hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ファンコニ貧血修復経路を分子標的とした脳腫瘍アルキル化剤の増感効果の検討

テモゾロミド(TMZ)、ニムスチン(ACNU)は悪性グリオーマ(膠芽腫、退形性星細胞腫)の化学療法に使用されるアルキル化剤である。これらの治療効果は薬剤抵抗性の獲得のために限界がある。薬剤抵抗性のメカニズムには、多くのDNA修復経路が関与し、薬剤効果はその寄与に強く左右されることが示唆されてきた。TMZおよびACNUによるDNA損傷の修復にDNA-DNA鎖間修復として知られているFanconi anemia修復経路が関与し、その因子であるFANCD1が増感の標的候補となることが明らかになった。悪性脳腫瘍の治療効果の向上を目指し、ファンコニ貧血[Fanconi anemia(FA)]修復経路がアルキル化剤のテモゾロミド(TMZ)および塩酸ニムスチン(ACNU)の増感の分子標的候補となるかどうかを明らかにすることを目的とした。そのために、ノックアウトマウスから確立されたMEF細胞FANCA-/-、FANCC-/-、FANCD2-/-、Chinese hamsterovary細胞由来のFANCD1mt、Chinese lungfibroblast細胞由来FANCGmtおよびそれぞれの親株細胞を用いて、TMZ、ACNUを培地中に添加して3時間、37°C処理し、コロニー形成法にて生存率を算出した。それぞれの細胞のD_<50>(50%生存率の薬剤濃度)を正常型のD_<50>と比較し、%表示した相対的D_<50>値を用いて細胞間で比較検討した。その結果、FANCGmt、FANCD1mtのTMZの相対的D_<50>値は13.3%、4%を示した。FANCGmt、FANCD1mtのACNUの相対的D_<50>値は10%、5.7%を示した。相対的D_<50>値はTMZおよびACNUでFANCD1mtが最小となった。FANCD1はグリオブラストーマをTMZおよびACNUで治療する際の増感の標的候補となることが示唆された。このことから、薬剤の増感の標的となるFANCD1のsiRNAを、ヒトグリオブラストーマA172細胞に導入し、TMZおよびACNUによる殺細胞効果が増感するのかを検討する。TMZおよびACMIの感受性にかかわるFA修復経路の中で、FANCD1はグリオブラストーマをTMZおよびACNUで治療する際の増感の標的候補となることが示唆された。このことから、薬剤の増感の標的となるFANCD1のsiRNAを、ヒトグリオブラストーマA172細胞に導入し、TMZおよびACNUによる殺細胞効果が増感するのかを検討してみた。その結果、FANCD1のノックダウンによって、TMZおよびACNUの殺細胞効果は著しく増感されることが確認できた。FA修復経路を介して、Homologous Recombination (HR)修復が進むことが知られているので、TMZおよびACNU処理後に生じたDNA損傷がHR修復経路によって修復されるかどうかをRecombination Assay (Hellday T, et al, Carcinogenesis 19 : 973-978, 1998.)によって調べた。その結果TMZおよびACNU処理後、Homologous Recombination (HR)修復が誘導されることが確認できた。さらに薬剤の増感の標的となるFANCD1のsiRNAを、A172細胞に導入した場合TMZおよびACNU処理後、HR修復経路にどのように影響するかを免疫細胞染色法によってHRの因子であるRad51のfociを定量的に数えて検討した。A172細胞にFANCD1 siRNAを導入し、TMZおよびACNUの処理をするとNegativecontrolsiRNAを導入した細胞に比べて著しくRad51のfoci形成が抑制された。結論として、FANCD1をノックダウンすると、HR修復が抑制されることによりTMZおよびACNUの殺細胞効果の増感が得られることが明らかになった。
完全ＷＫＢ解析によるパンルヴェ方程式の２点変わり点問題の研究

完全WKB解析の観点からパンルヴェ方程式の2点変わり点問題とその応用について研究を行った.すでに私が解析した第2型,および第3型のパンルヴェ方程式に対する2点変わり点問題に対する結果を全てのパンルヴェ方程式に対して拡張する枠組みとして, (形式解のレベルでは)ストークスセグメント上でのパンルヴェ方程式を上記の第2型や第3型の方程式に局所的に変換できることを示した.この結果は学術雑誌Publications of RIMSにアクセプトされ,近日中に掲載される予定である.この結果から,全てのパンルヴェ方程式のストークスセグメントに関わるストークス現象を記述する接続公式は第2型や第3型に対して私が得た公式から従うと期待できる.一方で,共同研究者とともに,完全WKB解析と, (解析学とは一見無縁な)団代数との関係性の研究も行った.上述のようなストークスセグメントに関わるストークス現象を記述する公式が,実は団代数を定義する際に重要な変異そのものであることを見出し,団代数における様々な概念を微分方程式論的に実現することができた.この結果はJ. Phys. A: Math and Theoに掲載されており,また研究集会等での講演も多数行った.このように一見異なる分野間の関係性を見出すことは,全く異なる視点からの研究を可能にすると期待できる.例えば,応用として完全WKB解析におけるStokes自己同型のなす恒等式が,団代数の持つ周期性という顕著な性質から従うことも明らかになった.今後は逆に,完全WKB解析の手法を用いて団代数の構造解析を行うことが重要な課題であろう.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究題目にある「パンルヴェ方程式の2点変わり点問題」の研究に取り組み、以下の結果を得た:2完全WKB解析とクラスター代数の関係の発見(名古屋大学の中西知樹准教授との共同研究).まず1について説明する.Stokes segmentとは2つの変わり点を結ぶStokes曲線のことであり,研究題目の「2点変わり点問題」を論じる上で最も基本的な考察対象である.特に, Stokes segrnentに関連して微分方程式の解に起こる「パラメトリックStokes現象」の解析は本研究の目的であった. 1の主結果は,「全てのパンルヴェ方程式は, Stokes segment上である変数変換により第II型のパンルヴェ方程式に変換される」ことを示したことである.この意味で標準形である第II型のパンルヴェ方程式の2点変わり点問題やパラメトリックStokes現象は,既に私の修士論文で研究されている.従って, 1の結果は「Stokessegmentに関連してパンルヴェ方程式の解に起こるパラメトリックStokes現象は,私の修士論文の結果を用いて記述できる」ということを示唆している.この結果は論文にまとめ,学術雑誌に投稿中である.次に2について述べる.クラスター代数の専門家である中西知樹氏と協力し, 2階線形上微分方程式の完全WKB解析の理論とクラスター代数の理論を結びつけることに成功した.これは申請書には記載しなかった内容だが,研究題目と密接に関わるので取り組んだ.実際, 2点変わり点問題において重要な上述のStokes segmentやパラメトリックStokes現象が完全WKB解析とクラスター代数を結びつける上で本質的な役割を果たしている.クラスター代数は解析学とは-見無縁な研究対象であったので,今回の発見は今後様々な応用を生むと期待される.この結果は論文としてまとめ,学術雑誌に投稿中である.完全WKB解析の観点からパンルヴェ方程式の2点変わり点問題とその応用について研究を行った.すでに私が解析した第2型,および第3型のパンルヴェ方程式に対する2点変わり点問題に対する結果を全てのパンルヴェ方程式に対して拡張する枠組みとして, (形式解のレベルでは)ストークスセグメント上でのパンルヴェ方程式を上記の第2型や第3型の方程式に局所的に変換できることを示した.この結果は学術雑誌Publications of RIMSにアクセプトされ,近日中に掲載される予定である.この結果から,全てのパンルヴェ方程式のストークスセグメントに関わるストークス現象を記述する接続公式は第2型や第3型に対して私が得た公式から従うと期待できる.一方で,共同研究者とともに,完全WKB解析と, (解析学とは一見無縁な)団代数との関係性の研究も行った.上述のようなストークスセグメントに関わるストークス現象を記述する公式が,実は団代数を定義する際に重要な変異そのものであることを見出し,団代数における様々な概念を微分方程式論的に実現することができた.この結果はJ. Phys. A: Math and Theoに掲載されており,また研究集会等での講演も多数行った.このように一見異なる分野間の関係性を見出すことは,全く異なる視点からの研究を可能にすると期待できる.例えば,応用として完全WKB解析におけるStokes自己同型のなす恒等式が,団代数の持つ周期性という顕著な性質から従うことも明らかになった.今後は逆に,完全WKB解析の手法を用いて団代数の構造解析を行うことが重要な課題であろう.26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は「WKB解析的変換論」の構築が目標であり,それは達成されている.ただし,ある種類のStokes segmentに関わるパラメトリックStokes現象の解析が手付かずのまま残ってしまった.またStokesグラフの性質についても期待していたような深い理解は得られなかった.

一方で,クラスター代数との関係のような,申請の段階では全く予想していなかったいくつかの副産物も結果として得ることができた.最終目標のパラメトリックStokes現象を記述する公式の厳密な導出に向けて研究を進める.問題点は,昨年得られた変換論が,具体的にどの解たちを結びつけるか?という部分の理解が甘いことである.この問題について,昨年の研究の中でいくつかの予想が得られているので,多くの例を計算して問題を解決したい.また,上述の「ある種類のStokes segmentに関わるパラメトリックStokes現象の研究」も進める.標準形となるタイプのパンルヴェ方程式の見当はついており,その標準形への変換論は昨年の結果と同様に得られるであろう.また,パンルヴェ方程式の楕円漸近解と完全WKB解析における2-パラメータ解の関係を探る、この問題において,最近Lisovyy氏らが研究している「パンルヴェ方程式のタウ函数の展開の明示的な公式」の理解が重要であると考えている.Lisovyy氏も私のクラスター代数の結果に興味を持っているようなので,今後は積極的に研究打ち合わせを行いたい.
血管内皮・血管平滑筋における容量性カルシウム流入に対する揮発性麻酔薬の影響

平成16年度は、血管内皮細胞における容量性カルシウム流入に対する揮発性麻酔薬の影響を検討した。カバーグラス上に定着させたウシ大動脈由来培養血管内皮細胞をFura-2でインキュベートした後、密閉性の高いclosed chamberに装着した。Ca^<2+>freeのHEPES-bufferにて潅流し、Thapsigargin10^<-7>Mを投与して小胞体内Ca^<2+>を枯渇させた。潅流液中のCa^<2+>濃度を2.2mMに上昇させることにより容量性Ca^<2+>流入を引き起した。Ca^<2+>freeのHEPES-bufferとCa^<2+>2.2mMのHEPES-bufferを交互に還流させることにより、再現性のある容量性Ca^<2+>流入が得られた。ハロタン、およびセボフルラン(2MAC)を適用することにより、容量性Ca^<2+>流入は有意に抑制された。抑制の強さは、ハロタン>セボフルランであった。容量性Ca^<2+>流入の調節に関与していると考えられているProtein kinase Cの阻害薬であるBIS-1 3x10-6Mの前適用により、ハロタンの抑制作用は有意に拮抗された。一方、セボフルランの抑制作用は、BIS-1の影響を受けなかった。平成17年度は、ウシ大動脈由来培養血管平滑筋細胞を用いて同様の実験を行った。ハロタン、イソフルランあるいはセボフルラン(13MAC)に暴露させた血管平滑筋細胞で同じ測定を行ったところ、ハロタン>イソフルラン>セボフルランの順で、それぞれ濃度依存性に容量性Ca^<2+>流入を抑制した。次に、BIS-1 3x10-6Mの前適用によりハロタンによる容量性Ca^<2+>流入の抑制が拮抗されたが、イソフルラン、セボフルランの抑制作用には影響しなかった。以上の結果より、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞において、揮発性麻酔薬は濃度依存性に容量性Ca^<2+>流入を抑制し、その抑制作用にはProtein kinase Cに対する作用の関与が示唆された。本年度(平成16年度)は、血管内皮細胞における容量性カルシウム流入に対する揮発性麻酔薬の影響を検討した。Ca^<2+>freeのHEPES-bufferにて潅流し、Thapsigargin10^<-7>Mを適用して小胞体内Ca^<2+>を枯渇させた。潅流液中のCa^<2+>濃度を2.2mMに上昇させることにより容量性Ca^<2+>流入を引き起こした。

1)揮発性麻酔薬の影響ハロタンおよびセボフルランをそれぞれ2MACの濃度で適用することにより、容量性Ca^<2+>流入は有意に抑制された。(ハロタン;コントロールの70%、セボフルラン;コントロールの90%)2)PKC阻害薬の影響容量性Ca^<2+>流入の調節に関与していると考えられているProtein kinase Cの阻害薬であるBIS-1 3x10-6 Mの前適用により、容量性Ca^<2+>流入に対するハロタンの抑制作用は有意に拮抗された。一方、セボフルランの抑制作用に対しては、BIS-1は影響しなかった。以上の結果より、揮発性麻酔薬は、血管内皮細胞における容量性Ca^<2+>流入を抑制し、その作用は、一部Protein kinase Cを介したものであるのことが示唆された。平成17年度今年度は、カバーグラス上に定着させたウシ大動脈由来培養血管平滑筋細胞を用いて実験を行った。Fura-2でインキュベートした後、密閉性の高いclosed chamberに装着し、Ca^<2+>freeのHEPES-bufferにて潅流し、Thapsigargin10^<-7>Mを投与して小胞体内Ca^<2+>を枯渇させ、その後、潅流液中のThapsigarginをwashoutした後、潅流液中のCa^<2+>濃度を2.2mMに上昇させることにより容量性Ca^<2+>流入を引き起こした。Ca^<2+>freeのHEPES-bufferとCa^<2+>2.2mMのHEPES-bufferを交互に還流させることにより、再現性のある容量性Ca^<2+>流入が得た。この時の細胞質Ca2+濃度の変化を蛍光色素法にて測定した。ハロタン、イソフルランあるいはセボフルラン(13MAC)に暴露させた血管平滑筋細胞で同じ測定を行ったところ、ハロタン>イソフルラン>セボフルランの順で、それぞれ濃度依存性に容量性Ca^<2+>流入を抑制した。次に、容量性Ca^<2+>流入の調節に関与していると考えられているProtein kinase Cの阻害薬であるBIS-1 3x10-6 Mをあらかじめ投与した後、同じ実験、測定を行った結果、BIS前処置によりハロタンによる容量性Ca^<2+>流入の抑制が拮抗された。以上の結果より、内皮細胞同様に、血管平滑筋細胞においても、揮発性麻酔薬は濃度依存性に容量性Ca^<2+>流入を抑制し、その抑制作用にはProtein kinase Cに対する作用の関与が示唆された。
免疫抑制状態にある患者の口腔内常在菌による感染の事態調査と予防法について

免疫抑制状態にある患者にとって、日和見感染は生命に関わる合併症の一つである。しかし、原因菌は常在菌であることから感染経路の解明は非常に困難であり、それを解明するためには個人に由来する菌株の特定が必要となる。そこで、本研究では口腔内常在菌であるStreptococcus mitisについて電気泳動による核型解析を行い、個人の菌株の特定と日和見感染経路の解明を試みた。結果は次のようであった。1.Streptococcusの基準株を核型解析した結果、同一種が同一のパターンを示すことはなく、個々の菌株ごとに独自のバンドパターンがみられた。2.名大医学部付属病院小児科病棟で敗血症をおこした5人の児の血液より検出されたS.mitisにおいても、バンドパターンは個によって異なっていた。3.患児の血液と咽頭より検出されたS.mitisでは、同一の核型を示すものがあった。4.親子の菌株では同一のバンドパターンを示すものはみられなかった。以上より、S.mitisの核型は個によって異なるパターンを示すため、感染経路の解明には非常に有効であることが示された。感染経路としては、今回咽頭と血液より同一核型を示す菌株が存在したことから、本人の保持している菌によって感染を起こしていることが明らかとなり、口腔内の清潔ケアのあり方を見直しの必要性が示唆された。また、今までのところ母子間では同一核型は認められておらず外部からの感染はみられていないが、可能性としては否定しきれるものではないため、今後もさらに追求していく必要がある。さらに、同じ患者が繰り返し感染する例もあり、それが同一の菌株によるものかについても明らかにしていかなければならない。
鉛直地震動による構造物等への影響の解明とその影響を低減させる鉛直免震機構の高度化

近年1Gを超える地震動が観測され、構造物への影響も問題視されつつある。そこで本研究では、その鉛直動の影響低減をめざし、鉛直免震に関して長周期化とセミアクティブ技術を用いた鉛直免震機構を提案、検証する。まず地震動の鉛直動について、過去の地震記録の収集と地震動の分析を行った。過去の地震観測記録では、1Gを超える鉛直動として、2003年宮城県沖の地震、2004年新潟県中越地震、2007年新潟県中越沖地震、2008年岩手・宮城内陸地震、2016年熊本地震(前震)などが記録されている。一方、構造物に大きな影響を与えた1995年兵庫県南部地震では300cm/s^2程度となっている。今後これらの鉛直地震動の特性と被害状況のさらなる分析と実験的検証を実施する。また、これらの鉛直動による影響を低減するため、セミアクティブ技術を用いた鉛直免震機構に関して、実験的検証を行うための鉛直免震台の基本検討を行った。本鉛直免震台は、上部構造の質量を支持し、かつその支持剛性をより柔らかく実現させるため、リンク機構と負剛性の効果を用いた負ばねを組み合わせた鉛直免震装置を採用することとした。この装置において負ばねの設置状態を調整することで、免震仕様の変更が複数に設定でき、これにより実験的検証時において、様々な条件下での評価が可能なものとしている。また、本鉛直免震台の鉛直加振による実験的検証を行うため、既存加振装置の必要な改修を行った。さらに、鉛直免震機構の免震周期を長周期化しつつ、かつ減衰が可変可能な回転慣性と磁気を利用したセミアクティブダンパーの基本検討を行った。本セミアクティブダンパーは、実用化を考慮し回転慣性を用いた回転慣性マスダンパーと磁気により減衰力を可変させるダンパーを一体としたものを考案し、小型化および低コスト化をめざした。次年度以降は、各装置の製作と実験的検証に着手する予定である。平成30年度において、当初の計画では、検証用鉛直免震台装置の製作等を行うこととしていたが、装置の設計検討がやや遅れ、装置の製作が当初計画より遅れることとなった。その理由として、検証用鉛直免震台装置を鉛直加振させる既存の加振装置を、鉛直加振が可能なように改修させることが必要となり、その改修後、加振性能を見極めたうえで検証用鉛直免震台の設計を行ったため、やや時間を要することとなったためである。ただし、次年度早々に検証用鉛直免震台装置の製作等を行うこととし、研究全体の実施期間としての遅れはほぼないと想定している。また一方、回転慣性マスダンパーおよびセミアクティブダンパーの検討および数値モデルの検討を当初計画より早めて実施しており、全体としての遅れはない。今後は、可変減衰が可能な回転慣性マスダンパーによるセミアクティブ制御を用いた免震機構の引き続きの検討とその結果に応じた回転慣性マスダンパー等の設計製作を行う。さらに単体での装置の加振実験を実施し、各種データおよび技術的知見の取得を行っていく。これらの結果から、鉛直免震構造に関する数値解析モデルの検討を推進し、当初の目的を達成させる。

その理由として、検証用鉛直免震台装置を鉛直加振させる既存の加振装置を、鉛直加振が可能なように改修させることが必要となり、その改修後、加振性能を見極めたうえで検証用鉛直免震台の設計を行ったため、やや時間を要することとなったためである。ただし、次年度早々に検証用鉛直免震台装置の製作等を行うこととし、研究全体の実施期間としての遅れはほぼないと想定している。また一方、回転慣性マスダンパーおよびセミアクティブダンパーの検討および数値モデルの検討を当初計画より早めて実施しており、全体としての遅れはない。今後は、可変減衰が可能な回転慣性マスダンパーによるセミアクティブ制御を用いた免震機構の引き続きの検討とその結果に応じた回転慣性マスダンパー等の設計製作を行う。さらに単体での装置の加振実験を実施し、各種データおよび技術的知見の取得を行っていく。これらの結果から、鉛直免震構造に関する数値解析モデルの検討を推進し、当初の目的を達成させる。当該年度において、検証用鉛直免震台装置の製作等を行うこととしていたが、装置の設計検討がやや遅れ、装置の製作が当初計画より遅れることとなった。そのため、次年度以降に検証用鉛直免震台装置の製作を行うこととなり、次年度以降への使用額が生じることとなった。ただし、次年度早々に検証用鉛直免震台装置の製作等を行うこととしている。
骨格筋におけるインスリンシグナル伝達経路の選択的制御機構の解明

生物は限られたシグナル伝達経路を用いて数多くの刺激パターンに対応している。シグナル伝達経路の本質の一つは、多彩な出力を限られた分子またはネットワークにコードするシステム機構にある。本研究の目的は、骨格筋に着目しインスリンの時間パターンによるシグナル伝達経路を介した細胞機能(例えば、遺伝子発現やタンパク質合成)の選択制御機構を定量計測と数理モデル解析を用いて解明することである.本年度は、昨年度までに計測した蛍光バイオセンサーが安定発現した骨格筋を用いたライブセルイメージングデータから分化骨格筋領域を自動的に抽出・定量を行う画像解析アルゴリズムの開発を行った。シングルチューブごとのタンパク質合成を制御するS6K活性の応答多様性を定量化し、学術論文として報告した(Inoue H et al, Cell Struct Funct. 2018)。また応答多様性を評価する定量的な指標として、情報工学のShannon情報量エントロピーを計算し、情報理論の観点からのインスリンシグナル伝達経路の情報伝送効率の評価を行った(学術論文を準備中)。一方で数理モデル解析に関しては,定量計測データから分子ネットワーク構造を同定する方法として統計モデルと生化学反応モデルに基づくシステム同定法の適用を行った。特に生化学反応モデルに関しては、ベイズ推論に基づきモデル構造とモデルパラメータの同時推定を行う解析アルゴリズムの開発を現在進めている。本研究の目的は、骨格筋に着目しインスリンの時間パターンによるAkt経路を介した代謝調節(タンパク質合成とグリコーゲン生成)を実験と数理モデルを用いて解明することである。インスリンのどのような時間パターンが下流のシグナル分子や代謝調節を選択的に制御しているかを定量化し、骨格筋を制御するインスリンシグナル伝達経路の時間情報コードを明らかにする。本年度は、リン酸化Aktとタンパク質合成を制御するリン酸化S6Kに着目しFRETバイオセンサーを用いたライブセルイメージング計測系の立ち上げを行った。(FRETバイオセンサーは京都大学青木一洋博士より分与頂いた)。マウス筋管細胞C2C12(未分化)に対してPiggyBacトランスポゾンシステムを用いてFRETバイオセンサーを安定発現した細胞株を樹立し、筋分化誘導行いライブイメージング計測を行った。0から100nMまでの11インスリン濃度を用いてインスリンステップ刺激を行い、骨格筋におけるリン酸化Akt及びS6Kの経時応答を取得した。大津の二値化法とトライアングル法を組み合わせた自動画像認識法を開発し、インスリン刺激に対する1筋チューブレベルでのリン酸化Akt及びS6Kの時間応答の定量化を行った。時間応答データに対して、特徴量抽出(ピーク値、ピーク時間、応答面積など)を行い、1筋チューブレベルでの応答ばらつきを定量化した。さらに未分化C2C12細胞を用いて、インスリン刺激後の各時間ごとのS6K応答分布に対してShannon情報量エントロピーを計算し、情報工学の観点からのインスリンシグナル伝達経路の情報伝送能力を評価した。本年度はリン酸化Akt及びS6Kと着目しFRETバイオセンサーを用いたライブセルイメージング計測系の立ち上げを行った。また定量的な画像解析法を開発して、シングルチューブごとのシグナル活性の時間応答をアンバイアスに定量化することが可能となった。定量的ライブセルイメージング計測により、空間・時間分解能高く実験データを計測することができるようになり、今後のインスリンシグナル伝達経路の数理モデルの構築に向けての準備が整った。生物は限られたシグナル伝達経路を用いて数多くの刺激パターンに対応している.シグナル伝達経路の本質の一つは,多彩な出力を限られた分子またはネットワークにコードするシステム機構にある.本研究の目的は,骨格筋に着目しインスリンの時間パターンによるAkt経路を介した代謝調節(タンパク質合成とグリコーゲン生成)を実験と数理モデルを用いて解明することである.本年度は,昨年度取得した未分化及び分化の骨格筋でのタンパク質合成を制御するS6K活性のライブセルイメージングデータに対する1定量解析と2数理モデル解析について引き続き研究を行った.定量解析に関しては,昨年度に引き続きライブセルイメージングデータから分化骨格筋領域を自動的に抽出する画像解析アルゴリズムの開発を行った.開発した画像解析アルゴリズムを用いて,インスリン濃度依存的なS6K活性のシングルチューブごとのばらつきの定量化を行った.現在,論文投稿中である.また未分化の骨格筋細胞のS6K活性の時間応答と時間応答に関する特徴量抽出(ピーク値、ピーク時間など)のシングルセルばらつきを定量化した.シングルセル分布データに対して,Shannon情報量エントロピーを計算し、情報工学の観点からのインスリンシグナル伝達経路の情報伝送能力を評価した.一方で数理モデル解析に関しては,実験データからネットワーク構造を同定する方法としてシステム同定法の適用を進めている.手法開発としてまずPC12細胞で計測された応答時間スケールの異なるシグナル分子と遺伝子発現の時系列データへのシステム同定法の適用を行い,論文発表を行った(Tsuchiya et al., PLoS Comput Biol 2017).またシングルセルごとのモデルパラメータのばらつきを推定するために,ベイズ推論に基づくシステム同定法の適用も進めている.研究進捗は,年度途中での所属機関の異動もあり当初計画よりも遅れ気味である.そのため研究期間の延長を申請し,来年度も引き続き本研究課題を継続して進めることとなった.本年度の一番大きな進捗は,昨年度から開発を行っていたライブセルイメージングデータから分化骨格筋領域を自動的に抽出する画像解析アルゴリズムの論文化である.特許も出願中である.

この画像解析アルゴリズムにより実験データからアンバイアスに定量データを抽出できるようになり,今後のインスリンシグナル伝達経路の定量的な数理モデルの構築に向けての準備が整った.生物は限られたシグナル伝達経路を用いて数多くの刺激パターンに対応している。シグナル伝達経路の本質の一つは、多彩な出力を限られた分子またはネットワークにコードするシステム機構にある。本研究の目的は、骨格筋に着目しインスリンの時間パターンによるシグナル伝達経路を介した細胞機能(例えば、遺伝子発現やタンパク質合成)の選択制御機構を定量計測と数理モデル解析を用いて解明することである.本年度は、昨年度までに計測した蛍光バイオセンサーが安定発現した骨格筋を用いたライブセルイメージングデータから分化骨格筋領域を自動的に抽出・定量を行う画像解析アルゴリズムの開発を行った。シングルチューブごとのタンパク質合成を制御するS6K活性の応答多様性を定量化し、学術論文として報告した(Inoue H et al, Cell Struct Funct. 2018)。また応答多様性を評価する定量的な指標として、情報工学のShannon情報量エントロピーを計算し、情報理論の観点からのインスリンシグナル伝達経路の情報伝送効率の評価を行った(学術論文を準備中)。一方で数理モデル解析に関しては,定量計測データから分子ネットワーク構造を同定する方法として統計モデルと生化学反応モデルに基づくシステム同定法の適用を行った。特に生化学反応モデルに関しては、ベイズ推論に基づきモデル構造とモデルパラメータの同時推定を行う解析アルゴリズムの開発を現在進めている。まず今回開発した大津の二値化法とトライアングル法を組み合わせたシングルチューブの自動画像認識法を画像解析の手法論文として纏める予定である。さらにすでに取得しているインスリンのステップ刺激データを用いて、インスリンのどのような時間パターンの特徴が下流分子に伝達できるかというフィルタリング特性を定量化するために、システム同定解析を行う。従来のシステム生物学研究で有用されている常微分方程式による生化学反応モデリングは、事前に詳細な経路やパラメータが分かっているケースに限られており、適用範囲が狭いという問題がある。工学のシステム同定手法を用いて、対象のネットワーク構造に未知の経路の寄与が強い場合でも、実験データだけからシステム特性を明らかにすることができるモデル化手法の適用を行う。このモデル化手法を用いることにより、シグナルの強度(ゲイン応答)や非線形性など推定することでき、上流分子のどのような周波数成分が下流に伝わるのか(つまり“シグナルの伝わりやすさ")という選択的な制御機構を明らかにすることが出来る。また得られたシステム特性を、光刺激によるAKT活性化システムを用いて検証・予測を行う。
物理化学的吸着によらない重金属捕集材の開発

重金属を効率的に回収する手法の開発は廃水処理のような環境問題を解決する上で重要な課題である.従来,重金属の回収は疎水性相互作用という物理化学的な吸着を利用し行われてきた.しかしその方法は弱い相互作用を利用するため,回収効率や選択性の点で満足できるものではなかった.今回,重金属とヘテロ原子の強い相互作用に着目し,ヘテロ環を含む高分子捕集材の開発を行った.その結果,従来の捕集材に比べて吸着力が強く,低濃度排水の処理に向いていることが分かった.本年度は重金属を回収するための捕集材の作成を行った。水中の金属を捕集する場合,捕集材の重量あたりの捕集効率は,この粒径が小さいほど表面積が大きくなるため良い結果が得られるが,一方,実際に捕集材をカラムに詰めて試験水を通過させることを考慮すると,粒径が小さすぎると十分な流速がえられないため実用性に欠ける,という問題が生じる。今までの研究結果より,これを満足する粒径がおよそ300μm前後であったことから,本研究ではまず,捕集材のベースとなるスチレンホモポリマーの作成に於いて,この粒径のポリマーが効率よく得られる条件について検討した。モノマーから懸濁重合により粒状ポリマーを生成する際,その粒径はモノマー濃度,分散剤の種類と濃度,開始剤の濃度,攪拌速度に依存する。はじめに分散剤としてリン酸カルシウムを用いたところ,目的のポリマーは得られるものの,単離段階での後処理が面倒であったため,より単離が簡便に行えるPVAを用いることとし,実験ではケン化度の異なる3種類のPVAを用い検討した。開始剤はAIBNを用いた。種々条件を検討した結果,モノマー濃度20%,分散剤(ケン化度8690%のPVA)濃度0.24%,開始剤濃度0.24%のとき,目的とする粒径のポリマーが収率良く得られることが分かった。この条件をもとにビニルピリジンとの共重合による捕集材の作成を行った。その結果,ビニルピリジンの含有量が5%以下のものでは,理想的な粒径のポリマーが得られた。一方,含有量5%以上のものでは粒径が大きくなる傾向があり,分散剤の濃度を高くするなどの反応条件の変更が必要であることが分かった。本年度は重金属捕集材としてスチレンービニルピリジン系共重合体の作成を目的とし,その合成条件の最適化を行った.前年度までに,捕集効率の良さと実用性を兼ね備えた粒径を持つ捕集材の作成について,ホモポリマーについてはその合成条件ほぼ確立できた.一方,共重合体についても同様な条件で作成可能と判断したが,その後,再現性に問題があることが明らかとなった.その原因について調査したところ,ビニルピリジン系モノマーの純度に問題があることが判明した.すなわち,捕集材作成の際にはビニルピリジン系モノマーを精製して用いているが,これが比較的不安定であるため,精製後冷暗所保存しても時間がたつと徐々に不純物を含むようになり,これが粒径に影響を及ぼしていた.そこで合成の直前に減圧蒸留により精製するようにしたところ,良い再現性が得られた.この精製については塩基性のアルミナカラムを通すことによっても同等の再現性が得られたため,操作の簡便性の利点からこの後の検討ではこれを用いた.結果として,ビニルピリジン系モノマー3%を含む共重合体の作成においては,全モノマー濃度25%,分散剤(ケン化度8690%PVA)濃度0.3%,開始剤(AIBN)濃度0.3%のとき目的とする粒径のポリマーがおよそ70%の収率で得られた.なお,この共重合体の合成ではその粒径は,特に分散剤(PVA)のケン化度に非常にセンシティブであり,例えばケン化度>90%のものでは,粒径は不揃いで大きくなるという知見が得られた.結果として共重合体においても,再現性良く粒径をコントロールすることが可能となった.当初は捕集材の機能評価まで行う予定であったが,共重合体の合成において,再現性を確立するのに時間を要したため,機能評価までは行えなかった.本年度は重金属捕集材としてスチレンービニルピリジン系共重合体を作成し,その機能評価を行った.前年度検討した反応条件を参考に,ビニルピリジン系モノマー5%を含む共重合体の作成を行ったところ,ビニルピリジン系モノマー3%のときよりも粒径が大きいものが含まれる割合は増えるものの,収率は94%と大きく改善されることが分かった.今回は,これを用いて機能評価を行った.まず,この共重合体は十分にコンディショニングすれば,試料溶液を流す際にチャネリングを起こさないことを確認した.共重合体100mgに5%のトリブチルスズ(TBT)を含む溶液を流し,その吸着量を測定したところ,最大2.9%のTBTが保持されることが分かった.一方,同様の粒径を持つ参照捕集材(スチレンホモポリマー)で実験したところ,その保持量は2.8%であった.このように二つの捕集材の間で最大保持量の差はほとんどなかった.これは表面積が同じであれば,ホモポリマーであっても最大吸着量は変わらないことを示している.

ただ,TBTを吸着したホモポリマーでは,TBTはヘキサン洗浄すると100%回収されるが,共重合体ではそうではないことから,TBTは共重合体と強く吸着していることがわかる.従って,高濃度廃水の場合は,ホモポリマーでも十分捕集でき,特に捕集されたTBTを回収し,捕集材を再利用することを考えると,ホモポリマーの方が容易であるというメリットがある.一方,共重合体はその吸着能の高さから低濃度廃水の処理に向いているといえる.重金属を効率的に回収する手法の開発は廃水処理のような環境問題を解決する上で重要な課題である.従来,重金属の回収は疎水性相互作用という物理化学的な吸着を利用し行われてきた.しかしその方法は弱い相互作用を利用するため,回収効率や選択性の点で満足できるものではなかった.今回,重金属とヘテロ原子の強い相互作用に着目し,ヘテロ環を含む高分子捕集材の開発を行った.その結果,従来の捕集材に比べて吸着力が強く,低濃度排水の処理に向いていることが分かった.当初様々なヘテロ環を有する捕集材を作成する予定であったが,最適な粒径を得る条件を決定するのに予想より手間取ったため,今年度は2種類の捕集材作成にとどまった。再現性良く共重合体が得られる合成条件が確立できたため,これにより捕集材を作成し,これを用いた重金属捕集材としての評価を行う.有機化学最適粒径の捕集材を得る条件は得られたため,今後は種々のヘテロ環を有する捕集材の合成を行い,それらを用いた様々な重金属の捕集効率について検討する。当初は捕集材の機能評価まで行う予定であったが,共重合体の合成において,再現性を確立するのに時間を要したため,機能評価までは行えなかった.そのため,機能評価に必要な経費を繰り越した.捕集材合成のための最適な条件を決定するのに予想より手間取り,当初予定した数の捕集材が合成できなかったため,その分の試薬・器具の購入費が少なくなった。今年度の経費は主に捕集材の機能評価に使用する.当初目的とした数の捕集材を合成するための試薬,器具などの購入に使用する。
形態と遺伝子から解明する近世アイヌ集団の起源と成立史

近世アイヌ人骨122体を対象としてDNAを抽出し、ミトコンドリアDNAの解析を行った。最終的に100体からDNA情報を取得し、アイヌ集団の成立の歴史の解明を試みた。解析の結果は、北海道のアイヌ集団は在来の縄文人の集団にオホーツク文化人を経由したシベリア集団の遺伝子が流入して構成されたというシナリオを支持した。また同時に行った頭蓋形態小変異の研究でも、アイヌは北海道の祖先集団に由来するものの、オホーツク人との間の遺伝的な交流を持っていた可能性が示された。計画の初年度である本年は、まず全国の大学にどのくらいの数のアイヌ人骨が収集されているかの実地調査を行った。その結果、全国の7大学に1500体以上のアイヌ人骨が収集されていることが明らかとなった。また、それらの人骨の保管状況や部位別の保存状態についても調査した。更に伊達市の噴火湾文化研究所には、2006-2007年度に調査発掘された有珠4遺跡出土の近世アイヌ人骨が23体分保管されていることも判明した。それを受けて、本年度は札幌医科大学と噴火湾文化研究所の近世アイヌ人骨から形態とDNAの基礎データの集積を行った。札幌医科大学には239個体の近世アイヌ人骨が保管されている。事前の予備的な調査野結果、これらの個体の中でDNA分析に適していると判断されたのは89個体であった。そこで研究計画の開始にあたって、これらの人骨からDNA解析用のサンプルとして歯を1本ずつ採取した。これらのサンプルからDNAを抽出し、ミトコンドリアDNAのD-ループ領域の塩基配列とコーディング領域のSNPから各個体のハプログループを決定する作業を進めた。その結果、現時点でほぼ全ての個体のDNA情報を収集することができ、近世アイヌの遺伝的な特徴についての情報を得ることができた。また噴火湾文化研究所が所蔵する有珠4号遺跡の人骨1体(20号成人男性)は形態学的根研究によって脊椎カリエスに罹患していることが明らかとなった。この人骨は火山灰の分析から1640-1663年の間に埋葬されたことが判明しており、結核の北海道への分布拡大の実態を知るための重要な証拠となることが明らかとなった。更に、平成23年に繰り越した費用を使い、この有珠4遺跡出土の人骨のDNA分析と札幌医大の残りのサンプルの分析を進めた。計画の2年目である本年は、昨年の全国調査の結果明らかとなった札幌医科大学と噴火湾文化研究所が所有する近世アイヌ人骨から形態とDNAの基礎データの集積を行った。昨年までに収集した札幌医科大学所蔵の近世アイヌ人骨89個体からDNAを抽出し、ミトコンドリアDNAのD-ループ領域の塩基配列とコーディング領域のSNP,から各個体のハプログループを決定する作業を進めた。その結果、ほぼ全てのサンプルの分析を終了した。これによって近世アイヌの遺伝的な特徴についての情報を得ることができた。また噴火湾文化研究所が所蔵する有珠4号遺跡の人骨のDNA分析を進めている。これまでの研究で近世アイヌの遺伝的な特徴が明らかになってきたが、そこで注目されるのは、当初考えていたよりもアイヌ集団内部での遺伝的な多様性が大きいことだった。特に道南・道央・道東の3地域に分けてみるとその違いはいっそう顕著になることが判明した。これは従来の形態学的な研究でも一部の研究者によって指摘されており、形態と遺伝子の研究結果が共通の結論を導いたことは興味深い。更にデータの解析を進めてその意義を明らかにする研究を進めている。また、北海道集団の成立史を明らかにするために、今回得られた近世アイヌ集団のDNAデータを、これまで比較対象としていた北海道の縄文人だけでなく、東北の縄文人も含めた分析を行った。更に北海道縄文・続縄文時代人全体の遺伝的特徴を可能な限り明らかにするため、特に道東地域を中心に試料の出土地域と数を増加させ、関連する人類集団の結果と比較検討することで、北海道縄文・続縄文時代人の遺伝的特徴を網羅的に明らかにする研究も同時に進めている。北海道の先住民集団であるアイヌの形成史は、日本列島集団の形成を考える上でも重要で、近世アイヌ人骨についてはこれまでも多くの形態学的な調査研究がなされてきた。しかし現在に至るまで、近世アイヌ人骨を対象とした集団遺伝学的な研究は存在せず,その遺伝学的な実体については知られていない。そこで本研究では、本土日本人との混血の影響を受けていない近世アイヌ人骨の形態および遺伝学的な研究を統合し、未だその実像が明確ではないアイヌ集団の成立史を明らかにすることを目的とした。計画の最終年度である本年は、これまで分析を続けていた札幌医科大学所蔵の人骨に加えて、伊達市噴火湾文化研究所が所蔵する近世アイヌ人骨を対象としてDNAを抽出し、最終的に100体からDNA情報を得ることが出来た。

その結果、近世アイヌ集団から13種類のミトコンドリアDNAのハプログループを検出したが、最も多かったのは、オホーツク文化人に高頻度で見いだされているハプログループYだった(32%)。それに続いて北海道の縄文人に高頻度で見られるN9bが検出され(20%)、それ以外は北方系の先住集団に多いG1b,A4,Zなどが検出された。一方、本土日本人に特徴的なD4も約10%の頻度で存在し、更に南方の要素と考えられるB4,F1b,N9aなども頻度は少ないものの存在を確認できた。この結果は、北海道のアイヌ集団は在来の縄文人の集団にオホーツク文化人が流入して構成されたというシナリオを支持している。また同時に行った頭蓋形態小変異9項目を指標にした,北海道集団(縄文/続縄文人・アイヌ・オホーツク人)とサハリンアイヌ・アムール川下流域集団・バイカル新石器時代人などと比較研究によって、北海道アイヌの祖先集団とオホーツク人は,これまで想定されていた以上に,活発な文化的・遺伝的交流を行っていた可能性が示され、遺伝子分析の結果を支持することになった。23年度までに目標としていた近世アイヌ人骨のサンプリングを終了している。また、DNA分析も順調に終了しており、その一部は学会発表等で公開していることから、概ね当初計画が順調に遂行されていると判断できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度上半期にはDNA実験を全て終了する予定である。その後、研究グループ内での会合を持ち、形態学と遺伝学のデータの突き合わせを行い、アイヌの成立史に関する新たなシナリオの構築を目指す。従って今年は各研究者間の連絡を密にして、情報の共有をしながら研究成果の取りまとめを行っていく。
戦国・織豊期の畿内における権力と宗教勢力

本研究は、16世紀に畿内・瀬戸内海東部を支配した三好氏権力を宗教勢力とのかかわりから分析しようとするものである。まず、本年度はこれまでの研究を総括した著書を刊行した。従来、三好氏は畿内政治史で足利将軍との京都争奪戦の中でのみ論じられるなど矮小化されてきた。それに対して、国人領主の統合、城郭の性格、宗教勢力からみた都市支配、裁判と村落共同体、天皇との関係など畿内の地域社会の特質から、その支配の特色を明らかにした。その結果、三好氏は戦国仏教と連携し、村や町の共同体を支配の基礎に置くなど、それまでの畿内の権力にはない性格を持つことが明らかになった。三好氏は、畿内の守護だけでなく、各地の戦国大名と比較検討できる支配の内実を持ち、室町幕府を克服する支配方式を編み出す点では、織田・豊臣政権の先駆的な「政権」であると評価した。また、法華宗寺院の文書調査から、16世紀中葉に京都の法華宗本山寺院の間で結ばれた「永禄の規約」の再検討を行った。従来は教義上の相論の和解とのみ理解されてきたが、実は京都を取り巻く軍事的緊張に対抗して形成された法華宗教団の臨時的な結合体が、三好氏の保障と調停によって、平時にも存続するために整備した規約であったことを明らかにした。また、肖像画やそこに記された賛の検討から、将軍や諸大名の葬礼を担った禅宗と三好氏の関係を検討した。足利将軍が住持を任命する南禅寺や五山に対抗して、三好氏は天皇により住持が任命され、南禅寺と同格を主張する大徳寺と関係を結んでいった。その背景には、三好氏が大徳寺の下に五山など幕府の官寺を包摂する形で、武家の宗教秩序の再編を志向していたことを明らかにした。本研究は、16世紀を通じて畿内・瀬戸内海東部で勢力をふるった三好氏権力を前提に、その織豊政権への展開を宗教勢力とのかかわりを主軸に分析しようとするものである。戦国期の大阪湾岸と四国東部を東瀬戸内という一体の地域として捉え、この地域の都市における法華宗日隆門流寺院や浄土真宗興正寺派寺院の台頭と、その動向を掌握することで、この地域を支配した三好政権の性格を解明した。また、統一政権が三好氏との養子関係を構築し継承する形で、織田・豊臣一族を東瀬戸内に配置し、この地域を一体的に支配する志向を持っていたことを明らかにした。これにより、織田政権の成立によって断続的に叙述されることが多い戦国時代の政治史に対して、連続的・段階的な展開の視角を提供した。また、大阪府の妙国寺文書、四天王寺文書、岡山県の法泉寺文書の調査をおこなった。戦国時代の天王寺については、従来の門前町・宗教都市の側面だけではなく、港町・政治都市としての側面を明らかにした。法泉寺文書からは、中世的な門流を中心とする教団が、近世的な宗派を中心とする教団へ展開していく中でおこなわれた三好氏の調停に関する新出史料を確認した。これにより、織田政権による大坂本願寺攻めや安土宗論などの宗教勢力に対する弾圧的側面や、豊臣政権の八宗の動員体制の再評価が可能になった。さらに、平成21年度の計画であったが、従来、畿内の政治史の叙述に利用されてきた軍記物『細川両家記』について史料学的検討を進め、作者の生島宗竹の歴史観や織田政権による統一事業を予定調和的に描かない叙述スタイルの有用性について、シンポジウムで研究報告をおこなった。本研究は、16世紀に畿内・瀬戸内海東部を支配した三好氏権力を前提に、その織田・豊臣政権への展開を宗教勢力とのかかわりを主軸に分析しようとするものである。三好氏権力は、摂津における山をめぐる村落間の争論を裁許するなど調停能力を示したが、法華宗教団内の争論についても裁許を求められた。京都の法華宗本山寺院の間で結ばれた「永禄の規約」は、従来は教義上の争論の和解として理解されてきた。しかし、京都を取り巻く軍事的緊張に対して形成された法華宗教団の臨時的な結合体が、三好氏の保障と調停により、平時にも存続するための条件を整備したものであったことを明らかにした。三好氏権力と法華宗教団(戦国仏教)の直接的な関係の形成は、室町幕府が比叡山延暦寺(顕密仏教)を介して行っていた寺社政策からの転換点の一つと評価できる。また、将軍や諸大名の葬礼を担った禅宗と三好氏権力の関係を検討した。三好氏は、足利将軍が住持を任命する五山に対抗して、山隣の大徳寺と関係を取り結び、大徳寺の下に五山を包摂する新たな宗教秩序を志向していたことを明らかにした。ここでも室町幕府の寺社政策からの転換が指摘できる。このような宗教秩序だけではなく、室町幕府は家格を介して武家権力の秩序を維持し、東国の上杉謙信や西国の大友宗麟の戦争に影響を与えてきた。それに対して、畿内では三好長慶が足利義輝を追放した際に天皇と直接関係を形成し、将軍の位置を絶対的なものから相対的なものに変質させた。また、義輝との和睦後も家格を急上昇させ諸大名や公家の強い反発を受ける一方で短期間で受容されていくなど、武家権力秩序を変質させていくことを明らかにした。

さらに、従来より畿内政治史の叙述に使用されてきた軍記物『細川両家記』について、三好氏家臣とされる著者の生嶋宗竹の歴史観を検討し、三好長慶段階においては三好氏権力の上層部の情報を知りえる立場になかったことの限界性や、織田政権の成立を予定調和的に描かないことの有効性を指摘した。本研究は、16世紀に畿内・瀬戸内海東部を支配した三好氏権力を宗教勢力とのかかわりから分析しようとするものである。まず、本年度はこれまでの研究を総括した著書を刊行した。従来、三好氏は畿内政治史で足利将軍との京都争奪戦の中でのみ論じられるなど矮小化されてきた。それに対して、国人領主の統合、城郭の性格、宗教勢力からみた都市支配、裁判と村落共同体、天皇との関係など畿内の地域社会の特質から、その支配の特色を明らかにした。その結果、三好氏は戦国仏教と連携し、村や町の共同体を支配の基礎に置くなど、それまでの畿内の権力にはない性格を持つことが明らかになった。三好氏は、畿内の守護だけでなく、各地の戦国大名と比較検討できる支配の内実を持ち、室町幕府を克服する支配方式を編み出す点では、織田・豊臣政権の先駆的な「政権」であると評価した。また、法華宗寺院の文書調査から、16世紀中葉に京都の法華宗本山寺院の間で結ばれた「永禄の規約」の再検討を行った。従来は教義上の相論の和解とのみ理解されてきたが、実は京都を取り巻く軍事的緊張に対抗して形成された法華宗教団の臨時的な結合体が、三好氏の保障と調停によって、平時にも存続するために整備した規約であったことを明らかにした。また、肖像画やそこに記された賛の検討から、将軍や諸大名の葬礼を担った禅宗と三好氏の関係を検討した。足利将軍が住持を任命する南禅寺や五山に対抗して、三好氏は天皇により住持が任命され、南禅寺と同格を主張する大徳寺と関係を結んでいった。その背景には、三好氏が大徳寺の下に五山など幕府の官寺を包摂する形で、武家の宗教秩序の再編を志向していたことを明らかにした。
核型雄性不稔遺伝子の網羅的解析とそれを利用した新規採種システムの開発

前年度に未解析であった残りの2系統(#711,#954)の雄性不稔変異体の解析を行った。#711・・電子顕微鏡下での花粉発達解析の結果、この変異体は花粉壁(エキシン)合成に異常があることがわかった。この変異体では四分子期にプライムエキシンが薄く、エキシン構成要素のスポロポレニンは小胞子に付着したがプロバキュラは形成されなかった。ギザギザの小胞子を持つ小胞子が形成されたので、hackly microspore (hkm)と名付けた。小胞子は発育後期に消失した。タペート組織の電顕観察を行ったところ、空胞化していた。遺伝子破壊により雄性不稔になることが報告されていたms1変異体と類似していたため、MS1遺伝子について照査したところ、hkm遺伝子にSNPが検出でき、交配実験によりMS1のアリルであることが明らかとなった。プライムエキシン形成が胞子体型に支配されていることが明らかになった。#954・・この変異体は雄性不稔性を示すのと同時に花糸伸長欠陥、dark greenの葉、矮性、開花の遅れ、reducedapical dominanceなどの栄養器官における欠陥も確認された。作られた花粉を自殖させると正常な種が作られたことから、雄性不稔性の原因は花粉の稔性ではなく、花糸の伸長欠陥に起因すると考えられた。しかし、この変異体の葯発達をTEMで観察した結果、プライムエキシン形成のタイミングが遅れ、一核期には球状のスポロポレニンの塊がランダムに小胞子に付着していたことが分かった。しかし、後のステージでこの塊が完全なエキシンへと変化した。栄養器官の表現型より、植物ホルモンの1つであるブラシノステロイドの変異体と推測され、このホルモンの合成に関わる遺伝子についての塩基配列を変異体で解析したところ、合成に関わるDET2遺伝子中に7塩基の欠失があることが分かった。本研究は、シロイヌナズナで蓄積されたゲノム情報を有効に活用して、核型雄性不稔遺伝子を解明し、それらの遺伝子を利用した実用の育種技術を開発することを目的としている。今年度は、スクリーニングした4つのシロイヌナズナの雄性不稔変異体(^*12、^*350、^*711、^*954)の解析を行った。この変異体は雄性不稔性を示したが、高湿度条件下で稔性が回復した。花粉表面を観察すると滑らかな花粉表面を持ち、エキシンの網目模様がほとんど見られなかったので、faceless pollen-1 (flp1)変異体と名付けた。T-DNAの隣接配列をクローニングしたところ、WAX合成関連遺伝子のcer遺伝子などと相同性が見られ、サザン分析を用いてT-DNAと遺伝子の連鎖を確認した。茎のWAXも著しく減少していた。相補性実験によりクローニングしたflp1遺伝子が原因遺伝子であることを証明した。この変異体は花粉が完全に崩壊する変異体であった。エキシンの構成要素であるスポロポレニンの付着、重合の足場となるプライムエキシンが正常に形成されないことにより花粉が崩壊することがわかった。エキシンが見られないために、no exine formation 1 (nef1)変異体と名付けた。T-DNAの隣接配列をクローニングしたところ、既知の遺伝子とは相同性を示さない新規の遺伝子であった。サザン分析を用いてT-DNAと遺伝子の連鎖を確認した。相補性実験によりクローニングしたnef1遺伝子が原因遺伝子であることを証明した。この変異体は、2細胞期にタペート組織が異常に空胞化し、花粉発達が停止する変異体であった。プライムエキシンは正常に形成されないが、スポロポレニンは小胞子に付着していた。ギザギザの花粉になるのでhackly microspore (hkm)変異体と名付けた。hkm変異はT-DNAにタグされていなかったため、原因遺伝手のクローニングに至っていない。この変異体は可稔個体と不稔個体が3:1で出現せず、複数の遺伝子が関与している可能性が示唆された。またこの変異もT-DNAにタグされておらず、原因遺伝子のクローニングに至っていない。

作られた花粉を自殖させると正常な種が作られたことから、雄性不稔性の原因は花粉の稔性ではなく、花糸の伸長欠陥に起因すると考えられた。しかし、この変異体の葯発達をTEMで観察した結果、プライムエキシン形成のタイミングが遅れ、一核期には球状のスポロポレニンの塊がランダムに小胞子に付着していたことが分かった。しかし、後のステージでこの塊が完全なエキシンへと変化した。栄養器官の表現型より、植物ホルモンの1つであるブラシノステロイドの変異体と推測され、このホルモンの合成に関わる遺伝子についての塩基配列を変異体で解析したところ、合成に関わるDET2遺伝子中に7塩基の欠失があることが分かった。