hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肥満脂肪組織における酸化ストレス亢進とグルタチオン蓄積病態の解明

catalaseとSODを脂肪組織に過剰発現するトランスジェニックマウスを交配し、両者を過剰発現するマウス(DTgマウス)を作出した。高脂肪高ショ糖食負荷を行うと、体重は有意に高値である一方で糖負荷テスト、インスリン負荷テストは改善していた。肝重量は有意に低下しており、脂肪組織重量は増加した。この時、肝臓での中性脂肪蓄積は低下しており、脂肪肝の改善が認められた。本マウスではインスリン感受性が改善することで脂肪組織への中性脂肪蓄積が増加し、肝臓への蓄積が低下した。グルタチオン合成酵素であるgamma-GCS-floxマウスと脂肪組織特異的なadiponectin-Creマウスの交配をおこなった。(I)脂肪組織特異的酸化ストレス除去モデル;aP2プロモータによってカタラーゼとSOD1を脂肪組織特異的に過剰発現するマウスを作成、確立した。両モデルマウスの交配を行い、脂肪組織特異的にcatalaseとSOD1を高発現するトランスジェニックマウス(DTg)を得た。DTgマウスの通常食摂食状態における血中インスリン濃度、血糖値、糖負荷テスト、インスリン負荷テストによる耐糖能評価を行った。体重には有意な変化を認めなかった。本マウスに、高脂肪高ショ糖食を負荷し、血中インスリン濃度、血糖値、糖負荷テスト、インスリン負荷テストによる耐糖能評価を行った。本マウスでは耐糖能が軽度改善していることを見出した。(II)グルタチオンによるインスリン抵抗性発症機序の解析;脂肪組織における培養3T3-L1脂肪細胞に対してグルタチオンを添加すると、インスリン誘導性のAktリン酸化が減弱することを見出した。本年は、gGCSを誘導性に発現する3T3-L1細胞を作成した。本細胞ではgGCSの発現誘導によって細胞内グルタチオンが増加し、インスリン誘導性のAktリン酸化が抑制されていた。さらに、MCP-1の発現量が有意に増加した。すなわち、外因性のグルタチオン添加でなく、内因性に合成酵素を過剰発現させることで、インスリン抵抗性が誘導されることを見出した。脂肪組織特異的にcatalaseおよびSOD1トランスジェニックマウスを得た。脂肪組織特異的に活性が上昇するラインを交配継続し、通常食摂食状態における血中インスリン濃度、アディポネクチン濃度、血糖値、糖負荷テスト、インスリン負荷テストによる耐糖能評価を行った。体重には有意な変化を認めなかったが、カタラーゼの過剰発現マウスでは精巣周囲脂肪重量が増加していた。また、血中およびインスリン標的臓器(脂肪、肝臓、骨格筋)における酸化ストレス指標には有意な差は認めなかった。脂肪組織のアディポサイトカイン発現量には有意な差を認めなかった。絶食および自由摂食下の血糖値およびインスリン値には差がなかったが、カタラーゼ過剰発現マウスではGTTでは差はなかったが、ITTは有意に改善した。SOD1過剰発現マウスではITT,GTT共に差を認めなかった。(II)グルタチオンによるインスリン抵抗性発症機序の解析;培養3T3-L1脂肪細胞に対してグルタチオンを添加すると、インスリン誘導性のIRS1リン酸化、Aktリン酸化が減弱する。肥満マウスを模倣し、脂肪組織においてグルタチオン合成酵素の過剰発現と細胞内グルタチオンが蓄積した細胞を作成した。レトロウイルスを用いたtet-onシステムを用いて、培養3T3-L1脂肪細胞においてグルタチオン合成酵素を誘導性に発現する細胞を確立した。本細胞においてグルタチオン量が誘導性に増加することを確認した。脂肪組織特異的酸化ストレス除去モデルとして、catalaseとSODを脂肪組織に過剰発現するトランスジェニックマウスを交配し、両者を過剰発現するマウス(DTgマウス)を作出した。酸化ストレス指標であるイソプロスタンは、DTgマウスでは有意に低下した。高脂肪高ショ糖食負荷を行うと、コントロールマウスと比較して体重は増加したが、糖負荷テスト、インスリン負荷テストは改善した。DTgマウスの肝重量は低下し、脂肪組織重量は増加した。肝臓での中性脂肪蓄積は低下し、脂肪肝が改善した。すなわち、本マウスではインスリン感受性の改善に伴い、脂肪組織への中性脂肪蓄積が増加し、肝臓への中性脂肪蓄積が低下していた。以上のことから、抗酸化酵素を過剰発現し、脂肪組織の酸化ストレス状態を解除することで、肥満病態が改善することが示された。ドキシサイクリン誘導性にグルタチオン合成酵素を過剰発現する3T3-L1脂肪細胞を作製した。本細胞では細胞内グルタチオン量が増加しており、インスリン誘導性のAktリン酸化が減弱していた。グルタチオン合成酵素であるgamma-GCS-floxマウスと脂肪組織

特異的なadiponectin-Creマウスの交配をおこない、マウスを作成した。内分泌代謝学カタラーゼとSOD1を脂肪組織特異的に過剰発現するマウスを作成、確立しており、脂肪組織特異的酸化ストレス除去モデルの作成は完了した。本マウスを用いて糖代謝指標の解析や、酸化ストレス指標の解析、遺伝子発現量の解析をすすめており、順調に進展していると考える。グルタチオンによるインスリン抵抗性発症機序の解析については、内因性のグルタチオン合成酵素の発現誘導によってもインスリン抵抗性が惹起されることを見出した。現在、脂肪組織特異的なノックアウトマウス作成を開始しており、本研究は順調に進行している。脂肪組織特異的酸化ストレス除去モデルの作成は完了しており、脂肪組織特異的な遺伝子発現の誘導に成功した。さらに、酵素活性も脂肪組織特異的に有意に増加しており、内在性の抗酸化酵素に匹敵する酵素活性を得ており、モデルマウスの作成に成功したと考える。糖代謝指標の解析や、酸化ストレス指標の解析、遺伝子発現量の解析もすすんでおり、順調に進展していると考える。グルタチオンによるインスリン抵抗性発症機序の解析については、将来のトランスジェニックマウス作成に備えて、グルタチオン添加だけでなく、内在性にグルタチオン合成酵素を誘導する細胞の作成に成功した。グルタチオン添加と本細胞を併用することで研究の進展が期待できると考える。脂肪組織特異的酸化ストレス除去モデル計画どおりにDtgマウスに高脂肪食負荷を行い、脂肪組織での酸化ストスを惹起した状態で、糖代謝指標および、アディポサイトカイン発現量、酸化ストレス指標の改善を解析する。脂肪組織グルタチオン合成酵素欠損マウスの作成脂肪組織特異的ノックアウトマウスの作成を開始する。脂肪組織特異的酸化ストレス除去モデル計画どおりに高脂肪食負荷によって脂肪組織での酸化ストスを惹起した状態で、糖代謝指標および、アディポサイトカイン発現量、酸化ストレス指標の改善を解析する。さらに、抗酸化酵素の発現を増強し、酸化ストレス指標の改善を期待して、カタラーゼとSOD1のダブルトランスジェニックマウスの作成を開始する。脂肪組織グルタチオン過剰発現マウスの作成培養脂肪細胞におけるグルタチオン産生酵素の過剰発現がインスリンシグナルにおよぼす作用を確認したうえで、当初の計画通り、トランスジェニックマウスの作成を開始する。平成26年度に脂肪組織特異的グルタチオン合成酵素欠損マウスの作成と解析を行い、多くの費用が必要となるため、次年度に経費を使用することとしました。マウス飼育費用、糖代謝指標測定、アディポネクチン測定試薬、マウス、PCR関連試薬、RNA抽出試薬、遺伝子発現量測定試薬の消耗品に使用する。研究に必要な糖代謝指標測定、アディポネクチン測定試薬、マウス、PCR関連試薬、RNA抽出試薬、遺伝子発現量測定試薬の消耗品に使用する。
Ｅ－カドヘリンのプロセシング抑制による口腔癌の浸潤・転移阻止療法に関する研究

α2-アンチプラスミンcDNAを組み込んだプラスミドを作製し,これを口腔扁平上皮癌細胞に導入しα2-アンチプラスミン蛋白の誘導を試みた.α2-アンチプラスミン蛋白発現が亢進により,扁平上皮癌細胞のサイクリンD1発現は抑制され,細胞増殖能と造腫瘍能も低下した.さらにα2-アンチプラスミン蛋白の誘導により,扁平上皮癌細胞の細胞質内のβカテニン発現が低下していることから,α2-アンチプラスミン誘導によるE-カドヘリンのプロセシング阻害は,Wnt/β-カテニンシグナル伝達を介した扁平上皮癌細の増殖を低下させている可能性が示唆された.α2-アンチプラスミンcDNAを組み込んだプラスミドを作製し,これを口腔扁平上皮癌細胞に導入しα2-アンチプラスミン蛋白の誘導を試みた.α2-アンチプラスミン蛋白発現が亢進により,扁平上皮癌細胞のサイクリンD1発現は抑制され,細胞増殖能と造腫瘍能も低下した.さらにα2-アンチプラスミン蛋白の誘導により,扁平上皮癌細胞の細胞質内のβカテニン発現が低下していることから,α2-アンチプラスミン誘導によるE-カドヘリンのプロセシング阻害は,Wnt/β-カテニンシグナル伝達を介した扁平上皮癌細の増殖を低下させている可能性が示唆された.がん治療を行う上での最大の障害は遠隔臓器への転移巣形成である.これまでに申請者らは,プラスミノーゲン/プラスミン系は口腔扁平上皮癌の蛋白分解カスケードの中心的な酵素であるとともに,E-カドヘリンを細胞間接着活性部位で切断することで,細胞間接着を抑制し細胞凝集能を低下させ,扁平上皮癌の細胞遊走を亢進していることをみいだしてきた.本申請課題は,口腔扁平上皮癌にα2-アンチプラスミン遺伝子の導入し,α2-アンチプラスミン蛋白発現を誘導させることでプラスミノーゲン/プラスミン系の機能を抑制し,従来の外科手術や放射線治療にかわる,口腔癌の転移を抑制するための新しい治療法を開発することを目的としている.ヒト肝臓total RNAからRT-PCR法にて増幅したプラスミン阻害分子であるα2-アンチプラスミンcDNAを哺乳動物発現ベクターpCI-neoに組み込み,pCI-neo/α_2-antiplasminを作製した.pCI-neo/α_2-antiplasminを口腔扁平上皮癌細胞に導入すると,α_2-antiplasmin蛋白が高発現することが確認できた.α_2-antiplasmin遺伝子が導入された扁平上皮癌細胞は,E-カドヘリンのプロセシングが抑制され,遺伝子導入されていない扁平上皮癌細胞に比べ細胞膜上でのE-カドヘリンが高発現していることが示された.また,α_2-antiplasmin遺伝子が導入された扁平上皮癌細胞の凝集能と運動能が低下した.さらに,α_2-antiplasmin遺伝子が導入された扁平上皮癌細胞は,ヌードマウスでのin vivo増殖能が著しく抑制されていることがわかった.これまでにプラスミノーゲン/プラスミン系は口腔扁平上皮癌のE-カドヘリンを細胞間接着活性部位で切断することで,細胞間接着を抑制し細胞凝集能を低下させ,扁平上皮癌の細胞遊走を亢進していることをみいだしてきた.本申請課題は,口腔扁平上皮癌にα2-アンチプラスミン遺伝子の導入し,α2-アンチプラスミンを発現誘導させることでプラスミノーゲン/プラスミン系の機能を抑制し,細胞凝集能を亢進させ,扁平上皮癌の細胞遊走能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制する新しい治療法を開発することを目的としている.ヒト肝臓total RNAからRT-PCR法にて増幅したプラスミン阻害分子であるα2-アンチプラスミンcDNAを哺乳動物発現ベクターpCI-neoに組み込むことでpCI-neo/α2-antiplasminを作製した.pCI-neo/α2-antiplasminを口腔扁平上皮癌細胞に導入すると,α2-antiplasmin蛋白が高発現することが確認できた.α2-antiplasmin蛋白発現に伴い,扁平上皮癌細胞のE-カドヘリンのプロセシングが抑制され, E-カドヘリンが高発現していることが示された.また,α2-antiplasminが高発現した扁平上皮癌細胞は,細胞増殖に関与するc-mycの遺伝子発現が低下し増殖能も抑制されていた.α2-antiplasmin発現誘導により,扁平上皮癌細胞の凝集能と運動能が低下し,I型コラーゲンゲルへのin vitro浸潤能も低下していた.さらに,α2-antiplasmin遺伝子が導入された扁平上皮癌細胞は,ヌードマウスでのin vivo増殖能が著しく抑制され,形成された腫瘍の細胞膜上にE-カドヘリンが高発現していることが確認された.これまでにプラスミノーゲン/プラスミン系は口腔扁平上皮癌のE-カドヘリンを細胞間接着活性部位で切断することで,細胞間接着を抑制し細胞凝集能を低下させることをみいだしてきた.本申請課題は,口腔扁平上皮癌にα2-アンチプラスミン遺伝子の導入し,α2-アンチプラスミンを発現誘導させることでプラスミノーゲン/プラスミン系の機能を抑制し,細胞凝集能を亢進させ,扁平上皮癌の細胞遊走能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制する新しい治療法を開発することを目的としている.ヒト

肝臓total RNAからRT-PCR法にて増幅したプラスミン阻害分子であるα2-アンチプラスミンcDNAを哺乳動物発現ベクターpCI-neoに組み込むことでpCI-neo/α2-antiplasminを作製した.pCI-neo/α2-antiplasminを口腔扁平上皮癌細胞に導入すると,α2-antiplasmin蛋白が高発現することが確認できた.α2-antiplasmin蛋白発現に伴い,扁平上皮癌細胞のE-カドヘリンのプロセシングが抑制され,細胞膜上でのE-カドヘリンが高発現していることが示された.また,α2-antiplasminが高発現した扁平上皮癌細胞は,細胞増殖に関与するサイクリンD1遺伝子発現が低下し増殖能も抑制されていた.さらに,α2-antiplasmin発現誘導により,I型コラーゲンゲルへのin vitro浸潤能も低下していた.さらに,α2-antiplasmin遺伝子が導入された扁平上皮癌細胞は,ヌードマウスでのin vivo増殖能が著しく抑制され,形成された腫瘍の細胞膜上にE-カドヘリンが高発現しているとともに,細胞増殖に関与するWntシグナル伝達経路の構成分子であるβ-カテニンの細胞質内での発現が低下していることが確認された.26年度が最終年度であるため、記入しない。口腔外科学26年度が最終年度であるため、記入しない。α2-アンチプラスミン蛋白発現の誘導ためのα2-antiplasmin遺伝子が組み込まれた哺乳動物発現ベクターを作製し,これを用いて口腔扁平上皮癌細胞にαを-アンチプラスミン蛋白発現誘導を行うことができ,さらにα2-アンチプラスミン蛋白発現誘導が扁平上皮癌細胞のin vivoでの増殖を抑制することが確認できたため.α2-アンチプラスミン蛋白発現の誘導ためのα2-antiplasmin遺伝子が組み込まれた哺乳動物発現ベクターを作製し,これを用いて口腔扁平上皮癌細胞にα2-アンチプラスミン蛋白発現誘導を行うことができた.α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導が,扁平上皮癌細胞のE-カドヘリン発現を亢進させ,増殖に関与する遺伝子発現を抑制し,細胞増殖能と細胞遊走能を低下させることが確認された.さらに,α2-アンチプラスミン発現誘導は,in vivoにおいても扁平上皮癌細胞のE-カドヘリン発現を亢進させ,造腫瘍能を低下させることが確認されたため.26年度が最終年度であるため、記入しない。in vivoでの造腫瘍性の詳細な解析とともに,増殖に関連すると考えらる遺伝子群(Wnt,カテニン,サイクリンD1等)の探索.in vivoでの造腫瘍性の詳細な解析とともに,扁平上皮癌の増殖に関連すると考えらる遺伝子群(Wnt,カテニン,サイクリンD1等)の探索を行う予定である.26年度が最終年度であるため、記入しない。購入物品の価格が予定した価格より低くなったため,その分を翌年度の研究費に加えた.翌年度は,α2-アンチプラスミン発現誘導が扁平上皮癌細胞のWnt/β-カテニンシグナル伝達に与える影響とα2-アンチプラスミン発現誘導による扁平上皮癌細胞の転移抑制効果を検討する予定である.前年度の試薬,機器等の使用に関して,工夫した結果,他の研究者と共用することが可能となったため,予想以上に出費を抑えることが可能となった.今年度での研究に使用する試薬等において,他の研究者と共用可能なものは少ないために,大量の遺伝子研究に関連する試薬,抗体及びヌードマウス等が必要となり,さらに遺伝子解析ソフト等のデータ解析用ソフトやパソコン用を購入する必要がある.
微小管安定性制御の情報伝達と細胞癌化

WntシグナルはDishevelledという細胞内情報伝達因子を介して伝えられる。Dishevelledの下流において、遺伝子発現を制御するβ-cateninの安定化など様々な細胞応答が起こる。私はDishevelledの強制発現が神経芽細胞腫N1E-115細胞からの顕著な神経突起形成を誘導することを見付け、しかもそれが微小管の安定化に起因することを示唆する実験データを得た。この分子メカニズムを解明するため、まずDishevelledの様々な部分発現コンストラクトを作製して、それぞれの神経突起誘導・微小管安定化能や、その他β-cateninの安定化能などを調べた。その結果、微小管の安定化作用は従来からよく解析されてきたβ-catenin安定化やその他の既知のWntシグナル系とは全く独立しているものであることが分かった。この作用にはDishevelledのDIXドメイン以降からPDZドメインの途中までの部分で十分であり、現在その部分に結合する蛋白の網羅的解析を行っている。一方、Dishevelledと相互作用することが既に報告されている蛋白の中で微小管安定化に関わっているものがあるかどうか探索したところ、細胞と基質間の接着に関わるインテグリンに結合することで発見・命名されたIntegrin-linked kinase(ILK)が候補として挙がってきた。実際ILKを培養細胞に強制発現させるとそれだけで微小管安定化を誘導できた。しかもDishevelledの微小管安定化誘導ドメインとして同定した部分と細胞内で複合体を作ることも分かった。現在ILKがDishevelledによる微小管安定化に関わる有力候補の一つと考え、そのより詳細な機能解析を継続しているWntシグナルはDishevelledという細胞内情報伝達因子を介して伝えられる。現在ILKがDishevelledによる微小管安定化に関わる有力候補の一つと考え、そのより詳細な機能解析を継続している
拡散強調ＭＲＩを用いた新たな半自動化乳癌診断法の確立

造影剤を使用することなく腫瘍の血流を評価可能なIVIM及び非ガウス分布拡散MRI(特に従来のADCモデルに加え、細胞膜の活動性などの腫瘍の微小構造を新たに評価可能と考えられるKurtosis解析)を用い、乳腺病変における拡散・灌流評価のパラメーターの臨床応用へ向けた有用性の検討を行った。がんが疑われる症例に対し拡散強調画像を撮像し、得られる各種パラメーター画像の定量評価、精度評価を行った。算出される灌流・拡散パラメーターにつきよりノイズの少ないデータや結果を得るための撮像方法の検討においてはファントム実験、ボランティア撮影により行い、初期段階における結果を国際雑誌に発表した。また各パラメーターマップにおいて最も診断能の高い閾値を設定する事により病変のカテゴリー化を行い、各パラメーターマップの診断能を総合した診断マップを作成し、新たなコンピューター支援乳腺腫瘍画像診断法を提唱した。従来の造影画像及び拡散強調画像上はグレースケールでの画像評価に留まり悪性度が高い場所の同定が困難であるが、拡散強調画像を多くのb値でもって撮像する事により、各パラメーターをピクセル単位で計算したパラメトリックマップを作成し、各マップにおいて診断能が最も高い閾値で二値化を行った上で、腫瘍をピクセル単位で複数(3段階以上)のカテゴリーに層別化した新たな診断マップを作成できるようになる。この新たな診断マップを用いた診断能と従来の造影MRIを用いた診断能を比較検討した結果を国際学会に発表した。また、灌流・拡散係数を表す各種パラメーターが腫瘍内の部位や正常組織によりどのような変動を示すのか、異なる組織間での比較を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。
非定常/非一様流れ大域的安定性解析による乱流マルチスケール相互作用の解明

これまでの研究で,時空間的な大スケール変動に重畳する小スケールの渦の特徴的な振る舞いが観察されている.本研究ではマルチスケール変動の非線形効果を考慮,非直交モードによるエネルギー過渡増幅にも焦点をあて,非定常/非一様流れの大域的安定性解析を実施,乱流の秩序構造の生成機構とそれらの相互作用の理論的解明を目指す.支配方程式に,申請者が検討を進めてきた時空間平均・位相変動・擾乱の三つのスケール分解をもとにしたレイノルズ応力モデル(Yakeno et al., PoF 2014)を組み込むことより,種々のマルチスケール流体現象が非直交性によるエネルギー過渡増幅として説明されるかを明らかにする.これまでの研究で,時空間的な大スケール変動に重畳する小スケールの渦の特徴的な振る舞いが観察されている.本研究ではマルチスケール変動の非線形効果を考慮,非直交モードによるエネルギー過渡増幅にも焦点をあて,非定常/非一様流れの大域的安定性解析を実施,乱流の秩序構造の生成機構とそれらの相互作用の理論的解明を目指す.支配方程式に,申請者が検討を進めてきた時空間平均・位相変動・擾乱の三つのスケール分解をもとにしたレイノルズ応力モデル(Yakeno et al., PoF 2014)を組み込むことより,種々のマルチスケール流体現象が非直交性によるエネルギー過渡増幅として説明されるかを明らかにする.
放線菌由来芳香族ポリケタイド化合物の生合成における酸化・水酸化機構の研究

一般に、抗生物質の生合成における後期修飾過程は、化合物の構造や物性、ひいては生理活性を大きく変える過程であり、その詳細な反応経路・反応機構の解明は、新薬創製を目指す上で必要不可欠なものである。Streptomyces coelicolor A3(2)の生産する芳香族ポリケタイド抗生物質actinorhodin(ACT)の生合成後期修飾過程においても二段階の酸化反応が必要であり、これら反応は生合成酵素ActVA-6およびActVA-5によってそれぞれ触媒されると考えられてきた。しかし、ACTの類縁化合物の生合成研究が進み得られた知見から、以前に提唱されてきたActVA-6,ActVA-5の酵素機能と生合成仮説に疑いが生じた。よって、ActVA-6,ActVA-5の生合成経路における真の機能を解明すべく、遺伝子破壊体および遺伝子再構築系の組換体を作成し代謝産物を分析した。また、ActVA-6,ActVA-5それぞれを大腸菌で発現し、精製したタンパクと各種アナログ基質を用いて酵素機能を検討した。こうしたin vivo、in vitro両実験系から、ActVA-5, ActVA-6に関する重要な知見を新たに得ることに成功し、以前とは異なる新たな生合成仮説を提唱することができた。放線菌Streptomyces coelicolor A3(2)の生産するベンゾイソクロマンキノン系抗生物質アクチノロジン(以下ACTと表記)の生合成における真の酸化・水酸化機構を解明するため、遺伝子の塩基配列情報からこれまで水酸化酵素と考えられてきたactVA-5について、その遺伝子破壊体の代謝産物を分析した。S.coelicolorはACTに加えREDと呼ばれる他の抗生物質を生産する。REDの生合成遺伝子破壊体M510株を標準株とし、そのactVA-5破壊体を(独)食品総合研究所・岡本晋博士からご供与いただいた。両菌株を同条件で液体培養し、培養後の菌体及び培地上清中の代謝産物を分析したところ、actVA-5によりACTが生産されず"X"と名づけた別の化合物が主生成物として蓄積されることを見出した。化合物Xの吸光スペクトルはこれまで得られたACT生合成中間体・shunt productsとは異なるものであり、新規化合物であることが示唆された。LC/TOF-MSを用いた精密質量分析から分子式はC_<32>H_<26>O_<10>と推定され、化合物Xは中間体(S)-DNPA (C_<16>H_<14>O_5)の二量体である可能性が浮上した。化合物Xが酢酸エチルに抽出されることを予試験で確かめた後、1Lの液体培養から2Lの酢酸エチルにて抽出し、HPLC分取により約5mgの化合物Xを単離精製した。これをDMSO-d6に溶解しNMRを測定したが、サンプルの見た目に反して溶解度が悪いようで解析可能なスペクトルは得られなかった。溶解度を増大させるため新たに得た粗抽出物についてメチル化反応を行い、化合物Xが問題なくメチル化されること、その際に分子量が28増えることを確認した。今後はこのメチル化体を精製し、NMRの測定結果から構造を決定する。また、平成18年6月下旬の国際学会(GIM)に参加しこれまでの成果を報告するとともに、ドイツ・フライブルク大学Andreas Bechthold教授と実験について打合せし、当初の計画通り抗生物質ランドマイシンAの生合成遺伝子lanZ5をご供与いただくことができた。actVA-5破壊体の生産する新規化合物Xの構造を決定するため、actVA-5破壊体の液体培養ILから得た酢酸エチル粗抽出物を酸性条件下でメチル化し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC分取により化合物Xのメチル化体3mgを精製した。続いて安定同位体含有酢酸の投与実験も行い、^<13>Cで標識した化合物Xのメチル化体を同様に取得し、それらのNMRスペクトルを解析した結果、化合物Xはperylenequinone型の新規sunt productであると決定しactinoperyloneと命名した。Actinoperyloneの構造は、actVA-5タンパクはmonooxygenaseとして働きアクチノロジン(以下ACTと表記)

6位への酸素導入に必須であること、6位酸化に先立ってACTの15位の立体化学が(R)に決定されること、actVA-5タンパクの基質は6-deoxy-dihydrokalafungin(DDHK)であることを強く示唆するものであった。DDHKは不安定で取得不可能であるため、当初計画していたactVA-5タンパクの異種大量発現と精製実験の優先順位を、現時点では落とすこととした。またactVA-5の相同遺伝子である、ランドマイシンA生合成遺伝子の一つlanZ5をactVA-5破壊体に導入し両遺伝子機能を比較検討するために、制限酵素サイトを付加したプライマーでPCRを行いlanZ5を増幅することに成功した。尚、先方のご都合により渡独・研究打合せは次年度に変更した。前年度までの研究で、actVA-5・actVA-6二重変異株か新規shunt product actinoperylone(ACPL)を生産することを明らかにしたことに基づき、今年度は生合成遺伝子actVA-5、actVA-6、actVeについて様々な組合せの変異株を作成し、それらの表現型を分析した。その結果、これまでACT6位のキノン生成を触媒すると考えられてきたActVA-6の野生株におけるACT生合成への寄与は極めて小さいものであり、一方、ACT8位の水酸基導入を触媒すると考えられていたActVA-51Act VB two-component svstemこそが6位キノン生成を触媒する主要因であることを明らかにした。続いて、ActVA-5とA6tVBそれぞれを大腸菌で発現させ、精製したタンパクを用いてin vitro assayも行った。本来の基質が不安定で取得不可能なため、アナログ基質としてemodin、authrone、dithranolを用いたところ、いずれの化含物もACT6位に対応する位置に酸素が添加されキノンが生成することを確認した。さらに、これまでActVA-5/ActVb svstlemの基質とされていたdihydro-kalafunginも基質としてassav系に供したところ、kalafunginに酸素が一分子添加したと思われる化合物に変換されることを見出した。またこれら一連の実験と併せて、生合成遺伝子再構築系の組替え体作成と表現型分析も行い、ActVI-2が立体特異的エノイル還元酵素として機能し、ACTl5位の立体化学を制御していることも証明した。ActVA-5は、よくあるP-450にはまったく相同性を示さない特異な酸素添加酵素であり、ActVI2も通常の等ノイル還元とは異なるジエン構造の1, 4還元を触媒する可能性がある。これらの酵素は、非天然型新規化合物を生合成工学的手法で創出する際に重要な役割を果たず可能性が高くその制御機構解明のために、本研究から重要な知見を得ることができた。
体腔鏡検査及び遺伝子診断を導入した新しい進行胃癌治療体系の確立

1、腹腔内の微小癌細胞を検出するための、腹腔洗浄液遺伝子微小転移診断法を確立した。(Int.J.Oncol,2003)この診断法により、根治術症例の術後の腹膜再発を感度85.7%、特異度84.1%で予測可能となった。2、漿膜浸潤が疑われる進行胃癌に対し、術前に腹腔鏡検査を施行し、漿膜浸潤を確認の後、腹腔内化学療法施行した。この結果、腹腔内遺伝子診断が陽性症例が化学療法により陰性化した場合、その予後が改善することが確認された。(Ann.Surg.Oncol,2004)3、これらの結果をもとに、従来の根治手術可能例に対する腹膜播種再発の予測と予防的化学療法の導入した治療方針でpilot studyを行なった。術前検査として、腹腔内洗浄を行ない遺伝子微小転移診断により腹膜再発危険群を選定し、予防的化学療法を施行した。術前腹腔内洗浄は、60例に施行し腹膜再発危険群の同定が可能であった。又、術前化学療法(腹腔内)により手術時に遺伝子診断が陰性化した場合予後が改善した(p=0.03)。術前腹腔内洗浄の有用が証明された。4、一方、術前腹腔内洗浄により細胞診陽性が証明された進行胃癌に対しては、以下の治療方針で行なった。細胞診陽性胃癌は、極めて予後不良である。腹腔内及び全身化学療法と腹腔鏡検査を組み合わせた集学的治療を検討した。術前検査により、細胞診陽性あるいは腹膜播種陽性が診断された13例が対象、集学的治療により13例中11例に胃切除術を施行した。内5例は、細胞診、腹膜播種が陰性化しており全例生存中である。一方、除性化しなかった症例は予後不良であった。以上より、漿膜浸潤を要する進行胃癌の治療を行なっていく上で、腹腔洗浄液遺伝子診断及び、腹腔鏡検査による診断に基づいた集学的治療が有効であることが示された。進行胃癌の予後改善のためには、腹膜播種を制御することが重要である。このためには、治療前に、腹膜再発高危険群を予測すること、さらに、これらの症例に対して、適切な治療法を選択することが重要となる。我々が確立した腹腔洗浄液遺伝子診断法は根治手術後の腹膜再発を予測するということにおいて、感度85.7%、特異度84.1%であった。又、漿膜浸潤陽性で腹腔洗浄液遺伝子診断のみ陽性であった症例の62.5%が術後に腹膜再発をきたし、腹腔洗浄液遺伝子診断法は、細胞診陰性の根治例においても、腹膜再発予測因子となることを示した。術前staging laparoscopyを導入した進行胃癌28症例における、術前腹腔内化学療法前後の定量的遺伝子診断の推移が腹膜再発とよく相関することを示した。術前治療により、開腹手術時に遺伝子診断が陰性化した16例は1例を除いて全例生存、遺伝子診断が陰性化しなかった12例は、3例を除いて全例死亡した。よって、細胞診陰性でも、遺伝子診断陽性は、腹膜再発高危険群であり、術前にこれを確認し、治療法を選択する必要がある。

我々は、術前腹腔内化学療法(MMC+CDDP)をこれまで46症例に施行し、その認容性良好なことを確認した。又、この治療により、CY0,PCR(+)16例中10例(63%)が開腹手術時にPCR(-)となっており、予後を改善できる有効な治療法と考えた。これらの事実に基づき、現在、漿膜浸潤が疑われる進行胃癌症例は、入院時に、病棟にて局麻下に腹腔ドレーンを挿入し、腹腔洗浄液を採取し、遺伝子診断陽性症例に対しては、そのまま、腹腔内化学療法を施行する治療方針で行っている(現在までに40例に施行)。腹腔洗浄液遺伝子診断は、進行胃癌治療方針決定の上で不可欠な診断法であり、遺伝子診断陽性症例に対しては術前腹腔内化学療法が有効である可能性が示唆された。進行胃癌の再発形式として最も頻度の高い腹膜播種に対する治療戦略の確立を目的として研究を行なった。要点は、以下の2点である。1、従来の根治手術可能例に対する腹膜播種再発の予測と予防的化学療法の導入。術前検査として、腹腔内洗浄を行ない遺伝子微小転移診断により腹膜再発危険群を選定し、予防的化学療法を施行した。術前腹腔内洗浄は、60例に施行し腹膜再発危険群の同定が可能であった。又、術前化学療法(腹腔内)により手術時に遺伝子診断が陰性化した場合予後が改善した(p=0.03)。術前腹腔内洗浄の有用性が証明された。2、術前腹腔内洗浄により細胞診陽性が証明された進行胃癌に対する集学的治療の検討細胞診陽性胃癌は、極めて予後不良である。腹腔内及び全身化学療法と腹腔鏡検査を組み合わせた集学的治療を検討した。術前検査により、細胞診陽性あるいは腹膜播種陽性が診断された13例が対象、集学的治療により13例中11例に胃切除術を施行した。内5例は、細胞診、腹膜播種が陰性化しており全例生存中である。一方、陰性化しなかった症例は予後不良であった。現在プロトコールは現在倫理委員会承認済みであり症例を集積中であるが新しい治療戦略の1つとして有望である。結語として、漿膜浸潤を要する進行胃癌の治療を行なっていく上で、腹腔洗浄液遺伝子診断及び、腹腔鏡検査による診断に基づいた集学的治療が有効であることが示唆された。
C末端ラベル化法によるタンパク質マイクロアレイの作出

本研究は,(1)タンパク質のC末端ラベル化,(2)タンパク質のマイクロアレイ化,(3)タンパク質間相互作用の解析という手順で行う。前年度は,これら各ステップについての基盤技術を,Fos-Junをモデルタンパク質としてほぼ確立できたので,本年度は,ラベル化およびマイクロアレイ化のハイスループット化を図るために,他のタンパク質について種類を増やして条件検討を行った.まず,ポリコーム遺伝子群の中からRYBPおよびRipg1A,カルモジュリン結合タンパク質の中からミオシン軽鎖キナーゼ,カルシニューリン,カルスペルミンなどの遺伝子をクローニングし,GST融合タンパク質として小麦胚芽由来無細胞タンパク質合成系で同時に平行してタンパク質を合成し,グルタチオンを塗布したスライドガラスに固定化した.この上に,蛍光色素Cy3とピューロマイシンが連結した化合物でC末端標識したRYBP, Ring1Aおよびカルモジュリンを振りかけ吸着・洗浄した後,蛍光スキャナーよってタンパク質間相互作用を検出することに成功した.このとき,様々な条件検討の結果,固定化するタンパク質の量は0.1mg/mlの濃度があれば未精製でも十分であり,また,固定化した後1週間経過してもスポットを検出することができたことから,スライドガラス上でタンパク質が安定に保存されることが分かった.さらに,96穴および384穴マイクロプレートを用いたハイスループット化のモデル実験を行った.ストレプトアビジンにペプチドを付加した融合タンパク質を96穴および384穴マイクロプレートで多数,無細胞転写・翻訳し,ビオチンを塗布したスライドガラス上にスポットした.ペプチドに対する抗体および蛍光標識二次抗体を用いて,各スポットのペプチドを検出することに成功した.今後,ヒト完全長cDNAを用いて,タンパク質マイクロアレイの作成を行う予定である.本研究は,(1)タンパク質のC末端ラベル化,(2)タンパク質のマイクロアレイ化,(3)タンパク質間相互作用の解析という手順で行う。前年度は,これら各ステップについての基盤技術を,Fos-Junをモデルタンパク質としてほぼ確立できたので,本年度は,ラベル化およびマイクロアレイ化のハイスループット化を図るために,他のタンパク質について種類を増やして条件検討を行った.まず,ポリコーム遺伝子群の中からRYBPおよびRipg1A,カルモジュリン結合タンパク質の中からミオシン軽鎖キナーゼ,カルシニューリン,カルスペルミンなどの遺伝子をクローニングし,GST融合タンパク質として小麦胚芽由来無細胞タンパク質合成系で同時に平行してタンパク質を合成し,グルタチオンを塗布したスライドガラスに固定化した.この上に,蛍光色素Cy3とピューロマイシンが連結した化合物でC末端標識したRYBP, Ring1Aおよびカルモジュリンを振りかけ吸着・洗浄した後,蛍光スキャナーよってタンパク質間相互作用を検出することに成功した.このとき,様々な条件検討の結果,固定化するタンパク質の量は0.1mg/mlの濃度があれば未精製でも十分であり,また,固定化した後1週間経過してもスポットを検出することができたことから,スライドガラス上でタンパク質が安定に保存されることが分かった.さらに,96穴および384穴マイクロプレートを用いたハイスループット化のモデル実験を行った.ストレプトアビジンにペプチドを付加した融合タンパク質を96穴および384穴マイクロプレートで多数,無細胞転写・翻訳し,ビオチンを塗布したスライドガラス上にスポットした.ペプチドに対する抗体および蛍光標識二次抗体を用いて,各スポットのペプチドを検出することに成功した.今後,ヒト完全長cDNAを用いて,タンパク質マイクロアレイの作成を行う予定である.本年度は,(1)タンパク質のC末端ラベル化,(2)タンパク質のマイクロアレイ化,(3)タンパク質間相互作用の解析という各ステップについて基盤技術を確立するために,相互作用することが知られているFos-Junをモデルタンパク質として条件検討を行った.(1)C末端ラベル化法の効率化まず,ラベル化効率に対するラベル化試薬の構造の影響について検討するために,ピューロマイシンと種々の蛍光色素(フルオレセイン,ローダミングリーン,Cy5)との間にリンカーとして(デオキシ)シチジル酸を12個挿入した化合物を合成し,ラベル化効率を調べた.その結果,いずれの色素の場合も,タンパク質のC末端をラベル化することができ,特に,デオキシシチジル酸1個のリンカーをもつ化合物は,リンカーがないものに比べ,最大140倍の高効率が得られた.次に,非翻訳領域の配列を変えてラベル化効率を詳細に検討した結果,これまでより56倍の効率でラベル化できる配列を見い出した.さらに,無細胞翻訳系の種類の影響について調べたところ,東洋紡社製の小麦胚芽抽出液は,プロメガ社製の小麦胚芽抽出液やウサギ網状赤血球抽出液に比べてラベル化効率が数倍高いことが分かった.以上により,効率的なC末端ラベル化の条件をほぼ確立することができた.(2)タンパク質のマイクロアレイ上への固定化と相互作用の確認ビオチン,Hisタグ,ストレプトアビジン,GSTなどを付加したFos, Junタンパク質をマイクロアレイヤーを用いてスライドガラス上にスポットした.いずれのタグの場合もタンパク質がきちんと固定化されていることを,蛍光標識抗体を用いて確認した.さらに,C末端蛍光ラベル化したFos, Junを振りかけ吸着・洗浄した後,蛍光スキャナーよってタンパク質間相互作用を検出することに成功した.今後は,他のタンパク質について種類を増やして条件検討を行う予定である.本研究は,(1)タンパク質のC末端ラベル化,(2)タンパク質のマイクロアレイ化,(3)タンパク質間相互作用の解析という手順で行う。

前年度は,これら各ステップについての基盤技術を,Fos-Junをモデルタンパク質としてほぼ確立できたので,本年度は,ラベル化およびマイクロアレイ化のハイスループット化を図るために,他のタンパク質について種類を増やして条件検討を行った。まず,ポリコーム遺伝子群の中からRYBPおよびRing1A,カルモジュリン結合タンパク質の中からミオシン軽鎖キナーゼ,カルシニューリン,カルスペルミンなどの遺伝子をクローニングし,GST融合タンパク質として小麦胚芽由来無細胞タンパク質合成系で同時に平行してタンパク質を合成し,グルタチオンを塗布したスライドガラスに固定化した.この上に,蛍光色素Cy3とピューロマイシンが連結した化合物でC末端標識したRYBP, Ring1Aおよびカルモジュリンを振りかけ吸着・洗浄した後,蛍光スキャナーよってタンパク質間相互作用を検出することに成功した.このとき,様々な条件検討の結果,固定化するタンパク質の量は0.1mg/mlの濃度があれば未精製でも十分であり,また,固定化した後1週間経過してもスポットを検出することができたことから,スライドガラス上でタンパク質が安定に保存されることが分かった.さらに,96穴および384穴マイクロプレートを用いたハイスループット化のモデル実験を行った.ストレプトアピジンにペプチドを付加した融合タンパク質を96穴および384穴マイクロプレートで多数,無細胞転写・翻訳し,ビオチンを塗布したスライドガラス上にスポットした.ペプチドに対する抗体および蛍光標識二次抗体を用いて,各スポットのペプチドを検出することに成功した.今後,ヒト完全長cDNAを用いて,タンパク質マイクロアレイの作成を行う予定である.
STAT-7によるTIMP-1 enhancerの活性化とTIMP-1産生能

食道癌株KE3,TE9,胃癌株MKN28,MKN45,大腸癌株SW620,KM12SMに対してIL10,FBS,および大腸癌組織より単離培養した繊維芽細胞のコンディションメディウム(CM)刺激によるCRTFのhumanTIMP-1enchancer(HTE)結合活性をgel shift assayにて検討した.IL10刺激によりKE3,MKN45およびSW620細胞ではCRTF活性化を介したTIMP-1産生が亢進した.FBS刺激ではいずれの細胞もTIMP-1産生増強を認めたが,明らかなCRTF活性増強は認めなかった.繊維芽細胞のCM刺激ではMKN28以外はTIMP-1産生増強を認めたが,CRTF活性増強はSW620とKE3にみられた.SW620とKE3はCRTF活性化によるTIMP-1産生がみられる株であり,繊維芽細胞CM刺激によるCRTF活性化を介したTIMP-1産生が確認された.繊維芽細胞を各種癌細胞のCMで刺激すると,大腸癌株SW620とKM12SMの2株およびTE9のCM刺激によりCRTF活性化を介したTIMP-1産生増強が認められた.2.ヒト大腸癌組織におけるCRTF活性化とTIMP-1濃度の検討大腸癌腫瘍組織(T)のCRTF活性化は正常粘膜(N)のそれに比べて高かった.T/N比は中・低分化腺癌では高分化腺癌に比べ有意に高値を示したが,分化度の違いによる組織内のTIMP-1濃度の差異は認めなかった.in situ hybridizationの結果,高分化腺癌組織のTIMP-1産生細胞は癌細胞と繊維芽細胞であったが,中・低分化腺癌では繊維芽細胞が主体であった.以上より,分化度の低い癌組織の繊維芽細胞ではCRTF活性化を介したTIMP-1産生の亢進がみられ,癌細胞の分泌する何らかの液性因子がCRTF活性化に重要と考えられた.以上より,消化器癌におけるCRTF活性化を介したTIMP-1産生経路の存在と本経路における癌細胞と繊維芽細胞との相互作用の重要性が示唆された.1.消化器癌細胞株における検討1)コントロール各種消化器癌細胞株(大腸癌2株:KM12SM,SW620,胃癌2株:MKN28,MKN45,食道癌2株:KE3,TE9)で同様にIL-10刺激を行ったところ,4株(SW620,MKN28,MKN45,KE3)でCRTFの増強を認めた.また同4株にTIMP-1濃度の上昇を認め,IL-10刺激によりCRTF活性化を介したTIMP-1産生機構が考えられた.3) 10%FCS刺激10%FCSによる刺激では,消化器癌細胞株全例でTIMP-1濃度の上昇を認めたが,明かなCRTFの発現増強は認めず,FCS刺激によるTIMP-1産生はCRTFを介さない他の経路によるものと考えられた.4)線維芽細胞コンディションメディウム(CM)刺激大腸癌組織より線維芽細胞を初代培養し,CMを作製した.CM添加では,SW620,KE3にCRTFの増強を認めた,TIMP-1濃度は同2株とKM12SM,MKN45,TE9で上昇した.CRTFが増強した2株は,IL-10刺激によりCRTF活性化,TIMP-1産生を認めた系であり,線維芽細胞のCM中にはCRTF活性化に関するシグナルの存在が考えられた.以上より消化器癌細胞においても,前立腺癌細胞と同様にCRTFを介したTIMP-1産生経路の存在が示唆された.CRTFを介したTIMP-1の産生には,癌細胞と線維芽細胞の相互作用が重要と考えられた.2.大腸癌組織における検討大腸癌組織を用いた研究では,TIMP-1濃度は大腸正常粘膜より癌組織において有意に高値を示した.またTIMP-1濃度は,肝転移巣ではさらに高値であったが,リンパ節転移巣では原発巣より低値を示した。CRTFの発現は,正常粘膜では軽度であったが,原発巣,肝転移巣及びリンパ節巣では高度であった.しかし,その発現度とTIMP-1濃度との相関性は認められず,臓器間に発現度の違いは認められなかった.食道癌株KE3,TE9,胃癌株MKN28,MKN45,大腸癌株SW620,KM12SMに対してIL10,FBS,および大腸癌組織より単離培養した繊維芽細胞のコンディションメディウム(CM)刺激によるCRTFのhumanTIMP-1enchancer(HTE)結合活性をgel shift assayにて検討した.IL10刺激によりKE3,MKN45およびSW620細胞ではCRTF活性化を介したTIMP-1産生が亢進した.FBS刺激ではいずれの細胞もTIMP-1産生増強を認めたが,明らかなCRTF活性増強は認めなかった.繊維芽細胞のCM刺激ではMKN28以外はTIMP-1産生増強を認めたが,CRTF活性増強はSW620とKE3にみられた.SW620とKE3はCRTF活性化によるTIMP-1産生がみられる株であり,繊維芽細胞CM刺激によるCRTF活性化を介したTIMP-1産生が確認された.繊維芽細胞を各種癌細胞のCMで刺激すると,大腸癌株SW620とKM12SMの2株およびTE9のCM刺激によりCRTF活性化を介したTIMP-

1産生増強が認められた.2.ヒト大腸癌組織におけるCRTF活性化とTIMP-1濃度の検討大腸癌腫瘍組織(T)のCRTF活性化は正常粘膜(N)のそれに比べて高かった.T/N比は中・低分化腺癌では高分化腺癌に比べ有意に高値を示したが,分化度の違いによる組織内のTIMP-1濃度の差異は認めなかった.in situ hybridizationの結果,高分化腺癌組織のTIMP-1産生細胞は癌細胞と繊維芽細胞であったが,中・低分化腺癌では繊維芽細胞が主体であった.以上より,分化度の低い癌組織の繊維芽細胞ではCRTF活性化を介したTIMP-1産生の亢進がみられ,癌細胞の分泌する何らかの液性因子がCRTF活性化に重要と考えられた.以上より,消化器癌におけるCRTF活性化を介したTIMP-1産生経路の存在と本経路における癌細胞と繊維芽細胞との相互作用の重要性が示唆された.
長崎原爆投下時における看護職者の災害復興活動に関する研究

この研究は、被爆者に対する看護という誰もが経験し得ない事を対象としている。被爆当時の看護職者に、救護活動の体験を語ってもらい、証言をDVDとして保存し、被爆地長崎における戦後復興期の看護活動をまとめた。証言内容を記述化し、分析することで、復興期の看護活動の体系化を図り、災害看護の構築を目的とした。このように看護職の知識と経験をまとめることは、新たな看護の視点や復興支援活動の指針の発見にも繋がり、意義があった。また、国際学会での発表、原著論文としても公表することができた。長崎における被爆者に対する看護という誰もが経験し得ない体験を研究対象として、復興期の看護活動をまとめた。当該研究課題の到達目標では、長崎原爆投下後の救護活動について、看護職者の経験による証言を一次資料としての形で残した。また、証言内容は、記述化し、可能な限り、詳細、かつ正確に記録した。それらをエスノグラフィーのデータ分析手順に基づき分析を行った。このように「長崎の原爆被災復興における看護活動」について、文献、証言から実態を把握した。次に看護職者の証言を資料としてまとめ、論文とした。災害・救急医学の専門誌へ「“Individual testimonies of nursing care after the atomic bombing of Nagasaki in 1945"」の論文として投稿し、掲載された。また、成果は、The Global Network of WHO Collaborating Centers for Nursing and Midwifery第9回国際学会にて、“Individual Testimonies of Nursing Care after the Atomic Bombing of Nagasaki in 1945"として、発表した。さらに、看護職者の証言を録画したものをパンフレット・DVDとした。これらは、英語版として翻訳し、完成した。最終的には、協力機関、関係機関へ資料として、配布する。このように世紀を越えた最大の災害看護の体系化を明らかにし、復興期の看護活動の内容とシステム化について明確化することで、これらが教訓として活かされ、新たな看護の視点や復興支援活動の指針の発見にも繋がり、意義のあるものと確信している。そして、さらに研究が進められ、学問的構築に繋がる価値ある一つの研究となるものと考える。被爆者に対する看護という誰もが経験し得ない体験を研究対象とし、被爆地長崎における第2次世界大戦前後の看護の変遷を明らかにすることは、非常に歴史的価値のあることである。今回、東日本大災害にともなう福島第一原発事故は、過酷な複合災害となった。また、今でも世界各地における地域紛争による被災地域や自然災害による被災地域では、災害で傷ついた人々の健康を守るために、世界中で看護職が活躍し、復興支援の活動を行っている。このことからも原爆被災復興の看護活動がどのようなもので、どのようにシステム化されていったのか明確化することは、今後の教訓として活かされるものと考える。また、このような看護職の方々の知識と経験をまとめることは、新たな看護の視点や復興支援活動の指針の発見にも繋がり、意義のあるものと確信している。今年度は、第1段階の文献・資料調査およびインタビュー調査を終え、第2段階として、1)当時看護職者4名の経験についての証言を一次資料としての形で残した。証言内容を記述化し、可能な限り、詳細、かつ正確に記録した。2)分析方法は、エスノグラフィーのデータ分析手順に基づき実施し、これらの調査結果から、「長崎の原爆被災復興における看護活動」の実態を正確に把握し、不明となっているところや明らかにしなければならないところの検討を行った。3)不十分となる点については、文献により根拠を示した。4)この一次・二次資料の中から、新たな看護の視点を見つけ出した。さらに進み、平成24年度第3段階に進んだ。これらの証言を資料としてまとめ、論文とした。さらに、録画されたものをDVDとして、編集し、使用可能とした。このDVDを外国語訳し、現在編集作業中である。そして、平成25年度第4段階の論文を投稿中である。平成24年度には、投稿した論文3編が本年度中に公表されることを目標としている。現在、編集中である外国語訳したDVDについては、国際学会にて発表し、外国の研究者から意見をもらい、完成度を高めることにしている。また、投稿中の論文3編については、査読者からの指摘に対応し、受理されるように国内外の有識者から助言をもらう予定としている。そして、今年度中の公表に努める。平成24年度は、現在、編集中である外国語訳のDVDの制作料30万円を予定している。次に、国際学会にて発表するための共同研究者3名分の旅費30万円を予定している。そして、プレゼンテーション用の機材20万円としている。また、投稿中の論文3編については、国内外の有識者からの研究助言費用として、50万円を予定している。そして、このような予算案であるが、低予算にて節約できるようであれば、協力機関、関係機関への配布資料まで終了したい計画である。
横紋筋収縮の初期過程の旋光性シグナルによる解析

ウシガエルをエーテル麻酔下で中枢神経を破壊して殺し、後肢より半腱様筋を取り出し、これから1本の筋線維を摘出した。これを、光学実験用チェンバーに張り、高速旋光測定装置によって、筋線維の興奮にと伴う旋光性シグナルを記録した。光源は、250Wのハロゲンランプで、550nmの干渉フィルターにより準単色光とした。筋線維の一端に電気パルスを与えて興奮させ、他の一端から細胞外活動電位を誘導した。筋線維の運動による障碍と小さくするため、外液として90%-95%の重水リンゲルを用い、筋節長を3.7μmまで伸展し、更に標本の上から円筒レンズで筋線維を軽く押さえた。その結果、顕微鏡下では収縮は全く見えなくなった。刺激により、短い持続の右旋性の増大が観察された。このシグナルは、神経で見られた旋光性シグナルと異なり、標本を変えてもその方向や持続は一定で、インパルスの伝導方向を変えても極性は変化しなかった。筋線維の周囲に線維を通過しない光があり、これを遮ると標本が損傷するので、旋光性シグナルの大きさを旋光角で表現できなかったが、神経からのシグナルの数百倍の大きさの旋光性変化と推定された。これらのことから、この旋光性シグナルは、細胞内の蛋白分子の形状の変化に由来するシグナルであると結論した。シグナルの持続は、約23msで、収縮の過程に比べて非常に短いので、アクチンミオシン、トロポニンなどの分子の変化を見ているのではなく、それに先行する興奮収縮連関に伴う分子活動に関係するものと推定された。それで、興奮収縮連関に作用するとされる薬物の効果を調べた。リアノジンは、シグナルの振幅をほぼ半分に減少させた。ニトレンジピンは、シグナルの持続をほぼ半分に短くした。百日咳毒素は、シグナルを、1例を除き、全く消失させた。これらの薬物の作用は、このシグナルが興奮収縮関連に働く分子から生じていることを更に証拠立てるものである。(1)低温室の整備.早稲田大学人間科学部の研究棟4Fの水槽室(479-2)の内部に,低温室用プレハブ(本研究費にて購入)を設置し,室外で空調装置を置いてプレハブ内部の気温を制御した.室内に実験装置を置かない状態でのテストでは,夏季でも5分以内にプレハブ内部の温度を2度Cに保つことができることがわかった.(2)実験設備の構築.低温室内に実験机を置き,その上に,卓上除振台(中央精機製ニューマボード3C)を置き,この上に光学測定装置を構築した.光源としては,250Wのハロゲンランプを用い,厚さ5mm-10mmのアルミ板で作った箱でその周囲を囲んでランプハウスとした.ランプハウスの中には,光源のほかに,凹面鏡,熱遮断用フィルターを置いた.ランプハウスの全面には,直径10cmの円形の穴を作り,これに大型の集光レンズ(Spindler-Hoyer 03500)を挿入して光線を取り出し,550nmの干渉フィルターで準単色光とし,平面鏡により光線の方向を垂直として,高速旋光測定装置に入射させた.(3)カエル筋による実験.カエルの小さな筋(ことにM.iliofibularis)を摘出し,一端に刺激を与えて光学的変化を記録した.複屈折性変化の検出を試みた所,シグナルを得ることができた.