hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
道徳的ジレンマ状況における「行動」と「判断」の乖離に関する検討

また、「共感性」を軸にした検証では、特性的な共感性が相対的に低い個人において、自己制御能力の高低と道徳ジレンマ判断との関連がみられた。このことから、個人の属性的な共感能力の影響が確認されたが、同時に、人によっては、ジレンマ状況で追求すべき目標に応じて共感を制御することができるかが、判断や行動にとって重要な規定因となる。以上の知見をもとにした今後の研究の展開として、感情制御や認知的注意の制御能力が道徳判断・行動に与える影響を、より詳細で直接的に検証すべく準備を進めている。見出された以上の知見について、平成29年度中に、国内学会(日本グループ・ダイナミックス学会第64回大会)と国際学会(AASP 2017 Conference)にて報告し、国内外の研究者と知見の妥当性や価値について議論した。また、当該年度には、既得の研究データを学会および学術誌にて発表した。平成29年度の研究計画は、初年度(28年度)に得られた知見をベースに、さらなる研究の推進を目指すことであった。この目的に照らし、28年度に得られたデータのより精緻な解析を進めるとともに、データを補強する調査を実施することで、知見の妥当性と信頼性を確認することができた。一方で、平成28年度中に購入を予定していた視線計測装置の開発中止および事業撤退があった影響で、当初は平成29年度中に実施を予定していた実験の一部で、計画の大幅な見直しが生じた。当該の実験は、平成30年度中の実施を計画しており、使用する測定ツールを部分的に変更した上で準備を進めている。本研究課題は、道徳的ジレンマ状況で人々の「判断」と「遂行」とが乖離する可能性と、その背後にある心的過程を解明することを目的とした。2018年度には、多数の人々の生命や社会正義を守るために少数を傷つける行為(道具的危害)が求められる場面を題材とした実験(参加者90名)を実施した。参加者の半数は、画面上に呈示されるジレンマについて、自らを行為者とした場合の遂行意図を回答した。残りの半数は、当該行為の許容度を評定した。分析の結果、全体的傾向として、行為の許容度の判断に比べ、遂行意図が低く示されることが認められた。意思決定過程をさらに詳細に検討するため、参加者のマウスカーソルの軌跡を解析したところ、行為を肯定(許容ないし遂行)した試行で「行為者」と「判断者」の間に特徴的な違いがみられた。具体的に、行為者は(1)各試行の初期段階には判断者より強く心理的葛藤を経験するが、(2)試行中盤で遂行の決断をした後は判断者よりも選択肢に向かい直進的に反応し、さらには(3)個人差として自己制御特性が高いほど葛藤が少ないといった知見が得られた。人は、道具的危害を遂行する必要性に迫られたとき、生じる葛藤をコントロール必要があり、それには自己制御過程が大きく関与するといえる。以上の結果は、2018年度中に海外学会にて報告した。2016年度からの期間全体を通して、道徳ジレンマでの人々の意思決定には、判断時に喚起される感情反応(対象への共感など)を合目的的に制御する過程が関わっており、それは特に「行為者」の立場で顕著であることが示された。この知見は、ジレンマ状況での意思決定に関して展開されている先行の議論に対し、自己制御の観点を組み込んだ視座を提供するものである。また、現実場面で人が人を傷つける状況を解釈する上でも有用な枠組みを提供する。現在、得られたデータをさらに解析した上で論文化する準備を進めている。
骨膜結合組織移植とシャペロン分子誘導を利用した新しい歯周組織再生法

本研究はヒト歯肉上皮細胞(HGK)およびヒト歯肉線維芽細胞(HGF)において,37°C,3時間の熱処理でconstitutivelyなタンパク発現が,42°C,3時問でストレスタンパク(シャペロン分子)のHsp (heat shock protein)が誘導されることを明らかにしてきた。今回,歯周病原性細菌A. actinomycetemcomitansをHGKに作用後,ストレスタンパクの発現応答をRT-PCR法およびwestern blotting法によって解析した結果,Hsp27, Hsp60, Hsp70の発現が認められた。この発現は培養上清には無くcell layerにみられた.Hsp90はHGKでは37°C, 42°Cの熱処理で発現が認められなかった。ストレスタンパクを安全かつ選択的に誘導して強力な細胞保護作用を発揮する,シャペロン分子誘導剤であるGeranylgeranylacetoneをHGKに作用させた場合northernblotting解析からCOX-2, IL-8のmRNAの発現を誘導した。HGKではCOX-2のmRNAの発現は37°C,3時間の熱処理でも増加した。HGFへの熱処理では,Hsp104の発現は37°C, 42°Cいずれも発現が確認できなかったが,Hsp90では42°Cで増加した。Hsp70, Hsp40の発現も同様に42°Cの熱処理で増加した。最終的には歯肉への温熱効果を踏まえて骨膜結合組織への熱処理の影響を,in vivoで捉えていく必要があるが,動物実験報告から,Hsp104/Hsp70/Hsp40系で,凝集したタンパクが脱凝集し活性を回復すること,細胞内で機能するHsp90がタンパクの変異を抑制し,恒常性に働くと考えられている。本研究のヒト細胞への熱処理によるHsp発現結果から,ストレスタンパクと歯周組織再生の関係を検討していく上で同様な事象が起きている可能性が示唆された。平成13年度はシャペロン分子の誘導実験を主として行った。ヒト歯肉上皮細胞(HGK)およびヒト歯肉線維芽細胞(HGF)に37°C,3時間(as a control)および42°C,3時間の熱処理を加えた後のストレス蛋白質の発現応答の解析を行った。そして、熱処理を加えた後のHGKおよびHGFに歯周炎成立の初期段階で重要な役割を担うと考えられているActinobacillus actinomycetemcomitans(A.a)を作用させストレス蛋白質の発現応答をRT-PCR法およびWestern Blot法によって解析を行っている。また、胃粘膜保護剤として知られている"Geranylgeranylacetone(セルベックス)"が、ストレス蛋白質を安全、かつ選択的に誘導して、強力な細胞保護作用を発揮する、いわゆるシャペロン誘導剤であることを利用した実験も考えている。実験材料としてのHGKおよびHGFは対象となる患者の人権保護を目的としたヘルシンキ宣言の精神に沿って充分な説明を行い同意のもと獲得した。HGKは健康な歯肉から、0.025%trypsinと0.01%EDTA処理により分離後、初代培養細胞とした。一方、HGFは健康な歯肉からexplant cultureによって初代培養細胞とした。これらの細胞は継代培養後、ほぼconfluentの状態になった時、実験に用いた。我々が行った現時点での実験結果は、HGKおよびHGFにおいて37°C,3時間ではconstitutivelyなストレス蛋白質の発現が42°C,3時間の熱処理を加えることによりストレス蛋白質が誘導されることを明らかにした。

今後は,現在行っている動物実験の結果から,ストレス蛋白と歯周組織再生の関係を検討していく予定である。本研究はヒト歯肉上皮細胞(HGK)およびヒト歯肉線維芽細胞(HGF)において,37°C,3時間の熱処理でconstitutivelyなタンパク発現が,42°C,3時間でストレスタンパク(シャペロン分子)のHsp (heat shock protein)が誘導されることを明らかにしてきた。今回,歯周病原性細菌A. actinomycetemcomitansをHGKに作用後,ストレスタンパクの発現応答をRT-PCR法およびwestern blotting法によって解析した結果,Hsp27,Hsp60,Hsp70の発現が認められた。この発現は培養上清には無くcell layerにみられた.Hsp90はHGKでは37°C,42°Cの熱処理で発現が認められなかった。ストレスタンパクを安全かつ選択的に誘導して強力な細胞保護作用を発揮する,シャペロン分子誘導剤であるGeranylgeranylacetoneをHGKに作用させた場合northernblotting解析からCOX-2,IL-8のmRNAの発現を誘導した。HGKではCOX-2のmRNAの発現は37°C,3時間の熱処理でも増加した。HGFへの熱処理では,Hsp104の発現は37°C,42°Cいずれも発現が確認できなかったが,Hsp90では42°Cで増加した。Hsp70,Hsp40の発現も同様に42°Cの熱処理で増加した。最終的には歯肉への温熱効果を踏まえて骨膜結合組織への熱処理の影響を,in vivoで捉えていく必要があるが,動物実験報告から,Hsp104/Hsp70/Hsp40系で,凝集したタンパクが脱凝集し活性を回復すること,細胞内で機能するHsp90がタンパクの変異を抑制し,恒常性に働くと考えられている。本研究のヒト細胞への熱処理によるHsp発現結果から,ストレスタンパクと歯周組織再生の関係を検討していく上で同様な事象が起きている可能性が示唆された。
脳卒中後筋受容器反射の変化及び運動トレーニングによる効果

本研究は,脳卒中などの中枢神経系疾患に伴い中枢性循環調節や末梢筋受容器反射がどのように変化するかについて高血圧に注目して検討した.健常のラットに比べ,高血圧ラットでは中枢性および末梢性の循環調節による昇圧反応が有意に大きかった.さらに,健常の場合では末梢筋受容器の刺激による反射性の入力は中枢性循環調節による昇圧反応を抑制するが,高血圧では抑制効果がみられなかった.これら調節機構の異常が高血圧をもたらす可能性が示唆された.本研究は,脳卒中などの中枢神経系疾患に伴い中枢性循環調節や末梢筋受容器反射がどのように変化するかについて高血圧に注目して検討した.健常のラットに比べ,高血圧ラットでは中枢性および末梢性の循環調節による昇圧反応が有意に大きかった.さらに,健常の場合では末梢筋受容器の刺激による反射性の入力は中枢性循環調節による昇圧反応を抑制するが,高血圧では抑制効果がみられなかった.これら調節機構の異常が高血圧をもたらす可能性が示唆された.随意運動に伴う血圧や心拍数の上昇は中枢性と末梢性の影響が考えられる。前者は、随意運動指令が高次脳中枢から発信されその信号が脳幹、脊髄を経て末梢筋を収縮させ運動を起こすと同時に、自律神経系を興奮させ、心交感神経活動の増加と副交感神経活動の減少により心拍数を増加させる。一方、後者は筋の物理的変形および代謝産物の蓄積により筋機械受容器と筋代謝受容器が刺激され、その信号はGroup III、IV群求心性線維を介して循環調節中枢へフィードバックされ反射的に血圧を上昇させる。脳梗塞や脳出血などの脳血管障害により中枢運動指令が減弱あるいは消失する場合、末梢筋受容器反射の役割の変化については明らかではない。本研究は除脳ラットを用いて、中枢からの信号が遮断された時の末梢筋受容器反射、特に筋機械受容器反射の変化について調べた。実験用ラットは麻酔下で左外頸静脈と頸動脈を剖出し、試薬の投与および血圧測定のためにカテーテルを挿入した。ラット下腿三頭筋を剖出し伸張させた状態で、血圧や心拍数の変化を観察した。次に、上丘前縁・乳頭体後縁(precollicular-postmammillarylevel, Bregma-4.5mm)で除脳した後、同様に下腿三頭筋の伸張を行なった。その結果、除脳前と比較して除脳後では心循環応答が有意に増加した。さらに、血管収縮剤(ノルエピネフリン、フェニレフリン)と血管拡張剤(ニトロプルシド)を用いて圧受容器反射を調べた結果、除脳後では除脳前に比べ反射の感受性は増加傾向にあった。これらの結果より、筋機械受容器反射は高位脳中枢により修飾を受けることが示唆された。以上の結果を踏まえ、来年度は末梢神経電気刺激による誘発筋収縮時の循環応答を観察することで、中枢運動指令の遮断が筋代謝受容器反射に及ぼす影響を明らかにしたい。脳血管障害を引き起こす危険因子として高血圧が挙げられる。高血圧のリハビリテーション戦略として運動療法が有効とされているが、高血圧患者において随意運動に伴う循環応答は健常者と比べ過常であることが明らかにされている。その理由として、随意運動における筋収縮に伴い、末梢筋機械受容器反射と筋代謝受容器反射は高血圧において亢進していることが報告されている。一方、中枢運動指令によって引き起こす循環応答は高血圧では増減しているかどうかは明らかではない。本研究は、ヒト本態性高血圧モデルである自然発生高血圧ラット〔spontaneouslyhypertensive rat,SHR}と対照ラット(Wistar-Kyoto rat,WKY}を用いて、中脳歩行誘発野〔mesencephaliclocomotor region,MLR)の電気刺激によって誘発される運動に伴う循環応答について調べた。上丘前縁で除脳したラットはMLRを同定した後、筋弛緩薬(pancuroniumbromide)投与したうえ実験を行った。その結果、高血圧ラットにおいて、MLR刺激(20,30、40,50μA)に伴う昇圧応答はWKYに比べSHRでは有意に高値を示した。また、腎交感神経活動の増加量もWKYに比べSHRでは有意に多かった。さらに、動脈圧受容体除神経(baro-receptor denervation)を行ったWKYとSHR群間の比較においても同様に、昇圧応答と腎臓交感神経活動では有意な差が認められた。以上の結果をまとめると、筋機械受容器反射と筋代謝受容器反射の影響と動脈血圧反射の影響を除外した状態で、MLR刺激によって誘発される運動に伴う循環応答はWKYに比べSHRでは有意に増加した。すなわち、高血圧において中枢運動指令による循環応答が亢進しているが示唆された。昨年度は脳血管障害の危険因子である高血圧の生理学的メカニズムについて調べた結果、運動昇圧反射の亢進に加え、中枢運動指令による循環応答も亢進していることが分かった。しかし、中枢性と末梢性の循環調節の相互作用について不明な点が多く、また高血圧では健常状態と比べてその関係は異なるかどうかは明らかではない。本年度は、ヒト本態性高血圧モデルである自然発生高血圧ラット(spontaneously hypertensive rat, SHR)と対照ラット(Wistar-Kyoto rat, WKY)を用いて、中脳歩行誘発野(mesencephalic locomotor region, MLR)の電気刺激(強度: 20-50 μA)によって誘発される運動に伴う循環応答に加え、坐骨神経(sciatic nerve, SN)の同時電気刺激(強度: motor threshold (MT)の3, 5, 10倍)による循環応答について調べた。

ラットは上丘前縁レベルで除脳し、筋弛緩薬(pancuronium bromide)を投与したうえ実験を行った。その結果、SNの刺激強度をx3 MTに設定した場合、MLRの刺激強度に依存した循環応答は変化せず、WKYとSHRでは同様の結果がみられた。一方、SNの刺激強度を上げると(x5, 10 MT)、WKYではMLRによる昇圧反応は減弱したが、SHRでは昇圧反応は逆に増加した。それぞれのラットで脊髄後根神経活動を記録すると、SN刺激強度の増加に従いI, II群に加えIII群神経線維の発火が認められた。以上の結果をまとめると、WKYでは筋受容器反射によって中枢性の昇圧反応は減弱されるが、SHRでは減弱されないことから、その抑制の障害が高血圧をもたらす一つのメカニズムであることが示唆された。脳血管障害において最も関係深い高血圧モデルにおいて、筋機械受容器反射および筋代謝受容器反射の亢進だけではなく、中枢運動指令によって引き起こされる昇圧応答も亢進していることを示した。24年度が最終年度であるため、記入しない。脳血管障害を引き起こす高血圧において、運動療法が有効とされているものの運動によって惹起される過常な循環応答は脳血管障害をもたらす危険性を高める。そのため、高血圧における過剰な循環応答の生理学的メカニズムを明らかにする必要がある。本研究では、筋受容器反射だけではなく中枢運動指令によって引き起こされる昇圧反応も亢進していることを示した。来年度では、運動時に筋受容器反射が中枢運動指令とどのように影響しあうか、また高血圧群では健常群と比べて違いがあるかどうかを調べる。
高齢者運動サロン活動による地域介護予防支援の長期・縦断的研究

本研究では、510年間、運動によるサロン活動に参加している高齢者の運動機能・認知機能・主観的健康感に及ぼす効果を縦断的に検討するとともに、サロン活動の社会的意義について調査する。また、高齢者運動サロンの育成や活動の継続支援に参考となるマニュアルを作成する。
抗菌米タンパク質成分のヒト病原菌に対する殺菌作用機構の解明と食品医薬品への応用

米由来タンパク質から歯周病菌、日和見感染真菌、ニキビ菌などのヒト病原菌に対して抗菌性を示す6種類のペプチドを見出した。これらのペプチドを構成するアルギニンやリジンなどの塩基性アミノ酸が抗菌活性を発揮するために重要であることが明かとなった。また、抗菌作用機構を細胞膜への作用とタンパク質合成の阻害に分けて検討した結果、2種類のペプチドは細胞膜を破壊することによって抗菌性を発揮することがわかった。したがって、これらの米由来ペプチドはヒトの疾病を予防するための医薬品や食品の素材として有用であることが判明した。米由来の抗菌タンパク質・ペプチドの精製と同定およびヒト病原菌に対する抗菌作用機構の解明について検討し、本年度は以下の結果が得られた。1.米由来のヒートショックプロテイン70ホモログの部分配列であるペプチドHsp70(241-258)は、歯周病菌と日和見感染真菌に対して抗菌活性し、その50%増殖阻害濃度(IC50)は、それぞれ63μMと70μMであることを明らかにした。2.Hsp70(241-258)の歯周病菌に対する抗菌作用機構を解明するために、Calceinを封入したベシクルの崩壊試験および蛍光色素であるdiSC3-5を用いた細胞膜脱分極アッセイについて検討した。その結果、Hsp70(241-258)は濃度に依存して、細胞膜に対する作用が強くなることが明らかとなった。すなわち、Hsp70(241-258)は歯周病菌の細胞膜に作用して抗菌作用を示すことが示唆された。また、Hsp70(241-258)の日和見感染真菌に対する抗菌作用機構を解明するために、Calcein-AMを用いた細胞膜透過試験および蛍光色素であるPIを用いた核酸染色アッセイについて検討した。その結果、両試験において、Hsp70(241-258)は細胞膜を破壊することによって日和見感染真菌を殺すことが示唆された。3.抗菌ペプチドの細胞内標的を明らかにするために、無細胞タンパク質合成系を利用したアッセイシステムおよびルシフェラーゼを用いた折りたたみを判定するシステムを開発した。すなわち、抗菌ペプチドがタンパク質合成の転写、翻訳、折りたたみのどの段階を阻害するのかを判定できるようになった。実際に、Buforin-IIは転写と翻訳ばかりでなく、折りたたみも阻害することを新しく解明した。米タンパク質由来の抗菌ペプチドの探索およびそれらのヒト病原菌に対する抗菌作用機構の解明について検討し、以下の結果が得られた。1.米タンパク質由来の抗菌ペプチドを探索した結果、酵素由来のCL(14-25)、ヒートショックタンパク質由来のHsp70(241-258)、α-アミラーゼ由来のAmyI-1(175-192)などを見出した。CL(14-25)は歯周病菌に対して抗菌活性を示した。Hsp70(241-258)は、歯周病菌と日和見感染真菌に対して抗菌活性した。AmyI-1(175-192)は、歯周病菌とニキビ菌に対して高い抗菌活性を示し、また日和見感染細菌、日和見感染真菌、侵襲性歯周炎原因菌、う蝕菌などに対しても抗菌活性を示した。2.抗菌ペプチドの歯周病菌や日和見感染真菌に対する抗菌作用機構を解明するために、蛍光色素であるdiSC3-5を用いた細胞膜脱分極アッセイ、Calcein-AMを用いた細胞膜透過アッセイおよび蛍光色素であるPropidium iodideを用いた核酸染色アッセイについて検討した。その結果、CL(14-25)とHsp70(241-258)は細胞膜を破壊することによって殺菌活性を示すことがわかった。実際に、AmyI-1(175-192)は翻訳ステップと折りたたみステップを阻害することを新しく解明した。1.米由来の酵素の部分配列であるCL(14-25)が、歯周病菌に対して抗菌活性を示すことを既に見出している。そこで、CL(14-25)の抗菌作用機構を解明するために、蛍光色素であるdiSC3-5を用いて細胞膜への作用を検討した。その結果、N末端から2番目のアルギニンとC末端から2番目のアルギニンが抗菌活性の発現に大きく寄与していることが明らかとなった。また、単一巨大ベシクル(人工リン脂質二重膜)を用いて細胞膜への作用を検討した結果、CL(14-25)を添加した4-5分後に破裂したことから、CL(14-25)は、細胞膜を破壊することによって歯周病菌を殺すことが示唆された。

2.抗菌ペプチドの細胞内標的を明らかにするために、無細胞タンパク質合成系を利用したアッセイシステムを部分的に開発した。すなわち、抗菌ペプチドがタンパク質合成(転写と翻訳)と折りたたみのどちらの段階を阻害するのかを判定できるようになった。3.新たに緩衝液を用いて砕米から抽出したタンパク質溶液から各種クロマトグラフィーや電気泳動を用いて、歯周病菌に対して抗菌性を示す1種類のタンパク質成分を単一にまで精製できた。飛行時間型質量分析計を用いて、この成分の分子量を精確に求めることができ、この成分はヒートショックプロテイン70ホモログと同定することができた。また、このタンパク質の部分配列であるペプチドHsp70(241-258)は、歯周病菌と日和見感染菌に対して抗菌活性を示すことを明らかにした。平成24年度の研究の目的は、1)米由来抗菌タンパク質・ペプチドの探索と同定、2)細胞膜を標的とした殺菌作用機構を解明するためのアッセイシステムの開発、および3)細胞内容物を標的とした殺菌作用機構を解明するためのアッセイシステムの開発であった。本年度の研究において、新しい抗菌ペプチドを発見し、歯周病菌と日和見感染真菌に対して抗菌活性を示すことを明らかにした。また、Calcein-AMおよびPIを用いた細胞膜を標的とした殺菌作用機構を解明するためのアッセイシステムを新たに確立し、米由来の抗菌ペプチドの歯周病菌および日和見感染真菌に対する抗菌作用は、細胞膜の破壊に起因することを明らかにできた。さらに、細胞内標的に対する作用機構を、転写、翻訳、折りたたみに分けて明らかにするための評価システムを開発できた。以上より、研究の24年度の目的は概ね達成できた評価できる。平成23年度の研究の目的は、1)米由来抗菌タンパク質・ペプチドの網羅的な単離・精製と同定、2)細胞膜を標的とした殺菌作用機構を解明するためのアッセイシステムの開発、および3)細胞内容物を標的とした殺菌作用機構を解明するためのアッセイシステムの開発であった。本年度の研究において、細胞膜を標的とした殺菌作用機構を解明するためのアッセイシステムを確立し、米由来の抗菌ペプチドの歯周病菌に対する抗菌作用は、細胞膜の破壊に起因することを明らかにできた。また、細胞内標的に対する作用機構を明らかにするための評価システムを部分的にではあるが開発できた。さらに、新しい抗菌ペプチドを発見し、歯周病菌と日和見感染菌に対して抗菌活性を示すことを明らかにした。以上より、研究の初年度の目的は概ね達成できたと評価できる。当初の研究の目的に沿って、新しい米由来抗菌ペプチドの探索と同定をさらに継続して実施し、また細胞膜への作用と細胞内標的への作用に区分して、新しい抗菌ペプチドの抗菌作用機構を解明する。さらに見出した抗菌ペプチドの抗菌スペクトルを明らかにし、ヒト病原菌に対して抗菌活性を示す有用なペプチドを探索する。当初の研究の目的に沿って、新しい米由来抗菌ペプチドの探索と同定を継続して実施し、また細胞膜への作用と細胞内標的への作用に区分して、それぞれ抗菌作用機構を解明するための評価手法を完成させる。
日本食コンポーネントが動脈硬化指標に与える影響-オミックス網羅的解析を用いた検証

生活習慣、特に食事習慣は動脈硬化と密接に関連していることが知られている。一方、どのような食事を取っているもので、どのような代謝物質が上昇し、動脈硬化につながっているかは明らかとはなっていない。そこで頸動脈が厚めの者と薄めの者で性・年齢を調整した上でのメタボロームの数値を比較した。東北メディカル・メガバンク計画、地域住民コホート対象者のうち宮城県の地域支援センターで調査を実施した約17000人から頸動脈内膜中膜肥厚、上位25%、下位25%の者を抽出し、さらに性・年齢を考慮した約2000人を抽出してメタボローム測定を行った。頸動脈エコーはGM-72P00A(パナソニック社)を用いて測定を行った。メタボローム測定はガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)ならびに核磁気共鳴(NMR)を用いて行った。今回はGC-MS由来165化合物とNMR由来37化合物(それぞれhttps://jmorp.megabank.tohoku.ac.jp/201902/metabolitesで公開されているTCIから始まる化合物とTCNから始まる化合物)について検討を行った。メタボロームは必ずしも正規分布しないため対数変換して分析を行った。また化合物は必ずしも全項目測定できたわけでないので、マッチングは行わず性年齢を調整した重回帰分析により頸動脈肥厚群(上位25%)と正常群(下位25%)に統計学的有意差が検出できるかどうかを検討した。有意水準はP=0.05で検討している。結果頸動脈正常群1002名、肥厚群993名の測定を実施した。性・年齢を考慮した抽出を行ったため平均年齢は正常群、肥厚群とも約61歳、女性の割合は75%であった。分析の結果、GC-MS由来165化合物中3項目、NMR由来37化合物中9項目で統計学的有意差を検出している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画では平成28年度はデータベースの整理、特に栄養素摂取量、内頚動脈内膜中膜肥厚、家庭血圧・中心血圧などのデータ整理を計画し実施した。栄養素に関しては、回答項目をいくつかの食事群に分け、食事群ごとの摂取量の計算を可能としたほか、食事パターンの分析を可能とした。内頚動脈内膜中膜肥厚についてもデータの整理を完了した。さらに家庭血圧・中心血圧・歩数についての整理も行った。平成28年度は東北メディカル・メガバンク調査、地域住民コホートの地域支援センター受診者のデータ整理を行った。内頚動脈肥厚についての情報は17931名にあり、そのうち緑茶摂取についての回答がなされているのは17868名であった。17868名のデータを分析したところ平均の頸動脈内膜中膜肥厚は右0.606mm左0.626mmであり左の方が厚い傾向にあった。1mm以上の肥厚がある者は右で252名(1.4%)、左で384名(2.1%)と当初の予測(5%)よりも少なかった。緑茶摂取については摂取無しが17.4%、週1-6杯が31.4%、1日1-6杯が46.3%、1日7杯以上が5.3%であった。内頚動脈の厚さを目的変数とした重回帰分析行った結果、内頚動脈の厚さが厚い者は、高齢者、男性、喫煙、高血圧通院者、糖尿病通院者であった。最小二乗平均を比較すると緑茶摂取の多い群の方が内頚動脈肥厚がむしろ高い傾向がみられるが統計学的に有意ではなかった。同様に魚摂取についても魚摂取の多い群の方が内頚動脈肥厚がむしろ高い傾向がみられるが統計学的に有意ではなかった。一方、豆類の摂取量については残差法を用いた解析で、摂取量の多い群の方が内頚動脈肥厚が有意に小さかった。更なる検討を深めていく予定である。予定していたデータ整理が完了し、一部メタボロームの測定も始められているので計画通り進捗していると考えられる。予想していたよりも頸動脈の肥厚ありのものの割合が小さかったものの精度の高い情報が得られており、分析に当たっての問題点は少ないと考えている。一方、データ整理に時間がかかり成果発表の機会を十分に持てなかったことは課題と考えている。

今回はGC-MS由来165化合物とNMR由来37化合物(それぞれhttps://jmorp.megabank.tohoku.ac.jp/201902/metabolitesで公開されているTCIから始まる化合物とTCNから始まる化合物)について検討を行った。メタボロームは必ずしも正規分布しないため対数変換して分析を行った。また化合物は必ずしも全項目測定できたわけでないので、マッチングは行わず性年齢を調整した重回帰分析により頸動脈肥厚群(上位25%)と正常群(下位25%)に統計学的有意差が検出できるかどうかを検討した。有意水準はP=0.05で検討している。結果頸動脈正常群1002名、肥厚群993名の測定を実施した。性・年齢を考慮した抽出を行ったため平均年齢は正常群、肥厚群とも約61歳、女性の割合は75%であった。分析の結果、GC-MS由来165化合物中3項目、NMR由来37化合物中9項目で統計学的有意差を検出している。東北メディカル・メガバンク計画、地域住民コホート対象者のうち宮城県の地域支援センターで調査を実施した約17000人から頸動脈内膜中膜肥厚、上位25%、下位25%の者を抽出し、さらに性・年齢を考慮した約3000人を抽出してメタボローム測定を行った。頸動脈エコーはGM-72P00A(パナソニック社)を用いて測定を行った。メタボローム測定はガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)ならびに核磁気共鳴(NMR)を用いて行った。今回はGC-MS由来165化合物とNMR由来37化合物(それぞれhttps://jmorp.megabank.tohoku.ac.jp/201902/metabolitesで公開されているTCIから始まる化合物とTCNから始まる化合物)について測定を行った。抽出されたリスト対象者の中で既に別途メタボローム測定を実施していた者も含まれていたため、本科学研究費では2002名について測定を完了した。メタボローム測定に時間はかかったが、データベース構築までの作業時間は最小限に済ますことができ、おおむね順調に進捗したと考えている。研究支援者を雇用することで解析のスピードアップを図り、今年度は成果報告の機会を増やしていきたいと考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今後、完成したメタボロームデータと動脈硬化の関連の分析を進めていく予定である。
邦産創薬資源植物を利用するカンプトテシン類の科学的生物学的生産研究

(I)アカネ科チャボイナモリOphiorrhizapumila再生植物体並びに毛状根の二次代謝産物(1)再生植物体の二次代謝産物:チャボイナモリカルスの再分化により再生植物体を得た。再生植物体からは、Camptothecinをはじめカンプトテシン関連アルカロイド計6種と他の9種の既知化合物を得るとともに新規配糖体型カンプトテシノイドである9-βーD-Glucoxyloxycamptothecinを単離することができた。(2)毛状根の二次代謝産物:再生植物体にアグロバクテリウム菌Agrobacterium rhizogenes(pRi15834;pGSGlucl)を感染させ、形質転換体である毛状根を誘導することができた。毛状根固型培地培養体では、Camptothecinの生産を確認できなかったが、3(S)-,3(R)-Deoxypumilosidなど関連アルカロイド計4種、アントラキノンなど3種を得た。また毛状根液体培養体からは、Camptothecinをはじめとしたカンプトテシン関連化合物計4種とアントラキノンなど6種を単離した。再生植物体・毛状根ともにカンプトテシンを生産することが明らかとなった。また、野生株と同じく毛状根でも3(S)-,3(R)-Deoxypumilosidの両者の存在が認められ、カンプトテシンの生合成経路を解明する上で大変興味深い。(II)カンプトテシシン類緑化合物の合成研究カンプトテシン仮想生合成経路にしたがって、3(S)-,3(R)-PumilosideのC-7位の酸素官能基を還元的に除去することにより、3(S)-並びに3(R)-Deoxypumilosidへの変換を達成した。また、再生植物体より単離した新規アルカロイド、9-βーD-Glucoxyloxycamptothecinの合成を行い、絶対配置を含めてその構造を科学的に決定した。(1)天然分子の構造特性を利用したカンプトテシン類縁分子の合成:Camptothecinは抗腫瘍性天然分子としてきわめて重要な化合物であり、関連化合物の合成が世界各地で行われている。一方植物中の生合成経路の解明もきわめて興味が持たれる研究課題で、解決が急がれる。我々はこの二つの視点を考慮に入れ、想定される生合成経路に沿ってカンプトテシン類縁分子を合成する試みを行ってきているが、これまでの研究でSecologaninとTryptamineを出発物質としPumilosideを合成することに成功している。今年度はPumilosideからDeoxypumilodeへの変換に焦点を合わせて研究を行いこれに成功するとともに重要な新知見を得た。すなわちPumiloside tetraacetateをエノールリフレートに変えた後、Pd触媒存在下ギ酸を用いて還元することによって3(R)-Deoxypumiloside tetraacetateを、また3-epi-Pumiloside teteaacetate(3(S)-Pumiloside tetraacetate)を同様に処理することによって3(S)-Deoxypumiloside tetraacetateを得ることができた。得られた二つの化合物について、天然分子との詳細な比較検討を行った結果、1)これまでDeoxypumilosideのC-3位立体配置を(R)と考えていたがこれを(S)と訂正しなければならないこと、2)チャボイナモリの野性種、ならびに毛状根(次項参照)に3(R)-Deoxypumiloside、3(S)-Deoxypumilosideの両方が含有されていること、が明らかになった。(2)資源植物

Ophiorrhizapumilaの細胞培養とそれを利用したカンプトテシン類縁体の生産研究:チャボイナモリOphiorrhizapumilaについて、(a)カルス培養、(b)再生植物培養、(c)アグロバクテリウム感染による毛状根の形成と培養、を平行して行った。その結果(b)、(c)から一連のCamptothecin系化合物を得ることが出来た。特に上記にもあるように、毛状根が3-(S)-Deoxypumilosideと3-(R)-Deoxypumilosideの両方を生産する事実は、カンプトテシン生合成ルートとの関連で興味が持たれる。(1)チャボイナモリOphiorrhizapumila再生植物体並びに毛状根の二次代謝産物再生植物体からは、Camptothecinをはじめカンプトテシン関連アルカロイド計6種と他の既知化合物9種を得るとともにメタノールエキスのn-BuOH分画より新規アルカロイドである9-β-D-Glucosyloxycamptothecinを単離した。毛状根固型培養体からは、3(S)-,3(R)-Deoxypumilosideなどのアルカロイド計4種、アントラキノンなど3種を得た。また毛状根液体培養体からは、Camptothecinをはじめとしたカンプトテシン関連化合物計4種とアントラキノンなど6種を単離した。さらに毛状根からは新規カンプトテシノイドと考えられる化合物を極微量であるが単離し構造解析を行っている。(2)チャボイナモリ再生植物体より得られた新規カンプトテシノイドの合成再生植物体より単離した新規アルカロイド、9-β-D-Glucosyloxycamptothecinの合成を行った。A環部は、3-Nitrophenolの2位にReimer-Tiemann反応によりアルデヒド基を導入した後、Acetobromoglucoseと縮合、ニトロ基を還元して三段階で合成した。CDE環部については、Camptothecinと同じ20S配置となるキラルな既知化合物を用い、3級アルコールをAcCl中室温にてアセチル化して導いた。続いてA環部とCDE環部をdryMeOH中AcOH存在下加熱還流し、Friedlander縮合体である9-β-D-Glucosyloxycamptothecin pentaacetateを得た。本合成品のスペクトルデータは、天然品より誘導した化合物と完全に一致し、これにより、糖と20位の絶対配置(D-glucose,20S)を含めて新規カンプトテシノイドの構造を決定した。更に脱アセチル化し9-β-D-Glucosyloxycamptothecinに導いた。
2次元系・変調構造の束縛励起子の増感を利用した高エネルギ－光波長変換結晶の創製

EUV(極端紫外:10100nm)-VUV(真空紫外:100-200nm)域の高エネルギー光励起発光材料は、医学診断、半導体検査、基礎科学分野に用途が拡大している。本研究では、2次元系層状や超構造を有する複合イオン結晶のEUV-VUV光によるホスト励起で、自己束縛励起子からの発光増強とそれに対する結晶の持つ2次元効果及び構造変調効果を明らかにする。自己束縛励起子からCe3+へのエネルギー移動による紫外/可視発光(励起子増感)と発光短寿命化を実現し、EUV-VUV光の高速・高時間分解能の波長変換結晶を創製する。これを利用し広帯域高エネルギー光検出器の開発を目指すEUV(極端紫外:10100nm)-VUV(真空紫外:100-200nm)域の高エネルギー光励起発光材料は、医学診断、半導体検査、基礎科学分野に用途が拡大している。これを利用し広帯域高エネルギー光検出器の開発を目指す
視覚情報を導入した弾性アームの適応的高速運動制御に関する研究

近年の急速なロボットの普及に伴い,それに要求される性能も年々高まってきている.即ち,より高速でより精確な制御性能への要求である.従来の剛体アームによって精密な位置決めを達成するには,アームの機械的剛性を向上させることが求められるが,これは重量増加を招きやすい.一方,高速化のためにはアームは軽量であることが望ましく,これは剛性の低下を招く.これらのことから,アーム自体を剛体ではなく弾性体として扱う制御方式を開発し,その振動を動的に抑制することが重要であり,従来のロボットアームにはない,高度の制御方式が要請される.本研究は,以上の観点から弾性アームの高速な運動制御系の実現を目指すものである.高速運動時では,アームの作業状況(可搬物の有無等)によって動特性は大きく変わるから,常にアームの状態を観測しながら最適な制御を行う必要がある.可搬負荷の変動に対して,動特性を一定に保つ適応制御系を構成する事を本研究の中心課題とする.このとき,本来は分布定数系として扱う必要がある弾性アームを,有限次元の制御系を構成するために,自己回帰モデルと無駄時間で近似する.更に,先端の位置決め精度の向上を考えて,先端変位をCCDカメラを用いて直接フィードバックする手法を提案する.制御手法としては,非最小位相系が対象になるので,極のみを配置する適応極配置型の制御系を構成する.この様にして導出された「視覚情報を導入した弾性アームの適応的高速運動制御系」を,実際に長さ1m程度のアームを制作しリアルタイムの制御システムを構成し実現した.実験による検証では,所期の目的が満足され,可搬負荷の有無に関わらずオーバーシュトのない高速位置決めが実現できた.また,ロバスト性の観点から,制御サンプリングの周期と無駄時間との関係を求めることができた.近年の急速なロボットの普及に伴い,それに要求される性能も年々高まってきている.即ち,より高速でより精確な制御性能への要求である.従来の剛体アームによって精密な位置決めを達成するには,アームの機械的剛性を向上させることが求められるが,これは重量増加を招きやすい.一方,高速化のためにはアームは軽量であることが望ましく,これは剛性の低下を招く.これらのことから,アーム自体を剛体ではなく弾性体として扱う制御方式を開発し,その振動を動的に抑制することが重要であり,従来のロボットアームにはない,高度の制御方式が要請される.本研究は,以上の観点から弾性アームの高速な運動制御系の実現を目指すものである.高速運動時では,アームの作業状況(可搬物の有無等)によって動特性は大きく変わるから,常にアームの状態を観測しながら最適な制御を行う必要がある.可搬負荷の変動に対して,動特性を一定に保つ適応制御系を構成する事を本研究の中心課題とする.このとき,本来は分布定数系として扱う必要がある弾性アームを,有限次元の制御系を構成するために,自己回帰モデルと無駄時間で近似する.更に,先端の位置決め精度の向上を考えて,先端変位をCCDカメラを用いて直接フィードバックする手法を提案する.制御手法としては,非最小位相系が対象になるので,極のみを配置する適応極配置型の制御系を構成する.この様にして導出された「視覚情報を導入した弾性アームの適応的高速運動制御系」を,実際に長さ1m程度のアームを制作しリアルタイムの制御システムを構成し実現した.実験による検証では,所期の目的が満足され,可搬負荷の有無に関わらずオーバーシュトのない高速位置決めが実現できた.また,ロバスト性の観点から,制御サンプリングの周期と無駄時間との関係を求めることができた.本研究の目的は、弾性アームの高速・高精度位置決めおよび軌道追従制御を実現することである。このために、弾性アームの先端位置およびアーム変形を検出するためのCCDカメラを用いた視覚情報システムと、ペイロード変動に対応するための適応制御を組合せたことを特徴とする。また、本研究は、背景としてロボットアームに対する軽量化・運動高速化の要求を考慮しており、さらに、ロボットアームを剛体と仮定して制御するのではなく、弾性体として制御するための実用的な手法の確立を目指している。本年度に計画した研究項目は、下記の通りほぼ順調に実績を上げた。(1)弾性アームのモデリングおよび適応制御のシミュレーション弾性アームを有限次元近似したモデルを用いて、ペイロード変動に対してロバストな適応制御系を設計した。その有効性をシミュレーションにより確認し、さらに、軌道追従、力制御への拡張も試み、見通しをつけた。(2)視覚情報システムを用いた1リンク弾性アームの試作試作システムは、CCDカメラを用いてアーム先端位置を検出し制御系に取り込む視覚情報システムと、1リンク弾性アームおよびこれを駆動制御するシステムとからなる。(3)弾性アームの適応的運動制御の実験上記の試作システムと本研究費により設備した計測システムを用いて実験を行った。その結果は、弾性振動を抑えた高速運動をペイロード変動に対応して自動的に制御器のパラメータを変えることにより実現でき、予想されたとおりであった。
多国籍企業の言語戦略と知識移転：日本企業の事例研究

3年間の科研期間中の2年目となる2018年度には、幅広くフィールド調査を進めながら、発見や考察をまとめ学会発表を行っていた。まず、フィールド調査としては、8月のドイツ調査、9月から12月にかけての日本国内調査、12月の中国調査、2019年2月のタイ調査、3月の中国調査を通じて、10社以上の企業におけるデータの収集ができた。各企業の言語政策や、なぜ特定言語を公用語として策定しているのか、それによるメリット・デメリットは何かなど、言語政策と人材管理について豊かな情報を収集し、作成中の論文に反映した。それに加え、今後さらなる調査が可能な人脈が作れたことも大きな成果の一つである。そして、2017年度からの研究内容と2018年度行っていたフィールド調査の成果を、1回の海外学会、2回の国内学会で発表した。それを通じて、関連分野の研究者と交流することができ、論文作成やジャーナル掲載に向けた貴重なアドバイスを得たり、刺激になるディスカッションを行うことができた。特に海外学会では、2019年度から開始する国際共同研究のための在外研究に備え、海外研究者とのネットワーク構築に力を入れ、意味のある成果が得られた。企業への調査を通じたデータ収集と、その成果をまとめた学会報告・論文執筆を進めることが2年目となる2018年度の計画であったが、おおむね計画通りの研究を進められたと考える。最終年度となる2019年度には、2018年度まで行った調査と学会報告から得られた知見をまとめ、海外ジャーナルへの投稿に向かって作業を進めるつもりである。それと同時に、海外学会における活動を強化することで、海外における研究者との交流を通じて共同研究を模索していきたい。H29年度の研究実績としては、大きく国内外における企業インタビュー調査、アンケート調査のデザイン作業、海外学会への論文投稿の3つに分けられる。以下で順に説明する。一つ目に、2017年の6月から2018年の3月に渡り、DMG森精機、デンソー、アルプス電気、日本バイリーン、アルバックの5社を対象に10回程度のインタビュー調査を実施してきた。日本本社においては、本社が持つ言語戦略の考え方及び施策、実行状況などを確認した。一方、韓国や中国拠点においては現地拠点においてどのような部門で、どの言語が使用され、それが日本との情報交換にどう影響するのかを探っていった。このような企業調査により、日本企業における言語の使われ方と特定言語を選択する理由とその結果について、現状をある程度把握することができた。二つ目は、企業調査と同時並行で、大量サンプル調査を念頭においたアンケート調査をデザインする作業を研究会などを通じて行ってきた。アンケート調査は、海外拠点が部門別に使用している言語の種類が、本社と海外拠点間の情報交換にどのような影響を与えるのかを、生産部門と開発部門に分けて分析するためのものである。今後においても、統計的有意性や研究目的との合致性などを検討しながら、さらなる工夫が必要な部分である。時間的制限はあるものの、企業調査は最初の計画通りほぼ進んでいる。初年度の企業調査を通じて、どのように研究テーマを絞り、より深く追求していくべきかが見えてきた。来年度からはよりフォーカスされた調査を重ねていきたいと考えている。アンケート調査は、そのデザインに力を注いだものの、実行することの有効性についてまだ検討が必要である。この部分については、来年度の前半までには方針を明確にしたいと考えている。2018年5月の国際学会への論文投稿は順調であったが、今回受けられたレフェリーコメントにどのように対応しながら、最初の論文をジャーナル投稿まで持っていくのかは今後の課題となる。全体として、データ収集及び学会報告といった当初の計画は、非常に順調に進んでいると考える。2018年度は大きく以下の3つの目標をもって研究を進めていきたい。二つ目は、ジャーナル投稿作業を進めながら、同時に、最初の論文をより発展させ2番目の成果報告につなげるためにどのような調査が必要なのかを研究会などで議論し、それに向けて企業へのインタビュー調査を重ねていきたい。

そのデータをもって、2018年末に学会報告を申請するといったサイクルを作っていきたいと考えている。三つ目は、2017年に作り上げたアンケート調査の実行について目途をつけたい。現在としては、本テーマで大量サンプルを集めることについてどれだけ意義があるのかを研究者同士で議論している途中である。最終年度となる2019年度には、2018年度まで行った調査と学会報告から得られた知見をまとめ、海外ジャーナルへの投稿に向かって作業を進めるつもりである。それと同時に、海外学会における活動を強化することで、海外における研究者との交流を通じて共同研究を模索していきたい。研究会を主に東京で開催し、金が仙台から東京へ出張する場合が多かったため、研究分担者の板垣の方の研究費が残ってしまった。
ヒト血小板膜糖蛋白GPIbのトロンビンレセプターのcDNAクローニング

HEL細胞をTPA(25ng/ml)の存在下24時間培養、培地交換後、TPAーフリーの培地でさらに44時間培養した後の細胞では、GPIbの発現を確認したので、TPAーフリー培地での24時間培養後の細胞から、型の如く全RNA画分、ついでpoly(A)RNAを抽出し、2本鎖cDNAを作成した。これをλgt10のベクターに挿入し、cDNAライブラリーを作成した。既に報告されたデータをもとに合成プローブを作成して使用し、5個のpositiveなクローン(0.7ー1.7kb)を得て、pUC18を用いたsubcloningおよびsequenceを施行したが、いずれも陽性の成績は得られなかった。無核の血小板においても若干の蛋白合成が行なわれているとの報告があり、大量の血小板を収集して、これからmRNAを抽出して、同様にcDNAクローニングを試みたが、成功しなかった。GPIbα鎖のN末端側の40kDaのfragment内のSーSloop付近にトロンビン結合部位の存在が想定されてきたが、この解明のため、Lopezらの報告に基ずいてこの領域(アミノ酸番号#181ー306)の11ー28個のアミノ酸残基から成る11種のペプチドを合成し、ヒト洗浄血小板を0.02U/mlトロンビンで刺激した時、これらのペプチドの凝集抑制活性を測定した。ペプチドFT25(#216ー240の25個のアミノ酸残基より成る、以上同様)は最大の抑制効果(IC_<50>=12μM)を示した。この領域の他のペプチドDK28(#235ー262)、DD26(#249ー274)、GA24(#268ー291)のIC_<50>はそれぞれ68、73、115μMであった。他方、この領域外のペプチド、例えばEP26(#181ー206)、ETP(281ー306)などのIC_<50>は500μM以上であった。しかし、この領域内のアミノ酸残基数が20個以下のペプチドはVK18(#236ー253)も含めて、抑制活性を示さなかった。トロンビンのGPIb上の結合部位はFT25を中心にして、広い部分にわたっているようであり、しかもその生理活性の発現にはアミノ酸残基数にして24個以上を要するように考えられた。ヒト血小板糖蛋白GPIbをコードするRNAのソースとして, HEL細胞を選択した.HEL細胞におけるGPIbの発現を,モノクローナ抗GPIb抗体TM60を用いて検討すると,末刺激状態では発現はみられず, TPA(25ng/ml)で24時間刺激し,洗浄後さらに48時間培養すると, GPIbの発現が確認された.

そこでTPA刺激24時間後に洗浄し,その24時間後に細胞を収集し,型の如く全RNA画分,ついでpoly(A)PNAを抽出し, 2本鎖CDNAを作成し, λgt10のベクターに挿入し, CDNAライブラリーとした. GPIbの既知のアミノ酸配列から合成プローブを体成し,スクリーニングしたところ,現在までに5個のpositive cloneを得, pUC18によるsubcloningおよびsequenceを行なっている段階である.GPIb上のトロンビン結合部位を決定するため, Lopezら(1987)の報告をもとにS-Sloop付近の近接する4種の合成ペプチド(2428残基)を作成し,これらのトロンビン凝集への効果を検討した.トロンビン0.02U/mlによる洗浄ヒト血小板凝集は,これら4種のペプチドのいずれによっても抑制された.特にN未側からのアミノ酸番号230番前後のペプチドAではもっとも顕著であり, 50%抑制濃度IC50は12MMであった.またトロンビンの酸素活性への影響を発色性合成基質S-2238を用いて検討したところ, 4種のペプチドのいずれにも62.5MM濃度で完全な抑制効果が認められ,もっとも強力であったのはN末側から250番前後のペプチドBであった.以上の成績から, GPIbとトロンビンとの相互反応にはGOIbのN末側の40KDaフラグメント上のS+Sloopに含まれる部分の関与が示唆された.GPIbにはリストセチン存在下でのvonWillebrand因子の結合部位も存在するとされているので,トロンビンの結合部位との位置関係も明らかにして行くつもりである.HEL細胞をTPA(25ng/ml)の存在下24時間培養、培地交換後TPA-フリーの培地でさらに44時間培養した後の細胞ではGPIbの発現を確認したので、TPA-free培地での24時間培養後の細胞から型の如く全RNA画分、ついでpoly(A)RNAを抽出し、2本鎖cDNAを作成した。これをλgt10のベクターに挿入し、cDNAライブラリーを作成した。既に報告されたデータをもとに合成プローブを作成して使用し、5個のpositiveなクローン(0.7-1.7kb)を得て、pUC18を用いたsubcloningおよびsequenceを施行したが、いずれも陽性の成績は得られなかった。無核の血小板においても若干の蛋白合成が行なわれているとの報告があり、大量の血小板を収集して、これからmRNAを抽出して、同様にcDNAクローニングを試みたが、成功しなかった。GPIba鎖のN末端側の40kDaのfragment内のS-S loop付近にトロンビン結合部位の存在が想定されてきたが、この解明のため、Lopezらの報告に基ずいてこの領域(アミノ酸番号#181-306)の11-28個のアノ酸残基から成る11種のペプチドを合成し、ヒト洗浄血小板を0.02U/mlトロンビンで刺激時の、これらのペプチドの凝集抑制活性を測定した。ペプチドFT25(#216-240の25個アミノ酸残基より成る、以下同様)は最大の抑制効果(IC_<50>=12μM)を示した。この領域の他のペプチドDK28(#235-262)、DD26(#249-274)、GA24(#268-291)のIC_<50>はそれぞれ68、73、115μMであった。他方、この領域外のペプチド、例えばEP26(#181-206)、ETP26(#281-306)などのIC_<50>は500μM以上であった。しかし、この領域内のアミノ酸残基数が20個以下のペプチドはVK18(#236-253)も含めて、抑制活性を示さなかった。トロンビンのGPIb上の結合部位はFT25を中心にして、広い部分にわたっているようであり、しかもその生理活性の発現にはアミノ酸残基数にして24個以上を要するように考えられた。