hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病増殖及び臍帯血移植生着過程における造血ニッチ構成細胞の機能解析

本研究では、白血病・リンパ腫病態における腫瘍細胞の組織微小環境(悪性ニッチ)の重要性を明らかにした。悪性ニッチを構成する生体分子の一つであるプラスミンは、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性化とこれに伴う造血因子の細胞外ドメイン分泌、そして単球・マクロファージ系細胞のニッチ内への動員と血管新生因子供給を介して腫瘍増殖の起点として機能していること、さらにその活性は、白血病・リンパ腫治療の新たな分子標的となる可能性が示唆された。東京大学医科学研究所附属病院では、1983年から2009年末までに634例の同種移植を行っており、移植細胞ソース別の内訳は、血縁ドナーからの骨髄移植が294例(46%)、末梢血幹細胞移植が32例(5%)、非血縁ドナーからの骨髄移植が99例(16%)、臍帯血移植が209例(33%)であった。この中で、1997年以降の移植例の成人患者で初回移植例、かつTBIを含む標準的前処置を用いた症例は284例であった。生着を好中球(500/μL以上)でみると、血縁ドナーからの骨髄・末梢血幹細胞移植症例77例中76例(99%)で生着を認め、生着日の中央値は17(10-35)日、非血縁ドナーからの骨髄移植症例52例中50例(98%)で生着を認め、生着日の中央値は18.5(12-33)日であった。一方、臍帯血移植症例155例中143例(92%)が生着し、生着日の中央値は22(16-46)日であった。また、上記の中で悪性疾患274例を対象に移植後の再発率を検討したところ、移植後5年での累積再発率は、標準リスク群(N=117)では血縁ドナーからの骨髄・末梢血幹細胞移植症で11%、非血縁ドナーからの骨髄移植で28%、臍帯血移植では15%であった。また、進行病期(N=157例)では、血縁ドナーからの骨髄・末梢血幹細胞移植症で37%、非血縁ドナーからの骨髄移植で44%、臍帯血移植では27%であった。以上の臨床解析から、臍帯血移植の生着は他ソースに比べ生着率が低く、回復の速度が遅いこと、一方で再発率は高くはないことが示された。また、臍帯血移植後に重症GVHDを発症した患者ではGVHDの重症化に伴い、TNF-α、Kit-リガンド、可溶性IL2受容体の血中濃度が上昇しており、α2PIプラスミン複合体の血中濃度上昇、プラスミノーゲン血中活性の低下を認めていた。現在、さらに移植後炎症性および非炎症性微小血管障害などについて、これらのサイトカインおよび繊維素溶解系を指標とした病態解析を進めている。他の移植ソースと比較して頻度は低いものの、臍帯血移植(CBT)でも重症GVHD例は存在し、一次治療にはステロイドが使用される。また、カルシニューリン阻害剤の継続投与が困難な例ではGVHD予防目的でステロイドが使用される場合もある。我々は、まず、東大医科研病院でのCBT例に対する移植後早期のステロイド投与について後方視的に検討した。1998年8月2010年4月の間に、骨髄破壊的前処置とCsA+sMTXによるGVHD予防を用いた1655歳の初回単一臍帯血移植を受けた158例について解析した。連続した5日間以上のステロイド投与をおこなった群を投与群、それ以外を未投与群と定義し、投与群は、予防群(CsAの継続投与が困難な例にするGVHD予防目的のステロイド投与)と治療群(CsA投与中に発症したGVHDにするステロイド投与)とに区別した。CBT後100日目までに158例中46例(29%)にステロイドが投与された。その中で、46例中26例がGVHD予防目的、20例が治療目的だった。また、5年全生存率は未投与群と治療群でほぼ同等(79%vs78%)、予防群で有意に不良(40%)だった。さらに、予防群の死亡原因ではGVHDが最も多く、免疫抑制が不十分である可能性が示唆された。一方、臍帯血移植後に重症GVHDを発症した患者ではGVHDの重症化に伴い、TNF-α、Fasリガンド、可溶性IL2受容体の血中濃度が上昇しており、α2PIプラスミン複合体、マトリックスメタロプロテイナーゼ-9(MMP-9)の血中濃度上昇の他、血液線維素溶解系(線溶系)の亢進を示唆するデータが得られた。近年、GVHDの重症化に伴って非炎症性微小血管障害などの血液凝固・線溶系亢進を示唆する病態が報告されており、GVHDの病態形成上の意義が示唆されつつある。

これまでの研究で我々は、MMP阻害剤の急性GVHDのマウスモデルにおける有効性、線溶系因子プラスミンの生成-プラスミノーゲンの活性化の炎症性サイトカイン分泌を促進するMMP活性の制御因子としての重要性を明らかにしており、現在、これらの臨床データを基礎として、線溶系因子群がGVHD病態において果たす役割についても、マウスモデルとヒト検体の両面から解析を進めている。研究では、正常造血微小環境(ニッチ)と白血病ニッチの機能・構成細胞の相違点の詳細解明を通じ、より効果的な造血幹細胞移植、臍帯血移植療法の開発を主な目的としている。前年度までの研究で、代表者らは、ニッチ構成分子の一つで細胞外基質分解に関与するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の活性が一部の白血病・リンパ腫の骨髄及び血液中で増加していることを明らかにした。また近年、代表者らの研究によりセリンプロテアーゼに属する血液線維素溶解系(線溶系)の主要因子であるプラスミンの生成が、MMPの活性化を制御していることも判明している。今年度の研究で、代表者らは、生体中のMMPの活性化を起点とした、Kit-ligandをはじめとする造血因子の細胞外ドメイン分泌の促進と共に、造血系細胞の分化・増殖、さらに単球・マクロファージ系前駆細胞より分化すると考えられるCDllb陽性F4/80陽性細胞が、主にT細胞由来の白血病・リンパ腫細胞周囲の組織微小環境-ニッチ中に集簇し、血管内皮増殖因子(VEGF)等の血管新生因子やさらなるMMPの産生分泌を通じて、これらの腫瘍増殖に関与することを明らかにした。さらに代表者らの研究グループによって見出されたプラスミン阻害剤が、これら一部のT細胞性白血病・リンパ腫の増殖を抑制することを報告した。このことは、血液凝固・線溶系を起点としたプロテアーゼの活性化が、生体内腫瘍の組織内浸潤、転移を介した増殖に直接関与する以外に、骨髄由来の造血系細胞の腫瘍周囲組織中への動員及び浸潤を介した白血病・リンパ腫ニッチの形成を通じ、腫瘍増殖機構に関与することを示唆しており、白血病・リンパ腫病態解明の点でも重要な研究成果と言える。さらに本研究は、ニッチ構成分子を標的とした新規分子療法の開発基盤としての意義を担っており、臨床検体データについて、現在も解析を進めている。
第一言語・第二言語における日本語指示詞コ・ソ・アの習得過程

第二言語習得理論と実際の経験的見地から、学習環境が第二言語習得を左右する重要な変数であると見なされてはいるか、実証研究に基づいた学習環境の影響の究明が待たれる。そこで、本研究は指示詞習得を取り上げ、縦断的及び横断的観点、またインタビュー(言語運用)及び質問紙調査(言語知識)により、日本国内で日本語を勉強している学習者(第二言語としての日本語学習者、以下JSL)と自分の母国で日本語を学習している学習者(外国語としての日本語学習者、以下JFL)の習得結果に着目し、そこに学習環境がどのように関与するのかについて調査した。その結果、JFLはJSLより「コ」系が観察された一方、コミュニケーション・ストラテジーという機能を持つ「ア」系がJSLのみ出現した。それに、使用頻度においては、JSLがJFLより遥かに頻繁に指示詞を利用することが明らかになった。その上、実際に指示詞の学習・使用時に感じたことについて、JSLとJFLに分けて検討してみると、全般的にJFLよりJSLの方が指示詞の伝達役割を認め、指示詞の使用に対する自信があるという傾向が見受けられた。学習ストラテジーに関しては、JSLの方がJFLより「メタ認知ストラテジー」と「社会ストラテジー」を多用する傾向がある一方、JFLの方がJSLより教師や教材に依存する傾向が窺がえる。しかし、JSLとJFLに共通したことが見出された。指示詞の正用の出現順序はJSLとJFLと共にコ系→ソ系→ア系である。また、日本語指示詞の第一言語・第二言語習得過程に関しては、細かい点では異なっている部分があるが、類似した発達パターンを示した。このことから、学習環境の違いに関わらず、共通する指示詞の習得順序があり、学習環境は指示詞をどのような順で習得するかといった習得過程のパターンには影響を及ぼさないことが浮かび上がってくる。本研究では、第二言語及び外国語として日本語を学ぶ台湾人学習者(JSL・JFL)における非現場指示の習得を検討した。学習者の実験時での指示詞の習得状況をより的確に把握するため、セルフモニターの働きにくい口頭資料を収集することにした。話題によって指示詞の使用頻度に偏りが現れる可能性を回避するため、自由会話ではなく、統一テーマ(思い出のある先生について)を設定した。また、初対面の緊張感を緩和するため、簡単な雑談の後、被験者に30分のインタビューを行った。インタビューした直後、実際に指示詞の学習、使用時に感じたことについてフォローアップインタビューを行い、指示詞の学習方略及び使用時における学習者の意識を質的に分析した。分析の枠組みは宋(1991)の枠組みに基づき、学習者の指示詞使用を分類し、学習環境が非現場指示の習得に及ぼす影響を探った。その結果、日本語能力に関わらず、JSLはJFLより指示詞の使用頻度が多いことを明らかにした。また、誤用については、中国語による負の転移である「誤用のコ」は、全体的にJFLよりJSLの方が少ないことがわかった。これについては、母語話者のインプットによる影響の可能性が考えられる。しかしながら、JSLとJFLの類似したところも見られた。「ア」系については、ほとんど誤用となっていることが挙げられる。JSL・JFLを問わず、台湾人の学習者の場合は聞き手がよく知らない指示対象に対しても、「ア」系指示詞を使用し、誤用となっている。以上の調査から、異なる学習環境により指示詞習得の異同の一端を明らかにした。
アモルファスシリカの溶解速度に及ぼすタンパク質の影響の定量評価

地球表層で進行している鉱物の溶解に及ぼす有機分子の影響を明らかにするため、タンパク質およびアミノ酸によるアモルファスシリカの溶解速度に及ぼす影響を検討した。実験方法として、タンパク質およびアミノ酸を含む溶液中(pH4、5、6)でのアモスファスシリカのフロースルー系溶解実験を行った。実験の結果、アモルファスシリカの溶解速度はタンパク質との反応で著しく増大することが確認され、塩基性アミノ酸によるアモルファスシリカとの静電的作用が主な溶解促進作用として寄与していることが推察された。地球表層環境で進行している鉱物の溶解反応には生物起源の種々の有機分子が大きく関与していると考えられている。前年度のフロー式によるアモルファスシリカの溶解実験で、溶解速度に及ぼすタンパク質(BSA)の影響の定量的な評価がなされたが、その反応機構は明らはにされていない。そこで本年度は等電点の異なる7種類のアミノ酸(中性アミノ酸:セリン、トリプトファン、アラニン、トレオニン、塩基性アミノ酸:ヒスチジン、リシン、アルギニン)を用いてアモルファスシリカの溶解実験を行い、溶解速度に及ぼすアミノ酸の影響の定量評価と反応機構の解析を行った。溶解実験は、pH6、5、4の3段階、バックグラウンドNaCl濃度0.1mM、各アミノ酸濃度10.0 mMの条件で行った。実験の結果、アミノ酸によるアモルファスシリカの溶解速度への影響はアミノ酸の種類により大きく異なり、アミノ酸の等電点の大きさに依存して溶解速度の増大が生じることが確認された。また、溶液pH低下に伴う溶解速度の増大も確認された。なお、地球化学コード(ChemEQL)計算から求めた各アミノ酸の陽イオン化学種濃度と溶解速度の増大量との関係はきわめて良好な正の相関を示し、アモルファスシリカ負電荷サイトへのアミノ酸陽イオン化学種の表面錯体形成による溶解速度の増大を示唆した。これらの結果は、タンパク質を用いたアモルファスシリカの溶解実験結果と調和的であり、タンパク質との反応においても同様の反応機構が想定された。そこで本年度は等電点の異なるヘテロ環化合物(piperidine (pK=11.12) >pyridine (pK=5.25) >pyridazine (pK=2.33))を用いてアモルファスシリカの溶解実験を行い、溶解速度に及ぼす影響の定量評価と反応機構の解析を行った。溶解実験は、pH6、5、4の3段階、バックグラウンドNaCl濃度:0.1mM、各ヘテロ環化合物:0.0、0.1、1.0、10.0 mMの条件で行った。実験の結果、タンパク質を用いた溶解実験と同様に、アモルファスシリカの溶解速度への影響は各ヘテロ環化合物の濃度上昇と溶液のpH低下に伴って増大することが確認された。また、piperidineを含む系ではヘテロ環化合物を含まない系と比較して9 17倍の溶解速度の増大、pyridineでは615倍、pyridazineでは3倍以下のわずかな増大が認められた。地球化学コード(ChemEQL)によるスペシエーション計算の結果、piperidineは全pH領域でプロトン化した陽イオン化学種として存在し、pyridine、pyridazineの順に陽イオン化学種濃度の著しい低下が認められた。なお、これらの陽イオン化学種濃度と溶解速度の増大量とはきわめて良好な相関を示し、アモルファスシリカ負電荷サイトへのヘテロ環化合物陽イオン化学種の表面錯体形成による溶解速度の増大が示唆された。なお、タンパク質による溶解速度の増大においても同様の反応機構が想定される。アモルファスシリカを用いたこれまでのバッチ式溶解実験では,タンパク質やアミノ酸による表面錯体形成がアモルファスシリカの溶解速度を著しく増大させることが確認されている。しかしながら,溶解速度に及ぼす影響の定量的9な評価や反応機構の詳細は明らかではない。そこで本年度はフロー式によるアモルファスシリカの溶解実験を行い、溶解速度に及ぼすタンパク質(BSA)の影響について検討を行った。溶解実験は,pH64条件下でタンパク質を含まない無機反応系と牛血清アルブミン(BSA)を添加したタンパク質系について行った。無機反応系では、バックグラウンドNaCl濃度を0.1、1.0、10.0mMの3段階に設定し、各NaCl濃度で溶液pH6、5、4の計9種類の反応系について検討した。タンパク質系では、NaCl濃度を0.1mMとし、BAS濃度0.01、0.1、1.0mg/mlの各濃度について溶液pH6、5、4に調整した計9つの反応系について溶解実験を行った。

実験の結果、無機反応系ではNaCl濃度に対応して溶解速度が増大が認められ、各NaCl濃度条件下での溶液pHをパラメータとする溶解速度式を得ることができた。一方、タンパク質系ではBAS濃度の上昇に伴ってアモルファスシリカの溶解速度の増大が認められた。BSAによる溶解速度の増大への影響は溶液pHの違いにより著しく異なり、各pH条件(pH6、5、4)での各BAS濃度(0.01、0.1、1.0mg/ml)における速度増大率は、pH6:1.4、2.2、2.8倍、pH5:1.5、4.5、7.7倍、pH4:1.7、6.3、11.4倍の値が得られ、アモルファスシリカの溶解速度に及ぼすBSAの影響を定量的に評価することができた。当初計画では次の3つの反応系でのアモルファスシリカの溶解実験を予定していた。反応系I:タンパク質およびアミノ酸を含まない無機反応系、反応系II:牛血清アルブミン(BSA)を含むを用いたタンパク質系、反応系III:酸性から塩基性の種々のアミノ酸を用いたアミノ酸系。これらの反応系のうち、反応系Iと反応系IIの実験および実験結果の解析はすでに終了している。さらに、反応系IIIのアミノ酸を用いた実験では中性および塩基性の7種類のアミノ酸を用いた実験は終了し、溶解速度の算出およびアミノ酸の陽イオン化学種濃度に関する計算もほぼ終了している。なお、酸性アミノ酸を用いた溶解実験は次年度実施予定である。したがって、研究は当初予定のとおりおおむね順調に進展していると判断される。当該年度予定の実験はほぼ終了し、アモルファスシリカの溶解速度に及ぼすタンパク質系(BAS)の影響を定量的に評価することができた。平成25年度は、当初計画どおり反応系IIIのうち酸性アミノ酸(アスパラギン酸、システイン、アスパラギン)を用いた溶解実験を行う。平成24年度までの研究でタンパク質系での溶解実験と中性および塩基性アミノ酸を用いた反応系での溶解実験は終了し、これらのデータを用いた溶解速度の解析もほぼ終了している。その結果、アミノ酸による溶解速度の増大はアミノ酸陽イオン化学種が反応イオンとして重要な働きをしていることが確認された。そこで、よりプロトン化傾向の小さい酸性アミノ酸を用いたアモルファスシリカの溶解実験を行い、アモルファスシリカの溶解速度に及ぼすアミノ酸の影響の定量評価と反応機構の構築を行う。次年度は当初予定のとおり、アモルファスシリカの溶解速度に及ぼすアミノ酸の影響の定量評価とその反応機構を明らかにするため、タンパク質分子を構成する各アミノ酸を含む溶液中での溶解実験を行う。研究費は主にSi濃度の測定に用いるSi分析カラム、分析試薬類、メンブレンフィルターなど、実験用消耗品の購入費として使用する。また、研究成果発表のために学会参加旅費(粘土科学討論会など)としても使用する。反応装置の消耗品、反応試薬、旅費等に使用する。
青色光情報伝達による光合成細菌の遺伝子発現の分子機構

1)光受容体AppAがリン酸化することを明らかにした。2)リン酸化部位がT30であることを明らかにした。3)リン酸化は二成分制御系のレスポンスレギュレーターとの機能的相互作用に重要であることを明らかにした。申請者は先の研究で新規の青色光受容体AppAを紅色光合成細菌から単離している。この受容体は転写因子PpsRと光依存的に直接相互作用することがわかっている。申請等はこの光受容体が自己リン酸化することを最近明らかにしている。本研究ではこの自己リン酸化反応が生体内でどのような生理的意義を持つのかを明らかにすることを目的としている。これまでに作成した、AppA特有の光反応を示さなくなるY21F,およびQ63L変異体AppAは、明所でも暗所でも自己リン酸化反応を起こすことがわかった。このことからin vitroで観測されるリン酸化反応は、AppAの光に依存したタンパク質の構造変化に依存して起こると考えられた。また光依存的にPpsRと相互作用しなくなるW104A変異体は、WTと同様光に依存した自己リン酸化反応を起こすことがわかった。このことからAppA-PpsR間の相互作用にリン酸化反応は関与しないと考えられた。そこでAppAとリン酸化反応を介して相互作用しうるいくつかの制御系を調べた。その結果AppAは二成分制御系のセンサーキナーゼPrrBとリン酸化反応を介して相互作用している可能性が考えられた。現在その詳細を検討中である。またAppAのリン酸化部位を特定するべく実験を行った。AppAと構造上相同性のあるフォスフォキヤリアープロテインHprのリン酸化部位であるHisがAppAではT30に相当することがわかった。T30A変異体の自己リン酸化を調べたところその活性が無くなることがわかった。この結果からAppAの自己リン酸化サイトはT30であると考えられた。先の研究で新規の青色光受容体AppAを紅色光合成細菌から単離している。昨年度までにこの光受容体が自己リン酸化することを明らかにした。本年度はこの自己リン酸化反応炉生体内でどのような生理的意義を持つのかを明らかにすることを目的とした。昨年度までに、AppAの自己リン酸化サイトはT30であることを明らかにした。T30の自己リン酸化がPpsRとの相互作用にどのような影響を及ぼすのかをゲルシフトアッセイ法で調べたところ、T30のリン酸化はPpsRとの複合体形成には影響を及ぼさないことがわかった。このことからPpsRを介さない新規の光シグナル伝達経路が考えられた。その結果AppAは二成分制御系PrrA/Bのシステムとリン酸化反応を介して相互作用していることがわかった。具体的には、AppAのフラビン結合ドメインBLUFはリン酸化されたレスポンスレギュレータPrrAを脱リン酸化する活性を有していることがわかった。T30はその際の活性中心を形成していると考えられた。実際T30AはPrrAの脱リン酸化活性を有しないこともわかった。AppAのリン酸化を介した光シグナル伝達の重要性を調べる目的で、T30A変異をゲノムに持つノックイン株を作成し、その表現型を調べた。その結果、その変異殊では光合成遺伝子の転写が恒常的に上昇していることがわかった。おそらくAppAは光依存的にPrrAの脱リン酸化を介して光合成遺伝子の転写を調節していると考えられた。二成分制御系はバクテリアに普遍的に存在する環境応答システムであるが、光受容体のシステムとの(リン酸化を介した)クロストークが直接示されたことはなかった。この点で今回の光受容体と2成分制御系との相互作用の発見は重要なものである。
HCVによる自然免疫攪乱機構の解明

C型肝炎ウイルス(HCV)による自然免疫システムの撹乱機構の解明を目的として行った研究において、以下のような成果を得た。(1)従来の報告とは異なり、NS3-4A蛋白質はTRIF蛋白質を切断しておらず、自然免疫機構の抑制はRIG-I/IPS-1経路に限定されていた。(2)NS5B蛋白質によるIFN-βの産生はTLR3経路およびRIG-I/MDA5経路の活性化、さらには両経路の下流の転写因子IRF-3の活性化を経て誘導されていた。(3)NS5B蛋白質によるIFN-βの産生誘導はTRAF3やTRAF6のノックダウンにより亢進することを示した。また、活性化されたIRF-3の調節にTRAF6が関与している可能性が示唆された。(4)PH5CH8細胞において、NS5Bは二本鎖RNAを産生していることを示した。これらの研究成果により、HCVはこれら分子との相互作用により自然免疫システムを撹乱している可能性が示唆された。C型肝炎ウイルス(HCV)の持続感染に因する肝発がんの予には、HCVをから排除し、HCVの持続感染による慢性肝炎を治療することが重要である。HCVの持続感染機構を解明するために、HCVと自然免疫機構に関する研究が国内外のいくつかの研究グループによりなされてきた。しかしながら、いずれの研究もHCV RNAの持続複製が可能ではあるが、ウイルス感染認識に重要なTLR3/TRIF経路の機能が欠損している肝がん細胞株HuH-7細胞(RIG-I/IPS-1経路は機能を保持している)でなされてきた。研究代表者はTLR3/TRIFおよびRIG-1/IPS-1両経路の機能を保持しているヒト不死化肝PHsCH8細胞(HCV感染に対する感受性を有し、低レベルではあるが、HCVRNAの複製も起こる)で、HCVのNS3-4A蛋白質(セリンプロテアーゼ及びヘリカーゼ活性をもつ)がインターフェロン(IFN)-βの産生を抑制できる場合(人工二本鎖RNAを細胞内添加した場合)と抑制できない場合(人工二本鎖RNAを細胞外添加した場合)があることを見出している。そこで、当該年度では、このNS3-4A蛋白質の機能的な違いの原因を明らかにすることを目的として、研究を遂行した。最初に、IFN-βの産生抑制がNS3-4A蛋白質のどの機能に依存しているか調べるために、セリンプロテアーゼあるいはヘリカーゼ活性を欠失させるような変異体を作成した。これらの変異体のうち、セリンプロテアーゼを欠失させた変異体では、IFN-βの産生を抑制することはできなかった。次に、IFN-βの産生に重要なIRF3の活性化に対するNS3-4A蛋白質の影響を、非変性ゲルを用いてIRF3の二量体形成を指標として調べたところ、IFN-βの産生抑制と相関して、人工二本鎖RNAを細胞内添加した場合ではNS3-4A蛋白質はIRF3の二量体形成を抑制したのに対し、人工二本鎖RNAを細胞外添加した揚合ではIRF3の二量体形成を抑制することはできなかった。また、従来の報告どおり、人工二本鎖RNAを細胞外添加した場合、PH5CH8細胞でもTLR3/TRIF経路を介してIRF3が活性化され、それに伴いIFN-βが産生されていることがわかった。そこで、NS3-4A蛋白質の標的分子の候補として報告されているTRIF、IPS-1両蛋白質に対する影響を調べたところ、NS3-4A蛋白質はIPS-1蛋白質は切断するが、予想外にTRIF蛋白質は切断できないことがわかった。NS3-4A蛋白質によるTRIF蛋白質が切断されない現象は従来の報告とは異なっているが、当研究室で樹立されたHCV RNA持続複製細胞でも確認された(FEBSJ, 2007)次に、無症候性キャリアー、急性肝炎、慢性肝炎及び肝がん患者血清由来の各種病態NS3-4A発現ベクターを作製し、IFN-βの産生に対する抑制能に違いがあるかどうか検討したところ、いずれのNS3-4A蛋白質もIPS-1蛋白質は切断するが、TRIF蛋白質は切断できないことがわかった。また、各種病態間で、その抑制能に大きな違いはなかった。

一方、PH5CH8細胞でも人工二本鎖RNAを細胞外添加した場合、IFN-βの産生経路とは別に、TLR3/TRIF経路を介してNF-kB経路を活性化していることがわかった。そこで、NF-kB経路の活性化に対する各種病態由来のNS3-4A蛋白質の影響を調べたところ、いずれのNS3-4A蛋白質もNF-kB経路の活性化を抑制することはできなかった。このことはHCV RNA複製に伴う肝内の炎症状態が持続されることとなり、肝発がんの一因となりうることが予想される(投稿準備中)。また、HCV RNA複製に必要な宿主因子に関する研究(J.Virol,2007)やIFNとの併用でのHCVRNA複製抑制効果が期待される栄養製剤に関する研究(AAC,2007)においても、次年度以降、HCVの持続感染機構を理解するのに重要な研究成果が得られた。C型肝炎ウイルス(HCV)の持続感染により引き起こされる肝発がんを予防するためには、HCVを体内から排除し、HCVの持続感染による慢性肝炎を治療することが重要である。HCVの持続感染機構を解明するために、HCVと自然免疫機構に関する研究が国内外のいくつかの研究グループによりなされてきた。本年度の研究の結果、ヒト不死化肝細胞株であるPH5CH8細胞内において、HCV NS5BのRNA依存性RNAポリメラーゼ活性によりHCVゲノムの非存在下でも二本鎖RNAが産生されることがわかった。また、HCVの近縁ウイルスであるGBV-B由来のNS5Bでも二本鎖RNAは産生された。産生された二本鎖RNAは、RIG-I、MDA5、あるいはTLR3のような細胞内の二本鎖RNA認識受容体のいずれによっても認識され、下流へとシグナルが伝達された後、IFN-betaの産生が誘導されることが明らかとなった。しかしながら、RIG-IやMDA5のアダプター分子であるCardifはNS5BによるIFN-betaの産生誘導機構に含まれていたのに対して、TLR3のアダプター分子であるTRIFは含まれていなかった。また、RIG-I/MDA5経路とTLR3経路の両経路に関与することが報告されているNAP1もNS5BによるIFN-betaの産生誘導機構に含まれていたことからも、合成二本鎖RNAであるpoly(I-C)の細胞外刺激とは異なるTRIFを介さない経路の存在が示唆された。一方、NS5Bを恒常的に発現するPH5CH8細胞ではIRF-3が二量体形成後、核内でIFN-beta遺伝子の転写を活性化した後に分解されている可能性が示唆された。これに対して、TRAF6をノックダウンしたPH5CH8/NS5B細胞では内在性のIRF-3の二量化が観察されるようになった。TRAF6はE3ユビキチンリガーゼ活性を持つこと、また、IRF-3もユビキチン-プロテオソーム系において分解されることがこれまでに報告されており、何らかの関係が示唆される。このように自然免疫システムを撹乱するNS5Bに対抗する手段を得ることは、HCVの持続感染を断ち切ることができる可能性を示唆しており、今後の重要な研究課題であると考えられる。
物体認知の責任領野候補としてのマウス側頭葉新規高次視覚野の解析

本研究の目的は、マウスの新規高次視覚野ECTが、価値判断に関与する物体認知領野として機能するかを明らかにすることである。本研究では、ECT領域の神経投射パターンを解明するとともに、物体弁別課題において報酬や罰と関連付けた刺激に対するECTニューロンの応答性を明らかにする。さらに、光遺伝学的手法を用いて課題中にECTの神経活動を抑制することで、マウスの判断行動がどう変化するかを検証する。
包括的なミトコンドリア品質管理制御機構の解明と代謝性疾患におけるその破綻

我々は、抗老化・寿命延伸効果のあるカロリー制限(CR)によるミトコンドリア(MT)の品質管理の向上に、Sirt3タンパク質のプロセシング亢進が重要である可能性を発見した。MTタンパク質のプロセシングには、シグナルペプチダーゼが関わっている。Sirt3はMPPとMipepという2つのシグナルペプチダーゼにより2段階切断をうけて活性型になる可能性を明らかにした。また、CRによりMPPではなくMipep発現が亢進した。そのため、CRによるMT品質管理の向上にMipepが重要であると考え、in vivoで証明するために、臓器特異的Mipep欠損マウスを作製した。今後このマウスを解析予定である。ミトコンドリアの品質は、オートファジーによる傷害ミトコンドリアの除去(ミトファジー)やプロテアーゼによる傷害ミトコンドリアタンパク質の分解など、オルガネラおよびタンパク質レベルそれぞれで担保されており、前者にはPINK1/PARKINが、後者には脱アセチル化酵素活性を有するSIRT3が重要であることが知られている。また、PINK1およびSIRT3のプロセシングにmitochondrial processing peptidase(MPP)が関わることが報告されている。加えて、MPPによるPINK1のプロセシングが抑制されると、PINK1はミトコンドリア外膜表面に蓄積し、Parkinがリクルートされ、ミトファジーが亢進することが明らかとなっている。一方、定量的質量分析手法を用いたSirt3ノックアウトマウスやその細胞でのミトコンドリアタンパク質のアセチローム解析から、抗酸化酵素であるSOD2や傷害タンパク質の分解に関わるLonプロテアーゼ、分子シャペロンであるHSP70などもSirt3の基質であることが示されている。非常に興味深いことに、我々は抗老化・寿命延伸作用のあるカロリー制限(CR)した脂肪組織では、摂食状態に関係なく、sterol regulatory element binding protein 1c(Srebp1c)依存的に、37KDaの前駆型Sirt3タンパク質から28KDaの活性化型へのプロセシングが亢進していることを発見した。本研究では、1)CRによるSIRT3のプロセシング機構を明らかにする。2)そのプロセシング機構の機能低下によるPINK1/PARKINそして、ミトファジーに及ぼす影響を明らかにする。適度な摂取カロリーの制限(CR)は、加齢に伴う種々の生理的、病理学的変化を抑制し、平均及び最大寿命を延伸する。我々は、このCRの抗老化・寿命延伸作用に、白色脂肪組織(WAT)特異的に発現が亢進する脂肪酸合成に関わる主要な転写因子であるSrebp-1cを介したde novo脂肪酸合成の活性化に加え、ミトコンドリアの生合成の亢進および酸化ストレスの抑制が重要であることを発見した。また、近年、Sirt3がミトコンドリアの品質管理に重要であることが示されている。Sirt3をはじめとするミトコンドリアタンパク質はミトコンドリアシグナルペプチターゼ(MtSPase)によって切断されるミトコンドリアに局在する。我々はCRしたマウスのWATにおいて、Sirt3タンパク質が37kDaの前駆型から28kDaの活性型へのプロセシングが亢進していること、また、MtSPaseの中でもMipepがSrebp-1c依存的にCRにより発現が亢進することを見出だした。そこで、マウス脂肪前駆細胞株3T3-L1において、MipepをノックダウンするとSirt3を含むミトコンドリア関連タンパク質の発現が減少した。ヒトの4家系において同様のMtSPaseの一つであるMPPαの変異がミトコンドリア病の一つであるFriedreich's Ataxiaの発症に関わることが2015年に報告された。これはMtSPaseの変異がヒトにおいて疾患を引き起こすという初めての報告である。それゆえ、MtSPaseであるMipepの欠損または変異もミトコンドリア病発症に関わる可能性が考えられた。現在、Mipepが生体においてミトコンドリア機能および老化に及ぼす影響を解析するために、Mipep knockout (KO) miceを作製中である。このマウスは臓器特異的にKOするため、Cre-loxPシステムを用いており、キメラマウスまで作製が完了した。CRによるSIRT3プロセッシング亢進の詳細を検討した。その結果、SIRT3は脂肪組織において、Srebp1c依存的に、37KDaの前駆型から、中間型を経て28KDaの成熟型に、2段階切断をうけることが明らかとなった。また、前駆型から中間型へはMPPが、中間型から成熟型へはmitochondrial intermediate peptidase(MIPEP)が関わる可能性が示唆された。さらにCRにより、Srebp1cが転写レベルでMIPEPの発現を亢進するが、MPPα、βの発現には影響を及ぼさないことが示唆された。

同様の結果は、肝臓、心臓、腎臓、骨格筋では観察できなかった。培養細胞では、脂肪前駆細胞である3T3L1細胞においてSIRT3の2段階切断が観察されたが、筋芽細胞株であるC2C12細胞や肝細胞株Hap1-6では観察されなかった。以上から、CRによるSrebp1c依存的なSIRT3プロセシングの亢進には、転写レベルでのMIPEPの発現亢進が重要で、脂肪細胞にかなり選択的な現象である可能性が示唆された。実験病理学今後、膵β細胞株であるMIN6、神経芽細胞株PC12において同様の解析を行なう。そして、SIRT3のプロセシングにおいて2段階切断が観察できる細胞株を用いて、MPPα、β、MIPEP発現を修飾することによるSIRT3プロセッシングへの影響、SIRT3の標的分子のアセチル化レベル、酸化ストレスレベル、ミトコンドリア膜電位、PINK1/PARKINを介したミトファジーへの影響などを解析する。以上の解析から、ミトコンドリアタンパク質のプロセシングに関わるシグナルペプチダーゼ群が、これらオルガネラもしくはタンパク質レベルでのミトコンドリア品質管理制御選択における決定因子であるという仮説1)、2)を証明する。加えて、ミトコンドリアを標的とした、代謝性疾患や神経変性疾患治療薬の開発の端緒とする。仮説1)MPPやMIPEPをはじめとしたミトコンドリアシグナルペプチダーゼ群の機能低下は、PINK1のプロセシングの減少を介したオルガネラレベルでの品質管理(ミトファジー)を選択する。一方、同ペプチダーゼ群の機能亢進は、SIRT3の活性化を介して、タンパク質レベルでの品質管理を選択する。仮説2)両者のバランスには細胞や組織特異性があり、そのバランスの乱れが代謝性疾患や神経変性疾患発症に関わる。佐々木研究所沖田博士の研究室では、実験系の立ち上げに時間を要し、本格的な解析に至っていない。そのため、配分額20万円は使用されていない。また、樋上の配分に関しては、実験支払いの都合上、ごく僅か残金が生じた。特別な利用計画はない。
平面代数曲線の埋め込み位相の研究の新展開

さらに,現在[6]で得られた着想を発展させた論文をE. Artal氏,徳永浩雄氏,白根竹人氏と共に執筆中である.2018年度の研究はおおむね順調に進展していると以下の理由で判断した.研究実績の概要で述べたように,論文2本を出版,プレプリントを4本執筆・投稿し,さらに1本の論文を執筆中である.また,国際研究集会での講演1件, Universidad Compultense Madridでのセミナー講演を1件行っており,業績は順調に伸びていると言える.また,研究内容については,本研究の短期的目標の一つであった平面4次曲線とその2重接線からなる配置の埋め込み位相の分類は研究概要[2], [4], [5]の論文により完全にではないが,詳細な状況がわかってきた.これらの結果は, Mordell-Weil格子の最短ベクトルの集合に付随するmatroid構造やtwo-graphの構造を調べる事により得られているが,これはまたZariski-pairの研究におけるmatroidやtwo-graphの有用性を示していてる.この意味で,他分野からの手法を導入するという目標についても概ね順調に進んでいると言える.研究環境についても, 2018年9月にスペインZaragoza大学のE. Artal-Bartolo氏, J.I. Cogolludo氏を訪問をするなどして,国内外の数学者との直接的な交流が広がりつつあり,順調に進展している.これは本研究費がなければできなかったことである.特に, E. Artal-Bartolo氏が2019年3月に来日した際に行った研究打ち合わせが切っ掛けとなり,研究概要[6]の着想を楕円曲面だけでなく他の曲線にも一般化する方向性が見出され,交流の広がりを研究の進展に結びつけることができたと言う意味でも順調である.今後の研究では,まず執筆中である論文を書き上げることを第一の短期的な目標とする.この論文で示された方向性により,今までの研究の中でMordell-Weil格子が果たしていた役割を,曲線の0次ピカール群で置き換えることができることが示唆されているが,これが正しいかを調べる. Mordell-Weil格子は2次被覆に付随してしか扱えなかったが, 0次ピカール群自体は被覆を与える必要がないので,本研究の長期目標の一つである分岐被覆にとらわれない設定での研究に向けての一歩が踏み出せる予定である.また,研究環境として,本年度はフランスのPau大学のV. Florensのもとを訪れる予定であり,あらに交流の幅を広げていく予定である.さらに,現在[6]で得られた着想を発展させた論文をE. Artal氏,徳永浩雄氏,白根竹人氏と共に執筆中である.2018年度の研究はおおむね順調に進展していると以下の理由で判断した.研究実績の概要で述べたように,論文2本を出版,プレプリントを4本執筆・投稿し,さらに1本の論文を執筆中である.また,国際研究集会での講演1件, Universidad Compultense Madridでのセミナー講演を1件行っており,業績は順調に伸びていると言える.また,研究内容については,本研究の短期的目標の一つであった平面4次曲線とその2重接線からなる配置の埋め込み位相の分類は研究概要[2], [4], [5]の論文により完全にではないが,詳細な状況がわかってきた.これらの結果は, Mordell-Weil格子の最短ベクトルの集合に付随するmatroid構造やtwo-graphの構造を調べる事により得られているが,これはまたZariski-pairの研究におけるmatroidやtwo-graphの有用性を示していてる.この意味で,他分野からの手法を導入するという目標についても概ね順調に進んでいると言える.研究環境についても, 2018年9月にスペインZaragoza大学のE. Artal-Bartolo氏, J.I. Cogolludo氏を訪問をするなどして,国内外の数学者との直接的な交流が広がりつつあり,順調に進展している.これは本研究費がなければできなかったことである.特に, E. Artal-Bartolo氏が2019年3月に来日した際に行った研究打ち合わせが切っ掛けとなり,研究概要[6]の着想を楕円曲面だけでなく他の曲線にも一般化する方向性が見出され,交流の広がりを研究の進展に結びつけることができたと言う意味でも順調である.今後の研究では,まず執筆中である論文を書き上げることを第一の短期的な目標とする.この論文で示された方向性により,今までの研究の中でMordell-Weil格子が果たしていた役割を,曲線の0次ピカール群で置き換えることができることが示唆されているが,これが正しいかを調べる. Mordell-Weil格子は2次被覆に付随してしか扱えなかったが, 0次ピカール群自体は被覆を与える必要がないので,本研究の長期目標の一つである分岐被覆にとらわれない設定での研究に向けての一歩が踏み出せる予定である.また,研究環境として,本年度はフランスのPau大学のV. Florensのもとを訪れる予定であり,あらに交流の幅を広げていく予定である.共同研究者との日程が会わず,実施予定であった研究打ち合わせ・セミナーの実施が次年度に先送りされたため.
転写因子Nrf3の大腸癌とapoptosis誘導における機能解析

転写因子Nrf3は、大腸癌ならびにT細胞分化において機能していることが予想されている.またapoptosisに関わるタンパク質分解酵素群Caspaseに分解され、細胞にapoptosisを引き起こすことも明らかにされている。以上の知見から、Nrf3の生理機能として、腫瘍とT細胞分化における機能そしてapoptosis誘導解明を研究計画を立てている.現段階までの進展状況としては、1)Nrf3結合因子を酵母two hybrid法で検索し、大腸・肺癌特異的に発現を示す機能未知の因子C20orf2と、Fasシグナル系のapoptosisに関わる因子を同定した。このことは,Nrf3によりもたらされるapoptosis誘導機構にはFas系とCaspase系の二つのルートが存在することを示唆する.2)関連因子Bach2結合因子であるMAZRを単離し,癌遺伝子産物c-myc遺伝子の発現を亢進することを明らかにした.最近他のグループから,MAZRはEWS肉腫において転座し融合遺伝子を形成するという報告を裏付けるものと考えている.3)現在これら生化学的知見を動物個体内で検討するために,Nrf3遺伝子破壊マウス(ノックアウトマウス)ならびにT細胞特異的なNrf3過剰発現マウス(トランスジェニックマウス)の作製を完了しつつある.今後これらマウスの表現型を解析することで,新たなるNrf3の機能を見出されることも期待している.転写因子Nrf3は、大腸癌ならびにT細胞分化において機能していることが予想されている.またapoptosisに関わるタンパク質分解酵素群Caspaseに分解され、細胞にapoptosisを引き起こすことも明らかにされている。このことは,Nrf3によりもたらされるapoptosis誘導機構にはFas系とCaspase系の二つのルートが存在することを示唆する.2)関連因子Bach2結合因子であるMAZRを単離し,癌遺伝子産物c-myc遺伝子の発現を亢進することを明らかにした.最近他のグループから,MAZRはEWS肉腫において転座し融合遺伝子を形成するという報告を裏付けるものと考えている.3)現在これら生化学的知見を動物個体内で検討するために,Nrf3遺伝子破壊マウス(ノックアウトマウス)ならびにT細胞特異的なNrf3過剰発現マウス(トランスジェニックマウス)の作製を完了しつつある.今後これらマウスの表現型を解析することで,新たなるNrf3の機能を見出されることも期待している.
中心循環血液量の増加がヒトの運動中および運動後の呼吸循環代謝系機能に及ぼす影響

中心血液量(CBV)の増加が安静時、運動中および運動後の心循環反応に及ぼす影響を運動強度との関係から明らかにするため、健常男性8名を対象に下半身部の水浸(WI)による水圧によって、一過性にCBVを増加させた条件下での上肢運動を施行した。その結果、安静時ではWIにより心拍出量(Q)、1回拍出量(SV)および収縮期血圧はそれぞれ39.1%、79.0%、7.1%増加し、心拍数(HR)や総末梢血管抵抗は21.8%、28.9%それぞれ減少した。WI条件での運動中のQおよびSVはすべての強度レベルにおいてコントロール条件よりも高値を示し、コンディションの有意な主効果が認められた。また、SVにはコンディション×強度の有意な交互作用効果が認められ、これは両コンディション間のSVの差が低強度運動レベルよりも高強度運動レベルで縮小した結果によるものであった。WI条件での運動中および運動後のHRはすべての強度レベルにおいてコントロール条件よりも低値を示し、コンディションの有意な主効果が認められた。また、コンディション×強度およびコンディション×時間の有意な交互作用効果も認められた。これは、両コンディション間のHRの差が低強度運動レベルよりも高強度運動レベルで、また、運動前半の時間帯よりも後半の時間帯で縮小した結果によるものであった。WI条件での運動終了後の平均血圧はコンディションに関連する交互作用効果は認められなかった。WI条件での運動中の酸素摂取量(VO_2)および血中乳酸濃度(LA)は高強度運動レベルにおいてコントロール条件よりも高値を示し、コンディション×強度の有意な交互作用効果が認められた。これは両コンディション間におけるVO_2やLAの差が低強度運動レベルよりも高強度運動レベルで増大した結果によるものであった。Q-VO_2モデル式に、VO_2×HRの交互作用効果の項を付加することによって、CBVに依存して安静時のQが変化する条件下でも、安静時や運動中のQが推定できる多変量回帰モデル式が得られた。以上、一過性のCVBの増加は運動に対応する心循環系の調節機構に影響を及ぼし、運動負荷による生理学的ストレスを軽減する可能性が示唆された。それは、高強度運動レベルよりも低強度運動レベルにおいて顕著であることが示された。
シグナルペプチド分解に関わる膜プロテアーゼＲｓｅＰの構造・機能解析

本研究では、タンパク質の膜透過の際に用いられるシグナルペプチドを、膜の疎水的環境中で加水分解する膜内プロテアーゼであるRsePに着目した。このRsePについて、X線結晶構造解析を用いることでRsePの基質結合機構や、基質切断メカニズムを原子分解能で明らかにすることを目指している。昨年度までに確立させた精製系を用い、本年度は結晶の質を改善させることを目的として各種結晶化条件の検討を進め、昨年よりも良好なデータセットの取得に成功した。しかしながら、分子置換による解は得られなかったため、今後はさらなる分解能の向上を目指して、結晶化条件や結晶化方法、精製条件や発現コンストラクトを改良してゆく予定である。また、RsePと基質の結合を観察するためや、機能解析に用いるための基質のデザインやそれらとの共結晶化を計画している。さらに、分子置換法や重原子による異常分散を用いた位相決定法を用いることで位相を決定し、新規構造であるRsePの結晶構造を決定することを目指す。本年度はこの他に、本研究室で得られた膜タンパク質トリオースリン酸/リン酸輸送体についてのMDシミュレーションを実施、及び論文を筆頭著者として執筆した。この論文は現在、Structure誌においてレビューを受けている。さらにこの論文について、プレプリントサーバbioRxivに掲載した。本年度はこの他に、本研究室で得られた膜タンパク質結晶構造についていくつかのMDシミュレーションによる解析を担当し、2報の論文を共著として出版した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、タンパク質の膜透過の際に用いられるシグナルペプチドを分解する膜内プロテアーゼであるRsePに着目し、X線結晶構造解析を用いることでRsePの基質結合機構や、基質切断メカニズムを原子分解能で明らかにすることを目指している。結晶化に適したRsePの生物種スクリーニングの後に、可溶化時の界面活性剤やバッファー条件の検討を行い、精製系の確立を行った。この精製RsePを用いてLCP法による結晶化を行ったところ、SPring-8における回折実験において、予備的なデータセットを得ることができた。今後、さらなる分解能の向上や、分子置換法や重原子による異常分散を用いた位相決定法により、RsePの結晶構造を決定することを目指す。本年度はまた、光駆動性陽イオンチャネルであるチャネルロドプシンのMDシミュレーションによる解析も行った。チャネルロドプシン(ChR)は青色光の照射によってチャネルを開口させて陽イオンを透過させるロドプシンファミリータンパク質の1種であり、近年光遺伝学のツールとして大きな注目を集めている膜タンパク質である。しかしそのツールとしての利用の広がりとは裏腹に、ChR自身の動作メカニズムの構造基盤は明らかになっていなかった。申請者は、MDシミュレーションによる解析と、共同研究による電気生理学的解析により、ChRに広く保存されている2つのグルタミン酸残基Glu122とGlu129の役割が明らかになった。また、レチナールの異性化によるタンパク質の構造変化もMDシミュレーションによって捉え、ChRの光サイクルの最初期に起こる構造変化を観察することができた。本研究成果をまとめた論文は、PLOS ONE誌に掲載された。ターゲットとなるタンパク質の生物種や発現・精製条件の検討を行い、予備的なデータセットを得ることができているという点で、おおむね順調に進展していると考える。これらのタンパク質以外にも、現在MDシミュレーションによる解析を進めているターゲットが複数存在し、いずれも現在、結晶構造と同時の出版に向けて論文を執筆中である。RsePについては、当初の計画に比べてデータの分解能が不十分であり、未だ構造決定に至っていないという点で計画よりもやや遅れていると言える。一方で、並行して進めている膜タンパク質のMDシミュレーションによる解析では良好な結果が得られており、こちらの研究についてはおおむね順調に進展しているといえる。

しかしながら、分子置換による解は得られなかったため、今後はさらなる分解能の向上を目指して、結晶化条件や結晶化方法、精製条件や発現コンストラクトを改良してゆく予定である。また、RsePと基質の結合を観察するためや、機能解析に用いるための基質のデザインやそれらとの共結晶化を計画している。さらに、分子置換法や重原子による異常分散を用いた位相決定法を用いることで位相を決定し、新規構造であるRsePの結晶構造を決定することを目指す。本年度はこの他に、本研究室で得られた膜タンパク質トリオースリン酸/リン酸輸送体についてのMDシミュレーションを実施、及び論文を筆頭著者として執筆した。この論文は現在、Structure誌においてレビューを受けている。さらにこの論文について、プレプリントサーバbioRxivに掲載した。本年度はこの他に、本研究室で得られた膜タンパク質結晶構造についていくつかのMDシミュレーションによる解析を担当し、2報の論文を共著として出版した。得られている精製タンパク質に対して結晶化に用いる脂質や最終状態における界面活性剤、および結晶化条件を検討することによって、より高分解能のデータセットを得ることを目指す。また、水銀やセレノメチオニンによる異常分散を用いた位相決定法のための条件検討を行う。RsePについては、現在得られている結晶化条件を改良するため、結晶化に用いる脂質や精製時の界面活性剤の種類等を検討する。また、LCP法以外の結晶化方法、例えば蒸気拡散法やバイセル法も試し、分解能の向上を狙う。さらに、重原子による異常分散を用いた位相決定法により、RsePの結晶構造を決定することを目指す。並行して進めている各種MDシミュレーションについては、共著となる研究室のメンバーとコミュニケーションを取りつつ、データの解析や論文の執筆を進め、出版を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
歯周組織における新規コラーゲン受容体(DDR)の機能解析

歯周病は歯周病原細菌の感染と歯周組織の破壊を伴う慢性炎症性疾患である。近年、歯根膜組織中に幹細胞が存在することが報告され、再生の鍵を握る細胞は歯根膜由来細胞であることが示唆されている。I型コラーゲンは歯根膜、骨組織に最も多くみられる細胞外マトリックスであり、コラーゲンと歯根膜および骨を構成する細胞との接着は、組織の恒常性や治癒過程において様々な役割を果たしていると考えられる。我々はこれまでに、I型コラーゲンと歯根膜細胞との接着によって活性化される細胞内シグナル伝達について研究を続け、歯根膜細胞をアスコルビン酸で刺激すると歯根膜細胞の骨芽細胞様分化が促進し、この過程にI型コラーゲンの産生とインテグリンの結合が必要であり、さらにERK1/2が活性化することを明らかにした。近年、コラーゲンの受容体としてインテグリン以外にdiscoidin domain receptors(DDR)が見出され、骨・軟骨形成において大きな役割を持つことが示唆されている。しかしながら、歯周組織におけるDDRの発現、役割については報告されていない。そこで本研究の目的は、DDR1,2の歯根膜組織での発現及び作用を検討することである。結果は、以下の通りである。1.歯根膜細胞をERK1/2阻害剤で前処理後、骨芽細胞様分化誘導させると、歯根膜細胞のALP活性量は減少したが、その減少は部分的であった。2.1検体からの歯根膜細胞を培養後、リアルタイムPCRにより、DDR1,2の遺伝子発現を確認した。今後検体数を増やし、再現性を確認する。