hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マッチングの安定性に関する研究　－外部性のある環境および動的環境を中心として－

当該年度ではマッチング理論に関する研究を行った。マッチング理論では男性と女性、企業と労働者のような二tuの異なる集団に属する人々の間のマッチング方法を分析する。マッチング理論における主要な解概念は安定マッチングであり、これは「いかなるプレイヤーのペアも新たにマッチングを結びなおすことで効用が増加しない」ようなマッチングである。私の研究課題では、外部性のある環境および動的環境におけるマッチング問題の安定マッチングの性質の分析を行なっている。外部性のある環境では、企業が労働者を雇うことによって得られる利潤が、ライバル企業の雇っている労働者にも依存する状況を考察する。特に、参加人数が多い市場における安定マッチングの性質を分析することを目的としている。当該年度の研究では、より基礎的な結果を得るために、参加人数が有限の時の安定マッチングの性質を深く分析し、"A modified deferred acceptance algorithm formany-to-one matching markets with externalitiesamong firms"という論文を完成させた。この論文では「企業の選好にいくつかの条件を仮定することで、労働者最適安定マッチングという全ての労働者にとって最も好ましい安定マッチングが、修正ゲールシャープレイアルゴリズムとよばれるアルゴリズムで見つけられる」という結果が証明されている。この論文は査読付き国際学術誌のJournal of Mathematical Economics誌に採択された。動的環境におけるマッチング問題では、マッチングを与えられた期間の間に繰り返し行う状況を考察する。新入社員のジョブローテーションなどが応用例である。ジョブローテーションでは「各新入社員は、各期ごとに異なる研修先を回らなくてはいけない」という制約が存在する。しかし、従来の理論ではこの制約は考えられていない。そこで、本研究では制約を考慮したマッチング問題を定式化し望ましいマッチング方法を分析した。当該年度の研究では制約のある環境では安定マッチングがプレイヤーの厚生の面では必ずしも望ましくないことを示した。外部性があるマッチング問題および動的環境におけるマッチング問題について、研究目的を完全に達成できたとはいえないが、今後の研究の基礎となる結果を得たという点では、おおむね順調に進展したと考えている。外部性のある環境では「市場に参加している人数が十分に大きいときに安定マッチングは存在するのか」という問題を考察する。この問題を考察するにあたり昨年度完成させた論文"A modifieddeferred acceptance algorithm formany-to-one matchingmarketswith externalitiesamoag firms"で使われている手法が有効であると考えられるので、この論文を基礎に分析していく。動的環境のマッチング問題では、制約付きのマッチング問題における望ましいマッチングを見つける方法を明らかにする。特に、安定性とパレート最適性をある程度両立させるようなマッチングを見つけるアルゴリズムを明らかにする。
高等学校数学科の図形的領域授業におけるコンピュータ活用に関する研究

本研究は,コンピュータを活用した高等学校数学科の図形領域の授業の実践を通して,図形の様々な具体物との比較から,「授業」「コンピュータの画面での表示や操作」「具体物」を直感的な感覚で生徒がとらえ,その中のおもしろさ,不思議さといった点に着目して発展的に考えられるようになるかについて検証したものである.本年度,本校2年生,数学Bのベクトルの授業に焦点を当て「黒板での授業」「コンピュータ」「具体物」の3点を絡めた授業展開を行ってきた.本校では教科「情報」は3年生で履修することになっており生徒たちはコンピュータ操作にやや不慣れな面もあったが,図形をコンピュータ上で動かすおもしろさは,彼らの知的好奇心に確実に火をつける形となった,また,コンピュータでは,すべてが綺麗にできすぎてしまうが,例えば教科書の例題「平行六面体ABCD-PQRSにおいて,△BDPの重心Gは,対角線AR上にあり,AG:AR=1:3であることを証明せよ.」を,段ボールで「具体物」を作らせてみた.コンピュータでは容易に図形を動かし1:3を実感していたが,それはあくまでPCの画面上である.それを「具体物」として段ボールで作ろうとしたとき,まず彼らはどこから手をつけたら良いのかから考えなければならぬ場面に遭遇した.そして切りとる長さを求めるために,1年時に学んだ正弦定理や余弦定理を必要としていった.そうして完成した平行六面体と内部の三角形の面,その重心を突き抜けるベクトルとしての「棒」,その棒が内部で,1:3になっているという長さ計測.「ほんとうになってる!!」という声はPC操作時の感動とは明らかに違うものであった.この形での授業展開において「具体物」の製作は必然的に「手」を使って考える場面に遭遇した.そして解決すべき課題を既習の知識を駆使して生徒たちは解決へと導いた.そしてそこには既に試みたコンピュータ操作で得た感覚あり,それを土台とした「具体物」の完成は彼らに強い達成感を残した.そして達成感はまた次のものをやってみようとする意欲につながって行った.単に「黒板での授業」だけでは得られない成果が得られた.本研究は,コンピュータを活用した高等学校数学科の図形領域の授業の実践を通して,図形の様々な具体物との比較から,「授業」「コンピュータの画面での表示や操作」「具体物」を直感的な感覚で生徒がとらえ,その中のおもしろさ,不思議さといった点に着目して発展的に考えられるようになるかについて検証したものである.本年度,本校2年生,数学Bのベクトルの授業に焦点を当て「黒板での授業」「コンピュータ」「具体物」の3点を絡めた授業展開を行ってきた.本校では教科「情報」は3年生で履修することになっており生徒たちはコンピュータ操作にやや不慣れな面もあったが,図形をコンピュータ上で動かすおもしろさは,彼らの知的好奇心に確実に火をつける形となった,また,コンピュータでは,すべてが綺麗にできすぎてしまうが,例えば教科書の例題「平行六面体ABCD-PQRSにおいて,△BDPの重心Gは,対角線AR上にあり,AG:AR=1:3であることを証明せよ.」を,段ボールで「具体物」を作らせてみた.コンピュータでは容易に図形を動かし1:3を実感していたが,それはあくまでPCの画面上である.それを「具体物」として段ボールで作ろうとしたとき,まず彼らはどこから手をつけたら良いのかから考えなければならぬ場面に遭遇した.そして切りとる長さを求めるために,1年時に学んだ正弦定理や余弦定理を必要としていった.そうして完成した平行六面体と内部の三角形の面,その重心を突き抜けるベクトルとしての「棒」,その棒が内部で,1:3になっているという長さ計測.「ほんとうになってる!!」という声はPC操作時の感動とは明らかに違うものであった.この形での授業展開において「具体物」の製作は必然的に「手」を使って考える場面に遭遇した.そして解決すべき課題を既習の知識を駆使して生徒たちは解決へと導いた.そしてそこには既に試みたコンピュータ操作で得た感覚あり,それを土台とした「具体物」の完成は彼らに強い達成感を残した.そして達成感はまた次のものをやってみようとする意欲につながって行った.単に「黒板での授業」だけでは得られない成果が得られた.
超音波診断における悪性腫瘍リンパ節転移のエコー像のコンピュータによる定量的解析

本学施設において、超音波診断画像における悪性腫瘍のリンパ節転位とリンパ節炎との画像的な差異をパーソナルコンピュータを用いて解析を行った。解析対象は東京歯科大学千葉病院歯科放射線科外来にて超音波診断を行った10名で、リンパ節炎5例、悪性腫瘍のリンパ節転移5例とした。撮影中の超音波画像を超音波装置から接続されたVTRに記録し、記録した超音波画像をコンピュータに取り込んだ。画像解析のためのソフトを自作し、取り込んだ画像で最も描出されたと思われる部位に関心領域ROIを設定した後、輝度分布、ヒストグラム、パワースペクトル、規格化積分パワースペクトル、最大グレイ値、最小グレイ値、標準偏差をリンパ節転移とリンパ節炎それぞれについて算出した。このように算出したデータについてリンパ節転移とリンパ節炎とを比較検討した。それぞれの内部エコーならびに後方エコーに関するデータをレファレンスデータを考慮しながら比較したところ、現在までに炎症と転移の鑑別を行えるほどの特徴的数値所見は得られていない。この原因として、今回分析対象とした症例が典型的なものが少なく、しかも5症例ずつと症例数が少なかったことが考えられる。今後、症例数を増やし、統計処理を行えば、特徴的な数値所見が得られるものと思われる。また、この結果は、コンピュータ画像解析を利用してもリンパ節の炎症と転移の鑑別は内部エコーや後方エコーなどの単独の所見では困難であり、肉眼での診査と同様、その他の超音波所見と合わせて総合的に判断される必要があることを示すものとも考えられる。今後症例数を増やすとともに、病巣の大きさ、縦横比などの幾何学的特徴量を求めるプログラム、さらに辺縁境界エコーなどを定量的に表現するための解析プログラムを開発し、種々の疾患に対して様々な方向からの分析を行うことで、総合的な診断支援情報を与えてくれるシステムを構築していく予定である。
酵素免疫測定法を用いた視床下部ホルモンの超高感度測定法の開発と臨床応用

サンドイッチ法による低分子ペプチドホルモンの酵素免疫測定法(EIA)は困難であるとされてきたが、本研究では視床下部ホルモン(growth hormone-releasing hormone,GHRH;somatostatin,SRIF)について非競合法による超高感度EIAを試みた。特異抗体は、家兎を抗原・担体複合体で免疫し作製した。GHRHではC端部に特異性の高い抗体を得ることができたが、N端部に特異性の高い抗体は得られなかった。SRIFについても、当初の計画ではN端部とC端部に特異性の高い2種類の抗体を用いて測定系を確立する予定であったが、中央部を認識する抗体のみ得られた。これらの抗血清よりアフィニティークロマトグラフィーでIgG分画を精製し、EIAに供した。EIAは1種類の特異抗血清による抗原抗体反応と、アビジンとビオチンの高親和性を利用したサンドイッチ法により行った。まず、ペプチドホルモンのアミノ基にビオチンを導入しビオチン化ペプチドを作製した。この両端に、プレートに固相化したアビジンおよび上記精製特異抗体を反応させた。さらに、酵素標識二次抗体(goat anti-rabbit IgG-peroxidase conjugate)およびo-phenylenediamine(OPD)による可視部の発色系(420nm)を用いる測定系で反応性を検討した。その結果、GHRHとSRIFのEIA系とも良好な用量反応曲線が得られ、その測定感度はGHRH 5.0pg/tube、SRIF 0.61pg/tubeで、既報のラジオイムノアッセイによる高感度な測定系と同等かそれ以上の感度を得ることができた。この測定系を用いて正常人の血漿濃度を測定したところ、血漿GHRH濃度は27±9.7pg/ml、血漿SRIF濃度は15±6.4pg/ml(mean±SD)であり、従来の報告値とほぼ同じ値を示した。問題点として、EIAの開発の際、良好な用量反応曲線が得られても非特異的な反応に伴うOPDの発色が強かったが、正常ヤギ血清(10%)の添加と非特異反応が少ない抗血清の使用により、非特異的発色を抑えることができた。ただ、最初に目標としたほどの感度の向上は得られなかった。将来的にはOPDによる発色系の代わりに、蛍光法(320nm,405nm)を用い、測定感度を良くする方法を考えたい。また検体中のビオチン化ペプチドを、特異抗体吸着(固相化)ポリスチレンボールと結合させたのち解離させる方法を試み、非特異的反応を少なくすることも検討した。しかし、現時点では特異抗体吸着ポリスチレンボールとビオチン化ペプチドの結合に問題があるため、この結合条件をよくする方法について検討中である。

サンドイッチ法による低分子ペプチドホルモンの酵素免疫測定法(EIA)は困難であるとされているが、視床下部ホルモン(growth hormone-releasing hormone(GHRH)、somatostatin(SRIF))について非競合法による超高感度EIAを試みた。まず、特異抗体は、家兎に抗原複合体を免疫し作製した。GHRHではC端部に特異性の高い抗体を得ることができたが、N端部に特異性の高い抗体は得られなかった。SRIFについても同様、当初の計画ではN端部とC端部に特異性の高い2種類の抗体を用いて測定系を確立する予定であったが、中央部を認識する抗体のみ得られた。これらの抗血清をアフィニィティクロマト法でIgG分画を精製し、EIAに供した。EIAはアビジンとビオチンの高親和性を利用した系で、ペプチドホルモンのアミノ基にビオチンを導入したビオチン化ホルモンの両端に、プレートに固相化したアビジンおよび上記精製特異抗体を反応させた。さらに、酵素標識二次抗体(goat anti-rabbit IgG-peroxidase conjugate)およびo-phenylendiamine(OPD)による可視部の発色系(420nm)を用いる測定系で検討した結果、既存のラジオイムノアッセイによる測定感度とほぼ同等の感度を得ることができた。しかし、現段階では、良好な用量反応曲線が得られるものの非特異的な反応にともなう発色が強い。OPDによる発色系の代わりに、蛍光による発色系(320nm,405nm)を用いることよって、測定感度を飛躍的に良くすることが可能になる。非特異的な反応を少なくするには、検体中のホルモンを、特異抗体吸着(固相化)ポリスチレンボールと結合させたのち解離させることによって改善できると考えられ、これらについて検討中である。この改善したEIA系で検討した結果、SRIFのEIAの測定感度は6.1pg/ml(0.61pg/tube)で、既報のラジオイムノアッセイ(RIA)系と同等かそれ以上の感度を得ることができた。また1,000pg/mlまでの範囲で用量反応相関性が得られた。一方、GHRHのEIAでは測定感度は50pg/ml(5.0pg/tube)で、既報のRIA系とほぼ同等の感度であった。また10,000pg/mlまでの範囲で用量反応相関性が得られた。この高感度EIAを利用して正常人の血漿SRIFとGHRH濃度を測定した。血漿の抽出にはSep-Pak C-18カートリッジを用い、抽出率はそれぞれ平均83%と87%で良好であった。血漿SRIF濃度は15±6.4pg/ml、血漿GHRH濃度は27±9.7pg/ml(mean±SD)であり、従来の報告値とほぼ同じ値を示した。サンドイッチ法による低分子ペプチドホルモンのEIAは困難とされてきたこと、SRIFとEIAとしては初めての報告であることから、この測定系の開発の意義は大きいと考えられる。ただ、最初に目標としたほどの感度の向上は得られなかった。このため、将来的にはOPDによる発色系の代わりに、蛍光による発色系(Excitation:320nm,Emission:405nm)を用い、測定感度を良くする方法を考えたい。また、検体中のビオチン化ペプチドを、特異抗体吸着(固相化)ポリスチレンボールと結合させたのち解離させる方法を試み、非特異的反応を少なくすることも検討した。
日本産シダ植物種形成ネットワークの包括的解明

約700種ある日本産シダ植物の中には、交雑と倍数化が絡む「網状進化」を起こしている可能性の高い種群が多い。コケシノブ科、ヒメシダ科、ホングウシダ科、コバノイシカグマ科、イノモトソウ科、ナヨシダ科、チャセンシダ科、オシダ科から計20群を解析対象として選定し、倍数性解析と分子系統解析に基づいてそれらの生物学的実体を明らかにした。れた。現在の種の分類が実体と対応していないものについては、分類・学名を見直した。日本で著しい多様化を遂げているシダ植物の複数の群を対象に、従来の形態分類では正確な把握が困難であった種形成ネットワークを総合的に解明するため、DNAマーカー(葉緑体DNA・核DNA)・倍数性情報(染色体数・フローサイトメーター)・胞子観察(稔性・生殖様式)・外部形態を総合的に解析した。前年度から解析を進めている群(オシダ科オシダ属、イノモトソウ科イノモトソウ属ハチジョウシダ類、ヒメシダ科ヒメシダ属ハリガネワラビ類とミゾシダモドキ類)については、各種データを追加することにより、より高い精度で種形成ネットワークの推定を行った。また、対象分類群をさらに拡大し、新たにヒメシダ科ヒメシダ属ニッコウシダ類・同コウモリシダ類・同ゲジゲジシダ類、コバノイシカグマ科フジシダ属、チャセンシダ科チャセンシダ属コバノヒノキシダ類などを新たな解析対象とした。いずれの群においても、従来の形態分類では全く想定されていなかった複雑な「種」の実態が明らかになった。特に無配生殖種が日本産の大半を占める群(例えばイノモトソウ属ハチジョウシダ類)では、日本で認められている「種」のほとんどが確かに遺伝的に異なる起源を持つことが解明されたが、その親となった種のほとんどは現在の日本には分布しないものであることが確実となった。一方、無配生殖は行わないと考えられている群のうち、ヒメシダ科コウモリシダ類、コバノイシカグマ科フジシダ属などでは、従来独立種と考えられていたものが、実は不稔性雑種である事例が見つかった。これらでは親を欠きながら不稔性雑種が日本国内に広がるという奇妙な状況が生じており、その起源と繁殖様式については今後詳細に研究する必要があると考えられた。れた。日本で著しい多様化を遂げているシダ植物の複数の群を対象に、従来の形態分類では正確な把握が困難であった種形成ネットワークを総合的に解明するため、本年度はいくつかの群で予備的な解析を進めた他、解析に必要な汎用DNAマーカーの開発を進めた。オシダ科オシダ属(特にイワヘゴ類、イタチシダ類)、イノモトソウ科イノモトソウ属(特にハチジョウシダ類)、ヒメシダ科ヒメシダ属(特にハリガネワラビ類、ミゾシダモドキ類)においては、種形成ネットワークを解明するための実際の材料収集と解析を進めた。各材料については、DNA解析の他、変異や分布状況を調査するためのさく葉標本の再検討、さらに倍数性の情報を得るための染色体観察を、研究協力者と共同で進めた。葉緑体DNAマーカー、核DNAマーカー、倍数性解析の結果を組合せることにより、各群における種形成ネットワークを描き出すことに成功した。平成24年度中にまとまったデータの一部は学会発表で公表を行った。さらにいくつかの群については、次年度の解析に備えた材料収集を行った。DNAマーカーの開発については、次世代シークエンサーによって得られた塩基配列データが既に手元にあるオシダ科オシダ属を材料に開発を進め、徐々に汎用性を高める戦略で進めた。その結果、少なくともオシダ属では広く利用可能で、一定量の変異が期待されるマーカーを5領域開発することができた。また、既存核マーカーについても、より安定した増幅が可能で、SSCP法を用いた解析に適した断片長になるような改良を試みた。日本産シダ植物全体の中で、特に日本とその周辺地域で多様化を遂げ、形態に基づく種の同定が難しい複数の群について、その生物学的実体解明を行った。本研究期間中に主な研究対象として選択した群として、コケシノブ科(アオホラゴケ属、ハイホラゴケ属)、ヒメシダ科(ハリガネワラビ類、ニッコウシダ類、ハシゴシダ類、ミゾシダモドキ類、ミゾシダ類、ゲジゲジシダ類、コウモリシダ類)、ホングウシダ科(ホングウシダ属、エダウチホングウシダ属、ホラシノブ属)、コバノイシカグマ科(フジシダ属)、イノモトソウ科(イノモトソウ属ハチジョウシダ類、シシラン属)、ナヨシダ科(ウスヒメワラビ属)チャセンシダ科(チャセンシダ属)、オシダ科オシダ属(特にイワヘゴ類、イタチシダ類)、オシダ科ヤブソテツ属が挙げられ、分類学的に未解決の問題を含む群の多くをカバーすることができた。

これらの種群について、標本庫に収められた標本を用いた形態・胞子形態と稔性の検討、野外現地調査による生材料の収集、染色体観察またはフローサイトメーターの使用による倍数性の判別、葉緑体DNAマーカーと核DNAマーカーを用いた分子系統解析を行い、それらの結果を組み合わせて、生物学的実体を総合的に考察した。新たな実体が認められた群については、分類学的な見直しを行い、新規分類群の記録・記載や、学名の見直しを発表した。いわゆる「網状進化」による種形成ネットワークが存在している種群においては、分類群の認識に不統一や混乱が見られる例が多い。しかし、本研究で、より正確な実体の認識を解明し、さらに分類学的な立場からの再編が行われたことによって、生物学的に意味のある分類の単位が広く認識されるようになることが期待される。植物分類学材料入手の問題などで当初予定していた属の一部が未解析であるが、新たに解析対象に加えた属もあり、全体として順調に推移していると考えられる。一部解析予定の属を変更したが、全体としてはほぼ当初の予定通り進行している。研究材料入手にあたって、研究代表者による活動のみでは期間内で必要なもの全てを収集しきれない(特に胞子塾期の材料が必要な場合など)ため、研究協力者(地方在住の愛好家などを含む)に協力を仰ぎながら進める予定である。本研究の目的である種形成ネットワークの包括的な解明を達成するために、地方在住の夏らリストを含めた多数の研究協力者との協力体制を一層充実させる。物品費の繰り越しは、研究協力者から受け取りを予定していたオシダ科イワヘゴ類の材料が、先方の学内業務多忙のため予定通りに到着しなかったことによるもので、その分のDNA解析用試薬代を繰り越すこととなった。人件費・謝金の繰り越しは、上記サンプルの解析補助のための謝金を使用しなかったことの他、種分化ネットワーク解明後の分類学的再編を本年度に行うことになったことに伴って、関係する証拠標本の整理作業も本年度に行う予定に変更したことによるものである。オシダ科イワヘゴ類については、次年度の早期に先方を自ら訪問して採集する予定にしており、DNA解析用試薬類及び解析補助のための謝金は本年度上半期には執行予定である。関係する証拠標本の整理作業は本研究課題の総括のために用いられため、次年度下半期に謝金として執行予定である。平成24年度はDNA解析について、本来謝金等を利用した実験補助を予定していたが、適当な人材が得られなかったことにより自ら解析を行うことで補間した。しかしながら、次年度は適当な人材を得ることにより、DNA解析の効率化を図ることを計画している。現地調査についても、研究代表者が十分に時間を確保できず、植栽植物を多く利用するなどの対応をとったが、次年度は計画通り野外調査を進める予定である。
^<18>O_2^+イオン銃の試作

超高真空を必要とする各種表面分析装置において、動作ガス圧が低いということから電子衝撃型イオン銃がよく用いられる。ところが、このイオン銃は電子源であるタングステン熱フィラメントが酸素雰囲気中で容易に焼き切れてしまうため、O_2^+ビームの発生には適していない。本研究ではこの欠点を解決して超高真空装置で使用可能なO_2^+イオン銃を開発することを目的とした。まず最初に以前に開発した電子衝撃型イオン銃のタングステンフィラメントをレニウムフィラメントに交換し、基本的な動作特性の測定で行い、最適動作条件の決定を行った。その結果到達真空度4×10^<-10>Torrの超高真空オージェ電子分光装置において、動作真空度8×10^<-10>Torr,加速電圧1kVでO_2^+イオンビーム電流80nAを得,15時間以上の安定動作に成功した。次にイオンスパッタ援用深さ方向分析の国際的な標準試料の有力な候補として提案されているGaAs/AlAs人工超格子試料に対して、上記O_2^+イオンビームを用いてオージェ電子分光による深さ方向分析を行った。おそらくこれは世界初の試みであると思われる。通常のAr^+イオンスパッタリングの場合と比べて以下の点で顕著な差異が生じた。1)AlAs層よりもGaAs層の方がスパッタ速度が約43%ほど大きい。2)GaAs→AlAs界面よりもAlAs→GaAs界面の方が深さ分解能が悪い。特に、3)はAr^+イオンスパッタリングの場合とまったく正反対の挙動である。以上のことと、従来のGaAs系での報告例を合わせて考えると、AlAs層においてAs原子O原子の置換が生じやすく、このためAl酸化物が形成されてスパッタ速度が遅くなり、また原子ミキシングが増大してAlAs→GaAs界面が荒れたものと思われる。
有機素反応過程の動的理解

研究班の全体会議を京都において計2回開催し、新しい有機反応設計の指導原理の構築のための研究分野と研究態勢の現状の分析、推進すべき研究分野および共同研究に関して検討を加えた。特に第1回の会議においては、有機素反応研究会(日本化学会)のメンバーを加えて、微視的な立場から有機反応の動的理解および反応における選択性の発現機構の解明の方策について議論を深めた。研究班の専門委員会を計4回開催し、より具体的な研究分野について現状の分析と今後の研究推進の方向性および研究態勢の在り方について検討した。さらに、10月に福岡で開催された第5回物理有機化学九州国際会議に於いて、班員以外の全国の研究者および海外の指導的研究者から、有機反応設計の原理の構築のための方策について種々の観点からの意見の集約を計った。これらの議論から、分子クラスターの研究、ICRによる気相中のイオン性分子種の研究など気相からのアプローチが有機反応における溶媒効果の微細機構の理解に重要であること、また、短寿命中間体の特性に基づく有機素反応の遷移状態の動的理解の深化は、有機合成反応および生体反応における選択性の解明および新奇有機反応の開発など有機反応関連の応用分野の進展に不可欠であること、等が強く認識された。これらの研究分野の飛躍的進展には有機化学者だけでなく理論化学者および物理化学者から構成される高度に組織化された研究態勢が必要であるとの結論に達した。その具体化の方策として、基礎研究の推進を目的として設立された九州大学「有機化学基礎研究センター」を中核に据えた新機軸の研究推進ネットワークを組織し、(1)動的分子構造と機能、(2)反応媒質効果、(三)活性化学種の動的特性、(4)構造-反応性相関、(5)反応経路解析、(6)複合系反応解析の6研究課題を立案し、平成7年度発足科学研究費補助金「重点領域研究」の領域申請を行った。
高度進行胃癌に対する術前化学療法における薬剤選択についての検討

対象となった高度進行胃癌(stage3以上もしくはBorromann4型)患者15人(男性11人女性4人)に対し、^<99m>Tc-MIBIシンチ検査をおこない、その結果によって化学療法を試行した。また、化学療法試行曲と後の標本を内視鏡もしくは手術により切除し、免疫染色などを試行した。^<99m>Tc-MIBIシンチ取り込みの評価はbackgroundとの差を、単位面積あたりの取り込み率に変換し、心臓と比較した。心臓より取り込みが強いものを取り込み陽性とした。結果1)進行胃癌は^<99m>Tc-MIBIシンチで取り込みを認め、とくに低分化型が強い取り込みを認めた。3)^<99m>Tc-MIBIの強い取り込みを認めた患者では、anthracycline系の薬剤が有効な症例を認めた。また取り込みを認めなかった症例は5-Fu薬剤が有効である傾向を認めた。現在、症例を重ねているところです。今後、RT-PCR含めて、mRNA量、蛋白発現量と薬剤感受性、^<99m>Tc-MIBIとの関係を集計し、^<99m>Tc-MIBIのモニタリングとしての有用性などを検討していく予定です。
正則保型形式を解として持つ線形微分方程式とその応用

数論的三角群の典型例であるFull modular groupの正則保型形式を同じ重みの保型形式へ移す線形微分作用素について、その作用素がある程度"良い"性質を満たすための条件をRankin-Cohen bracketを用いて表した。更に、その結果をもちいて、幾つかの1階の微分作用素を具体的に構成すると共に"良い"性質を持つ作用素が無数に存在するであろうことが明らかとなった。ここで構成した1階の微分作用素は今までの構成法では見つかり得ないものである。これら幾つかの線形作用素の固有関数は、Eisenstein級数の積で表され、この事実から、古典的なFull modular groupに関する保型形式の空間の構成を"微分作用素"の言葉で書き表すことが出来ることが分かった。次に、Full modular groupの元に関する双有理変換について、ある種の不変性を持つ複素上半平面上2階の微分方程式で、Full modular groupの楕円点でのみ方程式の係数に極を許したものを決定した。これは、それまでに見つかっていた正則保型形式を同じ重みの保型形式へ移す2階の微分線形作用素から定義される微分方程式を全て含むものとなっている。また、これら微分方程式の解を一部例外を除き超幾何級数を用いて表すことが可能であることが分かった。この具体的な解の表示を用いる事で、これら微分方程式がFull modular groupに関する保型形式を解に持っ場合をある程度知る事が可能である。前年度の研究を引継ぎ、Full modular groupの元に関する双有理変換について、ある種の不変性を持つ複素上半平面上2階の微分方程式で、Full modular groupの楕円点でのみ方程式の係数に極を許すものについて研究を進めた。昨年度の段階で、一部例外を除き、これら微分方程式の解を超幾何級数を用いて表すことが出来ることを突き止めていた。今年度は更に進んで、解が超幾何を用いたある型の表示を持つ必要十分条件を、簡潔に書き表すことが出来た。更に、解を超幾何級数を用いて表すことが可能な微分方程式の系列に、丁度保型形式の空間0次元が2次元丁度のとき、その2次元の空間がそのまま微分方程式の解となる、そのような微分方程式が全て含まれ、かつそれらが非常に面白い性質を満たすととがわかった。ここまでの結果を9月に開催された2003年度会秋季総合分科会において「重さkの保型性を持つ2階微分方程式のある系列について」と題して発表した。現在、これら結果について投稿準備を行っている。更に、正則保型形式を解として持つ線形微分方程式を、数年来の研究テーマであるAtkinの直交多項式系と楕円曲線の超特異多項式の関連を示すことに応用した。この結果、今まで非常に難解な議論を経なければならなかった幾つかの事実を、非常に平易な計算で示すことが可能になった。即ち、あるタイプの数論的三角群となる合同群に係る超特異多項式を、超幾何級数の有限体アナロジーで表示できることを、微分方程式のある解の正則保型形式による様々な表示を通じて導かれる超幾何級数の多項式関係を用いて示した。これにより、Atkinの直交系と超特異多項式の間の予想された関係を全て導くことができた。このテーマについては既にThe Atkin orthogonal polynomials for congruence subgroups of lowlevelsと題した論文に纏め、発表済みである。
分子系と凝縮系における高精度計算のための長距離補正密度汎関数の開発

LCgau法を最近の交換相関汎関数Becke97に適用した新しい汎関数LCgau-B97を開発した。最近、米国のHead-Gordonグループが開発したωB97とωB97Xは、基底状態のみに対して良い精度を与えるのに対して、LCgau-B97は基底状態だけでなく、励起状態にも高精度を示した。従来のDFT汎関数では再現出来なかった分岐アルカンや線形アルカンの異性化反応エネルギーを、LCやLCgau法を局所応答分散力(LRD)汎関数と組み合わせ、異性化反応エネルギーの計算を行なった。今回はLCgau-DFT+LRD汎関数を様々な系の異性化エネルギーに適用し、他の汎関数より優れた実験値に対する再現性があることを確認した。特に環化反応の異性化計算には短距離交換が必要であって、LCgau法によって効果的に改善できることが分かった。3、バンド計算に適した新しい汎関数の開発固体系のバンド計算に適したhybrid汎関数法(Gau-DFT法)を開発した。従来のバンド計算に使われるhybrid汎関数法HSEは、HF交換項を内包するために誤差関数を用いているので、化学反応障壁の計算には誤差が大きくて適用することができなかった。また、誤差関数を2回使うHISS汎関数は反応障壁計算には使えるようだが、誤差関数を2回使うことで計算コストが高いという問題がある。しかし、今回開発したGau-DFTではGauss関数を一回使うことにより、バンド計算だけでなく、化学反応障壁も高精度で計算ができる。また、HF交換を内包するためにGauss関数を用いることで、最適アルゴリズムの開発により、かなり低いコストでのバンド計算が期待できる。この汎関数をGaussianO9に実装し、また凝縮系の計算に適したソフトであるQuantum Esspressoにも実装することに成功した。1、短距離と長距離を補正した密度汎関数法の改善(LC2gau法)通常の励起エネルギーだけでなく、内殻励起エネルギーや熱力化学的な性質に対して同時に高精度で計算ができるような新しい汎関数LC2gau-BOPを開発に成功した。hybrid汎関数にとって中間距離のHF交換積分項が適切に内包することが重要であるということを示した。Becke97交換相関汎関数は15個の線形パラメータを持ち、パラメータフィッティングに時間や技術が必要である。最近米国のHead-Gordonグループが開発したωB97とωB97Xは基底状態のみに対して良い精度を与えるのに対して、LCgau-B97は基底状態だけでなく、励起状態にも高精度を示した。本研究結果について投稿準備中。本研究課題は本研究プロジェクトの開始時には計画していなかったが、最近、多くの研究論文で現在のDFT汎関数では分岐アルカンや線形アルカンの異性化反応エネルギーを全く再現できないことが報告されていることに注目し、またLCやLCgau法を最近開発した分子内分散力を取り扱える新しい汎関数である局所応答分散力(LRD)汎関数と組み合わせ、異性化反応エネルギーの計算を行なった。LC(gau)-DFTをLRD汎関数と組み合わせることで、これまで取り扱いが難しかった巨大分子の分子内分散力計算も可能となることを確認した。4、バンド計算に適した新しい汎関数の開発固体系にhybrid汎関数(LCgau法)を用いるためには長距離HF交換項をカットオフする必要がある。つまり、長距離HF交換項をDFT交換に置き替えて、ガウス形短距離HF交換項をフィッティングする必要がある。ガウス形を使うため、柔軟なHF交換項を入れることができる。これをGau-DFTと名づけた。現在この理論をGaussian03プログラムに実装し、周期境界条件(PBC)での計算を準備している。
気管支喘息患者のコントロールの認識に焦点を当てた早期教育プログラムの開発

本研究の目的は、気管支喘息患者のコントロールの認識に焦点を当てた早期教育プログラムの開発を行うことである。先行研究をもとに考案された早期教育プログラムは、治療開始後5年以内の喘息患者23名のグループを対象として実施されるものであり、3回の定期的なセッションのなかで患者同士での体験談の話し合い、テーマに基づいた主体的かつ効率的な学習、個人目標の設定等の特徴がある。この早期教育プログラムによって、コントロールの認識が早期に、かつ円滑に形成されて高い状態を維持でき、自己管理行動が継続または促進されて、喘息症状のコントロールやQOLの向上に繋がると考えられた。今年度は、女性患者2名1グループに実施した。プログラム開始前に比してプログラム開始後に2名とも喘息症状が認められた。2名ともコントロールの認識は低下せず、自己管理行動も継続されていた。そして、1名はQOLが変化しなかったが、1名はQOLが顕著に低下していた。また、患者は早期教育プログラムのなかで同病者と交流することにより、精神的な支えを得て、日常生活に自信を持っことができるようになっていたり、軽視していた喘息を改めて認識するようになっていたりしていた。喘息症状の体験は、患者に対して身体的心理的社会的に多大な影響を与えるものであることは先行研究で明らかになっており、今回の結果はそれを反映したものであると考える。プログラム開始後に2名とも喘息症状が認められたのは、季節が影響していると考えられるため、実施時期の検討が必要である。しかしながら、このような状況にある治療開始後早期の患者にとって、同病者との交流や療養生活等に必要なことについての学習は、コントロールの認識の維持、自己管理行動の継続に重要であると考えられる。早期教育プログラムの有効性を検討するためには、今後も対象者を増やしていく必要性があると考える。
肥満が引き起こす膵β細胞障害におけるＫｅａｐ１－Ｎｒｆ２システムの役割

Keap1-Nrf2システムは、酸化ストレスなどの環境ストレスを処理するために重要な生体防御機構の一つである。糖尿病は重篤な合併症を引き起こす社会的にも重要な代謝疾患であるが、その発症や進行において膵β細胞の保護は重要である。Keap1-Nrf2システムを活性化したモデルマウスは、肥満型糖尿病モデルマウスにおける膵β細胞障害をほぼ完全に抑制した。また、肥満型糖尿病モデルマウスから単離した膵ランゲルハンス島でNrf2を活性化すると抗酸化酵素が誘導された。以上よりKeap1-Nrf2システムの活性化は肥満による膵β細胞障害のよい治療標的になりうることが明らかとなった。肥満型糖尿病モデルであるdb/dbマウスにおける全身性Nrf2活性化モデルであるKeap1ノックダウン変異(Keap1flox/-)を導入した。膵臓インスリン免疫染色にて膵β細胞領域の著しい増加を認めたことから、高脂肪食負荷モデルにおけるNrf2活性化モデルマウスでの膵β細胞増殖について解析を行なった。Keap1flox/-と比較してNrf2活性化の程度が軽度である全身性Nrf2活性化モデルであるKeap1flox/floxマウスに高脂肪食を導入したところ、膵β細胞領域の拡大を認めた。さらに、Keap1flox/floxマウスにチミジンアナログである5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)を投与後、抗BrdU抗体により膵臓免疫染色を行なったところ、BrdUの取込みが増加を認めた。Nrf2が膵β細胞の増殖に関与する可能性が示唆された。さらに全身性Nrf2活性化モデルに加え、ラットインスリンプロモーターによりCreリコンビナーゼ発現(RIP-Cre)マウスを利用した膵β細胞特異的Keap1欠失マウスの解析を行なった。膵β細胞特異的Keap1欠失マウスに高脂肪食を負荷したところ、若齢のマウスではコントロール群と比較して膵β細胞特異的Keap1欠失マウスで膵臓インスリン陽性領域の拡大を認めた。しかしながら、加齢に従い膵β細胞特異的Keap1欠失マウスは体重増加の抑制作用が明らかとなり、体重増加抑制作用の顕在化と共に膵臓インスリン陽性領域の拡大は明らかでは無くなった。本研究成果は、Keap1-Nrf2システムが、肥満型糖尿病における膵β細胞の増殖に関与している可能性と同時にKeap1-Nrf2システムの高い抗肥満作用を示す結果となった。今後はKeap1-Nrf2システムの、抗肥満作用と独立した膵β細胞における作用の解明を目指した研究を進める予定である。全身性のNrf2誘導モデルであるKeap1ノックダウンマウスに高脂肪食を負荷したところ、著明な肥満の抑制およびインスリン抵抗性改善作用を認めた。しかしながら、本モデルはインスリン抵抗性改善に伴う二次的な膵島萎縮を認めた事から、膵β細胞機能および膵病理の評価には適さないと判断した。このため、モデルを膵β細胞特異的Keap1欠失マウスに変更して解析を行なった。膵β細胞特異的Keap1欠失マウスに高脂肪食を負荷したところ、コントロール群と比較して膵β細胞特異的Keap1欠失マウスでインスリン陽性領域の増加を認めた。このことより、膵β細胞においてNrf2シグナルの活性化は細胞の増加を引き起こすことが明らかとなった。また、Nrf2誘導モデルとは逆に、全身性Nrf2欠失マウス高脂肪食を負荷したところ、肥満抵抗性およびインスリン感受性亢進を示したことからKeap1ノックダウンマウスと同様に膵β細胞の評価に適さないと判断した。このため、モデルを全身性Nrf2欠失マウスから、膵β細胞特異的Nrf2欠失マウスに変更し、現在解析を行なっている。さらに、膵β細胞の生体イメージング解析の準備を進めた。マウスインスリン遺伝子制御領域にルシフェラーゼ遺伝子を結合したキメラ遺伝子のトランスジェニックマウスを樹立し、2ラインにおいてIVIS imagingsystemにより膵臓領域で発光反応を確認した。本トランスジェニックマウスについては、現在マウスの性質の確認を進めながら、必要な変異マウスラインと交配中であり、準備が整い次第解析を進める予定である。当初の目標としたモデルマウスの作成およびその表現型の確認は終了した。その結果、条件付きKeap1欠失マウスにおいて膵β細胞領域の拡大という良好な結果を得た。また、もう一つの目標である膵β細胞ライブイメージングにおいても、目標とするトランスジェニックマウスのラインの樹立まで完了している。1)単離膵島によるex vivo解析を進める。Nrf2遺伝子欠失db/dbマウス、Keap1遺伝子ノックダウンdb/dbマウス、膵β細胞特異的Keap1欠失db/dbマウスから膵島を単離し、ブドウ糖応答性インスリン分泌を解析する。

これはマウス個体の血漿インスリン濃度が、末梢組織のインスリン感受性の影響を強力に受けることから、膵β細胞機能の正確な評価に必須である。2) IVIS imagingsystemを用いた膵β細胞生体イメージング解析を進める。平成24年度に樹立したレポータートランスジェニックマウスのラインの有用性を慎重に確認しながら、Keap1およびNrf2変異を導入し、膵β細胞におけるin vivoでのKeap1-Nrf1システムの評価を進める。3)上記の2)の有用性が確認できた場合、既知のNrf2誘導剤を高脂肪食負荷マウスに長期投与を行い、その膵β細胞における役割を解明する。試薬類購入費として、生体イメージング用のD-ルシフェリンを中心として使用予定である。プラスチック器具類購入費として、マイクロチューブやコニカルチューブ類に使用予定である。キット類購入費として、血糖測定器センサーチップ、インスリン測定のためのELISAキット、グルカゴン測定キット、HbA1c測定カートリッジに使用予定である。実験動物購入費として、C57BL/6Jマウス、db/dbマウス、ICRマウスに使用予定である。次年度使用額は、解析モデルを当初計画していたKeap1ノックダウンマウスから、膵β細胞特異的Keap1欠失マウスに変更したことにより、血漿インスリン濃度や血糖測定を次年度に延期する事により生じたものである。このため次年度は、延期した血漿インスリン濃度や血糖測定に必要な経費として平成25年度請求額と合わせて使用する予定である。
WNKキナーゼによるCl-輸送体活性制御破綻が引き起こす癌転移メカニズムの解明

癌が発生した部位から異なる場所に移動し、再び腫瘍を形成することを転移という。現在においても、転移巣を形成した後の治療は困難を極め、癌転移の分子メカニズムの多くが未知のままである。我々は、細胞内Cl-が様々な細胞機能に関わっていることを明らかにしており、本研究では細胞内Cl-が癌転移に関与しているか検討することとした。本研究により、細胞内Cl-は細胞接着因子の発現や細胞接着能に影響を与えることが明らかになった。また細胞内Cl-濃度変化は、WNKやSrcといった細胞内シグナル経路の主要な調節因子の活性を制御することで、癌細胞の増殖、接着、運動を制御している可能性が示唆された。我々はこれまでの科学研究費採択研究により、WNKキナーゼがCl-輸送体の活性を調節することで細胞内Cl-濃度の周期的な変化(Cl-オシレーション)を生み出し、それが細胞周期進行を決定する重要な調節因子になりうる可能性を明らかにした。本研究では、細胞内Cl-オシレーションが細胞の運動能の制御にも重要な機能を持ち、癌化した細胞ではこのシステムが破綻し、癌細胞の転移能が亢進するという実験仮説の検証を行う事を目的としている。現在までに、NKCC1とKCC1を介した細胞内外間のCl-輸送バランスにより細胞内Cl-濃度が決定され、細胞の様々な生理機能に影響を与えていることを明らかにした。特にNKCC1に関しては、タンパク発現レベルやリン酸化による活性制御により細胞内へのCl-輸送が制御されることで細胞内のCl-濃度が決定され、細胞増殖や細胞運動に関して重要な働きをしていることを明らかにした。細胞内のCl-濃度変化はWNKキナーゼにより感受され、その結果WNKの活性レベルが変化するものと考えられる。そのシグナルが最終的にCl-輸送体の活性レベルを制御することから、WNKキナーゼによって感受された細胞内Cl-濃度変化が、どのようにNKCCやKCCといったCl-輸送体の活性にフィードバックされ細胞運動に影響を与えるのか、またそのシステムの破綻が細胞運動にどう影響するのかについて現在検討を行っている。我々はこれまでの科学研究費採択研究により、Cl-輸送体の活性が調節されることで細胞内Cl-濃度の周期的な変化(Cl-オシレーション)を生み出し、それが細胞周期進行を決定する重要な調節因子になりうる可能性を明らかにした。現在までに、NKCC1とKCC1といったCl-輸送体を介した細胞内外間のCl-輸送バランスにより細胞内Cl-濃度が決定され、細胞の様々な生理機能に影響を与えていることを明らかにした。現在は細胞内Cl-が癌細胞の転移や浸潤と言った細胞運動に影響を与えるかについて検討を行っている。癌細胞は転移や浸潤に関わる様々な細胞接着因子の発現や細胞の接着能を変えることが知られているが、細胞内Cl-濃度の低下は、癌細胞の転移・浸潤に関与する接着因子であるE-cadherinやEpCAMの発現を有意に減少させた。また、細胞内Cl-センサーと考えられるWNKキナーゼによって感受された細胞内Cl-濃度変化が、どのようにNKCCやKCCといったCl-輸送体の活性にフィードバックされ細胞運動に影響を与えるのか、またそのシステムの破綻による細胞内Cl-濃度の異常が細胞接着因子の発現にどう影響するのかについて現在検討を行っている。本研究では、細胞周期進行に伴った細胞内Cl-濃度変化が細胞運動能の制御に重要な役割を果たし、癌細胞ではこのシステムが破綻することで転移能が亢進するという実験仮説の検証を行った。まず、細胞内Cl-が癌転移に関わる細胞接着因子の発現や細胞の細胞外基質への接着能に与える影響について検討を行った。まず、上皮細胞に特異的に発現し、細胞間接着に関与しているE-cadherinの発現が、低Cl-環境下において有意に減少した。また、細胞と細胞外基質との間の接着に関与しているα2-integrin発現が低Cl-環境下で減少した。コラーゲンコートしたプレートへの細胞接着能についても評価を行ったが、低Cl-環境中ではコラーゲンへの細胞接着能が有意に低下していた。細胞運動能についてwound-healing assayにより評価を行ったところ、低Cl-環境下では細胞運動能が有意に抑制を受けた。以上のことから、細胞内Cl-濃度変化が癌細胞の細胞接着能や細胞運動能に大きく影響を与えることが明らかになった。次いで、細胞内Cl-が細胞増殖や運動に関与するWNKキナーゼやSrcキナーゼの活性に与える影響について検討した。cSrcは自己リン酸化部位であるpY416のリン酸化によって活性化されることが知られいるが、細胞内Cl-が低下するとpY416のリン酸化レベルが有意に減少した。また、cSrcの細胞接着に対するシグナルカスケードの下流分子であるFAKやpaxillinのリン酸化レベルも減少していた。一方、cSrcの細胞増殖に対するシグナルカスケードの下流分子であるSTAT-3は、低Cl-環境下でリン酸化レベルが有意に減少した。また、MKN細胞からWNKキナーゼのクローニングを行い、WNKの強制発現細胞株を作製し、細胞内Cl-濃度に対する影響について検討を行った。以上の結果から、細胞内Cl-は細胞内シグナルカスケードに影響を与え、細胞増殖や細胞接着など癌細胞の生理的機能に対する重要な制御因子の一つであることが示された。

癌が発生した部位から異なる場所に移動し、再び腫瘍を形成することを転移という。現在においても、転移巣を形成した後の治療は困難を極め、癌転移の分子メカニズムの多くが未知のままである。我々は、細胞内Cl-が様々な細胞機能に関わっていることを明らかにしており、本研究では細胞内Cl-が癌転移に関与しているか検討することとした。本研究により、細胞内Cl-は細胞接着因子の発現や細胞接着能に影響を与えることが明らかになった。また細胞内Cl-濃度変化は、WNKやSrcといった細胞内シグナル経路の主要な調節因子の活性を制御することで、癌細胞の増殖、接着、運動を制御している可能性が示唆された。WNKキナーゼ発現株の作製に必要なWNK expression vectorを作製し、MKN28細胞においてWNKキナーゼ安定発現株の作成を継続して進めている。また細胞内Cl-濃度の測定系および細胞運動評価システムとして、新たにIn cell analyzerによる解析系を確立した。また、細胞内Cl-がどのように細胞の運動を制御しているのかを評価するため、新たに細胞接着因子の発現・活性および細胞接着能の評価系についても新たに確立し、細胞内Cl-濃度とWNKキナーゼ活性がどのように細胞運動の調節をしているかについて総合的に検討を行った。細胞生理学今後は、新規細胞運動評価システムを用いMKN28細胞の運動能評価を進める。活性型・非活性型変異WNKキナーゼ発現株を用い、細胞運動時の細胞内Cl-濃度とWNKキナーゼ活性の相関性について継続して確認を行う。また各細胞に発現する癌の転移や浸潤に関与する接着因子を確認し、細胞内Cl-やWNKキナーゼの機能との相関についても検討を行う。さらに、様々な癌由来細胞株(胃癌由来細胞、肺癌由来細胞、前立腺癌由来細胞など)からWNKキナーゼのクローニングを行い、それぞれのWNKの塩基配列を比較する。特に分化度の違いによる特異的変異やそれぞれの細胞の運動性に応じた共通の変異部位などの有無について詳細に検討を行い、癌細胞におけるWNKキナーゼの変異と癌分化度との関係について検証する。本来平成25年度は細胞運動能評価システムの構築を目指していたが、C6細胞の細胞運動能が当初の想定よりも低かったため、他の細胞を用いて比較検討した結果、胃がん由来細胞株であるMKN28細胞を用いて評価を行うこととした。しかし、平成26年度に予定していたWNKキナーゼ発現株に必要なWNK expression vectorの作製等、細胞内Cl-とWNKキナーゼ活性の関係についての評価を優先して行ったことで、研究計画に関して大きな影響はない。今後は、MKN28細胞を用いた細胞運動評価システムの構築を目指すと共に、活性型・非活性型変異WNKキナーゼ発現株の作製を進める。それぞれの細胞の増殖・運動・細胞内Cl-濃度に対する影響について検討を行い、WNKキナーゼを介した細胞内Cl-ホメオスタシスが果たす生理学的な役割についての解明を目指す。
新しいIL-6/IL-12ファミリーサイトカインの同定とその機能解析

本研究では、まず、IL-27とIL-35の共通サブユニットEpstein-Barr virus-induced gene 3 (EBI3)が、IL-23のサブユニットの1つp19と結合することを見出し、両者をリンカーを挟んで一本鎖に繋いだ融合分子の発現ベクターを作製しマウスに投与すると、IL-17やGM-CSF等の産生が増強され、自己免疫性肝炎モデルマウスで肝炎発症が軽減することを明らかにした。また、マウス移植腫瘍モデルとしてメラノーマB16F10にこの発現ベクターを遺伝子導入すると腫瘍増殖が軽減された。以上の結果より、EBI3/p19が新しく機能的な会合分子であることを明らかにした。平成27年度は、EBI3とp19の結合について検討を行った。まず、ヒトHEK293T細胞にマウスEBI3とFLAGタグ付きのp19を強制発現させた後、その細胞溶解液を調製し、抗FLAG抗体で免疫沈降後、ウエスタンブロット解析よりp19と共にEBI3が共沈してくることが示された。この時、同時に内在性のカルネキシンも共沈してくることがわかり、細胞外へのEBI3とp19の分泌量は低くかった。カルネキシンは小胞体に局在する蛋白質であるため、カルネキシンとの結合が細胞外へ効率よく分泌されない原因の1つと考えられた。そこで、次にsiRNAを用いて内在性カルネキシン発現をノックダウンしたHEK293T細胞を用いて同様に細胞上清へのこれらの分子の分泌を調べたが、ノックダウンしていない細胞と殆ど変わらなかった。この原因が、ノックダウンの程度が低いことが原因である可能性と、カルネキシンと同様な分子シャペロンであるカルレティキュリンへの結合の可能性も考えられた。そこで、次に、EBI3のカルレティキュリンへの結合を、同様にHEK293T細胞へ遺伝子導入後免疫沈降反応とウエスタンブロット解析により検討したところ、EBI3は内在性カルレティキュリンにも結合することがわかった。そこで、現在、このカルレティキュリンの発現を完全に無くすためCRIPSR Cas9を用いたゲノム編集により発現を欠失した細胞を調製中である。さらに、生理的条件下でのEBI3とp19の会合を調べるため、LSPで刺激した骨髄由来未樹状細胞の細胞溶解液を用いて、両者が共沈してくるかについて調べたところ、共沈が見られることがわかった。現在さらに、その培養上清中での会合も検討中である。おおむね予定通りに進んでいると思われる。EBI3とp19の会合は見られることがわかったが、今後の活性のある組換え精製蛋白質の作製がチャレンジングである。(1)組換え精製EBI3/p19蛋白質の作製と機能解析(2) EBI3/p19のレセプターとシグナル伝達機構の解明FLAGタグ付きの1本鎖マウスEBI3/p19発現プラスミドを作製し、HEK293T細胞に一過性にtransfectし上清を抗FLAG抗体カラムにかけ組換え精製EBI3/p19蛋白質を調製した。また、この蛋白質の想定されるレセプターは、gp130とIL-23Rであるので、これらとさらにIL-12Rb1およびIL-12Rb2の発現ベクターを、因子依存的に増殖するB細胞株BaF/3細胞に遺伝子導入した。このBaF/3細胞は、3H-thymidineの取り込みによりIL-12、IL-23、IL-27のいずれのサイトカイン刺激によっても濃度依存的に細胞増殖を誘導した。ところが、この組換え精製EBI3/p19蛋白質は、抗FLAG抗体によるウエスタンブロット解析によりしっかりとした目的のバンドが見られたにも関わらず、このBaF/3細胞の増殖を誘導できなかった。この細胞は、IL-35のレセプターであるgp130とIL-12Rb2を発現しているので、IL-35に反応するはずであるが、市販の組換え精製IL-35蛋白質を用いても増殖は誘導できなかった。そこで、HEK293T細胞へ遺伝子導入し、細胞溶解液を用いた免疫沈降反応により、カルネキシンは、EBI3やp19およびp35と結合したが、IL-27のp28とは結合が殆ど見られないことがわかった。以上の結果は、EBI3/p28(=IL-27)と異なり、EBI3/p19やEBI3/p35(=IL-35)は、サイトカインおよびそのレセプターサブユニットとして未同定の分子の関与が必要と考えられるが、その分子については不明のままである。そのような分子の1つとしてカルネキシンが考えられるが、未だポジティブな結果は得られていない。今年度の、目標であった組換え精製EBI3/p19はできたが、その機能を確認するまでには至らなかったので、その点、遅れている。来年度も、この課題に取り組み、活性のある組換え精製蛋白質の作製を目指す。(1) EBI3/p19-トランスジェニック(Tg)マウスを用いた生体内での役割とその作用機序:肝臓特異的なプロモーターを用いて発現量の異なるFLAGタグ付き一本鎖EBI3/p19を発現する2系統のTgマウスを作製した。発現量は、肝臓の細胞溶解液の抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット解析より、10倍ぐらい発現量の違いがあることがわかった。