hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表皮細胞におけるオートファジーと有棘細胞癌の新規治療戦略

プログラムされた細胞死として,アポトーシスとネクローシスはよく知られているが,近年新しい第3のプログラム細胞死として,オートファジーによる細胞死が注目されはじめている.摂取する蛋白の2.5倍の蛋白が生命維持に必要と言われている.そのため,廃棄される蛋白を効率よく再利用するシステムが不可欠であり,それがオートファジーである.このオートファジーが大掛かりに起こると細胞は死まで至り,このオートファジーに伴う細胞死が生物の発生過程の様々な段階に生じていることが分かりはじめている.また,飢餓状態などでアミノ酸が枯渇するとオートファジーは急速に進行し,これにより自分の体を分解自食し,生命活動により重要な蛋白を再合成することにより,生物は生き延びることができる。本研究の目的は,生体の正常の機能や病態において重要な役割を果たしているオートファジーに注目し、表皮細胞におけるオートファジーによる新規病態を明らかにすること、並びにそこから発展し有棘細胞癌の画期的治療法を開発することにある.そのため、以下の2点を検討した。アミノ酸や亜鉛欠乏状態に見られる表皮上層の細胞死へのオートファジーの関与を明らかにすること,有棘細胞癌でのオートファジーの有無を確認し、オートファジーを強制的に誘導することにより癌細胞を殺傷する新しい観点からの治療法の開発も行うこと。その結果、アミノ酸欠乏症に認められる細胞死にオートファジーが関連する可能性が示唆された。また、オートファジーの皮膚癌への治療への応用に関しては、もうすこし検討が必要であった。以上、計画していた研究を終了し、十分な効果が得られた。
海事債権の実現方法に関する比較法的研究―船舶先取特権制度の再検討を中心として

船舶の運航に伴って生じる様々な債権の実現には,船舶を差し押さえて債務者である船舶所有者などに担保を提供させるという方法が,実際上はしばしばとられている。本研究は,このような船舶の差押え・仮差押えに関する日本法上の制度(その中でも特に,実務上よく利用される船舶先取特権制度)を,主要国の同様の機能を有する制度,すなわち,英米法系諸国における対物訴訟制度(船舶を相手方として開始することができる民事訴訟手続),大陸法系諸国における船舶の(仮)差押えに関する法制と比較し,機能面に着目して分析することで,日本の船舶先取特権制度,ひいては海事法制のあり方について,検討しようとするものである。
シナプス前膜カルシウムチャンネルとシナプス可塑性-パッチクランプ法による研究

1.出生直前のラット胎仔の海馬体からエキスプラントを採取し、定法に従って培養した。約一週間の培養の後、単-ニュ-ロンにパッチクランプ(whole-cell clamp)用の電極を当て、周囲の神経線維束を電気刺激したところ、約100pAの興奮性シナプス後電流(EPSC)が観察された(0.01mMビキュキュリン存在下)。0.1Hzの刺激頻度において対照のEPSCを記録した後刺激頻度を短時間だけ高め(50HZ,1秒間のテタヌスを10秒間隔で二回)、その後再び0.1Hzの刺激頻度に戻して20-30分観察を続け、長期増強の発生の有無を検討した。約20%の実験において、電流は30%以上増大し、観察している間その状態を保った。この事は、組織培養条件においても入力線維束のテタヌスが長期増強を誘発し得ることを示している。しかし残りの細胞では、EPSCが全く増強しないばかりではなく著しい振幅の減少を示したものがあった。さらに高い確率で安定に長期増強を誘発する条件(電極内液および刺激方法)を見出だすことが今後の実験のために必要であると考えられる。2.テンジクネズミの海馬体からいろいろな厚さの横断切片をマイクロスライスによって作製し、標準人工液中に保った。一時間以上のインキュベイション後ノマルスキ-顕微鏡下に観察したところ、50μm以下の厚さの切片において、苔状線維の終末と思われる構造が明瞭に認められた。したがってこの材料は、中枢のシナプス前膜のカルシュウムチャンネルの研究に好適であると考えられる。
ストラティファイド光触媒を用いた太陽光利用に関する研究

光化学反応のエネルギー源としての水素製造への適用は重要な課題であるが、光触媒内部で光励起された電子と正孔の再結合を抑制することが必要であった。我々は、天然のプロセスを利用した新しい触媒調整方法を見出し、結晶性の良い超微粒子をストラティファイド構造に配列させた光触媒を設計・開発した。ZnOを前駆物質として調製することによりZnSストラティファイド光触媒を得ることができる。これは粒径5nmのZnS超微粒子がカプセル状に配列した構造をもつ粒子で、紫外線照射下において高い反応活性を示し、水素を生成した。各種高性能分析装置を効果的に用いてZnSストラティファイド光触媒を評価・分析した結果、高活性の要因はストラティファイド構造の形成による電位勾配であることが確認された。こうして蓄積されたZnSストラティファイド光触媒の分析・評価結果を元に、反応効率の改善ならびに可視光領域への増感を目指し、可視光に応答性をもつ半導体素材についてストラティファイド光触媒の開発を行った。その結果、CdOを前駆物質としたCdSストラティファイド光触媒の開発に成功した。CdSストラティファイド光触媒は可視光領域において高い反応活性を示し、太陽光の照射下における水素の生成を可能にした。このCdSストラティファイド光触媒において、所有する透過型電子顕微鏡・フォーカスドイオンビーム加工装置やX線回折装置等により、分析・評価するとともに、実用化に向けたアセスメントならびに水素生成システムの設計を行った。また、反応活性のさらなる向上を目指し、前駆物質ならびにCdS生成における反応物質の組み合わせを検討した。その結果、ストラティファイド微粒子ならびにその構成粒子の微小化に成功し、さらに高活性な光触媒材料を得るに至った。今後の目標として、水の完全分解を目指し、反応溶液中の硫黄の回収ならびに回収硫黄を用いた水熱反応による反応溶液の再生、硫化水素生成細菌を利用した反応溶液の再生についての検討を行う予定である。我々は、新しい着想で触媒調製の反応形を見出し、ストラティファイド構造と格子欠陥の無い超微粒子を組み合わせるという光触媒を設計・開発した。本触媒は、粒子径5nmというナノメータサイズのZnS超微粒子が円筒状に配列したストラティファイド(層状)構造を有し、様々な評価法を用いて本光触媒を検討した結果、(1)円筒の内側と外側が,反応サイトになっている。(2)ナノメータサイズのZnS超微粒子は,ほぼ完全結晶であるために、電子とホールが効率的に反応サイトまで移動できる。この二つの要因が、光エネルギーの変換効率を向上させたものと考える。本研究では本触媒を基に、CdSやPbSという可視光領域で光エネルギーの化学エネルギーへの変換が可能な触媒を開発して太陽光の化学エネルギー変換を目指す。平成11年度は、既存のキセノン光源と強力単色光源を用いて、現在までの研究成果を基に、完成度の高いZnSストラティファイド光触媒に仕上げた。そして、水の光分解実験を通じて、最良のストラティファイド構造を決定した。そして、CdSおよびPbSといった可視光で利用可能な触媒の設計指針を確立した。特に,ストラティファイド層内でのZnおよびS元素の割合が変化していること水素発生効率を支配していることが判明した。上記装置を用いた実験と平行して、透過型電子顕微鏡やX線回折法を用いて評価を行いながら、太陽光で水素発生効率を向上できるストラティファイドCdSおよびPbS光触媒を調製するための指針を決定した。

我々は、新しい発想により見出した、触媒調整条件と反応系は非常に高効率な水の光分解を行うものである。その構造は、触媒自体が非常にきれいな配列をしたストラティファイド構造を持ち、その構成粒子は、粒子径5nmと非常に小さく、また格子欠陥のないナノメータサイズの超微粒子から作られている。平成12年度は、平成11年度に検討したZnSストラティファイド光触媒についての結果を踏まえて次の点に重点をおいて研究を行う。まず、キセノン光源や水銀光源によりZnSストラティファイド光触媒の可視光に対する反応効率の改善。次に、CdSやPbSにおいてもストラティファイド光触媒を生成しより太陽光に近いところでの水からの水素発生を目指した。その場合、所有する透過型電子顕微鏡・フォーカスドイオンビーム加工装置やX線回折装置等により、分析・評価を行う。本年度は、ZnS光触媒の太陽光への触媒活性感度の増大ねらい、いくつかのマテリアルを添加するなどの増感への試みを行った。さらに、CdS光触媒については、ZnS光触媒についての経験を生かしてストラティファイド化し、キセノン光源を用いてフィルターにより紫外光をカットした状態の実験系での実験を行いより現実に近い太陽光に近い光を用いた水の光分解をおこなった。この時も、各種高性能分析機器を効果的に用いて精力的に各反応の現象解明を行った。平成13年度は、これまでの実験の成果を用いて太陽光による水からの水素発生を目指した反応系の開発を目指し、ストラティファイド光触媒の実用化を現実のものとするための反応メカニズムの解明と効率のアップを目指すものとする。我々は、天然のプロセスを利用した新しい触媒調製方法を見出し、結晶性の良い超微粒子をストラティファイド構造に配列させた光触媒を設計・開発した。ZnSストラティファイド光触媒はZnOを前駆物質として、この方法により調製された光触媒である。ZnSストラティファイド光触媒は粒径5nmのZnS超微粒子がカプセル状に配列した構造をもつ粒子で、紫外線照射下において高い反応活性を示し、水素を生成した。平成11(8160)1612年度はZnSストラティファイド光触媒について各種高性能分析装置を効果的に用いて評価し、高い反応活性を示す要因を追求するとともに、反応効率の改善ならびに可視光領域への増感を目指してきた。平成13年度は、前年度まで蓄積してきたZnSストラティファイド光触媒の分析・評価結果を元に、可視光に応答性をもつCdS、PbS、FeS2などの素材についてストラティファイド光触媒の開発を行った。その結果、CdOを前駆物質としたCdSストラティファイド光触媒の開発に成功した。CdSストラティファイド光触媒は可視光領域において高い反応活性を示し、太陽光の照射下における水素の生成を可能にした。このCdSストラティファイド光触媒において、所有する透過型電子顕微鏡・フォーカスドイオンビーム加工装置やX線回折装置等により、分析・評価するとともに、実用化に向けたアセスメントならびに水素生成システムの設計を行った。また、反応活性のさらなる向上を目指し、前駆物質ならびにCdS生成における反応物質の組み合わせを検討した。その結果、ストラティファイド微粒子ならびにその構成粒子の微小化に成功し、さらに高活性な光触媒材料を得るに至った。
口腔外科手術のための全静脈麻酔の検討-正常血圧者と高血圧者での比較

本研究は、正常血圧ラットと高血圧ラットとで口腔領域侵害刺激時の循環変動の差と、それに対する各種薬剤の変動抑制効果を比較検討することを目的とした。平成11年度は、正常血圧ラットを用いて口腔領域侵害刺激として適切な刺激法を検討し、ラットでのモデル製作を試みた。平成12年度は、前年度に引き続き、正常血圧ラットを用いて口腔領域侵害刺激として適切な刺激法を検討した。その結果、ラットの三叉神経各分枝、口腔軟組織または歯髄などの他、脛骨神経、上腕神経、迷走神経などの電気刺激を用いて循環変動が生じることを確認した。しかし、オトガイ神経など細い神経束では電気刺激後の循環変動の再現性が乏しく、神経露出手技や刺激間隔などに工夫が必要と思われた。平成13年度は、正常血圧ラットを用いて口腔領域侵害刺激時の循環変動と各種薬剤の作用について検討した。その結果、フェンタニル(麻薬性鎮痛薬)やクロニジン(α2アゴニスト)はウサギでのデータ(平成7年度文部省科学研究費一般研究C「自律神経系の安定を目標とした口腔外科手術のためのよりよい全身麻酔の検討(課題番号07672189)」)とほぼ同様の抑制効果を示した。平成14年度は、さらに症例数を追加し、これらの薬剤の効果を検討した。また、ラットでの検討に加えて、ウサギのオトガイ神経電気刺激による循環変動の観察を追加した。刺激時間を30秒以上の長時間とし、循環変動の大きさと同時に変動のパターンに与える各種薬剤の影響を観察している。これらのデータから、未だに最終的な結論は得られていないが、現在臨床で行われている全静脈麻酔における、より適切な薬剤の組み合わせについての検討を続けてゆく予定である。平成7年度の文部省科学研究費一般研究C「自律神経系の安定を目標とした口腔外科手術のためのよりよい全身麻酔の検討(課題番号07672189)」として、ウサギのオトガイ神経電気刺激による口腔領域侵害刺激の際に発現する循環変動に対して、各種の麻酔薬や鎮痛薬がどのような変動抑制効果を示すかを検討した。そして、各種の薬剤がそれぞれ特徴ある抗侵害作用を現すことを示し、日常臨床で行われている全静脈麻酔の有用性と今後の検討課題を明らかにした。その一方で、これらの薬剤の作用に関する正常血圧モデルと高血圧モデルでの比較検討が必要であると思われた。今回の研究は正常血圧ラットと高血圧ラットとで口腔領域侵害刺激時の循環変動の差と、それに対する各種薬剤の変動抑制効果を比較検討することを目的としている。初年度には、正常血圧ラットを用いて口腔領域侵害刺激として適切な刺激法を検討し、ラットでのモデル製作を試みた。すでにラットでは頸骨神経や坐骨神経が神経電気刺激モデルとして利用されているが(SamsoEetal.:AnesthAnalg,1994,Ganjoo Pet al.:Anesth Analg, 1996)、口腔領域の神経電気刺激によって生じた循環変動を観察した報告はほとんどない。現在は未だ予備実験中であるが、ラットの三叉神経各分枝、口腔軟組織または歯髄などを用いて適度な循環変動が生じる刺激条件を検索しているところである。次年度は適切な刺激条件を設定したラットのモデルを確立し、まず正常血圧ラットでの口腔領域侵害刺激時の循環変動と各種薬剤の作用について検討してゆきたい。

今回の研究は正常血圧ラットと高血圧ラットとで口腔領域侵害刺激時の循環変動の差と、それに対する各種薬剤の変動抑制効果を比較検討することを目的としている。本年度は初年度に引き続き、正常血圧ラットを用いて口腔領域侵害刺激として適切な刺激法を検討した。現在まで、ラットの三叉神経各分枝、口腔軟組織または歯髄などの他、脛骨神経、上腕神経、迷走神経などの電気刺激を用いて循環変動が生じることを確認し、適切な電気刺激条件が明らかにしつつある。しかし、オトガイ神経など細い神経束では電気刺激後の循環変動の再現性が乏しく、神経露出手技や刺激間隔などに工夫が必要と思われ、現在、検討中である。また、基礎麻酔に使用する薬剤への反応性もウサギと異なると思われ、この点についても検討中である。次年度は適切な刺激条件のもとに正常血圧ラットでの口腔領域侵害刺激時の循環変動と各種薬剤の作用について検討してゆきたい。平成7年度の文部省科学研究費一般研究C「自律神経系の安定を目標とした口腔外科手術のためのよりよい全身麻酔の検討(課題番号07672189)」として、ウサギのオトガイ神経電気刺激による口腔領域侵害刺激の際に発現する循環変動に対して、各種の麻酔薬や鎮痛薬がどのような変動抑制効果を示すかを検討した。そして、各種の薬剤がそれぞれ特徴ある抗侵害作用を現すことを示し、日常臨床で行われている全静脈麻酔の有用性と今後の検討課題を明らかにした。その一方で、これらの薬剤の作用に関する正常血圧モデルと高血圧モデルでの比較検討が必要であると思われた。本年度は、正常血圧ラットを用いて口腔領域侵害刺激時の循環変動と各種薬剤の作用について検討した。現在まで、ラットのオトガイ神経を中心に口腔軟組織や歯髄などの電気刺激を行い、循環変動を観察してきた。そしてこれらの循環変動に対するフェンタニル(麻薬性鎮痛薬)やクロニジン(α2アゴニスト)の効果を検討した。その結果、前回の研究によってウサギで得られたのとほぼ同様の結果が得られつつある。しかし、オトガイ神経など細い神経束では電気刺激後の循環変動の再現性が依然として乏しく、さらにデータの蓄積が必要と考えている。次年度は適切な刺激条件のもとに、正常血圧ラットおよび高血圧ラットでの口腔領域侵害刺激時の循環変動と各種薬剤の作用について検討してゆきたい。
大脳皮質細胞サブタイプの脳波リズムへの関与

睡眠時や麻酔下の大脳皮質から記録した脳波では徐波振動が観察され、個々の錐体細胞と同期して脱分極(Up)相と過分極(Down)相を繰り返している。さらにそのUp相の中にはガンマやスピンドルという振動が含まれるが、その詳細な生成メカニズムや神経活動との関係性は未だ良くわかっていない。本研究において、大脳皮質5層の異なる投射先を持つ錐体細胞(CCS細胞、CPn細胞)と非錐体細胞(FS細胞)の発火を記録しスピンドル波・ガンマ波との関係を調べたところ、細胞サブタイプによってモジュレーションを受ける細胞の割合や、スピンドル波・ガンマ波中の発火位相が異なることがわかった。さらにそのUp相の中にはガンマやスピンドルという振動が含まれる。ガンマ波の発生には皮質の抑制性細胞が主要な役割を果たし、スピンドル波は視床網様核がそのリズム生成に重要であると知られている。しかし、その詳細な生成メカニズムや神経活動との関係性は未だ良くわかっていない。本研究では、サブタイプや層を同定した大脳皮質神経細胞の発火活動とスピンドル波・ガンマ波と相関を調べ、これらのリズムの生成機構や皮質内での機能解明への貢献を目指す。今年度は、ラットの大脳皮質において、皮質下の投射先が異なる2種類の錐体細胞と非錐体細胞(GABA細胞)を傍細胞記録で逆行性応答やスパイク幅によって同定した。ユニット活動の記録終了後、記録細胞を染色した。実験終了後、灌流固定し記録細胞の組織化学的処理及び皮質の層の同定を行った。以上のように、電気生理学・形態学・免役組織化学的手法を組み合わせて同定した皮質細胞のサブタイプ・サブレイヤー(主にII/IIIb, Va, Vb)ごとにスピンドル・ガンマ振動での発火位相の解析を開始した。申請者らは、以前に視床細胞と皮質の5層錐体細胞の一部が、スピンドル波の異なる位相で発火することを明らかにした。また、視床から皮質への入力密度は皮質サブレイヤーに依存するため、視床由来とされるスピンドル波と各細胞タイプの発火特性の間には特異的な関係がある可能性が高い。ガンマ波についても、抑制性細胞・錐体細胞のタイプに依存して発火時期が分化している可能性がある。さらに、錐体細胞のスピンドル波・ガンマ波中での発火位相が投射サブタイプに依存するかどうかについても検証したい。ラットの大脳皮質において、皮質下の投射先が異なる2種類の錐体細胞[皮質橋核細胞,corticopontine (CPn) cell、交叉性皮質線条体細胞, crossed corticostriatal (CCS) cell]と非錐体細胞(GABA細胞)を傍細胞記録で逆行性応答やスパイク幅によって同定した。ユニット活動の記録終了後、ニューロビオチンを細胞に注入し記録細胞を染色した。実験終了後、灌流固定し、記録細胞の組織化学的処理及び2型小胞型グルタミン酸トランスポーター(VGluT2)の免疫組織化学を用いた皮質のサブレイヤーの同定を行った。複数の皮質細胞のサブタイプにおいて、各サブレイヤー(主にII/IIIb, Va, Vb)からのデータを取得することが出来た。現在、個々の細胞においてスピンドル・ガンマ波とのカップリング状況を解析している。今年度は、ラットの大脳皮質から取得した皮質下の投射先が異なる2種類の錐体細胞と非錐体細胞(GABA細胞)の電気生理データから、スピンドル波・ガンマ波と皮質細胞との発火カップリングの強さ・発火位相について解析を行っている。視床から皮質への入力密度は皮質サブレイヤーに依存するため、皮質細胞のサブレイヤー(主にII/IIIb, Va, Vb)を組織学的に同定し、視床由来とされるスピンドル波と各皮質サブレイヤーでの発火特性の間の関係を検証している。また、錐体細胞の投射先に依存してスピンドル波・ガンマ波中との発火カップリングの強さ・発火位相が異なるかどうか、調べている。抑制性細胞については、物質発現についても比較した。染色状態が良好で形態の解析が可能な細胞については、その形態をNeurolucidaで再構成し形態学的解析を行っている。昨年の研究代表者の異動により研究の進捗がやや遅れているが、引き続き本研究課題に取り組んでいる。

ガンマ波の発生には皮質の抑制性細胞が主要な役割を果たし、スピンドル波は視床網様核がそのリズム生成に重要であると知られている。しかし、その詳細な生成メカニズムや神経活動との関係性は未だ良くわかっていない。本研究では、サブタイプや層を同定した大脳皮質神経細胞の発火活動とスピンドル波・ガンマ波と相関を調べ、これらのリズムの生成機構や皮質内での機能解明への貢献を目的とした。昨年度までに、大脳皮質5層の対側線条体に投射する細胞(CCS)と同側橋核に投射する細胞(CPn)並びに非錐体細胞(FS細胞)を同定し、電気生理記録・染色を行った。局所電場電位中のガンマ波の位相と皮質5層の個々の細胞の発火位相との関係を調べたところ、いくつかの細胞はガンマ波にロックした発火を示し、モジュレーションを受ける細胞の割合は、FS細胞と比べてCPn細胞において低いことがわかった。また、ガンマ波中の発火傾向は細胞タイプに依存し、錐体細胞(CCS細胞とCPn細胞)はFS細胞と比べて早い位相で発火することがわかった。今年度は、さらにサブレイヤーに分けてガンマ波・スピンドル波に関する解析を行ったところ、皮質細胞のサブタイプならびにサブレイヤーに依存してスピンドル・ガンマ振動中での発火特性が異なることがわかった。以上のことから、形態・機能が分化した皮質細胞サブタイプがスピンドル波・ガンマ波に対して異なる関与をする可能性が示唆される。睡眠時や麻酔下の大脳皮質から記録した脳波では徐波振動が観察され、個々の錐体細胞と同期して脱分極(Up)相と過分極(Down)相を繰り返している。さらにそのUp相の中にはガンマやスピンドルという振動が含まれるが、その詳細な生成メカニズムや神経活動との関係性は未だ良くわかっていない。本研究において、大脳皮質5層の異なる投射先を持つ錐体細胞(CCS細胞、CPn細胞)と非錐体細胞(FS細胞)の発火を記録しスピンドル波・ガンマ波との関係を調べたところ、細胞サブタイプによってモジュレーションを受ける細胞の割合や、スピンドル波・ガンマ波中の発火位相が異なることがわかった。引き続き、研究課題に沿ってデータの解析を行う。染色状態が良好で形態の解析が可能な細胞については、その形態をNeurolucidaで再構成し、形態学的解析も加えたい。引き続き、研究計画に従って電気生理データの解析を行う。並行して、染色状態が良好な細胞について、形態学的な解析を進める。神経科学研究代表者の異動により、物品の購入時期が遅れた為。研究の実施上必要となる物品に変更が生じ、購入時期が遅れた為。購入予定だった物品を次年度に購入し、研究を継続する。必要な物品を次年度早期に購入し、研究を継続する。
短パルス高出力レーザーによるコヒーレント軟X線生成と関連する物性の研究

黒田研究室では、超高光強度下における高密度物質相互作用研究を目的として、ピコ秒及びフェムト秒高出力レーザーの開発とそれによる新しい物理の研究に注力している。今年度における本研究の第一目標は、当該外国人特別研究員であるHao Teng氏がもつレーザー高度化技術を活用し、黒田研が所有するテラワット級チタンサファイヤレーザーシステムのさらなる高強度化・高品質化をめざす。これにより超高強度レーザーと高密度物質との相互作用、及び軟X線レーザーと高次高調波によるコヒーレント軟X線の生成・応用研究のための重要な道具立てを行えることになる。本年度はまず既存の10mJ、100fsチタンサファイヤレーザーシステムの改良を行った。具体的には従来のシステムに新方式のマルチパス増幅器を追加し、パルスコンプレツサー後の出力エネルギーを100mJまであげ、ピーク光強度1TWの達成に成功している。また超高強度レーザープラズマ実験を行う際に重要となるフェムト秒レーザー光の空間コヒーレンス向上を試みた。この目的達成のためには2つの手法を取り入れた。まず初めの方式ではマルチパス増幅器中にピンホール空間フィルターを導入した。この際、増幅媒質であるチタンサファイヤ結晶内においてビームフリンジが発生しないようにシステム全体の設計をしなおした。第2の方法ではdeformable mirrorを用いてフェムト秒レーザービームの波面補正を行い、ターゲット上におけるレーザー集光強度の増大を試みた。上記改良はすでに完了しており、現在は集光度向上を評価している。また異常磁場の生成や高エネルギー粒子生成という新しい物理の探究を目的として、20TW、11fsレーザーシステムの設計を開始している。このプロジェクトでもTeng氏は中心的な役割を担っており、着々と成果がでている。
ｓｉＲＮＡを標的とする蛍光性リガンドの創成と細胞内解析への応用

本研究では、RNAiの中核を担うsiRNAを標的とする蛍光性分子を開発し、これを利用した細胞内siRNA解析法の開発を試みた。siRNA構造的特徴である3'末端に存在するオーバーハング構造を認識するペプチド核酸を基本骨格として、そのN, C末端にそれぞれピレン、チアゾールオレンジを連結した分子がsiRNAオーバーハング選択的な発蛍光応答型プローブとして機能することを見出した。このプローブをsiRNAレポータとして用いることで、キャリアに内包されたsiRNAを選択的に可視化することが可能であった。本年度は、昨年度見出したsiRNAを標的とする蛍光性プローブの改良とその機能評価を行った。昨年度、siRNA構造的特徴である3'末端オーバーハング構造選択的な結合脳を持つプローブとしてPNA-TOを開発し、これがsiRNAオーバーハング選択的かつオーバーハング塩基識別能を有する発蛍光応答型プローブとして機能することを見出していたが、オーバーハングを持たないRNAなどに対する非特異的結合も大きく、その標的siRNAに対する選択性はそれほど高くなかった。そこで、PNA-TOのN末端にピレンを連結した新規蛍光性プローブPy-PNA-TOを設計、合成し、そのsiRNA結合選択性を検討した。その結果、PNA-TOに比べて最低でも3倍以上選択性が向上することを見出した。分光学、計算化学的解析により、得られた高いsiRNA結合選択性はピレン部位がTO部位に分子内スタッキングをすることで、TO部位単独による非特異結合を効果的に抑制していることが示唆された。上記Py-PNA-TOを用いて細胞内siRNA導入過程の蛍光イメージングを行った。ここでは、siRNAとPy-AA-TOの複合体を形成させた後に、高分子キャリアによるトランスフェクションを蛍光顕微鏡により観察した。その結果、キャリアに内包された複合体から輝点がおもに細胞質から観測された。蛍光色素修飾siRNAを用いた実験結果と併せて考察すると、プローブはキャリアに内包されている状態では蛍光を示すが、キャリアが崩壊し、細胞質に複合体が放出されると、プローブはすみやかにsiRNAから解離し無蛍光となることが分かった。一方で、重要なことに解離したプローブは細胞内に存在するRNAなどに結合せずバックグラウンド蛍光が極めて小さいことが分かった。したがって、本研究で開発したプローブはポリマー内包siRNAを選択的に可視化し、siRNA細胞導入過程を明瞭に解析できる新しいタイプの蛍光性プローブとして機能することが示唆された。研究課題であるsiRNAを標的とする蛍光性リガンドの合成とその機能評価を行った。まず、PNAとインターカレーターとを連結したコンジュゲートの合成について、標的siRNAに対応してPNA-アデニンモノマーを選択し、一方でインターカレーターとしては明瞭な発蛍光応答を示すチアゾールオレンジ(TO)を用いて、固相合成法にてコンジュゲートの合成を行った。ここでは、PNA, TOとを連結するアルキルリンカー長を変化させた一連のコンジュゲート群のsiRNA蛍光応答能を検討することで、リンカー長の最適化を行った。得られたコンジュゲートは、期待した通り、標的siRNAオーバーハング構造に対する選択性が発現し、明瞭な発蛍光応答を示すことを見出した。上記PNA(アデニン)-TOコンジュゲートを用いて細胞内siRNA解析へと適用した。ここでは、コンジュゲートが細胞透過性に乏しいことから、標的siRNA-コンジュゲート複合体を形成させた後、トランスフェクション剤と混ぜた後、蛍光顕微鏡にて観察を行った。その結果、細胞質にsiRNAに結合したコンジュゲート由来の蛍光が見られ、これはコンジュゲートの発蛍光応答が細胞内siRNA検出に有用であることを示唆している。さらにこの時、細胞内に導入されたsiRNAがRNAi活性を有していることが確認でき、開発したコンジュゲートを用いることで同一細胞にてsiRNA動態観察ならびにRNAi活性を評価できる可能性が示唆された。本研究で提案するPNAとインターカレーターとを連結したコンジュゲートがsiRNAオーバーハング選択性を示すことを見出し、siRNAに特化した蛍光プローブとして有用であることが分かった。加えて、予備検討として行った細胞内siRNA検出においても良好な結果が得られており。本手法に基づいた細胞内siRNA動的挙動解析へと発展・展開することが可能であると考えている。前年度で得られた蛍光性プローブ開発の結果をもとにして、結合親和性・オーバーハングに対する選択性・結合に伴う発蛍光応答の改良を目指す。ここでは、インターカレーターとしてチアゾールオレンジだけでなく、エチジウムブロマイド誘導体に着目し、よりsiRNA検出能に優れた蛍光性プローブの開発を図る。また、PNA-インターカレーターコンジュゲートに分子キャップを付与することで、オーバーハング塩基とのスタッキング相互作用を用いることができるため、有用な蛍光性プローブ開発における方法論として期待できる。ここでは、in vitroにおけるキャラクタライゼーションに加えて、細胞内siRNAに対する蛍光応答の結果と合わせて考察し、プローブ設計にフィードバックすることで、本系に適した蛍光性プローブへと進化させていく。

次年度使用額は、今年度の研究を遂行したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額と合わせて、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
二年生植物の開花を自在に操るための分子基盤の構築

本課題は、二年生植物の開花のタイミングが「質的かつ量的な低温要求性に依存する」ことに着目し、テンサイで発見されたユニークな低温要求性の変異系統を用い、全ゲノム情報を活用した解析を通じて、二年生植物の開花を自在に操ることを目的としており、以下の2つの小課題を実施した。1.屋外栽培での開花の誘導を決定づける量的低温要求性に関与する塩基多型の探索:平成30年度は、開花(抽苔)の誘導が気象条件に左右されることを考慮して、昨年度に引き続き、抽苔表現型データを取得した。具体的には、栽培環境下で開花が誘導されにくい(低温要求性の高い)系統であるNK-219mm-Oと開花が誘導されやすい(低温要求性の低い)系統であるNK-323mm-Oを両親とした、雑種第六世代(F6)系統群を用い、既に確立されている検定条件(人為春化処理法)に準じて、各系統の開花(抽苔)率を測定し、表現型の分離データを得た。また、既に2カ年分の表現型データが得られている雑種第六世代(F3)系統群については、QTL解析を実施して、2カ年共通の比較的効果の高いQTLを見出した。2.超短期間で開花が誘導できるBLONDの特性(質的低温要求性)に関与する塩基多型の探索:平成30年度は、上記と同様の理由で、昨年度に引き続き、抽苔表現型データを取得した。具体的には、全日長条件下で開花が誘導できるBLOND系統(NK- 420mm-O)と、開花が誘導されない通常の系統(NK-310mm-O)を両親とした雑種第三世代(F3)系統群を用い、既に開花が誘導されることが明らかな検定条件(全日長条件のガラス温室)で栽培して、各系統の開花(抽苔)率を測定し、表現型の分離データを得た。以上より、上記の1と2の両小課題で、遺伝解析に不可欠な2カ年分の表現型データの取得を計画通り進めることができた。平30年度は、本課題を構成する2種類の小課題である「屋外栽培での開花の誘導を決定づける量的低温要求性に関与する塩基多型の探索」と「超短期間で開花が誘導できるBLONDの特性(質的低温要求性)に関与する塩基多型の探索」のための遺伝解析集団より表現型の分離データを昨年に引き続き2カ年分取得することができた。そのため、本研究の目的である二年生植物の開花を自在に操るための分子基盤の構築へ向けて、当初の計画通りに進捗している。次年度は、これまでに取得した表現型データを用いて、関与遺伝子のゲノム上の位置を推定する。本課題は、二年生植物の開花のタイミングが「質的かつ量的な低温要求性に依存する」ことに着目し、テンサイで発見されたユニークな低温要求性の変異系統を用い、全ゲノム情報を活用した解析を通じて、二年生植物の開花を自在に操ることを目的としており、以下の2つの小課題で構成されている。1.屋外栽培での開花の誘導を決定づける量的低温要求性に関与する塩基多型の探索:平成29年度は、栽培環境下で開花が誘導されにくい(低温要求性の高い)系統であるNK-219mm-Oと開花が誘導されやすい(低温要求性の低い)系統であるNK-323mm-Oを両親とした、雑種第六世代(F6)系統群とした。この集団を用い、既に確立されている検定条件(人為春化処理法)に準じて、各系統の開花(抽苔)率を測定し、表現型の分離データを得た。2.超短期間で開花が誘導できるBLONDの特性(質的低温要求性)に関与する塩基多型の探索:平成29年度は、全日長条件下で開花が誘導できるBLOND系統(NK-420mm-O)と、開花が誘導されない通常の系統(NK-310mm-O)を両親とした雑種第三世代(F3)系統群を解析集団とした。この集団を用い、既に開花が誘導されることが明らかな検定条件(全日長条件のガラス温室)で栽培して、各系統の開花(抽苔)率を測定し、表現型の分離データを得た。以上より、上記の1と2の両小課題で、今後の遺伝解析に不可欠な表現型データが得られた。平成29年度は、本課題を構成する2種類の小課題である「屋外栽培での開花の誘導を決定づける量的低温要求性に関与する塩基多型の探索」と「超短期間で開花が誘導できるBLONDの特性(質的低温要求性)に関与する塩基多型の探索」のための遺伝解析集団より表現型の分離データを取得することができた。具体的には、栽培環境下で開花が誘導されにくい(低温要求性の高い)系統であるNK-219mm-Oと開花が誘導されやすい(低温要求性の低い)

系統であるNK-323mm-Oを両親とした、雑種第六世代(F6)系統群を用い、既に確立されている検定条件(人為春化処理法)に準じて、各系統の開花(抽苔)率を測定し、表現型の分離データを得た。また、既に2カ年分の表現型データが得られている雑種第六世代(F3)系統群については、QTL解析を実施して、2カ年共通の比較的効果の高いQTLを見出した。2.超短期間で開花が誘導できるBLONDの特性(質的低温要求性)に関与する塩基多型の探索:平成30年度は、上記と同様の理由で、昨年度に引き続き、抽苔表現型データを取得した。具体的には、全日長条件下で開花が誘導できるBLOND系統(NK- 420mm-O)と、開花が誘導されない通常の系統(NK-310mm-O)を両親とした雑種第三世代(F3)系統群を用い、既に開花が誘導されることが明らかな検定条件(全日長条件のガラス温室)で栽培して、各系統の開花(抽苔)率を測定し、表現型の分離データを得た。以上より、上記の1と2の両小課題で、遺伝解析に不可欠な2カ年分の表現型データの取得を計画通り進めることができた。平30年度は、本課題を構成する2種類の小課題である「屋外栽培での開花の誘導を決定づける量的低温要求性に関与する塩基多型の探索」と「超短期間で開花が誘導できるBLONDの特性(質的低温要求性)に関与する塩基多型の探索」のための遺伝解析集団より表現型の分離データを昨年に引き続き2カ年分取得することができた。そのため、本研究の目的である二年生植物の開花を自在に操るための分子基盤の構築へ向けて、当初の計画通りに進捗している。表現型は、屋外や屋内の気象条件に左右される側面がある。そのため、平成30年度も引き続き表現型の検定を継続する。加えて、その表現型データを用いて、関与遺伝子のゲノム上の位置を推定するために、ラフマッピングを、当初の計画通り実施する。次年度は、これまでに取得した表現型データを用いて、関与遺伝子のゲノム上の位置を推定する。平成29年度は、表現型のデータ取得を主な目的としており、研究課題を計画通り実施できた。繰越し金が発生したのは、翌年度に実施する予定であった分子遺伝学的実験の予備実験に必要な消耗品類の購入を、解析手法を再検討するために、先延ばししためである。今回発生した繰越し金は、解析が本格的に開始される平成30年度以降に課題遂行のために使用する。繰越し金が発生したのは、表現型データの取得と分子生物学的実験を効率よく進めることができたことが一因である。今回発生した繰越し金は、課題遂行のため次世代シーケンス解析を始め分子生物学的実験を行うために使用する。
Bach1ノックアウトマウスにおける脊髄損傷後の障害抑制の検討

Heme oxygenase-1(HO-1)は生体内で強力な抗酸化作用を有し、酸化ストレスによる組織傷害を抑制する。本研究の結果、Bach1 KOマウスでは、損傷脊髄におけるHO-1の発現が増加し、また神経組織傷害、アポトーシスおよび運動機能障害が抑制されることが分かった。したがって、Bach1のノックアウトによってHO-1の発現が増加し、脊髄損傷後の酸化ストレスによる脊髄障害が抑制されると考えられた。脊髄損傷における2次障害の原因として,近年酸化ストレスの影響が注目されている.Heme Oxygenase (HO-1)はHemeを分解し生体内で抗酸化物質を産生し、酸化ストレスに対する防御機構の一端をなす.過去の研究から、HO-1の抑制因子Bach1のノックアウトモデルでは、HO-1遺伝子の発現が強く誘導され、その結果、動脈硬化をはじめ肺障害、心筋障害といった酸化ストレスが関与する障害を抑制することがわかっている.本研究の目的はBach1ノックアウトマウスの脊髄損傷モデルを用いて、HO-1による損傷後の障害抑制効果を明らかにすることである。810週齢のBach1ノックアウトマウスとワイルドタイプマウスを本実験に用いた.Bach1ノックアウトマウスはC57BL/6Jマウスを最低12代バッククロッシングすることで作成した.マウス用に改造したNYUインパクターを用いてT10高位で脊髄を損傷した.術後42日まで麻痺の推移を調べた.その結果,Bach1ノックアウトマウスではワイルドタイプマウスに比べ,有意に麻痺の改善がみられた.術後342日後に脊髄を取り出し組織学的検討を行った.損傷中心から250μm頭尾側で42日後の障害組織面積を計測した.その結果,Bach1ノックアウトマウスではワイルドタイプマウスに比べ,有意に障害面積が小さかった.損傷中心とその250μm頭尾側で42日後の損傷中心とその250μm頭尾側で42日後のNeuN陽性細胞数を計測した.その結果,Bach1ノックアウトマウスではワイルドタイプマウスに比べ,有意に神経細胞の数が多かった.本研究から,HO-1の抑制因子Bach1のノックアウトマウスで脊髄損傷後組織障害と麻痺が有意に抑制されることが明らかになった.そして酸化ストレスが脊髄損傷における2次障害の原因となっていることが証明された.[目的]Bach1ノックアウト(KO)マウスの脊髄損傷モデルを用いて、損傷脊髄におけるHO-1発現の変化および脊髄傷害の抑制効果を検討した。[方法]成体雌のKOマウスおよび野生型(WT)マウスを用い、NYUimpactorで第10胸椎高位の脊髄損傷モデルを作成した。KOとWTマウスで以下の項目を解析し比較した。損傷後12時間から42日目までの運動機能をBasso mouse scale(BMS)を用いて経時的に評価した。損傷後3日目の脊髄におけるHO-1発現を免疫染色、Western blotで解析した。42日目の脊髄において、白質をLuxol Fast Blue染色で定量化し、さらに神経細胞数をNeuNの免疫染色で評価した。また、3日目の脊髄におけるアポトーシスをTUNEL染色およびcleaved-caspase-3のWestern blotで解析した。[結果]BMSでみた運動機能は、損傷後1日目以降、WTマウスに比べてKOマウスの方が平均点が高く、3, 7,21,28,35, 42日目で有意差がみられた。Western blotでのHO-1の発現はKOマウスの方が有意に多く、免疫染色でもKOマウスのHO-1陽性細胞数がより多くみられた。損傷後の脊髄白質、神経細胞数は共に、KOマウスの方が有意に多かった。損傷脊髄におけるTUNEL陽性細胞数およびcleaved-caspase-3の発現はKOマウスが有意に少なかった。[考察]本研究から、WTマウスに比べてBach1 KOマウスでは、脊髄損傷後にHO-1の発現が有意に多く、脊髄白質や神経細胞の傷害、アポトーシス、運動機能の障害が有意に少ないことが分かった。したがって、Bach1 KOマウスでは抗酸化作用をもつHO-1の発現が増加することにより、酸化ストレスによる脊髄傷害が抑制されたと考えられた。[結論]脊髄損傷においては、Bach1のノックアウトによって損傷脊髄内のHO-1発現が増加し、酸化ストレスによる脊髄傷害が抑制される。
網膜変性疾患に対する網膜再生分化の技術を応用した新規治療の開発

平成30年度には、1分化誘導に伴う発現遺伝子の変動について、網羅的遺伝子発現解析を行い、2新規細胞ソースとして、末梢血内皮細胞の可能性を検討した。また、3網膜変性の細胞モデルとしてのヒト変性視細胞モデルの作製・解析と並行し、in vitroモデルの検証のため、in vivoモデルとして作製したノックアウトゼブラフィッシュを用い、網膜変性の原因遺伝子が網膜変性を引き起こす機序解明を進めた。3網膜変性の細胞モデルとしてのヒト変性視細胞モデルの作製・解析について、解析の柱のひとつとして取り組んできたヒト変性視細胞モデルにおける変異型EYS遺伝子の転写産物の分解様式についてまとめた論文が査読付き国際誌に受理された。平成30年度には、1網膜前駆細胞への分化誘導を、A.ダイレクト・リプログラミング、B.インダイレクト・リプログラミングの2種類の方法を平行して進めることを念頭に、新規細胞ソースの開拓を行った。新規に血液由来内皮の細胞の単離・培養を行い、個体による増殖能にかなりの違いがあることを確認した。増殖能が低い個体があること、高齢の患者細胞の解析が必要になる可能性もあることを考慮し、血液由来血管内皮細胞は、本研究の細胞ソースには適していないと判断した。網膜前駆細胞への分化誘導実験は計画よりも遅れているが開始の目途は立っている。2網膜変性の細胞モデルとしてのヒト変性視細胞モデルの作製・解析と並行し、in vitroモデルの検証のため、in vivoモデルとしてのゼブラフィッシュモデルの作製・解析にとりかかった。本実験は当初計画には無かったものであるが、ノックアウトゼブラフィッシュの樹立に成功し、解析が順調に進んでいる。全体的にみて、おおむね順調であると考えられる。平成31年度には、1分化誘導に伴う発現遺伝子の変動について、網羅的遺伝子発現解析を行ったので、定量的な検証を加える。2網膜変性の細胞モデルとしてのヒト変性視細胞モデルの作製・解析と並行し、in vitroモデルの検証のため、in vivoモデルとして作製したノックアウトゼブラフィッシュを用い、網膜変性の原因遺伝子が網膜変性を引き起こす機序解明を継続する。3すでに、両者の網羅的遺伝子発現解析を行ったので、両者の結果の統合を試みる。4網膜変性の機序に関わる候補遺伝子のノックアウトを作製し解析する。5網膜変性に対する新規治療法について提案する。感覚の90%を占める重要な機能である視覚におけるセンサーである網膜は、1度損傷を受けると回復は困難である。失われた視覚の再生を目指して網膜の再生研究が行われているが、就労学齢期の失明原因の第1位を占める網膜色素変性症は神経網膜、その中でも最初に光を感受する細胞である視細胞を再生しないと視覚回復は期待できない。我々は、ヒト体細胞(虹彩細胞と皮膚線維芽細胞)からダイレクト・リプログラミングによって網膜視細胞様の細胞を作製することにすでに成功している。本研究は、ダイレクト・リプログラミングによる網膜視細胞作製を完成させ、応用範囲を広げることを目指している。平成27年度には、1平成28年度以降に予定されていた変性視細胞モデルの作製と解析を前倒しして開始した。単離・培養した網膜色素変性症患者細胞から変性視細胞を作出し解析した。特に、日本人常染色体劣性網膜色素変性症に多くみられるEYS遺伝子の変異を保有する患者の細胞由来転写産物の解析を行い、遺伝子変異の種類による違いあるいは分化誘導の時系列にそった変化を整理し、データの1部をセンター内発表会で発表した。2平成27年度に予定されていた研究として、細胞ソースをヒト眼球由来虹彩細胞やヒト皮膚線維芽細胞からヒト末梢血単核細胞へと広げ、誘導方法の改善を目指した。in vivoに近い条件で培養するため、ラット網膜色素上皮細胞との共培養を行い、3種類の転写因子を本来の発生過程に近い時系列で導入するために、レトロウィルスベクターと細胞質型RNAウィルスベクターを併用し導入した。現時点で、ヒト末梢血単核細胞から分化誘導した視細胞様細胞にロドプシンなど視細胞特異的遺伝子の発現と光応答が確認された(論文投稿中)。3長期誘導・最終分化を可能にするためには導入するベクターの改良することが必要であり、新規ベクターの開発に着手した。平成28年度以降に予定されていた変性視細胞モデルの作製と解析を前倒しして開始した一方で、平成27年度に予定されていた網膜前駆細胞の作製を平成28年度以降に持ち越した。平成28年度には、1変性視細胞モデルの作製と解析を行った。すなわち、単離・培養・凍結保存された網膜色素変性患者細胞から直接的分化誘導(Seko et al, 2012, 2014)によって視細胞様細胞(変性視細胞モデル)を作出し解析した。この細胞は、日本人常染色体劣性網膜色素変性に多くみられるEYS遺伝子変異を保有する患者由来であり、作製された変性視細胞モデルにおける転写産物の解析を主に行った。2細胞ソースをヒト眼球由来虹彩細胞やヒト皮膚線維芽細胞からヒト末梢血単核細胞へと広げ、誘導方法の改善を目指した。3種類の転写因子を本来の発生過程に近い時系列で導入するために、レトロウィルスベクターと細胞質型RNAウィルスベクターを併用し導入した。現時点で、ヒト末梢血単核細胞から分化誘導した視細胞様細胞にロドプシンなど視細胞特異的遺伝子の発現と光応答が確認され、論文としてまとめ掲載された。

3長期誘導・最終分化を可能にするためには導入するベクターを改良することが必要であり、新規ベクターを開発した。分化誘導効率が改善されることを確認したが、ロドプシンの発現は不十分である。一方で、in vivoモデルとしてのゼブラフィッシュモデルの作製・解析を始めるにあたり、野生型のゼブラフィッシュを用い、網膜電図による機能解析を始めた。試行錯誤により、錐体応答を検出することには成功した。。間接的分化誘導の実験が遅れているが、in vovoモデルとしてのゼブラフィッシュを用いた研究が進み、総合的に見て、おおむね順調であると考えられる。平成29年度は、1-a.変性視細胞モデルの作製と解析を継続した。単離・培養した網膜色素変性患者細胞から変性視細胞を作出し解析した。特に、日本人常染色体劣性網膜色素変性に多くみられるEYS遺伝子の変異を保有する患者の細胞由来転写産物のマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った。バイオマーカーの発掘を目指し、現在、解析中である。1-b.変性視細胞モデルにおけるEYS遺伝子の転写産物の解析も行った。変異の種類の違いによる分解様式の違いが示唆され、論文にまとめ、投稿準備中である。2分化誘導を、A.ダイレクト・リプログラミング、B.インダイレクト・リプログラミングの2種類の方法を平行して進めることを念頭に、新規細胞ソースの開拓を行った。血液由来の細胞の単離・培養を行い、個体による増殖能にかなりの違いがあることが判明した。今後の研究に用いる細胞ソースについて検討中である。3網膜変性の細胞モデルとしてのヒト変性視細胞モデルの作製・解析と並行し、in vitroモデルの検証のため、in vivoモデルとしてのゼブラフィッシュモデルの作製・解析にとりかかり、ノックアウトゼブラフィッシュの樹立に成功した。網膜電図による野生型ゼブラフィッシュを用いた機能解析では、錐体応答の検出には成功したが、杆体応答の検出には課題が残っている。今後は、in vitroモデルとin vivoモデルの情報を共有し病態解析を進める。これまでの成果の1部については論文発表に向けて準備中である。また、別の成果は平成30年度5月の国際学会で発表した。その他新規性の高い知見も複数得られており、複数の成果発表を目指している。平成30年度には、1分化誘導に伴う発現遺伝子の変動について、網羅的遺伝子発現解析を行い、2新規細胞ソースとして、末梢血内皮細胞の可能性を検討した。また、3網膜変性の細胞モデルとしてのヒト変性視細胞モデルの作製・解析と並行し、in vitroモデルの検証のため、in vivoモデルとして作製したノックアウトゼブラフィッシュを用い、網膜変性の原因遺伝子が網膜変性を引き起こす機序解明を進めた。3網膜変性の細胞モデルとしてのヒト変性視細胞モデルの作製・解析について、解析の柱のひとつとして取り組んできたヒト変性視細胞モデルにおける変異型EYS遺伝子の転写産物の分解様式についてまとめた論文が査読付き国際誌に受理された。
逐次近似法を用いた腹部CT低線量撮影における適切な線量の検討

本研究の目的は、腹部CT画像を逐次近似法(IR)を用いて再構成した場合に、従来のフィルタ補正逆投影法(FBP)を用いて再構成した画像と比較して診断能を低下させない範囲で、どの程度まで線量を低減できるかを検討することである。ファントムを用いて放射線科医による診断能を検討したところ、同じ線量で撮影した画像で比較するとFBPとIRで診断能に差を認めなかった。通常線量で撮影してFBPで再構成した画像と比較すると、半分の線量で撮影してIRで再構成した画像では有意に診断能が低下した。IR法を用いても、線量を過剰に低下させると診断能の低下を招く可能性がある。本研究の目的は、逐次近似画像再構成法(Iterative Reconstruction; IR)を用いることで、従来の線量及び画像再構成法(Filtered Back Projection; FBP)を用いて撮影した画像と比較して診断能を低下させない範囲でどの程度までCTの被曝を低減できるかを検討し、腹部における適切な低線量CTの撮影条件を確立することである。平成26年度は病変評価用ファントム作成のための予備実験として、模擬肝臓および模擬病変の作成を行った。本研究は肝臓に生じる腫瘍性病変の検出能について検討することを想定しており、実際の人体の肝臓および病変のCT値に近いファントムを作成する必要がある。そこで、希釈造影剤の濃度を変えて様々なファントムを作成し、CT装置で撮影を行った上で、得られた画像を解析してCT値の計測を行った。造影多時相CTの動脈相あるいは門脈相における肝実質の濃度に相当するCT値や、多血性あるいは乏血性の肝腫瘍に相当するCT値のファントムが得られるような造影剤濃度について検討を行った。また、低線量撮影時のノイズの量についても検討を行い、実際に病変評価用ファントムを撮影する線量の範囲について検討を行った。次年度はこの検討の結果を元にして、適切な濃度で作成した模擬肝臓および模擬病変を用いて病変評価用ファントムを複数作成し、様々な線量で撮影した上で、病変の診断能を評価して、適切な撮影条件について検討を行っている予定である。平成27年度は前年の実験結果を元にして実際にファントムを作成し、撮影を行って診断能を検討した。多血性肝腫瘍を模した球体(径5mmまたは10mm)を特注にて作成し、これを肝実質を模した寒天(造影剤にてCT値を調整)の内部にランダムに配置した円筒状のファントムを30個作成し、CT装置で撮影した。撮影線量は通常臨床で使用する程度の線量とその75%、50%の線量の計3種類の線量で撮影し、それぞれFBP法で再構成した。75%、50%で撮影した画像はIR法でも再構成を行い、計5種類の画像(100% FBP, 75% FBP, 75% IR, 50% FBP, 50% IR)を各ファントムにつき作成した。これらの画像を2名の放射線科医が評価し、病変の有無と位置を診断した。JAFROC解析の手法を用い、5種類の画像間で診断能を比較検討した。この結果、同じ線量(75%あるいは50%)間ではFBPとIRで診断能に差を認めなかった。また、50%の線量ではIR法を用いても、100%のFBP画像と比較して有意に診断能が低い結果となった。以上より、本研究で使用したCT装置ではIR法を用いても診断能の改善は期待できず、撮影線量を低下させると診断能の低下を招く可能性があることが示された。本研究の結果は2016年の欧州腹部消化器放射線学会(ESGAR)で発表予定である。前年度は模擬腫瘍の作成が困難であったため進捗が遅れていたが、業者に依頼して特注で作成してもらうことで解決できた。その後は特に問題なく、ほぼ予定通り研究を遂行できている。

ファントムを用いて放射線科医による診断能を検討したところ、同じ線量で撮影した画像で比較するとFBPとIRで診断能に差を認めなかった。通常線量で撮影してFBPで再構成した画像と比較すると、半分の線量で撮影してIRで再構成した画像では有意に診断能が低下した。IR法を用いても、線量を過剰に低下させると診断能の低下を招く可能性がある。病変の診断能を適切に評価するためには径1cm以下の模擬病変を複数作成し、それらを肝臓ファントム内にランダムに配置する必要があるが、以下の問題点があり、対応策を検討中である。1.小さな球形の模擬病変を作ることが技術的にやや難しい2.肝臓ファントム内に後から模擬病変を配置することができないため、模擬病変を配置しながら効率的に肝臓ファントムを作成する方法を模索する必要がある当施設での実験は終了しており、結果は2016年の欧州腹部消化器放射線学会(ESGAR)で発表予定である。現在、論文投稿のため執筆中である。また、他施設で新たな逐次近似法が使用できるCT装置が導入されたため、その施設の研究者と協力して新たな検討を行う予定である。放射線医学.現状の問題点について対策を行い、病変評価用のファントムが作成を試みる。複数のファントムを作成し、それらを様々な線量で撮影した上で、診断能の評価を行い、適切な線量を検討していく予定である。研究は概ね順調に遂行できたが、学会発表および論文投稿が当年度中にできなかったため。国内学会における情報収集・調査用に旅費を計上していたが、該当する国内学会への参加を行わなかったため。国際学会発表の旅費、論文投稿の際の英文校正、別刷代に使用する予定である。ファントム作成用の材料費、データ保存用媒体、論文の英文校正・別刷代等に使用する予定である。