hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
咀嚼による口腔感覚が胃の運動と胃排出に与える影響の解明

咀嚼による口腔感覚刺激は消化管の分泌や運動を促すが、胃への食物流入を伴わない擬似咀嚼(sham feeding)においても、迷走神経反射を通して同様の反応が生じることが知られている。しかしながら、咀嚼動作量と胃の運動との関連や、擬似咀嚼がその直後の食後期の胃運動に及ぼす影響については明らかにされておらず、それらの評価方法も確立されていない。本年度はsham feedingが食後期の胃運動に及ぼす影響を評価し、その評価パラメータを確立することを目的とした。成人男性9名を被験者とした。咀嚼困難者向け市販介護食(固形食)を用い経皮的胃電図法にて食事摂取前30分間と食事摂取後60分間の胃の電気的活動記録行った。試験食摂取条件は、(1)精咀嚼(2)丸呑み(3)ガム咀嚼+丸呑みの3条件とした。記録開始から2.5分間隔の各時点を中心とする5分間の区間で胃電図正常波帯域0.0430.059Hzのパワーを求め、各個人のパワーの最大値の7%を閾値として各区間のパワーがこの閾値を超える場合を"食後期の活発な胃運動あり"として、全被験者におけるこれら区間の合計区関数を求めた。咀嚼条件の相違が食後期の活発な胃運動を認める区関数に及ぼす影響を検索した。その結果、活発な胃運動ありと認めた区間の食後60分間の総数は各条件ほぼ数であったが、食後0-20分区間における精咀嚼と丸呑みがそれぞれ11および12区間であるに対し、ガム咀嚼+丸呑みが23区間であり、有意に大きかった(p<0.05)以上より、食後期胃運動が活発に営まれる時期は咀嚼運動量によって影響を受けることが判明し、今回用いた評価パラメータを指標として胃の電気的活動を評価可能であることが示された。【目的】咀嚼動作やそれが引き起こす口腔感覚は、迷走神経を介して消化管運動機能の調節に関与することが知られており、sham feeding(疑似咀嚼)を用いた研究において胃液分泌や胃の運動を賦活することが観察されている。しかしながら、口腔感覚に着目して消化管機能との関係を明らかにした研究は少なく不明な点が多い。本年度は、試験食品の咀嚼とは別に咀嚼動作を与えた場合の胃の運動、胃排出速度を観察し、その分析方法の検討を行うことを目的とした。【方法】健常成人男性9名を被験者、試験食品は咀嚼なしで嚥下可能な市販介護食を用い、試験食の咀嚼と別に与える咀嚼動作(sham feeding)としてガム咀嚼を用いた。胃の電気的活動の評価には経皮的胃電図法を用いて食事15分前60分後まで5分毎に周波数分析を行った。食物動態の分析には^<13>C呼気試験法を用いて胃排出速度を算出した。咀嚼条件は、1)試験食を十分に咀嚼2)試験食を咀嚼なしで摂取3)ガム咀嚼10分後、試験食を咀嚼なしで摂取、の3条件とした。【結果と考察】3条件間で胃排出速度の評価パラメータに統計学的な有意差は認めなかった。胃電図全帯域(0.0230.079HZ)パワー値について、3咀条件間の比較を行った。その結果、試験食を十分に咀嚼した条件1は、食後15分45分に高値を示しその後低下した。咀嚼を行っていない条件2は食後15分から上昇するものの、その値は条件1よりは小さかった。一方、条件3は食後10分でピークまで上昇し、その値は条件1,2と比較して有意に大きくなり(p<0.05)、その後は条件2と同程度に低下した。試験食摂取60分後では、条件1,3が同程度であり、それらと比較して条件2は有意に低値(p<0.05)であった。今回の結果からは、ガム咀嚼による試験食とは別の咀嚼動作が胃排出速度を変化させるには至らなかったが、胃の電気的活動を変化させることが明らかになった。今後、試験食、咀嚼動作の時間・タイミング等についてさらなる検討を行う予定である。咀嚼による口腔感覚の刺激は消化管の分泌や運動を促す。この反応は、胃への食物流入を伴わない擬似咀嚼(sham feeding)においても、迷走神経反射を通して同様の反応が生じることが知られている。しかしながら、咀嚼動作量と胃の運動との関連や、擬似咀嚼がその直後の食事摂取時の胃運動に及ぼす影響については明らかにされておらず、それらを評価する方法も確立されていない。本年度は食事摂取直前にsham feedingを行った場合の食後の胃の電気的活動に与える影響を評価することを目的として、胃電図測定を行い、それらの評価指標を検索した。成人男性9名を被験者とし、試験食品は咀嚼困難者向け市販介護食を用いた。

試験食の咀嚼と別に与える咀嚼動作(sham feeding)としてガム咀嚼を用いた。ガム咀嚼時間は今回使用した試験食を十分に摂取した場合の咀嚼時間をほぼ同じ10分間とした。胃の電気的活動記録は経皮的胃電図法を用い、食事30分前食後60分まで胃電図記録を行い、高速フーリエ変換を用いて2.5分毎に周波数分析を行った。咀嚼条件は、1)試験食を十分に咀嚼2)試験食を咀嚼なしで摂取3)ガム咀嚼10分後、試験食を咀嚼なしで摂取、の3条件とした。胃電図正常波帯域(0.0430.059HZ)のパワー値について、各個人の空腹期のパワー値の平均値に標準偏差の2倍を加えたものを閾値として、食後60分まで2.5分毎の各パワー値がこの閾値を超える場合を胃電気的活動"active"としてactiveであるtime pointの数を3条件間で比較した。その結果、食後20-40分、40-60分では条件1)は条件2)と比較して有意にポイント数が多かった(p<0.05)。また、統計学的な有意差を認めるには至らなかったが、shamfeedingを行った条件3)のactiveポイント数は、試験食の咀嚼条件は同じである条件2)の約2倍であった。これらの結果より、今回の手法を指標として胃の電気的活動を評価可能であることが示された。咀嚼による口腔感覚刺激は消化管の分泌や運動を促すが、胃への食物流入を伴わない擬似咀嚼(sham feeding)においても、迷走神経反射を通して同様の反応が生じることが知られている。しかしながら、咀嚼動作量と胃の運動との関連や、擬似咀嚼がその直後の食後期の胃運動に及ぼす影響については明らかにされておらず、それらの評価方法も確立されていない。本年度はsham feedingが食後期の胃運動に及ぼす影響を評価し、その評価パラメータを確立することを目的とした。成人男性9名を被験者とした。咀嚼困難者向け市販介護食(固形食)を用い経皮的胃電図法にて食事摂取前30分間と食事摂取後60分間の胃の電気的活動記録行った。試験食摂取条件は、(1)精咀嚼(2)丸呑み(3)ガム咀嚼+丸呑みの3条件とした。記録開始から2.5分間隔の各時点を中心とする5分間の区間で胃電図正常波帯域0.0430.059Hzのパワーを求め、各個人のパワーの最大値の7%を閾値として各区間のパワーがこの閾値を超える場合を"食後期の活発な胃運動あり"として、全被験者におけるこれら区間の合計区関数を求めた。咀嚼条件の相違が食後期の活発な胃運動を認める区関数に及ぼす影響を検索した。その結果、活発な胃運動ありと認めた区間の食後60分間の総数は各条件ほぼ数であったが、食後0-20分区間における精咀嚼と丸呑みがそれぞれ11および12区間であるに対し、ガム咀嚼+丸呑みが23区間であり、有意に大きかった(p<0.05)以上より、食後期胃運動が活発に営まれる時期は咀嚼運動量によって影響を受けることが判明し、今回用いた評価パラメータを指標として胃の電気的活動を評価可能であることが示された。
待機モードのゼロ消費電力を実現するＭＥＭＳウエイクアップモジュールの研究

Q値の大きいMEMS共振器を製作し、これを用いて無電源のウエイクアップモジュールを実現することを目的として、研究を行った。静電型MEMS共振器の設計法、製造法、測定法、動作シミュレーション方法を確立した。くし歯型静電型MEMSを製作し、131MHzの共振周波数を確認した。一方、静電型MEMS共振器では、ウエイクアップ信号発生に必要な共振エネルギーが得られないこともわかった。次に圧電型MEMS共振器について検討し、圧電型で一定の大きさのMEMS共振器で900MHz帯でウエイクアップモジュールが実現できることを明らかにした。本研究の最終目的はMEMS(Micro-Electro-Mechanical Systems)共振器を用い、特定の周波数を受信すると電力を全く消費することなくシステムを起動する信号を出力するウエイクアップモジュールを実現することにある。H25年度の研究計画は、本ウエイクアップモジュールに適したMEMS共振器の設計法の確立と試作法の確立をすることであった。これに対して、ウエイクアップモジュールに適した円環型の共振器を考案し、さらに有限要素解析シミュレータFemtetの応力解析機能を用いて共振周波数を割り出す設計法を確立した。固定電極が円環の中心にある形状1と固定電極が円環の外側にある形状2の2種類のMEMS共振器の解析を行い、それぞれの共振周波数は4.27MHzと5.7MHzと解析的に求めた値と10%以内の誤差でよい一致が得られた。設計したMEMS共振器の試作には、東京大学のキャンパス内にあるナノテクノロジープラットフォーム超微細リソグラフィー・ナノ計測拠点のEB露光装置及びDRIE装置と、本学東8号館(SVBL:Satellite Venture Business Laboratory)の研究設備を用いて行った。直径100μm、厚さ15μm、電極間ギャップ1μm及び直径90μm、厚さ15μm、電極間ギャップ1μmの円環型MEMSデバイスを製作できた。ギャップ部分のアスペクト比は15と大きなものが得られた。試作したMEMS共振器に直流バイアスを与えながら一方の電極に交流電圧を与えた時の他方の電極に現れる電圧をスペクトルアナライザで観測し、共振周波数4.50MHzを観測し設計値と±10%の範囲内で一致したことを確認した。特定の周波数を持つ電波を受信した際にスリープ状態にあるシステムを起動させるウェイクアップモジュールをMEMS共振器を用いて実現する研究を行っている。まずMEMS技術を用いて特定省電力無線の周波数帯である315MHzの共振周波数を持つくし型の静電MEMS共振器を作製し、設計どうりの共振周波数が得られることを確認した。これにより、静電MEMS共振器の製作法と共振現象の測定法を確立した。また、MEMS共振器が共振した際に構造体が蓄えるエネルギーをモデル化し、MatLabによるシミュレーションで評価した。MEMS共振器が共振した際に最大で1.5×E-12Jのエネルギーを持つことを明らかにした。これらの結果より、MEMS共振器が振動エネルギーを蓄積してウエイクアップ信号を発生できる可能性を確認した。ただし、静電型MEMSでは蓄積エネルギーが小さいため、圧電型MEMSを検討する必要があるという知見も得られ、H27年度は圧電型MEMSの作製を検討していく。これらの研究成果をまとめてH27年3月に開催された電子情報通信学会本会(立命館大学)で"くし歯型MEMS共振器の共振特性と蓄積エネルギー"と題する発表を行った。本研究の目的は、MEMS共振器の作製プロセスの確立と作製したMEMS共振器を特定の周波数の電波を検出してウェイクアップ信号を発生するウエイクアップモジュールを実現することにある。H26年度まで静電型共振器でウエイクアップモジュールを実現する研究を行ったが、静電型共振器は、900MHzの目標とする周波数帯においてウエイクアップ信号を発生するために必要なエネルギーを蓄積できないことがわかった。H27年度はその結果を踏まえ、高周波数でエネルギーの蓄積が可能になる圧電型のMEMS共振器の検討を行った。圧電膜として、製造の容易性等を考慮して酸化亜鉛(ZnO)を選択した。圧電型MEMS共振器の作製に関して、各プロセスレシピの作成とZnOのアライメント露光以前のプロセスを確立した。Bulk型圧電MEMS共振器を作製して共振周波数測定を行ったところ、2.12GHz付近に共振ピークを確認することができた。ウエイクアップモジュールの実現に向けて、有限要素解析シミュレータ(Femtet)と回路シミュレータ(LTspice)を活用して、MEMS共振器の等価回路のパラメータを導く方法を確立した。また、導いたパラメータを用いて回路を組み、MEMS共振器と受動素子によるパッシブゲインを用いた信号昇圧回路を検討した。そして、ウエイクアップモジュールを構成するために必要なゲインを確保できることを示した。以上により、圧電型MEMS共振器により、ウエイクアップモジュールを実現できる見込みを得た。

次に圧電型MEMS共振器について検討し、圧電型で一定の大きさのMEMS共振器で900MHz帯でウエイクアップモジュールが実現できることを明らかにした。静電型MEMSを検討してきたが、定量的に検討したところウエイクアップモジュールを実現するための蓄積エネルギーが十分でないことが判明した。そのため、圧電型MEMSに移行する予定で、遅延が生じている。エレクトロニクスH27年度は以下の研究を行っていく。1圧電型のMEMS共振器の作製技術を確立していく2ウエイクアップモジュールを実現するための、アンテナからMEMSまでのフロントエンド回路とMEMSのあとの整流器を含むバックエンド回路の検討を行う。3フロントエンド回路、バックエンド回路、圧電型MEMS共振器の設計、製作を行い、これらを組み合わせてウエイクアップモジュールを実現する。H25年度の研究計画である、本ウエイクアップモジュールに適したMEMS共振器の設計法の確立と試作法の確立をすることができたので、研究はおおむね順調に進展している。課題は学会発表をしていないことである。計画していた海外出張1回が取りやめになったため残金(¥79196)が発生した。H26年度は以下に述べる3点について重点的に研究を推進していく。1) H25年度に確立したMEMS共振器の設計法と試作法に基づき、さらに共振周波数が高く、より大きなエネルギーを蓄えられることのできるMEMS共振器を実現していく。2)MEMS共振器に電波からの電圧を入力するマッチング回路の設計、MEMS共振器に蓄積されたエネルギーを電圧として取り出してウエイクアップ信号を出力するための回路の設計、及びこれらの回路を試作し、MEMS共振器と組み合わせてウエイクアップ信号として取り出せるモジュールを実現する。3)上記1)、2)の研究成果を論文として発表する。H27年度はMEMSの試作費用の他に、研究成果の発表のための出張費に活用する。MEMSの加工、試作には光リソグラフィを用いることを考えていたためにホトマスクの外注費用が必要な予定であったが、実際の試作にはEB露光を用いることになったため、ホトマスクの費用が削減された。また、相見積の結果、購入したネットワークアナライザ一式の費用が予定より安価になった。昨年度の残額は、MEMS共振器の特性をより詳細に調べるための信号発生器及びLCRメータを購入する費用に充てる。
サンゴ礁を利用した二酸化炭素の吸収・固定法の確立に関する研究

室内実験および野外調査によおて、サンゴおよびサンゴ礁における有機無機炭素生産量および大気・海水中の二酸化炭素濃度変動を測定し、二酸化炭素吸収固定の可能性を確立した。(1)室内実験(サンゴによるCO2吸収・固定実験)琉球大学付属熱帯生物圈研究センターの屋外水槽(3m×4m×0.5m)で塊状サンゴ(キクメイシ)の飼育実験をおこなった。造礁サンゴの代謝量として、一日の有機炭素固定量(OP):(36mmo1/m2/day、無機炭素生産量(IP):14mmo1/m2/day、有機炭素生産/無機炭素生産の比(OP/IP):2.6が得られた。有機炭素生産(OP)と呼吸量(R)との比は2であり、呼吸量の2倍の生産量があり、効果的にCO2を吸収できる。(2)野外調査(サンゴ礁生態系による生物代謝量の観測)宮古島保良湾のサンゴ礁において、塊状サンゴを透明プラスチック製のドームで被って、サンゴ礁生態系による群集代謝量の測定実験をおこなった。有機炭素生産(OP)と無機炭素生産(IP)の比は1.5-2.5であった。これは、光合成による有機炭素生産量が石灰化による無機炭素生産量を上まって、その比が0.67以上であり、サンゴ礁生態系としても潜在的にCO2の吸収傾向にあり、二酸化炭素が吸収・固定される結果を得た。(3)今後の課題セジメントトラッフによる予察的な観測から、サンゴ礁で生産された余剰の有機物が粒子状有機物として、サンゴ礁から外洋に向けて輸送されることがわかった。今後、潮流、水の交換率、地下水の寄与等を含めて具体的な評価をおこなう必要がある。実行可能なCO2吸収・固定法としてのサンゴ礁の有効性を確立するためには、とくに有機物分解プロセスと大気-海水間のCO2フラックス収支を長期間にわたって評価する必要がある。
腸管に存在する好酸球様樹状細胞の生理的意義と経口免疫寛容誘導機序の解明

腸管において抗原特異的CD4陽性T細胞の"不応答"を誘導することが示唆された好酸球様樹状細胞(EDC)の細胞特性を評価することで、経口免疫寛容誘導におけるEDCの役割解明を目指した。各組織中の好酸球単離方法の確立および免疫組織化学的解析と網羅的遺伝子発現解析、好酸球欠損マウスを用いた免疫学的解析を行った。その結果、EDCは好酸球としての特性を有することを明らかとした。また、好酸球の免疫学的解析において非常に有用な基礎情報を蓄積することができた。本年度は,腸管粘膜固有層に存在する好酸球と樹状細胞の中間的な表現型を示す特殊な細胞の表現型を詳細に解析することにより,それらが生体内で担っている生理的意義を予測するための基礎情報を収集する事を主目的とした。それらは腸管粘膜固有層に存在するCD11c陽性細胞のおよそ56割を占める細胞集団であるにもかかわらず免疫学的機能に関する解析は進んでいない為,腸管粘膜免疫システムの理解を深める上で非常に興味深い。腸管の好酸球様樹状細胞,他の組織好酸球ならびにその他の血液細胞群を抗体染色とセルソーターにより高純度に単離し,網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果,腸管好酸球様樹状細胞は他の組織中好酸球と酷似した遺伝子発現パターンを示した事,好酸球欠損マウスの腸管ではそれらの細胞が認められなかったことから,本研究で着目している細胞は腸管粘膜固有層に存在する好酸球であると結論づけた。一方で,他の組織好酸球と比べて明らかに異なるパターンを示す発現分子を同定することにも成功した。また,好酸球欠損マウスの腸管粘膜免疫応答について解析したところ,野生型マウスとは異なる免疫応答が観察された。これらの結果は腸管好酸球が腸管粘膜免疫応答を制御する為の特殊な役割を担っている事を示唆している。本年度に作成したOVA特異的TCR発現好酸球欠損マウスを利用すること等により,これらの結果を精査しながら腸管好酸球の生理的意義を明らかにしていく予定である。昨年度の解析結果からマウスの腸管粘膜固有層に存在する好酸球様樹状細胞は、腸管組織中の好酸球であるという結論が得られた。従って本年度は、好酸球欠損マウスの免疫学的解析および好酸球特異的に発現が認められる免疫応答調節分子群の発現解析を中心に、腸管組織好酸球が経口免疫寛容を調節している可能性について解析した。抗原とアジュバントを経口的に投与した場合に、好酸球欠損マウスでは野生型マウスに比べて抗原特異的抗体産生の上昇が認められた。また、腸間膜リンパ節細胞を用いた抗原再刺激実験においても好酸球欠損マウスのリンパ球が高い増殖能を示し、腸管組織好酸球は腸管免疫応答を負に制御している可能性が示された。一方、好酸球欠損マウスと野生型マウスの経口免疫寛容誘導能について評価したところ、予想に反して両者に顕著な差は観察されなかった。経口免疫寛容を調節していると考えられる細胞種は他にもその存在が知られている(例えば形質細胞用樹状細胞など)。好酸球欠損マウスでは、他の細胞種の分化と性質は野生型マウスと同等であることから、腸管組織好酸球の欠失を補完する細胞の影響により、予想した結果が得られなかった可能性が高い。種々の組織好酸球を含む30種類の血球細胞の網羅的遺伝子発現解析結果から、他の細胞群に比べて好酸球で有意に高い発現パターンを示す数十の遺伝子群を同定することに成功した。その中には免疫応答を制御する可能性が高い遺伝子も含まれていたことから、腸管組織好酸球が腸管免疫応答を制御している可能性を証明できる分子が含まれている可能性も高く、現在それらの詳細な解析を進めている。以上、本研究では腸管組織好酸球の性状を知る上での重要な知見を蓄積することに成功した。本知見を基礎としたさらなる解析を遂行することで、経口免疫寛容の誘導機序を明らかとし、アレルギーを始めとする疾患の新規治療法開発に貢献することが期待される。
光の音響的・機械的作用を用いた薬剤動態観測・薬剤輸送一体型技術の開発

本年度は,薬剤のイメージング,そして薬剤の輸送と動態観測の一体型技術に関して動物実験を実施し,開発技術の有用性を検討した.まず,薬剤動態観測の実験として,光音響イメージング法の造影剤かつ光線力学的治療の光感受性薬剤として機能するインドシアニングリーン内包生分解性ナノ粒子(ICGラクトソーム)を使用し,腫瘍血管を経由してマウス皮下腫瘍へ輸送される同薬剤,そして光線力学的治療による薬剤の光褪色と抗腫瘍作用の機序の一つである血管閉塞を光音響イメージングにより捉えた.その結果は,これら診断と治療の組み合わせが重要であることを示唆した.次に,薬剤(エバンスブルー)を投与した皮下腫瘍マウスを対象に,低エネルギーパルス光により薬剤の光音響イメージングを,高エネルギーパルス光により腫瘍への薬剤輸送促進を目的としたフォトメカニカル波適用を行った.その結果,適用群における薬剤由来の光音響信号の振幅は非適用群(薬剤投与のみ)に対して有意に高くなり,フォトメカニカル波による薬剤輸送促進効果が示された.また,フォトメカニカル波適用後の光音響信号の振幅は個体ごとに大きくばらつき,輸送薬剤の分布をその場で観測することの重要性が示された.最後に,本技術の応用を視野に入れた発展のため,血管の光イメージングに精通するUniversity of California, IrvineのProf. Bernard Choi氏の研究室で,治療時の血流を迅速に観測可能な小型・軽量なレーザースペックルイメージング装置を開発した.これは本技術による血液から標的組織への薬剤の移行の制御,また治療効果の予測と判定に役立ち,高効率・低副作用の薬剤治療を支援する.以上より,本技術は標的組織の薬剤分布のイメージングと制御を可能にし,重要疾患に対する薬剤治療効果の向上に貢献できる.従って,本研究成果は社会的に大きな意義があると言える.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、光吸収体にパルス光を高強度で照射することで生じるフォトメカニカル波を用いた経血管的薬剤輸送と、低強度で照射した際に発生する光音響波を用いた生体イメージング(光音響イメージング)を技術統合し、病変部位の検出と、同部位を標的とした薬剤の輸送とその動態観測を同一スキームで実施して治療するシステムを開発することである。本年度は、まず血管およびそれらを経由して輸送される薬剤の分布を画像化するための高分解能イメージング装置を開発した。超音波検出器の先端に音響レンズを取り付け、その四方に石英光ファイバーを配置し、生体と音響特性の近い水を介して光音響波を受信する構造とした。本装置のプローブ部は従来装置に比べて小型かつ複雑なアライメントを必要としないため、in vivoでのイメージングに適している。直径7μmの炭素繊維を対象に空間分解能を評価した結果、横分解能105μm、深さ分解能51μmであり、ラット皮膚の計測では組織中の微小血管を鮮明に画像化できた。また、ラット熱傷皮膚を対象とした模擬薬剤(エバンスブルー)の計測では、組織中の薬剤分布を深さ分解的に画像化し、その時間変化を観測できた。しかし、同組織の蛍光断層画像との比較から、薬剤が連続的に分布する領域については画像化のための信号処理を施す必要があることが分かり、今後ファントムを用いた検討が必要である。一方、薬剤輸送技術に関して、上述のプローブをフォトメカニカル波発生のための照射系として共有できないか検討した。光ファイバーにより伝送させた高強度パルス光を黒色ゴムに照射し、エネルギー、スポット径、照射角度によるフォトメカニカル波の圧力波形の変化を調査した。その結果、レーザーパラメーターを適切に選択することで、同プローブで発生させたフォトメカニカル波により生体組織へ薬剤を経血管輸送できる可能性を示した。今後、動物実験を実施して薬剤輸送特性を評価する。本研究の目的は,光吸収体に短パルス光を高エネルギーで照射することで生じるフォトメカニカル波を用いた経血管的薬剤輸送と,低エネルギーで照射した際に発生する光音響波を用いた生体イメージング(光音響イメージング)を技術統合し,病変部位への薬剤輸送とその動態観測を実施可能な診断・治療一体型システムを開発することである.光音響イメージングは微小病変や深部病変の高感度検出に適しており,フォトメカニカル波は同部位への高効率・選択的な薬剤輸送を可能にする.よって両者の統合は多種多様な疾患に対して新しい薬剤治療戦略を与えうる.本年度は,薬剤輸送と薬剤動態観測の統合型プローブを開発し,動物実験によりその効果ならびに有用性を検討した.昨年度に開発したファイバー照射型の小型・軽量な光音響イメージング装置を基盤に,低エネルギーパルス光の伝送により光音響イメージングを,高エネルギーパルス光の伝送によりフォトメカニカル波を発生させて薬剤を輸送する統合型プローブを開発した.まず光音響イメージングの特性として,直径7マイクロメートルの炭素繊維を計測対象に空間分解能を評価した結果,横方向分解能65マイクロメートル,深さ方向分解能48マイクロメートルが得られることを確認した.次に薬剤輸送のためのフォトメカニカル波の特性評価として,出射パルス光をレーザー吸収材(黒色天然ゴム)に照射して発生するフォトメカニカル波の圧力時間波形をニードル型ハイドロフォンで取得した結果,ピーク圧力約90 MPaが得られ,生体組織へ薬剤を経血管輸送できる可能性が示された.

マウス皮下腫瘍モデルを用いた動物実験に本システムを適用した結果,標的組織への模擬薬剤(エバンスブルー)の空間選択的輸送と同部位の薬剤分布の経時的イメージングを達成した.本年度は,薬剤のイメージング,そして薬剤の輸送と動態観測の一体型技術に関して動物実験を実施し,開発技術の有用性を検討した.まず,薬剤動態観測の実験として,光音響イメージング法の造影剤かつ光線力学的治療の光感受性薬剤として機能するインドシアニングリーン内包生分解性ナノ粒子(ICGラクトソーム)を使用し,腫瘍血管を経由してマウス皮下腫瘍へ輸送される同薬剤,そして光線力学的治療による薬剤の光褪色と抗腫瘍作用の機序の一つである血管閉塞を光音響イメージングにより捉えた.その結果は,これら診断と治療の組み合わせが重要であることを示唆した.次に,薬剤(エバンスブルー)を投与した皮下腫瘍マウスを対象に,低エネルギーパルス光により薬剤の光音響イメージングを,高エネルギーパルス光により腫瘍への薬剤輸送促進を目的としたフォトメカニカル波適用を行った.その結果,適用群における薬剤由来の光音響信号の振幅は非適用群(薬剤投与のみ)に対して有意に高くなり,フォトメカニカル波による薬剤輸送促進効果が示された.また,フォトメカニカル波適用後の光音響信号の振幅は個体ごとに大きくばらつき,輸送薬剤の分布をその場で観測することの重要性が示された.最後に,本技術の応用を視野に入れた発展のため,血管の光イメージングに精通するUniversity of California, IrvineのProf. Bernard Choi氏の研究室で,治療時の血流を迅速に観測可能な小型・軽量なレーザースペックルイメージング装置を開発した.これは本技術による血液から標的組織への薬剤の移行の制御,また治療効果の予測と判定に役立ち,高効率・低副作用の薬剤治療を支援する.以上より,本技術は標的組織の薬剤分布のイメージングと制御を可能にし,重要疾患に対する薬剤治療効果の向上に貢献できる.従って,本研究成果は社会的に大きな意義があると言える.薬剤輸送とその動態観測のための統合型プローブを開発し,両機能において所望の性能を得ることができた.これにより疾患モデルを用いた動物実験を予定よりも早く開始することができたため.27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の成果により,薬剤輸送と薬剤動態観測の統合型プローブを開発し,マウス皮下腫瘍モデルと模擬薬剤を用いた実験でその有用性を示した.今後は,同モデルへの治療薬(光感受性薬剤)の輸送とその観測に本システムを用い,治療(光線力学的療法)の効果が向上しないか検討する.治療効果の評価方法としては,標的部位の血流の観測,腫瘍体積の測定,HE染色による病理組織学的評価の実施を予定している.光音響イメージング用のプローブの開発では、当初目標とした数100μmオーダーの空間分解能と計測可能深度1.5mmを獲得でき、これにより薬剤輸送との統合型プローブの開発を予定よりも早く開始することができた。薬剤分布の画像化に関しては、光吸収体が連続的に分布する領域の画像化について新たな課題が浮上し、今後追加の検討が必要である。薬剤輸送技術に関しては、レーザーの照射条件によるフォトメカニカル波の圧力特性の変化を調査した。全体として概ね計画通りに研究を遂行できたと考え、順調に進展しているものと評価する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
プリント教材と携帯電話用Web教材を連携させた基礎数学の教材開発

プリント教材とWeb教材の互いの長所を組み合わせ手軽に学習することができる新しいタイプの基礎数学の教材を開発した。e-ラーニングにおける数式入力の課題を回避し計算過程の記述を行わせる目的でプリント教材を用い、効率よく学習できるリンクバックラーニングを行うためにWeb教材を用いている。さらに、「いつでもどこでも学習できる」ことを実現するためにWeb教材は携帯電話対応とした。開発した教材を使った学習事例では、当該教材の有用性が確認できた。【e-ラーニング教材開発環境の構築】(1)学生スタッフがe-ラーニング教材を作成できる環境を整えた。(2)手書きによる数式以外に、MathMLで作成した数式をTeXに自動変換しGIF形式の画像を用い携帯電話のディスプレイに表示できるシステムを構築した.このシステムにより、効率よくMathML技術を用いて作成した数式を含むWeb教材を携帯電話に対応したWeb教材に自動変換することが可能となった。当初QVGA対応のWeb教材を作成すれば問題ないと考えていたが最近の状況よりVGAの対応も前記システムに導入した。これらの取り組みの結果、携帯電話だけでなくPSP(プレステーションポータブル)などの携帯情報端末でも携帯電話用のWeb教材が利用できるようになった。したがって,今回開発しているWeb教材の利用が携帯電話だけでなく携帯情報端末でも利用できるようになりより多くの方に利用していただくことが可能になった(PCからも利用可能)。【プリント教材の開発】当初計画とは一部変更し微分の教材を優先して作成した。関数の教材2部と微分の教材4部を完成させ、積分の教材4部が作成途中である。完成した教材は日ごろの個別指導にも活用している。【Web教材の開発】上記教材に対応するWeb教材の作成並びにリンクバックラーニング用の教材を作成した。PC用のURLはhttp://w3e.kanazawa-it.ac.jp/math/k-tai/index.htmlである。学生にプリント教材の問題を解いてもらい、携帯電話からプリント教材のヒントや解答を掲載しているWeb教材を利用して学習してもらった。その時のアンケート調査の結果、Web教材の作り方において改善すべき点がいくつかあることがわかり手直しをした。Web教材の利用状況の解析は当初Apacheのアクセスログを解析しようと考えていたが、得られるデータが不十分と考えアクセスログを生成する機能を前記システムに追加した。これにより、個別学習者のWeb教材利用状況を従来計画より詳細に入手することが可能となった。【Web教材の評価】(1)当初パスワードを設定して利用者を制限しようと考えていたが、「KIT数学ナビゲーション」のトップページ(http://w3e.kanazawa-it.ac.jp/math)から今回開発しているWeb教材がPCで利用できるようにした。携帯電話からは上記ページに掲載しているQRコードを読み込みアクセスできるようにた。(2)学生に開発した教材を評価したもらった結果、改善すべき点がいくつかあり教材を修正した。主な修正は、教材間のリンクの張り方を工夫し、よりスムーズに教材が利用できるようにしたことである。(3)アクセスログ生成機能から得られたデータを解析することにより学習動向を分析できるようになった。そして、自己採点結果とアクセスログデータを対比することにより、学習者の学力や学習意欲を判断できる可能性があることが分かった。アクセスログデータの解析が簡便にできるようにシステムを構築中である。(4)オンラインアンケート用サーバを準備しソフトを導入した。PCや携帯電話からでもアンケートに答えることが可能である。【プリント教材の開発の継続】当初計画とは一部変更し積分の教材を優先して作成した。因数分解の教材1部と積分の教材4部を完成させた。【Web教材の開発】上記教材に対応するWeb教材の作成および、数学の重要な項目を携帯電話で学習できるように基本的な公式を掲載したページやキーワード毎の解説ページを作成した。各ページはリンクにより有機的に結合され、リンクをたどることにより効率的に学習できるように構成している。【その他】MathMLで作成した数式をTeXに自動変換しGIF形式の画像を用い携帯電話のディスプレイに表示できるシステムに関して特許を申請した。【プリント教材の開発の継続】指数対数関数、三角関数のプリント教材の作成を行った。一部完成していないところがあり現在はまだ公開していない。ほぼ、高校数学の内容は網羅できた。作成したWeb教材は「携帯版KIT数学ナビゲーション」として公開している。また、現在普及が進んでいるiPhoneでも表示が携帯電話と同等になるように調整を進めている。【Web教材の評価】Web教材のアクセス解析用のプロトタイプのプログラムをPHPとMySQLで構築した。現在はその改善を進めている。

QRコードにWeb教材のURLだけでなく、変数情報を追加することにより、どのような状況で配布したプリントからのアクセスであるかを分析できるようにした。これにより、ユーザログインなしで、個別アクセスログデータを取得できるようになった。授業に作成したプリント教材を宿題として学生に利用させた。その結果、宿題は前日の夜に取り組んでいることが明らかになった。一般の利用者が携帯電話からの検索によってWeb教材を利用していることも確認できた。【学力と学習動向を関係の調査分析および利用動向調査】アクセスログデータを視覚化して、学習動向を容易に把握する方法を検討した。プリント教材の自己採点結果と合わせて利用すると、学生の学力を詳細に分析できる。現在のところ視覚化は自動化できておらず、今後の課題である。
培養細胞モデルを用いたシヌクレイノパチー病態機序の解明

GCI形成およびこれに続くオリゴデンドログリア変性機序を明らかにする目的で、HEK293T細胞およびKG1C細胞にαSYNとTPPPを共発現したモデルを作成した。TPPPはαSYNを特異的に凝集化させ、免疫沈降法でも相互に結合することが確認された。αSYNのセリン129リン酸化はTPPPによるαSYN凝集を促進させた。TPPP発現により両方の細胞体内にGCI類似のαsyn陽性細胞内封入体が形成されたが、うちKG1C細胞にのみアポトーシスが確認された。TPPP・αSYN共発現KG1C細胞にみられたアポトーシスはsirtuin2の選択的阻害剤で抑制された。申請者らはパーキンソン病(PD)多系統委縮症(MSA)におけるα-シヌクレイン(αS)陽性凝集体形成および細胞変性機序を明らかにすべく、α-シヌクレインおよびTPPP/p25αをOG系細胞(KG1C、MO3.13)に過剰発現することで、GCI類似のαS陽性細胞内凝集体を生じると共にcaspase-3活性化を伴う細胞死を起こす細胞モデルを樹立した(投稿中)。この細胞を用い、免疫沈降法によりαSがTPPP/p25αと相互にinteractionすること、ならびにTPPPが発現量依存的にαSのオリゴマー形成をもたらすことを確認した。さらにαS凝集、細胞死のプロセスにおいてはSer129部位におけるαSリン酸化が重要なステップであることを確認した。この細胞でみられる細胞内凝集体はauthenticなレビー小体、GCIと同様、アグレソームのマーカーで陽性となることから、凝集体形成メカニズムについては、微小管を介した逆行輸送系がその形成に深く関与していると推察された。これを踏まえ、過アセチル化により細胞内微小管であるチューブリンタンパクを安定化させるヒストン脱アセチル化酵素SIRT2に着目し、その選択的阻害剤であるAGK2に細胞を曝露したところ、細胞内に大型のαS凝集形成が促進されるとともに、細胞死が部分的に抑制されることを確認した。これらの研究成果は、αS凝集プロセスにおけるTPPP/p25タンパクの機能的役割を示すものであり、さらにはSIRT2阻害によるシヌクレイノパチー治療の可能性を示唆するものといえる。シヌクレイノパチーの一つである多系統萎縮症(Multiple system atrophy : MSA)は、パーキンソニズム、小脳失調、皮質脊髄路および自律神経系の症状を伴う進行性の神経変性疾患である。病変部位におけるαシヌクレイン(αSYN)陽性のグリア細胞内封入体(Glial cytoplasmic inclusion : GCI)の出現はMSAの病理組織学的特徴とされるが、近年オリゴデンドログリアタンパクであるtubulin polymerization promoting protein (TPPP)がαSYNの凝集促進作用を有することが示されている。我々はGCI形成およびこれに続くオリゴデンドログリア変性の分子病態機序を明らかにする目的で、HEK293T細胞およびオリゴデンドログリア系のKGIC細胞にαSYNとTPPPを共発現させたモデルを作成した。その結果、TPPPはαSYNを特異的に凝集化させ、免疫沈降法でも両者が相互に結合することが確認された。さらにαSYNのセリン129リン酸化がTPPPによるαSYN凝集を促進させることを明らかにした。TPPP・αSYN共発現KG1C細胞にみられたアポトーシスはチューブリン脱アセチル化酵素阻害剤であるsirtuin2の選択的阻害剤で抑制された。これらの研究結果はMSAの分子病態に新たな理解をもたらすと同時に、治療への可能性を示唆するものであるといえる。
オホーツク文化の雑穀

1.オホーツク文化のオホーツク文化の遺跡から出土した雑穀資料の集約オホーツク文化期の遺跡に伴う雑穀としては、網走市二ツ岩遺跡(貼付文期)からオオムギ、アワ、キビ、雄武町雄武竪穴群遺跡(沈刻文期)からオオムギ、キビ、枝幸町目梨泊遺跡(貼付文期)からオオムギ、アワ、キビが知られていた。今年度の調査では、新たに湧別町川西遺跡(貼付文期)からオオムギ、キビ、アワが出土し、常呂町TK73遺跡(貼付文期)からもキビが出土することが明らかになった。これまでにオホーツク文化期の遺跡から出土したオオムギは縦が短く幅が広く、「長さ/幅」の値が1.341.6を示すもので、北海道中央部の擦文時代や東北地方の平安時代の遺跡から出土する、「長さ/幅」の値が1.852.38を示す縦長で幅が狭いオオムギとは明らかに形態が異なるものである。大陸沿海地方では「長さ/幅」の値が1.431.68を示すオオムギが、紀元前7世紀頃から紀元12世紀頃まで栽培されており、オオムギを含めた数種の穀物が、大陸から渡来してきたものであることは明らかである。2.オオムギを使用した^<14>C年代測定結果年代測定結果が明らかになっている目梨泊遺跡を除いた3遺跡から出土したオオムギを使用し、加速器質量分析により^<14>C年代測定を行った。その結果は次のとおりである。(1)網走市二ツ岩遺跡;1,270±60y.B.P.(GEO-1404)暦年代;西暦690年875年(2)湧別町川西遺跡;1,300±60y.B.P.(GEO-1405)暦年代;西暦675年800年(3)雄武町雄武竪穴群遺跡;1,540±60y.B.P.(GEO-1406)暦年代;西暦535年635年以上のことら、6世紀から9世紀にかけて、オホーツク文化期の遺跡にオオムギが存在していたことが明らかになった。この年代は、狭くとらえたオホーツク文化期の年代とほぼ一致するもので、北海道で雑穀農耕文化を展開した擦文文化以前に、オホーツク文化の集団が小規模であっても雑穀農耕を行っていたことを示す。
多重崩壊α粒子測定による１２Ｃにおけるαクラスターガス状態の研究

本研究は、恒星中における炭素12の元素合成に重要な役割を果たすホイル状態の構造を実験的に決定することを目的とし、ホイル状態からの崩壊3α粒子の精密測定を行った。実験は、東北大サイクロトロン・ラジオアイソトープセンターにおいて110MeV、12Cビームを用いて12C(12C,3α)12C反応を行った。前方に散乱される崩壊3α粒子と反跳12Cを同時計測することによって、バックグランドのないクリーンな崩壊α粒子のデータを取得することに成功した。モンテカルロシミュレーションとの比較から、これまで観測されていなかったホイル状態から直接3α状態への崩壊を世界で初めて観測することに成功した。本研究の目的は、α凝縮状態と考えられている12C第二0+状態の構造を実験的に決定することである。最終年度である本年度は、次の3項目の実験研究を実施した。(1)東北大学CYRICにおいて、有限角度における12Cの第二0+状態からの崩壊3α粒子の精密測定の本実験。(2)大阪大学RCNPにおいて、大口径スペクトロメータによる36Arビームを用いた0°多重崩壊α粒子測定のテスト実験。(3)東北大学CYRICにおいて、0°における12C第二0+状態からの崩壊3α粒子測定実験。またCYRIC実験において、崩壊α粒子測定装置を安定に高分解能を維持するためのペルチェ素子を用いた冷却機構の導入や、実験データから様々な崩壊様式を分離するために用いるモンテカルロシミュレーションに、より現実的なエネルギー損失の分布、クーロン多重散乱による角度の広がり、検出器の分解能によるエネルギーの広がり等を導入し、改良を行った。実施した上記3つの実験のうち、(1)の実験が本研究に最も適していることが判明し、より高統計のデータを得るため(1)を重点的に行った。結果、精密に測定した崩壊3α粒子の運動量分布から、モンテカルロシミュレーションとの比較により、12C*→8Be+αの逐次崩壊成分と12C*→3αの直接3αに崩壊する成分とを分離することに成功した。また、直接3αに崩壊する成分も、エネルギーの揃った3つのα粒子を放出する崩壊(DDE)と位相空間に均一に崩壊する成分に分けることができた。α凝縮状態は、3つのα粒子が全て同一0S軌道上に存在するため、崩壊時に3つのα粒子が全て同一の運動エネルギー、つまり上記DDEのように崩壊すると考えることができる。厳密な三体崩壊の理論計算と比較する必要があるが、DDEの存在は12C第二0+状態がα凝縮であることを実験的に示していると考えられる。今年度における主な研究実績は以下の通りである。(1)東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンター(以下、東北大CYRIC)における110MeV-12Cビーム(核子あたり9.2MeV)を用いた12C(12C,12C*[3α])12C反応からの崩壊α粒子測定のテスト実験(3)大阪大学核物理研究センター(以下、阪大RCNP)における12C(α,α')12C*[α+X]反応実験によるαクラスターガス状態の研究成果に対してクラスター国際会議(ハンガリー、デブレッチェン)での招待講。および阪大RCNPにおける12C(α,α')および16O(α,α')反応実験によるαクラスターガス状態の研究成果に対するCOMEX4国際会議(日本、神奈川県葉山町)での招待講演(1)は、本研究の目的である12Cの第二0+状態の構造の実験的決定に向けた東北大CYRICにおける実験のテスト実験である。このテスト実験において、崩壊α粒子検出装置を開発し、12C(12C,12C*[3α])12C反応における検出器の最適な配置構成を決定した。(2)においては12C*→8Be+α→3αの逐次的な崩壊チャンネルについての放出角度、運動量、のパターンが得られ、検出器の角度およびエネルギー分解能が非常に良いという条件はつくが、実験結果から逐次成分を取り除くことが可能となった。(3)においては、12Cには第二0+状態のようなα粒子がボーズ・アインシュタイン凝縮のように同じクラスター軌道に存在しているようなαクラスターガス状態だけでなく、さらに希薄で広がったαクラスターガス状態やαクラスターが3つ直線的に並んでいるような状態を示唆する実験結果について発表を行った。今年度予定していた(a)崩壊α粒子検出装置の開発、(b)崩壊α粒子測定のモンテカルロシミュレーションプログラムの開発、については完了しており、予定通りに進んでいる。(a)の崩壊α粒子検出装置に用いるシリコンストリップ検出器は、研究費をプリアンプ等の回路を購入にあてたため、過去の研究で使用した検出器を流用し、その検出器に最適化した崩壊α粒子検出装置を作成、かつ最適なビームエネルギーを用いてテスト実験を行った。

(b)の崩壊α粒子測定のモンテカルロシミュレーションプログラムについても研究実績の概要で述べた通り、逐次崩壊チャンネルの崩壊α粒子の放出角度・運動量分布が求められており、実験結果から逐次崩壊成分を取り除くことが可能となっている。また、東北大CYRICにおける崩壊α粒子測定のテスト実験も行っており、本測定を平成25年6月後半に予定している。さらに阪大RCNPでの大口径スペクトロメータ(LAS)を用いた崩壊α粒子測定のテスト実験を5月に予定しているおり、ほぼ計画通りである。達成度の欄で述べたように、平成25年5月に阪大RCNPにおいてLASを用いた多重崩壊α粒子測定のテスト実験を予定している。ビームエネルギーに比べ、相対エネルギーが小さい崩壊α粒子を可能な限り一つ一つ分離して測定できるように、イベント発生のトリガー信号を生成するプラスチックシンチレータを通常11分割されているものから崩壊α粒子が飛来する高運動量領域をさらに細かく分割したものへと改良を行っている。さらに焦点面の直前でビームを止めるファラデーカップを製作し、LASを用いて逆運動学反応によって多重崩壊α粒子を測定できるかをテストする。このテスト実験では、甲南大学、秋宗英俊教授が推進している36Arにおけるαクラスターガス状態の探索実験と崩壊α粒子測定方法と同じであるため、共同して測定技術開発を行うことで研究を推進する。具体的に問題点を洗い出し対策を行った後、平成25年度後半に4He(12C,12C*[3α])4He反応における多重崩壊α粒子測定実験を行う予定である。次に東北大CYRICでは、平成25年6月末に重心系で約15度における測定実験を行う。この角度は、テスト実験において12Cの第二0+状態がバックグランドフリーで測定できることがわかっている角度で、現在世界一とされるデータに匹敵する統計量の崩壊α粒子測定を行う。さらに、平成25年度後半に12Cの第二0+状態の散乱断面積がより大きい0度における測定にチャレンジする。なお平成25年4月から本研究を修士論文の課題とする大学院生が加入したことにより、研究の推進力はより大きくなっている。研究費は、以下のような使途に用いる。1.東北大CYRICでの実験に向けて反跳粒子検出装置の開発および崩壊α粒子測定装置の改良。当初の計画では、反跳粒子検出器には常温のシリコン検出器を用いる予定であったが、エネルギー分解能、および飛行時間測定による粒子識別能力をさらに向上させるため、ペルチェ素子を用いて冷却システムを構築し、シリコン検出器を冷却して用いる。また、0度測定に向けて崩壊α粒子測定装置の改良も行う。崩壊α粒子測定側のシリコンストリップ検出器も冷却することによって、レート耐性、エネルギー・時間分解能の向上させる。2.阪大RCNPの実験に用いるHeガス標的の製作およびトリガーシンチレータ・ファラデーカップの改良。4He(12C,12C[3α])4He実験に最適化するため、入射窓により薄い膜を用い、崩壊α粒子および反跳4He原子核(=α粒子)を測定できるようにしたHeガス標的を作成する。Heガスの循環装置等は既存のものを利用する予定である。
良性歯原性腫瘍の二次的悪性転化機構に関する分子病理学的検討

本研究実施によって、ヒト上顎骨原発石灰化歯原性嚢胞(COT)の外科手術材料より腫瘍細胞単離し、COT1-COT6の6株細胞を樹立した。同細胞系の維持によって、周密化までの培養期間中に経時的に固定または回収して、免疫細胞化学とRT-PCR法による発現分子をおこない、さらに染色体標本のトリプシンG-バンド法による解析によって第9-13染色体の相互転座はじめ種々の染色体レベルの異常をみいだした。これらの細胞はケラチン16やアメロジェニン等の歯原性上皮性格を発現していた。細胞系樹立実験と平行して、本学病院の病理診断ファイルから、COTと診断された症例を収集し、再度検鏡後、嚢胞性部分、充実性増殖した部分、浸潤性部分、とくにそれら病変の移行部分を注目して詳細に再検討し、歯原性上皮細胞マーカ、各種細胞外基質とその関連分解酵素、石灰化関連分子等の発現を検索した。その結果、幻影細胞には、パールカン、テネイシン、ファイブロネクチンほかの細胞外基質分子が蓄積しており、これに対応して、MMP7やβカテニンも共発現していることが判明した。すなわち、COTに特徴的な幻影細胞の特徴的形態は細胞外基質の分泌障害によること、さらに、Wntのシグナル伝達経路の変調も生じていたので、それらの分子経路の相互関連が推測された。以上の組織ならびに細胞レベルでの検討から、染色体転座および細胞外基質分子分泌異常が複雑かつ相乗的に関与して、良性歯原性腫瘍COTの悪性転化が成立している可能性が示唆されたわけで、良性腫瘍の二次的悪性転化機構の具体的な分子背景を新たに追加することができた。ヒト石灰化歯原性嚢胞の本学病院における再発症例を検討したところ、二症例がみいだされたので、その初発ならびに再発病巣の組織学的所見を比較検討した。さらに、再発例より樹立したCOC1-COC6細胞について、維持培養した。免疫細胞化学、RT-PCR法、染色体標本作製、FISH法のために細胞を培養し、周密化までの適切な時期に固定、回収した。また、上記の株化細胞を、各種それぞれ5-6日間培養し、1.5x10^7/0.5mlの濃度に調整し、生後一週齢のヌードマウスの皮下に移植した。移植腫瘍がある程度に成長した段階で外科的に切除し、通法にて10%フォルマリンで固定パラフィン切片を作製し、HE染色をはじめ、上記の免疫組織化学的検索をおこない、腫瘍性格を確認した。前年度までに石灰化歯原性腫瘍(COT)から樹立した細胞COT1-COT6を維持培養し、周密化までの期間を経時的に固定または回収して、免疫細胞化学、RT-PCR法、染色体標本作製、FISH法実験の前年度までに不十分であった部分を補充した。トリプシンG-バンド法にて染色体解析をおこない。染色体の数の異常に加え、形態の異常を詳細に解析して、種々の染色体レベルの異常をみいだした。そのうち、第9-13染色体の相互転座に関して重点的に解析中である。上記細胞レベルの実験と平行して、本学医歯学総合病院の病理診断ファイルから、石灰化歯原性嚢胞またはCCOTと診断された症例を収集し、再度検鏡後、嚢胞性部分、充実性増殖した部分、浸潤性部分、とくにそれら病変の移行部分を注目して詳細に再検討し、歯原性上皮細胞マーカ、各種細胞外基質とその関連分解酵素、石灰化関連分子等の発現を検索した。その結果、幻影細胞には、パールカン、テネイシン、ファイブロネクチンほかの細胞外基質が免疫組織化学的に陽性で、これに対応して、MMP7、インテグリンβ1、βカテニン、CKI7も共発現していることが判明した。

すなわち、幻影細胞の特徴的形態は細胞外基質の分泌障害と関連していることが示唆され、これにともなって、ソニックヘッジホッグSHH、BMP、Wntの各経路のシグナル伝達経路の変調がおこることが想定された。以上の組織レベルならびに細胞レベルでの検討から、染色体転座および細胞外基質分子分泌異常を背景に、細胞増殖機転が亢進している背景が明らかとなったので、これらの背景が複雑かつ相乗的に関与して、COTの二次的な悪性転化に影響している可能性が示唆された。
エンバク体細胞の全能性と共役する遺伝子の分析と育種学的利用

1.高再生遺伝子型の選択`Lodi'×`Kanota'の自殖後代で、F2からF3への植物体再生に関する遺伝率(0.93)の高さから、高再生系統の選抜が可能であることが判明した。しかし一方では、カルスの長期培養中に生じるソマクロ-ン変異があり、育種への応用面では好ましくなかった。特に、この培養系では再生植物の染色体数の減少傾向が認められ、低次異数体の育成には好都合であるが、高繁殖系や優良品種の育成には不都合であった。そこで、R1、R2(再生世代)を選抜するのに一旦完熱種子を採種し、そこから植物体を裁培して、その自殖未熱胚からカルス誘導を行いソマクロ-ン変異を少なくしようとした。これらの世代をRS1、RS2(種子経由再生世代)と呼ぶ。RS1世代ではR2世代よりも染色体数2n=42の正倍数体が多くなり、再生力の高い系統が選抜できた。圃場試験での外部形態形質の変異幅もRS1世代で小さくR2世代で大きく、その差は5%レベルで統計的に有意であった。2.懸濁培養法の応用これまでの研究では、高再生系統の選抜にはB5基本培地(2,4ーD2mg/l)の固型培地のみを用いてきた。しかし、懸濁培養では大量の細胞を得たり、宿主特異性毒素などを添加した培地を利用しやすい。そこで、これまでの固型培地で再生能の高い`Lodi',`Bulwark',および`Iowa469'と中程度の`Solva'および低い`Rhiannon'の5品種を供試して懸濁培養での生長量や再生能を調べた。懸濁培養条件を検討すると、B5基本培地に0.2mg/lの2,4ーDを添加し、25°C暗黒条件下で10日毎に継代培養すると最も細胞の生長や植物体の再生が高かった。品種別にみると`Lodi'と`Rhiannon'の生長率や再生能は高かったが、`Iowa469'と`Solva'は殆ど生長しなかった。懸濁培養の接種源は、固型培地で6から7カ月の長期培養細胞を用いた。固型培地では長期培養カルス細胞は再生能を殆どなくしているが懸濁培養ではそれが回復できることが判った。3.核DNA量の変異と植物体再生能培養環境は非常に複雑で、再生個体にはおおきな遺伝的変異をともなう。そこで、核DNA量を遺伝的変異の指標にして、再生能との関係を調べた。固型培地でのカルスの核DNA量の分布は、例外もあるものの再生能の高い`Lodi'と`Iowa469'では正規分布に従い、`Aurora'や`Ffion'などの再生能の低い品種では、平均値や分散が共に小さく分布の尖度が高くなる傾向が認められた。