hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超分子疑似原子分解能電子線・X線構造解析法

生命機能を支える生体超分子の動作のしくみを解明し、医療やナノテクノロジーに役立てるためには、原子分解能での立体構造解析法の確立が必須である。電子顕微鏡像の解析による超分子立体像解析では原子分解能達成は困難であるが、構成分子のX線結晶解析による原子モデルを超分子立体像に組み込むことにより、擬似原子分解能での解析が可能になる。本研究課題では電子顕微鏡像解析のさまざまな工夫によりその分解能の向上と解析時間の短縮を図り、原子モデルの組み込み精度を高めて、原子レベルでの動作機構の解明を実現した。細菌の運動器官であるべん毛は、20数種類の蛋白質から構成される生体超分子で、回転モータである基部体、らせん繊維型プロペラとして働くフィラメント、そしてそれらを連結してユニバーサルジョイントとして働くフックと、おおまかに3つの部分からなる。べん毛フィラメントはフラジェリンが非共有結合でらせん状に重合したチューブ構造で、極低温電子顕微鏡像の画像解析による構造解析法の長年にわたる工夫によってその原子モデルの構築に成功し、2003年8月のNatureに発表した。フックの構造はフィラメントに比べて短く、電子顕微鏡だけによる高分解能構造解析が困難であったため、その直線型チューブ構造についての低温電子顕微鏡像の画像解析法による低分解能立体像と、サブユニット蛋白質FlgEフラグメントのX線結晶構造解析法による原子モデルを組み合わせ、擬似原子モデルを構築することに成功した。されにこのモデルをもとにして、通常働いている構造である、曲がったフックの原子モデルを構築し、ユニバーサルジョイント機能を果たす際に、フック蛋白質FlgEの構造とその分子間相互作用がどのような変化を示すかを詳細に調べた。この原子モデルをもとにした計算機による分子動力学シミュレーションにより、ドメイン間の相互作用表面で、ある一定数の水素結合やファンデアワールス接触点を保ちつつ、結合相手の原子を順次替えることで相互に滑りを起こし、各素繊維の周期構造が約30%にもおよぶ伸縮を実現して、ユニバーサルジョイント機能を実現していることが明らかになった。(Samatey et al. Nature2004)べん毛の自己構築過程においては、フックの完成とともに基部体の細胞質側にあるべん毛蛋白質輸送装置が、それまでのフック型蛋白質輸送モードから、フラジェリンなどのフィラメント型蛋白質輸送モードに切り替わることで、フックの長さが約55nmに制御され、それ以後はフィラメントの成長が起こる。このフックの長さを制御する2つの蛋白質の1つFliKの構造について詳細に調べた結果、N末ドメインがフックの長さをモニターしていること、C末ドメインがべん毛蛋白質輸送装置の輸送モード切替を引き起こしていることなど、新たな知見が得られた。(Minamino et al. J.Mol.Biol.2004)その他、基部体の軸を構成するロッド蛋白質のキャラクタリゼーションなど、様々な新しい知見が得られ、べん毛超分子の構造と機能の連関が徐々に明らかになりつつある。我々のグループは、極低温電子顕微鏡による超分子立体構造解析の技術開発と、超分子を構成する各分子のX線結晶解析と電子線解析の相補的連携技術の開発を目指し、多面的な研究を進めている。<電子顕微鏡解析の高分解能化を目指す技術開発>電子顕微鏡による解析では、画像解析法の改良と共に、電子線照射損傷による高分解能情報の劣化を抑えつつ照射量を増やしてS/N化を上げることが高分解能解析の鍵でなる。そこで、エネルギー分光型極低温電子顕微鏡(日本電子JEM-3200SFC)を用い、細菌べん毛とリボソームを試料として撮影条件の最適化を進めた。照射線量やデフォーカス等のパラメータを様々に変え、画像解析で得られる密度図の分解能を指標として、照射量増加によるS/N比の向上と損傷による高分解能情報の劣化のトレードオフを定量的に解析した。その結果、考えられている限界以上に分解能の劣化をともなわない照射が可能であることがわかった。今後もデータ収集と定量解析を続行し、どこまで分解能の向上を図れるかに関して定量的な解析を行う。<X線構造解析と電子顕微鏡解析の相補的連携を目指す研究>べん毛モータとべん毛繊維を連結するフックは、フック蛋白質FlgEが約130分子量合した長さ55nmのチューブ状構造体で、べん毛繊維がどこを向いてもトルクを伝えられるように、曲げに柔らかく捻れに強い構造を持つユニバーサルジョイントである。その分子機構を解明するため、FlgEのX線結晶構造解析と直線型フックの電子顕微鏡像解析を相補的に組み合わせ、直線型フックの原子モデルを構築し、さらに機能状態である曲がったフックの原子モデルを構築して、ユニバーサルジョイント機能に必須な分子間相互作用を同定した。また、べん毛の他の部分構造についても解析を進め、べん毛輸送装置の構成蛋白質ではFlhAcやFliIの構造解析が完了し、興味深い動作機構が明らかになりつつある。べん毛フック長の決定

機構にFliKがテープメジャーのように働くと同時に、FlhBcがフック重合制限時間を決めるタイマー機能を発揮することも明らかになった。今年度後半には高輝度X線回折装置(リガクFR-E、Cu/Cr切り替え式)を導入設置し、イオウ原子の異常分散による位相決定が可能になった。試料調整法の工夫により、べん毛の様々な部分複合体で均一な単分散試料が得られるようになり、べん毛各部の超分子構造が順次明らかになりつつある。我々のグループは、極低温電子顕微鏡による超分子立体構造解析の技術開発と、超分子を構成する各分子のX線結晶解析と電子線解析との相補的連携技術の開発を目指し、多面的な研究を進めている。<電子顕微鏡解析の高分解能化を目指す技術開発>電子顕微鏡による解析では、画像解析法の改良と共に、電子線照射損傷限界まで電子線照射量を増やしてS/N比を上げることが高分解能解析の鍵となる。エネルギー分光型極低温電子顕微鏡(日本電子JEM-3200SFC)を用い、細菌べん毛の基部体、ポリロッド、輸送装置ATPaseであるFliIの6量体リングなどを試料として、試料調整法や撮影条件の最適化を進めて3次元再構成像を得た。現在も、より高分解能をめざした解析作業中である。また、タンパク質2次元結晶を用いた照射損傷のデータ収集により、分解能限界についての定量的解析を継続中である。電子線トモグラフィーが可能な傾斜機構付き極低温電子顕微鏡も、ようやく定常的に稼働するようになり、トモグラフィーを目指した技術開発を開始する。<X線構造解析と電子顕微鏡解析の相補的連携を目指す研究>べん毛の部分構造についてはX線結晶解析を進め、輸送装置構成蛋白質のFlhAcやFliIの構造から、興味深い動作機構が明らかになりつつある。FliIについては電子顕微鏡像解析による6量体リングの構造にFliIモノマーの結晶構造を当てはめて、6量体リング構造の原子モデルを構築する作業が進んでいる。また、べん毛フック長の決定機構にFliKのC末端ドメインが果たす役割が明らかになりつつある。その他のべん毛構成蛋白質についても、試料調整法の工夫により、単量体や部分複合体で均一な単分散試料が得られるようになり、べん毛各部の超分子構造が順次明らかになりつつある。〈電子顕微鏡解析の高分解能化を目指す技術開発〉電子顕微鏡による解析では、画像解析法の改良と共に、電子線照射損傷限界まで電子線照射量を増やしてS/N比を上げることが高分解能解析の鍵となる。
塩害を受けたPC構造物の補修工法における電気防食の利用に関する研究

本研究では、現在特に被害が深刻で、しかも確実な補修工法が見い出せないでいるプレストレストコンクリート(以下、PC)構造物の塩害に対して、その補修工法としての電気防食法の適用性を検討した。ここではまず、電気防食法をコンクリート構造物に適用する場合の電気防食基準に関して、現在最も汎用性が高いと考えられている電位シフト基準を取り上げて検討を行った。その結果、通電によってコンクリート中の鋼材に生じる分極量が100mV以上あれば、鋼材に対する防食性はある程度確保できることを確認したが、この条件は鋼材腐食を完全に停止させるものではなく、また、コンクリート内外の環境の変化によって防食条件も変わるため、防食の確実性を考慮したより安全な防食設計が必要であることも確かめられた。次に、PC部材へ電気防食を適用性した場合に予想される過防食の問題を中心に検討を加えた結果、PC部材において過防食となると、鋼材周辺に発生する水素の影響によって、(1)PC鋼材の強度劣化が生じること、(2)コンクリートにひびわれが発生する場合もあることなどを明らかとした。一方では、通常の通電条件が確保されている場合には、電気防食がPC構造物に対しても極めて有効な方法となることを確認し、PC構造物においては、いかに過防食とならないような防食条件を設定できるかが重要となることが明確となった。さらに、鉄筋腐食劣化の生じた構造物に対して電気防食による補修試験施行を実施した結果から、(1)コンクリートの乾燥状態が比較的長く続く場合でも、電気防食は十分にその防食性を発揮できること、(2)劣化部の下地処理の程度によって電気防食の補修効果が異なること、などが確認された。また、電気防食における陽極システムの施工の簡略化を図る目的で、永久型枠式陽極の開発を行い、これが十分に利用可能であることも確認した。本研究では、最近、コンクリ-ト構造物の塩害補修工法の決め手として高い注目を集めている電気防食法を取り上げ、この方法のプレストレストコンクリ-ト(以下、PC)構造物への適用性について検討を行っている。本研究は、2年間の研究期間を設定して実施しており、今年度はその1年目にあたる。これまでの研究では、まず(1)RCおよびPCを含めた、いわゆるコンクリ-ト構造物への電気防食を施す場合の現行の防食旧準の見直しを行い、さらに、(2)通常の鋼材に比べて組織過敏性であるPC鋼材および、これを使用したPC構造部材おける通電の影響、(3)電気防食として外部電源方式のシステムを適用する場合の施工上の問題点等について検討を行った。また、実用上の問題点を把握するために、(4)実構造物に即した種々の状況を考慮したPC部材へ電気防食を施し、この部材の腐食実験も開始した。これらの検討結果を取りまとめると次のようである。1.コンクリ-ト構造物に電気防食を施す場合に確実な防食が可能な鋼材分極量は、外部環境条件やコンクリ-トの状況などを考慮とすると、少なくとも150200mV程度は必要である。2.通電量が同じであってもPC鋼材の緊張力の違いにより分極特性が異なる可能性があり、PC部材では、RC部材以上に通電条件の設定には慎重な対応が必要である。3.過防食に対してはRC部材以上に注意が必要である。電流量が極端に大きくなった場合にはPC鋼材の耐力低下が確認され、しかも、高強度のコンクリ-トを使用するPC部材では、過防食時に鋼材周辺に発生した水素ガスが内部に蓄積し、その圧力によってコンクリ-トにひびわれ発生する可能性が高い。

4.陽極システムはできるだけ補修箇所全面に配置し、やむを得ない場合でも陽極間隔は2030cm以下とする。本研究は、プレストレストコンクリート構造物(PC構造物)の塩害補修工法としての電気防食法の利用可能性を検討するものである。本年度は、昨年度からの継続課題である防食基準に関する検討および、電気防食の実施工上の問題点の把握とその解決策についての検討を試みた。本年度の主な検討内容と主な結果を以下に示す。1.Elogl試験の結果によると、通電初期の段階で防食上必要となる分極量は多くの場合-200-250mV程度であった。また、より長期的な通電実験の結果からも、少なくとも-100-150mV以上の分極量がないとコンクリート中の鋼材は防食性は十分には確保できないと予想された。なお、Instant off電位の測定は、分極量の測定に当たって欠くことのできない測定であるが、その測定方法についても1提案を行った。2.ポストテンショニング方式のPC構造物の場合、シースから排流点を取って通電させても、内部のPC鋼材へも電流は供給される。ただし、この結果は、シース中のグラウトの充填が不十分な場合には、PC鋼材への電流の分布が不均一となり、鋼材の防食に悪影響を及ぼす可能性もあることを示唆するものでもある。3.実構造物における電気防食法の施工上の問題点を探るため、鉄筋腐食劣化の生じたRCガレージに対して電気防食施工を実施した。この施工実験から、外部からの直接的な水分の供給がほとんど考えられないガレージ内面に対しても、問題が生じない範囲の電流量で十分な電気防食が可能であること、腐食鉄筋のケレンの程度によって、電気防食によるその後の補修性能はかなりことなること等を確認できた。4.電気防食システム施工の簡略化を図る方策の1つとして、陽極材をあらかじめ埋め込んだ永久型枠の開発を行った。
日本人のためのアラビア語教授法の開発―アラブ文化要素の効果的活用―

研究成果は、1.日本でのアンケート調査のデータ分析と結果の考察、2.アラブ諸国のアラビア語学校の日本人学生・アラブ人教員対象の面接調査分析の考察、3.アラブ諸国におけるアラビア語授業の分析、4.本研究のまとめ、を行ったことで、詳細は次のとおりである。1.日本でのアンケート調査のデータ分析と結果の考察アラビア語学習者対象のアンケート調査のデータ分析と結果の考察を引き続き行った。アンケートの質問項目は、アラブ文化要素への興味、アラビア語習得の困難さ、習得を希望するスキル・知識、授業で重視されているスキル・知識、アラビア語学習への動機づけなどで、分析方法は得られたデータを統計解析し、相関関係を調べるものであった。分析の結果、たとえば、学生はコミュニケーション能力を伸ばしたいと望んでいるが、教師は文法と単語・表現などを重視していることが判明した。2.アラブ諸国のアラビア語学校の日本人学生・アラブ人教員対象の面接調査分析の考察19年度20年度に実施した面接調査を通して、アラビア語の教育と学習におけるアラブ文化要素の役割を明らかにした。結果として、全教師がアラブ文化要素の授業への組み入れを肯定的に見ており、学習者のアラブ文化への興味は、アラビア語授業における学習意欲と主観的努力を促進する可能性があることなどが導き出された。3.アラブ諸国におけるアラビア語授業の分析21年度に行ったレバノンとチュニジアにおける海外調査での授業視察および資料収集の成果を視野に入れたアラブ諸国におけるアラビア語授業分析を進めた。4.本研究のまとめ21年度の研究成果も含めた、19年度21年度にわたる本研究全体のまとめとして、5章からなる研究成果報告書を平成22年3月に刊行した。研究成果は、1.海外のアラビア語教育機関でのインタビュー調査、2.海外のアラビア語教育機関での授業分析のための授業ビデ才撮影、3.日本で行うアンケート調査の準備、4.文献と教材の収集およびその分析と考察、を行ったことで、詳細は次のとおりである。1.については、チュニジアのエルマナール大学ブルギバ近代言語研究所(Tunis El Manar Univercity Bourguiba Instute for Modern Languages)のアラビア語科において日本人学生へのインタビュー調査とチュニジア人教師へのインタビュー調査を実施した。また、アメリカのノースカロライナ大学チャペルヒル校においてもアラビア話教員(アラブ人、アメリカ人)へのンタビュー調査を行った。いずれの調査も動機づけとアラブ文化要素についての質問項目が中心になっており、アラビア語教育においてアラブ文化要素の果たす役割が大きいことが検証された。2.では、チュニジアのブルギバ近代言語研究所アラビア語科において授業のビデオ撮影を実施した。英語授業分析め手法を用いながら、ビデ才を詳しく視聴し授業分析調査検討を行った。3.に関しては、日本のアラビア語教育機関で行うアンケート調査の質問項目を検討した。その際、1.のインタビュー調査の結果を参考にした。4.において、関連分野の先行研究を調査の結果、「動機付け」が言語学習のなかで重要な要素の一つであることがわかったので、動機付けと文化要素の関連性も研究していくこととした。アラビア語教授法においては特にアラブ文化要素について、外国語教授法においては主に動機づけについての文献を収集・精読し、上の13の調査の分析と考察に活用した。海外のアラビア語機関で入手した教材も各調査において参照を行った。研究成果は、1.海外のアラビア語教育機関でのインタビュー調査、2.海外アラビア語授業の分析、3.日本での自由記述式アンケートの実施と結果分析、4.日本での質問紙調査の実施と結果分析、5.文献と教材の収集およびその分析と考察、を行ったことで、詳細は次のとおりである。1.については、エジプトで語学学校に通う日本人アラビア語学習者に、クウェイトにおいてクウェイト大学言語センターアラビア語科の日本人アラビア語学習者にあらたにインタビュー調査を行った。いずれの調査も動機づけとアラブ文化要素についての質問項目が中心になっており、アラビア語教育においてアラブ文化要素の果たす役割が大きいことが再検証された。2.では、19年度にチュニジアのブルギバ近代言語研究所アラビア語科において撮影した授業ビデオのテープ起こしと日本語訳を行い、英語教授法の授業分析の手法を用いながら、分析項目の検討を行った。3.については、日本のアラビア語を学習する大学生計79名にアラビア語学習のきっかけと志向に関する自由回答式の調査を行った。きっかけ、志向ともにアラブ文化要素への興味が作用しており、アラビア語学習者の動機づけを高めていることが明らかになった。4.に関しては、日本でアラビア語の授業を提供する16の大学のアラビア語学習者を対象にアンケート調査を実施した。これらの学習者はアラビア語専攻の学生とアラビア語を専攻しない学生を含む。質問項目は、アラブ文化興味、動機づけ、志向、習得希望スキル・知識、習得困難度などから構成されている。結果の一部の分析・考察を行った。5.において、アラビア語教授法においては特にアラブ文化要素について、外国語教授法においては主に動機づけと授業分析についての文献を収集・精読し、上の14の調査の分析と考察に活用した。

アンケートの質問項目は、アラブ文化要素への興味、アラビア語習得の困難さ、習得を希望するスキル・知識、授業で重視されているスキル・知識、アラビア語学習への動機づけなどで、分析方法は得られたデータを統計解析し、相関関係を調べるものであった。分析の結果、たとえば、学生はコミュニケーション能力を伸ばしたいと望んでいるが、教師は文法と単語・表現などを重視していることが判明した。2.アラブ諸国のアラビア語学校の日本人学生・アラブ人教員対象の面接調査分析の考察19年度20年度に実施した面接調査を通して、アラビア語の教育と学習におけるアラブ文化要素の役割を明らかにした。結果として、全教師がアラブ文化要素の授業への組み入れを肯定的に見ており、学習者のアラブ文化への興味は、アラビア語授業における学習意欲と主観的努力を促進する可能性があることなどが導き出された。3.アラブ諸国におけるアラビア語授業の分析21年度に行ったレバノンとチュニジアにおける海外調査での授業視察および資料収集の成果を視野に入れたアラブ諸国におけるアラビア語授業分析を進めた。4.本研究のまとめ21年度の研究成果も含めた、19年度21年度にわたる本研究全体のまとめとして、5章からなる研究成果報告書を平成22年3月に刊行した。
16世紀フランスの歴史論と虚構論―歴史の真実に関する論争を介した文学的虚構の擁護

16世紀フランスにおける歴史と虚構の境界をめぐる議論の展開を明らかにするため、クセノフォンの『キュロスの教育』と擬フリギアのダレスの『トロイ滅亡史』の受容について分析した。これらは、真正な歴史書と言いうるのかに疑義を挟まれていた著作だからである。本研究は、これらのテクストの受容が、単に歴史記述論に関する理論的な議論の発展に裨益したにとどまらず、歴史と対照することによって詩や虚構を擁護する立場を生み出すことにも繋がったことを明らかにした。本研究の目的は16世紀の歴史記述論における真実と虚偽・虚構の境界を探ることであったが、本年度は特にクセノフォンの『キュロスの教育』の受容に着目し、研究を進めた。この作品は、ペルシャのキュロス大王の伝記の体裁をとりながらも、キケロが「信頼できる歴史としてではなく、正しい君主の模範を示すために書かれた」と述べているように、道徳的・政治的な指南書としても捉えられてきた。しかし、15世紀にこの作品が「発見」されると、あるものはこれをペルシャの古代に関する歴史的な事実を述べたものと読み、またあるものはクセノフォンの想像力の産物と見做すなど、議論は紛糾した。そしてこれは、キュロス大王が同時に旧約聖書の登場人物として重要な役割を果たしていることと相俟って、単なる古代史上の事実認定を超えた、大きな意義を持つことになった。このような観点から、ロレンツォ・ヴァッラやポッジョ・ブラッチョリーニといった15世紀のイタリア人文主義者に始まり、フランスの法曹歴史家たち、さらにはモンテーニュ、英国のサー・フィリップ・シドニーにいたる『キュロスの教育』の受容をたどり、そこから歴史叙述をめぐる議論が、文献学、修辞学、神学、年代記学、詩学といった諸分野と交錯しながら深まっていくことを明らかにした。現在、これについて論文をまとめ、最終的な確認を経てフランスかスイスの専門誌に投稿する予定である。本研究は、フランスの十六世紀の歴史記述論において、歴史の真実とは何かを考える上で議論の的となった、古代以来虚偽や虚言を含むと見做されてきた歴史家たちを対象に、当時の真実と虚偽の境界を探り、かつ詩や物語に関する同時代の虚構論との関係を明らかにするものだった。研究の成果として、一つには、トロイ戦争の真の歴史を書いたと称されるフリギアのダレスの『トロイ滅亡記』(実際は古代末期の偽作)のフランスにおける受容を、特に仏訳者シャルル・ド・ブルグヴィルの論説を主な対象としてに分析した。(『桜門論叢』第90巻所収)また一つには、歴史書かはたまた歴史小説風の哲学書かで論の分かれていたクセノフォンの『キュロスの教育』について、フランスを中心にした受容のあり方をテーマに論文を執筆、投稿した。これは間もなく刊行される予定である。(Seizieme siecle, no. 12近刊)16世紀フランスにおける歴史と虚構の境界をめぐる議論の展開を明らかにするため、クセノフォンの『キュロスの教育』と擬フリギアのダレスの『トロイ滅亡史』の受容について分析した。『キュロスの教育』の受容を扱うという予定は研究当初からあったが、実際に資料を広く分析することで、それが法曹歴史家たちの歴史記述論の枠にとどまらず、カルヴァンの神学的歴史論、スカリジェとヴィニエの年代学など、様々な分野と結びついていることが明らかになった。これは、当初の計画を良い意味で裏切る発見であった。2月18日から3月2日にかけて行ったフランスでの資料調査は、研究を進めるうえで極めて意義があった。パリの国立図書館で重要な資料を閲覧することができただけでなく、16世紀文学の専門家の意見を仰ぐこともできた。27年度が最終年度であるため、記入しない。フランス文学まずは前年度の研究成果として、現在ほぼ完成している『キュロスの教育』に関する論文の最終的なチェックを行い、専門誌に投稿することを予定している。その上で、文学的虚構をめぐる議論の中に、歴史記述についての議論がいかに取り込まれているのかを明らかにするため、詩論や物語論の類を中心に研究を進めることを計画している。例えばヘリオドロスの『エチオピア物語』(3世紀)を初めとするギリシャ小説の類などは、歴史と虚構の境界を考える上で、非常に重要なものとなるだろう。
知覚神経節での活性物質遺伝子発現操作と末梢神経傷害に伴う情報伝達異常

最近我々は、後根神経節の大型細胞のサブスタンスP(SP)、CGRP(カルシトニン遺伝子関連ペプチド)の発現が誘導され、中枢側の終末部位の一である後索核で増加し、その結果中枢神経系に影響を与える可能性を示した。そこでCGRP、SP、ニューロペプチド(NPY)など末梢神経障害後発現が誘導される活性物質の発現を抑制して、その生体における反応を検索し、神経ペプチドの発現誘導の意義を探る事が研究の目的である。方法1、アンチセンスオリゴヌクレオチド法によって、末梢神経障害後の知覚神経節において新たに発現が誘導される遺伝子を、mRNAレベルで抑制する為の基礎実験を施行した。ラットの一側に坐骨神経を切断し、同日よりL4-5椎体レベルにカテーテルを挿入し、intrathecalにinfusion pumpでアンチセンスオリゴヌクレオチドを連続的に投与した。プローブとしてOGRP mRNAに相補助な配列を用いた。発現の抑制はin situハイブリダイゼーション法を用いて確認した。また、翻訳後の蛋白レベルの確認には特異的抗体を用いた免疫組織化学法を使用した。2、末梢神経痛モデル動物でのアンチセンスオリゴヌクレオチドによるmRNA発現抑制を行う為にモデル動物を作成し、その痛覚関連行動の測定と神経活性物質の発現を検索した。結果アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法や最適濃度についての最適条件を見つけるために実験を繰り返した結果、一部の動物において末梢神経傷害後の知覚神経節において新たに発現が誘導される遺伝子産物が、減少した。しかし、センスプ-ブやミスセンスプローブを用いての特異性の検討などの問題が残っている。
歯槽骨再生治療へのダイレクト・リプログラミング技術の応用

歯槽骨吸収は歯牙の喪失につながり、患者のQOLを著しく低下させる。骨吸収部に自己骨芽細胞を移植できれば、歯槽骨を再生し歯牙喪失を回避出来る可能性がある。我々は最近、ヒト線維芽細胞にレトロウイルス・ベクターを用いて4つの転写因子の遺伝子を導入すると骨芽細胞を誘導できることを報告した。本研究ではこの技術をさらに発展させ、導入遺伝子が染色体に組み込まれてない骨芽細胞の樹立を試みた。その結果、プラスミド・ベクターを用いた遺伝子導入によりヒト線維芽細胞を骨芽細胞に誘導することに成功した。導入遺伝子は染色体に組み込まれていなかった。本研究の成果は、安全で有効な新しい骨再生医療につながる可能性がある。歯周病は日本人成人の80%が罹患しているといわれ、歯周病の進行に伴う歯槽骨の吸収は、歯牙を喪失する最も主要な原因となっている。患者由来の骨芽細胞を、歯槽骨の吸収部位に移植すれば、歯牙の喪失を予防し、患者のQOLおよびADLを著明に改善できる可能性がある。現在自己骨芽細胞を作出する方法としては、骨髄由来間葉系幹細胞から誘導する方法があり、外傷や骨肉腫切除後の骨欠損に対してはすでに臨床応用されているが、細胞採取に伴って大きな侵襲があること、得られる細胞の数が不十分であるなどの問題がある。またiPS細胞から誘導する方法も考えられるが、未分化細胞の混入に伴う腫瘍化の危険性が否定しにくい。我々は最近、ヒト体細胞を骨芽細胞に直接誘導(ダイレクト・リプログラミング)することに世界で初めて成功した。しかしながら現状では、レトロウイルス・ベクターを用いて遺伝子を導入しているので、より安全な骨芽細胞の作出方法が望まれる。そこで本研究では、レトロウイルス・ベクターに換わる方法を用いて、安全性の高い機能的なヒト骨芽細胞を線維芽細胞から直接誘導する技術を開発することを目的とし、研究を行った。その結果、我々がオリジナルで作成したプラスミド・ベクターを用いることで、ヒト体細胞からアルカリフォスファターゼ陽性の細胞を効率よく誘導することに成功した。また得られた細胞は、骨芽細胞関連遺伝子群を発現し、骨芽細胞様の性状は免疫染色、アリザリン染色ならびにvon Kossa染色によっても認められた。この細胞を、動物の精巣に移植したところ、石灰化基質の産生を認めた。さらに、移植後長期間観察しても、腫瘍を形成することはなかった。H27年度にさらなる検討を加えることにより、本研究は歯槽骨吸収に対する新しい再生医療をもたらす可能性が期待できる。歯周病は我が国の成人の80%が罹患しているといわれ、歯周病の進行に伴う歯槽骨の吸収は、歯牙を喪失する最も主要な原因となっている。患者由来の骨芽細胞を、歯槽骨の吸収部位に移植すれば、歯牙の喪失を予防し、患者のQOLとADLを著明に改善できる可能性がある。現在自己骨芽細胞を作出する方法としては、骨髄由来間葉系幹細胞から誘導する方法があり、外傷や骨肉腫切除後の骨欠損に対してはすでに臨床応用されているが、細胞採取に伴って大きな侵襲があること、得られる細胞の数が不十分な例があるなどの問題がある。我々は最近、ヒト体細胞にRunx2、Osterix、Oct4、L-mycの4遺伝子を導入すれば、骨芽細胞を直接誘導できること(ダイレクト・リプログラミング)を見出した。しかしながら現状では、レトロウイルス・ベクターを用いて遺伝子を導入しているので、導入遺伝子が染色体に組み込まれた骨芽細胞が得られる。そこで染色体への遺伝子の組み込みがない骨芽細胞の作出方法が望まれる。その結果、ヒト体細胞にOsterix、Oct4、L-mycの3遺伝子を組み込んだプラスミド・ベクターを導入すると、アルカリフォスファターゼ陽性で骨芽細胞関連遺伝子群を発現し、骨基質を産生する骨芽細胞が誘導されることを見出した(Yamamoto他, 2016)。この細胞の染色体には、外来遺伝子は組み込まれていなかった。またこの細胞をマウスに接種すると、移植部位に石灰化基質が認められ、その周囲にヒトRunx2陽性細胞を認めた。移植後長期間観察しても、腫瘍の形成は見られなかった。本研究成果は、歯槽骨吸収に対する有効で安全な新しい再生医療をもたらす可能性が期待できる。レトロウイルス・ベクターを用いず、プラスミド・ベクターにて骨芽細胞を誘導するという、当初の目標を達成できたため。再生歯科医学、骨免疫学、歯周病
On-the-job Training: from Acemoglu to Becker?

本論文は、摩擦のある労働市場での転職活動と、一般的な職業研修との両方を同時に説明することのできるモデルを分析する。市場均衡は「分配の非効率性」と「研修の非効率性」の2点を通じて非効率となる。市場均衡は社会的最適解に比して、「研修の非効率性」により多くの高度人材を有するこが彼らの転職は阻害され、この「分配の非効率性」により実質生産高および純生産高が低くなることが示された。このモデルでは離職率が向上することで両方の非効率性は改善するため、Acemoglu (1997)とは異なり、労働市場の摩擦が低減して完全競争が近づくにつれてBecker (1964)の結論に収束することを示された。本論文は、労働者が転職活動を行い、企業はその行動を見越してスキルに見合った賃金と訓練の報酬契約パッケージを提示するという、摩擦のある労働市場でのジョブサーチと、一般的な職業研修との両方を同時に説明することのできるモデルを分析する。労働者の転職活動を見越して提示される報酬契約は、転職活動を阻害するため「分配の非効率性」になる。フリーライダー問題は企業が一般的な研修への投資を抑制する方向に影響する一方で、追加的な動機の存在は企業がソーシャルプラナーよりもより多く研修に投資する方向へと働く。このトレードオフにより、市場均衡においてはソーシャルプラナーよりも多く研修に投資する企業と少なく投資する企業の両方が現れる可能性が生じる。数値計算の結果によると、市場均衡は社会的最適解に比して、「研修の非効率性」により多くの高度人材を有するこが彼らの転職は阻害され、この「分配の非効率性」により実質生産高および純生産高が低くなることが示された。興味深いことに、このモデルでは離職率が向上することで両方の非効率性は改善するため、Acemoglu(1997)とは異なり、労働市場の摩擦が低減して完全競争が近づくにつれてBecker (1964)の結論に収束することを示された。この論文に加えて、同じトピックを異なる環境下で検討した2本の論文を執筆した。1本目は企業が報酬動機と投資動機に基づいて一般的研修を行うモデルで、これによりBecker (1964)とAcemoglu (1997)を整合的に説明することが可能になった。もう一本は雇用者と労働者の間の関係的契約理論をモデルに反映したもので、長期関係下での評判効果が企業に一般的研修を行うインセンティブを与えるというものである。労働経済学
舌突出癖に対する筋機能療法の効果‐マルチモダリティ解析による検討

嚥下は口腔内の重要な生理機能のひとつであり、嚥下時舌運動が歯の位置や咬合状態に影響を及ぼすことは知られている。そこで我々は、非侵襲的なMRI movieを用いて、健常者に対し歯列および口蓋の描出を行うとともに、嚥下時舌運動の経時的変化の評価法を確立することを目的とした。本研究方法を用いることで、今まで描出が困難で、不明瞭であった舌、歯列および口蓋の境界を明瞭に判別することが可能となり、不正咬合に関連する舌癖を客観的に評価し、矯正治療にフィードバックするための有用な方法のひとつであることが示唆された。「研究の目的」舌突出癖を伴う、上下顎骨の前後的・垂直的位置関係の不調和が著しい不正咬合においては、矯正歯科治療単独での咬合の改善や顔貌の調和を図ることが困難である。このような場合に併用される筋機能療法のエビデンスには不明な点が多い。そこで、申請者は、『常態および病態を示す口腔機能が歯および歯列に与える影響を解明する』ことを研究の全体構想として掲げ、「舌突出癖患者における舌挙上訓練に伴う舌圧、口唇圧、咀嚼筋活動および舌運動の経時的変化における相互関連を探り、顎態および歯列に与える影響を解明する」ことを本研究の具体的な目的として遂行する。前年度の研究実績は以下のとおりである。1、「改良型舌圧分布測定装置の実用化」および「舌圧分布および咀嚼筋筋活動同時計測の実用化」に関して、各被験者用にカスタマイズされたプラスチックプレートを用いて、現在安定したデータを計測することが可能になり、健常者および舌突出癖を有する被験者をリクルートし順次計測、解析を行っている。2、「嚥下時MRI動画撮像の実用化」に関して、過去の嚥下時舌運動に関する報告は、X線を用いた嚥下造影検査、嚥下内視鏡検査などが報告されているが、非侵襲的に経時的変化を評価した報告は少ない。現在、その撮像条件が確立し、被験者をリクルートし順次計測、解析を行っている。舌突出癖を伴う、上下顎骨の前後的・垂直的位置関係の不調和が著しい不正咬合においては、矯正歯科治療単独での咬合の改善や顔貌の調和を図ることが困難である。そこで我々は「舌突出癖患者における舌挙上訓練に伴う舌圧、口唇圧、咀嚼筋活動および舌運動の経時的変化における相互関連を探り、顎態および歯列に与える影響を解明する」ことを本研究の具体的な目的とした。今年度は引き続き改良型舌圧分布測定装置の実用化の設定がほぼ終わり、健常者の舌圧分布を計測を開始している。このことにより、口唇圧、舌圧分布、咀嚼筋筋活動の変化を経時的に記録でき定量的に解析することが可能となる。さらに前年度計測方法を確立したMRI動画法に関しては、健常者の嚥下時舌運動の経時的変化を計測し解析しており、国際雑誌に発表予定である。このとこにより、健常者における嚥下時舌運動の位置変化が口唇圧、舌圧分布、咀嚼筋筋活動とあわせて考察することが可能になり、健常者の嚥下メカニズムがより詳細に確立することが可能になると考えられる。今後は、健常者のみならず、舌突出癖を伴う被験者に対して、計測、解析することにより健常者との異なるメカニズムが明らかになり、舌突出癖患者の治療法の確立を機能面から見出す端緒となりうる。そこで、申請者は、「舌突出癖患者における舌挙上訓練に伴う舌圧、口唇圧、咀嚼筋活動および舌運動の経時的変化における相互関連を探り、顎態および歯列に与える影響を解明する」ことを本研究の具体的な目的として研究を行った。本研究では、[1]申請者らが先行研究で使用した装置を改良して、訓練時に口蓋部および上顎前歯部における舌圧分布を超小型圧センサを用いて測定することが可能な装置の実用化を図る。[2]次に、[1]で開発した装置を用いたデータ採得中に、上顎前歯部口唇圧および咀嚼筋筋活動を同時計測を可能な環境を整える。その装置を用いて、[3]健常者群(対照群)、舌突出癖患者群(実験群)の2群をそれぞれ2グループに分け、2種類の異なる舌挙上訓練課題(低負荷・長時間課題および高負荷・短時間課題)を行い、その効果に関する機能的評価を行うとともに、顎態および歯列の形態計測による形態的評価を行う。さらに、MRI動画法においても、同様の対照群、実験群においての舌の経時的位置変化の計測・解析を行う。この過程で、対照群と実験群を横断的比較するとともに、実験群において課題の持続効果を縦断的に比較する。最終年度では、MRI動画法を用い健常者複数名および舌突出癖患者の経時的舌運動を計測、解析を行った。

嚥下は口腔内の重要な生理機能のひとつであり、嚥下時舌運動が歯の位置や咬合状態に影響を及ぼすことは知られている。そこで我々は、非侵襲的なMRI movieを用いて、健常者に対し歯列および口蓋の描出を行うとともに、嚥下時舌運動の経時的変化の評価法を確立することを目的とした。本研究方法を用いることで、今まで描出が困難で、不明瞭であった舌、歯列および口蓋の境界を明瞭に判別することが可能となり、不正咬合に関連する舌癖を客観的に評価し、矯正治療にフィードバックするための有用な方法のひとつであることが示唆された。被験者、特に舌突出癖患者の研究協力者の確保がやや困難である。臨床生理学研究協力者と連絡を密に取ることにより、被験者確保を進めていく予定である。前年度研究計画の通り「改良型舌圧分布測定装置の実用化」および「舌圧分布および咀嚼筋筋活動同時計測の実用化」は可能となり、「嚥下時MRI動画撮像の実用化」においても安定したデータを得ることが可能となった。この点に関して、当初の計画通り順調に進展していると考えられる。しかしながら、被験者のリクルートをするのがやや困難であることが挙げられる。被験者の確保が困難であったため、計測装置に使用する機器の使用数が異なったため。定量的なグループデータ解析に必要なサンプルサイズの確保には組織的に被験者を集めることが必須であると考えられる。そのため、研究グループおよび所属する機関の協力を得て被験者の確保を行いたいと考えている。研究協力者と密に連絡を取ることで、被験者の確保を行っていく予定。「改良型舌圧分布測定装置」および「嚥下時MRI動画撮像」のためのプラスチックプレート、圧センサ、筋電図用電極などの消耗品の購入費用および研究成果発表および研究調査、打ち合わせのための旅費、英文論文投稿費用のため。被験者一人に付きプラスチックプレートが最低2枚必要であり、圧センサ4つ使用し、また電極が6つ必要となる。そのため、今年度中は、被験者をリクルートしていくうえで購入をしていく予定である。
pHによるF_1F_0-ATPaseの分子集合の調節機構の研究

Entercocciの細胞内pHはF-typeのH^+-ATPaseによるH^+の排出により調節されている。即ち、細胞内pHが低下すると細胞膜のH^+-ATPaseの量が増加し、H^+が細胞外に排出されることにより、細胞内pHはいっていに保たれる。従って、細胞内pH調節にとっても最も大切なことはH^+-ATPase量の調節であり、この調節は細胞内pHによるH^+-ATPaseの分子集合の制御で行われていることが分かっていた。そこで、本研究ではこの調節機構を明らかにするために、以下の研究を行った。F-typeのATPaseは、細胞膜に存在するFo部分とFo部分に結合している膜表在性のF_1部分より構成されている。したがって、H^+-ATPaseの分子集合の調節機構として次の二つの機構が考えられる。(A)まずF_1とF_0のサブユニットが別々に集合して、F_1とF_0のcomplexができた後、両complesが結合してF_1F_0-complexができる。そして、F_1-complexとF_0-xomplexの結合がpHにより制御されている。(B)まず細胞膜にF_0-complexができ、このF_0-complexにF_1subunitsが集合してF_1F_0-complexができる。そして、いずれかのcomplexが集合する段階でpHによる調節が行われる。しかし、実験結果は、(A)の可能性はないことを示した。βsubunitの385番目のグリシンがトリプトファンに変化した変異株であるAS17株を調べたところ、この変異株は、pHが低下しても分子集合の促進が少なく、結果として酵素量の増加がない変異株であることがわかった。特にF_1部分の集合がpHにより促進されないこと、細胞質に蓄積するF_1subunitの量は野生株に比べ多いことがわかった。従って、上記の(B)の可能性が高く、pHによる分子集合の制御は、βsubunitが分子集合する段階である可能性が最も高いと考えられる。Enterococciの細胞内pHはH^+-ATPaseによるH^+の排出により調節されている。即ち、細胞内pHが低下すると細胞膜のH^+-ATPaseの量が増加し、H^+が細胞外に排出されることにより、細胞内pHは一定に保たれる。従って、細胞内pH調節にとって最も大切なことはH^+-ATPase量の調節であり、この調節は細胞内pHによるH^+-ATPaseの分子集合の制御で行われていることがわかった。EnterococciのH^+-ATPaseはF-typeのATPaseであり、細胞膜に存在するF_o部分とF_o部分に結合している膜表在性のF_1部分より構成されている。(A)まずF_1とF_oのサブユニットが別々に集合して、F_1とF_oのcomplexができた後、F_1-complexとF_o-complexが結合してF_1F_o-complexができる。そして、F_1-complexとF_o-complexの結合がpHにより制御されている。(B)まず細胞膜にF_o-complexができ、このF_o-complexにF_1-complexが集合してF_1F_o-complexができる。

このいずれが正しいかを調べた結果、(A)の可能性はないことがわかった。また、細胞質には分子集合しなかったF_1のサブユニットがcomplexとして多量に存在することがわかった。従って、F_o-complexの集合がpHにより制御されている可能性が高いと考えられる。即ち、pHが高くH^+-ATPaseを必要としないときはF_o-complexの集合が抑えられるが、F_1-complexはpHに関係なく作られるので、F_1-complexが余剰にでき、この余情のF_1-complexが細胞質に存在すると考えられる。一方、細胞質に存在するF_1-complexはATP分解活性がほとんどないことより、F_o-complexと集合できなかったF_1-complexは速やかにATP分解活性が失われ、細胞質でのATPの過剰の分解を防いでいることがわかった。今後は、F_o-complexの集合がどのようにしてpHにより制御されているかを明らかにしたい。Enterococciの細胞内pHはH^+-ATPaseによるH^+の排出により調節されている。即ち、細胞内pHが低下すると細胞膜のH^+-ATPaseの量が増加し、H^+が細胞外に排出されることにより、細胞内pHは一定に保たれる。従って、細胞内pH調節にとって最も大切なことはH^+-ATPase量の調節であり、この調節は細胞内pHによるH^+-ATPaseの分子集合の制御で行われていることがわかっていた。本年度はこの調節機構を明らかにするために、変異株AS17株を用いた解析を行った。EnterococciのH^+-ATPaseはF-typeのATPaseであり、細胞膜に存在するFo部分とFo部分に結合している膜表在性のF_1部分より構成されている。AS17株は細胞内が酸性化したとき、Fo部分は増加するが、F_1部分は増加しない変異株である。まず、AS17株の変異部位の同定を行ったところ、βsubunitの1153番目の塩基が置換したことにより385番目のグリシンがトリプトファンに変化した変異株であることがわかった。AS17株の膜にあるFo部分と野生株のF_1部分を結合させたところ、正常に結合したことより、Fo部分は正常に分子集合していることがわかった。さらに、AS17株のF_1部分もAS17株のFo部分と正常に結合したことから、AS17株において、分子集合したF_1Fo-ATPaseは野生株と変わらず、分子集合課程が正常に行われないことがわかった。分子集合していないF_1部分のsubunitsの分解速度も野生株と同じであった。しかし、細胞質の存在するF_1subunitsは野生株よりも多く、このことからも、AS17株が分子集合の変異株であることがわかる。このように、AS17株は分子集合の変異株であることがわかり、本酵素は分子集合の課程で調節されていることを示唆している。また、AS17株は今後の研究、特に分子集合課程の解析およびその調節機構の解析に、有用な変異株であることがわかった。
癌性腹水産生に関与する新規分子の同定とその作用機序の解明

(背景)卵巣癌は腹膜播種性の転移を形成し多量の腹水を伴う場合が多い。一般的に卵巣癌は抗がん剤に感受性が高く、臨床的に一旦は寛解が得られやすいものの再発率も高く、最終的には多量の腹水を伴うcachexiaに陥りやすい。従って、腹水を制御することはterminal careにとっても重要な課題であり患者のQOL改善に大きな効果が期待される。(成果)ムチン分子の1つであるmucin core peptide1(MUC1)が卵巣癌の病態に及ぼす影響について解析するため、ヒト卵巣癌細胞株ES-2にMUC1cDNAを遺伝子導入したES-2/T-42株は、ヌードマウス腹腔内に移植すると、全ヌードマウスの81.8%と高率に多量の血性腹水を生じさせた(ベクターのみを遺伝子導入したES-2/mock株では0%であった)ことから、ES-2/T-42株とES-2/mock株の遺伝子発現プロファイルをDNAchipを用いて網羅的に解析した。その結果、両細胞株間で発現量の異なる分子がMUC1以外にも数多く存在することが明らかとなった。さらに腹水産生分子を絞り込むため、ヒト子宮体癌細胞株HHUAをヌードマウスの子宮に同所性移植し、血性腹水を生じたマウスから腹水を採取し培養系に移し亜株を樹立した。本亜株はさらに同じ操作を5回繰り返すことで安定的に腹水を産生する亜株へと変化した。このHHUA腹水産生株と親株との間で異なる遺伝子発現を検索するためDNAchipを用いて網羅的に解析した。その結果、当初予想していたMUC1ムチンの発現量増加はみられず、ES-2/T-42株とES-2/mock株間の遺伝子発現プロファイルと比較するも同一遺伝子の発現量増加はみられなかった。(成果)ムチン分子の1つであるmucin core peptide 1(MUC1)が卵巣癌の病態に及ぼす影響について解析するため、ヒト卵巣癌細胞株ES-2にMUC1 cDNAを遺伝子導入したES-2/T-42株を作製しヌードマウス腹腔内に移植したところ、全ヌードマウスの81.8%と高率に多量の血性腹水を認めた(ベクターのみを遺伝子導入したES-2/mock株では0%であった)。このようにES-2/T-42株がほぼすべてのヌードマウスに癌性腹水を生じさせたことから、MUC1ムチンが癌性腹水産生のトリガーになっている可能性が示唆されたものの、MUC1遺伝子導入に伴って他の遺伝子の発現が変化している可能性も考慮し、まずES-2/T-42株とES-2/mock株の遺伝子発現プロファイルをDNA chipを用いて網羅的に解析した。さらに腹水産生分子を絞り込むため、ヒト子宮体癌細胞株HHUAをヌードマウスの子宮に同所性移植したところ、血性腹水を生じたマウスを認めたため、この腹水を培養系に移し亜株を樹立した。本亜株はさらに同じ操作を5回繰り返すことで安定的に腹水を産生する亜株へと変化しつつあり、今後、親株との問で網羅的な遺伝子発現プロファイルを解析し、先のMUC1遺伝子導入株における結果と併せて分析することで、真の腹水産生分子の同定が可能になるものと考えている。

その結果、当初予想していたMUC1ムチンの発現量増加はみられず、ES-2/T-42株とES-2/mock株間の遺伝子発現プロファイルと比較するも同一遺伝子の発現量増加はみられなかった。
肺癌における微小転移を規定する生物学的因子の解析

【目的】本研究は、特異性の高い微小癌転移の検出系を確立すること、さらに肺癌の発生や浸潤・転移に関与する遺伝子異常を解析し、生物学的特性を考慮した個別化された癌治療の指針を得ることを目的とした。【結果】(1)微小転移の検出:第I期非小細胞肺癌115例から郭清した所属リンパ節(LN)を、抗サイトケラチン(CK)抗体で免疫組織学的に染色した。CK陽性LNは1.7%、32例(27.8%)が陽性で、その予後は有意に不良であった。この研究に基づき、多施設共同研究による前向き試験を行なった。骨髄液351例中112例(31.9%)がCK陽性で、第IIIIIA期では有意に予後不良であった。また、第I期症例216例のLNを染色し、陽性症例の予後は有意に不良であった。第I期では、LNの微小転移が、第IIIIIA期では、骨髄の微小転移が有意な予後因子と考えられた。(2)分子生物学的因子と微小転移との関連:LN微小転移と、原発巣の血管新生因子(VEGE, VEGF-C)、細胞接着因子(E-cadherin, α,β,γ-catenin)の発現異常を免疫組織化学的に解析した。VEGF-C発現は、T2と扁平上皮癌で有意に高く、発現陽性例は有意に予後不良であった。β-catenin発現減弱は扁平上皮癌で、γ-catenin発現減弱は腺癌で有意に多かった。接着因子の発現低下とLN微小転移とに有意な相関を認め、接着因子が微小転移の指標になることが示唆された。糖転移酵素GalNAc-T3発現は、正常腺上皮とAAH細胞に強発現を認めた。強発現の頻度は、低分化、病期の進行とともに有意に低値となり、低発現は有意な予後不良因子であった。GalNAc-T3発現は、腺上皮から肺腺癌の進展と分化に関係し、新しい予後因子として有用である。メチル化の有無をCDH1, RASSF1A, FHIT, p16INK4aについて解析し、p16のメチル化は重喫煙と、FHITはリンパ節転移と相関していた。CDH1でメチル化があり、タンパク発現が低下しているものは有意に予後不良であった。【考察・結論】サイトケラチンを用いたリンパ節や骨髄中の微小癌転移の検出を確立し、臨床的に再発や予後の推定に極めて有用であることを示し、術後の補助療法の一つの選択基準となりうることが示唆された。肺癌の個々の個性を遺伝子発現のプロファイルからより明確にすることで、個々の症例の特性を把握し症例特異的な治療法を構築することが期待される。

肺癌の個々の個性を遺伝子発現のプロファイルからより明確にすることで、個々の症例の特性を把握し症例特異的な治療法を構築することが期待される。微小転移の検出と臨床的意義第I期肺癌におけるリンパ節のサイトケラチンによる微小転移の検出を行ない、陽性症例の予後は、有意に不良であることを示し、これを報告した(Osaki, et al. J Clin Oncol)。この研究に基づき、多施設共同研究による前向き試験を行なった。全国15施設から351例の非小細胞肺癌患者より骨髄液を採取し、抗サイトケラチン(CK)抗体(CK2)にて免疫化学的に染色し、112例(31.9%)が陽性であった。CK陽性例は予後不良の傾向があり(p=0.076)、第IIIIIA期では有意に予後不良であった(P=0.047%)。また、第I期症例216例のリンパ節を抗CK抗体(AE1/AE3)にて染色し、34例(15.7%)にCK陽性細胞を認め、その症例の予後は、有意に不良であった(P=0.004)。したがって、サイトケラチンを指標とした微小転移の検出において、第I期ではリンパ節の微小転移が、第IIIIIA期では、骨髄の微小転移が有意な予後因子と考えられた。分子生物学的因子と微小転移との関連血管新生因子であるVEGFとVEGF-Cの原発腫瘍での発現を免疫組織化学的に検討した結果、VEGF発現は42%に認められ、T因子との相関を認めた。一方、VEGF-C発現は70%に認め、種々の因子との相関は認められなかったものの、有意な予後因子(P=0.001)であった。細胞接着因子であるE-cadherinとβ-cateninの原発腫瘍での発現と転移との関連を非小細胞肺癌患者58例について検討した。E-cadherinの発現低下は27.6%に認められ、β-catenin発現低下は37.9%認められた。このE-cadherinとβ-cateninの発現が原発腫瘍で低下している症例とサイトケラチンを指標とした骨髄中の微小転移とには有意な相関(P=0.0392)が認められ、これらの因子は微小転移を推定する上で有用な因子である。微小転移の検出と臨床的意義サイトケラチンによるリンパ節と骨髄中の微小転移に関しては、昨年の報告書に記載した。分子生物学的因子の解析1.肺腺癌の進展における糖転移酵素GalNAc-T3発現の意義生体内において糖鎖は、細胞表面に局在し接着分子機能を有することから、その発現は、細胞構築の維持に重要であるとともに、細胞遊離の観点から癌転移との関連が指摘されている。肺腺癌切除例221例およびAAH病変に対し、糖転移酵素N-acetyl-galactosaminyl transferases (GalNAc-T3)発現を免疫組織化学的に解析したところ、GalNAc-T3発現は、正常腺上皮に発現しており、AAH細胞においても強発現を認めた.腺癌原発巣では、GalNAc-T3の強発現を56.1%に認めた。組織学的分化度において、強発現の頻度は、低分化ほど有意に低値となり、T因子、N因子、病期の進行とともに有意に低値となった。病理学的に野口のA型では全例が高発現であったが、B型以降は次第に低発現となった。また脈管浸潤と有意に相関していた。予後解析にて、GalNAc-T3強発現群に比較し、低発現群で有意な予後不良因子であった。したがって、糖転移酵素GalNAc-T3発現は、腺上皮から肺腺癌の進展と分化に関係する.また予後に関する新しいbiomarkerとして有用である。2.DNAメチル化の検出と臨床的意義遺伝子発現の調節機構として、DNAメチル化が重要で、それにより蛋白の不活化が生じると考えられる。非小細胞肺癌227例のメチル化の有無をCDH1,RASSF1A,FHIT,p16INK4aについてmethylation-specific PCR(MSP)により解析した。