hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
古海洋表層窒素サイクル研究の深化

本研究は,海洋環境における窒素安定同位体比(15N/14N比)を規定する要因を,観測と海洋生態系を組み込んだ窒素モデルの両面から研究し,その成果を過去の地質時代における海洋の窒素サイクルの変動へ応用するものである。平成30年度は主に,先カンブリア代である11億年前に形成された地層中(アフリカ北西部のモーリタニアで採取)からクロロフィルの分子化石であるポルフィリン(クロロフィルの中心環に由来するテトラピロール化合物)の化学構造と窒素安定同位体比について研究を行った。それらポルフィリン化合物の多くは,明らかにクロロフィル由来であることを示すE環を持っている。また,各ポルフィリンの窒素安定同位体比が+5.6 - +10.2パーミルであることを明らかにした。さらにその結果を,当時の生態系全体の窒素安定同位体比を表すと考えられる堆積物のバルク有機物の窒素同位体比と比較して,生態系内における窒素同位体分別が0.5 - 5.2パーミルの範囲にあることを明らかにした。その結果,食物連鎖による窒素安定同位体比の上昇が比較的低く抑えられていたことが示唆された。このことは,11億年前当時の海洋においては高次捕食者が未だ進化したおらず,現在の海洋に比べて食物連鎖が非常に短かったことによるものと解釈した。この成果はProceedings of the National Academy of Science USA誌に発表した。代表者の大河内は,さらなる試料として西赤道太平洋で得られた堆積物試料の分析を行い,クロロフィル化合物の窒素同位体比記録をなるべく増やす努力を行う。分担者の吉川は,南極海の堆積物記録がシミュレーション可能なモデルをなるべく早く確立する。また年度当初に,使用していたHPLCのオートサンプラーが故障したため新しいものを購入しなければならなくなった。ただしこのHPLCは別の予算で購入したものであるためマシンタイムに限りがあり,本研究専用のHPLCを購入することにした。今年度は予算の都合上,HPLCシステムの一部を購入し,来年度に残りの部分を購入することになる。今後11億年前に堆積した堆積岩試料に応用する。これまでこのような研究に応用されたことがなく,もしポルフィリン類が見出されれば,構造決定とともに安定同位体比の測定を行う予定である。こういった研究がなされた堆積物としては最も古いものになる。平成30年度は最終年度であるので,これまで得られた結果をコンパイルし,窒素サイクルの時代変化についても論じたいと考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
高齢者の日常身体活動水準と筋出力調整能力

1.日常的に身体活動を実施している高齢者(活動群)と在宅の一般高齢者(一般群)を対象に、アクトコーダ(改良型万歩計)による活動水準調査と簡便法による食事内容調査、および下肢筋力測定を行った。その結果、活動群の方が一般群より日常身体活動水準が高く、エネルギー摂取量(概算)も高くなる傾向が観察された。また、膝関節伸展時の最大筋力には顕著な差はみられなかったが、最大筋力の1/2および1/4の筋出力の再現性は活動群が優れる傾向にあった。2.老人ホームに居住する比較的脆弱な高齢者を対象に、リズム体操および軽スポーツ種目を開発し、生体にかかる負担度について運動生理学測定と映像解析による分析を行った。その結果、酸素摂取量や心拍数、血圧の応答から、高齢者が苦痛を覚えずに行えるリズム体操の強度は安静時の34倍程度であろうと推察された。また、屋内で行える軽スポーツ種目(例えば、シャッフルボードなど)の実施によって体重の1倍2倍程度の力を下肢にかけることが可能であることが実証された。以上の結果から、一般在宅および施設居住の高齢者の日常身体活動水準は低レベルにとどまりがちな状況にあり、このうな廃用性の機能低下を抑制するためには高齢者の好むスポーツ・レクリエーション種目を開発することが急務であることが示唆された。
アシル化ペプチド・グレリン過剰発現動物の開発および解析

種々のプロモーターを用いたグレリン過剰発現トランスジェニックマウスの開発に成功した。いずれのトランスジェニックマウスも未だ、解析中であり、アシル化グレリンの発現については不明である。全身にプレプログレリンmRNAを発現するトランスジェニックマウスの系では頭尾長、体重ともに対照マウスと比較して小さいことを証明した。過剰発現したアシル化グレリンもしくは非アシル化グレリンが何らかのメカニズムを介して成長ホルモン-IGF-Iアクシス、もしくは摂食調節機構に関与している可能性が想定される。現在、これらのトランスジェニックマウスの解析を続けている。トランスジェニックマウスの作製と解析と平行して、グレリンの分泌調節とその作用についてさらに詳細に検討した。肥満マウスにおいては、グレリンの絶食による分泌調節は遅延しており、少なくともその一部に血糖や血中インスリンのレベルが関与することを明らかにした。このとはエネルギー代謝機構におけるグレリンの役割を示唆する。また、ヒトにおける血中グレリン濃度を検索することにより、その臨床的意義を検討した。腎不全患者においては血中グレリン濃度が高値であることを示し、その病態に高グレリン血症が関与する可能性を示唆した。さらに、ヒトグルカゴノーマの症例においてグレリンが腫瘍内に発現していることを証明した。このことは膵ラ氏島α細胞におけるグレリンの発現に合致した所見である。以上のように、グレリン過剰発現トランスジェニックの作製と解析を進めるとともに、その解析と解釈に密接に関与する研究を進め、成果を上げた。本年度は過剰発現マウスの開発と密接に関連する、生体内でのグレリンの分泌調節についても詳細に検索した。1.グレリン過剰発現Tgマウスの開発:種々のプロモーターを使用して、複数のTgマウスを作出した。そのなかで、血漿グレリン濃度が高値を示すトランスジェニックマウスを数ライン得ることに成功した。現在のところ、トランスジェニックマウスの表現型は明らかでないが、これらのマウスは、GH/IGF-I axisに変化を来している可能性があるため、糖・脂質代謝などについて今後検索する予定である。2.肥満動物におけるグレリンの分泌調節:ob/obマウス、Zucker肥満ラットなどの遺伝性肥満動物の血漿グレリン濃度を測定し、絶食による変化を検討した。また、血糖もしくは血清インスリン濃度とグレリン分泌の関連を検索した。ob/obマウスは対照マウスと比べ、約2倍の体重を呈し、絶食後の血漿グレリン濃度は対照マウスの70%であった。BMI 25以上の肥満患者においても血漿グレリン濃度は対照群の57%に低下していた。グレリン分泌の詳細をZucker肥満ラットでさらに検索した。自由摂食下では、血漿グレリン濃度は対照ラットと肥満ラットで有意差がなく、24時間絶食後の肥満ラットにおける血漿グレリン濃度は対照ラットの58%であった。血漿グレリン濃度は対照ラットでは24時間絶食後に前値の187%に上昇したが、肥満ラットでは前値の96%にとどまった。24時間絶食後の肥満ラットに8単位の中間型インスリンを投与すると、血漿グレリン濃度は240分後に前値の228%に上昇した。また、24時間絶食後の対照ラットに5.0gのグルコースを腹腔内投与すると、血漿グレリン濃度は前値の78%に低下した。以上、グレリンの分泌調節が慢性の摂食状況によって修飾を受けることを明らかにした。本年度はグレリントランスジェニック(Tg)マウスの作成および解析を引き続き行うとともに、加齢動物におけるグレリンの作用を検討し、Tgマウスの解析の一助とした。1.グレリン過剰発現Tgマウスの開発:前年度に作出に成功した数系統のトランスジェニックマウスの解析を進めた。Tgマウスは数コピーから十数コピーの導入遺伝子を有しており、その遺伝子発現は種々の組織において認められた。また、それらの組織においてグレリンはペプチドレベルでも発現が亢進していた。Tgマウスは野生型の数倍から数十倍程度の高い血漿グレリン濃度を示した。

しかしながら、予想に反して、Tgマウスは野生型と比べ、体重、体長とも減少しており、グレリンの過剰発現が摂食行動、もしくは成長ホルモン分泌に何らかの影響を与えている可能性が示唆された。現在、この表現型の発生機序を解明するため、さらに検討を続けている。2.加齢動物におけるグレリンの作用:すでに我々のグループが報告した通り、グレリンは強力な摂食亢進作用を有している。若年および加齢マウスを用いてグレリンの摂食亢進作用を検討した。若年マウスは低用量のグレリン投与によっては、自然な体重増加を凌駕する体重増加作用を観察することはできなかったが、体重がほぼプラトーに達した加齢マウスにおいては低用量のグレリンはマウスの体重増加をもたらした。このことは、若年マウスと加齢マウスにおけるグレリンの作用の違いを示唆する。
Tagish Lake炭素質コンドライト隕石の物質科学的研究

Tagish Lake炭素質コンドライト隕石は2000年にカナダに落下した新しいタイプの始原阻石である。反射スペクトルの測定から、この隕石の母天体はD型小惑星であると考えられている。このタイプの小惑星は小惑星帯外縁部に存在し、対応する隕石タイプが存在しないと考えられていたものである。本研究において、Tagish Lakeの鉱物学的研究より、この隕石は明らかに母天体上での水の関与する変質を受けており、その変質の程度は高く隕石中の細粒部分はほとんど層状珪酸塩でできていることがわかった。層状珪酸塩はサポナイトが卓越しており、他の炭素質隕石の鉱物組み合わせ(サーペンテンとサポナイト)と異なる。したがって、Tagish Lakeは母天体上でこれまで見つかった隕石と異なる環境で水質変成を受けていたことが判明した。また、この隕石は鉱物組成と内部組織が異なる無数のゼノリスを含んでおり、このことはこの隕石の母天体が、角礫岩化作用を受けたことを意味する。一方、希ガス同位体比分析から、この隕石には太陽風希ガスが含まれておらず、したがって角礫岩化作用は天体表層ではなく天体集積時に起こったと推定される。これはこの隕石が集積角礫岩であることを示す(研究業績1)。また、Tagish Lakeは今までに見つかったどの隕石よりも、ダイヤモンドやSicといった先太陽系粒子の濃度が高いことがわかった。本研究より、Tagish Lake隕石は極めて始原的な物質であり、太陽系形成時の原始太陽系星雲内での小天体形成過程を記録していることが判明した。Tagish Lake炭素質コンドライト隕石は2000年にカナダに落下した新しいタイプの始原隕石である。落下時の観測により軌道が判明し、小惑星帯からきたと推測されている。また、反射スペクトルの測定から、この隕石の母天体はD型小惑星であると考えられ、このタイプの小惑星は小惑星帯外縁部に存在し、対応する隕石タイプが存在しないと考えられていたものである。本研究において、Tagish Lakeの薄片を作成し、その薄片に対し走査型電子顕微鏡を用いて詳細に分析した。それによるとこの隕石は明らかに母天体上での水の関与する変質を受けていた。この変質の程度は高く、隕石中の細粒部分はほとんど層状珪酸塩でできていることがわかった。これらの層状珪酸塩を特定する目的で、放射光X線を用いたX線回折分析を行った。その結果、層状珪酸塩はほとんどがサポナイトという粘土鉱物であることがわかった。ほとんどがサポナイトであるような炭素質隕石は他になく、大部分の隕石中の層状珪酸塩はサーペンテンとサポナイトの混合物である。一方、希ガス同位体比分析から、Tagish Lakeは今までに見つかったどの隕石よりも、ダイヤモンドやSiCといった先太陽系粒子の濃度が高いことがわかった。本年度の研究から、Tagish Lake隕石は太陽系形成時の情報を残しつつも、隕石母天体上で水質変成を受けていることがわかった。
頚動脈プラークにおける新規血小板活性化受容体CLEC-2の役割

頚部頚動脈狭窄症において、頚動脈プラークの不安定性が脳梗塞と強く関連することが報告されているが、その機序はいまだ解明されていない。一方、新規血小板活性受容体(CLEC2)は、そのリガンドであるポドプラニンと共働し、プラークの不安定化に関与することが示唆されている。そこで本研究では、頚動脈狭窄症の不安定性プラーク形成におけるポドプラニン-CLEC2の関与を検討した。その結果、免疫組織学的検討において、ポドプラニンは頚動脈内膜内のマクロファージや平滑筋細胞に発現しており、術前MRプラークイメージングでの不安定プラークを示唆される病変や症候性病変でその発現が増強されている傾向を認めた。CLEC-2(C-type lectin-like receptor 2)は最近同定された血小板活性受容体である。その生体内リガンドであるポドプラニンとCLEC-2が結合することにより、血小板が活性化され、血小板由来成長因子(PDGF)や血管内皮細胞増殖因子(VEGF)等が放出されることによって、動脈硬化病巣が伸展する可能性が示唆されている。本研究の目的は、頸動脈狭窄症の不安定プラーク形成における、ポドプラニン-CLEC-2の役割を解明することである。本年度は、当院で頸動脈内膜剥離術を行った症候性および無症候性の頸動脈狭窄症患者を対象として、手術で得られた内膜剥離標本を用いて、頸動脈内膜内でのポドプラニンの発現を、免疫染色により検討した。その結果、ポドプラニンは進行した動脈硬化病巣内のマクロファージおよび血管平滑筋に発現していることが観察された。また、ポドプラニンは、血小板上に発現しているCLEC-2と結合し血小板を活性化させるため、ポドプラニン発現細胞と動脈硬化病巣内の血小板との関係についても、免疫染色により検討している。アテローム血栓(プラーク)の形成とその不安定化を解明することは動脈血栓症治療の上で重要である。最近同定された血小板活性受容体CLEC2(C-type lectin-like receptor 2)の生体内リガンドあるポドプラニンは、動脈硬化部位のマクロファージや平滑筋細胞に発現していると報告されている。ポドプラニンとCLEC2が結合することにより、血小板が活性化され、活性化血小板内α顆粒より、血小板由来成長因子(PDGF)や血管内皮細胞増殖因子(VEGF)等が放出されることによって、動脈硬化病巣の炎症を促進するのみならず、透過性亢進による粥腫内圧の亢進や新生血管の血栓形成による粥腫コアの拡大に関与している可能性がある。本研究の目的は、頸動脈狭窄症の不安定プラーク形成における、ポドプラニン-CLEC2の役割を解明し、脳梗塞予防の新たな治療薬の開発に資することである。本年度は、当院で頚動脈内膜剥離術を行った症候性および無症候性の頚動脈狭窄症患者を対象として、手術で得られた内膜剥離標本を用いて、頚動脈内膜内でのポドプラニンの発現を、免疫染色により検討している。また、ポドプラニンの発現と、術前MRIでのプラークイメージとの相関について検討している。本年度は、当院で頚動脈内膜剥離術を行った症候性および無症候性の頚動脈狭窄症患者を対象として、手術で得られた内膜剥離標本を用いて、頚動脈内膜内でのポドプラニンの発現を、免疫染色により確認し、血管壁での発現部位を検討した。また、術前MRIでのプラークイメージ(TOF、T1WI、T2WI)での不安定プラーク、手術で得られた内膜剥離標本での粥腫の所見、およびポドプラニンの発現との相関について検討している。ポドプラニンが、血管壁での発現部位についても、検討している。

その結果、免疫組織学的検討において、ポドプラニンは頚動脈内膜内のマクロファージや平滑筋細胞に発現しており、術前MRプラークイメージングでの不安定プラークを示唆される病変や症候性病変でその発現が増強されている傾向を認めた。2重KOマウス(CLEC2-ApoE-KO)を用いた動物実験の進行が遅れており、頚動脈プラークの不安定化に対するポドプラニン-CLEC2の関与が十分に証明出来ていないため。脳神経外科手術で得られた内膜剥離標本を用いて、ポドプラニンの発現解析を進めると共に、2重KOマウスを用いた動物実験を行う。動物実験の進行が遅れているため。動物実験などが遅れ、この分の購入管理費が未使用金となった。手術で得られた内膜剥離標本を用いて、ポドプラニンの発現解析を進めると共に、動脈硬化モデルを用いた動物実験を行う。本年度の未使用金を含め、次年度の研究費は、動物購入管理費、抗体購入費などに使用する予定である。
次世代小径ステント用TRIP/TWIP Co-Cr合金の開発

心筋梗塞等の循環器系疾患の治療に用いられるバルーン拡張型ステント留置術は、患者の負担が少ない低侵襲性医療の一種である。より低侵襲なステント留置術の実現には、ステントの小径化が必須となる。これは、バルーン拡張型ステント用金属材料であるCo-Cr-W-Ni合金において、低降伏応力を維持したままでの高強度化、高延性化の両立が必要であることを意味する。そこで本研究では、高強度・高延性を両立する金属材料であるTRIP/TWIP鋼の塑性変形挙動に着目し、Co-Cr-W-Ni合金における元素機能という観点から、Mn, Siを添加した次世代バルーン拡張型ステント用Co-Cr合金を開発することを目的とした。
ヒト・ゲノム解析研究

ヒトのからだの形成とはたらきのしくみの理解を深め人類の健康と幸福に役立つ知識と技術の生産に貢献するための研究を進める。また、生命の研究と情報科学の融合による研究の情報化と生命現象の解析の高速・大量化に対処するために本研究を発足させた。研究は生命の設計図であるゲノムの構造と機能を解析研究し、そこに包含される遺伝情報の理解を目指して進めた。このために総括班ならびに3つの研究班を組織して研究の推進を図り次の成果を得た。1.総括班。全体としての活動を円滑に進めるため各種会合の企画立案調整、情報交流、調査などを積極的に進めた。また「ヒトゲノム解析と共役した遺伝病家系研究」、「日本における生物学的研究材料保存・供給体制のあり方について」「社会との接点の問題研究」について三つの推進小委員会を設けて調査研究、提言作成の作業を進めた。また、公開シンポジウム、国際シンポジウム講習会、ジャーナリストのためのチュートリアルとニュースレター発行等の広報活動も行った。2.ヒト・ゲノム構造解析班。技術開発を進めつつ特定の染色体あるいは染色体の機能領域の構造解析研究を行った。とくにヒト染色体21番、11番につき物理地図の作製を進め、また、染色体3、6、8、11、X、Yにつき高密度のコスミドマップ作製に成果をあげた。これらの成果を活用して、数種の疾病遺伝子の発見と入手に成功した。特定領域として免疫グロブリン遺伝子H鎖V領域とHLA遺伝子群を選び詳細なマップ作りと遺伝子の同定を実行し、シーケンシング時代のモデルとなる先導的研究を進めた。3.cDNA解析班。ヒトゲノムの機能解析のため、遺伝子として発現する部分に研究対象を絞り、ヒトの各種組織におけるcDNAの存在頻度情報の収集を進め、「3'特異的cDNAライブラリー」の構築を40余の組織について完成させた。また、200を越えるcDNAの全シーケンスの収集を達成した。これと共に、線虫をモデル系としてゲノムの構造解析と発生のステージで発現する遺伝子の情報を共役させる研究に進展をみた。4.DNA解析技術開発班。巨大ゲノムを解析するための技術開発とモデル生物(分裂酵母と枯草菌)を用いる大規模シーケンシングの実行とその効率化に関する研究を進めた。また、マーカーDNAの染色体上へのマッピングに係わる技術開発に進歩を示すことができた。このほかに、ゲノムスキャンニング法の応用、T3ファージによるDNA欠失セットの作成技術の完成をはじめ、国際協力によって大量シーケンシングを実行する研究を進めて、ゲノムデータベース作成を開始した。1.総括班。3.cDNA解析班。
変容する海外送金パターンがパキスタン経済に与える影響:米国同時テロ事件以降の展開

本研究は米国同時テロ事件以降大きく変化した海外からパキスタンへの送金パターンを分析し、その要因と送金の経済的役割を分析した。特に米国からの送金に焦点を当てた。米国からの送金が急増した要因として、インフォーマルな送金への規制、米国に資産を持ち続けることへの不安、パキスタン経済の成長などを指摘した。中東からの送金が受け取り家計の日々の消費ニーズに使用される一方、米国からの送金は経済的な利益を追求する目的として利用されていることを議論した。本研究は、2001年9月11日の米国同時テロ事件以降、著しく変容する海外からの送金パターンがパキスタン経済に与える影響を分析することを目的とする。特に米国からの送金受け取り世帯を主たる分析の対象とし、彼らの消費パターンが経済全体に与える影響を検討するものである。平成20年度は、本研究の初年度であり、文献収集、2次データの分析、海外の専門家やパキスタン関係省庁との意見交換等に重点を置き、在外パキスタン人からの送金額の推移と国・地域別の送金パターンに関するデータ整備及び米国からパキスタンへの送金が増加している要因分析等を行った。2次データからは、明確に9.11テロ事件以降、在外パキスタン人労働者からの送金(公式ルート経由)が急増したこと、特に米国からのパキスタンへの労働者送金が増加し、サウジアラビアを抜き、最大の送金元となったことが明らかとなった。また更なる分析から、9.11テロ事件以降、米国からの送金が増加した背景には、送金受け取り側であるパキスタンのPULL要因と送り手側である米国のPUSH要因が重なりあったものであると結論した。PUSH要因としては、インフォーマルな送金への規制、米国に資産を持ち続けることへの不安、そしてPULL要因としてはパキスタン経済の成長などが上げられる。これまで米国からの送金増加に関してその要因を検討した研究は皆無であり、その意味において本研究の分析は意義のあるものと言える。また平成21年度に予定する米国からの送金受け取り家計の調査に関して、パキスタンの研究者らと議論を行った。具体的には調査地選定、サンプリング、質問票の内容についてである。これらの研究成果もしくは途中経過は、海外の2つ学会において発表し、海外の専門家との意見交換や交流を行うことができた。これらは今後の研究において有意義なインプットとなるであろう。これまでに入手した二次データおよび家計レベルでの定量的な調査データより、米国からの送金の使用に関して以下の点が明らかとなった。その前にまずパキスタンから米国への移民者は二つの大まかなグループに分類することができる。一つは、1960、70年代の移民グループであり(米国社会に根付いており、米国におけるパキスタン社会を代表する層とも言える)、もう一つは1990年以降の移民規制の緩和後に移民したグループである。前者は比較的生活水準の高い家計からの移民であり、一方後者はその限りではない。よって送金目的もこの二つの主体によって異なる。大胆に二分した場合、前者のパキスタンへの送金は経済的機会の追求を目的としており、後者の送金はパキスタンに残した家族や親族の生活水準向上を目的としている(中東石油産出国への出稼ぎ労働者に類似した送金行動)。この結果、9.11テロ事件以降に顕著となった大都市圏での不動産購入や自動車などの奢侈財購入、株式市場での投資は前者移民者グループの送金によるものであると見られる。これに対し、ある既存研究では、後者の送金が米国からの送金全体の60%程度を占めると指摘している。また他の既存研究は寄付目的の送金も少なからずあり、2003年度ではおおよそ8000万ドルと推計されている。このように米国からパキスタンへの送金は、中東石油産出国からの送金と比べると大きくその使用に関して差異が見られる。この研究から浮かび上がる懸念としては、米国からの送金の持続性である。もし送金の多くが経済的利潤の追求であれば、それはパキスタンの景気変動に大きく左右され、パキスタン経済と米国からの送金はpro-cycleである可能性がある。本年度はこれまでに入手した二次データおよび家計レベルでの定量的な調査データの取りまとめを行った。その結果、非常に興味深い米国からの送金とパキスタン経済の関係性が認められた。まず米国からの送金量のトレンドであるが、本研究が開始した時点では継続的な増加傾向が示していたが、その後、送金量は伸び悩んでいる。一方で、中東石油産出国の出稼ぎ労働者からの送金量は大幅に増加し、2010年にはUAEやサウジアラビアが米国の送金量を上回った。それまでは2002年度以降、米国からの送金量が最大であった。パキスタン全体に占める米国からの送金の地位は低下傾向にあると判断できる。この変化の背景には、パキスタンおよび米国の経済事情が大きく影響している。

パキスタン経済はムシャラフ政権末期よりの経済停滞が継続し、2009年度にはGDP成長率1.2%という数十年来の低い経済成長を記録した。またインフレにより市民の生活(特に低所得者)は疲弊した。一方、米国経済は2008年秋のリーマンショック以降の景気後退から抜け出せていない。中東石油産出国への出稼ぎ労働者は、主にパキスタンの低所得層が中心であり、彼らの送金の動機はパキスタンに残している家族の生活水準向上である。パキスタン経済の景気が後退し、低所得者を中心に生活が困窮しているときこそ、送金を増やす傾向となり、近年の中東諸国からの送金増加が説明される。一方、米国への移住者は比較的富裕な家計出身が多く、送金は経済的な利潤の追求が動機付けとなっており、中東出稼ぎ労働者のそれとは異なる。パキスタン経済の景気後退により、経済機会が縮小し、一方、米国の景気後退による送金に回す所得の不足という二つの要因により、米国の送金量の絶対的、相対的低下が説明される。
象牙質基質タンパク分解産物の同定と覆髄材としての応用

象牙質基質タンパク(DMCs)はMMPなどの酵素によって分解を受けるが、その分解産物が歯髄細胞の様々な機能を促進し、さらに象牙質-歯髄複合体の創傷治癒も促進することが本研究により明らかとなった。特にMMP20により分解を受けたDMCsは他のMMP分子により分解されたDMCsと比較して、歯髄の創傷治癒をより促進することが明らかとなった。そこで、MMP20により分解されたDMCs分解産物のプロテオーム解析を行ったところ、歯髄の創傷治癒促進に有効な可能性のある8種のタンパクが同定された。以上の結果より、これらの分子は将来的に生物学的根拠に基づく覆髄剤として使用できる可能性が示された。平成25年度の研究実施計画に基づき、ヒト象牙質基質タンパク(Dentin Matrix Proteins: DMPs)の分解産物が歯髄細胞の遊走能および血管新生能に与える影響について検討し、さらにDMPs分解産物の同定を行った。1.これまでにわれわれが分離したDMPsに、象牙質に内在性に存在すると報告がある各種matrix metalloproteinase(MMP)ファミリー分子を37°Cで24時間作用させ、DMPs分解産物を生成した。得られた分解産物存在下において、ラット歯髄由来初代培養細胞の遊走能に与える影響について検討をおこなった(scratch-wound assayおよびtrans-well assay)。その結果、scratch-wound assayではMMP1, MMP3およびMMP9によって形成された分解DMPsの存在下において、歯髄細胞の遊走能は促進された。一方、trans-well assayにおいてはMMP1, MMP3, MMP9およびMMP20で誘導された分解DMPsの存在下で歯髄細胞の遊走能は促進された。2.実験1と同様にDMPs分解産物存在下において、ヒト臍帯静脈内皮細胞とヒト皮膚線維芽細胞を共培養し、血管新生能について評価を行った。その結果、MMP1, MMP2およびMMP3によって形成されたDMPs分解産物の存在下において、上記細胞の血管新生能は促進された。3.DMPs分解産物のどの領域が歯髄細胞の生理活性を上昇させるかを明らかにするために、分解産物の同定を行った。SDS-PAGEにて分解DMPsのタンパクプロファイルの確認を行い、高速液体クロマトグラフィにて得られたタンパクの解析を現在行っている。以上の結果より、象牙質に存在するMMP分子によって分解されたDMPsは歯髄細胞の遊走能および血管新生能を促進することが明らかとなった。このことより、第三象牙質の形成メカニズムの一端が明らかとなり、分解DMPsが象牙質ー歯髄複合体の治癒に影響を与えることが示唆された。平成26年度の研究実施計画に基づき、歯髄細胞の機能を促進することがこれまでに明らかとなったヒト象牙質基質タンパク(Dentin Matrix Proteins: DMPs)の分解産物が、象牙質-歯髄複合体の創傷治癒に与える影響について動物実験にて検討をおこなうとともに、DMPsの同定実験を継続して実施した。1.これまでにわれわれが分離したDMPsを各種matrix metalloproteinase (MMP)分子と作用させ、DMPs分解産物を生成した。前年度までにin vitroで歯髄細胞の機能を促進することが明らかとなった、MMP1、-2、-3、-8、-9、-13および-20によって得られたDMPs分解産物を用いて、8週齢雄性Wistar系ラットの臼歯に実験的窩洞を形成し、直接覆髄実験をおこなった。窩洞形成から4週間後に被験歯を摘出し、病理組織学的評価をおこなった。その結果、非分解DMPsを用いて覆髄をおこなった場合と比べて、MMP1、-9、-13、-20によるDMPs分解産物にて覆髄をおこなうと、より多くの第三象牙質形成を認めた。その中でもMMP20による分解産物を用いて覆髄をおこなった場合に形成された第三象牙質が一番多く、かつ形成された第三象牙質に細管構造も認められた。2.DMPs分解産物のどの領域が歯髄細胞の機能を促進するかを明らかにするために、分解産物の同定をおこなった。これまでの実験でMMP1およびMMP20によるDMPs分解産物が象牙質-歯髄複合体の創傷治癒を最も促進したことから、MMP1、-20で分解されたDMPsに共通した生理活性物質が存在すると考えられたため、各々の分解産物を高速液体クロマトグラフィにて分析をおこない、その後MALDI-TOFMS法にて得られたタンパクの解析を現在行っている。それに加えて、MMP1、-20によるDMPs分解産物をLC-MS/MS法を用いての解析も同時におこなっている。平成27年度の研究実施計画に基づき、歯髄細胞の様々な機能を促進することがこれまでに明らかとなったヒト象牙質基質タンパク(Dentin MatrixComponents:DMCs)の分解産物の同定実験を継続して行い、同定された候補分子が歯髄細胞に与える影響の検討を行った。これまでの研究で歯髄の創傷治癒を促進することが明らかとなっているMMP1およびMMP20により生成されたDMCs分解産物および非分解DMCsに対して、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法を行い、得られたマススペクトルについて差異解析を行い、比較検討した。

その結果、MMP1およびMMP20によるDMCs分解産物中に特有のタンパクがそれぞれ58種類、30種類、また両方に共通のタンパクが17種類同定された。さらに、非分解DMCs、MMP1もしくはMMP20によるDMCs分解産物の3試料を逆相液体クロマトグラフィーにて分析を行い、得られたピークを保持時間に基づいて14分画に分類し、回収を行った。回収された各ピークに含まれる成分を覆髄剤として用いたラット覆髄実験を行った結果、上記分画の内、MMP20により生成されたDMCs分解産物から得られた2分画の成分にて第三象牙質の有意な形成を認めた。さらに、上記分画が歯髄細胞の増殖と石灰化に与える影響を検討したところ、有意にその促進を認めたため、その分画についても上記と同様にプロテオーム解析を行ったところ、MMP1および20によるDMCs分解産物中に特有のタンパクが各々14種類、2種類、また共通のタンパクが9種類同定された。上記2パターンのプロテオーム解析の結果を総合した評価を行った結果、8分子のタンパクが象牙質-歯髄複合体の創傷治癒を促進する分子の候補として得られ、それらの分子が生物学的覆髄剤として使用できる可能性が明らかとなった。象牙質基質タンパク(DMCs)はMMPなどの酵素によって分解を受けるが、その分解産物が歯髄細胞の様々な機能を促進し、さらに象牙質-歯髄複合体の創傷治癒も促進することが本研究により明らかとなった。特にMMP20により分解を受けたDMCsは他のMMP分子により分解されたDMCsと比較して、歯髄の創傷治癒をより促進することが明らかとなった。そこで、MMP20により分解されたDMCs分解産物のプロテオーム解析を行ったところ、歯髄の創傷治癒促進に有効な可能性のある8種のタンパクが同定された。以上の結果より、これらの分子は将来的に生物学的根拠に基づく覆髄剤として使用できる可能性が示された。DMPs分解産物の同定実験の遅れが昨年から継続して発生しており、その遅延を取り戻すべく、分解酵素を先に決定した上で実験をおこなったところ、解析は順調に進行しているが、依然として結論を得る段階までは至っていない。しかし、実験結果はほぼ得られているため、平成27年度には期待した結果が得られるものと想定される。また、平成27年度に予定していた動物実験を平成26年度に一部実施したため、本研究課題開始当初の予定とはスケジュール変更が生じているが、最終的には平成27年度に全実験を終了予定である。保存治療系歯学平成27年度は、平成25、26年度に達成しきれなかったDMPs分解産物の同定実験の継続を予定しているが、前述のとおり、解析はすでに終了しているため、結果を早期に得られると考えられる。また、DMPs分解産物を用いた直接覆髄実験にて、象牙質-歯髄複合体の創傷治癒歯髄の治癒促進がすでに確認されたため、分解産物そのものと、同定された生理活性物質を用いて、歯髄細胞の増殖、石灰化、遊走能、血管新生能および歯髄細胞の分化マーカーなどに与える影響についても評価を行う予定である。DMPs分解産物を用いた細胞の遊走能および血管新生能の評価実験は順調に進行しているが、分解DMPsの同定実験については完了しなかった。その理由は、分解DMPsが細胞へ与える影響の実験に想定よりも時間を要したため、それに伴ってどのMMP分子により誘導された分解DMPsを同定すべきかを決定するのに時間を必要とし、その結果平成25年度内に同定実験を完了することができなかった。
待ち行列ネットワークの拡散過程近似とその応用

待ち行ットワークにたいし、各ステーションでの負荷がなくなった時にサーバーが休暇をとるようなシステムを対象として、拡散過程近似の研究をおこないつぎのような結果を得た。(1)各ステーションで、重負荷条件がなりたつつ場合に、各ステーションでの休暇の長さにおうじて、拡散過程近似として、吸収過程、反射過程、および跳躍過程が現れ、さらにこの跳躍過程は、大きな跳躍がある場合と跳躍が安定分布を持つ場合とに分けられる事を明らかにした。最後の場合は従来になかった新しい拡散過程であり興味深い結果である。またこのうな跳躍過程はSkorohodのM-top orogyでの近似を意味しているのであるがこれを示す確率論的手法は新しく応用の広いものである。(2)一方このような結果を得る過程において、非マルコフ的なモデルを対象にした結果として、再生過程に関する確率積分の収束の問題が生じ、収束するための条件をマルチンゲ-ル理論にもとずく確率解析の結果を使うことによって、明らかにする事ができた。これは確率積分をマルチンゲ-ルと漸近的に無視できる項に分解することが可能である事を示したもので応用の広い結果であると思われる。(3)上記(1)において得られた拡散過程は非負の領域に値をとり斜めな反射方向をもつ多次元過程であり、Skorohod方程式の解としてあらわされるものである。さらにdrift項や拡散項は状態に依存しておりこのような方程式の解の一意性に関しては従来の結果をつかう事ができなかったが、我々の研究において、石井-Dupuisの研究結果をもとにその条件を明らかにする事ができた。
微量放射線のヒトおよび生態系におよぼす遺伝的影響

1.汚染地域での土壌・生態系での放射性物質の蓄積とその核種:汚染地域(ゴメリー、コイニキ、ブラギン)と対照地域(ミンスク)の土壌、植物、野生動物等での放射性物質の測定と核種の同定を行った。殆ど全てが^<137>Csである。チェルノブイリ核施設崩壊後、土壌、水中より放射性降下物は減少していっているのに対し、10年たった現在でも、草木、食用植物(イチゴ、キノコ等)、水棲動物(鯉、カエルなど)など野生動植物への強度の濃縮を認めた。バッタ、トンボ、モグラ、マウスへとより高度の放射性物質の生物学的濃縮がみられた。2.微量長期汚染の生態系への継世代的影響:野生のショウジョウバエ、カエル、ハタネズミでの染色体異常の検出を行ったところ、カエル等に事故後10年たった今も、直後とほぼ同じぐらい高頻度に染色体異常が検出された。これは、継世代的影響と考えるよりも、野生動物に高濃度の放射能が残存(濃縮)しているためと考えた方がよい。3.生物学的影響の実験研究:粉末化した野イチゴ、キノコなどの食物を飼料に混ぜてショウジョウバエ幼虫を飼育し、ショウジョウバエ翅毛突然変異検出を行った。赤イチゴで、有意に体細胞突然変異が検出された。4.ヒトでの遺伝子変異の調査:放射能被曝者(放射性物質除去作業者、汚染地域住民など)およびその子供(約200名)の血液より単核球を採取し、白血病早期発見のため、WT1遺伝子発現の定量と分子レベルでの遺伝子変異の検出を行った。被曝者56名中血液症状を有した者28名中16名に異常に高いWT1遺伝子の発現がみられ、白血病高リスク群であることを示唆した。血液症状を呈しない被爆者28名中7名にも軽度のWT1の発現がみられたが、ミンスク在住正常人にも同じ傾向がみられた。しかし日本人49名や、日本在住のコーケシアン26名には全くWT1の異常値がみられず、今後の課題となった。チェルノブイリ核施設崩壊による微量・長期間・複合被爆の人類の未来におよぼす影響を予知、防護することを目的とし、初年度は、物理学的(土壌等)および、生態学的(野生動植物)汚染状況について調査研究を行うとともに、生態系への遺伝学的影響について調べた。1.汚染地域での土壌・生態系での放射性物質の蓄積とその核種:汚染地域(ゴメリ-、コイニキ、ブラギン)と対照地域(ミンスク)の土壌、植物、野生動物(昆虫、カエル、ハタネズミなど)等での放射性物質の測定と核種の同定を行った。土壌中の放射能濃度に比べ、草木に数倍の放射能が検出された。殆ど全てが^<137>C_Sである。特に樹木では、その外皮に放射能活性は集中していた。また、イチゴ、キノコ等を採取し、放射活性を測定したところ、高濃度に^<137>C_Sが検出された。強い生物学的濃縮が起こっている。2.生物学的影響調査:野生の植物やショウジョウバエ、カエル、ハタネズミでの染色体異常の検出を行ったところ、カエル等に事故後10年たった今も、直後とほぼ同じぐらい高頻度に染色体異常が検出された。3.生物学的影響の実験

研究:粉末化した野イチゴ、キノコなどの食物を飼料に混ぜてショウジョウバエ幼虫を飼育し、ショウジョウバエ翅毛突然変異検出を行った。赤イチゴで、有意に体細胞突然変異が検出された。4.ヒトでの遺伝子変異の検出:WT1遺伝子が全てのヒト白血病に強く発現する。しかも、通常の方法の1000倍も高感度に白血病細胞を末梢血液より検出できる。チェルノブイリ事故被爆者50人を調べたところ、18人に高度にWT1遺伝子が発現していた。追跡調査を行う。チェルノブイリ核施設崩壊により大気中に放出された放射性物質の殆どは、ベラル-シ共和国内に降下し、原爆、医療被曝等高線量、高線量率被曝と異なり、低線量・低線量率長期間内部・外部被曝という人類の通常の被曝形態と類似した被曝形態をとっている。本調査研究では、チェルノブイリ核施設崩壊により放出された放射性物質の環境および生態系への遺伝的影響調査に加え、被曝者とその子孫における遺伝的影響を分子レベルで調査した。1.微量長期汚染の生態系への継世代的影響:チェルノブイリ核施設崩壊後10年たって、土壌・水中より放射性降下物は減少していっているのに対し、草木、食用植物(イチゴ、キノコ等)などへの強度の生物学的濃縮に加え、野性動物(鯉、カエル、ハタネズミなど)へのより強度の濃縮を認めた。10年たった現在でも、カエル等に染色体異常が高率に検出されている。これは、単純に遺伝的影響を示していると解釈するのは早計である.むしろ、生物学的濃縮が野性動物に起こっている結果と思われる。2.ヒトでの遺伝子変異の調査:放射線被曝者(放射性物質除去作業者、汚染地域住民など)およびその子供(約200名)の血液より単核球を採取し、白血病早期発見のため、WT1遺伝子の検出と染色体および分子レベルでの遺伝子変異の検出を行ったところ、被曝者47名中18名にWT1遺伝子が強度に発現しており、白血病高リスク群であることを示唆した。ミンスクなど非汚染地域および日本在住のスラブ系民族より採血を行い、被曝者の異常高値の確認を急いでいる。チェルノブイリ核施設崩壊により大気中に放出された放射性物質の殆どは、ベラルーシ共和国内に降下し、原爆、医療被曝等高線量、高線量率被曝と異なり、低線量・低線量率長期間内部・外部被曝という人類の通常の被曝形態と類似した被曝形態をとっている。1.微量長期汚染の生態系への継世代的影響:チェルノブイリ核施設崩壊後、土壌、水中より放射性降下物は減少していっているのに対し、草木、食用植物(イチゴ、キノコ等)、水生動物(鯉、カエルなど)などへの強度の生物学的濃縮に加え、10年たった現在でも、野生動物への強度の濃縮を認めた。体重当たりで比較すると、バッタ、トンボ、モグラ、マウスへとより高度の放射性物質の生物学的濃縮がみられた。2.ヒトでの遺伝子変異の調査:放射能被曝者(放射性物質除去作業者、汚染地域住民など)およびその子供(約200名)の血液より単核球を採取し、白血病早期発見のため、WTl遺伝子発現の定量と分子レベルでの遺伝子変異の検出を行った。被曝者56名中血液症状を有した者28名中16名に異常に高いWTl遺伝子の発現がみられ、白血病高リスク群であることを示唆した。血液症状を呈しない被爆者28名中7名にも軽度のWTlの発現がみられたが、ミンスク在住正常人にも同じ傾向がみられた。しかし日本人49名や、日本在住のコーケシアン26名には全くWTlの異常値がみられず、今後の課題となった。
モノクロナル抗体法による嗅細胞新生の解析

モノマロナル抗体2D5,4G12をマ-カ-として、ウサギ嗅粘膜上皮の免疫組織化学的研究を行った。抗体2D5は、胎生14日目より成熟動物まで、すべての嗅細胞を標識した。抗体4G12は、成熟型の嗅細胞を選択的に標識した。嗅上皮の発生・分化を追求した結果、4G12陽性細胞は、胎生18日目に始めて出現し、その後、上皮の上方に位置し、日が経つにしたがって4G12陽性細胞数が増し、上皮の下方へ向って4G12陽性細胞が占める割合が増加した。次に、成熟動物を用いて一側嗅球除去に伴う嗅上皮の染色パタ-ンの変化を観察した。嗅球除去により、嗅上皮に核濃縮を示す細胞が多数見られ、嗅球除去後1週間経つと、嗅細胞数は顕著に減少し、層の厚さも小さくなった。2週間経つと、わずかであるが、細胞数と層の厚さが増した。その後、除々に増加し、6週間後には、健常側の9割位にまで改復した。しかし、この時期嗅細胞の成熟度は低く、生後間まない幼若動物のそれに類似していた。すなわち、4G12陽性細胞は上皮の上方のみにあり、深層の嗅細胞は4G12陰性であった。その後に起こる染色パタ-ンの変化は、「陽性一浅層」が嗅上皮に占める割合が除々に増加し、「陰性一深層」の占める割合が減少した。したがって、一側嗅球除去により、嗅細胞は死減するが、その後再び、嗅細胞が出現し、改復する。そして、その改復過程は、発生・分化の再演であった。また、嗅細胞の変性後に起る嗅細胞の再出現は、嗅上皮にある基低細胞の分裂増殖によることを確認した。嗅細胞の変性後に起きる嗅上皮上の再生は神経系の可塑的変化を研究するのに都合が良いモデルと考えられるので、今後さらなる研究の継続が必要である。5匹の成熟ウサギ嗅球を攬拌し、マウスの腹腔に注入した。8週間後、脾臓を摘出した。脾臓を小切塊にし、さらに、脾細胞をバラバラに分離した後、骨髄腫細胞と融合し、約1000等分し培養増殖した。それぞれの培養上清液をウサギ嗅球切片と反応させた。さらに、二次抗体として蛍光色素の付いた抗マウスIgGとさせ、蛍光顕微鏡にて陽性を示す上清液をスクリ-ニングした。その結果、嗅球に陽性を示すものが40個見つかった。それらをクロ-ニングした後、40個の抗体中、2D5、4G12と名付けられた抗体を用いて、成熟ウサギ嗅上皮に対する染色性を検索した。2D5嗅上皮上ある細胞の中、すべての嗅細胞を識別した。嗅細胞の細胞体、樹状突起、軸索は2D5陽性であったが、核は陰性であった。また、基底細胞、支持細胞、神経膠細胞、腺細胞、骨細胞は陰性であった。一方、4G12は嗅上皮の上方2/3にある嗅細胞を識別したが、下方1/3にある嗅細胞を識別しなかった。2D5と同様に、その他の細胞群は陰性であった。4G12に対する染色パタ-ンはolfactory marker protein(OMP)に対する抗血清による染色パタ-ンと類似しており、感熟型嗅細胞を識別したと考えられる。

しかし、OMPの分子量は18.5KDであるが、4G12に対する抗原分子の分子量は26.5KDであることが確かめられたので、4G12はOMPとは明らかに異なる蛋白を識別すると結論された。ウサギ胎児と生後間もない幼若ウサギを用いた。4%パラホルムアルデヒド液にて固定した。臭粘膜の凍結前額断切片(10μm)を作製し、モノクロナル抗体2D5,4G12を用いて、間接蛍抗体法を行い観察した。抗体2D5は、胎生14日目の嗅細胞を標識した。この時期、標識された嗅細胞は嗅上皮の上方に位置し、単層配列をしていた。軸索は脳に投射していたが、樹状突起の発達は遅れており、乳首のような形をしていた。胎生17日目になると、嗅細胞は上皮の中央に移動し、樹状突起は伸長し、形態的には成熟型と類似していた。胎生25日目になると、嗅細胞は多重配例し、上皮の厚さが著しく大きくなった。抗体4G12は胎生17日目まで嗅細胞を標識せず、胎生18日目に4G12陽性の細胞が散発的に見られるようになった。その後、嗅細胞が多層配列を呈しても、4G12は上皮上方の細胞しか識別しなかった。2D5に対する生後の染色パタ-ンでは、細胞の形態・配列や層の厚さは成熟型とほぼ同じであった。一方、4G12に対する染色パタ-ンは非常に特異であった。すなわち、生後1日目では、4G12陽性細胞は嗅上皮の上方にのみ見られたが、日が経つにしたがって、4G12陽性細胞の数が増加し、4G12陽性細胞は上皮上方から中程に広がり、約1ケ月経つと、深部を残して、4G12陽性細胞で占められた。このパタ-ンは成熟動物で見られた像と一致していた。したがって、4G12陽性細胞の出現パタ-ンは、「浅層一陽性、深層一陰性」であり、動物の成熟に伴って、「陽性」の細胞が占める嗅上皮の領域は浅層から深層へと広がって行き、嗅細胞の成熟度は上皮の深層から浅層へ向う縦軸にそって大きくなる。
成体視細胞の生理機能におけるSUMO化の作用機序の解明

1つの蛋白質より多彩な機能を発揮させる分子メカニズムの一つとして翻訳後修飾が重要な役割を担う。SUMO化は標的蛋白質に10kD程度のSUMO(SmallUbiquitin-like Modifier)蛋白質を結合するが、生体視細胞の光受容伝達におけるSUMO化の役割は不明であった。そこで、SUMO E2リガーゼを成体視細胞に成長後に欠損する時期特異的欠損マウスを作製した。免疫組織化学的・電気生理学的解析を行った結果、いずれも野生型と同様であることが分かった。この結果は成体のマウス視細胞においてSUMO化が分化決定に関与する一方、光情報伝達や維持には関与が少ない事を示唆している。成体視細胞における翻訳後修飾SUMO化の作用機序を調べるため、SUMO E2リガーゼをコードするUbc9のfloxマウスを作製した。このマウスに視細胞特異的遺伝子Crxのプロモータ制御下でタモキシフェン誘導型Creを発現するトランスジェニックマウスを掛け合わせたマウスを作製した視細胞の分化および成熟が完了している2週齢以降(P21およびP30)でタモキシフェンを投与し、1ヶ月後に網膜の形態を野生型と比較した。外節の光受容蛋白質(杆体および錐体オプシン)、シナプス形成因子など視細胞の分子マーカーの発現パターンを比較した結果、外節の長さや核の位置やシナプスの形態などにおいて特筆する変化は観察されなかった。また、双極細胞の視細胞への投射にも大きな変化は観察されなかった。この結果より成体視細胞の形態維持において、SUMO化は関与しない可能性が示された。また、視細胞の分化決定期におけるSUMO化カスケードの欠損はSオプシンの異所的な発現を引き起こしたが、P21以降にSUMO化を欠損させた視細胞ではこの現象は認められなかった。この結果は、分化後(P21)の視細胞においてサブタイプ特異的な遺伝子発現を維持するために、別の機構(例:メチル化による遺伝子発現の抑制など)が関与する可能性を示している。今後、網膜電図を測定し、視細胞の光情報伝達能にSUMO化が関与するか検証する。さらに、視細胞サブタイプの分化直後(P7P9)にタモキシフェンの投与し、視細胞の初期の形態形成においてSUMO化が関与しているか検証していく。SUMO化は標的蛋白質にユビキチン様分子であるSUMOを付加する翻訳後修飾であり、様々な分子がSUMO化によりその活性が制御される事が報告されている。マウス網膜は杆体視細胞と異なる波長感受性を持つ2種類の錐体視細胞を持ちこの分化決定においてSUMO化が重要であることを報告したが、成体視細胞におけるSUMO化の関与は不明である。そこで、視細胞の光情報伝達カスケードおよび形態の維持におけるSUMO化の役割をコンディショナルノックアウトマウスを用いて解析した。SUMO E2リガーゼをコードするUbc9のfloxマウスに、視細胞特異的遺伝子Crxプロモータ下でタモキシフェン誘導型Creを発現するマウスと掛け合わせ、視細胞の成熟が完了した3週齢以降でタモキシフェンを投与し、視細胞の発達後にSUMO化カスケードを欠損するマウスを作製した。光情報伝達能の解析はタモキシフェン誘導後1ヶ月後のマウスを用いて網膜電図を記録した。暗順応下(杆体視細胞由来)および明順応下(錐体視細胞由来)の網膜電図を記録した結果、視細胞由来の応答であるa波および脱分極型双極細胞由来の応答であるb波の応答はUbc9欠損マウスにおいて野生型と同等であった。次に、タモキシフェン投与後6ヶ月後の網膜を視細胞特異的マーカー(ロドプシンなど)で組織染色を行い視細胞の形態を比較した結果、野生型と同様であることが分かった。更に、視細胞で発現し、SUMO化による制御が報告されている分子(mGluR8,Caskなど)のSUMO化のリジン残基の変異体を電気穿孔法で導入したが、変異蛋白質の局在や視細胞の形態に明確な差は認められなかった。これらの結果より、視細胞においてSUMO化は分化決定に関与し、光情報伝達や維持には関与が少ない事が示唆された。
乳癌進展における脂肪組織環境の果たす役割の解明

脂肪細胞は乳腺の重要な構成成分であるが、癌微小環境における脂肪細胞の特徴および働きは明らかではない。今回、我々は癌周囲および非癌部から脂肪組織を単離し、それぞれCancer associated adipocyte(CAA)及びNormal breast adipocyte(NBA)として培養、その形態学的特徴及び増殖性について比較検討を行った。CAAは成熟脂肪細胞で発現するC/EBPαの発現がNBAと比べて有意に低下しており、乳癌微小環境において脂肪細胞はより未分化な状態で存在することが分かった。また、脂肪細胞由来のIL-6やMCP-1は乳癌細胞の走化性やEMTに寄与することが分かった。本研究は乳腺環境を特徴づける豊富な間質である脂肪組織に着目し、癌進展における脂肪細胞の役割の解明を目指すものである。現在までの研究において、我々は癌部組織より得られた脂肪細胞(CAA)は、非癌部脂肪細胞(NBA)と比較してより未熟な形質を示し、癌細胞の走化性が増加することを示唆する知見を得ている。具体的には乳房全摘術症例より癌周囲および非癌部から脂肪組織を採取、コラゲナーゼ処理後、脂肪細胞を単離した。得られた脂肪細胞をコラーゲン3次元培養するとCAAは紡錘形に形体変化、増殖しやすく、その培養上清は癌細胞の走化性が上昇させる。以上の研究を踏まえて、我々は単離直後の脂肪細胞にPCR法を用い、脂肪分化マーカー及びケモカインの発現を比較し、癌周囲脂肪細胞のプロファイルのさらなる検討を行った。結果、PPARγ、レプチン、アディポネクチンの発現には差が認められなかったが、CEBPαの発現は癌部で低下を認めた。病理標本におけるCEBPαの免疫染色と脂肪細胞の大きさの検討を行うと、NBAに比較しCAAは小さく、CEBPαの染色割合も低下し、未分化なフェノタイプを示すことが確認された。また、これらの培養上清を乳癌細胞株に添加し、変化を比較検討した結果、NBAと比較してCAAでは増殖性には有意な変化を与えなかったが、ER発現の有無にかかわらず乳癌細胞株の走化性を有意に増加させた。サイトカインアレイを行うとCAA培養上清中ではIL-6及びMCP-1濃度の上昇が認められ、PCRにおいてもCAAでは同因子の発現上昇が認められている。これら乳癌細胞ー脂肪細胞の相互作用に対する理解は、脂肪細胞をターゲットとした新たな乳癌治療の礎となる可能性を秘めている。癌部及び非癌部脂肪細胞の単離、コラーゲンゲル3次元培養を行う系を確立することができ、培養上清を用いた抗体アレイによるスクリーニング及び比較検討も可能であった。また、癌細胞と脂肪細胞のコラーゲンゲル3次元共培養も可能であり、観察が可能であった。癌部脂肪細胞は3次元コラーゲンゲル培養下では脂肪滴が減少し、紡錘形細胞となって増殖したが、非癌部脂肪細胞と比べ、その数が有意に増加した。さらに成熟脂肪細胞への分化マーカーであるC/EBPαの発現も癌部脂肪細胞では有意に低下していた。以上より、癌存在下において脂肪細胞はより未分化な状態にあることが示唆された。これらの培養上清を乳癌細胞株に添加し、増殖性、走化性において検討を試みた結果、増殖性には有意な変化を与えないが、乳癌細胞株の走化性を有意に増加させることが分かった。さらに、サイトカインアレイを用いると癌部培養上清中ではIL-6及びMCP-1濃度の上昇が認められた。