hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
開発途上国における環境汚染の小児健康影響に関する国際共同研究

近年、微量元素の低濃度曝露が妊婦およびその胎児・出生児の健康へ影響することが示唆されている。日本を含む先進国では大規模コホート調査が始まったが、その一方で、開発途上国においての健康影響はあまり顧みられていない。申請者らはこれまで、経済発展の著しい地域であるイラン、中国およびインドネシアの都市を対象とし、胎児期・新生児期における環境中微量元素の非職業性曝露について疫学調査を行い、これらの曝露が妊婦およびその胎児・出生児の健康に影響することを明らかにしてきた。本研究では、これら疫学調査対象者(児)のフォローアップを行うとともに、クアラルンプールにおいて妊婦およびその胎児・出生児を対象とした調査を計画した。環境化学物質、特に微量元素の低濃度曝露が、胎児期から小児期の健康に与える影響について途上国を中心に解明を行なう。テヘラン(イラン)、大連(中国)、セルポン(インドネシア)については、フォローアップ調査の実施開始にむけて検討を進めてきた。平成27年度にリクルートを開始した調査対象者(児)に対して、追跡可能な対象者について改めて研究目的と方法を十分説明しあらかじめ同意を得た上で、採血ならびに健康状態の調査を質問紙調査によって行なった。予算の都合上、特にイランに注力をして調査を行った。小児の採血などができない場合については毛髪や尿など、血液以外でのバイオマーカーに使える試料を取得を行った。クアラルンプール(マレーシア)郊外については、現地研究者とのフィージビリティーについての話合いの中で、予算内での研究実施が困難であることが確認されたので、新規調査は実施せずに、現地でのヒアリング等によって状況を把握するにとどめる予定となった。これまで収集してきた各種検体中の微量元素濃度の測定は集中的に日本にて行い、質問紙調査から得られた妊娠、分娩、新生児の状態および小児の発達状況について、環境中微量元素への暴露との関連性について統計数理的に解析を行う。なお本年度は最終年度にあたるため、イランの調査を中心に日本国内のデータとの比較についても検討を加えていく。また、他の補助金等に応募し、協力国の研究者らとの国際シンポジウム開催を目指す。テヘラン(イラン)、大連(中国)、およびセルポン(インドネシア)におけるフォローアップ調査を実施してきた。平成2326年度の調査対象者(児)に対して、追跡調査が可能な対象者に対して改めて研究目的と方法を十分説明し、あらかじめ同意を得た上で、採血ならび健康状態の調査を質問紙によって行っている。テヘラン(イラン)での調査はフォローアップ調査対象者が非常に少なくなったこと、また、近年の経済発展により環境が激変したことを受け、今回、改めてベースライン調査を開始した。また、今回の検討は、我国における環境省主導のエコチル調査のような調査をイランにおいて行うためのパイロット調査としての意味合いを持たせることを現地研究者と調整した。大連(中国)においては、現地研究者とともにデータ収集を行っているが、行政の関係上、得られるデータが関係各機関に散在しており、現地研究者と連携を図って取集をつとめている。セルポン(インドネシア)において、現地調査を計画した。現地研究者との予定が合わなかったが、研究デザインのすり合わせや、必要となる消耗品の購入を進めた。以上の調査は海外共同研究者の所属教室のスタッフと共同で実施している。この際、日本側の研究者、スタッフおよび大学院生が抗体で現地にい滞在をして情報収集にあたっている。データ収集終了後は、生体試料の国外持ち出しが許されている国については、試料を日本へ持ち帰り、より詳細な化学分析およびデータ解析を行っている。テヘランおよび我が国における調査は順調であるが、中国、インドネシアでの検討がやや遅れている。中国では国際情勢の影響を受けて、現地研究者との連絡が密に取れない状況である。インドネシアでは、現地研究者と当方研究者のスケジュールが合わず、現地調査を行う事ができなかった。テヘラン(イラン)、大連(中国)、およびセルポン(インドネシア)におけるフォローアップ調査を行ってきた。平成2326年度の調査対象者(児)に対して、追跡可能な対象者に対して、改めて研究目的と方法を十分説明し予め同意を得た上で、採血ならびに健康状態の調査を質問紙によって行っている。テヘラン(イラン)での調査はフォローアップ調査対象者が非常に少なくなった。また、近年の経済発展により環境が激変したことを受け、今回、改めてベースライン調査を開始した。大連(中国)においては、現地研究者とともにデータ収集を行っている。行政の関係上、得られるデータが関係各機関に散在しており、現地研究者と連携をはかって取集をしている。セルポン(インドネシア)については、今年度に現地調査をする予定でスケジュールを調整していたが、現地研究者のスケジュールが急遽変更となり、調査が行えなかった。よって、一昨年度に収集したデータの解析等を実施した。クアラルンプール(マレーシア)のベースラインの調査については、研究対象をマレーシアプトラ大学に出産の目的で訪れる妊婦、その配偶者および胎児とし、これらの妊婦・配偶者にアクセスできる研究者と研究遂行の可能性について打診をおこなった。以上の調査は、海外共同研究者の所属教室のスタッフと共同で実施している。この際、日本側の研究者、スタッフおよび大学院生が交代で現地に滞在した。

インドネシアでは、現地研究者と当方研究者のスケジュールが合わずに現地調査を行えなかった。近年、微量元素の低濃度曝露が妊婦およびその胎児・出生児の健康へ影響することが示唆されている。日本を含む先進国では大規模コホート調査が始まったが、その一方で、開発途上国においての健康影響はあまり顧みられていない。申請者らはこれまで、経済発展の著しい地域であるイラン、中国およびインドネシアの都市を対象とし、胎児期・新生児期における環境中微量元素の非職業性曝露について疫学調査を行い、これらの曝露が妊婦およびその胎児・出生児の健康に影響することを明らかにしてきた。本研究では、これら疫学調査対象者(児)のフォローアップを行うとともに、クアラルンプールにおいて妊婦およびその胎児・出生児を対象とした調査を計画した。環境化学物質、特に微量元素の低濃度曝露が、胎児期から小児期の健康に与える影響について途上国を中心に解明を行なう。テヘラン(イラン)、大連(中国)、セルポン(インドネシア)については、フォローアップ調査の実施開始にむけて検討を進めてきた。平成27年度にリクルートを開始した調査対象者(児)に対して、追跡可能な対象者について改めて研究目的と方法を十分説明しあらかじめ同意を得た上で、採血ならびに健康状態の調査を質問紙調査によって行なった。予算の都合上、特にイランに注力をして調査を行った。小児の採血などができない場合については毛髪や尿など、血液以外でのバイオマーカーに使える試料を取得を行った。クアラルンプール(マレーシア)郊外については、現地研究者とのフィージビリティーについての話合いの中で、予算内での研究実施が困難であることが確認されたので、新規調査は実施せずに、現地でのヒアリング等によって状況を把握するにとどめる予定となった。現地研究者との連携がとれない地域(中国)については、継続した調査を保留し、現状までの追跡結果を取りまとめる必要があると考えた。また、現地研究者とのスケジュール調整がとれなかった地域については連絡を事前に徹底しておくことにより実施を目指す。いずれも、研究者同士の国際連携を深めて研究を推進していく。現地研究者との連携がとれない地域(中国)については、継続した調査を保留し、現状までの追跡結果をとりまとめる必要があると考えた。また、現地調査のスケジュール調整については当該研究者同士の連携を深めて推進していく予定である。これまで収集してきた各種検体中の微量元素濃度の測定は集中的に日本にて行い、質問紙調査から得られた妊娠、分娩、新生児の状態および小児の発達状況について、環境中微量元素への暴露との関連性について統計数理的に解析を行う。なお本年度は最終年度にあたるため、イランの調査を中心に日本国内のデータとの比較についても検討を加えていく。また、他の補助金等に応募し、協力国の研究者らとの国際シンポジウム開催を目指す。
TRPチャネルによる大腸イオン分泌異常機構の電気生理学的解明

ワサビなどの香辛料は、東洋医学では健胃薬として用いられていることから、大腸機能への関与が示唆されてきている。本研究において、ワサビの辛味主成分であるアリルイソチオシアネート(AITC)がラットおよびマウス大腸粘膜からのCl-分泌を引き起こすメカニズムにTRPA1チャネルが関与するのかについて検討した。その結果、AITCはPGE2遊離を介してクリプト細胞のCl-分泌を誘導するが、このAITCの作用にはTRPA1チャネルは寄与していない可能性が考えられた。本研究により大腸粘膜におけるAITCの新規作用機構が明らかとなったワサビなどの香辛料は、東洋医学では健胃薬として用いられていることから、大腸機能への関与が示唆されてきている。本研究により大腸粘膜におけるAITCの新規作用機構が明らかとなった本年度は、ラットから大腸粘膜を単離し、Ussingチャンバー法を用いた組織レベルでの短絡電流(Isc)の測定を行い、わさびの辛味成分であるアリルイソチオシアネート(AITC)がどのように分泌性下痢を誘発するのかについて検討した。大腸粘膜の漿膜側へのAITCの添加により一過性のISC上昇および膜コンダクタンスの増加が観測できた。このIsc上昇は、漿膜側へのNa^+,K^+,2Cl^-共輸送体の阻害剤であるフロセミドの投与や溶液中のCl^-を除去することにより有意に抑制された。これらの結果から、AITCが大腸粘膜からのCl^-分泌を引き起こすことが明らかとなった。次に、このAITC誘導性Isc上昇に神経系が関与しているのかを検討した。神経活動を抑制するフグ毒のテトロドトキシンを作用させたり、神経層が含まれている粘膜下層を剥ぎ取った大腸粘膜を用いたりしても、AITCはIsc上昇を引き起こしたことから、このCl^-分泌に粘膜下層の神経系の関与はないことが示唆された。これまでに大腸のCl^-分泌を引き起こす細胞外シグナルとしてアラキドン酸代謝物が知られていることから、シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、シトクロムP450の各阻害剤の効果を検討したところ、AITC誘導性Isc上昇はシクロオキシゲナーゼ阻害剤により抑制されることが明らかとなった。さらにPGE_2受容体拮抗剤を添加したところ、AITCによるIsc増加が有意に抑制された。以上のことから、漿膜側に添加したAITCにより産生されたPGE_2がメディエーターとして大腸クリプト細胞に作用することで、Cl^-分泌を誘導していることが明らかとなった。これまでに、ワサビの辛味成分であるアリルイソチオシアネート(AITC)がシクロオキシゲナーゼ代謝物を遊離産生することで、Cl^-分泌を引き起こすことを明らかにしている。そこで本年度は、AITCがどのようなメカニズムでプロスタグランジン類を産生するのかについて検討することを目的とした。近年、Transient Receptor Potential (TRP)カチオンチャネルが辛味受容体として機能することが報告されている。ワサビの辛味であるAITCはTRP ankyrin 1(TRPA1)チャネルが受容体として同定されていることから、ATIC誘導性C1^-分泌におけるTRPA1チャネルの関与について調べた。まず大腸粘膜における短絡電流に対してTRPA1チャネルの特異的阻害剤であるHC-030031の効果を検討したところ、高濃度のHC-030031存在下においてAITCにより生じるC1^-分泌は有意に抑制された。次にAITCが実際にプロスタグランジン類を遊離するのかを検討するために、エンザイム・イムノアッセイ法を用いて、遊離産生されたエイコサノイド(PGE_2、PGF_2α、TXA2)の定量を行ったところ、AITC処理により主に産生されるのはPGE_2であり、このPGE_2産生はTRPA1チャネル阻害剤存在下で減少した。これらの結果から、TRPA1カチオンチャネルがAITCによるPGE_2産生過程に関与している可能性が考えられた。これまでのラット大腸粘膜を用いた研究で、ワサビの辛味成分であるアリルイソチオシアネート(AITC)が誘導するPGE2依存性Cl分泌にAITC受容体であるTransient receptor potential ankyrin 1(TRPA1)が関与する可能性が示唆されたことから、ラットから単離した大腸腺において、AITCにより誘導される膜電流が観測できるかをホールセルパッチクランプ法により検討した。その結果、ラット単離大腸腺にAITCを暴露しても、TRPA1様のカチオンチャネル電流だけでなく、Cl電流も観測できなかったことから、AITCは大腸クリプト細胞に直接作用しないことが示唆された。またAITCがTRPA1チャネルを介してCl分泌を生じるのかを検証するため、TRPA1欠損マウスを用いた。まず野生型マウスから単離した大腸粘膜においても、AITCはラットと同様にPGE2依存性Cl分泌を引き起こすことを確認した。このAITC誘導性Cl分泌はTRPA1阻害剤であるHC-030031により抑制された。次にTRPA

1欠損マウスを用いて検討したところ、予想外にも野生型マウスと同様にAITC誘導性Cl分泌が観測された。このCl分泌もTRPA1阻害剤により抑制された。これらの結果から、AITCはTRPA1以外の分子に作用して、Cl分泌を生じるものと考えられた。さらに大腸粘膜におけるPGE2産生細胞の局在を調べるため、PGE2合成酵素の局在を免疫蛍光染色法により検討した。その結果、mPGES1は粘膜筋板に、mPGES2はクリプト細胞に発現していることが明らかとなった。以上の結果から、AITCは大腸粘膜のPGE2産生細胞に作用し、産生されたPGE2がクリプト細胞のCl分泌を引き起こすことが示唆された。またこのAITCの作用にはTRPA1が関与していないことが明らかとなった。本年度の研究目的は、大腸粘膜におけるAITCによるCl'分泌にTRPA1チャネルが関与するかを検討することであったが、TRPA1チャネル阻害剤が大腸粘膜のC^-分泌だけでなく、PGE_2産生をも抑制することから、AITCはTRPA1チャネルに作用することでPGE_2を産生し、Cl^-分泌を引き起こすメカニズムを提案できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究で、大腸においてAITCがTRPA1チャネルを介したPGE_2産生を促し、C^-分泌を引き起こすといったメカニズムを提案した。今後は、TRPA1チャネルおよびPGE_2合成酵素の発現部位を明らかにし、クリプト細胞のC1^-分泌とどのように連関しているのかを検討したい。さらに、TRPA1チャネルの介在の有無を直接的に検証するために、ノックアウトマウスを使用した実験も進めたい。
放射光真空紫外円二色性による生体分子構造解析の新展開

広島大学放射光科学研究センターのBL-15を放射光源とした真空紫外円二色性(VUVCD)分散計を用い,変性タンパク質のVUVCDスペクトルを測定し,本装置による非天然状態タンパク質の構造解析への応用を検討した。また,密度汎関数法を用いて,アラニンのVUVCDスペクトルの理論的解析を行った。Metmyoglobinの酸・熱・低温変性状態の構造を詳細に解明するために,Thermolysineにより2つのペプチドに断片化し,それぞれをHPLCで分離・回収を行った後,各変性条件下でのVUVCDスペクトル測定を行った。その結果,metmyoglobinの熱・低温変性状態は,foldingの中間体であるA・G・H helix構造を維維していることが示唆された。また,酸変性状態においてもα-helix構造の存在が示唆された。これらの結果により,VUVCD分光法が,非天然状態のタンパク質構造解析に対して有効であることが示された。(論文作成中)アラニンの構造を基にして,カルボキシル基やアミノ基の回転及びこれら発色団周辺の水分子の数と位置を考慮しながら,密度汎関数法(DFT)法で構造最適化を行い,時間依存密度汎関数(TDDFT)法でVUVCDスペクトルを計算した。その結果,水分子9個の時に260140nmの範囲で実測値とよく一致したスペクトルが得られた。スペクトルの帰属(n-π^*,π-π^*,n-σ^*遷移)をすると共に,水分子ネットワークを含んだ溶液中でのアラニンの立体構造を明らかにした(J. Phys. Chem. A 109,6928-6933 (2005))。さらにこの手法を用いて,他のアミノ酸とペプチドのVUVCDスペクトルの計算を行った(発表準備中)。広島大学放射光科学研究センターのBL-15を放射光源とした真空紫外円二色性(VUVCD)分散計を利用し,各種糖類とタンパク質(天然状態)のVUVCDスペクトルを160nmまで、変性状態のタンパク質を172nmまで測定した。6つのグルコースのα,1-4グリコシド結合から成るマルトヘキソースとα-シクロデキストリンの測定から、CDはオリゴ糖の線形と環状構造の違いを敏感に反映することがわかった。また、構成するグルコースの数が異なるα,β,γ-シクロデキストリンの比較により、糖鎖の長さに対するCDの依存性が確認された。各種コンドロイチンの測定から、硫酸基やカルボキシル基の位置や配位がVUVCDスペクトルに大きく影響することがわかった。31種類のタンパク質のVUVCDスペクトル測定から、真空紫外領域において各二次構造(α-helix、β-sheet、turn、unordered structure)に特徴的なピークが観測された。測定した31種類の基底タンパク質のVUVCDデータと二次構造データを、特異値分解法を用いたSELCON3プログラムに組み込むことにより二次構造解析を行った。その結果、測定波長領域の拡張や基底タンパク質の増加と最適な選択により予測精度が格段に向上した。これにより高精度な二次構造解析法が確立できた。Metmyoglobin(pH3.9)、thioredoxin(pH1.8)、staphylococcal nuclease(pH3.8)の酸・熱・低温変性状態のVUVCDスペクトルを用いた二次構造解析から、metmyoglobinで各変性状態の構造の違いが予測された。また、数十%のβ-sheetが各タンパク質の変性状態で形成または維持されていることが示唆された。以上の結果は、VUVCD分光法が、生体分子の構造解析に対して有効であることを示している。広島大学放射光科学研究センターのBL-15を放射光源とした真空紫外円二色性(VUVCD)

分散計を用い,変性タンパク質のVUVCDスペクトルを測定し,本装置による非天然状態タンパク質の構造解析への応用を検討した。また,密度汎関数法を用いて,アラニンのVUVCDスペクトルの理論的解析を行った。Metmyoglobinの酸・熱・低温変性状態の構造を詳細に解明するために,Thermolysineにより2つのペプチドに断片化し,それぞれをHPLCで分離・回収を行った後,各変性条件下でのVUVCDスペクトル測定を行った。その結果,metmyoglobinの熱・低温変性状態は,foldingの中間体であるA・G・H helix構造を維維していることが示唆された。また,酸変性状態においてもα-helix構造の存在が示唆された。これらの結果により,VUVCD分光法が,非天然状態のタンパク質構造解析に対して有効であることが示された。(論文作成中)アラニンの構造を基にして,カルボキシル基やアミノ基の回転及びこれら発色団周辺の水分子の数と位置を考慮しながら,密度汎関数法(DFT)法で構造最適化を行い,時間依存密度汎関数(TDDFT)法でVUVCDスペクトルを計算した。その結果,水分子9個の時に260140nmの範囲で実測値とよく一致したスペクトルが得られた。スペクトルの帰属(n-π^*,π-π^*,n-σ^*遷移)をすると共に,水分子ネットワークを含んだ溶液中でのアラニンの立体構造を明らかにした(J.Phys.Chem.A 109,6928-6933(2005))。さらにこの手法を用いて,他のアミノ酸とペプチドのVUVCDスペクトルの計算を行った(発表準備中)。
ケイ素-ケイ素三重結合を機軸とするケイ素多重結合の化学

単離可能なケイ素-ケイ素三重結合化合物「ジシリン」の反応性について、実験的手法、計算化学的手法を用いて検討すると共に、そこから誘導された特異な構造や電子状態を持つ有機ケイ素化合物の構造や反応性についても明らかにした。また、新規な対称置換および非対称置換ジシリンの合成、構造解析にも成功し、ジシリンの構造や反応性に及ぼす置換基の立体的・電子的効果についても明らかにした。典型元素では最外殻電子がその原子の特性を特徴づけるという周期表の理解に基づいて、主として第2周期元素で骨格が構成されている有機化合物の構成元素を同族の第3周期以降の高周期元素に置き換えた化合物の化学が展開され、類似性と共に著しい差異の存在も明らかにされてきた。第2周期元素では多重結合化合物は単離可能な安定性を有し、その構築も容易であるが、高周期典型元素間の多重結合化合物は一般に反応活性であり、その合成さえ容易ではなかった。特にアセチレンのsp炭素を高周期14族元素で置き換えた三重結合化合物(あるいはその等価体)を安定な化合物として単離できるようになったのはごく最近であり、周期表で炭素の直下に位置するケイ素の三重結合化合物「ジシリン」を研究代表者らが世界に先駆けて合成、単離することに成功した。本研究では、ケイ素-ケイ素をはじめとする高周期14族元素同核三重結合のみならず、炭素-ケイ素三重結合などの異核三重結合、さらには炭素-窒素三重結合を有するニトリル化合物のsp炭素、sp窒素をそれぞれ高周期14、15族元素で置換した高周期ヘテロ三重結合などの高周期典型元素の相乗系多重結合の化学を展開すべく、それらの合成法の開拓、特異な構造、反応性の解明を行うことを目的としている。最近、筆者らが単離可能な化学種として合成・構造決定したケイ素-ケイ素三重結合化合物「ジシリン」はトランス折れ曲がり構造を持ち、それ故に二つのπ軌道、二つのπ^*軌道は等価ではなく、エネルギー的にも縮重していない。さらに、ケイ素-ケイ素結合が炭素-炭素結合に比べて長いこと、炭素2p軌道よりケイ素3p軌道の空間的広がりの大きいことに起因して、ケイ素-ケイ素間のπ軌道準位は著しく高く、一方反結合性π^*軌道は著しく低い。そのため、ジシリンは炭素-炭素三重結合化合物とは異なる多種多様な反応性を示すと考えられる。本研究ではジシリンの還元反応について検討した。ジシリンを配位性溶媒であるテトラヒドロフラン中、1当量のアルカリ金属(Li, Na)あるいはKC8を作用させると容易に1電子還元が進行し、対応するアニオンラジカル種を溶媒和分離イオン対として単離することに成功した。また、金属イオンに対する配位性の弱いトルエン中でもKC8による1電子還元が進行し、一方のspケイ素にカリウムイオンが結合した接触イオン対として得られ、両者の構造をX線結晶構造解析により決定した。ジシリンアニオンラジカルは、中性ジシリンと同様なトランス折れ曲がり構造を持ち、ケイ素-ケイ素三重結合部位の伸長、折れ曲がり角の縮小が認められた。ジシリンの最低非占有軌道は面内非対称π^*軌道であり、これに1電子を収容し、且つ軌道準位を下げて安定化することを反映した構造変化が引き起こされていることが示された。また、陰電荷がSi-Si三重結合部位に非局在化した電子状態を持つと結論され、溶液の電子スピン共鳴スペクトルの解析もこれを支持した。ケイ素-ケイ素三重結合化合物「ジシリン」はトランス折れ曲がり構造を持ち、二つのπ軌道、二つのπ*軌道は等価ではなく、エネルギー的にも縮退していない。また、ケイ素-ケイ素間のπ軌道準位は著しく高く、一方反結合性π^*軌道は著しく低い。そのため、ジシリンは炭素-炭素三重結合化台物とは異なる多種多様な反応性を示すと考えられる。本研究ではジシリンと炭素-炭素多重結合化台物(アルケン類、アルキン類)との反応性について検討した。のジシリンを過剰のアルケンと反応させると、[2+2]環化付加反応が容易に進行し、ジシラシクロブテン誘導体を与えることが明らかになった。また、cis-及びtrans-2-ブテンの付加がアルケンの立体を保持して立体特異的に進行することも見出した。理論計算の結果、本反応は1段階の反応ではなく、一つのspケイ素にアルケンが付加する[1+2]環化付加、続く環外二価ケイ素のシラシクロプロパン環への挿入の2段階で進行していると考えられた。また、ジシリンはアルキン類とも容易に反応し、特にアリールアルキンとの反応では形式的[2+2+2]環化付加により1,2ジシラベンゼンを与えることを見出した。本反応も、[1+2]

環化付加反応が1段階目の反応であり、続く環外二価ケイ素のシラシクロプロペン環への挿入によるジシラシクロブタジエンの生成、第二のアルキン分子の[2+2]環化付加によるジシラデュワーベンゼン中間体の生成、原子価異性を経て1,2一ジシラベンゼンを与えると推定された。さらに、1,2一ジシラベンゼンについては、X線結晶構造解析で決定した分子構造、各種分光学的データ、理論計算により、十分な芳香族性を有することを明らかにした。これまでにケイ素-ケイ素三重結合化合物「ジシリン」が炭素-炭素多重結合化合物(アルケン類、アルキン類)と容易に環化付加反応を起こすことを明らかにしてきた。本研究ではジシリンと炭素-窒素三重結合化合物である有機ニトリル類及びシリルシアニド類との反応性について検討した。ジシリンにアセトニトリル、ベンゾニトリル等の有機ニトリル類を反応させると、ケイ素-ケイ素π結合に対するニトリルC-N三重結合の[2+2]環化付加を経て1:3付加体である2, 6, 7-トリアザ-1, 4-ジシラビシクロ[2. 2. 2]オクター2, 5, 7-トリエン誘導体を与えた。一方、ジシリンにトリメチルシリルシアニドを反応させると1, 4-ジアザ-2, 3-ジシラベンゼンとビス(シラケテンイミン)が生成することが分かった。シリルシアニドの窒素原子でジシリンケイ素への配位が起こるが、有機ニトリルのような[2+2]環化は進行せず、もう一方のジシリンケイ素へもシリルシアニドの窒素原子での配位が進行し、シアニド炭素原子間での結合形成によりジアザジシラベンゼン与えたと考えられる。また、シリルシアニドは極少量のシリルイソシアニド体との平衡混合物として存在することが知られているが、シリルイソシアニド体の方がシリルシアニド体より配位力が強く反応性が高いと考えられるため、微量のシリルイソシアニド体が末端炭素原子でジシリンケイ素へ配位することでビス(シラケテンイミン)を生成したと考えられる。ジアザジシラベンゼンの単結晶X線構造解析により、骨格ケイ素原子が著しく非平面化しているがジアザジシラベンゼンはある程度の芳香族性を有しているものと推定され、理論計算もそれを支持した。また、ビス(シラケテンイミン)についても単結晶X線構造解析によりその分子構造を決定した。申請者らがビス[ビス(トリメチルシリル)メチル]イソプロピルシリル基(Dsi_2^iPrSi基)を置換基とするケイ素-ケイ素三重結合化合物「ジシリン」の合成、単離に成功し、本申請課題ではその反応性を主として検討してきた。しかしながら、これまでに単離・構造解析されたジシリンはわずか2例のみであり、ジシリンの化学のさらなる展開のためには多種多様な置換基を持つ多くのジシリンの合成研究が必要不可欠である。本研究では,新規なジシリンを合成し,それらの構造と物性,反応性について検討した。ケイ素-ケイ素三重結合部位を立体的に保護する嵩高い置換基としてビス[ビス(トリメチルシリル)メチル]ネオペンチルシリル基(Dsi_2NpSi基)、ビス[ビス(トリメチルシリル)メチル](トリメチルシリルメチル)シリル基(Dsi_2MsiSi基)を導入した新規な対称置換ジシリン、およびDsi_2^iPrSi基とDsi_2NpSi基を持つ非対称置換ジシリンの合成、単離に新たに成功し、それらの分子構造をX線結晶構造解析で決定した。本研究で新たに合成した対称置換ジシリンのケイ素-ケイ素二重結合部位はいずれもトランス折れ曲がり構造をとり、置換基の立体的嵩高さに起因してSi-Si=Si結合角が大きくなるほど(ケイ素-ケイ素三重結合部位がより直線構造に近づくほど)Si≡Si結合長が短くなることが実験的に示された。
高齢者造血器腫瘍の発症基盤としてのステムセルエイジングの解明

MDSは高齢者に多く、加齢に伴うクローナル造血がMDSの発症母地となっていると考えられている。代表的な早老症であるWerner症候群(WS)に発症したMDS例の全エクソン解析を行ない、TP53変異と染色体異常が同定されたが、高齢者MDSに特徴的なRNAスプライシング分子やエピゲノム修飾分子の変異は観察されなかった。また、MDS非発症例の末梢血の解析においても、クローナル造血は認められず、WSにおけるMDS発症は通常の加齢を基盤とした発症病態とは異なる可能性が示唆された。さらには食道がん患者の非がん部の食道上皮のゲノム解析を行い、加齢に伴い、Notch1やTP53などの変異を有するクローンが食道上皮細胞を占め、造血器腫瘍におけるクローナル造血と同様に、重要な発症基盤となっていることが示唆された。CLL幹細胞からの異常クローン派生メカニズムとしてCLL細胞に異所性に発現するIRAK-3分子を同定し、その機能解析に取り組んだ。さらに同じく、AMLで同定した白血病幹細胞特異的分子TIM-3の機能について、腫瘍細胞自身がTIM-3リガンドであるgalectin-9をautocrineに分泌し、恒常的なTIM-3シグナルを生じるTIM-3/galectin-9autocrine loopの存在を同定した。WS患者由来線維芽細胞は増殖低下,細胞老化および形態異常を有し、RNA-seq解析では細胞周期,DNA複製,染色体分離に関わる遺伝子群の発現低下が認められた。WSで皮膚潰瘍の一因となる,石灰化関連遺伝子発現の変化も同定された。Wrnと老化関連候補遺伝子Xのダブル欠損マウス(DKO)由来線維芽細胞は細胞老化およびDNA損傷マーカーが有意に増加し,細胞老化関連遺伝子の発現増加も示した。DKOマウスは内臓脂肪蓄積と脂肪肝を伴うインスリン抵抗性を示しWS類似の代謝異常が観察された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。再生不良性貧血(AA)は、自己免疫機序による造血不全であるが、一部の症例で骨髄異形成症候群(MDS)を発症する。そこで、AAの臨床検体を用いて継時的なクローン変化を遺伝学的に解析した。その結果、約半数の症例で、MDSへの進展の有無に拠らず、クローン性造血を認め、MDSや加齢に伴う遺伝子変異と共通した変化がしばしば観察された。血液疾患を有さない高齢者においてクローン性造血を示す知見が報告され、造血幹細胞(HSC)の老化、さらには造血器腫瘍との関連が示唆されるが、AAにおいても類似した病態が生じていると推察された。現在、同様の解析を遺伝的早老症であるWerner症候群(WS)においても進めている。慢性リンパ球性白血病(CLL)においてHSCが病態形成に本質的に寄与することを報告しており、本研究ではCLL症例のHSCを対象にした遺伝子解析を行った。欧米のグループとの共同研究の結果、約80%の症例でHSCを含む未分化な造血細胞に、CLL細胞と同一の体細胞変異が確認され、変異の多くはCLLにおけるrecurrentな変異であった(Damm et al., 2014)。HSCレベルでの遺伝子変異の同定は、先行研究におけるCLL症例のHSCの異常な機能的変化が生じている事実を補完する知見である。WSの原因遺伝子としてDNAヘリケース(WRN)が同定されたが、早老をきたす分子機構の解明は進んでいない。実際、Wrn欠損マウスは早老形質を示さず、ヒト早老症の動物モデルの開発が望まれている。本研究では、テロメラーゼ(Tert)とWrnの2重欠損マウスを作出し、WS症状を呈するか形態・組織学的な解析を行った。本マウスにおいて、テロメラーゼ活性の消失による生殖細胞系列でのテロメア短縮は確認されたが、2重欠損による目立った病理学的変化はないが、精巣や皮膚厚においては形態学的な変化が観察されている。高齢者の一部において、加齢に伴いクローナル造血が出現し、MDSの発症母地となっている可能性が現在、注目をされている。MDSの若年発症が散見される早老症であるWS患者において、MDSに先行するクローナル造血の有無を全エクソンシーケンスならびに高感度な解析が可能な標的遺伝子シーケンスにより評価したが、クローナル造血を示唆する結果は得られなかった。次に40歳代のWS患者に発症したMDS/AML例の網羅的なシーケンス解析を行ったが、典型的なMDS例とは異なる変異プロファイルであり、WSにおける造血幹細胞・造血環境の変化と通常の加齢に伴う変化は異質である可能性も示唆された。CLL患者のサンプルよりCLL細胞、T細胞、造血幹細胞前駆細胞をFACSソーターにて純化し、全エクソンシーケンスを行い、CLL細胞に獲得されている体細胞変異を同定した。次に同定した体細胞変異を、純化したCD34+CD19-造血幹細胞前駆細胞より抽出したgDNAを用いてPCR反応を行い、次世代シーケンサーによりターゲットシーケンスを行った。骨髄系細胞への分化能力を保持する非常に未分化な造血幹細胞前駆細胞群に一定の頻度でこのような変異が獲得されたクローンが存在していることが確認された。

実際、Wrn単独欠損マウスは早老形質を示さないため、本研究では、テロメラーゼ(Tert)とWrnの2重欠損マウスを作出し、WS症状を呈するか形態・組織学的な解析を行った。本マウスにおいて、テロメラーゼ活性の消失による生殖細胞系列でのテロメア短縮は確認されたが、2重欠損による顕著な病理学的な変化は認めず、マウスにおけるWS病態の発症にはテロメア短縮の寄与は大きくないことが示唆された。慢性リンパ性白血病(CLL)を対象とした研究では、CLLにおける体細胞変異の同定と、造血幹細胞前駆細胞におけるsingle cell levelでの評価系を確立し、症例解析を順調に進めている。また、再生不良性貧血(AA)およびWerner症候群(WS)の遺伝子解析結果は、高齢者においても観察をされるクローン性造血の生物学的意義、とりわけ、腫瘍化との関連について研究を進める上で、重要な知見、かつ有用なモデルであると考えられる。マウスモデルを用いた検証に関しては、WSのモデルマウスの作出は、当初予定していたマウスの作成ならびに表現型の解析も進んでいる。MDS患者由来の造血幹細胞分画についてRNAシーケンスを行い、スプライシング因子変異がRNAスプライシングに及ぼす効果を解析した。SF3B1変異例では、特徴的に3'スプライス部位の誤認識がおこり、異常な転写産物が生ずることを明らかにした。SF3B1変異に特徴的な環状鉄芽球の出現において、ヘム合成に関わる遺伝子のミススプライシングが重要な役割を担っている可能性が示唆された(投稿準備中)。さらには、MDSを含む高齢者骨髄系腫瘍においてPHF6の機能欠失型変異が観察をされることを明らかとした。また、MDSは造血幹細胞レベルの細胞がスプライシング関連遺伝子変異やエピゲノム修飾分子変異を獲得し、クローナルに拡大することが起源であると考えられるが、経過中に獲得される遺伝子変異により、その後の進展経過が推測可能であること、CBLやNRAS遺伝子変異の獲得が移植治療後の予後を規定していることを明らかとした。宮本らは、CLL幹細胞からの異常クローン派生メカニズムとしてCLL細胞に異所性に発現するIRAK-3分子に着目した。CLLではproB細胞レベルでIRAK-3の高発現が出現し、CLL細胞までその高発現が持続するのに対し、正常では前駆細胞にコミットすると同時にIRAK-3発現はshut offされていた。IRAK-3分子はCLL細胞において、c-CBLと結合し、その機能を抑制することでBCRシグナルを正に制御することを見出した。横手らは、WS患者由来細胞の細胞生物学的解析から、細胞増殖低下、ROS増加、および継代初期にSA-β-Gal活性の増加が認められた。さらに、IL-6遺伝子発現増加や核構造の肥大化など、典型的な細胞老化形質を示した。また核膜タンパク質LAP2やHP1に加えてHistone H3K9メチル基転移酵素SUV39H1発現も減少し、核構造異常やエピゲノム変化を裏付けた。概ね予定通りに経過していると考える。高齢者MDSに特徴的な遺伝子異常であるスプライシング遺伝子変異のMDSの病態形成における分子メカニズムについて、変異特異的なスプライシング異常ならびに標的遺伝子候補を明らかとした。さらには、スプライシング因子変異以降に獲得される遺伝子変異の中で、その後の進展経過や移植治療後の予後を規定している遺伝子を同定した。
細胞外マトリックス分子ビトロネクチンによる小脳顆粒前駆細胞の軸索決定制御

平成30年度において、本研究の目的である。ビトロネクチンのマウス小脳顆粒前駆細胞(CGCP)における軸決定機構解明において、ビトロネクチンの受容体であるαvβ5インテグリン以降のシグナル経路について検討を行った。すでに海馬神経において、PI-3キナーゼ、GSK3βが関わることが報告されており、同じ経路が関与しているかどうか検討した。その結果、PI-3キナーゼ阻害剤のWortmanninにより軸索形成が阻害されることを確認し、またGSK3β阻害剤の塩化リチウムにより軸索形成が促進することを確認した。これらの結果は、小脳顆粒細胞においてもPI3キナーゼ及びGSK3βが軸索形成を担っていることを確認した。当初計画していたビトロネクチンからインテグリンを介して細胞内のシグナル経路の道程だけでなく、突起選択モデルを使ってビトロネクチンの突起選択機構を解析できたのは、想定以上の進展であると判断した。今後の研究の推進方策であるが、当初に予定していた計画通りのインテグリン以降のシグナル経路の同定を進めていく。特にビトロネクチン添加後のシグナルの活性化レベルに関する各種シグナル因子のウエスタンブロット等を用いて解析を進める。これに加え、Neuro2aの系で、ビトロネクチンが突起選択を担う機構についても解析を進める。29年度において、本研究の目的にであるビトロネクチンのマウス小脳顆粒前駆細胞(CGCP)における軸索決定機構解明において、その受容体の特定及び特性解析を行った。まず、αvβ5インテグリンは、ビトロネクチンと同様CGCPの初期分化進行を制御しているのかを解析した。レンチウイルスを用いたβ5インテグリンのノックダウンや過剰発現の系において、この点を確かめると、予測通り、β5インテグリンがCGCPの初期分化進行に寄与していることがわかった。以上の結果を取りまとめ、次の論文において発表を行った。Ayaka ABE, Kei HASHIMOTO, Ayumi AKIYAMA, Momoe IiDA, Natsumi IKEDA, Ayana HAMANO, Riho WATANABE, Yokichi HAYASHI, Yasunori MIYAMOTO. “alpha v beta5 integrin mediates the effect of vitronectin on the initialstage of differentiation in mouse cerebellar granule cell precursors" Brain Res. (2018) in press.次に、αvβ5インテグリンは、ビトロネクチンによる軸索決定を制御しているのか?について、β5インテグリンのノックダウン(KD)、及び過剰発現を顆粒前駆細胞に対して行ない、軸索決定への関与を示す結果を得た。29年度において予定していた受容体のαvβ5インテグリンの軸索への関与の解析は終わり、また細胞内因子の解析にも着手しており、おおむね順調に進展している。さらに、αvβ5インテグリンがビトロネクチンと同様小脳顆粒前駆細胞の初期分化に関わる点の論文がBrain Researchに受理されたことも、評価として挙げられる。今後の研究の推進方策であるが、当初に予定した計画通り、まずVNからαvβ5インテグリンからのシグナルが、CRMP2とPar複合体のどちらに流れるかを検討を行う。それが特定できれば、それぞれの因子へのシグナルの流れを明らかにし、さらにその経路を培養細胞COS7で再構築し、検証していく。以上のことで、研究計画の目的である。ビトロネクチンによる小脳顆粒前駆細胞の軸索決定機構を明らかにしていく計画である。
非平衡オーディナリコンドライトの始原性の評価

平衡コンドライトは岩石学的分類で4から6の番号をもつのに対し、非平衡コンドライトは、オーディナリ・コンドライトに限定すれば岩石学タイプ3限定される。1つの分類番号を持つにもかかわらず、非平衡の程度の差は大きく、従って3.0から3.9までに細分類することが堤案され、現在ではこの細分類番号を付すのが通例である。この細分類では3.0が最も非平衡の程度が大きく、3.9が最も小さい。従来、この分類の基準として、熱ルミネッセンスの強度(以下TL強度と略記)が堤唱され、広く用いられてきた。この方法は測定は容易であるものの、解釈の点で十分理解されているとは言えず、他の独立の方法との対比が求められてきた。本研究はこのような状況を踏まえて行なわれた。本研究では始原性の評価を2つの異なる角度から考察した。1つはインジウムに代表される、いわゆる揮発性の高い元素の全岩試料中における存在度である。分析ではインジウムの他、亜鉛・銅を測定し、これら3元素の存在度を中性子放射化分析法で求めた。もう1つは、酸で不溶な鉱物相中の希土類元素存在度を求め、そのコンドライト隕石における含有量との相対存在度に基づいて考察する方法である。前者の揮発性の高い元素の存在度には大きな変動のあることが明らかとなったが、その大小と始原性(非平衡性)との間には必ずしも良い相関がなく、これら元素の含有量はコンドライト母天体形成以前に既に決まっていたものと考えられる。一方、希土類元素存在度は非平衡コンドライト間で、その分配において大きな変化を生じていることが明らかとなった。さらにその相対的な変化を類値化して求めたパラメターは、始原性を示すパラメターとして求いうることも示唆された。ただし既存のTL強度に基づく始原性のインデックスとは必ずしも整合性が得られず、この不一致に関しては今後の研究による解明が待たれる。
動脈硬化病巣特異認識モノクロナル抗体・動脈壁コレステロール蓄積機構の解析

動脈硬化病巣には多量の脂質が蓄積しており、血管壁内膜肥厚部位を詳細に調べると、泡沫細胞の細胞質への多量の脂質蓄積と、細胞間への脂質沈着が見られる。この蓄積脂質が結合している細胞間物質を同定することにより、脂質蓄積機構の解析を試みた。家族性高脂血症モデル動物として知られているWHHL(Watanabe heritable hyperlipidemic)ウサギ動脈硬化病巣のホモジェネートを抗原として、動脈硬化病巣の細胞間脂質蓄積部位を認識するモノクローナル抗体EMR1a/212D(212D)を調製した。さらにcDNAを用いた抗原物質解析から、本抗原物質は、Somatomedin B領域、RGD領域、3ヶ所のN型糖鎖結合部位、ヘパリン結合領域を持つ、分子量66kdのウサギ・ビトロネクチン(Vn)であると結論した。なお212D抗体は、Vnのシアル酸を含む部分をエピトープとしていた。さらに、ペプチド部分をエピトープする抗体の調製を試み、スクリーニング後、5株のモノクローナル抗体産生株を得た。これらの株のうち増殖性、抗原反応性を考慮し、244H抗体を以下使用した。244H抗体は、Recombinant Vnを認識することから、本抗体は、Vn・ペプチド部分をエピトープとする抗体であると結論した。244H抗体を用いて動脈壁中のVn・サブタイプの解析を行うと、動脈硬化病巣では66kd Vnの他に、56、50、47kdポリペプチドが見いだされた。動脈硬化病巣の粥腫形成は、動脈弓に近づくにしたがい高くなることが知られている。Vn全てのタイプは、粥腫形成度が高くなると蓄積量の増大が見られた、そのうち56、50kdポリペプチドは、蓄積量の増加が特に著しく、動脈弓においてはその蓄積量の約80%を占めていた。本研究の結果より、動脈壁へのVnの蓄積機構は、血中濃度の上昇によるものではなく、血管壁で局所的に合成されたか、あるいは、血中から浸潤してきた可能性が高い。高齢化社会が進むにしたがって、循環器系疾患はますます重要な課題になりつつある。最近の統計によると、日本人の2人に1人は、心疾患、脳血管疾患をはじめとする循環器系疾患で死亡しているという。本研究は、動脈硬化壁の泡沫細胞、ならびに内膜細胞間にコレステロ-ル・エステルがどのようにして蓄積してくるか、その機構を動脈硬化脂質蓄積部位を認識するモノクロナル抗体を用いて解析することを目的とした。我々は動脈硬化病巣のホモジェネ-トを抗原としてマウス(BALB/c)を感作後、組織化学による形態学的手法を用いて、動脈硬化病巣脂質蓄積部位を認識するモノクロナル抗体産生株(EMR1a/212D)を分離することに成功した。さらに、本抗原物質を分離精製し、N末端ペプチド構造を決定し、この物質に対応するDNAを合成、cDNAをクロ-ニングした。その結果、本抗原物質はウサギビトロネクチンであると同定することができた。また、精製したビトロネクチンを抗原としてマウス(BALB/c)を免疫し、モノクロナル抗体産生株を分離したところ、シアル酸をエピト-プとして認識する抗体(EMR1a/212D)とは異なって、ポリペプチド部位を認識する抗体産生株(EMR1b/244H)を選別することに成功した。

このような解析は、動脈硬化巣細胞間脂質蓄積機構を解析する上で有用な手法になるものと期待したい。動脈硬化壁にコレステロール・エステルが蓄積してくることはよく知られている。しかし、これらコレステロール・エステルが、どのようにして蓄積するのか、その機構については、ほとんど解明されていない。最近、我々は動脈硬化病巣のホモジェネートを抗原としてマウス(BALB/c)を感作し、組織化学による形態学的手法を用いて、動脈硬化病巣脂質蓄積部位を特異的に認識するモノクロナル抗体株(EMR1a/212D)を分離することに成功した。その後、本抗原物質を分離精製し、さらに、本物質に対するcDNAをクローニングしたところ、本抗原物質はビトロネクチンであると同定することができた。本年度は、さらに本抗原物質のポリペプチド部位を認識するモノクロナル抗体(EMR1b/244H)を分離し、以下の知見を得た。ビトロネクチンのシアル酸をエピトープとして認識するEMR1a/212D抗体と、ビトロネクチンのペプチド部位をエピトープとして認識するEMR1b/244H抗体を用いて総ビトロネクチン量を調べたところ、弓部の進展度の高い部位でビトロネクチンは正常血管壁の512倍蓄積していた。さらに、EMR1b/244H抗体を用いて動脈壁のビトロネクチンのsub-typeを検出すると、66kdの他、59kd、58kd、46kdのビトロネクチンが存在しており、動脈弓部に近くなるにしたがって59kd、58kdビトロネクチンの比率が増大していた。これらのビトロネクチンのうち、59kd、58kdビトロネクチンはヘパリン結合能を失っていた。今後、これらのビトロネクチンの生理学的、病理学的意義について解析したい。動脈硬化巣に蓄積してくるコレステロールは、血流のリポタンパク質ならびに崩壊した泡沫細胞に起因していると考えられている。内皮細胞を透過したリポタンパク質は、動脈壁マクロファージ及び変形平滑筋細胞内に取り込まれる。動脈壁内に過剰に浸潤してきたリポタンパク質は、マクロファージの泡沫化をさらに亢進し、泡沫細胞の崩壊、さらには、細胞内に蓄積した脂肪球が細胞外に放出されることになる。hydrophilicな環境で制御されていた動脈壁は、泡沫細胞の崩壊に伴って生じたhydrophobicな環境に適応できず、動脈硬化はさらに進展していくものと考えられる。我々は、以上のような作業仮説を立て、以下の実験を試みた。家族性高脂血症モデル動物として知られているWHHL(Watanabe heritable hyperlipidemic)ウサギ動脈硬化病巣のホモジェネートを抗原として、動脈硬化病巣の細胞間脂質蓄積部位を認識するモノクロナール抗体EMRIa/212D(212D)を調製した。さらに、cDNAを用いた抗原物質解析から、本抗原物質は、Somatomedin B領域、RGD領域、3ケ所のN型糖鎖結合部位、ヘパリン結合領域を持つ、分子量66kdのウサギ・ビトロネクチン(Vn)であると結論した。なお212D抗体は、Vnのシアル酸を含む部分をエピトープとしていた。さらに、ペプチド部分をエピトープする抗体の調製を試み、スクリーニング後、5株のモノクローナル抗体を得た。これらの株の増殖性、抗原反応性を考慮し、244H抗体を以下使用した。244H抗体は、Recombinant Vnを認識することから、本抗体は、Vn・ペプチド部分をエピトープとする抗体であると結論した。
MAPキナーゼの時間的制御による細胞運命決定機構の解析

昨年度までに私は、ERK・MAPキナーゼの活性化時間が遺伝子発現に与える影響をマイクロアレイを用いて解析し、一定の成果を挙げることができた。本年はタイリングアレイを用いてさらにその内容を発展させる予定であったが、その過程で興味深い現象を発見した。増殖刺激によって発現量が急激に上昇する遺伝子群は早期応答遺伝子と呼ばれるが、驚いたことに、早期応答遺伝子に近接する遺伝子群の発現量も上昇する傾向があった。さらに、タイリングアレイを用いて遺伝子間領域での発現変化を観察しなところ、アノテーションされていない新規転写産物の発現量も同期して上昇していた。すなわち、早期応答遺伝子群の転写活性化は、近傍の様々な転写産物の発現量に対して波及効果を持つことを見出した。この「転写の波及効果」は、ERK・MAPキナーゼ経路あるいは転写因子SRFを阻害することによって抑制された。また、早期応答遺伝子の近傍ではヒストンのアセチル化状態が亢進することもわかってきた。これらの結果は、遺伝子発現の解析時には、染色体上での位置や順序ももっと考慮されるべきファクターであることを示唆している。今後は、この「転写の波及効果」のさらなるメカニズムの解明を目指していく予定だが、これがどの程度一般的な現象なのか、あるいはどういった生理的意義を持つのかなども興味深い課題だと考えている。ERK MAPキナーゼは非常に多くの細胞応答に関わることが知られているシグナル伝達分子である。同一の分子が複数の異なるシグナルを伝達できる理由としては、ERK活性の強さや長さ、活性化する場所の違いがシグナルの特異性を生むという概念が提唱されてきている。私はなかでも活性化時間の長さに注目しており、昨年までに、静止期の繊維芽細胞が再増殖するためにはERKの持続的な活性化が必要なこと、このときERKの活性化時間に相関して発現状態が変化する遺伝子群が存在することを明らかにしていた。本年は特に、ERK活性に依存してmRNA量が減少する遺伝子群に注目して解析を進めた。この遺伝子群の発現量は、ERKの活性化と同時に低下しはじめ、ERKが不活性化すると直ちに元のレベルにまで回復する。興味深いことに、この遺伝子群には増殖抑制能力を持つ遺伝子が複数存在しており、その発現量を人工的に上昇させると実際に細胞増殖が阻害された。つまり、ERKは持続的に活性化して増殖抑制遺伝子群の発現状態を低く保ち続け、細胞周期の進行を保証する役割を担っていることが明らかになった。細胞はこのようにERKの活性化時間を指標に用いることによって、不適切な刺激による異常な増殖を回避できるのではないかと推察される。また、この遺伝子群の発現量低下には、早期応答遺伝子であるAP-1の活性が必要なことも見出しており、ERKが多数の遺伝子の発現量を下げる機構についての手がかりも得ることができた。ERK・MAPキナーゼは非常に多くの細胞応答に関わることが知られているシグナル伝達分字である。私はなかでも活性化時間の長さに注目しており、マイクロアレイによる遺伝子発現量の解析を中心に研究を進めてきた。昨年までに、静止期の繊維芽細胞が再増殖するためにはERKの持続的な活性化が必要なこと、この持続的活性化は一群の増殖抑制遺伝子の発現量を低く保ち続けるために必要であることを明らかにし、本年その成果を公表することができた。今年度はさらに本研究を発展させるべく、タイリングアレイという新しいタイプのマイクロアレイを用いての解析にも取り組みはじめた。タイリングアレイでは、対象生物の全ゲノムに対してプローブが等間隔で設計されており、各遺伝子に対して十数個のプローブが設計されている既存のマイクロアレイと比較すると、約80倍のデータが得られる。しかし、その膨大なデータを解析する手法はまだあまり確立されておらず、解析手法の探索が最初の主要な課題となった。その結果自分なりの解析方法をほぼ確立することができ、それによって既存のマイクロアレイでは知りえなかった新規転写産物の変化やクロマチンレベルでの変化が明らかになってきた。現在はこれらの変化とERK活性の関係を調べているところである。