hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規なスクリーニング法をもちいた根のパターン形成に関与する遺伝子群の同定

本課題は、酵母の転写活性化因子GAL4とそのシス配列UASをもちいたアクティベーションタギング法を開発して,これをモデル植物であるシロイヌナズナに応用し、根のパターン形成に関与する未知の遺伝子群を同定・解析することを目的としている。3年間の研究期間において、まず方法論の開発を終えることができた。さらに実際に約15,000のタギングラインを作製し、根の形態形成に異常を示す変異体を多数単離した。これらのうち根の組織パターン形成に異常を示す優性変異体(URP=UAS-tagged Root Patterning変異体)を8ライン同定し、これらの原因遺伝子を決定したところ、いずれもこれまでに報告されていない新規な遺伝子であった。また8個の遺伝子のうち7個は,コードするタンパク質のアミノ酸配列から転写因子をコードしていると思われた。これらの遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子を融合したコンストラクトを作製し、発現組織を調べたところ、これまでに解析できた6個の遺伝子について,根での組織特異的な発現が見られた。これらの結果はこのアクティベーションタギング系が,根のパターン形成に関与する未知の遺伝子を効率的に同定できることを示しており,本研究の当初の目的がほぼ達せられたと考えられる。各遺伝子の機能については,根の様々な組織で特異的に発現させるラインの解析や,T-DNA挿入変異体の表現型を解析することで,今後詳細に解析する必要がある。本課題は、酵母の転写活性化因子GAL4とそのシス配列UASをもちいたアクティベーションタギング法をモデル植物であるシロイヌナズナに応用し、これによって根のパターン形成に関与する遺伝子群を同定・解析することを目的としている。本年度は、まずタギングベクターの開発をおこない、ついでこれをもちいて実際に形質転換種子プールの作成とスクリーニングを開始した。タギングベクターの開発については、バイナリーベクターのレフトボーダー側に17塩基のUASの5回反復配列を挿入し、その内側に選抜用ハイグロマイシン耐性遺伝子と大腸菌の複製開始点を挿入した。まずこのベクターがアグロバクテリウム中で安定に保持されることをPCR法によって確認した。次にこのアグロバクテリウムをGAL4を発現しているシロイヌナズナ植物に感染させ形質転換体を得た。形質転換効率は1.3%であり、タギング種子プールの作成に十分なものであった。またランダムに選んだ20ラインのゲノムDNAをもとに、挿入UASの近傍配列をクローニングしたところ、ほぼすべてのラインでUASが無傷でゲノム内に挿入されていることが確かめられた。以上によりベクターと形質転換系の開発は達成できたと判断し、実際に種子プールの作成とスクリーニングを開始した。これまでに約6,000ラインの形質転換体を作成し、初代の形質転換体を実体顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、根の形態やパターニングに異常を示す変異体の候補が約300ライン得られた。次にこれらの中から次の世代に表現系が遺伝するものを42ライン同定した。現在これらのラインで挿入されたUAS近傍遺伝子の同定を進めると同時に、さらに多くの種子プールの作成とスクリーニングを続けている。本課題は、酵母の転写活性化因子GAL4とそのシス配列UASをもちいたアクティベーションタギング法を開発してモデル植物であるシロイヌナズナに応用し、これによって根のパターン形成に関与する遺伝子群を同定・解析することを目的としている。昨年度までに技術の開発を完了していたので,今年度は実際に大量の形質転換ラインを作成してスクリーニングをおこなった。宿主としては,根の全組織でGAL4を発現しているQ2610と,根の内皮と皮層のみでGAL4を発現しているJ0571の2つをもちいた。Q2610では約8,100ラインを作成し,実体顕微鏡観察によって根の形態に異常示す変異体をスクリーニングした。これらには,根端分裂組織でのパターン形成に異常を示すもの,根端分裂組織を維持できず成長を停止するもの,細胞伸長に異常を示すもの,などが含まれる。根端分裂組織を維持できない変異体の1つについては,タグされた遺伝子を同定したが,これは機能未知のタンパク質をコードしていた。,一方,J0571では約5,200ラインの形質転換体を作成し、共焦点レーザー顕微鏡観察によって変異体をスクリーニングした。その結果,根端分裂組織における細胞分裂が異常に亢進している変異体と,分裂組織での細胞分化に異常を示す変異体が得られた。前者については変異体の表現型が,MYB型転写因子の異所的発現によることをつきとめた。現在,他の変異体の原因遺伝子の同定と,既に同定された遺伝子の機能解析を平行して進めている。後者については,T-DNA挿入変異体を利用した機能欠損型変異体の表現系解析,レポーター遺伝子をもちいた野生型植物での発現パターンの解析,タンパク質の細胞内局在などを調べている。また,他の変異体についても平行して原因遺伝子の同定を進めている。

これらのうち根の組織パターン形成に異常を示す優性変異体(URP=UAS-tagged Root Patterning変異体)を8ライン同定し、これらの原因遺伝子を決定したところ、いずれもこれまでに報告されていない新規な遺伝子であった。また8個の遺伝子のうち7個は,コードするタンパク質のアミノ酸配列から転写因子をコードしていると思われた。これらの遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子を融合したコンストラクトを作製し、発現組織を調べたところ、これまでに解析できた6個の遺伝子について,根での組織特異的な発現が見られた。これらの結果はこのアクティベーションタギング系が,根のパターン形成に関与する未知の遺伝子を効率的に同定できることを示しており,本研究の当初の目的がほぼ達せられたと考えられる。各遺伝子の機能については,根の様々な組織で特異的に発現させるラインの解析や,T-DNA挿入変異体の表現型を解析することで,今後詳細に解析する必要がある。
意志決定と学習の神経機構

報酬の期待は、私たちの行動の動機をつくり、意志決定に影響を及ぼす。最近の研究から、多くの脳領域においてニューロン活動は報酬期待により変化することがわかってきた。しかしながら、どこでどのようにして報酬期待によるニューロン応答の変化が起こり、どのようにそのようなニューロン活動が運動の出力に変換されるのか、未だ明らかとなっていない。我々の研究室での眼球運動を使った一連の研究では、大脳基底核が報酬が得られる場所に注視を導くのに重要な役割をしていることが示唆された。まず第一に、尾状核の投射ニューロンは報酬位置に対して極端にバイアスがかかった応答をする。これらニューロンは、通常反対側にある大きな報酬に選好性を示す。この報酬によってバイアスされた信号は、黒質網様部の脱抑制回路を介して上丘に伝えられる。この結果、報酬が期待される場所にたいしてサッケードが早く起こるように、上丘ニューロンに興奮性のバイアスがつくりだされる。第二に、尾状核ニューロンの視覚応答性は報酬期待によって大きく変化するが、このことが報酬が期待される場所へのサッケードの準備を促進させることになる。この神経メカニズムとしては、空間性の皮質入力が、報酬予測の誤差信号を運ぶドーパミン性入力によるシナプスでの可塑的な変化を介して、強められたり弱められたりするということが考えられる。これらのデータは、行動の学習とニューロンの可塑性をうまく説明する強化学習説を強く支持する。我々の結果は、強化学習モデルが予測するようなニューロンネットワークが大脳基底核に存在することを示している。一方、実際の大脳基底核のネットワークは、現在の提唱されているモデルよりも、行動的な文脈にたいしてより適応的である。報酬志向的行動の神経機構を理解するためには、非対称報酬サッケード課題を使った研究は、今後理想的なパラダイムとなりうる。動機づけ・学習・推論など心的プロセスの神経機構を調べるためのいくつかの行動課題を考案し、被験者(主にマカクサルを対象とする)に訓練した。特に留意した点は、比較する複数の行動課題のあいだで、感覚・運動の条件を一定にすることである。たとえば、動機づけについて調べる場合、課題Aは動機づけ(+)、課題Bは動機づけ(-)の条件を満たすものとするが、感覚・運動の条件は同一にする。あるニューロンが課題Aで活動し、課題Bで活動しない場合、その活動は動機づけに関係することが推測される。以下の3項目について行動課題のセットを考案した。光刺激を使った眼球運動課題を共通する感覚・運動の条件とし、報酬の量や学習の程度を変えることによって、動機づけなどの心的プロセスの関与の程度を実験的に操作することを可能にした。次に、被験者(マカクサル)がこれらの課題を遂行しているときに、大脳基底核と大脳皮質前頭葉を中心とする領域から単一ニューロン活動を記録した。具体的には、大脳基底核の尾状核、黒質網様部、黒質緻密部から、また、大脳皮質前頭葉の背外側部の単一ニューロン活動を記録した。これらのどの領域のニューロンが、感覚・運動プロセスと心的プロセスに特異的に対応する活動を示すのかをまず明らかにした。次に、解剖学的に知られている神経結合関係に基づいて、これらの脳領域のあいだで感覚・運動・心的プロセスの情報が、どの領域で、どのように統合され、あるいは干渉しているのかを示す神経回路モデルを提唱した。意志決定は理性的にも感情的にも行われる。感情的な意志決定のなかでは、特に、報酬にもとづく動機づけの関与が大きい。

我々は、その神経機構を調べるために、1方向のみで報酬が得られる眼球運動(サッカード)課題(1DR)を考案してサルに訓練し、大脳基底核のいくつかの核の単一ニューロン活動の記録を行った。まず最初に、この課題によってサルの動機づけが変化するかどうかを調べるために、サッカードの運動特性を調べた。その結果、報酬が得られる場合にはサッカードの速度が大きく、潜時が短いことがわかった。サッカードの大きさは変わらなかったが、報酬が得られる場合の方が分散が小さく、より正確だった。この結果から、動機づけという心的現象が、サッカードの運動パラメータとして客観的に表現されることが示された。では、このような動機づけによるサッカードパラメータの変化は、脳のどの領域の機能の表現なのだろうか。我々は大脳基底核がその有力候補と考え、その仮説を検証するための実験を行っている。大脳基底核は、尾状核-黒質網様部-上丘という直列的抑制回路によって主にサッカードの発現を制御している。まず、尾状核の単一ニューロン活動を行った。尾状核のGABA作動性出力ニューロンが、1DRにおいて報酬の有無によって視覚性応答を強く変えることはすでに報告した。今回は、尾状核のおそらくAch作動性介在ニューロンの性質を調べた。その結果、出力ニューロンとは異なり、報酬の有無による視覚性応答の変化は非常に少なかった。それにたいして、報酬が常に与えられる場合(ADR課題)と部分的にしか与えられない場合(1DR課題)で視覚性応答の有意な差が見られた。これらの結果から、動機づけによる行動の変化が大脳基底核の中の階層的なメカニズムおこることが示唆された。
脂肪組織由来ストローマ細胞による急性肺傷害の治療

鎮静薬であるミダゾラムが骨髄に由来する樹状細胞に対して与える影響を詳細に解析し、さらに樹状細胞によって引き起こされる個体レベルでの免疫応答にミダゾラムは影響しうることを示した。さらにミダゾラムの樹状細胞に対する作用はGABA系を介したものではなく、末梢性ベンゾジアゼピン受容体のシグナル伝達を介したものであることを示唆する結果を得た。また急性肺傷害の際に自発呼吸を温存した人工換気法を採ることの意義をウサギの急性肺傷害モデルを用いて解析を行った。この実験では肺に保護的な人工換気戦略を採用している状況でも自発呼吸努力を不適切に温存すると、肺の機能的予後を悪化させる実験結果が得られた。この実験により自発呼吸の温存は急性肺傷害の予後に悪い影響をあたえる可能性を示した。樹状細胞は抗原提示細胞として重要な役割を担っており、樹状細胞がリンパ球の活性化に影響し、免疫反応の方向付けを決定することが明らかになっている。ミダゾラムは様々な免疫細胞に影響することが調べられてきたが、樹状細胞に対する影響に関する検討は行われていない。私たちはミダゾラムの樹状細胞の機能への影響を詳細に調べた。更にミダゾラムの樹状細胞への作用は末梢性ベンゾジアゼピン受容体を介するか否かを検討した。マウスの骨髄由来の樹状細胞(BM-DC)を樹状細胞として用いた。樹状細胞に発現されるリンパ球刺激分子(CD80,CD86)、MHCクラスII分子、サイトカイン産生(IL-12p40)を測定した。樹状細胞とT細胞を混合培養してT細胞の活性化に対する影響を調べた。ミダゾラムは樹状細胞のリンパ球刺激分子の発現とIL-12p40の発現を抑制した。またミダゾラムは試験管内でリンパ球のTh1型への分化を抑制するとともに、マウス個体レベルでのTh1型の免疫反応の発生(接触過敏症の発生)を抑制した。最後に樹状細胞に対する中枢性と末梢性ベンゾジアゼピン受容体に対する特異的リガンドを用いた解析から、樹状細胞に対するミダゾラムの影響は末梢性ベンゾジアゼピン受容体を介したものであることが示唆された。ミダゾラムは樹状細胞によるTh1型の免疫反応を抑制することから、個体レベルでも免疫抑制的に作用する可能性が示唆された。プロポフォール中枢神経系への影響は詳細に行われてきたが、免疫系に対しての影響の解析は極めて少ない。プロポフォールの樹状細胞に対する影響に関する検討は極めて少ない。申請者らはプロポフォールの樹状細胞の機能への影響を詳細に調べた。マウスの骨髄由来の樹状細胞(BM-DC)を樹状細胞の対象として用いた。骨髄よりGM-CSFを用いて樹状細胞を誘導する際にプロポフォールの存在下に骨髄由来の樹状細胞を誘導させると、樹状細胞への分化が抑制されて、CDllbとLy-6Cの陽性の単球が増加してくることを見出した。この現象は暴露するプロポフォールの濃度と時間に依存して変化することを見出した。これはプロポフォールが骨髄にいる単球から樹状細胞への分化の過程に影響をあたえる可能性を示唆している。次に、この現象をより詳細に明らかにするために骨髄に存在する単球のみをフローサイトメーターによる細胞分取によって精製して、精製された単球から樹状細胞への分化を観察する実験系を確立し、細胞分化過程にプロポフォールがどのように作用するかを検討している。更にプロポフォール存在下に分化してきた樹状細胞の性質を、樹状細胞のみを磁気分離カラムによって精製して解析すると、プロポフォールによって樹状細胞上のT細胞共刺激分子と主要組織適応抗原の発現が上昇することが観察され、プロポフォールは樹状細胞機能に対しては刺激的に働くことが示唆された。1、急性肺傷害における肺保護的人工呼吸法を施行する際に自発呼吸を温存することの意義を、ウサギの人工呼吸による肺傷害モデルを用いて検討した。このことを検討するために以下のような実験群を作成して肺傷害の程度をガス交換、肺生理学的パラメータ、組織学的検索によって評価した。(a)のLTV+SBweakでは血液ガス、肺コンプライアンス、肺の含気が最も良好であった。一方で(d)のMTV+SBstrongでは無気肺が広く、著しい好中球浸潤を示した。Transpulmonary pressureは(d)群以外では30cmH20以下に保たれたが、(d)群では33cmH20を超える値を示した。

以上の結果から、自発呼吸を温存している時には、一回換気量と最高気道内圧によってのみ規定する肺保護的な人工呼吸戦略をとっていても、実際には高いTranspulmonary pressureによって肺傷害を悪化させている可能性があることが示された。2、脂肪細胞由来の間葉系幹細胞による肺傷害の軽減に変えて、骨髄由来め樹状細胞を用いた炎症反応制御を試みることに方針変更した。その前段階として臨床に使用される鎮静薬で樹状細胞機能を制御することが可能かを追求した。本年度はプロポフォールの樹状細胞に対する作用を追求した。プロポフォールは試験管内で樹状細胞機能を促進した。さらにプロポフォールで前処置した骨髄由来の樹状細胞を用いてマウスを免疫すると樹状細胞によって惹起されるTh1型の免疫応答が増強されることを示した
ロシア帝政期南東コーカサスの「シーア派化」と「非イラン化」

ロシア帝政期(19世紀20世紀初頭)の南東コーカサス(現在のアゼルバイジャン共和国に該当する領域)において同時並行的に進展した「シーア派化」と「非イラン化」の実態を解明することで、南東コーカサスにおける民族意識形成の様態を解き明かす。さらには、ある地域が1つの文化圏から別の文化圏に移行するとはいかなる現象なのかを、近年盛んな帝国論の研究とも結びつけながら論ずることで、より大きな問題に接続する視座を提供する。
19世紀イギリスの帝国主義をめぐる言説における文学とジャーナリズム、政治の関係

19世紀イギリスの代表的な小説家、ジョージ・エリオット(1819-80)とジャーナリストでもあり作家でもあったハリエット・マーティノウ(1802-76)の「帝国意識」を探ることで、当時の文学とジャーナリズム、政治の関係を明らかにした。二人ともイギリス人の卓越性を信じ、それがイギリスの帝国支配を正当化する根拠となっている。しかし、民族支配の問題は階級およびジェンダーの問題と本質的に同じであることを洞察し、他者に対する寛容性を最も重視することで、独善的な帝国主義イデオロギーに染まるのを回避していたことが明らかになった。1.19世紀イギリスを代表するジャーナリストの一人、ハリエット・マーティノウの『イギリスのインド支配:歴史的点描』『未来のインド政府への提言』と同時代の代表的な作家、ジョージ・エリオットの『ダニエル・デロンダ』『テオフラストス・サッチの印象』の分析を通して両者の帝国意識、階級意識、およびジェンダー観について考察した。二人ともイギリス人の卓越性を信じ、支配関係のありようを洞察しているが、従属国民に対する見解や帝国主義に対する態度には違いが見られる。また、作家の関心が帝国の支配を正当化することから、従属国の存在、あるいは移民の増加や民族の融合が支配国に与える脅威へと移行している点に、帝国が抱える問題の深刻化をうかがうことができる。「歴史から抹消されたジャーナリスト」と評されるマーティノウの著作に光を当てることは、当時の帝国意識を探る上でも、文学とジャーナリズム、政治の関係を考察する上でも非常に重要である。2.マーティノウの著作『経済学例解』『自伝』『東洋の生活』から、彼女の関心のありか、人格、視点、公平な態度、弱者への共感、政治への関り方等を考察した。彼女がいかに政治家たちから信頼され、政府の策定に影響力を持っていたかも明らかになった。3.19世紀イギリスにおける主要雑誌Westminster Reviewの1852年から1876年までの内容と傾向を調査した。1832年にすでに南アフリカに関心を向けていたマーティノウの先見の明を明らかにすることができた。1.19世紀イギリスを代表するジャーナリストの一人、ハリエット・マーティノウの政治に関わる著作と『自伝』との関係を探ることで、彼女がイギリスとアメリカにおいて政治、文学、社会活動の領域におよぶネットワークを最大限に活用しながら、様々な社会問題について積極的に提言を行ったことが明らかになった。『自伝』は多くの政治家や出版者、作家の実態を暴露、批判しており、特に、アメリカ滞在時に奴隷制反対の立場を表明してからの経験は、『アメリカの社会』の背景として興味深いだけでなく、マーティノウの信念や帝国意識を考察する上で非常に重要である。彼女の人生そのものが19世紀における文学とジャーナリズム、政治の関係のありようを示しているのである。2.BritishLibraryにおける調査により、マーティノウがDaily Newsに投稿した論説のうち、帝国主義と深く関わるものを収集し、分析を開始した。インド、アイルランド、戦争、女性の問題に関するものである。特に、インドやアイルランドに関する論説は、それ以前に出版された著作との関連において意義深い。3.帝国主義に関わるマーティノウの著作のうち、『アメリカの社会』、『東方の生活、過去と現在』、『アイルランドからの手紙』は旅行記の範疇に入れることができる。これらの分析を通して、彼女の帝国意識は個人としてのアイデンティティの形成および美意識の変革と深く関わっていることが明らかになった。論文「源流への旅--『東方の生活、過去と現在』」を投稿した(平成21年出版予定)
開口時回転パノラマ撮影法による顎関節症III型診断へのファジィ推論の応用

ファジィ推論による診断システムを構築するために、システムの中核となるメンバーシップ関数を作成しなければならない。このため、パノラマ写真で直感的に判断している項目を整理する必要がある。その判断基準に関与する項目は、骨変形に関するものとして(1)下顎頭内側部の形態、および外側骨皮質線からの評価、(2)(1)の下顎頭評価に関節隆起内外側の最下点付近の形態の重みを加えたもの、また関節円板動態異常に関するものとして(3)下顎頭内側頭頂と内外側の関節隆起の位置、および内側関節隆起最下点に対する内側下顎頭頂の前後的位置に関する評価、(4)(3)の関節運動性の評価に下顎頭の立ち上がり角度の荷重を加えたもの、の4項目とした。この判断基準である4項目に属する6項目の各々について、個々のデータを本来はVAS(ビジュアルアナログスケール)を用いるべきであるが、時間の都合上、数値化し重心を求めず、数量化して同じ[If then]ruleを使って4段階の判定を行った。使用した資料は、91名の被験者による一人につき3種類の中顔面のみ規格化されたパノラマ写真(実質開口距離;20mm、30mm、40mm)、計273枚のフィルムである。このデータを用いて、触診だけによる左右顎関節の臨床診断との整合性を分析し、触診による判定の特徴とファジ-・システムを構築するベースとなる判断基準の有効性を両者の関係を用いて検討した。検討は、両側下顎頭のパノラマ診断が一致する群(運動制限のある群と骨変形のある群、運動制限のなし群と骨変形のなし群)と不一致群(運動制限の左右差のある群、骨変形の左右差のある群)に対して、それぞれ触診で左右下顎頭が協調した運動を示した群と不協調群の個数を算出して行った。今後、本結果を報告するとともに、確定診断となるMRIと開口時のパノラマエックス線写真の揃った20例の症例を追加し、メンバーシップ関数を設定し、非ファジィ化して数値データを求めた後に、この資料をさらに検討し、追加報告する予定である。
遺伝性筋萎縮性側索硬化症の運動ニューロン死発生機構とその防御

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、今日までその原因が充分には明らかにされていない進行性難治性筋疾患ある。ALS発症者の5-10%は遺伝性で(FALS)、1993年には細胞質内の活性酸素消去機構であるCu/ZnSOD(superoxide dismutase)遺伝子に点突然変異が見い出されてきて、これが一部のFALSの原因遺伝子であることが強く推定されるに至った。すでに以前の研究により日本人の家系を用いた予備的な研究によって2家系のCu/ZnSOD遺伝子に、症状の進行が極めて遅いなどの際立った臨床的特徴を持った新しい遺伝子変異(点突然変異)を見い出して報告している(H46R変異)。さらに本年度の研究により、もう5家系においても、白人家系にはまだ報告のないCu/ZnSOD遺伝子の5つの異なった異常を見い出した。異なった遺伝子変異は、それぞれに特徴的な臨床所見を示しており遺伝子変異と臨床的特徴の関連が注目される。さらにCu/ZnSOD遺伝子変異による蛋白チロシン残基のニトロ化が運動ニューロン死のメカニズムに深く関与していることを明らかにし、変異SOD導入マウスにおいて筋肉に大腸菌LacZ遺伝子を発現させることに成功したことは、本病の原因解明と治療法確立の足掛りとなり、本年度の当初目的は達成できたものと考えられる。
変異体の機能と構造との解析によるチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ機構の研究

チトクロム酸化酵素は分子状酸素を還元し水にするとともにプロトン(H^+)を膜内側から外側に能動輸送(ポンプ)する膜蛋白質複合体である。ウシ酵素のX線構造と変異体解析により我々はH-pathwayがH^+ポンプ経路であると提唱している。この経路は、水素結合ネットワークと、これと膜内側分子表面とを連結する水経路とから構成される。この水素結合ネットワークは、補欠分子であるヘムaの側鎖ホルミル基およびプロピオン酸基と水素結合をする。したがって、H^+まヘムaにより駆動されることが示唆される。今回このヘムa側鎖プロピオン酸基の役割を検証するモデル実験を実施した。ヘムbの側鎖プロピオン酸基(6,7位)が、それぞれメチル基に置換されたヘムを合成した。再構成法により6位欠損ヘムをチトクロムP450camに導入し、その機能を検討するとともにX線構造を決定した。構造変化は最小限であり、機能への影響も顕著でなかった(JACS,130,432,2008)。これまで、この側鎖は、ヘムの安定化に重要であるとともに、電子供与体からヘム鉄への電子伝達経路を形成すると提唱されていたが、上記結果は、これらを支持しなかった。側鎖欠損ヘムを利用した側鎖機能の検証が可能である。H^+ポンプの経路と機構との研究には、H^+ポンプ過程での機能中心アミノ酸側鎖官能基の化学構造および立体構造変化を赤外分光法で捕捉することが必要である。しかし、赤外スペクトルの検出と帰属のためには、無細胞系で蛋白合成をし、機能中心アミノ酸の部位特異的安定同位体標識化が不可欠である。細菌のチトクロム酸化酵素を大腸菌の無細胞系で機能発現する研究を10年続け、本年チトクロムc酸化活性と吸収スペクトルが正常である酵素標品を得る系を確立した。この無細胞発現系では、アミノ酸残基の標識化に加え、人工ヘムの導入も可能であり、構造に基づいた反応機構研究に有効である。水形成反応とH^+ポンプによって生じる膜内側が負の膜電位とH^+濃度勾配によってATP合成が駆動される。ウシ酵素のX線構造解析結果は、ヘムaによって駆動されるH^+ポンプ経路(H-pathwayと呼ぶ)を示唆する。この経路は、膜内側分子表面から分子内部に伸びる水分子が通れるスペース(水経路)と、これに続く水素結合ネットワークとから構成され、経路の膜外側末端の酸性アミノ酸残基(D51)は、H^+汲みだし部位、水素結合ネットワークに含まれるペプチド結合は一方向性のげ移動部位、そして水経路は膜内側H^+を集める部位である。本年、ペプチド結合を介するH^+移動を阻止する変異と水経路を閉塞させる変異が、それぞれ酸素還元活性には影響を与えないが、H^+ポンプ活性を消失させることを報告した(PNAS104,4200,2007)。この成果とD51の変異結果(PNAS,100,15304,2003)は、H-pathwayがウシ酵素のH^+ポンプ経路であることを強く示唆する。ウシ酵素のH-pathwayと相同な構造が、細菌酵素のX線構造にも認められるが、経路末端の酸性アミノ酸残基に代わり、グリシンと2分子の水分子が配置されており、水分子を介したH^+輸送が示唆される。水の機能を検討するために、Paracoccus denitrificans酵素の水分子を排除する変異(G84とI476の変異)を試みたが、変異はH^+ポンプ効率(電子伝達当量当りのポンプH^+量)に顕著な影響を与えなかった(昨年度の成果)。このH-pathwayに含まれるペプチド結合(Tyr475-Lle476)を介するH^+移動を阻止する変異も、上と同様にH^+ポンプ効率に影響を与えなかった。このペプチド結合に膜内側H^+を供給する経路の水分子は、隣のペプチドにもH^+を供給できるため、結果の評価は単純ではないだ、現在ウシ酵素と相同な細菌酵素のH-pathwayの機能を支持する変異体結果は得られていない。H-pathwayの水素結合ネットワークに分岐ネットワークの存在が示唆され、現在検討中である。

これまで、この側鎖は、ヘムの安定化に重要であるとともに、電子供与体からヘム鉄への電子伝達経路を形成すると提唱されていたが、上記結果は、これらを支持しなかった。側鎖欠損ヘムを利用した側鎖機能の検証が可能である。H^+ポンプの経路と機構との研究には、H^+ポンプ過程での機能中心アミノ酸側鎖官能基の化学構造および立体構造変化を赤外分光法で捕捉することが必要である。しかし、赤外スペクトルの検出と帰属のためには、無細胞系で蛋白合成をし、機能中心アミノ酸の部位特異的安定同位体標識化が不可欠である。細菌のチトクロム酸化酵素を大腸菌の無細胞系で機能発現する研究を10年続け、本年チトクロムc酸化活性と吸収スペクトルが正常である酵素標品を得る系を確立した。この無細胞発現系では、アミノ酸残基の標識化に加え、人工ヘムの導入も可能であり、構造に基づいた反応機構研究に有効である。
鉄・銅代謝異常関連遺伝子の単離およびその疾患との関わり

鉄の必要性とその細胞傷害性とのバランスを保つために細胞内鉄濃度を一定に保つ機構を細胞は保有している。出芽酵母ではAFT1転写因子がその調節のマスター遺伝子として働き、細胞内鉄濃度によりその活性が制御されている。このAFT1転写因子のgain-of function mutantAFT1-1^<up>ではこのバランス保持に異常をきたし、細胞内鉄濃度が上昇する。細胞はこの状態でさらに増殖すると好頻度に発生するフリーラジカルの影響でDNAに傷害が起きる可能性が高くなるため、その防御反応として増殖が停止する。この応答はgain-of function mutantAFT1-1^<up>で観察されるだけではなく、wild typeでも観察されるため、外界からのストレスに対する新たな防御反応であると考えられる。この増殖停止はG1/S期(start)の停止であり、高親和性鉄取り込み機構に依存し、RAD9によるDNA damage check pointには依存しなかった。Gl期特異的cyclinのCln3のC末欠失変異をもつcln3-2を過剰発現させるとバイパスすることができ、G1期特異的cyclin G1期特異的cyclin Cln1,Cln2の発現蛋白量が過剰の鉄存在により著しく低下するのが観察され、このG1/S期の停止はこのGl期特異的cyclinの発現蛋白量への鉄濃度の影響が原因と考えられた。このG1期特異的cyclinの発現蛋白量への影響は転写調節、蛋白質の安定性(分解促進)によるものではなく、翻訳レベルの調節である可能性が高く、出芽酵母においても転写レベルの調節だけでなく、iron-responsive proteins(IRPs)のような鉄濃度による翻訳調節の存在が示唆された。アルツハイマー病などの神経変性疾患において脳への鉄・銅などの沈着が観察される。金属イオン代謝の異常、それらが引き起こす酸化ストレスによる細胞傷害の疾患への関わりを解明する手がかりとして、その代謝機構を出芽酵母により解析した。ヒトと出芽酵母間の代謝機構の保存は関連遺伝子間のホモロジーにより強く示唆されていた。そのうち、細胞内メンブレン・コンパートメントに存在するP-type ATPaseのfamilyであり、細胞内メンブレン・コンパートメントに存在する銅トランスポーターをコードする遺伝子CCC2はWilson病・Menkes病原因遺伝子と高い相同性をもつ。正常なMenkes病原因遺伝子を出芽酵母のccc2変異株で発現するとFet3への銅の配位がおこりFet3のOxidase活性が回復した。したがって、CCC2遺伝子が単に相同性を持つだけでなく、機能的にもWilson病・Menkes病原因遺伝子と同じ働きをすることが確認された。また、Ctr1からCcc2に銅を運ぶ銅シャペロンAtx1とCcc2はともに銅の細胞内代謝に役割をもつが最終標的が鉄の取込みであるため、どちらもAftl転写因子の制御下にあり、その遺伝子制御領域にAftl結合コンセンサス配列の存在が認められた。銅代謝の制御因子としてはMAC1遺伝子が知られていたがその機能は明らかではなかった。CTR1,FRE1遺伝子制御領域を用いたレポーター・アッセイでMac1の標的配列を決定し、さらにin vitro translationsystemでMac1を合成し、その標的配列DNAへの結合を確認することにより、Mac1が転写因子であると結論した。
分離培養による黒質,腹側被蓋野ドーパミン神経の標的特異性の解析

1.線条体,側坐核の分離培養:新生仔ラット脳バイブラトーム切片とり線条体,側坐核を別々に切り出し,その分離培養を試みた。その結果,それぞれの分離培養において多くのGABA陽性神経が得られることが確認され,その形態は、線条体と側坐核のもので異なる特徴を示し、黒質分離培養におけるGABA陽性神経細胞とも細胞体の大きさ,突起の伸長形態が異なることが明らかになった。2.標的特異性の解析:線条体と黒質神経細胞の混合培養に先立って,それぞれの分離神経と同一または異なる神経組織由来のグリア細胞が分離神経細胞の成育におよぼす影響を調べた。その結果,黒質分離神経細胞は黒質由来または標的神経組織(線条体)由来のグリア細胞によって良好な成育を示すが,非標的神経組織(脊髄)由来のグリア細胞では成育が阻害された。また,線条体分離神経細胞についても同様な結果が得られ,神経細胞とグリア細胞との間にも標的組織による親和性が示唆された。3.分離培養におけるGABA作動性神経とドーパミン(DA)作動性神経のシナプス形成:先に我々が開発した黒質分離培養は,培養ニューロンの大部分がDAニューロン(約40%)とGABAニューロン(約40%)で構成されている。DA合成酵素であるチロシン水酸化酵素(TH)またはGABAに対する免疫組織化学を用いた電子顕微鏡観察により,両者は相互にシナプス形成を行うことが示唆された。黒質-線条体などの混合培養系におけるシナプス形成率の定量的解析は今後の課題として残されている。4.線条体における一酸化窒素(NO)合成ニューロンとDA終末の関係:近年,神経伝達物質としてのNOの作用が注目されている。線条体においてはNMDAリセプターを介したNO産生によるDAの放出が薬理学的に示唆さており,この形態学的根拠を明らかにするために,NADPH-diaphorase(NO産生ニューロンマーカー)組織化学とTH-免疫組織化学を組み合わせた電子顕微鏡観察を行った。その結果,NOニューロンに対するシナプス入力は少ないが、DA終末の多くがグルタミン酸作動性と考えられる終末(線条体投射ニューロンスパインと非対称性シナプスを形成)とともに、NOニューロンに直接接触しており,その部位が興奮性アミノ酸によるNO産生,DA放出機構を裏付ける構造であることが示唆された。1.線条体,側坐核の分離培養:新生仔ラット脳バイブラトーム切片より線条体,側坐核を別々に切り出し、その分離培養を試みた。それぞれの培養についてGABA,サブスタンスP,エンケファリン等の免疫組織化学染色を行い,分離神経細胞のタイプ,形態を明らかにした。その結果,それぞれの分離培養において多くのGABA陽性神経が得られることが確認され,その形態は,線条体と側坐核のもので異なる特徴を示し,黒質分離培養におけるGABA陽性神経細胞とも細胞体の大きさ,突起の伸長形態が異なることが明らかになった。2.標的特異性の解析:線条体と黒質神経細胞の混合培養に先立って,それぞれの分離神経と同一または異なる神経組織

由来のグリア細胞が分離神経細胞の成育におよばす影響を調べた。その結果,黒質分離神経細胞は黒質由来または標的神経組織(線条体)由来のグリア細胞によって良好な成育を示すが,非標的神経組織(脊髄)由来のグリア細胞では成育が阻害された。また,線条体分離神経細胞についても同様な結果が得られ,神経細胞とグリア細胞との間にも標的組織による親和性が示唆された。前年度(平成5年度)研究実績1)線条体,側坐核の神経細胞分離培養の確立,2)分離線条体神経細胞および黒質神経細胞に対するグリア細胞の標的特異性の解析,に続いて本年度(平成6年度)は以下の研究を行った.3)分離培養におけるGABA作動性神経とドーパミン(DA)作動性神経のシナプス形成:先に我々が開発した黒質分離培養は,培養ニューロンの大部分がDAニューロン(約40%)とGABAニューロン(約40%)で構成されている.DA合成酵素であるチロシン水酸化酵素(TH)またはGABAに対する免疫組織化学を用いた電子顕微鏡観察により,両者は相互にシナプス形成を行うことが示唆された.黒質-線条体などの混合培養系におけるシナプス形成率の定量的解析は今後の課題として残されている.4)線条体における一酸化窒素(NO)合成ニューロンとDA終末の関係:近年,神経伝達物質としてのNOの作用が注目されている.線条体においてはNMDAリセプターを介したNO産生によるDAの放出が薬理学的に示唆されており,この形態学的根拠を明らかにするために,NADPH-diaphorase(NO産生ニューロンマーカー)組織化学とTH-免疫組織化学を組み合わせた電子顕微鏡観察を行った.その結果,NOニューロンに対するシナプス入力は少ないが,DA終末の多くがグルタミン酸作動性と考えられる終末(線条体投射ニューロンスパインと非対称性シナプスを形成)と供に,NOニューロンに直接接触しており,その部位が興奮性アミノ酸によるNO産生,DA放出機構を裏付ける構造であることが示唆された.
熟練技術伝承に向けた機械操作熟達支援システム

本研究課題では,技術伝承に向けた機械操作の熟達支援技術を目的としている.機械操作技術を修得するためには,人間のイメージを操作対象の特性に近づけることが重要である.そこで,操作者のイメージに近づけるように機械を変化させることで,機械操作熟達を促進できることを示した.さらに,技術伝承を想定した複数の人間がかかわる作業では,他者の意図を考慮した挙動が含まれることが示唆された.そこで,複数人が協力して作業を行う際の他者の影響を定量的に計測する手法を提唱した.この他者配慮指標が協力作業に与える影響を実験的に解析し,互いの「気づかい」それぞれ協調作業に悪影響をおよぼす可能性が解析により明らかとなった.本研究課題では,技術伝承に向けた機械操作の熟達支援技術を目的としている.機械操作技術を修得するためには,人間のイメージを操作対象の特性に近づけることが重要である.そこで,操作者のイメージに近づけるように機械を変化させることで,機械操作熟達を促進できることを示した.さらに,技術伝承を想定した複数の人間がかかわる作業では,他者の意図を考慮した挙動が含まれることが示唆された.そこで,複数人が協力して作業を行う際の他者の影響を定量的に計測する手法を提唱した.この他者配慮指標が協力作業に与える影響を実験的に解析し,互いの「気づかい」それぞれ協調作業に悪影響をおよぼす可能性が解析により明らかとなった.本研究課題では本研究課題では,機械操作熟達支援システムの実現を目指して研究を進めている.機械操縦タスクにおいて,操作者の有する内部モデルと操作対象のダイナミクスをいかに短時間で近づけることができるかが熟達支援の鍵となる.そこで,現在シミュレータ上での機械操縦タスクに加え,フォースフィードバックの影響を検討するためのハードウェア構築を行っている.また,技術伝承の観点から複数のプレイヤーが介在するタスクへ拡張し,互いに及ぼす影響についての検証を行っている.本年度は,コンピュータグラフィックス環境内でのシミュレータをベースとした作業効率の評価を行い,操作対象ダイナミクスの修正に関する実験解析を進めてた(日本シミュレーション学会学会誌[投稿中]).さらに,実機化に向けた操作者と機械の力のインタラクションに着目した研究として,アクチュエータの挙動から印加された力の位置推定手法を発表した(国際会議H. Nagasawa, H. Igarashi: NCSP2014).また,複数の操作者による単独作業との違いに着目し,互いの発生する他者配慮に関する操作量の関係を検証した(国際会議N. Tsujita, H. Igarashi: NCSP2014,五十嵐:ロボティクスシンポジア2014).これらの知見をもとに,今後の複数の操作者による協調機械操作タスク環境を整備し,熟達支援技術の検証,および複数の操作者による作業の影響から効果的な技術伝承に関する検討を行う.本研究課題では,技術伝承に向けた機械操作の熟達支援技術に関する研究を行った.初心者が機械操作技術を修得するためには,人間の脳内のイメージ(内部モデル)を操作対象の動特性に近づけることが重要であるとの脳科学知見がある.そこで,操作者のイメージに近づけるように機械を変化させることができれば,機械操作熟達を促進することが期待できる.しかし,機械操作中の操作対象の特性変化は操作者に違和感や暴走している感覚を与えることから,人間に気づかれない範囲でサブリミナルに動特性を変化させることで,操作熟達に有効であることを確認した.本成果を論文にまとめ公表した.また,技術伝承を想定した複数の人間がかかわる作業では,他者の意図を考慮した挙動が含まれることが示唆された.そこで,複数人が協力して作業を行う際の他者の影響を他者配慮指標(Concern for others)として定量的に計測する手法を提唱した.この他者配慮指標が協力作業に与える影響を実験的に解析し,互いの配慮が大きすぎる,または小さすぎる場合にはそれぞれ協調作業に悪影響をおよぼす可能性が解析により明らかとなった.この知見により,技術伝承において他者配慮指標を考慮したトレーニングの有効性が示唆された.また,機械操作系におけるフォースフィードバック(力覚提示)についても同時に検討を進めている.フォースフィードバックデバイスを開発し,これを用いた操作熟達支援に向けて引き続き研究を進めている.今後,本研究課題で明らかとなった,機械動特性変化に対する感度および他者配慮の影響を,力情報として操作者へ与えることによる熟達効果の促進を目指す.人間機械系本課題の目的である熟達支援システムの実現に向けて,ソフトウェア・ハードウェアの両面からタスクを設定し実験を行ってきた.これらの融合と総合的な評価に向けた準備は整いつつあると考える.最終年度はソフトウェア・ハードウェアに対する個別の成果を有機的につなげた総合的な評価実験を行う.この際いくつか問題が生じる可能性があるため,その改善に向けて研究に取り組みたい.また,現実的な作業アプリケーションについても引き続き検討してく予定である.予定していた国際会議発表について,追加実験が必要となったため,次年度へ繰り越すこととした.予定していた学会とは別の学会への投稿に向けて準備を行う.
肝GSHの調節機構におけるGTPおよびtranssulfurationの関与

肝細胞内グルタチオン(GSH)はcysteineの供給量がその産生を律速する。循環中のcysteineは直接肝細胞には取り込まれず、肝GSH合成には、我々の報告したrGTPを介する基質供与の他、transsulfuration pathwayによりmethionineを利用しうる。Cystathionaseは後者の反応の最終段階を触媒しcysteineを生ずる。1.図に示すように、ヒト、guinea pig肝のrGTP活性は最も高く、逆にcystathionase活性は最も低い。一方、rat、dog、mouseでは低rGTP、高cystathionase活性を示した。結論:rGTPおよびcystathionase両酵素の、基質(cysteine)の供給を介し、互いに補完的に肝GSH濃度の維持に働く可能性について示した。
古生代末～中生代初期のパンサラッサ海における劣悪環境の出現と解消

ペルム紀末絶滅に伴う環境劣悪化の終結・解消に焦点を絞って研究を行った.その結果,(1)遅くとも前期三畳紀後期オレネキアン期後半には海洋の貧無酸素状態はほぼ解消し,放散虫の生産が回復(チャート堆積)していた.しかし短期間の無酸素状態が再出現した.(2)中期三畳紀前期に貧酸素状態と富酸素状態が短周期で繰り返した後,完全に富酸素状態に移行した.以上は前期三畳紀後半の不安定な環境を意味する.(3)下部三畳系珪質岩中に玄武岩質砂岩・礫岩を見出し,珪質岩の基盤岩として玄武岩の存在を推定した.その運搬は土石流及び乱泥流によるもので,前期三畳紀後半に深海域底層水塊の撹拌が発生していた.平成24年度ならびに25年度に研究目的達成のために相応しいPT境界珪質岩セクションの文献調査および現地調査を行って,層序の連続性,岩石組織の保存状況(風化の程度)などの観点から,研究目的に適った下部三畳系黒色粘土岩・層状チャートセクションの発見に努めた.その結果,大分県津久見市日代海岸の下部三畳系上部中部三畳系下部の層状チャートセクションが目的達成に相応しいと判断した.この年代範囲はPayne et al. (2004)が三畳紀古世中世初期浅海炭酸塩岩で見出した炭素安定同位体比の変動時期に大きく重なる.以上の点から平成25年度には,佐野,指田,上松が共同で層序の実測と試料採集を行った.佐野はチャートの構成鉱物,鏡下での特徴などの堆積岩石学的性質の把握,指田・上松はチャートセクションの放散虫化石の多様性,コノドント群集の変化などの古生物学的検討を開始した.桑原はSano et al. (2012)が報告した岐阜県山県市のPT境界セクションのペルム系放散虫化石の詳細な群集解析および国際対比を継続して行った.上松・佐野・指田は次の論文を投稿し,3月末に受理され現在印刷中である.これまでに代表者らが行ってきたPT境界珪質岩の層序,岩相,年代をレビューし,これまでの研究の不十分な点を検討したところ,PT境界珪質岩の堆積岩石学的検討が十分に行われていなかったことが明らかになった.そこで化石年代の再検討も含めて,岐阜県関市板取村ミオ谷,同山県市三尾谷,京都府福知山市菟原などの珪質岩セクションでの層序の記載,試料採集,薄片作成を行った.鏡下観察の結果および詳細な岩相層序のデータを取り込んで,わが国のPT境界珪質岩層の岩相,堆積岩石学的性質,年代をまとめ,投稿準備中である.なおこの成果の一部は日本地質学会年会(平成24年9月大阪府立大学)で講演した(佐野ほか,2012).さらに本年度は本研究課題の目的達成に適したPT境界及び関連の珪質岩セクションを探し出し,予備的な調査を行った.その結果,(1)古生代末の劣悪環境発生については岐阜県本巣市岩井谷セクション(Sano et al., 2012),(2)中生代初期の劣悪環境解消については大分県津久見市網代セクションが適していると考えるに至った.例えば後者のチャート層の場合,上位に向かって灰・灰緑色チャートから,数10 cm厚さで暗紫色・赤褐色チャートが交互する部分(約5 m厚さ)を経て,赤褐色チャートのみで構成される部分へと変化する層序が認められた.この色調変化は海洋無酸素状態の段階的解消,つまり三畳紀古世末の不安定な海洋環境を暗示するものと考えている.(1),(2)のそれぞれのセクションで予備的な調査ならびに試料採集を行った.1.平成24・25年度の研究から引き続いて,大分県津久見市網代島の中部三畳系下部チャートセクションにおいて堆積岩石学的検討を行った.平成26年度に採集した試料を用いて薄片観察およびX線粉末回折分析を実施した.その結果,(1)チャートはすべて放散虫を含むこと,(2)灰緑色チャート,紫灰色チャート,赤褐色チャートには共通して石英が含まれるほか,ごくわずかに粘土鉱物が含まれること,(3)チャートの色調の相違は赤鉄鉱の有無によることが明らかになった.2.岐阜県関市ミオ谷の下部三畳系珪質粘土岩に塩基性火山砕屑岩が夾まれること(未公表)にヒントを得て,栃木県鹿沼市の思川流域の下部三畳系珪質粘土岩層を調査検討した.鏡下観察の一部は未了であるが,当該珪質粘土岩層中に玄武岩円礫に富む礫質岩を確認した.これらの事例は,下部三畳系珪質粘土岩の堆積中にに玄武岩質火山砕屑物が供給されるイベントが起きたことを意味するものと考えた.3.美濃帯の中部ペルム系最上部上部ペルム系チャートにおいてLatentifistularia放散虫を用いた化石分帯案を新たに提案し,学会発表した.1.中期三畳紀初期における劣悪環境の解消大分県津久見市秩父帯における中部三畳系下部チャートを用いて色調と鉱物組成の変化を検討した結果,灰色チャートから暗紫色チャート・赤褐色チャート互層を経て赤褐色チャートに変化することが認められた.どれも放散虫チャートである.X線粉末解析の結果,赤褐色チャートに赤鉄鉱が含まれるのに対して灰色紫色チャートには赤鉄鉱が確認されなかった.

この結果は三畳紀中世初期にやや還元的な状態と酸化的状態とが短期間に繰り返しながら,最終的に劣悪環境が解消したことを示すと考えた.現在これらのチャートについて,参加・還元状態に鋭敏な微量元素の定量を進めつつある.2.前期三畳紀の海底火山活動岩相から判断して劣悪環境が維持されていたと思われる前期三畳紀前期および後期の深海珪質堆積物中に塩基性火山岩および同質火山砕屑岩,それらの礫を含む礫岩を見いだした.岐阜県郡上市,美濃帯の最下部三畳系と思われる砥石型珪質粘土岩と同山県市の砥石型下部三畳系上部の珪質粘土岩に玄武岩質火山砕屑岩層が共在する.また栃木県鹿沼市地域の足尾帯ジュラ紀付加体の下部三畳系砥石型珪質粘土岩に共在する玄武岩溶岩と砥石型珪質粘土岩の細礫を主とする礫岩層および玄武岩溶岩の上位に砥石型珪質粘土岩が重なる層序関係を見いだした.これらの玄武岩質岩石の地球化学的性質,礫岩の堆積様式の解明を進めつつある.ペルム紀末絶滅に伴う環境劣悪化の終結・解消に焦点を絞って研究を行った.その結果,(1)遅くとも前期三畳紀後期オレネキアン期後半には海洋の貧無酸素状態はほぼ解消し,放散虫の生産が回復(チャート堆積)していた.しかし短期間の無酸素状態が再出現した.(2)中期三畳紀前期に貧酸素状態と富酸素状態が短周期で繰り返した後,完全に富酸素状態に移行した.以上は前期三畳紀後半の不安定な環境を意味する.(3)下部三畳系珪質岩中に玄武岩質砂岩・礫岩を見出し,珪質岩の基盤岩として玄武岩の存在を推定した.その運搬は土石流及び乱泥流によるもので,前期三畳紀後半に深海域底層水塊の撹拌が発生していた.1.網代島セクションのチャートの薄片作成に予想以上の時間と手間を要したため,化学分析に進むことが出来なかったため.2.同上セクションでの放散虫の多様性の垂直変化の検討が難しく,計画通りに進行できなかったため.堆積岩石学1.津久見市網代島セクションの下位で,下部三畳系上部灰色・黒色チャート層の岩相層序の実測を行ったので(H26年度),これまでに得たデータと合わせて下部三畳系チャート・珪質粘土岩の岩相層序の概略を明らかにする.さらにUおよびMoの定量を実施して酸化還元環境を復元する.2.下部三畳系珪質岩中の塩基性火山砕屑岩の起源をさらに追求する.3.中部ペルム系最上部上部ペルム系チャートの放散虫化石分帯案に関する論文を投稿する.PT境界期での劣悪環境の出現・開始よりもその衰微・解消の検討がより興味深いと考え,下部三畳系珪質岩の連続セクションの発見に努めてきた.しかし課題の目的達成に相応しい珪質岩,下部三畳系中部三畳系下部のチャートの連続セクションの発見に時間を要したため,全体の進捗がやや遅れている.本研究課題の経費を用いてPT境界珪質岩の岩石薄片を作成し,それに基づく鏡下観察を行って堆積岩石学的性質珪質岩の堆積岩石学的検討を行うことができた点は,これまでの研究の不十分性を克服する第一歩として評価できると考えている.この堆積岩石学的検討の成果をも含めた,わが国のPT境界珪質岩のまとめを行えたことも研究の進展のひとつと考えている.また本研究課題の目的達成のために適した2つのセクションを見出し,予備的調査が開始できた点は大きな成果として評価できる.しかし地球化学的分析や微化石群集解析がほとんど未着手である.この点については次年度の課題としたい.
子宮頚癌発生におけるHPVならびにテロメレース活性に及ぼすホルモンの影響

1)テロメレース活性は正常6.6%,軽度異形成25.9%,中等度異形成35.3%,高度異形成ならびに上皮内癌68.%,浸潤癌96.7%に陽性であった.異形成は正常より,浸潤癌は異形成よりそれぞれ明らかに高値を示しており,異形成の中でも程度がひどくなるほど陽性率が高くなっている.2)異形成および浸潤癌から樹立されている培養細胞においてはすべてにおいてテロメレース活性の陽性化が認められた.正常細胞では陰性であったが,HPVウイルスによって不死化した細胞,煙草タールによって癌化させた細胞では陽性であった.以上より,テロメレース活性の陽性化は頚癌で高率に起こっており,しかも,その多段階発癌機構のなかで,比較的早期のイベントと思われる.半数以上の症例で、正常頚管腺細胞の核と間質細胞で、ER,PRは陽性であった.腺癌組織においては腫瘍組織の広い範囲にわたってER,PR陰性となったが、陽性例では限局性の染色パターンをとり、その陽性率はER19%、PR24%であった。再発死亡例は21例で、うちER陽性1例、PR陽性0例で、ER,PR陽性群は陰性群に比し有意に予後良好であった。子宮頚癌の発生ならびに進展に関しては,種々の内因性癌遺伝子,抑制遺伝子,上皮増殖因子などが複雑に関与していことが示唆されており,その発生過程においてヒト・パピローマ・ウイルス(HPV)感染が関与していることは多くの認めるところである。また最近,細胞の不死化と密接に関係するテロメレースが癌において活性化されていることが明らかにされている。1)細胞診正常の子宮頚部244例,軽度異形成27例,中等度異形成17例,高度異形成ならびに上皮内癌19例,浸潤癌30例よりサイトブラシにて摂取した細胞標本について,テロメレース活性をtelomerase repeat amplification protocol(TRAP)法によって測定した.テロメレース活性は正常6.6%,軽度異形成25.9%,中等度異形成35.3%,高度異形成ならびに上皮内癌68.%,浸潤癌96.7%に陽性であった.異形成は正常より,浸潤癌は異形成よりそれぞれ明らかに高値を示しており,異形成の中でも程度がひどくなるほど陽性率が高くなっている.2)異形成および浸潤癌から樹立されている培養細胞においてはすべてにおいてテロメレース活性の陽性化が認められた.正常細胞では陰性であったが,HPVウイルスによって不死化した細胞,煙草タールによって癌化させた細胞では陽性であった.以上より,テロメレース活性の陽性化は頚癌で高率に起こっており,しかも,その多段階発癌機構のなかで,比較的早期のイベントと思われる.半数以上の症例で、正常頚管腺細胞の核と間質細胞で、ER,PRは陽性であった.腺癌組織においては腫瘍組織の広い範囲にわたってER,PR陰性となったが、陽性例では限局性の染色パターンをとり、その陽性率はER19%、PR24%であった。
パーキンソン病のミトコンドリアDNAの変異について

パーキンソン病発症の一因としてミトコンドリアDNA(mtDNA)の変異が考えられ、検索を行なっている。我々はmtDNA上の点変異を正確にしかも効率良く見いだすために蛍光標識を用いた直接塩基配列決定法を開発し、パーキンソン病患者の剖検脳より抽出したmtDNA全長の塩基配列を決定した。パーキンソン病患者10例合計16万5千塩基対の配列を決定し同時に行なった29例の対象者の配列と比較した結果、各症例のmtDNA内において疾患群に特異的な点変異を確認した。症例1については蛋白翻訳領域内ND2とATPase6に2箇所と12SrRNA内に1箇所、16SrRNA内に2箇所の変異を確認した。症例2については蛋白翻訳領域内ND6に1箇所とtRNA^<Thr>内に1箇所。症例3は蛋白翻訳領域内ND2とND4に2箇所と12SrRNA内に3箇所。症例4は蛋白翻訳領域内ND2とND5に2箇所とtRNA^<Gln>内に1箇所。症例5は蛋白翻訳領域内ND5に1箇所と12SrRNA内に1箇所。症例6は16SrRNA、tRNA^<Gln>、tRNA^<Thr>内にそれぞれ1箇所ずつ。症例7は蛋白翻訳領域内ND2とATP^<ase>6に1箇所と12SrRNA,tRNA^<Ala>,tRNA^<Leu>内にそれぞれ1箇所。症例8は16SrRNA内とtRNAGln内に1箇所ずつ。症例9は蛋白翻訳領域内ATPase6とND4に2箇所。症例10は蛋白翻訳領域内に1箇所と12SrRNA内に1箇所の点変異が確認された。現在それぞれの特異的点変異の頻度を疾患及び正常対照患者の数を増やし、制限酵素を用いた方法で検索を進めている。