hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
樹状細胞を用いた潰瘍性大腸炎の抗原解析

潰瘍性大腸炎を含め、大部分の自己免疫疾患は自己抗原が不明であり、病因解明を困難にしているが、自己抗原の解析を行うことが本症の病態理解、根本治療につながると考え、本研究を企画した。さらに、樹状細胞がT細胞の抗原認識の最も初期の段階に重要であり、また、自己抗原に対しては免疫寛容が誘導されることに注目し、樹状細胞を用いた抗原認識の実験系を用いた。昨年度までに、インフォームドコンセントの得られた手術を施行された潰瘍性大腸炎患者の末梢血単球由来の樹状細胞を用いて、自己反応性T細胞をsortingし、それらをcell line化することに成功した。本年度は同患者の炎症部腸管上皮細胞cell lysateをspot毎にpeptideとしてB細胞にpulseし、自己反応性T細胞の増殖を促進させるpeptideの解析を行ったところ、各々の患者につきpeptideが数十個に絞り込まれた。それらのpeptideを質量分析、ペプチドマッチングをおこなったところ、自己由来のもの、および腸内細菌由来と考えられるものにさらに分けられた。以上より、潰瘍性大腸炎の患者由来のT細胞を増殖させる因子として、自己由来のものと腸内細菌由来のものが存在することを本研究で解明した。潰瘍性大腸炎はhomogenousな疾患ではなく、様々な因子が病態に関わっていると考えられているが、本研究で、その内でも、自己抗原と腸内細菌が重要であることが、証明できた。潰瘍性大腸炎を含め,大部分の自己免疫疾患は自己抗原が不明であり,病因解明を困難にしているが,自己抗原の解析を行うことが本症の病態理解,根本治療につながると考え,研究を進めている.さらに,樹状細胞がT細胞の抗原認識の最も初期の段階に重要であり,また,自己抗原に対しては免疫寛容が誘導されることに注目し,樹状細胞を用いた抗原認識の実験系の確立を目指している.本年度は以下の研究を行った.インフォームドコンセントの得られた手術を施行された活動性潰瘍性大腸炎患者より採血し,その末梢血より,単球を分離し,IL-4,GM-CSFと培養し,未成熟樹状細胞を得た.同患者の切除大腸標本より分離した炎症部腸管上皮細胞をcell lysateとし,CD4OL trimerとともに未成熟樹状細胞にpulseし,成熟樹状細胞へと分化させることに成功した.同患者の末梢血および腸管粘膜内リンパ球よりT細胞を分離し,electroporation法を用いてIL-2 promotor dependentGreen Fluolescent Protein(GFP)発現ベクターをtransfectさせた.これらの腸管上皮細胞由来抗原を提示する成熟樹状細胞とT細胞を共培養し,Flow cytometorにて,GFP発現T細胞,すなわち自己反応性T細胞をsortingした.単離された自己反応性T細胞を抗CD3/CD28抗体,IL-2存在下で培養し,cell line化することに成功した.現在,炎症部腸管上皮細胞cell lysateの2次元電気泳動をspot毎にpeptideとし同患者のB細胞にpulseし,自己反応性T細胞の増殖を促進させるpeptideを検索中である.次年度はさらに,得られた抗原peptideの質量分析,ペプチドマッチングを行い,さらにそれが,他の潰瘍性大腸炎患者の樹状細胞-T細胞共培養系で再現性があることを確認し,本症の自己抗原の解明に迫ることを予定している.潰瘍性大腸炎を含め、大部分の自己免疫疾患は自己抗原が不明であり、病因解明を困難にしているが、自己抗原の解析を行うことが本症の病態理解、根本治療につながると考え、本研究を企画した。
抗腫瘍免疫能の賦活化を企図したテーラーメード型前立腺癌遺伝子治療の開発基盤研究

本研究は個々の担癌患者における腫瘍免疫学的プロフィールに基づいて抗腫瘍免疫能の賦活化を企図するテーラーメード型遺伝子治療を開発するための基盤的研究である。前立腺癌を対象に、遺伝子治療臨床研究を実施し、個々の症例における腫瘍免疫学的なプロフィールを多面的に解析し、より効果的な抗腫瘍免疫能の誘導を企図するテーラーメード型遺伝子治療を開発するための基盤的エビデンスを集積することを目標とし関連する一連の基礎ならびに臨床研究を展開し以下の成果を得た。内分泌療法中に再燃してきた臨床的に遠隔転移を認めない局所再燃前立腺癌患者8名のべ9名を対象として実施し、安全性および治療効果を確認した。さらに治療前後における、個々の患者での種々の免疫学的パラメータの変化を解析した。血清中サイトカインレベル(IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α,IFN-γ)においては明らかな変化は認められなかった。末梢血における活性化Tリンパ球の指標であるCD8+/HLA-DR+の比率がベクター投与後上昇傾向を示した。細胞性免疫の活性化を示唆する所見であり、今後IL-12遺伝子治療臨床研究開始によって得られる免疫学的パラメータの結果と合わせて解析しテーラーメード型遺伝子治療を開発するための基盤的エビデンスになるものと判断された。2)免疫療法の標的となる腫瘍抗原の発現解析と免疫応答能の検討癌特異抗原(NY-ESO-1,SSX)の前立腺癌組織における発現について検討を加え、腫瘍抗原の発現に対応した特異的な宿主の免疫応答をあわせて解析しこれらの腫瘍抗原が免疫療法の標的となりうることを明らかにした。3)免疫療法の実施ペプチドをパルスした樹状細胞療法・NY-ESO-1蛋白を用いたワクチン療法を実施しその安全性・臨床的活性を確認するとともに少数例ではあるが特異的な細胞性免疫反応の誘導を確認した。4)IL-12遺伝子治療における発展的基盤研究本研究は個々の担癌患者における腫瘍免疫学的プロフィールに基づいて抗腫瘍免疫能の賦活化を企図するテーラーメード型遺伝子治療を開発するための基盤的研究である。4)IL-12遺伝子治療における発展的基盤研究内分泌療法局所再燃前立腺癌3例に対して、HSV-tk遺伝子発現IL-12遺伝子発現アデノウイルスベクターを前立腺内に注入した。注入に際しては、基盤研究(B)(2)(課題番号13557134)において開発・実用化したベクター注入制御装置を用いた。投与に伴う安全性は確認されると共にPSAを指標とした治療効果は認められた。治療前後で採取された血液、組織検体について種々の解析を実施した。2)Interleukin-12(IL-12)遺伝子による遺伝子治療臨床研究の実施申請内分泌療法抵抗性再燃前立腺癌を対象とした臨床研究を学内委員会に申請し3回の審議を経て承認を得た。現在までに遺伝子治療を実施した内分泌療法局所再燃前立腺癌7例に対して、その後の経過を慎重に観察し、投与に伴う安全性を確認するとともに、PSAを指標とした治療効果を認した。2)Interleukin-12(IL-12)遺伝子による遺伝子治療臨床研究の実施準備昨年度実施承認をうけた内分泌療法抵抗性再燃前立腺癌を対象とした臨床研究を実施すべく、ベクター作製調整等の打ち合わせをベイラー医科大学において実施した。3)他の免疫療法の実施遺伝子治療と併用する可能性を有する免疫治療について(HLA-A24,4拘束性PSMAペプチドをパルスした樹状細胞療法。NY-ESO-1蛋白を用いたワクチン療法)、倫理委員会での承認を得た後治療を実施した。遺伝子治療を実施した内分泌療法

局所再燃前立腺癌9例に対して回遺伝子治療を実施、その後の経過を慎重に観察し、投与に伴う安全性を確認するとともに、PSAを指標とした治療効果を認した。尿中へのベクター排泄は当日のみであり血液中への移行はほとんど認められず、血中の中和抗体価の上昇も一過性で中等度であった。6例の患者においてPSAの低下(平均39.3%)を認めた。腫瘍効果と患者の免疫学的なプロフィールを治療前後において解析した。その結果治療効果発現群は治療効果非発現群に比して治療前のCD8陽性リンパ球、NK細胞の比率が高く治療後も上昇する傾向を認めた。また血液中のインターフェロンγの濃度についても同様の傾向を認めた。治療前における生体の免疫環境がその後の治療効果を左右することが示唆された。Interleukin-12(IL-12)、樹状細胞療法などによる免疫賦活化による作用増強の可能性も合わせて示唆された。2)Interleukin-12(IL-12)遺伝子による遺伝子治療臨床研究の実施準備学内での実施承認をうけた内分泌療法抵抗性再燃前立腺癌を対象とした臨床研究を実施すべく、国への申請作業を実施するとともに、ベクター作製調整等の打ち合わせをベイラー医科大学において実施した。3)他の免疫療法の実施遺伝子治療と併用する可能性を有する免疫治療について(HLA-A24,4拘束性PSMAペプチドをパルスした樹状細胞療法。NY-ESO-1蛋白を用いたワクチン療法)、倫理委員会での承認を得た後治療を実施した。
ゴンドワナ超大陸形成時の変成作用の温度－圧力－時間履歴に対する変成流体の挙動

採用年度1年目は、年次計画書に記載した通り、スリランカ・ハイランド岩体南西部における変成温度-圧力-流体-時間履歴を解析し、当該地域のテクトニクスの再検討を試みた。しかし、1変成温度圧力の記録を残していると期待され、変成流体の主なホスト鉱物としても想定していたザクロ石が高温での変成作用による組成均一化を被っていること、2年代分析を行うジルコンの数が極めて少なく、また粒径も小さいため測定が困難である、という問題点が明らかとなり、研究計画の見直しを余儀なくされた。その一環として、スリランカとの連続性が指摘されている、東南極リュツォ・ホルム岩体の天文台岩から得られた苦鉄質変成岩の観察を行った。その結果、この試料中のザクロ石の周囲を取り囲む斜方輝石+斜長石のシンプレクタイト組織を発見した。このことと、ジルコンの希土類元素組成を測定することで変成温度-圧力-時間履歴の解析が可能であることを見出し、新たな研究課題とした。新たな研究手法および結果は以下のとおりである。1岩石薄片の作成および偏光顕微鏡での観察を行い、反応組織の存在を確認。2電子線マイクロアナライザーを用いた分析。3鉱物平衡モデリング法を適用し、ピーク変成温度圧力条件(温度=800-900°C、圧力=4-9 kbar)を推定した。4ジルコンのウラン-鉛年代および希土類元素組成を、国立科学博物館のレーザーアブレーションICP質量分析器を借用して測定した。発見した反応組織は、岩石の上昇によるザクロ石の分解を示唆するものである。また、ジルコンに記録された580-500 Maの変成年代と希土類元素組成を比較すると、約540-510 Maにザクロ石存在下に特徴的なパターンから非存在下のパターンに変化していることが確認された。この成果は当該地域のテクトニクスを考察する上で重要な情報であり、当該年度中に国内/国際学会で発表を行っている。当初の研究計画の実施が困難な状況となり、研究対象地域および研究手法の大幅な変更を行ったため、提出した研究実施計画書に照らし合わせれば、進捗は遅れていると言わざるを得ない。一方、新たな研究手法で重要な成果を挙げることに成功しており、学会における発表も問題なく実施できていることから、区分としては「やや遅れている」とした。今後は、リュツォ・ホルム岩体の他の地域に産出する岩石についても変成温度圧力の推定とジルコンの年代および希土類元素組成の測定を行い、岩体全体の温度-圧力-時間履歴の考察を進める。また、薄片中のジルコンについてその場でのカソードルミネッセンス像の観察を行い、ジルコンとザクロ石や反応組織との岩石学的関係も並行して明らかにする。可能であればスリランカや南インドなど他のゴンドワナ地域に見られる同種の岩石についても上記手法を適用し、超大陸規模のテクトニクスについて考察を行いたいと考えている。また、今年度も積極的に学会に参加し、これらの成果の発表を行う予定である。

今後は、リュツォ・ホルム岩体の他の地域に産出する岩石についても変成温度圧力の推定とジルコンの年代および希土類元素組成の測定を行い、岩体全体の温度-圧力-時間履歴の考察を進める。また、薄片中のジルコンについてその場でのカソードルミネッセンス像の観察を行い、ジルコンとザクロ石や反応組織との岩石学的関係も並行して明らかにする。可能であればスリランカや南インドなど他のゴンドワナ地域に見られる同種の岩石についても上記手法を適用し、超大陸規模のテクトニクスについて考察を行いたいと考えている。また、今年度も積極的に学会に参加し、これらの成果の発表を行う予定である。
慢性膵炎における膵線維化の病態解明-Smad3のトランスジェニックマウス作製-

慢性膵炎の病因および病態を解明するうえで膵臓の線維化機序を検討することは重要である。Smad3は線維化に関与していることが知られており、膵においてもSmad3の発現亢進により、線維化の増悪が予想される。Smad3導入遺伝子レポーターベクターは、テトラサイクリン応答因子を有するレポーターベクターにSmad3のcDNAを組み込んだマウスを作製した。Smad3を組み込んだマウスは16匹が得られ、PCRにて8匹(8系統)が確認できた。F1では8系統の内、5系統のマウスを得ることができた。F2では、3系統が継代可能であり、今後表現型などを検討する予定である。慢性膵炎の組織学的特徴は、膵実質のび漫性、時には限局性の炎症性破壊、消失に伴う不規則な線維化であり、慢性膵炎の病因および病態を解明するうえで膵臓の線維化機序を検討することは重要である。TGF-βの刺激が細胞外から伝達されるとII型およびI型受容体は細胞表面に複合体を作って活性化される。その複合体にSmad2やSmad3は結合して活性化され、Smad4とともに核内に移行し、DNAのプロモーター領域に作用して遺伝子の発現に関与していると考えられている。膵におけるTGF-βの作用は、Smad2よりもSmad3を経由していることが判明しており、膵においてもSmad3の発現増強により、線維化をきたしてくると予想される。今年度はTgマウス作製のため、まず導入するベクターを設計・作製した。臓器特異性をもたせ、必要な時期に発現を亢進させるために、クローンテック社製のTet-Onシステムを用いた。臓器特異性をもたせるためにプロモーターベクターとレポーターベクターの二種類のベクターが必要であった。プロモーターベクターはラットエラスターゼIのプロモーター領域をpTet-On vector CMVプロモーター領域の部分を組み換えることにより作製した。pTet-On vectorにはtTA(テトラサイクリン調節性トランス活性因子)とSV40poly(A)領域が含まれ、ラットエラスターゼIのプロモーター領域の下流に連結したDNA断片を作製した。Smad3導入遺伝子レポーターベクターの作製のため、テトラサイクリン応答因子を有するレポーターベクターにSmad3のcDNAを組み込んだ。ゲノムDNAを用いたほうが発現効率良好と思われたが、その場合には組み込むDNAが非常に長くなるために、今回はcDNAを用いた。実際にはマウスmRNAから得られたSmad3遺伝子の上流にテトラサイクリン応答因子(TRE)とminCMVを連結した領域およびレポーター領域に血液凝集素(HA)遺伝子とSmad3遺伝子とβ-globin poly(A)をもつDNA断片を調整した。来年度はこのDNAを用いてTgマウスを作成する予定である。昨年度まではTgマウス作製のため、まず導入するベクターを設計・作製した。プロモーターベクターはラットエラスターゼ1のプロモーター領域をpTet-On vector CMVプロモーター領域の部分を組み換えることにより作製し、Smad3導入遺伝子レポーターベクターは、テトラサイクリン応答因子を有するレポーターベクターにSmad3のcDNAを組み込んだものを作製した。今年度は、この二種類のベクターをマウス受精卵(200個以上)ずつに導入した。プロモーター領域を組み込んだマウスは27匹が得られ、PCRにて、5匹(5系統)のTgマウスが確認できた。Smad3を含むレポーターベクターを組み込んだマウスは16匹が得られ、PCRにて8匹(8系統)のTgマウスが確認できた。来年度はこの作製できたTgマウスの表現型などを調べた後に膵炎を惹起させたりする予定である。慢性膵炎の組織学的特徴は,膵実質のび漫性,時には限局性の炎症性破壊,消失に伴う不規則な線維化であり,慢性膵炎の病因および病態を解明するうえで膵臓の線維化機序を検討することは重要である。

TGF-βの刺激が細胞外から伝達されるとII型およびI型受容体は細胞表面に複合体を作って活性化される。その複合体にSmad2やSmad3は結合して活性化され,Smad4とともに核内に移行し,DNAのプロモーター領域に作用して遺伝子の発現に関与していると考えられている。膵におけるTGF-βの作用は,Smad2よりもSmad3を経由していることが判明しており,膵においてもSmad3の発現増強により,線維化をきたしてくると予想される。臓器特異性をもたせ,必要な時期に発現を亢進させるために,クローンテック社製のTet-Onシステムを用いた。プロモーターベクターはラットエラスターゼ1のプロモーター領域をpTet-On vector CMVプロモーター領域の部分を組み換えることにより作製し,Smad3導入遺伝子レポーターベクターは,テトラサイクリン応答因子を有するレポーターベクターにSmad3のcDNAを組み込んだものを作製した。昨年度は,この二種類のベクターをマウス受精卵(200個以上)ずっに導入した。プロモーター領域を組み込んだマウスは27匹が得られ,PCRにて,5匹(5系統)のTgマウスが確認できた。Smad3を含むレポーターベクターを組み込んだマウスは16匹が得られ,PCRにて8匹(8系統)のTgマウスが確認できた。今年度はこの作製できたTgマウスの表現型などを調べるために,継代可能な系を確立することにカを注いだ。F1では8系統の内,5系統のマウスを得ることができた。F2では,3系統が継代可能であった。TGF-betaの作用とSmad3に関する予備実験を行い,論文に発表した。今後はこの3系統を中心に繁殖をすすめて,表現型について精査する予定である。さらには膵炎を惹起させて,膵線維化の変化を観察する予定である。慢性膵炎の組織学的特徴は、膵実質のび漫性、時には限局性の炎症性破壊、消失に伴う不規則な線維化であり、慢性膵炎の病因および病態を解明するうえで膵臓の線維化機序を検討することは重要である。膵におけるTGF-βの作用は、Smad2よりもSmad3を経由していることが判明しており、膵においてもSmad3の発現増強により、線維化をきたしてくると予想される。臓器特異性をもたせ、必要な時期に発現を亢進させるために、クローンテック社製のTet-Onシステムを用いた。プロモーターベクターはラットエラスターゼIのプロモーター領域をpTet-On vector CMVプロモーター領域の部分を組み換えることにより作製し、Smad3導入遺伝子レポーターベクターは、テトラサイクリン応答因子を有するレポーターベクターにSmad3のcDNAを組み込んだものを作製した。昨年度は、この二種類のベクターをマウス受精卵(200個以上)ずつに導入した。プロモーター領域を組み込んだマウスは27匹が得られ、PCRにて、5匹(5系統)のTgマウスが確認できた。Smad3を含むレポーターベクターを組み込んだマウスは16匹が得られ、PCRにて8匹(8系統)のTgマウスが確認できた。この作製できたTgマウスの表現型などを調べるために、継代可能な系を確立することに力を注いだ。F1では8系統の内、5系統のマウスを得ることができた。F2では、3系統が継代可能であった。
低分子量唾液ペプチドの構造と口腔内機能に関する研究

唾液ペプチドの口腔内機能を検索した結果,炭酸カルシウムの沈澱形成を阻害するオリゴペプチドが唾液に含まれていることを見出した.すなわち,唾液にはリン酸イオンのほかに炭酸イオンが含まれており,とくに刺激唾液では炭酸イオンの濃度が著明に高まり,リン酸イオン濃度を上まわることが知られている.それにもかかわらず,唾液腺内結石は歯石の主成分はリン酸カルシウムであり,炭酸カルシウムが占める割合はきわめて少ない.この点に着眼して研究を行ったところ,ヒト唾液には炭酸カルシウムの沈澱形成を抑制する作用があることが判明した.実験に使用した反応系における唾液の有効濃度は0.91.0μgタンパク質/ml反応後であった.阻害活性を有する成分の検索を行ったところ,一連の高プロリン含有塩基性タンパク質にも阻害活性が認められたが,これらのタンパク質画分よりも,分子量3000附近および10002000のペプチド画分が高い阻害能を有することがわかった.この阻害能は各種のproteaseの影響を受けないが, alkaline phosphataseを作用させると速やかに消失した.また,唾液ペプチドが歯苔の有機酸性生成に及ぼす影響をしらべたところ,嫌気的条件下における酢酸生成を阻害するオリゴペプチドが存在することを見出した.すなわち,グルコース添加BHI培地1mlに歯苔懸濁液0.1mlおよひ唾液画分0.1mlを加え,好気的または嫌気的条件下にインキューベートして培地中に産生された有機酸を分析する実験条件を定めたのち,耳下腺唾液のペプチド画分について有機酸産生に及ぼす影響をしらべた.その結果,嫌気的条件下における酢酸産を著明に阻害するペプチドが存在することがわかった.ほかに, Sialinを合成して唾液ペプチド探索の指標としてが,唾液中にSialinの存在を確認することができなかった.唾液ペプチドの口腔内機能を検索した結果,炭酸カルシウムの沈澱形成を阻害するオリゴペプチドが唾液に含まれていることを見出した.すなわち,唾液にはリン酸イオンのほかに炭酸イオンが含まれており,とくに刺激唾液では炭酸イオンの濃度が著明に高まり,リン酸イオン濃度を上まわることが知られている.それにもかかわらず,唾液腺内結石は歯石の主成分はリン酸カルシウムであり,炭酸カルシウムが占める割合はきわめて少ない.この点に着眼して研究を行ったところ,ヒト唾液には炭酸カルシウムの沈澱形成を抑制する作用があることが判明した.実験に使用した反応系における唾液の有効濃度は0.91.0μgタンパク質/ml反応後であった.阻害活性を有する成分の検索を行ったところ,一連の高プロリン含有塩基性タンパク質にも阻害活性が認められたが,これらのタンパク質画分よりも,分子量3000附近および10002000のペプチド画分が高い阻害能を有することがわかった.この阻害能は各種のproteaseの影響を受けないが, alkaline phosphataseを作用させると速やかに消失した.また,唾液ペプチドが歯苔の有機酸性生成に及ぼす影響をしらべたところ,嫌気的条件下における酢酸生成を阻害するオリゴペプチドが存在することを見出した.すなわち,グルコース添加BHI培地1mlに歯苔懸濁液0.1mlおよひ唾液画分0.1mlを加え,好気的または嫌気的条件下にインキューベートして培地中に産生された有機酸を分析する実験条件を定めたのち,耳下腺唾液のペプチド画分について有機酸産生に及ぼす影響をしらべた.その結果,嫌気的条件下における酢酸産を著明に阻害するペプチドが存在することがわかった.ほかに, Sialinを合成して唾液ペプチド探索の指標としてが,唾液中にSialinの存在を確認することができなかった.唾液にはリン酸イオンのほかに炭酸イオンが含まれており、とくに刺激唾液では炭酸イオンの濃度が著明に高まり、リン酸イオンの濃度を上まわることが知られている。それにもかかわらず、唾液腺内結石や歯石の主成分はリン酸カルシウムであり、炭酸カルシウムが占める割合はきわめて少ない。以上の事実に着眼して、前年度の研究では唾液の炭酸カルシウム沈澱形成阻害能をしらべ、唾液に含まれる一連の高プロリン含有塩基性タンパク質のほかに、分子量1,0002,000および3,000附近の低分子量ペプチドにも阻害活性が認められた。本年度は、阻害活性を有する唾液ペプチドの精製をめざして努力したが、目的を達成できなかった。その理由として、一つには大量の唾液試料を必要とすることもあるが、なによりも、低分子量唾液ペプチドの系統的分画と精製に関する有用な実験条件を定めるに至っていないことが、本研究の障壁になっている。本年度は上記の研究のほかに、歯苔の有機酸生成に影響を及ぼす唾液ペプチドの検索を行ない、次の結果を得た。(1)グルコース添加BHI培地に新鮮な歯苔懸浤液を加え、37°Cにて好気条件下および嫌気条件下にインキュベートし、培地中に生成される乳酸と酢酸をシマズゲルSCR-101Hカラムを用いたHPLCで分析したところ、乳酸生成量は好気および嫌気の両条件下でほとんど差がなく、好気条件下で僅かに多い程度であった。しかし、酢酸生成量は嫌気条件下で多く、インキュベート8時間で好気条件下の1.3倍をしめした。(2)耳下腺唾液をゲル濾過法で粗分画した低分子量唾液ペプチド画分(10画分)について乳酸生成に及ぼす影響をしらべたところ、好気条件下の乳酸生成に対しては促進的に作用するが、嫌気条件下での乳酸生成を抑制する画分が見出された。
去勢抵抗性前立腺癌のドセタキセルに対する耐性獲得機構の解明と新規治療法の開発

平成30年度における本研究は、研究計画書に従い順調に推移した。まず、複数の去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)細胞株を、docetaxelに持続的に暴露させ、薬物濃度を段階的に上昇させることにより、docetaxelに対する耐性株を樹立した。なお、臨床的な視点を考慮し、docetaxelに対して母細胞株の約5-6倍のIC50を示す耐性株となるよう調整した。また、これらの耐性株は、cabazitaxelに対しては交叉耐性を示さず、母細胞株と同等の感受性を示すことを確認した。次いで、docetaxel暴露下および非暴露下における、Akt、MAPK、STAT3およびJNK等を介するシグナル伝達経路の主要分子の活性化を評価した。その結果、耐性株においては、docetaxel暴露の有無にかかわらず、AktおよびMAPKが恒常的にリン酸化されていることが明らかとなった。また、現在耐性株および母細胞株におけるチロシンキナーゼ活性を有する種々の受容体蛋白のリン酸化状態を、docetaxel暴露の有無別にRTK Phosphorylation Antibody Array (RayBiotech, Norcross, GA, USA)を用いて評価を行っている。研究実績の概要に記した通り、複数のCRP細胞株を用いて、docetaxelに対する耐性株を樹立し、さらに耐性獲得機序の一端を明らかにすることが出来た。以上より、本研究は概ね順調に進展していると判断するものである。まず、docetaxel抵抗性CRPC細胞株における遺伝子発現レベルの評価を行うが、これは特定の上皮間葉転換およびアポトーシス関連分子の発現をWestern blottingにより評価することに加え、ヒト前立腺癌組織を用いて作製したcDNA microarrayを用いた網羅的な遺伝子発現レベルの評価も併せて施行する予定である。次いで、昨年度および今年度以降の研究結果に基づき、CRPCのdocetaxelに対する耐性獲得に重要な役割を果たす可能性のある分子を同定し、それらの候補分子の活性を阻害し得る様々な方法を用いて、docetaxel耐性克服を目指した新規治療の確立に向けた検討を行う。具体的には、特異的阻害剤、アンチセンスオリゴ、siRNAおよび中和抗体等を用いることが想定している。昨年度の繰越金が生じた理由としては、研究そのものが順調に進捗したため、試薬等の購入費が予定額を下回ったという点と、当科研究室において既に所有していた物品を本研究において使用したという点が挙げられる。今年度においては、試薬および消耗品等で予定通り使用する見込みである。
ビスフェノール低用量効果はタンデムに並ぶ核内受容体が誘起する

プラスチック原料・ビスフェノールAには、低用量効果というごく微量の暴露での悪影響が知られている。しかし、エストロゲン受容体ERαやERβに対する結合は非常に弱いため、この分子機構は不明である。一方で、エストロゲン関連受容体(ERR)という別の核内受容体がERRα、ERRβ、ERRγの3種ある。申請者らはERαの活性がERRαやERRγの存在下で増強される現象を見出した。そこで「複数の核内受容体が応答配列に結合し、協同して転写活性を制御する協働作用が起きる」と考えた。この証明を試み、ERおよびERRの発現量には細胞特異性があること、ER-ERR協働作用は塩基長に依存することなどを明らかにした。申請者らはこれまでに、有害環境化学物質・新世代ビスフェノール・AFが、エストロゲン受容体α型に非常に強く結合し、活性化するアゴニストとして働くが、β型には活性を阻害するアンタゴニストであるという意外な新発見をした。さらに最近、ERαの活性は、ビスフェノールAにより、名前は似るが全く別の受容体であるエストロゲン関連受容体γ型が存在すると約20倍も増強される新奇な現象を見出した。これまでの緻密な転写活性試験と立体構造解析に基づき、「DNA上のタンデムなER応答配列に複数の核内受容体が結合し、互いの転写因子複合体に影響することによる、いわば『転写協同制御』がビスフェノール低用量効果の本質である」と考えられた。そこで本研究では、これら分子メカニズムの解明を目的とする。そのために、3年計画の初年度となる本年度は、培養細胞HeLa細胞で特に活性増強作用が強かったことから、TD47、MCF7など様々なエストロゲン受容体発現細胞において、エストロゲン受容体α型とβ型、さらに、エストロゲン関連受容体α型、β型、γ型のmRNA発現量をリアルタイムPCRで解析した。加えて各種転写因子などのmRNA発現量もリアルタイムPCRで解析した。さらに、これらに対するビスフェノールA暴露の影響を解析した。ビスフェノールAの暴露により、複数の受容体の発現量に変動が見られた。さらに、エストロゲンα型とβ型の細胞内局在解析実験のための発現プラスミドの構築を終了した。一過性発現により、その細胞内局在解析を現在実施中である。こうしてERαとERβの応答差異の分子メカニズム解明のための研究を順調に進展させた。申請者らはこれまでに、有害環境化学物質・新世代ビスフェノール・AFが、エストロゲン受容体α型(ERα)に非常に強く結合し、活性化するアゴニストとして働くが、β型には活性を阻害するアンタゴニストであるという意外な新発見をした。これまでの緻密な転写活性試験と立体構造解析に基づき、「DNA上のタンデムなER応答配列に複数の核内受容体が結合し、互いの転写因子複合体に影響することによる『転写協同制御』がビスフェノール低用量効果の本質である」と考えられた。そのために、3年計画の第2年度となる本年度は、まず前年度に構築したERαとERβの細胞内局在解析実験のためのEGFP融合発現プラスミドを用いて、CV1細胞で発現部位解析を実施した。いずれもリガンドであるビスフェノールAFの添加の有無にかかわらず、核に局在していた。細胞の種類や観察する時期特異的な局在の変化が考えられるため、今後引き続き検討を行い、リガンド依存的に局在が変化するのかを検討する。さらに、前年度に設計したゲルシフトアッセイのための受容体応答配列に従って核酸を合成し、放射ラベルプローブを用いた明敏なゲルシフトアッセイ系の構築に成功した。ところで、一般にレポーター試験には応答配列が3回繰り返された配列を用いる。そこで、放射比活性を指標に標識されたプローブの分子数が同じになるようにコントロールして1回繰り返しと3回繰り返し配列でエストロゲン関連受容体γ型の結合の程度を比較した。その結果1回のみの応答配列より3回繰り返し応答配列の方が、受容体が結合しやすいと考えられた。こうして計画した研究を順調に進展させた。有害環境化学物質・新世代ビスフェノール・AFは、エストロゲン受容体α型(ERα)に非常に強く結合し、活性化するアゴニストとして働く。一方で、β型には活性を阻害するアンタゴニストである。申請者のこうした意外な新発見に加え、さらに最近、ERαの活性は、ビスフェノールAにより、名前は似るが全く別の受容体であるエストロゲン関連受容体γ型が存在すると約20倍も増強される新奇な現象を見出した。そこで本研究では、これら分子メカニズムの解明を目的とした。そのために、3年計画の最終年度となる本年度は、次の実験を実施し成果を得た。まず、ERα型とβ型に対する新世代ビスフェノールの活性化機構の違いを解明するために、キメラ受容体の作製を行った。さらに、前年度までの実験結果に基づき、エストロゲン関連受容体γ型が存在することによるERα活性増強機構には、ERαが結合する応答配列の配向、すなわちDNA構造が重要であると考えられた。

そこで、応答配列をつなぐリンカー塩基を一塩基ずつ伸長して転写活性を測定することにより、活性増強機構に対する影響を精査した。リンカー塩基数が7 bpから22 bpまでのそれぞれのレポータープラスミドを作製し、エストロゲン関連受容体γ型が共存することによるERα活性増強機構を比較したところ、至適なリンカー塩基数が存在することが明らかになった。このように、計画した研究を順調に進展させ、新しい知見を複数得た。プラスチック原料・ビスフェノールAには、低用量効果というごく微量の暴露での悪影響が知られている。しかし、エストロゲン受容体ERαやERβに対する結合は非常に弱いため、この分子機構は不明である。一方で、エストロゲン関連受容体(ERR)という別の核内受容体がERRα、ERRβ、ERRγの3種ある。申請者らはERαの活性がERRαやERRγの存在下で増強される現象を見出した。そこで「複数の核内受容体が応答配列に結合し、協同して転写活性を制御する協働作用が起きる」と考えた。この証明を試み、ERおよびERRの発現量には細胞特異性があること、ER-ERR協働作用は塩基長に依存することなどを明らかにした。3年計画の第2年度となった本研究は、初年度に引き続き概ね計画通り順調に進展している。初年度にプローブの設計を行ったゲルシフトアッセイについては、予定通り申請者が既に構築済みのウサギ網状赤血球発現系を用いて全長を発現することにより核内受容体を調製して実施した。エストロゲン受容体α型およびβ型、エストロゲン関連受容体α型、β型、γ型の全ての受容体を発現できた。プローブはP32による高効率の放射標識を行い、アッセイに供出した。エストロゲン受容体とエストロゲン関連受容体の応答特性が識別出来た。さらに、これまでに作製した受容体をタンデムに並べることによる強制ダイマー発現プラスミドERαーERα、ERα-ERRα、ERRαーERα、ERRαーERRαの全てが、応答配列にモノマーを発現した場合と同様に結合していることが示された。こうして、エストロゲン関連受容体によるエストロゲン受容体の活性増強機構を考える上で、重要な知見を得られた。前年度に実行中であったCaspase7とのプロモーター部位配列のクローニングは、エストロゲン応答配列となる繰り返し配列により困難であったが、PCR酵素を検討ことにより最終的には目的領域を増幅できクローンの取得に成就した。レポーター試験では、人工的な応答配列同様に活性が見られた。しかし、エストロゲン受容体とエストロゲン関連受容体の共存による活性増強は見られなかった。また、本年度に予定通りERβの結晶化を実施したが、現時点では結晶は得られなかった。唯一、エストロゲン受容体α型およびエストロゲン関連受容体γ型の同時発現系における転写因子複合体の単離実験の実施が遅れている。これは実施計画を再検討しにより、より確実に複合体を取得できる方法を考慮しているためである。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物化学今後は、平成25年度に作製が終了し、平成26年度にCV1細胞を用いて試験した緑色蛍光タンパク質融合エストロゲン受容体α型およびβ型の新世代ビスフェノール依存的細胞内局在解析を、細胞の種類を変えて実施する。
画像認識における空間的特性の心理学的評価

視覚系に最初に入力される視覚情報の形態は,網膜に投影された2次元的な明るさの配列である。この配列に含まれる明暗の変動が我々にパターンについての情報をもたらすが,その中には,広い範囲にわたる大まかな変動も,局所的で細かな変動も含まれる。本研究においては,画像に含まれる種々の空間周波数成分を視覚情報のキャリアとして位置づけ,人が外界の対象像を認識する際に,どのような情報が用いられているかについての検討を行うことを目的とした。実験では,画像認識時の空間周波数特性を,初期視覚系の特性(コントラスト感度)から分離して測定するために,以下の手続きによった。まず,刺激画像に対して2次元の帯域通過型フーリエフィルタを適用し,特定の周波数成分を抽出したターゲット刺激を作成した。さらにこの画像のもつ位相成分のみを無作為化することによって,形状の情報をもたないマスク刺激を作成した。実験では,コンピュータ画面上に,種々のコントラスト比でターゲット刺激とマスク刺激の光学的重ね合わせをシミュレートして呈示し,認識の成立に最低限必要なコントラスト比を求めた。本年度の研究では,その大きさや基本構造が類似しており空間分析が行いやすいことから,人の顔を刺激として用い,その認識時の空間的特性を評価したが,その結果,顔の認識には顔の幅あたり20サイクル程度の中域周波数成分が重要であることが確認された。さらに,従来,画像の明暗反転や上下反転によって,顔の認識パフォーマンスは大きく低下することが知られており,両者は共に,人が顔を認識する際に部分の情報よりむしろ全体的な情報が重要であるためと論じられてきたが,本研究の結果から,前者は人が顔の画像から情報を抽出する際の周波数特性を反映するものであるが,後者は異なる原因(おそらくは画像から人物情報を読み取る際の方略が使えなくなるため)によるものであることが示唆された。
放射光X線によるヘテロ構造ナノワイヤの格子ひずみ解析と界面特性制御

その場放射光X線回折により、Au触媒InGaAsナノワイヤ(NW)成長におけるIn/Ga供給比の影響を検討した。その結果、In/Ga供給比が大きいほど、NWが下地の二次元層に埋没してしまうことがわかった。この問題を克服するため、成長温度を低くすることで、NWの成長を促進させ、二次元層への埋没を抑制することに成功した。InGaAs-NWのIn組成を調べたところ、In/Gaの供給比よりもIn組成は低くなることがわかった。この原因として、InはGaよりも結晶に取り込まれにくく、Au触媒中に残留しやすい可能性が示唆された。コアシェル型III-V族ナノワイヤは次世代量子デバイス構造として注目される一方で、コア/シェル界面での欠陥生成をいかに抑制出来るかが大きな課題となっている。したがって、ナノワイヤの結晶構造、格子定数、組成分布を同時に評価できる新たなその場測定の開発が求められている。本年度は放射光施設SPring-8、ビームライン11XUに設置の結晶成長その場X線回折装置(MBE/XRDシステム)を利用し、ナノワイヤ成長中のその場X線逆格子マッピング法を確立した。実験では、ガリウムヒ素基板上にコアに相当するインジウムガリウムヒ素(InGaAs)ナノワイヤを成長しながら、非対称逆格子ロッドの回折ピークをその場測定した。高エネルギーX線と2次元X線検出器を利用することで、ジンクブレンド構造、ウルツ鉱構造、双晶含有ジンクブレンド構造それぞれの格子定数および組成分布の変化を同時測定した。ウルツ鉱構造の回折ピーク位置からナノワイヤのインジウム組成は一定ではなく、成長時間と共に指数関数的に増加することが明らかになった。また双晶含有ジンクブレンド構造の回折ピークからナノワイヤと共に成長する二次元膜のインジウム組成がナノワイヤよりも高いことが明らかになった。このことから、均一な組成分布を有するInGaAsコアを得るためには、インジウムとガリウムの供給比の制御が極めて重要であることが示唆された。一次元構造の半導体ナノワイヤは、将来の量子ナノデバイスの構造として有望であり、結晶成長技術の確立が望まれている。これまで、ガリウム砒素(GaAs)基板上において、金(Au)を触媒として用いたGaAsナノワイヤの成長技術は確立されているものの、混晶であるインジウムガリウム砒素(InGaAs)ナノワイヤについての報告例は少ない。InGaAsはInとGaの組成比によって、バンドギャップエネルギーを広範囲に制御できる特徴があり、デバイス応用上も重要な材料である。平成27年度は放射光施設SPring-8(BL11XU)に設置の結晶成長その場X線回折装置を利用し、GaAsへのIn添加がナノワイヤ成長に与える影響を検討した。放射光を用いたその場X線回折の結果から、GaAsナノワイヤにInを添加するとナノワイヤの成長速度が低下し、結果的にナノワイヤが下地の二次元層に埋没してしまうことがわかった。さらにIn組成を高くするほど、ナノワイヤの成長速度は著しく低下することも明らかになった。その原因を追究するため、熱力学計算および電子顕微鏡による組成分析を実施した。その結果、Au触媒中のInはGaに比べてナノワイヤ結晶に取り込まれにくく、供給比の3倍以上のInはAu触媒中に残留することが示唆された。Au触媒にInがある程度溜まると、Au触媒はナノワイヤの成長に必要な固体状態から液体状態に変わるため、ナノワイヤ成長が阻害されたと考えられる。これを克服するため、Au触媒の共晶融点以下に成長温度を低温化した。その結果、高いIn組成においてもナノワイヤの成長速度の低下を抑えることができ、InGaAsナノワイヤの成長技術を確立することに成功した。本研究の実施により、放射光を用いたその場X線回折はナノワイヤの構造解析に有用であることが示された。今後は窒化物半導体などの各種材料系へ適用範囲の拡大が期待できる。現在までに、コアシェル界面のひずみ解析を実施する上で基盤となるその場測定技術を確立した。また、コアとなるInGaAsナノワイヤの成長技術も確立したため、残りはシェルとなるGaAsを成長しながらひずみ解析を実施するだけである。次年度(平成27年度)には当初計画通りのコアシェル界面のひずみ解析が達成される可能性が高い。さらに、当初計画では次年度(平成27年度)実施予定のコア/シェル界面評価用の蛍光測定システムを前倒して整備しており、結晶性評価は既に実施している。半導体結晶成長、放射光利用研究研究計画を変更する必要はなく、おおむね順調に研究は進展しているため2年間の研究実施期間で当初の目標を達成する可能性が高い。これまでに、ナノワイヤの格子ひずみ解析用その場測定技術の確立とコアとなるInGaAsナノワイヤの成長技術を確立した。したがって今後はシェルとなるGaAs成長中の格子ひずみ解析を実施し、コアシェル構造特有の臨界膜厚を実験的に明らかにする。
生体ボリュームイメージ解析を用いた骨細胞のメカノセンサー機能獲得過程の解明

骨細胞はメカノセンサーとして骨改造を統括していると考えられているが骨基質に囲まれているためその解析は困難を極めた。そこで我々は骨細胞単独に焦点を当てるのではなく、骨を基質構造と細胞構造の連続体として捉え、その両者の構築が骨細胞をメカノセンサーとして成熟させるのではないかと考えるようになった。そして「骨細胞は骨形成期において如何にメカノセンサーとしての機能を獲得していくのか?」という学術的問いに至った。そこで生体ボリュームイメージ解析により骨細胞と同時に個々のコラーゲン線維や石灰化領域も立体構築し、骨形成のステージで骨細胞にかかる機械的負荷をシミュレーションにより解明していく。
口腔レンサ球菌の免疫細胞による殺菌からの回避機構と感染性心内膜炎発症との関連性

口腔レンサ球菌であるStreptococcus gordoniiは傷ついた心内膜に感染し、疣贅を作る感染性心内膜炎を引き起こすことが知られている。本疾患の発症には細菌が心内膜に付着するだけでなく、血中に入った細菌が免疫細胞(好中球や単球など)による殺菌を受けずに生存していることが必須になる。S. gordoniiが免疫細胞による殺菌を回避することは報告されているが、殺菌回避に関与する遺伝子の報告はこれまでにない。そこで本研究では、S. gordoniiで免疫細胞による殺菌を回避するために働く遺伝子を探索し、その機能解析を行なう。その為、平成30年度は殺菌回避に関与する遺伝子を同定する目的で下記の研究を実施した。1S. gordoniiが好中球による殺菌を回避する際、どのような殺菌作用に抵抗性があるかを検討した。検査した殺菌物質は過酸化水素(H2O2)、酸(pH3.0)、リゾチーム、ディフェンシン、ラクトフェリンである。2好中球による殺菌の回避に働く遺伝子の探索を行った。当初Signature-tagged mutagenesis法を行う予定だったが、計画通りに進まなかった為マイクロアレイ法に変更して研究を進めることとした。具体的には好中球に感染させる前のS. gordonii DL1と感染させた後のDL1との間で発現が変化している遺伝子をマイクロアレイにより探索する。その為、まず初めに好中球がDL1を貪食する過程を経時的に観察し、サンプル回収に適している処理時間を検討した。次に、マイクロアレイに用いるRNAを調整する為に好中球に貪食されたDL1からRNAを効率よく回収する実験方法の確立を行った。好中球内に存在する細菌からRNAを効率よく抽出する実験方法の確立が予定よりも遅れてしまい、マイクロアレイが行えていない。確立出来次第早急にマイクロアレイを行う予定である。平成30年度の研究結果をもとに、令和元年度は以下の研究を行う予定である。1遺伝子欠損変異株を作製し、殺菌回避能が消失するかを検討マイクロアレイによって得られた情報を元に、目的遺伝子の単離、発現ベクターの作製を行い、S. gordonii DL1の目的遺伝子欠損変異株を作製する。作製した遺伝子欠損変異株を好中球に貪食させ、貪食後の生存率に変化があるかを調べる。当講座ではDL1株以外にS. gordoniiの標準株8株、臨床分離株2株を所有している。さらに、Streptococcus sanguinis、Streptococcus oralis、Streptococcus mutansなど他の口腔レンサ球菌も保有している。そこで、目的遺伝子がこれらの菌株にも存在するかをサザンブロット法により解析する。これらの菌株の好中球による殺菌に対する抵抗性はすでに明らかとなっている。そこで、本実験で得られる結果と、殺菌に対する抵抗性とを照らし合わせることで目的遺伝子が好中球による殺菌の回避に関与しているかを明らかにする。

さらに、Streptococcus sanguinis、Streptococcus oralis、Streptococcus mutansなど他の口腔レンサ球菌も保有している。そこで、目的遺伝子がこれらの菌株にも存在するかをサザンブロット法により解析する。これらの菌株の好中球による殺菌に対する抵抗性はすでに明らかとなっている。そこで、本実験で得られる結果と、殺菌に対する抵抗性とを照らし合わせることで目的遺伝子が好中球による殺菌の回避に関与しているかを明らかにする。好中球内に存在する細菌からRNAを効率よく抽出する実験方法の確立が予定よりも遅れてしまい、年度内にマイクロアレイが行えなかった。確立出来次第早急にマイクロアレイを行う予定である。
プロテオグリカンがつくる統合的細胞外環境とシグナル制御

細胞外マトリックスの構築と機能の中心的役割を担うと推測されるプロテオグリカン、バーシカンの生体内機能を、同分子のコンディショナルノックアウトマウスを用いて解析した。その結果、同分子が心臓形成初期の内皮細胞上皮間葉転換、中期の心筋細胞分化および中隔形成の各過程に必須であること、軟骨の初期発生と関節形成において重要な役割を果たすことがわかった。その作用はBMPsならびにTGFβのシグナル伝達制御を通じて発揮されることが明らかとなった。1.Cspg2^<flox/flox>マウス系列とPrx1-Creマウスとを交配させ、間充織特異的にバーシカン発現を欠失するマウスを作製し、解析を行ったところ、同コンディショナルノックアウトマウスは正常に出生したが生後4週頃より後肢の指に変形が出現した。また、ROSA26マウス系列とPrx1-Creマウスとを交配させprx1プロモーターの活性を経時的に解析したところ、生後2週の骨軟骨膜にも発現することがわかった。現在、指の異常の発症機構を探索中である。2.バーシカンのG1ドメイン内のAサブドメインを欠失したノックインマウスの解析を行い、同マウスが胎生期10.5-出生までの間に心形成不全によって死亡することを見出した。同マウスでは心臓の基本構造の形成に異常はないが、心室壁の拡張と心筋細胞の分化障害が観察され、これに伴う心不全が死因と考えられた。細胞外マトリックス分子に関しては、変異バーシカンとフィブリリンのマトリックスへの沈着低下が見られ、また、BMPシグナル伝達も抑制されていた。バーシカン沈着低下に基づく心室壁の脆弱化とBMPシグナル伝達抑制による心筋細胞分化障害が心拡張の原因と考えられた。TGFbetaの貯留量およびこれら分子のシグナル伝達の異常にもとづく心筋細胞の分化障害が原因と考えられた(論文投稿中)。4.本研究に関連する研究成果として、軟骨分化を促進するBMPのシグナル伝達経路を解析し、同リセプターに結合する分子としてSplicing factor 3bを同定した。バーシカン(旧遺伝子シンボルCspg2,現Vcan)は細胞外マトリックスの代表的な巨大コンドロイチン硫酸(CS)フロテオグリカンで、そのコア蛋白質は、ヒアルロン酸と特異的に結合するG1、他のマトリックス分子と結合するG3、中央に位置しCS鎖を共有結合するCSドメインを持つ。平成21年度は20年度に引き続き、以下の研究を推進した。Vcan<flox/flox>マウスと各種Cre発現マウスとの交配によって作製されたバーシカンコンディショナルノックアウト(cKO)マウスの解析を行った。CAG-CreER : Vcan<flox/flox>マウス:同マウス系列にタモキシフェンを投与し、バーシカンの発現の欠失と表現型を解析中である。Sm22-Cre : Vcan<flox/flox>マウス:当該マウスを作製したが、予想に反して大動脈に有意な異常は認められなかったが、心形成異常が見出された。現在詳細な解析を遂行中である。上記の如くVcan cKOマウス系が樹立できたのでG1-G3のトランスジェニックマウスを作製し、cKOマウスの表現型が回復するか否かを検討する方針に変換した。同マウス作製用のベクターの設計に不備があり、現在ベクターを再設計中である。バーシカンは細胞外マトリックスに存在する巨大なコンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate、CS)プロテオグリカンで、細胞外マトリックスのダイナミズムを司ると考えられている。本研究の目的は、バーシカンのコンディショナルノックアウトマウスとG1-G3ドメインから成るバーシカンV3バリアントのトランスジェニックマウス(V3-Tg)、さらにCS合成酵素遺伝子の強制発現系を駆使して、バーシカンが持つCS鎖の生体内機能を解明することである。平成21年度に挙げた成果を以下に記す。発生期四肢の間葉系細胞に特異的にバーシカンの発現を欠損するPrxl-Cre/Cspg2<flox/flox>マウスを作製し、野生型との比較解析を通じて同分子の四肢の骨格形成における役割を検討した。同変異マウスは正常に出生するが下肢足指の変形が観察された。組織学的解析から足指の変形の本体は異所性の肥大軟骨細胞結節の形成と関節表面の傾斜であり、これらの変異の原因が軟骨分化の遅延とこれによるInterzone(将来関節を形成する部位)の形成不全によることがわかった。バーシカン欠損による軟骨分化遅延機構を解析する目的でmicromass culture系を用いてシグナル分子やそのリセプターの分布を検討したところ、野生型ではTGF-βが形成中の軟骨結節周囲に局在したのに対し、バーシカン欠損細胞では幅広く分布していた(論文投稿中)。さらに現在、バーシカンによるTGF-βシグナル制御機構を解析中である。
武満徹と20世紀音楽

今日の日本を代表する作曲家武満徹の音楽と思想に関する体系的な研究を行なうべく、この作曲家に関する基本的な資料ー楽譜、著書、レコード、CD、コンサートのプログラム、演奏会評等ーの収集と整理を集中的に行なった。今回の資料収集で特に力点をおいたのは、武満の1960年代から1980年代にかけて世界各地で行なわれた創作・演奏の記録の収集と整理で、作曲家自身および出版社日本ショットの協力を得て作曲者自身の作品解説、音楽祭や演奏会のカタログやパンフレット、英・独・仏・伊・米語による新聞雑誌の批評をほとんど網羅的に収集できた。これらの資料を、約50冊のファイルに年代順に分類した。これらの基本的な資料の収集と整理によって、武満徹の音楽活動を、クロノロジカルに正確に展望することができるようになった。武満徹の音楽は、日本の伝統音楽とその美学思想に深く根ざしていると同時に、ドビュッシーからはじまる20世紀前半のヨーロッパ音楽、ケージにはじまる20世紀後半のアメリカ音楽から多くの影響を受けている。今回の研究では、武満の音楽作品を20世紀の世界の芸術音楽の諸潮流のなかにおき、その様式を分析することによって、武満の音楽様式が、ドビュッシー、シェーンベルク、メシアン、ケージの様式と思想から影響を受けていることを明らかにした。武満の音楽は、能や雅楽にみられる〈間〉や〈自然〉に基本をおきながら、欧米の作曲家の様式と思想に影響を受けつつも、独自のユニークな音楽的時間と音楽的空間を作りだしているのである。今回の基本的な資料の収集と整理と、20世紀音楽史のなかでの音楽様式の基礎的な分析の結論をふまえ、〈武満徹と20世紀音楽〉の著書にまとめるのが次の課題である。
子ども・若者の能力主義・競争意識についての経年比較調査研究

本研究の目的は、能力主義原理とそれに伴う競争の社会過程を基本的に是認する意識(=「能力主義・競争意識」)が、特に今日の日本の子ども・若者においては、どの程度見られるか、かれらの様々な意識や行動との間に規定・被規定の関係をもちつつそれらの全体の中にどのような位置を占めながら存在しているか、またその能力主義・競争意識がどのような変化の傾向性を孕みながら存在しているかを把握することである。そのために、2000年代に実施され研究代表者が携わった学齢期の子ども・若者対象の2つの質問紙調査の結果との経年比較が可能な形で、新たに子ども・若者対象の質問紙調査を設計し、実施する。