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再発見された絶滅種アイナエ（マチン科）の保全のための生活史と遺伝的多様性の解明

大阪市立大学理学部付属植物園で発見された絶滅種アイナエ(マチン科)の保全を図るため,分布状況、生活史、環境条件、交配様式および遺伝的多様性の解明を行った。その結果大阪府では4地点で分布が確認された。野外集団では5月末に実生が出現し成長して8月10月に開花結実した。種子は光発芽種子で、発芽・生育には十分な光が必要であることが判明した。交配実験からこの植物は自家和合性で自家受粉の割合が高いことが推定された。地理的遺伝構造はみとめられず植物園の集団の由来は不明瞭であった。この植物の保全には発芽成長期の光環境の確保が重要であり、フェノロジーに対応させた除草の実施が有効であると考えられる。都市近郊の森の博物館大阪市立大学理学部附属植物園内で発見された大阪府絶滅植物アイナエ(マチン科)の保全のために近畿についての標本庫の標本からの分布調査、野外での遺伝的多様性・生活史特性・および生育に適した環境条件の解明を目指して研究を進めた。25年度は特にアイナエの生活史と生育環境についての研究を中心に行った。生活史については、本年度はフェノロジーと交配様式を調査した。交配様式については近畿の自生4集団での比較を行い、生育環境については植物園内で光環境の測定・個体数調査を行った。その結果以下のことが明らかになった。1)アイナエは5月下旬からその実生が出現し8月下旬から開花結実を開始した。結実率は調査4集団で平均38.2%、袋がけ実験からは自家和合性であることも明らかになった。2)出現頻度と光条件とは関連が認められ,この種の生育には光条件が良いことが必須であることが判明した。3)植物園では本種の開花前の7月8月上旬に機械による草刈りが数回実施されているが、個体数調査からはアイナエ個体群の変動にはこの影響はほとんどなかった。これらのことから、アイナエ個体群の維持にはフェノロジーから明らかになった8月中旬以降の開花結実期に影響を与えない時期の現在の草地管理がアイナエの生育・繁殖を助長していることが判明した。遺伝的多様性については現在実験を継続中である。標本庫調査は大阪自然史博物館、鹿児島学博物館等で標本調査を行いその結果分、大阪では2000年以降、新たに2ヶ所で採集されていることが明らかになった。都市近郊の森の博物館大阪市立大学理学部附属植物園内で発見された大阪府絶滅植物アイナエ(マチン科)の保全のために近畿についての標本庫の標本からの分布調査、野外での遺伝的多様性・生活史特性・および生育に適した環境条件の解明を目指した。26年度には(1)生育環境の評価、(2)種子発芽特性の解明、(3)遺伝的多様性の解析および(4)集団間の系統解析行った。(1)についてはこれに関して個体群変動、個体サイズ、光条件、土壌水分含量の調査を行った。(2)については明暗交代条件と暗条件による発芽実験を行った。(3)および(4)については野外集団からのサンプリングの継続とDNA抽出を行い、有効なプライマーの探索を試みた。その結果、(1)5月下旬から野外での実生が出現し8月上旬から開花結実を開始した。個体サイズが大きい個体ほど結実数も多く、出現頻度と光条件に関連が認められた。個体の出現地は非出現地より土壌水分含量が多いことが分かった。(2)段階温度法における温度上昇系(IT系)明暗交代条件で多くの発芽が確認でき、5地点平均約17%、最大39.47%の発芽率を得た。最適発芽温度は30°C前後であると分かった。他の条件であるIT系暗条件、温度下降系(DT系)で発芽率は13%と非常に低く、光発芽種子であることが明らかになった。(3)については有効なプライマーを見つけるのに困難が伴い、近縁科のプライマーを試みるための準備段階までしか到達できなかった。(4)については葉緑体DNA11領域および核DNA2領域についての解析を行い、5領域で集団間に変異が見られる事が明らかになった。これらの成果の一部は共同研究者の植松が自らの科研の成果還元・社会貢献事業のひらめき☆ときめきサイエンスのプログラムのなかで高校生対象に紹介をおこなった。里草地の絶滅危惧種の中には基礎的生活史情報すら不明のまま個体数が激減している種も少なくない。その個体群の存続や回復には次世代供給である種子の発芽特性を含めその生育環境を明らかにしてく必要がある。材料としたアイナエ(マチン科)は大阪府では絶滅種とされていたが大阪市立大学理学部附属植物園で再発見され絶滅危惧種へと変更された。園内のこの種の保全のため近畿各地での分布状況、生活史特性、生育環境、遺伝的多様性の解明を行った。その結果(1)大阪府では4地点で分布・生育を確認できた。(2)生活史特性から5月下旬から実生が出現し、8月中旬から開花結実しこの時期が保全上重要であることが示された。さらに光発芽種子であり、交配様式は自家和合性で自家受粉を主とするが他家受粉も行っていることが明らかになった。(3)野外での出現・生育には光条件が特に重要であることが判明した。平成27年度には植物園集団の遺伝構造とその由来(自生か移入か)についての解析を行い

(4)SSR多型による遺伝構造の解析をめざし近縁グループから2種類のSSRプライマーを設計して試みたが全く増幅せず解析を行うには不十分であることが判明した。さらに(5)植物園集団の由来の解析のため用いた葉緑体DNA11遺伝子座のうち3遺伝子座で多型が見られ、これらを用いた8集団の解析結果からは距離的に近いはずの大阪集団間でのまとまりが認められず植物園集団の由来については解明することができなかった、ただし各集団内に多型が見られこれは完全自殖型ではないという交配実験の結果と一致した。これらの結果からこの種の保全には発芽成長期の光環境の確保が重要であり、フェノロジーに対応させた除草の実施が有効であることが示された。この結果は平成27年11月にSSH事業で高校生に講演しさらに共同研究者植松の「ひらめき☆ときめきサイエンス」でも紹介し地域還元を行った。大阪市立大学理学部付属植物園で発見された絶滅種アイナエ(マチン科)の保全を図るため,分布状況、生活史、環境条件、交配様式および遺伝的多様性の解明を行った。その結果大阪府では4地点で分布が確認された。野外集団では5月末に実生が出現し成長して8月10月に開花結実した。種子は光発芽種子で、発芽・生育には十分な光が必要であることが判明した。交配実験からこの植物は自家和合性で自家受粉の割合が高いことが推定された。地理的遺伝構造はみとめられず植物園の集団の由来は不明瞭であった。この植物の保全には発芽成長期の光環境の確保が重要であり、フェノロジーに対応させた除草の実施が有効であると考えられる。分布情報と生活史については既に平成25年度に研究が終了した。生育環境については、光環境および水分環境についての調査は概ね予定通り進展した。この間に本種の新たな分布地情報も得ることができた。だ他光環境については長期的な観察の必要性も示唆された。発芽実験についても概ね予定通り進展して光発芽種子である可能性が示唆された。系統解析においては有効と考えられるプライマーが5領域について見つかっており、系統解析に使用できる結果が得られている。一方SSR解析については、さらにDNA抽出をおこなったが有効なプライマー情報が少なく、近縁科で使えるプライマーの探索が終了したところである。生物学平成27年度は調査データの補填と遺伝的な解明を中心とし、得られた結果についての一般への情報発信を目指す。そのために平成27年度は次の4点の計画を実施する。(1)系統解析および集団の遺伝的多様性解明(SSR多型解析)のためにDNAプライマーの探索と有効性を検証しそのDNA遺伝子座を用いて集団間の系統解析および植物園集団での遺伝的多様性評価を試みる。(2)SSR解析については有効なプライマーが見つからなかった場合でもその交配システムが解明できるように野外集団で交配実験を行い交配様式の解明を試みる(3)前年度に採取した野外数集団からの種子を用い、段階温度法実験を行い2年間のデータを解析し発芽特性を明らかにする。(4)光環境を解明するために長期の光環境測定をオプトリーフを用いて行い、今まで得られたデータとともに解析を行う。(5)今までのデータから本種の保全法を策定し、このことを含め一般向けのパンフレットを作成し、大阪市立大学理学部附属植物園での配布、高校生向けの出前授業等で配布する。目的とした生活史と生育環境については、概ね予定通り観察解析が進展終了した。また各地からの種子の採取も順調であり現在発芽特性実験を継続中である。
ショウジョウバエにおける器官形成の遺伝的制御

ショウジョバエのescargo(esg)は成虫発生に必須なはたらきを行なう遺伝子である。本年度はesgの生体内の機能を解析するために突然変異体の表現型の詳細な解析を行ない以下の事実をあきらかにした。1)esg突然変異体で強い異常の見られる腹部を形成する腹部ヒストブラストの形態を調べた所esg変異体の三令幼虫においては通常二倍体のヒストブラストが巨大化して多倍体になっており周囲の幼虫の体細胞と区別できなくなっていた。一方幼虫期に盛んに細胞分裂を繰り返している成虫原基でも細胞分裂がraf遺伝子の停止した状態でesg突然変異が作用するしDNA含量が増大した核を持つ細胞が検出された。つまり細胞分裂の停止とesg突然変異という二つの条件が重なると将来成虫構造を作る2倍体細胞が幼虫細胞のような巨大化した細胞になると考えることができる。2)通常esgを発現しておらず多倍体になる幼虫の唾液線細胞でesgをectopicに発現させる実験を行った。このような個体は唾液線の発達が著しく遅れ通常ポリテン化する唾液線染色体でのDNA合成も強く阻害されて大幅な生存率の低下が見られた。この結果はesgの発現は幼虫体細胞のDNA含量の増大の生育を阻害することを示す。以上述べた結果によりesgは将来の成虫組識になり細胞で発現し、二倍体の核型を維持するために必須な働きを充制御因子であることが明らかとなった。esgは細胞十期でのGIチェックポイントノ存在に迫る有力な手がかりになると考えている。
損傷運動ニューロンにおけるDNAメチル化と遺伝子発現制御

ラット・マウス末梢運動ニューロンは損傷に対する耐性が異なる。我々はこの原因がマウス損傷運動ニューロン特異的な神経細胞型グルタミン酸トランスポーターEAAC1の転写抑制であることを明らかにした。このEAAC1転写抑制にはDNAメチル化転移酵素Dnmt1が何らかの形で関与しているのではないのかと考えられた。なぜならEAAC1とは逆にDnmt1はマウス損傷運動ニューロン特異的に発現上昇し核内へ移行していたからである。Dnmt1は分裂増殖する細胞でDNAメチル化転移酵素として機能する一方で、転写抑制成分をリクルートする足場としても機能する。そこで我々は神経系におけるDnmt1によるEAAC1転写抑制メカニズムを明らかにする目的で実験を行った。EAAC1プロモーターにはCpG配列の豊富な領域が存在し、この領域を介してDnmt1による制御を受けている可能性が高い。分化したPC12細胞をDnmt1阻害剤やHDAC阻害剤で処理するとEAAC1 mRNAは発現上昇した。bisulfite sequence法を用いてこれら刺激前後のEAAC1プロモーターCpG配列のDNAメチル化状態を検討した結果、CpG配列メチル化の程度は刺激前後で変化が認められなかった。これはDnmt1がDNAメチル化転移酵素としてよりもむしろ転写抑制成分をリクルートする足場として機能することを示唆していた。この場合CpGメチル化配列へ直接結合するDNA結合蛋白の存在が必須であり、MeCP2がその候補として極めて可能性が高い。我々は現在EAAC1プロモーター配列-MeCP2-Dnmt1の複合体形成を明らかにする実験を遂行中であり、これらのデータによりDnmt1によるEAAC1転写抑制メカニズムの一部を明らかにすることが出来ると考えている。損傷を受けた末梢運動ニューロンはラット・マウス間で逆の運命をたどる。ラット損傷運動ニューロンは生存再生するのに対し、マウスでは徐々に神経細胞死が引き起こされる。これはマウス損傷運動ニューロン特異的に神経細胞型グルタミン酸トランスポーターEAAC1の発現が抑制されることが原因であると考えられた。このようなラット・マウス間の遺伝子発現制御の違いには遺伝的背景が深く関与していると考えられた。そこで我々は1.マウスEAAC1プロモーター解析と2.マウス損傷運動ニューロンでのDNAメチル化あるいはメチル化転移酵素の発現動態の検討を行い、マウス損傷運動ニューロンで見られるEAAC1発現抑制のメカニズムを明らかにする目的で実験を行った。1.マウスEAAC1プロモーター解析各種長さのマウスEAAC1プロモーター領域にルシフェラーゼをつないだコンストラクトを作製しプロモーターアッセイを行った。その結果EAAC1プロモーター3'側領域に転写抑制を担う領域が含まれており、この部分を削ると著しくプロモーター活性が上昇することが明らかになった。また、この領域は極めてCGリッチな配列を含んでおり、DNAメチル化と何らかの関係を有すると考えられた。次年度はこのEAAC1プロモーター活性抑制効果のメカニズムを詳細に検討する。2.損傷運動ニューロンにおけるDNAメチル化転移酵素の発現動態3種類のファミリーからなるDNAメチル化転移酵素(Dnmt)のうち、マウス損傷運動ニューロンではDnmt1が神経損傷12時間後に転写促進し、Dnmt1蛋白質が損傷後24時間で核内へ集積することが明らかになった。しかしこのような変化はラットでは認められなかった。これはマウス損傷運動ニューロン特異的にひきおこされる遺伝子発現調節にDnmt1が何らかの影響を与えていることを示唆すると考えられる。
光格子中における中性フェルミ原子の高温超流動状態の研究

量子多体効果は多様な物理現象を起こす凝縮系物理学において、根幹をなすものである。そのもっともな顕著な例は、モット絶縁体相である。モット絶縁体相においては、粒子間の強い斥力相互作用によって、伝導性が強く抑制される。これまでに、冷却原子系の進展によって固体中の電子系に対応したモット絶縁体相が光格子中の原子系において近年、アルカリ原子において実現した。本研究においても、イッテルビウム(Yb)原子のボース同位体<174>^Yb, <170>^Yb)においても、超流動-モット絶縁体転移を観測した。これについては、すでに、以前の研究報告書においても報告した通りである。本年度は、昨年度に引き続き、3次元光格子中のボース原子と多成分フェルミ原子からなる混合量子縮退に着目し、強相関原子混合系(Strongly-Correlated Atomic Quantum Mixture System)の実現とその振る舞いについて研究を行った。本年度における主な研究成果は以下の3つに分けられる。(1)異種間が斥力相互作用する2つのモット絶縁体は、2つのモット絶縁体の大きさによって、混合モット絶縁体状態(Mixed Mott Insulator)と呼ばれる新しい量子相と相分離した絶縁体相(Phase Separated Insulators)の間のクロスオーバーが起きることを実験的に明らかにした。(2)異種間が引力相互作用する場合は、2つのモット絶縁体の大きさによって、異なる複合粒子(Composite Particles)が形成されることを実験的に示した。(3)相互作用し合う2つのモット絶縁体における熱力学特性を明らかにした。斥力側では、Pomeranchuk効果により冷却の効果が働き、一方で引力側では"anti-"Pomeranchuk効果が働き、加熱が起きることを示した。本研究の目的は、量子縮退イッテルビウム原子を用いて、光格子中の中性フェルミ原子の超流動状態を研究することである。本年度の主な達成事項として、二点挙げられる。一つは、安定な3次元光格子の作成に成功したことである。これによって、統計性の異なるさまざまな量子縮退イッテルビウム原子気体を3次元光格子へ導入することが可能となった。二つ目は、光格子中の原子集団をプローブする方法、およびその技術の確立である。まず、イッテルビウムのボース同位体である174Ybのボース・アインシュタイン凝縮体を3次元光格子に導入した系では、多重物質波干渉を観測することで、ボソンの超流動-モット絶縁体転移を実現した。また、1光子光会合を用いることで、モット絶縁体状態での格子中の占有数を調べた。さらに、イッテルビウムの特徴の一つであるISO状態-3P2状態間の超狭線幅の光学遷移を用いた高分解能分光を行って、モット絶縁体状態におけるモット・シェル構造を分光して、そのエネルギースペクトルを得ることにも成功した。さらに、ボース・フェルミ混合量子縮退を3次元光格子へ導入した系を作り、フェルミオンの影響を調べた。ボソン・フェルミオン間が斥力相互作用する174Yb-173Ybボース・フェルミ混合量子縮退と引力相互作用する170Yb-173Ybボース・フェルミ混合量子縮退を用意して、それぞれ3次元光格子へ導入して、ボソンの多重物質波干渉を観測することで混合系とボソン単体の場合との比較した。本研究の目的は、光格子中における中性フェルミ原子の高温超流動状態の研究を行うことである。第1年度目においては、3次元光格子中にイッテルビウム(Yb)原子のボース同位体の^<174>Ybのボース・アインシュタイン凝縮を導入して、光格子を断熱的に立ち上げてゆくことで、超流動・モット絶縁体転移を実現した。また、Yb同位体のボース・フェルミ混合系を3次元光格子中に導入することにも成功し、ボゾンの位相コヒーレンスへの影響等を調べた。第2年度目では、初年度の成果を踏まえて、さらに3次元光格子中のYbボース・フェルミ混合系の振る舞いについて系統的に研究を行い、本研究において深く関連する、ハバードモデルの理解を深めた。Yb原子に豊富な同位体があることを生かして、二種類の量子縮退したボース・フェルミ混合系を用いた。^<174>Yb-^<173>Ybボース・フェルミ混合系は、ボゾン・フェルミオン間の散乱長が+7.3nmであり、斥力相互作用する。^<170>Yb-^<173>Ybボース・フェルミ混合系は、ボゾン・フェルミオン間の散乱長が-4.2nmであり、引力相互作用する。このように相互作用が異なる2種類のイッテルビウム同位体の混合系を用意することで、異種間相互作用が、どのように系の振る舞いに影響を与えるか調べた。光格子中の原子のプローブする方法として、ボゾンの多重物質波干渉の観測による位相コヒーレンスのプローブと同核および異核の光会合分光を用いた二重占有数とボース・フェルミペア占有数の測定を行った。異種間相互作用の違いによって、二重占有数およびペア占有数の原子数依存性が大きく異なることを明らかにした。また、占有数の測定結果を、ハバード模型の数値計算と学外の研究者の協力を得て比較することにより、定量的によい一致を示すことを確認した。これにより、3次元光格子中のボース・フェルミ混合系の基礎的な振る舞い、およびボース・フェルミハバードモデルの理解を進めることに成功した。

量子多体効果は多様な物理現象を起こす凝縮系物理学において、根幹をなすものである。そのもっともな顕著な例は、モット絶縁体相である。モット絶縁体相においては、粒子間の強い斥力相互作用によって、伝導性が強く抑制される。これまでに、冷却原子系の進展によって固体中の電子系に対応したモット絶縁体相が光格子中の原子系において近年、アルカリ原子において実現した。本研究においても、イッテルビウム(Yb)原子のボース同位体<174>^Yb, <170>^Yb)においても、超流動-モット絶縁体転移を観測した。これについては、すでに、以前の研究報告書においても報告した通りである。本年度は、昨年度に引き続き、3次元光格子中のボース原子と多成分フェルミ原子からなる混合量子縮退に着目し、強相関原子混合系(Strongly-Correlated Atomic Quantum Mixture System)の実現とその振る舞いについて研究を行った。本年度における主な研究成果は以下の3つに分けられる。(1)異種間が斥力相互作用する2つのモット絶縁体は、2つのモット絶縁体の大きさによって、混合モット絶縁体状態(Mixed Mott Insulator)と呼ばれる新しい量子相と相分離した絶縁体相(Phase Separated Insulators)の間のクロスオーバーが起きることを実験的に明らかにした。(2)異種間が引力相互作用する場合は、2つのモット絶縁体の大きさによって、異なる複合粒子(Composite Particles)が形成されることを実験的に示した。(3)相互作用し合う2つのモット絶縁体における熱力学特性を明らかにした。斥力側では、Pomeranchuk効果により冷却の効果が働き、一方で引力側では"anti-"Pomeranchuk効果が働き、加熱が起きることを示した。
異型葉形成の生理機構の解析

本研究の目的は、水辺に生育する植物に見られる環境適応形態の一つの現れである、異型葉形成の生理学的基礎とその分子機構を明らかにすることである。前年度には、アカバナ科チョウジタデ属Ludwigia arcuataを用いて、水生葉を決定するのはエチレンであり、陸生葉を決定するのはアブシジン酸(ABA)であり、両者の間には拮抗的関係があること。また、L.arcuataが水没すると植物体にエチレンが蓄積され、その結果ABAレベルが低下し、水中葉を形成することを明らかにした。つまり、形態形成の最終段階で働くのはABAであるということである。本年度は、中位の葉に見られる、葉の形態形成のユニークな様式を明らかにすることに中心をおいて研究を進めた。すなわち、上位の葉では、その環境条件に適応して葉の形態を水中あるいは陸生葉とするが、下位では最早その可変性は失われている。ところが、中位では、水中→陸生、陸生→水中のいずれの場合であっても、一旦進行しつつあるプログラムを変化させることが可能で、その結果水中→陸生の変化では、葉の先端から分化の決定が始まることから、スプーン型の葉を生じ、陸生→水中の場合には、槍型の葉の形態を形成するという極めてユニークな形態変化をもたらすことを明らかにした。すなわち、「植物の発生分化の可塑的応答」反応が可視化できるという極めてユニークな系であることを示した。しかもこの変化には、間には、前年度調べた植物ホルモンのエチレンとABAの作用が関与しているので、植物ホルモンを介した形態形成の可塑的変化であることがユニークである。更に、これらの反応の結果最終的に細葉の水中葉と幅広の陸生葉の成立は、細胞分裂が関っていることを明らかにしている。従って、植物における可塑的形態研究のモデル系がこれで確立したと考える。アカバナ科Ludwigia arcuataは、水没により葉身が細くなるという異型葉性を示すことは、予備実験において確認されていたが、この誘導に関わる内因性の因子としてエチレンを確定することが出来た。一方、巾の広い陸上型の形成には別の植物ホルモンアブシジン酸(ABA)が関わっていることが示された。両者は、互いに拮抗的に作用するが、詳しい解析の結果わかったことは、葉身の幅の狭広は基本的にABAのレベルの高低で決まることであった。それでは、いかにして水没型が形成するかであるが、エチレンはABA濃度を低下させるという観測データを考慮すると、まず、水没によりエチレンが組織内にたまり、その結果ABAの濃度を低下させ、水没型を形成するというものであった。なお、これらの変化は細胞の伸長ではなく、細胞分裂であることが本実験系で見られた特徴であった。ところで、先端の葉位の若い葉では、ここで述べた変化が起こるが、基部の古い葉ではこのような応答は最早見られない。ところが、両者の中間領域では、葉身の縦横比が、先端より基部へ向けてある勾配を持って変化するという興味ある変化が観察された。しかも個別の葉を精査したところ、環境変化に可変なのは基部のみであることであった。葉の形態形成の初期から追跡すると、水中型、陸上型の変化は比較的早い段階で方向付けられるが、ある時期までは変かに対して可変であり、いわば分化の可塑性を保持しているが、ある段階で決定が起こり、それ以降は不可変であるという段階を踏んで、変わっていることが明らかとなった。これは、これまで余り知られていない分化の可塑性の研究に好適な系であることを示している。
非接地型低自由度力覚提示装置によるバーチャル物体表現に関する研究

本研究では低自由度力覚提示装置とフラットパネルディスプレイ、タッチセンサを組み合わせた直接指示・間接指示環境を構築し、低自由度力覚提示装置によるバーチャル物体の力覚レンダリング手法を提案した。直接指示環境と間接指示環境でのポインティング精度実験の結果、力覚提示装置を付加することで両者のパフォーマンスの差が無くなること、さらには擬似力覚と併用することで力覚提示装置単体の性能を上回る力覚知覚が可能であることが明らかとなった。本年度は力覚提示装置および力覚レンダリングアルゴリズムの開発行い、性能評価を行った。力覚提示装置は1自由度力覚提示装置および2自由度力覚提示装置を開発した。両者とも人差し指の可動域に合わせ、マウス程度の大きさで机などの平面上を動かせる。センシングは、光学式エンコーダによるリンクの角度情報および装置の位置を光学式マウスに用いられているセンサを2つ用いて、力覚提示装置の位置姿勢および効果器の位置を特定する。アクチュエータには小型DCサーボモータを1ないし2個用いPWM方式のモータドライバで駆動する。力覚レンダリングには基本的にはペナルティ法を用いた。すなわち力覚堤不装置の効果器位置がVR物体にめり込んでいれば最近傍の面に向かうカベクトルを提示する。1自由度力覚提示装置はVR物体のハイトマップに基づいて効果器位置の高さ情報を提示した。1自由度での物体認識を球や角柱、円柱、角錐、円錐等の基本形状を用いて、形状や大きさ、提示位置を複数用意して映像との違和感を計測する実験を行った。大きさによらず高さの低い物体は効果器が床面に接触しやすく、違和感が比較的大きくなる傾向にあったがアルゴリズム改良の結果、違和感を軽減できることが明らかになった。また、視覚提示刺激と力覚提示刺激をわざと異なる刺激にして与えると違和感が増大したことから、視覚と力覚の整合性が確保されていることが前提となることも明らかとなった。この結果は、本研究の目的である低自由度力覚提示装置でも力覚提示が可能であることを不しており、より安定で堅牢な情報提示端末の実現可能性を示す結果と言える。本年度は、1自由度力覚提示装置によるバーチャル物体表現において、視覚と力覚提示の場所が一致する直接指示環境の構築を行った。赤外線によるスクリーン上の物体位置検出センサにより指先位置検出を行ったが、位置検出センサの時間遅れがあった為、昨年度開発した光学センサを組み合わせて指先位置を検出する方式とした。力覚の有無、直接指示、間接指示環境の4種類のパターンにおいてポインティングや物体の側面のなぞり実験を行ったところ、直接指示の方が作業時間が短いことが明らかとなった。今後この違いの生じる理由を明らかにする予定である。また、視覚提示との組み合わせのデモンストレーションの一環として、レーザーレンジファインダを用いた遠隔物体を触ることが出来るシステムを構築した。このシステムはレーザーレンジファインダによって得られた遠隔物体までの距離情報から、力覚提示装置側で設定したバーチャルな棒をダイヤル式のインタフェースによって伸縮させる。さらに小形シースルーディスプレイを搭載し、CGを重ねて表示することで棒の長さが直感的に分かる。海外の展示会や学会においてデモンストレーションを行い、9割の参加者が力覚を認識できることが出来たことから、初心者でも低自由度力覚提示装置による情報提示が有効であることが確かめられた。最後に2自由度力覚提示装置をユーザの手と一緒に動かすことで、本来の可動範囲を超える大きさのバーチャル物体を触るシステムを開発した。円、三角形、四角形、多角形の側面をなぞる評価実験を行い、ほぼ違和感無く触れることが明らかとなった。ただし、装置上の指先の可動範囲外周では、それ以上外側に向いた力覚が提示できないため、その場所に行かないような工夫が必要であることがわかった。非接地1自由度力覚提示装置とテーブルトップディスプレイを組み合わせたシステムを用いて、視覚と力覚の提示位置を一致させた直接指示と両者を分離した間接指示環境による操作性の調査を行った。バーチャルな円環をなぞる実験を行い、その際の軌跡や時間の他に、指先の圧力、指の筋肉の筋電位を計測した。軌跡や時間については直接指示、間接指示の間に有意差はなく、力覚提示装置を用いることで両者のパフォーマンスに差がなくなることが明らかになった。また、圧力、浅指屈筋の筋電位については、直接指示が有意に小さくなった。これは長時間の作業による疲労に差が出てくる可能性が示唆された。一方、前年度やり残したユーザの可動範囲を制限することによる影響を調査した。定規を使うように装置の可動範囲を制限することで、物体認識精度が向上するかどうかを実験によって評価した。実験の結果、定規と力覚提示装置を用いることで、正確なポインティングが行えるとともに、一定の軌跡で平面上を移動させることで、フリーハンドでは気が付かない提示物体の詳細な形状情報を知覚可能であることが明らかとなった。

さらに、従来は立方体のような切り立った側面を持つ物体の形状を表現すると、急に大きな力が加わるため不自然な振動が発生した。これを回避するレンダリングアルゴリズムとして応答性を下げる方法や力覚の計算に用いる形状モデルに垂直面との違いを認知されない斜面を持たせた方式の2つの方式を開発した。これにより振動を抑制するだけでなく、側面の任意の高さの位置をなぞることを可能とした。最後に、本方式で減らした反力ベクトルの自由度を視覚的に補う方式として視覚と力覚のモデルを別に持たせた擬似力覚環境を開発した。特に従来、回転力に関する研究例が少ないため、回転トルクの提示手法を開発し、力覚提示装置と擬似力覚を組み合わせることで相乗効果が得られることが明らかとなった。装置の開発およびソフトウエアも開発が終わり、予想通りの実験結果も出ている。デモンストレーション用の機器も出来上がり、概ね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年のまとめに向けて評価実験を進める。とはいえ、実験条件が膨大になるため、重要な要件を見極めながら優先順位を付けて実験を進める予定である。
中枢神経系における金属イオン膜輸送機構の解明-脳機能との関連を中心として-

本研究は、未だ明らかにされていない脳の金属イオン膜輸送機構を解明し、神経伝達機構との関連などその神経生理学的意味を明らかにし、さらに、金属イオン膜輸送機構と痴呆症、パーキンソン病など神経難病や脳の老化機構との関連を検討し、神経疾患や老化のマーカーの発見や予防・治療法を開発することを目的とする。本年度に得られた成果は、以下のごとくである。1.ウィルソン病のモデル動物のLECラットを用い、銅代謝異常に伴う脳内微量元素および神経伝達物質代謝について詳細に検討し、脳内銅の動態が、他の微量元素およびカテコールアミン、アセチルコリン、セロトニン代謝の変動をもたらすことを明らかにした。さらに、脳内への銅の蓄積によって引き起こされるとされる脳障害に、銅の蓄積以前に引き起こされる神経伝達物質の変動が関与していることを明らかにした。2.ウィルソン病の原因物質である銅の膜輸送蛋白(ATP7B)のモノクローナル抗体を作成し、免疫組織化学的手法を用いて、ラットの脳、腎臓および肝臓の銅の膜輸送蛋白の局在、さらに、各組織でのmRNAの発現についても同時に検討した。その結果、ATP7Bは、脳では、神経細胞に特異的に分布し、部位別にみると、海馬、嗅球および小脳の顆粒細胞に高濃度で分布していた。腎臓では、皮質およびアウタ-ストライプ、アウタ-メジュラに高濃度で分布していた。これらの分布から、ATP7Bは、肝臓での銅代謝のみならず、脳機能の発現維持や腎臓での銅の再吸収に関与していることが示唆された。本研究は未だ明らかにされていない脳の金属イオン膜輸送機構を解明し、神経伝達機構との関連などその神経生理学的意味を明らかにし、さらに、金属イオン膜輸送機構と痴呆症、パーキンソン病など神経難病や脳の老化機構との関連を検討し、神経疾患や老化のマーカーの発見や予防・治療法を開発することを目的とする。1.ウィルソン病の原因物質である銅の膜輸送蛋白の抗体を作成し、免疫組織化学的手法を用いて、ラットの肝臓、腎臓および脳内の銅の膜輸送蛋白の局在を初めて明らかにした。さらに、各組織でのmRNAの発現についても同時に検討した。2.メンケス病の原因物質であるもう一つの銅の膜輸送蛋白の銅結合部位のDNAを、RPCRを用いて生成し、大腸菌によりペプチドを発現させた。今後、得られたペプチドを抗原として抗体を作成し、上述のごとく本銅膜輸送蛋白の組織内分布、局在を明らかにするもりである。現在、生体内で亜鉛の膜輸送に関与していると考えられるZn transporterのペプチド断片も分子生物学的手法を用いて発現させているところである。1.ウィルソン病の原因物質である銅の膜輸送蛋白(ATP7B)のモノクローナル抗体を作成し、免疫組織化学的手法を用いて、ラットの脳、腎臓および肝臓の銅の膜輸送蛋白の局在、さらに、各組織でのmRNAの発現についても同時に検討した。
がん細胞における酸化的リン酸反応と解糖系の共役を担うポーリンの機能解析

申請者は、がん細胞のミトコンドリアには多量のヘキソキナーゼが結合するが、正常な肝臓のミトコンドリアにはほとんど結合しないとの報告に基づき、本プロジェクトに着手した。本研究では、まずがん細胞に発現したポーリンの特性を明らかにする目的の研究を行った。得られた知見は以下の通り。1.がん細胞に発現した13型のポーリンの構造を解析したところ、すでに報告されている正常な組織に発現したポーリンのアミノ酸配列といくつかの差異を認めた。しかし、我々が正常組織のポーリンについて解析をやり直したところ、これらの差異は、がん細胞に特異的なものではなく、報告されている塩基配列の誤りであることが判明した。2.これらの3種以外のポーリンの発現の可能性を、縮重プライマーを用いて解析した。その結果、第4のアイソフォームの発現の可能性は否定された。これらの知見から、がん細胞に発現したポーリンは正常な組織に発現したポーリンと、質的には異ならないことが明らかになったので、次にがん細胞と正常な組織でのポーリンの発現量を比較した。その結果、3.いずれのポーリンも、がん細胞に顕著に発現しているわけではなく、心臓とがん細胞で同レペルの転写が観察された。しかし、特記すべき事項として、いずれのアイソフォームの転写レベルも、肝臓で顕著に低いものであった。この知見をあわせて考えると、肝臓のミトコンドリアに多くのヘキソキナーゼが結合しないのは、その量が少ないためであると考えられる。今後、ミトコンドリア膜上に実際に存在するポーリンの測定を行い、発現量の違いの生理的意義を明らかにしていく予定である。申請者らはこれまでの研究で,がん細胞では多量に発現したII型へキソキナーゼがミトコンドリアに結合して,解糖活性の亢進に寄与していることをつきとめてきた.本研究では,がん細胞に発現したポーリンの同定とそのキャラクタリゼーションを目的とした研究を行った.ポーリンには,少なくとも3種のアイソフォームが存在することが知られているが,がん細胞では,これら全てのアイソフォームが発現しているらしいことをつきとめ,うち2つのアイソフォーム,VDAC1およびVDAC2の構造の決定を行った.VDAC2には,N末の異なるバリアントの存在が報告されていたが,これまでの研究で,がん細胞では単一のタンパク質の発現が確認された.また,これらのcDNAが,実際に機能的なポーリンをコードしているかどうかを明らかにするために,在性のポーリンをコードする遺伝子を破壊させた酵母を用い,機能相補能の解析を行った.その結果,VDAC1,VDAC2とも,ポーリンとして機能するが,酵母では,酵母のポーリンよりも機能回復能が劣ることが明らかになった.ポーリンは基本的にはミトコンドリア外膜に存在するとされているが,細胞膜やSRでの発現の可能性も提唱されている.また,メッセージの解析だけでは,実際にミトコンドリア膜上に存在するかどうかを議論することは困難である.そこで,抗体を調製し,ウエスタンによる解析も行った.その結果,主としてミトコンドリア膜に存在するアイソフォームは,VDAC2であることを明らかにした.申請者はこれまでに、がん細胞に発現した3種のポーリンのクローン化を済ませていたが、他のアイソフォームの発現の可能性については検討できていなかった。そこで、本年は、縮重プライマーを用いたPCRにより、第4のポーリンの発現の可能性を検討した。縮重プライマーのデザインに際しては、すでに構造を明らかにした3種のポーリン間で高度に保存されている領域を指標に行った。調製したプライマーでPCRを行うのに先立ち、まずこれですでに構造解析を行った3種のポーリンのcDNAが均等に増幅されるかどうかの解析を行った。

その結果、同じ量の鋳型を用いても、増幅され可視化されるDNA量に顕著な差が認められたため、まずこれらのcDNAが均等に増幅される条件の検索を行った。その結果、プライマーのアニーリング温度を41度まで低下させることにより、3種のcDNAが均等に増幅されることが判明した。そこで、この条件下、AH130のcDNAを鋳型としたPCRを行った。増幅されたDNA断片をサブクローニングし、これで大腸菌を形質転換して得られた組み換え体を無作為に64クローン選択し、これらがいずれのポーリンのcDNAであるのか解析した。その結果、64クローン中、7クローンが1型、30クローンが2型、14クローンが3型であった。残りの13クローンはいずれのcDNAでもなかったが、これらの塩基配列を解析した結果、非特異的な増幅によるものであることが判明した。このような穏やかな条件下でのPCRでも、第4のポーリンがとらえられなかったことから、我々はがん細胞で第4のポーリンが発現している可能性はないと結論した。
気候変動に伴う都市における暴風災害リスクの評価

都市では、地球温暖化とヒートアイランド現象という二つの温暖化が進行し、建物の高層化や密集化により都市形態が変化している。地球温暖化により台風の強大化が予測される中、建物の高層化・密集化の因子が加わり、都市では災害に対する脆弱性が高まっている。本研究では、建物の高層化・密集化が進む都市において台風といった極端気象現象による暴風災害リスクが温暖化時にどう変化するかについて、現地気象観測と数値モデリングによって定量的に評価することを目的としている。平成30年度は以下の項目について研究を実施した。気象観測については、上空から地表面温度を計測するため、熱画像カメラ搭載のドローンを導入した。また、大気乱流を計測するため、超音波風速温度計を京都大学防災研究所「宇治川オープンラボラトリー」の気象観測鉄塔に設置し、2年度目の本観測に向けた大気乱流観測を試行し、データ処理系を構築した。このように、2年度目の気象観測のための計測器の整備を進めた。数値モデリング研究については、LESモデルの解像度を2 mとし、保有済みの京都市域の都市建物データを用いて実際の都市の建物や人工構造物をモデルに組み込み、LESモデルの精緻化を進める。また、2018年台風21号による都市での暴風の特徴を把握するため、大阪市および京都市の市街地での暴風をLESモデルによりシミュレーションし、都市での暴風リスク評価の試行をした。さらに、気象モデル・LESモデルの結合化手法の高度化・精緻化も進めた。観測については、熱画像カメラ搭載のドローンの購入が、製造元での製品の部品の不具合等により製造が大幅に遅れ、業者からの納品が1月末となった。これは当初計画から大幅に遅れることになり、結果としてドローンによる熱画像の空撮実験は、2年度目に延期せざるを得なくなった。一方、超音波風速温度計の気象観測鉄塔への設置は想定通りに進め、データ処理系を構築し、大気乱流観測を試行し、データの確認・整理をすることができた。数値モデル研究については、当初計画していた気象モデル・LESの結合手法の高度化や市街地を対象としたLES計算の試行は順調に進めることができた。さらに、2018年9月に生じた台風21号による近畿地方の都市での暴風災害は、本研究課題の目的に合致していたため、大阪市および京都市の市街地を対象として、LESモデルにより暴風の再現シミュレーションを試みることができ、研究論文の発表に繋げることができた。この点は、当初の計画以上に研究を進めることができた。以上のように、本研究課題全体を見れば、おおむね順調に研究は進展していると言える。気象観測については、初年度の遅れを取り戻すべく、2年度目の期間前半に、京都大学防災研究所・宇治川オープンラボラトリーにおいて、風速の弱い条件の日に、気象観測鉄塔傍の露場上空にドローンを飛翔し、ドローンに搭載した熱画像カメラにより地表面の熱画像の空撮の試行実験をする。また、同時に鉄塔に設置した超音波風速温度計による乱流計測も行い、ドローンによる空撮実験時の気象状況について把握する。これらの試行実験を進めることで、2年度目の9月に予定している本観測に備える。数値シミュレーションについては、空撮熱画像から得られる表面温度をLESモデルの下端境界条件として設定する手法の開発を進め、本観測の再現シミュレーションへの準備を進める。

さらに、2018年9月に生じた台風21号による近畿地方の都市での暴風災害は、本研究課題の目的に合致していたため、大阪市および京都市の市街地を対象として、LESモデルにより暴風の再現シミュレーションを試みることができ、研究論文の発表に繋げることができた。この点は、当初の計画以上に研究を進めることができた。以上のように、本研究課題全体を見れば、おおむね順調に研究は進展していると言える。気象観測については、初年度の遅れを取り戻すべく、2年度目の期間前半に、京都大学防災研究所・宇治川オープンラボラトリーにおいて、風速の弱い条件の日に、気象観測鉄塔傍の露場上空にドローンを飛翔し、ドローンに搭載した熱画像カメラにより地表面の熱画像の空撮の試行実験をする。また、同時に鉄塔に設置した超音波風速温度計による乱流計測も行い、ドローンによる空撮実験時の気象状況について把握する。これらの試行実験を進めることで、2年度目の9月に予定している本観測に備える。数値シミュレーションについては、空撮熱画像から得られる表面温度をLESモデルの下端境界条件として設定する手法の開発を進め、本観測の再現シミュレーションへの準備を進める。京都大学プレスリリース
バングラデシュ農村変容15年-同一村再調査に基づく農村階層構造の変化を中心に

1990年代以降、最近まで1520年間のバングラデシュ農村経済の変容を、異なる地域の2つの農村の再調査によって明らかにした。変化を生み出した主な原動力は、管井戸普及による農業集約化、農村内および周辺地域における非農業部門(特に第3次産業)の発展と雇用吸収、ダッカなど都市への出稼ぎの増大、海外出稼ぎの増大などであった。こうした農村経済の発展に伴って所得分配は悪化した形跡があるが、貧困削減は着実に進み、最近の農村では労働力不足の兆候さえ見られるようになった。初年度の平成21年度は、タンガイル県DC村およびボグラ村AR村のそれぞれにおいて、あらかじめ準備した調査票に基づき、全世帯の調査を終え、またそのデータをコンピュータ入力(ソフト名:SPSS)した。タンガイル県DC村では754世帯、ボグラ県AR村では360世帯を数え、1992年当時のそれぞれ538世帯、209世帯を大幅に上回り、過去17年間で、両村とも、大幅な人口増加があったことを示している。また、ボグラ県AR村の1992年の世帯データ(209世帯のうち、145世帯分のみが保存されていた)のコンピュータ入力も終えた。今後、これら入力されたデータの入力ミスのチェックと整理を行い、分析を始める必要がある。またタンガイル県DC村では、村の中の主な農村工業である手織物業と魚網製造業について、その従事者から聞き取りを実施し、それぞれの機械設備、原料調達、労働者雇用、製品販路、季節性などについて把握した。さらに、多くの村人が海外出稼ぎに出ていることに鑑み、主な出稼ぎ国別に、渡航手続き、渡航費用、渡航費用の調達方法、送金方法と金額、帰国後の就業状態などについて聞き取りを実施し、海外出稼ぎの実態とその農村経済へのインパクトを把握した。平成22年度に持ち越されたタンガイル県DC村の1992年世帯データのコンピュータ入力が終わると、過去17年間の2つの調査村の経済社会変化を分析するための基礎データが揃うことになり、初年度の目標は、目標通りほぼ達成されたといえる。当該年度は、世帯調査以外の調査を積極的に行った。タンガイル県ドッキンチャムリア村では、灌漑地下水市場に関する調査、小ビジネスを営む村人の詳細な調査、および海外出稼ぎに関する調査の3つである。またボグラ県アエラ村では、灌漑地下水市場に関する調査と農産物生産費調査である。また、前年にコンピュータ入力した世帯調査のデータ・チェックを行い、かつ当該年度に行った上記の調査データの一部のコンピュータ入力を終えた。以上のように、当該年度は、多くの補足的調査とデータ整理に時間を使ったが、その過程で重要な事実発見が多くあった。たとえば、ドッキンチャムリア村では、村の経済発展に寄与した要因として、海外出稼ぎの急増、小ビジネス機会の増加とその下請け仕事としての女性・子供向けの内職の就業機会が大きく増加し、そのためにかつての不完全就業状態がほぼ解消し、遊んでいる労働力が消滅したことである。一方のアエラ村では、灌漑用浅管井戸(STW)がほぼすべての農民の所有物となり、したがって地下水市場がほぼ消滅するに至ったこと、さらに浅管井戸の急増に伴って農地利用も大きく集約化し、三毛作も行われるようになり、その結果、農業労働需要が急増し、労働者世帯の家計経済が大きく上向いたことである。以上のような事実発見は、過去1520年くらいのバングラデシュの農村経済発展の典型的な2つの型を示すものであり、意義深いものがある。最終年度の今年度は、いよいよこれらの成果を発信することに努力を傾ける。最終年度である当該年度には、ボグラ県アイラ村において20世帯の土地なし労働者世帯の就業者全員について、1年間の毎日の活動を記録していく調査研究、および管井戸灌漑所有者による「売水」がほとんどなくなった状況がいかにして生まれたかについての実態調査を実施するとともに、プロジェクト全体の総まとめ、すなわちデータ分析とそれに基づく執筆活動を行った。具体的には、本プロジェクトの成果は、最終的には英文の本を刊行することにあるが、その主要なChapterの執筆を進めた。主要なChapterのうち、執筆を進めているものの主な内容は、1)タンガイル県ドッキンチャムリア村における海外出稼ぎの急増という事態を受け、その渡航先、期間、収入、送金、送金の村での使途、そして出稼ぎ費用の調達方法とその返済、2)同村における漁網ビジネスの内職が女性雇用に及ぼした影響についての分析、3)若年女性のダッカなどにおける縫製工場就業構造とその影響、4)ボグラ県アイラ村における管井戸灌漑の増大とその作付集約化への影響、5)同村における貧困層の生計向上の動きの実態解明、6)村外からの急激な人口流入と定着過程についての分析、である。

以上のような2つの村で観察された過去1520年の変化は、バングラデシュ農村で同期間に生じた経済変動をかなり典型的に反映するものであり、それを具体的に克明に叙述・分析することができており、本が完成・刊行されれば、わが国のバングラデシュ研究のみならず、世界のバングラデシュ研究の水準を大きく引き上げることになり、大きな反響が期待できる。
ペルオキシダーゼの立体構造に基づく基質の酸化と活性化機構の解明

ペルオキシダーゼは生体内で生じた過酸化水素を除去するだけでなく、反応過程で生じる活性種を用いて様々な生体物質の代謝に関与している。この酵素は過酸化水素により酸化を受けcompound Iとよばれる分子種になるが、これはハロゲンイオンなどの無機化合物だけでなくフェノール類などの有機化合物の酸化を触媒する。本研究では真菌Arthromyces ramosusが分泌するベルオキシダーゼ(ARP)をとりあげ、salicylhydroxamic acid(SHA)をはじめとする芳香族化合物やヒドロキシルアミンがARPにどのように結合し、反応にかかわるかを調べた。ARP結晶を25mMのSHAを含む溶液(pH5.5)にsoakし、そのX線回折強度を1.9Å分解能まで測定した。差フーリエ合成から、SHAはARPのヘムの遠位側のチャネル内に深く入り込み、ヘム面とほぼ平行に結合していることが明らかになった。BHAの場合と同じく、SHAのOH、NHおよびC=Oは、それぞれHis56 Nε、Pr0154 O、および,Arg52 Nεと水素結合していた。興味深いことに、native状態の水分子の位置と、SHAの3つの官能基それぞれの位置がほぼ重なる。SHAはBHAに比べOH基を1つ多く持っているが、このOH基はARPと結合していなかった。SHAのOHとヘム鉄原子との距離は4.3Åであり直接的接触はない。NMRとMDから、クレゾール、レゾルシノールやヒドロキノンはARPと多様な結合様式をとっていることが示唆された。示差ベクトルからヒドロキシルアミン(HA)とARPのKdは12.7mMであり、HAが結合することによりヘム鉄は6配位構造に変化した。ARP-HA複合体結晶を調製し、その2Å分解能X線解析の結果、HAはヘムの遠位側のポケットに結合していた。本分解能ではHAの方向を決定することは困難であるが、現在のモデルではHAの窒素原子が鉄に配位し、OH基が遠位ヒスチジン(His56)のNεと水素結合していると考えている。このモデルは共鳴ラマンスペクトルからも支持されている。HAが結合することによるARPの構造変化は無かった。さらにHAとARPとの結合のpH依存性を調べたところ、pKが5.4にあった。この値はHAのpKとよく似ており、HAはの結合のpH依存性はHAの解離による可能性が高いが、His56の解離による可能性も残されている。
脳虚血性疾患時における血液脳関門の機能変動と脳保護機構

【目的】脳血管障害(脳卒中)は我が国の3大死因の1つである。高齢化社会を迎え、この疾患に罹る患者数はますます増加すると予測される。脳血管障害は、虚血の後に脳実質細胞が遅発性に死滅する特徴的な疾患である。このように虚血から細胞死に至るまでに時間がかかる理由は、グルタミン-カルシウム仮説など神経細胞死を促進するメカニズムと、神経細胞を保護するメカニズムが双方向に働くからだと言われている。さらに脳虚血時に血液脳関門(BBB)の構造および機能が変化し、脳全体の機能に影響を及ぼすと推定されているが、詳細は明らかでない。本研究では神経細胞を保護することが知られているbasicfibrablast growthfactor(bFGF)に着目し、虚血時にbFGFが関わる受容体分子がどのように変動し、それが脳保護効果にどのように関連するか明らかにすることを目的とした。【方法】脳虚血動物はC57BL/6系マウスの両側頚動脈を10分間結紮することで作成した。遅発性神経細胞死は海馬CA1領域の神経細胞数の計数することで評価した。脳内FGFRs遺伝子の定量は定量的PCR法で行った。【結果および考察】本研究で作成した虚血モデルにおいて、海馬CA1領域における神経細胞数は経日的に減少し遅発性細胞死が起こっていることを確認した。一方、海馬CA1領域のFGFR1遺伝子は虚血後経時的に増加し48時間では無処置のマウスに比較し約2倍に増加した。この神経細胞保護効果とFGFR1の変動は、強力な脳保護作用があるカチオン性vasoactive intestinal peptide(cVIP)を投与した脳虚血マウスにおいてさらに増強した。これらの結果から、虚血時における脳保護メカニズムとしてFGFR1の変動が関与していることが示唆された。さらにここで用いたcVIPのin vivoにおける脳保護機構を明らかにするために、本研究ではcVIPのBBB輸送機構について検討した。その結果、cVIPは血液脳関門の塩基性ペプチド輸送系を介して脳内に移行した後、FGFR1の発現を促し、その結果として保護効果が増強されることが示唆された。【目的】高齢化社会の到来に伴い、脳や循環器の老化を基盤とする脳血管障害(脳卒中)が増えると予測されている。脳血管障害は、虚血の後に神経細胞やグリア細胞などの脳実質細胞が数日の時間スケールで死滅する特徴的な疾患である。一方、虚血巣周辺部では神経細胞を守る機構が働いており、いくつかの栄養因子がこのメカニズムに関与していると言われている。また、脳虚血時に血液脳関門(BBB)の構造および機能も変化すると考えられるが、詳細は明らかでない。従って、脳虚血時に起る脳保護機構およびBBBの機能変動を明らかにすることは、本疾患に対する治療法を確立する上で重要である。本研究では、脳内で脳保護に関わると言われているbasicfibroblast growthfactor(bFGF)に着目し、脳虚血モデルマウスにおける脳内FGFレセプター(FGFRs)の変動について検討した。【方法】実験にはC57BL/6系マウスを用いた。このマウスの両側頚動脈を10分間結紮(2VO)し、遅発性細胞死が誘発するかを観察した。

脳虚血モデルマウスにおける海馬CA1領域の神経生細胞数の変化をギムザ染色法にて観察した。脳内FGFR1およびFGFR2の発現変動は定量的PCRで測定した。さらにFGFRの変動と脳保護メカニズムとの関連を明らかにするために、FGFR恒常発現株の作製を試みた。【結果および考察】2VO処置7日目のマウスにおいて、海馬CA1領域の神経細胞数は有意に減少し、C57BL/6系マウスの両側頚動脈結紮(2VO)処置により遅発性細胞死が誘発していることを確認した。脳虚血モデルマウスの海馬CA1領域におけるFGFRs遺伝子の変動を検出した結果、虚血24時間後からFGFR1遺伝子の増加が起こり、48時間後ではコントロールの約2倍まで増加した。このFGFR1の増加はたん白レベルでも起っていることをウエスタンブロット法で確認した。一方、FGFR2遺伝子の発現は、FGFR1に比べ軽微であった。また、FGFR1およびFGFR2発現ベクターをHEK293細胞に導入し、FGFRs恒常発現株の作製に成功した。【目的】脳血管障害(脳卒中)は我が国の3大死因の1つである。高齢化社会を迎え、この疾患に罹る患者数はますます増加すると予測される。脳血管障害では、虚血の後に脳実質細胞が数日かけて死滅する遅発性細胞死が起こる。これまでに、グルタミン-カルシウム仮説など遅発性細胞死を誘発する様々なメカニズムが提唱されている。昨年度、申請者は脳虚血モデルマウスを作成し、一過性脳虚血時に脳内でFGFの受容体FGFR1が増加することを見出し、この現象が遅発性細胞死の中で神経細胞死を遅延させる脳保護作用であることを提唱した。この結果を受け、本年度は強力な神経細胞脳保護効果があるカチオン化VIPペプチド誘導体(cVIP)を脳虚血モデルマウスに投与することにより、脳内FGFR1の発現がどのように変化するかについて検討した。また、cVIPがどのようなメカニズムで脳内に移行するかについても併せて検討した。【方法】脳虚血動物はC57BL/6系マウスの両側頚動脈を10分間結紮することで作成した。このマウスにcVIPを投与し海馬CA1領域の神経細胞数の変化をギムザ染色法にて計数した。脳内FGFR1遺伝子の定量は定量的PCR法で行った。さらに、cVIPの脳移行機構を明らかにするためにラット脳還流法およびin vitro血液脳関門(BBB)細胞RBEC1を用いた輸送実験を行った。【結果および考察】cVIPを投与した脳虚血マウスにおける神経細胞数は、コントロールに比べ有意に多く、cVIP投与によって神経細胞死が有意に抑制されることがわかった。また、cVIP投与マウスにおいてFGFR1遺伝子は非投与群に比べ有意に増加しており、この現象は蛋白レベルでも確認された。一方、遅発性細胞死の速度が抑えられるにはcVIPが血液脳関門を透過し脳内に移行する必要がある。そこで、cVIPの脳移行について検討した。その結果、cVIPはBBBを透過し脳実質内に移行していることがわかった。さらにBBB細胞を用いた検討から、cVIPはBBBのカチオン性ペプチド輸送系に認識されて脳内に移行することが示唆された。