hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃がんにおけるHER2発現の腫瘍内ヘテロ不均一性に対するDNAメチル化異常の意義

ヒト進行胃癌の手術検体から、同一腫瘍内においてHER2発現が陽性および陰性の領域を含む症例を選び出し、そのそれぞれの領域を含む切片からRNAを抽出しマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的解析を行った。その結果、apoptosis関連遺伝子を含む少数の遺伝子に関しては、その両領域間で4倍以上の発現の差が観察された。その値の検証のためにreal-time RT-PCR法を行ったが、RNAの分解のため、再現性のある結果を得ることが困難であった。より再現性の高い結果を得るためにgenomic DNAを用いたSNP arrayを行い、上述の両領域間で互いに増幅の程度が異なるいくつかの遺伝子の候補を得た。ヒト胃癌で見られる腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示しうる原因としてエピジェネティクス、特にDNAメチル化の関与を示す目的で以下の実験を行った。本学附属病院病理部に保管されている病理検体に対して検索を行うことにより、患者様の同意が得られている胃癌検体のパラフィン包埋ブロックおよびその臨床医学的・病理学的情報を入手した。これらの症例のうち免疫組織化学的検討において抗HER2抗体陽性のものを選び出し、その中から腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示すものを少数ではあるが選出した。腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示す胃癌症例に対し、HER2タンパク発現陽性と陰性部分の薄切切片からLaser Captured Microdissection (LCM)法を用いて、あるいはトリミングにより、間質細胞の混入が少ない腫瘍細胞塊を選別し採取した。それらから分子生物学的方法による解析に十分な品質、量のゲノムDNAを抽出することが出来た。そこでHER2関連遺伝子や既知の胃癌関連遺伝子を含む遺伝子の状態を網羅的に検索する目的でComparative Genomic Hybridization (CGH)法を行うことにより、HER2タンパク発現陽性と陰性部分のゲノムDNAの状態を比較した。その結果、複数の染色体において広範囲な遺伝子のコピー数増加や減少が観察された。その中にはHER2タンパク発現陽性と陰性部分間においてコピー数の増加あるいは減少の状態が異なっている遺伝子があり、それらはコピー数に対する腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示していると考えられる。これらの遺伝子のうち、これまでに報告のないHER2関連遺伝子のコピー数増加が認められたので、この遺伝子のDNA増幅の定量やその頻度の算出、promoter領域のDNAメチル化の状態、RNAの発現の定量やその頻度およびタンパクの発現の頻度等を解析し、そのデータを蓄積している。ヒト進行胃癌手術検体のうちHER2タンパク発現陽性領域と陰性領域を含むもの、すなわちHER2タンパクの発現に関する腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示すものを20例選出した。同一腫瘍内におけるHER2陽性および陰性領域を含む組織切片から、それぞれの領域を含む組織をlaser captured microdissection法あるいはトリミングにより分離しRNAを抽出した。当初の計画では両領域におけるHER2及びその関連遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化の状態をmethylation specific PCR法やbisulfite sequence法により比較し、さらにその遺伝子発現との相関を検索する予定であったが、マイクロアレイによるRNA発現の差の比較を先行して行うことにした。その理由は、HER2関連遺伝子のみならず未知の遺伝子を含めた網羅的な解析やmRNAの転写制御と直接関わるDNAメチル化の選択的な解析が可能となると考えたためである。ホルマリン固定・パラフィン包埋材料(Formalin fixed paraffin embedded: FFPE)材料を用いたマイクロアレイはRNAの分解・架橋により困難であったが、FFPE材料にも対応が可能であった企業に依頼し解析結果を得ることが出来た。両領域における遺伝子発現の差はその大部分が3倍以内であったが、あるapoptosis関連遺伝子などでは4倍以上の差が観察された。それらの遺伝子に対してはreal-time RT-PCR法により定量を試みたが再現性が得られなかった。そのためより分解しにくいDNAに対してSNP array法を用いることにより両領域間の遺伝子増幅の差の解析を行った。その結果、複数の遺伝子において遺伝子増幅の差が検出されたため、臨床病理学的な情報との相関の結果と併せて国際的な学術雑誌への投稿を予定している。人体病理学本学附属病院病理部に保管されている胃癌症例のうち、患者様の同意が得られており、その臨床医学的・病理学的情報が入手できた胃癌検体のパラフィン包埋ブロックからHER2遺伝子に対する腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示すものを少数ではあるが選出した。それらの胃癌の腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示す部分から、種々の解析に十分な量と品質のDNAを抽出した。HER2およびその関連遺伝子、既知の胃癌関連遺伝子の状態を知る目的で、Array-based Comparative Genomic Hybridization法を行うことにより、腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示す遺伝子を含む多数のコピー数の変化した遺伝子の情報を得ることができた。そのなかには、これまでに遺伝子増幅が報告されていないHER

2関連遺伝子が認められたため、その遺伝子に対して胃癌検体100例を目標としてFluorecence in situ Hybridization (FISH)法によるDNAの増幅の確認およびMethylation Specific PCR (MSP)法およびBisulfite Sequence法を用いた遺伝子のpromoter領域におけるメチル化の状態の解析、Real-time RT-PCR法を用いたRNAの発現の定量および頻度の解析、免疫組織化学的方法によるタンパクの発現頻度の解析を行っている。以上のデータを整理し、予後などの臨床情報や分化度および深達度などの病理学的情報との関連性についても検索し、学術論文として投稿する予定である。ヒト胃癌で見られる腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示しうる原因としてのエピジェネティクスの関与を示すことを目標として実験を開始したが、その過程において遺伝子を網羅的に解析することの必要性を強く感じるようになった。そこで今年度に行ったHER2遺伝子に対する腫瘍内(ヘテロ)不均一性を示す複数の腫瘍に対して、HER2タンパク発現の陽性部分および陰性部分からゲノムDNAを抽出し、それぞれに対してArray-based CGH法による遺伝子のコピー数増加、減少および点突然変異などの遺伝子変異の有無を検索する。さらに可能であれは上記のゲノムDNAに対して遺伝子のpromoter領域のメチル化の状態を網羅的に検索する目的でCpG island microarray法を行う。一方で、今年度の実験においてDNAの増幅が示唆されているHER2関連遺伝子に対して、来年度も引き続き複数の胃癌検体に対しFISH法によるDNAの増幅の確認およびMSP法およびbisulfite sequence法を用いたメチル化の状態の評価、Real-time RT-PCR法を用いたRNAの発現の量および頻度の評価、免疫組織化学的方法によるタンパクの発現の頻度の解析を行う。この遺伝子に対する情報を整理し、生命予後などの臨床情報・分化度などの病理学的情報との関連性についても検索していく。さらにこの遺伝子に対して複数の胃癌細胞株を用いた遺伝子導入や発現抑制実験を行い、遺伝子の機能についても確認する。この遺伝子に対する遺伝子改変マウスを購入または作成し、in vivoにおける腫瘍形成に対する機能解析を行うことも検討している。
雷撃の強弱までも予測可能な落雷予知技術の開発に関する研究

本研究で開発した落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機(LAPOS5)を用いて、フロリダ大学のロケット誘雷実験場で自然落雷の最終雷撃過程の観測を平成30年度8月までに継続できた。その後、該当機器を無事に日本に撤収し、日本の冬季雷の観測に使用し続けている。フロリダでの観測では10例の自然落雷のデータを記録した。過去のデータと突き合わせて解析を行い、ダートリーダーの進展特性を明らかにした。国際会議において、これらの成果について担当学生二人が発表を行い、高い評価を受けた。また、国際学会誌論文一篇掲載、一篇投稿中。岐阜の夏季雷の観測データをより詳細に解析することにより、帰還雷撃の強弱はリーダに先行するpreliminary breakdown(PB)パルスよりもリーダ進展との相関性が高いことが分かった。雷雲ごとに解析すると、この傾向はより顕著であることが分かった。これらの結果を基にして、強い落雷を発生する雷雲の電荷構造のモデルを提案することが出来た。この研究成果について国際学会誌論文一篇投稿中。雷雲の電界計測では、当初予定していたフロリダ大学での実験をあきらめ、協力の約束を取り付けたアメリカのNational Severe Storms Laboratory(NSSL、暴風雨研究所、オクラホマ州にある)で行った。雷雲に本研究で開発した電界センサーを複数個同時飛行させることに成功した。しかし、雷雲が弱いため、有意義な観測データを獲得することが出来なかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。計画の落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機(LAPOS5)を作成し、その校正・検証の実験を行った。LAPOS5号機が設計通り、高い感度と広いダイナミックレンジを持っていることを確認できた。今年度の5月にLAPOS5号機をフロリダ大学ロケット誘雷実験場に設置し、観測を始める予定である。また、雷雲空間電界計測用電極を作成し、室内およびフロリダの夏季雷雲と日本の冬季雷雲の実環境における検証実験を行った。実内実験では、電極形状の最適化ができた上、空間電界と電極間での放電頻度との関係式を確立した。フロリダ夏季雷雲と日本の冬季雷雲の実環境における検証実験では、実測データがまだ少ないが、実内実験の関係式と同じ傾向が見られた。電界の極性を識別するための仕組みを考案し、実験により、この方法の有用性を確認した。落雷の最終雷撃過程の観測研究では下向き負極性リーダーのパルス放電が最終雷撃過程の一部になることがあると分かった。また、負極性スデップドリーダーのスデップ時の双方向進展特性を見出し、負極性スデップドリーダーの進展機構のモデル図を改善できた。落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機(LAPOS5)の作成において、協力してくれているメーカーの都合で納期が当初より遅れたが、何とか年度内で完成できた。本研究で開発した落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機(LAPOS5)を昨年の7月よりフロリダ大学のロケット誘雷実験場に設置し、落雷の最終雷撃過程の観測実験を開始した。昨年度の観測期間中、フロリダでは雷雲が極端に少なかったものの、8月16日までにロケット誘雷7例、自然落雷の10例の最終雷撃過程の観測に成功した。これらのデータを解析したところ、ロケット誘雷では、初めて後続雷撃の最終雷撃過程における上向きリーダの存在を確認した。この上向きリーダの伝搬速度を求めたところ、遅い時、10の6乗メートルパーセコンドとなっており、速い時、10の7乗メートルパーセコンドとなることを明らかにした。また、上向きリーダから求めた帰還雷撃の開始高度と従来方法で求めたものと一致することも確認した。自然落雷では、下向きリーダと上向き帰還雷撃の進展様相をより詳細に再現することができた。落雷極性別の最終雷撃過程のパラメータを比較したところ、正極性落雷の雷撃距離が明らかに短いことを発見した。この結果より、負極性落雷に比べて、正極性落雷の事故の割合が高いことの一因を突き止めた。雷雲電界の計測実験では、実験期間中、実験場所を通過する雷雲が殆どなく、用意した電極の一つを試しに打ち上げたが、有意義なデータが取れなかった。一方で、雷雲電界の極性を識別できる電極形状を割り出すため、さまざまな形状の電極を試作し、多くの実内放電実験を行った。その結果、最適な電極形状を見出した。昨年度、観測場所で発生した雷雲の数が極端に少なかった。雷雲電界の計測実験を試みたが、有意義なデータが取れなかった。さらに本研究に協力してくれているフロリダ大学の研究者達の大型研究予算が打ち切られてしまって、雷雲電界計測の実験はフロリダでできなくなった。本研究で開発した落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機(LAPOS5)を用いて、フロリダ大学のロケット誘雷実験場で自然落雷の最終雷撃過程の観測を継続できた。ただし、今年度も昨年度と同様、観測サイトに落ちた落雷は極端に少なく、LAPOS5号機は1例のデータしか取得しなかった。一方、フロリダ大学のキャンパスの建物に設置したLAPOS3号機は3例のデータを取得した。これらのデータを解析したが、現時点では新しい知見が出ていない。これと並行して、過去のデータをより詳細的に解析し、本研究で提唱したステップドリーダのステップ形成モデルに枝分かれの形成要素を追加できた。

雷撃強弱とリーダ特性との相関をより高効率に調べるため、今までフロリダ大学に依存してきた雷3Dマッピングシステムを独自で完成した。岐阜の夏季雷を観測し、リーダの速度が高いほど、その後の雷撃が強いことを突き止めた。さらに、リーダに先行するpreliminary breakdown(PB)パルスも強い傾向が見られた。PBとリーダ放電を利用する雷撃の強弱を予測する可能性が示された。雷雲の電界計測では、当初予定していたフロリダ大学での実験をあきらめ、協力の約束を取り付けたアメリカのNational Severe Storms Laboratory(NSSL、暴風雨研究所、オクラホマ州にある)で行った。雷雲に本研究で開発した電界センサーを初めて複数個同時飛行させることに成功した。実験中のLMAデータがNSSLから提供され、現在解析されているところである。観測期間中、実験場所への落雷が極端に少なかった。本研究に協力してくれていたフロリダ大学の研究者達の研究予算が打ち切られていたため、雷雲電界計測実験がオクラホマ州に場所変更せざるを得なく、スケジュール的に遅くなってしまった。本研究で開発した落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機(LAPOS5)を用いて、フロリダ大学のロケット誘雷実験場で自然落雷の最終雷撃過程の観測を平成30年度8月までに継続できた。その後、該当機器を無事に日本に撤収し、日本の冬季雷の観測に使用し続けている。フロリダでの観測では10例の自然落雷のデータを記録した。過去のデータと突き合わせて解析を行い、ダートリーダーの進展特性を明らかにした。国際会議において、これらの成果について担当学生二人が発表を行い、高い評価を受けた。また、国際学会誌論文一篇掲載、一篇投稿中。岐阜の夏季雷の観測データをより詳細に解析することにより、帰還雷撃の強弱はリーダに先行するpreliminary breakdown(PB)パルスよりもリーダ進展との相関性が高いことが分かった。雷雲ごとに解析すると、この傾向はより顕著であることが分かった。これらの結果を基にして、強い落雷を発生する雷雲の電荷構造のモデルを提案することが出来た。この研究成果について国際学会誌論文一篇投稿中。雷雲に本研究で開発した電界センサーを複数個同時飛行させることに成功した。しかし、雷雲が弱いため、有意義な観測データを獲得することが出来なかった。昨年度完成した落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機をフロリダ大学ロケット誘雷実験場に設置し、本格的な観測を始める。昨年度フロリダ大学のロケット誘雷実験場に設置した落雷最終雷撃過程観測専用高速カメラシステム5号機(LAPOS5)による最終雷撃過程の観測を継続するとともに、雷雲電界の計測実験をアメリカからの協力者が期待できるオクラホマ州で実施する。今年度はより早くオクラホマ州で雷雲電界計測実験を行う。
イギリス・ロマン派詩人の土地・環境・自然意識-その生成・変貌・影響

'Deism'の実態を究明することで、啓蒙主義がロマン派の土地・環境・自然意識に及ぼした影響の歴史的意味を明らかにした。イギリス・ロマン主義運動の両面性[親・啓蒙主義的側面と脱・啓蒙主義的側面]ならびに、ロマン派の「想像力」論の出自と展開について新しい知見を付け加えた。イギリス・ロマン派への「自然宗教」の影響を検証することで、新しい視点[啓蒙主義の中のロマン主義、ロマン主義の中の啓蒙主義という重層的視点]からのロマン派の再評価が可能となった。○主として次の3点において、所期の成果をあげることができた。(1)ヨーロッパ啓蒙主義[科学的合理主義]思想(とりわけDeism=`Natural Religion')がロマン派の《土地・環境・自然》意識の誕生・形成において果たした役割を究明する。(2)イギリス・ロマン派第1世代から第2世代への、また第2世代からポスト・ロマン派への、《土地・環境・自然》観の変貌の原因・経緯を明示する。(3)ロマン派の《土地・環境・自然》意識が17世紀以降のヨーロッパ人文諸領域(芸術・文学、思想・哲学、神学、政治・経済学、環境・生態学等々)に接続可能な広がりと深度を持つ際だった文化現象であることを実証し、その歴史的[過去・現在・未来にわたる】意義を明らかにする。○具体的成果としては、(1)論文「Ode to aNightingale再考-ロマン派の『鳥』をめぐって」および(2)共著書『ロマンティック・エコロジーをめぐって』がある。(1)では、イギリス・ロマン派第1世代(特にワーズワスとコウルリッジ)の自然観に対する、キーツのアンビバレントな姿勢(共感と反機)に着目し、キーツの自然意識に潜む<現代性>を明らかにした。キーツの<現代性>とは、美化された自然への懐疑(自然を審美的観点からのみ捉えることの危険性への認識)に他ならない。(2)では、ワーズワスをケース・スタディーとして取り上げ、歴史的観点からイギリス・ロマン派の自然意識の定位を試みた。キリスト教(啓示宗教)への不信から出発し、理神論を経て汎神論・物活論に接近し、伝統宗教へと回帰していくワーズワスの精神遍歴は、そのまま近代から現代へと続く<文化現象>の縮図となっている。伝統宗教という回帰場所が用意されていたワーズワスとは異なり、ポスト・ロマン派には<自然>をめぐる思想上のさらなる模索と戦いが待っていることを指摘した。○主として次の3点において,所期の成果をあげることができた。(1)ヨーロッパ啓蒙主義[科学的合理主義]思想(とりわけDeism='Natural Religion')がロマン派の《土地、環境、自然》意識の誕生、形成において果たした役割を究明する。(2)イギリス、ロマン派第1世代から第2世代への,また第2世代からポスト、ロマン派への,《土地、環境、自然》観の変貌の原因、経緯を明示する。(3)ロマン派の《土地、環境、自然》意識が17世紀以降のヨーロッパ人文諸領域(芸術、文学,思想、哲学,神学,政治、経済学,環境、生態学等々)に接続可能な広がりと深度を持つ際だった文化現象であることを実証し,その歴史的[過去、現在、未来にわたる]意義を明らかにする。○具体的成果としては,論文「キーツとワーズワス-ワーズワスの1815年版『詩集』をめぐって」がある。この論文では,1815年版『詩集』に見られるワーズワスの思想・信仰-上の両面性(異教精神とキリスート教信仰に着目し、この両面性に対するキーツの反応を検証するところから、ふたりの詩人の自然観の異同を明らかにした。キーツとワーズワスの交際が始まった1817年から1818年にかけての冬.皮肉なことに,ふたりの詩境ほ正友は対の方向に向かうベクトルを内包していた-キーツは無神論的不可知論へ、ワーズワスは伝統的キリスト教へと。相反する方向への詩人たちの出立を促した大きな要因は,共通して,<自然の癒し>への不満と懐疑であった。弟の水難死を直接の契機として「自然」の猛威を思い知らされたワーズワス(理神論的汎神論からの脱却をめざすワーズワス)には、傷ついた自然愛をキリスト教信仰に接続するみちがまだ残されていた。だが信仰を持たぬキーツの場合,自然界のもひとつの姿-弱肉強食の世界-は彼から心の平安を奪ってしまう。この点にキーツの近現代性が窺える。○主として次の4点において、所期の成果をあげることができた。(1)ヨーロッパ啓蒙主義思想がロマン派の《土地・環境・自然》意識の誕生・形成において果たした役割を究明する。(2)ロマン派の《土地・環境・自然》意識が17世紀以降のヨーロッパ人文諸領域(芸術・文学・思想・哲学、神学、政治・経済学、環境・生態学等々)に接続可能な広がりと深度を持つ文化現象であることを実証し、その歴史的意義を明らかにする。

(3)イギリス・ロマン派の《土地・環境・自然》意識が現代に及ぼした具体的影響を検証し、その歴史的な意義と価値を提示する。(4)イギリス・ロマン派第1世代から第2世代への、また第2世代からポスト・ロマン派への、《土地・環境・自然》観の変貌の原因・経緯を明示する。その際に、変質しなかった部分にも注目する。○具体的成果としては、論文「『ギリシア古壺のオード』における<話者>」がある。この論文では、古代の視覚芸術の美の規範から言えば美しくないキーツのオード(近代の言語芸術)がなぜ美しい作品として読めるのか、という問題を解明した。オードの腹話術的構造とポリフォニーを生み出す、キーツの“Negative Capability"にその答えは求められる。「美は真なり。真は美なり。」という、壺のプラトン主義的言説は、作品の多声構造によって相対化される。その結果、壺の託宣は、その真偽を読み手/聞き手の判断に委ねる形(open-endedness)で読者に提示される。そこには古典的な美の規範とは異なる、近・現代の-ポスト・ロマン主義の-言語芸術の<美しさ>がたしかに認められる。
Erk5シグナルによる内軟骨性骨化制御機構

軟骨無形成症は長管骨の成長障害をきたす難病のうちでも最も頻度が高い疾患であり、FGFR3遺伝子の点変異が原因であると考えられている。これまでの研究では間葉系幹細胞特異的Erk5欠損マウスの表現型がFGFR3欠損マウスの表現型と高い類似性があることを見出した。そこで本研究課題では、Erk5シグナルによる内軟骨性骨化の制御メカニズムについて明らかにする。Erk5欠損マウスの表現型を詳細に解析した結果、Erk5欠損マウスでは、Smurf2、Smad1のリン酸化が低下し、Smadのユビキチン化と分解が抑制されることで、Sox9タンパク質の過剰な発現により骨格形成に異常を起こす可能性が示唆された。軟骨無形性症は長管骨の成長障害をきたす難病のうちで最も頻度が高い疾患であり、FGFR3遺伝子の点変異が原因であると考えられている。そこで本研究課題では、1Erk5シグナルによる内軟骨性骨化の制御メカニズムについて明らかにし、2FGFR3とErk5のシグナルクロストークが軟骨無形成症の発症、進展においてどのくらい重要であるかを明らかにすることを目的とする。本年度は間葉系幹細胞特異的Erk5欠損マウスの詳細な表現型の解析、Erk5シグナル下流遺伝子の同定とその軟骨細胞での機能解析を行った。骨格形成におけるErk5の重要性を検討するため、胎児骨格標本を作製し観察した。その結果、Erk5欠損マウスでは頭蓋冠の形成不全、四肢の長管骨の肥大、指の骨の骨化不全が観察された。また、Erk5欠損マウスの表現型のメカニズムをin vitroで検討するため、Erk5欠損細胞において変化が見られる骨格形成関連遺伝子の網羅的解析を行った。その結果、Sox9のmRNAとタンパク質の発現上昇、Smad1/2/3とSmurf2のタンパク質発現が上昇していた。また、Erk5はリン酸化キナーゼであるため、変化の見られた各タンパク質と、Erk5をin vitro kinase assayにより反応させ、Erk5の基質となるかを検討した。その結果、各タンパク質の中でSmad1、Smurf2リン酸化が上昇し、Erk5の基質となる可能性が示唆された。Smurf2、Smad1はSox9上流に存在する因子であり、Sox9は骨格形成に必須の因子であることから、以上の結果よりErk5欠損マウスではSmurf2、Smad1を介したSox9発現の異常により、骨格形成に異常を起こす可能性が示唆された。間葉系幹細胞特異的Erk5欠損マウスの骨表現型の異常を詳細に解析することができた。また、Erk5下流のシグナルとして、Smad1、Smurf2をErk5の基質として同定することができ、これをもとにしてErk5欠損マウスの骨表現型を回復させる因子の候補を同定することができた。また、Erk5欠損マウスに骨関節疾患モデルを適用する実験では、複数のモデルを適用し、病態に変化があるかを観察することができた。これらの成果は当初計画していた予定を大きく超えた成果であり、研究課題は順調に進展しているといえる。しかし、2年目の研究計画に予定していた軟骨無形性症患者由来iPS細胞や、FOP患者由来iPS細胞を1年目に入手する予定であったが、RIKEN cell bankからの入手が遅れており、2年目の実験を着手できていないのが現状である。そのため、iPS細胞を用いた実験は一時的に保留しており、その他の実験を優先している。これらの状況を鑑みて本研究課題の進捗状況を(2)と判断した。本年度では間葉系幹細胞特異的Erk5欠損マウスの表現型を回復させる因子の探索と、Erk5下流のシグナルを調節することによる表現型の回復を検討した。Erk5欠損マウスの表現型を回復させるため、Sox9fl/+を導入したマウスをレスキューマウスとして、胎児骨格標本を作製し観察した。その結果、Erk5欠損マウスの表現型の一部である、指の骨の骨化不全がレスキューマウスでは回復することが観察された。また、Erk5欠損マウスの表現型のメカニズムをin vitroで検討するため、前年度で変化の見られた因子についてより詳細な解析を行った。その結果、Erk5欠損細胞ではSmad1、Smurf2タンパク質のリン酸化が低下していた。また、Smad1タンパク質のユビキチン化と分解が抑制されており、Sox9プロモーター上へのSmadのリクルートが上昇していることが示唆された。以上の結果より、Erk5欠損マウスでは、Smurf2、Smad1のリン酸化が低下することにより、Smadのユビキチン化と分解が抑制されることで、Sox9タンパク質の過剰な発現により骨格形成に異常を起こす可能性が示唆された。

軟骨無形成症は長管骨の成長障害をきたす難病のうちでも最も頻度が高い疾患であり、FGFR3遺伝子の点変異が原因であると考えられている。これまでの研究では間葉系幹細胞特異的Erk5欠損マウスの表現型がFGFR3欠損マウスの表現型と高い類似性があることを見出した。そこで本研究課題では、Erk5シグナルによる内軟骨性骨化の制御メカニズムについて明らかにする。Erk5欠損マウスの表現型を詳細に解析した結果、Erk5欠損マウスでは、Smurf2、Smad1のリン酸化が低下し、Smadのユビキチン化と分解が抑制されることで、Sox9タンパク質の過剰な発現により骨格形成に異常を起こす可能性が示唆された。今後はiPS細胞の入手が遅れているため、それ他の実験を優先して行う。Erk5欠損マウスの表現型を回復させる因子の候補を発見したので、これをErk5欠損マウスに導入し、表現型の回復が実際に行われるのかを検討する予定である。骨関節疾患モデルを適用したErk5欠損マウスにもこれらの因子を導入し、病態が回復するかを検討する。また、上述のように軟骨無形性症の原因の一つとしてFGFR3の点変異による活性化が報告されている。間葉系幹細胞特異的Erk5欠損マウスの表現型はFGFR3欠損マウスの表現型と類似しているため、Erk5とFGFR3のシグナルクロストークを解析する。間葉系幹細胞にFGFR3活性化型を導入した、軟骨無形性症モデル細胞を作成し、Erk5の活性化の状態を測定する。また、作製したFGFR3変異細胞にErk5阻害剤、Erk5活性化型、不活性化型変異体を導入し、軟骨細胞への分化の異常が回復するかを検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。骨格形成29年度が最終年度であるため、記入しない。
中央ユーラシア諸民族の文化基層に関する国際比較研究

本研究でいう中央ユーラシアとは,乾燥内陸アジアを中心とし,それに中国東北部を加えた地域をいう。この地域の住民は,現在の中国領域内でいえば,固有の特色をもった三地域すなわち東北地区・内蒙古自治区・新疆ウイグル自治区という行政区間のもとに、また旧ソ連領中央アジア地域でいえば,1991年から独立したウズベキスタン・カザフスタン・キルギズスタン・タジキスタン・トゥルクメニスタンという5カ国のもとに,それなりの帰属意識をもって暮らしている。しかし,それぞれの地域はいずれも多民族社会である。それぞれの住民のもつ「国家」への帰属意識と,「民族」や「歴史的伝統文化」および「宗教」への帰属意識ないし現状認識とは,共有される場合もあるし,矛盾する場合もある。こうした現状の中で,生活の具体的場面に視点を置きつつ,それぞれの地域・国家における「文化基層」の実態について調査研究をおこなった結果,さしあたって以下に述べるような分析成果と総合的知見を得た。【民族意識と国家意識について】トルコ系住民が今や政治面でも主流をしめるウズベキスタンなどにおいては,政府機関および知識人の間で新生国家としての自覚が高まる現象の中で,民族の歴史文化遺産の保護や再認識がすすみ,旧ロシア帝国やソ連などへの反発が強調されたり,新たな中央アジア統合へむけてかつてのティム-ル帝国の歴史的意義がとりあげられたりしている。しかし,そのような動きは,中央アジア諸国が歩調をあわせているわけではなく,一国内の民族問題もまさに現在進行形である。新疆ウイグル自治区の同系民族との連関は今のところ薄く,中国「国家」の枠組みの存在感は大きい。このことは中国内の諸少数民族の中でも同様であり,かれらは絶対多数の漢族を強く意識せざるをえず,少数民族地域への漢族流入は文化的な漢化現象を表出させている。このことは,メンタリティの面で,また地域の自然資源をめぐって,新たな民族意識の形成を促すことも予測されるであろう。【宗教意識について】ウズベキスタン独立後の情勢はイスラーム復興への関心を高めさせている。いわゆる「原理主義」派の日常宗教活動や,一般民衆レベルにおける聖者廟参詣などの活動も含め,歴史的に深い文化基層をなすイスラームの社会的影響は息づいている。この点,基本的な態様は新疆においても同様に指摘できるが,新疆の場合,宗教活動はかなり個人レベルに限定される側面が強く,それも民族や生業形態によって差異がみられる。回族のイスラーム日常活動は独自性を強調する傾向があり,最近の改革・開放政策の結果,ある程度自由度が増したアホンなどの教育と移動は,あらたなイスラーム活動の原点を形成しつつあるように見受けられる。一方、中国におけるチベット仏教・仏教・儒教・道教,とりわけ後三者は純粋な宗教的活動現象よりもむしろ民衆の新たな現世利益追究と文化保護政策とに基づく復興という要素が注目される。以上の諸現象には,それぞれ民族意識が付随する側面もある。【史跡・文献について】新生国家であるウズベキスタン・カザフスタンと,「大領域国家」かつ「多民族国家」でありつづけようとする中国とでは,その基本的イデアにニュアンスの差異があるとしても,各々の歴史的文化遺跡や,遺産としての文献の発掘・保護・研究については盛んなものがある。調査にあたっても数多くの新知見の集積成果を得たが,しかし,どこを見ても現状の経済状況の発展に社会全体の意識が集中しているため,体勢向上を保証する財政的裏づけは決定的に不足している。【総括】遊牧・農耕都市・流通経済など,住民の生業に関する比較調査からも確認された中央ユーラシアの基本的な生業要素は,歴史上の流れに沿うものである。しかし,人口増加を伴う都市化の進展と,その農村・牧畜区への影響は無視できない。また,内陸部における国際経済流通は,公のもの以外に私的貿易を核として,人の移動を伴いながら非常に活発化している。この二つの大きな変容は,上記のイスラームをはじめとする宗教・民族の意識とあいまって,中央ユーラシアの住民を活性化すると同時に,従来にもまして多極的な中央ユーラシア像を予測させるものである。

新疆ウイグル自治区の同系民族との連関は今のところ薄く,中国「国家」の枠組みの存在感は大きい。このことは中国内の諸少数民族の中でも同様であり,かれらは絶対多数の漢族を強く意識せざるをえず,少数民族地域への漢族流入は文化的な漢化現象を表出させている。このことは,メンタリティの面で,また地域の自然資源をめぐって,新たな民族意識の形成を促すことも予測されるであろう。【宗教意識について】ウズベキスタン独立後の情勢はイスラーム復興への関心を高めさせている。いわゆる「原理主義」派の日常宗教活動や,一般民衆レベルにおける聖者廟参詣などの活動も含め,歴史的に深い文化基層をなすイスラームの社会的影響は息づいている。この点,基本的な態様は新疆においても同様に指摘できるが,新疆の場合,宗教活動はかなり個人レベルに限定される側面が強く,それも民族や生業形態によって差異がみられる。回族のイスラーム日常活動は独自性を強調する傾向があり,最近の改革・開放政策の結果,ある程度自由度が増したアホンなどの教育と移動は,あらたなイスラーム活動の原点を形成しつつあるように見受けられる。一方、中国におけるチベット仏教・仏教・儒教・道教,とりわけ後三者は純粋な宗教的活動現象よりもむしろ民衆の新たな現世利益追究と文化保護政策とに基づく復興という要素が注目される。以上の諸現象には,それぞれ民族意識が付随する側面もある。【史跡・文献について】新生国家であるウズベキスタン・カザフスタンと,「大領域国家」かつ「多民族国家」でありつづけようとする中国とでは,その基本的イデアにニュアンスの差異があるとしても,各々の歴史的文化遺跡や,遺産としての文献の発掘・保護・研究については盛んなものがある。調査にあたっても数多くの新知見の集積成果を得たが,しかし,どこを見ても現状の経済状況の発展に社会全体の意識が集中しているため,体勢向上を保証する財政的裏づけは決定的に不足している。【総括】遊牧・農耕都市・流通経済など,住民の生業に関する比較調査からも確認された中央ユーラシアの基本的な生業要素は,歴史上の流れに沿うものである。しかし,人口増加を伴う都市化の進展と,その農村・牧畜区への影響は無視できない。また,内陸部における国際経済流通は,公のもの以外に私的貿易を核として,人の移動を伴いながら非常に活発化している。この二つの大きな変容は,上記のイスラームをはじめとする宗教・民族の意識とあいまって,中央ユーラシアの住民を活性化すると同時に,従来にもまして多極的な中央ユーラシア像を予測させるものである。本計画の初年度は,中国のなかで,中央ユーラシアを構成する三地域を調査の対象とした。それは,東からみて,東北地区(黒龍江省・遼寧省),内蒙古自治区,新疆維吾爾自治区である。それぞれは古代以来の大きな歴史・文化の流れからみれば地理的・民族構成面で連続する側面をもつ一方,中世期以後の民族移動や近現代の国際環境の変化により,民族分布・宗教・言語の流動性が限定され,現在の中国領域内の固有の特色をもった三地域となった。調査の際には,歴史的文化遺産と現実社会との関連に注意をはらった。
べん毛モーター膜蛋白質の大量精製と結晶化の検討

海洋性ビブリオ菌の極に生えているべん毛(極べん毛)はNa^+の流入によって回転する分子機械である。その回転力発生には、モーター蛋白質と呼ばれる4つの蛋白質PomA、PomB、MotX、MotYが関わっている。PomAは4つの膜貫通領域(TM1-4)をもっており、PomBと複合体となってNa^+チャネルを形成する。PomBは一つの膜貫通領域を持ち、そこにはNa^+の流入に重要なAspが存在する。本年度においては,ジスルフィド架橋したPomA/PomB複合体を部分精製し、その超複合体形成を解析した。最初に、D170C(TM3)変異のPomAと、ヒスチジンタグを持つPomBでS38C変異株を作製した。続いて、このPomA-D170C/PomB-S38C-Hisを含む膜画分から、オクチルグルコシドで可溶化してPomA/PomB複合体を部分精製し、ゲルろ過クロマトグラフィーとジスルフィド結合の解離実験から架橋産物の構成を調べた。その結果、ジスルフィド架橋の有無に関わらず、複合体を部分精製できたことが明らかになった。これら3つの架橋産物はいずれも、230440kDa付近に溶出された。また、PomBのみからなる約200kDaの架橋産物が確認され、PomA/PomB複合体がこれまで考えていた以上の大きな複合体を形成する可能性を示した。加えて、ジスルフィド結合の解離実験からも、単純に1PomA:1PomBから構成されない異なる性質を持つ架橋産物の存在が考えられた。以上の結果は、共にPomAとPomBによる複雑な複合体形成を示唆し、これらをいかに精製するかという方向性を決める上でも,結晶構造解析に結びつけていく上でも重要なデータとして位置づけられる.Vibrio alginolyticusの極毛モーターはNa^+駆動型で、菌体内外のNa^+の電気化学ポテンシャル差を利用して回転力を発生し。このモーターのトルク発生に必須の構成因子として、PomA、PomB、MotX、MotYが同定されている。我々は、PomA/B複合体及びPomAの精製とこれらのプロテオリポソーム中への再構成を行った。この際、界面活性剤としてβ-octylglucosideを用い、PomAのN末端に付加したヒスチジンタグを利用して精製を行った。しかし今回、過去と同様の方法で何度か精製を試みたところ、複合体の回収率が非常に低いことが判明した。また、PomBのC末端にヒスチジンタグを付加しPomA/B-His_6を発現する系で精製を試みたところ、PomBを高純度で回収することができたが、PomAの回収率は非常に低く、複合体は得られなかった。そこで、PomA/B複合体をより効率よく精製するために、使用する界面活性剤の検討を含め、精製系の再検討を行った。いくつかの界面活性剤でPomAB複合体の安定性を再検討したところ、Sucrose monocaprateを用いると、これまで用いてきたβ-octylglucosideに比べPomAとPomBの解離が少ないことが分かった。そこで、Sucrose monocaprateを用いてPomA/B-His_6を発現する系での精製を試みた。その結果、supeose6カラムでのゲル濾過で、マーカーであるチオグロブリンより早い約900kDaに対応する位置に溶出されるPomA/B複合体と推定されるデータを得ることができた。このフラクションを再分離しても、再び、同じ位置に溶出されることから、ここで得た複合体は安定した構造体であると考えられる。また、PomB単独でも約260kDaに対応する位置に溶出された。以上のことから、これまでに考えられていた以上に大きな複合体をPomAとPomBが形成する可能性が示唆された。これを補足する意味で、複合体をショ糖密度勾配遠心法で分離した結果、この複合体が巨大な見かけの分子量をもつ構造体であることを確認した。

また、PomBのみからなる約200kDaの架橋産物が確認され、PomA/PomB複合体がこれまで考えていた以上の大きな複合体を形成する可能性を示した。加えて、ジスルフィド結合の解離実験からも、単純に1PomA:1PomBから構成されない異なる性質を持つ架橋産物の存在が考えられた。以上の結果は、共にPomAとPomBによる複雑な複合体形成を示唆し、これらをいかに精製するかという方向性を決める上でも,結晶構造解析に結びつけていく上でも重要なデータとして位置づけられる.
放射線誘発口腔粘膜炎に対するバルプロ酸ナトリウムの有用性および安全性に関する研究

【研究目的】がん放射線治療により生じる口内炎は重篤で患者のQOLを大きく低下させるにも関わらず、現在のところ有効な治療薬剤はなく、臨床では局所麻酔や鎮痛・抗炎症薬による対症療法が行われているに過ぎないことから、口腔粘膜炎用薬の開発・開拓が望まれている。近年、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤が後天的な遺伝作用をもたらすことで、放射線によるDNAの損傷を防護することが報告された。これまでに我々は、放射線誘発口腔粘膜炎に対してバルプロ酸ナトリウムが改善作用をことを確認しており、本研究ではさらに詳細な作用機序および安全性について検討を行った。【方法】6週齢の雄性シリアンハムスターのチークポーチに放射線単回照射(30Gy)を行うことで口内炎を発症させた。バルプロ酸ナトリウム(600mg/kg)は放射線照射30分後に腹腔内投与し、頬袋のサンプリングを照射後14日目に行った。作用機序はPCR法により各種遺伝子の発現を評価した。また、安全性の確認として、ヒト舌扁平上皮がん細胞を用いて細胞増殖能を評価した。【結果・考察】バルプロ酸ナトリウム600mg/kgの投与により、β-cateninの発現上昇およびTGF-βの発現抑制が認められた。一方でNF-κbの発現には影響を与えなかった。上記のことから、バルプロ酸ナトリウムによる口腔粘膜炎改善作用はWnt/β-cateninシグナリングの亢進による粘膜修復作用やTGF-βの発現抑制による細胞死の抑制が関与することが示唆された。また、ヒト舌扁平上皮がん細胞に対してはlmM以上の濃度で放射線増感作用を示すことが明らかとなった。本研究によりバルプロ酸ナトリウムは口腔がん細胞に対して悪影響を与えることなく口内炎予防・軽減作用を示すことが明らかとなった。このことによりバルプロ酸ナトリウムは放射線誘発口内炎の予防薬として、有用かつ安全である可能性が示唆された。
鳥類精子における膜ラフトマイクロドメインを介した先体反応制御機構の解明

鳥類精子において膜ラフトの機能性解析を通じて先体反応機構分子基盤の解明に取り組み、以下の知見を得ている。1.鳥類精子膜ラフトに存在し、内卵膜との結合を仲介すると思われる新規60KDaタンパク質の分離に成功し、プロテオーム解析に供した結果、いくつかの候補と共に同定に成功した。現在、特異的抗体の作成を進めている。2.ニワトリ精子の先体部分から特異的に分離精製したタンパク質分子群の網羅的同定を行い、哺乳類精子の先体タンパク質群との共通性と特異性が示された。現在特異的抗体を作製中である。3.先体反応能力と鞭毛運動性の関係性を調べるため、先体反応をAMPK経路で促進するグルコースの鞭毛運動プロファイルに及ぼす影響を調べた。その結果、少なくとも鞭毛の振幅頻度に影響を及ぼさないことが分かった。データの一部はBiology of Reproductionにアクセプトされた。4.内卵黄膜への精子の結合がカルシウム動態に及ぼす影響を調べた。その結果、精子細胞内カルシウムは結合後直ちに著しく増加すること、また複数のチャンネルが関わっている可能性が明らかになった。網羅的定量的プロテオミクスを用いて先体反応機構に関わる分子群のスクリーニングが終わり、膜ラフトを起点とする先体反応関連分子は数種に絞り込まれた。今後、特異的抗体の作成が終われば、分子基盤の同定が加速することが期待出来る。コーネル大学において:1.卵膜結合性60KDaタンパクのレセプターの同定と結合メカニズムの解明をプロテオミクスと組換えタンパク作成を通じて進める。2.高解像共焦点レーザー顕微鏡を使い、1細胞レベルで内卵黄膜によるカルシウム動態特性を視覚化する。筑波大学において:1.抗体を使った先体反応関連分子の局在発現特性を調べる。また、組換えタンパクで免役した家禽で受精試験を行う。2.鞭毛運動の制御に関わる代謝メカニズムの解明とその先体反応における役割を精子運動解析システムで調べる。内定年度:2017鳥類精子において膜ラフトの機能性解析を通じて先体反応機構分子基盤の解明に取り組み、以下の知見を得ている。
トランプ政権下アメリカの対テロ・犯罪政策とマイノリティ市民の自由に及ぼす影響

本研究は、2001年9月11日の同時多発テロ事件以降のアメリカ合衆国を対象とし、人種的・宗教的な警察取締り政策(特にニューヨーク市およびニューヨーク市警察本部〔NYPD〕の政策。レイシャル・プロファイリングと呼ばれることがある)の憲法上の問題点を考察することを主眼とするものである。本研究では、テロの未然予防を目的とする取締り・監視政策がアラブ系・南アジア系市民の市民的自由に与えるダメージの実態を精査し、治安維持に偏重した施策や組織のあり方を批判的に検討する。また、特に地域コミュニティと警察活動との関係に注目し、トランプ政権下で一層社会的分断の進むアメリカ社会の変動を観察しかつ分析する。
エストロゲン欠乏によりヒト気道上皮細胞において発現変化をきたす遺伝子の網羅探索

非結核性抗酸菌感染によって起きるNTM症、特に肺MACが近年増加している。肺に器質的障害を持たない痩身の中高年の女性例に多い気管支拡張型は、閉経後に発症する場合が多く、女性ホルモンの欠乏が病態に関連する可能性が考えられる。本研究は、女性由来の不死化ヒト気道上皮細胞株HBE1と我々が保有する手術検体由来のヒト初代培養気道上皮細胞を用いて、エストロゲンの合成、代謝や作用に関わる遺伝子の遺伝型を考慮した上で、エストロゲンの有無による遺伝子発現の違いを網羅的mRNA発現解析により解析する。本研究により見出された遺伝子、パスウェイは、中高年女性の肺MACの病態に関わる遺伝子の候補となると考えられる。
事象関連脳電位を指標とした脳卒中患者の立位における予測的姿勢制御能評価基準の構築

本研究の目的は、高齢の脳血管障害患者における立位での予測的姿勢制御能を、運動準備と感覚情報に対する予測的注意に関わる脳活動を反映する事象関連脳電位(ERP)をもとに、非侵襲的かつ短時間で評価するための基準を確立することであった。臨床現場において、患者の脳機能が変化したかどうかは、パフォーマンスの変化を通じて推察されるにとどまっている。事象関連脳電位のひとつである随伴陰性変動)(CNV)のピーク潜時・振幅は運動準備および反応刺激に対する予測的注意に関わる脳活動の指標である。これと姿勢制御のための筋活動の記録が簡便に行うことができれば、臨床現場において脳卒中発症後の脳活動の変化を評価し、それに基づくリハビリテーションの効果判定をするうえで有用であると考えられる。実験では、立位での上肢運動課題を次の2つの被験者群に遂行させることとした:1健康な高齢者50名、2脳血管障害の既往を有する高齢者(健康な高齢者と年齢および性別を合わせる)50名。記録されたCNVのピーク潜時・振幅と下肢・体幹の筋活動タイミング・量の対応関係、および臨床研究で用いられる一般的な運動機能指標(Fugl-Meyer assessment、Berg balance scale)との対応関係を明らかにすることで、CNVを指標とする評価の妥当性を示すこととした。1では被験者の募集が計画通りとならず3名の地域在住の高齢者の測定のみとなった。その被験者らでは、CNVの振幅は、若年成人を対象として記録されたものよりも低く(3名中3名)、CNVが認められ難い者もいた(3名中2名)。姿勢筋活動については、上肢運動開始時点に先行する下腿三等筋の活動が不明瞭であった。本研究の実施上の課題として、被験者の確保以外には、筋電図と脳波を正確かつ短時間で記録するための電極選定およびその装着手順の簡素化があげられる。
ゲノムインプリントを受けた染色体領域のクロマチン凝縮の解析

マイス第7染色体上のZfp127/Snrpn領域とマウス第17染色体上のIgf2r領域の発現アレル/非発現アレル間のクロマチン凝縮度の違いを測定した。マウス正常肝より得られた細胞核を超音波破砕後、ショ糖密度勾配を用いて遠心し、ヘテロクロマチンまたはユウクロマチンに富む分画に分けた後、アレル特異的凝縮度を比較検討した。F1マウス(C57BL/6×MSM)とその逆交配F1マウス(MSM×C57BL/6)の両マウスでIgf2r領域の非転写アレルは転写アレルに比べクロマチン凝縮度は高かった。この結果は、ゲノムインプリンティング機構と両アレル間のクロマチン凝縮度の違いに強い関係があることを示している。一方、Zfp127/Snrpn領域では、F1マウス(C57BL/6×MSM)ではIgf2r領域の場合と同様に、非転写アレルは転写アレルに比べ、クロマチン凝縮度は高かったが、その逆交配F1マウス(MSMXC57BL/6)では両アレル間凝縮度に差を認めなかった。この領域についてのコンジェニックマウスでも逆交配F1マウスではやはり両アレル間でクロマチン凝縮度に差を認めなかった。以上の結果は、germ lineを通じて受け継がれるBlueprintによって、ゲノムインプリンティング領域を構成するドメインのクロマチン凝縮度の違いが生じ、安定に維持されていることを示している。クロマチン凝縮測定法(H/Eアッセイ法)を用い、13年度はRit1がん抑制遺伝子領域の染色体凝縮度を検討した。マウス放射線誘発胸腺リンパ腫でRit1遺伝子のエクソン2とエクソン3の領域に高頻度のHomozygous deletionを示す。そこで、BALB/cマウスの胸腺、脳および肝臓からヘテロおよびユウクロマチンを分画し、Rit1近傍領域のクロマチン凝縮度を調べた。胸腺および脳では、Rit1近傍から広範囲にわたってユウクロマチン優位のゆるい濃縮度を示したが、肝臓ではRit1近傍はユウクロマチン優位であり、内部欠失領域から離れるに従ってヘテロクロマチン優位のつよい凝縮度を示した。この結果から、臓器特異的な発現と染色体凝縮度との関連性が示唆された。ゲノムインプリンティングは生殖細胞(配偶子)において染色体上の特定の領域に性特異的なマーク(インプリント)がなされ、親特異的な発現、非発現をもたらすエピジェネティックな現象である。我々は細胞核を超音波破砕後遠心するクロマチン分画法と多型マーカー/PCR法を組み合わせた方法を開発し、ゲノムインプリンティング領域の両アレル間でのクロマチン凝縮度の違いを比較検討した。第17染色体上のIgf2-receptor領域では、C57BL6×MSMとMSM×C57BL6のF1マウスでは雄雌の交配に関わらず、父方アレル(非発現アレル)がより凝縮していた。また、第17染色体のみB6/MS MのF1パターンを示すコンジェニックマウスでも同様の結果を示し、本assay法によるアレル特異的なシグナルの強弱が、F1マウス作製時の交配の影響によるものではなく、アレル間のクロマチン凝縮度の違いを反映するものでることが確認された。

第7染色体上のPrader-Willi症候群領域ではC57BL6×MSMマウス、Chr.7 Congenic mouse:C57BL/6.MSM-Chr.7(D7Mit21-D7Mit362)b6/msmともに母方アレル(非発現アレル)がより凝縮していた。しかし、逆に交配させたMSM×C57BL6マウス、Chr.7 Congenic mouse:C57BL/6.MSMChr.7(D7Mit21-D7Mit362)msm/b6ではともに、両アレル間に凝縮度の違いは認めなかった。なお、ゲノムインプリントを受けない周辺の遺伝子領域でも、両アレル間でクロマチン凝縮度に差を認めなかった。以上より、ゲノムインプリント機構にクロマチン凝縮が関与することが示された。マウス第7染色体上のZfp127/Snrpn領域とマウス第17染色体上のIgf2r領域の発現アレル/非発現アレル間のクロマチン凝縮度の違いを測定した。マウス正常肝より得られた細胞核を超音波破砕後、ショ糖密度勾配を用いて遠心し、ヘテロクロマチンまたはユウクロマチンに富む分画に分けるクロマチン分画法と多型マーカー/PCR法を組み合わせたアレル特異的凝縮度測定法を用いて、比較検討した。F1マウス(C57BL/6×MSM)とその逆交配F1マウス(MSM×C57BL/6)の両マウスで、Igf2r領域の非転写アレルは転写アレルに比ベクロマチン凝縮度は高かった。一方、Igf2r遺伝子近傍のゲノムインプリントを受けないSod-2遺伝子領域では両アレル間のクロマチン凝縮度に差を認めなかった。この領域についてのコンジェニックマウスで1も、やはり同様の結果が得られた。このことは、ゲノムインプリンティング機構と両アレル間のクロマチン凝縮度の違いに強い関係があることを示している。一方、Zfp127/Snrpn領域では、F1マウス(C57BL/6×MSM)ではIgf2r領域の場合と同様に、非転写アレルは転写アレルに比べ、クロマチン凝縮度は高かったが、その逆交配F1マウス(MSM×C57BL/6)では両アレル間で凝縮度に差を認めなかった。この領域についてのコンジェニックマウスでも逆交配F1マウスではやはり両アレル間でクロマチン凝縮度に差を認めなかった。以上の結果は、germ lineを通じて受け継がれるBlueprintによって、ゲノムインプリンティング領域を構成するドメインのクロマチン凝縮度の違いが生じ、安定に維持されていることを示している。ゲノムインプリントされる染色体領域の凝縮度を比較測定するために開発した、クロマチン凝縮測定法(H/Eアッセイ法)を用い、本年度はRit1がん抑制遺伝子領域の染色体凝縮度を検討した。マウス放射線誘発胸腺リンパ腫でRit1は高頻度のHomozygous deletionを示す。この欠失した領域を測定すると、Rit1遺伝子のエクソン2とエクソン3の領域に限定されている例が多数見られる。すなわち、20-50kb領域の内部欠失が起こっている。この結果から、欠失領域は核内でループ構造をとり、再結合する配列はループの根本で接近し、しかも開かれたクロマチン構造をとっていると想像される。そこで、BALB/cマウスの胸腺、脳および肝臓から核を分離し、その核分画を超音波処理し、ヘテロおよびユウクロマチンに分画した。