hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
駿河湾深層水利用に関する低次生物生産構造の解明と有機物の特性把握

1.閉鎖系の培養実験による化学的因子と生物的因子の相互把握表層水、397m、687mの深層水各60lを滅菌済みのポリカーボネイトボトルに採取し、屋外に設置した水槽で培養を行った。水温は約25°C、光量は自然光の約10%とした。サンプリングは1日おきに11日間行い、1回おきに対照として同条件で遮光したサンプル(397m,687m)についてもサンプリングを行った。栄養塩、POC/N、DOC/N、植物および動物プランクトンの種組成、バクテリア、シアノバクテリアおよびnano-flagellate数、クロロフィル-aおよびカロテノイド類、基礎生産量を測定した。POC(粒子状有機炭素)の初期濃度は表層水、397m,687mでそれぞれ177,31,33μgC/lであった。表層水ではPOCは2日目に419μgC/lと最大になったのに対し397m、687mではそれぞれ1877μgC/l(9日目)3186μgC/l(11日目)となった。植物プランクトンの存在量は、表層では初日2.3×10^4から最大5.1×10^5となり、深層水では初日に20-150cells/lであったのが、2.7×10^6cells/l(397m)、6.6×10^6cells/l(687m)まで増加した。深層水中の優先種は、Thalassiosira sp(f.minima)Chaetoceros costatum, Skeletonema costatumであり、サイズは15μmがほとんどであった。バクテリアやnano-flagellateは79日目に顕著な増加傾向を示した。2.駿河湾深層水の有機物特性の把握POMの組成は深層水ではたんぱく質が40%、核酸が5%、脂質は23%、炭水化物は13%、未知同定が19%である。DOMの組成は深層水でアミノ酸は5%以下、炭水化物は10%、脂質は8%で、残りの80%近くは未同定である。植物ブランクトンによる基礎生産量として駿河湾では14μgCl^<-1>day^<-1>(Dec.2001)から132μgCl^<-1>day^<-1>(July,2001)の範囲にある。駿河湾深層水の蛍光スペクトルを測淀したところ標準品である「腐植物質」と極めて類似のスペクトルが得られた。酢酸エチルで抽出された化合物の^1H-NMRの解析から、グリセリドが主成分であることを明らかにした。駿河湾深層水の利用に関する基礎研究では、「味覚と鮮度」「基礎生物生産:光合成促進」「生態系利用による二酸化炭素の環境対策」が重要な課題と考えられる。これら三つの課題は、すべて海水中の有機物の特性と生物生産。分解過程と深く関係している。本年度の研究では駿河湾海水中の栄養塩,有機物濃度、プランクトンの種組成、微生物分布,有機物の分解速度、組成等について研究を行った。(1)海水中の粒子態および溶存態有機炭素の鉛直分布:海水中の有機物の変動を量的に示す最っと良い指標は有機炭素・窒素濃度である。溶存有機炭素の同じ観測点での昼(1)、夜(2)、朝(3)の3回の分布の変動を季節による違いを観測した。10月の表層のDOC濃度は一昼夜で60μmolC/Lから110μmolC/Lと2倍近く変動している。特に夜間に高く、朝には減少している。200m以深ではほぼ同程度の有機炭素が存在している。その濃度は4050μmolC/Lで、これを有機物の28%が炭素だとして、有機物の量に換算すると、深層水には1.72.1mg/Lの有機物が含まれている。粒子態炭素濃度は深層においては5μmolC/Lであり、有機物量に換算すると0.2mg/L存在している。さらに、限外ろ過膜装置(Millpore proxM-25と多孔質ガラス膜の異なる二つの方法)とマイクロアシライザー(旭化成)を用いて有機物の濃縮について検討した。その結果深層水中の有機炭素の3060%程度が脱塩水中に濃縮された。(2)深層水の有機物組成と微生物数について:有機物の特性では、粒子態有機物の組成は深層水ではたんぱく質が40%、核酸が5%、脂質は23%、炭水化物は13%、未知同定が19%である。溶存有機物の組成は深層水でアミノ酸は5%以下、炭水化物は10%、脂質は.8%で、残りの80%近くは未同定である。この未同定の有機物のうち50%程度は腐植酸と考えられるが、腐植酸は特定の化合物ではないため、より詳細な同定が必要である。微生物の数は表層で1mlの海水中に20万細菌数、深層水で1万前後から数千程度である。深層の細菌は表層の水温で有機物を加えて分解実験を行うと、有機物の量に対応して増加する。

サンプリングは1日おきに11日間行い、1回おきに対照として同条件で遮光したサンプル(397m,687m)についてもサンプリングを行った。栄養塩、POC/N、DOC/N、植物および動物プランクトンの種組成、バクテリア、シアノバクテリアおよびnano-flagellate数、クロロフィル-aおよびカロテノイド類、基礎生産量を測定した。POC(粒子状有機炭素)の初期濃度は表層水、397m,687mでそれぞれ177,31,33μgC/lであった。表層水ではPOCは2日目に419μgC/lと最大になったのに対し397m、687mではそれぞれ1877μgC/l(9日目)3186μgC/l(11日目)となった。植物プランクトンの存在量は、表層では初日2.3×10^4から最大5.1×10^5となり、深層水では初日に20-150cells/lであったのが、2.7×10^6cells/l(397m)、6.6×10^6cells/l(687m)まで増加した。深層水中の優先種は、Thalassiosira sp(f.minima)Chaetoceros costatum, Skeletonema costatumであり、サイズは15μmがほとんどであった。バクテリアやnano-flagellateは79日目に顕著な増加傾向を示した。2.駿河湾深層水の有機物特性の把握POMの組成は深層水ではたんぱく質が40%、核酸が5%、脂質は23%、炭水化物は13%、未知同定が19%である。DOMの組成は深層水でアミノ酸は5%以下、炭水化物は10%、脂質は8%で、残りの80%近くは未同定である。植物ブランクトンによる基礎生産量として駿河湾では14μgCl^<-1>day^<-1>(Dec.2001)から132μgCl^<-1>day^<-1>(July,2001)の範囲にある。駿河湾深層水の蛍光スペクトルを測淀したところ標準品である「腐植物質」と極めて類似のスペクトルが得られた。酢酸エチルで抽出された化合物の^1H-NMRの解析から、グリセリドが主成分であることを明らかにした。駿河湾深層水の利用に関する基礎研究では、「基礎生物生産:光合成促進」「生産有機物の有効利用」が重要な課題と考えられる。これら二つの課題は、すべて海水中の有機物の特性と生物生産。分解過程と深く関係している。本年度の研究では駿河湾海水中の栄養塩,有機物濃度、プランクトンの種組成、微生物分布、有機物の分解速度、組成および駿河湾深層水の年令等について研究を行った。(1)海水中の粒子態および溶存態有機炭素の鉛直分布:海水中の有機物の変動を量的に示す最っと良い指標は有機炭素・窒素濃度である。溶存有機炭素の同じ観測点での昼(1)、夜(2)、朝(3)の3回の分布の変動を4月、7月、9月、11月、2月の季節による違いを観測した。11月の表層のDOC濃度は一昼夜で60μmolC/Lから110μmolC/Lと2倍近く変動している。特に夜間に高く、朝には減少している。200m以深ではほぼ同程度の有機炭素が存在している。(2)深層水の有機物組成と微生物数について:有機物の特性では、粒子態有機物の組成は深層水ではたんぱく質が40%、核酸が5%、脂質は23%、炭水化物は13%、未知同定が19%である。溶存有機物の組成は深層水でアミノ酸は5%以下、炭水化物は10%、脂質は.8%で、残りの80%近くは未同定である。この未同定の有機物のうち50%程度は腐植酸と考えられる。この腐植酸の画分をXAD-8を用いて海水から濃縮し、アミノ酸組成を測定した。グルタミン酸の割合が海水中の全アミノ酸の割合に比べて2倍近く高い。
GPIアンカータンパク質によるシグナル伝達におけるスフィンゴ糖脂質の役割

申請者は神経系におけるガングリオシドの機能の解明を目的として、抗ガングリオシド抗体で免疫沈降する際に共沈してくる蛋白質の同定を試みた。ラット脳TritonX-100遠心上清の抗ガングリオシドGD3抗体による免疫沈降物に[γ-^<32>P]ATPを加えたところ、分子量53,56kDaの蛋白質の特異的なチロシンリン酸化が検出された。ペプチドマッピングおよび免疫沈降実験から、srcファミリーチロシンキナーゼLynであることがわかった。CHO細胞(ガングリオシドとしてGM3のみ発現、GM3はGD3合成酵素の基質)にガングリオシドGD3合成酵素遺伝子およびLyn遺伝子のcDNAを共発現させたところ、抗GD3抗体でLyn活性が共沈し、抗Lyn抗体でガングリオシドGD3が共沈した。抗GD3抗体はラット小脳初代培養ニューロンにおいてLynを活性化し、一過性のチロシンリン酸化を引き起こした。さらにショ糖密度勾配遠心で、ラット小脳LynおよびCHO細胞に発現させたLynはスフィンゴ脂質マイクロドメイン画分に回収された。CHO細胞にGD3合成酵素cDNAを発現させたところ、抗GD3抗体でカベオリン(マイクロドメインマーカー蛋白質)が共沈した。以上の結果から、ガングリオシドGD3はラット脳膜上のスフィンゴ脂質マイクロドメインにおいてLynと結合しており、その活性を制御している可能性が考えられる。
都市の地形と熱環境に注目した都市環境評価に関する研究

研究対象地域を、長崎市を中心とする長崎県南部地域に選定した。この地域における地形および土地利用状況が風系、気温などの局地気象に与える影響を評価するために、まず、標高データの数値地図や長崎県の資料を用いて、この地域の地形図や土地利用状況図を作成した。そして、この地域の数カ所に、風向・風速計や温度センサーを設置して、風向、風速、気温、地温、地中温度などの自記観測を行った。また、地表面の被覆状況により、日射による地表面温度が大きく異なるために、放射収支計を用いて、アスファルト舗装面、芝地、裸地などで、放射収支量を測定した。これらのデータをもとに、風配図、風速スカラー図、風速ベクトル図、風速のホドグラフ、日楕円、気温、地温、地中温度の経時変化図、等温線図、放射量の経時変化図などを作成した。そして複雑な海岸線や急峻な山地を有する地形や土地利用状況が風系や気温および地温に与える影響を評価した。さらに、風系と気温および地温の関係を明確にするために、運動量保存則、質量保存則、熱輸送方程式を用いて、3次元数値モデルを構築し、コンピュータによる数値計算を行い、実測値と比較・検討した。これらの結果は、気象利用研究会、農業気象学会九州支部大会、土木学会西部支部研究発表会などで、講演発表を行った。
アルツハイマーAβペプチドの新規自己開裂・閉環現象の解明と応用

アルツハイマー病は凝集性の高いβアミロイドペプチドが、脳内で長い時間をかけて凝集・沈着することが原因で引き起こされると考えられている。我々はこのペプチド断片が非酵素的に自己開裂および自己閉環することを見出した。まず、自己開裂と閉環がどのようなメカニズムでおこるのか、βアミロイドペプチドの610番目のアミノ酸配列HDSGYをもとにアミノ酸を置換した様々なペプチドを製作して調べた。自己開裂は末端の2残基のアミノ酸がジケトピペラジンを形成して、開裂することを、質量分析およびプロトンNMRにより確認した。HASGY、ADSGY、HdDSGY、HNSGYのペプチドではHDSGYとほぼ同じ速度で自己開裂がおこるものの、HDAGYおよびHisoDSGYでは全く起こらなかった。これらから、自己開裂はN末端のアミノ基と,3残基目のSerのOH基が相互作用でおこり、サクシイミドの形成を必要としないことが明らかになった。また、自己閉環は末端の2つのアミノ酸がジケトピペラジン構造をとっていることを明らかにした。HNSGY》HisoDSGY》HDAGY、ADSGY、HdDSGY》HASGYの順でおこることから、自己閉環には2残基目のAspが必須であり、サクシイミド形成が自己閉環を促進することが明らかになった。次に、自己開裂と閉環現象が生体内でもおこりえるのか確認した。ラット海馬初代培養神経細胞またはマウス不死化視床下部神経細胞の培養液にβアミロイドペプチド断片を静置した結果、βアミロイドペプチドの6残基目のHisの露出が起こることを確認した。このHisの露出が自己開裂・閉環に必須であり、この切断を細胞レベルで確認した。閉環型βアミロイドペプチド断片をコンビケム固相合成装置で大量に合成し、それに対する抗体の製作を試みたが特異性が確認できなかった。本研究の目的は、この自己開裂・閉環がどのような意味をもつのか解明することにある。まず、試験管内で観察されたこれら現象が生体内でも起こりえるのか検討した。自己開裂・閉環はβアミロイドペプチドの6番目のアミノ酸であるヒスチジンの露出が発端となり引き起こされる化学的現象である。ラット海馬初代培養神経細胞またはマウス不死化視床下部神経細胞の培養液にβアミロイドペプチド断片を静置し、ヒスチジンの露出が起こることを確認した。他の部位でも切断が見られヒスチジンの露出に関わる切断が顕著というわけではないが、本結果により自己開裂・閉環を起こすために必須の現象が細胞レベルで確認された。閉環型βアミロイドペプチド断片をコンビケム固相合成装置で大量に合成し、それに対する抗体の製作に着手した。6番目のヒスチジンと7番目のアスパラギン酸がジケトピペラチン構造をもつペプチド断片を、アリル基で保護されたアスパラギン酸を用い固相上で製作したが、合成収率がとても低かった。そこで7番目をイソアスパラギン酸で合成したβアミロイドペプチド断片を製作し、試験管内で自己閉環を起こし分離精製する方法で製作した。その結果、数十mgの閉環型βアミロイドペプチド断片を得ることができた。現在ウサギを用いて抗体を製作中であり、アルツハイマー病の有益な診断ツールとなり得ると期待する。
反応余剰エネルギー分布の定量測定による溶液内光反応メカニズムの解明

反応余剰エネルギーの緩和は、液相中での化学反応を理解するうえで非常に重要な過程である。ミオグロビンヘムの面内振動や面外振動について、アンチストークスバンドの強度減衰を測定し、各モードの振動エネルギー緩和速度を求めた。それらの値を比較し、ヘムの振動緩和過程について議論した。(1)振動モード間相互作用面内振動について、v_5モードの時定数は他の面内振動モードの値に比べて3倍程度大きかった。v_3、v_4、v_6、v_7モードはいずれもポルフィリン環のπ共役系構成原子の変位を伴う振動であり、互いに非調和性結合が大きいと考えられる。これに対して、v_5モードはピロール環の炭素原子と側鎖の炭素原子との間の伸縮振動であるため、他の面内振動モードとの間の非調和性結合が比較的小さいと予想され、上述のずれを生む原因と考えられる。また、低波数側に観測された2つの面外振動[v(Fe-His)およびγ_7モード]はいずれも面内振動モードの値に比べ小さな時定数を示した。これは面内振動と面外振動との間の非調和性結合が小さいことに由来すると考えられる。(2)プロピオン酸基の効果冷却過程における、ヘムのプロピオン酸基の効果を調べるために、プロピオン酸基を持たないヘムを含む再構成ミオグロビンを調製した。この系について得られたアンチストークスバンド強度減衰の時定数を、天然ミオグロビンのものと比較したところ、両者の時定数に大きな違いはみられなかった。このことは、ヘムの振動緩和過程においてプロピオン酸基が重要なチャンネルになっているという他の研究結果を支持しない。プロピオン酸の有無に関わらず、ヘムの振動冷却の速度がほとんど変わらないということは、ヘムが受け取った余剰エネルギーが、プロピオン酸基を通じてヘムから直接水に伝わっているのではなく、タンパク質を経由して水に伝わっていることを強く示唆する。本年度は、時間分解測定から過渡的な振動温度をモードごとに求めるための基礎データの取得を行った。以下のふたつの方法によって散乱断面積を評価し、ラマン散乱強度比と振動温度を関係付けられるようにした。1.高温測定試料温度を室温から約700Kまでの任意の温度に制御できる高温試料セルホルダーを製作した。これを用いて、高温平衡状態(統計的エネルギー分布)におけるアンチストークス/ストークス散乱強度比の温度依存性を詳しく調べた。ニッケルオクタエチルポルフィリン、テトラフェニルポルフィリンについて、それぞれ11本、8本のラマンバンドの温度依存性を明らかにした。ポルフィリン側鎖に関係する振動バンドについて、温度依存性に転移点がみられた。これは、側鎖の配向が異なるコンフォーマーへの構造変化によるものだと考えられる。2,励起プロファイル測定本研究課題において購入したレーザーおよび現有のレーザーを用いて、ニッケルオクタエチルポルフィリン、テトラフェニルポルフィリンの各振動バンドについて励起プロファイルを精密測定した。得られた励起プロファイルを解析し、アンチストークス/ストークス散乱断面積比を求めた。ふたつの方法から求められたアンチストークス/ストークス散乱断面積比は、ほとんどの振動バンドについて実験誤差範囲内で一致しており、これは解析の妥当性を示している。しかし、一部の振動バンドについて、ふたつの方法から求められたアンチストークス/ストークス散乱断面積比にずれがあり、現在その原因を究明している。初期の振動励起状態およびそこからの分子内、分子間緩和過程を調べるにはアンチストークスラマン線強度が直接的なプローブとなる。

一酸化炭素結合形ミオグロビンの光解離反応では、解離直後に振動励起されたヘムが生じる。われわれは一酸化炭素結合形ミオグロビンの光解離状態について、面内振動や面外振動の各モードの振動エネルギー緩和速度を求めた。デオキシ形の紫外・可視吸収スペクトル、ラマン励起プロファイルを解析し、振動励起温度を求めた。面内振動モードと面外振動モードとの間で、振動温度に大きな違いが見られた。これは面内振動と面外振動との間の非調和性結合が小さいことに由来すると考えられる。面内振動モードと面外振動モードとの間には、振動緩和の時定数にも違いが観測されており、今回の結果はこれとも矛盾しない。ミオグロビンでは、ヘムのプロピオン酸基が溶媒に露出しており、これがヘムから水への振動エネルギー緩和の経路になっているという分子動力学計算の結果が報告された。そこで、プロピオン酸基を欠くヘムをミオグロビンに再構成し、ヘムの振動緩和を調べた。天然ミオグロビンと再構成ミオグロビンとでは、振動緩和の時定数に有意な差は見られなかった。したがって、プロピオン酸基が振動緩和の経路になっているという計算結果は再検討を要することが明らかになった。
MRIにおける体動アーチファクト除去システム

腹部のように呼吸によって拡大縮小する部位のMRIエコー信号が振幅と位相変動を受ける式をすでに導き,呼吸アーチファクト除去手法の開発に道を開いた.この式を基本として開発済みである一部未知パラメータの推定手法を組み合わせると2次元平面内の拡大縮小運動によるアーチファクト除去に関してはおおよその目処が立った.これに加えて実用上の課題は3次元的な体動によるアーチファクトの除去であり,これについても理論的なシミュレーションによる実験は成功している.すなわち,対象の3次元運動を補正するためには,スピンエコー法で多断面(3次元)画像を同時に撮影しておく.これらに対し,我々は開発した撮像断面内の回転を含む剛体運動に対するアーチファクト補正アルゴリズム(IEEE Trans.Med.Imag.vol.15,p.768,1996)を3次元に拡張し(JAMIT Frontier'97,p.35),実際に適用して効果を検証した.この際,動きはinter-viewのみで生じるとの仮定を行う.マルチスライス画像間は双線形補間を行う.また,計算誤差を減少させるため,重ね合わせアルゴリスムを用いた.動きパラメータを推定するため,動きがあるとROI領域外では画像エネルギーが増大するという最小エネルギー手法を用いた.結果として,view間で体の不意の動きが複数回起こったとしても,それらは各2次元スライスのk空間のデータの振幅と位相に対してどのように影響を与えるかの解析的表現が得られているので補正可能である.動きパラメータ推定に関し,提案手法では,従来法のように特別の位相変調ナビゲ-タエコーを使うのではなく,位相変調画像そのものを使う方式である.したがって,特別の撮像法を用いるのではなく,通常のスピンエコー法において,動きによるアーチファクトが起こった後,後処理によってそれを補正できる点が本研究の大きな特長である本年度において修復の対象とする動きは,撮像断面内の任意平行運動と,任意の点を中心とするステップ状回転である.撮像断面内の剛体的並行移動によるアーチファクト除去に関しては,まず周波数軸方向についてエコー信号のフーリエ変換から移動量が分かるので,それを補正後,位相検索アルゴリズムを適用すればよいことがわかった.これを基に,撮像断面内の回転が入ってきたときには,(1)復元画像の領域外エネルギーを最小化するような対象物回転時刻と回転角度を求める.(2)それに基に,ライン毎のフーリエ変換の重ね合わせにより,画像復元を行う.この回転補正時,各フーリエ変換像は双一次面により補間を行う.(3)重ね合わせ像に対して位相検索アルゴリズムを適用し,回転中止の位置による位相補正を行う.この手法により,画像平面内の回転によるアーチファクトは実MRIにおいても除去可能であることが確かめられた.一方,呼吸に伴う腹部等の拡大縮小運動に対しては,x方向とy方向の拡大率に比例関係がある線形運動の場合,非均一標本化と位相変動を受けることがわかった.この補正に関しては実験中である.本年度は前年度までの(1)画像平面内平行運動(IEEE TMI,1995)を発展させ,(2)画像平面内回転運動(MIT 1996),(3)画像平面内剛体運動(IEEE TMI,1996),(4)画像平面内呼吸運動(MIT 1997)について体動によるMRIアーチファクトを除去する方式およびプログラムの開発を行った.(1)-(3)については,臨床的な環境でその可能性を確認済みである.3次元剛体運動は頭部等でしばしば起こり,臨床的に重要である.これについては今のところ他では誰も成功していない.そこで我々は,上記2次元アーチファクト除去プログラムの開発経験をもとに,それを拡張して3次元剛体運動がある場合の問題に取り組んできた.そこで(5)以下のような方式(JAMIT Frontier'97,p.35)を開発した.スピンエコー法で多断面(3次元)画像を同時に撮影しておく.これらに対し,前記撮像断面内の回転を含む剛体運動に対するアーチファクト補正アルゴリズムを3次元に拡張したアルゴリズムを適用する.具体的には:(i)まず,MRIデータのスライス選択軸方向の1次元フーリエ変換を計算する.(ii)すでに導いた位相変動式を用いて3次元変位パラメータ推定値に対する位相変動を計算し,実MRIデータとの誤差が少なくなるように3次元変位パラメータ推定値を修正する.(iii)(ii)で位相修正されたデータをスライス選択軸方向に1次元フーリエ逆変換を行う.(iv)撮像断面内の剛体的並行移動の時刻と,エコー信号のフーリエ変換,すなわち周波数軸方向の移動より求める.現在,実MRIデータの収集を従来の阪大病院放射線科の臨床用MRIのみでなく,機械技研の動物実験用MRIも加えて始めている.なお,前記画像断面内の回転を含む剛体運動に対するアーチファクト補正アルゴリズムは海外より移植希望がいくつかきており,インターネットを通して順次提供しつつある.これを利用して,その適用報告を集め,上記の3次元剛体運動アーチファクト補正アルゴリズムに反映させることを考えている.腹部のように呼吸によって拡大縮小する部位のMRIエコー信号が振幅と位相変動を受ける式をすでに導き,呼吸アーチファクト除去手法の開発に道を開いた.この式を基本として開発済みである一部未知パラメータの推定手法を組み合わせると2次元平面内の拡大縮小運動によるアーチファクト除去に関してはおおよその目処が立った.

これに加えて実用上の課題は3次元的な体動によるアーチファクトの除去であり,これについても理論的なシミュレーションによる実験は成功している.すなわち,対象の3次元運動を補正するためには,スピンエコー法で多断面(3次元)画像を同時に撮影しておく.これらに対し,我々は開発した撮像断面内の回転を含む剛体運動に対するアーチファクト補正アルゴリズム(IEEE Trans.Med.Imag.vol.15,p.768,1996)を3次元に拡張し(JAMIT Frontier'97,p.35),実際に適用して効果を検証した.この際,動きはinter-viewのみで生じるとの仮定を行う.マルチスライス画像間は双線形補間を行う.また,計算誤差を減少させるため,重ね合わせアルゴリスムを用いた.動きパラメータを推定するため,動きがあるとROI領域外では画像エネルギーが増大するという最小エネルギー手法を用いた.結果として,view間で体の不意の動きが複数回起こったとしても,それらは各2次元スライスのk空間のデータの振幅と位相に対してどのように影響を与えるかの解析的表現が得られているので補正可能である.動きパラメータ推定に関し,提案手法では,従来法のように特別の位相変調ナビゲ-タエコーを使うのではなく,位相変調画像そのものを使う方式である.したがって,特別の撮像法を用いるのではなく,通常のスピンエコー法において,動きによるアーチファクトが起こった後,後処理によってそれを補正できる点が本研究の大きな特長である
肝実質細胞由来の過酸化水素による虚血性類洞内皮細胞アポトーシスの機序解明と対策

我々はこれまで虚血性肝障害の機序解明とその対策について研究を進めてきた.今回の科学研究費補助研究は,類洞内皮細胞破綻から進行する虚血性肝障害の機序解明とアポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2を用いた肝保護の可能性(Bcl-2の細胞内局在)について行われ,以下の結果を得た.1.遷延する肝虚血によって生ずる肝障害は、肝実質細胞がmidzoneを中心に過酸化水素を産生することから始まり,過酸化水素は類洞内皮細胞を特異的にアポトーシスに導く.2.過酸化水素産生は特異的キサンチンオキシダーゼ阻害剤である(-)BOF4272前処置により抑制されたことより,過酸化水素産生はキサンチンオキシダーゼ由来であることが証明された.3.類洞内皮細胞の破綻した領域より末梢の領域では肝虚血が進行し,肝障害が進行してゆく.4.アポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2はこれまでラット肝組織にはほとんど存在しないといわれていたが,ラット肝細胞での発現をはじめて証明した.5.Bcl-2の細胞内分布を明らかにした.Bcl-2はミトコンドリア,小胞体,核に存在した.6.Bcl-2はこれまでミトコンドリア外膜に存在し,ミトコンドリアの膜電位を維持することによってアポトーシスを抑御するとされていたが,Bcl-2はむしろミトコンドリア内膜に多く存在した.以上の結果から虚血性肝障害の抑制には類洞内皮細胞保護が重要であり,ミトコンドリアBcl-2を操作することによる肝保護の可能性が示唆された.我々はこれまで虚血性肝障害の機序解明とその対策について研究を進めてきた.今回の科学研究費補助研究は,類洞内皮細胞破綻から進行する虚血性肝障害の機序解明とアポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2を用いた肝保護の可能性(Bcl-2の細胞内局在)について行われ,以下の結果を得た.1.遷延する肝虚血によって生ずる肝障害は、肝実質細胞がmidzoneを中心に過酸化水素を産生することから始まり,過酸化水素は類洞内皮細胞を特異的にアポトーシスに導く.2.過酸化水素産生は特異的キサンチンオキシダーゼ阻害剤である(-)BOF4272前処置により抑制されたことより,過酸化水素産生はキサンチンオキシダーゼ由来であることが証明された.3.類洞内皮細胞の破綻した領域より末梢の領域では肝虚血が進行し,肝障害が進行してゆく.4.アポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2はこれまでラット肝組織にはほとんど存在しないといわれていたが,ラット肝細胞での発現をはじめて証明した.5.Bcl-2の細胞内分布を明らかにした.Bcl-2はミトコンドリア,小胞体,核に存在した.6.Bcl-2はこれまでミトコンドリア外膜に存在し,ミトコンドリアの膜電位を維持することによってアポトーシスを抑御するとされていたが,Bcl-2はむしろミトコンドリア内膜に多く存在した.以上の結果から虚血性肝障害の抑制には類洞内皮細胞保護が重要であり,ミトコンドリアBcl-2を操作することによる肝保護の可能性が示唆された.【目的】癌遺伝子Bcl-2はアポトーシス抑制遺伝子であり,抗酸化剤として酸素ストレスによって生じるアポトーシスを抑制する.我々は肝虚血時に起こる肝実質細胞に由来する活性酸素による選択的類洞内皮細胞のアポトーシスに,Bcl-2の細胞内分布の変化が関与しているとの仮説をたてており,この仮説を証明し,類洞内皮細胞のアポトーシスの抑止策を検討することを目的とした.【方法】(1)虚血肝における肝構成細胞内のBcl-2分布の変化に関する研究(1)ラット肝虚血モデルでDCFH-DAを負荷し,生体蛍光顕微鏡にてH2O2産生量を測定する.(2)肝組織パラフィン切片を用い,Apop Tag in situ detection kitにてアポトーシス細胞を同定する.(3)肝組織をコラゲナーゼで灌流しエルトリエーターで肝細胞と類洞内皮細胞に分離し,Bcl-2蛋白量をwestern blotで,m-RNAをnorthen blotで解析する.(4)肝組織の凍結超薄切片を作成し,免疫電顕法でBcl-2蛋白の細胞内での動きを観察する.(5)特異的キサンチンオキシダーゼ阻害剤であるBOF4272を前投与したラットを用い同様の実験を行う.BOF4272前処置マウス,Bcl-2 transfectionマウスを用いて肝虚血再灌流実験を行い,肝障害,肝細胞,類洞内皮細胞のアポトーシスの有無,Bcl-2蛋白,m-RNAについて検討する.【結果,今後の予定】研究(1)により肝虚血時のアポトーシスが生じている類洞内皮細胞においてBcl-2蛋白量の低下をまた細胞内でのBcl-2蛋白の偏在を免疫電顕法にて確認した.今後は研究(2)によりBcl-2 transfectionなどによるBcl-2の制御が類洞内皮細胞のアポトーシスを抑止うるかを検討する.我々はこれまで虚血性肝障害の機序解明とその対策について研究を進めてきた.

今回の科学研究費補助研究は,類洞内皮細胞破綻から進行する虚血性肝障害の機序解明とアポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2を用いた肝保護の可能性(Bcl-2の細胞内局在)について行われ、以下の結果を得た.1.遷延する肝虚血によって生ずる肝障害は、肝実質細胞がmidzoneを中心に過酸化水素を産生することから始まり,過酸化水素は類洞内皮細胞を特異的にアポトーシスに導く.2.過酸化水素産生は特異的キサンチンオキシダーゼ阻害剤である(-)BOF4272前処理により抑制されたことより,過酸化水素産生はキサンチンオキシダーゼ由来であることが証明された。3.類洞内皮細胞の破綻した領域より末梢の領域では肝虚血が進行し、肝障害が進行してゆく。4.アポトーシス抑制遺伝子であるBcl-2はこれまでラット肝組織にはほとんど存在しないといわれていたが,ラット肝細胞での発現をはじめて証明した.5.Bcl-2の細胞内分布を明らかにした.Bcl-2はミトコンドリア,小胞体,核に存在した.6.Bcl-2はこれまでミトコンドリア外膜に存在し,ミトコンドリアの膜電位を維持することによってアポトーシスを抑制するとされていたが,Bcl-2はむしろミトコンドリア内膜に多く存在した.以上の結果から虚血性肝障害の抑制には類洞内皮細胞保護が重要であり,ミトコンドリアBcl-2を操作することによる肝保護の可能性が示唆された.
内視鏡下甲状腺悪性腫瘍手術における根治性・安全性の向上に関する研究

2009年、我々は吊り上げ式では世界初となる経口アプローチによる内視鏡下甲状腺切除術(TOVANS:H23年度挑戦的萌芽研究)を開発したが、この研究から得られた最大の収穫は、頭側→尾側アプローチによる操作が内視鏡下の気管周囲郭清において非常に有用であるという事実であった。その後、2方向アプローチによる内視鏡下甲状腺悪性腫瘍手術(BAVANS:H25年度基盤C)を開発し、これまでの内視鏡手術では不可能であった内視鏡下の気管周囲完全郭清を可能にした。本研究では、次なるステップとして視野可変式硬性内視鏡を使用した多方向アプローチ法を開発し、安全性と根治性を飛躍的に向上させ、いよいよ内視鏡下の頸部外側区域完全郭清を行うための専用器具の開発を行う。上記先行2研究で可能となった気管周囲完全郭清に加え、内視鏡下頸部外側区域完全郭清を多くの外科医が簡便かつ安全に施行可能な発展型の術式を確立する。発展型である多方向アプローチによる内視鏡下甲状腺悪性腫瘍手術は、これまで早期癌だけであった本術式の適応を、外側区域郭清を必要とする進行癌まで劇的に広げられる非常に有望な術式であり、術式の確立後は、世界的に普及する可能性が高い。平成30年度以降の計画は、下記の通りであり、順調に進行している。1前年度の平成29年度に試作した専用器具のさらなるBrush up 2術式の最終型の確立と論文発表3国際学会での発表平成30年度以降の計画は、下記の通りであり、研究計画は順調に施行している。1前年度の平成29年度に試作した専用器具のさらなるBrush up 2術式の最終型の確立と論文発表3国際学会での発表1については、29年度に試作・試用を行った各器具の微調整を行った。まず、鋼線筋鉤の改良が進み最終型が完成、いよいよ市販化へ大きく前進し、2019年度には市販化のめどが立つと思われる(当該特許あり)。さらに新規開発した上極剥離鉤については市販化が決定した。2については、上記器具を効果的に用いた本術式の最終型がほぼ確立し、英文医学雑誌(2編)に投稿した。3については、国内学会では発表を行った。本年度中の国際学会発表は行わなかったが、論文投稿を行っているため、次年度の2019年の国際学会での報告を行う予定とした。上記の如く、特殊器具の開発は市販化が決定しており、最終段階にはいった。次年度は、2つの器具の市販が行われる予定であり、それを用いた本術式のひとつの完成形が確立される。今後も、論文投稿、学会発表を行い、当該研究をまとめる予定である。先行する2つの研究(H23年度挑戦的萌芽研究、H25年度基盤C)で甲状腺悪性腫瘍に対する新しい術式を開発し、これまでの内視鏡手術では不可能であった内視鏡下の気管周囲完全郭清を可能にしたが、本研究では、次なるステップとして2方向アプローチによる気管周囲郭清を改良・発展させて安全性と根治性を飛躍的に向上させることと、いよいよ内視鏡下の頸部外側区域完全郭清を行うための専用器具の開発を行うことである。平成29年度の研究開発では4つの新しい手術用器具の開発を計画した。1耳介付近から前頸部に到達するための専用アクセスポートの開発2前胸部から下顎付近までの前頚部に至る皮下トンネルの内腔保持・周囲組織保護のための専用リトラクターの開発3すでに開発した視野確保のための分解・着脱式鋼線筋鉤のさらなるBrush up4前胸部創から挿入し、気管周囲の視野展開に用いる特殊鉤の開発1については耳介付近からのアプローチを前顎部からのアプローチに変更し、新しい専用アクセスポートを開発した。2については研究期間中に市販のリトラクターが販売されたため、急遽甲状腺上極剥離に関する専用鉤の開発に切り替えた。3については医工連携を進めて、これまでの弱点を克服し、完成度の高い着脱式鋼線筋鉤のプロトタイプが完成した。4についてもプロトタイプを完成され、現在試用・改良中である。この研究期間中に当該手術の保険適応が決定し、本研究の重要性がさらに高まった平成29年度計画は下記の4つの手術器具のプロトタイプを作製し、実際にそれを試用することであった。1耳介付近から前頸部に到達するための専用アクセスポートの開発:これについては当初の計画では耳介付近からのアプローチを想定していたが、現状では前頸部(下顎)からのアプローチが最適と判断しアクセス部位を変更した。そのため、前頸部からの専用アクセスポートのプロトタイプを作成し、試用している。このポートにより頸部郭清の操作性が劇的に改善した。2前胸部から下顎付近までの前頚部に至る皮下トンネルの内腔保持・周囲組織保護のための専用リトラクターの開発:我々の想定していた専用リトラクターが、研究期間中に日本のメーカーから市販されたため、これを使用している。この分の研究予算については、新たに甲状腺上極を剥離する上極剥離鉤の開発にコンバートしている。3すでに開発した視野確保のための分解・着脱式鋼線筋鉤のBrush up:前研究(口腔内アプローチによるによる新しい内視鏡下甲状腺切除術式に関する研究:H2324年度挑戦的萌芽研究)で開発し、すでに特許を取得した穿刺・着脱式鋼線筋鉤をさらにブラッシュアップし、操作性をかなり向上させた製品を医工連携により本年度に新しく作成した。

これにより、本筋鉤の市販化が現実的となった。4前胸部創から挿入し、気管周囲の視野展開に用いる特殊鉤の開発:現在プロトタイプを作成し、試用している段階で、更なる改良を図っている。2009年、我々は吊り上げ式では世界初となる経口アプローチによる内視鏡下甲状腺切除術(TOVANS:H23年度挑戦的萌芽研究)を開発したが、この研究から得られた最大の収穫は、頭側→尾側アプローチによる操作が内視鏡下の気管周囲郭清において非常に有用であるという事実であった。その後、2方向アプローチによる内視鏡下甲状腺悪性腫瘍手術(BAVANS:H25年度基盤C)を開発し、これまでの内視鏡手術では不可能であった内視鏡下の気管周囲完全郭清を可能にした。本研究では、次なるステップとして視野可変式硬性内視鏡を使用した多方向アプローチ法を開発し、安全性と根治性を飛躍的に向上させ、いよいよ内視鏡下の頸部外側区域完全郭清を行うための専用器具の開発を行う。上記先行2研究で可能となった気管周囲完全郭清に加え、内視鏡下頸部外側区域完全郭清を多くの外科医が簡便かつ安全に施行可能な発展型の術式を確立する。発展型である多方向アプローチによる内視鏡下甲状腺悪性腫瘍手術は、これまで早期癌だけであった本術式の適応を、外側区域郭清を必要とする進行癌まで劇的に広げられる非常に有望な術式であり、術式の確立後は、世界的に普及する可能性が高い。平成30年度以降の計画は、下記の通りであり、順調に進行している。1前年度の平成29年度に試作した専用器具のさらなるBrush up 2術式の最終型の確立と論文発表3国際学会での発表平成30年度以降の計画は、下記の通りであり、研究計画は順調に施行している。1前年度の平成29年度に試作した専用器具のさらなるBrush up 2術式の最終型の確立と論文発表3国際学会での発表1については、29年度に試作・試用を行った各器具の微調整を行った。まず、鋼線筋鉤の改良が進み最終型が完成、いよいよ市販化へ大きく前進し、2019年度には市販化のめどが立つと思われる(当該特許あり)。さらに新規開発した上極剥離鉤については市販化が決定した。2については、上記器具を効果的に用いた本術式の最終型がほぼ確立し、英文医学雑誌(2編)に投稿した。3については、国内学会では発表を行った。本年度中の国際学会発表は行わなかったが、論文投稿を行っているため、次年度の2019年の国際学会での報告を行う予定とした。〇これまでに開発した専用アクセスポート、専用リトラクター、特殊鉤など、各器具の微調整を行う。各々の試用で指摘された問題点を検討し、改良点を指摘する。改良型の作製・試用を重ねることでさらなるBrush upを行い、各々の器具の最終型を確立する。〇術式の最終型の確立と論文発表上記器具を効果的に用いた本術式の最終型を確立し、英文医学雑誌に発表する。現時点で本術式(気管周囲のリンパ節郭清を伴う悪性腫瘍手術)には3時間4時間を要するが、最終的には安全性を格段に高めながら容易な操作で手術時間の短縮を図る。〇国際学会での発表論文発表とともに各種国際学会および国内学会での報告を行う。このような場で世界の内視鏡外科医に批評を受け、意見を出してもらうことで本術式のさらなる改善点を見いだし、悪性腫瘍に対する甲状腺内視鏡手術の標準手術式のひとつとしての地位を確立していく。
断崖絶壁を浮上により全方向に移動可能な,長腕型移動ロボットの開発

本年度の目的は昨年開発したプロペラ反転機構を2個を取り付け,ウィンチにより移動可能な機体の開発である.まず昨年度に開発したプロペラ反転機構を2個取り付けた装置ではカタログ値で小型高出力な航空機ラジコン用として売っているモータを用いていた.しかし航空機ラジコン用モータは小型で高出力ではあるが寿命が極端に短く,数十分の実験で出力が極端に出なくなってしまった.これは航空機ラジコンでは軽量化のために小型のモータしか利用できないため,出力の小さいモータを無理に大電流で駆動しているためであった.そこでモータを汎用の出力の大きいモータに変えて機体を作り直した.荷重実験により1kgの錘を載せても機体は安定して壁面から浮上し,ウィンチを機体に搭載しても十分に浮上できることを確認した.本機は壁面上方から腕のように伸縮するワイヤ2本でV字型に吊り下げて移動する.機体の開発方向として,機体内にウィンチと簡単な検査装置を配置してワイヤ端部を壁面上方に引っ掛けて移動する方法と,壁面上方にウィンチを設置して機体内には作業用のアーム等を配置して壁面で作業する方法とが考えられる.崖等の自然物の調査には前者がふさわしいが,建築物の壁面検査や補修作業では後者の方がふさわしい.実験は身の回りの建築物を利用すること,実際の利用を考えると自然物の調査よりも建物の壁の補修調査の方が頻度利用価値が高いことから.壁面上方に固定するウィンチを2台開発し,V字型に機体をぶら下げて移動する装置を開発し屋外での浮上移動実験を行った.ワイヤが長くなりV字の角度が小さくなると左右のロータの出力バランスを調整しないと,容易に機体が左右に捩れてしまうことが確認されたが,ワイヤが長くなるほど容易に浮上が行えることを確認した.本研究では急傾斜移動ロボットとして,2本の長いアームで上方にV字型にワイヤを掛けて,これを引張りながら移動する移動ロボットを提案している.このようなロボットは急傾斜では壁面に対して力を加えるとワイヤにぶら下がった自機は壁面から浮き上がってしまい作業が行いにくいことから,ロボットにプロペラを取り付けて作業時には押し付ける方向に回転させる方法を採用する.またロボットは軽量化のため移動機構は簡単な車輪状の物のみとなるため多方向への移動能力が期待できない.そこで本研究では急斜面での移動時にはプロペラを逆回転させることで2本のワイヤにぶら下がった状態で壁面より浮上し,その間に2本のワイヤを巻き取ることで壁面を全方向に自在に移動する方法もまた新たに提案している.まずこうした移動ロボットを作るにあたり,ロボットの重量をどの程度とするかが問題となる.移動ロボットは一人で運用することを考え,500mm四方のサイズと考えると,プロペラはその中に内臓されφ300mm程度と考えられる.このプロペラと同程度のサイズを持つ小型のラジコンのヘリコプタは自重が170g程度で推力は190g程度を出すことが確認された.これをそのまま用いてその他の観測,作業装置を取り付けた場合,500g程度のロボットで70[deg],1000g程度のロボットで80[deg]程度の傾斜面で浮上が行えることがわかる.またヘリコプタとはプロペラの特性は異なり翼の枚数も半分であるが,同じ程度の直径の航空機用のプロペラで実験を行い,20Wモータにより同程度の推力が出ることを確認した.しかしこれらのロータは逆回転することを考えておらず,片方の回転方向に特化した形状に作られており,逆回転させても殆ど推力が出ないこともわかった.そこでロータに柔軟な構造を用いることで,正転時と逆転時にロータ断面形状が変化して,両方の回転方向で高い推力を出すことのできるロータを設計し現在製作している.本研究では急傾斜移動作業ロボットとして,2本の長いワイヤをV字に掛けてこれを引張りながら移動するロボットを提案している.このようなロボットは急傾斜では壁面に対して力を加えるとワイヤにぶら下がった自機は壁面から容易に浮き上がってしまい作業が行いにくい.また軽量化のためには移動機構は簡単な物としたい.そこで本研究ではロボット本体にプロペラを取り付けて,作業時には正転させて押付けに使い,移動時には逆回転させることで2本のワイヤにぶら下がった状態で壁面より浮上し,その間に2本のワイヤ長をウィンチで調整して壁面を全方向に高速に自在に移動する方法を提案している.ロータは反作用による回転を抑制するためと,壁面に対する傾きを制御するために,回転方向の異なる二つのロータを機体の左右に配置する.一人で容易に運用できるようにφ300mm程度のロータを幾つか比較したところ,小型のラジコンヘリコプタのロータが高効率であることが判った.しかしこのロータは片方の回転方向のみに推力を効率よく出せるように特化した形状をしており,逆回転では正回転の50%程度の推力しか出ない.そのためロータ面そのものを反転させて浮上,押付両方に大きな推力が出せる方法が有効であると考えられる.ロータ面を反転させるには,ロータ,減速機,モータを含む機構部全体を反転させる方法も考えられるが,これは装置が大きくまた動作範囲も広くなり,結果として装置そのものが大きく重くなる.そこでロータ回転軸の中に収まる,回転翼のみを回転翼の長手方向の軸回りに回転させてロータ面を反転させる,小型で簡単な機構を開発し,正転反転で同じ推力を出すことを実験で確認した.また開発した反転ロータを二つ搭載した試作機を製作し,壁面にぶら下げた状態でロータを回転させ,安定した浮上と押付動作を行うことを確認した.本年度の目的は昨年開発したプロペラ反転機構を2個を取り付け,ウィンチにより移動可能な機体の開発である.

まず昨年度に開発したプロペラ反転機構を2個取り付けた装置ではカタログ値で小型高出力な航空機ラジコン用として売っているモータを用いていた.しかし航空機ラジコン用モータは小型で高出力ではあるが寿命が極端に短く,数十分の実験で出力が極端に出なくなってしまった.これは航空機ラジコンでは軽量化のために小型のモータしか利用できないため,出力の小さいモータを無理に大電流で駆動しているためであった.そこでモータを汎用の出力の大きいモータに変えて機体を作り直した.荷重実験により1kgの錘を載せても機体は安定して壁面から浮上し,ウィンチを機体に搭載しても十分に浮上できることを確認した.本機は壁面上方から腕のように伸縮するワイヤ2本でV字型に吊り下げて移動する.機体の開発方向として,機体内にウィンチと簡単な検査装置を配置してワイヤ端部を壁面上方に引っ掛けて移動する方法と,壁面上方にウィンチを設置して機体内には作業用のアーム等を配置して壁面で作業する方法とが考えられる.崖等の自然物の調査には前者がふさわしいが,建築物の壁面検査や補修作業では後者の方がふさわしい.実験は身の回りの建築物を利用すること,実際の利用を考えると自然物の調査よりも建物の壁の補修調査の方が頻度利用価値が高いことから.壁面上方に固定するウィンチを2台開発し,V字型に機体をぶら下げて移動する装置を開発し屋外での浮上移動実験を行った.ワイヤが長くなりV字の角度が小さくなると左右のロータの出力バランスを調整しないと,容易に機体が左右に捩れてしまうことが確認されたが,ワイヤが長くなるほど容易に浮上が行えることを確認した.
寄生虫由来プロスタグランジンF合成酵素の阻害剤開発とその作用機構の解明

プロスタグランジン(PG)F_<2α>は、子宮平滑筋の収縮作用を有する生理活性物質の1つで、陣痛促進剤として広く臨床応用されている。寄生虫の増殖とPGF..の因果関係は未解明であるが、感染した家畜の血中でPGF_<2α>が大量に生合成され流産の原因となり、Nagana病と呼ばれている。本研究では、トリパノソーマ(Trypanosoma brucei、T.cruzi)、リーシュマニア(Leishmania major)などの病原性寄生原虫が持つヒトと薬剤感受性の異なるPGF合成酵素を分子生物学的に同定し、そのX線結晶解析により寄生原虫のPG生合成系を標的としたSBDDのための構造基盤を構築することを目的とした。アフリカ睡眠病の病原虫Trypanosoma brucei由来PGF合成酵素(TbPGFS)について、cDNAのクローニング、酵素の同定および反応性についての生化学的実験を行い、酵素の大量精製、結晶化、2.1Å分解能でのX線構造解析に成功した。本酵素は、アルドケト還元酵素(AKR)のファミリーに属し、活性中心で保存されているCatalytic tetrad(Asp47,Tyr52,Lys77,His110で構成)のいずれも必須不可欠と思われたが、singleおよびdouble変異体の作製および活性測定を行った結果、Lys77とHis110のみが反応に関与する、新たなCatalytic dyadの反応機構を提唱した。続いて、リーシュマニア症の病原虫Leishmania major由来(LmPGFS)についても同様に1.9Å分解能でのX線構造解析を行った。β-バレルの上側のループ領域で大きく異なる構造を有する他は、アミノ酸配列の相同性が61%と高いのを反映して、活性部位付近の構造もほぼ同一であり、反応機構も同一と考えられた。一方、活性中心にフラビンを有するシャーガス病の病原虫Trypanosoma cruzi由来の酵素(TzPGFS)についても分子置換法により構造解析に成功し、構造の精密化中である。今後、TbPGFSやLmPGFSとは異なる、ラジカルの関与する反応機構も構造から議論する予定であるが、病原虫の繁殖におけるPGF_<2α>の役割を解明する目的でこれら3種の寄生虫由来の蛋白質の構造基盤をもとに阻害剤の開発を行う予定である。本研究では、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、アフリカ睡眠病やシャーガス病の病因原虫(Trypanosoma brucei、T.cruzi)などの病原性寄生原虫が持つヒトと薬剤感受性の異なるプロスタグランジン(PG)生合成系の酵素を分子生物学的に同定することを目的とし、なかでも特に、科学研究費交付期間中に、3つの病原虫由来のPGF合成酵素のX線結晶構造解析を行ない、高分解能の三次元構造座標を決定して、寄生原虫のPGF生合成系を標的とした新規医薬品の開発の基礎を築くことを目的とする。まず初めに、シャーガス病の病原虫T.cruziのPGF2α合成酵素(TcPGFS)は旧黄色酵素遺伝子族に属する酵素で、他のトリパノソーマ由来のPGF合成酵素とはアミノ酸配列の相同性も全く異なり、酵素学的にも全く異なる機構で反応が進行することが予想され、反応機構解明に向けて、T.cruziのPGF2α合成酵素のcDNAクローニングおよび大腸菌を用いた大量発現系の構築を行った。精製酵素を用いて結晶化を行い、大型放射光実験施設SPring-8を用いた2.0Å分解能までのデータ収集に成功した。続いて、すでに結晶構造解析に成功したT.bruceiのPGF合成酵素(TbPGFS)の阻害剤複合体の結晶構造解析に着手したが、結晶化の沈殿剤であるクエン酸がIC50=0.3Mで酵素を阻害することが判明し、1.4Mの存在下で結晶化しているため、阻害剤複合体の解析には至らなかった。そこで、同じアルドケト還元酵素のファミリーに属し、相同性61%のリーシュマニア症の病原虫Leishmania. majorのPGF合成酵素(LmPGFS)の結晶学的・酵素学的研究に着手した。L.majorのPGF2α合成酵素のcDNAクローニングおよび大腸菌を用いた大量発現系の構築を行い、PEG4000を用いた新たな結晶化条件を確立した。低温下でのデータ収集が可能なようにクライオ条件の検索を行い、大型放射光実験施設において1.8Å分解能までのX線回折強度データの収集および構造解析に成功した。今後、LmPGFSと阻害剤複合体に着手する予定である。アフリカ睡眠病の病原虫Trypanosoma brucei由来PGF

合成酵素(TbPGFS)について、cDNAのクローニング、酵素の同定および反応性についての生化学的実験を行い、酵素の大量精製、結晶化、2.1Å分解能でのX線構造解析に成功した。本酵素は、アルドケト還元酵素(AKR)のファミリーに属し、活性中心で保存されているCatalytic tetrad(Asp47,Tyr52,Lys77,His110で構成)のいずれも必須不可欠と思われたが、singleおよびdouble変異体の作製および活性測定を行った結果、Lys77とHis110のみが反応に関与する、新たなCatalytic dyadの反応機構を提唱した。続いて、リーシュマニア症の病原虫Leishmania major由来(LmPGFS)についても同様に1.9Å分解能でのX線構造解析を行った。β-バレルの上側のループ領域で大きく異なる構造を有する他は、アミノ酸配列の相同性が61%と高いのを反映して、活性部位付近の構造もほぼ同一であり、反応機構も同一と考えられた。一方、活性中心にフラビンを有するシャーガス病の病原虫Trypanosoma cruzi由来の酵素(TzPGFS)についても分子置換法により構造解析に成功し、構造の精密化中である。今後、TbPGFSやLmPGFSとは異なる、ラジカルの関与する反応機構も構造から議論する予定であるが、病原虫の繁殖におけるPGF_<2α>の役割を解明する目的でこれら3種の寄生虫由来の蛋白質の構造基盤をもとに阻害剤の開発を行う予定である。