hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軟体動物前鰓類におけるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）の性状及び生理機能解析

イボニシから脊椎動物のRARとアミノ酸配列の相同性が比較的高いRAR様配列(イボニシRAR)が単離された。All-transレチノイン酸(ATRA)添加時のウエスタンブロットにより、イボニシRARタンパクは発現したが、転写活性は誘導されなかった。イボニシRARとヒトRARαのリガンド結合部位を融合させATRA, 9-cisレチノイン酸, 13-cisレチノイン酸, All-transレチノール添加時でもイボニシRARの転写活性は誘導されず、イボニシRARのDNA結合部位をヒトRARαリガンド結合部位と融合させると転写活性が誘導された。イボニシRARとRXRは相互作用すると考えられた。イボニシ腎臓及びペニスより抽出したRNAからRAR様配列(イボニシRAR)を単離した。この遺伝子のアミノ酸配列の比較より、今回得られた配列は脊椎動物のRARと相同性が比較的高いことが分かった。この配列を用い、ミドリザル腎臓由来の細胞に導入し、All-transレチノイン酸(ArRA)添加時のウエスタンブロットによるタンパク発現の確認と転写活性の測定を行った。イボニシRARタンパクの発現は確認できたが、転写活性の誘導は認められなかった。そこで導入細胞をヒト肝臓由来の細胞に変更し、イボニシRARとヒトRARα、β、γとを用い、二種類のレチノイン酸応答配列を用いた時の転写活性の測定を行った。ヒトRARを用いた場合、転写活性の誘導が認められたが、イボニシRARを用いた場合では誘導が認められなかった。この転写活性の非誘導の原因を探るため、イボニシRAR及びヒトRARαのリガンド結合部位をGAL4DNA結合部位と融合させ、転写活性の測定を行った。ヒトRARαリガンド結合部位を用いたアッセイではArRA,9-cisレチノイン酸,13-cisレチノイン酸,Ail-transレチノール添加時に転写活性の誘導が認められたが、イボニシRARでは何れの物質添加でも誘導が認められなかった。次にイボニシRARのDNA結合部位をヒトRARαリガンド結合部位と融合させ、転写活性の測定を行ったところ、転写活性の誘導が認められた。さらに、イボニシRARとイボニシRXRとの相互作用を調べるため、TwoHybridAssay法を行った。その結果、RARはRXRが存在する場合に転写活性が誘導され、イボニシR,ARはRXRとの相互作用があると考えられたo以上により、今回得られたイボニシのRAR様配列は、ほ乳類で知られている生体内リガンドであるArRAによる転写活性誘導は生じないものの、レチノイン酸応答配列は認識する可能性があることや、RXRと相互作用があると考えられることより、未知のリガンドを標的とするオーファン型の受容体であることが示唆された。この配列を用い、ミドリザルの腎臓由来の細胞に導入し、All-transレチノイン酸(ATRA)添加時のウエスタンブロットによるタンパク発現の確認と転写活性の測定を行った。ヒトRARでは転写活性の誘導が認められたが、イボニシRARでは誘導は認められなかった。この原因を探るため、イボニシRAR及びヒトRARαのリガンド結合部位をGAL4 DNA結合部位と融合させ、転写活性の測定を行った。ヒトRARαリガンド結合部位を用いたアッセイではATRA, 9-cisレチノイン酸, 13-cisレチノイン酸, All-transレチノール添加時に転写活性の誘導が認められたが、イボニシRARでは何れの化学物質添加時でも誘導は認められなかった。さらに、Two Hybrid Assay法によりイボニシRARとイボニシRXRとの相互作用の有無を調べた結果、RARはRXRが存在する場合に転写活性が誘導され、イボニシRARとRXRとの相互作用があると考えられた。以上の結果を論文にまとめ、公表した(Aquatic Toxicology, 2013, 142-3: 403-13)。一方、有機スズ化合物によるインポセックス誘導について、作用する有機スズの化学種に種差が示唆されている。

そこで、イボニシ、ヨーロッパチヂミボラ及びバイの3種類の前鰓類のRXRを用いて、転写活性の比較を進めている。有機スズ化合物による巻貝類(前鰓類)のインポセックス誘導には有機スズの化学種による種差が示唆されているため、イボニシ、ヨーロッパチヂミボラ及びバイの3種のRXRを用いて、転写活性の比較を行った。イボニシRXRには少なくとも2種類のvariantが存在するが、これらのvariantは上述のいずれの種においても同様に存在することが分かった。得られたこれらの配列を用い、レポータージーンアッセイ法により、16種類の有機スズ化合物(メチルスズ4種、エチルスズ3種、ブチルスズ4種、トリプロピルスズ(TPrT)、トリシクロヘキシルスズ(TcHT)及びフェニルスズ3種)による転写活性の誘導を測定した。何れの種のRXRでもトリブチルスズ(TBT)、テトラブチルスズ、トリフェニルスズ、TPrT、TcHTにより有意な転写活性の誘導が認められた。この結果を基に、上記のvariantにおける有機スズ化合物による反応性の差異を調べるため、複数の応答配列を用いてRXRのvariant毎の転写活性を測定し、有機スズ化合物の化学種による転写活性の種差及び、variantの転写調節機構における役割を評価・比較した。RXR遺伝子と協調的に働き得る遺伝子として、レチノイン酸受容体(RAR)や甲状腺ホルモン受容体、PPAR、FXR、LXR等の様々な受容体が脊椎動物・無脊椎動物に存在する。現在までに、ほ乳類RARと相同性のある遺伝子をイボニシから単離し、機能同定を行ってきた。一方、昆虫や甲殻類においてTBTがエクジソン受容体(EcR)の活性等に影響を及ぼすとの報告があり、EcRはRXRやUSPのヘテロパートナーであるが、現在までに軟体動物におけるエクジソンの役割は明らかとなっていない。われわれは、昆虫や甲殻類の脱皮や生殖腺の発達・成熟等を調節するEcRと類似した遺伝子をイボニシより単離した。これを用いて全長配列のクローニングを行い、機能同定を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。海洋生態毒性学26年度が最終年度であるため、記入しない。それぞれの実験が的確に実施されている(手法のミスがないとみられる)こと、並びに作業仮説の検証が現在まで順調に進展していることによると考えられる。イボニシRARの性状及び機能解析の結果を取りまとめた論文が公表され、また、有機スズの化学種別の転写活性能比較も順調に進んでいるため。引き続き、研究計画に沿って本研究を推進する。さまざまな有機スズ化合物によるRXRの転写活性能を前鰓類の代表種(イボニシ、バイ及びヨーロッパチヂミボラ)を用いて比較し、種差について取りまとめるとともに、生殖腺を中心としたイボニシの軟組織におけるRAR及びRXRの局在を、現在までに得られているRXR及びRARのcDNAを鋳型とし、DIG標識されたプローブを作成し、in situ hybridization法により調べる。また、これまでに、昆虫や甲殻類においてTBTがエクジソン受容体の活性などに影響を及ぼすなどの報告がなされており、エクジソン受容体はRXR受容体やUSP受容体のヘテロパートナーであることが知られているが、現在までに軟体動物においてエクジソンの役割は明らかとなっておらず、不明な部分が多い。
焼結助剤を含んだ炭化ケイ素スラリーの立体造形

構造用セラミックスは焼成用窯道具のほかセラミックスバーナーやメカニカルシールなどに用いられ、強度に加えて要求される形状・サイズに対応しなければならない。しかし、セラミックスは焼成による収縮に加え、成形時に変形することからニアネット成形が困難であった。そのため、製品に合わせた複雑な窯道具の作製をしなければならないというニーズに対応できていない。近年、立体造形に関する技術が進歩し、樹脂による立体物などの作製が実用化されている。一方、炭化ケイ素は、焼結助剤として炭素、炭化ホウ素などの添加が必要不可欠である。耐火材では、アルミナファイバーやカーボンファイバーなどといった断熱効果に優れる断熱材への変更が検討され、窯道具については緻密化・薄肉化が検討されている。しかし、窯道具の形状は焼成物の形状やサイズに依存するために、製品に合わせた複雑な窯道具の作製をしなければならないというニーズに対応できていない。近年3D造形技術が脚光を浴びるようになり、この技術を用いて立体成形できれば、(a)小ロットでのセラミックス製品は直接成形による製品化、(b)ある程度ロットが大きいものであれば立体造形物を製品の原型モデルとして使用できると考えられる。本研究ではインクジェット方式の立体造形法をその候補と位置づけ、インクジェットヘッドから吐出された紫外線硬化樹脂を含有したスラリーを紫外線照射によって硬化することによって型を用いずに成形体を得ることについての基礎的な検討を行った。構造セラミックスの一つである炭化ケイ素をインクジェット方式で立体造形を達成するために炭化ケイ素の紫外線硬化樹脂スラリーの調製方法について検討を行い、その紫外線照射固化挙動の知見を得ることができた。本研究ではインクジェット方式の立体造形法をその候補と位置づけ、インクジェットヘッドから吐出された紫外線硬化樹脂を含有したスラリーを紫外線照射によって硬化することによって型を用いずに成形体を得ることを検討する。平成28年度は、構造セラミックスの一つである炭化ケイ素をインクジェット方式で立体造形を達成するために炭化ケイ素と焼結助剤を混合した紫外線硬化樹脂スラリーの調製方法を検討して、その紫外線照射固化挙動の検討を行った。インクジェット方式で吐出するため、これまでの研究結果からスラリー粘度は40 mPa・s以下、表面張力を7080 mN/m以下にする必要がある。これら条件を達成するため、下記に示す研究要素を評価し、各要素と粘度表面張力の相関を調べ、紫外線硬化樹脂を用いて20 vol%以上の焼結助剤を含む炭化ケイ素スラリーの調製法を検討した。インクジェット噴霧用焼結助剤を含む炭化ケイ素混合スラリーの調製(岐阜大・櫻田、大学院博士前期課程学生):これまで我々が行ってきた炭化ケイ素の鋳込み成形法で確立したスラリー調製技術をもとに、分散媒となる非水系紫外線硬化樹脂の溶媒に種々の分散剤の添加を検討した結果、インクジェット噴霧に適した炭化ケイ素、焼結助剤から成る混合スラリーを調製することができた。さらに、スラリー粘度・炭化ケイ素粒子の表面電荷・粉体濃度の最適化(岐阜大・櫻田、吉田、大学院博士前期課程の学生、岐阜県セラミックス研究所・尾畑)により、紫外線硬化樹脂中に分散安定化した炭化ケイ素をうまく紫外線照射固化することができた。その成果の一部は、平成28年9月に開催された日本セラミックス協会第29回秋季シンポジウム(広島大学)ならびに、平成28年9月に開催された「第54回粉体に関する討論会(登別グランドホテル)で発表を行った。

耐火材では、アルミナファイバーやカーボンファイバーなどといった断熱効果に優れる断熱材への変更が検討され、窯道具については緻密化・薄肉化が検討されている。しかし、窯道具の形状は焼成物の形状やサイズに依存するために、製品に合わせた複雑な窯道具の作製をしなければならないというニーズに対応できていない。近年3D造形技術が脚光を浴びるようになり、この技術を用いて立体成形できれば、(a)小ロットでのセラミックス製品は直接成形による製品化、(b)ある程度ロットが大きいものであれば立体造形物を製品の原型モデルとして使用できると考えられる。本研究ではインクジェット方式の立体造形法をその候補と位置づけ、インクジェットヘッドから吐出された紫外線硬化樹脂を含有したスラリーを紫外線照射によって硬化することによって型を用いずに成形体を得ることを検討する。本年度はUV硬化樹脂に炭化ケイ素を流動性を保持したまま分散させ、濃厚化した泥漿の調製、ならびにUV硬化条件について検討を行った。平成29年度は、昨年度に引き続き構造セラミックスの一つである炭化ケイ素をインクジェット方式で立体造形を達成するために炭化ケイ素と焼結助剤を混合した紫外線硬化樹脂スラリーの調製方法を検討して、その紫外線照射固化挙動の検討を行った。下記に示す研究要素を評価し、各要素とレオロジーの相関を調べ、紫外線硬化樹脂を用いて20 vol%以上の焼結助剤を含む炭化ケイ素スラリーの調製法を検討した。インクジェット噴霧用焼結助剤を含む炭化ケイ素混合スラリーの調製(岐阜大・櫻田、大学院博士前期課程学生):これまで我々が行ってきた炭化ケイ素の鋳込み成形法で確立したスラリー調製技術をもとに、分散媒となる非水系紫外線硬化樹脂の溶媒に種々の分散剤の添加を検討した結果、インクジェット噴霧に適した炭化ケイ素、焼結助剤から成る34 vol%という高い固体濃度でほとんど降伏応力を示さないニュートン流動に近い混合スラリーを調製することができた。さらに、スラリー粘度・炭化ケイ素粒子の表面電荷・粉体濃度の最適化(岐阜大・櫻田、吉田、大学院博士前期課程の学生、岐阜県セラミックス研究所・尾畑)により、紫外線硬化樹脂中に分散安定化した炭化ケイ素をうまく紫外線照射固化することができた。構造用セラミックスは焼成用窯道具のほかセラミックスバーナーやメカニカルシールなどに用いられ、強度に加えて要求される形状・サイズに対応しなければならない。しかし、セラミックスは焼成による収縮に加え、成形時に変形することからニアネット成形が困難であった。そのため、製品に合わせた複雑な窯道具の作製をしなければならないというニーズに対応できていない。近年、立体造形に関する技術が進歩し、樹脂による立体物などの作製が実用化されている。一方、炭化ケイ素は、焼結助剤として炭素、炭化ホウ素などの添加が必要不可欠である。
細胞表面抗体マーカーによる硬組織形成細胞(セメント芽細胞・骨芽細胞)の鑑別

「研究目的」GTR法などの織誘導再生法は、一定の臨床的評価が得られてきている。しかし、GTR法は単に歯肉上皮細胞の深行増殖を防ぎ、セメント芽細胞や骨芽細胞そして歯根膜などの中胚葉系歯周組織が再生・新生するスペースを確保しているにすぎない。最近、エナメル蛋白質の一つであるアメロジェニンを主成分とする歯周組織誘導剤が市販されている。このメカニズムとしては、ヘルトビッヒ上皮鞘における内エナメル上皮から分泌される蛋白質がセメント芽細胞を誘導し、ついで歯根膜や歯槽骨が誘導されると言われている。さらに、ヘルトビッヒ上皮鞘が断裂して歯根周囲に残されたマラッセの上皮遺残が未分化間葉系細胞に働きかけて、セメント芽細胞に分化させるという報告も見られてきている。「研究計画実施および結果」平成9年度においては、セメント質の非コラーゲン蛋白質(osteopontin,sialoprotein)を免疫組織学的に染色し、これに近接する細胞をセメント芽細胞として捉えた。しかし、非コラーゲン蛋白質と離れた細胞が存在し、セメント芽細胞との判定は困難であった。平成10年度はマラッセの上皮遺残に着目し、この上皮細胞とラミニンを介して接着し、骨形成に関係の深いビタミンD3レセプターを有する中胚葉系細胞がセメント芽細胞と考え実験を進めた。その結果、上皮細胞と接する細胞を検出し、その細胞から硬組織形成に重要な役割を果たすアルカリフォスファターゼが分泌されていることは、透過型電子顕微鏡で確認できたものの、免疫染色による観察ではビタミンD3レセプターを見いだすことは出来なかった。「まとめ」ヒトから一定条件の資料を一定の数だけ収集することが困難であるため、ラットを用いて研究を進めているものの、ヒトとの整合性を考慮する必要がある。現在注目を集めている組織誘導再生法には、膜を利用したものやアメロジェニンを主成分とした注入型有機質による組織誘導剤があり、臨床に応用され歯槽骨やセメント質などの歯周組織最盛に一定の成果が得られている。しかし、骨性癒着に見られるように歯槽骨と象牙質を癒着させる硬組織が、セメント質なのか歯槽骨なのか判定困難な場合がある。この様な問題を解決するには、セメント芽細胞と骨芽細胞の鑑別基準を確立する必要がある。この目的で、以下の実験を行った。1、セメント質の免疫染色:現在、セメント芽細胞としての明らかな定義が確定していないため、まず、セメント質を分泌・形成するものがセメント芽細胞と考えて、セメント質の非コラーゲン性蛋白質の同定を行った。実験動物として、ウイスター系ラットを用いた。その結果、歯根象牙質とセメント質との境界に、ハイドロキシアパタイトと結合し石灰化開始部に多量に存在することから、石灰化調節因子と考えられている、osteopontinやbone sialoproteinが染め出された。2、骨芽細胞の培養:前骨芽細胞と成熟骨芽細胞の分化違いを示すosteocalcinとbone sialoproteinを検出することができた。今後、osteopontinは前セメント芽細胞のbonesialoproteinはセメント芽細胞のマーカーではないかという報告もあり、更に検討していく予定である。膜を用いたGTR法は単に歯肉上皮細胞の深行増殖を防ぎ、セメント芽細胞や骨芽細胞そして歯根膜などの中胚葉系歯周組織が再生・新生するスペースを確保しているにすぎない。最近、エナメル蛋白質の一つであるアメロジェニンを主成分とする歯周組が市販されている。

この組織誘導メカニズムとしては、ヘルトビッヒ上皮鞘における内エナメル上皮から分泌される蛋白質がセメント芽細胞を誘導し、ついで歯根膜や歯槽骨が誘導されると考えられている。さらに、ヘルトビッヒ上皮鞘が断裂して歯根周囲に残されたマラッセの上皮遺残が未分化間葉系細胞に働きかけて、セメント芽細胞に分化させるという報告も見られてきている。平成9年度は、セメント芽細胞としての明らかな定義が確定していないため、セメント質の非コラーゲン蛋白質を免疫組織学的に染色し、これに近接する細胞をセメント芽細胞とした。しかし、非コラーゲン蛋白質と離れた細胞が存在し、セメント芽細胞との判定は困難であった。そこで、平成10年度はマラッセの上皮遺残に着目し、この上皮細胞とラミニンを介して接着し、骨形成に関係の深いビタミンD3レセプターを有する中胚葉系細胞がセメント芽細胞と考え実験を進めた。その結果、上皮細胞と接する細胞を検出し、その細胞から硬組織形成に重要な役割を果たすアルカリフォスファターゼが分泌されていることは、透過型電子顕微鏡で確認できたものの、免疫染色による観察ではビタミンD3レセプターを見いだすことは出来なかった。
感染性心内膜炎診断のための栄養要求欠陥レンサ球菌のPCR法による迅速検出法の開発

栄養要求欠陥レンサ球菌とは、Nutritionally variant streptococci (NVS)と呼ばれるビタミンB_6誘導体要求性を特徴としたグラム陽性球菌からなる菌群である。NVSは口腔常在細菌として健康なヒトから分離されるだけでなく、心内膜炎をはじめ、糸球体腎炎、中耳炎、結膜炎など様々な感染症との関連が示唆されている。しかし、NVSはその特殊な栄養要求性のため、通常の血液寒天培地を用いた分離法では培養できないことが多く、常在細菌叢や感染病巣からの分離同定があまりなされていなかった。近年PCRプライマー法による細菌同定法が確立するにつれ、培養が困難な細菌が容易に検出・同定されるようになってきた。NVSにおいても16S rRNAシーケンスに基づいたPCRプライマー法により、Culture-negativeと診断されていた臨床サンプルから同菌が検出・同定されたという報告がなされている。しかし16S rRNAシーケンスは種を超えて保存されている領域であり、混合感染が見られるような感染巣の病原細菌を特定することはむずかしい。上記の問題を解決するためには16S rRNAにかわる菌種特異的な配列を確保する必要がある。我々は、NVSに種特異的なPCRプライマーを見いだした。現在ヒトから分離されるNVSは4種類(Abiotrophia defectiva, Granulicatella adiacens, Tranulicatella paradiacens, Tranulicatella elegans)に分類されているが、これら4種類のNVSそれぞれに特異的なプライマーを発見することができた。これらのプライマーは、混合感染の見本である歯垢(デンタルプラーク)を臨床サンプルとした場合にも有効に働き、プライマーごとに明瞭な単一のPCR産物を得ることができた。平成12年度研究計画実施および結果1ヒト口腔内から単離したA.adiacens TKT1株のゲノムDNAから約3.3kbのKpnI断片をクローニングした。ドットハイブリダイゼーション法によって調べた結果、このDNA断片は調べたすべてのA.adiacensとハイブリダイズしたが、A.defectivaとA.elegansにはまったくハイブリダイズしなかった。2シーケンスを決定した。その結果、このKpnI断片は3250bpから構成されていた。3シーケンスに基づきフォワードプライマーAとB(676-695と1862-1881)、リバースプライマーA′とB′(1303-1322と2934-295)を作製した。これらのプライマーを用いて、各菌のゲノムからPCRによってDNAフラグメントA-A′,B-B′が増幅されるかどうかを調べた。その結果、(1)KpnI断片とドットハイブリダイズしなかったA.defectivaとA.elegansのどの菌株からもDNA増幅は認められなかった、(2)ドットハイブリダイズしたA.adiacens 30株はA-A′とB-B′をともに合成できる14株、A-A′のみ合成できる8株、両者を合成できない8株に分かれた(B-B′のみを合成できる株はなかった)。結論および今後の計画3.3kb-KpnI断片はドットハイブリダイゼーションの結果からA.adiacens特異的なフラグメントと考えられる。しかし、A.adiacensのなかには作製した2種類のプライマーではPCRによるDNA増幅ができない株があった。今後、A-A′とB-B′でカバーされていない部分からA.adiacensすべての株がDNA増幅できるようなプライマーを探す必要がある。また他の2菌種それぞれに特異的なプライマーを新たに見つけなければならない。

科研申請時,Nutritionally variant streptococcはAbiotrophia属として3菌種から構成されると考えられていた。しかしその後の研究により,これらの菌は,Abiotrophia defectiva, Granulicatella adiacens, Granulicatella paraadiacens, Granulicatella elegans, Granulicatella balaenopteraeの5菌種から構成されると考えられるようになった。[平成13年度研究計画]PCR産物の有無によって菌種を同定できるような、菌種特異的プライマーを見つける。[実施と結果および結論]1G. adiacens ATCC 49175株のゲノム由来のシーケンス(5'-gcagatcctaaagttgta-3'と5'-attcatcagtcggttgaa-3')を用いてPCR反応を行った。その結果、調べた限りにおいて,反応産物(0.5kb)はG. adiacensのみに認められた。G.adiacens以外のNVSはもちろんのこと,S, mutanやS. sanguisなどのStreptococciやStaphylococcus aureusなどには反応産物は認められなかった。したがって,上記のシーケンスはPCR法によってG. adiacensを同定するための菌種特異的プライマーとして有用である可能性が高まった。2G. paraadiacensTKT1株のゲノム由来のシーケンス(5'-gcgtgaatgccatctatcag-3'と5'-atccccagtctaagaactg-3')を用いてPCR反応を行った。その結果,調べたG. paraadacens株すべてに反応産物(1.1kb).が認められた。G.Paraadiacens以外のNVSやStreptococciには反応産物は認められなかった。したがって,上記のシーケンスはPCR法によってG. paraadiacensを固定するための菌種特特異的プライマーとして有用である可能性が示唆された。[今後の計画]A. defectivaとG. elegansそれぞれに特異的なプライマーシーケンスを見つける必要がある。A. defectivaには「Trehaloseを代謝する」という特性があるので,この遺伝子に関係LたDNAシーケンスを,G. elegansには「Arginine dihydrolaseポジティブ」という特性があるので,この遺伝子に関係したDNAシーケンスを検索する予定である。平成14年度研究計画ヒトから分離されるNutritionally variant streptococci (NVS)は、16SrRNAのDNA配列に基づき、Abiotrophia defectiva・Granulicatella adiacens・Granulicatella paradiacens・Granulicatella elegansに分類される。これらの細菌の同定用PCRプライマーを決定し、そのプライマーが臨床検査に役立つ可能性を探る。実施および結果
ガス交換の効率化に関与する細胞膜のCO_2ガス輸送機構に関する研究

O_2/CO_2ガス交換は,肺,特に肺胞-血管界面の最も重要な機能であることは云うまでもなく,肺胞内腔を覆う肺胞上皮I型細胞の機能とも密接に関係する.しかし,肺胞上皮細胞の細胞膜ガス透過性は,従来,全く研究されていない.本研究では,肺胞I型上皮細胞が他の細胞種に比べ著明に細胞膜のCO_2ガス透過性が高いという我々のこれまでの成績をもとに着手し,ガス透過性亢進機構ならびにその調節機序を明らかにすることを目的とした.その結果,まず,肺胞I型上皮細胞に選択的に発現する水チャネルaquaporin-5(AQP5)が,水分子のみならず著明なCO_2ガス分子透過性亢進作用をもつことを明らかにした.AQPによるCO_2ガスの透過性亢進作用は,少なくともAQP1-AQP5の異種アイソフォームに保存されており,AQPの孔構造中のヒスチジンおよびシステイン残基が水の透過ではなくCO_2ガスの透過性のみに関わっていることを種々の変異AQPを用いて明らかにしした.また,肺胞上皮細胞におけるAQP5の転写調節機構および細胞膜上に発現するAQP5の機能調節機構について調べ,AQP5の転写はSp1により促進,Sp3により抑制され,これらの転写因子の核内存在比が細胞種選択的な転写に重要であった.また,レチノイン酸はSp1を促進することにより著明にAQP5発現を促進することを見出した.一方,機能調節機構についても,一酸化窒素(NO)が15分1時間という短時間の処理で,AQP5のシステイン残基をS-ニトロシル化することを見出した.すなわち,従来,開閉機構がないと考えられてきたAQP5が,NOによるS-ニトロシル化を引き金として閉口することが推定された.これらの成績は,炎症を伴う種々の呼吸器疾患時の換気効率に関する病態生理と,その正常化に向けた治療戦略を考える上で重要な基礎データと考えられる.O_2/CO_2ガス交換は,肺,特に肺胞-血管界面の最も重要な機能であることは云うまでもなく,肺胞内腔を覆う肺胞上皮I型細胞の機能とも密接に関係する.しかし,肺胞上皮細胞の細胞膜ガス透過性は,従来,全く研究されていない.本研究では,肺胞I型上皮細胞が他の細胞種に比べ著明に細胞膜のCO_2ガス透過性が高いという我々のこれまでの成績をもとに着手し,ガス透過性亢進機構ならびにその調節機序を明らかにすることを目的とした.その結果,まず,肺胞I型上皮細胞に選択的に発現する水チャネルaquaporin-5(AQP5)が,水分子のみならず著明なCO_2ガス分子透過性亢進作用をもつことを明らかにした.AQPによるCO_2ガスの透過性亢進作用は,少なくともAQP1-AQP5の異種アイソフォームに保存されており,AQPの孔構造中のヒスチジンおよびシステイン残基が水の透過ではなくCO_2ガスの透過性のみに関わっていることを種々の変異AQPを用いて明らかにしした.また,肺胞上皮細胞におけるAQP5の転写調節機構および細胞膜上に発現するAQP5の機能調節機構について調べ,AQP5の転写はSp1により促進,Sp3により抑制され,これらの転写因子の核内存在比が細胞種選択的な転写に重要であった.また,レチノイン酸はSp1を促進することにより著明にAQP5発現を促進することを見出した.一方,機能調節機構についても,一酸化窒素(NO)が15分1時間という短時間の処理で,AQP5のシステイン残基をS-ニトロシル化することを見出した.すなわち,従来,開閉機構がないと考えられてきたAQP5が,NOによるS-ニトロシル化を引き金として閉口することが推定された.これらの成績は,炎症を伴う種々の呼吸器疾患時の換気効率に関する病態生理と,その正常化に向けた治療戦略を考える上で重要な基礎データと考えられる.O_2/CO_2ガス交換は,肺,特に肺胞-血管界面の最も重要な機能であることは云うまでもなく,ガス交換の場となる肺胞上皮I型細胞の機能とも密接に関係する.しかし,肺胞上皮細胞の細胞膜ガス透過性は,従来,全く研究されていない.本研究は,肺胞I型上皮細胞が他の細胞種に比べ著明に高い細胞膜CO_2ガス透過性をもつという我々のこれまでの成績をもとに着手し,ガス透過性亢進機構ならびにその調節機序を明らかにすることを目的とし,既に肺胞I型上皮細胞に選択的に発現する水チャネルaquaporin-5 (AQP5)が,水分子のみならずCO_2ガス分子の細胞膜透過に重要であることを明らかにしてきた.そこで本年度は,細胞膜上のAQP5発現の調節について調べた.その結果,まず,細菌由来の毒素であるLPSがp38 MAP kinaseを介して,細胞内局在を変化させ膜上のAQP5量を増加させることが判明した.一方,AQP5の転写レベルではAQP5プロモーター領域の-1.2kb付近に存在するSp1/Sp3結合部位がI型細胞での発現に必須であることを明らかにした.さらに,この転写は,Sp1により促進され,Sp3では逆に抑制されることがわかった.さらにラット肺切片を免疫組織化学的に調べると,Sp1が肺胞I型およびII型細胞に存在していたのに対し,Sp3はII型細胞だけで存在していた。

以上の結果より,ガス交換の効率化に関わる肺胞I型細胞のAQP5の発現調節は,まずSp3による転写抑制の解除という転写レベルでの調節重要であり,さらにp38 MAPkinase依存的局在変化という転写後調節の二重の調節を受けていることが明らかとなった.これらの成績は,肺胞のCO_2ガス透過性が可変的であることを示唆するとともに,その調節機序を考える上で極めて重要な基礎データである.O_2/CO_2ガス交換は,肺,特に肺胞-血管界面の最も重要な機能であることは云うまでもなく,ガス交換の場となる肺胞上皮I型細胞の機能とも密接に関係する.しかし,肺胞上皮細胞の細胞膜ガス透過性は,従来,全く研究されていない.本研究は,肺胞I型上皮細胞が他の細胞種に比べ著明に高い細胞膜CO_2ガス透過性をもつという我々のこれまでの成績をもとに着手し,ガス透過性亢進機構ならびにその調節機序を明らかにすることを目的とし,既に肺胞I型上皮細胞に選択的に発現する水チャネルaquaporin-5(AQP5)が,水分子のみならずCO_2ガス分子の細胞膜透過に重要であることを明らかにしてきた.本年度は,肺胞上皮細胞におけるAQP5の転写調節機構および細胞膜上に発現するAQP5の機能調節機構についてについて調べた.その結果,まず,AQP5の転写がレチノイン酸によって著明に促進されることを見出し,また,この機序にSp1転写因子が関与することを解明した.一方,機能調節機構についても,一酸化窒素(NO)が15分1時間という短時間の処理で,AQP5のシステイン残基をS-ニトロシル化することを見出した.細胞膜の水透過性を指標として調べたAQP5活性はこのS-ニトロシル化によって著明に抑制された.さらに,NOを長時間(4-12時間)処理すると,AQP5の発現量も著明に減少することが分かり,細胞膜上のAQP5がNOによるS-ニトロシル化を引き金として,閉口し,その後分解されることが推定された.これらの成績は,炎症を伴う種々の呼吸器疾患時の換気効率に関する病態生理と,その正常化に向けた治療戦略を考える上で重要な基礎データと考えられる.
ヨード標識脂肪酸による糖尿病心筋の脂肪酸動態解析と糖尿病性心筋症早期診断への応用

BMIPPはパルミチン酸のアナログで、ヒト心筋細胞内では代謝されにくいと言われていたが、肝臓や心筋細胞内でα酸化を受けることが最近知られている。静注したヨード標識I-123 BMIPPは、主に肝臓、脂肪プール、心臓、筋肉に分布し、主として肝臓と心臓、筋肉で代謝される。I-123 BMIPPを静注し、経時的にシンチカメラにて、心臓部および肝臓部の放射能動態変化を、45分間測定記録し解析し、初期摂取率および全摂取率、消失率を算出した。その後、回転型シンチカメラにて、心臓のSPECTを撮像した。正常人と虚血性心疾患合併のない糖尿病患者において、静注30分後のI-123 BMIPPの心筋への全摂取率および心筋SPECT画像分布上の差を認めなかったが、空腹時の糖尿病患者では、I-123 BMIPP静注5分以内に、心臓、肝臓での初期摂取率が軽度亢進し、また心筋消失率も正常人に比較して、亢進を認めた。空腹時糖尿病患者における血中I-123 BMIPPの放射能は、正常人よりも低下を示した。この傾向は、絶食時間が長くなると、顕著であった。心筋や肝臓のI-123 BMIPPの摂取率や消失率の変化よりも、血中のI-123 BMIPP放射能の方が、著しい差を示し、体の脂肪組織のトリグリセライドプールが大きすぎて、心筋や肝臓など局所における脂肪代謝の差が出にくいように思われる。今後シンチカメラによる心臓、肝臓の体外計測による局所脂肪酸動態解析と共に、血中脂肪酸のHPLCによる解析により、I-123 BMIPPの血中放射能濃度変化や脂肪酸代謝産物を解析する予定である。
ラット原発性上皮小体機能亢進症実験モデルの検討とラット上皮小体細胞培養系の確立

2630週齢の自然発症性高コレステロール血症(SHC)ラットをDonorとした上皮小体移植実験を行った。Recipientは以下の4群で検討した。Group A;同種ラット(Jcl-SD)に無処置で移植した群、Group B;Jcl-SDラットに免疫抑制剤(FK506)を投与して移植した群、Group C;SHCラットの固有上皮小体を摘除し、FK506を投与した群、Group D;Jcl-SDラットの固有上皮小体を摘除し、FK506を投与した群。結果1)移植上皮小体は、Group Aでは移植後早期に、Group Bでは除々に拒絶に至った。Group Cでは移植15週後でも高率に生着していたが、Group Dでは移植11週以降、除々に拒絶された。2)rat-PTHは、Group Cでは移植後、全期間を通じ、PTHは高値を維持、Group Dでは移植後早期には高値を示したが、移植後15週では正常以下となった。3)腎の組織学的検討では、Group B,C,Dにおいて皮質髄質境界付近の尿細管内にplaqueが認められた。これらのplaqueは、Group Cでは移植後、除々に増加、Group Dでは移植後11週をピークに減少していた。4)von Kossa染色、Pizzolato染色の結果から、plaque内の物質には燐酸塩、蓚酸塩の存在が推定され、上皮小体機能亢進症に伴う尿路結石の初期病変である可能性が示唆された。SHCラットの上皮小体細胞培養は、初期培養には成功したものの、長期継代に至っておらず、現在、引き続き検討中である。これらの結果は、第61回日本泌尿器科学会東部総会、第6回日本尿路結石症研究会、第333回日本泌尿器科学会北海道地方会で発表した。
看護政策過程の分析と政策データ・ベースの作成

1.研究目的看護に関る政策決定過程について検討するために,事例を取り上げ,政策決定過程の分析を行い,さらに,看護職・学生の政策形成に関する理解を促進する目的で,国会で取り上げられた看護の課題についてデータベースを作成する。2.研究から得られた知見等1)看護の課題に関する国会議事録のデータベース作成第126国会(会期:1993年1月22日8月4日)第152国会(会期:2001年8月7日9月26日)の衆参両院を対象に,「看護」に関連した課題を取り上げた会議,発言者,政党,発言内容について,国立国会図書館「国会会議録検索システム」で検索を行い,看護に関連した課題についてキーワード検索できるように,データーベースを作成した。政策決定過程を図式化し,さらに政治・政策に関連する用語の解説を付記して,複雑な過程がデータベース利用者が理解しやすいようにした。さらに「看護政策学」の資料として看護教育の場で広く活用できるようホームページの開発を行った。2)政策決定過程の分析-急性期病床における看護職員配置基準決定過程の検討-平成13年3月,第4次医療法改正にともない一般病床の看護職員配置基準が改められたが,この政策決定過程を分析・検討した。医療提供体制を急性期と慢性期に分け、急性期の配置基準を作成するという主旨のもと事務局案2.5:1が検討され、最終的には3:1に決定した。ちなみに看護協会案は1.5:1であり、夜勤の看護配置を配慮したものであった。この過程を(1)改善を必要とした背景(2)医療審議会構成メンバーとその立場(3)決定過程を各構成員の発言とそのダイナミクスから分析した。(2)は(1)医療提供側と(2)保険者(3)消費者である国民側に大きく分けられる。(2)が重視することは効率的で効果的な医療であり、(3)は安全で効果的医療であるが(1)の構成は診療所側と中小病院と大病院で立場を異にしており、医療費全体の配分の上から人件費にとられることを嫌う診療所側を代表する医師会の戦略が効を奏し、更に自民党の政務調査会の中の厚生労働部会の圧倒的な医師会支持が結果として3:1の決定を導いていた。1.研究目的平成13年度は,看護政策がどのように立案され,法案として審議され可決されていくのかその政策決定過程について検討するために,過去において「看護」の課題が国会でどのように取り上げられ審議されたのかを調べ,さらにこの内容について看護職が検索できるようデーターベースを作成することを目的とした。2.調査から得られた知見(平成13年度)1)国会議事録の分析第126国会(会期:1993年1月22日8月4日)第152国会(会期:2001年8月7日9月26日)の衆参両院を対象に,「看護」に関連した課題を取り上げた会議,発言者,政党,発言内容について,国立国会図書館「国会会議録検索システム」で検索を行った。

その結果,「看護」に関連した課題が取り上げられた会議は1,265で,質疑の発言内容を検討課題別に分類したところ,「基礎看護教育」「卒後看護教育」「看護職員配置基準」「看護業務」「看護労働環境」「看護制度(保健婦助産婦看護婦法)」「専門看護師」「情報開示(看護記録等)」のカテゴリーに大別された。2)「看護政策」に関するデータ・ベースの作成国会で取り上げられた看護に関連した課題についてキーワード検索できるように,データーベースを作成した。平成13年度は,第145国会152国会の衆議院国会議事録についてデーターベース化した。検索結果は,(1)国会会期,(2)衆議院・参議院,(3)会議名,(4)発言者,(5)政党,(6)課題カテゴリー,(7)発言内容,(8)コメント等を表示するようにした。さらに,データーベース利用者の政策決定過程に関する理解を助けるために,議院内閣制,国会,立法過程,予算編成過程などについての用語解説の機能を加えた。平成14年度は,第126国会第153国会の衆参両院および関連する審議会議事録をデータベースに含める計画である。1.研究目的看護に関る政策決定過程について検討するために,事例を取り上げ,政策決定過程の分析を行い,さらに,看護職・学生の政策形成に関する理解を促進する目的で,国会で取り上げられた看護の課題についてデータベースを作成する。2.研究から得られた知見等(平成14年度)1)看護の課題に関する国会議事録のデータベース作成第126国会(会期:1993年1月22日8月4日)第152国会(会期:2001年8月7日9月26日)の衆参両院を対象に,「看護」に関連した課題を取り上げた会議,発言者,政党,発言内容について,国立国会図書館「国会会議録検索システム」で検索を行い,看護に関連した課題についてキーワード検索できるように,データーベースを作成した。政策決定過程を図式化し,さらに政治・政策に関連する用語の解説を付記して,複雑な過程がデータベース利用者が理解しやすいようにした。さらに「看護政策学」の資料として看護教育の場で広く活用できるようホームページの開発を行った。2)政策決定過程の分析-急性期病床における看護職員配置基準決定過程の検討-平成13年3月,第4次医療法改正にともない一般病床の看護職員配置基準が改められたが,この政策決定過程を分析・検討した。医療提供体制を急性期と慢性期に分け、急性期の配置基準を作成するという主旨のもと事務局案2.5:1が検討され、最終的には3:1に決定した。ちなみに看護協会案は1.5:1であり、夜勤の看護配置を配慮したものであった。この過程を(1)改善を必要とした背景(2)医療審議会構成メンバーとその立場(3)決定過程を各構成員の発言とそのダイナミクスから分析した。(2)は(1)医療提供側と(2)保険者(3)消費者である国民側に大きく分けられる。(2)が重視することは効率的で効果的な医療であり、(3)は安全で効果的医療であるが(1)の構成は診療所側と中小病院と大病院で立場を異にしており、医療費全体の配分の上から人件費にとられることを嫌う診療所側を代表する医師会の戦略が効を奏し、更に自民党の政務調査会の中の厚生労働部会の圧倒的な医師会支持が結果として3:1の決定を導いていた。
ベータクロトーの認識する糖鎖構造にもとづく活性型FGF19の同定を目指した研究

内分泌型線維芽細胞装飾因子(FGF23、FGF19およびFGF21)は適切な翻訳後修飾、とくに、ある特定の糖鎖修飾を受けることでその高い生理活性が得られることが知られている。FGF23に高い生理活性を与える修飾糖鎖の詳細な解析を基に、FGF19、FGF21に高い生理活性を与える修飾糖鎖の同定を行なった。どちらもその高い生理活性を得るには、糖鎖修飾の中でもグルクロン酸修飾がもっとも重要な影響を与えることを明らかにした。ヒトをはじめとするあらゆる生物個体は、電解質やエネルギーの恒常性をつねに維持することで生命(健康)を保っている。その代謝制御には、おもにふたつのクロトータンパク質に依存した系があることが明らかにされてきた。ひとつは、線維芽細胞増殖因子のシグナル伝達であり、もうひとつは、イオン輸送体の活性調節である。本研究課題において、クロトータンパク質と直接結合する、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、ナトリウムカリウム輸送複合体について、これらの相互作用を詳しく解析した。その結果、マウスの腎臓において、線維芽細胞増殖因子ー23、線維芽細胞増殖因子受容体ー1、ナトリウムカリウム輸送体ベータサブユニットはいずれも糖鎖修飾を受けており、その修飾糖鎖の末端部分にグルクロン酸が含まれていることを発見した。さらに、このグルクロン酸修飾はクロトータンパク質との相互作用を強め、これらのタンパク質に十分な生理機能を発揮させしめることを示した。とくに、グルクロン酸糖鎖がクロトータンパク質に結合した「ホロクロトータンパク質」は、その糖鎖が結合していない「アポクロトータンパク質」にくらべて、熱力学的に安定であることを証明した。これらの研究結果は、クロトータンパク質とこれらのタンパク質との結合は、以前提唱された【プレエグジスティングモデル】に沿う結果であった。今回の研究を通して、クロトータンパク質は新規のグルクロン酸結合レクチンであることを提唱することができた。さいごに本研究の結論として、クロトータンパク質は、このレクチンとしての機能を通じて、血液中を循環している線維芽細胞増殖因子ー23を効果的に腎臓に集め、ナトリウムカリウム輸送複合体を分泌小胞から細胞表面へと効率よく輸送することができるのである。ベータクロトーはおもに肝臓の肝細胞で発現している、グリコシダーゼ様ドメインを二つ持つI型の膜タンパク質である。アルファークロトーとともにクロトーファミリーに属する。胆汁酸合成の制御をとおした脂質の取り込み量の調整など、広くエネルギー代謝に関わる内分泌性タンパク質のひとつとして、線維芽細胞増殖因子(FGF)ー19が同定された。このFGFー19は小腸(より胃から遠い回腸末端部に発現が多い)の上皮細胞に発現しており、門脈中を循環して肝細胞にシグナルを受け渡す。そのシグナルを伝えるために、ベータクロトーを必要とする。ベータクロトータンパク質はアルファークロトータンパク質同様に、糖鎖を認識するレクチン構造をもつ(糖結合タンパク質のことレクチンとよぶ)。そのため、その認識する糖鎖構造がFGF19にもあるものと考え、これまで研究を進めてきた。本研究課題において、特殊糖鎖特異的抗体を用いることで、ベータクロトーが特異的に認識する糖鎖構造を見出すことに成功した。この発見は、クロトーファミリータンパク質がレクチンとしてどのように、FGFシグナルを伝えるのかの理解につながった。それだけでなく、アルファークロトーはナトリウムカリウムポンプ複合体との結合にも、同様の糖結合機構を使っていることが分かった。つまり、ひとつのタンパク質が、どのようにして複数の分子(FGFファミリーとナトリウムカリウムポンプ)と相互作用するのかについて、合理的に理解することができた。本課題での発見は今後、ナトリウムカリウムポンプ複合体のような生理分子がどのように細胞膜表面まで調節的に運ばれるか、という生理学上の未解決な問題を解く糸口となる。つまり、糖転移酵素による糖鎖修飾の制御が、生理分子の輸送を調節していることがわかった。この成果をもとに、糖鎖の生物学的な意義を解明する研究が広く行われることになると期待される。本研究課題の研究目的として、線維芽細胞増殖因子(FGF)ー19のホルモンとして十分に高い活性をあたえる、翻訳後修飾(おもにO型糖鎖修飾)を明らかにすることを掲げた。換言すれば、その糖鎖修飾とはベータクロトータンパク質が認識する糖鎖構造であり、それを明らかにすることでもある。生体内に比較的少なく存在する、ある特殊な構造をもった糖鎖に対する特異的抗体を用いた研究から、ベータクロトータンパク質が認識する糖鎖構造をほぼ特定するまで至った。さらに期待以上の成果として、ナトリウムカリウムポンプのベータサブユニットとアルファークロトーの結合にも、同様にN型糖鎖修飾が重要な役割を果たしていることを明らかにすることができた。このきわめてまれなN型糖鎖修飾は、腎臓においてナトリウムカリウムポンプのベータサブユニットに特異的になされており、この糖鎖修飾を目印としてアルファークロトーが糖鎖を認識していることがわかった。

しかしながら、これらの糖鎖の詳細な構造(糖の結合の向きや修飾基の位置)は未だ確定できていない。そのため、今後はFGFー19を培養細胞に大量合成し、さらに大量に精製をすることで、核磁気共鳴法(NMR法)による糖鎖構造の確定をおこなわなければならない。このための、培養細胞をもちいた大量合成、および大量精製系を立ち上げた。さらに、ニワトリを抗体産生動物として用いて、マウスのFGFー19にたいする特異的抗体を作製した。最新のニワトリモノクローナル抗体作成技術を用いて、そのハイブリドーマ細胞を樹立することができた。このモノクローナル抗体をもちいて、マウスにおけるFGFー19の発現部位を詳細に知ることができた。さらにこの結果、マウスの小腸の上皮細胞から直接、生体内のFGFー19を精製することができるようになり、本研究課題の研究目的である、糖鎖構造の確定へと大きくすすめるようになった。線維芽細胞増殖因子(FGF)ー19の修飾糖鎖構造を核磁気共鳴法(NMR法)で確定する本研究課題を通じて、マウスのFGFー19を特異的に認識する抗体を作製することに成功した(「現在までの達成度」の項参照)。この抗体を用いて、マウスの小腸上皮細胞から、生体内に存在するFGFー19を大量に精製することをこころみる。とくに、このニワトリモノクローナル抗体での組織染色から、マウスの小腸の回腸末端部において、FGFー19のタンパク質が高発現している上皮細胞を見出すことができた。そのため、このマウスの回腸末端部の小腸上皮をスタート実験材料にして、ここからマウスの『エンドジェナス』なFGFー19の精製をはじめる。また、特殊糖鎖特異抗体を用いた解析を通じて、ベータクロトーが認識する糖鎖構造が分かってきたことから、汎用される培養細胞にその糖鎖修飾酵素群を発現させて、FGFー19に糖鎖を付加することをこころみる。つまり、培養細胞において、生理活性の高いFGFー19を人工的に造り出す方法を開発する。その際に開発された「ほ乳類複製開始点」「マトリックス結合領域」遺伝子配列をFGFー19遺伝子を発現する培養細胞へと組み込む。こうすることで、従来の約100倍の発現をもつ安定発現株を得ることを目指す(株式会社トランスジェニックへの委託)。こうして得た精製FGFー19タンパク質から、ヒドラジン分解にて糖鎖を切り出してPAラベル化する。低速液体クロマトグラフィー(平成23年度の本研究課題の予算にて購入済み)をもちいて、PAラベルを指標にこの糖鎖を分離精製する。精製した糖鎖を核磁気共鳴法(NMR法)で測定することで、その原子レベルでの構造を明らかにする。この構造を確定する上に必要な、複数の標準糖鎖を有機合成する。これらの測定と合成はいずれも、株式会社ナード研究所と株式会社東京化成に実績があり委託する。平成24年度上半期に、マウスの小腸上皮細胞から、内在性のFGFー19を大量に精製する。この実験を遂行するために、イオン交換カラムとゲル濾過カラム(消耗品)が必要である。
アポトーシス機構の解析とその発がん、制がん研究への応用

アポトーシスはがん遺伝子、がん抑制遺伝子をはじめ、抗がん剤や放射線など細胞の内外に存在する様々な因子によって誘導・制御されている。本研究班ではこれら性質の異なった刺激によって活性化されるアポトーシスシグナルの伝達機構を各班員が独自に開発した実験系を用いて解析した。その結果c-mycやアデノウイルスE1Aなどのがん遺伝子をはじめ、がん抑制遺伝子としてのs-mycやp53の標的遺伝子であるbaxの発現、さらには制がん剤処理など、様々な刺激によって誘導されるアポトーシスにおいてもカスパーゼ3様プロテアーゼの活性化が共通して要求されることを見いだし、カスパーゼ3様プロテアーゼがアポトーシス実行において中心的役割を果たしていることを明らかにした。またがん遺伝子やがん抑制遺伝子の変異や発現亢進、がん遺伝子との協調発現によって細胞のがん化に関与する遺伝子の発現がしばしば細胞にアポトーシス耐性を与えていることを明らかにした。これら一連の研究成果は抗がん剤等のアポトーシスにおける作用点や作用機構を知る手掛かりとなり、アポトーシスを標的とした新たながんの治療法の開発に利用できるものと期待される。一方s-MycやFasLを発現させたがん細胞の移植実験からアポトーシスを介したlocal inflammationが宿主の抗腫瘍免疫能の活性化を惹き起こすことを見出し、アポトーシスを利用したがんに対する免疫療法の可能性を示唆した。最後に本研究において活性型Rasがアポトーシスとは異なったタイプの細胞死を誘導することを明らかにした。この細胞死はカスパーゼの活性化を要求せず、p53やBcl-2による制御も受けない。このような特徴をもつカスパーゼ非依存的細胞死誘導システムは、多くのアポトーシス耐性を獲得したがんの治療法として非常に有用であると思われる。この発見はまたこれまで不明な点が多かったプログラム細胞死の全体像を分子レベルで理解していく上で非常に意義があると思われる。アポトーシスは、生体の恒常性の維持に重要な役割を果たし、自己消去のシステムとして機能している。したがってアポトーシスは、遺伝子変異などを起こし、細胞や組織の形成・存続にとって不都合となる細胞を積極的に排除してがんなどの疾病の発生を未然に防ぐ生体防御機構の一つとしても機能していると考えられている。また多くのがん細胞はアポトーシスに対する耐性能を獲得することで、外部からの刺激に感応せず独自に不必要な分裂・増殖を繰り返すことができるようになっていると推察されている。このようなことからアポトーシスの機構を解明することは、がんの発生や進展の機構を理解するだけではなく、がんの増殖の阻止方法やがん細胞の殺傷除去に関する方策を考えていく上でも重要であると思われる。近年アポトーシス制御に関わる多くの因子・遺伝子が単離・同定され、細胞死誘導のためのシグナル伝達機構の解析が急ピッチで進められている。中でもICE family proteasesを主体とするプロテアーゼカスケードの活性化がアポトーシスのシグナル伝達に重要な役割を果たしていることが明らかにされ、注目されている。ところがアポトーシスの誘導機構についての研究はFasやTNFRを介するものを中心に進められており他のものについては未だ不明な点が数多く残されたままである。そこで本研究班では、班員が独自に開発した実験系を用いて、Mycによるアポトーシスを中心に、その誘導機構を明らかにするとともに、がん細胞におけるアポトーシス誘導や耐性能獲得の機構を多面的に、かつ分子レベルで理解することを目的として研究を行っている。今年度はがん遺伝子c-mycをはじめ、がん抑制遺伝子s-mycやエンドトキシンLPSによって誘導されるアポトーシスにもICE family proteasesの活性化が要求されることを明らかにした。またがん細胞が獲得しているアポトーシス耐性能もICE family proteasesの活性化抑制が原因していることを見いだした。この他にもアデノウイルスE1AによるアポトーシスにトポイソメラーゼIIαが関与していることや、アポトーシスに特異的なDNAの断片化に関与するエンドヌクレアーゼを胸腺細胞から精製し、対応するcDNAのクローニングに成功するなど、活発な研究活動を展開している。アポトーシスはプログラム細胞死の一型で、生体の恒常性維持に重要な役割を果たしている。したがってアポトーシスの異常はがんを含めた様々な疾患の発生原因となる。一方細胞のがん化やがん細胞の転移のプロセスがアポトーシス耐性と密接な関係にあることもわかってきた。このようなことからアポトーシスに関する研究はがんの発生や進展・転移の機構を理解していく上からも非常に重要であると認識されるようになってきた。ところがアポトーシスに関する研究はこれまでFasやTNFRを介するものを中心に進められ、がん遺伝子やがん抑制遺伝子、抗癌剤など、TNFRファミリー蛋白質以外の因子によって誘導されるアポトーシスについてはほとんどまとまった情報がなかった。そこで本研究班では各班員が独自に開発した実験系を用いて、c-Mycやs-Myc,LPS,アデノウイルスE1A、p53の標的遺伝子であるbaxなどによって誘導されるアポトーシスにおけるシグナル伝達機構の解明を試みた。その結果TNFRファミリー蛋白質以外の因子によって誘導されるアポトーシスにおいてもFasやTNFRの場合と同じく、カスパーゼ3様プロテアーゼを主体とするプロテアーゼカスケードの活性化が要求されるということがわかった。またえられた研究成果をもとにがん細胞が獲得しているアポトーシス耐性の機構についても解析を行ったその結果例えばc-Mycと協調してT細胞性リンパ腫の発生に寄与しているPim-1には、これまでの予想とは異なり、それ自身のもつキナーゼ活性に依存してc-Mycからのアポトーシスシグナルを増強する能力のあることを突き止めた。