hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多学年参加型教育プログラムとＩＴ遠隔指導による，新たな地域医療教育手法の開発

本研究では、地域医療に関する新たな教育モデルを提案することを目的とし、総合診療、在宅診療、遠隔診療を題材に、多学年医学生が参加する教育セミナーを試験的に実施した。低学年生は患者役、高学年生は医師役の模擬診療とOSCEを行ったが、低学年生の患者目線での評価と、高学年生の自己評価、教育者からの第三者評価とフィードバックは、各々の立場における地域医療に関する学習意欲を高めた事が明らかになった。低学年学生の評価には偏りが生じやすいが、多視点ビデオカメラ撮影による新たな動画評価を用いて補正したところ、受講者に対してより正確な評価が可能となり、より有効なフィードバックが可能となった。本研究は,地域医療教育に関して新たな教育プログラムを提案できることを主な目的として,多学年参加型の医学教育的ワークショップ・セミナーを定期開催して,その教育効果と有用性を測定するとともに,ITネットワーク技術を活用した多施設間の遠隔教育システムを導入し,上記と組み合わせることで,さらに有効性が高まるかどうかを測定するものである.初年度に本研究で用いる地域医療教育に関する教育効果を測定するポートフォリオ形式の評価法を作成した.しかし,平成25年度に本法による教育効果測定を行ったところ,下記の点で問題が見つかった.本研究では多学年参加型の医学教育的ワークショップ・セミナーを開催することが主な特徴となっており,低学年が患者側の模擬患者を演じながら,患者側の視点で医師役の高学年へのfeedbackを行うものである.高学年学生にとっては,患者診療の実技OSCEを行うことで,患者側からの意見を得られる利点が大きい.しかし,平成25年度のセミナーのプレ開催では,低学年学生が評価測定に慣れていない為に,高学年学生へのfeedbackに足りるような客観的評価が困難であることが判明した.これを解消するため,評価者を複数にするなどの工夫を行ったが,実技試験の際に行うリアルタイム評価のみでは評価が一定せず,評価者そのものに対する質的評価も難しいことが分かった.よって,OSCEを複数のカメラで動画記録し,多視点カメラ映像による録画を行うことにした.これにより,OSCE内容を,複数の評価者(低学年学生,指導医師,指導コメディカルスタッフなど)で同一条件で評価が可能となった.平成26年度中に上記の「4視点からの同時録画による実技試験システムを利用した多学年参加型教育ワークショップ・セミナーを本開催し,教育効果測定と評価方法の妥当性の検討を行う予定である.本研究は,地域医療教育に関して新たな教育プログラムを提案できることを主な目的として,多学年参加型の医学教育的ワークショップ・セミナーを定期開催して,その教育効果と有用性を測定するとともに,ITネットワーク技術を活用した多施設間の遠隔教育システムを導入し,上記と組み合わせることで,さらに有効性が高まるかどうかを測定するものである.まず,第1に本研究で用いる地域医療教育に関する教育効果を測定するための準備を行った.協力市中病院医師および医学部学生の一部にアンケート調査を行い,地域医療に関して卒業までに理解しておくべき到達目標を抽出し,それをコンピテンスとして設定した.次に,到達目標をもとに一般目標(GIO)と経験目標(SBOs)を設定し,各々の項目について評価方法と時期を決定するとともに,数値化が可能なものについては評定尺度の作成を行った.それらを踏まえて,被検者である多学年医学生それぞれに対して,通年で使用できるポートフォリオ形式の評価フォルダを作成した.その中には学生間の相互的ピア評価項目や指導教員からの他己評価項目を盛り込み,ポートフォリオから得られるフィードバックによる教育効果も期待できるような冊子として作成を行った.また,これらの評価内容をPC上で数値化できるよう,PCソフトを用いてプログラムできるように準備した.セミナー開催時に教育効果を測定する専用PCも2台購入した.第2に,多学年参加型医学教育的ワークショップ・セミナーを地域医療の場で定期的に開催できるよう,愛知県内の市中3病院および三重県内の市中1病院を選定し,持ち回りで開催場所として使用できるように交渉し,開催協力が得られることになった.また,各病院には上記のように,ITネットワークによる遠隔教育ができる様に,3eカンファレンスシステム(多施設IT会議システム)を導入し,接続動作確認を行い,成功した.本研究は,地域医療教育に関して新たな教育プログラムを提案できることを主な目的として,多学年参加型の医学教育的ワークショップ・セミナーを開始し,その教育効果と有用性を測定するとともに,ITネットワーク技術を用いた多施設間の遠隔教育システムを導入し,上記を組み合わせることで,さらに有効性が高まるかどうかを測定するものである。初年度に,本研究で用いる教育効果測定用のポートフォリオ形式の評価法を作成した。本教育システムでは,受講者を中心に,多職種あるいは多学年学生からの360°評価を特徴とするが,平成25年度に試用した際には,評価者のばらつきにより評価が一定しないなどの問題点が見つかった。このため,これを補うために,シナリオシミュレーションによるOSCEを多視点カメラ映像により録画し,振り返り視聴して,評価を行うシステムに改良したところ,同一条件での評価が可能となった。平成26年度中に本システム「多視点からの同時録画による実技試験システムを利用した多学年参加型教育ワークショップセミナー」を開催する予定であったが,下記の遠隔教育システムの開発に時間を要したため,平成27年度に開催を延期している。(2回の開催予定で,1回はすでに平成27年4月11日に開催済みである。)平成26年度には,ITネットワークを用いた遠隔医学教育手法の開発を手掛け,2つのシステムを試用して,その効果を比較しシステムを選択した。可搬性の高いシステムと,専用回線を用いた高解像度の映像相互配信が可能なシステムを比較した。

後者は可搬性には乏しく,高価であるが,受講者からのアンケート調査により,可搬性よりも,より安定で高解像度の映像配信を選択した方が,その導入効果が高いことが確認された。平成27年度に後者を用い,教育効果測定に応用する予定である。本研究は、地域医療教育に関して新たな教育プログラムを提案できることを主な目的として、多学年参加型の医学教育的ワークショップ・セミナーを定期開催して、その教育効果と有用性を測定するとともに、ITネットワーク技術を活用した多施設間の遠隔教育システムを導入し、上記と組み合わせることで、さらに有効性が高まるかどうかを測定するものである。初年度に本研究で用いる地域医療教育に関する教育効果を測定するポートフォリオ形式の評価法を作成した。本研究で行われる医学教育的ワークショップ・セミナーは、低学年学生が模擬患者を演じながら、患者視点で医師役である高学年学生の模擬診療に対するfeedbackを行うものである。高学年学生にとっては、患者診療の実技OSCEを行うことで、患者側からの意見を得られる利点が大きかったが、平成25年度に本法による教育効果測定を行ったものの、低学年学生の客観的評価標準化が困難で、評価者そのものに対する質的評価も検証が難しいことが分かった。このため、OSCEを簡易カメラで録画を平行して行い、検証が可能となるよう工夫した。これにより、OSCE内容を検証追加できることが可能となり、複数の評価者(低学年学生、指導医師、指導コメディカルスタッフなど)で一定の統一した評価が可能となった。平成26年度には、多視点に配置した簡易カメラによる同時録画を行って、OSCEを行ったところ、患者目線、医師目線、第3者目線などからの評価が比較的簡便に行うことができ、実用に耐えうるものと確認できた。今後、地域医学教育において、多学年学生が参加する、多視点カメラ動画併用の診療シミュレーション教育が有効であることが確認でき、応用が期待できるものと考える。ITネットワークを連携教育病院に接続し、OSCEの課題を補うような講義を定期的に行うことで、教育効果をさらに強調することができることも明らかになった。本研究では、地域医療に関する新たな教育モデルを提案することを目的とし、総合診療、在宅診療、遠隔診療を題材に、多学年医学生が参加する教育セミナーを試験的に実施した。低学年生は患者役、高学年生は医師役の模擬診療とOSCEを行ったが、低学年生の患者目線での評価と、高学年生の自己評価、教育者からの第三者評価とフィードバックは、各々の立場における地域医療に関する学習意欲を高めた事が明らかになった。低学年学生の評価には偏りが生じやすいが、多視点ビデオカメラ撮影による新たな動画評価を用いて補正したところ、受講者に対してより正確な評価が可能となり、より有効なフィードバックが可能となった。
レーザの創傷治癒促進効果

我々は,レーザーを照射された生活歯髄に,第一象牙質様の硬組織が形成されることを実験病理学的に明らかにし,一方では,レーザ照射による歯原性腫瘍の実験発生の研究を通じて,発生過程にある歯胚にレーザを照射すると,セメント質の増殖性変化がもたらされることを明らかにしてきた.これらの経験は,レーザが生体の間葉系組織,特に,硬組織に対して増殖性変化を惹起する生物学的効果があることを示唆している.本研究課題では,このようなレーザの生物学的作用を創傷治癒(特に抜歯窩,骨折などの骨病変)に応用するための基礎的研究を行うことを目的とする.すなわち,動物実験により,レーザ照射による骨病変の病理組織学変化を経時的に検索し,レーザの創傷治癒に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした.創傷モデルはラットの抜歯窩.レーザは連続波Nd:YAGレーザとGa-Al-As半導体レーザとを用いた.ラットの下顎第二臼歯を抜歯し実験群と対照群とに分ける.実験群はレーザ照射群で, Nd:YAGレーザ(10W, spot sizeφ2.5mm 0.5秒間照射)ないし半導体レーザ(30mW, spot sizeφ2.5mm, 3分間照射)を照射し,実験群と対照群を経時的に屠殺し,顎骨を切り出して通法にしたがって脱灰標本を作成し,病理組織学的に観察したところ以下のような結果を得た.すなわち, Nd:YAGレーザ照射群では,照射エネルギー密度の設定が高いためにレーザ照射群では創傷の治癒がかえって遅延する傾向(特に再上皮化の障害)があった.一方,半導体レーザ照射群では,対照群に比較して抜歯窩の治癒の過程において,明らかな形態学的差異を認めず,肉芽組織の誘導から再上皮化,新生骨の形成に至るまで時間的にもほぼ同じ経過を示した.現在,半導体レーザを用いて,照射条件を変えて創傷治癒過程を変動させるレーザ用量の検索と,あわせて抜歯窩の肉芽組織の生化学的分析(特にコラーゲン線維の分析)による比較検討を行っている.我々は,レーザーを照射された生活歯髄に,第一象牙質様の硬組織が形成されることを実験病理学的に明らかにし,一方では,レーザ照射による歯原性腫瘍の実験発生の研究を通じて,発生過程にある歯胚にレーザを照射すると,セメント質の増殖性変化がもたらされることを明らかにしてきた.これらの経験は,レーザが生体の間葉系組織,特に,硬組織に対して増殖性変化を惹起する生物学的効果があることを示唆している.本研究課題では,このようなレーザの生物学的作用を創傷治癒(特に抜歯窩,骨折などの骨病変)に応用するための基礎的研究を行うことを目的とする.すなわち,動物実験により,レーザ照射による骨病変の病理組織学変化を経時的に検索し,レーザの創傷治癒に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした.創傷モデルはラットの抜歯窩.レーザは連続波Nd:YAGレーザとGa-Al-As半導体レーザとを用いた.ラットの下顎第二臼歯を抜歯し実験群と対照群とに分ける.実験群はレーザ照射群で, Nd:YAGレーザ(10W, spot sizeφ2.5mm 0.5秒間照射)ないし半導体レーザ(30mW, spot sizeφ2.5mm, 3分間照射)を照射し,実験群と対照群を経時的に屠殺し,顎骨を切り出して通法にしたがって脱灰標本を作成し,病理組織学的に観察したところ以下のような結果を得た.すなわち, Nd:YAGレーザ照射群では,照射エネルギー密度の設定が高いためにレーザ照射群では創傷の治癒がかえって遅延する傾向(特に再上皮化の障害)があった.一方,半導体レーザ照射群では,対照群に比較して抜歯窩の治癒の過程において,明らかな形態学的差異を認めず,肉芽組織の誘導から再上皮化,新生骨の形成に至るまで時間的にもほぼ同じ経過を示した.現在,半導体レーザを用いて,照射条件を変えて創傷治癒過程を変動させるレーザ用量の検索と,あわせて抜歯窩の肉芽組織の生化学的分析(特にコラーゲン線維の分析)による比較検討を行っている.
実験近視モデルヒヨコ網膜において変化する遺伝子群の発見と解析

目的:近視モデルヒヨコを用いて、形態遮断による眼球発育に関係する遺伝子の発現の変化と網膜前駆細胞に与える影響を解析する。対象と方法:生直後のヒヨコの右眼に不透明なゴーグルを装着した状態で、3日、7日、14日間飼育することを行った。遮蔽を行わないヒヨコを対照とし、遮蔽後3日、7日、14日において各々の網膜からmRNAを抽出した。得られたmRNAをcDNAに変換した後、様々な特異的プライマーを用いて判定量的RT-PCR法にて解析を行った。変化のあった遺伝子についてWestern blot解析法を用いて蛋白レベルの解析を行った。また、遮蔽3日後に網膜を摘出し細胞に分離し、neurosphere法を用いた培養を施行し、形成されたneurosphere数を対照眼と比較した。結果:遮蔽眼の眼軸長は非遮蔽眼に比較して有意に延長しており、特に遮蔽3日、7日において著明であった。判定量的RT-PCRでは、BMP-2のみ遮蔽3日、7日で有意に非遮蔽眼に比較して発現の低下を示した。Western blot法にては、遮蔽7日、14日において有意な発現の低下が確認された。また、neurosphere法にて遮蔽眼のneurosphere形成能は非遮蔽眼に対し有意に増加しており後極部網膜においても顕著であった。結論:BMP-2は眼球発育においてTGF-beta 2やsonic hedgehogなどの形態を規定する遺伝子と関連して作用する遺伝子である。今回の結果は、BMP-2が近視の形成の重要な因子の一つである可能性を示唆している。近視モデル眼においてneurosphere形成能が増加していた事実は、形態遮断が生後の網膜前駆細胞に影響を及ぼすという可能性を示唆しており、今後の研究にてBMP-2の発現と網膜前駆細胞の関係につき検討する予定である。
アメリカ刑事訴訟における有罪答弁の事実的基礎に関する審査制度の研究

(1)2003年3月には、カナダにおける有罪答弁の受理手続を傍聴するとともに、担当判事との意見交換を行った。カナダ刑法は2002年9月に改正されており、有罪答弁の受理手続がより厳密となっていた(特に任意性の調査)のみならず、実務においては、アメリカ連邦刑事訴訟規則と類似して、「実体的正当性に関する事実的裏付け(response to the facts of substantially correct)」の吟味がなされていることを確認できたのは大きな成果であった。(2)アメリカとカナダにおける有罪答弁制度を調査したのち、2003年9月には、イギリスの有罪答弁制度の調査を行った。ロンドンの郊外にあるスナレスブロック刑事裁判所(Snares brook Crown Court)におけるとくにケネディ裁判官(H. H. J. William Kennedy)の有罪答弁受理手続を傍聴した。裁判官の強い訴訟指揮が際だった手続であることに強い印象を受けた。また、事前に質問表を提出しておいたので、傍聴の前後にケネディ裁判官から、質問表に対する解答を頂いた。そこでは、とくにアメリカ法におけるような死刑を逃れるための有罪答弁(いわゆるAlford Plea)に相当する事例あるいは議論がイギリスにあるかとの質問に対して、そのような答弁はありえないし、経験したこともないし、理解もできないとの解答があったことが参考になった。アメリカ法におけるような「取引」形態はイギリス法にはありえないことが確認できた。(3)論文として、「有罪答弁の事実的基礎-いわゆるアルフォード・プリーをめぐって-」において、被告人が有罪答弁を行いつつ、「自分は無実である」と主張する事例について、その答弁を有効と認めた1970年のNorth Carolina v. Alford事件を検討し、そこでの「「事実的基礎(factual basis)」の意義について考察した。(1)アメリカ法におけるアレインメント制度においては、今日、有罪答弁に「事実的基礎(factual basis)」を要求する制度が一般的となっている。有罪答弁が被告人の自己決定的要素を含むものであるとしても、そこに事実的裏付けを要求することで、真実主義の要請をも満たそうとする制度といえる。(2)裁判官による事実的基礎の審査がどのように実施され、どの程度厳密な有罪答弁の証拠的裏付けを吟味しているか。このような問題意識でアメリカ法を研究した日本の論文はほとんど見あたらない。アメリカ法を単純に被告人の自己決定に基づく「ラフ・ジャスティス」と評価して、これを拒否する態度は学問的な態度とはいえない。アメリカ法の実態とその理論を詳しく研究する必要がある。(3)そこで、一方において、そもそもアメリカ法の刑事司法において「真実」がどのような地位を占めているのか、そこではドイツ法流の「実体的真実主義」という考え方は全く拒否されているのかを改めて研究してみる必要がある。「実体的真実主義の相対性」の論文では、この問題を考察し、そもそもデュー・プロセスという考え方も、また当事者主義という考え方も、決して真実主義とは無関係なものではないということを確認した。(4)他方において、アレインメント手続の実際を観察してみることも必要であると考え、「有罪答弁の事実的基礎-ハワイ州の刑事実務を中心に-」では、有罪答弁の受理手続を観察した。そこでは、事実的基礎の確認は、被告人の権利保障のために真実の確認がなされているという新たな知見をえた。(5)このような最新の理論動向を踏まえて、その他、「刑事訴訟の基礎理論」あるいは「訴因と争点」などの論文を発表した。(1)カナダにおける有罪答弁の受理手続を傍聴するとともに、担当判事との意見交換を行った。

カナダ刑法は2002年9月に改正されており、有罪答弁の受理手続がより厳密となっていた(特に任意性の調査)のみならず、実務においては、アメリカ連邦刑事訴訟規則と類似して、「実体的正当性に関する事実的裏付け(response to the facts of substantially correct)」の吟味がなされていることを確認できたのは大きな成果であった。(2)アメリカとカナダにおける有罪答弁制度を調査したのち、イギリスの有罪答弁制度の調査を行った。ロンドンの郊外にあるスナレスブロック刑事裁判所(Snaresbrook Crown Court)におけるとくにケネディ裁判官(H.H.J.William Kennedy)の有罪答弁受理手続を傍聴した。裁判官の強い訴訟指揮が際だった手続であることに強い印象を受けた。また、事前に質問表を提出しておいたので、傍聴の前後にケネディ裁判官から、質問表に対する解答を頂いた。そこでは、とくにアメリカ法におけるような死刑を逃れるための有罪答弁(いわゆるAlford Plea)に相当する事例あるいは議論がイギリスにあるかとの質問に対して、そのような答弁はありえないし、経験したこともないし、理解もできないとの解答があったことが参考になった。アメリカ法におけるような「取引」形態はイギリス法にはありえないことが確認できた。(3)論文として、「有罪答弁の事実的基礎--いわゆるアルフォード・プリーをめぐって--」において、被告人が有罪答弁を行いつつ、「自分は無実である」と主張する事例について、その答弁を有効と認めた1970年のNorth Carolina v.Alford事件を検討し、そこでの「事実的基礎(factual basis)」の意義について考察した。
循環管理を支援する自動治療システムを臨床実用化するための研究

集中治療医学における循環管理は、患者生命予後を決する重要な高度医療であるが、最近の医師不足を背景に、医師の身体的負担は大きく、また過労が人為的ミスや医療過誤を招き、社会問題となっている。本研究は、テクノロジーを利用した自動医療システムによって、この状況の打開を目指す取り組みとして、循環動態を自動診断し、多薬剤同時投与によって自動治療するシステムの開発を、特に、その開胸下限定仕様から閉胸下適用仕様への発展に力点をおいて行い、循環不全動物(イヌ等)の循環動態を実際に正常化した。閉胸下臨床現場における循環動態の自動薬物治療システムを開発するには、まず、閉胸下において左心房圧を連続推定する方法を開発する必要がある。そこでまず、様々な循環動態(左室・右室不全等)における肺動脈圧-左心房圧関係を、コンピューターシミュレーションで調べ、この圧関係がおよそ線形一次式で近似できるがことを示した。次に、動物実験において、肺動脈圧連続値と左心房圧連続値の関係を実測し、これが実際に線形1次相関することを明らかにした。これを基に、間歇的な肺動脈楔入圧測定(スワンガンツカテーテル)より肺動脈圧-左心房圧関係を個体において求めて推定式(1次式)を決定し、肺動脈楔入圧の測定していない時間帯にはこの推定式を用いて肺動脈圧連続値から左心房圧を連続推定する論理の、左心房圧推定装置を開発した。時間経過や病態変化によって肺動脈圧-左心房圧関係が変化する可能性があるが、30分毎に肺動脈楔入圧を測定して肺動脈圧-左心房圧関係の推定式を更新した所、時間や病態変化に適応することができ、数時間に渡って推定精度を高く保持できた。一方、さらなるシステムの身体低侵襲化を図るため、スワンガンツカテーテルを用いない右心房圧からの左心房圧連則推定にも取組んだ所、左心と右心のポンプ機能の比が一定な状況では右心房圧-左心房圧の線形一次関係はおよそ一定であり、右心房圧連続値からも左心房圧を連続的に推定可能であったが、一方、左右の心ポンプ機能比が変化すると、圧関係式が変化し左心房圧推定の精度が大きく低下した。臨床現場では左右の心ポンプ機能比が変化するような病態変化があり得るため、右心房圧からではなく、肺動脈圧からの左心房圧連続推定の方が安全だと考えられた。循環動態の自動薬物治療の旧システムは、開胸下条件に限定されるという問題点がある。そこで、主に次の(1)(2)(3)の特長をもつ新システムを開発し、閉胸下臨床現場において使用可能に高めた。(1)旧システムでは、開胸下に左心房圧を実測したが、閉胸下ではこれを実測困難である。そこで、閉胸下でも可能な肺動脈楔入圧の間歇的測定、および、肺動脈圧の連続的測定(スワンガンツカテーテル)より、左心房圧を連続推定するシステムを試作した。この左心房圧推定装置を、旧システムと融合することによって、新規に閉胸下自動治療システムを試作した。(2)旧システムでは、実測した左心房圧を用いて左心ポンプ機能と有効循環血液量を診断したが、新システムでは、左心房圧推定値を用いて有効循環血液量を診断するアルゴリズムを開発した。(3)旧システムでは、実測した左心房圧を用いて左心ポンプ機能を診断し、それを制御対象としたが、新システムでは、左右の心臓ポンプ機能の線形1次相関性(左心不全では確認済)を利用して、右心ポンプ機能(右房圧-心拍出量関係から定量化)を診断し、右心ポンプ機能を制御することによって、結果として左心ポンプ機能を正常化するようなアルゴリズムを開発した。血行動態の診断治療シミュレーターを用いて、(1)(2)(3)を統合した新システムを開発し、これを用いて実際に心不全動物の治療実験を行った。その結果、旧システムと比して遜色のない、精確迅速な、循環動態の自動薬物治療を行った。次に、自動診断治療システムを実用化するために、想定される様々なシステムエラーに対して、安全装置やアラーム装置を搭載し、安全化を図った。特に、心拍出量推定のエラー、圧や薬剤投与ラインの閉塞抜去等のエラーを自動検知して対処するアルゴリズムを試作した。集中治療医学における循環管理は、専門技術と豊富な経験を必要とし、患者の生命予後を直接決定する重責を担う高度医療である。一方、医師の身体的負担や、心理的ストレスは大きい。特に地方の医療過疎地では医師不足が深刻化し、過労を背景とした人為的ミスが医療過誤を招き、社会問題となっている。研究チームは、この状況を打開するため、集中治療医学を支援する自動治療システムの開発を目指している。本研究では、循環動態の自動診断治療システムのプロトタイプ装置を開発に取り組んだ。

循環システムは、循環特性(心臓ポンプ機能・有効循環血液量・血管抵抗)が循環動態(血圧・心拍出量・心房圧)を決定する機能構造である。循環治療薬は、直接には循環特性に作用するため、循環特性反応は個体差が相対的に小さく、一方、循環動態反応はばらつきが大きく制御困難である。そこで、薬剤投与による直接の制御対象を循環特性とし、循環特性の正常化を通して循環動態を正常化するようにデザインする。まずプロトタイプとして、心不全モデル動物(イヌ)の薬物投与-循環特性応答の平均的特性を用いて治療アルゴリズムを構築し、正常から重症左心不全に至る個体差を制御によって吸収するような制御治療システムを開発した。さらに、患者個体差や病態の時間的変化に高度に対応した治療を目指して、制御工学の適応制御をシステムに組込み、その時刻の患者特性をシステム同定し、患者個人に特化した治療を行うような自動治療システムを試作した。また各種エラーに対応するためのアルゴリズム(次善治療の継続機能、アラーム機能など)を検討した。
RNAインターフェレンスを用いた分子標的筋再生療法の確立

筋芽細胞の分化・増殖を抑制するサイトカインを標的とし、その発現をRNA干渉(RNAi)技術を用いて特異的に制御する分子標的療法を開発し、長期臥床高齢者のリハビリテーションのための全く新しい筋肉の再生医療につなげることを目標とする研究を行った。このサイトカインに特異的なshort inter fering RNA (siRNA)(siC)を数種合成し、マウス筋芽細胞株に導入したところ、同遺伝子の有意な発現低下が認められ、また筋芽細胞の増殖能が亢進することが、real time RT-PCRとテトラゾリウム塩アッセイにて示された。in vivoでのsiCの効果を検討するために、マウス骨格筋へのsiRNA導入法に改変を加え、効率の向上を行った技術を用い、siCをマウス骨格筋にin vivo導入し、経時的にマウスを安楽死させ、筋肥大の指標として筋の断面積を測定した。さらに筋の収縮能の変化を評価する目的で、一定の電気パルスを与えたときの筋の収縮力を計測した。その結果、siRNAを導入しなかったマウスの筋、および非特異的siRNAを同様の手法で導入したものに比して、siCを投与した群では有意に筋断面積が増加し、このサイトカインの特異的サイレンシングにてin vivoで筋肥大が誘導できることが分かった。また収縮力がコントロールと比べて有意に増強していたことから、肥大筋が収縮能でも強まっていることが示された。また、得られた筋細胞を培養し種々のアッセイで解析することにより、さらに上記の所見をコンファームする結果が得られている。本研究の成果は、廃用性萎縮筋の肥大と増強が、サイトカインを標的とするRNAi分子標的療法にて生体内で可能なことを初めて示したものであり、長期臥床高齢者のリハビリテーションと筋の再生医療に全く新しい地平を開く可能性があるものとして期待できる。
抗不整脈薬ベプリジルの有害反応軽減法の開発

抗不整脈薬ベプリジルは優れた臨床効果を発揮する反面、QT延長に伴う致死性不整脈を来たすことがあり問題となっている。本研究では、亜ヒ酸によるQT延長に対して抑制効果を認めるα-リポ酸に着目し、α-リポ酸は、モルモットモデルにおいてべプリジルによるQT延長を用量依存的に抑制すること、心筋由来培養細胞においてべプリジルによる活性酸素種産生を抑制することを見出した。抗酸化薬α-トコフェロールにもべプリジルによるQT延長の抑制効果が認められたことから、α-リポ酸は、少なくとも一部には、抗酸化作用を介してべプリジルのQT延長を抑制すると考えられる。これまで研究代表者らは基礎研究により、α-リポ酸が急性白血病治療薬である亜ヒ酸の腎毒性や心毒性(QT延長)を予防・軽減することを見出し、その機序として抗酸化作用やキレート作用が関与することを明らかにした。そこで本研究では、基礎研究および臨床試験により、α-リポ酸がベプリジルによるQT延長を予防・軽減することができるか否かを明らかにすることを目的とする。本研究の成果は、ベプリジルの安全性を高め、多くの患者への使用を可能にすることから、不整脈治療の向上に大きく寄与するものと期待される。本年度は、まず、べプリジルによるQT延長を評価できるモルモットモデルを確立した。このモデルを用い、α-リポ酸の同時投与の効果を検討したところ、α-リポ酸はべプリジルによるQT延長を軽減しなかった。そこで、次に、α-リポ酸をべプリジルの投与開始2時間前から持続投与したところ、α-リポ酸は用量依存的にべプリジルによるQT延長を軽減した。一方、α-リポ酸はべプリジルの心拍数抑制作用は軽減しなかったことから、抗不整脈効果に対しても抑制していないことが示唆された。これらのことより、α-リポ酸はベプリジルのQT延長克服薬として期待できることが確認されたため、次年度はその機序について検討する予定である。前年度は、まず、ベプリジルによるQT延長を評価できるモルモットモデルを確立した。このモデルを用い、α-リポ酸は前投与することにより、用量依存的にベプリジルによるQT延長を軽減できることを明らかにした。一方、α-リポ酸はベプリジルの心拍数抑制作用は軽減しなかったことから、抗不整脈効果に対しても抑制していないことが示唆された。今年度は、α-リポ酸がベプリジルによるQT延長を軽減する機序を検討した。培養心筋細胞を用いた実験では、ベプリジルは細胞死を惹起することなしに活性酸素を増加させ、α-リポ酸はその活性酸素の増加を有意に抑制した。さらに、動物モデルにおいては、抗酸化作用のあるα-トコフェノールはα-リポ酸と同様にベプリジルによるQT延長を軽減した一方、キレート薬であるBALにはそのような効果は認められなかった。したがって、α-リポ酸のQT延長軽減作用は、少なくとも一部はその抗酸化作用を介してもたらされることが示唆された。これまでに、まず、ベプリジルによるQT延長を評価できるモルモットモデルを確立した。さらに、α-リポ酸がベプリジルによるQT延長を軽減する機序を検討した。

したがって、α-リポ酸のQT延長軽減作用は、少なくとも一部はその抗酸化作用を介してもたらされることが示唆された。最終年度である今年度に予定した電気生理学的研究が終了しておらず、1年間研究期間を延長することにした。抗不整脈薬ベプリジルは優れた臨床効果を発揮する反面、QT延長に伴う致死性不整脈を来たすことがあり問題となっている。これまで研究代表者らは基礎研究により、α-リポ酸が急性白血病治療薬である亜ヒ酸の腎毒性や心毒性(QT延長)を予防・軽減することを見出し、その機序として抗酸化作用やキレート作用が関与することを明らかにした。そこで本研究では、基礎研究および臨床試験により、α-リポ酸がベプリジルによるQT延長を予防・軽減することができるか否かを明らかにすることを目的とした。まず、ベプリジルによるQT延長を評価できるモルモットモデルを確立した。このモデルを用い、α-リポ酸は前投与することにより、用量依存的にベプリジルによるQT延長を軽減できることを明らかにした。一方、α-リポ酸はベプリジルの心拍数抑制作用は軽減しなかったことから、抗不整脈効果に対しても抑制していないことが示唆された。次に、α-リポ酸がベプリジルによるQT延長を軽減する機序を検討した。培養心筋細胞を用いた実験では、ベプリジルは細胞死を惹起することなしに活性酸素を増加させ、α-リポ酸はその活性酸素の増加を有意に抑制した。さらに、動物モデルにおいては、抗酸化作用のあるα-トコフェノールはα-リポ酸と同様にベプリジルによるQT延長を軽減した一方、キレート薬であるBALにはそのような効果は認められなかった。本研究の成果は、ベプリジルの安全性を高め、多くの患者への使用を可能にすることから、不整脈治療の向上に大きく寄与するものと期待される。本研究では、亜ヒ酸によるQT延長に対して抑制効果を認めるα-リポ酸に着目し、α-リポ酸は、モルモットモデルにおいてべプリジルによるQT延長を用量依存的に抑制すること、心筋由来培養細胞においてべプリジルによる活性酸素種産生を抑制することを見出した。抗酸化薬α-トコフェロールにもべプリジルによるQT延長の抑制効果が認められたことから、α-リポ酸は、少なくとも一部には、抗酸化作用を介してべプリジルのQT延長を抑制すると考えられる。動物モデルの確立ならびにα-リポ酸の効果の評価、その作用機序を明らかにするための培養細胞実験、動物実験は予定通り進んでいる。各種イオン電流におよぼすベプリジルおよびα-リポ酸の影響をパッチクランプ法により評価し、電気生理学的な視点からもα-リポ酸の作用機序と安全性を評価する。臨床薬理学当初の予定通り、各種イオン電流におよぼすベプリジルおよびα-リポ酸の影響をパッチクランプ法により評価し、電気生理学的な視点からもα-リポ酸の作用機序と安全性を評価する。動物モデルの確立ならびにα-リポ酸の効果の評価は予定通り進んでおり、その作用機序を明らかにするための動物実験および電気生理学的実験も現在進行中である。当初の予定通り、各種イオン電流におよぼすベプリジルおよびα-リポ酸の影響をパッチクランプ法により評価する研究を行っているが、年度内に研究が終了しなかったため、研究期間を1年間延長した。
論理的な思考力の育成を目指した数理教育に関する実践的研究

論理的に物事を考え問題を解決していく能力は,工学技術者として必須のものである.しかしながら,最近の学生は物事を論理的に深く考えるということを苦手とする傾向にある.本研究は,学生の論理的思考力の現状分析を進め,数理科目の中で,どのような教育方法がこの能力を高めることができるかを明らかにしていこうとしたものである.具体的には次の研究活動を行った.1.論理的思考力の定義:論理的思考力とは,物事を筋道立てて考え、話し、あるいは、記述し、考えをまとめていく能力と我々は定義した.具体的には三段論法の能力,論理的表現力,推理力そして帰納と演繹の能力である.2.論理的思考力の現状分析(1):論理的思考力の現状分析のため第1回目の調査を行つた.問題を8題準備し,各問題に関して,上記の観点から5段階評価を行った.これを下記のワークショップで発表した.3.ワークショップの開催:学外の教育機関との情報交換のため,このテーマに関するワークショップを開催した.これをワークショップ報告集としてまとめた.4.論理的思考力の現状分析(2):第2回目の調査を実施した.新しく8題の調査問題を準備し,各問題について,基礎知識・計算力,論理的表現力に関して5点法の評価を試みた.また,学生の講義での成績との相関についても調べた.詳細な調査結果を,報告書としてまとめた.最近は,論理的思考過程をたどらず記憶やパターンの認識のみで結論を導こうとする学生が増えてきている.調査においても,そのような例が散見された.この分析結果を基に,「テストの採点を厳格にする」「答案を論理的に書かせる」「深く学ぶと言う経験を積ませる」などの論理的思考力を高めるための提案がなされた.また,この研究の中で我々は,教材の改善などの実践的な目標を掲げてきた.論理を重視した教材を作ろうとする試みや,学生の論理的な表現力を育成しようとする考えは,間接的に数理教育を担当する教員に浸透してきている.論理的に物事を考え問題を解決していく能力は,工学技術者として必須のものである.しかしながら,最近の学生は物事を論理的に深く考えるということを苦手とする傾向にある.本研究は,学生の論理的思考力の現状分析を進め,数理科目の中で,どのような教育方法がこの能力を高めることができるかを明らかにしていこうとしたものである.具体的には次の研究活動を行った.1.論理的思考力の定義:論理的思考力とは,物事を筋道立てて考え、話し、あるいは、記述し、考えをまとめていく能力と我々は定義した.具体的には三段論法の能力,論理的表現力,推理力そして帰納と演繹の能力である.2.論理的思考力の現状分析(1):論理的思考力の現状分析のため第1回目の調査を行つた.問題を8題準備し,各問題に関して,上記の観点から5段階評価を行った.これを下記のワークショップで発表した.3.ワークショップの開催:学外の教育機関との情報交換のため,このテーマに関するワークショップを開催した.これをワークショップ報告集としてまとめた.4.論理的思考力の現状分析(2):第2回目の調査を実施した.新しく8題の調査問題を準備し,各問題について,基礎知識・計算力,論理的表現力に関して5点法の評価を試みた.また,学生の講義での成績との相関についても調べた.詳細な調査結果を,報告書としてまとめた.最近は,論理的思考過程をたどらず記憶やパターンの認識のみで結論を導こうとする学生が増えてきている.調査においても,そのような例が散見された.この分析結果を基に,「テストの採点を厳格にする」「答案を論理的に書かせる」「深く学ぶと言う経験を積ませる」などの論理的思考力を高めるための提案がなされた.また,この研究の中で我々は,教材の改善などの実践的な目標を掲げてきた.論理を重視した教材を作ろうとする試みや,学生の論理的な表現力を育成しようとする考えは,間接的に数理教育を担当する教員に浸透してきている.論理的に物事を考え問題解決をしていく能力は,国際化や技術革新の中にあって,工学技術者として必須のものである.一方,最近の学生は,物事を論理的に深く考えるということを苦手とする傾向にある.本研究は,学生の論理的思考力の現状分析を進め,数学,物理,化学などの数理科目の中で,どのような教育方法がこの能力を高めることができるかを明らかにして行こうとするものである.今年度行った研究は,主に次の2つにしぼられる.1.ワークショップの開催:学外の教育機関との情報交換のため,このテーマに関するワークショップを平成15年1月25日,26日に開催した.ワークショップは2部に分けて行われ,第1部では,西村和雄氏(京都大学経済研究所),岡部恒治氏(埼玉大学経済学部),浪川幸彦氏(名古屋大学大学院多元数理科学研究科)を交え,教育現場での学力低下問題を,論理的思考力という切り口で眺めた場合,どのような問題点が浮かび上がってくるかについて討議した.

また,第2部では,佐伯昭彦氏(金沢工業高等専門学校),阿蘇和寿氏(石川工業高等専門学校),公庄傭三氏(大阪清風高等学校),大谷実氏(金沢大学教育学部),鹿野健氏(山形大学教育学部)を交え,高校,高専,大学などでの考える教育の実践例の発表を通して,高校,高専,大学が,このテーマに関して連携できるかどうかについて討議した.さらに,討議内容をワークショップ報告集としてまとめた.2.数理問題の思考力に関する調査:論理的思考力をみるための問題を8題準備し,本学の2年生より希望者を52人集めて調査を行った.各問題に関して,論理的表現力,計算力,知識,推理力,直観力の観点から5段階評価を行った.分析結果をワークショップ報告集に掲載した.金沢工業大学は論理的な問題解決能力を持った技術者の育成を目指している.この目標を達成するため,平成14年度より本学の数理教育課程では,数理科目における学生の論理的思考力の分析を進め,この分析結果を基に,どのような教育方法が問題解決能力を高めることが出来るかを明らかにしようとしている.平成15年度も平成14年度に引き続き,この目標達成のために研究を行った.今年度行った研究は主の次の2つに絞られる.1.数理問題解決の考え方に関する調査:前年度の調査問題にさらに検討を加え,新しく8題の調査問題を準備し,本学の2年生より59名の希望者を募り6月に調査を実施した.各問題について,基礎知識・計算力,論理的表現力に関して5点法の評価を試みた.また,通常の試験の採点方法でも10点法で評価した.また,学生の講義での成績との相関についても調べた.論理的表現力についてはまだまだ十分とはいえない結果となっているが,我々が期待していた能力にほぼ近い結果が得られた.研究結果は第2回金沢工業大学工学基礎教育セミナーで発表した.また,「研究成果報告書」にも報告する.2.米国ローズハルマン工科大学との研究交流:米国ローズハルマン工科大学へ,青木克比古,山野剛助の2名の研究者を派遣し,この研究テーマに関して研究交流を行った.研究成果は「研究成果報告書」にまとめた.
結晶粒ナノ化によるセラミックスの異常力学特性探索

セラミック多結晶体において,結晶粒径がナノメートルオーダーにまで小さくなったとき,力学的性質がどのように変化するのかを系統的に調査し,力学的パフォーマンスに優れたセラミックスを探索することが本研究の目的である.立方晶ジルコニアでは,一般の金属材料で認められている硬さの粒径依存性のようなものは認められず,平均粒径100nmのナノ多結晶体と単結晶がほぼ同じ硬さを示すことが明らかとなった.正方晶ジルコニアでは,粒径が100nmより小さくなると応力誘起相変態が抑制され,立方晶と同じ程度の硬さを示すのに対して,それ以上の粒径では圧子直下の高応力場で誘起された相変態によって,単斜晶程度にまで硬さが減少することがわかった.単斜晶ジルコニアでは,粒径が100nmより小さくなると双晶変形が起こり難くなるため,それ以上の粒径のものよりも大きな硬さを示すことが明らかとなった.アルミナ多結晶体では,正方晶ジルコニアと同様,硬さの粒径依存性は認められなかった.多くのセラミックスの場合,特に室温では転位の独立なすべり系の数が少ない,パイエルス応力が大きいなどの理由により,結晶内の転位が粒界を通過できないため,硬さが粒径に依存しないと考察した.しかし,マグネシア多結晶体では,粒径が100nm程度にまで小さくなると一般的なミクロンレベルの多結晶体よりも約2倍の硬さを示すことが明らかとなり,セラミックスにおいても粒径制御によって力学的性質を設計できる可能性をジルコニア以外でも見つけることに成功した.さらに本研究により,理論的にセラミックスでは観察し難いと考えられていた硬さの押込み深さ依存性を新たに見つけることができた.この詳細については今後研究を継続する予定である.セラミック多結晶体において,結晶粒径がナノメートルオーダーにまで小さくなったとき,力学的性質がどのように変化するのかを系統的に調査し,力学的パフォーマンスに優れたセラミックスを探索することが本研究の目的である.立方晶ジルコニアでは,一般の金属材料で認められている硬さの粒径依存性のようなものは認められず,平均粒径100nmのナノ多結晶体と単結晶がほぼ同じ硬さを示すことが明らかとなった.正方晶ジルコニアでは,粒径が100nmより小さくなると応力誘起相変態が抑制され,立方晶と同じ程度の硬さを示すのに対して,それ以上の粒径では圧子直下の高応力場で誘起された相変態によって,単斜晶程度にまで硬さが減少することがわかった.単斜晶ジルコニアでは,粒径が100nmより小さくなると双晶変形が起こり難くなるため,それ以上の粒径のものよりも大きな硬さを示すことが明らかとなった.アルミナ多結晶体では,正方晶ジルコニアと同様,硬さの粒径依存性は認められなかった.多くのセラミックスの場合,特に室温では転位の独立なすべり系の数が少ない,パイエルス応力が大きいなどの理由により,結晶内の転位が粒界を通過できないため,硬さが粒径に依存しないと考察した.しかし,マグネシア多結晶体では,粒径が100nm程度にまで小さくなると一般的なミクロンレベルの多結晶体よりも約2倍の硬さを示すことが明らかとなり,セラミックスにおいても粒径制御によって力学的性質を設計できる可能性をジルコニア以外でも見つけることに成功した.さらに本研究により,理論的にセラミックスでは観察し難いと考えられていた硬さの押込み深さ依存性を新たに見つけることができた.この詳細については今後研究を継続する予定である.セラミック超微粉末をHIP焼結することにより、ジルコニア、アルミナ、マグネシアなど構造用酸化物セラミックスに対してナノ多結晶体の作製を試みた。その結果、ジルコニアに関しては、単斜晶、正方晶および立方晶のいずれに対しても平均結晶粒径が100nm以下の緻密なナノ多結晶体を作製できることがわかった。アルミナおよびマグネシアに関しては、緻密なナノ多結晶体が作製できていないので、最適焼結条件の探索に加えて粒成長抑制剤の探索を行っている。我々が独自に開発した高精度ナノインデンターを用い、ジルコニアナノ多結晶体に対してナノインデンテーション法を適用し、それらの力学的特性評価を行った。その際、既存のナノインデンテーション挙動解析法では正確な力学特性評価が困難であることに気が付いた。そこで、有限要素法で構築したデータベースを逆解析することによって正確な力学特性を評価できる新しいナノインデンテーション挙動解析法を開発した。降伏応力や加工硬化挙動を明確にできる複数の金属試験片に対して検証実験を行った(ナノインデンテーション逆解析の結果と1軸圧縮試験の結果を比較した)ところ、逆解析法の有効性が確認できた。この解析法により、立方晶ジルコニアの塑性変形抵抗は粒径に依存せず、押込み深さが小さくなるほど大きくなることが明らかとなった。これは幾何学的に要請される転位ループの発生によるものと考えられる。単斜晶ジルコニアの塑性変形抵抗は立方晶よりもはるかに小さく、押込み深さ依存性が認められないことがわかった。これは単斜晶ジルコニアの塑性変形が双晶変形によることに起因する。正方晶ジルコニアの塑性変形抵抗は、平均粒径が100nmより小さい場合は立方晶とほぼ同じ挙動を示し、平均粒径が100nmを超えると単斜晶のそれと一致することが明らかとなった。これは正方晶ジルコニアの応力誘起相変態によって説明できることがわかった。

セラミック多結晶体において,結晶粒径がナノメートルオーダーにまで小さくなったとき,力学的性質がどのように変化するのかを系統的に調査し,力学的パフォーマンスに優れたセラミックスを探索することが本研究の目的である.立方晶ジルコニアでは,一般の金属材料で認められている硬さの粒径依存性のようなものは認められず,平均粒径100nmのナノ多結晶体と単結晶がほぼ同じ硬さを示すことが明らかとなった.正方晶ジルコニアでは,粒径が100nmより小さくなると応力誘起相変態が抑制され,立方晶と同じ程度の硬さを示すのに対して,それ以上の粒径では圧子直下の高応力場で誘起された相変態によって,単斜晶程度にまで硬さが減少することがわかった.単斜晶ジルコニアでは,粒径が100nmより小さくなると双晶変形が起こり難くなるため,それ以上の粒径のものよりも大きな硬さを示すことが明らかとなった.アルミナ多結晶体では,正方晶ジルコニアと同様,硬さの粒径依存性は認められなかった.多くのセラミックスの場合,特に室温では転位の独立なすべり系の数が少ない,パイエルス応力が大きいなどの理由により,結晶内の転位が粒界を通過できないため,硬さが粒径に依存しないと考察した.しかし,マグネシア多結晶体では,粒径が100nm程度にまで小さくなると一般的なミクロンレベルの多結晶体よりも約2倍の硬さを示すことが明らかとなり,セラミックスにおいても粒径制御によって力学的性質を設計できる可能性をジルコニア以外でも見つけることに成功した.さらに本研究により,理論的にセラミックスでは観察し難いと考えられていた硬さの押込み深さ依存性を新たに見つけることができた.この詳細については今後研究を継続する予定である.
ラミニンα5鎖による癌細胞の基底膜浸潤メカニズムの解明

ラミニンα5鎖はβ1鎖およびγ1鎖とヘテロ三量体を形成し、ラミニン-511として成体基底膜の主要な構成分子として存在している。ラミニン-511は、正常細胞を秩序よく基底膜へ接着させ組織を安定化させている。一方、癌細胞の基底膜浸潤では足場として利用されるが、そのメカニズムは十分に解明されていない。本研究では、ラミニン-511とその細胞接着に着目し、癌細胞による基底膜形成阻害、癌細胞の基底膜への接着および運動メカニズムにアプローチした。その結果、ラミニン-511の不足は基底膜形成を抑制すること、ラミニン-511への細胞接着を弱めながら細胞運動を促進する細胞内シグナルが明らかになった。基底膜は細胞外マトリックスからなる非常に薄い膜状の構造体であり、細胞を秩序よく接着させ組織を安定化させている。癌細胞はこの特殊な基底膜を破綻させて、細胞増殖や浸潤・転移に適した細胞外環境として利用するようになる。これまでの癌細胞と基底膜の相互作用についての研究では、基底膜を代替する物質としてマウス肉腫由来のマトリゲルを使用してきた。しかしながら、マトリゲルに含まれるラミニン-111は胎児性のラミニンであり、癌細胞が相互作用することはまれである。このため、マトリゲル基底膜浸潤モデルは、必ずしも成体の基底膜浸潤を反映するものではなかった。平成26年度の研究では、三次元培養法による上皮様組織形成を促し、培養系でより成体の基底膜に近い構造の作成を試みた。その結果、上皮様組織が形成されるにつれて、ラミニンα5鎖を含む成体の基底膜に近い構造体が形成されることを見出した。さらに、この三次元培養法による上皮様組織形成の過程に、組換えラミニン-511を添加すると基底膜の形成が促されると明らかとなった。このことは、ラミニン-511が不足すると基底膜形成が破綻する可能性を示している。また、ラミニン-511の受容体であるルテランは、プロテアーゼによって切断され細胞表面から放出される。この放出されたルテランは、ラミニン-511に対する結合能を保持しており、細胞とラミニン-511の相互作用を妨げていることが明らかとなった。三次元培養法による上皮様組織形成においても、放出されたルテランがラミニン-511に結合することで、基底膜形成を抑制または破綻させる可能性が示された。これまでに、MDCK細胞を用いた三次元培養法において、ラミニンα5鎖を含む組換えラミニン-511を添加するとより成体に近い上皮様組織の基底膜の形成が促されると明らかにした。さらに、MDCK細胞を肝細胞増殖因子(HGF)で刺激したところ、ラミニンα5鎖の発現が有意に減少し、基底膜様構造が見られなくなった。このことは、ラミニン-511が不足すると基底膜形成が破綻する可能性を示した。このほか、ラミニンの細胞接着部位を合成ペプチドによって模倣し、そのペプチドを高分子膜であるキトサン膜に結合させた基底膜様の機能を持った培養基材の開発を行った。そのなかで、ラミニン由来の細胞接着ペプチドとキトサン膜の間にスペーサーを導入すると細胞接着活性が向上することを見出した。このアプローチは、ラミニンα5鎖の基底膜における癌細胞に対する機能を明らかにするのに役立つと期待される。平成27年度は、(1)単量体ラミニンα5鎖による基底膜形成への影響、および(2)ラミニンα5鎖受容体ルテランの局在が方向性のある細胞運動に与える影響の解明を行った。(1)は、ラミニンα5鎖N末端の組換え蛋白質を作製し大量調製に成功し、三次元培養系に添加することが可能になった。これまでにラミニンα5鎖N末端にも、細胞接着活性があることが明らかとなってきており、単量体ラミニンα5鎖が基底膜形成に影響するだけでなく、細胞接着を乱している可能性も示唆された。(2)は、細胞の動きに対するルテランの細胞表面における分布の偏りを捉えることを試みているが、有意な差が得られていない。ルテランは細胞内ドメインに細胞内シグナル伝達に関与する領域を持っている。このことから、ルテランの量的な変化よりも、細胞内ドメインの質的な変化が、方向性のある運動に影響する可能性も示唆された。

これまでの癌細胞と基底膜の相互作用についての研究では、基底膜を代替する物質としてマウス肉腫由来のマトリゲルを使用してきた。しかしながら、マトリゲルに含まれるラミニン-111は胎児性のラミニンであり、成体の基底膜に含まれている主要なラミニン-511ではないため、マトリゲル基底膜浸潤モデルは、必ずしも成体の基底膜浸潤を反映するものではなかった。平成28年度の研究では、ラミニン-511のα5鎖N末端にある細胞接着および自己会合に関与するアミノ酸配列の同定を試みた。その結果、血管内皮細胞の接着に関与し、さらにin vitroにおいて血管内皮細胞による管腔形成を抑制した。管腔形成の抑制はラミニン-511による自己会合の阻害を示唆したが、研究期間内に確認することはできなかった。また、ラミニン-511による癌細胞の運動促進は、発がんプロモーターであるPMAを用いることにより、細胞内のROCKを介した経路が、細胞表面受容体インテグリンα3β1のラミニン-511に対する接着を抑制することによると明らかになった。そして、ラミニン-511の特異的な受容体であるルテランに対するファージ抗体の単離に成功し、このファージ抗体がラミニン-511による癌細胞の運動促進を抑制するのを見出した。ラミニンα5鎖はβ1鎖およびγ1鎖とヘテロ三量体を形成し、ラミニン-511として成体基底膜の主要な構成分子として存在している。ラミニン-511は、正常細胞を秩序よく基底膜へ接着させ組織を安定化させている。一方、癌細胞の基底膜浸潤では足場として利用されるが、そのメカニズムは十分に解明されていない。本研究では、ラミニン-511とその細胞接着に着目し、癌細胞による基底膜形成阻害、癌細胞の基底膜への接着および運動メカニズムにアプローチした。その結果、ラミニン-511の不足は基底膜形成を抑制すること、ラミニン-511への細胞接着を弱めながら細胞運動を促進する細胞内シグナルが明らかになった。平成26年度は、(1)単量体ラミニンα5鎖による基底膜形成への影響、および(2)ラミニンα5鎖受容体ルテランの局在が方向性のある細胞運動に与える影響の解明を目的として研究を遂行した。(1)は、ラミニンα5鎖を含む組換えラミニン-511やα5鎖のN末端およびC末端部位を組換え蛋白質として調製しながら、MDCK細胞を用いた三次元培養の実験をおこなった。MDCK細胞には、いくつかの亜株があることが知られている。Cystを形成する細胞株を探索したところ、ATCCより購入したMDCK細胞がマトリゲルの中で効率よく明瞭なCystを形成することがわかった。このMDCK細胞を使用した三次元培養系に、組換えラミニン-511を添加するとCyst形成が促進されることを見出してきている。このことは、ラミニン-511が不足すると基底膜形成が破綻する可能性を示している。(2)細胞の動きに対するルテランの細胞表面における分布の偏りを捉えるために、免疫蛍光染色を行ったが、強い蛍光により有意な差が得られていない。分布の偏りおよび経時的な観察を可能にするため、SNAP-tagを導入したルテラン発現ベクターを構築し、この組換え蛋白質を発現している細胞株を樹立した。昨年度に引き続き、(1)単量体ラミニンα5鎖による基底膜形成への影響、および(2)ラミニンα5鎖受容体ルテランの局在が方向性のある細胞運動に与える影響の解明を行い、さらに(3)走化性因子のラミニンα5鎖による方向性のある細胞運動への影響の解明を目指す。(1)では、α5鎖のN末端およびC末端部位組換え蛋白質を添加することで基底膜形成の阻害を試みる。さらに、その組換え蛋白質のアミノ酸配列を網羅する合成ペプチドを作製し、基底膜形成を破綻させるアミノ酸配列の同定を試みる。