hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポストGWAS時代における脂質異常症に関わる新規パスウェイと遺伝マーカーの探索

血中トリグリセリドレベルに遺伝的関連を示すTRIB1遺伝子産物は、脂質合成のマスターレギュレーターであるChREBPタンパクと分子間相互作用し、ユビキチン・プロテアソーム系でのタンパク分解を制御していると同時にSAP18タンパクと相互作用することによって、MTTP遺伝子の発現制御を行い、VLDL分泌を制御することを明らかにした。TRIB1はこれら2つのメカニズムによって、血清脂質レベルと脂肪肝の両方に作用するため、そのエンハンサーに存在するSNPが遺伝的関連を示すと考えられた。また、内臓肥満にインクレチン遺伝子GIPが遺伝的関連を示すことを初めて明らかにし、特許申請した。ゲノムワイド関連解析(GWAS)によって新たに見出された血中トリグリセリドレベルに関連する遺伝子のひとつTRIB1の機能解析を行った結果、TRIB1は様々な転写因子やシグナル伝達分子との相互作用を介して、脂質合成の調節を行っていることが明らかになった。TRIB1を肝臓で強制発現させる実験では、脂質合成のマスター転写因子であるMLXIPLとの分子間相互作用の発見に至った。この相互作用の結果、ユビキチン・プロテアソーム系におけるMLXIPLの分解が促進され、脂質合成が負に制御される。また、GWASによって関連が見出されたゲノム領域の周辺には、TRIB1の発現を調節する配列が存在し、その配列のバリエーションが発現レベルの差をもたらすことが明らかになった。この結果から、TRIB1は様々なターゲット分子との相互作用を介して、脂質代謝の調節を行っている可能性が示唆された。それを新たに同定する目的で、イースト2ハイブリッド法を用いたスクリーニングを行った。得られたターゲット候補分子をノックダウンするアデノウイルスベクターを構築し、マウスに導入して機能的スクリーニングを行った結果、1つの分子の肝臓での発現低下が、血清脂質の有意な減少をもたらすことが明らかになった。現在、この分子メカニズムを明らかにするために実験を重ねている。GWASによって見出された血清脂質関連ゲノム領域の中で、未だに機能性分子が同定されていない領域がある。NCAN-CILP2領域は19番染色体短腕の約300kbの強い連鎖不平衡ブロックの中に、10遺伝子と1miRNAをコードしている。10遺伝子の中で肝臓発現遺伝子に着目し、アデノウイルスベクターを用いたマウス肝臓でのノックダウン実験を行った結果、2つの遺伝子の発現低下は血清脂質の有意な変化をもたらした。現在、そのメカニズムを明らかにするための実験を遂行中である。ゲノムワイド関連解析(GWAS)によって新たに見出された血中コレステロールとトリグリセリド値に関連する遺伝子のひとつTRIB1の機能解析の結果、TRIB1の新たな結合パートナーとしてMLXIPLを見出した。脂質合成のマスター転写因子であるMLXIPLは、TRIB1との分子間相互作用の結果、ユビキチン・プロテアソーム系による分解が促進され、脂質合成が負に制御される。また、血清脂質レベルとの関連が見出されたTRIB1下流の連鎖不平衡ブロックのSNPは、非アルコール性脂肪肝(NAFLD)とも深い関連を示すことを見出した。MLXIPLは血清トリグリセリド値と深い関連を示すが、NAFLDとの関連は認められていないことから、TRIB1は他のターゲット分子との相互作用を介して、肝細胞内脂質レベルの調節を行っている可能性が示唆された。得られたターゲット候補分子をノックダウンするアデノウイルスベクターを構築し、マウスに導入して機能的スクリーニングを行った結果、SAP18の肝臓での発現低下が、血清脂質の有意な減少と肝臓内の脂質の蓄積をもたらすことが明らかになり、SAP18はTRIB1と共同してSin3AとともにMTTP遺伝子の発現制御に働くことが明らかになった。GWASによって見出された血清脂質関連ゲノム領域の中で、機能性分子が同定されていなかった19番染色体短腕の約300kbの強い連鎖不平衡ブロックNCAN-CILP2領域に、機能性の候補遺伝子TM6SF2が見出され、東アジア5人種7集団において遺伝的検証を行った。その結果、TM6SF2遺伝子の稀なミスセンスSNPは血清コレステロールとトリグリセリド値に強く関連すること、NAFLDとも強く関連することを見出した。ゲノムワイド関連解析(GWAS)によって新たに見出された血中コレステロールとトリグリセリド値に関連する遺伝子のひとつTRIB1の機能解析の結果、TRIB1の新たな結合パートナーとして脂質合成のマスター転写因子であるMLXIPLを見出した。また、血清脂質レベルとの関連が見出されたTRIB1下流の連鎖不平衡ブロックにエンハンサー活性を見出し、そこに存在するSNPは、エンハンサー活性に変化をもたらすこと、非アルコール性脂肪肝(NAFLD)とも深い関連を示すことを見出した。TRIB1が相互作用するNAFLDに関わる新たな結合パートナーのスクリーニングを、イースト2ハイブリッド法により行った。得られたターゲット候補分子をノックダウンするアデノウイルスベクターを構築し、マウスに導入して機能的スクリーニングを行った結果、SAP18の肝臓での発現低下が、血清脂質の有意な減少と肝臓内の脂質の蓄積をもたらした。SAP18はTRIB1と共同してSin3AとともにMTTP遺伝子の発現制御に働くことが明らかになった。GWASによって見出された血清脂質関連ゲノム領域の中で、機能性分子が同定されていなかった19番染色体短腕の約300kbの強い連鎖不平衡ブロックNCAN-CILP2領域に、機能性の候補

遺伝子TM6SF2が見出され、東アジア5人種7集団において遺伝的検証を行った。その結果、TM6SF2遺伝子の稀なミスセンスSNPは血清コレステロールとトリグリセリド値に強く関連すること、NAFLDとも強く関連することを見出した。また、次世代シークエンサーを用いてTM6SF2遺伝子ならびに、VLDL分泌に関わる他の2分子(PNPLA3、MTTP)について、日本人男性950人を対象にディープ・リシークエンスし、TM6SF2とPNPLA3遺伝子に機能性レアバリアントを見出した。血中トリグリセリドレベルに遺伝的関連を示すTRIB1遺伝子産物は、脂質合成のマスターレギュレーターであるChREBPタンパクと分子間相互作用し、ユビキチン・プロテアソーム系でのタンパク分解を制御していると同時にSAP18タンパクと相互作用することによって、MTTP遺伝子の発現制御を行い、VLDL分泌を制御することを明らかにした。TRIB1はこれら2つのメカニズムによって、血清脂質レベルと脂肪肝の両方に作用するため、そのエンハンサーに存在するSNPが遺伝的関連を示すと考えられた。また、内臓肥満にインクレチン遺伝子GIPが遺伝的関連を示すことを初めて明らかにし、特許申請した。当初予定していた3つの課題は2年間で、以下のようにほぼ達成されつつある。1遺伝解析に基づいて同定された血清脂質関連遺伝子における機能性多型は、TRIB1遺伝子の発現制御配列の機能変化をもたらすSNPとNCAN-CILP2領域のミスセンスSNPを同定することができた。2新規脂質関連遺伝子の機能的検証ならびに関連する代謝パスウェイの探索についても、TRIB1ーMLXIPLという新たな制御パスウェイの発見に至った3新規脂質関連遺伝子産物が関与する分子間相互作用の探索では、TRIB1と相互作用するSAP18という新規結合パートナーを見出し、血清ならびに肝細胞内脂質レベルに影響を与える新規分子を同定できた。医歯薬学1新規脂質関連遺伝子産物が関与する分子間相互作用する新たな分子の血清脂質調節における機能的検証: shRNAテンプレートを用いたTRIB1の発現レベルの低下はエネルギー代謝の日内変動に関連する可能性が認められたため、コンディショナルノックアウトマウスを用いてこれをさらに検証し、TRIB1の生理的役割をさらに明らかにする。2新規脂質関連遺伝子の機能的検証と関連する代謝パスウェイの探索: NCAN-CILP2領域における機能分子の絞り込みをさらに進め、脂質レベル調節の新規代謝パスウェイの同定を目指す。3血清脂質関連分子の遺伝学的検証: TRIB1と相互作用することが明らかになった分子、NCAN-CILP2領域における機能分子が同定された後、それらの遺伝的バリエーションが血清脂質レベルに影響するかどうか、SNP関連解析や次世代シークエンサーを用いたレアバリアントの探索を行う。2013年度に予定していた計画の内、1遺伝解析に基づいて同定された血清脂質関連遺伝子における機能性多型の探索は、TRIB
EGF様構造とfollistatin様構造から成る新規蛋白質の消化管における役割

(1)TRのerbBリン酸化作用の解析既に私達は(1)tomoregulin(TR)が消化管粘膜内、粘膜固有層線維芽細胞に局在して発現すること、(2)sf9細胞に強発現させたTRを精製し、精製TRがMKN28胃癌細胞株、erbB4発現CHO細胞株でerbB4のリン酸化を刺激するが、EGF受容体、erbB2、erbB3のリン酸化は刺激しないことを示している。しかし、erbB4リン酸化は全長TRでは極めて弱いため、EGFドメインcDNAをCOS7細胞に一過性に導入し、TR-HGFドメインをCOS7細胞上清より精製して検討したところ、MKN28細胞株におけるerbB4リン酸化を再確認しえた。(2)MKN-1胃癌細胞株抑制作用の解析MKN-1では充分なerbB4リン酸化は観察されないが、全長TRはMKN-1の増殖反応を抑制する。この抑制作用がfollistatinドメインの作用によるものかEGFドメインの作用によるものかを検討したところ、全長TRと同様の作用が精製EGFドメインにても観察されたことから、EGFドメインがMKN-1胃癌細胞株を抑制するものと思われた。またMKN-1胃癌細胞株ではerbBのリン酸化はEGFドメインによって確認しえないにも関わらず、MAP-kinase p44、p42のリン酸化が観察された。したがってMKN-1細胞株ではTR-EGFドメインはerbB1、erbB2、erbB3、erbB4以外の受容体に作用し、MAP-kinaseのリン酸化を刺激すると同時に、細胞の増殖反応を抑制するものと思われる。(3)TR測定系の確立私達はこれまで、TR蛋白に対する単クローン、多クローン抗体の開発に成功している。両抗体を用いたサンドイッチ法によるELISA系の開発に成功し、培養液中のTR濃度を測定したところ、高感度にTRの測定が可能であった。現在、血中TR測定の試みや、TR放出機序を検討中である。(1)TRのerbBリン酸化作用の解析既に私達は(1)tomoregulin(TR)が消化管粘膜内、粘膜固有層線維芽細胞に局在して発現すること、(2)sf9細胞に局発現させたTRを精製し、精製TRがMKN28胃癌細胞株、erbB4発現CHO細胞株でerbB4のリン酸化を刺激するが、EGF受容体、erbB2、erbB3のリン酸化は刺激しないことを示している。しかしerbB4リン酸化能は全長TRでは極めて弱いため、今回はEGFドメインcDNAをsf9細胞に導入し、培養上胃からEGFドメインの精製を試みたが、現在のところまだ充分な精製に成功していない。COS7細胞への導入とその上清の生物学的作用の解析についても現在検討中である。(2)TRのMKN-1胃癌細胞増殖抑制作用の解析erbB4リン酸化が観察されないMKN-1胃癌細胞株では、TR刺激によりDNA合成及び細胞増殖が抑制される。(1)TRcDNAをMKN-1胃癌細胞株に導入し、TR高発現MKN-1細胞株を確立する、(2)follistatinドメインcDNAをsf9細胞に導入し、follistatinドメインを精製する、(3)全長TR及びfollistatinドメインのアポトーシスに対する作用を解析する。以上の3点について現在検討しているが充分な結果は得られていない。(3)TRの消化器癌における発現の解析

現在まで得られている癌組織標本での検討では、TRの大腸癌、胃癌細胞での発現は認められていない。正常消化管組織の線維芽細胞での発現が観察される。大腸癌組織におけるTR遺伝子のメチル化とTR発現抑制について癌細胞を用いて検討中である。(1)TRのerbB4リン酸化能と細胞増殖抑制作用の検討-TRはこれまでMKN28胃癌細胞のerbB4をリン酸化する一方、MKN1胃癌細胞株では細胞増殖反応を抑制した。そこでMKN1細胞株のerbB4のリン酸化を検討したが、TR刺激MKN1胃癌細胞ではerbB4のリン酸化は観察されなかった。一方、bovine aortic endothelial cell(H.H)の増殖反応に対してもTRは抑制的であり、MKN1、H.H両細胞に対する細胞内蛋白のリン酸化を検討したところ、TR刺激によりp44,p42のMAP kinaseのリン酸化が観察された。これら細胞株ではTRはMAP kinaseのリン酸化を刺激し、細胞増殖反応を抑制するものと思われるが、erbB4リン酸化能との関係はまだ一定の結論が得られなかった。(2)TRの消化管粘膜における局在と血中TR測定系の確立-TRの胃線維芽細胞における局在は報告した。しかし胃潰瘍底、胃癌組織、大腸癌組織における発現はRT-PCR、免疫組織染色によっても充分には認められなかった。一方、前立腺癌組織においてはTR発現が観察されるため、血中TR測定系の開発を試みた。私達はこれまでTR蛋白に対して単クローン抗体2H8と、抗TRウサギ多クローン抗体を開発している。両抗体を用いたサンドイッチELISAプレートを開発し、培養液中に放出されたTRを測定したところ、高感度にTRの測定が可能であった。今後血中TR測定を検討する予定である。
成長円錐の新規分子マーカー群及び関連分子の機能・動態解析

成長円錐のin vivo機能を解析するため、コンドロイチン硫酸(CS)の合成を抑制するCSGalNAcT1(T1) KOマウスを作製し、脊髄損小モデルを解析したところ、顕著な軸索再生が認められた。その理由は、単にCSが減少しただけでなく、成長円錐機能を促進するヘパラン硫酸(HS)が著明に増加していた。成長円錐のシグナル伝達活性化には、環境因子のCS/HSの量的最適化が必須であることが証明されt。また成長円錐を決定する極性決定機構に、GPM6aが必須であることを分子機構とともに証明した。1)成長円錐を最も強く阻害するコンドロイチン硫酸(CS)について、その合成酵素の1つCSGALNACT1をノックアウトしたマウスで、脳および軟骨でのCS量がほぼ半減していることを見出した。その結果、軟骨では特定サイズCS糖鎖の構造が異常で、それによって正常な骨端軟骨形成過程が微細構造でも阻害されることを証明した。一方、脳では神経細胞の移動および軸索経路の異常が見られた。また脊髄での神経損傷後の成長円錐維持が促進されるため、顕著な回復が見られた。2)成長円錐の新規マーカー分子nGAPsの局在性をPC12D細胞で詳細に調べたところ、大脳皮質細胞でのnGAPsはすべて、PC12D細胞での成長円錐に局在し、神経成長に関与することをRNAiで証明した。よって、nGAPsは神経細胞種によらず、成長円錐の普遍的な分子マーカーであることが証明された。3)成長円錐のnGAPsのノックアウトマウス作成解析として、まずPACS1のKOマウスを作製に成功した。4)M6aの下流の極性形成機構を検討し、GTP型rap2とM6BPが先に成長円錐に濃縮され、その後に成長円錐の極性が形成されることを見出した。1)nGAPsのうち、GPSN2,PACS1の遺伝子欠損マウス作成に成功した。解析を24年度に行うべく、準備を行った。2)成長円錐に関する極性形成機構を解析し、GPM6aがラミニン依存性にまず成長円錐に濃縮され、次いでその結合タンパク質であるRUFY3,rap2が濃縮されて、この3者の複合体が形成されることが神経細胞の極性決定における最初の事象であることを明らかにした。これらの濃縮は成長円錐における他の極性決定因子に先行して生ずることを証明した。3)コンドロイチン硫酸(CS)の合成酵素GT-1の遺伝子改変マウスGT-1KOを用いて脊髄損傷実験を行ったところ、対照群に比べて機能的にも組織学的にも回復が著しいことを証明した。この際に、再生軸索の数は圧倒的に増大していた。この結果は欠損マウスだけでなく、in vivo RNAiでこの酵素の活性を低下させたマウスでもほぼ同様に起こった。GT-1KOではCS合成の減少のほか、グリア瘢痕の大きさも有意に減少していた。一方、アイソフォームであるGT-2の欠損では全く改善がなかった。4)GAP-43のリン酸化のうち、新規に見出したリン酸化部位に関して特異抗体を作成したところ、培養系では成長円錐のみが強く染まり、in vivoでは損傷後に再生する末梢神経の再生軸索のみが選択的に認識されることが分かった。この結果から、当該のリン酸化は神経の成長・再生に密接に関係することが証明された。5)成長円錐内の小胞の挙動をライブイメージングで解析した結果、SCAMP1で標識される小胞が方向性とそのスピードから、少なくとも3種類の異なる動き方をもつことが分かった。以下の主要な成果を得た。1)神経成長をin vivoでコントロールするコンドロイチン硫酸(CS)の合成で律速酵素となるCSGalNAcT1(T1)のKOマウスを作製し、in vivoでの成長円錐機能解析を行った。その結果、再生軸索成長は脊髄損傷モデルできわめて顕著に生じており、機能的回復も歩行可能に到達した。この系でCSは一定量減少したが、それだけでは損傷部位が多少縮小したのみであったので、合成系を共有するヘパラン硫酸(HS)の解析を行った。その結果、HS合成酵素群は軒並み発現上昇し、産生されたHS量は20倍以上であった。HSを分解すると、成長円錐機能は野生型レベルに減少した。これらの結果は、成長円錐機能を最適化するためには環境因子であるCS-HSのバランスが最適化されることが必要であることをしょうめいするものである。2)成長円錐機能を発現させる神経細胞の極性決定に、ラミニン依存性にGPM6aの関与を検討していたが、GPM6aは神経細胞の突起伸長時に先端に局在化し、ここに結合分子群であるM6BP, Rap2, rac GEF, racが一括して濃縮され、極性を効率的に決定することが分かった。

この働きによって、従来型の仮説で微小突起が出現するStage IIはスキップされて素早く細胞の極性決定が生ずると考えられた。3)成長円錐機能に必要な分子であるsyntaxin-1aがCaMKIIと結合して神経伝達を調節するため、その不活性化マウスを作製した。この系では短期可塑性を負に調節する機構が障害され、行動の異常も認められた。分子機構として、膜融合を負に制御するcomplexinの取り込みが通常よりも低下したために、このような結果が生ずると解釈された。24年度について、以下の成果があった。1.成長円錐の新規極性形成機構:成長円錐のプロテオミクスから見出されたGPM6Aについて、極性形成の最初期に極性化することを見出した。大脳皮質の極性形成でこれを調べたところ、ラミニンの影響下には第二期をほとんど経由せず、軸索形成に入ること、この過程でM6BP, rap2, tiamなどの下流結合分子群が働くこと、これまで極性形成に関与するとの報告があった分子群よりもこれらの分子が先に集積することが見出された。これらの結果は、非常に新しい極性形成機構の原理を見出すことにつながったと考えられる。2.成長円錐の小胞運動機構:成長円錐の小胞輸送のうち、アクチン繊維依存性の運動を解析した。これらのうち、数が最も多い逆行性輸送小胞は、観察からアクチン重合機構と関係が深いことを見出した。またこれらはアクチン核形成のcomet tail形成の関連連性が示唆された。3.コンドロイチン硫酸(CS)の脳機能発達に関する影響:CS合成に関わる酵素の1つCSGalNAcT1 (T1)の遺伝子欠損(KOマウス)を作成・解析した。このマウスの脳内部位のCS減少は約30-50%であった。しかし、CS減少は脳全体では一様ではなく、集積している場所が非常に特異的に減少することが、組織化学的検討で明らかになった。またそのアイソフォームであるT2のKOは、ほとんど変化がなかったが、両方の交配ではDKO体は致死的であることが示された。4. CS合成欠損マウスの行動異常:代表者五十嵐が作成した上記のT1-KO(hetero)を分担者高雄が解析した結果、脳の巨視的異常・微視的異常はさほど顕著でないにもかかわらず、社会的な行動の異常が認められた。すでに予定した遺伝子改変マウスの作成に成功しており、成育や維持も順調である。リン酸化抗体の作成も順調で、これを用いた最初の論文が発表できた。また脊髄損傷に関する実験も進展しており、論文投稿中である。極性形成に関する研究は、予想以上の新しい発見があり、まとめるには若干のデータの追加が必要であるが、研究の価値は大きくなった。小胞の運動に関するライブイメージングもここ数カ月で急速に進展し、おおむね順調であると判断できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。成長円錐のnGAPs関連ノックアウトマウス作成については、若干時間がかかったが、25年度に解析可能な状況までにマウス頭数を増やすことができた。成長円錐の小胞の挙動も画像情報処理がネックであったが、この問題をほぼ解決することができた。M6aに関する極性の研究は、予想外の発展を見せたため、種々の先行研究との関連性をおさえる研究を追加したが、これによって大きな新知見であることが確認できた。これはすでに試行しているin vivo極性解析を完了することで、25年度前半に論文投稿を企図している。
内耳血管条上皮細胞のイオン輸送機構

(1)スナネズミから単離した血管条辺縁細胞について、パッチクランプ・ホールセル記録をおこなったところ、等張液中で細胞あたり約100nSの大きなCl^-コンダクタンスが観察された。(2)このCl^-コンダクタンスのイオン選択性は、SCN^->Br^-=Cl^->F^->NO_3^-=I^->gluconate^-の順であった。(3)等張液内におけるホールセルクランプの状態で、細胞外液を交換することによりCl^-に対する電気化学的勾配を負荷すると、辺縁細胞の体積が変化した。この体積変化はCl^-の移動に伴う水の移動によると考えられた。また細胞体積の変化に一致してCl^-コンダクタンスが変化した。(4)高張液中で辺縁細胞の体積を減少させるとCl^-コンダクタンスも減少した。(5)このCl^-コンダクタンスの電気生理学的性質は、辺縁細胞の基底側膜に発見されたCl^-チャネルとよく似ている。生理的状態においては、細胞体積の調節、基底側膜の膜電位に大きな役割をはたしていると考えられる。(6)スナネズミから単離した血管条基底細胞について、パッチクランプ・単一チャネル記録を行ったところ、コンダクタンスが約240pSのK^+チャネルが発見された。このチャネルは、EPの産生に関与している可能性がある。
着床におけるマクロファージの機能制御に関する分子細胞生物学的研究

家畜を対象とした胚操作は、最終的には、子宮内への胚移植、着床・胎盤形成を経て、出産され、個体として成長して完結する。一連の過程は、さまざまな、生殖工学ないしは、発生工学の技術を必要とするが、特に、胚移植後、着床・胎盤形成過程における胚の損失が多く、移植胚の着床効率を上げることが、獣医・畜産学のみならず、医学においても重要な課題となっている。本研究の主たる目的は、イスラエル側のマクロファージの分子・細胞生物学的研究に関する知識・技術や、家畜のトランスジェニック作出に関する知識・技術の提供を受けると同時に、わが国側で、東大牧場のクローズドコロニーとして維持されているシバヤギを材料として、子宮上皮細胞、トロフォブラスト細胞、ならびに、マクロファージのそれぞれ培養系を確立し、モデル系を用いて、in vitroで、着床現象におけるマクロファージの役割を解明し、胚移植後の着床効率を高めるための基礎知識を得ることにある。この目的を達成するために、Ahuva Knyszynski博士の来日を仰ぎ、シバヤギの培養細胞系確立を試みた。昨年度から、東大牧場のシバヤギの感染症による幼弱期における死亡率が高くなり、材料の確保が困難になるという不測の事態が生じ、研究の進展も思うにまかせぬこととなったが、子宮上皮細胞系については、まだ、クローン化されてはいないが、培養細胞株を確立することができた。現在、クローン化の実験を進めている。この細胞系は、in vitroで管腔形成や、分泌顆粒を豊富に持った細胞への分化など、興味深い挙動を示し、クローン化が終了し次第、解析的実験を行う計画である。一方、トロフォブラスト細胞については、予備的にトロフォブラスト細胞と判定された細胞について、培養系の確立を図り、明らかに繊維芽細胞とは挙動の異なる培養細胞系を得たが、実験に使用する目的で継代・増殖を図る過程で、増殖率が急激に低下し、現在、その原因と対策を模索している。増殖率が回復し次第、細胞表層マーカーに対する抗体によるアフィニティーコラム法で、繊維芽細胞など、混在する非トロフォブラスト性細胞の除去、適当なマーカーを用いたトロフォブラスト細胞の同定などを行う予定である。マクロファージについては、マウスやヒトで主に用いられている方法を用いて、シバヤギからマクロファージの培養系を得ることを試みたが、残念ながら、2年間の研究期間中に、適当な系を得ることはできなかった。シバヤギマクロファージのin vitroにおける挙動が、マウスやヒトのそれと異なる理由は明確でなく、今後、継続した研究が必要である。なお、得られたマクロファージを、レトロビールスを用いて不死化する手法も知られているが、われわれの研究室では、バイオハザード管理の適当な実験室が無く、シバヤギマクロファージ不死化の実験は、得られたマクロファージをイスラエル側に送って実験する計画であったが、マクロファージの適当な採取・培養法の確立ができぬ段階で、研究が終了することとなった。なお、イスラエル側では、マクロファージの活性化におけるシグナルトランスダクションについて研究を進め、主として、ラットおよびマウスのマクロファージを用いて実験を行い、MAPキナーゼの関与について、興味深い知見が得られつつある。なお、イスラエルでは、ヒト血液から分離したマクロファージを、床ずれ患者にIV注射で投与し、治療に用いる実験が、かつて、Weizmann研究所の超微形態部門の教授であり、Ahuva Knyszynski博士の共同研究者であったD.Danon教授を中心に、すでに臨床レベルで開始されている。その、最新の成果についての未発表情報を、今回の研究を通じて得ることができたことは、今後マクロファージに関する知識を、着床率の改善へ応用することを考える上で有益であった。また、着床における、CSF-1やインターロイキンファミリー、TNF-αをはじめとするサイトカインの役割の研究で著名な、B.Tartakovski博士は、従来Weizmann研究所で研究を行っていたが、現在はWeizmann研究所を離れ、企業で研究を続けている。今回の研究期間中、B.Tartakovski博士と、着床におけるマクロファージや他の免疫細胞の役割解明と、自己免疫疾患治療法の開発に関する意見の交換を行うことができた。一方、われわれの研究室では、マウスならびにシバヤギを用いて、胎盤におけるホメオボックス遺伝子群の発現動態の解析、マトリックスメタロプロテアーゼcDNAに関する研究を行い、興味深い知見をえることができた。これらの知見は、今後、トロフォブラスト細胞や子宮内膜細胞の動態調節における、LIFをはじめとするサイトカインの役割を解明する上で、重要な手がかりになるものと思われる。今回の研究期間中に、実際、LIF(マクロファージが分泌することが知られている)がマウストロフォブラスト細胞において、膜型MMPの発現を促進するらしい事実が明らかになった。さらに、マウスを用いた卵成熟の研究で著名な、Nava Dekel博士に来日を依頼し、家畜における胚操作の一環として重要な、in vitro卵成熟におけるシグナルトランスダクション系の役割に関する最新の研究成果や技術の情報を得ると共に、Weizmann研究所で所有するMRI装置によるラット着床部位や時期の非破壊的検出と、その着床・胎盤形成研究における応用について、今後の共同研究の可能性を論議した。また、イスラエルでトランスジェニックヤギの作出に成功しているMoshe Shani博士には、トランスジェニックヤギ作出の実際の作業を見学させてもらうことができた。また、博士に来日を依頼して、博士の研究グループの最新の研究情報を取得するとともに、今後の相互の研究交流の端緒を開くことができた。

今回の共同研究は、東大牧場のシバヤギの繁殖率の低下、Weizmann研究所における研究体制の大幅な改組など、不測の事態が生じ、当初予定した研究計画を消化することが困難であったが、今回の研究を端緒として、現在も、両サイドで研究を継続しており、今後、さらに、重要な成果が、日本、イスラエルの双方で挙げられることが期待される。家畜を対象とした胚操作は、最終的には、子宮内への胚移植、着床・胎盤形成を経て、出産され、個体として成長して完結する。一連の過程は、さまざまな、生殖工学ないしは、発生工学の技術を必要とするが、特に、胚移植後、着床・胎盤形成過程における胚の損失が多く、移植胚の着床効率を上げることが、獣医・畜産学のみならず、医学においても重要な課題となっている。本研究の主たる目的は、イスラエル側のマクロファージの分子・細胞生物学的研究に関する知識・技術や、家畜のトランスジェニック作出に関する知識・技術の提供を受けると同時に、わが国側で、東大牧場のクローズドコロニーとして維持されているシバヤギを材料として、子宮上皮細胞、トロフォブラスト細胞、ならびに、マクロファージのそれぞれ培養系を確立し、モデル系を用いて、in vitroで、着床現象におけるマクロファージの役割を解明し、胚移植後の着床効率を高めるための基礎知識を得ることにある。この目的を達成するために、Ahuva Knyszynski博士の来日を仰ぎ、シバヤギの培養細胞系確立を試みた。昨年度から、東大牧場のシバヤギの感染症による幼弱期における死亡率が高くなり、材料の確保が困難になるという不測の事態が生じ、研究の進展も思うにまかせぬこととなったが、子宮上皮細胞系については、まだ、クローン化されてはいないが、培養細胞株を確立することができた。現在、クローン化の実験を進めている。この細胞系は、in vitroで管腔形成や、分泌顆粒を豊富に持った細胞への分化など、興味深い挙動を示し、クローン化が終了し次第、解析的実験を行う計画である。一方、トロフォブラスト細胞については、予備的にトロフォブラスト細胞と判定された細胞について、培養系の確立を図り、明らかに繊維芽細胞とは挙動の異なる培養細胞系を得たが、実験に使用する目的で継代・増殖を図る過程で、増殖率が急激に低下し、現在、その原因と対策を模索している。増殖率が回復し次第、細胞表層マーカーに対する抗体によるアフィニティーコラム法で、繊維芽細胞など、混在する非トロフォブラスト性細胞の除去、適当なマーカーを用いたトロフォブラスト細胞の同定などを行う予定である。マクロファージについては、マウスやヒトで主に用いられている方法を用いて、シバヤギからマクロファージの培養系を得ることを試みたが、残念ながら、2年間の研究期間中に、適当な系を得ることはできなかった。シバヤギマクロファージのin vitroにおける挙動が、マウスやヒトのそれと異なる理由は明確でなく、今後、継続した研究が必要である。
超音波照射によるがん組織内NO誘導を利用した新規放射線効果増強法の開発

本研究は計画当初から大きく方向性を変えての実施となった。固形がんや脳梗塞の超音波治療で、治療部位が受ける超音波強度は最も重要なパラメターである。本研究では超音波の干渉現象によって、治療部位が受ける超音波強度が皮膚厚や生体の形状の些細な違いによって大きく周期的に変動することを、理論、モデル、及び生体サンプルで実証した。さらに、この有害な超音波強度変動を超音波変調技術によって顕著に抑制できることを実証した。これまで見過ごされてきたこの変動現象の解明と、超音波変調による変動の抑制は、安全で効果の高い超音波治療実現に大きく貢献する。本年度は以下の2つの事柄の実験を行った。In vivoでの超音波+X線照射併用療法を行うに当たり、最初に用いるがん細胞を決定する必要がある。併用療法の効果を最大に示すがん細胞を選択するために考慮した因子は、X線感受性、超音波によるNO産生、および癌組織新生血管の進展の程度である。X線感受性はがん細胞によって大きな違いは無く、また超音波によるNO産生については比較データが皆無であることから、第3点目の癌組織新生血管の進展の程度によって選択することにした。新生血管の密度が高い癌組織では、NO産生によって血液からの酸素供給によってのX線照射の高い殺細胞効果が期待できるからである。マウスの固形腫瘍であるC26を選定した。C26をin vitroで培養・増殖・凍結保存した。(2)骨による超音波照射の屈折、反射、干渉問題の検討in vivo超音波+X線照射併用療法では癌局所への選択的超音波照射が重要であるが、骨での反射・屈折によって正確な超音波照射が妨げられる可能性がある。この解析のために、ヒト頭蓋骨を用いてその500kHz超音波の透過超音波強度をハイドロフォンで測定した。すると骨表面での屈折のために照射深度50mmで14mmも超音波の焦点が横にずれていた場合があった。また、骨表面で反射した超音波が超音波振動子の表面で再反射し、直進波と干渉することで、透過超音波強度が大きく変動することが判明した。すなわち超音波振動子の位置を骨から1mm程度離すだけで透過超音波強度が3倍程度変動した。以上の事実は、超音波の骨での屈折・干渉挙動を確認しないと正確に癌局所への照射が不可能となることを意味する。以上のことから、in vivo実験の前にマウス骨での反射・屈折の検証が重要であることが判明した。癌局所への選択的超音波照射の懸念材料であった骨による屈折と干渉の問題を検討したところ、予想よりもずっと大きいものであることが判明したため、平成27年度はこの問題の解析を主に行うことに変更した。用いた骨はヒトの頭蓋骨であり、マウスの骨に比べて表面の湾曲も骨厚の変化も小さいものであるにもかかわらず、超音波の照射効果に重大な影響が生ずるほどの屈折と干渉による強度変動であった。これまでは、骨厚による超音波透過率のみが問題にされてきたが、新たに屈折と干渉による強度変動が重要であることを発見した。よって、予想外の大きな研究の進展となった。また、in vivo実験に関しては細胞等の準備が整った。今年度の研究実施は当初計画から大きく方向性を変えての実施となった。当初は、固形がんに超音波照射し発生したNOにより(1)radio-sensitizerとして放射線治療の効果を高める、(2)血管透過性を増大させ高分子ミセル型抗がん剤の到達効率を高める、ことによる新規併用療法開発が目的であった。方向性変えた理由は、超音波照射の効果に大きく影響する超音波の組織透過率に関する重大な発見があったからである。前年に、平板の人工骨モデルを用いた場合、ミリ単位の位置の違いで照射超音波強度が10倍以上にも変動することを見いだした。これに引き続いて、ヒト頭蓋骨で同様な測定をしたところ、予想に反して(形状が複雑な頭蓋骨の場合には、大きな変動は観察されないであろうというのが予想であった)大きな変動が観察された。この大きな変動は従来、予想も実証もされていなかったことと、生体の超音波透過率はがん治療のみではなく、急性期脳梗塞治療など医療の広い用途で最重要なパラメターであることから、透過率を複数の頭蓋骨と測定ポイントで測定し、生体での変動挙動を正確に求めることが必要と判断したためであった。研究は、500kHzの超音波を照射しヒト頭蓋骨を透過した超音波強度をハイドロフォンで測定した。ヒト頭蓋骨は3体用いた。照射部位の深さ、超音波周波数、超音波プローブの骨表面からの距離(皮膚厚に相当する)を変えると部位が受ける超音波強度が周期的に最大4倍程度、平均でも2倍程度変動すること、その変動が理論および平板の骨モデルと良く一致することを発見した。従来は、このような変動があり得ても、骨透過率の違いの中に埋没するため重要ではないとされてきた。本研究では、位置情報の正確な実験系を組み立て、多くの部位での測定を行うことで(変動の小さな部位もある)、この変動を初めて実証する成果に結びついた。

さらに、この有害な超音波強度変動を超音波変調技術によって顕著に抑制できることを実証した。これまで見過ごされてきたこの変動現象の解明と、超音波変調による変動の抑制は、安全で効果の高い超音波治療実現に大きく貢献する。マウスの骨格を用いて照射される超音波強度を検証してから, in vivo併用実験を開始する。In vivo実験の開始が当初の予定から6ヶ月ほど遅くなったために、ラットの癌の検討を行わずにマウスの癌に集中して実験を進める。ドラッグデリバリーシステム平成27年度は予定していた動物実験が開始できなかったので、使用した物品費が低く抑えられていた。平成28年度の動物実験を中心に次年度使用額が使われる予定である。
年輪幅・年輪同位体比・DNAマーカーを用いた新たな木材産地推定法の検討

年輪幅、年輪安定同位体比、DNAマーカーを用いたヒノキ科樹木、特にアスナロを対象とした日本での木材産地推定法確立に向けて研究を行った。年輪幅では、15か所の標準年輪曲線間の変動が、4つの地理的区分にグループ分けできること、酸素安定同位体比も東北と中部でその変動が異なり、地理的区分があることが明らかになった。アスナロのEST-SSRマーカー開発に成功し、アスナロとヒバが分かれること、これらが地理的にまとまることを明らかにした。以上から、今後、アスナロの木材産地推定が可能となることが示唆された。研究所年度は、試料空白地での試料収集、既存現生材試料の年輪幅分析、酸素同位体比の分析準備、および新規DNAマーカー開発を行った。新規試料収集は、東日本で老齢樹の森林が存在する新潟県佐渡島にある新潟大学演習林で行い、ヒノキアスナロ30点以上を収集した。また、既存の試料として、研究分担者が所属する奈良文化財研究所所蔵の岩手、長野県産のヒノキアスナロおよびアスナロ材10点の試料の年輪幅計測を実施した。今後、各地域での標準年輪曲線構築と他地域との年輪幅変動比較を行う予定である。木質古文化財試料としては、新たに青森県高間遺跡のヒノキアスナロ材調査を実施し、8-11世紀の新規標準年輪曲線を構築した。また、北海道江差町の古民家で天井板などに使用されているヒノキアスナロ材の予備調査を行い、今年度、本調査を実施する予定である。酸素安定同位体分析については、青森県下北および津軽半島産のヒノキアスナロ材5点(樹齢約250年)について、セルロース抽出及び測定試料の準備を行った。これらについては、今後、安定同位体測定を行う予定である。新規DNAマーカー開発では、アスナロ、ヒノキアスナロの集団遺伝学的研究に使用可能なEST-SSRマーカー22個を作製した。今後、天然分布のアスナロ、ヒノキアスナロの解析を行うことで、各集団間および集団内の遺伝的多様性を評価し、産地推定に繋げること可能になると期待される。研究2年目は、初年度に収集した試料の年輪幅解析、酸素安定同位体比の試料準備と分析、開発したEST-SSRマーカーによるアスナロの集団遺伝学的分析を行った。年輪幅解析では、岩手県ヒバおよび長野県産アスナロの年輪幅平均曲線を構築した。岩手県産試料は、青森県のヒバと同調性が確認された。一方、長野県産の試料は、北東北とは同調性が認められなかったが、長野県産のヒノキと同調性が確認され、北東北とは異なる年輪幅変動を有することが明らかとなった。また、木質文化財資料として、総ヒバ作りとされる江差・旧中村家住宅の調査を行い、天井板、建具など80点の部材について、年輪画像を撮影した。安定同位体については、青森県産2点(下北、津軽各1点)について、それぞれ約150年輪の酸素安定同位体比を測定した。その結果、両者には高い同調性があることが確認された。また、今後、安定同位体比および年輪幅を測定する試料として、万福寺のヒバ材、弘前藩上屋敷の出土材を収集した。昨年度開発したEST-SSRマーカー22座のうち、19座を用いたアスナロ、ヒバの集団遺伝学的分析を行ったところ、アスナロとヒバは異なるグループに分かれることが示唆された。またヒバの集団でも地域ごとにある程度のグループに分かれることも示唆された。以上のように、年輪幅、安定同位体比、DNAマーカー共、今後の産地推定に資する有用な基礎データを得ることができた。今年度は、木質文化財試料の年輪幅分析、年輪の酸素安定同位体比分析、開発したEST-SSRマーカーのマルチプレックス化を行った。年輪幅分析では、函館市の旧相馬邸および江差町の旧中村家住宅でそれぞれ74点、80点、の年輪画像を収集し、分析を行った。その結果、旧相馬邸では、1780-1900年の新たな標準年輪曲線が得られ、データの蓄積が進展すると共に、建築年代に関する有力な情報を得ることに成功した。また、旧中村家住宅でも新たなデータが蓄積された。酸素安定同位体比分析では、前年度に引き続き、青森の現生ヒバ試料2個体(下北1、津軽1)の測定を進め、双方とも300年間のデータを得た。また、中部地方の現生アスナロについても新たに測定を行った。これにより、青森県内では酸素安定同位体比に高い同調性があること、青森と長野では同調性がないことが明らかとなり、酸素安定同位体比が木材産地推定の有力なパラメーターであることが示唆された。岩手県および新潟県の現生ヒバ試料についても、セルロース抽出および試料調製を進め、測定準備を行った。同様に、建築材、出土木材についても、セルロース抽出準備を行っている。DNAマーカー開発では、昨年度に開発したアスナロ及びヒノキアスナロ(ヒバ)の両変種に使用可能なEST-SSRマーカーのマルチプレックス化を試みた。その結果、多型性が高いEST-SSRマーカー6座によるマルチプレックス化に成功し、個体同定や産地推定を簡便かつ正確に実施する手法を確立した。なお、得られた知見は日本森林学会誌に投稿、第97巻第5号に掲載された。

また、木材からのDNA抽出と開発したマーカーの適用については、結果が安定せず、良好な結果が得られていない。アスナロの年輪幅分析については、当初予定していた各地域での現生材分析を進め、地域内、地域間の変動の類似性について一定の知見を得た。また木質文化財でも当初予定していた建造物の調査を終えることができた。一方で、安定同位体分析については、質量分析計の不調などから現生材試料の測定が遅れており、まだデータの得られていない地域がある。また、文化財試料についても担当者の退職などで借用・許可が遅れたため、これから測定を行う予定である。DNAマーカーについては、開発が順調に進展し、当初予定していた成果を収めることができた。また、木材への応用についても、成果には必ずしも結びつかなかったものの、可能性について十分に検討を行うことができた。以上のことから、全体としてはやや遅れていると評価した。本年度は、これまで得られたアスナロを中心とした全国のヒノキ科現生木年輪幅標準曲線を用いて、その類似性に基づき、地域間変動のグループ分けを行った。類似性の評価は、ヨーロッパで多用されるt値を用いた。その結果、東北地方北部(青森)東北地方日本海側(秋田)、東北地方太平洋側(宮城)関東、中部(長野)四国(高知)、四国九州(福岡)というグループに分けられることが明らかとなった。このことから、江戸時代のように、東北や中部、四国などから江戸に向けて木材が長距離移送されたケースでは、年輪幅に基づく木材産地推定を行える可能性が高いことが示唆された。また、現状では日本海側のデータが不十分であり、今後、データ収集を行う必要があることが明らかとなった。一方、酸素安定同位体比については、アスナロ現生木を対象として、青森の2か所、岩手県、長野県の合計4地点で測定を実施した。その結果、青森県内の2か所は極めて同調性が高くなる一方、距離が離れる岩手県では、同調性がやや低くなり、長野県とはクロスデーティングができないことが明らかになった。このことから、酸素安定同位体比の変動は、地域間で変異があり、地域間変動に基づく木材産地推定の可能性があることが示唆された。また、江戸期の木質遺物(黄檗山万福寺など)についても、年輪幅、安定同位体比の測定を実施したが、既存の標準年輪曲線とクロスデーティングすることができず、良好な結果を得られなかった。年輪幅、年輪安定同位体比、DNAマーカーを用いたヒノキ科樹木、特にアスナロを対象とした日本での木材産地推定法確立に向けて研究を行った。年輪幅では、15か所の標準年輪曲線間の変動が、4つの地理的区分にグループ分けできること、酸素安定同位体比も東北と中部でその変動が異なり、地理的区分があることが明らかになった。アスナロのEST-SSRマーカー開発に成功し、アスナロとヒバが分かれること、これらが地理的にまとまることを明らかにした。以上から、今後、アスナロの木材産地推定が可能となることが示唆された。アスナロの年輪幅変動については、初年度に収集した長野、岩手県産の解析および、新潟・佐渡産の計測を進め、地域内、地域間での変動の類似性について一定の知見を得ることができた。これについては、当初予定した成果を収めている。木質文化財資料については、江差・旧中村家住宅で年輪幅画像を取得し、ヒバの分布最北端での年輪幅試料を得た。これらについては、現在計測を行っており当初の予定通りに進展している。安定同位体については、森林総合研究所において、青森県産の試料を測定し、個体間で高い同調性があることを見いだした。今年度中に、長野県産のアスナロ試料についても測定を行う予定であったが、測定時間を十分に取ることができないため、予定より若干の遅れが生じている。
近世の土地売買と社会慣行の研究

前年度に引き続いて、文部省史料館所管文書の調査を実施した。8月と10月の調査で、同藤代村飯田家文書、伊豆国君沢郡内浦史料(前年補足)、三井高維収集、出羽国秋田郡二井田村・一関家文書、美濃山県郡東深瀬村林家文書、和泉国大鳥郡豊田村・小谷家文書などについて、質地関係文書をフィルム94本分撮影した。文部省史料館には、なおかなりの質地関係文書が残されているが、残念ながら打ち切らざるを得なかった。また法政大学図書館にて、市町村史類から関係史料のコピーによる収集を若干おこなった。また平行して収集史料の整理を進め、フィルムをマイクロプリンターにより焼き付ける作業を開始した。収集データが大部に及ぶので、これらの作業の結果を出すのには、なお時間を要するが、とりあえず、畿内近国でも請戻しの事例を確保することができた。また美濃・信濃などの中間地帯や出羽などの後進地帯のデータを収集することができた。当初は、質地慣行に力点をおいて史料の収集にあたる予定であったが、作業の途中から、良質な史料のある村では、質地証文の変遷や土地関係台帳まで含めて史料を収集し、村落の展開を踏まえながら、土地売買慣行の趨勢をさぐることが重要との判断に達したので、とりあえず質地証文が系統的に残されている村については、これを全面的に撮影した。このため作業はますます大規模になってきたが、今後整理を進めてまとめを果たしたい。近世の土地売買とこれをめぐる社会慣行を究明することによって、前近代における共同体的社会関係の在り方を解明することが本研究の目標であるが、さしあたっては、近世の土地売買の中心であった質地売買とその慣行にかかわる史料を全国的に収集・整理する作業から着手した。平成3年度は文部省史料館・岐阜県文書館などの所管史料の調査を実施した。文部省史料館では武蔵国掛川家文書、同吉田家文書、祭漁洞文庫旧蔵文書、甲斐国下井尻家文書、同秋山家文書、出羽国宝幡寺文書、上野国萩原家文書、伊豆国大川家文書、信濃国土屋家文書、相馬家文書、下総国木村家文書、美濃国千秋家文書などの写真撮影を行った。また、岐阜県文書館では日濃国赤座家文書、林周教氏蒐集文書、井深家文書、宮川家文書、山田家文書などの写真撮影を行った。この結果、関係史料をフィルム270本余に収集することができた。これと平行して、フィルムの整理作業を行い、一部をマイクロコピ-により焼付け、内容の点検作業などを実施した。史料収集・整理作業ともに、作業の途上であり、不充分なものであるが、東国を中心とする地域の質地売買と請戻し慣行に関する貴重な事例を多数収集することができた。とくに、従来、研究を進めていた関東以外に、信濃・美濃でまとまった関連史料を収集することができたのは大きな成果であった。次年度は、さらに文部省史料館所管史料の撮影などを実施し、研究の一応のまとめを果たしたい。
コモン・マーモセットを用いた脊髄損傷に対する多角的介入戦略の開発

損傷部に形成される瘢痕組織ではセマフォリン3Aが発現し軸索伸展を阻害することが知られている。治療戦略として本研究ではコモンマーモセット頸髄半切モデルを用いて、上下肢リハビリテーションおよび軸索伸長薬剤SM-345431併用療法による運動機能回復を目指す。軸索の可塑的変化を形態学的及び電気生理学的で詳細に調べ、分子的な動きにも着目し網羅的に回復に寄与する要素を引き出し運動機能回復のメカニズムに迫る。リハビリ効果の定量には臨床に即した脊髄挫滅による圧挫損傷モデル及び皮質脊髄路半切モデルを用い、運動キネマティクスの解析及び一次運動野の可塑的変化を捉える。よりミクロな運動中の一次運動野の運動神経細胞の活動は、超小型顕微鏡を頭蓋に留置することで長期的に観察する。方法臨床に近い組織損傷を引き起こす圧挫モデルでは、トレッドミルを用いた下肢のリハビリを行う。皮質脊髄路半切モデルでは、手指のリハビリを行い、回復の軌跡を高速ビデオカメラを用いてとらえる。微弱な電気刺激により同定した脳の一次運動野の手指領域に、蛍光カルシウムインジケーターを導入し、蛍光顕微鏡を用いて同一の細胞を個別に数百個同時に記録を行う。結果前年度までに確認された軸索伸長薬剤の物理的な副反応により、薬剤及びリハビリの併用群の検討は行わなかった。皮質脊髄路半切モデルでは、運動キネマティクス解析から運動機能の回復が確認され回復に伴い脳機能地図の再編が見られデンドライトの可塑的変化が生じていることが分かった。論文にまとめるための運動機能解析を追加中である。運動中の一次運動野の神経活動は、無麻酔下でマーモセットが餌に手を伸ばす動作及び梯子をのぼる動作中に、動作に同期して活動する細胞を各々同時記録し、Cell Reportsに報告した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。中枢神経系の損傷部に形成される瘢痕組織ではセマフォリン3Aが発現し軸索伸展を阻害することが知られている。霊長類の中で最も小型で飼育及び繁殖が容易であるマーモセットを用いて脊髄損傷モデルを作製し、薬剤治療による治療効果の検証を目的とした。この目的遂行には3つの方式を確立する必要があった。1健常マーモセットにおける皮質脊髄路の同定、2マーモセット脊髄半切モデル作製技術の確立、3運動機能評価方法の確立である。一次運動野の活動低下を補う脊髄路内の回路変性がどのレベルで起こるのかを解明する事は、薬理効果を最大限に引き出すヒントになるであろう。一方で、運動機能は薬剤介入によって良い効果がみられなかった。臨床現場で一番求められる機能改善が見られなかった事は、大きな問題である。申請者は過去にマカクザル脊損モデルを用いて脊損後早期にリハビリテーションを行う群と、1ヶ月後にリハビリテーションを開始した群とで運動機能の改善を調べた。これによりリハビリテーションの重要性を確信し、機能的シナプス形成を目指す治療法の開発が必要と考えた。そこで薬剤により伸長した軸索が正しく標的に接続し、機能的なシナプスの形成を行うためには、リハビリテーション療法との併用が必要と考えた。今年度は1マーモセット皮質脊髄路の同定を論文化し23モデル作製及び運動機能評価を確立した。軸索伸展阻害セマフォリン3Aの阻害剤が電気生理的には損傷側の脊髄下部において上位中枢からの信号を伝える新生ニューロンを誘導した事が示唆された。頸随完全半切後に認めた損傷対側脳と損傷側上肢の電気的再接続は、損傷部吻側の皮質脊髄路および網様体脊髄路の可塑性によるものと考えられた。また来年度から開始予定の世界初霊長類リハビリテーション法の開発を行った。セマフォリン3A阻害剤単独投与群のモデル作製は計画通りに進んだ。しかし脊髄における組織学的検討があまり進んでいない。新生神経であることを組織学的に同定する様々な免疫染色を行ったがマーモセット組織に使用できる抗体が少なく条件検討に時間を有した。順行性神経トレーサー注入実験は全薬剤投与群に行い、解析を進めている。これまで多くの時間と労力を要していた軸索及び神経終末部(button)の定量解析であるが、ステレオロジー理論の妥当性を実際に確認し新たな解析法として導入した。この理論を用いて薬剤治療群の定量解析を始めているが、膨大なデータ量につき完了には至っていない。筋活動を正確にデータ化するための筋肉への微小電極埋め込み法がほぼ完成した。これにより自由行動下における脊髄損傷マーモセットの運動機能の評価が長期間安定的にモニター出来るようになった。皮膚の薄いマーモセットに人工物である金属電極の埋め込み手術は、化膿による皮膚欠損等術後のケアに時間を有したのは想定外であった。当初計画にはなかったが、脊髄半切モデルで得られたデータや解析方法を利用して、より臨床に即したモデルでの治療開発を目指すために、脊髄圧挫モデルの作製を検討した。圧挫の程度(重症度)により動物が死亡するため、モデル作製に時間を取られ確立半ばで翌年度に引き続き検討を行う事とした。リハビリテーションデバイス開発は、マーモセット用ジャケットのデザインがほぼ完成し、下肢用のトレッドミル上での歩行評価が安定的に行えるようになった。前臨床段階に迫った脊髄損傷の治療研究にとって、ヒトと同じ霊長類を用いた研究が必須となる。