hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物多様性への移入種の影響:和歌山タイワンザル交雑群に関する総合的研究

今年度は(1)骨格標本等の資料化、(2)遺伝子標識の開発と交雑評価、(3)個体群パラメータの推定、(4)ウィルス抗体保有率等の病理学的分析、(5)拡散個体のモニタリングに向けた予備的分析、を重点的におこなった。また、国内外の学会、シンポジウムにおいてこれまでの研究成果を発表し、中間的なまとめと公表に努めた。和歌山県の事業で安楽殺処置をうけた個体のほぼ全頭を回収し、昨年度につづいて身体計測、病理学的解剖をおこない、骨格標本や精巣標本を作成した。また、個体のウィルス学的検査や遺伝学的分析を行うため、血液試料も採取した。核DNAにみられる種特異的変異を利用して交雑状況を評価するため、NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein 1)の第5イントロン内にある種間変異を同定し、交雑度評価に利用した結果を論文として公表した。また、和歌山県の交雑事例と比較するため、青森県で生じたタイワンザル交雑群を調査し、分析結果を論文公表した。青森県の事例では、和歌山県と同様に長期間ニホンザルと接触する機会があったにもかかわらず、まったく対照的にほとんど交雑が進んでいないことが明らかになった。両者のちがいを生じた原因としては、自然環境のちがい、周辺のニホンザル分布状況のちがい、餌付けの有無、の可能性が考えられる。生態学的研究では昨年度のセンサス結果、近年の除去統計を解析して個体群動態を検討し今後の変動を予測した。年当たりの増加率は14パーセントと高い推定値となり、異種間の交雑で生じた個体群は高い繁殖性を維持しており、除去事業を停止した場合には急激な個体数回復が起きると予想できた。拡散個体の調査では和歌山県南部の日高川町の駆除個体のミトコンドリア遺伝子分析に着手した。14個体の分析では交雑群からの拡散を確認できなかった。研究の3年目にあたる今年度は9月に生息実態調査を実施した。6日間で延べ104人が参加し、和歌山市と海南市にまたがる交雑群生息地で直接観察および発信機を用いた追跡によりタイワンザル交雑群の行動域、群れ数、個体数を調査した。この結果、県が進めてきた捕獲事業により3群40個体以上まで個体数が減っていることを確認した。2年前の調査結果と比べると1群の消滅で行動域に変化が認められる一方、全体の行動域は以前と大きく変化していないことがわかった。和歌山県南部の日高川町、田辺市で有害駆除個体30から皮膚試料を得て、mtDNA分析により交雑群からの個体拡散の調査を行った。この結果、3種類のmtDNAハプロタイプが区別できたがいずれもニホンザルタイプで外来種群からの拡散の証拠は得られなかった。試料の分析では、2003年3月から2006年6月までに採血した287個体の遺伝子分析とデータ解析を進めた。全体を4期に区分して比較を行った。この期間では交雑集団の8294%が交雑個体になっていること、移入ニホンザルはすべてオスでメスがいないことが確認できた。経時的変化では、ニホンザル遺伝子の割合が増加したかに見えるが有意とは判定できなかった。常染色体の遺伝子標識の推定により、交雑群ではすでにその半分の遺伝子がニホンザルのタイプに置き換わっていることが判明した。昨年度につづき、今年度も遺体を回収し、形態調査のために骨格標本の作成を行い、すでに300個体を超える標本が利用できるようになった。最終年度の分析にこれらを利用する予定である。これまでの研究成果は、国内の学会や講演会等で口頭で発表し、遺伝子分析の論文を公表した。最終年度にあたる今年度の研究活動では、過去3年間の研究のとりまとめと結果の公表につとめた。
B型肝炎ウイルス関連抗原に対する免疫応答の解析

HBウイルス(HBV)関連抗原に対する特異的な生体の免疫応答を解析するため、HBV持続陽性者の未抗血リンパ球(PBMC)を用いて検討した。上記PBMCはHBs抗原には殆ど反応しないが、HBc抗原刺激に対し、肝炎の病態に関連して免疫反応が誘導されることを認めた。この際リンパ球幼若化反応よりもインタ-フェロン(IFN)γ産生の観察の方がより鋭敏な成績を示した。すなわち、HBc抗原またはHBe抗体陽性慢性活動性肝炎患者は、HBc抗原刺激によりIFNγ産生は有意に増強したが、HBc抗原陽性無症候性キャリア(ASC)では、反応を殆ど認めなかった。IFNγ産生能は単球やCD8^+T細胞機能に関係なく、CD4^+細胞機能に依存することも判明した。HBc抗原に対するin vitroでの反応もほぼ同様の傾向を示したが、HBe抗体陽性者の方が、HBe抗原陽性者に比し、有意に強い反応を呈した。HBe抗原の8種類の合成ペプタイドで刺激した成績は、PBMCはHBc抗原とHBe抗原の両方に共通なペプタイドに反応しIKNγを産生し、T細胞レペルでは交又反応性があって、両内部抗原はT細胞に同時に認識されると示唆された。しかし、PBMCは同時に複数の合成ペプタイドに反応し、HBV内部抗原には複数の抗原決定基が存在すると考えられた。次に、HBV持続陽性者は、HBc抗体は全例に病態に関係なく検出されるが、HBe抗体の産生は病態と密接に関連し、通常ウイルス排除につながる。in vitroでのHBc抗原、HBe抗原に対するHBc抗体、HBe抗体産生の成績は、HBc抗原はHBe抗原に比し免疫原性が高いことと、HBc抗体の産生はT細胞依存性、非依存性の両径路により産生された。一方、HBc抗体産生はT細胞依存性であることが証明された。
デザインの哲学的基礎付けに関する研究

デザインの哲学的基礎づけを意図する本研究は、まずもって、(1)社会のなかですでに現実化されている工学的な設計(エンジニアリング)やその設計対象物に対する哲学的検証を行った。それは設計対象物のうちに物象化されている倫理規範の分析というかたちをとった。またこうしたいわば工学的設計に関する研究と並んで、(2)従来のデザイン史やデザイン理論における問題についても哲学的検討を行った。本研究の目的は、20世紀に興隆を迎えた近代デザインの哲学的基礎にかんして、モダニズムとポストモダニズムの観点から考察し、デザインないしは芸術工学の認識論的・存在論的位置について一定のモデルを提示することを目的とするものである。本年度は、近代デザインの成立とその発展に関わる、19世紀の後半から20世紀の前半に関わる部分を中心として、主に基礎的な文献研究に従事した。本年度の研究は、(1)カント以来の伝統的な芸術美学、(2)20世紀哲学思想、(3)メディア論の三つの観点から、デザインのモダニズムを支える哲学的基礎として、ビーダーマイヤーやユーゲントシュティール、バウハウスをめぐるデザインの史的展開を分析した。その経過で、ドイツ工作連盟の創始者の一人である、ムテージウスの思想に特に注目して研究を行った。研究成果の発表に関しては、本年度は、デザインの哲学的基礎付けに関する基礎的文献を調査し、購入し、読解することに専念したため、研究成果の発表までには至らなかった。しかしながら、23年度の4月にバウハウスのデザインに関する研究発表を行う準備を整えた。また、その経過において、モダンデザインやその後の新しいデザイン潮流を示唆する主要な文献に関して、内容紹介を含む詳細なデータベースを構築した。またそのデータベースを閲覧可能なホームページ(http://kogatoru.sakura.ne.jp/design/)を作成・運営した。本研究の目的は、20世紀に興隆を迎えた近代デザインの哲学的基礎に関して、モダニズムとポストモダニズムの観点から考察し、デザインないしは芸術工学の認識論的・存在論的位置について一定のモデルを提示することを目的とする。本年度は、おもにデザインの倫理的側面からの研究を中心に行った。一つには、建築物の具体的な設計形態に、倫理学的な価値規範や認識論的な問題性がどのように反映しているかを具体的に研究し、設計の継承とその背後にある制度や思想の相関性について検証した。その成果を論文として公表した。また、2011年の3月11日に生じた東日本大震災とその後の原発事故に関して、当初の研究予定にはなかったが、原子力発電の存在論的・認識論的な研究を行った。これは工学技術と人間の関係に関するデザイン論的研究である。本研究は学会誌に掲載されることが決定している。また、研究成果の公表には至らなかったが、3.11以降の震災やその復興に関して、未来世代や過去の世代との関係、未来の記憶や想起に関する研究、これまでの社会の基本原理となった自由主義や功利主義の限界、新たな原理としての共同体論の観点からの街作りの可能性などについて研究を行いその一部を講演などで公表した。また、デザインのコンセプトに関する原理的研究を行った。デザイン行為は、形象と概念との関係によって成り立つが、それについて、ドゥルーズとガタリの概念論を応用する可能性について考察した。本研究は日本デザイン学会での発表を予定している。以上の研究と並んで、設備備品費で購入したデザイン書の一部に関して、その基本的な内容の書評・データベース化を進めた。本年度は研究の最終年度であるため、これまでの研究成果をとりまとめ、公表することに主眼を置いた。デザインの哲学的基礎づけを意図する本研究は、まずもって社会のなかで現実化されている設計対象物に対する哲学的検証を行った。それは設計対象物のうちに物象化されている倫理規範の分析である。自然物を改変し製品を作る過程は伝統的には同一の制作者に帰属していたが、産業革命以降、設計と労働は分化した。設計は科学的な基礎を持つことになるが、その学的理性が分業に基づき制作対象物を制御することの存在論的/認識論的基礎がそれ以降問題化している。とりわけ2011年の福島原子力発電所の事故にあっては、理性的設計と自然支配の限界が露呈したと考えられる。研究は、原子力発電を認識論的/存在論的/弁証法的考察を通じて、設計の限界についての原理的考察を行った。本研究の該当部分は雑誌論文として公表した。またこうした哲学的観点に即した設計に関する研究と並んで、従来デザイン史やデザイン理論のなかで問題にされてきたトピックについても研究を行った。一つは、いわゆるデザインコンセプトと呼ばれる設計の目的概念についての研究である。本研究は、デザインを支える概念が有機的なものであることの可能性と必然性をドゥルーズとガタリの概念をベースとして論じた。本研究の該当部分は学会における研究発表雑誌論文として公表した。また本研究は研究成果をとりまとめた研究報告書を出版し、そのなかで、戦後ドイツで展開した機能主義批判、とりわけウルム造形大学のいわゆる機能主義的な形式美学に対する批判の諸形態について検討を行った。クリッペンドルフの製品

意味論やオッフェンバッハ学派の製品言語論をヴィトゲンシュタインの言語論やパースの記号論をもとにしてその批判の妥当性を検証した。3.11の震災・原発事故が生じたため、当初の計画になかった研究の側面の重要性を認識し、それに対応するという経過をたどった。それにより、当初予定していた研究の一部に遅れが生じているが、それもまた研究全体にとって必要な理由による。全体としての研究は順調に推移している。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、研究の最終年度にあたるため、研究成果の公表に主に力を注ぐ。当初の研究内容に関する遅れをカバーし、新たな研究の側面を包括したかたちで、研究の全体的なとりまとめを行う。
具体性の高い構文の研究：実証的な言語分析手法の構築を目指して

本研究では、コーパスを用いて具体レベルの構文(項構造構文、イディオム構文など)を多方面から調査をすることで、構文の言語的な記述に加え、構文のパラ言語的・非言語的特徴づけ、心的実在性の確認、文化社会的基盤の考察を行う。また、コーパスを用いた定量的な意味分析モデルを精緻化したり、SNSやアンケートを用いた心理実験で、構文の実在性を検証するための方法論を提示する。さらに、コーパスを用いた実証的な方法論を中心として、用法基盤の言語学の学際的な研究を行うモデルを示す。
低クエン酸尿と腎尿細管細胞クエン酸トランスポーターの研究

実施した研究内容雄ラットを対象に1日2週間塩化アンモニウム水を負荷することで慢性アシドーシスモデルを作製し、コントロール群とともに尿中クエン酸排泄量を測定した。また両群の腎皮質からTRIZOLを用いRNAを抽出し、Northern Hybridization法によって腎尿細管細胞におけるクエン酸トランスポーターrNaDC-1,rNaDC-3のmRNAの発現を比較・解析した。これまでの研究から、慢性アシドーシスではrNaDC-1 mRNAの発現が増加し尿中クエン酸排泄量は低下することがわかっているが、この実験からはrNaDC-3のmRNAの発現は増加しないことが判明した。またこれらクエン酸トランスポーターのmRNA発現増加の有無がトランスポーターの蛋白の腎での発現とパラレルであるかどうかを解析するために新たにrNaDC-3抗体を作成してSDS-PAGE法および、Western Hybridization法によりトランスポーター蛋白質発現量を解析中である。またこれらの抗体を用い、両群の腎皮質組織標本でimmunohistochemistryによりトランスポーター蛋白質の発現量と組織局在を解析中である。またラットの急性アシドーシスモデルでもrNaDC-1のmRNAおよび蛋白質の発現が増加することがこれまでの研究で判明しているが、これを作製しrNaDC-3に対し同様にmRNAの発現量解析、蛋白質の定量・組織局在の解析を行っている。今後の予定これらの結果が出たところで学会発表する予定である。
アマゾン日系農業者によるアグロフォレストリー普及過程の解明

ブラジル北部で一世紀にわたり開拓に従事する日本人移民とその子孫は、ジュートとコショウの導入でアマゾンに初めて農業を確立した後、経営多角化を目指して1970年代から遷移型アグロフォレストリーを発展させた。周囲のブラジル人小農に模倣され普及していったが、熱帯雨林地域の環境に適合した持続的農法として国際的な評価を得ている。アマゾンの日系農場と、日系アグロフォレストリーを受け入れたブラジル人小農集落を調査し、この持続型農業体系の普及プロセスを明らかにした。ブラジル南部から進出した大資本による穀物やアブラヤシ(Elaeis guineensis)のプランテーションが東部アマゾンで急拡大を続ける中、これらに取り囲まれつつある中小農民の生産生活基盤は脆弱であり、都市周縁スラムへの急速な人口移動が起こり社会不安の要因となっている。こうした状況を改善させるため、現地日系農業者の開発した「遷移型アグロフォレストリー」を「社会技術」として普及する、トメアスー総合農業協同組合(CAMTA)2世リーダーたちの技術改良と普及活動の過程について、文献調査や関係者への聞き取りと観察を行った。乾季には、ベレン市のブラジル農牧研究公社東部アマゾン研究センター(EMBRAPA Amazonia Oriental)等において文献研究を行うとともに、アマゾン農業史に詳しい専門家に前世紀末以降のアマゾン・アグロフォレストリーの技術・社会的展開についてインタビューした。また、トメアスー入植地の日系団体や個人に対し、1990年代後半以降一世から二世への権限移譲プロセスと、日系団体の活動展開について、キーインフォーマントインタビューを行った。雨季には、乾季調査で出た疑問点について、再び上記専門家やトメアスーの関係者を訪ねて質し、また、トメアスーのアグロフォレストリーを実践する日系・非日系農場を訪問して、圃場を観察し、農業経営と栽培体系について現状の記録を取った。さらに、トメアスー農業の改良と技術移転の抱える諸課題について、日系の技術普及家と非日系小農の裨益者に対して、聞き取りと意見交換を行った。現地の乾季にあたる本学夏期休業時、ブラジル農牧研究公社東部アマゾン研究センター(EMBRAPA Amazonia Oriental)において、アマゾン農業史に詳しいAlfredo Kingo Oyama Homma(尾山・本間)研究員、トメアスー日系入植地出身の森林生態学者OzvaldoRyohei Kato(加藤)研究員、国際農業研究協議グループ(CGIAR)国際アグロフォレストリー研究センター(ICRAF)のラテンアメリカ事務所代表をつとめた、文化人類学者Roberto Porro研究員らに、トメアスーアグロフォレストリーシステム(SAFTA)の、前世紀末以降の技術的・社会経済的展開についてインタビューするとともに、文献資料調査を行なった。トメアスー入植地では、日系のトメアスー総合農業協同組合(CAMTA)とトメアスー文化農業振興協会(ACTA)における、1990年代後半以降、戦後移民一世から日系二世への権限移譲プロセスと、アグロフォレストリー普及の展開について、キーインフォーマントインタビューと資料調査を行った。さらに、両団体を通して同意を得られた20戸の日系農場を訪問し、アグロフォレストリー経営調査を行った。また、本学の実施する国際協力機構(JICA)草の根技術協力事業を通して、CAMTA農事部(ATEA)技師等からSAFTAによる栽培指導を受ける、サンタバルバラドパラー市とイガラペアスー市の非日系小農集落2ヶ所を訪ね、参与観察とキーインフォーマントインタビューを通して、SAFTAの技術導入プロセスとその課題について検討した。ブラジル農牧研究公社(EMBRAPA)東部アマゾン研究所と、日系トメアスー総合農業協同組合(CAMTA)及びトメアスー文化農業振興協会(ACTA)を訪問し、トメアスー式アグロフォレストリー(SAFTA)の評価や、普及状況について聞き取り調査を行った。加えて、CAMTAと協働してSAFTA普及を推進する、トメアスー市農務局(SEMAGRI)、パラー州農業局(SAGRI)、パラー州農業普及公社(EMATER/PA)、連邦カカオ院(CEPLAC)等の公的機関の事業責任者や実施担当者に、SAFTA普及の実績と将来展望について聞き取りを行った。それぞれの機関における普及事業の成功例と、課題の残された事例を推薦してもらい、許可を得て現地の日系・非日系農家を視察した。圃場観察に基づき農業経営と栽培体系について質問し、現状を記録した。また、SAFTAの技術移転と改良、及び課題について聞き取りを行った。さらに、グアマ河南岸に位置しトメアスー市北西に隣接するアカラ市、モジュ市、アバエテトゥーバ市に、CAMTAから農業技術指導を受けた日系・非日系小農を訪問して圃場を観察し、SAFTA普及とその制約条件に関する聞き取りを行った。SAFTAを受け入れ実践する農家と懇談し、技術移転と定着の過程を明らかにしつつ、今後のSAFTA改善の課題について検討した。また一部、グアマ河北岸に位置するブラガンチーナ地方日系入植地、サンタイザベル、カスタニャール、イガラペアスーで、日系及び非日系農家の営農状態とSAFTA受容について、圃場観察と聞き取りを行った。調査対象地では、関与している複数の研究・普及事業が総括の時期を迎え、多忙を極めた一年であったが、現地研究協力者と緊密な連絡を取りながら、本研究事業を予定に沿って進行させ、フィールド調査を実施して、日系農家から技術指導を受けた各地の小農集落を訪問し、聞き取りと参与観察を行った。前年度に引き続き、日系トメアスー総合農業協同組合(CAMTA)と、トメアスー文化農業振興協会(ACTA)の、アマゾン農民へのアグロフォレストリー技術普及活動の展開について、現地調査を行い記録した。パラー州

東北部のブラガンチーナ地方において、日系・非日系農家の営農実態と、トメアスー式遷移型アグロフォレストリー(SAFTA)の普及状況を調べると共に、最終年度に現地で予定している、専門家と農業者の農業技術普及に関するワークショップについて、ブラジル側関係者と計画を検討した。一方、本年度は東京農工大学がCAMTA、ACTAと20122016年度に共同実施した、JICA草の根技術協力事業「ブラジルアマゾンの農村所得向上と環境保全修復のための日系『遷移型アグロフォレストリー』普及認証計画」の最終年度にあたり、事業対象となった集落において、非日系の家族経営小農にインタビューを行った。以前のキャッサバ焼畑や、日系農業の模倣によるコショウ単作から、アグロフォレストリー複合経営を習得し実践した結果、これまでと何が変わったか、いかなる制約条件が明らかになり、今後営農はどのように行う意向か等について、聞き取りをした。さらに、日本国内において、アマゾン日系農家への栽培技術支援に携った元JICA専門家の訪問インタビューを行った。アマゾン森林の野生果樹を作物化し、アグロフォレストリーの要素として生産性を向上させるにあたり、直面した課題や克服の過程について証言を得た。現地の治安状況悪化により、日本人の遭難も発生し、渡航の注意喚起があったため、調査には慎重を期した。現地の本学客員教授や、CAMTA、ACTA等関係団体の協力を得て、おおむね研究の目的を達成することができた。ブラジル北部パラー州ブラガンチーナ地方の日系・非日系農家の営農実態と、日系遷移型アグロフォレストリーの普及状況について、前年度からの調査を継続した。この過程で、アマゾン原産で日系アグロフォレストリー基幹作物であるカカオは、今日、西アフリカの小農によって国際市場の7割を賄われるものの、彼らの栽培面積は現行モノカルチャーのままでは今後30年間に5分の1に縮小するとの予測を知った。原因の気温上昇に対して、小農が取り得る対策としてはカカオ葉面温度を低下させるアグロフォレストリーが有力視される。そこで、本研究で明らかにした、アマゾンにおける日系遷移型アグロフォレストリーの普及プロセスを元に、今後、同農法の西アフリカへの技術移転について国際共同研究を展開したい。そこで、東京農工大学と協定を締結しているFAOローマ・東京・ガーナ・アフリカ事務所を訪問して担当者と協議し、現地の姉妹大学、研究機関やNGO関係者を招いて以下内容でセミナーを行い、西アフリカでの実証研究について意見を交わした。ブラジル北部で一世紀にわたり開拓に従事する日本人移民とその子孫は、ジュートとコショウの導入でアマゾンに初めて農業を確立した後、経営多角化を目指して1970年代から遷移型アグロフォレストリーを発展させた。周囲のブラジル人小農に模倣され普及していったが、熱帯雨林地域の環境に適合した持続的農法として国際的な評価を得ている。アマゾンの日系農場と、日系アグロフォレストリーを受け入れたブラジル人小農集落を調査し、この持続型農業体系の普及プロセスを明らかにした。
新規に発見した腎有機酸転送系による分子病態検査手法の開発(高尿酸血症と腎癌)

ラットでクローニングされた新しい腎有機酸トランスポーター遺伝子は、尿酸に特異性を有することが示された。そこで、本研究に先立って、研究代表者はヒト末梢血RNAよりPCRクローニングにて同mRNAのヒトホモログをクローニングし、さらにデータベースからバイオインフォマティックスの手法で全長にわたるヒトホモログの配列情報を確定、その後同配列を参照して、新規にヒトcDNAをクローニングした。このヒト有機酸トランスポーターアナログのcDNAを用い、以下のを行った。1.PAC遺伝子ライブラリーから同遺伝子(UAT)をクローニングして全塩基配列を決定した。2.エクソン・イントロン境界を同定し、全遺伝子構造を確定した。3.プロモーター構造を決定し、転写因子結合部位をコンピュータ予測した。4.臓器特異的なalternative splicingの存在を明らかし、病態との関連を分析する素地を得た。5.遺伝子・タンパク質の構造解析をコンピュータを用いて行い、Extracellular domainとCytoplasmic domainを分類した。以上のドメインにはそれぞれ抗体としての特異性に特徴があると考えられるので、これらからそれぞれペプチド合成を行って特異抗体を作成した。6.本遺伝子が癌、とりわけ腎臓癌で高発現するため、その血中濃度測定を新たな腫瘍マーカーとして位置付けるための検討を加えた。7.癌転移のマーカーとしての評価を行なうため、アッセイ系確立とその臨床評価が今後可能となるように、各種条件設定をした。本研究は尿酸転送機構の分析に端を発してさらに広くがん研究への応用が可能となったテーマであり、今後さらに具体的な成果を求め、臨床応用を目指している。平成14年度は、新規にクローニングしたヒト有機酸トランスポーターアナログのcDNAと遺伝子の構造解析を行い、同遺伝子産物の生体でのアッセイ系確立のための以下の準備をした。・クローニングを終了しているcDNAには、少なくとも2種のmRNA種の存在を確認している。この塩基配列を確定した。ヒト腎組織やその他の手術材料から得た各種臓器からRNAを抽出し、RT-PCRを駆使してさらに他のmRNA種の存在を検索した。ここから臓器特異的なalternative splicingの存在を明らかにすべく検討をすすめている。・申請者の過去の他の遺伝子解析の経験上、一遺伝子から多数のスプライスバリアントが生成されることは希ではなく、それらひとつひとつが少なからず複数の生理活性や臓器特異的な発現形式を有する。この分析によって本遺伝子の構造を詳細に決定する予備的な情報を得る一方、どのmRNA種が尿酸転送に中心的役割を果たすか、他の種はどういう生理的な意義を有するかをひきつづき精査していく。・PACヒトゲノムライブラリーから目的遺伝子完全長をカバーできる複数の遺伝子クローンを単離した。この遺伝子について、全体の構造をmRNA種の情報も踏まえて確定中である。・cDNAを解析してエピトープ予測を行い、合成ペプチドを用いて本遺伝子産物に特異的な抗体を作成した。ヒト各種健常組織に対して免疫染色法を用いて臓器ごとの発現の有無や程度を分析する予定である。前年度にクローニングした腎で主として発現する尿酸・有機酸トランスポーター分子の発現を臨床検体での測定を介して、高尿酸血症の成因とそれに立脚した病態で明らかにし、治療手段の意思決定と適切な薬剤使用のガイドとする。さらには、本遺伝子が癌とりわけ腎臓癌で高発現するため、その血中濃度測定を新たな腫瘍マーカーとして位置付ける。また現在癌転移のマーカーは有効なものがなく、その面から特に特徴づける。本遺伝子産物の高感度かつ再現性の高いアッセイ系を構築するため研究をすすめた。・遺伝子解析を終了した分子の一次構造を参考に合成ペプタイドを合成し、以下の手法で特異的抗体を作成した。1.まずChou-Fasman分析から一次構造を想定し、いくつかのドメインを特定した。2.次にHydropathy分析から膜貫通部分を特定し、Extracellular domainとCytoplasmic domainを分類した。5.Cytoplasmic domainのC末端部分で、細胞膜から露出していると考えられる部分を同定した。

6.以上のドメインにはそれぞれ抗体としての特異性に特徴があると考えられるので、これらからそれそれペプチド合成を行って特異抗体を作成した。7.現在、得られた抗体の特異的・非特異的結合の有無を調査中で、血清、尿等の臨床検体で干渉なくアッセイが組めるかどうかを検討した。8.病理標本を用いて、免疫組織化学的な手法への活用が可能である。9.特異抗体が確定次第、アッセイ系の構築を行う予定である。これは研究年度終了以降も継続していく。本研究は尿酸転送機構の分析に端を発してさらに広くがん研究への応用が可能となったテーマであり、研究計画においてその基盤を形成することが出来た。今後の早期の臨床応用を目指して研究年度以降も研究は継続していく。
微生物機能を用いた重金属回収に関する研究

土壌の重金属汚染を緩和させる機能を持った微生物を分離するため、土壌から重金属耐性微生物の分離を試みたところ、緑色コロニーを形成する微生物を得ることができた。細胞は球形で直径5-8μm。蛍光顕微鏡で観察すると、赤く発色したのでクロロフィルを持つことが予想された。18SrRNA遺伝子の塩基配列を決定し類似性を検索すると、分離菌はクロレラであることがわかりChlorella sorokinianaANA99と命名した。このクロレラは300ppmのカドミウムの存在下で生育することが確認された。蒸留水(pH7)中でのカドミウム、亜鉛、銅における72時間後の吸着特性を調べてみると、乾燥菌体1mg当たりそれぞれ7.2、7.0、2.5μgを吸着し、他の微生物に比較すると多くの重金属を吸着する性質があることがわかった。さらにカドミウム障害を起させた稲にクロレラを添加し、障害の低減効果を調べた。稲をCd5ppm(0.75mg)を含む水溶液で生育させると、生育は対照の70%に抑制されるが、1.67g(生菌体)のクロレラを添加すると104%に回復させることに成功した。カドミウムは稲に吸収されるよりは、クロレラの細胞に優先的に吸収されることを示唆している。本クロレラは3%グルコースを含むYPD培地を用いた暗黒振盪培養にて30°C、4日で湿重量として50gを得ることができる。クロレラの土壌へ定着させる技術が確立されれば、カドミウムの拡散を防ぎ、作物の重金属障害緩和が可能になると考えられる。メタロチオネイン(MT)はほ乳類をはじめ、魚類、軟体動物、酵母など広い生物種に渡って存在しており、重金属を多く抱え込む生体キレートとしての性質がある。本研究ではMT遺伝子を人工合成し遺伝子組換え技術により大腸菌に導入し、重金属回収能の付与を試みた。ヒトメタロチオネインII(hMT-II)をβ-ガラクトシダーゼの融合タンパク質として発現する大腸菌[Escherichia coli JM109(pZMT001)]は、β-ガラクトシダーゼのみを発現する対照菌[E.coli JM109(pUEX2)]と比較して、1mM Cd^<2+>を含むLB液体培地において耐性が140%に増加した。また対照菌は2mM Cu^<2+>を含む培地では生育できないのに対し、E.coli JM109(pZMT001)は生育可能となった。Zn^<2+>を含む培地においては耐性度に顕著な差は見られなかった。E.coli JM109(pZMT001)は500μM、50μMのCd2+を含む培地で4日間の培養において、それぞれ22%、87%のCd^<2+>を回収した。E.coli JM109(pZMT001)のCd^<2+>の回収能力は10.47μg/mg dry cellで、対照菌と比較すると3倍に増加していた。一方、Zn^<2+>、Cu^<2+>の回収は見なれなかった。500μM Cd^<2+>を含む培地で48時間暴露培養したE.coli JM109(pZMT001)において、Cd^<2+>の局在をエネルギー分散型X線分析装置にて調べてみると、40%が膜付近に存在していたのでCd^<2+>の非特異的な吸着があることが示された。残りの60%は細胞内に存在しており、取り込まれたCd^<2+>はhMT-IIにトラップされていることが予想された。
TALENゲノム編集法を用いた骨形成促進薬のスクリーニングシステムの開発

骨形成を促進する低分子化合物をスクリーニングするために、TALENゲノム編集法にて蛍光遺伝子Venusとルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ細胞株を作製したが、陽性細胞株の選別が困難であることが明らかとなった。そこで、Cas9ゲノム編集法を用いたPITCh法を活用することにより、ガイドRNAならびにドナーベクターのプラスミドの作製が飛躍的に効率化できることが確認された。またドナーベクターに分泌型ルシフェラーゼ遺伝子とEGFP遺伝子の発現カセットをlox配列で挿入することにより、陽性細胞株の選択にも非常に効果的に行えることが示唆された。1.スクリーニングシステムの開発に必要な骨芽細胞株の決定骨形成因子BMP2刺激により、SOSTの発現を有意に増加させる細胞株として、骨芽細胞系株SaOS2が適していることを見出した。BMP2刺激ならびにRunx2あるいはOsterix等の過剰発現によりSOST遺伝子が安定的に誘導されることをRT-qPCR解析により確認した。またSSAレポーターアッセイにより、SaOS2細胞株がTALENゲノム編集に相応しいことも確認できた。したがって、SaOS2細胞は、TALEN法によるSOSTノックイン細胞作製に適していると考えられた。2.Wntアンタゴニストに対するノックイン細胞株の作製Wntに対しては、SOST以外にもアンタゴニストが存在するので、それらの関与も検討した。その結果、FrzBもBMP2刺激により、発現が誘導されることが明らかとなった。そこで、FrzBに対する創薬開発を目指して、FrzB遺伝子座にレポーター遺伝子をノックインすることを試みた。その結果、Golden Gate法を用いて、FrzB遺伝子座に対するTALENベクターを作製した。さらに、FrzBの挿入部位に相同組換えが可能なドナーベクターの構築も完了した。3.PITCh法用ベクターの作製TALEN法では、TALENベクターの作製ならびにドナーベクターの構築に多大な労力と時間を要する。一方、Cas9システムでは、ノックイン細胞株の作製は難しいとされてきたが、PITCh-Cas9法の開発(Nakade et al. Nat Commun 10.1038/ncomms6560.)により、Cas9法によるノックインが非常に効率的に可能となった。そこで、PITCh-Cas9法に必要なPITChベクターを作製し、PITCh-Cas9法を行える体制を整えた。1.Wntアンタゴニスト遺伝子座へのノックイン細胞の作製:WntアンタゴニストであるFRZBの発現をモニターできる、ハイスループットアッセイスクリーニングシステムを構築するために、TALENゲノム編集法を用いて、SW1353細胞株のFRZB遺伝子座にルシフェラーゼレポーター遺伝子カセットを挿入した。2.PITCh法の改良ドナーベクターの作製:PITCh法によるゲノム編集法をより効率的に実施でき、ノックイン細胞の検出を簡易化するために、新規PITCh法ドナーベクターを作製した。すなわち、3xFlag標識配列と分泌型ルシフェラーゼに加えて、蛍光遺伝子Venusとピューロマイシン耐性遺伝子(Puro)を2Aペプチド配列で接続したカセットをloxP配列で挟み込んで、ドナーベクターに挿入した。3.WntシグナルにおけるTAZの役割の解明:抗SOST抗体の骨形成に対する作用が注目される一方で、骨芽細胞におけるWnt/b-カテニンシグナルの活性化が、急性骨髄性白血病を誘発する可能性が懸念されている。そこで、off-targetの少ない骨形成促進薬の開発に貢献するために、骨形成を選択的に促進するWntシグナルの活性化機構を明らかにすることを目指した。その結果、Wntシグナルの新たな転写制御因子であるTAZが、Wnt3aによる骨芽細胞分化誘導効果に必須であることを見出した。またb-カテニンと共に機能するLef1もWnt3aの骨芽細胞分化誘導能に必要であることを示した。興味あることに、TAZとLef1が連動することにより、未分化間葉系細胞から骨芽細胞への分化を促進していることを明らかにした。さらに、Wnt3aは、骨形成因子BMP2と相乗的に骨芽細胞分化を促進すること、そのメカニズムとして、TAZ、Lef1と転写因子Runx2との相互連携が深く関与していることを見出した。平成26年度に、1.スクリーニングシステムの開発に必要な骨芽細胞株の決定、2.Wntアンタゴニストに対するノックイン細胞株の作製に必要なコンストラクション、3.PITCh法用ベクターの作製を実施できたので、概ね順調に進んでいると判断した。分子生物学1.SOSTノックイン細胞の作製SOST遺伝子座へのレポーター遺伝子の挿入部位を決定後、Golden Gate法によりTALENベクターを作製、PCR法ならびにInFusion法を活用してTALEN法用のドナーベクターを作製する。作製したTALENベクターおよびドナーベクターをSaOS2にトランスフェクションし、limiting dilutionにより陽性細胞株の選択を行う。具体的には、一次スクリーニングは、ルシフェラーゼ活性の有無にて実施する。

二次スクリーニングは、サザンブロット法による解析により、random integrationが無く、SOST遺伝子座にレポーターカセットが挿入されているクローンを選別する。2.FrzBノックイン細胞の作製すでに作製したTALENベクターおよびドナーベクターを細胞にトランスフェクションし、limiting dilutionによって培養する。一次スクリーニングは、ルシフェラーゼ活性の有無にて検索する。二次スクリーニングは、サザンブロット法により、random integrationが無く、FrzB遺伝子座にルシフェラーゼならびにVenusの融合遺伝子レポーターカセットが挿入されているクローンを分離する。PITCh-Cas9の有効性を確認するために、まず、目的細胞と標的遺伝子を決定する。標的遺伝子の挿入部位を決定後、PITChベクターに標的遺伝子導入に必要なモチーフを付与し、PITChベクターを完成させる。PITChベクターをCas9ベクター、ガイドRNAとともに、目的細胞にトランスフェクションし、ノックイン効率を検討する。平成26年度に予定していた情報収集・成果発表に関して、旅費が殆ど必要でなかったため、使用予定の研究費が、若干、少なくなった。平成27年度の研究に必要な研究試薬に充当させ、当該費用を使用する。
受容体遮断作用を有する天然物の血圧降下剤への応用開発研究

高血圧症が引き金となり動脈硬化を引き起こし、狭心症や心筋梗塞といった様々な循環器病の原因となっている。一般に高血圧の患者には血圧降下剤を連用しなければならないため、副作用の少ない治療薬の開発が社会的要請となっている。人類は、数千年前から動植物を病気の治療に用いてきた。また、現在汎用されている合成薬も元をただせば天然物由来のものが多い。伝統ある生薬や海洋生物などの天然資源から、リード化合物を見出し、種々の誘導体を合成し、副作用の少ない優れた血圧降下剤を開発することが本研究の目的である。我々は天然界からα-アドレナリン受容体やセロトニン受容体、あるいは筋収縮蛋白質系に作用する天然生理活性物質を数多く見出してきた。南天実のメタノールエキスから得られたナンテニンは、ラット胃平滑筋およびモルモット気管平滑筋、ウサギ大動脈平滑筋において、それぞれセロトニンによる用量-収縮反応曲線を高濃度側に平行移動させた。また、ラット大動脈平滑筋においてもフェニレフリンによる用量-収縮反応曲線を高濃度側に平行移動させたことから、α-アドレナリン受容体およびセロトニン受容体の両方を遮断する作用を持つことが示唆された。また、抗炎症の目的で用いられるタイ産薬用植物Garcinia mangostanaから新しいタイプの抗ヒスタミンおよび抗セロトニン活性成分を得ることに成功した。抗セロトニン作用を示したγ-マンゴスチンは血管収縮抑制作用を示しただけではなく、中枢神経系においても抗セロトニン活性を示した。また我々は、筋細胞の興奮収縮連関の鍵を担っている筋小胞体からのCa^<2+>放出機構に作用する化合物の中枢作用も検討した。高血圧症が引き金となり動脈硬化を引き起こし、それが狭心症や心筋梗塞といった様々な循環器病の原因となっている。我々は天然界からα一受容体やセロトニン受容体などのレセプター、および筋収縮系に作用する多くの天然生理活性物質を見出してきた。南天実のメタノールエキスから得られたナンテニンは、セロトニンによる多血小板血漿を用いた血小板凝集作用には影響を示さなかったが、ラット胃平滑筋およびモルモット気管平滑筋に対し、セロトニンの用量作用曲線を高濃度側に平行移動させた。このことから、ナンテニンが平滑筋と血小板のセロトニン受容体を識別できる抗セロトニン薬である可能性が示唆された。また、抗アレルギーの目的で用いられるタイ産薬用植物Garcinia mangostanaから新しいタイプの抗ヒスタミンおよび抗セロトニン活性成分を得ることに成功した。抗ヒスタミン作用を示したα-マンゴスチンは抗セロトニン作用は示さなかったが、この脱メチル化類縁体であるγ-マンゴスチンは、対照的に抗セロトニン作用のみを示した。脱メチル化によって抗ヒスタミン作用から抗セロトニン作用に作用点が変わることは非常に興味深い結果である。また、この化合物は分子内に窒素原子を含まない抗ヒスタミン、抗セロトニン薬では初めての例であり、創薬のリード化合物として注目される。このように新しい医薬資源からの血圧降下剤のリード化合物をいくつか見出すことに成功した。

一般に高血圧の患者には血圧降下剤を連用しなければならないため、副作用の少ない治療薬の開発が社会的要請となっている。人類は、数千年前から動植物を病気の治療に用いてきた。また、現在汎用されている合成薬も元をただせば天然物由来のものが多い。伝統ある生薬や海洋生物などの天然資源から、リード化合物を見出し、種々の誘導体を合成し、副作用の少ない優れた血圧降下剤を開発することが本研究の目的である。我々は天然界からα-アドレナリン受容体やセロトニン受容体、あるいは筋収縮蛋白質系に作用する天然生理活性物質を数多く見出してきた。南天実のメタノールエキスから得られたナンテニンは、ラット胃平滑筋およびモルモット気管平滑筋、ウサギ大動脈平滑筋において、それぞれセロトニンによる用量-収縮反応曲線を高濃度側に平行移動させた。また、ラット大動脈平滑筋においてもフェニレフリンによる用量-収縮反応曲線を高濃度側に平行移動させたことから、α-アドレナリン受容体およびセロトニン受容体の両方を遮断する作用を持つことが示唆された。また、抗炎症の目的で用いられるタイ産薬用植物Garcinia mangostanaから新しいタイプの抗ヒスタミンおよび抗セロトニン活性成分を得ることに成功した。抗セロトニン作用を示したγ-マンゴスチンは血管収縮抑制作用を示しただけではなく、中枢神経系においても抗セロトニン活性を示した。また我々は、筋細胞の興奮収縮連関の鍵を担っている筋小胞体からのCa^<2+>放出機構に作用する化合物の中枢作用も検討した。
鎮痛作用、抗不安作用に関するNitric Oxideの脳内情報伝達物質としての役割

不安や恐怖が痛覚過敏状態を起こすかどうかを調べるために、鎮痛作用、抗不安作用に関するNitric Oxideの脳内情報伝達物質としての役割を検索した。研究初年度ではラットの脳内Microdialysis法を用いて、Nitric Oxideを無拘束で高速液体クロマトグラフィにより測定するシステムを構築し、測定精度を確立した。次年度は不安の動物モデル(コンフリクトテスト、高架式十字迷路)を作製し定量性に関する実験を行い、その有用性を検証した。最終年度には、静脈麻酔薬(ミダゾラム、プロポフォール、ケタミン)の鎮痛作用、抗不安作用、鎮静作用、麻酔作用が脳内NO産生にどのような影響を与えるかを検討した。その結果、抗不安作用、鎮痛作用、麻酔作用の発現に脳内NOが深く関与していて、他のモノアミン神経系と相互作用を生じていることが明らかになった。しかし、実験によっては、従来の報告と異なる結果が得られた。このことから脳内NOの二面的な作用機序が考えられた。即ち、状況不安など弱い不安・ストレスに対しては、NOは保護的に作用するが、対象がはっきりした、強い恐怖のような情動変化では、活性化されたNOが他の神経伝達物質を増加させ、悪循環を形成すると予想される。いったん活性化され過剰に産生されたNOは密接な関連を持つ脳内セロトニン神経系などに影響を与え、痛覚過敏状態を作り出すのではないかと考えられる。最近、NO合成酵素阻害剤を使用するのではなく、過剰に生成された生体にとって有害なNOだけを消去し、生体にとって必要なNOは残してやろうという治療法が検討されている。NO消去剤の研究が進めば、痛みを増強するような悪循環のネットワークを断ち切る薬剤、管理法ができると期待する。本研究は鎮痛作用、抗不安作用に関するNitric Oxideの脳内情報伝達物質としての役割を調べるのが目的である。研究初年度ではラットの脳内Microdialysis法を用いて、Nitric Oxideを無拘束で高速液体クロマトグラフィにより測定するシステムを構築し、測定精度を確立するのを目的とした。備品としてエイコム社製の酸化窒素分析装置(ENO-10)を設置し、機器の整備・調整さらに実験環境も整い予備実験を開始した段階である。予備実験では当教室で使用しているラッコのコンフリクト・モデルを使用して行い、飲水時に与えられる電撃ショックに対する不安などの情動変化が、脳内Nitric Oxideの産生にどのような影響を与えるかを研究している。その結果、痛みを伴うような強いストレスに対して脳内Nitric Oxideが他のモノアミン系のneurotransmitterと相互的に作用している可能性が示唆された。すなわち当教室の研究から、海馬におけるセロトニン活性の変化が情動の変化に深く関与していることを示したが、この中でNitric Oxideなどのように細胞膜を自由に拡散できるガス体の情報伝達物質が中間物質として局所の素早い反応を調節している可能性がでてきた。今後は、いくつかの異なる条件下でNitric Oxideとセロトニンなどの脳内物質を同時に測定し、各物質の取り込み阻害剤などの影響を検討しつつ、脳内で情報伝達物質がどのように相互作用しているかを検討していく方針である。本年度の研究計画に基づき、ラットを用いて以下の実験を行った。1.脳内Ntric Oxide(NO)の活性をラットの海馬に挿入したプローベからMicrodialysisを用いて測定した。まず、安静状態で経時的に45時間NO活性を測定して定常状態でのラット海馬での産生量を調べた結果、安静時のNO活性は約20pmolであった。次にNMDA(1mmol)を投与する事によりNO活性を上昇させ(40%)、NO酵素阻害剤であるL-NAMEを(100mg/kg)投与してNO活性の低下(30%)を確認した。

以上の研究では、ラット海馬でのMicrodialysisによるNO活性の測定が定量性のある方法が確認された。2.従来より用いてきたコンフリクトモデルに加え、高架式十字迷路を作成し、ラットの行動変化の妥当性を検討した。モデルは高さ50cmの片方が開放されている十字の迷路で、開放されている迷路に侵入する回数(%)と、その時間(分)を評価する方法であるが、抗不安効果発現と脳内NO活性に関連があるかどうかを行動変化から検討した。ラットを4群に分け、それぞれ生食投与群(対照群)、ミダゾラム(1.53mg/kg)投与群、7nitro indazole(7-NI) (10100mg/kg)、L-NAME(10100mg/kg)を投与した時の行動変化を観察した。その結果、生食投与群(6.7%、8.7秒)に比べ、ミダゾラム3mg/kg投与群(24%、47.5秒)、7-NI(100mg/kg)投与群(30%、30秒)は有意に抗不安効果が認められた。しかしL-NAME(100mg/kg)投与群では明らかな抗不安効果は認めれなかった。3.上記の予備実験結果を踏まえて、各薬剤投与時の高架式十字迷路での行動変化に伴う脳内NO活性の経時的な変化を無拘束下でのMicrodialysis法を用いて測定し、抗不安効果と脳内NO活性の直接的な証明を行っており、現在までに新知見が得られている。全身麻酔薬であるケタミンはNMDA受容体が関与する痛みに対して、治療効果が大きいが、その麻酔作用の機構について未だ不明な点が多い。我々はケタミンの麻酔作用・鎮痛作用が脳内のNO/cGMP系を介してどのように調節しているかを、ラット海馬でのMicrodialysis法を用いて検索、プロポフォールの変化と比較検討した。ケタミン投与群では100mg/kgを腹腔投与して完全にrighting reflex消失させた後10分ごとに経時的にNOの値を測定した。また、プロポフォール群では、80mg/kg腹腔内投与で就眠させた後、経時的に測定した。その結果、ケタミン投与群(n=8)では麻酔覚醒時よりNOの上昇がみられ、完全覚醒後(righting reflex回復)約30分で対照値に対し約140%の有意な上昇が、覚醒時に異常行動(rotation)が認められた。これに対し、プロポフォール投与群(n=7)ではNOの軽度の低下が認められ、完全覚醒後30分で対照値に対し、約80%とやや低下し、異常行動は認められなかった。ケタミンは麻酔覚醒時に悪夢などの不快症状が発現することが知られているが、ラットの異常行動はこれと同様のもので、Glutamateなどが最終的には関与している可能性が大きく、今回の結果からみて覚醒時に賦活されるNO/cGMP系がこれらを調節していると示唆される。ケタミンはNMDA受容体を拮抗して麻酔作用を発現するが、麻酔覚醒時には逆にNMDA受容体のhypersencitivityが起こり、細胞内NOが急激に産生され、それがシナプス前終末に拡散・作用し、Glutamateなどを分泌させると推察される。しかし、同じNMDA受容体を介して麻酔作用を発現するプロポフォールではNO/cGMP系に変化がないのは、両麻酔薬のGABAA受容体への関与の違いが考えられる。
マウスサイトメガロウイルスの実験的細菌性尿路感染症に与える影響

我々は、ウイルス感染時に細菌感染に対する感受性が増すことを検討するために、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)感染マウスを用いて、実験的な細菌性尿路感染モデルを作成した。MCMV感染マウスの膀胱に逆向性に細菌を接種すると、MCMV感染マウスにおいては、尿中生菌数が著明に増加した。MCMV感染マウスに緑膿菌を接種した場合、致死量のMCMV接種マウスでは死亡までの期間の短縮がみられた。また、非致死量のMCMV接種マウスでも、緑膿菌の膀胱内接種にて、マウスの死亡率が増加した。これらのマウスは全て敗血症にて死亡しており、MCMV感染時に細菌性尿路感染症を併発すると、容易に敗血症へ移行することがわかった。特に、ウイルス感染4日後に細菌を膀胱に接種した場合、接種菌量が約10^2cfuでも容易に敗血症に移行した。これらの細菌感染症への感受性の増加は、MCMV感染によって引き起こされる自然抵抗性の減弱によると考えられる。致死量のMCMV感染は著明な好中球減少を伴う汎血球減少を来す。しかし、非致死量のMCMVはわずかな汎血球減少を来すのみである。さらに、致死量の1/100のMCMV感染時にも、細菌を接種すると尿中生菌数の増加を見ることから、単に好中球減少のみが細菌感染への感受性を増す因子にはなっていないことがわかる。MCMV感染時には、好中球の機能(貧食能、遊走能)の減弱が見られることから、軽微なウイルス感染は好中球機能の低下を引き起こし、これが、細菌感染症に対する感受性を増加させる因子となると考えられる。
子宮頸がんにおけるHPVウイルスの新規標的分子と治療戦略

MOB1A/B二重欠損マウスは、生化学的には下流のYAP1が活性化し、細胞生物学的には細胞増殖や未分化性が亢進し、染色体の安定性も傷害され、生後早期に子宮頸がんが発症することを見出した。しかしこのマウスでは染色体不安定性のためにp53の発現が亢進し、長期子宮頸がんにとどまるものの、さらにp53を欠損させると浸潤がんに移行した。またヒト子宮頸がん組織においてもYAP1が高頻度に活性化し、次にHPV非感染子宮細胞株にHPV E6,E7を発現させるとYAP1の活性とp53の低下を見た。このようなことから、HPVはHippo経路を標的として、子宮頸がんの発症を起こすことを見出した。近年接触抑制シグナルの鍵経路として、強力ながん抑制シグナルとしてHippoキナーゼ経路が脚光を浴びている。Hippo経路はショウジョウバエにおいて初めて見出され、接触抑制、細胞増殖、細胞死、幹細胞維持、器官サイズの制御シグナルとして注目されている。生化学的には細胞接触やストレス刺激後に、MSTキナーゼが活性化された後、LATSキナーゼが活性化され、活性化したLATSキナーゼは、細胞増殖に正に働く転写共役因子YAP1/TAZをリン酸化して、核から排除し、或いは蛋白質崩壊に導くことによって、主に細胞増殖に作用する標的遺伝子の転写を負に制御する。しかしながらこれまでに作製されたHippo経路遺伝子欠損マウスの多くは胎生早期に致死であったため、成体におけるHippo経路各分子の生理的役割やその破綻による腫瘍発症の有無の多くが不明であった。一方、子宮頚がんの発症はヒトパピローマウイルス(HPV)が原因であり、HPVの標的遺伝子としてはp53やRB1などのがん抑制遺伝子変化が重要であるものの、これら各々の不活化のみでは、早期からの子宮頚部の異形成を再現できず、それ以外の遺伝子変異の関与が示唆されていた。また子宮頸がんにおけるHippo経路研究の報告はまだ見ない。申請者らはMOB1A/1B二重欠損マウスに高頻度に子宮頸がんが起こることを見出した。またこれらの子宮頚部では細胞増殖の亢進、未分化性の亢進などを認めた。さらにヒト子宮頸がんにおいても高頻度にYAP1が亢進していることを見出した。このように子宮頸がんの発症にHippo経路が重要であることを見出した。がん遺伝子経路であるHippo経路は、近年大いに注目されてきているものの、これまでに子宮頚部においてHippo経路の機能を解析した研究は皆無であった。そこでまず、平成26年度には、(1)MOB1欠損マウスに早期子宮頸がん(上皮内癌)を全例みること、(2)子宮特異的MOB1欠損マウスは、増殖亢進、未分化性亢進、YAP/TAZの活性化をみること、(3)ヒト子宮頸がんにおいては全例YAP1が活性化していること、などを見出した。それに引き続き平成27年度には、(1)HPV非感染子宮頚部扁平上皮細胞に、HPVE6, E7をin vitroで遺伝子導入したところ、YAP1の活性亢進、p53やRBの活性は減弱することを見出した。(2)一方子宮特異的MOB1欠損マウスの子宮頚部ではYAPは活性化するものの、p53も発現亢進すること、またp53増加の一因は細胞質分裂障害による核の異数体形成によることが示唆された。そこでさらに、(1)HPVE6E7Tgマウスにみられる子宮頚部異形成変化とそのYAP依存性、(2)MOB1欠損にさらにp53を欠損させたときの子宮頸がんの増悪変化、(3)HPVE6E7によってp53が発現抑制されるメカニズムを解析する予定であったが、このマウスの飼育施設に原虫の感染事故があったことから、これまで作製したマウスをすべて廃棄し、再度一から交配を始め、研究費も翌年に繰り越す手続きをとった。これまで順調に進んでいたものの、上述のように感染事故があったことから、これまで作製したマウスをすべて廃棄し、再度一から交配を始め、研究費も翌年に繰り越す手続きをとった。<研究の目的>子宮頚がんの発症はヒトパピローマウイルス(HPV)感染が原因である。HPVの標的遺伝子としてはp53やRB1が重要であるとされているものの、p53やRB1の不活化のみでは早期からの子宮頸がんの発症を再現できず、それ以外の遺伝子異常の存在が示唆されていた。また近年がん抑制シグナルとしてHippo経路が見出されたが、子宮頸がんにおけるHippo経路研究の報告はまだ見ない。