hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
AQP1ノックアウトマウスを用いたリンパ節移植におけるリンパ節内循環機構の解明

リンパ浮腫に対する新たな治療法として近年リンパ節移植が注目されているが、その機序についてはまだ不明な点が多い。1つの仮説としてリンパ節移植によりリンパ管新生が促され、次にうっ滞するリンパ液が新生リンパ管により移植リンパ節に汲み上げられ、そしてリンパ節内の静脈との交通を介して排泄されることが推測される。またリンパ節内の水分動態にはaquaporin-1が関与しており、リンパ節移植においても重要な役割を果たしていることが推測される。そこで本研究では移植リンパ節がリンパ液をドレナージする機序を解明するためリンパ節内のhigh endothelial venulesに強く発現しているaquaporin-1に着目して行うリンパ浮腫モデルラット(n=3)と健常ラット(n=3)にそれぞれリンパ節移植を行い4週経過後に移植リンパ節を摘出しaquaporin-1の免疫染色を行った。移植リンパ節ではそれぞれaquaporin-1の発現は確認できたが、その発現量については大きな差異は見られない印象であった。また同時にリンパ浮腫モデルラットにおけるリンパ節移植(n=3)・非移植(n=3)時の組織水分量の測定を高感度角層膜厚・水分計ASA-MX100で行ったところ、組織水分量はリンパ節移植群の方が低い傾向にあった(リンパ節移植群:膝窩10.3μS、足底4.14μS、非リンパ節移植群:膝窩23.34μS、足底25.32μS)。本実験ではリンパ浮腫モデルラットでの移植リンパ節に、より多くのaquaporin-1が発現することを期待していたが、組織水分量の改善はあったにも関わらず発現量には明らかな違いは見られなかった。本研究ではリンパ節移植をnon- vascularizedで行っており、移植リンパ節の生着のばらつきによる影響があった可能性が懸念される。リンパ浮腫に対する新たな治療法として、近年リンパ節移植が注目されているが、その機序についてはまだ不明な点が多い。そこで本研究では移植リンパ節がリンパ液をドレナージする機序を解明するためリンパ節内のhigh endothelial venulesに強く発現しているaquaporin-1に着目して行う。当初aquaporin-1ノックアウトマウスを作成した上で、リンパ節移植を実施し実験を進める予定であったが、コンディショナルノックアウトマウスの作成が難航した。そのため、今回はノックアウトマウスを用いた実験を断念し、健常ラットを用いたリンパ節移植を通して、aquaporin-1の発現量と組織水分量の変化の関係性を調べることに変更することとした。まず過去の報告に則り、リンパ浮腫モデルラットの作成を行った。安定してモデル作成は可能であったが時間の経過である程度の後戻りが認められた。本実験では急性期・慢性期においての水動態の変化も観察したいため、今後はリンパ節移植の適切な時期について、組織水分測定器を利用して定量化しつつ検討を重ねる。ノックアウトマウス作成の手段を模索していたが、現状では困難との結論に至った。そのため実験計画の修正を余儀なくされ、健常ラットでの実験計画を策定し進めているところである。リンパ浮腫モデルラットの作成は安定して可能な状態だがリンパ節移植時期についてはまだ予備実験が必要である。並行して各種検査の予備実験は施行中である。次年度使用額はあるものの、比較的少額である。
核酸標的医薬の設計及びデリバリーシステムの開発

ヒトゲノムプロジェクトが終了し、改めて遺伝子に関心が集まっている。そこで、私はセントラルドグマの最上流に位置するDNAに対して高い配列認識能を持つPy-Imポリアミドに着目した。Py-Imポリアミドは転写因子などのタンパク質と比べると小さい分子量にも関わらず、転写因子と同程度のDNAとの結合力を有している。Py-Imポリアミドの配列認識能と結合力を用いて様々なアンチジーン薬剤の基礎研究が行われている。しかし、このPy-Imポリアミドをアンチジーン薬剤として応用する場合、いくつかの問題点がある。乳がん細胞であるSKBR-3等の細胞ではPy-Imポリアミドが細胞質で局在化してしまう。また、水溶性も薬剤として用いるためには十分ではない。したがって、アンチジーン薬剤として応用するためには、十分な水溶性とあらゆる細胞種で核内に局在化するほどの核透過性を兼ね備えることが理想である。そこで、申請者はナノサイズのヒドロゲルを形成するコレステロール置換プルラン(CHP)をドラッグデリバリーシステム(DDS)のキャリアとして用い、Py-Imポリアミドの問題点を解決する。CHPの細胞取り込み能を向上させるために、カチオン性基を導入したカチオン性CHPの合成を行った。実際に、牛血清アルブミンやβ-ガラクトシダーゼを細胞内の取り込みを行った。カチオン性CHPキャリアを用いた場合、市販されているタンパク質細胞内キャリアよりも効率よく細胞内に導入した。また、カチオン性CHPキャリアを用いた細胞内導入における酵素活性の有無の評価をβ-ガラクトシダーゼとその基質を用いて行った。その結果、CHPを用いた細胞内輸送の系ではタンパク質は活性を保持し、細胞内に導入されることがわかった。今後はカチオン性CHPを用いて細胞や生体におけるPy-Imポリアミドの徐放能の向上や標的部位への運搬を行う予定である。Py(ピロール)-Im(イミダゾール)ポリアミドは、塩基配列特異的に結合する。Py-Imポリアミドは塩基配列特異性が高いことから、転写因子の結合配列に結合することによりDNAの転写を阻害することがDervanらによって報告されている。しかし、Py-Imポリアミドは水溶性が著しく低いことや細胞特異性を持つことが知られている。一方、多糖に部分的に疎水性基を導入することによりナノサイズのヒドロゲル(ナノゲル)を形成することが秋吉らによって報告されている。このナノゲルは疎水性薬物やタンパク質などのキャリアとして有用であることも報告されている。本研究では、Py-Imポリアミドの細胞内取り込みキャリアとして疎水化ナノゲルを用い、Py-Imポリアミドの細胞特異性の排除及び徐放性の向上を目的としている。実験で用いるナノゲルはプルランにコレステリル基を導入したコレステロール置換プルラン(CHP)を用いた。しかし、CHPのみでは細胞内への導入効率が悪いために、細胞との相互作用を高めるためアミノ基を導入したカチオン性CHP(CHPNH_2)の合成を行った。CHPNH_2の細胞取り込み効率を調べるために疎水性タンパク質の細胞内導入を用いた。タンパク質は蛍光物質であるFITCを結合したbovine serum albumin及びチューブリン抗体を用いた。CHPNH_2は市販されているカチオン性リポソームやペプチドキャリアよりも効率よくタンパク質を細胞内に導入していることを確認した。今後は、Py-Imポリアミドの細胞取り込み効率が悪い細胞において、CHPNH_2ナノゲルを用いてPy-Imポリアミドの細胞内取り込み効率を観察する予定である。Py-lmポリアミドは二本鎖DNAに対し高い配列認識能を持っている。このことから特定配列の検出、特定遺伝子の抑制というように、アンチジーン薬剤として注目を集めている。しかし、このPy-lmポリアミドをアンチジーン薬剤として応用する場合、いくつかの問題点がある。乳がん細胞であるSKBR-3等の細胞ではPy-lmポリアミドが細胞質で局在化してしまう。また、水溶性も薬剤として用いるためには十分とはいえない。そこで、申請者はナノサイズのヒドロゲルを形成するコレステロール置換プルラン(CHP)を用いたドラッグデリバリーシステムを用い、上記の問題点を解決する。実際に、蛍光物質であるFITCを結合した牛血清アルブミンを細胞内の取り込みを行った。カチオン性CHPをキャリアとして用いた場合、市販されているタンパク質細胞内キャリアよりも効率よく細胞内に導入した。また、CHPを用いたタンパク質の細胞内導入の系におけるタンパク質の細胞内での活性の有無の評価ををβ-ガラクトシダーゼとその基質を用いて行った。今後はCHPを用いて細胞や生体におけるPy-lmポリアミドの徐放能の向上や標的部位への運搬を行う予定である。

乳がん細胞であるSKBR-3等の細胞ではPy-Imポリアミドが細胞質で局在化してしまう。また、水溶性も薬剤として用いるためには十分ではない。したがって、アンチジーン薬剤として応用するためには、十分な水溶性とあらゆる細胞種で核内に局在化するほどの核透過性を兼ね備えることが理想である。そこで、申請者はナノサイズのヒドロゲルを形成するコレステロール置換プルラン(CHP)をドラッグデリバリーシステム(DDS)のキャリアとして用い、Py-Imポリアミドの問題点を解決する。CHPの細胞取り込み能を向上させるために、カチオン性基を導入したカチオン性CHPの合成を行った。実際に、牛血清アルブミンやβ-ガラクトシダーゼを細胞内の取り込みを行った。カチオン性CHPキャリアを用いた場合、市販されているタンパク質細胞内キャリアよりも効率よく細胞内に導入した。また、カチオン性CHPキャリアを用いた細胞内導入における酵素活性の有無の評価をβ-ガラクトシダーゼとその基質を用いて行った。その結果、CHPを用いた細胞内輸送の系ではタンパク質は活性を保持し、細胞内に導入されることがわかった。今後はカチオン性CHPを用いて細胞や生体におけるPy-Imポリアミドの徐放能の向上や標的部位への運搬を行う予定である。
生理機能の発現と組換え機構

(1)細胞分化におけるDNAの再編成の機構。川市は、ショウジョウバエのRBP-Jκの遺伝が末梢神経系の発生に関与していることを、またマウスにおいては神経系を含む広範な組織の発生を調節する転写因子であることを示した。山岸は、マウスT細胞抗原レセプターα鎖J領域の上流から転写されるTEAを同定し、細胞分化の過程でα鎖遺伝子再配列に先行することを示した。大石は、従来のIGCR法に改良を加え、哺乳動物の1コピー/ゲノム以下のDNAの構造変化部位をクローニングする方法を確立し、酵母及びCHOゲノム中の特定遺伝子(ura及びAPRT)欠失部位の濃縮に成功した。(2)原核生物における遺伝子機能発現制御に関与する組換え機構。小林は、枯草菌のDNA再編成を引き起こす部位特異的組換え酵素の遺伝子spoIVCAが、胞子形成初期から中期の母細胞においてのみ機能するホロ酵素Eσ^Eによって転写されることを示した。駒野は、シャフロンのDNA再編成が、R64の接合伝達遺伝子群を強く発現している細胞では低く抑えられており、組換えが特殊な調節を受けていることを示唆した。(3)遺伝子の標的組み込みと非相同的組換え機構の解析。池田は、大腸菌のbio-λ領域における非相同組換えを解析する系を確立し、大腸菌recAとrecJ遺伝子の変異株において非相同組換えが減少することを見いだした。島田は、線状化したベクターDNAの両末端にヘアピン状のオリゴヌクレオタイドからなるキャップ構造を連結し、細胞内でのベクターの分解を防ぐことにより、標的遺伝子組換え体の選択の効率を飛躍的に上げる方法を確立した。町田は、AgrobacteriumのT-DNA、AcDNA転移因子、及び酵母の部位特異的組換え系を用いて植物遺伝子の突然変異を誘導する方法を開発した辻本は、遺伝性Fragile siteの分子構造を解明する目的で、第11染色体q13にマップされる遺伝性のFS(Frallq13.2)をモデルに選び、その脆弱部位のクローニングと構造解析を行った。
局所蛍光計測プローブによる核膜孔複合体を介した物質輸送・選別機構の1分子解析

本研究は、ガラスキャピラリや光ファイバを加工したプローブを用いて、"ひとつひとつの核膜孔複合体(NPC)"を対象にその輸送機能を計測するシステムを構築し、これまでの「部品」や「集団」に関する解析だけでは説明困難であった「個」のNPCにおける物質輸送の分子メカニズムに迫ることを目的とする。本年度は研究計画に従って研究を遂行し、これまでに下記の成果を得た。・ガラスキャピラリを加工することで先端開口100-300nmのプローブを作成し、この中に緑色蛍光タンパク質でラベルしたインポーティンβ(大腸菌で発現・精製)と、コントロールとして赤色でラベルしたグロブリンタンパク質を同時に充填した。HeLa細胞をジギトニンで処理して核膜を露出させ、マイクロマニピュレータを用いてこのキャピラリ先端を核膜上に接触させ、キャピラリ内の蛍光タンパク質が核内に移行する様子を経時的に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、接触後1時間で核内の緑色蛍光シグナル(インポーティンβ)がコンスタントに上昇したが、赤色のシグナル(グロブリンタンパク質)は全く上昇しなかった。一方で、キャピラリを接触させていない核では、どちらの蛍光シグナルも全く増加しなかった。このことは、キャピラリ内のインポーティンβが核膜上の核膜孔複合体を通過して核内に移行したことを示すものである。・長時間に及ぶ観察において、キャピラリが核膜表面からずれるという問題が頻発したため、倒立顕微鏡のステージ上にガラスキャピラリを安定に固定する特殊なホルダをデザインし、設置した。これにより、x, yおよびz方向のドリフトの軽減に成功した。本研究は、ガラスキャピラリや光ファイバを加工したプローブを用いて、“ひとつひとつの核膜孔複合体(NPC)"を対象にその輸送機能を計測するシステムを構築し、これまでの「部品」や「集団」に関する解析だけでは説明困難であった「個」のNPCにおける物質輸送の分子メカニズムに迫ることを目的とする。これにより、x,yおよびz方向のドリフトの軽減に成功した。
軽度知的障害及び学習障害等のある生徒に対する後期中等教育段階の支援に関する研究

本研究では、主としてLD,ADHD,高機能自閉症等の発達障害のある生徒の後期中等教育段階の教育的支援に関する国内の取り組みの現状と課題に関する調査及び海外の取り組みに関する調査を行った。本研究を通して,我が国の後期中等教育段階における支援の現状と課題について検討し,同時に海外の取り組みについて我が国の今後の取り組みの参考となる取り組みの例を整理することを目的とした。本年度は研究の最終年度であり,上記の内容について研究報告書を作成した。報告書には,都道府県及び政令指定都市の教育委員会と教育センターを対象とした質問紙調査の結果をまとめ,平成13年度に行った同様の調査結果と比較しながら考察を行った。平成13年度に行った同様の調査結果と比較すると,研修に参加する教員が増加していたり,取り組みが進められていたりする傾向があった。また,現在の取り組みとしては,後期中等教育機関の教員や管理職等を中心として,特別支援教育や障害の特性,または特別な支援の必要性に関する理解を促すことが最も必要な課題となっており,今後は,「支援体制の整備」「移行支援」「具体的な指導内容・方法の明確化」といったより具体的な支援に関する課題を整理し,支援の枠組みを作ることが必要であると考えられた。海外の取り組みからは,この段階で特に課題として考えられる就労に向けた移行支援について,オーストラリア南オーストラリア州で取り組まれている移行ポートフォリオに関する教師用マニュアルの和訳し紹介した。本年度は、文献の収集と日本及びオーストラリアの関連機関に対する実地調査を行った。これまでの研究及び文献から、後期中等教育段階においては、移行に向けた支援が重要な位置を占めていることが分かった。実地調査では、10月に静岡県東部養護学校伊東分校を訪問し、通常の高等学校の余裕教室を活用する試みに関して、通常の小学校、高等学校の中の余裕教室にできた経緯と教育活動、現状での通常の学校との交流、今後の方向性についてインタビューと資料の収集を行った。2月には、オーストラリア南オーストラリア州アデレード地区の軽度知的障害及び学習障害等のある生徒の後期中等教育段階における支援と中等教育段階以降への移行に向けた支援について資料収集およびインタビューを通した実地調査を行った。本年度は、文献及び実地調査から小中学校に比べ、後期中等教育段階において移行に向けた支援が重要となること、特に高等学校における移行に向けた支援において、自分の障害を含めた自分の長所と短所に対する認識を高めることが、就労等その後の自立に向けて重要な課題となることが分かった。文献の収集と日本及びオーストラリアの関連機関に対する実地調査を行うことによって、移行に向けた支援の重要性を探ることができた。今後は、我が国の後期中等教育段階における軽度発達障害のある生徒のニーズや現状で選られている支援について、実際の事例を追いながら明らかにしていく必要があると考えられる。本研究は、海外の通常の高等学校に在籍している軽度知的障害・学習障害等のある生徒への支援目的、内容、体制及び学校内外のリソースを含む支援のネットワーク等について分析し、後期中等教育段階における軽度知的障害・学習障害等のある生徒に必要な支援のあり方について検討することと同時に、我が国において行っている支援について、通常の高等学校等を対象とした調査を行い、我が国のそれぞれの後期中等教育機関での今後の教育やこれらの生徒への支援のあり方について考察することを主な目的とした。オーストラリア南オーストラリア州アデレード市における知的障害のある人を対象とした卒業後の進路や学習について、フリンダース大学,キャリアー・システム,地域のコミュニティーセンター等を訪問し,実地調査を行った。フリンダース大学,コインダ・コミュニティーセンター,カメドゥン・コミュニティセンター,キャリア・システムを訪問し,情報を収集した。フリンダース大学では,知的障害のある人が支援者(メンター)の補助を得て,大学の通常の科目を聴講生として受講するプログラムを実施していた。このプログラムの主な目的は,知的障害のある人の社会的ネットワークの形成であるということであった。また,LD等の障害のある学生に対しては,大学にディサビリティ・リエゾン・オフィサーという障害学生支援を行う職員がおり,相談とコーディネーションを行っていた。アデレード市のコミュニティーセンターでは,地域の人の生涯学習のための多様なプログラムを実施しており,知的障害のある人向けのプログラムがあったり,通常のプログラムの中に,知的障害のある人が参加したりしていた。
膝関節外傷と障害の予防法開発に向けた荷重下水平方向の下肢筋力評価と強化法の開発

本研究の目的は、スポーツ選手から高齢者まで幅広い対象の膝関節外傷・障害予防とリハビリテーションに貢献するため、立位の荷重下で両脚への並進方向の抵抗による下肢筋力評価とトレーニング方法を開発することである。目的達成のため、前後左右の並進方向の負荷を両脚に個別の強度で与え、床反力をコントロールして膝関節に不要な内外反や回旋の力を低減しながら、荷重下の下肢筋力(駆動力)を計測・強化できる運動装置とコンピュータ制御ソフトからなるシステムを開発する。また、足部の自然な動きを妨げず、かつ膝関節への負荷を低減するように揺動する足置き台を同時に開発する。平成29年7月、制御機構の考案の過程で、当初の予測に反し、仕様に適したマイコンが市販品にないことが判明し、制御機構の詳細設計と製作が行える業者を選定する必要が生じた。そのため研究に大幅な遅延を生じ、補助金を繰り越し、平成30年度においては平成29年度末までに進行した基本設計に続いて、1号機の詳細設計を開始し、1号機のハードウェアを製作した。これにより、荷重下で両脚同時に並進運動を行うことが可能となる。その後、ソフトウェアの外注先にてその調整が円滑に進行せず、完成が遅延している。このため、抵抗負荷を自由に調整できるシステムとしては完成できていない。その間、1号機について、揺動機構を持つ足置き台の開発・製作を達成した。1号機のソフトウェア完成の遅延に伴い、その評価試験は完遂していない。さらに2号機のハードウェア製作開始し、完成させた。平成29年度の遅延に加えて、平成30年度はソフトウェアの外注先にてその調整が円滑に進行せず、完成が遅延したことが主な理由である。そのため、ハードウェアは完成したがその抵抗負荷を適時調整するシステムとしては完成していない。本年度78月にはソフトウェアがバグ除去を含めて完成する予定であり、1号機・2号機ともに完成させて特性試験を開始する。以後、健常人による使用試験を実施し、試作機の抵抗負荷の量や質を調整したうえ、PCソフトのユーザビリティを改善する。完成した装置を使用して、健康人を対象に両脚での閉脚運動・開脚運動・前後交差運動などのシンプルな運動を行い、各脚に等速度制御下で並進方向の負荷を与える。各運動の抵抗量、運動速度、膝関節屈曲角度、ストライド(歩幅)などの条件を組み合わせて、膝関節負荷は最小で筋負荷は最大となる条件を検証する。生体運動計測には、研究分担者らが開発したウェアラブルな歩行解析システム(M3D歩行解析システム、テック技販社製)と表面筋電図(Noraxon社製、Myosystem)を用いる。本研究では、前後左右の並進方向の負荷を両脚に個別の強度で与え、床反力をコントロールして膝関節に不要な内外反や回旋の力を低減しながら、荷重下の下肢筋力を計測・強化できる運動装置とコンピュータ制御ソフトからなるシステムを開発する。これにより、立位の荷重下で両脚への並進方向の抵抗による下肢筋力評価とトレーニング方法を開発し、膝関節外傷・障害予防とリハビリテーションに貢献することを目的とする。平成29年7月までに、装置仕様の検討、制御機構の考案を行い、平成30年3月までに、基本設計、詳細設計の後、試作機1号機の製作を開始し、試作機1号機の完成後に特性試験を実施、その後、試作機2号機の製作を開始し、試作機2号機を完成する予定であった。しかし、平成29年7月、制御機構の考案の過程で、当初の予測に反し、仕様に適したマイコンが市販品にないことが判明し、制御機構の詳細設計と製作が行える業者を選定する必要が生じた。そのため、6ヶ月間の研究遅延を生じ、補助金を平成30年度に繰り越して計画を続行した。

平成30年度は1号機の詳細設計を開始し、そのハードウェアを製作した。これにより、これまでは困難であった、荷重下で両脚同時の並進運動に抵抗を与えることが可能となった。その後、ソフトウェアの外注先にてその調整が円滑に進行せず、完成が遅延している。その間、1号機について、足部の自然な動きを妨げず、かつ膝関節への負荷を低減するように揺動する足置き台の開発・製作を達成した。これにより、トレーニング中の床反力ベクトルの制御が容易になり、膝関節への不要な負荷が低減できると考えられる。1号機のソフトウェア完成の遅延に伴い、その評価試験は完遂しておらず、抵抗負荷を自由に調整できるシステムとしては完成できていない。さらに2号機のハードウェアを製作開始し、完成させたが、1号機と同様に評価試験を次年度に行う必要がある。平成29年度の遅延に加えて、平成30年度はソフトウェアの外注先にてその調整が円滑に進行せず、完成が遅延したことが主な理由である。そのため、ハードウェアは完成したがその抵抗負荷を適時調整するシステムとしては完成していない。本年度78月にはソフトウェアがバグ除去を含めて完成する予定であり、1号機・2号機ともに完成させて特性試験を開始する。以後、健常人による使用試験を実施し、試作機の抵抗負荷の量や質を調整したうえ、PCソフトのユーザビリティを改善する。完成した装置を使用して、健康人を対象に両脚での閉脚運動・開脚運動・前後交差運動などのシンプルな運動を行い、各脚に等速度制御下で並進方向の負荷を与える。各運動の抵抗量、運動速度、膝関節屈曲角度、ストライド(歩幅)などの条件を組み合わせて、膝関節負荷は最小で筋負荷は最大となる条件を検証する。生体運動計測には、研究分担者らが開発したウェアラブルな歩行解析システム(M3D歩行解析システム、テック技販社製)と表面筋電図(Noraxon社製、Myosystem)を用いる。令和1年78月にはソフトウェアがバグ除去を含めて完成する予定であり、1号機・2号機ともに完成させて特性試験を開始する。
ツバキ科種のアルミニウム集積機構の解明

アルミニウム集積に基づく耐性の分子構成要素の将来的な同定のために、アルミニウム超集積の鍵となる生理プロセスを発見する必要がある。私たちは、チャに代表される関連2科の8種の植物を調査し、7種の超集積植物の根の内皮細胞でプロアントシアニジン集積が共有されることを同定した。一方、調査対象の中の唯一の非アルミニウム集積種であるモッコク(Ternstroemia gymnanthera)では、ほとんどの通導木部においてプロアントシアニジン集積が認められなかった。葉の表現型と季節性の多様性にも関わらず、通導木部におけるプロアントシアニジン集積がこれらのアルミニウム超集積種間で共通の作用モードを持つ可能性が見いだされたことから、おそらくアルミニウムの長距離輸送がプロアントシアニジン輸送を伴うことが示唆された。しかしながら、アルミニウム集積性種の表現型の間の木部プロアントシアニジン含量にアルミニウム誘導パターンもアルミニウムとの分子化学量論のいずれも認められなかったことから、プロアントシアニジン以外の追加構成要素が木部のアルミニウム輸送に含まれる可能性があることがわかった。本成果は、定量的に木本植物種の特定科のアルミニウムおよびプロアントシアニジン集積パターンを分析した最初の包括的な研究となる。近縁種のアルミニウム集積の主要な生理学的プロセスに関するこれらの知見は、重金属、水と物質の長距離輸送、および葉の防御機構における有害金属超集積の分子進化と機能のより良い理解につながる可能性チャを含む特定植物の地上器官は、大部分の植物にとって有害なアルミニウム(Al)を多量に集積する。Al局在や共輸送における関与物質の実体を明らかにするため、本研究では、カテキン等が縮合したフラボノイド重合体であるプロアントシアジニン(PA)に着目し、ツバキ・モッコク科計8種の樹液におけるPA濃度と根および葉におけるPA分布を調べた。モッコク以外の7種全てで根内皮にPAが集積した。また、全種で木部道管と篩管近傍にPAが集積した。ヒメシャラでは根端から地上器官まで連続して内皮と木部道管および篩管にPAが集積した。一方、ツバキ科4種で根表面にPAは集積せず、モッコク以外のモッコク科3種で根端を含む全てで、モッコクで根端から約3 mmより基部側でPAが集積した。モッコク以外のツバキ科種全てで枝の木部道管と篩管にPAが集積したが、モッコクでは枝の篩管にのみにPAが集積した。葉では、ヒメシャラ・ナツツバキで背軸側、チャ・ヒサカキで向軸側の表皮細胞壁にAlが局在した。後者では葉表皮の細胞質領域にもAl分布が認められた。これらの種すべてで葉肉細胞および葉脈の通道組織にPAが分布した。モッコクでは主側脈の篩管のみPAが集積した。枝条の樹液のPA濃度は、Al集積性4種でAl非集積性種モッコクの10倍以上で、ヒサカキで最大だった。Alフリーで育成したヒメシャラ、ヒサカキ、サカキ苗の枝条の樹液のPA濃度は全て前述のAl集積性種と同レベルとなり、樹液のPAはAlによらず一定であることがわかった。水挿ししたヒサカキ切枝の樹液PA濃度は水挿し前の10%以下となり、地上部の樹液PAが根からの輸送に由来する可能性が示唆された。樹液のPA濃度はAl濃度よりも低かったことから、地上部へのPAとAl輸送に共輸送以外の要因が含まれる可能性が示唆された。近縁種のアルミニウム集積の主要な生理学的プロセスに関するこれらの知見は、重金属、水と物質の長距離輸送、および葉の防御機構における有害金属超集積の分子進化と機能のより良い理解につながる可能性酸性土壌で可溶化する過剰のアルミニウム(Al)は植物根の成長を阻害する。一方、チャを含む特定の植物は地上器官に多量のAlを集積して生育するが、このAl集積機構や輸送機構の詳細は不明である。チャの樹液ではAlとカテキンが複合体を形成するが、カテキンなどの重合体のプロアントシアニジン(PA)のAl輸送や集積における役割は明らかでない。ツバキ科8種のAl集積輸送の要因を明らかにするため、これらの樹液におけるPA濃度と根におけるPA分布を調べた。

モッコク以外のツバキ科7種で根の内皮にPAが集積した。また、全種で木部道管と篩管近傍にPAが集積した。ヒメシャラを詳細に調べたところ、内皮と木部道管および篩管のPA集積が根端から地上器官まで連続することがわかった。一方、根表面のPA集積はツバキ科4種になく、モッコク科3種で根端を含む全てで、モッコクで根端から約3 mmより基部側で認められた。モッコク以外のツバキ科種全てで枝の木部道管と篩管にPAが集積したが、モッコクでは篩管にのみだった。根の内皮と地上部の木部道管のPA集積がAl集積性ツバキ科種とモッコクの間で異なることがわかった。枝条の樹液のPA濃度は、Al集積性4種でAl非集積性種モッコクの10倍以上で、ヒサカキで最大だった。Alフリーで育成したヒメシャラ、ヒサカキ、サカキ苗の枝条の樹液のPA濃度は全て前述のAl集積性種と同レベルとなり、樹液のPAはAlによらず一定であることがわかった。水挿ししたヒサカキ切枝の樹液PA濃度は水挿し前の10%以下となり、地上部の樹液PAが根からの輸送に由来する可能性が示唆された。樹液のPA濃度はAl濃度よりも低かったことから、地上部へのPAとAl輸送に共輸送以外の要因が含まれる可能性が示唆された。ツバキ科種のアルミニウム(Al)集積を比較することで、地上部へのAl輸送に根のプロアントシアニジン(PA)の集積分布が重要な役割を果たす可能性を世界で初めて明らかにすることができた。さらに、樹液に含まれるPAがAlの地上部移行に関与する可能性を初めて明らかにすることができた。これらの発見はそれぞれ当初計画に基づく成果であり、計画ならびに進捗の妥当性を示していると考える。当初計画していたPAの構造解析が分析機器の導入が当初計画から遅れたため未実施であるが、平成24年度中に機器を導入する見込みとなっており、当該研究期間中に実施可能である。ツバキ科種根のAlとPAの生理生化学応答の検証を通じてAl輸送集積における内皮集積性PAの機能の作用機序を解明する。そのため、Al集積性の異なる種間のPA構造、Alとの結合性、AlーPA複合体の輸送特性、他のキレート物質との受け渡し能力、Alとの結合以外の修飾作用に着目する分析および評価試験を実施し、ツバキ科種のAl輸送におけるPAの実体を照射する。前年度ならびに本年度計画によって得られるデータを取りまとめ、Al輸送における内皮PAの機能を細胞内外の複合体形成、ローディングとアンローディングのリレー効果、結合以外の機能に絞り込んで考察する。これによりAl集積性ツバキ科種のPAとAl毒性、Al集積との関係を明らかにする。なお、別の予算で導入する予定であった質量分析装置の導入が遅れたため、分析用消耗品として計上した分の次年度使用額が発生したが、平成24年度中に機器を導入する見込みとなっており、これらの次年度使用額について<Al集積性の異なる種間のPA構造解析>ならびに<PAを介したAlリレー能力評価>における分析用消耗品として当該研究期間中に使用する計画である。<PAを介したAlリレー能力評価>チャにおけるAl形態が根と木部導管液中で異なる可能性が明らかにされている。ツバキ科種根の内皮PAが輸送時の異なるAl形態に関与するか明らかにするため、Al-PA複合体の結合力を共存物質との乖離試験から評価する。
ガングリオシド/リン脂質/蛋白質複合系の構造学的研究

糖蛋白質と共に細胞表面の「顔」としての様々な働きを担っている酸性糖脂質ガングリオシドは、糖鎖の多様性を通じて分子認識、細胞の分化・発生、免疫機能の発現等に関与していることが多数の生理学的・免疫学的研究により示されてきた。現在の課題は、細胞間認識における直接的関与、細胞と基質の接着の調節機能、細胞膜情報伝達調節機能等の機構解明であり、細胞のガン化、ガンの浸潤、転移等の極めて重要な課題を解決する鍵を握っていると考えられている。しかし、残念ながら、構造物性的研究では多量の試料を要するため、ガングリオシド分子の凝集系の構造、構造安定性・可変性、蛋白質との相互作用等に関する構造物性学的、物理化学的な知見は極めて乏しい状況にあった。そこで、本研究課題では、構造物性的な観点からガングリオシドの機能構造を明らかにする目的で、放射光X線及び中性子線を用いてガングリオシド分散系の溶媒条件をパラメーターとした構造安定性に関する研究を実施し、実験散乱曲線から凝集体の内部構造と表面電荷を直接評価可能な新たな解析法を開発して、温度変化に伴う糖脂質頭部領域の収縮と熱履歴、有効電荷の変化(ガングリオシドモノマーの解離度の変化)、糖鎖頭部領域の熱可逆的な多量の水の吐出・吸蔵等の極めて興味深い知見を得た。これらの結果は、細胞膜表面に存在するガングリオシド自身が外部環境の変化にダイナミックに応答し、生体膜の界面構造や表面電荷分布に局部的な変動や揺らぎを生じさせることを示唆し、また、蛋白質や高分子の膜界面への吸着、境界脂質で安定化された膜蛋白質の膜内充填状態や構造、膜蛋白質間相互作用などの変化を誘導する可能性も示唆している。また、細胞膜表面おける糖鎖による分子認識モデル系の研究(ガングリオシドミセルとモデル蛋白質との相互作用)を実施した結果、非特異的相互作用ながらモデル蛋白質表面とガングリオシド糖鎖の組み合わせの違いにより、複合体形成過程が著しく異なることなどを見い出した。(研究の目的)ガングリオシドは酸性糖質を含む糖鎖と炭化水素鎖をもつ複合糖脂質であり、原形質膜の外表面に存在し、糖蛋白質と共に細胞表面の「顔」としての様々な働きを担っている。ガングリオシド分子は細胞の分化・発生・成長の制御、免疫機能の発現等に関与していることが知られているが、現在のガングリオシド研究最大の課題は、細胞間認識に直接関与したり、細胞と基質の接着を間接に調節する機能、種々のレベルでの細胞膜情報伝達調節機能の解明である。本研究の目標は、ガングリオシド分子の生体膜における役割、ガングリオシド分子と特異的に反応する或種の抗体物質との相互作用、糖鎖を介した分子認識機構を、構造生物学の研究にとって極めて強力な手法である中性子散乱、放射光X線散乱を中心に、熱測定、NMR、光散乱等の物理化学的手法を相補的に利用して、生物物理学的観点から総合的に解明することにある。(現在までに実施された研究の経過と結果)

本課題代表者及び研究分担社は、ガングリオシドの溶液中での構造安定性と機能に関して、中性子散乱、放射光X線散乱、示差熱測定、NMR等の物理化学的実験手法と分子動力学的解析手法を用いて研究を推進し、その結果、ガングリオシドの水分散系での構造安定性に関して、通常の生体脂質とは著しく異なった性質を明らかにし、ガングリオシド親水性頭部及び疎水性脂肪酸側鎖の構造の基本構造に関して、詳細な情報を得た。すなわち、ガングリオシドが溶液中でミセル構造を取り、pH、温度、イオン強度の変化によりその形を変化させること、分子種による溶液構造の違い、糖鎖広がりと水和との関連等について知見を得て、一部は既に公表した(文献:1-4)。また、蛋白質との相互作用に関しても、蛋白質表面の糖鎖化学修飾の違いにより、複合体の構造及びその形成過程が著しく異なることを見いだし、結果の一部も公表した(文献:5)。現在までの研究経過を踏まえ、次年度(平成9年度)も十分な成果を得られるものと考える。(公表論文)(国際会議及び学会発表)2件:日本生物物理学会(1996.11.つくば市),日本物理学会(1997.3.29.名古屋市,発表予定)糖蛋白質と共に細胞表面の「顔」としての様々な働きを担っている酸性糖脂質ガングリオシドは、糖鎖の多様性を通じて分子認識、細胞の分化・発生,免疫機能の発現等に関与していることが多数の生理学的・免疫学的研究により示されてきた。現在の課題は、細胞間認識における直接的関与、細胞と基質の接着の調節機能、細胞膜情報伝達調節機能等の機構解明であり、細胞のガン化、ガンの浸潤、転移等の極めて重要な課題を解決する鍵を握っていると考えられている。しかし、残念ながら、構造物性的研究では多量の試料を要するため、ガングリオシド分子の凝集系の構造、構造安定性・可変性、蛋白質との相互作用等に関する構造物性学的、物理科学的な知見は極めて乏しい状況にあった。そこで、本研究課題では、構造物性的な観点からガングリオシドの機能構造を明らかにする目的で、放射光X線及び中性子線を用いてガングリオシド分散系の溶媒条件をパラメーターとして構造安定性に関する研究を実施し、実験散乱曲線から凝集体の内部構造と表面電荷を直接評価可能な新たな解析法等を開発して、温度変化に伴う糖脂質頭部領域の収縮と熱履歴、有効電荷の変化(ガングリオシドモノマーの解離度の変化)、糖鎖頭部領域の熱可逆的な多量の水の吐出・吸蔵等の極めて興味深い知見を得た。これらの結果は、細胞膜表面に存在するガングリオシド自身が外部環境の変化にダイナミックに応答し、生体膜の界面構造や表面電荷分布に局部的な変動や揺らぎを生じさせることを示唆し、また、蛋白質や高分子の膜界面への吸着、境界脂質で安定化された膜蛋白質の膜内充填状態や構造、膜蛋白質間相互作用などの変化を誘導する可能性も示唆している。また、細胞膜表面おける糖鎖による分子認識モデル系の研究(ガングリオシドミセルとモデル蛋白質との相互作用)を実施した結果、非特異的相互作用ながらモデル蛋白質表面とガングリオシド糖鎖の組み合わせの違いにより、複合体形成過程が著しく異なることなどを見い出した。
TP53 signatureの診断キット開発と検証のための後ろ向き観察研究

本研究の目的はTP53 signatureの臨床応用を目指し、簡便な診断キットの開発を行うことである。nCounterを用いたTP53 signatureのプローブセットを作成した。Stage I-IIの早期乳がんコホート(n=174)を用いて、TP53 signatureを取得した。単変量および多変量解析の結果からTP53 signatureが最もRFSと関連する因子であることが明らかとなった。また、網羅的遺伝子発現解析を行い、Mammaprint、OncotypeDXおよびPAM50と予後予測性の比較を行ったところ、TP53 signatureがもっとも予後の予測性が高いことが示された。我々が開発したTP53 signatureは予後および術前化学療法の治療効果の予測性が非常に高く、臨床的有用性が高い。本研究はこれまでの研究の出口戦略として、TP53 signatureの臨床応用を目指し、簡便な診断キットの開発を行うものである。また、その診断キットを利用したデータ検証のための後ろ向き観察研究を行うものである。27年度は、「早期乳がんを対象としたnCounterによるTP53 signatureの診断精度の検討」として、TP53 signature診断キットのプローブセットの作成を行った。作成したプローブセットを用いて、東北大学病院コホート25例について遺伝子発現データを取得した。この遺伝子発現データはこれまでの研究で取得済みのRT-PCRのデータとの良好な相関が確認された。また、星総合病院コホートおよび宮城県立がんセンターコホートについても、同プローブセットを用いて遺伝子発現データの取得を開始した。これらのコホートにおいては凍結組織由来のRNAとホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織由来のRNA間でのデータの取得が可能であり、その相関性についても確認していく予定である。また「術前化学療法施行症例検体の収集とnCounterによるTP53 signatureデータの収集」として、術前化学療法を行った症例に対する後ろ向き観察研究を実施するため、研究計画書を作成を開始した。今後、東北大学病院乳腺外科と協議の上、平成28年度の早期に倫理申請を行った上で、症例の収集および解析を開始する予定である。本研究計画は、「A.早期乳がんを対象としたnCounterによるTP53 signatureの診断精度の検討」および「B.術前化学療法施行症例検体の収集とnCounterによるTP53 signatureデータの収集」の2つの計画から成り立っている。Aについては、TP53 signatureを構成する33遺伝子および内部コントロール5遺伝子程度でプローブセットを作成することを予定していた。予定通り、33遺伝子+内部コントロール5遺伝子のプローブセットを作成した。33遺伝子中1遺伝子でシグナルデータが得られないことが明らかとなったが、32遺伝子は良好な発現データが得られることを確認した。また内部コントロールは全て良好なシグナルが確認できた。データの精度の確認のため、東北大学病院コホートでRT-PCRデータとの相関性の確認を行った。計25検体を用いて検討を行い、良好な相関性が確認された。また、収集済みの星総合病院コホートおよび宮城県立がんセンターコホートでも既に遺伝子発現データの取得を開始している。これらのことからA.に関しては概ね順調に進展していると考えている。Bに関しては、新規に術前化学療法を行った症例を収集する必要があるが、この研究については改めて研究計画書を作成し、倫理申請を行うこととした。このため、現在まで検体の収集は開始出来ていないが、研究計画書を作成はほぼ終了しており、平成28年5月までには倫理申請を行う予定としている。本研究は後ろ向き観察研究であることから、検体収集は容易であり、倫理委員会の承認が得られ次第、検体収集を開始する予定である。以上より、概ね順調に進展していると判断した。28年度は「早期乳がんを対象としたnCounterによるTP53 signatureの診断精度の検討」として、東北大学病院コホートから得られたTP53 signatureデータよりTP53ステータスを診断するカットオフ値(0.78)を設定した。28年度末までに星総合病院コホートおよび宮城県立がんセンターコホート175例のTP53 sigantureデータを取得した。同症例にカットオフ値0.78を用いて、TP53ステータスを診断したところ、変異型93例、野生型110例であった。変異型群と野生型群を比較するとER、PgR、HER2、組織学的悪性度、腫瘍径および臨床病期において有意差を認め、これらは既報と矛盾のない結果であった。またStage I-IIの症例171例について野生型と変異型群の無再発生存期間を比較したところ、変異型で有意に予後不良であった(P=0.01;Log-rank検定)。「術前化学療法症例を対象としたTP53 signatureと効果予測性の検証」として、東北大学病院乳腺外科との共同研究として、術前化学療法を実施したトリプルネガティブ乳がんを対象とした後ろ向き観察研究(「トリプルネガティブ乳癌の間質における腫瘍免疫・血管新生因子が薬物治療感受性に及ぼす影響の研究」の付随研究)の倫理委員会の承認を得、研究を開始した。平成28年度末までにトリプルネガティブ乳がん症例43例の検体を入手し、RNAの抽出を行った。

本研究計画は「A.早期乳がんを対象としたnCounterによるTP53 signatureの診断精度の検討」および「B.術前化学療法症例を対象としたTP53 signatureと効果予測性の検証」の2つの計画から成り立っている。A.においては、平成28年度以降の計画として、1)TP53ステータスを診断するカットオフ値を設定する、2)星総合病院および宮城県立がんセンターのコホートについて、TP53 signatureデータの取得、3)TP53ステータスの診断、4)TP53ステータスと臨床病理学的因子の関連性の検討、5)TP53ステータスによる予後の比較、を予定していた。前述の通り、上記の全ての解析を予定通り実施、完遂した。B.においては、平成28年度以降の計画として、1)研究計画の倫理委員会の承認取得、2)術前化学療法施行検体の収集、3)TP53 signatureデータの取得、4)TP53ステータスの診断、5)TP53ステータスと術前化学療法の治療効果のおよび予後の関連性の検討、を予定していた。H28年度末までに、1)を終了し、2)を開始している。症例は150例を目標に収集する予定であるが、前述の通り、平成28年度末までに43例の検体が入手できた。以上より、研究は概ね順調に進展していると評価した。我々が開発したTP53 signatureは予後および術前化学療法の治療効果の予測性が非常に高く、臨床的有用性が高い。本研究はこれまでの研究の出口戦略として、TP53 signatureの臨床応用を目指し、簡便な診断キットの開発を行うものである。また、その診断キットを利用したデータ検証のための後ろ向き観察研究を行うものである。nCounterを用いたTP53 signatureのプローブセットを作成した。TP53ステータスが既知のコホート(n=30)を用いてTP53 signatureデータを取得し、TP53ステータスを診断するカットオフ値(0.78)を設定した。Stage I-IIの早期乳がんコホート(n=174)を用いて、TP53 signatureを取得した。その結果、変異型64例、野生型110例であった。両群において、Stageに有意差は認めなかったが、ER、PR、HER2、Gradeには統計学的有意差を認めた。また、術後補助化学療法は変異型群で、術後補助内分泌療法は野生型群で実施率が高かった。無再発生存期間(RFS)では、TP53 signatre、Stage、リンパ節転移の有無において予後に有意な差を認めたが、多変量解析の結果からはTP53 signatureが最もRFSと関連する因子であることが明らかとなった。
戦後都市空間の形成と景観特性に関する研究

本研究は、当初は、戦災復興計画によって都市改造が行われた都市、非戦災都市、戦後の都市計画事業によって市街地改造が行われた都市の3つに分類していたが、戦災復興計画と戦後の都市改造事業を創造型とし、非戦災都市として伝統的なまちなみの保存活動に力を入れている都市を保全型、修理修景等によりまちなみの再生を図っている都市を再生型として再分類した。これにより地方都市の街路空間の景観特性を3つの地域類型に分類することができ、未だ景観整備の方向性が定まっていない地域に対してある程度の方向性を示すことができた。特に、色彩や形態意匠における統一性について以下のような有意義な知見を得ることができた。色彩では、保全型や再生型で、多様度指数が0.50以下の街路において伝統的建造物が集中しており、まちなみとして評価されており、今後伝統的建造物を内包する保全型や再生型においては0.50以下を確保していくことが重要だと明示した。一方で創造型においては、多様性が高くなっていたが、街区単位でみてみると統一性が確保できている街区があり、今後市街地の統一性や調和を確保していく上では街区単位による統一性が重要だと明示した。形態の統一性では、保全型では建築物自体はそろっていないものの塀の形態や素材を統一させることで美しいまちなみとして評価されていることから、市街地でも同様に二階以上の部分を統一させることといった一部分の統一を確保していくことの重要性を指摘した。このようにまちなみとして評価されにくい市街地の街路空間も多様性のなかに部分的な統一性を織り交ぜていくことで、評価することが期待できる。これは、戦後につくられた都市計画の遺産の保存にもつながると考えられる。今までの景観研究では、1つの地域に限った研究が多く、複数の地域を類型化し、景観整備の方向性を示唆した研究はないため、本研究は意義があるといえる。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、「地方都市における戦後の都市空間と景観特性」を中心に研究し、その成果を論文として発表した。「地方都市における戦後の都市空間」に関しては、戦後の都市計画史の代表である戦災復興計画によって都市改造が行われた岡山市に関する論考を、『日本建築学会計画系論文集』に投稿し、採択された(掲載は次年度5月号)。この論文では、行政による建築物のセットバックの要請(「お願い」)によって後退した建築物群が中心市街地に密集しており、それらが特徴的な都市空間を形成していることを明らかにした。壁面後退の代表的手法として知られる総合設計制度のような公開空地を確保することで容積率の水増しや斜線制限の緩和などの措置がとられるボーナス制度ではなく、「お願い」による要請は、緩和措置がなく無償で後退させるものである(セットバック方式)。このような全国的にも例をみない緩和措置のない壁面後退によるセットバック方式による街路空間の整備手法と空間特性について明らかにした。また、セットバックされた建築物群によって生み出された空間の経緯、課題、整備・活用についても詳しく精査した。「景観特性」に関しては、「県庁所在地の駅前における景観形成基準」と題して『日本建築学会中国支部研究発表会』にて共著で2報発表した。この論文では、全国の中心市街地が戦後の建築物群で形成されていることに着目し、各都道府県庁所在地の中心市街地である駅前の街路空間を中心に検討した。都道府県庁所在地の代表駅の駅前は、各都道府県の都市を代表するものであり、駅を利用する人や観光客がそのまちを訪れたときに、最初に目にする重要な空間である。このような戦後の重要な街路空間の景観特性について、景観計画をもとに整理した。この発表に基づいた論文は、現在執筆中である。都道府県庁所在地における景観政策に関する資料を収集・整理し、実際に全国の都道府県庁所在地の代表駅周辺の景観調査を実施した。対象都市の1つである岡山市の街路空間を明らかにした。この研究は、日本建築学会計画系論文集に投稿し、採択された。そのため、1年目の計画は、おおむね順調に進展していると考える。

このようにまちなみとして評価されにくい市街地の街路空間も多様性のなかに部分的な統一性を織り交ぜていくことで、評価することが期待できる。これは、戦後につくられた都市計画の遺産の保存にもつながると考えられる。今までの景観研究では、1つの地域に限った研究が多く、複数の地域を類型化し、景観整備の方向性を示唆した研究はないため、本研究は意義があるといえる。今後は、各都道府県庁所在地の景観計画を整理し、類型化していく。そのうえで、対象都市の都市計画史を明らかにし、中心市街地の景観特性の評価・分析を行う。景観特性の分析方法として、現在マンセル表色系による現地調査を予定している。都市の特徴に合わせて、そのほかの景観構成要素についても調査する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ソマトスタチン受容体遺伝子2型と5型のホルモンによる転写調節機構の解析

ラット下垂体では、5種類のソマトスタチン受容体サブタイプ(sst1-5)遺伝子の中で、主に5型と2型が発現し、エストロゲンの慢性投与では2型が誘導され、5型は顕著に減少することを私達は報告してきた。本研究は、2型と5型遺伝子のプロモーター解析と、転写調節の解析から、両サブタイプの下垂体における機能や発現調節の生理的意義を明確にすることを目的として行われ次に示す結果を得た。1、5'隣接上流域をPCR法で2型は転写開始点から約4Kbp、5型は約3Kbpを単離した。2型、5型共に、5'側非翻訳部に約5Kbpのイントロンが存在していた。TATAboxやCCAATboxを持たず、Sp1、CREなどの結合モチーフが存在していた。2、5'上流配列のプロモーター解析から、両型共に転写開始点上流近位に強いプロモーター活性を、遠位に転写を負に調節するような配列の存在が推測された。3、ゲルシフト法により、2型、5型、プロモーター領域でトランスに働く転写因子群を明らかにした。更に、部位特異的変異法ほ用いて、プロモーター活性に必要とされるシスのエレメントを明確にした。GH_3細胞では2型遺伝子のSp1サイトにSp2、Sp3が、cAMP応答エレメントにATF-2、c-Junが結合し、5型遺伝子ではSp1サイトにSp2、Sp3の結合を認めた。4、両遺伝子の5'上流域には典型的なエストロゲン応答配列は認めなかったが、エストロゲンは5型の転写を負に調節した。Pit-1の共発現はエストロゲン作用に抑制的に作用した。2型遺伝子ではエストロゲンの正の調節はCREサイトを介して認められた。下垂体の発生分化に関わる転写因子Ptx1は、両遺伝子5'上流領域に作用し、転写活性を正に調節した。以上、ソマトスタチン受容体2型、5型遺伝子の転写に機能するシス配列とトランスに働く転写因子を明らかにし、下垂体特異的転写因子による転写活性の修飾を示唆した。また、エストロゲンは両型の遺伝子転写を修飾するが、その作用機序は両型で異なっていることが推測された。ラット下垂体で発現しているソマトスタチン受容体は、結合特性やmRNA量から、主に、5型と2型であること、2型や5型のmRNAレベルは、エストロゲンや甲状腺ホルモンなどホルモンにより変動することを、私達はこれまで報告してきた。本研究は、2型と5型サブタイプ遺伝子の5'隣接上流域のプロモーター解析と、ホルモン受容体など転写調節因子による転写調節の解析から、両サブタイプの下垂体における機能や発現調節の生理的意義を明確にすることを目的としている。本年度の研究から次に示す結果を得た。(1)受容体遺伝子5'隣接上流域をPCR法で単離したところ、2型、5型の両遺伝子共に、5'側非翻訳部に約5Kbpのイントロンが存在していた。転写開始点は5゚-RACEで調べた限りでは、2型は複数個、5型は1個存在していた。2型遺伝子は転写開始点から約4Kbp、5型遺伝子は約3Kbpの5゚上流域の塩基配列を決定した。

いづれも、TATA boxを持たず、Spl、AP2、CREなどの幾つかの結合モチーフの存在が認められた。核内ホルモン(エストロゲン、甲状腺ホルモン、グルココルチコイドなど)受容体の典型的応答配列は認められなかったが、それらのhalf siteは複数個認められた。また、下垂体特異的転写調節因子Pit-1の典型的結合配列も認められなかった。(2)ルシフェラーゼをレポーターとして、5'上流配列の機能解析を行なったところ、両型共に転写開始点上流の近位に強いプロモーター活性が、遠位に転写を負に調節する配列の存在が推測された。現在、Pit-1などの下垂体特異的転写調節因子や、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体などの発現ベクターを準備し、これら転写調節因子が2型や5型遺伝子の転写調節に関与するか否かについて検索中である。ソマトスタチン受容体には5種類のサブタイプ(sst1-sst5)遺伝子が存在する。正常雄ラット下垂体では、主に5型と2型が発現していること、エストロゲンの慢性投与で2型が誘導され、5型は顕著に減少することを私達は報告してきた。本研究は、2型と5型遺伝子の5'隣接上流域のプロモーター解析と、ホルモン受容体など転写調節因子による転写調節機構の解析から、両サブタイプの下垂体における機能や発現調節の生理的意義を明確にすることを目的としている。本年度は次に示す結果を得た。(1)ゲルシフト法により、2型、5型プロモーター領域のトランスに働く転写因子群とそれらの認識部位を明らかにした。更に、部位特異的変異法を用いて、プロモーター活性に必要とされるシスのエレメントを明確にした。GH_3細胞では2型遺伝子のSp1サイトにはSp2、Sp3が結合し、cAMP応答エレメントにはATF-2/c-Junが結合することがわかった。5型遺伝子では遠位のSp1サイトにSp2、Sp3が転写調節因子として作用していることがわかった。(2)2型、5型、両遺伝子の5'上流域には典型的なエストロゲン応答配列は認められなかったが、エストロゲンは5型遺伝子の転写に負の調節を示した。下垂体特異的転写調節因子Pit-1の共発現はエストロゲン作用に抑制的に働き、Pit-1レベルが発現に強く影響することを明らかにした。2型遺伝子は、Pit-1の有無にかかわらず、エストロゲンは正の調節を示した。下垂体の発生分化に関わる転写因子Ptx1は、2型と5型の両遺伝子5'上流領域に作用し、転写活性を正に調節することがわかった。以上、本研究から、ソマトスタチン受容体2型、5型遺伝子の転写に機能するシス配列とトランスに働く転写因子を明らかにし、下垂体特異的転写因子による転写活性の修飾を示唆した。また、エストロゲンは両型の遺伝子転写を修飾するが、その作用機序は両型で異っていることが推測された。