hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フェライト鋼における変態超塑性を応用したSPF技術研究

本課題は、変態超塑性を応用した革新的超塑性成形(SPF)技術に関する研究である。超塑性は、大きく分けて「微細粒超塑性」と「変態超塑性」という種類に分けて考えることができ、前者は、その引っ張りによる巨視的延性を利用し、圧縮加工技術に応用されてきた。そこで本研究では、これまでほとんど着目されてこなかった変態超塑性という種類の超塑性を利用し、低荷重・高延性による圧縮加工のための実験を計画した。昨年度は研究期間の初年度であった。本研究期間において最も重要となるのが、主装置である熱変動圧縮試験装置である。本装置全体は、既存の汎用装置としては存在せず、すべてカスタマイズし、組み上げる必要があった。そこで昨年度は、この試験装置の組上げを行った。その成果として、主部品はすべて納入し、設置・加熱なしによる試運転を行うことに成功した。このような実験室レベルの熱変動圧縮装置を組上げた例はきわめて珍しく、この組上げ時点で非常に貴重な成果であると考えている。特筆すべき点として、本装置が、これまで先行研究で行ってきた変態超塑性実験による「引張試験」の台座を応用し、圧縮機および周辺装置をオリジナルに装着することによりデザインされている点があげられる。これが意味するところとして、先行研究の引張試験の実験ノウハウを圧縮試験に生かすことができるという点が考えられる。このように、先行研究との連結がとれ、次期研究へ知見をフィードバックできるよう装置を組み上げたことも大きな成果であると考えている。課題の年度ごとの予定計画として、この課題実施に向け、「1年目における主装置となる熱変動圧縮試験装置および周辺装置の準備」、「25年度における圧縮変形試験および組織観察」を計画していた。今年度は、主部品すべての搬入・設置を行い、加熱なしによる圧縮機および油圧ユニットの確認を行った。この時点で危惧された圧縮台座の傾きによる座屈や荷重の負荷不足は見られず、荷重が正確に圧縮台座に負荷されていることを確認した。この確認を経て、加熱なしによる実験前仮試験は成功したといえる。さらにこれからの試験における安全性を確保する上で重要となるのが「圧縮棒の固定」である。次年度以降には加熱し同様の実験を試みるわけだが、この時、圧縮棒(耐熱性金属棒)も同時に熱せられる。つまり高温となる金属棒をどのように固定するかは、安全性に配慮した持続的な研究をするためには必要不可欠な課題でもある。特に、圧縮試験による圧縮棒は引張試験によるワイヤーとは大きく異なり、その取り付けは重要であった。その固定に関しては、これまでにない装置のため非常に困難であったが、二重のクランプ方式を採用し、圧縮棒上下ともに滑落および座屈がないよう設計した。これらのシャフト連結部が完成したことにより、試運転開始が実現した。以上のように、今年度は当初計画していた準備段階は十分に満たしていると判断した。さらに現在は、当初より計画を早め、予備試験に着手している。これは、組み上げた装置を実際に起動し、試験材なしで加熱・圧縮をかけ、安全性確認を行う実験である。2年目の主目的は加熱ありの圧縮試験の開始および実際の試料を装填した圧縮試験である。本年度初期段階の計画として、予備試験のさらなる進行を計画している。本試験装置は非常にシンプルかつ扱いやすい装置でありながらも、これまでに実験装置として扱われたことのない装置である。このような試験装置の運用には十分な経験と安全装具の準備が必要となる。具体的な実験内容として、本年度前半は、初めての加熱同時の圧縮を行い、徐々に加熱温度を上昇させる。これにより予想される「シャフト曝露部分の高温化」や「座屈」、「試験体の飛散」などの事象をあらかじめ防止するための措置を講じていく予定である。最終的な温度は先行研究により既に決定されており、1050°Cを目標としている。この温度も先行研究で行ってきた変態超塑性実験による「引張試験」の知見をフィードバックしたものであり、研究の進行方法はそれ以降、引張試験による先行研究に準じていく予定である。2年目の主目的である「実際の試料を装填した圧縮試験」における具体的な内容として、実際の圧縮試験に供するサイズおよび材質(予定通り低放射化鋼JLF-1)の円筒型試験体を作成し、同様の試験を行うことを計画している。特にこの際に重要な検討事項となるのが、「試料温度測定」である。本試験において、試料はシャフトに固定されており、熱電対による測定が困難であることが予想されるが、空冷による冷却速度の測定も非常に重要となる。そこでこの温度測定として、放射温度計を採用することを検討している、これにより直接触れることなく遠隔で表面温度を測定することが可能となり、実験の効率化にもつながると期待している。このように本年度後半は3年目に向け、加熱圧縮試験後の温度測定法を検討する。

本装置全体は、既存の汎用装置としては存在せず、すべてカスタマイズし、組み上げる必要があった。そこで昨年度は、この試験装置の組上げを行った。その成果として、主部品はすべて納入し、設置・加熱なしによる試運転を行うことに成功した。このような実験室レベルの熱変動圧縮装置を組上げた例はきわめて珍しく、この組上げ時点で非常に貴重な成果であると考えている。特筆すべき点として、本装置が、これまで先行研究で行ってきた変態超塑性実験による「引張試験」の台座を応用し、圧縮機および周辺装置をオリジナルに装着することによりデザインされている点があげられる。これが意味するところとして、先行研究の引張試験の実験ノウハウを圧縮試験に生かすことができるという点が考えられる。このように、先行研究との連結がとれ、次期研究へ知見をフィードバックできるよう装置を組み上げたことも大きな成果であると考えている。課題の年度ごとの予定計画として、この課題実施に向け、「1年目における主装置となる熱変動圧縮試験装置および周辺装置の準備」、「25年度における圧縮変形試験および組織観察」を計画していた。今年度は、主部品すべての搬入・設置を行い、加熱なしによる圧縮機および油圧ユニットの確認を行った。この時点で危惧された圧縮台座の傾きによる座屈や荷重の負荷不足は見られず、荷重が正確に圧縮台座に負荷されていることを確認した。この確認を経て、加熱なしによる実験前仮試験は成功したといえる。さらにこれからの試験における安全性を確保する上で重要となるのが「圧縮棒の固定」である。次年度以降には加熱し同様の実験を試みるわけだが、この時、圧縮棒(耐熱性金属棒)も同時に熱せられる。つまり高温となる金属棒をどのように固定するかは、安全性に配慮した持続的な研究をするためには必要不可欠な課題でもある。特に、圧縮試験による圧縮棒は引張試験によるワイヤーとは大きく異なり、その取り付けは重要であった。その固定に関しては、これまでにない装置のため非常に困難であったが、二重のクランプ方式を採用し、圧縮棒上下ともに滑落および座屈がないよう設計した。これらのシャフト連結部が完成したことにより、試運転開始が実現した。以上のように、今年度は当初計画していた準備段階は十分に満たしていると判断した。さらに現在は、当初より計画を早め、予備試験に着手している。これは、組み上げた装置を実際に起動し、試験材なしで加熱・圧縮をかけ、安全性確認を行う実験である。2年目の主目的は加熱ありの圧縮試験の開始および実際の試料を装填した圧縮試験である。本年度初期段階の計画として、予備試験のさらなる進行を計画している。本試験装置は非常にシンプルかつ扱いやすい装置でありながらも、これまでに実験装置として扱われたことのない装置である。このような試験装置の運用には十分な経験と安全装具の準備が必要となる。具体的な実験内容として、本年度前半は、初めての加熱同時の圧縮を行い、徐々に加熱温度を上昇させる。これにより予想される「シャフト曝露部分の高温化」や「座屈」、「試験体の飛散」などの事象をあらかじめ防止するための措置を講じていく予定である。最終的な温度は先行研究により既に決定されており、1050°Cを目標としている。
月経周期を考慮した体重階級制アスリートにおける減量法の確立

レスリングなどの体重階級制競技選手の多くは、試合前の計量にて規定体重を下回る必要があるため、食事制限、水分制限を用いて減量をおこなう。女性アスリートのウェイトコントロールは、周期的に性ホルモン濃度が増減する月経周期を考慮して取り組むべきである。しかし、脱水を主とした急速減量と月経周期の関係は明らかとなっていない。そこで本研究は、脱水を主とした急速減量によって引き起こされる性ホルモン応答、体内水分量および血中電解質濃度の動態を明らかにし、体重階級制女性アスリートの最適な減量方法を確立することを目的とする。
好熱菌蛋白質の熱安定化機構の熱力学的研究

蛋白質は生命現象を司る最も重要な成分である。その蛋白質の生合成過程の研究ならびに機能を持つ蛋白質の作用機作に関する研究は近年めざましい進展を遂げている。しかし、機能発現の土台となる蛋白質の物性とりわけ構造の安定化に関する研究は遅れている。最近、遺伝子操作によって、蛋白質のアミノ酸配列を自由に変換できるようになったが、望みの物性に(例えば熱安定性の高い蛋白質に)変換するためのアミノ酸置換のルールはまだ確立されていない。本研究は蛋白質の立体構造の安定化機構を構成アミノ酸残基の役割に関連づけて解明することを目標にしている。具体的には、(1)高温においては、蛋白質の安定化に及ぼす水和の効果が減少し、安定化の機構解明には系が単純化されるという利点が予測できたので、熱安定性の高い好熱菌蛋白質と、(2)モデル蛋白質としてヒト・リゾチームとその変異型の熱安定化機構に焦点を絞った。研究方法は熱測定の方法を主体にし、蛋白質の熱安定化に関する熱力学的基礎を確立し、蛋白質の安定化の法則性を見いだすことを本研究の目的としている。(1)超高度好熱菌蛋白質の熱安定化機構100°C以上に至適温度を持つ超高度好熱菌、Pyrococcus furiosus、が生産する蛋白質の内、αアミラーゼ、ピログルタミルペプチダーゼ(PGP)、及びメチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)をコードする遺伝子をpTV118NプラスミドのSalIサイトにクローニングした。これらの3種の蛋白質を大腸菌で大量生産することに成功している。精製された3種の蛋白質の基礎的な物理化学的測定を行った。それぞれの蛋白質の等電点、分子量、CD及び吸収スペクトルの測定を行った。PGPはSS結合を介して2量体を作り、N状態では全体として四量体として存在していることが分かった。他の2種の蛋白質はいずれもモノマーで存在していることがわかった。3種の蛋白質を示差走査熱量計(DASM4)を用いて、種々のpHで熱測定を行い変性の熱力学的パラメータをもとめた。いずれの蛋白質も生理的条件では変性温度が100°C以上となり、常温生物の蛋白質のに比べ50°C以上も高かった。得られた熱力学的パラメータは、常温生物蛋白質から推定できるもの異なり、ここの蛋白質での詳細な検討の必要性を示した。特にPGPの場合、118位のCysが分子間会合をしていることが分かったので、C118S変異型を作製し、野生型との比較を行った。C118S変異型の熱変性は良好な可逆性を示したので今後の解析が期待できる。尚、野生型の異常な熱安定性はCys118の分子間結合によることが分かった。好熱菌蛋白質の熱安定性がSS結合によっているという結果は、これまでの常識に反するものであるが、化学的に不安定なSS結合が超高度好熱菌蛋白質の安定化に重要な役割を果たしていることを示している。更に、PGPの変性と復元の速度論的研究から、PGPの安定化は変性速度の異常な低下に起因していることが分かった。(2)モデル蛋白質としてのヒト・リゾチーム変異型の研究モデル蛋白質として、ヒト・リゾチーム変異型、Ile→Val(5箇所:23,56,59,89と106位)とVal→Ala(9箇所:2,74,93,99,100,110,121,125と130位)の14種の変異型を作製し、それらの変異型蛋白質の熱測定とX線結晶解析を行なった。14種の変異型全ての熱変性の熱力学的パラメーターを高性能断熱型示差走査熱量計(DASM4)を用いて求めた。Ile→Val変異型は同じ性質の置換であったが、変性のギブスエネルギーの差は0.4から1.2kcal/molの変化を示した。また、変性のエンタルピー変化は0.6から-6.0kcal/molの変化を示した。これらの結果は同じ性質の置換であっても置換部位構造上の特徴によって種々に安定性へ寄与することを示した。また、大きな変性のエンタルピーの変化はエントロピー項によって相殺され、安定性の変化の程度を低めるのに役立っていることが分かった。同様の結果はVal→Ala変異型においても見られた。以上述べた成果は日本側で得られたものであるが、親密な研究討議と交流によって双方にとって本研究課題に関する研究が着実に発展させられたと確信できる。

研究方法は熱測定の方法を主体にし、蛋白質の熱安定化に関する熱力学的基礎を確立し、蛋白質の安定化の法則性を見いだすことを本研究の目的としている。(1)超高度好熱菌蛋白質の熱安定化機構100°C以上に至適温度を持つ超高度好熱菌、Pyrococcus furiosus、が生産する蛋白質の内、αアミラーゼ、ピログルタミルペプチダーゼ(PGP)、及びメチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)をコードする遺伝子をpTV118NプラスミドのSalIサイトにクローニングした。これらの3種の蛋白質を大腸菌で大量生産することに成功している。精製された3種の蛋白質の基礎的な物理化学的測定を行った。それぞれの蛋白質の等電点、分子量、CD及び吸収スペクトルの測定を行った。PGPはSS結合を介して2量体を作り、N状態では全体として四量体として存在していることが分かった。他の2種の蛋白質はいずれもモノマーで存在していることがわかった。3種の蛋白質を示差走査熱量計(DASM4)を用いて、種々のpHで熱測定を行い変性の熱力学的パラメータをもとめた。いずれの蛋白質も生理的条件では変性温度が100°C以上となり、常温生物の蛋白質のに比べ50°C以上も高かった。得られた熱力学的パラメータは、常温生物蛋白質から推定できるもの異なり、ここの蛋白質での詳細な検討の必要性を示した。特にPGPの場合、118位のCysが分子間会合をしていることが分かったので、C118S変異型を作製し、野生型との比較を行った。C118S変異型の熱変性は良好な可逆性を示したので今後の解析が期待できる。尚、野生型の異常な熱安定性はCys118の分子間結合によることが分かった。好熱菌蛋白質の熱安定性がSS結合によっているという結果は、これまでの常識に反するものであるが、化学的に不安定なSS結合が超高度好熱菌蛋白質の安定化に重要な役割を果たしていることを示している。更に、PGPの変性と復元の速度論的研究から、PGPの安定化は変性速度の異常な低下に起因していることが分かった。(2)モデル蛋白質としてのヒト・リゾチーム変異型の研究モデル蛋白質として、ヒト・リゾチーム変異型、Ile→Val(5箇所:23,56,59,89と106位)とVal→Ala(9箇所:2,74,93,99,100,110,121,125と130位)の14種の変異型を作製し、それらの変異型蛋白質の熱測定とX線結晶解析を行なった。14種の変異型全ての熱変性の熱力学的パラメーターを高性能断熱型示差走査熱量計(DASM4)を用いて求めた。Ile→Val変異型は同じ性質の置換であったが、変性のギブスエネルギーの差は0.4から1.2kcal/molの変化を示した。また、変性のエンタルピー変化は0.6から-6.0kcal/molの変化を示した。これらの結果は同じ性質の置換であっても置換部位構造上の特徴によって種々に安定性へ寄与することを示した。また、大きな変性のエンタルピーの変化はエントロピー項によって相殺され、安定性の変化の程度を低めるのに役立っていることが分かった。同様の結果はVal→Ala変異型においても見られた。以上述べた成果は日本側で得られたものであるが、親密な研究討議と交流によって双方にとって本研究課題に関する研究が着実に発展させられたと確信できる。本研究課題の内、我が方が担当している研究は、好熱菌蛋白質の耐熱化の原因と考える因子を常温菌蛋白質でその因子がどの様に働くかを変異蛋白質を用いて確認することである。今年度得られた結果の内、特徴的なものを列挙する。(1)トリプトファン合成酵素α
新概念に基づく骨芽細胞分化制御機構の解明と鎖骨頭蓋骨異形成症に対する治療薬の開発

鎖骨頭蓋骨異形成症(CCD)はRUNX2遺伝子のヘテロ欠損変異に起因する骨芽細胞分化異常を伴う遺伝性骨疾患で、膜性化骨低形成などを呈するが、治療法はほとんど知られていない。一方、核膜タンパク質の異常はラミノパチーという一連の疾患群を引き起こすことが知られているが、骨組織でのラミノパチーの報告は無く、我々はCCDがRUNX2機能低下を介した核構造崩壊に伴う転写制御異常に起因するラミノパチーではないかと考えた。そこで本研究ではRUNX2の核膜構造制御を介した新たな骨芽細胞分化制御機構を解明するとともに、他のラミノパチーで試みられている薬剤がCCD治療薬として利用できるか否かについて検討する。
聴覚末梢系における機能低下を模擬した聴覚障害シミュレータに関する研究

聴覚障害の中で多くの比率を占める感音性難聴は,聴覚末梢系である内耳の有毛細胞や内耳から脳中枢系に接続される聴神経の機能低下・機能不全に起因する.本研究は,聴覚末梢系で生じる聴覚障害を模擬するリアルタイムシミュレータを開発することを最終的な目標としている.今回の研究期間中の研究実績として,聴覚障害において聴覚末梢系で生じる機能低下現象に関する論文調査の実施,および,これらの機能低下現象を客観的に測定するための各種計測装置の準備を行った.聴覚障害の中で多くの比率を占める感音性難聴は,聴覚末梢系である内耳の有毛細胞や内耳から脳中枢系に接続される聴神経の機能低下・機能不全に起因する.聴覚末梢系で生じている機能低下・機能不全を客観的に測定することで聴覚障害者個々人が持つ聴覚フィルタがどのような特性になっているかを推定し,それを再現することで個人が持つ聴覚障害の「聴こえ」の状態を模擬することが可能である.本研究では,聴覚障害を模擬するリアルタイムシミュレータを開発することを目的とし,同時に,聴覚フィルタの推定やその再構成方法などの関連技術の構築も行う.聴覚障害の「聴こえ」が体感できることにより,聴覚障害に対する社会的啓蒙の一助になることが期待される.感音性難聴の原因は聴覚末梢系の機能低下・機能不全に起因するが,聴覚末梢系でどのような現象が生じているかは,未だ解明されていない領域が多く存在する.断片的な聴覚障害の現象として捉えた報告[Brian C. J. Moore, Cochlear Hearing Loss Second Edition, Wiley, 2007.など]によると,聴覚末梢系の機能低下・機能不全により,聴覚障害者の聴覚末梢系の機能低下として,以下の3つの現象が観測されることが知られている.1.聴力閾値の上昇,2.聴覚フィルタの拡幅,3.リクルートメント(聴覚補充現象)平成27年度は,先に挙げた聴覚障害において聴覚末梢系で生じる機能低下現象に関する論文調査を主に実施した.また同時並行して,これらの機能低下を客観的に測定するための装置が入手または作成が可能かどうか等に関して調査を行った.論文調査に関しては,結果をまとめている段階である.本研究では,聴覚障害の聴こえの状態を再現する聴覚障害リアルタイムシミュレータの開発のために,研究項目を以下に分類して実施する計画である.a.聴覚末梢系の機能低下・機能不全に関する各種測定,b.測定結果に基づく聴覚フィルタの再構成,c.再構成した聴覚フィルタのシミュレータへの実装項目a.では,ヒトの聴こえの認知面を基礎とする心理物理実験により,聴覚障害の聴覚末梢系の機能低下・機能不全を測定指数値化する技術が必要になる.項目b.では,測定した聴覚末梢系の機能低下・機能不全の結果をもとに,被験者個人個人の持つ聴覚フィルタを推定,再構築するために,認知物理的側面と工学的側面の知識や技術が必要になる.項目c.では,再構築した聴覚フィルタを工学的手法により実際のリアルタイムシミュレータシステムへ実装する技術が必要になる.平成27年度は一つ目の研究実施項目である「聴覚末梢系の機能低下・機能不全に関する各種測定」を実施する.先に述べた通り,聴覚障害における聴覚末梢系の機能低下・機能不全は,断片的ではあるが,以下の3つの代表的な現象として観測することができる.1.聴力閾値の上昇,2.聴覚フィルタの拡幅,3.リクルートメント(聴覚補充現象)計画当初,平成27年度はこれら3つの現象を観測するための各種測定環境の構築を行う予定であった.しかしながら,研究を進める段階で事前調査が不足していることが判明したため,急遽,平成27年度の作業を論文調査に切り替えた.ただし本研究の実施期間は3年を計画しており測定環境整備を急ぐ必要があるため,論文調査と同時に聴覚末梢系の機能低下を客観的に測定できる装置で入手や作成が可能かどうかの調査を実施した.上記の理由から,当初の計画と比較すると計画は遅れていると言わざるを得ず,研究期間までにシミュレータを構築するために,再現する聴覚末梢の機能低下を限定して構築することも視野に入れている.聴覚障害の中で多くの比率を占める感音性難聴は,聴覚末梢系である内耳の有毛細胞や内耳からの脳中枢系に接続される聴神経の機能低下・機能不全に起因する.聴覚末梢系で生じている機能低下・機能不全を客観的に測定することで聴覚障害者個々人が持つ聴覚フィルタがどのような特性になっているかを推定し,そのフィルタを再現することで,個人が持つ聴覚障害の「聴こえ」の状態を模擬することが可能である.本研究では,聴覚障害を模擬するリアルタイムシミュレータを開発することを目的とし,同時に,聴覚フィルタの推定やその再構成方法などの関連技術の構築も行うことを目標とする.聴覚障害の「聴こえ」が体感できることにより,聴覚障害に対する社会的啓蒙の一助になることが期待される.感音性難聴の原因は聴覚末梢系の機能低下・機能不全に起因するが,聴覚末梢系でどのような現象が生じているかは,未だ解明されていない領域が多く存在する.断片的な聴覚障害の現象を捉えた報告[Brian C. J. Moore, Cochlear Hearing Loss Second Edition, Wiley, 2007.など]によると,聴覚末梢系の機能低下・機能不全により,聴覚障害者の聴覚末梢系として以下の3つの現象が観測されることが知られている.1.聴力閾値の上昇,2.聴覚フィルタの拡幅,3.リクルートメント(聴覚補充現象)の3現象である.

平成28年度は,平成27年度に引き続き,先に挙げた聴覚障害において,聴覚末梢系で生じる機能低下・機能不全に関する論文調査を実施した.また,同時並行して,これらの機能低下を客観的に測定するための計測機器関連の調査を行った.これらの結果として,外耳道からの音響的入射音に対する反応から内耳の外有毛細胞の状態を測定する耳音響放射装置を導入した.同時に,シミュレータをPC上に再現する方法,および,ハードウェア実装のために必要となる部品や装置に関して選定調査を行った.本研究では,聴覚障害の聴こえの状態を再現する聴覚障害リアルタイムシミュレータの開発のために,研究項目を以下のように分類した.a.聴覚末梢系の機能低下・機能不全に関する各種測定,b.測定結果に基づく聴覚フィルタの再構成,c.再構成した聴覚フィルタのシミュレータへの実装の3項目である.平成28年度は一つ目の研究実施項目である「聴覚末梢系の機能低下・機能不全に関する各種測定」のための調査等を実施し,目的となる測定が可能かどうかを検討した.聴覚障害における聴覚末梢系の機能低下・機能不全は,断片的ではあるが,以下の3つの代表的な現象として観測することができる.1.聴力閾値の上昇,2.聴覚フィルタの拡幅,3.リクルートメント(聴覚補充現象)計画当初,昨年度および今年度はこれら3つの現象を観測するための各種測定環境の構築を行う予定であった.しかしながら,研究を進める段階で事前調査が不足していると判断し,急遽,論文調査などの調査作業に切り替えた.論文調査と同時に聴覚末梢系の機能低下を客観的に測定するための装置が入手または作成可能かどうか等に関して調査を行い,結果,外耳道からの音響的入射音に対する反応から内耳の外有毛細胞の状態を測定する耳音響放射装置を導入した.同時に,シミュレータをPC上に再現する方法,および,ハードウェア実装のために必要となる部品や装置に関して選定調査を行った.上記の理由から,当初の計画からは遅れていると言える.聴覚障害系の中でも多くの比率を占める感音性難聴は,聴覚末梢系である内耳の有毛細胞や内耳からの脳中枢系に接続される聴神経の機能低下・機能不全に起因する.聴覚末梢系で生じている機能低下・機能不全を客観的に推定することで聴覚障害者の個々人が持つ聴覚フィルタがどのような特性になっているかを推定し,それを再現することで個人が持つ聴覚障害の「聴こえ」の状態を模擬することが可能である.本研究では,聴覚障害を模擬するリアルタイムシミュレーターを開発することを目的とし,同時に,聴覚フィルタの推定やその再構成方法などの関連技術の構築も行う.聴覚障害の「聴こえ」が体感できることにより,聴覚障害に対する社会的啓蒙の一助になることが期待される.感音性難聴の原因は聴覚末梢系の機能低下・機能不全に起因するが,聴覚末梢系でどのような現象が生じているかは,未だ解明されていない領域が多く存在する.断片的な聴覚障害の現象として捉えた報告[Brian C. J. Moore, Cochlear Hearing Loss Second Edition, Wiley, 2007.など]によると,聴覚末梢系の機能低下・機能不全により,聴覚障害者の聴覚末梢系には,以下の3つの機能低下現象が観測されると言われている.
病原性真菌のアゾール抗真菌剤耐性獲得機構に関する分子レベルでの解析

本研究課題ではC.albicansのフルコナゾール耐性DUMC136株を対象として、アゾール耐性機構を標的酵素であるCYP51の変異に注目して解析した。DUMC136株は、アゾール感受性を低下させるような変異を起したCYP51のホモ接合体となることでアゾール耐性を獲得しており、C.albicansのCYP51にはこの領域に変異が蓄積しやすい性質があって、アゾール抗真菌剤の存在する環境でアゾール感受性の低下したCYP51のホモ接合体が選択されることが、アゾール耐性C.albicansが出現する基本機構であろうと推定した。アゾール耐性株と野生株のCYP51を大腸菌内に発現させて精製し、それらの構造とアゾール感受性の変化の関係を解析した。野生株のCYP51との間に二つのアミノ酸置換をもつ耐性株のCYP51では、精製標品による再構成系での触媒活性とフルコナゾール感受性が有意に低下していた他、酸化型のSoret吸収帯の僅かな長波長シフト、還元型CO結合物の安定性の低下など、野生株由来のCYP51とは明らかに異なる性質を示した。最近のM.tuberculosis CYP51の結晶構造解析結果によれば、CYP51_<DUMC>で変異が起こっているCヘリックス領域は可動性が高い領域であり、基質や阻害剤との結合などによる酵素の立体構造変化に関与する可能性が指摘されている。したがって耐性株CYP51のアゾール耐性は、変異によってアゾール化合物と直接相互作用するアミノ酸残基が置換してアゾール化合物との親和性が低下するのではなく、アミノ酸置換による分子全体の立体構造の微妙な変化が間接的にアゾール化合物との反応性を低下させるという機構で生じたものである可能性が高いと結論できる。3年間を予定している本課題研究の開始年度に当たる本年度は、病原性カンジダ酵母からクローニングされたステロール14脱メチル化P450(CYP51)の構造解析とそれを大腸菌内で発現させる基本的条件の検討を行い、以下の成果を得た。1.構造解析とそれに基づく基本的な研究方針の策定:フルコナゾール耐性カンジダ菌由来の変異CYP51分子と感受性株の2つのCYP51対立遺伝子の構造を解析し、フルコナゾール感受性菌のCYP51対立遺伝子が構造の異なる酵素をコードしており、耐性菌のCYP51はその一方に極めて近い構造を有していることを明らかにした。この事実は、対立遺伝子の一方に蓄積した変異が耐性菌出現の潜在的な要因となっていることを示唆する。この点を確認するため、これら3種のCYP51遺伝子を個別に大腸菌内で発現させ、それぞれがコードする酵素の性質を比較することとした。2.大腸菌内発現に関する基本的条件の設定:我々が従来ラットのCYP51や結核菌のCYP51の発現に成功した実績を持つ大腸菌発現系を用いて上記3種のCYP51遺伝子の発現系を構築した。この過程では、カンジダ属酵母のみに存在する特異なコドンの置換、発現ベクターへの組み換えに必須の塩基の置換など多くの技術的困難の克服に時間を要したが、最近になって発現ベクターの構築と予備的な発現に成功した。3.次年度以降の計画など:上記の発現系による3種のカンジダCYP51タンパク質の大量産生条件を検討し、産生されたタンパク質を単離精製する。また、それらの酵素化学的性質を相互に詳細に比較し、酵素タンパク質の構造変化とアゾール抗真菌剤に対する感受性の関係の解析を進める。

3年間を予定している本課題研究の2年目に当たる本年度は、前年度の研究方針と成果に基づいて、フルコナゾール耐性カンジダ菌由来の変異CYP51分子と感受性株の2つのCYP51対立遺伝子を個別に大腸菌内で大量に発現させ、発現タンパク質を精製することを試み、以下の成果を得た。1.フルコナゾール耐性カンジダ由来の変異CYP51遺伝子、感受性カンジダに見出されている2種のCYP51対立遺伝子を個別に大腸菌内で発現させることを試み、何れのCYP51分子種についても安定かつ大量に、大腸菌膜画分内に発現させる条件を確立した。2.個々の分子種の精製に先立って、大腸菌膜画分に回収されたそれぞれの分子種について、触媒活性、温度安定性、フルコナゾールに対する感受性などを検討した。その結果、大腸菌内に発現させた3種のCYP51分子種がほゞ同じステロール14脱メチル化活性を示すこと、膜に結合した状態での温度安定性に関しても3分子種の間で本質的な差が認められないことを見出した。しかし、フルコナゾールに対する感受性に関しては、感受性株の両対立遺伝子から発現させた分子種間では差が認められなかったものの、耐性変異株の遺伝子から発現させた分子種では予想通りの顕著な感受性の低下を確認した。3.それぞれのCYP51分子種を発現させた大腸菌膜画分を出発材料として、CYP51の可溶化、精製実験に着手した。カンジダ菌のCYP51のタンパク質化学的な性質がこれまで手がけてきたサッカロミセス酵母や哺乳動物のCYP51のそれとはかなり異なっているらしく、可溶化した状態での安定性の確保、精製に用いるクロマトグラフィー条件などの確立に時間を要したが、最近になって基本的な条件をほゞ確定することに成功した。次年度においては各分子種の本格的な精製と性質の比較実験を行うことを予定している。本研究課題ではC.albicansのフルコナゾール耐性DUMC136株を対象として、アゾール耐性機構を標的酵素であるCYP51の変異に注目して解析を行なっている。最終年度にあたる本年度は、大腸菌内に発現させたアゾール耐性株と野生株のCYP51(3種類)を精製し、それぞれと酵母から精製したP450還元酵素による再構成酵素系を作成して、個々のCYP51の活性と種々のアゾール化合物に対する感受性の違いを解析した。野生株のCYP51対立遺伝子にコードされている2種のCYP51では、二つのアミノ酸置換があるにもかかわらず、活性、アゾール感受性、分光学的性質に有意な差が見られなかった。しかし、野生株のCYP51との間に2ないし4個のアミノ酸置換をもつ耐性株のCYP51では、活性とフルコナゾール感受性が共に有意に低下していた他、酸化型のSoret吸収帯の僅かな長波長シフト、還元型CO結合物の安定性の低下など、野生株由来のCYP51とは明らかに異なる性質を示した。最近のM.tuberculosis CYP51の結晶構造解析結果によれば、耐性株CYP51で変異が起こっているCヘリックス領域は可動性が高い領域であり、基質や阻害剤との結合などによる酵素の立体構造変化に関与する可能性が指摘されている。したがって耐性株CYP51のアゾール耐性は、変異によってアゾール化合物と直接相互作用するアミノ酸残基が置換してアゾール化合物との親和性が低下するのではなく、アミノ酸置換による分子全体の立体構造の微妙な変化が間接的にアゾール化合物との反応性を低下させるという機構で生じたものである可能性が高いと結論できる。
DNA塩基配列の解析による日本人の起源

制限酵素切断多型による分布で、ヒトmtDNAは、顕著な人種特異性を示す事が知られている。我々は、黒人7人、白人18人、アジア人70人のmtDNA相同領域の塩基配列を決定し、比較分析をおこなった。胎盤よりmtDNAを分離精製し、KpnI、SacIの2重消化を行い、nonーcoding領域(Dル-プ)、約500塩基対の塩基配列を決定した。すでにこの領域の配列が決定されている6個体の配列を含めて計101個体の配列を比較したところ、563塩基のうち113の部位で多型性を示した。これら多型部位のうち、塩基置換によるものが106部位であった。そのうち、transition型置換が91%をしめた。また一塩基の欠失・挿入の起きている部位が7カ所で確察された。また、多型部位の分布を調べたところ、nonーcoding領域中においてもかなりの偏りが観察された。すなわち、Dル-プの開始部(SacI側)には変異が少なく、tRNAーPro側に行くにしたがって多型部位が増大する傾向にあり、Dル-プ内においても機能上の制約に差異があることを示唆している。さらに超可変ドメインがあり、わずか14塩基の領域で、塩基置換・欠失・挿入等で17種類の異なる配列が観察された。すなわち、約60%の個体がAAAACCCCCTCCCCという配列であったが、その他の個体ではCストレッチ内の塩基置換、TからCの置換とそれに伴うCストレッチの伸長とAストレッチの減少などの種々の配列が観察された。以上のようにnonーcoding領域の多型性はいちじるしく、制限酵素切断型多型分析によるnucleotide diversityの値(0.4%)の約4倍の値(1.5%)を示し、ヒトの集団内変異を同定するのに極めて有効な領域であると考えられた。
電子カルテ2次利用システムを用したがん化学療法における副作用危険因子の抽出

【研究目的】がん化学療法を安全かつ確実に遂行するには、がん化学療法レジメン毎の副作用を適切に把握する必要がある。本研究は、電子カルテ記録を基に副作用情報を収集しレジメン毎の副作用に関連する危険因子を明らかにすることで、治療レジメンの選択や副作用の支持療法の強化など、個々の患者の背景に応じた個別化医療を実践に貢献することを目的とする。【研究成果】化学療法を継続する上で臨床的に問題となるGrade3以上の副作用として白血球減少(1例)、好中球減少(3例)、血小板減少(1例)、貧血(1例)、肝機能障害(AST, ALT, ALP上昇)(1名)が認められた。また、白血球数および好中球数が化学療法後の最下点(Nadir)となる期間は投与後7日目(中央値)であり、Nadirの好中球数と年齢に有意な相関が認められた(p<0.05)。Grade3以上の副作用頻度としては少ないが、投与後にASTの上昇を認めた患者は10例(Grade1:8例、Grade2:1例、Grade3:1例)であり、ASTの上昇と関連する因子について現在統計解析中である。
古代エンドウ「ツタンカーメン豆」の調理により生じる着色機構の解明と抗酸化性の解析

エンドウの古代品種である通称ツタンカーメンエンドウは、未熟な豆である実を食する実エンドウである。その実は一般品種と同様に緑色をしているが、加熱によって赤く着色するユニークなエンドウである。また、当該エンドウは一般品種と比較してDPPHラジカル消去活性を指標とした抗酸化性が高いがその抗酸化性成分は未同定である。本研究では、抗酸化成分の同定および調理による抗酸化性の挙動を解析し、さらに、約50%の廃棄部にあたる莢の有効活用の可能性を検討する。上記の目的を達成するために、平成30年度は主に以下の2点について検討した。(1)ツタンカーメンエンドウの加熱調理による抗酸化性の挙動解析各種の調理方法(煮る、煮含める、茹でる、蒸す、電子レンジ加熱、オーブン加熱)によってエンドウを調理し、抽出液のDPPHラジカル消去活性および総フェノール量を測定した。豆の抽出物の抗酸化活性は、ポリフェノール量と高い相関を示し、主な抗酸化成分はポリフェノール類であることが示唆された。加熱によって抗酸化性は約30%低下し、茹でた場合に茹で汁への流出が20%程度認められた。そのため、ツタンカーメン豆の抗酸化性を効果的に利用するためには、煮豆やスープ料理が適すると考えられた。さらに実験動物を用いたin vivoにおける抗酸化性の評価のために用いる試料を大量調製した。(2)ツタンカーメンエンドウの莢の抗酸化成分の同定莢の凍結乾燥試料から酸性エタノールを用いて抗酸化成分を抽出し、DPPHラジカル消去活性を指標に抗酸化成分を追跡した。抗酸化成分およびその加水分解物のHPLC分析ならびにLC-MS/MS解析から成分を同定した。さらに、当該成分を含む莢抽出液を大量に調製し、凍結乾燥品として得た。今後、エンドウ抽出物および莢抽出物を用いて動物実験における抗酸化性の評価を行う予定である。当初の予定では、平成30年度はin vivoにおける豆の抗酸化性の評価までを計画しており、豆由来の試料は調製済みである。当該試験において抗酸化酵素測定用のキットを使用するが、詳細なメカニズムを検討するためには項目の追加が必要となった。しかし、キットは高価であり、計画通りに進めた場合に予算が不足することが判明した。そこで、当初は豆と莢の2種類の評価を別々の年に実施し、キットも2回購入することを予定していたが、同時に測定することでキットの少量化を図り、次年度に実施予定であった莢の抗酸化性の試験と同時に測定することにした。そのため、in vivo実験は次年度に繰り越すことにしたが、一方で次年度に計画していた莢のin vitroの抗酸化性の評価および成分の同定を先行して行った。よって、総合的に判断して、概ね順調に進展していると判断した。令和元年度は、まずin vitroにおける莢の加熱処理前後の抗酸化性の比較を行う。次いで、豆および莢由来の抽出物を用いて、in vivoにおける抗酸化性の評価を実施する。その実は一般品種と同様に緑色をしているが、加熱・保温によって赤く着色する。しかし、その着色の原因となる物質やその着色反応のメカニズムについては、解明されていない。また、ツタンカーメンエンドウは一般品種と比較して、DPPHラジカル消去活性を指標とした抗酸化性が高いが、その抗酸化性成分も未同定である。本研究では、ツタンカーメンエンドウの着色機構の解明、抗酸化性の調理・加工による挙動解析、機能性の評価を計画した。平成29年度は、1)ツタンカーメンエンドウの加熱調理による着色機構の解明、2)ツタンカーメンエンドウの抗酸化成分の同定を目標に研究を実施した。まず、加熱による着色反応のメカニズムの一端を明らかにするために、着色源Xおよび着色成分Yの単離・同定を試みた。着色源Xは、主に実の皮に存在したが、非常に低濃度であった。そこで、皮抽出液から各種クロマトグラフィーによる分画および着色反応による目的成分の追跡を行い、着色源Xを濃縮・単離した。次いで、単離した着色源XのLC-MS/MS分析を実施し、ペアレントイオンおよびそのドーターイオンのクロマトグラムから、目的成分を同定した。着色源Xは、ポリフェノールの一種であり、さらに、着色成分Yは着色源Xの酸化重合体であることを示唆する結果を得た。次いで、ツタンカーメンエンドウの抗酸化性の検討に先立ち、抗酸化成分Zの同定を実施した。DPPHラジカル消去活性を指標に抗酸化成分を追跡し、各種クロマトグラフィーを駆使して抗酸化成分Zを単離した。最終的に、機器分析によって抗酸化成分Zを同定した。今後、調理・加工における抗酸化性の挙動を検討する予定である。当初の計画では、平成29年度は、1)ツタンカーメンエンドウの加熱調理による着色機構の解明、2)ツタンカーメンエンドウの抗酸化成分の同定を予定していた。このうち、2)については、抗酸化成分の同定後、平成30年度に実施予定であった、「加熱調理による抗酸化性の挙動解析」についても、既にin vitroにおける評価に着手しているため、計画以上に進展している。

本研究では、抗酸化成分の同定および調理による抗酸化性の挙動を解析し、さらに、約50%の廃棄部にあたる莢の有効活用の可能性を検討する。上記の目的を達成するために、平成30年度は主に以下の2点について検討した。(1)ツタンカーメンエンドウの加熱調理による抗酸化性の挙動解析各種の調理方法(煮る、煮含める、茹でる、蒸す、電子レンジ加熱、オーブン加熱)によってエンドウを調理し、抽出液のDPPHラジカル消去活性および総フェノール量を測定した。豆の抽出物の抗酸化活性は、ポリフェノール量と高い相関を示し、主な抗酸化成分はポリフェノール類であることが示唆された。加熱によって抗酸化性は約30%低下し、茹でた場合に茹で汁への流出が20%程度認められた。そのため、ツタンカーメン豆の抗酸化性を効果的に利用するためには、煮豆やスープ料理が適すると考えられた。さらに実験動物を用いたin vivoにおける抗酸化性の評価のために用いる試料を大量調製した。(2)ツタンカーメンエンドウの莢の抗酸化成分の同定莢の凍結乾燥試料から酸性エタノールを用いて抗酸化成分を抽出し、DPPHラジカル消去活性を指標に抗酸化成分を追跡した。抗酸化成分およびその加水分解物のHPLC分析ならびにLC-MS/MS解析から成分を同定した。さらに、当該成分を含む莢抽出液を大量に調製し、凍結乾燥品として得た。今後、エンドウ抽出物および莢抽出物を用いて動物実験における抗酸化性の評価を行う予定である。当初の予定では、平成30年度はin vivoにおける豆の抗酸化性の評価までを計画しており、豆由来の試料は調製済みである。当該試験において抗酸化酵素測定用のキットを使用するが、詳細なメカニズムを検討するためには項目の追加が必要となった。しかし、キットは高価であり、計画通りに進めた場合に予算が不足することが判明した。そこで、当初は豆と莢の2種類の評価を別々の年に実施し、キットも2回購入することを予定していたが、同時に測定することでキットの少量化を図り、次年度に実施予定であった莢の抗酸化性の試験と同時に測定することにした。そのため、in vivo実験は次年度に繰り越すことにしたが、一方で次年度に計画していた莢のin vitroの抗酸化性の評価および成分の同定を先行して行った。よって、総合的に判断して、概ね順調に進展していると判断した。引き続き、古代エンドウの加熱調理による抗酸化性の挙動解析について、in vitroに加えて、in vivoにおける評価を実施する。in vivoにおいては、試料の大量調製が必要であることから、予め、その調製に時間を要する可能性があるが、余裕をもった計画になっているため、予定通り遂行できるものと考えている。令和元年度は、まずin vitroにおける莢の加熱処理前後の抗酸化性の比較を行う。次いで、豆および莢由来の抽出物を用いて、in vivoにおける抗酸化性の評価を実施する。材料費が予定よりも少量で済み、その費用分が余ったため。
市場経済移行期における高等教育の機能変容に関する比較研究

本研究の目的は、ともに市場経済体制への移行期にあるベトナムとラオスの両国において、社会体制の急激な転換に伴い、高等教育の機能がどのように変容しつつあるのかを比較考察することである。平成11年度はラオスの事例(ラオス国立大学)を中心に調査・考察を行った。平成12年度は、主にベトナム高等教育の動向を把握するため、2回の現地調査を行った。訪問先は、ハノイ市とホーチミン市の高等教育関係諸機関、国家図書館、政府機関等である。具体的には、両国の高等教育における、1.入学者選抜機能、2.管理・運営機能、3.教育機能、4.交際交流・協力機能、5.人材供給機能の5項目について検討した。これによって、ベトナムとラオスの共通点が下記のとおり明らかとなった。1.進学希望者の急増に伴って、高等教育就学者数は急激に増加しており、高等教育の門戸も以前よりもオープンになりつつある。各大学では定員を増やしたり、就学形態の多様化を図って、増大する教育需要に対応している。2.大学に対する中央政府の管理・監督権限は次第に弱まりつつあり、各大学では各種ビジネスや寄付金など、自主財源の確保が急務となっている。3.授業の形態は、いまだ伝統的な講義形式が圧倒的に多い。教師の授業負担は大きく、教室のインフラはおしなべて貧弱である。ティーチングをサポートする体制も整備されていない。4.かつての共産圏ネットワークが崩壊したことにより、各大学では欧米先進国及び近隣アセアン諸国との人材交流が活発化している。また、教育援助を得るために国際機関とのネットワークづくりにも積極的である。5.両国とも、大卒者の就職状況は良好とはいえない。現在の経済停滞が長引けば、近い将来、深刻な失業問題が発生する可能性が高い。早急な対策が求められる。専門分野によって、卒業生の就職需要に大きな格差が生じている。本研究の目的は、市場経済体制への移行期にあるベトナムとラオスの両国において、社会体制の急激な転換に伴い、高等教育の機能がどのように変容しつつあるのかを比較考察することである。そこで、ベトナム・ラオス現地調査を2000(平成12)年2月19日より同月28日まで行い、現地の高等教育関係諸機関を訪問し、面接調査および資料収集を行った。具体的には、両国の高等教育の1,入学者選抜機能、2,管理・運営機能、3,教育機能、4,交際交流・協力機能、5,人材供給機能の5項目について検討した。現時点での両国の共通点は次の通りである。1,進学希望者の急増に伴って、高等教育就学者数は急激に増加しており、高等教育の門戸も以前よりもオープンになりつつある。各大学では定員を増やしたり、修学形態の多様化を図って、増大する教育需要に対応している。2,大学に対する中央政府の管理・監督権限は次第に弱まりつつあり、各大学では各種ビジネスや寄付金など、自主財源の確保が急務となっている。3,教育カリキュラムは、従来の硬直的な社会主義型のシステムから、モジュール化された欧米型のシステムに改編されつつある。しかしながら授業の形態は、いまだ伝統的な講義形式が圧倒的に多い。4,かつての共産圏ネットワークが崩壊したことにより、各大学では欧米先進国及び近隣アセアン諸国とのプロジェクトが活発化している。いずれも諸外国の高等教育機関との交流・提携に意欲的である。5,両国とも、大卒者の就職状況は良好とはいえない。
小脳シナプス可塑性後期相の発現・維持機構

小脳におけるシナプス可塑性は運動学習の基盤と考えられており、平行線維・プルキンエ細胞間のグルタミン酸作動性興奮性シナプスで起る長期抑圧、抑制性介在神経細胞・プルキンエ細胞間のGABA作動性シナプスで起る脱分極依存性増強等が知られている。シナプス可塑性は、持続時間が短く新たな転写に依存しない初期相と新たな転写誘導に依存し数時間以上持続する後期相に分けられる。本研究では、これらシナプス可塑性後期相の発現・維持機構を、小脳神経細胞の培養系において、シナプス伝達の単位であるシナプス小胞1個に対する応答であるmEPSCの計測を行うことにより解析した。長期抑圧に関しては、カルシウム・カルモジュリン依存性脱リン酸化酵素のカルシニューリンを阻害すると、長期抑圧後期相と同様のmEPSCの大きさの減少が起こった。このカルシニューリンによるmEPSCの減少は、長期抑圧後期相と同じ薬剤感受性を示し、また長期抑圧後期相を起こらなくした。また、恒常的活性型カルシニューリンをプルキンエ細胞核内で発現させると、長期抑圧後期相は起こらなくなった。さらに、後期相を誘導する刺激により、プルキンエ細胞内で活性酵素が増加し、それがカルシニューリン活性を抑制することにより、長期抑圧後期相が引き起こされることを示唆する結果も得られた。また、抑制性介在神経細胞・プルキンエ細胞間のGABA作動性抑制性シナプスにおける脱分極依存性増強については、その全時間経過を決める実験を行い、新規の転写に依存した後期相が1日以上持続することを明らかにした。また、長期抑圧の後期相はプルキンエ細胞のグルタミン酸応答性の低下によっていたが、脱分極依存性増強後期相においては、はプルキンエ細胞のGABAに対する応答性の増大の他にシナプス前細胞からのGABA放出の増大も起こっている可能性が示唆された。小脳のシナプス可塑性は運動学習の基盤と考えられており、平行線維・プルキンエ細胞間のグルタミン酸作動性興奮性シナプスで起る長期抑圧.抑制性介在神経細胞・プルキンエ細胞間のGABA作動性抑制性シナプスで起る脱分極依存性増強等が知られている。本研究では、これらのシナプス可塑性維持の分子機構を明らかにすることをめざしている。シナプス伝達のユニット反応であるmEPSCの大きさを長期抑圧時に計測する実験により、長期抑圧には約2日間持続しmRNA・蛋白質合成に依存する後期相が存在することが明らかになっていた。平成12年度に行った培養プルキンエ細胞を用いた実験により、長期抑圧後期相の維持にカルモヂュリン依存性の脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが関与することが明らかになった。培養プルキンエ細胞をカルシニューリン阻害剤で処理することにより長期抑圧後期相が出現した。そしてこの長期抑圧後期相はカルモヂュリン依存性キナーゼの阻害により抑えられた。また、私たちはGABA作動性抑制性シナプスにおける脱分極依存性増強について、脱分極時にシナプス前神経細胞を活性化させたりGABAを投与してプルキンエ細胞のGABA(B)受容体を活性化すると、増強が起らなくなることを見い出した。この知見をふまえて、培養プルキンエ細胞をGABA(B)受容体阻害剤と高濃度のカリウムイオンを含む液で処理することにより脱分極依存性増強を引き起こし、それがどのくらいの時間持続するかをmIPSCの計測により調べた。その結果、脱分極依存性増強にも一日以上持続する相が存在することが明らかになった。

小脳のシナプス可塑性は運動学習の基盤と考えられており、平行線維・プルキンエ細胞間のグルタミン酸作動性興奮性シナプスで起る長期抑圧、抑制性介在神経細胞・プルキンエ細胞間のGABA作動性抑制性シオプスで起る脱分極依存性増強等が知られている。本研究では、これらのシナプス可塑性維持の分子機構を明らかにすることをめざしている。シナプス伝達のユニット反応であるmEPSCの大きさを長期抑圧時に計測する実験により、長期抑圧には約2日間持続しmRNA・蛋白質合成に依存する後期相が存在することが明らかになっていたが、平成12年度は長期抑圧後期相の維持にカルモヂュリン依存性の脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが関与することを明らかにした。平成13年度は、カルシニューリンがどのように長期抑圧後期相の維持にかかわるかを検討した。小脳の培養系において、長期抑圧後期相を引き起こす5分間以上の高カリウム液刺激により、スーパーオキサイドが発生してそれがカルシニューリン活性を抑えることにより、長期抑圧後期相を引き起こしていることを示した。また、私たちは抑制性介在神経細胞・プルキンエ細胞間のGABA作動性抑制性シナプスにおける脱分極依存性増強についても、どのくらいの時間可塑的変化が持続するかを、培養プルキシエ細胞でのmIPSCの大きさの測定により調べ、脱分極依存性増強が一日以上持続することを平成12年度に示した。平成13年度は、GABA作動性抑制性シナプスで起こる脱分極依存性増強についても、mRNA合成に依在する後期相が存在することを明らかにした。小脳におけるシナプス可塑性は運動学習の基盤と考えられており、平行線維・プルキンエ細胞間のグルタミン酸作動性興奮性シナプスで起る長期抑圧、抑制性介在神経細胞・プルキンエ細胞間のGABA作動性シナプスで起る脱分極依存性増強等が知られている。本研究では、これらのシナプス可塑性の後期相の発現・維持機構の解析を小脳神経細胞の培養系を用いて行ってきた。シナプス可塑性後期相は、新たな転写誘導に依存し数時間以上持続する。長期抑圧に関しては、後期相を誘導する脱分極とグルタミン酸の組み合わせ刺激により、プルキンエ細胞内の活性酸素が増加し、それがカルシニューリン活性を抑制することにより、長期抑圧後期相が引き起こされることを示唆する結果が得られた。また、後期相の発現に際して転写誘導される分子の検索を行い、後期相を引き起こす刺激によりmRNA量がプルキンエ細胞で特異的に増加するcDNA断片を得て、現在その全長を決定すべく実験を行っている。また、抑制性介在神経細胞・プルキンエ細胞間のGABA作動性抑制性シナプスにおける脱分極依存性増強については、その全時間経過を決める実験を行い、新規の転写に依存した後期相が1日以上持続することを明らかにした。また、長期抑圧の後期相はプルキンエ細胞のグルタミン酸応答性の低下によっていたが、脱分極依存性増強後期相においては、プルキンエ細胞のGABAに対する応答性の増大の他にシナプス前細胞からのGABA放出の増大も起こっている可能性が示唆された。