する装置の構築については、真空破砕法により火山岩試料から揮発性成分を抽出した後、冷却トラップで水を除去し、二酸化炭素を液体窒素トラップで隔離し、希ガスであるヘリウムとアルゴンの回収を効率良く行うためのラインを設計し製作した。標準ガス試料を用いてテストを行い、分離と回収を問題なくできることを真空圧力計と四重極質量分析計を用いて確認した。超微量の二酸化炭素の同位体分析については、当初使用を予定していた安定同位体質量分析計を用いるよりも、当該機関に最近導入されたレーザー分光装置を用いた炭素同位体質量分析のほうが微小量でも簡便に精度良く分析できる可能性があることが分かり、今後この装置を研究に用いるべくテストを行った。測定を行う火山岩試料の準備については、中央海嶺玄武岩、南太平洋ポリネシア地域の海洋島玄武岩等の中から、揮発性成分の研究に適した水中急冷ガラスとオリビン斑晶を選び、測定試料として準備した。特にオリビン斑晶中の揮発性成分の大部分はメルトインクルージョンにトラップされていると考えられているが、メルトインクルージョンの微細構造に着目してどのような相に揮発性成分が分配されているかはまだよく分かっていない。そこで、メルトインクルージョンに含まれるメルト相、急冷結晶相、収縮気相の揮発性元素の含有量と分布を局所分析で明らかにすべく、メルトインクルージョンの準備も行った。平成27年度は二酸化炭素と希ガスのバルク分析法の確立と、それと平行して二酸化炭素を含む揮発性成分の局所分析法の確立を行った。岩石中の二酸化炭素と希ガスのバルク分析については、平成26年度に製作した揮発性成分を抽出・分離する装置と超微量の二酸化炭素の同位体分析法のさらなる改良を行った。同一試料から抽出した二酸化炭素と希ガスを分離しそれぞれを異なる分析装置で測定できるようにするため、二酸化炭素と希ガスの両方を含む標準ガスを準備し、その分離効率を調べ装置の最適化を図った。超微量の二酸化炭素同位体分析については、当初予定していた安定同位体質量分析計からレーザー分光による同位体分析に切り替えた。それは後者のほうが試料準備が簡便でより多くの試料を短時間で分析できるためである。レーザー分光装置を用いて、岩石試料に含まれると想定される二酸化炭素量で装置の最適化を行い、標準ガスの測定から十分な精度が得られることが確認できた。鉱物中の揮発性成分はメルト包有物にも保持されているので、上記のバルク分析と平行してメルト包有物を対象とした揮発性成分の局所分析手法の確立も行った。海洋島玄武岩に含まれるオリビンメルト包有物を準備し、二次イオン質量分析計を用いて二酸化炭素と同時に水、フッ素、塩素、硫黄といった揮発性成分の測定を試みた。また二酸化炭素の大部分はメルト包有物中の気泡に含まれるので、ラマン分光分析により二酸化炭素量の測定を試みた。この両者の手法により得られた揮発性成分量を合算し、メルト包有物が元来持っていた揮発性成分組成を決定することが可能となった。また、天然のメルト包有物とそれを加熱均質化したメルト包有物の両者に対して分析を行い、メルト包有物内で起こる結晶化が揮発性成分測定に与える影響を評価した。これらの成果の一部は、国際学会で発表するために投稿した(発表は平成28年度)。岩石・鉱物中に含まれる二酸化炭素と希ガスのバルク分析は、平成26年度にガス抽出・分離装置の構築、平成27年度にその装置の改良とレーザー分光による微量の二酸化炭素の同位体比測定をテストすることができ、実試料を分析するための準備が完了した。また、実際に分析を行う海洋島玄武岩、中央海嶺玄武岩、島弧玄武岩のオリビン鉱物試料や海底ガラス試料も準備した。当初の予定では平成27年度にこれらの実試料のいくつかをテスト的に分析するところまで計画していたが、希ガス質量分析装置の不調等により実試料の分析までは行うことができなかった。しかし当該装置も復旧し、平成28年度には実試料をルーチン的に分析する段階に入ることができる。これと平行して進めたメルト包有物の局所分析手法の確立は予想以上に進展した。実試料のメルト包有物に対して、ラマン分光分析でメルト包有物の気泡中の二酸化炭素量測定、二次イオン質量分析計で二酸化炭素を含む揮発性元素濃度測定、EPMAやICPーMSによる主成分・微量成分元素濃度と鉛同位体比測定といった一連の分析を可能とした。

メルト包有物を天然のまま分析するか、加熱均質化してから分析するかが問題とされているが、同一試料に対して両方を分析することによりそれぞれの利点、欠点を洗い出した。以上によりメルト包有物の分析により揮発性元素のマグマ中でのミクロな挙動を明らかにするための準備が整った。平成28年度は(1)岩石全岩試料から二酸化炭素と希ガスを抽出・分離する手法と同位体測定データの信頼性の確認を行い、(2)前年度までに確立した二酸化炭素を含む揮発性成分の局所分析法を応用して、海洋島玄武岩に含まれる二酸化炭素濃度の測定を行った。(1)岩石中の二酸化炭素と希ガスの全岩分析については、前年度までに製作・改良した揮発性成分を抽出・分離する装置を実際に運用し、濃度の異なる複数の標準ガス試料を作成した。分離された二酸化炭素試料に対して、レーザー分光装置を用いて炭素同位体比を測定した結果、岩石中に含まれる微量の二酸化炭素量まで十分な精度で同位体比分析ができることを確認した。同時に抽出・分離された希ガスの濃度も問題なく測定できることを確認した。(2)上記の全岩分析と平行して、岩石に含まれるオリビン斑晶に内包されるメルト包有物を対象とした二酸化炭素の局所分析を行った。二次イオン質量分析計を用いてメルト包有物のガラスの部分の二酸化炭素濃度を定量する手法は前年度までに確立しており、それを南太平洋のライババエ島に産出する海洋島玄武岩のメルト包有物に応用した。ライババエ島には鉛同位体比の異なる二種類の火山岩が噴出しているが、両者の火山岩中のメルト包有物は異なる二酸化炭素濃度を示すことが分かった。このことから、両火山岩のマグマ源であるマントル物質は異なる炭素量を持ち、地球表層由来の炭素がマントルに存在する可能性が示唆された。これらの成果の一部は平成28年度の国際学会で発表し、また平成29年度の国際学会で発表予定であるのと同時に、国際学術誌に投稿するための論文を準備している。炭素を含む揮発性成分の地球表層とマントルの間の循環過程はよく分かっていない。マントルに地球表層由来の炭素が存在するかどうかを検証するために、火山岩に含まれる炭素濃度と同位体を分析する技術開発を行った。二酸化炭素は火山岩が噴出するときに容易に脱ガスするため、ガスを保持していると考えられる海底噴出急冷ガラス試料を対象とした全岩分析と、火山岩中の斑晶に含まれるメルト包有物を対象とした局所分析を行った。この手法をマントル深部由来の海洋島玄武岩に応用した結果、一部の海洋島玄武岩には地球表層由来の炭素が含まれている可能性が示唆された。上記のように初年度に計画した項目は実施することができた。本研究は火山岩の水中急冷ガラスやオリビン斑晶といったバルク試料を用いて、揮発性成分のマクロな挙動、すなわち脱ガス等によるフラクショネーションを希ガス同位体で補正しながら、マントル由来のマグマが本来持っていた炭素同位体比を決定するのが目的であり、そのために必要な準備を初年度で行うことができた。その一方この1年間の研究の中で、マグマ中の揮発性成分のミクロな挙動も併せて理解することで、炭素同位体比の解釈がより強固なものになると気づき、オリビン斑晶に含まれる一つ一つのメルトインクルージョンを詳細に調べる研究も平行して行うべく準備を行った。ルーチン的な測定が可能となった二酸化炭素と希ガスの抽出・分離システム、超微量の二酸化炭素同位体比を測定するレーザー分光分析計、希ガス含有量を測定する希ガス質量分析計を組み合わせて、ルーチン的にこれらの元素量と同位体比を測定していく。
均一な糖鎖を持つバイオ医薬品の微生物酵素を用いた革新的生産技術

本研究はバイオ医薬品である糖タンパク質のヒト由来サイトカインを組換え酵母で発現させ、得られた酵母型の糖鎖を有する糖タンパク質を糸状菌のエンドグリコシダーゼ(Endo-M)の糖転移活性を用いてヒト型糖鎖へリモデリングすることにより、ヒトに適応したバイオ医薬品を創製することを目的とする。これまでにヒト由来インターフェロン-γ(IFN-γ)およびインターロイキン-3(IL-3)について、それぞれの合成DNAを用いてPichia酵母による組換えサイトカインの生産に成功している。得られた組換えサイトカインの糖タンパク質の糖鎖にEndo-Hを作用して酵母特有の高マンノース型糖鎖を切断遊離し、N-アセチルグルコサミン一残基を有したサイトカインを得て、これを受容体としてヒト型糖鎖であるシアロ複合型糖鎖を有する糖ペプチドを糖鎖供与体としてEndo-M変異酵素の糖転移活性によりシアロ糖鎖の転移付加を試みた。しかし、シアロ糖鎖特異的なSNAレクチンを用いたLectin blottingで調べた結果、糖転移生成物をほとんど見出すことができず、リモデリングに成功していない。この結果はEndo-Mの分子サイズが大きいために受容体の目的の作用部位に作用することができないためと考え、Endo-Mのサイズを縮小化するために744アミノ酸残基からなる完全長のEndo-MからC末端を部分的に削除した組換えEndo-Mの作成を試みた。すなわち、G581までをコードするdeletion mutantとE546までをコードするdeletion mutantのコンストラクトを構築した。G581およびE546をコードするコドンから逆向きに2つのプライマーを設計し、またHisタグをコードする領域から順方向にプライマーを設計して、これらのプライマーを用いて全長Endo-Mを含むpET23dベクターを鋳型として加えPCRを行い、得られた断片をそれぞれセルフライゲーションして、2つのコンストラクトを得たが、いずれも活性が消失していてEndo-Mのサイズの縮小には成功しなかった。申請者らは土壌より単離同定した糸状菌Mucorhiemalisの特異なエンドグリコシダーゼ(Endo-β-N-acetylglucosaminidase、Endo-M)の糖転移活性を活用したタンパク質への糖鎖の付加やすげ替えの技術を開発し、糖鎖を有する多くの生理活性物質の生産に成功している。本研究では、この酵素的技術を用いることによって、酵母を宿主として生産された組換えバイオ医薬品の糖鎖を均一な構造の糖鎖に変換し、動物細胞で生産された先発品と品質が全く変わらないバイオシミラーの生産を企てるとともに、糖鎖構造を変えることによってより優れた薬効が期待できるバイオベターの生産を試みる。当初は、組換えヒトIgGについて、産業技術総合研究所の千葉靖典博士より遺伝子の提供を受けて当研究室にて、酵母Pichia pastorisを宿主とした組換えヒトIgGの生産を計画していたが、準備不足のため、提供を受けたSaccharomyces cerevisiaeを宿主とした組換えヒトIgGについてグライコシンターゼ様の効率的な糖鎖付加を行う変異酵素Endo-M-N175Qを用いることによってIgG糖鎖のリモデリングの技術開発を進め、ヒト型糖鎖を有したヒトIgGの効率的な生産を目指した。その結果、ヒト型糖鎖であるシアロ複合型二本鎖糖鎖をIgGのFc領域に持つヒトIgGを得ることに成功した。さらにヒト由来のサイトカインであるインターフェロン-γ(IFN-γ)を酵母Pichia pastorisで発現させた組換えバイオ医薬品について、ヒト型糖鎖へのリモデリングを試みた。その結果、酵母を宿主とするIFN-γの発現に成功し、Endo-Hによって酵母型の糖鎖を切断遊離することに成功している。本研究の当初の計画では、糖鎖のリモデリングの対象である組換えヒトIgGについて、遺伝子の提供を受けて、酵母Pichia pastorisを宿主とした組換えヒトIgGの生産を計画していたが、先ず、提供を受けたSaccharomyces cerevisiaeを宿主とした組換えヒトIgGについて糖鎖のリモデリングを実施することにした。すなわち、酵母の組換えヒトIgGにEndo-Hを作用させて結合している高マンノース型糖鎖を一残基のN-アセチルグルコサミン残基を残して遊離した後、シアロ複合型二本鎖糖鎖のオキサゾリン化合物を供与体として、グライコシンターゼ様の変異酵素Endo-M-N175Qによって糖転移反応を行い、電気泳動により分析後、ヒトIgGに対する抗体を用いてWestern blottingをしたところ、シアロ複合型糖鎖を有するIgGの生成を見出した。また、シアル酸に特異的なSNAレクチンによるブロッティングによっても確認した。この結果は、酵母により発現された組換えバイオ医薬品をヒトに適応したバイオ医薬品に変換できることを示したものである。続いて、バイオ医薬品であるヒト由来インターフェロン-γ(IFN-γ)をPichia酵母によって生産し、得られた組換えIFN-γの糖鎖のヒト型糖鎖へのリモデリングを試みた。既報のヒトIFN-γのアミノ酸配列から酵母発現用に塩基配列を最適化した合成DNAを外注し、これを酵母用ベクターpPICZαAにInfusion法で導入して、メタノール資化性酵母Pichia pastoris KM71株へエレクトロポレーション法により形質転換を行った。グリセロール含有培地で30°Cにて培養後、メタノール含有培地に移してIFN-γを発現誘導し、次いでこの組換えIFN-γにEndo-Hを作用して高マンノース型糖鎖を遊離し、これを受容体として糖転移反応を試みている。