hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペルオキシレドキシンIノックアウトマウスによる口腔癌リンパ節転移の解析

本年度は、これらのマウスの生物学的特性を調べるため、前年度に引き続き交配を行いノックアウトマウスのホモタイプを製作した。その際、ジェノタイプの決定はPCRでおこなった。PrxIノックアウトマウスは、外見や妊孕性、行動などは異常がみられなかった。マウスは実験可能な数まで増殖させ、C57/BL6とのバッククロスを繰り返しマウスのゲノムのバックグラウンドをそろえた。また、腫瘍の転移の実験を開始した。腫瘍の肺転移モデルには、マウスメラノーマ由来癌細胞株のB16細胞の系を用いた。培養したB16細胞を5x10^5個ずつ、それぞれワイルドタイプ、ノックアウトヘテロタイプ、ホモタイプマウスのマウスフットパットに移植し、移植部の腫瘍の大きさ、膝のリンパ節転移、肺への転移の数を測定したところ、ワイルドタイプマウスでは腫瘍は浸潤性に増殖し、リンパ節へ転移し、6週間後には肺に転移が見られたが、PrxIノックアウトマウスでは、ヘテロタイプ、ワイルドタイプとPrxIの発現が消失していく順に腫瘍細胞は生育せず、腫瘍の消失が見られた。さらに肺の転移数も減少した。以上、生体におけるPrxIと腫瘍のリンパ節の関連について、PrxIが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。一方、PrxIノックアウトマウスの解析と同時に、すでに誕生している、PrxIとおなじ転写因子Nrf2によって制御をうけている酸化ストレスタンパク質A170のストレス応答の解析も行い、PrxIノックアウトマウスの予備実験とした。前年度までにジーントラップ法により得られたESクローンについてPrxIノックアウトマウスを完成させ、マウスメラノーマ由来癌細胞株のB16細胞の系を用いて実験をおこなったところ、PrxIノックアウトマウスでは、ヘテロタイプ、ワイルドタイプとPrxIの発現が消失していく順に腫瘍細胞は生育せず、腫瘍の消失する現象が見られた。今年度は、これらの結果を確認するためC57BL/6とのバッククロスを繰り返しマウスのゲノムのバックグラウンドをそろえ、移植部の腫瘍の大きさ、膝のリンパ節転移、肺への転移の数を測定したところ、腫瘍は浸潤性に増殖しリンパ節へ転移し、6週間後には肺に転移が見られたが、PrxIノックアウトマウスとワイルドタイプマウスの間には有意な差が認められなかった。また、細胞株をLLC細胞に変え、3x10^6個ずつ、それぞれワイルドタイプ、ノックアウトヘテロタイプ、ホモタイプマウスのマウスフットパットに移植し、移植部の腫瘍の大きさ、膝のリンパ節転移、肺への転移の数を5週後に測定したが、明らかな差がみられなかった。さらに、マトリゲルに混入したB16細胞をマウスの皮下に移植し、血管増生能をしらべたところ、血管増生能には明らかな差が見られなかった。以上、生体におけるPrxIと腫瘍のリンパ節の関連についてはメラノーマ細胞固有のマウスの遺伝的背景に左右される現象で、必ずしもPrx Iが重要な役割を果たしているかについては不明である可能性が示唆された。一方、Prx Iノックアウトマウスが赤血球に異常を生じることから、同様に血球の変異が現れるGATA-1転写因子についても、トランスジェニックマウスを用いて検討をおこない、GATA-1遺伝子のN-フィンガードメインが重要であることも見いだした。
コンタミネーションを抑制したスターラーレス微小量液滴撹拌技術の開発

電界による吸引力を用いてnLからμLオーダーの液滴を温度上昇無く、かつ非接触(スターラーレス)で簡便に撹拌する電界撹拌技術を開発している。本研究期間内では、基本的な撹拌の挙動観察を行い、本撹拌の特徴を、印加電圧、印加周波数等をパラメータとして評価した。さらに、この撹拌を抗原抗体反応を迅速化させる技術として応用し、今まで出来なかった手術中にがんの特性を把握可能な免疫組織染色を可能にした。そして抗原抗体反応の迅速化メカニズムを検討し、撹拌により抗原と抗体との接触頻度が高まること、電界印加で液中の抗体が分散することによって抗原抗体反応が迅速化するという2つのメカニズムについて実験的に明らかにした。当年度は、簡易的な交流高電場印加液滴挙動観察装置(本装置の上電極はITO(透明電極膜付)ガラスを用いることによって上部からも液滴挙動が観察できる装置となっている)を用いて、電界印加による微小液滴の基本的な挙動観察、溶液内部の挙動観察を行い、印加電圧や印加周波数をパラメータとして、定量的に電界印加によるスターラーレス撹拌技術の特徴を明らかにした。具体的には、まず動力計を用いて、電界印加により発生する力を定量的に測定・評価した。また、電界印加によって液滴が最大の振幅を示す共振周波数について、液量と液滴の底面直径の観点から調査した。さらに、本撹拌技術が液温度に及ぼす影響について評価した。結果として、印加電圧(電界強度)と吸引力とは比例関係が成り立ち、印加電圧は吸引力の大きさに影響を与えることが明らかになった。次に、液滴が共振する周波数については、液滴重量が軽い微小液滴ほど、共振周波数が高くなり、液滴が上下する振動特性に優れていることを明らかにした。従来、微小量液滴では乱流を生じさせ難いということであったが、この結果より、本撹拌技術においては液滴重量が軽い少量の液滴ほど、撹拌性に優れていることを明らかにした。また、温度については本撹拌技術による液滴温度の上昇は無く、タンパク質や組織の変性の恐れが無いという特徴を得ることができた。さらに、本撹拌中に液滴内部で微粒子が示す挙動観察実験を炭酸カルシウム粒子を用いて行った。観察結果から算出した粒子速度と印加電圧との関係から、印加電圧に対して,粒子速度は対数的に上昇し、無電界に対して、3kVにて約1200倍の粒子速度が上昇することを確認した。これより、電界印加によるスターラーレス撹拌により微粒子の粒子速度が加速されることが明らかになった。また、良好な撹拌再現性を導くためのリング状はっ水コート材の開発も行い、開発に成功した。当年度は、昨年度開発が遅れていた、新たな交流高電場印加液滴挙動観察装置を製作した。これは従来用いていた簡易的なシステムを大幅に改良し、様々な動作、撹拌環境に対応した装置である。従来モデルでは、上下固定された平行平板のみの環境でしか電界撹拌できず、液滴は上下運動のみであった。そこで新たに開発した装置では、更なる撹拌の効率化のために、自動制御により液滴に左右運動や円弧運動を与えることが出来るものであり、尚且つ温度コントロールユニットが搭載され、撹拌温度環境も制御できる装置である。本装置を用いて通常の固定平行平板における電界撹拌よりさらに効率的な撹拌が可能か検討した。従来の固定並行平板において、スライドガラスを置く下部電極側を3パターン、プログラムにより自動制御させた。3パターンとは、まずX軸方向に往復させたパターン、傾斜往復させたパターン、そしてX軸と傾斜往復を複合されたパターンである。磁性ナノビーズを用いて、30秒撹拌し、粒子の撹拌状態を調査した結果、従来の固定平行平板に比べ、3パターンにおいていずれもよりナノビーズが拡散しているのがわかった。下部電極側を動かすことによって従来方法より、高効率な撹拌が行われたと考えられる。さらに、交流高電場印加が、内容物に及ぼす影響を調査した。電界撹拌させたTEバッファーのpH、電気伝導率、ORP電位を詳細に測定し、電界撹拌前後でわずかながら差異があることを発見した。昨年度開発が遅れていた、新たな交流高電場印加液滴挙動観察装置も開発し、さらに当年度の目標である交流高電場印加が、内容物に及ぼす影響の調査も粛々と行っているため。昨年度まで免疫組織染色の迅速メカニズムを解明するために、抗体模擬粒子や実際の蛍光たんぱく質抗体を用いて挙動観察実験を行い、撹拌により抗原と抗体との接触頻度が高まることで染色品位が向上するというメカニズムを実験的に明らかにした。本年度は、抗原抗体反応が更なる迅速化、さらには撹拌領域拡大に向けた電極形状を検討した。結果として、電極を多極化させることで、液滴を吸引する力は半分になり、また、電極間距離が短くなり、電場の強度が上がることによるシナジー効果により、撹拌効率が良り、免疫染色結果も向上することがわかった。そして、比較的大きな組織に対応するべく、撹拌領域拡大に向けた電界集中電極形状の最適化について検討した。撹拌領域を拡大すると、従来の平行電極では撹拌は困難となる。

そこで今回新たな7種類の電界集中形状の電極を製作し、ナノビーズを用いて電界撹拌を行い、拡散の度合いを数値化した。その結果、電界を4か所に集中させる凸部を有する電極で撹拌効率が良いことがわかった。さらに、電界撹拌技術の新たな展開としてIn situハイブリダイゼーション(ISH)の迅速化へ応用するための試薬蒸散抑制に関する実験を行った。従来方法では、通常7時間から18時間を要する検体遺伝子と既知のプローブDNAが結合するハイブリダイゼーション工程に電界撹拌技術を適応し3時間に短縮、さらには抗原抗体反応工程にも電界撹拌技術を適用して、DISH法の短縮技術を開発した。ここで、今回開発したDISH法におけるハイブリダイゼーション工程にて、長時間に渡る電界撹拌において試薬の蒸散という課題が顕在化した。そこで、この課題を解決する蒸散抑制剤の選定やその粘度の最適化に関する検討を行い、低粘度の流動プパラフィンを用いることで高速ハイブリダイゼーションが可能であるということがわかった。電界による吸引力を用いてnLからμLオーダーの液滴を温度上昇無く、かつ非接触(スターラーレス)で簡便に撹拌する電界撹拌技術を開発している。本研究期間内では、基本的な撹拌の挙動観察を行い、本撹拌の特徴を、印加電圧、印加周波数等をパラメータとして評価した。さらに、この撹拌を抗原抗体反応を迅速化させる技術として応用し、今まで出来なかった手術中にがんの特性を把握可能な免疫組織染色を可能にした。そして抗原抗体反応の迅速化メカニズムを検討し、撹拌により抗原と抗体との接触頻度が高まること、電界印加で液中の抗体が分散することによって抗原抗体反応が迅速化するという2つのメカニズムについて実験的に明らかにした。従来用いていた簡易的なシステムを大幅に改良し、様々な撹拌条件に対応できる交流高電場印加液滴挙動観察装置の開発が遅れているため。しかし、交付申請書に記載した研究の目的の液滴挙動メカニズムの解明、リング状はっ水コート材の開発は達成している。今年度は、新たな交流高電場印加液滴挙動観察装置も開発し、さらに当年度の目標である交流高電場印加が、内容物に及ぼす影響の調査を行った。平成28年度は抗原抗体反応の更なる迅速化のための電場集中電極形状と最滴条件の開発と電場の影響を積極的利用した新たな反応プロセスの開発を行う。機械工学平成26年度は、電界印加によるスターラーレス撹拌技術の特徴を明らかにした。平成27年度は、被撹拌物質の内容物の方に着目し、交流高電場印加が、内容物に及ぼす影響を調査し、そのメカニズムを解明する。最終年度として抗原抗体反応の更なる迅速化のための電場集中電極形状と最滴条件の開発、さらに電場の影響を積極的利用した新たな反応プロセスの開発を行うため。次年度使用額が生じた理由として、簡易的な観察システムの大幅改良を行わなかった事が挙げられる。また、当助成金を旅費として使用する回数が少なかったことも挙げられる。抗原抗体反応が更なる迅速化するような電極形状を考案、製作する。また、本技術の更なる展開の模索と広く周知させるため、旅費を使用する。上下電極の回転運動かつ往復運動可能な機構を備えて、さらに上下電極を数度傾けられる機構を備えた交流高電場印加液滴挙動観察装置を開発する。また、本技術の更なる発展と周知のために旅費を使用したいと考えている。
CD271を発現する肺扁平上皮がんの解析と治療戦略への応用

肺癌幹細胞性の発揮を関わるCD271の解析を行った。CD271をノックダウンすると腫瘍形成が著明に抑制された。同時に細胞周期がG0にて停止すること、MAPK(Erk)シグナルが減少することが示された。G0アレスト誘導には、CDKN1Cの発現上昇が重要であることが示された。実際にCDKN1のノックダウンによりG0アレストが部分解除された。一方、CD271ノックダウンは細胞遊走を著明に抑制したが、この抑制はエフェクター分子RhoAによることが示唆された。CD271の下流シグナルは複数存在し、細胞増殖と細胞遊走を別個に制御していた。CD271は肺癌治療の標的となりうる分子であると考えられる。本課題では、扁平上皮がんのがん幹細胞(CSC)マーカーとして同定されたCD271に着目し、肺扁平上皮がん幹細胞における機能解析と臨床応用に取り組む。特に、1肺がん「がん幹細胞」の機能発現におけるCD271細胞内ドメインの果たす役割は何か?、2がん幹細胞性の発揮に関わるエフェクター分子および複合体は何か?3CD271の活性化するパスウェイおよび標的遺伝子は何か?、4CD271を標的とした特異的治療法の開発は可能か?の4点を検討する。まず第一にCD271シグナル解析を行った。細胞内領域欠損体(dC)およびDeath Domain欠損体(dDD)を作成し、これらCD271変異体を用いて細胞増殖に関与するかを調べたところ、dCでは増殖が抑制されることが示唆された。細胞内ドメインにおいて、DD領域以外が細胞増殖に関与していた。そこで、扁平上皮癌細胞株を用いてCRISPR/Cas9法によりCD271欠損細胞樹立を試みている。一方、CD271の標的遺伝子を同定するため、CD271陽性分画と陰性分画にソーティングしマイクロアレイ解析を行った。シグナル伝達および細胞周期関連の遺伝子群に変動が認められたため更に詳細な解析を加える予定である。さらに、CD271会合分子の解析のためCD271にOne-Streptタグを付加したコンストラクトを作成した。網羅的プロテオミクス解析に向けた準備を進めている。ほぼ予定通り進んでいる。肺扁平上皮がん幹細胞におけるCD271の機能解析と応用に向けた基礎解析に取り組んだ。肺がん「がん幹細胞」の機能発現におけるCD271細胞内ドメインの果たす役割、がん幹細胞性の発揮に関わるエフェクター分子、CD271の活性化するパスウェイおよび標的遺伝子について検討した。CD271をノックダウンすると腫瘍形成が著明に抑制されたことから、CD271の必要性が示された。Erk阻害薬を添加したところ、細胞増殖を著明に抑制したことなどから、同経路の関連が示唆された。さらに、CD271ノックダウンにより、細胞周期がG0にて停止すること、MAPK(Erk)シグナルが減少することが示された。さらに、G0アレストに重要なCDKN1Cが発現上昇していた。CDKN1のノックダウンを更に行ったところ、G0アレストが部分的に解除された。一方、CD271ノックダウンは細胞遊走を著明に抑制したが、この抑制はエフェクター分子であるRhoAによることが示唆された。したがって、CD271の下流シグナルは複数存在し、細胞増殖と細胞遊走を別個に制御していることが示唆された。この事実はCD271が癌治療の標的であることを強く示唆していると考えられた。計画通り進める予定である。変更はない。呼吸器腫瘍学順調に研究が進んだため。当初予定通り全額使用する予定である。
看護実践能力の育成に関する体験型学習の要因分析と活用‐身体侵襲を伴う技術教育から

身体侵襲を伴う看護技術の体験型学習の学習効果を検討した結果、援助的人間関係の形成の方法を修得できる学習方法であり、この援助的人間関係の形成の方法の修得は、身体侵襲を伴う看護技術の実地体験と看護実践能力の形成及び育成に関係する要因であることが示唆された。現在、身体侵襲を伴う看護技術教育については、倫理的配慮等によりモデルや模擬患者が検討されているが、今後、実地体験できる環境を検討していく必要がある。1.目的:看護基礎教育カリキュラムにおいて,看護学実習は欠かせない科目であり,そこでは学習者である看護学生の対人関係が重要な役目を果たしているが,その対人関係がもたらす学生の学習効果についての検討は,まだ不十分である。本研究では,身体侵襲を伴う看護技術の実地体験が看護実践能力の形成及び育成に関係するかどうか明らかにすることである。そこで,H19年度は,体験型学習により得られる学習の成果と体験実施に伴う心身の侵襲について検討することに重点をおいた。2.方法:看護学生に身体的・心理的侵襲を与える経鼻的胃管挿入の体験型学習と体験学習に対する質問紙調査を実施した,自由回答による「学生の思い」の既存の内容を質的に分析した。さらに,身体侵襲を伴う看護技術の実地体験と看護実践能力に関する調査を実施した。3.結果と考察:身体侵襲を伴う看護技術の体験型学習は,援助的人間関係の形成の方法を修得できる学習方法であり,看護学生が感じる心理的侵襲の有無によって学習到達度は影響しないことが明らかになった。高島尚美ほか(2004)が,新人看護師の看護実践能力は,社会的スキルを含めた「対人関係」が基盤となっており,それと平行して対象把握を含めた問題解決能力が成長することを述べていることから,身体侵襲を伴う看護技術の実地体験は,看護実践能力の育成に関係する学習方法であり,その要因は援助的人間関係の形成の方法の修得である。以上より,身体侵襲を伴う体験型学習は,学生の心理的侵襲に対する感じ方や個別性により学習目標の到達は影響を受けるが,教員が心理的侵襲に対する対処と,他の学生との学びの共有を意識した働きがけをすることにより,学生が自らの振り返りから問題解決過程に進むことができ,学習目標は到達できることが示唆された。これらの結果をふまえて,身体侵襲を伴う看護技術の実地体験と看護実践能力に関する調査の分析を進行していく。【目的】本研究の目的は、身体侵襲を伴う看護技術の実地体験が看護実践能力の形成及び育成に関係するかどうかを検討することである。H20年度は、身体侵襲を伴う看護技術の体験学習効果と卒後の看護実践能力に関する調査を分析し、看護実践能力の育成に関係する要因と今後の課題を明らかにする。【方法】(1)看護実践能力に関する調査:対象)胃管挿入の体験型学習を実施した看護師54名、看護学生時に身体侵襲を伴う看護技術の体験型学習を未実施の看護師14名。調査内容)身体侵襲を伴う看護技術の体験型学習が実践の場で役に立つと思うか否か、看護学教育に必要と思うか否か(2)オーストラリアの看護基礎教育と臨床現場の視察調査【結果・考察】体験型学習の実施者54件については、回収数30件、未回収24件、回収率55.6%であった。体験型学習の未実施者14件については、回収数11件、未回収3件、非該当2件、回収率78。6%であった。身体侵襲を伴う看護技術の体験型学習の実地体験と看護実践能力の関係について分析した結果、身体侵襲を伴う看護技術の体験型学習の実施者は、卒後も援助的人間関係の形成に関する学びの修得が看護師生活に大きく影響していることが示唆された。それに比して、体験型学習の未実施者は、体験型学習は看護師としての実践の場に役立ち、看護基礎教育に必要と考えていたが、その理由には、知識・技術の修得や就職後の不安の軽減などの看護師としての立場に対する期待があることが明らかになった。本研究結果は、体験型学習の実施者に対する比較対象者数が限られた数での検討であったので、研究を継続し体験型学習の大学教育への具体的な活用方法を明らかにしていく必要がある。オーストラリアの看護基礎教育と臨床現場の教育体制については、看護実践力の向上に看護基礎教育機関と臨床現場が協力している現状が明らかになったので、日本への活用方法を今後も検討していく。
ゼオライト中のアルカリ金属クラスターの電子構造に関する軟X線分光による研究

本研究は,ゼオライト中のアルカリ金属クラスターの電子構造を,明らかにするすることを目的としている.平成15年度準備した試料作成のための真空ラインを更に拡充し,真空に引きながら,ゼオライト骨格中に多数分布する水分を加熱除去出来るようにした.16年度はさらに,クラスターを作成する前の,ゼオライトそのものの状態に着目し,遠赤外領域のスペクトルにより,陽イオンの挙動を調べた.また,15年度測定を行った軟x線発光分光及び光電子分光の結果を更に詳細に検討した.本年は得られた成果を物理学会及び国際会議で発表した.本研究は,ゼオライト中のアルカリ金属クラスターの電子構造を,軟X線分光で直接観測することを目的としている.本年度は,試料を作成するための真空ラインの作成,及び,KやNaを吸蔵したゼオライトSODの軟X線発光分光・光電子分光測定を行った.ゼオライト結晶は大気中で多量の水分を含む.試料作成の際は,真空中でゼオライトを加熱脱水し,そのままガラス管に封入しなくてはならない.本年度,この行程を行うための真空ライン及び真空ポンプを整備した.来年度以降,測定に使う試料を本研究所で自前で作成できるようになる.また,本年度,軟X線分光に用いたゼオライトSOD中には,内径約0.7nmの球形の細孔が体心立方構造で配列している.SODにKやNaを吸蔵させ,クラスターを細孔と同じ周期で配列させた試料は,磁性金属を全く含まないにも拘わらず,71K,48Kで半強磁性転移を示す.SOD中のアルカリ金属クラスターは,他のゼオライト中のアルカリ金属クラスターに比べると,大気に若干安定であるため,本年度,測定に取り上げた.試料を大気にさらさないための専用のトランスファーロッドを作成して測定チャンバーに輸送し,軟X線発光分光と光電子分光を試みた.その結果,光電子分光スペクトルにゼオライト骨格のヴァレンスバンドが観測された.骨格のヴァレンスバンドを観測した例はまだ他に報告されていない.また,発光スペクトルには,Kを吸蔵させたSOD試料において,Kクラスターのクラスター準位によると思われるバンドを観測した.今後,試料のハンドリングを更に工夫して試料の劣化を極力抑え,クラスター準位によるバンドである確証を得たいと考えている.また,今回は試料のチャージアップを防ぐために,光電子スペクトルの分解能を下げざるを得なかった.この点も工夫して,分解能を上げた測定を行う予定である.本研究は,ゼオライト中のアルカリ金属クラスターの電子構造を,明らかにするすることを目的としている.昨年度準備した試料作成のための真空ラインを更に拡充し,真空に引きながら,ゼオライト骨格中に多数分布する水分を加熱除去出来るようにした.今年度はさらに,クラスターを作成する前の,ゼオライトそのものの状態に着目し,遠赤外領域のスペクトルにより,陽イオンの挙動を調べた.また,昨年度測定を行った軟x線発光分光及び光電子分光の結果を更に詳細に検討した.アルミノ珪酸塩であるゼオライトは,Si,Al,Oから骨格構造ができており,電荷補償のための陽イオンが骨格の隙間に分布している.骨格構造と陽イオンとは結合状態が異なるため,赤外活性モードの波数領域が異なっている.100^-200cm-1の遠赤外領域には,骨格構造の振動モードはあまり観測されず,陽イオンのモードが多く観測される.今回は,100μm程度の大きな単結晶が得られるゼオライトMORに着目し,遠赤外顕微分光を行った.測定はSPring-8,BL431Rの顕微分光ステーションで行った.MORは,結晶のc軸方向に一次元チャンネルを持っており,構造が異方的である.チャンネルに平行な偏光と垂直な偏光を指定した顕微分光を行った結果,偏光方向により波数の異なる陽イオンの振動モードを観測した.今後,アルカリを吸蔵させた試料における遠赤外測定も行い,電子状態と振動モードとの関係を調べる予定である.昨年度測定した軟X線発光分光ではKを吸蔵させたゼオライトSODにおいて,吸蔵Kに由来すると思われる構造を観測した.この構造は,細孔中に形成されたKクラスターの状態を反映している可能性があるため,今後,Kを吸蔵させた試料と未吸蔵の試料との比較,Kの吸蔵量を変えた試料との比較などを行い,クラスター準位によるバンドである確証を得たいと考えている.本研究は,ゼオライト中のアルカリ金属クラスターの電子構造を,明らかにするすることを目的としている.平成15年度準備した試料作成のための真空ラインを更に拡充し,真空に引きながら,ゼオライト骨格中に多数分布する水分を加熱除去出来るようにした.16年度はさらに,クラスターを作成する前の,ゼオライトそのものの状態に着目し,遠赤外領域のスペクトルにより,陽イオンの挙動を調べた.また,15年度測定を行った軟x線発光分光及び光電子分光の結果を更に詳細に検討した.本年は得られた成果を物理学会及び国際会議で発表した.
ヒストン脱アセチル化酵素HDAC3に着目した抗うつ効果機構の解明

標準的な薬物療法に抵抗する難治性の抑うつ状態は、気分障害、甲状腺機能低下症、その他の精神疾患でしばしば認められ、患者の日常活動を著しく障害するだけでなく、自殺行動に至るなど、新しい治療法の開発が医学的・社会的急務となっている。我々はこれまでに抗うつ薬が共通して有する部位特異的なヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)2, 3, 5への薬理効果を明らかにしている。先行文献ではMS-275などの非選択的HDAC阻害薬の全身投与において抗うつ効果を示すことが報告されていることから、HDACの機能抑制が抗うつ効果の発現に重要であるという説が世界的に主流の考えであるが、HDAC阻害薬による効果が直接的HDACの阻害作用なのか間接的な作用で抗うつ効果を示すのか、いずれの脳部位においての作用なのかについて詳細な作用メカニズムは判っていない。本研究では、神経細胞において特に発現強度が高く、大脳皮質、扁桃体、海馬といった情動制御に関連した脳部位局在性をもつHDAC3がうつ病の神経機能異常に深く関与するのではないかと考え、HDAC3が抗うつ効果の作用機構に重要な役割を有するかを明らかにすることを目的に研究を行っている。先行文献にて報告されている非選択的HDAC阻害薬による抗うつ効果は、HDAC2、HDAC3の一方における選択的制御によって表現される行動学的変化ではないことを我々はH28年度に検出しており、H29年度には社会敗北ストレスによってもたらされる抑うつ関連行動(強制水泳試験、尾懸垂試験)を指標とし、HDAC2阻害薬、HDAC3阻害薬を投与することによる変化について検討を行った。本研究計画では脳の局在的HDAC変化と抑うつ関連行動の関連性を明らかとすることを目的としているが、先行文献にて報告されている非選択的HDAC阻害薬による抗うつ効果は、HDAC2、HDAC3の一方における選択的制御によって表現される行動学的変化ではないことを我々はH28年度に検出しており、研究期間を1年間延長し、HDAC2の機能についてより詳細な検討を行う行動薬理試験をH29年度に実施した。H29年度までに行動薬理試験と脳のサンプル回収を終えており、H30年度には生化学的研究を行える段階にある。行動薬理試験の後、扁桃体、線条体、前帯状皮質、海馬などにおけるタンパクレベルでのHDAC2, HDAC3の発現変化、ヒストンアセチル化レベルの変化を明らかとする。本年度の研究では社会敗北ストレスモデルが研究を行うに適する抑うつモデルマウスであるかを確認することから始めた。その結果、10日間の社会敗北ストレス刺激が33日間にわたり有意な抑うつ行動をもたらすことを、行動薬理試験(強制水泳試験、尾懸垂試験、スクロース嗜好試験)を用いて確認した。そこで社会敗北ストレスモデルを用いて抗うつ効果の検討を行うことにした。同モデルに対して、Vehicle、抗うつ薬、HDAC3阻害薬(RGFP966)を投与することによる行動薬理学的影響に関して検出をこれまでに行った。先行文献にて報告されている社会敗北ストレスモデルが本研究実験系における抑うつモデルとしての妥当性を有することが、研究計画の根幹として重要であったが、先行研究とも一致する行動薬理学的変化を確認することができた。本研究計画では行動薬理試験と脳の局在的HDAC発現レベルの変化を検出する生化学的研究を主軸としているが、H28年度までに行動薬理試験と脳のサンプル回収を終えており、H29年度には生化学的研究を行える段階にある。

先行文献ではMS-275などの非選択的HDAC阻害薬の全身投与において抗うつ効果を示すことが報告されていることから、HDACの機能抑制が抗うつ効果の発現に重要であるという説が世界的に主流の考えであるが、HDAC阻害薬による効果が直接的HDACの阻害作用なのか間接的な作用で抗うつ効果を示すのか、いずれの脳部位においての作用なのかについて詳細な作用メカニズムは判っていない。本研究では、神経細胞において特に発現強度が高く、大脳皮質、扁桃体、海馬といった情動制御に関連した脳部位局在性をもつHDAC3がうつ病の神経機能異常に深く関与するのではないかと考え、HDAC3が抗うつ効果の作用機構に重要な役割を有するかを明らかにすることを目的に研究を行っている。先行文献にて報告されている非選択的HDAC阻害薬による抗うつ効果は、HDAC2、HDAC3の一方における選択的制御によって表現される行動学的変化ではないことを我々はH28年度に検出しており、H29年度には社会敗北ストレスによってもたらされる抑うつ関連行動(強制水泳試験、尾懸垂試験)を指標とし、HDAC2阻害薬、HDAC3阻害薬を投与することによる変化について検討を行った。本研究計画では脳の局在的HDAC変化と抑うつ関連行動の関連性を明らかとすることを目的としているが、先行文献にて報告されている非選択的HDAC阻害薬による抗うつ効果は、HDAC2、HDAC3の一方における選択的制御によって表現される行動学的変化ではないことを我々はH28年度に検出しており、研究期間を1年間延長し、HDAC2の機能についてより詳細な検討を行う行動薬理試験をH29年度に実施した。H29年度までに行動薬理試験と脳のサンプル回収を終えており、H30年度には生化学的研究を行える段階にある。行動薬理試験の後、扁桃体、線条体、前帯状皮質、海馬などにおけるタンパクレベルでのHDAC3の発現変化、ヒストンアセチル化レベルの変化を明らかとする。行動薬理試験の後、扁桃体、線条体、前帯状皮質、海馬などにおけるタンパクレベルでのHDAC2, HDAC3の発現変化、ヒストンアセチル化レベルの変化を明らかとする。本研究系は行動薬理試験と生化学的実験の2つの実験系からなる。本年度は行動薬理試験を主軸に研究計画を実施し、動物購入と飼育経費、試薬に関する消耗品を購入したが、生化学的実験に比べて必要となる費用に差が生じたものである。H30年度は本年度までに回収した脳を用いて、生化学的研究を行う。ウエスタンブロッティングの試薬や器具の購入、成果報告にかかる費用を支出する予定である。H29年度は本年度に回収した脳を用いて、生化学的研究を行う。
糖鎖を識別するレクチンおよびモノクロ-ン抗体の精密構造認識とその応用

昨年度報告したキカラスウリレクチンTJAーIとTJAーIIの糖結合特異性をさらに解析するため、それぞれNeuAcα2→6Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc_<OT>(LSTーC_<OT>),Fucα1→2Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc_<OT>(LNFーI_<OT>)を用いて平衡透析を行なった。Scatchardplot法により、TJAーIは1モル当たり4つの均一な結合部位を有し、LSTーC_<OT>に対する結合定数は8.00×10^5M^<-1>、一方TJAーIIは1モル当たり2つの均一な結合部位を有し、LNFーI_<OT>に対する結合定数は3.05×10^5M^<-1>であることが明らかになった。また両レクチンとも結合している糖鎖はManα1→6(Manα1→3)(±Xy1α1→2)Manβ1→4GlcNAcβ1→4(±Fucα1→3)GlcNAcで、植物に広く分布しているアスパラギン結合型糖鎖であった。さらにメチルーβーガラクトシドとの相互作用を^1HーNMRで解析した。TJAーIではガラクト-スのHー2,3,4,5,6、特にHー4が最も線幅が広くなることから、Hー4がレクチンの結合部位に最も接していると推定された。一方、糖結合特異性の極めて類似しているカブトムシレクチン(Allo AーII)はHー1,3,5の線幅が著しく広くなり、これはβーガラクト-スの下面がレクチンの結合部位に接していることを示しており、レクチンの糖認識機構が極めて複雑であることが示唆された。明らかになったTJAーIとイヌエンジュレクチン(MAL)の糖結合特異性を組合せることによって、Siaα2→6Galβ1→4GlcNAcとSiaα2→3Galβ1→4GlcNAcとの識別が可能となった。一方、TJAーIIはType1H鎖とType2H鎖、Sd抗原決定基を認識しており、Type2H鎖を認識するハリエニシダ(UEAーI)とSd抗原決定基を認識するフジレクチン(WFA)を組合わせることにより、この3種の糖鎖の識別が出来るようになった。これらの識別は少糖の還元末端のトリチウム標識法を改良することにより1pmolで可能となった。
半導体-金属接触構造のヘリウム準安定原子と吸着キセノン光電子による微視的研究

半導体表面上へ異種原子が吸着して薄膜へと成長する過程において、そのごく初期段階で現れる多様な原子構造変化の電子論的メカニズムを理解するために、吸着キセノン光電子分光によって最表面の局所原子構造をモニタ-しながら、準安定原子脱励起分光(MDS)によって半導体表面-金属原子間の結合に寄与する電子状態を追跡する。本年度実施した研究内容は以下の通りである。1.新しい原理(アルカリ金属原子との電荷移行衝突)に基づくヘリウム準安定原子ビ-ム源の試作。2.吸着キセノン光電子分光のための真空紫外光源の製作。3.現有の準安定原子脱励起分光装置を用いて、アルカリ金属吸着Si表面最外層の局所電子状態の抽出を行った。その結果、(1)Si(100)表面へのK吸着過程に対して、得たMDSスペクトルから、金属吸着子の真空側沖合における局所電子状態密度が、金属吸着被覆度に依存して変化すること。また、飽和吸着に近づくに従い、吸着層の凝縮に伴って電子状態が金属的なものへ移行することを直接示した。(2)次に、この様にして形成された金属吸着表面が他の原子・分子に対していかに活発な働きかけをするかを、K及びCs吸着Si(100)表面の酸素取り込み過程に対するMDSスペクトルで実証した。即ち、ごく微量の酸素露出によってK4S^^或いはC_S6S^^強度が急激に減少することから、吸着金属原子の価原子軌道から電子が完全に流出することが判明した。分子の解離・吸着を促進させる金属吸着子の役割は、この局所的な(下地を介してではない)電荷移行にあることを確めた。
太陽系初期における揮発性元素の挙動-隕石中の希ガスの主要担体Qの徹底解明-

我々は、「Qは太陽系前駆物質のダイヤモンド表面にイオン化された希ガスが打ち込まれ、結晶構造の乱された相である」とのモデル(プラズマモデルあるいは大阪モデル)を提唱している。この基盤研究(A)の主たる目的はこのモデルの検証でもあった。この研究の結果、以下のようなことがわかった。1.Huss et al.(1996)の研究によれば、Qは普通コンドライトの岩石学タイプがあがるにつれて、減少されるが、プリソーラーダイヤモンドの方がより熱変成に弱いとされている。我々の研究では、水質変成では、この耐性が逆になり、Qの方がダメージを受けやすいことがわかった。2.化学処理ではなく純粋に物理的な方法で、希ガスの濃縮成分を分離する技法は、我々が炭素質隕石について世界で初めて見つけたものだが、同じ技法を普通コンドライトのHコンドライトに適用して実験を行なった。そのフラクションの分離に成功し、希ガス測定を行ったが、希ガスは入っていない事がわかった。3.鉄隕石Canyon Diabloのグラファイト包有物について、Qの存在を確認、また、新たな希ガス成分(El Taco Xe)があることを見つけた。4.QがSiCではないかという作業仮説のもとに、実験室内で希ガス雰囲気下でのSiCの合成実験を行った。SiCの薄い層だけにあるとすると大変な濃縮率になることがわかった。5.アレンデ隕石から純粋に物理的な手法により分離された希ガス濃縮成分について、コロイドに成りやすさ、密度の相違などによる分離を行い、どのようなフラクションにQなりプリソーラーダイヤモンドが濃縮しているかを調べた。それによれば、密度は1.65±0.04g/cm^3のフラクションにQとプリソーラーダイヤモンドが濃縮していることがわかった。この試料のSIMSによる測定からは、ほとんどが炭素物質であることもわかった。Qにおける軽元素の同位体比を精密に決定するため高感度高精度の安定同位体用質量分析計を導入した。炭素や窒素の同位体比測定について、基本データを取って調整を行っている最中である。今年度はこの立ち上げが中心であった。また、以下のような研究も行った。1、アレンデ隕石から純粋に物理的な手法により分離された希ガス濃縮成分について、コロイドに成りやすさ、密度の相違などによる分離を行い、どのようなフラクションにQなりプリソーラーダイヤモンドが濃縮しているかを調べた。Qとプリソーラーダイヤモンドはどのフラクションにおいても同じで、大変強くカップリングしていることもわかった。これについて、現在論文を執筆中。2、化学処理ではなく、純粋に物理的な方法で分離する技法は、これまで炭素質コンドライトだけに応用されている。この方法が、普通コンドライトにも適用できるかどうか、Hコンドライトで実験を行ったが、なかなか分解が進まないこともわかった。3、QがSiCではないかという作業仮説のもとに、実験室内で希ガス雰囲気下でのSiCの合成実験を行い、希ガスの取りこまれ方(元素存在度、同位体効果など)を調べた。4、フラーレンの合成実験も行い、SiCと同じく、希ガスの取りこまれ方(元素存在度、同位体効果など)を調べた。5、Heの精密測定のための標準試料を作成した。神戸隕石の希ガス分析も行った。今年度は、以下のような研究を行った。

1、アレンデ隕石から純粋に物理的な手法により分離された希ガス濃縮成分について、コロイドに成りやすさ、密度の相違などによる分離を行い、どのようなフラクションにQなりプリソーラーダイヤモンドが濃縮しているかを調べた論文を投稿したが、その論文がようやく受理された。2、安定同位体のマスの立ち上げが終り、ダイヤモンド、グラファイト、フラーレンなどについての燃焼実験の結果を論文にまとめた。ダイヤモンド、フラーレンは完全燃焼するが、グラファイトは完全燃焼しないことがわかった。カルサイトを含む天然の岩石学試料についても実験を行い、無酸素状態でカルサイトの選択的分解が可能であることなどをしめした。これについては、論文を投稿した。3、化学処理ではなく純粋に物理的な方法で、希ガスの濃縮成分を分離する技法は、我々が炭素質隕石について世界で初めて見つげたものだが、同じ技法を普通コンドライトにも適用できるかどうか、Hコンドライトで実験を行なった。そのフラクションの分離に成功し、希ガス測定を行った。4、QがSiCではないかという作業仮説のもとに、実験室内で希ガス雰囲気下でのSiCの合成実験を行った。SiCの薄い層だげにあるとすると大変な濃縮率になるが、さらに研究が必要である。結果については論文にまとめるのを準備中である。5、市販のフラーレンで合成条件のわかっている試料について、希ガスの取りこまれ方(元素存在度、同位体効果など)を調べた。6、Heの精密測定のための岩石の標準試料の測定を行った。今年度は、以下のような研究を行った。1.安定同位体のマスの立ち上げが終り、ダイヤモンド、グラファイト、フラーレンなどについての燃焼実験の結果を論文にまとめた。これについては、論文が受理された。2.化学処理ではなく純粋に物理的な方法で、希ガスの濃縮成分を分離する技法は、我々が炭素質隕石について世界で初めて見つけたものだが、同じ技法を普通コンドライトのHコンドライトに適用して実験を行なった。そのフラクションの分離に成功し、希ガス測定を行ったが、希ガスは入っていない事がわかった。アレンデのような炭素質隕石CVでは成功したのに、普通コンドライトでは成功しないことがわかったが、このことがQの性質に関係しているのかも知れない。3.おなじ炭素質隕石であるCMのマーチソン隕石について、純粋に物理的な方法で、希ガスの濃縮成分を分離する技法を適用して分離を試みた。これまでのところ、そのフラクションの分離に成功したが、希ガス測定はまだ行っていない。4.鉄隕石Canyon Diabloのグラファイト包有物について、Qの存在を確認して、新たな希ガス成分(El Taco Xe)があることを見つけた。5.希ガスの担体は炭素質物質であることから、希ガス雰囲気下で、炭素蒸着する装置を組みあげ、その希ガスの取り込み効率、炭素同位体比の分別効果などを調べた。今年度は以下のような研究を行った。
富士山周辺湧水の年代測定と地下水流動系の解明

地下水の流動系の解明に時間情報は不可欠となってきているが、わが国では分析の問題もあり、必ずしも十分でなかった。本研究では、核実験起源のトリチウム、そのトリチウムと壊変してできたヘリウム、塩素36、さらに人為起源であるフロンガスをトレーサーとして、富士山周辺の地下水、湧水の年代測定を行い、各測定法の整合性、長所・短所、課題などを検討するとともに、他のトレーサー情報とともに富士山の地下水流動系について考察した。本研究では、富士山を主な研究地域とし、複数のトレーサーを利用した年代測定法<CFC法、トリチウム-ヘリウム法、塩素36法>を確立、適用し、地下水、湧水の絶対年代を求めることを目的としている。とれらの3つの方法で、同一のサンプルを測定し、各測定法の精度、長所、短所を明らかにする。また、ケイ素の時間情報についても同時に検討する。なお、基礎的な検討を行うため、ドイツのオーデル川低地も研究対象地域とする。19年度は、フロンガスによるCFC法の採水、分析法をほぼ確立し、いくつかの地域で分析、推定した年代/滞留時間はこれまでの研究とほぼ整合したが、対象地域のフロン濃度の時系列の推定方法の重要性が判明した。塩素36についても、前処理法などの改良を含め、天然レベルの濃度を分析できる段階に来ている。年代を推定するための基礎となる塩素36の時系列については、グリーンランドの氷床コアの時系列を基本に、ドイツのオーデル川低地での濃度とトリチウム-ヘリウム法による年代との関係、つくばの地下水および降水のデータより、スケーリングファクター法により復元をした。富士山において、30地点で一般水質、水素・酸素安定同位体などを分析するとともに、塩素36の予備的な分析を行い、十数年50年以上という滞留時間を得た。推定値はこれまでの報告値とほぼ一致したが、地下水流動系と合わせて考察することが必要である。2007年11月に再度採水を行い、CFC法と塩素36法の同時分析を現在行っている。次年度のトリチウム-ヘリウム法による分析の準備も行った。これらの3つの方法で、同一のサンプルを測定し、各測定法の精度、長所、短所を明らかにし、これを元に富士山の地下水流動系を解明する。20年度は、36Cl法、CFC法については、前処理方法、分析精度の確立がほぼできたので、解析に必要な濃度の時系列の精度を向上させるため、できるだけローカルな分析値を収集するとともに、降水や大気中の濃度を分析した。フロンガスによるCFC法の採水、分析法をほぼ確立し、いくつかの地域で分析、推定した年代/滞留時間はこれまでの研究とほぼ整合したが、対象地域のフロン濃度の時系列の推定方法の重要性が判明した。トリチウム-ヘリウム法の適応は、ヘリウムガスの分析を行い、火山起源のヘリウムの寄与なども検討したが、トリチウムの分析が未完のため、年代の推定は次年度となった。富士山山麓において、数十地点で一般水質、水素・酸素安定同位体などを分析するとともに、塩素36、CFCの分析を行い、十数年50年以上という滞留時間の推定値を得た。推定値はこれまでの報告値とほぼ一致したが、一部の地域では、整合性のない推定値が得られ、供給源の検討や、地下水流動系と合わせて考察することが必要である。また、地表起源の硝酸イオンと窒素安定同位体を分析することにより、浅層と深層地下水の混合メカニズムを評価した。本研究では,富士山を主な研究地域とし,複数のトレーサーを利用した年代測定法を確立・適用し,これらの方法で,同一の地下水・湧水サンプルの絶対年代を求め,各測定法の精度,長所,短所を明らかにし,これをもとに富士山の地下水流動系と滞留時間を解明することを目的とした。^<36>Clの場合,核実験による1950-1957年の降下量上昇期と,それ以降1980年代にかけての下降期があり,1950-1980年の情報を得ることができる.過去の^3Hを用いた研究から,主な湧水・地下水は下降期に涵養されたものと考え,核実験起源^<36>Clを用いて推定を行ったところ,東麓では25-35年,南東麓では20年以下,南麓では25年以下,西麓では30年という結果となった.1965年から1995年の先行研究で測定された代表的な湧水の^3H濃度を降水の^3H濃度の時系列変化と比較すると,南東麓・南麓よりも東麓・西麓において高い値を示しており,滞留時間がより長いことが示唆され,得られた年代は妥当なものと考えられる.

南麓における地下水の^<36>Cl濃度に注目すると,酸素同位体比が低く高標高で涵養されたもので値が低く,酸素同位体比が高くなるにつれて値が高くなる傾向がみられたことから,南麓の主要な帯水層の地下水は,50年前後の年代をもっていることが示唆される.一方,フロンガス・CFCsによる結果では,多くの湧水が大気中濃度を上回る値を示し,工場などからの汚染が大きな制約条件となることが明らかとなった.年代の推定が可能であった地点の中で,東麓では^<36>Clによる推定結果と矛盾しない結果だったものの,愛鷹山周辺の自噴井では50年以上と推定され,^<36>Clによる30-35年という結果と整合しなかった.原因の1つとして,^<36>Clでは降下量の下降期を利用して推定を行ったが,実際は上昇期に相当する可能性も考えられた.この点は今後の課題であるが,現在測定中の^3Hなど他の同位体やCFCsを含めて総合的に判断する必要があると考えられる.
クラスター負イオンの電子構造と化学反応過程

平成11年度には以下の研究成果を得た。1.クラスター負イオンの衝突反応装置の製作オクタポールイオンガイド付きの反応室および反応生成物質量分析部の設計を行い,現存の装置に取付けを行った.現在,分子クラスター負イオンの衝突誘起解離の実験を行い,装置の性能評価および最適化を進めている.(CO_2)_n^-に対してH_2OやCH_3OHなどの極性分子が付加した2成分クラスターの電子構造・幾何構造を光電子分光法およびab initio計算によって調べた.その結果,CO_2^-およびC_2O_4^-の2種類のイオンコアが存在し,極性分子はこれらに対して水素結合を介して溶媒和していることがわかった.また,ある組成の混合クラスターでは2種類の電子構造異性体の共存が観測された.ホールバーニング分光法を光電子分光と併用し異性体の共存機構を明らかにし,クラスター内での電子構造異性化過程のモデルを提示した.3.アクリロニトリルに対する(CO_2)_n^-の求核付加反応アクリロニトリル(AN)と(CO_2)_n^-との反応で生成した[(AN)CO_2]^-の電子構造・幾何構造を光電子分光法と分子軌道計算によって調べた.その結果、ANのαおよびβ炭素に対して,CO_2^-が求核的に付加した2種類の分子負イオンが生成することがわかった.このことは,(CO_2)_n^-が有効な求核試剤として働き,カルボキシル化した生成物を与えることを示している.平成10年度には以下の研究成果を得た。1クラスター負イオンの衝突反応装置の設計:現存の実験装置は、クラスター負イオン源、質量選別器、光電子分光器で構成されている。次年度にこれと組み合わせる予定の、反応室と質量分祈器に関する設計、製作を行った。2 (NO)_n^-の電子構造:(NO)_n^-(n=1-7)の電子束縛状態について光電子分光法を用いて調べた。光電子スペクトルと分子軌道計算の結果をもとに、2量体ではtrans-ONNO^-、3量体以上では直鎖あるいは枝分かれ構造をもつN_3O_3^-がイオンコアとして形成されているものと結論した。3 {(CO_2)_nROH]^-の電子構造:(CO_2)_n^-に対してH_2OやCH_3OHなどの極性分子が付加した2成分クラスターの電子構造を調べた。極性分子がCO_2^-およびC_2O_4^-のイオンコア対して水素結合を介して溶媒和し、2種類の電子構造異性体を生成することがわかった。ホールバーニング分光法を光電子分光と併用し異性体の共存機構を調べ、電子構造の異性化過程のモデルを提唱した。4アクリロニトリルに対する(CO_2)_n^-の求核付加反応:アクリロニトリル(AN)と(CO_2)_n^-との反応で生成した[(AN)CO_2]^-の構造を光電子分光法と分子軌道計算によって調べた。その結果、ANのαおよびβ炭素に対して、CO_2^-が求核的に付加した分子負イオンが生成していることがわかった。この研究によって、(CO_2)_n^-が求電子的な炭素に対するカルボキシル化試剤として有効であることを示した。5新奇負イオン[OCH_3l]^-の生成と構造:O^-(N_2O)_nを反応試剤としてCH_3lと反応させると、会合体[OCH_3l]^-が得られた。その光電子スペクトルの解析および分子軌道計算の結果から、ヨウ素引き抜きやS_N2の反応中間体に相当する2種類の異性体[CH_3lO]^-および[l^-...CH_3O]が共存しているものと結論した。また[CH_3lO]^-の光励起により、通常のイオン-分子反応では進行しないlO^-生成過程を引き起こすことに成功した。1.クラスター負イオンの衝突反応装置の製作オクタポールイオンガイド付きの反応室および反応生成物質量分析部の設計を行い,現存の装置に取付けを行った.現在,分子クラスター負イオンの衝突誘起解離の実験を行い,装置の性能評価および最適化を進めている.(CO_2)_n^-に対してH_2OやCH_3OHなどの極性分子が付加した2成分クラスターの電子構造・幾何構造を光電子分光法およびab initio計算によって調べた.その結果,CO_2^-およびC_2O_4^-の2種類のイオンコアが存在し,極性分子はこれらに対して水素結合を介して溶媒和していることがわかった.また,ある組成の混合クラスターでは2種類の電子構造異性体の共存が観測された.ホールバーニング分光法を光電子分光と併用し異性体の共存機構を明らかにし,クラスター内での電子構造異性化過程のモデルを提示した.3.アクリロニトリルに対する(CO_2)_n^-の求核付加反応アクリロニトリル(AN)と(CO_2)_n^-との反応で生成した[(AN)CO_2]^-の電子構造・幾何構造を光電子分光法と分子軌道計算によって調べた.その結果、ANのαおよびβ炭素に対して,CO_2^-が求核的に付加した2種類の分子負イオンが生成することがわかった.このことは,(CO_2)_n^-が
タンパク質間相互作用によるエピジェネティクス制御機構の構造生物学的基盤

本研究ではエピジェネティクスに関与する重要な因子であるUHRF1/2タンパク質に注目し、UHRF1と相互作用するタンパク質との構造生物学的からエピジェネティクスの制御機構の解明を目指した。本申請の成果により、UHRF1と相互作用するタンパク質の同定、およびUHRF2によるDNAの認識機構の詳細を明らかにした。DNAのメチル化やヒストンの翻訳後修飾はエピジェネティクスな現象の主要な因子であり、真核生物の発生や細胞分化、遺伝子発現の制御に極めて重要な働きをしている。本研究ではDNAメチル化の維持とヒストン認識に関与するUHRF1タンパク質に焦点をあてる。UHRF1とエピジェネティクス関連因子の複合体のX線結晶構造解析を主体とした構造生物学的な観点からエピジェネティクスな現象の制御機構を明らかにするために下記の研究を行った。1,維持型DNAメチル化酵素Dnmt1との複合体構造解析Dnmt1とUHRF1の結合領域の最適化を分析ゲルろ過カラムを用いて行い、これまでに報告されていない新規の相互作用領域の候補を見出した。また調製した複合体を用いて結晶化を行ったが、今のところ結晶は得られていない。今後は今年度発見した新規の結合領域の情報を加味して、結晶化行っていく。2,UHRF1のリン酸化酵素Plk1との複合体構造解析報告されている文献に従いUHRF1のリン酸化Ser287を含むペプチドとPlk1のpolo-like domainとの複合体の結晶化を行ったが、複合体の結晶は得られなかった。また、等温滴定型カロリメトリーでUHRF1リン酸化Ser287とPlkの結合を測定したが確認できなかった。今後、さらなる結合領域の最適化と翻訳後修飾との関連を調べて行く必要がある。る。3,ヒストン修飾酵素JMJD6との複合体構造解析JMJD6の大腸菌での発現系を構築し、結晶化に向けて精製を行った。共同研究者が発見した基質との複合体結晶を調製したが、今のところ結晶は得られていない。精製の過程でJMJD6が非特異に凝集している可能性があり、今後精製条件のさらなる検討を要する。1.UHRF1-Dnmt1の相互作用の生化学、物理化学的な解析。UHRF1SRAdomainとDnmt1のRFTS domainとの結合を等温滴定型カロリメトリーで定量した。その結果、解離定数が約3μMであることが分かった。両者が結合することが明らかになったので、SRA : RFTSの複合体を調製して、様々な条件で結晶化を行ったが、複合体の結晶は得られていない。結晶が得られなかった理由としてUHRF1とDnmt1の結合が遷移的なものである可能性が考えられる。今後は溶液中でのUHRF1とDnmt1の相互作用の構造学的な知見を得るために低分解能で構造解析、X線小角散乱、高速AFM等の解析を行う予定である。生化学的な研究より、SRA domain, Dnmt1,ヘミメチル化DNAが3者複合体を形成しないことを明らかにした。2.JMJD6と基質ペプチドとの複合体結晶構造解析。これまでに共同研究者とともにJMJD6が水酸化活性を示すタンパク質の同定を行った。本年度はJMJD6と基質ペプチドとの複合体結晶の調製を行った。JMJD6全長および、立体構造を保持していないと考えられるC末端領域を除いたJMJD6を大腸菌内で高発現させた。カラムクロマトグラフィーににより高純度に精製して、JMJD6の基質であるピストンH4のN末端領域のペプチドと混ぜ合わせ結晶化のスクリーニングを行った。しかしながら、JMJD6の結晶は得られなかった。これはJMJD6が溶液中で単分散で存在していないこと、基質との結合が遷移的であることが原因であると考えられる。今後サンプル調製を改善し、構造学的な観点から」JMJD6の基質認識機構の解明を進めて行く予定である。3.UHRF2 SRAdomainとDNAとの複合体構造解析。ゲノムDNA中のCpG配列のシトシンヒドロキシメチル化(5hmC)はメチル化DNA(5mC)の脱メチル化に関与するDNA修飾であると考えられている。UHRF2はUHRF1のホモログである。UHRF1のSRA domainはヘミメチル化DNAを認識するが、UHRF2のSRA domainとUHRF1のSRA domainの基質認識ポケットを形成するアミノ酸残基にはいくつか違いがある。UHRF2のSRA domainが5mCを含むDNAに加えて、5hmCを含むDNAにも結合することを新たに解明した。一方でUHRFIのSRA domainは5hmCを含むDNAに対しては結合を示さない。さらにメチル化シトシンの酸化誘導体である5-ホルミルシトシン、5-カルボキシルシトシンにもUHRF2のSRA domainが結合することを新たに見出した。しかし、UHRF2 SRAdomainのDNAへの結合は非常に弱いことが競合阻害剤を用いたDNA結合実験で明らかにった。

さらにUHRF2のSRA domainと5hmCを含むDNAとの複合体を調製し結晶化に成功したものの、構造決定した結晶構造中にはDNAが含まれていなかった。これらのことから、UHRF2は様々な修飾状態のメチル化DNAに結合できるが、その結合は弱いことが明らかになった。このようなUHRF2のDNAへの結合特性がUHRF1との機能にどのように関連しているのを明らかにしていく予定である。