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自衛隊の災害派遣の史的考察-戦後政治における「国防」と「防災」の交差-

本年度の研究成果は3つある。第一に、自衛隊草創期の一次資料の入手である。国立公文書館等の公文書館所蔵の一次資料の収集に努めてきたが、新たに初期の第一管区隊史を発見・入手した。これは第一管区隊全般の活動を記述した内部資料であり、災害派遣の内容や位置づけを検証する上で、重要な資料である。この資料を足掛かりにして、防衛省に対してはさらなる情報公開開示請求も行った。第二に、英連邦占領軍による災害派遣活動の研究である。本研究は、自衛隊の災害派遣における「在日米軍との関係」も考察範囲に含めている。そこで、従来、占領下のアメリカ軍の災害派遣活動の検証を進めてきたが、その過程で英連邦軍の役割も極めて大きかったことが分かったのである。本年度は英連邦軍が進駐していた広島県呉市を調査し、先行研究を入手した。第三に、研究成果の発表である。「自衛隊と憲法改正問題」を佐藤史郎・川名普史・齋藤孝祐編『日本外交の論点』(法律文化社、2018年4月)に発表した。本稿は冷戦終結後に機能を大きく変容させてきた自衛隊の概要を明らかにするものであり、国防組織や憲法論議の中での災害派遣の位置づけを明らかにしていく上で、重要な研究成果となった。また、大阪大学と防衛研究所が主催した「国際安全保障フォーラム・イン・関西」(2109年3月)のセッション1「災害救援における国防当局の役割」において、研究報告を行った(「自衛隊の災害派遣の来歴」)。安全保障研究者や参加者から、本研究を進める上で非常に有意義な質問やアドバイスを多数得ることができた。3年目の平成30年度は、新たな資料を発見し、研究報告を行うこともできた。一方、国立公文書館やアメリカ国立公文書館での資料収集やインタビューは、計画通りには進まなかった。令和元年度は、まず作年度に充分ではなかったインタビューと資料収集に力を入れたい。そして、計画通り、「中央レベル」、「地方レベル」、「日米関係レベル」の三層において立体的に進行してきた「国防」と「防災」の交差を分析し、自衛隊の災害派遣を生み出した史的構造を明らかにしたい。その研究成果をいくつかの学会にて報告し、また、出版に向けた準備も進めたいと考えている。平成28年度の研究実績としては、第一に、2つの論文を投稿したことがあげられる。まず、〝The GSDF and Disaster Relief Dispatches"をRobert D. Eldridge and Paul Midford eds., The Japanese Ground Self-Defense Force: Search for Legitimacy(Palgrave Macmillan,2017)に掲載した。また、「自衛隊の災害救援活動」を片山裕編『防災をめぐる国際協力の在り方』(ミネルヴァ書房、2017年刊行予定)にも投稿した。前者においては、警察予備隊創設から東日本大震災までの自衛隊の災害派遣全般を通史的に概説した。そこでは、冷戦期の災害派遣活動は基盤的防衛力の一環として構築されたが故に機動性に欠ける面があったが、冷戦後の災害派遣活動は動的な防衛力構想の影響を強く受け、機動力に富むようになってきていることを明らかにした。後者においては、自衛隊の災害派遣活動と在日米軍との関係を通史的に概説した。そこでは、冷戦期においてすでに在日米軍の構想の中に、東日本大震災における「トモダチ作戦」の萌芽がみられたことを明らかにした。第二に、先行研究および一次資料(警察予備隊総隊普通科学校史など)の収集を行った。これらの2つの実績を通じ、次年度以降に実施する資料収集およびインタビューの準備作業を円滑にすすめることができた。特に英語論文の発表の機会を得たことの意味は大きい。それにより研究上のネットワークを拡大することができ、在日米軍に関する資料調査とインタビューを本格的に実施する体制を整えることができたからである。初年度の平成28年度は、2年目以降に予定していた論文作成(うち1つは平成29年度に出版予定)を達成することができた。この点で予定以上の進捗がみられる。一方、国立公文書館での資料収集やインタビューは、研究代表者の健康上の理由(手術入院)等によって実現することができなかった。この点で、初年度に予定していた作業がすべて実現できたわけではなかったが、先述のとおり、通史的な論考を先行して完成させることによって、来年度に繰り越した資料収集やインタビューをより円滑に進めることを期待できる状況にある。平成29年度の研究実績としては、第一に、2つの論考を発表したことがあげられる。まず、「自衛隊と憲法改正問題」を佐藤史郎・川名普史・齋藤孝祐編『日本外交の論点』(法律文化社、2018年4月出版予定)に投稿した。本稿は憲法九条と日米安保条約の枠組みを堅持しつつ、冷戦終結後に機能を大きく変容させてきた自衛隊(「存在する自衛隊」から「機能する自衛隊」へ)にとって、憲法九条改正が持つ意味を考察した。加えて、昨年度末に脱稿した「自衛隊の災害救援活動」も片山裕編『防災をめぐる国際協力のあり方』(ミネルヴァ書房、2018年)の一部として出版された。第二に、先行研究や一次資料の収集を継続した。特に占領期から戦後初期にかけての米軍による災害派遣活動(福井地震や新潟地震)に関する貴重な資料を入手したことが大きな成果であった。

第三に、研究成果の一部を「大規模災害と日米同盟」として、九州大学主催のワークショップ『日本の安全保障環境』(2018年2月19日)にて報告した(安全保障の専門家や外務省、防衛省担当者も報告)。本報告では国内の災害対応に果たしてきた自衛隊と米軍の役割を歴史的に考察した。また、陸上自衛隊の災害派遣活動の伝統が国際平和協力活動にどのように生かされているのかを考察し、その成果の一部を「再考・カンボジアPKO」として、関西アジア太平洋安全保障フォーラム(駐大阪・神戸米国総領事館と自衛隊兵庫県地方協力本部が後援。総領事館や自衛隊関係者等が出席)にて報告した。本報告では、安保法制をカンボジアPKOの事例に適用したシミュレーションを行い、その課題や問題点を考察した。2年目の平成29年度は、予定していた論文作成や研究会報告が達成できた。一方、国立公文書館での資料収集やインタビューは、研究代表者の健康上の理由(再度の手術)や本務校の異動等の理由により、計画通りには進まなかった。本年度の研究成果は3つある。第一に、自衛隊草創期の一次資料の入手である。国立公文書館等の公文書館所蔵の一次資料の収集に努めてきたが、新たに初期の第一管区隊史を発見・入手した。これは第一管区隊全般の活動を記述した内部資料であり、災害派遣の内容や位置づけを検証する上で、重要な資料である。この資料を足掛かりにして、防衛省に対してはさらなる情報公開開示請求も行った。第二に、英連邦占領軍による災害派遣活動の研究である。本研究は、自衛隊の災害派遣における「在日米軍との関係」も考察範囲に含めている。そこで、従来、占領下のアメリカ軍の災害派遣活動の検証を進めてきたが、その過程で英連邦軍の役割も極めて大きかったことが分かったのである。本年度は英連邦軍が進駐していた広島県呉市を調査し、先行研究を入手した。第三に、研究成果の発表である。「自衛隊と憲法改正問題」を佐藤史郎・川名普史・齋藤孝祐編『日本外交の論点』(法律文化社、2018年4月)に発表した。本稿は冷戦終結後に機能を大きく変容させてきた自衛隊の概要を明らかにするものであり、国防組織や憲法論議の中での災害派遣の位置づけを明らかにしていく上で、重要な研究成果となった。また、大阪大学と防衛研究所が主催した「国際安全保障フォーラム・イン・関西」(2109年3月)のセッション1「災害救援における国防当局の役割」において、研究報告を行った(「自衛隊の災害派遣の来歴」)。安全保障研究者や参加者から、本研究を進める上で非常に有意義な質問やアドバイスを多数得ることができた。3年目の平成30年度は、新たな資料を発見し、研究報告を行うこともできた。一方、国立公文書館やアメリカ国立公文書館での資料収集やインタビューは、計画通りには進まなかった。平成29年度は、平成28年度に充分ではなかったインタビューと資料収集に力を入れたい。
線虫C.elegans陰門形態形成運動制御の分子機構の解明

細胞の再配列と移動は形態形成における基本的な現象である。線虫Caenorhabditis.elegans(C.elegans)の産卵孔である陰門は表皮の再配置による管状構造形成のモデルとして有用である。陰門形成における陰門前駆細胞の細胞運命決定機構が極めて詳細に解析されているのに対して、陰門形態形成運動の分子機構に関しては、これまで全く調べられていない。私たちはC.elegansのプレキシン(plx-1)変異体を作成し、C.elegansではプレキシンが表皮細胞の配列・移動を制御する重要な因子であることを明らかにしてきた。本研究ではC.elegans陰門形成におけるセマフォリン/プレキシンの役割を明らかにした。幼虫腹側正中部に前後方向に一列に並んだ6個の表皮細胞であるVPCは、形成直後には互いに孤立しているが、やがて前後方向へ伸張して相互に接触する。野生型では一旦VPC同士が接触すると前後方向の伸張は停止するが、膜貫通型セマフォリンSMP-1変異体およびプレキシンPLX-1変異体では、VPCは相互接触後も伸張を続け、左右にオーバーラップするようになる。smp-1,plx-1遺伝子はいずれも全VPCにおいて発現しているが周囲の細胞には発現が無く、さらに、それぞれの変異体で、各cDNAをVPC特異的に発現させるとオーバーラップ表現型が救済されることから、両分子のVPCでの発現が適切な配列形成に必要十分と考えられる。おそらく、隣接するVPC上のセマフォリンを受容したプレキシンから細胞内へ一種の反撥シグナルが伝えらることによってVPCの伸長が停止する、と予想される。smp-1,plx-1変異体では陰門細胞の配列は常に異常であり、成虫はMultivulvae様の構造を形成することもある。しかし、上記のcDNA発現によってVPCでの配列異常が救済された変異体では、その後の発生における陰門細胞の配列がほぼ正常であったことから、smp-1,plx-1両遺伝子は陰門後期発生には大きな役割を持たないことが示唆された。また、VPCの配列異常によって、少数の変異体ではVPCの運命決定に異常が認められた。線虫C.elegansの産卵孔である陰門は表皮の再配置による管状構造形成のモデルとして有用である。私たちはC.elegansのプレキシン(Plx-1)変異体を作成し、C.elegansではPLX-1が表皮細胞の配列・移動を制御する重要な因子であること、また、PLX-1のリガンドが膜貫通型セマフォリンSMP-1(Ce-sema-1a),SMP-2(Ce-sema-1b)であることを明らかにしてきた。本研究では陰門形態形成運動制御の分子機構解明を目的として、1)陰門形成におけるセマフォリン/プレキシンの役割、2)陰門形態形成の制御に関与する因子の高効率RNAiによる検索、という2項目からなる研究を実施する。本年度は以下の成果を得た。1)陰門原基細胞形態の可視化のため、形態マーカーとしてadherens junctionマーカーであるajm-1::gfpを染色体に組み込んだ系統を作成した。また、ced-10::gfp

形質転換体を共焦点顕微鏡と3次元画像解析ソフトを組み合わせて、陰門原基細胞全体の形態を可視化することができた。2)以上のマーカーを用いて、plx-1変異体およびsmp-1変異体陰門原基細胞では、表層近くだけでなく3次元的にも配列が乱れていることを明らかにした。一方、膜貫通型セマフォリンsmp-2(Ce-Sema-1b)変異体では陰門原基細胞の形成過程の配列異常は見られなかった。3)セマフォリンシグナルがプレキシンにいつ・どこで受容されるのかを調べるため、smp-1,smp-2遺伝子を単離し、ほぼ遺伝子全長をふくむgfp translational fusionを作成した。smp-1::gfpはplx-1::gfpと同様に、陰門発生の全段階で原基細胞にGFP発現が見られたが、smp-2::gfpは陰門発生後期に一部の細胞で発現が見られただけだった。細胞の再配列と移動は形態形成における基本的な現象である。線虫Caenorhabditis.elegans(C.elegans)の産卵孔である陰門は表皮の再配置による管状構造形成のモデルとして有用である。陰門形成における陰門前駆細胞の細胞運命決定機構が極めて詳細に解析されているのに対して、陰門形態形成運動の分子機構に関しては、これまで全く調べられていない。私たちはC.elegansのプレキシン(plx-1)変異体を作成し、C.elegansではプレキシンが表皮細胞の配列・移動を制御する重要な因子であることを明らかにしてきた。本研究ではC.elegans陰門形成におけるセマフォリン/プレキシンの役割を明らかにした。幼虫腹側正中部に前後方向に一列に並んだ6個の表皮細胞であるVPCは、形成直後には互いに孤立しているが、やがて前後方向へ伸張して相互に接触する。野生型では一旦VPC同士が接触すると前後方向の伸張は停止するが、膜貫通型セマフォリンSMP-1変異体およびプレキシンPLX-1変異体では、VPCは相互接触後も伸張を続け、左右にオーバーラップするようになる。smp-1,plx-1遺伝子はいずれも全VPCにおいて発現しているが周囲の細胞には発現が無く、さらに、それぞれの変異体で、各cDNAをVPC特異的に発現させるとオーバーラップ表現型が救済されることから、両分子のVPCでの発現が適切な配列形成に必要十分と考えられる。おそらく、隣接するVPC上のセマフォリンを受容したプレキシンから細胞内へ一種の反撥シグナルが伝えらることによってVPCの伸長が停止する、と予想される。smp-1,plx-1変異体では陰門細胞の配列は常に異常であり、成虫はMultivulvae様の構造を形成することもある。しかし、上記のcDNA発現によってVPCでの配列異常が救済された変異体では、その後の発生における陰門細胞の配列がほぼ正常であったことから、smp-1,plx-1両遺伝子は陰門後期発生には大きな役割を持たないことが示唆された。また、VPCの配列異常によって、少数の変異体ではVPCの運命決定に異常が認められた。
対称行列空間における線形最適化問題に対する効率的な解法アルゴリズムに関する研究

対称行列空間における線形計画問題に対する内点法、特にアフィンスケーリング法の研究が主なテーマであったが、本研究ではこの方法がうまく働かないことを示すことができた。対称行列空間における線形計画問題は、凸計画問題の一種であり、さまざまな工学的応用があることと、線形計画問題に対する内点法が自然に拡張できることから、近年注目を浴びて活発に研究されている。特に主双対内点法とよばれる方法がよく研究され、一定条件下での多項式時間による収束が証明されると共に、現実の問題を解けるようになってきている。一方アフィンスケーリング法はもっとも基本的な内点法の一種であるが、対称行列空間への拡張の研究は最近に始まったばかりである。これに対し本研究では、具体的な問題を構成し、この問題に対し適当な場所からアフィンスケーリング法を始めると、最適解でない点へ収束することを証明した。すなわち、対称行列空間における線形計画問題に対するアフィンスケーリング法は、大域的収束性を持たないことを示した。当初の目的(大域的収束の証明)とは反対のネガティブな結果であるが、重要な結果である。なお、ここで提示した具体的な問題は非常にシンプルなものであり、主双対内点法を使えば簡単に解けるものである。従ってこの結果は、アフィンスケーリング法が対称空間の線形計画問題に対しては有力な方法ではないことを強く示唆するものである。
インド職能カーストの制作と経済活動

(1)インドの染織品と職能カーストの歴史的研究1:10月-11月に英国、フランス、スイスに文献閲覧と資料調査のため赴いた。フランスとスイスにおいては博物館所蔵のインド染織品を調査した。英国においては、19世紀後半にインドを植民統治していた大英帝国とインド染織品との関わりを明らかにするために、大英図書館インド省セクション、ナショナル・アート・ライブラリー、V&A博物館アーカイブ、V&A博物館アジア・インド部門において文献を閲覧した。19世紀後半に英国で産業美術や産業デザインの発展の要請があり、東インド会社がインドの産品をロンドンに建設されたインド博物館に蒐集した経緯を明らかにした。また、英国内で機械化による繊維製品の開発のためにそれに応える形でインド各地から染織品が蒐集され、見本榎としてまとめられていった経緯やその用途についても明らかにすることができた。また、植民地期のセンサスなどからカッチ県周辺においてどのようなコミュニティーが染織業に携わっていたか明らかにした。(2)インドの染織品の歴史的研究2:Anada K.Coomaraswamy、E.B.Havell、G.Birdwoodらの著作を大学図書館で閲覧し、19世紀後半の英国に市いて、彼らが、インドの美術や産業美術、手工芸の評価にどのような形で影響を与えたかを分析した。この成果については、日本の民芸運動と比較する形で、1月に国立民族学博物館共同研究『柳宗悦と民芸運動』シンポジウムにて発表した。この研究発表は、来年度に出版される予定である。(3)人類学におけるアート研究:人類学においてアートがどのように研究対象になり、どのような視点から分析されてきたかについて、とくに染織品の研究を参照する形で過去の先行研究を大学図書館にて閲覧調査した。この成果については、10月に京都大学人文科学研究所共同研究『フェティシズム研究の射程』において発表した。
ジェイムズ・シャーリーの『宮廷の秘密』の手書き原稿と出版テキストの比較研究

本研究の目的はジェイムズ・シャーリーの『宮廷の秘密』の二つのテキストである手書き原稿(manuscript)と1653年に出版されたテキストとの比較を通して、作家ジェイムズ・シャーリーの作劇に迫り、さらには作家、出版業界、劇団の力関係の考察にある。手書き原稿には削除、修正、加筆があり、その版を数えるとテキストは三つ存在することとなる。精査な比較を通し、同じ言葉が違う意味合いで使われていることがわかることから、作家シャーリーが、何度も原稿に手をいれる作家であったことは明らかである。シャーリーの特徴が、印象深い主人公にではなく、会話の積み重ねによって構築される人間対人間のドラマにあることも読み取れた。『宮廷の秘密』が収められているSixNewPlaysの六作品一作ずっに書かれた献辞は、劇場閉鎖前後の時勢を反映するものであり、作家シャーリーと出版業者HumphreyMoseleyとの密接な関係をも表している。The Court Secretは、1642年の劇場閉鎖の年に、King's Menの座付き作家であったJames Shirleyによって書かれ、1660年の王政復古を経て、1664年上演された希有な作品である。テキストは王位不在の時代、1653年にHumnhrey Moseleyによって出版されている。Oxford大学Worcester Collegeにおいて、The Court SecretのManuscriptに直接あたり、滞在期間内で可能な限りテキストを解読し、出版テキストとの比較を行なうとともに、加筆削除修正部分を細かく分析した。Manuscriptは、出版テキストに比べて、完成度が高く、主役の王侯貴族に加えて、主従関係にも重点がおかれ、身分の低い者に名前がつけられ、セリフが割り当てられている。出版テキストが非常に込み入った印象を与えるのに比べて、Manuscriptは話の流れがわかりやすい。両テキストを比較すると、同じ語句を使いながちその語句が別の人の台詞になっていたり、同じ語句を使いながら話の展開が異なっていることから、Shirleyが、両方のテキストのもとになった草稿を目の前におきたがら、手を加えて書き上げだことがわかる。Manuscriptの修正部分では、入退場が加筆され、身分の低い者達の役が削除されており、上演する劇団にあわせての修正と考えられる。Shirlev本人によって加筆されたと考えられている箇所に関しては、さらなる吟味が必要である。The Court Secretの前に書かれ、劇場閉鎖の直前に上演されたThe Sistersでは、偽物の公爵が公爵よりも生き生きと描かれている。Julie Sandersも指摘していることだが、チャールズ一世をパトロンに抱いたKing's Menの座付き作家であり、王党派の一員と目されていたShirleyの、王への複雑な気持ちを反映したものと考えられる。本研究は、チャールズ朝に活躍した劇作家ジェイムズ・シャーリーの最後の戯曲である『宮廷の秘密』の手書き原稿と出版テキストとの比較を行い、劇作家の執筆活動を研究することを目的としている。さらに、劇場閉鎖後の劇作家、出版業界、劇団の関係にも光をあてることを目的としている。1642年の劇場閉鎖の年に執筆されたこの作品は、上演する機会を失い、手書き原稿として残されているが、その一方で、王位不在の時代、1653年にシャーリーの他の作品と一緒に、ハンフリー・モーズリーによって出版されてもいる。オックスフォード大学ウスターカレッジにおいて、『宮廷の秘密』の手書き原稿に直接あたり、滞在期間内で可能な限りテキストを解読し、出版テキストとの比較を行なうとともに、加筆削除修正部分を細かく分析した。手書き原稿は、出版テキストに比べて、完成度が高く、主役の王侯貴族に加えて、主従関係にも重点がおかれ、身分の低い者に名前がつけられ、セリフが割り当てられている。今年度は、召使のペドロに注目して比較を行い、手書き原稿にはペドロの人間性とドラマがあり、出版テキストには存在しないことをテキストの分析から明らかにし、東北英文学会で口頭発表を行った。その一方で『宮廷の秘密』の直前に執筆された作品『姉妹たち』について論文発表を行った。王党派に身を置きながらも、観客の共感と笑いを取ることに秀でていた作家が、本物の公爵よりも偽物の公爵を生き生きと描いていることに注目し、1642年の劇場閉鎖の直前には、シャーリーが宮廷よりも民衆側に立って作劇していることを検証した。さらに、劇場閉鎖前後の劇作家、出版業界、劇団の関係にも光をあてることを目的としている。

今年度は、手書き原稿とテキストとの比較に加えて、出版業者と劇団の関係から、出版テキストの成り立ちについて、焦点をあてた。前年度に引き続き『宮廷の秘密』の手書き原稿と出版テキストとの比較を行ない、加筆削除修正部分を細かく分析した。手書き原稿に描かれた召使のペドロの人間性とドラマが、出版原稿からは消えてしまう事や、侍女たちの人数が減らされる事で、出版テキストの方が、主侯貴族である主要人物にのみ重きが置かれることを考察した。その一方で、喜劇『籠の中の鳥』(The Bird in a Cage,1633)の出版時の事情についての考察を行った。この作品は、出版に際し、タイトルが変更され、作家の献辞が添えられている。17世紀前半ピューリタンは芝居を堕落の源として攻撃していたが、パンフレット作家ウィリアムプリンはそれに加えて女性が舞台に上がることを糾弾し、それが仮面劇に参加した王妃ヘンリエッタ・マライアへの誹謗中傷とみなされ、投獄され「籠の中の鳥」の状態にあった。作品において、女性達が塔に閉じ込められていたり、その塔に鳥籠が送られてきたり、「籠の中の鳥」という言葉には、何重にも意味がかけられているものの、タイトルを「籠の中の鳥」に変更し、プリンへの皮肉に満ちた献辞を添えるシャーリーは、明らかにピューリタンに対して挑戦状を送っている。作家シャーリーと出版業界の密接な関係がわかる。
ヌクリングの関与する癌及び神経変性疾患発症機構の解明

ヌクリングノックアウトマウスでは肝炎・ガンの自然発症が生後一年を経過した集団で著増することが観察されている。これまで得られている我々も含めた研究の知見から、我々は独自にヌクリングノックアウトマウスにおける肝ガン発症機構モデルを構築してこのモデルの検証を行い、クッパー細胞死を伴った新規の肝炎・肝癌発症機序を明らかにした。ヌクリングノックアウト(KO)マウスの老齢雄個体に頻発する肝炎併発肝ガンの自然発症機構の解明を目指し、研究実施計画に則り以下の実験を行った。(1)発ガンの最初のステップと予想されるNF-κB活性化にヌクリングがどのように関わっているかを検討した。我々はヌクリングKOマウス由来の胚性線維芽細胞(MEF)や肝組織においてNF-κBが恒常的に活性化していることを見いだしていたが、ヌクリング自体にこのNF-κB活性化を制御する働きがあるかどうかを検討した。HEK293細胞にヌクリングを強制発現させ、NF-kBの活性化をウェスターンブロット、ルシフェラーゼアッセイ、蛍光抗体染色等で検討した結果、ヌクリング自体にNF-κB活性を抑える働きがあることを確認できた。(2)ヌクリングKOマウスの肝在住マクロファージ(クッパー細胞、以下KCと表記)が著減している原因の解明を試みた。NK/NKT細胞はNF-κBの活性化によりFasLの発現が誘導されることが報告されている。検証の結果、マウス肝臓におけるNK/NKT細胞のほとんどがFasLを、KCのんほとどがFasを発現していることが確認された。またNK/NKT特異的抗体によりNK/NKTを除くことにより、同時にKCが除かれることを確認した。このことからヌクリングKOマウスではNF-κBの活性化によりFas/FasL系が活性化されKCがアポトーシスで減少することが強く疑われた。以上の結果はヌクリングがNF-κBの活性化を制御する重要な分子であることを示唆しており、またこの制御機構の破綻が肝炎併発肝ガン発症機序の一因となりうることを明らかにした初めての研究成果と考えられる。以上の結果をまとめ、現在投稿中である。ヌクリングノックアウト(KO)マウスに頻発する肝炎併発肝ガンの発症機構の解明を目指し、研究実施計画に則り以下の実験を行った。1.発ガン初期のステップと予想されるNF-κB活性化にヌクリングがどのように関わっているかを検討した。我々はヌクリングKOマウス由来の細胞や組織においてNF-κBが恒常的に活性化していることを確認し、更にヌクリング自体にこのNF-kB活性化を制御する働きがあるかどうかを検討した。その結果、ヌクリングがNF-κBと相互作用し、その細胞内分布を制御していることを見いだした。特に、NF-κBの活性化に伴う核内移行にヌクリングは重要であることを明らかにした。以上の結果を論文にまとめ、ヨーロッパ生化学連合雑誌に掲載された(Liuet al.FEBS J 2009)。2.ヌクリングKOマウスの肝癌発症機構として、NF-κB活性化に伴うガレクチン3の発現誘導を検討した。ガレクチン3は肝癌発症時に肝臓において発現誘導されることが報告されており、実際ヌクリングノックアウトマウスでは肝における発現が野生型に比べて高いことを確認した。3.また、肝癌発症の新たな要因として肝在住マクロファージ(クッパー細胞、以下KCと表記)からの種々のサイトカインの放出が報告されている。ヌクリングノックアウトマウスにおいてはこのKCが著減しており、その原因としてTNFαによるアポトーシス誘導が考えられた。TNFα刺激はKCのアポトーシス誘導と共にKCからのサイトカイン放出も誘導するという仮説を立て、これを検証した。
腎移植における免疫抑制療法への導入を目的としたビタミンK2の薬効解析

本助成を受け、昨年度末までにビタミンK2(VK2)は、健常人、透析患者共に末梢血単核細胞Peripheral Bood monomuclear Cells(PBMC)増殖抑制効果が得られた。しかしながらVK2は、サイトカイン生成能に影響を与えなかったが、透析患者の制御性T細胞に限り濃度依存的な抑制効果が確認され併せて報告することが可能となった(1)。腎移植における免疫抑制療法は、過剰免疫抑制による日和見感染症やステロイド性の骨粗鬆症等の副作用も多い。本来VK2は、骨粗鬆症の治療に適応を持つ。そこでVK2を腎移植の免疫抑制療法に追加投与することにより、薬効評価を行う必要があると考えられた。よって最終年度の研究目標として、VK2と他の免疫抑制薬の併用を模した薬効測定方法を"コンビネーション感受性測定"として開発、実施した。VK2感受性は、健常人、透析患者共に個人差が少なく、ステロイド薬は薬効に個人差が大きい。本年度は、コンビネーション感受性測定を行うにあたりVK2の添加濃度を決定させ、薬効評価を行うことを確認した。よってVK2が腎移植の免疫抑制療法のひとつとして薬効評価できる体制を大きく進展させることが可能となった。VK2は、PBMC増殖抑制効果を併せ持つが、作用のメカニズムは明らかに解明する必要がある。VK2はPregnane X Receptor(PXR)のリガンド活性を有していることから健常者PBMCにVK2を添加したPXRの発現量の検討を行ったところ、VK2の細胞増殖抑制作用はPXRの発現量を変化させないことを明らかにした。さらに健常者PBMCにVK2を添加することにより、NF-κB発現の検討を行った。デキサメタゾン同様にT細胞マイトゲン刺激によるp-NF-κBの発現を有意に抑制した。よって、NF-κBとそのリン酸化体を抑制することにより、薬効を発揮すると考えられた。初年度は、本助成を受け健常者と透析患者における末梢血単核細胞(PBMC)を対象にビタミンK1(VK1)およびビタミンK2(VK2)の増殖抑制作用、サイトカイン定量試験、制御性T細胞(Treg)率測定試験を行った。その結果、健常者と透析患者に対してVK2がいずれもほぼ同等な薬効を持つことを明らかにした。これらの結果から、VK2が腎移植患者に対して、副作用の頻度の高い免疫抑制薬を離脱若しくは減量させる一助となる薬物になり得ることを示唆した。しかしながらVK2が臨床で応用されるためには、PBMCのマイトゲン応答性増殖に対する効果以外にも、免疫能に対する作用をより詳細に確認する必要があると考えられた。昨年度は、共同研究施設として横浜警友会けいゆう病院(けいゆう病院)の腎臓内科と薬剤部の協力により透析患者の活性化PBMCにおけるMitogen-activated protein kinase(MAPK)活性試験を行い、VK2がシグナル伝達経路を介した免疫能に及ぼす影響について検討について着手した。具体的には、健常人と透析患者PBMCの増殖能に対してVK2がMAPK活性試験の各シグナル伝達経路であるPhospho-p44/42 MAPK、Phospho-p38 MAPK、Mek1、Phospho-Mek1/2、SAPK/JNKそしてPhospho-SAPK/JNKの6種類について反応性があるか検討を行った。さらに反応性のある個々のシグナルに対してVK2が濃度依存的に有意な減少が認められるかについても検討し、VK2がPhospho-p44/42 MAPK、Mek1、そしてSAPK/JNKを阻害してPBMC増殖を抑制することを明らかにした。透析患者のPBMCを対象として、VK1とVK2の作用を、免疫抑制薬の感受性試験、サイトカイン定量試験、および制御性T細胞(Treg)率測定試験により検討し、不足されたデータを補い論文投稿の準備までに到達した。健常人と透析患者のPBMCの増殖能に対してVK2がMAPK活性試験の各シグナル伝達経路であるPhospho-p44/42MAPK、Phospho-p38 MAPK、Mek1、Phospho-Mek1/2、SAPK/JNKそしてPhospho-SAPK/JNKの反応性について更に症例数を増加させ検討を行っている。その結果、Phospho-p44/42 MAPK、Mek1、そしてSAPK/JNKについて濃度依存的にVK2に反応性があり、個々のシグナルに対して有意に減少させることについても更に検討を加えている。

よってVK2が腎移植の免疫抑制療法のひとつとして薬効評価できる体制を大きく進展させることが可能となった。VK2は、PBMC増殖抑制効果を併せ持つが、作用のメカニズムは明らかに解明する必要がある。VK2はPregnane X Receptor(PXR)のリガンド活性を有していることから健常者PBMCにVK2を添加したPXRの発現量の検討を行ったところ、VK2の細胞増殖抑制作用はPXRの発現量を変化させないことを明らかにした。さらに健常者PBMCにVK2を添加することにより、NF-κB発現の検討を行った。デキサメタゾン同様にT細胞マイトゲン刺激によるp-NF-κBの発現を有意に抑制した。よって、NF-κBとそのリン酸化体を抑制することにより、薬効を発揮すると考えられた。我々は、ビタミンK(VK)類が免疫抑制作用を持つことに注目した。特にVK3、VK5は、シクロスポリンと同様な強い免疫抑制作用を持ち、ヒト末梢血リンパ球からの様々なサイトカインを濃度依存的に抑制することも明らかにした。しかしながらVK3やVK5は、臨床応用されていない。そこで私は、臨床上適応を持つVK1とVK2に着目した。VK1は、低プロトロンビン血症に、VK2は、骨粗鬆症にそれぞれ適応を持つ。そこで、健常者のヒト末梢血単核細胞(PBMC)に対する薬物感受性試験により、VK1とVK2の増殖抑制作用を確認した。VK1は、PBMC増殖抑制作用を持たないが、VK2は、対照群に比べPBMC増殖を有意に抑制することを明らかにした。腎移植患者は、拒絶反応の予防のために免疫抑制療法が開始される。この免疫抑制療法は、カルシニューリンインヒビター、代謝拮抗薬、ステロイド薬から構成されている。ステロイド薬の使用により、ある頻度で骨粗鬆症の副作用が発生する。VK2は、臨床上骨粗鬆症に適応を持ち、副作用の頻度も免疫抑制薬に比べ圧倒的に少ない。よって本科学研究費を得て、腎移植に適応を持つ透析患者を対象に、PBMCにおけるVK1とVK2の感受性測定を実施し、これらVK類の免疫系に対する薬効評価を試みた。そこで横浜警友会けいゆう病院(けいゆう病院)の透析患者を対象に、VK1とVK2の薬効解析の一環として、1)免疫抑制薬の感受性試験、2) Cytokine Beads Array Kitによる7種類のサイトカイン産生や制御性T細胞率測定試験、および3) Mitogen-activated protein kinase(MAPK)活性試験を行った。以上、VK1とVK2が腎移植患者に対して副作用の頻度の高い免疫抑制薬を離脱若しくは減量させる薬物となりうるか、健常者と透析患者のPBMCを用いて比較検討した。透析患者のPBMCを対象として、VK1とVK2の作用を、免疫抑制薬の感受性試験、サイトカイン定量試験、および制御性T細胞(Treg)率測定試験により検討し、健常者PBMCを用いた結果と比較検討した。透析患者PBMCのVK1とVK2に対する感受性試験の結果、健常者PBMCと同様、VK1が増殖抑制作用を持たず、一方VK2は抑制作用を持つことを明らかにした。
微分幾何に基づく船型CADシステムとCFD間のインターフェースに関する研究

本研究は、微分幾何学に基づいたCADシステムによって作成された船型とそのまわりのCFD解析による流場とを簡潔に結びつけることを目的としている。平成14年度には2次元翼形状を対象とし、簡易的なCADとしてベジェ曲線を用いて翼形状を表現した。その形状パラメタとCFD解析による流場との関係については、随伴変数法を用いて感度解析を行うことにより、迅速に形状と流場を結びつけられることを示した。本年度は、随伴変数法を応用して2次元粘性流場の逆解析手法を構築することを試みた。随伴変数法は流場の支配方程式の性質に着目した効率的感度解析手法である。この手法では、物体周りの流れを考える場合、物体形状と流場がそれぞれ変化したときに生じる支配方程式の残差がお互いキャンセルするように形状変化に対して流場変化を拘束する。この関係は、局所線形化された支配方程式を解くことによって、非常に短時間に求めることができる。逆に流場の変化に対して、形状の変化を拘束することも可能である。このことは、流場の変化を指定したときに、それに対応するような形状が求められることを意味する。これはまさに逆解析そのものである。しかしこれは前述のとおり、局所線形化した方程式に基づく解法であるため、指定する流場変化量を大きくとると、流場に支配方程式の非線形性から、解に誤差を生ずる。この誤差修正には、ニュートン法に準じた繰り返し計算を行う手法を用いた。この手法を2次元キャビティー流れに適用した。具体的には適当な境界条件の下にキャビティー流れを解き、キャビティー内のある点の流速が指定した値となる境界条件を求める逆問題を解いた。その結果、計算格子数が少ない場合については、極めて迅速に逆解析が実行できることを確認した。この手法は物体周りの流れに対しても適用可能であると考えられる。以上の成果をもって、本年度の所期の目的はほぼ全て達成できたと考える。本研究の目的は、船体のような流体力学的形状をパラメトリックに表現し、形状とCFD解析によって得られるその周り流場の関係をできるだけ簡単に関連付けることである。本研究では、形状と流場の関連付けを形状変化に伴う流場特性変化の感度を求めることと考え、効率的な形状表現手法と感度解析手法について考察した。本年度はまず、2次元翼を対象とした。形状のパラメトリック表現手法としてBezier曲線を採用し、3次のBezier曲線を2つ連結して2次元対称翼の片舷を表現した。コントロールポイントの数は7つであるが、非常に豊かな形状表現能力を有する。CFDコードについては有限体積法を用いた2次元一般曲線座標系に対応した計算コードを今回新たに開発した。感度解析については、翼に働く揚力を対象とし、コントロールポイントの変化に対する揚力の変化を随伴変数法(Adjoint Variable Method)を用いて求めた。今回用いた随伴変数法は感度を求める際に、あらためてCFD解析を行う必要がないことから極めて迅速な感度解析を行うことができる。反面、随伴方程式を形成する巨大なマトリクスを解かなければならない。本研究ではこの随伴方程式の解法について、マトリクスが常に有対角となる解法を開発し、さらに迅速な計算手法を示した。感度解析の精度については、CFD計算結果の差分法による解法を比較したところ、概ねよい精度が得られることが分かった。以上の成果をもって、本年度の所期の目的はほぼ達成できたと考える。
日本語版ISMI-10尺度の信頼性・妥当性：地域で支えるためのアセスメントツール

1.平成29年度に得られたアンケート結果をエクセルに入力し、その後、データをスクリーニングした。調査に参加した242名のうち、知的障害,器質性脳疾患,質問を完了することができなかった人を除き,230名を分析の対象とした。2.分析については統計解析ソフト「SPSS」等を使い集計・解析し、日本語版ISMI-10尺度の信頼性・妥当性を検討した。尺度全体の内的整合性のα係数は0.81であった。再テスト信頼性係数はr=0.85であった。基準関連妥当性に関して、日本語版ISMI尺度はベックの抑うつ評価尺度と正の相関があり、ローゼンバーグの自尊心尺度、エンパワメント尺度とは負の相関があった。構成概念妥当性については、因子分析した結果、2つの因子が得られた。3.日本精神保健看護学会第28回学術集会・総会および第83回日本健康学会総会において、一般演題発表をした。日本精神保健看護学会は精神看護に関わる人が多く所属しており、精神看護に関する専門性が高い学会である。そのため、日本精神保健看護学会で発表することで、より多くの精神看護に関心のある人の目に触れることができる。日本健康学会は、健康に関心のある幅広い分野の人々に知ってもらうという点でも意義のあることである。2つの学会において、「日本語版ISMI-29尺度」の内容を分かりやすく示したリーフレットを作成し、配布した。平成29年4月中に調査票及び研究計画書の作成を終え、5月に高崎健康福祉大学の倫理委員会に研究に係る許可申請を出し、6月5日に許可が出た(高崎健康大倫第2910号)。その後、調査施設を選定した。大学の夏休みを中心に新潟県内で調査を実施し、9月以降群馬県、1月以降埼玉県で調査を実施した。どこの社会福祉施設のスタッフも社会福祉施設を利用している精神障がいのある方々も協力的であった。平成30年度は、最初にデータの入力およびスクリーニングした。データのスクリーニングをキチンとしたことで、その後の解析が順調に進んだ。学会発表ではあるが、日本精神保健看護学会第28回学術集会・総会および第83回日本健康学会総会において、発表することができた。このことは、今後の論文作成の大きな礎となる。2つの学会発表ができたことも、「おおむね順調に進展している」ことの大きな理由の一つである。平成29年度中に調査書の作成及び調査の実施を、平成30年度中にデータの入力とスクリーニングおよび解析を終えることができた。今後は、当初の計画通り、次の13を行っていきたい。統計解析ソフト「SPSS」を使い集計・解析し、日本語版ISMI-10尺度の信頼性・妥当性を検討する。さらに、日本語版ISMI-10尺度と日本語版ISMI-29尺度の結果を比較・検討し、日本語版ISMI-10尺度の精度を明らかにする。1信頼性・妥当性の検討:結果に基づき信頼性と妥当性の検討し、論文にまとめる。2成果発表:日本語にまとめた論文を英訳し、海外の論文に発表するなどして研究成果を発信する。また、リーフレットやホームページを作成し、普及に努める。3日本語版ISMI-10尺度の信頼性・妥当性の結果をJennifer E. Boydらに伝えに行く。1.調査票を作成した。調査票は、対象者の属性(年齢、性別、学歴、病名、発病年齢など)、日本語版「精神障がい者の内面化したスティグマ尺度」、比較対象尺度(ベックの抑うつ評価尺度、ローゼンバーグの自尊心尺度、エンパワーメント尺度)から構成される。2.研究計画書を作成し、高崎健康福祉大学の倫理委員会で倫理審査を受け、承認された。3.群馬県内、新潟県内及び埼玉県内の社会福祉施設を中心に研究対象施設を選定し、施設長等に連絡し、直接伺い、研究説明書を用いて研究の説明をし、同意書を用いて許可が得られた施設で調査を実施した(新潟県内12か所、群馬県内9か所、埼玉県内9か所)。4.群馬県、新潟県および埼玉県の社会福祉施設を利用している精神障がい者に対し、研究の目的や方法などが書かれた説明書を配付して説明し、同意書で同意の得られた274名に対して調査を行った(群馬県89名、新潟県114名、埼玉県71名)。5.再テストは調査から5週間後に、研究の目的や方法などが書かれた説明書を配付して説明し、同意書で同意の得られた148名に対して行った。調査票及び研究計画書の作成を4月中に終え、5月に高崎健康福祉大学の倫理委員会に研究に係る許可申請を出すことができたことが第一にあげられる。その結果、多少の修正を加え、6月5日に許可が出た(高崎健康大倫第2910号)。選定にあたって、新潟県内は研究協力者の藤田氏、群馬県内は研究協力者の高山氏の協力を得た。夏休みを中心に新潟県内で調査を実施し、9月以降群馬県、1月以降埼玉県で調査を実施した。

社会福祉施設を利用している精神に障がいのある人に対し調査を実施したわけであるが、どこの施設のスタッフも協力的であったこと、そして、何よりも社会福祉施設を利用している精神障がいのある方々が協力的であったことが順調に進んでいる大きな要因である。1.平成29年度に得られたアンケート結果をエクセルに入力し、その後、データをスクリーニングした。調査に参加した242名のうち、知的障害,器質性脳疾患,質問を完了することができなかった人を除き,230名を分析の対象とした。2.分析については統計解析ソフト「SPSS」等を使い集計・解析し、日本語版ISMI-10尺度の信頼性・妥当性を検討した。尺度全体の内的整合性のα係数は0.81であった。再テスト信頼性係数はr=0.85であった。基準関連妥当性に関して、日本語版ISMI尺度はベックの抑うつ評価尺度と正の相関があり、ローゼンバーグの自尊心尺度、エンパワメント尺度とは負の相関があった。構成概念妥当性については、因子分析した結果、2つの因子が得られた。3.日本精神保健看護学会第28回学術集会・総会および第83回日本健康学会総会において、一般演題発表をした。日本精神保健看護学会は精神看護に関わる人が多く所属しており、精神看護に関する専門性が高い学会である。そのため、日本精神保健看護学会で発表することで、より多くの精神看護に関心のある人の目に触れることができる。日本健康学会は、健康に関心のある幅広い分野の人々に知ってもらうという点でも意義のあることである。2つの学会において、「日本語版ISMI-29尺度」の内容を分かりやすく示したリーフレットを作成し、配布した。平成29年4月中に調査票及び研究計画書の作成を終え、5月に高崎健康福祉大学の倫理委員会に研究に係る許可申請を出し、6月5日に許可が出た(高崎健康大倫第2910号)。その後、調査施設を選定した。大学の夏休みを中心に新潟県内で調査を実施し、9月以降群馬県、1月以降埼玉県で調査を実施した。どこの社会福祉施設のスタッフも社会福祉施設を利用している精神障がいのある方々も協力的であった。平成30年度は、最初にデータの入力およびスクリーニングした。データのスクリーニングをキチンとしたことで、その後の解析が順調に進んだ。学会発表ではあるが、日本精神保健看護学会第28回学術集会・総会および第83回日本健康学会総会において、発表することができた。このことは、今後の論文作成の大きな礎となる。2つの学会発表ができたことも、「おおむね順調に進展している」ことの大きな理由の一つである。調査書の作成及び調査の実施を平成29年度中に終えることができた。今後は調査票に書かれたデータのスクリーニング及び入力をする。その後、統計解析ソフト「SPSS」を使い集計・解析し、日本語版ISMI-10尺度の信頼性・妥当性を検討する。さらに、日本語版ISMI-10尺度と日本語版ISMI-29尺度の結果を比較・検討し、日本語版ISMI-10尺度の精度を明らかにする。平成29年度中に調査書の作成及び調査の実施を、平成30年度中にデータの入力とスクリーニングおよび解析を終えることができた。今後は、当初の計画通り、次の13を行っていきたい。統計解析ソフト「SPSS」を使い集計・解析し、日本語版ISMI-10尺度の信頼性・妥当性を検討する。
沖縄における超高齢者の認知機能障害予防のためのコホート研究

2007年11月から2008年2月に実施した沖縄県宜野湾市在住の80歳以上の高齢者197人を対象とした生活習慣および血清中栄養素と健康度に関する調査をベースラインとし、身体的機能や認知機能に関する2年間のフォローアップ調査を実施した。1年後の認知機能と血漿ホモシステイン、血清ビタミンB_<12>および葉酸とに関連がみられなかったが、2年後の認知機能と血清ビタミンB_<12>とには有意な関連が見られた。2007年11月から2008年2月に実施済みの沖縄県宜野湾市在住の超高齢197人を対象とした生活習慣および血清中栄養素に関する調査(Linus Pauling Institute at Oregon State Universityからの研究助成金による)をベースラインとし、身体的機能や認知機能調査のフォローアップ調査を2008年11月から2009年3月に実施した。ベースライン調査において健康診断および面接調査両方に参加し、臨床痴呆評価尺度が0.5以下であった193人のうち、2007年度フォローアップ調査に参加した人は137人(男性36人、女性101人)であった(フォローアップできなかった55人の内訳:拒絶46人、入院7人、引っ越し1人、連絡取れず1人、疲労のため途中で調査中止1人)。今回解析対象となった137人のうち、ベースライン調査において血漿ホモシステイン濃度が高い人は男性22.2%、女性30.7%であった(基準値:男性>16.9umol/L、女性>12.2umol/L)。Mini-Mental State Examination(MMSE)スコアの1年後の変化をホモシステイン濃度の高いグループ(高ホモシステイン血症群)と基準内のグループ(標準群)を比較すると、標準群ではMMSEのスコアが平均0.72上昇したのに対して、高ホモシステイン血症群は0.12減少した。P値が0.151であったので有意な差ではなかったが、ホモシステイン濃度が高いと1年後のMMSEスコアが低下する傾向が見られた。ベースライン時の中性脂肪、LDLコレステロール、HDLコレステロールに関しては、1年後のMMSEスコアの変化には関連が見られなかった。血漿ホモシステイン濃度は認知機能低下に関連していることが示唆されるので、2008年度調査において2年後の認知機能の変化を調べるとともに、高ホモシステイン血症と認知機能との因果関係を検討していく予定である。2007年11月から2008年2月に実施済みの沖縄県宜野湾市在住の超高齢者197人を対象とした生活習慣および血清中栄養素に関する調査(Linus Pauling Institute at Oregon State Universityからの研究助成金による)をベースラインとし、身体的機能や認知機能調査の第2回目フォローアップ調査を2009年11月から2010年3月に実施した。ベースライン調査および2008年度フォローアップ調査に参加した137人(男性36人、女性101人)のうち、2009年度フォローアップ調査に参加した人は101人(男性29人、女性72人)であった。今回解析対象となった101人のベースライン時における血漿ホモシステイン濃度は男性12.5±5.1umol/L、女性11.0±5.0であり、血漿ホモシステイン濃度が高い人は男性20.7%、女性29.2%であった(基準値:男性>16.9umol/L、女性>12.2umol/L)。ベースライン時のMini-Mental State Examination (MMSE)スコアから2年後のスコアが2点以上低下した場合を認知機能低下とすると、ホモシステイン濃度が基準内のグループ(標準群)に対する高いグループ(高ホモシステイン血症群)の認知機能低下の粗オッズ比は1.85(95%CI:0.67-5.10)、性、年齢調整済みオッズ比は1.76(95%CI:0.63-4.89)であった。ホモシステイン濃度が高いグループは認知機能が低下しやすい傾向にあったが、有意な関連は見られなかった。解析対象者が101人と少ないため、統計的検出力が低かったことも原因としてあげられる。検出力0.8を得るためには約250人の対象者が必要である。
輸送系に関わっているタンパク質の構造解析

我々は、タンパク質の詳細な3次元立体構造を、X線結晶構造解析の手法を用いて決定しようとしている。Heddle博士は、バクテリアのNikAと呼ばれるタンパク質の遺伝子のクローン化に成功し、同タンパク質の大量発現系構築およびタンパク質の精製法を確立している。良質なタンパク質結晶も得られており、現在ではセレノメチオニン置換タンパク質を調整し、位相情報決定に用いようとしている。また、超遠心分析法(流体力学の理論を用いて、タンパク質分子のおおよその形を求める)、等温熱量測定法(リガンド結合に伴うエンタルピー変化を測定することによって、リガンド結合の親和性を求める)、など様々な物理化学的手法を用いて、NikAの性質を測定した。横浜市大の佐藤衛博士の協力を得て、X線小角散乱を利用した溶液中のNikAの構造解析も試みた。得られた低分解能立体構造データは、超遠心分析法で測定された性質と良い一致を示した。また、横浜理研ゲノムセンターの伊藤隆博士の協力を得て、NMRによる溶液中NikA構造解析にも着手した。NikAの分子量は非常に大きい。NMRで構造が決定できれば、今までで最大級のタンパク質である。あと数ヶ月で、NikAの高分解能立体構造は決定できると考えている。構造決定ができ次第、活性部位についての考察・議論をするため、アミノ酸置換タンパク質を調整して活性測定を行う予定である。
有機溶媒耐性大腸菌を用いた有機溶媒耐性生体触媒の開発

本研究の目的は、大腸菌の有機溶媒耐性変異株を宿主として用いて溶媒存在下における疎水性物質変換反応を行い、高度溶媒耐性大腸菌の溶媒存在下における変換菌としての有用性について明らかにすることである。既に取得している有機溶媒耐性大腸菌を親株として用いて、さらに有機溶媒耐性度の向上した新規な有機溶媒耐性大腸菌の取得を行なった。毒性の強い有機溶媒を重層した培地を用いて大腸菌を培養し、生育した有機溶媒耐性変異株を分離した。大腸菌の有機溶媒耐性には薬剤排出タンパク質であるAcrAB-TolCポンプが関与していることが知られており、これらタンパク質の発現を調節している複数の転写制御因子が同定されている。これら転写制御因子のうちの1つが取得した有機溶媒耐性変異株の有機溶媒耐性に関与していることを見出した。また、これら有機溶媒耐性向上変異株のうち特に有機溶媒耐性度の高かった変異株のタンパク質発現を解析し、親株と比較して発現量が増加しているタンパク質を同定した。変異株の膜タンパク質と菌体内タンパク質を分離して調べた結果、膜タンパク質において顕著なタンパク質発現量の変化が確認された。これらタンパク質の有機溶媒耐性への関与を調べるために、各遺伝子を破壊株した株を構築し、有機溶媒耐性を調べた。この結果、浸透圧調節に関わるタンパク質が、有機溶媒耐性に関与することが示唆された。さらに、取得した変異株に芳香族化合物酸化酵素であるインドールからインジゴ(青色の染料)を生成する酵素をコードする遺伝子を導入し、形質転換体を作製した。現在、この形質転換体を水-有機溶媒の2相培養液を用いて培養し、インジゴ生産性を検討した。この結果、溶媒存在下において親株(非有機溶媒耐性株)よりも、変換効率が向上した有機溶媒耐性変異株を取得できたことを確認した。そこでまず、既に取得している有機溶媒耐性大腸菌を親株として用いて、さらに有機溶媒耐性度の向上した新規な有機溶媒耐性大腸菌の取得を行なった。段階的に添加する有機溶媒の毒性を高めることにより、高度な有機溶媒耐性度を示す有機溶媒耐性大腸菌変異株を取得した。この結果、多くの微生物に対して強い毒性を示すp-キシレン存在下において生育する有機溶媒耐性度向上変異株を10株取得した。これらの変異株は、p-キシレン存在下では溶媒無添加の場合に比べて、100分の1から10000分の1程度の生育頻度を示した。これら有機溶媒耐性向上変異株のうち特に有機溶媒耐性度の高かった変異株のタンパク質発現を解析し、親株と比較して発現量が増加しているタンパク質を同定した。また、膜タンパク質を内膜タンパク質画分と外膜タンパク質画分に分けて解析した結果、内膜タンパク質画分において複数のタンパク質の発現量の増加が確認され、これらのタンパク質の有機溶媒耐性への関与が示唆された。