hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
国の制度と地域の制度の相互作用：制度理論を基盤とした多国籍企業の研究

この研究領域では、国を制度の単位として考えてきたが、各地で進む経済的な統合は、国を制度の分析単位とすることに限界をもたらし始めている。国の制度は、地域的な経済統合から影響を受ける可能性があり、地域自体も制度を形成する単位となっている。このような背景のもと、本研究では、制度理論を基盤とした多国籍企業の研究に、地域の制度を導入することを試みている。制度理論を基盤とする多国籍企業の研究では、新興国を対象とする場合が多いが、地域を制度の単位とみることにより、先進国にも分析範囲を広げる必要が生じる。先進国を含む地域でインタビュー調査を行い、国の制度と地域の制度について調査を行った。経済的な統合の枠組みに参加している国では、自国の制度を地域統合の要求に適合させていく必要がある。これは地域の制度が国の制度に影響を与えることを示しているが、国によって対応の度合や速度は異なるようである。一方で、地域的な経済統合は、地域内での戦略策定のために企業が考慮する1つの要素になっているようである。インタビュー調査と並行し、日本企業のパネルデータセットを用いた分析も行った。分析からは、多国籍企業の地域的な拡大と、地域内の海外子会社のパフォーマンスの間には、S字型カーブの関係があることが示された。多国籍企業が、地域内で子会社の数を増やしていくと、初期段階では子会社のパフォーマンスが悪化する。地域内での拡大をさらに進めると、パフォーマンスは好転する。しかし、ある閾値以上に拡大すると、子会社のパフォーマンスは再度悪化に転じる。多国籍企業が地域内の他国に進出する場合には、制度の類似性は高いと思われるが、進出国に関する学習が必要であることが示唆される。一定の学習を行った後は、地域内での制度の類似性は、子会社業績に正の影響を与えるようである。先行研究のレビュー、インタビュー、統計分析の3つのアプローチにより研究を進めた。先行研究のレビューとインタビューから、国の制度と地域の制度について調査し、どのような要素によって構成されているかを整理した。地域の制度については先行研究が少なく、今後、さらに研究を進めていく必要があるが、現時点ではおおむね順調な進捗度合だと思われる。また、先行研究のレビューとインタビューをもとに、国レベルおよび地域レベルの制度の多国籍企業への影響について、仮説を導出した。仮説の検証は今後の作業となるが、現時点では、仮説導出については順調だと思われる。今後仮説検証を進めていくためのパネルデータセットも、完全ではないが、分析を行える状態まで構築されている。このデータセットを用い分析を行い、いくつかの仮説について検証を行った。行った分析の一部について、さらに検証を進め、論文を作成した。データセットに含む国および地域の制度の数値化についても作業を行った。制度は多くの要素で構成されるため、すべての要素を数値化することは困難であるが、いくつかの制度の構成要素について、数値化に必要なデータを収集した。それをもとに、制度の各要素を数値化し、さらに、地域内での制度のばらつきについても数値化を行った。一部、進捗が遅い作業もある一方、予定以上に進捗したものもある。総合的にみると、おおむね順調だと思われる。
ワンポイント転がり軸受を用いた新しい遠心血液ポンプによる全置換型人工心臓

インペラの支持及び駆動機構は式血液ポンプの最も重要な技術要素の一つである。医療費の高騰が問題とされる昨今、医療経済的許容されうるコストで血液適合性と機械寿命といった性能をバランスよく満たす血液ポンプの開発が必要である。本科学研究費助成金等により研究室内にNCフライス盤と小型精密旋盤を導入し、試作体制を整え、軸受け、血液ポンプを試作した。血用ポンプとして必要な流体出力を確認できたが、試作した軸受けを長時間運転した際に破損が起きることが分かった。考えられる原因としてはまず、加工精度の問題に起因する摺動面の粗さや真円度、そして重心の偏心があげられる。加工装置に起因する問題として各軸の同士の直交度の問題が明らかになっているおり、最終的な加工部品の精度への影響しているものと考えられる。ポンプの動作時に見られた振動についても原因の究明が必要である。インペラの設計では後退角が不適切であると流れの剥離が起きやすく振動を生じる可能性があるとワンポイント軸受けではモータ電磁石と磁石の吸引力により一点に拘束されているがモータ始動時と脱調時には大きな振動が伴うことがあるが知られている。転がり軸受の幾何学的形状の検討では"公転球は軸受面と接触し、この接点の付近では狭い間隙の領域がひろがる。血球が破壊される数um程度の間隙値の領域をできるだけ少なくすることを考えると、公転球半径と軸受面の曲率半径の比は大きい方が良い"一方、耐荷重を考えると反対に公転球半径と軸受面の曲率半径が近いほうが良いことになり、最適な比率を見出す必要がある。改良型のポンプを研究室内で試作したが軸受けの破損の問題が明らかになり原因と改良方法を検討した。研究代表者所の属機関の移動に伴い研究設備を新たに整える必要があったがNCフライス盤、精密旋盤などを導入し、血液ポンプの試作が出来るようになった。製造装置の差異による試作上の問題もあり、改善をその都度行う必要があり、時間を要している。そのため研究期間の延長を申請し軸受けの破損問題を解決し成果をまとめられるよう研究を進める。前年度の研究活動では軸受けの破損の問題が明らかになった。まず、導入したNCフライス盤ではXYZ各軸の直交度が初期状態では正確ではなく、調整方法の検討を行っている、直交が確保されたのちにベアリングの試作を行い、加工精度の問題に起因する摺動面の粗さや真円度、重心の偏心等について測定、検証を行う。インペラの設計では後退角が不適切であると流れの剥離が起きやすく振動を生じる可能性があるため新たに後退角を寝かせ、羽の数も増やした新しいインペラを設計し数値流体解析(CFD)と流れの可視化で振動につながる流れの剥離が起こらないことを確認する。ワンポイント軸受けではモータ電磁石と磁石の吸引力により一点に拘束されているがモータ始動時と脱調時には大きな振動が伴うがこれには振動の起きにくいモーターを採用することと軸受けの容量を上げることの2つの方法で対応する。特に軸受けでは拡大モデルをアクリル樹脂で試作し、好転球の動きをより観察しやするなどして幾何学的構造の最適化を図るとともに補助軸受け機構を設けるなどして振動を抑えるように設計する。実用に向けては材質の検討も必要である。形状が確定した段階でまずは血液ポンプによく用いられているチタン合金で軸受けを外注試作し、耐久性を確保する。試作、評価結果について、来年度中の学会発表ができるように準備を進める。また、保持器を持たない転がり軸受については多方面の産業応用がきたいされているため、血液ポンプ以外への展開も模索する。回転式血液ポンプにおいて軸受もしくは回転支持機構は最重要課題である。ピボット軸受やピン軸受では摩擦により軸受表面の摩耗によって寿命が限定される。動圧軸受けではミクロンオーダーの高い加工精度が要求されるため高コストである他、軸受隙間が小さいために血栓が生じる問題があり、臨床でも少なくない有害事象が報告されてされている。磁気浮上軸受を用いた血液ポンプでは浮上用コイルとその駆動回路や距離を測定するセンサーが必要である。浮上系に関するトラブルと大型化の問題があり、やはり高コストなシステムである。他方、溶血指標について過剰な競争が行われたが医療経済的許容されうるコストで血液適合性と機械寿命をマージナルに満たした人工心臓が望まれている。そこで本研究ではワンポイント転がり軸受を用いた新しい遠心血液ポンプを提案し研究開発を行った。本軸受では外輪に収められた複数個の公転球の上にピン状の回転軸を乗せ、電磁石と磁石の吸引力により一点に拘束される。初めに本軸受の原理モデルの試作を行った。軸受の主要部品はアクリル樹脂をNCローランドPCN3100に切削し試作した。パラメータについて検討した。公転球の個数は3個では破たんし、5個以上で安定することが分かった。ハイスピードカメラをもちいて支持機構の観察を行った。結果、公転球の速度が近接点で遅くなり、再び加速する自律分散動作を確認した。3Dプリンターでは心臓モデルを作成し、ポンプモデルと合わせ解剖適合性の検討を行った。3次元CADで作成したポンプのディジタルモデルをSimulationCFDにより流体解析を行い必要なポンプ性能を確認した。研究代表者が東北大学から鈴鹿医療科学大学に移動した初年度であったため、研究設備の準備に時間がかかった。

特に実験室の割り当てが卒研生の配属のある2年目からであったため、本格的な研究の始動には更なる整備が必要である。特に重量のある工作機械等は実験室の整備を待つ必要があった。これらの工作機械については本研究の遂行に適切なものを精査しつつ発注を進めており、一部は昨年度から業者との内容打ち合わせを行い、本年度に入り設置をおこなった。インペラの支持及び駆動機構は式血液ポンプの最も重要な技術要素の一つである。現在、臨床で使用されている回転ピボット軸受やピン軸受、動圧軸受け、磁気浮上型軸受ではそれぞれメリットとデメリットがある。回転ピボット軸受やピン軸受では簡便で低コストである反面、摩擦により軸受表面の摩耗によって寿命が限定される。動圧軸受けではミクロンオーダーの高い加工精度が要求されるため高コストである他、隙間が狭いために血栓が生じる問題があり、臨床でも少なくない有害事象が報告されている。磁気浮上軸受を用いた血液ポンプでは浮上用コイルとその駆動回路や距離を測定するセンサーが必要で、複雑で高コスト、故障の可能性が高いシステムと言える。他方、医療費の高騰が問題とされる昨今、医療経済的許容されうるコストで血液適合性と機械寿命といった性能をバランスよく満たす人工心臓が望まれている。そこで本研究ではワンポイント転がり軸受を用いた新しい遠心血液ポンプを提案し研究開発を行ってきた。本軸受では外輪に収められた複数個の公転球の上にピン状の回転軸を乗せ、電磁石と磁石の吸引力により一点に拘束される。本軸受の溶血との関係を明らかにするため、まず軸受設計論に基づく溶血発生メカニズムを検討した。公転球は軸受面と接触し、この接点の付近では狭い間隙の領域がひろがる。血球が破壊される数um程度の間隙値の領域をできるだけ少なくすることを考えると、公転球半径と軸受面の曲率半径の比は大きい方が良い。また、この領域の回転によって移動することで血球はより破壊されていくため、公転半径、回転数、公転球の数に比例して血球の破壊が起こると推測された。血球の破壊は物理的な要素だけではなく、熱やシェアストレスへの継続的な暴露によっても変化する。試作段階ではインペラの揺動が観察されており、これに伴い溶血が亢進することも予想された。現在の所属大学の移動に伴い、研究環境について大きな変化があったことも影響としてあるが本研究の軸受は保持具を持たない転がり軸受を構築するものであり機械工学的にもハードルが高いものあることが明確になった。これを具現がするためのいくつかのアイディアについて検討を始めており、本研究が保持具の軸受機構が実現できれば、人工心臓のみならず産業界全体にとって省エネルギー性や高耐久性をもたらす革新的技術となりうる。医療費の高騰が問題とされる昨今、医療経済的許容されうるコストで血液適合性と機械寿命といった性能をバランスよく満たす血液ポンプの開発が必要である。本科学研究費助成金等により研究室内にNCフライス盤と小型精密旋盤を導入し、試作体制を整え、軸受け、血液ポンプを試作した。血用ポンプとして必要な流体出力を確認できたが、試作した軸受けを長時間運転した際に破損が起きることが分かった。考えられる原因としてはまず、加工精度の問題に起因する摺動面の粗さや真円度、そして重心の偏心があげられる。
サブトラクション抗体作成法を用いたゼノパス発生関連蛋白質の網羅的解析

当初計画年度前半は、昨年度後半より開始したモノクローナル抗体作成を引き続き行う。4月、未精製ハィブリドーマの培養上清を用いたスクリーニング。56月、ハィブリドーマのクローニング。7月、腹水採取およびモノクローナル抗体の精製。89月、抗体反応性ゼノパス卵蛋白質の同定と免疫組織化学的解析。年度後半は、抗体により同定された蛋白質の質量分析と遺伝子クローニングを行う。また平行して、受精関連の膜ラフト蛋白質の分子同定と特異抗体作成実験を行う。46月、精製膜ラフト蛋白質の調製。78月、質量分析実験及び合成ペプチド作成。911月、遺伝子クローニング、培養細胞発現実験、ウサギの免疫。122月、発現膜ラフト蛋白質の活性再構成実験と抗体の精製。研究成果ゼノパス受精卵特異的な反応性を示すモノクローナル抗体群を作成した。クローンの1つは、受精後の卵蛋白質と強い反応性を持つことが確認された。この抗原蛋白質は受精卵における局在性が免疫組織化学的手法により明かとなった。抗体の標的には、新規合成蛋白質のアミノ酸配列、翻訳後修飾基(リン酸基、糖鎖、ユビキチン基など)、非蛋白質性の抗原(脂質成分等)等が考えられ、現在検証中である。さらにまた、抗体クローンが別種の動物受精卵に特異的反応性を持つか、という点についてもマウスなどのモデル動物を使って検証している。この実験により、動物種を超えた共通の受精特異的抗原の存在を検討することになる。以上の結果の一部は班会議で報告したが、特許申請のため一般の公表は控えている。一方、未受精卵の膜ラフトの受精成立関連因子である蛋白質チロシンキナーゼの精製、質量分析、分子同定、細胞発現実験、及び特異抗体作成が予定通り進み、日本分子生物学会(12月、横浜)で発表した。その関連で、国際会議での口頭発表(国際プロテオミクス会議、10月、キャンベラ)や論文発表(成果公表リスト参照)を行った。
肥満モデルラットを用いた骨格筋・脂肪組織間のクロストーク機構の解明

本研究は、骨格筋の発達と体内の脂肪蓄積との間に相互作用が存在する、という仮説を検証することを目的としたものである。前年度、本研究で用いる予定であった肥満モデルのトランスジェニックラットの繁殖効率が低下し、十分な解析を行うことが出来なかったが、本年度は繁殖効率が回復したため、加齢に伴う骨格筋発達の低下について詳細な検討を行った。その結果、(1)本トランスジェニックラットにおける骨格筋発達の低下は、速筋線維を主体とする前脛骨筋、長指伸筋で著しく、遅筋線維を主体とするヒラメ筋では比較的軽微であることが判明した。(2)また、前脛骨筋重量の低下についてより詳細な解析を行ったところ、筋線維直径の著しい発達不全が生じていることがわかった。これらについては、現在、運動負荷などにより、脂肪蓄積を減少させた場合に改善が見られるか否かについてさらなる検討を行っている。一方、前年度に着手した筋衛星細胞の脂肪細胞への分化機構に関しては、筋線維の状態がその分化能に影響を与えるという新たな知見を得ることができた。すなわち、筋衛星細胞が筋線維に付着したin vivoの状態を忠実に再現する培養系をまず確立した。この系により、筋線維の壊死・変性により筋衛星細胞が脂肪細胞へと分化誘導されることを見いだした。この結果から、筋線維が壊死・変性した際に何らかの因子の産生が亢進し、この因子が筋衛星細胞へと作用することにより脂肪細胞への分化が生じたものと推察された。現在、この因子の同定を目的とした実験が進行中である。以上、本年度の研究により、骨格筋の発達と体内の脂肪蓄積との間に相互作用が存在するという仮説をさらに支持する知見を得ることができた。今後は骨格筋と脂肪との間の相互作用を仲介する因子の本態の解明に向け、さらに研究を遂行し、老化に伴う骨格筋萎縮の予防法や運動低下による肥満に起因する生活習慣病の予防法への確立へと応用していきたい。本研究では、骨格筋の発達と体内の脂肪蓄積との間には相互作用が存在する、という仮説を検証することを目的とした。本年度はそのなかでも特に、骨格筋発達の低下としばしば随伴して観察される脂肪蓄積に着目し、申請者らの保有するhGHトランスジェニック(Tg)ラットが、生後早期から骨格筋発達の低下、著しい体内脂肪の蓄積を呈することから、本ラットをその相互作用解明のモデルとして利用することを考えた。本Tgラットの骨格筋の生後の発達について解析した結果、(1)生後2ヶ月以降、すでにその発達はほとんど停止しており、(2)この時期からすでに骨格筋線維内に脂肪蓄積が生じていることが判明した。また、本Tgラットの血清を、筋衛星細胞初代培養系に添加したところ、(2)筋管細胞への分化が抑制され、細胞内に脂肪滴を有するような異常な細胞形態を呈した。これらの結果から、本Tgラットにおける骨格筋発達の低下には、筋衛星細胞の本来有する筋分化能が損なわれるという現象が関与していることが推察され、その結果、筋衛星細胞の脂肪細胞への分化が生じている可能性が高いと考えられた。そこで、あらためて筋衛星細胞の脂肪細胞への分化機序について細胞レベルで検討するために、(3)トログリタゾン添加による筋衛星細胞初代培養系の脂肪細胞への分化系を確立した。さらに、この系を用いた検討により、(4)それが由来する骨格筋により筋衛星細胞の脂肪細胞への分化能には違いが見られることや、(5)筋衛星細胞の由来するラットの年齢によっても脂肪細胞への分化能には違いが見られること、が判明した。本年度は、Tgラットの繁殖効率が低下するという予期せぬ事態が生じたため、本ラットを用いた検討は必ずしったが、今回得られた知見は、筋衛星細胞の分化能が、肥満や老化に伴って変化する生体内環境に大きく影響さち筋衛星細胞が高い程度で可塑性を有した細胞であるという可能性を引き出した点では、意義深いと思われる。

以上、本年度の研究により、骨格筋の発達と体内の脂肪蓄積との間に相互作用が存在するという仮説をさらに支持する知見を得ることができた。今後は骨格筋と脂肪との間の相互作用を仲介する因子の本態の解明に向け、さらに研究を遂行し、老化に伴う骨格筋萎縮の予防法や運動低下による肥満に起因する生活習慣病の予防法への確立へと応用していきたい。
成人呼吸窮迫症候群(ARDS)の病態、病理

成人呼吸窮迫症候群ARDSの病因病態の解明のために、肺胞構造の破綻と修復による歪んだ再構築の形態学的な検討、早期からおこる線維化の基本的な実態を分子論的に検討した。材料は剖検52症例、42例はARDS発症から死亡までの期間が2-7日(浸出期)で、10例は8-14日(増殖期)であった。肺胞の基底膜に対してlaminin,type IV collagen,7S collagen,肺胞上皮や血管内皮細胞に対しても抗体を用いて免疫組織化学を行った。肺感染症33例、特発性間質性肺炎24例など123例の症例について血清7S collagenの測定をRIAにより行い臨床像と比較検討した。DAD浸出期では硝子膜に接する肺胞上皮基底膜からlamininは消失、7S collagenは部分的に消失、しかしtype IV collagenは完全に保持されていた。肺胞毛細管基底膜は硝子膜に接する肺胞壁でのみ肺胞毛細管内皮とその基底膜の染色性が完全に消失していた。肺胞虚脱が高度で硝子膜が肺胞嚢を覆う段階の肺胞上皮基底膜ではlamininに加え、7S collagenも広範囲に消失していた。増殖期における虚脱の強い肺胞壁の肺胞上皮基底膜では7Sやtype IV collagenの消失はより高頻度となり、その消失部を通って肺胞腔内線維化が起こっていた。一方、血清7S collagenは健常成人の測定値平均3.91+0.85ng/mlであり、ARDS合併例では10.93+3.76ng/mlで、非合併26例の4.86+1.85ng/mlに比し有意に高かった。以上から結論として肺胞基底膜の傷害と肺胞微小循環の破綻がDADにみられる不可逆的肺胞構築の改築に大変重要であることが明らかになった。「結果」DAD浸出期では硝子膜に接する肺胞上皮基底膜からlamininは消失、7S collagenは部分的に消失、しかしtype IV collagenは完全に保持されていた。その時期Thrombomodulinの染色性も消失していた。増殖期における虚脱の強い肺胞壁の肺胞上皮基底膜では7S collagenやtype IV collagenの消失はより高頻度となり、その消失部を通って肺胞腔内線維化が起こっていた。52例中の46例(浸出期の90%、増殖期の60%)に肺胞毛細管内に微小血栓を認め、血管造影剤の注入による微小血管構造の解析からは増殖期において毛細血管網の強い改変が起こっていることが分かった。一方、血清7S collagenは健常成人に比べて、ARDS合併例では有意に高値を示した。「結論」肺胞基底膜の傷害と肺胞微小循環の破綻がDADにみられる不可逆的肺胞構築の改築に大変重要である。また、血清7S collagenの測定が予後の予測によいことが分かった。

材料は剖検52症例、42例はARDS発症から死亡までの期間が2-7日(浸出期)で、10例は8-14日(増殖期)であった。肺胞の基底膜に対してlaminin,type IV collagen,7S collagen,肺胞上皮や血管内皮細胞に対しても抗体を用いて免疫組織化学を行った。肺感染症33例、特発性間質性肺炎24例など123例の症例について血清7S collagenの測定をRIAにより行い臨床像と比較検討した。DAD浸出期では硝子膜に接する肺胞上皮基底膜からlamininは消失、7S collagenは部分的に消失、しかしtype IV collagenは完全に保持されていた。肺胞毛細管基底膜は硝子膜に接する肺胞壁でのみ肺胞毛細管内皮とその基底膜の染色性が完全に消失していた。肺胞虚脱が高度で硝子膜が肺胞嚢を覆う段階の肺胞上皮基底膜ではlamininに加え、7S collagenも広範囲に消失していた。増殖期における虚脱の強い肺胞壁の肺胞上皮基底膜では7Sやtype IV collagenの消失はより高頻度となり、その消失部を通って肺胞腔内線維化が起こっていた。一方、血清7S collagenは健常成人の測定値平均3.91+0.85ng/mlであり、ARDS合併例では10.93+3.76ng/mlで、非合併26例の4.86+1.85ng/mlに比し有意に高かった。以上から結論として肺胞基底膜の傷害と肺胞微小循環の破綻がDADにみられる不可逆的肺胞構築の改築に大変重要であることが明らかになった。
金属蒸気分離分析(SMVE)法の開発・改良研究

金属蒸気を直接分離でき,複雑なmatrixを有する試料を精度よく,化学干渉が無く,しかも超微量元素を高感度で分析することができるSMVE分析法の開発・改良研究を2年間にわたりを行ってきた。これらの成果は4の報文にまとめ,国際雑誌に報告してきた。また1報が投稿中である。学会での口頭発表も5回以上に及んだ。これらの成果を以下に概説する。◎SMVE分析法に関する基礎的な開発研究これまでの研究により、モリブデン管(カラム)中における各種元素の原子化・蒸気化特性は明らかであったが、固形試料を直接入れ(酸などに溶解することなく)分析できる可能性の検討研究は未だ行ってなかった。そこで、以下の研究を行った。またSMVE分析法のための超微量金属元素の予備濃縮法の開発を行った。○モリブデン管を用いた原子吸光法による固形試料(銅合金粉末)中の微量鉛の直接定量、○パン酵母を用いた超微量銅の吸着濃縮、○吸着材としてタンタル棒を用いた環境試料中の超微量クロムの濃縮○酵母菌へ超微量銀の吸着濃縮・・・これらの研究によりモリブデン管中に直接固形試料を導入して分析できる可能性を明らかにした又、SMVE分析法のための超微量金属元素の予備濃縮法として,タンタル棒および酵母菌が有様であることを明らかにした。◎SMVE分析法の改良・応用研究以前の研究から、金属蒸気分離(SMVE)分析法の利点は1)高温金属蒸気の物理的・化学的性質の解明・2)金属蒸気の直接分離分析、3)化学的前処理の不要-<(3E)16>汚染の抑制,簡便化,低コスト4)光学・化学干渉の低減、5)Tandem instrumentation(MS, ICP, AAS, AES)への応用の可能性、であることが分かってきた。そこで今回は最大の欠点であるカラムの熱変形を避けるために、カラムの電源方式を従来のオーミック加熱法から高周波誘導加熱法に変えた.これにより加熱測定時におけるカラムの変形が少なくなり、原子吸光法による検出が非常に容易になった。改良した本方法を錫の直接分離分析に応用した。従来のオーミック加熱法では信号を得ることができなかった錫の信号を得ることができた。カラム温度1250K・蒸気化温度1250K・キャリーアガス流量1.0mL/minの条件において、錫をカルシウム・カドミウム・鉄・カリウム・マンガン・亜鉛から分離させることができた。試料を気化し,金属ガスを直接分離できる金属蒸気分離分析システムは,多大な利点《1)高温金属蒸気の物理的・化学的性質の解明,2)金属蒸気の直接分離分析,3)化学的前処理の不要-

>汚染の抑制,簡便化,低コスト,4)光学・化学干渉の低減,5)Tandem instrumentation(MS,ICP,AAS,AES)への応用の可能性》が期待できる。にもかかわらず,システム化の困難性という大欠点が在るために,これまで国の内外ともに研究されていなかった。金属管(モリブデン又はタングステン)より製作される金属蒸気分離分析(SMVE)装置(カラム温度が1300°C以上)はこれまで,我々以外によっては研究されていない。従来の類似した研究についても世界的に非常に少ない。カラム温度が超高温であるため,原子蒸気が直接分離する。従って,化学干渉が無くなり,精度良い超微量元素分析が期待できる。しかし,超高温のカラムが必要な事もあって、システム化の困難性という大欠点があった。平成12年度は金属蒸気分離システムの設計。適切な分離カラムの開発・改良(耐熱窒化物,耐熱酸化物,炭化物,モリブデン,タングステン等高融点カラム素材の検討)及びカラムの設計。開発・改良した高温金属ガス分離カラムを新規購入の小型高周波誘導加熱装置(MU-1700B)に入れ,これに検出器として既存の原子吸光・発光法または他の検出器を組合わせた。金属蒸気分離分析装置の性能試験と金属ガスの分離に関する性能を調べた。基礎実験として加熱したモリブデン金属管及びタングステン金属管よりの、鉛、銅などの環境汚染金属の原子化(蒸気化)の状態を調べ、環境試料及び生体試料の分析に応用した。これらの金属はモリブデン管またはタングステン管アトマイザーから約1800°C以上で安定して蒸気化するが、モリブデンカラム中ではナトリウム、カドミウム、鉛、銅などの金属はカラム温度7001800°Cでキャリヤガス(アルゴン、アルゴン+水素)0.56ml/minを流すことにより、分離した。金属蒸気を直接分離でき,複雑なmatrixを有する試料を精度よく,化学干渉が無く,しかも超微量元素を高感度で分析することができるSMVE分析法の開発・改良研究を2年間にわたりを行ってきた。これらの成果は4の報文にまとめ,国際雑誌に報告してきた。また1報が投稿中である。学会での口頭発表も5回以上に及んだ。これらの成果を以下に概説する。◎SMVE分析法に関する基礎的な開発研究これまでの研究により、モリブデン管(カラム)中における各種元素の原子化・蒸気化特性は明らかであったが、固形試料を直接入れ(酸などに溶解することなく)分析できる可能性の検討研究は未だ行ってなかった。そこで、以下の研究を行った。またSMVE分析法のための超微量金属元素の予備濃縮法の開発を行った。○モリブデン管を用いた原子吸光法による固形試料(銅合金粉末)中の微量鉛の直接定量、○パン酵母を用いた超微量銅の吸着濃縮、○吸着材としてタンタル棒を用いた環境試料中の超微量クロムの濃縮○酵母菌へ超微量銀の吸着濃縮・・・これらの研究によりモリブデン管中に直接固形試料を導入して分析できる可能性を明らかにした又、SMVE分析法のための超微量金属元素の予備濃縮法として,タンタル棒および酵母菌が有様であることを明らかにした。◎SMVE分析法の改良・応用研究以前の研究から、金属蒸気分離(SMVE)分析法の利点は1)高温金属蒸気の物理的・化学的性質の解明、2)金属蒸気の直接分離分析、3)化学的前処理の不要->汚染の抑制,簡便化,低コスト4)光学・化学干渉の低減、5)Tandem instrumentation(MS,ICP,AAS,AES)への応用の可能性、であることが分かってきた。
小胞体を起点とする骨軟骨代謝の制御と破綻

我々が同定した小胞体ストレストランスデューサーBBF2H7の解析を行った。この分子は小胞体ストレスに応答して膜内切断を受け、DNA結合領域であるbZIPドメインを含むN末端側が核内へ移行して転写因子として機能する。BBF2H7欠損マウスは軟骨基質タンパク質の分泌異常を伴う重度の軟骨形成不全を示す。BBF2H7欠損軟骨細胞に転写因子として機能するN末端断片を発現させると軟骨基質タンパク質の分泌異常は改善した。転写因子BBF2H7の軟骨細胞における標的遺伝子のひとつは小胞体-ゴルジ間のタンパク質輸送に必須の因子であるSec23aであり、BBF2H7欠損軟骨細胞ではSec23aの減少によって軟骨基質タンパク質の分泌異常が引き起こされることを見出している。さらに軟骨細胞におけるBBF2H7の転写制御機構を明らかにするために解析を行った。BBF2H7プロモーター領域内の配列を調べると、Sox9が結合し得るSox-binding siteが存在していた。Sox9は軟骨細胞の分化、成熟を制御するマスター転写因子であり主要な軟骨基質タンパク質である2型コラーゲンの転写を誘導する。初代培養軟骨細胞においてSox9を過剰発現させるとBBF2H7の転写は促進され、ただちにタンパク質へと翻訳された。一連のプロモーターアッセイによって、Sox9がBBF2H7のプロモーター領域に存在するSox-binding siteに直接的に結合してBBF2H7の転写誘導を行っていることが明らかになった。さらにSox9によって引き起こされた2型コラーゲンをはじめとする軟骨基質タンパク質の大量合成が小胞体の負荷を増大させ、生理的な小胞体ストレスを誘発することが分かった。BBF2H7はこの生理的小胞体ストレスに応答して活性化し、大量に合成された軟骨基質タンパク質をスムーズに細胞外へ分泌していることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。我々が同定に成功している小胞体ストレスセンサーOASISおよびBBF2H7の骨格系組織における機能解明を目指した。1.軟骨組織におけるBBF2H7の役割軟骨細胞においてBBF2H7はその下流で抗アポトーシス作用を示すATF5-MCL1経路を活性化させ、アポトーシスを回避していることがわかった。軟骨細胞の分化の過程では、大量の軟骨基質タンパクが合成されることによって生理的な小胞体ストレスが発生する。BBF2H7-ATF5-MCL1経路はこの生理的な小胞体ストレスによる細胞への傷害を回避するために活性化している可能性が示唆された。BBF2H7のC末端断片が細胞外に分泌され、ヘッジホッグシグナルの活性化を介して周辺細胞の細胞増殖を促進していることがわかった。このことから、軟骨細胞においてBBF2H7はN末端断片による軟骨基質タンパクの分泌促進と、C末端断片による細胞増殖の促進という二つの機能をもつことが明らかになった。3.OASISおよびBBF2H7の活性化機構の解明OASISおよびBBF2H7の活性化機構解明を試みた結果、以下の特徴を有することが明らかとなった。(1)OASISおよびBBF2H7は常にプロテアゾームによる分解を受ける。(2)小胞体ストレスが負荷されると、OASISおよびBBF2H7は分解から回避し、安定化する。(3)安定化したOASISおよびBBF2H7はすみやかにゴルジ装置に輸送され、プロテアーゼによる膜内切断を受ける。(4)E3ユビキチンライゲースであるHRD1がOASISおよびBBF2H7のプロテアゾーム分解に関与する。以上のことから、HRD1の発現を減弱させることでOASISおよびBBF2H7の機能を促進できることが明らかになった。我々が同定した小胞体ストレストランスデューサーBBF2H7の骨軟骨組織形成制御機構の解析を行った。BBF2H7は小胞体ストレスに応答して膜内切断を受け、N末端側が核内へ移行して転写因子として機能する。軟骨細胞におけるBBF2H7の転写ターゲットの一つは小胞体ーゴルジ間輸送に必須のSec23aであり、BBF2H7欠損マウスはSec23aの減少によって軟骨基質タンパクの分泌異常を伴う軟骨形成不全を示す。しかしながらC末端断片の機能や局在については不明であったため、C末端断片の機能解析を行った。BBF2H7欠損マウスでは軟骨細胞数が顕著に減少しているが、細胞死の亢進はみられない。初代培養軟骨細胞を用いて細胞増殖能を調べると、BBF2H7欠損細胞でBrdUの取り込みの減少、細胞周期関連遺伝子の発現減少、G1期からS期への進行抑制等が見られ、細胞増殖速度が低下していることがわかった。BBF2H7欠損細胞に全長型BBF2H7を発現させると細胞増殖速度は回復した。しかし転写因子として機能するN末端断片を発現させても細胞増殖速度は回復しなかった。それに対し小胞体内腔側のC末端断片を発現させると野生型と同程度まで回復した。このことからBBF2H7のC末端断片に細胞増殖を促進させる働きがあることがわかった。C末端断片の細胞内局在を調べると、切断後、小胞体から速やかに細胞膜側へ移動し、細胞外へと分泌された。また、C末端断片を発現させた細胞の培養上清をBBF2H7欠損細胞に添加すると細胞増殖能が改善した。

細胞外に分泌されたBBF2H7のC末端断片が細胞増殖を活性化するメカニズムを調べた結果、C末端断片はヘッジホッグリガンドのインディアンヘッジホッグとその受容体であるPtch1に結合し、下流シグナルを活性化することで細胞増殖を促進させることがわかった。我々が同定した小胞体ストレストランスデューサーBBF2H7の解析を行った。この分子は小胞体ストレスに応答して膜内切断を受け、DNA結合領域であるbZIPドメインを含むN末端側が核内へ移行して転写因子として機能する。BBF2H7欠損マウスは軟骨基質タンパク質の分泌異常を伴う重度の軟骨形成不全を示す。BBF2H7欠損軟骨細胞に転写因子として機能するN末端断片を発現させると軟骨基質タンパク質の分泌異常は改善した。転写因子BBF2H7の軟骨細胞における標的遺伝子のひとつは小胞体-ゴルジ間のタンパク質輸送に必須の因子であるSec23aであり、BBF2H7欠損軟骨細胞ではSec23aの減少によって軟骨基質タンパク質の分泌異常が引き起こされることを見出している。さらに軟骨細胞におけるBBF2H7の転写制御機構を明らかにするために解析を行った。BBF2H7プロモーター領域内の配列を調べると、Sox9が結合し得るSox-binding siteが存在していた。Sox9は軟骨細胞の分化、成熟を制御するマスター転写因子であり主要な軟骨基質タンパク質である2型コラーゲンの転写を誘導する。初代培養軟骨細胞においてSox9を過剰発現させるとBBF2H7の転写は促進され、ただちにタンパク質へと翻訳された。一連のプロモーターアッセイによって、Sox9がBBF2H7のプロモーター領域に存在するSox-binding siteに直接的に結合してBBF2H7の転写誘導を行っていることが明らかになった。さらにSox9によって引き起こされた2型コラーゲンをはじめとする軟骨基質タンパク質の大量合成が小胞体の負荷を増大させ、生理的な小胞体ストレスを誘発することが分かった。BBF2H7はこの生理的小胞体ストレスに応答して活性化し、大量に合成された軟骨基質タンパク質をスムーズに細胞外へ分泌していることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画であった小胞体ストレスセンサーの活性化機構の解明、転写因子としての機能の解明、分泌因子としての機能の解明の全てを達成し、小胞体ストレスおよび小胞体ストレス応答による骨軟骨組織の形成とその破綻によって発生する障害の一端を明らかにすることができたため、計画はおおむね順調に進展していると判断する。当初の計画であった小胞体ストレストランスデューサーの分泌因子としての機能解明に関して、BBF2H7のC末端断片が細胞外に分泌され、周辺細胞の細胞増殖を促すシグナル伝達分子としての機能をもつことを明らかにし、小胞体ストレスおよび小胞体ストレス応答による骨軟骨組織の形成メカニズムの一端を明らかにすることができたため、計画はおおむね順調に進展していると判断する。各センサータンパクの転写因子および分泌因子としての詳細な機能を明らかにすることで、骨・軟骨代謝を制御する小胞体ストレス応答系のシグナル系統図を完成させる。
強磁性ならびに反強磁性を示す有機高分子の電子状態に関する研究

本研究は、特異な磁気物性、特に強磁性あるいは反強磁性を示す有機高分子の分子設計ならびに電子状態の理論的解明などを目的として実施したもので、その研究実績の概要は以下のようである。(1)安定な強磁性有機高分子として期待できるポリ(m-アニリン)の分子設計を行い、併せてその電子状態、特にスピン状態の解析を非制限ハートリー・フォック法に法づく結晶軌道法によって行った。その結果、本ポリマーの適当な酸化により、主として窒素原子上に強磁性的スピン相関を示す電子状態をとりうることが明らかとなった。またポリマー鎖中のフェニル基への適当な置換基導入により、スピン状態の制御を行いうることも明らかとなった。(2)有機強磁性体としての潜在的可能性を有する、何種類かのポリ(フェニルニトレン)の電子状態および磁気的性質についての解析俎、非制限ハートリー・フォック法に基づく結晶軌道法によって行った。その結果、π性スピンはベンゼン環中をスピン分極を伴いながら非局在化しており、長距離磁気的秩序配列が可能であることが明らかとなった。一方、σスピンは1価の窒素上に比較的局在化していることも明らかとなった。以上により、ポリ(フェニルニトレン)はポリ(mーフェニルカルベン)と同様に、強磁性ポリマーの有効な候補でありうることが結論された。(3)3回対称性を有する非ケクレ有機分子に対して、非経験的分子軌道法を用いてその高スピン状態の理論的解析を行った。1,3,5ートリメチレンベンゼン及び1,3,5ートリアミノベンゼンのトリカチオンは、ほぼ縮退した3つの非結合軌道を持ち、4重項状態はヤーン・テラー変形した2重項状態より安定で、基底4重項であることが明らかとなった。これは別途得られている実験結果ともよく一致している。
興奮性,アミノ酸シナプス伝達に及ぼすプロスタグランディンE_2作用機構

プロスタグランディン(PG)は視床下部で発熱を誘発するなど、中枢神経系(CNS)においても多様な作用がある。しかしPGの中枢ニューロンに対する作用機構はほとんど解明されていない。本研究では、ラット孤束核スライス可視ニューロン細胞体からパッチクランプ(whole-cell)記録し興奮性アミノ酸(グルタミン酸)シナプス伝達に対するPGE_2の作用を解析した。抑制性アミノ酸(GABA及びグリシン)によるシナプス伝達は薬理学的に遮断して実験を行った。電位固定(-60mV)下に,誘発EPSC、mEPSC、グルタミン酸投与が誘発する電流をシナプス後細胞から記録し,これらに対するPGE_2の作用を記録した。なお,CNQXで遮断することにより,これらの電流がいずれも非NMDA型グルタミン酸受容体を介することを確認した。(1)EPSCに対する作用:PGE_2は、EPSCの振幅を有意に上昇させた。また、PGE_2はEPSCの低振幅に偏った分布を対称的な分布へ変化させた。この変化は、PGE_2がシナプス前終末放出作用を促進することを示唆する。(2)mEPSC対する作用:フグ毒(TTX)で活動電位の発生を阻害し、残存する微小EPSC(mEPSC)を記録した。PGE_2は、mEPSCの発生頻度を有意に上昇させたが、振幅分布を変化させなかった。これは、PGE_2がシナプス前終末に作用しグルタミン酸の放出確率を上昇させたことを示す。(3)非NMDA受容体に対する作用:外来性グルタミン酸を微小イオン電気泳動法で投与し受容体を介した内向き電流を誘発させた。PGE_2は、その電流振幅を変化させなかった。これはPGE_2が非NMDA受容体の感受性を修飾しないことを意味する。以上の結果、PGE_2はシナプス前終末に作用しグルタミン酸の放出確率を上昇させると結論した。
EBNに基づく高脂血症のための効果的食教育のモデル化

以下の目的、研究デザインのもとで介入研究を実施した。目的:EBNに一環として、高脂血症者を対象とし、2種類の食育法の無作為割付に基づく比較試験(RCT)により、FFQW 65に基づいた食育効果の評価を行うことを目的とする。研究デザインと作業仮説:高脂血症者(日本動脈硬化学会基準2002年)を対象とし、従来型教育群(非介入群)と新食育群(介入群)の2群に無作為に割り付ける並行群間無作為化比較試験(RCT)に基づいて、新食育の評価を行う介入研究である。調査対象は平成16年2月から1年間に、東京都内某人間ドックを受診する勤労者(年齢3570歳)のうち高脂血症者と診断され、文書による同意を得られ、血糖値、血圧値、脂質値を下げるための投薬や治療を受けていない者である。目標標本数は300名としたが、現在まで計200名の登録を終了した。調査の内容と方法としては、開始時には全員に対し検診、食物摂取頻度調査(FFQW65)、運動・生活習慣等に関する項目の調査を行い、2ヵ月ごとに新教育群のみ郵送による食教育を実施した。1年後(全員)には検診、食物摂取頻度調査(FFQW65)、運動・生活習慣等に関する項目の調査を実施するものとした。本来なら調査期間内に1年後のデータまで収集できる予定であったが、個人情報保護法の制定により、調査実施機関内での調整等に時間がかかり、多少の遅れが生じた。しかし、1年後の結果収集までの継続は保証されており、今後、さらに目標症例数と1年後のデータ収集まで継続していくことについては了解が得られている。食教育の要点は、(1)適正エネルギー摂取、たんぱく質・脂質・糖質エネルギー比を適性にし、朝・昼・夕食のエネルギー摂取バランスを1:1:1、(2)飽和脂肪酸(S):1価不飽和脂肪酸(M):多価不飽和脂肪酸(P)の摂取割合を3:4:3になるように図る、(3)食品グループの適正摂取を図る、(4)規則正しい食事リズムをとる、である。ベースラインデータの分析として、現在までのエントリーのデータに基づき比較検討したところ、新食育群、従来型食育群別のベースライン値は両群の間で、現在までのところ特に大きな相違は認められなかった。今後、データの収集が終了次第、解析を行い、成果の発表を図る。1.研究目的:FFQW65に基づいた高脂血症予防のための新栄養教青の効果の評価を高脂血症者を対象として、2種類の栄養教育法の無作為割付に基づく比較試験(RCT)を目的とする。2.研究デザイン:高脂血症者を対象に、従来型教育群(非介入群)と新栄養教育群(介入群)の2群に無作為に割り付ける並行群間無作為化比較試験(RCT)による介入研究である。

a.研究対象:東京都内某人間ドック受診の勤労者(年齢35歳70歳)のうち高脂血症者b.研究仮説:FFQW65に基づき新たに開発した栄養教育法に基づいて行った栄養教育(介入)により、従来の教育(非介入)に比べて、1年後の血中総コレステロール値(TC)が10mg/dl以上低下する。c.対象者数と設定根拠:調査対象者は、本研究の仮説を両側有意水準5%で検証するために、検出力80%で検出できるよう設定した。その設定根拠は以下の通りである。TCの1年後の変化に対して、これまでの報告より、ベースラインでの平均値220mg/dlが、新教育群で205mg/dlまで減少する、従来型教育群では220->215mg/dl自然減少するという仮説を設定し、TCのベースライン値と1年後の値との差の標準偏差を28-30mg/dlと想定し、10%前後の脱落を考慮して介入群n=150、非介入群n=150、計n=300とした。d.評価指標:評価は調査開始後12ヶ月目に行う。主要評価指標は1年後のTCであり、開始時のTCに対する変化率をとる。副次的な指標としてその他の血清脂質(LDL、HDL、TG)をとる。さらに、総摂取量、PFC比、朝・昼・夕食での摂取エネルギー比(1日エネルギー摂取量に対する配分の1/3からのズレ)等を検討する。いずれも開始時値に対する変化率を評価指標とする。平成16年2月から開始し、現在のエントリー患者数35名(TC:242.7mg/dl±38.32(平均値±標準偏差))について第1回目の介入を終了し、この対象のうち2ヵ月経過後の患者に対し第2回介入を開始しており、研究は順調に推移している。本年度は以下の目的、研究デザインのもとで介入研究を実施した。目的:EBNに一環として、高脂血症者を対象とし、2種類の食育法の無作為割付に基づく比較試験(RCT)により、FFQW 65に基づいた食育効果の評価を行うことを目的とする。研究デザインと作業仮説:高脂血症者(日本動脈硬化学会基準2002年)を対象とし、従来型教育群(非介入群)と新食育群(介入群)の2群に無作為に割り付ける並行群間無作為化比較試験(RCT)に基づいて、新食育の評価を行う介入研究である。調査対象は平成16年2月から1年間に、東京都内某人間ドックを受診する勤労者(年齢3570歳)のうち高脂血症者と診断され、文書による同意を得られ、血糖値、血圧値、脂質値を下げるための投薬や治療を受けていない者である。目標標本数は300名としたが、現在まで計200名の登録を終了した。調査の内容と方法としては、開始時には全員に対し検診、食物摂取頻度調査(FFQW65)、運動・生活習慣等に関する項目の調査を行い、2ヵ月ごとに新教育群のみ郵送による食教育を実施した。1年後(全員)には検診、食物摂取頻度調査(FFQW65)、運動・生活習慣等に関する項目の調査を実施するものとした。本来なら調査期間内に1年後のデータまで収集できる予定であったが、個人情報保護法の制定により、調査実施機関内での調整等に時間がかかり、多少の遅れが生じた。しかし、1年後の結果収集までの継続は保証されており、今後、さらに目標症例数と1年後のデータ収集まで継続していくことについては了解が得られている。食教育の要点は、(1)適正エネルギー摂取、たんぱく質・脂質・糖質エネルギー比を適性にし、朝・昼・夕食のエネルギー摂取バランスを1:1:1、(2)飽和脂肪酸(S):1価不飽和脂肪酸(M):多価不飽和脂肪酸(P)の摂取割合を3:4:3になるように図る、(3)食品グループの適正摂取を図る、(4)規則正しい食事リズムをとる、である。
超臨界流体中の同位体効果の測定とその制御

本研究の目的は,純水中に約150ppm含まれるHDOを二酸化炭素(CO_2)にリン酸トリブチル(TBP)のような添加物を加えることにより,常温,加圧下で抽出し,HDOとH_2Oとの分離係数を測定することで,超臨界流体抽出における重水素の同位体効果を定量すること,同位体効果に及ぼす温度,圧力,添加物の影響を実験的に調べて超臨界CO_2が同位体効果に及ぼす影響を溶媒和の観点から把握することにある.また,トレーサレベルのトリチウム水を用いてトリチウムの超臨界流体抽出における同位体効果についても重水素と同様に定量化することとした.平成14年度は最終年度であり,約450Bq/cm^3のトリチウムを添加した純水を用いて実験研究を行うとともに結果を取り纏めた.TBPを添加物として含む超臨界CO_2でトリチウムを含む純水を抽出する実験を昨年度作製した実験システムを用いて行い,この際に観測されるHTOとH_2O間の分離係数を617MPaで圧力やTBPのCO_2に対するモル比0.050.6で変化させて液体シンチレーションカウンタを用いて測定した.この結果,圧力が低い6MPaでHTO/H_2O間のTに対する最大の平衡分離係数1.148が得られた.この値はHDOに対する値よりも大きい.また,圧力が高い17MPaでは分離係数が小さくなること,TBPの二酸化炭素に対するモル比が小さいほど大きな平衡分離係数が得られることがわかった.これらはHDO-H_2O系と同一の傾向であった.2カ年間の研究を要するに,超臨界流体中での同位体効果を測定するとともに,同位体効果の大きさを圧力や組成で制御できることを発見し,同位体効果の発現機構としては,TBP水錯体にCO_2が溶媒和してTBPと水との水素結合が弱くなることで説明できることを明確化した.ここで測定された平衡分離係数は水蒸留での値に比較して大きいことも確認した.純水中に150ppm含まれるHDOを超臨界二酸化炭素(SF-CO2)にリン酸トリブチル(TBP)を添加することによって,常温,加圧下で超臨界流体抽出し,H2Oとの分離係数を測定評価した.抽出操作は,液体二酸化炭素をシリンジポンプで高圧セルに導入し,予め調整したTBP水錯体と接触させた後,高圧容器ごと遠心分離機にかけ,水相,有機相,超臨界相を分相した後,必要試料をサンプリングし,有機相中のH2OまたはD2O量はカールフィッシャー水分計で,H2OとHDOの存在比はFinnigan MAT252型質量分析計で測定することにより,分離操作で得られる各相の割合とH2OとHDOの分離係数を評価した.常温,常圧で純粋なD2OをTBPで抽出する実験を実施した結果,TBPとD2OはH2Oと同様に1:1錯体を形成することがわかった.150ppmのHDOが含まれる純水をTBPで抽出すると,HDOは水相に濃縮され,その分離係数は1.019±0.001であることがわかった.ここで得られたTBPとH2OまたはHDOとの錯体をSF-CO2で抽出すると,TBPに錯形成していたH2OおよびD2Oが水相として分相され,HDOはこの水相中に濃縮され,その分離係数は純水に対して1.012±0.0011.026±0.001となり,SF-CO2の圧力(816MPa)によって緩やかに変化することがわかった.SF-CO2の圧力が高くなるほど,分相されるH2OおよびHDOの量が増えることから,SF-CO2はTBPによるH2OおよびHDO抽出の貧溶媒として機能すると考えられる.本研究の目的は,純水中に約150ppm含まれるHDOを二酸化炭素(CO_2)にリン酸トリブチル(TBP)のような添加物を加えることにより,常温,加圧下で抽出し,HDOとH_2Oとの分離係数を測定することで,超臨界流体抽出における重水素の同位体効果を定量すること,同位体効果に及ぼす温度,圧力,添加物の影響を実験的に調べて超臨界CO_2が同位体効果に及ぼす影響を溶媒和の観点から把握することにある.また,トレーサレベルのトリチウム水を用いてトリチウムの超臨界流体抽出における同位体効果についても重水素と同様に定量化することとした.平成14年度は最終年度であり,約450Bq/cm^3のトリチウムを添加した純水を用いて実験研究を行うとともに結果を取り纏めた.TBPを添加物として含む超臨界CO_2でトリチウムを含む純水を抽出する実験を昨年度作製した実験システムを用いて行い,この際に観測されるHTOとH_2O間の分離係数を617MPaで圧力やTBPのCO_2に対するモル比0.050.6で変化させて液体シンチレーションカウンタを用いて測定した.この結果,圧力が低い6MPaでHTO/H_2O間のTに対する最大の平衡分離係数1.148が得られた.この値はHDOに対する値よりも大きい.また,圧力が高い17MPaでは分離係数が小さくなること,TBPの二酸化炭素に対するモル比が小さいほど大きな平衡分離係数が得られることがわかった.

これらはHDO-H_2O系と同一の傾向であった.2カ年間の研究を要するに,超臨界流体中での同位体効果を測定するとともに,同位体効果の大きさを圧力や組成で制御できることを発見し,同位体効果の発現機構としては,TBP水錯体にCO_2が溶媒和してTBPと水との水素結合が弱くなることで説明できることを明確化した.ここで測定された平衡分離係数は水蒸留での値に比較して大きいことも確認した.
再生鱗における隆起線形成の日周性と時計遺伝子との関連:メラトニンによる制御

硬組織には、約1日を単位として形成される日周輪(成長線)の存在が古くから知られているが、その日周輪形成の制御機構を明らかにした研究は無い。そこで本研究では、キンギョの再生鱗を用いて、それらを明らかにする実験を行った。まず、キンギョの鱗の再生過程において我々が単離した骨芽細胞関連遺伝子の発現を調べたところ、哺乳類の膜性骨の再生過程で発現する遺伝子のパターンとほぼ同じパターンを示すことが分かった。次に、再生鱗を用いて、隆起線(成長線)が1日1本ずつ外側に形成されていくこと、また、時計遺伝子の中では少なくともper-3の発現に明瞭な概日リズムが認められることを明らかにした。歯の象牙質におけるエブネル線や硬骨魚類の再生鱗における隆起線など、硬組織の中には約1日を単位として形成される日周輪(成長線)の存在が古くから知られている。しかしながら、その日周輪形成に関して、時計遺伝子やメラトニンなど具体的な制御因子との関連を調べた研究はまったくなされていない。そこで本研究は、これまでキンギョのウロコから単離した骨芽・破骨関連遺伝子とこれまで明らかにしたメラトニンの破骨・骨芽細胞の制御機構との関連を基盤に、キンギョの再生鱗における隆起線(日周輪)の形成を支配する時間生物学的な制御機構を明らかにし、硬組織形成の基盤となる日周性の制御機構を解明することを目的とした。12L 12Dの24時間周期の明暗サイクル下やLLの恒明下でできる再生鱗の隆起線は、1日に約1本ずつ外側に形成されことを明らかにした。キンギョのウロコからすでにクローニングが済んでいる骨芽細胞の分化制御遺伝子(4種)と機能遺伝子(3種)および破骨細胞の分化制御遺伝子(3種)や機能遺伝子(3種)に関して、再生鱗形成過程においてリアルタイムPCR法を用いて調べた結果、日周リズムが認められる遺伝子を見出した。また、24時間よりも短い周期で変動している遺伝子の存在も明らかにした。さらに、時計遺伝子であるper-1,per-2,per-3やclock遺伝子をキンギョのウロコからクローニングし、それらの遺伝子の発現の日周リズムを調べた結果、少なくともper-3の発現に明瞭な概日リズムが観察された。硬組織の中には、約1日を単位として形成される日周輪(成長線)の存在が古くから知られている。そこで本研究は、キンギョのウロコから単離した骨芽・破骨関連遺伝子と時計遺伝子、さらにこれまで明らかにしたメラトニンの破骨・骨芽細胞の制御機構との関連を基盤に、キンギョの再生鱗における隆起線(日周輪)の形成を支配する時間生物学的な制御機構を明らかにし、硬組織形成の基盤となる日周性の制御機構を解明することを目的とした。本年度は、再生鱗における隆起線形成機構を解明するために、比較の意味で通常(普通)鱗を用いて、24時間周期の明暗サイクル下やLLの恒明下における骨芽・破骨細胞関連遺伝子の発現と時計遺伝子の発現の日周変動を調べた。その結果、通常鱗では破骨細胞の機能遺伝子の発現に概日リズムが観察された。また、per-1, per-2, jper-3の遺伝子発現の日周リズムを調べた結果、少なくともper-3の発現に概日リズムが観察された。次に、24時間周期よりも短い明暗周期や長い明暗周期下における隆起線の形成と遺伝子の発現を調べるために、新たに水槽装置を作成した。さらに、隆起線形成に対するメラトニンの作用を明らかにするために、水槽内のメラトニン濃度を繰り返し時間とともに変化させることができる装置を作成した。現在、これらの装置を用いて隆起線形成と各遺伝子の発現変動を解析中である。骨の皮質骨、歯の象牙質や硬骨魚類の再生鱗の中には、約1日を単位として形成される日周輪(成長線)の存在が古くから知られている。しかし、その日周輪形成の制御機構、すなわち時計遺伝子やメラトニンなど具体的な制御因子を明らかにした研究は無い。そこで本研究では、キンギョのウロコから単離した骨芽・破骨関連遺伝子と時計遺伝子、さらにこれまで明らかにしたメラトニンの破骨・骨芽細胞の制御機構との関連を基盤に、キンギョの再生鱗における隆起線(日周輪)の形成を支配する時間生物学的な制御機構を明らかにし、硬組織形成の基盤となる日周性の制御機構を解明することを目的とした。これまで、骨芽細胞と破骨細胞関連遺伝子の日周変動に関して、平成21年度は主として再生鱗を用いて、平成22年度は通常(普通)鱗を用いて明らかにしてきた。