hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
維管束植物の生殖器官の形態進化を形態形成遺伝子の進化として解明する

(1)昨年度、生殖器管特異的発現の見られたコバノグネツムMADS遺伝子GPMADS1.3、4の発現様式をin situハイブリダイゼーションにより解析した。全ての遺伝子は胚珠原基と、3枚のenvelopeそれぞれの原基で発現しており、envelopeの成長に従い、発現が減少することがわかった。GPMADS3遺伝子の相同遺伝子がラディアータマツで研究されており、種鱗と胚珠で発現していることが知られている。GPMADS3遺伝子の発現との比較から、従来、他の裸子植物の生殖器官との対応付けが困難であった、グネツム類の胚珠(珠心と3枚のenvelope)は、針葉樹類の種鱗-胚珠複合体と相同である可能性が高いことが判明した。(2)コバノグネツムLFY遺伝子GPLFYを単離し、他の陸上植物LFY遺伝子と共に遺伝子系統樹を作成した。その結果、GPLFYは被子植物LFYとは異なったグループに属することがわかった。しかし、アミノ酸配列はLFY遺伝子に良く類似していた。GPLFYはGPMADS3と同じ領域で発現しており、被子植物におけるのと同じように、コバノグネツムでもLFYによってMADS遺伝子が誘導されている可能性がある。さらに、GPLFY遺伝子をシロイヌナズナで過剰発現させると、LFYを過剰発現させたときと同じ表現型を示したことから、GPLFYはLFYと良く類似した機能を持っていることがわかった。従って、LFY遺伝子は花の進化にはそれほど重要でなかったのではないかと推測している。(3)コバノグネツムおよびイチョウにおけるMADS遺伝子の解析から、裸子植物にも被子植物が持つほとんどのグループのMADS遺伝子が存在していることがわかった。しかし、裸子植物からはAP1遺伝子が単離されていないことから、この遺伝子グループの欠失が裸子植物が花を形成しない理由ではないかと推察した。
伝達物質放出の分子機構に関する研究

本研究では、伝達物質放出の機構について、分泌小胞を開口部位に供給し係留する機構、ならびにCaシグナルに応答して直ちに小胞と形質膜の融合をもたらす機構を分子レベルで明らかにすることを目的として、以下のように成果を得た。1.クロマフィン細胞で分泌小胞を開口部位に供給し係留する機構1)抑制的クランプ分子と考えられるイノシトールポリリン酸は、Ca刺激によってシナプトタグミンC2ドメインから解離し細胞質に遊離してくることを明らにした。イノシトール-6-リン酸を細胞内投与すると、自発性の開口頻度ならびに脱分極刺激にたいする応答の開口頻度が顕著に抑制されたが、イノシトール-6-硫酸は全く阻害作用を持たず、特異性が示された。2)形質膜直下のF-アクチンならびにこれを介したアクチン-ミオシン相互作用が開口可能な分泌顆粒の持続的供給に重要であること、さらにCキナーゼの活性化はこの過程を増強させることを明らかにした。PKCによるプライミング増強作用の分子機構においては、活性化されたPKCα,βが形質膜近傍に移行し、RACK1を介してF-アクチンと結合する事が重要であることを明らかにした。2.シグナルに応答して直ちにシナプス小胞と形質膜の融合をもたらす機構1)PC12細胞の低分泌能株を分離して、SNARE蛋白質の発現との関連を解析した結果、シンタキシン、VAMP-2、SNAP-25およびMunc-18の発現が有意に低いことが分泌能の低下に関わる可能性が明らかとなった。2)シナプスにおける開口分泌を解析し、SNARE蛋白質のリサイクル、SNARE蛋白質とN型カルシウム・チャネルとの結合などの関与を明らかにした。また、開口に先立ってDoc2αとMunc13-1の結合が進むことを明らかにした。本研究は、伝達物質放出の機構について、分泌小胞を開口部位に供給し係留する機構、ならびにCaシグナルに応答して直ちに小胞と形質膜の融合をもたらす機構を分子レベルで明らかにすることが目的である。本年度は、以下のように成果を得た。1.最近我々が仮説を提唱したシナプトタグミンとイノシトールポリリン酸による抑制的クランプ調節の検証を進めた結果、高透過性クロマフィン細胞ではCa刺激によってイノシトールポリリン酸が細胞質に遊離してくることが明らかとなり、それがシナプトタグミンC2ドメインに由来することが示唆された。また、In vitro実験系により、副腎髄質から調製した分泌顆粒の凝集に対してイノシトールポリリン酸が顕著な抑制を示すことを明らかにした。この抑制は、イノシトールポリリン酸がによるクランプ機構のモデル系となりうるので、現在その特異性についてさらに実験を進めている。2.我々はこれまでに、形質膜直下のF-アクチンならびにこれを介したアクチン-ミオシン相互作用が、開口可能な分泌顆粒の持続的供給に重要であると示唆してきた。分泌顆粒の持続的供給について解析を進めた結果、Cキナーゼの活性化はこの過程を増強させることによって開口分泌機能を亢進させており、その一部にはGAP43のリン酸化が関わる可能性が明らかとなった。この調節に関わるCキナーゼの分子種とその機構を解析するために、Cキナーゼの受容体蛋白質の細胞内局在を免疫組織化学的に解析した結果、クロマフィン細胞ではCキナーゼまたはC2領域を持つ蛋白質分子が、RACK1を介してF-アクチンに結合する可能性が示唆された。この点と調節機構との関連について、解析を継続している。3. SNARE蛋白質の開口分泌における役割について、有芯顆粒の開口と、シナプス小胞の開口それぞれにおける役割の相違について解析を進めている。

本研究は、伝達物質放出の機構について、分泌小胞を開口部位に供給し係留する機構、ならびにCaシグナルに応答して直ちに小胞と形質膜の融合をもたらす機構を分子レベルで明らかにすることが目的である。本年度は、以下のように成果を得た。1.シナプトタグミンとイノシトールポリリン酸による抑制的クランプ調節の検証を進めた結果、高透過性クロマフィン細胞ではCa刺激によってイノシトールポリリン酸が細胞質に遊離してくることが明らかとなり、それがシナプトタグミンC2ドメインに由来することが示唆された。イノシトールー6ーリン酸を細胞内マイクロインジェクションで投与すると、自発性の開口頻度ならびに脱分極刺激にたいする応答の開口頻度が顕著に抑制された。これに対して、イノシトールー6ー硫酸は、全く阻害作用を持たず、特異性が示された。また、In vitro実験系により、副賢髄質から調製した分泌顆粒の凝集に対してイノシトールポリリン酸が顕著な抑制を示すが、シナプトタグミンに結合活性を持たないイノシトールー3ーリン酸には、阻害作用は無かった。2.我々はこれまでに,形質膜直下のF-アクチンならびにこれを介したアクチン一ミオシン相互作用が開口可能な分泌顆粒の持続的供給に重要であること、さらにCキナーゼの活性化はこの過程を増強させることを明らかにした。この調節に関わるCキナーゼの分子種とその機構、細胞骨格系との関連を解析するために、Cキナーゼの受容体蛋白質RACK1の細胞内局在を免疫組織化学的に解析した。RACK1は細胞膜直下、核膜周辺部、細胞質に局在しており、TPA刺激後も局在は変化しなかった。細胞膜直下に局在するRACK1はF-アクチンと同じ局在を示した。クロマフィン細胞にはPKCα,β(βI,βII,ε,ζがあり、静止時には細胞質に局在していた。TPA刺激を行うと、PKCα,βの移行が観察され、PKCαは細胞膜直下へ、PKCβはRACKIと同じ局在部位へ移行した。F-アクチンの切断実験および免疫沈降実験から、クロマフィン細胞では活性化されたPKCα,βがRACK1を介してF-アクチンに結合する可能性が示唆され、PKCα,βのRACK1を介したF-アクチンへの結合がプライミング増強作用の分子機構に重要であることが推察された。3.SNARE蛋白質の開口分泌における役割について、PC12細胞の低分泌能株を分離して、SNARE蛋白質の発現との関連を解析した結果、シンタキシン,VAMP-2、SNAP-25およびMunc-18の発現が有意に低いことが分泌能の低下に関わる可能性が明らかとなった。
銀／硫化銀ナノ粒子によるランダムネットワークを用いた革新的脳型デバイスへの挑戦

Ag/Ag2Sコアシェルナノ粒子を利用し、ランダムネットワークを有する回路をプログラマブルに作製する。得られたランダムネットワークは電圧信号により組み換え可能であり、それを用いた脳型演算デバイスを実現する。既存の脳型デバイスに比べ容量、消費電力とも飛躍的に低減できる。研究手順は以下の通り。(1)原子スイッチ構造を有するナノ粒子(Ag/Ag2Sコアシェルナノ粒子)を用いてランダムネットワーク構造作製、(2)脳型挙動の一つである学習演算を多電極で行い、制御。(3)ランダムネットワークを用いて常温での論理ゲートやリザーバ演算の実行を目指す。
金属錯体をプローブとする水のキャラクタリゼーション

水は溶媒および溶質として複雑多岐にわたる反応性を示す。水の塩基性度と酸性度は溶液中における水の溶存する分子形態(二量体、三量体、溶媒和した水分子など)によって変化することが指摘されてきたが、実験からの検証はほとんどない。そこで本研究ではIR、NMR法によって種々の溶媒中の水の溶存状態を定量的に把握し、水の配位に対して選択性のある大環状平面錯体、1,4,8,11-テトラメチル-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンニッケル(II)〔Ni(tmc)〕^<2+>のソルバトクロミズムを利用して水のキャラクタリゼーションを行なった。ドナー溶媒-ニトロベンゼン混合溶媒系中の水:ドナー溶媒としてピリジン誘導体、ジメチルスルホキシドを用い、水(W)とドナー溶媒(S)との1:1水素結合種(WS)のみが存在するドナー溶媒の濃度範囲を決定した。この混合溶媒中の〔Ni(tmc)〕^<2+>のソルバトクロミズムの平衡解析から得た知見は次の通りである。イ)、水はドナー溶媒と水素結合することにより塩基性(配位能)が高くなる。そしてSの塩基性度が高い程その効果は大きい。ロ)、〔Ni(tmc)WS〕^<2+>の水分子の水素結合していない水素の水素結合供与性はWSの錯体への配位定数が大きい程大きくなり、バルクに存在しないWS-Sが配位した錯体〔Ni(tmc)WS-S〕^<2+>が形成される。Aerosol-OT(ACT)逆ミセル中の水:濃度比R(=〔H_2O〕/〔AOT〕)が10以上の場合は、〔Ni(fmc)〕^<2+>はバルク水溶液中と同じスペクトルを示したがRが10以下次第に小さくなるとともに4配位錯体が減少し、水が配位したら配位錯体のピークは長波長にシフトした。そしてOH^-が配位した錯体のスペクトルに漸近することを見い出した。このことからRが小さくなると〔Ni(tmc)〕^<2+>とAOTのスルホ基との協同的な分極効果によって、配位した水分子がよりOH^-イオンに類似した形に分極すると考えられた。
脳機能画像法による記憶錯誤の神経基盤の研究

本研究ではまず健常被験者を対象として、虚再認と嘘の神経基盤を機能的磁気共鳴画像法による実験で検討した。嘘は虚再認に比べ前頭前野の活動が高く、また虚再認は嘘に比べ内側側頭葉(右海馬前方)の活動が高いことを報告した。嘘の神経基盤についてはパーキンソン病患者群を対象とした神経心理学的研究を行い、前頭前野が重要な役割を果たすことを報告した。さらに、これまで行ってきた研究成果をまとめた総説を発表した。本年度は健常被験者を対象に行った虚再認と嘘の神経基盤に関する研究成果を報告した(Abe et.al., 2008)。この研究ではDRMリストと呼ばれる、虚再認を高い確率で引き起こすことが可能な単語リストを用いて、1)学習した単語を正確に再認できた時、2)学習していない単語にもかかわらず学習したものであると虚再認を起こした時、3)学習していない単語にもかかわらず学習したものであると意図的に嘘をついた時、の3種類の認知過程に伴う神経基盤を同定するために脳機能画像法による実験を行った。被験者は聴覚呈示による単語リストを学習した後、視覚呈示による再認記憶課題中の神経活動を機能的磁気共鳴画像法(fMRI)によって測定された。結果として、まず意図的に嘘をついた場合には外側の前頭前野の賦活が認められ、これまでの先行研究の知見とも合致するものであった。次に虚再認に比べ正確に再認できた場合には当聴覚連合野の賦活が認められた。この結果は実際に知覚入力を経て学習した単語の再認の際には、聴覚関連領域の再活動が関与している可能性を示唆している。最後に、虚再認と嘘に関わる神経活動の直接比較を行った結果、嘘に関連して前頭前野の賦活が認められ、虚再認に関連して内側側頭葉(右海馬前方)の賦活が認められた。後者の内側側頭葉の活動に関しては、この領域が記憶の客観的な正確性だけではなく、主観的な判断にも関係している可能性を示唆しており、記憶錯誤における内側側頭葉の関与を考察する上で非常に重要な知見を得ることができた。本年度はパーキンソン病(PD)における欺瞞行動の障害の神経基盤に関する研究を報告した(Abe et al.,2009)。PDは振戦、筋固縮、無動を主徴とする疾患であるが、遂行機能障害などの認知機能障害を伴うこともある。また、「真面目」「勤勉」「正直者」といったように、性格に一定の傾向を示すことも多くの研究によって示唆されているが、これらの性格傾向が脳の病理変化に由来しているかどうかは不明であった。本研究では「正直者」すなわち、嘘をつかないという傾向に焦点をあて、以下のような認知課題を施行した。PD患者群に、まず48枚の写真(生物及び物品)の記銘課題を施行した。その後、学習した写真48枚に学習していない写真48枚を加えた再認課題を行った。再認課題では、動画上で4名の人物がランダムな順序で登場し、写真を見たことがあるかどうかを一枚ずつ質問した。PD患者群は「見た」「見てない」を口頭で答えたが、4名のうち1名に対しては一貫して嘘をつくよう教示された。この課題を健常コントロール(NC)群にも施行し、その成績を比較した。また、PD患者群に対してはFDG-PETによる撮像を行い、嘘をつく課題の成績低下と相関して糖代謝が低下する脳領域を解析した。その結果、NC群に比べPD患者群では、嘘をつく課題で有意に成績が低下しており、課題成績の低下は前頭前野における糖代謝の低下と有意に相関していた。これらの結果は、嘘をつかないというPD患者群の性格傾向が、実際には前頭葉の機能低下による認知機能障害に由来している可能性を示唆している。また、脳機能画像法によってのみ検討されていた嘘の神経基盤について、神経心理学的な観点からも前頭葉が直接的に関与していることを示唆している。本年度は上記の研究に加え、これまで行ってきた嘘と記憶錯誤の神経機構についての研究成果をまとめた総説を発表した(Abe,2009)。
固体高分解能^<13>C NMRによる膜蛋白質の高次構造とイオン輸送機能の解析

高度好塩菌(Halobacterium salinarium)の光プロトンポンプ蛋白質、バクテリオロドプシンの活性部位近傍の高次構造解析および、バクテリオロドプシンに類似の高次構造を持つG蛋白質共役型受容体の膜表面信号伝達部位の構造の予測を目的として、レチナ-ル近傍のα-ヘリックス構造および膜表面の親水性部位の高次構造を固体^<13>C NMRにより解析した。膜の細胞質側に位置するバクテリオロドプシンC末端部位(残基228-248)は蛍光プローブ等を用いた研究から無秩序な構造をとるとする報告と一部に構造を持つとする報告があったが、アラニン側鎖メチル炭素の^<13>C NMR化学シフト値からC末端部位にはα_<II>-ヘリックス構造(16.4ppm)が見い出され、パパインによる加水分解処理によるスペクトル変化から残基228-235に帰属された。この膜表面に突出したα_<II>-ヘリックス構造はpH、温度に依存して構造変化し、低pH(4.25)ではランダムコイルをとり、低温(<10°C)では15.7ppmのシフト値を持つα-ヘリックス構造を形成する。このことから、蛋白質共役型受容体の膜外部位における秩序構造の存在と環境の変化にともなう膜外部位の高次構造変化の可能性が示唆された。一方、光プロトンポンプ活性の中心であるシッフ塩基近傍の膜貫通ヘリックス部位に位置し、光反応の際に高次構造変化が予測されるα-ヘリックスのキンク部位近傍に位置する49位バリンをアラニンに置換した変異バクテリオロドプシンの固体^<13>C NMR測定の結果、キンク部位近傍のヘリックス構造は16.6ppmに化学シフト値をもつα-ヘリックス類似の構造に帰属され、この構造は近傍のループ部位(71-72位)の加水分解により影響を受けないことが明らかとなった。現在、これらの活性部位、膜表面部位の高次構造に注目し、光反応時のバクテリオロドプシンの高次構造変化を解析中である。
リン酸利尿因子作用発現に関わる分子群の機能的連関

まず、近位尿細管におけるメガリン依存性エンドサイトーシスとリン酸再吸収調節ホルモンであるFGF23の作用との関連について検討を試みた。メガリンのリガンドの一つで、他のリガンドの結合を阻害するreceptor associated protein(RAP)の可溶型分子のヒスチジンタグ融合蛋白質を恒常的に発現するCHO細胞を樹立し(CHO-His-sRAP)、ヌードマウスに移植することにより、メガリン機能撹乱モデルを作製した。FGF23の機能獲得型変異体であるFGF23[R179Q]を恒常的に発現するCHO細胞も合わせて樹立した。これらの細胞の担癌マウスを用いた解析から、メガリン機能の異常に伴う過リン酸尿、低リン血症においては、種々の遺伝性低リン血症の場合とは異なり、血中FGF23値は上昇していないことが示唆された。この知見は、ヒトのFanconi症候群などの近位尿細管機能障害にともなう低リン血症において、血中FGF23値がむしろ低下しているという臨床データと良く一致していた。最近、FGF23がFGF受容体及びKlothoと複合体を形成することにより、腎臓からのリン酸排泄量を増加させることが報告された。しかしながら、細胞外液中のリン酸濃度がFGF23の作用に及ぼす影響については検討されていなかった。そこで、ヒト胎児腎尿細管由来の細胞株HEK293を用いて、細胞外のリン酸濃度がFGF23シグナルに及ぼす影響を検討した。その結果、細胞外リン酸濃度の変化によりひきおこされるシグナルと、FGF23シグナルにおいて、その下流のネットワークに共通性が存在することが示唆された。近位尿細管におけるメガリン依存性エンドサイトーシスとリン酸再吸収調節ホルモンであるFGF23の作用との関連について検討を試みた。メガリンのリガンドの一つで、他のすべてのリガンドの結合を阻害するreceptor associated protein (RAP)の可溶型分子のヒスチジンタグ融合蛋白質を恒常的に発現するCHO細胞を樹立し(CHO-His-RAP)、ヌードマウスに移植することにより、メガリン機能撹乱モデルを作製した。また、FGF23の機能獲得型変異体であるFGF23[R179Q]を恒常的に発現するCHO細胞(CHO-FGF23[R179Q])も合わせて樹立した。CHO-His-RAPをヌードマウスの背側皮下に移植することにより、形成された腫瘤から血中にHis-RAPが分泌されることを確認した。また、CHO-FGF23[R179Q]をヌードマウスの皮下に移植し腫瘤を形成させることにより、血中FGF23レベルの上昇、低リン血症を呈することを確認した。ヌードマウスにCHO-FGF23[R179Q]およびCHO-His-RAPあるいはCHO親株を移植し、経時的に採血し、血清リン値を測定したところ、CHO-FGF23[R179Q]とCHO-His-RAPを移植した群で、CHO-FGF23[R179Q]とCHO親株を移植した群と比較して、移植後2週目の血清リン値がより低い傾向を認めた。また、血中FGF23値は、CHO-FGF23[R179Q]とCHO-His-RAPを移植した群でCHO-FGF23[R179Q]とCHO親株を移植した群よりも低い値を示した。以上より、メガリン機能の異常に伴う過りン酸尿、低リン血症においては、種々の遺伝性低リン血症の場合とは異なり、血中FGF23値は上昇していないことが示唆された。FGF23はFGF受容体及びklothoと複合体を形成することにより腎臓からのリン酸排泄量を増加させる。

そこで、ヒト胎児腎尿細管由来の細胞株HEK293細胞を用いて、細胞外のリン酸濃度がFGF23シグナルに及ぼす影響を検討した。HEK293細胞はklothoをわずかに発現しており、FGF23の機能獲得型変異体である。FGF23[R179Q]の添加によりERK1/2のリン酸化、early growth response-1 (Egr-1)遺伝子の発現誘導を示した。この、FGF23[R179Q]に対する反応性は、klothoを過剰発現させることにより増強した。次に、HEK293細胞に高濃度(4の細胞外無機リン酸刺激を与えたところ、ERK1/2のリン酸化、Egr-1の発現誘導が観察され、その経時的変化はFGF23[R179Q]を添加した場合と類似していた。この細胞外無機リン酸刺激により誘導されるERK1/2のリン酸化、Egr-1の発現誘導は、ナトリウム・リン酸共輸送担体に対する阻害剤であるphosphonoformic acid (PFA)を添加することにより解除された。さらに、HEK293細胞に高濃度リン酸刺激とFGF23[R179Q]刺激を同時に与えたところ、ERK1/2のリン酸化、Egr-1の発現誘導は相加的に増強した。このことから、細胞外リン酸濃度の変化によりひきおこされるシグナルと、FGF23シグナルにおいて、その下流のネットワークに共通性が存在することが示唆された。
土壌・植物・微生物機能を用いた人工湿地によるマンガン含有坑廃水処理システムの開発

マンガン酸化菌を人工湿地の植物根圏において優占化し、水溶性マンガンを不溶性のマンガン酸化物として酸化除去する。マンガン酸化菌は、一般的に培養が困難なものが多いが、外部炭素源を用いず、植物が根から分泌する有機物と酸素を基質・電子受容体として増殖できるものの集積を目指す。マンガン酸化菌によって形成されたマンガン酸化物は、水溶性マンガンを吸着除去し、さらに吸着されたマンガンは酸化物になり、他の金属を吸着・酸化しつつ、目詰まりしない範囲では、マンガンの飽和吸着量は維持される。また、マンガン酸化菌の酵素反応による酸化は、pHが8以上でなくとも効率的に進行することが期待できる。
プロトンおよび金属イオンとの酸塩基相互作用によるケチルラジカルの反応性制御

光誘起電子移動(PET)反応に関する課題では,ベンゾフェノンの光還元をプローブ反応として1,3-ジメチル-2-フェニルベンズイミダゾリン(DMPBI)および2-(2'-ヒドロキシフェニル)-1,3-ジメチルベンズイミダゾリン(σ-HPDMBI)のPET反応性について調査し,DMPBIラジカルカチオンでは2位の炭素上の脱プロトン化が,O-HPDMBIラジカルカチオンではフェノール部位の脱プロトン化が優先することが示された。また,電子供与性置換基を有するピレンおよびアントラセンを増感剤とし,ベンズイミダゾリン誘導体を還元剤とする複合光増感系の比較評価を行い,ピレンがアントラセンよりも優れた増感剤であることを明らかにした。また,2-ハロメチル-2-(3-ブテニル)置換芳香族環状ケトンのPET反応を検討し,"PET反応で生成するケチルラジカルは分子内炭素-ハロゲン結合に対して求核置換ではなく一電子移動を起こす"という結論を導いた。一方,金属酸化還元剤を用いる反応に関する課題では,ヨウ化サマリウム(II)とアシルオキシ置換ケトン,ケト炭酸エステルとの反応を検討し,分子内ケトン-エステルカップリング反応が進行することを見出した。また,γ-ケトエステル構造を有するインダノンとヨウ化サマリウム(II)の反応で生成したシクロプロパノール誘導体を酸化剤と反応させベンゾトロポロンへと導いた。次いで,ハロケトンのサマリウムバルビエ反応で得られるシクロプロパノール誘導体の酸化反応を行ない,そのワンポット反応化にも成功した。最後に,電子移動条件に依存するシクロプロピルシリルエーテルの位置選択的開環反応を見出し,その支配因子を明らかにした。今後は,これらの電子移動反応系の詳細機構解明による精密制御とその情報に基づく新規電子移動型機能性物質の創製へと展開する。電子移動化学分野において,ケチルラジカルと分子内官能基との反応機構の解明は重要な課題であるが,ケチルラジカルの分子内反応性に関する情報は意外に少ないのが現状である。このような背景を踏まえ,平成15年度は,2-ハロメチル-2-(3-ブテニル)置換芳香族環状ケトンをモデル反応基質として,光誘起電子移動反応において生成するケチルラジカルと分子内の炭素-ハロゲン結合との反応性について検討した。はじめに,トリストリメチルシリルシランとの熱反応にょり上記反応基質のラジカル反応プローブ機能を検証した。次に,アミン類との光誘起電子移動反応を行ったところ,炭素-ハロゲン結合の開裂により生成した炭素ラジカルからの特徴的な転位生成物が得られた。これは,反応基質のハロゲン置換基の種類や環サイズの違いなどに依らず一般的な現象であった。このことより,"光誘起電子移動反応により生成するケチルラジカルは分子内の炭素-ハロゲン結合に対して求核置換反応ではなく一電子移動を起こす"と結論した。また同反応系に,種々のルイス酸(金属塩)およびブレンステッド酸を添加したところ,この分子内一電子移動過程が抑制されることが分かった。さらに、メトキシアレーン増感剤を用いる同反応基質の光増感反応を行ったところ,前例のないハロゲン原子移動反応が進行することを発見した。そして,メトキシアレーンラジカルカチオンとハロゲン化物イオンとの間の一電子移動が関与する機構を新たに提案した。今後は,1)他のカルボニル反応基質の光誘起電子移動反応におけるプロトンおよび金属イオンの影響の検討,2)上記の新規ハロゲン原子移動反応機構の解明,3)上記反応基質の他の電子移動条件(金属還元剤を用いる熱反応など)における反応の検討,などを行う。

平成16年度は,前年度に開発した光誘起電子移動および金属酸化還元剤を用いる新規分子変換法の反応機構的検討を行い,それに基づくより一般性の高い方法への発展を主目的に研究を実施した。はじめに,種々のケチルラジカルプローブ基質を用いて2-(2'-ヒドロキシフェニル)-1,3-ジメチルベンズイミダゾリン(ο-HPDMBI)の光誘起電子移動反応性の調査を行った。特にベンゾフェノンを用いる反応系の検討より,プロトン供与体存在下におけるο-HPDMBIと1,3-ジメチル-2-フェニルベンズイミダゾリン(DMPBI)の二つのラジカルカチオンの対照的な反応性を明らかにした点は注目に値する(論文投稿準備中)。また,Ru(bpy)_3Cl_2とο-HPDMBIあるいはDMPBIとの組み合わせによる複合光増感法について検討し,従来の1,6-ビスジメチルアミノピレンとこれらベンズイミダゾリン誘導体を用いる方法と相補的であることが示された。さらに現在,ケトン基質と上記ベンズイミダゾリン誘導体の溶液反応を固相反応(無溶媒反応)へと展開する試みを行っている。今後も,ベンズイミダゾリン誘導体の特徴を生かした新規反応系の開発および新規誘導体の創製をさらに推進していく。次に,ヨウ化サマリウム(II)による分子内サマリウムケチル-エステルカップリング反応については,アルコキシカルボニル置換鎖状ケトンへの展開を試みた。また,新たにアシルオキシ置換ケトンへと展開し環状エーテル化合物の合成に成功した(論文作成中)。ヨウ化サマリウム(II)とアルコキシカルボニル置換環状ケトンの反応で得られる双環状シクロプロパノール誘導体の酸化的開環反応については,機構的検討と合成化学的検討を行った。この一連の反応は,"連続的な還元-酸化による環化環拡大反応過程"と見ることが出来る。今後はこの新規コンセプトの一般性の拡張を行っていく。光誘起電子移動(PET)反応に関する課題においては,ベンゾフェノンの光還元をプローブ反応として1,3-ジメチル-2-フェニルベンズイミダゾリン(DMPBI)および2-(2'-ヒドロキシフェニル)-1,3-ジメチルベンズイミダゾリン(o-HPDMBI)のPET反応性について調査した結果,両者のラジカルカチオンの脱プロトン化の位置選択性に顕著な違いが見られた。すなわち,DMPBIラジカルカチオンでは2位の炭素上の脱プロトン化が,o-HPDMBIラジカルカチオンでは2位の炭素上ではなくフェノール部位の脱プロトン化が優先することが明らかとなった(J.Org.Chem.に発表)。特に後者の位置選択性は基質特異的なものか普遍的なものかについての検討が今後の課題となる。また,電子供与性置換基を有するピレンおよびアントラセンを増感剤とし,DMPBI,o-HPDMBIおよび他のベンズイミダゾリン誘導体を還元剤とする複合光増感系の比較評価を行い,ピレンがアントラセンよりも優れた増感剤であることが明らかとなった(Tetrahedronに印刷中)。今後は,ピレン増感剤を用いる種々の有機化合物の還元的分子変換の一般性の拡張を目指す。
パーキンソン病の病態を説明する大脳基底核スキームの提案

大脳皮質-大脳基底核-視床ループは行為選択や随意運動実行に関与している。げっ歯類の線条体背外側部はこのうち運動機能と関わりが深い部位とされ、大脳皮質の一次運動野・二次運動野や、運動視床であるVA/VL核、および、視床髄板内核群・正中線核群から興奮性シナプス入力を受ける。今回我々は、線条体の少なくとも背外側部においてはPVニューロンは入力元の領域に拘らず視床からは樹状突起の近位に、大脳皮質からは樹状突起の全体に投射を受けるという傾向をもつことを明らかにした。大脳基底核の直接路・間接路スキームは、パーキンソン病に無動の症状があることは説明できても、突進歩行や振戦が生じることは説明できない。申請者らは、大脳基底核各領域の単一ニューロントレースを積み重ねることにより、直接路が淡蒼球外節に側枝を出すことなどを明らかにしてきた(Fujiyama et al., 2015; Koshimizu et al., 2013; Fujiyam et al. 2011; Matsuda et al. 2009)。今年度はこれに加えて、線条体投射ニューロンのうち、淡蒼球外節のみに投射するニューロン(以下、間接路ニューロン)は淡蒼球外節の周辺領域(以下、淡蒼球外節外殻部:カルビンディン陽性領域)に投射する(Fujiyama et al., in press)という所見や、視床線条体投射には線条体のストリオソーム領域を好むものと、マトリックス領域を好むものが存在する(Unzai et al., Cerebral Cortex, in press)という知見を得ることができた。1)線条体投射ニューロンのうち、淡蒼球外節のみに投射するニューロン(以下、間接路ニューロン)は淡蒼球外節の周辺領域(以下、淡蒼球外節外殻部:カルビンディン陽性領域)に投射する(Fujiyama et al., in press)。という知見を得ることができた。『大脳基底核には運動発現のアクセルとなる直接路およびブレーキとなる間接路という二つの拮抗する経路が存在し、これらのバランスがどちらかに偏ることによって、パーキンソン病の無動やハンチントン舞踏病の過動という病態が生じる』これが現在最も広く受け入れられている従来の大脳基底核スキームである。しかしこのスキームでは、パーキンソン病の「無動」を説明することはできても、「突進歩行」や不随意運動の一つである「振戦」が生じる理由を説明することはできない。ドーパミンは運動機能や認知機能の調整のみならず学習や報酬系にも深く関与しており、その制御の解明については重要課題である。近年、大脳基底核の淡蒼球外節細胞がドーパミン細胞群である黒質緻密部に投射することが報告されたが、淡蒼球外節のどのニューロンが投射し、どのように作用するかは明らかではなかった。本研究では、PV-Creラットを初めて使用し、淡蒼球外節の中でもパルブアルブミンを持つ細胞だけを赤の蛍光タンパクで可視化することで、神経終末が黒質緻密部の特定の領域に優位に分布することを明らかにした。さらに、淡蒼球外節のパルブアルブミン細胞の活性化によって黒質緻密部のドーパミン細胞が強く抑制されることが電気生理学的に証明された( Oh, Karube et al., Brain Structure and Function, in press)。この結果によって、運動や学習における大脳基底核の理解、黒質緻密部の変性疾患であるパーキンソン病の病態への理解の進歩が期待できる。また今後、この独自に発見した回路の詳細を解析し、ドーパミンニューロンをめぐる新しい回路であることを形態学と最先端の電気生理学を融合させた解析手法で証明する予定である。この新たな回路の機能的な証明は真の大脳基底核スキームの確立のみならず、パーキンソン病の治療にも貢献できる。予定していた共同研究によるウイルスベクタと遺伝子改変動物の開発をはじめ、実験に必要な具体的技術について順調に軌道に乗ったため、予定通りに形態学的解析および電気生理学的解析を始めることができた。また、研究分担者が同じ研究室に所属しているため、常に綿密な議論を重ねることが可能になっている。線条体はGABA作動性の投射ニューロン(medium spiny neuron; MSN)が大部分を占め、それ以外をGABA作動性のインターニューロン・アセチルコリン作動性のインターニューロンが占める。このうちGABA作動性のインターニューロンは、パルブアルブミン発現ニューロン(PVニューロン)が最も数が多く、MSNを主な標的として抑制し線条体の出力を制御している。これまでの研究から、これら線条体PVニューロンもMSNと同様に大脳皮質・視床から興奮性の入力を受けることが知られている。

本研究では大脳皮質二次運動野からの興奮性入力と、VA/VL核からの興奮性入力とがPVニューロンの樹状突起のどの位置に入力されるか、また、より広範な大脳皮質・視床入力をどのように受けるかを形態学的に明らかにし、それにより、PVニューロンが視床・皮質興奮性入力をどのように処理しMSNの抑制を行っているかを解明することを目的としている。今回我々は、パルブアルブミンのプロモーター配下にmyrGFP-LDLRct遺伝子を導入したトランスジェニックマウス(PV-FGLマウス)を用いて、線条体の少なくとも背外側部においてはPVニューロンは入力元の領域に拘らず視床からは樹状突起の近位に、大脳皮質からは樹状突起の全体に投射を受けるという傾向をもつことを明らかにした。大脳皮質-大脳基底核-視床ループは行為選択や随意運動実行に関与している。げっ歯類の線条体背外側部はこのうち運動機能と関わりが深い部位とされ、大脳皮質の一次運動野・二次運動野や、運動視床であるVA/VL核、および、視床髄板内核群・正中線核群から興奮性シナプス入力を受ける。今回我々は、線条体の少なくとも背外側部においてはPVニューロンは入力元の領域に拘らず視床からは樹状突起の近位に、大脳皮質からは樹状突起の全体に投射を受けるという傾向をもつことを明らかにした。今後は機能的な大脳基底核スキームを確立するために、1)直接路に特異的に発現するD1R CreマウスとloxPを組み込んだウイルスベクターを用いて、直接路ニューロンの側枝(図1A)が淡蒼球外節のどのニューロンを駆動しているのかを検証する。昨年度まで、PV-Creラットを使用し、淡蒼球外節の中でもパルブアルブミンを持つ細胞だけを赤の蛍光タンパクで可視化することで、神経終末が黒質緻密部の特定の領域に優位に分布することを明らかにした。さらに、淡蒼球外節のパルブアルブミン細胞の活性化によって黒質緻密部のドーパミン細胞が強く抑制されることが電気生理学的に証明された( Oh, Karube et al., Brain Structure and Function, in press)。しかし淡蒼球外節から強い抑制を受けるこのドーパミンニューロンが、全体の神経路のなかで、どのような入出力を受けているのかはわかっていない。具体的には、このドーパミンニューロンは線条体のどこに投射しているのか、またこのドーパミンニューロンは淡蒼球外節パルブアルブミン細胞以外にどの場所のどのニューロンから投射を受けるのかという疑問が残っている。今後はウイルスベクターを用いた順行性および逆行性標識実験と電気生理実験および光遺伝学実験を組み合わせ、この「淡蒼球外節から強い抑制を受けるこのドーパミンニューロン」が大脳基底核のなかで、どのような役割をになっているのかを解析していく予定である。神経解剖学神経線維を特異的に可視化する免疫染色に用いる抗体に関して、目的に合致したものが複数あるため、どの抗体を用いるべきかの検討を多角的に行っていたため、購入が次年度にずれ込んでしまっった。昨年度開始する予定だったウイルスベクターの実験の一部が、インジェクションのセットアップの関係で次年度に開始することになった。このため、新規のウイルスベクターなど実験に必要な消耗品の購入を次年度に見送ることになった。本年度は昨年度購入できなかったこの抗体を購入し、使用して、大脳基底核におけるドーパミン神経投射を特異的に可視化する予定である。昨年度までは淡蒼球外節ニューロンに順行性のウイルスベクターを注入して淡蒼球外節ニューロンから黒質緻密部のドーパミンニューロンへの投射を解析していたが、次年度は逆に黒質緻密部のドーパミンニューロンに逆行性のウイルスベクターを注入してドーパミンニューロンへの入力を調べる必要がある。
企業・投資家の情報取得と学習過程に関する研究

本研究では、企業行動や投資家行動と情報取得・学習過程との関係について分析を行う。経済主体は様々な情報に基づいて意思決定を行う。投資家は、企業価値に関連する情報を取得し、株式の売買を決定する。企業は、マクロ経済環境や株式市場に関する情報を参照して、設備投資などの行動を決定する。しかし、経済主体にとって完全な情報を取得することは容易ではなく、意思決定に必要な情報を取得するためにコストを支払ったり学習したりする必要がある。この情報に関する制約が、投資家の市場参加を抑制する可能性や、企業の設備投資を非効率的にする可能性について分析する。
不登校児童・生徒の集団場面における行動特性と人間関係に関する研究-野外における集団生活をベースとして-

本研究は、不登校児童生徒の行動特性と人間関係について研究した。研究は、不登校児童生徒のキャンプ活動を実際に組織し、観察して行った。キャンプの主催は長野県教育委員会である。キャンプは2年間で4回行われた。1泊2日の短期キャンプが2回、5泊6日の長期キャンプが2回である。いずれも、7月と8月に行われた。報告者はこの活動を組織し、キャンプ・ディレクター、コーディネイタ-として参加した。また、特に自己体験を中心にしたキャンププログラムを開発した。この結果、不登校児童生徒でも集団生活や新たな環境への適応ができること、人間関係の形成が十分に可能であることがわかった。特に、人間関係は関係の相手や方法を変えることによって成功していることがわかった。また、ここでの生活経験を経た後に、登校を再開するものや心理面での改善を示すものが70%から80%にのぼった。このため、このような活動は不登校対策にとっても効果的であるといえる。またこれは、野外(キャンプ)活動の新たな効果と展開の道を示すものである。今後、教育に活用できると考える。本研究の報告書として次の2点を著した。・不登校児童・生徒の集団場面における行動特性と人間関係に関する研究-野外における集団生活をベースとして-I.不登校児童生徒支援のための野外での集団生活キャンプの企画に関する研究・不登校児童・生徒の集団場面における行動特性と人間関係に関する研究-野外における集団生活をベースとして-II.不登校児童生徒の人間関係形成に関する研究本研究は、不登校児童生徒の行動特性と人間関係について研究した。・不登校児童・生徒の集団場面における行動特性と人間関係に関する研究-野外における集団生活をベースとして-I.不登校児童生徒支援のための野外での集団生活キャンプの企画に関する研究・不登校児童・生徒の集団場面における行動特性と人間関係に関する研究-野外における集団生活をベースとして-II.不登校児童生徒の人間関係形成に関する研究不登校児童生徒の行動特性と人間関係について野外の集団生活キャンプを実施して研究した。また、実施後の再登校について追跡調査をした。キャンプは1泊2日(短期)と5泊6日(長期)で各々を1回ずつ行った。2箇所で実施した。参加対象は不登校の状態にある小学校5・6年生と中学生およびその友人である。参加者は2箇所あわせて短期キャンプ141人、長期キャンプ112人である。このなかで、不登校にある児童生徒は短期キャンプ46人、長期キャンプ69人で、各々の参加率は短期で約32%、長期で約62%である。長期終了後の不登校者を対象としたアンケート調査(対象69人、回答50人、回収率72%)によれば再登校をはたした者は7名で14%、心理面などの改善傾向がある者42人で84%である。野外キャンプは自己体験をねらいとした。不登校から再登校へ向けた行動実現を追求するが、その出発点ともなる自己受容の実現をめざした。その具体的な実現として自己体験を位置づけた。活動内容は1部は施設泊もあるが自然の中での野外集団生活活動を基本とした。レクレーション、飯盒炊飯など行事プログラムも計画したが、それらは人間関係や行動を促す契機、自己体験の手がかりと位置づけられた。参加者の世話は二十代の大学生、社会人のボランティアがあたった。不登校の子ども達の集団生活の可能性で心配な面もあったが十分に実現できた。行動面で、共に参加した不登校でない子ども達と比較しても同じように活発に活動ができ、人間関係の形成もできた。人間関係はスタッフによる行動観察からソシオグラムを作成し、検証した。不登校児はとかく集団生活や人間関係が苦手であると言われているが、必ずしもすべてにあてはまるのではないといえる。再登校を始める者は必ずしも集団生活で活発に行動したり、人間関係を形成した者とは限らない。これには集団の中での行動形成も考えられる。不登校児童生徒の行動特性と人間関係について野外の集団生活キャンプを実施して研究した。キャンプは1泊2日の短期キャンプと5泊6日の長期キャンプを2カ所で実施した。参加者は短期キャンプ104名、内、不登校児童生徒42名(40%)長期キャンプ104名、内、不登校児童生徒40名(38%)である。

事後についてアンケートを実施したが回答は24名であり、このうち再登校が11名、気持ちの上などで改善傾向ありが13名である。全員が何らかの肯定的な変化を示している。人間関係は長期キャンプについてソシオメトリックであらわした。方法はキャンプスタッフが1日の中で共に過ごした相手とその時の行動を観察し、記録した。行動は期間の進行とともに2つの方向性を持って現れた。1つは次第に自分自身の行動をあらわすことであり、他は集団の中で自己の活動を始めることや、友達などを作っていく過程である。これらの動向は一方では自己を主張する行動の表現という過程が現れてくるとともに、他方で人間関係が築かれていく過程が現れてきていることを示しているといえる。そのため、キャンプが進むにしたがって、子ども達には両者を調和させることが課題として浮かび上がってくる。子ども達が自己体験を得る上で大きな要因としてキャンプの「プログラム」と「その運営」、キャンプの運営の側での子ども達を「受容する認識や態度」、「人間関係」が大きく影響することが窺える。今後の課題として、現在、不登校対策は決めてとなる効果的な方法が確立されているとは言い難い。今回の研究で実施、検討した野外体験を活用した方法は一定の効果があったと考えられる。さらに検討を加えてこのような方法の確立と普及をめざしたい。
人工知能による生物生産機械・装置の制御システムの研究

本研究では、耕うん、播種・間引・除草、かんがい、組織培養の諸作業について、それそれ新しい視点に基づく因子をとりあげ、それらを他の因子と組み合わせ、人工知能ないしそれに準じる手法によって機械を制御したり、設計したりすることを試みた。耕うんシステムに関する研究としては、きわめて多くの因子を考慮しなけれがならないミニマムティレッジとりあげ、これに多用されているスプリングタインの特性を明らかにするとともに、各種タインの圃場作業性能を調べ、これらを基にして、人工知能によるミニマムティレッジ機械設計計画法を追求し、そのためのエキスパートシステムを構築した。播種・間引・除草については、播種機設計のための大豆種子を例にとり、その3次元形状画像解析によって、これまでとりあげられなかった形状要素を定式化し、精密播種に役立つ基礎データを得た。また葉形の画像解析による作物・雑草の識別法の研究を行い、条件によって68-95%の確率で雑草を識別することが可能で、除草の完全自動化の基礎とすることができた。かんがいの自動化では、これまで肝心の作物の水分状態に関する因子がとり入れられていなっかたので、植物の体内水分状態の計測・制御に関する研究を進めて、自己回帰モデルによる最適制御を試みた。すなわち最適レギュレータによる動的制御を行い、人力側の状態変数に対して出力側の重み関数を1:10の範囲で変化させると良い制御結果が得られた。植物組織培養装置に関しては、画像処理のアルゴリズムの研究を通じて1mm以下の微少なプロトコームの自動移植ロボットシステムを開発した。形状記憶合金アクチュエータを利用したソフトハンドリンググリッパを試作し、プロトコームを一つずつ新鮮な培地上に7mm間隔の格子上に着床させる制御を行い、一個当り約8秒で作業を行うことができた。本年度は、人工知能(AI)を用いた耕うん,潅漑、移植、組織培養などの新しい制御システムの基礎として、次のような研究を行った。(1)耕うん作業の結果をAIで処理し、機械にフィ-ドバックするには、耕うん前後の圃場面の状態を素早く自動的に計測する必要がある。発信周波数150kHzの超音波モジュ-ルを用いて、地面からの微弱な反射波の波形を解析して、畦形状を測定することができた。またAIによって、ミニマムティレッジの各種方式を自動的に選択できるシステムを作ることに着手した。(2)潅漑のAI制御の基礎として、超音波によって植物体の水分状態を計測する実験を行った。植物は光の強度に応じて蒸散量、水分吸収量が変化し、また茎の直径も変化するが、これらの反応は一様でなく、それぞれ時定数がことなる。これらの応答を信号処理の手法を用いて解析した。この結果、茎径変化と蒸散量は放射量とほぼ同時に変化が生じるが、吸収量は数時間の時間遅れがあることが分かった。(3)圃場にある作物の画像から、AIを応用して植物の3次元状態をコンピュ-タが自動的に判断できるシステムを作って、移植、間引きなど植物を対象とした機械作業の自動化に結びつける。このためイメ-ジスキャンナ-を用いて得られた植物の2次元画像から、コンピュ-タに茎と葉の区別や、枝分かれ構造、葉の形状の特徴等を抽出させ、学習させる試みを行った。(4)植物組織培養のカルス植え継ぎのため、形状記憶合金を用いたロボット用アクチュエ-タを試作し、ファジイ制御によって不整形で軟弱なカルスを熟練者と同じようにソフトにハンドリングできる方法を開発した。すなわち、速度アルゴリズムによるファジィ制御を試み、ONーOFF制御では不可能であったスム-ズな制御を行うことができた。

本年度は、人工知能を用いた耕うん、潅漑、移植・除草、組織培養などの新しい機械制御システム開発の基礎として次のような研究を行った。(1)耕うん作業の結果をAIで処理して、機械にフィ-ドバックするために、超音波によって圃場面形状を自動的に計測する必要がある。これまでは超音波センサの圃場に対する角度が一定であったため、斜面や曲面の形状測定が十分にできなかった。そこでセンサの方向を制御できるマニピュレ-タを試作して基礎試験を行い、測定精度の向上を図った。(2)潅漑のAI制御の基礎として、植物体内水分の自己回帰モデルを求め、茎径および蒸散速度についてシミュレ-ションを行い、実験結果とかなり良い一致をみた。また、植物体内水分が超短波透過速度に及ぼす影響を、弾性波動方程式によって解析することを試みた。(3)圃場にある植物の画像をAI処理して、移植・間引・除草などの機械の自動制御を行うための基礎として、2次元レベルの葉の形状特徴を、知識ベ-ス化する試みを行った。その結果、植物を識別できる画像解析パラメ-タの選択方法や生長にともなうパラメ-タの変化状況がわかった。また圃場管理作業車の試作を行い、操向のためのファジィ制御モデルの同定を行った。(4)植物組織培養の自動化を目的として、生長点の切り出しをロボットで行うための基本装置の試作と生長点周辺の画像処理によるピンセット及び鉗子の制御を行い、形状が比較的単純なササゲについては自動化できる見通しをえた。またカルス植え継ぎのため、形状記憶合金アクチュエ-タを用いたソフトハンドリング用ロボットハンドのファジィ制御を行った。すなわち、ハンドの先に力が作用していないときのファジィル-ルを追加し、その結果、PID制御に較べて行き過ぎ量も少なく、良好な制御結果をうることができた。本年度は、人工知能を用いた耕うん、圃場管理、移植・除草、組織・細胞培養などの新しい機械・装置制御システム開発の基礎として次のような研究を行った。1)圃場での耕うん・管理作業のためのガントリ-システム及び知能ロボットの制御のため、超音波(発・受信素子)アレイによる反射波の波形をコンピュ-タ処理して、圃場面形状、土塊分布、作物列等の情報を得て、駆動系を制御するシステムを開発した。2)圃場における作物と雑草の2次元レベルの葉の形状特徴の知識デ-タベ-スを増強し、作物と雑草の雑別をほぼ行えるようになった。また、除草を目的とした作物と雑草の識別には、雑草の幼少期での除草が3次元での画像解析的にも、またエネルギ-的にも有利であると考えられたので、微小物体に対応した3次元形状スキャナ(視覚センサ)の改良を行った。3)植物培養組織ハンドリング用エンドエフェクタを試作し、形状記憶合金アクチュ-エ-タをファジィ制御することにより、微小な組織をソフトに把持することができるようになった。4)ジャ-ファ-メンタによる植物培養速度の計測法としては、乾重量、PCV(Packed Cell Volume)、OD(Optical Density)などのオフライン計測、pH、ECなどのオンライン計測が行われているが、これらはジャ-内の局部内状態を表すもので、全体の状態を示すものではない。そこで、超音波をジャ-内に伝播させて培養濃度変化に対する超音波特性の変化を計測した。
分化能の異なるがん幹細胞の同定とがん免疫療法による治療可能性の検討

本研究は、膵臓がんを発生する遺伝子改変マウスから樹立したがん細胞株と、温度感受性T抗原を発現させた膵組織より樹立した不死化CK19+細胞について、三次元培養中に形成されるsphere structure (SS)と管状腺管構造(tubular Structure:TS)の違いに着目して実施した。分化の異なる幹細胞が、SSとTSの違いを決定しており、TGFβとそのシグナル伝達系がSSからTSを誘導していることを明らかにした。一方、がん幹細胞をカバーするワクチン療法は有効であるものの、その成否は、免疫寛容の抑制と初期化に依存すると結論する。膵臓上皮特異的なCre/loxP遺伝子組換えにより、Rbとp53の活性を阻害できる温度感受性T抗原(tsT抗原)とKrasG12Dを同時に発現させることでde novoにPDACを生じるマウスの作製に、我々は成功している。生じた腫瘍組織から樹立した培養細胞株と、tsT抗原のみ発現させたマウスの膵管上皮より樹立した不死化CK19+細胞は、コラーゲンゲル内で3次元的に(3D)培養すると、いずれも、sphere structure (SS)に加えて管状腺管(Tubular Duct) (TD)構造を再現した。本研究では、a)樹立したがん細胞株と不死化CK19+細胞を、cancerとCell-of-Origin for cancerとして対比し、b) SSとTDを、細胞分化能の異なる幹細胞に由来する細胞集団として対比検討を実施している。24年度に引き続き25年度も、このモデル系を用いてi)細胞分化能の異なるがん幹細胞の同定と、それを同定できるバイオマーカー探索、ii)がんに対する免疫応答が、がん幹細胞の治療にも有効であるかどうかの検討を、並行して進めた。分化能の異なる細胞集団の比較検討については、これまでに得られた結果を一般化するためにN数を増やすとともに、異なる複数のクローンについて3D培養下でTDとSSを分離するなどして解析し、検証作業を進めた。がんに対する免疫応答については、villin-creマウスとの掛け合わせでT抗原を大腸上皮特異的に発現させたマウスをレシピエントに、樹立したがん細胞株を同所移植することで、すい臓がんの増殖をモニタリングできるモデルを確立している。同モデルの解析を通じてこれまでに、免疫寛容の環境を作り出す制御性T細胞などが移植部位にリクルートされることで、抗腫瘍免疫が抑制されているのであろうと考察している。本研究では、生じた腫瘍組織から樹立した培養細胞株を用いて、i-a)細胞分化能の異なるがん幹細胞の同定と、i-b)これを区別できるバイオマーカーの探索を実施している。また、発がんに利用した遺伝子をモデルがん抗原とすることで、ii)これまでに開発を進めてきたオリゴマンノース被覆リポソーム(OML)の使用で誘導される抗腫瘍免疫が、がん幹細胞の治療にも有効であるかどうかについても検討を進めている。平成24年度には、膵組織由来の不死化上皮細胞と、腫瘍組織から樹立した培養細胞株を対象に、各種幹細胞マーカーを利用して幹細胞の同定を進めた。各種マーカーで同定される細胞集団を、フローサイトメーターで分取し、ヌードマウスへの接種およびコラーゲンゲル3次元培養系で評価したところ、幹細胞集団の造腫瘍性を明らかにできた。次に、CD133+/c-Met+分画もしくは、ALDH活性を指標にすることで、分化能の異なるがん細胞株よりそれぞれの幹細胞集団を分取して、i-b)がん幹細胞に特徴的なマーカー分子の探索を実施した。DNAマイクロアレイによる発現解析によって、細胞分化能を特徴づける候補分子群を絞り込むことができ、定量的PCRによって再現性も確認できたところである。がん免疫に関する実験検討では、研究背景として明らかにしていた「T抗原を発現している同がん細胞株は、同系のB6マウスには生着しないが、villin-creマウスとの掛け合わせでT抗原を大腸上皮特異的に発現させたマウスには生着する」ことの背景メカニズムの検討を行った。腫瘍組織から樹立した培養細胞株が生着したマウスでは、CD4+CD25+Tregと、CD11b+ F4/80+単核球の増加が顕著であり、これら細胞による免疫寛容が関与していることを見出している。我々は、膵臓上皮特異的なCre/loxP遺伝子組換えにより、Rbとp53の活性を阻害できる温度感受性T抗原(tsT抗原)とKrasG12Dを同時に発現させることでde novoにPDACを生じるマウスの作製に成功している。