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東アジアにおける蘇軾「和陶詩」の受容と発展に関する研究

平成30年度は、蘇軾「和陶詩」の源を探るにあたり、唐代以後の陶淵明受容の論文が多く、新たに考察することが困難であったので、蘇軾と蘇轍の帰隠への意識について「烏台詩案」から考察することにした。「烏台詩案」の先行研究については、蘇軾の文学性や筆禍事件としての歴史的意義についての論攷が多い。しかし、このとき、蘇轍も蘇軾に連座して左遷されており、今回、その経緯や蘇轍の思想の変遷に関して詳しく考察することで、「烏台詩案」およびその後の流謫が後年の彼らの「和陶詩」創作の基礎となったことが分かった。平成30年7月に口頭発表し、そこでの批正を受けて、翌年3月に「蘇轍烏臺詩案考」と題して論攷にまとめた(東英寿編著『唐宋八大家の世界』所収)。また、蘇門四学士と「和陶詩」の研究も引き続き行った。蘇門の筆頭である黄庭堅については、平成29年度に既に考察し、論文としたため、他の晁補之・張耒・秦観について、それぞれの受容と創作についての資料を収集し、分析を行った。来年度に学会にて発表し、論文を作成する予定である。東アジア全体の「和陶詩」受容についても別に研究を進めたが、朝鮮半島における「和陶詩」については既に先行研究があったため、日本における「和陶詩」について考察することにした。拙稿「蘇軾『和陶詩集』編纂考」で宋代から元代までの大陸における『和陶詩集』の編纂過程を考察したが、そこから『和陶詩集』の日本への流入および収蔵・翻刻の過程、そして、日本における「和陶詩」創作の両面から資料を収集した。これらの資料については整理が十分にされていないため非常に難航したが、来年度には論文としてまとめるつもりである。研究の対象がこれまで学界であまり注目されていない詩人や資料であったため、十分に整理されていなかった。よって、収集・分析に時間がかかり、論文を作成するには至らなかったが、来年度に研究をまとめる目途は付けられた。来年度は研究の最終年であるため、研究のまとめを行いたい。優先度に鑑みて、現在行える課題のうち、蘇門四学士の「和陶詩」について、そして、日本における「和陶詩」について、それぞれ資料を収集しながら、考察を加えて論文にまとめるつもりである。また、来年度9月は隔年で行われている中国宋代文学学会が上海復旦大学で開催される。これまでの研究成果を発表し、様々なご意見を頂いて研究に活かしたいと考える。四学士より後の南宋から清代までの中国大陸の「和陶詩」創作については、分析したところ、創作した人数も作品数も多いため、来年度に全てを終わらせることは無理であろうと推測するが、その場合はその後の課題としたい。本研究は北宋の文壇を牽引した蘇軾の文学の中でも、六朝東晋の隠逸詩人陶淵明の詩文124篇に唱和した「和陶詩」の継承過程を系統的に考察することを目的とする。蘇軾の文学、中でも晩年の代表作である「和陶詩」は時代を越えて読み継がれ、そのことを論及するものは多数存在する。しかし、それは現存の中国におけるテキスト系統を整理した考察や陶淵明と蘇軾の関連性に終始した論説で、彼の弟子や後世の文人が詠んだ「和陶詩」を具体的に究明したものはあまり見られず、日本や朝鮮半島への影響にも注意が払われてこなかった。蘇軾「和陶詩」のテキストと後人の「和陶詩」創作という二つの継承過程を、東アジア全体に与えた影響とともに系統的に解明することで、蘇軾研究だけでなく、陶淵明受容研究・比較文学研究など各研究分野の発展にとっても大いに意義が有ると言えよう。前年の28年度において、弟の蘇轍やいとこの程之才などの協力を得て「和陶詩」の文集編纂に至った過程を辿り、かつ、南宋から元にかけて出版された文集7本の流伝について、系統的に網羅した研究を行った。その成果を「蘇軾『和陶詩集』編纂考」としてまとめ、平成29年5月『日本宋代文学学会報』第3集に掲載された。また、蘇軾を師とする文人集団「蘇門」における「和陶詩」継承を考察するために、まず門人筆頭である黄庭堅について分析し、平成29年12月『中国文学論集』第46号に「黄庭堅における蘇軾追悼の詩ー「帰去来兮辞」の追和に代わるもの」として掲載された。また、蘇軾以前の文人の陶淵明受容について、蘇軾や蘇門の門人たちに影響を与えたと思われる李白・白居易・柳宗元を中心に調べている。これらの考察により、「和陶詩」テキストの編纂と流伝、そして、蘇軾・蘇轍の直近の弟子への継承課程を一部明らかにすることができた。平成29年度で行うべき、蘇軾の薫陶を直に受けた弟子の筆頭格である「蘇門四学士」の和陶詩の継承課程や様相を調査したところ、それぞれが北宋において文壇で活躍した詩人であるために、独自の詩論や継承の特色があって一つの論文にまとめきれず、まず黄庭堅の考察を行うにとどまった。

ほか3人の晁補之・張耒・秦観の考察については、更に資料収集を行う必要があり、当初の予定であった一ヶ年で終わることができなかった。平成30年度は、蘇軾「和陶詩」の源を探るにあたり、唐代以後の陶淵明受容の論文が多く、新たに考察することが困難であったので、蘇軾と蘇轍の帰隠への意識について「烏台詩案」から考察することにした。「烏台詩案」の先行研究については、蘇軾の文学性や筆禍事件としての歴史的意義についての論攷が多い。しかし、このとき、蘇轍も蘇軾に連座して左遷されており、今回、その経緯や蘇轍の思想の変遷に関して詳しく考察することで、「烏台詩案」およびその後の流謫が後年の彼らの「和陶詩」創作の基礎となったことが分かった。平成30年7月に口頭発表し、そこでの批正を受けて、翌年3月に「蘇轍烏臺詩案考」と題して論攷にまとめた(東英寿編著『唐宋八大家の世界』所収)。また、蘇門四学士と「和陶詩」の研究も引き続き行った。蘇門の筆頭である黄庭堅については、平成29年度に既に考察し、論文としたため、他の晁補之・張耒・秦観について、それぞれの受容と創作についての資料を収集し、分析を行った。来年度に学会にて発表し、論文を作成する予定である。東アジア全体の「和陶詩」受容についても別に研究を進めたが、朝鮮半島における「和陶詩」については既に先行研究があったため、日本における「和陶詩」について考察することにした。拙稿「蘇軾『和陶詩集』編纂考」で宋代から元代までの大陸における『和陶詩集』の編纂過程を考察したが、そこから『和陶詩集』の日本への流入および収蔵・翻刻の過程、そして、日本における「和陶詩」創作の両面から資料を収集した。これらの資料については整理が十分にされていないため非常に難航したが、来年度には論文としてまとめるつもりである。研究の対象がこれまで学界であまり注目されていない詩人や資料であったため、十分に整理されていなかった。よって、収集・分析に時間がかかり、論文を作成するには至らなかったが、来年度に研究をまとめる目途は付けられた。蘇門四学士のうち、晁補之・張耒・秦観の「和陶詩」については、30年度8月までに発表および論文作成を行う予定である。同時に、李白や白居易、柳宗元などの唐代の詩人の陶淵明受容の作品が、蘇軾や彼ら門人たちの創作に影響した過程も考察したい。また、唐代までの詩人の陶淵明受容については、日中の学界でそれぞれの専門家による考察が行われていた。そこで、平成30年3月に大学紀要において中等教育の教材として活用する研究レポート「漢詩教材研究ー李白「山中問答」を読み解く」をまとめた。30年度以後も幾つかを教材研究のレポートとしてまとめるつもりである。そして、30年度8月から夏休みを使って、南宋および金・元の文人の「和陶詩」の資料収集および分析を行う。これについては31年度10月から3月までに考察をまとめ、発表および論文作成を行う予定である。来年度は研究の最終年であるため、研究のまとめを行いたい。優先度に鑑みて、現在行える課題のうち、蘇門四学士の「和陶詩」について、そして、日本における「和陶詩」について、それぞれ資料を収集しながら、考察を加えて論文にまとめるつもりである。また、来年度9月は隔年で行われている中国宋代文学学会が上海復旦大学で開催される。これまでの研究成果を発表し、様々なご意見を頂いて研究に活かしたいと考える。四学士より後の南宋から清代までの中国大陸の「和陶詩」創作については、分析したところ、創作した人数も作品数も多いため、来年度に全てを終わらせることは無理であろうと推測するが、その場合はその後の課題としたい。当初、国際学会である「中国宋代文学学会」に参加する予定であり、その際に旅費や学会参加費、発表論文のネイティブチェックの謝金、現地で収集した資料の書籍の物品費などが発生するはずであった。しかし、29年度は主に資料分析と論文作成を行うことにしたため、学会に参加することができなかった。次年度には、国内外の学会に参加するほか、資料収集を積極的に行うつもりである。
生物発光基質アナログによる発光タンパク質の持続的発光の実現

発光タンパク質を持続的に発光させることを目的として研究を行った。まず発光後クロモフォア酸化物のモデル化合物を合成し、発光タンパク質を再生させる条件を見出した。次に蛍光性基質誘導体を合成した。ヒカリカモメガイ由来の発光タンパク質は基質特異性が高いが、天然型基質に匹敵する発光活性を示す基質誘導体の創製を達成した。本研究成果により、発光タンパク質を持続的に発光させる基盤技術が確立できた。発光タンパク質の発光量は蛍光タンパク質に比べて小さく、このことは発光タンパク質をイメージング手段として利用する際の大きな問題点となっている。発光タンパク質には、基質がタンパク質に結合したクロモフォア(発光を司る化学構造)があり、これが発光後酸化物となる。この酸化物の遊離を促しかつ発光効率の良い基質誘導体の創製を本研究では目指している。本研究で取り扱っている生物発光基質「デヒドロセレンテラジン(DCL)」は蛍光を示さないが、分子修飾により蛍光物質としての機能を付与することができれば、生体機能分子のモニタリングが可能となる。そこで、ベンゾチアゾール(BZT)を導入したDCL誘導体の化学合成を目的とした。DCL誘導体合成には様々な合成経路があるので、すべての方法について検討した結果、以下の合成経路を採用することにした。まず、市販のBZTアルデヒドとグリシンからピルビン酸誘導体へと導き、次いで、セレンテラミンと縮合してデヒドロアミノ酸を得た。最後に無水酢酸で処理したところ、BZTが導入されたDCL誘導体が合成できた。これを亜鉛イオンで処理すると、分子内で錯体を形成して緑色の蛍光を示し、蛍光性DCL誘導体の合成を達成した。このDCL誘導体は発光タンパク質に限らず、生体分子におけるシステイン残基などのチオール化合物に選択的に結合する特徴があるので、生細胞内における機能分子のモニタリングが可能になるという意義がある。本研究で取り扱っている発光タンパク質は基質特異性が高く、これまで合成してきた様々な基質「デヒドロセレンテラジン(DCL)」誘導体の発光活性は低かった。本年度は、基質であるデヒドロセレンテラジン(DCL)の構造にホタル発光基質の構造を融合させた新規DCL誘導体の化学合成を検討した。その結果、市販のアミノピラジンを臭素化し、芳香族チオールとの置換反応、そしてクロスカップリング反応により基本骨格が効率よく構築できた。最後にピルビン酸誘導体と縮合してDCL誘導体の合成を完了した。フッ素と硫黄原子を導入したDCL誘導体(S-F-DCL)は天然型基質に匹敵する発光量を示し、これまで合成してきた誘導体の中で最高の活性を示すことが明らかになった。本成果により、生体成分を2成分同時計測することが可能となり、機能分子の活性発現機構を解明する手段として利用することが期待される。発光タンパク質の発光量は基質が結合した発光タンパク質の量で規定されるため、発光量を増やすためには使用済み基質をタンパク質から除去し、新たな基質を導入し発光タンパク質を再生する必要がある。これが実現すれば発光量を増やすことが可能となる。本研究では、発光後生成物からクロモフォア(発光を司る化学構造)を再生する条件を模索し、発光タンパク質による連続的生物発光の実現を目的とした。本年度は、システイン残基にクロモフォアが共有結合した発光タンパク質について、そのクロモフォア酸化物のモデル化合物の合成法について検討した。ベンズアルデヒドから数段階にて、チオール基が導入されたフェニル酢酸誘導体を合成することができた。次いで、既存の方法で別途化学合成したセレンテラミンとの縮合条件について検討した。これまではカルボン酸部分を酸クロリドへと変換してから縮合していたが、カルボン酸をそのまま縮合する方法を用いることでクロモフォア酸化型アナログが効率よく合成できた。本手法を用いて、発光後クロモフォア酸化物のモデル化合物の合成が完了した。このモデル化合物は発光タンパク質を再生させるための条件を模索するための重要な分子プローブである。持続的な発効には効率的に発光する基質誘導体が不可欠である。本年度合成を完了した誘導体は新しい蛍光特性の機能を併せ持つ持続的発光の実現に重要な基質となる。この合成を完了したことから、研究はおおむね順調に進展している。本年度はこれまでに合成例のない発光後クロモフォア酸化物のモデル化合物の合成方法を確立することが課題であった。ベンズアルデヒドから数段階でクロモフォア酸化物モデルを効率的に化学合成することに成功したので、研究はおおむね順調に進展している。

これまでに合成を完了したクロモフォア酸化物モデル、そして蛍光性デヒドロセレンテラジン類を利用して、発光タンパク質の発光機構を詳細に解明し、発光効率の向上と、持続的発光の実現についてさらに検討を重ねる。本年度化学合成した分子プローブ(発光後クロモフォア酸化物モデル)からチオール基が遊離する条件について、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)を用いて詳細に検討する。現在のところ、2通りの遊離経路を予想しているので、そのどちらの経路でこのモデル化合物が分解するのかを明らかにする。その結果を基にして、天然型基質を改変し、発光タンパク質の発光量を増加させる条件について検討する。本年度の研究費のうち次年度使用分は、年度末に購入する消耗品費として支出する計画である。次年度以降における上記の研究を推進するために、有機合成用反応剤の購入に消耗品費の使用を計画している。本年度の研究費のうち次年度使用分は、年度末に購入する消耗品と、年度末の学会発表旅費として支出する計画である。次年度以降における上記の研究を推進するために、有機合成用反応剤、有機合成用溶媒、生化学用試薬、実験用ガラス器具、実験用プラスチック器具、HPLC用移動相、そして電気泳動用試薬の購入に消耗品費の使用を計画している。また、本研究成果を学会発表するために国内旅費を使用する計画である。
移動物体への部品組付システムの研究

PSDはPosition Sensitive Deviceの略称で,通常光像の重心位置を検出するために使われる。本研究では検出回路及び信号処理ソフトを工夫することにより,ボルト取り付け穴のように黒い部分の重心位置及びその傾きを検出することのできるPSDセンサシステムを開発した。本センサシステムの穴の位置及び角度検出分解能はおよそ3μm及び0.3度であった。本センサシステムと4軸直交ロボットを組み合わせた組立用ロボットシステムを構築した。本システムでは±3mm,±5度程度の位置及び姿勢ずれのある公差30μmの穴へのシャフト挿入を行うことができた。さらに1自由度のロボットと組み合わせて,移動物体へのシャフト挿入システムを構築した。本システムでは9mm/secで移動する物体へシャフトを組み付けることが可能であった。しかし本PSDは受光部が平面であり,角度分解能か良くないので,角度分解能を格段に向上できる十字型受光部のPSDを考案し,浜松ホトニクス(株)と共同開発を行った。またロボットの制御を高速で行うために,アクチュエータの制御システムを改造して,直接コンピュータでロボットが制御できるようにした。新しいシステムでは150mm/secの速度で移動する物体の追従が可能であった。新しく開発した十字型PSDの穴の位置及び重心検出特性,及びこのセンサ及び新しく改造したロボットを用いた移動物体へのシャフト組み付けについては,今後実験を行い結果を順次発表する。
低O_2および高CO_2環境下における筋求心性刺激による呼吸抑制規機序の解明

侵害的なガス環境(低O_2、高CO_2)要素と、侵害受容器であるポリモーダル受容器入力による反射性の呼吸系ネガティブフィードバックの相互作用について検討した。呼吸系に最も直接的に作用するO_2、CO_2濃度を各々高低2つのレベルに変化されたガス環境(血液ガス連続モニタリングシステムにより動脈血ガス分圧をモニター)下で、麻酔下、人工呼吸下のネコを用いて実験を行った。横隔神経放電記録から呼吸出力を算出し、CO_2レスポンスカーブの変曲点から個体毎に基準呼吸出力を便宜的に決めた。この基準呼吸出力の約2倍の呼吸出力を生じる高CO_2(呼気CO_2:6.0±0.3%,n=10)、低O_2(呼気O_2:10.0±0.4%,n=4)においては、筋細径神経求心性刺激により誘導される反射性の呼吸抑制が基準呼吸出力時(各々呼気CO_2:4.3±0.2%;呼気O_2:20.5±0.3%)と比べ大きく減弱された。ガス環境による呼吸促進成分により、反射性の抑制効果が相殺されたものと推測される。この反射性呼吸抑制には内因性オピオイドが関与すると考えられてきたので、呼吸調節に係わると考えられる脳幹尾側領域の潅流液中のβ-エンドルフィンをエンザイムイムノアッセイ法により測定したところ、極めて侵害的なガス環境、8%O_2吸入(n=5)あるいは6%CO_2(n=5)吸入によっても酸素添加空気吸入と比べてその免疫活性に有意な変化はみられず、ガス環境による内因性オピオイド量の変化は認められなかった。モルヒネの静脈内投与による呼吸抑制作用は高CO_2環境(呼気CO_2:6.0±0.4%,n=6)による高呼吸出力状態においては基準呼吸出力時(呼気CO_2:4.7±0.4%,n=6)と比べ、より小さかった。ガス環境による呼吸促進成分により、モルヒネによる呼吸抑制効果が相殺されたものと推測される。異常ガス環境はオピオイド放出量に変化を与えず、その作用の程度に影響を与えたものと考えられる。呼吸系に最も直接的に作用するO_2、CO_2濃度を各々高低2つのレベルに変化させたガス環境下で、麻酔下、人工呼吸下のネコを用いて実験を行った。呼吸出力(ピーク値と呼吸頻度の積)の指標として横隔神経放電を記録し、ガス環境変化の指標として、呼気O_2、CO_2濃度と動脈血pH、O_2、CO_2分圧を経時的に測定した。定常状態においては動脈血CO_2分圧は、呼気CO_2分圧と良く相関した(r=0.968,n=58)が、再呼吸のような急激なCO_2変化時においては両者間にズレが見られた。呼吸出力のCO_2レスポンスカーブ(再呼吸法を使用)の変曲点から個体毎の基準呼吸出力を便宜的に決めた。

この基準値の約2倍の呼吸出力を生じるガス環境、高CO_2(呼気CO_2:4.6±0.3%から6.0±0.2%に上昇,n=10)、低O_2(呼気O_2:20.0±0.3%から10.4±0.3%に低下,n=5)の定常状態においては、呼吸のピーク値が呼吸頻度より大きく促進された。この高呼吸出力状態において筋細径神経求心性刺激により誘導される反射性の呼吸修飾を観察し、基準呼吸出力時と比べた。ピーク値がより促進されたこのような高呼吸出力状態においてはピーク値における反射性呼吸抑制が見られず、呼吸出力における呼吸抑制の程度は基準呼吸出力時に比べて大きく減弱された。ガス濃度による呼吸促進成分が侵害刺激に加算され、より大きな反射性の呼吸抑制を生じると予測したが、結果は、ガス濃度による呼吸促進成分により、反射性の呼吸抑制成分が相殺されたものと推測される。次のステップとしてこの反射性呼吸修飾に、呼吸のレベル調節に係わると考えられる結合腕傍核がいかにかかわるかを神経ペプチド、Fos蛋白等を指標にして、明らかにしたい。侵害的なガス環境(低O_2、高CO_2)要素と、侵害受容器であるポリモーダル受容器入力による反射性の呼吸系ネガティブフィードバックの相互作用について検討した。呼吸系に最も直接的に作用するO_2、CO_2濃度を各々高低2つのレベルに変化させたガス環境(血液ガス連続モニタリングシステムにより動脈血ガス分圧をモニター)下で、麻酔下、人工呼吸下のネコを用いて実験を行った。横隔神経放電記録から呼吸出力を算出し、CO_2レスポンスカーブの変曲点から個体毎に基準呼吸出力を便宜的に決めた。この基準呼吸出力の約2倍の呼吸出力を生じる高CO_2(呼気CO_2:6.0±0.3%,n=10)、低O_2(呼気02:10.0±0.4%,n=4)においては、筋細径神経求心性刺激により誘導される反射性の呼吸抑制が基準呼吸出力時(各々呼気CO_2:4.3±0.2%;呼気O_2:20.5±0.3%)と比べ大きく減弱された。ガス環境による呼吸促進成分により、反射性の抑制効果が相殺されたものと推測される。この反射性呼吸抑制には内因性オピオイドが関与すると考えられてきたので、呼吸調節に係わると考えられる脳幹尾側領域の潅流液中のβ-エンドルフィンをエンザイムイムノアッセイ法により測定したところ、極めて侵害的なガス環境、8%O_2吸入(n=5)あるいは6%CO_2(n=5)吸入によっても酸素添加空気吸入と比べてその免疫活性に有意な変化はみられず、ガス環境による内因性オピオイド量の変化は認められなかった。モルヒネの静脈内投与による呼吸抑制作用は高CO_2(呼気CO_2:6.0±0.4%,n=6)による高呼吸出力状態においては基準呼吸出力時(呼気CO_2:4.7±0.4%,n=6)と比べ、より小さかった。ガス環境による呼吸促進成分により、モルヒネによる呼吸抑制効果が相殺されたものと推測される。異常ガス環境はオピオイド放出量に変化を与えず、その作用の程度に影響を与えたものと考えられる。
アクチビン-ホリスタチン-プロテオグリカン相互作用による細胞増殖・分化調節機構

アクチビンはTGF-βスーパーファミリーに属する細胞増殖・分化因子の1つで、多彩な生理作用を有する。一方、ホリスタチンはアクチビンの結合蛋白質としてアクチビンの活性を阻害するとともに、細胞外マトリックスを構成するプロテオグリカンのヘパラン硫酸と強く結合してアクチビンを細胞表層にトラップする働きを持つ。このようにアクチビンの作用は、ホリスタチンやプロテオグリカンなどとの相互作用によって細胞表層で複雑に調節されている可能性が高い。本研究では、アクチビン-ホリスタチン-プロテオグリカンの3者の協奏作用による細胞増殖・分化制御機構の一端を明らかにするため、特に複数の分子種として分泌されてくるホリスタチンの精製やヘパラン硫酸との結合特性とその生理活性を中心に解析し以下の成果を得た。(1)ヒト卵胞液、胎盤から新たにホリスタチンを分離して、哺乳類では共通して複数のホリスタチン分子種が合成・分泌されている可能性を指摘した。(2)ブタ卵巣から分子量32kDa-38kDaの6種のホリスタチンアイソフォームを精製し構造解析した結果、アイソフォーム間でポリペプチド鎖のC末端領域の長さや付加する糖鎖数に違いがあることを明らかにした。(3)アイソフォーム間で、細胞表層ヘパラン硫酸に対する親和性は異なり、高分子ホリスタチン(38kDa,315アミノ酸)がほとんど結合しないのに対して、C末端酸性領域を欠く低分子ホリスタチン(32kDa,288アミノ酸)は強く結合し、しかもホリスタチンの下垂体からのFSH分泌抑制活性も低分子ホリスタチンが最も高かった。従って、アクチビンの生理作用は低分子ホリスタチンとプロテオグリカンとの協同作用によって細胞表層で効率的に抑制制御される一方、高分子ホリスタチンが液相において低分子ホリスタチンとは異なる働きをしている可能性が考えられた。
計算関理学ー物性研究における新展開ーA01 第1原理からの物性予測

本研究班の本年度の主要な実績としては、CarーParrinello的な第一原理分子動力学法の開発と応用、局所密度汎関数法の新しい発展、表面・界面・クラスタ-・磁性・超高圧系などへの局所密度汎関数法の応用があげられる。まず第一原理分子動力学法の開発と応用については、標準的なノルム保存型のBHS擬ポテンシアルによるプログラム開発が完了するとともに、分離型ノルム保存擬ポテンシアルであるKB擬ポテンシアル、Vanderbildtソフト分離型ノルム保存擬ポテンシアルなどの開発がかなり進んだ(塚田)。この第一原理分子動力学法を応用して、表面の吸着構造、および半導体中の不純物反応などの重要な問題について数値計算がなされた。前者ではSi(100)表面上のアルカリ吸着の電子状態と吸着構造(寺倉)及び、Si(100)表面上の炭素の吸着構造(塚田)について興味ある結果が得られた。後者では多重電荷状態、負の電子相関、触媒効果による不純物化学反応および拡散機構について、新しい知見が遠られた(吉田)。またより現実的な簡単化された方法として、電荷密度を変分するLDFーLCAC法が提案され、金属クラスタ-系に適用された(里子)。局所密度汎関数法の新しい問題への応用として、走査トンネル顕微鏡像の第一原理計算によるシミュレ-ション法が開発され、Si表面上の銀の吸着系に適用された(塚田)。またSi表面上のIII族あるいはV族原子吸着系についても、重要な結論が得られた(永吉)。さらに異結晶系超格子の電子状態(中山)、金属シリサイド・シリコン界面の電子状態(浅野)など応用的に興味ある界面系について、局所密度汎関数法による解明が進んだ。磁性系については、3d/4f強磁性体の電子状態の研究が進み、X線磁気二色性について興味ある結果が得られ(城)また合金の磁気的不規則状態についての研究が進んだ(赤井)。
糸球体神経核の神経回路特性とその可塑的行動制御のメカニズム

哺乳類を中心とする多くの脊椎動物中枢神経系において、神経核は多くの場合比較的小型の多種の細胞により構成され、構築も複雑である。一方、ある種の硬骨魚類(今回用いたのは主にカワハギ)に存在する「第3型糸球体核」は視覚性の入力を受け視床下部下葉に投射する機能的に興味深い神経核で、構成細胞種が少なく(2種)、明瞭な層状細胞構築を持ち、また巨大な(>60mm)シナプス後樹状突起を含むという形態学的特徴をもち、神経核機能の解析の為の優れたモデル系になる可能性がある。今年度は糸球体核脳スライス標本を用いて神経核機能の解析を行うために、まず,日本医科大学医学部解剖学教室の伊藤博信・山本直之両博士との共同研究により実験系となる硬骨魚類の糸球体核に関する神経解剖学的知見を得た。これを元にして,我々は硬骨魚類糸球体神経核の脳スライス標本を開発した。これを用いて,まず電気生理学的手法により2種の構成細胞及びシナプス伝達の生理学的解析を行った。皮質核から糸球体核への入力線維の刺激に対する樹状突起先端部でのシナプス後電位(PSP)の細胞内記録を行った結果から,大型細胞は皮質核活動の時間的な特徴を抽出する機能があり,小型細胞は皮質核活動の強度(同期性)をコードすると考えられた。また,このシナプス伝達にはNMDA型およびAMPA型のグルタミン酸受容体とGABAA受容体が関わっていることもわかった。次に,巨大シナプス後樹状突起のシナプス後電位活動を単一細胞の分解能で膜電位感受性色素を用いたイメージングにより多点測定することを理化学研究所のKnopfel博士らとの共同研究で行った。
MRP1の抗癌剤結合部位の同定と輸送機能ドメインの解析

腫瘍細胞の抗癌剤に対する治療抵抗性は癌治療の大きな障害である。MRP1 (multidrug resistance protein)は多種類の抗癌剤に対する治療抵抗性(多剤耐性)を担う分子としてカナダのColeらによってcDNAが単離された。我々はMRP1の輸送機能を阻害する新規な分子アゴステロール(AG-A)にアジド基と^<125>Iを付加して放射性光親和性誘導体([^<125>I]azido-AG-A)を合成した。この新規誘導体を用いて、[^<125>I]azido-AG-AによるMRP1のフォトラベルにGSHが必要であることを発見した。(J. Biol. Chem. 2001 ; 276(25):23197-23206)。今回我々は以上の研究をさらに進め、以下のことを明らかにした。1.MRP1の1295番目アミノ酸から1531番目アミノ酸までの領域は[^<125>I]azido-AG-AのGSH依存性の結合に必要ではないことが判った。2.MRP1の1222番目アミノ酸のC末端に二つのHAエピトープを挿入したミュタント(1222HA)を作成した。[^<125>I]azido-AG-Aでフォトラベルした1222HAのプロテアーゼによる消化実験により、[^<125>I]azido-AG-Aのフォトラベル部位はMRP1の膜貫通領域14-17にあることが判明した。3.dual expressionvectorを用いた実験により、AG-AのGSH依存性の結合部位はMRP1の1222番目アミノ酸から1295番目アミノ酸までの領域であることとフォトラベル部位はMRP1の膜貫通領域14-16にあることが判った。4.MRP1のAG-A結合部位に突然変異を導入して、1249番目のアルギニンは薬剤結合に重要であることが判った。以上の結果より、AG-Aの結合部位はMRP1の1222番目アミノ酸から1295番目アミノまで領域であること、フォトラベル部位はMRP1の膜貫通領域14-16にあることを明かにした。
情動分析による人間らしい情緒あるピアノ自動演奏

近年、MIDIのような楽器電子制御技術の発達により、音楽の自動演奏に関する技術は飛躍的に進歩した。それに伴いコンピュータによる「人間らしい」自動演奏を実現するために様々な研究が行われるようになってきた。しかし、コンピュータによる自動演奏は人間の演奏と比肩できるまでには至っていない。自動演奏を行うためには、まず楽譜情報をデータとして入力するが、それだけでは規則的な音の列が演奏されるだけで感情は感じられない。感情を感じる演奏を実現するためには、「人間らしさ」に関する情報が必要である。しかし、「人間らしい」演奏データの実現は、人間の演奏が非常に経験的・専門的で複雑なため難しい。自動演奏に「人間らしさ」を含ませるためには、まず、音楽演奏のどの要素が人間にとって「人間らしい」演奏と感じるかを調べる必要がある。すなわち、人間が感じる「人間らしさ」と音楽に含まれている様々な要素との関係を明確にすることによって、「人間らしい」演奏データの作成に有用な情報が得られる。音楽と聴取印象との関係を明らかにする目的とした様々な研究が行われている。しかし、これらの研究ではテンポ及び音の強さが形容詞に影響を与える重要な物理量として認識されたが、各物理量と形容詞の関係に関する検討は行われていない。そこで、本研究では各物理量と形容詞との関係について詳しい試聴実験を行った。その結果、音楽の物理パラメータとしてローカルテンポ及びヴェロシティを変化させた場合のピアノ曲の聴取印象の試聴実験により、SD法で用いた形容詞の評価値の相関より形容詞対の妥当性を検討した。また、形容詞と各物理量との関係について15個の形容詞を用いてローカルテンポやヴェロシティを変化させた場合の試聴実験に対して因子分析を行った結果、各物理パラメータの自然さへの影響がかなり大きいことが分かった。計算機や電子楽器の発達により、計算機を用いた音楽の演奏や音楽放送が盛んになってきた。それに伴い、機械的な演奏からより人間らしい演奏へ近付ける研究の重要性が増している。研究代表者は、複数のピアノ演奏者の演奏データと楽譜データとの詳細な比較により人間が補う演奏データを抽出する研究を行なってきた。本研究では、コンピュータによる自動演奏を、機械的な演奏からより人間に近い演奏にすることを目指している。解析データには、楽譜情報が詳細に記述されているクラシックピアノ演奏を用いた。世界的著名な5名のピアノ演奏者のピアノ演奏データと楽譜データの対応づけを行いメロディーやコードの揺らぎ、曖味な表現などについて詳しく議論した。実際のピアノ演奏データ間の対応づけは、3000符以上のデータから和音同士のマッチングを行なうために、先ずクラスタリングを行なう新しい_<DP>マッチングを提案した。この新しい_<DP>マッチングにより_<98%>以上の成功率を達成できることを明らかにした。一般に、上級奏者の演奏データは、個性や演奏・録音環境に依存するため、同一曲の演奏データ間の解析から個性や環境に影響しないと考えられる標準的演奏データの構築方法の提案を行なった。標準的演奏データの構築には発音時刻、音長やベロシティの正規化を行う手法を与えたりローカルなテンポ抽出とペダル操作の検討を行なった。提案した構築手法によりコンピュータにより自動生成した標準的演奏データの波形は、ベロシティーやテンポともに上級奏者の演奏データに全体的に類以していることを示した。また、37名による標準的演奏データの試聴実験を行ないその聴衆印象の解析を行なった。その結果、標準的演奏データは、自然ではあるが好きでない演奏という回答が得られ、上級奏者の個性をある程度なくした自動演奏を達成できることを明らかにした。この標準的演奏データと情動分析を基にして、個人のメロディーやコードの揺らぎ、曖味な表現などの人間が補うべき情報を明らかにして人間らしい情緒あるピアノ自動演奏の基礎研究を行なう。
マウス肺発癌耐性遺伝子Par2の腫瘍化標的細胞における発現の検討 :Par2-congenic系統を用いて作成されたキメラマウスによる解析

BALB/cマウスはその18番染色体上にウレタン誘発肺発癌耐性遺伝子であるPar2(Pulmonary adenoma resistance 2)を有している。我々はPar2遺伝子のポジショナルクローニングを行うため、まずPar2を含む約20cMの染色体領域をC57BL/6からBALB/cに移入したBALB.B6-Par2 congenic系統を樹立した。このBALB.B6-Par2系統を利用した高精度染色体マッピングにより、Par2の第18染色体における位置を約0.5cMの領域にまで絞られている。今年度は、Par2の候補遺伝子選択に有用な情報を得るため、BALB.B6-Par2とBALB/cとの間でキメラマウスを作成し、同マウスにおけるウレタン誘発肺腫瘍を解析した。すると、キメラマウスに発生した肺腫瘍の8割以上がBALB.B6-Par2細胞由来であった。従って、Par2形質の責任因子は腫瘍化標的細胞自身に存在することが判明した。さらに、キメラマウスにおいては、BALB/c細胞由来腫瘍とBALB.B6-Par2細胞由来腫瘍の平均サイズが同等であり、Par2形質の責任因子は二段階発癌説におけるイニシエーションへの感受性を修飾することも明らかになった。Par2に関するこれらの情報に従ってmouse genome databaseを検索したところ、約0.5cMのPar2領域に極めてfidelityの低い損傷乗り越え型DNA polymeraseであるPolιの遺伝子が存在することを発見した。様々なマウス純系のPolιcDNAの塩基配列を決定すると、BALB/c PolιcDNAのcDNAはsingle nucleotide polymorphismやアミノ酸配列の観点から、非常に特異であることが明らかになった。よって、現在我々はPolιを最も有力なPar2侯補遺伝子と考え、さらなる解析を進めている。
成年者の身上監護をめぐる法的課題の研究―包括的な意思決定支援制度の構築にむけて―

わが国の現行法は、判断能力が不十分な者の身上事項について決定がなされる際に、人格的利益が損なわれないような保障を提供するものであるとはいいがたい。そこで本研究は、身上事項のうち、特に重大な利益に関わる医療・居所・面会交流の決定に焦点を当て、イギリス法およびカナダ法を参照しながら、わが国が導入すべきセーフガードの在り方について検討した。その結果、まずはそれらの事項の決定にあたり本人、家族、介護・医療従事者等の間で、行政の監督の下、協議での決定を目指し、協議が整わない場合に初めて裁判所が代行決定機関として判断を行うという合意形成アプローチ優先の手続モデルを提示した。わが国は、判断能力が不十分な成年者に対して、その意思決定を支援する制度として成年後見制度を用意している。しかし、この制度は主に財産管理のために機能するものであり、人々が実際の生活において必要とする自己の身上にかかわる決定には、十分に対応できていないとの批判がある。本研究は、そのような成年者の身上監護事項について決定がなされる際に、その者の利益を保護しながら、意思決定が行われるために必要と考えられる制度保障のあり方を検討するものである。本年度は、高齢者や精神障害者等の身上監護事項をめぐって、家族や周囲の者の間で意見の対立が生じた場合、その紛争解決手段として、メディエーション(調停)手続きを用いることができないか、イギリス・日本・カナダ(オンタリオ州)の各法域の制度を調査し、比較検討した。先ごろ、わが国も批准した障害者権利条約は、締約国に対して、従来の成年後見制度に代表される「代行型の決定」から「支援型の決定」へのパラダイムシフトを要請するものであるといわれている。メディエーションのような合意形成型のアプローチは、条約が目指すところの「支援型の決定」に分類されるものと思われる。したがって、わが国の将来における意思決定支援制度を検討するうえで、合意形成型アプローチの紛争解決システムを研究することは、有意義であると思われる。とりわけ、成年後見制度を申し立てる際に、メディエーションを経ることを義務付けているオンタリオ州の制度は、非常に参考になるものであった。この制度は、紛争が生じる前、またはその争いが激化する前の段階において、判断能力が不十分な成年者について、当事者が必要な事項を話し合うことができるという利点があり、学ぶところが大きかった。本年度は、判断能力を欠く者の身上監護事項のうち特に本人の自由剥奪に関する議論を中心に検討を行った。その研究の概要は、以下の通りである。1わが国の法のあり方について考察するための素材として、イギリス法の状況を調査した。イギリスでは、2007年に「自由剥奪セーフガード(DoLS)」という諸規定が2005年精神能力法(Mental Capacity Act 2005)に新しく組み込まれ、判断能力を欠く成年者の自由が剥奪される状況においてとられなければならない手続きが細かく規定された。まずは、そのような制度が新しく導入された経緯について、欧州人権裁判所の諸判決との関係に着目し、検討する作業を行った。つぎに、DoLSの規定の具体的な中身について整理し、現行制度の問題点を洗い出した。その作業の過程において、2014年3月に下されたイギリスの最高裁判決を機に、立法後とられてきた従来の自由剥奪に関する規制のあり方が大きく転換される可能性があることを明らかにした(「同意能力を欠く成年者の自由剥奪をめぐるイギリス法の現状と課題」早稲田法学会誌65巻2号249-299頁)。2昨年度に引き続き、カナダにおける成年後見メディエーションに関する調査を行った。本年度は、実際にトロントに赴き家族法情報センターを訪問するほか、現地の研究者とコンタクトをとり、有益な資料を得た。3わが国における判断能力を欠く成年者のための自由剥奪セーフガードを検討するにあたり、とくに障害者権利条約12条および14条の意義と締約国に対する要請を分析した。本研究と上記1および2の研究によって得られた知見を基に、わが国が将来とりうる一つの手続きモデルを提示した。その成果は、今年度提出した博士論文「判断能力を欠く成年者の居所および面会交流の決定をめぐる法的課題の研究」の一部にまとめた。1最終年度に実施した研究本年度は、3つの事項について研究を実施した。まず、障害者権利条約が締約国に求める障害者の法的能力の平等について整理し、この点に関するイギリス国内の議論を調査した。近時、わが国も障害者権利条約を批准しており、精神障害により判断能力が不十分な要保護者の権利を保障するための法的枠組みを作るためには、この条約に抵触しないようなシステムを考える必要がある。そのためには、2009年に同条約を批准し、わが国とは異なる要保護者の意思決定支援制度を有しているイギリスでの議論を探求することは示唆的であった。次に、わが国において要保護者の生活支援とかかわりを持つ諸機関(地域包括支援センター、社会福祉協議会、医療・介護従事者、後見人等および家族)の職務権限および責任について調査した。この研究を通じて、現行制度の下で、要保護者の身上監護のための意思決定支援を行うためには、各機関がどのような職務を執行し、どのような点において連携を図る必要があるのかを明らかにした。2研究期間全体を通じて実施した研究身上監護事項の中でも、特に要保護者の自律と保護の利益調整が困難である事項の一つに、居所の決定や面会交流の制限があげられる。本研究期間を通じて、これらの事項の決定における要保護者の人格的利益の保障に必要な法的枠組を検討し、博士論文にまとめた。

わが国の現行法は、判断能力が不十分な者の身上事項について決定がなされる際に、人格的利益が損なわれないような保障を提供するものであるとはいいがたい。そこで本研究は、身上事項のうち、特に重大な利益に関わる医療・居所・面会交流の決定に焦点を当て、イギリス法およびカナダ法を参照しながら、わが国が導入すべきセーフガードの在り方について検討した。その結果、まずはそれらの事項の決定にあたり本人、家族、介護・医療従事者等の間で、行政の監督の下、協議での決定を目指し、協議が整わない場合に初めて裁判所が代行決定機関として判断を行うという合意形成アプローチ優先の手続モデルを提示した。本年度は、イギリスの2005年精神能力法が規定する身上監護に関する研究を深め、一定の成果を挙げた。これは、昨年度一部変更した研究計画に相違ない内容である。1 DoLSの制定に大きな影響を与えた欧州人権裁判所のHL事件判決を検討し、当時のイギリス法のどの点に不備があるとされたのかを具体的に明らかにした。そして、HL事件判決を含む欧州人権裁判所の諸判決から精神障害者の自由の剥奪に関する欧州人権条約上のルールを抽出し、それらのルールがDoLSに反映されている点を明らかにした。さらに、200条以上の附則、2つの行政規則および全125頁にわたる行動指針によって構成されるDoLSの下では、どのような手続きに従って判断能力を欠く成年者が病院やケアホームに収容され、その自由が剥奪されるかを明らかにした。この作業と共に、DoLSの適用に関連して裁判所に持ち込まれたケースから、現行法に対して実務からどのような問題が指摘されており、それに対して裁判所がどのような解決策を提示しているか、ということを分析した。他にも2005年精神能力法立法後調査において指摘される現行法の問題点を明らかにした。2障害者権利条約14条の下で精神障害者に対する自由剥奪を許容されうる場面および締約国が導入すべき自由剥奪セーフガードの態様について検討した。また、カナダ諸州でとられる判断能力を欠く成年者の意思決定のための制度を検討した結果、それらが同条約12条の要請する「支援型」アプローチになじむものとの所見を得た。カナダ諸州の制度については、次年度も引き続き調査していく予定である。3以上の研究によって得られた知見から、わが国における判断能力を欠く成年者の自由剥奪セーフガードの一試案を描くところまで到達した。この点については、次年度以降、慎重に検討しなおし、紀要等で公表したいと考えている。民事法学次年度においては、これまでの研究をさらに深め、本年度方向性を示したわが国における自由剥奪セーフガードの構想を公表すること、身上監護に関する意思決定制度の将来像を検討する予定である。そのために、下記の2つの作業を行う。1「支援型」アプローチとして参考になると思われるカナダの諸州の制度について引き続き詳しく調査する。10月にブリティッシュコロンビア州で行われるカナダ高齢者法センター主催の国際会議に出席するほか、現地での調査および研究者との意見交換を行う予定である。
がん遺伝子トランスジェニックマウス前がん段階の免疫調節による発がんの制御

retがん遺伝子を免疫グロブリンH鎖エンハンサ-(Eμ)あるいはメタロチオネイン(MT)プロモ-タ-/エンハンサ-に組み合わせてBCF_1マウス受精卵に移入し作製したトランスジェニックマウスにはそれぞれプレBリンフォ-マとメラノ-マが発生した。本研究ではこれらがん好発トランスジェニックマウスの基礎的性状を調べるとともに、トランスジェニックマウスに発生する腫瘍に対する特異免疫の誘導を試み、この免疫を利用して腫瘍発生を制御することを試みた。プレBリンフォ-マ好発系トランスジェニックマウスにマウスの交配によってアロ抗原遺伝子を導入しこのマウスに発生する腫瘍をライン化して免疫原とした。この腫瘍をBCF_1マウスに接種するとアロ抗原が標的となって拒絶されたが、このマウスには親トランスジェニックマウスに発生した腫瘍から樹立した細胞株をも拒絶する免疫が成立していた。この免疫はEμーmycトランスジェニックマウス発生腫瘍から樹立した腫瘍細胞株を拒絶しなかったが、Eμーretの他のトランスジェニックマウス個体に由来する腫瘍細胞株やret/MTトランスジェニックマウス発生メラノ-マ細胞株も拒絶した。このことからこの免疫はret特異的であると考えられた。この免疫はまた少なくとも一部、ret特異細胞傷害性Tリンパ球に媒介されることが示された。そこでプレBリンフォ-マ好発トランジェニックマウス系にアロ抗原導入腫瘍細胞株を反復注射し腫瘍発生への影響を調べた。その結果、トランスジェニックマウスにおける腫瘍発生が有意に遅延し、マウスの腫瘍死が抑制されることが見い出された。
生体の安全性確認のための超音波照射時における生体軟部組織ならびに骨内部の温度推定

本年度は,生体内部の音波伝搬と温度上昇に関する検討をより詳細に行った.複雑な形状の生体と骨内部を伝搬する音波を計算機で解析する手法としてFDTD法を用いた.そして,骨内を伝搬する音波をより正確に求めるために横波成分を同時に解析する弾性FDTD法のプログラムを開発して,骨の有無によって超音波の強度分布がどのように変化するか求めた.その結果,強度として数dB程度の差が出ることが分かった.さらに,生体組織と骨内の発熱状態を綿密に調べるために通常の超音波診断装置と瞬間的な強度は同じだが,エネルギーとしては数百倍の照射となる連続波を送信した条件で解析を行った.その結果,横波を考慮すると生体組織と接する面での発熱が大きくなる結果が得られ,安全性の面から注視すべき結果が示唆された.次に製作したシミュレーションソフトウエアの信頼性と精度を確認するために生体組織に似せた音響的・熱的特性を持つ生体模擬ファントムを作成して模擬実験を行った.生体軟部組織のファントムはIEC60601-2-37のAnnexに示されている組成で作成し,骨はアクリルを擬似骨として用いた.中心周波数2MHzの超音波をファントムに連続30分間照射し,生体模擬ファントム内部の温度変化を熱電対で測定した.その結果,実測したデータとシミュレートした結果が良い一致が見られ,製作したソフトウエアの信頼性を確認することができた.本年度は,まず,生体内部の音波伝搬と温度上昇に関する基礎的な検討を行った.複雑な形状の生体と骨内部を伝搬する音波を計算機で解析する手法として時間領域差分(FDTD)法を用いた.FDTD法は任意の形状を計算機上でモデル化に適した手法ではあるが,複雑なモデルと広範囲の計算においては解析時間が長時間となるため並列計算機を用いて,計算時間の削減を図った.さらに,現実的な問題に対応できるようにその計算領域を従来の2次元から3次元に拡張して,その差異を確認した.そして,骨内を伝搬する音波をより正確に求めるために横波成分を同時に解析する弾性FDTD法のプログラムを開発して,骨の有無による超音波の強度分布がどのように変化するか求めた.その結果,強度として数dB程度の差が出ることが予測された.さらに,骨内の発熱は横波を考慮すると生体組織と接する面での発熱が大きくなることが分かり,安全性の面から重視すべき結果が示唆された.次に,製作したシミュレーションソフトウエアの信頼性と精度を確認するために生体組織に似せた音響的・熱的特性を持つ生体模擬ファントムを作成して模擬実験を行った.周波数2MHzの超音波を連続30分間照射し,生体模擬ファントム内部の温度変化を熱電対で測定した.その結果,実測したデータとシミュレートした結果が良い一致が見られ,製作したソフトウエアの信頼性を確認することができた.今後はソフトウエアのユーザーインターフェイス部を改良し,より使用感が高いソフトウエアに改良し,一般へ配布する予定である.本年度は,生体内部の音波伝搬と温度上昇に関する検討をより詳細に行った.複雑な形状の生体と骨内部を伝搬する音波を計算機で解析する手法としてFDTD法を用いた.そして,骨内を伝搬する音波をより正確に求めるために横波成分を同時に解析する弾性FDTD法のプログラムを開発して,骨の有無によって超音波の強度分布がどのように変化するか求めた.その結果,強度として数dB程度の差が出ることが分かった.さらに,生体組織と骨内の発熱状態を綿密に調べるために通常の超音波診断装置と瞬間的な強度は同じだが,エネルギーとしては数百倍の照射となる連続波を送信した条件で解析を行った.その結果,横波を考慮すると生体組織と接する面での発熱が大きくなる結果が得られ,安全性の面から注視すべき結果が示唆された.次に製作したシミュレーションソフトウエアの信頼性と精度を確認するために生体組織に似せた音響的・熱的特性を持つ生体模擬ファントムを作成して模擬実験を行った.生体軟部組織のファントムはIEC60601-2-37のAnnexに示されている組成で作成し,骨はアクリルを擬似骨として用いた.中心周波数2MHzの超音波をファントムに連続30分間照射し,生体模擬ファントム内部の温度変化を熱電対で測定した.その結果,実測したデータとシミュレートした結果が良い一致が見られ,製作したソフトウエアの信頼性を確認することができた.
活性化血小板による凝固血栓形成促進メカニズムの解明とその抑制方法の開発

心筋梗塞を代表とする動脈系の血栓性疾患は、灌流動脈内の動脈硬化巣の破綻部位への血小板の集積と、引き続くフィブリン形成による閉塞血栓により惹起される。血流条件下で血管壁損傷部位に集積した血小板表面における凝固系活性化のメカニズムを解明するために、ex vivoの評価系を作成した。すなわち、損傷血管壁のモデルとして、コラーゲンを固相化したガラス表面を用いた。緑の蛍光を発するメパクリンで蛍光標識した血小板をコラーゲン表面上に1,500s^<-1>のずり速度で灌流した。赤の蛍光を発するAlexaFluor 595で健康標識した抗フィブリンモノマーモノクローン抗体を作用させ、血小板血栓の凝固系活性化をイメージングする方法を平成15年度の研究により確立した。本法を用いて、選択的抗トロンビン薬の血小板血栓形成におよぼす効果を検討した。可逆的抗トロンビン薬であるアルガトロバンの濃度を10μMから100μMまで変化させて、コラーゲン上に形成される血小板血栓の3次元的成長と、血小板血栓上のフィブリンモノマーの関係を検討した。アルガトロバン濃度を増加させるとともに、血小板血栓上のフィブリンモノマーの産生量は減少し、また単位時間灌流時の血小板血栓の3次元的成長も抑制された。従来、抗凝固薬として理解されていた選択的抗トロンビン薬には、血小板血栓上でのトロンビンの機能阻害を介した血小板血栓の成長抑制効果を有することを明らかにした。さらに、トロンビンの機能を非可逆的に阻害するヒルログと、可逆的阻害薬であるアルガトロバンの効果の差異を検討した。ヒルログでは用量依存性の効果が出難いこと、非逆的阻害薬であるヒルログのフィブリンモノマー産生抑制効果、血小板血栓成長抑制効果が、可逆的阻害薬であるアルガトロバンの効果よりも効率的であることを示した。心筋梗塞を惹起する冠動脈血栓などの動脈閉塞性血栓は、血管壁の損傷部位に集積した血小板と、活性化血小板周囲で形成されたフィブリンの混合血栓よりなる。心筋梗塞の発症を効率的に予防する抗血栓薬を開発するためには、血管壁損傷部位における血小板の形成と、その周囲における凝固系の活性化を同時に評価する系が必須である。平成15年度には、血小板血栓と周囲の凝固系の括性化を同時に評価できる多色蛍光イメージングシステムを開発することを目的に研究を行った。損傷血管壁のモデルとして、コラーゲンを固相化したガラス表面を用いた。血小板血栓の形成過程を蛍光顕微鏡にて連続的に観察した。血栓が成長したのち、赤の蛍光を発するAlexaFluor 595で蛍光標識した抗フィブリンモノマーモノクローン抗体を作用させた。血小板血栓周囲、特に血栓の下流側にフィブリンモノマーの形成を認めた。灌流した血液中に選択的抗トロンビン薬であるアルガトロバンを、様々な終濃度となるように添加した。血小板血栓周囲の赤色蛍光は、アルガトロバンにより容量依存性に抑制された。赤色蛍光の集積が活性化血小板によるトロンビン生産を反映することが示唆された。単一血小板を標的として、高速レーザー共焦点顕微鏡により活性化

血小板周囲の凝固系活性化のイメージングを試みた。定性的には血小板周囲のフィブリンモノマーの産生を示すことが可能となった。定量化に向けて、装置、実験条件の改善を続けている。活性化血小板上に形成されたトロンビンは、自らのトロンビン受容体を刺激して血小板血栓の3次元的成長と血栓の安定化にかかわることも示した。平成16年度に計画しているメカニズムの解明、選択的阻害薬の開発を行う環境は整った。平成15年度の研究により血小板血栓表面における凝固系活性化のイメージング法を確立した。過去の研究において確立した血小板血栓の3次元リアルタイム投影図法と2色蛍光による血小板と凝固系の同時イメージング法を組み合わせて、血栓の3次元的成長におよぼす血小板表面の凝固系活生化とトロンビン産生の役割を検討した。実験中の血液の流動性を維持するために選択的抗トロンビン薬アルガトロバンを添加した。アルガトロバンの濃度を10μMから100μMまで変化させて、各種濃度のアルガトロバンを含む全血をI型コラーゲンを固相化したガラス表面上に灌流した時にコラーゲン上に形成される血小板血栓の3次元的成長と、血小板血栓上のフィブリンモノマーの関係を検討した。アルガトロバン濃度を増加させるとともに、血小板血栓上のフィブリンモノマーの産生量は減少し、また単位時間灌流時の血小板血栓の3次元的成長も抑制された。従来、抗凝固薬として理解されていた選択的抗トロンビン薬には、血小板血栓上でのトロンビンの機能阻害を介した血小板血栓の成長抑制効果を有することを明らかにした。さらに、トロンビンの機能を非可逆的に阻害するヒルログと、可逆的阻害薬であるアルガトロバンの効果の差異を検討した。ヒルログでは用量依存性の効果が出難いこと、非可逆的随害薬であるヒルログのフィブリンモノマー産生抑制効果、血小板血栓成長抑制効果が、可逆的阻害薬であるアルガトロバンの効果よりも効率的であることを示した。