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日本統治下パラオにおける沖縄出身者の植民地経験―歴史をめぐる対話をめざして

平成24年度は、沖縄でのフィールド調査を継続し、かつて日本統治下パラオに暮らした人々から、当時の体験について聞き取りをした。文献調査においては、とくに沖縄の市町村史、県史、自叙伝など、移民経験をめぐる資料の収集・精読を行い、「移民」が沖縄においてどのようにとらえられ、歴史化されてきたかを検討した。本研究第一の目的である、沖縄出身者の目から見た「日本統治下パラオ」像を描き出すことについては、聞き取り調査から得られた沖縄の人々の語りを順次書きおこし、オーラル・ヒストリーの記録の作成を進めている。本研究第二の目的である、パラオ人、沖縄出身者、日本本土出身者の間に植民地の記憶をめぐる対話を促すことに関しては、AJJ(Anthropology of Japan in Japan)Spring Workshop(大阪学院大学4月22日)および、国際シンポジウムtransoceania2012:Currents of Memory,Identity,and Representation Between the Islands of Japan and Oceania(東京大学7月15日)において研究発表を行った。この三年間に行った調査をもとに、オーラル・ヒストリーから自民族中心的な「私たちの歴史」を築いてきたこれまでの動向に対し、植民地にともに生きた他者のまなざしをいかに歴史認識に取り込むか、方法論をめぐる論文を執筆中である。さらに、この方法論をベースに、日本統治下パラオをめぐる記憶語りの民族誌を執筆中である。本研究の意義は、植民地経験をめぐり、複数の民族の記憶を交差させることで、歴史をめぐる対話を構築することにある。他者の歴史語りに耳を傾け、他者とともに過去について議論することで、歴史を活性化することをめざしている。本研究第一の目的である「沖縄出身者の視点から見た日本統治下パラオ像の記述」については、順調に調査を重ね、オーラル・ヒストリーを収集している。第二の目的である、「歴史をめぐる多民族間の対話構築」については、論文や学会発表においてその方法的展望を明らかにしている。よって、本研究はおおむね順調に進展していると考える。最終年度は、沖縄のパラオ帰還者への聞き取り調査を継続するとともに、沖縄の県市町村史のレビューを行う。さらに、戦後、日本本土においてパラオ帰還者会等で中心的役割をした人への聞き取りも行い、沖縄出身者の経験を日本全体の中に位置づけることを試みる。また、学術論文や一般書の執筆を通して、研究成果の発信に努める。
広域地下構造物に対する迷走電流解析システムの開発

本研究では,従来,解析手法が確立していなかった迷走電流腐食問題に対し,高速多重極境界要素法と不定条件逆解析手法を併用した,広域埋設構造物の迷走電流腐食を解析するシステムを開発した.研究実績は以下のようにまとめられる.防食を達成する電極を決定する最適化問題では,繰り返し計算が行なわれる.しかし,問題の非線形性が強い場合,繰り返し回数が多くなり計算時間が莫大になる問題があった.本研究では,非線形性が強い場合の計算時間を短くするために,高速多重極境界要素法の特徴を利用して効率的な最適化手法を開発した.本最適化問題は,非線形性を持っているため,初期値が最適解と大きく異なると計算時間が非常に多くなる.理想的な防食状態は,与える電流に過不足ない状態で,表面全ての電位および電流密度が,防食電位および電流密度となっている時である.表面全ての電位および電流密度を,防食電位および電流密度とした時,それを実現する電極を設計した.すなわち,本問題を境界積分方程式に理想的な状態の境界条件を二重境界条件として与え,逆に電極の設計変数(電流および電極の位置)を求める逆問題に帰着させた.また,迷走電流腐食を合理的に推定する解析においては,つぎの3点の手法を提案し解析システムに採り入れた.●幾何的情報や電気伝導度が得られない構造物および地域を仮想境界で囲むことで統一的に解析を行う手法●多様な先験情報に対しファジー数を用いることで統一的な表現として取り扱う枠組●解析対象とする構造物に能動的に電流を印加し,観測する電位の変化量に注目して,複数の推定量を独立に取り扱う手法以上の提案により開発したシステムを用いて,埋設構造物表面上の電流密度を定量的に推定するシミュレーションを行い手法の有効性を確かめた.本年度は,広域地下トンネルを例に取り,現場の調査に基づいて,腐食解析用高速多重極境界要素法および不定境界逆解析のプログラムを,作成・評価・改良を繰り返して,開発した。本年度の結果は以下のようにまとめられる。防食を達成する電極を決定する最適化問題では,繰り返し計算が行なわれる.しかし,問題の非線形性が強い場合,繰り返し回数が多くなり計算時間が莫大になる可能性があるという問題がある.本研究では,非線形性が強い場合の計算時間を短くするために,高速多重極境界要素法の特徴を利用して効率的な最適化手法を開発した.本研究では,繰り返し計算にシンプレックス法を用いている.本最適化問題は,非線形性を持っているため,初期値が最適解と大きく異なると計算時間が非常に多くなる.理想的な防食状態は,与える電流に過不足ない状態で,表面全ての電位および電流密度が,防食電位および電流密度となっている時である.表面全ての電位および電流密度を,防食電位および電流密度とした時,それを実現する電極を設計した.すなわち,本問題を境界積分方程式に理想的な状態の境界条件を二重境界条件として与え,逆に電極の設計変数(電流および電極の位置)を求める逆問題に帰着させた.境界積分方程式から電極の設計変数を求める時,通常の境界要素法は電極と要素は個々に影響があるため,大規模問題では記憶量および計算量が莫大となる.そこで,高速多重極境界要素法を用いて効率的に計算した.本研究では,従来,解析手法が確立していなかった迷走電流腐食問題に対し,高速多重極境界要素法と不定条件逆解析手法を併用した,広域埋設構造物の迷走電流腐食を解析するシステムを開発した.研究実績は以下のようにまとめられる.防食を達成する電極を決定する最適化問題では,繰り返し計算が行なわれる.しかし,問題の非線形性が強い場合,繰り返し回数が多くなり計算時間が莫大になる問題があった.本研究では,非線形性が強い場合の計算時間を短くするために,高速多重極境界要素法の特徴を利用して効率的な最適化手法を開発した.本最適化問題は,非線形性を持っているため,初期値が最適解と大きく異なると計算時間が非常に多くなる.理想的な防食状態は,与える電流に過不足ない状態で,表面全ての電位および電流密度が,防食電位および電流密度となっている時である.表面全ての電位および電流密度を,防食電位および電流密度とした時,それを実現する電極を設計した.すなわち,本問題を境界積分方程式に理想的な状態の境界条件を二重境界条件として与え,逆に電極の設計変数(電流および電極の位置)を求める逆問題に帰着させた.また,迷走電流腐食を合理的に推定する解析においては,つぎの3点の手法を提案し解析システムに採り入れた.●幾何的情報や電気伝導度が得られない構造物および地域を仮想境界で囲むことで統一的に解析を行う手法●多様な先験情報に対しファジー数を用いることで統一的な表現として取り扱う枠組●解析対象とする構造物に能動的に電流を印加し,観測する電位の変化量に注目して,複数の推定量を独立に取り扱う手法以上の提案により開発したシステムを用いて,埋設構造物表面上の電流密度を定量的に推定するシミュレーションを行い手法の有効性を確かめた.
実在気体中の衝撃波に関する数理工学的研究とその工学的応用

実在気体中の衝撃波現象を、ミクロからマクロレベルまでの一貫した観点から、数理工学的に研究した。理論的基礎として拡張された熱力学理論を新たに構築した。(1)衝撃波内部での強い熱的非平衡状態の熱・力学的特性を明確にした。(2)衝撃波により誘起される気体-液体相転移現象の特徴を研究した。(3)ミクロレベルでの衝撃波現象を解析するため、拡張された熱力学に基づく流体力学的揺らぎ理論を確立し、その数値解析を試みた。本年度は衝撃波面内部での強い熱的非平衡状態の熱・力学的特性の研究を実行した。具体的には以下の(A)と(B)の課題に取り組んだ。(A)内部自由度を持つ剛体球系を採用した場合:ランキン-ユゴニオの関係の解析(理論的解析およびシミュレーションによる数値解析)を進展させた。内部自由度がランキン-ユゴニオの関係に及ぼす影響を検討した。さらに、剛体球系特有の、いわゆるアルダー転移を伴う場合のランキン-ユゴニオの関係に注目しその安定性について検討した。これらの結果を踏まえ、衝撃波面構造の研究についても解析を開始した。(B)実在気体系を採用した場合の解析:剛体球系で得られた結果を基準として、液体物性論などで用いられている摂動理論を採用する。分子間相互作用をこのようにして取り入れ、実在気体中の衝撃波において見られる強い非平衡現象を理論および数値的に解析した。種々の分子間相互作用を持つ系に対して研究を開始した。例えば、相互作用ポテンシャルの中のパラメータに、衝撃波面での非平衡現象がどのように依存しているのかを明確にするよう解析を進めた。特に、非平衡現象の研究として、以下の内容に集中することとした:(B1)分子内部自由度(回転、振動さらには解離)が関わる衝撃波面での熱的非平衡現象の研究について研究を行った。この現象を記述する従来の基礎式は現在でもよく用いられているが、新しい非平衡熱力学からみると不十分である。従来の研究において見落されていた重要な効果が、本研究において見いだすことができたことは特筆すべき実績である。本研究は、宇宙工学の分野で、例えば、惑星大気への探査機の突入時における衝撃波を解析する上などで重要となるであろう。この観点からも、さらに、解析結果を整理する必要がある。(B2)衝撃波構造の研究で、特に、衝撃波面の厚さのマッハ数依存性についても検討を加えた。衝撃波面内部での粘性流および熱伝導などが伴う非平衡現象の解明に取り組んだ。この研究は衝撃波現象の理解とその応用にとって基礎となる。得られた成果は以下のとおりである。(A)多原子分子気体中の衝撃波の内部構造は、分子の内部自由度に強く依存することが実験的に知られている。しかし、この実験結果を説明する満足すべき理論は今まで存在しなかった。本研究において、まず、この実験事実を十分に説明する理論を構築することから取りかかった。いくらかの試行錯誤の後、非常に有望な、拡張された熱力学に基づく理論を構築することに成功した。(B)この理論が、期待通りの性質を持っているのかどうか検討した。具体的には、希薄な二酸化炭素気体中の衝撃波構造に関する実験結果が知られているため、これと理論的予言との整合性を調べた。実験結果は、マッハ数が1から増加するにつれて、衝撃波構造が対称的なものから非対称なものへと変化し、さらにマッハ数が増加するといわゆるサブショックと呼ばれる構造が出現する。これらの事実を全て一貫して説明することは従来の理論ではできなかったが、新しくわれわれが提案した理論では確かに説明可能であり、実験データとの一致もよいことが確認できた。(C)マッハ数がさらに大きくなると、非平衡の度合いが強く増大する。このような強い非平衡状態にも適用可能な、非線型構成式の導出を行った。これを用いた衝撃波構造への応用は次の年度になされる予定である。このような、非線型の拡張された熱力学理論は、今まで知られていなかった。(D)衝撃波に伴う相転移現象、特に気体相から液体相への転移現象を研究するためには、希薄気体とは違って質量密度が大きくなった場合の気体にも適用できる理論を構築する必要がある。このような理論の構築へ向けた研究も大きく進展した。今後これに関するより深い研究がなされる。実在気体、すなわち十分希薄な場合の理想気体モデルでは取り扱えないような現実的な気体中の衝撃波現象を、ミクロからマクロレベルまで統一的観点から、数理工学的に研究した。具体的には、以下の3項目の研究を遂行した。特に、多原子分子気体中の衝撃波の内部構造は、分子の内部自由度(回転や振動)に強く依存することが実験的知られている。しかしこの実験事実を説明する満足すべき理論は今まで存在していなかった。本研究において、まず、この実験事実を十分に説明できる、拡張された熱力学に基づく理論を確立した。さらに、この理論から導かれる結果と実験結果を比較し、われわれの理論が適切であることを具体的に示した。マッハ数が大きくなると衝撃波内部での非平衡の度合いがつよくなるが、このような場合にも適用可能な非線型構成式をもった拡張された熱力学もあわせて構成した。この非線型理論に基づき、最終年度において、非平衡温度の特異な挙動を明確にした。

(2)衝撃波により誘起される相転移現象(気体から液体への相転移)の熱・統計力学的解析を行った。この研究を遂行するためには、希薄気体とは違って質量密度が大きい気体にも適用できる理論を構築する必要があるが、最終年度の研究により、その構築がほぼ終了した。今後、この理論の特徴を的確に理解すると同時に、その工学的な応用も本格化する必要がある。(3)微細流路におけるナノ流れでは流体の揺らぎの効果が無視できないが、そこで発生するミクロレベルでの衝撃波現象を解析するための理論的枠組みの構築を行った。また、その工学的応用についても考察を進めた。さらに、最終年度において、衝撃波現象で重要となる、気体の体積粘性率の微視的起源を、熱的揺らぎ理論を用いることにより明らかにした。実在気体中の衝撃波現象を、ミクロからマクロレベルまでの一貫した観点から、数理工学的に研究した。理論的基礎として拡張された熱力学理論を新たに構築した。(1)衝撃波内部での強い熱的非平衡状態の熱・力学的特性を明確にした。(2)衝撃波により誘起される気体-液体相転移現象の特徴を研究した。(3)ミクロレベルでの衝撃波現象を解析するため、拡張された熱力学に基づく流体力学的揺らぎ理論を確立し、その数値解析を試みた。当初に計画した研究を進める中で、まったく新しい局面が拓けてきたことが大きな理由である。具体的には、以下のような研究成果が得られたことに基づき、「研究目的」の達成度を上記のように評価した。(A)希薄な多原子分子気体中に特徴的な衝撃波構造全てを、ひとつの理論で一貫して説明することに、他に先駆けて成功した。(B)マッハ数が大きく、より非平衡度が大きい場合の衝撃波を解析するための、非線型非平衡理論を、拡張された熱力学により構築することに成功した。このような成果は、この分野で最初になされたものである。この成果により、マッハ数が大きい場合の解析も、高い信頼性をもってなされるようになる。具体的な数値計算による応用などは、来年度の課題として今後なされる。(C)濃密な気体中の衝撃波解析に使える理論の構築に着手することができた。具体的には、濃密な気体中の、体積粘性率の微視的あるいはメゾスコピックな起源が明確になり、どのような熱的揺らぎがこの係数に寄与しているのかが明確になった。この成果は、当初の計画では認識されていなかったことであり、当初の計画以上のものが明らかになってきた。この研究により、今後、濃密な気体、あるいは液体中の衝撃波現象の解析、特に、衝撃波誘起相転移の研究が格段に進展する可能性が拓けた。大きなブレイクスルーが期待できる。(D)多原子分子気体で見られる、温度のオーバーシュートに関して、非平衡温度の考察を行うことにより新しい解釈を加えることができた。従来の理論および実験をこの観点から再検討することが重要なテーマのひとつである。この研究は、衝撃波の研究のみならず非平衡熱力学理論一般においても、基礎的な研究である。数理工学、熱・統計力学、連続体力学前年度の成果を受けて今年度は以下の項目を研究する。(A)希薄多原子分子気体中の衝撃波構造を、前年度に引き続き、詳細に研究する。この際、非平衡温度に関するより深い議論をする。従来までの理論と実験の批判的再検討を行う。
日本語周辺方言における中舌母音の歴史的性格に関する研究

本研究においては、日本語周辺方言における中舌母音の歴史的性格について、研究代表者による調査資料が蓄積されている琉球諸方言及び東北諸方言を中心にして、主として以下の3点について研究を遂行した。1)既存の音声資料の分析に基づく中舌母音の歴史的性格の究明2)新たな臨地調査による中舌母音の歴史に関連した音声資料の補完及び分析3)中舌母音の歴史的性格に関する仮説づくりと仮説の検証1)においては、中舌母音を有する日本語周辺方言から北琉球奄美方言を取りあげ、歴史的に想定される4要因のうちエ段音起源とス・ズ・ツ拍起源の歴史的関係に着目して、Ci・Ce・Cu(C=s・z・c)の奄美方言全体における統合状況を5つの類型に分けて地図化を行い、大野「一つ仮名弁ではない奄美北部方言の歴史的研究」『音声研究(日本音声学会機関誌)』として発表した。また、北奄美における周辺方言の音声的特徴に関して、大野「北奄美周辺方言の音韻的特徴」『岩手大学教育学部研究年報63』を報告した。2)においては、南琉球方言において中舌母音の顕著である波照間島方言と、中舌母音が衰退の途上にある竹富島方言を取りあげ、中舌母音生成に関連した高母音化を含む母音推移の過程で生じた半広母音(特にオ段音)の状況把握と中舌母音化との歴史的関係について音声資料の収集を行った。3)においては、1)において発表した論考及び2)の臨地調査によって得られた資料を踏まえて、琉球方言のみならず本土東北方言等を視野に入れた日本語圏全体の中舌母音生成過程に関する歴史的再構築を行い、岩手大学語文学会第23回研究発表会(2004.7.)において、「ズーズー弁(中舌母音方言)は古いのか、新しいのか?」と題する研究発表を行った。本年度においては、以下の3点について標記研究を遂行した。1)既存の音声資料の分析に基づく中舌母音の歴史的性格の究明2)新たな臨地調査による中舌母音方言資料の補完及び分析3)中舌母音の歴史的性格に関する仮説作りと仮説の修正1)においては、中舌母音を有する日本語周辺方言から北琉球奄美方言を取り上げ、(1)エ段音対応、(2)su・zu・cu対応、(3)連母音ai・ae等対応、(4)隣接中舌拍からの同化、の4つの要因のうちの(1)及び(2)の歴史的関係に着目して、Ci・Ce・Cu(C=s・z・c)の奄美方言全体における統合状況を5つの類型に分けて地図化を行い、大野「一つ仮名弁ではない奄美北部方言の歴史的性格」『音声研究(日本音声学会機関誌)8-1』として発表した。また、北奄美における周辺方言の音声的特徴に関して、大野「北奄美周辺方言の歴史的性格」『岩手大学教育学部研究年報63』を報告した。2)においては、南琉球において中舌母音の顕著である波照間島方言の臨地調査を行い、高母音化に関連した半広母音(特にオ段拍)の状況把握を行った。3)においては、1)において発表した論考及び2)の臨地調査によって得られた資料を踏まえて、琉球方言全体の中舌母音の歴史に関する先行仮説の批判と新たな再構築を行っている。また、本土の東北方言等における中舌母音の歴史の外部指標として、近世におけるタターリノフやレザーノフらの漂流民史料や、古代におけるアイヌ語地名表記の活用の可能性についても検討を進めている。平成1516年度にわたり、下記の3点について標記研究を遂行した。1)既存の音声資料の分析に基づく中舌母音の歴史的性格の究明2)新たな臨地調査による中舌母音方言資料の補完及び分析3)中舌母音の歴史的性格に関する仮説づくりと仮説の修正

1)においては、中舌母音を有する日本語周辺方言から北琉球奄美方言を取りあげ、(1)エ段音対応、(2)su・zu・cu対応、(3)連母音ai・ae等対応、(4)隣接中舌拍からの同化、の4つの要因をうちの(1)及び(2)の歴史的関係に着目し、Ci・Ce・Cu(C=s・z・c)の奄美方言全体における統合状況を5つの類型に分けて地図化を行い、大野「一つ仮名弁ではない奄美周辺北部方言の歴史的性格」『音声研究8-1』として発表した。また、北奄美方言の音声的特徴について、大野「北奄美周辺方言の歴史的性格」『岩手大学教育学部研究年報63』として報告した。2)については、南琉球方言において中舌母音の顕著である波照間島方言と、逆に中舌母音が衰退状況にある竹富島方言を取りあげ、南琉球方言の高母音化に関連した後舌半広母音(オ段音)の残存状況を把握した。3)については、1)及び2)によって得られた資料をもとに、琉球方言及び東北方言を含む日本語の中舌母音の歴史に関する先行仮説の批判と新たな仮説の構築を行い、岩手大学語文学会第12回研究会において大野「ズーズー弁(中舌母音方言)は古いのか、新しいのか?」として口頭発表を行った。
扁桃体による海馬神経新生の調節

本研究では、「扁桃体が海馬の神経新生を左右する」という仮説の実証を試みた。ラットにおいて脳弓-海馬采の切断は、海馬歯状回における神経幹細胞(ブロモデオキシウリジン陽性細胞)が増加した。一方、扁桃体破壊群の海馬歯状回では神経幹細胞数が減少した。これらの結果は、海馬神経新生に扁桃体が関与することを示唆する。海馬の神経細胞が変性脱落して記憶障害が起こるアルツハイマー型認知症に対する本質的な治療のためには、海馬を元に戻す技術が必要になる。近年、完成した大人の海馬には神経幹細胞が存在し、絶えず神経細胞が新生されていることが発見され、神経新生の仕組みをうまく制御できれば、萎縮した海馬を部分的にでも元に戻すことは可能と期待されている。また、豊かな環境で育った動物では海馬の神経新生が活発になる一方で、過度の刺激はストレスを生じ海馬神経新生を阻害すると報告されている。同じ環境刺激でも個人によって受容のしかたは異なり、「快」と判断されたときと「不快」と判断されたときでは海馬新生に対する影響が違うと考えられる。脳の中で感覚情報の価値判断を行うのは「扁桃体」であることから、本研究では「扁桃体が海馬の神経新生を左右する」という仮説をたて、その実証を試みるとともに、そのメカニズム解明と認知症治療への応用を検討することとした。初年度にあたる平成22年度は、in vivoおよびin vitroで海馬の神経新生を定量解析する手法の確立をめざした。増殖性の細胞に取込まれるブロムデオキシウリジン(BrdU)をラットに注射で連投し、一定期間後に動物を灌流固定して脳切片を作成し、抗BrdU抗体と神経細胞のマーカーであるNeuNに対する抗体を用いた免疫染色により神経新生を定量することができた。また、ラット胎児海馬の細胞を分離培養し、既報の手順に従ってneurosphereを作成し、神経幹細胞を継代培養することができた。ただし、収率やその特性などが培養ごとに差があり、薬物効果を評価できるように安定供給するには培養条件の再検討が必要と思われた。次年度からは確立された手法を用いて、扁桃体の関与ならびに海馬神経新生を促す化合物の探索に着手したい。海馬が変性脱落して記憶障害が起こるアルツハイマー型認知症を本質的に治療するには、海馬を元に戻す技術が必要になる。近年、大人の海馬にも神経幹細胞が存在し絶えず神経細胞が新生されていることが発見され、この仕組みをうまく制御できれば、萎縮した海馬を部分的にでも元に戻すことは可能と期待されている。同じ環境刺激でも「快」と判断されたときと「不快」と判断されたときでは海馬新生に対する影響が違うと考えられる。2年目にあたる平成23年度は、まずin vivoにおける海馬の神経新生について「増殖」と「分化」を区別して定量解析する手法を確立した。具体的にはマウスまたはラットにブロムデオキシウリジン(BrdU)を注射で連投し、24時間後あるいは28日後に灌流固定して脳切片を作成し、抗BrdU抗体と神経細胞のマーカーであるNeuNに対する抗体を用いた免疫染色により増殖細胞および分化した新生細胞数を定量することができた。扁桃体の関与を明らかにするため、海馬采あるいは扁桃体を破壊した影響を調べている。また、ラット胎児海馬の細胞を分離培養して作成されたneurosphereより神経幹細胞を継代培養し、神経幹細胞の増殖におよぼすいくつかの化合物群の効果を検討したところ、フィセチンをはじめとするフラボノイド群に有効性を認めた。化学構造を変えた誘導体をテストすることで、より効果的に海馬神経新生を促進する化合物を発見したいと考えている。海馬の神経細胞が変性脱落するアルツハイマー病の本質的治療には、海馬を元に戻す技術が必要になる。近年、完成した大人の海馬には神経幹細胞が存在し、絶えず神経細胞が新生されていることが発見された。脳が備えた神経新生の仕組みをうまく制御できれば、萎縮した海馬を部分的にでも元に戻すことは可能だろう。また豊かな環境で育った動物では、海馬の神経新生が活発になると報告されている。脳の中で感覚情報の価値判断を行うのは「扁桃体」であることから、本研究では「扁桃体が海馬の神経新生を左右する」という仮説をたて、その実証を試みた。計画3年目(最終年度)にあたる平成24年度は、これまでに確立したin vivo海馬神経新生の定量解析法を応用し、海馬の神経幹細胞に対する脳弓-海馬采(FF)ならびに扁桃体破壊の影響を検討した。

ラットを麻酔下で脳定位固定装置に固定し、脳座標に従って両側のFFを切断し、2週間の回復期間を経た後に実験に供した。増殖性細胞に取り込まれるブロモデオキシウリジン(BrdU)を腹腔内投与し、その24時間後にパラホルムアルデヒド溶液で経心還流固定してから脳を摘出した。脳スライスに抗BrdU抗体を用いた免疫染色を施して顕微鏡観察したところ、海馬歯状回におけるBrdU陽性細胞細胞数がFF切断によって増加する傾向が認められた。一方、扁桃体については、麻酔下で電極を刺入して通電(1.5 mA、10秒)することにより破壊した。BrdUの腹腔内投与24時間後に動物を経心還流固定してから脳を摘出し、脳スライスに抗BrdU抗体を用いた免疫染色を施して観察したところ、扁桃体破壊群の海馬歯状回ではBrdU陽性細胞数が減少する傾向が認められた。今後さらに解析を進めることで海馬神経新生における扁桃体の関与を明らかにできると期待された。当初計画していた生体での海馬神経新生を定量解析する手法は確立できた。また培養系の実験で、海馬神経新生を促進できると思われる新化合物を見出すことができた。これらの成果を統合して計画を進めれば、順調に進展すると期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね順調に進展しているので、当初計画どおりに進めることが第一である。ただし、生体での海馬神経新生の定量解析には時間がかかるので、多群間での相違を調べるのは困難かもしれない。検討課題を絞り込むことによって効率的な解決を図りたい。
空間制御型量子ビーム誘起反応よる有機汚染物質の分解

ナノ空間を反応場、高エネルギー電子線パルスを量子ビームトリガーとする空間制御型量子ビーム誘起反応による有機汚染物質の分解の基礎研究を行った。ナノ秒過渡吸収パルスラジオリシスのシステムを高度化することにより紫外から近赤外領域でのシングルショット測定が可能となった。ジセレナイドラジカルアニオンの解裂機構を明らかにした。薄膜中ナノ空間に包接した有機化合物の量子ビーム誘起反応において親水および疎水部位ナノ空間反応場選択性を見出すことができた。電子線パルスラジオリシス過渡共鳴ラマンシステムを構築した。チオアニソール誘導体の一電子酸化活性種の振動構造を解析し、反応性との関係を明らかにした。薄膜対応透過型psns電子線パルスラジオリシスシステム構築のため、平成25年度ナノ秒過渡吸収パルスラジオリシス測定システムの高度化を行った。電子線照射による試料の劣化、短い分析光路長によるS/N比が低下を抑制するため、広波長領域でのシングルショット電子線照射過渡吸収システムを立ち上げた。本補助金により測定系オシロスコープの新規購入、測定制御コントローラの更新した。フォトダイオードアレイ(290から900 nm)とInGaAsピンフォトダイオード(900-1600 nm)検出器との組み合わせにより同一光学系紫外近赤外領域での過渡吸収測定が連続的かつ簡便に行うことが可能となった。また分析光取込光ファイバーの新規設置により、S/N比を大幅に向上させることができた。光路長2mmにおいてもシングルショットパルスラジオシス測定が達成できた。高度化したナノ秒パルスラジオリシス装置は、薄膜材料や、不安定な生物などの試料への適用も可能となり、空間制御型パルスラジオリシスへの発展が実現化された。一方、パルスラジオリシス過渡共鳴ラマン分光システムを立ち上げた。水溶液のパルスラジオリシスは水の放射線分解で生じるヒドロキシルラジカルの反応によりSCNダイマーラジカルアニオンやBrダイマーラジカルアニオンなどの酸化活性種を生成させ、そのS-SやBr-Brの振動スペクトルを時間分解能5 nsでとらえることに成功した。ナノ秒パルスラジオリシスにおいて時間分解過渡吸収分光と時間分解共鳴ラマン分光を組み合わることにより、放射線化学で生成する短寿命活性種の詳細な分子構造を調べられるようになった当該年度、ナノ空間への基質の包摂を試みた。高透過性・耐量子ビーム性・相分離高次構造を持つNafionの主鎖疎水性領域と側鎖末端親水性イオンクラスター領域の各ナノ空間に選択的に基質を包接させ、ナノ空間場の環境の違いよる基質の取り込みの違いを明らかにした。基質はチオアニソール誘導体について検討した。また各空間に基質の特性を反映した選択的包摂が観測された。昨年度立ち上げた薄膜パルスラジオリシス過渡吸収測定システムにより、ナノ空間内包摂基質の選択的量子ビーム誘起短寿命活性中間体を観測した。Nafion量子ビーム誘起反応において、親水性イオンコア内では水を介する間接的一電子酸化反応が、疎水性コア内では主鎖のイオン化に由来する直接的一電子酸化反応が観測された。溶液中とは異なる反応性も観測された。ナノ反応場における選択的量子ビーム誘起反応機構を明らかにできた。昨年度構築したパルスラジオリシス共鳴ラマン分光システムにより、各種溶液中における量子ビーム誘起短寿命活性中間体の振動分光を行った。各種溶液中いずれもシングルから100ショット程度の測定で非常に良好な結果が得られた。Nafion膜に包摂された基質のパルスラジオリシス共鳴ラマン分光を行った。基質一電子酸化反応中間体のみならずNafion膜に由来する量子ビーム誘起振動分光測定に成功した。振動分光をより詳細に検討するため、理論計算ソフトを購入し振動構造の帰属を開始した。平成27年度は反応場制御量子ビーム誘起有機汚染物質分解への実用化のための、基礎的研究を進めた。溶液、薄膜中様々な環境下における有機汚染物質の量子ビーム誘起反応の初期的活性種の構造と反応性を明らかにすることを目的とした。(1)パルスラジオリシスにおける紫外近赤外領域での過渡吸収測定では、溶液中パルスラジオシスにおいて一昨年達成した2mm光路長シングルショットパルスラジオリシスシステムをさらに高度化し、1mm光路長シングルショットパルスラジオリシス過渡吸収測定に成功した。これにより紫外領域測定で課題とされていた基質の吸収によるプローブ光量の低下が改善され高濃度溶液においても320 nmからの高感度過渡吸収測定が可能となった。薄膜パルスラジオリシスにおいても膜厚200 μmからの過渡吸収測定が可能となった。(2)有機汚染物質(チオアニソール誘導体)の水溶液中パルスラジオリシス過渡ラマン分光で観測された活性種チオアニソールモノマーラジカルカチオンの振動モードを、昨年購入した理論計算ソフトにより解析し、活性種の振動構造を帰属することができた。過渡吸収では解析できない活性種の振動構造の違いを明らかにすることができた。モノマーラジカルカチオンの二量化反応におけるモノマーラジカルカチオンの振動構造との関係を明らかにした。(3)ラマン不活性な振動構造を明らかにするためにパルスラジオリシス過渡赤外吸収分光システムの立ち上げを開始した。レーザー過渡赤外吸収分光において、時間分解300 nsで、4000-800 cm-1の領域での測定が可能となった。ラジカル種、励起種の振動構造の測定に成功した。パルスラジオリシスシステムへの拡大を進めている。

溶液、薄膜中パルスラジオリシス測定の高度化により、過渡吸収測定においては、量子ビーム誘起有機汚染物質分解のための基礎研究が順調に進んでいる。77 Kから室温まで広い温度領域でのシングルショット測定が可能となり、照射試料へのダメージも大幅に抑制され、再現性の高いデータが得られている。溶液中パルスラジオリシス過渡ラマン分光においても、理論計算の導入により、有機汚染物質チオアニソール誘導体活性種の振動構造を明らかにすることができ、S原子やO原子が活性種におよぼす影響を明らかにすることができた。薄膜や様々なナノ反応場におけるパルスラジオリシス過渡ラマン分光も進行中である。量子ビーム誘起反応による分解の基礎過程を明らかにする目的で、有機汚染物質としてチオアニソール誘導体をモデル化合物とし、最終年度パルスラジオリシス過渡共鳴ラン分光法による量子ビーム誘起チオアニソール誘導体ラジカルカチオンの振動分光を行い、pー置換基による振動構造の違いを明らかにした。量子ビーム誘起チオアニソール誘導体ラジカルカチオンの過渡吸収スペクトルはいずれも同じ領域に吸収を有し、またラジカルカチオンの反応によって生成するダイマーラジカルカチオンの過渡吸収とも類似していることから、チオアニソール誘導体ラジカルカチオンの置換基効果を得ることはできていなかったが、チオアニソール誘導体ラジカルカチオンの振動構造を明らかにすることにより、セミキノイド型ラジカルカチオンとキノイド型ラジカルカチオンの2種の構造の存在とp-置換基の関係を明らかにすることができた。さらにセミキノイド型ラジカルカチオンでは効率的な二量化でダイマーラジカルカチオン生成が進行するのに対し、キノイド型ラジカルカチオンでは二量化が進行しなかった。チオアニソールのp-置換基がラジカルカチオンの構造と反応性に大きく影響することを明らかにした。新たな理論計算法の導入により高い精度で、チオアニソールラジカルカチオンの共鳴過渡ラマンシグナルの帰属をするこができた。空間制御型量子ビーム誘起反応による有機汚染物質の分解おける基礎過程を明らかにすることができた。また得られた結果は量子ビーム照射による有機汚染物質の分解への発展のみならず、生体内での抗酸化過程において重要な役割を担っている硫黄化合物の酸化反応中間体の構造解明への発展が期待された。ナノ空間を反応場、高エネルギー電子線パルスを量子ビームトリガーとする空間制御型量子ビーム誘起反応による有機汚染物質の分解の基礎研究を行った。ナノ秒過渡吸収パルスラジオリシスのシステムを高度化することにより紫外から近赤外領域でのシングルショット測定が可能となった。ジセレナイドラジカルアニオンの解裂機構を明らかにした。薄膜中ナノ空間に包接した有機化合物の量子ビーム誘起反応において親水および疎水部位ナノ空間反応場選択性を見出すことができた。電子線パルスラジオリシス過渡共鳴ラマンシステムを構築した。チオアニソール誘導体の一電子酸化活性種の振動構造を解析し、反応性との関係を明らかにした。シングルショット薄膜対応透過型パルスラジオリシスシステムによりナノ空間選択的包摂基質の各包摂部位における量子ビーム誘起活性中間体の観測に成功している。
メリステム形成・維持に必須な細胞接着関連遺伝子の同定と機能解明

茎頂や根端などのメリステムにおいては、細胞は高い分裂活性を維持しつつ周囲の細胞群と常に接し、緊密な情報交換を行っている。そのためには、強い細胞同士の接着が必須である。この細胞間の接着が時空間的にどのように制御されているのかを知ることは、高等植物の形態形成現象、特にメリステムの形成と維持の機構を理解するうえで欠かすことができない。しかし現在のところ、細胞接着の主役であるペクチンの生合成機構に関する知見は極めて乏しい。半数体Nicotiana plumbaginifoliaの葉切片にアグロバクテリウムを介してT-DNAを導入し、不定芽形成能力の喪失と共に細胞接着性の低下した変異体を作出した。そのうちnolac-H18株において、変異の原因遺伝子として新規糖転移酵素遺伝子=NpGUT1(glucuronyltransferase 1)が同定された。NpGUT1は、ペクチン多糖にグルクロン酸を転移する新規酵素をコードするペクチン合成に関わる初めての遺伝子で、頂端分裂組織で特に発現が強かった。また、変異体のペクチンではホウ素を介した分子間架橋が形成されなかった。次に、NpGUT1::GUS形質転換タバコを用いて、生育ステージによる発現解析を行ったところ、NpGUT1は、球状胚、心臓型胚、魚雷型胚といった若いステージの種子胚の全体、発芽直後の子葉・茎頂、芽生えの茎頂および篩部・維管束形成層で発現を示した。花においては、タペート組織、成熟花粉、花粉管の先端部、花柱の伝達組織において発現が見られた。
色彩・蛍光性脂肪族ポリエステルの創成と機能評価

ポリエステルはカルボニル基の禁制遷移のため、発光機能やデバイス応用の研究は皆無であった。マロン酸エステル化合物は励起状態での分子内プロトン移動(ESIPT)を起こす。そこで酸性メチレンを含有する脂肪族ネットワークポリエステルフィルムを作製し、精密な熱反応性プロセッシングにより、青色発光機能の付与と微細構造の簡便形成を実現した。また、蛍光性ポリエステルの微細パターニングによるバイオチップへの応用を見込んで、予備検討として非常に簡便な蛍光性ポリマーの蛍光イメージパターニング技術を開発した。(PACIFICHEM2005/韓国高分子学会2005年度春季総会招待講演にて発表)1.ネットワークポリエステルフィルムの作製:ペンタエリトリトールと2当量のジエチルマロン酸エステルのバルク重合体から、無色透明かつ柔軟な自立膜を作製した。2.青色発光機能の付与:作製したポリマー自立膜を空気中240°C、4時間加熱すると、300450nmの吸収帯が著しく増大し、無色透明から淡黄色へ変化した。加熱によりポリマーマトリックス中の活性メチレン部位とカルボニル基が自己縮合型クネフェナゲル反応し、新たな共役構造が形成した。さらに加熱処理膜は325nm以上の波長励起で非常に強い緑青蛍光(極大波長450nm)を示し、ポリマーマトリックス中に形成された共役構造からのESIPT現象が放射機構として起こった。3.微細構造の簡便形成:プレポリマーのキャスト後、フィルムを240°Cでポスト重合すると直径数10-100μmのシリンダー状のピンホールがフィルム中に形成され、エッジ部分から強い蛍光を発した。ポリマーマトリックス(n=1.5@400nm)と周辺の空気(n=1.0)からなるシリンダー状の面発光共振器構造形成によるもので、今後プラスチックレーザーへ応用できる。3.蛍光イメージパターニング:蛍光顕微鏡下でフォトマスクを利用し、非常に強い蛍光を示す二置換アセチレンポリマー薄膜から線幅数ミクロンしかない非常に微細な蛍光イメージパターニングを可能にする技術を確立した。脂肪族蛍光性ポリエステルにも適用可能である。ポリエステルはカルボニル基による禁制遷移のため、発光機能の付与やデバイス応用の研究は皆無であった。マロン酸エステル化合物はプロトンドナーとアクセプターの役割が可能な酸性メチレンとカルボニル基の両方を分子内に有するため、励起状態での分子内プロトン移動(ESIPT)を起こす。(第53回高分子学会年会討論会/第13回高分子材料フォーラムにて発表)1.脂肪族ネットワークポリエステルフィルムの作製:ペンタエリトリトールと2当量のジエチルマロン酸エステルをバルク重合させ、無色透明のオイル性ガム状のプレポリマーを得た。さらに、溶媒キャスト後、150°Cでポスト重合させ無色透明かつ柔軟な自立膜を作製した。3.微細構造の簡便形成;プレポリマーのキャスト後、フィルムを240°Cでポスト重合すると直径数10-100μmのシリンダー状のピンホールがフィルム中に形成され、エッジ部分から強い蛍光を発した。3.微細構造の簡便形成:

プレポリマーのキャスト後、フィルムを240°Cでポスト重合すると直径数10-100μmのシリンダー状のピンホールがフィルム中に形成され、エッジ部分から強い蛍光を発した。ポリマーマトリックス(n=1.5@400nm)と周辺の空気(n=1.0)からなるシリンダー状の面発光共振器構造形成によるもので、今後プラスチックレーザーへ応用できる。3.蛍光イメージパターニング:蛍光顕微鏡下でフォトマスクを利用し、非常に強い蛍光を示す二置換アセチレンポリマー薄膜から線幅数ミクロンしかない非常に微細な蛍光イメージパターニングを可能にする技術を確立した。脂肪族蛍光性ポリエステルにも適用可能である。
含ケイ素σ結合の活性化による触媒的シリレン種の発生:有機ケイ素化合物合成の新展開

安定で取扱容易な含ケイ素反応剤から触媒的にシリレン等価体を調製し、ケイ素元素を高い効率で有機分子に導入する新手法の開発を目的として研究を実施した。平成22年度は、交付申請書に記載した研究項目「触媒的シリレン発生法を用いた有機ケイ素化合物の合成法開発」の一環として、まず「アルケニルインドールとの反応」について詳細な検討を行った。重水素化したインドールを用いて反応を検討したところ、特徴的なアリル位重水素の移動が観測された。また、反応はアルケン部位の構造と置換位置に大きく影響を受けることが明らかになり、インドール5員環部の芳香属性を失う[4+1]環化付加と、炭素-水素結合へのシリレンの挿入反応に基づき芳香属性が再生する異性化の、2つの特徴的な素反応過程が関与していることを見出した。次に上述したインドールの検討で得た知見を基に、「アルケン置換複素環状化合物との反応」への展開を検討した。アルケニル基が置換したベンゾフランおよびベンゾチオフェンと(アミノシリル)ボランの反応を検討したところ、リン配位子を有するパラジウム触媒を用いることで、脱芳香族化を伴ったシリレンとの[4+1]環化付加が効率よく進行することを見出した。本反応で生成した環状ケイ素化合物の変換反応を検討したところ、キノンを用いた酸化条件に付すことにより、シロール構造へ効率よく変換できることを明らかとした。以上、本年度の研究により従来のフリーシリレンを経由する反応では達成困難な、複素環状化合物の効率的かつ特徴あるシリル化が実現した。本成果はケイ素が関与する触媒反応の新設計指針となり、シロールに代表される機能性有機ケイ素化合物の創出に資すると考えられる。有機ケイ素化合物は安定性と適度な反応性を兼ね備えた有用な合成中間体である一方、有機ケイ素化合物自体の物性に対する関心も近年高まりつつあり、その簡便かつ高選択的な合成法の開発は急務である。本研究では、ケイ素元素を高い効率で有機分子に導入する新手法の開発を行った。既に明らかとしている、ケイ素上にジアルキルアミノ基を有するシリルボランが遷移金属触媒存在下シリレンの合成等価体として反応する、という知見を基に、平成20年度は、(a)触媒およびシリルボランの構造と反応効率の相関を解明することによる、1,3-ジェンとの高効率炭素-ケイ素結合形成、および、(b)生成する2,5-ジヒドロシロールを用いた二置換シロール合成への応用、に取り組んだ。まず項目(a)において、ケイ素上に種々のジアルキルアミノ基を有するシリルボランを合成し検討を行った結果、ジエチルアミノ基を有するシリルボランを用いた場合に、シリレン種の発生と炭素-ケイ素結合形成が最も効率的に進行することが明らかとなった。また、触媒構造の最適化を行った結果、ジメチルフェニルホスフィンを配位子に有するパラジウム触媒が最も効果的であることを見出した。最適条件下、様々な1,3-ジエンとの反応を行い、2,5-ジヒドロシロールを最高94%の収率で得ることができた。次に(b)において、2,5-ジヒドロシロールのキノン酸化を検討したところ、高収率で対応するシロールに変換できることを見出した。シロールは蛍光性の代表的な含ケイ素機能性材料であり、本手法により、従来では合成困難な置換様式である、異なる二種の芳香環を有する2,4-二置換および2,5-二置換シロールが合成できたことから、新規物性に対する興味がもたれる。既に明らかとしている、ケイ素上にジアルキルアミノ基を有するシリルボランが遷移金属触媒の存在下、シリレンの合成等価体として反応するという知見を基に、平成21年度の研究では、「種々の置換様式のアルケンと(アミノシリル)ボランのパラジウム触媒による反応」を行った。特にアルケンとして、(a)エチレンおよび、(b)アルケニルインドールを用いた場合について反応を検討したところ、従来の熱分解や光反応から発生させたフリーシリレンとは異なった反応性を有することを見出した。(a)では、シリレン等価体3分子とエチレン2分子の間で炭素-ケイ素およびケイ素-ケイ素結合形成反応が進行し、1,2,5-トリシラシクロヘプタンが生成したのに対し、(b)ではシリレン等価体のジエン部位での[4+1]環化付加と炭素-水素結合への挿入が連続的に進行し、二つのシリル基を有するインドールが生成することを、それぞれ明らかとした。今回の検討により、本反応系で形成されるパラジウム-シリレン種は、従来の熱反応や光反応から発生させたフリーシリレンとは異なった、特徴的な反応性を有することが明らかとなった。今後、このパラジウム-シリレン種についてさらに検討を進めることにより、有機ケイ素化合物の有用な新合成法開拓が期待できる。

平成22年度は、交付申請書に記載した研究項目「触媒的シリレン発生法を用いた有機ケイ素化合物の合成法開発」の一環として、まず「アルケニルインドールとの反応」について詳細な検討を行った。重水素化したインドールを用いて反応を検討したところ、特徴的なアリル位重水素の移動が観測された。また、反応はアルケン部位の構造と置換位置に大きく影響を受けることが明らかになり、インドール5員環部の芳香属性を失う[4+1]環化付加と、炭素-水素結合へのシリレンの挿入反応に基づき芳香属性が再生する異性化の、2つの特徴的な素反応過程が関与していることを見出した。次に上述したインドールの検討で得た知見を基に、「アルケン置換複素環状化合物との反応」への展開を検討した。アルケニル基が置換したベンゾフランおよびベンゾチオフェンと(アミノシリル)ボランの反応を検討したところ、リン配位子を有するパラジウム触媒を用いることで、脱芳香族化を伴ったシリレンとの[4+1]環化付加が効率よく進行することを見出した。本反応で生成した環状ケイ素化合物の変換反応を検討したところ、キノンを用いた酸化条件に付すことにより、シロール構造へ効率よく変換できることを明らかとした。以上、本年度の研究により従来のフリーシリレンを経由する反応では達成困難な、複素環状化合物の効率的かつ特徴あるシリル化が実現した。本成果はケイ素が関与する触媒反応の新設計指針となり、シロールに代表される機能性有機ケイ素化合物の創出に資すると考えられる。
神経細胞の恒常性を維持するMKK7-JNK経路の解析

神経ネットワーク中において、JNK活性がいつ、どこで、どの程度変化するのかを、神経細胞の初代培養を用いて生細胞で評価する。JNK活性をMKK7 cKOマウス由来の神経細胞と比較し、MKK7によるJNK活性制御機構の数理モデルを立てることで、JNK活性制御の重要反応を推定する。MKK7-JNK経路を制御する分子を網羅的手法により同定することで、MKK7が神経細胞でJNK活性を制御する分子機構の詳細を明らかにする。得られた知見に基づきMKK7-JNK経路の活性を変化させることで、神経細胞の応答がどのように変化するか、神経細胞の恒常性維持機構にどのような影響を与えるかを検証する。
ES細胞の樹立におけるインプリンティングの役割

胚盤胞からのES細胞樹立の機構を解析するため、インプリンティングに着目して以下の研究を遂行した。1ES細胞樹立時のインプリンティングの動態と機構:雌性および雄性単為発生胚と、それらの胚からのES細胞樹立過程を対象に、遺伝子発現変化を解析した。その結果、胚盤胞の培養1週間という比較的短期間にインプリンティングの破綻が生じ、特に雄性発現遺伝子の両アレル性発現が生じていた。さらに、このとき両アレル性発現を獲得する父性アレル発現遺伝子をノックダウンするとES細胞の増殖が顕著に低下することも見出した。これらの遺伝子が両アレルから発現することで、発現量が増加し、ES細胞の増殖がさらに進行することが示唆されている。また、このインプリンティング遺伝子の発現をリアルタイムで観察できるレポーターマウスの樹立を行った。2インプリンティング破綻しないES細胞樹立の試み:ES細胞細胞の樹立・維持には分化に機能するMEKとGSK3bの阻害剤(2i)が用いられるが、2iはエピジェネティック修飾にもゲノムワイドな影響を与えることが明らかになっている。そこで、2iのうち、特に、DNAメチル化転移酵素の発現に関連するMEK阻害剤の使用を最低限にした、新規のES細胞樹立・維持方法の開発を試みた。いくつかの阻害剤を用いない培養方法を試行したところ、MEK阻害剤を用いず、GSK3b阻害剤を減量した培養条件(LowGiL条件)でもES細胞が維持可能なことを見出した。一方で、LowGiL条件ではES細胞の樹立は不可能であった。ES細胞樹立過程で破綻するインプリンティング遺伝子の同定、機能解析などは順調に推移している。また、インプリンティング遺伝子発現をモニターできるレポーターマウスの樹立は成功した。インプリンティングを維持したES細胞樹立の試みも順調に進行しており、LowGiL条件という新規のES細胞維持手法を発見した。この条件は、ES細胞の樹立は不可能だが維持は可能という特徴を有しており、この研究を進展することでES細胞の樹立機構の一端を明らかにできると考えている。Tet1欠損マウスを用いた実験は、交配の効率の問題などから若干遅れているが、全体としては、概ね順調に進展している。ES細胞におけるインプリンティング遺伝子の機能を明らかにするため、複数の遺伝子を組み合わせた機能欠損ES細胞の樹立などを試みる。また、Tet1欠損マウスやレポーターマウスを用いたES細胞細胞樹立の解析も粛々と進める計画である。さらに、LowGiL法で樹立したES細胞や、樹立過程で生じている遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析する計画である。ES細胞は着床前初期胚の胚盤胞を培養することによって樹立されるが、片アレル性遺伝子発現を示すインプリンティング遺伝子はこの樹立過程でインプリンティングを喪失して両アレル性遺伝子発現を示すことがわかっている。この生理的意義と分子機構は不明であった。そこで、まず、いつ、どのようにインプリンティング喪失が生じているのかを明らかにするために、樹立過程における遺伝子発現プロファイルを解析した。胚盤胞とES細胞のRNAシーケンシングの結果を解析すると、父性発現遺伝子のインプリンティング喪失が顕著であったことから、母性ゲノムしか有しない雌性単為発生胚盤胞をES細胞樹立用の培地で培養し、遺伝子発現を解析した。その結果、インプリンティングの喪失は培養開始2-3日ですでに認めらていた。インプリンティング喪失を野生型で、単一細胞レベルで詳細に解析するために、ES細胞において特に発現が高い父性発現遺伝子Phf17遺伝子に緑色、赤色蛍光タンパク質遺伝子を挿入したレポーターマウスの作製を開始し、それぞれのレポーターマウスの樹立に成功した。胚盤胞の時点でいずれかのインプリンティングを全く持たない単為発生胚からES細胞の樹立を行うと、樹立効率が雌性、雄性単為発生胚の両方で効率が低く、その傾向は特に雄性単為発生胚で顕著であった。Phf17を欠損したES細胞は増殖に顕著な低下が認められることから、インプリンティングの喪失は生体外で安定した増殖を実現するための基盤として機能している可能性が示唆された。ES細胞樹立の過程でのインプリンティング喪失のタイミングの同定、父性発現インプリンティング遺伝子Ph17の発現をそれぞれのアレルで異なる蛍光タンパク質の発現でモニターできるレポーターマウスの樹立、Phf17のノックアウトによる増殖低下の表現型の確認、単為発生胚からのES細胞樹立の解析などを完了することが出来、概ね順調に進展していると評価できる。

いくつかの阻害剤を用いない培養方法を試行したところ、MEK阻害剤を用いず、GSK3b阻害剤を減量した培養条件(LowGiL条件)でもES細胞が維持可能なことを見出した。一方で、LowGiL条件ではES細胞の樹立は不可能であった。ES細胞樹立過程で破綻するインプリンティング遺伝子の同定、機能解析などは順調に推移している。また、インプリンティング遺伝子発現をモニターできるレポーターマウスの樹立は成功した。インプリンティングを維持したES細胞樹立の試みも順調に進行しており、LowGiL条件という新規のES細胞維持手法を発見した。この条件は、ES細胞の樹立は不可能だが維持は可能という特徴を有しており、この研究を進展することでES細胞の樹立機構の一端を明らかにできると考えている。Tet1欠損マウスを用いた実験は、交配の効率の問題などから若干遅れているが、全体としては、概ね順調に進展している。今後はインプリンティング破綻が樹立の過程でどのようなタイミングで、どのような機構で生じているのか、を明らかにするために、Phf17レポーターマウスを用いた解析を行う。まずは父母アレルで異なるレポーターを有する胚盤胞を回収し、培養過程でどのようにインプリンティング破綻して二重陽性となっていくのか、そのような細胞はどのような性質を有しているのかを免疫染色や単一細胞RNAシーケンシングなどを通じて解析する。また、なぜインプリンティングが破綻しているのかを明らかにするために、エピジェネティック状態の制御因子の発現動態を解析し、ノックダウンや強制発現実験、さらに培養条件の検討などを行ってインプリンティングが維持されているES細胞の樹立を試みる。また、単為発生胚からのES細胞樹立の効率低下がどのような機構で生じているのかも明らかにするために、単為発生胚と受精胚で異なる遺伝子発現を解析し、責任因子の同定を試みる。ES細胞におけるインプリンティング遺伝子の機能を明らかにするため、複数の遺伝子を組み合わせた機能欠損ES細胞の樹立などを試みる。また、Tet1欠損マウスやレポーターマウスを用いたES細胞細胞樹立の解析も粛々と進める計画である。さらに、LowGiL法で樹立したES細胞や、樹立過程で生じている遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析する計画である。