hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非線形現象に関連した非線形偏微分方程式における解の特異性の生成とその性質

1.片岡は非線形の演算を許す超関数のクラスとしてフランスのColombeauによるいわゆる一般関数の理論を超局所解析の立場から研究し,富川との共同研究の中で,従来の弱い同値関係のままでは(佐藤超関数の枠内でさえ解を持たないことがわかっている)Levy-溝畑型の方程式を含むほとんどの方程式がColombeau関数内に自明な弱い解をもつことになってしまうが,片岡があらたに導入した弱い同値関係の下ではLevy-溝畑型の方程式は弱い解を持たない事が,周期性などの付帯条件なしにF.B.I.変換を利用して証明することができた.このことは片岡の弱い同値関係が従来のものの本質的な改善になっていることを一層強く示している.2.堤は非線形波動方程式に関して研究し,非線形シュレデインガー方程式の場合において、解の正則性と非線形性の関係を調べ,シュレデインガー方程式においては,ゲージ不変性が大きな役割を果していることを解明した。そして、ゲージ不変性に関連したある種の対称性を持つ場合には,解の正則性が良くなることを証明した。ここでローレンツ不変性に関連したある種の対称性を持つ非線形性の場合には、解の正則性について特別な結果が成立することが、KlainermanとMachedonの研究により知られていた.3.谷島は時間によって変化する係数をもつSchrodinger方程式を研究し,基本解の正則性および非正則性に関する結果を得た.4.長田はDirichlet形式論を使って相互作用をもつ無限次元Weiner過程を構成した.この方法の利点はhard coreポテンシャルやLennard-Jones 6-12ポテンシャルなどの特異ポテンシャルの場合に応用できることである.1.片岡は非線形の演算を許す超関数のクラスとしてフランスのColombeauによるいわゆる一般関数の理論を超局所解析の立場から研究し,富川との共同研究の中で,従来の弱い同値関係のままでは(佐藤超関数の枠内でさえ解を持たないことがわかっている)Levy-溝畑型の方程式を含むほとんどの方程式がColombeau関数内に自明な弱い解をもつことになってしまうが,片岡があらたに導入した弱い同値関係の下ではLevy-溝畑型の方程式は弱い解を持たない事が,周期性などの付帯条件なしにF.B.I.変換を利用して証明することができた.このことは片岡の弱い同値関係が従来のものの本質的な改善になっていることを一層強く示している.2.堤は非線形波動方程式に関して研究し,非線形シュレデインガー方程式の場合において、解の正則性と非線形性の関係を調べ,シュレデインガー方程式においては,ゲージ不変性が大きな役割を果していることを解明した。ここでローレンツ不変性に関連したある種の対称性を持つ非線形性の場合には、解の正則性について特別な結果が成立することが、KlainermanとMachedonの研究により知られていた.3.谷島は時間によって変化する係数をもつSchrodinger方程式を研究し,基本解の正則性および非正則性に関する結果を得た.4.長田はDirichlet形式論を使って相互作用をもつ無限次元Weiner過程を構成した.この方法の利点はhard coreポテンシャルやLennard-Jones 6-12ポテンシャルなどの特異ポテンシャルの場合に応用できることである.
がん幹細胞の根絶を目指した新規ウイルス療法の基礎開発

第三世代がん治療用遺伝子組換え単純ヘルペスウイルスI型、G47Δを元に、がん幹細胞をも標的とする、脳腫瘍の根絶的な治療に結びつく新規ウイルスの開発研究を実施した。BMP4分子に着目し、BMP4発現型ウイルスを作製した。膠芽腫の臨床検体から樹立した複数のがん幹細胞株において、高い殺細胞効果を示した。更に、がん幹細胞で形成したマウス脳内腫瘍モデルにて有効性を検証したところ、がん幹細胞性の高い脳腫瘍に対して、BMP4発現型G47Δは高い有効性を持つ可能性が示唆された。再発率の高い悪性神経膠腫における根絶的治療として実用性の高いウイルス療法の基礎開発が進んだ。脳腫瘍の中でも膠芽腫は予後不良の難治性腫瘍であり、現状では再発は必至である。その要因の一つとして脳腫瘍幹細胞の存在が考えられている。申請者の所属する研究室ではがん細胞におけるウイルス複製能に優れ、かつ安全性が高い第三世代がん治療用単純ヘルペスウイルスI型のG47Δを開発し、再発膠芽腫を対象とした臨床試験が展開されている。更にG47Δは膠芽腫由来のがん幹細胞にも効率良く感染し破壊することを見出している。そこで、がん幹細胞をも標的とする、脳腫瘍の根絶的な治療に結びつく新規がん治療用HSV-1を開発し、その有効性を評価することを目的として本研究を進めている。まず、膠芽腫の臨床検体から樹立した複数のがん幹細胞におけるG47Δの効果をin vitroにて検証し、多くの細胞株において高い殺細胞効果を確認できた。更に、がん幹細胞性を失わせる分子として、TGF-βスーパーファミリーに属する骨形成因子(bone morphogenetic protein)の一つであるBMP4分子に着目し、BMP4発現型G47Δを作製した。作製したウイルスの機能評価として、ゲノム構造の確認、複製能力や抗腫瘍効果の検証ならびに発現タンパクの定量などを行った。BMP4存在下で培養した場合、多くの脳腫瘍幹細胞は分化傾向を示し、またいくつかの細胞株で、BMP4発現型G47Δはin vitroの系でより高い殺細胞効果を示したことから、今後はin vivoの系での検証を進めていく予定である。また脳腫瘍幹細胞のパネルを用い、BMP発現ウイルスによる治療効果の増強や、幹細胞性に関連する因子のmRNAおよびタンパクレベルでの増減について検討を行い、その関連性を検討している。昨年度に引き続き、新たに膠芽腫の臨床検体から樹立した複数のがん幹細胞におけるG47Δの効果をin vitroにて検証し、多くの細胞株において高い殺細胞効果を確認できた。更に、がん幹細胞性を失わせる分子として、TGF-βスーパーファミリーに属する骨形成因子(bone morphogenetic protein)の一つであるBMP4分子に着目し、BMP4発現型G47Δを、T-BACシステム(所属研究室で開発された任意の遺伝子カセットを確実に挿入し、短期間で作製可能なG47Δを基本骨格とするbacterialartificial chromosome (BAC)システム)を利用して作製した。対照ウイルスとしては目的遺伝子のない空のカセットを同様のシステムで導入したT-01を用いた。がん幹細胞で形成したマウス腫瘍モデルにて、BMP4発現型G47Δの腫瘍形成能やマウス生存に及ぼす効果をT-01の効果と比較検討したところ、In vitroの系でT-01に比べBMP4発現型G47Δが高い殺細胞効果を示した細胞株においては、mock群およびT-01投与群に比べ有意に生存期間の延長を示した。所属研究室では、膠芽腫の臨床検体からがん幹細胞を分離培養することに成功しており、現在も樹立を続けていることから、昨年同様、複数の脳腫瘍幹細胞に対するG47Δの効果を検討することができた。また、所属研究室ではマウス脳腫瘍モデルの系が既に確立しており、予備実験の時間が短縮できた。所属研究室ではがん細胞におけるウイルス複製能に優れ、かつ安全性が高い第三世代がん治療用単純ヘルペスウイルスI型のG47Δを開発し、再発膠芽腫を対象とした臨床試験が展開されている。そこで、がん幹細胞をも標的とする、脳腫瘍の根絶的な治療に結びつく新規がん治療用HSV-1を開発し、その有効性を評価することを目的とした。所属研究室では、膠芽腫の臨床検体からのがん幹細胞樹立に成功しており、本年度も含め、研究期間を通して新たに樹立した複数のがん幹細胞におけるG47Δの効果をin vitroにて検証し、多くの細胞株において高い殺細胞効果を確認した。

更に、がん幹細胞性を失わせる分子として、TGF-βスーパーファミリーに属する骨形成因子の一つであるBMP4分子に着目し、BMP4発現型G47Δを、T-BACシステム(所属研究室で開発された任意の遺伝子カセットを確実に挿入し、短期間で作製可能なG47Δを基本骨格とするシステム)を利用して作製した。対照ウイルスとしては目的遺伝子のない空のカセットを同様のシステムで導入したT-01を用いた。がん幹細胞で形成したマウス脳内腫瘍モデルにて、BMP4発現型G47Δの腫瘍形成能やマウス生存に及ぼす効果をT-01の効果と比較検討したところ、In vitroの系でT-01に比べBMP4発現型G47Δが高い殺細胞効果を示した細胞株においては、mock群およびT-01投与群に比べ有意に生存期間の延長を示した。以上から、がん幹細胞性の高い脳腫瘍に対して、G47Δも十分効果的ではあるがそれ以上にBMP4発現型G47Δは高い有効性を持つ可能性が示唆された。第三世代がん治療用遺伝子組換え単純ヘルペスウイルスI型、G47Δを元に、がん幹細胞をも標的とする、脳腫瘍の根絶的な治療に結びつく新規ウイルスの開発研究を実施した。BMP4分子に着目し、BMP4発現型ウイルスを作製した。膠芽腫の臨床検体から樹立した複数のがん幹細胞株において、高い殺細胞効果を示した。更に、がん幹細胞で形成したマウス脳内腫瘍モデルにて有効性を検証したところ、がん幹細胞性の高い脳腫瘍に対して、BMP4発現型G47Δは高い有効性を持つ可能性が示唆された。再発率の高い悪性神経膠腫における根絶的治療として実用性の高いウイルス療法の基礎開発が進んだ。所属研究室では、膠芽腫の臨床検体からがん幹細胞を分離培養することに成功しており、現在も分離培養を続けていることから、複数の脳腫瘍幹細胞に対するG47Δの効果を検討することができた。また、所属研究室で開発された、任意の遺伝子カセットを確実に挿入可能なG47Δを基本骨格とするbacterial artificial chromosome (BAC)システムを利用することで、短期間でBMP4発現型G47Δを作製することが可能であった。平成27年度は、in vitroおよびin vivoにおけるBMP4発現型G47Δのウイルスの殺細胞効果等およびがん幹細胞で形成したマウス脳腫瘍モデルでのマウス生存に及ぼす効果を検証できたので、平成28年度は、脳腫瘍幹細胞のパネルを用いたBMP発現ウイルスによる治療効果の増強や、幹細胞性に関連する因子のmRNAおよびタンパクレベルでの増減の比較検討結果から、その関連性を見出す。また、複数の脳腫瘍幹細胞におけるG47ΔおよびBMP4発現型G47Δの効果を比較することで総合的にG47Δの有効性を評価する。医歯薬学、分子生物学平成26年度は、in vitroの系を中心に実験を進め、ウイルスの殺細胞効果等を検証できたので、平成27年度は、がん幹細胞で形成したマウス腫瘍モデルを用いたin vivoの系を用いた腫瘍形成能やマウス生存に及ぼす効果を検証し、G47Δの効果と比較検討する。
次世代ナノ加工・計測システムのためのダイヤモンドプローブの開発

本研究では,"次世代ナノ加工・計測システム"実現のために必須となる,高硬度・耐摩耗性に優れ,かつ高アスペクト比を有するダイヤモンド製プローブを開発するための基礎的研究を行った.得られた成果をまとめると以下のとおりである.1.高精度エッチング技術の確立(1)反応性イオンエッチング(RIE)によるダイヤモンド膜の異方性エッチング技術を確立した.RIE条件(O_2プラズマ中へのCF_4ガス添加量,ガス圧力,高周波(RF)パワーなど)の影響を詳細に検討した結果,O_2プラズマ中へCF_4ガスを2%添加することで,ほぼ垂直な側壁形状をもつダイヤモンド構造体の形成が可能となった.ガス圧力6.9Pa,RFパワー150Wの条件でのエッチレートは約22nm/minとなった.(2)エッチング用のマスクとなるSOG(Spin-on-glass,SiO_2膜)の塗布条件と膜厚の関係を明らかにした.また,CHF_3ガスを用いたRIE条件を検討し,等方的なエッチング形状を得るための条件を明らかにした.(3)SOGマスクを用いたダイヤモンド膜の異方性エッチングによって,直径が約1μm,高さ約4μm(アスペクト比4)の円柱形状をもつダイヤモンド構造体の形成が可能となった.この結果から,作製したダイヤモンド構造体が原子間力顕微鏡(AFM)の探針として十分に利用であることを示した.2.平坦化技術の確立(1)気相合成ダイヤモンド膜の新しい平坦化技術を確立した.ダイヤモンド膜(表面粗さ:約1μmRz)上へのSOG膜の塗布条件を最適化することで,表面粗さを0.1μmRz程度まで改善することが可能となった.(2)開発した平坦化技術は,機械的な研磨やイオンビームなどとは異なり,簡便にダイヤモンド膜の表面粗さを改善できる方法である.また,SOG膜はダイヤモンド膜のエッチングの際のマスクとしても利用可能であることや,ダイヤモンド膜とガラスとの陽極接合を行う際の平坦化層としても適用できるなど,ダイヤモンド膜を利用したMEMSデバイスの開発に対し多くの利点を有する技術といえる.本研究では,"次世代ナノ加工・計測システム"実現のために必須となる,高硬度・耐摩耗性に優れ,かつ高アスペクト比を有するダイヤモンド製プローブを開発するための基礎的研究を行った.得られた成果をまとめると以下のとおりである.1.高精度エッチング技術の確立(1)反応性イオンエッチング(RIE)によるダイヤモンド膜の異方性エッチング技術を確立した.RIE条件(O_2プラズマ中へのCF_4ガス添加量,ガス圧力,高周波(RF)パワーなど)の影響を詳細に検討した結果,O_2プラズマ中へCF_4ガスを2%添加することで,ほぼ垂直な側壁形状をもつダイヤモンド構造体の形成が可能となった.ガス圧力6.9Pa,RFパワー150Wの条件でのエッチレートは約22nm/minとなった.(2)エッチング用のマスクとなるSOG(Spin-on-glass,SiO_2膜)の塗布条件と膜厚の関係を明らかにした.また,CHF_3ガスを用いたRIE条件を検討し,等方的なエッチング形状を得るための条件を明らかにした.(3)SOGマスクを用いたダイヤモンド膜の異方性エッチングによって,直径が約1μm,高さ約4μm(アスペクト比4)の円柱形状をもつダイヤモンド構造体の形成が可能となった.この結果から,作製したダイヤモンド構造体が原子間力顕微鏡(AFM)の探針として十分に利用であることを示した.2.平坦化技術の確立(1)気相合成ダイヤモンド膜の新しい平坦化技術を確立した.ダイヤモンド膜(表面粗さ:約1μmRz)上へのSOG膜の塗布条件を最適化することで,表面粗さを0.1μmRz程度まで改善することが可能となった.(2)開発した平坦化技術は,機械的な研磨やイオンビームなどとは異なり,簡便にダイヤモンド膜の表面粗さを改善できる方法である.また,SOG膜はダイヤモンド膜のエッチングの際のマスクとしても利用可能であることや,ダイヤモンド膜とガラスとの陽極接合を行う際の平坦化層としても適用できるなど,ダイヤモンド膜を利用したMEMSデバイスの開発に対し多くの利点を有する技術といえる.
蚕の濃核病ウイルスの感染増殖に関する研究

カイコ濃核病ウイルスはBmDNV-1(伊那株)とBmDNV-2(山梨株・中国株)に大別される。本研究班は3年間の研究により下記の成果を得た。1、cDNV(中国株)の早期診断法としてDot-IGSS法を検討し、ウイルス感染後10時間で診断でき、検出感度は10ngで陽性反応を示した。2、cDNVとNPV又はCPVとの混合感染を調査し、特にNPVとの間に高い干渉作用があることを認めた。3、cDNVの2種類の核酸、DNA-1(6.56Kb)とDNA-2(6.07Kb)について制限酸素地図を作成すると共に、両DNAの塩基配列の相達を認めた。4、cDNVとyDNV(山梨株)のゲノムDNAの制限酸素地図を作成、比較検討し、特にDNA-1に相達が認められたが、末端の塩基配列は極めてよく似た構造をしていることを明らかにした。5、cDNVのDNA-1(6.56Kb)にクロ-ニングを行ない、完全核のゲ-ムDNAをpUC19プラズミドベクタ-にインサ-トし、クロ-ンを得た。6、BmDNVー1のDNA(4.9kb)のクロ-ニングを試み、完全核のゲノムDNAをpUC119プラズミドベクタ-にインサ-トし、クロ-ンを得た。また、クロ-ンのp17238を用いて、その全塩基配列の5048ヌクレオチドの解析ができた。7、cDNVは41、43、48、51、100Kのポリペプチドから成ることが分った。2次元電気泳動で8種を確認できた。cDNVにポリアミンを認めた。8、2種の昆虫培養細胞系がそれぞれ直径20nm(単鎖DNA)と直径22nm(RNA)との球形ウイルスに持続湖染していることを見いだした。9、桑園害虫であるクワノメイガGlyphodespyloalisの外観健全な幼虫はDNVと血清学的に全く区別できないウイルスを〓々中腸に保持しているところから、本虫はDNVの起源的宿主であり、このウイルスの垂直伝播に重要な役割を果していることが推察された。I.DNVの感染DNVの本来の宿主はクワノメイガであり、この虫の経卵表面伝達の形で垂直伝播を繰返し、蚕における本病の感染はクワノメイガのアクシデンタルな水平伝播によって生ずる(渡部)。II.DNVの増殖中腸細胞核内での増殖を超微形態学的に究明する目的で、金コロイド標識法を検討し、血清濃度、固定条件などの諸条件が分かり、本法による増殖過程の追跡を行った(岩下)。雌雄モザイック蚕を用いてDNV-1の感染細胞と非感染細胞とがモザイック状に存在し、本ウイルスの感染抵抗性を検討する糸口の一端が得られた(渡部)。DNVとCPV又はNPVとの混合感染について病理組織学的に検討し混合感染した両ウイルスは、共に増殖が抑制された。特にNPVはウイルス粒子の形成、膜の産生及び多角体形成などに顕著な異常が認められた(岩下)。

培養細胞におけるDNVの増殖をVero細胞、LD-S細胞及びLD-Y細胞などに接種したが、増殖が確認できなかった(福原)。III.DNVの蛋白質・核酸中国株DNVにスペルミジン、スペルミンプレシンの存在を確認した(菅家)。DNV-1の5'末端の未決定領域408塩基対を決定した。ORF-1は5'末端より286番目の塩基から始まる。ORF-1は分子量51Kの蛋白質をコード可能であった。また5'末端には約70塩基の自己相補的な配列が存在し、この領域がヘアピン構造をとることを示唆した。3'末端は300塩基であり、その5'側と同様な自己相補的な配列が存在した(川瀬)。DNV(山梨株)の核酸のDNAIとIIを分離し、制限酵素で切断、塩基配列決定用クローンを作成した。この地図をもとにして、得られたクローンがウイルスDNAをインサートしていることを確認した。まだデレーションミュタントを数種作成できた。山梨株と中国株のプラスミド・クローンを作成し、制限酵素の切断像より、2株ウイルスの核酸の相違が確認された(中垣)。2.DNV感染の早期診断法のために金コロイド標識抗体によるドットイムノブロッティング法を開発した。ニトロセルロ-ズメンブレン上に被検体磨砕液を1μg滴下し、1次崎体で1時間反応、続いて2次抗体(ヤギ血清+5nm金コロイド)で反応後、銀粒子増感反応を行って発色させた。1次元体濃度は約1万倍、2次抗体は100倍希釈が適当であった。本法はオクタロニ-法の1000倍、エレクトロシネレ-シス法の1万倍の感度で、精製DNV1ngが検出可能であり、ウイルス接種後10時間で個体レベルの感染について検出ができた。3.消石灰及び高度サラシ粉飽和液によるDNV不活化効果を明らかにした。消石灰飽和液及び高度サラシ粉飽和液はDNV浸漬20分で完全に不活化した。更に電気泳動パタ-ンによる不活化過程を追跡した。両飽和液にDNV5分以上の浸漬でウイルスタンパク質は消失した。ウイルス核酸は高度サラシ粉液は20分浸漬で消失したが、消石灰飽和液は5.9Kbpのバンドのみが消失したが6.6Kbpは消失しなかった。マイクログリット上のウイルス粒子は両飽和液5分以上の処理でウイルスキャプシットは崩壊し、ウイルスコアが露出し、30分処理で粒子形態は完全に消失した。4.培養細胞SCLD細胞に20nmのウイルス粒子を細胞質及び核内に産生を認めた。STE-MSH-805細胞には21nmのウイルス粒子が細胞質に形成するのを確認した。しかし、蚕DNVが増殖可能な昆虫培養細胞系について10株の細胞を調査したが、増殖を認めることができなかった。濃核病ウイルス,DNVーI(伊那株)及びDNVーII(山梨株・中国株)の主としてウイルス構成タンパク質と核酸について研究し、下記の結果を得た。1.中国株ウイルスの2種類の核酸の長さを決定した。即ちDNAー1は6.56Kbp,DNAー2は6.07Kbpであった。2.中国株DNVを消石灰飽和水溶液に浸漬すると、5分後には粒子が変性、崩壊したが、一部の粒子は変形することなく集合して残留した。このウイルスを蚕に経口投与したが感染性はなかった。残留した粒子は核酸の制限酵素地図及びサザンハイ・ブリダイゼ-ションによりDNAー1であることを明らかにした。DNVーIIは2形の粒子を有し、両者により、宿主細胞への感染が成立することが推察された。3.中国株DNVのDNAー1(6.56Kbp)の全遺伝子をホモポリマ-結合法により、pUCl9プラズミドにインサ-トし、クロ-ン細胞を得た。4.山梨株と中国株DNAのそれぞれのゲノムDNAにおける制限酵素地図の解析から、DNAー2の塩基配列は殆ど同じであった。しかしDNAー1には相違が認められたが、その末端構造は極めてよく似た塩基配列をしていることを明らかにした。5.山梨株DNVの構成
抗真菌性ポリエーテル分子ガンビエル酸の効率的全合成と機能解析

・J環部側鎖導入方法の検討ガンビエル酸類は分子右側に、三置換オレフィンとそのアリル位に不斉炭素を持つ特徴的な側鎖を有しており、その合成の困難さから、これまでに全合成に有用な右側側鎖の導入方法は報告されていない。筆者は三置換オレフィンの立体選択的な構築に、第一級スルホンとメチルケトンを用いたJulia-Kocienski反応が適しているのではないかと考え、まず、モデル化合物を用いて反応条件の検討を行った。その結果、塩化セリウムの添加がこの反応の収率およびE/Z選択性の向上に極めて効果的であり、目的の三置換オレフィンを80%の収率(E/Z=1.6:1)で与えることを見出した。これまでに塩化セリウムを用いたJulia-Kocienski反応の報告例は無く、今回得られた知見は全く新しいものである。・右側側鎖を含むGHIJ環部フラグメントの合成前年度までに合成を達成したGHIJ環部の右側部分をメチルケトンへと誘導後、モデル実験で最適化を行った反応条件でJulia-Kocienski反応を行い、目的の(E)-オレフィンを優先的に得ることに成功した(E体:58%,Z体:18%)。これにより文献既知のエポキシアルコールから37段階で側鎖を含むGHIJ環部フラグメントの収束的な合成を達成した。・ガンビエル酸類のGHIJ環部の効率的合成ガンビエル酸類の全合成にむけて、まず、GHIJ環部フラグメントをアルドール反応によるフラグメントの連結と脱水環化反応を鍵反応として合成することにした。まず、1,3-プロパンジオールから24段階でJ環部メチルケトンを合成し、文献記載の方法に従い調整したG環部アルデヒドとのアルドール反応による連結を試みた。種々検討した結果、ホウ素エノラートを用いた条件が最も良い結果を与えることを明らかにした。次に、H環部に相当するジヒドロピロン環の構築を試みた。その結果、ジケトンに対する脱水環化反応がジヒドロピロン環の構築に適していることを見出し、さらに、これまでに報告されていない新規な脱水環化反応の条件(PPTS,MeOH,80°C)が最も良い収率でジヒドロピロン環を与えることを明らかにした。次いで、I環部の構築を中田らによって報告されている手法に従って行い、GHIJ環部フラグメントの合成を達成した。・分子右側側鎖の合成研究ガンビエル酸類は分子右側に、三置換オレフィンとそのアリル位に不斉炭素を持つ特徴的な側鎖を有しており、その合成の困難さから、これまでに全合成に有用な右側側鎖の導入方法は報告されていない。そこで、筆者はモデル化合物を用いて右側側鎖の導入方法の検討を行った。その結果、第二級スルホンとアルデヒドを用いたJulia-Kocienski反応による三置換オレフィンの合成が適していることを見出した。さらに、スルホンに対してアルデヒドを過剰量用いることで、合成の最終段階で予想される低濃度の反応条件において、この方法が適用可能であることを明らかにした。
非ウィルス・ベクターによる膀胱へのin vivo遺伝子導入法

【目的】膀胱癌を対象とした遺伝子治療の臨床応用を想定して,導入効率が良く,安全で繰り返し使用できる非ウイルス・ベクターによる膀胱へのin vivo遺伝子導入法の開発を目的として研究を行った。【方法】カチオニック・リポソーム:陽荷電したリン脂質DOTMAと中性のDOPEの1:1混合物から作製したリポソームをDNAと混和、ラットの膀胱内に注入した。2.HVJリポソーム法:センダイ・ウイルス(HVJ)の細胞膜融合能と核蛋白質HMG1による核へのDNA輸送能をもたせたHVJリポソームは,金田らの方法(J Biol Chem 264;12126,1989)によって作成し、ラットに膀胱内注入した。3.パーティクル・ガン:DNAをコートした直径0.5-1.0μmの金粒子を高圧窒素ガスを利用したパーティクル・ガンによってウサギ膀胱粘膜に打ち込んだ。4.電気穿孔法:DNA水溶液をウサギ膀胱粘膜下に局所注入し、その部分を挟むように針電極を粘膜下に刺入して直流パルス電流(500-1000V,0.1msec)を通じた。マーカー遺伝子としてはpSV-β-GalactosidaseおよびpCATを用いた。【結果および考察】カチオニック・リポソームでは、正常膀胱、BBN化学発癌膀胱とも部分的に発現が見られたのみで、繰り返しての投与が必要と考えられた。HVJ-リポソームでは広範囲の膀胱粘膜の表層でβ-galactosidaseの発現が見られ,上皮内癌タイプへの応用が可能と思われる.発現は遺伝子導入後3-5日でピークとなり、少なくとも2週間持続した。パーティクル・ガンでは発現が不均一ではあるが粘膜深層での発現も見られた.電気穿孔法では発現効率はそれほど高くないものの上皮から粘膜下にかけて発現が認められた。後者の2つの方法は内視鏡との組み合わせにより、臨床的な応用が可能と考えられる。【目的】膀胱癌を対象とした遺伝子治療の臨床応用を念頭に置いて,,導入効率が良く,安全で繰り返し使用できる非ウィルス・ベクターによる膀胱へのin vivo遺伝子導入法の開発を目的として研究を行った.【方法】1. HVJリポソーム法:センダイ・ウイルス(HVJ)の細胞膜融合能と核蛋白HMG1による核へのDNA輸送能をもたせたHVJリポソームは,金田の方法(J Biol Chem 264 ; 12126, 1989)によって作成し、ラットに膀胱内注入した.2.パーティクル・ガン: DNAをコートした直径0.51.0μmの金粒子を高圧窒素ガスを利用したパーティクル・ガンによってウサギ膀胱粘膜に打ち込んだ.3.電気穿孔法: DNA水溶液をウサギ膀胱粘膜下に局所注入し、その部分を挟むように針電極を粘膜下に刺入して直流パルス電流(500-1000 V, 0.1msec)を通じた。マーカー遺伝子としてはpSV-β-Galactosidaseを用い,遺伝子導入後48時間で摘出した膀胱の凍結切片を作成し,β-galactosidaseの発現をX-galの分解による染色を組織化学的に検討した.また,HVJリポソームによる発現の経時的変化には、pCATをマーカー遺伝子として用いた。【結果および考察】HVJ-リポソームでは広範囲の膀胱粘膜の表層でβ-galactosidaseの発現が見られ,上皮内癌タイプへの応用が可能と思われる.発現は遺伝子導入後3-5日でピークとなり、少なくとも2週間持続した。パーティクル・ガンでは発現が不均一ではあるが粘膜深層での発現も見られた.

電気穿孔法では発現効率はそれほど高くないものの上皮から粘膜にかけて発現が認められた。後者の2つの方法は内視鏡との組み合わせにより、幅広い応用が可能と考えられる。【目的】昨年度は膀胱へのin vivoでの遺伝子導入法を検討したが、このうちのHVJ(センダイ・ウイルス)リポソーム法を用いて本年度は膀胱癌モデルに対し治療を試みた。癌に対する免疫遺伝子治療、とくに腫瘍細胞にサイトカインなどの遺伝子を導入しワクチンとして用いる腫瘍ワクチン療法は、腫瘍とサイトカインの種類の組み合わせが検討され、そのいくつかは有効な治療手段となりうる可能性が示されている。膀胱腫瘍についても細胞株を用いた系でインターフェロンγ(INF-γ)の有効性が示されている。そこでラットのBBN誘発膀胱癌モデルに対し、HVJ-リポソーム法を用いてINF-γ遺伝子を導入し、その抗腫瘍効果を検討した。【方法】雄性SDラットで0.1%BBMの飲水によって膀胱癌を誘発した。BBN投与開始1週後より、2週間ごとにHVJリポソームによりINF-γ遺伝子を膀胱上皮に導入した。HVJ-リポソームは昨年度に報告したように、金田らの方法によって作製し、ラット膀胱へは麻酔下で下腹部を切開し直視下で穿刺注入した。コントロール群ではDNAを含まない空のHVJ-リポソームを注入した。BBNの投与は10週間、HVJ-リポソーム注入は4-6カ月続け、その後に屠殺し抗腫瘍効果について検討した。【結果および考察】INF-γ遺伝子導入群とコントロール群とを比較して、膀胱重量、腫瘍数について検討したが、いずれも有意差は認められなかった。また、組織学的にも明らかな差は認められなかった。一方、HVJ-リポソームの注入によると思われる膀胱結石の発生を高頻度で認めた。結石による影響や注入による尿路感染によって発癌のプロモーションが促進され、INF-γの効果が打ち消された可能性も考えられる。
低分子量G蛋白質の活性制御機構と作用機構

現在、低分子量G蛋白質は、種々の重要な細胞機能を制御していることが明らかになっており、その活性化機構と作用機構を分子レベルで解明することが、医学・生物学領域において重要な課題となっている。本研究において、私共は、RabとRho低分子量G蛋白質の活性化機構と作用機構について解析を行い、以下の成果を得た。1.Rab3Aの活性化機構:Rab3Aの活性制御蛋白質Rab3 GEPとRab3 GAP、Rab GDIが、Rab3Aの活性制御を介して神経伝達物質の放出を制御していることを明らかにした。特に、Rab GDIについては、神経特異的に発現するアイソフォームRab GDIαのノックアウトマウスを作製し、このマウスの解析から、Rab GDIαは、Rab3Aを不活性型に維持し、Rab3Aによるシナプス小胞輸送の過度の促進を抑制して神経の過度の興奮を抑える作用を有することを明らかにした。2.Rab3AおよびRab11の作用機構:ヤリイカの巨大シナプスの系により、Rab3Aの標的蛋白質Rabphilin-3Aが神経伝達物質の放出を制御していることを明らかにした。また、Rab11の標的蛋白質であるRabphilin-11を見い出し、Rab11-Rabphilin-11系が小胞のリサイクリングの制御を介して細胞運動に関与することを示した。3.Rhoの活性化機構:Rhoが時間的・空間的にOn/Offとなり、ストレスファイバーや接着斑の形成を介して細胞運動を制御していることを明らかにした。さらに、チロシンホスファターゼSHP-2が、Rhoの活性化を制御し、細胞運動の制御に関与していることを明らかにした。また、Cdc42の活性制御蛋白質FrabinとCdc42を介する系が細胞運動の最も上流に位置する可能性を示した。4.Rhoの作用機構:動物細胞において、出芽酵母のRhoの標的蛋白質BNI1のカウンターパートであるmDiaと今一つのRhoの標的蛋白質であるROCKの機能を検討し、Rhoによるアクチン細胞骨格の再編成には、両者の協調的な作用が重要であることを明らかにした。海外研究分担者との共同研究という形で論文は発表できなかったが、彼等との研究打ち合わせや直接の研究技術指導により、本研究は、2年間の研究期間において上記のように予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。現在、低分子量G蛋白質は、種々の重要な細胞機能を制御していることが明らかになっており、その活性化機構と作用機構を物質的に解明することが、医学・生物学領域において重要な課題となっている。本年度の本研究において、私共は、RhoとRab低分子量G蛋白質の活性化機構と作用機構について解析を行い、以下の成果を得た。(1) Rab3Aの活性化

機構:私共が見い出したRab3Aの活性制御蛋白質Rab3 GEPとRab3 GAPが、Rab3Aと共に神経終末に局在し、Rab3Aの活性を制御することによってCa^<2+>依存性分泌を制御していることを明らかにした。(2) Rab3Aの作用機構:ヤリイカの巨大シナプスの系により、Rab3Aの標的蛋白質Rabphllin-3Aが実際に神経伝達物質の放出を制御していることを明らかにした。(3) Rhoの活性化機構: MDCK細胞のTPAによる細胞遊走の際には、Rhoが時間的・空間的にOn/Offとなり、ストレスファイバーや接着斑の形成を介して細胞運動を制御していることを明らかにした。(4) Rhoの作用機構:私共は、出芽酵母において、Rhoの標的蛋白質BNI1がアクチンの重合過程を制御することを明らかにしているが、本研究では、このBNIlを細胞膜へ局在させる蛋白質としてSPA2を見い出し、さらに、SPA2に結合する因子が細胞質分裂に関与するセプチンであることを見い出した。また、動物細胞においては、BNIlのカウンターパートであるmDiaと今一つのRhoの標的蛋白質であるROCKの機能を検討し、Rhoによるアクチン細胞骨格の再編成には、両者の協調的な作用が重要であることを明らかにした。本年度は、海外研究分担者との共同研究という形で論文は発表できなかったが、Novick博士およびHall博士との研究打ち合わせやLacal博士およびBar-Sagi博士による研究技術指導により、本年度の研究は上記のように予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。現在、低分子量G蛋白質ば、種々の重要な細胞機能を制御していることが明らかになっており、その活性化機構と作用機構を分子レベルで解明することが、医学・生物学領域において重要な課題となっている。本年度の本研究において、私共は、RhoとRabファミリー低分子量G蛋白質の活性化機構と作用機構について解析を行い、以下の成果を得た。1.Rhoファミリーの活性化機構:私共は、チロシンホスファターゼSHP-2がRhoの活性化を制御し、細胞運動の制御に関与していることを明らかにした。また、Cdc42の活性制御因子FrabinとCdc42を介する系が細胞運動の最も上流に位置する可能性を示した。2.Rhoファミリーの作用機構:私共は、出芽酵母において、Rhoの標的蛋白質であるBNI1を見い出しているが、BNI1がアクチン細胞骨格を介して微小管系細胞骨格をも制御していることを明らかにした。3.Rabファミリーの活性化機構:私共は、Rab3の活性制御因子RabGDIの2個のアイソフォームのうち、神経特異的に発現するRabGDIαのノックアウトマウスを作製した.このマウスの解析から、RabGDIαは、Rab3を不活性型に維持し、Rab3によるシナプス小胞輸送の過度の促進を抑制して神経の過度の興奮を抑える作用を有することを明らかにした。4.RhoとRabファミリーの脇調的作用:私共は、RhoとRabファミリーが脇調的に作用し、CadherinやHGF受容体(c-Met)を含む小胞の輸送を制御して細胞の運動や接着を制御していることを明らかにした。また、Rsb11の標的蛋白質であるRabphin-11を見い出し、Rab11-Rabphilin11系が細胞運動に関与することを示した。海外研究分担者との共同研究という形で論文は発表できなかったが、Schuhlman博士やTamanoi博士との研究打ち合わせや彼等の直接の研究技術指導により、本年度の研究は上記のように予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。
血管内皮細胞において重金属相互作用を担う責任分子と機構の解明

カドミウムは現在も環境を汚染している重金属であり,血管病変発症・進展の危険因子である。血管病変の発症には血管内腔を一層で覆っている内皮細胞の機能障害が重要である。一方,食品中には亜鉛,鉛,マンガンなど重金属が共存している。カドミウムによる血管病変発症・進展をより現実的に理解するために,重金属相互作用による毒性の修飾とその機構解明は重要課題であるが,その詳細については十分に明らかになっていない。本研究の目的は,血管内皮細胞に対する細胞毒性を指標として,カドミウムと他の重金属との相互作用様式を確定するとともに,その相互作用を担う責任分子と機構を解明することである。
液中グロー放電法による世界最小ステンレス合金ナノボールの創製

ステンレス合金のナノボール(ナノメートルサイズの球状粒子)に関して,申請者らが開発した液中グロー放電法を利用して極小化ナノボールを作製するための基礎技術を確立し,最小のステンレス合金ナノボールを得た。また、このステンレス合金ナノボールがデバイス化への応用面の期待ができる光触媒効果を有することを見出した。(1)近年,工業製品においてエネルギーの効率化やより高度な機能を追求する動きが高まっており,新しい機能性材料の開発が望まれている。その中でも10nm以下のシングルナノ粒子は,融点の低下や高い触媒作用など特異物性を有すること従来から知られており,素のバルク材料の物性とは異なる性質を持つためにその可能性に注目が集まっており、中でも10nm未満(シングルナノ)の粒径を有し製造後の性状安定性に優れた合金の球状ナノ粒子を安定的に製造,分級回収することが求められていた。(2)本研究では,申請代表者らがすでに独自開発を行った液中プラズマ放電の手法(「導体微粒子を製造する方法」,出願人北海道大学特願2007-034698、PCT Int. Appl. (2008)(WO 2008099618 A1 20080821))を基礎に微小で高品質なステンレス合金ナノボールを量産するための基礎技術開発を行なった。そこで、本研究では、ステンレス合金のナノボール(ナノメートルサイズの球状粒子)に着目し、申請者らが開発した液中グロー放電法を利用して極めて小さなナノボール作製するための基礎技術を確立すると共に、ナノボールを効率よく作り出すメカニズムを解明し、ナノボール合金設計・機能評価を行うことを目的とした。極小ステンレス合金のナノボール作製に関して,液中グロー放電法を利用したナノボールを作製する基礎技術の高度化をはかり,印加する電圧と磁場および電解溶液を変えることにより作られるナノボールの粒径分布を制御することを可能にした。これにより粒径23nmの世界最小のステンレス合金ナノボールを得ることができた。ステンレス合金のナノボール(ナノメートルサイズの球状粒子)に関して,申請者らが開発した液中グロー放電法を利用して極小ナノボール化作製するための基礎技術を確立し,最小のステンレス合金のナノボール作りに挑戦する.これには磁場を用いたプラズマの制御法ならびに高電圧化により,平均サイズの最小化に加えて,分級を行いながら実施する.本研究により,グリーンナノテクとして低エネルギー・低コストの新たな高機能ステンレス材の開発などが見えてくる.液中放電による金属のナノボール作製法をより応用範囲の広いステンレス鋼に適用することにより,工学的な生産性を見据えた研究展開を行い,触媒,創薬,電子材料といった環境・エネルギー材料分野への新たな高機能化鉄鋼材料開発をもたらすことが期待できる.・磁場印加によるステンレス合金ナノボール作製:各種ステンレス鋼材料を出発原料として準備し,棒状試料(0.5-3mm径)に加工したのち, K2CO3を添加した水溶液中でグロー放電を行いナノボールの作製を行った。・分級・サイズ分布評価・電子顕微鏡観察:生成したステンレスナノボールの評価はFE-SEMによる表面形状評価,同時にEDS装置による濃度分析評価を行った.また、ナノトラック粒度分布測定装置により、粒度分布を測定した。・ナノボールの機能評価:今年度は作製したステンレスナノボールの光機能特性を調査を実施した.これにより、UV光照射による光触媒効果を確認することができ、次のステップへの大きな手掛かりが得られた。当初計画に基づき、順調に研究を進めている。また、ステンレス合金ナノボールの光機能特性に関して、光触媒効果などの効果があることが判明した。これにより、デバイス化への応用面の期待ができる。・磁場印加によるステンレス合金ナノボール作製:前年度に引きつづき,磁場印加の実験を行う.高速カメラ撮影と電流値データの揺らぎ解析のためアバランシェ放電の発生頻度との相関をノイズ解析よりFFTパワースペクトラム解析評価する.・分級・サイズ分布評価・電子顕微鏡観察:前年度の評価に加えて,得られたTEM,SEM像について画像処理を利用した粒度分布測定を用いて平均サイズ分布(大きさと頻度)について調査を行う.・ナノボールの機能評価:得られたナノボールを用いて,デバイスの開発を行うために,半導体等の基板表面の上に,ステンレス合金ナノボールを塗布し,触媒デバイス(フミン等の分解除去テスト)ならびに発光デバイス(光ミネッセンス特性の評価)の開発基礎テストを行い.特許,論文発表,状況に応じてプレスリリース等による成果発表を行う.本年度は研究補助員の雇用費が当初予定より少額になったため残金が発生したが、これを次年度に繰り越しとして、研究補助員の雇用費にあて、当該研究の推進を予定である。その他、消耗品費、また英文校正、論文投稿、学会発表の予算支出を予定している。
リポソームを用いる抗原,抗体および補体定量への接触分析の応用

G【A_1】抗原を保持したリポソームベシクル(内水層:モリブデン酸ナトリウム)に、抗体および補体を作用させてベシクルを割り、内水層をリポソーム懸濁液に流出させ、流れ分析の流路中に注入する。リポソームから流出したモリブデン酸イオンは、流路を流れる反応混液中で、【H_2】【O_2】+2【I^-】+2【H^+】【→!Mo(VI)】2【I_2】+2【H_2】Oの反応の触媒として働き、ヨウ化物イオンを減少させる。一定時間後に、流路の終端にあるヨウ化物イオン電極でヨウ化物イオン濃度を測定する。ヨウ化物イオン濃度の減少は、電位のピークとなって示され、ピーク高を測定することによって、抗原、抗体および補体が定量できる。1、反応混液組成の決定:流れ分析でリポソームから流出したモリブデン酸イオンを高感度に定量するための条件を検討したところ、過酸化水素、ヨウ化物イオン、塩酸の最適値は2.5mM,0.05mMおよび0.05Mであった。2.補体濃度の影響:ジセチルフォスファチジルコリン:コレステロール:G【A_1】抗原が1:1:0.08のリポソームを用い、αG【A_1】抗体を一定として補体濃度について検討したところ、補体の希釈系列X16X256で検量線は直線となり、この濃度範囲の補体の定量が可能である。3.抗体濃度の影響:うさぎ抗G【A_1】抗体を【10^2】【10^5】の希釈系列で補体(X64)と供に添加したところ、【10^4】からモリブデン酸イオンのリリースによるピークが始まり、【10^2】倍で25%マーカーリリースとなった。本法で【10^4】【10^3】の抗G【A_1】抗体の定量が可能であることがわかった。4.G【A_1】エピトープ:シセチルフォスファチジルコリンに対するG【A_1】抗原の添加比を0.02から0.2まで変化させ(αG【A_1】:【10^3】,補体X64)で実験を行ったところ、G【A_1】抗体の添加比が0.1を越えると、接触反応が妨害を受ける。また添加比が0.02では、抗原・抗体・補体反応が不安定で、接触反応によるピークが不安定でかつ再現性が悪かった。G【A_1】抗原は0.050.1の間で良い結果が得られることがわかった。
情報機器が内蔵する位置決めサーボ機構の統合最適設計

情報機器が内蔵する位置決め制御機構の高性能化を達成するために、構造系と制御系の統合設計法の提案および開発を行った。本方法は、遺伝的アルゴリズムと感度解析法を用いた非線形計画法に基づいており、制御性を考慮した構造最適化および構造系と制御系の統合最適化の両方を実行可能である。まず、位置決め時に構造系が発生する残留振動により追従性能が劣化するのを防止するために、構造系とH^∞制御系の統合最適設計法を開発した。ここでは、遺伝的アルゴリズムを用いて構造物形状と制御則、さらにセンサーおよびアクチュエーターの配置最適化を行うことにより、高性能な周波数整形を可能にし、位置決め制御系における残留振動問題を改善した。構造系とサーボ系の統合最適化では、周波数領域と時間領域の性能に対応するために2種類のサーボ系を導入した。すなわち、1入出力系に対して用いられる動的補償器と、多入力系に対して設計されるLQI制御系である。サーボ性を考慮した構造最適化では、制御対象の固有振動数と固有モードをサーボに適した周波数応答が実現されるように最適化する方法を開発した。構造系と動的補償器の統合最適化では、着目する全てのモードの安定性を維持しながら、サーボ性能を左右する主要な極の配置を最適化し、閉ループ系に要求される周波数特性を達成することを可能にした。構造系とLQI制御系の統合最適化では、閉ループ系の安定性を維持しながら、目標入力に対する時間領域での高速追従性能を実現した。本方法を簡易構造の位置決めデバイスの開発に適用した結果、手法の有効性と実用性が確認された。
抗癌剤の奏効率向上を目指した膵癌新規治療標的へのアプローチ

ヒト膵癌細胞株を用いてメタボローム解析を行い、ゲムシタビンの標的としてCTP合成酵素が関与している可能性が考えられた。さらに、CTP合成酵素はゲムシタビン感受性にも関与していることが示唆された。また、薬剤耐性に関与している内皮-間葉転換に着目し、内皮系細胞および間葉系細胞をメタボローム解析したところ、数種類の代謝物に変化が見られた。これらの代謝物がEMTやゲムシタビン耐性と関連があるかも知れない。膵癌治療の第一選択薬として用いられるゲムシタビンの詳細な作用機序解明を明らかにするためにゲムシタビン曝露後のヒト膵癌細胞株Miapaca-2のメタボローム解析を行った。その結果、ゲムシタビンの主要な作用箇所である核酸代謝について、リボヌクレオチド還元酵素阻害によるdCTPの減少が観察された。加えて、CTPの減少およびUTPの上昇も観察されたことから、ゲムシタビンの標的としてUTPからCTPへの反応を触媒するCTP合成酵素の関与が示唆された。また、リボヌクレオチド還元酵素およびCTP合成酵素特異的阻害剤であるHydroxyureaおよび3-deazauridineを用いて、メタボローム解析を行ったところ、3-deazauridineとゲムシタビンの核酸代謝阻害様式が極めて類似していたことから、ゲムシタビンの標的は、CTP合成酵素であることが確認された。さらに、ゲムシタビン感受性の異なる2種類のヒト膵癌細胞株(Miapaca-2およびAsPC-1)のCTP合成酵素発現量を確認したところ、CTP合成酵素はゲムシタビン感受性にも関与していることが示唆された。次に、8種類のヒト膵癌細胞株のE-カドヘリンおよびビメンチンの発現をウエスタンブロッティングで確認し、内皮系および間葉系細胞4種類ずつに分類し、メタボローム解析を行った。その結果、内皮系細胞群および間葉系細胞群においては、それぞれイノシンおよびアデニンのレベルが高いことが観察された。そのため、イノシンやアデニンが内皮系および間葉系細胞特性の維持に関与している可能性が考えられた。内皮ー間葉系転換(EMT)は薬剤耐性を引き起こすことが知られているため、これらの代謝物がゲムシタビンやその他の抗癌剤耐性に関与している可能性がある。さらに、ゲムシタビンの奏効率を向上させるためには、これらの代謝物の存在も考慮する必要があるかも知れない。本研究では膵癌治療の奏効率向上を目的として、メタボローム解析手法等を用いたヒト膵癌細胞における代謝拮抗剤ゲムシタビンの作用機序およびゲムシタビン耐性メカニズムの解明を試みた。作用機序解明に関する検討では、膵癌研究において汎用されているヒト膵癌細胞株Miapacap-2を用いてゲムシタビン曝露後の細胞内代謝応答を調べた。その結果、細胞内に取り込まれたゲムシタビンは速やかに3リン酸化体までリン酸化を受けた。核酸代謝においては、ゲムシタビンは膵癌細胞内でCTP合成酵素およびリボヌクレオチド還元酵素を阻害することが示唆された。各酵素の阻害剤曝露の結果、CTP合成酵素阻害剤曝露後の核酸代謝変動がゲムシタビンのそれと類似していたことから、ゲムシタビンはピリミジン代謝において主にCTP合成酵素を阻害することを初めて見出した。さらに、核酸代謝阻害に対する細胞応答として解糖系およびTCAサイクル活性の上昇が観察された。ゲムシタビン耐性に関する検討では、Miapaca-2および、よりゲムシタビン感受性の高いAsPC-1にゲムシタビンを曝露した後のゲムシタビン代謝物および核酸代謝変動について調べた。ゲムシタビン代謝において、Miapaca-2ではAsPC-1よりゲムシタビンリン酸化体量が低いことが明らかとなった。この原因の1つにリン酸化酵素デオキシシチジンキナーゼの発現量が関与していることが示唆された。また、ゲムシタビンのCTP合成酵素阻害において、Miapaca-2の方がその阻害程度が小さいことが示唆され、原因としてMiapaca-2におけるCTP合成酵素発現量がAsPC-1より高いことが挙げられた。このように本研究では、初めてゲムシタビンの膵癌細胞内での作用機序を明らかにし、耐性のメカニズムについての知見を得ることに成功した。膵癌細胞におけるゲムシタビンの作用機序を明らかにすることは、ゲムシタビン耐性のメカニズム解明につながり、それらの情報をもとに膵癌治療の奏効率向上にもつながる。そのため、平成23年度の研究計画ではヒト膵癌細胞におけるゲムシタビンの作用機序を明らかにすることに比重をおいた。始めに、メタボローム解析手法を用いたゲムシタビン測定系を確立し、最終的にゲムシタビン曝露後のゲムシタビン代謝物およびその他の細胞内代謝物を網羅的に測定することに成功した。その結果、膵癌細胞内におけるゲムシタビンの作用機序を明らかにすることが出来た。さらに、複数の細胞を用いた検討からゲムシタビン感受性に関与している代謝応答を見出し、ゲムシタビン耐性メカニズム解明のために有用な情報を得た。

上皮間葉転換(EMT)が膵癌のゲムシタビン耐性に関与していることが知られていることから、上皮細胞および間葉系細胞の代謝物プロファイルの違いを調べることでゲムシタビン耐性メカニズムを明らかにすることが出来ると思われる。現在、約10種類の膵癌細胞の代謝物プロファイルを測定中であるため、全体を通して現在までの研究計画はおおむね順調に進んでいると考えられる。今後は、まず始めにすでに入手済みの約10種類の膵癌細胞株のゲムシタビン感受性を調べる。次いで、これらの細胞株に含まれる代謝物網羅的に調べそれらの値を細胞間で比較する。感受性と相関のある代謝物あるいは代謝経路を探索する。また、感受性の低い耐性細胞株のモデルとして当教室で作成したゲムシタビン耐性株も比較対象に加える。これまでの検討で、数種類の膵癌細胞においてゲムシタビンは同様の作用機序を示すことが確認されたものの、ゲムシタビン曝露に対する細胞応答とゲムシタビン感受性に関係については明らかにされていない。そこで、上述した感受性の異なる約10種類の膵癌細胞株にそれぞれゲムシタビンを曝露し、ゲムシタビン代謝物、核酸、アミノ酸など細胞内代謝物の応答を調べることでゲムシタビン感受性因子の探索を行うと同時に、ゲムシタビン耐性メカニズムについて考察する。さらに、これら約10種類の細胞株をEMTマーカーであるE-カドヘリンとビメンチンを用いて上皮細胞と間葉系細胞に分類し、それぞれの細胞内代謝物やゲムシタビン曝露後の細胞応答の違いから、EMTによるゲムシタビン耐性のメカニズムについても考察する。今後の研究費は、主に細胞培養関連試薬(培地や血清)や培養関連器具(フラスコ類)、抗体、一般試薬および溶媒など消耗品の購入にあてる予定である。また、一部国内学会や研究打ち合わせ、論文投稿料などにあてる予定である。