hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規遺伝子増幅法を用いた発がん関連遺伝子検出システムの構築

EGFR-1及びKRAS遺伝子の変異検出システムを構築し、口腔細胞診検体を用いてこれら遺伝子変異の検出を試みた。それぞれの遺伝子変異に対してプライマーを設計し、数種の細胞株を用いて遺伝子変異の検出を行った。その結果、約20分で遺伝子変異の検出が可能であった。口腔細胞診検体を用いたところ、明らかな変異は検出できなかった。細胞株の数や条件を調整して同様に実験したところ、少量の細胞(10-100個)から上記遺伝子変異が検出された。以上から口腔細胞診検体にはこれらの遺伝子の変異陽性症例が少ないか、あるいは角化細胞からの検出が困難と推測された。細胞診検体から核酸(DNAおよびRNA)を抽出し、遺伝子増幅に用いるまでそれぞれを保存した。蛍光によるloop mediated isothermal amplification(LAMP)法の検出システムをチェックするために、がん遺伝子Xの既知の突然変異ホットスポットに対してプライマーを試作し、最終的に基本プライマー4種に加えループプライマー1種を設計した。培養細胞(前述の遺伝子Xに既知の遺伝子変異を持つ)から得られたDNAを元にIsothermal Master Mix(ニッポンジーン社)を用いてLAMP反応溶液を調整し、Genie II(等温増幅蛍光測定装置、OptiGene社)によりLAMP増幅反応の検出を行ったところ、約20分で遺伝子変異の検出が可能であった。従来より用いている等温増幅濁度測定装置では検出までに約40分を要しており、本システムによる遺伝子変異の検出が感度に優れていると考えられた。本研究では、発がんや薬剤の奏功率に関わる遺伝子変異(塩基配列の異常)を迅速に検出する技術を開発することを企画した。本法は、新規の核酸増幅技術である、loop-mediated isothermal amplification(LAMP)を元にしている。LAMP法は、従来から利用されているPCR法と比較して、短時間に特異性の高い核酸増幅が可能である。本法はLAMP法の反応液に加えて、ターゲットとするがん遺伝子が野生型である場合にLAMP反応を阻害する物質を添加することで、EGFR遺伝子の変異を検出する方法であるがん遺伝子である上皮成長因子受容体(EGFR)の一部に変異がある場合は、EGFRチロシンリン酸化阻害剤(ゲフィチニブ、エルロチニブ)の奏功率が高いことが知られている。この領域に対する特異プライマーを設計した。遺伝子増幅とその検出には、OptiGene社のGenie IIを用いた。検体は、EGFR遺伝子に変異が生じていることが知られているがん細胞(変異株)4種と、変異の起きていない細胞株(野生株)3種について検索した。それぞれの細胞からDNAを抽出・精製した。また、細胞から得られた粗抽出液を作製した。DNAおよび粗抽出液を検体として、1検体につき、本法と通常のLAMP法のそれぞれを行った。その結果、DNAを鋳型に用いた場合、EGFR変異株では本法とLAMP法では遺伝子が増幅されるに要した時間はどちらも15分程度であった。一方で、EGFR野生株では、本法では遺伝子増幅が有意に抑制され、遺伝子増幅までに45分程度を要したが、LAMP法で遺伝子増幅に要した時間は15分程度と変異株と同程度の時間で検出された。粗抽出液を用いて検討した結果、遺伝子増幅に要す時間が15分程度の延長したものの、その結果はDNAを用いた実験と一致した。がん細胞では、上皮成長因子受容体(EGFR)-1への刺激は、RAS経路を介してがん細胞の増殖や浸潤・転移など、生体に不利な現象を生じる。EGFRリン酸化阻害薬やEGFR-1抗体薬は、EGFR-1の機能を阻害し、がん細胞の増殖などを抑制する。EGFR-1遺伝子のcodon 746-753に変異が生じている場合、EGFリン酸化阻害薬の奏功率が高まる。またKRAS遺伝子のcodon 12-13の変異は大腸癌の予後不良因子で、EGFR-1抗体薬を投与する基準となっている。本研究では、EGFR-1遺伝子やKRAS遺伝子の変異検出システムを構築・ブラッシュアップし、口腔細胞診検体を用いてこれら遺伝子変異の検出を試みた。細胞診検体から核酸を抽出し試料とした。蛍光によるloop mediated isothermal amplification(LAMP)法の検出システムをチェックするために、EGFR-1遺伝子の突然変異ホットスポットに対してプライマーを試作し、最終的に基本プライマー4種に加えループプライマー1種を設計した。同部位に遺伝子変異が生じている培養細胞から得られたDNAを元にLAMP反応溶液を調整し、等温増幅蛍光測定装置によりLAMP増幅反応の検出を行ったところ、約20分で遺伝子変異の検出が可能であった。従来から用いている等温増幅濁度測定装置では検出までに約40分を要しており、本システムによる遺伝子変異の検出が感度に優れていると考えられた。口腔細胞診検体を用いたEGFR-1遺伝子とKRAS遺伝子の変異検出を試みたが、明らかな変異は検出できなかった。細胞診検体を模倣するように、培養細胞の数や条件を調整して同様に実験したところ、はるかに少量の細胞(10-100個)から上記遺伝子変異が検出された。以上から、口腔細胞診検体にはこれらの遺伝子の変異陽性症例が少ないか、あるいは角化細胞からの検出が困難と推測された。

その結果、約20分で遺伝子変異の検出が可能であった。口腔細胞診検体を用いたところ、明らかな変異は検出できなかった。細胞株の数や条件を調整して同様に実験したところ、少量の細胞(10-100個)から上記遺伝子変異が検出された。以上から口腔細胞診検体にはこれらの遺伝子の変異陽性症例が少ないか、あるいは角化細胞からの検出が困難と推測された。上皮成長因子受容体の遺伝子変異検出システムが確立され、その進捗状況は良好である。病態科学系歯学・歯科放射線学上皮成長因子受容体の他に、がんの進行を左右する遺伝子や、薬剤耐性に係わる遺伝子の変異を検出するシステムを構築する。具体的には、KRAS、NRAS、BRAF、ALKをターゲットとする予定である。また、がん組織から得られた検体を用いて本法を行い、遺伝子変異の有無とがんの振る舞い(広がり、増大するスピード、病理組織学的な組織型と分化度)との関係を検討する。PT53遺伝子は安定したLAMP増幅反応が得られなかった。具体的には、PT53遺伝子変異のホットスポットであるアミノ酸残基245, 248, 249をカバーするプライマーセットを設計し、複数の口腔癌細胞株を中心に検出を試みたが、PT53 wild typeと比較すると反応時間の遅延や完全な抑制が見られた。その理由として、口腔癌ではPT53遺伝子に高頻度に変異が見られるものの、変異の生じている部位が広範囲にわたり、かつその種類が多岐にわたることが知られている。本法は遺伝子増幅のために4種類以上のプライマーを用いるため、一般的に用いられている核酸増幅技術であるpolymerase chain reaction法と比べて、プライマーのアニーリング部位の遺伝子変異は反応阻害に重要なファクターであると考えられる。現在、この現症の原因を明らかにするためにDNA塩基配列の解読を進めている。原因が明らかとなれば、この反応遅延・消失の現象を利用して、「Wild typeのPT53のみを検出する核酸増幅技術」の開発に応用が可能と考えている。研究は順調に進行しているが、使用する物品(主にプラスチック製品)を予定より安価なものに変更したため、次年度使用額が生じた。本年度の研究課題は、大きく以下の4つである。1)RAS遺伝子変異検出システムにおけるテンプレート(非精製検体や、パラフィンブロックおよび細胞診材料からの増幅)を検討する。2)EGFR遺伝子変異検出システムにおけるループプライマーの設計とシステム反応条件の決定ならびに、あらかじめ変異の明らかとなっている複数の細胞株を新規購入し、反応特異性の検討をおこなう。3)PT53遺伝子変異検出システムにおける反応遅延・消失の原因解明のために、DNA塩基配列の解読を進め、「Wild typeのPT53のみを検出する核酸増幅技術」の開発をめざす。4)検出強度のレベリングに用いるハウスキーピング遺伝子の選定と、レベリングの方法を検討する。候補遺伝子はプライマー設計完了の見込みである。
確率過程の極限定理の確率Besov空間におけるwavelet解析

今年度は確率過程のwavelet解析に関する基礎付けにということに関し、確率過程の汎関数の極限分布の解析の観点から研究を行ったWavelet係数の一般的な特徴として非ランダムな関数解析で知られている元のBesov関数とWavelet係数の間に成り立つノルム同値性を,確率過程に対してはどのように定式化するかということが当該分野では数年来一つの論点となっている。これまでの欧米の確率統計の観点からの研究では、wavlet関数族をkernelとするkernel法により過程の極限分布を推定するという問題における定式化が一つの考え方のようにみなされてきた感があった。この欧米の研究では過程のサンプルパスに対しwevelet変換を取らず、サンプル数を無限大にとるlarge sample極限の議論がなされたいるが、そこには何かしっくりこない気持ち悪さもあった。この疑問に対し私は、本年度の研究により次のような解答を得た。すなわち、過程ドメインで過程のある汎関数の極限分布を調べたいときに、サンプルパスのwavelet係数に対する汎関数を取り、その汎関数の確率ノルムに対して上記のようなノルム同値性が成り立っということである。そこではノルム同値性の意義も明らかとなり、過程ドメインでの推定量の収束の評価が対応するwavelet係数ドメインでの収束の評価で上下からなされるということになる。従って、元の過程ドメインでは長期記憶性を持つあるいは非中心極限定理しか得ることのできないような状況でも対応するwavelet係数ドメインにおいてwavelet係数の時間-周波数局在性の特長を利用し対角成分のみの評価により中心極限定理での収束評価ができることになる。このことは現在、自己相似過程、定常過程、一般の過程クラスに対しそれぞれ成果としてまとめているところであり、近々公表できるものと考えている。CLTについては、過程のwavelet係数の各スケールjを固定したときの非線形汎関数のシフトkに関するサンプル平均を考察し、Breuer&Major(1982)に従いwavelet係数の共分散が短期記憶である(局在性がよい)ことを示すことによりCLTをverifyした。そこでは過程の増分の分散E[{X(_T)-X(O)}^2]がT↓Oのときregularly varyingであるならwaveletのvanishing moment性から短期記憶であることが得られる。また、CLTが成り立つために必要なvanishing moment次数をregularly varying指数を用いた不等式で与えた。FBMについては特に、CLTを応用してHurstパラメータの区間推定について考察し、Hurstパラメータにwavelet係数のサンプル分散に関する連続性を示すことによりそれを与えた。特徴付け関係については、過程の増分が定常エルゴードであるようなクラスに対し、過程とwavelet係数の間に、非ランダムな関数の解析において知られているBesov関数および数列空間での連続性が成り立つことを示した。このうちのWavelet係数の過程に関する連続性からは、性質が既知の過程のwavelet係数の性質を特徴付けるという順問題がwell-defined性が与えられ、逆に過程のwavelet係数に関する連続性からは、性質が未知の過程のwavelet係数を調べてそれにより元の過程を特徴付けるという逆問題がwell-definedであることが与えられる。現在、このクラスに対してCLTをどのような形で議論できるかということについて考察しているところである。
歯周病増悪因子Cot/Tpl2を分子標的とした治療法を探る

最終年度には、遺伝子のプロモーター領域において、この発現誘導に関わるNF-kB結合部位の検索を行うため、プロモーター解析用のLuciferase発現ベクターと骨芽細胞株を用いた実験を行った。すると、今まで報告されていない-230から-50bpの領域が、新たなNF-kB結合推定部位3か所を持つ可能性が見出された。現在、結合推定部位に変異を持つベクターを作製済みであり、3か所のうちのどの部位が重要であるか、解析を進めている。今回の研究では、我々が作製に成功したマウスの歯周病モデルを、JNK脱リン酸化酵素であるDUSP16のトランスジェニクマウスで作製した結果、DUSP16が歯周病発症を抑制する可能性が示された。野生型マウスの歯周病モデルでは、歯周病の発症のみならず歯周組織の再生も再現可能であったことから、このモデルが歯周病の増悪と治癒の双方のメカニズムの探索に有用であることが示された。今後は、一連のLuciferase発現ベクターを用い、様々な歯周組織由来の細胞でのMAP3K8/Cot/Tpl2の発現誘導を調べるとともに、LPS以外の歯周病原菌の菌体成分、炎症性サイトカインの刺激などについても解析する予定である。これらの研究により、MAP3K8/Cot/Tpl2を介した歯周病の増悪や歯周病再生抑制に関与する細胞が予測可能となる。同時に、歯周病モデルでのCot/Tpl2遺伝子発現状況、病態との相関性を調べることで、より詳細な解析が可能となる。MAP3K8/Cot/Tpl2、DUSP16を分子標的とし、歯周病の増悪抑制ならびに再生治療の、双方を視野に入れた研究がさらに進むものと期待される。我々は、歯周病マウスモデルの作成に成功している。以前、MAPKであるCot/Tpl2のノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して、歯槽骨吸収の減少が生じることを報告した。そこで今回は他のMAPKであるJNKを、脱リン酸化する酵素であるDUSP-16のドミナントネガティブを発現するトランスジェニックマウスでの歯周病モデル作成と歯槽骨吸収を解析した。マウスをケタミン/ドミトールで麻酔した後、上顎第一臼歯を0.2mmのワイヤーで結索し、7日間おき、マイクロCTスキャンで歯槽骨の吸収を評価した。その結果、DUSP-16のトランスジェニックマウスでは歯槽骨吸収が少ないが、野生型のマウスでは臼歯近心および分岐部の著名な歯槽骨の吸収が認められた。このことからJNKのシグナルが歯周病マウスモデルにおける歯槽骨吸収に重要な役割を示すことが示唆された。さらに、ワイヤーを除去して7日間置いたものでは、野生型のマウスで、根分岐部の歯槽骨の骨の再生が認められた。ヒトでは歯周病による骨吸収の再生が難しいことから、マウスの骨のリモデリングの詳細を解析することにより、歯槽骨再生の治療法の開発が期待された。我々は、Tpl2のノックアウトマウスではLPS刺激時のIL-12およびそのサブユニットp40の発現が多いことを報告している。IL-12は破骨細胞の活性を抑制することから、その発現調節の解明は重要である。IL-12p40のmRNAは、Tpl2のシグナルを介して発現する、MCPIP-1というRNA分解酵素により分解される。そこで、IL-12p40のmRNAの安定性を解析するために、mRNAの3'末端のUTRを持ったルシフェラーゼmRNAを発現するベクターをRaw264.7細胞にトランスフェクトした。この細胞をLPSで刺激した時のルシフェラーゼ活性がTpl2下流のERKのインヒビターで阻害された。このことから、Cot/Tpl2はIL-12p40のmRNAの安定性を高める可能性が示された。我々は以前、Cot/Tpl2のノックアウトマウスで歯周病マウスモデルを作製した結果、野生型のマウスでは歯槽骨が高度に吸収されるが、それと比較して、Cot/Tpl2のノックアウトマウスでは歯槽骨の吸収が有意に低下していることを報告した。このことは今まで報告された、骨芽細胞のRANKL発現と破骨細胞のRANKを介した分化の双方でCot/Tpl2シグナルが重要であることと一致した結果である。ところが、Cot/Tpl2はリン酸化により活性化された後、プロテアソームで分解されるユニークなMAP3Kである。さらに、歯周病原菌の菌体成分LPSはTLR4を介しCot/Tpl2を活性化することが知られている。したがって、歯周病罹患部位に存在する骨芽細胞や破骨細胞前駆細胞がLPSに暴露されると、Cot/Tpl2自身が分解してしまい、その後の骨芽細胞のRANKLの発現や、それによる破骨細胞の分化に働くCot/Tpl2のシグナルが抑制されてしまうことになる。このことは、Cot/Tpl2のノックアウトマウスと野生型のマウスを用いた歯周病マウスモデルにおいて、骨吸収に大きな差が認められることと矛盾している。そこで我々は、LPS刺激によるCot/Tpl2の分解の後、回復させるシステムが存在するという仮説を立て、LPS刺激後のCot/Tpl2の動態を、破骨細胞と同じ血球系の細胞であるマクロファージを用いて観察を試みた。LPS刺激後の動態を確認したところ、刺激後1-2時間でCot/Tpl2が分解し減少するものの、6時間後ぐらいから回復していた。

リアルタイムRT-PCR法でCot/Tpl2のmRNAの発現を確認したところ、刺激後2時間で約4倍に増加していた。したがってCot/Tpl2がLPSにより活性化されたのち、一過性にそのタンパク量が減少するが、同時にmRNAの発現誘導によりそのタンパク量が回復し、維持される可能性が示唆された。LPS刺激によるCot/Tpl2のmRNAの発現誘導には、遺伝子のプロモーター領域のNF-kB結合部位が重要であることも明らかにした。最終年度には、遺伝子のプロモーター領域において、この発現誘導に関わるNF-kB結合部位の検索を行うため、プロモーター解析用のLuciferase発現ベクターと骨芽細胞株を用いた実験を行った。すると、今まで報告されていない-230から-50bpの領域が、新たなNF-kB結合推定部位3か所を持つ可能性が見出された。現在、結合推定部位に変異を持つベクターを作製済みであり、3か所のうちのどの部位が重要であるか、解析を進めている。今回の研究では、我々が作製に成功したマウスの歯周病モデルを、JNK脱リン酸化酵素であるDUSP16のトランスジェニクマウスで作製した結果、DUSP16が歯周病発症を抑制する可能性が示された。野生型マウスの歯周病モデルでは、歯周病の発症のみならず歯周組織の再生も再現可能であったことから、このモデルが歯周病の増悪と治癒の双方のメカニズムの探索に有用であることが示された。今後は、一連のLuciferase発現ベクターを用い、様々な歯周組織由来の細胞でのMAP3K8/Cot/Tpl2の発現誘導を調べるとともに、LPS以外の歯周病原菌の菌体成分、炎症性サイトカインの刺激などについても解析する予定である。これらの研究により、MAP3K8/Cot/Tpl2を介した歯周病の増悪や歯周病再生抑制に関与する細胞が予測可能となる。同時に、歯周病モデルでのCot/Tpl2遺伝子発現状況、病態との相関性を調べることで、より詳細な解析が可能となる。MAP3K8/Cot/Tpl2、DUSP16を分子標的とし、歯周病の増悪抑制ならびに再生治療の、双方を視野に入れた研究がさらに進むものと期待される。予定では骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、抗原提示細胞におけるCot-Tpl2の役割を調べることを目的としている。以前我々は、骨芽細胞が、破骨細胞の分化と活性化に必要なRANKLを発現する際に、Cot/Tpl2シグナルが重要であることを報告した。最近になって骨芽細胞から提示されるRANKLのシグナルが破骨細胞の分化に働く際に、破骨細胞内のCot/Tpl2のシグナルが重要である可能性が報告された。したがってCot/Tpl2は骨芽細胞と破骨細胞の双方で活性化され、破骨細胞の分化促進に働くことが示唆された。そこで、本年度はCot/Tpl2のシグナル経路の詳細を調べることとし、歯周病におけるCot/Tpl2の発現調節にターゲットを絞り、抗原提示細胞であるマクロファージを用いて実験を行った。計画とは多少ずれが生じているが、このような場合も想定して実験計画を立てているため、大きな混乱はない。我々は、歯周病原菌の菌体成分であるLPSの刺激によりCot/Tpl2が活性化された後、分解されるのにもかかわらず、RANKL刺激によりCot/Tpl2シグナルを介して破骨細胞の分化や骨吸収が生じることに疑問を抱いた。そこでCot/Tpl2が活性化されて分解されても、回復させるシステムが存在するという仮説を立て、実験を行ってきた。
DNA由来発光性カーボンナノワイヤを用いる広帯域波長光電エネルギー変換

DNAナノファイバの熱分解による発光性カーボンナオワイヤ・アレイの作製方法を開発した。作製されたCNWsの発光は励起波長に依存し,広帯域にわたる発光特性を有していた。さらに銀ナノ粒子が十分に結合されたDNAナノファイバ(金属ナノファイバ)を熱分解する事で,発光増強を示すAgNP-CNWsが得られた。AgNP-CNWsの最大発光増強はAgNPs-CNWsの局在プラズモン共鳴(LPR)波長と励起波長が一致したときに観察された。DNAナノファイバの熱分解より伴われる炭素化の様子がレーザラマン顕微鏡を用いたSERSイメージングにより明らかにされた。本研究ではDNAナノファイバを熱処理し、発光特性に優れたカーボンナノワイヤへ変換し、これを広帯域においてエネルギー変換可能な光電変換材料として応用することを目的とする。発光性カーボンナノワイヤの先駆体となるDNAは生体分子であり、毒性は低く環境にやさしい材料である。本研究の発光性カーボンナノワイヤの作製法は特別な機械装置の使用を伴わず、一般的な研究設備を有する施設で実行可能で、きわめて環境負荷の少ない次世代の光電エネルギー変換素子の開発技術となる。平成26年度はDNAナノファイバの熱処理により調製された発光性カーボンナノワイヤの広帯域における発光特性を明らかにする。PDMS上に作製されたDNAナノファイバをガラス基板に転写印刷し、熱処理することで発光性カーボンナノワイヤへ変換した。ガラス基板上の発光性カーボンナノワイヤを原子間力顕微鏡、走査型電子顕微鏡そして光学顕微鏡を用い観察した。熱処理温度は250°Cで得られたカーボンナノワイヤの発光強度が最も大きくなる事がわかった。また発光性カーボンナノワイヤへの変換の様子を共焦点レーザーラマン顕微鏡により観察した結果、発光の発現は炭素化と関係する事が分かった。発光性カーボンナノワイヤ中で1次元配列した銀ナノ粒子はプラズモンカップリングによる強い局在プラズモン共鳴を示し、この現象を利用し発光特性を向上させる事ができた。特に520nmの励起においては発光強度が10倍程度向上させる事ができた。PDMS表面に凹凸パターンを施し、表面上に形成されるDNAナノファイバの長さおよび固定位置を制御し、発光性カーボンナノワイヤのパターニングを検討した。まず始めにPDMS表面にカッターナイフにより傷を与え、表面に凹凸構造を与えた。この結果ファイバ成長はこの凹凸構造上で停止し、凹凸構造を越えた地点より再びファイバ成長が始まることを確認した。DNAナノファイバはPDMS表面の界面移動方向に成長していくため、表面上に存在する凹凸構造はファイバ成長を阻害する。凹凸パターンはフォトリソグラフィによりシリコン基板上にマスター作製し、PDMSによりパターンを写し取る。シリコン基板マスターは機構内の微細加工プロセス装置を用いて作製する。またステンシルマスクパターンを用いたプラズマソフトエッチングにより、PDMS表面の特定個所を親水化処理することで、DNAナノファイバのパターン化も試みた。この結果マスク穴を通して親水処理化された表面のみにDNAナノファイバの成長パターンが確認された。これら結果から、PDMS表面上の構造と選択的親水処理により、DNAナノファイバ・アレイのパターンが形成できる事を証明した。現在、リソグラフィによるシリコンパターンを形成し、この基板をマスターとしてPDMS表面にラインパターンを形成した基板を作製している。表面に作製されたマイクロ電極ギャップに転写し、これを熱処理し、発光性カーボンナノワイヤが電極間に配置されたデバイスを作製した。暗電流と室内灯下でこのデバイスの電流変化を測定したところ、十分な違いを見出せなかった。また金属ナノ粒子を含有したカーボンナノワイヤを用いた測定も行ったが、この場合も暗電流と室内灯下の違いは見られなかった。電極とカーボンナノワイヤとの間のコンタクト抵抗が高く、電気的接触が十分でない可能性がある。発光性カーボンナノワイヤの作製技術は、現時点で十分再現性があり、顕微鏡下における分光測定を容易にし、現有設備ににおける詳細な光学特性の検討が行えたため。局在プラズモン共鳴を最適化した金属ナノファイバ用いる事で、500-600nm付近の発光特性を増大でき(最大10倍)、これにより可視域の広範囲において、カーボンナノワイヤの発光特性を向上する事ができた。表面分析作製されたカーボンナノワイヤの光電変換特性を検討する。この目的のために、くし型電極パターン上に金属ナノファイバを転写印刷し、これを加熱処理しカーボンナノワイヤが電極間ギャップに配置したものを得る。これにさまざまな波長の光(400-650nm)を照射して、電流-電圧変化を測定する。現有設備においては数ピコAレベルの測定が可能である。また温度制御下での厳密な測定が要求される場合、当研究機構の別グループの測定装置の使用が可能である。

また転写印刷を同一くし型電極上に複数回繰り返す事で、カーボンナノワイヤ密度を増加させ、電流値の増大を試みる。当初購入予定のソーラしゅみれータは予算の減額により購入は困難であるため、他グループの装置を使用して行う。追加の試薬購入が必要でなくなったため。次年度の消耗品代として使用する。
乳癌の乳管内進展に関する画像評価と分子生物学的切除断端マーカー開発に向けた研究

乳房温存療法における造影超音波を活用した正確な切除法の開発と生物学的切除断端マーカーの探索を研究している。前半の部分は造影超音波などの画像診断により癌の広がり診断を向上させ、的確に癌を切除する手術法の開発を目指している。すでに造影超音波による乳管内進展の所見は小さな低エコー域に血流が確認されるかどうかで、ある程度判断できることがわかり、2018年に論文化した。この広がり診断を正確に手術に反映する目的で次の研究に移行した。すなわち、造影超音波検査時にハイドロゲルフィルム剤を患者の乳房に貼付し、癌の広がりを下書きしたのち、水系エマルジョン樹脂塗料によって切除範囲の模型化を行う研究で、IRBの承認を受けて開始し、2019年2月までに100例を施行し症例集積を終了した。中間報告として、従来法と断端陰性率で遜色なく、模型により患者への説明ができ、全身麻酔導入後円滑にマーキング可能で、残った模型を参照することで病理所見との対比ができ、手術手技の向上や教育面でも意義があると日本乳癌画像研究会で報告した。後半の切除断端マーカーの検索は切除標本の癌・非癌ペアサンプルの採取、細胞検体からマイクロRNAを抽出し、症例を集積した。現在異常乳頭分泌症例で癌・非癌の細胞検体を収集中である。ペアサンプルのうち3例に対して定量的RT-PCR法に基づくマイクロRNAアレイ解析をおこなった。未だ少数例にとどまるため、今後も解析例を増やしていく予定である。計画では平成30年度に造影超音波による広がり診断法を確立する予定で、水系エマルジョンを使用した切除法を研究し、臨床研究を終了した。切除断端マーカーの探索の研究は癌・非癌ペアサンプルの集積を行いつつ、アレイ解析に入る予定であったが、実際に解析を行うことができた。造影超音波と切除範囲の模型化の研究は解析に入り、乳癌学会での発表と論文作成に入る。切除断端マーカーの探索研究はアレイ解析の症例を増やしていく予定である。すでに抽出されたRNAサンプルの良いものから臨床像などを参考に解析に回し、RNAサンプルの不足については追加して症例を集積する。造影超音波を用いた乳癌部分切除における切除線決定については、症例を重ねた結果、乳管内進展の候補となる小さな低エコー域に注目して造影の有無で判断することで進展の有無をとらえられることが分かった。このことを利用して術前に外来でハイドロゲルフィルム剤を患部に載せて進展部分を下書きし、下書きをもとに水系エマルジョン樹脂塗料を用いて病変の進展範囲と切除範囲を模型化している。この模型化までの過程については確立できたので、「マスキングカラーシミュレーション」として、学会発表して症例を集積中である。細胞検体からのRNA抽出については乳癌症例の癌部、非癌部のサンプルを採取している。当初非癌部は切除断端の面を擦過して細胞採取をしていたが、穿刺吸引で採取するほうが効率が良いことがわかり、癌部と非癌部をそれぞれ穿刺吸引する方法とした。さらに対象を乳房切除症例にも拡張した。また、乳管内からの細胞採取として乳管内視鏡検査時の洗浄細胞診検体の一部を利用することとした。洗浄細胞診には乳管内病変の細胞が豊富に含まれ、同時に組織標本が採取されて病理診断されることもあるので細胞検体と良悪性の対応ができる。マイクロRNAサンプルの質についても氷温下での保存が重要であることがわかってきた。RNA抽出にはRNAiso Plus(タカラバイオ)を用いた。RNAの純度(品質)検定として、まずBioSpec-nano (SHIMADZU)を用いて吸光度を測定し、次にQuantiFluor&reg; RNA System(Promega)にてRNA微量定量を行った。RNA濃度を厳密に測定した上でAgilent 2100 BioAnalyzerでRNA Integrity Number (RIN)を算出し、RNAの品質の客観的評価を行った。試行錯誤の結果、RINが7以上の質の良いRNAを抽出することが可能であることを確認した。サンプルは現在60検体を超し、さらに集積を継続する予定である。正確な切除に対する切除線決定については3D表示には至っていないが、術前に外来でハイドロゲルフィルム剤を患部に載せて進展部分を下書きし、下書きをもとに水系エマルジョン樹脂塗料を用いて病変の進展範囲と切除範囲を模型化する方法を確立した。細胞診検体については当初の予定であった断端からの擦過は細胞採取量が少なく、穿刺吸引という方法へ切り替えた。しかし、この変更によりサンプルは部分切除以外の乳癌症例からも採取が可能となった。さらに乳管内視鏡検査時の洗浄細胞診検体も利用できることがわかり、乳癌の乳管内進展細胞を高純度で採取することが可能となった。現段階はサンプル採取で高質なRNAが採取できる方法の検討段階で、検体保存の氷温下管理でうまくいくことからさらに継続していく。高質なサンプルを収集してからマイクロRNAのアレイ解析へとつなげていく予定である。

すなわち、造影超音波検査時にハイドロゲルフィルム剤を患者の乳房に貼付し、癌の広がりを下書きしたのち、水系エマルジョン樹脂塗料によって切除範囲の模型化を行う研究で、IRBの承認を受けて開始し、2019年2月までに100例を施行し症例集積を終了した。中間報告として、従来法と断端陰性率で遜色なく、模型により患者への説明ができ、全身麻酔導入後円滑にマーキング可能で、残った模型を参照することで病理所見との対比ができ、手術手技の向上や教育面でも意義があると日本乳癌画像研究会で報告した。後半の切除断端マーカーの検索は切除標本の癌・非癌ペアサンプルの採取、細胞検体からマイクロRNAを抽出し、症例を集積した。現在異常乳頭分泌症例で癌・非癌の細胞検体を収集中である。ペアサンプルのうち3例に対して定量的RT-PCR法に基づくマイクロRNAアレイ解析をおこなった。未だ少数例にとどまるため、今後も解析例を増やしていく予定である。計画では平成30年度に造影超音波による広がり診断法を確立する予定で、水系エマルジョンを使用した切除法を研究し、臨床研究を終了した。切除断端マーカーの探索の研究は癌・非癌ペアサンプルの集積を行いつつ、アレイ解析に入る予定であったが、実際に解析を行うことができた。切除線決定については造影超音波時の所見から模型を作成する方法が確立されたので、今後は症例を集積して、断端陰性率などの評価を行う予定である。また切除方法の手順を確立し、その有効性を検討する。とくに術前の検査時に画像で表示されたものを手術時に再現する方法もさらに検討する。細胞診検体については採取法、保存法がほぼ確立してきたのでさらに検体を収集し、より高質なRNAサンプルが採取できるようにしていく。質のよいRNAを得ることが可能となった乳癌サンプルを用いて、次世代型アレイ(Affymetrix社Clariom D)または定量的RT-PCR法に基づくアレイシステムであるTaqMan Human MicroRNA Array(サーモフィッシャー)を用いて、網羅的かつ定量的なマイクロRNA発現プロファイルの比較解析を行う。候補となるマイクロRNAについては文献的にも検討し、研究者で協議して決定する。新たに臨床研究を立ち上げて、臨床検体を用いてValidationを行う。候補マイクロRNAの有無と乳管内進展の有無を照合して候補マイクロRNAが切除断端マーカーとなるかを検証する。造影超音波と切除範囲の模型化の研究は解析に入り、乳癌学会での発表と論文作成に入る。切除断端マーカーの探索研究はアレイ解析の症例を増やしていく予定である。すでに抽出されたRNAサンプルの良いものから臨床像などを参考に解析に回し、RNAサンプルの不足については追加して症例を集積する。日本臨床外科学会に投稿した切除線決定に関する論文の掲載料の請求が年度内にあるものと考えていたため、他の物品の購入を差し控えていた。しかし、掲載料の請求が次年度となったので次年度への繰り越しとなった。今回RNA網羅的解析に進んだために前倒し請求を行っている。RNA網羅的解析は1例あたりの金額が高いために端数が出てしまった。
テロメラーゼ活性を用いた肝細胞癌切除後の早期再発予測と術後補助療法の適応決定

肝細胞癌手術後の残肝再発形式には、多中心性再発と遺残再発が考えられるが、比較的早期の再発形式は殆どが後者であり、これは術前の画像診断では捉えることのできない経門脈的な肝内転移によると考えられる。このような背景において、画像で捉えることのできない微少な肝内転移巣や多中心性発癌を術前から把握することが可能であれば、個々の患者において適切な治療選択が可能となる。従来の臨床病理学的因子では残肝再発を予測することは不可能であり、信頼性の高い新たな予測因子が期待される。我々は悪性腫瘍に特異性が高く、また発癌過程で活性が発現するとされるテロメラーゼ活性について、現在まで各種消化器癌でその発現を確認し、手技的にも微量の癌細胞からの活性を測定可能としてきた。そこでこのテロメラーゼ活性が肝細胞癌の悪性度、とりわけ残肝再発の予測因子として臨床応用できないかを検討した。当科で切除した肝細胞癌症例の非腫瘍部のテロメラーゼ活性をTelomerase Deteoction Kit(Oncor社)を用いたTRAP assayにて測定した。活性陽性と陰性の2群で、臨床病理学的因子との関係および無再発生存期間、生存期間との関係を検討した。非腫瘍部のテロメラーゼ活性陰性例と活性陽性例とに分け、臨床病理学的因子との関係を検討したが、何れの因子とも相関を示さなかった。初回手術例で1年以上経過観察できた症例を対象とし、活性陰性例、陽性例を検討したところ、活性陽性例が有意に残肝無再発生存率、生存率ともに低かった。また残肝無再発生存期間に寄与する因子を単変量解析にて解析したところ非癌部のテロメラーゼ活性が最も強く関与していた。以上のごとく非癌部テロメラーゼ活性の残肝再発の予測因子としての有用性の知見が得られた。これを基盤に現在臨床応用の計画中である。当科で切除した肝細胞癌症例の非腫瘍部のテロメラーゼ活性をTelomerase Detection Kit (Oncor社)を用いたTRAP assayにて測定した。非腫瘍部のテロメラーゼ活性陰性例と活性陽性例とに分け、臨床癖理学的因子との関係を検討したが、何れの因子とも相関を示さなかった。本年度は追試を行い以上の結果を再確認した。これらのことから非癌部テロメラーゼ活性の有無が残肝再発の予測因子として大きな期待がもてることが分かった。現在論文作成中である。

以上のごとく非癌部テロメラーゼ活性の残肝再発の予測因子としての有用性の知見が得られた。これを基盤に現在臨床応用の計画中である。
高齢者における静脈性勃起障害の病態解明-特に静脈性閉鎖機構へのNOの関与と障害

【結果】(1)VIP陽性神経は、PGP9.5陽性神経と同様に陰茎深動脈、ラセン動脈、動静脈吻合の周囲、陰茎海綿体小柱内、白膜下の疎性結合組織内に豊富に分布していた。(2)NPY陽性神経は、陰茎深動脈とその比較的太い枝の周囲、陰茎海綿小柱内に分布していたが、白膜下の疎性結合組織内には認められなかった。(3)CGRP陽性神経は、陰茎深動脈とその比較的太い枝の周囲には乏しく、白膜近傍の陰茎海綿小柱内、白膜下の疎性結合組織内に比較的限局して分布していた。(4)NADPHdiaphorase陽性神経は、PGP9.5陽性神経の分布とは完全に対応しておらず、ラセン動脈、動静脈吻合の周囲、陰茎海綿体小柱内に多く分布していた。また、NADPH diaphorase陽性反応が海綿体洞やラセン動脈の内皮細胞にも認められた。(5)NOS陽性神経は、NADPH diaphorase陽性神経とほぼ同様の分布を示した。【結論】(1)血液流入系(動脈系)がVIPとNPY、血液流出系(静脈系)がVIPとCGRPという異なる神経伝達物質の組み合わせにより血流調節されている可能性が示唆された。(2)前述のペプチド作動性神経に加え、NO作動性神経がラセン動脈から海綿体洞の血流調節に密接に関係していることが示唆された。(3)特に白膜下の疎性結合組織内にPGP9.5陽性神経、VIP陽性神経、CGRP陽性神経を認めたことより、従来の仮説を覆す能動的な静脈系の血流調節機構の存在が強く示唆された。(4)能動的な静脈系の血流調節機構にNO作動性神経が関与しているか否かについては、今回はNOS染色の試料数が少ないため断定し難く、さらに追試して明確にしたい。
遺伝子解析と脳機能イメージング解析を統合したＡＤＨＤにおける脳機能解明

ADHDの病態の抑制・注意機能障害の解明と、治療薬の塩酸メチルフェニデート(MPH)とアトモキセチン(ATX)の脳機能学的薬理効果をfNIRSを用いた無作為化二重盲検プラセボ対照試験で検討した。抑制機能課題では、ADHD児の薬服用前、プラセボ(PLA)服薬後は脳活性がなかったが、MPH、ATX服用後は右前頭前野に活性がみられた。注意機能課題では、ADHD児の薬服用前、PLA服薬後に脳活性がなかったが、MPH服用後は右前頭前野のみ、ATX服用後は右前頭前野と右頭頂葉に活性がみられた。右前頭前野の変化はADHDの客観的診断指標に、右頭頂葉の変化はMPHとATXの選択指標となりうる。平成24年度にADHDの中心病態である抑制機能に関与する右前頭前野の脳機能変化を抽出し、治療薬である塩酸メチルフェニデート(MPH)を内服後に定型発達児と同様の脳活動変化(=正常化)を示し、プラセボ薬では変化が見られなかったことを報告した(Monden, Nagashima, et al.,2012)。平成25年度の実績は、ADHDの表現型として抑制機能障害に影響される衝動性や多動性に加え、注意機能障害による不注意症状が関与する脳機能学的モニタリングを実施した。ADHD児22名、定型発達児22名において検討し、注意機能関連領域に右前頭前野だけでなく、右頭頂葉の活動低下があることを報告した(Nagashima et al., 2014)。以上の結果は、ADHDの中核症状である衝動性、多動性、不注意をすべて網羅可能な脳機能学的モニタリングを実践した世界初の報告である。その他、我々は、予定を上回る人数のリクルートが可能であった。当初は、平成24年ー26年度にかけて100名のリクルートを目標にしていたが、ADHD児を150名、定型発達児を100名程度がすでにリクルートでき、2名以上の医療者によるADHD診断、知能検査が終了している。以上から、今後の遺伝子研究課題に着手できる準備がなされたと考えられる。本研究計画の目的の1つである、ADHD児の抑制機能における前頭前野の神経基盤を明らかにするために、fNIRSによる健常児16名とADHD児16名(人数、年齢、性別マッチ)の前頭前野の活性を調べる検討を行った。また、ADHDの治療薬である塩酸メチルフェニデート(MPH)の服用前後における前頭前野の活性を調べるために二重盲検査プラセボ試験を行った。健常群で認めた右前頭前野の脳機能活性が、ADHD児の治療前には活性がなく、治療薬であるMPH服用後にのみ認められた。このことから、fNIRSを用いた我々の解析系が、ADHDの客観的診断、効果予測因子の判定法として確立される可能性を示唆した。(文献1,2)発表論文2門田行史、檀はるか、長嶋雅子他;小児ADHDに対するMPH投与効果のNIRSによる評価法の探索・日本薬物脳波学会雑誌2012; 13:57-66本研究計画の目的の1つは、ADHD児の抑制機能障害、注意機能障害の神経基盤を明らかにすることである。そのために、次のfNIRSによる検討を報告した。(1)抑制機能課題を用いて、fNIRSによる健常児とADHD児(人数、年齢、性別マッチ)の脳活性を調べた。また、ADHD治療薬の塩酸メチルフェニデート(MPH)とアトモキセチン(ATX)服用前後の脳活性変化を二重盲検査プラセボ試験で調査した。健常群で認めた右前頭前野の脳活性が、ADHD児の治療前には活性がなく、MPH、ATX服用後にのみ認められた(文献12)。(2)注意機能課題を用いて、fNIRSによる健常児とADHD児(人数、年齢、性別マッチ)の脳活性を調べた。また、MPHとATXの服用前後における脳活性変化を二重盲検査プラセボ試験で調査した。健常群で認めた右前頭前野と右頭頂洋の脳活性が、ADHD児の治療前には活性がなく、MPH服用後には右前頭前野のみ、ATX服用後には右前頭前野と右頭頂葉の活性が認められた(文献34)。MPHは前頭前野に関与するドパミンネットワークに親和性が強く、ATXは前頭前野と頭頂葉に関与するノルアドレナリンネットワークに親和性が強いとされる。注意機能課題におけるMPHとATXの活性部位の異同は関与するネットワークの違いをfNIRSで可視化したことを示唆した。

上記から、fNIRSを用いた我々の解析系は、ADHDの客観的診断、機能障害別の薬物効果予測因子判定法の確立の可能性を示した。発達神経学本研究の目的は、ADHDの病態解明を目的に、ADHD児の表現型と病因遺伝子と脳機能学的結果の関連を検討する事である。我々は、ADHDの表現型である、衝動性と多動性が、右前頭前野の機能低下であることを平成24年度に報告(Monden, Nagashima, et al.,2012)した。本年度は、不注意症状が、右前頭前野と右頭頂葉の機能低下に関与すると報告(Nagashima et al., 2014)した。また、治療薬である塩酸メチルフェニデート(MPH)を内服後に脳機能が改善する事を報告した。現在、ADHDのもう一つの治療薬である、アトモキセチン(ATX)の薬理効果について、論文投稿準備中である。以上から、表現型と脳機能学的関連については、おおむね目標を達成していると考える。一方で、遺伝子検査については、本年度以降の課題であるが、当初の予定よりもリクルート者が確保でき、ADHD児、自閉症児、定型発達児を合わせて350名のリクルートができている。よって、今年度から、遺伝子多型解析のサンプルを集めて解析を開始し、表現型と脳機能イメージングとの関連結果の抽出を試みる予定である。本研究の目的は、ADHDにおける遺伝子多型解析とニューロイメージング解析を用いて、ADHD児の表現型と病因遺伝子と脳機能の病態との関連を解明する事である。我々は、健常群とADHD児における抑制機能についての脳機能解析を実施し、報告した(文献1)。現在、ADHDにおける抑制機能障害以外の機能障害、すなわち注意機能障害について、健常児13名、ADHD児13名(人数、年齢、性別マッチ)の注意機能課題遂行時のfNIRS計測による脳機能解析を終了し、報告予定である。また、ADHDの児のMPH以外の治療薬である、アトモキセチン(ATX)の服用前後における前頭前野の活性を調べる予定である。これらにより、ADHDの表現型を含めた客観的診断、薬剤別の効果予測因子の判定法の確立に貢献できる可能性がある。本研究の目的は、ADHDの表現型と合併症を病因遺伝子と脳機能の病態との関連を解析し、診断、予後判定および適切な治療法の選択基準を作る事である。ADHDの診断目的とする研究では、本年度、ADHDの中核表現型である衝動性、多動性、不注意について、症状プロファイルと脳機能イメージング結果の相関性について報告した(Monden, Nagashima, et al., 2012; Nagashima, et al., 2014)。これらの結果は統計学的に極めて頑健であるため、当初の予定を変更し、表現型と脳機能イメージング結果から判定可能なADHD疾患の予後判定基準を作る予定である。ADHD治療については、ATXの効果判定について脳機能イメージングを用いた論文を投稿準備中である。抑制機能と注意機能に関与する別々の薬理効果を報告する予定である。本結果により、MPHとATXの薬理効果を脳機能学的に考察可能となり、当初の目的である薬物選択基準の作成をすすめる原動力となる。さらに、当初の予定通り、リクルート者数が300名以上となったため、ADHDの遺伝子多型と脳機能イメージング結果の相関性の有無について継続して検討し、ADHDの病態解明に取り組む。我々の先行研究により、ADHDの脳機能低下を抽出する解析手法の基盤は確立された。
肝内胆管癌の遺伝子・分子生物学的機構に基づいたイメージバイオマーカーの研究

IDH1/IDH2遺伝子変異は肝内胆管癌(ICC)の25%ほどに見られると報告されており、この変異を有するICCの予後が良いことが知られている。治療前のICCにおいて、この遺伝子変異を示す画像的特徴が示されれば、予後予測・治療方針決定に大きなインパクトがあると考えられる。今回、41例の腫瘤形成型ICCに対して遺伝子解析を行った。これらのうち14例にIDH1/IDH2変異を見いだした。14例中11例に病変のほとんどに細胆管癌様所見が病理学的に確認された。一方、IDH1/IDH2変異を認めない27例においても13例に細胆管癌様所見を認めたが、その割合はIDH1/IDH2変異を伴うものと比べて軽微であった。さらに41例の腫瘤形成型ICC41例の中でMRI検査が行われた14例について、画像解析を行った(IDH1/IDH2変異有群n=5,IDH1/IDH2変異無群n=9)。このうち、IDH1/IDH2変異例では腫瘤中心部の見かけの拡散係数(ADC値)が有意に低い値(1.3±0.3mm2/s vs 1.8±0.3mm2/s, p<0.05)を示した。病理学的にはIDH1/IDH2変異有群では成熟した間質で占められており、一方、IDH1/IDH2変異無群では線維芽細胞を伴った活動性の線維組織がよく見られた。これらのコホートにおける生存期間の検討では、IDH1/IDH2変異有群はIDH1/IDH2変異無群に比べて長い傾向にあったが、症例数が十分でなかったためか、有意差は示すことは出来なかった。IDH1/IDH2は腫瘍間質の形成に影響を与え、それらがMRI画像(特にADC値)で検出できる可能性が示唆された。FDG-PET/CTでは肝内胆管癌はFDG集積をすることでhot spotを呈することが知られているが,まれに例外的な症例が散見される。肝内胆管癌を組織学的に亜分類することで,FDG-PET/CTの集積の多寡の原因を検討した。外科切除された腫瘤形成性肝内胆管癌14例(全例腺癌)を対象とし,組織学的に腫瘍細胞が細胆管に類似し,置換性増殖を特徴とするものをBile ductular carcinoma (BDC)と亜分類し,それ以外の肝内胆管癌をordinaryadenocarcinoma (OAC;通常腺腔径が100μm以上で粘液産生を認めるもの)について,FDG-PET/CTでのFDG uptakeをSUV-max値として計測し,二群を比較し,さらに得られた組織検体から各種グルコーストランスポーター,およびその関連抗体(Glut-1, 2, HK II, glucose-6-phosphatase (G6P))の発現について検討した。その結果,BDCはOACに比べFDG-PET/CTで低集積,またGlut-1発現の低下していることが判明した。BDCは糖代謝の側面からも肝内胆管癌の一亜型であると言える。また,Gd-EOB-DTPA造影MRIのEOB肝細胞相では肝細胞癌の10-15%に細胞膜トランスポーターのOATP1B3の発現とともに,腫瘍の造影効果が示されているが,肝内胆管癌でのこれらの所見の出現率,機序は不明である。外科切除された腫瘤形成性肝内胆管癌23例(全例腺癌)を対象とし,Gd-EOB-DTPA造影MRIの所見とOATP1B3発現を比較したところ,OATP1B3に依存しないEOB uptakeが肝内胆管癌で見られる知見を得た(未発表)。肝内胆管癌のイメージバイオマーカーとして,FDG-PET/CT,Gd-EOB-DTPA造影MRIの画像所見の有用性ならびにその背景となる分子生物学的所見(グルコーストランスポーター,肝細胞膜トランスポーター)について明らかとすることが出来た。平成29年度は肝内胆管癌(iCCA)の発生母地に応じた生物学的多様性について、画像的所見と病理所見による腫瘤形成性肝内胆管癌(MF-iCCA)の亜分類の対比を行った。外科切除されたMF-iCCA(n=40)を対象とし、術前画像よりMF-iCCAの局在を領域胆管(B-2)、区域胆管(B-3)、亜区域胆管(B-4)に分類し、それらの画像所見(CT、FDG-PET/CT)と病理所見(粘液産生のない増生細胆管に類似した腫瘍をcholangiolocarcainoma(CLC)、粘液産生を伴う腺癌をiCCA)との対比を行った。腫瘤形成性肝内胆管癌のうち末梢に局在するものは乏血である頻度が少なく、SUV-max値が低い傾向にあり、CLC成分を含むものが多いことが判明した。しかしながら各群間には少なからずオーバーラップが見られること、特に肝門部領域における局在判断の一致率が低いことが問題点として挙げられ、よりよい画像バイオマーカーの確立が必要であることが明らかとなった。本研究の目的は腫瘤形成性肝内胆管癌の遺伝子・分子多様を反映したイメージバイオマーカーを確立することを目的としている。

現在までにFDG-PET/CT、Gd-EOB-DTPA造影MRI、ダイナミックCTの有用性が確認出来ているが、遺伝子変異に基づいた検討が出来ていない。Retrospective designであるため、標本の固定状況が不良であることが一因であるが、本年度は新鮮標本を用いた検討あるいは遺伝子多型を反映した免疫組織科学染色による分類での検討を行う予定である。IDH1/IDH2遺伝子変異は肝内胆管癌(ICC)の25%ほどに見られると報告されており、この変異を有するICCの予後が良いことが知られている。治療前のICCにおいて、この遺伝子変異を示す画像的特徴が示されれば、予後予測・治療方針決定に大きなインパクトがあると考えられる。今回、41例の腫瘤形成型ICCに対して遺伝子解析を行った。これらのうち14例にIDH1/IDH2変異を見いだした。14例中11例に病変のほとんどに細胆管癌様所見が病理学的に確認された。一方、IDH1/IDH2変異を認めない27例においても13例に細胆管癌様所見を認めたが、その割合はIDH1/IDH2変異を伴うものと比べて軽微であった。さらに41例の腫瘤形成型ICC41例の中でMRI検査が行われた14例について、画像解析を行った(IDH1/IDH2変異有群n=5,IDH1/IDH2変異無群n=9)。このうち、IDH1/IDH2変異例では腫瘤中心部の見かけの拡散係数(ADC値)が有意に低い値(1.3±0.3mm2/s vs 1.8±0.3mm2/s, p<0.05)を示した。病理学的にはIDH1/IDH2変異有群では成熟した間質で占められており、一方、IDH1/IDH2変異無群では線維芽細胞を伴った活動性の線維組織がよく見られた。これらのコホートにおける生存期間の検討では、IDH1/IDH2変異有群はIDH1/IDH2変異無群に比べて長い傾向にあったが、症例数が十分でなかったためか、有意差は示すことは出来なかった。IDH1/IDH2は腫瘍間質の形成に影響を与え、それらがMRI画像(特にADC値)で検出できる可能性が示唆された。本年度は肝内胆管癌の遺伝子プロファイルに関連した画像所見を検討していく予定である。すなわち肝内胆管癌をサイトカインやSTAT3 activationの高発現を認める"炎症型"とoncogenic signal pathwayの活性化とKRASの11q13.2のDNA増殖、BRAFの14q22.1欠損を示す“増殖型"に分類した上で,これらは腫瘍肉眼形態および脈管浸潤あるいはMR信号について検討する。また,画像所見の解析についてはtexture解析の手法を用い,定量評価値も併せて検討し,上記サブタイプを臨床画像から推測する有効な所見(イメージバイオマーカー)を検討する。研究体制・組織図については変更はない。平成29年度に出来なかった遺伝子多型に基づいたイメージバイオマーカーの確立を推進していく。研究体制・組織図については、研究アドバイザーである松井修については役職の変更があるが、指導体制に変更はない。当初予定していたデスクトップパソコンについて,更新の必要が生じなかったため,助成額に余りを生じた。(理由)昨年に引き続き情報処理システムの更新の必要が生じなかったため、助成額に余りを生じている。(使用計画)本年度は前半でシステムの改築と病理診断において予算使用をする。また、研究結果を国際学会で発表するための旅費として予算使用する。前述の装置の老朽化があるので平成29年度には新たに購入する予定である。