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「アニミズム」概念の受容と変容-オランダの"思惑"とインドネシアの"現実"-

本年度は、オランダのライデン大学図書館と王立言語・地理・民族学研究所にてカルティニ関係の資料の収集とG・J・ヘルドの著作・関連資料の収集、およびインドネシアのガジャマダ大学、インドネシア大学の図書館、インドネシア科学院にてカルティニ関係の資料の収集とカルティニ関係施設の訪問、クンチャラニングラット関係の著作・関連資料の収集と関係者へのインタビューを行った。カルティニはオランダの学知をインドネシアに伝達する役目を果たした知識人であり、オランダ人に送った書簡が書籍として出版されている。オランダの王立言語・地理・民族学研究所にはカルティニ直筆の書簡や、書簡以外のカルティニによる雑誌記事もあり、それらはカルティニの思想を知る上で必要不可欠な資料である。また、インドネシア大学人類学の教授であったG・J・ヘルドは、インドネシアの人類学の形成を考察するさいに、非常に重要な人物である。彼の書簡や未刊行論文などは王立言語・地理・民族学研究所にG・J・ヘルドコレクションに収められており、それらを複写することができた。インドネシアにおいてはカルティニ関係の資料の収集および施設の訪問、インタビューを行い、インドネシアにおいてカルティニがどのように受容されているかを調査した。クンチャラニングラットは、上述のヘルドの助手を務め、インドネシア人類学の祖と呼ばれている。インドネシアにおいて大きな影響力を持った人物である。資料収集のほか、彼の教え子であるTony Rudyansjah氏やYunita T.Winarto氏と、クンチャラニングラットの宗教研究についてのパースペクティブについて討論を行った。彼の「宗教」概念を理解することは、現代インドネシアの「アニミズム」概念を考察するうえで意義あることである。今年度のインドネシアでの資料収集とインタビューの成果は本研究において非常に意味をもつものとなった。本年度は、オランダの宗教学と民族学における「アニミズム」概念の成立過程および変容過程の調査を行った。具体的には、オランダのライデン大学図書館と、王立言語・地理・民族学研究所における資料収集の実施と、資料における「アニミズム」概念の精査および比較検討である。資料収集は、蘭領インドネシアの行政官や宣教師によるインドネシアの民族誌を中心に行った。主に、行政官でありライデン大学民族学教授も務めたG・A・ウィルケンと、後のオランダ宗教現象学に関わりの深い宣教師A・C・クロイトの著作を収集・精読した。また、それら民族学者と関係の深い宗教学者における「アニミズム」概念の研究も行った。同大学における宗教学と民族学は成立時期を同じくし、「アニミズム」概念を用いて研究を行ったという共通点がある。宗教学の初代教授C・P・ティーレと、ウィルケンとクロイトの「アニミズム概念」を精査・比較検討し、その結果「アニミズム」概念が本国と植民地との知的交流から成立したことと、使用者によって意味が異なることが明らかになった。その違いは、学説史的な立場と、使用者の植民地からの距離によると考察される。それは、ヨーロッパのアカデミズム世界と植民地社会の関係を考えるうえで意義あることであり、現代の「アニミズム」概念のはらむ問題を検討するに際しても非常に重要性を持つ。今年度の研究は二つにまとめられる。一つはオランダの宗教学と民族学におけるアニミズム概念とプレアニミズム概念の形成過程についての研究を行った。オランダがインドネシアを研究する際に用いた概念が変化する過程を調査することによって、オランダのインドネシアに対する眼差しが明らかとなった。またその眼差しは研究者ごとに異なり、複雑性を持つ。それにはオランダ本国でのアカデミズムの影響もあるが、研究者の立場によることが大きい。これらのことにより、植民地には西洋対非西洋という二項対立では捉えきれない状況が存在することが明らかとなった。もう一つはインドネシアにおける学知の形成とその意味の研究である。そのためにオランダ人と関わりを持っていたインドネシア人カルティニを取りあげ、その先行研究の分析を行った。それとともにポストコロニアル論の精読も行った。先行研究の精読によって、これまでの学知の形成についての研究においては、西洋側の営みにのみ注目され、その対象となった植民地現地の人々の関与や彼らに対する意義にはあまり注意が払われてこなかったことがわかった。今年度の研究により、西洋も植民地も一枚岩的なものとして扱われがちであり、それらの複雑性は考慮に入れられていなかったことが明らかとなった。本研究ではそれらの問題を踏まえ、現地の人々の主体性や西洋および植民地の複雑性を考慮に入れることで、ポストコロニアル論の限界を乗り越える可能性を見出すことができる。

彼の書簡や未刊行論文などは王立言語・地理・民族学研究所にG・J・ヘルドコレクションに収められており、それらを複写することができた。インドネシアにおいてはカルティニ関係の資料の収集および施設の訪問、インタビューを行い、インドネシアにおいてカルティニがどのように受容されているかを調査した。クンチャラニングラットは、上述のヘルドの助手を務め、インドネシア人類学の祖と呼ばれている。インドネシアにおいて大きな影響力を持った人物である。資料収集のほか、彼の教え子であるTony Rudyansjah氏やYunita T.Winarto氏と、クンチャラニングラットの宗教研究についてのパースペクティブについて討論を行った。彼の「宗教」概念を理解することは、現代インドネシアの「アニミズム」概念を考察するうえで意義あることである。今年度のインドネシアでの資料収集とインタビューの成果は本研究において非常に意味をもつものとなった。
高転移性細胞に対するIGFーIの作用の解析

高転移性NLー17細胞に対するIGFーIの増殖促進効果は、その血中レベルの1/10以下の濃度(10ng/ml)で認めれる。一方、低転移性NLー44細胞に対するIGFーIの効果は弱い。両者の間で、IGFーIレセプタ-発現の差は見られなかったが、NLー17細胞ではIGFーI刺激により、150160kDa(pp150/160)の細胞質蛋白に著明なチロシンリン酸化が認められ、このリン酸化の程度は、NLー44細胞に比べ有意に高いことが判明した。この反応はEGF、PDGFでは惹起されずIGFーIに特異的であった。pp150/160のチロシンリン酸化はIGFーI添加後10秒以内に認められ、IGFーIを除去すると30分以内で基底状態に復帰した。以上のことから、pp150/160はIGFーIのシグナル伝達に重要な役割をなすと考えられた。そこで、増殖因子レセプタ-キナ-ゼの基質として注目されているホスホリパ-ゼCγ(PLCγ)およびホスファチジルイノシト-ル3キナ-ゼ(PI3K)との関連を調べた。PLCγ(145kDa)はその分子量がpp150/160と近いが、IGFーIではPLCγのチロシンリン酸化はおこらず両者は異なる分子であった。一方、IGFーI刺激したNLー17細胞抽出液を抗PI3Kモノクロ-ナル抗体CA3(東京大学農学部福井泰久博士より供与された)で免疫沈降し、沈降物を抗リン酸チロシン抗体によりイムノブロットした結果、PI3Kにチロシンリン酸化されたpp150/160が結合していることが明らかとなった。従って、pp150/160はIGFーI刺激によりチロシンリン酸化されPI3Kに結合することによってIGFーIのシグナル伝達に関与することが示唆された。pp150/160のチロシンリン酸化体の精製を行なうため、モノクロ-ナル抗リン酸チロシン抗体MAb25.2G2産生ハイブリド-マを樹立した。この抗体で作製したアフィニティカラムに、IGFーI刺激したNLー17細胞抽出液をかけることによりpp150/160の濃縮と部分精製に成功した。この画分には、pp150/160以外の微量蛋白のチロシンリン酸化体が含まれており、さらに精製を進めている。
初期のユダヤペルシア語の研究に基づく、近世ペルシア語形成期の言語状況について

本研究は中世ペルシア語から近世ペルシア語にかけての言語変化を,初期の近世ペルシア語文献を参考として解明することが目的であり,その際に特に豊富な文献を有する初期ユダヤペルシアの研究は必要不可欠と言える。今年度は,この本研究の基盤となる初期ユダヤペルシア語について,特にヘブライ語との関連で研究を行った。初期ユダヤペルシア語は当時のイラン語圏におけるユダヤ人によって,ヘブライ文字で書かれた近世ペルシア語である。この言語ではヘブライ語の語彙が用いられ,あるいはヘブライ語の文法的要素が利用されるなど,ヘブライ語の影響は無視できない。特に宗教に関する文献ではヘブライ語とペルシア語の対訳がなされるものが多く,ヘブライ語への理解が重要となる。執筆者はそのようなヘブライ語とペルシア語の翻訳資料により,両言語の比較を行うことが可能であることに着目し,ヘブライ語の特有の言語現象がペルシア語においてどのように反映されているか調査を行った。特にヘブライ語とペルシア語の動詞体系について研究し,ヘブライ語の動詞型(ビンヤン)がペルシア語ではどのように反映されるか調査し,その成果を学会発表の形で報告を行った。上記のほか,執筆者は過去に発表された文献について改訂を進めており,旧約聖書を参照することで,今まで未解明であった箇所を明らかにすることに成功している。この研究を通じて,初期ユダヤペルシア語の文献をより洗練された形で提供できる。また,ペルシア語とヘブライ語という大きく異なる言語の懸隔を,当時の話者が如何に解消したか示すことができ,両言語が相互に及ぼした影響を明らかにするという点で極めて重要と言える。28年度が最終年度であるため、記入しない。執筆者の研究内容・目的は,近世ペルシア語形成期の言語状況を明らかにすることである。すなわち,中世ペルシア語から近世ペルシア語にかけて起こった言語の変化を,それぞれの言語を比して記述し,その間の文献資料,特に初期のユダヤペルシア語に基づいて変化の動機や環境を説明することを目的とする。中世ペルシア語から近世ペルシア語にかけて生じた言語変化のうち,執筆者はこれまでに,用いられる関係代名詞の変化を扱った。中世ペルシア語では関係代名詞として`y, ky, cyの異なる3つの形式が用いられているのに対し,近世ペルシア語でkyだけが専ら用いられている。執筆者は中世ペルシア語における3つの関係代名詞の機能・用法を文献に基づき研究し, `yとkyについてはその使い分けが先行詞の性質や導かれる関係節構造の違いによらないことを明らかにした。また初期ユダヤペルシア語においても複数の関係詞が用いられているが,中世ペルシア語と同様その使い分けには明確な基準がないことを確認した。一方で,同時代の異なる方言で,用いられる関係詞に違いがあることや,文献によって`yの用法が中世ペルシア語よりも広いことから,関係代名詞の用法が時代ごとに連続して変化したものではなく,方言ごとに異なる変化を見せ,近世ペルシア語はあくまでもそのうちの一つの方言を採用したと考察し,論文とした。また,関係代名詞の他に,過去分詞の用法の変遷についても着目している。中世ペルシア語において多くの場合動詞形容詞を形成するために用いられる形式が,近世ペルシア語では,一般的な過去分詞として,より動詞的に用いられるようになった。この問題に対して,執筆者は中期西イラン語,初期近世ペルシア語の文献を紐解き,時代や言語の違いに注目して考証している。筆者の研究の主題はペルシア語の中期(主にササーン朝期)から近世にかけての言語変化を明らかにし,特に初期(凡そ8-12世紀)の近世ペルシア語の文法を記述することである。この研究目的のため執筆者は該当言語の文献研究を行っている。本年度では過去分詞の機能・用法の変遷について研究し,また,接続法及び動詞前辞beの用法に関する初期的研究を行った。過去語幹を*-akaで拡張することで作られる過去分詞は,中期西イラン語の段階では主に形容詞的用法で用いられていたが,近世ペルシア語になると完了や受動を表すために,動詞パラダイムの中でより頻繁に用いられるようになった。執筆者は過去分詞の動詞構文を調査し,語順や動詞前辞との位置関係を根拠に,動詞構文において中期西イラン語から近世ペルシア語にかけて過去分詞の性質が変化していることを示した。また,初期近世ペルシア語においては過去分詞によって表わされる完了が能格的であることから,この段階でも過去分詞が形容詞的性質を強く有していることを確認したが,一方で現代のペルシア語のように対格的に用いられている例のあることから,完了においても対格型へと変化する萌芽を見ることが出来た。また接続法に関しては,中期西イラン語では接続法を表す独自の形式が用いられるが,近世ペルシア語では動詞前辞beによって表わされるようになる。執筆者は初期近世ペルシア語においてそれぞれの形式の用いられる状況を確認し,それぞれの機能の違いを見た。また, beはその機能や用いられる環境に不明な点が多いが,ヘブライ語の翻訳文献を手掛かりとして一定の知見を得ている。本研究はイラン語学における重要な問題というばかりでなく,言語変化のデータを提供し,その動機を解明する点で,歴史言語学に貢献するものである。本研究には第一に中期西イラン語,初期近世ペルシア語の文献研究が必要であり,執筆者はこれまで中期西イラン語のマニ教文献と初期ユダヤペルシア語の文献を重点的に扱ってきた。一方でパフラヴィ文献やアラビア文字の初期近世ペルシア語文献に関しては調査が不足している。またイラン語の言語変化を扱う以上,古代ペルシア語,アヴェスタ語から現在のペルシア語まで幅広く手掛ける必要がある。

加えて執筆者は初期ユダヤペルシア語に特に興味を持って取り組んでおり,その中でも聖書の翻訳文献に着目しているが,ペルシア語がどのように聖書を翻訳したか知るためにも,よりヘブライ語に習熟する必要を感じている。また,ユダヤ教と当時のイラン語圏におけるユダヤ人の在り方についての理解が不可欠である。研究課題である言語変化の記述に関しては,現在までに関係詞,過去分詞と接続法を扱い一定の知見を得ており,順調と言える。一方でより広範な文献研究を通じて研究結果を補強することが必要であるし,例えば過去分詞の研究は能格型言語から対格型言語への変化に通じるため,研究そのものを一層発展させることが重要と言える。従って本研究には多くの課題が残されている。本研究は中世ペルシア語から近世ペルシア語にかけての言語変化を,初期の近世ペルシア語文献を参考として解明することが目的であり,その際に特に豊富な文献を有する初期ユダヤペルシアの研究は必要不可欠と言える。今年度は,この本研究の基盤となる初期ユダヤペルシア語について,特にヘブライ語との関連で研究を行った。初期ユダヤペルシア語は当時のイラン語圏におけるユダヤ人によって,ヘブライ文字で書かれた近世ペルシア語である。この言語ではヘブライ語の語彙が用いられ,あるいはヘブライ語の文法的要素が利用されるなど,ヘブライ語の影響は無視できない。特に宗教に関する文献ではヘブライ語とペルシア語の対訳がなされるものが多く,ヘブライ語への理解が重要となる。執筆者はそのようなヘブライ語とペルシア語の翻訳資料により,両言語の比較を行うことが可能であることに着目し,ヘブライ語の特有の言語現象がペルシア語においてどのように反映されているか調査を行った。特にヘブライ語とペルシア語の動詞体系について研究し,ヘブライ語の動詞型(ビンヤン)がペルシア語ではどのように反映されるか調査し,その成果を学会発表の形で報告を行った。上記のほか,執筆者は過去に発表された文献について改訂を進めており,旧約聖書を参照することで,今まで未解明であった箇所を明らかにすることに成功している。この研究を通じて,初期ユダヤペルシア語の文献をより洗練された形で提供できる。また,ペルシア語とヘブライ語という大きく異なる言語の懸隔を,当時の話者が如何に解消したか示すことができ,両言語が相互に及ぼした影響を明らかにするという点で極めて重要と言える。本研究に当たって必要となる研究には2点ある。第1に基礎研究として,研究に関連する言語の文献を網羅的に読むことであり,第2にその基礎研究と先行研究に基づき,中世ペルシア語と近世ペルシア語とで異なる言語特徴を示し,その違いを説明することである。執筆者はこれまでに基礎研究として,中世ペルシア語とマニ文字,シリア文字,ヘブライ文字で書かれた初期近世ペルシア語の主要な文献を読み終えているが,網羅性の点では十分とは言えず,より多くの文献に目を通す必要がある。ことに初期ユダヤペルシア語のEzekier Tafsirは特に重要な文献であるが,読解が不十分であるので研究を要する。
併用療法における有望な抗マラリア薬標的としてのチミジル酸合成酵素

5-フルオロオロト酸(FOA)抵抗性マラリア原虫の生物学的特性の解析を目的とした。Petersの方法(2%血虫率再燃法)で作製されたFOA抵抗性原虫に感染したマウスは、最終的には死亡したが、未処理原虫感染群との間に生存期間の違いが認められた。未処理原虫感染マウスは感染後1週から2週の間に死亡したが、FOA抵抗性原虫に感染したマウスは3週から4週以上生存した。このことは、FOAに対する抵抗性は、原虫の増殖を抑制するとともに病原性も減少させたことを意味する。薬剤刺激は原虫の病原性を減弱させたと推論される。FOA抵抗性が宿主ではなく原虫への有害な効果を与えたことは、原虫のTSを標的とする薬剤の研究および臨床応用を促進すると思われる。FOA抵抗性原虫感染マウスの血液塗抹標本で、細胞質の減少や細胞全体の委縮を伴った、あるいはクロマチン濃縮が認められる原虫が観察された。これらの形態学的特徴はアポトーシスと思われ、透過型電子顕微鏡観察および電気泳動法による分析を行った。透過型電子顕微鏡下での観察では、原虫発育の初期段階である「輪状体や初期栄養体」では、FOA抵抗性原虫と薬剤未処理原虫には明らかな形態的差異は認められなかった。しかしながら、「成熟栄養体や分裂体」の時期では、FOA抵抗性原虫と薬剤未処理原虫の間に顕著な形態的差異が認められた。FOA抵抗性原虫は、クロマチンの凝集や細胞内小器官の微細構造を消失が認められた。また、FOA抵抗性原虫から抽出したDNAの電気泳動パターンは、DNAラダー(はしご状の断片)を示しアポトーシスを起こしていることが示唆された。予定していたマラリア感染ザルの治療実験に関しては、京都大学霊長類研究所等で発生した「ニホンザル血小板減少症」(京都大学霊長類研究所報告書、2010年11月11日付)のため、NBR事業推進室から本学動物実験施設へのニホンザルの供給が禁止され、今年度内での治療実験は断念した。抗マラリア薬として葉酸代謝系の酵素に対する新規阻害薬の研究が注目されており、チミジル酸合成酵素(TS)が標的として有望視されている。我々は、ネズミマラリア原虫の一種のPlasmodium berghei NK65に感染させたマウスでの実験で、TSを標的とする5-フルオロオロト酸(FOA)が感染赤血球率(血虫率)の増加を抑制すること、FOAとDHFR阻害薬のピリメサミン(PYR)との2剤併用、あるいはダプソンとアーテスネートとの3剤併用投与により感染マウスが治癒すること、さらに宿主マウスには有害な作用が認められないことを報告している(Muregi et al.,1009,Exp Parasitol)。本研究では、FOAとの併用効果をさらに検討するために、FOAおよびPYRに対する抵抗性原虫の作成をPetersの方法(2%血虫率再燃法)を用いて行った。Plasmodium berghei NK65感染後にFOA(40mg/kg)およびPYR(30mg/kg)を経口的に感染マウスに投与し選択圧をかけ、薬剤抵抗性原虫の作製を試みた。FOAに関しては、15世代(92日)以上を経過して、原虫感染マウスが2%血虫率を示す感染後日数は、8日から4日に減少し抵抗性獲得が認められた。一方、PYRに関しては、93日(12世代)以上を経過しても未処理原虫と同様の血虫率パターンを示し、抵抗性の獲得は認められなかった。しかし、選択圧開始後の2、3世代のPYR処理原虫は、感染4日後の血虫率には有意差は認められなかったが、感染7日目に未処理原虫が示す増殖率のおよそ2倍の増殖率を示したが、4世代以降では未処理原虫とほぼ同様の増殖率を示した。このことは、原虫はPYRに対する抵抗性は獲得できなかったが、選択圧初期の段階で生物学的特徴が薬剤の影響で変化したことが考えられた。一方、薬物非存在下において、選択圧開始後12世代を経たFOA抵抗性原虫の、感染4日目の血虫率は未処理原虫の増殖率と同様であるが、感染後7日目の血虫率は未処理原虫の1/3を示した。2、5、10および12世代のFOA抵抗性原虫に対する薬物感受性試験で、この抵抗性は安定であることが確認された。FOA抵抗性

原虫感染マウスの血液塗抹標本で、細胞質の減少や細胞全体の委縮を伴った、あるいはクロマチン濃縮が認められる原虫が観察された。これらの形態学的特徴はアポトーシスと思われ、透過型電子顕微鏡観察および電気泳動法による分析を行った。透過型電子顕微鏡下での観察では、原虫発育の初期段階である「輪状体や初期栄養体」では、FOA抵抗性原虫と薬剤未処理原虫には明らかな形態的差異は認められなかった。しかしながら、「成熟栄養体や分裂体」の時期では、FOA抵抗性原虫と薬剤未処理原虫の間に顕著な形態的差異が認められた。FOA抵抗性原虫は、クロマチンの凝集や細胞内小器官の微細構造を消失が認められた。また、FOA抵抗性原虫から抽出したDNAの電気泳動パターンは、DNAラダー(はしご状の断片)を示しアポトーシスを起こしていることが示唆された。予定していたマラリア感染ザルの治療実験に関しては、京都大学霊長類研究所等で発生した「ニホンザル血小板減少症」(京都大学霊長類研究所報告書、2010年11月11日付)のため、NBR事業推進室から本学動物実験施設へのニホンザルの供給が禁止され、今年度内での治療実験は断念した。
高品質血液RNAを用いた腎細胞癌新規血液バイオマーカーの探索

腎癌患者、健常者それぞれ12例の末梢血からPAXgeneを用いてRNAを抽出し、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を行った。腎癌患者において有意に発現上昇していた遺伝子であるCXCL7に注目し、別のコホート180例を用いて検証し、腎癌患者において有意に発現上昇していることを確認し、ROC曲線解析にてAUC=0.722と診断で有用であった。またCXCL7は腎癌の進行に伴い上昇し、pT1aの小径腎癌患者においても上昇していた。術後の検体では検証しえた全例で発現低下を認めた。多変量解析を行ったところ、末梢血液細胞におけるCXCL7の発現は独立した腎癌の診断の予測因子であった。腎癌の新たな血液バイオマーカーの探索のため、2013年に大阪大学附属病院で腎癌と診断された患者12例および健常者12例からそれぞれPAXgeneというRNAを安定化剤を添加した採血管を用いて採血・RNAの抽出を行い、Gene Chip 2.0(Affimetrix社)マイクロアレイを用いた末梢血液細胞の遺伝子発現解析を行った。マイクロアレイより簡便、安価な定量的PCR法を用いた診断ツールの創生を目標とし、一定の基準にて腎癌患者において特異的に発現変化する15の遺伝子を同定した。13遺伝子が腎癌患者で上昇し、2遺伝子が腎癌患者で低下していた。定量的PCR法を用いてマイクロアレイと同様の結果が得られることを確認し、その中でROC解析にて最も診断予測能が高かった遺伝子に着目した。別のコホート(2013-2016年に大阪大学附属病院で腎癌と診断された患者130例および健常者50例)を用いてその診断予測能を検証したところ、この遺伝子は腎癌患者において健常者に比べ有意に発現上昇しており、ステージが進行するにしたがって発現上昇していた。そしてROC解析にてAUC 0.722と腎癌の診断に有用であった。また小径腎癌の末梢血液細胞においても同様に健常者に比し発現上昇していた。COX比例ハザードモデルによる多変量解析にて、末梢血液細胞におけるこの遺伝子の発現は独立した腎癌の診断予測因子であった。以上より末梢血液細胞におけるCXCL7の発現は腎癌の新規血液バイマーカーになりうることが示唆された。腎癌患者および健常者の末梢血液細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行うことで腎癌患者で有意に発現上昇している遺伝子を同定し、別のコホートを用いて同様の結果が得られることを確認した。またこの遺伝子は小径腎癌においても発現上昇しており腎癌の新たな血液バイオマーカーとなりうることが示唆された。前回の報告に続き、術後の評価が可能であった症例において、原発巣摘除前後の末梢血液細胞におけるCXCL7の発現をPCR法にて比較した。検討した10例では全例で術後に発現低下を認め、病勢のモニタリングに有用である可能性が示唆された。PAXgeneは血液中の全てのRNA(主に好中球,PBMC由来)を抽出している。そこで健常者,癌患者から好中球,PBMCを採取し,CXCL7の発現の局在を定量的PCR法にて比較した。その結果CXCL7は主にPBMCに発現していることが明らかになった。この結果から末梢血液細胞におけるCXCL7の発現変化はPBMCにおける発現変化を捉えていたと考えられた。そこでPBMCにおけるCXCL7の発現上昇が,腎癌の存在により引き起こされていることの検証として以下の実験を行った。まず腎癌細胞株Caki-2、786-OおよびコントロールとしてHEK293T細胞株を2日間培養し、健常者より採取したPBMCをトランスウェルインサートに播種し、共培養。18時間後にPBMCを回収しCXCL7の発現上昇が同様にみられるか定量的PCR法を用いて検証した。するとCaki-2および786-Oと共培養したPBMCにおいてコントロールのHEK293Tと共培養したPBMCと比較し、有意にCXCL7の発現が上昇していました。末梢血液細胞におけるCXCL7の発現変化はPBMCにおける発現変化を捉えていたと考えられた。腎癌細胞株と共培養した健常者由来のPBMCにおいて、CXCL7は有意に発現上昇していた。末梢血液細胞におけるCXCL7の発現は腎癌の診断・モニタリングの新規バイオマーカーになりうると考えられた。CXCL7は主にPBMCに発現しており、腎癌の存在により発現上昇することが示唆された。この遺伝子の術後の発現が低下するかどうかを検証する。またin vitroの実験によって腎癌の存在により末梢血液細胞においてこの遺伝子が同様に発現上昇するかを検討する。泌尿器悪性腫瘍予定していた出張が延期になった為。
ヒトのコリンアセチル転移酵素の構造と病態に関する研究

中枢および末梢神経の伝達物質であるアセチルコリンはコリンアセチル転移酵素(ChAT)による一段階反応で合成される。アルツハイマー病や筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患で、コリン作動性ニューロンの変性、脱落が知られている。このためコリン作動性ニューロンの発生、分化および機能維持のメカニズムと、その病態を解明することは社会的に強く求められている。ヒトの各種神経疾患におけるコリン作動性ニューロンの動態を解析する目的で、ヒトのChATcDNAクローンを単離した。ヒトのChATcDNAはラット、マウス、ブタで翻訳開始コドン(ATG)に相当する箇所がスレオニン(ACG)に変異しており、N末側にさらに108残基のアミノ酸が付加する特異な構造であった。本年度は、上記のcDNAとはN末部分の構造の異なる、新しいタイプのChATcDNAのクローンをヒト脳cDNAライブラリーにより単離し、その構造を決定した。さらにRT-PCR法により、3種類の新規構造を持つChATcDNAを同定した。これらの結果、ヒトChATにはN末構造の異なる複数の分子種が存在することが明らかとなった。また、人体病理組織におけるChATタンパク質を特異的に解析するために、ヒトChATタンパク質を特異的に検出する抗体の作製に成功した。現在は、ヒトChAT分子種の多様性の生理的、病理的役割の解明を目指して解析を求めている。
光エネルギー捕集と電子移動を合わせて効率化する発色基配列化ペプチドの創成

本研究では、N末端にジスルフィド基、側鎖に直線上に配列した六つのナフチル基、C末端にナフチル基からの励起エネルギーを受け取るエネルギーアクセプターを有する3_<10>-ヘリックスペプチドを金-硫黄結合により金表面に結合させることによって、垂直配向の規則正しい自己組織化単分子膜を調製した。これらの単分子膜は、電子ドナーを含む水溶液中でナフチル基を光励起するとアノード電流を発生した。解析の結果、エネルギーアクセプターのスペクトル特性と還元電位が重要であることが明らかとなった。本年度は、2-ナフチルアラニン-αアミノイソ酪酸(Aib)-Aibの3量体を繰り返し単位とする9量体、18量体、27量体ペプチドのN末端にリポ酸を結合したヘリックスペプチドを合成した。それぞれのヘリックスペプチドの溶液に、金基板を浸漬することにより、自己組織化単分子膜の調製を行った。電子ドナーとしてトリエタノールアミンを含む永溶液中に単分子膜修飾基板を浸漬し、280nmの光でナフチル基を励起して光電流発生実験を行った。光電流値は、N3膜で0.23nA、N6膜で0.48nA、N9膜で0.72nAであり、末端ナフチル基についての量子収率はそれぞれ、9.3%、15.0%、21.6%と求められた。光電流発生実験の結果を定量的に議論するために、励起状態の生成、エネルギー移動を含めた励起状態の失活、そして電子移動、それぞれの素過程の速度定数を理論的に計算し、それらの速度定数と反応中間体の数との間の関係式を定常状態近似により解くことで光電流値を理論的に計算し、実験結果と比較した。まず、ペプチド鎖を長くすることにより、C末端ナフチル基と金との距離が長くなり、それによって励起エネルギーの金による消光が抑制され、アニオンラジカルの生成効率が向上することがわかった。また、ナフチル基間での電子ホッピングを考慮しない場合の計算値は実験値に比べて非常に小さいのに対して、電子ホッピングを考慮した場合は計算値と実験値がよく一致した。このことから、ナフチル基間で効率のよい電子ホッピングにより、C末端ナフチル基から金への長距離移動が効率よく起こることがわかった。一方、ナフチル基間でのエネルギーマイグレーションは光電流発生に影響を与えないことがわかった。これは同種発色基間でのエネルギー移動が方向性をもたないためと考えられる。以上のように長鎖ヘリックスペプチドを用いて発色基を規則正しく配列することにより、励起エネルギーによる初期電荷分離とその後の電子伝達が効率よく起こる光電流発生システムの構築に成功した。我々のグループでは、ペプチドの二次構造の一つであるヘリックスが、優れた自己集合化特性を持ち、高密度に配列したアミド結合に由来する高い電子伝達性や、ダイポールモーメントによる電場効果を示すことを見出し、ヘリックスペプチドの分子エレクトロニクス素子としての可能性を示してきた。これまでに側鎖に複数の発色基を規則正しく配列させたヘリックスペプチドを用いて、金基板上に自己組織化単分子膜(SAM)を調製し、発色基の光励起による光電流発生について検討を行い、側鎖発色基間の良好な電子ホッピングによって光電流発生が促進されることを見出している。本研究では、エネルギーアクセプターをヘリックス末端に導入して、側鎖発色基の励起エネルギーを集めることで、光エネルギーを電気エネルギーへ効率よく変換する新規な光電変換システムの構築を目指した。平成21年度においては平成20年度に得られた知見から、新た2-ナフチルアラニン-αアミノイソ酪酸-αアミノイソ酪酸からなる3量体配列を6回繰り返した18量体ペプチドのN末端に含硫黄リンカー、C末端に側鎖ナフチル基からの励起エネルギーアクセプターとしてエチルカルバゾリル基をそれぞれ結合したペプチド、N6Eを分子設計・合成した。溶液中での1)吸収、2)蛍光、3)円偏光二色性、それぞれのスペクトル測定より、N6Eにおいては、1)側鎖ナフチル基間およびナフチル基とエチルカルバゾリル基間には基底状態での強い電子的相互作用がないこと、2)励起されたナフチル基からエチルカルバゾリル基へ良好なエネルギー移動が起こること、3)ペプチドは3残基でほぼ一周する3_<10>ヘリックス構造をとること、などが明らかとなった。N6Eの溶液に金基板を浸漬することにより、自己組織化単分子膜を調製した。エリプソメトリー、赤外反射吸収スペクトル測定、サイクリックボルタンメトリーによりキャラクタリゼーションを行った結果、N6Eは稠密で分子配向が均一な単分子膜を形成することが明らかとなった。

2-ナフチルアラニン-αアミノイソ酪酸-αアミノイソ酪酸からなる3量体配列を6回繰り返した18量体ペプチドのN末端に含硫黄リンカーを導入した構造を共通な構造として、ペプチドのC末端にナフチル基、アントリル基、ピレニル基、エチルカルバゾリル基をそれぞれ結合したペプチド、N6N、N6A、N6P、N6Eを合成した。N6Nはエネルギーアクセプターを持たない参照ペプチドであり、それ以外はC末端にエネルギーアクセプターを有するペプチドである。各ペプチド溶液に金基板を浸漬することによってSAMを調製し、種々のキャラクタリゼーションを行ったところ稠密で分子配向の均一な単分子膜が形成されていることがわかった。続いて電子ドナー水溶液中でナフチル基を光励起し電流応答を調べた。いずれのSAMにおいても光照射に応答してアノード電流が発生した。量子収率を計算した結果、N6N、N6A、N6P、N6E SAMの量子収率は、それぞれ4.5%、2.5%、2.0%、2.3%と求められた。理論計算により末端発色基の励起エネルギーの捕集効率を見積もったところ、エネルギーアクセプターを導入した系では、光捕集効果が認められた。しかしながら、蛍光消光実験の結果、発色基によって電子ドナーから末端発色基への電子移動速度定数に大きな違いがあることがわかり、このため光捕集効果が直接光電流発生の促進につながらなかったことも明らかとなった。以上の結果から末端発色基の電子特性を最適化することにより、天然の光合成系に見られるような光エネルギー捕集と電子移動を効果的に利用した光エネルギー変換分子システムが構築可能であることが明らかとなった。
プロスタグランジンE2による脳保護作用の解析

プロスタグランジンE2(PGE2)は発熱応答に必須の分子である。これまでに5つのPGE合成酵素(PGES)、すなわち膜型PGES(mPGES-1)、mPGES-2、細胞質型PGES(cPGES)、GSTM2-2、及びGSTM3-3が同定されている。しかし、これらのPGESのうちどの酵素が発熱を起こすPGE2を合成するのかは分かっていない。これまでの研究で、発熱時にmPGES-1が脳の血管に誘導されることが分かった。このことから我々のグループではmPGES-1が発熱を起こすpGE2を合成すると考えている。本研究では、この仮説を証明するために、mPGES-1遺伝子欠損マウス(mPGES-1KO)の発熱応答を、3つの発熱モデルを用いて調べた。mPGES-1KOと対照群野生型マウス(WT)で平常時の体温、その概日変化に有意な差はなかった。インターロイキン1-βを脳室内投与;WTでは投与後36時間後をピークに約2°Cの発熱が起こった。mPGES-1KOでは発熱は起こらなかった。テレピン油後肢皮下注射;WTでは注射後1113時間をピークに約2°Cの発熱が起こった。一方でmPGES-1KOでは発熱は起こらなかった。リポポリサッカライド腹腔内注射;WTでは注射25時間後をピークに約1°Cの発熱が起こった。また、この時mPGES-1KOでは脳内PGE2濃度の上昇が抑制されていた。これらの結果から、mPGES-1が発熱を起こすPGE2を合成することが明らかになった。本研究課題"PGE2による脳保護作用の解析"に関して、炎症性刺激によりmPGES-1が脳血管に誘導されることを考えると、mPGES-1が脳保護作用を持つPGE2を脳血管で産生していることを意味する。
タンパク質品質管理機構

細胞内には、タンパク質の品質を厳正に管理するためのシステムが存在する。特に分泌タンパク質や膜タンパク質の合成の場である小胞体には、分子シャペロンをはじめとしたタンパク質のproductive foldingを促すシステムと、一方でミスフォールドしたタンパク質を適正に処理するための分解促進システムが存在する。後者のシステムは小胞体関連分解(ERAD)機構と呼ばれ、ミスフォールドしたタンパク質を認識する因子、誤ったジスルフィド結合を開裂させる因子、サイトゾルへそれら基質を逆輸送するための因子など、幾つかの小胞体タンパク質が必須の因子として関与している。本研究による主な成果として、1)ERADにおいて重要な働きをする還元酵素ERdj5の結晶構造が明らかになり、基質がどのような分子間を受け渡されて分解にいたるのか、その一連の経路を明らかにした、2)従来、糖タンパク質の品質管理機構については研究が進んできたが、非糖タンパク質のERAD機構として、まったく新しい経路の存在することを明らかにした、3)productive foldingによって新生タンパク質が正しく合成される過程で、小胞体内の酸化還元酵素(oxidoreductase, OR)によるジスルフィド結合形成は必須のプロセスであるが、小胞体内レドックスネットワークについて研究を行い、主要な酸化酵素Ero1aからPDI、ERp46などのORにいたる酸化カスケードの存在を明らかにした。後者のシステムは小胞体関連分解機構と呼ばれ、ミスフォールドしたタンパク質を認識する因子、誤ったジスルフィド結合を開裂させる因子、サイトゾルへそれら基質を逆輸送するための因子など、幾つかの小胞体タンパク質が必須の因子として関与することが判明しつつある。本研究では、これら因子の作用機序を分子構造レベルで詳細に解明し、かつ小胞体品質管理機構の全体像をも正確に記述・理解することを目的として、細胞生物学、生化学、構造生物学的研究を展開している。本研究は、ミスフォールドタンパク質が細胞内で蓄積することにより引き起こされる種々の病態の成因解明および治療戦略にも将来的につながり、医学的にも極めて貢献度の高いものである。新規レドックスタンパク質ERdj5が、小胞体に存在し、ミスフォールドタンパク質の分解(小胞体関連分解)に関与することを明らかにした。この際、分解すべき基質の認識に関わる因子EDEMと、小胞体分子シャペロンBiPとの間に、三者複合体を形成することを明らかにした。分解すべき糖タンパク質は、糖鎖がmannose 8Bフォームまでトリミングされた後、EDEMによって認識され、EDEMと結合したERdj5によってジスルフィド結合の開裂が起こる。さらにBiPの働きによって伸びたポリペプチドとして逆輸送チャネルを通過し、サイトゾルでの分解につながると考えられる。この成果は2008年のScience誌に掲載され、大きな注目を浴びた。現在、非糖タンパク質の分解におけるERdj5の関わりについて研究を進めている。なんらかの原因で細胞内にミスフォールドしたタンパク質ができてしまった場合、それを分解処理する必要があるが、本研究においては、細胞の品質管理機構において、1)どのように分解すべき基質のみが認識され、分解処理にまわされているか、および、2)変性あるいは凝集したタンパク質を、どのように分解可能な状態に保持し、かつ効率的に分解装置にアクセスさせるか、という2点に注目して研究を行うことを目的とする。平成20年度においては、基質のジスルフィド結合を還元し、伸びたポリペプチドにする小胞体還元酵素ERdj5の性質を明らかにするため、主として次の2点について研究を行い、成果を得た。まず、内在性ERdj5が基質の還元、分解に寄与しているかについてノックダウン実験を行い、ERdj5をノックダウンすると基質の分解が遅くなることから、内在性ERdj5の寄与を確認し得た。ERdj5には分子中に還元活性に関与する4つのチオレドキシンドメインが存在し、それらにはそれぞれCXXCからなる還元活性モチーフが存在するが、それらのうちどのCXXCモチーフが還元活性に寄与しているのかを明らかにした。

そのため4つのCXXCモチーフの一個所だけをCXXCのまま残し、他のCXXCを不活性なAXXAモチーフに置換した変異体、および4つのCXXCモチーフのーカ所だけをAXXAモチーフに置換した変異体を用いて、分解活性、および還元活性について詳細に調べた。その結果、3つ目と4つ目のCXXCに還元活性、分解促進活性の両方が存在することが明らかになった。なんらかの原因で細胞内にミスフォールドしたタンパク質ができてしまった場合、それを分解処理する必要があるが、本研究においては、細胞の品質管理機構において、1)どのように分解すべき基質のみが認識され、分解処理にまわされているか、および、2)変性あるいは凝集したタンパク質を、どのように分解可能な状態に保持し、かつ効率的に分解装置にアクセスさせるか、という2点に注目して研究を行うことを目的とする。平成21年度においては、ERdj5の結晶構造解析を行い、大きな分子であり、さらに小胞体内在性の分子であることから、結晶化には困難を極めたが、持続的な努力の結果、比較的短期間のうちにこれに成功した。大腸菌から得た組み換え体ERdj5を精製し、結晶化のための条件検討を行い、最終的に2.5Åの解像度で結晶構造を解くことに成功した。その結果次のような諸点が明らかになった。1)ERdj5は4つのチオレドキシン様ドメインを持っており、それぞれには活性中心CXXCが存在しているが、1番目と2番目のチオレドキシン様ドメインの間に、2つの新たなチオレドキシン様構造が見つかった。これらには活性を担うCXXCモチーフは存在しなかった。2)6つのチオレドキシン様ドメインはすべて同一の平面上に存在するという極めて特徴的な構造を示した。3)前年度、活性を有することを明らかにした3番目、4番目のCXXCモチーフは、ループを介してC末端クラスター領域に分離して存在することが明らかになった。4)ERdj5と共同して働く因子EDEMとの結合部位も、このC末端クラスターに存在することが明らかになった。5)ERdj5によって還元され、分解される基質タンパク質の結合部位もC末端クラスターに存在することをあきらかにした。小胞体内にミスフォールドタンパク質が生じた場合、小胞体からサイトゾルへ逆輸送した後、それをユビキチン・プロテアソーム系によって分解する機構が、それぞれの細胞には備わっている。これを小胞体関連分解(ERAD)と呼ぶ。申請者たちは、ERADの分子機構を明らかにする上で、極めて重要な二つの因子を発見した。1つはミスフォールドしたタンパク質を糖鎖トリミング依存性に認識し、分解経路へまわす機能をもつEDEMであり、もう1つは分解タンパク質中のジスルフィド結合を還元し、ディスロコンを通りやすくする還元酵素ERdj5である。
電波の相反性を用いた秘密鍵共有方式の研究

個人情報など第3者に秘匿とすべき情報を無線で通信する際に有効となる秘密鍵を通信の相手方と共用する方法について理論的および実験的研究を行った。少ない電波のやり取りでできるだけ効率的に安全な鍵を共有するためには、盗聴者が近傍に存在すると想定し、盗聴者が推定する鍵と正規の相手が共有する鍵の相関を低減することがポイントである。本研究ではこの相関を低減できる新しいアンテナ構成と信号処理方式を発明し、実験によりこれを実証した。可変指向性アンテナをスティックメモリサイズにまで小型化するための設計手法を確立するための具体的基本構造として、半波長ダイポールを3本平行に配置した。これに指向性可変機能を付加するため、中央素子に給電ポート、両側パラサイト2素子にバラクタを装荷した。バラクタに直流バイアス電圧を印加することにより指向性を制御する装置を試作した。指向性可変機能を高く維持したまま素子長と素子間隔を如何に小さくできるかの限界を極めるため、モーメント法により素子間電磁結合アドミタンス行列を数値的に求め、これに基づいて等価ウェイトベクトル法により放射指向性の可変パタンを算出した。振幅および位相指向性の空間相関を指標として、アンテナサイズの下限を12分の1波長と決定した。この結果が正しいかどうか確認するためにプリント基板と銅線で製作したブレッドボードモデルで実験を行った。鍵生成するための十分なゆらぎが様々な環境において得られるかどうかを理論的ならびに実験的に調べた。上述の指向性計算結果を用いて、直接波およびマルチパス反射波によって生じる受信点でのゆらぎをレイトレース法により推定した。どのようなアンテナの構造パラメータおよびバラクタ電圧でどのようなゆらぎが得られるかをコンピュータシミュレーションで探った。これを種々の環境において繰り返し計算することによりゆらぎを統計的に評価した。ブレッドボードモデル2セットを離れた場所に設置し相互に送受を切り替えて実空間での鍵生成実験を実施し、2地点間での電波ゆらぎ特性ならびに鍵一致率を実測することに成功した。これらにより得られた知見に基づきバラクタ電圧制御法を発明し特許として出願した。秘密鍵方式においては正規局間の鍵一致率に加えて、第3者に対する耐盗聴性の確保が必須である。2つの正規端末と1つの盗聴端末が典型的なオフィスルームである8m×10mの長方形空間にあるとして、シミュレーション実験を行った。部屋の中のランダムな位置に上記2つの正規端末を配置、第3の端末は盗聴に最も有利と考えられる位置(2つの正規端末を結ぶ直線上)に配置し、盗聴者は鍵生成のアルゴリズムを完全に知っているもの仮定した。このような条件で正規端末間で鍵生成を行っている状態において、盗聴端末を常に受信モードに設定して正規局で生成される鍵と盗聴局で生成される鍵の相互相関係数を評価した。正規局と盗聴局の場所を様々に変えてこの相互相関係数の評価を何度も繰り返していたところ、稀にある特異な現象があることを発見的に気づいた。最初はなんらかの計算誤差ではないかと疑ったが、同じ評価を場所を変えて実施してみたところ確率的に再現された。これは相互相関係数が平均的な値に比べて明らかに低い値となる場所があることを意味している。さらに繰り返して評価していくうちに、この現象は正規局間を直接到達する電波の強度が一旦壁に反射して到達する電波に比べて低い場合に発生するということがわかってきた。つまり、電波が相手端末に直接届かないような場合に盗聴耐性が向上することになる。そこで、このような環境をあえて設定しシミュレーション実験を再実施し統計的に相関係数を評価したたところ見事に優位さが現れた。これは反射を低減した方が良いという通常の無線通信の常識とは全く相反するものである。この発見にもとづき、正規局間でアンテナの偏波方向をあえて直交させる配置とする秘密鍵生成方式およびその装置を特許出願するに至った。当年度は本方式の総合実験段階に入った。ハードウェアとしては前年度までに試作したスティックタイプのアンテナ内蔵無線送受信回路およびこれを装荷したノートパソコンを複数台セットで用いた。実験環境として、大学の電波暗室での実験に加えてオフィスの実環境条件で所望の鍵長を有する鍵生成共有ができるかどうか試験を行った。実験場所が異なると、電波の伝播状態や反射物のレイアウト、さらには人体などの動きが様々である。上りリンクと下りリンクのわずかな時間差の間に環境が変化する可能性もある。その場合は電波伝播の相反性が成立しなくなる。さらには、実際の生活環境においては電子レンジや他の無線機器からの電波干渉が発生することも考えられる。鍵の生成に失敗した場合は、基本的にはリトライの繰り返しをすることになり、実際問題としては成功するまでの時間がかかってしまうことが懸念される。そこで本実験では、あらゆる環境下においてリアルタイムに鍵生成に成功するために、アナログ量である電波ゆらぎをデジタル信号に変換する際の信号量子化および得られたデジタル信号から「鍵」を生成するための信号処理アルゴリズムに工夫を施した。

具体的には、電波ゆらぎの統計的性質を把握し、量子化における閾値付近のゆらぎを削除するというアイデアを実験で実証した。これにより盗聴耐性を高めるプライバシ増幅が確認できた。さらに、正規局と盗聴局の相関の大きな要因が直接波伝播であることを発見し、これを抑圧する複数の手法を実証実験した。得られた成果を国内公開研究会や国際会議で発表した(招待講演を含む)。学会論文誌に投稿し採択掲載された。これら業績一覧を大学ホームページにてインタネット上に公開した。
RAPDマーカー法による遺伝的変異と染色体変異の比較解析

植物の進化において重要な役割を果たす倍数化や異数化により、DNA分子種や染色体構造にどのような変化が生じているかを明らかにするため、半数染色体数がn=2からn=15と変異に富む、キク科ブラキスコ-ム属の植物で解析を試みた。形態、染色体、及び葉緑体遺伝子解析より、近縁と見なされる群のn=9、4、3の種について、植物体より抽出したDNAを鋳型として、PCR法による遺伝的変異解析を行い、以下の結果が得られた。1.任意配列プライマーを用いたRAPDマーカー法解析では、種間に共通して出現するバンドと種内で変異が見られるものが検出され、種を特徴づけるマーカーは得られなかった。比較した種群でn=9のものは個体間のバンドパターンの変異が少なく、一方、n=4、3のものでは個体間の変異が大きい。2. adh遺伝子の多型解析では、n=9の種群では増幅された遺伝子断片数が1本で、個体間の長さも変異も認められなかった。一方、n=4、3のものでは3-9本のバンドが検出され、個体間で数や長さの変異が見られ、変異は転移因子に由来すると推定された。ブラキスコ-ム属ではn=9のものから、染色体の減数したものや異質倍数体が生じたと考えられており、本研究においても染色体数の少ない種群には個体変異が多く、転移因子も認められ、これらの群が比較的最近になって急激に分化しつつあることを示した。また、遺伝子座の数が、乾燥地に生育し、一年生や自殖など派生的な特徴を持つ少数染色体群で多く、染色体数の減少はむしろ遺伝子座の増幅をうながしており、染色体数の変化による種分化が環境適応と深く関連していることを示唆した。植物の進化において倍数体や異数体の形成は重要な役割を占め,それに伴い染色体ゲノムはどのように量的あるいは質的変化をとげたのか,また、倍数化により重複したゲノムは保存されているのであろうか。オーストラリアに生育するキク科ブラキスコ-ム属は染色体の数的、構造的変化を伴って、急激な環境条件の変化に適応した形態や生殖様式を生じている。本研究ではこの群の植物を用い、RAPDマーカー法による種間の遺伝的変異を比較するとともに、マーカーとなるDNA分子種の染色体上の位置を比較し、種分化に伴う、ゲノム構成と染色体変化の様相を明らかにすることを試みた。10塩基の任意のプライマーを用いたRAPDマーカー法は近縁な植物間のゲノム解析の方法として開発されたものである。ブラキスコ-ム属では、この方法により増幅されたDNA鎖の多くは種内で長さの変異が少なく,部分的に塩基配列を決定した結果、これらはリボゾームRNAをコードする遺伝子と推定された。リボゾーム遺伝子群は染色体上では2次狭窄部位や動原体付近に位置しており、種間での比較にはあまり適していない。また、長さが変位するRAPDマーカーもわずかながら得られたが、これらは個体レベルで変化するため適していなかった。現在、この方法と並行して特定の遺伝子の配列の比較解析も行っており、アルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン配列には種々のトランスポゾンやSINE因子といった転移因子の配列が認められた。キク科では多くの植物でウイルス感染が知られているが、ブラキスコ-ム属で遺伝子内に転移因子が多数発見されたことは、この群の多様な種分化の機構にウイルスが関与していることが可能性が示され極めて興味深い。また,グリセロアルデヒド-3ーリン酸脱水素酵素遺伝子はミニ多重遺伝子族を形成していると思われ,これらの特定の遺伝子をもとに,現在,染色体のマッピングを試みている。

昨年度に引き続き、キク科ブラキスコ-ム属の植物で染色体数の減少に伴うDNA分子種や染色体構造の変化を明らかにするために、形態、染色体、葉緑体遺伝子解析より、近縁と見なされる群でPCR法による遺伝的変異解析と染色体マッピングを行った。任意配列プライマーを用いたRAPDマーカー法解析では、種を特徴づけるマーカーはほとんど得られず、種間で共通に出現するバンドと種内で変異するものが検出された。一般にどのプライマーでも、n=9の種群はn=4、3のものより検出されるバンド数が少なく、固体間のバンドパターンの変異も小さい。形態や遺伝子解析の結果より、この属ではn=9のものから、染色体の減数が起こった考えられ、RAPDマーカーやadh遺伝子の多型解析において、少数染色体群で固体間の変異が大きいことは、これらが比較的最近になって急激に分化しつつあることを示唆した。さらに、染色体数の減少した群では逆に遺伝子座の増幅が起こっていることが示唆され、これらは乾燥や洪水など環境の急激に変化する地域に生育しており、適応的な遺伝的変異が生じている可能性が高い。染色体構造解析のためにRAPDマーカーやadh遺伝子断片を用いて、染色体マッピングを試みたが、これらは遺伝子座の数が少ないためか、検出することができなかった。そこで遺伝子座が重複し、染色体上で検出が比較的容易なリボゾーム遺伝子をプローブとして、染色体マッピングのための実験方法の確立を行った。その結果、染色体プレパラート上でPCR増幅を行った後、ハイブリダイゼーション反応を行うことで、シグナルを得ることが可能となり、今後さらに単一遺伝子座の検出方法の改良を行いたい。