hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非単調知識ベースにおける時間限定推論に関する研究

人間が行う知的問題解決を計算機上で実現するためには,問題解決に必要な知識を計算機に記憶した上,計算機の有限な計算資源を利用して問題の解を推論しなければならない.従って,資源限定の立場からの推論方法の研究は,実用的で効率の良い知識ベースシステムを実現するために,不可欠である.このような問題を対処するために,われわれが既に推論時間を限定する立場から,知識ベースKBから質問alphaを推論する基本的な手続きKB〓alphaの停止性に注目し,知識ベースにおける時間制限推論の定式化を行ってきた。本研究では,より一般的な分野で時間制限推論を利用するため,デフォルト推論システムの構成原理を与えた.具体的には,まず,知識の信頼性の立場から,デフォルト理論の拡張の内容が知識と信念に分けられることを示した.そして,時間限定推論が拡張の計算に与える影響を分析し,実際に有限の時間で構成できる部分拡張と近似拡張の概念を与えた.さらに,計算資源を節約し,不必要な計算をできるだけ排除する立場から,従来の枚挙的な拡張計算法の不合理性を指摘し,利用者の関心を示す質問による拡張構成法,新しい質問形式と処理方法を与え,このような構成法による推論システムが各時点で利用者にとって「最もよい信念集合」を自動的に構成できることを示した.最後は,推論プログラミング言語PROLOGで実現した.時間限定推論と様相論理の関連,ある意味で従来の手続き的な世界と認知的な世界の間の関連については,研究の途中で,具体的な結果がまだ得られていない.これからもこの問題の研究を進めていきたい.人間が行う知的問題解決を計算機上で実現するためには,問題解決に必要な知識を計算機に記憶した上,計算機の有限な計算資源を利用して問題の解を推論しなければならない.従って,資源限定の立場からの推論方法の研究は,実用的で効率の良い知識ベースシステムを実現するために,不可欠である.このような問題を対処するために,われわれが既に推論時間を限定する立場から,知識ベースKBから質問alphaを推論する基本的な手続きKB〓alphaの停止性に注目し,知識ベースにおける時間制限推論の定式化を行ってきた。本研究では,より一般的な分野で時間制限推論を利用するため,デフォルト推論システムの構成原理を与えた.具体的には,まず,知識の信頼性の立場から,デフォルト理論の拡張の内容が知識と信念に分けられることを示した.そして,時間限定推論が拡張の計算に与える影響を分析し,実際に有限の時間で構成できる部分拡張と近似拡張の概念を与えた.さらに,計算資源を節約し,不必要な計算をできるだけ排除する立場から,従来の枚挙的な拡張計算法の不合理性を指摘し,利用者の関心を示す質問による拡張構成法,新しい質問形式と処理方法を与え,このような構成法による推論システムが各時点で利用者にとって「最もよい信念集合」を自動的に構成できることを示した.最後は,推論プログラミング言語PROLOGで実現した.時間限定推論と様相論理の関連,ある意味で従来の手続き的な世界と認知的な世界の間の関連については,研究の途中で,具体的な結果がまだ得られていない.これからもこの問題の研究を進めていきたい.
癌細胞における染色体異常発生の分子機構

動物細胞のG2期制御機構と癌化に伴う染色体異常の発生機構について研究している。本年度は、1)分裂酵母のwee1変異株を相補する新たなヒト遺伝子(min1)、2)3種類のヒトcdc25遺伝子のうち、cdc25Aについて研究した。1)wee1変異株を相補する新たなヒト遺伝子min1を単離した。この遺伝子産物は分子量130KDの蛋白質で、その発現は、G2/M期で最高に達する。分裂酵母の種々の変異株を用いた解析結果から、リン酸化を介しないcdc2キナーゼの新たな抑制因子であることがわかった。このcdc2キナーゼの抑制活性は、min1遺伝子産物の約半分のC末端領域に存在する。更に、ある種の癌細胞で、翻訳停止の点変異が存在し、その発現量は、正常細胞に比べて顕著に低下していることが明らかになった。現在、このmin1遺伝子の染色体マッピングを行なっており、この遺伝子の近傍で転座や欠失などの異常があるか否か調べて行く予定である。2)ヒトcdc25Aは、cdc25BやCと異なりその発現がG1/S期で見られることから、この時期で機能している可能性が考えられる。そこで、同調培養したNRK細胞にcdc25Aの特異抗体を微量注入し、細胞がM期へ進入するか否かを調べた結果、ほとんどの細胞がM期へ進入していないことがわかった。次に、坑cdc25A抗体を注入した細胞が、細胞周期のどの時期で停止しているかをレーザー顕微鏡を用いたフローサイトメトリーで検討した結果、約76%の細胞がG1期で停止していることが判明した。
新たに同定した肝類洞内皮細胞のT細胞抑制機構を応用した移植免疫制御法の開発

肝臓移植の拒絶機構にはレシピエントのT細胞が移植肝臓内のドナー由来抗原提示細胞(APC)から主要組織適合性抗原(MHC)を直接認識する経路とレシピエント自身のAPCから移植肝臓内由来のドナー抗原を間接的に認識する経路がある。我々はマウス肝類洞内皮細胞によって抗原提示された同系(間接経路)あるいは異系(直接経路)T細胞は死滅あるいは麻痺に陥り、移植抗原特異的免疫寛容が誘導されることを報告した。また、ドナー由来のペプチド抗原を表出した宿主由来の肝類洞内皮細胞を門脈内移入することで、ドナー抗原に間接認識経路で応答するT細胞を低反応化あるいは寛容化できる可能性も確認した。本年度の研究では、肝臓移植の際摘出されたレシピエントの肝臓から類洞内皮細胞を分離し、移植後の肝臓に門脈投与することでキメラ類洞内皮細胞を構築し、両経路で抗原提示するT細胞を共に寛容化する可能性を検討し、以下のような結果を得た。1)マウス類洞内皮細胞の門脈内移入によるキメラ類洞内皮細胞の構築:同種異系マウス間で、類洞内皮細胞を門脈内移入すると、MHC class I染色によってキメラ類洞内皮細胞の構築が確認できた。キメラ内皮が誘導できた個体では、アロ反応性T細胞の応答が有意に抑制された。2)ヒト類洞内皮細胞の免疫寛容性に対する免疫抑制剤の機能的影響の解析:肝癌に対する肝臓切除切片から類洞内皮細胞を分離する方法を確立した。分離した類洞内皮細胞を用い、in vitro解析系でヒト類洞内皮が同種異系反応性T細胞の活性化を抑制することを確認した。肝臓移植後の拒絶機構には、レシピエントのT細胞が移植肝臓内のドナー由来抗原提示細胞から主要組織適合性抗原(MHC)を直接認識する経路とレシピエント自身の抗原提示細胞から移植肝臓内由来のドナー抗原を間接認識する経路がある。移植抗原に対する免疫寛容の誘導には、それぞれの経路で抗原提示されるT細胞を制御しなければならない。我々は、マウス肝類洞内皮細胞によって抗原提示された異系T細胞は死滅あるいは麻痺に陥り、移植抗原特異的免疫寛容が誘導される可能性を確認した。すなわち同種異系肝臓移植の場合、直接経路で抗原認識するT細胞は寛容化され易く、間接経路で抗原認識するT細胞の活性化が拒絶反応に少なからず関与するものと考えられた。本年度の研究では、肝臓移植の際に摘出されたレシピエントの肝臓から類洞内皮細胞を分離し、ドナー由来の抗原提示機能を誘導した後に、移植肝臓に門脈内注入することで、両経路で抗原認識するT細胞を共に寛容化する可能性をマウスモデルで検討した。
DSB-HR食道がん放射線化学療法感受性予測診断システム構築

食道扁平上皮癌に対する放射線化学療法の治療効果予測診断システムの構築を目的として、治療感受性の「カギ」となる遺伝子のDNAメチル化異常を見つけ出すために高感度網羅的メチル化解析を行った。非癌部に比べ、癌部で有意にメチル化している37の候補アレイプローブ(15遺伝子)を選出した。その中で最も多くのプローブが該当し、薬物代謝に関わるCYP26C1遺伝子が、食道癌特異的メチル化遺伝子候補として、抽出された。パイロシークエンス法による定量的メチル化解析において、放射線化学療法前後のCYP26C1遺伝子のDNAメチル化レベルの変化を明らかにした。分子マーカーとして今後の臨床応用が期待される。食道がんに対する放射線化学療法の治療効果予測診断システムの構築を目的として、治療感受性の「カギ」となる遺伝子のDNAメチル化異常を見つけ出すために高感度網羅的メチル化解析を行った。メチル化シトシンに感受性のある制限酵素を用いたmethylated CpG island amplification coupled with representational difference analysis(MCA-RDA)法とマイクロアレイ解析とを組み合わせたHyper/Hypo Methylation Sensitive MCA-Micorarray(H/H-MCAM)法の実験条件の至適化を行った。次に、テストサンプルを用いて解析した。メチル化シトシンに感受性の制限酵素を用いた切断の後、特異的にアダプターをつけPCRにてメチル化CpG断片のみ増幅した。PCRプロダクトをCy3、Cy5でラベリングした後、カスタムアレイプローブを用いてアレイ解析した。アレイ解析ソフトによる解析が可能なレベルの生データを得ることができた。細胞発生、細胞死、薬物代謝に関わる遺伝子などのメチル化が認められ、さらに食道がん特異的メチル化遺伝子候補を絞り込むことに成功した。H/H-MCAM法とは別に、パイロシークエンス法によるhomologous recombination(HR)関連遺伝子のメチル化定量解析を進めた。HR関連遺伝子のメチル化定量解析をbisulfite-pyrosequencingで行うべく、食道がん細胞株を用いて、候補遺伝子を選定し、実験条件の至適化に成功した。食道がんにおける臨床的な最大の問題点は放射線化学療法の効果予測が出来ないことにある。本研究では、治療感受性の「カギ」となるメチル化異常を網羅的かつhomologous recombination(HR)機構に焦点を当て解析し、「食道がんに対する放射線化学療法の治療効果予測診断システム」の構築することを目的とした。食道がん特異的メチル化遺伝子の解析では、少数例での検証実験の結果が十分でなく、選択した候補遺伝子が適切ではないのかメチル化解析のプライマーの選定が適切ではないのか、検討に時間を要した。また、最終的に、再候補の選定作業からのやり直しを要し、十分な結果を得られなかった。また、パイロシークエンス法によるHR関連遺伝子のメチル化定量解析においても、当初、選定した候補遺伝子メチル化の少数例の検討で、ポジティブな結果を得ることができず、多くの検体を用いた本格的な検討まで、進展しなかった。研究実績の概要に記載した通りの理由により、食道がん特異的メチル化遺伝子の解析、パイロシークエンス法によるHR関連遺伝子のメチル化定量解析ともに、達成度が低く、大幅な遅れを生じている。食道がん細胞株で選定したHR関連遺伝子のメチル化定量解析をbisulfite-pyrosequencingを用いて臨床検体で解析し、複数のマーカー候補を得た。高感度網羅的メチル化解析では、H/H-MCAM法の実験条件の至適化後、テストサンプルを用いて、食道がん特異的メチル化遺伝子候補を絞り込むことに成功した。次年度につながる成果であり、研究は順調に進展している。また、パイロシークエンス法によるHR関連遺伝子のメチル化定量解析では、候補遺伝子の選定、bisulfite-pyrosequencingによる実験条件の至適化に成功した。従って、研究計画通り、順調に進展している。28年度は、これまでの大幅な遅れを取り戻すべく、前年度まで未施行分の研究計画を含めて、並行してできる研究内容は、最大限、並行して行い、研究を推し進めていく。消化器内科学順調に進展した26年度に引き続き、27年度も研究計画に基づき、研究を推し進めていく。特に有望な成果の得られたDNAメチル化異常に関して、絞り込んだ食道がん特異的メチル化遺伝子の解析を進める。また、HR関連遺伝子のメチル化定量解析を進め、前記の研究との連携を強化し、研究を推し進める。食道がん特異的メチル化遺伝子の解析、パイロシークエンス法によるHR関連遺伝子のメチル化定量解析ともに、達成度が低く、大幅な遅れを生じた。

コンピュータ上での公共データベースを用いた遺伝子発現の検索などの作業に多くの時間を費やし、多数の検体を用いた解析等に進めなかったため、27年度使用額が生じた。26年度は、所有している試薬消耗品を使用して研究を開始し、途中、有望な研究成果を得る事ができ、その後も研究は順調に進展した。加えて、26年度の研究成果に伴い、27年度の試薬消耗品にかかる費用が当初予算を上回ることが予想されたため、27年度に繰り越した。28年度は、前年度まで未施行分の研究を含めて、研究項目が多岐にわたるため、繰り越し分を含め、試薬消耗品購入に使用する。27年度は、研究項目が多岐にわたるため、繰り越し分を含め、試薬消耗品購入に使用する。
神経系各種活性物質の機能解析のためのプログラムドノックアウトマウスの作成系の開発

本研究の目的は標的遺伝子組換えを用いるのではなく標的遺伝子の発現を一時的に抑制しようと試みるものである.この系を開発する背景として、我々が以前から神経再生関連遺伝子の探索を行っていた経緯があり、本研究では損傷を与えた後神経再生時に特異的に発現する遺伝子群の発現を抑制することによって、それら遺伝子の機能を検討することを目指した.このために、神経損傷に応じて著しい発現促進を示す遺伝子GAP-43の発現をコントロールしているプロモーターに着目し、このプロモーターの下流に目的遺伝子のアンチセンスやリボザイムをコードした遺伝子のトランスジェニック動物を作成することを試みた.平成7年度はGAP-43プロモーター領域のクローニングを行い.平成8年度には、これが正しく作動することを試みるために本プロモーターの下流にLacZを結合させた遺伝子のトランスジェニックマウスの作成を試みた.ここで、一つの問題点が明らかになった.トランスジェニックの効率が極端に悪いということである.このため、GAP-43プロモーター領域を短くし軽量化を試みた.平成9年度に入ってからGAP-43のプロモータの下流にGAP-43のN末のアミノ酸配列とLacZの融合蛋白をつないだコンストラクトによるトランスジェニック動物が完成した.本トランスジェニック動物は本研究の最終目標産物ではないが、今後の神経可塑性や再生の研究には極めて利用価値が高い.上述のようなトランスジェニック動物の作成を試みる傍ら、遺伝子発現抑制の新たな手法でさらに多くの利点を有すると考えられるアデノウイルスを用いた遺伝子導入の方法の開発を同時に開始した.本手法により、少なくとも末梢神経の損傷時に損傷神経解剖に特異的に遺伝子を導入することが容易になった.本研究は、標的の遺伝子の発現を一時的に抑制するために標的遺伝子組換えを用いるのではなく、アンチセンスのDNA配列を有した遺伝子や、特定のmRNAを酵素的に切断するリボザイムを特定の時期にのみ発現させ、目的遺伝子発現を一時的に抑制しようとするものである。従ってトランスジェニックマウス作成法を用い遺伝子を導入するが、導入する遺伝子のベクターを工夫することによりプログラムされたときにのみ抑制のための遺伝子を発現させるよう計画されている。本年度はこれを行うためのベクターの開発が課題の中心である。ベクター開発の中核をなすプロモーターには、神経成長関連蛋白(GAP-43)のプロモーターを用いた。これは損傷神経軸索が再生するときにのみ発現のスイッチが入るようにデザインするためである。本プロモーター(約16kベース)をクローニングし、βガラクトシダーゼ遺伝子を下流につないだ。本遺伝子コンストラクトをマウス受精卵に注入し、胚における遺伝子発現を検索することによりプロモーターが予定通り作動しているかを検索中である。一方、アンチセンス以外の遺伝子発現抑制の手法としてリボザイムを計画しているが、PC12を用いGAP43の発現抑制を試みた。その結果少なくとも培養系ではリボザイムがうまく作動していることが明らかになった(Imaizumi et at,Mol.Brain Res.,32,338,1995)。さらに我々は、特定の分子群を過剰発現させた動物を用いて神経再生の現象の解析も試みた。神経再生にはIL-6などのサイトカインの関連がいわれているので、我々はIL-6とIL-6受容体の両者を過剰発現させた動物では、神経軸索再生に何らかの影響があるかどうかを検討した。その結果、過剰発現動物では、神経再生の速度が早くなっていることが明らかになった(Hirota et al,J.Exp.Med.in press)。本研究の目的は標的遺伝子組換えを用いるのではなく標的遺伝子の発現を一時的に抑制しようと試みるものである.この系を開発する背景として、我々が以前から神経再生関連遺伝子の探索を行っていた経緯があり、本研究では損傷を与えた後神経再生時に特異的に発現する遺伝子群の発現を抑制することによって、それら遺伝子の機能を検討することを目指した.このために、神経損傷に応じて著しい発現促進を示す遺伝子GAP-43の発現をコントロールしているプロモーターに着目し、このプロモーターの下流に目的遺伝子のアンチセンスやリボザイムをコードした遺伝子のトランスジェニック動物を作成することを試みた.平成7年度はGAP-43プロモーター領域のクローニングを行い.平成8年度には、これが正しく作動することを試みるために本プロモーターの下流にLacZを結合させた遺伝子のトランスジェニックマウスの作成を試みた.ここで、一つの問題点が明らかになった.トランスジェニックの効率が極端に悪いということである.このため、GAP-43プロモーター領域を短くし軽量化を試みた.平成9年度に入ってからGAP-43のプロモータの下流にGAP-43のN末のアミノ酸配列とLacZの融合蛋白をつないだコンストラクトによるトランスジェニック動物が完成した.本トランスジェニック動物は本研究の最終目標産物ではないが、今後の神経可塑性や再生の研究には極めて利用価値が高い.上述のようなトランスジェニック動物の作成を試みる傍ら、遺伝子発現抑制の新たな手法でさらに多くの利点を有すると考えられるアデノウイルスを用いた遺伝子導入の方法の開発を同時に開始した.本手法により、少なくとも末梢神経の損傷時に損傷神経解剖に特異的に遺伝子を導入することが容易になった.本年度は主にプロモーターの軽量化を試みた。昨年度、GAP-43のプロモーター領域をクローニングしトランスジェニック動物の解析を行ったが、トランスジェニック動物がなかなかできなかった。神経傷害時に特異的に発現させるためにプロモーター領域を大きくとりすぎたためと考えられるため、GAP-43プロモーター領域を短くし軽量化を試みた。

LacZの発現を指標に、各種プロモーター長のコンストラクトを用いトランスジェニック動物を作成した結果、ようやく目的のGAP-43の発現特徴を有するものが得られた。現在これのライン化を試みている。また、本年度は発生工学的な手法を用いずに神経損傷直後に損傷神経細胞のみに遺伝子導入を行うための手法の開発にも着手した。これは、当初の予定にはなかったものだが、発生工学的な遺伝子発現抑制の手法にとって変わる新たな手法であり多くの利点を有すると考えられるので、急遽開発することとした。遺伝子導入の方法としては、非分裂性の神経細胞にきわめて効率良く感染することが分かっている、アデノウイルスを用いた。末梢神経の損傷部位から損傷神経細胞にのみ遺伝子を導入するため、LacZ発現を指標にさまざまな手法を試みた。その結果、損傷部位を加工することによって、きわめて効率の良い遺伝子導入が可能となった。本手法により、少なくとも末梢神経の損傷時に損傷神経解剖に特異的に遺伝子を導入することが容易になった。本手法を応用して発現を抑制する試みを来年度は試みる予定である。また、特定のトランスジニック動物やノックアウト動物を用いることにより、神経損傷時の機能解析がどの程度可能であるかの試みた。ここでは、IL-6やIL-6Rを過剰発現している動物で神経軸索損傷後の再生速度が促進することが明らかになった。また、p53ノックアウトマウスを用いた実験では、神経軸索再生にはあまり影響を及ぼさないことも分かった。本年度の実施計画に記載した以下の2点について研究を実施した。GAP-43のプロモーターの下流にGAP-43のN末アミノ酸とLacZの融合蛋白を結合させた遺伝子を用いトランスジェニック動物を作成していたが,ようやくトランスジェニックマウスが生まれた。現在ホモのライン化を行っている。本トランスジェニックマウスの発生過程におけLacZの発現を検討したところ,極めて神経特異的に発現が見られた。さらに,E12.5のマウスなどでは三叉神経をはじめ伸展途上の神経の先端(成長円錐)にもLacZの発現が認められた。このような胎生期の発現は極めてネイティブなGAP-43に近いと考えられる。通常の成熟動物においてもGAP-43の発現と同様に極めて視神経に豊富に発現が認められた。さらに,大脳皮質などにも発現が観察された。現在神経損傷を与えて発現動態がGAP-43とどの程度類似しているかを検討している。(本研究結果はアメリカ,ニューオリンズで行われた第26回北米神経科学会で発表した。)(2)アデノウイルスを用いた遺伝子導入アデノウイルスによる発現系の構築を行った。現在神経再生に関連があると考えられ低るRasの発現抑制を試みるために,RasのドミナントネガティブやRasを抑制するRas-GAP1mをアデノウイルスに組み込んだ.さらにRasのドミナントポジティブや下流のMEK1についてもアデノウイルスの作成を行った.
水利施設における魚類行動に関する確率過程モデルの構築

水利施設における魚類の行動に関する基礎理論を構築するため,滋賀県長浜市に設定した試験サイトにおいて調査を行い,Fokker-Planck偏微分方程式とその付帯条件によって記述される数理モデルの導出ならびにその数値モデル化を行った.試験サイトは,琵琶湖に注ぐ一級河川丁野木川を含む低平地水田からの農業排水路系であり,コイ,ナマズのような魚類が産卵のために水田へ遡上することを可能にするため「水田魚道」が数箇所に設置されている.5月から7月の産卵期の降雨時において,数次にわたり暗視ビデオカメラなどの観測機器を用いた調査を行い,魚類行動に関するデータを取得した.また,農業排水路系の緒元について,詳細な現地測量に基づくデータベース化,ならびに,衛星画像による確認を行った.丁野木川河口からの農業排水路系全体において時空間的に分布する魚類の「遡上確率」を数学的に定義し,その支配式であるFokker-Planck偏微分方程式および水理構造物において課せられる内部境界条件を解析的に導いた.それらのパラメータを,実測データに基づいて決定した.有限要素法に基づいて,Fokker-Planck偏微分方程式系の数値モデルを開発し,有限体積法を用いて農業排水路系の流れ場を計算する1次元地表流モデルと併せ,「遡上確率」に関する数値解析を行った.なお,入力としては,現地に設置した高解像度雨量計による実測時系列データを用いた.以上の内容を,国際シンポジウムにおいて発表し,また,学術誌に投稿した.水利施設における魚類の行動を記述する基礎理論を構築するため,試験サイトの選定,観測システムの構築,デジタル動画像を中心としたデータの取得,データの解析,Fokker-Planck偏微分方程式の適用と内部境界条件の導入によるモデル化を行った.試験サイトは,滋賀県旧びわ町益田の農業排水路に選定した.この農業排水路は,琵琶湖に注ぐ一級河川丁野木川の支流である益田川に道路下に埋設された土管を介して接続している.豪雨時には,益田川の水位が上昇し,土管内さらには農業排水路まで背水の影響が生じる.そのような状況が,コイ,ナマズ,フナなどの産卵期に発生すると,通常は琵琶湖を生活の場としているそれらの魚類が,丁野木川,益田川,土管を経て農業排水路に侵入する.これは,農業排水路からさらに水田へ遡上して産卵を行うためであるが,現在の圃場整備のなされた農業排水システムにおいては農業排水路と水田の間に大きな落差があるため遡上が阻害される.この試験サイトでは,農業排水路に階段状に堰板を設置することにより,そのような落差を解消して魚類が水田へ遡上することを可能にしている.それらの堰板を被覆する形で観測やぐらを組み,暗視ビデオカメラを鉛直下向きに設置し,パソコンに接続してデジタル動画像を保存するシステムを構築した.また,雨量と農業排水路水位を自動観測する機器も設置した.7月4日の豪雨時に8時間の連続観測を行い,多数のニゴロブナが遡上する状況を記録することができた.魚類遡上確率の時空間分布を支配するFokker-Planck偏微分方程式および堰板地点におけるその内部境界条件を解析的に導き,実測データに適用して数値計算を行った.本年度の研究は,農業排水路内に限定されたものであったため,次年度においては琵琶湖から河川,試験サイト以外の農業排水路などを含めた水系ネットワークへモデルを拡張する予定である.水利施設における魚類の行動に関する基礎理論を構築するため,滋賀県長浜市に設定した試験サイトにおいて調査を行い,Fokker-Planck偏微分方程式とその付帯条件によって記述される数理モデルの導出ならびにその数値モデル化を行った.試験サイトは,琵琶湖に注ぐ一級河川丁野木川を含む低平地水田からの農業排水路系であり,コイ,ナマズのような魚類が産卵のために水田へ遡上することを可能にするため「水田魚道」が数箇所に設置されている.5月から7月の産卵期の降雨時において,数次にわたり暗視ビデオカメラなどの観測機器を用いた調査を行い,魚類行動に関するデータを取得した.また,農業排水路系の緒元について,詳細な現地測量に基づくデータベース化,ならびに,衛星画像による確認を行った.丁野木川河口からの農業排水路系全体において時空間的に分布する魚類の「遡上確率」を数学的に定義し,その支配式であるFokker-Planck偏微分方程式および水理構造物において課せられる内部境界条件を解析的に導いた.それらのパラメータを,実測データに基づいて決定した.有限要素法に基づいて,Fokker-Planck偏微分方程式系の数値モデルを開発し,有限体積法を用いて農業排水路系の流れ場を計算する1次元地表流モデルと併せ,「遡上確率」に関する数値解析を行った.なお,入力としては,現地に設置した高解像度雨量計による実測時系列データを用いた.以上の内容を,国際シンポジウムにおいて発表し,また,学術誌に投稿した.
KGFR阻害剤およびTGFβR阻害剤を用いた胃癌転移の分子標的治療開発

スキルス胃癌の病態と、その病態に基づいた新しい分子標的治療の有用性を検討した。スキルス胃癌は、チロシンキナーゼ型fibroblast growth factor receptor 2(FGF-R2)と相同性のあるK-samII遺伝子が増幅し増殖に関与している。また、TGFbeta/TGFβreceptorはスキルス胃癌細胞の浸潤転移に関与している。そこでこれらFGF-R2/K-samIIおよびTGFβreceptorに対する阻害剤を用いた分子標的治療の有用性を検討した。【材料と方法】I.FGF-R2/K-samII阻害剤の検討:FGF-R2/K-samIIリン酸化阻害剤Ki23057(2003年特許)を用い、胃癌細胞の増殖抑制効果やFGF-R2,ERK,Aktリン酸化阻害を検討した。胃癌腹膜転移モデルを作成し、Ki23057経口投与による転移抑制効果を検討した。II.TGFβreceptor阻害剤の検討:TGFβreceptor阻害剤A-77を用いた。胃癌リンパ節転移モデルを作成後、A-77投与群、S-l投与群、A-77・S-l併用群間の腫瘍径と転移リンパ節数を検討した。【結果】Ki23057は、スキルス胃癌細胞の発現するFGF-R2,MAPK,PI3Kリン酸化を阻害し,癌細胞増殖を抑制した。Ki23057投与により、腹膜播種転移マウスの生存率を有意に延長した。TGFβreceptor阻害剤A-77は非投与群に比し、A-77投与群、S-l投与群、併用群において胃腫瘍径およびリンパ節転移が有意に抑制された(2006年特許)。【結論】FGF-RI/K-samII阻害剤(Ki23057)およびTGFβreceptor阻害剤(A-77)は、スキルス胃癌転移に対する分子標的治療に有用であることが示唆された。FGF-R2リン酸ヒ且害剤Ki23057はスキルス胃癌細胞増殖を抑制するスキルス胃癌細胞株2株(OCUM-2MD3,OCUM-8)および非スキルス胃癌細胞株3株(MKN-7,MKN-45,MKN-74)を用い、Ki23057が各紬胞株の増殖能に及ぼす影響を検討した。Ki23057はスキルス胃癌細胞株の増殖を抑制するが、高分化型胃癌細胞の増殖は抑制しない。すなわち、Ki23057は30 nM以上濃度にてFGF-R2/K-samIIを発現するスキルス胃癌細胞株OCUM-2MD3,OCUM-8の増殖を有意に抑制する。一方、Ki23057は高分化型胃癌細胞の増殖を抑制しない。以上より、FGF-R2/K-samIIリン酸化阻害剤Ki23057はスキルス胃癌細胞の増殖を特異的に抑制する事が明らかになった。FGF-R2リン酸化阻害剤Ki23057はスキルス胃癌のMAPキナーゼ系やPI3キナーゼ系のリン酸化を阻害するwestern blotにて各細胞株のK-samII発現を検討すると、スキルス胃癌細胞はK-samII発現を認めたが非スキルス胃癌細胞には認められない。Ki23057投与によりスキルス胃癌細胞株のFFGF-R2/K-samIIのリン酸化が抑制されるが、非スキルス胃癌細胞は抑制されない。

次に、FGF-R2の下流シグナルを検討すると、Ki23057はスキルス胃癌細胞の発現するMAPK経路のERKリン酸化、PI3K経路のAktリン酸化を抑制した。すなわち、スキルス胃癌細胞株(OCUM-2MD3)に種々の濃度のKi23057を投与しp-ERK, ERK, p-AKT, AKTの発現の差をWestern blot法で検討すると、リン酸化ERKのp-ERKは100nMのKi23057より抑制され1000nMで発現がほとんど認めないのに対し、totalのERKは発現変化しない。また、P-AKTも同様に1000 nMでリン酸化が抑制されるのに対して、total AKTは変化しない。OCUM-8でも同様にKi23057によるリン酸化抑制がみられる。一方、分化型胃癌細胞株ではp-ERK、ERKともに抑制されない。これらのことより、Ki23057のFGF-R2リン酸化阻害作用が、MAPキナーゼ系やPI3キナーゼ系を抑制しアポトーシスを誘導することでスキルス胃癌細胞の増殖を抑制していることが示唆される。スキルス胃癌の病態にもとづいた新しい分子標的治療の可能性を検討した。スキルス胃癌はチロシンキナーゼ型FGF-R2と相同性のあるK-samII遺伝子が増幅し、FGF7/FGF-R2シグナルが癌細胞増殖に関与していること、またセリンスレオニン型TGFβ/TGFβ-Rシグナルが癌細胞の浸潤転移に関与していることを報告した。そこでこれらFGF-R2およびTGFβRの阻害剤の有用性を検討した。【材料と方法】1).FGF、R2阻害剤:FGF-R2/K-samIIリン酸化阻害剤Ki23057を用い、胃癌細胞の増殖抑制効果を検討した。さらに、FGF-R2、ERK,Aktリン酸化阻害を検討した。in vivoでは、マウス腹膜転移モデルを作成し、Ki23057経口投与による転移抑制効果を検討した。2).TGFβ-R阻害剤:TGFβ-R阻害剤A-77を用いた。胃癌リンパ節転移モデルを作成後、A-77腹腔内投与群、S-1経口投与群、A-77およびS-1併用群間の腫瘍面積と転移リンパ節数を比較検討した。【結果】1)Ki23057は、スキルス胃癌細胞の発現するFGF-R2、MAPK系およびPI-3系のリン酸化を阻害し、癌細胞増殖を抑制した。Ki23057の経口投与により、腹膜播種転移マウスの生存率を有意に延長した。2)control(非投与)群に比し、A-77投与群、S-1投与群、A-77/S-1併用群において胃腫瘍およびリンパ節転移が有意に抑制された。【結論】FGF-R2阻害剤Ki23057およびTGFβR阻害剤A-77はスキルス胃癌の分子標的治療に有用であることが示唆された。
非鉛強誘電体エピタキシャル薄膜における電界誘起相転移を用いた巨大圧電応答

微小電気機械システム(MEMS)に用いる非鉛系圧電薄膜として、菱面体構造を有し良好な強誘電特性が報告されているBiFeO_3に、正方晶構造が予想されるBiAlO_3を固溶させることで、モルフォトロピック相境界(MPB)を有する新規なBi系強誘電体の開発を試みた。酸化物基板上にエピタキシャル成長させることによって薄膜の方位を制御し、「電界誘起相転移」によって生じる巨大圧電応答が出現する組成、結晶方位を明らかにすることが当初の目的であった。製膜温度の低温化による薄膜からのBiの再蒸発の防止やターゲットの焼結密度の向上などを行った結果、Feサイトを20%までAlと置換したBi(FexAll-x)O_3薄膜の作製に成功した。さらに当初の目的通り、菱面体晶の正方晶の濃度相境界が存在することを確認した。この結果はJpnJ.Appl.Phys.43,6609(2004)において報告した。しかしながら、薄膜のリーク電流が大きく、電界誘起層転移を発現させるに充分な電界を印加することができなかった。そこでいくつかの製膜条件の最適化を行った。酸素欠損量を低減させる必要があると考え製膜中の飛散粒子の状態を発光分光分析し、酸素活性種の量が増大する製膜条件を見出した。また、表面平坦性を向上させるため、成長初期過程の観察や下部電極の検討を行った。最終的にRMS表面粗さを0.5nm程度まで減少させることに成功した。しかし、表面平坦性が向上した膜では結晶構造がBiFeO_3においても正方晶となり、電界誘起層転移を発現させるための要件を満たさなくなった。基板の選択によってAl無添加BiFeO_3薄膜の結晶構造を変化させる必要があるものと考えられる。その他本研究では、リーク電流を低減させる方法として血のFeサイトへの置換を検討した。酸素欠損量の多い薄膜では、Mnの置換によりリーク電流が低減することを明らかにし、リーク電流に及ぼすMn置換効果について知見を得ることができた。近年、環境保全の観点から非鉛系の圧電材料の開発が求められており、本研究では、ペロブスカイト型酸化物の圧電特性と構成金属イオンの質量比にフォノンを介した相関があることを考慮して材料設計を行い、非鉛であるBi(Fe_xAl_<1-x>)O_3に着目した。これまでの検討において、バルクセラミックプロセスでは固溶体単相を得ることが非常に困難であることが明らかになっていたので、本年度はレーザーアブレーション法を用いて酸化物基板上にエピタキシャル成長したBi(Fe_xAl_<1-x>)O_3薄膜の作製を試みた。まず製膜に用いるターゲットについての検討を行った。固溶体が作製できないため、必然的に複数の相が混ざったバルク体をターゲットとして用いる必要があるが、バンドギャップの大きいAl_2O_3がターゲットに含まれていると組成ずれの問題が発生することが明らかとなった。そこで、まずBi_2O_3とAl_2O_3を固相反応させてAl_4Bi_2O_9を合成し、これにBiFeO_3、Bi_2O_3を目的組成となるように混合し焼成したセラミックスをターゲットとして用いたところ、組成ずれの少ない薄膜を作製できるようになり、Alを20%まで固溶させたBi(Fe_xAl_<1-x>)O_3エピタキシャル薄膜の作製に成功した。X線回折を用いた逆格子空間マッピング測定によりAl量の増加に伴って結晶の正方晶歪が増加していることが確認できた。しかしながら、誘電特性に関しては、容量-電圧特性において強誘電的な挙動が見られるものの、明確な強誘電性を確認するには至っていない。これは薄膜の表面形態が悪いために大きな漏れ電流が流れることが原因と考えられ、これを解決するためには、製膜温度の低温化による薄膜からのBiの再蒸発の防止やターゲットの焼結密度の向上などを行う必要があることが明らかとなった。近年,環境保全の観点から非鉛系の圧電材料の開発が求められており,本研究では,ペロブスカイト型酸化物の圧電特性と構成金属イオンの質量比にフォノンを介した相関があることを考慮して材料設計を行い,非鉛であるBi(Fe_xAl_<1-x>)O_3に着目した.昨年度,Bi(Fe_xAl_<1-x>)O_3薄膜の合成には成功したものの,明確な強誘電性を確認するには至らなかった.これを解決するためには薄膜の組成を厳密に制御して製膜を行う必要があることが明らかとなったので,本年度は発光分光分析を用いて,レーザーアブレーション状態の解析を行い,レーザーエネルギー密度や製膜ガス圧力が薄膜の成長にどのような影響を及ぼすかについて調べた.また,製膜に用いるターゲットの改善方法として,放電プラズマ焼結法を用いて,高密度なBiFeO_3ターゲットを用いることも検討した.レーザーアブレーション時に発生するプラズマ発光(プルーム)に対して行った発光分光分析から,プルーム中の飛散粒子はFe,Biの中性原子と原子状酸素であることが明らかとなった.これらの飛散粒子のプルーム内での分布は,プルームの外側に原子量の小さいFeがより多く存在し,またターゲットから離れるにつれて原子状酸素の比が減少していた.これらの飛散粒子の存在比が,製膜条件の変化によってどのように変化するかを調べたこところ,Fe,Biの比はレーザーエネルギー密度や酸素ガス圧力によってはあまり変化しなかった.

一方で,原子状酸素の比は酸素ガス圧力には依存性を示さなかったものの,レーザーエネルギー密度を増加させるにつれて増加することが分かった.また,ターゲットにBi_2O_3が存在することによっても原子状酸素の比が増加することも明らかとなった.この原子状酸素の比が多い製膜条件で実験を行うことによって,Bi(Fe_xAl_<1-x>)O_3薄膜の酸素欠損量を低減できると期待できる.微小電気機械システム(MEMS)に用いる非鉛系圧電薄膜として、菱面体構造を有し良好な強誘電特性が報告されているBiFeO_3に、正方晶構造が予想されるBiAlO_3を固溶させることで、モルフォトロピック相境界(MPB)を有する新規なBi系強誘電体の開発を試みた。酸化物基板上にエピタキシャル成長させることによって薄膜の方位を制御し、「電界誘起相転移」によって生じる巨大圧電応答が出現する組成、結晶方位を明らかにすることが当初の目的であった。製膜温度の低温化による薄膜からのBiの再蒸発の防止やターゲットの焼結密度の向上などを行った結果、Feサイトを20%までAlと置換したBi(FexAll-x)O_3薄膜の作製に成功した。さらに当初の目的通り、菱面体晶の正方晶の濃度相境界が存在することを確認した。この結果はJpnJ.Appl.Phys.43,6609(2004)において報告した。しかしながら、薄膜のリーク電流が大きく、電界誘起層転移を発現させるに充分な電界を印加することができなかった。そこでいくつかの製膜条件の最適化を行った。酸素欠損量を低減させる必要があると考え製膜中の飛散粒子の状態を発光分光分析し、酸素活性種の量が増大する製膜条件を見出した。また、表面平坦性を向上させるため、成長初期過程の観察や下部電極の検討を行った。最終的にRMS表面粗さを0.5nm程度まで減少させることに成功した。しかし、表面平坦性が向上した膜では結晶構造がBiFeO_3においても正方晶となり、電界誘起層転移を発現させるための要件を満たさなくなった。基板の選択によってAl無添加BiFeO_3薄膜の結晶構造を変化させる必要があるものと考えられる。その他本研究では、リーク電流を低減させる方法として血のFeサイトへの置換を検討した。酸素欠損量の多い薄膜では、Mnの置換によりリーク電流が低減することを明らかにし、リーク電流に及ぼすMn置換効果について知見を得ることができた。
細胞膜リン脂質に見られる脂肪酸種の不均衡分布機構の解明

本研究においては、細胞膜リン脂質に含まれる二重結合の不均衡な分布と我々が見出したアシル転移酵素との接点を解明した。酵母において見出した2種類のアシル転移酵素Lpt1とSlc1の高発現株より酵素を精製あるいは部分精製し基質特異性を調べた。また、それぞれの遺伝子破壊株をより抽出した脂質をLC-MS/MSを用いて解析した。その結果、両酵素は極性基の選択性は異なるもののリゾリン脂質に優先的に2重結合を導入することが明らかとなった。平成21年度の研究計画に基づいて酵母アシル転移酵素LPT1と細胞膜リン脂質の不均衡分布の関連を解析した。LPT1は、リゾリン脂質に不飽和結合を含むアシル基を好んで転移することが我々を含む研究グループによって報告されている。そこで、LPT1遺伝子破壊株、LPT1高発現株を構築し、それぞれの培養菌体よりBligh&Dyer法により脂質を抽出し、アルミナカラムを用いてリン脂質の精製を行った。このようにして得られたリン脂質をLC-MSを用いて解析したところ、それぞれ株において細胞膜構成リン脂質に含まれる二重結合の割合に変化は認められなかった。酵母にはアシル転移酵素としてLPT1の他にSLC1が知られており、2つの酵素はホスファチジン酸合成において協調して働いていると考えられたことから、新たに分裂酵母においてLPT1,SLC1それぞれの遺伝子破壊株、高発現株の構築を行った。SLC1遺伝子破壊株にLPT1高発現プラスミドを形質転換した株より調製したミクロソーム画分を用いて酵素活性をしらべたところ、不飽和結合をもつアシル基に高い特異性を示した。さらに、LPT1遺伝子破壊株にSLC1高発現プラスミドを導入した株を構築し酵素の基質特異性をしらべたところ、SLC1はリゾホスファチジン酸に高い特異性を示したが、リゾホスファチジルコリンでは活性の有無は確認できなかった。現在、高発現したSLC1が可溶化できる条件を見出し酵素の精製を行い性質の解明に向けて研究を進行している。平成22年度の研究計画に基づいて酵母アシル転移酵素LPT1と細胞膜リン脂質の不均衡分布の関連を解析した。そこで、大腸菌を用いたSLC1の高発現系の構築を行った。その結果、分裂酵母を宿主とする場合よりも高い活性を得ることができた。さらに、C-末端にHis-tagを付加した組み換え酵素の生成に成功し粗酵素標品について基質特異性を調べるとともに、ニッケルカラムを用いた酵素の精製と詳細な性質の解明をめざして研究を行っている。前年度に分裂酵母において構築したアシル転移酵素LPT1およびSLC1の遺伝子破壊株、高発現株を培養し、Bligh & Dyer法により脂質抽出した。これらの脂質をMS/MSを用いた比較解析を行った。その結果、破壊株においては、リゾリン脂質の蓄積が認められた。また、出芽酵母のリゾリン脂質アシル転移酵素であるLPT1に関して細胞膜におけるトポロジー解析を行った。Lpt1-GFPを用いた蛍光顕微鏡解析の結果Lpt1-GFPは、小胞体膜に局在することが考えられた。そこで、Lpt1のハイドロパシープロット解析を行い膜貫通領域の推定を行った。その結果を基にLpt1の親水性領域に酵母のインベルターゼであるSuc2の糖鎖付加配列を導入したキメラ酵素13種類を構築した。このキメラ酵素を用いてLpt1が小胞体膜でどのような配位をしているかを解析した。すなわち、Suc2の糖鎖付加配列が小胞体内腔に配位すると糖鎖が付加されるが、細胞質側に配位すると糖鎖付加が起こらないことを利用して解析する方法である。糖鎖の付加は、Lpt1を糖鎖切断酵素であるEndo-Hで処理することで判別した。その結果、Lpt1のN-末端、7番目と11番目の親水性ループが小胞体内腔に配位していることが明らかとなった。また、活性中心として保存されているヒスチジン残基は、9番目の親水性ループに存在することから、本酵素の触媒作用は細胞質側で行われていることが明らかとなった。
蝸牛における細胞間結合装置および細胞接着分子に関する研究

13年度)ラット蝸牛におけるタイト結合タンパクclaudinの局在について、共焦点レーザ顕微鏡を用いて免疫組織化学的に検討した。内リンパ電位産生に最も重要な役割を果たしている血管条には、内リンパ側の辺縁細胞および外リンパ側の基底細胞ともにタイト結合が存在し、それぞれのタイト結合タンパクの発現と局在について検討した。その結果、辺縁細胞、基底細胞ともに、タイト結合タンパクoccludinが発現し、辺縁細胞ではclaudin-1、3の発現が認められたが、基底細胞では認められないことを確認した。それぞれの細胞におけるタイト結合の構成タンパクが異なり、各々のタイト結合が異なる機能をもつ可能性が示唆された。14年度)ラット蝸牛におけるギャップ結合タンパクconnexin43の発現および局在について共焦点レーザ顕微鏡を用いて免疫組織化学的に詳細に検討し、connexin26の発現および局在と比較し、さらにタイト結合関連タンパクZO-1との関係について検討した。すなわち、connexin43とconnexin26は異なる発現様式を示し、蝸牛管外側壁ではconnexin43は主に血管条に発現を認め、connexin26は血管条とラセン靭帯のいずれにも発現した。ラセン縁ではconnexin43は広く発現したが、connexin26は前庭階側に主に発現した。コルチ器支持細胞においては、connexin26の発現と比較して、connexin43の発現は少数であった。蝸牛の部位によって、ギャップ結合を構成するconnexinの組み合わせや割合が異なると考えられ、さらに各部位によって、ギャップ結合の機能が異なる可能性が示唆された。上記結果について原著論文の形式で発表した(J Histochem Cytochem, in press)。ラットおよびマウスの蝸牛について、タイト結合タンパクclaudinの局在を検討した。内外リンパ間のバリア機能に関して、最も重要かつ複雑な役割を果たしているのは血管条である。血管条は、内リンパ腔に面する辺縁細胞および内リンパ腔側と反対側の基底細胞ともにタイト結合が存在し、血管条内に存在するintrastrial compartmentを確立している。それぞれのタイト結合の構成タンパクおよびその局在について検討し、辺縁細胞および基底細胞の機能の一端を明らかにしようと試みた。現在までに1)辺縁細胞、基底細胞ともに、タイト結合の膜タンパクであるoccludinの発現は認められた、2)辺縁細胞ではclaudin-1、3の発現が認められたが、基底細胞では認められなかった、との結果を得ている。それぞれの細胞におけるタイト結合の構成タンパクが異なり、各々のタイト結合が機能的に異なる特性をもつ可能性が示唆された。
ニパウイルスのリバースジェネティクス系の確立

本研究の目的はニパウイルスのreverse genetics系を作製し、これをウイルス学的基礎研究およびワクチン開発などの応用研究に有用なツールとして確立することである。平成17年度は、ニパウイルス感染細胞から抽出したRNAをもとに、ウイルスゲノム全長(約19kb)を組み込んだプラスミドおよびウイルスレスキューに必要なN、P、L蛋白を発現するためのプラスミドを作製した。これらのプラスミドを用いて、フランス国立医学研究所(INSERM)のP4施設内でウイルスレスキュー実験を行なった。その結果、遺伝子から感染性ニパウイルスを作出することに世界で初めて成功した。平成18年度には、前年度までに確立したリバースジェネティクス系を用いてEGFP発現ニパウイルスを作出することに成功し、各種細胞への感染性の有無を調べた。その結果、ニパウイルスのリセプターの発現とウイルス増殖の有無が一致しない細胞があることを見いだした。さらに、ウイルスのインターフェロン耐性などへの関与が考えられている、アクセサリー蛋白の機能を解析するため、V,C,Wそれぞれを欠損させたウイルスの作出にも成功した。これら組換えウイルスの性状については、現在解析を行なっている。さらに、ニパウイルスのN,P,M,Lの構造蛋白について大腸菌発現系を作製した。各蛋白にはGSTタグを付加し、このタグを利用して大腸菌のlysateから目的の蛋白を回収精製した。精製した蛋白をウサギに免疫してポリクローナル抗体を作製した。これら抗体は、各蛋白の細胞内動態解析の基礎研究、また感染動物からの抗原の検出やサンドイッチ法での抗体診断等にも役立てられる。本研究成果により、組換えニパウイルスの作製が可能になり、ウイルス学的基礎研究、ワクチン開発などへの応用が期待される。本研究の目的はニパウイルスめreverse genetics系を作製し、これをウイルス学的基礎研究およびワクチン開発などの応用研究に有用なツールとして確立することである。平成17年度は、ニパウイルス感染細胞から抽出したRNAを用い、RT-PCR法により6つのウイルス構造遺伝子とリーダーおよびトレーラー領域をそれぞれ増幅したのちプラスミドに組み込んだ。この際、のちに各遺伝子の組換えを容易に行なえるようにするため、各遺伝子間に人為的に制限酵素認識配列を導入した。これらを用いて最終的にウイルスゲノム全長(約19kb)を組み込んだプラスミドを作製した。また、ウイルスレスキューに必要なN、P、L蛋白を発現するためのプラスミドを作製した。これにより今後組換えニパウイルスの作製が可能になり、ウイルス学的基礎研究、ワクチン開発などへの応用が期待される。さらに、ニパウイルスの6つの構造蛋白について大腸菌発現系を作製した。
難分解性芳香族有機塩素化合物の高温加水分解挙動の解明

有害な芳香族有機塩素化合物をクローズド処理する方法として水熱分解法が注目されており、その反応性に関する知見が重要となっている。しかし、不活性条件下で高温水中における有機物の分解反応について検討した報告はほとんどない。本研究では、温度調節器付恒温装置を内蔵させた紫外-可視分光光度計内に石英を窓材料に用いたSUS316製高温高圧セルを入れ高温水の紫外吸収スペクトルをその場測定できる装置を新規に作成し、不活性雰囲気下での高温水中における芳香族化合物の紫外吸収スペクトルを測定しその反応挙動について検討した。また、耐圧ビン中で同様の条件下で反応を行い、反応挙動について比較した。本年度は3-クロロフェノールの加水分解生成物と考えられているレゾルシノール(1,3-ジヒドロキシベンゼン)の高温アルカリ水溶液における分解挙動について検討した。温度100-150°C,水酸化ナトリウム濃度0.050.5M、レゾルシノール濃度100250μMの条件下において、温度が高く、アルカリ濃度が濃いほど、レゾルシノールの分解率は増加したが、分解率は3時間で最大でも13%程度であった。同様の条件で、耐圧ビン中で反応を行った場合、レゾルシノールの分解率は温度が高いほど増加したが、アルカリ濃度が0.5Mになると逆に分解率は減少し、反応時間の経過と共に溶液の色は茶褐色となり、白色沈殿が生成した。これらの結果より、耐圧ビン中では溶液中の微量の溶存酸素により酸素酸化反応がおこり、ベンゾキノン等の生成と2量体化による沈殿生成がおきたと考えられる。また、反応溶液の固相抽出液のGC-MS測定からベンゼンと、4-ヒドロキ-4-メチル-2-ペンタノンの生成が確認された。高温アルカリ水溶液中におけるレゾルシノールの反応は微量の溶存酸素に大きく影響されることがわかった。ここでは、高温高圧セルを用いて高温水溶液におけるクロロフェノールのUV-vis吸収スペクトルをその場測定し、高温水溶液中におけるクロロフェノールの解離反応のpH依存性について検討した。温度調節器付恒温装置を内蔵させた紫外-可視分光光度計(日本分光V-570)内に直径15mm、厚さ10mmの石英を窓材料に用いたSUS316製高温高圧セルを入れ吸光度を測定した。クロロフェノールは弱酸であり、水溶液中で酸解離し、(Ph-OH=Ph-O-+H+)する。フェノール基のプロトンが未解離の場合(Ph-OH)215,275nmに、解離した場合(Ph-O-)に238,293nmに吸収のピークをもつ。そこで各温度におけるpH5.9,12.4におけるスペクトルをPh-OH,Ph-O-型のスペクトルとしてその中間のpHにおける吸収スペクトルを2つの合成スペクトルとみなし、分解スペクトルをもとめPh-OH/Ph-O-の吸光度比により各温度における解離定数を計算した。温度が上昇するとPh-OH/Ph-O-の吸光度は低下し、解離定数が小さくなり、酸解離反応のエンタルピーが負であることがわかった。また、水の解離定数を考慮にいれたクロロフェノールの酸解離定数のアレニウスプロットはよい直線性を示した。