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ジャコモ・レオパルディの著作における詩と哲学の関係についての研究

そこで、レオパルディの快楽理論においては、欲望の対象のごまかしと欲望自体のごまかしの区分がなされていることを発見し、この軸に沿って快楽理論を体系化するとともに、レオパルディと彼に先行する思想家とのあいだに様々な本質的相違があることを明らかにした。また、この研究を基盤として、レオパルディの快楽理論とその詩学との関係についても考察し、レオパルディが18世紀イタリア文学の重要カテゴリーである「多様性」を重視して創作を行なっていることを見出した。3レオパルディのペシミズム:近年、レオパルディ研究では、ペシミストとしてのレオパルディ像が否定されるようになってきている。こうした潮流に反論する形で、19世紀後半から20世紀前半においてペシミズムという言葉にはある程度明確な共通理解が存在していたことを示すとともに、その観点からすればレオパルディはショーペンハウアーと並びもっとも純粋なペシミスト哲学者の一人であるということを明らかにした。レオパルディの認識論の研究については、期待以上の結果を得た。レオパルディの認識論を新たな観点から再構築した上で、バークリーやヒュームといったイギリス経験論の哲学者との共通点など、当初予定していなかった新たな発見も得ることができた。レオパルディの快楽理論についても、期待以上の結果を得た。新たな視点による快楽理論の体系化に成功した上、これにおけるdoloreとpenaの明確な峻別など、当初は予定していなかった新たな発見も得ることができた。当初は、レオパルディの作品を否定神学の議論に照らして捉えなおす研究も予定していた。しかしこれについては、具体的に文献を読み進めていくなかで、仮説そのものに困難があったことが判明したため、断念した。しかしその代わり、当初は予定していなかったレオパルディのペシミズムについて研究を大きく進展させることができた。そのため、総じて当初の計画以上に研究を進めることができたと自負している。今後は、以下の6つの観点からの研究を計画している。1『ジバルドーネ』における詩と哲学の対立:レオパルディは、とくにその初期の思索において、詩と哲学を敵対関係にあるものとして考えていた。このことが、後期における詩と哲学の協働関係についての思索とどのような関係にあるのかを明らかにする。2レオパルディ哲学における想像力と詩的霊感:レオパルディは、哲学者の素質として、理性や体系的考察力だけではなく、想像力と詩的霊感を重視していた。そのことの意義を、これまでに研究を行なったレオパルディの心像論との関係から明らかにする。3レオパルディの対話篇における対話と声の役割:先行研究において、対話の形をとった一種の哲学論文のようにして語られることが多かった『オペレッテ・モラーリ』の対話篇を分析し、『形而上学者と物理学者の対話』等の作品を、対話者どうしのけっして論理的に解消されることのない葛藤そのものとして提示するとともに、それぞれの対話者ごとの声の差・文体的個性が、作品において本質的な役割を担っていることを明らかにする。4『ストラトンの偽書断片』研究:先行研究において、レオパルディの唯物主義哲学の心髄として語られてきたこの作品を、『ジバルドーネ』の懐疑主義を根拠に喜劇的作品として捉え直し、形而上学の破綻そのものを表現した作品として再解釈する。
ニューロン・グリアの分化決定とニューロン個性獲得にいたる制御機構の解析

本研究は神経幹細胞の自己複製・分化調節機構に関するMusashi、Notchシグナル関連分子について着目した研究であり、併せて再生医療を念頭においた神経幹細胞の分化誘導技術開発の研究を行った。主な実績は以下の通りである。(1)ショウジョウバエMUSASHI蛋白質が転写因子Tramtrackの翻訳を抑制することで、神経母細胞の非対称性分裂を制御していることを明らかにし(Okabe et al.,2001)、マウス中枢神経系幹細胞において、Musashi1がNotchシグナルのアンタゴニストであるm-Numbの翻訳を抑制することでNotchシグナルを増強していることを明らかにした(Imai et al.,2001)。さらに、musashi遺伝子群(musashi1,musashi2)を欠失したマウス個体の神経幹細胞は自己複製能が低下することを明らかにして(Sakakibara et al.,2002)、musashi遺伝子の機能を分子レベル、個体レベルで明らかにした。(2)神経幹細胞においてNotchシグナルの活性化の可視化を試み、活性化型Notch1特異的抗体を用いた手法(Tokunaga et al.,2004)、HES1プロモーター下の制御下で蛍光蛋白質を発現させる手法(Koyama et al.,投稿中)の複数の手法で成功した。(3)nestin promoter-EGFPTgマウスの蛍光、FACSを組み合わせた手法で、神経幹細胞をドーパミン産生ニューロンへと分化させ、濃縮する技術を確立し(Sawamoto et al.,2001)、さらに、ES細胞からドーパミン産生ニューロン、モーターニューロンへの効率的な分化誘導・濃縮法の確立に成功し、細胞移植を用いた再生医療への布石を敷いた(Yoshizaki et al.,2004;Okadaeta1.,2004)。Musashi1(Msi1)は哺乳類初期発生において脳室周辺部の中枢神経系未分化幹細胞において強く発現しているRNA結合蛋白質である。本研究ではm遺伝子産物の神経幹細胞の分化制御における役割を検討した。1.Msi1は、RNA結合蛋白質であり、そのin vivoで標的となっているRNAの同定を行った。Msi1は、in vivoでNotch-シグナル細胞内アンタゴニストをコードするm-Numb mRNAの3'-UTRに結合していることが示された。luciferase-mNumb 3'UTRキメラレポター遺伝子由来のLuciferase活性は、外来性のMsi1の導入量依存的に低下することが明らかとなった。しかしながら、luciferase-mNumb 3'UTRキメラレポーター遺伝子由来の転写産物の量は、外来性のMsi1の導入量にかかわらず、一定であった。よってMsi1は、m-Numb mRNAの3'-UTRに結合し、この翻訳を抑制しているものと考えられる。2.Hes1-luciferase活性を指標に、活性化型NotchとともにNIH3T3に導入した外来性Msi1によるNotchシグナルへの影響を検討したところ、外来性Msi1はNotchシグナルを活性化させることが明らかとなった。3.Neurosphere法を用いて、musashi遺伝子活性が減少した時の神経幹細胞の性質について検討したところ、よってmsi1とその関連遺伝子であるmsi2は協調して神経幹細胞の増殖あるいは生存維持に必須な役割を担っていると考えられた。本研究では、神経幹細胞の自己複製と分化調節機構に関する解析を行っていおり、本年度は、神経幹細胞に強く発現するRNA結合性蛋白質Musashiファミリーの機能解析を行った。msi1遺伝子欠損マウスのホモ接合体の出生前の胎児の剖検、組織学的観察からはmsi1遺伝子欠損マウスにおける顕著な異常は観察されなかった。

神経幹細胞の増殖や分化が活発で、Msi1の発現が最も高い胎生期の脳室周囲部のventricular zone(VZ)や脳室下帯のsubventricular zone(SVZ)においても組織構築の異常を認めることはできなかった。しかし出生後約一週齢でホモ接合体では頭部の膨大が始まり2-3週齢までにドーム型の頭部を特徴とする水頭症を高頻度で(ホモ接合体の約70-80%の個体)発症した。msi1遺伝子欠損マウスは高頻度で出生後水頭症を発症し、重篤な個体は約1-2ヶ月で死亡した。水頭症を発症した成体個体を組織学的に解析した結果、側脳室の対称性の激しい拡大、大脳皮質の薄化、白質、灰白質の浮腫を伴う実質の欠損、中隔の低形成が観察された。また頭蓋内圧の亢進によると考えられる嗅球、小脳、海馬の吻側、尾側方向への圧迫変性も観察された。msi1遺伝子欠損マウスの初代培養系を用いることにより、神経幹細胞の性質を詳細に検討した。まずneurosphere法を用いて神経幹細胞の数および自己複製能を検討した。神経系の幹細胞は増殖因子存在下で浮遊培養することにより、neurosphereと呼ばれる球状の細胞塊を形成することが知られている。一定数(1x10^5細胞)の胎生14.5日終脳細胞に由来するneurosphereの数は野生型およびmsi1遺伝子欠損マウスで差はみられず、約10回の継代によっても再びneurosphereを形成することから、msi1遺伝子単独欠損によって神経幹細胞の数と自己複製能は変化しないことが明らかとなった。msi1およびmsi2遺伝子は重複した発現パターンを示しており、これらふたつの遺伝子が協同して神経幹細胞の性質を維持している可能性も考えられたため、msi1遺伝子欠損マウスのneurosphere assayにおいてmsi2遺伝子の機能をアンチセンス(antisense peptide nucleic acids ; asPNA)で抑制することにより、msi1、msi2両遺伝子を抑制した場合の神経幹細胞の性質を検討した。細胞は添加したmsi2のasPNAの濃度に依存してneurosphereの形成能を低下させることが明らかとなった。これに対して同腹の野生型由来の神経幹細胞はmsi2のasPNAの濃度には関わらず一定のneurosphereを形成していた。よってmsi1とmsi2は協調して神経幹細胞の増殖あるいは生存維持に必須な役割を担っていると考えられた。本研究は、神経幹細胞の自己複製と分化調節機構を解析するため、神経幹細胞に強い発現のみられるRNA結合性蛋白質Musashi(Msi)ファミリーの機能解析を、遺伝子欠損マウスを用いて行った。Msiファミリー蛋白質は、哺乳類の神経幹細胞に強い発現のみられるRNA結合蛋白質として同定されてきた。このmsi1遺伝子を欠失したマウスを作成し解析を行ったところ、高頻度で先天性水頭症を発症して、生後約1-2ヶ月で死亡することが明らかとなった。
炎症性骨吸収抑制薬による骨形成促進作用の検討

【実験の背景および目的】このプロジェクトは炎症性骨吸収の抑制効果が確かめられているW9ペプチドが、骨再生を促進する効果があるか否かを確かめるプロジェクトであった。このW9ペプチドは炎症部位においてマクロファージなどから産生される炎症性サイトカインTNFαのアンタゴニストである。TNFαは骨芽細胞の増殖や分化を抑制することがすでに報告されているが、今回このW9ペプチドがマウスの抜歯後の骨再生を促進するか否かを検討した。【方法】C57/BL6マウスを用いて左側切歯を削合し1週間後抜歯した。W9ペプチドを抜歯と浸透圧ポンプを用いて4mg/kg/dayの用量で皮下に投与した。3週間後、屠殺しpQCTを用いて切歯を抜歯した部位の骨密度を測定した。また、抜歯後6時間後および1,2,4,7日後に血液を採取し血清中のTNFα濃度をELISA法にて測定した。【結果】溶媒投与群と比較してW9ペプチドによる骨再生促進効果は認められなかった。血清TNFα量はどのサンプルも検出限界以下であった。【考察】まず、歯槽骨の再生のモデルである、マウス切歯抜歯モデルを確立したことが実験成果の一つとしてあげられる。抜歯後10週間、マウスを生きたままpQCTにて切歯抜歯後の骨密度の変化をモニタリングした結果、ほぼ100%が骨(海綿骨1%、準皮質骨35%、皮質骨65%)に置き換わることが分かった。3週後には抜歯窩の75%の部位が骨に覆われるが、W9投与によってもこの骨再生を促進することが出来なかった。全身のTNFαの血中濃度は抜歯後6時間でも検出できなかったことから、抜歯によってTNFαが抜歯窩で思ったより産生されておらず、TNFαによる骨芽細胞の増殖分化が思ったより抑制されていなかったことがW9ペプチドの骨再生促進効果が現れなかった原因と考えられた。【結論】TNFαの産生が局所で亢進しているモデルを用いて再度検討する必要があると思われるが、今回の実験においては骨吸収抑制剤の骨再生促進作用は認められなかった。BMP(Bone morphogenic protein)は局所における骨誘導能がありながら、歯科分野において実用化にいたっていない。我々はTNFアンタゴニストであるWP9QYペプチド(W9)の骨破壊抑制効果を関節炎モデルや歯周病菌による骨破壊モデルなどを用いて示してきた。骨形成過程には骨芽細胞の増殖分化が必須であるが、炎症部位において放出されるTNF-αがこの骨芽細胞の増殖分化を抑制することから、TNFアシタゴニストであるW9がBMP誘導の骨形成を促進するという仮説を立てた。まず初めに我々はW9の最適な薬物担体を検討した。なぜならばW9には1.ペプチドであるがゆえの分解されやすさ2.中性よりわずかな酸性環境下(pH7.0)でも凝集をはじめてしまう不安定さという2つの問題点があり、歯周病の骨欠損部への応用を考える場合,浸透圧ポンプを埋めるわけにもいかず、また炎症部位は酸性環境に傾くためW9は凝集を起こし効力を持たなくなると考えられたためである。ひとつの候補としてナノゲルエンジニアリングを応用した担体を検討したところW9はその単体に酸性環境下でもきれいに溶け込み粒子サイズが大きくなることはなかった。また、その担体を骨吸収モデルである低Ca食飼育マウスに皮下殺与したところ、3時間おきに8回打たないと効かなかったがW9が一日2回の投与で効果を発揮した。現在、さらに担体を修飾してもっと効果が発揮される担体を検討中であるが、まずこの担体を利用してBMPとW9を溶け込ませて、局所における骨形成誘導能に対するW9の効果を検討する予定である。なお、この結果は特許申請するために公表を差し控えてください(別紙参照)。

3週後には抜歯窩の75%の部位が骨に覆われるが、W9投与によってもこの骨再生を促進することが出来なかった。全身のTNFαの血中濃度は抜歯後6時間でも検出できなかったことから、抜歯によってTNFαが抜歯窩で思ったより産生されておらず、TNFαによる骨芽細胞の増殖分化が思ったより抑制されていなかったことがW9ペプチドの骨再生促進効果が現れなかった原因と考えられた。【結論】TNFαの産生が局所で亢進しているモデルを用いて再度検討する必要があると思われるが、今回の実験においては骨吸収抑制剤の骨再生促進作用は認められなかった。
タンパク質間相互作用を光制御する化学ツールの開発

本研究では、細胞内生体分子の機能を操作するための機能性小分子を開発することを目的としている。任意のタイミングで細胞内局所での分子機能操作を実現するために、時空間分解能の高い「光」を利用する。生体分子機能を任意のタイミングで可逆的に制御することができれば、様々な分子が相互作用し合う複雑な生命システムの理解につながると期待される。光応答性タンパク質二量化剤の開発に取り組んだ。具体的には、FKBP12(F36V)リガンドとHaloTagリガンド間のリンカー長を変えた誘導体を作製し、それぞれの誘導体のFKBP12(F36V)に対する親和性の評価を蛍光偏光解消法により評価した。その結果、リンカー長が短い誘導体においてcis体とtrans体間での親和性の差が大きくなることが明らかとなった。続いて、培養細胞を用いた実験へと移行するために、コンストラクトの作製を行った。哺乳動物用発現ベクターにFKBP12(F36V)と赤色蛍光タンパク質、およびHaloTagと緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した。さらに、細胞核や細胞膜内葉にタンパク質を局在化させるシグナルペプチド配列の遺伝子を導入したコンストラクトも作製した。開発した光応答性二量化剤が生細胞内で機能するか、共焦点レーザー蛍光顕微鏡観察を用いて評価した。ヒト胎児腎細胞(HEK293T)内の細胞質全体にFKBP12(F36V)を、核内にHaloTagを発現させた。共焦点レーザー蛍光顕微鏡観察下で光応答性二量化剤を添加したところ、細胞全体に広がっていた赤色蛍光が核内へと移行する様子が観察された。さらに、移行初期の段階でUV光を照射したところ、移行が抑制されることがわかった。したがって、開発した光応答性二量化剤によるタンパク質二量体化の度合いを生細胞内でも光照射により制御可能であることが示唆された。FKBP12(F36V)に対する光応答性リガンドの誘導体を合成し、試験管内での結合親和性評価の結果、昨年度開発したものより良いものが見出された。さらに培養細胞を用いた蛍光顕微鏡観察の実験へと移行しており、研究計画は概ね順調に実施されている。培養細胞内におけるタンパク質二量体化の光制御について、光照射条件(照射波長・照射時間・タイミングなど)を種々検討し、より効率の良い条件を探索する。また、二量体化の誘起と解除を光で可逆的に制御可能化について検証を行う。さらに、タンパク質の局在依存性を評価するために、核・ミトコンドリア・ERなど様々な細胞小器官に局在化させるためのコンストラクトを作製する。本研究では、細胞内で働く生体分子の機能を人為的に操作するための機能性小分子を開発することを目的としている。機能制御法として「光」を用いることで、時空間分解能の高い操作が実現可能である。特に、生体分子機能を任意のタイミングで可逆的に制御することができれば、数多くの分子が相互作用し合う複雑な生体システムの理解につながると期待される。そこで、タンパク質間の相互作用(二量体化)を光操作するための光応答性小分子の開発に取り組んだ。二量体化させるタンパク質としてFKBP12(F36V)変異体とHaloTagを選択し、それぞれのリガンドの合成を行った。光照射依存的にリガンド構造を変化させるために、FKBP12(F36V)のリガンド構造にフォトクロミック化合物であるアゾベンゼン骨格を組み込んだ。実際、365 nmと488 nmの光を交互に照射し紫外可視吸収スペクトルの測定を行ったところ、transーcisーtransの構造変化に伴うスペクトル変化が観測された。続いて、光応答性リガンドの構造が変化することでFKBP12(F36V)への結合親和性が変化するかを試験管内で評価した。まず、大腸菌発現ベクターにFKBP12(F36V)の遺伝子配列を導入し、大腸菌内で発現させることで精製タンパク質を得た。また、結合親和性の評価は蛍光偏光解消法を用いるため、トレーサーとなる蛍光標識されたFKBP12(F36V)リガンドを合成した。これらと上述の光応答性リガンドを用いた予備的実験の結果、光照射の有無によってFKBP12(F36V)に対する結合能が変化することがわかった。今年度はFKBP12(F36V)変異体の精製タンパク質を得た。さらに、FKBP12(F36V)に対する光応答性リガンドを合成し、試験管内での結合親和性を評価した。その結果、光照射の有無によって光応答性リガンドの結合能が変化することを明らかにした。したがって、本研究計画は概ね順調に達成されているといえる。

その結果、リンカー長が短い誘導体においてcis体とtrans体間での親和性の差が大きくなることが明らかとなった。続いて、培養細胞を用いた実験へと移行するために、コンストラクトの作製を行った。哺乳動物用発現ベクターにFKBP12(F36V)と赤色蛍光タンパク質、およびHaloTagと緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した。さらに、細胞核や細胞膜内葉にタンパク質を局在化させるシグナルペプチド配列の遺伝子を導入したコンストラクトも作製した。開発した光応答性二量化剤が生細胞内で機能するか、共焦点レーザー蛍光顕微鏡観察を用いて評価した。ヒト胎児腎細胞(HEK293T)内の細胞質全体にFKBP12(F36V)を、核内にHaloTagを発現させた。共焦点レーザー蛍光顕微鏡観察下で光応答性二量化剤を添加したところ、細胞全体に広がっていた赤色蛍光が核内へと移行する様子が観察された。さらに、移行初期の段階でUV光を照射したところ、移行が抑制されることがわかった。したがって、開発した光応答性二量化剤によるタンパク質二量体化の度合いを生細胞内でも光照射により制御可能であることが示唆された。FKBP12(F36V)に対する光応答性リガンドの誘導体を合成し、試験管内での結合親和性評価の結果、昨年度開発したものより良いものが見出された。さらに培養細胞を用いた蛍光顕微鏡観察の実験へと移行しており、研究計画は概ね順調に実施されている。FKBP12(F36V)に対する結合能が光依存的に変化するリガンドの開発に成功した。今後は、解離定数の算出や照射光の波長の最適化を行う。その後、培養細胞を用いて、タンパク質二量体化の光制御が可能か検証する。培養細胞内におけるタンパク質二量体化の光制御について、光照射条件(照射波長・照射時間・タイミングなど)を種々検討し、より効率の良い条件を探索する。また、二量体化の誘起と解除を光で可逆的に制御可能化について検証を行う。さらに、タンパク質の局在依存性を評価するために、核・ミトコンドリア・ERなど様々な細胞小器官に局在化させるためのコンストラクトを作製する。当初計画していた光応答性リガンドの合成が順調に進んだことから、物品費(有機合成試薬)を予定より抑えることができた。翌年度は細胞培養実験を開始することから、次年度使用額をそれらに充て計画的に使用する予定である。計画が順調に進んでいるため、比較的経費を抑えることができた。また、細胞実験は予備検討段階であり、細胞培養に関する消耗品費も予定より少なかったため次年度使用額が発生した。次年度は本格的に細胞培養ならびに蛍光イメージングを実施するため、そのための消耗品類(血清・観察用ディッシュなど)の購入を予定している。
有機試料用高分解能低損傷逆光電子分光装置の製作と機能性有機物質の非占有準位の観測

平成16年度、17年度を通して有機試料用の高分解能逆光電子分光装置の製作を行った。(1)高分解能電子銃についてはカーボンナノチューブ電界放出素子、及び、BaO傍熱型カソードを用いて作成を行った。作成後、評価を行い、前者は、得られる電子線のエネルギー分布が0.2eV程度と狭く、当初の高分解能化の目的を達している。また、後者も0.20.3eV程度の分布が得られており、測定に十分使用可能となっている。(2)高分解能検出器の作成に関しては、次の2タイプの検出系の製作を行った。(A)SrF_2窓を用いたバンドパス型検出器:SrF_2,KClを組み合わせ、さらに、SrF_2の吸収端の温度変化特性を利用した高分解能検出器の開発・製作を行った。製作した検出器は放射光施設(分子研)において評価を行い、約0.1eVの高分解能が達成されている事を確認した。(B)真空紫外分光器を用いた高分解能検出器:集光系の開発を行い、試料から放出される微弱な真空紫外光を効率的に集めるために、真空紫外域の楕円集光鏡の作成を行った。また、新たに製作した専用の測定槽と組み合わせて新たな逆光電子分光装置の作成を行った。また、試料損傷を低減するための専用マニュピュレータの作成も行った。以上の装置開発によって、約0.2eV程度のエネルギー分解能(金試料により評価)を持つ逆光電子装置の開発に成功した。上記の(A)の検出器の取り込み角を大きくした事によって、電子銃の電流値を1μA以下に抑えることが出来るようになったために有機試料においても測定が可能となり、各種フタロシアニン分子や電子輸送性有機材料の測定に成功した。得られたスペクトルを分子軌道計算による計算結果と比較する事によって、従来、特定できなかった微細なスペクトルの構造を特定することが可能となり、実際に高分解能化の成果を確認するに至った。また、角度分解測定も可能となり、高配向性グラファイトの角度分解逆光電子分光も行い、従来の逆光電子分光スペクトルでは、はっきりとは観測されていなかった低エネルギーの微細な構造を分離することに成功した。また、新規物質としてイオン液体の測定も行い、これらの結果を"春季第53回応用物理学関係連合講演会"にて発表した。現在は作成した装置によって様々な機能性有機試料をはじめ無機試料についても測定を進めている状況である。また、以上の結果をもとに国内学会での発表を行い、現在、成果を投稿論文にまとめている状況である。平成16年度において有機試料用高分解能低損傷逆光電子分光装置の製作を進めた。製作は以下のような進捗状況にある。

(1)電子銃の電子源のために、多層カーボンナノチューブを用いた電界放出素子を電子源として用いた新規高分解能電子銃の設計を行い、現在までに製作が終了し、光電子アナライザーを用いて、エネルギー分解能等の特性評価の段階に入っている。(2)高分解能検出系の設計・開発においては、(a)新規バンドパスフィルターを用いたBIS型検出系の開発を行った。従来、使用されてきた真空紫外域の窓材の組み合わせとは全く異なり、10eV以上の高い閾値を持つと考えられる全フッ素化アルカン分子を光電材料として採用した検出器の設計、製作を現在までに終了し、その評価を行っている。分解能等の検出器の特性評価は分子科学研究所・極端紫外光研究施設において行い、全フッ素化アルカン分子の検出器の光電面への定着性に関して改善すべき問題点を洗い出した上で、現在、設計の改良を行っている。(b)真空紫外分光器を用いたIPES型検出系の設計を行った。(a)とは別に真空紫外分光器と集光楕円ミラーを有する検出系、および測定槽の検討、設計を行い、現在、その改良を進めている。(3)試料の低損傷化のための新規測定槽の設計を行った。電子線照射によって起こり得る、有機試料の損傷を低減するために、逆光電子分光測定中に試料を回転させて照射される電子線密度を劇的に少なくする機構の設計を現在までに終了し、現在、その製作に取り掛かっている。有機試料用の高分解能逆光電子分光装置の製作を行った。電子銃は、カーボンナノチューブを用いた高分解能電子銃、及び、BaO傍熱型カソードを用いた電子銃を作成した。前者は、得られる電子線のエネルギー分布が0.2eV程度と狭く、当初の高分解能化の目的を達している。また、後者も0.20.3eV程度の分布が得られており、測定に十分使用可能となっている。また、以下の2タイプの高分解能検出系の製作を行った。(1)SrF2窓を用いたバンドパス型検出器:SrF2,KClを組み合わせ、さらに、SrF2の吸収端の温度変化特性を利用した高分解能検出器の開発・製作を行った。製作した検出器は放射光施設(分子研)において評価を行い、約0.1eVの高分解能化を確認した。(2)真空紫外分光器を用いた高分解能検出器:集光系の開発を行い、試料から放出される微弱な真空紫外光を効率的に集めるために、真空紫外域の楕円集光鏡の作成を行った。現在、既存の分光器、製作した測定槽と組み合わせて新たな逆光電子分光装置の作成を行うに至っている。以上の装置開発によって、約0.2eV程度のエネルギー分解能(金試料により評価)を持つ逆光電子装置の開発に成功した。上記の(1)の検出器の取り込み角を大きくした事によって、電子銃の電流値を1μA以下に抑えることが出来るようになったために有機試料においても測定が可能となり、各種フタロシアニン分子や電子輸送性有機材料の測定に成功した。得られたスペクトルを分子軌道計算による計算結果と比較する事によって、従来、特定できなかった微細なスペクトルの構造を特定することが可能となり、実際に高分解能化の成果を確認するに至った。また、角度分解測定も可能となり、高配向性グラファイトの角度分解逆光電子分光も行い、従来の逆光電子分光スペクトルでは、はっきりとは観測されていなかった低エネルギーの微細な構造を分離することに成功した。現在は作成した装置によって様々な機能性有機試料をはじめ無機試料についても測定を進めている状況である。また、以上の結果をもとに国内学会での発表を行い、現在、成果を投稿論文にまとめている状況である。
メダカ頭蓋顔面形態の多様性～個体差を担う遺伝子を探す～

頭蓋顔面形態は多様性に富む興味深い形質であり、その形成には環境と遺伝要因の両方が関わるとされている。我々は頭蓋顔面形態の多様性形成に関わる遺伝子の同定を目指し、メダカを用いた統計遺伝学的解析を実施した。その結果、形質とゲノム領域との関連を複数見出し、形質L33の関連ゲノム領域を6番染色体の約5Mbpに絞り込むことに成功した。また、形質D29に対する二つの関連ゲノム領域の検証を進めたが、いずれも陰性であった。もう一つの形質V13では、形質自体が環境の影響を受けやすく不安定であることが判明し、解析不能との判断を下した。今後まもなくL33の絞り込みが完了し、遺伝子の同定へと進める予定である。頭蓋顔面形態は、種特異性と種内多様性という両方の性質を併せ持つ、非常に興味深い構造である。本研究課題においては、頭蓋顔面形態の種内多様性に関わる遺伝要因を明らかにすることを目的とし、遺伝学的解析を進めている。これまでに行った量的形質遺伝子座解析にて、3つの頭蓋顔面形質への関与が示唆される4つのゲノム領域を見出しており、現在、各々について解析を進めている。以下にその進捗状況を述べる。形質L33は6番染色体の関与が示唆され、既にコンソミック系統(対象の染色体一本が別系統のゲノムに置換された系統)による検証が完了していた。そこで、今年度は形質関連領域を更に絞り込むための系統作りを行った。具体的には、6番染色体の半分程度が別系統のゲノムに置換されたコンジェニック系統を二つ作成した。形質D29については15番、22番染色体の関与が示唆されていたため、それぞれのコンソミック系統の樹立を試みた。15番染色体については遺伝的雌が雄として育ってしまう現象が頻発し、系統樹立作業が難航した。このため、コンソミック系統の樹立を断念し、染色体を二つに分けたコンジェニック系統にてカバーすることとした。これら2つの系統作成は順調に進み、樹立に成功している。22番染色体のコンソミック系統は、大きな問題もなく樹立することができた。しかし、表現型解析を行ったところ形質との関連は確認できず、示唆された関連は擬陽性であったと思われた。形質V13は5番染色体の関与が示唆されていた。そこで今年度は、この染色体のコンソミック系統の樹立を行った。15番染色体のコンソミック系統樹立で見られたのと同様に、遺伝的雌の雄化が若干認められた。しかし系統樹立に大きく影響するほどではなく、無事に系統樹立にたどりつくことができた。これまでに行った量的形質遺伝子座解析にて、3つの頭蓋顔面形質への関与が示唆される4つのゲノム領域を見出した。昨年度の解析で、1つのゲノム領域は擬陽性であることが判明したため、残り3領域(3形質)での解析を各々進めた。形質L33は6番染色体の関与が検証できており、関連ゲノム領域をさらに絞り込むためのコンジェニック系統(対象領域のみ別系統のゲノムに置換された系統)2系統が準備できていた。そこで今年度はそれらの表現型解析を実施し、6番染色体の端である約5Mbpの領域に形質関連領域があることを示唆できた。現在、この結果を検証するための系統を作成中である。更に、対象領域には多数の遺伝子が存在するため、コンジェニック系統を用いた領域特定をさらに進めるべく、新たな系統も複数作成しつつある。また、より詳細な領域確認を可能にするため、領域内に新たな遺伝マーカーの設定も行っている。形質V13(5番染色体)およびD29(15番染色体)については、量的形質遺伝子座解析により得られた結果の検証のために作成した一部の系統にコンタミネーションが発生するなど、想定外の状況が重なり、今年度は系統の再整備を行うにとどまった。上述を受け、系統全体のコンタミネーションを避けるための方法として、各世代の継代ペアの遺伝子型モニタリングを行うこととした。具体的には、各染色体2遺伝マーカーずつ、1個体につき計48マーカーの遺伝子型確認を行う。このためのマーカーの選抜を行った。量的形質遺伝子座解析により得られた結果の検証を行うべく、5番染色体のコンソミック系統(対象の染色体一本が別系統のゲノムに置換された系統)の表現型解析を進めていたところ、この系統全体にコンタミネーションが起き、実際にはコンソミック系統になっていないことが判明した。このため、新たに系統を準備する必要が生じてしまい、解析の遅れの原因となった。また、15番染色体をカバーする二つのコンジェニック系統の内、片方の系統では、表現型解析のために増やした個体が全滅する事故が起きてしまった。そこで解析個体を準備し直す必要に迫られたが、思うように産卵せず、未だ必要な個体数をそろえられていない。他方の系統は、遺伝的雌が雄として成長してしまう現象が頻繁に起きてしまい、系統の維持が難しくなった。そこで、系統のバックアップ維持をお願いしていた連携研究者からこの系統を分与していただいたところ、先方の研究室内でコンタミネーションが起きていたことがわかった。

幸い、コンタミネーションが起きていない家系が1つ見つかったため、現在、その家系の個体を増やしつつある。頭蓋顔面形態は、種特異性と種内多様性という両方の性質を併せ持つ、非常に興味深い構造である。本研究課題においては、頭蓋顔面形態の種内多様性に関わる遺伝要因を明らかにすることを目的とし、遺伝学的解析を進めている。量的形質遺伝子座(QTL)解析にて3つの頭蓋顔面形質(L33、V13、D29)への関与が示唆されるゲノム領域(L33ー6番染色体、V13ー5番染色体、D29ー15,22番染色体)を見出していたが、一昨年度の解析を通じ、22番染色体のゲノム領域は擬陽性であることが判明した。このため、残り3領域(3形質)の解析を進めた。以下にその進捗・結果を述べる。形質L33ー6番染色体:昨年度までの解析にて、6番染色体の端約5Mbpの位置が形質関連領域であることが示唆されていた。そこで、この領域を更に細かく分断したコンジェニック系統を6系統作成した。各系統の表現型解析用個体を確保し、現在、その成長を待っている段階である。これら系統の表現型解析により、形質関連領域を500kbp1Mbp程度に絞り込む見通しである。形質V13ー5番染色体:形質への関連が示唆された領域をカバーするコンジェニック系統を用い、表現型解析を行った。その結果Hd-rRとの間に有意な差が認められ、QTL解析結果の検証に成功したかに見えた。しかし追試として同時に行った、Hd-rRとHNIの比較解析では、V13における2系統間の関係が当初とは逆転してしまった。すなわち、コントロールしきれていない何らかの環境要因がV13に関わっており、表現型が不安定になっていることが示唆された。このため、現時点では、解析不能との判断を下した。形質D29ー15番染色体:15番染色体をカバーする2つのコンジェニック系統の頭部撮影を行った。今後、撮影した画像をもとに表現型の定量化を行い、表現型解析を完了させて、QTL解析結果を検証する。頭蓋顔面形態は多様性に富む興味深い形質であり、その形成には環境と遺伝要因の両方が関わるとされている。我々は頭蓋顔面形態の多様性形成に関わる遺伝子の同定を目指し、メダカを用いた統計遺伝学的解析を実施した。その結果、形質とゲノム領域との関連を複数見出し、形質L33の関連ゲノム領域を6番染色体の約5Mbpに絞り込むことに成功した。また、形質D29に対する二つの関連ゲノム領域の検証を進めたが、いずれも陰性であった。もう一つの形質V13では、形質自体が環境の影響を受けやすく不安定であることが判明し、解析不能との判断を下した。今後まもなくL33の絞り込みが完了し、遺伝子の同定へと進める予定である。本来ならば、上述の系統樹立を行った後、表現型解析までを今年度中に終える予定であった。しかし、15番染色体のコンソミック系統作成時に、遺伝的雌が雄化してしまい、次世代をとるための適切な雌が得られない状態に陥ってしまった。何度か、「遺伝的雄を戻し交配した後に兄妹交配してホモ接合化を行う」、という過程を繰り返したため、全体としての遅れが生じてしまった。コンタミネーションの被害を最小にとどめるため、今後、作成したコンソミック・コンジェニック系統は各世代の継代ペアを遺伝子型モニタリングすることとする。以下に、それぞれの形質・染色体についての今後の推進方策を述べる。
有機反応論の動力学的検証に向けた有機イオンビーム法の開発

本研究は、有機反応論で展開されている化学反応の微視的モデルが、求核性・求電子性といった静電的指標に基づいたイオン・分子反応的性質をもつことに着目して、有機イオン分子ビーム源を中心とした反応動力学的実験手法の開発を目的としている。開発する真空装置全体は、(a)イオンソース、(b)8重極イオンガイド、(c)衝突セル、(d)検出系チェンバーから構成される。共鳴多光子イオン化法により発生させた内部状態(V_<ini>)と衝突エネルギー(E_<col>)が制御されたイオンビームを、反応分子を充填した衝突セルに導入する。セル内でのイオン・分子反応による生成物を質量分析検出することで、内部状態と衝突エネルギーの関数としての反応断面積[σ(V_<ini>, E_<col>)]を測定する。これまでに各構成要素の設計を行い、真空装置全体の製作を終了した。測定対象とするイオン・分子反応系を、製作した装置性能の観点から検討した。σ_<reac> (V_<ini>; E_<col>)測定に対しては、{C_2H_2^+、H_2CO^+、CH_3CHO^+、NH_3^+、CH_3^+}+{アルカン、オレフィン、アルコール}のイオン・分子反応系を有力な測定対象候補として決定した。また、始状態・終状態相関を含むσ_<reac> (vini^⇔V_<final>; E_<col>)測定を目的とした中性生成物の状態選別イオン化検出の対象反応系として、(a)H_2CO^++M→HCO+MH^+、および(b)CH_3^++M→CH_2+MH^+(いずれもM=R-H、-C=C-、R-OH)を検討した。HCO(ホルミルラジカル)およびCH_2(メチレンラジカル)の検出には、それぞれ共鳴励起状態が安定であり回転準位構造が分離できるB^2A'-X^2A'[1+1]およびH(3p)-X^3B_1[2+1]遷移に共鳴多光子イオン化法を適用することとした。
コレクチンとの相互作用による免疫グロブリンの機能制御

本研究により、コレクチンのMBLとSP-Dが糖認識領域を介してIgMに結合することが明らかとなった。さらにMBLの結合性はIgMの多量体構造、抗原結合親和性、抗原密度などに依存することが示された。これらの結果は、IgMの形状は抗原結合によって親和性や抗原密度に依存して変化すること、そしてそれらの変化をMBLが見分けることが出来ることを示唆している。また、MBLが補体系古典経路の活性化制御に関与する可能性を示唆する結果が得られた。我々は、生体防御レクチンであるコレクチンの免疫反応制御について研究を行っている。本研究の目的は、獲得免疫生体防御に重要な分子である免疫グロブリンとコレクチンの相互作用を解析し、コレクチンの結合が免疫グロブリン機能に及ぼす影響を明らかにすることである。以下に本年度の研究成果を要約する。1、ビオチンで標識した肺コレクチンのSP-AやSP-D、マンノース結合レクチン(MBL)を用いて、コレクチンが様々なクラスのマウス由来モノクローナル抗体や組換え免疫グロブリンとカルシウム存在下で結合することを示した。またコレクチンは、ハプテン特異的モノクローナル抗体とハプテン化キャリア蛋白で形成された免疫複合体に結合した。特にMBLとSP-Dは、IgMの免疫複合体と強い結合性を示した。コレクチンと免疫グロブリンの相互作用が証明されたことで、今後はその機能と生物学的意味を解明していくことが重要である。2、コレクチンと免疫グロブリンや免疫複合体の相互作用は、EDTAや過剰のマンノースによって部分的に阻害された。このことは、レクチン様結合の重要性を示唆している。また、免疫グロブリンのクラスやクローンによって、コレクチン結合性の強さが異なることを示唆する結果を得た。各クローン間のアミノ酸配列や修飾糖鎖等の構造の違いを反映している可能性が考えられる。コレクチンと免疫グロブリンの結合様式に関してより詳しい解析を行うことは、免疫グロブリンのエフェクター機能とコレクチン結合の関連を明らかにする上で重要である。本研究の目的は、獲得免疫生体防御に重要な分子である免疫グロブリンとコレクチンの相互作用を解析し、免疫グロブリン機能との関連を明らかにすることである。1.解析している3つのコレクチン分子のうち、SP-AよりもSP-DとMBLがコレクチンに対する結合性が高かった。同一の可変領域を持ち、定常領域を入れ換えた組換え免疫グロブリンを作製して、これらのコレクチンとの結合を調べた結果、特にIgMやIgEに強い結合を示した。IgMへの結合では、SP-DやMBLの糖結合領域(CRD)に対するモノクローナル抗体によって結合の抑制が見られたことから、コレクチンのCRDが免疫グロブリンとの相互作用に重要であることが示された。IgMやIgEはIgGと比べて修飾糖鎖が多いことからも、コレクチンは免疫グロブリンのFc領域に結合した糖鎖を認識している可能性が高いと考えられるが、これについては更なる検討を必要とする。また、複数のモノクローナルIgMを比較すると、MBLの結合性に違いがあることもわかった。2.免疫グロブリンの機能との関連を調べるため、マクロファージによるIgG依存性ファゴサイトーシスの系を用いた。ラット肺胞マクロファージに蛍光標識したビーズを貪食させるとき、ビーズにIgG2bが結合しているとマクロファージによる貪食が増強される。ここにSP-Aが存在すると更なる貪食の促進が見られ、SP-Aはマクロファージの貪食活性を高めることがわかった。しかし、IgG2bがなくても低い程度のSP-Aによる貪食の促進はみられ、SP-Aがビーズ上のIgGに結合することにより貪食を促進しているのかは、現在のところ明らかではない。本研究の目的は、獲得免疫生体防御に重要な分子である免疫グロブリンと生体防御レクチンであるコレクチン(SP-A、SP-DおよびMBL)の相互作用を解析し、免疫グロブリン機能との関連を明らかにすることである。1.マウス骨髄由来マスト細胞およびラット好塩基球細胞株(RBL-2H3)を用いて、IgE依存脱顆粒反応におけるコレクチンの影響を検討した。FcεRIにIgEを結合させた後、抗原で刺激することにより脱顆粒を起こさせた。この反応にSP-A、SP-D、MBLのいずれを加えても、有意な違いは見られなかった。2.抗NP IgMを結合させた抗体感作ヒツジ赤血球とウサギ補体成分を用いて、溶血反応により補体活性化を測定した。SP-AやSP-Dの添加では20μg/mlまでの濃度で溶血反応に有意な変化は見られなかったが、MBLでは反応がやや低下した。

さらにMBL濃度を50μg/mlにすると、溶血反応に顕著な減少が見られた。抗ヒツジ赤血球血清を用いた場合も、MBLによる溶血反応の阻害がみられた。よって、MBLには補体系古典経路活性化を阻害する効果があることが示唆された。そのメカニズムは今後検討する必要がある。この濃度は通常血清中のMBL濃度より高いので、生理的条件化でMBLが補体活性化を制御しているのかは明らかではないが、MBLを補体活性制御へ応用できる可能性を示唆するものである。3.抗原に結合したIgMとMBLの相互作用を詳しく解析した結果、抗原親和性の高いIgMがエピトープ密度の高い抗原に結合すると、MBLの結合性が低くなることがわかった。これは、抗原に結合したIgMの構造は親和性と抗原密度に依存し、IgMの構造変化がMBLの結合性に反映されていることを示唆する。我々はMBL結合性と同様に、IgMによる補体活性化も親和性の高いIgMが高密度の抗原に結合したときには低くなることを見つけており、MBL結合性との関連は興味深い。今後IgMの抗原結合時における構造変化とその意味について、詳しく解析したい。
分子複合体を可逆架橋とした形状記憶ゲルの設計と分子応答形状記憶特性

本研究では,一時的な形状を維持するための可逆架橋として分子複合体を利用することにより,分子刺激によって一時的形状から元の形状へと変化する分子応答性の形状記憶ゲルの設計を試みる。本年度は以下のような研究成果が得られた。i)ビスフェノールA(BPA)に応答する形状記憶ゲルの設計:シクロデキストリン(CD)とBPAとのCD-BPA分子複合体からなる可逆架橋と架橋剤モノマーのN, N'-メチレンビスアクリルアミド(MBAA)からなる共有結合架橋との比率により,一時形状の記憶効果が大きく変化した。さらに,可逆架橋と共有結合架橋によって決定される初期形状と一時形状の2種類の安定化構造を明確にし,優れた分子応答性形状記憶ゲルを合成するための設計指針を明らかにした。ii)グルコースに応答する形状記憶ゲルの設計:フェニルボロン酸基含有モノマー(PBA)と側鎖グルコース含有モノマー(GEMA)とからなるPBA-GEMA複合体からなる可逆架橋とMBAAからなる共有結合架橋との比率により,一時形状の記憶効果が大きく変化し,グルコースに応答した形状回復率を明らかにした。さらに可逆架橋と共有結合架橋によって決定される初期形状と一時形状の2種類の安定か構造を明確にし,優れた分子応答性形状記憶ゲルを合成するための設計指針を明らかにした。iii)複数形状を記憶する形状記憶ゲルの設計:CD-BPA複合体とPBA-GEMA複合体を可逆架橋とする各ネットワークが相互に絡み合った相互侵入網目(IPN)ゲルの合成を試みた。現段階ではIPNゲルの合成に成功しておらず,今後も2種類の分子複合体を可逆架橋とするゲルの合成を試み,その形状記憶挙動を検討する予定である。iv)形状記憶ゲルのセンサー応用:標的分子濃度と形状記憶率や形状回復率との関係を明らかにした。今後はこのような形状記憶システムを利用したセンサーシステムの構築を目指す。i)ビスフェノールA(BPA)に応答する形状記憶ゲルの設計:可逆架橋としてシクロデキストリン(CD)とBPAとの分子複合体を利用することにより,BPAに応答して一時形状を維持する形状記憶ゲルの設計を試みた。具体的には,重合性官能基を導入したアクリロイル化CDと親水性モノマーのアクリルアミド(AAm),架橋剤モノマーのN, N'-メチレンビスアクリルアミド(MBAA)を共重合することにより,BPAに対するリガンドとしてCDを有するP(CD-AAm)ゲルを合成した。この合成時の形状を成形初期の元形状とし,このゲルに応力を負荷させて変形させた状態でBPA水溶液に浸漬させ,一時的な形状を固定することに成功した。この一時形状のP(CD-AAm)ゲルをアセトン水溶液に浸漬し,ゲルからBPAを除去して可逆架橋を解離させると,初期形状へと回復することが確認された。ii)グルコースに応答する形状記憶ゲルの設計:側鎖グルコース含有モノマー(GEMA)の重合体であるPGEMAを存在させた状態でフェニルボロン酸基含有モノマー(PBA)とAAm,MBAAを共重合することにより,フェニルボロン酸基と側鎖グルコース基をもつPBA-GEMAゲルを合成した。このとき,PBA-GEMA複合体の形成を阻害する過剰のグルコースを存在させた状態でPBA-GEMAゲルを合成した。このゲルを変形させた状態で緩衝液に浸漬してグルコースを除去し,PBA-GEMA複合体形成により一時的な形状を固定することに成功した。この一時形状のPBA-GEMAゲルをグルコース水溶液に浸漬すると,その阻害効果によって可逆架橋を解離させることができ,ゲルが初期形状へと回復することが確認された。ビスフェノールA(BPA)およびグルコースに応答する形状記憶ゲルを合成し,特定条件下で一時形状を維持することが確認できた。またBPAの除去やグルコースの添加により,初期形状へとゲルの形状が回復することを確認し,予定よりも早く分子刺激に応答する形状記憶ゲルの合成に成功した。したがって,当初の計画以上に進展していると判断した。

さらに可逆架橋と共有結合架橋によって決定される初期形状と一時形状の2種類の安定か構造を明確にし,優れた分子応答性形状記憶ゲルを合成するための設計指針を明らかにした。iii)複数形状を記憶する形状記憶ゲルの設計:CD-BPA複合体とPBA-GEMA複合体を可逆架橋とする各ネットワークが相互に絡み合った相互侵入網目(IPN)ゲルの合成を試みた。現段階ではIPNゲルの合成に成功しておらず,今後も2種類の分子複合体を可逆架橋とするゲルの合成を試み,その形状記憶挙動を検討する予定である。iv)形状記憶ゲルのセンサー応用:標的分子濃度と形状記憶率や形状回復率との関係を明らかにした。今後はこのような形状記憶システムを利用したセンサーシステムの構築を目指す。今後の方針として以下のような研究計画に基づいて研究を遂行する予定である。i)BPA応答性形状記憶ゲルの構造と形状記憶効果:CD-BPA複合体からなる可逆架橋とMBAAからなる共有結合架橋との比率によって形状記憶効果が左右されると考えられる。そこで,P(CD-AAm)ゲルを合成する際のCD含有率とMBAA含有率を変化させたゲルを合成し,BPA存在下での一時形状の記憶効果を検討する。さらに,可逆架橋と共有結合架橋との比率によって決定される初期形状と一時形状の2種類の安定化構造を明確にし,形状記憶機構を解明すると共に,優れた分子応答性形状記憶ゲルを合成するための設計指針を明らかにする。ii)グルコース応答性形状記憶ゲルの構造と形状記憶効果:PBA-GEMA複合体からなる可逆架橋とMBAAからなる共有結合架橋との比率によって形状記憶効果が左右されると考えられる。そこで,PBA-GEMAゲルを合成する際のPBA含有率とMBAA含有率を変化させたゲルを合成し,一時形状の記憶効果とグルコースに応答した形状回復率を検討する。iii)複数形状を記憶する形状記憶ゲルの設計:CD-BPA複合体を可逆架橋とするネットワークとPBA-GEMA複合体を可逆架橋とするネットワークからなる相互侵入網目(IPN)ゲルを合成する。このような2種類の分子複合体を可逆架橋とするゲルの形状記憶挙動を検討する。iv)形状記憶ゲルのセンサー応用:標的分子濃度と形状記憶率や形状回復率との関係を調べ,分子センサーや分子アクチュエータへの応用を検討する。さらに,分子種を入力情報とし,形状変化を出力情報としたAND/OR型ロジックゲートへの応用も検討する。
高等植物細胞における分子シャペロンの構造と役割

本研究は高等植物細胞のオルガネラに局在する分子シャペロンの構造と機能を解析することにより、これらタンパク質による植物細胞のストレス防御系を明らかにすることを目指してしる。本年度はクロロプラストに局在する分子シャペロン、特にシャペロン60(Cpn60)と熱ショックタンパク質70(Hsp70)を取りあげ、タンパク質のクロロプラスト膜の透過、アセンブリーにおけるこれら分子シャペロンの役割を解析した。クロロプラストタンパク質としてはフェレドキシン-NADP^+レダクターゼ(FNR)、フェレドキシン、Rubisco小サブユニット等のcDNAをin vitroで翻訳転写させ、これらの産物をエンドウ葉より調製した無傷クロロプラストに取り込ませた。取り込みの効率はFNRが一番高い結果を与えたので、以後の実験はFNRの輸送系を中心に行った。取り込まれたFNRの前駆体はプロセシングをうけて成熟型のFNRに変換する。この新たにクロロプラストに導入されたFNRとHsp70の相互作用を解析するため、Hsp70特異抗体による免疫沈降を試みた。この結果、導入されたFNRの一部はATPレベルが低い場合にのみHsp70の特異抗体により沈降し、ATPを添加すると沈降は見られなかった。このことから、新たに導入されたFNRはATP濃度が低い条件下においてHsp70と相互作用していることが初めて明らかになった。Cpn60の特異抗体を用いた免疫沈降実験からも同様のFNRの沈降がみられたことから、新たに導入されたFNRはCpn60とも相互作用していることが判明した。これらの分子シャペロンのFNRとの結合は時間に伴って変化し、Hsp70特異抗体によって免疫沈降されるFNRは輸送の初期に一過性であるのに対し、Cpn60抗体ではその後にFNRが沈降された。この結果はFNRはまずHsp70に相互作用し、その後Cpn60と結合することを示唆している。以上の研究により、これら分子シャペロンが新たにクロロプラストに導入されたタンパク質と相互作用していることを初めて明らかにした。