hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国の完全甘ガキ品種の特異な甘渋性遺伝とそのタンニン蓄積機構の分子生物学的解明

従来、中国には甘ガキが存在しないとされてきたが、1982年、羅田県に完全甘ガキ'羅田甜柿'が存在することが報告され、その後の調査から、'羅田甜柿'と日本の完全甘ガキ品種との交雑により、その後代に完全甘ガキ個体とともに渋みの強い個体が高率で出現することが示された。そこで本研究は、'羅田甜柿'の甘渋性遺伝の特異性を明確にし、分子生物学的手法を用いてその機作を解明する事を目的として実施した。まず、完全甘ガキと非完全甘ガキを決定する要因が果実中のタンニン細胞の大きさであることを明らかにした後、'羅田甜柿'と日本の完全甘ガキの交雑によって分離した渋みの強い個体がタンニン細胞の大きさが大きく、完全甘ガキ以外(非完全甘ガキ)であることを確認し、'羅田甜柿'の甘渋性形質の特異な遺伝を証明した。次に、'羅田甜柿'果実のタンニン化学的特性を調査したところ、'羅田甜柿'果実のタンニン分子量分布やアセトアルデヒドとの反応性は日本の完全甘ガキと異なり、その分子量が大きく、また、アセトアルデヒドとの反応性も高いことが証明され、'羅田甜柿'果実のタンニンの化学的特性は日本の非完全甘ガキ品種と酷似していることを示した。さらに、果実へのタンニン蓄積に関与するフラボノイド生合成系遺伝子群の発現を経時的に調査したところ、日本の完全甘ガキはそれら遺伝子群の発現が7月にはほとんど消失しているのに対して、'羅田甜柿'は日本の完全甘ガキとは異なった遺伝子発現の消長を示し、その特異性が証明された。以上、本研究により中国で発見された完全甘ガキ'羅田甜柿'の甘渋性決定機構の特異性が明確となり、タンニン蓄積に関わる遺伝子群の発現様式の差異が関係している可能性が示された。まず、中国の完全甘ガキ品種である'羅田甜柿'と日本の完全甘ガキ品種との交雑により、渋ガキが生じるかどうかを確かめるために、農研機構果樹試験所ブドウ・カキ研究部で維持されている'羅田甜柿'に'太秋'を交雑して得られたF_1集団34個体について、そのタンニン細胞の大きさを成熟期に測定した。その結果、日本の完全甘ガキ個体同士の交雑からは生じることがない、タンニン細胞の大きな渋ガキ個体が多数存在することが明らかとなり、'羅田甜柿'の甘渋性の遺伝様式の特異性が明確となった。またその分離比はタンニン細胞の小さい個体:大きい個体が22:12となり、渋ガキ個体がかなりの頻度で生じることが明らかとなった。また、これら個体のタンニン物質の分子量分布およびアセトアルデヒドとの反応性を調査したところ、親の'羅田甜柿'およびそのF_1世代のタンニン細胞の小さい個体、大きい個体はいずれもその分子量分布が日本の完全甘ガキと比較するとかなり大きく、日本の渋ガキと同等の分子量分布を示した。さらに、アセトアルデヒドとの反応性も渋ガキ同様、かなり高く、タンニンの化学性は日本の完全甘ガキとは異なり、渋ガキと近いことが明らかとなった。さらに、このF_1世代を用いたDifferential Display法により、タンニン細胞へのタンニン蓄積に関与する遺伝子を探索する試みを予備的に検討したところ、現在、いくつかの候補が見つかりつつあり、来年度さらにこの試みを進展させる予定である。

最後に、中国の羅田県で海外共同研究者の王氏の協力で調査を行い、'羅田甜柿'以外にも完全甘ガキが中国に存在することを確認し、今後'羅田甜柿'の起源を調査する手掛かりを得た。昨年度の'羅田甜柿'に'太秋'を交雑して得られたF_1集団(約50系統)の調査から、果実のタンニン細胞が大きい個体は完全甘ガキであり、小さい個体は渋ガキであることが確認され、'羅田甜柿'と日本の完全甘ガキを交配することによって、日本の完全甘ガキ同士の交配では出現しない、渋ガキが分離することが確実となった。本年度はまず、この現象が交配ミスから生じたものでないことを確認するために、数種のSSRプライマーを構築し、これらの交雑集団が'羅田甜柿'と'太秋'から生じた実生であることを確認した。その上で、このF_1集団の果実からmRNAを7月中旬に抽出した後、タンニン細胞が大きい個体(渋ガキ)とタンニン細胞が小さい個体(完全甘ガキ)とにわけてバルク化し、cDNA-AFLP法により渋ガキの出現に関与する遺伝子の探索を試みた。現在、このcDNA-AFLP法から数種の候補となるDNA fragmentを得ており、それらの塩基配列の決定を行っている。また、これら個体のゲノムDNAをバルク化した試料を用い、AFLP法によりタンニン細胞の発育を制御する遺伝子に連鎖するマーカーを探索し、そのAFLPマーカーから遺伝子を探索することも試みたが、64種類のプライマー組合せの分析からでは有望なAFLPマーカーを見いだすことが出来なかった。さらに'羅田甜柿'の特異性をタンニン生合成系の遺伝子発現から解析するため、'羅田甜柿'、日本の完全甘ガキ、渋ガキの果実を幼果期から経時的に採取し、フラボノイド合成系に関与する重要な酵素であるPAL、CHS、DFRをコードする遺伝子の発現を調査したところ、'羅田甜柿'は日本の完全甘ガキとは異なる発現様式を示し、'羅田甜柿'の特異性が明らかとなった。また、ゲノムライブラリーからの甘渋性関与遺伝子の単離および甘渋性簡易判別のためのDNAマーカーの構築も試み、それらについても本年度、若干の知見を得た。本年度はまず、カキのタンニン生合成に関与する遺伝子の単離を試み、渋ガキを幼果期に樹上脱渋することによりタンニン蓄積能力を消失した果実を人為的に作成し、その果実とタンニン蓄積能力を持つコントロール果実とを用いて、両者の間で発現に差異のあるmRNAを単離することで、タンニン生合成に関与する遺伝子の探索を試みた。具体的には、両果実から抽出したmRNAから合成したcDNAを用い、Clontech社のPCR-Select cDNA Subtraction Kitでのサブトラクション法により発現に差異のあるmRNA断片を特定した。その結果、CHI、F3H、PALのようなフラボノイド生合成系の酵素をコードする遺伝子とともに、anthocyanidin reductaseをコードする遺伝子およびserine carboxypeptitaseをコードする遺伝子と近い配列をもつ遺伝子をクローニングすることができた。そこで次に、この両者の発現様式を日本のPCNA品種である'富有'と'次郎'、中国のPCNA品種'羅田甜柿'で解析したところ、日本のPCNA品種ではタンニン蓄積能力の低下とともに、この両者の遺伝子発現が消失していくが、'羅田甜柿'ではanthocyanidin reductase遺伝子の発現は低下せず、serine carboxypeptitaseをコードする遺伝子に近い配列を持つ遺伝子の発現のみが低下することが明らかになり、'羅田甜柿'の脱渋機構の特異性が明らかになった。さらに、'羅田甜柿'に'太秋'を交雑して得られたF_1集団で分離したPCNA個体とnon-PCNA個体を用い、この両者の遺伝子発現を調査したところ、anthocyanidin reductase遺伝子の発現はPCNA個体とnon-PCNA個体で差異が認められず、serine carboxypeptitaseをコードする遺伝子に近い配列を持つ遺伝子の発現のみがPCNA個体で低下していくことが確かめられた。
マルチロール型エンジニア育成のためのエンジニアリングデザイン教育プログラムの構築

生産現場における開発・設計・生産など全体を見通して製品開発できる、マルチロール型エンジニアの育成を目標として教育プログラムを開発した。プログラムは開発プロセスを学ぶ講義科目、創造性を養う演習、そしてクライアントのニーズに基づいた装置を開発する製作演習から構成される。開発プロセスを理解し、その知識を製品開発に活用できるエンジニアが教育プログラムの目標である。研究では,ものづくりの各部門の知識や技能を横断的に理解し,開発・設計・生産を一貫して主導できるエンジニア,すなわち「マルチロール型エンジニア」の育成を目標として,企業における開発プロセスを適切に教授するエンジニアリングデザイン教育プログラムを構築する。さらに,邦文教科書のないエンジニアリングデザイン教科書およびe-learning教材を作成することにより,広く工学部教育に資することを目的とする。平成21年度は、機械製造業2社、電気製造業3社、設備製造業1社、半導体製造業1社、公共システム製造業2社に訪問調査を実施し、デザインプロセスについて取材した。いずれの企業においてもデザインレビューによって問題点の洗い出し、エキスパートからの知識の伝授、品質の向上、開発目標との整合、次の段階へ進めるための認証、が計られているが、高専におけるエンジニアリングデザイン教育ではこれらの観点の教授が欠けていることがわかった。専門的な知識を要求されるレビューをどのように教育に盛り込むかを、今後検討する予定である。なお、調査した企業はいずれもB2B(Business to Business)製品を開発する企業であり、今後、consumer用製品を主とする製造メーカに訪問調査を実施し、産業用製品との開発プロセスの相違について検討する。また、松江高専において実施してきたエンジニアリングデザイン製作演習をホームページ公開した。さらにデザインプロセス教育についてもホームページ公開を進める予定である。平成21年度の日本企業におけるデザインプロセス調査を元に、22年度からはメカニクス、エレクトロニクス、ソフトウエアを統合的に理解できるエンジニアを育成するための教科内容および教材の開発を行っている。多くの装置・機器では、メカ、エレキ、ソフトのいずれかを専門とするエンジニアが、他の専門のエンジニアとチームを組んで開発している。チーム作業では、他の分野とのインタフェースが理解できれば一応の作業はできるが、他の分野のキーとなる考え方を身につけていれば、より高度なデザインをより効果的に実現することが可能となる。しかし多くの学生にとって複数の専門を学ぶ時間的余裕はない。そこで1つの分野を身につけた学生を対象として、他分野のキーとなる知識や考え方を学ぶ教科を開発する。先ず、第一段階として、機械系のエンジニアを対象として電気系のセンサ、アクチュエータ、マイクロコンピュータを学ぶための教科書および教材を開発中である。機械系エンジニアにはメカトロニクスとして電気系の知識が必要となっているが、電気系の教科では、センサは計測工学や電子回路、アクチュエータは電気機器やエネルギー変換工学、マイクロコンピュータはデジタル回路や計算機工学と、それぞれに細分化されており、ある程度の工学知識を持った学生が統合的に学べる科目はない。平成23年度は教科書の完成を目標とする。開発・設計・生産を通してプロセスを理解するためには、製品の設計から製造に至るプロセスを論理的に系統立てて理解し、その理解をものづくりに展開することが効果的と考える。松江高専では、エンジニアリングデザインを統合的に学ぶためのカリキュラムとして、高専本科でものづくりを体験し、専攻科においてエンジニアリングデザイン知識を学び、同時にデザインに用いられる技法をトレーニングするとともに、学んだ知識を活用するものづくり演習を実施するカリキュラムを実施した。この経験について2件の学会発表を行った。また、多くのシステム開発では、機械(メカニクス)、電気(エレクトロニクス)、ソフトウエア(プログラム)のいずれかを専門とするエンジニアが、他の専門のエンジニアとチームを組んで作業する。チーム開発では、他分野とのインタフェースを理解できれば一応の作業はできるが、他分野のキーとなる考え方を身につけていれば、より高度なデザインをより効果的に実現することが可能となる。そこで1つの分野を身につけた学生を対象として、他分野のキーとなる知識や考え方を学ぶ教科の開発に22年度から着手している。現在、機械系学生を対象として電気電子系のセンサ、アクチュエータ、マイクロコンピュータを学ぶための教科書および教材を開発中である。
細胞外マトリックスの視点からの血液眼関門の構造的・機能的評価

毛様体無色素上皮細胞で腫瘍壊死因子(以下TNF-α)にて発現増加したマトリックスメタロプロテアーゼ(以下MMP)のMMP-1、MMP-3、MMP-9は、インフリキシマブ投与により、mRNAおよび蛋白レベルで抑制される。またMMP-1、MMP-3、MMP-9は、血液房水関門の主要構成分子である毛様体無色素上皮細胞のclaudin-1およびoccludinを分解する事も免疫染色法により確認された。我々は以前の研究で、毛様体表面である無色素上皮細胞層にはFibrillin-1とversicanとhyaluronanが巨大分子複合体であるFiVerHyを形成することを示した(Ohno et al.,2008)。毛様体無色素上皮細胞として今回はhuman non-pigment ciliary epithelial cellsを用いて、この培養細胞においても同様の構造が構築されており、しかも、この分子複合体が例えばMatrix metalloproteinase-3(MMP-3)で破綻されることを目的として設定した。これまでの研究では、毛様体細胞においてlatanoprostがMMP-3発現を誘導することが示されている。培養液にMMP-3あるいはlatanoprostを加えると、培養上清中にFibrillin-1とversicanの分解物が増加することがMALDI-TOFMASで確認された。FiVerHyは房水の抵抗として働き、この分解はぶどう膜炎におけるflareの増加を促す現象と一致して眼圧が低下する臨床的意義や、latanoprost投与により眼圧低下に働く事実と一致する。FiVerHyの機能解明が、血液眼関門としての血液房水関門の機能解明と眼圧下降薬の開発への新たなる布石となる事を信じて、今後も本研究を継続する。本年度の研究は、血液房水関門を構成する細胞における生理的MMPならびにTIMP発現量を調べ、異なる濃度のTNF-aを添加した事による、これらの遺伝子発現量の変化を調べる事にある。さらに、この実験系にて、抗TNF-a製剤として知られるinfliximabを加え、TNF-aの添加によって変化したMMPならびにTIMPの遺伝子発現量に対する抑制効果を調べた。前房蓄膿などの、ベーチェット病による前部ぶどう膜炎の発症機序、ならびに、infliximabによる治癒過程をin vitro系にて再現するモデルの確立を目的としている。今回の実験にはhuman non-pigment ciliary epithelialcells(HNPCECs)を用いた。その他、実験方法は、既に我々が報告した論文に準拠した(Li et al., JOcul Pharmacol Ther. 2010)。その結果、血液網膜関門を構成する細胞系を用いた時の変化とは異なるMMPならびにTIMPの発現変化が確認された。一方で、infliximabによる抑制効果は、血液網膜関門の報告と同様に、TNF-aの添加前に投与した時の方が、添加後に投与した時よりも抑制効果が強かった。この事実は臨床的に、眼発作前からのinfliximab投与が有効である事をサポートしている点で、非常に意義ある結果と解釈している。さらに今回は遺伝子変化だけでなく、蛋白発現変化についても調べており、現在、投稿準備中である。抗ヒトTNF-αモノクローナル抗体であるinfliximabはベーチェット病ぶどう膜炎に有効である。ここでは血液房水関門を形成するヒト毛様体無色素上皮細胞を用いて、前部ぶどう膜炎の治癒機序を調べた。TNF-α存在下でMMPとTIMPの発現量を定量的PCRおよびELISAにて測定した。TNF-αの存在でMMP-1、MMP-3、MMP-9の発現が増加し、この増加はinfliximabの投与で抑制された。TNF-α投与後よりもTNF-α投与前にinfliximabを加えた方が、より強い抑制効果がみられた。Gelatinzymography解析でもMMPのプロテアーゼ活性はTNF-αの存在で増加し、この増加はinfliximab投与で抑制された。ウェスタンブロット法ならびに、ブタ毛様体無色素上皮およびヒト毛様体無色素上皮細胞の免疫染色解析の結果、MMP-1、MMP-3、MMP-9は毛様体無色素上皮細胞にあるタイトジャンクションのcaudin-1とoccludinを分解した。さらにMMP-1、MMP-3、MMP-9処理によりヒト毛様体無色素上皮細胞層の分子透過性は増加した。すなわちTNF-αは血液房水関門を構成する細胞でMMP発現を増加させ、増加したMMPは血液房水関門のタイトジャンクション構成分子を分解し、細胞透過性を増加させた。Infliximabは血液房水関門を構成する細胞でのTNF-αによるMMP発現の増加を抑制することで、ぶどう膜炎抑制効果を発揮するのかもしれない。当初予定していた実験は概ね実施され、その結果についても興味深いものであった。現在、発展的知見を得るための実験を準備中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。

本研究の結果をふまえ研究をさらに推進させ、治療に貢献できる情報を得て、将来的に臨床に応用できる分野へと発展させる予定である。現時点では特に問題点はない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
慢性偽性腸閉塞症の新規治療法の開発

慢性偽性腸閉塞(Chronic intestinal pseudo-obstruction以下CIPO)は主に小腸の運動が低下することによる腸管内容物の輸送障害により器質的消化管の閉塞機転がないのにかかわらす消化管閉塞による症状と画像上の鏡面像を呈する原因不明の難治性疾患である。今回の研究ではCIPO患者の症状緩和及び小腸機能廃絶防止の観点から、患者負担の少ない腸管減圧方法として胃瘻空腸チューブ(PEG-J)の有用性を検討した。PEG-J減圧療法は、CIPOの症状の主観的側面(腹部症状)、客観的側面(栄養状態)いずれの改善に対しても大いに貢献することが示された。CIPOは手術は無効で腸管内減圧が有効である。CIPOの根幹となっている病態異常は腸管運動低下による内容物の輸送層障害による腸液の貯留と内圧亢進である。この異常病態の解除のために適切な腸管内減圧が重要である。今回の研究ではCIPO患者で複数回腸閉塞症状の急性増悪で入院しイレウス管挿入をした患者で同意を得られた患者6名を対象に胃瘻を作成しjejunal tube経由に細径減圧チューブを挿入し拡張腸管の減圧を試みた。効果に関しては前後の自覚症状の改善と画像所見の改善で比較検討した。また1年間の観察期間で長期的効果の持続性、チューブの設置場所の変更の必要性や有害事象などを検討した。減圧に関して今回の研究では通常の60cmの空腸チューブでは減圧が難しく、新たに業者に特注で120cmの空腸チューブを作成して挿入した。現在経過観察中であるが、腸閉塞症状や拡張腸管の程度の低減が得られている。本デバイスの治療効果の機序であるが、空腸チューブにより、もともと鋭角に屈曲していた患者腸管がチューブのステンティング効果により角度が鈍角になることで腸閉塞症状の改善、食事摂取の可能性の拡大、排液量の減少など当初予想していない副次的機序により効果がもたらされた可能性が示唆された。この証明のためにはPEG-J挿入前後の腸管走行の角度の解析、検討が重要となると考えられた。今後は、挿入前後での腸管の走行屈曲角度の検討に冠状断でのCT撮影を行うことで可能になると思われた。次年度さらに症例を増やして検討するとともに、挿入前後での解析を行いさらに長期の検討を行う予定である。急性増悪時には経鼻的にイレウスチューブを挿入して治療が行われ、待機的に減圧のために胃瘻や小腸瘻が増設されるが充分万遍なく減圧されるとは限らない。今回たまたま胃瘻からイレウスチューブを入れることになった患者の症状寛解効果が高く経過が良いことを認めたため本疾患の治療に胃瘻よるチューブの長期留置で減圧を適切に行う新しい治療法の開発の端緒を得、研究を開始した。初年度は胃瘻増設による治療効果の検討を行い効果を確認できた。2年目である本年度は胃瘻より60120cmの空腸留置チューブを挿入して先端より罹患腸管での腸管減圧を行う新規治療機器(PEG-J tube)の開発の検討を行った。6例に施行して前後で自覚症状の改善、合併症の有無を検討したところ。5例で改善効果を求めた。しかしながら胃瘻増設部位の疼痛や逆流する腸液によると思われる腐食性皮膚炎などの合併症を認め今後の課題と考えられた。一方拡張腸管のために胃瘻増設そのものが困難な症例がおり、その場合事前に経鼻的イレウス管を挿入して拡張腸管を減圧して胃前壁と腹壁を直接接触することができれば挿入可能であることも確認できた。我々の開発したPEG-J減圧療法は患者の自覚症状の改善、画像上の拡張腸管径の低下に有効であることが強く示唆された。今後は比較検討試験で検証することが最も妥当な検討になるが、希少難病であるが故治療前後での治療効果の判定を行い症例数を増やすことが課題であると考えられた。

消化器内科新規治療器具の開発が完了し、実際の患者に少数例ながら使用して良好な治療効果が得られているため今後器具のさらなる改良と、治療効果の長期的観察、治療症例数を増加することを目指す。
転座型クロマチンリモデリング因子による細胞がん化機構の解析

本研究は、未分化骨髄性白血病に関連したクロマチンリモデリング因子とヌクレオポリンの融合遺伝子であるTAF-I-CANによる細胞がん化機構を明らかにすることを目的としてすすめた。構築したTAF-I-CANトランスジェニックマウスを用いて、TAF-I-CANが造血細胞の分化を阻害し、幼若な細胞画分を増加させることを見いだした。一度TAF-I-CANにより形質転換した細胞から、TAF-I-CANをノックアウトしても、完全にがん形質が戻らないことから、TAF-I-CANによる細胞がん化にはエピジェネティックな変化が関わっている可能性が考えられた。TAF-I-CANが核外輸送される転写因子の輸送を阻害し、あるいは転写因子を奪うことで、NF-κBやCBPによる転写を負に制御する可能性も示された。一方、小児の急性リンパ性白血病において最も高頻度に観察されるTEL-AML1の染色体転座に、RAGによるRAG偽シグナル配列依存的な切断が関与している可能性が示唆された。本研究の目的は、新たながん化機構の解明を念頭に、未分化骨髄性白血病に関連したクロマチンリモデリング因子とヌクレオポリンの融合遺伝子による細胞がん化機構を明らかにすることにある。その範疇の融合遺伝子として、TAF-I(Template Activating Factor-I)/SET-CANおよびDEK-CANを対象とした。我々はこれまでに、TAF-I/SET-CANが、がん遺伝子であることを示した。TAF-I-CANによる細胞がん化機構を明らかにする目的で、siRNA法を用いてTAF-I-CANで形質転換した細胞でのTAF-I-CANの発現抑制を行なった。その結果、TAF-I-CANにより形質転換した細胞のがん形質が部分的に解消された。アレイ解析を行なったところ、発現量に変動の見られた遺伝子の中には、TAF-I-CAN発現細胞でTAF-I-CANの発現を抑制した際、非発現細胞での発現量とほぼ同程度まで戻ったものがある一方、TAF-I-CAN発現細胞とあまり差異が見られないものも存在した。これらの結果から、TAF-I-CANによる細胞がん化にはエピジェネティックな変化が関わっている可能性が考えられる。造血細胞特異的にTAF-I-CANが発現するトランスジェニックマウスを作成したところマウスでは脾臓の増大が観察された。骨髄細胞についてFACS:解析を行ったところ、トランスジェニックマウスでは細胞数の増加が認められ、また未分化な(c-kit陽性)細胞画分の割合の増加が認められた。従って、TAF-I-CANの発現によりマウス造血細胞において造血細胞の分化が阻害され、幼若な細胞画分の増加が生じた可能性が考えられる。細胞がん化の機構解析に加えて融合遺伝子を構成する各パーツの機能解析をすすめた。TAF-IはHRXとの相互作用し、標的遺伝子の発現を協同的に促進することを見いだした。我々が新たに同定したクロマチン関連因子であり、いくつかの転座型融合がん遺伝子の産物を構成しているTAF-IIIは、リボソームRNAの合成と細胞増殖制御に関わっていることを明らかにした。本研究の目的は、我々が同定したクロマチンリモデリング因子の一つであるTAF-I/SETをコードする遺伝子と核膜孔構成成分である.CAN/Nup214をコードする遺伝子の融合遺伝子であり、未分化の骨髄性白血病の染色体転座領域に見いだされる融合遺伝子であるTAF-I/SET-CAN/Nup214による細胞がん化機構を明らかにすることである。これまでに、TAF-I-CANが細胞の足場非依存性増殖を促し、低血清存在下での増殖を可能とし、またヌードマウスで造腫瘍活性を持つことを示してきた。本研究では、loxP配列でcDNAの両側を挟んだTAF-I-CAN発現ベクターを挿入したTAF-I-CAN発現細胞株を作成した。Creリコンビナーゼを発現させ、TAF-I-CANのcDNA配列を除いた細胞は、足場非依存的な増殖能を失い、低血清培地存在下における細胞死も誘導されるようになったが、低血清培地存在下での細胞増殖能は維持されていた。すなわち、この細胞株ではTAF-I-CANが一度発現したことで得られた表現型の一部は、エピジェネティックな機構で維持されている可能性が示唆された。個体レベルでTAF-I-CANの機能を検討するため、赤芽球系及び巨核球系細胞で活性のみられるGATA-

1プロモーターにTAF-I-CANを挿入したトランスジェニックマウスを構築したところ、顕著な血小板減少が認められた。加えて、大球性貧血が認められたラインも出現した。血小板減少と貧血が観察されたラインでは、白血病の発症は観察されなかったが、野生型マウスに比べ生存期間の減少が観察された。骨髄細胞のFACS解析を行った結果、Tgマウスでは骨髄細胞数の増加と骨髄前駆細胞の割合の増加が認められた。一方、赤芽球系の細胞分化において、Tgマウスでは前駆細胞より分化が進行したステージの細胞群の割合が減少していた。従って、TAF-I-CANの発現によりマウス造血細胞において造血細胞の分化が阻害され、幼若な細胞画分の増加が生じた可能性が考えられる。本研究の目的は、新たながん化機構の解明を念頭に、未分化骨髄性白血病に関連したクロマチンリモデリング因子とヌクレオポリンの融合遺伝子による細胞がん化機構を明らかにすることにある。その範疇の融合遺伝子として、TAF-I(Template Activating Factor-I)/SET-CANおよびDEK-CANを対象とした。我々はこれまでに、マウス繊維芽細胞NIH3T3細胞とヌードマウスを用いた形質転換実験により、TAF-I/SET-CANが、がん遺伝子であることを示してきた。TAF-I/SET-CANを発現するトランスジェニックマウスでは、一部の造血細胞の分化抑制が認められた。一度がん形質を獲得した細胞においてTAF-I/SET-CANをノックアウトすると、足場非依存的増殖能が失われた。一方、低濃度血清下での増殖能は維持されていたものの、p38MAPKを含むアポトーシス経路が回復していた。これらの結果は、TAF-I/SET-CANが足場非依存性増殖能に関わると考えられているG1/S期のチェックポイントおよびp38MAPKが関わるアポトーシス経路の破綻を導く可能性を示している。TAF-I/SET-CANの細胞周期およびアポトーシス経路の異常を引き起こす機能は、TAF-I/SET-CANによる細胞がん化の過程に密接に関わっている可能性がある。加えて、TAF-I/SET-CANによる細胞がん化には、低濃度血清下での増殖能で観察されたようなエピジェネティックな機構が存在する可能性も示された。細胞がん化の機構解析に加えて融合遺伝子を構成する各パーツの機能解析をすすめた。TAF-Iが細胞内でそのヒストンシャペロン機能に依存して、遺伝子の発現調節に関与していることを見いだした。我々が新たに同定したクロマチン関連因子であり、いくつかの転座型融合がん遺伝子の産物を構成しているTAF-IIIは、リボソームRNA遺伝子の構造変換を介して細胞増殖制御に関わっていることを明らかにした。SET/TAF-Iβ-CAN/Nup214(以後TAF-Iβ-CANと表記)は、白血病で見られる染色体異常del(9)によって生じる融合型遺伝子産物である。TAF-Iβ-CANによる細胞がん化機構の培養細胞レベルでの解析の結果、TAF-Ib-CANの恒常的発現により、細胞はがん形質を獲得し、Gl/S期のチェックポイントおよびアポトーシス経路にTAF-Iβ-CANが直接作用し異常を引き起こすことが明らかとなった。TAF-Ib-CANの構成要因であるTAF-Iβは遺伝子発現調節に関与していることから、TAF-Ib-CANの遺伝子発現への影響を調べた。
深海魚抽出物によるスフェロイド形成の分子基盤の解明

深海魚の皮下組織からの抽出物は、培養細胞に対してスフェロイド化活性を持つ。深海魚抽出物より単離された蛋白Aは既知の分泌性蛋白であるが、これまでに細胞スフェロイド化に関する報告はない。蛋白Aのスフェロイド化活性は発現実験により確認したが、魚類相同蛋白にのみ同活性があり、哺乳相同蛋白にはその活性はない事が分かった。蛋白Aのpull down assayにより、培養細胞側の標的蛋白Bを同定した。蛋白Bは細胞の接着接合部に局在し細胞間接着を安定化させる蛋白である。深海魚抽出物より形成されたスフェロイド内での細胞極性の解析により、単なる細胞の塊ではなく、細胞極性に準じた集合体であることが示唆された。深海魚ノロゲンゲのゼラチン状皮下組織からの抽出物は、培養ほ乳動物細胞に対してスフェロイド形成を誘導する活性を持つ。この活性は広範囲の細胞種で認められ、ディッシュ底面への接着を阻害し、細胞-細胞間の接着を促進することによる。これまでの研究から生化学的には、その活性の本体は糖蛋白質であることが示唆されている。本年度は深海魚抽出物より活性本体を精製・同定することを目指し様々な精製方法を検討してきたが、液相等電点電気泳動により活性を保持した状態での精製に成功した。質量分析によるアミノ酸配列の解析により、活性蛋白の候補Aを同定した。蛋白Aは幅広い生物種に保存されている分泌性蛋白であり、魚類等では細胞外の環境を整える機能について報告されているが、細胞を三次元化させるという報告はない。今後リコンビナント蛋白質により活性が再現できることを検証する。また、スフェロイド形成技術の応用のために、ノロゲンゲ抽出物により形成されたスフェロイド内での細胞極性や細胞間接着装置の解析を検討課題に取り入れ、形成したスフェロイドが生体内での細胞の配置をどれだけ再現できるかについても検討を行った。2種類の異なる細胞を混合培養した際に、その細胞極性に応じて局在をリモデルする実験系として膵臓ランゲルハンス島のα細胞とβ細胞に着目した。異なる蛍光ラベルを行ったα細胞とβ細胞を混合培養し、ノロゲンゲ抽出液を処理して三次元化させたところ、α細胞が外側、β細胞が内側という、ランゲルハンス島で見られる細胞局在が確認され、本素材による細胞三次元化は単なる細胞塊形成ではなく、細胞極性に準じた集合体の形成が可能であることが示唆された。昨年度は深海魚抽出物の液相等電点電気泳動により活性を保持した状態での精製に成功し、質量分析によるアミノ酸配列の解析により、活性蛋白の候補Aを同定した。蛋白Aは幅広い生物種に保存されている分泌性蛋白であり、細胞をスフェロイド化させるという報告はない。今年度は蛋白Aを遺伝子組換えにより再現し、スフェロイド化活性がみられるかどうかを検証した。transientの遺伝子発現では活性が非常に低く、遺伝子導入試薬のみでも細胞がわずかに凝集する傾向が見られたことから蛋白Aのstable cell lineを作成し、遺伝子が発現している細胞では播種したのみで細胞が三次元化する事を確認できた。このことから、蛋白Aは細胞をスフェロイド化する活性があることが示唆された。また、スフェロイド内での細胞極性の確認のために、細胞内コレステロール濃度依存性に局在を変える蛋白Bの、GFP融合カセットをstableに発現する細胞株を作成し、その局在が細胞の凝集度によりどのように変化するかを共焦点レーザー顕微鏡のタイムラプス撮影で観察したところ、通常は細胞小胞上に局在する蛋白Bが細胞の凝集度が上がるにつれが細胞膜上に移動することがわかり、これは通常の平面培養ではコレステロールの除去を行わない限り見られない変化であることから、スフェロイド中での栄養飢餓状態を反映し蛋白Bがその極性を変化させたことが示唆された。このことから、本素材による細胞三次元化は単なる細胞塊形成ではなく、細胞極性に準じた集合体の形成が可能であることが示唆された。ノロゲンゲから蛋白Aを再現するために、ノロゲンゲRNAライブラリーを作成し、RT-PCRを行ったが、生きた状態でのノロゲンゲ取得が困難であること、遺伝子情報が全く蓄積しておらず類似の遺伝子情報を参考にするほかなかったことから、蛋白A遺伝子の取得に失敗したことが、最も進捗を遅らせる要因となった。そこで遺伝子研究の専門家に相談し、蛋白Aのfunctional domainが種を超えて保存されていることから、研究対象をノロゲンゲから、遺伝子情報が蓄積している他の種に代えても差し支えないと意見であったので、同じ魚類でも遺伝子研究が盛んに行われているゼブラフィッシュとメダカの相同蛋白Aを取得し、糖鎖修飾が必須のため哺乳細胞で再現実験を行った。幸いに魚類蛋白Aに同様の機能があったことから、stable cell lineの作成により、その活性を確認することができた。

その一方で、ノロゲンゲ抽出物を細胞に投与したほど、stable cell lineでのスフェロイド化活性は高くないことから、1)ノロゲンゲ抽出物内に含まれる他の因子が補助的に機能している、2)ノロゲンゲ蛋白Aの活性が非常に高い、ということが考えられたため、1)に関してはノロゲンゲ抽出物に最も多く含まれている要素Cを培養時に添加することで検証し、2)に関しては魚類の遺伝子にはintronが無い、あるいはあっても非常に短いものが多いことから、劣化が激しいサンプルからも安定的に取得可能なgenomeを用いた、genomic southern blottingでノロゲンゲ蛋白Aの遺伝子構造を明らかにする予定である。深海魚の皮下組織からの抽出物は、培養ほ乳動物細胞に対してスフェロイド形成を誘導する活性を持つ。この活性は広範囲の細胞種で認められ、ディッシュ底面への接着を阻害し、細胞-細胞間の接着を促進することによる。スフェロイド化活性の本体は蛋白であり、液相等電点電気泳動による精製、質量分析によるアミノ酸配列の解析により、活性蛋白の候補Aを同定した。蛋白Aは幅広い生物種に保存されている分泌性蛋白であり、これまでに細胞を三次元化させるという報告はない。深海魚より遺伝子情報を取得することが困難であったため、魚類の相同遺伝子を用いた。蛋白Aのスフェロイド化は魚類遺伝子で確認できたが、哺乳類相同遺伝子では確認できなかった。このことから、蛋白Aのスフェロイド化誘導は、魚類の蛋白Aにのみ見られる現象であることが示唆された。蛋白Aが細胞間接着を促すためのターゲット蛋白を検索するため、cadherinを持たないL細胞の細胞溶解液を対象とした蛋白Aのpull down assayを行い、そのターゲットとなる蛋白Bを同定した。蛋白Bは細胞のadherence junctionに局在し細胞間接着を安定化させる蛋白であり、この抗体によりL細胞のスフェロイド化が抑制されることから、蛋白Bが蛋白Aのターゲットとなることがわかった。深海魚抽出物より形成されたスフェロイド内での細胞極性の解析を行ったところ、膵臓ランゲルハンス島のα細胞とβ細胞がスフェロイド内で極性に応じて配置することや、脂質要求性に局在を変化させる蛋白のスフェロイド内でのapicalとbasolateral sideの局在変化を観察することができた。このことにより、深海魚抽出物により形成されたスフェロイドは単なる細胞の塊ではなく、細胞極性に準じた集合体であることが示唆された。深海魚の皮下組織からの抽出物は、培養細胞に対してスフェロイド化活性を持つ。深海魚抽出物より単離された蛋白Aは既知の分泌性蛋白であるが、これまでに細胞スフェロイド化に関する報告はない。蛋白Aのスフェロイド化活性は発現実験により確認したが、魚類相同蛋白にのみ同活性があり、哺乳相同蛋白にはその活性はない事が分かった。蛋白Aのpull down assayにより、培養細胞側の標的蛋白Bを同定した。蛋白Bは細胞の接着接合部に局在し細胞間接着を安定化させる蛋白である。深海魚抽出物より形成されたスフェロイド内での細胞極性の解析により、単なる細胞の塊ではなく、細胞極性に準じた集合体であることが示唆された。ノロゲンゲ抽出物中の活性蛋白の精製に、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、レクチン精製など古典的な蛋白精製法により抽出物からの精製を試みたが、各精製に用いられている固相に吸着するためか、精製が進むほど活性がロスする点が問題となった。そこで液相での分離が可能な等電点電気泳動装置を導入し、活性が濃縮できるような精製条件を確立し、質量分析計を用いた蛋白同定が可能となったが、精製法の確立や質量分析計のセットアップに手間取り、進捗に遅れが生じている。
看護学部における基礎医学教育モデル・コア・カリキュラム案の策定

(1)前年度までに、解剖学、生理学、生化学、微生物学、病理学、薬理学について、それぞれの教科書、問題集、医学基礎教育コア・カリキュラム、薬学部基礎医学教育コア・カリキュラム、歯学部基礎医学教育コア・カリキュラムなどを参照・調査し、看護基礎医学教育コア・カリキュラムとして必要と思われる項目を抽出した。(2)本年度は、各項目について、それぞれの学外専門家1ー2名に質問書を送付して、看護基礎医学教育のコア・カリキュラムとしての適否について意見をうかがった。(3)さらに、看護国家試験の過去の出題問題や出題基準と照合し、看護基礎医学教育コア・カリキュラム案を作成した。(4)作成した看護基礎医学教育コア・カリキュラム案について、学内看護系教員に供覧し、意見をうけ修正した。現在の看護基礎医学教育の一番の問題点は、看護教育独自の医学教育カリキュラムが確立していないことにある。医学科における科目構成をそのまま看護教育に適用しようとしているために、時間的に無理が生じている。そこで、本コア・カリキュラム案では、1)生化学、微生物の内容を総論にとどめ、各論的な部分は臨床医学で扱う(栄養学、感染症など)、2)病理学は総論のみを扱い、病態生理学や病理学各論は臨床医学で扱うこととした。今後、1年の延長期間で、海外の状況等さらに情報を収集し、完成を目指す。また、疾病論、疾病治療論など、臨床医学の科目についても整備する必要がある。看護基礎医学教育科・カリキュラムの基本案を期限内に作成した。今後、さらに海外の状況などを取り上げて、完成した形にして公表したい。本研究では、看護教育全体のモデル・コア・カリキュラム化に先駆けて、基礎医学科目でモデル・コア・カリキュラムの構築を目指す。そのために、国内外の大学看護学部における基礎医学教育の実態を調査するとともに、各科目から達成目標となる項目を抽出・選定し、検証する。平成28年度は、1)医学教育モデル・コア・カリキュラム、2)歯学教育モデル・コア・カリキュラム、3)全国看護系大学の基礎医学科目シラバス、4)看護師試験問題集(2016年に出題基準が改訂)等について検索を行った。これらの項目をリストアップし、互いに照合したうえで、統合、整理した。さらに、4)解剖学、生理学、病理学について、それぞれ数種類の教科書を選択し、学習目標項目のリストアップを行った(現在、進行中)。今後、網羅的な項目のリストを整理して、絞り込みの段階に入っていく予定である。インターネット検索、各科目の学習目標項目の抽出などの作業を先行させた。この作業に時間がかかるため、海外大学の実地調査、国内大学のアンケート調査については未実施の状況にある。本研究では、看護基礎医学科目(専門基礎科目)のモデル・コア・カリキュラムの構築を目指している。2017年度に、文部科学省より「看護学教育モデル・コア・カリキュラム(案)」が公表された。専門基礎科目についていえば、教科書の大見出しが並んでいて、大筋の項目の列挙にとどまっていた。したがって、看護系教員や非常勤の医学系教員が科目を担当する際に、どこまで教えれば良いか判断するための共通の指標とはなりにくく、本研究の目的からは不十分と判断した。そこで、さらに細部にわたるモデルカリキュラムが必要と考え、研究を続行した。(1)専門基礎科目(基礎医学科目と疾病に関する科目)のモデル・コア・カリキュラムの構築のために、カリキュラムを構成する項目(細目)の抽出と再編成を行った。1)医学教育モデル・コア・カリキュラム、2)歯学教育モデル・コア・カリキュラム、3)看護師試験問題出題基準及び過去問題集を参考に、細目を抽出し、「看護学教育モデル・コア・カリキュラム(案)」(文科省)の項目立てに沿って再編した。微生物学、解剖生理学、病理学など一部の科目については、看護教育におけるそれぞれの項目の妥当性を検討するために、アンケートによる調査を開始した。(2)国内外の大学シラバスの調査:現時点でWEBに掲載されている国内外の看護系大学のシラバスの調査に着手した。それぞれの大学について、科目立て、時間数、教育内容を調査した。海外の大学については、科目概要程度の情報しかえられないため、今後、調査方法について再検討する予定である。専門基礎科目のモデル・コア・カリキュラムに関わる細目をピックアップし、「看護学教育モデル・コア・カリキュラム(案)」(文科省)の項目立てに沿って再編成した。2018年度に各項目の妥当性をさまざまな角度から検証することによって、研究の完成を目指している。

そこで、本コア・カリキュラム案では、1)生化学、微生物の内容を総論にとどめ、各論的な部分は臨床医学で扱う(栄養学、感染症など)、2)病理学は総論のみを扱い、病態生理学や病理学各論は臨床医学で扱うこととした。今後、1年の延長期間で、海外の状況等さらに情報を収集し、完成を目指す。また、疾病論、疾病治療論など、臨床医学の科目についても整備する必要がある。看護基礎医学教育科・カリキュラムの基本案を期限内に作成した。今後、さらに海外の状況などを取り上げて、完成した形にして公表したい。1)インターネット検索の範囲を海外の大学に広げ、各科目の学習目標項目の抽出を進める。2)国内大学や海外大学を対象としたアンケート調査、実地調査に着手する。なお、現在、全国規模で看護教育モデルコアカリキュラム化推進の動きがあるので、その進展状況を注視しながら、本研究の方向を適宜修正しつつ実施する。前年度までに抽出した「専門基礎科目のモデル・コア・カリキュラム」に関わる細目について、1)アンケート調査、2)シラバスとの照合、3)看護専門職者の意見聴取、などにより検証を進める。2018年度末を目標に「看護専門基礎科目モデル・コア・カリキュラム」(案)についての提言をまとめる。インターネット調査、モデルコアカリキュラム調査、看護師国家試験問題検索、教科書検索、など費用がかからない作業を先行させたため、初年度は使用額が少なかった。1回分の海外調査を計画していたが、延期したため。2019年度に調査予定。最終的な成果の取りまとめが終了していないので、1年延期して、学会発表や成果印刷などの成果公表のための費用に充てる。1)当初予定していた海外調査を、平成29年度と平成30年度に実施する予定。2)協力研究者(学生など)を雇用し、事務作業の効率化を図る予定。
免疫性神経疾患における「ジシアロシル基をもつ糖タンパク」に対する免疫反応の解析

ジシアロシル基をもつGD1b感作によるウサギ失調性ニューロパチ-モデルにおいて、後根神経節細胞のアポトーシスを確認したGD1bにきわめて特異的な抗体が失調の病態に関連することを示したFisher症候群および関連疾患で、GQ1bを含むガングリオシド複合体に特異的抗体の存在を見出した。ジシアロシル基に反応する抗体と神経組織のタンパク成分の反応をWestern blottingで認めた。本研究は、感覚障害性失調性ニューロパチー(sensory ataxic neuropathy, SAN)患者血中の、「ジシアロシル基をもつガングリオシド」に反応をもつモノクローナル抗体(IgM Mタンパク)が交叉反応する糖タンパクの解析である。そのためのプローブとして、ジシアロシル基をもつガングリオシドと糖タンパクの両方に反応することが文献的に報告されているS2-566に着目し、その反応性を検討してGD3に対する反応を確認した。現在本抗体を用いてマウス脳のタンパク成分との反応を検討中である。陽性所見の得られたタンパクについては、SAN患者血中のIgMMタンパクとの反応を検討し、さらに後根神経節(dorsal root ganglion, DRG)における抗原の同定をすすめていく。一方ジシアロシル基をもつガングリオシドに対する抗体によるSANのモデルである、「GD1b感作によるウサギSAN」では、症状の重篤度に比して病変の首座であるDRGの病理変化が軽微であることが特徴であった。本年度このSANをきたしたウサギから採取したDRGの神経細胞核に、TUNEL法にて陽性所見を得、本モデルの病態がapoptosisによることを明らかにした。この型のSANはapoptosisによるのではないかという可能性は従来指摘されていたが、明らかな所見を得たのはこれがはじめてである。これにより、症状の重篤なウサギのDRGにおいても炎症所見がほとんどみられないことが説明可能となり、SANの病態解明において大きな進歩を得ることができた。今後抗GD1b抗体、あるいはジシアロシル基を認識する抗体のDRG神経細胞への結合が、どのようなメカニズムでapoptosisにつながるかの解明が必要である。上記のジシアロシル基をもちSAN血中抗体の標的となる糖タンパクを同定し、その機能を明らかにすることができれば、本病態メカニズム解明につながると考えられる。本研究は、深部感覚障害による失調性ニューロパチー(sensory ataxic neurop athy,SAN)患者血中の、「ジシアロシル基をもつガングリオシド」に反応するモノクローナル抗体(IgMMタンパク)が交叉反応する糖タンパクに関するものである。そのためのプローブとして、ジシアロシル基をもつガングリオシドに広く反応するMタンパクをもつ患者血清を用いて、ヒトの神経組織のタンパク成分との反応をWestern blottingにより検討したところ、いくつかの陽性バンドが得られた。陽性所見の得られたタンパクについては、モノクローナル抗体S2-566など他のジシアロシル基を認識するプローブとの反応も検討し、どのようなタンパクであるかの同定をすすめていく。一方ジシアロシル基をもつガングリオシドに対する抗体によるSANのモデルである「GD1b感作によるウサギSAN」では、後根神経節(DRG)の病理変化が軽微であることに着目してapoptosisの可能性を考え、昨年度TUNEL,法にて一部の細胞に陽性所見を得ていた。本年度TUNEL陽性細胞が大型細胞であること、抗caspase 3抗体による免疫染色でも染色されることを示し、本モデルの病態がDRG大型細胞のapoptosisによることを明らかにした。またGuillain-Barre症候群にみられる抗GD 1b抗体の、GD 1aなど他のガングリオシドとGD 1bの形成するエピトープ(ガングリオシド複合体、GSC)との反応を検討し、失調をきたす例ではGSCには反応しないGD 1bに特異性の高い抗体が上昇することを明らかにした。今後抗GD 1b抗体、あるいはジシアロシル基を認識する抗体のDRG神経細胞への結合が、apoptosisを引き起こすメカニズムの検討が必要である。ジシアロシル基をもつ糖タンパクが同定され機能がわかれば、SANのさらに詳細な病態が解明されると考えられる。本研究は、深部感覚障害による失調性ニューロパチー(sensory ataxic neuropathy, SAN)患者血中の、「ジシアロシル基をもつガングリオシド」に反応するモノクローナル抗体(IgM Mタンパク)が交叉反応する糖タンパクに関するものである。そのためのプローブとして、ジシアロシル基をもつガングリオシドに広く反応するMタンパクをもつ患者血清やモノクローナル抗体S2-566を用いて、ヒトの神経組織のタンパク成分との反応をWestern blottingにより検討したところ、いくつかの陽性バンドが得られた。ジシアロシル基をもつGD3類似の構造をもつと報告されているGD3レプリカペプチドについて、抗GD3抗体と反応することを確認後、それを用いてマウスを感作した。得られた血清の反応性を現在解析中である。

一方、昨年度Guillain-Barre症候群(GBS)ではGD1bにきわめて特異性が高い抗体の上昇が失調の病態に関連することを報告したが、今年度はIgM Mタンパクを伴う慢性ニューロパチーだけでなく、GBSにおいてもGD1bを含むジシアロシル基をもつ複数のガングリオシドに反応するIgM型の抗体を伴う例があることを報告し、ジシアロシル基を標的に含むことがSANを引き起こす抗体として重要な条件であることを示した。またフィッシャー症候群やGBSでみられる抗GQ1b抗体について、GQ1bがGM1やGD1aと形成する複合体に特異性をもつ抗体陽性例が存在し、反応性が感覚障害の有無と関連すること、GM1とGa1NAc-GD1aの複合体に特異性をもつ抗体が伝導ブロックを高頻度に伴う純粋運動型のGBSにみられることを報告し、糖鎖に対する抗体と免疫性ニューロパチーの発症機序の関連および抗体の臨床的有用性についての新たな知見を報告した。
トロンボポエチン細胞内シグナル伝達機構の解析

血小板産生を促進因子する、いわゆるトロンボポエチンは長年にわたる追跡にもかかわらず、最近までその存在さえ疑問視する向きがあった。ごく最近になってトロンボポエチンはc-mpl癌遺伝子のリガンドとして精製、クローン化された。この蛋白をマウスに投与すると血小板数は4倍に増加し、c-mplのノックアウトマウスでは血小板数が85%減少することが確認され、c-mplリガンドがまさにトロンボポエチンそのものであること立証された。我々はごく最近新しくクローン化されたトロンボポエチンに増殖依存性を示し、巨核球の性格を有する亜株UT-7/TPOの樹立に成功した(Blood印刷中)。UT-7/TPO細胞をトロンボポエチン非存在下で24時間培養後、新たにトロンボポエチンを添加し、経時的に細胞を採取し、蛋白を抽出。SDS-PAGEにて蛋白を分画し、ニトロセルロース膜に転写後、抗リン酸化チロシン抗体でウエスタンブロットを行った。トロンボポエチンにより新たなチロシンリン酸化された蛋白の分子量は145kDa、130kDa、120kDa、95kDa、80kDa、66kDa、56kDa、52kDa、44kDa、42kDaであった。そこで本研究ではこれらの分子の同定を試みた。本研究により、(1)145kDa蛋白=phospholipase C-γ1(論文投稿中)、(2)130kDa蛋白=JAK2チロシンキナーゼ(Blood印刷中)、(3)120kDa蛋白=GTAase activating protein(論文投稿中)、(4)66,56,46kDa蛋白=Shc(論文投稿中)、(5)44,42kDa蛋白=MAPキナーゼ(BBRC217:230,1995)、であることを明らかにしたので、ここに報告する。
新規神経伝達調節因子D−アミノ酸の神経系における作用機構の解明

D-アミノ酸酸化酵素欠損マウスでは脳内のD-アミノ酸が増加している。D-セリンはNMDA受容体のグリシン結合部位に作用し、NMDA受容体電流を増強すると言われているので、D-アミノ酸酸化酵素欠損マウスにおいてNMDA受容体を介するシナプス伝達に変化がみられるかどうかを調べた。D-アミノ酸酸化酵素欠損マウスと正常マウスの後肢にホルマリンを皮下注射し、その疼痛刺激に対する反応の継続時間を計測した。この反応の第2相は脊髄内のNMDA受容体の活性化を介することが知られているが、この反応はD-アミノ酸酸化酵素欠損マウスで有意に増強していた。次に生後34週令のマウスの脊髄を摘出し、スライスを作成し、抑制性シナプスをブロックし、周辺の神経線維に電気刺激を加え、誘発される興奮性シナプス電流をNMDA受容体を介する成分とnon-NMDA受容体を介する成分とに分離し、ニューロンのホールセル記録を行った。その結果、D-アミノ酸酸化酵素欠損マウスにおいて興奮性シナプス電流のNMDA成分とnon-NMDA成分の振幅の比が有意に大きな値を示した。これらの結果からD-アミノ酸酸化酵素欠損マウスでは中枢神経内のNMDA受容体を介するシナプス伝達が正常マウスに比べて活性化されやすい状態にあり、その結果として慢性疼痛刺激に対する反応に変化が生じていることが示唆された。D-アミノ酸酸化酵素欠損マウスと正常マウスを用いてモーリス水迷路の実験を行った。その結果、D-アミノ酸酸化酵素欠損マウスの方が、プラットフォームに到達するまでの時間が長いことがわかった。モーリス水迷路の空間認知には海馬のNMDA受容体が重要な役割を担っていることが知られているので、この結果はD-アミノ酸酸化酵素欠損マウスでは脳内のD-アミノ酸の濃度が高く、それが海馬領域のNMDA受容体の興奮伝達に影響を及ぼしているものと考えられた。
ニカラグアの貧困削減と国際移動：ポストコンフリクト地域における宗教観を手がかりに

本研究は、ポストコンフリクト地域の宗教観を手がかりに、ニカラグア移民の国内外の三つの移動ルートの相関関係を明らかにし、貧困削減のメカニズムを解明する。ニカラグアでの調査対象地は、旧ゲリラ戦闘地域で、その住民の約7割がプロテスタントである。この地域の住民は、先行研究で言われてきたコスタ・リカや米国への国際移動ではなく、ニカラグア国内の地域間移動を選ぶ者が多い。文献研究はもとより、ニカラグア、コスタ・リカ、米国でのフィールド調査を通して、国際移動と地域間移動の関係性を明らかにし、貧困削減と国際移動のメカニズムの解明へと繋げる。