hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオミネラリゼーションにおける生体高分子が関与した炭酸カルシウムの結晶成長機構

バイオミネラルにおける有機・無機相互作用を解明すれば、新規の有機・無機複合ナノ材料の創製や、炭酸塩バイオミネラルの二酸化炭素固定による環境科学への応用が期待される。生物が関与して形成される固体無機物質はバイオミネラルと呼ばれ、それを構成する結晶の結晶相や方位、形態、機械的性質などは高度に制御されている。この要因として、結晶内部に含有されている有機高分子が重要な役割を果たしていると考えられている。そこで私は軟体動物の貝殻を研究対象とし、結晶内に存在する有機高分子の機能を解明することを目指した。本研究では、炭酸カルシウムの多形の一つである方解石で構成された貝殻に着目した。まず、アコヤガイ(Pinctada fucata)、タイラギ(Atrina pectinata)、イワガキ(Crassostrea nippona)のという三種の二枚貝貝殻の稜柱層を調べた。EDTA(エチレンジアミン四酢酸)で結晶を溶解し、残渣として残った有機高分子を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察すると、アコヤガイとイワガキにはネットワーク状の、タイラギには細い繊維状の有機高分子が見られた。次に走査透過電子顕微鏡(STEM)により得られるZコントラスト像の電子線トモグラフィーを用いて、有機高分子の3次元分布を可視化した。その結果、やはりアコヤガイやイワガキではネットワーク状の有機高分子が存在していることが確かめられた。ネットワーク状の有機高分子は結晶に小角粒界を伴ったsub-grain構造を導入することが透過型電子顕微鏡(TEM)観察により分かり、結晶成長の物理的障害となっていることが考えられた。ネットワーク状の有機高分子がsub-grain構造を導入している様子は、二枚貝のみならず、巻貝のエゾアワビ(Haliotis discus hannai)やカモガイ(Collisella dorsuosa)の方解石結晶でも観察され、多種に渡って見られた。sub-grain構造は方解石結晶の機械的性質を向上させることが示唆されており、貝が生き残るための戦略としてこのように微細構造を制御していることが考えられた。またこのようなバイオミネラルにおける有機・無機相互作用は、新規の有機・無機複合ナノ材料の創製や、炭酸塩バイオミネラルの二酸化炭素固定による環境科学への応用が期待される。バイオミネラリゼーションにおける結晶と生体高分子の相互作用を解明することを目指し、バイオミネラルとin vitroで形成された結晶を比較しながら研究を行った。その結果、多くの新たな結果を得ることができ、そのうちのいくつかを論文として公表することができたため。バイオミネラリゼーションにおける有機・無機相互作用を理解するために、in vitro炭酸カルシウム結晶形成実験を中心に実験を進め、結晶に影響を与える生体高分子について考察した。その結果、いくつか重要な知見が得られ、現在それを論文にまとめて投稿し、査読中である。学会発表もいくつか行っており、本研究はおおむね順調に進展している。
脳細胞傷害時における細胞間情報伝達分子としての過酸化水素の役割

ラット大脳皮質線条体領域から作製したスライス培養系において、過酸化水素はアストロサイトなどのグリア細胞においてMCP-1をはじめとした複数のサイトカイン/ケモカインの産生を惹起した。また、ラジカル除去薬であるエダラボンとジメチルチオウレアでは、過酸化水素による細胞傷害に対しては同様に抑制作用を発揮する一方で、サイトカイン/ケモカイン発現上昇に対しては部分的に異なる効果を示すことを明らかにした。過酸化水素(H_2O_2)が脳傷害時の細胞間情報伝達分子として働いている可能性を検討するため、ラットの大脳皮質線条体領域から作製した脳スライス培養系を用い、H_2O_2による細胞傷害ならびにケモカインMCP-1の産生に着目して検討を行った。H_2O_2はその濃度依存的に細胞傷害およびMCP-1産生を惹起し、主なMCP4産生細胞はアストロサイトであった。この細胞傷害およびMCP-1産生の詳細なメカニズムを明らかにするため、ラジカル消去薬エダラボンの効果を検討したところ、エダラボンはH_2O_2による細胞傷害を濃度依存的に抑制する一方で、H_2O_2によるMCP-1産生には全く影響を与えなかった。そこで、他のラジカル消去薬あるいはラジカル生成抑制薬によっても同様の効果が観察されるかどうかを検討した。ラジカル消去薬ジメチルチオウレアは、エダラボンとは異なり、H_2O_2による細胞傷害およびMCP-1産生の両方を濃度依存的に抑制した。また、H_2O_2からヒドロキシラジカル(・OH)への生成に必要な鉄のキレート剤2, 2'-dipyridylも、細胞傷害ならびにMcP-1の産生を抑制した。これらの結果から、H_2O_2による細胞傷害は、・OHの生成を介した作用であることが示唆された。一方、ジメチルチオウレアや2, 2'-dipyridylがMCP-1産生を抑制するにもかかわらず、エダラボンが抑制作用を示さなかった理由については今のところ不明であり、そのことが脳保護薬としてのエダラボンの薬理作用機序に関わるか否かも含めて今後の検討課題である。過酸化水素(H_2O_2)が脳傷害時の細胞間情報伝達分子として働いている可能性を考え、昨年度の検討では、ラットの大脳皮質線条体領域から作製した脳スライス培養系を用い、H_2O_2が濃度依存的に細胞傷害およびアストロサイトでのケモカインMCP-1の産生を惹起すること、また、ラジカル消去薬エダラボンはH_2O_2による細胞傷害を濃度依存的に抑制する一方で、MCP-1産生には全く影響を与えないことを明らかにしてきた。さらに、他のラジカル消去薬ジメチルチオウレアや鉄のキレート剤2,2'-dipyridy1は、エダラボンとは異なり、H_2O_2による細胞傷害およびMCP-1産生の両方を濃度依存的に抑制することも明らかにしてきた。そこで、本年度は、H_2O_2によるMCP-1以外のサイトカイン/ケモカイン発現変化を検討するとともに、変化が認められたものに関しては、その発現変化に対するこれらラジカル消去薬の効果を検討した。ラットの大脳皮質線条体領域から作製した脳スライス培養系において、H_2O_2はCINC-1やIL-6、LIFなどのmRNA発現を有意に増加させた。そこで、これらのmRNA発現上昇に対するエダラボンの効果を検討したところ、IL-6およびLIFについてはMCP-1同様に抑制されなかったが、CINC-1 mRNA発現上昇は有意に抑制された。また、ジメチルチオウレアおよび2,2'-dipyridy1は、H_2O_2によるIL-6、LIF、CINC-1いずれのmRNA発現上昇に対しても有意な抑制作用を示した。以上より、これらサイトカイン/ケモカイン産生に対する抑制効果の違いが、エダラボンと他のラジカル消去薬の脳保護薬としての薬理作用の差の一端を担っている可能性が示唆された。
プルキンエ細胞およびバーグマングリア特異的Sept7欠損マウスの解析

Sept7(exon3)floxedマウスを作製し、L7Cre、S100b-CreおよびDAT-Creドライバーマウスと交配した。組み換えはPCRでは検出されるものの、組織染色ではSept7蛋白質欠損細胞は検出されなかったことから、両アレル同時には欠失しない程度に組み換え効率が低いと推測された。一方、Tリンパ球特異的なCd4-Creでは組み換えが起こって期待される形質が発現したことから(投稿準備中)、Sept7(exon3)floxedアレルの組み換え効率が分化状態ないし細胞系譜による影響を受けやすいことがわかった。対策として、1 hitでnullが得られるようdel/floxedマウスの作製を開始した。また、支援班の崎村教授グループの協力を得て(GluR2-Creマウスとの交配を試みるとともに、組み換え効率の改善を期待してSept7(exon4)floxedマウスを作製した。関連研究として、大脳皮質ニューロンにおけるSept7RNAiが軸索・樹状突起の伸長を阻害することを示した。これは線虫のセプチン変異体unc-59/-61で報告された神経突起伸長・分岐異常と符合する。このメカニズムが既知のセプチン機能(微小管、アクチン、tSNAREの機能修飾・安定化)で説明できるか否かを検証中である。また、低分子量G蛋白質Cdc42はエフェクター蛋白質ファミリーCdc42ep1-/1Borg1-5を介してセプチン系を制御する(Nat Cell Biol 2001)。このパスウェイの生理的意義を検証するため、バーグマングリアと海馬歯状回ニューロンで選択的に発現するCdc42ep/Borgに着目してノックアウトマウスを作製し、解析中である。以上、本研究で作製した研究リソースが、脳研究に貢献し、さらに、がん、不妊、肝線維化、感染防御、免疫系の研究にも役立つ得ることがわかった。代表者らの以前の研究で、神経系の中でも特に前シナプス終末やBergmann glia終末足などでセプチン重合体がクラスターを形成することを見出したが(萩原ら、未発表)、その分子機構や生理的意義は不明である。本年度はセプチン重合体がリン脂質膜と直接相互作用することを再構成系で示すとともに(Curr Biol 2009)、細胞膜直下のセプチン系とアクトミオシン系との協調が形態形成や剛性の制御に必須であることを示した(NatCell Biol 2009)。しかし、個体レベルでSept7遺伝子を欠損するマウスは胎生致死となるため(Wareら、未発表)Sept7 floxedマウスを作製し、細胞特異的にSept7遺伝子を欠損させるべくL7-Cre、S100b-Creなどのドライバー系統と交配した。21年度中にプルキンエ細胞およびバーグマングリア特異的Sept7欠損マウス個体の解析に着手する予定である。これらの系統や試料の供与、未発表データや新規解析手法の共有などを通じて、領域内および国内外グループとの共同研究を積極的に行っている。セプチン系の異常を伴うヒトの精神・神経疾患が複数知られるようになり、疾患モデル解析系としてのセプチン遺伝子改変マウスの重要性が注目されつつあるため、これまでの知見を英文総説として著書(分担執筆)を出版した。
ペア型受容体LMIR3とLMIR7によるマスト細胞活性化制御機構の解析

LMIR3欠損マウスにおいてDSS誘発腸炎の悪化が認められた。大腸マスト細胞におけるLMIR3とセラミドの結合はATPによるマスト細胞の活性化を抑制して腸炎の発症・進展を抑えた。従って、セラミド含有vesicleの投与はマスト細胞の活性化を抑えて野生型マウスの腸炎を改善させた。他方、LMIR3欠損マウスは敗血症性腹膜炎に抵抗性を示した。LMIR3とセラミドの結合は大腸菌に反応してマスト細胞と好中球が産生する好中球遊走因子量を低下させ感染局所への好中球集積を抑制した。従って、セラミドとLMIR3の結合を阻害する薬剤の投与は局所への好中球集積を促進して野生型マウスの敗血症性腹膜炎を改善させた。物理的な結合アッセイと機能的なレポーターアッセイを利用して、LMIR7リガンドのスクリーニングを試み、リガンド候補脂質を同定した。現在、そのリガンド候補脂質とLMIR7の結合がマスト細胞のFceRIシグナルをin vitroで制御するかを検討中である。野生型マウスとLMIR3欠損マウスに対して、DSS誘発腸炎モデルとTNBS誘発腸炎モデルを施行した結果、野生型マウスと比較してLMIR3欠損マウスの腸炎は著しく増悪した。マスト細胞欠損マウスに野生型またはLMIR3欠損マスト細胞(bone marrow-derived mast cell; BMMC)を生着させた後にDSS誘発腸炎モデルを行うと、後者で腸炎は著しく悪化した。LMIR3欠損マウスの大腸では活性化したマスト細胞の増加とともに炎症性細胞の増加が認められた。興味深いことに、LMIR3のリガンドセラミドの存在下では、ATPによるBMMCの活性化がLMIR3依存的に抑制されることがin vitroで示された。また、LMIR3-Fcやセラミド抗体(生体内でLMIR3とセラミドの結合を阻害する)の投与は野生型マウスのDSS誘発腸炎を悪化させる一方、セラミドリポソームの投与は野生型マウスのDSS誘発腸炎を改善した。これらの結果から、大腸マスト細胞のLMIR3とセラミドの結合は腸炎の発症・進展を抑制することが明らかになった。本研究の目的は、マスト細胞に発現するペア型受容体である抑制型受容体LMIR3と活性化型受容体LMIR7の生体内リガンド脂質を同定すること、LMIR3あるいはLMIR7とその脂質リガンドの結合が種々の受容体を介するマスト細胞の活性化をどのように制御するかを明らかにすることである。最終的には、LMIR3とLMIR7を標的とするアレルギー・炎症性疾患に対する新規治療法を開発することである。LMIR3欠損マウスは野生型マウスと比較して炎症性腸疾患が増悪すること、脂質セラミドとLMIR3の結合が(大腸の損傷に伴い放出される)ATPを介するマスト細胞の活性化を抑制すること、を明らかにした。また、IgEとマスト細胞が関与するアナフィラキシーに対して有効なように、セラミド含有vesicleの投与は炎症性腸疾患の発症・進展を抑制することが示された。また、LMIR7欠損マウスは野生型マウスと比較してIgEとマスト細胞が関与するアナフィラキシーや気道炎症が軽減することが示された。野生型マウスにLMIR7とリガンドの結合を阻害する分子を投与すると、アナフィラキシーが改善すること、逆に、リガンド脂質を含有するvesicleを投与すると、アナフィラキシーが悪化することが示された。このように、LMIR3とセラミドの結合がマスト細胞の活性化を抑制し、LMIR7と脂質リガンドの結合がマスト細胞の活性化を促進することが明らかになった。LMIR3欠損マウスとLMIR7欠損マウスを利用したアレルギー・炎症性疾患モデルの解析により、LMIR3とLMIR7によるマスト細胞活性化の制御がin vivoで解明されつつある。本年度は、cecal ligation and puncture(CLP)による敗血症性腹膜炎に対してLMIR3欠損マウスが抵抗性を示す機序を明らかにするために、2種類のマスト細胞欠損マウスの腹腔に野生型あるいはLMIR3欠損マウスの骨髄由来マスト細胞を移植してからCLPを施行する実験を行った。その結果、マスト細胞におけるLMIR3欠損が致死率の改善に寄与することが示された。In vitro及びin vivo実験から、LMIR3とそのリガンドであるセラミドの結合は(盲腸穿孔により播種する)大腸菌によるマスト細胞の活性化を抑えてマスト細胞が産生する好中球遊走因子の産生を抑制することによって、局所への好中球集積を抑えることが明らかになった。従って、セラミドとLMIR3の結合を阻害する分子<LMIR3抗体やLMIR3-Fc(LMIR3の細胞外領域とヒトIgG1のFc領域の融合タンパク質)>の投与は、野生型マウスにおける局所への好中球集積を促進することにより致死率を改善させることが示された。野生型マウスとLMIR7欠損マウスに対してIgEとマスト細胞が関与するアナフィラキシーモデルを施行した結果、LMIR7欠損マウスではアナフィラキシーの程度が減弱することが示された。また、LMIR7のリガンド候補脂質を同定し、LMIR7とそのリガンドの結合を阻害する分子の投与により野生型マウスのアナフィラキシーがLMIR7欠損マウスと同程度に抑制されることが示された。マスト細胞のLMIR7とLMIR3は生体内においてIgEによるマスト細胞の活性化をそれぞれ正負に制御することが明らかになった。

大腸マスト細胞におけるLMIR3とセラミドの結合はATPによるマスト細胞の活性化を抑制して腸炎の発症・進展を抑えた。従って、セラミド含有vesicleの投与はマスト細胞の活性化を抑えて野生型マウスの腸炎を改善させた。他方、LMIR3欠損マウスは敗血症性腹膜炎に抵抗性を示した。LMIR3とセラミドの結合は大腸菌に反応してマスト細胞と好中球が産生する好中球遊走因子量を低下させ感染局所への好中球集積を抑制した。従って、セラミドとLMIR3の結合を阻害する薬剤の投与は局所への好中球集積を促進して野生型マウスの敗血症性腹膜炎を改善させた。LMIR7のリガンド候補脂質が結合及びレポーターアッセイにより同定された。腸炎モデルの解析から、LMIR3とセラミドの結合がATPによるマスト細胞の活性化を抑制して腸炎の発症・進展を抑えることが証明された。以上より、現在までの研究目的の達成度はおおむね順調であると考えられた。LMIR3欠損マウスとLMIR7欠損マウスを利用したアレルギー・炎症性疾患モデルの解析を継続しながら、LMIR3とLMIR7によるマスト細胞活性化制御の分子メカニズムを明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。アレルギー・免疫学LMIR7のリガンド候補脂質とLMIR7の結合がマスト細胞の活性化をin vitro及びin vivoで制御するかどうかを明らかにする。マスト細胞が関与する各種アレルギー・炎症性疾患モデルを野生型マウス、LMIR3欠損マウス、LMIR7欠損マウスに施行して、マスト細胞におけるLMIR3とLMIR7の役割を明らかにする予定である。平成27年度は、当該大学内で当研究室及び動物施設の移転があり、一時的に研究が停止したため、次年度使用額が生じた。研究代表者は平成26年度の途中に東京大学から順天堂大学へ異動があり、一時的に研究が中断したため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は物品に使用し、本年度使用額は計画通りに(物品費、旅費、その他)使用する予定である。研究に必要な物品費として使用する予定である。Gutに掲載された論文の内容は順天堂大学よりプレスリリースされた。
体内埋込型計測制御装置への応用としたニューラルハイブリッドICの試作

本年度は昨年度の研究成果をもとに体内埋込型排尿ペースメーカを想定した計測制御装置を8ピットのマイクロプロセッサ(Z84C015)を用いて試作した.そのシステムの特徴は以下の通りである.1.ホストコンピュータとの間で無線による両方向のデータ転送機能をDTFM信号のFM変調方式を用いて実現した.また転送されたデータが生体信号データ、処理用パラメータ、プログラム、コマンドのいずれであるかの判断は処理プログラムによっている2.半導体圧力センサで検出された膀胱内圧はAD変換器で8ビットデータに変換されると同時にその値によって膀胱括約筋および膀胱利尿筋への電気刺激パルスの振幅をDA変換器を用いてそれぞれ調節し,昇圧用トランスを介して刺激を加えている.3.2つのCPUを用い,それぞれに個別の処理機能を持たせて処理速度の向上とプログラム開発の効率化を図った。またひとつのCPUの故障でも他方のCPUがその機能の一部を肩代りして最低限の処理機能を実行する信頼性の高いシステムを実現する可能性を探った.4.システムを防水箱の中に入れて生理食塩水で満たされた容器中に沈め,超短波帯無線を用いたDTMF信号による両方向のデータ転送の実験結果から,人体内外でのデータ転送は可能であると判断された.なおこの研究における今後の問題点としては,システムの電力を賄うための電磁波を用いた電源供給方式の検討,ハイブリッドIC化するための集積回路素子パッケージの削り込み法とワイヤーボンデングによる各素子間の信頼性の高い配線方法の検討,タバコの箱の約3倍程度である現在のシステムの小型化のための高い表面実装密度の基板設計手法の導入,膀胱内圧値に対応した刺激パターン生成のためのマイクロプロセッサを用いたニューロコンピュータ用処理プログラムの改善などがある.本年度は主にニュ-ラルハイブリッドICを表面実装技術および既存のハイブリッドICの製造技術を用いて試作するための環境作りに重点を置いて研究を行ってきた。1.ボンダ用超音波発生装置およびXYθ軸精密ステ-ジを購入して簡易型ボンダ装置を組み立てた。しかしワ-クステ-ジの可動範囲が狭くて必ずしも操作性が充分でないということが判明した。そこで年度末に偶然に入手したマニュアルボンダのステ-ジ部にこれらの装置の一部を組み込み、最適な条件を得るための調整を行っている。2.研究室内レベルでのハイブリッドIC製造にはセラミックス基板よりも感光剤塗付型ガラスエポキシ基板を用いた方が有利と判断し、写真フィルムを用いてパタ-ン作成を行うものとした。このための線部の幅や現像条件などについて調査中である。またDIP型のICピンを基板に取り付けるための治具の作成は完了した。3.市販されているプラスチックモ-ルドタイプのICを利用して小型化をはかるためにリ-ドフレ-ムの一部を機械的に除去し、ボンダを用いて基板上に素子として組み込む方法を採用した。このため加工前後の電気的特性の変化および長期間使用の信頼性を調べるために恒温恒湿試験装置を整備し、同時にパソコンを用いて電気的特性を自動的に調べるシステムを開発中である。4.アマチュア無線周波数帯(435MHz)でのマイクロプロセッサを搭載した両方向テレメ-タリングシステムを別途開発中で、基本的なシステムは完成した。今後の小型化をさらに推進するために名刺サイズ基板にすべての回路を実装すべくパタ-ン設計を現在行なっている。またひとつのCPUの故障でも他方のCPUがその機能の一部を肩代りして最低限の処理機能を実行する信頼性の高いシステムを実現する可能性を探った.4.システムを防水箱の中に入れて生理食塩水で満たされた容器中に沈め,超短波帯無線を用いたDTMF信号による両方向のデータ転送の実験結果から,人体内外でのデータ転送は可能であると判断された.なおこの研究における今後の問題点としては,システムの電力を賄うための電磁波を用いた電源供給方式の検討,ハイブリッドIC化するための集積回路素子パッケージの削り込み法とワイヤーボンデングによる各素子間の信頼性の高い配線方法の検討,タバコの箱の約3倍程度である現在のシステムの小型化のための高い表面実装密度の基板設計手法の導入,膀胱内圧値に対応した刺激パターン生成のためのマイクロプロセッサを用いたニューロコンピュータ用処理プログラムの改善などがある.
フランスにおけるポール・ゴーガンの受容とコレクション形成史

本研究は、ポール・ゴーガン(1848-1903)のフランスにおける受容を、美術館におけるコレクション形成史の観点から検証するものである。具体的には、美術館委員会の議事録などの一次資料を参照した上で、美術史の同時代的なコンテクストに焦点を当てながら、芸術家受容において美術館が果たした役割を分析した。フランス各地の美術館に所蔵されたゴーガン作品を調査した結果、コレクターの寄贈や遺贈によってもたらされた作品が大半であるのに対し、購入によって収蔵された作品は僅かで、その経緯をめぐる更なる調査が必要であることが確認された。美術館は歴史を映し出す鏡であるだけでなく、歴史的な変化を促す装置でもあり、そこには様々な要因が絡み合っている。本研究を通して、ゴーガンの芸術家受容とコレクション形成史の密接な繋がりを示すことができた。平成23年度は博士論文「二十世紀前半のフランスにおけるポール・ゴーガンの受容研究-芸術家表象と作品蒐集をめぐる芸術社会学的考察」を、東京大学大学院総合文化研究科超域文化科学専攻比較文学比較文化コースに提出し、審査を経て、課程博士の学位を授与された。研究成果の発表としては、ゴーガンの作品を蒐集した初期のフランス人コレクターの実態を調べ、『実践女子大学美學美術史學』(26号)に「ポール・ゴーガンとフランス人コレクター」(審査有)と題した論文を発表した。一人の芸術家に対する複数の蒐集家の関与を解明した先行研究が乏しいなか、親類や知人の枠組みを越えて、第三者による能動的擁護が生まれてくる歴史的変遷を、各種の資料で裏付けることができた。このように評価が確立されていくプロセスの解明は、他の画家の事例にも応用できる研究のアプローチとなる。また、作品を通した芸術家受容という観点から、ドイツのゲーテ大学で平成23年5月に開催された「第9回国際美術史コンソーシアム春季アカデミー」、ならびにスイスのフリブール大学で平成23年10月に開かれた研究集会において、フランス語による2回の口頭発表を行った。その成果の一部を『國學院大學紀要』(50号)に、フランス語論文「フランスにおけるポール・ゴーガンの受容と没後の肖像画の変奏」(査読有)としてまとめた。没した芸術家を画面に描くという行為は、美術史に対する画家自身の積極的な関与に他ならないことを、多くの作例を挙げて論証した。今後の研究の発展につながる準備のために、平成24年1月に倉敷市の大原美術館に赴き、ゴーガンの絵画が収蔵された経緯と同時代の反応を調べ、フランスと対照させながら日本の状況を論じる基礎的調査を行った。また、平成24月2月にパリとリヨンで現地調査を実施し、未見であった一次資料を確認し、ゴーガンの作品が美術館に購入されたときの議論や経緯を把握した。研究の最終年度にあたる平成24年度は、ポール・ゴーガンの作品がフランスの美術館に収蔵されたときの背景や議論に関し、主にルーヴル美術館に関わる事例を対象として、2012年8月から9月にかけて、フランスのパリとナントで現地調査を実施した。そこでは特に1959年に実現した松方コレクションの日本への寄贈返還に焦点を絞り、フランス政府が未返還の決定を下した一群の作品に、最多となる4点のゴーガンの油彩画が含まれることになった経緯の解明に取り組んだ。具体的には、美術館の各種委員会の記録、同時代の新聞雑誌などの一次資料に加えて、ナントの外務省公文書館で、関係者の書簡や議事録、関係法規の集中的な調査を実施した。そこでは、1950年代を通して続いた両国の交渉のプロセスについて、残されたフランス側の資料から再構成を行った。さらに、日本側の資料と対照させる作業を通して、両国の関係者の本音、あるいは温度差や齟齬が部分的に浮き彫りとなり、第二次世界大戦後の日仏文化交渉の一端を歴史的に検証するための、資料的基盤と新たな知見が得られた。また、各地の作品収蔵の歴史的調査を活かす形で、2012年11月17日の美術史学会東支部例会での討議「コレクションの形成とフランス近代美術」において、「フランス近代美術とコレクション形成ーポール・ゴーガン作品の収蔵をめぐる歴史と交渉」と題した、コメンテーターとしての発表を行い、芸術家受容との関わりのなかで、コレクション形成史を実証的に論じた。平成23年度には、国内の審査付きの紀要雑誌に2本の論文を発表し、内1本をフランス語で執筆した。また、計6回の口頭発表を行った。その内訳を記すと、2回はドイツとスイスにおけるフランス語での口頭発表、3回は国内での招待発表および招待講演、1回は学内の学術イベントでの発表となっている。

平成24年2月の調査では、オルセー美術館資料室、ルーヴル美術館附属中央図書館、国立美術館連合資料室、リヨン美術館資料室を中心に調査を実施し、関連する一次資料の蒐集を行った。これらの現地調査を踏まえて、新たな研究成果を発表する準備を鋭意進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、松方コレクションが日本政府に寄贈返還されたときの交渉の経緯を調べるために、平成24年8月から9月にかけて、パリとナントで現地調査を行う予定である。他にゴーガンの作品を所蔵するグルノーブル美術館、ル・アーヴルのアンドレ・マルロー美術館、ボン=タヴェン美術館などの地方美術館でも、効果的な調査が実施できるかを見極めるべく、各美術館の担当者とメール等で連絡を取って、所蔵資料や研究者への公開状況などを確認している最中である。その一方で、2012年2月に実施したフランスでの現地調査の成果も論文にまとめていく。現時点では、国内外の研究者と緊密な連絡が取れており、今後の研究の遂行に向けて、特筆すべき問題はないと考える。
統合失調症の脳内グルタチオンと脳構造・血流への影響

統合失調症の病態仮説の一つに酸化ストレス仮説のメインハブであるグルタチオン(GSH)の減少が挙げられている。しかし、患者の生体脳内のGSHをMRスペクトロスコピー(MRS)で調べた海外研究の結果は一貫していない。一貫しない理由として、GSHの日内変動を検討する必要性がある。GSHのヒト末梢血の研究では日内変動が報告されており、また、動物脳内でも日内変動が指摘されている。しかし、ヒトのMRSを用いた、脳内GSHの日内変動は、未だ明らかでない。今回の研究では、まず、健常者での脳内GSHの日内変動の有無を測定した。次に、患者と健常者間の違いを同一時間に設定して測定した。MRSは、脳機能総合研究センターの3テスラSiemens TimTrioを使用した。現在、解析中の為、実験結果は研究成果報告書に記載する。今回の方法・結果から7テスラMRSによる精神疾患の病態解明に発展させる。(1)Phantom実験:GSH濃度を0, 1, 1.75, 2.5, 5, 10mM、計6種類作成し、濃度一定のアスパラギン酸、クレアチン、GABA、グルコース、グルタミン酸、myo-イノシトール、N-アセチル-Lアスパラギン酸、GPCと合わせ脱気したPhantomを作成した。MEGA-PRESSとPRESSの両方で測定した。(2)健常者8人の日内変動GSH測定実験:20歳40歳の健常男性4人、女性4人に朝食前から夕食後まで1日6回MEGA-PRESSを用いてGSH測定した。(3)健常者10人のGSH測定再現性実験:日内変動6回測定時に、MRI機から出入りを繰り返すため、出入り連続2回の中での再現性を健常男性10人でMEGA-PRESSによりGSH測定した。(4)現在、非喫煙者の統合失調症患者17人と健常者17人の撮像実験:朝食摂取前の午前の撮像条件が同じ時に、MEGA-PRESSでGSH測定した。当初の計画では、京都大学倫理委員会の承認を得た後、平成27年度中にシーメンス社製のMRIを用いて、統合失調症患者群と健常者群のスペクトロスコピーによるグルタチオンの撮像を開始する予定であった。しかしながら、過去の統合失調症群と健常者群を対象としたスペクトロスコピーによるグルタチオンを測定した研究と、健常者を対象としたスペクトロスコピーによるグルタチオンの研究の両方の精度から、方法論を再検討する必要性が出現した。また、過去の末梢血を用いたグルタチオン濃度の研究測定では、グルタチオンは日内変動があり、かつ数日間隔での測定でも変動があることが判明している。一方、健常者では脳組織内のグルタチオンの変動は、正確に測定されていない。まずは、健常者の脳内のグルタチオン濃度の日内変動、数日間隔での変動の有無を測定する必要性がある。そのため、疾患群を対象とした研究の前に、健常者での予備的研究が必要となった。さらに、抗酸化物質であるグルタチオンは、食物、喫煙、アルコール、運動などの影響を受けやすいため、これらの情報を十分に把握する必要性が出現している。MRスペクトロスコピーについてもShort TEとMEGA-PRESSの方法が存在するが、両者の比較も予備的研究として必要となっている。統合失調群と健常者群の比較を実施する以前に、過去の研究で、健常者におけるグルタチオン濃度の変化の有無について、十分に明らかになっていないため、健常者での基礎的な研究の必要性が出現したために遅れている。また、脳内のグルタチオン濃度を測定すると同時に変動性が指摘されている末梢血のグルタチオン濃度を測定するために、測定方法を検討中である。当初の計画と異なり、末梢血のグルタチオンの研究から日内変動、隔日変動が報告されていること、また、動物脳内のグルタチオンでも日内変動が指摘されていることから、健常者での日内変動・隔日変動の検討が追加された。さらに健常者のグルタチオンは、過去の末梢血液の研究から、食事・運動の影響を受けることが判明している。また、グルタミン酸は、グルタチオンを生成する代謝経路で重要な役割を果たしており、グルタチオンと同様に食事や運動に影響を受けやすいことも最近の末梢血の研究で判明している。疾患によるグルタチオン・グルタミン酸の病態を計るには、食事・運動の影響も考慮する必要性が生じたため、健常者で検証することとなった。平成28年度は、京都大学大学院医学研究科・医学部及び医学部附属病院・医の倫理員員会に2つの倫理書類「健常者の脳内グルタチオンとグルタミン酸濃度の日内・隔日変動と運動・食事習慣との関連性について」「統合失調症患者の脳内グルタチオン・グルタミン酸濃度と運動・食事習慣・認知機能との関連性」を提出・承認された。健常者の研究では、運動あり・なしの群、偏食あり・なしの群のデザインで実施する計画となった。また、グルタチオン測定のためのMEGA-PRESS使用願いをSIEMENS社に提出を行った。グルタチオンのMRスペクトロスコピーによる測定は、京都大学脳機能総合研究センター、明治国際医療大学との共同作業により、準備段階を進めている。

健常者でのグルタチオンの日内変動が強く疑われるため、健常者での検証が必要となり、統合失調症群・健常者群の2群の比較という当初の計画から追加実験が発生したこと、また、MEGA-PRESSの提供が即時、困難なため、遅れている。当初の計画と異なり、末梢血のグルタチオンの研究から日内変動、隔日変動が報告されていること、また、動物脳内のグルタチオンでも日内変動が指摘されていることから、健常者での日内変動・隔日変動の検討が追加された。平成28年度は、京都大学大学院医学研究科・医学部及び医学部附属病院・医の倫理委員会を申請書類が認可された。平成29年度は、グルタチオン測定のため、シーメンス社よりMEGA-PRESSの使用の許可を得て、Phantom及び、生体脳での濃度測定実験を実施している。実験に際しては、京都大学大学院医学研究科附属脳機能総合研究センターと明治国際医療大学との共同作業を実施している。現在、MEGA-PRESSまたは、PRESSを使用するかを検討中である。期間とシーメンス3TのMRI・TimTrioの使用期限から健常者の3群(運動群、偏食群、運動・偏食なし群)での比較は、中止した。グルタチオン測定のための撮像条件確定に時間を要している。また、当初の計画から追加実験が発生したこと、MEGA-PRESSの使用許可までに時間を要している。統合失調症の病態仮説の一つに酸化ストレス仮説のメインハブであるグルタチオン(GSH)の減少が挙げられている。しかし、患者の生体脳内のGSHをMRスペクトロスコピー(MRS)で調べた海外研究の結果は一貫していない。一貫しない理由として、GSHの日内変動を検討する必要性がある。GSHのヒト末梢血の研究では日内変動が報告されており、また、動物脳内でも日内変動が指摘されている。しかし、ヒトのMRSを用いた、脳内GSHの日内変動は、未だ明らかでない。今回の研究では、まず、健常者での脳内GSHの日内変動の有無を測定した。次に、患者と健常者間の違いを同一時間に設定して測定した。MRSは、脳機能総合研究センターの3テスラSiemens TimTrioを使用した。現在、解析中の為、実験結果は研究成果報告書に記載する。今回の方法・結果から7テスラMRSによる精神疾患の病態解明に発展させる。(1)Phantom実験:GSH濃度を0, 1, 1.75, 2.5, 5, 10mM、計6種類作成し、濃度一定のアスパラギン酸、クレアチン、GABA、グルコース、グルタミン酸、myo-イノシトール、N-アセチル-Lアスパラギン酸、GPCと合わせ脱気したPhantomを作成した。MEGA-PRESSとPRESSの両方で測定した。(2)健常者8人の日内変動GSH測定実験:20歳40歳の健常男性4人、女性4人に朝食前から夕食後まで1日6回MEGA-PRESSを用いてGSH測定した。(3)健常者10人のGSH測定再現性実験:日内変動6回測定時に、MRI機から出入りを繰り返すため、出入り連続2回の中での再現性を健常男性10人でMEGA-PRESSによりGSH測定した。(4)現在、非喫煙者の統合失調症患者17人と健常者17人の撮像実験:朝食摂取前の午前の撮像条件が同じ時に、MEGA-PRESSでGSH測定した。健常者での日内、隔日内での脳内グルタチオンの変動の有無をスペクトロスコピーで確認し、同時にスペクトロスコピーによるグルタチオンの測定の精度向上を目指す。健常者でのグルタチオンの動態とスペクトロスコピーの技術確立の後に、統合失調症群と健常者群の比較検討に進む予定である。
クサリフクロカビ目の菌に起因するエビ類の真菌病に関する研究

クルマエビのゾエア幼生から分離された1株(A株)、およびヨシエビの卵とミシス幼生から分離された2株(B株、C株)について詳細にその性状を検討した。菌の分離は菌の感染が確認された卵および幼生をPYGS寒天培地に接種し、細菌の発育を抑制するために抗生物質を散布し、25°Cで培養する方法で行った。同定は主にKarling(1981)に従って行った。全ての分離菌は海水中で明瞭なfrafmentを形成し、その内部に遊走子が形成されたことからHaliphthoros属に分類された。A株とB株はHaliphthoros milfordensis vishniacに同定された。C株は1mmに達する程の極めて長い放出管を形成することが特徴で、しかも菌糸の径が比較的不規則であった。このような特徴は既知のHaliphthoros属の菌種とは明らかに異なった。またC株の発育は他の2株より遅く、しかも人工海水の代わりにKClで作製した培地には発達しなかった。このことからC株はHaliphthoros属の新種であると判断し、H.hiroshimaensisと命名した。各株の発育適温試験を5、10、15、20、25、30、35°Cで行った結果、AおよびB株は30-35°Cで、またC株は35°Cで最も良好な発育を示した。これらの結果は、本病が水温の高い夏期に流行することと一致していて興味が深い。いっぽう、クルマエビおよびヨシエビ幼生から分離された他の形状を示す各1株づつの菌の分類上の位置を検討した結果、両菌株ともにHalocrusticida属の菌に分類され、1株はH.panulirataに、また他の1株はH.parasiticaに同定された。これらの菌は集落が大きくならず、また、ゲンマを形成することが特徴であった。当期予想した通り、本年度も種苗生産されたヨシエビおよびクルマエビの幼生に真菌病が発生した。下等菌類に原因する真菌病であるか否かは、幼生の体内に無隔の菌糸が充満しており、菌糸は決して体外には伸長しないことなどから容易に診断できた。このため、PYGS agarで原因菌の分離・培養を試みた結果、各幼生ごとに純培養的に“下等菌"の分離に成功した。常法に従って、まず、分離菌株をPYGS液体培地で25°Cで数日間培養し、形成された菌糸体を減菌水に移入する方法で遊走子を産生させ、その産生様式および遊走子嚢の形状などから分類を試みた。分離菌は全実性の組織内寄生菌であり、遊走子を産生する時だけ放出管を形成し、その先端から遊走子を放出させた。これの特徴から分離菌はクサリフクロカビ目に分類されるHaliphthorosまたはHalocruticida属の菌に同定された。分離菌の病原性試験はシャーレ内に甲殻類の幼生を収容し、その中に菌糸体を減菌海水に移入後に産生される遊走子を10^3個/ml以上収容する方法で実施できることが明らかにされた。感染試験により病原性を有する菌は数日以内に幼生を死滅させたが、病原性の弱い、また腐生的な菌では感染に原因する斃死は起こらなかった。

分離菌の同定は遊走子の産生様式によっているが、PYGS agar上で長期間継代培養を繰り返すと遊走子産生能が低下する。その解決策として、宿主である甲殻類を培養基質として用い、遊走子産生能が復活可能か否かの検討も実施している。原因菌の発育可能温度はかなり広範囲で、しかも適温域は25°C以上であった。歯の海水要求性を試験した結果、殆どの菌は発育に海水を要求する絶対海生菌であることが判明した。クルマエビのゾエア幼生から分離された1株(A株)、およびヨシエビの卵とミシス幼生から分離された2株(B株、C株)について詳細にその性状を検討した。菌の分離は菌の感染が確認された卵および幼生をPYGS寒天培地に接種し、細菌の発育を抑制するために抗生物質を散布し、25°Cで培養する方法で行った。同定は主にKarling(1981)に従って行った。全ての分離菌は海水中で明瞭なfrafmentを形成し、その内部に遊走子が形成されたことからHaliphthoros属に分類された。A株とB株はほぼ同様な菌学的特徴を示した。すなわち、菌糸の径はほぼ均一で約6-50μm、遊走子形成は海水移入後約12時間で起こった。放出管は1個のfragmentから1本形成され、長さが約600μm以内、幅が約5-15μmであった。遊走子は側生的に等長な2鞭毛を有し、発芽は休眠後約8時間後から認められた。これらの特徴からAとB株はHaliphthoros milfordensis Vishniacに同定された。C株は1mmに達する程の極めて長い放出管を形成することが特徴で、しかも菌糸の径が比較的不規則であった。このような特徴は既知のHaliphthoros属の菌種とは明らかに異なった。またC株の発育は他の2株より遅く、しかも人工海水の代わりにKClで作製した培地には発育しなかった。このようなことからC株はHaliphthoros属の新種であると判断し、広島県内から分離された菌であったことからH.hiroshimaensisと命名することにした。各株の発育適温試験を5、10、15、20、25、30、35°Cで行った結果、AおよびB株は30-35°Cで、またC株は35°Cで最も良好な発育を示した。これらの結果は、本病が水温の高い夏期に流行することと一致していて興味が深い。なお、Haliphthoros属の菌だけではなく、Halocrusticida属に分類される菌も培養されているがそれらの菌の詳細な検討は今後の課題として残された。
保健師らが対人援助業務で遭遇する暴力の予測について

暴力被害の軽減を目的に、保健所の専門職から聴取した21の暴力を事例集としてまとめ、以下の様に分析した。(1)回避の成功例;妄想状態の本人からの攻撃回避には、本人を常に視野に入れて距離を確保することが有効。職員チームの事前対策協議と役割分担による連携プレイも重要。(2)予測しても回避できない例;家族による受診強行や本人の自傷行為等、目の前で発生した暴力を職員が阻止する中で被災。(3)予測できない例;「バカにした」と表情を誤認識しての暴力や待ち伏せ等、稀な例。事例集等から知識として得ておくことが望ましい。■H22年度補助金で実施した内容;専門職者(保健師・精神保健福祉士・社会福祉士)が、「対人援助業務において対象者から受けた暴力」を聞き取り調査した。計画通りに神奈川県、千葉県、東京都の3地域の保健所等から複数ずつの事例を提供してもらうことができ、予定数集め終えた。H22年度補助金では、その過半の事例について、インタビュー録音を文章表記に書き起こしてもらえた。インタビュー対象者からは、「本研究成果である事例集を必要としている」旨や「暴力対策のために事例を公表していくことの必要性」が聞かれ、本研究の意義が確認できた。また複数の対象者から、「インタビュー自体が振り返りの機会となり、自分の経験を客観的に見るいい機会となった」旨の自発的発言が聞かれ、第3者に暴力被害を話すことは、対象者にとって必要である可能性が示唆された。■研究の意義と重要性;「対象者からの暴力」は、専門職者には心身両面に傷を残し、対象者にも加害者という傷を残し、業務上も人的経済的損失をもたらすものであり、WHOやILO等は実態調査や対策マニュアルの必要性を共同報告書で主張している。本研究は、WHO等が要請している実態調査に該当する。そして、研究の目的や研究実施計画にあげた「暴力の発生」についての専門職自身の予測や、予測を困難にする原因・理由についてのまとめは、暴力発生の科学的知見として暴力対策に活かされ、WHO等が要請しているマニュアルを作成する際にも活かされることを期待している。更に「事例」毎のまとめを集めた「事例集」を、暴力対策研修の一つとして現任教育の場で使うことを、調査を受けてくれた保健所等が期待している。■H23年度に実施した内容;専門職者(保健師・精神保健福祉士・社会福祉士)が、「対人援助業務において対象者から受けた暴力」を聞き取り調査し、インタビュー内容の録音を文字にしてそれを基に(1)対象者の特徴や支援のきっかけ等の暴力発生を理解する時の背景となる情報と、(2)暴力が発生したときから収まるまでの時間経過に沿った状況の変化、更には(3)専門職者自身が暴力の発生について予測していた内容とその根拠、あるいは、予測できなかった暴力については予測を困難にした原因や理由について「事例」毎に整理してまとめた。現在、専門職者自身に経験「事例」のまとめを渡して、内容の確認と修正を求めている最中である。暴力事例はH23年度中に予定数の聞き取り調査を終了し、4月現在「事例」毎のまとめも残り1例を残すのみとなっている。H24年10月末までには「暴力の発生に関して、体験した専門職者自身が、何を根拠にどの時点でどんな予測をしていたか」を整理した報告をまとめられる見通しが立った。
iPS細胞を用いた培養系・移植実験系による統合失調症の神経細胞病態解明

統合失調症は人口の約1%を占める精神疾患だが、その病態は未解明である。生体脳から細胞を採取して解析できないことが、未解明である要因として大きいが、iPS細胞の技術を用いることでヒト神経細胞の観察が可能になった。よって我々はより厳密な比較検討のため、総合失調症一卵性双生児不一致症例のサンプルを得て、iPS細胞由来神経細胞を作製し、その細胞生物学的な差異を検討した。結果として、統合失調症患者由来の神経細胞ではシナプス形成の異常が示唆された。奈良県立医科大学精神科に通院、入院中の統合失調症患者で本研究に同意能力があり同意を得た患者、および本研究の趣旨に賛同する健常対照者を対象とした。現在までに、11名の統合失調症患者および12名の健常対照者から、研究参加の同意を得て、上腕内側部からパンチバイオプシーを行ったが、特に合併症は生じなかった。得られた皮膚から皮膚線維芽細胞を培養し、保存した。このうち8名の線維芽細胞を基に、エピソーマルプラスミドベクターを用いた方法でiPS細胞を樹立し、保存した。作成したiPS細胞のうち、双子1ペア及び年齢・性別をマッチさせた健常対照者1名の計3名のサンプルを用いて、以後の解析を行った。樹立したiPS細胞株の中から、プラスミドベクター由来遺伝子の残存のない株をqPCRで確認し、選別した。iPS細胞の多能性細胞マーカーの発現を免疫染色で確認したが、患者・健常者間で差は認めなかった。次に、神経細胞への分化誘導を行った。神経幹細胞への分化誘導性、幹細胞の増殖能に差は認めなかった。誘導後2ー3カ月培養すると、免疫染色で成熟ニューロンのマーカーであるMAP2の発現、また興奮性シナプスを形成する蛋白としてSynaptophysin(シナプス前蛋白)およびPSD95(後シナプス)についても確認できた。機能的な解析のため、これら分化誘導したニューロンの電気活動を、パッチクランプ法を用いて記録した。いずれのサンプルから誘導したニューロンも、培養3カ月が経過するとニューロンは成熟した様相を呈し、current-clampでは連発する活動電位を示し、spontaneous post-synaptic current(自発性シナプス後電流)も認めた。統合失調症患者由来の培養ニューロンでは、免疫染色および電気生理学的解析でシナプス蛋白の減少が示唆される結果を得ている。奈良県立医科大学精神科に通院、入院中の統合失調症患者で本研究に同意能力があり同意を得た患者11名、および本研究の趣旨に賛同し同意を得た健常対照者12名から、書面にて研究参加の同意を得た。全例の上腕内側部からパンチバイオプシーを行ったが、特に合併症は生じなかった。得られた皮膚から皮膚線維芽細胞を培養し保存した。このうち8名の検体からエピソーマルプラスミドベクターを用いた方法でiPS細胞を樹立し、保存した。作成したiPS細胞のうち、双子1ペア及び年齢・性別をマッチさせた健常対照者1名の計3名のサンプルを用いて、以後の解析を行い以下の結果を得た。iPS細胞の誘導性に群間で差は無かった。iPS細胞の多能性細胞マーカーの発現を免疫染色法で確認したが、群間で差は認めなかった。iPS細胞からニューロスフェアへの分化誘導性に差は認めず、ニューロスフェアを接着培養した後のPAX6陽性/Nestin陽性細胞の増殖にも差は無かった。接着培養後の細胞は、そのほとんどがvGlut1陽性で大脳皮質のLayer marker陽性の細胞であった。接着培養後、シナプス前蛋白質であるSynapsinIの発現をqRT-PCR法で継時的に測定したところ、その発現パターンに群間で有意差を認めた。パッチクランプ法による電気生理学的解析を接着培養後1ヶ月、3ヶ月の時点で行ったところ、細胞の発火数、閾値、振幅などの性質に差は無かった。シナプス機能を反映すると考えられる自発性シナプス後電流(sPSC)の頻度、振幅についても有意差は認めなかった。検体のうち、特に高齢検体において、iPS細胞の誘導効率が悪く、iPS細胞を樹立する段階で樹立作業を複数回行う必要が生じ、予定よりも時間を要している。また、分化誘導については以前よりも誘導機関が短く、誘導効率も上昇していることを確認できているが、データを得るためにはiPS細胞から分化誘導して3ヶ月以上は培養期間が必要であることから、各個体につき2-3株の神経細胞への分化誘導が可能なiPS細胞株を探索し、さらにデータを取得するという行程について、時間を要している。双子不一致症例の3ペア分はiPS細胞の樹立に至っており、解析に至っていない2ペアのうちでも神経細胞に分化誘導な株の検索は進めている。

精神医学現在、より神経細胞の成熟を促す因子を加えて培養しており、これにより成熟した神経細胞を得るまでの期間の短縮、また効率の上昇が期待される。技術的に分化誘導法については安定してきているため、数を増やして解析していく。差異の得られそうなターゲットとしては、シナプスの形成に的を絞って解析を進めていく。免疫染色やウェスタンブロット法による蛋白質の発現状態や、電気生理学的解析による機能的な解析を行う。
口腔粘膜上皮前駆/幹細胞の分離・同定

22年度は、当初計画していた実験手技をそのまま遂行することはなかったが、口腔粘膜上皮前駆/幹細胞の同定という目的を目指して実験を遂行した。最終的な口腔粘膜幹細胞in vitroモデルの確立という最終目的までには至らなかったものの、着実にそれに向かって近づいている。すなわち、培養口腔粘膜上皮細胞中のALDH陽性細胞は、FACS Ariallを用いて分取後organotypic culture環境下において、接着細胞においても、浮遊細胞においても口腔粘膜の上皮再生能が高いことが示された。さらに、ALDH陽性細胞に関しては、インテグリンα6などの接着因子の発現も検索したが、こちらは予想に反してALDHが陽性ではない細胞群に強く発現していた。また、In vivo組織においてALDH陽性細胞は、歯肉重層扁平上皮の基底細胞層には存在せず、基底細胞より1-2層上部の層に存在した。一方、ALDHの機能はビタミンAとその類似体から、生物学的に活性のあるレチノイン酸の生合成に関わる酵素であることから、レチノイン酸を培養液に加え、培養細胞にALDHを多く発現するように操作することで、培養粘膜の分化再生能が変化することを確認した。In vivoで粘膜上皮幹細胞は基底細胞層に存在するという一般的に受け入れられている定説とは異なる所見が得られたことで、ALDHの発現がピュアな前駆/幹細胞マーカーとして受け入れられる状況には至らないが、上記のin vitroの結果は、口腔粘膜上皮におけるALDH陽性の細胞が"ニッチ"の位置に関してなんらかの役割を果たしている可能性を示唆する所見が得られた。本研究の目的は、ヒト培養口腔粘膜細胞を材料に、Aldehyde Dehydrogenase(ALDH)が正常口腔粘膜幹細胞のマーカーとなりえると仮定し、ALDH陽性細胞の幹細胞機能の分析、Ultra low adhesive culture plate(超低接着培養皿)で浮遊培養した3次元sphere組織の免疫組織化学的検索、分化能の検討により、口腔粘膜幹細胞の同定、性質と局在を明らかにすることである。得られた研究成果は以下の通りである。1.2次元培養細胞から得られる発芽細胞とヒト新鮮組織から採取・分離された細胞を用い、超低接着培養皿でSphere形成を試みた。Sphere様の組織塊の形成が確認されたが、組織学的観察では、いわゆる生きている幹細胞によって形成されるSphereとは異なっていた。このことは、培養プレートとともに培養液に加える成長因子の組成を工夫する必要があることを示唆している。2.2次元培養細胞、それらから得られる発芽細胞およびヒト新鮮組織から採取・分離された細胞を用い、ALDH陽性細胞の分析を行った。ヒト新鮮組織内にALDH強陽性細胞が存在することを示した。また、2次元培養細胞とそれらから得られる発芽細胞におけるALDH強陽性細胞の割合は、常に発芽細胞で多く観察され、発芽細胞における口腔粘膜前駆/幹細胞の性質の特徴付けに重要であることが示唆された。さらに、これらのALDH強陽性細胞は、in vivo細胞でもin vitro細胞でも、他の細胞集団に比べ、細胞の構造が単純であった。