hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
平安末期百首和歌の研究

未開拓な平安時代末期の百首の内、とりわけ校本の作成の待たれている為忠百首・久安百首等の伝本を、今回の補助金によって、数多く写真紙焼等で収集することができた。一本一本が大部なものであるから、たいへん有益であった。そして善本と思われるものを底本とし、両百首とも、原稿化し、収集した諸本により校本作成に着手することができた。なお何人かの大学院生などとともに、内容の検討にも入った。とくに、ユニークな百首でもある為忠百首、また後の応制百首に大きな影響を与えたと思われる久安百首について、今回の補助金によってその基礎的研究が進捗し、近い将来、その特色をまとめ、作成した校本とともに公表したいと考えている。更に、久安百首の系統を引く平安最末期から鎌倉期にかけての百首の伝本をも、比較研究のため資料を集めたものがあり、影響史を軸に、百首和歌の歴史的考察を加えてみた。巨視的な和歌の流れ、王朝和歌から中世和歌への展開において多く成立した百首和歌は、題詠という方法を創作の中心とするが、その題詠の考察も百首歌研究に当たって重要である。とりわけ歌題を多く集めた明題抄・明題部類といった写本・板本の類も、各地の百首伝本を採訪した折りに多く写真紙焼によって集めることができた。貴重な収穫といえる。最近、平安末期を中心とする和歌研究論文が、次第に多くなっているが、複写等によって、それら参考文献を多く収集することができた。これらの収穫を、王朝和歌から中世和歌へ、という歴史的視野の中におさめて、今後その意義づけを行いたいと思っている。貴重な収穫といえる。
機械翻訳と意味順英語学習法を融合させた英文ライティングプロセスの研究

本研究は,機械翻訳を利用した英作文授業の方法を確立するべく,次のIIIIのテーマに分けて研究を遂行している。I:機械翻訳で可能な限り正確に訳出させるにはどのような中間日本語を作成すべきか、II:中間日本語の作成に「意味順英語学習法」の手法はどのように応用できるか、III:機械翻訳を利用した英作文の評価方法の確立。IおよびIIについては、意味順英語学習法により出力が想定される和文英訳が、機械翻訳を用いた場合はどのような和文英訳になるかについて研究を進めていった。233文の文章が検証され、完全一致するものと、誤訳されるものに分類され、誤訳されるものについて、中間日本語をどのようにすべきかについて議論を深めることができた。IIIについては、機械翻訳を利用した場合と、しなかった場合の評価方法の違いについて検証した。具体的には、機械翻訳を利用しなかった場合の評価ルーブリックが、そのまま機械翻訳を利用した場合の評価ルーブリックに当てはめることができるかどうか検証してみたが、評価ルーブルリック自体にまだ改善の余地があり、機械翻訳あり・なしに関わらず、評価ルーブリックを改良することが必要であることがわかった。当初予定されていたアジェンダに基づいて研究は遂行できている。機械翻訳利用のための中間日本語の作成については、「意味順英語学習法」の手法は応用しながらガイドラインを作成していく。また、機械翻訳を利用した英作文の評価方法の確立については、初年度に問題が見つかった評価ルーブリックの改善を試み、実際の授業で使用する。上記をPDAサイクルに乗せて、当初の目的である、I:機械翻訳で可能な限り正確に訳出させるにはどのような中間日本語を作成すべきか、II:中間日本語の作成に「意味順英語学習法」の手法はどのように応用できるか、III:機械翻訳を利用した英作文の評価方法の確立する、ことを明らかにしていく。当初予定していた学会への参加がキャンセルとなってしまったため、計上していた旅費に残額が発生した。また購入を予定していたPCは納品が大幅に遅れる通知があったため、年度内に購入を見送った。旅費の残額については、次年度以降に積極的に学会に参加し、知見を広げる。PCは次年度に購入する。
遺産分割と紛争の予防

遺産分判に関して、フランス法では、公証人が伝統的に活躍しており、その結果、紛争の予防に大きな役割を果たしていることが、実務を検討することで理解できた。遺産分割にあたって、相続人が全員公証人の事務所に集合し、場合によっては、被相続人の債権者、相続人の債権者も参加することがある。このように関係者が一同に会して、遺産分割案が、公証人の指導によって作成されていく。この際に、公証人の指針になるのが民法典であることに注意が必要である。民法典に従えば、正義が実現できるという法典に対する信頼が存在している。相続人の確定方法、遺産の範囲、遺産管理の問題など、民法典に従って、遺産分割案が作成される。なかでも持戻や遺留分減殺請求もこの場で考慮される。これはほとんど、裁判による遺産分割と同じ内容になるといわれている。このように作成された遺産分割案に対して、相続人間で合意が得られれば、遺産分割が完了する。公証人の遺産分割に対する積極的な関与と、民法典に対する信頼の差が、日仏で大きな特徴として明らかになった。特に公証人に関与は、一方当事者の利益のために参加する弁護士とは異なり、関係当事者間で正義を実現するという役目に意味がある。このような法律家の位置付けが可能なところに、紛争の予防を果たしうる理由が存在しているといえる。フランス民法典の中に、遺産分割に関して、正義を実現できるシステムが存在しており、大いに参考になる。紛争予防を果たしうる機能の重要な要素は、民法典の中にある。この意味で、わが国の法定相続に関する規定を充実させることは重要である。この目的で、代襲相続に関しても分析を行なった。遺産分割は、法的な問題であり、もっぱら法の専門家によつて、進められる意味は紛争予防の観点から、重要であることが理解できた遺産分判に関して、フランス法では、公証人が伝統的に活躍しており、その結果、紛争の予防に大きな役割を果たしていることが、実務を検討することで理解できた。遺産分割は、法的な問題であり、もっぱら法の専門家によつて、進められる意味は紛争予防の観点から、重要であることが理解できたI、今年度は、大きく二つの方法で、フランスの遺産分割を研究してきた。1)第一に、遺産分割を実定法として研究している。そのための文献を収集し、遺産分割に関する法律をまとめつつある。相続財産の評価から、持戻し、遺留分の減殺などを含めて総合的に遺産分割に関する実定法を研究している。フランス法では、相続人に対する贈与や遺贈がなされた場合に関して、詳細な規定があり、それを欠いているわが国の民法典に有益な示唆があることが理解できた。相続法の研究と並行し、フランス公証人制度の文献研究も行なっている。制度や活動領域、責任、社会とのかかわりなど、文献を通じて整理をしている。わが国の法制度のもとでも、公証人が同じような活動をなすことが可能かどうか、そのためには何が必要なのかという視点で、分析を行なっている。2)第二に、パリ第二大学ミッシェル・グリマルディ教授の協力のもとに、フランスで公証人実務の予備調査を行なった。フランス公証人協会会長のレイニス氏とパリの事務所にて数回にわたり面会し、遺産分割における公証人関与の実務についての説明を受けた。当事者が全員参加し、基本的に法律に従った法定相続に基づき案を作成し、遺産分割を進めていく公証実務を、実際に体験した。持戻し、遺贈の扱い、遺留分の可能性をどのように手続きに反映するのか、また特定財産を巡って意見がまとまらない場合の手法など、伝統的な実務の手法を学んだ。このように、公証人が介入することにより、フランスでは遺産分割が比較的短期間に解決し、紛争の予防の機能を果たしていることに確信を得た。実際に、遺産分割で裁判になる事例は限られているという説明は今後の研究を進めるヒントを与えてくれた。

II、フランスでは公証実務は、都市によって遺産の種類にも相違があり、フランスの公証実務を知るためには、特徴となる地方都市での調査も必要であると助言を頂き、そのため研究の協力も承諾していただいた。今後、より客観性を高めるよう研究を進めていく予定である。なお平成13年のパリでの調査をもとにした研究成果を、フランスの公証人制度ともからめて、平成15年6月に開催される公証法学会にて発表し、公証法学33号に公刊する予定である。本年度は、相続法の公証実務を中心に研究を進めた。その中間報告として、日本公証法学会で、フランスにおける公証人と紛争予防と題して、2003年6月に研究発表を行った。学会の折に頂いた質問にも考慮を払い(たとえば、公証人の民事責任等)、公証法学33号に論文を発表した。今年度の研究は大きく2部からなっている。フランスの公証制度の歴史的な発展と、現在の公証人の役割についてまず分析を試みた。これは主として、文献、資料を題材にした研究である。書面のもつ意味、書面の法的な効力、公証人の責務に関して、分析した。第2部は、公証人の関与によって、どのように紛争が予防されているかに関して、相続法を題材に分析を行った。遺産分割が、公証人という法律の専門家が介入することによって、いかにスムーズに進んでいくのかを、実証的に分析した。また同時に、法解釈学的に、遺産分割、持戻、遺留分減殺が一連の作業として行われるように規定が準備されていることを明らかにした。この作業にあたって、フランスにて多くの公証人に面会し、具体的な計算の事例を題材にして、遺産分割に関する公証実務の説明を受けた。また現在、公証実務と民法典の規定の適合性の関連性について、興味の対象が発展している。公証実務の確立は、単に公証人の実務から自然発生したものではなく、その背後に法的な伝統があり、フランス民法典編纂がはたした役割を無視することはできない。公証実務は民法典の編纂とも基本的に同じ流れであるという仮説を得た。その実証のために、フランス民法典に影響を与えたポティエの文献の分析を試みている。このようにして、フランス公証法の予防的な役割を実証面と法解釈学的な二面において深め、日本法の視点での分析を加える来年度の研究につなげたい。平成16年度は、もっぱら情報の収集を図った。パリとトゥールーズを中心にして、公証人や研究者から、相続実務の説明を受けた。またさらに、パリ12大学とトゥールーズ第1大学では、日本の相続法の問題点を研究者や学生に対して講演し、色々な意見を頂いた。これらの調査や情報収集から、遺産分割に至るまでの期間の、遺産の管理問題に、フランスの実務家は注意を払っており、その結果、よりスムーズな遺産分割が実現できることが理解できた。相続が開始し、遺産分割までの間の権利、義務が実務的にも明確になるようにフランス法は留意されており、その間になされた、管理や、財産処分、相続債務の弁済などは、遺産分割において、直接的に考慮されるシステムが準備されている。一方で、相続財産の債権者が守られ、財産取得者の権利が考慮され、また他方では、債務を弁済したり、債権の履行を求めたり、処分をしたりした相続人間の平等が考慮される。遺産分割が比較的短期間でなされるにもかかわらず、遺産分割までの間の権利義務に解釈上の注意を払っているのは興味深い。
神経ペプチドオレキシンの消化管運動調節機構とその意義

オレキシンは胃収縮を促進し,また大腸収縮を促進させ便排出を促進させる.また迷走神経による胃運動促進効果は,内因性のオレキシンが関与することを明らかとした.さらにCRFの末梢投与は胃排出を抑制するが胃収縮を促進することをラットで示した.CRFはCRF1,2の2種類の受容体を介して作用するが,CRF1の刺激により胃収縮は促進し,CRF2はこれに拮抗する作用を持つことを初めて示すことができた.さらにwater-avoidance stressは胃排出に変化を与えないが,CRF1を介して胃収縮を促進させることを明らかにした.これらは,消化管機能障害の病態理解のために重要な結果である.研究計画に沿い,CRFの消化管運動に対する作用を明らかにした.末梢にCRFを投与すると,胃運動は促進し,この反応は末梢のCRF1受容体刺激によるものであることを明らかにした.また末梢CRF2受容体の刺激は基礎状態の胃運動に変化を与えなかったが,CRFによって引き起こされた胃運動促進効果を抑制し,逆にCRF2の遮断は,CRFによるこの反応を増強した.つまり,CRF2はCRF1 signalingを抑制するcounter-regulation作用を持つことが明らかとなった.これは過度にストレス反応が進行すると,生体の生存に不利益となるためその反応を収束させる系として,CRF2の作用が存在するものと解釈できる.一方これまでストレス,CRF投与により胃排出は抑制されることが知られていた.しかしながら今回の結果は,CRF投与により胃運動は促進しており,胃排出とは一見乖離した状態になることを示したことになる.胃排出は胃収縮の他に,十二指腸運動との同期など様々な要因により決定されるので,今回の我々の結果は,必ずしもこれと矛盾する事実ではない.ストレスにより胃排出が低下し,また今回の実験結果のように,胃収縮は促進するなら,胃内圧上昇によって胃壁伸展がより一層強くなり,食後の消化器症状が強く増強されることにつながると思われる.FDの病態にCRFが関与するのなら,今回の研究結果は,非常に大きな意味を持つ.CRF2受容体刺激薬の投与により,FD症状が改善する可能性を示唆するからである.これらの仕事は,Neurogastroenterol Motil. 2013;25:190でpublishされた.それでは実際に,ストレスを与えたとき,胃収縮はどうなるかを調べたのが,次の仕事であり,ラットにwater-avoidance stressを負荷し,それを評価した研究成果は,現在論文として投稿中である.LPSをラットに投与すると胃収縮が抑制されるが,この反応は,urocortin2の前投与により阻止されることを明らかにした.これはLPSの胃運動抑制作用が,末梢のCRF2(CRF受容体サブタイプ2)signaling活性化によりブロックされることを示し,炎症と消化管運動,末梢CRF受容体のリンクの証拠を示す実験結果である.機能性消化管障害(FGID)の病態とその治療を考える上で,示唆的な結果であると考えられる.本論文はRegulatory Peptidesにacceptされ,in pressである.また末梢CRF受容体サブタイプ信号強度のバランスにより,ストレスによって誘導される消化管機能異常のパターンが決定されるという仮説を元に,大腸収縮と内臓感覚を測定する実験系で,CRF受容体サブタイプの役割を詳細に検討した.CRFを末梢投与すると大腸収縮は促進し,これはCRF1(CRF受容体サブタイプ1)を介する作用であり,一方CRFの投与前にCRF2拮抗薬を投与しておくと,このCRFの収縮促進反応は促進された.この結果はCRF2がCRF1のsignalingをmodulateすることにより,CRF1の効果に対して抑制的に働いていることを示している.つまりCRF1,CRF2の信号強度のバランスにより,大腸収縮活動は決定される.内臓感覚の実験系でも同様な結果が得られたことより,このCRF受容体サブタイプsignalingバランスが,ストレスによって誘導される消化管機能異常の病態理解のために重要であることを明らかにした.この仕事は現在投稿準備中である.研究期間全体を通して,オレキシン,CRFシグナルがFGIDの病態と関連する可能性を示すことができた.これらの事実を踏まえて,今後本疾患の治療法への応用へと研究を進めたい.オレキシンは胃収縮を促進し,また大腸収縮を促進させ便排出を促進させる.また迷走神経による胃運動促進効果は,内因性のオレキシンが関与することを明らかとした.さらにCRFの末梢投与は胃排出を抑制するが胃収縮を促進することをラットで示した.CRFはCRF1,2の2種類の受容体を介して作用するが,CRF1の刺激により胃収縮は促進し,CRF2はこれに拮抗する作用を持つことを初めて示すことができた.さらにwater-avoidance stressは胃排出に変化を与えないが,CRF1を介して胃収縮を促進させることを明らかにした.これらは,消化管機能障害の病態理解のために重要な結果である.オレキシンの胃運動への作用を,意識下非拘束のラットで検討した.オレキシンを大槽内に投与すると,胃運動は促進した.アトロピンを腹腔内投与すると,オレキシン中枢投与の刺激反応は阻止された.2-DGを静脈内投与すると,胃運動は促進した.オレキシンの拮抗薬である,SB-334687を大槽内投与すると,2-DGの促進反応は抑制された.以上より,内因性に分泌される脳内のオレキシンは,迷走神経を介して,胃運動を促進することを明らかにした.

さらにCRFとオレキシンのinteractionについて研究を進め,オレキシンの中枢投与による胃運動促進は,CRFの拮抗薬を中枢に投与しておくと,抑制されることが明らかとなった.一方CRFを皮下注すると,胃運動は用量依存性に促進した.CRFは末梢,あるいは中枢投与すると,胃排出は抑制されるが,末梢投与すると,胃運動は促進することが明らかとなり,胃排出の結果と相反する結果が得られた.この作用は末梢のCRF type1受容体を介する作用であり,CRFtype2受容体の刺激は,CRFの胃運動刺激作用を抑制した.これはストレスによって起きる生体反応には,必ずその反応にブレーキをかける経路が,生体の生存のために必要であるという仮説を裏付けるものである.一方ストレス負荷により,胃排出は抑制され,この作用は末梢のCRFtype2受容体を介することが明らかとなっている.しかし,実際に胃運動を測定すると,胃運動はストレス負荷中,著明に亢進している.これまでその機序が明らかとなっていなかったが,今回の末梢CRF投与による胃運動促進作用が,その機序である可能性が高くなった.さらに詳細な機序を説明するため実験を継続中である.これまでの2年を併せて,4編の論文publishと1編は現在submit中で有り,科学研究費を有用に使用していることの証明になると考えている.細かい計画は,全てクリアできていないが,仕事を進める上で,予想外の興味深い結果が得られたため,CRF関連の仕事の割合が多くなっている.しかし,論文3編のうち2編はorexin関連の仕事で有り,充分研究計画を遂行できていると考えている.計画通り,orexinの胃,大腸運動への作用とその機序を明らかとし,さらに末梢CRF受容体の胃収縮における役割を報告できた.H23年4月には,オレキシンの大槽内投与が大腸運動を促進し,便排出を促進させることを論文上で報告しており,今回の研究と併せて,オレキシンの上部,下部消化管運動への効果を明らかにしたこととなる.さらにCRFとオレキシンのinteractionの証拠を示し,CRFの末梢作用で,これまで全く報告されていない,胃運動促進作用を明らかとした.この事実の機序を,CRFサブタイプ受容体の作用より,その詳細を明らかとして,CRF受容体のcounter regulationと,生体がストレスに対応するための,その生理的な意義を示唆するに至った.当初の予想以上の成果,結果が得られたため,ストレスによる消化管運動の変化のその詳細なメカニズムを,新しい視点より解析ができている.ストレスによる消化管運動の変化をこれまで,orexin,CRFを中心に研究を進めてきたが,今後は運動機能だけではなく,内臓感覚機能の評価も併せて進める予定であり,これにこれらのneuropeptideがどのように関わっているのかを明らかにしていく.これは当初の研究計画にはなかったが,研究の進行上,必要な仕事であると判断した.また,CRFに関しては,サブタイプ受容体により,正反対の生理作用を引き起こしうることが明らかになったので,感覚機能でもそのことを確かめたい.すでにこの新しい実験系は確立しており,新しい機器を購入せず実験進行が可能になっている.またこの実験に絡んで,腸管の肥満細胞,セロトニンも腸管感覚に関与する可能性大で有り,さらにストレスによる内臓知覚の変化のメカニズムにも迫りたい.
特殊な脂肪酸を利用する神経再生医療法の検証

本研究は、「神経損傷や神経変性の新規治療法開発」と「神経細胞突起の伸長や分岐に関する新規機構の解明」という二つの究極的目標を有する。脳や神経細胞の脂肪酸組成が他の臓器と異なることは古くから知られているが、その差異が生じるメカニズム、および、生物学的意義の全貌は今なお未解明である。本研究では脳に微量に存在する特殊な脂肪酸が神経細胞に及ぼす影響を解析し、これを神経再生医療に応用する可能性を探る。
局所 Langlands 対応の幾何化

Fargues-Fontaine曲線上のベクトル束のモジュライスタックとその上のHeckeスタックを用いて定式化される局所Langlands対応の幾何化に関し,局所Langlands対応の関手性を幾何学的に実現するための設定について考えた.より具体的には,非アルキメデス的局所体上の準分裂簡約代数群Gとその極大不分岐トーラスTを考え,極大不分岐トーラスから簡約代数群への局所保型誘導を実現する空間の構成について考えた.Fargues-Fontaine曲線上でDeligne-Luszitig多様体の構成の類似をたどることによって,そのような空間の候補を構成した.構成においてはFargues-Fontaine曲線の無限次数の被覆を用いて,その被覆の上でのベクトル束のフィルトレーションをパラメトライズする空間を考えた.無限次数の被覆を考えるため構成した空間は無限次元の非常に大きな空間になるが,その空間がv位相に関してスタックになっていることを示した.また,その空間とFargues-Fontaine曲線上のベクトル束のモジュライスタックを用いて局所Langlands対応の関手性を幾何学的に実現する予想を定式化した.さらに,上記の空間の変種としてある種の有界性の条件を考えて定まる空間を定義した.この空間についても同様の予想を定式化し,その予想がGL(n)の場合に予想が正しいことを確認した.空間の構成及び予想の定式化を与え,予想の証拠も与えることができたので,おおむね順調に進展している.有界性の条件を付けた空間に関する場合の予想と,条件なしの空間に関する予想の関係について考える.研究推進のため必要に応じて,情報収集のための出張を行う.Fargues-Fontaine曲線上のベクトル束のモジュライスタックとその上のHeckeスタックを用いて定式化される局所Langlands対応の幾何化に関し,局所Langlands対応の関手性を幾何学的に実現するための設定について考えた.より具体的には,非アルキメデス的局所体上の準分裂簡約代数群Gとその極大不分岐トーラスTを考え,極大不分岐トーラスから簡約代数群への局所保型誘導を実現する空間の構成について考えた.Fargues-Fontaine曲線上でDeligne-Luszitig多様体の構成の類似をたどることによって,そのような空間の候補を構成した.構成においてはFargues-Fontaine曲線の無限次数の被覆を用いて,その被覆の上でのベクトル束のフィルトレーションをパラメトライズする空間を考えた.無限次数の被覆を考えるため構成した空間は無限次元の非常に大きな空間になるが,その空間がv位相に関してスタックになっていることを示した.また,その空間とFargues-Fontaine曲線上のベクトル束のモジュライスタックを用いて局所Langlands対応の関手性を幾何学的に実現する予想を定式化した.さらに,上記の空間の変種としてある種の有界性の条件を考えて定まる空間を定義した.この空間についても同様の予想を定式化し,その予想がGL(n)の場合に予想が正しいことを確認した.空間の構成及び予想の定式化を与え,予想の証拠も与えることができたので,おおむね順調に進展している.有界性の条件を付けた空間に関する場合の予想と,条件なしの空間に関する予想の関係について考える.研究推進のため必要に応じて,情報収集のための出張を行う.
ベクター媒介性感染症におけるベクター唾液の役割の解明

病原体の侵入口は“病原体と宿主防御機構の最初のせめぎ合いの場"で、そこで繰り広げられるイベントとその結果は、病態に大きな影響を及ぼす。本研究では、ベクター媒介性感染症の感染局所で繰り広げられるイベントについて、ベクター唾液成分が宿主の生理機能や免疫機構、病原体の感染に及ぼす影響を解明する。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。1)アジアに分布する吸血性サシガメTriatoma rubrofasciataの唾液腺遺伝子転写産物について、Triatoma属およびPanstrongylus属サシガメのそれらとの詳細な比較バイオインフォマティックス解析を行った。Triatoma rubrofasciataの唾液腺遺伝子転写産物は、これまで明らかにされているTriatoma属の唾液成分の相同分子に加え、複数の特徴的なKazal型セリンプロテアーゼインヒビター相同分子が多く含まれていることが分かった。また、これらKazal型セリンプロテアーゼインヒビター相同分子の組換えタンパクを作製し、その1つが血液凝固因子の酵素活性を阻害することを明らかにした。。2)アジア、アフリカに広く分布するサシチョウバエPhlebotomus papatasiおよびP. duboscqiのコロニーを維持し、人工吸血系を確立した。また、このサシチョウバエおよび人工吸血系を用いてリーシュマニア原虫の実験感染の確立にも着手し、効率よくリーシュマニア原虫を伝播する実験系を確立した。3)サシチョウバエの主要唾液成分の組換えタンパクを作製し、それらが血液凝固に及ぼす影響を検討した。内因系血液凝固系に作用するサシチョウバエ唾液タンパクを新たに同定することができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、ベクター媒介性感染症の感染局所で繰り広げられる初期のイベントについて、ベクター唾液成分が宿主の生理機能や免疫機構に及ぼす影響に着目して解析することを目的とする。1)サシチョウバエの唾液から、2つの異なるメカニズムで止血作用を阻害する物質を同定した。2)ベトナムにおいて近年刺咬症が問題となっているサシガメTriatoma (T.) rubrofasciataを採取し、そのコロニーの樹立に成功した。3)南米に分布するPanstrongylus (P.) chinaiの唾液腺遺伝子転写産物を解析し、それらはRhodnius属とは全く異なり、Triatoma属の唾液成分に近いことを明らかにした。4)P. chinaiの唾液腺からKazal型protease inhibitor構造を持つ物質を同定し、組換えタンパクを作製してその生理活性を検討したところ、血液凝固系の阻害活性を持つことを明らかにした。H27年度の研究では、Panstrongylus属のサシガメでは2種目となる、P. chinaiの唾液腺遺伝子転写産物の構成について明らかにすることができた。また、アジアに分布する吸血性サシガメT. rubrofasciataのコロニー樹立に成功し、唾液腺トランスクリプトーム解析を行うことができた。これは、アジアに分布する吸血性サシガメでの初めての解析となる。一方、唾液タンパクの性状解析については、既知のタンパクとは相同性のないサシチョウバエ唾液タンパクが、2つの機序で止血機構を阻害する物質であること、サシガメ由来の新規Kazal型protease inhibitor構造を持つ物質が抗凝固活性を持つことなど、新たな知見を得ることができた。1)サシチョウバエの唾液から、繰り返し配列の数が異なる3つの相同タンパクの組換えタンパクを作製し、凝固系に及ぼす役割を検討した。抗凝固活性自体は弱いものの、活性の強さは繰り返し配列の数に比例していた。今後より詳細な解析が必要である。2)Panstrongylus chinaiの唾液腺から同定したKazal型protease inhibitor構造を持つ物質の生理活性を検討し、このタンパクは内因系血液凝固因子FXIIaの酵素活性の阻害物質で、内因系血液凝固因子FIXa、外因系血液凝固因子FVIIa、共通系血液凝固因子FXaおよびトロンビン、カリクレイン・キニン系因子カリクレインに対しては阻害作用を示さないことを明らかにした。3)サシチョウバエの唾液タンパクが補体系に及ぼす役割を検討し、補体系の3経路(古典経路、レクチン経路、副経路)を阻害するタンパク、レクチン経路のみを阻害するタンパクを同定した。今後は作用機序など詳細な解析を行う予定である。唾液タンパクの性状解析については、サシガメP. chinai唾液腺由来の新規Kazal型protease inhibitor構造を持つ物質の生理活性を明らかにすることができ、また、サシチョウバエ唾液からは、異なる数のこれまで報告のない繰り返し配列を持つタンパクを同定するなど、新たな知見を得ることができた。さらに詳細な機能解析を行うことで、この繰り返し配列の意義を明らかにすることが期待される。一方、自然免疫系の中で重要な役割を果たす補体系に対して阻害作用をもつ唾液タンパクを複数見つけることができた。これらの相同物質は他の昆虫等で見つかっているものもあるが、補体系に影響を及ぼす報告はこれまでになく、今後は作用機序を詳細に解析する予定である。

病原体の侵入口は“病原体と宿主防御機構の最初のせめぎ合いの場"で、そこで繰り広げられるイベントとその結果は、病態に大きな影響を及ぼす。本研究では、ベクター媒介性感染症の感染局所で繰り広げられるイベントについて、ベクター唾液成分が宿主の生理機能や免疫機構、病原体の感染に及ぼす影響を解明する。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。1)コロニーの樹立に成功したアジアに分布する吸血性サシガメTriatoma rubrofasciataの唾液腺遺伝子転写産物について、詳細な比較バイオインフォマティックス解析を行い、その構成を明らかにした。また、Triatoma属、Panstrongylus属、Rhodnius属など他のサシガメの唾液との比較解析を行った。2)Panstrongylus chinaiの唾液腺遺伝子転写産物の詳細な解析を行い、その構成成分を明らかにした。また、唾液タンパクの70%程度を占めるリポカリンファミリーについて、より詳細な解析を行った。この結果、Panstrongylus属の唾液成分は、Rhodnius属よりもTriatoma属に近いことが明らかになり、また、分子レベルでもTriatoma属と類似したものが主要成分であることが分かった。3)アジア、アフリカに広く分布するサシチョウバエPhlebotomus papatasiおよびP. duboscqiのコロニー確立に成功した。現在、感染実験を念頭に、人工吸血系の確立を試みている。4)サシチョウバエおよびサシガメの唾液成分の組換えタンパクを作製し、それらが血液凝固に及ぼす影響を検討した。血液凝固系を阻害するタンパクがいくつか見つかってきた。コロニーの樹立に成功したアジアに分布する吸血性サシガメTriatoma rubrofasciataの唾液腺トランスクリプトーム解析、その中から多数の新規物質を同定することができた。これまでとは異なる次世代シークエンスを用いた解析で、膨大なデータ量を得ることができた。また、Panstrongylus chinaiの唾液の構成成分を明らかにし、主成分のリポカリンファミリーの詳細な解析を行い、結果は2報の論文として発表した。本研究は、Panstrongylus属のサシガメで2種目の唾液成分の報告で、Panstrongylus属サシガメの唾液要素や、それぞれのタンパクの二次構造はRhodnius属よりもTriatoma属に近縁であるこが明らかになった。一方、サシガメの唾液成分は属ごとに特徴的な構成をしており、属によって異なる吸血戦略を持つことが示唆された。サシチョウバエおよびサシガメの個々の唾液成分については、継続して生理活性の解明を行っている。また、サシチョウバエのコロニー飼育に日本で初めて成功し、今後は唾液成分のin vivoでの解析や、唾液がリーシュマニア感染に及ぼす影響についての研究の進展が期待される。
遺伝子組み換え技術を応用した覆髄剤の開発

ヒト組み換え骨シアロタンパク質の生化学的特性の解析昨年度の研究で、我々はバキュロウイルス発現システムを用いて、組み換えヒト骨シアロタンパク質(rhBSP)をSf9細胞内で65kDaおよび60kDaの分子量サイズで発現することに成功した。またcobalt affinity chromatographyを用いて、その精製に成功した。そこで今年度は、rhBSPの生理活性を調べる目的で、ウシ歯小嚢由来前駆体細胞(Bovine Dental Follicle Cells ; BDFC)に対する細胞接着活性を測定した。実験方法はrhBSPをコートした96-multi well plateに、[S^<35>]methionineでラベルした2×10^4個のBDFCを播種し、37°Cで1時間インキュベートを行った。接着した細胞数は、細胞を0.1%SDSで可溶化したのちに液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。その結果、rhBSPは、BDFCに対して有意に細胞接着活性を有することが認められた。以上の結果より、本システムは生理活性を有するrhBSPを発現させるのに有用である可能性が示唆された。しかしながら、本システムでは、創薬を主眼とした場合にタンパクの発現量に問題を残しており、現在より高い収量を得ることを目的として、in vitro translationsystemおよびタンパク高発現型昆虫細胞および改良型ベクターを用いた実験を立案中である。平成12年度の本研究では、バキュロウィルスを用いたタンパク質発現システムを用いて、ヒト骨シアロタンパク質の組み換えタンパク質(以下rhBSP)を作製し、その生化学的特性を解析することを目的とした。まず、健常ヒト歯胚組織よりtotal RNAを抽出し、RT-PCR法にてヒト骨シアロタンパク質のcDNAクローニングを行った。タンパク精製時に利用する目的で、得られたcDNAの5'末端に6個のヒスチジンをコードする塩基配列を繋いだ。このcDNAをバキュロウイルスゲノムに組み込んだ後、昆虫細胞であるSpodoptera frugiperda 9(Sf9)細胞に導入を行った。ウィルス感染後、タンパクの発現を確認する目的で、ウィルス感染細胞を溶解してSDS-PAGEを行い、抗ヒスチジン抗体を一次抗体としてwestern blottingにより検索したところ、rhBSPは60kDaおよび65kDa付近に存在するバンドとして検出され、rhBSPが昆虫細胞内に発現していることが確認された。さらに生理活性を調べる目的で、rhBSPを精製してdish表面にrhBSPのコーティングを行い、ウシ歯小嚢由来細胞に対する細胞接着活性を測定したところ、あきらかに接着活性を有していることが認められた。今後の展開としては、アミノ酸配列分析器にて内部アミノ酸配列を解析後、rhBSPの誘導する細胞接着機構を解明し、硬組織形成に与える影響を調べる必要があると考えられる。
層状ケイ酸塩と有機金属錯体とのナノハイブリッド型発光材料の創製

効率よく燐光発光するイリジウム錯体は、均一系では自己消光等が避けられず、効率の低下が懸念される。効率のよいイリジウム錯体の発光を得るため、層状ケイ酸塩の層間へのシクロメタル化イリジウム錯体の導入を試みた。生成物にはイリジウム錯体由来のMLCTが観測され、発光分析では可視光領域において発光が確認された。また、生成物の光物性は溶液系と比較して変化することが確認された。無機-有機ナノハイブリッド材料は、新物性・新機能発現の期待から、多くの注目を集めている。申請者は、これまでに層状ケイ酸塩のシリル化を活用し、新規無機有機ナノハイブリッドを創製するとともに、シリル化反応を制御し、新規ケイ酸骨格の構築に成功した。本研究課題においては、層状ケイ酸塩層間に光捕集アンテナとなり、かつ金属と配位結合を形成可能な分子を固定化し、その後、層間でEuやTbなどと反応させることにより、発光系ナノハイブリッド材料を創製することを目的としている。また、シリル化の反応条件を変化させ、金属種の配列を精緻に設計することにより、光物性を制御することを目的としている。本年度の研究では、高い熱的安定性を有し、結晶層表面に規則的に配列したSi-OH基を持つ層状オクトシリケートに対し、安息香酸エチルのp位がトリクロロシリルメチルで置換したシリル化剤を反応させ、層間に安息香酸エチルを固定化した後、層間のエトキシ基の加水分解によるカルボン酸への転換を試みた。シリル化生成物の層間隔(1.76nm)はオクトシリケートのケイ酸層の厚み(0.74nm)に比べ増加し、13C CPIMAS NMRより安息香酸エチル由来のシグナルを観測した。29Si MAS NMRの結果より、新たにT2環境にシグナルが出現し、Q3環境のシグナルは減少し、さらにそれらの積分強度比より、一つのシリル基は二つの層表面Si-OH基と反応し、層間を規則的に固定化していることが示された。また、塩酸処理後の試料において、XRDによる層間隔の減少および13C CP/MAS NMRにおけるエトキシ基由来のシグナルの減少を観測したことから、層間のエトキシ基の加水分解が示された。ナノゼオライト/希土類カチオン/有機物のハイブリッド化により1粒子で、RGB3色の発光を示すナノ結晶の創製が報告されている。このように不均一系の利用の中でもゲスト分子のシリカホスト材料への導入は発光特性を制御できる可能性を持つ。層状無機化合物は層間距離を変化させることにより様々な大きさの分子を層間に取り込むことができる。特に層状ケイ酸塩は層間に多くのOHまたはO-基が規則的に配列しているので、多くのゲスト分子を規則性を持って収容できると考えられる。発光材料としてイリジウム錯体は高い量子収率を示すことから注目を集めている。しかも、イリジウム錯体を不均一系へ導入した無機有機ハイブリッド系は自己消光による発光効率の低下を抑えることが期待される。本研究では、ホスト化合物である層状ケイ酸塩中でのイリジウム錯体の合成を試み、合成したイリジウム錯体-層状ケイ酸塩系の発光特性の変化について検討した。ICP分析ではC16TMA-Ir-Octosilicate、Ir complex-C16TMA-Octosilicateにおいて、Ir元素の存在が確認された。SEM像より、反応の前後で粒子の形態に大きな変化は観察されなかった。また、Ir complex-C16TMA-Octosilicateでは、吸収スペクトルのうちイリジウム錯体に由来するMLCT吸収が370nm付近に、発光スペクトルのピークが549nmに現れ、発光に対する励起スペクトルのピークが350nmに観測された。以上のことから、層状ケイ酸塩間でのイリジウム錯体の形成が確認された。
動脈硬化症における転写因子Nrf2の役割

これまでの培養細胞での研究より,Nrf2は血管内皮細胞では抗炎症作用を示す一方でマクロファージではスカベンジャーレセプターであるCD36を発現誘導し酸化LDLの貪食を促進すると考えられており,Nrf2の動脈硬化症での役割は不明であった.そこでNrf2の個体レベルにおける動脈硬化症への関与を調べるために,動脈硬化症モデルマウスであるApoE遺伝子欠損マウス(ApoEKO)とNrf2遺伝子欠損マウスをかけ合わせることによりApoE::Nrf2遺伝子二重欠損マウス(DKO)を作成した.このDKOマウスに高脂肪食を12週間投与し,大動脈における動脈硬化巣の形成を脂肪染色法により解析した.ApoEマウスでは動脈硬化巣が形成されるのに対して,DKOマウスでは動脈硬化巣が出来にくいことが明らかになった.このことは動脈硬化症おいては血管内皮細胞のNrf2よりもマクロファージのNrf2が動脈硬化巣の形成に大きく関与していると考えられる.また,マウスマクロファージ培養細胞にNrf2誘導剤であるDEMを処理したところ,酸化LDLを取り込んだマクロファージのアポトーシスを抑制するAIM(apoptosis inhibitor expressed by macrophage)が誘導されることが明らかになった.Nrf2はマクロファージにおいて酸化LDLに対するCD36を介した貪食能だけでなく細胞のアポトーシスを制御することにより動脈硬化巣形成へ関与していることが示唆された.個体レベルでマクロファージにおけるNrf2の役割を明かにするために,DKOマウスにApoEKOマウスの骨髄を移植し,動脈硬化巣形成への影響を現在解析中である.今回の個体レベルでの研究により動脈硬化巣形成に対してはマクロファージにおけるNrf2の役割が重要であることが示された.これまでの培養細胞での研究より,Nrf2は血管内皮細胞では抗炎症作用を示す一方でマクロファージではスカベンジャーレセプターであるCD36を発現誘導し酸化LDLの貪食を促進すると考えられており,Nrf2の動脈硬化症での役割は不明であった.そこでNrf2の個体レベルにおける動脈硬化症への関与を調べるために,動脈硬化症モデルマウスであるApoE遺伝子欠損マウス(ApoEKO)とNrf2遺伝子欠損マウスをかけ合わせることによりApoE::Nrf2遺伝子二重欠損マウス(DKO)を作成した.このDKOマウスに高脂肪食を12週間投与し,大動脈における動脈硬化巣の形成を脂肪染色法により解析した.ApoEマウスでは動脈硬化巣が形成されるのに対して,DKOマウスでは動脈硬化巣が出来にくいことが明らかになった.このことは動脈硬化症おいては血管内皮細胞のNrf2よりもマクロファージのNrf2が動脈硬化巣の形成に大きく関与していると考えられる.また,マウスマクロファージ培養細胞にNrf2誘導剤であるDEMを処理したところ,酸化LDLを取り込んだマクロファージのアポトーシスを抑制するAIM(apoptosis inhibitor expressed by macrophage)が誘導されることが明らかになった.Nrf2はマクロファージにおいて酸化LDLに対するCD36を介した貪食能だけでなく細胞のアポトーシスを制御することにより動脈硬化巣形成へ関与していることが示唆された.個体レベルでマクロファージにおけるNrf2の役割を明かにするために,DKOマウスにApoEKOマウスの骨髄を移植し,動脈硬化巣形成への影響を現在解析中である.今回の個体レベルでの研究により動脈硬化巣形成に対してはマクロファージにおけるNrf2の役割が重要であることが示された.本年度は以下の実験を実施した.1)内皮細胞におけるNrf2の役割の解析動脈硬化症を抑制するLaminar flowは,培養細胞での実験でNrf2を活性化することが明らかになっている.Laminar flowにより誘導されたNrf2標的遺伝子群は,血管内皮における炎症性のサイトカインや細胞接着因子などの発現を未知のメカニズムで抑制すると考えられている.そこで,Nrf2遺伝子欠損が内皮細胞の炎症性遺伝子の発現に与える影響を個体レベルで解析した.マウス大動脈を単離し,RT-PCRにより解析したところ,Nrf2遺伝子欠損マウスでは炎症性遺伝子であるICAM-1 VCAM-1,MCP-1の発現が野生型に比べて上昇しているという結果が得られた.2)Nrf2が動脈硬化症の病態形成に果たす役割の解析上記の結果から,Nrf2は内皮細胞において抗炎症性因子として機能していることが明らかになった.しかしながら,Nrf2はマクロファージにおいては酸化LDLにより活性化され,動脈硬化巣の形成に必須であるスカベンジャーレセプターCD36の発現を誘導することにより動脈硬化症を促進することが考えられている.そこで,動脈硬化症のモデルマウスであるApoE遺伝子欠損マウスとNrf2遺伝子欠損マウスを交配し,二重欠損マウスを作成して実際に動脈硬化症へのNrf2の関与を解析した.予備的な結果では,Nrf2欠損が動脈硬化症を抑制するという結果が得られた.これまでの培養細胞での研究より,Nrf2は血管内皮細胞では抗炎症作用を示す一方でマクロファージではスカベンジャーレセプターであるCD36を発現誘導し酸化LDLの貪食を促進すると考えられており,Nrf2の動脈硬化症での役割は不明であった.そこでNrf2の個体レベルにおける動脈硬化症への関与を調べるために,動脈硬化症モデルマウスであるApoE遺伝子欠損マウス(ApoEKO)とNrf2遺伝子欠損マウスをかけ合わせることによりApoE::Nrf2遺伝子二重欠損マウス(DKO)を作成した.このDKO

マウスに高脂肪食を12週間投与し,大動脈における動脈硬化巣の形成を脂肪染色法により解析した.ApoEマウスでは動脈硬化巣が形成されるのに対して,DKOマウスでは動脈硬化巣が出来にくいことが明らかになった.このことは動脈硬化症おいては血管内皮細胞のNrf2よりもマクロファージのNrf2が動脈硬化巣の形成に大きく関与していると考えられる.また,マウスマクロファージ培養細胞にNrf2誘導剤であるDEMを処理したところ,酸化LDLを取り込んだマクロファージのアポトーシスを抑制するAIM(apoptosis inhibitor expressed by macrophage)が誘導されることが明らかになった.Nrf2はマクロファージにおいて酸化LDLに対するCD36を介した貪食能だけでなく細胞のアポトーシスを制御することにより動脈硬化巣形成へ関与していることが示唆された.個体レベルでマクロファージにおけるNrf2の役割を明かにするために,DKOマウスにApoEKOマウスの骨髄を移植し,動脈硬化巣形成への影響を現在解析中である.今回の個体レベルでの研究により動脈硬化巣形成に対してはマクロファージにおけるNrf2の役割が重要であることが示された.
新しい高精度のモデル内殻ポテンシャルの開発とそれらの応用

これまで、LiKrまでの元素に関しては非相対論的モデル内殻ポテンシャル(MCP)を開発しているが今回はこれらの元素に対して相対論的MCPと基底関数を開発している。このMCPと基底関数を使って、スピン軌道相互作用を扱えるように改良を行っている。これらのMCPと基底関数を使い、ArI_2の2つの異性体の相対的安定性について調べるために、MRSDCI計算およびそのCEPA型バージョンであるMRCPA計算を行った。T字型が線形異性体より安定であるという結果が得られ、多参照配置を考えることの重要性を示した。また、TiCl,ZrCl分子の低い電子状態を計算し基底状態を求めるために、MCPと基底関数を使いMRSDCI計算とMRCPA計算を行った。TiCl分子では^4Φ状態が基底状態であったが、ZrCl分子では^2Δ状態が基底状態であることがはじめて明らかになった。
顔面の形態形成を制御する新規シグナルネットワークの解明

本研究では、形態形成を司るWntシグナルについて顎顔面の形成時におけるメカニズムを明らかにすることを目的とした。これまでWntシグナル阻害による細胞増殖活性の変化を調べたところ、DKK-1投与24、48時間後、BrdU陽性細胞数が有意に減少し、細胞増殖能が低下することを明らかにした。また、Bmp4、Tbx22、Sox9、Barx1遺伝子発現は、DKK-1投与1時間後有意に減少したが、Wntシグナルを活性化させるAlsterpaulloneを投与すると遺伝子発現が回復した。したがって、Bmp4、Tbx22、Sox9、Barx1は形態発生を司る因子であることから、Wntシグナルは上顎の形態発生に関与していることが確認された。昨年度は、chick embryoの上顎突起にAlsterpaulloneを投与すると、Msx1遺伝子発現が1.5倍に増加していることを明らかにした。平成30年度は、AlsterpaulloneによるN-cadherinの発現について免疫組織学的に調べたところ、Alsterpaullone投与24時間後から上顎突起にN-cadherinの発現上昇を認めた。N-cadherinは、軟骨形成に必要な軟骨細胞の凝集に関与する蛋白であり、その発現が上昇したことから、Wntシグナルを活性化すると軟骨形成が促進されることが示唆された。本研究では、形態形成の情報伝達となるWntシグナル経路について、顎顔面の形成時におけるメカニズムを解明することを目的とした。Wntシグナルを阻害するためにWntレセプターのantagonistとして、Dickkopf-1(Dkk-1)を用い、上顎突起と前頭鼻突起が癒合する時期(stage 20HH)に作用させた。ニワトリ胚をstage 20HHまでincubateしたのち、Dkk-1(1mg/ml)をBeadsに浸潤させておき、embryoの上顎突起に埋入した。Dkk-1投与による細胞増殖活性の変化を調べるため、BrdUをembryoの静脈に投与した。パラフィン標本を作成して、Diaminobenzidine(DAB)による免疫組織染色を行い、BrdU陽性細胞を測定した。その結果、Dkk-1投与24時間後、48時間後で、上顎突起におけるBrdU陽性細胞の発現割合が有意に減少した。以上の結果から、WntシグナルをDkk-1によってブロックすると上顎組織発生に関与するBmp4、Barx1、Tbx22遺伝子発現が有意に減少し、細胞増殖が減少することが明らかとなった。4.In vivo electroporationは、当初予定した実験器材が製造販売中止になり、別の実験器材に変更する予定である。本研究では、形態形成を司るWntシグナルについて顎顔面の形成時におけるメカニズムを明らかにすることを目的としている。WntレセプターのantagonistであるDickkopf-1(DKK-1)を上顎突起と前頭鼻突起が癒合する時期stage 20HHのchick embryoに投与すると、Wntシグナルが阻害され、唇裂と上顎骨の欠損を生じることが明らかとなっている。昨年度は、Wntシグナル阻害による細胞増殖活性の変化を調べるため、BrdUをembryoの静脈に注射し、DABによる免疫組織染色を行い、BrdU陽性細胞を測定した。その結果、DKK-1投与後24時間、48時間で、DKK-1投与群のBrdU陽性細胞の発現割合が有意に減少することを明らかにした。また、Beads埋入6時間後のembryoの上顎突起からreal-time PCRを行ったところ、上顎発生に関与するBmp4、Tbx22、Sox9遺伝子が有意に減少し、上顎突起内の細胞増殖が減少することを明らかにした。平成28年度研究計画の内、Wntシグナル阻害効果を検証するレスキュー実験を実施した(前述)。平成27年度から予定していたin vivo elecroporationは、実験器材が購入できなくなり(製造販売中止)、実験を中止した。平成27年度は、Wntシグナル阻害による細胞増殖活性の変化を調べた。BrdUを投与し免疫組織学的染色を行って、Beads周辺のBrdU陽性細胞数を測定した。DKK-1投与後24時間、48時間で、DKK-1投与群のBrdU陽性細胞の発現割合が有意に減少し、細胞増殖能が減少した。また、Beads埋入6時間後のembryoの上顎突起からreal-time RT-PCRを行ったところ、形態発生に関与するBmp4、Tbx22、Sox9、Barx1遺伝子発現が有意に減少した。平成28年度は、上記のDKK-1によるWntシグナル阻害を検証するために、DKK-1投与1時間後、Wntシグナルの細胞内伝達物質beta-cateninの分解阻害剤Alsterpaulloneを投与して上記のWntシグナル阻害が回復するかどうか調べた。その結果Bmp4、Tbx22、Sox9の発現が回復したことから、WntシグナルはBmp4、Tbx22、Sox9、Barx1遺伝子発現に影響を与えていることを確認した。平成29年度は、Wntシグナルの顎顔面形成への影響を調べるために、chick embryoの上顎突起にAlsterpaulloneを投与し、Wntシグナルをupregulateした。Real-timeRT-PCRの結果、Msx1遺伝子発現が1.5倍に増加していることが明らかとなった。

Msx1遺伝子は顎顔面の形成を司る主要な因子であり、Alsterpaulloneによって発現増加したことから、WntシグナルはMsx1遺伝子を介して顎顔面の発生・形成に関与していることが示唆された。平成29年度研究計画の内、Wntシグナルによる顎顔面形成への効果を検証するため、Alsterpaulloneを投与し、Wntシグナルをupregulateし、さまざまな遺伝子発現を測定した(研究結果は前述)。本研究では、形態形成を司るWntシグナルについて顎顔面の形成時におけるメカニズムを明らかにすることを目的とした。これまでWntシグナル阻害による細胞増殖活性の変化を調べたところ、DKK-1投与24、48時間後、BrdU陽性細胞数が有意に減少し、細胞増殖能が低下することを明らかにした。また、Bmp4、Tbx22、Sox9、Barx1遺伝子発現は、DKK-1投与1時間後有意に減少したが、Wntシグナルを活性化させるAlsterpaulloneを投与すると遺伝子発現が回復した。したがって、Bmp4、Tbx22、Sox9、Barx1は形態発生を司る因子であることから、Wntシグナルは上顎の形態発生に関与していることが確認された。昨年度は、chick embryoの上顎突起にAlsterpaulloneを投与すると、Msx1遺伝子発現が1.5倍に増加していることを明らかにした。平成30年度は、AlsterpaulloneによるN-cadherinの発現について免疫組織学的に調べたところ、Alsterpaullone投与24時間後から上顎突起にN-cadherinの発現上昇を認めた。N-cadherinは、軟骨形成に必要な軟骨細胞の凝集に関与する蛋白であり、その発現が上昇したことから、Wntシグナルを活性化すると軟骨形成が促進されることが示唆された。今後は、平成28年度の実験計画に沿って実施する。遺伝子発現に変化が見られない場合は、定量する遺伝子を変更する。また、Dkk-1によるWntシグナル阻害効果を検証するために、レスキュー実験として、Dkk-1投与1時間後、Alsterpaullone(GSK-3β;阻害剤)投与して、上顎突起を摘出後、RNAを抽出、上記のreal-time RT-PCRを行う。Dkk-1のWntシグナル阻害によるβ-catenin分解に働くGSK-3βを阻害し、Dkk-1によって減少したBmp4、Barx1、Tbx22をrescueできるかどうか確認する。また、Wntシグナル阻害による形態的変化を追跡するため、ほぼ顔面骨格が完成するstage 36(投与後10日目)のembryoを摘出し、顔面骨格および骨形成の状態を観察する次年度の研究実施計画に沿って実施する。具体的には:平成29年度が研究計画の最終年度にあたるため、まだ結果の出ていない実験を完成させるため期間を延長する。具体的には:Wntシグナルをup-regulateするAlsterpaulloneをembryoの上顎突起に投与し、BrdUによる細胞増殖能やcleaved caspase-3を用いたapoptosisの発現について調べる。