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エリスロポエチンの昇圧機序に関する研究

平成8年度は,透析患者におけるエリスロポエチン誘発性高血圧に対する抗血小板薬の降圧効果をNOとの関連で検討中であることと,In vitroで抗血小板薬のパナルジンのNO産生に対する影響を培養血管平滑筋細胞で検討した.臨床検討貧血を有する安定維持期の透析患者で過去にエリスロポエチン投与にて血圧上昇を認めた症例か、ないしは降圧薬を増量した症例.服薬の良好な患者で体重増加率がDWの5%以内の者を対象としてパナルジン非投与および投与中にエリスロポエチンを投与して、血中NO濃度および各種血管作動物質を測定した。現在,症例を集積中である.基礎的研究我々は透析患者におけるエリスロポエチンの昇圧機序検討の一環として、抗血小板薬のジピリダモ-ルがサイトカイン刺激による一酸化窒素の産生を増強させることを培養血管平滑筋細胞で確認している(European J.Pharmacol,296:319,1996).機序に関しては,cAMP分解酵素であるcAMPホスホジエステラーゼ活性を阻害し,細胞内cAMP含量を増加することによりNO産生を増強することが明らとなった.ただし,ジピリダモ-ルのNO産生増強作用はサイトカインのIL-lβが存在してはじめて発揮されることであり,透析患者では血中サイトカインが増加していることを考えると抗血小板薬がNO産生を介して降圧的に作用しても矛盾はないと考えられた.また,臨床で透析患者に良く使われている塩酸チクロピジンに関しては現在検討中であるが,ジピリダモ-ル同様IL-lβ存在下でNOの産生やiNOS-mRNAを増強することが明らかとなった.機序に関しては,ジピリダモ-ルがcAMPホスホジエステラーゼ活性を阻害して作用を発揮するのとは異なり,cAMP合成酵素のadenylate cyclaseを刺激して発揮する可能性が示された.今後この結果は,国内の学会や国際学会で発表する予定である.平成8年度は,透析患者におけるエリスロポエチン誘発性高血圧に対する抗血小板薬の降圧効果をNOとの関連で検討中であることと,In vitroで抗血小板薬のパナルジンのNO産生に対する影響を培養血管平滑筋細胞で検討した.臨床検討貧血を有する安定維持期の透析患者で過去にエリスロポエチン投与にて血圧上昇を認めた症例か、ないしは降圧薬を増量した症例.服薬の良好な患者で体重増加率がDWの5%以内の者を対象としてパナルジン非投与および投与中にエリスロポエチンを投与して、血中NO濃度および各種血管作動物質を測定した。現在,症例を集積中である.基礎的研究我々は透析患者におけるエリスロポエチンの昇圧機序検討の一環として、抗血小板薬のジピリダモ-ルがサイトカイン刺激による一酸化窒素の産生を増強させることを培養血管平滑筋細胞で確認している(European J.Pharmacol,296:319,1996).機序に関しては,cAMP分解酵素であるcAMPホスホジエステラーゼ活性を阻害し,細胞内cAMP含量を増加することによりNO産生を増強することが明らとなった.ただし,ジピリダモ-ルのNO産生増強作用はサイトカインのIL-lβが存在してはじめて発揮されることであり,透析患者では血中サイトカインが増加していることを考えると抗血小板薬がNO産生を介して降圧的に作用しても矛盾はないと考えられた.また,臨床で透析患者に良く使われている塩酸チクロピジンに関しては現在検討中であるが,ジピリダモ-ル同様IL-lβ存在下でNOの産生やiNOS-mRNAを増強することが明らかとなった.機序に関しては,ジピリダモ-ルがcAMPホスホジエステラーゼ活性を阻害して作用を発揮するのとは異なり,cAMP合成酵素のadenylate cyclaseを刺激して発揮する可能性が示された.今後この結果は,国内の学会や国際学会で発表する予定である.平成6年度は透析患者でエリスロポエチン投与前後の血圧、血中NOの安定代謝産物であるNO2ないしはNO3を測定予定だったが、NO測定系が安定せず本年度は一部計画を変更して、次に述べる検討を施行した。1.臨床検討:透析患者におけるエリスロポエチンの昇圧機序検討の一環として、抗血小板薬がエリスロポエチンによる高血圧に有効との結果を得ている。抗血小板薬としてはパナルジン、アスピリン使用した。血小板から放出される血管作動因子を抗血小板薬中止前後で測定したが有意な変動を認めなかった。従って、機序は不明であり今後さらに検討が必要である。2.培養血管平滑筋細胞(VSMC)を用いたIn vitroの検討VSMCでサイトカインIL-1で刺激される一酸化窒素(NO)ならびにその合成酵素に対するエリスロポエチンの効果を検討した。エリスロポエチン単独ではNO産生に影響は見られず、さらにIL-1で刺激される-NO産生に対してエリスロポエチンは影響を与えないという結果だった。本年度は当初の予定どうり透析患者におけるエリスロポエチン投与による血中NOの動態とSHRとWKYラットの培養血管内皮および平滑筋細胞を用いたIn vitroの検討を行なう予定である。平成7年度は,透析患者におけるエリスロポエチン誘発型の高血圧に対する抗血小板薬の降圧効果をNOとの関連で検討予定であったが,若干その検討が遅れている.従って,in vitroの検討が主となった.基礎的研究我々は透析患者におけるエリスロポエチンの昇圧機序検討の一環として、抗血小板薬がエリスロポエチンによる高血圧に有効との結果を得ている.

その機序を検討して,抗血小板薬のdipyridamole (European J. Pharmacol, in press)はIL-1β刺激によるNO産生を増強し,iNOSの発現を増強することを培養血管平滑筋細胞で確認している.機序に関しては,cAMP分解酵素であるcAMPホスジェステラーゼ活性を阻害し,細胞内cAMP含量を増加することによりNO産生を増強することが明らかとなった.ただし,dipyridamleのNO産生増強作用はサイトカインのIL-1βが存在してはじめて発揮されることであり,透析患者では血中サイトカインが増加していることを考えると抗血小板薬がNO産生を介して降圧的に作用しても矛盾はない.また,ticlopidineに関しては現在検討中であるが,dipyridamole同様サイトカイン存在下でNOの産生を増強していることが明らかとなった.現在その機序に関して検討中である.平成8年度は,透析患者におけるエリスロポエチン誘発性高血圧に対する抗血小板薬の降圧効果をNOとの関連で検討中であることと,In vitroで抗血小板薬のパナルジンのNO産生に対する影響を培養血管平滑筋細胞で検討した.臨床検討貧血を有する安定維持期の透析患者で過去にエリスロポエチン投与にて血圧上昇を認めた症例か、ないしは降圧薬を増量した症例.服薬の良好な患者で体重増加率がDWの5%以内の者を対象としてパナルジン非投与および投与中にエリスロポエチンを投与して、血中NO濃度および各種血管作動物質を測定した。現在,症例を集積中である。基礎的研究我々は透析患者におけるエリスロポエチンの昇圧機序検討の一環として、抗血小板薬のジピリダモ-ルがサイトカイン刺激による一酸化窒素の産生を増強させることを培養血管平滑筋細胞で確認している(European J.Pharmacol,296:319,1996).機序に関しては,cAMP分解酵素であるcAMPホスホジエステラーゼ活性を阻害し,細胞内cAMP含量を増加することによりNO産生を増強することが明らとなった.ただし,ジピリダモ-ルのNO産生増強作用はサイトカインのIL-1βが存在してはじめて発揮されることであり,透析患者では血中サイトカインが増加していることを考えると抗血小板薬がNO産生を介して降圧的に作用しても矛盾はないと考えられた.また,臨床で透析患者に良く使われている塩酸チクロビジンに関しては現在検討中であるが,ジピリダモ-ル同様IL-1β存在下でNOの産生やiNOS-mRNAを増強することが明らかとなった.機序に関しては,ジピリダモ-ルがcAMPホスホジエステラーゼ活性を阻害して作用を発揮するのとは異なり,cAMP合成酵素のadenylate cyclaseを刺激して発揮する可能性が示された.今後この結果は,国内の学会や国際学会で発表する予定である.
ガドリニウムの熱中性子捕獲反応でのガンマ線の多重度とエネルギー分布測定

本研究の目的は、ガドリニウム(Gd)の熱中性子捕獲反応から放出されるガンマ線の総数とそれぞれのエネルギーを実験により精度良く測定することである。また実験データとの比較により、同反応からのガンマ線放出について再現性の良い計算シミュレーションモデルを得ることを目的とする。申請者らはJ-PARC/MLFのANNRI中性子ビームラインを使用することで、天然Gdについて35億事象、濃縮Gd-155,157について計80億事象の大統計高精度のデータを取得した。また、この実験データを良く再現する計算モデルを新たに構築した。この研究結果は、Gdを使用する科学分野、医療分野等への応用が期待される。本研究の目的は、ガドリニウム(Gd)の熱中性子捕獲反応から放出されるガンマ線の総数とそれぞれのエネルギー、ガンマ線間の角相関を測定することである。ガドリニウムの熱中性子捕獲反応は近年の高エネルギーニュートリノ実験に用いられているのみならず、中性子線医療にも用いられている。ガドリニウムからの中性子捕獲ガンマ線の理解は、これらの応用分野において技術の向上を生むと期待される。平成26年度の研究として、「同位体Gd-157・Gd-155を用いたビーム実験」、「天然ガドリニウムの熱中性子捕獲ガンマ線のデータ解析」を計画に基づき実施した。具体的な平成26年度の研究の実績としては以下の通りである。1.大強度陽子加速器施設J-PARCの物質生命科学実験施設(MLF)において、中性子ビームラインBL04とGeガンマ線検出器ANNRIを用いたビーム実験を行った。これは研究計画の通りである。ビーム実験の標的にはGd-157・Gd-155をそれぞれ用いた他、校正用にコバルト、ナトリウム、セシウム、ユーロピウムのガンマ線データを取得した。また、取得した各データの解析を行い、標的とした原子核固有の離散ガンマ線スペクトラムを確認した。これにより、今後の解析に用いるデータが正しく取得できたことを確認できている。2.平成26年以前に天然ガドリニウムを標的とし、取得したデータの解析を行った。解析に際しては素粒子実験に広く用いられるGeant4計算機シミュレーションライブラリを用いた。これにより、ANNRI検出器の応答を良く再現するシミュレーションの構築に成功した。本シミュレーションを用いて各種のガドリニウム熱中性子捕獲ガンマ線モデルとデータを比較することで、現在一般に使われているモデルはいずれも不十分であることが改めて確認できた。現在は新たな計算モデルの作成と、データとの比較・評価を進めている。近年、ガドリニウムの熱中性子捕獲反応はニュートリノ実験を始めとした素粒子分野で広く応用がなされている。また、中性子による癌医療にも用いられている。ガドリニウムからの中性子捕獲ガンマ線の理解は、これらの応用分野における基礎的な量の理解、技術の向上を生むと期待している。平成27年度の研究として、「平成26年度に得たビーム実験データの解析」、「新たなガンマ線放出モデルの構築」を行った。具体的な平成27年度の研究実績としては以下の通りである。1.大強度陽子加速器施設J-PARC/MLFのANNRI検出器において取得した、Gdの熱中性子ビーム実験のデータ解析を行った。解析にはANNRI検出器の計算機シミュレーションを併用した。これは平成26年度に我々が開発したものである。我々はまず較正線源データの解析により、計算機シミュレーションが±15%でANNRI検出器を再現していることを確認した。この計算シミュレーションはANNRIを用いた他の実験にも提供することを予定している。次項のガンマ線放出モデルの構築は、実データと計算機シミュレーションを比較することで行った。2.昨年度の研究により、既存のガドリニウム熱中性子捕獲ガンマ線のモデルは不十分であることが確認できた。この状況を受け、今年度はガドリニウムの熱中性子捕獲ガンマ線の放出の為の新しい計算モデルの構築を行った。我々の新しいモデルは現時点で±30%で実験データを再現しており、全エネルギー域において既存のモデルより再現性が良い。このモデルについては、さらなる精度の向上を行った上で論文としての公表を予定している。本研究計画について、平成26年度はおおむね順調に進展していると自己評価する。まず評価すべき点の一つは、平成26年12月に計画通り「同位体Gd-157・Gd-155を用いたビーム実験」を実施し、研究に必要な中性子捕獲ガンマ線のデータを取得した事である。また、データ取得に際しNaの中性子捕獲のデータ、Co線源、Cs線源、Eu線源の高統計のデータを新たに取得したことも評価できる。

これにより、後に示す通りANNRI検出器の応答を理解することが出来た。これらのデータについては解析中であるが、平成26年12月以前に取得した天然Gdを標的としたデータに比べバックグラウンドが少なく、良質なデータであること等が確認できている。これにより、今後の解析の段階においてより良好な情報を取得できることが期待される。第二に評価すべき点は、データ解析において精度良くANNRI検出器を再現する計算機シュミレーションを構築した点である。本シミュレーションは高エネルギー粒子物理学研究において広く利用されているGeant4を基礎として構築したものである。線源のデータを使用し、エネルギースペクトルを良く再現出来ることが確かめられている。また、ガドリニウムのガンマ線データについてもモデル計算と本シミュレーションを組み合わせることによって、各モデルの評価を行うことの出来る段階まで進んでいる。これにより、ガンマ線放出のモデルと実データの比較を行うための基礎を固めることが出来た。この点も平成26年度の実験計画通りである。実験計画から遅れている点は、『ガンマ線の本数・エネルギー分布・角度相関の測定手法の確立』である。エネルギー分布については、上記のシミュレーションの使用により十分進展している。ガンマ線の本数および角度相関については現在解析を進めている。以上から、平成26年度の本研究はおおむね計画通り進展していると評価する。素粒子物理学平成26年度までに、解析に必要なGd-157・Gd-155の熱中性子捕獲ガンマ線のデータの取得が出来ている。また、『研究の目的である熱中性子捕獲ガンマ線の多重度とエネルギー分布測定』を行うにあたって必要となる検出器の計算機シミュレーションも精度良く構築することが出来ている。今後の研究にあたっては、既存のデータの解析に主眼をおいて進める方針である。平成26年度のデータにはGd-157・Gd-155の両方について10の9乗事象を超える熱中性子捕獲ガンマ線放出事象が含まれており、まずこのデータを十分に整理し、理解することが必要である。解析における課題は、信頼できるGdの中性子捕獲反応のモデルの構築である。ガンマ線検出に用いたANNRI検出器は、実験の時点でカバーする範囲は全立体角の22%であった。これは震災の影響で、側面のGe検出器が復旧中だったことによる。この影響により立体角が当初予定の半分となり、解析に若干の困難を伴っている。これを解決するため、現在新しく信頼できるGdの中性子捕獲反応モデルの構築を行っている。モデルと検出器シミュレーションを精度良く構築し、それらによりデータを良く再現出来れば、モデルが示す放出ガンマ線のエネルギーや多重度によって実データを評価することが可能である。既存のモデルについては平成26年の研究により評価を行ったが、いずれも再現が不十分であることが分かっている。現在の時点で我々は検出器シミュレーションの構築に成功しており、今後熱中性子捕獲ガンマ線のモデルの構築を行ってゆく。また、新しい実験データの取得については、検出器の立体角の回復の状況を見て行ってゆく予定である。
イノシト-ル燐脂質代謝を介するトランスメンブランコントロ-ル

本年度は、Ca^<2+>シグナル系及びイノシト-ル燐脂質(PI)代謝に関与する種々の蛋白質の生化学的及び分子生物学的研究に加えて、これらの蛋白質が関与する種々の現象に関する薬理学的及び生理学的研究が行われた。(1)低分子量G蛋白質ーホスホリパ-ゼ(PLC)系:ボツリヌス毒素が低分子量G蛋白質をADPーリボシル化するとともにリンパ球PLCの活性化を誘導することを発見し(大沢)、PLCがATP依存性に活性化されること、この活性化がイソフラボン化合物で抑制される事を見いだした(小河原)。PLCγ_2のZ領域がチロシンキナ-ゼやリン酸化蛋白の認識と活性化を行う部位であることを見いだした(竹縄)。(2)イノシト-ルリン酸認識蛋白質:IP_3、IP_4の分解に関与するフォスファタ-ゼに分子多様性を見いだした(中川)。IP_4アナログを化学合成し、IP_4認識蛋白質の活性中心の構造解析を行った(古賀)。(3)プロテインキナ-ゼC(PKC)アイソザイムとその局在:免疫電顕法を用いてPKC各分子種の神経細胞内特異分布を明らかにした。PKC各分子種に加え、カルモジュリン依存性酵素であるカルシニュ-リン(Aα、Aβ)のmRNAの脳内分布をin situ hybridization法により明らかにした(田中)。PKCアイソザイム間の機能的差異を、PKC過剰発現細胞を用いて転写活性化能を指標とする事により明らかにした(大野)。PKC分解産物に分子量8万の新しい活性化型酵素の存在を明らかにした(山村)。PKC分子種の活性変動を蛋白、mRNAレベルで解析し、それぞれが異なる細胞周期で機能する事を示唆し得た(荻田)。(4)Ca^<2+>結合蛋白質及びフォスファタ-ゼの特性:合成カルモジュリン阻害剤をリガンドとしたアフィニティ-精製法により新しいEFーhand蛋白質を見いだした(日高)。プロテインフォスファタ-ゼ2AのδサブユニットがPKCにより燐酸化されることを見いだした(武田)。(5)PI代謝ーPKCの機能:単離前庭神経核細胞を用いた実験により、PKCのチャンネル制御機構における役割を示唆した(笹)。PI代謝に共役したグルタミン酸受容体が、海馬CA3シナプスにおける長期増強において重要な役割をはたしていることを示唆する結果を得た(杉山)。Balb/c3T3細胞においてインスリン様成長因子(IGFーI)により細胞内Ca^<2+>濃度の上昇及びPKCの持続的活性化が惹起されることを見いだした(尾形)。グリコフォリンー4、1蛋白質を介する赤血球膜変形能の調節にPI代謝が関与していることを明らかにした(石橋)。これら研究班員の研究成果は国内外の学術誌に掲載され、平成3年1月1011日に東京で開催された公開シンポジウム及び合同班会議で公表され、情報交換を行った。

Balb/c3T3細胞においてインスリン様成長因子(IGFーI)により細胞内Ca^<2+>濃度の上昇及びPKCの持続的活性化が惹起されることを見いだした(尾形)。グリコフォリンー4、1蛋白質を介する赤血球膜変形能の調節にPI代謝が関与していることを明らかにした(石橋)。これら研究班員の研究成果は国内外の学術誌に掲載され、平成3年1月1011日に東京で開催された公開シンポジウム及び合同班会議で公表され、情報交換を行った。
マイクロプロセッサの形式的論理設計検証システムの試作研究

本研究では、大規模な順序回路設計の中でも、特にマイクロプロセッサの正しさを厳密に保証するための形式的検証システムの試作を目指している。算術演算回路はマイクロプロセッサの重要な構成要素のひとつであるが、特に乗算器などの算術演算回路を検証することは一般に難しかった。これに対して、本研究では二分モーメントグラフによる新しいアルゴリズムを開発・実装して、従来手法では扱いきれなかった乗算器の検証が、現実的な時間で検証可能であることを世界で初めて示した。また、より直観的な記述が可能な時相論理である線形時間型の論理LTL (Linear Time Temporal Logic)に対して、従来より効率的な検証アルゴリズムを構築・実装して、有効性を示した。一方、マイクロプロセッサのような回路の設計検証を、論理回路レベルで直接行うことは、あまり現実的とはいえない。そこで本研究では、データパスなどを抽象化するために、限量子のない等号付き第一階述語論理を取り上げて、上記の線形時間型の時相論理に類似した時相演算子を導入し、時間に関する性質の直観的な記述が容易な体系を構築した。この論理について、まず、設計検証に用いる恒真判定問題が決定可能であることを証明した。次にこのアルゴリズムを時間および領域量の点から改良して実装し、その有効性を示した。また、設計検証において基盤技術となっている二分決定グラフについて、その変数順序付け問題がNP完全であることや、OR節点と呼ばれる特殊な節点を導入した場合の、二分決定グラフの表現能力について研究を行った。実用規模のマイクロプロセッサは、一般に極めて大規模な回路として設計されるため、部分回路を抽象化した機能レベルの記述に対する設計検証と、各部分回路の機能の設計検証を個別に行う手法が有効であると考えられる。本年度は、この観点から次の研究を行った。(1)機能レベルで記述された回路の設計検証技術機能レベルの設計検証では、例えば、算術演算回路の機能を抽象的に関数記号と表現する必要があるが、これを形式的に取り扱うためには本研究では、等式を含む第一階述語論理のサブクラスに着目している。検証問題は、この論理における恒真性判定問題に帰着することができ、決定可能であることが知られているが、従来効率の良いアルゴリズムが知られていなかった。これに対して、本研究では二分決定グラフを用いた、実用的に有効と考えられるアルゴリズムを作成した。現在、このアルゴリズムの評価を行うため実装に取りかかっている。(3)算術演算回路の設計検証技術機能レベルにおいて抽象化される部分回路、例えば算術演算回路については個別に検証する必要がある。しかし、特に乗算器については、従来の手法では指数時間を要していた。これに対して、本研究では、二分モーメントグラフと呼ばれる関数の新しい表現手法を用いたアルゴリズムを新たに作成・実装して、多項式時間での検証が可能であることを実証した。(3)論理関数処理手法に関する研究各部分回路の形式的設計検証のためには、論理関数の効率的処理が必須である。本研究では、二分決定グラフを拡張した∧(∨)二分決定グラフや三分決定グラフについて、その表現能力の理論的な解析を行っている。本研究では本年度の研究の準備として、前年度に二分モーメントグラフを用いて、マイクロプロセッサで重要な構成要素となっている算術演算回路、特に乗算器に対するきわめて効率の良いアルゴリズムを構築・実装し、また、時間に関する性質について、より直観的な記述が可能な線形時間時相論理による設計検証アルゴリズムを実装したほか、ゲートレベルではなくデータパスなどを抽象化した機能レベルの記述を直接検証するために、限量子を含まない等号付第一階述語論理の恒真性判定問題の効率の良いアルゴリズムについて検討した。さらに設計検証において基盤技術となる二分決定グラフによる論理関数処理について、その変数順序付け問題がNP完全となるとを示した。

これを踏まえて今年度は、限量子を含まない等号付第一階述語論理に、上記の線形時間時相論理に類似した時相演算子を導入し、時間に関する性質の直観的な記述が容易な体系を構築した。この論理について、まず、設計検証に用いる恒真判定問題が決定可能であることを証明し、人手による介入を必要しない自動的な検証システムの構築が可能であることを示した。次にこのアルゴリズムを時間および領域量の点から改良して実装し、その有効性を示した。また。設計検証において基盤技術となっている二分決定グラフについて、OR節点と呼ばれる特殊な節点を導入した場合の、二分決定グラフの表現能力について研究を行った。
日本語諸方言における否定疑問形式の終助詞化に関する記述的研究

本研究は、否定疑問形式に由来する日本語諸方言のモダリティ形式に焦点を当て、各形式の用法を包括的に記述し、それぞれを対照させることで「否定疑問形式の終助詞化」という文法化現象の一類型を提示しようとするものである。そして,方言文法の記述から得られた知見をもとに方言研究と標準語研究との連携を促し,日本語のモダリティ研究に新しい視点を提供することを目的としている。本研究では,大阪方言・鳥取西部方言・宮崎方言を主たる対象とし、否定疑問形式に由来するとされるそれぞれのモダリティ形式の文法的意味に関する記述を試みた。また並行して、否定疑問文やモダリティに関する標準語研究の成果を整理し、〈同意要求〉のモダリティをどのように記述するべきかについて検討した。本研究では対象方言を長野市・大阪市・鳥取県米子市・高知市・宮崎市の各方言としている。これは、否定疑問形式由来のモダリティ形式の存在がすでに指摘されている方言であることによる。本研究では、各地点においてフィールドワークを実施し、それぞれの形式の記述を行う。また平行して、否定疑問文やモダリティに関する標準語研究の成果を整理し、対象方言以外の方言における否定疑問形式のふるまいについても情報収集を行う。初年度の平成21年度は、大阪方言の終助詞コトナイカ・クナイカの意味用法の記述を行った。クナイカについては「関西若年層の用いる同意要求の文末形式クナイについて」と題した論文にまとめ、『日本語の研究』5巻4号に掲載された。次に、大阪方言のコトナイカ・クナイカに関する記述研究を踏まえ、各地方言の記述のための共通調査票〈第一案〉を作成した。その共通調査票を用いて、鳥取県(平成21年12月)および宮崎県(平成22年1月)において予備調査を行い、当該の調査票の有用性を確認した。また同時に、関連する諸形式に関する情報を収集し、それぞれの方言に特化させた調査票の作成を進めた。平成22年度には、この調査表を用いて、鳥取県と宮崎県での臨地調査を行う予定である。本研究は、否定疑問形式に由来する日本語諸方言のモダリディ形式に焦点を当て、各形式の用法を包括的に記述し、それぞれを対照させることで「否定疑問形式の終助詞化」という文法化現象の一類型を提示しようとするものである。本研究では対象を長野市・大阪市・鳥取県米子市・高知市・宮崎市の各方言としている。また並行して、否定疑問文やモダリティに関する標準語研究の成果を整理し、対象方言以外の方言における否定疑問形式のふるまいについても情報収集を行う。平成22年度は、東日本大震災の影響によって、3月に予定していた「専門的知識を持つ協力者との意見交換およびインタビュー調査」を実施することができなかった。当初は、その予定を今年度に繰り下げ、4月から7月のあいだに意見交換とインタビュー調査の場を設けることを計画していたが、震災の影響により先方との調整がつかず、会合そのものをとりやめざるをえなくなった。そのため、4月7月には、とりたて否定疑問形式のもつモーダルな用法についてのデータ収集と分析を行った。その成果の一部を「日本語諸方言における同意要求表現」として音声学会研究例会(6月)のシンポジウムにて報告し、同じようなテーマに関心を持っている研究者との意見交換の場をもつことができた。さらに、高知県をフィールドにとりたて否定疑問形式の持つモーダルな用法を記述するための予備調査を行った。今後は、これらの記述を総合し、否定疑問形式が終助詞化する背景に、とりたて否定疑問形式のモーダル化の存在があるということを明らかにしていく予定である。

4年計画の3年目である平成23年度は、前年度に引き続き、取り立て否定形式の文法化現象と否定疑問形式の終助詞化との関連について考察を行った。また、同意要求表現がもつイントネーションの特異性・普遍性という観点から音声研究者と共同研究を行い、その成果の一部を日本音声学会第323回研究例会のシンポジウム「日本語諸方言における同意要求表現とその音調の諸相」にて発表した(2011年6月、於山梨大学)。年度の後半には、専門的知識をもつ宮崎市方言話者の協力を得て、当該方言の終助詞コッセンの記述を行った。さらに、次年度に向けて、長野市にて終助詞シナイに関する準備調査を行った。本研究は、否定疑問形式に由来する日本語諸方言のモダリティ形式に焦点を当て、各形式の用法を包括的に記述し、それぞれを対照させることで「否定疑問形式の終助詞化」という文法化現象の一類型を提示しようとするものである。本研究では対象を長野市・大阪市・鳥取県米子市・高知市・宮崎市の各方言としている。これは、否定疑問形式由来のモダリティ形式の存在がすでに指摘されている方言であることによる。本研究では、各地点においてフィールドワークを実施し、それぞれの形式の記述を行う。また並行して、否定疑問文やモダリティに関する標準語研究の成果を整理し、対象方言以外の方言における否定疑問形式のふるまいについても情報収集を行う。4年計画の最終年度である平成24年度は、前年度に引き続き、取り立て否定形式の文法化現象と否定疑問形式の終助詞化との関連について考察を行った。そして、否定疑問形式の終助詞化には、それぞれの方言が、取り立て否定形式と単純否定形式の二つの否定形式を備えていることが前提となっている可能性を指摘した。また、取り立て否定疑問形式によって表される複数の用法のうちの、同意要求に特化する形で取り立て否定疑問形式の一部が析出され、終助詞として文法化してゆくという変化のプロセスを導き出した。また、各地方言の文法記述の成果をもとに、現代日本語(標準語)および日本語諸方言の確認要求的表現について研究を進めている他の研究者と共同して、「同意要求」という文法的意味をどう規定するかということについて議論を深め、その成果を学会のパネルセッションで発表した(日本語文法学会第13回大会パネルセッション「確認要求的表現と対照方言学」三宅知宏、松丸真大、高木千恵)。当初の計画では、対象とする五つの方言(長野市・大阪市・鳥取県米子市・高知市・宮崎市)のうち、高知市方言をのぞく4方言については本年度までに臨地調査を終える予定であった。しかしながら、22年度において、雪害・口蹄疫による被害・新燃岳の噴火といった自然災害によってフィールドワークが実施できなかったことが影響し、進行にやや遅れが生じている。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度に当たる本年度は、長野市方言および鳥取県米子市方言のフィールドワークを優先的に実施し、それぞれの方言に否定疑問形式由来の終助詞について、その意味用法の記述を行う。年度の後半には高知市方言についてのフィールドワークを行い、それぞれの記述を対照させることで否定疑問形式の終助詞化プロセスについて考察を行う。
パーキンソン病におけるドーパミン神経細胞特異的な新たな病態発症機構の解明

本研究ではiPS細胞由来ドーパミン神経細胞をGFP標識することによりドーパミン神経特異的なミトコンドリア機能・形態解析を可能にし、パーキンソン病におけるドーパミン神経特異的な変性機序を見出すことを主目的としている。今年度はドーパミン神経細胞特異的にGFPを発現するiPS細胞の樹立を目指した。ドーパミン神経に特徴的なマーカーTyrosine Hydroxylase(TH)遺伝子へGFP遺伝子をCRISPR/Cas9システムによりノックインするため、まずヒトTH遺伝子エクソン12内ターゲット配列を含むsgRNA発現ベクターを作製した。また、切断部位に隣接した相同配列を含むドナーベクターを作製した。作製したこれらのベクターとCas9ベクターを健常者及びPARK2患者iPS細胞へ導入し、薬剤セレクションとPCRを行った結果、標的部位にGFP遺伝子が挿入されたTH-GFP iPS細胞が健常者、患者共に複数クローン得られたことが明らかになった。これらのTH-GFP iPS細胞から分化誘導させたドーパミン神経細胞においてGFPの発現を確認した。さらに、TH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞のTH抗体とGFP抗体による免疫染色の結果、同じパターンの染色像が得られた。これらの結果から、ドーパミン神経細胞特異的にGFPを発現する健常者及びPARK2患者iPS細胞株の獲得に成功したことが確かめられた。今年度の研究により、ドーパミン神経細胞においてGFPを発現するパーキンソン病患者iPS細胞株が得られた。これまでTH遺伝子にレポーターをノックインしたiPS細胞は健常者についてのみ報告されており、患者TH-GFP iPS細胞の樹立については未だ報告がなかった。今後、作製したTH-GFP患者iPS細胞由来ドーパミン神経細胞の光顕電顕相関観察法(CLEM)を用いたミトコンドリア超微形態学的解析を行うことによりパーキンソン病に至る形態的特徴を見出す可能性があり、患者TH-GFP iPS細胞株の獲得は重要な進展であったといえる。また、今回作製したTH-GFP iPS細胞株はドーパミン神経細胞への分化に伴い持続的にGFPを発現するため、iPS細胞からドーパミン神経細胞への分化誘導法の改良等にも有用である。さらに、今回作製したsgRNA発現ベクターやドナーベクターは、他の疾患特異的iPS細胞を用いたTH-GFP iPS細胞株の作製にも応用可能であるため、本研究結果は重要な成果である。今後は、光顕電顕相関観察法(CELM)を用いてTH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞とその他サブタイプの神経細胞との比較解析や健常者と患者間の比較解析を行い、パーキンソン病ドーパミン神経に特徴的なミトコンドリアの超微形態学的変化を明らかにする。今年度は子の出産による産前産後・育児休暇の取得により実験を約11ヶ月間停止した。従って、予定していた新たに購入する消耗品費や学会経費等は未使用となった。

次年度は作製したTH-GFP iPS細胞の評価及びTH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞の形態解析を主に行うため、培養関連試薬や形態解析用試薬のために研究費の大部分を使用する。また、電顕解析用標本作製依頼のための人件費、研究成果を発表するための学会経費や論文投稿費にも使用する。
嗅覚器及び嗅球の神経細胞数のステレオロジーを用いた定量解析

マウスの鼻腔にはGrueneberg ganglion・鋤鼻器(Vomeronasal organ:VNO)・Septal organ・主嗅上皮と4種類の嗅覚器が存在する。その中で主嗅上皮は嗅覚をつかさどる主たる器官である。我々は実験動物としてひろく利用されているC57BL/6Jマウスの一側鼻腔の嗅上皮で、嗅球に投射して機能している嗅神経細胞数は成獣で約500万個であることを明らかにした。またラットにおける一側鼻腔の嗅上皮に存在し、嗅球に投射して機能している嗅神経細胞数は新生児期では約50万個であるのに対し、生後8週の成獣では約2100万個であり2歳齢までほぼ不変であることを明らかにした。マウス主嗅上皮に存在する嗅神経細胞の総数を明らかにすべく、雌雄のC57BL/6Jマウスの成獣(8週齢)の頭蓋骨を鼻腔を含めて採取し、脱灰したのち、100マイクロメートル間隔で10マイクロメートル厚の切片を作成した。切片は成熟し機能している嗅神経細胞に特異的に発現しているOlfactory Marker Protein (OMP)に対する抗体を用いた免疫組織化学法による染色を行った。その後、マウス嗅覚器の中で最も大きい主嗅上皮に存在する嗅神経細胞をStereologyの手法を用いて計測した。その結果、成獣(8週齢)のC57BL/6Jマウスの1側主嗅上皮におけるOMP陽性嗅神経細胞の総数は雄では5,140,000±380,000個、雌では5,210,000±380,000個であることが明らかとなった。また8週齢のC57BL/6Jマウスの主嗅上皮に存在するOMP陽性嗅神経細胞の数は統計学的に性差は認められなかった。これらの結果、マウスの一側主嗅上皮におけるOMP陽性嗅神経細胞の総数が約5,000,000個であることを初めて明らかとした。また硫酸亜鉛(ZnSO4)を用いて嗅上皮を傷害した場合、成獣(アダルト)ラットにおいて、シクロヘキシミドを識別する嗅覚機能を維持するためには約50%(約10,000,000個)のOMP陽性嗅神経細胞が必要であることも明らかとした。これは幼児期に母ラットからの授乳のために必要な嗅覚機能維持のためのOMP陽性嗅神経細胞の比率(約50%)と同じであった。ただ、アダルトラットにおいては現在までの報告と比べ、非常に高いパーセンテージの嗅神経細胞残存が必要であり、におい物質によって嗅覚識別に必要な嗅神経細胞数が異なる可能性を示唆した。神経科学本年度は各種実験動物(齧歯類)の標本作成を主として行っており、ラットにおいては新生児(P0)、4週齢、8週齢、12週齢、6か月齢、1年、2年の標本作成を行った。これらの標本は抗OMP抗体を用いた免疫組織化学法による染色を実施しており、現在Stereologyの手法を用いた計測が進められている。また、今まで遺伝子解析によく用いられていたにもかかわらず主嗅上皮に存在する嗅神経細胞総数の報告がなかったマウス(C57BL/6J)においては8週齢における標本を作製し、主嗅上皮内のOMP陽性嗅神経細胞数の計測をStereologyの手法を用いて行った。その結果、マウスの一側主嗅上皮におけるOMP陽性嗅神経細胞の総数は性差なく、約5,000,000個であることを初めて明らかとすることができた。現在齧歯類における嗅覚器の比較を行うため8週齢のWistarラットの主嗅上皮に存在するOMP陽性嗅神経細胞の総数をStereologyの手法を用いて計測を行っている。また、成長に伴う各種嗅覚器の変化を明らかとするために新生児期(P0)、成獣期から老齢期にかけての各齢のラットにおいてもOMP陽性嗅神経細胞の総数の計測を行う。
膵臓における外分泌および内分泌機序に果す微小循環の役割

平成6年度研究成果:(1)顕微分光装置および循環パラメーターの計測法の確立を、正常血流下のラットの実質臓器(肝臓)および灌流肝を用いて行った。(2)上記研究で確立した方法論を膵臓に用いて、以下の研究成果を得た。1.膵外分泌領域の微小血管(直径約10μm)内の酸素輸送に関する循環パラメーターの測定および酸素放出速度を求めることに初めて成功した。2.膵液分泌量および総蛋白分泌量と微小循環パラメーターとの同時測定により、外分泌機能の亢進と酸素放出速度の増加との関係を定量的に理解し得た。[平成6年度の研究成果はほぼ当初の計画どうり進展した。]平成7年度研究成果:平成7年度の研究においては、膵臓の内分泌機序に果たす微小循環の役割を検討することを目的として研究を進めてきたが、内分泌組織の血管網は外分泌組織のそれと比べ、極めて密であったため、一本一本の微小血管内の循環パラメーターおよび酸素放出速度の測定は技術的に困難であり、断念した。このため、内分泌機能と関連させた外分泌領域の微小血管の循環動態をさらに詳細に検討した。その結果、以下の新しい知見を得た。(1)飽食時と断食時の膵外分泌領域の微小血管からの酸素放出速度には有意な差がみられたが,赤血球速度、ヘモグロビン濃度および酸素飽和度には有意な差はみられなかった。(2)膵臓の解糖系を抑制することにより、膵外分泌の微小血管からの酸素放出速度が有意に低下した。[平成7年度は、先述の理由で途中で研究方針を転換したため、上記(1)、(2)の詳細なメカニズムの検討は今後の研究課題とした。]平成6年度研究成果:(1)顕微分光装置および循環パラメーターの計測法の確立を、正常血流下のラットの実質臓器(肝臓)および灌流肝を用いて行った。](1)顕微分光装置および計測法の確立をラット肝辺縁の微小血管(類洞)および灌流肝を用いて検討した。ラット肝臓で確立した方法論を膵臓に用いて、上記本年度研究テーマについて検討した。その結果、平成6年度はほぼ当初の予定どうり研究が進展し、以下のような研究成果を得た。(1)膵外分泌領域の微小血管(直径10μm以下)内の酸素輸送に関する循環パラメーターの測定に成功した。(1)コントロール時における赤血球速度及び酸素放出速度は、それぞれ約1mm/secおよび2nmol/cm^2/secであり、肝類洞におけるそれらの値より3倍ほど大きかった。(2)一方、セクチレンやアセチルコリンによる外分泌刺激により酸素放出速度は、最大で約2.5倍増加した。(3)またこの時、赤血球速度は0.5倍から2倍まで変化し得、赤血球速度が低下(または増加)する場合は微小血管内のヘマトクリットの増加(または低下)により酸素供給量の調節が行われていることがわかった。(2)膵液分泌量および総蛋白分泌量と微小循環パラメーターとの同時測定により、外分泌機能の亢進と酸素放出速度の増加との関係を定量的に理解し得た。上述のごとく、平成6年度の研究成果はほぼ当初の計画どうり進展した。平成7年度の研究は、本研究成果を基に内分泌機序に果たす微小循環の役割を検討する。

[平成6年度の研究成果はほぼ当初の計画どうり進展した。]平成7年度研究成果:平成7年度の研究においては、膵臓の内分泌機序に果たす微小循環の役割を検討することを目的として研究を進めてきたが、内分泌組織の血管網は外分泌組織のそれと比べ、極めて密であったため、一本一本の微小血管内の循環パラメーターおよび酸素放出速度の測定は技術的に困難であり、断念した。このため、内分泌機能と関連させた外分泌領域の微小血管の循環動態をさらに詳細に検討した。その結果、以下の新しい知見を得た。(1)飽食時と絶食時の膵外分泌領域の微小血管からの酸素放出速度には有意な差がみられたが、赤血球速度、ヘモグロビン濃度および酸素飽和度には有意な差はみられなかった。(2)膵臓の解糖系を抑制することにより、膵外分泌の微小血管からの酸素放出速度が有意に低下した。[平成7年度は、先述の理由で途中で研究方針を転換したため、上記(1)、(2)の詳細なメカニズムの検討は今後の研究課題とした。]
局所的・部分的な特徴の集合を入力とする固有空間ベースのパターン認識機構

コンピュータに画像や音声を認識させるパターン認識や,何らかの課題を自動的に遂行できるように「学習」させる機械学習の研究は急速に進展しており,近年はディジタルカメラの顔認識機能のように広く実用されるようになってきています.本研究課題では,パターン認識と機械学習に関する新しい手法を研究し,それらの手法を用いることで,カメラとコンピュータによる三次元世界の知覚や顔画像からの表情識別の精度を従来より向上させられることを明らかにしました.コンピュータに画像や音声を認識させるパターン認識や,何らかの課題を自動的に遂行できるように「学習」させる機械学習の研究は急速に進展しており,近年はディジタルカメラの顔認識機能のように広く実用されるようになってきています.本研究課題では,パターン認識と機械学習に関する新しい手法を研究し,それらの手法を用いることで,カメラとコンピュータによる三次元世界の知覚や顔画像からの表情識別の精度を従来より向上させられることを明らかにしました.本研究は,人間の視覚系のように柔軟なパターン認識機械の実現を目指し,パターン全体が大きく変動する状況に対応可能なパターン認識(様々な向きの顔画像を受容可能な個人識別,大幅な姿勢変化を許容する人体領域検出など)の手法を開発することが目的である.パターン認識手法としては,ニューラルネットやSupport Vector Machine等を用いる「例題からの学習」アプローチを採用し,多層パーセプトロンの恒等写像学習やカーネル主成分分析等,主成分分析によってデータの特徴をとらえた固有空間を抽出する方法をベースとしている.平成18年度は特に,「頑健な恒等写像学習による三次元形状復元」を主なテーマとして研究を行った.これは,複数の画像の特徴点座標列からカメラの運動と物体の形状を復元するという,コンピュータビジョンにおいて基本的かつ重要な問題である.多層パーセプトロンの恒等写像学習アルゴリズムを修正することでこの問題が解けるようになることを明らかにした.さらに,データに例外値が含まれる場合にも安定した形状復元が可能なアルゴリズムを開発した.これを用いることで,特徴点の追跡を失敗した場合のようにデータ中に大きな誤差が含まれる状況でも,カメラ運動と物体形状を高精度に復元できることを明らかにした.本研究成果については,18年度中に学術雑誌論文(藤木,高橋,栗田,2006)として発表している.本研究は,人間の視覚系のように柔軟なパターン認識機械の実現を目指し,パターン全体が大きく変動する状況に対応可能なパターン認識(様々な向きの顔画像を受容可能な個人識別,大幅な姿勢変化を許容する人体領域検出など)の手法を開発することが目的である.パターン認識手法としては,ニューラルネットやSupport Vector Machine等を用いる「例題からの学習」アプローチを採用し,多層パーセプトロンの恒等写像学習やカーネル主成分分析等,主成分分析によってデータの特徴をとらえた固有空間を抽出する方法をベースとしている.平成19年度は特に,「画像から抽出した特徴量を従来のようにベクトルとして扱うのではなく行列として扱うパターン認識手法」についての研究を行った.例えば,画像の局所特徴としてよく用いられるガボール特徴の場合,画素位置毎に複数種類(方位/スケール)のガボールフィルタを用いて複数の特徴量が取り出される.通常は取り出した特徴量を一列に並べて特徴ベクトルを構成するが,種類毎に列を分ければ(画素数)x(種類数)の行列を構成することができる.このような行列データに対する主成分分析/線形判別分析を考察し,表情識別や歩行者検出への応用を試みた.従来の手法と比較する数値実験を行い,より高い識別率が得られることを明らかにした.また,行列の構成の仕方を変えることで識別率が変化すること,カーネルベースの手法と組み合わせてさらなる性能向上が見込まれることも示した.本研究成果については19年度中に学会発表を行っている.本研究は,人間の視覚系のように柔軟なパターン認識機械の実現を目指し,パターン全体が大きく変動する状況に対応可能なパターン認識(様々な向きの顔画像を受容可能な個人識別,大幅な姿勢変化を許容する人体領域検出など)の手法を開発することが目的である.パターン認識手法としては,ニューラルネットやSupport Vector Machine等を用いる「例題からの学習」アプローチを採用し,多層パーセプトロンの恒等写像学習やカーネル主成分分析等,主成分分析によってデータの特徴をとらえた固有空間を抽出する方法をベースとしている.平成20年度は,前年度に続き「画像から抽出した特徴量を従来のようにベクトルとして扱うのではなく行列として扱うパターン認識手法」についての研究を行った.これは,ガボールフィルタの出力のような局所特徴量をならべた行列を構成し,これを識別器への入力とする手法である.前年度にはこの手法を表情識別と歩行者検出に適用し,高い識別率その他の興味深い結果を得ている.今年度は,動画像中の顔の追跡と顔の向きによらない個人識別への応用を試みた.データの準備のための研究補助者の手配がかなわず計画と経費の使途に軽微な変更は生じたものの,上述のような目的に沿った成果を得つつある.本テーマに関する研究は,本研究課題の研究期間終了後も継続して行なう予定である.
堆積物環境に優占する未培養アーキアの分離培養と生理生態機能の解明

堆積物環境に優占する微生物群について、分離培養・遺伝子解析手法によりその生理機能及び生理学的役割の解明を行っている。今年度は、海成由来堆積物試料を用いて集積培養を行い、目的とする微生物種が優先的に検出される培養物について次の成果を得た。メタゲノム・メタトランスクリプトーム解析により、目的とする微生物種ゲノムの再構築(90%以上のcompleteness)と遺伝子発現レベルの取得に成功した。アノテーション及びパスウェイ解析に基づくと、当該菌種は添加した培養基質の直接的な分解に関わっており、代謝産物が他の菌種に利用されることによって分解経路の促進、ひいては、目的種の増殖促進につながっていることが示唆され、培養実験に基づく結果と調和的であった。また、pangenome解析により、当該分解経路に関与する遺伝子は目的とする系統群に広く分布して存在することが明らかとなり、堆積物環境において重要な役割を持つことが示唆された。また、上記集積培養を行う過程で純粋培養に成功した堆積物環境に広汎に分布する新門の細菌種について、生理学的・形態学的諸性質、及び、ゲノムの特徴を調べた。単糖等を資化する発酵型の従属栄養性で、他の発酵細菌と比較して増殖速度が非常に遅いこと、産生する発酵産物により顕著な増殖阻害が起こること、発酵産物を利用する別種との共生培養により顕著な増殖が促進することなどが明らかとなった。また、電子顕微鏡観察から、他の原核細胞には見られない細胞内に特徴的な構造を有しており、中枢代謝と関係する重要な役割を持つことが推察された。計画通り、堆積物試料から目的とする微生物種にの代謝経路の特定し、生態環境における重要性を示した。また、当初予定していなかった系統的に新規性の高い微生物種を新たに獲得し、その特徴を明らかにした。オミクス解析により推定した代謝経路に基づいて、目的微生物種の分離・培養を引き続き試みる。同時に、トレーサー法等を用いた培養実験により推定経路を検証し、最終的に純粋培養が出来ない場合であっても目的微生物種の生態機能が明らかにし、論文成果として纏める。また、純粋培養した微生物種については、新種としての特徴付けを引き続き行い、論文成果として纏める。海底の堆積物環境に優占する微生物群について、分離培養・遺伝子解析手法によりその生理機能及び生理学的役割の解明を行っている。今年度は、海成由来堆積物試料を採取し、様々な基質を用いて集積培養を行い、下記3つの成果を得た。1)分離の対象としている微生物種について、優占的に検出される培養系の構築に成功した。さらに、物理化学的な培養条件の検討を行い、対象種の優占度を保ったまま、集積培養物に含まれる微生物種の数を削減すること、安定的に継代培養することに成功した。本培養物に含まれる微生物の多様性を16S rRNA遺伝子に基づいて系統解析したところ、対象種以外にFirmicutes門細菌、Spirochaeta門細菌、Methanobacterium属等の水素利用性メタン生成アーキア、Methanosaeta属等の酢酸利用性メタン生成アーキアが検出された。本培養物に含まれる微生物群の代謝機能を解明することを目的としたメタゲノム・メタトランスクリプトームショットガンシーケンスを行った。2)上記の培養の過程で、系統的な新規性の高い微生物種の純粋培養に成功した。生理学的実験の結果、従属栄養細菌であるこの種はメタン生成アーキアやその他の従属栄養細菌と共培養させることで、増殖が大きく促進されることが明らかとなった。16S rRNA遺伝子に基づく系統解析では、本細菌は、主に堆積物環境、それ以外の嫌気環境にも普遍的に検出される系統群に帰属することが明らかとなり、これらの嫌気環境において様々な微生物種との共生が生態学的ニッチを生み出していることが示唆された。計画通り、堆積物試料から目的とする微生物種の安定的かつ優占的に培養できる条件を見いだすことに成功した。1度の培養に時間を要したため、当初予定していたメタゲノム・メタトランスクリプトーム解析は大量データ取得のみに留まったが、その前段階となる集積培養をさらに推し進め、系の微生物群の種数を減らすことで、より効果的なオミクス解析に供することができた。培養実験の過程で、当初予定していなかった、系統的に新規性の高い微生物種の純粋培養に成功したため、その種の生理学的・分類学的実験を進め、分類学的・生態学的な位置づけを行った。

単糖等を資化する発酵型の従属栄養性で、他の発酵細菌と比較して増殖速度が非常に遅いこと、産生する発酵産物により顕著な増殖阻害が起こること、発酵産物を利用する別種との共生培養により顕著な増殖が促進することなどが明らかとなった。また、電子顕微鏡観察から、他の原核細胞には見られない細胞内に特徴的な構造を有しており、中枢代謝と関係する重要な役割を持つことが推察された。計画通り、堆積物試料から目的とする微生物種にの代謝経路の特定し、生態環境における重要性を示した。また、当初予定していなかった系統的に新規性の高い微生物種を新たに獲得し、その特徴を明らかにした。各種バイオインフォマティクス系ソフトウェアを用いて遺伝子リードのアセンブルと、得られたコンティグのビンニングを行い、集積培養系に存在する微生物ドラフトゲノムを再構築する。さらに、アノテーション解析を実施して各ドラフトゲノムに含まれる機能遺伝子から、集積培養系に存在する微生物種の代謝機能の推定し、発現mRNAシーケンスデータから発現遺伝子を特定することで、培養系における微生物種間の関係性(競合あるいは共生関係)を推定する。これらの知見に基づいて、さらなる集積培養、純粋培養を行い、分離・培養を試みる。純粋培養あるいはそれに準ずる培養(例えば、二者共生等)の段階まで成功したら、培養実験に基づく生理学的諸性質並びに分類学的特徴を解明する。オミクス解析により推定した代謝経路に基づいて、目的微生物種の分離・培養を引き続き試みる。同時に、トレーサー法等を用いた培養実験により推定経路を検証し、最終的に純粋培養が出来ない場合であっても目的微生物種の生態機能が明らかにし、論文成果として纏める。また、純粋培養した微生物種については、新種としての特徴付けを引き続き行い、論文成果として纏める。現在までの進捗に示した通り、当初予定していたオミクス解析の一部を次年度以降に行うこととし、その解析に必要な外注分析費が繰り越されたために次年度使用額が生じた。次年度使用額は、計画の内容通り外注分析費のために今年度使用する予定である。当初予定していたオミクス解析の一部を次年度以降に行うこととし、その解析に必要な外注分析費が繰り越されたために次年度使用額が生じた。