hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
外部環境応答型の電子スピン構造を有する有機ラジカルの合成

分子骨格全体に広く非局在化した電子スピンを有し空気中でも安定な中性ラジカルである6-オキソフェナレノキシルに着目し、電子供与性分子や相補的水素結合が可能な核酸塩基類等を結合させた中性ラジカルを合成した。そして、溶液状態における溶媒や温度変化、光照射などに応答した分子内電子移動の動的な挙動や、電子スピンの非局在化様式を明らかにした。開殻有機分子は、分子骨格上への電子スピン密度の分布の程度により「電子スピン局在型」と「電子スピン非局在型」に分類できる。日本のオリジナリティの高い分子磁性体研究の発展に重要な貢献をしてきたのは、古くから知られているごくわずかな種類の電子スピン局在型の開殻有機分子に限られていた。従って、新しい骨格・電子系を有する安定なスピン非局在型の開殻有機分子の合成とその電子構造についての研究は未開拓の領域である。我々は、6-オキソフェナレノキシル(6OPO)と命名できる空気中でも安定な中性開殻有機分子を設計・合成・単離した。6OPOの電子スピンは、分子骨格全体に一定のトポロジー的対称性を持って広く非局在化しており、酸化還元活性な15π型の平面構造を有している。本研究では、この6OPOに対する以下に示した化学修飾を行い、溶液状態における電子スピン構造に関する性質を明らかにした。(1)相補的水素結合が可能な各種の核酸塩基誘導体を結合させた中性ラジカルを設計し、量子化学計算から分子構造および電子スピン構造についての情報を集積した。また、ウラシル誘導体を結合させた中性ラジカルを合成し、ESR/ENDOR/TRIPLE測定により電子スピン構造を決定した。(2)拡張されたπ共役系を有する電子供与性分子である1,6-ジチアピレンを6OPOに結合させた中性ラジカルを設計・合成した。そして、溶液状態における溶媒、温度等に依存・応答した分子内電子移動や会合挙動による電子スピン構造の動的な挙動を明らかにした。有機分子骨格上全体に不対電子が広く非局在化した「電子スピン非局在型」の開殻有機分子は、合成の困難さから従来ほとんど研究対象になってこなかった未開拓の物質群である。分子骨格上のπ電子と不対電子の強固な相互作用が期待でき、用いる溶媒、温度やpH、光などの外部環境変化に敏感に応答した電子スピン構造の自由度を有する物質群であると考えられる。我々は、精密有機合成化学の手法と構造有機化学的考察を活用することでこれらの開殻有機分子群の合成に成功してきた。本研究課題において我々は、独自に設計・合成した6-オキソフェナレノキシル(6OPO)と命名できる空気中でも安定な中性開殻有機分子(中性ラジカル)に着目し、以下に示した化学修飾を行い、溶液状態における外部環境応答型の動的電子スピン構造に関する実験を行いその性質を明らかにした。(1)相補的水素結合が可能なウラシル誘導体を結合させた中性ラジカルを合成し、ESR/1H-ENDOR/1H-TRIPLE測定により電子スピン構造を決定した。また、分子間水素結合と電子スピン構造との相関についての実験的および理論的知見を集積した。そして、溶液状態における光照射実験を行い、照射エネルギーと分子内電子移動に基づく電子スピン構造の動的な挙動を明らかにした。
免疫制御を応用した慢性創傷の新規治療法の開発～NKT細胞は炎症・治癒を支配する～

褥瘡や糖尿病性下腿潰瘍などの慢性創傷は、感染や壊死により炎症が遷延し難治化する症例が多い。感染が疑わしい慢性創傷の局所療法として、ヨード製剤や銀イオン製剤が選択されているが、ターゲットが曖昧であり、さらに細胞障害性を併せ持つ。本研究では、慢性創傷の新規治療法として、「NKT細胞を起点とした免疫制御法」に注目した。すでに頭頸部癌や肺癌で臨床研究がスタートしている治療法であり、炎症制御に働くNKT細胞の活性化は他の白血球や線維芽細胞の賦活化を誘導し、停滞している治癒過程を劇的に変化させる可能性が高い。本研究では、C57BL/6 (WT)マウスおよびNKT細胞を欠損したJα18KOマウスを用い、創部への緑膿菌接種に対するNKT細胞の役割について解析を行った。マウスの背側皮膚に皮膚生検用バイオプシーパンチを用いて創を作成し、直ちに創部に緑膿菌を接種し閉鎖環境においた。創作成後3,5,7,14日目に創部組織を摘出し,創閉鎖率と創部緑膿菌数の算出,病理学的解析,リアルタイムPCR法によるmRNAの発現解析を行った。結果:創閉鎖率はすべてのタイムポイントにおいて両群間に有意差はみられなかった。WTマウスと比較し,Jα18KOマウスにおいて再上皮化率は創作成7日目に有意に低下し,創部緑膿菌CFUは有意に増加した。また,創作成5日目においてはIL-17A,β-defensin1発現量がWTマウスと比較しJα18KOマウスで有意に低下した。Jα18KOマウスではIL-17Aの低下に起因した抗菌ペプチド産生の低下により,再上皮化率および緑膿菌排除の低下が示唆される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。褥瘡や糖尿病性下腿潰瘍など慢性創傷は、感染や壊死により炎症が遷延し難治化する症例が多い。感染が疑わしい慢性創傷の局所療法として、抗菌剤、銀イオン製剤等が選択されているが、ターゲットが曖昧であり、さらに細胞障害性を併せ持つ。はじめに、急性創傷におけるNKT細胞欠損の影響について解析を行ったところ、野生型マウスと比較し、iNKT細胞を欠損したJα18KOマウスでは、創閉鎖率の遅延を認めた。さらに、その機序について解析を進めたところ、通常は急性期に観察される好中球集積が後半の治癒過程においても確認され、すなわち創部での好中球遷延が治癒遅延に関与していることが明らかとなった。さらに、慢性皮膚潰瘍モデルの確立を目指し、Jα18KOマウスの背側皮膚組織にバイオプシーパンチで開放創を作成し、緑膿菌PAO1株を接種した。創部に接種するPAO1株の濃度について検討したところ、1×10^21×10^4いずれの濃度においても創傷作成12日目においても創傷治癒が停滞している状況が観察された。さらに、創部の細菌数を定量化したところ、緑膿菌を接種した野生型マウスと比較し、Jα18KOマウスでは細菌数が有意に多いことを確認した。以上のことより、iNKT細胞は緑膿菌排除や緑膿菌接種下の創傷治癒過程に重要な役割を担うことが示唆された。本年度の目標であった急性創傷におけるNKT細胞の役割について明らかになり、さらに慢性皮膚潰瘍モデルの開発に着手できたため、おおむね順調に伸展しているといえる。感染が疑わしい慢性創傷の局所療法として、抗菌剤や銀イオン製剤等が選択されているが、ターゲットが曖昧であり、さらに細胞障害性を併せ持つ。本年度は、創傷が慢性化する要因の一つである細菌感染とNKT細胞に注目した。すなわち、緑膿菌感染マウスモデルにおけるNKT細胞欠損の影響について、iNKT細胞を欠損したJα18KOマウスを用いて解析を行った。C57BL/6(野生型;WT)マウスおよびJα18KOマウスの背側皮膚に皮膚生検用パンチを用い、6 mmの全層欠損創を2つ作成した後、被覆し創を閉鎖環境においた。創作成後経日的に創部組織を摘出し、創閉鎖率、創部緑膿菌数、病理学的解析、リアルタイムPCR法によるmRNAの発現解析を行った。その結果、創閉鎖率はすべてのタイムポイントにおいて両群間に有意差を認めなかった。WTマウスと比較し、Jα18KOマウスにおいて創作成7日目の再上皮化率が有意に低下し、創部緑膿菌CFUが有意に増加した。また、創作成5日目において、IL-17A、抗菌ペプチドであるβ-defensin1発現量がJα18KOマウスで有意に低下した。IL-17Aは非無菌的である開放創モデルにおいては抗菌ペプチド産生を増加させ、上皮化を促進することが報告されている。さらに抗菌ペプチドそのものが緑膿菌排除を促進することが知られている。

以上のことより、Jα18KOマウスではIL-17Aの低下に起因した抗菌ペプチド産生の低下により、再上皮化率および緑膿菌排除が低下したことが考えられる。本年度の目標であった、慢性皮膚潰瘍モデルとして、細菌(緑膿菌)感染創におけるNKT細胞の役割が明らかになり、概ね順調に進行しているといえる。褥瘡や糖尿病性下腿潰瘍などの慢性創傷は、感染や壊死により炎症が遷延し難治化する症例が多い。感染が疑わしい慢性創傷の局所療法として、ヨード製剤や銀イオン製剤が選択されているが、ターゲットが曖昧であり、さらに細胞障害性を併せ持つ。本研究では、慢性創傷の新規治療法として、「NKT細胞を起点とした免疫制御法」に注目した。すでに頭頸部癌や肺癌で臨床研究がスタートしている治療法であり、炎症制御に働くNKT細胞の活性化は他の白血球や線維芽細胞の賦活化を誘導し、停滞している治癒過程を劇的に変化させる可能性が高い。本研究では、C57BL/6 (WT)マウスおよびNKT細胞を欠損したJα18KOマウスを用い、創部への緑膿菌接種に対するNKT細胞の役割について解析を行った。マウスの背側皮膚に皮膚生検用バイオプシーパンチを用いて創を作成し、直ちに創部に緑膿菌を接種し閉鎖環境においた。創作成後3,5,7,14日目に創部組織を摘出し,創閉鎖率と創部緑膿菌数の算出,病理学的解析,リアルタイムPCR法によるmRNAの発現解析を行った。結果:創閉鎖率はすべてのタイムポイントにおいて両群間に有意差はみられなかった。WTマウスと比較し,Jα18KOマウスにおいて再上皮化率は創作成7日目に有意に低下し,創部緑膿菌CFUは有意に増加した。また,創作成5日目においてはIL-17A,β-defensin1発現量がWTマウスと比較しJα18KOマウスで有意に低下した。Jα18KOマウスではIL-17Aの低下に起因した抗菌ペプチド産生の低下により,再上皮化率および緑膿菌排除の低下が示唆される。本年度の解析により、iNKT細胞が緑膿菌排除や緑膿菌接種下の創傷治癒過程に重要な役割を担うことが示唆されたことから、詳細な機序解明を予定している。すなわち、iNKT細胞が直接的に緑膿菌排除に関連するのか、それとも好中球など他の炎症性細胞を介して関与するのか、さらにバイオフィルム形成との関連についても解析を進める予定である。本年度の解析により、iNKT細胞が欠損したJα18KOマウスではIL-17Aの低下に起因した抗菌ペプチド産生の低下により、再上皮化率および緑膿菌排除が低下したことが考えられるため、今後は緑膿菌接種創におけるIL-17A産生細胞に関する詳細な解析を予定している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
原子力施設のための大規模地震動推定システムの開発

本研究の目的は、大地震が発生したときの原子力施設周辺における地震動、すなわち、原子力施設に対する地震外力を適切に推定することにある。具体的には、大地震のシミュレーション手法の開発、およびそれを使った未知断層推定のための逆解析手法の構築を目的としている。平成20年度は、地震波の力学モデルである弾性体および粘弾性体中における波動の解析手法の開発を行ってきた。基本方針としては、地盤のような無限領域を扱うのに有利な時間領域境界要素法を用いることとし、さらに、粘弾性波動も弾性波動と同等に解析することのできる演算子積分法を適用した、演算子積分時間領域境界要素法の開発を行ってきた。また、大規模な問題を効率的に解析するための手法として、高速多重極法を適用した高速多重極境界要素法の開発を行った。主として、2次元波動伝播問題を対象とした解析手法の開発を行い、その成果を公表してきた。平成21年度は、上の成果を3次元問題に拡張するとともに、研究開発の過程で現れた種々の問題点の解決を目的とした研究を進めてきた。(1)2次元問題において開発してきた解析手法の3次元問題への拡張適用:a)スカラー波動問題(物理的な問題としては音響問題)については成果が上がっており、その一部はすでに公表されている。b)弾性(粘弾性)波動問題についても研究は進んでおり、解析の高速化のための手法開発の段階にある。解析手法の定式化に関する部分については一部公表している。(2)演算子積分境界要素法の開発にかかわる課題:演算子積分境界要素法は、対象とする問題のLaplace変換における基本解を用いてVolterra型積分方程式を時間領域で近似して解析する方法である。時間領域での計算を進めるためには、Laplace変換パラメータを複素平面上で動かして経路積分をする必要がある。積分経路は実軸が正となる領域になければならず、そうでない場合には数値解が不安定になる。積分経路は近似パラメータに依存する。弾性問題のように、連立積分方程式を扱い、行列型の基本解を用いる場合に、適切な積分経路選択のためのパラメータの条件はあまり明らかではない。そこで、同じように演算子積分境界要素法を適用でき、しかも、連立の次元がはるかに高い群中性子拡散問題の研究を並行して行い、近似パラメータの決定法について研究を進めた。(3)実地震への適用法の検討:解析的方法による地震のシミュレーションには、地盤構造の単純化、震源断層の単純化などがどうしても必要であり、これらのモデル化による不確定要素を含んでしまう。そこで、解析的方法の適用性を検討するために、疑似経験的Green関数法にここで開発している手法を応用した。震源断層のモデルを導入し、スカラー波動の解析結果を適用したところ、SH波成分に関しては比較的良好な結果を得ている。(4)高速多重極法のさらなる高速化と並列化:3次元問題における高速多重極法は、きわめて複雑な計算を必要とし、その計算負荷は大きい。解析には当然並列化が必要であるが、並列化に適合した、計算が単純となる高速多重極法の導入を検討した。本研究の目的は、応用力学的知見から、原子力施設周辺における大地震のシミュレーションおよび未知の断層を推定する逆解析手法の構築にある。この目的を達成するために、本年度は、弾性体および粘弾性体中における波動伝播問題の解析手法の開発を行った。解析手法としては、境界要素法を用い、波動伝播問題を扱うために、時間ステップごとに逐次的に解析を進める手法として、Fredholm-Volterra型の境界積分方程式を基礎式とする時間領域境界要素法を開発した。時間領域境界要素法の定式化にはLubich(1988)により提案された「演算子積分法」を用いた。演算子積分法は繰込み積を適切に離散化する数値解析手法の一つであり、Volterra型の積分方程式に適用する場合には、数値解の安定性が良い、積分核のLaplace変換だけを使うので、より広範囲の波動伝播問題の定式化が可能であるなどの利点がある。本年度は、以下の諸問題について手法を開発した。(1) 2次元弾性面外波動伝播問題。(既発表)(2) 2次元弾性面内波動伝播問題。(既発表)(3) 2次元粘弾性面外波動伝播問題。(既発表)(4)3次元スカラー波動伝播問題。(未発表)(5)3次元弾性波動伝播問題。(未発表)これらの波動伝播問題の解析プログラムは、目的とする大規模地震波動シミュレーターの主要なエンジンとなるものである。境界要素法は、無限の地盤中を伝播する地震波の伝播問題のように、波動問題の解析に適した解析手法である。しかしながら、境界要素法には問題点がある。それは、境界全域における相互作用を一度に処理するために、蜜行列計算が必要とされる点である。蜜行列計算においては、少なくとも行列の大きさの2乗の計算量と記憶容量が必要とされる。すなわち、ここで想定している50km200km四方程度の地盤の解析においては、必要とされる波長を考慮すると、境界要素数は数100万数1000万ともなり、通常の計算機では計算不能となってしまう。そこで、従来から研究を続け、成果を挙げてきた「高速多重極境界要素法」を導入した。「高速多重極法」は天体物理学、分子動力学などのN体問題において広く利用されている解析手法であり、積分核の加法分解を利用して、遠方の点への影響の計算を大幅に短縮する手法である。高速多重極法では、さらに、分割統治アルゴリズムを使って、計算量および記憶容量を行列の大きさ程度に抑えることができる。

すなわち、1000万要素の問題であれば、計算速度はほぼ1000万倍になり、通常の計算環境で十分に解析可能である。ここで用いる時間領域境界要素法においては、積分核のLaplace変換に関する行列計算に高速多重極法を利用している。具体的には、変形Bessel関数の加法定理を用いて積分核の加法分解を行っており、この手法は演算子積分法を用いる時間領域境界要素法においては、かなり一般的な手法となる。上記の成果のうち、(1)(3)については、高速多重極境界要素法を用いている。本研究の目的は、大地震が発生したときの原子力施設周辺における地震動、すなわち、原子力施設に対する地震外力を適切に推定することにある。具体的には、大地震のシミュレーション手法の開発、およびそれを使った未知断層推定のための逆解析手法の構築を目的としている。平成20年度は、地震波の力学モデルである弾性体および粘弾性体中における波動の解析手法の開発を行ってきた。基本方針としては、地盤のような無限領域を扱うのに有利な時間領域境界要素法を用いることとし、さらに、粘弾性波動も弾性波動と同等に解析することのできる演算子積分法を適用した、演算子積分時間領域境界要素法の開発を行ってきた。また、大規模な問題を効率的に解析するための手法として、高速多重極法を適用した高速多重極境界要素法の開発を行った。主として、2次元波動伝播問題を対象とした解析手法の開発を行い、その成果を公表してきた。平成21年度は、上の成果を3次元問題に拡張するとともに、研究開発の過程で現れた種々の問題点の解決を目的とした研究を進めてきた。(1)2次元問題において開発してきた解析手法の3次元問題への拡張適用:a)スカラー波動問題(物理的な問題としては音響問題)については成果が上がっており、その一部はすでに公表されている。b)弾性(粘弾性)波動問題についても研究は進んでおり、解析の高速化のための手法開発の段階にある。解析手法の定式化に関する部分については一部公表している。(2)演算子積分境界要素法の開発にかかわる課題:演算子積分境界要素法は、対象とする問題のLaplace変換における基本解を用いてVolterra型積分方程式を時間領域で近似して解析する方法である。時間領域での計算を進めるためには、Laplace変換パラメータを複素平面上で動かして経路積分をする必要がある。積分経路は実軸が正となる領域になければならず、そうでない場合には数値解が不安定になる。積分経路は近似パラメータに依存する。弾性問題のように、連立積分方程式を扱い、行列型の基本解を用いる場合に、適切な積分経路選択のためのパラメータの条件はあまり明らかではない。そこで、同じように演算子積分境界要素法を適用でき、しかも、連立の次元がはるかに高い群中性子拡散問題の研究を並行して行い、近似パラメータの決定法について研究を進めた。(3)実地震への適用法の検討:解析的方法による地震のシミュレーションには、地盤構造の単純化、震源断層の単純化などがどうしても必要であり、これらのモデル化による不確定要素を含んでしまう。
上部白亜系首長竜の比較解剖学及び野外調査

カナダ国マニトバ・エスカープメントの上部白亜系から産出した保存状態のよい首長竜化石を詳細に記載し関連分類群との比較を行い、三次元スキャナーを用いて脳函の三次元構造を復元した。また、現地の野外調査と地元博物館の収蔵標本を調査し、未報告・未記載の多くの首長竜化石の所在が確認された。本研究によって白亜紀後期の海生爬虫類の研究におけるマニトバ・エスカープメントの学術的価値が極めて高いことが示された。本研究では、カナダ上部白亜系の未記載標本ROM 29010(カナダ国・ロイヤルオンタリオ州博物館所蔵)を用いた脳函の比較解剖学による首長竜(双弓類、鰭竜類)の系統仮説の検証、野外調査、及び博物館所蔵標本の記載的研究による化石産出地域(カナダ中西部のマニトバ・エスカープメント)の学術的将来性の評価を目指している。平成20年度は3年計画の1年目であり、カナダ出張(オンタリオ州オタワ、アルバータ州、サスカチュワン州、マニトバ州)及び中華民国(台湾)と中華人民共和国の研究者との情報交換を含む以下の研究活動を行った1. Canadian Museum of Nature(カナダ・オタワ市)にて借用しているROM 29010を詳細に観察し、論文に使用するscientific illustration作成の際に必要な骨学的な形質の同定や下絵作りなどを行った。2.系統解析における形質の極性評価のため、原始的な鰭竜類や鰭竜類に近縁な可能性のある三畳紀の双弓類との比較解剖学的研究を、国立自然科学博物館(中華民国・台中市)、中華人民共和国浙江省自然史博物館、及びロイヤルティレル古生物学博物館(カナダ・アルバータ州ドラムヘラー市)が所蔵している標本を中心に行った。3.平成21年度夏に予定しているカナダでの野外調査に備え、調査地域(マニトバ・エスカープメント)及び関連する地域の地質情報の文献調査を行った。4. ROM 29010標本の産出地域(マニトバ州南部Thornhill-Morden area)を含む、調査地域の下見を行った。併せて、マニトバ州にて行われた古生物学会に参加し、マニトバ州とサスカチュワン州の博物館・関係者を訪問するなどして、新しい標本や露頭に関する情報の収集、及び平成21年度の野外調査における協力予定者との打ち合わせを行った。平成22年度は3年計画の2年目であり、カナダ出張(オンタリオ州オタワ、サスカチュワン州、マニトバ州)を含む以下の研究活動を行った。1. Canadian Museum of Nature(カナダ・オンタリオ州)にて借用しているROM 29010の記載を行った。頭蓋骨の詳細な形状を示すScientific illustrationを作成し、三次元スキャナーを用いて不完全な脳函を復元することに成功した。得られたデータを用いて詳細な記載論文を執筆・投稿した。2.系統解析における形質の極性評価のため、原始的な鰭竜類や鰭竜類に近縁な可能性のある三畳紀の双弓類との比較解剖学的研究を、国立自然科学博物館(中華民国・台中市)、中華人民共和国淅江省自然史博物館が所蔵している標本を中心に行い、学会口頭発表と論文の投稿を行った。3.マニトバ・エスカープメントの複数の地点で野外調査を行い、ROM 29010など既知の標本の産出層準を特定し、追加標本の採集を行った。また、地元の博物館・関係者を訪問するなどして、新しい標本や露頭に関する情報の収集、及び平成22年度の調査における協力予定者との打ち合わせを行った。4.関連するトピックについて、IGCPによる国際シンポジウムでの講演や、日本古生物学会編「古生物学事典」の項目の執筆を行った5.日本の上部白亜系首長竜標本(フタバスズキリュウ)と共産するサメ化石に基づいて、化石爬虫類の生態系における位置づけについて、共同研究を行った。本研究では、カナダ上部白亜系の未記載標本ROM 29010(カナダ国・ロイヤルオンタリオ博物館所蔵)を用いた脳函の比較解剖学による首長竜(双弓類、鰭竜類)の系統仮説の検証、野外調査、及び博物館所蔵標本の記載的研究による化石産出地域の学術的将来性の評価を目指している。平成22年度は3年計画の最終年であり、主に論文執筆や学会発表を中心に以下の研究活動を行った。1.昨年度投稿したROM 29010の記載論文が、今年度に入って受理・出版された。また、同論文の内容についてアメリカで10月に開催されたSociety of Vertebrate Paleontology年会において口頭発表を行った。

本研究によって初めてポリコティルス類首長竜の脳函が3次元で復元され、他の首長竜との比較が可能になり、従来の系統仮説と必ずしも一致しない分布を示す形質や、これまでに系統解析に含まれていなかった新たな形質が見出された。2.形態形質の極性評価のために行っていた中国三畳系産の鰭竜類標本の記載論文が出版された。首長竜よりも原始的な形質を示すと予想されるこれらの生物の詳細な形態と系統学的位置づけが明らかになり、首長竜のユニークな体形の多系統性なども示された。3.8月にマニトバ・エスカープメント北部で野外調査を行い、これまでに報告のない層準から追加標本を採集し、地元のThe Manitoba Museumに登録した。また、アルバータ州のRoyal Tyrrell Museum of Palaentologyで比較標本の観察を行うことにより、形態学的な多様性についても理解を深めた。4.8月に中国・北京で開催された国際シンポジウムTriassic and Later Marine Vertebrate Faunasに招待され、マニトバ・エスカープメントの首長竜化石の学術的重要性について講演を行った。
膵島α細胞の形態形成とグルカゴン遺伝子の発現調節に関わる転写因子の単離と解析

平成13年度の研究において酵母Two-Hybrid法により転写因子BETA2と結合する蛋白として単離した新規遺伝子Alpha1について以下の研究を行なった。1.Alpha1によるグルカゴン遺伝子転写調節能の検討Alpha1の全長cDNA配列を哺乳動物細胞で組み換え蛋白発現させるためのベクターであるpRC/CMVに組み込み、既にクローニング済みであるマウスグルカゴンプロモーター配列をルシフェラーゼ遺伝子の5'上流に結合させたレポータープラスミドと共に、マウス膵α細胞由来細胞株であるα-TC1.6細胞(グルカゴンの高発現が認められる細胞株)に導入し、48時間培養後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、まずグルカゴンプロモーター配列を含むレポータープラスミドを導入したものでは、グルカゴンプロモーター配列を含まないレポータープラスミドを導入したものと比べて、ルシフェラーゼ活性は数十倍高くなった。また、Alpha1をpRC/CMVベクターに組み込んで過剰発現させたα-TC1.6細胞ではルシフェラーゼ活性のさらなる上昇が認められた。従って、今回同定した新規遺伝子Alpha1はグルカゴン遺伝子の転写活性化に関与している可能性が高いと考えられた。2.培養細胞におけるAlpha1蛋白発現の検討Alpha1に対するペプチド抗体を作成し、α-TC1.6細胞および膵β細胞由来細胞株MIN6細胞より抽出した蛋白質を用いてWestern blot法により、培養細胞におけるAlpha1の蛋白発現について検討した。その結果、アミノ酸配列より予測されたサイズは30kDaであるが、これよりも大きなサイズのおよそ3840kDaのバンドが認められた。このサイズの違いについては、Alpha1蛋白の翻訳後修飾の可能性が示唆され、現在検討中である。1.膵島α細胞で発現しているグルカゴン遺伝子プロモーターE-box配列に結合する転写因子のスクリーニンググルカゴン遺伝子のプロモーター領域に位置するE-boxに結合する転写因子を単離するために、膵島α細胞株α-TC1.6から作製したcDNAライブラリーを、BETA2をbaitとして酵母two-hybrid法を用いてスクリーニングを行った。その結果、BETA2に結合すると考えられるクローンが4つ得られた。この内の1クローンの塩基配列に基づいたホモロジー検索の結果、相同性の高いマウスESTクローンを2つ得た。これらのクローンを用いて塩基配列決定を行ったところ、825bpのORFを含む1,676bpのcDNA配列が認められ、275個のアミノ酸からなる蛋白をコードする新規蛋白であることが明らかとなった。さらに、データーベース検索で高い相同性が得られたヒト神経細胞由来ESTクローンより、ヒトホモローグの塩基配列決定を行った。ヒトとマウス間では、アミノ酸レベルでは93.8%、核酸レベルでは88.8%の相同性が認められた。そこで、この新規遺伝子をAlpha1と命名した。Alpha1の染色体上の位置をFISHにより検討したところ、マウスでは第7染色体のF2-F3に、ヒトでは第16番染色体短腕11.2領域にそれぞれ位置することが明らかとなった。2.発現組織の検討RT-PCRによる発現組織の検討により、マウス臓器では脳および膵臓で高発現が認められた。Alpha1の発現部位は、BETA2の発現部位と類似していることから、Alpha1およびBETA2は生体内で相互作用している可能性が高いと考えられる。現在、Alpha1のグルカゴン遺伝子の転写調節能について検討中である。さらに今後、脳での高発現意義の解明も含め、本遺伝子のノックアウトマウス等を作成し、発生・分化におよぼす影響について検討が必要であると思われる。
枯草菌が生産する殺虫成分の構造と作用機構の解明

これまでに肉食性昆虫の消化管内から農業害虫であるハスモンヨトウ幼虫に経口投与で殺虫効果を発揮する数種の細菌菌株の単離に成功している.その殺虫性菌株のひとつがひとに対する安全性の高いことで知られている枯草菌であることを明らかにしてきた.この菌株ならびにこの菌が生産する殺虫成分は安全な生物農薬として開発されることが期待できるものの,殺虫成分が何であるのかは定かではない.本研究ではこの殺虫性枯草菌が生産する殺虫成分を精製し,その構造とコードする遺伝子配列を解明し,組換え体タンパク質を作成するとともに,殺虫スペクトルに関する知見を得ることを目的としている.殺虫効果を示す枯草菌A1-3株を培養して得られた培養上清と菌体に殺虫活性があることを確認した後,それぞれを各種カラムクロマトグラフィーに供して分画し,殺虫活性を評価した.衛生害虫であるアカイエカ幼虫とイエバエ成虫に対する殺虫活性を測定したところ,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分子量が異なる画分に殺虫効果が認められることを見出し,本菌株が殺虫成分を複数生産していることを明らかにした.なお,標準菌株には活性が認められなかった.SDS-PAGEにより分析することで殺虫活性を示した画分に含まれている殺虫成分を特定し,そのひとつは機器分析などによりペプチド性の物質であることを突き止めることができた.既知の抗菌活性物質の可能性が考えられたが,比較検討した結果,その既知物質とは異なることが強く示唆された.また,この殺虫成分のラット赤血球に対する溶血活性を評価したところ,活性は認められず,哺乳動物に対して安全性の高い成分であることが明かとなった.今年度実施したBacillus subtilisの培養液から精製する過程で,イエバエ成虫とアカイエカ幼虫に殺虫症状を示す成分はそれぞれ別のものであり,殺虫性枯草菌が複数の殺虫成分を生産していることを明らかにすることができた.分子量の異なる殺虫成分が複数存在していることが明かになったが,当初の計画通りそれぞれの殺虫成分の内部アミノ酸配列を明らかにすることができた.さらに,アカイエカ幼虫に対して殺虫効果を示すタンパク質に関してはアミノ酸配列をもとにして,コードする遺伝子を明らかにすることもでき,殺虫成分の過剰発現実験を試みている.一方,イエバエに殺虫効果を示すものに関しても,部分構造に関する知見を得ることができている.また,イエバエに即効性の殺虫効果を引き起こす成分の作用機構に関する知見を得るために,細胞毒性を評価した結果,昆虫細胞Sf9細胞やイエバエ成虫から摘出した中枢神経系由来の神経細胞には毒性が認められず,即効的な効果は細胞毒性によるものではないことが明らかとなった.即効的な致死症状を引き起こす要因のひとつでもあるcell lysis活性を除外することができたことは大きな成果と考える.殺虫スペクトルの拡大を狙ってアザミウマに対する殺虫試験も試みたが,効果が認められなかった.一方で,イエバエ成虫に殺虫効果を示す成分は注射投与でハスモンヨトウ幼虫に効果を発揮することを新たに見出した.以上のことから,本研究は当初の計画どおりおおむね順調に進展していると考えられる.昨年度の研究成果から,本菌株が複数の殺虫成分を生産することを明らかにすることができた.また,殺虫成分である可能性の高いタンパク質性の物質を特定し,そのうちの一つであるアカイエカに殺虫効果を示したタンパク質に関してはコードする遺伝子の塩基配列を明らかにすることもできている.標準菌株には殺虫効果は認められていないことから,殺虫成分をコードする遺伝子が標準菌株にも認められるのか解析をすすめる.その結果によりこの殺虫成分の生産がどのように制御されているのか知見を得ることを試みる.また,これまでに塩基配列は特定できているものの,発現までには至っておらず,今後過剰発現系により組換体タンパク質を調製し,本当に殺虫成分であるか確証を得る必要がある.この組換え体タンパク質を調製した後は,部位特異的に変異を導入したものを複数調製し,殺虫効果を発揮するために必要な部分構造を明らかにすることを目指す.一方,イエバエに殺虫効果を示す物質に関しても早急に構造ならびにコードする遺伝子の塩基配列を特定することを目指す.イエバエに即効的な殺虫効果を示す成分の作用機構に関しては,細胞毒性の可能性が除外されたので,次に呼吸阻害の可能性を考え,電子伝達阻害活性を評価することを試みる.電気生理活性に関しても時機を見て検討していきたい.また,殺虫スペクトルを明らかにするために,他の害虫に対する殺虫活性を評価するとともに,益虫に対する効果を評価していく.これまでに肉食性昆虫の消化管内から農業害虫であるハスモンヨトウ幼虫に経口投与で殺虫効果を発揮する数種の細菌菌株の単離に成功している.その殺虫性菌株のひとつがひとに対する安全性の高いことで知られている枯草菌であることを明らかにしてきた.この菌株ならびにこの菌が生産する殺虫成分は安全な生物農薬として開発されることが期待できるものの,殺虫成分が何であるのかは定かではない.本研究ではこの殺虫性枯草菌が生産する殺虫成分を精製し,その構造とコードする遺伝子配列を解明し,組換え体タンパク質を作成するとともに,殺虫スペクトルに関する知見を得ることを目的としている.殺虫効果を示す枯草菌A1-3株を培養して得られた培養上清と菌体に殺虫活性があることを確認した後,それぞれを各種カラムクロマトグラフィーに供して分画し,殺虫活性を評価した.

衛生害虫であるアカイエカ幼虫とイエバエ成虫に対する殺虫活性を測定したところ,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分子量が異なる画分に殺虫効果が認められることを見出し,本菌株が殺虫成分を複数生産していることを明らかにした.なお,標準菌株には活性が認められなかった.SDS-PAGEにより分析することで殺虫活性を示した画分に含まれている殺虫成分を特定し,そのひとつは機器分析などによりペプチド性の物質であることを突き止めることができた.既知の抗菌活性物質の可能性が考えられたが,比較検討した結果,その既知物質とは異なることが強く示唆された.また,この殺虫成分のラット赤血球に対する溶血活性を評価したところ,活性は認められず,哺乳動物に対して安全性の高い成分であることが明かとなった.今年度実施したBacillus subtilisの培養液から精製する過程で,イエバエ成虫とアカイエカ幼虫に殺虫症状を示す成分はそれぞれ別のものであり,殺虫性枯草菌が複数の殺虫成分を生産していることを明らかにすることができた.分子量の異なる殺虫成分が複数存在していることが明かになったが,当初の計画通りそれぞれの殺虫成分の内部アミノ酸配列を明らかにすることができた.さらに,アカイエカ幼虫に対して殺虫効果を示すタンパク質に関してはアミノ酸配列をもとにして,コードする遺伝子を明らかにすることもでき,殺虫成分の過剰発現実験を試みている.一方,イエバエに殺虫効果を示すものに関しても,部分構造に関する知見を得ることができている.また,イエバエに即効性の殺虫効果を引き起こす成分の作用機構に関する知見を得るために,細胞毒性を評価した結果,昆虫細胞Sf9細胞やイエバエ成虫から摘出した中枢神経系由来の神経細胞には毒性が認められず,即効的な効果は細胞毒性によるものではないことが明らかとなった.即効的な致死症状を引き起こす要因のひとつでもあるcell lysis活性を除外することができたことは大きな成果と考える.殺虫スペクトルの拡大を狙ってアザミウマに対する殺虫試験も試みたが,効果が認められなかった.一方で,イエバエ成虫に殺虫効果を示す成分は注射投与でハスモンヨトウ幼虫に効果を発揮することを新たに見出した.以上のことから,本研究は当初の計画どおりおおむね順調に進展していると考えられる.昨年度の研究成果から,本菌株が複数の殺虫成分を生産することを明らかにすることができた.また,殺虫成分である可能性の高いタンパク質性の物質を特定し,そのうちの一つであるアカイエカに殺虫効果を示したタンパク質に関してはコードする遺伝子の塩基配列を明らかにすることもできている.標準菌株には殺虫効果は認められていないことから,殺虫成分をコードする遺伝子が標準菌株にも認められるのか解析をすすめる.その結果によりこの殺虫成分の生産がどのように制御されているのか知見を得ることを試みる.また,これまでに塩基配列は特定できているものの,発現までには至っておらず,今後過剰発現系により組換体タンパク質を調製し,本当に殺虫成分であるか確証を得る必要がある.この組換え体タンパク質を調製した後は,部位特異的に変異を導入したものを複数調製し,殺虫効果を発揮するために必要な部分構造を明らかにすることを目指す.一方,イエバエに殺虫効果を示す物質に関しても早急に構造ならびにコードする遺伝子の塩基配列を特定することを目指す.
歯と顎顔面骨格の空間的配置特徴に基づく新しい矯正診断システムの構築

本研究では、患者のデジタルデータから生成した仮想患者モデルの歯列および頭蓋顎顔面骨格の空間的配置に基づく幾何学的データから患者固有の形態学的特徴を定量化することによって、この患者の問題点を抽出・整理・理解できる客観的矯正診断法を確立した。これにより、これまで困難または不可能とされてきた顔面非対称を伴う不正咬合患者に対する明確な三次元的治療目標の設定が可能となった。本研究の目的は、未治療の患者データを基に三次元構築した仮想患者モデルの歯列および頭蓋顎顔面骨格を構成する各要素の空間的配置(相対位置・姿勢)より求めた幾何学的データから、個々の患者がもつ形態的特徴量を抽出し、ここから導き出した問題点を体系的に整理・理解できる客観的矯正診断法を確立することにある。これにより、従来の方法では困難とされてきた顔面非対称を伴う不正咬合患者(以下、顔面非対称症例)の的確な診断と三次元治療目標の設定を可能にするシステムを構築することを最終到達目標としている。24年度では、前年度で確立した新しい分析手法を活用して顔面非対称症例がもつ形態学的特徴を明らかにする目的で、仮想患者モデル(n=32)の上顎複合体に対する下顎の不調和と上下顎歯列に対する各顎骨の不調和との関連性を三次元で検討した。結果、前頭面における上顎複合体に対する下顎骨の姿勢と下顎骨に対する下顎歯列の姿勢との間に負の相関を認めた(r=-0.75)。体軸面における上顎複合体に対する下顎骨の姿勢と下顎骨に対する下顎歯列の姿勢との間に負の相関(r=-0.58)、上顎複合体に対する下顎骨の左右的位置と下顎骨に対する下顎歯列の左右的位置との間に負の相関(r=-0.77)、前頭面における上顎複合体に対する下顎骨の姿勢と上顎複合体に対する上顎歯列の姿勢との間に正の相関(r=0.88)、上顎複合体に対する下顎骨の左右的位置と上顎複合体に対する上顎歯列の左右的位置との間に正の相関(r=0.85)を各々認めた。一方、体軸面における上顎複合体に対する下顎骨の姿勢と上顎複合体に対する上顎歯列の姿勢との間には、唯一相関を認めなかった(r=0.23)。以上のことより、顔面非対称症例における上下顎歯列は、顎間関係の不調和と左右差の程度に対応し、各顎骨内でそれをマスクするような位置と姿勢を示すことが明らかとなった。本研究の目的は、初診時の患者資料から生成した仮想患者モデルの歯および頭蓋顎顔面骨格の空間的配置が示す幾何学的データから、患者個人がもつ形態学的特徴を定量化し、問題点の抽出、整理、理解が行える客観的矯正診断法を確立すること、さらには、これまで困難とされてきた顔面非対称を伴う矯正患者に対する的確な三次元的治療目標の設定を実現することにあった。23年度で既に所期の目的を概ね達成することができた。そのため24年度では、この手法を応用して顔面非対称症例がもつ形態学的特徴を調査し、顔面非対称症例における上下顎歯列が顎間関係の不調和と左右差の程度に対応し、各顎骨内でそれを代償するような位置と姿勢を示すことを明らかにした。最終年度の25年度では、顔面非対称を伴う不正咬合症例の術前矯正治療で十分な臨床的効果が得られているかについて、本手法を用いてレトロスペクティブに検証した。条件を満たした患者の中から、初診時(T1)と術前矯正終了時(T2)で仮想患者モデルを生成して三次元的診断を行った8名の資料を用いた。仮想患者モデルを脳頭蓋・上顎複合体と下顎骨、上顎歯列、下顎歯列の4要素に細分化し、各要素に設定した基準座標系間の前頭面での相対姿勢、矢状面での相対姿勢、体軸面での相対姿勢、左右的相対位置、垂直的相対位置、前後的相対位置で計測し、T1とT2の違いについて統計学的に分析した。その結果、T1とT2の間には前頭面、矢状面における下顎骨に対する下顎歯列の姿勢と脳頭蓋・上顎複合体に対する上顎歯列の前後的位置でのみ有意差を認め、その他の項目では差を認めなかった。本研究に用いた症例の術前矯正終了時においては、上下顎歯列と各顎骨との間に十分な幾何学的調和をみることができなかった。この結果は顔面非対称を伴う症例の術前歯科矯正治療が困難であることを示唆しており、従来の治療法の再検討を迫る結果となった。本研究の目的は,初診時の患者データから三次元構築した患者モデルの歯(歯列)および頭蓋顎顔面骨格の空間的配置(相対位置・姿勢)が示す幾何学的データから,患者個人がもつ形態学的特徴を定量化し,問題点の抽出,整理,理解が行える客観的矯正診断法を確立すること,さらには従来法では困難とされてきた顔面非対称を伴う矯正患者に対する的確な三次元治療目標の設定を実現することにある.平成23年度では,精度の高い仮想患者モデルの構築と空間的基準座標系の設定手法を確立することに主眼を置いて本課題に取り組んだ.

その手順と成果を以下に示す.1)頭蓋顎顔面骨格情報と歯列情報の取得・処理:X線CTのDICOMデータから頭蓋顎顔面骨格モデルを生成した.また開口位と咬頭嵌合位の咬合状態を三次元計測して得た点群データに画像処理を行い,2つの顎位の位置情報を持つ歯列モデルを生成した.2)三次元画像融合:頭蓋顎顔面骨格モデルと歯列モデルを基準マーカーを基にIterative Closest Point法による位置合わせを行い,患者の詳細な頭蓋顎顔面骨格形態と歯列形態を表現した仮想患者モデルを生成した.3)仮想化患者モデルの細分化:仮想化患者モデルを脳頭蓋・上顎複合体と下顎骨,上顎歯列,下顎歯列の4要素に細分化した.4)空間的基準座標系の設定:脳頭蓋・上顎複合体から表面形状基準法を用いて正中矢状平面を抽出し,これを作業平面に左側外耳道上縁点と眼窩下縁点を指定して座標系を設定した.他の3要素に対しても同様に正中矢状平面を抽出後,各要素の持つ解剖学的特徴点を2点指定して座標系を設定した.以上のことより,仮想患者モデルを構成する4要素にローカル座標系を設定し,これらの相対位置・姿勢を基準座標系の3平面上で観察することで患者の持つ特徴量を抽出することが可能となった.申請時に本研究で掲げた研究目的である歯(歯列)および顎顔面骨格の空間的配置特徴(構成要素間の相対位置・姿勢)に基づく客観的矯正診断法の確立に関しては、23年度で既に概ね達成できていた。そのため本年度では研究内容を進展させて、本学所蔵の未治療の患者のデータに本法を適用し、その有効性を確認した。その結果、顔面非対称症例がもつ形態的特徴を三次元で体系的に整理し理解できることが確認された。本法は、顔面非対称を伴う不正咬合患者の診断基準や分類、更には治療ガイドライン作成に有益な情報を得るために有効な方法であると考えられる。以上のことから申請時の計画に照らしてみると、それ以上に進展しているといえる。今年度の到達目標としては,精度の高い仮想患者モデルの構築と空間的基準座標系の設定手法を確立することに主眼を置いた.研究開始当初は乾燥頭蓋でファントムモデルを作製し,X線CT撮像と歯列三次元計測を行い仮想化ファントムモデルを生成して実空間のファントムモデルと仮想空間のファントムモデルを比較することで仮想化したモデルの精度と信頼性を調査する予定であった.しかし本研究で使用する頭蓋顎顔面骨格情報取得のためのX線CT装置と歯列情報取得のためのサーフェススキャナが臨床応用する上で十分に高い精度を有するとの文献や学会発表を散見するようになった.そこで本研究に使用する計測機器がトレーサビリティを確保しているものと判断し,これらの項目を簡略化して本研究を遂行した.結果,今年度では仮想患者モデルの構築と空間的基準座標系の設定手法の確立はもとより,仮想患者モデルを4要素に細分化し,各々に設定した座標系の相対位置・姿勢から患者個人のもつ形態学的特徴を抽出することが可能となった.以上のことから到達目標と照らしてみると,それ以上に進展しているといえる.本年度で既に方法の信頼性と可用性を概ね実証することが出来たと考える。今後は、本法の作業工程の効率化と簡素化、高速化を図り、一般の臨床医が日常的に利用できる環境を構築することを次年度の到達目標とする。そのためには、現在使用している高価で操作が煩雑なプロユースのソフトウェアから、比較的容易に使用できるオープンソースのソフトウェアが使用できるプラットホームへの移行を図り、新しい環境下においても同様に有用なデータを導き出せる手法を再提案したいと考えている本研究で最初に掲げた目標の客観的矯正診断法の確立における患者個人の形態学的特徴量の抽出に関しては,本年度で概ね達成することができた.
華僑資本企業の中国小売進出に関する比較研究

本年度は、前年度に実施した華僑系資本企業グループ10社の比較研究から、台湾系企業グループの頂新(康師傅)グループと統一企業の二大食品メーカーを選び、それらを対象として、中国における戦略の比較研究を行った。台湾の消費財市場には、統一企業グループという台湾最大の食品メーカーで、かつセブン-イレブン統一超商という台湾最大の小売業チェーンを持つ巨大な食品・流通グループが存在している。統一企業グループは、製造、卸売、小売の3段階を機能的・人的・資本的に垂直統合している「完全なる製販統合型企業」であり、台湾市場において、今日まで競争の優位性を発揮し発展してきた。1992年、統一企業は中国市場に参入し、1989年に中国市場に参入した頂新(康師傅)グループとともに、中国の即席麺市場とお茶飲料市場における上位3位の市場シェアを占めている。今年度行った比較研究は、この二大食品メーカーの中国市場におけるブランド形成プロセス、および小売進出を含めたマーケティング・チャネル戦略を明らかにし、中国市場における製販統合型経営の有効性と形成要因を考察した。先発企業である頂新(康師傅)の場合には、統一企業が台湾で実践してきた製販統合型経営を模倣したことが、中国市場でトップの地位に立った最大の理由になる。条件がそろえば、中国市場においても製販統合型経営が有効であることが確認できた。一方、後発企業である統一企業の場合には、参入障壁が存在しているため、台湾のように製販統合経営を推進することが難しい。同じ企業による展開でも、参入市場によって製販統合型企業の形成を加速あるいは減速させる要因が存在していることが判明した。以上の研究成果は、2007年5月28日に大阪商業大学で開催された「流通経済研究会研究総会」において発表した。本研究は、華人・華僑資本企業が中国市場に進出した経緯や戦略、母国市場との事業の関係性、および参入パターンの特徴を明らかにすることを目的とする。特徴のある個別企業に対しては、それぞれのマーケティング展開プロセスを明らかにする。本年度は、本研究費補助金を受ける前に行っていた予備調査をベースに、企業インタビューや現地調査を含めた実証研究を精力的に行った。最初の研究成果は論文「華僑系資本の中国小売市場への参入動向」(2005年3月)に公表し、日本商業学会関東部会の定例研究会(2005年4月)においては口頭報告を行った。それに基づいて、2005年8月には中国・上海において、また2006年1月と3月には台湾において、企業インタビューと現地調査を行い、華人・華僑系企業の実証分析を行った。対象とした企業グループ10社を基礎調査で比較した結果、以下の特徴が捉えられる。(1)華僑系資本の最初の進出先は、広州・深〓を中心とした珠江デルタ、上海を拠点とした長江デルタ、北京・天津の環渤海という3大経済圏にわたっている。香港系企業の参入が早い。(2)また、中国小売市場における事業展開は、大きくつぎの3パターンがある。パターンI:本国(製造業、小売業)→中国(製造業、小売業)、台湾系企業に多い。タイのCPグループも同様である。パターンII:本国(製造業)→中国(製造業、小売業)、一部台湾系企業。パターンIII:本国(小売業)→中国(小売業)香港系企業が多い。(3)資本提携およびM&A(企業買収・合併)の積極的な活用。(4)国際移転の面で活発なのは、言語、文化面で共通性のある台湾・中国間の人材交流である。そのほかに、台湾の統一企業グループの中国戦略という個別企業を対象として研究を深めた。その成果は、法政大学で開催された「中国流通研究会」(2006年3月)において報告を行った。今後もさらに研究を進めたい。
ヒト培養リンパ節の開発

ヒトのリンパ節細胞の培養に成功した。頭頸部癌患者において郭清された頸部リンパ節のうち、転移のないリンパ節を一部採取し、最大18日間培養した。リンパ節組織を粉砕、洗浄濾過後に培養するとリンパ節を構成する主な細胞である血球系の細胞と間質系の細胞が培養された。本研究で、比較的容易にヒトリンパ節細胞が培養されることが証明された。さらに研究を発展させればiPS細胞などの幹細胞を用いなくても自身のリンパ節細胞からリンパ節を増殖できる可能性が示された。ヒトリンパ節培養に必要になると予想されるものは1スキャフォールド、2ストローマ細胞、3抗原刺激細胞の三種類である。28年度はスキャフォールドに代わる培養器質の検討を行った。コラーゲンを基礎としたスキャホールドを数種類準備した。検討した培養方法はまず、得られたリンパ節を分割し、洗浄後にMEM培地で撹拌、洗浄を行う。得られた細胞懸濁液をMEM培地、RPMI培地、Tリンパ球培養キットで培養する。得られた細胞塊を作成したコラーゲンスキャホールドで三次元培養する。平成28年度は実際のヒトリンパ節の採取は研究に合致した症例が得られず、まだ培養を行えていない。平成29年5月に一例目のリンパ節採取を行う予定である。研究の遅れがあるため、得られた培養組織はリンパ節としての構造を完全にとっていなくても免疫不全マウスの皮下、筋膜下、鼠径部などに移植する。マウス体内でリンパ節組織形成が得られるならば臨床応用が可能となる見込みである。リンパ節採取を行う条件を満たした症例が得られなかったため、具体的な培養が行えなかった。一時的にマウスによる培養も検討したが、本研究の利点はヒトの組織を用いる点であり、人組織での培養を優先することとなった。そのため、まずはスキャホールドの検討を共同研究者と行い、異なる構造のコラーゲンスキャホールドを準備している。平成29年度は3例の頭頸部癌患者からの頸部リンパ節を採取し、培養実験を行った。採取したリンパ節は破砕、コラゲナーゼ処理、セルストレーナー濾過後に培養した。1例目では1RPMI 1640培地、2MEM培地、3DMEM培地、4Tリンパ球培養キットの培地で比較検討した。顕微鏡でこれらを明視野観察した結果、培地13のどれも、56 min静置後の沈殿に、よく伸展した接着細胞が多数確認できた。抗体染色されたこれらを蛍光観察した結果、FDCとFRCであることが分かった。4のTリンパ球培養キットはDAPIで血球系細胞の核染色が確認できた。同時にFDCやFRCのような接着性細胞も確認できた。2例目と3例目では1と4の培地で比較検討した。1例目と同様に1では接着性細胞が培養され、4では接着性細胞と血球系細胞の療法が確認できた。培養は18日まで行ったが、4では18日目に細胞の凝集塊が確認できた。また、リンパ節を処理する際に、培地内で細かく破砕した沈殿物には接着性の細胞が多く含まれ、上清内には血球系の細胞が多く含まれていた。これらの結果から、採取したリンパ節の破片から血球細胞、接着細胞を各々培養することが可能であることが判明した。リンパ節郭清を行った患者に対し、他部位からリンパ節の一部を採取し、人工的に増殖して再移植できる可能性が示唆された。平成29年5月19日に一例目のリンパ節採取、および培養を予定している。採取した培養は分離、撹拌したのちに4種類の培地で同時に培養予定である。次に得られた細胞塊を複数の組み合わせでコラーゲンスキャホールドで培養を行う。5月19日以降はおよそ一週間から2週間に一度、リンパ節の採取が行える見込みである。研究進捗状況が遅れているため、得られたリンパ節様組織は完全にリンパ節といえる条件(T細胞、B細胞の濾胞構造を得ている、濾胞樹状細胞がみられる、高内皮細静脈が形成される)を満たしていなくても、免疫不全マウスの皮下、腎被膜下、筋膜下などに移植する。皮下や筋膜下への移植でリンパ節の特徴を得るようになれば、今後の臨床応用が十分に期待できる。形成外科実験の条件にあう症例からのリンパ節採取が行えなかったために、実際の培養操作が行えなかった。そのため、当初予定した培地、各種抗体の購入を行わなかったために予算に余裕が生じた。28年度に購入予定であった各種培地、抗体を購入予定である。