hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー病脳における脳アミロイド・神経原線維変化蓄積機構の解明

アルツハイマー病(AD)では、脳内に沈着したアミロイドβ蛋白(Aβ)が、二次的にTau蛋白からなる神経原線維変化(NFT)を引き起こし痴呆をきたすと考えられている。APを過剰発現するTransgenicmice(Tg)では脳アミロイド沈着は再現できたが、著明な神経細胞死やNFTを示してはいない。Tau遺伝子変異はParkinsonismを伴う家族性前頭側頭型痴呆(FTDP-17)を引き起こすことから、ADの発症機序の解明には、まずTauの遺伝子変異がTauの蓄積と神経細胞死を引き起こすかどうかを解明することが先決と考え、平成12年度は、R406W変異を有するヒト4-repeat-Tauを導入したTgを作製した。大脳の皮質・白質,海馬,扁桃体の神経細胞胞体と突起に著明なTauの蓄積を認め、電顕で細胞質内にStraight tubuleを確認した。大脳皮質で神経細胞の減少と著明なGliosisが認められた。生化学的にSarkosyl不溶性のTauの蓄積を証明した。10月齢で運動機能低下、12月齢で学習記憶の保持障害を再現でき、FTDP-17の動物モデルとして確立した。平成13年度はこのTg脳を組織学的に検索し、蓄積しているTauはリン酸化されていること、リン酸化酵素としてGSK3βの役割が重要であることを明らかにした。既に我々が確立した脳アミロイド沈着を認めるAPPsw miceと交配させ、Double Tgを作成した。APPsw miceと比べて老人斑の大きさ、数に差はみられなかったが、老人斑とかけ離れた海馬の顆粒細胞近傍にGallyas陽性の神経細胞や突起が観察された。以上から、脳アミロイドは老人斑周囲の変性神経突起にリン酸化Tauを蓄積させ、海馬の神経細胞の嗜銀性を増加させると考えられた。Tauによる明らかなAβ蓄積効果はなく、脳アミロイドがADのより本質的な病理学変化と考えられた。アルツハイマー病(AD)では、脳アミロイドβ蛋白(Aβ)アミロイドーシスとともにTau蛋白を主成分とする神経原線維変化の出現が特徴とされている。Tau遺伝子変異はADとは異なるparkinsonismを伴う家族性前頭側頭型痴呆(FTDP-17)を引き起こすことから、ADではAβ増加が脳Aβアミロイドーシスを誘発し、二次的にtauopathyを発生させるものと思われる。Aβを過剰発現するTransgenicmice(Tg)では脳アミロイドーシスは再現できたが、著明な神経細胞死やtauopathyを示してはいない。脳Aβアミロイドーシスがtauopathyを誘発する機序の解明には、まずTauのミスセンス変異がTauの蓄積と神経細胞死を引き起こすかどうかを解明することが先決と考え、Hamster prion protein promoterを用いて変異型(R406W)ヒトfourrepeat tauを導入したTgを作製した。10ヶ月齢Tgの前頭葉・側頭葉の皮質と白質、海馬の神経細胞と神経突起に著明なTauの蓄積を認め、電顕では細胞質内にstraight tubuleが確認された。前頭葉・側頭葉では神経細胞の減少と著明なグリオーシスが認められた。サルコシル不溶性分画のWestern blot解析では68kDのTauのバンドがみられた。10ヶ月齢では運動機能の低下、12ヶ月で学習記憶の保持障害が出現した。このマウスはFTDP-17の動物モデルとして疾患の発生機序と治療法を検討する上で有用であると考えられた。

さらに我々が既に確立したAPPsw miceと交配させ、変異Tau R406W xAPPswマウスを作成しAβアミロイドーシスによる二次性tauopathyの解明を目指している。アルツハイマー病(AD)では、脳内に沈着したアミロイドβ蛋白(Aβ)が、二次的にTau蛋白からなる神経原線維変化(NFT)を引き起こし痴呆をきたすと考えられている。Aβを過剰発現するTransgenicmice(Tg)では脳アミロイド沈着は再現できたが、著明な神経細胞死やNFTを示してはいない。Tau遺伝子変異はParkinsonismを伴う家族性前頭側頭型痴呆(FTDP-17)を引き起こすことから、ADの発症機序の解明には、まずTauの遺伝子変異がTauの蓄積と神経細胞死を引き起こすかどうかを解明することが先決と考え、我々は昨年度、R406W変異を有するヒト4-repeat-Tauを導入したTgを作製した。大脳の皮質と白質、海馬、扁桃体の神経細胞胞体と突起に著明なTauの蓄積を認め、電顕で細胞質内にStraight tubuleを確認した。大脳皮質で神経細胞の減少と著明なGliosisが認められた。生化学的にSarkosyl不溶性のTauの蓄積を証明した。10月齢で運動機能の低下、12月齢で学習記憶の保持障害を再現でき、FTDP-17の動物モデルとして確立した。本年度はこのTg脳を組織学的に検索し、蓄積しているTauはリン酸化されていること、リン酸化酵素としてGSK3βの役割が重要であることを明らかにした。既に我々が確立した脳アミロイド沈着を認めるAPPsw miceと交配させ、Double Tgを作成した。APPsw miceと比べて老人斑の大きさ、数に差はみられなかったが、老人斑とかけ離れた海馬の顆粒細胞の近傍にGallyas陽性の神経細胞や突起が観察された。このことから、脳アミロイドは老人斑周囲の変性神経突起にリン酸化Tauを蓄積させ、海馬の神経細胞の嗜銀性を増加させると考えられた。Tauによる明らかなAβ蓄積効果はなく、脳アミロイドがADのより本質的な病理学変化と考えられた。
マウス乾癬様皮膚炎モデルにおけるアディポネクチンの役割の解明

乾癬患者にメタボリックシンドロームの合併が多いことはよく知られている。近年、アディポネクチンは従来の代謝機能を有するのみならず、免疫反応に関与することが注目されている。今回我々はアディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて乾癬様皮膚炎が増悪し、その皮膚においてIL-17の産生が亢進していることを見出した。IL-17産生細胞は真皮内のVg4陽性gdT細胞であり、アディポネクチンはgdT細胞に作用し、IL-17の産生を抑制した。さらにアディポネクチンの腹腔内投与により、皮膚炎の改善が見られた。これらの結果からアディポネクチンがIL-17の産生を介して乾癬の病態形成に寄与していることが示唆された。アディポネクチン遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスにイミキモドを6日間、連日外用し、乾癬様皮疹を誘導した。その結果、両群マウスにおいて、鱗屑、紅斑、浸潤といった乾癬様皮疹を認めたが、アディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、鱗屑、紅斑、浸潤の増悪がみられた。また、マウス耳にイミキモドを外用し、耳の厚さを評価したところ、アディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、有意に耳の厚さが厚かった。マウスは各群5-7匹ずつ、使用した。次に組織学的評価を行った。皮疹は肉眼的に6日目(5日間外用24時間後)において最も増悪していたため、6日目の背部皮膚を用いて、組織学的検討行った。HE染色にて、アディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、野生型マウスに比べ、表皮の層数、浸潤細胞数の有意な上昇がみられた。免疫組織学的検討において、真皮に浸潤している細胞はMHCII陽性細胞およびCD3陽性細胞であり、両者とも、アディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、陽性細胞数が多くみられた。次に、乾癬様皮疹部で発現している遺伝子の発現量を定量的に評価した。具体的にはイミキモド外用前および外用後24時間、48時間における背部皮膚のmRNA発現量をreal-time PCR法を用いて検討した。検討を行ったサイトカインは1炎症性サイトカインであるTNF-α、IFN-γおよびIL-6、2樹状細胞から産生されるサイトカインであるIL-12p40およびIL-23p19、3Th17サイトカインであるIL-17A、IL-17F、IL-22である。両群マウスにおける外用前のサイトカイン発現に有意差はみられなかったが、1のうちTNFαおよびIL-6、2IL-12p40およびIL-23p19、3IL-17A、IL-17F、IL-22の発現がアディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、野生型マウスに比較し、有意に上昇がみられた平成25年度には、イミキモド外用乾癬様皮膚炎モデルを用い、アディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて野生型マウスに比して、肉眼的、組織学的に乾癬様皮膚炎の増悪がみられることを確認した。さらに、皮膚炎を生じている皮膚のmRNAの発現についてreal-time PCR法により検討したところ、アディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、TNF-alpha, IL-6, IL-12p40, IL-23p19, IL-17A, IL-17F, IL-22などの乾癬の病態形成に関与するサイトカインの発現が有意に上昇していた。平成26年度には皮膚炎を生じている皮膚に浸潤している細胞およびIL-17の産生について細胞内フローサイトメトリー解析を行った。皮膚炎を生じている皮膚ではアディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいてCD3陽性細胞およびIL-17陽性細胞がより多くみられ、両マウスにおいて、IL-17を産生している細胞の85-90%はgdT細胞であった。皮膚におけるgdT細胞にはVg4陽性gdT細胞およびVg5陽性gdT細胞があることが知られており、表皮および真皮に浸潤しているgdT細胞がVg5陽性およびVg4陽性であることをRT-PCR法を用いて確認した。次に、細胞内フローサイトメトリー解析を行ったところ、乾癬様皮膚炎が生じている皮膚において、IL-17を産生している細胞はVg4陽性gdT細胞であった。これらのことから乾癬様皮膚炎モデルにおけるIL-17の産生細胞は真皮内のVg4陽性gdT細胞であり、アディポネクチンの欠損により、これらの細胞浸潤およびIL-17産生の増加がみられることが示唆された。さらにアディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいてはアディポネクチンの腹腔内投与により、皮膚炎の改善が見られた。これらの結果からアディポネクチンが乾癬の病態形成に寄与していることが示唆された。

皮膚科学当初の申請時の予定では、平成25年度の実験計画はアディポネクチン遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスにイミキモド外用による乾癬様皮疹を誘導し、皮疹に差がみられるかを検討し、さらに皮疹部におけるサイトカイン発現について評価を行うものであった。予備実験にて実際にイミキモド外用にて乾癬様皮疹が誘導されることが確認され、さらにアディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、野生型マウスに比較し、皮疹の増悪がみられ、サイトカインの発現解析まで研究は進んでおり、おおむね予定通り、実験が進んでいる状況である。平成25年度の研究実績において、アディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて、野生型マウスに比較し、1TNF-α, IL-6、2IL-12p40, IL-23p19、3IL-17A, IL-17F, IL-22のサイトカインの発現上昇がみられた。12のサイトカインの産生細胞と考えられるマクロファージ、樹状細胞、皮膚角化細胞に対して、アディポネクチンがこれらのサイトカインの産生を抑制するといった抗炎症作用については、過去に我々が報告しているため、今回は3IL-17A、IL-17F、IL-22に注目して、解析をすすめる。まず、IL-17Aの発現はmRNAレベルのみならず、タンパクレベルにおいてもアディポネクチン遺伝子欠損マウスにおいて上昇していることを確認するため、intracellular FACSの解析を行う。具体的にはイミキモド外用前および5日間連日外用後に所属リンパ節から細胞を取り出し、IL-17Aにて標識を行う。その際、IL-17を産生している細胞も同定を行うため、IL-17を産生していると考えられるT細胞の各種マーカーであるCD3, CD4, CD8, γδTCRにて標識を行う。また、実臨床における応用として、抗TNFα抗体や抗IL-17抗体、抗γδTCR抗体の投与にて皮疹が改善するかを検討する。また、その際、アディポネクチン遺伝子欠損マウスと野生型マウスにおいて、皮疹の改善に必要とする抗体量に差があるかどうかも検討を行う。さらに、抗体投与にて皮疹が改善した場合、mRNAレベルでもTNFαやIL-17Aといった皮疹の増悪因子となっているサイトカインの発現の改善がみられるかを検討する。
高機能電極触媒に向けたメソポーラスPt系合金の階層的構造設計

触媒として高い活性を持つことが知られている白金(Pt)は,現在まで電池などの電極や工業触媒(自動車の場合は排気ガスの浄化触媒)として広く用いられている。白金の表面積を大きくすると,露出している白金の表面積が増加するため,触媒としての機能が活性化することが期待できる.ナノ構造化することで,通常の粉宋よりも大幅に表面積を広くすることが可能になる.分子集合体上での金属析出プロセスにも着目し,細孔壁の組成を金属化することにも成功している.これらのメソポーラス金属は,骨格が金属のみから形成し電気伝導性の高い多孔体であり,従来の無機酸化物系メソポーラス物質とは異なる電気化学分野への応用が期待される.具体的には,高い表面積を持つ反応触媒担体電極,二次電池用電極や化学センサー等の電気化学系デバイスや金属触媒等への幅広い応用が期待される.複数の金属イオンを溶存させることで,様々な組成へと展開できることを示してきている.多くの界面活性剤や金属塩を組み合わせることで,これまで不可能であったメソ構造や細孔径の精密な調節も可能となってきた.特に,メソポーラスPtやPt系合金は,次世代のDMFC(メタノール直接型燃料電池)の電極材料として最適であり,電極の多孔質化は,反応面積の増大ばかりでなく,電極中における物質の拡散性が向上し,より高い反応効率を達成することができる.少ないPtの使用量で,最大の活性を生み出す,まさにレアメタルの低減技術であり,資源のない日本にとって重要である.従来の白金黒や白金担持カーボンよりも高い表面積を有しており,それらと比較してメタノール酸化能も数十倍活性がある.コアに金やパラジウムの金属を用いることで,さらに熱的安定性やメタノール酸化反応における活性が大幅に向上している.白金は,触媒として高い活性を持つことが知られており、電池などの電極や工業触媒(自動車の場合は排気ガスの浄化触媒)として広く用いられている。白金の表面積を大きくすると、露出している白金の表面積が増加するため、触媒機能が非常に活性化する。そのため、これまでにもナノ粒子、ナノファイバー、ナノチューブ、ナノ(メソ)ポーラス物質などの様々な白金ナノ材料の合成法が盛んに研究されてきた。また、希少元素の使用量を減らす最近の社会の動きからも、少量の白金で、更に大きい表面積を実現し、高い触媒活性を示す新たな白金ナノ材料の開発が求められている。本研究では、界面活性剤、白金イオン種、溶媒からなる水溶液に還元剤を添加し、金平糖状の形状を有する白金ナノ粒子を高速で合成する。溶液をベースにした合成法を開発する.界面活性剤分子と白金との相互作用を利用し、白金ナノ粒子の表面にナノレベルの凹凸を作り出す。更に、還元剤の量を制御することにより、均一な粒子径を実現し、ナノ粒子が完全に分散した溶液としても得ることができる。表面積は、55m2/g以上であり、今までに報告されているすべての白金ナノ材料中で最も大きい表面積を達成した。また、結晶性も高く熱的安定性も高い.白金以外でも,ルテニウム,パラジウムなどの他の貴金属との合金化を目指し,小型燃料電池の電極材料としての応用を展開している.特に,骨格を合金することによって,さらに活性の高い電極材料を作製できる.Wang Liang研究員は,高機能電極触媒に向けたメソポーラス白金系合金の階層的構造設計という目標を掲げ,白金のナノ構造化を研究してきた.平成22年度では,特に,コアシェル型のナノ粒子の合成に着目してきた.コアとなる材料としては,金やパラジウムなどの金属に着目しそれらのナノ粒子を作製する.そして,その周りにナノポーラス構造化した白金の層で被覆する.コアシェル型の粒子は,ナノポーラス白金粒子と比べ,非常に高いメタノール酸化反応に対する活性を示した.これは,コア金属のサポートにより,反応中のナノレベルの白金粒子の凝集を抑制し,さらにコア金属との界面に形成するヘテロ界面構造が大きく寄与していることによると考えられる.このように,白金の表面積を向上させるばかりでなく,他の金属との融合により,新しい電極触媒の開発につながることを示した.さらに,最近では,シリカナノ粒子を用いて,ナノポーラス白金の中空構造の作製に成功している.シリカナノ粒子の周りにナノポーラス化した白金を被覆し,その後シリカコアをエッチングにより,溶解させる.このように内部に中空構造を作ることで,内部と外部両面からのゲスト種のアプローチが可能となり,高い拡散性を実現することができる.触媒として高い活性を持つことが知られている白金(Pt)は,現在まで電池などの電極や工業触媒(自動車の場合は排気ガスの浄化触媒)として広く用いられている。白金の表面積を大きくすると,露出している白金の表面積が増加するため,触媒としての機能が活性化することが期待できる.ナノ構造化することで,通常の粉宋よりも大幅に表面積を広くすることが可能になる.分子集合体上での金属析出プロセスにも着目し,細孔壁の組成を金属化することにも成功している.これらのメソポーラス金属は,骨格が金属のみから形成し電気伝導性の高い多孔体であり,従来の無機酸化物系メソポーラス物質とは異なる電気化学分野への応用が期待される.具体的には,高い表面積を持つ反応触媒担体電極,二次電池用電極や化学センサー等の電気化学系デバイスや金属触媒等への幅広い応用が期待される.複数の金属イオンを溶存させることで,様々な組成へと展開できることを示してきている.多くの界面活性剤や金属塩を組み合わせることで,これまで不可能であったメソ構造や細孔径の精密な調節も可能となってきた.

特に,メソポーラスPtやPt系合金は,次世代のDMFC(メタノール直接型燃料電池)の電極材料として最適であり,電極の多孔質化は,反応面積の増大ばかりでなく,電極中における物質の拡散性が向上し,より高い反応効率を達成することができる.少ないPtの使用量で,最大の活性を生み出す,まさにレアメタルの低減技術であり,資源のない日本にとって重要である.従来の白金黒や白金担持カーボンよりも高い表面積を有しており,それらと比較してメタノール酸化能も数十倍活性がある.コアに金やパラジウムの金属を用いることで,さらに熱的安定性やメタノール酸化反応における活性が大幅に向上している.
環状ジスルフィドのラジカル環拡大重合による超環状高分子の合成とその特性解析

環状ジスルフィドの単独重合における重合機構ならびに生成ポリマーの解析についての検討を行った。まず、環状ジスルフィドの合成において6員環ジスルフィドであるテトラメチレンジスルフィド(TMDS)をα,ω-ブタンジチオールより合成した。このとき蒸留による精製のみでは微量の原料が存在し、その高い連鎖移動能により重合は著しく遅くなり、生成するポリマーも直鎖状の末端基を有するものであった。一方、メタノールよりTMDSを再結晶により精製すると、その重合性は著しく高くなった。このようにして精製したTMDSの重合はラジカル開始剤なしで非常に容易に重合した。生成ポリマーの核磁気共鳴スペクトルの解析から末端の存在は認められず、大環状ポリマーが生成していることが分かった。さらに、このようにして合成したポリマーをベンジルメルカプタンと紫外線照射下に反応することにより末端基が導入されることが核磁気共鳴スペクトルの解析から確認され、TMDSの重合からは大環状ポリマーが生成していることが明らかとなった。TMDSの重合はDPPHなどのラジカル禁止剤の存在下では進行しないことよりラジカル機構で進行していることが分かった。また、TMDSの重合において生成ポリマーの分子量は重合の進行にともない増大することがGPC測定より分かった。TMDSの重合速度に及ぼすモノマー濃度の依存性の検討から、その依存性は通常のビニルモノマーのそれと比較して非常に高かった。以上ような結果からTMDSの熱重合は環拡大機構により進行していることが明らかとなった。5員環環状ジスルフィドであるリポ酸およびリポアミドの重合を検討した。その結果、両モノマーとの融点以上では容易に重合し、重合速度に及ぼすモノマー濃度の影響においても、高いモノマー濃度依存性を示すことが分かった。また、生成ポリマーの核磁気共鳴スペクトルの解析から大環状ポリマーが生成してることが確認された。
膜の疎水領域でのリポクオリティ認識機構とナノ膜ドメインの解明

電位依存性プロトンチャネルHv1について、これまでに構築した全反射照明蛍光顕微鏡を用いてパッチクランプ膜電位固定同時計測下で経時的にHEK2932細胞へ発現させたmCherry-Hv1融合分子の蛍光シグナルを計測し、膜電位依存的な細胞膜表面へのチャネルの組み込みと思われる信号変化を得ることに、成功した。1分子での計測には、今後発現密度を適度に落とす方策が必要であるが、stopコドンの下流に蛍光分子のコード領域をいれて、低比率でのリードスルーの効果を用いる手法などを活用することで、今後、単一分子レベルでの解析を目指す予定である。電位依存性ホスファターゼCi-VSPについては、フォトマルを用いた電位センサーの動きをVoltage clamp fluorometry法で、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて計測し、酵素領域の動きを非天然アミノ酸Anapのアンバーサプレッサー遺伝学導入手法を用いて定量した結果、酵素ドメイン中にVSP間で保存されているhydrophobicspineは、酵素活性の調節と、電位センサーから酵素活性へのカップリングの両方に増強作用があることを見出した。電位センサーの具体的などのような構造変化がhydrophobicspineを介して酵素活性を活性化するのかの詳細は未だ不明であり、今後の検討が必要であるが、複数の酵素の構造変化の段階依存的に、hydrophobicspineと膜との相互作用が異なる役割を担うと結論した。Anapの蛍光変化の生物物理学的特性を明らかにする解析については、スペクトロフォトメーターを装着したセットの構築を終え、膜電位固定下で波長スペクトル特性の計測に成功した。VSP全長蛋白と基質との共結晶化について複数のコンストラクトから質の良いタンパク質のコンストラクトを得ることに成功し結晶化スクリーニングを行っている。現在得られているコンストラクトの発現精製条件の更なる検討を行い、VSPと基質との共結晶化を更にすすめ、基質のリポクオリティ認識機構の解明を目指す。Hydrophobic spineについて、VCFとAnap蛍光計測と電気生理を組み合わせた解析を進め、電位センサーの構造変化との関係を明らかにすると共に、構造生物学側の解析では分解能の高い構造解析を目指し、膜との相互作用の分子機構に迫る。電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPについては、マウスHv1の点変異体を複数作成し、パッチクランプ計測によりアラキドン酸の作用を調べたところ、作用責任部位を単一のアミノ酸に帰することはできなかった。一方C末端側細胞質領域を欠失させた変異体ではゲーティング速度の加速化は認められたが電流-電圧曲線I-Vのシフトが見らなくなった。I-Vのシフトとゲーティングの加速化は異なる部位に依存する可能性が考えられる。リポソーム再構成系については、どの動物種のオルソログ分子が解析に適するかを検討した。ノイズ解析からの単一チャネル電流量の推定値を比較した結果、ウニ由来SpHv1が最も大きかった。X線結晶化された分子に近いマウス由来Hv1と平行し、SpHv1のタンパク質精製を試みた。電位依存性ホスファターゼVSPについては、基質であるイノシトールリン脂質の特異的な認識機構を明らかにするため、中川研究分担者とともに、基質存在下でのX線結晶化に取り組み、発現、精製条件の検討を行い、素性の良いコンストラクトを得た。酵素領域で膜に面すると予測される部位に変異導入実験をおこなって、電位依存性酵素活性の計測を電気生理学計測および非天然蛍光アミノ酸であるL-Anapを用いた蛍光測定により行ったところ、PTENと保存性の高い疎水性部位がPBMと基質結合ポケットの間に存在し、これが電位依存性酵素活性に必須であることから、新規の膜相互作用部位であると推定された。当初の計画通り、電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPへのアラキドン酸作用部位の特定を試みた。C末端側の細胞質領域を欠失させるとI-Vカーブのシフトが生じなくなることから、ダイマー内サブユニット間にアラキドン酸の作用部位がある可能性が示された。1,電位依存性プロトンチャネルHv1:ダイマー内サブユニット間相互作用をFRETで解析する目的で、これまでアフリカツメガエル卵母細胞での発現が困難であったマウスHv1のN末端側に、アフリカツメガエル卵母細胞に多く発現させることが可能なCi-Hv1のN末端側細胞質配列をつけた分子を作成したところ、アフリカツメガエル卵母細胞で電位依存性プロトン電流が出現することを確認した。このコンストラクトを用いて、S3-S4リンカー部分にシステインの変異を導入し、Cy3とCy5の二重標識を行って全細胞からのFRET計測を試みたところ、Cy3とCy5間で(つまりプロトマー間で)FRETが効率よく生じることが明らかになった。リポソーム再構成系および培養細胞などを用いた1分子計測に必要な全反射照明蛍光顕微鏡のセットアップを行った。また、電位依存的な蛍光変化を観測するために電気生理計測用のアンプと取得装置を設置して、培養細胞から膜電位固定法による蛍光観察を試みた。2,電位依存性ホスファターゼVSP:前年度明らかにされた新規の膜相互作用部位(以下hydrophobic spineと呼ぶ)に着目し、様々なアミノ酸への置換や、酵素内の様々な部位の構造変化の蛍光計測を行った。その結果、L284、F285ともに親水性アミノ酸への変異は電位依存的酵素活性を顕著に減弱させ、疎水性アミノ酸への変異は活性を維持することが判明した。更に芳香環をもつアミノ酸(Phe、Tyr、Trp)への変異は活性を増強することが明らかになった。

中川・研究分担者は、昨年度から引き続き、基質との共結晶化を試みた。本年度は等温滴定型カロリメトリーを用いて各種リン脂質との結合定数を測定し、結晶化に適した安定な複合体の探索を行い,安定な複合体を中心に結晶化スクリーニングを行った。昨年度の解析において電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPへの不飽和脂肪酸の作用にはダイマー内プロトマー間の相互作用が重要であることが判明した。サブユニット間の相互作用を詳細に明らかにするため蛍光分子Cy3、Cy5をアミノ酸に導入して実験を行い、全細胞からのFRET計測が可能であることを確認した。中川・研究分担者とのVSPの基質との共結晶化については精製、結晶化ともに条件検討が十分に行われ、現在良い結晶が得られつつある。一方Hv1/VSOPとアラキドン酸との共結晶化は必ずしも容易ではないことから、X線結晶構造解析以外の解析法を検討していく必要がある。電位依存性プロトンチャネルHv1について、これまでに構築した全反射照明蛍光顕微鏡を用いてパッチクランプ膜電位固定同時計測下で経時的にHEK2932細胞へ発現させたmCherry-Hv1融合分子の蛍光シグナルを計測し、膜電位依存的な細胞膜表面へのチャネルの組み込みと思われる信号変化を得ることに、成功した。1分子での計測には、今後発現密度を適度に落とす方策が必要であるが、stopコドンの下流に蛍光分子のコード領域をいれて、低比率でのリードスルーの効果を用いる手法などを活用することで、今後、単一分子レベルでの解析を目指す予定である。電位依存性ホスファターゼCi-VSPについては、フォトマルを用いた電位センサーの動きをVoltage clamp fluorometry法で、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて計測し、酵素領域の動きを非天然アミノ酸Anapのアンバーサプレッサー遺伝学導入手法を用いて定量した結果、酵素ドメイン中にVSP間で保存されているhydrophobicspineは、酵素活性の調節と、電位センサーから酵素活性へのカップリングの両方に増強作用があることを見出した。電位センサーの具体的などのような構造変化がhydrophobicspineを介して酵素活性を活性化するのかの詳細は未だ不明であり、今後の検討が必要であるが、複数の酵素の構造変化の段階依存的に、hydrophobicspineと膜との相互作用が異なる役割を担うと結論した。Anapの蛍光変化の生物物理学的特性を明らかにする解析については、スペクトロフォトメーターを装着したセットの構築を終え、膜電位固定下で波長スペクトル特性の計測に成功した。VSP全長蛋白と基質との共結晶化について複数のコンストラクトから質の良いタンパク質のコンストラクトを得ることに成功し結晶化スクリーニングを行っている。電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPについては、ダイマー内サブユニット間の相互作用に注目して解析を進める。
新奇な光刺激応答性高分子ゲル基板による細胞挙動の解析

本研究では、近赤外光励起によって可視発光を示すアップコンバージョンナノ粒子を合成し、このナノ粒子が発する可視発光を利用した高分子の光重合や光増感剤の活性化を行うことで、近赤外光照射によって弾性が制御可能な細胞培養基板の作製や、生体深部の光線力学療法が可能になることを見出した。今後、高分子ゲル構造中への複合化や、in vivo実験を進めることで、作製した材料の実用化が期待される。細胞運動は,癌の転移などの病理学的な現象にも関与し,細胞外マトリクス(ECM)の力学的特性がその挙動に大きな影響を与えることが明らかとなっているため,弾性を自在に制御できる細胞培養基材を開発して足場の力学的影響について研究することが重要な意味を持つ。本研究は,近赤外(NIR)光刺激によって弾性を制御可能なゲルを開発し、このゲルを細胞培養基板に用いて、ゲルの弾性が細胞運動に及ぼす影響を観察することで, ECMの弾性が細胞移動現象に与える影響を明らかにすることを目的としている。本年度は, NIR光刺激応答ゲルの作製に向けて, NIR励起が可能な希土類含有セラミックスナノ粒子の合成を行った。粒径がそろったナノ粒子を得るために,熱分解法を用いて平均粒径60nmの希土類含有セラミックスナノ粒子を合成した。得られた希土類含有セラミックスナノ粒子にNIR励起光を照射したところ,強い可視アップコンバージョン発光を示した。またセラミックスナノ粒子が含有する希土類イオンの種類や濃度を変化させることで,様々な発光波長を観察することができた。さらに,合成した希土類含有セラミックスナノ粒子の表面に生体機能性ポリマーを固定することで,水中でも分散可能なナノ粒子を作製することもできた。これらの結果から,光応答性ゲルの作製に向けて, NIR光励起が可能な希土類含有セラミックスナノ粒子の作製に関して,その粒径制御や発光特性の制御における重要な知見を得ることができた。当初予定していたNIR光刺激によって弾性を制御可能なゲルの開発に向けた前段階として,ゲルの架橋点となる希土類含有セラミックスナノ粒子の合成を行った。粒径が小さく、また分布が狭いナノ粒子を得るために,熱分解法を用いて粒子を合成した。この結果,平均粒径が60nm程度でほぼ均一なナノ粒子を合成することができた。また,粒子の特性を評価しやすいため,可視のアップコンバージョン発光を示す希土類イオン含有率でナノ粒子を合成したところ,実際にNIR励起光下で強い可視発光を示すことが確認された。さらにその発光波長は希土類イオン含有量を調整することで制御可能であり,ゲルの架橋点に用いる前段階として,重要な知見を得ることができた。以上を踏まえると,おおむね順調に進展していると考えらえる。細胞の運動性は癌の転移などにも大きく関与することから、細胞外マトリクスの力学的特性が細胞運動に与える影響が注目されている。本研究は、生体に低毒性な近赤外(NIR)光刺激によって弾性を変化させることが可能な足場を開発し、この足場上で細胞を培養することで、NIR光照射によって弾性が変化する足場の上における細胞運動の変化を観察することを目的としている。本年度は、NIR光に応答して弾性が上昇する「光硬化性足場」を構築するために、NIR励起・可視発光が可能な希土類含有セラミックスナノ粒子(アップコンバージョンナノ粒子)を用いて、NIR光照射によるポリマーの光重合を検討した。溶媒中で希土類含有セラミックスナノ粒子とモノマーとしてスチレン、光重合開始剤を攪拌、混合し、近赤外光を照射したところ、希土類含有セラミックスナノ粒子近傍においてポリスチレンを重合することができた。この結果から、光応答性の足場材料の作製に向けて重要な知見を得ることができた。さらに、この希土類含有セラミックスナノ粒子のアップコンバージョン発光を利用して、可視光に応答する光増感剤を刺激することで、希土類含有セラミックスナノ粒子上から一重項酸素を発生させ、がん細胞を効果的に死滅させることにも成功した。これらの結果から、この希土類含有セラミックスナノ粒子のアップコンバージョン発光は、細胞培養基板の弾性制御のみならず、がん治療技術や診断材料への応用展開も期待することができる。4アームのPEG鎖の各末端に活性エステル基を有するポリマーとPEG鎖の両末端にアミノ基を有するポリマー,希土類含有セラミックスナノ粒子を混合することで,光応答性ゲルを作製する。さらにそのゲル表面にコラーゲンを修飾し,細胞接着性を付与することで,細胞培養基板への応用を試みる。また応用展開として,希土類含有セラミックスナノ粒子の近赤外発光を用いて、小動物のin vivoイメージングや温度センシングを行う。バイオマテリアル本年度は,細胞培養用光応答性ゲル基板の材料となるナノ粒子合成を中心に進めたため,細胞培養実験のための試薬等を購入する予算を使用しなかったため,次年度使用額が生じた。ゲルを構成する高分子材料および,細胞培養試薬を購入する。
PRPと徐放化FGF-2を併用した体内埋入型チャンバーを用いた血管柄付き組織再生

再生場:in vivo chamber、細胞外matrix:collagen sponge、血管source:既存の血管束、細胞増殖因子:PRPとbFGFの実験モデルで、有害事象無く独自の栄養血管を有した肉芽組織を再現性を持って再生出来た。細胞増殖因子は、活性化PRPと徐放性bFGFを併用するのが最も有用であった。血管柄付き組織(器官)再生の臨床応用へ歩み出す上での重要な研究成果と考える。平静25年度は、軟部組織再生におけるPRPの投与方法とFGF-2の併用の効果について検討を目的として研究を行った。1.血管付軟組織再生に及ぼす活性化PRPと非活性化PRPの効果を比較した結果、有意差が見られなかった。2.FGF-2の併用効果を検討した結果、FGF-2の併用効果が有意に認められた。さらにFGF-2の徐放化効果を見たところ再生組織の成熟(線維化)の程度が進んだ組織が得られることが示された。また、これまでの実験でFGF-2単独では一定の頻度(約10%)で異物反応bが生じたが、PRPを併用した実験群では一切認めなかった。このことは、臨床応用におけるPRP併用の有用性を示した。以上から、<活性化あるいは非活性化PRP+徐放化FGF-2>の組み合わせが最も良い血管付き軟組織を再生する方法であると結論された。今後、この実験群で得られた再生組織に植皮を行い、皮弁(grafted flap)を作製して血管吻合の手技を用いて皮弁移植実験(n=5)を行う。さらに移植6ヶ月経過後の皮弁組織を採取して、組織学的に検討する予定である。なお、この実験群の中で、2年間体内に埋入されたチャンバーがあった。取り出すと全てが脂肪組織に置き換わり、導入血管で栄養されていた。すなわち血管柄付き脂肪組織が再生されていた。そこで何週で脂肪組織に置き換わるのか、再現性があるのかを実験し、12週で再現性をもって脂肪組織に置き換わることがわかった。今後は、この脂肪組織に置き換わる機序の解明も同時に研究していく予定である。その結果、組織再生にはPRP(多血小板血漿)とbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)の併用が有用で、control及びPRP単独使用に比べて有意に大きな組織が再生された。肉芽形成の成熟度(線維化の程度)で比較すると、bFGF徐放化を併用した実験群が線維化の程度が進んでいた。これまで、bFGFの単独使用ではcollagen spongeの異物分解反応が希に見られた。PRPを併用することで、異物分解反応は全く見られなくなり、安定した組織再生が再現性を持って得られた。現在、各実験グループの組織採取は終わり、組織学的に再生組織量、線維化、炎症部位の比率について、さらに検討しているところである。今年度は、各実験群(Control,活性化PRP,bFGF単独、活性化PRP+bFGF、活性化PRP+徐放化bFGF)で再生された組織成分別組織量について比較して臨床応用への可能性を検討した。組織成分別再生量は、ハイブリッドセルカウント機能(Bio-Revo BZ-700)で求めた。結果)組織学的には、PRPを併用した実験群で、血管束の周囲にリンパ球やマクロファージなどが集積した炎症性組織層が認められた。この炎症性組織は経時的に線維性組織へ、さらに脂肪細胞に置換されることが判明した。従って、炎症性細胞の集積は組織再生に有利に働いていると考えられた。再生組織量は、活性化PRP+bFGF群と活性化PRP+徐放化bFGF群で多く、control群に比して多かった(one-way ANOVA, p<0.05)。組織成分別再生量(血管束/脂肪組織、線維性組織、炎症性組織、低細胞密度組織)は、活性化PRP+bFGF群の低細胞密度組織が他の実験群に比べ多い(p<0.05)以外は有意差が無かった。以上から、PRPを併用することで、これまで見られたcollagen spongeの異物反応が抑制され(安全性の確保)、再現性をもって栄養血管を有した肉芽組織がchamber内で再生できることが示された。また、組織成分別再生量及び全再生組織量の比較から、活性化PRP+徐放化bFGF群がchamber内での軟組織再生において最も有用な成長因子の併用方法であると考えられた。研究協力者との連携のもと、またこれまでの研究の経験もあり、予定通りに進捗している。再生医療今後、採取した標本をBIOREVO BZ-9000のハイブリッドセルカウント機能を用いて、各実験群における炎症組織、線維化組織、血管束と脂肪組織、総再生組織の体積を求め再生組織の形成への最も有用な細胞増殖因子の組み合わせを求める予定である。実験計画で記載した通りに進んでいる。

また新たな発見に対して平行した実験も行っているほぼ予定通りに補助金を用いているが、実験に用いる材料費(縫合糸が、予定より少なくて済んだため次年度使用額が生じました。研究で得られた結果をもとに、1.TEC実験系と<活性化PRP+徐放化FGF-2>併用方法を用いて血管付き軟組織を再生する。2.この再生組織に植皮を行い、皮弁(grafted flap)を作製して血管吻合の手技を用いて皮弁移植実験(n=5)を行う。3.移植6ヶ月経過後の皮弁組織を採取して、組織学的に検討する。4.新たに発見された脂肪組織の再生のメカニズムの解明実験も平行して行う。次年度使用額と助成金を追加実験の費用に用います。実験がスムーズに行えたこと、動物の中途脱落が無く、追加実験の必要が無かったことが大きな理由である。1.TEC実験系と<活性化PRP+徐放化FGF-2>併用方法を用いて血管付き軟組織を再生する。以上に用いる予定である。
粥状硬化症のバイオマーカーの開発

HDLの主要アポ蛋白であるapoA-Iは抗動脈硬化作用を有するが、一部のapoA-Iはキマーゼによって切断され、その機能を失うと考えられる。切断されたapoA-Iにのみ反応する抗体を作製し、遺伝子技術によって合成した蛋白を用いてその特異性を確認した。次に、健常者血漿中に切断されたapoA-Iが存在することを証明した。この抗体を用いて切断されたapoA-Iの測定法を構築し、それが機能することを確認したが、更なる高感度化の必要性が示唆された。粥状硬化層のマクロファージからコレステロールを効率よく引き抜き、肝臓に転送して胆汁中に排泄する、いわゆるreverse cholesterol transportにはHDLの主要アポ蛋白であるapoA-I(分子量:約28,000)が関与している。しかし、肥満細胞から放出されたキマーゼによって一部のapoA-IのC末端(18アミノ酸残基)はtruncateされ、その結果apoA-Iはコレステロールを引き抜く能力を失うと考えられる。すなわち、このtruncated apoA-I(分子量:約26,000)を測定することによって粥状硬化の病態を評価することを目的とした。私たちは、健常者血漿中にtruncated apoA-Iが存在することを、イムノブロッティング法を用いて証明した。次に、HDLあるいはapoA-Iをキマーゼ処理することによって分子量約26,000のtruncated apoA-Iと思われるバンドと分子量約24,000のN末端がtruncateされたと思われるバンドが増加することを確認した。また、キマーゼ処理を長時間実施すると、正常apoAIおよびtruncated apoA-Iの両方とも消失し、分子量約24,000のバンドだけが認められた。一方、truncated apoA-IのC末端の10アミノ酸と同じ配列の合成ペプチドを用いてモノクローナル抗体の作成を試みた。その結果、分子量約26,000のtruncated apoAIと反応し、正常apoAIとは反応しない抗体が得られた。しかし、この抗体は分子量約24,000のバンドとも反応した。今後、得られた抗体の特性評価、ELISA法によるtruncated apoA-I測定法の構築を進め、粥状硬化のバイオマーカーとしての有用性を明らかにする。Reverse cholesterol transportにはHDLの主要アポ蛋白であるapoA-I(分子量:約28,000)が関与している。しかし、肥満細胞から放出されたキマーゼによって一部のapoA-IのC末端(18アミノ酸残基)はtruncateされ、その結果apoA-Iは泡沫化マクロファージからコレステロールを引き抜く能力を失うと考えられる。すなわち、このtruncated apoA-I(分子量:約26,000)を測定することによって粥状硬化の病態を評価することが可能であると考えられる。Truncated apoA-Iには反応するが、apoA-Iには反応しない抗体を得るため、truncated apoA-IのC末端の10アミノ酸を抗原として、モノクローナル抗体の作製を試みた。得られた抗体はIgMクラスであったが、apoA-Iとは反応せず、apoA-Iをキマーゼ処理すると分子量約26,000の反応するバンドが出現した。この抗体の特異性を確認するために、recombinant truncated apoA-Iおよびrecombinant apoA-Iを作製して抗体との反応をみたところ、recombinant truncated apoA-Iとのみ反応することが確認された。すなわち、truncated apoA-Iに特異的なモノクローナル抗体であることが示された。この特異抗体を用いて、ヒト血漿中にtruncated apoA-Iが存在することを証明した。また、キマーゼ処理によって生じる分子量約26,000のフラグメントは、複数の分解パターンによって生じた混合物であり、すべてが、いわゆるtruncated apoA-Iでないことがわかった。作製抗体の特異性が確認されたので、競合ELISA法でtruncated apoA-Iの測定系を構築し、方法論的に測定可能であることを確認した。現時点で感度は十分でないが、高感度化によって粥状硬化の血清バイオマーカーとして期待される。
生体情報系における糖タンパク質糖鎖の構造と機能解析:糖タンパク質遺伝子発現と有機合成によるアプローチ

アスパラギン、セリン、スレオニンに結合した糖鎖は細胞外の情報伝達に重要な機能を果たしている。糖鎖は遺伝子の鋳型で直接造られていないため、その生合成の調節は、タンパク質合成や核酸合成と比べ、細胞環境に大きく影響を受けることになる。したがって、細胞環境の変化は糖鎖構造の変化を通じて遺伝子に伝えられて、細胞は環境に対して適切に対応できるようになるわけで、細胞の分化や機能調節機構を理解するには糖鎖構造を理解することは必然であると考えられる。遺伝子工学的手法の発達により、cDNAのクローニングでアミノ酸配列の一次構造や糖鎖を含むタンパク質の修飾の有無を推測することができるようになったが、付加される糖鎖構造とその生物学的意義については知ることができない。本研究計画は遺伝子組換えによる糖タンパク質生産系と糖鎖有機合成法を中心に、、糖タンパク質の糖鎖構造と機能の関連について研究しようとするものである。遺伝子工学的手法を用いてヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)とウマ絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)、ラット胎盤性ラクトジェン(PL-Im)およびラットLeukemia inhibitoryfactor(rLIF)の野性型および糖鎖付加部位ミュータント分子を生産し、糖鎖付加部位とその生物活性の一端を明らかにした。また、複数の糖ペプチドを有機化学的手法で合成した。また、糖脂質の機能解析も行い、動物種を通じて一定の種類の糖脂質が胎盤で発現していることを報告した。さらに、NMRおよびマススペクトルメトリーによる糖鎖および糖ペプチド断片の構造解析を行ない、化学合成による再構成のための基礎的データを収集した。これらにより、糖鎖は生理活性発現に様々な役割を果たしていることを明らかにした。糖鎖は細胞外の情報伝達に重要な機能を果たしており、糖鎖を介した細胞間情報伝達機構が細胞の反応を惹起しているとも言える。すなわち、細胞の遺伝子の発現調節は、実は遺伝子が間接にしか支配していない糖鎖の手に握られている。本年度はバキュロウイルス-昆虫細胞を用いた糖タンパク質発現系を完成させ、糖鎖を有する遺伝子組換えPL-Im(rPL-Im)を生産した。rPL-Imはラット肝臓の受容体に結合することが示された。また、ウマ胎盤由来の絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)とヒト卵胞刺激ホルモン(hCG)のcDNAクローニングを行ない、バキュロウイルス-昆虫細胞系と哺乳類細胞による糖タンパク質発現系を用いて組換え糖タンパク質の生産した。これらの糖タンパク質については遺伝子ポイントミューテーション法を用いて糖鎖部分の修飾分子を作成し、その生理的意義を調べた。その結果、eCGの機能はαサブユニットの糖鎖を除去すると黄体形成ホルモン様作用は大きく低下するが卵胞刺激ホルモン様活性は逆に増加することが明らかになった。また、PL-Imも糖鎖付加部位を修飾した場合に生物活性は大きく低下し、機能発現に糖鎖が重要な機能を果たしていることが示された。ラットLeukemia inhibitoryfactor(rLIF)の組み替え蛋白質生産にも成功した。さらに、NMRおよびマススペクトルメトリーによる糖鎖および糖ペプチド断片の構造解析を行ない、化学合成による再構成のための基礎的データを収集する予定である。また、LIFのポイントミューテーションによる選択的糖鎖付加を制御した糖タンパク質の解析も行なう。

すなわち、細胞の遺伝子の発現調節は、実は遺伝子が間接にしか支配していない糖鎖の手に握られている。糖鎖は遺伝子の鋳型で直接造られていないため、その生合成の調節は、タンパク質合成や核酸合成と比べ、細胞環境に大きく影響を受けることになる。したがって、細胞環境の変化は糖鎖構造の変化を通じて遺伝子に伝えられて、細胞は環境に対して適切に対応できるようになるわけで、細胞の分化や機能調節機構を理解するためには、まず糖鎖構造を解明することが必然であると考えられる。本研究計画は遺伝子組換えによる糖タンパク質生産系と糖鎖有機合成法を中心に、機能糖鎖の最小単位決定を含む糖タンパク質の糖鎖構造と機能の関連について研究しようとするものである。本年度は遺伝子工学的手法を用いて、ヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)とウマ絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)、ラット胎盤性ラクトジェン(PL-Im)およびラットLeukemia inhibitory factor(rLIF)の野性型および糖鎖付加部位ミュータント分子を生産し、糖鎖付加部位とその生物活性の一端を明らかにした。また、複数の糖ペプチドを有機化学的手法で合成した。また、糖脂質の機能解析も行い、動物種を通じて一定の種類の糖脂質が胎盤で発現していることを報告した。さらに、NMRおよびマススペクトルメトリーによる糖鎖および糖ペプチド断片の構造解析を行ない、化学合成による再構成のための基礎的データを収集した。これらにより、糖鎖は生理活性発現に様々な役割を果していることを明らかにした。
大腸がん・大腸腺腫の予防に関する総合的研究

われわれは大腸がんの一次予防のために、大腸腫瘍(腺腫・腺腫内がん)摘除後の腫瘍発生に関する無作為割付臨床試験(RCT)と併行して、大腸がん・大腸腺腫の症例対照研究、大腸腺腫患者のフォローアップ、栄養士集団の長期フォローアップ、有酸素運動集団のフォローアップなど多角的・総合的な研究を行っている。ここでは大腸腫瘍摘除後の腫瘍発生に関するRCTの進捗状況と中間結果について報告する。大腸腫瘍の内視鏡的摘除を受けた患者を、実験群・対照群に無作為に割付け、実験群には、a)総脂肪摂取抑制、b)n-6多価不飽和脂肪酸(n-6PUFA)(リノール酸など)を多く含む植物油摂取の抑制、c)魚介類摂取の勧奨、d)α-リノレン酸を多く含むしそ油摂取の勧奨、e)魚油摂取の勧奨を行い,対照群には総脂肪酸摂取抑制のみを介入している。これまでに研究対象者85名(男65名、女20名)のうち、実験群41名、対照群35名に対して介入を実施した。血漿中総脂肪酸は実験群および対照群とも二減少していた。実験群では摂取を抑制したn-6PUFAは減少し、摂取を勧奨したn-3PUFAは上昇し、その結果、n-6PUFA/n-3PUFA、アラキドン酸(AA)/EPA、AA/DHAは低下していた。なお、プロトロンビン時間(%)および過酸化脂質は、副作用が出現するほどの値ではなかった。エンドポイントとして、介入後12ヶ月および介入後24ヶ月の腫瘍発生率は、両群間に差はなかったが、介入後12ヶ月から介入後24ヶ月の間の腫瘍発生率は、実験群で低い傾向にあった。介入後24ヶ月の腫瘍の個数は、実験群に少ない傾向にあったが、腫瘍の大きさは、両群間に差は認められなかった。介入後12ヶ月におけるポリープ発見率は実験群75%、対照群は83%であり、ポリープ0個の者を含めずに算出した平均ポリープ数は実験群1.8個、対照群2.4個であった。また、ポリープ0個の割合は実験群25%、対照群17%であった。今後、対象数を増やし、コンプライアンスを維持し,中間マーカーの分析を試み、エンドポイントの解析に耐えうるデータ維持・管理を継続する必要がある。
Ｘ線トモグラフと地球化学指標に基づく新しい炭酸塩溶解指標の確立

マイクロX線CT(MXCT)技術による骨格密度測定手法の確立とその解析、そして地球化学的手法を用いた微量元素研究の2つの手法を用いて、炭酸塩溶解プロセスとその要因、そして骨格の地球化学的性質の研究を行った。北太平洋の観測点K2のセジメントトラップ観測により得られた浮遊性有孔虫の骨格密度には明瞭な季節性があり、年間を通して大きく変化していたことを発見した。この原因は海洋の物理環境と炭酸系の変化によるものである。また浮遊性有孔虫の骨格は異なる複数の結晶型からなる部位をもち、その化学的性質にも違いがある。これらの違いが選択的な溶解の促進と、殻の化学的性質を変化させることを明らかにした。昨年度までの研究では、北西部北太平洋の表層で季節的なpCO2変化に対応した骨格の溶解現象が起こっていることを、セジメントトラップに記録された骨格記録についてマイクロフォーカスX線CTを用いて世界で初めて突き止めた。本年度はこの実績に基づき、天然でみられる骨格密度低下現象が炭酸系をコントロールした室内実験環境下で再現できるか、また再現された骨格密度は天然のものと比較してどのような違いがあるかを検討し、浮遊性有孔虫骨格の溶解プロセスのモデル化を行った。溶解実験には、天然海水にCO2をマイクロバブラーで曝気することで、アルカリ度を変化させること無くpHを低下させ、一定に保った。同時にpH、全炭酸、アルカリ度を分析し実験の初期条件とした。浮遊性有孔虫の殻は北西太平洋より採取された、溶解の影響を受けていない浮遊性有孔虫グロビゲリナ・ブロイデスの骨格を用いた。溶解実験を終えた骨格について、マイクロフォーカスX線CTを用いて骨格の相対密度を定量した。この結果、溶解実験で見られる溶解は、天然のそれと極めて類似した溶解パターンを示し、次のようなパターンがあることを明らかにした。1.浮遊性有孔虫の骨格は内側層と外側層に大きく分けることができ、両者は有機質膜で区別されている。2.溶解は骨格の内側層よりはじまり、最外殻の溶解は高い密度を保ったまま徐々に溶解する。3.内側層は顆粒状の炭酸塩粒子の凝集体からなり隙間の多い構造であるのに対し、外側はいわゆる菱柱構造(自形の炭酸塩結晶)をなしていた。北西太平洋に生息する本種はこの菱柱構造がとくに発達しており、それ以外の種と比較して炭酸塩溶解に対する耐性があるといえる。この厚い外側層はグロビゲリナ・ブロイデスの北太平洋種であるType IIe遺伝子型をもつものに典型的であることから、厚い骨格をもつことで天然の低pHに耐性をもった可能性を示唆している。本年度は、天然における浮遊性有孔虫の骨格形成がどのようなものであるかを最初に把握するため、当初の研究計画に基づき、海洋酸性化の進行が顕著に観測される亜寒帯循環域で採取した浮遊性有孔虫骨格(セジメントトラップ試料)を用いて分析を行った。骨格の密度測定には東北大学総合学術博物館に設置されたマイクロフォーカスX線CTスキャナー(空間分解能0.8μm)を用いた。本研究では、基準物質として空気と0、カルサイト結晶を1000とするカルサイトCT値を新たに定義し、得られるX線吸収係数をカルサイトCT値に換算し、個体の骨格密度とした。水深150mと1000mより回収されたG. bulloidesの骨格の平均カルサイトCT値は、800-1200の値を示した。当該海域の1年間にわたる平均CT値の時系列変化は明瞭な周期性を示し、とくに冬期(2009年1月3月)にもっとも骨格密度が低下していることが明らかとなった。この周期的な密度変化のパターンは、北太平洋の鉛直混合の周期と完全に一致することが明らかとなった。すなわち冬期に活発になる鉛直混合がもたらす低pH・高CO2の海水の湧昇が、表層に生息する浮遊性有孔虫の骨格形成に影響している可能性を示唆する。さらにコンピュータ上で再構成した断層画像による個体別の骨格密度分布解析を行なった結果、多くの個体で骨格の外側よりも内側で顕著に密度が低下していたことが明らかとなった。これは骨格の中でも選択的に溶解の影響を受ける部分があることを明確に示している。本研究により、北太平洋において浮遊性有孔虫の骨格密度の時系列変化があることが初めて明らかとなった。本手法は従来行なわれてきた骨格の重量測定やSEM観察などとくらべて遥かに定量性にすぐれており、現在および過去における海洋酸性化の炭酸塩生物に対する影響を知る上で極めて有効であることがあらためて実証された。本年度は北太平洋観測点K2に係留したセジメントトラップの中でもっとも深い水深に設置された浮遊性有孔虫グロビゲリナ・ブロイデスの骨格密度解析を終了した。