hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重症筋無力症のワクチン療法開発のための基礎的研究

ヒト抗体産生マウス(KM mouse)を使用し、重症筋無力症(MG)の自己抗体の作成とそれを認識する抗イディオタイプ抗体の作成を本研究の目標とした。(2)AChR親和性の検討:得られたmAbもを使い,TE671細胞膜外AChRとの親和性をFACscan, Immunohistochemistryより検討した.またAChRを、native PAGE, SDS-PAGE, IEFのそれぞれの電気泳動を行た。12クローンが膜外のAChRを認識していることを確認した。(3)ヌードマウスによる自己抗体の確認:精製したmAbを1mg/mlに調整し,ヌードマウスに静注投与を行い,48時間後に大腿筋を採取し,AChRの崩壊度を検討した。2種類のmAbがMG惹起性を持つことを確認した。(4)抗イディオタイプ抗体の作成:ヒトAChRの61-76に対するコンプリメンタリーペプチドにN末にCytein残基を結合させたペプチド(CHIVVKEPIWIVIATHF-COOH)をまず合成し、KM mouseに感作を行い、2種類のモノクローナル抗体を作成に成功した。(5)Fabの作成:作成した抗イディオタイプ抗体は,ヒト抗体であるために患者血清中の自己抗体との区別が出来ない.今後の自己抗体のスクリーニングを容易にするために,作成した2種類のmAbのFab化をimmobilizedPapainとSephacryl S-100でのgel filtrationによる精製に成功した。ヒト抗体産生マウス(KM mouse)を使用し、重症筋無力症の自己抗体の作成をそれを認識する抗イディオタイプ抗体の作成を本年度行った。(2)自己抗体の性状確認:ELISAよりAChRに対するaffinityは確認されているが、AChRを表出するTE671の染色性を確認した。全抗体ともAChRの膜蛋白を認識可能であった。またTE671をcell analyzerでの確認でもその親和性が確認された。(3)抗イディオタイプ抗体の作成:ヒトAChRの61-76に対するコンプリメンタリーペプチドにN末にCytein残基を結合させたペプチド(CHIVVKEPIWIVIATHF-COOH)をまず合成し、さらに感作用にさらにCytein部にKLHを結合させた。KM mouseへの感作は、このKLH couplingペプチドをTMD-emulsionで行った。最終boostはコンプリメンタリーペプチドの20μgの静注で行い、(1)と同様にモノクローナル抗体の作成を行った。現在1種類のモノクローナル抗体を作成した。今後の予定(1)自己抗体のin vivoでのAChRの崩壊促進の証明(2)AChR崩壊可能抗体のエピトープ解析(3)コンプリメンタリーペプチドで作成されたイディオタイプ抗体の患者血清中での認識についての検討をおこなう。ヒト抗体産生マウス(KMマウス)を使い,13年度に引き続き重症筋無力症(MG)の自己抗体の作成および解析とその自己抗体を認識する抗イディオタイプ抗体の作成と精製を本年度行なった.(1)自己抗体の作成:ヒトアセチルコリンレセプター(AChR)を産生するTE671細胞より,TritonX-100による膜の可溶化を行い,DEAE sepharose FFによるAChRの精製方法を確立した.この精製AChRをTMDとのemulsionを作成し,KMマウスに感作した.この脾細胞とSP2/0ミエローマ細胞とのFusiohにより,モノクローナル抗体(mAb)を作成した.現在15種類のmAb抗体を作成した.(2)AChR親和性の検討:得られたmAbを使い,TE671細胞膜外AChRとの親和性をFACscan, Hitochemistryより検討した.またAChRをnativePAGE,SDS-PAGE,IEFのそれぞれの電気泳動を行い,PDVF膜に転写し,western blott解析を行なった.12cloneが膜外のAChRを認識していることを確認した.(3)ヌードマウスによる自己抗体の確認:

精製したmAbを1mg/mlに調整し,ヌードマウスに静注投与を行い,48時間後に大腿筋を採取し,AChRの崩壊度を検討した.現在1種類のmAbがMG惹起性を持つことを確認した.(4)抗イディオタイプ抗体の作成:ヒトAChR61-76に対するコンプリメンタリーペプチドのN末にCysteinを加えたペプチド(CHIVVKEPIWIVIATHF)を合成し,KLHとのカップリングしたものをTMDとのemulsionでKMマウスに感作して,mAbの作成を行なった.2種類のmAb(IgG1,IgG3)を作成した.(5)Fabの作成:作成した抗イディオタイプ抗体は,ヒト抗体であるために患者血清中の自己抗体との区別が出来ない.今後の自己抗体のスクリーニングを容易にするために,作成した2種類のmAbのFab化をimmobilizedPapainとSephacryl S-100でのgel filtrationによる精製に成功した.今後の予定(1)MG惹起自己抗体のエピトープ解析:作成したmAbをphage display library法により,エピトープの解析を行なう.
自然免疫系におけるTLR4のリガンド認識機構の構造生物学的研究

本申請課題では自然免疫応答において病原体認識分子として働くToll様受容体〔TLR〕の1種であるTLR4細胞外ドメイン・MD-2複合体の結晶構造解明を目的に研究を行った。昆虫細胞を用い、結晶化を可能な純度の量の複合体を調製し、結晶化を試みたが回折実験を行えるような良質の結晶は得られなかった本申請課題では自然免疫応答において病原体認識分子として働くToll様受容体〔TLR〕の1種であるTLR4細胞外ドメイン・MD-2複合体の結晶構造解明を目的に研究を行った。昆虫細胞を用い、結晶化を可能な純度の量の複合体を調製し、結晶化を試みたが回折実験を行えるような良質の結晶は得られなかったTLR4はグラム陰性菌の細胞外膜主要構成分子であるリポ多糖を認識する.グラム陰性菌の生体への感染は、エンドトキシンショックと呼ばれる多臓器不全を生じさせる.抗エンドトキシンショック分子標的薬開発に向け,本研究ではX線結晶構造解析法によりTLR4のリガンド認識機構、免疫応答活性化機構を、(1)TLR4細胞外ドメイン、(2)TLR4細胞外ドメイン・MD-2複合体,(3)TLR4細胞外ドメイン・MD-2・LipidA(アゴニスト)複合体、(4)TLR4細胞外ドメイン・MD-2・LipidIVa(アンタゴニスト)複合体、の4つの立体構造を決定することにより明らかにすることを目的としている.19年度は結晶化を行うのに必要な質および量のTLR4細胞外ドメインを得ることを中心に研究を行った.ヒトおよびマウス由来のTLR4について検討した。本研究では、昆虫細胞を用いたバキュロウィルス発現系よりTLR4細胞外ドメインを細胞外に分泌させて、調製することとしている.発現を試みたところ、TLR4細胞外ドメインは発現するものの細胞内に多くとどまり、一部しか細胞外に分泌されていないことが明らかとなった.細胞外分泌シグナル配列やMD-2の共発現系を作成し、安定化した発現を得られる発現系の検討を行った.結果、研究開始時に用いた発現系の約10倍の発現量を見込める結果を得た.結晶構造解析には高純度かつ高濃度の蛋白質溶液を得る必要がある.本年度はその根幹である発現量の改善を行った.TLR4はグラム陰性菌の細胞外膜主要構成成分であるリポ多糖を認識する。グラム陰性菌の生体への感染はエンドトキシンショックと呼ばれる多臓器不全を生じさせる。抗エンドトキシンショック分子標的薬開発に向け、本研究ではX線結晶構造解析法によりTLR4のリガンド認識機構、免疫応答活性機構を以下の、4種類の構造を決定することにより、解明することを目的とした。1. TLR4細胞外ドメイン構造。2. TLR4細胞外ドメイン・MD-2複合体。3. TLR4細胞外ドメイン・MD-2・lipidA〔アゴニズト〕複合体。4. TLR4細胞外ドメイン・MD-2・lipidA〔アンタゴニスト〕複合体。19年度9月にマウスTLR4細胞外ドメイン・MD-2・エリトラン〔アンタゴニスト〕複合体、ヒトTLR4細胞外ドメイン・MD-2複合体の構造が決定された。そこで、20年度は3のアゴニスト結合型の構造解析を目指した。19年度からの継続的な研究により、付加タグや分泌シグナル配列、発現領域について検討した結果、ヒトTLR4とヒトMD-2を昆虫細胞で共発現することにより、1L培養液あたり、約0.06mgのヒトTLR4細胞外ドメイン・MD-2複合体を安定的に得ることに成功した。アゴニストとの結合条件を検討しながら、結晶化条件を検索したが、回折実験を行えるような良質な結晶を得ることはできなかった。TLR4およびMD-2はともに、糖蛋白質であるため、糖鎖の短鎖化が可能であり、結晶化用標品への精製系が確立している酵母で発現させ、調整したヒトMD-2と複合体を形成させて結晶化を行ったが、結晶を得ることが出来なかった。
大規模SSPDアレイによるシングルフォトンイメージング技術の創出

可視から赤外の波長領域で光子計数が可能な究極の感度を持つイメージセンサの実現を目指して、超伝導単一光子検出器(SSPD)の大規模アレイ化に向けた基盤技術を開発した。単一磁束量子(SFQ)回路を用いて光子を検出したピクセルのアドレス情報をディジタル信号として出力するエンコーダ回路を設計・評価し、64ピクセルSSPDアレイを信号処理回路と組み合わせて動作実証した。また、配線数を削減する新たな読み出し手法や、SFQ回路よりもさらに低消費電力動作が可能な断熱型磁束量子パラメトロン(AQFP)回路の導入についても検討し、原理実証に成功した。H26年度は、大規模超伝導単一光子検出器(Superconducting Single-Photon Detector: SSPD)アレイを実現するため、n x nピクセルからの読み出し信号線をn^2から2nに削減する構成について検討を行った。当初、列毎にバイアスを印可する手法で検討を進める予定であったが、大規模化するほどバイアスが印可されていない領域が増加し、全体として感度が低下することから、光子1つを検出するという究極の感度のイメージングセンサとしての魅力を失ってしまうことが判明した。そこで、つねに全ピクセルにバイアスを印可した状態で読み出し信号線を大幅に削減可能な構造を検討した。その結果、列側の読み出しには直流電流を遮蔽するキャパシタが必要になるものの、情報通信研究機構でこれまでに培った単一磁束量子(SFQ)論理回路による読み出し信号処理をそのまま流用できる大規模SSPDアレイ構成法を見出し、3 x 3規模のアレイで正常動作することをSPICEシミュレーションにより確認した。それ以上の規模でのスケーラビリティについては現在確認中である。一方、SFQ回路による読み出し信号回路については、64ピクセルSSPDアレイ用の信号処理回路について、液体ヘリウム中で正常動作を確認した。しかしながら、回路の駆動に400 mA近い直流電流を必要とするため、冷凍機で動作させた場合、バイアス電流により配線で発生する熱による冷凍機の温度上昇が問題になることがわかった。現在、この問題を克服するために、超伝導配線の導入も視野に入れ検討を進めている。大規模SSPDアレイを作製する上で鍵となる回路平坦化プロセスについても検討を行い、カルデラ法と呼ばれる手法でほぼ所望のデバイス構造を作製できることを確認した。H27年度は、64ピクセルSSPDアレイ用SFQ信号処理回路への大電流供給に伴う冷凍機温度の上昇を抑制するため、従来のパルスカウンターとシフトレジスタを基本とした回路設計を見直し、2のn乗チャンネルある光子の入射位置情報をnビットのシリアルコードにエンコードして1本の出力ケーブルで読み出す回路を新たに設計した。その結果、従来よりも約30%バイアス電流を削減することに成功した。この新方式の回路では、光子の入射位置情報だけでなく、時間情報も判別できるよう、光子が入射する毎にアドレス情報を出力するイベントドリブン型の回路設計とし、この回路の液体ヘリウム中での正常動作を確認した。また、SFQ回路を構成するジョセフソン接合の最小臨界電流は100uAであるが、これを50uAとした新たな論理セルについても設計を行い、基本ゲートの正常動作を確認した。これらの論理セルを用いることでSFQ信号処理回路へ供給電流量をさらに半減できる見通しである。また、SFQ回路への電流供給による冷凍機の温度上昇を抜本的に抑制するため、断熱型超伝導論理回路(AQFP: Adiabatic Quantum Flux Parametron)を使ったSSPDからの信号読み出しに向けて、高速超伝導インターフェイス回路を開発した。この回路は10uA以下という微弱な信号入力で動作し、SSPDと直接接続して使用することが可能である。磁束量子に変換した信号をAQFP回路で処理後、最終的に信号を数mVまで増幅して出力することが可能である。H27年度は、液体ヘリウム中で、この回路が数GHzで動作することを確認した。AQFP回路へは3相もしくは4相の交流バイアス電流が必要であるが、SFQ回路で現状200mA以上必要としているバイアス電流量を数mAに削減できる見込みである。SFQ信号処理回路においては、新しいエンコード方式を採用して約30%のバイアス電流量の削減を実現し、さらに回路を構成するジョセフソン接合の臨界電流値を従来の半分としたSFQ論理セルについても設計・評価を行い、正常動作を確認している。これらは、大規模SSPDアレイを実現する上で必要となる数1000接合規模のSFQ信号処理回路を冷凍機で動作させるために不可欠である。現状、64ピクセルSSPDアレイ用の信号処理回路(約3000接合)を設計・評価しているが、これらをSSPDと組み合わせて冷凍機で動作させることができれば、2のn乗ピクセルを2nの読み出し信号線数に削減する手法を適用したとすると、32x32=1024ピクセルのSSPDアレイに適用できることになる。米国NISTで8x8のSSPDアレイの報告例があるが、それを大きく超える大規模SSPDアレイの実証が可能であると考えている。また、バイアス電流を抜本的に削減可能なAQFP回路においても、SSPDと組み合わせて動作させる上で必須となる出力ドライバを設計し、数GHzでの動作を確認することができた。SFQ回路の冷凍機動作でどうしても温度上昇を抑制することが難しい場合は、AQFP回路による信号処理回路により大規模SSPDアレイの実証を進めていくことも十分視野に入ってきた。H28年度は、光子が入射する毎にアドレス情報を出力するイベントドリブン型の64ピクセル

SSPDアレイ用SFQ信号処理回路について、0.1W GM冷凍機に実装して試験を行い、正常動作を確認すると同時に、実際に64ピクセルSSPDアレイと接続し、光子の入射タイミングに併せてアドレス出力情報を読み出すことに成功した。また、最終的な目標であるSSPDアレイとSFQ信号処理回路の実現に向けて、作製プロセスの検討を行った。実際に、16ピクセルおよび64ピクセルSSPDアレイをNICTで作製し、その後AISTで同一ウェハにSFQ多重化回路を作製・評価した。その結果、16ピクセルSSPDについてはSFQ多重化回路を含めて動作実証することに成功した。しかしながら、SSPDの光キャビティを構成するSiO誘電体層に、SFQ回路作製中の膜ストレスにより一部膜剥がれが生じ、その下部にあるNbTiN配線層がその後のエッチング工程で消失するという問題が発生した。そのため、アレイ全体での検出効率は通常のSSPDの1/100以下と低く、作製プロセス上の課題が残った。光子が入射する毎にアドレス情報を出力する64ピクセルSSPDアレイ用イベントドリブン型エンコーダー回路の0.1W GM冷凍機での動作実証に成功したことで、ほぼ同程度の回路規模になると予想される32x32=1024ピクセルSSPDアレイ用についても、0.1 W GM冷凍機でSFQ回路による極低温信号処理で動作実証できる目処がついた。また、最終的に目標としているSSPDアレイとSFQ信号処理回路のモノリシック集積化についても、現状ではSFQ回路作製時の膜ストレスによるSSPD配線層の膜剥がれ等により十分に高い検出効率を実証できていないが、作製プロセス上の課題を昨年度中に洗い出すことができたため、今後はそれらを1つ1つ解決していくことで、SFQ信号処理回路をモノリシックに集積化した大規模SSPDアレイチップの実現についても十分視野に入ってきたと考えている。また、バイアス電流の抜本的な削減を可能とするAQFP回路においても、SSPDとAQFP回路を直接接続して、SSPDからの出力信号を読み出すことに成功し、AQFP回路の動作中も回路を実装した0.1 W GM冷凍機のステージ温度に全く上昇が見られないことを確認した。将来的な大規模アレイの実現に向けて、SFQ回路よりもさらに低消費電力なAQFP回路を信号処理回路として利用できる目処がついた。H29年度は、昨年度に引き続きSSPDアレイとSFQ信号処理回路のモノリシック集積化プロセスの検討を進めた。SSPDアレイの光キャビティを構成する誘電体層をSiO蒸着膜からSiO2スパッタ膜に変更することで、SFQ回路作製中の誘電体層のはく離を防ぐことができるものの、超伝導ナノワイヤの特性が変化することも判明した。誘電体材料の変更ではなく、SFQ回路作製プロセスにおける膜ストレスの緩和を検討する必要がある。
ドーパ関連化合物の構造決定と構造活性相関

我々は従来もっぱら神経伝達物質ドパミンの前駆体に過ぎないと考えられてきたドーパが神経伝達物質であることを示す知見を集積してきた。しかしその特異的受容体は未同定である。本研究においては、特異的受容体の同定のための一環として、ラット孤束核(NTS,nucleus tractus solitarii)微量注入時にドーパ様の活性を示すL-3,4-dihydroxyphenylalanine(ドーパ)あるいはL-threo-dihydroxyphenylserine(ドプス)由来の活性誘導体の構造決定を試み、ドーパ受容体同定に有用なリガンド候補を獲得することを目的とした。方法:活性成分の分離は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)・紫外分光光度計を用いた。活性は、麻酔したラットを人工呼吸下に大動脈ヘカニューレを挿入し、頭部を固定・開頭して下部脳幹部を露出し、孤束核(NTS)領域に微量注入し測定した。結論:ドーパおよびドプス誘導体の中にドーパ様活性を示す活性成分を見出した。線虫ライブラリーから発現クローニングを行ったドーパ受容体候補分子CO6H5.7は、ドーパ自体をリガンドとせず、水溶性物質3,4-dihydroxybenzaldehydeおよびその類似構造体数種をリガンドとすることを突き止めた。線虫は、1000種類以上の化学物質により誘引あるいは忌避行動を惹起される3,4-dihydroxybenzaldehydeの構造類自体benzaldehydeは従来忌避および誘引物質の二相性作用を惹起する物質として報告されてきた。今回、CO6H5.7の遺伝子欠損体を単離し、行動解析を行ったところ、このbenzaldehydeに対する忌避応答が減弱していることを発見した。ドーパ受容体のクローニングからスタートした研究ではあったが、この発見は重要である。なぜなら、これまでに化学感覚受容体の候補として数百にのぼる7回膜貫通構造を有するタンパク質が報告されているが、diacetylに対し誘引応答を惹起するOdr-10が、リガンドが同定された唯一のGタンパク質受容体であり、今回の発見は全く新しい手法によりリガンドー受容体の関係が明らかとなった最初の例として位置づけられるからである(Neuronへ投稿予定)。一方、麻酔下ラット孤束核への微量注入時に惹起される血圧下降応答を指標として、ドーパ以外の活性画分が得られている。Fab-Mass, NMR解析により複数の候補分子を絞りつっある。また海馬初代培養神経細胞系においてドーパがカルシウム応答を惹起するかいなか、およびグルタミン酸応答に対する修飾作用を示すか否かを検討したところ、無作用濃度のドーパがグルタミン酸応答を抑制する傾向を示すことを確認した。本研究においては、特異的受容体の同定のための一環として、ラット孤束核(NTS, nucleus tractus solitarii)微量注入時にドーパ様の活性を示すL-3,4-dihydroxyphenylalanine(ドーパ)あるいはL-threo-dihydroxyphenylserine(ドプス)由来の活性誘導体の構造決定を試み、ドーパ受容体同定に有用なリガンド候補を獲得することを目的とした。
糖尿病性腎症治療ターゲットとしての核内受容体の研究

糸球体肥大は糖尿病性腎症の初期の特徴的な組織変化であるが、その細胞肥大はG1期細胞周期停止によってもたらされることが知られている。また肥満においても脂肪細胞肥大にサイクリン依存性キナーゼインヒビター(CKI)の関与が報告されている。OLETFラットを用いてPPARγアゴニストまたRXRアンタゴニストの治療効果を比較し、その作用メカニズムをメサンギウム細胞および脂肪細胞の細胞周期異常是正の観点から検討した。肥満と2型糖尿病の動物モデルであるOLETFラットを、コントロール群、PPARγアゴニストであるpioglitazone (PIO)投与群、RXRアンタゴニストであるHX531投与群に分けて糖・脂質代謝および糸球体病変を比較した。また、高糖濃度下で培養メサンギウム細胞にPIO、HX531を添加して、Laser scan cytometerにより細胞周期を解析し、CKIやこれを制御するMitogen-activated protein kinase (MAPK)の発現をウエスタンブロットで定量した。さらにLETO群、OLETFコントロール群、PIO群、HX531投与群の脂肪組織から成熟脂肪細胞を分離して細胞周期を解析し、培養脂肪細胞にPIO、HX531を添加してCKIやMAPKなどの発現についてウエスタンブロソトで検討し、メサンギウム細胞の結果と比較した。OLETFラットを8週齢から30週齢にわたって観察したところ、PIO投与群ではOLETF群と比較して著明な体重増加を認めたが、HX531投与群では体重増加が抑制されていた。PIO、HX531投与群の両群で、血糖値やHbAlc、血清中性脂肪・コレステロール値はOLETF群に比べて改善し、尿中アルブミン量の減少と、組織学的には糸球体肥大の改善を認めた。高糖培養下のメサンギウム細胞で認められるG1期細胞周期停止は、PIO、HX531添加により解除された。また高糖培養下では、CKIの発現を制御しているp44/42MAPK、p38MAPKのリン酸化が亢進し、p21cip1, p27Kip1の発現が亢進していたが、PIoやHX531の添加により、G1期細胞周期停止に関与するこれらの蛋白発現は両薬剤で同様に抑制された。一方、PIO投与OLETFラットの成熟内臓脂肪細胞ではM+late M期の細胞の比率が高いのに比して、HX531投与群ではGO+GI期の細胞が増加しており、培養内臓脂肪細胞にPIOやHX531を添加すると、前者が分化を促進するのに対して、後者は分化を抑制し、更にCKIやMAPKの発現が両薬剤では異なっていた。糖尿病性腎症におけるメサンギウム細胞および肥満における内臓脂肪細胞の細胞周期異常を明らかにし、その異常は核内受容体modulatorによって制御されることを示した。細胞種やその状態により、核内受容体modulatorは複雑に作用するが、細胞周期異常の是正が、肥満の改善と蛋白尿や糸球体硬化の抑制をもたらすことが期待される。核内受容体である、PPARには、α、γ、δの3種類のサブタイプが存在し、PPARδアゴニストは、抗炎症作用や抗動脈硬化作用があることが報告されている。一方、PPARδの腎臓における機能やそのアゴニストの糖尿病性腎症への治療効果は不明である。我々はPPARδアゴニストが糖尿病性腎症の進展機序である慢性炎症に作用して治療効果を発揮するのではないかという仮説をたて、糖尿病動物モデル(ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウス)を用いて、核内受容体PPARδアゴニスト(GWO742)の糖尿病性腎症への治療効果を検討した。C57BL/6マウス(雄、8週齢)を(1)非糖尿病群(以下C群)、(2)非糖尿病+GWO742投与群、(3)糖尿病群(以下D群)、(4)糖尿病+GWO742投与群(以下G群)の4群に振り分け、糖尿病誘発後にGWO742を8週間経口投与した(1mg/kg/日)。糖尿病誘発前、糖尿病誘発後4週、8週の時点で体重測定、血圧測定、蓄尿検査を行い、糖尿病誘発後8週でsacrificeを行った。腎症の治療効果は、アルブミン尿、腎機能に加えて、腎臓組織におけるメサンギウム基質の面積率(Mesangial matrix index ; MMI)、IV型コラーゲンの発現、糸状体内マクロファージの浸潤を観察した。またPCR法にて炎症性サイトカインの遺伝子発現を検討した。GWO742の投与により、体重、血圧、HbAlcに有意差を認めなかったが、糖尿病誘発8週の時点でG群マウスはD群マウスと比較し尿中アルブミン(μg/day)の有意な減少をみとめた(C群:11.1±0.9、D群:91.9±13.2、G群:39.3±2.6)。腎臓組織の観察ではD群マウスにみられるMMI(%)の増加がGWO742投与により抑制され(C群:9.18±0.40、D群:12.14±0.37、G群:9.57±0.17)、IV型コラーゲンの発現増加も抑制された。さらに糸状体内マクロファージの浸潤(個/糸状体)も抑制された(C群:0.23±0.02、D群:2.71±0.09、G群:1.80±0.08)。

また炎症性サイトカインの遺伝子発現の検討では、腎臓においてMCP-1、CD14のmRNAの発現が減少していた。PPARδアゴニストは糖尿病性腎症において炎症を抑制することで、腎症を改善させることが示唆された。【目的】糸球体肥大は糖尿病性腎症の初期の特徴的な組織変化であるが、その細胞肥大はG1期細胞周期停止によってもたらされることが知られている。また肥満においても脂肪細胞肥大にサイクリン依存性キナーゼインヒビター(CKI)の関与が報告されている。OLETFラットを用いてPPARγアゴニストまたRXRアンタゴニストの治療効果を比較し、その作用メカニズムをメサンギウム細胞および脂肪細胞の細胞周期異常是正の観点から検討した。【方法】肥満と2型糖尿病の動物モデルであるOLETFラットを、コントロール群、PPARγアゴニストであるpioglitazone(PIO)投与群、RXRアンタゴニストであるHX531投与群に分けて糖・脂質代謝および糸球体病変を比較した。また、高糖濃度下で培養メサンギウム細胞にPIO、HX531を添加して、Laser scan cytometerにより細胞周期を解析し、CKIやこれを制御するMitogen-activated protein kinase(MAPK)の発現をウエスタンブロットで定量した。さらにLETO群、OLETFコントロール群、PIO群、HX531投与群の脂肪組織から成熟脂肪細胞を分離して細胞周期を解析し、培養脂肪細胞にPIO、HX531を添加してCKIやMAPKなどの発現についてウエスタンブロットで検討し、メサンギウム細胞の結果と比較した。【結果】OLETFラットを8週齢から30週齢にわたって観察したところ、PIO投与群ではOLETF群と比較して著明な体重増加を認めたが、HX531投与群では体重増加が抑制されていた。PIO、HX531投与群の両群で、血糖値やHbAlc、血清中性脂肪・コレステロール値はOLETF群に比べて改善し、尿中アルブミン量の減少と、組織学的には糸球体肥大の改善を認めた。高糖培養下のメサンギウム細胞で認められるG1期細胞周期停止は、PIO、HX531添加により解除された。また高糖培養下では、CKIの発現を制御しているp44/42MAPK、p38MAPKのリン酸化が亢進し、p21cipl,p27Kip1の発現が亢進していたが、PIOやHX531の添加により、G1期細胞周期停止に関与するこれらの蛋白発現は両薬剤で同様に抑制された。一方、PIO投与OLETFラットの成熟内臓脂肪細胞ではM+lateM期の細胞の比率が高いのに比して、HX531投与群ではGO+G1期の細胞が増加しており、培養内臓脂肪細胞にPIOやHX531を添加すると、前者が分化を促進するのに対して、後者は分化を抑制し、更にCKIやMAPKの発現が両薬剤では異なっていた。【結論】糖尿病性腎症におけるメサンギウム細胞および肥満における内臓脂肪細胞の細胞周期異常を明らかにし、その異常は核内受容体modulatorによって制御されることを示した。細胞種やその状態により、核内受容体modulatorは複雑に作用するが、細胞周期異常の是正が、肥満の改善と蛋白尿や糸球体硬化の抑制をもたらすことが期待される。【背景】オステオポンチンは炎症性のサイトカインであり、単球の遊走因子でもあり、糖尿病性腎症の病態形成に炎症を介して関与していると考えられている。また核内受容体は炎症性サイトカインの発現調節に重要である。【目的】
アルツハイマー型痴呆脳のいわゆるアミロイド斑の免疫組織化学的,超微形態的研究

アルツハイマー型痴呆の脳に出現する老人斑で“アミロイドの塊の中にグリア線維束が入り交じり,変性神経突起は殆ど認められない"という基準をみたす“アミロイド斑(以下APと略)"を7剖検例を用いて検索し,以下の結果をえた.(1)組織学的研究:APが広範に出現する2症例では,APは変性の強い側頭葉と頭頂葉の脳回の谷部に多数出現する傾向があった.3症例では,側頭葉・頭頂葉などの脳回の谷部にわずかに出現していた.APが全く出現しない例が2例あった.(2)免疫組織化学的研究:β-amyloid(Aβ)のAβ1-40,Aβ1-42,Aβ8-17を認識する抗体による検索では,APはこれら3種の抗体に陽性を示した.Aβ1-40とAβ1-42の両分子種ともAPの構成成分であった.また抗GFAP抗体ではAPの周囲とAPの中に細かく入り込む星状膠細胞の細い突起が染色された.抗タウ抗体ではAPの周囲に陽性反応を示す変性神経突起がごく少数確認された.(3)超微形態学的研究:グリア線維束からなる星状膠細胞の細い突起がアミロイドの中心まで侵入し,アミロイドを区画する像が観察された.検索対象とした2例のAPの特殊性が確認された.また,星状膠細胞の突起の一部がglial filamentsとともにpaired helicalfilaments(PHF)に類似する異常細管をもつことを2例で見いだした.(4)Gallyas電顕と免疫電顕による研究:星状膠細胞の突起内の異常細管が嗜銀性をもち,また抗タウ抗体に陽性を示し,PHFと類似することを明らかにした.結論以上の研究から,APは変性神経突起の欠除や星状膠細胞の反応の点で他の老人斑から区別される特殊型である.しかし構成するAβの分子種に相違がないことが明らかになった.また長期臨床経過例でも少数しか出現しない例があり,臨床経過との関連性も乏しいと思われる.アルツハイマー型痴呆の脳に出現する老人斑で“アミロイドの塊の中にグリア線維束が入り交じり,変性神経突起は殆ど認められない"という基準をみたす“アミロイド斑(以下APと略)"を7剖検例を用いて検索し,以下の結果をえた.(1)組織学的研究:APが広範に出現する2症例では,APは変性の強い側頭葉と頭頂葉の脳回の谷部に多数出現する傾向があった.3症例では,側頭葉・頭頂葉などの脳回の谷部にわずかに出現していた.APが全く出現しない例が2例あった.(2)免疫組織化学的研究:β-amyloid(Aβ)のAβ1-40,Aβ1-42,Aβ8-17を認識する抗体による検索では,APはこれら3種の抗体に陽性を示した.Aβ1-40とAβ1-42の両分子種ともAPの構成成分であった.また抗GFAP抗体ではAPの周囲とAPの中に細かく入り込む星状膠細胞の細い突起が染色された.抗タウ抗体ではAPの周囲に陽性反応を示す変性神経突起がごく少数確認された.(3)超微形態学的研究:グリア線維束からなる星状膠細胞の細い突起がアミロイドの中心まで侵入し,アミロイドを区画する像が観察された.検索対象とした2例のAPの特殊性が確認された.また,星状膠細胞の突起の一部がglial filamentsとともにpaired helicalfilaments(PHF)に類似する異常細管をもつことを2例で見いだした.(4)Gallyas電顕と免疫電顕による研究:星状膠細胞の突起内の異常細管が嗜銀性をもち,また抗タウ抗体に陽性を示し,PHFと類似することを明らかにした.結論以上の研究から,APは変性神経突起の欠除や星状膠細胞の反応の点で他の老人斑から区別される特殊型である.しかし構成するAβの分子種に相違がないことが明らかになった.また長期臨床経過例でも少数しか出現しない例があり,臨床経過との関連性も乏しいと思われる.アルツハイマー型痴呆の脳に出現する老人斑で“アミロイドの塊の中にグリア線維の細い束がよく入り交じり,変性神経突起は殆ど認められない"という基準をみたす“アミロイド斑(以下APと略)"を7剖検例を用いて検索し,以下の結果をえた.(1)組織学的研究:APが広範に出現する2症例では,APは変性の強い側頭葉と頭頂葉に多く,また脳回の谷部に多数出現する傾向があった.3症例では,側頭葉・頭頂葉などの脳回の谷部にわずかに出現していた.APが全く出現しない例が2例あった.経過が20年にわたる長期経過例でも少数しか出現しない例があり,臨床経過との関連性は乏しいと思われる.(2)免疫組織化学的研究:抗βアミロイド抗体(residues8-17を認識)ではこのアミロイドは陽性に標識された.抗GFAP抗体ではAPの周囲とAPの中に細かく入り込む星状膠細胞の細い突起が染色された.抗タウ抗体ではAPの周囲に陽性反応を示す変性神経突起がごく少数確認された.(3)超微形態学的研究:グリア

線維束からなる星状膠細胞の細い突起がアミロイドの中心まで侵入し,アミロイドを区画する像が観察された.定型斑では星状膠細胞由来と推測される突起はアミロイドの周囲に認められるが,グリア線維を持つことは稀であることから,検索対象とした2例のAPの特殊性が確認された.また,星状膠細胞の突起の一部がglial filamentsとともにpaired helicalfilaments (PHF)に類似する異常細管構造をもつことを,APを多数有する症例と少数持つ症例各1例で見いだした.これは星状膠細胞由来のグリアタングルである.この微細構造を詳細に検索し報告した.(4)Gallys電顕と免疫電顕による研究:星状膠細胞の突起内の異常細管が嗜銀性をもち,また抗タウ抗体に陽性を示し,PHFと類似することを明らかにした.アルツハイマー型痴呆の脳に出現する老人斑で“アミロイドの塊の中にグリア線維束が入り交じり,変性神経突起は殆ど認められない"という基準をみたす“アミロイド斑(以下APと略)"を7剖検例を用いて検索し,以下の結果をえた.(1)組織学的研究:APが広範に出現する2症例では,APは変性の強い側頭葉と頭頂葉の脳回の谷部に多数出現する傾向があった.3症例では,側頭葉・頭頂葉などの脳回の谷部にわずかに出現していた.APが全く出現しない例が2例あった.(2)免疫組織化学的研究:β-amyloid(Aβ)のAβ1-40,Aβ1-42,Aβ8-17を認識する抗体による検索では,APはこれら3種の抗体に陽性を示した.Aβ1-40とAβ1-42の両分子種ともAPの構成成分であった.また抗GFAP抗体ではAPの周囲とAPの中に細かく入り込む星状膠細胞の細い突起が染色された.抗タウ抗体ではAPの周囲に陽性反応を示す変性神経突起がごく少数確認された.(3)超微形態学的研究:グリア線維束からなる星状膠細胞の細い突起がアミロイドの中心まで侵入し,アミロイドを区画する像が観察された.検索対象とした2例のAPの特殊性が確認された.また,星状膠細胞の突起の一部がglial filamentsとともにpaired helicalfilaments(PHF)に類似する異常細管をもつことを2例で見いだした.(4)Gallyas電顕と免疫電顕による研究:星状膠細胞の突起内の異常細管が嗜銀性をもち,また抗タウ抗体に陽性を示し,PHFと類似することを明らかにした.結論以上の研究から,APは変性神経突起の欠除や星状膠細胞の反応の点で他の老人斑から区別される特殊型である.しかし構成するAβの分子種に相違がないことが明らかになった.また長期臨床経過例でも少数しか出現しない例があり,臨床経過との関連性も乏しいと思われる.
眼内増殖性疾患、網膜変性疾患の遺伝子治療と網膜色素上皮移植

1.ラット脈絡膜新生血管発症モデルを用いて、vascular endothelial growthfactor(VEGF)およびその受容体であるKDRの発現を検討し、VEGFが脈絡膜新生血管形成にautocrine的またparacrine的に働くことを示した。このモデルにおいてオリゴヌクレオタイド、2重鎖核酸(デコイ型核酸)またLacZ遺伝子をHVJ(hemagglutinating virus of Japan)-リポソーム法で硝子体内に注入し観察した結果、脈絡膜新生血管発生部の細胞にそれぞれが特異的に導入できた。HVJ-リポソーム法で遺伝子導入を行い血管新生に関与するサイトカインを抑制、脈絡膜新生血管の治療が可能であることが示された。2.網膜変性モデルであるオルニチン網膜症や虚血再環流モデルでは網膜神経細胞のアポトーシスがおこる。虚血再環流モデルにおいて、basic fibroblast growth factor(bFGF)、Midkineなどの神経栄養因子の発現が上昇した。さらに、虚血再環流モデルではVEGFの発現が一過性に上昇するのみであった。3.網膜色素上皮細胞にbFGF遺伝子もしくはアンチセンス遺伝子を導入し、遺伝子導入した細胞をクローン化できた。網膜色素上皮細胞に遺伝子を導入し、目的とする蛋白を強く発現する網膜色素上皮細胞を作成することが可能である。臨床的に脈絡膜新生血管の抜去術後、網膜色素上皮細胞の欠損部ができ、視機能の面で改善のみられないことが多い。遺伝子導入した網膜色素上皮細胞の移植により、より有効な脈絡膜新生血管の治療を行える。さらに網膜変性疾患に対して神経栄養因子を導入した網膜色素上皮細胞の移植を行うことで網膜神経細胞保護を行える。1.ラット脈絡膜新生血管発症モデルを用いて、vascular endothelial growth factor(VEGF)およびその受容体であるKDRの発現を検討し、VEGFが脈絡膜新生血管形成にautocrine的またparacrine的に働くことを示した。1.ラット眼底に強度光凝固を施行し,脈絡膜新生血管を発生させた。この脈絡膜新生血管発症モデルを用いてVascular endothelial growthfactor(VEGF)およびその受容体であるKDR/flk-1のmRNAの発現をinsitu hybridization法によって検討した。脈絡膜新生血管形成過程で新生血管内皮細胞、網膜色素上皮細胞などにこれらのmRNAが発現していることが明らかとなり、VEGFが脈絡膜新生血管形成にautocrine的またparacrine的に働くことがわかった。このモデルにおいてFITCラベルしたオリゴヌクレオタイドをHVJ-リポソーム法で硝子体内に注入し観察した結果、脈絡膜新生血管発生部の細胞にオリゴヌクレオタイドが特異的に導入されることが明らかとなり、hemagglutinating virus of Japan(HVJ)-リポソーム法で有効に脈絡膜新生血管部に遺伝子導入ができることがわかった。さらに、VEGFアンチセンスオリゴヌクレオタイドをHVJ-リポソーム法で硝子体内に注入し、VEGFの発現を抑制、脈絡膜新生血管形成過程を観察したが、脈絡膜新生血管の発生が見られた。2.網膜色素上皮細胞にbasic fibroblast growthfactor(bFGE)遺伝子もしくはアンチセンス遺伝子をエレクトロポレーション法で導入し、遺伝子導入された細胞をクローン化することかできた。これらの遺伝子導入された網膜色素上皮細胞は、導入された遺伝子を強く発現することがわかった。この結果から、網膜色素上皮細胞に遺伝子を導入し、目的とする蛋白を強く発現する網膜色素上皮細胞を作成することができ、より有効な網膜色素上皮細胞移植を行える可能性が強くなった。この脈絡膜新生血管発症モデルに外来遺伝子であるLacZ遺伝子をhemagglutinating virus of Japan(HVJ)-リポソーム法で硝子体内注入により導入した。脈絡膜新生血管発生部の網膜色素上皮細胞など増殖した細胞にβガラクトシダーゼ活性がみられ、HVJ-リポソーム法でLacZ遺伝子を脈絡膜新生血管に導入できた。

さらに、2重鎖核酸(デコイ型核酸)をHVJ-リポソーム法を用い脈絡膜新生血管発症モデルに硝子体内注入で導入できた。特異的配列をもったデコイ型核酸は転写因子の作用を阻害することができる。我々は、脈絡膜新生血管の発生進展に、vascular endothelial growth factor(VEGF)などのサイトカインが関与することを平成10年度科研費実績報告書で報告している。HVJ-リポソーム法でデコイ型核酸を導入し、血管新生に関与するサイトカインを抑制、脈絡膜新生血管の治療が可能であることが示された。2.網膜色素上皮細胞にbasic fibroblast growthfactor(bFGF)遺伝子もしくはアンチセンス遺伝子を導入し、遺伝子導入された細胞をクローン化することができた。この結果から、網膜色素上皮細胞に遺伝子を導入し、目的とする蛋白を強く発現する網膜色素上皮細胞を作成することが可能である。臨床的に脈絡膜新生血管の手術的治療として脈絡膜新生血管の抜去術が行われる。しかし、脈絡膜新生血管の抜去後、網膜色素上皮細胞の欠損部ができ、視機能の面で改善のみられないことが多く、遺伝子導入した網膜色素上皮細胞の移植により、より有効な脈絡膜新生血管の治療を行える可能性が強くなった。
ミトコンドリア機能障害による難聴の新規治療法の開発

CBAマウスに二酸化ゲルマニウムを投与して進行性難聴を作成した結果、apotosisなどに関する遺伝子発現が増え、エネルギー代謝、聴覚などに関する遺伝子の発現が低下した。タウリン、水素水、CoQ10を投与し、その予防効果を調べたところ、タウリン、CoQ10、水素水の順に聴力低下は有意に抑えられ、組織の変性も抑えられた。ミトコンドリア3243位点変異の難聴患者に対してCoQ10、タウリン内服、水素水の投与を行っところ、大多数の症例で難聴の進行はほとんどないが、1例だけ急性増悪を示した。平衡障害は緩徐ではあるが、進行した。CBAマウスに二酸化ゲルマニウムを投与し、進行性難聴を作成した。内耳では血管条の変性、有毛細胞の軽度脱落、ラセン神経節細胞の減少が見られた。蝸牛からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイで調べたところ、apotosisやinflammationなどに関する遺伝子発現が増え、エネルギー代謝、聴覚、神経伝達、DNA修復などに関する遺伝子の発現が低下した。定量的RT-PCRではミトコンドリア呼吸鎖複合体の代表的遺伝子発現が低下していた。さらに酸化ストレスを除去するサプリメント(タウリン、水素水、CoQ10)を投与し、その予防効果を調べたところ、タウリン、CoQ10投与群で聴力低下は有意に抑えられ、ラセン神経節の減少も抑えられた。ミトコンドリア3243位点変異の患者に対してはCoQ10、タウリンの内服と水素水の投与を行い、聴力経過を観察しているが、大多数の症例で難聴の進行はほとんどないか、緩徐になっている。CBAマウスに二酸化ゲルマニウムを投与し、進行性難聴を作成した結果、内耳では血管条の変性、有毛細胞の軽度脱落、ラセン神経節細胞の減少などの組織変化が見られた。蝸牛からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイで調べたところ、apotosisやinflammationなどに関する遺伝子発現が増え、エネルギー代謝、聴覚、神経伝達、DNA修復などに関する遺伝子の発現が低下していた。定量的RT-PCRでミトコンドリア呼吸鎖複合体の代表的遺伝子5個の発現を確認したところ、すべて有意な発現低下が見られた。この二酸化ゲルマニウムによる内耳障害が、ミトコンドリア障害を保護するサプリメント(タウリン、水素水、CoQ10)により予防できるか検討したところ、タウリン、CoQ10、水素水の順に聴力低下が有意に抑えられた。組織学的変化でもラセン神経節の減少や血管条の変性がこの順に抑えられた。さらにこのサプリメントを投与した動物の蝸牛からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイでサプリメントを投与していない動物と比較したところ、上述した遺伝子発現変化が抑制されており、予防効果と相関が見られた。臨床では、ミトコンドリア遺伝子3243位点変異を持つ難聴患者に対してCoQ10、タウリン、水素水を投与し、聴力経過を観察した。この1年間には大多数の症例で難聴の進行はほとんど見られなかったが、1例だけ急性増悪を示した。しかし投与期間での急性増悪は投与前に比して有意に抑えられる結果であった。なお平衡障害は極めて緩徐ではあるが、進行する傾向にあった。ゲルマニウム投与実験は聴力経過と組織検査で安定した結果が出ている。サプリメントによる難聴予防評価も、3つのサプリのうち2つが有意に効果があるなど、期待通りの結果であり、今後サンプル数を増やして確認すれば良い段階になっている。臨床例でもhistorical controlに比べて難聴の進行はゆっくりとなっており、期待通りの治療効果が得られてきている。耳鼻咽喉科学ゲルマニウム投与実験についてはサンプルを増やして再現性を確認した上で、学会発表と論文化を目指す。また臨床例ではhistorical controlとの比較を継続し、難聴の進行予防に有意な効果があるか、確認を行う。臨床例については研究期間を超えての観察も必要と考えている。
多能性神経幹細胞の増殖と分化の分子機構の解析

哺乳動物の中枢神経系を構成するニューロン及びグリアの多様な細胞系列は、いずれも共通の神経幹細胞より発生する。しかしながら、この多能性幹細胞に関する知見は未だ限られたものに留まっている。我々は最近ラット胎児脳より多能性神経幹細胞を単離・培養する技術を確立し、これを用いてニューロン及びグリアが発生、分化する過程を試験管内で再構成することに成功している。本研究ではこの培養法を用いて、多能性幹細胞の増殖と分化の分子機構を解析した。まず、分化制御分子の候補として転写制御因子であるMash-1およびProx-1遺伝子に着目し、その発現動態および機能を解析した。また、Mash-1遺伝子欠損マウスの胎児脳の形態形成異常を詳細に解析した。その結果、Mash-1およびProx-1が多能性幹細胞の自己複製から分化へのコミットメントの初期過程を正に制御する因子であることを明らかにした。さらに、細胞間相互作用を媒介する細胞膜受容体分子えあるNotchを介したシグナル伝達系が、Mash-1の機能を抑制することにより多能性幹細胞の分化を負に制御することを見出した。そこで、この制御に関わるNotchの細胞内情報伝達系の詳細を解析した。その結果、ショウジョウバエdeltex遺伝子の哺乳動物相同遺伝子として単離されたDeltex-1(Dtx1)が、Notchの下流でMash-1の機能を抑制するシグナルを伝達する、これまでに知られてていない新規の情報伝達系を構成する分子であることが明らかになった。以上の結果から、脳神経系の初期発生過程の重要な現象である多能性幹細胞の増殖・分化の運命選択は、Mash-1およびProx-1による正の制御ならびにNotchシグナル伝達系による負の制御バランスによって、巧妙にコントロールされていることが明らかとなった。特異抗体を用いた免疫組織染色により、Mash-1及びProx-1遺伝子産物が脳の発生過程で-過的に出現する2次前駆細胞で発現することを見出した。さらに幹細胞の初代培養系を用いて、両遺伝子は幹細胞が未分化な状態で自己複製を繰り返している場合には発現せず、分化へとコミットする最も初期の過程で-過的に誘導されることを明らかにした。また、神経幹細胞由来の不死化細胞株MNS-70を用いて、Mash-1の発現が幹細胞の分化の初期過程を促進する活性を持ち、Prox-1の発現および幹細胞のマーカー抗原であるnestinの消失を誘導する転写制御因子であることを明らかにした。本研究によって、中枢神経系においては多能性幹細胞からの分化過程に他階段のスッテプが存在し、このうちMash-1遺伝子は神経幹細胞が自己複製と分化へのコミットメントという初期発生の重要な2つの運命を選択する過程を制御することが明らかになった。
DNA修復と蛋白質分解系をつなぐRAD23ホモローグの機能に関する研究

DNA損傷に伴って特異的に誘起されるXPC蛋白質の翻訳後修飾がユビキチン化である可能性を検討するため、XP-C群患者由来のXP4PASV細胞でFLAG-XPCとHA-ユビキチンを同時に過剰発現した。この細胞抽出液からFLAG-XPCを免疫沈降することにより、XPCが細胞内でユビキチン化されうることが確認された。また、XPCの種々の欠失変異体を用いて同様の実験を行うことにより、比較的ユビキチン化を受けやすい領域が見いだされた。さらにこのユビキチン化の細胞内での機能を探る目的で、FLAG-XPCを生理的なレベルで安定に発現する細胞株を樹立した。これに紫外線や4-NQOなどの薬剤を用いてDNA損傷を与えると、クロマチン構造に強く結合するXPCの割合が増加する一方、ユビキチン化XPCの大部分は比較的穏和な条件でクロマチンから離れることがわかった。また、XPCのユビキチン化はG1/S境界からM期の間で、細胞周期に依存せずに起こることが示された。XPC蛋白質と相互作用する新規因子を探索する目的で、酵母2ハイブリッド法によるスクリーニングを行ったところ、ユビキチン様蛋白質SUMO-1、およびその結合酵素であるUbc9が得られた。そこでユビキチン化の場合と同様にFLAG-XPCとHA-SUMO-1を同時に過剰発現することにより、XPCがSUMO-1化も受ける可能性があることが示唆された。遺伝子ターゲティングによりHR23A、HR23Bを二重に欠損したマウス胎仔線維芽細胞を用いて、種々の変異HR23Bを安定に発現する細胞株を作成した。その結果、HR23BのN末端のユビキチン様配列はXPCの安定化、および損傷の除去活性そのものには必須でないことが明らかになった。細胞にDNA損傷を与えた際に見られるXPC蛋白質の翻訳後修飾を詳細に解析する目的で、まず内在性のXPC蛋白質を発現しないXP-C群患者由来の細胞(XP4PASV)を親株として、N末端にFLAGタグを融合したXPC蛋白質(FLAG-XPC)を安定に発現する細胞株を樹立した。この細胞株に紫外線を照射した後、全細胞抽出液を作成して抗FLAG抗体で免疫沈降を行ない、さらに抗XPC抗体を用いたイムノブロッティングによって検出した。その結果、紫外線照射に伴って高分子量領域に出現するXPC蛋白質のバンドは、免疫沈降後に脱ユビキチン化酵素であるisopeptidaseTで処理すると消失することがわかった。すなわち、細胞に紫外線を照射するとXPC蛋白質がユビキチン化を含む特異的な翻訳後修飾を受けることが示された。さらに、XP4PASV細胞でFLAG-XPCとHAタグを融合したユビキチンを同時に一過性強制発現し、抗FLAG抗体による免疫沈降と抗HA抗体によるイムノブロッティングを行なうことによってもユビキチン化されたXPC蛋白質を検出することができた。現在、このユビキチン化部位のアミノ酸レベルでの同定を試みている。また、遺伝子ターゲティングによりHR23AとHR23Bを同時に欠損したマウス胎仔線維芽細胞を用いて、種々のHR23B蛋白質の変異体を安定に発現する細胞を樹立した。これらの細胞における内在性XPC蛋白質の量をイムノブロッティングで調べたところ、HR23BのN末端に存在するユビキチン相同配列はXPC蛋白質の安定化には必要でないことがわかった。現在、これらの細胞におけるXPC蛋白質のヌクレオチド除去修復機能や修飾、および蛋白質分解系との関連について検討中である。

昨年度までの研究で、細胞にDNA損傷を与えた際に特異的に見られるXPCタンパク質の翻訳後修飾の少なくとも一部が、ユビキチン化によるものであることが示された。一方、XPCと相互作用する新規因子を探索する目的で酵母2ハイブリッド法によるスクリーニングを行ったところ、ユビキチン様タンパク質であるSUMO-1、およびSUMO-1の結合酵素であるUbc9が得られた。そこで、HAタグを融合したSUMO-1をFLAG-XPCと共に細胞内で一過性に過剰発現したところ、XPCがユビキチン化だけでなくSUMO-1化を受けうることが示された。XPCの種々の欠失変異体を用いてユビキチン化、およびSUMO-1化部位の決定を試みたが、いずれも複数の部位で修飾を受けると考えられ、現在のところアミノ酸レベルでの同定には至っていない。また、生理的条件下でDNA損傷依存的に見られるXPCの修飾は細胞周期非依存的に起こること、DNA損傷によって一部のXPCの核内での存在状態に変化が起こり、クロマチンにより強固に結合するようになるが、修飾されたXPCタンパク質は比較的クロマチンから離れやすいことなどがわかった。一方、遺伝子ターゲティングによりHR23A、HR23Bを同時に欠損したマウス胎仔線維芽細胞を親株として、種々の変異HR23Bを発現する細胞株を樹立した。その結果、26Sプロテアソームと相互作用することが示されているHR23BのN末端のユビキチン様配列を除いてもXPCタンパク質の安定性、および紫外線損傷の除去活性に影響がないことが示された。現在、HR23Bの各ドメインのNER機構やDNA損傷に対する細胞応答における役割の詳細な解析を進めている。