hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
理論化学における時間依存アプローチに関する共同研究

本研究では、理論化学における緊急の課題として、時間に依存する現象を定量的に扱う理論的手法と分子設計、反応設計を可能にする大きな系の定量的計算法の確立をめざし、国内外の研究者との共同研究によって電子相関、電子-核相互作用における時間依存アプローチを新たに開発することを目的としている。特に、時間依存アプローチを行う上で非常に重要な要素である、化学反応のポテンシャルエネルギー曲面を、高精度かつ高速に構築する理論の開発、構築されたエネルギー曲面上での動的反応経路に基づく反応経路モデルの開発、電子-核相互作用を考慮した波束動力学法の開発を行い、これらの手法を現実の化学反応に適用することを主眼とする研究を行ってきた。Handy教授との共同研究では、時間依存密度汎関数法と電子相関を考慮した多配置摂動論のエネルギー微分法について新たな定式化を行い、同時にプログラムコードも開発した。これによって、エネルギー曲面の高精度かつ高速な構築が可能となった。また、並行して、多次元ポテンシャル面でのトンネル現象を扱う理論も提唱し、多原子化学反応に適用した。Carbo教授との共同研究では、ポテンシャルエネルギー曲面の高速な構築に不可欠な大次元ハミルトニアン行列の新しい対角化法を開発し、アルゴリズムの精度と速度について実証を行った。Cederbaum教授とは電子-核相互作用を考慮した波束法と動的反応経路に基づくポテンシャルエネルギー曲面の構築法の開発について共同研究を行うとともに、これまで開発した前述の手法を現実の化学反応に適用し、多原子分子の解離機構の解明、蛍光分光への応用等を行った。本研究では、理論化学における緊急の課題として、時間に依存する現象を定量的に扱う理論的手法と分子設計、反応設計を可能にする大きな系の定量的計算法の確立をめざし、電子相関、電子-核相互作用における時間依存アプローチを新たに開発することを目的としている。本年度は、Handy教授を招聘し、時間依存密度汎関数法と電子相関を考慮したエネルギー微分法、それぞれの方法論について、情報交換と共同研究を行った。また、山下、武次がCederbaum教授を訪問し、電子-核相互作用を考慮した波束法と動的反応経路に基づく反応経路モデルの開発についても共同研究を行った。時間依存密度汎関数法は、Handy教授との議論から、従来の方法論の比較的簡単な拡張をすることによって、(電子)基底状態のみならず、励起状態にも適用できる手法が提案され、新たな定式化を行うことができた。また、電子相関を考慮したエネルギー微分法は、多参照摂動論に対して定式化を行い、既に9年度予定のアルゴリズム、プログラム開発の準備段階に入っている。電子-核相互作用を考慮した波束法、動的反応経路に基づく反応経路モデルは、並列計算機・ベクトル計算機に適した高速計算を可能にするような定式化をCederbaum教授と共同で行うことができた。大型abinitio分子軌道計算のための理論・プログラム開発、及び、時間依存多体摂動論についての準備は、現在のところ自国にて別々に行っている。9年度にCarbo教授を招聘し、共同で定式化とプログラム開発を行う予定である。本研究では、理論化学における緊急の課題として、時間に依存する現象を定量的に扱う理論的手法と分子設計、反応設計を可能にする大きな系の定量的計算方の確立をめざし、国内外の研究者との共同研究によって電子相関、電子-核相互作用における時間依存アプローチを新たに開発することを目的としている。特に、時間依存アプローチを行なう上で非常に重要な要素である、化学反応のポテンシャルエネルギー曲面を、高精度かつ高速に構築する理論の開発、構築されたエネルギー曲面上での動的反応経路に基づく反応経路モデルの開発、電子-核相互作用を考慮した波束動力学法の開発を行い、これらの手法を現実の化学反応に適用することを主眼とする研究を行ってきた。

また、並行して、多次元ポテンシャル面でのトンネル現象を扱う理論も提唱し、多原子化学反応に適用した。Carbo教授との共同研究で、ポテンシャルエネルギー曲面の高速な構築に不可欠な大次元ハミルトニアン行列の新しい対角化法を開発し、アルゴリズムの精度と速度について実証を行った。Cederbaum教授とは電子-角相互作用を考慮した波束法と動的反応経路に基づくポテンシャルエネルギー曲面の構築法の開発について共同研究を行なうとともに、これまで開発した前途の手法を現実の化学反応に適用し、多原子分子の解離気候の解明、蛍光分光への応用等を行った。
ウズラ卵黄膜の精子レセプターの同定および生合成機構について

本研究ではウズラ卵黄膜の精子レセプターを同定し,その生合成機構について研究した。鳥類の卵黄膜は,内層と外層の二層からなるが,卵子は内層だけに覆われた状態で排卵される。卵黄膜内層を精子とインキュベーションすると穴があくこと,その際にタンパク分解酵素阻害剤を添加すると精子の接着が認められること,さらにZPCタンパク抗体によって接着が阻害されることからは卵黄膜内層のタンパクのひとつであるZPCが精子レセプターの本体であると同定した。そこでZPCの発現をウエスタンブロッティングおよびノーザンブロッティングで解析し,さらに培養顆粒膜細胞を用いて産生及び分泌の調節機構について調べた。その結果,顆粒膜細胞にのみ1.4kbのZPCmRNAが検出された。卵胞が成熟するにつれてこのシグナルは強くなる傾向にあり,これはウエスタンブロッティング法による卵胞のZPC含有量の結果ともよく一致した。培養顆粒膜細胞を用いて各種ホルモンや細胞成長因子の効果を調べたところ,ZPCの産生はFSHによって最も顕著に促進されることがわかった。これらの結果から,精子レセプターであるZPCタンパクはFSHの刺激によって顆粒膜細胞で産生されていることが明らかとなった。ウズラZPC遺伝子の塩基配列は,哺乳類の透明帯のZP3,両生類の卵黄膜のZPC,さらに魚類のコリオンのL-SFと呼ばれているタンパクとも非常に相同性が高い。これらのタンパクは共通の祖先タンパクから由来しているらしい。ところが本研究では,ウズラのZPCは卵胞の顆粒膜細胞が起源であることが示された。哺乳類と両生類では卵子が産生分泌していることが明らかとなっている。魚類では肝臓が産生分泌している。共通の祖先タンパクから由来しているのになぜ別々の臓器で産生されているのであろうか。今後これらの点を中心に研究をさらに展開する予定である。鳥類の卵黄膜は,外側から順に外層,連続膜,内層という3層の膜で構成されているが,排卵されたばかりの卵は内層だけに包まれている。内層に包まれた卵は体外で受精できるが,外層が付着した卵には精子は侵入できないことから,配偶子間の認識には卵黄膜内層が関与していると考えられている。このような認識機構を研究するためには,排卵直後の腹腔内の卵か,もしくは卵管漏斗部に取り込まれ外層が付着される前の卵を回収することが望ましい。しかし,排卵される時刻を正確に予想するのが難しいこと,また腹腔内に留まっている時間が1030分間と短いこと,さらに排卵が近づくと最大卵胞を包みこむように卵管漏斗部が移動することもあり,このような卵を回収することは非常に困難である。そこで本研究では,鳥類の受精の際の配偶子間の認識機構を解明するため,腹腔内の卵の卵黄膜内層に代わる膜として,最大卵胞および産卵された卵から卵黄膜内層を分離し,精子とインキュベーションすることによって膜に形成される孔を観察し,インキュベーションの諸条件について検討を加えた。最大卵胞の卵黄膜内層は,顆粒膜細胞を蒸留水中で破壊する方法によって分離した。産卵された卵の卵黄膜は10%NaClで洗浄することによって内層のタンパクを主成分とする膜とした。これらの膜を精子とインキュベーションして形成された孔を観察した結果,産卵された卵では孔の数は少ないが,最大卵胞の卵黄膜内層では精子の濃度依存的に孔が形成されることが明らかとなった。これら2種類の膜の構成タンパクを電気泳動で比較したところ,分子量33,000のタンパクの移動度が異なっており,これが精子との反応に何らかの役割を果たしていることが示唆された。以上の結果から,最大卵胞から分離した卵黄膜内層を用いて鳥類の配偶子間の認識機構を研究できることが明らかとなった。

哺乳類と両生類では卵子が産生分泌していることが明らかとなっている。魚類では肝臓が産生分泌している。共通の祖先タンパクから由来しているのになぜ別々の臓器で産生されているのであろうか。今後これらの点を中心に研究をさらに展開する予定である。卵の外側を被っている無細胞性の膜は“卵外被"と呼ばれている。鳥類の卵の卵黄膜は,卵黄と卵白の境界にある卵外被で,内層と外層の二層からなるが,卵子は卵黄膜内層だけに覆われた状態で排卵される。卵黄膜外層は卵子が卵管ロート部に取り込まれた後に卵管上皮細胞が分泌したものである。われわれは排卵前卵胞の顆粒膜細胞が,卵黄膜内層のタンパクであるZPCタンパク(精子レセプター)を含んでいることを見つけた。そこでこのZPCタンパクの発現をウエスタンブロッティングおよびノーザンブロッティングで解析し,さらに培養顆粒膜細胞を用いて産生及び分泌の調節機構について調べた。実験動物として成熟雌日本ウズラを用いた。排卵前卵胞から得た顆粒膜細胞をコラゲナーゼで単離し,M199培養液中で41Cで培養した。ZPCタンパクの合成量の測定は,細胞を[^3H]ロイシンと6時間インキュベートし,抗33K抗体を用いて免疫沈降法によって定量した。ウエスタンブロッティングは,SDSで可溶化したタンパクをSDS-PAGEで分離し,抗33K抗体とHRP-標識二次抗体を用いておこなった。またノーザンブロッティングによる解析では,全RNAをアガロース電気泳動で分離し,^<32>P-標識プローブによって検出した。その結果,ノーザンブロッティング法によって,顆粒膜細胞にのみ1.4kbのZPCmRNAが検出された。卵胞が成熟するにつれてこのシグナルは強くなる傾向にあり,これはウエスタンブロッティング法による卵胞のZPC含有量の結果ともよく一致した。培養顆粒膜細胞を用いて各種ホルモンや細胞成長因子の効果を調べたところ,ZPCの産生はFSHによって最も顕著に促進されることがわかった。以上の結果から,ZPCタンパクはFSHの刺激によって顆粒膜細胞で産生されていることが明らかとなった。
反射高速電子回折・電子分光法による窒化チタン薄膜の高機能化に関する研究

不定比化合物窒化チタンはチタンと窒素の組成比によって金属性から絶縁性に変わり、チタンと配位子である窒素との結合状態も変化する。この窒化チタンを次世代のデバイスに応用するには、組成とともに変わるチタンと配位子との結合状態を明らかにし制御する必要がある。本研究では、反射高速電子回折法によりその場観察のできる超高真空装置中で膜厚100nmのTi薄膜を作製し、その薄膜に窒素イオン(62keVのN_2^+)を注入して、窒化チタン薄膜の形成過程をオージェ電子分光法、電子エネルギー損失分光法、透過電子顕微鏡法などを用いて明らかにする。Tiを蒸着した薄膜にはhcp-Tiの他にTiH_x、も成長していた。TiH_xの窒化ではfcc-Ti副格子の四面体位置の水素が脱離し、fcc-Ti副格子の八面体位置に侵入した窒素がTiと結合してTiN_xが成長した。水素の脱離は、プラズモンによる損失ピークの低エネルギー側へのシフトをもたらす。また、試料温度の上昇に伴って水素の脱離によるTiH_xの格子定数の減少が起こり、試料温度350°CではTiH_xがhcp-Tiにすべて構造変態することも新たに見出された。一方、hcp-Tiを350°Cまで加熱してもその格子定数に有意な変化は見られなかった。hcp-Tiの窒化では、hcp-Tiの局所的な原子配列を継承した変態によりできたfcc-Ti副格子の八面体位置に窒素が侵入し、TiN_yが成長した。プラズモンによる損失エネルギーを評価した結果、TiN_yにおけるTi3dとN2p軌道の混成した結合性軌道からなる価電子帯の電子密度が注入量の増大に伴い増加することが分かった。これは結合に関わる窒素量が増大するためと考えられる。クラスターモデルの分子軌道計算により、Tiの窒化とともにTi-Tiの結合が急激に弱まり新たに強いTi-N結合ができることが分かった。これらのことから、窒化チタンの物性を制御し高度な機能性を持っようにするにはTi-Nの結合状態を考慮して設計したTiN_yの薄膜をプラズモン測定による評価を行いながら製作する必要があるという指針を得た。窒化チタンの物性はチタンと窒素の組成比によって金属性から絶縁性まで変わり、チタンと配位子である窒素との結合環境も変化する。この窒化チタンを次世代のデバイスに応用するには、組成とともに変るチタンと配位子との結合環境を明らかにし制御する必要がある。本研究では、反射高速電子回折法によるその場観察のできる超高真空装置中で膜厚100nmのTi薄膜を作製し、その薄膜に窒素イオン(62keVのN_2^+)を注入して、窒化チタン薄膜の成長素過程および電子状態をオージェ電子分光法、電子エネルギー損失分光法、透過電子顕微鏡法などを用いて明らかにする。Tiを蒸着した薄膜にはhcp-Tiの他にTiH_xも成長していた。TiH_xの窒化ではfcc-Ti副格子の四面体位置の水素が脱離し、fcc-Ti副格子の八面体位置に侵入した窒素がTiと結合してTiN_yが成長した。

hcp-Tiの窒化では、hcp-Tiの局所的な原子配列を継承した変態によりできたfcc一Ti副格子の八面体位置に窒素が侵入し、TiN_yが成長したbプラズモンによる損失エネルギーを評価した結果、TiN_yにおけるTi3dとN2p軌道の混成した結合性軌道からなる価電子帯の電子密度が注入量の増大に伴い増加することが分かった。これは結合に関わる窒素量が増大するためと考えられる。クラスターモデルの分子軌道計算により、Tiの窒化とともにTi-Tiの結合が急激に弱まり新たに強いTi-N結合ができることが分かつた。また、炭化チタン薄膜の形成過程でも同様なことが起こることも見出した。これらのことから、窒化チタンの物性を制御し高度な機能性を持つようにするにはTi-Nの結合状態を考慮して設計したTiN_y薄膜をプラズモン測定による評価を行いながら製作する必要があるという指針を得た。窒化チタンの物性はチタンと窒素の組成比によって金属性から絶縁性に変わり、チタンと配位子である窒素との結合状態も変化する。この窒化チタンを次世代のデバイスに応用するには、組成とともに変わるチタンと配位子との結合状態を明らかにし制御する必要がある。本研究では、反射高速電子回折法によりその場観察のできる超高真空装置中で膜厚100nmのTi薄膜を作製し、その薄膜に窒素イオン(62keVのN_2^+)を注入して、窒化チタン薄膜の成長過程をオージェ電子分光法、電子エネルギー損分光法、透過電子顕微鏡法などを用いて明らかにする。Tiを蒸着した薄膜にはhcp-Tiの他にTiH_Xも成長していた。TiH_Xの窒化ではfcc-Ti副格子の四面体位置の水素が脱離し、fcc-Ti副格子の八面体位に侵入した窒素がTiと結合してTiN_yが成長した。水素の脱離は、プラズモンによる損失ピークの低エネルギー側へのシフトをもたらす。また、試料温度の上昇に伴って水素の脱離によるTiH_Xの格子数定の減少が起こり、試料温度350°CではTiH_Xがhcp-Tiにすべて格子変態することも新たに見出された。一方、hcp-Tiを350°Cまで加熱してもその格子定数に有意な変化は見られなかった。hcp-Tiの窒化では、hcp-Tiの局所的な原子配列を継承した変態によりできたfcc-Ti副格子の八面体位置に窒素が侵入し、TiN_yが成長した。プラズモンによる損失エネルギーを評価した結果、、TiN_yにおけるTi3dとN2p軌道の混成した結合性軌道からなる価電子帯の電子密度が注入量の増大に伴い増加することが分かった。クラスターモデルの分子軌道計算により、Tiの窒化とともにTi-Tiの結合が急激に弱まり新たに強いTi-N結合ができることが分かった。これらのことから、窒化チタンの物性を制御し高度な機能性を持つようにするにはTi-Nの結合状態を考慮して設計したTiN_yの薄膜をプラズモン測定による評価を行いながら製作する必要があるという指針を得た。
キンドリング現象を用いた慢性てんかんに伴う種々の障害に関する基礎的研究

本研究は動物(ラット)を用いて慢性的キンドリング現象を完成させ、その後の脳内の様々な部位、特に記憶にとって重要な部位である海馬や他の大脳辺縁系間の神経結合様式を神経解剖学的及び免疫組織化学的に解析し、キンドリングの慢性化に伴う脳内神経機構の変容過程を明らかにすることを目的とした。まず、最もキンドリングの生じやすい扁桃核を毎日一回後発射闘値で刺激し連続数回の全身けいれん発作が誘発されるまで続け、慢性キンドリングの動物モデルを作製した。このキンドリング現象が完成した時点から直後、一週間後、二週間後、三週間後、一ケ月後にそれぞれのラットの脳を潅瘤固定後摘出し、GABA免疫組織化学的方法に従って海馬内GABA陽性ニュ-ロンの動態を観察した。その結果、キンドリング完成直後では変化せず、むしろキンドリング完成から三週間以降にGABAニュ-ロンの顕著な減少を示した。これらのことから少なくともキンドリング形成そのものには海馬内GABAニュ-ロンはそれほど関与していないことが示唆された(日本心理学会第53回大会発表論文集、1989)。将来は海馬以外の部位やその他の神経伝達物質を含有するニュ-ロンの解析を行う予定である。また神経解剖学的検索として、従来から注目されている内側中隔核一海馬投射経路関して、順行性標識物質であるPHA-Lを内側中隔核に電気泳動法によって注入し海馬で標識された神経終末分布を三次元的に解析した(Neuroscience Letters,1990, in press)。今回はまず統制群(非キンドリングラット)でのデ-タを収集した。その結果、内側中隔核の吻側部の神経細胞は主に背側海馬へ投射しており、内側中隔核の尾側部は腹側海馬へ主な入力を送っていることが明かとなった。今後は、慢性キンドリングラットの例数を増やし、キンドリングに伴う中隔一海馬投射線維の変容過程を詳細に吟味する計画である。
信号情報提供に対する反応を考慮したネットワーク交通流円滑化とCO2削減効果の分析

交差点に接近する車両に信号情報を提供することにより,交通流の円滑化や二酸化炭素排出量の削減を図るシステムの開発を目指した.実環境を模擬した交通状況を再現し,その中の1台としてドライビングシミュレータで運転実験を行い,情報提供の効果を把握した.その結果,情報提供によって無駄な加減速挙動が減り,CO2排出量も削減されることがわかった.信号情報に反応するドライバーが混在する環境での情報提供の効果を把握するため,マルチエージェントシミュレーションを行った.その結果,反応ドライバーが多いほど,交差点での停止率が減少して交通流の円滑化につながることもわかった.本研究では,道路などのインフラ側の情報として信号情報の利用が実務的に可能となりつつあることから,信号交差点での車両の停止時間を減少させたり,走行車両が青のまま通過できるようにしたりすることができる「アクセルオフ情報」や「推奨速度情報」を個々の車両に提供することによって,道路ネットワーク全体における二酸化炭素排出量の削減や交通流の円滑化を図ることができる情報提供システムの開発を目指している.平成27年度は,大別して2点の研究を遂行した.1つは,「全方向視野型ドライビングシミュレーション環境の構築」であり,より現実に近い走行環境を再現できる没入感の高い全方向視野のドライビングシミュレーション環境を,ヘッドマウントディスプレイを用いて構築した.もう一つは,「情報提供形式の最適化」であり,色や形,表示場所などが異なる様々なデザインの情報提供下におけるドライビング実験等を行い,その評価結果に基づいて,最適な情報提供の形式を明らかにした.これら以外に,同じ道路上で複数車両を同時に走行させることができるドライビングシミュレーション環境の構築にも着手した.没入感のあるドライビングシミュレーション環境ならびに複数車両でのシミュレーション環境の構築は,より現実に近い環境における走行実験を安全に行うことを可能にし,様々な条件下での情報提供効果の正確な把握を容易にする.最適な情報提供のデザインが明らかになったことは,より多くのドライバーにわかりやすくかつ従いやすい情報を提供することを可能にし,二酸化炭素の削減効果や交通流円滑化の効果を向上させることができると期待される.平成27年度は,全方向視野型ドライビングシミュレーション環境を構築し,そのシミュレーションを用いて走行実験を実施し,開発した情報提供システムの評価を行い,二酸化炭素排出量の削減効果などを捉えることを計画していた.しかしながら,本研究で用いるドライビングシミュレータのヘッダマウントディスプレイ用のプラグインの開発が遅れ,全方向視野型ドライビングシミュレータによる走行実験までを行うことができなかった.一方,最適な情報提供のデザインや提供位置は,開発した簡易な全方向視野型ドライビングシミュレーション環境の実験から明らかにすることができ,これらは計画通りの進捗となった.全方向視野型ドライビングシミュレータによる走行実験が進まなかった代わりに,複数車両を同時に稼働させることができるドライビングシミュレーションの環境の構築を早めに進め,全体として進捗状況に遅れは生じていないものの,計画通りではなかったことから"(3)やや遅れている"と自己評価することにした.本研究では,前年度に引き続き,道路などのインフラ側の情報として信号情報の利用が実務的に可能となりつつあることから,信号交差点での車両の停止時間を減少させたり,走行車両が青のまま通過できるようにしたりすることができる「アクセルオフ情報」や「推奨速度情報」を個々の車両に提供することによって,道路ネットワーク全体における二酸化炭素排出量の削減や交通流の円滑化を図ることができる情報提供システムの開発を目指している.平成28年度には,全方向視野型ドライビングシミュレータを用いて,実際の道路を模擬した仮想空間を作成し,走行実験を行った.その結果,現実に近い道路空間においても,二酸化炭素排出量削減に対する情報提供の効果があることを確認した.並行して,ミクロ交通シミュレーションを用いた道路ネットワークにおける情報提供の評価も行った.シミュレーション上に道路ネットワークを作成し,まずは交通現況を再現した.続いて,情報提供時の車両の動きを記述し,交通流や二酸化炭素排出量へ及ぼす影響を定量的に把握し,情報提供の効果を確認した.さらに,一部の研究計画を前倒しし,マルチエージェントシステムを用いて,個々の車両が信号情報を得た場合に自ら走行挙動を決めるアルゴリズムの開発に着手した.まずは単一の交差点が存在する道路において,自車の位置・走行速度と信号表示の残り時間に基づいて走行挙動を最適に選択できるように学習させ,円滑に信号を通過できるかどうかを実験した.その結果,学習によって,信号情報を与えることが停止時間や停止回数の削減につながり,二酸化炭素排出量の削減につながる可能性があることを示した.以上のように,今年度は,各種の異なるシミュレーションを用いることによって,ドライバー個人,また,道路ネットワーク全体から,信号情報の提供が二酸化炭素排出量の削減に効果があることを明らかにした.平成28年度は,前年度に行えなかった全方向視野型ドライビングシミュレーション環境での走行実験を実施し,開発した情報提供システムの評価を行った.平成28年度は,複数ドライバーが走行する環境での実験を行う予定であったが,プラグインの開発が遅れ,実験までは至らなかった.一方,ミクロ交通流シミュレーションによって実際の道路ネットワークにおける交通状態を生み出す環境の構築と情報提供による交通流への影響の評価は,計画通りの進捗となった.ただし,まだ,ドライビングシミュレータUC-win/ROADとの連携まではできていない.これらの研究が計画通りに進まなかった代わりに,自律的に走行挙動を決めることができるマルチエージェントシミュレーションモデルの開発に着手し,全体として進捗状況に遅れは生じているものの,一部は発展的に研究が進んでいることから,"(3)やや遅れている"と自己評価することにした.本研究では,前年度に引き続き,「アクセルオフ情報」や「推奨速度情報」を個々の車両に提供することによって,道路ネットワーク全体における二酸化炭素排出量の削減や交通流の円滑化を図ることができる情報提供システムの開発を目指した.

平成29年度には,これまでに開発した情報提供システムを組み込んだミクロ交通流シミュレーションとドライビングシミュレーションの連携を図ることに成功した.ミクロ交通流シミュレーションでは,「アクセルオフ情報」を提供した場合と,提供しない場合の車両一台一台の動きを再現し,この交通流中の一台の車両をドライビングシミュレータで運転するための統合環境の構築を行った.情報提供を受けている交通流の中を走行しながらの走行実験の結果,対象車両のみに情報を与えた場合にでも交通流円滑化や二酸化炭素排出量の削減効果は見られ,その効果は,交通流全体に情報を与えた時が最も大きいことが明らかとなった.並行して,マルチエージョントシステムと強化学習を用いて,信号情報を受け取った際,信号交差点を青信号で通過する場合にはできるだけ規制速度に近い速度で通過し,赤信号で停止する場合にはできるだけ停止時間が短くなるような運転挙動を取るドライバーのモデル化を行った.このドライバーの混入割合が交通流に与える影響を分析した結果,混入率が約50%になると,全平均停止時間が大きく減少することがわかった.ただし,総平均旅行時間は大きく変化が無かったことから,無駄な減速や加速挙動が減り,交差点通過の円滑化が図られたことがわかった.以上のように,実際に近い交通環境においても,「アクセルオフ情報」や「推奨速度情報」の提供によって,交差点接近時の無駄な運転挙動を減らすことができ,その結果,エリア全体の道路ネットワークでの二酸化炭素排出量も減少することがわかり,地球温暖化防止の一助になることがわかった.交差点に接近する車両に信号情報を提供することにより,交通流の円滑化や二酸化炭素排出量の削減を図るシステムの開発を目指した.実環境を模擬した交通状況を再現し,その中の1台としてドライビングシミュレータで運転実験を行い,情報提供の効果を把握した.その結果,情報提供によって無駄な加減速挙動が減り,CO2排出量も削減されることがわかった.信号情報に反応するドライバーが混在する環境での情報提供の効果を把握するため,マルチエージェントシミュレーションを行った.その結果,反応ドライバーが多いほど,交差点での停止率が減少して交通流の円滑化につながることもわかった.前年度に引き続き,ヘッドマウントディスプレイを用いた全方向視野型のドライビングシミュレーション環境の構築を進める.特に,ヘッドマウントディスプレイは新型が発売されているため,それに対応した環境の構築を進める予定である.
脊髄運動路モニタリング法の実用化に関する基礎的・臨床的研究

本年度は昨年度までに得られた動物実験の結果と購入した特注電気刺激装置を利用し、脊髄刺激末梢筋記録電位の臨床応用を試みた。さらに経頭蓋磁気刺激による脊髄誘発電位による脊髄機能モニタリングを臨床例において試み、経頭蓋電気刺激による電位との比較も行った。またこれらの電位の伝導路と有用性についての動物実験をサルを用いて行った。サルを用いた動物実験では経頭蓋磁気刺激ならびに電気刺激によって誘発される脊髄記録電位はいずれも大部分は運動路、とりわけ錐体路を下行する電位であるが、その一部には伝導速度の早い錐体外路、あるいは知覚線維を逆行性に伝導した電位が含まれていることが判明した。脊髄電気刺激-末梢筋活動電位によるモニタリングを術前の神経障害が無いか、あっても筋力低下を呈していないような軽症の患者群で行った。連発電気刺激による吸入麻酔下でも比較的安定した筋電位の記録が可能で運動路の術中モニタリング法の一つとしての有用性を証明することが出来た。他方経頭蓋磁気刺激による脊髄誘発電位を臨床例において記録したところ、ほぼ電気刺激と同等の電位が記録可能であった。刺激コイルの安定した保持など今後解決しなければならない問題は残すが、術中のモニタリング法としての有用性を証明することが出来た。さらに術後についても、麻酔覚醒後も引き続き磁気刺激による脊髄誘発電位をクモ膜下腔に留置した電極を利用して記録を行った。麻酔覚醒と共にI-波が多く出現して来るのが観察されたが、D-波を指標としてモニタリングが可能であると判断した。今後も引き続き臨床例を重ねて行く予定にしている。脊髄機能モニタリングの実用化に関する基礎的研究として、ネコを用いて脊髄刺激筋記録電位、ニホンザルを用いて経頭蓋刺激脊髄誘発電位ならびに脊髄刺激筋記録電位の検討を行った結果、若干の新しい知識を得た。まず、電気刺激の条件の検討については脊髄刺激筋記録電位において、連続刺激が電位に与える促通効果とその限界を明らかにした。すなわち、条件刺激として域値下の連続刺激を数十発加えることにより従来の単発刺激や2連刺激をはるかに上回る促通効果が確認できた。しかし、連発刺激を増加させてもそれ以上促通効果の増強しない限界点があり、さらに、域値下条件刺激にも至適刺激強度と至適持続時間が存在することが判明した。また経頭蓋刺激については従来の約2倍の198mA程度の強さの刺激を用いることにより安定した下行性電位を脊髄から記録することが可能となり、臨床的にも有用であることを確認することが出来た。一方、脊髄刺激筋記録の電位の測定に際しての麻酔条件については、吸入麻酔薬としてのハロセン、イソフルレン使用下でも比較的浅い麻酔深度であれば、上記のような刺激条件を適用することにより、経時的評価に耐え得る電位の記録が可能であった。しかし、深麻酔(薬2MAC以上)の条件下では、従来の方法と同様、電位は不安定となり、記録、評価は困難となった。また、静脈内投与全身麻酔薬プロポフォールを使用すると、比較的深麻酔の条件下においても、安定した電位の記録が可能であった。プロポフォールの場合も、適当な連発刺激の組み合わせの選択により、吸入麻酔薬の場合と同様、記録電位に著名な促通効果がみられる傾向は同一であった。
X線結晶構造解析によるミトコンドリアトランスロケータSAM複合体の構造基盤

ミトコンドリアが正常に生命活動を維持するには、ミトコンドリアタンパク質を正確にミトコンドリア内に配送しなければならない。この配送を担うのがトランスロケーターである。Soritng and assembly machinery(SAM)複合体は、ミトコンドリアβバレル型膜タンパク質を、ミトコンドリア外膜に挿入するトランスロケーターである。SAM複合体はβバレル膜タンパク質であるSam50と膜表在タンパク質であるSam35/Sam37により構成される。しかし、SAM複合体がどのようにタンパク質と結合して膜に挿入するのか、構成タンパク質がどのように相互作用してその機能を発揮するのかなど、様々な課題があるのが現状である。そこで本研究では、各タンパク質のX戦結晶構造解析を行うこととした。当初、Sam37の結晶化に成功したが、のちに精製したSam37が全く別のタンパク質であることや、各タンパク質を単独で精製することは困難であることがわかった。そこで、最も大きな構成単位である、αヘリカル膜タンパク質をミトコンドリア外膜に挿入するSAM-Mdm10超複合体の精製と構造解析に切り替えることとした。まず、SAM-Mdm10大量発現用変異酵母を大量培養し、単離ミトコンドリアをDigitoninにより可溶化した。可溶化ミトコンドリアを用いてIgG精製・ゲル濾過精製を行なった。その結果、1 L培地から約200ugのSAM-Mmd10超複合体を高純度で精製することに成功した。さらに、精製SAM-Mdm10をナノディスクに再構成し、クライオ電子顕微鏡による構造解析を行なった結果、分解能4.0 angstromで構造を決定することに至った。現時点ではクライオマップの強度が部分的に低いので、これを解決するため、Fab抗体を用いた分子量増加によるマップの向上を目指す予定である。本研究の当初の計画では、各Samタンパク質のX線結晶構造解析を行うことになっていた。しかし、研究を進めるにつれ、酵母から各Samタンパク質を単独で精製することは困難であることがわかった。そこで、これらを最小単位とした最も大きなタンパク質複合体であるSAM-Mdm10超複合体の精製に着手することになった。結果的に、SAM-Mdm10超複合体の大量精製とクライオ電子顕微鏡による構造決定に至っている。これにより、各Samタンパク質のそれぞれの構造と、加えてMdm10の構造、合計4つのタンパク質を一挙に明らかにしたことになる。そのため、当初の計画であるX線結晶構造解析では、これら4つのタンパク質を一つずつ明らかにしなければならなかったが、計画よりも著しく効率的に構造解析ができたと考えている。また、超複合体として構造を決定したことにより、それぞれのタンパク質間の空間配置や相互作用が明らかになり、どのようにSAM-Mdm10超複合体がαヘリカル膜タンパク質を挿入するのかといった作用機序を提唱できる可能性を見出すことができた。本年度では、研究計画に盛り込んでいた、「各Samタンパク質のX線結晶構造解析」を完了するに至っている。また、SAM-Mdm10超複合体の構造が明らかになったことで、研究計画の一つである「光部位的架橋によるタンパク質間相互作用の解析」をスキップすることにもなった。以上のことから、本年度における研究成果は、当初の計画以上に進展していると言える。SAM複合体の本来の機能は、ミトコンドリア外膜にβバレル膜タンパク質を挿入することである。一方で、SM-Mmd10超複合体は、αヘリカル膜タンパク質を挿入する。SAM複合体にMdm10が結合することにより機能が大幅に切り替わることは、非常に興味深く、原核生物の外膜にもこのようなタンパク質複合体は未だ見つかっていない。おそらくSAM-Mdm10超複合体は、細胞共生によるミトコンドリアの獲得後、真核細胞において独自に進化した姿であると考えられる。そのため、SAM-Mdm10超複合体がどのようにαヘリカル膜タンパク質の挿入メカニズムを明らかにすることは重要な課題になると考えられる。今後は、得られた構造を基盤として、SAM-Mmd10超複合体の変異体を作成し、in vivoあるいはin vitroによるαヘリカル膜タンパク質を用いた機能解析を行う。

さらに、精製SAM-Mdm10をナノディスクに再構成し、クライオ電子顕微鏡による構造解析を行なった結果、分解能4.0 angstromで構造を決定することに至った。現時点ではクライオマップの強度が部分的に低いので、これを解決するため、Fab抗体を用いた分子量増加によるマップの向上を目指す予定である。本研究の当初の計画では、各Samタンパク質のX線結晶構造解析を行うことになっていた。しかし、研究を進めるにつれ、酵母から各Samタンパク質を単独で精製することは困難であることがわかった。そこで、これらを最小単位とした最も大きなタンパク質複合体であるSAM-Mdm10超複合体の精製に着手することになった。結果的に、SAM-Mdm10超複合体の大量精製とクライオ電子顕微鏡による構造決定に至っている。これにより、各Samタンパク質のそれぞれの構造と、加えてMdm10の構造、合計4つのタンパク質を一挙に明らかにしたことになる。そのため、当初の計画であるX線結晶構造解析では、これら4つのタンパク質を一つずつ明らかにしなければならなかったが、計画よりも著しく効率的に構造解析ができたと考えている。また、超複合体として構造を決定したことにより、それぞれのタンパク質間の空間配置や相互作用が明らかになり、どのようにSAM-Mdm10超複合体がαヘリカル膜タンパク質を挿入するのかといった作用機序を提唱できる可能性を見出すことができた。本年度では、研究計画に盛り込んでいた、「各Samタンパク質のX線結晶構造解析」を完了するに至っている。また、SAM-Mdm10超複合体の構造が明らかになったことで、研究計画の一つである「光部位的架橋によるタンパク質間相互作用の解析」をスキップすることにもなった。以上のことから、本年度における研究成果は、当初の計画以上に進展していると言える。SAM複合体の本来の機能は、ミトコンドリア外膜にβバレル膜タンパク質を挿入することである。一方で、SM-Mmd10超複合体は、αヘリカル膜タンパク質を挿入する。SAM複合体にMdm10が結合することにより機能が大幅に切り替わることは、非常に興味深く、原核生物の外膜にもこのようなタンパク質複合体は未だ見つかっていない。おそらくSAM-Mdm10超複合体は、細胞共生によるミトコンドリアの獲得後、真核細胞において独自に進化した姿であると考えられる。そのため、SAM-Mdm10超複合体がどのようにαヘリカル膜タンパク質の挿入メカニズムを明らかにすることは重要な課題になると考えられる。今後は、得られた構造を基盤として、SAM-Mmd10超複合体の変異体を作成し、in vivoあるいはin vitroによるαヘリカル膜タンパク質を用いた機能解析を行う。ターゲットタンパク質の構造決定にクライオ電子顕微鏡解析を利用していたが、当該年度中盤から使用料金が徴収されることになった。これに伴い、次年度使用額を使わざるを得なかった。
JLCのためのファーストフィードバックシステムの開発研究

本ファーストフィードバックシステムは将来の電子陽電子リニアコライダーでのナノメータサイズのビーム同士の安定な衝突を維持するのに必要なものである。システム設計とその基本的な性能評価のためのシミュレーションを存ない3つのフィードバックモデルを提案した。このモデルの実現可能性の試験をATFの取り出しビームラインで既存設備を利用して行なわれた[1]。その結果、10ナノ秒以下の反応時間を持ち大きな電場の必要なことがわかった。そのため、40cm長のストリップ電極間距離が可動できるキッカーを設計・製作した[2]。これら2つの電極間距離の15mmでビームの蹴り出しの大きさをビームテストによって測定した。このとき印加されたパルスの周波数は50KHz,100KHzであり、必要な5001000Mhzではビームの蹴り出しを測定することができなかった。また、ビームの通過する最小の電極間距離として1.12mmを測定した。この最小距離は電極のゆがみによることがわかった。本システムの入力シグナル源となりまた位置分解能1μmを有するビーム位置モニターも製作した。それはキッカー同様に可動式のボタン型電極を持つものである。その電極間距離1mmでのビーム位置変動の500μmの領域で位置較正を行なうことができた。本システムの総合的試験のためにビームテストに臨んだが、ATF加速器の不調により本研究期間内にその結果を得ることができなかった。現在、継続試験がATFでは行なわれている。本システムの性能は2つのビームの衝突時に生成される放射光(ビームストラールングと呼ばれている)を測定することによっても評価できることをシミュレーションにより示した。その中で、その放射光の測定方法も提案された。本ファーストフィードバックシステムでは1.4ナノ秒間隔で衝突するバンチ間の相互作用も考慮して補正する必要があり、その補正方法を提案しシミュレーションによりその性能を評価した(投稿中)。本研究とともに、大きな余次元の物理によるヒッグスボゾン生成の研究を行なった[3]。
離乳期における舌運動の経時的変化-超音波エコーによる動態解析-

これまで超音波診断装置を摂食機能診断に応用するために機能時に安定した描出画像が得られる方法を検討してきた。本研究ではこれまでの方法を応用して,離乳期における舌の運動の発達過程を超音波診断装置を用いて前額断面での舌の動きを中心とした定性的な動態解析をおこなった。対象および方法:被験児は1名の健常女児で期間は生後3か月から1歳2カ月までの11カ月間。超音波診断装置(東芝SSA-250A)に乳児の顎の大きさに合った最適な周波数を有するプローブ(東芝PVF-738H, 7.0MHz)を被験児の顎下部に固定し,前額断面での舌背面を描出した。観察は、母乳と人工乳吸啜時および被験食品に用いたペースト状食品と赤ちゃんせんべいの摂取時とした。描出画像上の舌背中央の陥凹の動き,舌背の上下・左右への移動と傾斜などについて動態解析をおこなった。これらを外部から観察した口唇・顎の動きと乳歯の萌出状況とを関連させても検討した。結果:(1)母乳と人工乳啜時の舌運動には,大きな違いは観察されなかった。また,出生後31週頃より,吸啜の動きが不規則になった。(2)吸啜時の舌背には見られなかった舌背中央の陥凹が固形食嚥下時には観察され,この陥凹は生後26週頃より顕著に見られるようになった。(3)生後35週頃より前額断面での舌の左右側への移動や舌背面の傾斜する動きが初めて観察された。その後43週頃には,舌の左右側への移動や舌背面の傾斜する様子が活発になった。(4)外部観察との関連から前額断面で舌背中央の陥凹が顕著となる時に,捕食時口唇閉鎖が可能となり,舌突出が見られなくなった。(5)乳歯の萌出状況との関連から,前額断面での舌の左右側への移動や舌背面の傾斜する様子が見られるようになったのは,乳中切歯が萌出した生後35週頃で,より活発になったのは乳側切歯が萌出した生後43週頃であることが分かった。
日本人由来株を用いた高感度ELISA法による猫ひっかき病特異抗体の検出と病態解析

高感度ELISAによるBartonellahenselae IgG抗体価測定には特異性の高い抗原精製が必要である。その抗原液を得るには1)Bartonella henselaeを二層培地(5%ウサギ血液加HI寒天培地+D-MEM液体培地)で培養する。2)その菌液を37°C下で0.1%CHAPS液で抽出(1回目)した不溶性成分を再度0.5%CHAPS液で抽出(2回目)する。3)その可溶性成分をDEAE-Sepharose法で245-310mMNaCL中に溶出する蛋白成分を精製する。この精製液中には特異性の高い蛋白成分が含まれており、これを抗原としたELISA-IgGの臨床的有用性が期待される。【背景】本研究目的は猫ひっかき病(CSD)の病原菌で培養困難なBartonella henselaeに対する血清抗体価を高感度に測定できるELISA法の確立である。そのためにはまず、N-ラウリルサルコシン(サルコシン)抽出後のイオン交換クロマトグラフィ(DEAE)法による抗原精製が重要であることがわかった。今年度は抽出条件、およびゲル濾過法による精製、さらには菌液条件(固形培地・液体培地)について基礎的検討を行なった。【方法】サルコシン抽出条件は固形培地(チョコレート寒天培地)上のB. henselae ATCC49882株コロニーについて検討した。すなわち5mMHEPES緩衝液(pH7.4)で作成した菌液を洗浄後、沈渣を各条件下(サルコシン濃度・温度)で抽出した。次いで、10,000rpm、30分間超遠心し、その沈渣を再び抽出し、この操作を繰り返した。各上清液をDEAE法およびゲル濾過法で精製後、各液についてCSD患者血清と健常人血清を用いてELISAで抗原性を比較した。一方、液体培地は37°C、3日間炭酸ガス培養後のB. henselae菌液について、固形培地コロニーの至適抽出条件下で抽出後、DEAE精製後、抗原性を検討した。【結果と考察】固形培地由来B. henselae菌液からのサルコシン抽出は“37°C下で、0.1%サルコシン液で抽出後の沈渣を再度0.2%サルコシン液で抽出(23回)した上清液"が優れていることが判明した。この上清液をDEAE法(240-290mM NaCL)やゲル濾過法で処理することにより、その抗原の精製度が向上することが確認できた。また液体培地由来菌液抽出後のDEAE法による精製液は固形培地由来菌液のそれより精製度が高く、抗原としてより優れていることが示唆された。使用抗原の基礎的研究において、固形培地由来B. henselae菌液からのサルコシン(陰イオン界面活性剤)抽出条件は“37°C下で、0.1%サルコシン液で抽出後の沈渣を再度0.2%サルコシン液で抽出(23回)した上清液"が優れていることが判明した。しかしサルコシン抽出液では冷蔵により結晶析出が認められ,その後の操作が煩雑であり,また2次元電気泳動の際、分離に悪影響を与えてしまうなど,今後の研究に不都合が生じることが示唆された。そこで本年度はサルコシンに替わって中性界面活性剤CHAPS使用による抗原精製を中心に研究を進め,B. henselae IgG抗体価測定用高感度ELISAの確立を目指し,CHAPSによる抽出条件の設定を新たに行い,更にはイオン交換カラムクロマトDEAE法とゲルろ過法による抗原精製を行った。【方法】CHAPS抽出条件を固形培地(チョコレート寒天培地)上のB. henselae ATCC49882株コロニーについて検討した。すなわち5mMHEPES緩衝液(pH7.4)で作成した菌液を洗浄後、沈渣を各条件下(CHAPS濃度・温度)で抽出した。【結果と考察】CHAPS抽出は37°C,0.1%CHAPS液で抽出後の沈査を再度0.5%CHAPS液で抽出した上清液がELISA抗原として優れており,この液をDEAE法およびゲルろ過法で精製することによりその抗原精度が向上することが明らかになった。液体培地での多量の抗原作製が予想以上に困難である。これは液体培地での菌液作成中の雑菌混入すること、現段階の液体培地では菌増殖が不十分であることによる。【背景と目的】本研究目的は猫ひっかき病(CSD)の病原体で培養困難なBartonella henselaeに対する血清抗体価を高感度に測定可能なELISAの確立である。使用抗原の基礎的研究としてB. henselae菌体のサルコシン(陰イオン界面活性剤)抽出法を中心に検討してきた。しかし本抽出液は冷蔵下では結晶析出が認められ、その後の操作が煩雑になり、2次元電気泳動法による解析にも悪影響を及ぼすなど、今後の研究に不都合が生じることが判明した。

そこで、両性界面活性剤CHAPS使用による抗原精製を中心に変更し、研究を進めた結果、0.1%CHAPS液で抽出後の沈渣を再度0.5%CHAPS液で抽出した上清液がELISA抗原として優れ、この液をDEAE法で精製することでこの抗原精度が向上することが期待された。今年度はこの抽出・精製条件での抗原性をB. henselaeの培地由来別(固形培地および二層培地)に比較検討した。【方法】B. henselae ATCC49882株を使用して2種類の菌液(固形培地由来菌:チョコレート寒天培地、二層培地由来菌:5%ウサギ血液加HI寒天培地+D-MEM液体培地)を作成した。これら菌液をそれぞれ同様にCHAPS抽出・DEAE精製後、2種類の抗原を使用したELISAを確立し、CSD(疑)患者血清61例と健常人血清25例のB. henselae IgG抗体価を測定し、両者を比較した。【結果と結語】精製蛋白のウエスタンブロット解析では33kDaおよび11kDa付近に患者血清と強い反応が認められた。2種類のB. henselae菌液(二層培地由来と固形培地由来)のELISA抗原性の比較では二層培地由来菌からの抗原が明らかに優れていた(ROC曲線解析;p<0.05)。高感度ELISAによるBartonella henselae IgG抗体価測定には特異性の高い抗原精製が必要である。その抗原液を得るには1)Bartonella henselaeを二層培地(5%ウサギ血液加HI寒天培地+D-MEM液体培地)で培養する。2)その菌液を37°C下で0.1%CHAPS液で抽出(1回目)した不溶性成分を再度0.5%CHAPS液で抽出(2回目)する。3)その可溶性成分をDEAE-Sepharose法で245-310mMNaCL中に溶出する蛋白成分を精製する。この精製液中には特異性の高い蛋白成分が含まれており、これを抗原としたELISA-IgGの臨床的有用性が期待される。サルコシン液が低温下では白濁し、対応に苦慮したがおおむね順調に進展した。1)各種液体培地でのB. henselae菌液の発育状況と抗原性の検討2)固形培地と各種液体培地とで得た抽出液(サルコシン液あるいはCHAPS液)を精製し、これらを抗原としたELISAで多数の患者血清および健常人血清についてB. henselae IgG抗体価を測定し、抗原の有用性を比較する。3)2次元電気泳動後、ウエスタンブロット法で解析し、CSD患者血清と特異性が高い代表的な蛋白質を抗原液から選出する。選出したタンパク質スポットを切り出し質量分析によりタンパク質を同定する。臨床微生物学1)サルコシンに代わる抽出法の検討:サルコシン液は陰イオン系界面活性剤で低温化では白濁し、扱いがやや煩雑である場合が認められた。そこで両性界面活性剤(CHAPS)で同様に検討してみる。2)固形培地と液体培地とで得た抽出液(サルコシン液あるいはCHAPS液)を精製し、これらを抗原としたELISAで多数の患者血清および健常人血清についてBartonella henselae抗体価を測定し、抗原の有用性を比較する。
分泌型リソソームを保持したT細胞ハイブリドーマの作製法と機能解析法の開発

C57BL/6マウスより単離した脾臓細胞をコンカナバリンAで3日間刺激した。この幼若化したT細胞よりトータルRNAを調製し、オリゴdTを用いた逆転写反応によって、cDNAライブラリーを作製した。それを鋳型として、制限酵素配列(EcoRI、XhoI)を連結した一対のプライマーによって、T-bet遺伝子およびEomesodermin遺伝子の全長をPCRで増幅した。これらのPCR産物をN末端にFLAGタグを連結できる動物細胞用発現ベクター(CMVプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子)にクローニングした。DNA塩基配列解析を行い、変異のないT-bet遺伝子とEomesodermin遺伝子であることが確認された。ヒト胚性腎293T細胞に一過的に発現させ、抗FLAG抗体によるウェスタンブロッティングを行ったところ、予想される分子量にT-betタンパク質およびEomesoderminタンパク質が検出された。さらに、FLAG-T-bet遺伝子を3つの動物細胞用発現ベクター(SRαプロモーター・ピューロマイシン耐性遺伝子、EF-1αプロモーター・ピューロマイシン耐性遺伝子、EF-1αプロモーター・ハイグロマイシン遺伝子)にサブクローニングし、FLAG-Eomesodermin遺伝子を2つの動物細胞用発現ベクター(SRαプロモーター・ピューロマイシン耐性遺伝子、EF-1αプロモーター・ピューロマイシン耐性遺伝子)にサブクローニングした。FLAG-T-bet遺伝子、およびFLAG-Eomesodermin遺伝子をマウスT細胞リンパ腫BW5147細胞に安定的に発現させるために、ピューロマイシンおよびハイグロマイシンのBW5147細胞に対する感受性を検討した。その結果、BW5147細胞は、ピューロマイシン0.5μg/mlおよびハイグロマイシン1.5mg/ml以上でほぼ完全に死滅すること確認された。リソソームや細胞傷害顆粒に局在する膜貫通タンパク質LAMP-1(lysosome-associated membrane protein-1)は、そのC末端側がサイトソル側に突出し、リソソームへの局在化に必要な11アミノ酸を含んでいる。そこで、LAMP-1遺伝子のC末側に免疫沈降が可能なエピトープタグ(FLAG)を付加した融合遺伝子の構築を行った。まず、ラットナチュラルキラー細胞株RNK-16細胞よりトータルRNAを調製し、オリゴdTを用いた逆転写反応によってcDNAライブラリーを作製した。それを鋳型として、制限酵素(EcoRI、XhoI)配列を連結した一対のプライマーによって、シグナル配列を含むLAMP-1遺伝子の全長をPCRで増幅した。このPCRフラグメントをC末側にFLAGタグを連結できる動物細胞用発現ベクター(CMVプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子)にクローニングした。DNA塩基配列解析を行ったところ、変異のないLAMP-1遺伝子であることが確認された。さらに、このプラスミドを鋳型として、LAMP-1(FLAG)遺伝子を、2種類の動物細胞用発現ベクター(EF-1αプロモーター・ピューロマイシン耐性遺伝子、およびSRαプロモーター・ピューロマイシン耐性遺伝子)に挿入した。これらのLAMP-1発現ベクターをリン酸カルシウム法によってHEK293T細胞に一過的にトランスフェクションし、抗FLAG抗体によってFLAG-LAMP-1の発現を検出した。その結果、90-120kD付近に、糖鎖が付加したと思われるブロードなバンドが観察された。