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HOMOLOGOUS RECOMBINATION を応用した脱白血病化の研究

白血病をはじめとする悪性腫瘍に対する本来の意味での遺伝子治療は、腫瘍細胞の異常癌遺伝子を正常な遺伝子に置き換えることにより、腫瘍細胞を正常化することである。このように異常癌遺伝子の修正を行うには、homologous recombination法を用いた遺伝子導入を行う必要がある。我々は、homologous recombination用のプラスミッドを作成し、そのプラスミッドについての予備的検討を行った。homologous recombination用のプラスミッドpGDTKbcrNeoablreverseは、pGD210を基本に、pSHTから切り出したTKを組み込み、BCR-ABLの間にpMC1NeoPolyAより切り出したNeoを組み込んだBCR-Neo-ABLをhomologous部位(BCR-ABL領域)の特異性を高めるために逆向きに挿入し直すことにより作成した。IL-3依存性マウス骨髄細胞株FDC-P2に電気パルス法でBCR-ABL遺伝子を導入することによりその発現が確認されたクローンが得られ、これらには自律増殖能の獲得が認められた。また、得られたすべてのクローンにおいて、1コピーの遺伝子が導入されていた。FDC-P2にpGDTKbcrNeoablreverseを導入することにより、Neo、TKの発現が認められ、G418に耐性となり、かつgancyclovirに対する感受性が亢進したクローンが得られた。すなわち、今回作成したプラスミッドを用いれば、homologous recombinationによりBCR-ABL遺伝子をつぶすことができる可能性が想定され、これらの細胞においては、G418に耐性となり、この作成したプラスミッドがrandomに組み込まれた細胞に比べgancyclovirに対する抵抗性が強く、G418とgancyclovirの両者を用いることにより、homologous recombinationをおこした細胞を選択することができると考えられた。この研究における最大の課題は、いかにしてhomologous recombinationの効率を上げることができるかということであるが、この点については哺乳動物についてもこの作用があると考えられているRad51等の応用が考えられる。BCR/ABL融合遺伝子を導入し形質転換をきたした細胞を用いて、修飾を加えてBCR/ABL融合遺伝子をつぶし、相同なDNA配列を認識して染色体DNAに組み込まれた細胞のみを選択できるように新たな遺伝子を組み込んで作製した遺伝子を導入し、BCR/ABL部位のhomologous recombinationによる遺伝子導入をおこさせることにより、脱白血病化、すなわち自律増殖能をこれらの細胞から奪うことができるかどうかについて検討することを目的とした実験で、以下の段階までの進展が得られた。すなわち、pGD'210〔MPSVのLTRをプロモーターとし、BCR/ABL融合遺伝子のcDNAとネオマイシン耐性遺伝子(Neo)を組み込んだプラスミッド〕からNeoを取り除いたpGD'210・Neo(-)を作製した。マウス増殖因子依存性細胞株(FDC-P2)に電気パルス法でpGD'210・Neo(-)を導入し、増殖因子無添加の培養を行うことにより、プラスミッドが取り込まれBCR/ABLの発現により増殖因子非依存性となった細胞のクローンの樹立を行っている。一方、homologous recombinationのためにpGD'210・Neo(-)のBCR/ABL融合部位にNeoを組み込み、ガンシクロビルで選択するために単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子(tk)をくみこんだpGD'210・HSV-tkを作製した。pGD'210・Neo(-)を遺伝子導入し自律増殖するようになった細胞に、pGD'210・HSV-

tkを電気パルス法で導入し、G418(ネオマイシン・アナローグ)とガンシクロビルを添加し、かつ増殖因子を加えた培養を行うことにより、Neo遺伝子が導入されたことにより、G418耐性となり、HSV-tkが導入の際に落ちてガンシクロビルにも耐性になっている細胞を選択する実験を行う計画である。Homologous recombinationを応用した脱白血病化の研究は、白血病の遺伝子治療を確立する上に重要である。我々は、マウス血液細胞株を用いて、homologous recombination法を応用して遺伝子導入を行うことにより、あらかじめ導入されているBCR-ABLをつぶすためのプラスミッドを作成し、そのプラスミッドについての予備的検討を行ったので報告する。【方法】homologous recombination用のプラスミッドpGDTKbcrNeoablreverseは、pGD210(Dr.Martin L.Scottより供与を受けた)を基本に、pSHTから切り出したTKを組込み、BCR-ABLの間にpMC1NeoPolyAより切り出したNeoを組み込んだBCR-Neo-ABLをhomologous部位(BCR-ABL領域)の特異性を高めるために逆向きに挿入し直すことにより作成した。遺伝子導入標的細胞としてIL-3依存性マウス骨髄細胞株FDC-P2を用い、遺伝子導入は矩形波による電気パルス法で行った。遺伝子導入細胞の選択は、導入したプラスミッドの構造により、G418添加培養、またはIL-3を加えない培養で行った。導入遺伝子発現の確認は、BCR-ABL、Neo、TKについて、PCRおよびRT-PCRにより行い、導入遺伝子のコピー数は、FISH法にて判定した。【結果】FDC-P2にBCR-ABL遺伝子を導入することにより自律増殖能の獲得が認められ、すべてのクローンにおいて、1コピーの遺伝子が導入されていた。FDC-P2にpGDTKbcrNeoablreverseを導入することにより、Neo、TKの発現が認められ、G418に耐性となり、かつgancyclovirに対する感受性が亢進したクローンが得られた。これらのクローンには自律増殖能の獲得は認められなかった。【結論】BCR-ABL遺伝子を導入して、自律増殖能を獲得したFDC-P2にpGDTKbcr Neoablreverseを導入することにより、homologous recombinationによる組込みがおこれば、BCR-ABLをつぶすことができかつそれをG418とgancycloviruで選択できる可能性が示唆された。
乳がん患者と家族の関係性の向上を目指した心理支援プログラムの開発

本年度は、乳がん患者に対する縦断的質問紙調査を引き続き行ったことに加え、乳がん患者の配偶者に対する質問紙調査を行い、結果をまとめた。まず、乳がん患者に対する縦断的調査の7時点のうち、入院時(T1;N=201)、1ヶ月後(T2;N=196)、半年後(T3;N=196)のデータを用いて、解析を行った。親しい他者からのネガティブサポートの中で、過剰関与と問題回避は時間の経過に従って減少するサポートであり、過小評価は変化しないサポートであることが示された。また、各時点でのネガティブサポートが心理的適応に及ぼす影響を検討したところ、3時点ともに問題回避のみが有意な影響を及ぼしていた(T1:β=0.27,p<0.01;T2:β=0.34,p<0.01;T3:β=0.27,p<0.01)。親しい他者が問題回避していると報告している患者には、NEOによる性格傾向に特徴はなかったが、感情抑制傾向が強いことがわかった(r=0.27,p<0.01)。このことから、二者間の問題回避は、どちらか片方ではなく両者のダイナミズムの問題として捉える必要があることが示唆された。そのため、乳がん患者の配偶者(N=368)を対象に、どの程度患者に対して問題回避を行っているのか、また、問題回避を行う配偶者の特徴を調べることを目的に質問紙調査を行った。その結果、ときどきよりも頻回に問題回避をしている配偶者が、診断直後では約半数、また現在(術後平均2.4年)でも約35%いることが明らかになった。また、配偶者自身の問題回避と患者がとっていると認識している問題回避との相関は強かった(r=0.62,p<0.01)。問題回避をとる配偶者の特徴として、がんに対する脅威性が高い、侵入想起症状が強いという特徴が明らかとなり、問題回避をとることには、配偶者の性格傾向や家族機能ではなく、配偶者自身の心理的不適応が背景にあることが明らかとなった。これらの結果から、患者と配偶者の両者の視点にたった心理支援ツールを開発し、乳腺外科のある病院やクリニックの外来、ホームページなどで情報発信する準備を進めている。本年度に実施した研究は、親しい他者からの「ネガティブサポート」が患者の心理的適応に及ぼす影響の経時的変化を明らかにすることを目的とした。具体的には、大学病院にて乳がんの診断を受け、治療中の患者を対象に、ネガティブサポート(過剰関与因子・問題回避因子・過小評価因子)、全般的なソーシャルサポート(サポート数・サポート満足感)、心理的適応に関して、手術前・1カ月後・3カ月後の3時点で縦断的な質問紙調査を行った。まず、各変数と年齢を独立変数として、適応障害の基準を従属変数としたロジスティック回帰分析を行った。その結果、術前(N=97)は、問題回避ネガティブサポートが有意傾向となった(OR=2.15, p<0.10)。また、1カ月後(N=75)は化学療法の有無(OR=2.52, p<0,10)が、3カ月後(N=56)は問題回避ネガティブサポート(OR=2.52, pく0.10)が有意傾向となった。次に、問題回避ネガティブサポートに着目し、各時点でのサポートが各時点の心理的適応得点に及ぼす影響と、前の時点のサポートがその後の心理的適応に及ぼす影響を考慮したモデルを構築し、構造方程式モデル分析を行った。その結果、術前の問題回避ネガティブサポートが術前の心理的適応に影響し(B=0.25, p<0.05)、術前の心理的適応が術後の心理的適応に影響を及ぼしている(B=0.41,p<0.05)ことが示唆された(X2乗値=12.56, p<0.01, CFI=0.96, RMSEA=0.14)。これらの結果から、乳がん患者の術後6ケ月の心理的状態は、術前の心理的状態によって予測され、術前の心理的適応には親しい他者との関係性が影響すること、また、術後6ケ月の心理的状態は、それ以前の心理的状態や対処などによって説明されるため、早い段階で悪循環を止めることが重要であることが示唆された。本年度に実施した研究は、親しい他者からの「ネガティブサポート」の心理的適応への影響を、他者依存性という個人要因が緩衝しているかどうか検討することを目的としていた。他者依存性の個人差が顕著になるであろう術前の乳がん患者を対象に、郵送による質問紙調査を行った。返送により同意の確認できた150名(平均年齢:50.6±9.2歳)を分析対象とした。質問項目は、患者の属性、ネガティブサポート項目(過剰関与因子・問題回避因子・過小評価因子)、心理的適応(HADS)であった。他者依存性得点の平均値で分けて、高群(N=74)と低群(N=76)に分類した。群間で、年齢、術式、腋窩の郭清状況、リンパ節転移の数に違いはみられなかった。各群で、ネガティブサポートが心理的適応に及ぼす影響を検討したところ、低群においてのみ問題回避的サポート(β=0.50,p<0.01)と過小評価的サポート(β=-0.23,p<0.10)が心理的適応に有意な影響を及ぼしていた。多母集団同時分析を用いて、各群におけるパラメーター間で差がみられるか検討したところ、問題回避的サポートには5%水準で、過小評価的サポートには10%水準で有意な差がみられた。

他者依存性によって、ネガティブサポートが心理的適応に及ぼす影響が異なることが示された。今後は、サポートの受け手の特性によってサポートの効果が異なることだけでなく、サポートの文脈やサポートの送り手の特性を考慮して検討していく必要性があることが示唆された。本年度は、乳がん患者に対する縦断的質問紙調査を引き続き行ったことに加え、乳がん患者の配偶者に対する質問紙調査を行い、結果をまとめた。まず、乳がん患者に対する縦断的調査の7時点のうち、入院時(T1;N=201)、1ヶ月後(T2;N=196)、半年後(T3;N=196)のデータを用いて、解析を行った。親しい他者からのネガティブサポートの中で、過剰関与と問題回避は時間の経過に従って減少するサポートであり、過小評価は変化しないサポートであることが示された。また、各時点でのネガティブサポートが心理的適応に及ぼす影響を検討したところ、3時点ともに問題回避のみが有意な影響を及ぼしていた(T1:β=0.27,p<0.01;T2:β=0.34,p<0.01;T3:β=0.27,p<0.01)。親しい他者が問題回避していると報告している患者には、NEOによる性格傾向に特徴はなかったが、感情抑制傾向が強いことがわかった(r=0.27,p<0.01)。このことから、二者間の問題回避は、どちらか片方ではなく両者のダイナミズムの問題として捉える必要があることが示唆された。そのため、乳がん患者の配偶者(N=368)を対象に、どの程度患者に対して問題回避を行っているのか、また、問題回避を行う配偶者の特徴を調べることを目的に質問紙調査を行った。その結果、ときどきよりも頻回に問題回避をしている配偶者が、診断直後では約半数、また現在(術後平均2.4年)でも約35%いることが明らかになった。また、配偶者自身の問題回避と患者がとっていると認識している問題回避との相関は強かった(r=0.62,p<0.01)。問題回避をとる配偶者の特徴として、がんに対する脅威性が高い、侵入想起症状が強いという特徴が明らかとなり、問題回避をとることには、配偶者の性格傾向や家族機能ではなく、配偶者自身の心理的不適応が背景にあることが明らかとなった。これらの結果から、患者と配偶者の両者の視点にたった心理支援ツールを開発し、乳腺外科のある病院やクリニックの外来、ホームページなどで情報発信する準備を進めている。
α放射性同位体の核医学利用のための２１１Ｒｎ／２１１Ａｔジェネレータ開発

核医学利用の観点から期待されているアルファ放射性同位体211Atを供給するための211Rn/211Atジェネレーターの開発を行った。原子力機構タンデム加速器施設から供給される60 MeVの7Liビームを金属ビスマス薄膜標的に照射して211Rnを合成し、開発したジェネレーター装置で211Rnの放射崩壊で生成する娘核種211Atのトレーサー溶液を作成した。ジェネレーターの実用化のための基礎基盤技術を確立した。昨年度に引き続き211Rn(ラドン)/211At(アスタチン)ジェネレータ用Rn分離装置、ジェネレータ装置の製作、改良を行い、211Rnトレーサーを用いた性能試験に備えた。震災の影響で211Rnの許認可申請が遅滞しているため、211Rnでのトレーサー実験に先駆けて、211Atでのトレーサー実験を行った。原子力機構タンデム加速器施設において原子核反応、Li(リチウム)+natPb(鉛)でAt(アスタチン)同位体を合成し、乾式蒸留法に基づくAtトレーサー分離精製法における分離条件を詳細に調べ、分離効率の再現性が良いことを確認した。Atの化学挙動を基礎科学の観点からより深く理解するため、ハロゲン同族元素のヨウ素との対照実験を開始した。I(ヨウ素)トレーサー実験の基礎基盤となる核データ取得のため、Li+natSn(スズ)反応で合成できるI同位体の励起関数をγ線スペクトロメトリーにより決定した。Li+natSn反応で合成したIトレーサーを用いて、本研究でAtトレーサー用に開発した分離精製法におけるIの分離効率を調べた。Atの分離効率はIに比べて約10倍優れていることを明らかにした。同族ハロゲン元素間での化学挙動の違いを明らかにすることで、Atジェネレータ開発、放射性医薬品の研究、放射化学的基礎研究について重要な知見を得た。Li+natPb反応でのAtトレーサーの製造と利用について得られた研究成果を9月にイタリアのコモで開催された第8回核・放射化学国際会議(NRC-8)でポスター発表を行った。また、日本放射化学会年会(10月)および京大原子炉専門研究会(1月)で口頭発表した。幅広い観点から議論することで、新しい研究開発の意義や重要なポイントなどを再確認した。希ガス放射性同位体211Rnの化学的特性を利用した分離法に基づく211Rn(ラドン)/211At(アスタチン)ジェネレータ用Rn分離装置、ジェネレータ装置を製作し、装置の気密性やヘリウムガス循環等の性能試験を行った後、211Rnトレーサーを用いた性能試験を行った。具体的には、原子力機構タンデム加速器から供給される60 MeVの7Liビームを金属ビスマス標的に照射し、核反応7Li(209Bi,5n)211Rnによって211Rnを合成した。金属ビスマス標的内に捕捉された211Rnをジェネレータ用化学分離装置内の電気炉において550度に加熱し、融解した金属ビスマスから希ガス放射性同位元素211Rnを気化させ、ヘリウムガスによって液体窒素で冷却したトラップへ導き、トラップのステンレス管内壁に吸着させることで化学分離した。化学分離1日後、ジェネレータ装置によって、211Rnの放射崩壊で生成した娘核種211Atをエタノールで高い回収率、放射性純度で回収し、トレーサー溶液を精製した。本研究で開発したジェネレータ用Rn化学分離装置、ジェネレータ装置が、研究当初の想定通り、安全かつ有効に機能することを確認した。これら装置の機能に基づいた211Rn/211Atジェネレーターが実用化可能であることを実証した。震災の影響で211Rnの許可申請が遅延したため、211Rnトレーサーを用いた性能試験は、当初の計画通り十分には実施できていない。引き続き、製作したジェネレータ装置の性能試験を行い、実用化に必要な基礎データを取得する。211Rnトレーサー実験に先駆けて、211Atトレーサーでの予備実験を行い、ジェネレータ開発に必要な無担体アスタチンの化学挙動や標識化合物合成に関する研究を実施した。その研究成果を国際学会等で報告した。これらの研究も継続し、展開していく予定である。原子力機構タンデム加速器施設において原子核反応、29-57MeV Li(リチウム)+natPb(鉛)で生成した209-211At(アスタチン)同位体の励起関数をガンマ線、アルファ線スペクトロメトリーにより決定した。今後のトレーサー実験の基礎基盤となる重要な核データを得た。211Rn(ラドン)/211Atジェネレータ用Rn分離装置、ジェネレータ装置の製作に着手した。震災の影響で211Rnの許認可申請が遅滞しているため、211Rnでのトレーサー実験に先駆けて、分離装置内での211Atの化学挙動を調べるためのトレーサー実験を行った。

加速器で生成したAtトレーサーを照射試料から分離するための簡易乾式分離法の研究開発を行い、211Rn/211Atジェネレータ用Rn分離装置でのAtの化学挙動を明らかにした。これによって、ジェネレータ開発で必要となる211Atの溶出特性についての重要な知見を得た。「タンデム加速器を利用した核医学のための研究ーα放射性同位体による新しい癌治療を目指してー」と題する基礎科学セミナーを8月に開催した。211Rn/211Atジェネレータ研究開発についてタンデム加速器利用課題研究として共同研究を進めている本研究課題の連携研究者である金沢大学横山明彦教授の研究グループ、日本放射化学会、製薬企業の研究開発者から参加者を募り、幅広い観点から議論することで、新しい研究開発の意義や重要なポイントなどを再確認した。Li+natPb反応での励起関数測定とAtトレーサーの簡易化学分離法の開発について得られた予備的な研究成果を日本放射化学会年会(9月)および京大原子炉専門研究会(1月)で口頭発表した。また、金沢大学横山明彦教授の研究グループと研究成果報告会を1月に実施し、研究の進捗状況、研究成果、研究計画について議論、検討した。震災の影響のため211Rnの放射性同位体使用許認可申請が遅滞していたため、今年度も211Rnトレーサーを用いた実験が実施できなかった。この点では当初の研究実施計画から遅延しているが、平成24年度に引き続きジェネレータ装置の製作、改良を行った。くわえて乾式蒸留法に基づくAtトレーサー分離精製法における分離条件を詳細に調べた。これにより3年間の研究期間で研究目的を達成するという観点からはおおむね順調に進展していると判断する。平成25年2月に211Rnの許可申請が認められ、211Rnトレーサーを用いた性能試験も可能となり、研究目的が達成できる見込みである。Atトレーサーの製造、化学挙動に関する実験研究では、引き続き、乾式蒸留法に基づくAtトレーサー分離精製法の開発を行い、分離効率の再現性が良いことを確認した。211Rn/211Atジェネレータ開発で必要となる無担体Atトレーサーの乾式蒸留、溶出挙動などの化学挙動についての重要な知見を得た。当初の計画には無かったが、ハロゲン同族元素のヨウ素との対照実験を開始した。Atの化学挙動を基礎科学の観点から調べることは、Atの化学挙動を基礎科学の観点からより深く理解することにつながり、211Rn/211Atジェネレータ開発、放射性医薬品の研究、放射化学的基礎研究に対して重要な知見を与える。昨年度に引き続き、日本原子力研究開発機構の量子ビーム応用研究部門RI医療応用研究GrにAtトレーサーを提供し、このAtトレーサーを用いて、多くのがん細胞に発現が確認されている膜タンパク質「Her2」に親和性のあるペプチドへの標識を行った。Atトレーサーを用いた放射性医薬品研究での研究結果をフィードバックし、本ジェネレータ開発に活かす協力研究体制が整った。この協力研究体制は当初の研究計画にはなかったが、本研究の目的達成に向けて、その有効性を高く評価する。震災の影響のため211Rnの放射性同位体使用許認可申請が遅滞しているため、211Rnトレーサーを用いた実験が実施できなかった。この点では当初の平成23年度研究実施計画から遅延しているが、研究実施計画を見直し、平成24年度に計画していたジェネレータ装置の製作に着手するとともに、Atトレーサーの製造、無担体放射性元素アスタチンの溶出特性などの化学挙動に関する実験研究を精力的に進めた。
累積的文化進化を生み出す環境と心のアーキテクチャ

人間を他の動物から区別する最大の特徴ーそれは文化の存在である。人間が持つ言語やシンボル、技術、数学や科学などの知識体系は、世代から世代へと伝達される中で漸進的に改良され、個人の力では生み出すことが不可能なレベルまで進化した。これが累積的文化進化(cumulative cultural evolution)と呼ばれる現象である。本研究は、文化の累積的進化において、情報が伝達される過程に着目した。そして文化が累積的に進化するためには、単なる模倣としての伝達ではなく情報に対する篩として機能していることが必要不可欠であることを実験室実験とコンピュータ・シミュレーションを用いて検証した。人間が持つ言語やシンボル、技術、数学や科学などの知識体系は世代から世代へと伝達される中で漸進的に改良され、個人の力では生み出すことが不可能なレベルまで進化した。近年、言語学から心理学に渡る広い領域で人間を対象とした実験室実験によって累積的文化進化のプロセスを再現し、人間だけが持つ文化の本質を実験的に探求する領域横断的な営みが展開されつつある。本年度は、コンピュータ・シミュレーションと実験室実験の両方を通じて、文化が累積的に進化するために必要な認知能力を検討した。本年度は、世代間重複伝達パラダイムに基づいた一連の実験を実施し、技術が世代から世代へと伝達される中で累積的に進化していく状況を再現した。具体的には実験室内で累積的文化進化を再現した過去の研究に基づき、与えられた素材を用いて制限時間内にペアが共同でできるかぎり高い構造物を作成する実験を実施した。同一のペアが繰り返し課題を実施するペア条件と、個人が次々と入れ替わり技術や情報が世代から世代へと伝達されていく状況を模した伝達条件の2つを設定し、複数の実験を実施した。実験を通じて、技術が伝達されていく条件においては、ペアが繰り返し試行錯誤を通して技術を向上させていく条件と同程度に技術が向上していくこと、だが前者においては技術がより単純な方向へと進化する現象が繰り返しロバストに観察された。これは伝達という過程において、あまりにも複雑な技術や知識は伝達され得ないこと、すなわち伝達という過程が自然淘汰と同様のふるいとしての機能を技術に対して持つことを示唆すると考えられる。従来の実験研究では、情報や技術が世代から世代へと伝達される中で漸進的に向上していく現象、すなわち文化の累積的進化を実験室内で再現することにのみ注目が集まっていたが、本研究は世代間の伝達を通して情報や技術が一定の構造を持つようになることを見出したものである。こうした伝達を通じた構造の発生という現象は、言語進化に関する理論研究では既に指摘されているが、それ以外の情報や知識において同様の現象が発生することは見出されていなかった。本研究の成果に基いて英語論文を準備中である。本年度は、累積的文化進化に関する諸問題を検討するために、以下2つの研究を行なった。1昨年度、累積的文化進化の実験室実験を実施した。ペアとなった参加者が限られた時間内で技術を習得する。その技術が別の参加者へと伝達されていく状況、すなわち技術が世代から世代へと伝達されていく条件においては、同一のペアが入れ変わることなく繰り返し技術を習得していく状況、すなわち技術が個人の内部で蓄積されていく条件と比較して、世代を経るにつれて技術が単純化することが見出された。そして、技術の単純化は伝達というプロセスが複雑な技術に対する淘汰圧として機能していたためである可能性が見出された。本年度は、この説明の妥当性をサポートするために、この実験データに対してさらに精緻な分析を行い、この結論の妥当性を検証した。2文化進化研究においては、文化とは人から人へと伝達される情報として定義されている。本年度はこうした伝達される文化のもう一つの例として物語に着目した。宗教の発生に関する認知科学・人類学の研究においては、因果推論における認知バイアスが超自然的存在という概念の源泉であるという議論がある。この議論を援用し、この因果推論上の認知バイアスが駆動しやすい状況においては、超自然的な存在に関する物語が伝達されやすくなると同時に累積的に蓄積されていく可能性を検討した。複数の実験の結果、概ね仮説を支持するデータが得られ、物語の文化進化における認知システムの影響について新たな知見を追加した。期待通りの成果が得られており、特に今後の研究の進展に影響を与える要因は見当たらない。27年度が最終年度であるため、記入しない。社会心理学、適応的意思決定来年度も予定した研究、すなわち、個人では解決不可能な課題を用いた累積的文化進化の理論及び実証研究を実施する予定である。予定されていた実験及びコンピュータ・シミュレーションを実施し、研究は順調に進んでいる。

実験に利用を想定していたパソコンなどの機器の購入が予定額を下回ったため27年度が最終年度であるため、記入しない。現在までのところ、予定通りの成果が見出されており、特に予定の変更はなく、予定通り粛々と研究を推進していく予定である。最終年度であるため、研究成果の発表及のための旅費、あるいは、研究成果を議論するためのワークショップの開催費用として利用する予定である27年度が最終年度であるため、記入しない。
ポリオウイルスの血液脳関門透過機構の解明

ポリオウイルス(PV)は血液を介し中枢神経系に到達し、四肢の麻痺(ポリオ)を引き起こすウイルスである。本研究ではPVに存在する中枢神経指向性の責任部位の同定を研究課題として進めてきた。候補因子として考えていた血管内皮細胞の細胞膜上に存在するトランスフェリンレセプターとPVの結合部位の同定からその機能の解明を進めてきた。またPV外殻を構成する蛋白質のひとつであるVP1がトランスフェリンレセプターとの結合に重要であり、VP1およびトランスフェリンレセプター双方の結合必須部位の同定を行なった。VP1は細胞内移行にも関与することからPVの中枢神経への伝播への責任部位であることが示唆された。ポリオウイルス(PV)は、中枢神経系に指向性を示す一本鎖RNAウイルスであり、小児マヒ(ポリオ;急性灰白髄炎)の病因ウイルスである。ヒトに経口感染後、消化管、局所リンパ小組織、血流を介し、血液脳関門(BBB)を透過して中枢神経系に侵入し、神経細胞で増殖することで病原性を示す。PVの体内伝播において、感染(ウイルス複製)はヒトPVレセプター(PVR)の存否で決まるが、PV粒子の血液から脳への移行についての詳細な分子機構については不明である。PVのBBB透過はヒトPVRを持たないnon-Tg(トランスジェニック)マウスでもPV感受性を示すTgマウスと同様に起こることを個体実験の結果から我々は既に報告している。つまりPVは血液中から脳実質部分にPVR非依存的に非常に速い速度で移行する(Yang W et al. J.Virol 1997)。この事実はPVR依存型のウイルス感染に至る経路とは異なるPVの細胞透過(トランスサイトーシス)のみに必要な別経路がマウスに存在していることを意味する。我々はこれまでの解析の結果、PVのBBB透過に関与する宿主因子の候補としてトランスフェリンレセプター(TfR1)を見出したことから、本研究ではPVのBBB透過におけるTfR1の役割とその詳細な分子機構を解明することを目的とする。PVはマウスには感染しないが、マウスの血中にウイルスを直接投与することで脳への侵入が確認されることから、マウスはPVのBBB透過を解析する動物モデルとして最適である。そこでマウス由来の血液内皮細胞を用いて、PVのBBB透過の細胞側責任因子、およびPV側責任因子の同定を進めている。初年度の解析の結果、PVおよびトランスフェリンセレプターそれぞれのin vitro結合における欠失変異体解析を通して責任部位の同定を完了した。薬物の効果を最大限に発揮する薬剤送達システムの発展において、薬剤標的化技術の向上は副作用の低減、および薬効の増強の意味合いから重要課題の一つである。特に中枢神経系への薬物運搬技術は、BBBを越えることができる低分子物質やペプチド(cell penetrating peptide; CPP)などをキャリアーとすることが有効であると考えられるが、BBB透過の分子機構は未解明な点が多く具体的なキャリアー候補が乏しいため、明確な方法論が存在しない。我々はこれまでにマウスモデルを用いた研究で、ポリオウイルス(PV)が消化管から侵入後、血液中からBBBを越えて脳実質部分に非常に速い速度で移行することを報告している(Yang W et al. J.Virol 1997)。申請者はこのPVの性質がBBB透過の技術開発に有効と考え、PVに存在する中枢神経指向性の責任部位の同定を研究課題として進めてきた。初年度の解析では候補因子として考えていた感染標的の細胞膜上に存在するトランスフェリンレセプターとPVの結合部位の同定からその機能の解明を進めてきたが、今年度のさらなる解析により、PV外殻を構成する蛋白質中から新たに2種類の細胞透過性を示すペプチド配列(CPP-N4,CPP-N6と命名)を同定した。このCPP-N4、N6はマウス脳血管内皮細胞株(MBEC4、bEnd.3)に効率良く細胞内移行を示す一方で、子宮頸癌由来細胞株(HeLa)、大腸がん由来細胞株(RKO)ではそれが確認されない。すなわち当該ペプチドは脳血管内皮細胞に特異的な細胞指向性を明白に示しており、BBB透過の責任ペプチドとしての可能性が期待される。本成果は研究目的に掲げたPVのBBB透過の分子機構の解明につながる意義ある成果である。ウイルス学初年度の解析の結果、PVおよびトランスフェリンセレプターそれぞれのin vitro結合における欠失変異体解析を通して責任部位の同定を完了した。PVのトランスフェリンレセプターを用いたin vivoの細胞透過性の検討については次年度の検討課題として進める。PVとTfR1との相互作用、およびその責任部位を生化学的に明らかにした。そこで現在はPVとTfR1との相互作用におけるBBB透過のin vivo解析による生理的機能の解明を進めている。

初年度は実験進捗において試薬類の使用が想定より若干少なくすんだため、研究費執行において残額が発生した。当初の申請書内計画に沿って次年度研究費と合算し、消耗品費、旅費等に使用する。
上皮間葉転換(EMT)による幹細胞誘導リプログラミングの分子機構の解明

IMS32(不死化マウスシュワン細胞)およびadultマウス一次培養シュワン細胞にSnai1をレンチウイルスを用いて導入した。その結果、これら2種のシュワン細胞に線維芽細胞様の形態変化を観察し、上皮間葉転換が起こったと考えられた。、さらにIMS32においてはsphere形成能、および脂肪細胞への分化能を持つ間葉系幹細胞類似の細胞を誘導することに成功した。しかし軟骨細胞への分化能は本方法では誘導することができなかった。一方、一次培養シュワン細胞については幹細胞としての性質を誘導することはできなかった。本成果は、シュワン細胞由来リプログラミング細胞を用いた再生医療への分子的基盤となるものである。1) IMS32(マウス不死化シュワン細胞、東京都医学総合研究所、渡部和彦先生より供与)をTGF-bで刺激すると線維芽細胞様の形態に変化し、上皮間葉転換が起こったと考えられた。これらの細胞を幹細胞培地で培養したところ、一部にcontrolより大きなsphereが形成されたが、それらのsphereはcontrolと同様、培養48時間後より急速に減少した。Jagged-1によるNotch信号系刺激やWnt信号系刺激では、細胞形態の変化やsphere形成効率の明らかな上昇は見られなかった。Jagged-1刺激ではsphere生存期間の軽度の延長が見られたが、間葉系幹細胞に見られるような長期間(数か月程度)の生存は見られなかった。2) IMS32およびRT4(ラットシュワノーマ細胞)にレンチウイルスを用いてSnai1遺伝子を導入した上でピューロマイシンで選択することにより、これら2種の細胞株において100%GFP陽性(Snai1陽性)の細胞株を得ることができた。これらのSnai1導入に伴う明らかな細胞形態変化やsphere形成効率の亢進は見られなかったが、Snai1導入IMS32をさらにTGF-bで刺激したところ、1)と同様に線維芽細胞様の形態に変化(上皮間葉転換の誘導)するとともに著明な増殖速度の亢進を認め、未熟な間葉系細胞が誘導された可能性が考えられた。今後はこの細胞を出発点として間葉系幹細胞誘導を目指す。本年度、Snai1導入IMS32(不死化マウスシュワン細胞、神経鞘腫細胞にも対応)の間葉系細胞形態への変化を確認し、EMT(上皮間葉転換)が誘導されたと考えられた。この細胞の幹細胞培地での培養により、sphere作成に成功した。このsphereを間葉系幹細胞用培地(StemCell Technologies)で培養したところ、活発に増殖した。さらにこの細胞を脂肪細胞分化用培地(StemCell Technologies)で3週間培養し、Oil Red Oで染色したところ、細かい脂肪滴を多数認める細胞が全細胞の30-40%出現していた。つまり脂肪細胞前駆細胞分化が誘導された。一方、control細胞(Snai1非導入IMS32)を直接幹細胞培地に入れることによって形成されたsphereを、Snai1導入IMS32と同様に脂肪細胞分化を試みたが、Oil Red O染色で脂肪滴を認める細胞は1%程度であった。一方、Snai1非導入IMS32由来のsphereを神経細胞分化培地で培養するとtubulin-ベータ3陽性の神経細胞様細胞が少数ながら出現した。以上の本年度の結果の主要な意義は次の3つである。1 IMS32に神経幹細胞が含まれている可能性の示唆2 IMS32へのSnail導入によるEMTの誘導3上記EMT誘導に基づく間葉系幹細胞様細胞の誘導これらの結果は、ハンセン病原因菌のシュワン細胞リプログラミングの機序にEMTが役割を果たしているという仮説の証明、新しい人工的間葉系幹細胞誘導法開発の第一歩、神経鞘腫細胞がEMTによって腫瘍幹細胞を形成する可能性の示唆、といった点でハンセン病の病態解明、幹細胞による再生医療、神経鞘腫の悪性化の病態という少なくとも3つの医学研究分野に及ぶ重要性を持っている、と考えられる。IMS32へのSnai1導入によりEMTの導入に成功し、さらにsphere形成、脂肪細胞前駆細胞への分化を確認し、間葉系幹細胞様細胞が誘導できたことの意義は「研究実績の概要」に書いたように小さなものではない、と考える。またIMS32に神経幹細胞が含まれている、という予期せぬ発見もあった。しかし骨細胞、軟骨細胞への分化にまだ成功しておらず、multipotentな間葉系幹細胞を作成できた証明がまだできていない点、作成した間葉系細胞様細胞のトランスクリプトーム分析が未実施である点、当初27年度に予定したマウスシュワン細胞の一次培養細胞の分析が未実施である点でやや遅れている、と自己評価する。前年度、Snai1導入IMS32(不死化マウスシュワン細胞株)が間葉系幹細胞様細胞に変化したことを示唆する証拠を提出し、この細胞がoil redO陽性の脂肪細胞へ分化したことを報告した。これを受け、本年度は浮遊培養法による軟骨細胞への分化を試みた。しかしこの培地中で通常の間葉系幹細胞は一塊となって浮遊状態で培養できるのに対し、Snai1導入IMS32はこの培地中では一塊となって浮遊せず、浮遊させようとすると細胞がばらばらになってしまい、軟骨細胞への分化は不可能であった。以上からIMS32へのSnai1導入によっては間葉系幹細胞へのリプログラミングは不完全な形でしか起こらないと考えられた。

一方、Snai1導入を不死化細胞株ではなく、一次培養マウスシュワン細胞で行うべく、共同研究者のRambukkana教授にこの細胞を供与いただいた。この細胞に対するSnai1導入に成功し、Snai1導入一次培養シュワン細胞においてもIMS32と同様、間葉系の細胞形態への変化が見られ、Sphere形成能力も確認できた。しかしこの細胞の脂肪細胞への分化を試みたところ、oil red O陽性細胞への分化はほとんど見られなかった。このため、以前報告した独自の一次培養マウスシュワン細胞分離方法(Masaki et al., Cell 2013, Masaki et al., Methods in Molecular Biology, 2017 in press)に基づき、再度マウスシュワン細胞の分離を試みた。この際、十分量のシュワン細胞を得るまでに、培養皿のコーティング方法などでいくつかの試行錯誤が必要であり、最終的に十分量のシュワン細胞を得ることはできたが、この試みの中で時間を消費し、今回は新しく分離したマウスシュワン細胞へのSnai1導入実験を行うことはできなかった。IMS32(不死化マウスシュワン細胞)およびadultマウス一次培養シュワン細胞にSnai1をレンチウイルスを用いて導入した。その結果、これら2種のシュワン細胞に線維芽細胞様の形態変化を観察し、上皮間葉転換が起こったと考えられた。、さらにIMS32においてはsphere形成能、および脂肪細胞への分化能を持つ間葉系幹細胞類似の細胞を誘導することに成功した。しかし軟骨細胞への分化能は本方法では誘導することができなかった。一方、一次培養シュワン細胞については幹細胞としての性質を誘導することはできなかった。本成果は、シュワン細胞由来リプログラミング細胞を用いた再生医療への分子的基盤となるものである。1) IMS32をTGF-b刺激すると上皮間葉転換が起こり、間葉系細胞が誘導されたこと。2) IMS32にSnai1遺伝子を導入した上でTGF-b刺激すると1)と同様に上皮間葉転換が起こったが、誘導された間葉系細胞の増殖速度は1)で誘導された細胞に比べはるかに速かったこと。以上の結果は、ハンセン病原因菌によりシュワン細胞から上皮間葉転換を介して誘導された間葉系幹細胞の増殖速度が非常に速かった事実と考え合わせると、Snai1強制発現とTGF-b刺激の組み合わせにより未熟な間葉系細胞の誘導に成功したことが強く示唆される。しかしこの未熟な間葉系細胞が間葉系幹細胞と言える段階までリプログラムされているかどうかの確認、特にsphere形成能についての詳細な評価が未施行であることから、1年間で間葉系幹細胞を誘導するという当初の計画よりは「やや遅れが見られる」と自己評価する。1 Multipotentな間葉系幹細胞誘導の確認:Snai1導入IMS32由来sphereの骨細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞などへのin vitro, in vivoでの分化能の解析2 DNA microarrayによるSnai1導入IMS32由来sphereのトランスクリプトームの解析3 Snai1導入IMS
子ども虐待におけるアウトリーチと多機関連携の問題解決モデル

本研究目的は、子ども虐待対応現場における自ら援助を求めない養育者への対応事例に対して、1どのように各機関がアウトリーチをするか、2医療一福祉一司法機関が多機関連携を構築するか、という二つの問題を解くことである。昨年度に引き続き、日本の各機関のアウトリーチの特徴、また多機関連携における困難事例や失敗事例を集め、共通点・相違点の分析を行った。その結果、特に性的虐待における多機関連携の知見が蓄積されておらず、司法(警察・検察)と司法面接(日本では被害確認面接と呼ばれる)における連携に問題点を抱えていることが見出された。現在、日本でのデータ収集の発展とさらなる詳細なデータ分析を終え、随時論文投稿中である。また、ブリティッシュコロンビア大学の倫理委員会にも申請し、研究の公共性を高め、北米でも調査を続ける予定である。これまでに得られた研究結果を元に、現場で使えるツールとして、虐待を受けた子どもへのインタビューを標準化したアプリケーションの開発(Hacking Health Hackathon Vancouver 2014にてMGSデザイン賞&オーディエンス投票部門を同時受賞)、現場のリスクアセスメントを元にしたリコメンデーションシステムの開発(University of British Columbia, Capstone Project採択)、そして得られた知見をTwitterやYouTube、Change. orgを用いた子ども虐待対応の情報啓発をチームで行った。Twitter (@childfirsttan)や、Youtubeではインフォグラフィックス「性暴力を受けている子ども達へ」が4ヶ月で再生回数1万6千件を超え朝日新聞に特集された。現在所在不明児童に対する多機関連携のシステム提案について、Change. orgでも12月現在1万7千署名を集めている。本研究課題は平成26年度が最終年度のため記入しない。現場では、支援に対するニーズが低く、怒りを露わにする養育者へのアウトリーチに困難を感じたり、一方で支援者同士・支援機関同士の多機関連携自体が上手くいかず、支援に支障をきたしていることも少なくない。このような背景から、申請者の研究は、日本の子ども虐待対応現場における自ら援助を求めない養育者への対応事例に対して、1どのように各機関・専門職がアウトリーチをしていくか、2どのように医療-福祉-司法機関が多機関連携を構築して対応するか、という二つの問題を解くことが目的である。今年度は、日本の子ども虐待対応現場における医療-福祉-司法機関に対する聞き取り調査を行い、各機関のアウトリーチの特徴、また多機関連携における困難事例や失敗事例を集め、共通点・相違点の分析を行った。その結果を大まかにまとめると、1アウトリーチについては、機関毎に介入と支援の役割に対する比率の変化が予想されること、2多機関連携の困難事例には、法的要因、組織要因、専門性要因、個人要因がそれぞれ見出され、連携困難事例に対する各機関の特徴的な要因が見出された。現在、日本でのデータ分析を終え、論文投稿準備中である。昨年8月末より、カナダ・ブリティッシュコロンビア州を拠点に、北米におけるさらなる発展的な研究データを集めるため研究協力者を募っている。カナダやアメリカでは、日本との違いとして、虐待事例のほとんどに司法機関(警察・検察・裁判所・弁護士)が入ることで、第三者としての客観的な視点を確保すること、及び児童相談所の調査、警察・検察の捜査の緻密さを担保すると共に、保護者に対する支援方針や多機関連携を法的に義務化する動きがある。日本より30年進んだ北米のシステムと、北米における失敗事例を分析することで、今後の日本におけるシステムと個別アプローチの両面をより良く改善していくための解決策を見出していく。申請者のこれまでの継続的な調査、及び当該年度調査により、ある程度の質的なデータの飽和化が見られた。それを元に、現在、国際比較研究としてカナダに渡航し、研究遂行の準備段階に着実に移っているため。

当初、オンタリオ州で研究協力者だった方が、今年度他国への招聰・異動により、一部の研究協力者の内諾を得られなくなっている。そのため、現在カナダだけでなく、新たにアメリカ・北欧圏(National Child Advocacy Centerなど)も対象を拡大し、研究協力者のリクルートを行っている。今後は、今年度までの研究データを論文投稿するだけでなく、国際比較のための研究データを引き続き集める。特に日本とシステムの違う、司法の点について主に研究協力者のリクルートを強化していく予定である。また、虐待対応の意思決定システムについて、ICTを利用した意思決定支援システムの基礎研究も進めていく。
ヒト肺上皮細胞株に対するnotch遺伝子発現の影響に関する研究

本研究ではNotchの細胞分化、増殖、形質転換におよぼす影響とシグナル伝達の分子機構について、ヒト上皮系細胞を用いて明らかにすることを目的とする。即ち、ヒト肺クララ細胞株HPL1にwild type notch,活性型notchを遺伝子導入し、遺伝子発現の有無と細胞分化、増殖、形質転換におよぼす影響を比較検討する。(2)notch遺伝子構成発現系におけるリガンドの影響について検討した。preB細胞株NALM-6にレトロウイルスベクター(PMX)を用いてnotchのリガンドの1つであるjagged1を遺伝子導入したjagged1発現系を作成し、wild type notch1導入HPL-A細胞とco-cultureした。その結果、リガンド結合によるnotchの活性化に伴い、HPL-A細胞の増殖が抑制された。この場合のnotch1の活性化をHes-1ルシフェラーゼアッセイを行い、リガンド刺激に反応するルシフェラーゼ活性の増強を確認した。今後、細胞分化および形質転換に関して検討する。
赤血球酵素異常症の病因解明とモデルマウスを用いた新しい治療法の検討

CBAマウス純系コロニー内に自然発症した遺伝性溶血性貧血症の原因を明らかにするため、赤血球酵素活性および解糖中間体の測定、赤血球・肝臓抽出液のイムノブロット解析、肝臓抽出液のアイソザイム解析を行ない、この貧血がピルビン酸キナーゼ(PK)異常によることを決定した。次いでRACE法にてCBA系マウス骨髄mRNAからマウス赤血球(R)型PKcDNAクローニングを行い、得られた配列をもとに異常マウスの分子異常を解析した。PK異常マウスではR型PKの活性中心にG338D置換が明らかになり、活性中心の構造変化により基質親和性が低下し、赤血球内の生理的基質濃度におけるPK活性がほとんど消失したものと結論できた。このPK異常モデルマウスを用いて、赤血球酵素異常症の貧血に対する内因性エリスロポエチンの増加による代償作用の関与、薬理量のエリスロポエチン単独投与、ないしエリスロポエチンとbutyrateやhydorxyureaを用いて構造上正常な他のアイソザイムの強制発現による治療効果を検討する為に、今年度はPKのR型アイソザイムの細胞特異的発現調節機構を解明した。先ず、肝(L)型PK遺伝子上流のDNasel高感受性領域を検索し、次いでヒト遺伝子ライブラリーより単離したPK遺伝子クローンの塩基配列をR型PKの転写開始部位より約7kb上流まで決定した。その結果、PK遺伝子転写開始部位の上流約4kbに赤芽球系細胞特異的なDNasel高感受性領域を同定し、その領域の約700bp内に4つのGATA、4つのCACCC、さらに分化段階特異的転写因子NF-E4の認識配列を同定した。現在、ヒトL型遺伝子の第1・2エクソンおよびその5′上流域約8kbを含む遺伝子断片とヒトR型PkcDNAおよび3′領域約2.6kbに存在するAP-1サイトを用いて、ヒト赤血球型PKミニ遺伝子を構築し、PK異常マウスの受精卵に注入し、トランスジェニックマウスを作製している。
噴火湾地方を中心としたアイヌ物質文化の民族学的研究

本研究は計画が縮小され単年度となったため,当初予定していた課題を整理し遂行した.すなわち,研究代表者が参加している国際学術研究「在米アイヌ関係資料の民族学的研究」と連動しつつ,そこでの調査資料から,地域,年代のわかるものを選択し基礎資料としたうえで,研究対象も衣服および編みかご(サラニプ)に絞りおこなった.一方,道内の博物館資料のうち,噴火湾地方のまとまったコレクションがある北海道開拓記念館蔵資料,児玉コレクションの一部,白老アイヌ民族博物館,平取町アイヌ資料館,北海道大学図書館を調査した.調査では,アイヌ文様のある木綿衣服のうち,ルウンペ,カパラミプとそれぞれ呼ばれるものについて,両者の関係すなわち前者から後者が誕生する過程をあとづけることができ,また,明治初期に収集された資料にはカパラミプは確認されず,したがってその成立は,従来推測されていたように,明治中期以降であることを立証できた.さらにこれまで白老地方のものとされてきたある種のルウンペの文様について,虻田など噴火湾地方に広がっていたことが確認できた.また,編みかごはラシサラニプと呼ばれるものについて,資料の観察・比較から製作方法を復元する試みをおこない製作方法を確認できた.とくにサラニブ調査は,今後のアイヌ編みかご研究の基礎資料を提供するものであるが,同時に編みかご製作のマニュアルとしてアイヌ民族の伝承活動にも寄与しうるものがある.今後は,衣服・編みかご研究において,今回得られた見通しをさらに発展させるため,ほかの種類の衣服文様,あるいはサラニプを考察対象に含め,全体の系統をかんがえていく必要がある.また,今回の研究で,収集地・年代など付帯状況がわかる資料の重要性が再確認できた.そうした資料を蓄積すべく,国内外のアイヌ資料について,未調査のものの調査が望まれる.本研究は計画が縮小され単年度となったため,当初予定していた課題を整理し遂行した.すなわち,研究代表者が参加している国際学術研究「在米アイヌ関係資料の民族学的研究」と連動しつつ,そこでの調査資料から,地域,年代のわかるものを選択し基礎資料としたうえで,研究対象も衣服および編みかご(サラニプ)に絞りおこなった.一方,道内の博物館資料のうち,噴火湾地方のまとまったコレクションがある北海道開拓記念館蔵資料,児玉コレクションの一部,白老アイヌ民族博物館,平取町アイヌ資料館,北海道大学図書館を調査した.調査では,アイヌ文様のある木綿衣服のうち,ルウンペ,カパラミプとそれぞれ呼ばれるものについて,両者の関係すなわち前者から後者が誕生する過程をあとづけることができ,また,明治初期に収集された資料にはカパラミプは確認されず,したがってその成立は,従来推測されていたように,明治中期以降であることを立証できた.さらにこれまで白老地方のものとされてきたある種のルウンペの文様について,虻田など噴火湾地方に広がっていたことが確認できた.また,編みかごはラシサラニプと呼ばれるものについて,資料の観察・比較から製作方法を復元する試みをおこない製作方法を確認できた.とくにサラニブ調査は,今後のアイヌ編みかご研究の基礎資料を提供するものであるが,同時に編みかご製作のマニュアルとしてアイヌ民族の伝承活動にも寄与しうるものがある.今後は,衣服・編みかご研究において,今回得られた見通しをさらに発展させるため,ほかの種類の衣服文様,あるいはサラニプを考察対象に含め,全体の系統をかんがえていく必要がある.また,今回の研究で,収集地・年代など付帯状況がわかる資料の重要性が再確認できた.そうした資料を蓄積すべく,国内外のアイヌ資料について,未調査のものの調査が望まれる.
大腸がん発症とトロンボキサンレセプター遺伝子発現異常の連関の分子生理学的研究

本研究では、大腸癌患者から摘出した腫瘍組織およびその近傍の正常組織の間でトロンボキサンA_2(TXA_2)レセプター、トロンボキサン合成酵素、シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)の発現量変化について検討した。腫瘍組織におけるTXA_2レセプタ-mRNAの発現は、正常組織に比べて高い症例もあったが、再現性が低く、全く変化の見られない症例もあった。しかし興味深いことに、トロンボキサン合成酵素mRNAは、大腸癌のうち高分化腺癌において、再現性の良い発現量増大が観察された。抗トロンボキサン合成酵素抗体を用いた免疫組織染色において、合成酵素タンパク質の発現量増大が、癌細胞自身に由来していることがわかった。COX-2mRNAの腫瘍組織における発現量増大の程度はトロンボキサン合成酵素の場合ほど顕著ではなかった。TXA_2レセプターおよびトロンボキサン合成酵素mRNAの発現は、各種ヒト大腸癌培養細胞(KM12-L4、T-84、HT-29、WiDr)において再現性良く観察された。一方、COX-2mRNA発現の再現性はトロンボキサン合成酵素の場合よりも乏しかった。大腸癌培養細胞のHT-29およびKM12-L4に対して、トロンボキサン合成酵素阻害剤を付加しても細胞の増殖能に変化はなかった。トロンボキサン合成酵素阻害剤あるいはトロンボキサンA_2安定アナログは、大腸癌培養細胞の遊走能を変化させなかった。以上の結果から、高分化腺癌の腫瘍組織で発現が増大するトロンボキサン合成酵素は、大腸癌と密接に関連しているものと考えられた。トロンボキサン合成酵素により産生されたTXA_2は、オートクライン因子として、癌細胞自身に作用するものではなく、近傍の血管内皮細胞などに影響を与えている可能性がある。他方、トロンボキサン合成酵素の発現自体が、大腸癌の発生・進展に関与している可能性も考えられる。