hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化器系癌における免疫寛容と自家癌細胞を抗原とする特異的免疫療法の研究

消化器系癌腫に対し、特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)誘導を行い、これをエフェクターとした養子免疫療法を研究してきた。高度進行癌では宿主内において自家癌細胞に対し、免疫寛容が成立していると考え、生体内でのサイトカイン動態と、CTL誘導時のin vitro内のサイトカイン動態を比較した。癌性胸腹水症例より採取した胸腹水と、通常手術後にドレーンから採取される腹水中のサイトカインを比較検討した。癌性胸腹水10検体、術後腹水10検体を比較したが、Th1サイトカインであるIL-2、IL-12、IFNγはともに低値で、Th2サイトカインIL-4、IL-6はともに高値を示した。IL-10についても検討したが、ばらつきが多かった。また、可溶性IL-2receptorは癌性胸腹水にて高値を示す症例が散見された。血漿中の可溶性IL-2receptorも測定した。遠隔転移のある高度進行消化器癌で高値を示し、可溶性IL-2receptorは悪性リンパ腫に限らず、消化器系癌腫の宿主免疫動態を反映するものと考えられた。CTLを誘導するin vitroにおいて、OK432が時として有効であることは他の研究者も発表しているが、癌性胸腹水症例のin vivo内の投与ではIFNγは増加する傾向があるものの、他のTh1サイトカインには影響を認めなかった。CTLの誘導に関しては自家腫瘍細胞株を樹立できた症例に対し、alternative pathwayの概念に沿った2段階混合刺激培養(MLTC)で誘導を試みた。これまでの研究からCD14^+細胞の多寡がCD4^+Tリンパ球の分化に強い影響を与えていることが判明している。これは培養上澄液に含まれるサイトカインの分析より示唆された。CTLをエフェクターとする養子免疫療法については当研究機関内の倫理委員会の承認を得て自家腫瘍細胞株を樹立した大腸癌絶対非治癒切除症例を対象に行った。臨床効果判定はminor responseにとどまった。腺癌を中心とした消化器系癌手術症例中、絶対非治癒切除例を対象にalternative pathwayによる特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)誘導とこれをエフェクターとした養子免疫療法を研究している。CTLの誘導に関しては自家腫瘍細胞株を樹立できた3症例に対し、alternative pathwayの概念に沿った2段階混合刺激培養(MLTC)で誘導を試みている。現段階ではCD14^+細胞の多寡がCD4^+Tリンパ球の分化に強い影響を与えていることが判明している。すなわちCD14^+細胞の多い条件でのMLTCではTh2の分化に優位に働くと思われ、alternative pathwayによるCTLの誘導に極めて不利な状況になる。CTLをエフェクターとする養子免疫療法については当研究機関内の倫理委員会の承認を平成10年11月に得て自家腫瘍細胞株を樹立した大腸癌絶対非治癒切除症例を対象に行っている。臨床効果は腫瘍マーカーの減少と自覚症状の消失を得られたが、効果判定はminor responseにとどまった。これまでの研究では進行癌担癌宿主では抗腫瘍免疫が強く抑制されているために、通常のMLTCではTh1CD4^+Tリンパ球の活性化すら容易ではない。しかしOK432などのいわゆるBRM製剤をMLTCに少量添加することが有効である例が散見されている。このメカニズムについては抗原提示細胞の活性化が重要な役割をしていると考えられるが、今後の検討が必要である。

この趣旨の報告は第36回日本癌治療学会総会、第60回日本臨床外科学会総会ワークショプ、第100回日本外科学会で発表した。癌性胸腹水症例における局所的な免疫寛容の研究では胸腹水中のサイトカインの分析を中心に行っているが、術後の浸出液との相違に明確な差が認められていない。腺癌を中心とした消化器系癌手術症例中、絶対非治癒切除例を対象にalternative pathwayによる特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)誘導とこれをエフェクターとした養子免疫療法を研究している。CTLの誘導に関しては自家腫瘍細胞株を樹立できた症例に対し、alternative pathwayの概念に沿った2段階混合刺激培養(MLTC)で誘導を試みている。これまでの研究からCD14^+細胞の多寡がCD4^+Tリンパ球の分化に強い影響を与えていることが判明している。これは培養上澄液に含まれるサイトカインの分析より示唆された。CTLをエフェクターとする養子免疫療法については当研究機関内の倫理委員会の承認を得て自家腫瘍細胞株を樹立した大腸癌絶対非治癒切除症例を対象に行っている。しかしながら、最近の化学療法の進歩により癌巣がよくコントロールされ、本研究の対象症例となるころは免疫動態が刺激しても反応しなくなっており、臨床効果判定はminor responseにとどまった。進行癌担癌宿主では抗腫瘍免疫が強く抑制されているために、通常のMLTCではTh1 CD4^+Tリンパ球の活性化すら容易ではない。この要因を宿主の免疫動態に影響を及ぼす物質に絞り、研究した。その結果、可溶性、IL-2receptorが高度進行癌症例では血中に高濃度認められ、in vivoではTh1系リンパ球の不活性化が進んでいることがあきらかになった。
紀伊半島ALS・パーキンソン認知症のデータベース化による病態・病因研究への活用

研究代表者と分担研究者、および研究協力者が保有している「紀伊半島神経難病多発地の筋萎縮性側索硬化症(ALS)とパーキンソン認知症(PDC)患者の臨床情報と剖検脳・脊髄の情報のデータベース化を以下の形で行った。臨床情報:約50症例の臨床病歴、家族歴、検査データ、画像所見は、PDF化可能なものはPDF化して、外部とは連結されていないパソコンに保存している。剖検脳脊髄試料:愛知医科大学加齢医学研究所の研究協力者(神経病理学者)に標本作成と病理所見判読を依頼して、2015年以前の18剖検症例の神経病理学的所見は、病理診断所見と顕微鏡像のパワーポイントとして保存している。臨床情報と病理情報に関しては、氏名や家族歴は匿名化しているが、内部の記述などの完全匿名化は不可能であるので、パソコンへのアクセス用パスワードと、外部に接続のないパソコンに保存するという形で対応している。その後に追加された2例の剖検例は、諸般の事情でまだ検索中であるが、所見が得られ次第、本研究のデータに含める予定である。これらのデータの活用は、研究担当者間では既に論文化や学会発表で使用し、数編の論文も発表した。しかし、外部への公開は特に個人情報管理という点で難しいので、三重大学の倫理委員会審査に準拠して、照会があったものについて個々に対応する。資料の解析と本疾患の歴史的背景を検索する中で、紀伊半島ALS/PDCに関する明治以降の古い文献を入手した。これらは公開可能なので、研究者間のクラウドを通じて、利用可能とした。本研究の成果として発表した研究論文も、三重大の共同研究者のHPで閲覧可能にする予定である。紀伊半島南部沿岸の熊野灘に面した牟婁地方には、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の多発地が存在することが明治以来知られていた。1960年代に、和歌山県立医科大学の木村・八瀬らの研究者によって、和歌山県のK地区と三重県のH地区は、他地域の40100倍近い発生頻度を示し、グアム島と並ぶALS高集積地として注目されたが、1980年代に両地域とも発生数の激減を見て、多発地は消滅したと考えられていた。主任研究者者らは、1990年以降にも、かつての多発地在住者や出身者にALSが多発していることに気づき、1994年から再調査を開始した。その結果、ALS多発の持続と、グアム特有疾患であるパーキンソン・認知症複合(PDC)が、紀伊半島多発地区にも発生していることを確認して報告した。しかし、2000年以降にALS、PDC共に新規発生が激減し、近年は散発的発生をみるだけになった。また、紀伊ALS研究を担っていた和歌山県立医科大学と三重大学の研究者達も、世代交代で研究者が減少し、かつて収集された貴重な資料が散逸する事態となっている。本研究の対象は、主任研究者が三重大学教授として在職中にで収集した、主に高集積地のH地区の患者に関係する資料であるが、和歌山県立医科大学研究者保管の関連資料もまとめてデータベース化し、本疾患の病態を研究すると共に、後世の研究者の研究に資することが目的である。初年度は、主任研究者の手元に保管されている資料、三重大学地域イノベーション研究科の共同研究者によって保管されている資料、および、我々が保管していたが今は愛知医科大学加齢医学研究所に保管を委託している脳と脊髄の病理標本について、保管資料のリスト作りと、紙ベース資料のPDF化に取り組んだ。年度途中で、資料リストづくりとPDF作成の研究補助者を雇用することができたので、既に判明している資料のPDF化は予定通り進んでいる。主任研究者と分担研究者によって、過去の資料は十分には整理されていない紙ベースではあるが保存されている。これらをまとめて一覧できるリストを作成中である。また、個々の患者データについては、リスト作りとは独立にPDF化を進めている。神経病理学的所見については、2010年以前に作成された病理標本は、現在の基準からみて不完全な点があるので、研究協力者である愛知医大の神経病理学者の援助をえて、標本の作り直しと再評価を実施している。これらは、代表的な写真と所見を合わせてデータベース化する予定である。さらに、明治以来の紀伊半島のALSとPDCに関する文献のデータベースも作成中である。明治以来、紀伊半島南部沿岸の熊野灘に面した牟婁地方には筋萎縮性側索硬化症(ALS)の多発が知られていた。1960年代に、和歌山県立医科大学の木村・八瀬らによって実施された牟婁地区一帯のALS調査によって、和歌山県のK地区と三重県のH地区において他地域の40倍100倍の高集積があることが明らかにされ、グアムと並んでALS高集積地として注目された。ところが1970年代にALSの発生数激減が始まり、グアムでは1980年までに、紀伊半島では1990年までに高集積地は消滅したと考えられていた。しかし、主任研究者らは1990年代にH地区を再調査し、ALS多発が持続しているだけでなく、グアム特有の疾患と考えられていたパーキンソン・認知症複合(PDC)も同時発生していることを剖検例で確認して報告した。ところが、2000年以降にH地区でも患者数は激減した。しかも、研究を担う研究者数も激減し、過去の貴重な資料である病歴や家族歴などの臨床資料と、剖検脳標本や血液などの患者検体資料が散逸し失われる危険性が生じている。

本研究の目的は、主任研究者の前任地である三重大学で収集した資料と、和歌山県立医大で収集したH地区関連の資料をデータベース化して活用すると共に、個人情報を匿名化して広く外部の研究者の使用に供することが可能な形に整えることである。昨年度に引き続いて、今年度も主任研究者や分担研究者が保管している各種資料と患者試料の整理とリスト作りに取り組み、患者病歴などの紙資料のPDF化は大半が完了した。貴重な剖検材料については、愛知医科大学彼医学研究所の協力を得て、資料の集約化と標本リスト作りを進め、剖検例のリスト作りはほぼ完成した。1.主任研究者と分担研究者が保管していた三重大学で収集した紙ベースの資料は整理して、患者別に分けてPDF化した。和歌山県立医大から貸与された資料については、三重大学の資料と対照し整理中で、終了し次第、PDF化する予定である。2.病理材料と標本については、全例を愛知医大加齢医学研究所に集約した。神経変性疾患の診断は、近年は各種脳蛋白の免疫組織化学的染色所見と、脳蓄積タンパクの生化学的分子生物学的所見に基づいてなされるので、再検査が可能な症例については追加検査している。3.明治以来の紀伊半島のALS/PDCに関する古い文献の収集とPDF化、データベース化は順調に進行中である。4.今年度は、古いスライドのIT化による保存に取り組む計画である。研究代表者と分担研究者、および研究協力者が保有している「紀伊半島神経難病多発地の筋萎縮性側索硬化症(ALS)とパーキンソン認知症(PDC)患者の臨床情報と剖検脳・脊髄の情報のデータベース化は以下の形でほぼ完了しつつある。臨床情報:臨床病歴、家族歴、検査データ、画像所見は、PDF化可能なものはPDF化して、外部とは連結されていないパソコンに保存している。剖検脳脊髄試料については、愛知医科大学加齢医学研究所の研究協力者(神経病理学者)に標本作成と病理所見判読を依頼して、2015年以前の剖検症例約20症例の神経病理学的所見は、病理診断所見と顕微鏡像のパワーポイントという形で保存している。臨床情報と病理情報に関しては、氏名や家族歴は匿名化しているが、内部の記述などの完全匿名化は不可能であるので、パソコンへのアクセス用パスワードと、外部に接続のないパソコンに保存するという形で対応している。昨年度に2例の剖検例の追加が発生したので、これらについても本研究に含めることができるようするべく準備している。これらのデータの活用は、研究担当者間では既に論文化や学会発表で使用し、数編の論文も発表した。しかし、外部への公開は特に個人情報管理という点で難しいものが多いので、研究期間修了までに外部からの利用希望者への対応法を検討して決定する予定である。資料の解析と本疾患の歴史的背景を検索する中で、紀伊半島ALS/PDCに関する明治以降の古い文献を入手した。これらは公開可能なので、研究者間のクラウドを通じて、利用可能とした。本研究の成果として発表した研究論文も、何らかの形で活用可能な方策を講じたい。1.手持ちの臨床資料については、ほぼ入力を終えた。2.脳脊髄の剖検資料の病理学的検索については、概観的な検討は修了した。追加で、詳細な脳蓄積異常タンパクの免疫組織化学とWernickeスターンブロットによるタンパク解析を研究協力者に依頼して実施中である。新しく得られた2例の剖検例についても、病理学的な研究が開始されたので、間に合えば最終報告に加えたい。
金属配位によるナノカーボン分子の集積化

有機太陽電池や有機ELなどに用いられる電荷輸送性材料として,π共役系が三次元に広がった化合物の開発が注目されている。π共役配位子を用いて金属錯体を形成することにより,多彩な三次元構造を構築することが可能である。本研究では,強い分子間π-π相互作用を示す三次元π共役金属錯体の合成を目的として,パラジウム触媒による分子内直接アリール化を用いる手法により,π拡張型8-キノリノール配位子を合成した。得られた配位子を用いてAl錯体を合成し,X線結晶構造解析を実施した結果,固体中で二次元ハニカム型シート構造を形成し,そのシート同士が分子間π-π相互作用による積層構造を構築していることが明らかとなった。本研究は,多環式π共役系を金属原子に配位させて分子の立体構造を制御することにより,シート型あるいは3Dネットワーク型構造をもつメタル化π電子材料を創成し,電極活物質,有機太陽電池などに向けた機能性材料を提供することを目的としている。過去に開発されてきた電子輸送性材料を見ると,フラーレン誘導体(有機太陽電池)やAlq3(有機EL)などがよく知られているが,いずれの分子も三次元に広がったπ共役系が物性発現に重要な役割を担っている。本年度の研究では,Alq3の鍵構造として中心金属への配位構造に焦点をあて,キノリノール配位子にナフト縮環構造を導入することによるπ拡張効果を解明することを目的に,トリナフト縮環型Alq3の合成ルートを開発した。まず,ナフト縮環キノリノール配位子の合成法について検討した結果,5-ブロモ-8-キノリノールを出発原料として,1)水酸基の保護,2)ホウ素化,3) 1,8-ジブロモナフタレンとの鈴木カップリング,4)酢酸パラジウム(II)触媒を用いた分子内直接的アリール化,5)水酸基の脱保護,という5段階の反応を経て,ナフト縮環キノリノール配位子を合成した。さらに,塩化アルミニウム(III)との反応により,トリナフト縮環型Alq3を濃紫色固体として合成することができた。得られた錯体の溶解性は非常に低かったが,ODCB/アセトニトリル混合溶媒から微小単結晶が得られ,予備的なX線結晶解析の結果,トリナフト縮環型Alq3とアセトニトリル分子との共結晶であることを確認した。近年,有機太陽電池や有機ELなどに用いられる電荷輸送性材料として,π共役系が三次元に広がった化合物の開発が注目されている。π共役配位子を用いた金属錯体の形成により,多彩な三次元構造を構築することが可能であり,例えば8-キノリノールを配位子にもつAlq3は優れた電子輸送性材料として知られている。この8-キノリノールのπ共役系を拡張することにより,強い分子間π-π相互作用を示す新たな三次元π共役金属錯体の合成が可能になると考えた。本研究では,パラジウム触媒による分子内直接アリール化反応を用いる手法により,π拡張型8-キノリノール配位子を合成し,添加剤と反応温度の工夫により環化の位置選択性を制御できることを見出した。DFT計算の結果,添加剤としてピバル酸を加えた120 °Cにおける加熱条件化では協奏的メタル化-脱プロトン化(CMD)機構,ピバル酸を添加しない180 °Cでの加熱条件ではHeck型反応の機構で環化が進行することが示唆された。さらに,得られたアザペリレン骨格を含むキノリノール誘導体を脱保護した後,Al(OiPr)3との反応によりアルミニウム錯体の形成を試みた結果,目的とする錯体が濃紫色固体として得られた。1H NMR測定の結果から,このAl錯体は溶液中でAlq3と同様のmeridional構造をもつと考えられる。この錯体の単結晶を育成し,X線結晶構造解析を行ったところ,錯体は二次元ハニカム型シート構造を形成し,そのシート同士が分子間π-π相互作用による積層構造を構築していることがわかった。H26年度の研究では,金属への配位サイトをもつ拡張π電子系骨格の一つとして,ナフト縮環キノリノールを簡便な経路で合成できることを示した。溶解性を向上させるための置換基の導入と,それがパッキング構造に及ぼす影響を解明する研究に進めるための知見が得られた。物理有機化学H27年度は,前年度に開発した合成ルートの最適化を引き続き進めるとともに,置換基導入により溶解性を高めたトリナフト縮環型Alq3誘導体を合成し,固体構造および固体物性の解明,さらには有機太陽電池の新しいn型半導体材料として展開する。さらに,拡張π電子系に複数の金属配位サイトを導入することにより,金属を介したπ電子系のネットワーク構造を構築し,電極活物質としての応用を図る。

H26年度の研究においては,合成経路の探索のため主として小スケールでの合成実験を実施した。固体物性を評価するには,よりスケールアップした合成実験が不可欠となる。薬品などの物品費に多額の経費が見込まれる状況であったため,次年度使用額が生じた。H27年度の助成金は,主として薬品などの消耗品費として計上する。
粒径制御シルセスキオキサン元素ブロック合成法の開拓

構造の規定された無機ナノ構造体であるかご型シルセスキオキサン(POSS)を基本骨格とし、有機化学的手法で複数のPOSSを結合させたダンベル型やスター型ハイブリッドブロックの設計合成を行い、それら単独で光学透明膜を形成し、その光学的評価に成功した。次いで、構造が規定された二官能性POSSの合成法を確立することで、高分子化の手法と融合させた元素ブロック高分子の創出を行った。また、高周期15族元素を組込んだ新たな元素ブロックの創製も押し進めることで、新たな元素ブロック高分子材料のライブラリー拡大化を行った。かご型シルセスキオキサン(POSS)を基本骨格とした元素ブロックの設計合成を行い、これら単独での材料物性・機能評価をA03班との連携で行い、さらにA04班との理論支援を受けて元素ブロック基盤材料としての特徴と課題を明らかにすることで元素ブロックのモデルケースを提示を目的として研究を行った。また、ヒ素元素を組込んだ新たな元素ブロックの創製も押し進めることで、新たな元素ブロック高分子材料のライブラリー拡大化も目的として研究を行い、以下の研究成果を得た。1)アミノプロピルへプタイソブチルPOSSのコーナーオープニング法とコーナキャッピング法を利用することで、分子構造が規定された二官能性POSSの合成に成功するとともに、モノ置換POSSに対するコーナーオープニング法の選択性に関する理論的解析を行った。さらに得られた二官能性POSSを用いた重合による透明性POSS含有ポリイミドフィルムが得られることを示した。2)メチレン鎖がC2、C3およびC8で架橋したスター型ヘプタイソブチル置換POSS化合物を合成し、膜形成能および熱特性を評価したところ、メチレン鎖が長くなるにつれて結晶性と融点が上昇するものの光学的透明性は維持した膜が得られることを見出した。3)T8R7R'型シルセスキオキサンを出発原料として水酸基またはカルボン酸基を末端に有する第3世代ポリ(アミドアミン)型両親媒性POSS核デンドロンを合成し、それらのキャスト膜表面にデンドロン部の末端基による層が形成されたことを示し、膜表面のぬれ性がpH変化によって制御できる光学的透明膜の作製に成功した。4)環状ヒ素配位子ジヨード白金単核錯体は再結晶条件を変えることで、室温で強く赤色に固体発光する立方状結晶、室温で赤色に固体発光する針状結晶、および室温で無発光の結晶の三種類の異なる構造と発光量子収率を示す結晶が得られることがわかった。かご型シルセスキオキサン(POSS)を基本骨格とし、有機化学的手法で複数のPOSSを結合させたスター型ハイブリッドブロックの設計合成を行い、これら単独での材料物性・機能評価を行い、元素ブロック基盤材料としての課題を抽出することを第一の目的として研究を行った。また、高周期15族元素を組込んだ新たな元素ブロックの創製も押し進めることで、新たな元素ブロック高分子材料のライブラリー拡大化を行い、以下の成果を得た。1)8個のイソブチル置換POSSを架橋ユニットであるアルキレン鎖の長さを変更させてオクタジメチルオクタシリケートに結合させたスター型POSS誘導体を合成し、それらの特性を評価することで化合物の結晶性や物性の制御を検討した結果、アルキレン鎖が短いほど結晶性が低下し、それにより光学的透明膜を形成することが分かった。2)テトラエチルアンモニウム水酸化物(TEAOH)を塩基として用いたビニルへプタイソブチルT8のコーナーオープニング反応について検討し、分子構造が規定されたビスビニルヘキサイソブチルPOSS誘導体の合成に成功した。またこのモノマーを用いてPOSS元素ブロック高分子の合成を行った。3)非対称アセチレン化合物を用いることで、不斉および非対称環状ヒ素配位子が得られると考えられる。そこで、ペンタメチルシクロペンタアルシンとフェニルアセチレンとの反応において、再沈殿および再結晶によって精製し、cis-2,5-ビスフェニル-1,4-ジメチル-1,4-ジヒドロ-1,4-ジアルシニンを収率5%で得た)。これを配位子としてとヨウ化銅との錯体形成を行った。単結晶X線構造解析より配位子とヨウ化銅が3対2の割合で配位したかご型錯体であり、片方のエナンチオマーのみで選択的に配位していることが分かった。T8かご型シルセスキオキサン(T8)はすべての頂点に有機官能基を持ち、優れた熱的、化学的安定性を持つ化合物である。T8を主構成要素とした主鎖型高分子は他の材料と比べてよりT8の特徴を活かした高分子材料として期待されているが、その研究例はほとんどなかった。このような背景のもと平成26年度までに体対角二頂点に重合性官能基が修飾されたビスアミノプロピルヘキサイソブチルT8 (1)およびビスビニルヘキサイソブチルT8 (2)の開発に成功した。これらの成果を受け、平成27年度は以下の成果を得た。1)1に対して酸二無水物を加えて重合させ、加熱処理することで透明な主鎖型T8ポリイミド自立膜が得られた。これは室温から400 °Cまでにガラス転移点が観測されず、T8によってポリマーの分子運動が抑制されたことがわかった。また硬度測定を行った結果、マルテンス硬さは通常のポリエチレンと同程度の柔らかさを有していることがわかった。

T8を主鎖に導入することで耐熱性と柔軟性というトレイドオフの関係にある特性を併せ持つ高分子材料が期待できる。2)2に対して鎖長の異なるシロキサンモノマーを加えて重合させることで主鎖型T8ポリシロキサンの合成に成功した。得られたポリマーフィルムは優れた透明性を持つことがわかった。3)上記成果とは別にヒ素を組込んだ新たな元素ブロックの創製も押し進め、以下の成果を得た。不揮発性前駆体であるフェニルアルソン酸を還元して得られるヘキサフェニルヘキサアルシンをヨウ素溶液と反応させることによりジヨードフェニルアルシンを系中で発生させ、その反応溶液をそのまま求核試薬と反応させることにより、安全かつ簡便にAs-C結合形成するジヨードヒ素化合物系中発生法を開発し、種々のヒ素含有元素ブロックを合成し、その特徴を明らかにした。当初実施計画で予定した平成26年度までに開発したビスアミノプロピルヘキサイソブチルT8およびビスビニルヘキサイソブチルT8を用いた高分子合成とその特性評価に関して、領域内共同研究を進めるとともに、企業との共同研究による元素ブロック高分子材料の実用化研究さらに押し進めることができ、元素ブロック高分子の概念が未来の新素材として有望であることの産業界への認知度を高めることができた。さらに、平成26年度当初に計画した他の置換基を有する二官能性T8モノマーが合成できる可能性を見出すことができた。当初実施計画で予定していたヒ素元素を組込んだ新たな元素ブロック創出に関してもA03班およびA04班との共同研究によって、強く固体発光する含ヒ素元素ブロックが新たに創出されるなど、予想以上の成果を得ることができた。以上のことから本研究課題は当初目的と照らし合わせて、おおむね順調に進展していると判断できる。平成27年度までに合成されたスター型誘導体や主鎖型ポリマーに含まれるかご型オクタシルセスキオキサン(T8)の置換基がイソブチル基に限られていることから、平成28年度は、物性の制御や新たな機能の発現を目指して他の置換基を有するT8を用いた検討を行い、以下の成果を得た。1)様々な置換基含有スター型誘導体の合成および物性評価:イソブチル、シクロペンチルおよびフェニル基を有するモノアリル置換T8をオクタジメチルシロキシ-Q8-シルセスキオキサンに対してヒドロシリル化反応させることで、対応するスター型誘導体(1a-c)を得た。1はいずれも可視領域において光学的透明性を示した。次に窒素下で熱重量分析を行ったところ、シクロペンチル基、さらにフェニル基に置換することで熱分解温度が著しく上昇することが分かった。またエリプソメーターを用いて、屈折率評価を行った結果、置換基の特性を反映した屈折率を有する光学的透明膜を得られることが分かった。2)トリフルオロプロピル基を有するビスアリルT8とその元素ブロック高分子の合成:アリルへプタ(3,3,3-トリフルオロプロピル)T8の部分加水分解反応を行い、次にアリルトリクロロシランを反応させることで、トリフルオロプロピル基を有するビスアリルT8を得ることに成功した。得られたモノマーに対して等量の鎖長の異なるシロキサンモノマーを加えて重合し、シリコンウェハ上にスピンコートして得られたポリマーの屈折率は1.3以下であり、従来の高分子よりも著しく低い屈折材料であることを見出した。
セミパラチンスク核実験場近郊住民を対象とした疫学データベースの構築と健康影響調査

現在、データベースには2006年11月末時点で、136,000人のセミパラチンスク州住民の基本情報および、69,000人の死亡情報、その他が入力されている。本研究代表者は、これまで広島で開かれた国際シンポジウムなどで疫学的側面からの中間的解析結果を発表してきたが、2007年9月に国際がん登録学会(スロベニア共和国リュブリアナ市)にて、がんによる死亡に関する詳細な発表を行った。この発表内容はカザフ放射線医学研究所を通じて、カザフスタン保健省に報告された。データベースに登録された、がん(11,034件)のタイプ別の死亡数とパーセントをみると、1949年から1975年までの死亡数は食道がん、胃がん、肺がんの順位であるが、1975年以降は肺がん、胃がん、食道がんと順位が逆転している。食道がんによる1949年死亡の傾向では、食道がんの年齢調整死亡率(ASR)は1970年までは増加傾向にあるが、1970年以降は男女とも減少傾向にある。肺がんの死亡動向では、1950年から1960年にかけての男性のASRは20以下だったものが、1960年から1970年にかけて急激に増加している。この増加傾向は女性では全く観察されない。カザフスタンの人々は元来、喫煙の習慣はなかったが、第2次世界大戦に旧ソビエト軍に徴集され、そこで喫煙習慣がついたこと、現在では男性で12歳くらいから喫煙を始めることが、肺がんが急増している原因と考えられる。男性に比べて、女性では喫煙習慣がなく、喫煙による肺がんの発生を顕著に示していると言える。本研究の目的は、現在カザフスタン共和国保健省放射線医学環境研究所(以下、研究所)と共同で進めている疫学解析用データベースの構築を行ない、低線量被曝の核実験場周辺住民の健康影響を調査することである。主任研究者は2003年7月に現地に疫学解析用データベースを設置、現地研究所の全面的な協力によりセミパラチンスク旧核実験場周辺の住民の基本情報および死亡原因の収集を行なっている。これまでに死亡情報が69000件、基本情報では136000件がデータベースに保存された。1949年からの死亡データを用いて解析を行なった。データの収集が完全ではないために、被曝による影響を観察するには至っていないが、カザフスタンでのこの地域の死亡の傾向は明らかにできた。(1)1949年から1975年にかけてのがん死亡の1位、2位は胃がん、食道がんである。(2)イラン北部から中央アジアを横断し中国北西部にかけて、食道がんベルトと呼ばれる特異的に食道がんの罹患、死亡が多い地域が存在すると推定されているが、今回の解析でこの地域の実際の死亡データによる食道がんによる死亡が顕著であることが証明された。(3)肺がんは1949年のデータ収集時から顕著に増え続けており、この傾向は男性に非常に高く、女性では殆ど変わらない。カザフ人は元々喫煙習慣がなく、第二次世界大戦での従軍により喫煙習慣ができたことから、この肺がんによる死亡率の上昇は明らかに喫煙によるものと推定される。(4)全死亡の2位および4位は呼吸器系と感染症であり、年齢別に見ると2歳児までの死亡が約70%近くを占める。これは、病院で出産しても自宅での衛生環境が非常に悪いことが推定される。実際に、村での下水道は発達しておらず、井戸を利用する生活であり、汚水も流れ込んでいると考えられる。今後の予定であるが、低線量被曝の影響を見るには、甲状腺疾患などの罹患率を出すことが重要である。

したがって、次年度以降は診断センターおよびがんセンターと接触を取り、罹患データが補完できるようにすること、また死亡データの収集に年度によるばらつきが見られるので、これらを保管すること、更に、データを年齢別の人口で調整するための統計データの収集を行なう。現在、データベースには2006年11月末時点で、136,000人のセミパラチンスク州住民の基本情報および、69,000万人の死亡情報、その他が入力されている。本研究代表者は、これまで広島で開かれた国際シンポジウムなどで疫学的側面からの中間的解析結果を発表してきたが、2007年9月に国際がん登録学会(スロベニア共和国リュブリアナ市)にてがんによる死亡に関する詳細な発表を行った。この発表内容はカザフ放射線医学研究所を通して、カザフスタン保健省に報告された。データベースに登録された、がん(11,034件)のタイプ別の死亡数とパーセントをみると、1949年から1975年までの死亡数は食道がん、胃がん、肺がんの順位であるが、1975年以降は肺がん、胃がん、食道がんと順位か逆転している。食道がんによる1949年死亡の傾向では、食道がんの年齢調整死亡率(ASR)は1970年までは増加傾向にあるが、1970年以降は男女とも減少傾向にある。肺がんの死亡動向では、1950年から1960年にかけての男性のASRは20以下だったものが、1960年から1970年にかけて急激に増加している。この増加傾向は女性では全く観察されない。カザフスタンの人々は元来、喫煙の習慣はなかったが、第2次世界大戦に旧ソビエト軍に徴集され、そこで喫煙習慣がついたこと、現在では男性で12歳くらいから喫煙を始めることが、肺がんが急増している原因と考えられる。男性に比べて、女性では喫煙習慣がなく、喫煙による肺がんの発生を顕著に示していると言える。
ＧＡＢＡ受容体β３遺伝子多型解析によるプロポフォールの作用機序の解明

プロポフォールによる入眠濃度の個人差にはGABRB3遺伝子の遺伝子多型が関与すると仮説を立てた。GABRB3遺伝子のコード領域におけるミスセンス変異となる一塩基多型(SNP)の遺伝子型を決定したが、入眠濃度との関連は認められなかった。入眠濃度の予測因子の候補となりうるいくつかSNPsの存在を指摘できたが、研究手法の再考が必要だと思われた。GABA受容体β3遺伝子多型解析と静脈麻酔薬における就眠濃度の差異について一定の知見が得られ、平成24年度米国麻酔科学会に出題した。本演題はさらに網羅的遺伝子解析手法を取り入れ、報告予定である。申請者らは平成24年度プロポフォール血中濃度測定器Perolus 1000(講座内機器)を用いてプロポフォール血中濃度を測定する実験系を確立した。これにより臨床的なプロポフォールの就眠濃度の予測効果部位濃度(TCIシリンジポンプより算出)と実測値との差異を検討した。結果として、就眠濃度はかなり実測値と乖離があることが分かり、手術中の安定期はそれほど差異がないことを確認した。この知見自体は新規ではないものの、得られた就眠濃度の差異と、遺伝的背景の差異と解析することにより静脈麻酔薬の就眠濃度の原因遺伝子の特定は可能であると考えられる。同時に、当学共用機器であるIon-PGMシーケンサーを用いてGABA受容体関連遺伝子の包括的なシーケンスを行う実験系を確立した。これらの知見より、遺伝子多型とそれに伴う就眠濃度の差異についての知見は新規である。来年度はBISモニターだけでなく、当講座で所有しているSEDLINEから得られるSEF95と、プロポフォール就眠濃度およびGABA受容体遺伝子関連遺伝子多型についての臨床検体を集積し、知見を発表できるものと考えている。また時間的余裕および予算的余裕が生じれば、他の遺伝子も標的としたエクソーム解析を導入したい。平成25年度、申請者らはGABA受容体β3遺伝子多型解析を行い、静脈麻酔薬の就眠濃度と遺伝多型との関連について一定の知見を得た。就眠濃度はPerolus 1000(講座内機器)を用いて血中濃度を実測し、遺伝子多型解析はIonPGM sequencer(学内機器)を用いて網羅的に解析した。Ion PGM sequencerによって得られた遺伝子多型解析ではGABA受容体β3遺伝子多型と就眠濃度と関連のある遺伝子多型は検出できず、dbNSFPソフトウェアによって就眠濃度に影響を与えるであろう遺伝子多型をin silicoに解析した。その結果、rs41307112、rs34489220、rs25409、rs17850679の4つのSNPsは就眠濃度と影響を与える可能性が示唆されたが、全て日本人における変異頻度は0.01%以下のレアバリアントであり、本研究の臨床研究検体では変異体は認められず、臨床検体でdbNSFPの結果を確認することはできなかった。【諸言】麻酔薬の作用機序の解明は麻酔の安全性の向上や副作用の軽減,ひいては患者が享受する手術医療の質の向上に繋がるので重要な研究課題である.本研究では頻用されている全身麻酔薬プロポフォールによる意識消失の個人差の機序に,GABAA受容体β3サブユニットをコードするGABRB3遺伝子の一塩基多型(SNPs)がどのように影響を及ぼすかを検討して,麻酔薬の作用機序の一端を解明するものである.本研究ではまず麻酔入眠時のプロポフォールの予測脳内濃度との関連を調べた.【方法と結果】GABRB3遺伝子のcoding領域のアミノ酸非同義SNPs7ヶ所について39人の手術患者で調べた.調べたSNPsはrs78196007,rs41307112,rs75397216,rs72708067,rs34489220,rs77416943,rs76962261であるがいずれも日本人で変異がなかった.次にHapMapデータベースの日本人のデータのうちマイナーアリル頻度が高い3つのSNPs,rs2114217,rs11632969,rs718304について同じ39人の手術患者で検討した.しかしタイピング結果を入眠濃度と比較したが関連は見いだせなかった.【今年度の総括】予想した10ヶ所のSNPsは入眠濃度との関連はなかった.臨床検体の集積不足が挙げられるものの、GABA受容体β3遺伝子解析は順調に行えている。臨床的なアウトカムが就眠濃度であるため、年齢・背景因子などを統一した患者背景が要求されるため、臨床検体の集積の難易度が増大している。しかし全体的にはおおむね順調と言えるかと思われる。臨床の業務が多忙で予定より実験時間が取れなかった.学内に新規に導入されたIon-PGMシークエンサを用いてGABA受容体関連遺伝子の網羅的解析を行い、さらにプロポフォールの個人差の機序に詳細に迫りたい。

標的とするSNPsの選択を再考する必要がある.またGABRB3遺伝子だけではなく他のGABA受容体関連遺伝子群の遺伝子多型を次世代シークエンサで決定する方がいいかもしれない.昨年度は主に実験系の確立を行い、大量シーケンスとは違い、予算の消耗が少なかったため予算の繰り越しが可能であった。今年度は分子遺伝学的試薬を中心に購入を予定している。次世代シークエンサの試薬,消耗品を購入する.
生体深部の可視化と操作が同時に可能な個体用ｉｎ　ｖｉｖｏ２光子顕微鏡の開発と応用

最先端のレーザー光科学技術、蛍光プローブの導入や生体中での光学特性の定量的評価法を開発し、"in vivo"2光子励起顕微鏡による可視化解析の高度化を目指した。その結果、2光子顕微鏡の深部到達性や空間分解能を向上させることができ、特に、マウス生体脳においては、世界最深部の海馬歯状回での「そのまま」観察に成功した。加えて、光操作・刺激の方法論を切り開き、マウス生体脳深部での神経線維のレーザー破断にも成功した。光学的な観察・測定法は「生きた」対象内部で(in vivo)、多種類の分子や細胞の動態を、同時かつ高時空間分解能で、計測することが可能である。2光子顕微鏡は、近赤外域のフェムト秒光パルスにより生じる非線形光学過程である2光子励起過程を利用する方法論であり、他の顕微鏡法では観察が困難な、生体組織深部の観察が可能である。現在、生物個体中で細胞や生体分子の非侵襲的な可視化解析が可能な方法論として、最も期待されている。本研究計画では、新規レーザーや補償光学系の導入により、現在のin vivo 2光子顕微鏡を発展させ、光による観察と操作を真の生体組織深部で実現するin vivo 2光子顕微鏡の完成を目指した。さらに、新規蛍光タンパク質や光機能性分子の導入より、生体脳の神経伝達、分泌現象をモデルとして、生体内の分子機構を理解する新規イメージング手法を確立することも目標とした。(1)新規2光子顕微鏡システムによる2光子励起光刺激法の検証昨年度、近赤外超短光パルスレーザーを導入し、2光子励起イメージングと2光子励起光刺激を逐次的同時刺激を可能とするシステムの設計、統合化を図ることに成功した。また、in vivo生体脳観察のための麻酔システム、脳保定システム等を構築した。(2)収差補正のプロトコルの検討安定な蛍光プローブをドープした様々な組成のファントムを用いて、屈折率等の光学パラメーターと、点分布関数や断層像のS/Nの変化を解析し、深部解像イメージングにおける収差補正に付いて知見を得た。(3)がん、神経伝達に普遍的な分泌・開口放出の分子基盤の解明のための蛍光可視化系の確立申請者が共同研究を行った世界で最も短い蛍光波長を持つ蛍光タンパク質シリウスの蛍光強度はpH依存性が無いことを活用し、酸性環境下での蛍光イメージングに極めて有効である。昨年度は、酸性小胞を可視化する系の確立に成功した。2光子顕微鏡は、近赤外域のフェムト秒光パルスにより生じる2光子励起過程を利用し、他の顕微鏡法では観察が困難な生体組織深部の観察が可能である。現在、生物個体中で細胞や生体分子の非侵襲的な可視化解析が可能な方法論として最も期待されている。本研究計画では、新規レーザーや補償光学系、試料作製法の改善により、光による観察と操作を真の生体組織深部で実現するin vivo2光子顕微鏡の完成を目指した。(1)新規2光子顕微鏡法:in vivo生体脳観察のための麻酔システム、脳保定システム等を改善すると共に、新型蛍光検出器の導入を行った。その結果、世界で最深部の生体脳断層イメージングに成功し、海馬CA1ニューロンのin vivoイメージングに世界で初めて成功した。(2)収差補正の検討:昨年度の光学ファントムの成果をに基づき、さらにH-lineマウス生体脳のin vivoイメージングを実施し、特に、瞳充足率や球面収差補正量をパラメーターとして最適なレーザー照射条件の検討を行った。さらに屈折率等の試料の光学的性質や点分布関数や断層像のS/Nの変化を解析し、生体深部のin vivoイメージングにおける光学的な特性に付いて重要な知見を得た。また、ある試薬が新規透徹剤として有効である可能性を見出した。(3)がん、神経伝達に普遍的な分泌・開口放出の分子基盤の解明のための蛍光可視化系の確立:tdTomato、mCherryなどの、より蛍光波長の長い蛍光タンパク質のスクリーニングを行った。(1)昨年度導入した光刺激と光イメージングの同時実行のためのダイクロイックミラーシステムに動作上の問題があることが判明したため、機械的な改良を実施した。その結果、本来のT:Sapphireレーザーの有する広帯域の波長に対して、今まで以上の組合わせで実験、観察を実施することが可能になった。(2)深部イメージングに関しては、昨年度に引き続き、導入光学系や光学パラメータの最適化を行うと共に新たな新規レーザー光源の可能性を探索することを開始した。

その潜在的な可能性が高いことが判明した。特に、多様な脳部位におけるin vivo深部イメージングへの応用が可能であることを確認することができた。さらに光学的なパラメータを解析するために、マウス生体脳深部へ、マーカーとして微小蛍光ビーズを安定して導入する方法論の開発に着手した。(3)長期in vivoイメージングのための新規薬理物質溶液の開発や、反対側から交連線維を介して神経軸索を延ばす神経細胞のin vivoイメージングのためのマルチカラー染色法の開発にも着手した。(4)PFA固定サンプルのための新規透徹剤の応用として高NA対物レンズとの併用可能性を検討した。その結果、H-lineマウス固定脳スライス標本において、深部到達性と空間分解能の改善を示唆する蛍光画像を取得することができた。その結果、海馬錐体細胞の樹状突起スパインの形態の多様性に関して新しい知見を得ることができた。この成果は日本生理学会おいてポスター発表され、「優秀ポスター賞」を受賞した。(5)グルコース輸送体の細胞内分布やそのダイナミクスに関する可視化解析を進め、インスリン刺激前後での細胞内分布変化をライブイメージングで取得することに成功した。本年度は、本研究課題において構築した顕微鏡等のシステムを活用し、標本内の屈折率分布に由来する球面収差等の光学的な収差を制御することにより、生体深部における光学分解能の向上について、および、生体におけるin vivo光刺激・光操作の可能性について検討を行った。特に、生体脳中における光学特性を定量的に評価するための方法論を確立することができ、その結果、生きたマウス脳深部における空間分解能向上に成功した。さらに新規レーザー技術と組み合わせることで世界最深部の、マウス生体の海馬歯状回(脳表から1.6mm)における神経細胞のin vivoイメージングに世界で初めて成功した。さらに、この方法論を光刺激に適用することで、代表者の知る限り、世界で初めて脳表から500μm以上の生体脳深部で神経線維のin vivo光操作・光破断に成功した。また他の計画班との共同研究により、本技術をがんイメージングに適用しスキンフラップ法を用いて作成したモデル動物において皮下のがん組織の900μm以上のin vivo断層蛍光イメージングに成功した。また固定脳標本の透徹化技術の高度化を推進し、高屈折率条件における屈折率不一致を解消することで、高NA対物レンズを用いた高分解能観察を実現した。その結果、海馬スライス標本における単一神経細胞の樹状突起に沿ったスパインの可視化と高精度の網羅的な形態解析に成功し、形態的な多様性とその生理学的意義についての知見を得ることに成功した。また生体脳の透明化に関する研究も推進した。これらの研究成果は原著論文による発表に加えて、国内外の学術的集会で発表し優秀演題賞等を獲得した。本研究課題において新規導入した広帯域の近赤外フェムト秒パルスレーザー(SpectraPhysics社, Maitai Deepsee)を用い、光操作が同時に実行可能な新型in vivo2光子顕微鏡システムの高度化を推進した。光刺激を同時に行うためのレーザー光の導入光学系については、近赤外領域で720nmと800-1000nmの2本の波長を合成可能とするために、特殊なダイクロイックミラーを用いて構築した。また、レーザー波面の補正による高次収差の補正の効果を確認した。
精神分裂病におけるHLAおよび神経発達障害に関連する遺伝・環境要因の解析

分裂病の少なくとも一部で感染・免疫機能が発病と関連していることは、慢性関節リューマチとの負の関連、患者の免疫機能変化、分裂病患者における出生季節の偏りから強く示唆されている。この機序を少しでも具体化することとさらに詳しい証拠を得ることが、本研究の目的である。具体的には、分裂病患者におけるHLAならびに近傍領域の発達関連遺伝子のタイピングを行い、さらに分裂病にとって重要な胎生期・周産期の環境的要因と深く関連する出生季節の偏りについて検討した。まずHLAについてだが、1980年代を中心に日本(=関東地方の患者対象)の研究を含めて何度か報告されたがその後十分検討されていないHLA-A24、A26の増加について調べるためHLA class-Iのタイピングを行った。これまで分裂病におけるHLAの検討がほとんど行われていない東日本以外のpopulation(長崎県でリクルートした患者・対照者)と、以前にA24・26の増加が報告された関東を近辺の患者・対照を対象に検討した。その結果、いずれの対象においても分裂病におけるA24、A26の増加は認められなかった。関東周辺の対象では出生季節を考慮しての検討も行ったが、結果は同様であった。すなわち、80年代から最近まで繰り返し日本人の分裂病患者で報告されているHLA class-IIのDR1の増加とは対照的に、分裂病とHLA class-Iとの関連については否定的な結果であった。なお、HLA領域内または近傍の有力な候補遺伝子としてTNF、Notch-4などについても検討しているが、現在のところ有意な結果は得られていない。次に出生季節の検討であるが、まず平成12年度は日本人の分裂病患者でも欧米と同様の出生季節性パターンが見出されるかを東京周辺の患者を対象に検討した。その結果、出生季節の偏りは主に男性で見られ、夏生まれによる分裂病発病リスクの減少は顕著だが、冬生まれによるリスク増加は余り目立たなかった。これが出生地の気候と関係するかを検討するため、東北地方出身の患者での分布を調べ東京周辺でリクルートされる患者一般と比較した。その結果、冬季の気候が厳しい東北地方出生の患者では冬季出生の頻度が高いこと、リスクの増大は男性で強いことが認められた。今後は、これらの結果を受けて、HLA-class-IIの再検討、HLA近傍の候補遺伝子、それ以外の免疫関連遺伝子についての解析をさらに進め、それぞれについて出生季節との関連の検討を行いたい。また出生季節の分布については、東北地方など寒冷地域での対象をさらに増やすとともに、それ以外の地域での検討も行うため、現在国内複数施設との共同研究を進めている。本研究は、HLAその他の遺伝的要因が感染その他の環境的要因との相互作用により胎生期や乳児期の神経発達に影響を与え、のちの分裂病発病とどのように関連するかを明らかにすることを目的としている。これは、研究代表者がこれまで行ってきた分裂病とHLA-class IIとの関連に関する研究をさらに発展させるものである。

研究代表者の以前の結果では、関東地方の分裂病患者では一貫してHLA-DR1の増加が観察された。これを受けて、平成12年度はHLA-class Iに関する検討をまず行った。対象者はまず関東周辺から新たに集めた分裂病患者約150例および長崎大学・三重大学との共同で行った長崎県の患者約100例である。それぞれ同じ地域から集めた健常者を対照群とした。HLA-class Iの中で最も注目されたのは、以前にと関東圏の日本人の分裂病患者で増加が報告されているHLA-A24とA26である(Asaka et al.Br J Psychiatry 1981)。特にA24は日本人ではHLA-DR1とhaplotypeを形成しており、最も興味深かった。しかし、長崎のサンプルについてはA24やA26の増加は確認されなかった。これが、サンプル数の不足による偶然の結果なのか、先の報告が偶然の結果であったのか、あるいは同じ日本人でも地域による違いであるのかなど、注意深く検討する必要がある(Am J Med Genet投稿中)。関東近辺からリクルートした対象については、収集と解析の遅れから今回は結果を報告できないが、長崎の結果を解釈する上でも重要であり、慎重に解析を進めている。今年度はこれと平行して、遺伝的要因とともに神経発達に影響を及ぼす環境的要因の手がかりとして重要と考えられる分裂病患者の出生季節の問題についても、3000人規模の対象で検討を進めた。その結果、日本人の患者においても、出生季節に偏りがあること、特に夏生れの減少が著しく、また男性で影響がより明らかなことが示された(Schizophrenia Res印刷中)。来年度はさらに対象の収集を進め、HLA領域を含めて他の遺伝子多型の検討、出生季節や出生地域との関連などについて解析を進める予定である。分裂病発病の少なくとも一部において感染・免疫機能が一定の役割を果たしていることは、慢性関節リューマチとの関連、患者における免疫機能変化、分裂病患者における出生季節の偏りから強く示唆されている。この機序をできるだけ具体化し、またさらに詳細な証拠を示すことが、本研究最大の目的である。昨年度はこれまで検討されてこなかった東日本以外の日本人populationで分裂病のHLAの分布がどのようになっているかを知るため、長崎県でリクルートした対象についてHLA-classIの分布を調べた。その結果、以前関東を中心とする地域の対象で報告されたA24、A26の分裂病における増加は長崎の対象では見られないことが明らかとなった。また、日本人の分裂病患者でも欧米と同様の出生季節性パターンが見出されるかを東京周辺の患者を対象に検討した。その結果、出生季節の偏りは男性で主に見られること、東京周辺の対象では夏生まれによる分裂病発病リスクの減少は明らかだが、冬生まれによるリスク増加はそれほど目立たないことが明らかになった。このため出生地域による違いを検討するため、東北地方出身の患者ではどのような分布を示すかの検討を開始した。
TNF-αの骨細胞刺激に対する破骨細胞形成および矯正学的歯の移動への影響の検討

関節リウマチや感染などによる病的骨吸収は、TNF-αが主に関与しているものだと考えられている。一方、生理的な骨吸収に関しては骨細胞がRANKLを発現し、破骨細胞形成を誘導していることが新しくわかった。しかし、TNF-αによる破骨細胞形成に対する骨細胞の働きを調べた報告は未だないのが現状である。そこで本研究は、骨細胞へTNF-αを作用させ炎症性の破骨細胞形成がどのような影響を受けるのかin vitroおよびin vivoで検討しそのメカニズムを解明することを行った。まずTNF-αによる骨細胞刺激に対するRANKL発現のin vitroによる解析を行った。骨細胞がGFPにより蛍光するC57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/Jマウスより頭蓋骨を採取してFACSにて骨細胞を単離し、TNF-αの存在下で培養を行いRANKLの発現をリアルタイムPCRにて解析した。TNF-αの骨細胞刺激によりRANKLが増加することがわかった。また、TNF-αによる骨細胞刺激に対する破骨細胞形成因子(RANKL)発現のin vivoによる解析を行った。WTマウスの頭蓋部にTNF-αを注入し、mRNAを抽出しRANKLの発現をリアルタイムPCRにて解析し、RANKLの発現を確認している。また、TNF-αによる骨細胞の細胞内シグナル伝達の解析を行い、TNF-αでの骨細胞刺激でMAPKsのリン酸化が進むことがわかった。また、骨細胞とTNFRs遺伝子欠損マウスからの破骨細胞前駆細胞との共培養を行うとTNF-αを作用させると破骨細胞が誘導され、骨細胞のTNF-αによる破骨細胞形成への関与があることがわかった。さらに、歯の移動によるTNF-αの骨細胞刺激に対するRANKL発現への影響をTNFRs遺伝子欠損マウスとWTマウスとで比較したところ、TNFRs遺伝子欠損マウスでRANKLの発現が減少した。近年、炎症性のサイトカインであるTNF-αで破骨細胞が誘導されることがわかってきた。そこで本研究は、骨細胞へTNF-αを作用させ炎症性の破骨細胞形成がどのような影響を受けるのかin vitroおよびin vivoで検討しそのメカニズムを解明することを行っている。現在までにTNF-αによる骨細胞刺激に対する破骨細胞形成因子(RANKL)発現のin vitroによる解析を行った。WTマウス(C57BL6/J、8週齢雄)の頭蓋部にTNF-α(1.5μg/100μl)を5日間連続で注入し、mRNAを抽出しRANKLの発現をリアルタイムPCRにて解析した。同様にRANKLの発現を確認している。概ね計画通りに進んでいる。消耗品購入で使用額ちょうどにならず端数が生じてしまったために十数円の端数ができてしまった。次年度にTNF-

αによる骨細胞の細胞内シグナル伝達の解析、骨細胞とTNFRs遺伝子欠損マウスからの破骨細胞前駆細胞との共培養による、骨細胞のTNF-αによる破骨細胞形成への関与の解析、TNF-αによる骨細胞刺激に対する破骨細胞形成因子(RANKL)発現のin vivoによる解析、歯の移動によるTNF-αの骨細胞刺激に対するRANKL発現への影響を解析していく。