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18世紀西洋の美術解剖学史－美術解剖学とメディカルイラストレーションのつながり

美術解剖学は、現代でも画家や彫刻家のみならず、CGクリエイター、漫画家、イラストレーター、アニメーターなど多くの人体を扱うクリエイターから支持を受ける。しかし国内では18世紀以前の歴史的な調査が行われておらず、当時の学問の変遷を理解するには至っていない。研究代表者はこれまで19世紀の美術解剖学の歴史を調査し、現代的な美術解剖学の歴史が19世紀末に成立したことを明らかにした。また同時期に成立したメディカルイラストレーション教育についても、美術解剖学との関係性を明らかにすることができた。本研究では、18世紀の美術解剖学およびメディカルイラストレーションの歴史を明らかにすることを目的としている。
『分子カルテ』：タンパク質を生体内イベントの記録媒体と考える網羅的修飾解析

タンパク質は、病態由来の生理的・化学的ストレスにより様々な化学修飾(酸化、糖化、脂質化など)を受ける。とりわけ豊富に存在し、主標的となる主要タンパク質は、『生体内イベントの記録媒体』となる。申請者は、アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン上の化学修飾解析システムの構築・分子カルテとしての利用を目的とし以下の研究成果を得た。1アルブミン上の網羅的修飾解析法を確立し、個人により修飾状況が違う事を明らかにした。2ヘモグロビン上の酸化・糖化・脂質化修飾の高感度同時解析法を確立した。3表皮ケラチン上のUV照射による酸化状態の解析法を開発し、表皮のUVダメージを非侵襲的に評価可能な事を明らかにした。タンパク質は、病態等の生理的・化学的ストレスにより様々な化学修飾(酸化、糖化、脂質化など)を受ける。更にその修飾は、酵素的な修飾と同様、高次構造・活性変化を惹起し、病態への関与が示唆される。先に申請者らは、タンパク質の網羅的発現解析である『プロテオミクス』と同様、病因タンパク質中のアミノ酸の化学修飾を網羅的・徹底的に解析する『化学修飾オミクス』が、効率的バイオマーカー探索に有効な事を提唱し、そのコンセプトを確認した。本研究では、修飾の標的となり易い主要タンパク質を『生体内イベントの記録媒体=分子カルテ』とした化学修飾解析法構築を目的とし、以下の研究実績を得た。【アルブミン上の網羅的化学修飾解析法】血清タンパク質の6割を占めるアルブミン上の化学修飾を、網羅的かつ徹底的に解析する方法論を開発した。また、差異解析とMS/MS情報を用いた解析の効率化も達成した。また別途、Cys34-グルタチオン、システイン付加体、薬物-付加体分析の基礎的知見を得た。【ヘモグロビン上の網羅的化学修飾解析法】主要修飾(酸化、ニトロ化、糖化、脂質化)をターゲットとした感度・選択性に優れるスクリーニング系を同様に構築した。【ケラチン上の網羅的化学修飾解析法】皮膚状態評価法として、表皮タンパク質のケラチン上の化学修飾を、テープストリッピングによる非侵襲的サンプリングと簡便な精製法を組合せたLC/ESI-SRM/MS法を開発した。【アルブミン上の網羅的化学修飾解析法】既報のMALDI-TOF/MS法(Goto, Murata, Lee, Oe, 2013, Anal. Bioanal. Chem. , 405, 7383-7395)の効率化を目的に、LC/ESI-MS/MSによる方法論を以下構築した:イムノアフィニティー抽出、異なる消化酵素(トリプシン、Glu-C)・検出モード(正負イオン)、LC分離モード(逆相分配、親水性相互作用)の併用、差異解析ソフト・MS/MSデータの利用。その結果、修飾解析の効率化・信頼性の向上が可能であった。本法により、ヒト正常血漿試料から,36箇所のアミノ酸上に、7種の修飾を同定した(Goto, Kudo, Lee, Oe, 2015, Bunseki Kagaku, 64, 653-659 )。また、RedOxタンパク質としての評価を目的としたCys34-グルタチオン、システイン付加体の分析法、薬物修飾体スクリーニング系開発を目的に、基礎的な知見を得た。。【ヘモグロビン上の網羅的化学修飾解析法】主要修飾(酸化、ニトロ化、脂質化、糖化)をターゲットとした感度・選択性に優れるスクリーニング系の構築を目的に、LC/ESI-SRM/MS法を以下構築した:モデル修飾体の調製と構造解析、主要生成物のSRM条件の最適化。本法により、主要な修飾の高感度なスクリーニングが可能となった(Kojima, Lee, Oe, Anal. Bioanal. Chem.,投稿中)。とりわけ生体中に豊富に存在し、主標的となるアバンダントプロテインは、『生体内イベントの記録媒体』となるため、その修飾解析は新たなバイオマーカー探索法となる。申請者は、血清アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン上の網羅的化学修飾解析システム構築・分子カルテとしての利用を目的として以下の研究実績を得た。1血清アルブミン上の修飾解析法として、血漿中からのイムノアフィニティー精製法、LC/ESI-iontrap-MS/MSによる網羅的修飾解析法、差異解析による効率的修飾スクリーニング法を確立し、個人差による修飾パターンの違いを確認した。2ヘモグロビン上の高感度修飾解析法として、酸化・ニトロ化・糖化・脂質化ヘモグロビンをin vivoで調製し修飾位置と共に同定し、前処理法を含め、主な修飾体の高感度一斉解析法としてのLC/ESI-SRM/MS法を確立し、健常人全血からも酸化修飾(α-Met32,76,β-Met55,β-Trp15)、マロンジアルデヒドおよび糖付加体(α-Val1)を確認できた。3表皮ケラチン上のUV照射による酸化位置を同定(Met259,262,296 in K1)、LC/ESI-SRM/MS法を開発し、これを指標とした表皮のUVダメージおよびサンスクリーン剤の影響を非侵襲的に評価可能な事を明らかにした。またその過程で、on-tape消化法がtape-stripping法により採取したケラチンの回収率向上に効果的である事を見出した。タンパク質は、病態由来の生理的・化学的

ストレスにより様々な化学修飾(酸化、糖化、脂質化など)を受ける。とりわけ豊富に存在し、主標的となる主要タンパク質は、『生体内イベントの記録媒体』となる。申請者は、アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン上の化学修飾解析システムの構築・分子カルテとしての利用を目的とし以下の研究成果を得た。1アルブミン上の網羅的修飾解析法を確立し、個人により修飾状況が違う事を明らかにした。2ヘモグロビン上の酸化・糖化・脂質化修飾の高感度同時解析法を確立した。3表皮ケラチン上のUV照射による酸化状態の解析法を開発し、表皮のUVダメージを非侵襲的に評価可能な事を明らかにした。【アルブミン化学修飾オミクス】<目的>年代別、喫煙/非喫煙血清、生活習慣と化学修飾との関連を把握する。<方法>健常人ボランティアの年代別(20、30、40、50代)の喫煙・非喫煙、生活習慣ごとに血清を上記分析法で測定する(各群、n=5)。および患者血清(高血圧、糖尿病など市販のもの)。LC/ESI-MS/MSにより、標的化学修飾の消長を対照群ごとに解析する。【生体試料からのケラチン化学修飾オミクス】<目的>病態と化学修飾との関連を把握する。<方法>アレルギー性皮膚炎患者と健常人の表皮試料を得、測定する(各群、n=5)。LC/ESI-SRM/MSにより、標的酸化修飾の消長を対照群ごとに解析する。臨床分析化学
液体超急冷した金属間化合物のミクロ組織構造と相安定性

本研究のまとめとして,主としてNi_3AlとTiAlを代表する種々の金属間化合物についての液体超急冷実験の成果を要約すると以下のとおりである。1)TiAlの液体超急冷組織の観察結果から,これまでに明確にされていなかった。TiーAl 2元系平衡状態図におけるαTi相,Ti_3Al相,TiAl相間の相境界関して信頼できる評価を得ることができた。2)Ni_3Alの液体超急冷組織に出現する準安定相の出現傾向におよぼす第3元素添加の効果を系統的に調べた結果,その出現を抑制する添加元素は同時にNi_3Alの延性を改善する元素であることが明かとなった.この2つの現象がいかなる理由で同時に起こるのかについては不明であるものの金属間化合物の構造用材料としての実用化のネックとなっている延性の欠如を解決する方策の一つとして有用であると考えられる.本研究のまとめとして,主としてNi_3AlとTiAlを代表する種々の金属間化合物についての液体超急冷実験の成果を要約すると以下のとおりである。2)Ni_3Alの液体超急冷組織に出現する準安定相の出現傾向におよぼす第3元素添加の効果を系統的に調べた結果,その出現を抑制する添加元素は同時にNi_3Alの延性を改善する元素であることが明かとなった.この2つの現象がいかなる理由で同時に起こるのかについては不明であるものの金属間化合物の構造用材料としての実用化のネックとなっている延性の欠如を解決する方策の一つとして有用であると考えられる.本年度は主としてNi_3AlならびにTiAl系金属間化合物について合金の組成ならびに溶製方法の検討、そして液体超急冷プロセスの選択、得られた超急冷薄帯の組織ならびに結晶構造の評価方法等に関する基礎的研究を実施した。Ni_3Al合金についてはAl量を2426at%とした合金をア-ク溶解により溶製し、これをハンマ-アンビル法で超急冷して得られた薄帯の透過電子顕微鏡観察を行い非平衡相ならびに準安定相の出現の有無とAl量の関係について新たな知見を得た。これらについては部分的に別紙のとおりの研究発表を行った。TiAl系合金については、まずAl量を変えたTi_3Al金属間化合物についてNi_3Alと同様の手法によって急冷薄帯を作製することを試みたが、この場合は表面での酸化物形成によって超急冷が効果的に行えないことが判明した。このため、現在トリア-ク式溶解炉の銅ハ-スを改造することにより高真空中でのハンマ-アンビルタイプの超急冷を可能にする努力を行っている。これらと平行して、CuPtなどその他の金属間化合物数種を選択して超急冷実験を開始している。これら超急冷した合金について示差熱分析法等を用いて非平衡状態から平衡状態への遷移過程を調べるとともに、それにともなう組織変化と対応させながら特定の結晶構造を有する金属間化合物の相安定性について総合的な評価を展開して行けるものと考えている。本年度は平成元年度に引続き主としてNi_3AlならびにTiAl系金属間化合物について、非化学量論組成や第3元素添加の影響にまで範囲を広げ液体超急冷後の微細組織ならびに構成相の結晶構造を調べ、出現する非平衡相や準安定相の組成依存性について検討を行った。Ni_3Al合金においては2元系合金でAl量を2426at%としたもの、Cr添加合金として(Al+Cr)量を2426at%としたもの、さらに2元合金に微量のBを添加したものについて、ハンマ-アンビル法による超急冷後の組織を調べ、NiAl(L1_0-β)相、Ni_5Al_3相などのこれらの組成での非平衡相が出現する傾向が、Alあるいは(Al+Cr)量の増加とともに増加することが明かとなった。このことは化学量論組成からのずれや第3元素添加が平衡状態図に出現する相の固相線を変化させることと関連すると考えられ、示差熱分析などを用いた研究を継続中である。TiAl合金においても、Al量を4856at%に変化させて液体超急冷組織を観察し、平衡状態図から予測されるものとは異なる組織を見いだしている。ここではDO_<22>構造のTi_3Al相との相安定性が重要であるが、これまでに得られた成果からは現在報告されている平衡状態図中のこの相の安定存在領域に誤りがあるのではないかと推定できる。この合金系についてはさらにCr、Si、Niを添加した場合のTiAl(γ)相の安定存在組成領域についても検討を行った。今年度は本研究の最終年度であるため,主としてNi_3AlとTiAlについての追加実験を行い,これまでの研究成果のまとめを行った。本年度に新たに明らかになった成果を要約すると以下のとおりである。1)TiAlの液体超急冷組織の観察結果からこれまでに明確にされていなかったTiーAI2元系平衡状態図におけるαTi相,Ti_3Al相,TiAl相間の相境界に関して信頼できる評価を得ることができた。2)Ni_3Alの液体超急冷組織に出現する準安定相の出現傾向におよぼす第3元素添加の効果を系統的にしらべた結果,その出現を抑制する添加元素は同時にNi_3Alの延性を改善する元素であることが明かとなった。

この2つの現象がいかなる理由で同時に起こるのかについては不明であるものの金属間化合物の構造用材料としての実用化のネックとなっている延性の欠如を解決する方策のひとつとして有用であると考えられる。
PETによる分子・機能イメージングを組み合わせたヒトの認知・注意・感情の機能研究

PETの特徴である高感度を生かした分子イメージング法と脳血流測定による脳機能イメージング法を用いて、ヒトにおける様々な認知機能の脳内処理メカニズムを解明することを目的に研究を実施した。脳内アセチルコリンエステラーゼを生体画像化するために[^<11>C]Donepezilの合成法を確立し、健常人および認知症患者を対象としたPET studyを行った。[^<11>C]Donepezilの脳内分布を定量解析した結果、その分布容積は線条体で最も高く、視床、小脳がこれに次ぎ、前頭葉・側頭葉・頭頂葉などの大脳皮質では中等度であった。健常高齢者に比べてアルツハイマー病患者では、大脳皮質、海馬領域を中心とした分布容積の顕著な低下がみられ、認知機能障害の重症度とよく相関することが確認された。この他、新しい心理学的課題を用いた脳賦活試験をH20-PET、fMRIを用いて実施した。異なるモダリティである視覚情報と聴覚刺激の同時処理メカニズムを解明する目的で、新たな二重課題を作成し、脳賦活試験を実施した。自動車運転シミュレーターを用いた脳賦活試験では、視床・中脳・後部帯状回の脳血流が運転パフォーマンスと関連することを明らかにした。また痒みと痛みの脳内処理メカニズムに関するfMRI研究を実施した結果、後部帯状回および島後部の活動が痒み刺激に選択的であるのに対し、視床の活動が痛み刺激に選択性が高いことを明らかにした。さらに美的感覚の脳内基盤を解明する目的で和音刺激を用いた脳賦活試験を実施したところ、島皮質、左中側頭回、前部帯状回が美的感覚の受容に深く関与することを明らかにした。
細胞間で同調する周期性インスリン分泌の定量的生物発光イメージング解析

膵島β細胞の同調した周期性インスリン分泌は、糖尿病のインスリン分泌障害と密接に関係することが知られているが、簡便に解析できる細胞株や解析手法が無かったことから、その分子機構はほとんど不明なままである。これまでの研究から、独自開発の「分泌タンパク質のビデオレート生物発光イメージング法」を用いて、グルコース刺激による周期性インスリン分泌の可視化が可能な発光膵β細胞株(iGL細胞)を樹立した。三次元(3D)培養を行なった膵島様iGL細胞塊(スフェロイド)で生物発光イメージングを行った結果、細胞塊全体が完全に同調した周期性インスリン分泌が1時間以上持続するという、親株のINS-1E細胞を含めた他の細胞株では例のない特長を示した。さらにiGL細胞が定常発現するヒトインスリンとガウシアルシフェラーゼ(Gaussia Luciferase,GLase)の融合タンパク質(Insulin-GLase)の分泌については、生物発光イメージングに加えてルミノメーターを用いた定量解析が可能である。iGL細胞のグルコース応答性インスリン分泌について、ルミノメーターによる発光測定法と一般的に利用されているELISA法を比較した結果、発光測定法は検出感度が100倍以上高く、解析時間とコストも大幅に削減できた。このことからiGL細胞は同調性インスリン分泌機構解析と糖尿病薬の評価に有用と考えられた。次に、還元剤や細胞外マトリックスの有無など、iGL細胞を用いたグルコース応答性インスリン分泌を解析するための培養条件について最適化を行った。その結果、メルカプトエタノールやモノチオグリセロールなどの還元剤は、細胞の増殖には必須ではないが、グルコース応答性を高める上で必要であった。また培養器具のコーティング剤として、ポリDリジンよりも8倍希釈したマトリゲルの方が、高い細胞接着とグルコース応答性を両立させる上で、適していると考えられた。前年度の論文発表(Suzuki et al. BBRC, 2017)により、企業からiGL細胞の取り扱いについて申し入れがあったことを受けて、今年度は、還元剤や細胞外マトリックスの有無など、グルコース応答性インスリン分泌をルミノメーターで安定して測定できるiGL細胞の培養条件を検討し、最適化を行うことができた。このことにより、iGL細胞を周期性インスリン分泌の基礎研究や糖尿病薬の開発・評価に広く利用できる基盤ができた。その中で生物発光イメージング解析を行った結果、細胞集団で同調した周期性インスリン分泌を示す実験条件では、ルミノメーターによる測定によるグルコース誘導率も高く、インスリン分泌の同調性は、インスリン分泌量を増大させることが示唆された。また、iGL細胞の蛍光イメージングによる分泌小胞動態や細胞内カルシウム濃度測定と生物発光イメージングによる分泌動態解析の比較も進めた。以上のことから本研究は順調に進展していると考えている。平面(2D)培養におけるiGL細胞の同調した周期性インスリン分泌を生物発光イメージングおよびルミノメーター測定により安定して定量解析できる実験系を確立したことから、次に三次元(3D)培養条件での最適化も行う。また、蛍光イメージングと生物発光イメージングによる解析を行い、同調した周期性インスリン分泌における分泌小胞動態と細胞内カルシウム濃度変化について解析を進める。最終的に、これらの研究成果について、学術論文発表を行う。膵島β細胞間の同調性インスリン分泌機構及び糖尿病のインスリン分泌障害は不明な点が多い。本課題では、三次元(3D)培養細胞のタンパク質分泌動態を定量的に可視化できる独自開発の「分泌タンパク質のビデオレート生物発光イメージング法」を用いて、グルコース刺激による同調性インスリン分泌動態とその制御機構を明らかにすることを目的とし、研究を進めた。ヒトインスリンとガウシアルシフェラーゼ(Gaussia Luciferase,GLase)の融合タンパク質をレポーターとし、水冷EM-CCDカメラを備えた顕微鏡システムで生物発光イメージングを行い、タンパク質分泌動態を300-500 ms/frameで可視化解析した。Insulin-GLaseを一過性発現させた単離ラット膵島では、高グルコース刺激により膵島表層全体が一斉に同調して周期変動する分泌の発光シグナルが可視化された。ラット膵β細胞株(INS-1E細胞)から新規に樹立したInsulin-GLase定常発現株(iGL細胞)では、三次元(3D)培養したスフェロイドにおいて、単離ラット膵島と同様に、グルコース刺激で細胞集団全体が同調する周期性インスリン分泌が1時間以上観察された。一方グリベンクラミド刺激では、刺激直後から3回程度の同調性インスリン分泌が観察されて徐々に同調性が失われた。iGL細胞は、生物発光イメージング解析に加えて、ルミノメーターを用いた発光測定により簡便にインスリン分泌の相対定量解析が可能であり、細胞密度および細胞培養時間に比例して、インスリン分泌量が増大することが示された。以上の結果から、生物発光イメージング法により、3D培養細胞におけるタンパク質分泌動態の可視化が可能であり、細胞間接着がインスリン分泌部位の形成および同調性と分泌量の増大に重要であることが示唆された。Insulin-GLaseを一過性発現させたINS-1E細胞の生物発光イメージングでは、インスリン分泌における細胞間の同調性や個々の細胞における周期性がほとんど観察されなかったのに対して、INS-1E細胞から選別を行って樹立したInsulin-GLase定常発現株であるiGL細胞は、グルコース刺激時に同調性インスリン分泌を示した。このように細胞集団で完全に同調した周期性インスリン分泌を簡便に解析可能な細胞株は他に例がなく、iGL細胞は、極めて有用な細胞株であると考えられる。

また、本研究成果は、3D培養細胞におけるタンパク質分泌を簡便に定量解析する初めての手法を提供しており、細胞塊(スフェロイド)を扱うことが必須となる再生医療研究など、生理的培養条件として注目されている3D培養細胞を用いた研究に広く応用することが期待できる。以上のことから本研究は順調に進展していると考えている。膵島β細胞の同調した周期性インスリン分泌は、糖尿病のインスリン分泌障害と密接に関係することが知られているが、簡便に解析できる細胞株や解析手法が無かったことから、その分子機構はほとんど不明なままである。これまでの研究から、独自開発の「分泌タンパク質のビデオレート生物発光イメージング法」を用いて、グルコース刺激による周期性インスリン分泌の可視化が可能な発光膵β細胞株(iGL細胞)を樹立した。三次元(3D)培養を行なった膵島様iGL細胞塊(スフェロイド)で生物発光イメージングを行った結果、細胞塊全体が完全に同調した周期性インスリン分泌が1時間以上持続するという、親株のINS-1E細胞を含めた他の細胞株では例のない特長を示した。さらにiGL細胞が定常発現するヒトインスリンとガウシアルシフェラーゼ(Gaussia Luciferase,GLase)の融合タンパク質(Insulin-GLase)の分泌については、生物発光イメージングに加えてルミノメーターを用いた定量解析が可能である。iGL細胞のグルコース応答性インスリン分泌について、ルミノメーターによる発光測定法と一般的に利用されているELISA法を比較した結果、発光測定法は検出感度が100倍以上高く、解析時間とコストも大幅に削減できた。このことからiGL細胞は同調性インスリン分泌機構解析と糖尿病薬の評価に有用と考えられた。次に、還元剤や細胞外マトリックスの有無など、iGL細胞を用いたグルコース応答性インスリン分泌を解析するための培養条件について最適化を行った。その結果、メルカプトエタノールやモノチオグリセロールなどの還元剤は、細胞の増殖には必須ではないが、グルコース応答性を高める上で必要であった。また培養器具のコーティング剤として、ポリDリジンよりも8倍希釈したマトリゲルの方が、高い細胞接着とグルコース応答性を両立させる上で、適していると考えられた。前年度の論文発表(Suzuki et al. BBRC, 2017)により、企業からiGL細胞の取り扱いについて申し入れがあったことを受けて、今年度は、還元剤や細胞外マトリックスの有無など、グルコース応答性インスリン分泌をルミノメーターで安定して測定できるiGL細胞の培養条件を検討し、最適化を行うことができた。このことにより、iGL細胞を周期性インスリン分泌の基礎研究や糖尿病薬の開発・評価に広く利用できる基盤ができた。その中で生物発光イメージング解析を行った結果、細胞集団で同調した周期性インスリン分泌を示す実験条件では、ルミノメーターによる測定によるグルコース誘導率も高く、インスリン分泌の同調性は、インスリン分泌量を増大させることが示唆された。
定量的評価に基づいたメチル化による肺癌の分子病理学的診断法の確立

癌部及び非癌部肺組織100例に対し, Real-time quantitative methylation-specific PCR法を用いて, H-cadherin, RASSFIA, RUNX3各遺伝子プロモーター領域のメチル化率を測定した.各々の遺伝子のメチル化率は, H-cadherin〔癌部: 0-40.16%(平均7.36%),非癌部: 0-5.21%(平均0.6%)〕, RASSF1A〔癌部: 0.09-79.56%(平均14.34%),非癌部: 0-15.39%(平均3.84%)〕, RUNX3〔癌部: 0.03-5771%(平均8.5%),非癌部: 0-12.29%(平均2.44%)〕であり,いずれも癌部で有意にメチル化率が高かったが,非癌部でもメチル化がみられた.次に再発死亡例と生存例に分けてメチル化率を検討すると,調べた3遺伝子いずれにおいても再発死亡群でメチル化率が高かった.次にRASSF1AとRUNX3のメチル化率を元に6群に分けさらに検討を行った.その内訳はRASSFlA : (-) : 3.8%未満, (+) : 3.8%以上15.4%以下, (++) : 15.4%超, RUNX3 : (-) : 2, 6%未満,(+):2.6%以上12.3%以下,(++) : 12.3%超,と設定しA(-, -), B(+, -)もしくは(-, +), C(+, +), D(++, -)もしくは(-, ++), E(++, +)もしくは(+, ++), F(++, ++)とし,予後との関係を検討するとA群の5年生存率は95%, B-E群では約60-70%, F群では20%であった.さらに病理病期I期に限定して検討すると, A-C群は100%, D-E群では約70%, F群では20%であった.このことからメチル化率を調べることにより予後不良群を予測することができ,予後予測マーカー,治療への応用の可能性が示唆された.癌部及び非癌部肺組織100例に対し, Real-time quantitative methylation-specific PCR法を用いて, H-cadherin, RASSFIA, RUNX3各遺伝子プロモーター領域のメチル化率を測定した.各々の遺伝子のメチル化率は, H-cadherin〔癌部: 0-40.16%(平均7.36%),非癌部: 0-5.21%(平均0.6%)〕, RASSF1A〔癌部: 0.09-79.56%(平均14.34%),非癌部: 0-15.39%(平均3.84%)〕, RUNX3〔癌部: 0.03-5771%(平均8.5%),非癌部: 0-12.29%(平均2.44%)〕であり,いずれも癌部で有意にメチル化率が高かったが,非癌部でもメチル化がみられた.次に再発死亡例と生存例に分けてメチル化率を検討すると,調べた3遺伝子いずれにおいても再発死亡群でメチル化率が高かった.次にRASSF1AとRUNX3のメチル化率を元に6群に分けさらに検討を行った.その内訳はRASSFlA : (-) : 3.8%未満, (+) : 3.8%以上15.4%以下, (++) : 15.4%超, RUNX3 : (-) : 2, 6%未満,(+):2.6%以上12.3%以下,(++) : 12.3%超,と設定しA(-, -), B(+, -)もしくは(-, +), C(+, +), D(++, -)もしくは(-, ++), E(++, +)もしくは(+, ++), F(++, ++)とし,予後との関係を検討するとA群の5年生存率は95%, B-E群では約60-70%, F群では20%であった.さらに病理病期I期に限定して検討すると, A-C群は100%, D-E群では約70%, F群では20%であった.このことからメチル化率を調べることにより予後不良群を予測することができ,予後予測マーカー,治療への応用の可能性が示唆された.
環状ポリエステルの流動誘起エステル交換反応を用いた分子量制御と結晶化核剤への応用

本研究の目的は、環状ポリエステルに流動を印加してエステル交換反応を誘起させ、そのエステル交換反応を介した分子間環拡大または自己縮環反応によって環状ポリエステルの分子量を自在に制御することである。この過程で得られた分子量の制御された環状ポリエステルの同種直鎖状ポリエステルに対する結晶化核剤としての利用可能性を検討した。具体的な検討事項は、1環状ポリ乳酸の合成とキャラクタリゼーション(初期分子量の決定)、2流動有機エステル交換反応後の試料の分子量およびその分布測定、3分子量が制御された環状ポリエステルの結晶化核剤としての能力検証である。本研究の目的は、環状ポリエステルに流動を印加してエステル交換反応を誘起させ、そのエステル交換反応を介した分子間環拡大または自己縮環反応によって環状ポリエステルの分子量を自在に制御しようとする試みである。そのようにして得られた分子量の制御された環状ポリエステルの同種直鎖状ポリエステルに対する結晶化核剤としての利用可能性を検討する。この目的を達成するために、1環状ポリエステルの合成とキャラクタリゼーション(初期分子量の決定)、2流動印加後試料の分子量およびその分布測定、3分子量が制御された環状ポリエステルの結晶化核剤としての能力検証を行う。環状ポリエステル試料として、1,3-dimesitylimidazol-2-ylidene (IMes)を用いたL-ラクチドの環拡大重合によって調製される環状ポリ乳酸を用いた。調製した試料の化学構造を現有のNMRおよび赤外吸収分光計で確認し、分子量とその分布をゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって測定した。初期分子量評価の完了した環状ポリ乳酸に対し、所定の融液保持温度にてせん断流動を印加し、本研究提案で期待する流動誘起エステル交換反応を試料に生じさせた。せん断流動によってポリエステル類のエステル交換反応が促進されるという報告を参考に、印加するせん断速度や印加時間などの検討を行った。せん断流動を印加している際に起こる結晶化挙動を、現有のせん断印加機構を組み込んだホットステージと高感度・高解像度顕微鏡画像記録システムによって同時にその場観察し、エステル交換反応を介した分子量制御の最適条件決定を探索した。流動印加後の試料について、再びGPCによって分子量とその分布の測定を行い、エステル交換反応を介した環拡大経由の分子量増大または縮環経由の分子量減少が起こっているか検証した。出発原料である環状ポリ乳酸の初期分子量、エステル交換反応による分子量制御を行うために最適なせん断速度やその印加時間、印加する際の温度などの条件を明らかにすることができたため。前年度までに明らかになったデータに基づき、エステル交換反応を介して分子量を様々に制御した環状ポリ乳酸を調製した。平成28年度は、この分子量制御された環状ポリ乳酸を直鎖状ポリ乳酸に添加して、その結晶化核剤効果の検討を行った。必要な直鎖状ポリ乳酸については、広く用いられている2-エチルヘキサン酸スズを触媒とした重合法によって調製した。また、使用した環状および直鎖状ポリ乳酸の平衡融点の決定は、現有の示差走査型熱量計(DSC)で行った。環状および直鎖状ポリ乳酸を所定の割合(直鎖状ポリ乳酸に対し環状ポリ乳酸を1-10%添加)でブレンドした試料を調製した。結晶化核剤能は試料中の分散状態に強く依存するので、試料の良好な混合を担保する必要があるので、通常利用される混練法ではなく、溶液キャスト法によってブレンド試料を調製した。現有の加熱冷却が可能なホットステージと高感度・高解像度顕微鏡画像記録システムを用いて、ブレンド試料の静置下における結晶化過程をその場観察した。上記の結晶化直接観察の結果、直鎖状ポリ乳酸に環状ポリ乳酸を添加すると、環状ポリ乳酸を添加しない場合に比べ、結晶核数が著しく増大し、核生成速度が増大することがわかった。また、添加濃度を1%から10%に増加させることによって、結晶核数と核生成速度が増加することがわかった。さらに、このような結晶核数や核生成速度の増大を起こすためには、直鎖状ポリ乳酸の分子量に対して最適な環状ポリ乳酸の分子量が存在することがわかった。以上のことから、直鎖状ポリ乳酸に環状ポリ乳酸を添加した場合、環状ポリ乳酸は直鎖状ポリ乳酸に対して有意な結晶化核剤効果を有することがわかった。前年度までに明らかになったデータに基づき、エステル交換反応を介して分子量を様々に制御した環状ポリ乳酸を調製する。今後は、この分子量制御された環状ポリ乳酸を直鎖状ポリ乳酸に添加して、その結晶化核剤効果の検討を行う。必要な直鎖状ポリ乳酸については、広く用いられている2-エチルヘキサン酸スズを触媒とした重合法によって調製する。また、使用する環状および直鎖状ポリ乳酸の平衡融点の決定は、現有の示差走査型熱量計(DSC)で行う。

続いて、環状および直鎖状ポリ乳酸を所定の割合(直鎖状に対し環状を数%添加)でブレンドした試料を作製する。結晶化核剤能は試料中の分散状態に強く依存するので、試料の良好な混合を担保する必要がある。そこで、通常利用される混練法ではなく、溶液キャスト法によってブレンド試料を作製する。まず始めに、現有の加熱冷却が可能なホットステージと高感度・高解像度顕微鏡画像記録システムを用いて、静置下における結晶化過程をその場観察する。引き続き成形加工で重要な流動場における結晶化についてその場観察を行う。以上の結晶化直接観察によって、直鎖状ポリ乳酸に環状ポリ乳酸を添加したときの結晶化核剤効果が明らかにできる。具体的には、添加する環状ポリ乳酸の最適分子量や最適添加量などである。また、静置下と流動場で結晶化核剤能が同一であるか否かについても明らかにできる。高分子物理化学研究の遂行のために必要不可欠なGPC装置が故障するというトラブルを解決するために、想定外の時間を要し、計画していた試料の調製のいくつかが行うことができなかったため。当初の計画では試料の調製は次年度においても行うため、未使用額を次年度経費と合算して使用することとした。
癌幹細胞関連マイクロRNAに着目した悪性胸膜中皮腫の新規治療法の開発

悪性胸膜中皮腫(MPM)は治療抵抗性を示す予後不良な疾患で、病態の解明と新しい治療法の確立が急がれる。治療標的となる癌幹細胞と、癌幹細胞関連マイクロRNA(miRNA)に注目することで、MPMの病態解明と新しい治療法の開発を試みた。網羅的解析から、miRNA-34とmiRNA200ファミリーを候補miRNAとして、その発現や、遺伝子導入による幹細胞分子マーカー発現、細胞増殖や薬剤感受性の変化について解析を終了し、細胞株から癌細胞特性をもつ細胞を抽出し、解析することで、新たな候補miRNAを同定することを試みている。悪性胸膜中皮腫は従来の治療に抵抗性を示す予後不良な疾患であり、その病態の解明、並びに新しい治療法の確立が急がれる。癌幹細胞は自己複製能・多分化能を備え、薬剤・放射線治療に対しても高い抵抗性を示すことが報告されており、新しい癌治療戦略における標的と考えられる。マイクロRNA (以下、miRNA)はRNA干渉によりタンパク質の発現を制御するが、癌幹細胞と関連のあるmiRNAが報告され、新規治療法に結びつく可能性が示唆されている。本研究の目的は、悪性胸膜中皮腫における癌幹細胞特性に関連するmiRNAを同定・解析し、悪性胸膜中皮腫の病態の解明と新しい治療法の開発を目指すことである。本研究では3年間の研究期間内で以下の項目を検討する。#1.癌幹細胞特性に関連したmiRNAをエピジェネティクス異常、薬剤耐性癌幹細胞様細胞に着目して網羅的解析により同定し、その機能を解析する。#3. #1で同定したmiRNAの薬剤・放射線感受性の改善効果を検討する。初年度は、#1を目的として、網羅的解析を行い、標的miRNAとして、miRNA-200ファミリーに着目して、解析を行っている。miRNA-200ファミリーは、薬剤体制、上皮間葉系移行などに関与することが報告されており、本研究の標的miRNAとなり得ると考え、現在、様々な悪性胸膜中皮腫細胞株でmiRNA-200ファミリーの発現状況を確認している。悪性胸膜中皮腫(MPM)は従来の治療に抵抗性を示す予後不良な疾患であり、その病態の解明、並びに新しい治療法の確立が急がれる。本研究の目的は、MPMにおける癌幹細胞特性に関連するmiRNAを同定・解析し、MPMの病態の解明と新しい治療法の開発を目指すことである。網羅的解析から候補miRNAをmiRNA-34 family(特にmiRNA-34b/c)とmiRNA-200family(特にmiRNA-200c)として、発現を確認したところ、多くのMPM細胞株でその発現が低下していることを確認したため、miRNA-200c発現ベクターによる細胞導入実験を行ったが、幹細胞分子マーカーの発現変化や細胞増殖、白金製剤・葉酸拮抗剤などのへ薬剤感受性に変化を認めなかった。そこで、幹細胞特性を持つ細胞のみをソーティングし、網羅的解析を行い、候補miRNAを絞り込むこととした。手技の確立に苦労をしたが、これまでYUMC63、YUMC64、H2052について、幹細胞特性を持つ細胞の抽出が完了して、現在miRNAアレイ解析の準備を行っている。胸部悪性腫瘍本年度は、網羅的解析などから、候補miRNAの絞り込みと、候補miRNAの発現レベルについて、薬剤耐性株・IL6長期暴露株などの様々な細胞株で、検討する予定であるが、薬剤耐性株の樹立に難渋しており、その部分のみ遅れている。薬剤耐性株が樹立できない場合は、他の細胞株で樹立を試みるが、難しければ、薬剤耐性株での検討は、次年度以降とし、次年度の計画を実行することを予定している。本年度は、#2、3が検討項目となる。候補miRNAの機能解析が終了し次第、候補miRNAの発現抑制ベクター、または強発現ベクターを作成して、#2の検討に移る予定である。

本研究は3年計画であり、次年度(2年目)以降も継続して研究を行う予定であるため。薬剤耐性株の樹立を試みるとともに、候補miRNAの機能解析をさらに推し進める。候補miRNAの絞り込みが終了すれば、計画に基づいて「miRNAの悪性胸膜中皮腫細胞株に対する抗腫瘍効果の検討(in vitro& in vivo)」「同定されたmiRNAの薬剤・放射線感受性の改善効果の検討(in vitro)」を行っていく。
日本美術にみる「死のイメージ」の歴史的変遷

本研究は、かつてわが国古代中世期の人びとが心中に思い描いた「死のイメージ」--いかに他者の死を哀しみ悼み、また、自己の死を怖れつつも受け入れたのか?--の歴史的変遷を美術史学の立揚から考察しようと企てるものである。本研究は次の三つの柱により構築される。(A)物語のなかの「死のイメージ」(仏教説話画に描かれたイメージ解釈)、(B)儀礼のなかの「死のイメージ」(仏教儀礼における絵画・彫刻など視覚イメージの機能分析)、(C)社会のなかの「死のイメージ」(肖像画など視覚媒体による故人の顕彰の社会構造分析)。このうち(A)に関しては、主として聖衆来迎寺本六道絵について、その調査・研究を行った。また(B)に関しては、主として臨終行儀について、儀礼の場にまつられた仏像・仏画の機能について考察を行った。さらに(C)に関しては、主として足利将軍像など権力者の肖像画について、その調査・研究を行った。以上、三つの柱の統合の上に、共同幻想とも呼ぶべき仮想的なイメージの問題が社会構成員一人ひとりの現実的な「死」の問題と深く関わることが明らかにされた。今年度の研究は、1,仏教説話画2,肖像美術3,当該テーマに関する近接領域の研究の現状調査、の3点にまとめられる。各項毎に研究の進捗と今後の課題について記す。1,仏教説話画。これまで研究代表者は二河白道図や六道絵など我が国古代中世の説話画について少なからず研究論文を発表してきた。今年はこれまでの研究を振り返り、それらを一つの構想のもとにまとめるよう尽力した。「死のイメージ」という観点からそれらを整理し直してみたとき、これまで個別作品としてのみ考察してきた数々の説話画遺品(仏伝図・法華経絵・浄土教絵画等)に通底する説話画の視覚構造(見る者/見られる者、みえるもの/みえないもの...といった二項対立)が解釈された。こうした考察の成果の一部は次年度に論文(著書)刊行もしくは口頭発表の予定である。2,肖像美術。研究代表者にとって新しいテーマとして肖像美術の研究に着手した。この分野は近年学会でも活況を呈しているが、その多くは像主の特定あるいは似絵をめぐる考察である。それに対して、研究代表者の関心は肖像の機能にある。葬送葬礼において故人の肖像を祀る事例を文献史料から拾い出し、現在遺品についてその造像背景がわかるものをリストアップした。そうした遺品は歴史的資料として扱うよりも、バルトの云う「プンクティウム」の視座から個別に考察すべきであると考える。本年度、文献・写真資料ともに相当数入手できたので、次年度以降は個別作品研究に着手する予定である。3,近接領域。「死のイメージ研究」というテーマ設定自体が日本美術史学にとっては未開拓な領域であるため、それに関して他の近接研究領域から多くの情報を仕入れることに今年は力を注いだ。特に西洋美術史学(New Art History)、日本文学研究(テクスト論・記号論)、文化人類学(構造論)から学んだ点が多く、今後の研究に活かしていきたいと思う。本研究は、かつてわが国古代中世期の人びとが心中に思い描いた「死のイメージ」--いかに他者の死を哀しみ悼み、また、自己の死を怖れつつも受け入れたのか?--の歴史的変遷を美術史学の立場から考察しようと企てるものである。(A)物語のなかの「死のイメージ」(六道絵など仏教説話画に描かれたイメージ解釈)、(B)儀礼のなかの「死のイメージ」(臨終行儀など仏教儀礼における絵画・彫刻など視覚イメージの機能分析)、(C)社会のなかの「死のイメージ」(肖像画など視覚媒体による故人の顕彰の社会構造分析)。以上、三つの柱の統合の上に、共同幻想とも呼ぶべき仮想的なイメージの問題が社会構成員一人ひとりの現実的な「死」の問題と深く関わることが明らかにされる。上記のテーマのうち、本年度は特に(A)に関する研究が大きく進展した。

すなわち、二河白道図・聖衆来迎寺本六道絵・京都国立博物館ほか分蔵病草紙・地獄極楽図屏風・山越阿弥陀図についての研究論文(19902000年間に学会誌や大学紀要等に既発表)に新たに全面的な加筆訂正を施し、論文集として出版(『仏教説話画の構造と機能-此岸と彼岸のイコノロジー-』中央公論美術出版・2003年3月刊)。また同書の序論では古代近世初期に至る死のイメージを概観し、そこでは肖像画等についても多く言及。また最終章は「臨終行儀の美術」と題し、死の儀礼を分析。これによって(B)(C)に関する研究も進展をみた。ほかに論文形式ではなく、新聞紙上にコラム連載というかたちで死へと至る老いの問題を取り上げ論じた(「老いの図像誌-仏教美術十選-」日本経済新聞2002年10月4日21日)。多くの読者から投書や問い合わせがあり、その反響ゆえに、研究の社会的な貢献を幾ばくか果たし得たと思う。本研究はかつて我が国古代中世期の人々が心中に思い描いた「死のイメージ」--いかに他者の死を哀しみ、また、自己の死を畏れつつも受け入れたのか?--歴史的変遷を美術史学の立場から考察しようと企てるものである。本研究は次の三つの柱により構築される。(A)物語のなかの「死のイメージ」(六道絵など仏教説話画に描かれたイメージ解釈)、(B)儀礼のなかの「死のイメージ」(臨終行儀など仏教儀礼における絵画・彫刻など視覚イメージの機能分析)、(C)社会のなかの「死のイメージ」(肖像画など資格媒体による個人の顕彰等の社会構造分析)。以上、三つの柱の統合の上に、共同幻想とも呼ぶべき仮想的なイメージの問題が社会構成員一人ひとりの現実的な「死」の問題と深く関わることが明らかにされる。上記のテーマの結節点に位置すると目される作品として、本年度はとくに家原寺蔵行基菩薩行状絵伝(重要文化財)について深く考察をなした。すなわち、まず2003年夏に奈良国立博物館に於いて当該作品の実地調査、同年12月には比較対象作品として西大寺所蔵行基菩薩行状絵巻(未指定作品)を実地調査、さらに2004年冬には堺市教育委員会文化財保護課にて聞き取り調査を行った。併せて唐招提寺所蔵行基菩薩坐像(重要文化財)、東大寺蔵東大寺縁起絵などさらになる比較作品についてデータを収集し、『行基菩薩行状絵詞』を精読することにより、当該作品についてかつてなされたであろう絵説き法会の場について考察をした。こうした調査および考察の結果は次年度中に口頭発表もしくは活字論文として発表の予定である。ほかに美術史学会東支部主催シンポジウム「仏教と女性」にパネラーとして参加した。ジェンダーの視点から新たに「死のイメージ」をめぐって考察する機会を得ることができた。本研究は、かつてわが国古代中世期の人々が心中に思い描かれた「死のイメージ」--以下に他者の哀れみ悼み、また、自己の死を恐れつつも受け入れたのか?--歴史的変遷を美術史学の立場から考察しようと企てるものである。(A)物語のなかの「死のイメージ」(六道絵など仏教説話画に描かれたイメージ解釈)、(B)儀礼のなかの「死のイメージ」(臨終行儀など仏教儀礼における絵画・彫刻など視覚イメージの機能分析)、(C)社会のなかの「死のイメージ」(肖像画など視覚媒体による故人の顕彰の社会構造分析)。以上、三つの柱の統合の上に、共同幻想とも呼ぶべき仮想的はイメージの問題が社会構成員一人ひとりの現実的な「死」の問題と深く関わることが明らかにされる。
質量分析法を用いたリボソーム複合体のsemi-in vivo溶液構造解析

細胞内の巨大タンパク質複合体について、その構造ダイナミクスを検出・解析することで生体内での機能解析を推し進めていくために、単細胞生物(大腸菌)と高等動物(ヒト培養細胞HEK293)の細胞から直接取り出したリボソームをターゲットに質量分析とH/D交換を用いた動的構造解析法の開発を行った。H/D交換反応を終えたのち粗精製やマトリクス溶液の最適化により、1mg以下の細胞の超音波破砕液からリボソームタンパク質の構造変化を一斉に捉える測定法を確立することに成功した。この方法により遺伝子クローニングや大量発現を介さず、見たい生物個体から直接タンパク質複合体の構造変化を捉えられることが示された。多くの抗生物質がターゲットとしている70Sリボソームは3種類のRNAと55種類のタンパク質によって構成される超巨大な複合体であり、その構造機能相関は主にX線結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡によって大きく解明が進んだ。それらの情報は座標情報を与えかつ高分解能であるが、構造情報を応用するには溶液構造でかつ細胞外の刺激に対する経時的な構造変化について計測することが重要である。それらの課題を解決するため、本研究ではMALDI-TOF型質量分析とH/D交換による質量変化を用いて、精製物ではなく細胞の持つ内在性リボソームが細胞外刺激に対してどのような構造変化を引き起こすのかを測定する測定法開発を行った。初年度はE.coliを対象に測定法開発・最適化を行った。申請段階で菌体そのものをMALDIプレートに載せマトリクスを添加するだけで30を超えるリボソームタンパク質のピークを得られていたが、有効な解析を行うために2つの課題があった。一つ目はH/D交換実験に適用するには菌体内リボソームを重水へ同時に曝す必要があること、二つ目はその処理による各ピークのブロードニングを超えるS/N比で測定を行う必要がある点であった。一つ目の課題はパルス超音波による細胞膜破壊で解決を図った。二点目は溶液中のCellデブリと脂質成分によるS/N比の低下を多段階の遠心処理で回避し、ピーク感度をマトリクスの溶液調整によって最適化した。その結果1mgの細胞に10uLの重水を加えてH/D交換を行いパルス超音波処理と多段階遠心を行うことで、45種類のリボソームタンパク質のダイナミクスを一斉検出することに成功し、細胞内リボソームの構造変化情報を得る基盤が構築できた。細胞内の巨大複合体構造(本申請内ではリボソームに絞って)のダイナミクスを解析し、その複合体の生体内での機能解析を行うために、質量分析とH/D交換法を用いた分析法の開発、及びその利用による生命現象の解明を進めている。本年度は大きく2つの研究を進めた。一つ目は初年度に開発した1mg大腸菌細胞抽出液のリボソームダイナミクスを検出する方法を高度化しつつ、抗生物質を使った応用実験に着手した。リボソーム構造の動きをLOCKする作用を持つフシジン酸を用いた阻害実験では、大腸菌に一定の時間と濃度で抗生物質を作用させ、細胞を一度洗った後に微弱なパルス超音波による膜破壊と重水投与を同時に行う。その後遠心分離で数分間分離し、2段階の上精処理を経てMALDIーMSによる測定を行った。結果としては細胞のフシジン酸排出機構の速度が速く、mM濃度の実験でも顕著な差を検出できていない。今後は構造変化こそ少ないが確実に作用するゲンタマイシンなどを用いて更なる実験を進める。二つ目は真核生物細胞(ヒト由来のHEK293T)を用いた方法論開発を行った。基本的には大腸菌の時と似た方法であるが、蛋白質数が多いことや脂質の性質の違いで当初全く検出できなかったが、溶媒条件等の最適化で現状では約20程度の蛋白質について帰属できた。他にも多くのピークが検出できているため、それらの同定作業を行っており、翻訳後修飾による変化などを含めて、次年度の成果が期待される。細胞内の巨大複合体構造分子について、その構造ダイナミクスを検出・解析することで生体内での機能解析を推し進めていくために、質量分析とH/D交換を用いた分析法の開発及びその利用による生命現象の解明を目指している。中でも本研究課題では他の溶液構造解析では困難とされている分子量が2MDaを超える巨大なリボソーム複合体について50個を超える様々なタンパク質の重水素取り込み速度を一斉検出することで動的構造変化を解析する研究を進めてきた。H25年度は大腸菌の菌体から直接リボソームの情報を取りだし、55あるタンパク質のうち45個についてダイナミクスの情報を得る系を確立した。26年度ではフシジン酸等を用いた大腸菌リボソームの構造の動きを止める阻害実験を進めながら、HEK293細胞を用いたヒト由来リボソーム検出系に着手した。最終年度の27年度では本研究課題での最大の目標である高等動物由来のリボソーム構造変化を検出することを目指し、様々な実験を行った。HEK293ヒト由来の細胞のリボソームをターゲットとし、細胞に直接レーザー脱離イオン化を行うなど試みたが、最終的には抽出液を用いることでS/N比の向上を果たした。また、より生体内に近いリボソーム構造の情報を得るために、比較的弱い超音波を使った細胞破砕液をそのままH/D交換に使ったが、粗精製を行えばよりS/N比の高い情報が取れることも分かった。

直接破砕液で34のピークがリボソームタンパク質の質量と一致し、ヒト由来のリボソームについて世界で初めて動的な構造変化を一斉検出可能になった。今回開発した手法は更なる分析前処理の改良により、粗精製画分を用いた阻害実験・相互作用実験などを通じて、これまで困難とされてきた構造解析から巨大複合体の生命現象を解明する道が開かれた。細胞内の巨大タンパク質複合体について、その構造ダイナミクスを検出・解析することで生体内での機能解析を推し進めていくために、単細胞生物(大腸菌)と高等動物(ヒト培養細胞HEK293)の細胞から直接取り出したリボソームをターゲットに質量分析とH/D交換を用いた動的構造解析法の開発を行った。H/D交換反応を終えたのち粗精製やマトリクス溶液の最適化により、1mg以下の細胞の超音波破砕液からリボソームタンパク質の構造変化を一斉に捉える測定法を確立することに成功した。この方法により遺伝子クローニングや大量発現を介さず、見たい生物個体から直接タンパク質複合体の構造変化を捉えられることが示された。原核生物においては高品質な質量分析データを取る方法論を開発できた。一方で真核生物(ヒト)細胞由来のデータにはさらなる改善の余地あり、計画は年次計画通り順調に進んでいる。生物物理学効果の高い抗生物質による原核生物リボソーム構造への作用を、本研究により開発した方法で検出する。この時抗生物質の濃度や、リボソームに直接作用するまでの時間などを計測していく。また真核生物(ヒト培養細胞)による方法論開発を進め、Cell cycleに関連した構造変化まで検出することを目指す。進行速度は概ね計画通りに進行している。試行錯誤の末、当該年度の最大目的であるMSスペクトルのS/N比向上に成功し、帰属可能になったデータ量が計画以上に増加したため、今後の薬剤効果研究に期待が持てる。実験データの精度が想定していたものより良いため、当初の計画よりインパクトのある論文を目指し、次年度の成果を含めて論文投稿するために、投稿時期を次年度に先送りした。初年度で開発した方法を使って、抗生物質を菌体に与えた時のリボソーム構造に対する効果を見る。その時、抗生物質濃度や効果が出るまでの時間を測定することで、薬剤効果とリボソームの立体構造ダイナミクスの関係を直接的に明らかにしていく。英文校閲、論文投稿費用。試薬購入。当初予定していた国際学会による成果報告をより適した学会に変更し、年度を超えた。現在の研究結果によって購入品が変わるため。国際学会による成果報告。試薬購入。