hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
回復期片麻痺者の歩行改善の分析ー下肢装具と理学療法が歩行に及ぼす影響ー

計測用装具は底屈方向の機能以外は同じ条件とするために金属支柱つき装具を使用し、足継手に底屈を止めるクレンザック継手(制限群)と油圧ダンパーによって底屈制動を行う継手(制動群)を使用した。40名の回復期片麻痺者をランダムに2群に割り付け、底屈制動装具と底屈制限装具を使用した理学療法士による歩行練習を2週間実施した。歩行練習前後の歩行を3次元動作分析装置を使用して計測して、練習前の装具なし歩行と練習後の装具歩行を比較して歩行の変化と装具の機能の関係を調べた。動作分析の結果より、歩行練習の前後で歩行速度や歩幅、足関節底屈モーメントなど多くのパラメータが改善したが、これらについて装具間の違いは見られなかった。両群間で違いが見られたのは骨盤と胸郭の前傾角度であり、底屈制限群では立脚初期に骨盤が前傾し、制動群では胸郭が立脚期を通じて伸展することが明らかになった。従来より装具の違いが片麻痺者の歩行に及ぼす影響を示した研究は数多く存在するが、それらの結果は装具の機能が直接影響する足関節と膝関節に限定したものであった。装具の機能が骨盤より上部の身体の動きに影響することを示したのは、本研究が初めてである。この研究の結果はProsthetics and Orthotics International(国際義肢装具学会誌)に投稿し、採択された。歩行補助のための短下肢装具(以下、装具)の機能の違いが片麻痺者の歩行に及ぼす影響を明らかにすることが本研究の目的である。回復期片麻痺者40名をランダムに2群に割り当て、足関節の底屈をとめた装具と底屈を制動しながら動かす装具を使用した理学療法士による歩行練習を実施した。歩行練習前の装具なし歩行と練習後の装具歩行を三次元動作分析装置で計測して両群間で比較した結果、底屈を止めた装具は歩行時の骨盤を前傾させ、底屈を許す装具は胸郭を伸展させることが明らかになった。平成26年度は計測条件の設定や必要物品の準備に時間を要したため、当初計画の50例の計測は行えなかったが、計測が軌道にのりつつあるため今後は計画通り進めることができると考える。底屈制動群と底屈制限群で歩行の違いがみられることが明らかになったことから、平成28年度もさらに対象者を増やして計測を継続する予定である。当初予定していた歩行練習時のフィードバックの有無の比較については、研究実施方法を検討した結果、統制された方法を実施することが困難と判断したため、フィードバックの有無の比較については行わないこととし計画を変更した。対象となる片麻痺者の歩行改善と身体機能の関係を明らかにする。現在までに明らかになった結果については、学会発表、論文投稿などを行う。リハビリテーション工学計測結果の中間的なまとめでは、当初の目的である底屈制動の装具と底屈を止めた装具による歩行の変化が得られている。2年目である平成27年度は、底屈制動つき装具にフィードバック装置を用いた理学療法を組み合わせた歩行練習を実施して、歩行改善について計測で示していく。当初予定していた歩行練習時のフィードバックの有無の比較のために歩行時の油圧効力を表示する装置をレンタルする予定であったが、計画変更によりレンタルの必要性がなくなった。本研究で得られた結果を発表予定の学会が終了年度以降に開催されることと、残された課題についての打ち合わせを共同研究施設で行う必要があり、そのための旅費が必要である。データ処理などを研究者本人が行ったため、平成26年度の予算で計上していた人件費、謝金が不要となったため、余剰金が発生した。
ペルオキシソーム形成機構および先天性ペルオキシソーム欠損症病因の解明

先天性ペルオキシソーム欠損症には症状の重篤度の異なる3つの病型が存在する。軽症型患者皮膚線維芽細胞を30°Cで培養するとペルオキシソームが形成されることを見いだし、温度感受性(ts)の原因と考えられるPEX2のts変異(E55K)を同定した。ペルオキシソーム形成過程を解析するために、PEX2欠損CHO細胞(Z65)にts変異PEX2を導入したステーブルトランスフォーマントを単離し、ts性を示すクローンを単離した。CHO細胞由来のペルオキシソーム欠損変異株を用いた一過性発現系を利用したスクリーニングにより、ヒトPEX12、PEX1を単離し、患者の変異を同定した。ペルオキシソーム移行シグナルを付加した、GFP(Green Fluorescent Protein)の発現ベクターをペルオキシソーム欠損CHO変異細胞(Z65,ZP92,ZP102)で発現させたところ、これらのGFP融合タンパク質はいずれも核を含む細胞全体に分散した。これらの変異細胞を用いて、各相補遺伝子(PEX2,6,5)を導入した際のペルオキシソーム形成過程の検討を行った。生細胞の連続観察では、各変異細胞間で形成時間に多少の差は見られたが、基本的にマイクロインジェクションでの相補遺伝子導入後、数時間でペルオキシソームの形成が認められた。-方、固定細胞を用いた高解像度顕微鏡を用いた詳細な観察により、ZP92細胞には数個のCFP-SKLの点状構造物が観察された。ペルオキシソーム膜タンパク質に対する抗体との2重染色により、ペルオキシソーム膜タンパク質を含むいわゆるゴ-ストとこの点状構造物とは近接しているが一致はしていないことがわかった。
臍帯血造血幹細胞移植に関する基礎的研究

平成8年度は前年度にひきつづき非血縁臍帯血幹細胞移植の臨床応用に向けて,臍帯血の採取,保存を行った.神奈川内の数施設と神奈川臍帯血バンクを設立し現在までに150の臍帯血の保存を行っている.さらに平成9年2月28日に当教室において,我が国において初めての非血縁臍帯血幹細胞移植を施行した.対象は初診時8ヶ月の女児で,診断は急性骨髄性白血病(FAB分類M6)である.化学療法に対する反応が悪く予後不良と考えられたため,同種造血幹細胞移植の絶対適応と考えたが血縁および骨髄バンクにてもドナーが得られず,神奈川臍帯血バンクHLA1抗原のみ不一致の臍帯血が2例得られた.非血縁臍帯血幹細胞移植は米国を中心として200例以上が施行されており,臍帯血のHLA1抗原不一致は骨髄の6抗原一致に相当するとされている.この2例のうち幹細胞数の多い例を選んで,当医学部の倫理委員会の承認を得た上で移植を施行した.この臍帯血は細菌,真菌およびウイルスの感染を認めなかった.また臍帯血を提供した男児は移植の時点で生後1年を経過しており,先天性疾患は認めず順調に発育している.現在移植後2週間であるが順調に経過している.本年度は臍帯血造血幹細胞移植の臨床応用へ向けて,臍帯よりの血液の採取量の検討,そのなかに含まれる造血前駆細胞の測定および保存についての基礎的検討を行なった。臍帯血の採取は遺伝的疾患や感染症のない正常妊娠経過,正常分娩の臍帯より母親の同意を得たうえで行なった.今回施行した採取法はACDを加えた50mlの注射器で臍帯静脈を直接穿刺採取する方法である.この方法では胎盤一つから採取可能な臍帯血は30-60(30,35,40,40,47,60)mlで平均45mlであった。臍帯血採取については工夫をかさねてさらに採取率をよくする必要がある。採取した血液の一部を用いてHLA-A,B,C,DRの検査を行ないHLAの適合した症例がいる場合に備えて,臨床応用可能な体制をとっている.Ficoll-hypaqueを用いた比重遠沈法にて分離した後の単核細胞数は6-12.5(6,8.75,10,10,10,12.5)x10^7個で平均10x10^8個であった.得られた単核細胞はプログラミングフリーザ-にて凍結した後,液体窒素中に保存している.今回採取された臍帯血造血幹細胞を用いた場合の臨床応用は,CFU-GMを基準にした場合,最小採取検体を除外すれば20-40kgの体重の患者に移植可能と考えられる.平成8年度は前年度にひきつづき非血縁臍帯血幹細胞移植の臨床応用に向けて,臍帯血の採取,保存を行った.神奈川内の数施設と神奈川臍帯血バンクを設立し現在までに150の臍帯血の保存を行っている.さらに平成9年2月28日に当教室において,我が国において初めての非血縁臍帯血幹細胞移植を施行した.対象は初診時8ヶ月の女児で,診断は急性骨髄性白血病(FAB分類M6)である.化学療法に対する反応が悪く予後不良と考えられたため,同種造血幹細胞移植の絶対適応と考えたが血縁および骨髄バンクにてもドナーが得られず,神奈川臍帯血バンクHLA1抗原のみ不一致の臍帯血が2例得られた.非血縁臍帯血幹細胞移植は米国を中心として200例以上が施行されており,臍帯血のHLA1抗原不一致は骨髄の6抗原一致に相当するとされている.この2例のうち幹細胞数の多い例を選んで,当医学部の倫理委員会の承認を得た上で移植を施行した.この臍帯血は細菌,真菌およびウイルスの感染を認めなかった.また臍帯血を提供した男児は移植の時点で生後1年を経過しており,先天性疾患は認めず順調に発育している.現在移植後2週間であるが順調に経過している.
神経回路再編成の構造的基盤としてのセプチンの役割

興奮性シナプスへの入力に応じた重合性蛋白質のリモデリングは構造的可塑性の主要メカニズムとして長期記憶に関与する。長期記憶ないしL-LTPの維持にはスパイン内のアクチン系のリモデリングが必須である。我々はセプチンおよび関連分子を欠損または過剰発現する複数のマウスの系統的行動解析の結果、空間学習・記憶を評価する複数のパラダイムにおいて一貫した機能障害を呈する1系統を見出した。そこで、定量性の高い質量分析手法を用いて海馬プロテオームのgenotype間比較を施行したところ、グルタミン酸受容体サブユニットを含む複数の学習・記憶関連蛋白質に量的異常を認めた。発達期の脳内では神経細胞の分裂と移動、軸索/樹状突起の伸展、シナプス結合の形成などが盛んに起きているが、これらの過程には細胞骨格系の動的制御が不可欠である。一方、神経回路形成が完了した成熟脳でも、学習や記憶形成の過程でシナプスやその基盤構造である樹状突起棘(スパイン)がダイナミックに再編成する。しかし、神経活動依存的なシナプス伝達機能の再編成と共役した細胞骨格系の動的調節の分子メカニズムには不明な点が多い。当グループでは、ニューロンやグリアで高発現するGTP結合蛋白質セプチン(SEPT1-14)の重合体が、1)アクトミオシン膜骨格の特定の領域に局在し、膜蛋白質の足場ないし拡散障壁として機能すること、2)発生過程では神経突起伸展、成熟後にはシナプス伝達に関与すること、3)神経活動依存的にリモデリングすることなどを示してきた(Neuron 2007, Cytoskeleton 2011, Molecular Brain 2013, Nature Communications 2013および未発表)。セプチンおよび関連分子を欠損または過剰発現する複数のマウスの系統的行動解析の結果、空間学習・記憶を評価する複数のパラダイムにおいて一貫した機能障害を呈する1系統を見出した。の表現型は、空間学習・記憶に関する未知の分子メカニズムの解明への糸口になると期待される。そこで、定量性の高い質量分析手法を用いて海馬プロテオームのgenotype間比較を施行したところ、グルタミン酸受容体サブユニットを含む複数の学習・記憶関連蛋白質に量的異常を認めたため、膜画分のイムノブロットや免疫共沈実験を含めた生化学的検証を行った。神経細胞の移動、軸索/樹状突起の形成・伸展、シナプス形成過程には、微小管とアクチン細胞骨格系による動的制御が不可欠である。一方、神経細胞同士の結合が形成され神経回路が出来上がると、神経細胞の形態やシナプス結合は大きく変化せず、細胞骨格系は静的な構造支持装置であるという考えが主流であった。しかしながら近年、シナプス長期増強現象(LTP)に伴いスパインが変化する様相が明らかにされた。この過程では、スパインの形態/機能制御とその協調性が重要であり、シナプス後部の分子構築が、動的なアクチン骨格と学習・記憶関連分子(Vesl-1S、Arc、AMPA受容体の特定サブユニットなど)の発現が神経活動依存的に変化することが報告されている。そこで、スパインにおける「機能と形態の協調的な変化」がどのように制御されているかを明らかにするためには、シナプス内およびシナプス近傍にある細胞骨格のダイナミクスを理解しなければならない。重合性ヌクレオチド結合蛋白質ファミリーSEPT1-14から成るセプチン細胞骨格系も神経系に大量に存在するが、その生理的意義には不明な点が多い。本研究計画では、長期記憶ないしL-LTPの維持における、セプチンの機能探索を実施し、(1)LTPに伴いセプチンが再編成すること(2)定量性の高い質量分析手法で、セプチン欠損マウスの海馬プロテオームを行い、グルタミン酸受容体サブユニットを含む複数の学習・記憶関連蛋白質に量的異常が認められること(3)一貫した学習障害(歯状回機能異常)を呈することを見出した。今年度は長期記憶ないしL-LTPを維持する構造的基盤を支える細胞骨格系の協調作用の中でセプチン系が果たす役割を生理的コンテクストで理解するため、分子・細胞レベルから個体レベルまでの異なる階層を縦断的、統合的に解析する。セプチン結合分子欠損マウスを用いた研究成果を論文としてまとめたため(Nature Communications 2015)。セプチン細胞骨格は14種類のサブユニットからなる細胞分裂蛋白質として発見された。分裂細胞においては収縮環や鞭毛のリングの構成成分として、多数の分子を集積し相互作用させる足場として、また、細胞の微小領域における分子の局在や非対称性を保証する拡散障壁としての役割が報告されている(Sharma et al., Nature 2013; Koch et al., Cell 2015)。一方で最終分化した神経系で最も高発現し、アルツハイマー病(Kinoshita et al., Am J Pathol 1998)やパーキンソン病(Zhang et al., PNAS 2003)のような神経疾患にも関与することが示唆されている。申請者らはこれまでにセプチンがHDAC6による微小管脱アセチル化の物理的足場として働くことで、微小管の安定化レベルを最適化し神経突起伸長を制御することを見出した(Ageta-Ishihara et al.,Nature Commun 2013)。さらに成体小脳では、バーグマングリアにおいてセプチン-CDC42EP4(セプチン会合分子)複合体はグルタミン酸トランスポーターGLASTを平行線維-プルキンエ細胞間シナプス近傍に集積させる足場として機能し、グルタミン酸クリアランスと運動学習を促進することを見出した(Ageta-Ishihara et al., Nature Commun 2015)。

今年度は長期記憶ないしL-LTPを維持する構造的基盤を支える細胞骨格系の協調作用の中でセプチン系が果たす役割を生理的コンテクストで理解するため、分子・細胞レベルから個体レベルまでの異なる階層を縦断的、統合的に解析した。興奮性シナプスへの入力に応じた重合性蛋白質のリモデリングは構造的可塑性の主要メカニズムとして長期記憶に関与する。長期記憶ないしL-LTPの維持にはスパイン内のアクチン系のリモデリングが必須である。我々はセプチンおよび関連分子を欠損または過剰発現する複数のマウスの系統的行動解析の結果、空間学習・記憶を評価する複数のパラダイムにおいて一貫した機能障害を呈する1系統を見出した。そこで、定量性の高い質量分析手法を用いて海馬プロテオームのgenotype間比較を施行したところ、グルタミン酸受容体サブユニットを含む複数の学習・記憶関連蛋白質に量的異常を認めた。セプチン結合分子の欠損マウスを作製し、表現型スクリーニングを実施、さらにメカニズム探索を追え、現在、成果の一部を論文として投稿中であるため。1.分子レベル昨年度、当該分子欠損マウスの行動レベル、形態レベルの表現型に繋がる分子メカニズムを解明するため、免疫沈降と質量分析(ショットガン法)を用いてセプチン会合分子の網羅的同定を進めた。今年度は形態的に得られたデータを海馬培養神経ニューロン(in vitroレベル)で再現し、同定した結合分子を遺伝子導入することで分子ネットワークを明らかにする。2.行動レベルセプチン欠損マウスの系統的行動解析(18項目)の結果、複数のパラダイムにおいて一貫した学習障害(歯状回機能異常)を呈することを見出している。本研究で使用したセプチン欠損マウスは全身性ノックアウトマウスのため、学習障害が歯状回のセプチン欠損の結果生じたかは評価できていない。そこで、セプチン欠損マウスの海馬歯状回において、ウィルスを用いて当該セプチンサブユニットを過剰発現させ、記憶機能障害がレスキューできるかを評価する。さらにin vivo RNAiによる成熟後・急性・海馬歯状回選択的セプチン欠乏マウスを用い空間弁別障害を(少なくとも部分的に)再現するかを評価する。すでに海馬歯状回選択的ウィルス注入の系は立ち上げており問題なく実施できる。分子神経科学1.学習・記憶関連分子の量的変動の検証定量性の高い質量分析法(ジメチルラベル法)でセプチン欠損マウスのプロテオームを行い、複数の学習・記憶関連蛋白質に量的異常を検出した。昨年度は記憶関連分子の密集するシナプス後肥厚部(PSD)を生化学的に抽出し、異常を検出した複数の学習・記憶関連蛋白質のPSD画分での変動を精査した。今年度は網羅的解析結果を電子顕微鏡レベルで精査する。具体的には、急速凍結・凍結割断レプリカ標識(SDS-FRL)法を用いた高空間分解能解析を行い、当該分子の局在から変動部位を同定する。2.記憶形成におけるセプチンの役割
放射線治療が行われた扁平上皮癌患者における腫瘍免疫学的解析と治療効果との相関

平成30年度、食道扁平上皮癌約100症例において、放射線治療による抗腫瘍免疫の誘導の有無および予後と相関する腫瘍免疫学的バイオマーカーの解析を進めた。手術施行症例において、治療前の診断時生検で採取された検体と手術で摘出された検体の病理組織学的な解析が可能な症例を選択し、CD8陽性T細胞の浸潤、CD163陽性細胞の浸潤、腫瘍細胞におけるHLA Class I分子発現、PD-L1発現、pStat1発現を免疫組織化学的に解析を開始した。免疫染色の工程や組織標本の評価法における手技的な調整にやや時間を要したが、現在、概ね順調に解析は進められている。術前治療が施行されなかった群(コントロール)、術前化学療法が施行された群、術前放射線治療が施行された群、術前化学放射線治療が施行された群に分け、それぞれにおいて、免疫学的な指標の変化、予後、組織学的治療効果などの相関を解析中である。現在の解析では、化学療法、放射線治療、両方の併用などの術前治療によって食道癌の原発巣におけるCD8陽性T細胞の浸潤数が増加することが示唆されており、放射線治療、化学療法、またはそれらの併用における宿主の免疫反応がどのようにその抗腫瘍効果に関与しているかを解析中である。また、それらの反応が治療予後にどのような影響を持つか解析しており、今後、その他の因子の解析も含め継続していく予定である。一方、国内において放射線治療や免疫治療に関連する学会に参加し、本研究に関連する情報収集や意見交換を行い、研究遂行に役立てた。現在、食道扁平上皮癌症例において、免疫組織染色による解析を進めている。免疫組織染色の工程や組織検体の評価法において、多少の微調整が必要であり、やや進捗が遅れている。現在、CD8陽性リンパ球、CD163陽性細胞、腫瘍細胞のHLA-Class I、PD-L1、pStat1に対する免疫染色がほぼ終了している。また、腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用に関わる他の因子の解析は今後進めていく予定である。頭頚部扁平上皮癌、子宮頸癌の解析については、食道扁平上皮癌の解析がやや遅れているため、順次進めていく予定である。今後、食道扁平上皮癌症例における免疫組織学的解析を進めていき、学会発表、論文発表の準備を進めていく予定である。順次、頭頚部扁平上皮癌、子宮頸癌の解析を進めていく予定である。平成30年度、現状の他の実験の工程と同様にして免疫組織学的な解析を継続したため、実験試薬や一次抗体は一部既存のものを使用することが可能であった。また、今年度は海外への調査旅費を執行できなかったため、次年度使用額が発生した。
微分方程式の数式処理システムの研究

モノドロミ-群の研究は、微分方程式論の大域的研究の中でも重要な課題である。例えば、微分方程式が可約(低階の微分方程式に分解可能)かどうかの判定等は、モノドロミ-群の可約性と密接に関連する。P ́上に確定特異点しか持たないフックス型微分方程式は超幾何微分方程式系と呼ばれる連立形に変換できる(そのアルゴリズムは既に研究代表者河野の研究によって数式処理化されている)が、本研究課題の研究目的の一つとして、そうした超幾何微分方程式系に対するモノドロミ-群の決定や可約性に対する研究、S-N分解による解の構成に関する研究及びそれ等の数式処理化の研究を行い、数々の成果を挙げることが出来た。先ずモノドロミ-群についてであるが、局所解が対数的特異性を示す場合の計算例はほとんど無く、研究代表者河野は4階、5階、6階の超幾何微分方程式系に対する最も一般的な形でのモノドロミ-群を完全に決定した。生成元の行列の要素を決めるにあたっては、従来の研究では小行列式の退化条件を用い、非線形不定方程式を解くという複雑な計算に依っていたが、決定条件を全て線形関係式に帰着させるという方法論を開発し、システムを構築した。次に局所解の構成に関する研究では、微分作用素のS-N分解理論に従いその数式処理化を行った。また純理論的研究成果としては、超幾何微分方程式系に対する接続問題の完全な解明がある。分担者達も、超幾何微分方程式系の既約性の研究(原岡)、ポテンシャル論の研究(相川)、非線形現象の解明の研究(菱田)や、統計処理に関する研究(高田)において、それぞれ多大の成果を挙げた。
自由デザイン画入力による衣服パターン自動作成システムの開発

『デザイン画を入力するだけでパターンを自動的に作成するシステム』の開発に関して、本年度は以下の3点に重点をおき、研究を進めた。1.フレア-スカートのパターン寸法推定式の適合性の検討。過去に研究開発を行ったフレアスカートの自動パターンメ-キングシステムについて、その適合性を検討した。具体的には物理特性の異なる各種布地を用いて実際にスカートを作成し、そのシルエットがデザイン画のイメージ通りであるかを調べ、イメージに合わなかったものに関しては重回帰式の再検討を行った。2.シャツ・ブラウスのデザイン画の自動パターンメ-キングの検討。シャツ・ブラウスのデザイン画16枚について、パターンに関する専門家12名に実際にパターンを作成してもらい、その際の専門家のテクニックを研究してパターン寸法推定のための重回帰式を導いた。又、これらの重回帰式を用いて実際にパターンを作成し、シャツ・ブラウスを縫製して、重回帰式の適合性についても検討した。自動作成したパターンの縫製後形状シミュレーションの基礎検討。自動作成したパターンの縫製後形状を手軽に短時間で確認できる方法として、コンピュータによる縫製後形状予測シミュレーションを行うことをフレアスカートを例に検討した。具体的には、フレアスカートを数十種類作成し、パターンと生地に関する情報(要因)と縫製後形状(結果)との関係を追究し、重回帰分析によって縫製後形状を予測する方法を研究した。
リポソームによる細胞内薬物送達システムの開発

リポソームの薬物担体としての可能性はこれまでに種々の角度から検討され、特に肝臓での取込過程に関する研究は数多い。しかしながら、細胞内での挙動に関してはライソゾームに移行し、崩壊されるという"常識"のもとに、研究はほとんど行なわれていない。さらに、ライソゾームへの移行を回避するなど、細胞内移行性をコントロールする試みは皆無に等しい。リポソームに高分子化合物を内封して標的部位に送達してその薬理効果を期待する時、第一に、リポソームを細胞に選択的にターゲッティングするにはどのようなリポソームを用いるべきか、第二に、細胞内に取込まれた後、ライソゾームへの取込を回避する必要のある化合物とその必要のない化合物でのリポソームをどのように選択すべきか、という課題に答える必要がある。本研究はこれらの課題に答えるための細胞内分布過程までを考慮したリポソームによる肝臓への薬物送達システムの開発を目的とした。細胞内の過程を解析する前に、まず、取込過程に関して、リポソームの粒子径、投与量、表面修飾の効果等について検討した。肝還流系で、リポソームの粒子径に依存してオプソナイズされることが明らかとなった。投与量に関しては、リポソームの肝臓の取込過程にみられる飽和性は従来のミカエリスメンテンの速度過程には従わず、取込量に依存して取込クリアランスが減少することを見いだした。表面修飾の効果については、マンノース修飾リポソームはマンノースレセプターを介してではなく、補体レセプターを介して取込まれることが明らかとなった。次に、ライソゾームでのリポソームの分解過程を定量的に評価する方法を開発した。リポソームの細胞内分解のマーカーは^<125>I-アルブミンを用いた。この方法により、細胞系では腹腔マクロファージ、全身系では肝臓と脾臓におけるリポソームの分解過程を測定することができた。これらのタイムコースをさらに速度論解析することにより、分解過程の定量化にも成功した。今後、リポソームの取込過程と細胞内運命の間にどのような関係があるかを解明し、有効な細胞内ターゲッティングシステムの開発を行なっていく予定である。個体レベル及び臓器レベルでの体内挙動について検討した。コントロ-ルリポソ-ム、マンノ-ス表面修飾リポソ-ム、ガラクト-ス表面修飾リポソ-ムをExtrusion法によってサイジングした。粒子径は0.05、0.1,0.4及び0.8umについて検討した。各種リポソ-ムは3Hーinulinをマ-カ-として内封した。1)臓器クリアランスの測定:実験動物としてWistar系雄性ラットを用いた。大腿動・静脈にカニュレ-ションを施し、単回静脈投与を行い、血中消失、臓器分布、尿中排泄を測定した。各種リポソ-ムについて、臓器クリアランスに及ぼすリポソ-ムの投与量依存性について検討した。取込クリアランスは実験条件の範囲内で無視できた。血中濃度のAUCと各臓器取込量より、各臓器の取込クリアランスを求めた。(原島)

2)血液中での安定性:in vitroにおける安定性の実験では、eggPCと水素添加PCリポソ-ムの比較をラット血清を用いておこなった。分解の機構に差があることが見いだされ、水素添加リポソ-ムの分解には補体系を介する分解が重要な役割を果たしていることが示された。一方in vivoにおいては、ラットに各種リポソ-ムを静脈投与後、経時的に血液と尿を採取し、イヌリンの尿排泄クリアランスより血液中でのリポソ-ム分解率を算出した。分解率はリポソ-ムの血中濃度の上昇とともに減少し、血液中の分解に関与する成分の枯渇が示唆された。(際田)3)単離還流肝における臓器クリアランスの測定:還流系において、上記各種リポソ-ムをボ-ラス投与後、希釈曲線より、抽出率(E)、臓器クリアランス(CL)、平均通過時間(MTT)、分布容積(Vd)を計算し、リポソ-ムの粒子系、投与量の影響を検討した。(原島)4)臓器内分布3)と同様の条件下で単離還流肝を用いて、各種リポソ-ムをボ-ラス投与後、コラゲナ-ゼ処理により、肝実質細胞、Kupffer細胞、血管内皮細胞を分離し、3)で求めた臓器クリアランスを各細胞に分配し、見かけのクリアランスを計算した。(際田)個体レベル、臓器レベル、及び細胞レベルでのリポソ-ムの挙動について検討した。リポソ-ムのマ-カ-は3Hーinulin及び3Hーcholesterylhexadecyletherを用いた。リポソ-ムはExtrusion法によってサイジングした。粒子径は0.05、0.2,0.4及び0.8μmについて検討した。1)血液中での安定性:in vitroにおける安定性の実験を行い、分解率に及ぼす粒子径の影響について検討した。水素添加PCリポソ-ムについてラット血清における安定性を測定した。分解は脂質濃度の増加、粒子径の減少にともなって減少した。従って、脂質濃度と粒子径が薬物保持に重要な一因であることがわかった。一方、in vivoにおいては、ラットに各種リポソ-ムを静脈投与後、経時的に血液と尿を採取し、イヌリンの尿排泄クリアランスより血液中でのリポソ-ム分解クリアランスを算出した。In vivoにおける分解クリアランスはリポソ-ムの血中濃度の上昇とともに減少し、in vitroにおける結果と良い対応を示した。(際田)2)In vivoにおける臓器クリアランスの測定:In vivoにおける取込クリアランスは投与量及び投与速度の上昇とともに減少し、著明な投与量依存性を示した。この取込過程は非ミカエリスーメンテン型の速度過程に従うことがわかった(原島)。3)還流肝における臓器クリアランスの測定:還流系において、リポソ-ムの取込に及ぼす血清成分の影響を検討した。リポソ-ムの取込は血清により明らかな増加を示し、オプソナイズの効果が見られた。オプソナイズの効果が粒子径によってどのような影響を受けるかを検討したところ、0.4μm以上の大きなリポソ-ムにおいてオプソナイズの効果が見られた。また、血清によるリポソ-ムのオプソナイズする能力には飽和過程があることもわかった。(原島)。4)細胞への取込過程:培養肝細胞におけるリポソ-ムの取込過程のモデリングを試みた。グリチルリチンで表面修飾したリポソ-ムの細胞への取込過程を、1)細胞表面上に一定の結合部位が存在する、
MARCH I/c-MIR2欠損による免疫異常の解析

新規E3ユビキチンリガーゼファミリー、MARCHファミリーの機能の解析を行っている。その結果、これまでにその中の一つであるMARCH(membrane-associated RING-CH protein)Iは、抗原提示を司る抗原提示細胞に発現する分子であるMHCクラスII(MHC II)と補助受容体B7-2の生体内での発現をユビキチン化により制御し、免疫機能を抑制する事ができ、更に、MARCH Iの遺伝子欠損(KO)マウスでは、樹状細胞やB細胞等の抗原提示細胞に機能異常が認められ、その異常はB7-2ではなく高発現しているMHC II依存性であることを見出している。さらに今回、欠損マウスでは、樹状細胞および制御性T細胞にそれぞれ相互に発現するFasとFasLとの相互作用を介したカスパーゼ経路の活性化が誘導され、樹状細胞にアポトーシスを介した細胞数の減少がみられることが示唆された。
表面制御原子層エピタキシー法によるSiC純正結晶の製作と光物性制御

本研究は表面制御原子層エピタキシー法を用いて、広禁制帯幅半導体シリコンカーバイド(SiC)の高品質結晶を製作し、紫青色を含む全可視領域にわたる光物性を制御することを目的とする。我々は、表面ステップ密度の制御によりステップフロー成長を誘起促進させ、極めて高品製のSiC成長層を得ることに成功した。本年度に得られた主な成果は下記の通りである。1.原子ステップ制御法によりSiCの結晶成長低指数面に数度の傾斜をつけた基板を用いることにより、ステップフロー成長を促進させ、12001500°Cの低温で高品質の6H-SiC単結晶が得られた。成長機構においては、坂界層中の反応種の拡散律速となることを実験的理論的に明らかにした。禁制帯幅が大きく(3.24eV)、電子移動度が高い4H-SiCの高品質成長層を再現性良く得る技術を確立した。極めて表面平担性に優れており、p、nの価電子制御も容易である。発光センターとしてアルミニウムを添加した青色発光ダイオード(LED)を製作したところ、実用化に適用可能な色純度の優れた青色発光が得られることが判明した。本年度の研究の結果、表面制御原子層エピタキシーの成長機構が明らかになった。さらに、4H-SiCという新しい材料の発光デバイスとしての可能性を示した。今後は、我々が開発した表面超格子制御法による原子層エピタキシーを活用した単原子層局在発光中心の導入を行い、量子効果を誘起して、発光波長の短波長化、効率の増大を図る必要がある。
リグニン分解酵素は、なぜ異種発現できないのか?

木質系バイオマスは、食糧と競合しない循環型のバイオマス資源として、その変換利用に社会的要請が高まりつつある。白色腐朽菌(キノコ)の仲間は、木材中に存在する難分解性の高分子リグニンを分解する能力を持っており、その特有の酵素群を大量に調整することができれば、木質バイオマスの利用におけるエネルギーや環境負荷を大きく低減することが期待されている。本研究では、リグニンを分解する酵素がどのような発現制御を受けているかを明らかにするための基礎的な研究を行った。石油資源の枯渇と地球温暖化問題への対応が急がれている中で、木質系バイオマスは、トウモロコシやサトウキビなどと異なり、食糧と競合しない循環型のバイオマス資源として、その変換利用に社会的要請が高まりつつある。木材に代表されるリグノセルロースは、多糖類のまわりを難分解性のリグニンが被覆しているため、デンプンなどと異なり酵素的な糖化に先立つ前処理が必要であり、各国で効率のよい糖化を可能にする総合プロセスの開発が盛んに試みられている。担子菌類に属する白色腐朽菌は、木材中に存在する難分解性の高分子リグニンを分解する能力を持っており、その特有の酵素群を大量に調整しリグノセルロースのセルラーゼによる糖化の際に併せて用いることができれば、前処理に必要とされるエネルギーや酸などの環境負荷を大きく低減することが期待されている。これまでの研究では、酵母などの異種生物を用いて白色腐朽菌のリグニン分解酵素を発現することは困難であり、人工的にリフォールディングを行うことで酵素分子の数%が活性を示すのみであった。このことは、タンパク質の折りたたみ機構の違いが重要であることを示している。本研究は、白色腐朽菌独自のタンパク質折りたたみのメカニズムについて分子生物学的なメスを入れることを目的とする。リグニン分解酵素を大量に生産することで、木質バイオマスの効率的な酵素糖化や難分解環境汚染物質の処理など、様々な産業プロセスを開発するためのプラットフォームを確立することが期待される。初年度は、子嚢菌で報告されているタンパク質折りたたみ制御系のhacA遺伝子のホモログのクローニングを行ったが、まだ成功していない。並行して、白色腐朽菌における一過性の形質転換体の取得を試み、導入遺伝子に依存して一時的に形質が発現する実験系を見出すことに成功した。石油資源の枯渇と地球温暖化問題への対応が急がれている中で、木質系バイオマスは、食糧と競合しない循環型のバイオマス資源として、その変換利用に社会的要請が高まりつつある。担子菌類に属する白色腐朽菌は、木材中に存在する難分解性の高分子リグニンを分解する能力を持っており、その特有の酵素群を大量に調整しリグノセルロースの糖化の際に併せて用いることができれば、前処理に必要とされるエネルギーや酸などの環境負荷を大きく低減することが期待されている。本研究は、白色腐朽菌のリグニン分解酵素生産のメカニズムについて分子生物学的なメスを入れることを目的とする。本年度は、初年度に引き続き子嚢菌で報告されているタンパク質折りたたみ制御系のhacA遺伝子のホモログのクローニングを行ったが、繰り返し検討を行ったがポジティブなクローンは得られなかった。このことは担子菌では子嚢菌と異なる独特なタンパク質分泌系を持っていることを示唆するものと考えられる。一方、白色腐朽菌における遺伝子発現の開始をコントロールするプロモーターの活性評価系は、これまで有効なものが存在していなかった。今回の研究では、染色体上への組込み位置やコピー数による影響を受けない一過性の遺伝子発現系を用いて、正確にプロモーター活性を測定することができるアッセイ系を担子菌類では初めて開発し、担子菌類における遺伝子の転写開始に必要な配列の解析を可能とする新しい研究の方向性を見出すに至った。この系は、遺伝子の転写開始の制御機構の解明だけではなく、転写物の成熟に必要となる配列や、翻訳開始に必要となる配列、翻訳効率の変化など、担子菌類における遺伝子発現の様々なフェーズの解析に用いることができるため、当該分野における基礎科学の進展と、応用に向けた障壁の除去のための基盤となることが期待される。本年度は、昨年度までに確立した選択的リグニン分解菌における、染色体上への組込み位置やコピー数による影響を受けない一過性の遺伝子発現系を用いたプロモーターアッセイ系の評価を行った。

gpd遺伝子は、解糖系の鍵酵素(glycelaldehyde-3-phosphate dehydrogenase)をコードしており、転写量の高いハウスキーピング遺伝子として知られている。本研究では、選択的リグニン分解菌Ceriporiopsis subvermisporaのgpd遺伝子プロモーターからの転写開始に必要となる塩基配列を明らかにするために、12330bpに至る様々な長さのプロモーター領域を持つ14株からなる欠失シリーズを作成し、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を行わせることによって、転写開始活性を比較した。その結果、基本的な転写開始には翻訳開始点の上流141bpが必須であることが明らかになった。次にこの領域の塩基配列をin silicoで解析したところ、TATAA box,CT-rish motifの他、真核生物の転写においてしばしば観察されるSp-1,AP-1,GCN4結合配列、などが存在していることが明らかになった。現在これらの配列の重要性を評価するため、様々な変異株を作成中である。担子菌類に属する白色腐朽菌は、木材中に存在する難分解性の高分子リグニンを分解する能力を持っており、その特有の酵素群を大量に調整しリグノセルロースの糖化の際に併せて用いることができれば、前処理に必要とされるエネルギーや酸などの環境負荷を大きく低減することが期待されている。本研究は、白色腐朽菌のリグニン分解酵素生産のメカニズムについて分子生物学的なメスを入れることを目的とする。本年度は、昨年度までに確立した選択的リグニン分解菌における、染色体上への組込み位置やコピー数による影響を受けない一過性の遺伝子発現系を用いた最小プロモーター領域内のcis配列の重要性の評価を行った。本研究では、選択的リグニン分解菌Ceriporiopsis subvermisporaのgpd遺伝子プロモーターからの転写開始に必要となる塩基配列を明らかにするために、基本的な転写開始に必要であることが明らかとなった翻訳開始点の上流141 bp内に存在するTATAA box, CT-rish motif, Sp-1, AP-1, GCN4結合配列内に部位特定的な変異株を作成し、転写活性を測定した。その結果、GCN4、AP-1結合コンセンサス配列とTATAA-boxに変異を入れた時に、プロモーター活性が著しく低下するという結果となった。従って、これらの配列が転写の開始に重要であることが明らかとなった。これらの結果は、担子菌における初めてのプロモーター配列解析となった。さらに、国産の重要な白色腐朽菌であるヒラタケにおいてGFPの導入・発現に成功した。これは、同菌において初めてのレポーター系の開発となった。当初予定通りに、担子菌類においては初めてとなる正確なプロモーターアッセイ系を用いて、glycelaldehyde-3-phosphatede hydrogenase(gpd)遺伝子の転写開始に必要となる塩基配列の決定が終了した。
腫瘍細胞走化性促進因子、PD-Iの作用機構の解明およびがんの質的診断への応用

PD-IβcDNAをプローブとしてヒトBAC DNAライブラリーをスクリーニングし、PD-Iβ遺伝子の全長を含むクローンを得た。PD-Iβ遺伝子は約60kbの大きさで、25のイントロンと26のエクソンからなっていた。また、各機能ドメイン(細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ソマトメジンB領域、酵素活性領域、EF handドメイン)はそれぞれ一つのエクソンにコードされていた。5'非翻訳領域にはTATA boxを欠いていたが、複数のCCAAT結合蛋白質の結合配列が認められた。ラット9Lグリオーマ細胞を用いたルシフェラーゼ・アッセイの結果、PD-Iβ遺伝子の転写には-245bpまでの領域が必要であった。また、部位特異的変異導入法によってPDIβの酵素活性にはEF hand配列が必須である事を明らかにした。三つのPD-Iファミリー蛋白質の構造は、細胞外ドメインは極めて良く保存されているが、細胞内ドメインおよび膜貫通領域には全く類似性が認められない。そして、我々のこれ迄の解析によって、肝細胞においてはPC-1はapical surfaceに、PDIβは細胞内小器官およびbasolateral surfaceに局在する事が明らかとなっている。そこで本研究では不死化ヒト軟骨細胞であるTC28細胞にPC-1およびPD-Iβを強制発現して細胞内/外のピロリン酸を測定して、これらの分子の細胞内輸送と作用部位を解析した。PC-1およびPD-Iβ発現細胞はともに細胞内および細胞外のピロリン酸濃度を上昇させた。これらの細胞にゴルジ体から小胞体への輸送を阻害するbrefeldinAを作用させるとPC-1発現細胞のピロリン酸濃度は著明に低下したが、PD-Iβ発現細胞には影響を与えなかった。
水質評価指標および閉鎖系水域の水質浄化を主題とした環境教育プログラムの開発

水環境に関する環境学習は以前から行われているが、汚濁の程度を的確に示す指標がなく、プランクトン、COD、BOD、全窒素、全リン、クロロフィルなど多くの水質項目を測定して総合的に判断しなければならない。このような技術論的な問題が、学校における水環境学習推進の障害になっている場合が多い。本研究では、的確でしかも簡便な水質評価指標を求めるために、ため池等の閉鎖系水域において精密な化学分析を行い、その結果を古典的統計解析(多変量解析)に並行してニューラルネットワーク解析を行った。これらの結果を受けて、環境教育プログラムの開発を行い、学校における教育実践や教員研修を実施した。基礎研究として、「ファジイクラスタリングを応用したため池の水質分類評価」では、大阪府内の25のため池において地理、護岸、生物、化学的水質ほか多項目の調査を行い、その結果を自己組織化マップとファジイクラスタリングにより解析した。また、「ファジィC-means法を用いた抽水植物による実験水槽の水質改善」では、人工的に閉鎖系を作り、ハスなどの植物による水質浄化実験を行った。これらの結果から水質評価指標として窒素やリン以外に濁度が良い指標になることがわかり、また、抽水植物が水質浄化に大きく働いていることが実験と現地調査の両方で明らかになった。教育実践として、「生物指標を用いた水環境調査と環境学習」では、水質評価指標を使って、高校生と生物担当教員により大阪府内の河川を中心とする調査を行い、その調査結果を授業で解析する授業実践を行った。教員研修として、「水関係環境教育実践例」と「水質分析フローチャート」を作成し、その中で水質評価指標の科学的な意味や水質浄化などをテーマとした環境教育プログラムについての解説等を行い、教育センターや学校での環境教育推進の資料として活用した。本研究成果は、各種学会等で発表すると共にA4版380ページ報告書にまとめた。水を題材とした環境教育は以前から行われてきたが、水質調査を伴う環境教育の実践では、汚濁の程度を的確に示す水質評価指標が1つに絞ることができず、調査や分析が繁雑になり先に進めないという技術論的な問題が障害となることがしばしばあった。本研究では、その問題を解決すべく、ニューラルネットワークの手法を用いて自然界の複雑な非線形問題の解(水質評価指標)を求めることに主眼をおいた。平成15年度は、大阪府内のため池を主とする閉鎖系水域の水質調査を実施し、水質汚濁の現状を把握すると共に、古典的な多変量解析と自己組織化マップおよびファジークラスタリングの手法を組み合わせた水質データの解析により水質評価指標を見いだす取組みを行った。調査した大阪府内のため池の多くは窒素・リンの現存量が高く環境保全目標や農業用水の水質基準を達成していないものが多く、また、藻類の異常増殖(いわゆる水の華の発生)が見られるものがあった。富栄養化の指標として古くから用いられている窒素、リン、クロロフィルと、これらの解析法によって関係が認められた指標としてはCOD、BODのほか濁度があった。弱い関係ではあるが水色やにおいなど測定の容易な指標もあった。また、水質浄化に貢献するものとして、ヨシなどの抽水植物帯の存在、石積み護岸の存在などがあった。これらの結果をもとに教育センターの教員研修において、学校で取り扱いやすい濁度、水色、におい、CODなどを水質評価指標とした水質浄化を主題とする環境教育や理科教育に関する研修を実施した。平成16年度は、本研究を発展させ、より的確で容易な水質評価指標を見いだすと共にこの指標を用いた水質調査や水質改善に関する環境教育プログラムの構築とその授業実践、授業分析と評価を行う予定である。

水環境に関する環境学習は以前から行われているが、汚濁の程度を的確に示す指標がなく、プランクトン、COD、BOD、全窒素、全リン、クロロフィルなど多くの水質項目を測定して総合的に判断しなければならない。このような技術論的な問題が、学校における水環境学習推進の障害になっている場合が多い。本研究では、的確でしかも簡便な水質評価指標を求めるために、ため池等の閉鎖系水域において精密な化学分析,を行い、その結果を古典的統計解析(多変量解析)に並行してニューラルネットワーク解析を行った。これらの結果を受けて、環境教育プログラムの開発を行い、学校における教育実践や教員研修を実施した。基礎研究として、「ファジイクラスタリングを応用したため池の水質分類評価」では、大阪府内の25のため池において地理、護岸、生物、化学的水質ほか多項目の調査を行い、その結果を自己組織化マップとファジイクラスタリングにより解析した。また、「ファジイC-means法を用いた抽水植物による実験水槽の水質改善」では、人工的に閉鎖系を作り、ハスなどの植物による水質浄化実験を行った。これらの結果から水質評価指標として窒素やリン以外に濁度が良い指標になることがわかり、また、抽水植物が水質浄化に大きく働いていることが実験と現地調査の両方で明らかになった。教育実践として、「生物指標を用いた水環境調査と環境学習」では、水質評価指標を使って、高校生と生物担当教員により大阪府内の河川を中心とする調査を行い、その調査結果を授業で解析する授業実践を行った。教員研修として、「水関係環境教育実践例」と「水質分析フローチャート」を作成し、その中で水質評価指標の科学的な意味や水質浄化などをテーマとした環境教育プログラムについての解説等を行い、教育センターや学校での環境教育推進の資料として活用した。本研究成果は、各種学会等で発表すると共にA4版380ページ報告書にまとめた。
生体類似組織構築のための人工細胞外マトリックスの創製

顎関節軟骨は基底部の硝子軟骨層および関節摺動面の繊維軟骨からなる複合組織である。この例に代表されるように、異なる組織構造が機能発現の鍵を握る組織は少なくない。顎関節症に伴う損傷軟骨の再建には間葉系幹細胞を用いた再生治療が有効であると期待されているが、繊維軟骨ー硝子軟骨からなる層構造を再建することが難しいため、その治療効果は満足できるものではない。本研究の結果、間葉系幹細胞から繊維軟骨および硝子軟骨の作り分けるための条件が見出され、さらに、それらの組織を合一させることで、繊維軟骨ー硝子軟骨の二層構造をもつ組織体の形成が可能になった。本研究は、組織工学の技術を活用した損傷組織の再生治療に関するものであるが、中でもとくに、顎関節軟骨の再生治療をターゲットとして研究を開始した。顎関節軟骨は基底部の硝子軟骨層および関節摺動面の繊維軟骨からなる複合組織であり、その組織構造が機能発現の鍵を握る。顎関節症に伴う損傷軟骨の再建には間葉系幹細胞を用いた再生治療が有効であると期待されているが、硝子軟骨/繊維軟骨からなる層構造を再建することが難しいため、その治療効果は満足できるものではない。そこで、本研究では、生体類似構造をもつ移植片の調製に適した組織工学足場材料の創製を目的とし、組織誘導因子を部位特異的に担持させた多孔質足場材料の設計に取り組んだ。本年度はまず、間葉系幹細胞から繊維軟骨および硝子軟骨を形成する細胞の誘導に効果的と考えられるな細胞増殖因子の探索を行った。不死化されたヒト間葉系幹細胞株を用い、標準的な軟骨形成条件にてペレット培養を行った。一定期間後、軟骨基質の生成についてトルイジンブルーおよびアルシアンブルー染色法によって調べ、軟骨特異的マーカーの発現をRT-PCR法を用いて経時的に調べた。その結果、TGF-betaおよびIGF-1による刺激が、とくに繊維軟骨様組織の形成にとって効果的であることがわかった。ただし、硝子軟骨の分化については現在のところ有効な増殖因子は見つかっておらず、今後も引き続き探索を行う。本年度はさらに、細胞増殖因子と生分解性高分子結合性ペプチドとのキメラタンパク質の合成を開始した。キメラタンパク質の合成には遺伝子組み換え技術および大腸菌発現系を利用している。本研究は顎関節軟骨の再生治療を目標とする。顎関節軟骨は基底部の硝子軟骨および関節摺動面の繊維軟骨からなる複合組織であり、その構造が機能発現の鍵を握る。顎関節症に伴う損傷軟骨の再建には間葉系幹細胞(MSC)を用いた再生治療が有効であると期待されているが、硝子軟骨/繊維軟骨からなる層構造を再建することは難しい。そこで本研究では、まず、MSCから線維軟骨・硝子軟骨への効率のよい分化条件を探索した。昨年度までに、TGF-beta3およびIGF-1による刺激が、とくに繊維軟骨様組織の形成に効果的であることがわかった。しかし、硝子軟骨の分化については有効な増殖因子を見出されていない。そこで本年度はとくに、MSCから硝子軟骨形成細胞の分化誘導条件の最適化に取り組んだ。不死化ヒトMSCを用いてペレット培養を行った。培地中に種々の増殖因子を添加した。4週間の培養後、とくにII型コラーゲンとI型コラーゲンの遺伝子発現比を指標として硝子軟骨への分化を判定した。また、硝子軟骨への分化を更に促進するため、細胞外マトリックスの一種であるI型あるいはII型コラーゲンを培地に添加してそれらの効果を調べた。以上の検討の結果、TGF-beta3とIGF-1を組み合わせて添加することによって硝子軟骨細胞が比較的高い割合で分化することがわかった。さらに、II型コラーゲンの添加によって分化効率は上昇した。以上のように、MSCから硝子軟骨を形成する細胞の誘導に効果的と考えられるタンパク質性因子を同定することができた。また本研究では、繊維・硝子軟骨の誘導に効果的な細胞増殖因子を生体分解性高分子からなる足場材料内に安定に担持するため、足場材料結合性ペプチドと増殖因子とのキメラ蛋白質の合成に取組んだ。これまでにBMP-2キメラ蛋白質の合成が完了している。前年度までに、間葉系幹細胞から線維軟骨および硝子軟骨に類似した組織体を作製することに成功した。そこで本年度は、これらの組織体を培養により合一させ、一つの組織体内に線維軟骨および硝子軟骨が部位特異的に配置された複合組織体を作製することを試みた。まず、線維軟骨様ペレットおよび硝子軟骨様ペレットを別々に作成し、その後、両ペレットを密着させながら培養することによってペレット同士を結合させた。14日間の培養の後に組織切片を作成し、免疫染色法によって組織体内におけるI型およびII型コラーゲンの分布について調べた。その結果、両ペレットの細胞が界面において増殖し、ペレット同士が合一した。また、免疫染色により、密着培養の開始初期に繊維軟骨様組織であった部位では硝子軟骨様組織であった部位に比べI型コラーゲンの産生量が多く、逆にII型コラーゲンの産生量は少ないことがわかった。この結果は、繊維軟骨/硝子軟骨の二層構造をもつ組織体の形成されたことを示している。繊維軟骨様ペレットと硝子軟骨様ペレットを密着させて培養することによって、繊維軟骨/硝子軟骨の二層構造をもつ組織体の形成が可能であることが示された。

この例に代表されるように、異なる組織構造が機能発現の鍵を握る組織は少なくない。顎関節症に伴う損傷軟骨の再建には間葉系幹細胞を用いた再生治療が有効であると期待されているが、繊維軟骨ー硝子軟骨からなる層構造を再建することが難しいため、その治療効果は満足できるものではない。本研究の結果、間葉系幹細胞から繊維軟骨および硝子軟骨の作り分けるための条件が見出され、さらに、それらの組織を合一させることで、繊維軟骨ー硝子軟骨の二層構造をもつ組織体の形成が可能になった。硝子軟骨の分化誘導に適した増殖因子を見出すまで、予想以上の時間を要したため。27年度が最終年度であるため、記入しない。生体材料学細胞増殖因子と生分解性高分子結合性ペプチドとのキメラタンパク質を合成し、生分解性多孔質足場材料へ担持する。足場材料の素材として脂肪族ポリエステル共重合体に着目し、適切な空隙をもつ多孔質体の作製法を確立する。その際、3次元造形技術の組み合わせを検討する。次に、生体の顎関節軟骨に見られるような複合化組織構造を再現するため、硝子軟骨誘導条件(多孔質構造および誘導因子に基づく)と繊維性軟骨誘導条件を異なる領域に配置させた人工細胞外マトリックスを構築し、その評価を行う。軟骨組織の形成実験に適した細胞を選定するため、当初の予定以上に時間を要したのが第一の原因である。また、ペレット培養された組織体の切片作成および染色操作の習得が順調には進まなかった。間葉系幹細胞から繊維軟骨および硝子軟骨を形成する細胞の誘導に効果的と考えられる細胞増殖因子に関する評価をさらに進める。さらに、細胞増殖因子と生分解性高分子結合性ペプチドとのキメラタンパク質を合成し、生分解性多孔質足場材料へ担持する。次に、生体の顎関節軟骨に見られるような複合化組織構造を再現するため、硝子軟骨誘導条件(多孔質構造および誘導因子に基づく)と繊維性軟骨誘導条件を異なる領域に配置させた人工細胞外マトリックスを構築する。複数種類のキメラタンパク質を多孔質足場材料の特定の部位にそれぞれ担持させる方法について検討する。これには、多孔質体の一方向からの含侵や、予め異なる因子を担持させた二つの多孔質体を合着させる方法などを検討する。最後に、得られた人工細胞外マトリックスを用いてin vitroでの軟骨形成実験を行う。
新規なユウロピウム錯体の合成と^<151>Eu-メスバウアー分光法による研究

新規なユウロピウム錯体の合成と^<151>Eu-メスバウアー分光法による研究を目的として今年度の研究を行った。新規錯体としては、1,8-ナフチリジンを配位子とする、[Eu(napy)_2][Fe(CN)_6]・6H_2O(napy=1,8-ナフチリジン)やクロラニル酸を配位子とする錯体の合成を行うとともに、^<151>Eu-メスバウアー分光の立上げを行い、種々のタイプの錯体について、メスバウアースペクトルの温度変化測定を行った(温度変化には設備備品として購入したSI社の温度コントローラーを用い、スペクトルの測定には、購入したシンチレーションプローブを用いた)。その結果、新規錯体である[Eu(napy)_2][Fe(CN)_6]・6H_2Oは[Eu(napy)_2(H_2O)_n]^<3+>イオンと[Fe(CN)_6(H_2O)_<6-n>]^<3->イオンからなる錯体であることが推定できたが、詳細については単結晶によるX線構造解析が必用である。クロラニル酸との錯体については、組成比が必ずしも一定でなくさらに検討を要す。一方、メスバウアースペクトルの温度依存性の測定においては、分子性錯体であるEu(DPM)_3(DPM=ジメチルピバロイルメタナト)、Eu(acac)_3・H_2O(acac=アセチルアセトナト)、Eu(CH_3COO)_3・4H_2O及びEu(CF_3COO)_3・3H_2Oでは直線からはずれ、特に嵩高い配位子であるDPMの場合には傾きも急で、室温において、配位子がかなり激しく熱振動していることが分かった。また、Eu[Fe(CN)_6]・4H_2O、KEu[Fe(CN)_6]・4H_2O及びEuF_3では、温度変化は直線を示し、特に、EuF_3の温度依存性は小さく、この化合物が3次元の強い結合を有した化合物であることが分かった。このように、^<151>Eu-メスバウアー分光法は錯体の格子力学的性質を検討する上で有用な手段となり得ることが明らかにできた。これらの結果については、国内の討論会や国際会議などにおいて発表するとともに、論文として報告すべく準備を進めている。