hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
幹細胞における無限自己複製の制御機構

哺乳動物の幹細胞は、分化能を保って分裂する能力(自己複製能)をもつ。その分子機構は、幹細胞特異的転写因子による分化能維持・細胞老化因子群の統合的制御機構であるが、その構成遺伝子や転写制御様式については大部分が不明である。本研究は、これを規定する遺伝子群の同定を通じて、発生学と細胞老化を転写因子の観点から結合させる。神経幹細胞および栄養幹細胞は、分化能は異なるもののどちらも転写因子Sox2を強く発現し無限に自己複製する。Sox2は両者の正常な自己複製に必須なので、本研究では両細胞においてSox2下流遺伝子を網羅的に探索し、共通の下流遺伝子について機能解析を行って、無限自己複製機構を明らかにすることを目的とした。神経幹細胞(NSC)と栄養幹細胞(TSC)はES細胞(ESC)からの樹立法が確立されているため、申請者が樹立した誘導的Sox2ノックアウトESCを利用して誘導的Sox2ノックアウトTSC,NSCをそれぞれ樹立できる。20年度までに、テトラサイクリン制御性Sox2ノックアウトNS細胞NS22-2を樹立し、テトラサイクリン添加によって自己複製が阻害されることがわかった。ところが、高密度培養条件下では自己複製が保たれることも同時に明らかとなった。21年度では、細胞間シグナルの阻害によるSox2ノックアウトのフェノタイプ顕在化を試み、Notchシグナル阻害剤を用いての解析を行ったが、効果はみられなかった。マイクロアレイ解析に進むことが困難と判断したため、より直接的な機能解析法として、NS細胞における中心的転写因子を数個同定し、これを用いて繊維芽細胞MEFからNS様細胞を誘導できることを明らかとした。この転写ネットワークをさらに解析することで、自己複製機構の解明につながる。無限に自己複製を行うものとして、生殖細胞・胚性幹細胞(ESC)・神経幹細胞(NSC)・栄養膜幹細胞(TSC)が知られる。一般に幹細胞は分化細胞特異的遺伝子の発現を抑制すると同時に、細胞老化の開始を抑制すると考えられる。すなわち無限自己複製機構とは、幹細胞特異的転写因子による分化能維持・細胞老化因子群の統合的制御機構であるが、その構成遺伝子や転写制御様式については大部分が不明である。NSCおよびTSCは、発生系譜や分化能が全く異なるものの、共通の性質として無限に自己複製し、転写因子Sox2を強く発現する。我々はこれまでに、Sox2の機能は両者の正常な自己複製に必須であることを見出している。本研究では両方の幹細胞においてSox2下流遺伝子を網羅的に探索し、共通して見出される下流遺伝子について機能解析を行って、無限自己複製機構に必須の新規遺伝子および転写制御回路の同定を目指す。高精度でSox2下流遺伝子を同定する目的で、均一な未分化集団として培養できるNSCを用いて解析するため(一般的なNSC培養法であるニューロスフェア法では分化細胞の混入割合が高い)、誘導的Sox2ノックアウトESC(2TS22C)を材料に、平面培養法にて誘導的Sox2ノックアウトNSC(NS22-2)を樹立した。NS22-2はテトラサイクリン存在下でSox2を完全に消失し、自己複製/増殖を停止した。この系を用いてマイクロアレイ解析を開始している。一方、自己複製は複数の因子が協調的に働いて引き起こされるだろうから、上述の解析からNSCとTSCに共通して見出されるSox2下流遺伝子については、同時に多数発現させて機能検定する必要がある。現在の遺伝子導入法では数十因子以上の同時発現ができないため、導入遺伝子の直接の効果として解析できない。本研究ではこれを可能にする新規遺伝子発現システムを開発した。
溶融燃料の粘性および表面張力評価への光散乱法の適用

核燃料の高温融体の物性は原子炉過酷事故における炉心溶融の解析にとって極めて重要である。本研究ではレーザー誘起表面波(LiCW)法を粘性係数および表面張力の測定に適用し、基本的な装置の組み上げ、粘性率既知の液体の室温での測定を行った。LiCW法で必要な表面波の波長をアクリル板への干渉縞の焼付およびCCDカメラによる可視化から推定することが可能となった。室温にて、トルエン、純水、粘性標準溶液の表面波の動的挙動を観察し、粘性係数が高くなると表面波の減衰が大きく、逆に低くなると振動が持続しやすくなることを確認した。核燃料の超高温物性、特に高温液体の物性は測定が困難であり、過去の研究例も極めて少ない。しかしながら、福島第一原子力発電所事故の事象進展の解析をはじめ、原子炉の安全解析においては、溶融燃料の物性は必要不可欠なものである。そこで本研究では、液体物性の中でも表面張力・粘性係数に着目し、それらの測定手法の開発を目的とした。ここで提案する測定手法は、液体の表面に局在する波(リプロン)を回折格子と見なし、そこへレーザー光を照射し、リプロンから散乱されてくる一次回折光の強度の時間変化を解析することで、これらの動的物性を評価するものである。当初は自然発生的に存在するリプロンに対して測定することを予定していたが、粘性が低いものには有効であるが、測定時間を要する(繰り返し測定が必要)、外部からの振動を最大限抑える必要があることなどが判明した。本研究で測定対象となる溶融燃料などの粘性が高い液体は自然な状態ではリプロンが生じにくいため、二光束レーザー干渉法により外部から強制的にリプロンを生じさせる手法を採用することとした。この手法は測定システム自体は複雑になるものの、一方で測定時間がμsオーダーになることが期待できる。初年度は主に光散乱装置の設計・製作を実施した。具体的には、リプロンの挙動を反映した信号としての回折光を得るための可視レーザーおよびノイズ除去用空間フィルター、リプロンを強制的に発生させるための二光束干渉法用レーザーおよび光強度調製用アッテネータ、各種ミラー、ビームスプリッター、回折光検出器等を適切な位置に光学テーブル上に配置することにより、光散乱装置を作製した。原子力発電所の過酷事故における燃料挙動および関連する材料の挙動を解析することは、今後の原子炉の安全性・事故耐性を向上させる上で必要不可欠である。しかしながら、実規模スケールで実験的にこれを模擬することは、現在原子力をとりまく環境を考えると非現実的であり、当面は計算機シミュレーションを活用せざるをえない。計算機シミュレーションの予測精度を考える上で重要なことの一つに、材料の物性値の精度および蓄積がある。特に事故時のケースでは溶融状態における物性値が必要であるにも関わらず、実際に計算に使用されているものは過去のデータや他の物質からの類推であったり、測定精度が低いなどの問題がある。そこで本研究では従来の液体物性の測定法(回転振動法など)に替わる手法として、レーザ光散乱法に着目し、表面張力・粘性率を短時間・非接触で測定可能とする装置の開発に取り組んだ。測定法の原理は液体表面に二光束レーザ光干渉法により干渉縞を生じさせ、それに応じた温度分布により表面波(リプロン)を発生させ、その過渡現象(減衰振動)を別なレーザーを使って観察するものである。初年度に、二光束干渉法に用いるパルスYAGレーザ、観察光としてHe-Neレーザを導入し、装置の大部分を作製した。最終年度には、装置の性能の検証として、干渉縞の直接的(CCDカメラによる強度分布測定)および間接的(アクリル板への焼き付け)測定を行い、解析で重要となる干渉縞の間隔を特定した。その後、測定試料として水および粘度測定用標準溶液を使って、リプロンの減衰振動現象の測定に成功した。測定の結果、粘性率が高くなる程、リプロンが大きく減衰することが確認できた。光散乱測定装置の設計・製作を以下の通り行った。(1)プローブ光として高強度He-Ne(波長633 nm)を選択し、レーザー光の空間ノイズ除去用スペイシャルフィルタとして、入射(対物)レンズ-ピンホール-出射レンズから構成される装置を製作した。スペイシャルフィルタは、空間ノイズ除去性能を有するだけではなく、レーザー光の液体表面上でのスポット径が可能な限り小さくなるように、また発散が小さくなるように、ピンホール径およびレンズ焦点距離等を考慮し、設計した。(2)当初、液体表面に発生する波(リプロン)を自然発生的に存在するものとして測定することを予定していたが、高粘性液体では外部から強制的に発生さる方が有利なことから、リプロン発生機構にとして二光束干渉法装置を準備した。

具体的には、短パルス(ナノ秒)YAGレーザーから発せられる光をビームスプリッタで分け、再び液体表面上で重ね合わせ干渉縞を発生させる。その結果、この干渉縞に応じた温度分布が瞬時に液体表面に生じ、リプロンが発生する。更に、干渉縞の大きさ、すなわちリプロンの波長を正確に把握するために、アッテネータをYAGレーザーの前面に配置することによりレーザー光の強度を調節可能とし、液体表面に発生する干渉縞観察用として空間分解能に優れたCCDタイプのビームプロファイラを光路上に配置できるようにした。(3)He-Neレーザー光が液体表面で散乱される際に発生する一次回折光を検出するために、アバランシェフォトダイオードを光路上に配置した。また、フォトダイオードには信号解析用として高速デジタルオシロスコープを接続した。核燃料工学(1)試料としてグリセリン-水系液体を測定する。グリセリンの粘度は約1000 mPa・s、水は0.89 mPa・sであり、その割合を変えることで粘度調整が可能となる。その結果、これまで報告されているUO2の粘度最大約8 mPa・sを十分にカバーできる。(2)光散乱装置の組み上げ・調整を引き続き実施する。低粘性液体の場合、自然状態でもリプロンは存在するが、粘性が高くなると減衰効果が大きくなり発生しにくくなる。これは光散乱法での測定が困難になることを意味する。そこで、自然状態での測定から、液体表面に強制的にリプロンを生じさせるための二光束レーザー干渉機構の導入へと計画を変更した。ここではUO2融体の測定を想定し、短パルスYAGレーザーを導入した。リプロンの発生原理は、液体表面での干渉現象を利用し、空間的に周期的な温度分布を液体表面に発生させ、熱膨張作用により凹凸を発生させるというものである。液体の表面張力・粘性測定は、パルス照射が終了したと同時に、凹凸が元に戻る際のリプロンの挙動を測定することで実現できる。ここで重要なのはリプロンの波長の決定であり、ビーププロファイラを使った干渉縞の短時間での精密測定を実施する。また代替案として、黒アクリルプレート上に干渉縞から回折格子を作製し、回折格子の格子間隔の観察・測定、およびそれを使った回折実験も行う。液体表面での散乱強度は、プローブ光(He-Neレーザー)の偏光状態に依存することから、半波長板の導入を実験的に検討する。(3)試料の加熱溶解機構を検討する。本研究の最終目的はアクチニド酸化物融体の物性測定であることから、試料の非接触加熱機構として、赤外線加熱(ハロゲンランプ等)およびレーザー加熱(半導体レーザーまたは炭酸ガスレーザー)を検討する。
Hartnup病原因遺伝子B^0AT1の上皮頂上膜移行を制御する結合蛋白質の解析

Hartnup病は、腎近位尿細管及び小腸上皮での中性アミノ酸の吸収が阻害される常染色体劣勢の遺伝性疾患であり、その原因遺伝子としてアミノ酸輸送系B^0の分子実体であるB^0-type amino acidtransporter 1(B^0AT1)が関与することが報告されている。本研究期間中に、我々はこのB^0AT1の機能を制御している蛋白質を同定すべく、この輸送体に結合する蛋白質の同定及びその生理的機能の解析を行ってきた。B^0AT1のC末端領域をBaitとした酵母Two-hybrid法により、モーター蛋白質であるdynein複合体に結合するTctex-1の同定に成功した。生化学的手法であるin vitro pull down法および免疫沈降法により、両者の結合を確認した。実際にTctex-1のB^0AT1との関わりを調べるために、siRNAを用いたTctex-1のノックダウン実験により、MDCKII cellにおいてB^0AT1の頂端膜への移行が阻害されることを確認した。さらに全身諸臓器の中で、少なくとも腎臓の近位尿細管におけては両者が局在していることを示し、生体内においてTctex-1によりB^0AT1の機能が制御されていることが示唆された。本研究により、膜タンパク質であるトランスポーターも、細胞内でモータータンパク質による輸送を受けているという世界で最初の知見を示すこととなった。Hartnup病は、腎近位尿細管及び小腸上皮での中性アミノ酸の吸収が阻害される常染色体劣勢の遺伝性疾患であり、その原因遺伝子としてアミノ酸輸送系B^0の分子実体であるB^0-type amino acidtransporter 1(B^0AT1)が関与することが報告されている(Kleta et al. Nat.Genet. 36(9), 999-1002, 2004 Sep.)。本年度、我々はこのB^0AT1の機能を制御している蛋白質を同定すべく、この輸送体に結合する蛋白質の同定及びその生理的機能の解析を行ってきた。また、B^0AT1のC末端領域には、Tctex-1への結合部位と思われるコンセンサス配列が二つ存在するが、酵母Two-hybrid法によるpoint mutationを用いた解析により、二つ目のコンセンサス配列に結合することが分かった。現在、pull downや免疫沈降法などの生化学的手法を用いてこの結合の確認を行っている。同時に、Tctex-1以外の結合蛋白質を同定するべく、Affinity pull-down MS/MS法にて新たな結合蛋白質の探索を行っている。次年度では、Tctex-1を含めたB^0AT1への結合蛋白質の生理的意義を明らかにし、Hartnup病患者でのこれら結合蛋白質の変異の有無を調べ、病態への関与を調べる予定である。
スペイン植民都市図が示す「都市計画」の近代性に関する研究

主にインディアス古文書館が所蔵するスペイン植民地時代のニュータウン建設時に描かれた都市図の分析から、「都市計画」という概念が未成立の時代に、都市計画に相当する表現行為がどのようなものであったかを整理し、近代初期ヨーロッパの都市計画史研究における新たな知見を得た。論文4編(うち審査付き3編)、学会発表・講演として4件の成果を上げた。また、学術的知見を日本との比較から考察し、スペイン・バジャドリッド大学において招待講演を行い、国際交流にも役立てることができた。今年度実績は、スペイン国立インディアス古文書館の地図・都市図部門が所蔵する植民地時代の史料のうち、都市図等の視覚的資料ならびに都市建設に関わる規範文書や指示書等を選出し、スペイン植民地時代の「都市計画」がどのような行為として捉えられていたかを検討するための関連要素を抽出した。イメージ資料については、スペイン植民地の統治地域区分中メキシコ部門を中心に、都市を描いた史料や都市計画を示す史料を閲覧し選定した。これらの都市図選定作業においては、都市図資料を都市一般図や都市計画図に分類した既往研究の知見も参照しながら、都市の現況を示す都市一般図、都市計画図、都市の立地条件を示すもの、道路や都市施設の位置情報を示す図、都市の作図法を示す図、図の凡例等を示した資料を抽出した。選定した都市図に関しては、都市図の標題、作成年、都市図の大きさ、都市図が示す内容および目的、縮尺、都市図に記載された教会堂や公共施設等の建築物、広場、空地利用、城壁の有無、描画色等についての情報を抽出し、スペイン植民統治期における都市図データとして蓄積した。また都市建設に関わる規範文書および指示書については、土地の区分方法や規模に関する情報を示すものを抽出した。これらの文書からは、農地、放牧地、宅地など土地の種類によっては、一般的な区画規模があったことが読み取れた。宅地に関しては、街区のスケールについて一般的に利用される長さ単位が統一されていく傾向が読み取れたとともに、街区の区画規模について一定の規模を促す傾向が規範の変遷から読み取れた。考察の成果は、以下の査読論文で公表し、2013(平成25)年日本都市計画学会年間優秀論文賞を受賞した。・加嶋章博、「スペイン植民地法に見られる植民初期の都市計画の尺度に関する試論」『都市計画論文集No.48, No.3』、日本都市計画学会、2013年、pp.219-224.今年度実績として、スペイン国立インディアス古文書館の地図・都市図部門メキシコ、ブエノスアイレス各セクションのほか、グアテマラ・セクションにも目を向け、都市を描いたイメージ資料の選定を進めた。これらの資料が伝達する情報を吟味し、スペイン植民地時代に「都市を計画する行為」が具体的にどのような行為として捉えられていたかを考察した。都市図選定作業は、選定基準そのものの妥当性を検討しつつ進め、都市図から得られた描画要素はすべて都市図データとして蓄積している。今年度は、特に市壁の輪郭線の位置を検討した図に着目し、都市の建設場所の選定後、都市の輪郭を決定する作業を示す複数の都市図を比較した。こうしたイメージ資料は、城壁の位置検討プロセスや都市のスケールをどのように決定していたのか、その判断材料を示すものでもある。考察の成果は、以下の査読論文で公表した。・加嶋章博、スペイン植民地時代におけるグアテマラ市都市図の作図に関する一考察、学術講演梗概集2014(建築歴史・意匠)、日本建築学会、2014, pp.127-128.本年度は、スペイン国立インディアス古文書館の地図・都市図部門が所蔵する植民地時代の史料の選定範囲を拡げ、グアテマラ・セクションの都市図等のイメージ資料ならびに付随するテクスト資料の選出を増やし、スペイン植民地時代の「都市計画」行為として認識できる要素の抽出に注力した。特に前年度より、都市図選定基準に「都市計画のプロセスを示すイメージ資料」という項目を加え、都市の形状やスケールの決定要因に注目している。また本年度は、都市建設初期に準備された複数の類似する都市図にも着目し、それぞれ類似する情報であるものの、作成時期により、現地調査を踏まえながら幾何学性や方位との関係から都市形態の修正を行っている点など、計画変更時に意識されている要素を特定した。都市計画の最終形態のみならず、こうした計画プロセスに見られる変化にも着目することで、都市の位置検討やスケールの決定について、どのような要素が「都市計画」において重視されたのかを分析する視点を得た。イメージ資料から抽出された都市の道路・街区のレイアウト、広場の計画手法、施設計画、都市のスケールおよび輪郭決定など描かれた要素を整理し、あわせて、イメージ資料に付随するものや「都市計画」行為を説明するテクスト資料の分析から、都市を計画するうえで非常に合理的な計画思想が窺えるとともに、あわせて、都市がまったくの均質空間に向かわないよう多様性の創出を意図していたとも考えられることがこれらの資料分析を通じて窺えた。城壁建設の時代に都市は拡張していくものであり、計画的に対応する必要性が認識されていた点も説明できる資料が整ってきた。また本年度は、現段階の研究成果に照らし合わせて、スペイン植民地時代の「都市計画」の特徴に関する多くの既往研究が積み上げてきたスペイン植民地時代の都市像と本研究で指摘してきた都市像の共通性と相違性を整理し論稿にまとめ発表した。

論文4編(うち審査付き3編)、学会発表・講演として4件の成果を上げた。また、学術的知見を日本との比較から考察し、スペイン・バジャドリッド大学において招待講演を行い、国際交流にも役立てることができた。数々ニュータウンを建設した16、17世紀のスペイン植民地時代において、都市を計画するにあたってどのような技術や検討作業が必要であったのかを主としてイメージ資料に描かれた要素の分析を中心に考察を進めている。都市図等のイメージ資料は、複数の資料がある場合など特に描画内容の経年変化や計画(作図)の手順、形態決定の拠り所となる決定要因が窺える場合がある。今年度グアテマラ・セクションから選出した都市の計画検討図2枚は、都市の輪郭を検討する異なる内容を示すものであった。こうしたイメージ資料は、どのように都市の形状やスケールを決定しようとしたのかを物語るイメージ資料であるため、都市図選定基準に「都市計画のプロセスを示すイメージ資料」という項目を加えた。都市計画・建築計画今後は、インディアス古文書館の地図・都市図部門を中心として、(1)都市空間や都市そのものがどのように描画されているか、(2)どのような都市施設がどのように配置されているか、(3)道路や街区の構成パターンがどのように計画・表現されているか、(4)都市はどのような縮尺で表現されているか、(5)どのような地理的条件や都市の立地条件が表現されているか、といった特性に加えて、都市の作図をどのように進めたか、という項目を追加し、「都市計画行為」と認識されたその作業内容について分析を進める。インディアス古文書館においては、メキシコ・セクション、ブエノスアイレス・セクション以外においても、イメージ資料の収集、分析、データ化作業を進める。スペイン植民地における数多くのニュータウン建設の計画作業を示すイメージ資料の作図作業を追いながら、都市図を構成する視覚的要素の共通性や、都市計画的行為と見なせる要素の共通性を検討し、「都市計画」の役割がどのように認識されたのか、何に注意を払い、何を表現する行為だと捉えられていたのかを考察する。またイメージ資料にとどまらず、法規範や制度や記録を伝えるテクスト史料も活用する。主要広場と均質なレイアウトパターンに集約されるスペイン植民地の都市イメージの中に、どのような多様な視点が盛り込まれたのかを検討しながら、近代都市計画との連続性や不連続性についても考察する。スペイン植民地において、都市計画がどのような行為として捉えられていたのかを明らかにするために、主たる分析対象として都市計画図等の都市を描いた視覚的資料を整理した。これに加えて、都市建設に関わる規範文書や指示書等に見られるテクストの変遷を追うことで、都市計画的行為の特徴や傾向が読み取れた。イメージとテクストの両方の資料抽出と考察の重要性をより強く認識した。訪問先機関のスケジュールと校務の都合により渡航回数が本年度は減じたため。
基本転写因子によるRNAポリメラーゼIIの構造変換の分子機構の解析

本研究ではRNAポリメラーゼIIの構造変換を制御する因子が、開始から伸長への移行段階でどのように入れ替わり、転写活性を制御しているのか解明することを目指す。実施した一つ目の項目として、ヒト組換え体clamp(rClamp)を用いた結合実験を行っている。我々は以前の解析でTFIIEとTFIIBが転写開始から伸長への移行段階で協調的に機能することを報告している。本解析でrClampとTFIIEの結合はTFIIB存在下でより強く結合しており、転写伸長因子Spt5を添加することにより、rClampとTFIIBの結合が阻害されて、TFIIEがrClampから解離しやすくなることが明らかとなった。さらに実施した2つめの項目として、クライオ電子顕微鏡により転写初期段階のPol IIと基本転写因子からなる複合体の構造が報告されており、CC(closed complex), OC(open complex), ITC(initiation transcription complex)を比較するとTFIIEとPol II clampの結合部位が異なっている。転写初期段階における基本転写因子によるPol IIの構造変換による活性制御機構を調べるため、これらの構造を参考に点変異体を作成した。今後、これらの変異体を用いた転写活性の評価と因子間の結合実験を行い、Pol IIの構造変化に与える基本転写因子の役割を解析する。ヒト組換え体clamp(rClamp)を用いた結合実験によるclampを制御する因子の結合様式の検討については計画通りである。またクライオ電子顕微鏡により転写初期段階のPol IIと基本転写因子からなる複合体の構造を参考にした変異体を作成したが、これらの変異体を用いた転写活性の評価と因子間の結合実験の準備を進めているところであり、実験計画からやや遅れている点である。またTFIIHによるTFIIEのリン酸化が本解析の鍵となると考えているが、リン酸化標的候補のアミノ酸に変異を導入したTFIIE変異体を作成したがin vitroリン酸化アッセイ等によるTFIIEのリン酸化による転写活性への影響の評価が行えておらず、実験計画が遅れている点である。rClampおよびclampを制御する因子の変異体を用いて結合に必要なアミノ酸の同定に関しては、rClamp点変異体およびTFIIE点変異体の大腸菌発現ベクターが作成できたので、タンパク発現と精製を行い、結合実験により相互作用に重要なアミノ酸を同定する。TFIIHによるTFIIEのリン酸化部位の同定に関しては、TFIIEがPol IIから解離する機構の一つとして、我々はTFIIHによるTFIIEのリン酸化が関わると考えている。我々がTFIIHによるTFIIEのリン酸化を調べた結果、いくつかの標的部位の候補が見つかった。そこでそれらのアミノ酸の変異体を作成して、リン酸化部位を同定する。TFIIHによるTFIIEのリン酸化がClamp結合に及ぼす影響と転写活性の評価に関しては、TFIIEのリン酸化がrClampへの結合に与える影響を結合実験により検討する。さらにTFIIHによるTFIIEのリン酸化が転写に与える影響を、in vitro転写アッセイで転写活性を評価する。Immobilized template PIC captureアッセイによる因子の集積の評価に関しては、鋳型DNAの末端にビオチンを結合させ、ストレプトアビジンビーズに結合させて、精製したPol II,基本転写因子または転写伸長因子を添加したimmobilized template PIC captureアッセイを行う。反応系に添加する因子に変異体を用いること、また反応系に因子を添加するタイミングを考慮することで、プロモーターでの因子の集積を評価する。

TFIIHによるTFIIEのリン酸化部位の同定に関しては、TFIIEがPol IIから解離する機構の一つとして、我々はTFIIHによるTFIIEのリン酸化が関わると考えている。我々がTFIIHによるTFIIEのリン酸化を調べた結果、いくつかの標的部位の候補が見つかった。そこでそれらのアミノ酸の変異体を作成して、リン酸化部位を同定する。TFIIHによるTFIIEのリン酸化がClamp結合に及ぼす影響と転写活性の評価に関しては、TFIIEのリン酸化がrClampへの結合に与える影響を結合実験により検討する。さらにTFIIHによるTFIIEのリン酸化が転写に与える影響を、in vitro転写アッセイで転写活性を評価する。Immobilized template PIC captureアッセイによる因子の集積の評価に関しては、鋳型DNAの末端にビオチンを結合させ、ストレプトアビジンビーズに結合させて、精製したPol II,基本転写因子または転写伸長因子を添加したimmobilized template PIC captureアッセイを行う。反応系に添加する因子に変異体を用いること、また反応系に因子を添加するタイミングを考慮することで、プロモーターでの因子の集積を評価する。平成31年2月1日から令和元年9月30日まで産前産後の休暇および育児休業を取得することにより次年度使用額が生じた。研究再開は令和元年10月1日からとなり、研究再開後は計画にしたがって研究を進め、得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。
中高年者の体力とADLに及ぼす身体活動の効果についての研究

わが国の在宅高年者を調査対象として、彼等の日々の生活に占める意図的身体活動(運動・スポーツ活動を含む)が、身体的に自立した生活を送る上で必要な「生活体力」と「日常生活動作能力(ADL)」にどのような影響を及ぼしているかを検討することを目的とした。調査対象者-「調査1」の対象者は、K県ゲートボール協会審判員認定講習会に参加した160名の高年者(男85名;女75名)。「調査2」の対象者は、1993年宮崎市で開催された第10回世界ベテランズ陸上競技選手権大会への日本人参加者126名(男85名;女41名)。「調査3」の対象者は、K市運営の老人デイ・サービスセンター通所の60歳以上の女性住民125名であった。結果-調査1,2,3の主な結果は、以下のようであった。1.身体活動指標としてのゲートボールの実行度指標(実施年数、実施頻度、実施時間)は、生活体力を規定する有意な影響要因とはなり得なかった(調査1)。2.生活体力のレベルが相対的に高い者は、手段的ADLの指標(老研式活動能力指標)の自立度も高いことが実証された(調査1)。3.週2回以上の運動実施者群(A群)と週1回以下の運動実施者群(B群)の単純全身反応時間(真上への方向への全身跳躍;Jumping RT)を比較した結果、A群の成績がB群より有意に優れていた。これらA、Bの2群を更に年齢範囲別に個々に下位3群(44歳以下、45-54歳群、55歳以上)に分けて単純JRTを比較した結果、いずれの年齢群でもA群がB群より優れていた(調査2)。4.虚弱女性老人群の生活体力レベルは、手段的ADL及び簡易知的評価スコアと高い相関関係を示した。また、本調査で用いた高年者用の生活体力テストを標準化した(調査3)。本研究の目的は、地域住民の一定のサンプルを調査対象として、中高年者(40歳以上)の労働状況や運動習慣をはじめとする保健習慣のあり方が、彼らの体力水準とADL(日常生活活動能力)に及ぼす影響性について研究することである。2年継続研究の初年度は、調査対象地区の選定と調査項目の検討ならびに第一次の調査を実施した。主な研究経過は次のようであった。1.一定の地域住民を母集団(1100人)として、10歳区分の年齢構成比を基準にランダムサンプリングを実施した。そして最終的に400名の対象者を抽出した。個別・郵送調査の手法を用いて、第一次の「地域住民保健行動アンケート調査」を実施し回収した。その最終回収率は70%であった。2.次に同地域住民に、「健康体力測定」を実施し、測定予定者200名の60%の検査を終了した。3.60歳以上の住民40名については、運動習慣度と骨の老化度との関連性を検討した。血液検査、骨のレントゲン検査による骨粗鬆症検査、重心計による平衡性の測定を実施した。生活背景との関連分析は、次年度の課題である。次年度は、初年度の調査対象者を継続して調査を実施する。その中で保健行動評価の高い群と低い群に分類し、彼らの体力水準や社会活動指標(ADL、生活関連変数)との対応性を検討する。

本研究では、地域住民の一定のサンプルを調査対象として、中高年者(約500名)の身体活動の実態と保健行動の実態を2年間にわたり継続的に調査した。また同一の対象者群に対して、日常の生活自立に必要な身体的活動能力(生活体力)を測定できる高年者用の機能的体力テスト(5種類の検査項目から成る)を実施した。その結果、以下のようなことが明らかとなった。1) ADL(日常生活動作能力)と体力テストの各項目は、正の対応関係が認められた。即ち、ADL能力のレベルが低下しているほど体力テストの評価値も低レベルにあった。2)各体力テストの評価値は、同じ対象者群に実施した高年者用知的評価尺度の結果と正の高い対応関係にあることが認められた。特に調整力をみる「ジユース缶置き換え作業」や全身の動的バランスと敏捷性をみる「バランス歩行」の体力評価値は、知的レベルと高い相関関係がみとめられた。高年者の日々の身体活動(特に運動習慣度)は、生活体力と明白な対応関係を示さなかった。以上の研究成果を踏まえて、生活体力評価とADL能力を対応させた高年者用の体力テストの標準化が可能となった。本テストの完成により生活自立能力の評価の客観化が一歩、前進した。
建築物の最適耐震構造計画への人工知能の応用に関する研究

本研究では、地震活動性,建築物の地震時応答及びその崩壊性状等の構造計画上の知見だけではなく、建築計画,設備計画に関する評価も踏まえた、建築物としての機能を考慮した最適耐震構造計画手法に人工知能的手法を適用し、より人間的な判断機構とマンマシンインタ-フェ-スを備えたシステムを構築することを試みた。まず、初年度には、最適耐震構造計画エキスパ-トシステムのプロトタイプを構築した。このシステムは、数値計算を行う部分(応答解析)と推論を行う部分の2つのシステムからなり、推論部分は、知識ベ-ス部分と推論エンジン部分で構成されている。知識ベ-スの構築は、人間の主観性を考慮するために、ファジィ集合理論と言語表現を用いて行った。ここでは、1つの設計変数に対して最適化を行うことができる。また、対象構造物は中低層鉄筋コンクリ-ト構造物とした。次年度では、プロトタイプシステムを基に、複数の設計変数に対して最適化が行える様にシステムを拡張し、さらに数値計算を行うシステムを推論システムと結合し、一貫システムを構築した。また、構造工学の分野では、連続的な物理量を取り扱うことも多いため、ファジィ集合理論の帰属度関数を用いた、画像表現型最適耐震構造計画システムの構築も併せて行った。さらに、ユ-ザ-の主観性が大きく影響すると考えられる階層構造モデルについても、予備的アンケ-ト調査を行い、構造技術者の主観性及び階層構造モデルの設定に関する検討を行った。最終年度では、画像表現型のシステムに関して、ユ-ザ-インタ-フェ-スの改善として、階層構造モデル,建物情報入力システムを附加した。さらに、同手法を中低層鉄骨建物に適用したシステムの構築を行った。以上により、最適耐震構造計画を支援するエキスパ-トシステムの構築に関して、知識ベ-スの作成,主観性評価手法,システム構築手法等の基本的知見や方法論を得ることができた。本年度は、人工知能を応用した建築構造物の最適耐震計画を行うためのエキスパートシステムのプロトタイムの構築を行った。まず、最適化を行うための階層モデルの設定を行い、これを用いてシステムの構築を行った。システムは、数値計算を行う部分(C、BASICを用いて構築)と推論を行う部分(PROLOGを用いて構築)からなり、32ビットマイクロコンピュータ上で作動する。対称としては、一般的な中低層鉄筋コンクリート建物を設定し、構造要素として、耐震壁、長柱を考慮した。本システムでは、与えられた構造物について、ユーザーにより設定された環境パラメータの基で、まず1設計変数についての最適化を行う事が可能であり、複数の設計変数についても最適化が行える様システムの拡張を行った。本システムの推論部分は、知識ベース部分と推論・最適化を行う推論エンジン部分で構成され、前者はフレーム形式で、後者はプロダクションルールを用いて表現されている。なお、知識ベースの作成については、人間の主観性を考慮する為に、ファジィ集合理論と言語表現を用いて行い、これにより、種々のあいまい性を考慮する事が可能となっている。さらに、最適化推論もこの言語表現を用いて行っている。なお、最適化に必要となる建築構造物の応答性状については、先に述べた数値計算を行う部分で別途計算しておくものとし、その結果のみを推論部分へ受けわたしている。次年度以降で、数値計算部分と推論部分との結合を考え、より一般的なシステムの構築をめざす。本年度構築したシステムにより、最適耐震構造計画を行うエキスパートシステムの作成に関する知識ベース、推論エンジン構築に関する基本的知識や方法論が得られた。本年度は、昨年度構築した鉄筋コンクリ-ト構造物に対するプロトタイプエキスパ-トシステムを基に、そのシステムの拡張を行なった。

すなわち、昨年度構築した言語変数を用いたシステムについては、最適化を行なう際の設計変数に関して、昨年度は1変数であったものを多変数の場合に適用できるシステムに拡張し、また、最適化に必要となる構造物の応答性状についても、別途計算していたものを、一貫システムとして行なえるように拡張した。システム構築言語としては、構造物の応答性状についてはBASICを、推論システムは述語論理型のPROLOGを、一部の画像表現にCを用いて構築した。これらのシステムは、32ビットマイクロコンピュ-タ上で一貫システムとして実行される。アプリケ-ションとして、本年度も中低層鉄筋コンクリ-ト構造物に対して、耐震壁、長柱、短柱の構造要素を考慮したシステムを構築した。ここでは、与えられた構造物について、ユ-ザ-が任意に設定する環境パラメ-タの基で、複数の設計変数に対する耐震構造計画の最適化を行う事が可能である。このシステムでは、言語表現を用いて最適化を行っているが、構造工学の分野では、連続的な物理量を扱う事も多い。そこで、本年度で、ファジイ集合理論の帰属度関数を用いた。画像表現型最適耐震構造計画システムの構築もあわせて行なった。これにより、両システムの長所・短所を考慮して、目的に応じて最適なシステムを用いることが可能となる。また、ユ-ザ-の主観性が大きく影響をおよぼすと考えられる階層構造モデルについても、予備調査として若干のアンケ-ト調査を行い、構造技術者の主観性を考察するとともに、階層構造モデルの設定に関する検討もあわせて行なった。以上、本年度では、多目的最適耐震構造計画エキスパ-トシステムの構築に関して、種々の基本的知識や方法論を得ることができた。本年度は、最終年度として、まず、昨年度までに作成したシステムのユ-ザ-インタ-フェ-スの改善を行った。昨年度までの画像表現型システムでは、対象とする問題に対する階層構造モデルを前もってシステムに与えておく必要があり、問題対象が変化するとシステムプログラムを修正する必要があった。そこで、システムに階層構造モデル入力システムを附加することにより、任意の階層構造モデルに対してシステムを実行する事が可能となった。さらに、昨年度までは、中低層鉄筋コンクリ-ト建物に対してシステムを構築していたが、本年度は、同様のシステムを中低層鉄骨建物に対して構築した。このため、まず、極限地震応答解析に必要となる解析式の立式及びシステムの構築を行った。さらに、構造種別が複数となったため、建物情報入力システムとして、建物の平画計画・立面計面,構造低抗要素の断面,配置等の概要を対語的に入力できるシステムも附加した。これにより、鉄筋コンクリ-ト,鉄骨建物に対して柔軟にシステムを適用する事が可能となる。また、言語表現型のシステムについても、画像表現型システムと同様に、任意の階層構造モデルに対して最適耐震構造計画が実行できるよう、エキスパ-トシステム構築ツ-ルの開発を行った。本研究では、人工知能的手法を応用して、言語表現型,画像表現型の2つの最適耐震構造計画支援システムの構築を試みた。
宇宙論的な２１ｃｍ線放射の将来観測によるニュートリノ質量とその階層構造への制限

ニュートリノは質量を持つ素粒子であるということが確認されているが、現在のニュートリノ振動実験の結果からは、3世代あるニュートリノの質量がどのような大きさの順になっているのか(質量階層構造と呼ばれる)ということは判明していない。このニュートリノの質量階層構造を決定することは、現在の素粒子の標準模型を越えた新しい物理理論を構築する上で必要不可欠な情報である。このようなニュートリノの性質を探る手法として、ニュートリノが宇宙の密度ゆらぎに与える影響を測定するという、宇宙観測を利用する方法が存在している。以上の背景の元で私の行っている研究は、宇宙が再電離する時期に中性水素原子が放射する21cm線放射の観測を利用して、宇宙の密度ゆらぎを測定することにより、ニュートリノの質量階層構造がどの程度の精度で決定できるのかについて定量的に評価することである。本研究では前述した目的を達成するため、平成26年度に以下の研究を行った。1.1年目で開発した将来の21cm線観測実験がニュートリノ質量階層構造に対して持つ観測の精度を評価する統計的手法(フィッシャー解析)の計算コードを利用し、21cm線観測と宇宙マイクロ波背景放射(CMB)という2つの異なる観測を組み合わせた場合に、ニュートリノ質量和及び質量階層構造がどの程度制限可能かについて評価を行った。結果として、SKAの様な将来の21cm線観測とCMBの観測の組み合わせによって、ニュートリノの質量階層構造を決定できる可能性があるということが判明した。26年度が最終年度であるため、記入しない。以上の背景の元で私の行っている研究は、宇宙が再電離する時期に中性水素原子が放射する21cm線放射の観測を利用して,宇宙の密度ゆらぎを測定することにより、ニュートリノの質量階層構造がどの程度の精度で決定できるのかについて定量的に評価することである。本研究では前述した目的を達成するため、平成25年度に以下の研究を行った。1.将来の21cm線観測実験がニュートリノ質量階層構造に対して持つ観測の精度を評価する統計的手法(フィッシャー解析)の開発。2, 21cm線観測と宇宙マイクロ波背景放射(CMB)という2つの異なる観測を組み合わせた解析方法の開発。この際、ニュートリノ質量に対する感度を増大させることのできるCMBの重力レンズ効果まで含めた解析手法の開発を行った。3.より現実的な非一様な再電離まで考慮した21cm線のパワースペクトルの構築と、この場合に適用できるフィッシャー解析の計算コードの開発。当初1年目で計画していた内容に加え、2年日に予定していた。非一様な再電離まで考慮した21cm線のパワースペクトルを含んだ解析手法の開発まで達成したため。2年目は以上を踏まえ、1年目で開発した計算コードを利用し、21cm線観測計画と高精度CMB偏光観測の組み合わせによって、ニュートリノ質量和及び質量階層構造がどの程度制限可能かについて評価を行い、最終的に論文として学術雑誌に投稿することを計画している。
ボツリヌス毒素複合体構成成分の無毒タンパク質を用いた経口的薬物送達システムの開発

ボツリヌス菌の産生する神経毒素は、AGの7種の血清型に分類され、種々の無毒タンパク質成分(NTNHA、HAs)と会合した毒素複合体(TC)として存在している。NTNHAは、神経毒素をプロテアーゼの分解から保護する。このNTNHAを経口的に摂取が困難なペプチド・タンパク質製剤を体内へ経口的に送達させる輸送容器として応用可能ではないかと考えられる。本研究では、D型NTNHAを新規ペプチド・タンパク質製剤輸送容器として応用するために、NTNHAのX線結晶構造解析、NTNHA-神経毒素間相互作用領域解析ならびに細胞毒性試験を行った。NTNHAの結晶化をハンギングドロップ蒸気拡散法で行った結果、0.2×0.1×0.1cmの結晶が析出した。さらに回折実験を行い、最高分解能3.9Å、P321あるいはP3121/P3221に属し、格子定数はa=b=147.85Å、c=229.74Åと測定された。神経毒素とNTNHAの相互作用領域を解析するためにC型、他のD型菌株の産生する神経毒素とNTNHAの再構成試験を行った。全ての神経毒素はD型NTNHAと複合体を形成した。それぞれの解離定数を求めた結果、C型神経毒素が最も強い値を示した。神経毒素のアミノ酸配列を比較したところC型神経毒素のC末端側配列の相同性が高い神経毒素が強い相互作用を示したことから神経毒素とNTNHAの結合は神経毒素のC末端側の関与が考えられた。NTNHAの小腸上皮細胞に対する細胞毒性を培養液中のラクテイトデヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定した。その結果、NTNHAを添加した細胞の培養液中のLDH量は何も添加していない細胞培養液のLDH量と同等の値を示した。このことから、NTNHAは細胞毒性を示さないことが明らかとなった。これらの結果は、新規薬物送達システムを確立する上で重要な知見であると考えられる。本年度は、研究対象としているボツリヌス毒素複合体構成成分のNTNHAの結晶化に成功し、その構造解析に取り組むことができた。また、NTNHAに他の血清型の神経毒素が結合するとが明らかとなり、さらに神経毒素-NTNHA間の相互作用には神経毒素のC末端側が関与していることが考えられた。しかしながら、NTNHAにシクロデキストリン等の包接化合物を結合させた複合体等の作製にはいたっておらず、このような複合体の作製が、今後の課題である。今後、NTNHAの構造解析、ならびに神経毒素-NTNHA間相互作用領域を明らかにする。NTNHAの構造、神経毒素-NTNHA間相互作用領域が明らかとなれば、神経毒素とNTNHAの結合に関与する配列が明らかとなる。その配列をペプチド合成しNTNHAと相互作用するかを調べ、相互作用したペプチド配列をタグとして応用し、有用なペプチド・タンパク質製剤に融合あるいは化学結合させ、NTNHA/ペプチド・タンパク質製剤複合体の作製を目指す。作製した新規複合体タンパク質製剤のマウス経口投与試験等を行い、その有用性を試験することで、将来、ボツリヌス無毒タンパク質成分を応用した新しいタンパク質薬物送達システムを確立することが出来ると考えられる。ボツリヌス神経毒素(BoNT)は、種々の無毒タンパク質と会合した複合体型毒素として存在している。BoNTに直接結合している非毒非血球凝集素(NTNHA)は、BoNTを消化器官に存在するプロテアーゼの分解から保護する。この特異な機能を持つNTNHAを、経口的接種が極めて困難なタンパク質・ペプチド製剤を体内へと輸送するキャリアタンパク質として応用可能ではないかと考え研究を進めている。本年度は、経口的薬物送達システムの開発に向けて、組換えNTNHA(rNTNHA)の結晶化条件のスクリーニングおよびX線回折強度測定およびBoNTの重鎖C末端ドメインの発現および精製、rNTNHAへの再構成試験を実施した。rNTNHAは自発的にN末端側の特異的部位に切れ目が生じるので、完全に切れ目が生じたrNTNHAを結晶化標品とした。結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法で実施した結果、タンパク質濃度55mg/ml、温度20°C、リザーバー溶液(塩;0.2M Ammonium Sulfate、緩衝液;0.1M Sodium Acetate trihydrate (pH 4.6)、沈殿剤;30% w/v Glycol Monomethyl Ether 2000)の条件で大きさ0.2×0.1×0.1cmの形のととのった単結晶を得ることができた。この結晶のX線回折強度測定を行った結果、最高分解能3.9Aが得られた。BoNTで毒性を示さないC末端側の重鎖(Heavy chain; Hc)ドメインのNおよびC末端側ドメイン(それぞれ、HcNおよびHcC)を組換え発現させ、それらとNTNHAの相互作用を水晶発振子マイクロバランス法(QCM)およびゲルろ過法により調べた。その結果HcCドメインが最も強い相互作用を示していた。このことからBoNTのC末端側ドメインが、NTNHAとの結合に関与していることが明らかとなった。

このNTNHAを経口的に摂取が困難なペプチド・タンパク質製剤を体内へ経口的に送達させる輸送容器として応用可能ではないかと考えられる。本研究では、D型NTNHAを新規ペプチド・タンパク質製剤輸送容器として応用するために、NTNHAのX線結晶構造解析、NTNHA-神経毒素間相互作用領域解析ならびに細胞毒性試験を行った。NTNHAの結晶化をハンギングドロップ蒸気拡散法で行った結果、0.2×0.1×0.1cmの結晶が析出した。さらに回折実験を行い、最高分解能3.9Å、P321あるいはP3121/P3221に属し、格子定数はa=b=147.85Å、c=229.74Åと測定された。神経毒素とNTNHAの相互作用領域を解析するためにC型、他のD型菌株の産生する神経毒素とNTNHAの再構成試験を行った。全ての神経毒素はD型NTNHAと複合体を形成した。それぞれの解離定数を求めた結果、C型神経毒素が最も強い値を示した。神経毒素のアミノ酸配列を比較したところC型神経毒素のC末端側配列の相同性が高い神経毒素が強い相互作用を示したことから神経毒素とNTNHAの結合は神経毒素のC末端側の関与が考えられた。NTNHAの小腸上皮細胞に対する細胞毒性を培養液中のラクテイトデヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定した。その結果、NTNHAを添加した細胞の培養液中のLDH量は何も添加していない細胞培養液のLDH量と同等の値を示した。このことから、NTNHAは細胞毒性を示さないことが明らかとなった。これらの結果は、新規薬物送達システムを確立する上で重要な知見であると考えられる。本年度は、研究対象としているボツリヌス毒素複合体構成成分のNTNHAの結晶化に成功し、その構造解析に取り組むことができた。また、NTNHAに他の血清型の神経毒素が結合するとが明らかとなり、さらに神経毒素-NTNHA間の相互作用には神経毒素のC末端側が関与していることが考えられた。しかしながら、NTNHAにシクロデキストリン等の包接化合物を結合させた複合体等の作製にはいたっておらず、このような複合体の作製が、今後の課題である。今後、NTNHAの構造解析、ならびに神経毒素-NTNHA間相互作用領域を明らかにする。NTNHAの構造、神経毒素-NTNHA間相互作用領域が明らかとなれば、神経毒素とNTNHAの結合に関与する配列が明らかとなる。その配列をペプチド合成しNTNHAと相互作用するかを調べ、相互作用したペプチド配列をタグとして応用し、有用なペプチド・タンパク質製剤に融合あるいは化学結合させ、NTNHA/ペプチド・タンパク質製剤複合体の作製を目指す。作製した新規複合体タンパク質製剤のマウス経口投与試験等を行い、その有用性を試験することで、将来、ボツリヌス無毒タンパク質成分を応用した新しいタンパク質薬物送達システムを確立することが出来ると考えられる。
翻訳後修飾シグネチャによる革新的肺がん分子病態診断法の開発

網羅的タンパク質発現解析と術後再発期間を含む詳細な臨床情報を基盤としたバイオインフォマティクス解析の結果、肺癌術後再発期間の診断に関して有用性が極めて高い4種類のタンパクを見出すと共に、当該分子を対象とする精密定量解析系を構築した。これらの解析を駆使することにより、肺癌手術摘出組織検体を用いた当該分子の発現解析を行った。その結果に基づいて、術後5年以内に再発が確認された肺癌症例群と5年以上の術後観察期間中に再発もしくは原病による死亡が認められなかった肺癌症例群の判別を可能とする術後再発期間の精密予測法構築を完了した。本研究課題では、最新のプロテオミクス技術を応用し、肺癌組織中の翻訳後修飾タンパク質発現情報を網羅的に解析し、詳細な臨床情報とともに、バイオインフォマティクス技術を最大限に活用する事によって、病態と深く関連する翻訳後修飾タンパク質群を抽出を目指している。本年度は、最新の網羅的且つ定量的なプロテオミクス解析手法を用いて肺組織中に存在する翻訳後修飾タンパク質発現情報の網羅的集積を進めた。酵素消化後の非放射性安定同位体ペプチド標識技術と質量分析装置を組み合わせ、多次元液体クロマトグラフィーを駆使した徹底的な分画化を併用し、150検体を超える肺がん組織に加えて、90検体の正常肺組織試料を対象として、タンパク質発現の網羅的比較定量解析を推進、肺組織中に存在する翻訳後修飾ペプチド情報の全体像把握を目指した。当該解析の結果から、全ての試料について1検体あたり3,000種類以上のタンパク質が検出されることが確認された。総数250検体を超える肺組織試料からは、10、000種類以上のタンパク質が同定されるとともに、300、000種類以上のペプチドが同定された。これらのペプチドの中で、翻訳語修飾を受けたペプチドに関しては30、000種類以上検出されることが明らかとなっている。以上の検討から取得された発現情報に基づいて、詳細な臨床情報を活用したバイオインフォマティクス解析を進めた結果、肺癌手術後の予後との関連性が示唆されるタンパク質群を500種類以上同定することに成功している。今後は、これらのタンパク質の翻訳語修飾に着目した解析技術の開発を進める計画である。本研究は、最新のプロテオミクス技術とバイオインフォマティクス技術を最大限に活用して、タンパク質活性制御の根幹をなす翻訳後修飾の精密定量法開発を推進し、極めて予後不良な肺がん症例の飛躍的な生存率向上の実現に貢献する翻訳後修飾シグネチャの同定を目指し、既存の検査法とは全く異なる次世代型高精度分子診断法の確立を目指している。前年度までに、肺癌手術摘出組織173検体を対象として、タンパク質標識技術と質量分析装置を応用して行った網羅的かつ定量的なタンパク質発現解析結果と、術後再発期間を含む詳細な臨床情報を基盤として、バイオインフォマティクス解析を進めた結果、肺癌の術後再発期間と関連性を認める500種類以上のタンパク質を同定している。本年度は、これらの肺癌術後予後関連タンパク質を対象として、非標識のタンパク質精密定量解析系(MRM: multiple reaction monitoring)の構築を進めた。この過程では、個々のタンパク質に特有の解析メソッドの設定が、精密な定量を遂行するために極めて重要であるが、我々は、取得したタンパク質発現プロファイルをデータベース化し、保存情報を活用することにより、これらの標的タンパク質に対する解析メソッドの設定を全て完了した。さらに、設定したメソッドを応用した新たな解析法を用いて、肺癌術後再発期間との関連性が極めて高い30タンパク質を対象とした予備解析を遂行した結果、取得されたタンパク質発現情報と術後再発期間との関連性が認められることを確認している。次年度は、統計学的に診断精度の有用性評価を行うのに十分な検体数を用いて、精密定量解析を継続的に推進する計画である。前年度までに、肺癌手術摘出組織173検体を対象として、タンパク質標識技術と質量分析装置を応用して行った網羅的かつ定量的なタンパク質発現解析結果と、術後再発期間を含む詳細な臨床情報を基盤として、バイオインフォマティクス解析を進めていた。本年度はバイオインフォマティクス手法の検討をされらに進める事により、肺癌の術後再発期間と有意な関連性が認められるタンパク質を800種類以上同定するに至った。これらの肺癌術後予後関連タンパク質の中でも、有意性が極めて高い4種類のタンパクを対象として、非標識のタンパク質精密定量解析系(MRM: multiple reaction monitoring)の構築を進めた。この過程は、個々のタンパク質に特有の解析メソッドの設定が、精密な定量を遂行するために極めて重要であるが、我々は、取得したタンパク質発現プロファイルをデータベース化し、保存情報を活用することにより、これらの標的タンパク質に対する解析メソッドの設定を全て完了した。さらに、設定したメソッドを応用した新たな解析法を用いて、肺癌術後再発期間の精密予測法の確立を目指して、予備的解析を遂行した結果、取得されたタンパク質発現情報を用いて、術後再発期間の予測が可能である事を示唆する結果を得ている。