hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管内皮成長因子(VEGF)を併用した虚血心筋再潅流の研究

以上1)2)の結果には、モデルが実験に適さない可能性と、IGF-1や心電図非同期TMLRが無効である可能性の両者があると考えられたが、予算の制約から中動物モデルへの変更は断念した。またここ2年間で、心筋虚血に関する種々GF投与の効果、TMLRとのcombination therapyの効果についての報告がいくつかみられるようになり、心筋虚血に関する実験継続の意義も低下した。そこで、脊髄の虚血障害防止に対する各種GFの応用に実験の中心をシフトした。3)IGF-1はBBBを通過しないことが知られており、従来教室で脊髄虚血モデルとして用いてきたウサギ腎動脈下バルーン遮断モデルにおける応用を考慮して、ウサギくも膜下腔に留置カテーテルを挿入するモデルを検討した。(n=10)。しかし従来報告されている椎弓切除を伴う方法では、手術侵襲が大きく急性期死亡が多いため、本実験系には不向きであると判断した。そこで、実験動物をラットに変更し、くも膜下腔カテーテル留置慢性動物を作成した(n=3)。現在、胸部下行大動脈バルーン遮断による脊髄虚血障害モデルの確立に取り組んでいる。1)New Zealand White rabbitを用い、左前側方開胸にて左冠動脈前下行枝を結紮した急性心筋虚血モデルを作成した。1-2週の生存が可能であった。2)GF投与法について、予備実験として冠動脈内投与、心筋内投与を、本モデルにおける色素注入により検討した。冠動脈内投与は可能であったが、本モデルではその注入が不確実であることにより不適当と判断した。心筋内投与は、その広がりが限局しているため少量・多数の注入を要すること、本モデルでは注入時に不整脈等により血行動態が悪化することから断念した。以上の成績より、GF導入は全身投与を用いることとした。3)TMLRの実験モデルとしてのウサギモデルの可能性を検討した(進行中)。CO2レーザーの心電図非同期出力を用い、種々の直径のtransmyocardial channelを作成した。前下行枝領域の虚血領域に、3-5mm間隔で4-6個のchannnel作成が可能であるが、至適channnel直径と出力に関してはレーザー機器の限界もあり、更なる検討を継続中である。4)GF左房内投与による梗塞縮小効果について、作成したウサギ心筋虚血モデルにより検討した(進行中)。考えられる作用機序としては、急性実験であるため側副血流の増加よりapoptosisの抑制の方が重要ではないかと考え、現在虚血後4.5時間のinfarctarea/area at riskとapoptosisについて検討中である。GFとしては、VEGFよりもapoptosisの抑制が期待できると思われる他のものを検討中である。1) New Zealand White rabbitの左前側方開胸、左冠動脈前下行枝結紮による急性心筋虚血モデルを用い、IGF-1(ソマトメジン)1mgとvehicleの左房内投与の心筋梗塞縮小効果を検討した。検討項目としては虚血4.5時間のinfarctarea/area at risk、TUNEL法によるapoptosisの同定とH-E染色による病理組織所見を用いた。両群n=4まで施行したが、infarct area/oea at riskはばらつきが大きく一定の差異を認めなかった。これには、心筋梗塞モデル(再潅流を伴わない)の選択、GFとしてのIGF-1の選択と投与量、ウサギモデルの制約(GF投与経路の制約)などの要素が影響していると考えられるが、practicalには、ウサギモデルは標本自体が小さいためarea判定の誤差が大きくでるという問題点も有していた。現在、IGF-1投与量を変えた検討を試行中である。3)以上の成果をふまえ、また最近の海外での研究成績の動向(心筋虚血に関してはすでに数多くのGF没与が報告され、TMLRとのcombimtion therapyの実験もすでに散見されるようになっている)も考慮し、今後の展望としては、心筋以外の臓器、具体的には脊髄保護における各種GFの応用を視野に入れpilot studyを施行している。(n=10)。
無細胞化凍結気管をScaffoldとする気管再生と再生過程のin vivo観察

雑種犬(1416kg)の10軟骨輪長の縦隔気管を、-82°Cで保存してきた。これを37°Cの温浴で急速解凍、次にこれをノニオン系界面活性剤で処理し、組織内構成細胞ならびに各種蛋白質を完全除去し、無細胞化した。そして乾熱滅菌装置で滅菌処理、次に凍結乾燥機で真空乾燥させ、長期保存可能な状態とし、移植時は滅菌蒸留水にて膨潤させ、内腔に別に作製したステンレス製スパイラルステントを挿入、内腔を保持し気管Scaffoldとした。このScafoldを犬縦隔気管切除部へ移植し、有茎大網弁でScaffoldを全周性に被覆した。Scaffold単独群として移植実験を4頭に行ったところ、3頭は一ヶ月目から急激なScaffold内腔の狭窄みられ、2ヶ月目には気道開存率が10%以下となり犠牲死とした。残る1頭は術後4ヶ月まで、狭窄無く生着したが、絞掘性イレウスで失った。3頭の急激な狭搾原因としてScaffoldに抗原性が存在するのではないかとの仮説のもと、術後免疫抑制剤投与群を3頭作製した。しかし結果は同じであった。2005年度、赤外光観察が可能な拡大気管支鏡が導入。無細胞処理改良の間、気管Scaffoldとして吸収素材を導入、犬縦隔気管への移植を5頭行い拡大気管支鏡による血管新生の状態を赤外光システムにより観察を行った。その結果、インドシアニングリーンを静脈内投与し、約1分以内に生体気管表面の血管が観察された。同様に移植気管内腔表面の新生血管を観察したところ、ScaffoldのPoreに直接観察される血管はNative気管と同じ様に約1分以内で観察された。2006年度、面活性剤での脱細胞化の時間や凍結乾燥法を改良した気管Scaffoldを作製。さらに、内腔狭搾予防の止めPoly-L-Lactideでステントを作製し、移植後一ヶ月に挿入した。4頭の移植実験を行い、術後68ヶ月経過観察中である。Program freezerを使用せずDulbeco's modified Eagle's medium内マイナス82°Cで保存してき10軟骨輪長の犬気管を37°Cの温浴で急速解凍。次にこれをノニオン系界面活性剤で処理し、組織内構成細胞ならびに各種蛋白質を完全除去し、コラーゲン主体の無細胞化マトリックスとした。そして乾熱滅菌装置で滅菌処理、次に凍結乾燥機で真空乾燥させ、長期保存可能な状態とした。移植時は滅菌蒸留水にて膨潤させ、内腔に別に作製したステンレススパイラルステント(素材径0.3ミリメートル、5cm長)を挿入、内腔を保持しScaffoldの基本モデルとした。これを全身麻酔人工呼吸管理下、仰臥位で上腹部正中切開をおき開腹、まず有茎大網弁を作製。一旦仮閉腹、左側臥位へ体位変換する。右第四肋間で開胸、縦隔気管を10気管軟骨輪長切除。術野挿管で左肺への複雑分離換気下で全身麻酔を維持しつつ、Saffoldを移植、これに有茎大網弁を右胸腔内へ誘導被覆し、閉腹閉胸して手術を終了。まず、2頭の犬に移植実験を行った。2頭とも耐術し合併症もなかった。

術後一週目には気管支鏡検査で吻合部狭窄は無く、かつScaffold内は赤色調に観察でき、拡大気管支鏡では、血管新生を観察できた。しかし、術後1ヶ月で移植Scaffold内腔全体が狭窄し、犠牲死とした。組織の肥厚性瘢痕狭窄であった。この原因として、無細胞化処理した気管の抗原性が完全に除去されていなかった可能性を考慮、術後免疫抑制剤投与群を新たに作製することにし、2頭に移植実験を行った。免疫抑制剤は術直後に皮下に植埋したカプセルから除放させた。その結果は、Control群と同じであり、拒絶反応による狭窄ではないと考えている。そこで現在、新たな手法での無細胞化、更に早期の血管新生を誘導すべくScaffoldの多孔化を検討中である。雑種犬(1416kg)の10軟骨輪長の縦隔気管を、-82°Cで保存してきた。これを37°Cの温浴で急速解凍、次にこれをノ二オン系界面活性剤で処理し、組織内構成細胞ならびに各種蛋白質を完全除去し、コラーゲン主体の無細胞化マトリックスとした。組織の抗原性が存在しない事はHE染色で細胞が無核であることとした。そして乾熱滅菌装置で滅菌処理、次に凍結乾燥機で真空乾燥させ、長期保存可能な状態とし、移植時は滅菌蒸留水にて膨潤させ、内腔に別に作製したステンレス製スパイラルステントを挿入、内腔を保持し気管Scaffoldとした。移植手術は全身麻酔人工呼吸管理下、仰臥位で上腹部正中切開をおき開腹、まず有茎大網弁を作製。一旦仮閉腹、左側臥位へ体位変換する。右第四肋間で開胸、縦隔気管を10気管軟骨輪長切除。術野挿管で左肺への複雑分離換気下に全身麻酔を維持しつつ、気管Scaffoldで気道を再建した。同一の体位で再開腹し、経横隔膜的に有茎大網弁を右胸腔内へ誘導、移植したScaffoldを全周性に被覆し、閉腹閉胸して手術を終了した。Scaffold単独群として移植実験を4頭に行ったところ、術後一週目からScaffold内に組織侵入がみられたが、3頭は一ヶ月目から急激なScaffold内腔の狭搾がみられ、2ヶ月目には気道開存率が10%以下となり犠牲死とした。残る1頭は術後4ヶ月まで、狭搾無く生着したが、絞扼性イレウスで失った。3頭の急激な狭搾原因としてScaffoldに抗原性が存在するのではないかとの仮説のもと、術後免疫抑制剤投与群を3頭作製した。しかし結果は同じであり、現在無細胞処理の改良ならびに、Scaffoldの組織親和性を向上させる対策を行っている。また、拡大気管支鏡に関しては、赤外光観察が可能なNew modelを開発中であり17年4月に完成予定である。これを37°Cの温浴で急速解凍、次にこれをノニオン系界面活性剤で処理し、組織内構成細胞ならびに各種蛋白質を完全除去し、コラーゲン主体の無細胞化マトリックスとした。このScaffoldを犬縦隔気管切除部へ移植し、有茎大網弁でScaffoldを全周性に被覆した。
ワブラー法による電子ビーム制御を利用した高線量率Ｘ線フラットビーム治療装置の開発

本研究では、金属標的に衝突する電子の軌道を電磁場で制御することにより、発生する制動X線の分布を調整し、平坦な線量分布を生成する手法を提案した。これにより高線量率で平坦な線量分布の取得が可能となり、臨床でよく利用される照射野サイズにも適応できる。シミュレーションや基礎実験によって本手法の実現可能性を明らかにすることが本研究の目的である。最終年となった29年度は、前年度に実施した実験データに基づいたシミュレーションを継続して行った。得られたデータを元に創り出された平坦な線量分布に対して、それらの特性を定量的に評価・比較した。本研究で得られた成果は29年度7月にアメリカで開催された“The American Association of Physicists in Medicine"にて報告した(口頭発表)。さらにこれらをまとめた論文を執筆し、Medical Physics Journalに提出した。また27年度に、過去の患者データを用いて平坦なX線分布とそうでない分布の比較を、放射線治療に利用される治療計画装置を用いて実施し、論文にその成果をまとめた。前年度までにその論文の英文校正まで完了していたが、今年度は推敲した後Report of Practical Oncology and Radiotherapy Journalへ提出した。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は交付申請書に示したとおり、シミュレーションに基づいた本手法の妥当性検証と、購入した電磁界解析ソフトウェアによる磁場パラメータの導出の2点を軸に研究を実施した。さらに本手法が現在のX線治療装置にとって有用であることを、これまでの治療データを用いて検証を行った。以下にそれぞれの内容に対する結果を記す。(1)シミュレーションによる本手法の妥当性検証:モンテカルロシミュレーションによって、高線量率を維持したまま平坦な線量分布が取得できることを確認した。この結果はICRR 2015にて発表した。ただし、シミュレーション体系を簡便にして計算を行っていたこともあり、更なるシミュレーションを継続中である。(2)電磁解析ソフトウェアによる磁場パラメータの導出:平成28年度以降に実施予定の本手法の実現可能性を示すための実験を行う前段階の準備として、磁場パラメータを導出することは必須条件である。27年度中に導出することは出来なかったが、シミュレーションに必要な体系を現在構築中である。(3)過去の治療データの比較検討による本手法の有効性の検証:過去の強度変調X線治療を受けた患者データを利用し、平坦な線量分布とそうでない分布で治療計画を再び作成し、物理パラメータを指標に比較した結果、平坦な線量分布で作成した方が優れていることを確認した。この結果は、平坦な線量分布が比較的小さな照射野にも有効であることを示しており、本手法の有用性を示す結果となった。上記でも記したとおり、平成27年度はシミュレーションによる本手法の有効性の検証・磁場解析ソフトによる磁場パラメータの導出を行い、さらに当初計画をしていなかったが、本手法の有効性をより確かなものにするために、過去の治療データを利用し、治療計画装置による治療データの比較検証の3つを軸に研究を行った。現在までの進捗状況としては以下の通りである。(1)ミュレーションによる本手法の妥当性検証:上記にも示したとおり、モンテカルロシミュレーションによって本手法の有効性を確認することができた。これにより、従来の金属製の平坦化フィルタを用いた方法よりも、本手法が有効であることを示すことができた。ただしシミュレーション条件を簡便化して計算を実行したため、従来のX線治療装置のデータとの比較は出来ていない。詳細な体系を構築し、今現在更なる詳細なX線データを取得するためにシミュレーションを継続中である。(2)電磁解析ソフトウェアによる磁場パラメータの導出:平成27年度に購入した磁場解析ソフトによって、本手法の検証に必要な基礎実験で使用予定の電磁石の磁場パラメータを導出する予定である。計画上は平成27年度中に磁場パラメータの取得までを目指していたが、そこまでには至らず、現在シミュレーションに必要な体系を構築中である。(3)過去の治療データの比較検討による本手法の有効性の検証:この研究内容は、従来の計画には無いものだったが、本手法の有効性を示すためには必要な項目と判断して比較検証を行った。治療計画装置を用いた過去の患者データの比較に関しては結果が揃ったので、論文を執筆中である。ただし追加で検討が必要と考えている項目もあるため、別のソフトウェアを使用して検証し、その結果も論文に組み込む予定である。今回得られた結果は平成28年度中に学会で報告予定である。平成28年度は交付申請書に示した計画とは少し異なり、実験を基に研究を進めた。また前年度に実施した研究成果の論文を執筆した。以下今年度の進捗状況を記す。

(1)実験による本手法の有効性検証:昨年度はモンテカルロシミュレーションによって、高線量率を維持したまま平坦な線量分布が取得できることを確認したが、28年度は実験による実証を試みた。具体的には実験で取得した電子線の測定データをシミュレーションに組み込み、実験データに基づいたシミュレーションによる本手法の有効性を示すことである。実験は大阪大学産業科学研究所にある量子ビーム科学研究施設のLバンド電子線ライナックを使用させて頂いた。28年度中に実験を完了させ、測定データをモンテカルロシミュレーションに組み込ませて現在計算を実施している状況である。得られた結果は29年度7月にアメリカで開催される“The American Association of Physicists in Medicine"にて報告する予定である。(1)27年度に得られた研究成果のまとめ:放射線治療に利用される治療計画装置を基に、過去の患者データを利用し平坦なX線分布とそうでない分布の比較を実施した結果、平坦なX線分布の方が治療に適していると言う結果を得た。28年度はこの結果を第112回日本医学物理学会で報告した。論文も執筆しており、英文校正まで28年度中に完了させた。平成28年度は、実験を軸に研究を進めた。当初計画を立てていた様に、シミュレーションによる本手法の有効性の検証が完了した後、実験による有効性の検証に従って研究を進めている。現在までの進捗状況としては以下の通りである。(1)実験による本手法の有効性検証:“研究実績の概要"でも記載したが、28年度は実験を基に研究を進めた。当初は電磁石を実際に使用して電子ビームの軌道を調整し、本研究で提案した手法を検証する予定であったが、使用している照射室の制約等によって電磁石を使用することを断念した。そこで、電子線の実測データに基づくシミュレーションによって本研究の有効性を検証することを試みた。Lバンド電子線ライナックの使用にあたって、まずは電子ビームのエネルギーや強度、焦点サイズの調整から開始した。私が要求するライナックの運転条件が普段の使用条件と大きく異なることや、マシンタイムの制約などもあり、測定までに多くの時間を費やしてしまったが、なんとか28年度中に測定を終えることが出来た。測定内容としては、(i)電子線のエネルギースペクトル及び空間分布の測定、(ii)電子線を金属ターゲットに衝突させて発生するX線の空間分布測定の2点を実施した。(i)はシミュレーションに使用するための測定であり、(ii)はシミュレーション上で測定した電子線が問題なく再現されていること確認するために、シミュレーション上でX線の空間分布を計算し、この計算結果と比較するために実施した測定である。上記2点の測定を終え、(ii)に関してはシミュレーションと測定結果の良い一致も確認できた。
有機-化学反応の圧力制御に関するNMR的研究

(1)先年はシス-1,12-ジメトキシ[12]パラシクロファンの環プロトンのNMRシグナルを3900気圧まで追跡測定し、加圧によってこの分子のベンゼン環回転速度が増加することを明らかにした。この現象は回転の遷移状態の体積が原系の体積よりも小さいと言う、いわゆる負の活性化体積により説明される。なお、高圧になるに従い、回転速度の増加率は減少することも見いだした。これらの知見をふまえて、本年度はこの分子のメチレンループ内のプロトン化学シフトを4500気圧付近まで追跡測定した。その結果、ループの頂上にあるプロトンが4500気圧の加圧により0.050.1ppm高磁場にシフトする事がわかった。ベンゼン環による反磁性磁気異方性効果を想定すると、メチレンループが圧力変形して少し押しつぶされ、ベンゼン環面に0.10.5Å接近したと見積もることができる。上述の高圧領域における回転速度増加率の減少はループの縮小によってシクロファン分子の内部ポテンシャルが変化し、回転の圧力加速が阻害されたためであろう。(2)これと並行して、合成石英セルを用いる高圧NMR装置の改良開発にも力を入れてきたが、現在のところ6500気圧までの耐圧性能を有するNMRセルの試作に成功している。装置の性能テストも兼ねて、蛋白質を測定試料とした750MHz、3700気圧までの実験(赤坂教授との共同研究)をおこない、分子生物学上のきわめて重要な知見を得つつある。1.シス-1,12-ジメトキシ[12]パラシクロファンについて、その環プロトン波形を90MHz、Tc付近(133゚C)において約4000気圧まで追跡測定した。各圧力における波形をAA′BB′の4-スピン系としてQCPE-DNMR5プログラムにより解析し、ベンゼン環の回転速度を求めた。解析に必要な各圧力での化学シフト差はNMRタイムスケール上、環の回転をほぼ止めてみることの出来る400MHz高圧NMRの測定波形から決定した。加圧によって回転速度は増加することが確認できた(先に発表した2-スピン系としての近似計算の結果とほぼ一致)。この現象は負の活性化体積により説明される。なお、高圧になるにしたがい、回転速度の増加率は減少する事が明らかになった。400MHz高圧NMR測定によりメチレンブリッジ頂上のメチレンプロトンの高磁場圧力シフトが顕著であることが分かった。化学シフトに対する圧力効果への寄与因子は複雑で、詳しい解析は来年度の課題としたいが、定性的には加圧によってメチレンブリッジがわずかに縮小して頂上メチレンプロトンがベンゼン環に接近したため、環電流効果が増大したものと考えられる。上述の高圧領域における回転速度増加率の減少は、ブリッジの縮小によってシクロファン分子の内部ポテンシャルが変化し回転の圧力加速が阻害されたと考えることもできる。2.高圧NMR装置の改良開発もおこなったが、当初立案していた増圧機・セパレータアセンブリを用いる方法よりもセパレータ自体を設計変更して装置に組み込む方法が優れていることを見い出した。そこで増圧機・セパレータの購入はとりやめ、セパレータに特殊工作を施して使用した。上述したように90MHz、400MHzにおいて約4000気圧までの高圧実験をルーティン的に実施することが可能となった。なお装置の性能テストも兼ねて、蛋白質を測定試料とした750MHz、2000気圧までの実験を行い(赤坂教授との共同研究)、種々の重要な知見を得ている。

これらの知見をふまえて、本年度はこの分子のメチレンループ内のプロトン化学シフトを4500気圧付近まで追跡測定した。その結果、ループの頂上にあるプロトンが4500気圧の加圧により0.050.1ppm高磁場にシフトする事がわかった。ベンゼン環による反磁性磁気異方性効果を想定すると、メチレンループが圧力変形して少し押しつぶされ、ベンゼン環面に0.10.5Å接近したと見積もることができる。上述の高圧領域における回転速度増加率の減少はループ縮小によってシクロファン分子の内部ポテンシャルが変化し、回転の圧力加速が阻害されたためであろう。(2)これと並行して、合成石英セルを用いる高圧NMR装置の改良開発にも力を入れてきたが、現在のところ6500気圧までの耐圧性能を有するNMRセルの試作に成功している。装置の性能テストも兼ねて、蛋白質を測定試料とした750MHz、3700気圧までの実験(赤坂教授との共同研究)をおこない、分子生物学上のきわめて重要な知見を得つつある。
酸化ストレスによって障害を受けた精子機能に対する分子状水素の改善効果

本研究は、近年報告されたH2の医療への応用(水素分子医学)という革新的な研究の一端である。生殖医療におけるH2の応用研究は、本申請時点で申請者の研究グループ以外からの報告はまだない。このため、精子への酸化ストレス障害と、それにより引き起こされる受精脳の低下を水素が改善できるか確かめる本研究の独創性は極めて高い。現在までの研究成果より、マウス精子に過酸化水素を添加することで精子の運動機能低下を誘導する酸化ストレス障害モデル精子の実験系を確立した。そして、これにより生じる精子運動機能、体外受精による受精率および胚移植による個体発生率の低下に対するH2の抑制効果を検証した。その結果、H2によりマウス精子の運動機能改善効果を確認した。さらに今後の研究では、精子の機能低下とミトコンドリア活性に着目し、まだ未解明な部分の多いH2の分子レベルでの作用機序解明に向けた新たなデータを提供することができる可能性がある。本研究は臨床の観点からも極めて高い意義を持つ。不妊治療では可能な限りIVFが選択される。H2による精子運動性の活性化がIVFによる受精率向上につながれば、安全で効果的な新しい男性不妊治療法となりうる。また、凍結保存精子の出生率改善も期待できる。このように、本研究が遂行されれば、薬剤治療の困難な「生殖医療」に安全性の高いH2を応用することで、社会的問題となっている高齢出産における不妊を始めとした諸問題の解決への基盤となる知見を得ることができる。マウス精子に過酸化水素を添加することで精子の運動機能低下を誘導する酸化ストレス障害モデル精子の実験系を確立した。さらに、H2によりマウス精子の運動機能改善効果を確認した。精子ミトコンドリアに着目し、STED超解像顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて形態学的な観察と、蛍光プローブを用いたミトコンドリアの構造解析を可能にした。マウス精子においてH2が酸化ストレス防御機構を誘導するメカニズムについての研究昨年度に引き続き、H2飽和培養液の添加による運動性低下の抑制効果を、運動率から個体発生に至る過程で評価する。過酸化水素で上昇、H2添加によって抑制されるROSと過酸化脂質は定量的に測定する。さらに精子ミトコンドリア機能については膜電位とATPの変動について解析する。これらをSTED超解像顕微鏡、電子顕微鏡などより時空間的に解析することで、H2の酸化ストレス防御機構を分子レベルで解明する。このため、精子への酸化ストレス障害と、それにより引き起こされる受精能の低下を水素が改善できるか確かめる本研究の独創性は極めて高い。

このように、本研究が遂行されれば、薬剤治療の困難な「生殖医療」に安全性の高いH2を応用することで、社会的問題となっている高齢出産における不妊を始めとした諸問題の解決への基盤となる知見を得ることができる。マウス精子に過酸化水素を添加することで精子の運動機能低下を誘導する酸化ストレス障害モデル精子の実験系を確立した。さらに、H2によりマウス精子の運動機能改善効果を確認した。精子ミトコンドリアに着目し、STED超解像顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて形態学的な観察と、蛍光プローブを用いたミトコンドリアの構造解析を可能にした。マウス精子においてH2が酸化ストレス防御機構を誘導するメカニズムについての研究H2飽和培養液の添加による運動性低下の抑制効果を、運動率から個体発生に至る過程で評価する。過酸化水素で上昇、H2添加によって抑制されるROSと過酸化脂質は定量的に測定する。さらに精子ミトコンドリア機能については膜電位とATPの変動を測定し、これを制御するCa2+シグナルについて解析する。これらをSTED超解像顕微鏡などより時空間的に解析することで、H2の酸化ストレス防御機構を分子レベルで解明する。マウス精子においてH2が酸化ストレス防御機構を誘導するメカニズムについての研究昨年度に引き続き、H2飽和培養液の添加による運動性低下の抑制効果を、運動率から個体発生に至る過程で評価する。さらに精子ミトコンドリア機能については膜電位とATPの変動について解析する。これらをSTED超解像顕微鏡、電子顕微鏡などより時空間的に解析することで、H2の酸化ストレス防御機構を分子レベルで解明する。研究はおおむね順調に進んでいる、当初の計画よりも効率的に研究を進められたため、試薬、消耗品等の高額支出が少なく、人件費への支出がなかったため、次年度に繰り越すこととなった。繰り越した経費は引き続き、物品費、旅費、人件費等に計画的に使用する。今年度の研究はおおむね順調に進んでいるが、試薬、消耗品等の高額支出が少なく、人件費への支出がなかったため、次年度に繰り越すこととなった。繰り越した経費は引き続き物品日、旅費、人件費等に使用する様、計画的に使用する。
好塩基球からのヒスタミン遊離量を指標としたカルボプラチン過敏症の予測性評価

カルボプラチンは投与回数を重ねるとアナフィラキシー様症状を発症する危険性が高い。これまでに、アナフィラキシー様症状を呈する過敏症はI型アレルギー機序が有力と考えられ、カルボプラチンの皮内反応テストの有用性が報告されている。しかし、皮内反応試験の実施は、抗がん剤の被曝の観点から臨床応用は困難であることから、陽性検出率の高い安全な検出法の開発が切望されている。本研究では、I型アレルギーに特有であるヒスタミン遊離に着目して、カルボプラチンによる過敏症の予測性を評価した。三重大学医学部附属病院産科婦人科病棟に入院し、カルボプラチンによる過敏症の既往のある患者(発症群)又はカルボプラチンを8回以上投与し過敏症の既往のない者(未発症群)を対象とした。対象患者の末梢血を採取し、1、IgEモノクローナル抗体を用いて末梢血中の白血球を分離し、2、分離白血球にカルボプラチン希釈液を作用させてヒスタミン遊離反応を行った。そして、3、モノクローナル抗ヒスタミン抗体を用いて、遊離されたヒスタミンを酵素免疫測定にて測定した。カルボプラチン過敏症発症群7名と非発症群8名のヒスタミン遊離率の平均値は、それぞれ7.2%、1.7%であり、発症群で高かったものの有意な差はみられなかった(Mann Whitney-U test p=0.15)。過敏症発症群のうち、ヒスタミン遊離率10%を超えた患者はわずか1名であった。また、過敏症発症の前日に採血を施行した患者のヒスタミン遊離率は3.0%であり、顕著な上昇はみられなかった。以上の結果から、サンプルサイズの少ない検討ではあるが、本研究におけるヒスタミン遊離率によるカルボプラチン過敏症の検出感度は低く、また、過敏症の発症予測に対しても有用性を見出すことはできなかった。今後、カルボプラチンの過敏症については、感度の高い分子マーカーを探索していく必要がある。
樹状細胞分化におけるGATA2の機能同定－MonoMac症候群の病態解明－

MonoMAC症候群の責任遺伝子であるGATA2が免疫応答の中心となる樹状細胞の分化において果たす役割を解析した。GATA2の欠失により骨髄球系共通前駆細胞および樹状細胞共通前駆細胞からの樹状細胞分化が障害された。さらに、GATA2が骨髄球系前駆細胞においてGATA3などT細胞分化に関連する遺伝子発現を抑制した。GATA2が造血幹細胞の維持・増殖だけではなく、血球の分化過程でも重要な役割を果たすことが示された。転写因子GATA-2は、hematopoietic stem cell (HSC)の維持・増殖に必須の転写因子である。再生不良性貧血のCD34陽性細胞においてGATA-2の発現が特異的に低下していること、GATA-2がHOXB4遺伝子の発現を制御していること、さらにGATA-2が骨髄微小環境の構築に重要な間葉系幹細胞・前駆細胞の脂肪細胞への分化を制御していることが示されている。これらの知見は、骨髄におけるGATA-2の発現異常は造血幹細胞・間葉系幹細胞の機能異常をもたらし、血液疾患の発症に至ることを示唆する。2011年にHsuらが免疫不全を経てMDS/AMLを発症するMonoMAC症候群の責任遺伝子がGATA-2であることを報告し、GATA-2の先天的変異は造血不全にとどまらず、急性白血病にまで至ることが明らかになった。免疫応答の中心的役割を担う細胞は樹状細胞(DC)であること、MonoMAC症候群で減少・欠損している細胞の一つがDCであることから、MonoMAC症候群の病態解明にはDCの分化・機能におけるGATA2の役割を明らかにすることが必須である。本研究ではこれまでに、条件つきGATA-2 KOマウスを用いることで、GATA-2は造血幹細胞からcommon myeloid progenitor (CMP)、そしてcommon dendritic cell progenitor (CDP)に至る骨髄球系分化経路において重要な役割を果たしていることを見出している。さらに、GATA-2KOによる遺伝子発現の変化をマイクロアレイで確認し、GATA-2が制御する転写因子の同定を進めている。樹状細胞(DC)は免疫応答において中心的な役割を担うが,DC分化のメカニズムに関する理解は未だ不十分である。ヒトでは転写因子GATA2のヘテロ異常により単球の減少や細胞内寄生菌に対する易感染性,骨髄異形成症候群や急性骨髄性白血病への進展を特徴とするMonoMAC症候群を発症するが,同症候群では単球減少に加えて、DCも減少することが知られている。GATA2は造血幹細胞の維持・増殖に必須の転写因子であり、再生不良性貧血などの血液疾患との関連も報告されている。そこで我々はDC分化におけるGATA2の役割を解析した。はじめにGATA2ヘテロノックアウトマウスの解析したが,DCの数に有意な変化は認められなかった。そこでタモキシフェン誘導性GATA2条件付きノックアウトマウス(GATA2 flox/flox/ER-Creマウス)を作成し,in vivoでGATA2をノックアウトしたところ,DCの著明な減少が認めた。次にDC分化にかかわる骨髄前駆細胞を分取し,in vitroでGATA2をノックアウトしながらDC分化を誘導したところ,LSK, CMP,そしてCDPから産生されるDCの数が減少した。この結果からGATA2がDC分化の“骨髄球系分化経路"において必要な機能を有することが示唆された。DC分化誘導条件下でGATA2をノックアウトしたDC前駆細胞のマイクロアレイ解析では,骨髄球系転写因子の発現低下と,T細胞系転写因子の発現上昇が認められた。CMPでのChIP解析からGATA2はGata3のプロモーター領域下流への結合が認められ,レポーター解析では同領域へのGata2の結合はGata3の転写抑制に働いていることが示唆された。以上のことから、Gata2は血液前駆細胞において骨髄球系細胞とT細胞への細胞運命の決定を調節することによりDC分化に関与していると考えられる。樹状細胞(DC)分化におけるGATA2の役割を解析するためにタモキシフェン誘導による条件付GATA2ノックアウトマウス(GATA2flox/flox/ER-Creマウス)を作成し、GATA2ノックアウトの影響をin vivoで解析することに成功した。GATA2は造血幹細胞の増殖・維持に重要な転写因子であり、GATA2のノックアウトにより各段階の骨髄前駆細胞の減少が観察された。さらに、今回の解析対象であるDCだけでなく、好中球、リンパ球、単球の減少も観察された。次に試験管内で骨髄前駆細胞からDCへ分化させる培養法において、タモキシフェン誘導によるGATA2ノックアウトの系を確立した。この実験系により、どの段階の骨髄前駆細胞においてDC分化にGATA2が必要となるのかを同定することが可能となった。更には、骨髄前駆細胞においてGATA2をノックアウトすることにより、どのような遺伝子発現の変化が誘導されるかを解析することができた。この実験により、骨髄球系およびリンパ球系の分化に必要とされる転写因子群の変化が観察され、DC分化との関連について検討を進めることができた。MonoMAC症候群は易感染性などの免疫不全状態を経て、ときに骨髄異形成症候群や急性骨髄性白血病を発症する疾患である。その責任遺伝子として転写因子GATA2が知られている。MonoMAC症候群では免疫応答の中心的役割を担う樹状細胞(DC)の数も減少する。タモキシフェン誘導性の条件付きGATA2ノックアウトマウス

由来の造血幹細胞、前駆細胞を用いて解析を行ったところ、GATA2を欠失させると骨髄球系共通前駆細胞や樹状細胞共通前駆細胞からのDC分化が障害され、一方でリンパ球系共通前駆細胞や顆粒球/単球系前駆細胞からのDC分化は障害されないことが分かった。つまり、GATA2は造血幹細胞からDCへの骨髄球系分化経路においてより重要な役割を担っていることが示された。次に、DCの細胞表面マーカーであるCD11cを発現した細胞でのみGATA2を欠失するマウスを作製し、DCの機能発現におけるGATA2の役割を解析した。GATA2欠失により、DCの活性化と関連する細胞表面抗原、食作用、T細胞刺激能、アポトーシスなどの基本的なDCの機能に変化は認められなかったが、炎症性サイトカイン産性能に違いが認められた。MonoMAC症候群では青年期以降に臨床所見を呈する事が多く、発症には環境刺激が寄与している可能性がある。これはSPF環境下のマウスとヒトにおいて表現型が異なる原因かもしれない。以上の研究結果より、転写因子GATA2は血球分化の初期における役割を超えてより広い範囲で血液細胞の分化や機能発現に関わっている可能性が示唆された。また、骨髄の間葉系幹細胞においてGATA2を欠失させたマウスを用いた解析からもGATA2は骨髄微小環境において造血前駆細胞の分化調節に関わっている可能性が示されている。今後の研究により、MonoMAC症候群のさらなる病態解明が望まれる。MonoMAC症候群の責任遺伝子であるGATA2が免疫応答の中心となる樹状細胞の分化において果たす役割を解析した。GATA2の欠失により骨髄球系共通前駆細胞および樹状細胞共通前駆細胞からの樹状細胞分化が障害された。さらに、GATA2が骨髄球系前駆細胞においてGATA3などT細胞分化に関連する遺伝子発現を抑制した。GATA2が造血幹細胞の維持・増殖だけではなく、血球の分化過程でも重要な役割を果たすことが示された。DCの分化におけるGATA-2の関与を解析するためにGata2ヘテロ不全マウス、並びにGata2の第5エクソンの両端にloxp配列が導入されたGata2f/fマウスとER-Creマウスを交配することにより作成した条件付きGATA-2 KOマウス( Gata2f/f/ER-Creマウス)を用いた。Gata2ヘテロ不全マウスの解析ではDC分化にかかわる骨髄前駆細胞や脾臓のDC割合には有意な変化は認められなかった。一方、in vivoにおいてタモキシフェンを投与したGata2f/f/ER-Creマウスの解析では骨髄前駆細胞はほぼ消失し、脾臓におけるDCの割合は著明に低下した。しかしながら、GATA-2 KOによるHSCの枯渇によるものか、GATA-2がDCの分化を制御していることによるものかは不明であった。このため、DCの分化に関与する骨髄前駆細胞をsortingにより分取し、GATA-2をKOしDCへの分化誘導を行うin vitro培養系を確立した。
業績指標の多元化傾向と財務業績報告-アメリカの動きを中心に-

(1)平成16年度に十分明らかにできなかった問題点や渡米して入手した資料を中心に検討を加えた。とくに、損益計算書におけるirregular item(非経常項目)あるいは時価評価に伴う評価損益の取り扱いについてとくに問題となっていることに留意しながら、米国の会計基準設定動向について考察した。(2)米国企業のアニュアルレポート等にもとづき、これまでの損益計算書の様式の変化について考察した。従来、米国では、「無区分式」損益計算書が多かったのに対して、近年では逆に「区分式」損益計算書が多くなってきている。この点に着目しながら、いくつかの米国企業の損益計算書の様式の変化についてケース・スタディを行った。(3)これまで、米国会計原則において、「業績」ないし「業績観」がどのように論じられてきたのかについて、「当期業績主義対包括主義」論争に着目しながら、検討を行った。(4)業績報告問題に関する各国の動向、とくにアジア諸国での動きを知るため、シンガポールの職業会計士団体主催のワークショップに参加すると同時に、現地でヒアリング調査を行った。(5)2年間の研究の総まとめとして、米国における業績報告問題の動向についての論文を執筆した。米国では、依然として当期業績主義と包括主義に関する論争が燻り続けていること、その基底には、経営者の業績を重視すべきか企業の業績を重視すべきか(あるいは両者を区別すべきかどうか)という論点が横たわっており、こうした論点は、比較可能性の解釈や監査のあり方など会計・ディスクロージャー制度のあり方そのものにかかわる問題としても提起されていることが明らかとなった。この点を指摘して、米国と国際会計基準との業績報告の考え方の相違の背後にある会計思想の相違を明確にした。本年度、米国における業績報告の実務、制度面の全般的動向についてのサーベイと関係者へのヒアリング調査が中心となった。その概要は以下のとおりである。1.国際会計基準審議会の会計測定のフレーワークの内容を、米国財務会計基準設定機関FASBのフレームワークと比較しながら、検討を加えた上で、業績報告問題に関する内外の先行研究についてサーベイを行い、IASBにおける議論の動向とその特徴について整理した。その結果、IASBとFASBではそもそも時価評価の対象領域について異なる考え方をもっていたこと、まさに、そのことが、業績報告のあり方についての考え方が相違していることの基底的な要因となっていることが明らかとなった。これらの研究調査ついては、論文を作成し、すでに公表済みである。2.1990年代以降の業績報告とりわけ損益計算書における報告実務の傾向を、文献・資料を用いて調査を行った。その結果、米国では損益計算書におけるirregular item(非経常項目)あるいは時価評価に伴う評価損益の取り扱いについてとくに問題となっていること、このことが米国における業績報告に関する議論の一つの背景となっていることが明らかとなった。3.近年の米国における業績報告に関するFASBでの議論の動向を調査するため、これまでのボードミーティングの議事録を整理し、その上で、2度にわたり渡米し、FASBのボードメンバー等に対するインタビューを行った。このインタビューによって、FASB議論のプロセスが時系列的に理解でき、IASBにおける議論の内容との相違、さらには両者の間の考え方の隔たりの意味が明確となった。
大変位・低サイクル疲労を受けたコンクリート構造物の劣化度評価システムの開発

上記課題について平成8年度から3年間にわたって科学研究費補助金を受けて研究を行ってきたが、これまでに得られた研究成果についてまとめると次のようになる。コンクリート構造物が疲労劣化を起こすケースとして震災を被った構造物のように大きな変位・変形を受けて急激に劣化するケースと、橋梁上部工のように長い年月を経て徐々に劣化するケースがある。本研究は、主に前者を対象とするものであるが、荷重レベルの大きさと破壊に至るまでの荷重繰り返し回数には密接な関係があり、大変位・低サイクル疲労を受けた構造物の安全性や耐久性を評価するためにはその相互関係を理解する必要がある。そこで、鉄筋コンクリート(RC)構造物のモデル実験としてRC梁部材の曲げ疲労試験に関する室内実験を行い、超音波法やAE法を用いて荷重レベルの相違に基づく部材の疲労劣化度評価の可能性を検討した。その結果、超音波スペクトロスコピー法で得られる応答スペクトルや超音波伝播エネルギー、音速法で得られる超音波伝播速度、AE法で得られる単位時間当たりのAEカウント数やAE波形振幅分布などには、部材の疲労に伴う劣化度を評価するための有力な情報が含まれていることが明らかになった。例えば部材疲労過程で得られる応答スペクトル振幅は荷重繰り返し回数の増加に伴って漸次低下する傾向があり、その低下率は荷重レベルが大きいほど大きくなること、荷重繰り返し過程における単位時間当たりのAEカウント数は荷車レベルや荷重繰り返し回数の増加に伴って漸次増加する傾向があることなどが明らかになった。また、研究分担者(大津)の努力によりひび割れ発生に伴うAEの発生源位置評定の適正化に関するデータ処理法(SiGMA解析)の開発や、微小ひび割れ発生に伴うAE波形(せん断卓越型,引張り卓越型,混合型など)の分類方法としてのモーメントテンソル解析が開発された。これらの手法は部材の疲労劣化に伴う破壊過程を評価する上で有力な手段となっている。さらに境界要素法(BEM)を用いて部材の疲労劣化に伴う粘弾性応答解析を行った結果、ひび割れ進展に伴う応答振幅の変化やピーク周波数の変化が確認された。そこで、これらの手法を組み合わせることにより鉄筋コンクリート構造物の荷重繰り返しに伴う疲労劣化度評価がほぼ可能になり、その評価システムの構築が可能になったと考えている。しかしながら、実験室内では地震を被った構造物の劣化状況を効果的に再現することが困難であるため未だ十分とは言い切れず、今後この方面の益々の発展が期待される。本研究は、震災を受けた構造物のような大変位・低サイクル疲労を受けた構造物の安全性や耐久性に関する疲労劣化度評価法を開発することを目的としている。本研究では、主に弾性波や超音波を利用したいくつかの方法を併用し、それぞれの方法で得られたデータを大容量のパソコンで収録、解析して構造物の状態を評価する方法について検討している。これを実現するために、本年度はこれに用いるパソコン一式(PC-9821 XV20/W30,その他)を購入した。そして、超音波スペクトロスコピー法で用いる岩崎通信社製の波形解析器(SM-2100C)とAE計測で用いるNF回路ブロック社製のU-プロット(9502)をGP-IBケーブルでパソコンに接続した。

また、マイクロソフト社の基本ソフト(ビジュアルベーシック・プロ)を購入して、データ取り込み方法について現在検討中である。なお、この基本ソフトの取り扱いについて不慣れであるため、データ取り込み方法、および、これを用いてデータを分析あるいは解析するソフトの開発は次年度に残された。超音波スペクトロスコピー法では、120kHz間や1400kHz間の比較的高い周波数帯域の応答スペクトルを利用して、主に構造物の材料劣化に伴う疲労度や部分的欠陥の評価に用いる。AE法は、構造物の疲労過程で発生するAEの頻度分布や振幅分布等を利用して構造物の疲労劣化度評価に用いる。今後、さらに構造物の構造的欠陥を評価するために、インパクトハンマーによる打撃応答法を併用して構造物の低周波数領域(1kHz以下)の挙動を解明するための方法について検討する予定である。これらのデータを用いて各種欠陥を推定する評価システムの構築は、現在進行中である。一方、鉄筋コンクリート梁(幅15cm,高さ20cm,長さ120cm)の繰り返し曲げ疲労試験を行って、鉄筋コンクリート(RC)梁の曲げ疲労過程における超音波応答スペクトルや単位時間当たりのAE発生率等を計測し、梁の疲労度との関係を調査している。そして、その成果を1997年度JCI年次論文報告集に現在投稿中である。本研究は、震災を被災した構造物のように、大変位・低サイクル疲労を受けた構造物の安全性や耐久性に関する疲労劣化度評価を行うための手法を開発するためのものである。コンクリート構造物の疲労劣化のメカニズムは複雑であるため、ある1つの方法では疲労劣化の程度を精度良く評価することは困難と考えられる。そこで本研究では、超音波や弾性波を利用した方法として、主に超音波スペクトロスコピー法,音速法,インパクトエコー法,アコースティック・エミッション(AE)法等を組み合わせた手法を用いて、繰り返し曲げ疲労を受ける鉄筋コンクリート(RC)部材の劣化度評価法について検討している。本研究に関する本年度(平成9年度)における活動の結果、超音波スペクトロスコピー法とAE法で得たデータをパソコンに取り込んで解析する手法については、おおよその目途を立てることが出来る様になった。また、本実験で使用する梁供試体製作用型枠も出来上がり、現在本格的にRC部材の曲げ疲労試験を実施している。そして、実験結果と理論との整合性を明らかにするため、共同研究者(大津)の協カを得て、境界要素法(BEM)による粘弾性解析によるモデル化されたRC部材の疲労劣化に関する数値解析を実施している。なお、音速法とインパクトエコー法によるデータをパソコンに取り込む方法については、若干の装置の追加の必要性も考えられ、未だ未解決の状態であり、現在検討中である。なお、1998年7月に実施が予定されている土木学会構造工学委員会・構造物診断研究小委員会主催の「構造物の診断に関するシンポジウム」に、本研究成果の一部を発表する予定である。
アポA-I模倣ペプチドによる末梢動脈疾患の多面的治療戦略

C57/BL6マウスの下肢動脈の結紮、除去を行った後にレーザードップラーで虚血肢の評価を行い、結紮の部位や方法の検討を重ね、最適な下肢虚血作成の方法と安定して同程度の虚血を作成できることを確認した。次に、C57/BL6マウスおよび高脂肪食を負荷しHDL機能低下、内皮機能低下を有するC57/BL6マウス(高脂肪食マウス)の下肢動脈の結紮、除去を行い、下肢虚血モデルマウスを作成した。予備実験として5週間FAMPまたはPBS (Control群)を腹腔内投与、または筋肉内への投与を行い、レーザードップラーで下肢虚血の改善の検討を行った。その結果、腹腔内投与よりも筋肉内投与の方が虚血改善効果の大きいことを見出した。そのため、本実験ではFAMPを筋肉内投与する方針とし、通常食または高脂肪食を負荷したC57/BL6マウスにFAMPまたはPBSを5週間、筋肉内投与行い、レーザードップラーで下肢虚血の回復の程度を測定した。下肢虚血の改善は、高脂肪食を負荷しPBSで治療したマウスが最も悪かったが、FAMPの投与により、著明な虚血の改善を認めた。次に、治療後の筋肉組織の新生血管の評価をCD31染色により行い、FAMP群で新生血管が増加していることを確認した。また、治療後の血中の脂質プロファイルの検討も行った。FAMP投与による全身への影響を見るために、FAMP投与後の下肢虚血モデルマウスのHDLの機能(コレステロール引き抜き能、抗酸化能)の検討と、FAMP短期投与後の血中への血管内皮前駆細胞の動員をフローサイトメトリーで検討した。さらには、FAMPの虚血肢の機能に対する効果をみるために、Cat Walkシステムを使用し歩行機能の測定を行い、虚血作成後1週間でFAMP群がControlと比較して歩行能が有意に改善していることを確認した。現在までに末梢動脈疾患の患者では、活性酸素産生の原因となるNADPHoxidaseが増加していることが報告されている。また、NADPH oxidaseの増加は、内皮機能不全へ繋がるeNOSのuncouplingと関係している。一方でHDLは酸化ストレスを軽減し、内皮機能を改善することが分かっている。そこで、FAMPの活性酸素産生の経路に対する影響を調べるため、FAMP投与群と非投与群で虚血肢中のNADPHoxidase 2 (NOX2)を測定した。その結果、FAMP群で有意に減少していることが分かった。これにより、FAMPがeNOSの活性に関与している可能性も考えられた。次にin vitroの実験で、FAMPによるヒト血管内皮細胞に対するeNOS活性化、細胞内伝達因子への影響を検討した。その結果、FAMPは血管内皮細胞におけるAkt、ERK、eNOSを活性化させることが分かった。PI3K/Aktの阻害薬であるLY294002はFAMPによるeNOSの活性化を阻害したが、ERK阻害薬であるPD98059ではeNOSの活性化は阻害されず、FAMPのeNOS活性化作用はPI3K/Aktの経路を介していると考えられた。さらにFAMPの効果を検討するため、scratch injury modelで血管内皮細胞遊走能への影響を検討した。その結果、FAMP群はcontrolと比べ有意に遊走能が増強しており、NO産生阻害薬であるL-NAMEはFAMPによる内皮細胞の遊走促進作用を阻害した。さらに通常食群と高コレステロール食群のマウスのHDLを用いて、そこにFAMPをincubationしたものを添加したところ、高コレステロール食群マウスのHDLによる遊走能の改善を認めた。研究目的であった血管内皮細胞を使用したin vitroにおけるFAMPの血管新生メカニズムを明らかにすることは、ある程度実現できているため。下肢虚血モデルマウスと血管内皮細胞を使用し、FAMPの虚血改善効果及びそのメカニズムについて検討した。下肢虚血の改善は高脂肪食を負荷しPBSで治療したマウスが最も悪かったが、FAMPの投与により、著明な虚血の改善を認めた。次に、治療後の筋肉組織の新生血管の評価を行い、FAMP群で新生血管が増加していることを確認した。歩行機能の解析では、虚血作成後1週間でFAMP群がControlと比較して歩行能が有意に改善していることを確認した。一方で、FAMP投与によるHDL機能(コレステロール引き抜き能、抗酸化能)の増強は認められなかった。また、FAMP群の末梢血液中におけるEPCの動員の増加も認められなかった。ヒト血管内皮細胞を使用した実験では、FAMPは内皮細胞におけるAkt, ERK, eNOSを活性化させ、内皮細胞の遊走能を促進した。PI3K/Aktの阻害薬であるLY294002はFAMPによるeNOSの活性化を阻害し、NO産生阻害薬であるL-NAMEはFAMPによる内皮細胞の遊走促進作用を阻害した。また、eNOSノックアウトマウスにはFAMPの下肢虚血改善効果は認められなかった。以上の結果より、FAMPは高脂肪食マウスにおける下肢虚血からの回復を、PI3K/Aktを介したNO産生の経路により促進することが分かった。FAMP局所投与によるHDL機能の増強やEPC動員等の全身作用は認められず、局所でその効果を発揮しているものと考えられた。

PETを使用したイメージングの結果からもFAMPが動脈のプラークに留まり作用を発揮することが分かっており、従来の治療とは全く異なり、生体で実際に動脈硬化が存在する部位に作用してアクティブな末梢動脈硬化疾患の治療ができる可能性を秘めている。本研究結果より、FAMPの投与は末梢動脈疾患における魅力的な治療戦略となり得ることが考えられた。当初の予定通りに、アポA-I模倣ペプチドFAMPによる下肢虚血改善作用をレーザードップラーで証明し、新生血管の評価ができたため。FAMPの効果的な投与方法、脂質輸送体・受容体の検討や、FAMPによる血管新生遺伝子導実験を行う。動脈硬化今後は血管内皮細胞などを使用し、in vitroにおけるFAMPの血管新生メカニズムの検討を行っていく。最小限のサンプル測定で結果を出すことができたため、その分繰越金が発生した。今後の推進方針であるFAMPの効果的な投与方法、脂質輸送体・受容体の検討や、FAMPによる血管新生遺伝子導実験に必要な試薬などの購入を行う。