hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病細胞の増殖を制御するシグナル分子機構の解明

HedgehogシグナルとWntシグナル, Notchシグナルはがん細胞の増殖に関与していることが知られているが,具体的なメカニズムはまだ明らかになっていない.本研究では, Hedgehogシグナル関連遺伝子のGLI-1 siRNAとWntシグナル関連遺伝子のCTNNB1 siRNAを用いて,シグナルへの効果とその関係性を明らかにする研究を行った.その結果, NB4細胞株において, Wnt, Hh, Notch, mTORシグナル間に相互作用が存在する可能性が示唆された.症例ごとの白血病幹細胞の特性を検出する分子学的検査法の開発や,分子標的薬の選択に役立つことが期待される.Hedgehogシグナル(Hh)とWntシグナル,Notchシグナルはがん細胞の増殖に関与していることが知られている。我々はこれまでにこれらのシグナル阻害剤が白血病の増殖を抑制することを報告したが、それぞれのシグナルがどのように関与しているのか具体的なメカニズムはまだ明らかになっていない。本研究では、Hhシグナル関連遺伝子のGLI-1 siRNAとWntシグナル関連遺伝子のCTNNB1 siRNAを用いて、Hh、Wnt、Notch、mTORシグナルへの効果とその関係性を明らかにすることにより、白血病細胞の分子病態の一端を解明することを目的としている。平成26年度は白血病幹細胞の分子病態の解明とその検査法の開発についての研究を実施した。白血病細胞株を対象に検討し、siRNAを細胞に導入してsiRNAが目的の遺伝子の発現をノックダウンさせていることを確認し、細胞株毎のsiRNA導入条件を確立させることができた。その後、白血病幹細胞への増殖効果と遺伝子、タンパク発現量の変化を解析し、シグナルの相互作用の有無を評価した。これまでの研究から、一部の白血病細胞においてWnt、Hh、Notch、mTORシグナル間に相互作用が存在する可能性が示唆された。白血病細胞の増殖に関与するシグナル伝達系の分子機序が解明されれば、症例ごとの白血病幹細胞の特性を検出する分子学的検査法の開発や、分子標的薬の選択に役立つことが期待され、今後更なる検討をしていく所存である。【研究の目的】白血病細胞の増殖と分化には、幹細胞の制御に関わるシグナルの異常が関与するといわれている。これまでの研究で、白血病細胞の増殖にNotchシグナルが関与しており、Notchシグナルを阻害するガンマセクレターゼ阻害剤(GSI)は、ほとんどの白血病細胞株において増殖抑制効果を及ぼすが、一部の細胞株では増殖促進傾向を示すことを見出した。しかし、その詳細な薬剤耐性メカニズムはまだ明らかになっていない。本研究では、GSIにより増殖促進が認められたJurkatにおいて、Notchシグナル阻害が増殖促進効果を及ぼす分子機序について解析した。【方法】急性Tリンパ芽球性白血病(T-ALL)由来細胞株のJurkatとKOPT-K1を用いた。これらの細胞に対してNOTCH1の遺伝子発現を抑制するsiRNA (siN1)とNOTCH2の遺伝子発現を抑制するsiRNA (siN2)を単独または混合して、エレクトロポレーション法により細胞内に導入し、細胞増殖に対する作用と細胞形態や分化に対する作用を評価した。さらに、Notch、mTOR、Hedgehog、Wntシグナル関連蛋白発現量と遺伝子発現量の変化を解析した。【結果】KOPT-K1では、siN1により増殖抑制がみられたのに対し、Jurkatでは増殖促進傾向がみられた。また、JurkatにおいてsiN1だけでなく、siN2も増殖促進傾向を示した。さらに、JurkatにおいてsiN1によりNotch2蛋白が増加し、siN2によりNotch1蛋白、活性型Notch1蛋白、HES1蛋白、MYC蛋白が増加し、mTORシグナル関連蛋白であるmTOR蛋白、リン酸化mTOR蛋白、AKT蛋白も増加した。【研究の意義】本研究から、Jurkatには他の白血病細胞株とは異なる独自のNotchシグナルの伝達の仕方があり、その結果、GSIへの耐性を獲得した可能性が示唆された。GSIは白血病に対して有用な分子標的治療薬になり得るが、本研究で示したように、すべての白血病細胞に有効とは限らないため、投与前には薬剤感受性検査を行う必要がある。HedgehogシグナルとWntシグナル, Notchシグナルはがん細胞の増殖に関与していることが知られているが,具体的なメカニズムはまだ明らかになっていない.本研究では, Hedgehogシグナル関連遺伝子のGLI-1 siRNAとWntシグナル関連遺伝子のCTNNB1 siRNAを用いて,シグナルへの効果とその関係性を明らかにする研究を行った.その結果, NB4細胞株において, Wnt, Hh, Notch, mTORシグナル間に相互作用が存在する可能性が示唆された.症例ごとの白血病幹細胞の特性を検出する分子学的検査法の開発や,分子標的薬の選択に役立つことが期待される.当初の研究計画通り、研究は進展している。一部の白血病細胞株ではシグナル間に相互作用の存在が示唆される新たな知見結果が得られた。siRNAを白血病細胞に導入してシグナルの相互作用の分子メカニズムを明らかにする研究は本研究が初であり、今後更なる検討を実施する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。病態検査学研究計画は順調に進行しているので、H26年度に得られた知見を基に、Notch、Wnt、Hedgehogシグナル関連遺伝子のsiRNAを混合し、更なる検討を行う。siRNAを単独で導入したものと、siRNAを混合して導入したものを比較し、細胞増殖に相乗効果のような変化が認められるか調べる。さらに、目的とするシグナル以外の遺伝子とタンパクへの作用を解析することで、シグナル間で相互作用がないか解析する。

以上の研究から、白血病とシグナルの関与を総括し、Notch、Wnt、Hedgehogシグナル伝達系の分子機序の解析と白血病幹細胞の分子病態の一端を解明し、研究成果を英語論文および学会で発表する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
地域住民コホート研究による腰部脊柱管狭窄症の自然経過の解明

腰部脊柱管狭窄症(lumbar spinal stenosis,以下LSS)の自然経過を解明するために、大規模地域住民コホート研究を縦断的に実施した。第一次調査の参加者は1009名で、4年後に第二次追跡調査を追加実施した際の参加者は778名(追跡率77%)であった。ベースラインで症候性LSSと診断された参加者が4年後も症状を有している割合は37%に過ぎなかった。一方、画像的LSSと診断された参加者のうち、4年後に発症していたものは27%であった。本研究結果から、LSSは寛緩と増悪を繰り返すものの、自然治癒も期待できる予後良好な良性疾患であることが判明した。研究の具体的内容:the Wakayama Spine Studyは、脊椎脊髄疾患の研究に主眼を置いた、車両搭載型MRIを用いた地域住民コホート研究である。和歌山県T町(漁村部)は2010年に、H町(山村部)は2012年に第一次調査を実施した。本コホート研究によって、一般地域住民における腰部脊柱管狭窄症の潜在的な患者数は膨大な数でありながら、有病者は約1割程度に過ぎないという疫学的実態を解明できた。この横断的研究結果をさらに発展させる意味で、当該年度は和歌山県T町において第2次追跡調査としての腰椎検診を実施した。検診期間は、10月3日12月6日で、件数日数は54日、参加人数857人を得た。検診内容は整形外科専門医による脊椎診察と全脊柱MRI撮像である。また、生活習慣やADL、QOLについても調査を行った。本研究の意義:2010年の検診開始時の有病者における症状の推移や予後、ADLおよびQOLに関する疫学的データを定量的に解析し、それに与える因子、すなわち、年齢、性、罹病期間、臨床症状、画像上の狭窄の程度などを詳細に検討することで、個々の参加者の予後予測が可能となる。また、新規発生例の発症要因を未発生例と統計学的に比較検討することにより危険因子を抽出することができる。本研究の重要性:本コホート研究を長期に継続することによって、世界で初めて腰部脊柱管狭窄症の自然経過が明らかとなる。また、予後や危険因子を解明することで腰部脊柱管狭窄症の新たな治療指針を策定することができる。研究の具体的内容the Wakayama Spine Studyは、脊椎脊髄疾患の研究に主眼を置いた、車両搭載型MRIを用いた地域住民コホート研究である。H町(山村部)は2008年に、和歌山県T町(漁村部)は2009年に第一次調査を実施した。腰部脊柱管狭窄症の自然経過を解明する目的で、H町は2012年に、T町は2013年に第二次追跡調査としての腰椎検診を追加実施した。各々約800名程度の参加者を得ている。本研究の意義第一次調査開始時の有病者における症状の推移や予後、ADLおよびQOLに関する疫学的データを定量的に解析し、それに与える因子、すなわち、年齢、性、罹病期間、臨床症状、画像上の狭窄の程度などを詳細に検討することで、個々の参加者の予後予測が可能となる。本研究の重要性本コホート研究を長期に継続することによって、世界で初めて腰部脊柱管狭窄症の自然経過が明らかとなる。整形外科本年度は、初年度に実施したT町の疫学的データ解析を行い、得られた結果をもとに、逐次学会発表と論文投稿を実行する。最終年度に予定しているH町の第2次追跡調査は、既に住民の同意と地域自治体の協力が得られているため、準備は問題なく整っている。本調査の実施により、LSSの3年間の発生率、予後、それに影響する要因を明らかにすることが可能と考えている。LSSの自然経過を十分に理解し、それに与える因子、すなわち、年齢、性、罹病期間、臨床症状、画像上の狭窄の程度などを詳細に検討することで、個々の参加者のLSSの発生、あるいは、すでに発生しているものについては予後予測が可能となる。本研究により明らかになったLSSの危険因子を地域保健福祉の現場に還元することにより、地域住民の要介護予防にわずかでも貢献することを目標としている。
インド都市史の研究

本研究の成果は、1.南インドの主要都市に関するGIS(地理情報システム)インフラを整備し、各都市のGISベース・マップを今後の都市研究の基礎的資料として活用できる形にした、2.都市史研究の推進に必要な各種史料を整備した、3.旧マドラス管区全域の1871年国勢調査の村別統計をデジタル化し、それらをGISに統合した、4.インドで登記された約12万の株式会社や銀行関係の情報をデジタル化して分析し、都市形成の地域的特徴を明らかにした、5.マドラスの内外交易統計を処理し、域内外の経済関連を解明した、6.院生を含む若手研究者を育成すると共に、研究成果を内外に発信した等である。本研究は、申請者が進めてきたインドを対象とするGIS(地理情報システム)インフラをインドの都市部まで拡大して整備し、それを基礎として植民地都市と地方都市に関する18世紀以降の形成過程を実証的に解明することを目的としている。本年度は、この目的に沿って、主対象であるマドラス、コインバトゥール、カーンチープラムに加えて、ハイデラバードをはじめとする計22の南インド諸都市のGISベース・マップを入手し、それらの都市内の全地名データを抽出して既存のインド地名検索システムであるIndia Place FinderのVersion IIをウェッブ上に提供するためのデータ整備を行った。Version IIは、近々にオープン予定である。次に、研究代表者は研究協力者と共に、英国図書館で18世紀以来のマドラス税務局報告を中心とした史料調査を行い、総計数千枚にわたる写真撮影を行い、印刷・整理した。同図書館では、最初期の国勢調査の内、これまで入手し難かった1871年の南インド各県の村落・都市別報告を入手し、データ入力を終え、その一部をGISに組み込んだ。その内、マドラスに関しては、同地の各種地図を入手すると共に、それらを元に19世紀以来の基本GISベース・マップを数種作成し、統計とリンクする作業を行った。カーンチープラムに関しては、南インドの綿業構造・宗教活動の中に同地を位置づけ、それを都市史として描くべく準備をしている。コインバトゥールに関しては、南インドの製造業の発展と同地の企業活動を結びつけるべく、関連資料の収集を図っている。いずれも、次年度に研究を進める予定である。なお、研究代表者は、この研究の成果を国際的に示していく場として、オランダの国際社会史研究所、シンガポールのアジア世界史会議、京都の国際経済史学会、インド歴史協議会、ジャワハルラルネルー大学などで報告を行った。本研究は、本年度が初年度であるため、本欄での記述内容は基本的には【研究実績の概要】と同様である。まず、先年まで申請者が整備してきたインド農村部に関する世界で最も精細なGISベース・マップに、本研究は都市部のデータを加えることによって、インド全域の最精細のGISベース・マップを整備することを目的としているが、現在まで、ハイデラバードをはじめとする計22の南インド諸都市のGISベース・マップを入手し、それらの都市内の全地名データを抽出して既存のインド地名検索システムであるIndia Place FinderのVersion IIをウェッブ上に提供するためのデータ整備を行った。次に、英国図書館所蔵の手書きの植民地統治文書のうち、18世紀末から作成される最も詳細な記録を得ることができるマドラス税務局報告を調査し、関連する文書数千枚を写真撮影し、印刷・整理した。加えて、1871年の南インド各県の村落・都市別報告のデータ入力を終え、その一部をGISに組み込む作業を行った。次に、事例研究の対象とする都市の内、マドラスに関しては、同地の精細なGISベース・マップを入手・整備すると共に、それを元にしてさらに19世紀以来の基本GISベース・マップを数種作成し、19世紀以来の都市統計とリンクする作業を行った。カーンチープラムに関しては、南インドの綿業構造・宗教活動の中に同地を位置づけ、それを都市史として描くべく史料・情報の収集を行った。コインバトゥールに関しては、南インドの製造業の発展と同地の綿業を中心とした企業活動を結びつけるべく、関連資料の収集を図った。なお、研究代表者は、本研究の成果を、オランダの国際社会史研究所、シンガポールのアジア世界史会議、京都の国際経済史学会、インドの歴史協議会、ジャワハルラルネルー大学などで報告した。本研究は、インドを対象とするGIS(地理情報システム)インフラをインドの都市部まで拡大して整備し、それを基礎として植民地都市と地方都市、具体的にはイギリスによるインド植民地支配の管区政府が置かれたマドラス、代表的な宗教都市であり、また伝統的な綿業都市でもあるカーンチープラム、20世紀に入り新興工業都市として台頭し、現在はインドの代表的な工業都市へと成長してきたコインバトールを選び、各都市に関する18世紀以降の形成過程を実証的に解明することを目的とした。この目的に沿って、基礎作業として、南インド諸都市のGISベース・マップを入手し、それらの都市内の全地名データを抽出して整備し、ウェッブ上のインド地名検索システムであるIndia Place Finderに提供した。次に、前年度に行った英国図書館での総計数千枚にわたる写真での撮影データを印刷・整理し、その一部をGISに組み込んだ。マドラスに関しては、同地の各種地図、国勢調査報告などを元に19世紀以来の基本GISベース・マップを数種作成し、統計とリンクさせ、カーンチープラムに関しては、南インドの綿業構造・宗教活動の中に同地を位置づける作業をし、コインバトゥールに関しては、南インドの製造業の発展と同地の企業活動に関する情報をGISに結びつけるためのベース・マップを作成した。また、インド都市史に関連する各種文献を収集・整備した。

こうした基礎作業と並行して、研究代表者は数名の研究協力者を集め、インドの都市史に関する研究会を合宿形式で9月および3月に組織した。そこでは、全員による報告、三都市の比較のための研究視角と問題点の整理、および最終報告書のための研究計画の再編を行った。当初の計画で、マドラス、カーンチープラム、コインバトールの三都市を選び、それらの都市に関するGISベース・マップを作成し、それらの都市の歴史的進展を具体的に地図化すると同時に、三都市の比較を行って、インドの都市史研究に寄与することを目的としていた。いずれの課題も、順調に進展したが、当初本年度に計画していた現地調査が実施できず、また英国図書館からの地図の一部が送付されてこなかったことから、それらの部分については翌年度に繰り越さざるをえなかった。しかし、全体として順調に進展したと考えている。本研究は、インドを対象とするGIS(地理情報システム)インフラをインドの都市部まで拡大して整備し、それを基礎として植民地都市と地方都市に関する18世紀以降の形成過程を実証的に解明することを目的とした。この目的に沿って、南インド諸都市のGISベース・マップを入手し、それらの都市内の全地名データを抽出して整備し、ウェッブ上のインド地名検索システムであるIndia Place Finderに提供した。次に、英国図書館で18世紀以来のマドラス税務局報告を中心とした史料調査を行い、総計数千枚にわたる写真撮影を行い、印刷・整理し、GISに組み込んだ。マドラスに関しては、同地の各種地図、国勢調査報告などを元に19世紀以来の基本GISベース・マップを数種作成し、統計とリンクさせ、カーンチープラムに関しては、南インドの綿業構造・宗教活動の中に同地を位置づける作業をし、コインバトゥールに関しては、南インドの製造業の発展と同地の企業活動に関する情報をGISに結びつけると共に、同地での資料調査で発見した1920-30年代の大量の日記類をデジタル化し、ウェッブ上に載せる処理をした。これらの作業を基礎にした最終的な成果は、成果報告書として提出する予定であるが、第1の成果は、インドの都市研究の基礎となるGISインフラを革新的に整備したことであり、第2は、それによって、各都市の形成過程についての各種地図、統計、記述情報の統合が図られたことであり、第3は、それらによって、貿易都市、宗教都市、工業都市の具体的な形成過程が明らかになったことである。なお、これらの作業やそれによる分析結果について、研究代表者、研究協力者は、オランダの国際社会史研究所、シンガポールのアジア世界史会議、京都の国際経済史学会、デリーのインド歴史協議会、同じくジャワハルラルネルー大学などの海外の学会・研究機関、および国内の学会・研究会などで報告した。
養殖魚の自発摂餌システムの開発に関する研究

自発摂餌を養魚技術として実用化するため,我が国の主要な養殖魚であるニジマス,マダイ,ブリを用いて,摂餌行動,摂餌リズム,成長,飼料および給餌装置に関する研究を行い,下記の成果を得た.1)上記魚種は,固体でも群れでも早期に自発摂餌を開始し,自発摂餌のみで長期飼育でき,かつ好成長が得られた.2)ニジマスは光と水温を制御した年周環境では常に明期に摂餌し,多様な摂餌パターンがみられた.自発摂餌の日周リズムは生物時計で制御されているが,この生物時計は眼球にはないと考えられた.自発摂餌を用いることによって,ニジマスは自ら主栄養素(タンパク質,脂質,炭水化物)を選択して摂取できることが明らかになった.今後は,養殖規模と放養密度との関係,明期のみでの自発摂餌の研究が重要であることが示唆された.3)マダイを屋外で飼育したところ,自発摂餌を用いると従来型の給餌法より残餌が少ないことが分かった.自発摂餌を明期のみに制限したところ,残餌はさらに減少した.屋内実験では,マダイは主に明期に自発摂餌するが,暗期でも自発摂餌が認められた.また,自発摂餌を行うマダイと他のマダイとの関わりについての行動学的な研究も行った.自発摂餌の日周リズムは生物時計で制御されていることも明らかになった.4)ブリは人工照明下では主として明期に自発摂餌を行うが,屋外では暗期の自発摂餌が増加するなど,光環境に大きく影響を受けることが明らかになった.自発摂餌を明期に制限することにより,残餌を削減することができた.ブリは報酬量が異なっても摂餌回数を調節して必要な餌量を摂取することが明らかとなった.5)屋外で使用可能な自発摂餌システムを開発し,マダイで数ヶ月間の実験に用いて有効性を確認した.安定した自発摂餌を行わせるためには摂餌要求の高感度センサと正確な繰出し制御が可能な給餌機が必要である.自発摂餌を養魚技術として実用化するため,我が国の主要な養殖魚であるニジマス,マダイ,ブリを用いて,摂餌行動,摂餌リズム,成長,飼料および給餌装置に関する研究を行い,下記の成果を得た.1)上記魚種は,固体でも群れでも早期に自発摂餌を開始し,自発摂餌のみで長期飼育でき,かつ好成長が得られた.2)ニジマスは光と水温を制御した年周環境では常に明期に摂餌し,多様な摂餌パターンがみられた.自発摂餌の日周リズムは生物時計で制御されているが,この生物時計は眼球にはないと考えられた.自発摂餌を用いることによって,ニジマスは自ら主栄養素(タンパク質,脂質,炭水化物)を選択して摂取できることが明らかになった.今後は,養殖規模と放養密度との関係,明期のみでの自発摂餌の研究が重要であることが示唆された.3)マダイを屋外で飼育したところ,自発摂餌を用いると従来型の給餌法より残餌が少ないことが分かった.自発摂餌を明期のみに制限したところ,残餌はさらに減少した.屋内実験では,マダイは主に明期に自発摂餌するが,暗期でも自発摂餌が認められた.また,自発摂餌を行うマダイと他のマダイとの関わりについての行動学的な研究も行った.自発摂餌の日周リズムは生物時計で制御されていることも明らかになった.4)ブリは人工照明下では主として明期に自発摂餌を行うが,屋外では暗期の自発摂餌が増加するなど,光環境に大きく影響を受けることが明らかになった.自発摂餌を明期に制限することにより,残餌を削減することができた.ブリは報酬量が異なっても摂餌回数を調節して必要な餌量を摂取することが明らかとなった.5)屋外で使用可能な自発摂餌システムを開発し,マダイで数ヶ月間の実験に用いて有効性を確認した.安定した自発摂餌を行わせるためには摂餌要求の高感度センサと正確な繰出し制御が可能な給餌機が必要である.本年度は、(1)摂餌行動の信号検出と給餌装置の試作,(2)自発摂餌学習と摂餌リズムに主眼を置き下記結果が得られた。1.マダイは集団(20・50尾)でも個体でも容易に自発摂餌を学習し,明期型と暗期型の2型の活動リズムが観察された。しかし,摂餌活動の位相は容易に変位することから本質的に2相性(Dual phasing)の性質を持っていることが明らかとなった。恒明条件でフリーランリズムが,また制限自発摂餌で予知行動が観察され,摂餌リズムが生物時計で制御されていることが明らかとなった。(田畑満生)2.マダイの2才魚で自発摂餌と自動給餌を用いて成長率と飼料効率を調べた。5・8月の実験では両方式での成長率に有為差は認められなかった。適切な報酬量の決定が課題となったため8・10月の実験では3段階の報酬量を用いたところ,最多報酬量が与えられたマダイの成長率は9月までは差がなかったものの水温が低下する10月に高くなった.手給餌と比較したところ成長率,飼料効率とも高い値を示した.(会田勝美)

3.ブリは1・3日目で自発摂餌を学習し,学習成立後は自発摂餌のみで継続飼育できた.摂餌活動はすべて明期に集中しており明瞭な日周リズムが観察された.自発摂餌で34日間飼育したところ,飼料効率は90.9・100.0%,増肉係数は1.00・1.10であった.(日高磐夫)4.ニジマスを集団飼育(70・80g,20尾)して自発摂餌させた.一部の水槽では特定の魚だけがスイッチを押していることが分かった.現在,野外の実用規模実験や海産仔稚魚への応用を計画中である.(竹内俊郎)5.自発摂餌装置,活動記録のプログラムおよびセンサーからコンピューターの間のコントロールユニットを作成した.市販フィーダーを用いたため信号から給餌までの応答時間が長すぎて魚の早期学習という点で問題が残ったため新フィーダーを開発中である.(市川眞祐)1.ニジマスを用いて主栄養素が各50%を占める3種類の飼料の選好性を自発摂餌で調べたところ,タンパク質飼料を多く摂取することがわかった。主栄養素飼料の総摂取量は標準飼料の1.7倍だが、可消化エネルギー総量は標準飼料とほぼ同値であったことから,ニジマスは可消化エネルギーを基に主栄養素を選択摂取できることが明らかとなった。自発摂餌は養魚技術として飼料・栄養分野にも応用できると考えられる。(田端満生)2.マダイ2才魚の自発摂餌の適性報酬量を求めるため,摂餌量,残餌量,成長について調べた。昨年度より広い範囲の報酬量を用いた結果,魚は報酬量が少ない場合はスイッチへのアクセス回数を補償的に増加させて必要量を摂取するが,報酬量が極端に少ないと摂餌活動を抑制することが明らかとなった。また水温が低くかつ報酬量が過剰な場合は,摂餌量は増加するが飼料効率は低下することが判明した。(会田勝美)3.ブリ若魚の自発摂餌の適正報酬量,摂餌活動,摂餌量について調べた。報酬量が少ないと摂餌活動が増加する傾向がみられたが、報酬量が異なっても摂餌量や成長に顕著な差は認められないことから、報酬量の差をアクセス回数で調節して必要な摂餌量を得ていると考えられた。さらに今年度はカサゴの自発摂餌の予備実験を行ったところ,プル型スイッチで活発な継続的自発摂餌が観察された。(日高磐夫)4.昨年度の自発摂餌の試作1号システムでは,給餌量のばらつきと応答性に問題があったため,本年度は縦軸型回転目皿方式による試作2号システムを開発し,繰出し量のばらつきと応答性を向上させた。また,本年度は接触音センサ,振動センサ,光センサを応用した摂餌センサを試作してキンギョに応用した結果,改良の余地はあるもののいずれも摂餌センサとして使用できることが確認できた。(市川眞祐)光と水温を制御した四季のシミュレーション環境でニジマス小個体群の自発摂餌の日周パターンの周年変化について調べたところ,どの月もすべて明期に摂餌し,摂餌パターンは基本的に7型((1)日の出+全体型,(2)双峰型,(3)日の出型,(4)日の出+日没型,(5)全体型,(5)前半型,(7)後半型)に分類できた.(1)と(2)はどの月にも出現する傾向がみられた.(3)と(4)は冬季以外に出現した.(5),(5),(7)はほとんど冬季に出現した.一方,ニジマスの自発摂餌を制御する生物時計についてメラトニンを指標として眼球での局在を調べたところ,生物時計の存在する可能性は小さいと考えられた.(田畑満生,竹内俊郎)ブリを自発摂餌と手撒き給餌で飼育し,摂餌パターン,摂餌量および残餌量を調べた.自発摂餌の日周パターンは,明期摂餌型、薄明時型、明期から暗期への移行摂餌型が観察された.日間摂餌量は自発摂餌と手撒き給餌の両者間で有意差は認められなかった.残餌量は明期摂餌型が最も少ない(1.9%)ことから,明期のみに制限した自発摂餌を行えば残餌の削減に有効と考えられた.(日高磐夫)マダイを自発摂餌と定量自動給餌で飼育し、成長、残餌量について調べた.
子宮筋腫が増大する機序に関する分子生物学的研究

子宮筋腫がエリスロポエチン(EPO)を産生し,多血症を呈す病態をヒントに子宮筋腫とEPOについて検討した,先行研究で我々は,一部の筋腫はEPOを高発現しており,EPO発現と腫瘍径には相関が認められることから,EPOが一部の筋腫に見られる巨大な増大に関与している可能性を報告した.本研究では,EPO発現と筋腫に多いMED12遺伝子変異との関連およびEPO発現を調節する因子について検証を行なった.その結果,EPOはMED12野生型の筋腫で特異的に分泌されており,低酸素よりもエストロゲンがその調節に関与していることを示した.本研究は,子宮筋腫の遺伝生物学的な多様性を解明する一助になったと考える.<背景と目的><平成27年度研究実績の概要>当院で摘出された子宮筋腫108例で,70%の子宮筋腫の発生に関わることが報告されている遺伝子(Mediator Complex Subunit 12:MED12)遺伝子点変異を検証した.その結果,MED12野生型に比較してEPOの発現量が有意に低く,EPO発現量上位20例の筋腫ではMED12変異型がわずか15%だったのに対し,EPO発現下位20例の筋腫はMED12変異型が85%存在していた.MED12点変異以外の遺伝子異常すなわちHMGA1&2 mRNAの発現とFHのLOHについて検証したが,EPO発現量との差は認められなかった.したがって,子宮筋腫における様々な分子遺伝学的サブタイプのうち,最も多く認められるMED12点変異でないタイプにおいて,EPOの高発現が誘導されているものと考えられたが,EPO発現が亢進する分子遺伝学的サブタイプは未だ解析中で,同定されていない.また,子宮筋腫組織初代培養系を用いて,EPO発現に対する卵巣ホルモンや低酸素の影響を検証したところ,MED12野生型の筋腫についてエストロゲンがEPO発現を誘導し,低酸素は影響を及ぼさないことを確認した.EPOを高発現する筋腫はほぼ全例MED12野生型のものであったことから,分子遺伝学的に特異的な筋腫においてEPOが発現し腫瘍増大に関与している可能性を示唆する結果を得,今後の研究への大きな足がかりとなった.また,筋腫におけるEPOの作用や発現機序を検証するにあたっては従来我々が行ってきた筋腫の全組織や初代培養系を用いた実験系では限界があり,不死化細胞などを用いたin vitroの実験系の確立が必要であり,平成28年度以降の課題と考えている.本課題のもう一つの課題であるEPOの発現と臨床データ(年齢,妊娠・出産の有無やホルモン周期との関連,画像診断との関連,腫瘍増大などの臨床経過)との関連については,症例データの不足などから新規症例登録が必要であったため今年度は進捗が見られなかった<背景と目的><平成28年度研究実績の概要>子宮筋腫の70%で認められるMediator Complex Subunit 12 (MED12)遺伝子の変異とEPOの発現様式について検証した.その結果,MED 12遺伝子野生型筋腫は変異型筋腫に比してEPO mRNA発現量が有意に高いことが判明した.しかし,MED12遺伝子野生型全てがEPO発現するのではないため,EPO異常発現はMED12点変異以外の遺伝分子学的変異の結果によるものと推測された.そこでMED12点変異以外の遺伝子異常であるHMGA1, 2 mRNA発現亢進およびFHのLoss of heterozygosityについて検討したがEPO発現との関連は確認できなかった.同時に,子宮筋腫組織初代培養系を用いた実験系で正常平滑筋よりEPO高発現している筋腫はMED12野生型であり,低酸素ではなく,エストロゲンによってEPO発現が誘導された.MED12点変異型の筋腫ではエストロゲン負荷でもEPO発現は誘導されなかった.EPO高発現の筋腫は巨大化する傾向があり,また未知の分子遺伝学的変化を有したものである可能性があるため,新たな筋腫のサブタイプであると考えられる.巨大化する筋腫は臨床的に重要であることから,さらなる解析が有用と考えている.平成27年度にEPOを高発現する筋腫はほぼ全例MED12野生型のものであったことを明らかにし,翌年への大きな足がかりとなった.本年度はEPO発現筋腫のサブタイプについて解析を続けたが,既知の遺伝子異常では説明がつかないことが明らかとなり,網羅的遺伝子検索が必要と考えられた.予算の必要な実験系となるので,慎重に計画立案している.子宮筋腫組織初代培養系を用いた,エストロゲンによる筋腫のEPO発現調整機構も重要なデータであるが,さらに解析を続けるには従来我々が行ってきた筋腫の全組織や初代培養系を用いた実験系では限界があり,不死化細胞などを用いたin vitro実験系の確立が必要であり,現在その樹立を行なっている.子宮筋腫組織の初期培養系を使用した実験で,erythropoietin (EPO)の発現はMED12野生型の筋腫に限りエストロゲンにより誘導されるが,低酸素の影響はほとんど受けていないことを明らかにした.MED12変異型の筋腫は野生型の筋腫に比較してサイズが小さくエストロゲンの影響を受けにくいこと,一般的に筋腫は常に腫瘍内が低酸素状態にあるために低酸素によるHIFタンパクの発現が調節が起こりにくいなどの先行報告の内容に一致した所見であった.

したがってMED12野生型の筋腫の一部ではエストロゲンが何らかの機序によりエリスロポエチン分泌を促し,おそらく血管増生や血管成熟を介して腫瘍の増大に寄与していると考えられる.MED12野生型筋腫におけるEPO発現の分子遺伝学背景とEPOの機能を解析すべく,現在,EPOを分泌するMED12野生型の筋腫とEPOを分泌しないMED12野生型筋腫におけるmRNA発現様式の差異について,マイクロアレイ法を用いて網羅的に検索中である.我々の研究はこれまでに認識されていなかった,巨大に増大しうる筋腫のサブタイプが存在することを提示した.これまでは子宮筋腫は単独の疾患と認識されてきたが,実際にはその性質や振る舞いには多様性があり,その多様性を理解することは患者ごとに適切な治療戦略を計画するために必要不可欠であり,今後臨床的に応用しうる重要な知見を示したものと考えている.同時に,MED12野生型でそれぞれEPO高発現,低い発現の筋腫細胞の不死化を行なった.今後はこれらの細胞株を用いて,筋腫細胞におけるEPOの作用を検証する予定である.子宮筋腫がエリスロポエチン(EPO)を産生し,多血症を呈す病態をヒントに子宮筋腫とEPOについて検討した,先行研究で我々は,一部の筋腫はEPOを高発現しており,EPO発現と腫瘍径には相関が認められることから,EPOが一部の筋腫に見られる巨大な増大に関与している可能性を報告した.本研究では,EPO発現と筋腫に多いMED12遺伝子変異との関連およびEPO発現を調節する因子について検証を行なった.その結果,EPOはMED12野生型の筋腫で特異的に分泌されており,低酸素よりもエストロゲンがその調節に関与していることを示した.本研究は,子宮筋腫の遺伝生物学的な多様性を解明する一助になったと考える.EPO高発現の筋腫はMED12野生型であることは確認できたが,その中で具体的にどのような遺伝子異常が発生しているかの同定については,全ゲノム解析やそれに準じた手法が必要と考えている.しかし研究経費の問題があり代替えの実験法も含め検討中である.さらに,現在MED12野生型および変異型,EPO高発現型および低発現型の筋腫組織についてレンチウィルスを用いた不死化細胞株を作成中である.不死化細胞株が確立し次第,筋腫細胞におけるEPO発現機序(卵巣ホルモンや成長因子,低酸素による影響),EPOの筋腫細胞に対する作用(細胞増殖や抗アポトーシス作用,および血管新生と血管成熟に対する影響)の検証を行う予定である.不死化細胞株が樹立するまでの期間には,平成27年度に引き続き筋腫組織の初期培養系を用いた上記に関する実験を行う.また,EPOの発現と臨床データとの関連性の検討に関しても,来年度以降はデータの整った症例が蓄積しはじめているため解析開始できるものと考える.EPO高発現の筋腫の分子遺伝学的特徴の解析に関しては,全ゲノム解析を行うことが予算的に困難であることから,まずMED12野生型EPO低発現症例と高発現症例を比較したmRNAマイクロアレイ解析を施行する予定としている.EPO発現機序や子宮筋腫から発現するEPOの機能に関する解析のためにはin vitro実験系が必要であり,レンチウイルスを用いた不死化細胞株を樹立している.今年度はこの細胞株を利用して,EPO発現様式の平滑筋腫細胞の増殖・アポトーシス・血管新生や血管成熟への関与に関し解析を進める予定である.産婦人科
ソフトウェアプロダクトラインの構築・保守方式の確立に関する研究

ソフトウェア開発の生産性の向上、品質の安定、開発のリードタイムの短縮のために、同一ドメインの製品ファミリーを対象にした、プロダクトライン型のアプローチが注目されている。プロダクトライン方式のソフトウェア開発とは、大規模かつシステマティックなソフトウェア部品の再利用方式である。本研究では、どのような組織においても、一定の以上の品質をしたプロダクトラインを、定められた方法論に従って構築し、利用できるようにすることを、その目的とした。特に、最適なコアアセットの表現法、明確なスコーピング手法の確立、コアアセットの選択法などについての研究を行い、その問題点を指摘し、対応策を提示し、その有効性を検証した。さらに、開発が終了したコアアセットの保守法に対しても、新たな方式を提案した。本研究によって、構築されたプロダクトラインを利用して、高い生産性で、高い信頼性のアプリケーションを容易に開発できるようになることが期待される。本年度は、本研究プロジェクトの初年度であり、本研究を特徴付ける各要素技術についての基本的な研究を行った。(1)コアアセットの表現法については、これまで提案してきたZachmannフレームワークに活用法についての見直しを行い、今後の基礎となる情報を作成した。(2)フレームワークのスコーピング技術については、これまでに発表されている手法についてのサーベイを行った。(3)コアアセットの品質特性を明確にするために、コアアセットに含まれる可能性のある、アーキテクチャ、コンポーネント、仕様書、テストケース、ツールなど、ソフトウェア開発のライフサイクルで作成または利用されるあらゆる成果物についてのメトリクスに関する研究を行った。我々は、すでに、コンポーネント、パターン、フレームワークに対して、各々メトリクスを提案し、その有用性を検証してきている。これらを、さらに多くの種類のコアアセットに広げるとともに、それらから構成されるプロダクトラインのメトリクスを提案した。(4)プロダクトラインが対象にしている市場、利用技術、組織は、時間の経過と共に変化する。また、コアアセットを利用した製品開発を通して、コアアセットへの修正や拡張の要望も蓄積される。すなわち、プロダクトラインは固定されたものではなく、進化させていく必要がある。今年度はこの点についての論文調査にとどまった。(5)実用規模のプロダクトラインとして開発する障がい者支援プロダクトラインを本研究プロジェクト中に開発する。これにより、たとえば、聴覚障がい者に対しても、視覚障がい者に対しても、障がいの程度によって、さまざまな機能を有した多くのバージョンを提供できる。本年度は、この一部として、大量の数値データ(一般的には、Web上でグラフ表現されているようなもの)を音声表現して示すシステムの完成度を上げた。平成22年度に予定していた研究内容は以下の通りである。・コアアセットの表現について:開発済みの評価用プロダクトラインに対して、プロトタイピング結果を整理する。・スコーピングについて:昨年度提案したスコーピング・メトリクスを、実アプリケーションに対して適用し、その有効性を検証する。・コアアセットの選択について:昨年度提案したコアアセットの候補の種類の列挙とその各種類に対するメトリクスを評価し、その結果に基づいて、改良を試みる。・プロダクトラインの進化について:これまでに提案してきた進化パターンおよび進化プロセスの見直しを行う。・障がい者支援プロダクトラインの研究・開発:これまでに開発してきた障がい者支援の整備を行うとともに、基本アーキテクチャを明確にする。特にコアアセット選択について注力した。・コアアセットとしては、アーキテクチャ、コンポーネント、仕様書、テストケース、ツールなど、ソフトウェア開発のライフサイクルで作成または利用されるあらゆる成果物が候補となる。これらの内で、どのような要素をコアアセットとして選択すべきかについてのメトリクスが必要となる。プログラムのメトリクス、テストのメトリクスに関しては、多くの研究が行われているので、ここでは研究の対象としなかった。・我々は、すでに、コンポーネント、パターン、フレームワークに対して、各々メトリクスを提案し、その有用性を検証してきている。・この結果をいくつかの論文にまとめた。大規模かつシステマティックなソフトウェア部品の再利用方式として着目をされているプロダクトライン方式のソフトウェア開発に対して、いまだに明確になっていない、最適なコアアセットの表現法、明確なスコーピング手法の確立、コアアセットの選択法などについての研究を行い、その有効性を検証する。さらに、開発が完了したコアアセットの保守法に対しても、新たな方式を提案する。この評価のために実際に利用可能なプロダクトラインの構築も行なう。

本研究では、プロダクトラインの開発およびそれを利用したアプリケーションの開発における問題点を明らかにし、どのような組織においても、一定の以上の品質をしたプロダクトラインを、定められた方法論に従って構築し、利用できるようにすることを、その目的とする。本研究が一定以上の成果を収めれば、構築されたプロダクトラインを利用して、高い生産性で、高い信頼性のアプリケーションを容易に開発できるようになることが期待される。上記に対して今年度は、以下のような研究を行った。・コアアセットの表現について:開発済みの評価用プロダクトラインに対して、プロトタイピング結果を整理した。・スコーピングについて:昨年度提案したスコーピング・メトリクスを、実アプリケーションに対して適用し、その有効性を検証した。・コアアセットの選択について:昨年度提案したコアアセットの候補の種類の列挙とその各種類に対するメトリクスを評価し、その結果に基づいて、改良を試みた。・プロダクトラインの進化について:これまでに提案してきた進化パターンおよび進化プロセスの見直しを行った。・障がい者支援プロダクトラインの研究・開発:これまでに開発してきた障がい者支援の整備を行うとともに、基本アーキテクチャを明確にした,本年度は、本研究費の最終年度であり、各種の成果をまとめて、これまで論文化していないものについては、補足実験などをして、研究の完遂に向けての努力をすすめてきた。その中で、本年度か、これまで研究が予定よりも遅れてきていた「プロダクトラインの進化について」の研究に、特に注力した。この視点は、コアアセットの使いやすさや再利用性を向上させるためには、さまざまな変化や要望に対応し、コアアセットを改善し、進化させることが重要であるからである。複数の事業を扱うソフトウェア開発企業は、複数のプロダクトラインを保持する。このような企業は、新規にプロダクトラインを構築しながら、既に利用中のプロダクトラインを進化させることになり、特にコアアセットの進化・改善の方針の共有が重要である。よって、企業内でコアアセットの進化・改善の手法を標準として定め、共有することが重要となる。本研究では、プロダクトライン型開発の経験に基づき、組織全体の最適化を考慮した、コアアセットの改善手法を提案した。我々の手法では、望ましい改善のノウハウを組織の標準として定義し、同標準に基づき、コアアセットの改善計画を立案し、改善を実行する。標準は、コアアセットの状態を計測するメトリクスと、同メトリクスによるコアアセットのタイプの定義、改善ノウハウを示した改善パターン、継続的な改善を定義したプロセスから構成することとした。改善パターンは、組織のねらいとコアアセットの状況を考慮した、コアアセットの改善方法の経験的な知識である。
協同トムソン散乱による燃焼プラズマの模擬計測

燃焼プラズマに閉じ込められたアルファ粒子を計測するために、炭酸ガスレーザーを光源とした協同トムソン散乱法を開発したJT-60Uを用いた実証実験のデータ解析結果では、迷光の発生を完全に抑えることができず、プラズマからの散乱光は同定できなかった。研究期間内にアルファ粒子測定法の実証には至らなかったものの、従来に無い性能(出力エネルギー17J,繰り返し周期15Hzの単一モード発振)のレーザーを完成させるとともに、電源の増設による、エネルギー17J、繰り返し周期30Hzのレーザー出力の見通しを得た。(1)パルス炭酸ガスレーザーの改造燃焼プラズマのアルファ粒子計測に必要となるパルス炭酸ガスレーザーの出力(出力エネルギーと繰り返し周期)を得ることを目的として、高繰り返し周期を得るために電源の改良を実施した。6連結しているガス励起電極部を、従来は3台の電源より給電していた。平成19年度は、2つのガス励起電極部について2倍の周;期で放電できるように、追加電源1台を製作した。これにより、実際のアルファ粒子計測に向けて、レーザーの出力増強が可能になった。また、レーザーパルス後半で発振周波数が変移(マルチモード発振)するために、正常な散乱信号が得られないという問題があった。これを解決するために、種レーザーとパルスレーザーの間にアイソレーターを挿入し、パルス炭酸ガスレーザー出力が種レーザーに入らないように光学系を設計し、光学機器の調達を行った。これにより、パルスレーザーの発振周波数の安定化が可能になる。協同トムソン計測法によるアルファ粒子計測法の実証は国際的に期待されており、これを実証するためにレーザー光をJT-60Uプラズマに入射して散乱光を受信することが目的である。受信システムについては完成していたが、平成19年度は(1)のパルス炭酸ガスレーザーの改造について、電源の製作に時間を要したため、電源と光学機器の設計及び調達で終了した。実証実験を実施するのは平成20年度となる。本計画研究の目的は、協同トムソン計測法による核燃焼プラズマのアルファ粒子計測法を実証すること、及び、そのための光源として炭酸ガスレーザーを開発することである。JT-60Uプラズマへのレーザーの入射実験の結果、レーザー光が真空窓などで反射されて発生する迷光の重畳により、プラズマからの散乱信号の同定が困難であった。下記の方法により、迷光の除去を実施した。散乱光を高温炭酸ガス吸収セル中に通すことにより、パルス前半の迷光信号を除去した。しかし、パルス後半から立ち上がる多モード発振成分に起因する迷光は完全に除去することができなかった。そのため、レーザーの運転条件の改善、種レーザーの安定度改善による多モード発振成分の除去を実施し、迷光の発生率は約30%となった。次に、多パルスの信号から迷光成分の多い約30%のパルスを除去し、残りのパルスを重畳して信号成分を抽出する手法を開発した。その結果、迷光の影響を減少させたが、協同トムソン散乱成分は同定されていない。これまでに、アルファ粒子測定法の原理実証には至ってないものの、従来に無い性能(出力エネルギー17J,繰り返し周期15Hzの単一モード発振)のレーザーを完成させるとともに、電源の増設により、エネルギー17J、繰り返し周期30Hzのレーザー出力の見通しを得ることができた。国際熱核融合実験炉(ITER)におけるアルファ粒子計測法として、ジャイロトロンを光源に用いた協同トムソン散乱計測法が進められているが、ITERのプラズマ条件では実証されておらず、ジャイロトロンの代替光源として炭酸ガスレーザーを開発した意義は大きい。
農村空間の保全管理における受委託システム化に関する基礎的研究

近年、農業・農村の多面的機能が認識され、農村を公共的な空間として保全する必要がいわれるようになった。本研究では、その背景を把握し、自治体の関連業務が増大する一方で財源が逼迫して十分な対応がとれない問題と民間委託への流れを整理した。そこでは、現有の技術・装備で対応可能なものが多いこと、追加所得の獲得になることなどから、地域の農業者に農村空間保全業務を委託する方向が新しい動きとして見出された。しかしながら、北海道十勝の農家調査からは、集落等の保全業務を現有の技術、機械設備で対応できる範囲での受託には興味があることは確認されたものの、公共的な業務に付随する実務管理の煩わしさ、規格規制の多さから、所得確保のあり方には農業専業→兼業→保全業務の請負という序列が存在することが明らかとなった。ドイツでは、農村空間の保全業務を自治体がマシーネンリングという農作業の受委託仲介組織を通じて地域の農家に委託するという対応が進んでいる。マシーネンリングは、もともと機械作業の受委託を仲介する組織であったが、情報及び仲介のノウハウの蓄積によって、労働力派遣も行うようになり、80年代に入ってからは地域の公共的な保全業務を自治体と農家の間に入って仲介するようになっている。そのため、農家は入札手続きや多くのペーパー業務から解放されており、自治体にとっては民間企業へ委託するより経済的メリットがあることが確認された。また、州政府の補助金を非農業生産分野で受け入れるために、子会社を設立し、形式的にはその子会社が公共的な業務を請け負うという対応がなされていることが把握できた。以上の受委託の進展は、もともと地縁的結合で遂行されていた公共の管理業務を機能集団が引き継ぐ形になっている現象と捉えることができた。近年、農村がもつ保養空間、景観保護空間、自然保護空間などといった多面的な機能が評価されるようになり、農村を公共的な空間として捉え、適切な維持管理をする必要性が増してきた。将来的に農業生産所得の伸びが期待できない状況において、農村保全に関する業務を農家が請け負うことは、所得拡大の機会として注目される。また財政が逼迫する自治体にとっても、関係業務の農家委託は経済的なメリットがあるといえる。この農村空間の保全管理に関する業務に関して、北海道十勝の自治体でヒアリングをしたところ、現時点では農家への業務委託の具体化は検討されていない状況にあることが把握できた。そこに存在する問題点として、(1)業務を民間委託する際の手続き等の制度的な制約、(2)農家の非生産分野における技術水準、(3)農村空間保全の中身の不明確性と具体的な業務体形の未形成、が挙げられた。他方、受託側となる農家に関しては、現有の機械の稼働率向上に結びつく作業に関しては受託の需要があるものの、(1)農閑期のアルバイトとして雇用の場があればよく、事業を受託する形での業務受託には抵抗感があること、(2)補助事業、保険制度の規制から自由に業務受託ができない、(3)農村空間の保全についての意識が未成熟あるいは具体性の欠如、といった問題点が指摘できた。調査からは、料金水準、技術水準という問題よりも、受委託のシステムの工夫の必要性があるといえ、自治体と農家の間に仲介・調整といったワンクッションが入るような体制が望まれることが明らかになった。その点、ドイツのマシ-ネンリングにみられるように、自治体と農家の間にマシ-ネンリングが受委託の仲介・調整役として介在し、制度的な煩雑さもそこで吸収できるような受委託のシステムは有益な参考材料といえた。
新規殺虫剤創製を目指した昆虫脱皮ホルモン受容体－リガンド間相互作用の分子機構解明

脱皮ホルモン(20-hydroxyecdysone,20E)は,核内受容体である脱皮ホルモン受容体(ecdysone receptor,EcR)に結合することで昆虫の脱皮・変態を制御している.これは昆虫の生育にとって必須の過程であるため,EcRに結合するリガンドは新たな殺虫剤のシードとして期待されている.本研究では,テトラヒドロキノリン(THQ)骨格を有するEcRリガンドについて,その受容体への結合メカニズムを分子レベルで解明し,高活性化合物を創出することを目的とする.今年度は,これまでのTHQ類の定量的構造活性相関(QSAR)解析の結果およびヒトスジシマカEcRのリガンド結合部位の構造的特徴に関する考察をまとめ,学術論文として公表した.続いてこれらの知見に基づき,高活性が期待されるピリジン環を部分構造として持つ化合物を分子設計した.設計した化合物のヒトスジシマカEcRに対する結合親和性(IC50)を評価したところ,期待通りに高い活性を示すことが明らかになった(IC50 = 10 nM).この結果は,これまでに実施したQSAR解析の妥当性を裏付けるものである.また,EcRによるリガンド認識機構を直接的に明らかにするために,ネッタイシマカEcRの大量発現とX線結晶構造解析に着手した.その結果,100 μMの20E存在下で針状結晶を得たが,これはX線回折実験にとって十分な品質の結晶ではなく,立体構造の取得には至らなかった.また,THQ類の存在下におけるEcRの結晶化にも至っていない.今後は,結晶化条件をより詳細に検討する必要がある.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,テトラヒドロキノリン(THQ)型リガンドの脱皮ホルモン受容体に対する結合メカニズムを解明し,高活性化合物を分子設計することを目的とする.今年度は,THQ類縁体の構造展開と活性評価を行い,得られた結果を定量的構造活性相関(QSAR)の手法を用いて解析した.以下,方法および結果について簡単に述べる.方法:以前に申請者が独自に確立した不斉合成経路に基づき,活性本体である(2R,4S)体のTHQ類を立体選択的に合成した.このとき,THQ類の部分構造のうち,ベンゾイル部およびアニリノ部の置換基を種々変換することで,40種の類縁体からなる化合物ライブラリーを得た.続いて合成した化合物の活性を,ヒトスジシマカ由来の培養細胞(NIAS-AeAl-2)を用いた受容体結合試験により評価した.標識リガンドである[3H]Ponasterone Aの結合を50%阻害する供試化合物の濃度[IC50 (M)]を濃度応答曲線より算出し,その逆対数値であるpIC50を受容体結合親和性の指標とした.結果:まずアニリノ部を変換した化合物に関してQSAR解析を行ったところ,メタおよびパラ位への置換基導入は立体的に不利であり,特にメタ位では親水性の置換基が活性を低下させることが明らかとなった.続いてベンゾイル部を変換した化合物に関するQSAR解析を行ったところ,電子求引基の導入が活性を向上させること,またパラ位の置換基には最適な長さが存在することが明らかとなった.この過程で,脱皮ホルモンの約2倍という強力な受容体結合親和性を有するTHQ類縁体を得ることに成功した.当初の計画通り,化合物の合成,活性評価,および構造活性相関の定量的解析を行うことができている.また,ここまでの成果をまとめた学術論文を現在投稿準備中である.以上の点から,研究は順調に進展していると判断した.脱皮ホルモン(20-hydroxyecdysone,20E)は,核内受容体である脱皮ホルモン受容体(ecdysone receptor,EcR)に結合することで昆虫の脱皮・変態を制御している.これは昆虫の生育にとって必須の過程であるため,EcRに結合するリガンドは新たな殺虫剤のシードとして期待されている.本研究では,テトラヒドロキノリン(THQ)骨格を有するEcRリガンドについて,その受容体への結合メカニズムを分子レベルで解明し,高活性化合物を創出することを目的とする.今年度は,これまでのTHQ類の定量的構造活性相関(QSAR)解析の結果およびヒトスジシマカEcRのリガンド結合部位の構造的特徴に関する考察をまとめ,学術論文として公表した.続いてこれらの知見に基づき,高活性が期待されるピリジン環を部分構造として持つ化合物を分子設計した.設計した化合物のヒトスジシマカEcRに対する結合親和性(IC50)を評価したところ,期待通りに高い活性を示すことが明らかになった(IC50 = 10 nM).この結果は,これまでに実施したQSAR解析の妥当性を裏付けるものである.また,EcRによるリガンド認識機構を直接的に明らかにするために,ネッタイシマカEcRの大量発現とX線結晶構造解析に着手した.その結果,100 μMの20E存在下で針状結晶を得たが,これはX線回折実験にとって十分な品質の結晶ではなく,立体構造の取得には至らなかった.また,THQ類の存在下におけるEcRの結晶化にも至っていない.

今後は,結晶化条件をより詳細に検討する必要がある.今後の研究においてはまず,脱皮ホルモン受容体へのTHQ類の結合様式を明らかにする必要がある.当初の計画では,計算化学的手法のみを用いて結合様式を予測する予定であった.しかし,今年度実施した予備的な計算結果から,当研究室で利用可能な計算資源ではそのような計算は困難であることが示唆された.そこで当初の計画を変更し,X線結晶構造解析などの実験的手法を用いて結合様式を決定することを予定している.これには,今年度見出すことができた,脱皮ホルモンの約2倍の結合活性を有するTHQ類縁体を用いる.THQ類の結合様式を解明することができれば,それに基づいて計算化学的手法を駆使した分子設計を行い,候補化合物の合成および活性評価を実施する.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。