hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍内 HIF-1 存在低酸素領域の特異的描出を目的とした 低分子放射性プローブの開発

腫瘍の悪性化、治療抵抗性に関与する低酸素誘導因子(HIF-1)の酸素依存的分解に関与するアミノ酸配列を母体としたペプチドプローブ(^I-DKOP30)を開発した。^I-DKOP30は通常酸素条件で培養した細胞より低酸素条件で培養した細胞に高く集積し、体内分布実験では腫瘍イメージングに成功した。腫瘍内のHIF-1発現部位に^I-DKOP30の集積を認めたことから、^I-DKOP30がHIF-1存在低酸素領域のイメージングプローブとして有効であることが示された。本応募課題では、腫瘍の悪性度や治療抵抗性と密接に関係する腫瘍内低酸素領域(低酸素誘導因子[Hypoxia-inducible factor-1; HIF-1]存在領域)を体外から非侵襲的に検出するための放射性分子プローブ開発を目的とする。具体的には、HIF-1のαサブユニットの酸素依存的分解メカニズムに基づき、低酸素領域でのみ安定化され、それ以外の組織では分解されるペプチドプローブを開発することで、HIF-1存在低酸素領域への選択的プローブ送達と非標的臓器や血中からの速やかな放射能クリアランスの達成を目指す。昨年度の検討により、HIF-1α配列中の564番目のプロリン残基を含むアミノ酸配列に、膜透過配列としてL-リジン9残基を導入して作製したKOP30にHIF-1存在低酸素領域としての可能性を見出した。しかしKOP30は腫瘍血液比が低かったため、本年度は膜透過配列を種々変更して体内動態の改善を試みた。ポリアルギニン、MAPなど5種類以上の膜透過配列を検討し、D-リジン9残基が最も効果的であることを見出した。膜透過配列としてD-リジンを有するプローブDKOP30はプロテアソーム依存的に分解を受け、低酸素培養細胞に対して通常酸素培養細胞の4倍高い放射能集積を認めた。担がんマウスを用いた体内分布実験では、腫瘍血液比は投与2時間後で1を上回り、腫瘍イメージングに成功した。またDKOP30の腫瘍集積はHIF-1転写活性と有意な正の相関を示し、さらに腫瘍内のDKOP30の局在はHIF-1α免疫染色陽性部位と一致した。DKOP30に含まれるプロリンをアラニンに置換したmDKOPではプロテアソーム依存的な分解を認めず、その腫瘍集積もHIF-1転写活性とは相関しなかった。これらの結果からDKOP30のHIF-1存在低酸素領域イメージングプローブとしての可能性が示された。HIF-1αの酸素依存的分解に必須のプロリン残基を含むペプチドプローブOP30、およびそれに細胞膜透過配列を導入したKOP30、プロリン残基をアラニン置換したmKOPを設計・合成し、放射性ヨウ素標識を行った。得られたプローブを細胞溶解液とインキュベートしたところ、OP30とKOP30では90%以上が分解されたが、mKOPでは80%以上が未変化体として残存した。低酸素・通常酸素条件下で細胞取り込み実験を行ったところ、OP30ではいずれの条件下でも取り込みが認められなかったが、KOP30は通常酸素細胞と比較して低酸素細胞に4倍高い取り込みを認めた。担がんマウスでの体内分布実験の結果、腫瘍血液比は1を下回ったものの、KOP30の腫瘍集積はルシフェラーゼ発光で評価したHIF-1転写活性と有意な正の相関を示し、その腫瘍内局在はHIF-1α存在領域との一致を認めた。以上の結果から、KOP30が腫瘍内HIF-1存在低酸素領域イメージングプローブに必要な基礎的性質を有する事を見出した。次年度の課題として、腫瘍血液比を向上させる修飾をプローブに加えるなど、高コントラストに腫瘍内HIF-1存在低酸素領域をイメージングするべくプローブの最適化を行う。当初計画では、当該年度は見出したプローブの正常マウスにおける体内動態検討までを行う予定であったが、実際には担がんマウスにおける体内動態検討、腫瘍集積とHIF-1転写活性との比較、腫瘍内局在とHIF-1発現との比較など、次年度に予定していた検討項目まで終えることができたので、当初の計画以上に進展していると言える。

当該年度に開発したプローブKOP30の改善すべき点として、腫瘍血液比の低さが挙げられることから、次年度はそれを高め、高コントラストに腫瘍内HIF-1存在低酸素領域をイメージング可能なプローブ開発・最適化を行う。KOP30の腫瘍集積はHIF-1転写活性と相関し、腫瘍内局在はHIF-1発現部位と対応が認められたことから、HIF-1と同様のメカニズムで分解を受ける基礎的性質は有していると考えられる。そのため、分解に関与するプロリンおよびその周辺残基は保持しつつ、分解には直接関係しない細胞膜透過配列部分に変更を加えることで、プローブの体内動態改善を目指す。当初計画では、多数のプローブ候補ペプチドを合成してインビトロ・インビボ検討で絞り込みを行う予定であったが、早期の段階でKOP30を見出すことができたため、その評価検討に注力した結果、合成用試薬購入用に確保していた研究費が次年度使用分となった。次年度はプローブの最適化のために、細胞膜透過配列部分に変更を加えたプローブを多数合成し、評価する必要があるので、予定通り合成試薬の購入に使用する。
hERGチャネル独自の細胞内ドメイン間相互作用に基づく構造機能連関の解析

細胞膜の電位変化に応じて、細胞内外のカリウムイオンを受動的に輸送する電位作動性カリウムチャネル(Kv)の1つであるhERGチャネルは、ヒト心臓の拍動リズムの調節に寄与しており、その機能不全は心疾患の原因として知られる。このhERGチャネルは、他のKvには見られない独自の分子構造(Non-domain swapped構造)をとり、それに伴い細胞内の構造(ドメイン)間にも独自の相互作用が存在する。この相互作用はhERGチャネルが正常に機能するうえで重要な役割をもつ可能性がある。そこで、本研究ではこの相互作用の解析を中心に、hERGチャネル独自の分子構造と機能の関係性の解明を目指す。
卓上型鋳造装置の開発とハンズオン・ワークショップとしてのパッケージ化への試み

○研究目的鋳造は一般的に大掛かりで特殊な設備が必要となり、かつ危険を伴う作業となる。そのため、ワークショップとして多くの人たちに体験してもらう作業としては、色々な制限が多くなり実施例は多くない。ただ、身の回りには多くの鋳造製品が溢れおり、その製造工程を体験できることは貴重であると考え、場所や規模を問わず安全に鋳造体験ができる卓上型装置を開発するという着想に至った。そこで、鋳造による成型加工を、年齢・性別等に関係なく多くの人たちが安全かつ容易に体験できる装置の開発を行い、それをワークショップで専門的な知識がなくても実施できるようなパッケージ化を目指した。○研究方法本研究では、高温の液体(湯)を型に流し込む(鋳込み)危険な作業をできるだけ直接行わないことや、鋳肌(表面)仕上がりの良好さや後処理の容易さなどを考慮し、各種鋳造法の中から「低圧鋳造法」と「真空(吸引)鋳造法」の鋳造法を選択し、次の「3つの特色」を組み込んだ鋳造装置の開発を行い、性能・実証実験を行った。1装置一台で二種類(低圧鋳造&真空吸引鋳造)の鋳造法が実践できる装置として開発。2溶融炉部から鋳型内にかけての可視化(見える化)。3成型材として低融点(100°C以下)材を用いる。○研究成果●コンパクトな卓上型鋳造装置として開発。●「真空(吸引)鋳造法」での性能一実証実験を行い良好な結果を得ることができた。●「低圧鋳造法」での性能・実証実験を行い、やや問題点が残るものの概ね良好な結果を得ることはできた。●相応の成果を得ることができた。しかし、当初の目的であった二種類の鋳造法が実施可能な装置としての完成度には不満が残る結果であったため、引き続き改良を継続。●上記のことから、ワークショップとしてのパッケージ化についても完成には至っていない。これらの内容をまとめ、「平成26年度山口大学実験実習技術研究会」において発表・報告を行った。
チオカルボニル系の光反応を利用した複素環化合物の合成

1.芳香族チオアミドと2-アルコキシフランとの分子間光反応2-アルコキシフランがベンズアネレーション反応において3炭素源になることをすでに見出している。さらに有用な炭素源を探索した結果、2-トリメチルシロキシフランが有用であることが示され、ベンゼン縮合型アミノ安息香酸エステル化合物を合成することができた。2.芳香族チオアミドとアルデヒドとの分子間光反応芳香族チオアミドと各種アルデヒドの光反応を検討したところフェナンスロイミダゾールが得られ、アルデヒドとチオアミドの反応性が新たに見出された。3.N-側鎖にアルケニル基を有するグルタルチオイミドの分子内光反応アルケンと窒素原子を2及び3個のメチレンで結合し、二重結合炭素にメチル基を導入した種々のチオイミド類を合成し、光反応を検討した。二重結合炭素に結合しているメチル基の数及び位置による構造上の違いは、環化付加反応(Paterno-Buchi型)にはあまり影響せず、インドリチジン骨格を有する化合物が得られた。4.側鎖にアルケニル基またはベンジル水素を有するチオバルビツレートの分子内光反応チオバルビツレートのようなチオイミドとチオアミドを合わせ持つ系が、分子間の炭素-炭素二重結合と容易にチエタンを形成することを見出している。更に、チオバルビツレートの分子内光反応においても環化付加反応が効率よく起こることが見出された。その結果、種々の二三環性複素環化合物を合成することができた。また、ベンジル水素を有するチオバルビツレートにおいては、水素引き抜きによる反応が起こり、二環性複素環化合物が得られた。1.芳香族チオアミドとフラン誘導体との分子間光反応2-メトキシフランとの反応においてベンズアネレーション反応を見出している。更に、この反応を発展させるために3炭素源としての2-シロキシフランとの光反応を検討し、いくつかの多環式複素環系化合物を合成することが出来た。2.芳香族チオアミドとアルデヒドとの分子間光反応芳香族チオアミドとフラン誘導体による光反応を検討する中で、フェナンスロイミダゾールの生成が認められ、イミダゾール部の構成炭素はフランに由来するアルデヒドであることが推定された。そこで芳香族チオアミドと各種アルデヒドの光反応を検討したところフェナンスロイミダゾールが得られ、アルデヒドとチオアミドの反応性が新たに見出された。3.チオバルビツレートの光反応による縮環反応我々は、すでにチオバルビツレートのようなチオイミドとチオアミドを合わせ持つ系が、分子間または分子内の炭素-炭素二重結合と容易にチエタンを形成することを見出している。更に、トリチオバルビツレート自身が光縮環反応を起し、Norrish I反応による縮合ピリミジン誘導体の新しい合成法を見出した。2.N-側鎖にアルケニル基を有するグルタルチオイミドの分子内光反応アルケンと窒素原子を2及び3個のメチレンで結合し、二重結合炭素にメチル基を導入した種々のチオイミド類を合成し、光反応を検討した。3.側鎖にアルケニル基またはベンジル水素を有するチオバルビツレートの分子内光反応チオバルビツレートのようなチオイミドとチオアミドを合わせ持つ系が、分子間の炭素-炭素二重結合と容易にチエタンを形成することを見出している。
虚血性心疾患におけるリポ蛋白(a)遺伝子多型性の解析

(1)健康者群:健常者1508人(男性1058人、女性450人、平均年齢43±7歳)のLp(a)は正規分布せず、平均値18.2±9.6mg/dl、中央値13.0mg/dlであった。Lp(a)値が30mg/dl以下、30-50mg/dl、50-80mg/dl、80mg/dl以上の各群男女20人(80mg/dl以上の群は男性4人、女性5人)のフェノタイプ解析を行った。既報と同様に分子サイズの小さいアイソフォームほどLp(a)値が高かった。(2)心筋梗塞患者群:当科に入院した心筋梗塞患者56人(男性38人、女性18人、平均年齢62±12歳)について同様の解析を行った。Lp(a)はの平均値20.4±14.5mg/dl、中央値13.8mg/dlで健常者群と有意な差は認めず、フェノタイプの解析の結果も健常者と同様であった。うちの1例はヘテロ接合型家族性高コレステロール血症と高Lp(a)血症(Lp(a)値は90mg/dl)を合併していた。興味あることに、この患者は42歳の女性、コレステロールが300mg/dl前後と比較的リスクファクターが少ないと考えられるにもかかわらず重度の冠動脈硬化症(3枝病変)であった。2.Apo(a)遺伝子多型性の解析Apo(a)遺伝子多型性の解析は非RI-SSCP法により行った。末梢血より常法によりDNAを抽出したのち、Apo(a)遺伝子5 ́領域(-90-+310塩基)をPCR法により増幅した。PCR産物を12.5%ポリアクリルアミド(Phastgelシステム)にて電気泳動したのち、銀染色し、遺伝子変異を解析した。上記の対象者は、全て同じパターンを示し、5 ́領域には多型性を認めなかった。クリンゲル4領域は繰り返し構造であることと、増幅領域が長いため、PCR法による増幅ができず解析できなかった。今研究ではApo(a)遺伝子5 ́領域に多型性を認めなかった。しかしながら、解析した5 ́領域はコード領域に近い下流の部分(-90-+310塩基)であり、通常の遺伝子転写調節がかなり上流に存在することを考えると、Apo(a)遺伝子多型性が5 ́領域のもっと上流に存在する可能性がある。今後はApo(a)遺伝子の上流の塩基配列の決定と転写調節遺伝子の同定が必要であると考えられる。1.血中Lp(a),Lp(a)フェノタイプの解析(1)健康者群:健常者1508人(男性1058人、女性450人、平均年齢43±7歳)のLp(a)は正規分布せず、平均値18.2±9.6mg/dl、中央値13.0mg/dlであった。
戦国時代摂津・河内の都市に関する基礎的研究

摂津の大坂(石山)・有岡(伊丹)・堺・平野・尼崎・塚口・小浜・池田・花熊・高槻と河内の富田林・大ヶ塚・久宝寺・高尾・若江を取りあげて、都市構造の分析をおこなった。またこれらと比較検討するため、山城京都、寺内町としては和泉貝塚・山城山科・越前吉崎、城下町としては下総結城・下野小山・相模小田原・尾張清須、越前一乗谷、近江安土などを分析した。とりわけ、都市全体を囲繞する惣構(そうがまえ)に注目し、その空間構造ならびに惣構を成立させる都市社会構造を解明した。その結果、惣構が、(1)京都・堺や寺内町など畿内のいわゆる「自治都市」で先行してあらわれること、(2)城下町においては河内高屋や摂津池田が全国最初であること、(3)織田信長の影響下にある城下町の中でも、摂津有岡・高槻・花熊や河内若江など、大坂本願寺を包囲する摂津・河内の城下町で先行し、近江安土などはむしろ遅れることを明らかにした。このことは都市の惣構が摂津・河内をはじめとする畿内の都市で発達し、それが城下町に影響を与え、やがて織豊系の城下町に採用されてゆくという道筋を示す。こうした発展の系譜は、単に惣構だけに限定されるものではなく、都市づくりの基本的な理念の展開を示すといえよう。なお、以上のような研究成果を公開するため、複数の論稿を発表した。惣構論については別稿を準備中である。また、有岡城跡国史跡指定記念シンポジウム、関西近世考古学研究会大会などでも成果を報告した。中世の摂津地域における都市として、兵庫・西宮・尼崎・塚口・小浜・伊丹・池田・原田・富田・高槻・芥川・大坂(石山)・渡辺・天王寺を、河内地域における都市として、招提・枚方・飯盛・若江・稲田・久宝寺・萱振・金田・古市・富田林・大ヶ塚をそれぞれリストアップした。そしてそれらにかかわる文献史料や地図・発掘調査報告書、研究文献・自治体史などの蒐集・整理を開始した。またそれらをデータベース化するための準備作業をおこなった。戦国期の摂津・河内の都市と比較検討するため、肥前名護屋、筑前博多、周防山口など、西国の中世都市遺跡を現地踏査した。また畿内都市として山城大山崎、山城山科などについて、性格を再検討し、論稿にまとめた。これらの作業を通じて、摂津・河内都市に関するデータ蒐集と、その都市としての特質解明のための基礎的条件を整備した。
幼児虐待の連鎖-サルを対象とした不適切養育行動の世代間伝達の研究

不適切養育行動の世代間伝達の機序解明のため、コモンマーモセットで見られる新生児の尾の欠損「尾食い」について検討した。その結果、尾食いされた個体が自身の子の尾食いをする場合は養育状況や家系よりも行為視認あるいは味覚的経験が関係している可能性が示唆された。また、新生児の尾の形状が行為を誘発し、嗅覚的味覚的忌避物質で尾への接触を避けることで行為を予防・終息できる可能性が示唆された。不適切養育行動の世代間伝達の機序解明を目標にコモンマーモセットで見られる新生児の尾の欠損「尾食い」について検討を開始、国内外複数施設の調査から本現象の発生が各施設共通の事実であること、自らが管理しているコロニーと他のコロニーにおける本現象の実態についての調査をまとめたところ不適切養育家系で育った個体は親になった時に「尾食い」する傾向があること、被害個体は通常個体より体重が少ないこと、等が明らかになった。今年度は当施設の既存家族で新生児が出生せず新生児存在下の行動観察や実験を実施できなかった。母親の体調不良や兄弟間の諍いのため家族飼育形態の変更や解体を余技なくされたためである。原因の1つにビタミンD不足を疑われたため経口・非経口経路での補給を実施したが、新生児出生には至らなかった。そこで新たな家族で検討するため、通常家系と不適切養育家系、各々から雌雄1頭づつ選び掛け合わせてペアを作製したところ、両ペアとも新生児が出生した。この時は不適切養育家系出自の個体が父親でも母親でも「尾食い」は見られなかった。出生後行動観察を開始したが、途中、コロニー管理の都合で部屋やケージなどの飼育環境を大きく変えざるを得なくなり、寄り添いその他の行動頻度に影響が出てしまった。1組の新ペアには年度末にも新生児が出生したが、その際も「尾食い」は見られなかった。既存の不適切養育家系の場合、一旦発生すると以後継続して見られたことから、その発生には経験と嗜癖が深く関与するものと推察した。すなわち、偶然または何かに魅かれて口にし摂取する、または、他個体の行動を見て口にし摂取することにより、やみつきとなり、以後その行動を繰り返してしまうと仮定した。この点を確認するため、まず対照物となり得るコモンマーモセットの高嗜好性食品を探索検討した。その結果、セネガル種のアラビアガムが適当であると判断した。不適切養育行動の世代間伝達の機序解明を目標にコモンマーモセットで見られる新生児の尾の欠損「尾食い」について検討を続けた。伝達形式把握のため、管理コロニーとその出自個体の移管先コロニーにおける発生状況を検討したところ、移管先での「尾食い」現象発生には出自家系以外の要因が深く関与している可能性が示唆された。すなわち、通常家系か不適切家系かに関わらず、現象発生時に同一ケージ内にいたか、あるいは、別ケージでもその現象を視認し得る場所にいたかどうかが発生を左右していた。また、移管先コロニーでは「尾食い」に留まらず「食殺」にまで派生して伝達していた。味覚、嗅覚、視覚情報が発生に重要であると推察された。そこで、今年度2回出産した通常家系出自のメスと不適切養育家系出自のオスから成るペアで検証を実施した。その結果、オスが「尾食い」をしたが、その新生児の尾先患部に異味異臭のする液体を塗布すると行為が止んだ。この液体は、その昔獣医療で創面消毒に使用されていたブルンス液で、創傷治癒を促進する効果がある。苦味物質の安息香酸デナトリウム塗布では「尾食い」防止効果がなかったことから、ブルンス液は異味異臭で捕食を防ぎつつ創傷治癒に寄与する点が功を奏するものと推察された。創面の何かが行為を誘発し嗜癖となる可能性が示唆された。これら発生状況やブルンス液の「尾食い」防止効果について、学会発表を行った。また、周産期の行動観察から、初回の「尾食い」発生時期や、兄姉の行為発現、同腹仔間の優劣が背負い行動に及ぼす影響と「尾食い」との関係に関して、知見が得られた。加えて、今後の展開に関わる可能性からコモンマーモセットにおける脳脊髄液の採取法について検討し、学会発表を行った。コモンマーモセットの「尾食い」発生および伝達に関与する知見が得られ、有効な対策と成り得る方法を見出し、発表することができたため。コモンマーモセットの「尾食い」防止策としては、国内外通じて初の報告となる。まだ症例数が少ないものの、これまで発生を止める術が無く対応に苦慮していた問題に解決の糸口を提示することができたことは有意義であると判断している。また、コモンマーモセットにおける脳脊髄液採取法について適切な麻酔法や採取台などを検討開発し発表することができたことも評価理由にあげることができる。コモンマーモセットの脳脊髄液採取法はこれまでに2,3件報告があるのみで、実際試すと麻酔や手技の面で問題が多いものだった。実験動物としてのコモンマーモセットの意義が増している昨今、貴重な生体サンプルである脳脊髄液の採取方法を提示することができたことは関連分野の研究推進に寄与できる成果だと思われる。昨年度までの研究で「尾食い」行為防止効果が認められたブルンス液についてその効果検証を続行した。加えて、初回「尾食い」

発現時期把握、背負い行動や新生児回収時間と「尾食い」との関係検討等も実施した。検証は今年度出産した通常家系出自と不適切養育家系出自の個体からなるペア2組で実施した。いずれのペアでも初回の尾食いは出生直後から翌朝までの間に行われていた。死産児と健常児が混在して出生したペアでは、同腹の健常児の「尾食い」は軽微なものであったのに対して死産児では尾全長の半分程度が欠損していた。周産期観察からこの欠損は不適切養育家系出自のオスが「尾ぐい」した結果であることを確認した。いずれのペアでも出生当日から毎日尾先創面にブルンス液を少量塗布したところ、出生後3日目までには更なる欠損や創傷、咬み跡が認められなくなった。背負い行動や新生児回収時間と「尾食い」発現の間には相関がなかったことからも、新生児の状態あるいは創面の何らかの情報が行為を誘発する可能性が改めて示唆された。また、家族飼育の同腹仔観察で認められたコモンマーモセット同腹仔間のTwin-Fightという現象について検討し、学会発表を行った。今年度初めに実施されたコモンマーモセット飼育施設の大規模な設備拡充・整備工事によって多数の個体が体調不良に陥り、対象個体においても、流産死産、繁殖個体の死亡、予後不良からの安楽殺等が相次ぎ研究を中断せざるを得なくなったため。回復に至るまで数ヶ月を要したが、現在は妊娠を控えた個体が複数存在し新たな繁殖ペアも順次増やしているため、次年度は今年度より研究を推進する機会が増えるものと期待される。不適切養育行動の世代間伝達の機序解明のためコモンマーモセットで見られる新生児の尾の欠損「尾食い」について検討を続けた。昨年度までの研究で新生児の尾の状態が「尾食い」行動を誘発している可能性が示唆された。これまでの観察および行為発現状況から、新生児の尾の形状が行為誘発の一因であるものと推察し、ブタの尾食い研究で用いられている擬似尾による嗜好性試験tail model testを実施し、呈示から接触までの時間や手に保持している時間および口に含んでいる時間を比較した。その結果、コモンマーモセットは新生児尾の太さや長さを模した細い切り離し状態の擬似尾に対する嗜好性が有意に高いことが判明した。コモンマーモセットにとって新生児の尾の形状は視認すると近寄って手に持ち口にせずにはいられないもので、その衝動が「尾食い」行動発現の契機になっていることが示唆された。その新生児擬似尾にブルンス液を塗布すると嗜好性が有意に下がり、ブルンス液の「尾食い」行動忌避効果が実験的に証明された。新生児に対するブルンス液塗布を開始して以来、当該コロニーにおいては尾長の1/3以上を欠損するような重度の「尾食い」は1例も認められず、行動が発現した場合も軽微な状態で終息させることが可能となった。これらの効果は不適切養育を受けた個体が繁殖した時も同様であった。本研究により、コモンマーモセットにおける不適切養育のひとつとされる「尾食い」は、新生児尾の形状が誘発要因であること、そこに忌避効果のある嗅覚的味覚的修飾を加えることにより行動の発現および継続を終息させ、ひいては世代間伝達も阻止できる可能性あることが示唆された。不適切養育行動の世代間伝達の機序解明のため、コモンマーモセットで見られる新生児の尾の欠損「尾食い」について検討した。
金属板の加工プロセスにおける温度モニタリング法の開発

材料内部で反射した超音波を温度測定の指標に用いた手法について新たな視点から研究を試みた。はじめに、材料中を伝搬する際に干渉波が連続的に発生する機構についてシミュレーションを用いて検証を行った。その結果、干渉波の間隔は温度分布及びその温度の高低によって変化することが確認された。また、シミュレーションの妥当性を検証するため、実際の金属板(アルミ合金A2017)を用いて干渉波の計測を行った。近年、自動車産業など日本のものづくりの現場において物体の内部温度を精度よく測定するための技術が必要とされている。とくに溶接や鋳造など加熱、冷却を伴う材料の加工プロセスにおいて、材料内部の温度分布を測定する技術へのニーズがある。また近年、超音波パルスエコー計測と熱伝導解析を効果的に組み合わせた温度分布計測法が新たに研究されている。この測定の原理は材料中を伝搬する超音波の音速の温度依存性を用いたもので、これまでの検証(アルミのダイカストプロセスを想定した鋳造模擬実験、レーザー超音波法による非接触の温度モニタリング実験など)を通じて本手法の工業プロセスへの有効性を確認した。本課題では、材料内部で反射した超音波を解析の指標に用いた手法について新たな視点から研究を試みた。はじめに、超音波が材料中を伝搬する過程をシミュレーションによって解析し、材料中を伝搬する際に干渉波が連続的に発生する機構について材料内部に温度分布を与えた条件でのシミュレーションを繰り返し行うことで検証を行った。その結果、干渉波の間隔は温度分布及びその温度の高低によって変化し、その変化の程度は従来用いられる超音波計測法で十分に計測可能な量であることが確認された。しかしながらその変化の傾向は材料の中心を基準に対称となったため、材料内部の温度分布を一意的に求めることは困難であることが判明した。また、シミュレーションの妥当性を検証するため、実際の金属板(アルミ合金A2017)を用いて干渉波の計測を行った所、計測された波形には材料内部を伝搬する際に生じる干渉波が周期的に計測され、その間隔はシミュレーションの結果とほぼ一致したことからシミュレーションの妥当性が確認された。はじめに、材料中の温度分布を測定するための基礎研究として、対象とする材料の検討を行った。材料中を超音波が伝播する速さは材料の温度と共に変化するため、温度ごとに材料の縦波、横波の音速が得られるものについて情報を収集した。その結果、アルミ合金(主にA2017系)についてのデータが最も詳細に収集できたことや、アルミ合金は工業界でも多用される材料であるため、本材料を対象とした研究を行うことした。なお、アルミ合金内の温度分布が計測する事が出来れば、アルミダイカストのインラインモニタリングや、溶接時の温度変化の様子などを計測でき、より高品質な製品を製造するための技術として期待できる。なお、本研究で検討している温度分布の測定法は、材料の温度ごとの音速が分かれば、材料によらず適用できるので、本計測技術の適用範囲は広く、社会に貢献する。次に、コンピュータシミュレーションを用いた解析を行った。ある温度で、一定の厚さを持つアルミ合金の端面から数MHzの超音波パルスを入射し、材料内部を超音波が伝搬する様子を解析した。アルミ合金の他端で計測した超音波波形は、入射した超音波パルスが初めに計測され、その後に材料内で超音波が反射、屈折することで生じた干渉による超音波が周期的に観測された。ここで、材料中の温度分布を変化させたところ、干渉による超音波の間隔が温度、温度分布のパターンによって変化する事を確認した。また、観測された干渉による超音波について、各波のピークの時間でデータを整理したところ、温度、温度分布のパターンによってピークの時間が連続的に変化する事が判明した。温度分布のパターンと振幅の関係についても検討したが、明確な関係は見いだせず、振幅からの温度分布の計測は困難であると思われる。東日本大震災によって研究の遂行が完全に停止した期間があった。また、学校が再開した後も震災対応に多くの労力を奪われた。平成23年度の後期からはほぼ通常の研究環境を回復できたため、研究が計画通りに進んだ。このように、研究計画と比べて約半年の遅れが生じたと評価した。コンピュータシミュレーションを用いた解析によって、材料中を伝搬する超音波の干渉した波が材料中の温度分布と相関があることが判明した。今後は、当初の予定に従い、温度分布解析に用いる指標を決定するため、解析で得た超音波波形のFFT周波数解析(強度、位相)や相関法を用いた高精度な時間の算出を行う。また平成23年度は、計測装置の購入を計画していたが、メーカーから装置の見積もりをとり、科研費の申請をしたところ、減額されたため購入できなかった。そのため、今年度に繰り越した予算を用いて計測装置を購入し、実際の試験片を用いた検証を行う予定がある。実験装置を新規に構築し、コンピュータシミュレーションで与えた条件の実証実験を行い、シミュレーションで得た結果の妥当性を評価する。メーカーから装置の見積もりをとり、科研費の申請をしたところ、減額されたため購入できなくなった。

また、平成23年度前期の研究が遅れ、学会発表を行わなかったため、出張旅費も生じなかった。平成24年度に目的の装置を購入し、研究の推進を図り、研究成果を広めるため、学会等への積極的な参加も予定している。
ビシクロ骨格の縮環した含硫黄環状π電子系の合成と性質

1.2個のビシクロ[2.2.2]オクテン(以下BCOと略記)ユニットの縮環した1,2-ジチインを合成し、そのラジカルカチオンおよびジカチオンの性質について検討した。その結果1,2-ジチインラジカルカチオンは、脱気条件下では、分子間で反応して、新奇なテトラチアビシクロ[2.2.2]オクテン骨格を持つラジカルカチオン1とチオフェン体に、空気中では、酸素と反応してさらに転位することにより新奇な1,2-ジチオリウムイオンに異性化することを見いだした。またこの1,2-ジチイン体および1を五フッ化アンチモンで酸化させると、1,2-ジチインのジカチオンが生成することがわかった。さらにNMRおよび理論計算の結果からこのジカチオンは芳香族性を有することを見いだした。2.BCO骨格で覆われたオリゴチオフェン(2量体、3量体、4量体、6量体)を合成し、その酸化還元特性をサイクリックボルタメトリーにより測定した。その結果、一電子目と二電子目の酸化のピーク間電位は、オリゴマー長が長くなるにつれ、狭くなっていくことが観測された。さらに2量体および3量体においても一電子目の酸化は可逆となり、ラジカルカチオンがBCO骨格により安定化されていることが示唆された。事実、2量体および3量体のラシカルカチオン塩が空気中でも安定に存在出来ることを見いだし、2量体のラジカルカチオンとしては初めてそのX線結晶解析に成功し、さらに3量体ではジカチオンがNMRによる観測が可能であることも見いだした。1.2個のビシクロ[2.2.2]オクテン(以下BCOと略記)ユニットの縮環したチオフェンを合成し、スペクトル性質を明らかにするとともに、容易に一電子酸化を受けることを電気化学的手法により見いだした。また、化学的な酸化反応によりこれをラジカルカチオンに変換し、ESR測定によりスピン分布を明らかにした。さらに、ラジカルカチオン塩を黄色結晶として単離し、X線結晶構造解析により構造決定することに初めて成功した。2.2個のBCOユニットの縮環した1,4-ジチインを合成し、これが極めて低い電位で二段階の可逆的な一電子酸化を受けることを見いだした。また、化学的な一電子酸化によりラジカルカチオンに変換し、ESRスペクトル測定を行なった。硫黄によるカップリング定数から、BCOによる縮環が、スピンと陽電荷の非局在化に関してベンゼン環の縮環よりも有効であることを明らかにした。さらに赤褐色のラジカルカチオン塩としてこれを単離し、X線結晶構造解析することに成功した。これによりπ共役系は平面性を保持していることが明らかとなった。3.2個のBCOユニットの縮環した1,4-ジチインについて、強い酸化剤である五フッ化アンチモンを用いて二電子酸化することにより二価カチオンへと導き、これをH-1およびC-13NMRにより観測した。特にビシクロ骨格の橋頭位プロトンのケミカルシフトの値から、この二価カチオンが6π電子系としての芳香族性を有していることを明らかにし、さらに理論計算によってこれを確認した。
染色体分配装置の再構成

キネシン8は真核生物において保存されたモータータンパク質で、動原体微小管先端に局在し動原体微小管の長さ制御および染色体整列に重要な働きをする。しかし、このタンパク質によってどのように染色体整列が制御されるかについての詳細な機構はよく分かっていない。生化学的活性についても定まっていなかった。例えばヒトのキネシン8は微小管脱重合活性があるとする報告と、微小管伸縮を抑制するという報告がある。本研究では前年度までに、ショウジョウバエにひとつだけ存在するキネシン8の生化学的活性を決定した。すなわち、キネシン8タンパク質全長を精製し、試験管内において伸び縮みする動的な微小管と反応させると、微小管の伸長から短縮に移行する「カタストロフ」と呼ばれる現象の頻度が上昇し、微小管の長さを制限した。さらに精製したキネシン8は微小管の短縮速度を減少させ、伸長、短縮いずれも起こらない、「ポーズ」と呼ばれる現象や、短縮から伸長に移行する「レスキュー」と呼ばれる現象の頻度を上昇させた。今年度は、これらの活性がキネシン8の動原体機能にどう関与するかを明らかにすることを目指した。ショウジョウバエS2細胞においてキネシン8を欠損させると異常に長い動原体微小管が観察されるが、S2細胞においてキネシン8を欠損させ、さらに微小管重合阻害剤であるコルセミドを加え微小管の長さを制限したが、染色体整列異常の表現型をレスキューできなかった。このことから、キネシン8のカタストロフを促進する以外の機能も染色体整列に重要なことが示唆された。そこで、ショウジョウバエS2細胞においてキネシン8を欠損させ、動原体-微小管の結合を詳細に観察することにした。研究は順調に進んだが、重複制限により、本研究課題は廃止となった。我々は2007年に、欠失によりスピンドル形態に異常が生じる205遺伝子をショウジョウバエS2細胞で同定したが、そのうち機能的なスピンドルの最少単位を構築するのに十分と考えられる約10のショウジョウバエタンパク質の精製プロトコルを確立した。この中には、スピンドル微小管のプラス端動態を制御するEB1、センティン、Minispindles(XMAP215オルソログ)、Mast/Orbit(CLASPオルソログ)、Klp10A(キネシン13)、Klp67A(キネシン8)や、スピンドル微小管同士の架橋に必要なKlp61F(キネシン5)、Ncd(キネシン14)、Asp(ASPMオルソログ)、D-TPX2(TPX2オルソログ)、さらには、これらの因子の活性をリン酸化により制御すると思われるPoloキナーゼ、オーロラBキナーゼ複合体が含まれる(Aspを除いて全長タンパク質の精製に成功した)。さらには、ショウジョウバエ培養細胞から、in vitro微小管動態アッセイに使用するのに十分な量のチューブリンも精製できた。2)細胞内濃度の見積り上記のタンパク質のうち、チューブリン、EB1、センティン、Minispindles、Mast/Orbit、Klp10Aについては、特異的抗体を用いて、細胞内でのおよその濃度を見積もった。具体的には、精製したタンパク質とショウジョウバエS2培養細胞の抽出液を並べてSDS電気泳動したのち、ウェスタンブロットを行い、バンドの強度を測定・比較した。球形とみなしたS2細胞の直径と細胞核の直径を測定後、細胞質の容量を見積もることで、細胞質内のタンパク質濃度をおおまかに見積もった。この情報をのちの試験管内再構成実験に役立てる。当初の計画どおり、スピンドル再構成に用いる複数のタンパク質の精製法を確立できたため。ショウジョウバエのS2細胞内でキネシン8を欠失させると、異常に長い微小管より成る細胞分裂装置が形成され、染色体の分配に異常が出ることが知られている。キネシン8は動原体外表に多く存在するため、染色体と分裂装置の接点でなんらかの働きを有していると予想される。28年度は、特にショウジョウバエのキネシン8タンパク質に着目して生化学的研究を進めた。(1)組み換えタンパク質(GFPを融合したもの)を大腸菌から精製した。精製の最後のステップとしてショ糖勾配密度遠心を加えることで、前年度よりもさらに純度の高いタンパク質を得ることができた。(2)得られた組み換えタンパク質を用いてMicrotubule gliding assay(微小管滑動アッセイ)やsingle molecule motility assay(一分子歩行アッセイ)を行い、ショウジョウバエのキネシン8には微小管のマイナス端からプラス端に歩行する活性があることを確かめた。これは、酵母やヒトなど他の生物種で見られていたものと同様であった。(3)伸び縮みする動的な微小管と混ぜ、そのダイナミクスに変化をもたらすかを調べたところ、キネシン8は動的な微小管のプラス端に蓄積し、そのダイナミクスを顕著に変化させることがわかった。この活性は、キネシン8が欠失すると細胞分裂装置内部の微小管の長さが異常になることと矛盾はなかった。以上の結果はショウジョウバエのキネシン8がどのようにして染色体分配装置の働きに寄与しているかに対して新たな知見を与えるものであり、アメリカ細胞生物学会年会で発表した。染色体分配装置の構築に必須の因子の分子活性を決定できたためキネシン8は真核生物において保存されたモータータンパク質で、動原体微小管先端に局在し動原体微小管の長さ制御および染色体整列に重要な働きをする。

しかし、このタンパク質によってどのように染色体整列が制御されるかについての詳細な機構はよく分かっていない。生化学的活性についても定まっていなかった。例えばヒトのキネシン8は微小管脱重合活性があるとする報告と、微小管伸縮を抑制するという報告がある。本研究では前年度までに、ショウジョウバエにひとつだけ存在するキネシン8の生化学的活性を決定した。すなわち、キネシン8タンパク質全長を精製し、試験管内において伸び縮みする動的な微小管と反応させると、微小管の伸長から短縮に移行する「カタストロフ」と呼ばれる現象の頻度が上昇し、微小管の長さを制限した。さらに精製したキネシン8は微小管の短縮速度を減少させ、伸長、短縮いずれも起こらない、「ポーズ」と呼ばれる現象や、短縮から伸長に移行する「レスキュー」と呼ばれる現象の頻度を上昇させた。今年度は、これらの活性がキネシン8の動原体機能にどう関与するかを明らかにすることを目指した。ショウジョウバエS2細胞においてキネシン8を欠損させると異常に長い動原体微小管が観察されるが、S2細胞においてキネシン8を欠損させ、さらに微小管重合阻害剤であるコルセミドを加え微小管の長さを制限したが、染色体整列異常の表現型をレスキューできなかった。このことから、キネシン8のカタストロフを促進する以外の機能も染色体整列に重要なことが示唆された。そこで、ショウジョウバエS2細胞においてキネシン8を欠損させ、動原体-微小管の結合を詳細に観察することにした。研究は順調に進んだが、重複制限により、本研究課題は廃止となった。プロトコルを確立した精製タンパク質を使い、スピンドルのいくつかのパーツの再構成を個別に進める。染色体分配装置のうち、動原体微小管の構築原理に迫る研究を推進する消耗品にかかる費用を節約できたため未使用額が生じた消耗品にかかる費用を節約できたため未使用額が生じた消耗品購入に使用予定消耗品購入に使用予定
1943年の「上海ゲットー」設置後における、ユダヤ避難民の状況の変化・比較研究

本研究は「上海ゲットー」がいかなる性質の収容施設であったのかを問うものである。そのためには、その施設を設置した日本人とその施設に収容されたユダヤ人の双方が、それに対してどういった見解を持っているのかが重要になってくる。本年度は終戦後に焦点を絞り、ユダヤ人が上海生活を経て、どこに移住していったのか、どういう理由でその移住先を選択したのかを研究してきた。戦後に渡った新天地と上海での生活を比較することが重要であると考えたからである。研究方法としては、戦後も上海で発行されていたイギリス紙の『ノース・チャイナ・デイリー・ニュースNorth China Daily News』を精査し、ユダヤ人の移住の経緯を調べた。また、ユダヤ人が戦後に記した回想録などからも、当時の心境や移住の進捗状況などを知ることもできた。また、とくにアメリカの移民計画などを知るために、アメリカ移民史関係の著書などからも多くの知見を得ることができた。研究の公開という点では、2018年8月5日の日本上海史研究会例会において、「戦後上海のユダヤ人」という題目で、上記研究の途中経過を報告した。また、2019年の3月上旬には、上海出張を行い、当時ユダヤ人が発行したドイツ語紙『上海ジューイッシュ・クロニクルShanghai Jewish Chronicle』を調査し、必要な個所をコピーしてきた。また、「ユダヤ難民記念館」を訪れ、周囲の街並みの変化も実感することができた。今後の論文作成に資する出張になったと思われる。戦後の上海ユダヤ人の状況については、本年度でほぼ把握できるようになったため、本年度の研究は順調に進展していると考える。残るのは、戦前においてユダヤ人が上海に至るまでの状況と、戦時における上海ユダヤ人の生活実態を見ることであるが、後者はこれまでの蓄積された研究からも、順調に進捗すると予想される。戦後のユダヤ人の動向については、現在論文を執筆中である。今年度中に進めた調査によって、論文は順調に進んでおり、上海出張での体験も論文に織り込む予定である。この論文は本年度中に刊行予定の『アジア遊学』(勉誠出版)に掲載される。その後は、上海に至るまでにドイツでどんな体験をし、いかなる理由で上海に来たのかを調査する必要があると考えている。そのためドイツでの調査も計画中である。最後に上海のユダヤ人の動向を調査し、ドイツから上海に至るまでの状況や心境と比較していきたい。当初は学会参加などで東京などへの出張経費を見積もっていたが、学会が関西で開催されるなどして、当初の計画ほどは必要がなかった。また、海外出張も二度予定していたが、諸事情のため一度に減ったため。本年度は二度の海外出張に加え、学会参加などの東京への出張などもあるので、前年度の繰り越し金でまかなう予定にしている。
微生物の共生関係を巧みに利用した嫌気共生培養による未知環境微生物の分離手法の確立

我々は低分圧の水素をゆっくりと連続的に供給可能な方法として嫌気共生培養系に着目し、様々な嫌気環境中から未培養系統分類群に属する新規なメタン生成古細菌の分離・培養を試みた。その結果、水田土壌を植種源に用いたプロピオン酸培養系内から、分類学上目レベルで新規なメタン生成古細菌SANAE株を分離することに成功した。分離株の菌学的特徴を決定したところ、SANAE株は運動性のない桿菌であり、その細胞サイズは幅0.3-0.6μm、長さは1.8-2.8μmであった。また、DNAのG+C含量は56.6%であった。水素およびギ酸を基質として利用可能であり、その生育には酢酸を要求した。至適生育温度は37°C、至適生育pHは7であり、至適生育条件下での倍加時間は4.2日であった。16S rRNA遺伝子のほぼ全長を決定し分子系統解析を行った結果、本分離株は、今まで未培養なメタン生成古細菌のグループとして認識されていたRice Cluster Iに属する目レベルで新規なメタン生成古細菌であることが明らかとなった。Rice Cluster Iに属するメタン生成古細菌は、様々な水田環境中に普遍的かつ優占的に存在し水田環境中からのメタン生成に大きく寄与していることが示唆されており、環境問題を考える上でも本菌株の分離は非常に重要な知見であるといえる。我々は以上の結果を踏まえ、本分離株をMethanomicrobia綱に属する新目を代表する新属新種のメタン生成古細菌として提案する予定である。未培養のメタン生成古細菌を分離・培養する1つの方法として、低分圧の水素を連続的かつ緩やかに供給可能な嫌気共生培養系に着目し、様々な嫌気環境から未培養なメタン生成古細菌の分離を試みた。10種類の嫌気環境サンプルを植種源として、嫌気共生系によって分解されるエタノール、酪酸及びプロピオン酸を基質として集積培養を行った。エタノールでの集積培養には1週間、酪酸及びプロピオン酸では1-3ヶ月程度を要した。その時の水素分圧は、エタノールの集積系では20-100Pa程度、酪酸及びプロピオン酸の培養系では数十Pa程度に保たれていた。これらの培養系内には、メタン生成古細菌に特有のF_<420>様の自家蛍光を持つ微生物と、数種の形態が異なる嫌気共生菌と思われる微生物を確認できた。これら集積培養系内の古細菌のクローン解析を行った結果、既知のメタン生成古細菌と97%以上の高い相同性を示すクローン配列が検出された培養系もあったが、プロピオン酸を基質としたいくつかの集積培養系から、Methanomicrobia綱に属する目レベルで新しい配列(Rice cluster I)やMethanomicrobiales目に属する科レベルで新規な配列(グループMM-1)などが高頻度に検出された。さらにこれらプロピオン酸集積培養系を植種源とし、一般的にメタン生成古細菌が単独で利用可能な水素やギ酸で培養を行った結果、Rice cluster I等に属する新規なメタン生成古細菌を優占的に培養することができた。以上の結果から、嫌気共生培養系を用いることで未培養系統分類群に属するメタン生成古細菌を選択的に分離・培養できる可能性を示した。
間質流制御に基づく血管化組織工学の展開

現在の組織工学では複雑な三次元臓器の再生手法が必要とされている。特に、毛細血管を含む三次元複合組織の再生が課題であり、本研究は生体工学の立場から三次元肝細胞組織に毛細血管を導入する血管化の技術を検討した。具体的には、3チャンネル型マイクロ流体デバイスにおいて血管形成と三次元肝組織形成の時期を調節することで、三次元肝組織に血管組織を導入することに成功し、再現性を確認した。さらに、肝細胞調整培養液やコラーゲンゲル粒子を用いることによって効率を高める可能性を示した。本研究では、組織工学・再生医工学において課題となっている毛細血管網を有する三次元組織の再生に関して、マイクロ流体システムを用いて生体工学の立場から取り組んでいる。平成25年度は、2チャンネルおよび3チャンネル型のマイクロ流体システムを用いて間質流を制御し、3次元肝組織を血管化する最適な微小環境構成法を検討した。具体的には以下の研究成果が得られた。1マイクロ流体システムの作製:ソフトリソグラフィーによってマイクロ流路およびコラーゲンゲルを有するマイクロ流体システムを作製した。特に、培養の際には、マイクロ流路間に圧力差を形成することによってコラーゲンゲルを浸透する間質流を起こし、微小培養環境における対流・拡散を制御した。その結果、間質流によって毛細血管網を誘導できることを見出した。2細胞配置の時間的・空間的な制御:マイクロ流体システムにおいて肝細胞と血管内皮細胞の共培養に取り組んだ。肝細胞については三次元組織形成の観点から、血管内皮細胞については毛細血管網形成の観点から培養条件の最適化を行った。特に、間質流によって毛細血管網の形成を誘導し、その後で肝細胞をマイクロ流路に追加する手法によって細胞配置を時間的・空間的に制御することで、毛細血管網と三次元肝組織を融合させるための共培養モデルを作成することができた。32チャンネル型および3チャンネル型マイクロ流体システムにおける三次元肝組織血管化の検討: 2チャンネル型および3チャンネル型のマイクロ流体システムを作製し、上記の実験を行い、2チャンネル型と3チャンネル型での血管形成および血管化のプロセスについて比較検討した。その結果、2チャンネル型システムでは間質流によって血管形成を誘導し、3チャンネル型システムでは肝細胞からの分泌物によって血管形成を誘導できることを見出した。平成26年度は、2チャンネルおよび3チャンネル型のマイクロ流体システムを用いて間質流を制御し、3次元肝組織を血管化する最適な微小環境構成法を検討した。1タイムラプス顕微鏡ビデオ撮影法と多細胞ダイナミクスの定量的解析:マイクロ流体システムでライブセルイメージングを行い、3チャンネル型マイクロ流体システムにおいて異なる細胞播種条件において血管スプラウト形成や血管伸張距離などを定量的に解析し、血管化三次元肝組織を再構築するために最適な細胞配置を明らかにした。2間質流の強さが組織化へ及ぼす影響:間質流は肝細胞の三次元組織形成やコラーゲンゲルの修飾、血管形成の誘導など様々な役割をもつ。そこで、2チャンネル型マイクロ流体システムにおいて間質流の強さを変更することで、ラット微小血管内皮細胞の血管形成を誘導しうることを見出した。また、コラーゲンゲルだけでなく、フィブリンゲルを用いた実験も検討し、血管形成の観点からはフィブリンゲルがより適した条件であることが分かった。3再生された三次元複合肝組織の解析: 2チャンネル型マイクロ流体デバイスでは、間質流によって血管形成を誘導し、その後で肝細胞を追加することで三次元複合肝組織を構築した。一方、3チャンネル型マイクロ流体システムでは肝細胞との相互作用によって血管形成を誘導し、その後で肝細胞を追加することで三次元複合肝組織を構築した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて三次元的に組織を観察し、特に、3チャンネル型による手法において毛細血管様構造が肝細胞組織内部に伸張する様子が確認された。平成27年度は、2チャンネル及び3チャンネル型マイクロ流体デバイスを用いて血管化肝細胞組織を構築するプロセスの再現性の確認と効率化に取り組み、三次元組織の内部構造を検討した。1再生された三次元複合組織における上皮組織-毛細血管界面の解析:三次元肝組織に毛細血管網が導入されたかどうか免疫蛍光染色法によって詳細に検討した。特に、3チャンネル型マイクロ流体デバイスにおいて血管形成と三次元肝組織形成の時期を調節することで、三次元肝組織に血管組織を導入しうることを見出し、共焦点レーザー顕微鏡によって三次元肝組織内部における血管組織の構造を三次元的に解析し、複合肝組織の構造を明らかにした。2肝細胞調整培養液による血管化組織形成効率化の検討: 3チャンネル型マイクロ流体デバイスを用いることで血管化組織の構築に成功したが、さらに効率を高める必要がある。そこで、肝細胞調整培養液を利用することで血管形成を誘導し、最終的に血管化組織を構築する手法を確立した。3コラーゲンゲル粒子による血管化組織形成効率化の検討:三次元肝組織の血管化の効率を高めるためには、三次元肝組織内部の細胞外基質の分布が重要となる。そこで、細胞スケールのゲル粒子を作製し、肝細胞と混合した三次元肝組織を構築することに成功した。

特に、毛細血管を含む三次元複合組織の再生が課題であり、本研究は生体工学の立場から三次元肝細胞組織に毛細血管を導入する血管化の技術を検討した。具体的には、3チャンネル型マイクロ流体デバイスにおいて血管形成と三次元肝組織形成の時期を調節することで、三次元肝組織に血管組織を導入することに成功し、再現性を確認した。さらに、肝細胞調整培養液やコラーゲンゲル粒子を用いることによって効率を高める可能性を示した。平成26年度の計画は、2チャンネル型と3チャンネル型のマイクロ流体デバイスを用いて、特に血管形成の観点から細胞動態を定量的に評価し、3次元肝組織を血管化する最適な条件を評価することであったが、当初に予定通りに進んでいるため。27年度が最終年度であるため、記入しない。組織工学、生体工学平成26年度の研究計画をさらに発展させ、肝細胞組織と毛細血管網の融合を図る。特に、肝細胞の三次元組織に毛細血管を導入する効率を高めることに注力し、最終的に構築される血管化複合肝組織の構造・極性を三次元的に解析する。平成25年度の計画は、2チャンネル型と3チャンネル型のマイクロ流体デバイスを作成し、特に血管形成の観点から3次元肝組織を血管化する最適な微小環境構成法を検討することであったが、当初に予定通りに進んでいるため。本研究で使用するシリコンモールドの微細加工が予定していたよりも効率的に進み、関連する試薬・器具を節約することができたため。平成25年度の研究計画をさらに発展させ、肝細胞組織と毛細血管網の融合を図る。また、実験結果における再現性の確認、定量的評価を行うことに加え、血管化複合肝組織の構造を詳細に調べる。今後の研究において三次元複合肝組織の構造を免疫蛍光染色によって明らかにしていくため、染色に必要な抗体や蛍光試薬を購入する費用に充当する。今後の研究において微細加工するシリコンモールドの改良型をデザインする予定であり、その加工に要する費用に充当する。