hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熊本県における有機溶剤(特にスチレン)使用とその健康影響に関する総合的研究

スチレンの量・影響関係を確立し、スチレン個人暴露量と色覚異常や末梢神経および皮膚障害との疫学的な関連性を検討することを目的として、平成9年度から3年間の調査研究を行った。平成9年度には、熊本県下でスチレンを使用する9つのFRP事業所の従業員を対象として、11月1月の冬期に調査を行い、平成10年度には特に季節による差も検討するため、上記に2つの事業所を加えて、7月9月の夏期に同様の内容の調査を実施した。その結果、1)夏期のスチレン作業環境濃度は冬期と差が無く、また許容濃度より低値で作業者の個人暴露濃度平均値の半分以下であった。2)スチレンの個人暴露濃度が許容濃度(50ppm)を越えた作業者はほとんどおらず、これには中小企業であるが故の自然換気と不景気が影響していると推察された。3)マスク未使用者におけるスチレン個人暴露濃度と尿中マンデル酸排泄量の相関係数は、夏期も冬期も0.9前後と高かった。これらの回帰直線から求めた、FRP作業者のスチレン個人暴露濃度50ppmに相当する尿中マンデル酸排泄量は、0.60g/g・Crとこれまでの報告より若干低値を示した。4)スチレン暴露者は性・年齢をマッチさせた対照者に比較して、冬期も夏期も色覚テスト(ランソニーパネルD-15)の得点が悪かったが、この得点と現在のスチレン個人暴露濃度との間には関連がなかった。5)皮膚検診により40%弱の対象者に何らかの皮膚障害が観察された。平成11年度には、これらに自覚症状データを加えてマスターファイルを作成した後に、相互関連性を検討している。一方で、皮膚障害の原因を追求するため溶剤等から化学物質を精製分離し、被験者の合意を得た上でパッチテストを行い、現在解析中である。さらに、いままでの調査結果を逐次各事業所に還元し、作業者ぐるみの健康教育に役立てている。スチレンの量・影響関係を確立し、スチレン個人暴露量と色覚異常や末梢神経および皮膚障害との疫学的な関連性を検討することを目的として、調査研究を行なっている。本年度は、熊本県下でスチレンを使用するFRP事業所のほとんどを訪問し、その多くの協力を得て、まず各事業所のスチレン使用に関する資料を収集しスチレン作業者を同定した。平成9年10月から平成10年1月にかけて第1回目の集中調査(9事業所の各1-2日)を行ない、1)各人の作業歴の聞き取りと作業条件・作業内容に関するタイムスタディー、2)作業前後の自覚症状、3)作業環境中のスチレン濃度の測定、4)各作業者にバッシブサンプラーを装着してスチレン個人暴露濃度の測定、5)作業終了時に採尿してマンデル酸排泄量の測定、6)皮膚障害の臨床的観察、を行なった。その結果、1)スチレン作業環境濃度は低く、作業者の個人暴露濃度の平均の50%以下であった。2)スチレンの許容濃度50ppmを越えた個人暴露濃度を示したのは10%未満で、これには防毒マスクの使用のみならず、中小企業であるが故の自然換気も有効と考えられた。3)スチレン個人暴露濃度と尿中マンデル酸排泄量の相関係数はマスク未使用者で0.88と高かった。これらの回帰直線からFRP作業者のスチレン個人暴露濃度50ppmに相当する尿中マンデル酸排泄量は0.69g/

gCrとこれまでの報告より若干低値であった。4)皮膚診断により40%弱の対象者に何らかの皮膚の異常がみられた。現在、これらのデータに自覚症状を加えて相互関連性を検討しており、来年度は上記集中調査を最も環境条件の悪い夏と、作業改善を積極的に進める予定の冬に2度実施し、全3回の調査結果の差異を検討する予定である。一方で、これらの資料・調査結果を各事業所に還元し、作業者ぐるみの健康教育に役立てたいと考えている。スチレンの量・影響関係を確立し、スチレン個人暴露量と色覚異常や末梢神経および皮膚障害との疫学的な関連性を検討することを目的として、昨年度に引き続き調査研究を行った。昨年度は、熊本県下でスチレンを使用する9つのFRP事業所の従業員を対象として、11月から1月の冬期に調査を行ったが、本年度は特に季節による差も検討するために、上記に2つの事業所を加え、7月から9月の夏期に同様の内容の調査を実施した。すなわち、1)作業条件・作業内容に関するタイムスタディー、2)作業前の自覚症状、3)1日の作業環境中のスチレン濃度の測定、4)パッシブサンプラーを用いたスチレン個人暴露濃度の測定、5)作業終了時の尿中マンデル酸排泄量の測定、6)皮膚障害の臨床的観察、を行った。その結果、1)夏期のスチレン作業環境濃度は冬期と同様に環境基準濃度より低く、また作業者の個人暴露濃度の平均値の半分以下であった。2)スチレンの個人暴露濃度が許容濃度50ppmを越えた作業者はほとんどおらず、これには中小企業であるが故の自然換気と景気の悪さが影響していると考えられた。3)マスク未使用者におけるスチレン個人暴露濃度と尿中マンデル酸排泄量の相関係数は、夏期も冬期も0.9前後と高かった。これらの回帰直線から、FRP作業者のスチレン個人暴露濃度に相当する尿中マンデル酸排泄量は0.60g/g・Crと、これまでの報告より若干低値を示した。4)スチレンに暴露された者は性・年齢をマッチさせた対照者に比較して、冬期も夏期も色覚テスト(ランソニーパネルD-15)の得点が悪かったが、現在のスチレン個人暴露濃度との間には関連性は見られなかった。5)皮膚検診により40%弱の対象者に何らかの皮膚障害が観察された。現在、これらのデータに自覚症状の結果を加えて相互関連性を検討する一方、皮膚障害の原因を追求するため、パッチテストを希望者に順次行っているところである。また、逐次これらの調査結果を各事業所に還元し、作業者ぐるみの健康教育に役立てている。スチレンの量・影響関係を確立し、スチレン個人暴露量と色覚異常や抹消神経および皮膚障害との疫学的な関連性を検討することを目的として、平成9年度から3年間の調査研究を行った。平成9年度は、熊本県下でスチレンを使用する9つのFRP事業所の従業員を対象として、11月から1月の冬期に調査を行い、平成10年度は特に季節による差も検討するために、上記に2つの事業所を加え、7月から9月の夏期に同様の内容の調査を実施した。その結果、1)夏期のスチレン作業環境濃度は冬期と同様に環境基準濃度より低く、また作業者の個人暴露濃度の平均値の半分以下であり、2)スチレンの個人暴露濃度が許容濃度50ppmを越えた作業者はほとんどおらず、これには中小企業であるが故の自然換気と景気の悪さが影響していると推察され、3)マスク未使用者におけるスチレン個人暴露濃度と尿中マンデル酸排泄量の相関係数は、夏期も冬期も0.9前後と高かった。
「統合古典籍データベース」(国文学研究資料館)を利用した個別書誌作成の試み

本年度は、本研究の最終年度として、(1)から(4)までの実施計画の項目に基づき、以下のような作業を進め、一応のまとまりを付けることができた。(1)分類体系の検討『内閣文庫国書分類目録』を基本に立てながら、他の目録類を参考に検討を加えた。また、文学及び音楽、演劇の領域を中心に、古典文学としての体系性、研究の現状などの観点から、思い切った見直しを加えて、改正試案を作成した。これにより今後、順次、他の領域にも見直しを加えて、全体の改正試案を作成する基礎ができた。(2)当館蔵和古書分類目録の作成国文学研究資料館所蔵で、現在、業務レベルで整理を終えている和古書約8,000点のうち、前年度までに分類コードを与えられなかった準漢籍類、諸大名コレクション、貴重書、その他、約1,000点について、それぞれ内容を検討し、分類コードを付与した。(3)分類仮目録の作成(2)により、和古書8,000点すべての分類コード付与作業が終了し、コードによる排列が可能となったので、その排列に従って分類仮目録(「国文学研究資料館蔵和古書分類仮目録」)を作成した。(4)他機関との協議等今年度は、当館主導の共同研究「古典籍の分類に関する総合研究」(代表者・鈴木淳)とリンクし、他機関の研究者等と古典籍の分類について討議を重ね、その成果を今後の研究に反映させる道筋を付けた。またドイツ、ケルンのゲルハルト・プルヴェラー氏の日本絵本コレクションの調査を行い、絵本類の分類について研究を行った。今年度は、既成の50音順の『国文学研究資料館蔵和古書目録』に対する分類上の検討を重点的に行った。すなわち同目録に掲載されている計7,500点の和古書について、『内閣文庫国書分類目録』と『国書総目録』の分類を当てはめる作業を行った。その結果、全体の約3割ほどのタイトルに『内閣文庫国書分類目録』の分類を与えることができ、9割強のタイトルに『国書総目録』の分類を与えることができた。両書の分類を比較すると、たとえば、『禁秘抄』は典例・儀式か、有職故実か、『皇太神宮年中行事』は神社(神宮)か、祭祀か、『国号考』は地誌か、国学か、その他の分類概念の相違に起因する差異が存することが明らかになった。今後はそれらを分類体系の上から検討し、分類シソーラスを完成させ、『和古書目録』の分類目録化を完成させる必要がある。また、他機関との協議については、大英図書館、ロンドン図書館(SOAS)等と和古書の分類、整理の問題について話し合った。また、ドイツ国ケルンのプルベラー邸の絵本類調査や、アイルランド国のチェスタービーティー・ライブラリー所蔵絵本の図録作成を通じ、絵本類の分類上の問題、とくに絵本、画譜の分類の定義、狂歌絵本、絵俳書など文学を主題とする絵本の捉え方などについて、実践的な取り組みを行った。和古書の中でも、海外に多く所伝し、分類上、もっとも問題を孕んでいるのは絵本類であり、その検討を抜きにしては、分類体系を確立できない。そのため、本年度は絵本類の分類の定義について重点的に研究を進めた。本年度は前年度に引き続き、既成の50音順目録『国文学研究資料館蔵和古書目録』の分類目録化に向けて、国文学研究資料館並びに他機関が所有する分類目録等の調査を行い、目録の分類語等に関する検討を中心に行った。その際の作業方法並びに手順については、以下の通りである。1.『内閣文庫国書分類目録』『大東急記念文庫目録』『国書総目録』『古典籍総合目録』の4種類の目録における分類語について比較検討を行うと共に、『和古書目録』の中に取り入れた。2.『内閣文庫国書分類目録』の分類・配列に従って、各分類語にそれぞれ固定番号を付け、分類シソーラスの基本となる資料を作成した。

3.館内の「国書基本データベース」より、館蔵の和古書のみを抜き出したデータをもとに、1の『和古書目録』にメモした分類語と、2で付けた固定番号をもとに一覧表を作成し、データ入力作業を行った。4.1で挙げた目録に記載がなく、分類が不明のものについて、内閣文庫の分類方式に近い他館の所蔵目録や、『神道書分類目録』等の主題別目録を資料として調査を行い、3で作成した一覧表の不足部分について補充した。5.14の作業を行ったことにより、国文学研究資料館蔵の和古書データ総数7,954点のうち、現在までで997点の分類未了を残すだけとなり、来年度も引き続き作業を行う。6.国内の所蔵機関や海外の大英図書館、ドイツのプルベラー家などに赴き、古典籍の分類の現状を調査し、併せて絵本等、分類が未解決の分野について、検討を加えた。本年度は、本研究の最終年度として、以下のような作業を進め、一応のまとまりを付けることができた。(1)「分類体系の検討」については、『内閣文庫国書分類目録』を基本に立てながら、他の目録類を参考にして検討を加えた。また文学及び音楽、演劇の領域を中心に、古典文学としての体系性、研究の現状などの観点から、思い切った見直しを加えて、改正試案を作成した。これにより今後、順次、他の領域にも見直しを加えて、全体の改正試案を作成する基礎ができた。(2)「当館蔵和古書分類目録の作成」については、国文学研究資料館所蔵で、現在、業務レベルで整理を終えている和古書約8,000点のうち、前年度までに分類コードを与えられなかった準漢籍類、諸大名コレクション、貴重書、その他、約1,000点について、それぞれ内容を検討し、分類コードを付与した。(3)「分類仮目録の作成」については、(2)により、和古書8,000点すべての分類コード付与作業が終了し、コードによる排列が可能となったので、その排列に従って分類仮目録を作成した。(4)「他機関との協議」等については、今年度は、当館主導の共同研究「古典籍の分類に関する総合研究」(代表者・鈴木淳)とリンクし、他機関の研究者等と古典籍の分類について討議を重ね、その成果を今後の研究に反映させる道筋を付けた。またドイツ、ケルンのゲルハルト・プルヴェラー氏の日本絵本コレクションの調査を行い、絵本類の分類について研究を行った。
生態系生態学と数理最適化の融合による複合型内湾養殖漁業の高度化

1)志津川湾内の複数ゾーンにおける栄養塩・有機物動態パターンの調査,2)物質動態の違いが養殖生物各種の成長や生残に及ぼす影響および各種養殖生物の栄養・餌料要求の調査,3)世帯レベルで漁業者が複合型養殖の施業形態を決める社会的・経済的要因(世帯労働力,求める収入,技能等)の調査を実施する.これらの情報をもとに,持続的な施業の観点から同一の内湾域において複数生物種を適正に養殖する条件を明らかにする.1)志津川湾内の複数ゾーンにおける栄養塩・有機物動態パターンの調査,2)物質動態の違いが養殖生物各種の成長や生残に及ぼす影響および各種養殖生物の栄養・餌料要求の調査,3)世帯レベルで漁業者が複合型養殖の施業形態を決める社会的・経済的要因(世帯労働力,求める収入,技能等)の調査を実施する.これらの情報をもとに,持続的な施業の観点から同一の内湾域において複数生物種を適正に養殖する条件を明らかにする.
長寿命遷移を用いたラビサイクルレーザ冷却装置の試作

本試験研究では長寿命遷移を用いてCa原子をレーザ冷却するためのラビサイクル冷却用光変調装置を試作し、その冷却性能を評価する。平成5年度はラビサイクルレーザ冷却を行なうために必要となるレーザ光源の条件について検討し、その条件を満たす光変調装置を試作した。平成6年度は、引き続き、ラビサイクル冷却に必要な条件をシミュレーションにより求めた。その結果ラビサイクル冷却を実現するためには、以下の条件を満たす必要がある。1)吸収光と誘導放出光の周波数は共鳴周波数に対してほぼ対称になる。2)完全なπパルスを実現する。この要求精度はサイクル数が多いほど厳しくなる。3)1パルス毎にレーザー周波数を反跳による減速分だけシフトする。4)減速スピードと周波数掃引スピードを一致させる。5)パルス幅は短いほうが望ましい。この結果をもとに実際の装置の設計をCa原子の長寿命遷移で行なった。現在、設計された装置を実現するべく装置の開発を行なっている。既に、πパルスの作成装置についての研究は終え、一度光学系を組み立て、実際にCa原子に照射する実験を行なった。しかし、レーザ冷却装置を完成するためには指摘されたように早い周波数掃引が必要で、そのタイミング回路を現在試作中である。シミュレーションの結果にあるように、如何に正確なπパルスを実現できるかで減速できる範囲が決まる。それゆえ、本方式は初段の減速より、ある程度冷却された原子の冷却に向いている。本研究では、長寿命遷移を用いてCa原子などをレーザ冷却するためのラビサイクルレーザ冷却用光変調装置を試作し、その冷却性能を評価する。平成5年度は、ラビサイクルレーザ冷却を行うために必要となるレーザ光源の条件について検討し、その条件を満たすための光変調装置を試作し、その性能を測定した。具体的には以下のことを行った。1.購入した設備備品の周波数変調装置を用いて、安定に単一周波数で発振し周波数掃引できる色素レーザが設備できた。2.ラビサイクルを使って原子に吸収と誘導放出を交互に行わすために、レーザ光の発振周波数を基準に、周波数シフト用発振器、高周波増幅器でドライブしたE-Oフェーズモジュレーターを用いてドップラーシフト周波数内に側帯波を発生させることができた。3.原子ビームとレーザ光の相互作用時間内に多重回のラビサイクルを行わすために、この光を1MHzの周波数で交互に強度変調する装置を試作し、出力光の特性を測定した。10MHzの周波数での強度変調は理論的に可能であるが、減速の確認実験には現在1MHzの性能で十分可能であると思われる。4.レーザ冷却の効果を原子の速度分布の変化で評価するために、速度分布測定のための高感度光検出技術について検討を行った。6)原子が見る最初のパルスは吸収πパルスであることが望ましい。既にπパルスの作成装置についての研究は終え、一度光学系を組み立て、実際にCa原子に照射する実験を行なった。シミュレーションの結果にあるように、如何に性格なπパルスを実現できるかで減速できる範囲が決まる。
都市スケール建築エネルギー需要モデルの精度保障に関する研究

民生部門を対象とするエネルギーマネジメントは重要な課題である。近年エネルギーマネジメントの中長期的な効果を推計するエネルギー需要モデルの開発が盛んに行われている。本研究はエネルギー需要モデルの数値計算結果の精度を保障するモデル開発手法を開発した。また、開発した手法を地域、都市、国家と異なる空間スケールの家庭・業務ストックに適用し、中長期の温室効果ガス削減シナリオの評価などに用い、開発手法の有用性を示した。アジア諸国の多くの都市において、建築に起因するエネルギー消費は急速に増加している。エネルギー消費の増加は大気汚染やヒートアイランド現象、地球温暖化などの環境影響をもたらすだけではなく、ピーク電力需要の伸びによる電力インフラへ圧迫などさまざまな影響を及ぼしている。その影響を緩和し、望ましい建築ストックを集積していくためには、建築のエネルギーの構造を解析し、エネルギー需要の総量および時間的変動を制御することが重要である。本研究は、このような目的に用いることができるエネルギー需要の数値モデル(エネルギー需要モデルとする)において数値計算結果の精度を保障するモデル開発手法を確立することを目的とする。エネルギー需要モデルにおける誤差は、(1)計算アルゴリズム、(2)入力条件、(3)最終出力の算出部分に含まれる誤差、不確実性によって生じる。本年度は、特に(2)、(3)の領域に注目し、エネルギー消費の実績値が得られた建物(100件程度)を対象としてエネルギー消費量の予測を行い、各種の建物属性がエネルギー消費に及ぼす影響、加えて、モデルの簡略化手法によってもたらされる予測精度の低下を定量化した。このほか、大阪市業務部門、日本の家庭部門、大阪府豊中市家庭部門、新規建設が予定されている集合住宅や複合施設などを対象としてエネルギー需要モデルを開発し、精度検証を行ったほか、居住者の行動、照明などのエネルギー消費機器、建築・設備の性能、気象条件など、エネルギー需要に影響を及ぼす要因を考慮して可能な限り計算精度を向上させるためのモデル開発手法を検討した。本研究は民生部門におけるエネルギー需要の構造を解析し、エネルギー需要総量および時間的変動を制御する方法の検討に用いることができるエネルギー需要モデルを開発するとともに、数値計算結果の精度を保障するモデル開発手法を確立することを目的とした。エネルギー需要モデルとしては、民生家庭部門(地域・都市・国家の3スケール)、民生業務部門(地域・都市の2スケール)のエネルギー需要モデルのほか、近畿圏における民生部門・旅客交通部門のエネルギー需要モデルを開発し、エネルギー需要構造の分析を始め、温暖化対策技術導入・普及、人口構造の変化によってもたらされるエネルギー消費量変化の分析に用いた。開発したモデルは人、機器、建物・住宅をエネルギー需要の最小単位とし、その積み上げとして対象地域のエネルギー需要を表現するものである。エネルギー需要モデルの設計においては、モデルの最小単位のエネルギー需要モデルにおいてパラメータスクリーニングを行い、モデルの入力条件における不確実性が出力の誤差に及ぼす影響を相対的に比較し、影響の大きいものから当該パラメータに起因する不確実性を減少させるための手法を決定し、モデル全体における精度を確保する方法を開発した。この成果は地域エネルギー需要モデルの開発手法として建築部門におけるシミュレーション専門誌であるJournal of Building Performance Simulationに投稿し、採択が決定している。加えて、同済大学の譚教授の指導のもと、上海家庭部門のエネルギー需要モデルを開発し、将来におけるエネルギー消費量の増加や各種エネルギー技術の向上によってもたらされる二酸化炭素排出量削減効果の定量化を行った。
CD差スペクトル法による鎖状ポリオールの絶対配置決定法の開発

近年、微生物や海洋生物から複雑な鎖状ポリオール構造を持つ生理活性物質が、単離構造決定されている。しかし、生物活性と密接に関連する立体構造については、ほとんど未解決のままである。本研究では、「相対配置を決めることなく絶対配置を決定する」という研究命題を掲げ、我々が既に考案したCD差スペクトル法が、末端に1,2-ジオール構造を持つ鎖状1,2,4,6...ポリオールの直接的な絶対配置決定にも有効であるかどうかを検討した。1.光学活性ポリオール化合物の合成光学活性ブタン-1,2,4-トリオールを出発原料にして6-ヘプテン-1,2,4-トリオールの光学異性体4種、ヘキサン-1,2,4,6-テトラオールの光学異性体およびそれらの誘導体8種を合成した。さらに我々が開発した四炭素増炭法による1,3-ポリオール合成法を用いて、不斉炭素を3個もつ1,2,4,6-テトラオール誘導体4種を合成することに成功した。2.CD差スペクトル解析合成したモデルポリオールは、CDスペクトル測定のために2種の誘導体すなわち完全ベンゾイル体(I)と1-O-ピバロイル-2,4,..-ベンゾイル体(II)に導いた。IとIIのCDスペクトルを測定し両者の差スペクトルを求めたところ、そのコットン効果の符号が正の符号ならば2S配置、負ならば2R配置と決定できることが判明した。従って、本法は、関連天然物の立体化学の研究に対して有用な手段を提供するものである。
緑内障視神経症における軸索流変化を捉える画期的な眼底イメージング

緑内障は、網膜神経節細胞の軸索(視神経)がダメージを受け、細胞生存に必要な物質の軸索輸送が停止することにより、細胞死を起こし、失明する。本研究の目的は、緑内障における軸索輸送の時間空間的変化を無侵襲かつライブイメージで観察し、その病態をあきらかにすることである。我々は、眼科診療機器である光干渉断層計(OCT)で、軸索輸送されるミトコンドリアが観察出来る画期的な実験マウスであるYFP-Thy1-mito-トランスジェニックマウスを独自に作成した。このマウスを用いて、軸索内を輸送されるミトコンドリアが、緑内障でどのように分布変化するのかを無侵襲かつ経時的に観察する。
可逆的酸化還元反応による転与調節タンパクの活性制御機構

大腸菌OxyRタンパクは、細胞が酸素ストレスに晒された時に発現する遺伝子群の転写活性化タンパクである。この研究では、酸化ストレス下で起こるOxyR蛋白の活性化は蛋白内のどの場所のどのような修飾によるのかを明かにすること、及び、活性型OxyR蛋白を還元して不活性型に変換する酵素(現在、同定されていない)を同定し、その働きを調べることにより、酸化還元による蛋白の機能制御機構を明かにすること目的とした。今年度は、次のような結果が得られた。1)蛋白質内のメチオニンの酸化型であるメチオニンスルホキシドを還元する酵素であるメチオニンスルホキシド還元酵素の遺伝子をクローン化した。このクローン化した遺伝子を用いて、OxyRの活性制御にメチオニンの酸化型が関与している可能性を検討した結果、メチオニン残基の関与はないことが明かとなった。2)OxyR蛋白によって発現の調節されている遺伝子を解析している過程でクローン化した遺伝子の内の一つについて塩基配列の解析の結果、この遺伝子のコードする蛋白は、蛋白質の酸化還元反応に関与している可能性のあることが解った。現在、この蛋白質がOxyR蛋白の活性制御に関与しているかどうかを調べるため、この蛋白質の増産、精製と、この遺伝子を欠く変異株の作成を行っている。3)OxyR蛋白の機能ドメイン解析を行うため、oxyR遺伝子にランダムな変異を導入したライブラリーを作成した。このライブラリーの中から、レドックス応答能を失った変異体を選択した。現在このクローンの詳細な解析を行っている。
学校文化の影響と新任教師の成長：小学校英語教育に関する教員養成の成果と課題

1.2019年度:文献研究、予備調査(5名の内、英語の授業を担当している新任教師の授業参観、インタビューを開始)。予備調査に基づいて、インタビューの質問項目を修正。2.2020年度:文献研究、本調査開始。3.2021年度:本調査継続、成果発表(中間発表:国内および海外の研究集会)。4.2022年度:本調査を終える、成果発表(最終発表:国内および海外の研究集会)。
傍腫瘍性症候群で出現するHu、Yo抗体の神経細胞発達・分化に対する阻害性の検討

傍腫瘍性症候群で出現するHu、Yo抗体の神経細胞発達・分化に対する阻害性を検討するために、今回はラット胎仔の大脳皮質由来神経細胞を抗Hu抗体存在下に培養し、神経細胞の突起伸展と生存に対する影響およびHu抗原の機能を探るために免疫電子顕微鏡レベルで免疫反応を用いて抗原の局在を調べた。[方法](1)神経細胞の初代培養;妊娠17日目のSDラットより胎仔を取り出してEagle's MEM培養液中にて大脳皮質を取り出した。トリプシンにて30分間酵素消化、血清添加培養液で中和後、ステンレスメッシュを通して細胞を分散させた。細胞数をカウントしてから3×10^4cells/wellで8 wellのチャンバースライド(Nunc)に蒔き3日間培養した。(2)抗Hu抗体の神経毒性の検討;上記神経細胞培養系に抗Hu抗体を補体添加あるいは無添加の条件で正常ヒトIgGをコントロールとして、添加2日目での生細胞数をトリパンブルー染色法にて検討した。また神経細胞の形態を抗NF(ニューロフィラメント)、抗NSE(神経細胞特異的エノラーゼ)あるいは抗MAP2(微小管結合蛋白質2)抗体を用いて免疫細胞化学的に染色して対照と比較検討した。(3)Hu抗原の免疫電子顕微鏡による神経細胞内局在;抗原の局在を明らかにするために培養した神経細胞を常法にて固定、超薄切後、抗Hu抗体で染色してから金コロイド結合ヤギ抗ヒトIgGと反応させ、電子顕微鏡にて観察した。(3)[結果と考察]初代培養神経細胞が形態的に成熟な突起の発達および分化を遂げる過程である培養3日目にて抗Hu抗体の影響を調べた。その結果、神経細胞の生存率は補体の添加の有無に関係なく統計学的には有為な変化は見られなかった。しかしながら、神経細胞の抗NF、抗NSEあるいは抗MAP2を用いた形態学的観察から昨年報告した研究結果(奨励研究課題番号07770462)のように、抗Hu抗体添加の培養系では神経突起の成長が阻害されている傾向が見られた。また抗Hu抗体を用いた神経細胞の免疫電顕の結果、細胞核内では抗Hu抗原はヘテロクロマチンに結合して存在することが示唆された。このことはHu抗原がRNAのスプライシングに関係するRNA結合蛋白質であるという証拠に加えて、核内では別な機能をしている可能性が示唆された。すなわち、抗Hu抗体が核内になんらかの形で侵入した場合、抗Hu抗体がHu抗原が抑制している遺伝子を発現させる可能性が示唆され、それによって神経細胞がアポトーシスを起こすことも考えられる。この変化は時間を要すると思われるので、さらに長期間の神経細胞の培養系を使った実験が必要と思われれる。
MRI環境下高精度画像診断・治療支援プラットフォームの開発

本研究では,次世代医療のモデルとなる,医用画像撮影・観察下において高精度な治療を行うためのインタラクティブな治療支援機器の基盤技術開発を行った.具体的には,MRI下の悪性脳腫瘍摘出を目的とした高精度診断用像取得技術および画像重畳表示技術開発を行った.さらに,術者の治療作業の円滑化を目指した手術のインテリジェント化について研究し,手術プロトコルと手術デバイスとが連動したインテリジェント・アシスト手術の基盤技術を確立した.本研究では,次世代医療のモデルとなる,医用画像撮影・観察下において高精度な治療を行うためのインタラクティブな治療支援機器の基盤技術開発を行った.具体的には,MRI下の悪性脳腫瘍摘出を目的とした高精度診断用像取得技術および画像重畳表示技術開発を行った.さらに,術者の治療作業の円滑化を目指した手術のインテリジェント化について研究し,手術プロトコルと手術デバイスとが連動したインテリジェント・アシスト手術の基盤技術を確立した.本研究では,次世代医療のモデルとなる,医用画像撮影・観察下において高精度な治療を行うためのインタラクティブな治療支援機器の基盤技術開発を行うことを目的とする.支援対象としてMRI下の悪性脳腫瘍摘出術を目的とした高精度診断用画像取得技術,画像重畳表示技術開発,手術プロトコルと手術デバイスとが連動したインテリジェント・アシスト手術の基盤技術の確立を目標としている.本年度は初年度として基盤技術の調査・設計・試作を中心として以下を行った.(1)MRI対応アクチュエータの要素技術として,非磁性・非金属である樹脂性のギアおよびシリンダを用いた新しい原理による空圧ステッピングモータ(CPDモータ)を開発した.ギア配置の工夫により回転用,直動用のものを用意した.前者は直径30mm,20rpm時にトルク150mNmが得られた,後者は直径38,5mmであり,30msec/stepの速度で駆動時に24.8±0.7Nの押し込み力を得た.また,MRI下局所アンテナ搭載精密ロボットによる高精度広域MRI撮像の構築のため,CPDモータを用いたリンク機構による2自由度位置決めロボットを試作した.また,局所アンテナコイルの試作を行った.(2)細径光ファイバ束による軽量・ハンディ型非磁性画像重畳ディスプレイを開発した.既存の開発物よりファイバの経が細くなり,取り回し自由度が上がったが,画素数は少なくなった.また,位置合わせについては既存の三次元位置計測手法を用いたが,並行してMRIの傾斜磁場による位置計測法を検討した.また,より高解像度画像を表示するためのMRI室内外で使用できる携帯型拡張現実感システムを試作した.これらの基盤技術により術者は手術中容易に情報にアクセスできる.(3)MRI下脳外科治療のシナリオ可視化・同期システム開発を目指し,調査および基本設計方針の検討を行った.本年度は,昨年度の成果を元に以下に列挙する研究を進め下記の成果を得た.(1)MRI下局所アンテナ搭載精密ロボットの改良および高精度局所MRI撮像技術との連動システムの構築のため,完全非磁性・非金属材料によるMRI対応精密位置決めロボットの改良を行った.また,局所コイルの製作を試みたが,保有するMRIに対する最適化調整が困難であり時間を費やしたが,本年度末になりようやく十分な高信号の画像撮影に成功した.今後,コイルの性能評価および3自由度ロボットへの実装・検討評価を行う.(2)拡張現実感によるナビゲーションシステムの実験評価では,単眼のナビゲーションシステムとして,タブレットPCを用いた拡張現実感システムの開発を行った.位置合わせ手法として三次元位置計測装置を利用したものでは臨床使用可能な装置改良を行った.また,特別な三次元位置計測装置を必要としないマーカレスでのナビゲーションシステムの画像処理・計算アルゴリズムを開発した.画像更新速度最大15Hzであり,医師による追従動作評価を行った.(3)手術工程把握の詳細の決定および,それぞれの要素技術の試作評価を行うため,臨床ターゲットの工程のより詳細なモデル化調査を行った.また,(1),(2)のシステムに組み込む検討を行った.また,MRI環境下治療支援のための局所部位へのアクセスを可能とする非磁性外套管の開発も以上により,高精度画像診断・治療支援を行えるプラットフォームの基盤技術の試作評価体制が整う.本研究では,特にMRIを中心とした医用画像撮影・観察下において高精度な治療を行うためのインタラクティブな治療支援機器の基盤技術開発を行うことを目標とし,以下の事項について研究開発を行い成果を得た.1)高磁場環境下であるMRI下の悪性脳腫瘍摘出をターゲットとした高度診断治療技術の提案として,MRIに対応可能な非磁性・非金属かつ高精度・高トルクな回転/直動アクチュエータの開発および精密位置決めロボットの開発を行った.また,MRIによる局所高解像度画像を撮影するためのコイルの試作を行い,局所計測・位置情報による接触状況の把握を行う基盤技術を開発した.2)拡張現実感技術の応用として,マーカの画像処理および加速度センサの複合利用による頑強な位置対応付けアルゴリズムをタブレットPCに実装し,術前の局所画像の重畳表示ナビゲーションソフトウェアの開発を行った.最大平均ターゲット誤差1.2mmが得られ,精度良くターゲットに対して画像重畳できていることが確認できた.基盤技術の実装およびフィージビリティ検証として,本技術の必要性が高い血管外科/形成外科における動物実験を行った.3)手術シナリオとデバイスの同期によるアシストシステムのソフトウェア基盤技術を開発した.具体的には,モデル作成・編集機能の実現,手術手技の注意事項や動画像データベースの蓄積が可能,時間等の数値予測・評価が可能なシステムで,術中にタブレットPCによる入力を行うシステムの構築を行った.

脳神経外科における開頭術の手術手技・工程の詳細な調査および上記シナリオモデルへの実装を行い,工程モデルおよび作業モデルの適合度としてそれぞれ100%,93.3%を得た.以上の成果により,次世代の高度治療機器の開発基盤技術が一つ得られたといえる.今後は,これら技術による各症例・各科への波及展開を目指す.局所アンテナコイルの開発が遅れたものの,高解像度画像撮影の目処が立ったことから,おおむね順調であると言える.最終年度に向けて十分な成果が出ている.24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度として,各基盤技術要素について研究を進めると同時に,組合せ開発を行い評価実験を行う.手術工程については汎用的な評価を行うことは困難であり,対象症例を限局的にすることとして進める.24年度が最終年度であるため、記入しない。
発達性読み書き障害の支援ツール開発

発達性読み書き障害児の文字学習方法は、訓練することが教育の主流である。障害されていない認知機能に焦点を当てた支援ツールを開発し、次の知見を得た。(1)大細胞・小細胞系障害仮説に基づいて、文字を動的に提示する方法を導入し、障害のある彼らの視覚系あるいは視覚情報処理系を検査した。その結果、患者群は視覚課題に対し、非患者群と同じレベルの成績を示した。(2)漢字学習の負担軽減のため、タブレット端末で動くアプリケーション「かんじダス」を開発した。漢字を自然に楽しく学習することができた。読み書き障害児のために開発したものではあるが、小学校低学年の漢字導入学習材料としても有効であることが示唆された。発達性読み書き障害者のアセスメントと聞き取り調査被験者(成人3名)に対して心理的アセスメント、生育歴、形態認知課題テスト等を実施した。文字習得に困難があり現在も読みに困難を抱えるが、独自の読みの工夫による努力性文字認識で、日常の社会生活を送ることが可能であった。読みやすい文字として丸ゴシック(12ポイント)との先行研究がある。(2)読み書き障害に対する大細胞・小細胞系障害説の検証追実験ランダムドットを使用し、明暗・コントラスト・動き・方向をかえた文字認識に有意差があるか否かの実験を行った。今回の実験からはいずれも読みの健常者との間に有意差が認められなかった。そのため1知覚心理学的視点から文字(ひらがな、カタカナ、数字、漢字)を明暗、サイズ、コントラストを変えて瞬間呈示する実験を行った。さらに図形認知として地と図、錯視とビジュアル・スパンの実験を行った。結果は文字提示では一部画数の多い文字の読みに多少の困難がみられたが、ほぼ読むことができた。錯視に関しても一部の錯視図形に困難があるものの錯視が起こることが確認された。地と図の分離でも多少のバラツキがあるがおおむね通常の見え方であった。ビジュアル・スパンでは確実な読み(数字)は3桁までが可能であった。困難の要因として、複雑な構造の図形の全体把握の困難、図形の一部分へスポットライトのように注意が向きその箇所が強調される、鋭敏に輝度・向き・色をとらえ強調されること等が推測された。実験後、被験者に文字や図形の見え方の聞き取りを行ったところ、ゆがむ、奥行が出てくる、かすむ、凹む、疲労感、さらに画面の傾斜・顔の位置により奥行や角度に変化が生じるとの報告を得た。これらは呈示条件が一定ではなく、その時の体調の状態など多少の変化で生じる不安定さがあった。知識からの推測等の努力性文字認識を裏つけたものと考える。本研究は学習障害の中核である読み書き障害の学習支援ツール開発を目的としている。読み書き障害の症状は多様であり、機序に関しても未解明部分が多い。平成25年度は1発達性読み書き障害の人の読みやすい文字・字体の検討と制作2読み書き障害児のための学習支援ツールの開発を行った。1については小学校教科書「書写」の仕様と体裁について見やすさの調査を行った。また、読みやすいフォントといわれる丸ゴシックを元に書き文字の要素を取り入れた字体の作成を試みた。2の読み書き障害学習支援ツール開発では文字に親しみ、楽しく自然に読むことができる教材として、情報端末を使用したゲーム性のあるアプリケーションソフト「かんじダス」の開発を行った。(dyslexia.chobi.net公開)「かんじダス」は漢字の中の象形文字を対象に、絵と漢字を合わせるゲームである。漢字の字体は書き文字の要素を取り入れて開発したフォントを使用した。また、作成したアプリ「かんじダス」の使用感について調査を行った。対象は読みの健常児・障害のある児童・読み書き障害児者である。本アプリは発達性読み書き障害のための教材として開発したものであるが、当事者はもとより読みの健常児にとっても楽しく学べることが明らかとなった。平成27年度は「かんじダス」を象形文字から形声文字漢字に広げ開発を進める。紙媒体に比して学習に抵抗感の少ない情報端末を使用することで楽しく自然に文字の学習ができると考える。平成27年度は(1)独自フォントの開発と(2)読み書き障害のための教材アプリ「かんじダス」の開発を行った。(1)については発達性読み障害者が読みやすいといわれているフォントのゴシック体を基に文字習得の初期段階においては手書きに近い文字を使うことが望ましいと考え、均一な太さで親しみやすい「渡部フォント」を作成した。平成26年にひらがな、象形文字を作成したが、平成27年は形声文字を加えた。大学生を対象とした明朝体・教科書体等の代表的なフォントとの比較調査を行ったところ最も柔らかく,自身の書字と似ているとの評価を得た。(2)読み書き障害のための教材アプリ「かんじダス」の開発では漢字が表語文字であることを体感できる、象形文字を用いた「漢字ー絵合わせ」(平成26年度作成)と、漢字が要素の組み合わせであることを体感できる、形声文字などを用いた「漢字パズル」(平成27年度作成)の2つのゲームで構成した。「漢字パズル」は、漢字がばらばらになるアニメーションが表示され、次にばらばらになった各部分を元の位置に指で動かし、漢字を完成させる仕様である。漢字は「天気」「自然」「場所」「人」「色・形」「学校」「動き」のカテゴリ別に分類し提示した。

通常の学級の児童31名を対象に本アプリの実施と使用感の検証を行った。「漢字ー絵合わせ」と同様に楽しい、使いやすいとの高評価を得た。また漢字成績別群分けによる検討を行ったが、下位群において高度な漢字にチャレンジしたいという意欲につながる発言があり、発達性読み書き障害児への有効性が期待された。本アプリは学習への抵抗感を少なくし、楽しく自然に文字(漢字)学習ができる学習支援ツール作成という本研究の目的を具現化していると考える。本アプリはdyslexia.16mb.comで公開をしている。発達性読み書き障害児の文字学習方法は、訓練することが教育の主流である。障害されていない認知機能に焦点を当てた支援ツールを開発し、次の知見を得た。(1)大細胞・小細胞系障害仮説に基づいて、文字を動的に提示する方法を導入し、障害のある彼らの視覚系あるいは視覚情報処理系を検査した。その結果、患者群は視覚課題に対し、非患者群と同じレベルの成績を示した。(2)漢字学習の負担軽減のため、タブレット端末で動くアプリケーション「かんじダス」を開発した。漢字を自然に楽しく学習することができた。読み書き障害児のために開発したものではあるが、小学校低学年の漢字導入学習材料としても有効であることが示唆された。1発達性読み書き障害は多くのサブタイプが存在する。読みにくさの要因も多岐にわたり、さらに当日の体調や天候にも左右されるなど多くの要因が複合的に関わっている。平成24年から成人の読み書き障害者の心理的アセスメントと聞き取り調査を実施しているが「読み書き障害の臨床像」として結果をまとめた。2見やすい文字の検討及び書き文字の要素を取り入れた字体の作成が終了していること、文字に親しみ、楽しく自然に読むことができる教材としてアプリケーション「かんじダス」の開発ができたことでおおむね研究の目的は達成できていると考える。特別支援教育1読み書き障害学習支援ツールとしてのアプリ「かんじダス」を象形文字から形声文字へと広げ開発を発展させる。形声文字を構成要素に分解し再構成するゲームを作成し、感覚的に捉えることで自然に楽しく漢字を学習できることを目的とする。2発達性読み書き障害の状態像の多様性を考え、ツール開発にあたっては学際的な研究者のチームを構成する。これまでも心理学・教育・医学の専門家チームによる研究と開発を行ってきたが、今年度も協力を得て継続的に実施する。鍛錬・訓練的な単一の学習方法ではなくアセスメントとそれに基づく個々の認知特性に合わせた教具・教材の開発を目標とする。大細胞・小細胞系障害説の実験において当初実験方法としたランダムドット使用における実験で有意差を得ることができなかった。そのため、26年度計画の一部を繰り上げ、文字認知の特徴を地と図等の知覚心理実験を行った。今後ランダムドット使用を含め、各年度の計画を見直すことが必要となった。アプリ「かんじダス」の開発を行い、技術的検討と使用感についての調査を行った。しかし、アプリの完成後、調査実施学校との交渉、倫理委員会からの承認等の手続き等が当初に予定した期日よりずれ込み調査を3月に実施することになった。
ハロアセチレンへの新規求核付加反応の開発とヘテロ環化合物および薬剤合成への応用

本研究では、ハロアセチレンへの求核付加反応について、基質適用性等の拡大ならびにその応用利用を検討し、新規合成手法として確立することを目的としている。平成26年度は研究計画に従って以下の項目について検討し、下記の成果を得た。1.ハロアセチレンへの求核付加による官能性cis-ハロオレフィン合成法の開発研究実施計画に記載した炭素求核剤の利用は実現できなかったが、その研究途上カルボン酸アミドがハロアセチレンへ求核付加することを見出し、収率良くハロエナミン誘導体が得られることを明らかにした。2.ハロアセチレンへの求核付加-異性化-求核置換による高効率有機合成手法の開発2-1. 2-アミノアルカノールのダブル付加によるジヒドロオキサジンの簡便合成2-アミノアルカノールとハロアセチレンの反応により種々の置換形式のジヒドロオキサジンを合成できることを明らかにした。また、本反応が当初想定した「求核付加-異性化-求核置換」の経路ではなく、これにさらにアミノ基が転位するステップが加わった、より複雑な経路で進行することを明らかにした。2-2.エチレンジアミンのダブル付加と空気酸化によるアセチレン結合の切断1, 2-エチレンジアミンとハロアセチレンとの反応を空気雰囲気下で行うと、2-1.と同様のダブル付加によって生成した中間体の酸化的切断を経て、出発物質のアセチレンの炭素が1つ減生したアミドが得られることを見出した。したがって本反応は例が少ないアセチレン結合のワンポット切断反応として有用である。なお、上記の成果については平成27年3月の日本化学会第95春季年会で発表した。以上平成26年度の研究展開により、ハロアセチレンへの求核付加反応を機軸として、新たな官能性cis-ハロオレフィンやヘテロ環化合物の合成法、およびアセチレン結合の切断反応などの、新規な有機合成反応を開発し、平成25年度の研究成果と併せて、本反応を有用な有機合成手法として確立できた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。本研究では、ハロアセチレンへの求核付加反応について、基質適用性等の詳細ならびにその応用利用を検討し、新規合成手法として確立することを目的としている。平成25年度は研究計画に従って以下の3項目について検討を行い、下記の成果を得た。1.ハロアセチレンに効率良く付加する求核剤の探索炭素求核剤およびリン求核剤の付加を検討したところ、現在まで目的の付加物を得るには至っていない。しかし、窒素求核剤として従来のスルホンアミド等よりも酸性度が大きいテトラゾールも利用できることを見出し、薬剤骨格に頻出するヘテロ環を有する官能性cis-ハロオレフィンの新規合成法を開発した。2.ハロアセチレンへの求核付加-カルベン中間体を経る新反応の開発N-フェニルエチル-6-ハロ-5-ヘキシニルアミン・トリフルオロ酢酸塩を炭酸カリウムと安息香酸の共存下DMA中で加熱した際に、想定したカルベン捕捉によるインドリジン誘導体は得られず、代わりにN-フェニルエチル-6-[(ベンゾイル)オキシメチル]-1,2,3,4-テトラヒドロピリジンが単離できた。この結果から、ハロアセチレンにアミンが求核付加した後にはカルベン中間体の発生ではなく、ハロエナミン部位の異性化を経てハロゲン基が置換されると結論付けた。更に、上記反応を利用して官能性ピペリジンの合成法を開発した。3.ハロアセチレンへの求核付加を利用する薬剤分子合成予定していた抗炎症薬ゾメピラックの合成は実現していない。しかし、2.で記した官能性ピペリジンの合成法を利用して、抗HIV活性を有するイソソレノプシンのラセミ体合成を達成した。なお、上記の2.および3.の成果は第104回有機合成シンポジウムにおいて発表した。以上平成25年度の研究展開により、ハロアセチレンに求核付加する新たな求核試薬を見出すとともに、アルカロイド合成の中間体として有用な官能性ピペリジンの新規合成法を開発し、本反応の汎用性をさらに高めた。2-2.エチレンジアミンのダブル付加と空気酸化によるアセチレン結合の切断

1, 2-エチレンジアミンとハロアセチレンとの反応を空気雰囲気下で行うと、2-1.と同様のダブル付加によって生成した中間体の酸化的切断を経て、出発物質のアセチレンの炭素が1つ減生したアミドが得られることを見出した。したがって本反応は例が少ないアセチレン結合のワンポット切断反応として有用である。なお、上記の成果については平成27年3月の日本化学会第95春季年会で発表した。以上平成26年度の研究展開により、ハロアセチレンへの求核付加反応を機軸として、新たな官能性cis-ハロオレフィンやヘテロ環化合物の合成法、およびアセチレン結合の切断反応などの、新規な有機合成反応を開発し、平成25年度の研究成果と併せて、本反応を有用な有機合成手法として確立できた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。平成25年度の研究として申請した「炭素およびリン求核剤の付加」に関しては、現在のところ付加物を得るには至っていない。しかしながら、窒素求核剤としてのテトラゾールを付加できることを見出した。また、ハロアセチレンへのアミンによる分子内求核付加を利用して官能性ピペリジンの新規合成法を開発した。さらにこれを利用して、抗HIV活性を有するイソソレノプシンの簡便合成法を開発した。平成25年度の研究によって、ハロアセチレンにアミンが求核付加した後にカルベン中間体の発生ではなく、ハロエナミン部位の異性化を経てハロゲン基の置換が進行することが示唆された。そこで当初予定していた「ハロアセチレンへの求核付加-カルベン発生反応の開発」に代わり、「ハロアセチレンへの求核付加-異性化を経る有機合成手法の開発」を新規テーマとして設定した。平成26年度は、まずこれについて基質適用性との詳細について検討を行い、新規のヘテロ環化合物合成開発を目指す。また、「ハロアセチレンへの求核付加を利用する薬剤合成」についても検討を行い、これまでに見出してきたハロアセチレンへの求核付加によるヘテロ環化合物合成法を利用し、人工の薬剤分子もしくはは天然の生物活性分子の合成を行う。
蛍光レポーターシステムを用いた iPS 細胞からの軟骨分化誘導法の検討

Col2a1,Prx1などのプロモーターを用いた蛍光レポーターiPS細胞を樹立し、レチノイン酸やBMPなどを用いた分化誘導法にて蛍光発色し、かつ軟骨マーカーを高発現することを確認した。この細胞を用いて様々な誘導因子の検討を行い、BMPのほか、インスリン、TGF-beta、Notchシグナル阻害剤、Wntシグナル阻害剤でも強力に蛍光発色することを見出した。現在はそれらの最適な組み合わせについて検討している。軟骨細胞の蛍光インジケーターマウスであるCol2a1-GFPトランスジェニックマウスの胎児から線維芽細胞を採取し、山中4因子を導入してCol2a1-GFP-iPS細胞を50クローンほど樹立した。それらのESマーカー遺伝子の発現を調べ、ES細胞とほぼ同程度の発現を示すクローンを絞りこむとともに、トランスジーンが良好にサイレンシングされていることを検証し、もっとも良好と思われる2クローンを選定した。これらの多分化能を確認するために、テラトーマ形成実験を行い、in vivoでの三胚葉分化を確認した。またこれらの細胞をBMP-2やインスリンなど、既知の軟骨誘導性のサイトカインによって分化誘導させ、蛍光発色が良好でかつ2型コラーゲンの発現増加と比例することを確認した。さらに未分化間葉系マーカーであるPrx1プロモーターに赤色蛍光DsREDのcDNAを接合したレポータートランスジーンをレトロウイルスベクター化し、樹立したCol2a1-GFP-iPS細胞にPrx1-DsREDのトランスジーンを安定導入し、間葉系分化時に赤色、軟骨分化時に緑色に発色するレポーターiPS細胞を樹立した。レチノイン酸などによる初期分化誘導を行い、赤色陽性緑色陰性のフェーズを確認し、それぞれのレポーターが独立して適切に作動することを確認した。これら蛍光レポーターを指標として、レトロウイルスベースの発現ライブラリーを用いた発現クローニングを行い、得た陽性クローンから責任遺伝子を抽出し、現在それらの機能を解析している。事前に樹立していたCol2a1-GFPトランスジェニックマウスの胎児線維芽細胞由来のiPS細胞の中から複数のESマーカーの発現を検証し、最もES細胞に近いクローンを2つ選別した。これらについてテラトーマ形成能を検討したところ、いずれも良好な三胚葉分化を示し、高品質のiPS細胞であることが確認できた。このうち一つの株に間葉系細胞のマーカーPrx1のプロモーターにDsREDExpress2を接合したレポーターカセットをレトロウイルスベクターを用いて導入し、間葉系分化時に赤色、軟骨分化時に緑色の蛍光を発するクローンを得た。レチノイン酸を用いた1週間の平面培養での分化誘導で蛍光顕微鏡にて赤色蛍光を確認し、さらにインスリン、BMP-2の添加にて2週間後に緑色の蛍光を確認することができた。この株に対してレトロウイルスベースの間葉系幹細胞由来、成長板軟骨細胞由来のcDNA発現ライブラリーを感染させ、薬剤セレクションをかけながらフィーダーフリーで培養増幅を続けたところ、赤色を発するクローンを3つ得ることができたが、緑色を発するクローンを得ることはできなかった。この赤色発光クローンについてはトランスジーンをシークエンスし、含まれる配列を調べたところ全てノンコーディングシークエンスでありmicroRNAと考えられるような配列も含まれなかった。現在はウイルスの力価を上げて再度感染を行い、新たにクローンを複数得た段階である。比較的早い段階で二段階蛍光レポーターiPS細胞を樹立することができ、品質的にも上質であることが確認できた。遺伝子発現ライブラリーを用いたスクリーニングでは有望な遺伝子は得られていないが、クローンを得るまでの系は安定してきた。引き続き複数の遺伝子発現ライブラリーを用いた遺伝子スクリーニングを行うとともに、レチノイン酸など古典的な手法で間葉系に分化させた細胞集団を用いて軟骨分化段階に特化したスクリーニングも行っていく。また低分子化合物ライブラリーを用いたスクリーニングも行う。さらに得られた遺伝子や化合物の有効な組み合わせについても検証し、実際に分化させた細胞をマウス膝関節内に移植する実験も行う。細胞培養に用いる消耗品類、RNA、DNAの精製キット、シークエンスの試薬などを中心に100万円強の使用を予定している。またマウス移植実験を行うため、マウスの購入、組織切片作成、組織染色の費用として30万円前後を想定している。
N-myc遺伝子の導入による神経芽細胞腫の病態解明と治療への応用

小児の代表的な固形腫瘍である神経芽細胞腫のcell lineを用いて、IGF-IR抗体(αIR3)と抗癌剤との併用効果を細胞増殖の面より検討すると同時に、その作用機序をapoptosisの発現の面より検討した。ヒト神経芽細胞腫のcell lineとしてSK-N-SHを用いた。細胞を1x10^5cells/ml(100μl/well)の密度で96-welltissue-culture plateに植え、24時間後にcisplatin (0.5μg/ml)またはdoxorubicin (0.01μg/ml)にαIR3(05μg/ml)を投与し、1、2、3日後に細胞数をMTT法で測定した。細胞を1x10^6cells/ml(2ml/well)の密度で6-well tissue-culture plateに植え、24時間後に抗癌剤及びαIR3を投与し、48時間後にapoptosis細胞数および細胞膜IGF-IR数をflowcytometryを用いて測定した。核酸及び蛋白合成の指標としての^3H-thymidineおよび^3H-leucine incorporationを測定した。抗癌剤にαIR3併用群では、投与2,3日目において、それぞれの単独投与群に比し、細胞増殖が有意に抑制された。抗癌剤およびαIR3併用群のapoptosisの細胞数はそれぞれの単独投与群に比し著明に増加した。抗癌剤投与群のIGF-IR数は非投与群に比し著明に増加した。以上より、抗癌剤とIGF-IR抗体(αIR3)を併用した場合に見られた腫瘍増殖抑制効果は、併用によるapoptosis促進作用を介して発揮されると考えられる。(1)神経芽細胞腫の代表的cell lineであるSK-N-SHにおいて、細胞膜トランスポートの特徴を検討した。その結果、本cell lineではグルタミンはSystem ASCのシステムにより細胞内にactive transportされること、細胞増殖速度はグルタミン濃度に依存すること、グルタミン欠乏によりSystem ASCの遺伝子発現がdown-regulationされることが明らかとなった。(2)IGF-Iはin vitroにおける神経芽細胞腫の増殖を促進する。この効果は癌細胞の細胞膜アミノ酸トランスポート、DNAおよび蛋臼合成を増加させることで発揮される。(3)IGF-I receptor抗体を投与することで、グルタミン欠乏単独に比較し神経芽細胞腫増殖抑制効果を発揮する。この効果はグルタミン欠乏に伴う細胞膜アミノ酸トランスポートのup-regulationを抑制することで発揮される。(4)抗癌剤とIGF-Ireceptor抗体の併用により、それぞれの単独投与に比し、より強い癌細胞増殖抑制効果を発揮する。神経芽細胞腫のcell lineを用いて、Insulin-like growth factor I receptor(IGF-IR)抗体(αIR3)と抗癌剤との併用効果を細胞増殖の面より検討した。培養液は10%FBS、2mMグルタミンを含んだDMEMを用い、5%CO_2、95%Air、37°Cの条件下で培養した。細胞をtissue-culture plateに植え、24時間後にcisplatin(0.5μg/ml)またはdoxorubicin(0.01μg/ml)にαIR3(0.5μg/ml)を投与し、1、2、3日後に細胞数をMTT法で測定した。48時間後にapoptosis細胞数および細胞膜IGF-IR数をflowcytometryを用いて測定した。