hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地熱微動の到来方向の決定

また,コヒーレンスと3次元回転スペクトルの併用により地熱振動の定常性のみならず,その振動の原因となる波動の定常性が評価されることを示した.(3)本解析法を地熱地帯および沖積平野における実測データに適用したことろ,地熱地帯の振動はコヒーレンスが高く比較的定常性が高いのに対して沖積平野ではコヒーレンスが低く波動場の定常性が低いことが明らかとなった.本研究で提案した3次元振動のスペクトル解析法を地熱地帯と沖積平野の再地域の微動解析に適用して、この解析法の有用性を確認する作業を行ってきた。本年度は、沖積平野の微動解析にこの3次元回転スペクトル解析法を適用するうえでの問題点について考察を加え、解析精度等を明らかにした。これらの結果にもとづいて微動の3次元回転スペクトル解析を行い、各周波数成分ごとにその主因となる波動成分を分析するとともに、これらの波動の振源方向と成因について考察した。沖積平野である熊本市内において24時間の微動測定を行い、雑踏地における微動スペクトルの時刻変動を明らかにした。すなわち、昼間と夜間における振幅への時刻変動は高周波成分ほど大きく、低周波成分ほど小さいことを示し、この原因は昼間に比べて夜間では散在するノイズ源へ数が減少するためであると推論された。3次元回転スペクトル解析による微動の振動形態の分析によって、沖積平野における微動の卓越動は主としてレーリー波とラブ波からなることが明らかになった。特に、前者は高周波成分に後者は低周波成分に多く、また、前者の微動は昼間と夜間とで振幅が大きく変動することを明らかにした。さらに、3次元回転スペクトル解析を用いると、雑踏地における変動データからも地下構造の推定に有用なラブ波成分を抽出できることが確かめられた。以上に概略を述べたように、3次元回転スペクトル解析法は火山性微動のみでなく、平野での常時微動の解析にも有用であることがわかった。
到達運動のプリズム適応における大脳小脳神経回路機能連関の動的変化

ヒトやサルが行う上肢による到達運動には脳内における視覚情報から運動情報への変換が必要である。これまでの研究により、座標変換系として運動前野腹側部が重要な役割を果たしていることを明らかにしてきたが、本年度の研究では座標変換系における学習系として小脳から運動前野腹側部への経路がどのような機能を果たしているかを調べるため、以下の実験を行った。第一に、プリズム適応に特異的変化をする運動前野腹側部ニューロンを同定し、その存在部位に標識物質(BDA)を注入し、この領域に投射する視床核が主に領域Xであることを確認した。第二に、運動前野腹側部および他の皮質運動関連領域に投射する視床ニューロンが視覚運動変換に際してどのような活動をしているのかを記録し解析した。実験ではニホンザルに手首の屈曲・伸展運動を示す視覚指示信号を呈示し、1.5-3.0秒の準備期間の後、異なる感覚信号の種類(視覚・聴覚・体性感覚)による運動の契機信号を呈示した。サルは契機信号に応答して正確な運動を行うよう訓練した。訓練終了後、大脳皮質に存在する運動関連領域に刺激電極を埋め込み、領域Xを含む視床腹側核群を中心に記録を行い、逆行性同定により皮質領域への投射を確認した。この視床の大脳皮質投射ニューロンには、運動の直前に活動を開始する運動関連活動と、準備期間に視覚指示信号に応答して持続的に発火の変化をする準備関連活動の存在を明らかにした。また運動関連活動は運動が同一であれば感覚信号の種類によらず同様の活動を示しており、投射先の非一次運動野の活動との差異を明らかにした。この結果は、小脳大脳機能連関が座標変換に必要な運動のパラメーター生成と運動開始のタイミング生成に主要な役割を果たしており、感覚の種類ごとの感覚運動変換には重要な寄与をしていないことを示唆すると考えられる。実験ではニホンザルに手首の屈曲・伸展運動を示す視覚指示信号を呈示し、1.5-3.0秒の準備期間の後、運動の契機信号を呈示した。訓練終了後、皮質領域に刺激電極を埋め込み、領域Xを含む視床腹側核群を中心に記録を行い、逆行性同定により皮質領域への投射を確認した。さらに、視床腹側核群から運動の直前に活動を開始する運動関連活動と、準備期間に視覚指示信号に応答して持続的に発火の変化をする準備関連活動を記録したが、視覚信号に一定の潜時で短時間応答する信号関連活動はほとんど記録されなかった。準備関連活動と運動関連活動のうち、一次運動野に投射するニューロンは行うべき運動の方向などのパラメーターに関与するものが多かった。他の領域に投射するニューロンは運動のパラメーターへの関与が少なかったが、一次運動野への投射ニューロンより活動の変化が早く起こっていた。この結果は、小脳大脳機能連関が座標変換系として運動のパラメーター生成と運動開始のタイミング生成に主要な役割を果たしていることを示唆すると考えられる。

また運動関連活動は運動が同一であれば感覚信号の種類によらず同様の活動を示しており、投射先の非一次運動野の活動との差異を明らかにした。この結果は、小脳大脳機能連関が座標変換に必要な運動のパラメーター生成と運動開始のタイミング生成に主要な役割を果たしており、感覚の種類ごとの感覚運動変換には重要な寄与をしていないことを示唆すると考えられる。
林市藏の履歴と方面委員制度の関係についての歴史的研究

2007年度の研究では、山口縣、廣島縣、新潟縣の各事務官、三重縣知事から東洋拓殖會社理事までの履歴の解明作業を続け、林市藏が方面委員制度創設に関わるまでの歩みをより明確なものにできた。2008年度の研究では、大阪府知事着任に関する風評、米騒動と白虹事件への関り方を考察し、大阪府救済課の設置も大阪府方面委員規定の制定も、内務官吏としての職務に忠実であったという視点から、従来の定説に新たな見解を加えた。市藏はその後、山口縣、廣島縣、新潟縣で事務官となり、三重縣知事から東洋拓殖會社理事、山口縣知事を経て、米騒動直前に就任した大阪府知事で依願免本官となって官界から離れる。その大阪府知事時代に「大阪府方面委員規程」を制定し、免官後に民間会社の役職を得てからも、方面委員の発展に尽力する。19年度の研究では、山口縣、廣島縣、新潟縣の各事務官、三重縣知事から東洋拓殖會社理事までの履歴の解明作業を続け、林市藏が方面委員制度創設に関わるまでの歩みをより明確なものにできた。特に東拓総裁吉原三郎が、1916(大正5)年10月21日に辞職し、野田副総裁、市藏、井上孝哉ら四理事も連挟辞職した理由として、背景に政友會・非政友會の政治的駆け引きがあったことを推察できたのが成果であった。しかし市藏の東拓理事退任から山口・大阪の両知事着任までの人事が、寺内内閣の下で行われている。これらの背景を明らかにすることと大阪府方面委員制度創設の関係について、20年度の研究で引き続き継続するが、政党の政治的駆け引きもひとつのキーワードになるだろう。本年度の研究では、ほとんど定説になっている、大阪府方面委員制度の創設事情について、若干の考察を試みた。まず林の知事着任に関する風評について、いくつかの資料を分析する。次に在任中に起こった米騒動と白虹事件への関り方を考察した。それらを前提として、大阪府救済課の設置も大阪府方面委員規定の制定とその後の関与の仕方についても、内務官吏としての職務に忠実であったという視点から、従来の定説に見解を加えた。すなわち、林は、府知事着任時点で、大阪朝日新聞対策という政治的色彩の強い職務も認識していたが、感化救済事業についての取り組みも内務官吏としての重要な職務と認識していた。その後、米騒動を実際に経験して、その両職務がどういう方向で為されるべきかを実感した。それは、後の社会局につながる救護課を設置した内務省の政策動向に沿うものであった。したがって、小河滋次郎の考案しつつあった救済委員も方面委員として換骨奪胎した制度に仕上げた。そして制度の創設期に、たまたま小河が病気療養している間、大阪府救済課のメンバーとともに、方面常務委員会をリードし、その方向性を決定づけた、というものである。また林市藏宛山縣有朋書簡の翻刻では、1917(大正6)年10月15日付(消印も10月15日)で山縣有朋から林市藏宛に出された書簡を扱った。当時の山縣は、枢密院議長、林は山口県知事であった。添え書きをした入江は、枢密院議長秘書官であり、山縣の側近であった。内容は、青年団活動に関する山縣から林への激励である。
社会行動への遺伝環境作用の進化心理学および行動遺伝学による検討

実験経済学で用いられる経済ゲームでの行動の個人差を双生児データを収集し、遺伝と環境の影響を検討した。統計分析に必要となる多量の双生児データを収集するためにWebサイトを用いて、戦略型の公共財ゲーム実験を実施した。282名の双生児を対象とした実験からは、他者の協力度が低いときの行動には遺伝、家族で共有する環境の影響とも小さいこと、他者の協力度が高いときの行動には、家族の共有環境の影響が大きいことが示唆された。また遺伝的個人差の進化にかんして、パーソナリティが内的環境として働き行動に影響するとした内的環境仮説を提唱し、他者一般への信頼感が、パーソナリティによって影響されることを明らかにした。質問紙調査について、他者一般への態度を測定する一般信頼尺度得点と、NEOパーソナリティ質問紙によって測定される外向性特性および協調性得点についての双生児データの多変量遺伝環境分析を行い、パーソナリティ特性によって一般信頼得点が影響を受けるという因果関係が示された。この結果についてはEvolution and Human Behavior誌に掲載された。双生児を対象としたStrategy Methodによる公共財ゲームのデータについて、遺伝と環境の影響を分析した。他者の協力度が低いときの協力度は家族内で共有されない非共有環境で説明されることが示された。一方、他者の協力度が高くなるにつれ家族環境や遺伝の影響が現れることが示された。これは社会環境(他者の協力度)によって、個人差への遺伝寄与率が変化することを示しており、遺伝環境交互作用を考える上で重要な発見であった。この結果については、日本心理学会の第71回大会にて発表した。一方で経済ゲーム実験への男性二卵性ペアの参加率がきわめて低く、双生児の大規模サンプルを対象とした実験室実験の困難さも浮き彫りとなった。郵送による質問紙調査では参加率が高いものの、経済ゲームを郵送調査で行った場合、ゲームの内容の理解が得られたか確認する方法がない。そこでWebブラウザを通じてインタラクティブにゲームの内容理解を確認をした上で実験を行うシステムを開発した。個人情報保護の観点から専門業者にシステム開発を発注し、研究者が内容を確認し、ボランティア学生が使用感を確認する形をとった。インターネットを通じたWebブラウザ上でのStrategy Methodによる公共財ゲームについて、システムの開発および調整と、その妥当性の検討を行った。行動指標や心理指標への遺伝環境要因の分析を行うには数百組の双生児データが必要である。実験室実験によりこれだけのデータを得ることは、過去の研究協力率の実績から現実的でなく、Webブラウザを用いた実験システムを開発した。2008年度はこのシステムを用いた実験について、1)オンライン上で双生児データを集めることの研究倫理的問題の検討、および2)オンライン上で公共財ゲームを行うことの妥当性の検討を行った。1)については、双生児レジストリを保持する慶應義塾大学文学部の研究倫理審査委員会の協力を得て、インターネット上のサーバに保持するデータの種類や、実験協力者への実験内容の説明について検討を進めた。2)については38名の大学生にオンライン上で実験を実施し、実験室実験で行われた先行研究(Fischbacher et al., 2001)と同様の個人差パターンが見られることを確認した。また実験参加者のうち10名にインタビューを実施し、オンライン実験においては、公共財ゲーム実験で求められる匿名性が、実験室実験の場合よりも、むしろ強く自覚されることを確認した。また、母胎内での雄性ホルモンの影響を受け、パーソナリティや社会的態度との相関が示唆されている2D4D指標(人差し指と薬指の長さの比)の双生児データについての分析を進め、きょうだいの共有環境が強い影響をもつという予測に反し、この指標の遺伝規定力が極めて強いことを確認した。さらに、次年度に公共財ゲームのデータ、2D4Dデータと合わせて分析するための社会的態度指標をオンラインで収集するためのアンケートシステムの開発を行った。実験経済学で用いられる経済ゲームでの行動の個人差を双生児データを収集し、遺伝と環境の影響を検討する。さらにゲームでの行動データを、既存の性格特性、社会的態度、認知能力データと掛け合わせて分析することにより、パーソナリティーから社会行動にいたる遺伝環境構造を明らかにすることを目的とした。統計分析に必要となる多量の双生児データを収集するためにWebサイトを用いて、戦略型の公共財ゲーム実験を、2009年11月から2010年2月にかけて実施した。3600名の双生児に郵送にてWeb実験への参加を求め、282名からの協力を得た。実験参加者はインターネットを通じてWebサイトにアクセスし実験に参加した(通信はSSLによって保護された)。参加者には光実際のゲームの結果に応じた謝金が銀行振込により支払われた。

参加者が実験室を訪問する形で行われた先行研究の結果と合わせると、実験状況におけるさまざまな相違点にもかかわらず、個々人の回答パターンのばらつき方については、ほぼ同様の結果が得られた。一方で、双生児きょうだいの回答相関を見たところ、実験室実験においては、他者の協力度が高い状況での回答において遺伝の影響が見られたのに対し、Web実験においては遺伝の影響よりも家族の共有環境の影響の方が大きいことが示唆された。このことは1)双生児が全く同じ環境で回答した実験室実験で、むしろ遺伝の影響が強く表れたこと、および2)心理指標にかかわる双生児研究では希にしか観察されない共有環境の影響が観察された点で、興味深いものと言える。
粒子充填樹脂複合材料の力学的特性に対する充填粒子と母材樹脂の相互作用の影響

ナノシリカ粒子を充填したエポキシ樹脂複合材料の力学的特性:弾性係数,強度および破壊靭性値の測定を行い,母材樹脂の架橋構造とナノシリカ粒子間の相互干渉効果が力学的特性に及ぼす影響について明らかにした.非化学量論比で硬化させた母材樹脂の複合材料を作製し測定を行った.弾性係数は粒子の体積充填率にのみに依存することを確認した.架橋密度の高い密な網目構造の母材樹脂にナノシリカ粒子を充填することで曲げ強度および破壊靭性値が増加することを明らかにした.しかし架橋密度の低い疎な網目構造の母材樹脂ではむしろナノシリカ粒子が欠陥となり,母材樹脂よりも複合材料の強度,破壊靭性値より低下させることが判明した.架橋密度,ガラス転移により母材樹脂の物性を同定し,複合材料の力学的特性を測定し,架橋密度などをパラメータとする母材樹脂の内部構造と力学的特性との相関について考察を行った.240 nmの粒径の球状シリカ粒子を体積含有率20%で充填し,エポキシ樹脂コポリマーを硬化剤に対して過剰に加えた非化学量論比で硬化させて,様々な網目密度を有するエポキシ樹脂を母材とする複合材料を作製した.作製された複合材料の評価:作製されたシリカ充填エポキシ複合材料およびエポキシ樹脂の熱粘弾性特性を220 Kから470 Kの温度範囲で測定し,作製された複合材料のガラス転移温度および架橋密度を同定した.その結果,非化学量論比で硬化させることで架橋密度が2740 mol/m3から490 mol/m3,ガラス転移温度が440 Kから350 Kのエポキシ樹脂およびシリカ粒子充填複合材料を得ることができた.非化学量論比で硬化した複合材料の粘弾性係数,強度,破壊靱性値の測定を行い,母材樹脂の架橋密度とそれらの力学的特性の関係を明らかにした.その結果,ガラス状態における粘弾性特性は架橋密度の影響をほとんど受けず,従来から知られている複合則で十分に説明でき,母材樹脂の内部構造に影響をうけないことがわかった.化学量論比で硬化された母材樹脂にはシリカ粒子を充填することで強度,破壊靱性値も向上するが,架橋密度が低い,すなわち疎なネットワーク構造を有する母材樹脂の場合,粒子がむしろ力学的特性を低下させる欠陥として作用することが明らかとなった.また次年度において検討を行う動的力学的特性の測定のための実験装置の準備も合わせて行った.動的圧縮応力ーひずみ線図を測定するためのスプリットホプキンソン棒試験装置を,動的破壊靱性値を測定するための動的ダブルトーション試験装置を作製し,測定が可能であることを確認している.複合材料の力学的特性を測定し,架橋密度などをパラメータとする母材樹脂の内部構造と力学的特性との相関について考察を行った.240 nmの粒径の球状シリカ粒子を体積含有率20%で充填し,エポキシ樹脂コポリマーを硬化剤に対して過剰に加えた非化学量論比で硬化させて,様々な網目密度を有するエポキシ樹脂を母材とする複合材料を作製した.作製された複合材料の評価:作製されたシリカ充填エポキシ複合材料およびエポキシ樹脂の熱粘弾性特性を220 Kから470 Kの温度範囲で測定し,作製された複合材料のガラス転移温度および架橋密度を同定した.その結果,非化学量論比で硬化させることで架橋密度が2740から490 mol/m3,ガラス転移温度が440 Kから350 Kのエポキシ樹脂およびシリカ粒子充填複合材料を得ている.非化学量論比で硬化した複合材料の粘弾性係数,強度,破壊靱性値の測定を行い,母材樹脂の架橋密度とそれらの力学的特性の関係を明らかにした.その結果,ガラス状態における粘弾性特性は架橋密度の影響をほとんど受けず,従来から知られている複合則で十分に説明でき,母材樹脂の内部構造に影響をうけないことがわかった.化学量論比で硬化された母材樹脂にはシリカ粒子を充填することで強度,破壊靱性値も向上するが,架橋密度が低い,すなわち疎なネットワーク構造を有する母材樹脂の場合,粒子がむしろ力学的特性を低下させる欠陥として作用することが明らかとなった.粒子を充填することで強度が大きくが向上しないが,破壊靱性値は母材樹脂より1.6倍程度まで増加することを明らかにした.また動的力学的特性の測定のために,動的圧縮応力ーひずみ線図を測定するためのスプリットホプキンソン棒試験装置および動的破壊靱性値を測定するための動的ダブルトーション試験装置を作製し,その測定値の妥当性を検証し,実際に測定に使用できることを明らかにした.シリカ粒子充填エポキシ樹脂複合材料の力学的特性を測定し,架橋密度などをパラメータとする母材樹脂の内部構造と力学的特性との相関について考察を行った.球状シリカ粒子を充填し,エポキシ樹脂コポリマーを硬化剤に対して過剰に加えた非化学量論比で硬化させて,様々な網目密度を有するエポキシ樹脂を母材とする複合材料を作製した.作製された複合材料の評価:作製されたシリカ充填エポキシ複合材料およびエポキシ樹脂の熱粘弾性特性を220 Kから470 Kの温度範囲で測定し,作製された複合材料のガラス転移温度および架橋密度を同定した.その結果,非化学量論比で硬化させることで架橋密度が2740から490 mol/m3,ガラス転移温度が440 Kから350 Kのエポキシ樹脂およびシリカ粒子充填複合材料を得ている.2015年度では,直径300 nmのシリカ粒子を異なる体積充填率で作製したエポキシ樹脂複合材料について力学的特性の測定を行い,粒子の体積充填率の影響について考察を行った.

その結果,架橋密度により曲げ強度が影響するものの,粒子の体積充填率に対しては大きな影響を及ぼさないことがわかった.破壊靭性値については,1300 mol/m3を超える高い架橋密度の母材に粒子の充填量が増加すると大きな値を示すのに対して,それ以下の架橋密度の母材に対しては体積充填率が大きくなるとむしろ母材単体の破壊靭性値より複合材料の破壊靭性値が低下することが判明した.さらに充填粒子の大きさを1600 nmの粒子を充填した場合,架橋密度が低い母材に対しても破壊靭性値は母材のときの値よりも低下することがないことが明らかとなった.すなわち,母材内のミクロな網目の大きさに対して,粒径が相対的に小さくなるとむしろ破壊靭性値が低下することが示唆された.したがって,粒径をナノサイズからさらに小さくすると破壊靭性値に悪影響することが判明した.ナノシリカ粒子を充填したエポキシ樹脂複合材料の力学的特性:弾性係数,強度および破壊靭性値の測定を行い,母材樹脂の架橋構造とナノシリカ粒子間の相互干渉効果が力学的特性に及ぼす影響について明らかにした.非化学量論比で硬化させた母材樹脂の複合材料を作製し測定を行った.弾性係数は粒子の体積充填率にのみに依存することを確認した.架橋密度の高い密な網目構造の母材樹脂にナノシリカ粒子を充填することで曲げ強度および破壊靭性値が増加することを明らかにした.しかし架橋密度の低い疎な網目構造の母材樹脂ではむしろナノシリカ粒子が欠陥となり,母材樹脂よりも複合材料の強度,破壊靭性値より低下させることが判明した.本研究の推進に最も重要となる広範囲の架橋密度,すなわち異なるネットワーク構造を有するエポキシ樹脂を作製することに成功した.さらに基本的な力学的特性の測定を行い,力学的特性,特に強度,破壊靱性値に対して,架橋密度に強く依存していることが判明した.一般に粒径が小さくなると強度,破壊靱性値が向上することが知られているが,本研究において,必ずしも粒径が小さければ向上せず,母材樹脂の内部構造によってはナノ粒子を充填してもかえって強度,破壊靱性値が低下することもあることを示した.さらに化学量論比よりもわずかにコポリマーを過剰に加えた状態で硬化させることが,一般的に行われている化学量論比硬化の複合材料よりもかなり大きな強度および破壊靱性値を得ることを明らかにしている.さらに得られた試験結果から,ある母材の架橋密度より高い場合には,粒子充填効果により母材の特性よりも向上し,それ以下の架橋密度の母材樹脂では粒子が欠陥とさせ母材の特性より強度および破壊靱性値ともに低下することを明らかにした.以上のことから,充填粒子と母材の架橋密度が密接に関係し,それが力学的特性に大きく関係していることを明確に示した.また動的特性を測定するための2つの試験装置および測定システムを完成させている.本年度までに,充填粒子の粒径だけでなく母材樹脂の内部構造が力学的特性に大きな影響を及ぼすことを明らかにした,さらに次年度においては,測定された力学的特性に基づき考察を深めることで,強度および破壊靱性値に対する複合則を構築することを試み,さらにそれを裏付ける実験データを取得する.以上のことから今年度の研究成果は十分に達成できたと考えられる.材料力学,材料工学,高分子系複合材料の力学的特性,衝撃工学平成26年度までに,シリカ粒子充填エポキシ樹脂複合材料において,粒子の粒径と母材樹脂の内部構造の干渉効果が力学的特性に大きく影響することが明らかにしている.
肝硬変に対する遺伝子治療の基礎的研究と臨床応用への展望

非可逆性慢性疾患と考えられ、治療は対症療法のみであった肝硬変症に対しHGF遺伝子導入による遺伝子治療を行いラット肝硬変モデルで優れた治療効果を確認した。本研究では本法をヒトへの臨床治療に応用すべく、1.HGFの抗線維作用の基礎的メカニズムの解明、2.霊長類動物を用いたHVJ-liposomeのベクターとしての安全性の確認、3.HGFを用いた動物肝硬変モデルに対する肝切除術に伴う肝不全状態の予防、さらに臨床応用にあたり、より実用的かつ安全と考えられるベクターを用いない4.HGFnaked DNAによる肝硬変ラットの遺伝子治療効果の検討、5.HGFnaked DNAによる大動物(イヌ)肝硬変モデルの遺伝子治療効果の検討、6.HGF発現が肝腫瘍増殖に及ぼす影響、以上6項目につき研究を行った。結果として、HGFの抗線維作用のメカニズムの解明ではHGFがKuppfer細胞に作用してTGF-β1の発現を抑制するよりも、MMPの発現を増強することにより抗線維作用が発揮される可能性が示唆された。霊長類動物へHVJ-liposomeを用いて遺伝子導入を行いベクターとしての安全性を確認しヒトへも十分に応用可能であることを証明した。HGF導入により肝切除範囲の制限や術後の肝不全の回避される可能性が示唆された。ベクターを用いないHGFnaked DNAによる肝硬変モデルでの遺伝子治療効果の検討ではラットのみならず大動物であるイヌでも良好な結果を得ることができた。HGF発現が肝腫瘍増殖に及ぼす影響においてはin vivoでHGFは肝癌増殖に有意に働くという所見は示唆されず、むしろ抑制の方向に働く傾向を認めた。以上の結果より難治性肝疾患である肝硬変に対する遺伝子治療はヒトへの臨床応用が十分に可能であることが示唆された。肝硬変患者に対するHGF遺伝子治療臨床研究を目的として、プラズミドそのもの(naked DNA)を生体に導入する方法を中心に研究を進めた。現在までのセンダイウイルスの膜融合能を利用したHVJ-liposomeによる遺伝子導入方法と比較すると、導入効率は約10%に低下するが、いかなるウイルス成分も、リピッド成分も含まず、より安全性が高く、より現実的な方法であると考える。DMNによる薬剤性ラット肝硬変モデルを作製し、肝動脈よりヒトHGFのnaked DNAを直接に肝臓に注入した。ラット肝臓におけるヒトHGF蛋白の発現は良好であり、200μg naked DNA注入群では遺伝子導入後2週目に最大値(0.11ng/100mg protein)を示した。発現は一過性で、4週目にはほぼ遺伝子発現は消失した。病理組織学的検討ではヒトHGF遺伝子導入群では形成された繊維組織の著明な改善が認められ、コンピューター画像解析装置で定量化するとコントロール群に比べ72%(平均)の繊維減少を認めた。つぎに大型動物(ビーグル犬)を用いて同様に肝硬変モデルを作製、肝動脈にカテーテルを留置、皮下のリザーバーより反復的に10mgのヒトHGFのnaked DNAを直接に肝臓に注入した。イヌでも同様に組織学的に著明な肝硬変の改善が認められた。現在、実験動物数を増やして追試中である。また、遺伝子導入後の長期観察を行い、悪性腫瘍の発生の有無を検討中であるが、現時点では認めていない。イヌにおいてもラットにおいてもnaked DNAを直接に肝臓に注入したことにより肝機能障害はおきておらず、また組織学的にも障害は認めない。HGFの抗線維化作用については,マトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)の発現量を検討した。ジメチルニトロースアミン(DMN)により作成したラット肝硬変モデルにおいて,HGF治療群と非治療群でMMP-3の発現量をWestern blotによる解析で比較した。

HGF治療群において,病理組織学的検討および肝組織中HGF発現量からHGF投与後7日目14日目が抗線維化作用の最も強い時期と考えられた。HGF投与後7日目14日目において,肝組織中のMMP-3の発現量は非治療群に比し有意に増加していた。この結果から,肝組織中で発現したHGFが,TGF-βを抑制することにより線維化を抑制し,肝組織中の既存の線維に対してはMMPが働き抗線維化に作用していると考えられた。ヒト臨床研究への展開については,安全性の面を中心に検討した。安全性の面でウイルスベクターを用いずnaked plasmid DNAを肝動脈より注入する遺伝子導入方法を選択している。この方法での全身の臓器におけるplasmid DNAの分布を経時的にPCR法で検討した。プライマーはplasmidに特異的なものを作成し,HGF導入後2日目,7日目,14日目,21日目,28日目の全臓器からDNAを抽出し,PCRを行なった。脳,精巣,卵巣などの主要臓器にも2日目,7日目で検出されたものもあったが,いずれも一過性であった。肝臓のみが28日目まで検出され,肝動脈からの遺伝子導入は臓器選択性の高いことが示され,他臓器におよぼす影響は非常に少ないものと考えられた。安全容量の検討では,HGFの抗線維化作用が確認できている容量の50倍,100倍濃度のHGFを投与し癌誘発への関与などの副作用を検討したが,naked plasmid DNAの遺伝子導入では認められなかった。非可逆性慢性疾患と考えられ、治療は対症療法のみであった肝硬変症に対しHGF遺伝子導入による遺伝子治療を行いラット肝硬変モデルで優れた治療効果を確認した。本研究では本法をヒトへの臨床治療に応用すべく、1.HGFの抗線維作用の基礎的メカニズムの解明、2.霊長類動物を用いたHVJ-liposomeのベクターとしての安全性の確認、3.HGFを用いた動物肝硬変モデルに対する肝切除術に伴う肝不全状態の予防、さらに臨床応用にあたり、より実用的かつ安全と考えられるベクターを用いない4.HGFnaked DNAによる肝硬変ラットの遺伝子治療効果の検討、5.HGFnaked DNAによる大動物(イヌ)肝硬変モデルの遺伝子治療効果の検討、6.HGF発現が肝腫瘍増殖に及ぼす影響、以上6項目につき研究を行った。結果として、HGFの抗線維作用のメカニズムの解明ではHGFがKuppfer細胞に作用してTGF-β1の発現を抑制するよりも、MMPの発現を増強することにより抗線維作用が発揮される可能性が示唆された。霊長類動物へHVJ-liposomeを用いて遺伝子導入を行いベクターとしての安全性を確認しヒトへも十分に応用可能であることを証明した。HGF導入により肝切除範囲の制限や術後の肝不全の回避される可能性が示唆された。ベクターを用いないHGFnaked DNAによる肝硬変モデルでの遺伝子治療効果の検討ではラットのみならず大動物であるイヌでも良好な結果を得ることができた。HGF発現が肝腫瘍増殖に及ぼす影響においてはin vivoでHGFは肝癌増殖に有意に働くという所見は示唆されず、むしろ抑制の方向に働く傾向を認めた。
電磁的バンドギャップ(EBG)構造による電磁干渉抑制に関する研究

電子装置の電源/グランド層に対して周期構造とフェライト磁性薄膜の導入を試みた。これにより、電磁的バンドギャップを形成するだけでなく、磁気損失の効果も加えたことで、高周波ノイズの伝搬阻止を効果的に行えることを、実験と電磁界シミュレーションの両面から検討し、その実現可能性を示した。さらに、実ボードを想定した模擬電源回路を構築し回路シミュレーションを行った結果、電源品質の劣化も生じない電源/グランド層が実現できることを明らかにした。本研究課題における具体的な目標は次に示す2点である。・多層プリント回路基板における電磁波伝搬の減衰効果の大きいEBG単位セル設計アルゴリズムの構築・磁性膜と組み合わせて最少単位セルで十分なノイズ抑制効果を有するプレーナEBG構造の実現平成20年度は上記目標に対して研究を遂行し、以下の成果を得た。1磁性膜を適用したEBG構造による不要電磁波伝搬抑制ノイズ抑制シートを電源/グランド層間へ挿入した実験により、EBG構造の小型化及び高周波側への阻止域拡大を実現できることは既に判明している。今年度は、小型化に有効な阻止域の低周波側へのシフトがノイズ抑制シートの異方性誘電率の効果によるもので、特にスリットにおける面内方向の電界成分に作用したためであることを実験とシミュレーションから明らかにした。さらに、高周波側への阻止域拡大が透磁率の虚部の効果によることも確認した。以上より、磁性膜を用いて効果的なノイズ抑制特性を示すEBGパターン形成のために有効な知見を得た。2EBG単位セル設計ツールの開発のための計算手法の確立プレーナEBG構造では幅の狭いスリットを導入することでEBG単位セルのパターン形状を実現するため、微細構造分割を伴う電磁界計算ではこのような狭いスリットを含むことによる計算コスト上昇が避けられない。設計ツールでは最適化のために繰り返し計算が求められる。そこで、スリット間の電磁結合を表現するため、結合マイクロストリップ線路から求めた等価回路モデルを用いて単一のスリットのみを含むスリットセグメントを構成し、グリーン関数のモード展開を利用するポート問インピーダンス解析手法に対してセグメンテーション法を適用するためのスリットモデルを実現した。これにより、微細構造分割を行わず、高速かつ実用的な計算精度での電磁界解析を可能にした。・多層プリント回路基板における電磁波伝搬の減衰効果の大きいEBG単位セル設計アルゴリズムの構築・磁性膜と組み合わせて最少単位セルで十分なノイズ抑制効果を有するプレーナEBG構造の実現平成21年度は上記目標に対して研究を遂行し、以下の成果を得た。1 EBG単位セル設計ツールの開発EBG単位セル設計ツールを作成するため、MATLABベースの自作シミュレータHISESにスリットモデルを実装した。2減衰量の大きな単位セルの要件の電磁界シミュレータを用いた調査簡易なスリットモデルで狭いスリットの影響をより正確に表現するため、市販の電磁界シミュレータMicrowave Studioを用いて伝送線路モデル(スロット線路で表現)に基づくモデル化を検討した。終端条件が短絡と見なせるスリット単体については正確に表現できた。終端開放の場合やスリット間の電磁結合については十分な精度が得られなかったが、これは22年度の課題である。加えて、格段の小型化が可能として提案されているオープンスタブ構造を導入したEBG構造について、市販の電磁界シミュレータSonnetを用いてその特性とメカニズムを調査した。伝送線路構造を利用した共振器を単位セル内に導入する手法は非常に興味深く、我々が検討している単位セル構造に対する重要な知見を得た。3テストボードによる実証の準備当初シミュレータを用いた特性解析で実証準備を行う予定であったが、関係機関の好意により、実際のプリント回路基板と同じ製造工程でフェライト磁性薄膜を導入したEBG構造のテスト基板を試作した。テスト基板を評価したところ、これまでに電磁界シミュレータで得られた結果とよく一致することが判明し、磁性膜によるノイズ抑制効果の有効性を確認した。・多層プリント回路基板における電磁波伝搬の減衰効果の大きいEBG単位セル設計アルゴリズムの構築・磁性膜と組み合わせて最少単位セルで十分なノイズ抑制効果を有するプレーナEBG構造の実現平成22年度は上記目標に対して研究を遂行し、以下の成果を得た。1阻止域における減衰量の大きなEBG単位セルの決定減衰量の大きなEBG単位セルの実現において、単位セルの内部や境界における電磁界の振る舞いを理解しておくことは重要である。3次元電磁界シミュレーションにより得られた電磁界の振る舞いと、フェライト膜の電気特性及びEBGの構造パラメータが阻止特性に与える影響の関係を調べた。その結果、誘電体厚に対してスリット間隔が大きくなるほどフェライト膜の磁気損失がノイズ抑制に有効に寄与することを確認した。格段の小型化が可能なオープンスタブ構造を有するEBG構造を対象として、回路解析に基づく分散解析を行った。阻止域の同定、並びに、減衰量の予測がよい精度で行えることを確認した。これにより減衰量の大きなEBG単位セル構造を判別するため重要な知見を得た。2テストボードによる実証

現実のPCBを模擬し、フェライト磁性薄膜を導入したEBG構造を有するテストボードの外注試作は困難であった。そこで、フェライト磁性薄膜を導入したEBG構造の電源グランド層のみのテスト基板を試作し、さらに、その基板を用いて得られた測定データを使用して、実ボードを模擬したノイズ抑制特性を回路シミュレーションにより評価した。加えて、電源品質特性も評価した。今回検討した基板構造の範囲では、ノイズ抑制特性、電源品質特性とも良好な結果を得た。
放射線治療期間中の患者の体型変化を予測する仮想CBCT画像生成システムの開発

本研究では、放射線治療期間中の頭頸部がん患者の日々のCBCT画像より患者の形態変化を抽出し、治療期間後半の形態変化を予測するシステムの構築を目標とした。研究初年度では患者の形態変化を抽出するための非剛体レジストレーション(Deformable Image Registration)に関してハイパーパラメータの最適化を行い、研究2年目には治療期間前半の患者の形態変化を抽出した変形ベクトル場を主成分分析して得られた主成分ベクトルを用いて、治療期間後半の形態変化を表現する変形ベクトル場を再現することに成功した。一般的な線量分割方法を用いた外部照射放射線治療は、おおよそ6週間から2か月程度と比較的長期間の治療期間を要し、その間に腫瘍の縮小や体重の減少による大幅な体輪郭の変化が見られる場合がある。特に頭頚部がんの放射線治療では、多くの症例で治療部位周辺の大幅な形態変化が見られる。この治療期間中の体輪郭の変化や患者の状態の変化に適応しながら放射線治療を遂行しようとする適応型放射線治療(Adaptive Radiotherapy)というアプローチがあるが、一方でこれを臨床現場で日常的に施行するには、治療計画の再計画の判断や再計画のタイミングなど未だ課題は多い。本研究では、主に頭頚部がん患者の放射線治療期間中の形態変化に着目し、治療期間の前半の早い時期に形態変化の可能性を把握して治療期間後半の形態変化を予測し、その予測画像を仮想CBCT画像として出力することを最終的な目標とする。平成28年度は以下のことを実施した。(1)毎日の放射線治療の際に撮影される患者位置決め用のコーンビームCT画像を素材として、患者の体輪郭および内部の臓器の変形や移動を変形ベクトル場として抽出するためのDeformable Image Registration ( DIR )を行うシステムの構築を行った。(2)前項で構築したシステムに関して、DIR手法の選定と、使用するパラメータの最適化を行った。(3)最適パラメータを用いたDIRを5人分の患者データに適用し、すべての患者データにて良好な結果が得られていることを確認した。平成28年度は、患者CBCTデータ取り込みのためのインターフェース部、変形成分を抽出するためのDIR部のシステム構築と、DIRのパラメータ最適化を実施した。これにより患者の変形成分の抽出が可能となった。一方、抽出された変形ベクトル場のPCA解析(主成分分析)を行うシステムの構築については今後の課題である。患者CBCT画像データに関しては継続して収集していく。一般的な線量分割方法による外部照射放射線治療は、おおよそ6週間から2か月程度と比較的長期の治療期間を要し、その間に腫瘍の縮小や体重の減少による大幅な体型の変化が見られる場合がある。この治療期間中の患者の形態変化に適応しながら放射線治療を遂行しようとする適応型放射線治療というアプローチがあるが、これを臨床現場で施行するには治療計画の再計画の判断やタイミングなど未だ課題が多い。本研究では、主に頭頸部がん患者の形態変化に着目し、治療期間の位置合わせコーンビームCT画像から形態変化の可能性を把握して治療期間後半の形態変化を予測し、その予測画像を出力することを目的とした。まず研究初年度である平成28年度に、コーンビームCT画像から患者の形態変化を変形ベクトル場として抽出するためのDeformable Image Registration ( DIR )について、そのパラメータ最適化と精度評価を行なった。5人の患者のコーンビームCT画像を用いて、RigidレジストレーションとDIRレジストレーションの2通りのレジストレーションを行い、その精度を比較した。その結果、Rigidレジストレーションと比べてDIRは精度が良く、その誤差の中央値はコーンビームCT画像の画素サイズと同程度であることを明らかにした。研究最終年度である平成29年度には、毎日のコーンビームCT画像から日々の変形量を抽出しその解析を行った。治療期間中に毎日取得されたコーンビームCT画像を用い、連続する2日の画像間でDIRを行うことで日々の変形ベクトル場を取得し、これらを主成分分析して日々の変形ベクトル場に共通する成分と形態変化にほとんど寄与していない成分を得た。今後、この主成分ベクトルを用いて、治療初日と治療最終日のDIRから得られた治療期間全体の変形ベクトルの再現を行う予定である。平成29年度には、一連のCBCT画像から抽出した変形成分を用いて仮想CBCT画像を作成するため、以下のシステム構築を実施する。(1)毎日のCBCT画像から抽出した一連の変形成分に対して主成分分析を行うシステムの構築(2)前項の結果として得られる主成分ベクトルの上位数個を用いて仮想CBCTを作成するシステムの構築上記2項に加えて、多くの患者データを収集、蓄積し、仮想CBCT画像の精度向上を目指す。医学物理学29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
エキサイトトキシンによる神経毒性出現メカニズスの解明研究

エキサイトトキシン類の神経毒性は、細胞膜上グルタミン酸レセプターを介して出現するが、3種類のイオノトロピック型サブタイプの中で、特にNMDA型とKA型サブタイプが神経細胞変性に強く関与する。本研究では、エキサイトトキシンによる神経毒性出現メカニズムに、特定機能蛋白質の「denovo」生合成が関与するとの仮説をうち立て、脳内における遺伝子転写調節に着目した。転写制御因子は、細胞核内で遺伝子DNAからmRNAへの転写を制御する核内蛋白質である。マウスにNMDAを全身的に適用すると、選択的にactivator protein-1(AP1)のDNA結合能上昇が、特に海馬の歯状回顆粒細胞層において強く認められたが、CA1野およびCA3野錐体細胞ではこのような増強は見られなかった。同様の解析を、KA全身適用マウスについても行った結果、歯状回顆粒細胞層だけでなく、CA1野およびCA3野錐体細胞層においても著明なAP1結合上昇が見出された。次いで、神経細胞層を含まない周辺領域についても検索を進めたところ、KA投与は各神経細胞層のみならず、周辺領域のAP1結合も著明に増強するのに対して、NMDA投与は周辺領域AP1結合には著変を与えないことが明らかとなった。KA投与後の海馬切片をニッスル染色により検討すると、NMDA投与2ヵ月後までいずれの神経層においても、海馬内神経細胞に著変は見出せなかったが、KA投与後3日以内には錐体細胞層において著しい神経細胞の脱落が誘発された。KA投与後2週間目には、CA1野およびCA3野錐体細胞は完全に脱落したが、歯状回顆粒細胞層には神経細胞脱落は見出せなかった。以上のように、本研究によりNMDAシグナルは一過性AP1結合上昇を、海馬歯状回顆粒細胞においてのみ招来するのに対して、KAシグナルは神経細胞層とは関係なく、海馬領域の広範囲に渡る持続的なAP1結合上昇を誘発することが明らかとなった。神経,細胞死の出現メカニズムとして、グルタメイト(Glu)をはじめとする脳内興奮性アミノ酸の関与が近年注目されている。Gluは、興奮性情報伝達物質として脳内のシナプス伝達に貢献する以外に、神経細胞の選択的破壊を引き起こす内因性エキサイトトキシンとしての役割を併せ持つ。つまり、脳血管障害やアルツハイマー病、あるいは低血糖や脳外傷時などに観察される特徴的神経細胞死の発症メカニズムと密接に関連する。さらに、けいれん発作やてんかん症状の出現、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症および脳性麻痺など、神経細胞変性疾患の出現にGluのエキサイトトキシンとしての作用が関与する可能性は高い。したがって、今年度は細胞外Gluシグナル入力に必要なGluレセプターの中でも、特にN-methyl-D-aspartate(NMDA)に感受性の高いサブタイプについて、シグナル受容メカニズムの詳細な解析を行った。ラット脳から調製したシナプス膜標品への[^3H]MK-801結合は、NMDAチャネルの生化学的指標としての特性を示したが、膜標品を予め低濃度の二価鉄イオンで処理すると、鉄イオン濃度上昇に比例して著明な[^3H]MK-801結合阻害が観察された。しかしながら、三価鉄イオンをはじめ他の鉄含有化合物にはこのような強い結合阻害作用は認められなかった。内因性エキサイトトキシンの一つであるキノリン酸を添加すると、この二価鉄イオンの結合阻害作用は消失した。以上のように、キノリン酸はアゴニストとしての作用の他に、鉄イオンキレーターとしてもNMDAチャネルの開口を調節する可能性が示唆される。

グルタメイト(Glu)のような内在性エキサイトトキシンが、数多くの神経変性疾患発症時に観察される、特徴的な神経細胞死の出現メカニズムに関与すると思われる。つまり、脳血管障害やアルツハイマー病、あるいは低血糖や脳外傷、さらにけいれん発作やてんかん症状の出現、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症および脳性麻痺など、神経細胞変性疾患の出現には、Gluの神経毒性作用が関与する可能性は高い。今年度は、細胞外Gluシグナル入力に必要なGluレセプターの中でも、特にN-methyl-D-aspartate(NMDA)に感受性の高いサブタイプについて、細胞内シグナルとして遊離Caイオンの詳細な解析を行った。妊娠18日齢の雌ラットから、胎児を取り出したのち、実体顕微鏡下で大脳皮質を切り出した。神経細胞を機械的に分散したのち、無血清条件下で培養した。種々の日数培養後、抗MAP-2抗体と抗GFAP抗体を用いて、それぞれの陽性細胞を検索したところ、抗MAP-2抗体陽性細胞はいずれの培養日数でも検出されたのに対して、抗GFAP抗体陽性細胞は3日間培養では全く検出されなかったが、6日間培養の場合は同陽性細胞の存在が確認された。3日間培養の大脳皮質神経細胞内に、Ca蛍光色素fluo-3AMを取り込ませたのち、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光強度変化を測定した。その結果、1050μMのNMDAに暴露したところ、暴露2分後にはほとんどの培養細胞が著名な蛍光強度の上昇を示した。この上昇は、NMDAアンタゴニストのMK-801の添加により完全に消失したので、細胞膜上のNMDAレセプターを介する現象であることは明らかであった。以上の結果から、初代培養大脳皮質神経細胞では、NMDAシグナルに応答して、細胞内遊離Caイオン濃度が上昇するものと推察される。エキサイトトキシン類の神経毒性は、細胞膜上グルタミン酸レセプターを介して出現するが、3種類のイオノトロピック型サブタイプの中で、特にNMDA型とKA型サブタイプが神経細胞変性に強く関与する。本研究では、エキサイトトキシンによる神経毒性出現メカニズムに、特定機能蛋白質の「de novo」生合成が関与するとの仮説をうち立て、脳内における遺伝子転写調節に着目した。転写制御因子は、細胞核内で遺伝子DNAからmRNAへの転写を制御する核内蛋白質である。マウスにNMDAを全身的に適用すると、選択的にactivator protein-1(AP1)のDNA結合能上昇が、特に海馬の歯状回顆粒細胞層において強く認められたが、CA1野およびCA3野錐体細胞ではこのような増強は見られなかった。同様の解析を、KA全身適用マウスについても行った結果、歯状回顆粒細胞層だけでなく、CA1野およびCA3野錐体細胞層においても著明なAP1結合上昇が見出された。次いで、神経細胞層を含まない周辺領域についても検索を進めたところ、KA投与は各神経細胞層のみならず、周辺領域のAP1結合も著明に増強するのに対して、NMDA投与は周辺領域AP1結合には著変を与えないことが明らかとなった。KA投与後の海馬切片をニッスル染色により検討すると、NMDA投与2ヵ月後までいずれの神経層においても、海馬内神経細胞に著変は見出せなかったが、KA投与後3日以内には錐体細胞層において著しい神経細胞の脱落が誘発された。
リン脂質代謝酵素による神経突起形成と伸長の制御

リン脂質代謝酵素のホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼや(PIP5K)とホスホリパーゼD(PLD)の神経突起伸長と退縮機構への関与について培養細胞を用いて解析した結果、以下のことが明らかとなった。PIP5Kαをマウス神経芽細胞腫N1E-115細胞に強制発現させると、血清除去による神経突起の形成・伸長が阻害され、球形を保持していた。PIP5Kαのキナーゼ欠失型変異体(D266A)を強制発現させると、血清存在下で培養しているにもかかわらず非常に長い神経突起が形成された。さらに、N1E-115細胞において形成された神経突起はリゾホスファチジン酸(LPA)刺激により退縮するが、D266AはLPAによる神経突起の退縮を阻害した。従来より、低分子量G蛋白質のRhoAとそのターゲットであるROCK(Rho kinase)は神経突起の退縮において重要な役割を果たしていることが知られているが、D266AはROCKによる神経突起の退縮を阻害した。これらの結果から、PIP5Kαは神経突起退縮シグナリングにおいてRhoA/ROCKの下流因子として機能していることが示唆される。一方、PLDアイソザイムの発現誘導可能なクロム親和性細胞腫PC12細胞において、PLD2を発現させると上皮増殖因子(NGF)による神経突起の形成は非常に顕著に促進された。また、NGFによる神経突起の形成・伸長は、PLD2の活性欠失型変異体の発現およびPLDによるホスファチジン酸の産生を抑制する1-butanolにより阻害された。これらの知見から、PLD2は神経突起の形成・伸長において重要な役割を果たすことが結論づけられる。
骨芽細胞のアポトーシスと蛋白質脱リン酸化

我々は蛋白質脱リン酸化と骨芽細胞のアポトーシスに注目し、蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤でかつ発癌のブロモーターであるオカダ酸とカリクリンAを用いて一連の研究を進めてきた。骨芽細胞の性質を有するヒト骨肉腫細胞、Saos-2とMG63及びマウス骨芽細胞、MC3T3-E1をオカダ酸とカリクリンAで処理すると、これらの細胞はインビトロで細胞内のPP1とPP2Aを阻害する濃度でアポトーシスを起こして死滅する。オカダ酸により誘導されるMG63細胞のアポトーシスは蛋白合成阻害剤、サイクロヘキシミド、ピューロマイシン、とRNA合成阻害剤アクチノマイシンDにより抑制されるが、オカダ酸によるSaos-2細胞のアポトーシスはこれらの阻害剤によって抑制されない(Morimoto et al.1999)。このことは、細胞の種類により、アポトーシス誘導経路、およびその実行過程に差があることを意味する。PP1はそのアイソザイムの種類により、PP1α,PP1γ-1,PP1γ-2,PP1δに分類される。骨芽細胞におけるこれらの酵素の局在は特異的で、特に、PP1δの発現はNucleolar Organizer Regions(NORs)の細胞内局在と酷似する。アポトーシスをおこしていない正常細胞では、核小体にPP1δの局在と類似するAgNORsが検出されるが、アポトーシス細胞では、この構造物は分解されて検出されない。アポトーシス細胞では分子量100kDaの蛋白の発現が減少し、逆に分子量80kDaの蛋白が新たに出現し、その発現量は増加した。この分子量100kDaの蛋白はNORsの構成蛋白ニュークレオリン、分子量80kDaの蛋白はニュークレオリンの分解産物である(Morimoto et al.,in press)。NORsは核小体に局在し、その構成蛋白の一部がニュークレオリンである。PP1δとニュークレオリンの細胞内局在は完全に一致し、抗-PP1δにより免疫沈殿されるMG63の細胞抽出液にニュークレオリンが存在する。以上の所見はPP1δとニュークレオリンは核小体内で互いに結合し、PP1δはニュークレオリンを脱リン酸化する酵素であることを示唆する(Morimoto et al,submitted)。骨芽細胞の性質を有するヒト骨肉腫細胞、Saos-2とMG63及びマウス骨芽細胞、MC3T3-E1を蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤、オカダ酸とカリクリンAで処理すると、これらの細胞は球形に変化し、シャーレより浮遊し、ミトコンドリア活性は急激に減少して、細胞死を引き起こす。この細胞死はクロマチンの凝集、核の断片を伴っていた。さらにオカダ酸とカリクリンAは濃度および時間依存的に骨芽細胞のDNAラダー形成を誘導し、その至適濃度はそれぞれ、20nMと2nMであった。これらの濃度はインビトロで細胞内のPP1とPP2Aを阻害する濃度である。よって、細胞内の蛋白質脱リン酸化酵素活性を阻害することにより、これらの阻害剤は骨芽細胞にアポトーシスを誘導するものと考えられる。

アポトーシスは遺伝子に組み込まれた積極的な細胞死であるため、細胞死の実行には特異蛋白の新生またはその活性化が必須である。オカダ酸により誘導されるMG63細胞のアポトーシスは蛋白合成阻害剤、サイクロヘキシミド、ピューロマイシン、とRNA合成阻害剤アクチノマイシンDにより抑制されるが、オカダ酸によるSaos-2細胞のアポトーシスはこれらの阻害剤によって抑制されない(Morimoto et al.1999)。このことは、細胞の種類により、アポトーシス誘導経路、およびその実行過程に差があることを意味する。PP1はそのアイソザイムの種類により、PP1α,PP1γ-1,PP1γ-2,PP1δに分類される。骨芽細胞におけるこれらの酵素の局在は特異的で、特にPP1δは核小体に強力に発現している。この発現様式はリボソームRNAの合成場と考えられ、硝酸銀により染色されるNucleolar Organizer Regions(NORs)の細胞内局在と酷似して興味深い。現在PP1δとNORsとの関係について検討中である。骨形成過程で50-70%の骨芽細胞はアポトーシスによって死滅する。骨芽細胞の機能に関する研究は様々なアプローチから行われてきたが、骨芽細胞のアポトーシスと蛋白質脱リン酸化に関する研究は少ない。我々は蛋白質脱リン酸化と骨芽細胞のアポトーシスに注目し、蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤でかつ発癌のプロモーターであるオカダ酸とカリクリンAを用いて一連の研究を進めてきた。オカダ酸とカリクリンAは濃度および時間に依存してあらゆる種類の骨芽細胞にアポトーシスを誘導し、その至適濃度はインビトロで細胞内のPP1とPP2Aを阻害する濃度である。よって、細胞内の蛋白質脱リン酸化酵素活性を阻害することにより、オカダ酸とカリクリンAは骨芽細胞にアポトーシスを誘導すると考えられる。オカダ酸により誘導されるMG63細胞のアポトーシスはサイクロヘキシミド、ピューロマイシンとアクチノマイシンDの蛋白合成阻害剤やRNA合成阻害剤により抑制されるが、オカダ酸によるSaos-2細胞のアポトーシスはこれらの阻害剤によって抑制されなかった(Morimoto et al.,1999)。MC3T3-E1細胞におけるPP1の局在は非常に特異的で、PP1αは細胞核に瀰漫性に分布し、PP1γ1は核周辺に局在する。PP1δは細胞核に5-7個のドット様構造として、核小体に強力に発現している。この存在様式はリポゾームRNA合成の場と考えられ、硝酸銀により染色されるNucleolar Organizer Regions(NORs)の細胞内局在と酷似する。NORsは核小体に局在し、その構成蛋白の一部がニュークレオリンである。PP1δとニュークレオリンはの細胞内局在は完全に一致し、MG63細胞の核小体内で互いに結合して存在する(Morimoto et al,submitted)。よってPP1δは核小体内でニュークレオリンを脱リン酸化する酵素であることが示唆される。