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顎骨嚢胞内溶液の破骨細胞活性化作用に関する分子メカニズムの解明

顎骨に発生する嚢胞や良性腫瘍は骨を吸収しつつ顎骨内で増大する。その過程で、いかにして骨を吸収する破骨細胞形成が活性化されるのかについて研究を行った。その結果、病変が産生するサイトカインが周囲の細胞で破骨細胞活性化因子発現を促進することが明らかとなった。この機序により、病変周囲の骨が吸収され、病変の増大の一つの機序になることが示唆された。顎骨嚢胞および顎骨腫瘍が破骨細胞を活性化する因子を産生し,破骨細胞形成,骨吸収の過程を介して顎骨内で増大・進展する機序を仮定し,研究を行った.臨床検体の研究使用の同意の得られた患者の各種顎骨嚢胞(角化嚢胞性歯原性腫瘍,濾胞性歯嚢胞),顎骨腫瘍(エナメル上皮腫)の嚢胞内容液を吸引採取し,その上清をろ過滅菌して保存して試料とした.また,手術による摘出組織からは上皮細胞および間質線維芽細胞を分離した.さらに摘出組織はパラフィン包埋し,免疫染色に用いた.まず,角化嚢胞性歯原性腫瘍,濾胞性歯嚢胞でPTHrP,TGF-beta,IL-lalphaの免疫染色を行った.嚢胞裏装上皮細胞はPTHrP,TGF-beta,IL-lalpha陽性で,特に嚢胞腔側に近い,または角化層に近い上皮細胞にTGF-betaは強陽性を示し,基底細胞層,有棘細胞層にPTHrPは陽性で,IL-lalphaは角化層に最も強く,上皮細胞層全層で陽性を示した.そして,嚢胞裏装上皮下の繊維性結合組織と顎骨との境界にはTRAP染色陽性の破骨細胞形成を認めた.また,骨境界領域周囲の嚢胞結合組織線維芽細胞にはRANKL陽性を示した.これらより,顎骨嚢胞-顎骨境界領域で破骨細胞形成がなされていることが示唆された.嚢胞上皮細胞での発現が免疫組織染色で確認されたサイトカインについて,その内容液に含まれる濃度をELISA法で測定した.その結果,歯原性角化嚢胞には高濃度のTGF-beta(平均6.7mg/ml),IL-lalphaを含んでいることが示された.ついで,嚢胞内容液が破骨細胞形成を促進するか否かを(1)破骨細胞前駆細胞培養実験,(2)破骨細胞前駆細胞と嚢胞由来線維芽細胞との相互作用を検討した.(1)での破骨細胞形成はその前駆細胞としてヒト末梢血単核球を比重遠心分離法で分離し,抗CD-14抗体マグネットマイクロビーズを用いてCD-14陽性細胞を単離し,M-CSF,sRANKL存在下で種々のサイトカインを添加し培養し,破骨細胞形成をTRAP染色で評価した.同様の実験をマウス破骨細胞前駆細胞株RAW264細胞で行った.(2)では,歯原性角化嚢胞あるいはエナメル上皮腫の間質線維芽細胞を分離・培養し,上記の種々のサイトカインを添加し破骨細胞形成の正の制御因子であるRANKL発現と負の制御因子であるOPG発現をRT-PCR法で検討した.その結果,TGF-bおよびIL-laは濃度依存的に破骨細胞形成を促進し,その両者を添加すると相加的に破骨細胞形成が促進された.次いで,嚢胞間質線維芽細胞を介した破骨細胞形成を検討するため,破骨細胞形成を制御するRANKL,OPGの発現を検討した.歯原性角化嚢胞内容液は間質線維芽細胞のRANKL発現を上昇させ,OPG発現を変化させなかった.また,嚢胞内容液を酸処理することでRANKL発現はより一層促進され,線維芽細胞のSmad-3のリン酸化,核内移行をきたしたことから,嚢胞内容液内のTGF-bが間質線維芽細胞のRANKL発現を調節していることが示唆された.以上より歯原性角化嚢胞は嚢胞上皮細胞が産生するサイトカインが直接的に破骨細胞形成を促進し,および間接的に間質線維芽細胞のRANKL発現を促進することで破骨細胞形成を促進することが示唆された.顎骨嚢胞および顎骨腫瘍が破骨細胞を活性化する因子を産生し,破骨細胞形成,骨吸収の過程を介して顎骨内で増大・進展する機序を仮定し,研究を行った.臨床検体の研究使用の同意の得られた患者の各種顎骨嚢胞(角化嚢胞性歯原性腫瘍,濾胞性歯嚢胞),顎骨腫瘍(エナメル上皮腫)の嚢胞内容液を吸引採取し,その上清をろ過滅菌して保存して試料とした.また,手術による摘出組織からは上皮細胞および間質線維芽細胞を分離した.さらに摘出組織はパラフィン包埋し,免疫染色に用いた.嚢胞裏装上皮下の繊維性結合組織と顎骨との境界にはTRAP染色陽性の破骨細胞形成を認めた.また,骨境界領域周囲の嚢胞結合組織線維芽細胞にはRANKL陽性を示した.これらより,顎骨嚢胞-顎骨境界領域で破骨細胞形成がなされていることが示唆された.

本年度はTGF-bとIL-1aに焦点をしぼり研究を行った。TGF-b,IL-1aは嚢胞内容液に高濃度に含有され、特に角化嚢胞性歯原性腫癌では高濃度であった。免疫染色でTGF-b,IL-1aはともに歯原性上皮細胞に陽性であった。ついで,嚢胞内容液が破骨細胞形成を促進する機序を検討した。角化嚢胞性歯原性腫瘍の間質線維芽細胞を分離・培養し,上記の嚢胞内容液、TGF-b,IL-1aを添加し破骨細胞形成の正の制御因子であるRANKL発現と負の制御因子であるOPG発現をRT-PCR法で検討した.その結果,歯原性角化嚢胞内容液は間質線維芽細胞のRANKL発現を上昇させ,OPG発現を変化させなかった,嚢胞内容液により誘導されるRANKL発現は、TGF-b中和抗体またはTGF-b受容体阻害剤、およびIL-1受容体拮抗剤により部分的に抑制され、その両者の処理で完全に抑制されたことから、嚢胞上皮細胞が産生するTGF-b,IL-1aが嚢胞間質線維芽細胞のRANKL発現を誘導することが示された。また、TGF-bはCOX-2発現、PGE2合成をわずかしか上昇させなかったが、IL-1aはCOX-2発現とPGE2合成を促進し,TGF-b存在下でさらに相乗的に促進した。顎骨腫瘍・嚢胞上皮細胞はTGF-bとIL-1aを産生し、周囲の間質繊維芽細胞でのRANKL発現を誘導して破骨細胞形成、骨吸収を促進する機序が示唆された。研究者らは顎骨腫瘍・嚢胞が産生するサイトカインが1)周囲の間質線維芽細胞、骨芽細胞、または間質細胞に作用し、破骨細胞活性化因子RANKL発現を誘導し破骨細胞形成を促進する間接的経路、2)破骨細胞前駆細胞の破骨細胞分化を促進する直接作用、により破骨細胞を誘導し骨破壊と病変の増大をきたすと考えて研究を進めてきた。このサイトカインのうち、現在までの研究結果からTGF-bとIL-1aが1)の間接的作用の主役を担っていると考えられるにいたった。実際に、顎骨嚢胞や腫瘍の上皮細胞でTGF-bとIL-1aは産生され、間質線維芽細胞や間質の炎症性浸潤リンパ球でRANKLが陽性であった。そこで本年度はTGF-b,IL-1aのよる間質線維芽細胞でのRANKL発現誘導のメカニズムを検討した。その結果、IL-1aは間質線維芽細胞のCOX-2合成を促進し、その後のPGE2合成を促進した。間質線維芽細胞のIL-1aによるRANKL発現促進は選択的COX-2阻害薬で抑制された。一方、TGF-bはCOX-2合成もPGE2合成も促進せずにRANKL発現を誘導した。そして、TGF-bとIL-1aは相乗的にCOX-2発現とRNAKL発現を促進させた。次いで、それぞれのサイトカインの破骨細胞分化の直接作用を検討した。その結果、TGF-bは破骨細胞前駆細胞の破骨細胞分化を促進し、ILilaとTGFibの相互作用は相加的であった。さらに顎骨嚢胞内容液間質が存在する炎症性リンパ球でのRANKL発現を検討した。嚢胞内容液はヒト末梢血リンパ球でのRANKL発現を促進した、しかしTGF-b,IL-1aはRANKL発現を抑制した。以上より、顎骨腫瘍・嚢胞の骨吸収、骨破壊の機序として、1)上皮細胞が産生するTGF-b,IL-1aが周囲の間質線維芽細胞でのRANKL発現を相乗的促進して破骨細胞形成を促進する機序、2)TGF-bは破骨細胞前駆細胞の破骨細胞分化を促進する機序、3)TGF-b,IL-1a以外のサイトカインが間質に浸潤したリンパ球のRANKL発現を促進して組織内のRANKL濃度を高める機序、の3つの機序が示唆された。
肥満遺伝子過剰発現トランスジェニックマウスの開発-肥満遺伝子の臨床的意義の解明-

肥満遺伝子(レプチン遺伝子)の臨床的意義を明らかにする目的でレプチン過剰発現トランスジェニックマウスの作製を試みた。レプチンのマウスcDNAを肝臓特異的なSerum amyloid component P(SAP)遺伝子プロモーターの下流につなぎ、BDF_1マウスの受精卵へマイクロインジェクトし、産まれたマウスについて、サザンブロット解析を行い、8-30コピーのトランスジーンを含むF_0トランスジェニックマウスを得た。眼窩静脈より採血し、血漿を分離して、マウスレプチンに特異的なラジオイムノアッセイで測定された血漿レプチン濃度は、正常マウスで約10ng/mlであるのに対し、トランスジェニックマウスで約80-300ng/mlであり、トランスジーンのコピー数にほぼ比例して上昇しており、トランスジェニックマウスにおけるレプチン過剰発現が明らかになった。レプチン過剰発現トランスジェニックマウスおよび同腹の対照マウスで毎週に体重測定を行ったところ、レプチン過剰発現トランスジェニックマウスで体重の低い傾向が認められた。これらF_0トランスジェニックマウスをB6マウスと交配し、F_1トランスジェニックマウス、さらにF_2トランスジェニックマウスが得られ、同様な低い体重の傾向が認められた。トランスジェニックマウスにおいてマウスの行動や生殖能力について異常は観察されない。以上より、レプチン過剰発現トランスジェニックマウスの確立に成功した。現在トランスジェニックマウスの数を増やし、体重、摂餌量について統計的に解析しており、また他の遺伝性肥満マウスと交配を行い、レプチンの肥満における意義について検討している。
B細胞、T細胞分化をモデルとした、細胞分化・運命決定機構の解析

Dll^R-Bpが細胞膜表面にB220、Cd19、ll7r、Flt3を発現し、B細胞受容体重鎖を発現しないことをすでに明らかにしている。またマウス生体内での局在に関しても、末梢血、胸腺には存在せず、骨髄に特異的に認められる細胞集団であることを示唆する結果も得ている。平成23年度には、Dll^R-Bpの各種サイトカインへの依存性について解析を行った。Dll^R-Bpが過剰量のDll存在下でもB細胞に分化することから、Dll^R-BpはDllによって誘導されるNotchシグナルに対して抵抗性であると考えられるが、この抵抗性がどのような機構によって賦与されているかを検討する目的である。B細胞分化に重要であることが知られているKitl、Flt3l、ll7について検討を行った。Dll^R-BpがDllを低発現するOP9上でB細胞に分化する際、ll7は必須であり、Kitlに対しては依存性と非依存性の増殖が認められた。また、Flt3lに対する依存性は、本分化誘導系では認められなかった。一方、Dllを過剰発現するOP9-DL1上でDll^R-BpがB細胞へ分化する時、OP9上と同様にll7に対する強い依存性が認められ、Flt3lの量はその増殖、数に影響を与えなかった。興味深いことに、Dll^R-BpのOP9-DL1上でのB細胞分花・増殖はKitlの受容体Kitに対する阻害抗体の添加によって99%抑制されることが分った。このことから、Dll^R-BpのB細胞への分化にはKitl、Kitシグナルが必須であることが示唆された。KitシグナルはB細胞分化にとって必須ではないが、Dll存在下ではこれに対する依存性が劇的に上昇すると予想される。これまでにNotchシグナルとKitシグナルの明確な関連を示した報告はごくわずかであり、より詳細な解析による新たな事実の解明が期待される。次に、骨髄外(末梢血中、胸腺内)におけるDll^R-Bpの局在を解析した。その結果、Dll^R-Bpは骨髄にのみ存在することが示唆された。Dll^R-Bpが胸腺に存在しない理由として(1)Dll^R-Bpは骨髄から末梢血中に移出できない、(2)Dll^R-Bpは末梢血中から胸腺に移入できない、の2つの可能性が挙げられるが、今回の研究成果から(1)の可能性が正しいのではないかと考えられた。さらに研究を進展させる為に、Dll^R-Bpを単離する技術は必須である。そこで、DllR-Bpの精製法を構築した。DllR-BpはCd19^+Flt3^+細胞である。まず、骨髄細胞をFlt3^-細胞とFlt3^+細胞に、磁気細胞分離法を用いて分離する。さらに、蛍光細胞分析分離装置を用いることで、純化したFlt^3+細胞の中から、Cd19^+細胞のみを単離する。得られた細胞は、胸腺環境下で非常に効率良くB細胞へと分化した。つまり、この方法で単離したCd19^+Flt^3+細胞は、機能的にDll^R-Bpと一致すると考えられる。
ダイオキシン類の毒性発現に関わる原因遺伝子の探索を介したトキシコゲノミクス研究

TCDD毒性には、動物種間あるいは系統間で著しい感受性の相違が存在する。このような、種差あるいは系統差の多くは、主にTCDDとの結合親和性の違いをもたらすAh受容体(AhR)の一次構造の違いに原因があると推測されている。実際に、B6とD2マウスのAhRは転写調節領域の大きな構造的違いに加え、TCDDの結合ドメインにおけるアミノ酸変異を有し、結合定数において約10-14倍の差があることが報告されている(Ema et al.,1994)。しかし、AhRの構造に依存しない生体毒性の系統差を示す事例がいくつか知られている。B6およびD2マウスのポルフィリン発症およびHLZとSD-IGSラットにおける胎仔死亡・胎盤機能不全の系統差を決定する因子には、AhR以外の感受性決定遺伝子が存在することの報告がある(Robinson et al.,2002,Kawakami et al.,inpress)。しかし、そのような遺伝子を単離し構造決定した報告はひとつもなされていない。本研究では、AhRの一次構造が異なるB6(AhR^<b-1/b-1>)とD2(AhR^<d/d>)マウスのB6D2F1インタークロスマウスを交配して得たB6D2F2インタークロス胎仔から、同一のAhRアレルを有する集団(AhR^<b-1/b-1>,AhR^<b-1/d>,AhR^<d/d>)を分離し、TCDD曝露による口蓋裂発症率および胎仔肝臓内遺伝子変動にAhR以外の遺伝的背景(Modifier)が影響するかどうかについて検討した。口蓋裂の発症に関しては、(1)B6D2F2 AhR^<b-1/b-1>マウスにおいてほぼ100%の発症が確認されたこと、(2)B6D2F2 AhR^<d/d>ウスではおよそ10%の胎仔に口蓋裂の発症が確認されたが、F0世代のD2マウスでも同様の発症率が確認されたことからAhR以外の遺伝背景は感受性の決定に関与していない可能性が示唆された。また、DNAマイクロアレイを用いた解析から、B6とD2マウスのCYP1A2 mRNAの誘導率には著しい個体差が存在し、B6D2F2 AhR<d/d>マウスには、F0世代D2マウスでは認められないCYP1A2 mRNA誘導率の著しい個体差が認められたことから、B6由来のModifierがTCDD曝露によるCYP1A2 mRNA誘導能に関与していることが示唆された。現在、CYP1A2 mRNA誘導が高い個体と低い個体に関して、全ゲノム約10cMあたりのマイクロサテライトマーカーを設定してModifier遺伝子の探索をおこなっている。AhRという遺伝子の発見きっかけとなったのは、ダイオキシン(TCDD)に対する感受性の著しく異なる2系統の動物であるC57BL/6JマウスおよびDBA/2Jマウスの比較解析による。C57BL/6Jマウスは口蓋裂などの催奇形性に関して、比較的、低用量のTCDDを胎仔期曝露しても生じるが、DBA/2Jマウスでは耐性であるとされている。また、肝臓内CYP1A1の誘導能においても、この2系統では著しい差がある。このフェノタイプの違いにより、原因遺伝子としてAhR遺伝子座がマッピングされた。その結果、二つの系統の持つAhR分子種は、複数の構造的多型を有し、リガンドバインディングドメインのアミノ酸置換による結合定数において約10-14倍の差があることがin vitroの結合試験により証明されている(Ema et al.,1994)。さらにC末端側のドメインにC57BL/6JマウスではDBA/2Jマウスや、他の生物種には見られない、大きなデリーションがありこの部分の変異もAhRの転写活性に大きな差を生じさせる原因と考えられている。しかしながら、この口蓋裂発症、あるいはCYP1A1誘導能に関して、C57BL/6JマウスのAhR遺伝子以外の遺伝的背景が関与していないかに関する詳細な研究はまだなされていない。本研究では、AhRの一次構造が異なるC57BL/6J(B6;AhR^<b-1/b-1>)およびDBA/2J(D2;AhR^<d/d>マウスのF2インタークロスマウスを作製し、その口蓋裂の発症率および胎仔肝臓内で発現変動する遺伝子群を比較し、AhR以外の修飾因子(Modifier)がこの2系統において存在するかどうかについて検討した。F1マウスの妊娠12.5日目(GD12.5)に30μg/kgのTCDDを曝露し、GD17.5に胎仔の口蓋裂の発症率の測定し、胎仔肝臓を採取した。AhR^<b-1/b-1> F2マウスにおける口蓋裂の発症率はほぼ100%であったのに対し、AhR^<d/d> F2マウスでは約9%の胎仔に口蓋裂の発症が認められた。これまでの報告では、純系のD2に対する同用量のTCDD曝露では口蓋裂の発症は確認されておらず、口蓋裂の発症にModifierの関与が示唆された。一方、純系のB6およびD2のTCDD曝露胎仔肝臓のDNAマイクロアレイ解析から選別されたB6で特異的に誘導のかかる3遺伝子(CYP1A1,CYP1A2,AhRR)に関して、AhR^<d/d> F2

マウスでのリアルタイムPCR解析をおこなった結果、各遺伝子の発現誘導率には個体間で大きなばらつきがあり、Modifierの関与が示唆された。TCDD毒性には、動物種間あるいは系統間で著しい感受性の相違が存在する。このような、種差あるいは系統差の多くは、主にTCDDとの結合親和性の違いをもたらすAh受容体(AhR)の一次構造の違いに原因があると推測されている。実際に、B6とD2マウスのAhRは転写調節領域の大きな構造的違いに加え、TCDDの結合ドメインにおけるアミノ酸変異を有し、結合定数において約10-14倍の差があることが報告されている(Ema et al.,1994)。しかし、AhRの構造に依存しない生体毒性の系統差を示す事例がいくつか知られている。B6およびD2マウスのポルフィリン発症およびHLZとSD-IGSラットにおける胎仔死亡・胎盤機能不全の系統差を決定する因子には、AhR以外の感受性決定遺伝子が存在することの報告がある(Robinson et al.,2002,Kawakami et al.,inpress)。しかし、そのような遺伝子を単離し構造決定した報告はひとつもなされていない。本研究では、AhRの一次構造が異なるB6(AhR^<b-1/b-1>)とD2(AhR^<d/d>)マウスのB6D2F1インタークロスマウスを交配して得たB6D2F2インタークロス胎仔から、同一のAhRアレルを有する集団(AhR^<b-1/b-1>,AhR^<b-1/d>,AhR^<d/d>)を分離し、TCDD曝露による口蓋裂発症率および胎仔肝臓内遺伝子変動にAhR以外の遺伝的背景(Modifier)が影響するかどうかについて検討した。口蓋裂の発症に関しては、(1)B6D2F2 AhR^<b-1/b-1>マウスにおいてほぼ100%の発症が確認されたこと、(2)B6D2F2 AhR^<d/d>ウスではおよそ10%の胎仔に口蓋裂の発症が確認されたが、F0世代のD2マウスでも同様の発症率が確認されたことからAhR以外の遺伝背景は感受性の決定に関与していない可能性が示唆された。また、DNAマイクロアレイを用いた解析から、B6とD2マウスのCYP1A2 mRNAの誘導率には著しい個体差が存在し、B6D2F2 AhR<d/d>マウスには、F0世代D2マウスでは認められないCYP1A2 mRNA誘導率の著しい個体差が認められたことから、B6由来のModifierがTCDD曝露によるCYP1A2 mRNA誘導能に関与していることが示唆された。現在、CYP1A2 mRNA誘導が高い個体と低い個体に関して、全ゲノム約10cMあたりのマイクロサテライトマーカーを設定してModifier遺伝子の探索をおこなっている。
Dirac作用素のスペクトル散乱理論

当初、目的としたのはDirac作用素のレゾルベントの性質をさまざまな角度から詳しく調べることであった。その理由はShrodinger作用素のスペクトル散乱理論においてレゾルベント性質が重要な役割を演じており、同じことがDirac作用素のスペクトル散乱理論においても期待されるからである。本研究において得られた結果を以下に項目ごとにまとめる。・Dirac作用素のレゾルベントの作用素ノルムはスペクトルパラメータが大きくなるとき、有界にとどまるが、0に収束しない。・Dirac作用素のレゾルベントはスペクトルパラメータが大きくなるとき0に強収束はする。・Dirac作用素に対して放射条件を導入して、これを用いて極限吸収原理の結果として得られる2つの一般化されたレゾルベントを識別できるようにした。これらの結果からわかることは、Dirac作用素のレゾルベントはShrodinger作用素のそれとは質的にまったく異なる漸近挙動を示すということである。これは大変興味深いことである。しかしながら、Shrodinger作用素の逆散乱問題においては、レゾルベントの作用素ノルムがスペクトルパラメータが大きくなるとき、0に収束することが要点であるので、Dirac作用素の逆散乱問題への応用には問題があることがわかる。Dirac作用素に対する放射条件はこれまでに発表されたことがなく、本研究において初めて導入されたものである。Dirac方程式は抽象的にはBanach空間における発展方程式とみなせるが、これに関連して分坦者の八木教授は準線形の放物型の発展方程式について結果を得た。また、上木講師はDirac作用素と関わりの深いShrodinger作用素(磁場のポテンシャルがある場合)のスペクトルに関して興味ある結果を得た。
19世紀収集のスミソニアン研究機構所蔵日本関係資料の調査研究

日本の近世末から近代初期に当たる19世紀に,日本から多量の文物が海外に流出したことは良く知られている。アメリカ合衆国でもボストン美術館等に多数の美術工芸品があり,ピーボディ博物館にモース・コレクションが収蔵されていることは著名である。これらの文物は,日本のどのような側面にアメリカ人が関心を抱いたかを具体的に示す好資料である。スミソニアン研究機構にも,日本に開国をもたらしたペリー艦隊乗組員の収集資料が民族資料の第1号として登録されており,日米の国交あるいは個人的な旅行を通じて収集した約8,000点の日本関係資料を所蔵し,そのうち約2,000点が19世紀に収集されたものである。しかしながら,日本関係集資料を研究するスタッフの不足や文献史料や美術工芸品以外の物質的資料に対する日本研究者の無関心等のため,これまで各々の資料について詳細な調査は行われていなかった。このため,我々のプロジェクトでは,ペリー艦隊収集資料(以下ペリー・コレクションという)を中心としてスミソニアン研究機構所蔵品を中心とした19世紀にアメリカ人によって収集された日本関係資料の実態調査を,平成2年度以来実施してきた。平成4年度には,前年度までにペリー・コレクションの調査が一応終了したことを受けて,9月にスミソニアン研究機構側研究分担者のチャンスー・ハウチンズ夫人を招聘して,資料情報の整理,日本所在の関係資料の調査,スミソニアン研究機構が希望しているペリー・コレクションの日本での展示を含む今後の研究上の問題点整理を行った。その結果,展示については近い将来に企画展示「幕末日米交渉史」(仮称)を国立歴史民俗博物館その他で開催することとして,スミソニアン研究機構以外に所蔵されている関連資料の調査も行うことにした。12月には日本側研究分担者3名が渡米して,1.スミソニアン研究機構の博物館支援センター(MSC)所蔵の日本前近代武器・武具の悉皆調査と国立自然史博物館内の人類学資料館が所蔵する日本関係スケッチ・写真資料等の調査,2.アメリカ東部各地の博物館収蔵のペリー艦隊日本遠征関係資料の調査ならびに目録作成を行った。その結果,MSCには,付属品まで完全に揃った甲冑が多数収蔵されており,多くは近世の作であるが中世の甲冑も1件有ることが判り,人類学資料館ではペリー艦隊乗組員が描いたと思われるスケッチ数点を発見した。また,ロード・アイランド州ニューポートでペリーの生家と墓所および関連資料を調査し,併せてメリーランド州アナポリスの海軍兵学校博物館およびワシントンD.C.の海軍歴史センターでペリー艦隊乗組員によるスケッチ21点等の資料とアメリカ合衆国内の諸機関が所蔵するペリー並びにペリー艦隊日本遠征に関する文書・記録等の史料の所在目録を入手した。以上の調査によって,スミソニアン研究機構を始めとしたアメリカ合衆国東海岸での19世紀収集の日本関係資史料の所在の概要を把握することができた。これら東海岸の諸機関の資史料は,合衆国政府機関やその関係者が日本において収集したものである。それに対して,西海岸には日本開国後早い時期から日系人が移住しており民間レベルでの日米交渉が行われている。我々が,今後「幕末日米交渉史」に関する展示を企画するためには,日系移民関係の資料をも把握しておく必要が痛感された。このため,3月に短時間ではあったが,研究分担者2名が渡米しカリフォルニア州ロスアンゼルスの全米日系人博物館・カリフォルニア大学ロスアンゼルス校(UCLA)アジア系アメリカ人研究センター,並びにユタ州ソルトレイクで長年日本語新聞を発行していたユタ日報社とにおいて,日系移民の文化変容とその資料について調査をおこなった。3年間の調査研究を通じて,日米交渉史の初期における日米両国民のカルチャーギャップ,すなわち相手の文化や文物に対する関心や誤解について多くの研究資料を得ることができた。今後,「幕末日米交渉史展」等の具体的な企画に研究成果を反映させてゆく。

12月には日本側研究分担者3名が渡米して,1.スミソニアン研究機構の博物館支援センター(MSC)所蔵の日本前近代武器・武具の悉皆調査と国立自然史博物館内の人類学資料館が所蔵する日本関係スケッチ・写真資料等の調査,2.アメリカ東部各地の博物館収蔵のペリー艦隊日本遠征関係資料の調査ならびに目録作成を行った。その結果,MSCには,付属品まで完全に揃った甲冑が多数収蔵されており,多くは近世の作であるが中世の甲冑も1件有ることが判り,人類学資料館ではペリー艦隊乗組員が描いたと思われるスケッチ数点を発見した。また,ロード・アイランド州ニューポートでペリーの生家と墓所および関連資料を調査し,併せてメリーランド州アナポリスの海軍兵学校博物館およびワシントンD.C.の海軍歴史センターでペリー艦隊乗組員によるスケッチ21点等の資料とアメリカ合衆国内の諸機関が所蔵するペリー並びにペリー艦隊日本遠征に関する文書・記録等の史料の所在目録を入手した。以上の調査によって,スミソニアン研究機構を始めとしたアメリカ合衆国東海岸での19世紀収集の日本関係資史料の所在の概要を把握することができた。これら東海岸の諸機関の資史料は,合衆国政府機関やその関係者が日本において収集したものである。それに対して,西海岸には日本開国後早い時期から日系人が移住しており民間レベルでの日米交渉が行われている。我々が,今後「幕末日米交渉史」に関する展示を企画するためには,日系移民関係の資料をも把握しておく必要が痛感された。このため,3月に短時間ではあったが,研究分担者2名が渡米しカリフォルニア州ロスアンゼルスの全米日系人博物館・カリフォルニア大学ロスアンゼルス校(UCLA)アジア系アメリカ人研究センター,並びにユタ州ソルトレイクで長年日本語新聞を発行していたユタ日報社とにおいて,日系移民の文化変容とその資料について調査をおこなった。3年間の調査研究を通じて,日米交渉史の初期における日米両国民のカルチャーギャップ,すなわち相手の文化や文物に対する関心や誤解について多くの研究資料を得ることができた。今後,「幕末日米交渉史展」等の具体的な企画に研究成果を反映させてゆく。19世紀ー即ち日本の近世末から近代初期にかけて多数の日本関係資料が海外に流出したことは良く知られている。アメリカ合衆国でもボストン美術館等に多数の美術工芸品があり、ピ-ボディ博物館にモ-ス・コレクションが収蔵されていることは著名である。スミソニアン研究機構も、日本に開国をもたらしたペリ-艦隊の収集資料が民族資料の第1号であることが示すように、日米の国交を通じて、或いは個人的コレクションを受入れて、約8,000点の日本関係資料を所蔵しており、うち約2,000点が19世紀に収集されたものである。しかし、資料台帳に登録されていても、ペリ-・コレクション以外はほとんど調査整理されておらず、資料的な価値については不明なものが多数ある状況である。このため、今回の調査研究ではスミソニアン研究機構の研究者と共同で日本関係資料を調査整理し、その資料価値を明らかにすることを目的としている。
サブミリ波(400-700GHz)光源の開発とH_2^+イオンの分光

1.400-700GHz帯サブミリ波光源の開発当初の研究計画としては、クライストロン(80-130GHz)の出力と非線形素子(GaAs,ダイオ-ド)を組み合せて、倍周波器、3倍周波器を試作、試験、改良し、最終的に45倍周波器を試作し、400-700GHz帯の出力を得、星間分子イオンとして重要なH_2D^+のサブミリ波スペクトルを測定することが目的であった。倍周波器の開発としては、3倍周波器の試作まで進めることができたが、目標の出力を得るには到らなかった。現在3倍周波器の改良を試みているが、良い結果が得られれば、次年度以降4倍周波器の試作とこれを用いた分光に進みたい。2.短寿命星間分子のミリ波・サブミリ波分光既説のミリ波・サブミリ波分光器に試作した倍周波器を併用し、寿命の短い分子、特に、星間分子として可能性の大きい分子の分光をおこなった。本研究としての成果は以下の通りである。1).新星間分子の発見、CH_2CN(^2B_1)、Cyclic-C_3H(^2B_2)、CP(^2Σ^+)ラジカルおよびはじめての含けい素炭素鎖分子C_4Siを、いずれも、実験室での分光結果に基づいて新しい星間分子に同定した。特にCH_2CNは、野辺山宇宙電波観測所45m電波望遠鏡などで以前から検出されていた主要なスペクトル線に対応するスペクトル線を与え、今まで発見された70余の星間分分子のなかで最も複雑なスペクトル線を与える分子と判明した。このスペクトルの解析には実験室分光の詳細な結果が必須であった。2).その他の短寿命分子。PS(^21Tr)、MgS,CaS,AlS(^1Σ^+)、FeS(^5Δi)、NH_2O(^2B_1)、ND_2(^2B_1)、HSiS(^2Δ^1)などの短寿命分子のスペクトルを実験室ではじめて検出した。特にNH_2O、Nb^2、HSiSは非常に複雑なスペクトルを示すが、詳細な解析の結果、各分子について精度の高い分子定数を決定し、それら分子の物理的特徴を明らかにすることができた。1.周波数倍周波器の製作と試験.周波数倍周波器の基本的な特性も把握するため,市販のミクサーダイオード(IN53)と導波管を用いて2倍周波器を試作した.導波管の構成はWRJ740×WRJ1200としたので基本波の最高周波数は73.8GHzである.光源として70V11A(出力120250mW)用い, 2倍波の出力としては137143GHzにわたって100150μW, 144GHzでは20μWが得られた.この倍周波器について,最大出力とバイアスの関係,出力とミクサーダイオードの位置関係,チューナーの良否などを各周波数領域にわたって調べた.

2.短寿命分子のミリ波・サブミリ波分光.既設のサブミリ波分光器に上記の試作した倍周波器も併用し,寿命の短い分子(分子イオン・フリーラジカル,不安定分子),特に星間分子として宇宙空間に存在する可能性の大きい分子の分光をおこなった.1)Ps(^2πr), Cp(^2Σ^+).PSラジカルは酸素星大気中で最も存在量の多い含りん化合物として,また,CPは比較的暖かな分子電中での存在が予想されているラジカルである.これら両多子のマイクロ波スペクトルを実験室で初めて明らかにした.その際, 140GHz領域での分光には試作した倍周波器を用いた.実験室での結果に基づいて,野辺山宇宙電波観測所45m電波型遠鏡を用いてPS,CPの星間スペクトルを探査したが,検出に至らなかった.2)CH_2CN(^2B_1).メチルラジカル(CH_3)は以前から基本的な炭化水素星間分子としてその存在が期待されていたが,分子の対称性が高いため,電波領域に強いスペクトルを与えず,したがって電波望遠鏡に上る探査もできなかった.今回,そのシアン化誘導体であるCH_2CNラジカルのマイクロ波スペクトルを実験室で初めて明らかにした.その結果,未同定線U20120,U40240,U80480,U100601がCH_2CNのK_<-1>=0のスペクトル線と同定され, CH_2CNは新星間分子となった.1.周波数倍周波器の製作と試験。市販のミクサーダイオード(IN53)を利用して製作した2倍周波器の試験結果に基づいて3倍周波器の設計をおこない、製作に入りつつある。2.短寿命分子のミリ波分光、サブミリ波分光、既設のミリ波、サブミリ波分光器を用い、寿命の短い分子、特に星間分子として宇宙空間に存在する可能性の大きい分子の分光、および、実験室での分光結果に基づいて、星間分子としての探査を電波望遠鏡を用いておこなった。1).CH_2CN(^2B_1)ラジカル、CH_2CNラジカルのマイクロ波スペクトルを実験室で初めて明らかにし、その結果に基づいて未同定線U20120、U40240、U80480、U100601をCH_2CNのK_<-1>=0のスペクトル線と同定し、星間分子としてのCH_2CNの存在を確立したことは前年度に報告した。これらのスペクトル線はOrtho分子(K_<-1>=偶)のものであるが、これらとは全く別に振舞うpara分子(K_<-1>=奇)の星間スペクトル線の探査を、やはり国立天文台野辺山宇宙電波観測所の45m電波望遠鏡を用いて、今年度おこなった。結果はpara-CH_2CNのスペクトル線の検出には到らず、その存在量の上限値を得ることができた。この結果から、TMCー1の雲の中ではortho-CH_2CNとpara-CH_2CNが5Kの熱平衡にあるとの結論に到達した。2).DCCN(^3Σ^-)ラジカル・DCCNラジカルのミリ波・サブミリ波スペクトルを観測した。今後、他の^<13>Cなどの同位体種についての結果と併用し、PCCNラジカルの分子構造、特に直線か非直線かを明らかにする。3).ND_2(^2B_1)ラジカル。ND_2のサブミリ波スペクトルを観測し、窒素核及び重水素核による非常に複雑なスペクトルの詳細な解析をおこなった。4).NH_2O(^2B_1)ラジカル。NH_2Oラジカルのミリ波・サブミリ波スペクトルを実験室で初めて検出した。やはり非常に複雑なスペクトルを示すが、順次解析を進めつつある。1.周波数倍周波器の試作、6263年度に試作した2倍周波器の試験結果に基づいて、本年度は、3倍周波器の試作をおこなった。300GHz付近で得られた出力は、当初の目標の数分の1程度であった。試作倍周波器の出力特性を詳細に調べ、出力を向上するための条件を試行錯誤に上り。改良型の設計を生かしつつある。当初の目標の450GHz以上を発生する4倍周波器の開発は次年度以降におこなう。
ナノ・マイクロエンジニアリングにおける数理最適化の展開

ナノ・マイクロエンジニアリングに代表される,非常に小さな物体を扱う精密工学の現場においては,誤差が部品の精度などに大きく影響を与える.このような場合には,従来の最適化計算は誤差に影響されて正しい答えを求めるのが難しかったが,本研究では誤差の影響が少ない,最適な答えを求める数理的手法を開発した.研究の成果は,精密工学の現場においてより小さな製品の開発などに利用できる,有用なものである.ナノ・マイクロエンジニアリングに代表される,非常に小さな物体を扱う精密工学の現場においては,誤差が部品の精度などに大きく影響を与える.このような場合には,従来の最適化計算は誤差に影響されて正しい答えを求めるのが難しかったが,本研究では誤差の影響が少ない,最適な答えを求める数理的手法を開発した.研究の成果は,精密工学の現場においてより小さな製品の開発などに利用できる,有用なものである.本研究の目的である「ナノ・マイクロエンジニアリングにおける数理的最適化の展開」について,平成20年度の研究計画に従い,「データ収集および問題の数理的構造の解明」に焦点をあてて研究を行った.(1)制約2次計画法および2次錐計画法を用いたアルゴリズムの開発目的関数が複数の項の最大値という形で表され,なおかつ2次関数を含むタイプの問題は,目的関数が滑らかでないため従来の微分情報を利用するタイプのアルゴリズムはうまく動作しなかった.この種の問題に対して,制約2次計画法および2次錐計画法を用いたモデル化を行い,最適解を高速に求めることに成功した.(2)混合0-1整数計画法を用いたアルゴリズムの開発精密工学の分野に現れる,ある種類の最適なフィッティングを求める問題に対して,混合0-1整数計画法を用いたモデル化を行い,最適解を求めるアルゴリズムを開発した.従来この種の問題は,最小2乗法もしくはその改良法などを用いて答えが求められていたが,ある種の近似を行った結果であり,あくまでも得られる出力は近似最適解にすぎなかった.本研究の成果を利用することにより,真の最適解を求めることができ,また従来の近似最適解の精度があまり高くないことが判明した.本研究の目的である「ナノ・マイクロエンジニアリングにおける数理的最適化の展開」について,平成21年度の研究計画に従い,「問題構造の特徴を生かした高速な数理最適化アルゴリズムの構築」を行なった.(1)誤差の不連続性を考慮した精密工学におけるロバスト最適化問題の解法の構築誤差に強い最適化手法として,従来からロバスト最適化という手法が提案されてきたが,これらの手法では誤差に不連続性がある時のモデル化が議論されていなかった.今年度の研究においては,この種類の誤差が発生する際の精密なモデル化を行うことに成功し,また計算機実験によって従来の手法より誤差に格段に強い最適解が求まることを確認した.この成果は,従来の(連続的な)ロバスト最適化手法と,整数計画問題に代表される離散的な手法を組み合わせた独創的なものであり,今後の発展が期待される.(2)計算が難しい問題に対する高速な近似アルゴリズムの開発精密工学に限らず,何らかの移動コストを最小化する問題はしばしば現実社会に現れるが,これらの問題は計算が非常に困難なことが知られている.今年度の研究において,従来近似アルゴリズムの構築が難しいと考えられていたいくつかの間題について,入力のサイズに依存しない定数近似アルゴリズムを構築することに成功した.本研究の目的である「ナノ・マイクロエンジニアリングにおける数理的最適化の展開」について,平成22年度の研究計画に従い,「数理最適化アルゴリズムの評価実験および改良」に焦点をあてて研究を行った.主に得られた研究成果を以下に記述する.1.誤差に強いロバストなアルゴリズムの構築誤差の絶対値を最小にするような関数に対する最適化問題は,ナノ・マイクロエンジニアリングでしばしば出現する.これらの問題に対し数値計算を行なうと,微分できない点の周辺で数値精度が不安定になり,結果として計算が破綻することが多かった.本研究ではこれらのタイプの関数に対して,変数変換などにより不安定性を解消できることを示し,実際の問題に適用し非常に精度の高い解を得ることに成功した.2.厳密計算が困難な問題に対する定数近似比率アルゴリズムの開発本研究課題の対象である「誤差に強いロバストなアルゴリズム」が要求されている問題群の中には,いわゆるNP-困難とよばれる厳密計算が非常に困難である問題が存在する.このような問題の一種である,ある種類の制約条件付き移動距離最小化問題に対して,定数近似比率で近似を行なうアルゴリズムの開発に成功した.従来この種の問題に対しては経験的解法が使うのが主であったが,近似比率の保証ができていなかった.本研究の成果により,どんな入力パラメータに対しても最適解に対する定数倍の近似比率を保証する,高速な多項式時間アルゴリズムの構築が可能となった.
歯科診療における発達障害児のストレスへの対応と評価に関する研究

【研究目的】発達障害児を対象とし,各患児のストレスを歯科診療時の唾液中のクロモグラニンA(以下CgA)値並びに,保護者に対する児の歯科適応質問紙の結果両面より分析し,感覚刺激に対する反応性の高さや言語能力の低さ等がストレスに関連する要因であることが示唆された(平成22年度奨励研究)。この結果を基に,今研究では感覚刺激に対する反応性などのストレス関連要因に関して,各患児に特化したフォローを行いながら診療を重ねることで,ストレスに変動が起こるかどうかを明らかにすることを目的とした。【研究方法】広島大学病院小児歯科外来受診患児の中で,言語的コミュニケーションが難しく,感情の表出が困難な患児のうち,研究の趣旨を理解し協力の得られた患児を対象とした。保護者へのアンケート結果に基づき,次回の診療時より各児に特化したフォローを行いならが,歯科治療時に受けている歯科的ストレスを診療の前後に唾液中のCgAa値を測定し,診療時の行動をFlank1の行動分類を用いて評価した。【研究成果】協力の得られた患児は7歳から15歳までの発達障害児18名(男女比13:5)である。障害内訳は,自閉症が14名,精神発達遅滞4名であった。加療によるストレス条件を統一するため定期健診(機械的口腔内清掃を含む)時を対象とし,複数回採取できた患児は7人で1患者につき4回から2回の試料を得た。フォローの内容は,聴覚過敏の患児に聴覚アナルゲシアを目的として診療時にイアーマフやiPadを使用し,また加療の見通しを助けるツールとして絵カードやホワイトボードなどを使用した。CgA値の比較から,フォローが奏功したと思われる児,変化のない児と一貫性は認められていない。同一の患児においても身心の状態や治療内容によってCgA値は異なるが,特化したフォローでストレスが軽減する患児では的確なフォローの実践が必要であると考える。
超短パルス時間分解光電子分光測定によるワイドギャップ半導体の表面再結合速度の同定

本研究では、表面に敏感な紫外光電子分光測定において時間分解二光子光電子分光測定系(Tr-2PPE)を構築し、半導体の表面再結合速度の同定を目指している。初年度では、まず系の構築を目指す目的で、un-dope (001) GaAs基板表面に励起された電子の短寿命緩和過程を評価した。励起光源としてTi:Sappレーザー(パルス幅: 100 fs、繰り返し周波数: 80 MHz)を用い、GaAsのバンドギャップ1.42 eVよりも僅かに大きいエネルギーを持つ基本波(波長800 nm, 1.55 eV)をポンプ光として利用した。さらに基本波をBBO結晶に通して得られた第二高調波(波長400 nm, 3.10 eV)をプローブ光として用い、MachーZehnder干渉計にそれぞれのパルス光を入射した。この際、各パルスの光路差を制御することで高い時間分解能を有するTr-2PPE系を作製した(Δt 6.7 fs)。GaAsの電子親和力が4.07 eVであることから、上記ポンプ・プローブ光による二光子励起過程では光電子放出に十分なエネルギーを得られないため、真空チャンバー内で試料表面にCsを蒸着する(被覆率14%)ことにより電気二重層を形成し、実効的な電子親和力を低減した。上記試料の測定により得られた光電子強度の時間分解減衰曲線に対して、基本波と第二高調波の相互相関関数(FWHM: 170 fs)と、マルチexponential関数をコンボリューションした関数で減衰曲線をフィットし、励起電子の緩和寿命を見積もった。フィッティング結果から、GaAs表面では微小スケールで点在する表面欠陥を反映した複数の再結合寿命が見積もられ、0.55-1.7 psの緩和寿命が見積もられた。局所的な構造欠陥がない表面における表面再結合寿命は24.2 psであることが示唆された。マルチカラーの短パルスレーザーを集光することで、高い時間分解能を有する時間分解二光子光電子分光系を実現した。さらにCs修飾機構も備え付け、半導体の仕事関数制御を可能にした。実際の測定により、GaAs半導体表面でのサブピコ秒レベルの表面再結合寿命に関する知見も得られており、研究は極めて順調に進行している。当初の研究計画に比べて遅れは生じていない。初年度では、GaAs試料を利用して表面再結合速度の同定に成功した。今後は、ワイドギャップ半導体材料に本測定を適用し研究を進めていく予定である。これまでの研究で、チタンサファイアレーザーの基本波と第二高調波を利用した時間分解二光子光電子分光系を実現したが、今後のワイドギャップ半導体での実験のためには、より高エネルギーの励起が可能な第三高調波を系に組み込む必要がある。次年度以降に更なる測定系の拡張を行う予定である。これまでの研究で、チタンサファイアレーザーの基本波と第二高調波を利用した時間分解

二光子光電子分光系を実現したが、今後のワイドギャップ半導体での実験のためには、より高エネルギーの励起が可能な第三高調波を系に組み込む必要がある。次年度以降に更なる測定系の拡張を行う予定である。
^<31>P-MRSによる培養神経芽腫細胞の代謝に関する研究

生きた神経芽腫細胞の^<31>P-MRS(magnetic resonance spectroscopy)スペクトル測定のために、中空糸培養用ホローファイバーを用いて、潅流培養系を確立した。得られたスペクトルでは、PMEピーク(phosphomonoester)は高くPCrピーク(phosphocreatine)は認められず、腫瘍組織のin vivoのスペトクルと同様の傾向であった。外因性のグルコサミンとウリジンが代謝に及ぼす影響を、検討したところDPDE(diphosphodiester)ピークの増加を認めた。本系は培養神経芽腫細胞のリン含有代謝物質の変化を検討するうえで有用であることが示された。またDPDEは最近、分化との関連性が報告されている。本結果は神経芽腫におけるDPDEはUDP-N-アセチルグルコサミンによりなることを示唆する。つぎにクレアチンの類似体であるサイクロクレアチン(Cyclocreatine:CCr)の作用について検討した。CCrにより細胞の増殖は抑制される。負荷によりサイクロクレアチンリン酸(phosphoryl-cyclocreatine:CCr-P)ピークの出現,増加を認めた。CCrが細胞内でリン酸化されて、CCr-Pが合成され蓄積することが示唆された。またPMEピークは減少の傾向であった。腫瘍の高いPMEは増殖性と関連する。低いPCrはエネルギーバッファーが少ないことを示す。腫瘍では異常な増殖と関連して、high energy demandの状態にあることが示唆されている。本系は神経芽腫の増殖と代謝についての検討に有用であると考えられる。本研究はエネルギー代謝の立場から神経芽腫の生物学的特性についての示唆を与えるものと考える。また腫瘍に対する^<31>P-MRS法の臨床応用として、PMEピークが腫瘍増殖のマーカーとなる可能性が示唆された。(1)当初の計画のとおりに、新たな患児よりヒト神経芽腫細胞株の樹立に成功している。(2)大量培養については、ホロ-ファイバ-(HollowーFiber:HF)培養方法(HF法)を用いている。細胞は当科で樹立したヒト神経芽腫細胞株KPーNーRTBMIを、HFはグレ-スジャパン社アミコン,ミニヴィタファイバ-を用いた(中空糸500本,内径/外径200/350μm,膜面積約300cm^2,ECS約70ml,分画分子量30000)。HF内に1×10^8個の細胞を注入し、細胞が中空糸へ着床した後より中空糸内空間(intracapillary space:ICS)を25ml/minの流速で,24時間後より中空糸外空間(extracapillary space:ECS)を8ml/hrの流速で、培養液を潅流し長期間培養した。HFの中空糸膜は限外濾過膜となっているため、増殖に高分子蛋白が不可欠な細胞株はHF法には適さない。本系ではそれを克服するために、ECSの潅流を試み成功した。またECSの潅流により迅速な薬剤負荷が可能であると考えられた。(3)Phosphorusー31nuclear magneticresonancespectroscopy( ^<31>PーMRS)の測定は潅流条件下で培養環境の恒常性を維持しつつ、積算回数2000で行なった(測定条件:繰返し時間2.0sec,60°パルス幅,81.134MHz)。MRS装置はGE社CSIーIIで、20mm径のコイルを装着した自家製プロ-プを用いた。培養14日目で明瞭なスペクトルが得られ、ヒト培養神経芽腫細胞の^<31>PーMRS測定に成功した。一般にHF法の欠点として、ICS容積が大きいこと,潅流圧が高いことなどがある。

今回良好なスペクトルが得られたことより、HF法によりMRS分析に必要な高密度細胞培養が可能であることが示された。【ホローファイバー(Hollow-Fiber:HF)式高密度培養】HFは本来はハイブリドーマ細胞やLAK細胞の培養のためのリアクターであるために、浮遊性細胞の培養により適している。我々の研究対象である培養神経芽腫細胞は付着性細胞であるので、潅流圧の設定、すなわち中空糸内空間(intracapillary space:ICS)潅流の流速の設定が比較的困難である。我々はアミコン社、ミニヴィタファイバー(中空糸500本、内径/外径200/350μm、膜面積約300cm^2、中空糸内空間(extra-capillary space:ECS約7ml、分画分子量30000)を用いている。我々が用いている細胞株ではミニヴィタファイバーのICS流速が25ml/min前後が最適と考えられる。HFにより、細胞株KP-N-RTに加えてKP-N-SIの培養が可能であった。【^<31>P-MRS測定】培養1014日でスペクトルが得られた。RTとSIは同様のスペクトルで、腫瘍組織におけるin vivo MRSと同様にPMEは高くPCrは低い傾向であった。【低酸素負荷】RTに対して潅流を停止することにより低酸素の状態を負荷した。潅流停止後060min、60120minでは、ATPピークの減少を、120180minではATPピークの消失を認めた。その後に再潅流を行ったところ、ATPピークの回復を認めた。【抗腫瘍剤負荷】RTに対して抗腫瘍剤を負荷した。CDDP(cis-diamminedichloroplatinum)負荷では、12時間までは著明な変化はなかったが、1日後、4日後にはピークの漸減を認め、7日後にはスペクトルは平坦化した。【結果】以上のように^<31>P-MRSにより、PME変化、および高エネルギーリン酸化合物であるATP変化の経時的検討が可能であることが示された。生きた神経芽腫細胞の^<31>P-MRS(maghetic resonance spectroscopy)スペクトル測定のために、中空糸培養用ホローファイバーを用いて、灌流培養系を確立した。得られたスペクトルでは、PMEピーク(phosphomonoester)は高くPCrピーク(phosphocreatine)は認められず、腫瘍組織のin vivoのスペクトルと同様の傾向であった。外因性のグルコサミンとウリジンが代謝に及ぼす影響を、検討したところDPDE(diphosphodiester)ピークの増加を認めた。本系は培養神経芽腫細胞のリン含有代謝物質の変化を検討するうえで有用であることが示された。またDPDEは最近、分化との関連性が報告されている。本結果は神経芽腫におけるDPDEはUDP-N-アセチルグルコサミンよりなることを示唆する。
東南アジアにおける狂犬病及びリッサウイルス感染症の分子疫学

本研究は、東南アジアで流行している犬からの狂犬病ウイルスを分子遺伝学的に解析し、その感染環を明らかにすることと野生動物からリッサウイルの遺伝子を検出し、リッサウイルスの侵淫状況を調査し、その成果を狂犬病並びにリッサウイルス感染症の防疫に役立てることである。1年目はタイ、2年目はインドネシアでそれぞれウイルス遺伝子を多数収集し、以下の成績を得た。1.タイ北部、中部、南部で流行している狂犬病ウイルスは、N遺伝子の解析からおよそ2大別され、さらに6つに細分化された。2.各地域独自のタイプと、北部と中部及び南部と中部にそれぞれ共通のタイプがあり、首都バンコクには種々のタイプが集まっていた。3.タイ東北部におけるウイルスは、他の地域と類似していたが、同じものはなく4つに分類された。そのうちの一部はラオス国境に集中していた。4.タイ4地域で流行しているウイルスのG遺伝子の解析から、それらのG蛋白質の推定アミノ酸は、4地域間で高い相同性を示したが、日本の動物用ワクチンとでは8889%であった。5.タイ南部における野生のネズミ及びコウモリそれぞれ50例からリッサウイルス遺伝子の検出を試みたが、全て陰性であった。6.現在、インドネシアの各地から収集した140例の狂犬病ウイルスの遺伝子解析を進めている。以上の結果から、N遺伝子の解析により、タイにおける狂犬病ウイルスの動態の一部を明らかにすることが出来た。また、G遺伝子の解析は、有効なワクチン開発の基礎データーとなる。今後、この調査の継続は、東南アジア諸国のみならず日本の狂犬病防疫対策にとっても必要である。本研究の目的は、東南アジアで流行している狂犬病ウイルスを分子進化学的に解析し、その感染環とリッサウイルスの存在を解明すると共に、その成果を基に本病の有効な防疫方法を提案することである。本年度はタイにおける調査を重点的に以下の手順で進めている。1)狂犬病及びリッサウイルスのN遺伝子を特異的に検出可能なプライマーをジーンバンクのデータを基に設計した。2)タイの協力研究機関(チュラロンコン大学獣医学部・赤十字狂犬病診断センター・畜産局畜産疾病診断センター)の共同研究者にタイ全土から感染した犬及び一見健康なコオモリ並びに野ネズミの収集を依頼し、現在までにそれぞれ約50検体がタイ南部、ツンソンにある畜産局畜産疾病診断センターで凍結保存されている。3)材料収集の関係で、2000年2月にタイ畜産局畜産疾病診断センターで、保存材料から狂犬病及びリッサウイルス遺伝子を抽出し、cDNA合成を行う予定である。4)合成cDNAを申請者の研究室に搬入し、PCRによりN及びG遺伝子を増幅し、その遺伝子の塩基配列を決定し、分子進化学的解析を行うと共にリッサウイルスの存在を確認する。本研究は、東南アジアで流行している犬からの狂犬病ウイルスを分子遺伝学的に解析し、その感染環を明らかにすることと野生動物からリッサウイルスの遺伝子を検出し、リッサウイルスの侵淫状況を調査し、その成果を狂犬病並びにリッサウイルス感染症の防疫に役立てることである。1.タイ北部、中部、南部で流行している狂犬病ウィルスは、N遺伝子の解析からおよそ2大別され、さらに6つに細分化された。5.タイ南部における野生のネズミ及びコウモリ

それぞれ50例からリッサウイルス遺伝子の検出を試みたが、全て陰性であった。6.現在、インドネシアの各地から収集した140例の狂犬病ウイルスの遺伝子解析を進めている。以上の結果から、N遺伝子の解析により、タイにおける狂犬病ウイルスの動態の一部を明らかにすることが出来た。また、G遺伝子の解析は、有効なワクチン開発の基礎データーとなる。今後、この調査の継続は、東南アジア諸国のみならず日本の狂犬病防疫対策にとっても必要である。