hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞外O-GlcNAc修飾のNotchシグナルと血管形成における役割

さらに、EOGTは、シグナルの送り手ではなく、シグナルの受け手の細胞において機能することが明らかになった。また、NOTCH1のO-GlcNAc修飾部位のアラニン置換を行い、NOTCH1上の特定のO-GlcNAc修飾部位が、DLL4によるNOTCH1活性化に関与することが明らかになった。以上の結果より、EOGTによるNOTCH1のO-GlcNAc修飾が、DLL4を介したNOTCH1の活性化に重要な役割を果たすことが明らかになった。Eogt欠損マウスに一部、未実施の実験計画が残っているものの、本筋で、予定された研究結果が得られたため。申請者は、数年前に新規翻訳後修飾として細胞外O-GlcNAc修飾の存在を発見し、EOGTを介した新規のO-GlcNAc修飾機構を解明したが、哺乳動物では、EOGTはNotch受容体を糖修飾するが、生理機能は不明であった。最近、EOGTの遺伝子変異が、四肢末端と頭頂部に異常を伴う病因不明のAdams-Oliver症候群において同定された。本研究では、ヒトの表現型を手がかりにして、EOGT欠損マウスを用いた網膜血管の表現型解析や遺伝学的相互作用解析、そして、レポーターアッセイや相互作用解析などにより、細胞外O-GlcNAc修飾のNotchシグナルと血管形成における生物学的機能を解明することを目的とした。これまでに、細胞外O-GlcNAc修飾の低下に伴うNotchシグナルの異常が血液網膜関門において、血管のintegrityの保持に必要であることが明らかになった。また、分子機構の解析を進め、EOGTを会したNOTCH1の特定のEGFリピートにおけるO-GlcNAc修飾が、DLL4とNOTCH1の相互作用を制御することを明らかにした。さらに、研究を進め、エバンスブルーを用いた灌流実験より、脳血管のintegrityにおいてもEOGTを介したNotchシグナルが重要な役割を果たすことが明らかになった。同様な表現型が、ガンマセクレターゼ阻害剤の投与によっても観察され、Eogt欠損マウスにおいては、ガンマセクレターゼ阻害剤の効果が増強した。これらの結果より、EOGTを介したNotch受容体のO-GlcNAc修飾が血管のバリア機能に重要な役割を果たすことが考えられた。Notch受容体の細胞外領域に存在する上皮成長因子(EGF)様リピートには特徴的な翻訳後修飾が存在している。これまでの研究で、O-フコースとO-グルコースに加えて、O-GlcNAc修飾が存在することを報告した。しかしながら、O-GlcNAc修飾のNotch受容体における役割は不明であった。本研究では、O-GlcNAc修飾に関わる糖転移酵素EOGTの遺伝子欠損マウスを作製し、表現型解析を行なった。その結果、Notch1の特定のEGFドメインのO-GlcNAc修飾が、Delta-like 4リガンドを介したNotch1の活性化を制御することで、網膜の血管形成に関与することが明らかになった。EOGTの血液網膜関門における役割を明らかにしたこと、血管内皮における役割を示唆するデータを得たこと、などの研究成果をもとに、次年度以降の研究の進展が大いに期待できるため。
遺伝的組換えを用いた植物の発生分化解析の分子基盤

植物の形態形成および発生分化のメカニズムのエピジェネティックな現象をも含めた視点で理解を深めることを目指し、その分子基盤を開発することを目的に、既に開発を進めつつあった単子葉モデル植物のイネでの遺伝子ターゲティング法の開発を完成させることおよびイネとマルバアサガオで見出した易変性変異系統の機構を、内在性トランスポゾンに着眼して、解析し、変異の仕組みを明らかにするとともに、タギングに応用できる新規トランスポゾンの発見を試みた。イネターゲティング系では、すでに得られている6系統のWaxy遺伝子破壊系の後代植物について詳細な解析を進め、再現性、精度等を明らかにした。我々のターゲティング系ではWaxy遺伝子座の第一イントロンにEn/Spm型トランスポゾンの転写終止領域とハイグロマイシン耐性(HTP)のマーカー遺伝子をヘテロ型でターゲット挿入している。まず得られた6系統のT1ホモ系統を育成し、アミロース発現によるWaxy表現型を種子と花粉のヨード染色によって確認し、ついで同種子の発芽根を用いてターゲット挿入したハイグロマイシン耐性遺伝子発現の分離を確認した。次に次世代の葉よりDNAを抽出し、Waxy遺伝子の組換え周辺領域約について4種類の制限酵素を用いた詳細なサザン解析とWaxy組換え領域約16kbの全塩基配列の解析を行った。その結果、本ターゲティング法では1塩基の間違いも無く、極めて正確な相同組換えが、再現性良く生じたことが明らかとなった。Waxy遺伝子の発現制御について未熟胚から、mRNAを集めノーザン解析を行ったところ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は検出されたが、Waxyの発現は検出されず、ターゲティングによって転写レベルでのWaxyの発現抑制が確認された。また葉緑体の分化に関する変異イネおよび双子葉のマルバアサガオの種皮の着色に関わる易変性変異系統の解析では、マルバアサガオで、アントシアニン色素合成系を司る転写因子のプロモーター領域に2つの内在性トランスポゾンが挿入されていることを明らかにした。また葉緑体変異イネの解析ではマップベースドクローニングを進めた結果、約100kb近くまで変異領域を絞り込むことができた。
表面張力の温度依存性を利用したマイクロマシン用アクチュエータの開発

本研究は、液体用アクチュエータ、特に液体搬送用マイクロポンプとして、従来ほとんど類をみない作動原理に基づく方式を、似つ流体工学の立場から提案するとともに、その実用化への基礎的な検討を行うものである。すなわち、微小スケールの世界において体積力に比して支配的となる表面力の一つとして、気液界面での表面張力を利用したアクチュエータを対象として研究を行った。表面張力は温度に依存するので、気液界面に沿って温度こう配を付与できれば、液体を駆動することができる。しかし、微小スケールの世界では熱伝導がよいので自在な温度分布を形成するのは、従来行われてきたようなヒーター設備による方法では困難である。そこで温度分布を制御できる熱電素子の導入を試みた。具体的な例としては、2次元チャネルの壁面に、熱電素子と気液界面を形成する空隙とを、周期的に繰り返して配置するような系を考えた。本年度は、過去2年間に行った数値解析の取りまとめを行って、2002年8月に開催される国際伝熱会議での論文として投稿した。幸い、2002年3月に最終審査を通過し、発表の運びとなっている。マイクロポンプの試作については、昨年度に引き続き、熱電半導体としては入手しうる最小の市販熱電モジュールの部品を利用することを考え、一片1mm以下の立方体形の熱電半導体を手作業でアセンブルしなおす技術を確立した。得られた熱伝素子の特性もまずまずであったが、若干のばらつきもあったので、流動実験は、市販の熱電素子を並べた状態で行った。可視化による流れ観察の結果、マランゴニ対流に加え、自然対流も生じたため、両者の渦が対になってローラー上の作用をすることがわかった。この結果、全体的にはポンプ作用が生じなかったが、この点は界面形状を制御することによって克服できる見通しである。焼結段階からの熱電素子の製作は、現在も日本冶金株式会社と共同で進行中である。本研究は、液体用アクチュエータ、特に液体搬送用マイクロポンプとして、従来ほとんど類をみない作動原理に基づく方式を、熱流体工学の立場から提案するとともに、その実用化への基礎的な検討を行ったものである。しかし、微小スケールの世界では熱伝導がよいので自在な温度分布を形成するのは、従来行われてきたようなヒーター設置による方法では困難である。今年度は、まず実験条件の設定等に関して定量的予測を行うため、このような2次元流れに関して、熱電素子内のペルチェ発熱・吸熱やジュ-ル発熱等を考慮することにより、チャネル壁内の温度分布も連成した表面張力対流の数値解析を重点的に行った。これにより、熱電素子の特性、液膜厚さ・熱電素子間隔等の幾何学的因子が、流れ場に及ぼす影響を明らかにすることができ、基礎的特性は把握できた。同時に、熱電素子をマイクロ加工する試み等の実験的検討も行った。

本研究は、液体用アクチュエータ、特に液体搬送用マイクロポンプとして、従来ほとんど類をみない作動原理に基づく方式を、熱流体工学の立場から提案するとともに、その実用化への基礎的な検討を行うものである。すなわち、微小スケールの世界において体積力に比して支配的となる表面力の一つとして、気液界面での表面張力を利用したアクチュエータを対象として研究を行う。表面張力は温度に依存するので、気液界面に沿って温度こう配を付与できれば、液体を駆動することができる。しかし、微小スケールの世界では熱伝導がよいので自在な温度分布を形成するのは、従来行われてきたようなヒーター設置による方法では困難である。そこで温度分布を制御できる熱電素子の導入を試みた。具体的な例としては、2次元チャネルの壁面に、熱電素子と気液界面を形成する空隙とを、周期的に繰り返して配置するような系を考えた。昨年度行った予備的な数値解析の知見に基づき、本年度はマイクロポンプの試作を行った。熱電半導体としては入手しうる最小の市販熱電モジュールの部品を利用することを考え、一片1mm以下の立方体形の熱電半導体を手作業でアセンブルしなおす技術的な検討に重点をおいた。すなわち、P型およびN型半導体のペアを電極にハンダ付けし、リード線を付加し、微小チャネルに直列配置できるような形状に工作するのであるが、このようなスケールにおいては例えばハンダ付け一つをとっても表面張力がマイナスに作用し困難を極めた。試行錯誤の末、専用ジグを開発し、ようやく形状的には当初の目的を達成したが、マランゴニ効果を最大限に引き出す気液界面の形成と実際の液体駆動の点では未達成となった。これらは、次年度の課題である。すなわち、微小スケールの世界において体積力に比して支配的となる表面力の一つとして、気液界面での表面張力を利用したアクチュエータを対象として研究を行った。本年度は、過去2年間に行った数値解析の取りまとめを行って、2002年8月に開催される国際伝熱会議での論文として投稿した。幸い、2002年3月に最終審査を通過し、発表の運びとなっている。マイクロポンプの試作については、昨年度に引き続き、熱電半導体としては入手しうる最小の市販熱電モジュールの部品を利用することを考え、一片1mm以下の立方体形の熱電半導体を手作業でアセンブルしなおす技術を確立した。得られた熱電素子の特性もまずまずであったが、若干のばらつきもあったので、流動実験は、市販の熱電素子を並べた状態で行った。可視化による流れ観察の結果、マランゴニ対流に加え、自然対流も生じたため、両者の渦が対になってローラー状の作用をすることがわかった。この結果、全体的にはポンプ作用が生じなかったが、この点は界面形状を制御することによって克服できる見通しである。焼結段階からの熱電素子の製作は、現在も日本冶金株式会社と共同で進行中である。
ＭＥＭＳを利用した細胞の３次元組織構築

本研究では、マイクロサイズの構造を形成する微細加工技術を利用することによって、細胞レベルのプレートを作製し、その上に接着細胞を播種し、培養した。このマイクロプレートをハンドリングすることにより、接着細胞を3次元的に操作した。具体的には、マイクロプレートにヒンジをつけることにより、細胞による折り紙を行い、3次元構造を構築した。また、マイクロプレート内に磁場応答性の合金であるパーマロイを導入することで非接触に細胞を3次元的に操作し、細胞表面で起こる現象を高分解能観察することに成功した。これらの成果は細胞の3次元組織の構築や細胞間の情報伝達解析や細胞の高分解能観察の発展に貢献すると期待される。(A)細胞の足場のためのマイクロ構造折り畳み技術の確立細胞の足場として機能するマイクロプレートの2次元平面展開図上に、折り畳み機構をデザインすることにより、様々な形状の細胞の立体構造を構築する手法を確立した。具体的には、MEMS技術により作製したマイクロプレート上に細胞を培養し、隣接したプレートにまたがって細胞が増殖すると細胞の牽引力によってこの2つのプレートの一方が引き寄せられ立ち上がることがわかった。この原理を利用して、正十二面体などの多面体の展開図にあたるパターンのマイクロプレートを作製し、細胞培養後にそれらの牽引力によて望み通りの多面体構造をした細胞組織を作製することに成功した。(B)マイクロプレートとして用いる足場材料の探索と表面処理法の確立次に、マイクロプレートとして用いる足場材料を検討し、表面処理を施すことで、立体構造形成中に細胞がマイクロプレートからはがれることなく立体構造を構築できる技術を確立した。具体的には、これまで使用してきたパリレンにフィブロネクチンをコートすることで、細胞とプレートの密着性を向上させた。また、細胞の牽引力が弱いHepG2細胞は、単独ではプレートを折り畳めず、立体構造ができないが、3T3細胞と組み合わせることで立体構造を作製することができた。(C)作製された3次元細胞組織の機能解析を行う作製された3次元細胞組織の機能解析として、細胞の3次元細胞組織を構築後に細胞の生死検証を行い、立体構造構築の一連の行程が細胞に影響ないことを明らかにした。平成24年度は(1)パリレン上での細胞のパターン、(2)細胞を播種したマイクロプレートの駆動力の組み込みを行った。パリレン上での細胞のパターンについては、PDMSを用いてマイクロプレート上にてフィブロネクチンのパターンを作ることにより、接着した細胞の配向を任意に決定することに成功した。また、折りたたむ前に異種細胞を添加することで二種類の細胞からなる三次元構造の構築に成功した。マイクロプレートの駆動力については、磁場応答性を示す、鉄・ニッケル合金(パーマロイ)を組み込んだマイクロプレートの作製に成功した。これにより磁場を外部からかけることでマイクロプレートの位置、および向きを制御することができるようになった。この技術を利用することで、共焦点顕微鏡で観察を行いながら細胞ののったマイクロプレートの角度を制御することに成功した。共焦点顕微鏡は三次元的に観察することができる顕微鏡であるが、XY軸方向に比べて、Z軸方向では分解能の低い観察しかできなかった。本研究で開発した磁場応答性マイクロプレートを使うことにより、観察中の細胞の角度が変えられるため、細胞をどの方向からも高分解能で観察することができるようになった。また、細胞牽引力をマイクロプレートの駆動力として用いた場合でも、マイクロプレートのデザインをかえることで、従来では谷折りの方向でしかマイクロプレートの折り畳みができなかったものを、山折で折りたたむことにも成功した。これにより、これまで以上に複雑な三次元構造をマイクロプレート技術によって構築することが可能になった。また、細胞の牽引力を駆動力としてマイクロプレートを折り畳み、三次元構造を作製する細胞折紙技術について論文としてまとめ、PLOS ONEに掲載された。平成25年度は、(1)磁場応答性プレートによる細胞表面における寄生虫の挙動解析、(2)マイクロプレートによる神経細胞回路構築と計測基盤構築、(3)バクテリアセルロースによるマイクロプレート構築、(4)パリレン上での温度応答性樹脂積層の条件検討を行った。(1)磁場応答性プレートを利用した細胞表面における寄生虫の挙動解析は、鉄、ニッケル合金であるパーマロイを組み込んだマイクロプレート上に細胞を播種し、外部磁場をかけることで角度を制御し、共焦点顕微鏡によって観察を行った。従来の共焦点顕微鏡観察では、XY軸方向の分解能は高いが、Z軸方向の分解能は低い。本マイクロプレートを用いることで、Z軸方向についても高い分解能での観察ができるため、宿主細胞表面における寄生虫の挙動を観察することができた。本解析結果は論文にまとめ、Advanced Materials誌に報告した。(2)マイクロプレートによる神経回路の構築においては、デザインしたマイクロプレート上に神経細胞の培養細胞であるPC12を播種した。また、細胞が播種されたマイクロプレートをマイクロピンセットでハンドリングすることに成功した。さらに、これを解析するため、金電極をパターンした基盤を構築した。(3)また、パリレンのかわりにバクテリアセルロースをマイクロプレートの素材として利用することにも成功した。(4)パリレン上に温度応答性時樹脂を積層した。本研究は、A03班大和グループと共同で行った。当初、温度応答性樹脂を積層した際、パリレンが基盤より剥がれたが、パリレン蒸着の条件を最適化することで、パリレン上への温度応答性ポリマーの積層に成功した。また、細胞の接着・解離に最適な樹脂濃度の検討も行った。また、本年度はマイクロプレートのハンドリングに関して、論文にまとめて、Small誌に発表した。

平成26年度は、(1)人工的な神経ネットワーク構築のため、マイクロプレート上でのプライマリーセルの培養と(2)本領域のタスクフォース研究である医療応用が可能なデバイスの開発の二つを実施した。(1)の人工的な神経ネットワーク構築については、プライマリーセルをマイクロプレート上で培養することに成功した。当グループではこれまで、マイクロプレート上に神経様細胞であるPC12を任意の形状で培養し、ハンドリングする技術を確立していた。機能をもつ神経ネットワークを構築するためには、神経細胞のプライマリーセルを用いてネットワークを構築する必要がある。平成26年度は、ラットの海馬由来から神経細胞を単離し、マイクロプレート上で培養する条件を検討した。これにより、マイクロプレート上で神経細胞のプライマリーセルを培養することに成功した。また、免疫染色により、マイクロプレートの形状に基づいて、神経細胞が軸索と樹状突起に分化したことが示唆された。(2)のタスクフォース研究については、複雑な形状の壁面に細胞シートを転写を目的としたデバイスの開発を行った。重篤な中耳手術の際、患部は耳介の後部に穴をあけて手術される。この後部にあけられた人工的な穴は中耳の環境を損なうため、中耳炎の再発を引き起こす。切削穴の表面に粘膜細胞由来の細胞シートを移植することで、再発が防がれるが、穴の形状が複雑であるため、移植が難しかった。そこで、当グループは、3Dプリンターを用いて型をつくり、エラストマーの一種であるEcoFlexをかためることで、穴の壁面にシートを転写することができるデバイスを開発した。プラスチックチューブと牛乳膜をモデルとして転写実験を行ったところ、容易にチューブ内壁に牛乳膜を転写することに成功した。これまでマイクロピンセットによるハンドリングや細胞牽引力を利用した三次元折り畳みにより、マイクロプレートを用いて形態的な組織構築に成功している。さらに、形成した組織に機能を付加するためには、構築した各細胞の機能が発現する必要がある。これまで利用してきた培養細胞と異なり、神経細胞のプライマリーセルは機能をもつ軸索と樹状突起を有しており、構築した組織に機能を付加することに適している。まだ、構築した組織における機能を確認できていないが、マイクロプレート上での培養、およびマイクロプレートの形に応じた樹状突起と軸索の分化は成功しているため、研究は順調に進展しているといえる。タスクフォース研究については、当初計画にない研究であり、平成26年度の11月に実施が決定した。細胞シートを用いた実験には至っていないものの、デバイスの設計は完了しており、また、牛乳膜を細胞シートのモデルとして、また、プラスチックチューブを中耳手術時にあける人工的な切削穴のモデルとした実験では、牛乳膜の転写に成功している。
機能的神経回路を同定するための新技術の開発

脳神経系における神経ネットワークを解析するための技術開発を目的とし、神経ウイルスの長所を取り入れた新規の神経回路トレサ遺伝子の創製を試みた。神経ウイルスの構造蛋白質とGFPレポーターとの融合蛋白質を作製し、その挙動を詳細に調べた結果、一部のGFPレポーター融合蛋白質は元の神経ウイルスと似た挙動を示した。しかし、神経回路トレーサーとして実用化するためには、検出感度の点で更なる改良が必要と考えられた。中枢神経系におけるニューロン間の複雑なネットワークを明らかにするための手段としては、「経シナプストレーサー」を用いる方法が最もシンプルかつ簡便であると考えられる。従来から用いられているトレーサー遺伝子として、小麦麦芽レクチンや破傷風毒素Cフラグメントの遺伝子がある。これらは特定のニューロンや特定の神経領域特異的なプロモーターと組み合わせて利用できるという長所を持つが、シナプスを介した伝播効率は非常に低い。一方、狂犬病ウイルスやヘルペスウイルスを利用した組換えウイルスベクターは、高感度で神経回路網を明らかにするためのツールとして注目されている。しかしながら、毒性を弱めた変異株をベースにした組換えウイルスが用いられているとはいえ、安全性には十分な注意を払う必要があり、誰でも気軽に使えるツールとは言い難い。そこで本研究では、マウス遺伝学との組み合わせが可能であるという既存の経シナプストレーサー遺伝子の長所と、効率よくシナプスを介して伝播するという狂犬病ウイルスやヘルペスウイルス等の神経ウイルスの長所を組み合わせ、新規の神経回路トレーサー遺伝子の創製を試みた。具体的には、シナプスを介してニューロン間を伝搬する性質を示す様々なウイルスの構造蛋白質と、GFPレポーターとの融合蛋白質遺伝子を作製した。これらを網膜のニューロン特異的プロモーターにつないだ発現ベクターを構築し、マウス網膜内に導入した後、GFP融合蛋白質の挙動を詳細に調べた。一部のGFPレポーター融合蛋白質は元のウイルスと似た挙動を示したが、検出感度の点で課題を残した。実用化するためには、更なる改良が必要と考えられる。ニューロン間の複雑なネットワークを明らかにするための手段としては「経シナプストレーサー」を用いる方法が最もシンプルかつ簡便であると考えられる。しかしながら、神経組織へのウイルス注射という操作が伴うため、目的のニューロンのみにウイルスを感染させることが困難であるという弱点を持つ。また、毒性を弱めた変異株をベースにした組換えウイルスが用いられているとはいえ、安全性には十分な注意を払う必要がある。そこで本研究では、マウス遺伝学との組み合わせが可能であるという既存の経シナプストレーサー遺伝子の長所と、効率よくシナプスを介して伝播するという狂犬病ウイルスやヘルペスウイルス等の神経ウイルスの長所を組み合わせ、新規の神経回路トレーサー遺伝子の創製を計画した。初年度にあたる平成23年度は、狂犬病ウイルスを始めとするシナプスを介してニューロン間を伝搬する性質を示す幾つかのウイルスの遺伝子を入手した。これらを基にしてウイルスのエンベロープ蛋白質遺伝子をPCR法によって増幅し、レポーター遺伝子との融合蛋白質を作製した。これらを網膜の視細胞特異的プロモーター、双極細胞特異的プロモーター、およびアマクリン細胞特異的プロモーターにつないだコンストラクトを構築した。当初の計画では、入手困難なウイルスを含む様々なウイルスの遺伝子を、企業のDNA受託全合成サービスを利用して作製していく予定であった。しかし、実際の研究費の交付額が希望額よりも少なかったため、比較的高価なDNAの受託全合成サービスを全面的に利用する計画の変更を迫られた。ウイルスDNAを研究者から入手し、それを鋳型にしてPCR法で増幅する事で、ある程度の目的を達する事は出来たが、当初の予想以上に時間を要してしまった。平成23年度は、前年度に作製したDNAコンストラクトをマウス網膜に導入し、融合蛋白質が「経シナプストレーサー」として機能するか否かを詳細に検討する。具体的には、生後間もないマウスの網膜にin vivoエレクトロポレーション法で導入し、細胞分化が完了する生後2週間目以降に網膜を摘出して組織切片を解析する。効率よくニューロン間を伝播する融合蛋白質が見つかれば、ウイルスのエンベロープ蛋白質の様々な欠失変異体とレポーター遺伝子との融合蛋白質を作製し、ニューロン間の輸送に必要な最小ドメインを決定する。また、マウス胎児の脳にもin vivoエレクトロポレーション法で作製したDNAコンストラクトを導入し、脳においても経シナプストレーサーとして機能するか否かを検討する。それと並行して、当初の計画では候補に含めていなかったGroup Vに属するネガティブ一本鎖RNAウイルスの幾つかについて、エンベロープの遺伝子の単離あるいは人工遺伝子合成を行う。平成24年度は、マウスの購入・維持費、ならびに、免疫組織染色用の抗体の購入用に主に研究費を使う予定である。
交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索ガイダンスの分子機構

本研究では、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索ガイダンスを制御している分子機構の解明を目指している。今回の研究成果として我々は、交連ニューロンのサブタイプレベルでの研究を推進する上で戦略的に中核となるマウスのin vivoでの遺伝子導入技術を確立させ、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索ガイダンスを担っている可能性がある転写調節因子を複数見出した。さらに、これらの転写調節因子がサブタイプ特異的な軸索ガイダンスを制御しているかどうかを今回確立した実験システムにより検討した。本研究課題では、中枢神経系における神経回路網形成機構の理解に関して、先導的な役割を果たしているモデルの一つの正中交差を形成する哺乳類(マウス)交連ニューロンの系に着目し、そのサブタイプの個性決定化プログラムを転写調節因子の発現レベルにおいてまず同定し、そのプログラムによって連動して制御されていると考えられている軸索ガイダンスプログラムの同定を最終的な目的としている。本年度は、交付申請書に記載した研究実施計画を念頭に以下の研究を集中的に押し進めた。すなわち、後脳および中脳における正中部フロアプレートを越えて伸長した後の交連ニューロン軸索のサブタイプに固有の伸長パターンを網羅的、かつ系統的に把握し、個々のサブタイプに特有の軸索投射の表現型を詳細に解析した。具体的には以下のような成果が得られた。以前の申請者らの研究において、ラット胎仔の中脳ならびに後脳における交連ニューロンのフロアプレートへの軸索伸長時期は調べられているので、それをベースに今回マウス胎仔において正中部フロアプレート通過後の軸索の挙動を脂溶性の蛍光色素トレーサーとして知られるDiIを用いて可視化し、軸索投射パターンを網羅的に把握した。また神経細胞の細胞体から軸索先端までの軸索投射パターンをより明確にするために、マウス胎仔へのエレクトロポレーション法によりEGFP, EYFP, DsRedの蛍光タンパク質(レポータータンパク質)を含む発現ベクターを中脳ならびに後脳の交連ニューロンに導入する技術の確立に努めた。今回、エレクトロポレーションに関連した様々な実験上のパラメーターを詳細に検討することで中脳、後脳の交連ニューロンの軸索の挙動の詳細な解析を可能とさせるシステムの構築に成功した。このシステムを用いることで、より詳細な軸索投射パターンの基礎データを得るに至った。本研究課題では、神経管の背側に位置する主要な神経細胞群として知られる交連ニューロン(正中交差性ニューロン)の分化発生過程に着目し、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索ガイダンスの分子機構を、交連ニューロンサブタイプの運命決定という観点から迫ることで、運命決定化プログラムに連動して制御されているその下流の軸索ガイダンス関連分子の同定を目指している。特に、交連ニューロンのサブタイプ固有の軸索投射パターンは正中交差後に現れてくることから、昨年度の研究では正中部のフロアプレートを越えて伸長した後の軸索伸長パターンの把握に重点を置き、まずマウス胎仔の交連ニューロンへの遺伝子導入技術(エレクトロポレーション法による蛍光蛋白質等の発現ベクターの導入)を確立させた。さらに本年度は軸索伸長パターンの詳細な解析と交連ニューロンサブタイプの運命決定に関わっている可能性のある候補転写調節因子群に対する抗体を用いた免疫染色の結果解析を共焦点レーザー顕微鏡によっても行い、交連ニューロンサブタイプの軸索伸長パターンと個々の交連ニューロンサブタイプの細胞体の位置との相関を調べた。現在、次のステップとして交連ニューロンへのエレクトロポレーションによる遺伝子導入技術を用いて、交連ニューロンサブタイプの運命決定に関わっていると考えられる候補転写調節因子を様々な交連ニューロンのサブタイプに異所的に導入し、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索投射パターン形成に候補分子群が関わっているかどうかを調べている。また、転写調節因子による運命決定過程では同時に発現している複数の転写調節因子の組み合わせが個性の多様化に貢献していることから、複数の候補分子の組み合わせ発現をも考慮した遺伝子導入の実験も同時に行い、正中交差後の交連ニューロンの軸索伸長パターンに与える影響を解析している。本研究課題では、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索ガイダンスの分子機構を、交連ニューロンのサブタイプレベルでの運命決定(特異的な転写調節因子による神経細胞の個性発現)という観点から迫ることで、サブタイプ特異的な軸索ガイダンスプログラムの同定を目指している。昨年度までの研究において、マウス胎仔の脊髄から中脳における交連ニューロンの軸索伸長パターンを詳細に把握し、それらの交連ニューロン(サブタイプ)における転写調節因子群の発現パターンを解析し、交連ニューロンのサブタイプの個性決定に関わっている可能性がある候補分子をリストアップした。本年度は、候補分子の中でも転写調節因子Otx2に着目し、Otx2が交連ニューロンのサブタイプ固有の軸索投射パターン形成に関わっているかどうかを検討した。そのために、Otx2と軸索の挙動をモニターするための蛍光レポータータンパク質が共発現するように設計されたIRESバイシストロン性発現ベクターを構築した。

この発現ベクターを、本来Otx2を発現しない交連ニューロンのサブタイプに遺伝子導入し、サブタイプ特異的な軸索伸長パターンが形成されるかどうかを調べた。また、この遺伝子導入技術は昨年度までの研究成果として既に確立させているマウス胎仔へのin vivoエレクトロポレーション法に従い行った。遺伝子導入後の交連ニューロンの軸索の挙動は、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて解析した。その結果、Otx2の異所的な発現ならびにその単独の作用では、サブタイプ特異的な軸索伸長パターンが引き起こされないことが示唆された。転写調節因子による個性決定過程では複数の特異的な転写調節因子の組み合わせ(共同作用)が個性決定に貢献していることが知られていることから、現在さらに、複数の候補分子の組み合わせ発現をも考慮した遺伝子導入の実験を行い、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索伸長パターン形成への寄与を検討している。
新たなキラーT細胞標的分子「リポペプチド」に着目した、ヒトエイズ制御の新戦略

サルエイズモデルにおいて、サル免疫不全ウイルスが産生するリポペプチドを標的としたキラーT細胞の免疫応答が誘導され、感染制御に働くことが示されつつある。一方、ヒトにおけるリポペプチド特異的T細胞応答の存在や意義は不明であった。本研究において、ヒト免疫不全ウイルス感染患者末梢血中には、リポペプチド特異的T細胞が存在し、感染防御因子のひとつであるインターフェロンガンマを産生することを初めて明らかにした。サルエイズモデルを用いたこれまでの研究から、ミリスチン酸付加Nefペプチド(リポペプチド)に対するキラーT細胞応答の存在が明らかとなったが、ヒトにおける同様の応答は不明であった。そこで本研究において、ヒト免疫不全ウイルス感染患者より提供を受けた末梢血を用い、ヒト免疫不全ウイルス由来のNefリポペプチドに対するT細胞応答の検証を行った。まず8名の患者より末梢血単核球を得、合成Nefリポペプチド存在下あるいは非存在下でインターフェロンガンマエリスポット法を行った。その結果、1名の患者の末梢血においてNefリポペプチドを特異的に認識し、インターフェロンガンマを産生するT細胞の存在を確認した。一方、末梢血単核球全体を用いたこの方法では、充分な抗原提示細胞の供給ができていない可能性を考え、患者よりまず単球由来樹状細胞を誘導し、これを抗原提示細胞として用いたインターフェロンガンマエリスポット法に切り替えた。10名の患者より得た末梢血リンパ球を応答細胞として用いたところ、1名において、合成Nefリポペプチドに対して特異的に反応しインターフェロンガンマを産生するT細胞の存在が明らかになった。このT細胞はフリーフォームのペプチドやミリスチン酸には反応を示さなかったことから、両者が共有結合したリポペプチドを認識すると結論づけた。そこで、この患者より得た末梢血T細胞を樹状細胞の存在下で複数回抗原刺激を行い、特異的T細胞の株化を試みた。その結果、Nefリポペプチドに対する抗原特異性を示すCD8陽性T細胞株の樹立に成功した。以上の結果から、サルエイズモデルで検出されたのと同様のリポペプチド特異的T細胞応答が、ヒトにおいても存在することが明らかとなった。
ポップス(音楽)から探る国民性〜日独比較

前年度、日本とドイツにおいてポップス(音楽)に関するアンケート調査を実施した。これは第二次世界大戦の敗戦後、似たような復興の経過を辿ってきた日本とドイツにおける平均的国民感情を探ることを目的としたものであった。今年度は、そのアンケートの中で回答の多かった楽曲を集計し、主に歌詞の分析と流行時の時代背景を探ることにより、「ドイツ・ポップス研究」として研究成果をまとめた。(11.研究発表〔雑誌論文〕の項を参照。)これは、通常のアンケート集計・分析のように図表やグラフにまとめるのではなく、回答に多く挙げられた曲や歌手(グループ)について歌詞を分析したり、歌手の経歴等を照射する個別的手法を取った。全体の構成は往年の大ヒット曲とそれに見られる普遍性、人生に慰めや勇気を与えてくれる曲、そしてそれ以外で欠かすことのできない曲とに分けて、それぞれ主としてその歌詞をできるだけ詳しく紹介しつつ、ドイツにおける現在にいたる音楽傾向、及びポップスの今後の可能性について言及した。その際、特にその歌詞について、日本人が受けとめる場合のドイツ人との感覚のずれなどに注目したものである。ドイツ渡航は、ドイツのアンケート回答の中で不明な点を探るため、また必要の生じた資料収集のためのものである。デュッセルドルフでは市立図書館等で資料(特に音源)を収集した。書籍、音源(CD等)も購入することができた。さらに当地滞在中、約100km北にあるグローナウにロックンポップ・ミュージアムという施設があることを知り、そこを訪れ、見学および貴重な資料を収集することができた。ニュルンベルクではエアランゲン・ニュルンベルク大学の日本語学科の山中教授に面会し、歌詞内容やその時代背景についての不明部分を確認した。こうして収集した資料や情報は、今後この研究を継続していく上で極めて有益なものといえる。第二次世界大戦で壊滅的打撃を受けた後、似たような復興の過程を辿ってきた日本とドイツにおける平均的国民感情を探るため、両国でポップス(音楽)に関するアンケート調査を行った。当初、日本は東京と宇都宮、ドイツではベルリンとデュッセルドルフという、それぞれ大都市と中都市を選びそこで実施する予定であった。しかし、アンケートを作成する過程で、都市の規模によってそれほど回答内容に影響が出るとは思えないと判断し、日本ではもっぱら宇都宮市で、ドイツはニュルンベルク、デュッセルドルフにおいて実施した。また、調査対象について男女、年齢層とも均等に回収することを理想としていたが、これもそう簡単には行かず、特に年齢層の方は偏りが出てしまったことは反省点のひとつである。しかしながら、本研究では性別や世代等をもれなく均等に回収し、平均的データを導き出すことが主眼ではなく、むしろ回答された曲を個別に当たり、特にその歌詞をその当時の時代背景なども加味して分析することに重きを置いているので、回収データの偏りは重大な問題点ではないと判断している。それ以上に注目に値するのは、日本でもドイツでも世代ごとに支持される曲があると同時に、世代を越えて、いわば「歌い継がれていく」曲があるということである。初年度である平成19年度ではまだ分析には至らないが、次年度の課題としては、世代によって支持される歌の内容を吟味しながら、それがヒットしたその当時の時代背景と比較すること、さらに両国の間に何らかの共通点が見出されるのか、あるいはどのような相違点があるのか、そして世代を越えて支持される歌をいくつか選び出し、その歌詞内容の分析からいかなる国民性の特徴が浮かび上がるのかを探ることである。
治療耐性・癌幹細胞克服に向けた消化管癌の新規診断・治療標的の包括的同定と展開

治療耐性・癌幹細胞に関連する消化管癌の新規診断標的について、CAST法による網羅的遺伝子解析から、TM9SF3, ZDHHC14, FKTN, PCDHB9, BST2等を同定し、機能解析にから治療標的になり得ることを明らかにした。胃癌の癌幹細胞マーカーの内、ALDH1が未分化型胃癌の転移に重要である可能性を指摘した。癌の不均一性によってもたらされる治療抵抗性に関わる新たな標的が同定され、その克服と診断・治療への応用に大きく貢献するものと今後の展開が期待される。本年度は,消化管癌の治療耐性・癌幹細胞克服に向けた新規標的分子を同定し、機能を明らかにする目的で以下のとおり研究を実施した。1)CAST法による消化管癌特異的膜蛋白・分泌蛋白コード遺伝子の発現と機能解析スキルス胃癌組織およびスキルス胃癌細胞株(HSC-44PEと44As3(HSC-44PE由来高腹膜転移株)についてそれぞれ1632、1152、1152クローンを解析した。両者の比較および正常組織との比較から,TMgSF3、ZDHHC14等をリストアップした。ZDHHCI4は44As3で高発現しており、siRNAによるノックダウンで細胞の浸潤、運動、接着が抑制された。同時に、インテグリンα5β1およびMT4-MMPの発現が抑制された。臨床検体では、ZDHHC14の発現とステージの進行に有意な相関が見いだされた。TMgSF3は胃癌の約20%で過剰発現しており、ふたつの異なるコホートにおいてTMgSF3の高発現は低分化非充実型胃癌患者の予後と有意に相関していた。さらに機能解析によって、細胞の浸潤に関わることが明らかとなった。2)胃癌における癌幹細胞の解析胃癌症例について、癌幹細胞のマーカーであるALDH1、CD44、CD133の発現を検討した。それぞれ、55%、62%、9%の症例で発現が確認され、いずれもステージの進行と相関していた。多変量解析によってCD44とCD133はどちらも独立した予後因子であることが明らかとなった。さらに、これらのマーカーの発現を胃癌原発巣と転移巣で比較検討したところ、ALDH1の発現に関し分化型では差は認められなかったものの、未分化型胃癌においては、原発巣では43%に発現が認められたのに対し、転移巣では75%に発現しており、両者に有意差が認められた。1)CAST法で同定した分泌蛋白コード遺伝子FKTNの発現・機能解析胃癌細胞株(MKN-1、HSC57)に対するCAST法による癌特異的分泌蛋白コード遺伝子の発現解析から、両細胞株に共通して高発現する遺伝子として、FKTNを同定した。FKTNはfukutin蛋白をコードしており、福山型先天性筋ジストロフィーの原因遺伝子である。fukutinはシグナルシークエンスを有し、分泌蛋白質であり、細胞ではゴルジに局在する。FKTN・fukutinの過剰発現は、定量的RT-PCRでは32%(9/28)、免疫染色では43%(297/695)の胃癌で認められ、fukutin陽性例は、高分化腺癌に多く、深達度、リンパ節転移と有意な相関が認められた。さらに胃癌細胞株を用いたFKTNノックダウン系による機能解析において、浸潤能には影響はなかったが、細胞増殖が有意に抑制された。胃癌の新しい診断・治療標的である可能性が示された。2)抗癌剤耐性癌細胞株に対するCAST法による網羅的遺伝子の発現解析消化管癌の標準的抗癌剤である5-FUに対する耐性獲得とその克服にむけて、胃癌細胞株(MKN-45, MKN-74およびKATO-IIIの親株とそれぞれの5-FU耐性株)を対象とし、CAST法による網羅的膜蛋白・分泌蛋白コード遺伝子の解析を開始した。MKN-74に関しては数100クローンのシークエンスを終了しており、親株と耐性株で発現レベルの異なる複数の遺伝子を同定した。1)CAST法で同定した膜蛋白コード遺伝子FKTNの発現・機能解析胃癌細胞株(MKN-1、MKN-28)に対するCAST法による癌特異的膜蛋白コード遺伝子解析および種々の癌組織と正常組織におけるqRT-PCR解析により、癌にほぼ特異的に発現する遺伝子としてPCDHB9 (Protocadherin beta-9)を同定した。PCDHB9は、カルシウム依存性細胞接着分子である。PCDHB9は、胃癌・食道癌では過剰発現するが、種々の正常臓器では発現が殆ど見られなかった。

臨床症例におけるPCDHB9の発現は癌の進行と相関し、PCDHB9陽性例は陰性例に比較して有意に予後不良であった。細胞株を用いた機能解析により、PCDHB9は癌細胞の浸潤・運動・接着に関与することを見いだした。消化管癌の新しい診断・治療標的である可能性が示された。2)抗癌剤耐性癌細胞株に対するCAST法による網羅的遺伝子の発現解析胃癌細胞株MKN-74(親株と消化管癌の標準的抗癌剤5-FU耐性株)を対象としたCAST法により、親株で過剰発現し、5-FU耐性株では発現が低下する遺伝子としてBST2 (Bone marrow stem cell antigen 2)を同定した。胃癌の約30%で過剰発現し、がんの進行と相関することを見いだした。一方、細胞生物学的検討により、BST2はEGFR/ERKを介して癌細胞の増殖・浸潤に関与するとともに、siRNAによるノックダウンで5-FU耐性が惹起されることを明らかにした。さらに、臨床検体を用いた検討で、術後S-1/5-FU療法が施行された症例では、BST2低下例が予後不良の傾向にあった。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の計画通り、スキルス胃癌細胞株のCAST解析を行ない、診断治療標的の候補となる遺伝子群を同定した。研究実績の概要に示したように、その一部については様々な細胞生物学的機能解析を行なった。また、癌幹細胞の局在については、数種類の癌幹細胞マーカーを用いて、癌原発巣と転移巣における解析を行なった。本年度の計画通り、胃癌細胞株のCAST解析から抽出した診断治療標的の候補遺伝子群について癌細胞、正常細胞・組織および胃癌臨床検体について発現特異性の検証を行なった。その中でFKTN/fukutinについては、研究概要に示したように様々な細胞生物学的機能解析を行なった。さらに、抗癌剤耐性の克服に向けた研究として、消化管癌の標準的抗癌剤である5-FUの注目し、胃癌細胞株3株の親株とそれぞれの5-FU耐性株を材料に、CAST法による網羅的膜蛋白・分泌蛋白コード遺伝子の解析を開始した。当初の計画に従って研究を推進する予定である。但し、癌幹細胞の特性の解析に関しては、セルソーターでSP細胞と非SP細胞に分離することに加え、活性酸素種の異常細胞についてもマイクロアレイ解析を含む遺伝子発現解析を行なうこととした。技術的、設備的には問題なく遂行することができる。研究計画に従って実験を推進する予定である。さらに、抗癌剤耐性の克服に向けた研究として、消化管癌の標準的抗癌剤である5-FUの注目し、胃癌細胞株3株の親株とそれぞれの5-FU耐性株を材料に、CAST法による網羅的膜蛋白・分泌蛋白コード遺伝子の網羅的発現解析とそこから同定される新規抗癌剤耐性関連遺伝子の機能解析ならびに臨床病理学的解析を行なうこととした。CAST法による網羅的遺伝子発現解析において、クローン解析時に一定の割合でロスがおこるため、それを含めた使用計画としていたが、ロスを押さえる方法が分かったために、効率よく研究が実施でき、当該助成金が生じた。翌年度には、これを加えて、追加する活性酸素種異常細胞の解析に充てる計画である。
脳腫瘍における腫瘍抑制遺伝子のstop codon assay法の確立とその応用

本申請では脳腫瘍で変異を起こしている遺伝子種を特定し,それらを酵母内で対象遺伝子のstop codonを簡便に判定する新たな手法(stop codon assay)の開発とその応用についての研究計画を提唱した.本研究の結果以下に示すような成果を得た.1)膠芽腫細胞ではp53,PTEN,p16,p14ARFの変異が複数組み合わされて,変異または欠失していることを明らかにした(Brain Pathol,1999)2)特にp53変異は良性星細胞腫から膠芽腫への悪性化進展に重要なこと(Oncogene,1999),また特に優性阻害効果のある変異は,膠芽腫の発症を早めることを示した(Cancer Res,1999).3)p53のホモログであるp73のC-末端の機能を明らかにし,p73の酵母アッセイを確立し,脳腫瘍での変異を検討したが,変異はなかった(Cancer Res,1999;Brain Pathol 11:296-305,2001).5)APC遺伝子のstop codon assayを開発し,脳腫瘍に応用したが,APC変異は無かった.一方大腸癌症例では高い頻度,乳癌症例でも18%の症例に変異を検出した(Am J Pathol,2000).6)NF2 stop codon assayを脳腫瘍などに応用し,高い変異検出率を得るとともにexon skippingが.変異の重要な形として同定された.これらの結果をまとめ近く誌上発表の予定である.本申請では脳腫瘍で変異を起こしている遺伝子種を特定し,それらを酵母内で対象遺伝子のstop codonを簡便に判定する新たな手法(stop codon assay)の開発とその応用についての研究計画を提唱した.本研究の結果以下に示すような成果を得た.1)膠芽腫細胞ではp53,PTEN,p16,p14ARFの変異が複数組み合わされて,変異または欠失していることを明らかにした(Brain Pathol,1999)2)特にp53変異は良性星細胞腫から膠芽腫への悪性化進展に重要なこと(Oncogene,1999),また特に優性阻害効果のある変異は,膠芽腫の発症を早めることを示した(Cancer Res,1999).3)p53のホモログであるp73のC-末端の機能を明らかにし,p73の酵母アッセイを確立し,脳腫瘍での変異を検討したが,変異はなかった(Cancer Res,1999;Brain Pathol 11:296-305,2001).5)APC遺伝子のstop codon assayを開発し,脳腫瘍に応用したが,APC変異は無かった.一方大腸癌症例では高い頻度,乳癌症例でも18%の症例に変異を検出した(Am J Pathol,2000).6)NF2 stop codon assayを脳腫瘍などに応用し,高い変異検出率を得るとともにexon skippingが.変異の重要な形として同定された.これらの結果をまとめ近く誌上発表の予定である.1)両assay法とも被検遺伝子産物をPCR増幅cDNAを酵母/大腸菌シャトル発現ベクターに相同組換えで組み入れ,ADE2蛋白とのキメラ蛋白として発現させ,被検遺伝子cDNA内にnonsenese変異がある場合に,ADE2以前に翻訳が停止し,酵母コロニーが赤色となるassay法として完成,assayのテストでも線形性,感度の点で満足な結果を得た.3) PTENstop codon assayでのCowden病でのgermline変異を正しく検出することができ,Gradc IIVの星細胞腫に本assayを応用することによりglioblastomaにおいて高い変異検出をみた.また,赤色と白色の中間色であるピンク色のコロニーを多数例に観察し,そのシーケンス解析の結果,PTH2と呼ばれる,PTENの偽遺伝子(processed pseudogene)が病的に発現していることを確認した.この発現はPTEN変異を相補的関係にあり,PTEN変異に代わる病的役割が示唆された.次年度は11.研究発表の欄に記載したような我々が明らかにした新らしい遺伝子異常(Mdm2 varian,neuralized)についてのstop codon assay構築や,他の既知遺伝子のstop codon assayを構築する予定である.1)NF2 stop codon assayをschwannoma,ependymoma,meningiomaなどに応用し、高い変異検出率を得るとともにexon skippingが変異の重要な形として同定された.これらの結果をまとめ近く誌上発表の予定である.2)PTENstop codon assayにてGrad IIVeの星細胞腫に本assayを応用することによりglioblastomaにおいて高い変異検出をみた.また、ピンク色のコロニーとしてPTENの偽遺伝子PTH2mRNA発現を高い頻度で、しかもPTH2変異に相補的な形で検出し、PTEN変異に代わる病的役割が示唆された.この結果をまとめ近く誌上発表の予定である.3)APC stop codon assayを開発し、脳腫瘍に応用したが、APC変異は検出されなかった.一方大腸癌症例では高い頻度でAPC変異を検出し、また、乳癌症例でも18%の症例に変異を検出し誌上発表の予定である(Am J Pathol,2000 in press)4)さらに特定遺伝子だけではなくいかなる遺伝子にも即座に応用できるUniversal stop codon assayを開発し、APC,MLH1,MLH6,E-cadherin,BRCA1などの遺伝子に応用している.

本研究の目的は腫瘍抑制遺伝子のchain terminating mutationを簡便かつ正確に検出できる酵母stop codon assayを開発し,脳腫瘍をはじめとするヒト腫瘍に応用し,腫瘍におけるそれら遺伝子変異の意義を探ることである.本研究により最終的に以下のような研究成果を得た.1)PTEN/MMAC1遺伝子のstop codon assayを確立,Cowden/Lhermitte-Ducros病においてPTEN胚細胞変異を正しく検出・同定した.さらに,GradeIIVの星細胞腫に本アッセイを応用することにより膠芽腫において高い頻度で変異を検出した.また,ピンク色のコロニーとしてPTENの偽遺伝子ψPTEN発現を高い頻度で,PTEN変異に相補的な形で検出し,PTEN変異に代わる病的役割が示唆された.この結果は2000年,Oncogene誌に発表された.2)APC遺伝子のstop codon assayを開発し,脳腫瘍に応用したが,PAC変異は検出されなかった.一方大腸癌症例では高い頻度でAPC変異を検出し,また,乳癌症例でも18%の症例に変異を検出し,誌上発表を行った(Am J Pathol,2000).3)NF2 stop codon assayをschwannoma,ependymoma,meningiomaなどに応用し,高い変異検出率を得るとともにexon skippingが変異の重要な形として同定された.これらの結果をまとめ近く誌上発表の予定である.
内因性血管新生阻害物質活性化を標的とした天然由来新規抗がんリード化合物の創製

本研究では,endostatinやangiostatin,thrombospondinといった内因性血管新生阻害因子に着目し、これら因子の発現をがん細胞や血管内皮細胞自身において高めることができる天然由来の「内因性血管新生阻害因子プロモーター活性化物質」の探索を試みた。ホスト細胞に内因性血管新生阻害因子であるthrombospondin-1遺伝子のpromoter領域を融合したluciferaseレポータープラスミドを導入・安定発現させた遺伝子改変細胞の樹立を試みたが、安定発現株の樹立には至らなかった。一方、ヒト齊帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)とヒト咽頭上皮がん細胞(KB)やヒト慢性骨髄性白血病細胞(K562)など数種の由来の異なるがん細胞を用いて増殖抑制試験を行い、HUVECに対して選択的に増殖抑制効果を示す化合物の探索法を用いてスクリーニングし、生薬の抽出エキスライブラリーから数種のエキスに活性を見いだし、試験の結果を指標に分画精製を行った。本研究では,endostatinやangiostatin, thrombospondinといった内因性血管新生阻害因子に着目し,これら因子の発現をがん細胞や血管内皮細胞自身において高めることができる天然由来の「内因性血管新生阻害因子プロモーター活性化物質」の探索を試みた。一方、ヒト齊帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)とヒト咽頭上皮がん細胞(KB)やヒト慢性骨髄性白血病細胞(K 562)など数種の由来の異なるがん細胞を用いて増殖抑制試験を行いHUVECに対して選択的に増殖抑制効果を示す化合物の探索法を用いてスクリーニングし、生薬の抽出エキスライブラリーから数種のエキスに活性を見いだし、試験の結果を指標に分画精製を行った。本研究では,endostatinやangiostatin,thrombospondinといった内因性血管新生阻害因子に着目し,これら因子の発現をがん細胞や血管内皮細胞自身において高めることができる天然由来の「内因性血管新生阻害因子プロモーター活性化物質」の探索を試みた。ホスト細胞に内因性血管新生阻害因子であるthrombospondin-1遺伝子のpromoter領域を融合したluciferaseレポータープラスミドを導入・安定発現させた遺伝子改変細胞の樹立を試みた。ベクターの種類やプロモーター領域の大きさなどを種々検討しトランスフェクションを試みたが、安定発現株の樹立には至らなかった。また、ヒト齊帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)とヒト咽頭上皮がん細胞(KB)やヒト慢性骨髄性白血病細胞(K562)など数種の由来の異なるがん細胞を用いて増殖抑制試験を行いHUVECに対して選択的に増殖抑制効果を示す化合物の探索法を用いてスクリーニングし、生薬の抽出エキスライブラリーから数種のエキスに活性を見いだし、試験の結果を指標に分画精製を行った。一方、ヒトの前立腺がんおよび膵臓がんに高発現が見られ、増悪因子でもあるDNA脱メチル化酵素PCA-1の脱メチル化活性を阻害する化合物のスクリーニングを行った。生薬の抽出エキスライブラリーをスクリーニングした結果、数種のエキスに活性を見いだした。活性の見られたエキスは試験の結果を指標に各種クロマトグラフィーにより分画を行ない、最終的にはHPLCを用いて精製することで活性物質の単離に成功した。現在、質量分析スペクトルや各種NMRスペクトルを測定してその化学構造を解析している。本研究では,endostatinやangiostatin, thrombospondinといった内因性血管新生阻害因子に着目し,天然由来の「内因性血管新生阻害因子プロモーター活性化物質」の探索を試みた。すなわち、ホスト細胞に内因性血管新生阻害因子であるthrombospondin-1遺伝子のpromoter領域を融合したluciferaseレポータープラスミドを導入・安定発現させた遺伝子改変細胞の樹立を試みた。ベクターの種類やプロモーター領域の大きさなどを種々検討しトランスフェクションを行った結果、一過性にレポータージーンの発現は確認できたが、安定発現株の樹立には至らなかった。また、ヒト齊帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)とヒト咽頭上皮がん細胞(KB)やヒト慢性骨髄性白血病細胞(K562)など数種の由来の異なるがん細胞を用いて増殖抑制試験を行いHUVECに対して選択的に増殖抑制効果を示す化合物の探索法を用いてスクリーニングを行った。その結果、生薬の抽出エキスライブラリーからオンジやセネガといった植物のエキスに活性を見いだし、試験の結果を指標に分画精製してサポニーン成分に活性を見いだした。

一方、ヒトの前立腺がんおよび膵臓がんに高発現が見られ、増悪因子でもあるDNA脱メチル化酵素PCA-1の脱メチル化活性を阻害する化合物のスクリーニングを行った結果、アスナロやゴシュユといった生薬の抽出エキスに活性を見いだした。活性の見られたエキスは試験の結果を指標に各種クロマトグラフィーにより分画を行ない、最終的にはHPLCを用いて精製することで活性物質としてフラボノイド二量体やインドール型アルカロイド・エボカルピンの単離に成功した。