hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光照射による蛍光基NBD脱離を利用したNBD標識ペプチドの同定

既に開発している、生物活性化合物の標的タンパク質選択的にNBD蛍光基を結合させる蛍光標識法を用いて、NBD標識されたタンパク質を質量分析法で同定する事は可能であったが、NBD標識ペプチドの検出は容易でなかった。本研究では、光照射によりNBD標識ペプチドからNBD蛍光基が脱離する現象に着目し、液体クロマトグラフ-質量分析計(LC-MS)を用いたNBD標識ペプチド選択的な検出・分析法を確立し、標的タンパク質のNBD修飾部位の同定を目指している。今年度は、モデルペプチドおよび多種多様なNBD標識ペプチドを用いて、NBD標識ペプチドを効率的にLC-MS/MSで同定するための試料調製法の確立や、LC-MSシステムの構築を目指した。しかし、使用予定のLC-MSのLCに不具合が多発したことから、LC-MSシステム構築を一旦保留にし、実サンプルへの適用を進めながら、汎用性の高いNBD標識ペプチドの試料調製法の確立を優先することとした。昨年度の実験により、LC-MS導入前に試料の複雑性を下げることがNBD標識ペプチドの検出に有効である知見が得られていたため、それに基づき、分析に適した試料調製の検討を進めた。ミトコンドリア膜タンパク質阻害剤に本蛍光標識法を適用し、培養細胞中でNBD標識されるタンパク質を得たのち、NBD標識ペプチドの回収を試みた。電気泳動後のゲル切り出し、ゲル内消化の手順などの検討を行ったところ、大量の非標識ペプチド中から目的のNBD標識ペプチドを回収する手順を確立することができた。本研究を遂行するにあたって、質量分析計や周辺機器の状態を維持することは非常に重要である。使用予定であったLC-MSにおいて、特にLCの不具合により、しばしば測定を中断してのメンテナンスが必要となった。そのため十分な測定時間を割くことができず、LC-MSシステム構築に関連する各種パラメーターの検討を進めることができなかった。一方で、NBD標識ペプチドの効率的な同定法の確立において鍵となる、LC-MS測定に適した試料調製法に重きをおいて進め、NBD標識ペプチド回収方法の構築に取り組んだ結果、汎用性のある手法の確立に成功している。よって総合的に判断し、おおむね順調に進展していると評価を行った。当初使用する予定であった機器類の不具合や変更により、実験データの取得が予定通りに進まず、再現性のあるデータ取得が困難となったため、研究を遂行する上での課題として、それに代わる装置の検討を行いたいと考えている。また、LC-MSで取得したデータをタンパク質データベースと照合してタンパク質同定を行う際、タンパク質同定検索エンジンとしてmascotを主に用いて研究を進めているが、検索条件の工夫を行うことで同定率が向上する知見が得られたため、その点に関して調査を行う予定である。NBD標識ペプチドの試料調製の手順はほぼ確立できたため、使用予定機器の環境が整い次第、LC-MSシステム構築に着手し、多種多様のNBD標識ペプチドの解析を進める予定である。既に開発している、生物活性化合物の標的タンパク質選択的にNBD蛍光基を結合させる蛍光標識法により、NBD標識されたタンパク質を質量分析法で同定することは可能であったが、NBD標識ペプチドの検出は容易ではなかった。本研究では、光照射によりNBD標識ペプチドからNBD部分が脱離する現象に着目し、液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS)を用いたNBD標識ペプチド選択的な分析法を確立し、標的タンパク質のNBD修飾部位同定を目指した。初年度は、NBD標識ペプチド選択的な光照射LC-MS/MS分析に必要な条件を探索するため、NBD蛍光基を導入したペプチドをモデルペプチドとして準備し、光照射によるNBD脱離の確認をLC-MSで行った。その結果、モデルペプチドからNBDが脱離して生じた分子を確認でき、この現象は非標識ペプチド混合溶液中にモデルペプチドを少量添加した際にも見られたことから、細胞抽出物などの混合溶液中からNBD標識ペプチドの検出を行うといった複雑な系への適用も可能であることがわかった。また、実験を進めていくなかで、LC-MS導入前に試料の複雑性を下げることが有効であることがわかり、試料調製法を検討したところ、分析に適した手法の知見を得ることができた。一方で、LCのメンテナンスやシステム構築に時間を要し、NBD標識ペプチド選択的な分析条件を決定するまでには至らなかったが、分析条件に関していくつかの知見が得られ、LC-MSシステム構築に着手することができた。NBD標識ペプチド選択的な分析法の確立に向けて、試料調製法の検討やMS/MSメソッド作成に着手できており、LC-MSシステム構築においては、いくつかの知見が得られている。これらの知見を基に、LC-MSシステム構築の最適化を進めながら、試料の測定を開始できると考えている。

昨年度の実験により、LC-MS導入前に試料の複雑性を下げることがNBD標識ペプチドの検出に有効である知見が得られていたため、それに基づき、分析に適した試料調製の検討を進めた。ミトコンドリア膜タンパク質阻害剤に本蛍光標識法を適用し、培養細胞中でNBD標識されるタンパク質を得たのち、NBD標識ペプチドの回収を試みた。電気泳動後のゲル切り出し、ゲル内消化の手順などの検討を行ったところ、大量の非標識ペプチド中から目的のNBD標識ペプチドを回収する手順を確立することができた。本研究を遂行するにあたって、質量分析計や周辺機器の状態を維持することは非常に重要である。使用予定であったLC-MSにおいて、特にLCの不具合により、しばしば測定を中断してのメンテナンスが必要となった。そのため十分な測定時間を割くことができず、LC-MSシステム構築に関連する各種パラメーターの検討を進めることができなかった。一方で、NBD標識ペプチドの効率的な同定法の確立において鍵となる、LC-MS測定に適した試料調製法に重きをおいて進め、NBD標識ペプチド回収方法の構築に取り組んだ結果、汎用性のある手法の確立に成功している。よって総合的に判断し、おおむね順調に進展していると評価を行った。初年度に準備したモデルペプチドを用いて、引き続きNBD標識ペプチドを効率的にLC-MS/MSで同定する手法の確立(試料調製法の確立、LC-MSシステム構築、およびMS/MSメソッド作成など)を目指す。LC-MSシステムにおいては、初年度に得られた知見に基づき、分析カラムやペプチドの溶出条件を確定する。そして、試料調製法およびMS/MSメソッド作成においては、試料に応じた最適化を行う。また、NBD脱離現象の汎用性を調査するため、初年度に準備したモデルペプチド以外にも多種多様なNBD標識ペプチドを準備し調査を行う予定である。当初使用する予定であった機器類の不具合や変更により、実験データの取得が予定通りに進まず、再現性のあるデータ取得が困難となったため、研究を遂行する上での課題として、それに代わる装置の検討を行いたいと考えている。また、LC-MSで取得したデータをタンパク質データベースと照合してタンパク質同定を行う際、タンパク質同定検索エンジンとしてmascotを主に用いて研究を進めているが、検索条件の工夫を行うことで同定率が向上する知見が得られたため、その点に関して調査を行う予定である。NBD標識ペプチドの試料調製の手順はほぼ確立できたため、使用予定機器の環境が整い次第、LC-MSシステム構築に着手し、多種多様のNBD標識ペプチドの解析を進める予定である。LC-MSに関連する一部消耗品の購入時期を次年度としたため。また、当初計画していた学会への参加を次年度にすることとしたため。質量分析データの解析にタンパク質同定検索エンジンmascotを主に用いているが、検索エンジンを搭載しているパソコンの経年劣化によりシステム一式を交換する必要性が生じた。研究継続には当該システムの更新が必要であったため今年度の物品費で購入した。
手指に痛みない美容師の鋏の使い方を学習して手指の障害を予防する鋏練習装置の開発

本研究は(1)鋏操作に熟達した上肢に痛みのない美容師と専門学校生等の鋏操作初学者の鋏技能を電気生理学的に分析し違いを明らかにする,(2)鋏操作の電気生理学的知見を基に熟練者と初学者とを判別できるAIを作成する,(3)鋏を開閉する角度と速度,そのための指の筋作用を正しく学習できるバイオフィードバック型鋏練習装置の開発を行う.本研究は(1)鋏操作に熟達した上肢に痛みのない美容師と専門学校生等の鋏操作初学者の鋏技能を電気生理学的に分析し違いを明らかにする,(2)鋏操作の電気生理学的知見を基に熟練者と初学者とを判別できるAIを作成する,(3)鋏を開閉する角度と速度,そのための指の筋作用を正しく学習できるバイオフィードバック型鋏練習装置の開発を行う.
古代・中世の漢文訓読文資科の文体史的研究

金水は、UCLAでの春学期講義のために、日本語における漢文訓読文の影響について総合的な整理を行い、その結果をもとにUCLAにおいてThe Influence of Translation upon the Historical Development of the Japanese Languageと題する講演を行った。結論として、古代において開発された漢文訓読という方法が、中世、近世、近代を通じて日本語の書きことばに影響を与え続け、明治時代における欧文直訳文体にまでそれが及んでいることを実証的に確認した。朝倉は、禅林聯句の中で、特に「江東避乱聯句」(仮称)の全容を解明するために、総集『聯句集』(相国寺慈照院所蔵)、字書の一種と目される『詩作通考』(建仁寺両足院所蔵)、未定稿『聯句集』(京都大学附属図書館所蔵)に所載される作品を整理した。さらに、聯句作品の内容解釈に資するために、詩文を製する際の手引書や字書の役割を果たした彭叔守仙編『増禅林集句韻』(京都大学附属図書館、建仁寺両足院所蔵)について、整理の上で利用法を検討しつつある。本研究では、語彙論的側面と、文献学的側面の両面から、漢文訓読文が文体形成に与えた影響の歴史的変遷について研究を進めた。まず語彙論的側面からの研究として、金水は、「をり」の古代から近代までの変遷を追った。資料として、抄物、近世漢文訓読文、近代雑誌記事、小説等を用い、「をり(おる)」の分布を調べた。その結果、「をり(おる)」が多用される文体の背後に、「をり(おる)」を多用する話体(スピーチスタイル)が存在するという仮説が得られた。この話体は教養ある男性が主に使用するもので、古代・中世・近世の儒者・僧侶、近世の武士層、近代の男性知識層といった話者が想定される。次に、文献学的側面として、金水は高山寺所蔵の『恵果和尚之碑文』の研究を進め、特に表紙の裏面に記された字書様抜き書きの原典について考察した。その結果、抜き書きされた語句の多くは『大日経疏』から採られている蓋然性が高いことが明らかになり、『恵果和尚之碑文』全体の性格に合致することが確認された。また、金剛寺所蔵『観無量寿経』の読解を進め、翻字本文、釈文、訳文を作成した。その結果、本文献が平安末期漢文訓読文の資料として、また観経の古訓点本として重要な価値を有することが判明した。一方朝倉は、禅林聯句の全容を解明するために、作品の収集・整理を継続したほか、聯句(漢句)の解読(訓読)と内容理解(抄物)の原点を探るために、大学図書館や禅院塔頭に出張し、調査の上、重要資料については写真撮影を敢行した。なお、『〔湯山聯句〕』と『成吠詩集』については、原本との照合を果たした。
エイジングに伴うエピゲノム変化に注目した造血幹細胞の前がん化機構

(背景)造血幹細胞では、加齢に伴いDNAメチル化修飾の変化が生じている。この変化が造血幹細胞の「前がん細胞化」に関わるか否かは明らかでない。(目的)DNAのメチル化シトシン(5mC)をヒドロキシメチル化シトシン(5hmC)に変換する酵素(TET1、TET2、TET3)の機能不全による5mCから5hmCへの変換障害と、造血幹細胞の「前がん細胞化」との関連を解明する。さらに、前がん細胞化した造血幹細胞から血管免疫芽球性T細胞リンパ腫が発症することを実証する。(方法と結果)(1)TET酵素をコードするTet2およびTet3を、ヘテロまたはホモに造血幹細胞で欠損するマウスを作製し、造血幹細胞の前がん細胞化の検討を行っている。両遺伝子のヘテロ欠失(Tet2+/-Tet3+/-)マウスは、欠失から1年を経過しても白血病発症の兆しはなかった。一方、いずれか一方をホモ欠失、他方をヘテロ欠失したマウスは、欠失から6ヶ月を経て急性骨髄性様病態を呈し死亡し始めた。さらに、両遺伝子をホモに欠失したマウスは、欠失から約1ヶ月を経て短急性骨髄性白血病様の病態を呈し、2ヶ月以内に約80%のマウスが死亡した。(2)造血幹細胞でTet2をホモ欠失し、かつT細胞でG17V変異RHOAを発現するマウスを作製したところ、約8ヶ月で血管免疫芽球性T細胞リンパ腫様の病態を呈するようになった。(結論)TET酵素遺伝子の欠損の程度に依存して、急性骨髄性白血病が発症することが明らかになった。5mCから5hmCへの変換障害の程度に依存しているものと推察される。また、TET酵素機能不全とG17V変異RHOA発現の組み合わせにより、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫が発症することが示唆される。マウスは予定通り作製し、フェノタイプの解析は順調に進んでいる。今後、特にTet2およびTet3のいずれか一方をホモ欠失、他方をヘテロ欠失したマウスについての解析を進めることで、目的遂行が可能であると考えられる。1)TET酵素遺伝子の欠損の程度依存性の急性骨髄性白血病発症が、5mCから5hmCへの変換障害の程度に依存していることを実証する。2)5mCから5hmCへの変換障害が比較的弱い場合に造血幹細胞が前がん細胞化していることを実証する。3)造血幹細胞で弱い5mCから5hmCへの変換障害が生じ、その造血幹細胞に由来するT細胞でG17V変異RHOAが発現した場合に血管免疫芽球性T細胞リンパ腫が発症することを実証する。4)以上が予定通り進捗した場合、我々がTet3遺伝子のポジティブ・フィードバック機構の責任領域ではないかと推察している領域を特異的に欠失するマウスを作製し、ポジティブ・フィードバック機構の存在を実証する。

3)造血幹細胞で弱い5mCから5hmCへの変換障害が生じ、その造血幹細胞に由来するT細胞でG17V変異RHOAが発現した場合に血管免疫芽球性T細胞リンパ腫が発症することを実証する。4)以上が予定通り進捗した場合、我々がTet3遺伝子のポジティブ・フィードバック機構の責任領域ではないかと推察している領域を特異的に欠失するマウスを作製し、ポジティブ・フィードバック機構の存在を実証する。
軟骨形成マスター分子SOXトリオの上流、下流、修飾分子の解明のための戦略的研究

SOXトリオの下流分子をマイクロアレイによりスクリーニングし候補分子を解析する中で、S100A1,S100Bが軟骨組織に高発現するSOXトリオの直接の転写ターゲットであり、SOXトリオによる軟骨細胞の後期肥大分化の抑制作用を担う主分子であることを明らかにした。ヒトII型コラーゲン遺伝子のSOX9結合エンハンサーと蛍光レポーターを組み合わせた軟骨分化リアルタイムモニタリング細胞株ATDC5-S2RD5を樹立した。ATDC5-S2RD5を利用してBMP2によるII型コラーゲンの転写制御がSMAD経路よりもP38やJNKなどのMAPKシグナルを主に介していることを明らかにした。ATDC5-S2RD5とレトロウィルス発現cDNAライブラリーを組み合わせて、発現クローニングを行いSOX6およびII型コラーゲン誘導能を持つ新規軟骨分化誘導因子SNX19を同定した。SOXトリオの上流分子を直接同定するためヒトマウスエンブリオのcDNAを用いた5'RACE法によりSOX6のエンブリオニックプロモーター及びプロモーター内最小エンハンサー配列CES6を同定した。CES6をベイトにしたサウスウェスタンスクリーニングにてSOX9、SOX6、II型コラーゲンなど軟骨分化のキー遺伝子の転写制御配列に直接結合して作用する軟骨分化のマスター転写因子がP63であることを同定した。SOX6の上流分子、SOX9の転写共役因子である核内分子としてGNL3を同定した。SOX9と協調してII型コラーゲン遺伝子の転写を活性化する転写因子としてRUNX1-3までのRUNXfamily遺伝子とGATA5を同定した。SOXトリオの上流および修飾分子同定のため、インスリン刺激に反応して軟骨分化するマウス細胞株ATDC5に、SOXトリオ反応性エンハンサーを直列につないでシグナルを増強したII型、IX型コラーゲンプロモーターをレポーター遺伝子と組み合わせ、安定導入した。レポーターとして、蛍光蛋白・ブラストサイジン耐性遺伝子の2種類を用意した。インスリン刺激下で特異的にレポーター遺伝子が活性化されるクローンを選んでレトロウィルス発現cDNAライブラリーを導入、軟骨分化陽性細胞クローンを選別し、導入cDNAを同定した。その結果GFPと薬剤をレポーターにした複数の陽性クローンに共通する新規軟骨分化因子を同定しnovel chondrogenic factor 25kDa (NCF25,仮称)と命名した。NCF25はレトロウィルスによる安定導入でATDC5や間葉系幹細胞に軟骨マトリックス遺伝子を誘導し、プラスミドやアデノウィルスによる一過性の強制発現ではSOXトリオによる軟骨分化を増強する。ヒト間葉系幹細胞へのSOXトリオ強制発現系に対してマイクロアレイを用いた発現プロファイリングを行った結果、発現に差異を認めた遺伝子が603個存在した。Real Time PCRによる確認の結果、SOX単独ではなくSOXトリオに特異的に発現誘導される遺伝子として、SCRG1,LOXL3,PPYR1,TRIM48,PTGER3など機能既知、未知を含め多彩な分子が確認されたが、これらのうちもっとも発現誘導が強かったのはS100A1,S100Bの2遺伝子であった。未分化軟骨細胞株ATDC5への強制発現系とRNAiによるノックダウンの系を用いた検討では、これら2遺伝子が軟骨細胞の肥大分化・石灰化の抑制に対し中心的な役割を果たしている可能性が示された。SOXトリオの上流分子をよりダイレクトにクローニングするため、とくに軟骨分化時に強く誘導されるSOX6のプローモーターをヒト・マウスエンブリオからクローニングし、46bpの最小エンハンサーとその活性型欠失変異配列を得た。これらを用いたサウスウェスタンスクリーニングの結果p63とNOTCH1が軟骨分化誘導因子であることを新たに同定した。NOTCH1の細胞内ドメインとp63の強制発現はレポーターアッセイ上SOX6のみならず、SOX9やII型コラーゲンの転写を活性化し、軟骨とは全く関係のない癌細胞株の代表であるHeLaにII型コラーゲンmRNAを誘導した。とくにp63は活性が強く、レトロウィルスにて強制発現すると脱分化軟骨細胞にアルシアンブルーの染色性を回復させた。

またATDC5に導入したところ、II型コラーゲンのみならず肥大分化のマーカーであるX型コラーゲンも強く誘導し、軟骨の初期分化から肥大分化、アポートシスまで広く制御するより上位のマスター分子である可能性が示唆された。現在アデノウィルスを作成してin vivo投与の準備をすすめるとともに、ノックアウトマウスを繁殖して解析準備中である。II型コラーゲンプロモーターを活性化しSOX6のN末側のQ boxと結合する分子としてSNX3,SNX8,SNX19の3分子を同定した。SNX3は手指欠損や小眼球症をともなうヒトの遺伝病MMEPの原因遺伝子として知られており、軟骨分化についても一定の役割を持つと想定されるため、その機能を解析中である。S100A1、S100Bが軟骨の後期分化のネガティブレギュレーターであること、SOX9がこれら2遺伝子のプロモーターへの直接結合すること、を実験的に証明した。SOXトリオの下流分子をマイクロアレイによりスクリーニングし候補分子を解析する中で、S100A1,S100Bが軟骨組織に高発現するSOXトリオの直接の転写ターゲットであり、SOXトリオによる軟骨細胞の後期肥大分化の抑制作用を担う主分子であることを明らかにした。ヒトII型コラーゲン遺伝子のSOX9結合エンハンサーと蛍光レポーターを組み合わせた軟骨分化リアルタイムモニタリング細胞株ATDC5-S2RD5を樹立した。ATDC5-S2RD5を利用してBMP2によるII型コラーゲンの転写制御がSMAD経路よりもp38やJNKなどのMAPKシグナルを主に介していることを明らかにした。ATDC5-S2RD5とレトロウィルス発現cDNAライブラリーを組み合わせて、発現クローニングを行いSOX6およびII型コラーゲン誘導能を持つ新規軟骨分化誘導因子SNX19を同定した。SOXトリオの上流分子を直接同定するためヒトマウスエンブリオのcDNAを用いた5 'RACE法によりSOX6のエンブリオニックプロモーター及びプロモーター内最小エンハンサー配列CES6を同定し、CES6をベイトにしたサウスウェスタンスクリーニングにてSOX6の上流分子でありかつSOX9の転写共役因子である核内分子GNL3を同定した。またSOX9と協調してII型コラーゲン遺伝子の転写を活性化する転写因子としてRUNX1-3までのRUNXfamily遺伝子とGATA5を同定した。
脳脊髄液中α-synuclein微量測定による神経変性疾患診断方法開発の試み

α-シヌクレインはパーキンソン病、Lewy小体型痴呆症(DLB)、多系統萎縮症(MSA)などで不溶性線維を形成して脳に蓄積するシナプス蛋白である。遺伝学的、病理学的知見から、α-シヌクレインの凝集は神経細胞死に深い関連を有する変化と考えられている。昨年度までに我々はDLBなどのシヌクレイン蓄積症の脳で不溶化したα-シヌクレインは、C末端側に位置するセリン129が高度にリン酸化されていることを蛋白化学的に同定した。アルツハイマー病(AD)脳神経細胞に蓄積するタウ蛋白がやはり高度のリン酸化を受けており、脳脊髄液中のリン酸化タウがADのよい生化学的診断マーカーとなることを考え合わせると、脳脊髄液中のα-シヌクレイン、特にリン酸化α-シヌクレインを定量することはシヌクレイノパチーの診断に有用である可能性がある。我々はα-シヌクレインのセリン129位のリン酸化を特異的に認識するモノクローナル抗体#64を樹立し、これを用いた酵素免疫測定法(ELISA)の作出を試みた。サンドウィッチELISA法の捕捉抗体として、α-シヌクレインのC末端側を認識するモノクローナル抗体#102を使用し、直接HRP標識したリン酸化依存性抗体#64を検出抗体とする系を組み立てた。このELISAは、カゼインキナーゼ2でセリン129をリン酸化したリコンビナントα-シヌクレインをカットオフ値4ng/mlで検出し、非リン酸化α-シヌクレインとは反応しなかった。DLB脳抽出物尿素可溶画分に回収されるリン酸化α-シヌクレインの定量的検出にも本ELISA系は有効であった。脳脊髄液に適用するために、α-シヌクレインのアミノ末端側と結合する高親和性の捕捉抗体を用いることなどにより感度をさらに改善すべく、系を改良中である。パーキンソン病(PD)、Lewy小体型痴呆症(DLB)の脳にはLewy小体(LB)などの形でα-synucleinが凝集・蓄積するが、アルツハイマー病で脳脊髄液中のタウが上昇することを考えあわせ、PDやDLBでもα-synucleinが生化学マーカーとして利用可能かどうかが注目されている。しかし髄液中のα-synucleinはごく微量と考えられ、その免疫化学的検出は困難であった。本年度はDLB脳に蓄積したα-synucleinを蛋白化学的に解析し、マーカーとして応用可能な翻訳後修飾について検討した。DLB脳不溶画分に検出された約15kDの不溶性α-synucleinをQ-sepharoseカラム・HPLCで精製、臭化シアンで消化後、HPLCでペプチド断片を分離し、MALDI-TOF Massで解析すると、128-140ペプチドに対応する質量数1515のシグナルに加えて、質量数1595を示すシグナルが検出された。さらに質量数1595のピークをMS/MS解析し、Ser129のリン酸化を確認した。リン酸化ペプチドを抗原としてSer129リン酸化α-synuclein特異抗体を作製しPD,DLB脳を染色すると、LB及びLewy neuriteが陽性を示した。DLB脳由来α-synucleinのウェスタンブロットでも、リン酸化α-synuclein特異抗体は約15kDaの不溶化α-synucleinのみと反応し、正常α-synucleinは反応しなかった。α-synucleinのSer129はリン酸化されうるが、そのレベルは生理的条件下では低いことが示されている。PD,DLBの生化学的診断マーカーとしてリン酸化α-synucleinが利用できる可能性が明らかになったので、現在酵素抗体免疫測定法の樹立を試みている。

脳脊髄液に適用するために、α-シヌクレインのアミノ末端側と結合する高親和性の捕捉抗体を用いることなどにより感度をさらに改善すべく、系を改良中である。
密閉雰囲気内で行う光触媒反応と電解作用の援用型特殊加工装置の開発とその特性

これまでのCMP(Chemical Mechanical Polishing)特性・メカニズムを踏まえて,ユニークな密閉式の両面同時ベルジャー(チャンバー)型CMP装置を設計・試作した.その結果,高圧酸素雰囲気の密閉ベルジャー内で,紫外線を照射しつつ光触媒反応を援用した高効率CMP法と両面同時加工法の革新的融合装置を実現した.とくに難加工材料のSiC基板については,従来加工法の4.5倍の加工能率が得られ脚光を浴びている.これまでのCMP(Chemical Mechanical Polishing)特性・メカニズムを踏まえて,ユニークな密閉式の両面同時ベルジャー(チャンバー)型CMP装置を設計・試作した.その結果,高圧酸素雰囲気の密閉ベルジャー内で,紫外線を照射しつつ光触媒反応を援用した高効率CMP法と両面同時加工法の革新的融合装置を実現した.とくに難加工材料のSiC基板については,従来加工法の4.5倍の加工能率が得られ脚光を浴びている.これまでに筆者らは、高度な次世代型CMP技術の構築を目指し、加工雰囲気を変えられる「密閉型のベルジャー型CMP法」を考案してきた。今年度は、従来の試作したプロトタイプの装置を適用して基本的加工特性を把握し、来年度試作する「両面同時加工方式の“光触媒反応/電気化学的作用を援用した加工環境コントロール型CMP装置"」の骨格決定のための構想を確定すべく検討を行った。これまでの研究から、加工部の雰囲気を変えることによって、様々な難加工材料の高能率化加工できる可能性を見出してきた。まず、難加工材料の単結晶SiC基板を加工対象として、500kPaの酸素雰囲気下で加工を行ったところ、通常の大気圧下の加工レートよりも増大する傾向にあることを確認した。そして、スラリーにTiO_2粒子を添加し紫外線を照射して加工を試みたところ、大気中では光触媒反応らしき効果は見られないが、「高圧酸素雰囲気」ではじめて通常のCMPの揚合の数倍に相当する加工レートが得られ光触媒反応らしき効果が認められた。このことは、サファイア基板の場合でもその効果が見られた。一方、高圧の不活性ガス雰囲気ではマイナス(加工レート低下)の現象があることが分かった。さらに新しいアイデアとしてスラリー中への気体の溶解しやすいCO_2を雰囲気ガスとして加工を試み、Cu基板を加工対象例に基本的加工特性を把握した結果、スラリー中への溶け込みがあって興味深い化学反応の応用の可能性を見出した。本提案の新たな加工援用効果を複合化すべく光触媒反応/電解作用を付加した革新的な装置によって、機械的・化学的に安定した難加工材料を、あるいは逆に機械的強度の弱い材料を、高効率に高品位加工の実現を目指す。そのため21年度は、実際の基板材料の平行平面を高精度に加工できる両面同時加工方式も念頭に、新しい装置の試作を行い加工特性を把握していく。これまでに筆者らが試作したプロトタイプの装置を適用して基本的加工特性を把握し、試作装置「両面同時加工方式の"光触媒反応/電気化学的作用を援用した加工環境コントロール型CMP装置"」の骨格決定と詳細設計のための検討を行った。試作した装置は,密閉容器内部を様々なガス種・ガス圧に制御して,加工部の雰囲気による付加効果を用いることで加工の高能率化・高品位化を図ろうとするもので,最終目標は,加工雰囲気を制御しながら難加工性の結晶材料(SiC,サファイア,GaNなど)を両面同時に高能率・高品位に平坦化加工する次世代型CMP技術の構築を目指すものである.本年度は、試作した密閉耐圧型CMP装置の運動機構について解析して,均一平滑平坦化を得るための相対運動条件を明らかにした.この条件を基にして,単結晶シリコンウエハを用いて試作装置の加工特性を把握しつつ装置の動作特性を調べたところ、所期の運動機構であることを確認した.さらにSiウエハを用いて常圧大気中での装置の基本特性,および種々の高圧ガスを導入した時の効果について比較検討を行い、以下の結果を得た.1)試作装置の常圧大気中での加工レートは,上下定盤の回転速度比ではなく回転速度差に依存する.2)機械的作用の弱い(低加重・低回転速度など)条件下では加工雰囲気の影響はほとんど現れない.3)高圧酸素ガス中でSiウエハのCMPを行った結果,加工レートが増加することが確認できた.特に,機械的作用が強い条件下(高荷重・高回転速度)で酸素ガスの影響が強く発現することが分かった.以上の結果を踏まえて、今後は酸素をはじめとする各種の雰囲気下でのCMPに着目し,活性酸素を発生する光触媒反応を援用することも視野に入れて難加工材料の加工研究を進める.また、電界複合ポリシングの可能性についても検討する。そして、最終的には、次世代型加工装置として提案していく。半導体材料の仕上げ加工の主流になっているCMP(Chemical Mechanical Polishing)においては,材料を超精密平滑表面に仕上げることを大前提として高い加工能率が求められている.特に近年,省エネデバイス用の半導体材料としてシリコンカーバイド(SiC)が注目を浴びているが,その機械的・化学的な安定性から最終製品に至るまでに多段階のCMP工程を組まなければならない.現在,CMPはクリーンな環境下で行われているが,加工中の周辺の雰囲気や光などといった加工環境に対してはほとんど考慮されておらず,大気に対して剥き出しの状態で加工が行われている.そのため,不安定な加工特性になりがちで,高能率な加工条件の設定に限界がある.この問題に対処するため,過去の研究において,加工部周辺の環境が加工に及ぼす影響に着目し,雰囲気を制御しながら片面CMP加工を行ったところ,様々な難加工性材料を高能率に加工できる可能性を見出してきた.

そこで先の結果に鑑み,両面同時CMP中に加工環境制御を適用することで更なる高能率化を達成することを目的とし,耐圧密閉チャンバー(ベルジャー)型両面同時CMP装置を試作した.本装置を用いて加工環境を制御しながらシリコン(Si)およびSiCの加工特性を把握した結果,Si,SiCともに酸素を含む高圧ガス中で研磨能率が増大し,特に,高圧酸素ガス中で最も高くなり,Siは約1.3倍,SiCは約2.8倍となった.このことから酸素による酸化が加工に影響を及ぼす重要な因子であることを突き止めた.そこで難加工性であるSiCに対しては酸素よりもさらに強力な酸化力を有する活性酸素を加工に用いることを考え,研磨剤中に光触媒であるチタニア粒子(TiO_2)を添加し,高圧酸素ガス中で紫外線を照射しながらCMPを行ったところ,高圧酸素による研磨能率の増加分に加え,光触媒反応による1.3倍の研磨能率の増加を確認した.これらの結果はデバイスウエハの製造コストの低減に貢献できる.(750字)
血清レプチン、アディポネクチンと潜在性動脈硬化進展度に関する研究

720人の一般住民男性を対象にアディポサイトカインとCT検査による冠動脈石灰化(CAC, Agaston score (AS)>=10)と頸動脈内膜-中膜肥厚度(IMT)を用いて検討した。レプチン(lep)およびアディポネクチン(adip)を重回帰分析で解析するといずれもIMTとは関連がなかった。一方CACの有無をロジスティック解析で検討すると、年齢のみで調整した場合log-lepはCACと正の関連があったが、さらにBMI等を調整因子に加えるとlog-lepはCACと有意な負の関連が現れてきた。log-adipとCACの間には何ら有意な関連は無かった。ERA JUMPの第一の目的は,非侵襲的に評価できる冠動脈石灰化度や頸動脈内膜-中膜肥厚度(IMT)により,潜在的動脈硬化の進展度を比較すること。これまでに,一般住民を対象としてこのような国際比較が行われたことはなく,非常にユニークな研究といえる。その結果,日本人では潜在性動脈硬化がほとんど進展していないことが明らかになった。そこで遺伝的な要因についても検討を行うため,日本人と共通した遺伝的背景をもつハワイの日系人コホートもあとから加わった。だがハワイの日系人でもアメリカ人と同様に潜在性動脈硬化が進んでいることが明らかになり,こうした進展度の違いには遺伝子以外の要因が関与していることが示唆される結果となった。そこでさらに研究をすすめ、以下の結果を得た。<研究1>では日本およびハワイ在住の日本人の一般中年男性住民を対象にCT検査による大動脈石灰化と喫煙の影響について検討した。大動脈石灰化は日系米人に比べて日本在住男性において遙かに少なかった。喫煙率は日本在住男性が高かった。喫煙は大動脈石灰化に寄与する独立因子であった。従って大動脈石灰化の両者の差は喫煙では説明されなかった。<今後の研究>「血清レプチン、アディポネクチンと潜在性動脈硬化進展度に関する研究」について平成24年度に血清レプチン、アディポネクチンの測定[測定業者に依頼して保存血清を解凍してレプチン、アディポネクチン測定を完了したところである。今後レプチン、アディポネクチンとCT検査による冠動脈石灰化、および頸動脈超音波検査により得た頸動脈内中膜肥厚(MIT)のとの関連を交絡因子を考慮して解析を実施する予定である。動脈硬化進展に関与するサイトカインとしてアディポネクチンとレプチンの2つのアディポサイトカインの役割が最近注目されている。アディポサイトカインの動脈硬化進展作用の最上流には肥満があるが、急速な肥満改善を安全に行うのは困難であるため、過渡的に治療目的でアディポネクチンやレプチンを投与する計画が立案されている。しかし上記知見の多くは動物実験の結果に依存する部分が多く、動脈硬化予防にアディポサイトカインを体外から投与することの妥当性はあらかじめヒトで確認する必要がある。滋賀県草津市在住の720人(40-69歳)の一般住民男性を対象に血清レプチンおよびアディポネクチンと潜在的動脈硬化の関係をCT検査による冠動脈石灰化(CAC, Agaston score ≥10)と頸動脈内膜-中膜肥厚度(IMT)を用いて検討した。レプチンおよびアディポネクチンを5分位に分けると平均IMTとAgaston scoreはレプチンが高いグループほど高く、またアディポネクチンが高いグループほど低かった。重回帰分析にて解析すると対数変換レプチン(log-leptin)と対数変換アディポネクチン(log-adip)のいずれもIMTとは関連がなかった。一方CACの有無をロジスティック解析で検討すると、年齢のみで調整した場合log-leptinはCACと正の関連があったが、さらに収縮期血圧、喫煙、飲酒量、HbA1c、BMI、BMIxlog-leptinを調整因子に加えるとlog-leptinはCACと有意な負の関連が現れてきた。このため減量目的の補助手段としてレプチンを使用することにある程度の期待が出来ることとなった。本結果は現在英文に投稿中である。当初本年度に血清レプチン、アディポネクチンの測定を行う予定であったが、次年度に繰り越したい。その理由は凍結血清は数個に分割して凍結しているが、1つの標本を解凍して2指標のみを測定すると血清に余分が多く残る。再凍結、再解凍を繰り返すと測定する物質によっては大きな誤差を生じる。このため可能な限り多くの生化学物質を測定することが望ましいが、今年度は他の共同研究者の研究資金が潤沢でない。来年度には獲得できる研究資金の目処が立っているため、両者の測定も他の生化学物質と合わせて測定を行いたい。一方、INTERLIPIDデータセットを用いて同様の解析を行った。

対数変換CRP(lCPR)と他の変数との地域(日本とハワイ)および性別で調整した偏相関関係を調べると年齢、BMI、収縮期血圧、対数変換レプチン(lLept)、HbA1C(糖尿病指標)、喫煙本数と有意な正相関があり、対数変換アディポネクチン(lAdipo)とは有意な負相関があった。運動強度、食事総摂取熱量とは有意な相関はなかった。次にlCRPを従属変数とし、調整因子として地域、年齢、収縮期血圧、HbA1C、喫煙本数、運動強度、食事総摂取熱量を投入し、lLeptまたはlAdipoが炎症マーカーであるlCRPを規定するか男女別に検討した。その結果、男女ともlLeptはlCRPの有意な正の関連因子、lAdipoはlCRPの有意な負の関連因子であることが判明した。しかしさらにBMIおよび相互関連があるかの検討のためBMIとlLeptないしlAdipoの積を投入すると男性におけるlLeptはlCRPの有意な正の関連のみが残り、他の関連は有意性が消失した。従って安全なレプチンの拮抗因子が作成出来れば肥満とは独立して炎症を抑制し動脈硬化を抑制することが期待できるが、アディポネクチンはその効果が限定される可能性があることを示唆した。平成24年度に血清レプチン、アディポネクチンの測定[測定業者に依頼して保存血清を解凍してレプチン、アディポネクチン測定を完了したところである。今後レプチン、アディポネクチンとCT検査による冠動脈石灰化、および頸動脈超音波検査により得た頸動脈内中膜肥厚(MIT)のとの関連を交絡因子を考慮して解析を実施する予定である。当初本年度に血清レプチン、アディポネクチンの測定を行う予定であったが、次年度に繰り越したい。その理由は凍結血清は数個に分割して凍結しているが、各研究対象者の1つの標本を解凍して2つのみを測定すると血清に余分が多く残る。再凍結、再解凍を繰り返すと測定する物質によっては大きな誤差を生じる。このため可能な限り多くの生化学物質を測定することが望ましいが、今年度は他の共同研究者の研究資金が潤沢でない。来年度には獲得できる研究資金の目処が立っているため、両者の測定も他の生化学物質と合わせて測定を行いたい。採取するデータは全て集まったので、次年度は統計解析、学会発表、論文発表を推進していく予定である。<血清レプチン、アディポネクチンの測定>測定業者に依頼して保存血清レプチン、アディポネクチンを測定する。測定時期が単一統一出来ないときは系統的誤謬が生じないように配慮する。<統計解析>必要により運動量、摂取総熱量で調整した主要栄養素摂取量を加えた解析を行う。従属変数に心臓CTで得られる冠動脈石灰化、頚部超音波検査での内頚動脈中内膜肥厚など潜在的動脈硬化病変の程度、または炎症マーカー高感度CRPを投入し、アディポサイトカインとの関係を肥満係数、腹囲、腹部CTで得た内臓脂肪面積、年齢などの交絡因子を考慮に入れて検討する。必要により食品摂取頻度、運動量などの交絡因子を加えての解析を行う。主に海外の学会での発表に対する渡航費に当てる。<旅費>海外学会でのINTERLIPIDの結果報告<統計ソフト>
マウスB白血病細胞の分化誘導と抗腫瘍性免疫誘導の試み

本研究はB白血病細胞に対する宿主の抗腫瘍性増強を図る研究の手始めとして(【i】)T細胞由来でマウスB白血病細胞を抗体産生細胞に迄分化させる液性因子の単離、同定をする、(【ii】)B白血病細胞に対する抗腫瘍性細胞なかんづく細胞傷害性T細胞の誘導及びその増強を試みると共に、(【iii】)分化誘導因子及び細胞傷害性T細胞の誘導法及び増強法を併用することによりB白血病に対する免疫学的治療実験法のモデルを確立することをその研究目的とする。本年度の研究実績に関しては以下の通りである。(【I】)正常活性化B細胞因子の一種であるTcell・replacingfactor(TRF)の作用により、マウス慢性B白血病細胞はIgM産生細胞に分化する。然しながら既知の他のリンフォカイン例えばインターロイキン2、免疫インターフェロン、インターロイキンク、B cell-stimulatory factor(BSF-1)などはBC【L_1】の分化に何ら影響を与えない。発癌プロモーターであるPHMも何ら分化誘導活性を示さずむしろ抑制的に作用した、我々の樹立したTハイブリドーマ由来のTRFは分子量18Kの糖蛋白質であり、TRF活性以外の生物活性は検出されない。TRFはBC【L_1】細胞の分泌型MRNAの転写を促進する。(【II】)BC【L_1】細胞に対する抗腫瘍性T細胞を誘導すべく各種系統マウスを不活化BC【L_1】細胞で免疫しBC【L_1】細胞に殺細胞効果を示す活性を示すものを調べた。BC【L_1】細胞と同種同系マウスを結核死菌で感作し、ツベルクリン(PPD)修飾BC【L_1】細胞で免疫すると有意な殺BC【L_1】細胞活性を示すT細胞の生成を意起しろることが明らかになった。BC【L_1】細胞の亜京細胞を静脈内に投与すると抗【BCL_1】活性を示す細胞を誘導できることが明らかとなった。
イギリスの公法改革における普遍性と固有性の相互関係再編に関する総合的比較法研究

イギリスにおける司法審査は、原告適格が拡大し、政府は、司法審査のアクセス制限を提案した。提案に対しては、法の支配に反するとして、厳しく批判がなされてきた。政府は、原告適格の制限等は取り下げたものの、財政的負担を増やす提案を実施した。また、カート(Cart)事件最高裁判決を受け、審判所は司法の一部を構成するので、裁判所とともに、法の支配を支えるものとされた。裁判所・審判所に共通して、裁判官の任命過程が注目され、司法の独立性のみならず、司法のアカウンタビリティの重要性が指摘されている。さらに、政府は、より略式の紛争解決手段の活用を目指しているが、公正性や独立性の点で疑問が出されている。本年度は、2013年秋に追加採択を受けた後、急ピッチで研究を進め、12月に研究代表者・分担者で合宿研究会を行い、それぞれの担当内容や今後の計画を確認した。各メンバーは担当内容に関する文献の収集や検討を行い、担当内容について研究を行った。2014年3月には、ゲスト・スピーカーとして、イギリス社会保障法を専門とする札幌学院大学山下慎一講師と、イギリス憲法を専門とする関西学院大学柳井健一教授に研究会で報告をお願いし、2007年の審判所改革の意義や、日本とイギリスにおける日英憲法セミナーの成果や研究会の準備の仕方について議論した。同じく3月には、イギリス調査に研究代表者と研究分担者3名が行き、資料収集をするとともに、全員で計画法上の開発行為の許可拒否処分に関する公開審問(public inquiry)を視察し、不服申立人側のバリスタと、拒否処分をした自治体側のソリシタによって、裁判類似の手続が進行することを確認した。さらに、3名は、Landmark Chambers(法律事務所)において、Public Law Project(PLP)のサンキン(Sunkin)教授とリサーチ・ダイレクターであるボンディ(Bondy)氏にヒアリング調査をした。まず、PLPのプロジェクトの概略を説明してもらい、その後、現在司法審査の改革が司法省から提案され、法案も提出されていることから、その提案の意味や評価について討論をした。また、出入国管理領域においては、司法審査の管轄権を高等法院行政裁判所(行政部)から、第二層(上級)審判所に移す改革も行われているので、同じ司法審査権限を高等法院と第二層審判所で行使する場合の相違などについて討論を行った。この会合の最後には、2014年度に日本で行う研究会において、お二人に報告をしていただくことなどについて打ち合わせをした。2014年度の重点の一つとして計画していた、エセックス大学から、サンキン(Sunkin)教授とボンディ(Bondy)上席研究員を迎えた南山大学と龍谷大学でのセミナーを、3月中旬に予定通り実施した。セミナーのテーマは、イギリスの司法審査の価値と現実、近年の司法審査制度改革、司法審査のインパクト、比例的紛争解決の概念と行政的正義と司法審査との関係といったものである。事前にわが国の行政救済制度の状況を英文で両氏に紹介し、それを受けて、両氏に事前に報告ペーパーを用意してもらった。それ以外にもセミナーのテーマに関連する英文資料を参加者に事前に配布した。イギリス憲法研究会の研究者にもセミナーへの参加を呼びかけ、実際に多数の研究者に参加してもらうことができ、質疑応答も含め、充実したセミナーになった。また、2014年度は、研究分担者の6名がイギリス調査に行き、資料収集、研究会・講演会参加、裁判・計画審問傍聴のほか、マッケルドーニー(MacEldowney)教授、ヒムズワース(Himsworth)教授、UK Administrative Justice Instituteのリサーチャーであるドイル(Doyle)氏、ユーイング(Ewing)教授等多数の研究者や実務関係者にヒアリング調査を行った。さらに、スコットランド独立のレファレンダムの調査のために、研究協力者2名にイギリスに行ってもらった。その他、行政法研究フォーラムにあわせて研究会を行うとともに、2014年12月には、先にあげた3月のセミナーの打ち合わせや、研究の進展の確認等のために、研究会と打ち合わせを行った。加えて、出版助成を受けて、一つ前の科研の研究成果と本科研の研究の中間的な成果として、研究代表者と研究分担者12名の計13名で『行政法システムの構造転換ーイギリスにおける「行政的正義」』(日本評論社、2015年)を公刊した。2015年度の研究の重点の一つは、研究の中間的成果を示すために、比較法学会ミニ・シンポにおいて報告を行うことであった。龍谷大学において、事前の検討会として、研究代表者と研究分担者4名の計5名の報告予定者が報告を行い、報告者以外の研究分担者から助言を受け、報告内容の調整を行った。それを受けて、5名で比較法学会の報告を行い、学会誌(比較法研究)に報告の内容を掲載した。重点のもう一つは、南山大学と龍谷大学におけるセミナーでのサンキン教授・ボンディ上席研究員の報告ペーパーの翻訳と、この比較法学会ミニ・シンポでの報告をベースにした論文からなる本の出版準備である。具体的な出版企画を立て、2016年1月には提出原稿に基づき、技術的調整の研究会も開催し、2016年度には確実に出版できる状況にまで至っている。さらに、2015年度は、研究分担者の倉持孝司教授を中心に、江草基金からの助成を受けた名古屋大学愛敬浩二教授と協力しつつ、科研の計画として、エジンバラ大学のヒムズワーズ名誉教授と、ウォーリック大学のマッケルドーニー教授を招いて、セミナーを実施した。本科研から憲法だけではなく行政法の研究者も多数セミナーに参加し、意見交換を行った。

これ以外では、過去2年間と同様の研究活動を行った。まず、2015度には6名がイギリス調査に行くことを計画し、必要な文献収集、ヒアリング調査等を行った。例年と同じく、研究会も数回開催した。まず、8月の行政法研究フォーラムの開催にあわせて、日本大学で研究会と打ち合わせを行った。また、研究代表者である榊原が本出版を計画していたことから、上記で触れた2016年1月の調整の研究会の際に、外部のコメンテーターからの意見も含め、参加者で意見交換を行った。年度末の3月には研究合宿を開催した。各研究分担者が報告を行い、また、外部の2名の研究者に報告を依頼し、質疑応答を行った。研究計画に従い、比較法学会ミニ・シンポにおいて、研究代表者と研究分担者4名の計5名で報告を行った。また、2015年3月のセミナーと比較法学会の報告を併せて、出版企画を立て、2016年1月には技術的な調整の研究会も開催した。イギリス調査や研究会も予定通りに実施した。2016年3月には、研究合宿を行い、2015年度のまとめと2016年度の予定について研究会と打ち合わせをした。なお、研究年度の終わりに、1名の研究分担者が病気になり、研究費に未使用分が発生したが、その他の点では、概ね当初の計画通りに研究を進めることができた。本年度の研究の最重点は、サンキン教授・ボンディ上席研究員の報告ペーパーの翻訳と、比較法学会ミニ・シンポでの報告をベースに加筆などした全部で9つの論文からなるイギリスの司法審査に関する本を出版することであり、最終的に2016年12月に出版することができた。本出版以外では、過去3年間と同様の研究活動を行った。まず、4名がイギリス調査に行った。イギリス調査の目的であるヒアリング調査として、まず、シェフィールド大学を訪問し、ジー(Gee)教授に司法のアカウンタビリティを中心にインタビューを行い、その後、カーカム(Kirkham)博士、トムリンソン(Tomlinson)氏とも意見交換した。マンチェスター大学では、トーマス(Thomas)教授に行政的正義に関してインタビューを行った。また、大学などで開催されるBrexit、司法審査などに関するセミナーに出席するとともに、補充的な資料収集を行った。さらに、上述した本をサンキン教授・ボンディ上席研究員に手渡し、意見交換を行った。研究会も全体では2回開催した。まず、8月の行政法研究フォーラムの開催にあわせて、京都において研究会と打ち合わせを行った。最初に触れた本出版前ということもあり、その最終調整もあわせて行った。また、2017年1月には研究合宿を開催し、多数の分担者が参加した。各研究分担者が本科研の成果について報告を行い、質疑応答を行った。また、外部から報告者を招き、「正当な期待」に関する報告を受けて、日本における判例状況との比較を交えて、意見交換を行った。この科研合宿に参加できなかった分担者については、別途、小規模の研究会などを行った。最終年度ということもあり、研究の取りまとめや今後の計画についても議論した。
ヒトWilms腫瘍細胞株を用いたWilms腫瘍抑制遺伝子(WT-1)の機能解析

(目的)本研究では、当初、1.無虹彩症患児に発生したWilms腫瘍より樹立したヌードマウス移植腫瘍株KCMC-WT-1よりin vitro培養細胞株を樹立し、性格付けを行う、2.1で樹立された培養細胞株に、Wilms腫瘍抑制遺伝子(候補)WT-1 cDNAを組み込んだ発現プラスミドを移入し、細胞の性格の変化を検討し、WT-1遺伝子の機能解析を行う、ことを目的とした。(方法および結果)1.KCMC-WT-1の継代時毎に(現在継代21代)、培養細胞株を樹立を試みた。しかし、組織片植え込み法、酵素消化法のいずれにおいても、マウス線維芽細胞の増殖により腫瘍細胞の安定した増殖は得られなかった。現在、培養条件を検討中であるが、無血清培地、低カルシウム培地、浸透圧を変化させた培地などを用いた培養を試みている。2.KCMC-WT-1より細胞株の樹立が困難であったため、我々が樹立したラットWilms腫瘍細胞株ENU-T-1(Nagashima et al.,1989; Sumino et al.,1992, Nagashima et al.,1992)をrecipient細胞として用いることを検討した。本細胞株はノザン法にてラットWT-1遺伝子転写産物を欠いており、本実験に適している。3.WT-1遺伝子の発現プラスミドとしてpCAGGS-neo-WT1(秋山徹博士より供与)を用いENU-T-1に、リポフェクチン法による遺伝子移入を行った。現在、得られたクローンの性格(増殖性変化、ヌードマウス移植性の変化など)を検討している。(付記)KCMC-WT-1は継代中に、組織学的に、器官様成分が失われ、腎芽細胞成分によって構成されるようになった。このことから、細胞株の樹立がより容易になると期待される。