hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラット視交叉上核培養細胞の遺伝子発現制御による生物時計同調機構の研究

概日リズムをもたらす生物時計は、哺乳類では、視床下部の視交叉上核(SCN)に存在する。本研究では、ラットSCNの培養細胞を用いて、神経ペプチドであるvasoactive intestinal polypeptide(VIP)や前癌遺伝子であるc-fosが、光による同調機構に関与する可能性について調べた。光同調に関与する物質は、生物時計と光の両者によって制御されていることが必要条件であることから、VIPやc-fosがこれら条件を満たすがどうか検討した。(1)外界の条件を一定にし、2時間毎に48時間に渡ってVIPの放出量を調べたところ、明確な概日リズムが見られた。しかし、同じ条件下でc-fos産物(Fos)の免疫組織化学的染色を行ってもFosは検出されなかった。以上のことは、自由継続リズム条件下において、VIPは生物時計によって制御されているがc-fosは制御されていない可能性を示している。(2)光情報は興奮性アミノ酸によってSCNに伝達されるので、in vitroにおける光刺激としてN-methy1-D-aspartate(NMDA)を代用し、VIPとc-fosの反応性を調べた。VIPのリズム位相は低濃度(10^<-5>M)のNMDAによって投与位相に依存して変化した。そして、NMDAのVIPリズムへの作用様式は、光がラットの行動リズムを変化させる様式に似ていた。一方、高濃度(10^<-4>M)NMDAによって、Fosは位相依存性にSCNに発現したが、低濃度(10^<-5>M)NMDAによってはFosの発現は見られなかった。また、NMDAのFosの発現への作用様式は光の行動リズムへの作用様式とは異なっていた。以上の結果から、VIPやc-fosのNMDAに対する反応性は生物時計によって制御されているが、その感受性は異なり、VIPの方が高感度性であり、より時計の光に対する感受性に似ていた。かくて、VIPは光同調機構に密接に関与していることが解ったが、c-fosの光同調への関与については積極的に支持する結果は得られなかった。
溶媒極性スケールの理論的研究

溶媒の極性の尺度を表わす経験的及び半経験的パラメータは、今まで50以上提案されていると言われている。これらのパラメータは溶質分子と溶媒分子とのどのような相互作用に基づいているかが詳しく吟味されておらず、この種の理論的研究は皆無に等しい。本研究では、ともに基底電子状態にある中性溶質分子と溶媒分子との相互作用エネルギーを既に電子スペクトルの溶媒効果で成功している本研究者の理論的取扱いに基づいて求めた。更に、このエネルギーを溶質に関係する項(xとy)及び溶媒に関係する項(f_1とf_2)で表す近似式に定式化した。その結果、溶質の溶媒和エネルギー(z)をz=-xf_1-yf_2の形で表わした。ここで、溶媒だけに関係する項f_1とf_2は理論的溶媒極性パラメータであり、各溶媒の密度、屈折率、電気双極子モーメント及びイオン化ポテンシャルの実測値を用いて計算できる値である。そうすると、溶媒中での中性溶質の熱分解反応または2種の中性溶質間の2分子反応にたいして、速度定数R及び活性化エネルギーEaを、それぞれlnk=a+bf_1+cf_2及びEa=d+ef_1+gf_2と表わすことができる。ここで、a,b,...,gは溶質だけに関係する項である。補助金により購入したパーソナルコンピュータNEC9801-VX41(ディスプレイ,プリンター附属)を用いて、64種の溶媒について理論的溶媒パラメータ、f_1及びf_2値を計算した。報告されている9種の有機反応について、上記コンピュータを用いて、速度定数の溶媒効果の実測値をlnR=a+bf_1+cf_2に最小二乗法で適用した。その結果、lnRにたいする実測値と計算値との間に良好な相関関係がえられた。したがって、本研究で初めて提案した理論的溶媒パラメータ、f_1とf_2値は、溶媒極性を示す妥当な値と考えられる。
ソフトウェア無線の情報通信ネットワークへの拡張に関する研究

本研究では、ソフトウェア無線システムを実現するための新理論・技術を研究すると共に、ソフトウェア無線のソフトウェアによる再構成可能(Reconfigurable)性などの概念を無線システムのみならず有線システムを含む情報通信ネットワーク全般に拡張する研究を行った。具体的には、1.ソフトウェア無線実現のための物理層技術の問題整理と対策として、(1)マルチモード対応の広帯域アンテナの構造と制御アルゴリズムの研究、(2)変調、情報源符号化、通信路符号化、データ速度、フレーム構成などの適応推定アルゴリズムの研究を行った。2.ソフトウェア無線実現のための情報科学技術の導入による検討として、(3)モード間の瞬断ないシステムハンドオーバーのためのシステムアーキテクチャの研究を行った。3.ソフトウェアReconfigurable情報通信ネットワークへの拡張に関する必要な問題整理として、(4)ソフトウェア無線システムの全体のモデル化、(5)ソフトウェアとハードウェアの互換性とバランスの検証、(6)ソフトウェア無線が対象とする有線、無線環境のモデル化を行った。4.ソフトウェア無線のための上位層の各種方式検討と理論解析として、(7)ソフトウェア無線によるシームレスマルチプロトコル変換の検討、(8)ソフトウェア無線における無線ダウンロード方式の検討、(9)ソフトウェア無線におけるダウンロードセキュリティ方式の検討、(10)ソフトウェア無線のためのACS(Autometic Certification System)の検討を行った。5.ソフトウェア情報通信ネットワークに関する方式検討と理論解析として、(11)ソフトウェア無線による方式ダイバーシチの検討、(12)ITSにおけるIPネットワークの構成法に関する検討をおこなった。具体的には、1.ソフトウェア無線実現のための物理層技術の問題整理と対策:(1)マルチモード対応の広帯域アンテナの構造と制御アルゴリズムの研究、(2)マルチバンド、広帯域対応RF・ベースバンドのアナログ回路およびデバイスの研究、(3)Reconfigurabilityを向上させるディジタルデバイスおよび、種々なサンプリング方式の対応したADCの研究、(4)変調、情報源符号化、通信路符号化、データ速度、フレーム構成などの適応推定アルゴリズムの研究、(5)モード間の瞬断ないシステムハンドオーバーのためのシステムアーキテクチャの研究についての問題の整理、その解決策を考案し評価した。2.ソフトウェア無線からソフトウェアReconfigurable情報通信ネットワークへの発展のための理論的な問題整理:(1)ソフトウェア無線システムの全体のモデル化、(2)ソフトウェアとハードウェアの互換性とバランスの検証、(3)ソフトウェア無線が対象とする有線、無線環境のモデル化、(4)有線、無線通信における上位レイヤにおける相互接続性に関する問題の整理、その解決策の検討を行った。3.ソフトウェア無線プラットホームの試作による実験実証:(1)ソフトウェア無線のソフトウェア実験系の製作;考案する各種方式の性能評価と理論的解析の確認のために、計算機上に無線伝搬路だけでなく、有線系を含む異種間ネットワークを表現できるソフトウェアシミュレータを構築した。(2)ソフトウェア無線機の適応環境能力を効果的に実現するアダプティブアレーアンテナを中心とする構成法の理論・実験的解析を行った。具体的には、ソフトウェア無線実現のための物理層技術の問題整理、ソフトウェア無線のための上位層の各種方式検討と理論解析として、(1)Reconfigurabilityを向上させるディジタルデバイスおよび、種々なサンプリング方式の対応したADCの研究(2)変調、情報源符号化、通信路符号化、データ速度、フレーム構成などの適応推定アルゴリズムの研究(3)ソフトウェア無線によるシームレスマルチプロトコル変換の検討(4)ソフトウェア無線における無線ダウンロード方式の検討、(5)ソフトウェア無線におけるダウンロードセキュリティ方式の検討をおこなった。

次に、ソフトウェア情報通信ネットワークに関する方法検討と理論解析として、(6)無線に限らず有線等の異種間情報通信ネットワークにおける通信方式の違い考慮して、シームレスな通信を行うためのアルゴリズムについての検討、(7)ネットワークレイヤにおいてマルチメディア情報のQoSを考慮し、無線伝搬路におけるフェージング環境における影響を考えたアクセス制御、ルーティングなどのプロトコルに関する研究を行った。また、ソフトウェア無線の概念をITSに応用した技術として、(6)ソフトウェア無線のためのソフトウェアアンテナの検討、(7)ITSにおけるTCP/IPネットワーク上ルーティング手法の検討、(8)ITSにおける環境適応型マルチメディア・マルチモード統合端末の検討を行った。
天敵利用を目指したタマゴクロバチ科の種多様性及び寄主の解明

本年度は、博士課程の過去2年間に行った野外調査及び標本調査で得た標本を元に、日本産タマゴクロバチ亜科の分類学的整理及び記載作業を行った。本研究により、日本産タマゴクロバチ亜科は13族38属112種が確認された。新たに6属が見出され、このうちの4属は東南アジアから記録がある属であり、日本での記録も1属を除いて南西諸島に限られていた。一方Dichoteleas属はオーストラリア・インド・マダガスカルから記録されている属であり、Oethecoctonus属は北米・南米及びセーシェル諸島での記録がある属である。国内においてDichoteleas属は本土から1未記載種が確認され、Oethecoctonus属は本州と八重山諸島から2未記載種が確認された。新たに見出された種は16種であり、1種を除いて近隣地域(極東ロシア・フィリピン等)から知られる種であった。Duta politaはインド南部から知られる種であった。Gryoniniでは3属18種が確認され、6種が未記載種であった。Gryon属は9種群に属する16種が確認された。G. misellum種群では2未記載種を含む3種が確認された。G. myrmecophilum種群では1種が確認された。日本から記載されたG. remotumはG. marinaの同物異名であった。G. muscaeforme種群では1未記載種を含む3種が確認された。G. mischaはG. japonicumの、G. maruzzaeとG. sugonjaeviはG. yamagishiiの同物異名であった。G. charon種群では1未記載種を含む2種が確認された。G. floridanum種群では1未記載種が確認された。日本から記録されていたG. pennsylvanicumは未記載種の誤同定であった。また、のべ15種の害虫カメムシへの寄生が確認された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、種多様性の解明に焦点を置き、野外調査及び標本調査と、それらの調査で得られたサンプルの種同定に重点を置いて研究を行った。野外調査では、福井県(6/9-12)、鹿児島県沖永良部島(6/20-25)、同徳之島(6/25-7/1)、同奄美大島(7/1-8)、福島県(7/13-18)、岩手県(7/19-23)、長野県(7/29-8/3)、北海道(8/10-21)、高知県(9/6-9)にて調査を行い、イエローパントラップ、スイーピングによるサンプル採集を行った。また、台湾(5/7-21)でも野外調査を行い、日本産種との比較標本の収集を行った。標本調査は、名城大学(9/24-28)及び北海道大学(8/7-9)での調査を行い、これまでの調査で特に不足していた北日本のサンプルを借用した。本年度の研究の結果、日本産タマゴクロバチ亜科については、クモの卵嚢寄生者であるダルマタマゴクロバチ族を除いて分類学的な整理は終了した。これまで日本産本亜科は13族32属67種が知られていたが、60未記載種と1族8属16種の日本未記録分類群を確認し、合計で14族40属141種となった。ツヤタマゴクロバチ族では9属が確認された。本族に属する属のうちCalotelea属では、これまで7種が知られていたが、3種の所属変更と1種の同物異名を認めた。更に南西諸島より3未記載種を確認した。未記載種のうち2種は新大陸及びヨーロッパから知られていたocularis種群に所属すると考えられた。ヘリカメタマゴクロバチ族は3属が確認された。ヘリカメムシ卵に寄生する事が知られるGryon属では、日本産既知種23種のうち同物異名4種、誤同定6種、所属変更3種を見出し、新たに9未記載種を確認し、4例の寄主を新たに記録した。未記載種には重要害虫に寄生する種と酷似した種が存在しており、本属の分類学的な問題点が浮き彫りとなった。今年度の目標としていた形態形質による分類学的再検討については、一部の分類群を除き終了した。分子実験用サンプルについては、ある程度のサンプルを収集することができた。寄主解明についてはやや難航しているものの、カメムシ卵寄生蜂については一定の成果を上げることができた。

新たに見出された種は16種であり、1種を除いて近隣地域(極東ロシア・フィリピン等)から知られる種であった。Duta politaはインド南部から知られる種であった。Gryoniniでは3属18種が確認され、6種が未記載種であった。Gryon属は9種群に属する16種が確認された。G. misellum種群では2未記載種を含む3種が確認された。G. myrmecophilum種群では1種が確認された。日本から記載されたG. remotumはG. marinaの同物異名であった。G. muscaeforme種群では1未記載種を含む3種が確認された。G. mischaはG. japonicumの、G. maruzzaeとG. sugonjaeviはG. yamagishiiの同物異名であった。G. charon種群では1未記載種を含む2種が確認された。G. floridanum種群では1未記載種が確認された。日本から記録されていたG. pennsylvanicumは未記載種の誤同定であった。また、のべ15種の害虫カメムシへの寄生が確認された。今年度は、寄主解明と分子実験に重点をおいて研究する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Ｓ期ヒト細胞におけるＤＮＡ二本鎖切断の修復過程に関する新しい概念の検証

DNA二本鎖切断(DSB)の修復経路に関する新たな知見を得るために、本研究を始めた。複雑な構造を持つDSBはresectionと呼ばれる相同組換え初期の反応で高頻度に処理されることを明らかにし、またヒトG1期細胞がresection反応を示すことも示した。この反応にはS/G2期と同様にCtIPが重要な役割を担っていること、resection開始後にも未知の機能を持っていることも明らかにした。また、重粒子線照射により複雑なDSBが生じた細胞では細胞老化、細胞死関連遺伝子が高いレベルで誘発されている事が明らかになった。DNA二本鎖切断(DSB)の修復系は、主として非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)に大別される。HRの反応は、まず5 '側のDNA鎖の削り込み(DNA end resection)により3'の一本鎖が露出することから始まる。HR反応には組換えの相手となる姉妹染色分体が必須のため、S期後期とG2期でのみ起こりうると考えられてきた。しかし申請者はこれまでの研究からS期細胞における削り込みの活性に関しては新規の概念が必要であるとの考えに至り、本研究によりこれを検証する。まず、S期を中心とした各細胞周期における削り込み活性を調べることが本研究の初めの段階として重要である。姉妹染色分体を持たないG1期細胞でも削り込み活性が見られることを示す結果が得られたので、この点を確立するためにさらに検証を進めた。その結果、ヒト骨肉腫細胞U2OSとヒト不死化正常繊維芽細胞1BR-hTERTでは、ともに30 %前後のG1期細胞が削り込み活性を保持している事を明らかにした。さらに、S/G2期での削り込みの始動にCtIPがMre11とともに重要な役割を果たすことが知られているが、このG1期での削り込み活性もCtIPに依存していることを明らかにした(Yajima et. al. 2013)。CtIPはHR反応の初めの段階で機能するため、削り込み活性の細胞周期における制御を解明する上でも重要な因子である。その機能に関する研究を進める過程で、放射線照射後の長時間に渡ってCtIPがフォーカスを形成していること、低レベルの損傷誘導リン酸化状態を維持していること、DNA二本鎖切断部位でCtIPタンパク質がターンオーバーしており積極的なリクルートが絶えず続いていると考えられることなどが明らかになり、削り込みの始動以外の機能を持っていることが強く示唆された。この知見に関しても投稿準備中である。DNA二本鎖切断(DSB)は、主として非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)によって修復される。HRの反応は、まず5'側のDNA鎖の削り込み(DNA end resection)により3'の一本鎖が露出することから始まる。申請者はS期におけるDNA未複製領域に生じたDSBの修復に関しては新規の概念が必要であると考え、本研究によりこれを検証している。前年度までに、姉妹染色分体を持たない(DNAが複製されていない)G1期細胞でも、ヒト骨肉腫細胞U2OSとヒト不死化正常繊維芽細胞1BR-hTERTではともに30 %前後が削り込み活性を保持している事を明らかにした。さらに、このG1期での削り込み活性もCtIPに依存していることを明らかにした(DNA repair. 2013)。CtIPはresection反応の始動の段階で機能するため、resection活性の細胞周期制御を解明する上でも重要な因子である。CtIPがresectionの始動以外の機能を持っている可能性に関して詳細に検討を進めた。その結果、放射線照射後の長時間に渡って低レベルのリン酸化状態を維持しながらCtIPがフォーカスを形成しており、そのリン酸化はATMだけでなくATRにも制御されていると考えられること、DNA損傷後にはCtIPの分解が始まり、DSB部位では新規合成されたCtIPタンパク質の積極的なリクルートが絶えず続いていると考えられることなどを明らかにした(Mutat Res, 2015)。これらのことからCtIPはresectionが進行した後にも何らかの役割を果たしていると考えられ、resection後の修復過程の解析に重要な知見を得られた。HRの反応は、5'側のDNA鎖の削り込み(end resection)により3'の一本鎖が露出することから始まる。HR反応には姉妹染色分体が必須のため、S期後期とG2期でのみ起こると考えられてきた。DNA未複製領域に生じたDSBの修復に関しては新規の概念が必要であると考え、本研究を始めた。まず、DSB構造の複雑さが修復経路選択の重要な要因であることを明らかにし、複雑なDSBを生じさせる高LET重粒子線照射後は、G1期細胞の30 %前後がCtIP依存的なresection活性を示す事も明らかにした(DNA Repair, 2013)。CtIPがresectionの進行後にも何らかの役割を持っている可能性も報告した(Mutat. Res., 2015)。resection後の修復過程の解析に重要な知見になると期待される。さらに、CtIP機能の解明を進めるために相互作用タンパク質の探索を進め、幾つかの候補が得られた。

80%以上がresectionを引き起こす、重粒子線誘発の複雑なDSBがどのような経路で修復されているかを検討するために、重粒子線誘発HPRT遺伝子変異細胞株を分離した。ゲノム遺伝子内部を欠損している株のゲノム欠失部の接続配列を解析するためにエクソン領域のPCRを行ったところ、変異株の大多数は全てのエクソンを保持しているか逆に全てを失っているかのどちらかだった。修復の痕跡を解析するためには、さらに多くの変異株を分離する必要があると考えられる。細胞周期におけるresection活性の制御を明らかにしていくために、まずG1期(複製開始以前)での活性をはっきりとさせることが重要であり、重粒子線の特質を活用して検証を進めて成果を論文発表するに至った(DNA Repair, 2013)。G1期のCtIP依存的なresection活性に関しては、2014年になって少なくとも海外の2グループから同様の結果の報告が続いた。G1期細胞でもHRの初期過程(resection)によってDSBが処理される場合のあることが明確となり、本研究は先駆的な仕事となった。また、G1期でのresection活性にも重要なCtIPの新規の機能発見にも繋がる仕事も論文発表できた。複雑なDSBの修復経路を解明するために、CtIP機能とゲノム中のDSB修復の痕跡の解析を進めており、未複製DNA領域におけるDSB修復過程の解明という課題において「おおむね順調に進展している」と考えられる。DNA二本鎖切断(DSB)は、主として非相同末端結合と相同組換え(HR)によって修復される。HRの反応は、5'側のDNA鎖の削り込み(resection)により3'の一本鎖が露出することから始まる。HRには姉妹染色分体が必須のため、S期後期とG2期でのみ起こると考えられてきた。DNA未複製領域に生じたDSBの修復に関しては新規の概念が必要であると考え、本研究を始めた。まず、DSB構造の複雑さが修復経路選択の重要な要因であることを明らかにし、複雑なDSBを生じさせる高LET重粒子線照射後は、G1期細胞でもCtIP依存的なresection活性を示す事も明らかにした。CtIPはresectionの始動段階で機能し、resection活性の細胞周期制御を解明する上でも重要な因子である。CtIPがresectionの進行後にも何らかの役割を持っている可能性を報告し、CtIPと相互作用するタンパク質の探索も進めて幾つかの候補が得られた。複雑なDSBがどのような経路で修復されているかを検討するために、重粒子線誘発HPRT遺伝子変異細胞株を分離した。遺伝子内部での欠失配列を解析するために多くの変異株についてエクソンPCRを実施したところ、変異株の大多数は全てのエクソンを保持しているか逆に全てを失っているかのどちらかであった。損傷構造の違いによる修復方法の差を、修復の痕跡を調べる事によって定量的に解析するためには相当数の変異株を用いる必要が有ると判断される。
拡散型移動過程の一般化特性曲線に関する基礎的研究

1.拡散型非定常移動過程の代表例として、吸、脱着過程と非親水性多孔質固体の等温乾燥過程をとりあげ、前者については平板・球、後者については平板の場合に対して、全移動過程を材料中心濃度が初期値のままである浸透期間と初期条件に依存しない安定期間に分け、それぞれの期間に対して速度過程を表現する(一般化)特性関数〔曲線〕を導出した。2.1でとりあげた過程に対して、材料内部移動係数に種々の濃度依存性を与えた場合の速度過程を数値計算によりシュミレ-トした。3.1で得た特性関数を用いて2で得た数値解を整理したところ、材料内部移動係数の温度依存性が既知の場合には、特性関数を用いて簡便に速度過程が推定可能なことが解かった。4.平板および球状材料の脱着速度過程に対して特性関数を適用し、材料内部移動係数の濃度依存性を簡便にかつ精度良く決定する方法を開発した。この決定法を、2で得た種々の濃度依存移動係数をもつ系に対する数値計算速度過程に対して適用して、その有用性を確認した。5.4で得た決定法を実在の系に対して適用するため、球状活性炭および合成吸着剤を用いて水-ニトロベンゼン、水-ベンゾニトリル系について(1)脱着平衡関係(2)微分脱着実験による材料内部移動係数の吸着量依存性、を測定した。今後同系に対して積分脱着実験を行い本決定法の実用性に対して検討を加えたい。
非局所非線形微分方程式と最適制御の理論と応用

サイズ構造を持つ線形個体数変動モデルとその双対問題に対する解の存在と一意性に関する基本理論を整備するとともに最適収穫問題に対して最適制御の存在や最適制御であるための必要条件を与える最大値原理についての結果を得た。また、非線形の場合にも収穫率が時間のみに依存する場合に最適収穫率の存在を得た。一方、多種生物系をモデルとするサイズ構造を持つ一般の非線形系に対する解の存在、総個体数の有界性、および総個体数の減衰に関する結果を得た。サイズ依存型個体数変動モデルついて考察した。まず、サイズと時間に依存する線形個体数変動モデルに対する解の存在、一意性、連続依存性などの基礎理論を構築し、弱解や双対問題などを考察した。そして、その応用として最適収穫問題ついて考察した。これは,例えば農産物のように収穫することにより、個体数が減少するという影響を考えたモデルであり、その時の収穫量を最大にする制御問題が最適収穫問題である。ここでは、サイズと時間を変数とする収穫率の最適制御の存在にっいての結果を得た。次に、非線形モデルに対する収穫問題を考察した。非線形の場合、時間のみを変数とする収穫率の場合は以前の研究から最適制御の存在がわかっていた。収穫率はサイズと時間を変数とする方が自然であるが、この場合に最適制御が存在するかどうかはまだわかっていない。ここではサイズと時間に依存する非線形問題の一意解の存在を示した。しかし、時間周期的な解の存在については知られていない。そこで、四季の周期性を持つ植物モデルを想定して、Box法とよばれる離散化を行って数値解析を試み、四季ごとの変動を視覚化した。さらに、相互作用を持っ多種の生物系を考えるため、サイズ依存型非線形個体数変動の一般モデルの系について考察した。ここでは、解の一意性、正値局所解の存在と大域解の存在、有界性及び漸近挙動に関する結果を得た。この結果は、アメリカのテキサス州で開かれた国際会議にて発表した。非線形のサイズ依存型個体数変動モデルに対する収穫問題ついて考察した。例えば収穫することにより、総個体数が減少するとその影響で死亡率や誕生率が変化し,個体数変動に影響を及ぼす可能性がある。この場合,一定の収穫率を保っていると収穫量を最大にできなくなるおそれがある。一定時間の収穫量を最大にするための収穫率を求めるのが最適収穫問題であり,それは応用面からも重要で,それを解析することは意義がある。収穫率が時間のみに依存する場合に,方程式を同等な方程式の系に変換することで正値解の存在と一意性を示し,その解の表現を用いることで,最適収穫率が存在することを国際雑誌J. Math. Anal. Appl.に掲載した。また収穫率が時間とサイズに依存する場合の解析は,国際雑誌J. Comp. Appl. Math.に発表された。そこでは,正値解の存在と一意性を示すとともに数値解析の結果も示された。さらに、相互作用を持つ多種の生物系をモデルとするため,サイズ依存型非線形個体数変動モデルの系について考察した。このようなモデルを研究することは,より実際の現象を知る上で重要である。以前の研究では,成長率が各種で異なるものの時間とサイズのみに依存した場合を取り扱った。これに対し,成長率が各種で異なりしかも総個体数に依存するという非線形性を持つ場合を考察し,正値解の存在を示した。これは以前から得られていた結果を拡張するものであり,この結果は、ウィーン工科大学で開かれた国際会議にて発表した。以前の研究で線形のサイズ依存型個体数変動モデルに対して収穫量を最大にする最適収穫問題ついて考察し,最適収穫率の存在のための十分条件を得ている。ここでは逆に収穫率が最適であるための必要条件を示す最大値原理について考察し,最適制御が本質的に有限個の値しかとらないBang-Bangタイプであるための十分条件を与えた。それは応用面からも実際に最適制御を見つけるための指針を得るという意義があり重要である。この結果は国際誌Mathematical Population Studiesに掲載された。次に,相互作用を持つ2種の生物系をモデルとするサイズ依存型非線形個体数変動モデルに対する最適収穫問題ついて考察した。2種の生物の間には競争系,捕食・被食系,共生系が考えられるがいずれの場合にも収穫による利益を最大にする最適収穫問題を研究することは,応用上より重要である。ここでは最大値原理を示すとともに最適制御の存在を示した。この結果は、米国フロリダで開かれた国際会議WCNA2008において発表した。また,同じ非線形成長率を持つ多種生物系のサイズ依存型非線形個体数変動モデルに対して,その解が半群性を持つことを示し,さらに解軌道がコンパクトになるための十分条件を与えた。このことにより,解の漸近挙動を調べることができた。また,場所に依存するモデルとして拡散項を持つサイズ依存型線形個体数変動モデルに対する解の存在と一意性についての結果も得た。
統合失調症におけるDPYDとIGHMの関与についての検討

統合失調症は社会的機能が低下する精神疾患であり、生物学的な病態解明が急がれる疾患の一つである。申請者は一卵性双生児統合失調症不一致例リンパ芽球様細胞を用いた発現解析から、候補遺伝子としてDPYDとIGHMを見出していた。しかし、その発現の差をもたらしうる原因については不明であり、その原因探索としてコピー数多型解析を一卵性双生児統合失調症不一致例3組を対象として行った。コピー数多型解析では、一卵性双生児不一致間のDPYDとIGHMには明らかなコピー数多型の差を認められなかった。全エクソン解析、DNAメチル化解析、エクソン欠失解析をDPYDとIGHMに対して今後行っていく必要があると考えられた。統合失調症は生物学的病態の解明が急務な疾患であるが、現在までに遺伝要因として同定されたものは一定せず、候補遺伝子は増大の一途を辿っている。その中で、申請者は一卵性双生児統合失調症不一致例を用いたmRNA発現解析から、罹患双生児においてDPYD(Dihydropyrimidine dehydrogenase)とIGHM(immunoglobulin heavy constant mu)の発現変化を認め、統合失調症の有力な候補遺伝子であることを示した。本研究では、この2遺伝子について、1発現の差異をもたらしうる原因の探索を一卵性双生児統合失調症不一致例に対して行う、2多数例サンプルの統合失調症患者に対して、エクソン欠失の有無の検討を行い、統合失調症病態解明の一助としたい。1DPYDとIGHMの発現差異をもたらしうる原因探索として、全エクソン解析、コピー数多型解析を一卵性双生児統合失調症不一致例のゲノムDNAに対して行い、現在解析中である。2MLPA法を用いてエクソン欠失の有無の検討は、統合失調症患者サンプルを収集中である。実験は順調に進展しているが、解析に難渋している。統合失調症は、陽性症状、陰性症状、認知機能障害により、社会的機能が低下する精神疾患の一つである。思春期以降に発症することが多く、再発と寛解を繰り返し、慢性の経過をたどる。十分な治療法が存在せず、当事者のみならずそれを支える家族も大きな苦悩を抱え、生物学的な病態解明が急がれる疾患の一つである。その中で、申請者は一卵性双生児統合失調症不一致例リンパ芽球様細胞を用いた発現解析から、分子生物学的差異の存在、並びに有力な候補遺伝子としてDPYDとIGHMを見出していた。しかし、その発現の差をもたらしうる原因については不明であり、その原因探索としてコピー数多型解析を一卵性双生児統合失調症不一致例3組(41歳女性、46歳女性、28歳女性)を対象とし、末梢血白血球由来のゲノムDNAを用いて研究を行った。コピー数多型解析では、一卵性双生児不一致間のDPYDとIGHMには明らかなコピー数多型の差を認めず、今後全エクソン解析、DNAメチル化解析、エクソン欠失解析などをDPYDとIGHMに対して行っていく必要があると考えられた。今後としては、実験結果の解析を行い、研究を推進していく。その中で、問題になりうるのが、解析の段階であり、なるべく精度の高い解析結果を得られるような解析方法を検討し、行っていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。統合失調症28年度が最終年度であるため、記入しない。
未成熟染色体凝集法を用いたヒト悪性腫瘍の放射線感受性予測法の研究

おもにin vitroで本法の有用性を検討した。使用した細胞は、正常ヒト線維芽球細胞AG1522およびN3、Ataxia Telangiectasia患者由来ヒト線維芽細胞AT5BIおよびAT2052、ヒト悪性黒色腫細胞Melanoma903、ヒト線維肉腫細胞HT1080の放射線感受性の異なる6種の細胞である。これらの細胞とM期Hela細胞を細胞融合させ未成熟染色体凝集を誘導した。ヒト第4染色体に特異的なDNAプローブを用い蛍光in situ hybridizationを行い、ヒト第4染色体のみがfluoresceinによる黄色の蛍光を発し、他の染色体はpropidium iodideにより赤色の蛍光を発するよう二重染色し、容易に第4染色体異常が観察可能となった。まず、放射線照射後24時間後の細胞を用いて、それぞれの細胞の放射線感受性をコロニー法にて求めた。次に、それぞれの細胞系の放射線照射直後の第4染色体切片数と放射線線量との関係を求めた。放射線照射直後の第4染色体異常の頻度は、照射線量に比例し、同一の照射線量では放射線感受性の異なる細胞でも等しかった。一方、放射線照射24時間後の第4染色体切片数と放射線線量との関係を求めると、それぞれの細胞系で、染色体切片数は放射線照射直後に比較して減少し、さらに染色体切片数は放射線線量の増加にともない増加した。同一の放射線線量では、放射線感受性の高い細胞ほど第4染色体切片数が多かった。また、細胞の放射線感受性と無関係に、放射線照射24時間後の第4染色体切片数から細胞生存率が推定できた。手術組織を用いた研究は、現在進行中で、症例数が少なく結論はでていない。今後、症例を増やし本法の臨床応用への可能性を検討し、放射線感受性予測法としての確立をめざす。
異常アミノ酸を多数含有する天然抗生ペプチドの合成と構造活性相関

本研究では主として高い抗菌活性を有するデヒドロヘプタペプチドである8種類のアントリマイシン類のうち,2種類のAvおよびDvの全合成を行った。他に,大環状デヒドロペプチド類の部分骨格,それらの伸長反応についても検討した。まず,アントリマイシン類のペプチド鎖中に含まれている4つの異常アミノ酸,ヒドロキシメチルセリン,2,3,4,5-テトラヒドロピリダジン-3-カルボン酸(Pya),(2S,3S)-2.3-ジアミノブタン酸(Dab),およびデヒドロバリンとデヒドロイソロイシンを合成したのち,N端トリペプチドとC端テトラペプチドを合成し,それらの縮合を試みた。しかし,この縮合は殆んど進行せず,回収に終ったので別法でのカップリングを行った。すなわち,中央部分のDab-Pya部分を合成したのち,N端とC端側からアミノ酸を伸長し,保護アントリマイシン8種類すべての合成を行った。その後,デヒドロバリン残基を含む二種類の脱保護を行い,精製した。得られた結晶は天然物の隔,比旋光度および種々の分光学的データ(IR,^1HNMR,^<13>CNMR etc)が完全に一致した。さらに大環状ペプチドでチオストレプトン系抗生物質であるミクロコッシンP,ノシヘプチド,ベルニナマイシンなど多種類の天然物に含まれるデヒドロチアゾールカルボン酸やデヒドロオキサゾールカルボ酸などの合成に成功したので,これらを含む多種類のペプチドの部分骨格の合成を行った。さらに,それらの縮合を行って,上記抗生物質の長鎖ペプチドの合成にも成功している。以上の成果はすでにいくつかの論文になっているもの,印刷中,投稿中のものまで含めて10以上あり,成果として優れていることを証明している。
ペルオキシソーム－小胞体間の膜接触部位の構成蛋白質の同定

哺乳類細胞のペルオキシソームー小胞体間に近接部位が存在することを、Proximity Ligation Assayという方法を用いて証明した。次に、ペルオキシソームー小胞体間の膜接触部位の変異細胞が薬剤により濃縮できるかを検定したが最適薬剤濃度をHAP1において得ることができなかったので細胞をHAP1からMEF細胞に変更し最適薬剤濃度を得た。更に分割タンパク質を用いた膜接触部位を定量化する新しい方法を樹立した。また、新たな変異細胞の樹立方法として、ゲノムワイドなCas9/CRISPR gRNA libraryを使用した。現在それらの方法を組み合わせ、膜接触部位の変異細胞を樹立中である。ペルオキシソームの主な機能の一つはアルキル(アシル)リン脂質の初期段階の生合成であり、その異常により疾患が引き起される。この中間体が完成型になるためには小胞体に輸送される必要があり、当研究課題申請者はその輸送はペルオキシソームー小胞体間の膜接触部位を介して行なわれていると推測した。オルガネラ間膜接触部位は脂質やイオンの小胞非依存的・ATP非依存的輸送を担う特殊な膜ドメインであると提唱されているが、哺乳類細胞においてはその構成蛋白質や基質の輸送機序などはほとんど解明されておらず、その存在自体も不確実である。当応募課題の研究目的は、ペルオキシソームー小胞体間の膜接触部位の構成蛋白質を同定し、膜接触部位がペルオキシソームー小胞体間に存在することを証明することである。そのため、まずペルオキシソームー小胞体間において近接部位が存在することを証明するために、物理的近接タンパク質を検出するProximity Ligation Assayを用いて固定細胞におけるペルオキシソームー小胞体膜間で膜近接部位が存在することを証明した。次に、遺伝子トラップ法で作製されたヒト一倍体変異細胞プールから、未濃縮変異細胞プールとMCS機能欠損細胞を特異的に濃縮することを試みた。この濃縮方法は、これまでCHO細胞でペルオキシソーム変異細胞を樹立した実績のある方法であるが、当実験で用いたヒト一倍体細胞では、うまく濃縮が効かなかった。そこで、膜接触部位を直接検出するために、分割タンパク質システムを構築することを試みた。その結果、分割DHFRを用いて膜接触部位をセルソーターで定量的に評価できる系を樹立することができた。現在、最新の技術であるCas9/CRISPRシステムに基づくgRNAライブラリーを用いてペルオキシソームー小胞体間の膜接触部位の構成蛋白質を網羅的に同定しようと試みている。細胞生物学
マウス野生集団に潜在する行動・代謝異常遺伝子の検策方法の有用性検証と新規系統開発

本研究は、新規な行動・代謝異常遺伝子を野生マウス個体を広く検索・発見する方法論とシステムによって、発見・開発したモデル動物や遺伝子を実験動物、家畜、ヒトを対象とするライフサイエンス研究の推進に資することを目的として行った。東南アジア産の野生マウス(Mus musculus castaneus、キャス・マウス)の捕獲個体群を育種素材とし、動物行動・代謝異常マウスの検索システムを利用して、有用形質・遺伝子の発掘と研究用有用モデルマウス系統の開発を試みた。1)内因性概日リズム消失マウスは、主働遺伝子を含む劣性遺伝形質と推定し、この系統を純化すべくコンジェニック系として育成を進めるとともに、種々の環境条件、特に異なる明暗サイクル等における同調能力の行動学的解析とQTL解析のための試料の蓄積を進め、解析を待つ段階となった。2)キャス・マウス×C57BL/6JのN_2に由来する非肥満型NIDDM型マウスは病態解析の結果、高血糖と軽度の肥満を伴い、かつ高インシュリン血漿を呈する典型的なII型糖尿病のモデルとして論文に公表し、さらに系統の純化を進めた。3)眼瞼閉鎖と四肢掌融合異常を併発するマウス・ラインは遺伝様式の分析の結果、常染色体上の独立座位にある2対の劣性遺伝子によって支配されていると解釈されたが、さらに系統の純化と遺伝解析が必要な段階にある。4)その他、マウスのRI系統を用いたQTL解析を幾つかの突然変異遺伝子について行う一方、スンクスの糖尿病系統の病体解析を行い結果を公表論文とした。本研究は、新規な行動・代謝異常遺伝子を野生マウス個体を広く検索・発見する方法論とシステムによって、発見・開発したモデル動物や遺伝子を実験動物、家畜、ヒトを対象とするライフサイエンス研究の推進に資することを目的とする。東南アジア産の野生マウス(キャスタネウス・マウス)の捕獲個体群を育種素材とし、動物行動・代謝異常マウスの検索システムを利用して、有用形質・遺伝子の発掘と研究用有用モデルマウス系統の開発を試みた。その結果、概日リズム異常、高血糖・高インシュリン血漿、形態形成異常等の遺伝性研究用モデル候補マウスを発掘することができ、遺伝様式と病態の解析、染色体上へのマッピング、さらに系統の純化を進めている。これらの新規に開発しつつあるマウス系統あるいはラインは、人為誘発ではない、世界的に希少な遺伝性の有用研究用モデル動物として、共同研究者等の間で遺伝学的・生理学的解析が進められている。1)内因性概日リズム消失マウスは、主働遺伝子を含む劣性遺伝形質であると推定され、この系統を純化すべくコンジェニック系として統育成を進めるとともに、種々の環境条件、特に異なる明暗サイクル等における同調能力の行動学的解析とQTL解析のための試料の蓄積を進めている。2)キャス・マウス×C57BL/6JのN2に由来する非肥満型NIDDM型マウスは病態解析の結果、高血糖と軽度の肥満を伴い、かつ高インシュリン血漿を呈する典型的なII型糖尿病、すなわち日本人に特に多いタイプの糖尿病のモデルとして注目されている。3)眼瞼閉鎖と重度の四肢掌融合異常を併発するマウス・ラインは遺伝様式の分析の結果、常染色体上の独立座位にある2対の劣性遺伝子によって支配されていると推定された。4)その他、新たなリズム・摂食行動異常のモデルマウス候補を発掘するため、他のアジア地域から得られた野生マウスを用いて試みている。
イメージング質量分析による心筋症病態進行関連バイオマーカー同定および治療応用研究

難治性かつ進行性の心疾患である拡張性心筋症に対する適切な治療マネジメント戦略を立てる目的のため、重症度に関連するバイオマーカーを同定することが本研究の目的である。ハムスター拡張型心筋症モデルの各週齢(各重症度)の個体の心臓および血液を採取し、最先端のイメージング質量分析法であるMALDI-TOF/IMS法を用いて特異的なシングルピークを検出・比較し、別途作製したハムスタープロテオームライブラリを参照することで、病態進行に特異的なバイオマーカーを同定し、将来的な臨床研究による実証を経た、最終的な拡張型心筋症に対する包括的マネジメント戦略の確立につなげるための基礎科学的知見を得る。
固体水素III相のX線構造研究

金属化が予言されている固体水素高圧相(III相)の結晶構造解析を目的に、放射光X線回折実験を100Kの低温で超高圧下200GPaまで行い、X線回折データの収集に成功した。得られた観測データから、III相では200GPaまで、水素分子の重心は依然としてhcp構造の格子点近傍にあること、またII-III相転移に伴って、格子定数のc/a比が減少することを明らかにした。この比の減少は、回転楕円体形状を持つ水素分子の回転の秩序化に伴って、分子軸がc軸と角度を成すことに起因する。さらに、300GPaまでのラマン散乱実験から、III相におけるhcp構造の低対称化は230GPa程で生じることが明らかになった。最近,Max-Planck研究所のM. Eremetsらにより室温,270 GPa程で水素の金属化が報告され話題になっている。その後のラマン散乱及び光学吸収実験そして赤外吸収実験による追試から,固体水素はこの圧力では未だナローギャップ半導体的な振舞いを示すことが明らかとなったが、金属水素の実現は今や目と鼻の先に迫っている。固体水素III相においてはバンドオーバラップによる分子性(半)金属状態が実現すると考えられる。それゆえ,水素の金属化を電子論的に理解する上で,III相の結晶構造の解明は喫緊の課題となっている。本研究では,固体水素III相の構造と物性に関する知見を得る目的で,超高圧低温下でX線回折とラマン散乱実験を行った。低温粉末X線回折実験はSPring-8の単色マイク集光ビームとキュレット径100 μmのダイヤモンドアンビルを用いた角度分散法で行い、固体水素の回折データを200 GPaまで収集できた。観測された2本の回折線のd値は、我々がこれまで蓄積したd値の圧力依存性の結果と良い一致を示した。また、低温ラマン散乱実験ではHe-Neレーザーを励起光源とし,キュレット径20 μmのダイヤモンドアンビルを用い、水素分子のvibronとlibronモードを300 GPaまで測定し、250 GPa程で、分子の回転運動の凍結に対応するとみられるlibronモードの分裂を初めて観測した。一方、我々の超高圧発生技術を試す目的で、単体テルルの330 GPa領域までの粉末X線回折実験を行い、255 GPaでfcc構造の高圧相を発見した。また、固体水素との比較を目的に、同じ軽元素である等核二原子分子O2とN2二元系の高圧相の構造とその物性を調べ、純粋な固体酸素では現れないカゴメ格子を組む磁気秩序を初めて観測した。これらの成果は、現在論文投稿中である。それゆえ,この金属化を電子論的に理解する上で,III相の結晶構造の解明は喫緊の課題となっている。今年度は200GPa領域の低温粉末X線回折を収集するため、ダイヤモンドアンビルを2段ベーベル型に改良し、キュレット径を70 μmおよび80μmに狭めて2回の実験を行った。SPring-8の放射光を用い100Kの低温で、これまでに固体水素の回折データを200 GPaまで収集できた。その結果、固体水素III相においては200GPaの圧力までは、水素分子の重心がhcp格子の格子点近傍にあることが明らかとなった。また、低温ラマン散乱実験ではHe-Neレーザーを励起光源とし,キュレット径20 μmのダイヤモンドアンビルを用い、水素分子のvibronとlibronモードを300 GPaまで測定し、250 GPa程で、分子の回転運動の凍結に対応するとみられるlibronモードの分裂を初めて観測し、この分裂に対応しvibronの圧力依存性にも異常を観測した。一方、ダイヤモンドアンビルを用いた超高圧発生の技術開発を目的に、単体金属モリブデンの粉末X線回折実験を行いに410GPaの超高圧発生に成功し、bcc-Moの状態方程式を決定した。また、固体水素との比較を目的に、同じ軽元素である等核二原子分子O2とN2二元系の高圧相の構造とその物性を調べ、純粋な固体酸素では現れないカゴメ格子を組む磁気秩序相の低温高圧相図を決定した。[背景]水素は、最も単純な元素で、科学研究の基本物質であることから、その物性は古くから研究されている。近年、超高圧下の金属化の研究やエネルギーへの応用研究が注目を集めている。固体水素には、最近発見された半導体相(IV相)を加え、現在、四つの相の存在が明らかにされている。低温下160 GPa程で出現するIII相では分子の回転は完全に凍結され、分子の配向秩序が定まると考えられているがその結晶構造は不明である。多くの理論研究は、単原子金属相への転移に先立って、III相のバンドオーバーラップ金属化を報告しているが、提案された結晶構造と金属化圧力は収束していない。それゆえIII相の構造解明は、重要課題である。[目的]

本研究では、超高圧下でのX線回折実験とラマン分光実験を行い、固体水素III相の結晶構造を解明することを目的とした。また、ダイヤモンドアンビル高圧セル(DAC)を用いた超高圧発生技術開発を目的とした。[成果]本実験では、固体水素の回折データを100 Kの低温で最高圧200 GPaまで収集できた。マイクロフォーカス放射光単色X線ビームを用いることで比較的統計精度の高い水素からの回折線を観測できた。観測された回折線は2本で、hcp構造の低対称化に伴う回折線の分裂等は見られなかった。回折線のd値は、我々がこれまで蓄積したd値の圧力依存性の結果と良い対応を示し、200 GPaでも水素分子は依然としてhcp構造の格子点近傍にあることを明らかにした。また、300 GPaまでのラマン分光実験の結果、III相のhcp構造の低対称化が230 GPa以上で顕著になることを提言した。これらの成果は、スペインのマドリッドで開催された高圧力の科学と技術に関する国際会議(AIRAPT)で発表し、そのプロシーディングスが査読付論文としてJ. Phys.誌に出版される予定である。金属化が予言されている固体水素高圧相(III相)の結晶構造解析を目的に、放射光X線回折実験を100Kの低温で超高圧下200GPaまで行い、X線回折データの収集に成功した。得られた観測データから、III相では200GPaまで、水素分子の重心は依然としてhcp構造の格子点近傍にあること、またII-III相転移に伴って、格子定数のc/a比が減少することを明らかにした。この比の減少は、回転楕円体形状を持つ水素分子の回転の秩序化に伴って、分子軸がc軸と角度を成すことに起因する。さらに、300GPaまでのラマン散乱実験から、III相におけるhcp構造の低対称化は230GPa程で生じることが明らかになった。水素は元素の中で最もX線の散乱能が低くこれまで100GPaを超える圧力でX線回折実験は困難と考えられてきた。本研究で、固体水素III相の回折データを200GPaまで収集することができ、さらに超高圧発生の技術開発も進展したため。高圧物理学ダイヤモンドアンビルの加圧部分を2段ベーベル型の改良し、キュレット径を80μmに狭めることで250GPaまでのX線回折データを収集して、固体水素III相の構造を決定する。水素は元素の中で最もX線の散乱能が低くこれまで100GPaを超えるX線回折実験は困難と考えられていた。今回、超高圧下での固体水素の回折データを200 GPaまで収集することができ、加えてさらなる超高圧領域へ実験を拡張し、固体水素高圧相IIIの構造解明の目途がついた。現在、液体窒素冷却Siモノクロメータを用い250 GPaまでの回折実験を計画中である。また、ラマン散乱実験では、固体水素III相におけるlibronモード分裂の再現性を確認するための再実験を行う。
菌体内物質の選択的放出および分離法の開発に関する研究

媒体攪拌型ビーズミルによる酵母の細胞破砕により,酵母内に含まれるグルタチオンを放出させた。グルタチオンは補酵素としての作用や解毒作用を示す生理活性物質として知られている。グルタチオンの放出特性に及ぼす攪拌翼回転数,破砕時間,ビーズと酵母の仕込み質量比(=α)およびビーズ径の影響を調べ,さらにこれらの操作因子の効果を統一的に表示しうる指標である応力負荷積算量との関係を明らかにした。以下に結果を述べる。1)グルタチオン抽出率に及ぼす攪拌翼回転数の影響は2000rpm以下では未破砕の酵母が多く,抽出率は低かった。4000rpmではα≧7のときに熱水抽出法の約1.5倍の高い抽出率がえられた。それ以上の回転数にしても抽出率の増加はみられなかった。2)抽出率に及ぼす破砕時間の影響は,最大抽出率に到達するまでの破砕時間はα=5では510分であったが,α≧7では35分と短かくなった。従って,短時間で高い抽出率を得るためにはαは大きい方が良い。3)抽出率に及ぼすビーズ径(α=0.252.0mm)の影響は,α=7では特に認められなかったが、αの値が小さくなるとビーズ径の影響が現われ,抽出率を最大にする最適ビーズ径は0.5あるいは0.75mmであった。4)破砕に伴い液温が上昇するが,40°Cまでは抽出率に影響を与えなかった。5)破砕に影響を与える操作因子をすべて含む応力負荷積算量で種々の破砕条件と結果を整理した効果,α≧6の条件ではすべての破砕条件における比抽出率と応力負荷積算量の関係はひとつの曲線で表わされた。最大抽出率を与える応力負荷積算量は3001000であった。また小型のWaringブレンダーにおいて得られた抽出率と応力負荷積算量の関係は工業用のDYNO-MILLにおいて得られた結果と一致した。このことから応力負荷積算量は酵母からのグルタチオンの破砕抽出プロセスの設計に有用な指標になることがわかった。以下に結果を述べる。
肝細胞癌の進展における酸化ストレスの関与およびその分子生物学的メカニズムの解明

ヒト肝細胞癌組織において酸化ストレスの増加にともない肝癌細胞のテロメア長が短縮し、PTEN・Aktシグナルに依存してテロメラーゼ活性の増加と細胞増殖の活性化・アポトーシス耐性の傾向があることが明らかとなった。またAktシグナルの活性化に関連して、肝細胞癌組織における酸化ストレスはVEGF、VEGF receptor2の発現増加を介した血管新生にも関与していることが明らかとなった。以上より本研究は、肝細胞癌において酸化ストレスがテロメラーゼの活性化、血管新生の増加を介して、癌病態の悪性化に寄与していることを明らかにし、肝細胞癌の新たな治療として抗酸化療法の有用性について示した点で意義があったと考える。昨年度の研究において,ヒト肝細胞癌組織における酸化ストレスの程度とその他の因子との関連について検討した。結果,酸化ストレスの増加にともない肝癌細胞のテロメア長は短縮,テロメラーゼ活性は増加していることが明らかとなった。また,酸化ストレスの程度が強く,テロメラーゼ活性が増加している肝細胞癌組織では増殖活性の増加とアポトーシス耐性の傾向があることも判明した。・肝細胞癌組織における酸化ストレスの程度の解析:肝細胞癌組織で8-OHdGの免疫染色を行い,その程度を4段階(grade0-3)に分類した結果,全体の77%でgrade1以上の酸化ストレスの増加を認めた。・肝細胞癌組織における酸化ストレスのテロメア長への影響:肝細胞癌組織でテロメアPNAプローブを用いた組織FISHを行い,肝癌細胞のテロメア長を測定した。テロメア長と酸化ストレスの程度とを検討した結果,酸化ストレスの増加にともない有意に(P<0.001)テロメア長の短縮を認めた。・肝細胞癌組織における酸化ストレスのテロメラーゼ活性への影響:肝細胞癌組織を用いてhTERTの免疫染色およびTRAPassayを行い,肝細胞癌のテロメラーゼ活性の程度を評価した。テロメラーゼ活性と酸化ストレスの程度とを検討した結果,酸化ストレスの増加にともない有意に(P<0.001)テロメラーゼ活性の増加を認めた。・肝細胞癌組織における酸化ストレスおよびテロメラーゼ活性の癌病態への影響:肝細胞癌組織における酸化ストレスの程度と組織学的分化度とのあいだには有意な関連を認めなかった。Ki67の免疫染色で増殖活性,TUNEL法でアポトーシスの頻度を評価したところ,酸化ストレスの程度が強い組織(grade2-3)ではテロメラーゼ活性の程度により増殖活性・アポトーシスの頻度に有意差(P<0.05)を認めた。現在,ヒト肝細胞癌組織において酸化ストレスによるテロメラーゼ活性増強の機序について,免疫組織化学の手法やin situhybridizationを用いて検討している。平成20年度の研究において、ヒト肝細胞癌検体を用いてhTERTおよびテロメラーゼ活性制御因子(Akt、p53、c-myc、SIP1、Had1、TGF-β)、抗酸化系酵素(SOD、GSH、TRX、GSH peroxidase、TRX peroxidase、catalase)の発現をISHで解析した。結果、酸化ストレスの増加に伴いhTERTの発現は増加していたが、テロメラーゼ活性制御因子・抗酸化系酵素については酸化ストレスの程度と関連して発現が有意に変化する因子は認められず、テロメラーゼ活性の増加および酸化ストレスが生じる機序については不明だった。次に、Akt、ERK1/2、JNKのテロメラーゼ活性増加につながるシグナル伝達系について、免疫組織染色を行い、その活性について検討した。結果、酸化ストレスの増加に伴い、肝細胞癌組織においてAkt活性が増加し、またAkt活性化の抑制因子であるPTENの発現が低下していることが明らかとなった。Aktの下流のシグナルには血管新生因子VEGFが報告されており、上記の結果をふまえて、次に肝細胞癌組織における酸化ストレスと血管新生の関連について検討を行った。肝細胞癌組織における新生血管についてはCD31の免疫組織染色を行い、画像解析により評価した。またVEGF、VEGF recep tor2の発現も免疫組織染色により評価した。結果、肝細胞癌組織において酸化ストレスの程度が強くなるに伴ってVEGFの発現が増加し、また新生血管の数も増加することが判明した。ヒト肝癌細胞株HLEを用いてさらに検討したところ、H202添加下の培養でHLE株でのAKTの活性化、およびその下流のNF-κB活性化、VEGFの発現増加が認められ、その効果は抗酸化剤NACの投与により打ち消されることが明らかとなった。以上より本研究は、肝細胞癌において酸化ストレスがAKTの活性化、それに続くテロメラーゼ活性化、血管新生の増加を介して、癌病態の悪性化に寄与していることを明らかにし、肝細胞癌の新たな治療として抗酸化療法の有用性について示した点で意義があったと考える。