hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
角膜感染症に対する光線力学的抗微生物化学療法（PACT）の開発と臨床応用

in vitroの研究として,糸状真菌に対するPACTの効果は,F. solaniに有効であったが,A. fumigatusには効果がなく,菌種によってPACT効果が異なることがわかった。さらに,アカントアメーバに対するPACTが,栄養体に対して非常に有効であることも確認できた.シストに対しても抑制効果が確認できた。これまでの研究でTONS504-PACTについて以下のことを明らかにした。1)メチシリン耐性黄色ブドウ球(MRSA)すなわち薬剤耐性菌に対して有効である。2)他の病原微生物の殺菌に必要な最小TONS濃度とLED照射条件の検討で,グラム陰性細菌と真菌はグラム陽性細菌と比較し高濃度のTONS504が必要である。3)アシクロビル耐性HSV-1(2種類)に対しても有効である。4)培養ヒト角膜実質細胞への有意な細胞障害性はない。5)PACTの緑膿菌に対する経時的抗微生物効果の出現には一定の時間を要する。本研究は,光線力学的抗微生物化学療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy: PACT)による新規角膜感染症治療法の確立が究極の目的である。in vitroの研究として,糸状真菌に対するPACTの効果は,フサリウムに有効であったが,アスペルギルスには効果が低く,菌種による違いがあった。アカントアメーバに対するPACTが,栄養体に対して非常に有効であることも確認できた。シストに対しても抑制効果が確認できた。白色家兎角膜感染症モデルによるin vivoでのPACTの有効性の検討を行った。黄色ブドウ球菌感染眼に対するPACTの有効性が確認できた。現在の遅れを取り戻すべく,感染症眼の作成効率を各菌種において効率かつ安定させることに傾注する必要がある。したがって,動物実験施設内の感染区域で一度に作成できる感染症眼の数を少し増やしてスピードアップを図る予定である。感染眼の作成が安定した後は,従来予定した研究計画に則って,PACTの臨床的有用性についての評価を進めていく予定である。本年度の当初の予定は,TONS504-PACTを行った感染症モデル角膜の組織学的検討の予定であったが,現在黄色ブドウ球菌感染に対する臨床的評価にとどまっている。最終年度は,他の菌種に対する臨床的評価をおこないつつ,現在収集している感染症モデル角膜の組織学的検討を始める。今後も,動物実験施設の感染区域内で一度に作成できる感染症眼には制約上上限があるため,スピードアップが困難であるが,感染効率が向上していることより遅れを挽回できると考えている。具体的には,来年度中に緑膿菌を用いた感染症モデルに対するTONS504-PACTの有効性は確認したい。また,一方で,in vitro研究では,複数の興味深い成果が得られており,来年度にかけて糸状真菌やアカントアメーバに対する有効性の確認を行っていく予定である。眼科学動物実験施設内の感染区域で一度に作成できる感染症眼の数に上限があり,かつ,安定した感染症眼の作成効率が不安定なことで,作成効率を上げる対策に時間を要している。
顕微授精法やレーザー穿孔法を用いない低運動性精子による体外受精法の検討

[研究の目的]運動性の低い精子を体外受精に用いる方法として、透明帯をレーザーで穿孔する方法や顕微授精法などが知られている。しかしこれらの実験に用いるレーザーやマニュピレータなどの装置は、高価で容易に導入することはできない。また顕微授精を安定した成績で実施するには一定期間の訓練が必要である。申請者の所属施設において、Tgオスマウスを輸入した際に輸送上のトラブルにより、非常に悪い健康状態で到着した例を経験した。容態が悪化し、系統を繋ぐ必要から急遽体外受精を行なったが精子の運動性が低く、8個の受精卵しか得られなかった(受精率16.3%:8/41、受精卵は移植し2頭のTg産仔を得た)。引き続き、翌日に冷蔵保存した片側の精巣上体を用い、再度体外受精を試みることにした。しかし精子の運動性が非常に低い状態であり、通常の体外受精法では受精が望めないと判断。打開策として、酸性タイロードで卵の透明帯を除去して体外受精を行ない、85個の桑実胚を得た。さらこの胚を子宮内に移植し1頭のTgマウスを得た。緊急避難的に用いたこの方法は、体外受精や胚移植などの一般的な胚操作技術を持っていれば十分に行なえるものである。しかし透明帯を完全に除去しているため多精子受精が起きやすい。媒精時の精子数の条件を吟味することで、簡易に行なえる「低運動性精子による体外受精法」となる可能性があることから本実験を計画した。[実施内容]低運動性精子のモデルとして、4°Cの冷蔵庫で72時間保存した精巣上体尾部から採取した精子をTYH培養液で前培養した。定法にしたがい、過剰排卵を行なって未受精卵を採取し、ヒアルロニターゼで卵丘細胞を、さらに酸性タイロードで透明帯を除去した。精子数を卵1個当たり、20個から160個まで5段階希釈して体外受精を行なった。2細胞期胚への発生率で受精率を求め、その後胚盤胞への発生率をみた。一部の媒精条件でラクモイド染色を行い、受精率、多精子受精率を観察した。また、桑実胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、その産仔成績を見た。[まとめ]受精率は20個群で平均26%、160個群で78.8%、胚盤胞への発生率は20個群で9.5%、160個群で26.8%となった。精子数に比例して高くなっているが、多精子受精率も160個群で32.4%と高くなることが明らかとなった。また、各媒精条件で得られた桑実胚を子宮内移植したが、今回は産仔を得ることができなかった。現時点では実用的な媒精条件は160個以下と推測している。今後は更なる媒精条件を検討し、産仔を得られる条件を設定したいと考えている。

精子数に比例して高くなっているが、多精子受精率も160個群で32.4%と高くなることが明らかとなった。また、各媒精条件で得られた桑実胚を子宮内移植したが、今回は産仔を得ることができなかった。現時点では実用的な媒精条件は160個以下と推測している。今後は更なる媒精条件を検討し、産仔を得られる条件を設定したいと考えている。
数層グラフェン薄膜のナノスケール伝導特性の解明

SiC上に熱成長したグラフェンの局所電子物性の解明を目的に研究を進めた。低エネルギー電子顕微鏡を用いることにより精密な層数制御に成功した。さらに、層数制御を行った高品質なグラフェン薄膜に対して、独自に開発した集積化ナノギャップ電極プローブを用いてその局所電子物性の計測を行った。その結果、ナノグラフェンにおいては閉じこめ効果に由来するコンダクタンスの幅依存性が観察できた。また、均一グラフェンにおいてはステップ部での導電率変調を見いだした。今後のグラフェンの電子デバイス応用に関して有益な知見が多く得られた。次世代の高性能エレクトロニクス材料として期待されている数層グラフェン薄膜の電子物性の解明を目的に研究を進めている。本年度はSiC上の熱成長法で作製した数層グラフェンを低エネルギー電子顕微鏡(LEEM)を用いて層数同定する技術を確立、及び、集積化ナノプローブによるグラフェン局所電子物性評価の基礎検討を行った。LEEMに関する成果として、低エネルギー電子線のグラフェン層間での干渉により大きなコントラストが生じることを、実験的、及び、理論的に示すことが出来た。この技術を用いて、03層程度の数層グラフェンの成長制御が可能となった。この成果は今後の高均一大面積エピタキシャル数層グラフェン基板の実現への第一歩と位置づけられる。層数制御技術を活用して作製した数層グラフェンの局所物性評価を集積化ナノプローブの一種である、集積化ナノギャップ電極プローブで評価した。ナノギャップ電極間隔が30nmと小さいプローブを用いて、ナノサイズの単層グラフェン島の導電率計測を初めて成功した。多数のグラフェン島の計測から導電率がサイズに依存する等の定量的な計測が可能であることが示せた。通常はナノリソグラフィと複雑な微細加工技術でデバイス化を行う必要があるナノ領域の物性評価を比較的簡便な走査プローブ顕微鏡上でプローブのみを用いて行える。絶縁物上のナノ構造に自由にアクセスしてその物性計測が可能なプローブ技術を確立した意義は大きく、他のナノ構造系への波及効果も大きい。また、LEEMによる層数同定技術、及び、集積化ナノプローブによる局所物性技術は独自技術として注目を浴びており、講演会等を通して日本のグラフェン研究の活性化に寄与することができた。ポストシリコンの高性能エレクトニクス材料とし期待される数層グラフェン薄膜の電子物性解明を目的に研究を進めている。昨年度までに、低エネルギー電子顕微鏡(LEEM)を用いて、SiC上にエピクキシャル成長した数層グラフェンの層数を同定する技術を確立した。今年度は、LEEMによるSiC上熱成長グラフェンのミクロスコピックな層数、及び、形態制御技術を確立すると共に、成長制御グラフェンの局所電子物性を、独自開発した集積化ナノプローブにより評価して新たな知見を得ることを目標に検討を進めた。昨年度、着手したナノグラフェン(実効幅30nm程度)の電子物性について集積化ナノギャップ電極プローブでの計測結果の解析を進め、伝導度が幅に比例する現象は閉じこめ効果によることを明確にした。ナノ構造に対してリソグラフィを適用することなくその電子物性評価が可能であることを示した意義は大きい。今年度は、LEEMによる成長制御技術を用いて作製した高均一グラフェンについての検討を開始し、SiC基板上のステップ構造を越えてテラス幅よりも大きなドメインの単結晶2層グラフェンの成長に成功した。さらに、この均一グラフェンの局所電子物性を集積化ナノギャップ電極プローブを用いて評価し、ステップ構造部での導電率変調現象を発見した。SiC上グラフェンのデバイス応用を実現するためには、基板構造のグラフェン電子物性への影響を理解し制御する必要があり、本成果はその第一歩と位置づけられる。また、今年度はグラフェンの機械的な物性評価の準備としてナノ構造の機械特性計測法の探索も開始した。グラフェンの優れた電子物性と、優れた機械物性の相関を明確にすることができれば、新たな応用分野が拓ける。これらの成果の発表・論文化を進める一方、多くの招待講演・取材・執筆依頼を受けた。これらはグラフェン研究の注目度の高さを示していると考えている。昨年度までに、低エネルギー電子顕微鏡(LEEM)を用いて、SiC上にエピタキシャル成長した数層グラフェンの層数を同定する技術を確立し、さらに、高均一なグラフェン薄膜の作製条件の探索を行い、超高真空中で高品質二層グラフェンの作製に成功した。また、その局所電子物性を独自開発した集積化ナノプローブにより評価して新たな知見を得ることができた。今年度は、高均一・高品質グラフェン薄膜の電子物性評価を、走査プローブによるナノスケール評価、及び、デバイス化によるマクロスケール評価の両面から進めた。

昨年度までに、明確となっていた均一グラフェンの基板ステップ部での導電性低下現象に関して、これが基板との相互作用の変調が原因であるとの推論に基づき、プローブとグラフェン/基板システムの力学応答を含めた知見の収集を行った。その結果、基板との相互作用の強さによりグラフェンとメタルプローブとのコンタクト抵抗を大幅に変調できることを発見した。また、別途進めている、SiC上グラフェンのtopゲートプロセスによるFET化にも成功し、特性の取得を行った。さらに、グラフェンの局所機械物性評価のための手法開発を行い、走査プローブによる励振、振動振幅同時検出手法を確立した。これらの成果の発表・論文化を順調にすすめ、一方で、多くの招待講演・取材・執筆依頼を受けた。
単頭1分子モーターによる運動機構の解析

前年度までに、単頭キネシン分子を作製することができ、アビジン・ビオチン系によりガラスに固定することで微小管の運動活性を得ることができたので、今年度は運動の定量的な測定及び1分子モーターでの運動活性の測定に重点を置いた。スライドガラスにアビジンを吸着させ、この上にビオチン化したキネシンの単頭及び双頭のフラグメントを載せて固定し、この上をATP存在下で微小管が滑り運動するのを観察する方法では、双頭の場合(キネシンのN末端からアミノ酸数386と410)には運動速度が約0.5μm/secでnativeの双頭分子と同程度であった。単頭分子のアミノ酸数340、351、368の場合は、それぞれ0.036、0.046、0.055μm/secであり、アミノ酸数が長いほど速くなる傾向があったが、双頭分子に比べると約十分の一程度になっていた。一方、アビジンをコートしたビーズにビオチン化したキネシンフラグメントを結合させ、スライドガラス上に固定した微小管上に光ピンセットを用いて接触させ、相互作用によるビーズの変位を測定する方法によると、双頭分子も単頭分子も同様な挙動を示した。即ち、微小管と相互作用を始めると急速に力を発生してから等尺状態に近づいていき、67pNに達した。また、力発生の初期における最大速度は0.6μm/secであり、これらの値は、nativeの双頭分子と同程度であった。また、ビーズに結合させるキネシンフラグメントの量を減らしていっても運動がみられる限りこれらの値は変わらなかったので、1分子に近い状態の運動を観測していると考えられる。前述のガラス表面にキネシンフラグメントを固定する系では、1本の微小管に複数のキネシンモーターが相互作用しており、その向きもまちまちであるのに対し、後述のビーズのキネシンを固定する系では、1分子のモーターが最も運動に適した向きで相互作用することが可能である。従って、単頭1分子のキネシンでも、双頭の場合と同程度の最大速度と最大力を出すことができることが明らかになった。本研究の目的は、1個の単頭のキネシンによる微小管の運動を、再構成系を用いて解析し、力発生の分子的実態を明らかにすることである。そのために本研究では、遺伝子組み換え技術によりキネシン単頭の末端を修飾しこの部位で基板に固定した。そして、1個の部キネシンと微小管との運動を観察し、双頭のキネシンの場合と同じように連続的な運動が生じるかどうかを調べた。キネシンの単頭分子を得るために、キネシンのN末端からアミノ酸数が340から410までの間の5種の異なる長さの蛋白質をコードする遺伝子を大腸菌で発現させた。精製した蛋白質が単頭であるか双頭であるかを区別するために、ゲルろ過法、沈降平衡法、ショ糖密度勾配遠心法、電子顕微鏡観察などを行った。その結果、アミノ酸数340、351、368の3種は単頭であり、386、410り2種は双頭であることがわかった。これら5種とも、C端末にシスタインを導入して、マレイミドビオチンでラベルし、BSAビオチン、アビジン上に固定させると、微小管を動かすことができた。

微小管の運動のスピードは双頭のキネシンでは0.7um/secほどでintactな分子とあまり変わらないが、単頭のキネシンではそれより1桁以上遅くなることがわかった。単頭キネシンの基板上の密度を減らしていくと、1um^2あたり2000分子以下になると、微小管の連続的な運動は見られなくなった。しかしこの値は、アビジン・ビオチン系を介するものだけではなく,非特異的吸着により運動に寄与しないキネシン頭部も含むものであった。以上のように、単頭キネシン分子を作製し、微小管の運動活性を得ることができた。複数分子とはいえ、単頭分子で運動活性を明らかに示したのは初めてであり、意義が大きい。前年度までに、単頭キネシン分子を作製することができ、アビジン・ビオチン系によりガラスに固定することで微小管の運動活性を得ることができたので、今年度は運動の定量的な測定及び1分子モーターでの運動活性の測定に重点を置いた。スライドガラスにアビジンを吸着させ、この上にビオチン化したキネシンの単頭及び双頭のフラグメントを載せて固定し、この上をATP存在下で微小管が滑り運動するのを観察する方法では、双頭の場合(キネシンのN末端からアミノ酸数386と410)には運動速度が約0.5μm/secでnativeの双頭分子と同程度であった。単頭分子のアミノ酸数340、351、368の場合は、それぞれ0.036、0.046、0.055μm/secであり、アミノ酸数が長いほど速くなる傾向があったが、双頭分子に比べると約十分の一程度になっていた。一方、アビジンをコートしたビーズにビオチン化したキネシンフラグメントを結合させ、スライドガラス上に固定した微小管上に光ピンセットを用いて接触させ、相互作用によるビーズの変位を測定する方法によると、双頭分子も単頭分子も同様な挙動を示した。即ち、微小管と相互作用を始めると急速に力を発生してから等尺状態に近づいていき、67pNに達した。また、力発生の初期における最大速度は0.6μm/secであり、これらの値は、nativeの双頭分子と同程度であった。また、ビ-スに結合させるキネシンフラグメントの量を減らしていっても運動が見られる限りこれらの値は変わらなかったので、1分子に近い状態の運動を観測していると考えられる。前述のガラス表面にキネシンフラグメントを固定する系では、1本の微小管に複数のキネシンモーターが相互作用しており、その向きもまちまちであるのに対し、後述のビーズにキネシンを固定する系では、1分子のモーターが最も運動に適した向きで相互作用することが可能である。従って、単頭1分子のキネシンでも、双頭の場合と同程度の最大速度と最大力を出すことができることが明らかになった。
ヒト内軟骨性骨化モデルに於ける成長軟骨帯形成メカニズムの解明

本研究ではヒトiPS細胞から作成した軟骨組織をマウスに移植することで起こる骨形成のメカニズムを詳しく解析し、骨の成長に重要な役割を果たす成長軟骨帯を正確に再現することを目指しています。それによって成長障害を来す疾患の病態解明や新たな創薬に応用できることが期待されます。
結び目理論の幾何的研究

1.内田は(1)三次組み紐と三橋結び目上分岐する三次元球面分岐被覆空間を結び目のダイアグラムを利用しで決定ずる方法を発見した。そしてそれらの空間がそれぞれレンズ空間L(n,1)とL(n,m)となる事を示した.(2)三次元球面内のトーラス結び目上分岐する分岐被覆空間の研究で次の結果を得た.非正規三重分岐被覆空間を持つトーラス結び目はT(2x,3y)(x,yは互いに素な整数)の型であり、その被覆空間はザイフエルトファイバー空間になる.そして、2xβ_2+3yβ_1=±1となる整数β_1とβ_2に対してM(β_1/2x,β_1/x, β_2/y)となるザイフェルトレファイバー空間が被覆空間となる事を示した.また、トーラス結び目T(2,x)、T(3,x)の族に対しては結び目のダイアグラムだけを使用する証明方法でM(β_1/2x,β_1/x,β_2/y)となる事を示した.2.足利は(1)リーマン面の退化族の局所不変量、位相モノドロミー、分裂族やLefschetz fibrationの大域的性質に関する進展についての概説を論文にまとめた.(2)退化代数曲線束のファイバー芽に対するエータ不変量を経由する局所符号数に対しては、その安定還元芽め持つ同種の符号数との比較公式を与えだ.(3)負型連分数を用いてDedekind和を明示する新公式を提示し、これからDedekind相互律が導かれることを示した.3.鳥巣は(1)Howards-Lueckの定理を絡み目に拡張した.また、二橋絡み目のstrong trivialityについて研究を行い、(自明でない)すべての二橋絡み目はn≧1に対してstrongly n-trivialとならないことを示した.(2) strongly 1-trivial Montesinos結び目の族を与え、もし、有名なSeifert surgery予想が有効ならば、この族はすべてのstrongly n-trivial Montesinos結び目を含む事を示した.また、(3)Legendrian twist knotの分類、写像類群とcontact open bookなどの研究を行った.1.内田は(1)三次組み紐と三橋結び目上分岐する三次元球面分岐被覆空間を結び目のダイアグラムを利用しで決定ずる方法を発見した。そしてそれらの空間がそれぞれレンズ空間L(n,1)とL(n,m)となる事を示した.(2)三次元球面内のトーラス結び目上分岐する分岐被覆空間の研究で次の結果を得た.非正規三重分岐被覆空間を持つトーラス結び目はT(2x,3y)(x,yは互いに素な整数)の型であり、その被覆空間はザイフエルトファイバー空間になる.そして、2xβ_2+3yβ_1=±1となる整数β_1とβ_2に対してM(β_1/2x,β_1/x, β_2/y)となるザイフェルトレファイバー空間が被覆空間となる事を示した.また、トーラス結び目T(2,x)、T(3,x)の族に対しては結び目のダイアグラムだけを使用する証明方法でM(β_1/2x,β_1/x,β_2/y)となる事を示した.2.足利は(1)リーマン面の退化族の局所不変量、位相モノドロミー、分裂族やLefschetz fibrationの大域的性質に関する進展についての概説を論文にまとめた.(2)退化代数曲線束のファイバー芽に対するエータ不変量を経由する局所符号数に対しては、その安定還元芽め持つ同種の符号数との比較公式を与えだ.(3)負型連分数を用いてDedekind和を明示する新公式を提示し、これからDedekind相互律が導かれることを示した.3.鳥巣は(1)Howards-Lueckの定理を絡み目に拡張した.また、二橋絡み目のstrong trivialityについて研究を行い、(自明でない)すべての二橋絡み目はn≧1に対してstrongly n-trivialとならないことを示した.(2) strongly 1-trivial Montesinos結び目の族を与え、もし、有名なSeifert surgery予想が有効ならば、この族はすべてのstrongly n-trivial Montesinos結び目を含む事を示した.また、(3)Legendrian twist knotの分類、写像類群とcontact open bookなどの研究を行った.すべての閉三次元多様体は結び目上分岐する三重分岐被覆空間で表されることがわかっている.そこで,ある結び目の集合で得られる多様体を決定する問題が考えられる.古くは細川・中西によりプレツェル結び目に対して決定された.また,3次の組み紐結び目に対しては村杉が決定し,そして筆者が結び目からその多様体を決定するアルゴリズムを与えた.そこで,トーラス結び目上分岐する三次元球面の被覆空間を求めるアルゴリズムを考察した.トーラス結び目はザイフェルト多様体の構造を持ち自然にその構造が被覆空間に持ち上がる.そこで,三重分岐被覆空間を持つトーラス結び目を決定し,それのなす被覆空間を決定しようとした.今のところ部分解を得ただけなので,来年度さらに拡張したい.また,これにより,ある多様体で異なる結び目の二重被覆空間になりえる候補を見つけることができる.また,被覆空間を用いた多様体の不変量の研究では,東工大の畠中氏が不変量を与えている.また,それの拡張として,Dijkgraaf-Witten不変量の被覆空間から見た解釈を与えた.

彼女の方法は,結び目の被覆空間を決定するモノドロミーと呼ばれるものの他にカラーと呼ばれる群の要素を対応させるというものである.筆者はモノドロミーを与える方法については長く研究しているので,それの拡張として新しい,不変量の研究を行っている途中である.Dijkgraaf-Witten不変量を被覆空間から求めることができるので,プレツェル結び目,3次組み紐結び目などの被覆空間として得られる多様体のDijkgraaf-Witten不変量は被覆空間を用いて計算できることになった.三次元球面内のトーラス結び目で非正規三重分岐被覆空間を持つ結び目はT(2x,3y)(ただし、xとyは互いに素な整数)の型である事を示した.y=1である時には、その被覆空間はレンズ空間になる.また、x=2である時には、その被覆空間はトーラス結び目T(2,z)とそのトーラスの中心からなる二成分の絡み目上分岐する二重被覆空間と同相になる事を示した.この結果は、11月に山形蔵王高原で行った東北結び目セミナーにて発表をした.一般のxとyに対して結果が得られれば、まとめて論文にする予定である.結び目上分岐する三次元球面の分岐被覆空間を用いて三次元多様体を表示して得られる、多様体の不変量に対しては、東京工業大学の畠中氏が構成した.私は量子不変量の知識が少ないので、8月に山形に来てもらい、10日間ほど共同研究を行った.現在、基本群が同型だが同相でないレンズ空間が区別できているので、なぜ可能なのか等を考察中である.また、上記のトーラス結び目等はすでに被覆空間がわかっているので、それらと、この不変量との関係を考察している.結び目の被覆空間を用いて、同じ結び目を表す2つの結び目の組み紐表示でマルコフ変形の2(組み紐の次数を変化させる変形)を許さない場合の同値類に対して分類を得た.この結果はすべての結び目の組み紐表示に対して適応できる.この成果を現在論文にまとめている.内田は三次元球面内のトーラス結び目上分岐する分岐被覆空間の研究で次の結果を得た.非正規三重分岐被覆空間を持つトーラス結び目はT(2x,3y)(x,yは整数)の型であり、その被覆空間はザイフェルトファイバー空間になる.そして、2xβ_1+3yβ_2=±1となる整数β_1とβ_2に対してM(β_1/2x,β_1/x,β_2/y)となるザイフェルトファイバー空間が被覆空間となる事を示した.また、トーラス結び目T(2,x)、T(3,x)の族に対しては結び目のダイアグラムだけを使用する証明方法でM(β_1/2x,β_1/x,β_2/y)となる事をしました.結び目の組み紐表示において同値な結び目を表示する組み紐はマルコフ移動の有限列で互いに移ることが知られている.この時共役同値だけを考えた場合に移らないものが存在する事を結び目の被覆空間を用いて幾何的に証明を与えた.これは新庄玲子氏(大阪市立大学数学研究所)の結果の別証明になっている.足利は退化代数曲線束のファイバー芽に対するエータ不変量を経由する局所符号数に対して,その安定還元芽の持つ同種の符号数との比較公式を与えた.また、負型連分数を用いてDedekind和を明示する新公式を提示し,これからDedekind相互律が導かれることを示した.その証明として,Matsumoto-Montesinos公式を用いる方法と,同変符号数定理を用いる方法の2種類を与えた.
ApoE蛋白質が制御するアミロイド線維の形成と除去の分子メカニズム

ApoEは、アルツハイマー病患者の脳に見られる蛋白質沈着物(老人斑)の構成蛋白質として早くから同定されており、Aβのアミロイド形成を促進することが示唆されてきた。しかし、アルツハイマー病の神経病理がApoE遺伝子型により異なるという報告もあり、ApoEアイソフォームはアミロイドの化学的性質に影響を及ぼす可能性が考えられる。つまり、ApoEはアミロイド形成を制御する重要な蛋白質であると示唆されるが、その詳細な機構に関しては明らかでない。まず、ApoE蛋白質のアイソフォーム(E2,E3,E4)を大腸菌に発現させたところ、全てのアイソフォームにおいて毒性が認められた。そこで、培養温度を下げ緩やかな発現誘導を行うことで、培養液1LあたりmgオーダーでのApoE蛋白質の精製に成功した。一方、大腸菌においてAβペプチド単独ではその発現を認めることができなかったものの、GST蛋白質と融合させることで発現量を増加させ、精製後にプロテアーゼで切断することでAβペプチドを大量に得る手法を開発した。また、再構成Aβペプチドは一定時間後に直径が約10nmの線維状凝集物であるアミロイドを形成することを原子間力顕微鏡により確認した。ApoE蛋白質単独では線維状凝集物の形成を確認できなかったが、ApoE蛋白質はAβペプチドのアミロイド化を遅らせることが分かった。特に、Aβのアミロイド化を遅らせる効果はE3よりもE4の方が弱かったことから、脳内にAβアミロイドが蓄積するまでの時間がApoEの遺伝子型に依存する可能性が考えられた。アミロイドとは、約40個のアミノ酸からなるペプチド(Aβ)が凝集し線維構造を形成したもので、神経細胞毒性を有する。アルツハイマー病患者の脳内に見られるアミロイドの量は、アポリポタンパクE(ApoE)の三種類の遺伝子型(E2,E3,E4)に依存する。なかでも、脳内AβアミロイドはE4型で最も多く観測され、アルツハイマー病の危険因子とされている。よって、ApoEはアミロイド形成を制御する重要な蛋白質であると示唆されるが、その詳細な機構に関しては明らかでない。そこで本課題では、ApoEがAβアミロイド形成・分解過程に及ぼす影響を明らかにすることを目的とする。本年度は、ApoE蛋白質がAβアミロイド形成過程に及ぼす影響を検討するために、ApoE蛋白質の大腸菌発現用プラスミドを作成し、三種類のアイソフォーム(E2,E3,E4)を含む再構成ApoE蛋白質の発現・精製を行った。また、大腸菌を用いた再構成システムによりAβペプチドを大量に得る手法を開発した。再構成Aβペプチドはインキュベート開始後、一定時間経過するとThioflavin-Tと結合し蛍光を発することが分かった。また、原子間力顕微鏡を用いることで、直径が約10nmの線維状凝集物を形成していることが観察され、大腸菌を利用した再構成Aβペプチドはアミロイドを形成することを確認した。ApoE蛋白質単独では線維状凝集物の形成を確認できなかったが、ApoE蛋白質はAβペプチドのアミロイド化を遅らせる効果があることが明らかとなった。現在、in vivoでのAβアミロイド形成・分解におけるApoE蛋白質の役割を検討するために、各ApoEアイソフォームを発現するノックインマウスを作成中である。
頑健な音声認識のための正準化に関する研究

音声言語に対する聴覚の高次処理として,弁別的音韻特徴(Distinctive Phonetic Feature: DPF)抽出機能を識別器へ組込み,頑健な音声認識を実現する研究を行った。DPFは発話器官の振る舞いを,有声/無声,破裂性の有無,摩擦性の有無などの対立構造から分類したもので,本研究はDPF特徴ベクトルを介して,音声を精度良く音素系列に置換することを目指している。提案方式は,音韻間距離をリカレントニューラルネットワーク(RNN)と弁別特徴間の相互抑制ネットの競合学習を通して確保する枠組みを持ち,高い音声識別性能を期待できる。これまでの途中経過では,提案方式は騒音下においても高いセグメンテーション(連続する音声信号波形を離散的な音素系列への分節化)を実現できることを示した。研究員はサウジアラビアのKing Saud UniversityにAssistant Professorとして採用され,研究途中での離日となったが,赴任先においても,本研究を引き続き行いたい意向である。今後は本格的実地検証と共に理論的裏づけを行う計画である。
日本の農村社会における高齢化と国際化の関係(移住・交流・通婚)

日本の人口高齢化と国際化は、微妙に絡まりあって、地域社会の態様に影響を与えている。その様相は地域によって異っている。日本農村の高齢化は、若年人口流出によって進行すると、一般的には考えられているが、沖縄県南大東村では、むしろ高齢人口流出によって、高齢化が抑止されてきたといえる。また大分県大山町では、国際交流を通じて、むしろ伝統的農村家族の存続を可能にしてきた。これらの町村に比べると山口県東和町は、古くから出稼ぎ者を送り出してきた所であり、高齢化が日本一の状態になっている。山形県朝日町では、高齢化しながら、何とか伝統的農村家族を存続させようとした結果、町民の国際結婚を行政自ら図っていく動きにまでなっている。これらの地域における高齢化と国際化の態様は、単なる自然地理上の特徴から結果するものではなく、そこに住まう住民の意識の中に埋めこまれてきた文化的伝統と、そこからリ-ダ-シップをとって、主体的に動き出している人物の存在から理解されるべきだろう。南大島村は、日本だけでなく、外国からも出稼ぎに来る「仕事場」としての地域であり、大山町は国際的に通用する「生活の場」としての地域であり、東和町は国内外へ出稼ぎに出かけて後に帰郷する「墳墓の地」としての地域であり、朝日町は外国との通婚を行なってまで、家を持続させようとする「再生産の場」としての地域である。それぞれに高齢化と国際化の絡みは今後も複雑になっていくだろうが、タ-ニング・ポイントには、地域リ-ダ-の存在が大きく浮かび上がってくる。また、こうした地域課題の解決にむけては、各種制度の柔軟な組み換えが必要になってくる。国際関係が、ますます緊密になる日本の中で、今や農村は社会としての再生力を問われており、人々の構想力を刺激する地域理念をどのように立てていくかが焦眉の急になっている。
細胞がん化におけるポリADPーリボース合成酵素遺伝子の役割

ヒト正常胎盤およびSV40でトランスフォームしたヒト線維芽細胞由来の2種のcDNAライブラリーからクローンを得て本酵素に対するcDNAの特性を調べ以下の知見を得た.1)本酵素のmRNAはNorther Blotから約4.2kbと推定される.2)cDNAのcodingregionは, 1014個のコドンから成り,本酵素の分子量は113,153と算定される.3)本酵素のDNA結合ドメインはN末側に存在しており,アミノ酸残基数373個から成る塩基性タンパクである.続いてアミノ残基152個から成る自己修飾ドメインがあり,この部分も塩基性が強い. C未側には489個のアミノ酸塩基から成る基質NAD結合ドメインがある.このドメインの電荷は中性である.4)DNA結合ドメインは独特の反履配列を有し,この部分は発癌遺伝子産物であるcーfos,vーfosと相同性が強い.またこの部分にはZnを結合するMetal fingerが存在する.さらにこのドメインにはSV40のT抗原などに見られる核局在に必須と思われるリジン残基のクラスターが存在する.5)基質NAD結合ドメインにはATPase等にみられるアデニン部分を認識する為の独特のアミノ酸配列が存在する.6)トランスフォームした場合にはDNA結合ドメインのみに2ケ所に亘り点突然変異が存在し,荷電の変化を含むアミノ酸置換がみられる.以上の知見からポリADPーリボース合成酵素は,細胞がん化に重要な役割を持つことが示唆され,現在genomic DNAの構造と発現制御の解析を行なっている.ヒト正常胎盤およびSV40でトランスフォームしたヒト線維芽細胞由来の2種のcDNAライブラリーからクローンを得て本酵素に対するcDNAの特性を調べ以下の知見を得た.1)本酵素のmRNAはNorther Blotから約4.2kbと推定される.2)cDNAのcodingregionは, 1014個のコドンから成り,本酵素の分子量は113,153と算定される.3)本酵素のDNA結合ドメインはN末側に存在しており,アミノ酸残基数373個から成る塩基性タンパクである.続いてアミノ残基152個から成る自己修飾ドメインがあり,この部分も塩基性が強い. C未側には489個のアミノ酸塩基から成る基質NAD結合ドメインがある.このドメインの電荷は中性である.4)DNA結合ドメインは独特の反履配列を有し,この部分は発癌遺伝子産物であるcーfos,vーfosと相同性が強い.またこの部分にはZnを結合するMetal fingerが存在する.さらにこのドメインにはSV40のT抗原などに見られる核局在に必須と思われるリジン残基のクラスターが存在する.5)基質NAD結合ドメインにはATPase等にみられるアデニン部分を認識する為の独特のアミノ酸配列が存在する.6)トランスフォームした場合にはDNA結合ドメインのみに2ケ所に亘り点突然変異が存在し,荷電の変化を含むアミノ酸置換がみられる.以上の知見からポリADPーリボース合成酵素は,細胞がん化に重要な役割を持つことが示唆され,現在genomic DNAの構造と発現制御の解析を行なっている.
人工心肺下開心術における体外循環温度が血管内凝固、線溶系亢進に及ぼす影響

(1)体外循環下の血液凝固系の亢進の機序に関してprostaglandin I2,thromboxane A2の推移を、さらにアプロチニン、Heparin-coated人工心肺回路の使用が血小板保護、内因性血液凝固・線溶系亢進の抑制につながるか検討した(結果)内因性血液凝固・線溶系亢進はHeparin-coatedの群でアプロチニンの使用の有無にかかわらず、有意差を持って低体温群、常温群よりも優位に低値を示した。血小板数の保存率は低体温群で最も低く、他の3群と比較して有意に低値であった。Heparin-coatedにアプロチニンを加えた場合、血小板数の保存率は常温群、Heparin-coatedのみの群よりも有意に良かった。また、常温は低体温に比較し、血小板数、機能保持の面で有利であった。(2)人工心肺装置は術後に見られるsystemic inflammatory response(SIRS)の主たる原因であるとされている。従ってSIRSを軽減するという目的での心拍動下冠動脈バイパス術(OPCAB)の導入は臨床的に意義が高い。SIRS指標に加え、好中球、補体、血小板活性、インターロイキン産生、prostacyclin産生、エンドセリン産生、酸化ストレス産生の相違をOPCABとONCAB群において比較検討した。(結果)SIRS指標では白血球数のみがONCAB群にて有意に高く、体温は逆にOPCAB群にて術後有意に高値であった。IL6は手術終了時ONCAB群にて有意に高値であったが、第1病日以降は逆に有意に低値となった。IL8においては両群間に差が見られなかったものの、エラスターゼ値は手術終了時ONCAB群にて有意に高値であった。その他の指標には差異を認めなかった。術後ICUでのPO2値、挿管時間、ICU stayにおいても両群間に差はみられず、OPCABの優位性は証明されなかった。平成15年度は常温体外循環および中等度低体温(32度C)下開心術における凝固、線溶系の変化について検討し、術後出血と術中体外循環温度との関係を明白にすることを目的に研究を遂行した。常温体外循環、中等度低体温体外循環ともに、体外循環開始直後より凝固系亢進の指標であるFibrinopeptide Aの有意な上昇を認めた。その上昇は体外循環中、時間経過(大動脈遮断時、45分経過後、大動脈遮断解除時)とともに上昇し、人工心肺終了後のプロタミン投与時に最高値となった。ICU入室時にはFibrinopeptide Aは減少傾向となったにもかかわらず、依然として術前値より有意に高値であった。線溶系亢進の指標であるD-ダイマーをみるとまったく同様の変化を経過観察中に認めた。両群とも術後血小板数、血小板機能においても有意に低下を示した。また、血小板活性化によって放出されるThromboxane A2も両群で有意に上昇した。しかしながら、両群間において、凝固(血小板機能を含む),線溶系の双方において有意な相違は経過中を通して見られなかった。今回の程度の温度差においては凝固・線溶系の亢進には相違が生じないと判断された。それを裏付けるがごとく、術後出血量においても有意な差異は認めなかった。16年度においてはさらなる低体温循環下での凝固・線溶系の変化を調査する。

さらに、体外循環時にヘパリンコーティング回路使用することによって、凝固・線溶系の亢進抑制が理論上認められるはずであり、その事実を証明することと、その結果が術後出血量軽減への具体策となるかを検証する予定である。人工心肺装置は心臓手術に欠くことのできない補助手段であるとはいえ、術後に見られるsystemic inflammatory response (SIRS)の主たる原因であるとされている。従ってSIRSを軽減するという目的において心拍動下冠動脈バイパス術(OPCAB)の導入は臨床的に意義がある。今回、我々は一般的SIRS指標に加え、好中球活性(エラスターゼ活性)、補体値、血小板活性(thromboxane A2)、インターロイキン産生(IL6,IL8,TNF-α)、prostacyclin産生、エンドセリン産生、酸化ストレス産生の相違をOPCABとONCAB群において比較検討し、その推移の相違と術後肺・腎機能及び術後経過との関連を検討した。(結果)一般的なSIRS指標では白血球数のみがONCAB群にて有意に高く、体温は逆にOPCAB群にて術後有意に高値(発熱あり)であった。CRP遊走因子のIL6は手術終了時ONCAB群にて有意に高値であったが、第1病日以降は逆に有意に低値となった。好中球活性化因子(IL8)においては両群間に差が見られなかったものの、エラスターゼ値は手術終了時ONCAB群にて有意に高値であった。その他の指標においては全く両群間に有意差を認めなかった。術後ICUでのPO2(FIO2:1.0)値、挿管時間、ICU stayにおいても両群間に差はみられなかった。術後Creatinine、BUNの推移も同様に差を認めなかった。(結語)ONCAB群において有意な好中球活性(エラスターゼ上昇)が手術終了時のみに認められたが、その他の因子、経過においてはOPCAB群と差異はなく、SIRSの観点からはOPCABの優位性は証明されなかった。人工心肺の使用はかならずしもSIRSの大きな問題とはならないと思われた。
病態時の薬物消化管吸収の変化におよぼす薬物トランスポーターの影響

本研究では,小腸における薬物トランスポーターの機能的変動および変動影響因子の解明を目的として,総胆管結紮ラットにおけるin situ, in vitro系での小腸タウロコール酸輸送変動の検討,およびヒト小腸モデルCaco-2細胞における内因性物質によるMRP2, ASBT mRNA発現変動の検討を行った。胆管結紮3日後のラット小腸において,apical sodium-dependent biletransporter (ASBT)のmRANの発現量が有意に増加した。しかし、小腸薬物輸送能の検討として、closed loop法およびUssing chamber法でタウロコール酸の吸収の吸収を測定したところ,コントロール群,胆管結紮ラット群間で小腸のどの部位においても有意な差がみられなかった。よって、ASBT mRNAの発現増加は小腸での吸収機能にまで影響するものではなかった。また,どちらの実験系においても上部,中部で分泌指向性がみられたことから,上部,中部では内因性胆汁酸を分泌方向に輸送する未知のトランスポーターが存在し,機能している可能性が示唆された。胆汁鬱滞の状態では血中ビリルビンに加え,胆汁酸,サイトカインが増加することを確認した。これら内因性物質のトランスポーター発現調節の検討では,タウロコール酸およびコール酸はmultidrug resistance-associated protein 2(MRP2),ASBT mRNA発現に影響を与えないことが明らかになった。一方,ビリルビンおよびTNF-α処理によってMRP2 mRNA発現量が減少した。また,TNF-αとIL-1βの同時処理によって,MRP2 mRNA発現量が減少した。この結果から,胆汁鬱滞により増加する血漿中内因性物質のうち,ビリルビンおよびサイトカインが,小腸MRP2 mRNA発現量の減少に関与している可能性が示唆された。病態時に消化管での薬物輸送能が変化するのか、その時、薬物トランスポーターの発現量は変動するのかどうかを検討するためにモデル動物を作製し検討した。消化管障害時モデルラットを抗癌剤メトトレキサート(MTX)大量投与により作製し、ロイコボリン(LV)投与による救援時のトランスポーターの遺伝子発現変動と、in vivoにおける薬物吸収能との相関性について検討した。小腸粘膜重量はMTX投与で減少しLV救援で増加し、それぞれ、小腸形態の障害・回復がみられた。内部標準遺伝子であるGAPDHに対するPepT1ならびにP-糖タンパク質(P-gp)の相対的発現量は、いずれも障害時で減少、救援回復時で増加した。小腸全体での発現量を発現数として解析するために、擬似的ではあるが、相対的発現量に粘膜湿重量を掛け合わせたところ、発現数変動はより顕著なものとなった。PepT1の良好な基質であるセファレキシン経口投与後のAUCは、消化管障害時では減少し、救援回復時では上昇がみられた。さらに、両者の間には有意な相関性が得られたことより、本障害・救援モデルラット小腸でのPepT1発現数の変動が、in vivoでのセファレキシン吸収量を規定する要因の1つとなっていることが示唆された。また、胆汁鬱滞モデルとして胆管結紮ラットにおける消化管のトランスポーター遺伝子発現量を定量した。結紮により、肝機能検査値は異常を示した。小腸でのASBT遺伝子発現量は結紮3日で上昇し、その後、低下した。一方、MRP2 mRNAの発現量は結紮4週間で低下した。小腸組織でパラアミノ馬尿酸は分泌指向輸送を示し、この分泌方向の輸送はアニオン性化合物により阻害され、MRP2欠損ラットEHBRでも、結紮4週間ラットの小腸組織でもこの分泌方向の輸送が低下した。したがって、胆管結紮による小腸MRP2遺伝子の発現量の低下は、機能的な低下を伴っている可能性が示唆された。胆汁鬱滞時の小腸トランスポーターの発現変化に薬物輸送機能の変化が伴うかを胆管結紮ラット小腸組織を用いて検討した。トランスポーター発現は結紮4週間でmrp2 mRNAが減少した。mrp2の基質であるパラアミノ馬尿酸の輸送も減少し機能的な低下を伴っていた。一方、asbtは結紮初期において増加したが、特異的基質であるタウロコール酸の小腸組織輸送は変化せず、機能的な変動は見られなかった。ラットにおけるトランスポーター発現変動の要因を明らかにするため、小腸上皮モデル細胞であるCaco-2細胞を用いて検討した。胆管結紮ラットにおいて変動した内因性物質に着目した。胆管結紮ラットでは血漿中総胆汁酸,総ビリルビン,サイトカイン(interleukin 1β[IL-1β],tumor necrosis factor α[TNF-α])が増加していた。これらの内因性物質をCaco-2細胞に添加して624時間培養し、トランスポーターmRNA発現量の変動をみた。胆汁酸成分処理ではタウロコール酸でmrp2およびasbt mRNA発現量に差はなく、コール酸で増加傾向がみられたものの対照群に比べて有意差はなかった。ビリルビン処理ではmrp2 mRNA発現量に有意差はみられなかったが減少傾向を示した。サイトカイン処理では、TNF-α処理で6時間に比べて24時間処理でmrp2 mRNA発現量が減少し、24時間処理ではTNF-α濃度依存的にmrp2 mRNA発現が減少する傾向を示した。IL-1β6時間処理では濃度依存的に増加したが,24時間処理では変化が見られなかった。

TNF-αとIL-1βを同時に処理した場合,6時間処理でMRP2 mRNA発現量が減少する傾向を示した。以上より、胆管結紮ラットにおける小腸トランスポーター発現量の変動にTNF-αおよびビリルビンが影響を与えている可能性が示唆された。本研究では,小腸における薬物トランスポーターの機能的変動および変動影響因子の解明を目的として,総胆管結紮ラットにおけるin situ, in vitro系での小腸タウロコール酸輸送変動の検討,およびヒト小腸モデルCaco-2細胞における内因性物質によるMRP2, ASBT mRNA発現変動の検討を行った。胆管結紮3日後のラット小腸において,apical sodium-dependent biletransporter (ASBT)のmRANの発現量が有意に増加した。しかし、小腸薬物輸送能の検討として、closed loop法およびUssing chamber法でタウロコール酸の吸収の吸収を測定したところ,コントロール群,胆管結紮ラット群間で小腸のどの部位においても有意な差がみられなかった。よって、ASBT mRNAの発現増加は小腸での吸収機能にまで影響するものではなかった。また,どちらの実験系においても上部,中部で分泌指向性がみられたことから,上部,中部では内因性胆汁酸を分泌方向に輸送する未知のトランスポーターが存在し,機能している可能性が示唆された。胆汁鬱滞の状態では血中ビリルビンに加え,胆汁酸,サイトカインが増加することを確認した。これら内因性物質のトランスポーター発現調節の検討では,タウロコール酸およびコール酸はmultidrug resistance-associated protein 2(MRP2),ASBT mRNA発現に影響を与えないことが明らかになった。一方,ビリルビンおよびTNF-α処理によってMRP2 mRNA発現量が減少した。また,TNF-αとIL-1βの同時処理によって,MRP2 mRNA発現量が減少した。この結果から,胆汁鬱滞により増加する血漿中内因性物質のうち,ビリルビンおよびサイトカインが,小腸MRP2 mRNA発現量の減少に関与している可能性が示唆された。
アミロイド前駆体蛋白質高発現ニューロンの作製とその変性過程の解析

アデノウイルスベクターにアミロイド前駆体蛋白質(APP)遺伝子を組み込み、ラット初代培養海馬ニューロンに感染させると、培養海馬ニューロンは34日間に変性/死滅した。この変性過程では、カスペース3の一過性の活性化がおこり、その酵素阻害により細胞死は遅延した。グリア細胞では、同じ条件で細胞死が誘導されなかったが、活性酸素種の生産増大が認められた。ニューロンやグリア細胞を用いてデイファレンシャルデイスプレイ法を行ったところ、グリア細胞の実験から1クローンが得られた。部分配列解析から、これはIL-8の遺伝子であることが判明し、IL-8分子の生産量の増加も確認された。IL-8の存在下で培養したニューロンでは、APP遺伝子導入により細胞死が著明に早まる結果が得られた。APP変異体遺伝子解析から、APPによる細胞死とIL-8生産誘導活性には正の相関関係があった。また、APP代謝産物の細胞外分泌を阻害剤により抑制したところ、この場合もAPPによる細胞死が亢進することが判明した。以上、本モデル系細胞死には、APP代謝産物の細胞内蓄積が直接関わっていると考えられたが、アミロイドベータペプチドの関与は認められなかった。また、APPによりグリア細胞からのケモカイン等の生産増大がニューロン死を決定的にする役割があると推測された。それゆえ、本実験系は、弧発性アルツハイマー病の新たな側面を示しているのみならず、抗痴呆性食材の探索、抗痴呆薬の評価系、変性遺伝子探索系として、極めて有用なアルツハイマー病病態モデル系と考えられる。アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白質(APP)が過剰発現すると培養株化細胞の変性死滅を引き起こす。本研究では、同様なことがヒト脳組織により近いラット初代培養神経細胞で起こるか否かを調べた。まず、非分裂成熟神経細胞を実験的に調整するため、ラット胎児海馬ニューロンを無血清条件化で長期培養する系の作製を試みた。その結果、グルタミン酸感受性、細胞内Ca濃度、形態、神経特異的分子の発現などから成熟ニューロンと判断出来る初代培養系を約45週間の培養で作製できた。次に、この成熟ニューロンにAPP遺伝子導入するため、アデノウイルスベクターを用いてベクター構築を進め、超遠心法による高力価ウイルスサンプルを調整した。本長期培養ニューロンにAPP遺伝子導入を実施したところ、90%以上の高効率遺伝子導入が確認できた。興味深いことには、アデノウイルス感染ニューロンはAPP発現上昇とともに変性を始め、ウイルス暴露34日目にほぼすべての感染ニューロンが死滅した。対照群として、β-gal遺伝子を含むアデノウイルスや外来遺伝子を含まないアデノウイルスを用いたところ、同様な著しい細胞変性・死滅が全く認められなかった。本ニューロンの細胞死は、タネル法で陽性反応を示したことから、APP誘導によるアポトーシス様細胞死と考えられた。次に、この細胞死を抑制する作用について様々な物質の効果を検討したところ、線維芽細胞増殖因子(bFGF)や神経成長因子(NGF)が成熟ニューロンの変性死滅を遅延させる作用があることが判明した。以上、本実験系は、孤発性アルツハイマー病の病態モデル細胞として極めて興味深い実験系であると考えられた。現在、アデノウイルスでBcl-2遺伝子を導入し、APP遺伝子による細胞変性阻止効果がるか否かを調べており、さらに、カスペース3などの関与をも検討したい。また、本細胞死に関わる分子機構解明を進めるともに、アルツハイマー病治療薬候補物質のinvitro評価系としての可能性もあわせて検討していきたい。ウイルスベクターを用いたこれまでの遺伝子導入実験により、アミロイド前駆体蛋白質(APP)が過剰産生した培養海馬ニューロンは、34日間で変性/死滅することを確認した。今年度は、この過程を遅延させたり進行を阻止する分子が存在するか否か、さらには、この細胞変性/死滅過程にはどのような遺伝子群が関与しているかを明らかにする実験を開始した。

まず、カスペース3の阻害剤で処理しながらAPP遺伝子導入を実施したところ、一過性の効果ではあるが、有意に海馬ニューロンの変性を遅延させることが明らかになった。しかし、カスペース1の阻害剤では、それ程明確な効果が認められなかった。抗酸化作用を持つ各種ビタミン類を同様に検討したが、どれも有効な阻害効果を示さなかった。次に、神経栄養因子の処理効果を比較検討したところ、ニューロンの培養上清に含まれる因子活性や近年栄養因子活性が示されたM-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)などに、細胞変性や死滅を遅延させる性質が認められた。しかし、神経成長因子であるNGFやその仲間のNT-3やBDNFなどにはそのような効果は検出できなかった。これらのことから、本実験系における細胞死には、種々のアポトーシスに関与しているカスペース類の働きが示唆されたが、その系路を制御する生体因子については、存在が予想されるものの、さらに十分検討することが必要と考えられた。一方、本細胞変性過程に関わっている細胞内分子の探索/同定をおこなうため、ウイルスベクターによるAPP遺伝子導入後、その培養ニューロンからmRNAを経時的に調整した。差分法およびディファレンシャルディスプレイ法により、遺伝子発現が変化する候補分子の2クローンを見い出した。今後、この遺伝子の発現変化に関して再現性が得られれば、これら遺伝子断片のDNA塩基配列し、ノーザンブロットなどにより細胞変性との関わりを詳細に調べる予定である。アミロイド前駆体蛋白質(APP)の遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターで初代培養海馬ニューロンを感染させると、神経細胞は数日の内に死滅するが、同じ培養皿に存在する非感染ニューロンは死滅しない。そこで、感染細胞の死滅過程において働く分子種を同定するため、ニューロンからmRNAを抽出してデイファレンシャルデイスプレー法を用いて調べたところ、遺伝子発現が上昇する候補分子2個を見い出した。ノーザンブロットによりこれら2クローンの遺伝子発現を調べたところ、2クローンとも大きな変動をしないことが判明した。それゆえ、これらは偽発現上昇クローンであり、スクリーニング方法におけるアーデイファクトの可能性が高いと判断された。長期培養における初代培養海馬ニューロンからmRNAの調整は非効率的であり、そのことが再現性のある実験系を構築する上での問題であると考えられる。そこで、大量mRNAが調整可能となる株化細胞のうち、本アッセイで培養海馬ニューロンと同じように細胞変性を示すものを探索したところ、ヒトアストロサイトーマがAPP遺伝子導入により数日後に変性/死滅を誘導することが判明した。この細胞/死滅過程では、APP遺伝子導入により、先ず、細胞接着性が1-2日で低下し、細胞が丸くなってきた。2-3日後には、細胞内ラジカル産生が約15-20%ほどの上昇で認められた。培養4-5日では炎症性ケモカイン類の生産上昇が確認された。そして、5-7日程では、ラジカル産生の低下と共に顕著な細胞死が確認された。