hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セルロースの由来による分子特性の相違の解明及びその特性に合った利用法の開発

セルロースは地球上で最も大量に生産されるバイオマスの一つであり、循環型社会の構築及び維持のため、再生可能な資源であるセルロースを高度に利用するためには、その分子特性の解明が不可欠である。地球上でセルロースは植物界、モネラ界(酢酸菌)、動物界(ホヤ類)で生産されている。従来これらのセルロースはそれぞれの由来の違いにもかかわらず、分子特性・分子構造はすべて同じであるというのが常識であった。しかし我々はこれら由来の異なるセルロースを、溶媒系LiCl/DMAc及びLiCl/DMIに溶解させることによって、それらの分子特性に明白な違いのあることを見出した。LiCl/DMAc系に植物由来のセルロース(針葉樹、広葉樹セルロース、綿セルロース)は溶解し等方性溶液となる。バクテリアセルロースはある濃度以上では液晶となり、ツニシン(ホヤ由来のセルロース)は溶解しない。尚ツニシンはLiCl/DMIには溶解することが我々によって見出されている。このように溶解性が異なるということは、分子特性に何らかの違いがあるということを意味する。光散乱によって測定したセルロースの重量平均分子量は、針葉樹、綿、バクテリア及びホヤ由来のセルロースで、それぞれ98.2x10^4,170x10^4,192x10^4及び413x10^4であった。さらに当研究では、各セルロース溶液のレオロジー特性を測定し、由来によるセルロースの分子特性の違いを明白に示すデータを得ている。溶液粘度(縦軸)とセルロース濃度(横軸)の関係は、分子間相互作用の無視できる低濃度領域では、全ての試料のデータは一致し、勾配1の直線で表される。一方、分子間相互作用が重要になる高濃度領域では、植物由来のセルロース系のデータはほぼ完全に一致し、粘度は濃度の4乗に依存する。これは植物由来のセルロースは、ほぼ同じ分子特性をもつことを意味する。一方、バクテリアセルロース及びツニシン系ではそれらとは一致せずに、それぞれ粘度は濃度の3乗及び8乗に依存する。これは、植物由来のセルロース、バクテリアセルロース、ツニシンはそれぞれ分子間相互作用の機序あるいは強さに違いのあることを示している。さらにバクテリアセルロースの液晶性及びツニシン溶液の高い曳糸性を利用することによって、高強度の新規セルロース繊維を創製できる可能性が示された。循環型工業社会の構築・維持のための工業源材料として、自然の循環系に組み込まれているバイオマスの一つであるセルロースを高度に利用することが期待されている。このためには、セルロースの分子特性の解明が不可欠である。地球上でセルロースは主に植物界、モネラ界(酢酸菌)、動物界(ホヤ類)で生産されている。これら由来の異なるセルロースを比較対照しながら、セルロースの分子特性と物性の関連、分子特性と溶液及び固体における秩序性並びに溶解性の関連及びセルロースの新しい利用法について研究した。セルロース試料として、針葉樹溶解パルプ(DP)、バクテリアセルロース(BC)、綿リンター(CC)及びマボヤ)由来のセルロース(ツニシン、TN)を用いた。8%LiCl/DMAc溶媒系へ植物由来のセルロースであるDP、CCは溶解し、無色透明の等方性溶液となる。

BCは濃度の低い領域では等方性溶液になるが、8wt%程度より高濃度では非等方性溶液(液晶)となり複屈折を示す。TNは全く溶解しない。このようにセルロースの由来によって、この溶媒への溶解性は大きく異なることが明らかにされた。光散乱測定から求めた重量平均分子量はDP,CC,BCそれぞれ98.2x10^4,170x10^4,192x10^4であった。零せん断粘度は低濃度領域ではいずれの系でも濃度の1乗に比例する。一方、高濃度領域では、DP及びCC系では濃度の4乗に、BC系では濃度の3乗に比例して増加する。この粘度の濃度依存性の違いは、セルロース分子の分子特性の違いの反映でもある。DP及びCC分子は溶液中で比較的柔らかい屈曲性高分子として、BC分子はどちらかと言えば剛直な棒状分子として挙動していることになる。以上の結果は、これら同じセルロースといわれる物質でも、その由来によって分子特性に何らかの違いがあることを示唆する。循環型工業社会の構築・維持のための工業源材料として、自然の循環系に組み込まれているバイオマスの一つであるセルロースを高度に利用することが期待されている。このためには、セルロースの分子特性の解明が不可欠である。地球上でセルロースは主に植物界、モネラ界(酢酸菌)、動物界(ホヤ類)で生産されている。これら由来の異なるセルロースを比較対照しながら、セルロースの分子特性と物性の関連、分子特性と溶液及び固体における秩序性並びに溶解性の関連及びセルロースの新しい利用法について研究した。セルロース試料として、針葉樹溶解パルプ(DP)、バクテリアセルロース(BC)、綿リンター(CC)及びマボヤ由来のセルロース(ツニシン、TC)を用いた。8%LiCl/DMAc溶媒系へ植物由来のセルロースであるDP、CCは溶解し、無色透明の等方性溶液となる。BCは濃度の低い領域では等方性溶液になるが、6wt%程度より高濃度では非等方性溶液(液晶)となり複屈折を示す。TCはこの溶媒には全く溶解しないが、8%LiCl/DMI系には溶解し、無色透明の等方性溶液となることが判明した。このようにセルロースの由来によって、この溶媒への溶解性は大きく異なること.が明らかにされた。光散乱測定から求めた重量平均分子量はDP, CC, BC及びTCそれぞれ98.2x10^4, 170x10^4, 192x10^4及び413x10^4であった。一方、高濃度領域では、DP及びCC系では濃度の4乗に、BC系では濃度の3乗に、またTC系では8乗に比例して増加する。TC系の8乗については、現時点で天然及び合成高分子いずれの系でも見出されていない。以上の結果は、これら同じセルロースといわれる物質でも、その由来によって分子間相互作用の機序に違いがあること、延いては分子特性に何らかの違いがあることを意味する。
データ駆動型マテリアルデザインによる新奇高エントロピー合金材料の探索

主要金属原子が1種もしくは2種である一般的な合金とは異なり、高エントロピー合金は多種類(5種類以上)の金属元素をほぼ等原子量含む新種の材料である。多種類金属原子が結晶格子上に不規則分布するため、ギブス自由エネルギーに含まれる混合エントロピー項が増大することにより安定化する。その高い不規則性によって生じる高強度、耐食性、耐熱性等といった従来の合金材料より優れた特性により、高エントロピー合金は新たな機械・構造材料として注目を集めてきた。本研究課題の目的は従来の第一原理電子状態計算に立脚したマテリアルデザインにデータ科学を統合した材料開発手法の開発であり、シミュレーションとデータ科学の協奏は次世代エレクトロニクスに必要な「新機能」、それを可能にする「デバイス」、そのデバイスを実現するのに必要な「材料」と通常の過程とは逆に辿るデザイン主導の材料開発を可能にする。高エントロピー合金の物性データベースを作成するため、独自の大規模電子状態計算パッケージである「KKRnano」の開発・拡張を行った。一般の電子状態計算手法とは異なり、KKRnanoでは空間をボロノイセルに区切りグリーン関数を定義するため、各ボロノイセルで局所エネルギーを計算することが可能であり、スーパーコンピュータによる大規模並列計算と組み合わせることで膨大な量の局所エネルギーのデータを取得することができる。この局所エネルギーのデータベースにデータ科学的手法を用いることにより局所構造の安定性をデータ駆動で予測することができる。我々は記述子として第1、第2近接原子種の数を用い、線型回帰手法の一つであるLASSOによるCrFeCoNiの局所構造解析を行った。その結果、Cr原子に比べNi原子の局所エネルギーの予測性能が高いことが判明した。これは磁気モーメントが小さいNi原子とは異なりCr原子は他の原子と反強磁性的な相互作用を有するためであり、記述子として最近接原子種のみを用いるだけでは不十分であることを示している。この解析により、我々はデータ駆動で局所構造の安定性の議論に成功し、CrFeCoNiでは第一近接(二近接)Cr原子間には斥力(引力)的相互作用が支配的であることを解明した。さらに、大域的にはランダムな固溶体を形成するより、L12構造を有した方が安定であることが判明した。大阪大学産業科学研究所小口研究室にワークステーション(ノード1台)を導入予定であったが大規模計算のためには性能の面で難しい問題が発生しため、スーパーコンピューター「Oakforest-PACS」の一般利用に応募し計算資源を獲得した。そのためノード1台分の差額が生じた。2019年度は生じた差額を国外・国内の長期出張旅費に割り当てる。
変異毒素タンパク質を封入した膜融合リポソームを使ったガン治療の基礎研究

1)CRM22封入膜融合リポソームのin vivo投与によるガン治療実験本年度は腹水ガンと固形腫瘍について、CRM22封入膜融合リポソームの抗腫瘍効果を詳細に検討するとともに、最も治療効果をあげることができる投与法を検討した。その結果、CRM22を封入してあるが膜融合能を持たないリポソームや、膜融合能は持っているが内部に何も封入していないリポソームではまったく抗腫瘍効果が認められなかった。このことから、少なくとも腹腔や皮下という限定した部位では、膜融合リポソームの持つ細胞内にタンパク質などの高分子物質を導入する活性と、CRM22の持つ強い細胞殺傷能力の組み合わせにより、ガン細胞が特異的に死滅することがわかった。センダイウイルスは培養系ではほとんど細胞特異性を示さないので、今後なぜin vivoでは腫瘍に対する特異性が生まれるのか検討を加える予定である。2)CRM22タンパク質とその遺伝子による細胞障害活性の検討CRM22封入膜融合リポソームによるガン治療を実用化するために、まずCRM22の構造と機能について詳細に調べた。CRM22を産生するジフテリア菌のゲノム上の構造遺伝子を解析し、CRM22はジフテリア毒素の180番目のアルギニンコドンが停止ゴトンに変化したためにできた変異体であり、C末端の1アミノ酸残基を除いてフラグメントAと同時であることがわかった。次にCRM22をこの菌の培養上清から回収するため、硫安分画・疏水性クロマトグラフィー・イオン交換クロマトグラフィーで精製した。その結果、100μg/mlの高濃度でもまったく毒性を示さず、エンドトキシン・分解酵素など有害な不純物を含んでいない標本を得、細胞に導入したときの毒性から、このタンパク質がEF-2の不活化によって細胞のタンパク質合成を止め、細胞を死にいたらしめることが確定できた。
情報化社会における統計教育に関する国際比較分析・研究

情報化の進展に伴い,統計教育に対する社会の要請は変化し,拡大してきている。これからの情報化社会においては,数字を正しく読み,理解する能力と統計的な考え方は,一般市民にとって最小限必要な能力と考えられる。また,統計学の応用分野の拡大により,多くの専門領域においても,統計の知識および応用能力が必要になってきている。このような環境の中でわが国の教育の現状を見ると,中学・高校での統計教育は,2002年度から施行される新学習指導要領により,これまで以上に弱体化されることになる。大学教育においても,高等教育の大衆化と相俟って,多くの大学において,カリキュラムの見直しが行われた結果,基礎教育としての統計教育の弱体化が見られる。このようなわが国の統計教育の現状は,情報化社会の要請や他の学問分野の要求に逆行するもので,諸外国の動きとも異なっている。そこで,本研究は,主要国の統計教育の現状と新しい動きについて,調査,比較分析するものである。平成11年度においては,アメリカ,イギリスを中心に,教科書,統計教育関係の文献を収集して,中等教育レベルでの統計教育の内容,使用する教材器具,使われている統計の事例などについて分析した。また,統計教育の標準カリキュラムについて調査した。平成12年度においては,前年度に引き続き,アメリカ,イギリスを中心に,教科書,統計教育関係の文献に基づいて,中等教育レベルの統計教育について分析した。イギリスの全国統一教育課程(ナショナル・カリキュラム),韓国の標準カリキュラムについて分析した。また,中国の高等教育における統計教育の現状と問題について,中国の専門家からのヒヤリング,意見交換を行った。これらの諸国では,わが国と比べ,数学教育の中で,データの扱い方,統計的な考え方が1つの重要な部分を占めている。さらに,平成12年夏に日本で開かれた第9回数学教育世界会議に参加(三浦,澤田)したほか,東京で国際統計協会の国際統計教育協会(IASE)の円卓会議を組織し,討論に参加(三浦,村上,新家)した。調査・研究結果は,研究成果報告書に取りまとめた。情報・通信技術の急速な進歩による情報化の進展に伴い,統計教育に対する社会の要求は変化,拡大してきている。今後も進展する情報化社会において,データを正しく読み,正しく使う能力と,統計的な考え方は,市民にとってますます必要となってくる。統計学の応用分野の拡大により,多くの専門分野においても,統計の知識および応用能力が必要になってきている。一方,わが国の教育の現状を見ると,中学・高校での統計教育は弱体で,コンピュータ教育との連携も不明確である。2002年度から施行される学習指導要領の改正により,統計教育はさらに弱体化されることになる。大学教育においても,多くの大学において,カリキュラムの見直しの結果,基礎教育としての統計教育の弱体化がみられる。このようなわが国の統計教育の現状は,情報化社会の要請や,他の学問分野での要求に逆行するもので,先進諸国の実情とも異なっている。そこで,本研究は,主要国の統計教育の現状と新しい動きについて調査,比較研究するものである。平成11年度においては,アメリカ,イギリスを中心に,教科書,統計教育関係の文献を収集して,中等教育レベルにおける統計教育の内容,使用する教材器具,使われている統計の事例などについて分析した。また,統計教育の標準カリキュラムの内容,イギリスにおける統計の資格認定についても調査,分析を行った。

学会発表:国際統計協会第52回大会(1999-8)(三浦),日本計算機統計学会第13回大会(1999-10)(村上),総合学習学会第1回大会(1999-11)(村上),シンポジウム「21世紀へ向けての統計教育」(1999-12)(新家,村上)情報化の進展に伴い,統計教育に対する社会の要請は変化し,拡大してきている。これからの情報化社会においては,数字を正しく読み,理解する能力と統計的な考え方は,一般市民にとって最小限必要な能力と考えらる。また,統計学の応用分野の拡大により,多くの専門領域においても,統計の知識および応用能力が必要になってきている。このような環境の中でわが国の教育の現状を見ると,中学・高校での統計教育は,2002年度から施行される新学習指導要領により,これまで以上に弱体化されることになる。大学教育においても,高等教育の大衆化とも相俟って,多くの大学において,カリキュラムの見直しの結果,基礎教育としての統計教育の弱体化が見られる。このようなわが国の統計教育の現状は,情報化社会の要請や他の学問分野の要求に逆行するもので,諸外国の動きとも異なっている。そこで,本研究は,主要国の統計教育の現状と新しい動きについて,調査,比較分析するものである。平成12年度においては,前年度に引き続き,アメリカ,イギリスを中心に,教科書,統計教育関係の文献に基づいて,中等教育レベルの統計教育について分析した。イギリスの全国統一教育課程(ナショナル・カリキュラム),韓国の標準カリキュラムについて分析した。また,中国の高等教育における統計教育の現状と問題について,中国の専門家からのヒヤリング,意見交換を行った。これらの諸国では,数学教育の中で,データの扱い方,統計的な考え方が1つの重要な部分を占めている。さらに,平成12年夏に日本で開かれた第9回数学教育世界会議に参加(三浦,澤田)したほか,東京で国際統計協会の国際統計教育協会(IASE)の円卓会議を組織し,討論に参加(三浦,村上,新家)した。調査・研究結果は,研究成果報告書に取りまとめる。
リパーゼ・スーパーインデューサー作用機構の解明と有用蛋白質大量生産システムの構築

1.一連のリパーゼ・スーパー・インデューサー群のうち、高級アルコールの作用機構に関しては、翻訳後の活性レベルと膜の透過性への寄与は少ないため、リパーゼ遺伝子発現レベルでのシグナル伝達機構が示唆された。センサーキナーゼとレスポンスレギュレーターからなる二成分制御システム(BT. Nixon, et al. PNAS, 83,7850-7854,1986)は、べん毛回転方向の制御や転写調節等に重要な役割を演じているが、最近、リパーゼ発現レベルでも二成分制御システムが働くとの報告が出された(J. Krzeslak, et al. Appl. Environ. Microbiol.74,1402-1411,2008)。Nixonらの系では約3倍程度で、我々のスーパーインデューサーシステムの数十倍よりも劣っていたため、更に詳細な検討を加える為、このシステムの大腸菌等への移築を試みている。2.リパーゼ・スーパーインデューサーの添加よって菌体外に大量分泌される15kDa蛋白質(昨年度、長鎖炭化水素や脂質を乳化する界面活性タンパク質であることが判明)は、更なる機能解析とアミノ酸配列データの相同性解析から、久塚らが発見したプロテインアクティベーター(K. Hisatsuka, et al. Agr ic. Biol. Chem. 41,445-450,1977)と示唆された。最近,細菌のトリグリセリド、脂肪酸、n-アルカン等の細胞外脂質の資化システムにおいても、二成分制御システムが機能して環境変化に適応していることが判明しつつある。3.高級アルコールの添加よって、トリグリセリド資化システムと長鎖炭化水素資化システムの双方が極端に活性化される(共通の代謝産物である脂肪酸は活性化にほとんど寄与しない)ことは、バクテリアの環境適応システム解明の格好の材料を得たと思われる。リパーゼと界面活性タンパク質の共分泌および誘導機構のさらに詳細な解明により、有用蛋白質の大量分泌システム確立等への応用が期待できる。リパーゼ・スーパーインデューサー作用機構の解明と有用蛋白質大量生産システムの構築の為の第1段階として、平成18年度は以下の研究結果を得た。1.最近見出した高級アルコールで超誘導される熱安定リパーゼの遺伝子をクローニングし、蛋白質の部位特異的アミノ酸残基変異(S130A、R137P、C228A)による熱安定化因子を探索した結果、S130はリパーゼ活性に必須、R137は活性部位の側面を覆うα-ヘリックスドメインを形成して熱安定化に寄与、C228はC286とジスルフィド結合して触媒能に寄与すると推定された。また、未分泌性のラクトン特異的エステラーゼ遺伝子をクローニングし、進化分子工学的手法によるアミノ酸残基置換により、野生型エステラーゼより10°C安定なエステラーゼの創製に成功したことにより、高級アルコールを超誘導剤とした有用蛋白質生産システムの対象材料二つを確保できた。2.好気培養条件下では高級アルコールの添加によりリパーゼと機能未知の15kDa蛋白質が大量に分泌されるが、酸素供給量を制限すると、それら以外に機能未知の17kDa蛋白質が菌体外に大量分泌される。培養後期には17kDa蛋白質が消失し、15kDa蛋白質の菌体外濃度が上昇するため、17kDa蛋白質は15kDa蛋白質の前駆体であることが示唆された。15kDa蛋白質を精製してN-末端アミノ酸配列を決定した結果、長鎖炭化水素の分解促進作用システムに関係すると推定される蛋白質群の遺伝子クラスター中の機能未知遺伝子から推定した遺伝子産物のアミノ酸配列と高い相同性があった。15kDa蛋白質は相同蛋白質のN-末端アミノ酸配列を欠く事実からも、17kDa蛋白質は15kDa蛋白質の前駆体と示唆された。この蛋白質の機能を解明することによって、リパーゼ・スーパーインデューサーの作用機構解明の糸口となることが期待できる。リパーゼ・スーパーインデューサー作用機構の解明と有用蛋白質大量生産システムの構築の為の第1段階として、平成19年度は以下の研究結果を得た。1.高級アルコール等のリパーゼ・スーパーインデューサーで超誘導される熱安定リパーゼに関しては、昨年度の熱安定化に関与するアミノ酸残基の同定作業を引き続き実施するとともに、組換え大腸菌でのリパーゼ生産量を約20倍増加させることに成功した。また、未分泌性のラクトン特異的エステラーゼを、進化分子工学的手法により、野生型エステラーゼより1213°C安定なエステラーゼの創製に成功したことにより、リパーゼ・スーパーインデューサーを超誘導剤とした有用蛋白質生産システムの、昨年度より優秀な対象材料を確保できた。2.リパーゼ・スーパーインデューサーの添加により、リパーゼとともに大量に分泌される機能未知の15kDa蛋白質(昨年度、N-末端アミノ酸配列を決定した結果、長鎖炭化水素の分解促進作用システムに関係すると推定される蛋白質群の遺伝子クラスター中の機能未知遺伝子から推定した遺伝子産物のアミノ酸配列と高い相同性があった)には長鎖アルカンや脂質を乳化する作用が見出されたことから、界面活性タンパク質であることが判明した。このことにより、バクテリアにおける多様な脂質資化システムのメ.タボロミクス研究が可能になった。酸素供給量を制限した揚合に菌体外に大量分泌される機能未知の17kDa蛋白質との関連性については、17kDa蛋白質が15kDa蛋白質の前駆体であることが強く示唆された。リパーゼ・スーパーインデューサーによるリパーゼと界面活性タンパク質の共

分泌および誘導機構の詳細な解明により、有用蛋白質の大量分泌システム(コンビナトリアルシステム)確立の糸口となることが期待できる。1.一連のリパーゼ・スーパー・インデューサー群のうち、高級アルコールの作用機構に関しては、翻訳後の活性レベルと膜の透過性への寄与は少ないため、リパーゼ遺伝子発現レベルでのシグナル伝達機構が示唆された。センサーキナーゼとレスポンスレギュレーターからなる二成分制御システム(BT. Nixon, et al. PNAS, 83,7850-7854,1986)は、べん毛回転方向の制御や転写調節等に重要な役割を演じているが、最近、リパーゼ発現レベルでも二成分制御システムが働くとの報告が出された(J. Krzeslak, et al. Appl. Environ. Microbiol.74,1402-1411,2008)。Nixonらの系では約3倍程度で、我々のスーパーインデューサーシステムの数十倍よりも劣っていたため、更に詳細な検討を加える為、このシステムの大腸菌等への移築を試みている。2.リパーゼ・スーパーインデューサーの添加よって菌体外に大量分泌される15kDa蛋白質(昨年度、長鎖炭化水素や脂質を乳化する界面活性タンパク質であることが判明)は、更なる機能解析とアミノ酸配列データの相同性解析から、久塚らが発見したプロテインアクティベーター(K. Hisatsuka, et al. Agr ic. Biol. Chem. 41,445-450,1977)と示唆された。最近,細菌のトリグリセリド、脂肪酸、n-アルカン等の細胞外脂質の資化システムにおいても、二成分制御システムが機能して環境変化に適応していることが判明しつつある。3.高級アルコールの添加よって、トリグリセリド資化システムと長鎖炭化水素資化システムの双方が極端に活性化される(共通の代謝産物である脂肪酸は活性化にほとんど寄与しない)ことは、バクテリアの環境適応システム解明の格好の材料を得たと思われる。リパーゼと界面活性タンパク質の共分泌および誘導機構のさらに詳細な解明により、有用蛋白質の大量分泌システム確立等への応用が期待できる。
電話用補聴装置における周囲雑音の補聴効果に及ぼす影響に関する研究

一般のアナログ公衆電話回線により伝送された音声信号を感音性難聴者が受聴する場合に使用される補聴装置は、品質が劣化した音声から難聴者の個人の聴覚特性に適合する振幅圧縮、周波数圧縮等の処理を施しその出力を生成する必要があるが、電話により通話では周囲雑音をはじめ信号伝送系での雑音の混入が考えられる。一方実用的な補聴装置は、その安定な動作がこれらの雑音により阻害されないように、補聴効果が低下せず、また聴覚に対し聞き取り易い補聴出力を提供できる補聴方式が必要となる。本研究では、このような実用性の高い電話用補聴装置での周囲雑音が補聴効果に及ぼす影響を明らかにするために検討をする事を目的として行われた。雑音の影響を受けにくい電話音声用の補聴方式を検証するための模擬雑音を生成するため、次のような方法で、信号処理を行うシステムを構成した。まず、ハードウェアで雑音源を製作しその信号出力をDSPによるリアルタイム演算部に送り、必要とされる模擬雑音の周波数特性やレベルを変化させるソフトウェア処理を加える。次に、処理によって得た信号をDATレコーダに記録し、更にDATインターフェースを通して信号をパソコンに送りノイズ形状等生成した模擬雑音の評価を行った。その結果概ね目的としたスペクトル形状が実現されているのが確かめられた。次にこれらの雑音信号を予め準備された振幅圧縮音声と重畳するための、ミキシング部を構成し、基本的な聞き取り試験をおこなった。その結果実験システム全体は、実験のための条件を満たしていることが確認できた。今後ノイズの加工処理に使用するDSPプログラムの内容を改善し、種々の周囲環境雑音の影響を定量的に検証できるようにし、補聴方式の評価を行う予定である。
遺伝子浸透を伴うマイマイガの種分化に関する研究

遺伝的に著しく異なった北海道マイマイガ2系統間での遺伝子浸透の実体を、ミトコンドリアDNAとマイクロサテライトを解析することによって明らかにすることを目的とした。実施計画として、北海道個体群に存在するオスが卵内で死んでメスのみが生育するものや、その逆にメスが幼虫期に死んでオスのみが生育するものについて、性決定に関わる遺伝子であるdouble sex遺伝子を解析して、性決定過程を追跡することで現象の解明を行った。北海道のマイマイガは、Lymantria umbrosa(L.u)として本州や大陸のマイマイガL.dispar(L.d.)とは別種とする見解があり、両種の明瞭な違いとして終齢幼虫頭部の斑紋形状が指摘されている。mtDNAハプロタイプの異なる石狩低地帯東部(北海道ハプロタイプ:美唄市)と同西部(本州ハプロタイプ:小樽市、赤井川村)で野外採取した終齢幼虫を比較したところ、3調査地いずれにおいてもL.u.タイプとL.d.タイプが混在した(L.u.:L.d.の比は美唄市1.0:0.6、小樽市1.0:1.0、赤井川村1.0:0.9)。これは、北海道では両種が混在することを示すのではなく、これまでの雄成虫交尾器形態や核遺伝子の解析結果を考慮すれば、種差として考えられてきた終齢幼虫頭部の斑紋形状の違いは種内変異とみなすのが妥当である。今後は、北海道や四国、対馬で起っていると推定される、二次的接触による個体群間の遺伝的相互作用を明らかにして、侵入外来種の影響を分子生態学的にも究明する必要がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。北海道各地で採集した卵塊から孵化させたマイマイガ幼虫からDNAを抽出して保存したのち、幼虫を飼育して、発育速度や齢数、卵塊ごとの性比を調べた。また、ミトコンドリアDNA(mtDNA)のCOI遺伝子のハプロタイプを調べた。卵塊を採集した場所は、厚沢部町と北斗市、ニセコ町、倶知安町、札幌市南区、旭邦市、東神楽町であり、これまでmtDNAハプロタイプが異なる境界であることが分かっている石狩低地帯の両側である。札幌市南区の卵塊では、孵化率が約50%で子がすべてメスになるものが半数含まれていた。北海道各地の卵塊から得た成虫を、mtDNAのハプロタイプが異なる組み合わせで交配して次世代の卵塊を得た。対照として同じ採集場所から育てた成虫同士の交配も行った。北海道マイマイガの遺伝子流動を調べるため、核遺伝子のマイクロサテライト多型を検出できるPCRプライマーを新たに3遺伝子座について開発した。各遺伝子座の対立遺伝子数が約30あり、これまで論文で公表されている5遺伝子座のプライマーも利用して遺伝子流動の実体を解明していく手がかりを得た。フェロモントラップによるオス成虫の採集を、釧路市と幕別町、富良野市、小樽市の北海道各地で行った。また、本州の、三田市と倉吉市、東広島市、三次市、四国の愛南町と宇和島市、九州の対馬市でも行った。採集したオス成虫からDNAを抽出し、ハプロタイプ解析をCOI遺伝子について行った。四国と対馬で採集したオス成虫のハプロタイプは、本州以南型ハプロタイプの他に、沖縄型のハプロタイプが含まれていた。mtDNAハプロタイプの解析では、本州以南型から沖縄型が300万年前に分岐し、北海道型は100万年前に分岐したとされている。系統的に非常に異なるマイマイガが日本各地で同所的に分布していることが明らかになったことで、これらの地域での遺伝子流動の実体解明も興味深い。北海道のマイマイガで、東部の個体と西部の個体を交配することによって得られる、雌のみや雄のみの系統について、性決定遺伝子が関与しているとの仮説のもとに、マイマイガのdouble sex遺伝子(LdDsx)を相補的DNA (cDNA)を作成して解析した。その結果、多くの生物で保存されている領域と相同性を持つマイマイガのLdDsxが同定できた。このLdDsxの系統解析をしたところ、ショウジョウバエよりもカイコに近縁であることが分かった。LdDsxが同定できたことにより、雌ばかりの系統や雄ばかりの系統の性決定の過程をこの遺伝子を用いて解析することが可能となった。四国や九州で採集した個体のミトコンドリアDNAを解析した結果、本州や四国、九州に分布するハプロタイプ以外に、沖縄のハプロタイプが四国や九州で広範囲に分布することが明らかになった。現在、沖縄のマイマイガ(Lymantria albescens)は、本州・四国・九州のマイマイガ(L. dispar japonica)とは別種とされているが、沖縄のマイマイガが沖縄だけではなく四国や九州に分布しているとすると、遺伝子交流の可能性もあり、分類的な検討も必要となる。マイマイガの寄生蜂である、ブランコサムライコマユバチ(Glyptapanteles liparidis)は、北海道や青森で同一のミトコンドリアDNAハプロタイプであることが分かったが、この寄生蜂の交替寄主であるツガカレハ(Dendrolimus superans)について、北海道美唄市と青森県青森市で採集した個体について解析した結果、マイマイガとは異なり同一のハプロタイプであった。これらのことは、寄生者と寄主との相互関係を明らかにする手がかりとなるものである。一昨年度、フェロモントラップで採集したオス成虫について、ミトコンドリアDNA (mtDNA)と核遺伝子のマイクロサテライトを分析した。

すなわち、北海道と東北地方の個体群間の比較を行った。北海道の個体群ではmtDNAハプロタイプが異なっていても、距離に比例してマイクロサテライトの類似度(Fst)が異なる結果が得られた。しかし、北海道西部と東北地方では、mtDNAハプロタイプが同じであってもマイクロサテライトは大きく違っていた。これは、北海道個体群では、mtDNAハプロタイプの違いに関わらず核遺伝子の交流があることを示す証左となる資料だと思われる。兵庫県、鳥取県、広島県、愛媛県、高知県、長崎県(対馬)の個体群間でもmtDNAとマイクロサテライトを比較した。沖縄県は個体数が少なく、マイクロサテライト解析は行えなかったので、次年度の課題となった。北海道旭川市、北斗市、厚沢部町、青森県、東京都、岐阜県、滋賀県、大分県、熊本県から得た卵を飼育し、これらの系統を保存するとともに、地域間の交配を行った。北海道と東北地方の個体について、mtDNAハプロタイプと交尾器を含めた形態の比較を行った。しかし、形態の差は今のところ見いだせていない。マイマイガに寄生する、ブランコサムライコマユバチのmtDNAハプロタイプの変異を北海道で調べた。マイマイガとは違って北海道で一つのハプロタイプしかなく、マイマイガと同じ旅をしていないと思われた。遺伝的に著しく異なった北海道マイマイガ2系統間での遺伝子浸透の実体を、ミトコンドリアDNAとマイクロサテライトを解析することによって明らかにすることを目的とした。実施計画として、北海道個体群に存在するオスが卵内で死んでメスのみが生育するものや、その逆にメスが幼虫期に死んでオスのみが生育するものについて、性決定に関わる遺伝子であるdouble sex遺伝子を解析して、性決定過程を追跡することで現象の解明を行った。北海道のマイマイガは、Lymantria umbrosa(L.u)として本州や大陸のマイマイガL.dispar(L.d.)とは別種とする見解があり、両種の明瞭な違いとして終齢幼虫頭部の斑紋形状が指摘されている。mtDNAハプロタイプの異なる石狩低地帯東部(北海道ハプロタイプ:美唄市)と同西部(本州ハプロタイプ:小樽市、赤井川村)で野外採取した終齢幼虫を比較したところ、3調査地いずれにおいてもL.u.タイプとL.d.タイプが混在した(L.u.:L.d.の比は美唄市1.0:0.6、小樽市1.0:1.0、赤井川村1.0:0.9)。これは、北海道では両種が混在することを示すのではなく、これまでの雄成虫交尾器形態や核遺伝子の解析結果を考慮すれば、種差として考えられてきた終齢幼虫頭部の斑紋形状の違いは種内変異とみなすのが妥当である。今後は、北海道や四国、対馬で起っていると推定される、二次的接触による個体群間の遺伝的相互作用を明らかにして、侵入外来種の影響を分子生態学的にも究明する必要がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。マイクロサテライトマーカーのPCRプライマーの新たな作成にも成功し、今後遺伝子流動の実体を明らかにする手がかりを得た。また、四国や対馬で、本州型ハプロタイプと沖縄型ハプロタイプが同所的に存在することが明らかになり今後遺伝子流動の解明に期待できる。
出芽酵母の接合因子によるPAFの産生機構及び生理機能の解明

PAF(血小板活性化因子)は、高等動物において見出された多彩な生理作用を有するリン脂質である。本研究では、酵母におけるPAFの生理的意義を解明する目的で、接合過程に焦点を絞り、以下の実験を行った。1.酵母細胞の接合過程におけるPAFの産生(1)a接合型(MATa)細胞をα因子処理、(2)MATaとMATα細胞の混合、の2種類の接合反応系を用いた。経時的に菌体より総脂質を抽出しPAFを精製後、ウサギ洗浄血小板の凝集により測定した。その結果、(1)ではα因子処理6090分にPAF産生は最大値を示し、未処理のものの約2倍高くなった。また、(2)においても、12時間後に単独培養時よりも接合によりPAF産生の増大が認められた。(1)(2)両反応系において、カルシウム除去培地やキレート剤を用いて検討した結果、接合前期のPAF産生の増大はCa^<2+>依存的であることが示唆された。2.接合過程におけるPAF産生機構の解明上記の実験と並行して(1)、(2)の接合反応の酵母細胞を経時的に採取し、超遠心により細胞分画を行った。ミクロソーム画分の合成酵素アセチルトランスフェラーゼ活性は、(1)ではα因子未処理のものより、(2)では単独培養の細胞のものよりもそれぞれ高くなっていた。また、細胞質の分解酵素活性は接合により低くなることが明らかとなった。以上より、接合過程前期に見られるPAF産生の増大は、修復系合成経路の亢進によることが示唆された。3.接合過程におけるPAFの生理機能の解明現在、反応系にPAFやレセプターアンタゴニストを添加し、接合への影響(接合突起の形成、凝集、接合など)を検討中である。接合因子の情報伝達系へのPAFの関与について検討することが、今後の問題である。
特異的な反応を用いる有機非電解質の識別と新しいイオン交換膜輸送システムの設計

有機物と無機イオンとの特異的な反応と膜透過を組み合わせることにより、膜による有機の識別輸送を行なうことが可能である。本研究では、アルデヒドあるいは糖と亜硫酸水素イオンとの付加物生成反応、糖とほう酸の錯形成反応およびこれらの有機物の酸解離反応を利用することにより、アルデヒドや糖を陰イオン交換膜によって選択的に輸送させることを試みた。膜のイオン型を変えてアルデヒドの輸送速度を測定したところ、塩化物イオン型の時は輸送されないが、亜硫酸水素イオン型にすることにより、ホルムアルデヒドは膜内の亜硫酸水素イオンと反応してヒドロキシメタンスルホン酸イオン(HMSA)となり、HMSAの生成と分解をくり返しながら、濃度差に基づいてホッピング輸送されることが明らかになった。受相に亜硫酸水素イオンを添加すると、膜内のHMSAイオンと受相の亜硫酸水素イオンとの間のイオン交換反応のために輸送速度は大きく増大し、亜硫酸水素イオンの濃度によってはホルムアルデヒドの濃縮も可能となった。さらに、これらのことから透過機構を考察し、透過式の誘導を行なった。その結果、原相濃度によって流束が大きく変化し流束の限界値が存在することが予測され、実験的にも確かめられた。また、亜流酸水素イオンとの付加物生成定数の違いにより、種々のアルデヒドの分離も可能であった。同様なことは糖に関しても確かめられ、糖の促進輸送、各種の糖の相互分離も可能となった。以上のように、非電解質との特異的な反応を利用した膜透過システムにより有機物の選択的な透過、濃縮が可能となった。金属イオンの膜透過の報告は多いが、有機非電解質の選択的透過についてはほとんど報告がない。本研究では、アルデヒドが亜硫酸水素イオンと特異的に反応してヒドロキシアルカンスルホン酸(HASA)イオンとなることを利用してアルデヒドを識別したのち、陰イオン交換膜によって選択的に輸送させることを試み、その透過機構の検討を行った。得られた研究成果の要点を列記すると以下の通りである。1.陰イオン交換膜に様々なイオンを保持させてホルムアルデヒドの輸送を測定したところ、Cl型の膜ではほとんど輸送されていないが、膜をHSO_3型にすることにより、ホルムアルデヒドは膜内の亜硫酸水素イオンと反応しながら濃度差に基づいてホッピング輸送された。さらに受相側へ亜硫酸水素ナトリウムを添加すると、濃度差に基づく輸送だけではなくイオン交換が働くため輸送速度は増大した。2.HSO_3型の膜について、輸送速度の濃度依存性を測定したところ、アルデヒドの流束は濃度の0.6乗に比例するという興味ある結果が得られた。膜をCl型とすると、アルデヒドは漏れによる輸送となり、流束は濃度差に比例した。3.様々なアルデヒドについて、HSO_3型膜内の輸送速度を測定したところ、HASA生成定数の大きいアルデヒドほど効率よく輸送された。4.以上の結果より、アルデヒドはこの系の中で亜硫酸水素イオンとの付加物を膜内で生成しながら濃度差に基づくホッピング輸送とイオン交換により輸送されることが確認された。今後さらに膜への分配過程と放出過程の検討、輸送速度式の確立を試み、これらの結果に基づいて糖とホウ酸等の他の有機非電解質の系への展開を図るとともに、アルデヒドから糖を生じるホルモ-ス反応の膜システム内での制御にまで、研究を発展させる予定である。アルデヒドは亜硫酸水素イオンと特異的に反応してヒドロキシアルカンスルホン酸イオンとなる。本研究では、この反応を利用したアルデヒドの陰イオン交換膜による選択的輸送挙動について解析するとともに、アルデヒドの濃度勾配に逆らった輸送、濃縮を行なった。さらに、膜による反応制御の目的で、同様な膜システム内において、アルカリ溶液中でアルデヒドから糖を生成するホルモ-ス反応を検討した。

膜のイオン型を変えてアルデヒドの輸送速度を測定したところ、塩化物イオン型の時は輸送されないが、亜硫酸水素イオン型にすることにより、ホルムアルデヒドは膜内の亜硫酸水素イオンと反応してヒドロキシメタンスルホン酸イオン(HMSA)となり、HMSAの生成と分解をくり返しながら、濃度差に基づいてホッピング輸送されることが明らかになった。受相に亜硫酸水素イオンを添加すると、膜内のHMSAイオンと受相の亜硫酸水素イオンとの間のイオン交換反応のために輸送速度は大きく増大し、亜硫酸水素イオンの濃度によってはホルムアルデヒドの濃縮も可能となった。他のアルデヒドの輸送速度については、硫黄(IV)との付加物の安定度定数の大きいものほど輸送量は大きくなった。さらに、陰イオン交換膜を組み込んだシステム内におけるホルモ-ス反応については、陰イオン交換膜を介して水酸化物イオンが反応系内に供給されることによりホルモ-ス反応が促進されることが明らかになった。また、ギ酸が系から除去されてクロスカニッツァロ反応が促進されることにより、生成する糖の組成の変化も示唆された。この系とアルデヒドの選択輸送の系を結合するなら、アルデヒドを含む有機物の混合溶液から糖が効率よく生成されることになる。このように反応系を組み込んだ膜システムは、有機物の選択的透過、濃縮、および生体系と同様の反応制御を可能にすることが示された。
Angiopeptinの移植心冠動脈狭窄抑制効果の検討

近交系ラットの雄性ACIラットをドナー、雄性Lewisラットをレシピエントとして用い、腹腔内に異所性心移植を行った。移植心生着モデルに投与した免疫抑制剤により上6群に分類し、I群、II群、IV群、V群のAngiopeptin末投与について最長90日目の移植心冠動脈の変化を検討した。(免疫抑制剤の種類及び量により、冠動脈硬化様病変に差をきたすかどうかの検討。この結果については現在投稿中)その結果、移植心の浸潤細胞の同定によるRejection grade scoreは、I群:2.2±0.5、II群:0.4±0.5、IV群:2.1±0.6、V群:0.3±0.5、更に冠動脈狭窄率をみると各々、31.8±7.0%、4.8±5.6%、34.3±7.2%、3.7±4.8%と拒絶反応を抑制すれば、冠動脈狭窄率も低下することが判明した。Angiopeptinの連続併用効果について、現在III群、VI群では10日目、20日目、1ケ月(30日)目の移植心冠動脈の変化を検討中であるが、30日目におけるAngiopeptin併用免疫抑制剤少量群では、冠動脈狭窄はきたしていない。しかし今後これについては、90日目の上記結果と比較検討することが必要で、現在、その有効性について結論を出すに至っていない。尚、各種免疫抑制剤の血中濃度測定も併用して行ったが、cyclosporine 5mg/kg/day及びFK506 0.25mg/kg/day投与群中でも血中濃度に差を認め、冠動脈狭窄の程度は、各々の免疫抑制剤の血中濃度に依存する傾向を示している。(現在検討中)近交系ラットの雄性ACIラットをドナー、雄性Lewisラットをレシピエントとして用い、腹腔内に異所性心移植を行った。(現在検討中)
時系列地図表示システムの開発とその教育分野での応用に関する研究

本研究では、時系列的な地図データを扱うソフトを開発し、データを整備することによって、教育現場でのGISの活用を目指した。平成17年度では、ラスター型の時系列地形図閲覧ソフト『今昔マップ』(首都圏編)を開発し、教員を含めて200部ほどを配布した。このソフトは平成19年2月に行われた日本地理学会地理教育専門委員会主催の講習会でも使用され、好評を博した。平成18年度には、「昭和の大合併」以前の市区町村境地図データの整備を行った。地図データは昭和5年前後に発行された1/50,000地形図をもとに作成し、昭和20年代までの「昭和の大合併」以前の国勢調査等の市区町村別統計データを地図化できるようにした。整備の手順としては、3大都市圏の範囲で地形図ごとに白地図画像を作成し、筆者開発の「MANDARA」の白地図処理機能を用いてベクトルデータに変換し、その後にそれぞれの地形図の領域を結合していった。平成18年度中に、三大都市圏のうち首都圏分についての地図データが完成し、ホームページで公開した。また、明治期の埼玉県の町並を知る貴重な資料である『埼玉県営業便覧』を用いて、埼玉県の町の商店の業種構成を分析し、前述の地図データで地図化した。この研究成果は、小学校・中学校における身近な地域の歴史学習などにも利用できるであろう。従来GISの教育現場への普及の問題点としてあげられていた、コンピュータなどのハードウェアや、高価なソフトウェア・地図テータの問題は、現在かなり解決されつつあると考えられている。しかしながら、これまで初等・中等教育においてGISを利用してきた教員はコンピュータに詳しい一部の教員に限られており、それに続く利用者層の拡大が必要である。従来のGISを利用した教育実践の報告の多くは、生徒自身によるGISの操作に重点を置いたものがほとんどであった。しかしながら、生徒自身がGISを操作する授業はかなりの時間を必要とし、教員側の準備にかかる負担も大きいのが実際であり、今後は生徒自身が利用するGISだけでなく、閲覧・資料提示型のGISを検討する必要が大きいと考えられる。閲覧・資料提示型のGISの中でも、過去の地形図と現在の地形図を比較することを目的とした既存ソフトは存在せず、潜在的ニーズは大きい。こうしたことから、Windows上で動作するソフトウェアである、時系列地形図閲覧ソフト「今昔マップ」(首都圏編)を開発した。このソフトは、およそ東京50km圏に含まれる1/25000地形図62図幅分について、大正時代から現在まで8時点をスキャナで取り込み、処理を施して時期を変更しながらスムーズにスクロールさせて表示することができるソフトである。地形図画像データ以外には、標高および地名データを用意した。開発した「今昔マップ」の機能としては、移動、ジャンプ、拡大・縮小、標高色変更、印刷、時期変更等であり、閲覧用のソフトとして十分な機能を備えている。公開に際しては国土地理院に対して使用承認申請を行い、承認を得た。このソフトはDVDとして300部複製し、現在配布中である。
細胞内チロシンリン酸化のリアルタイム画像化法の開発

タンパク質チロシンリン酸化を捉えるための蛍光プローブ開発を目的として研究を行なった。まずpEGFP-N、-Cベクター(Clontech)にGrb2/Ash、PLCγ1のSH2ドメインを組み込み、各種GFP-SH2発現ベクターpEGFP-SH2を作製した。これらを大腸菌で発現させ、GFPと同じ蛍光特性を有する融合タンパク質4種を得た。しかしpEGFP-SH2をHeLa、RBL-2H3、HepG2等に導入、発現は確認できたが、リン酸化刺激による再現性のある顕著な蛍光局在の変化は観察されなかった。そこで蛍光特性の異なるGFP変異体(CFP、YFP)間のFRETを利用して、リン酸化を蛍光波長の変化としてとらえるプローブ作製を試みた。CFP-SH2(Grb2/Ash)-YFP、YFP-SH2(Grb2/Ash)-CFP、YFP-SH2(PLCγ1)-CFP発現プラスミドを作製した。これら融合タンパク質を評価するため、EGF受容体やPDGF受容体βの配列中のSH2ドメインによって認識されるチロシン残基を中心とした20残基のペプチド、およびそのチロシンリン酸化ペプチドを化学合成した。大腸菌に発現させて得た各YFP-SH2-CFPを合成ペプチドとインキュベートし、チロシンリン酸化の有無による蛍光変化を測定したところ、YFP-SH2(PLCγ1)-CFPで変化がみられた。さらにもう一つの試みとして、チロシンリン酸化の基質となる配列(EGF受容体、PDGF受容体等)のN末端、C末端にCFP、YFPを持つ融合タンパク質発現プラスミドを作製した。発現させたこれら融合タンパク質を細胞(HeLa、RBL-2H3等)溶解液、ATP、EGF(PDGF)とともにインキュベートしてチロシンリン酸化反応にともなう蛍光変化を測定したところ、CFP-(PDGF受容体のチロシンリン酸化部位±10残基)-YFPにおいて、ATP濃度依存的な蛍光変化(527nm/475nmの減少)が観察された。以上の作製した各種プラスミドを各種細胞に導入し融合タンパク質を発現させ、画像取得しているが、細胞内ではリン酸化刺激に伴う蛍光変化の検出には成功していない。チロシンキナーゼ情報伝達系において、タンパク質がチロシンリン酸化をうけた後、細胞内の各種機能分子がリン酸化部位を認識してタンパク質に結合し、その結果機能分子が活性化をうけ、さらに情報が下流に伝わることが明らかとなっている。その際機能分子がリン酸化部位を認識するにあたっては、SH2領域あるいはSH3領域と呼ばれるこれら機能分子に共通した相同領域が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。したがってSH2領域を有する機能分子をプローブとして用いることにより、チロシンキナーゼ情報伝達系において重要な役割を果たすリン酸化部位を特異的に検出することが可能になるととも、さらに機能分子の動きを画像化することにより情報が下流に伝わる経路の解析にも利用できる可能性が生まれる。そこでSH2領域を有する機能タンパク質分子であるホスホリパーゼCγ(530-850)およびGRB2(1-217)のCy2およびCy3.5による標識を試みた。その結果、ホスホリパーゼCγについてはCy2およびCy3.5についてそれぞれ1分子あたり2.8分子および2.7分子が標識されていると概算された。

一方GRB2についてはどちらも2.0分子標識されていると概算された。次に蛍光標識ホスホリパーゼCγをMDCK細胞にマイクロインジェクションし、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、多くの細胞で形質膜への分布が検出された。この細胞をEGF5μg/mlを30分処理してみたところ、細胞質への蛍光の核酸が観察され。今後GRB2との局在の違い、およびGFPで標識したタンパク質を発現させ、局在の違いを検討する予定である。チロシンキナーゼ情報伝達系において、タンパク質がチロシンリン酸化をうけた後、細胞内の各種機能分子がリン酸化部位を認識してタンパク質に結合し、その結果機能分子が活性化をうけ、さらに情報が下流に伝わることが明らかとなっている。その際機能分子がリン酸化部位を認識するにあたっては、SH2領域あるいはSH3領域と呼ばれるこれら機能分子に共通した相同領域が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。したがってSH2領域を有する機能分子をプローブとして用いることにより、チロシンキナーゼ情報伝達系において重要な役割を果たすリン酸化部位を特異的に検出することが可能になるととも、さらに機能分子の動きを画像化することにより情報が下流に伝わる経路の解析にも利用できる可能性が生まれる。そこで初年度チロシンリン酸化のプローブとしてSH2領域を有する機能タンパク質分子であるCy-2およびCy3.5標識ホスホリパーセCγ(530-850)およびGRB2(1-217)を作製した。今年度はこれら蛍光プローブをMDCK細胞以外にHela細胞や初代培養肝細胞へもマイクロインジェクションにより注入し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内の挙動を画像化した。どちらの細胞でも、多くの細胞では形質膜付近への分布が観察されたが、細胞をEGF処理すると、蛍光は細胞全体へ拡散し、特にGRB2では核への分布が観察された。また初代培養肝細胞ではHGF刺激でも同様の変化が観察され、この変化はαアドレナリン性刺激あるいはバソプレシン刺激では観察されなかった。以上の局在の変化はゲニステインによって阻害された。たんぱく質のチロシンリン酸化を画像化するためのプローブを開発するためsrc homology domain(SH-ドメイン)を含む機能分子と緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合タンパク質を作成し、その特性を調べた。まずpEGFP-N、pEGFP-Cベクター(Clontech)にGrb2/Ash、PLCγ1、P13Kp85のSH2ドメインを組み込み、EGFP-SH2融合タンパク質発現プラスミドを作製した。pGEX-3XのBamHl、EcoRlサイトに組み込まれたSH2ドメインを制限酵素で切り出しpEGFPベクターのBglll、EcoRlサイトに組み込み、GFPのN末端側、C末端側にSH2ドメインを融合した6種類のプラスミドを得た。作製したプラスミドをHeLa、COS-7細胞等に導入し、融合タンパク質の発現の確認を行った。上記培養細胞にSuperFect reagent(Qiagen)を用いて目的遺伝子を導入し、一日後、細胞をSDSサンプルバッファーに溶解、5分間95°Cで加熱した。