hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熟練幼稚園教師の国際比較研究ー日本・中国・アメリカー

本研究は、“熟練幼稚園教師"を日本・中国・アメリカの3カ国の国際比較から検討するもので、2点の研究課題解明を目的としている:1各国の熟練幼稚園教師の教授法の特徴は何か、2熟練幼稚園教師に至る過程に何が貢献しているのか。平成29年度から平成30年度にわたって3か国(アメリカ・日本・中国)で6人の担任教師に加え、他の熟練教師・園長・幼児教育専門家と合計107名にインタビューを行った。1各国の熟練幼稚園教師の教授法の特徴は何か:昨年度実施した日本・中国でのインタビューで“余裕が出てきた"“言葉より体を使うようになった"“子どもと向き合えるようになった"などの答えを得ていたが、今年度実施したアメリカでのインタビューでも同じようなことが聞かれた。その結果、これらの特徴は3か国で共通していることがわかった。これは各国での教授法の違いを報告していた今までの研究を踏まえると、意外な結果であると言え、面白い結果である。2熟練幼稚園教師に至る過程に何が貢献しているのか:師弟関係、現場経験、ワークショップ、園内研修など、色々な要因が挙げられた。こちらは各国で特有の傾向が見られている。中国では師弟関係・評価システムが、日本では現場経験・園内研修、アメリカではワークショップ・大学院での学び、が多くあげられた。平成30年はアメリカでのデータ収集を行い、それにより研究調査を終え、後半はデータ分析の予定であった。アメリカでのデータ収集はおおむね予定通りに進んだが、6人の担任教師のうち1人が在住のハワイでのデータ収集ができなかった。データ分析は順調に進んだ。平成31年度はアメリカハワイでのデータ収集を行う予定である。ハワイでのデータ収集と同時にデータ分析をもとに論文執筆・本執筆を進める予定である。また、研究をより広く発信するためホームページ開設を目指している。掲載する文面は準備が整ってきている。ホームページ作成のSoftwareを決定次第、掲載を開始していく予定である。本研究は、“熟練幼稚園教師"を日本・中国・アメリカの3カ国の国際比較から検討するもので、2点の研究課題解明を目的としている。1)各国の熟練幼稚園教師の教授法の特徴は何か、2)熟練幼稚園教師に至る過程に何が貢献しているのか2002年にまどか幼稚園の貝塚真理子先生・小松谷保育園の森田千里先生・Sinanlu幼稚園のWang Jain先生・Daguan幼稚園のZhangRui先生・Alhambra幼稚園のFranSmith先生・St. Timothy幼稚園のJannie Umeda先生の3カ国計6クラスのビデオ撮影・インタビュー調査を行った。15年経った現在(2017年)、6人の先生達はそれぞれの形で幼児教育に携わっている。この6人の担任教師に加え、他の熟練教師・園長・幼児教育専門家も調査対象者として、ビデオを使ったインタビュー法(“Video-cued multivocal ethnography")による調査を実施した。平成29年度は6人の先生達の中国・日本の4人の先生達と、中国・日本・アメリカの熟練教師・園長・幼児教育専門者への調査を実施した。各国のインタビュー調査で“余裕が出来てきた"“言葉より体を使うようになった"“子どもと向き合えるようになった"という答えを得た。これらの回答は、教職歴5年目から18年目という年月に伴う文化・国を超えた教師の教授法の変化を示唆している。また、その変化に何が貢献しているのか、という2番目の研究課題では、師弟関係、現場経験、ワークショップ、園内研究など、各国特有の傾向が見られている。平成29年度に、日本とアメリカでの研究調査実施予定だったが、研究協力者の都合もあり、日本と中国での研究調査実施(各国約20時間のインタビュー調査)となった。インタビューで得たデータは随時テープ起こしと翻訳作業を行った。調査の進捗状況は調査場所の変更はあったものの、概ね予定通りである。論文発表・紀要報告・学会発表の多くは、アカデミック対象なので、より広い社会への発信を目指し、ホームページ開設を予定していたが、開設に至らず、遅れている点である。

アメリカでのデータ収集はおおむね予定通りに進んだが、6人の担任教師のうち1人が在住のハワイでのデータ収集ができなかった。データ分析は順調に進んだ。平成30年度は、アメリカでの研究調査(約20時間のインタビュー)を実施予定である。平成30年度前半にて、全ての研究調査を終え、後半はデータ分析を中心とする。データ分析と同時に論文執筆・本執筆への構想を考え、論文執筆・本執筆を開始する。中間報告として成果を学会などで発表していく予定である。また、研究開始初年度よりホームページを開設する予定だったが、開設に至らなかったため、平成30年度中には開設し、研究結果を随時掲載していきたい。平成31年度はアメリカハワイでのデータ収集を行う予定である。ハワイでのデータ収集と同時にデータ分析をもとに論文執筆・本執筆を進める予定である。また、研究をより広く発信するためホームページ開設を目指している。掲載する文面は準備が整ってきている。ホームページ作成のSoftwareを決定次第、掲載を開始していく予定である。3月に参加した国際学会の会計処理が平成29年度内にできず(3月31日に帰国したため)、その分が次年度使用額へと移行となったが、現時点(5月17日)ですでに処理済みで、平成30年度の使用計画にほぼ変更はありません。3月に参加した国際学会の会計処理が平成30年度内にできず(3月31日に帰国したため)、その分が次年度使用額へと移行となった。平成31年度の使用計画にほぼ変更はありません。
芳香族結晶における励起子と輻射場の量子制御

本研究では、電気四重極子型励起子ポラリトンの伝播を介した、透過光と反射光の強度のパルス応答について、モデルをナフタレン結晶の最低エネルギー励起子(a-励起子)にとり、数値計算を行った。結晶内部では、結晶の厚さの有限性を考慮に入れると、それぞれに進行波と後退波があるため、4つのポラリトンモードが存在する。これらの分極波と透過光及び反射光の振幅は、表面と裏面でMaxwellの境界条件とPekarの付加的境界条件を用いることで決定することができる。更に入射光の振幅を畳み込んでフーリエ変換することにより、透過光と反射光のパルス光による応答を計算した。試料の厚さを10μmとし、入射光は中心エネルギー3.9024eV(励起子のk=0におけるエネルギー)、半値全幅10psのガウス型形状を持つとした。透過光強度は振動しながら減衰している。また、ポラリトンの分散関係を反映して、入射後400psの間に振動の周期が30PSから100ps弱に変化しているのが特徴的である。一方、反射光の強度は同様なプロファイルであるが、振動の周期が透過光の場合と比べおよそ半分になっている。このように、1光束のパルス光により上下のブランチが同時に励起できる程度に小さいLT分裂を持つ励起子ポラリトンであれば、このような干渉効果が観測できることが予測される。透過光強度の時間分解スペクトルも計算した。入射直後では、共鳴領域と非共鳴領域の群速度の違いにより,中心にディップを持つスペクトルとなる。しかし、時間の経過に伴い、非共鳴領域ではすぐに減衰する一方、共鳴領域のポラリトンの伝播による成分が支配的になって両側からピークが現れ、1つのピークに収束する。このように透過光の強度を時間分解することによって、ポラリトンの分散関係を直接反映するという結果が得られた。
銅(I)塩を用いる有機ケイ素化合物のカップリング反応とその機能性材料への応用

本研究は,銅(I)塩を用いることにより有機ケイ素化合物の炭素ミケイ素結合を活性化し,炭素ミ炭素結合を形成し,最終的にはそれらの反応を用いて機能性高分子材料の合成へ応用していくことを目的としている。まず,アルキニルシランと銅(I)塩の反応により,アルキニル基がケイ素から銅に移動することがわかったので,その知見を基に,パラジウム/銅(I)塩共触媒系によるアルキニルシランとアリールトリフラートとの交差カップリング反応をおこなった。この反応は末端アセチレンの保護基として多用されるトリメチルシリル基をそのまま直接的に交差カップリング反応がおこなえる点で,有機合成上有用な反応である。さらに,その有機素反応を高分子合成に応用することを検討した。二官能性のアルキニルシランと二官能性のアリールトリフラートとをモノマーとして用いて,上記の交差カップリング反応をおこなった結果,期待した高分子を合成することに成功した。合成した高分子の分光学的,物理的特性を測定した結果,その中のいくつかはエレクトロルミネセンス材料としての期待が持てる高分子であった。本研究ではケイ素から銅(I)塩へのトランスメタル化について検討し,それを利用した高分子合成反応を達成した。銅(I)塩を用いる有機ケイ素化合物の新規トランスメタル化反応により,本研究で明らかにした以外にも様々な反応が期待できるので,本研究により有機ケイ素化合物の有機合成的価値がさらに高まったとといえる。本研究は銅(I)塩を用いることにより有機ケイ素化合物の反応性を向上し,最終的にはその反応を用いて機能性材料へ応用していくことを目的としている。まず,有機基のケイ素から銅(I)塩へのトランスメタル化について検討した。その結果,トランスメタル化をおこす為には溶媒としてDMFなどの非プロトン性極性溶媒を用い,銅の塩としてCuClやCuOTfを用いることが必須であることがわかった。この知見を基に,パラジウム/銅(I)塩共触媒系によるアルキニルシランとアリールトリフラートとの交差カップリング反応に成功した。さらに,銅(I)塩触媒によるアルキニルシランと1-クロロアルキンとの交差カップリング反応を検討した。その結果,良好な収率で交差カップリング体を得る反応条件を見つけた。この反応もアルキニルシランと1-クロロアルキンの両方の芳香環上の4位の置換基効果を受けることがわかった。つまり,アルキニルシラン側に電子供与性基,1-クロロアルキン側に電子求引性基を有するものの組み合わせが最も収率が高く,その逆の組み合わせでは収率が低いことがわかった。本研究ではケイ素から銅(I)塩へのトランスメタル化について検討し,それを利用した反応を設計した。このトランスメタル化により,本研究で明らかにした以外にも様々な反応が期待できるので,本研究により有機ケイ素化合物の有機合成的価値がさらに高まったとといえる。今後は本成果を高分子合成に応用し,機能性材料の創製に展開していく予定である。
ゲノム編集技術を用いた糖尿病性腎症発症モデルブタの創出

本研究では、医学領域における糖尿病性腎症の発症メカニズムの解明および前臨床試験研究に使用する糖尿病性腎症モデルブタの作製を行う。具体的にはこれまでに作製した膵臓形成に関連するPDX1遺伝子改変糖尿病ブタの精子を用いて体外受精卵を作製し、さらにゲノム編集技術を用いて生体の血圧調整に関連するBK2R遺伝子をノックアウトすることで、BK2R遺伝子とPDX1遺伝子を改変し、糖尿病と高血圧の両疾患を有する糖尿病性腎症発症モデルブタを創出する。糖尿病患者は高血圧も同時に患うケースが多く、よりヒトの病態に近いモデル動物として外挿性の高い効果的な研究が可能となると期待できる。
環境情報入力との連関を基盤とする新規生殖機能制御系に関する分子機能形態学的解析

本研究は生殖制御に関して新規に見出されたKisspeptinとその含有ニューロンを統合中枢とする新たな生殖機能制御システムを基盤として、様々な内外の生殖機能に影響に影響を与えるであろうと考えられる因子の変動と、Kisspeptin-GnRH-LH/FSH-Sex steroids軸の変動に関して、免疫組織化学法やin situ hybridization法、免疫電子顕微鏡法等の組織化学的携帯研究法やRadioimmunoasssayなどの生理学的研究手法、遺伝子解析などの分子生物学的研究手法を組み合わせて解析することを目的としている。今年度は主にKisspeptin受容体(GPR54)の脳内発現の検索、性差によるkisspeptin受容体の発現変化、代謝エネルギー制御とkisspetin-HPG軸の変動に関して、estrogen受容体α(ERα)のvariant探査等においての研究が進展している。Kisspeptin受容体(GPR54)の脳内発現の検索、性差によるkisspeptin受容体の発現変化に関しては高感度検出i situ hybridization法(RNAscope)の研究応用を確認し、脳全体のkisspetpin受容体発現の再確認、性差や雌における卵巣周期に伴う変動などを明らかにした。また、ERαの新たな変異体の発見とその機能に関しての研究も進んでおり、現在、論文化を進めている。代謝エネルギーと生殖制御システムの相関性に関しては、成長ホルモン欠損ラットにおけるkisspeptin-HPG軸の解析が進行中であり、またSTZを用いて作成する糖尿病モデルラットにおけるKisspeptin-HPG軸の機能形態学的解析が進行中である。さらにPCOS(多嚢胞性卵胞症候群)との関連に関して、妊娠中母体の栄養が児(雌)の生殖機能とPCOSの発現率に関する研究を開始している。当初研究計画で示した研究の約7割について、成果を得たもの、研究開始に至っているもの等であり、英文国際雑誌への発表出来たもの、投稿準備、あるいは投稿直前に至っている成果もあり、ほぼ順調と判断できる本研究計画に挙げた生殖機能に伴う様々な生理環境変化と病態におけるKisspeptin、Kisspeptin受容体の分子機能形態学的研究は予定通りのスタートである。また、Kisspeptin、Kisspeptin受容体における内外環境因子の入力の処理機構に関しては、KisspeptinニューロンとPRL分泌機能に関しての予備研究が終了し、本研究に入る。KNDyニューロンの電子顕微鏡的解析も予備実験が間もなく終了し、具体的な解析を始める。光ファイバーを介した脳内微量発現細胞モニタリングのシステム開発は本研究課題申請中にほぼ完成し、バゾプレシン、GnRHなどに発現させたGFPのリアルタイムイメージングに成功しており、Kisspeptinニューロンでの応用可能な段階であるので、予定通り計画を進める。研究費の使用計画をrigidに計算しながら運用していた結果、さいしゅうてきに1592円の残額が出てしまったが、意図的なものではない
口腔領域の悪性腫瘍、前癌病変における遺伝子異常の解析とその生物学的・臨床的意義

申請者は北海道大学歯学部附属病院口腔外科を受診した患者を対象に生検、あるいは外科切除され、病理組織学的に扁平上皮癌と診断された腫瘍組織を用い、p53遺伝子の異常について研究を行った。さらにp53遺伝子産物に結合し、その分解を促進するヒトパピローマウイルス(HPV)の感染についても同じ組織を用い検索を行った。その結果、38症例中9例(23.7%)に異常を認め、HPVの感染は8例(21.1%)に認められた。p53遺伝子に異常が認められ、かつHPVの感染が認められたのは2例であり、ともに下顎骨中心性腫瘍であった。臨床データとの比較はp53不活化例(p53遺伝子異常、あるいはHPV感染例)(15例)とp53遺伝子異常を認めず、かつHPV感染を認めない例(23例)で行った。年齢、性別、T stage、N stage、喫煙歴、飲酒歴などでは両群間で差は認められなかったが、予後は後者で有意に不良であった。従って、p53遺伝子の異常、あるいはHPVの感染が口腔扁平上皮癌の発生に重要な役割を果たしているが、p53遺伝子、あるいはHPV以外で予後を不良にする因子が存在する可能性が示唆された(第19回日本頭頚部腫瘍学会、第86回米国癌学会で発表、Oncogene印刷中)。南アジア地域では噛みタバコの習慣があり、これに起因して口腔癌(特に頬粘膜癌)が多く認められる。今回、協力体制の整っているスリランカの口腔扁平上皮癌および前癌病変を対象として同様の検索を行った。その結果、p53遺伝子の変異は口腔扁平上皮癌の33%に認められ、かつ、変異の位置がエクソン5に集中する傾向にあった(第54回日本癌学会で発表、投稿準備中)。HPVの感染に関しては現在検索中である。申請者は北海道大学歯学部附属病院口腔外科を受診した患者を対象に、生検、あるいは外科切除され、病理組織学的に扁平上皮癌と診断された腫瘍組織を用い、p53遺伝子の異常について研究を行った。さらにp53遺伝子産物に結合し、腫瘍抑制遺伝子の作用を不活化することが知られているヒトパピローマウイルス(HPV)DNAについても同じ組織を用い検索を行った。その結果、p53遺伝子は38例中9例(23.7%)に異常を認め、HPV DNAは8例(21.1%)に同定された。p53遺伝子に異常が認められ、かつHPVの感染が認められたのは2例であり、共に下顎骨中心性腫瘍であり、顎骨内上皮性腫瘍の成因についてさらに検討が必要であると考えられた。臨床データとの比較は、p53遺伝子の異常、あるいはHPVの感染の認められる症例(15例、39.5%)と、両者とも認められない症例(23例、60.5%))で行った。年齢、性別、腫瘍の大きさ、リンパ節転移の有無、喫煙歴、飲酒歴などでは両群間で差は認められなかったが、p53遺伝子異常(+)、あるいはHPV DNA(+)の症例では、ともに認められない症例に比較して有意に予後が良好であった。従って、p53遺伝子の異常、あるいはHPV DNAが口腔癌の発生に重要な役割を果しているが、p53遺伝子、あるいはHPV DNA以外で予後不良を規定する遺伝子が存在する可能性が示唆された(第86回米国癌学会にて発表)。申請者は昨年度、北海道大学歯学部附属病院口腔外科を受診した患者を対象に、生検、あるいは外科切除され、病理組織学的に扁平上皮癌と診断された腫瘍組織を用い、腫瘍抑制遺伝子p53遺伝子の異常について研究を行った。

さらにp53遺伝子産物に結合し、腫瘍抑制遺伝子の作用を不活化することが知られているヒトパピローマウイルス(HPV)の感染についても同じ組織を用いて検索を行った。その結果、p53遺伝子は38例中9例(23.7%)に異常を認め、HPV DNAは8例(21.1%)に同定され、予後との相関を見い出した(第19回日本頭頚部腫瘍学会、第86回米国癌学会にて発表、Oncogene印刷中)。本年度は口腔癌多発地帯の一つであり、当科と協力体制が整っているスリランカに注目し、検索を行った。同地域は噛みタバコの習慣があり、それが口腔癌の原因となっていると考えられている。同地域で口腔扁平上皮癌、および前癌病変の生検材料、手術材料を採取し、遺伝子変異の検索を行った。その結果、p53遺伝子の変異は33%に認められ、かつ、変異の位置がエクソン5に集中する傾向にあった。したがって、噛みタバコ中の発癌物質が遺伝子のある特定の部位を標的として作用している可能性が示唆された(第54回日本癌学会で発表、投稿準備中)。HPVの感染および他の遺伝子については現在も検索中である。
HPV遺伝子導入口腔扁平上皮癌細胞の放射線化学療法に対する感受性について

本研究は、HPV陽性口腔扁平上皮癌細胞の放射線化学療法に対する感受性について解析する目的で行った。具体的には、口腔病変における正確なHPV検出感染率を求め、さらに、HPV陽性細胞と陰性細胞について免疫組織化学的(p16^<INK4a>、p53、CD4、CD8、CD68、CD1a、Ctr1)に検討した。その結果、口腔病変におけるHPV検出率は22. 4%であり、HPVの有無による免疫染色結果との有意な相関も認められなかった。HPV陽性細胞の化学療法感受性については今回検索したマーカー以外の他の要因が関わっていることが示唆された。ヒトパピローマウイルス(HPV)は子宮頸癌の原因ウイルスであることが知られているが、高リスク型であるHPV16型、18型が近年、口腔扁平上皮癌においても関連することが注目されている。頭頸部癌においてはHPV陽性群では、陰性群に比して放射線療法や化学療法に対する感受性が良く、予後が良好という報告もある。申請者は、予備実験において、型に関わらず、HPV遺伝子を有する口腔扁平上皮癌をPCR法にて同定し、その中から陽性、陰性症例を各10例抽出した。ウイルス感染が確認された症例および確認されない症例における形態学的解析において明らかな違いは確認できなかった。一方、ウイルスDNAの存在は感染を示すものの、発癌やウイルス感染による癌の形質変化を意味するわけではなく、ヒト遺伝子へのウイルスDNAの取り込みが必要である。ウイルスの取り込みを確認するため、転写産物であり、種々の癌遺伝子との関連が知られているE6、E7タンパクの発現を免疫組織学的に検討したが、非特異的反応が著明であり、評価が困難であった。現在染色条件に関して検討中である。また、子宮頸癌におけるウイルスの取り込みの指標であるp16タンパクに関し、免疫組織学的検討を行うための予備実験を終了した。ウイルスDNAの取り込みに関し、検討中であるが、癌組織中にHPV遺伝子が存在する症例および存在しない症例を抽出することができたため、今後、症例の詳細な後ろ向きの解析によりウイルス陽性および陰性頭頸部扁平上皮癌の特徴を明らかにすることが出来ると予想される。申請者は、HPV遺伝子を有する口腔扁平上皮癌をPCR法にて同定し、その中から陽性、陰性症例を抽出し、ウイルス感染が確認された症例および確認されない症例における形態学的解析において明らかな違いは確認できなかった。ウイルスDNAの存在は感染を示すものの、発癌やウイルス感染による癌の形質変化を意味するわけではなく、ヒト遺伝子へのウイルスDNAの取り込みが必要である。ウイルスの取り込みを確認するため、転写産物であり、種々の癌遺伝子との関連が知られているE6、E7タンパクの発現を免疫組織学的に検討したところ、当初、非特異的反応が著明であり、評価が困難であった。抗原賦活化についての条件を検索設定したところ、安定した染色性を得ることができた。その結果、放射線化学療法の効果とHPVE6、E7タンパクの発現に関連性は認められなかった。一方で、症例の後ろ向きの解析により、口腔多発癌、多臓器との重複癌においてHPVウイルスの存在が有意に認められ、HPVウイルスが多発癌、重複癌に関与することが示唆された。
中性子磁気構造解析によるスピンを担う電子密度の可視化

磁気構造解析から磁気モーメント分布を求め、電子軌道を可視化するという試みとして、平成19年度の研究結果から磁気反射の測定範囲と分解能の問題が明確になった。逆格子空間での測定データと理論値を比較すると十分に満足できる結果であるが、実空間のイメージに戻すときにはフーリエ合成の分解能が効いてきて、大きなQのところまで大量のデータがないと満足できる分解能に達しないことが分かった。そこで、平成20年度は、効率的な磁気反射測定の手段として大型中性子湾曲二次元カウンターの開発を集中的に行った。これは、韓国原子力研究所との共同研究として実施したものである。装置の開発は韓国が担当し、我々はどのように使用すればよいか、どのようにデータ解析すればよいのかなどの方法論を受け持った。特に、当該研究と結びつけることを強く意識した開発である。最終的な大型カウンター開発の前段階として、プロトタイプのカウンターを制作してテストした。試料として、最初は標準結晶のNaClで方法論の開発を行い、次に、複雑な磁気転移を行うテルビウム鉄ガーネットやマルチフェロイック物質として注目を浴びているHoMn_2O_5の低温高圧相の磁気反射測定を行った。簡単な結晶構造解析は十分な精度で行えるまでに装置やプログラムの開発を行うことが出来た。複雑な磁気構造は、まだ磁気構造解析のプログラムの問題で進んでいないが、データ収集は出来るようになった。韓国では、さらに大型の最終段階のカウンター制作に進んでおり、最終的には高効率でBragg反射の測定が可能になる見込みなので、今回の研究成果を今後生かして、次の段階の高分解能での磁気構造解析から磁気モーメントと電子軌道のイメージ化につなげていく見通しが立った。磁気構造解析から磁気モーメント分布を求め、電子軌道を可視化するという試みとして、平成19年度に中性子回折により磁気散乱強度を測定した物質と解析状況は、以下の通りである。(1)中性子回折により測定して得られたデータはd-電子系としてLa_2CuO_4とNd_2CuO_4であり、π電子系としてβ'-ET_2ICl_2という有機物である。(2)結晶構造解析と通常の磁気構造解析は全て問題なく行われた。(3)磁気モーメント分布を出す一番簡単な方法はフーリエ合成法であり、以前にMnF_2という標準物質で手がけたことがある。再度、この方法の妥当性を検証するためにMnF_2の再実験とフーリエ合成法のテストを行い、その後に上記物質にフーリエ合成法を適用した。(4)成果を国際会議で発表した。(5) d-電子系の磁気モーメント分布の解析に関しては、フーリエ変換による可視化と最大エントロピー法による可視化を試みて修士論文としてまとめることができたが、最大エントロピー法の妥当性に対する吟味が終了していないので、まだ発表には至っていない。
ヒト消化管癌・前癌病変と正常臓器・組織における癌遺伝子・遺伝子産物の発現について

今年度の研究実績は主に下記の4つに分けられる。(1)ヒト胃癌の増殖能・転移能に癌遺伝子rdsが関与するのか否かをみる為、107例の切除胃癌症例をras-P21単クローン抗体Rap5を用い、免疫組織化学的に検索した。Rap5によるras-P21の陽性度は癌細胞の組織学的異型度(核異型度など)と大まかに関連したが、増殖先進部では必らずしも陽性度の増加は認められなかった。転移巣では原発巣よりras-P21の陽性度高くかつ核異型も高度な傾向がみられ、原発巣中の特定(ras-P21強陽性で核異型高度)な細胞群が転移しやすい事を示唆した。なおras-P21は非癌組織中でも幅広く存在したが、胃の前癌病変あるいは前癌状態として議論されている腺腫および腸上皮化生(不完全型)腺管では、他の幽門腺・腺窩上皮などよりも高頻度に陽性を呈した。(2)個体発生上の正常臓器・組織におけるras-P21の生物・生理学的役割を検索した仕事では、ラットの胎児期から骨格筋,心筋,脳脊髄神経にras-P21の発現(免疫活性)が認められ、出生後、胃の塩酸分泌を担う壁細胞,肝細胞,腎尿細管などemergy産生,イオン交換,膜電位変化の盛んな臓器・組織にras-P21の発現を認めた。ras-P21のSignal transducer,high energy sourceとしての役割が強調された。(3)またWestern blot法による検索では、ras-P21含有が知られているai-1培養細胞、ヒト胃癌・大腸癌組織内の分子量21,000の蛋白質がras-P21の単クローン抗体Rap5や多クローン抗体と反応し、各抗体がras-P21を認識している事を確認した。しかし、両抗体は分子量の異なる他の蛋白質とも交又反応を示し、その特異性に限界がみられた。(4)Transfection assay-Southern blot法による検索では、35例の大腸癌中1例の直腸癌にN-rasの活性化を認め、Codon13の部位にSingle G→C point mutationがあること、P-21中ではGlycine→Arginineの変換があることを明らかにした。
類人猿型ロボットにおける二足行動への形態・機能発達の研究

本研究は、人型ロボットが、手をついて歩き、倒れても起き上がり、二足で歩き、手で物を扱って運べるようにもなるという行動が段階的に実現され、その過程を統一的に見通せる機能発現や行動発達の機構を研究しようとしている。その中で、本年度は、二本の腕を移動に利用できる条件のもので、二足歩行が発現する段階に焦点をおいた。行動を発現させるために、行動指標の表現、身体の形態・構造・運動の制約、発現の操作、などを自由に切替えることができる環境を作り、実機により発現した行動を確認しつつ行動の発現機構に関する事例と発現した機能を段階的に発達させるための操作がどういうものとなるかに関する考察を行なうのが本研究の目的である。ここでは、まず仮想環境でのシミュレーションで終るのではなく、形態的に発達段階の異なる実態を設け、発現した行動を実環境において検証できる枠組を取り込み、仮想と現実の間の折り合いをどのようにつけるかを明らかにしつつ研究を進めようとして以下のような枠組と実験を行なった。まず、簡単な行動指標を与えるだけで動作生成がなされ、生成される動作も発展する仕組みをもつ自動化された動作生成・評価系の構築を行なった。基本となるシステムは、ロボットをBodyとBrainに分け、BrainとBrainを育てるMother部を同一のソフトウェア環境に構成するリモートブレイン方式とした。これにより仮想環境だけでなく実環境において同一の行動プログラムが検証可能となっている。この環境において、人型のロボットが移動する行動に関して行動指標を与えれば、その行動指標値がより高くなるような動作が生成される機構を実現した。生成される動作はパラメータ表現されたレベルであり、条件判断や制御構造が入ったプログラムにはなっていないが、生成される動作が行動指標を高めるように変化する。とくに、ロボットボディの形態と構造がデータ化されており同じ行動指標であっても身体の形態や構造が変われば生成されてくる行動が変わる。与えられた行動指標に適した形態を与えた場合にはそうでない場合にくらべてより発展したロボットとなる。また、従来は人間が個々の動作をプログラムして与えるという枠組から、行動指標を与え、計算機が動作を生成し評価する枠組への変化は、プログラムを生成するプロセス自体を変えた形の発展形態となっている。
ギンコライド類の脳神経保護作用機序解明を目指した炭素11標識誘導体の合成

イチョウ葉エキスは記憶力の減退や抗鬱、めまい、耳鳴や痴呆の治療に有効であることから、ドイツやフランスなど多数の国で医薬品として扱われ、我が国では健康食品として販売されている。このようなイチョウ葉エキスの脳神経細胞保護作用を明らかにするため主成分ギンコライド類を短寿命放射性化合物で標識し、動物での体内動態を観測してその作用機序の解明を目指した。脳神経細胞保護作用を持った誘導体および18F-フッ素誘導体の合成に成功した。イチョウ(銀杏)は2億5千万年前から存在し、「生きた化石」と呼ばれている最古の植物である。イチョウ葉の抽出液(EGb761)は記憶力の減退や抗鬱、めまい、耳鳴や痴呆の治療に有効であることから、ドイツやフランスなど多数の国で医薬品として取り扱われている。近年、我が国でも、健康ブームからイチョウ葉エキスを用いた製品が多数販売されている。イチョウ葉エキスの有効成分はフラボノイド類とギンコライド類である。特にギンコライド類は唯一イチョウから単離された天然物であり、その構造は天然物として極めて稀なtert-ブチル基を有した、高度に酸化された複雑なカゴ型構造を持つジテルぺノイドである。分子内の水酸基の数の違いによりギンコライドA、B、C、JおよびMが知られている。ギンコライド類が血小板活性化因子(PAF)受容体、GABA,受容体およびグリシン受容体の括抗剤として働くことはすでに報告されていたが、近年、申請者等によりギンコライド類が脳虚血後の梗塞部位の脳神経細胞保護作用を示すことが明らかになってきた(未発表)。本研究ではその作用機序を陽電子放射断層画像撮影法(PET法)等により明らかにし、ギンコライド類を用いた神経変性疾患の治療薬の開発および診断マーカーの創成を目指し行っている。本年度は、市販のイチョウ葉粉末1.5kgからギンコライド類約20gを単離し、これを用いた誘導体合成を行った。ギンコライドAおよびBは10位水酸基に置換基を導入したもの、F環ラクトンをテトラヒドロフラン環に還元した誘導体を合成した。ギンコライドCおよびJは7位水酸基にフッ素を導入したものおよびそのF環ラクトンをテトラヒドロフラン環に還元した誘導体の合成を行った。ギンコライド誘導体は脳虚血モデルマウスを用いた神経保護作用の検証行い、顕著な保護作用が観測されればPETプローブ化を検討する予定である。イチョウ葉の抽出液(EGb761)は記憶力の減退や抗欝、めまい、耳鳴や痴呆の治療に有効であることから、ドイツやフランスなど多数の国で医薬品として取り扱われている。特にギンコライド類は唯一イチョウから単離された天然物であり、その構造は天然物として極めて稀なtert-ブチル基を有した、高度に酸化された複雑なカゴ型構造を持つジテルペノイドである。ギンコライド類が血小板活性化因子(PAF)受容体、GABA_A受容体およびグリシン受容体の拮抗剤として働くことはすでに報告されていたが、近年、申請者等によりギンコライド類が脳虚血後の梗塞部位の脳神経細胞保護作用を示すことが明らかになってきた(未発表)。本研究ではギンコライド類の作用機序を陽電子放射断層画像撮影法(PET法)等により明らかにすることを目的とし、神経変性疾患の診断マーカーおよびその治療薬の創成を目指し行っている。昨年度は、1)市販のイチョウ葉粉末1.5kgからギンコライド類約20gの単離2)ギンコライドBの誘導体合成(フッ素化体)を行った。ギンコライドBの誘導体が脳梗塞マウスに有効であることが判明したので本年度は1)フッ素18[^<18>F]-ギンコライドB誘導体(ギンコライドのPETプローブ)の合成2)ギンコライドのPETプローブをもちいた体内動態解析(健常ラットを使用)を行った。その結果、今後モデルラットでの体内動態解析を行い、目的部位への集積が確認されれば、治療薬および診断薬としての利用の可能性が示唆された。
グアニン四重鎖結合タンパク質によるDNA構造制御機構の解明

グアニン四重鎖DNAとRNAはゲノムDNAや転写されたRNAに存在すると考えられている。しかし、それらの機能はほとんどわかっていない。その理由の1つに、グアニン四重鎖DNAとRNAをそれぞれ特異的に認識する分子が存在しないことが挙げられる。そこでグアニン四重鎖DNAとRNAに対してそれぞれ特異的に結合する分子を開発して、グアニン四重鎖の機能を解明することにした。特に、本研究では染色体末端構造のテロメアについて解析した。その結果、テロメアのグアニン四重鎖DNAとRNAは異なる機構でテロメアのヘテロクロマチン化を促進していることがわかった。本研究課題の目的はグアニン四重鎖を特異的に認識するタンパク質の核酸結合性とテロメアやゲノム構造に対する作用を明らかにすることである。その中で1年目の平成26年度は、核酸結合タンパク質TAF15の核酸結合性の解明を計画していた。TAF15はチロシンを含むRGG3領域を含む核酸結合性タンパク質であり、テロメアから転写される非翻訳RNAであるTERRAに結合することがわかっている。そこでTAF15の核酸結合性を試験内で調べたところ、TAF15中のRGG領域とTERRAとはグアニン四重鎖構造依存的に結合するが、1本鎖や2本鎖のRNAやDNA、グアニン四重鎖DNAとはほとんど結合しないことがわかった。また、このRGG領域1分子に対してグアニン四重鎖RNA3分子と結合することがわかり、グアニン四重鎖構造中のループ部分の2'-OHを認識して結合することが明らかとなった。さらに、TAF15の細胞内の核酸結合性を解析した結果、グアニン四重鎖を形成するテロメアDNAには結合しないが、TERRAに結合することがわかり、試験官内の核酸結合性の結果を一致した。また、予定以上に実験が進行したため、平成27年度に予定していたTAF15のテロメアにおける機能の解明のための実験を行った。テロメア中のヒストンは本来、高度にメチル化されておりヘテロクロマチンという凝集した構造を形成している。細胞内のTAF15の発現をsiRNAによって抑制すると、テロメアのヒストン中のメチル化の程度がより上昇し、ヘテロクロマチン化が進行することがわかった。この結果から、TAF15はテロメアのヘテロクロマチン化を抑制していることがわかった。これらの研究成果は日本化学会第95春季年会で発表した。本研究の目的であるグアニン四重鎖を介したDNA構造制御機構を解明するために、グアニン四重鎖DNAとRNAのそれぞれに特異的に結合する新規人工タンパク質を開発した。このタンパク質はこれまでに申請者らによって明らかしたグアニン四重鎖結合タンパク質を元に作成した。さらにこの人工タンパク質を利用して、染色体末端構造であるテロメアにおけるDNA構造制御機構を解明した。これまでの研究によりテロメアのヒストン中の特定のリシンは高度のメチル化されることでヘテロクマチンを形成し、凝縮していることが知られている。しかし、テロメアで形成されるグアニン四重鎖とこのヘテロクマチンとの関係はわかっていなかった。そこで、今回開発したグアニン四重鎖DNAとRNAのそれぞれに特異的に結合するタンパク質を細胞内に発現させたところ、ヒストンのメチル化修飾を低下させた。これは、グアニン四重鎖がテロメアのヘテロクロマチン化を促進することを示している。さらに、これらの分子によってグアニン四重鎖DNAとRNAはそれぞれ異なるリシンのメチル化に関与していることがわかった。また、染色体末端構造であるテロメアは、細胞のガン化や寿命に関わっていることが知られており、ヒストンの修飾がこれらの機能と強く関わっていることがわかっている。本研究課題において申請者らの研究知見より、グアニン四重鎖DNAとRNAはそれぞれ異なる機構でテロメアのヘテロクロマチン化を促進することで細胞のガン化を抑制していることが予想される。これは、グアニン四重鎖DNAとRNAはエピジェネテエィクスを制御する抗がん剤などの薬剤の標的として有用であることを示している。当初の目的であるグアニン四重鎖結合タンパク質の機能解明を課題として研究を行なっているが、本来の研究結果だけでなく、その結果を元に人工グアニン四重鎖結合タンパク質の作成にも成功している。さらに、この分子を利用することで、グアニン四重鎖によるエピジェネティクス制御機能の解明にも成功している。細胞内の核酸は二本鎖や一本鎖だけでなく、グアニン豊富な配列はグアニン四重鎖を形成することが知られている。しかし、それらの役割についてはほとんどわかっていない。そこで、本研究ではグアニン四重鎖の機構を解明するために、これらの構造に結合するタンパク質を見出し、その核酸結合性と機能を解析した。その結果、ガン原遺伝子であるTLS/FUSが染色体末端構造であるテロメアのグアニン四重鎖に結合して、この領域をヘテロクロマチン化していることがわかった。さらにこのタンパク質の核酸結合性を詳細に解析したところ、C末端にあるアルギニンーグリシンーグリシンの繰り返しからなる領域が関与していることがわかった。さらに、この繰り返し配列中のチロシンがグアニン四重鎖RNAとの結合性に、フェニルアラニンがグアニン四重鎖DNAとの結合性に重要であることがわかった。これらの知見を利用して、グアニン四重鎖RNAとDNAのそれぞれに特異的に結合する新規人工タンパク質を開発した。

すなわち、約100アミノ酸からなるC末端のアルギニンーグリシンーグリシン繰り返し領域のうち、フェニルアラニンを含む領域を除いたチロシンを含む領域からなるポリペプチドと、逆にチロシンを含む領域を除いたフェニルアラニンを含む領域からなるポリペプチドはそれぞれグアニン四重鎖RNAとDNAに特異的に結合した。さらに、これらの人工ポリペプチドを利用して、テロメアのヘテロクロマチン化におけるグアニン四重鎖DNAとRNAのそれぞれの役割の調べた。その結果、グアニン四重鎖RNAはヒストンH3のK9のメチル化に、グアニン四重鎖DNAはヒストンH4のK20のメチル化とヒストンH3のK9のメチル化の両方に関わっていることがわかった。これらの結果から、グアニン四重鎖はエピジェネティクスを制御することがわかり、薬剤の標的として有用であることを示している。グアニン四重鎖DNAとRNAはゲノムDNAや転写されたRNAに存在すると考えられている。しかし、それらの機能はほとんどわかっていない。その理由の1つに、グアニン四重鎖DNAとRNAをそれぞれ特異的に認識する分子が存在しないことが挙げられる。そこでグアニン四重鎖DNAとRNAに対してそれぞれ特異的に結合する分子を開発して、グアニン四重鎖の機能を解明することにした。特に、本研究では染色体末端構造のテロメアについて解析した。その結果、テロメアのグアニン四重鎖DNAとRNAは異なる機構でテロメアのヘテロクロマチン化を促進していることがわかった。当初、平成26年度は核酸結合タンパク質TAF15の核酸結合性の解明をして、平成27年度はTAF15のテロメアにおける機能の解明を行なう予定だった。しかし、これまでに当研究室で行なってきた核酸結合タンパク質の核酸結合性の解析をするための実験方法が当該タンパク質にも適用できたため、予定より早くTAF15の核酸結合性が明らかにできた。すなわち、TAF15はRGG3領域でグアニン四重鎖依存的にRNAに結合して、グアニン四重鎖内のループ構造を認識することがわかった。さらに、タンパク質1分子に対して3分子のグアニン四重鎖RNAであるTERRAと結合することがわかった。そのため、平成27年度に実験予定だったTAF15のテロメアにおける機能の解明を進めた。その結果、TAF15はテロメアのヒストンH3の9番目のリシンのトリメチル化を抑制することがわかった。このヒストンH3の修飾能は細胞内のTERRAの役割であることが報告されている。これらの結果から、TAF15は細胞内でグアニン四重鎖依存的にTERRAに結合して、TERRAによるヒストン修飾能を阻害していることが考えられる。現在、作成したグアニン四重鎖DNAとRNAのそれぞれに特異的に結合する新規人工タンパク質をさらに応用して、細胞内に存在するグアニン四重鎖結合タンパク質の機能解明をすすめる。すなわち、新規人工グアニン四重鎖タンパク質をもともと細胞内に存在するグアニン四重鎖結合タンパク質に対する阻害剤として用いることで、グアニン四重鎖の機能解明をすすめる。申請者らが開発したグアニン四重鎖DNAとRNAのそれぞれと特異的に結合する分子としては世界初の分子であるため、本研究目的を遂行する上で非常に有用であると考えられる。また、我々の研究室で新たに見出したグアニン四重鎖RNA結合タンパク質の核酸結合性と細胞内での機能解析をさらにすすめる。
制酸剤が酸化マグネシウムによるオピオイドの便秘予防効果に及ぼす影響

【研究の目的】我々は、多施設共同研究でオピオイドによる便秘対策に緩下剤の予防投与が重要であることを明らかにした。この研究の中で多くの施設で酸化マグネシウム(以下、MgO)が緩下剤として使用されていた。一方、MgOが緩下作用を発揮するには、1,000mg/day以上の投与量が必要であるが、MgOが1,000mg以上投与されていても便秘を発現している患者が見受けられた。一般的にMgOによる緩下作用は胃酸(HCl)が必要であるが、制酸剤の併用による胃酸分泌の低下がMgOの緩下作用に及ぼす影響は明らかではない。また、オピオイドを服用している患者の多くは、NSAIDsを服用しており、その胃腸障害予防の為にH2ブロッカー(以下、H2R-B)やプロトンオポンプ阻害薬(以下、PPI)などの制酸剤を併用している。そこで本研究では、オピオイドの便秘に対して、MgOが投与されている患者において、制酸剤の併用がMgOの緩下作用に影響を及ぼすか否かを検討する。さらに、制酸剤による影響が明確になった場合、緩下剤の種類、用量について解析し、オピオイド投与時の適切な薬剤の種類および投与量を明らかにすることにより、オピオイド内服薬投与時の投薬投与計画を確立する。【方法】2007年1月から2014年10月の期間に、当院においてオピオイドが新規に投与された患者441症例を対象とし、MgOが予防投与された患者において、制酸剤(H2R-BあるいはPP工)が併用されている場合と併用されていない場合の便秘の発現状況を比較検討した。また、MgOが投与されている患者において、便秘発現率に影響を及ぼす要因について解析した。【結果】全症例441例中、MgOが単剤で投与された患者は248例であった。また、このうち制酸剤が併用されていた患者は約60%を占め、これらの患者ではMgOの便秘予防効果は有意に阻害されていた(p=0.017)。ただし、MgOの投与量が2,000mg/day以上投与されている場合は、制酸剤併用の影響はほとんど受けていなかった。一方、センノサイドなどMgO以外の緩下剤が予防投与されていた場合は、制酸剤併用の影響はほとんどなかった。また、MgOが投与されている患者の中で便秘発現のオッズを有意に上昇させたのは、制酸剤が併用されている場合[オッズ比(OR)=2.335, 95%信頼区間(CI)=1.093-4.986, p=0.028]とMgOの投与量が1,000mg/day以下の場合[OR=4.587, 95%CI=2.287-9.198, p<0.001]であった。【結論】オピオイドによる便秘対策としてMgOを予防投与する場合、MgOの投与量として1日2,000mg未満では制酸剤の影響を強く受けることが明らかとなった。

一方、センノサイドなどMgO以外の緩下剤が予防投与されていた場合は、制酸剤併用の影響はほとんどなかった。また、MgOが投与されている患者の中で便秘発現のオッズを有意に上昇させたのは、制酸剤が併用されている場合[オッズ比(OR)=2.335, 95%信頼区間(CI)=1.093-4.986, p=0.028]とMgOの投与量が1,000mg/day以下の場合[OR=4.587, 95%CI=2.287-9.198, p<0.001]であった。【結論】オピオイドによる便秘対策としてMgOを予防投与する場合、MgOの投与量として1日2,000mg未満では制酸剤の影響を強く受けることが明らかとなった。
β細胞における核内DGKδ機能不全がもたらす脂質代謝異常と２型糖尿病発症との関連

本研究では、膵β細胞に高発現するDGKδがβ細胞機能に及ぼす影響について検討を進めた。本研究において、DGKδはβ細胞核に局在すること、β細胞特異的DGKδ欠損マウス(βDGKδKO)において、小型の膵島数が増加することで血清インスリン値の増加や随時血糖値の低下、耐糖能の改善がもたらされることが明らかとなった。また、βDGKδKOにおいてβ細胞量が保持される結果、streptozotocin誘発血糖値上昇が抑制されることがわかった。本研究により、β細胞核内に発現するDGKδがβ細胞増殖を抑制性に制御しており、その発現抑制によりβ細胞の増殖が促進される結果、耐糖能改善をもたらすことが示された。2型糖尿病では膵島にDAGが蓄積するという過去の報告やDGKの抑制により、インスリン分泌が低下するという我々が得た結果などから、2型糖尿病病態下のβ細胞において、DGKの発現や活性が低下し、DAGが蓄積する結果、脂質シグナリングが破綻し、インスリン分泌の低下あるいは細胞増殖障害が引き起こされる可能性が考えられる。本研究では、この新たなDGKを介したインスリン分泌制御系の存在をさらに裏付けるべく、DGKの機能低下によるインスリン分泌障害メカニズムの解明とともに、膵β細胞特異的DGK欠損マウス(βDGKδ-/-)を用い、脂質シグナリングの破綻が2型糖尿病にもたらす影響について検討し、β細胞インスリン分泌や細胞増殖におけるDGKの役割、および2型糖尿病発症とDGK機能変化との関連について解明することを目的としている。本年度は、膵β細胞におけるDGKδの機能評価についての検討を行った。その結果、βDGKδ-/-マウスの体重はcontrolマウスと比較し変化がないことを確認した。ところが、随時血糖値は有意に低値を示し、耐糖能は亢進、血中インスリン濃度も有意に増大していることが明らかとなった。またβDGKδ-/-の膵島をコラゲナーゼ消化法により単離し、バッチインキュベーション法により各種刺激に対するインスリン分泌反応測定を行った。その結果、βDGKδ-/-マウスの単離膵島におけるインスリン分泌能は、controlと比較して変わらないことが明らかとなった。そこで、膵β細胞量が変化している可能性を考え、膵臓の凍結薄切切片を作製し、現在、βDGKδ-/-の膵β細胞量の変化の定量の検討を進めている。また、βDGKδ-/-膵島の細胞周期関連分子の遺伝子発現検討実験も進行中である。本研究では、膵β細胞核に存在するジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)δを介したβ細胞機能制御系の存在を裏付けるべく、DGKの機能低下がβ細胞機能に及ぼす影響について検討を進めた。昨年度までに膵β細胞特異的DGKδ欠損マウス(βDGKδKO)を作製し検討を進めた結果、DGKδ欠損マウスの随時血糖値が低めに推移する、経口糖負荷試験による糖負荷後の血糖値が低値を示す、血中インスリン濃度が増大する等の表現型が認められ、欠損マウスの耐糖能が亢進することが明らかとなった。一方で、βDGKδKOより単離した膵島におけるグルコース誘発インスリン分泌反応は変化しなかったことから、βDGKδKOにおける耐糖能の亢進は、β細胞量の変化によるものではないかと考え、2015年度はβDGKδKOの膵β細胞量の解析を行った。βDGKδKOの膵薄切切片を用いた免疫組織化学的解析により、β細胞における増殖マーカーの発現増大や膵島数の増加が認められた。これらの膵島について、膵島のサイズ毎に解析を行った結果、サイズの小さい膵島のみが著しく増加していることが示された。さらに細胞周期促進因子の発現が有意に増大していることが明らかとなった。以上の結果より、β細胞核におけるDGKδの欠損により、新たな膵島の新生が促されていることが示唆された。今後、膵島新生メカニズムや糖尿病に対するDGKδ欠損の影響について解析を進めていく予定である。2014年度までにβ細胞特異的DGKδ欠損マウスの耐糖能が亢進することが明らかとなったため、2015年度は耐糖能が亢進する理由として、β細胞増殖に着目し解析を行った。方法として、マウス膵を200μm毎に薄切し、インスリン、核、Ki67増殖マーカーを3重染色し、染色切片をThermo社Array Scanを用いて、インスリン陽性細胞面積、インスリン陽性細胞数、インスリン陽性Ki67マーカー陽性細胞等の解析を行った。その結果、直径60μm以下、β細胞数20個未満の小型の膵島の数がDGKδ欠損により著しく増加すること、Ki67陽性β細胞の割合も有意に増加することが明らかとなった。そこで、β細胞増殖メカニズムを解析するため、膵島を単離し、細胞周期関連遺伝子や、代償性過形成に関連する遺伝子等の発現の解析を行った。その結果、細胞周期促進因子の発現が増大する一方で、代償性過形成に関連する遺伝子の発現には影響がないことが明らかとなった。このように、実験はおおむね順調に進行したが、DGKδ欠損マウスの出産数が少なく、予定していた免疫染色法による細胞周期促進因子の局在についての解析を終わらせるまでには至らなかった。本研究では、膵β細胞核に存在するジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)を介したβ細胞機能制御系の存在を裏付けるべく、DGKδがβ細胞機能に及ぼす影響について検討を進めてきた。

昨年度までの研究から、DGKδは膵β細胞核に局在すること、β細胞特異的DGKδ欠損マウス(βDGKδKO)において、サイズの小さい膵島の数が増加することにより、インスリン分泌が増大し、耐糖能の改善や随時血糖値の低下をもたらすことを明らかにした。すなわち、DGKδが核内においてβ細胞増殖抑制に寄与していること、核内DGKδ発現の低下によりβ細胞増殖が引き起こされることを突き止めた。しかしながら、DGKδ機能低下が実際に糖尿病の進展を抑制する効果を有するのかは不明であった。そこで、本年度はβ細胞破壊をもたらすストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病モデルマウスを作製し、DGKδ欠損による糖尿病病態への影響について検討を行った。STZ投与βDGKδheteroKOではSTZ投与後60日目における随時血糖値が、STZ投与controlマウスと比較し有意に低下していた。そこで、DGKδ欠損がSTZ投与後のβ細胞量および膵島形態に与える影響ついて免疫染色法により解析した。その結果、STZ投与controlマウスと比較しβDGKδheteroKOでは膵臓におけるインスリン陽性細胞面積が有意に増大し、さらに膵島あたりのインスリン陽性細胞の割合も増加していた。以上の結果から、βDGKδheteroKOではSTZ投与後においてもβ細胞量が保持されることにより、血糖値の上昇が抑制されることが示唆された。本研究課題を通じ、β細胞核に局在するDGKδは細胞増殖抑制作用を有し、DGKδを機能抑制することで、β細胞増殖亢進によりβ細胞量が増大もしくは保持される結果、糖尿病による高血糖症状が緩和されることが明らかとなった。本研究では、膵β細胞に高発現するDGKδがβ細胞機能に及ぼす影響について検討を進めた。本研究において、DGKδはβ細胞核に局在すること、β細胞特異的DGKδ欠損マウス(βDGKδKO)において、小型の膵島数が増加することで血清インスリン値の増加や随時血糖値の低下、耐糖能の改善がもたらされることが明らかとなった。また、βDGKδKOにおいてβ細胞量が保持される結果、streptozotocin誘発血糖値上昇が抑制されることがわかった。本研究により、β細胞核内に発現するDGKδがβ細胞増殖を抑制性に制御しており、その発現抑制によりβ細胞の増殖が促進される結果、耐糖能改善をもたらすことが示された。本年度、β細胞特異的DGKδ欠損マウスの作製に取り組み、作出に成功した。そこで、表現型の解析(血糖値、血中インスリン値、耐糖能)およびβ細胞の形質(β細胞量、インスリン分泌能)について解析した。(1)βDGKδ-/-マウスの表現型の解析:βDGKδ-/-マウスの体重、血糖値、血中インスリン濃度、耐糖能(経口糖負荷試験により測定)を測定し、コントロールマウスと比較した。本年度の研究から、βDGKδ-/-マウスの体重はcontrolと比較し、変化がないことを確認した。ところが、随時血糖値は有意に低値を示し、耐糖能は亢進、血中インスリン濃度も有意に増大していることが明らかとなった。(2)βDGKδ-/-マウス膵島の形態変化の解析:βDGKδ-/-膵臓の凍結薄切切片を作製し、インスリン抗体免疫染色によるβ細胞量の測定、および抗Ki67抗体免疫染色による細胞増殖能の確認を行う予定であったが、本年度の研究では、βDGKδ-/-の膵島サイズが小ぶりなこと、一方で数が増えていることなどの可能性を見出しているものの、定量までには至っていない。現在、検討を進めている。