hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性疾患患者を対象としたストレス対処力向上プログラムの構築

HIV/AIDS患者においてはこちらも極めて低いSOCレベルにあることが明らかになった。そのなかで、SOCが低いことによりCD4細胞数やウィルス量とも微弱に関連することもわかり、また、内服アドヒアランスとも関連しており、アドヒアランスを通じて健康に関与する可能性が考えられた。また、物質依存との関係も示唆された。その一方で、地域、および経済状況によってSOCに差があることがわかり、SOC向上に向けて、地域性を加味すること、経済的に制約がある者に対しSOC向上を視野に入れた支援の方法について検討していくことが必要であることが示唆された。他方、生理的機能との関連について、特に副交感神経系の活性との相関が極めて高いことが示され、介入プログラムの中にはリラクゼーションや自律訓練法に関する手法を盛り込むことが重要である可能性が示唆された。慢性疾患患者においてストレス対処力とは何であり、それはどのようなもので、向上させるためには何が必要であるのか明らかにすることを目的とした。ストレス対処力として有用な概念は、ストレッサー処理に重要な人生に対する見方、向き合い方の感覚である首尾一貫感覚(sense of coherence: SOC)であることが挙げられた。慢性腎不全、脳血管疾患、HIV陽性者のそれぞれに対する調査の結果、SOC尺度の測定は問題なく適用可能で、一般人口よりも低い得点であった。SOCの向上には、特に対処資源の観点から自身の人生経験に対する意味づけをしなおし、使用できる資源を再発見することが有用であることがわかった。研究ネットワーク構築、および基礎的情報収集、基礎的評価項目の検討の三点について進めることができ、当初の目標を達成することができたといえる。大きく3つの推進方策を検討している。第1に、研究フィールドをさらに拡大し、特に難病患者におけるストレス対処の実態とSOCに関して研究的アプローチを推進していくことが、本研究成果の一般化のうえで必要である。第2にこれまでの調査で得た多岐にわたる知見について結果の公表を推進し、研究者ネットワークならびに批評を得ることを通じ、研究内容のブラッシュアップをはかっていくことが必要である。第3にこれまで実施してた3つの調査結果および今後実施する難病患者における調査について分析を深化させ、SOC向上に向けたメカニズムに関する新たな枠組みの構築を行っていくことである。また、その成果を用いた介入にかかわるプログラムの構築につなげていく必要がある。研究対象者として浮上してきた慢性疲労症候群患者を対象とした調査について、次年度中に調査実施を行い、さらなるSOCと療養生活におけるストレス対処経験との関連性と、そこへの介入の可能性について明らかにしていくことが期待される。
散逸力学オペレータの随伴固有関数スペクトル解析による自己組織化機構の解明

従来の自己組織化の理論は散逸項が無い場合の系が持つ不変量に基礎を置くために、理論的に導かれる自己組織化した状態が散逸項や散逸パラメータに依存しないという欠点を持っていた。研究代表者の近藤による新しい自己組織化の一般理論は、力学系の分布が散逸力学オペレータの随伴固有関数によりスペクトル展開され、非線形項によるスペクトル遷移とスペクトル上での高モード側の選択的散逸によって最小固有モードが自己組織化した状態として現れる事を導いている。この新しい理論を検証するために3次元MHDプラズマのシミュレーションを行い、散逸力学オペレータの随伴固有関数によるスペクトル解析を行った。その結果、自己組織化機構として重要な次の三つの基礎物理過程を明らかにした。1.不安定性の成長過程では非線形モード結合により2つのモードの和と差の形で高低両モード側へのスペクトル遷移が次々に起こる。低モード側には下限があるために最小固有値モードへのエネルギーの堆積が起こり、上限の無い高モード側では無数のスペクトルへの分散が起こる。2.これと並行して、散逸力学オペレータの性質から高い固有値モードのスペクトル成分ほど速く散逸するために、このスペクトル上での選択的散逸が起こり、自己組織化のアトラクターとして最小固有値のモードが最後に残る。3.散逸緩和の最終段階の平衡状態に近づくと非線形項よりも散逸項の値が相対的に大きくなり、支配的力学オペレータの交代が起こる。この結果、自己組織化した状態は散逸力学オペレータに支配された分布を持つ。これらの研究結果は論文にして投稿中である。
防災教育・地学教育に関わる地震波の伝搬を可視化する教材と授業プログラムの作成

東日本大震災を受け,特に地震に備えての防災教育が重要視されている.高校では地学の履修率が低く,生徒の多くは地震についての正しい知識を持たないまま,中等教育を終えることが多い.情報化社会の今,あふれる情報の中から,防災についての正しい情報を自分で判断するためにも,また,東日本大震災の教訓を風化させないためにも,地震について正しく理解する防災教材を作成する必要があった.地震は極めて身近な現象であるが,その実態である波としての性質は可視化が困難で,生徒たちがイメージを持つことが難しい領域である.これまでも,地震波を可視化する教材は様々作成されてきたが,本研究では以下の2つの教材の作製と,教材を用いた授業プログラムを用い,地震波の性質をもとに,緊急地震速報の原理や地震の被害を抑える工夫について考える授業を所属校で実践した.(1)地震波可視化装置;ワイヤーに吊るした錘をバネで連結し,末端に取り付けたセンサーの動きにより,波の振動方向を観察するもの.また,センサーの振動方向をもとに,震源を同時に出発した地震波でも, P波がS波より速く到達する様子が観察できる.また, S波がP波よりゆれが大きいこと(地震被害はS波により生じること),バネ定数の異なる装置で比較することで,硬い地盤ほどゆれが少なく,地震波速度が速いことが観察できる.(2)地震波速度測定装置; 4チャンネルデジタルオシロスコープを用い,アンプで増幅した,クリスタルイヤホンを用いたセンサーが拾った地震波を, PCディスプレイ上に走時曲線として提示するもの.机上の岩石や木材を伝搬する地震波のP-S時間が,震源からの距離に比例して長くなることを観察できる.また,オシロスコープの測定機能を用い,媒質中を伝搬する地震波速度も測定できる.以上2つの装置を用い,以下の点の理解に有効な地震防災に関する授業プログラムを作成することができた.(1)地震波は震源から同時に伝搬を始めるが,伝搬速度の差によりP-S時間が生じること(2)地震被害の大きくなる地域と,そうでない地域の条侮について考察する.(3)緊急地震速報の原理と,地震動から身を守るための方策について考察する.※実績は,地学教育学会誌に26年秋までに投稿予定であり,現在執筆中である.東日本大震災を受け,特に地震に備えての防災教育が重要視されている.高校では地学の履修率が低く,生徒の多くは地震についての正しい知識を持たないまま,中等教育を終えることが多い.情報化社会の今,あふれる情報の中から,防災についての正しい情報を自分で判断するためにも,また,東日本大震災の教訓を風化させないためにも,地震について正しく理解する防災教材を作成する必要があった.地震は極めて身近な現象であるが,その実態である波としての性質は可視化が困難で,生徒たちがイメージを持つことが難しい領域である.これまでも,地震波を可視化する教材は様々作成されてきたが,本研究では以下の2つの教材の作製と,教材を用いた授業プログラムを用い,地震波の性質をもとに,緊急地震速報の原理や地震の被害を抑える工夫について考える授業を所属校で実践した.(1)地震波可視化装置;ワイヤーに吊るした錘をバネで連結し,末端に取り付けたセンサーの動きにより,波の振動方向を観察するもの.また,センサーの振動方向をもとに,震源を同時に出発した地震波でも, P波がS波より速く到達する様子が観察できる.また, S波がP波よりゆれが大きいこと(地震被害はS波により生じること),バネ定数の異なる装置で比較することで,硬い地盤ほどゆれが少なく,地震波速度が速いことが観察できる.(2)地震波速度測定装置; 4チャンネルデジタルオシロスコープを用い,アンプで増幅した,クリスタルイヤホンを用いたセンサーが拾った地震波を, PCディスプレイ上に走時曲線として提示するもの.机上の岩石や木材を伝搬する地震波のP-S時間が,震源からの距離に比例して長くなることを観察できる.また,オシロスコープの測定機能を用い,媒質中を伝搬する地震波速度も測定できる.以上2つの装置を用い,以下の点の理解に有効な地震防災に関する授業プログラムを作成することができた.(1)地震波は震源から同時に伝搬を始めるが,伝搬速度の差によりP-S時間が生じること(2)地震被害の大きくなる地域と,そうでない地域の条侮について考察する.(3)緊急地震速報の原理と,地震動から身を守るための方策について考察する.※実績は,地学教育学会誌に26年秋までに投稿予定であり,現在執筆中である.
神経幹細胞の運命決定に関わる染色体構造変換の働き

近年神経幹細胞(NSC)が成体脳にも存在し神経系機能細胞を生み続けていることが発見され、再生治療への適用が期待されてきた。しかし成体NSCは少数なうえに脳深部の特定領域にのみ存在することから内在NSCを用いた治療法は困難であると予測され代替法の開発が期待されている。受入研究者は成体脳の様々な領域にも豊富に存在するオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)が特定の培養条件により多分化能を有するNSC様細胞へ脱分化することを見出した。更にNSCマーカー因子sox2を指標に脱分化過程でのエピジェネテイクス変化(ヒストン修飾の変化、SWI/SNF染色体構造変換因子の働き)を明らかにしている。エピジエネテイクス変換は体細胞核リプログラミングの中心機構であると示唆されておりその制御機構の解明は学問的重要性に加え新規再生治療法の創出に繋がるものと考えられる。本研究課題においてEkblad博士は3つの研究課題を遂行している。(1)テトラサイクリン依存的にFLAG標識したSWI/SNF複合体因子Brmを発現するNSCを作成した。現在抗FLAG抗体カラムおよびsox2エンハンサー領域を含むオリゴカラムを用いBrmを含むSWI/SNF複合体の精製を試みている。(2)当研究室で見つけたsox2発現制御DNA結合因子をFLAG標識しテトラサイクリン依存的に発現を誘導出来るベクターを構築した。上記同様にFLAG標識した転写因子を誘導発現できるNSCの作成を試みている。(3)エピジェネティクスと神経系細胞分化について既存の因子の発現をRT-PCR法および免疫染色法を用いて検討を行いオリゴデンドロサイト分化過程でヘテロクロマチン制御因子(HP1alphaとbeta)とメチル基転移酵素(Dnmt)の発現が消失することを見いだした。しかしニューロンおよびアストロサイト分化過程でこれら因子の発現に変化は見られなかつた。この結果はオリゴデンドロサイト分化に伴い全染色体レベルで構造変換が起きていること、幹細胞機能維持にヘテロクロマチン維持が重要な働きを担っていることを示唆している。(研究目的)近年神経幹細胞(NSC)が成体脳にも存在し神経系機能細胞を生み続けていることが発見され、中枢神経系再生治療への適用が期待されてきた。受入研究者は成体脳の様々な領域に豊富に存在するオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)が特定の培養条件により多分化能を有するNSC様細胞へ脱分化することを見出した。更にNSCマーカー因子sox2を指標に脱分化過程でのエピジェネティクス変化を明らかにしている。エピジェネティクス変換は体細胞核リプログラミングの中心機構であると示唆されておりその制御機構の解明は学問的重要性に加え新規再生治療法の創出に繋がるものと考えられる。本研究課題においてEkblad博士はエピジェネティクス変換に関与するSWI/SNF染色体構造変換複合体(SWI/SNF複合体)の精製・同定・機能解析および体細胞のNSC化を誘導する因子の決定を試みる。(進展状況)現在までに(1)sox2エンハンサー領域を含むDNA断片を結合させたアフィニティーカラムを作製しsox2エンハンサーに結合するNSC核内タンパク質の同定に始めている。(2)HA標識したSWI/SNF複合体構成因子Brmを恒性的に発現するベクターとテトラサイクリン依存的に発現するベクターを構築し、HA標識Brmを発現するNSC株を作製している。細胞株樹立後抗HA抗体を用いNSCに存在するBrmを含むSWI/SNF複合体の精製を行い構成因子を同定する。また複合体を非NSCに導入しsox2およびNSCマーカー因子の発現を検討する予定である。(3)他の研究グループの報告から細胞抽出物が細胞運命転換を誘導することが出来ると報告されていることからNSC細胞抽出物を用い293細胞株に内在sox2遺伝子発現を誘導する実験系を確立している。

上記同様にFLAG標識した転写因子を誘導発現できるNSCの作成を試みている。(3)エピジェネティクスと神経系細胞分化について既存の因子の発現をRT-PCR法および免疫染色法を用いて検討を行いオリゴデンドロサイト分化過程でヘテロクロマチン制御因子(HP1alphaとbeta)とメチル基転移酵素(Dnmt)の発現が消失することを見いだした。しかしニューロンおよびアストロサイト分化過程でこれら因子の発現に変化は見られなかつた。この結果はオリゴデンドロサイト分化に伴い全染色体レベルで構造変換が起きていること、幹細胞機能維持にヘテロクロマチン維持が重要な働きを担っていることを示唆している。
陰影を伴う画像の処理と物件認識の研究

2.Nitzbergと共同で研究した非線型フィルターに付随する2次型式の固有値・行列式等を用いてtextureを認識・分類することを試みた。またこの方法の画像分割への応用を行った。3.Peter Hallinanによる陰影を伴う顔の画像データベースを用いた顔の認識の研究(HarvardでのHallinanの学位論文)を参考にして、とくにHallinanの用いたデータベースから影の特徴を抽出することを試みた。4.なめらかな凸体やその限られた組合せが平面上におかれている場合など、幾何学的に単純な場合について、陰影を伴う画像から陰影の特徴を抽出し、さらにそれを画像の理解に応用することを試みた。(光源の性質にも条件を課すことで部分的な成果が得られたが、一般には物体の形にかなり強い制限を課しても問題が難しいことが明らかになった。)2.Nitzbergと共同で研究した非線型フィルターに付随する2次型式の固有値・行列式等を用いてtextureを認識・分類することを試みた。)
超高精細医用画像時代における解剖構造自動認識 - マイクロ画像解剖学に向けて

平成30年度はマイクロ画像解剖学の創成に向けた以下の研究を実施した。(1)数理モデルに基づいた3次元マイクロCT画像からの層構造抽出手法の実現:消化管壁面の層構造を対象としてマイクロ解剖構造認識手法を開発した。3層の胃壁面を自動識別し画素単位の分類を行う方法を検討した。ここでは、深層学習の手法を用いて胃壁の層構造を自動的に分類する手法を実現した。加えて、構造に着目した微細構造分類方法を開発し、マイクロCT像に対して適用した。これにより、マイクロCT画像を基にした解剖構造抽出手法の基礎的な手法が実現できた。(2)教師なし学習に基づいたマイクロ解剖構造の認識手法の実現:マイクロCT画像等は手動による正解情報付与が難しい。そこで教師なし学習による解剖構造の認識手法を開発した。画像の局所テクスチャパターンに基づいて特徴空間でのクラスタリングを行い、層構造を認識する手法を実現した。(3)マクロ-マイクロ解剖構造レジストレーション手法の実現:CT画像等に含まれるマクロ解剖構造とマイクロCT画像等に含まれるマイクロ解剖構造の対応付けを行う手法を検討した。画像間の特徴的な解剖構造を用いて対応付ける手法を開発した。特に、血管などの解剖学的構造に着目して、臨床の場で撮影されるCT画像と高精細なマイクロCT画像とを帯同づける手法が実現できた。これによって、マクロCT像とマイクロCT像との間の関係性を容易に把握することが可能となった。さらに、マクロCT画像からマイクロCT画像で撮影されたかのような画像を生成する超解像についても併せて研究を進めた。マイクロ画像解剖学の創成に向けた各研究項目は予定通り進展している。昨年度作成した3次元マイクロ画像データベースを利用し、マイクロCT画像からの正常・異常組織の教師なし分類、層構造の識別、マクロ-マイクロ画像間のレジストレーションの検討を行った。それぞれの検討において深層学習等を活用し、データベースに基づく高精度な識別手法を実現している。マイクロ画像からの解剖構造認識においては今年度の研究の中で十分な成果が得られた。これを基にして、次年度からはマイクロ解剖構造情報及び対応付けされたマクロ解剖構造情報を利用して、診断・治療支援・医学教育支援などの研究を実施する予定である。平成30年度の検討結果を基に、マクロ解剖画像からのマイクロ解剖画像の推定手法の実現、マイクロ解剖情報の診断治療支援における利用法の検討、医学教育におけるマイクロ解剖情報利用検討等を行う。最終的に、マイクロ解剖情報を診断・治療支援・医学教育支援へと利用可能とする方法を実現する。平成29年度はマイクロ画像解剖学の創成に向けた以下の研究を実施した。(1)マイクロ画像解剖の認識対象の検討:本研究において開発する画像認識手法の対象となる解剖構造について検討した。胃などの消化管領域を対象とし、層構造、膜構造など従来のマクロ解剖構造の画像処理では対象とされてこなかったマイクロ解剖構造の認識対象について検討した。ここでは,胃壁等がパラフィン包埋されたブロックならびに病理標本画像を対象とすることとした。(2) 3次元マイクロ画像データベースの構築:マイクロCT装置などを利用して、マイクロ解剖構造に関する3次元マイクロCT画像データベースを構築した。また、対応する標本の3次元病理画像の取得も検討した.病理標本画像の本格的な取得は平成30年度となる予定である.なおこのデータベース構築は継続的に進める予定であり,この研究項目は研究期間全体に渡って行う予定である。(3)マイクロ解剖構造アノテーションのための効率的入力方法の検討:マイクロ解剖構造の認識手法の開発のためには、3次元マイクロCT画像などのマイクロ画像において3次元的な構造をトレースしたground truthデータを作成することが重要である。微細構造を対象としているため、マクロ画像解剖で行っていた臓器領域を手動でトレースすることと比較すると格段に難しい問題となる。そこで部分的に解剖構造を手動で入力すると、その入力に基づいて自動的に画像全体に渡って解剖構造を精密抽出する手法の検討を行った。スパースアノテーションとよばれる手法の有効性について検討を進めた.マイクロ画像解剖学の創成に向けた各研究項目は予定通り進展している。特に3次元マイクロ画像データベースの構築では医師との強い連携のもと、標本の3次元画像をマイクロCT装置を用いて多数撮影した。これらを用いて胃等の消化管のマイクロ解剖構造の認識に関する検討を進めた。マイクロCT画像において胃粘膜、壁面下構造を識別可能であることを確認し、これらを含んだ認識対象の検討を行った。今後のマイクロ画像解剖認識に必要となる検討が実施できたため、次年度からの研究実施の基盤が整った。そのため、研究はおおむね順調に進展していると言える。

(3)マクロ-マイクロ解剖構造レジストレーション手法の実現:CT画像等に含まれるマクロ解剖構造とマイクロCT画像等に含まれるマイクロ解剖構造の対応付けを行う手法を検討した。画像間の特徴的な解剖構造を用いて対応付ける手法を開発した。特に、血管などの解剖学的構造に着目して、臨床の場で撮影されるCT画像と高精細なマイクロCT画像とを帯同づける手法が実現できた。これによって、マクロCT像とマイクロCT像との間の関係性を容易に把握することが可能となった。さらに、マクロCT画像からマイクロCT画像で撮影されたかのような画像を生成する超解像についても併せて研究を進めた。マイクロ画像解剖学の創成に向けた各研究項目は予定通り進展している。昨年度作成した3次元マイクロ画像データベースを利用し、マイクロCT画像からの正常・異常組織の教師なし分類、層構造の識別、マクロ-マイクロ画像間のレジストレーションの検討を行った。それぞれの検討において深層学習等を活用し、データベースに基づく高精度な識別手法を実現している。マイクロ画像からの解剖構造認識においては今年度の研究の中で十分な成果が得られた。これを基にして、次年度からはマイクロ解剖構造情報及び対応付けされたマクロ解剖構造情報を利用して、診断・治療支援・医学教育支援などの研究を実施する予定である。平成29年度の検討結果を基に、数理モデルに基づいた3次元マイクロCT画像からの層構造抽出手法の実現、教師なし学習を用いたマイクロ解剖構造の認識手法の実現等を行う。そして認識結果を用いたマクロ-マイクロ解剖構造対応付け手法の実現と診断・治療支援・医学教育支援等への応用を行う。平成30年度の検討結果を基に、マクロ解剖画像からのマイクロ解剖画像の推定手法の実現、マイクロ解剖情報の診断治療支援における利用法の検討、医学教育におけるマイクロ解剖情報利用検討等を行う。最終的に、マイクロ解剖情報を診断・治療支援・医学教育支援へと利用可能とする方法を実現する。平成29年度の研究計画ではマイクロCT画像処理に用いる高性能画像処理ワークステーション(Dell Precision T7910)及び、マイクロCT画像データベースを格納する大容量ディスク装置(Supremacy RAID)を導入する予定であった。しかし、終了した研究課題で使用していたワークステーション及び大容量ディスク装置を流用することで、平成29年度の画像処理研究及びデータベース構築は問題なく実施することができた。ワークステーション及び大容量ディスク装置の購入予定金額が未使用となり次年度使用額が生じた。次年度は、画像の増加によりマイクロCT画像データベースを格納するディスク装置の必要容量増加が見込まれる。
造血幹細胞増殖分化における幹細胞ー骨髄間質細胞間細胞膜接着分子の精製と機能解析

ストロ-マ造血における接着分子の役割は重要と考えられるが分子レベルでの検索はヒトにおいてはまだ殆ど行われていない。ヒト骨髄ストロ-マ細胞株と骨髄系血液細胞株の間には蛍光色素Lucifer Yellow CHの交通が低頻度であるがみられ、電顕的にもデスモゾ-ム様細胞接着装置の存在が確認される。接着関連分子を解析する目的で造血細胞ー骨髄間質細胞間の接着分子を同定することを試みた。ヒト骨髄ストロ-マ細胞株(KM)を免疫源としてストロ-マ細胞膜抗原を認識するモノクロナ-ル抗体を作製した。また標的細胞として用いる骨髄系細胞株(HLー60,KGー1,U937,K562,TFー1,CMK,HEL,BーALL,RPMIー8402,JM,ELMー1)の接着関連分子の存在をFACSで検討した。用いた抗体はcommonβ_1β_2,VLAー4(8F2),VLAー5(2H6),LFAー1(S6F1)のα鎖,LAMー1(TQー1),CD26(1F9),CD44に対するものである。HLー60,CMKー7では検索した分子がすべて発現しており複雑な接着現象が起こっていることが示唆された。K562細胞株はこれらの分子の発現が最も制限されており、commonβ_1,VLA5のα鎖の発現が認められるのみであった。それ故以下の実験では標的細胞としてK562を用いた。作製抗体中1クロ-ンはin vitroのストロ-マ細胞株ー骨髄系血液細胞株(K562)(SーH)の接着をきわめて強く増強した。この抗体の認識抗原はSDSーPAGE後のwestern blottingで分子量約13万5千の膜蛋白であり、この抗体のFabを調製後、SーHの混合培養系に加えるとその結合を抗体の容量依存性に阻止した。この抗体の認識する分子は血液細胞,組識間質,平滑筋,血管内皮,膵導管上皮,賢集合管上皮,培養線維芽細胞,骨髄間質細胞に広く分布しCD44の分布に似るがT,Bリンパ球,顆粒球に発現が低く,上皮における分布や抗原の分子量が異なる。また、K562、TFー1細胞にTPAを処置すると発現量がK562では2倍程度に増強したが、TFー1では逆に1/2程度に減弱した。ILー1ではいずれの細胞株も変化がなかった。本研究の当該年度の目的は機能を持ったヒト骨髄間質細胞株をヒト造血細胞株を用い、それら細胞膜に存在する細胞接着分子を同定、精製することである。<成果>ヒト骨髄間質細胞株(KM-101、102)、および骨髄系血液細胞株(CMK7、HL-60、K562、KOPM、HEL、U937)を免疫源としてBald/cマウス腹腔に繰り返し接種することによりモノクロナール細胞膜抗体を産生するハイブリドーマを作製した。

このうちの2クローンはin vitroの間質細胞-血液細胞株の接着をきわめて強く増強した。ヒト間質細胞株の膜成分を可溶化後、この抗体を用いてウェスタン・ブロッティングを行なったところ、一つの抗体(C-F-9)は、膜蛋白非還元の条件で分子量約22万の分子を認識した。しかし、膜蛋白を還元した試料では明確なバンドは得られなかった。C-F-9ハイブリドーマはIgG_1サブクラスの抗体を産生し、このハイブリドーマをマウスの腹水系にして大量の抗体を得てからこれを精製した。精製抗体をパパインにて処理し、Fabフラグメントを作製し、in vitroのヒト骨髄間質細胞株-骨髄系血液細胞間の接着阻止試験を行なったところ、抗体そのものでは接着増強がみられたが、抗体Fabフラグメントの処理により、接着の阻止を観察することができた。更に、この精製抗体をSepharose 4B CLの担体にカップリングし、抗原の精製を試みた。精製抗原を還元、非還元の条件でSDS-PAGEにて電気泳動を行なったところ非還元の蛋白試料は分子量約22万の単一のバンドとして認識され、還元状態の試料は分子量11万と10万5千の2本のバンドとて認識された。以上の結果は、この分子がhetero dimerの分子から成り、Reterophilicな細胞間の接着に関与する分子であることを示唆する。現在、この分子のアミノ酸配列の検索、遺伝子のクローニングを計画中である。ヒト骨髄間質細胞株(KM-101,102)、および骨髄系血液細胞株(CMK7,HL-60,K562,KOPM,HEL,U937)を免疫源としてBalb/cマウスに繰り返し免疫することによりモノクロナ-ル細胞膜抗体を産生するハイブリド-マを多数採取してきた。この内の2クロ-ンはin vitroの間質細胞株-血液細胞株の接着をきわめて強く増強した。ヒト間質細胞株の膜成分を可溶化後、この抗体を用いてWestern Blottingを行ったところ、一つの抗体(c-f-9)は、膜蛋白非還元の状態で分子量約20万の分子を認識していた。しかしながら、膜蛋白をメルカプトエタノ-ルで還元した試料では明確なバンドは得られなかった。c-f-9ハイブリド-マはlgG_1サブクラスの免疫グロブリンを産生し、このハイブリド-マをマウスの腹水系にして、大量の抗体を得てからこの抗体分子を精製を計った。精製抗体をパパインにて処理し、Fabフラグメントを調整してから、in vitroのヒト骨髄間質細胞株-血液細胞株(CMK,KOPM,K562,U937,HL60,T細胞株,B細胞株,マウス血液細胞株)間の接着に対する影響を検討した。骨髄間質細胞は骨髄系血液細胞株(CMK,KOPM,K562,U937,HL60)とよく接着し抗体Fabフラグメントによりこの接着は一部著明に、あるいは一部弱く阻止され、この抑制はFab濃度依存性であった。また、ヒト二倍体線維芽細胞(W138)-血液細胞株間接着は種々の程度にみられ、この接着には調製抗体Fabフラグメントは影響を与えなかった。更に、この精製抗体をSepharose 4B CLの担体にカップリングし、抗体カラムを作製し、抗原の精製を試みた。精製抗原を還元、非還元の状態でSDS-PAGEにて電気泳動を行ったところ非還元の蛋白は分子量約20万の単一のバンドとして認識され、還元状態の蛋白は分子量約11万と9万5千の2本のバンドとして認識された。以上の結果はこの分子がheterodimerからなり、heterophilicな細胞間の接着に関与する分子であることを示唆する。ストロ-マ造血における接着分子の役割は重要と考えられるが分子レベルでの検索はヒトにおいてはまだ殆ど行われていない。
ジアステレオマ-法による光学分割機構の解明と実用的新規光学分割剤の開発

ラセミ酸,ラセミ塩基の光学分割で最も広範に行なわれているジアステレオマ-塩法について,結晶構造をもとにキラル識別機構を検討し,その結果をもとにした新規光学分割剤の設計を試みた。初めに,(R)-マンデル酸を分割剤として種々のラセミ体1-アリールアルキルアミンの光学分割を試みた。その結果,アミンのアリール基上の置換基により分割成績が大きく影響されることを見出した。すなわち,無置換あるいはオルト置換アミンは効率よく分割されたのに対し,パラ置換体は全く分割できなかった。そこで,分割成績の良かった塩について,難溶性塩のX線結晶構造解析を行なった。その結果,難溶性塩結晶中では極めて特徴的な水素結合ネットワークが共通して形成されていることが分かった。この水素結合ネットワークは(1)アンモニウム部とカルボキシラート部が2回らせん軸を中心に有するカラム状の構造になっている,(2)マンデル酸の水酸基を介してカラム状構造どうしが水素結合で結ばれており,結果的に平面状の水素結合ネットワークが形成されている,(3)水素結合ネットワーク表面の平面性が高く,極めて密なパッキング状態になっている,という特徴を有していた。これらの結果から,パラ置換体のアミンが分割できなかった理由として,パラ位の置換基によりマンデル酸とアミンの作る水素結合ネットワークの平面性が乱れ,両ジアステレオマ-塩とも難溶性塩結晶に見られた安定な結晶構造がとれなくなったためと考えられた。そこで,マンデル酸のフェニル基のパラ位に置換基を導入すれば,パラ置換アリールエチルアミンの一方の対掌体と,上記の条件を満たすような平面性の良い水素結合ネットワークが形成できるのではないかと考えた。いくつかのパラ置換マンデル酸を用い,これらアミンの光学分割を試みたところ、良好な効率で分割できることが分かった。光学的に純粋な単一異性体を経済性に優れた方法で工業的に合成できる技術を開発することは,薬物開発をはじめ,光学活性な化合物を必要とする分野にとって極めて重要な課題である。現在,光学異性体を工業的スケールで得る方法には,物理的または化学的方法として優先晶析法やジアステレオマ-塩法などがあり,さらにアミノ酸類の製造で確立されている酵素法や生物化学的方法が知られている。本研究は,ジアステレオマ-塩のクリスタルエンジニアリングを基に,分割剤と被分割剤との分子認識機構を明らかにし,分割剤選定基準の一般化を目指し,また,得られた結果に基づいた新規光学分割助剤の開発を目的として行った。マンデル酸は比較的安価で,1-フェニルエチルアミンを初めとして各種のキラルアミンの分割剤として広く用いられている。そこで申請者らは,マンデル酸による光学分割機構の解明のため,各種1-フェニルエチルアミン誘導体の光学分割を試みた。その結果,アミンの芳香環上の置換基によって分割成績が大きく変化することを見出した。すなわち,オルト置換体の分割は比較的良好な結果を与えたのに対し,メタ置換体は置換基の種類に依存し,さらにパラ置換体は全く分割できないことが明らかとなった。一方,マンデル酸のフェニル基のパラ位にメチル基を導入し,同様に光学分割を試みたところ,パラ置換1-フェニルエチルアミンを分割できることがわかった。これらの結果から,酸とアミンの分子長差が分割能に影響を与えることが示唆された。一方,いくつかのジアステレオマ-塩についてX線結晶構造解析を行なったとろ,いずれも結晶内で特徴的な2次元水素結合ネットワークが形成されていることがわかった。この水素結合ネットワークの形状が分割能に影響を与えているものと考えられるため,現在さらに多くの塩について結晶構造を分類・検討中である。

カルボン酸のアンモニウム塩結晶を用いた光学分割法のなかで最も一般的に行なわれているジアステレオマ-塩法について,結晶構造をもとに,新規光学分割剤の設計を試みた。まず初めに,(R)-マンデル酸を分割剤として種々のラセミ体-1アリールアルキルアミンの光学分割を試みた。その結果,アミンのアリール基上の置換基によって分割成績が大きく影響されることを見出した。すなわち,無置換あるいはオルト置換アミンは効率よく分割されたのに対し,パラ置換体は全く分割できないことがわかった。そこで,分割成績の良かった塩について,難溶性塩のX線結晶構造解析を行なった。その結果,難溶性塩結晶中では極めて特徴的な水素結合ネットワークが共通して形成されていることが分かった。この水素結合ネットワークは,(1)アンモニウム部とカルボキシラート部が2回らせん軸を中心に有するカラム状の構造になっている,(2)マンデル酸の水酸基を介してカラム状構造どうしが水素結合で結ばれており,結果的に平面状の水素結合ネットワークが形成されている,(3)水素結合ネットワーク表面の平面性が高く,極めて密なパッキング状態になっている,という特徴を有していた。これらの結果から,1-フェニルエチルアミンのフェニル基のパラ位に置換基を導入すると,マンデル酸とアミンの作る水素結合ネットワークの平面性が乱れ,両ジアステレオマ-とも難溶性塩結晶に見られた安定な結晶構造がとれなくなり,その結果,分割効率が低下したものと考えられた。そこで,マンデル酸のフェニル基のパラ位に置換基を導入すれば,メタあるいはパラ置換アリールエチルアミンの一方の対掌体と,上記の条件を満たすような平面性の良い水素結合ネットワークが形成できるのではないかと考えた。いくつかのパラ置換マンデル酸を用い,これらアミンの光学分割を試みたところ,良好な効率で分割できることが分かった。
核内蛋白との相互作用によるDNAポリメラーゼα・プライマーゼの複製開始制御

哺乳類細胞のDNA複製酵素と調節因子との蛋白-蛋白相互作用を解析してG1/S移行の機構にアプローチすることを目的とする。Rb蛋白はG1からS期に進むとcdk蛋白リン酸化酵素により高リン酸化型に変換する。この高リン酸化型Rb蛋白は従来不活性であると考えられていたが、我々は高リン酸化RbがS期を通して存続することに注目し、これがS期の進行に未知の役割を果たしていると考え、精製Rb蛋白の複製酵素に対する影響をin vitroにて検討した。バキュロウイルス昆虫細胞系で発現させ抗Rb抗体カラムで精製したRb蛋白はDNAポリメラーゼαの活性を促進した。昆虫細胞で発現されたRb蛋白は中程度リン酸化型であり、これを脱リン酸化酵素PP2Aで処理すると促進活性は低下し、逆に、cdk2/cyclineEを共発現して高度リン酸化型にすると促進は増強した(Takemura et al.Oncogene(1997)15,2483-2492)。この結果は、Rb蛋白はG1期には主としてE2Fなどの転写因子を不活性化する事によって複製系酵素蛋白の発現を阻害し、DNA複製の開始をブロックしているが、cdk/cyclin系によりリン酸化を受けるとE2Fに対する結合能を喪失して転写制御が解消すると同時に、リン酸化Rbそれ自体が複製酵素DNAポリメラーゼαを促進して、複製反応に促進的に作用するS phase promoterの一つ事であるを示唆する。我々は抗DNAポリメラーゼα・モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的解析から、核内ではDNAポリメラーゼα・プライマーゼ複合体は大きな構造体としてDNA複製部位に局在し、細胞周期に伴い離合集散を繰り返す事を明かにした。この複製複合体の実体に迫るため、平成7年度及び8年度においてはDNAポリメラーゼαと蛋白相互作用によって結合する核内蛋白を検索した結果、T因子、MAPII、ポリADPリボシル化酵素(PARP)等を同定した。またDNAポリメラーゼα・プライマーゼ複合体に結合するDNAヘリカーゼ、α酵素の複製忠実度を向上させ、又プライマーゼの反応開始特異性を変えるRP-A(HSSB)もRF-C、PCNAとならんで複製複合体の構成因子であることが示唆された。本研究は哺乳類細胞のDNA複製酵素と調節因子との蛋白-蛋白相互作用を解析してG1/S移行の機構にアプローチすることを目的とする従来我々は増殖細胞を抗DNAポリメラーゼα・モノクローナル抗体を用いて免疫組織化学的に解析し、核内ではDNAポリメラーゼα・プライマーゼ複合体は大きな構造体としてDNA複製部位に局在し、細胞周期に伴い離合集散を繰り返す事を明かにした。この複製複合体の実体に迫るため、DNAポリメラーゼαと蛋白相互作用によって結合する核内蛋白を検索した結果、T因子、MAPII、ポリADPリボシル化酵素(PARP)等を同定した。平成7年度においては、これらの因子のうち、PARPはRbと結合してその促進活性を失うことを認め、この性質は我々が既に発表したSV40T抗原の挙動と類似する。このことからPARPがT抗原の細胞性カウンターパートであり、Rb蛋白が複製複合体の活性調節及び解離に関与する可能性を示唆した。一方、リン酸化型のRb蛋白(ppRb)を精製し複製系酵素に及ぼす影響を調べたところ、ppRbが直接にDNAポリメラーゼα活性を強く促進する事を見い出した。

この促進活性は、ppRbをポテト酸フォスファターゼあるいはウサギ筋肉蛋白フォスファターゼIIAで脱リン酸化することにより消失した。この結果は細胞周期においては、G1期において低リン酸化型のRb蛋白が他の因子を介して抑制的に、S期においてはリン酸化型Rbが促進的に複製を調節する可能性をしめすものとして興味深く、今後さらに解析を進める予定である。哺乳類細胞のDNA複製酵素と調節因子との蛋白-蛋白相互作用を解析してG1/S移行の機構にアプローチすることを目的として以下の実験を行った。リン酸化型のRb蛋白が、複製系の酵素、特にDNAポリメラーゼα・プライマーゼの活性を強く促進するという予備的結果を得た。この結果は予想外ではあったが、Rb蛋白がG1期においては低リン酸化型でありE2Fなど転写因子と結合して転写を抑制するがS期には高度にリン酸化された「不活性形」で存在するという細胞周期におけるリン酸化サイクルとよく符号し、従来不明であったリン酸化型Rb蛋白の機能を示唆するものである。Rb蛋白はバキュロウイルス・昆虫細胞系で大量発現させ抗Rb抗体カラムにより精製した。またヒト白血病培養系Raji細胞核より同様に精製した。DNAポリメラーゼαは牛胸腺及びヒトHela細胞より抗体カラムを用いて精製した。それぞれ二種類の組み合わせた実験でRb蛋白それ自体がDNAポリメラーゼαを10-50倍に活性化することを認めた。Rb蛋白をポテト酸ホスファターゼおよびホスファターゼ2Aで脱リン酸化すると促進活性は消失し、リン酸化Rb蛋白が促進活性を担っていることが明らかとなった。ビーズに固定したRb蛋白カラムを用いてリン酸化Rb蛋白とDNAポリメラーゼαは直接結合する事が示され、蛋白-蛋白相互作用によって活性促進がもたらされる事を示した。一方、複製蛋白RP-AはDNAプライマーゼの塩基配列特異的結合・開始を修飾する事を明らかにした。従来DNAプライマーゼはピリミヂンに富む配列を有する一本鎖DNAがのみプライマーRNA合成を行う事が知られているがRP-Aを結合したDNA上ではプリンに富む配列に結合してプライマーRNAを合成し複製をスタートすることが明らかとなった。複製フォークに於ける岡崎断片の開始機構に示唆を与える結果として興味深い。哺乳類細胞のDNA複製酵素と調節因子との蛋白-蛋白相互作用を解析してG1/S移行の機構にアプローチすることを目的とする。Rb蛋白はG1からS期に進むとcdk蛋白リン酸化酵素により高リン酸化型に変換する。この高リン酸化型Rb蛋白は従来不活性であると考えられていたが、我々は高リン酸化RbがS期を通して存続することに注目し、これがS期の進行に未知の役割を果たしていると考え、精製Rb蛋白の複製酵素に対する影響をin vitroにて検討した。バキュロウイルス昆虫細胞系で発現させ抗Rb抗体カラムで精製したRb蛋白はDNAポリメラーゼαの活性を促進した。昆虫細胞で発現されたRb蛋白は中程度のリン酸化型であり、これを脱リン酸化酵素PP2Aで処理すると促進活性は低下し、逆に、cdk2/cyclineEを共発現して高度リン酸型にすると促進は増強した(Takemura et al.Oncogene(1997)15,2483-2492)。
波動現象を用いる気体の熱分離現象に関する研究

「波動現象を用いる気体の熱分離現象に関する研究」の課題のもと、東北大学流体科学研究所学際衝撃波研究拠点に設置されている空力冷凍器(Pressure Wave Refrigerator : PWR)を用い、圧縮気体を利用して気体を温度減少させることを目的とし実験を行った。波動現象を利用して気体を冷却する方法には、主に二つの方法が考えられる。第一の方法としては、タービンを用いたexpander(拡張機)であるが、構造が複雑で、気体を分離するのが困難である。他方、"Thermal Separator(熱分離器)"と呼ばれるPWRは構造が簡単、低コスト、高効率で石油会社、化学工場、エネルギー転換に応用される。エアコンや冷蔵庫のようにフロン等の冷媒を用いず気体温度を下げることが可能である。熱分離器は1970年代に開発され、静止構造と回転構造の構造が知られている。前者は構造が簡単であるが、気体が入口と出口で混合するため、効率は低い。後者は回転する分配器とその周りに配置された多数の膨張管からなる。高圧の気体が分配器に入り、高圧気体は回転分配器を経て、ノズルから周期的に膨張管へと流れ込む。この方法では気体が混合することが無く、効率も前者より高い。PWRは低温の動体を使うのではなく、自身の非定常膨張によって温度を下げるため、気体の冷却には極めて有効である。研究実績として、PWRの小型化に成功し、温度低下は最大34度を得ることができた。また、温度低下は回転数、膨張間長さ、圧力によって決定されることが分かり、各膨張管長さに対して最も温度を減少させる回転数が存在し、膨張管を長くするにつれ最適な回転数は減少していくことが確認された。理想的な最も高い効率は、気体を膨張管に流入させる時間と、膨張した気体を排出させる時間の比率を適切に調節した上で得られるため、実験結果を元にして、更なる効率の向上を目指す。
運動を習慣化させるための行動医学的介入方法の開発

運動習慣の獲得・継続に役立っ実践的介入方法を開発することを目的とし、1)行動医学理論モデルであるTranstheoretical Modelにもとづいた「運動行動変容の過程」尺度(POC)の新たな開発、および2)行動医学的手法を取り入れた集団ストラテジーに則った介入の層化無作為割付対照試験による効果の検討を行った。1)POCの開発:45項目,11概念(プロセス)の質問紙を作成した。某社社員を対象に実施し、調査研究に同意が得られた1,287名(対象者全体の53.1%)を分析の対象とした。確認的因子分析の結果,11プロセスのうち項目数3つ以上の9プロセスにおいてCronbachのα信頼性係数は0.7以上であり,高い信頼性が示された。また、対象者の運動習慣のステージ(SOC)とPOC11プロセス各尺度得点との関連を検討したところ、すべての尺度得点において、SOCによる有意差が認められ(p<0.001),SOCが高いほど高得点を示し,尺度の妥当性が確認された。2)介入効果の検討:規模と地域を考慮して、事業所単位で層化後、無作為割付を行い、介入事業所の社員(介入群)に対して、ポスター掲示および社内メールによる情報提供型の介入を、14回、6ヶ月間(1週間隔の集中的介入期間8週間を含む)行った。提供した情報は、身体活動・運動の健康影響や推奨されている活動量に関するもので、ベースライン評価時のSOCに応じて行動医学的技法を用いた情報を追加した。介入の前後で、SOC、POC11尺度得点、日常生活における身体活動量、加速度計による歩数の変化について検討したが、いずれの評価尺度も、介入群、対照群ともに有意な変化はなかった。集団ストラテジーに則った介入は、情報提供型が多いが、SOCに応じた行動医学的技法を取り入れても、行動変容を起こすことは困難であった。今後、効果的な介入方法の開発が必要である。身体活動の推進と関連した行動医学理論モデルであるTranstheoreticalTheoryに関する研究の文献レビューに基づいて、地域・職域など様々な場において適用可能で、身体活動の上昇に有効かつ継続率の高い介入方法の確立のために、実践的介入方法を視野に入れ、「運動行動変容の過程」(以下POC)の構成概念の検証と質問票の整備を行った。具体的に本年度は、先行研究の文献検討によるPOCの概念の確認と、英語版POC調査票の訳出を行った後、一般成人に"自分の運動習慣が変わるとき、変えようとするとき"を想定した自由記述を依頼し、質問項目の作成を行った。その結果、全部で146項目の質問票が作成された。これを基に、運動による健康づくりを専門とする医師、管理栄養士、健康運動指導士、健康に関わる教育者によるブレインストーミングを行って、同意義の質問項目の排除や言葉の整備を行い47項目の質問票に整理した。これらの質問は、「意識の高揚」、「情緒覚醒」、「環境再評価」、「自己再評価」、「社会的解放」、「行動置換」、「社会的支援」、「強化」、「自己解放」、「刺激統制」、「代償行動」、「モデリング」の概念に分類することができた。現在、このようにして新しく作成されたPOC調査票を用いて、その信頼性と妥当性の検討を、運動習慣のステージ評価、身体活動調査票ならびにライフコーダによる身体活動量評価と合わせて行っている。また同時に、行動変容技法に関する15程度のスキルを挙げ、それを用いた指導者向け介入マニュアル試案を作成中である。昨年度は、行動医学理論モデルであるTranstheoretical

Theoryにもとづいた「運動行動変容の過程」尺度(以下POC)を作成し、その構成概念の検証と質問票の整備を行った。まず、先行研究の文献検討によるPOCの概念の確認と、英語版POC調査票の訳出を行った後、一般成人に"自分の運動習慣が変わるとき、変えようとするとき"を想定した自由記述を依頼し、質問項目の作成を行った。その結果、全部で146項目の質問票が作成された。これを基に、運動による健康づくりを専門とする医師、健康運動指導士等によるブレインストーミングを行って、同意義の質問項目の排除や言葉の整備を行い47項目、11概念(プロセス)の質問紙とした。本年度は、現在の運動習慣の有無や運動習慣のステージを尋ねる質問表とPOC調査票を職域において実施し、POC調査表の信頼性と妥当性の検討をした。POCの11プロセス(行動ならびに認知のプロセス)はいずれも運動習慣のステージにより有意に異なり、妥当性が確認された。また、確認的因子分析の結果、11プロセスのうち9のプロセスではクロンバックのα信頼性係数が0.7以上と高く信頼性は高かった。この調査を実施後、某社56事業所を事業所規模に応じて層化後無作為割付を行い、介入群に対して毎週ポスター掲示と個人宛に行動医学的技法を用いた情報を社内メールを用いて配布3ヶ月間配布し、集中的介入を行った。提供した情報は、介入前の運動習慣のステージに応じ、POC調査票の項目を参考とした内容とした。3ヵ月後の再調査の結果、介入群、非介入群ともに運動習慣のステージには有意な変化がなかった。介入前に運動習慣のステージが関心期であった者では、「刺激統制」「環境再評価」などのPOC尺度が、介入群においてのみ上昇した。以上より、情報提供型の介入は、運動習慣のステージを変化させるものではなかったが、関心期の対象者に対しては、運動に関する行動プロセスや認知のプロセスを変化させることが可能であることが明らかとなった。
糖鎖修飾縫い込み型インターカレータを利用した遺伝子のターゲッティング

糖鎖をその構造内に有する天然のインターカレータには、ノガラマイシンをはじめ数種が知られている。。ノガラマイシンはDNAに対し、「縫い込み型」様式で結合し、特異な結合・解離挙動を示す。当研究室では、この関連の興味から、糖鎖をもつDNAインターカレータの開発、及びこれらの化合物とDNAとの相互作用について系統的な検討を行うことを目的としている。これまで単純な開環状の糖鎖をインターカレータに導入した型の配位子を検討してきた。その結果、これら配位子がDNA鎖を加水分解的に切断するという非常に興味深い結果が得られた。また、導入した糖鎖の数、構造等によりDNA結合親和性の制御を行うことが出来た。この様な結果をふまえ、更にDNA配位子に糖の特性をより明確に発揮させる観点から、開環状ではなく環状構造を保持した糖鎖をもつDNA配位子の合成を新たに試みた。具体的なインターカレータの母骨格として、当研究室で多くの知見を得ているアントラキノン環、更にはビオローゲン誘導体を採用した。これらの母骨格の末端アミンにヨウ化アルキル型糖鎖を導入し、目的の糖鎖型DNA配位子を得ることにした。新たに設計した配位子は正荷電を有することから、ポリアニオンであるDNAに対して強い親和性が期待できる。特にビオローゲン誘導体ではオレフィン部位を有することから、光異性化に伴い、DNAに対する配列選択性・結合形態を制御できると考えられる。また、これら化合物間のDNA相互作用およびDNA切断能の比較を行うことも興味深い。今後、還元アミノ化等による環構造を維持した様々なDNA配位子を合成する。また、これらの配位子とDNAとの相互作用を、吸光光度法、円偏光法、トポイソメラーゼアッセイ法等を用いて調べる。更に進み、細胞内遺伝子導入に関する基礎的知見を得るための検討を行う。。
リピート配列を持つＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合様式解明と人工蛋白質創製への展開

任意のDNA配列に結合できる人工DNA結合蛋白質は、転写制御やゲノム編集ツールとして有用である。TALE蛋白質はDNA1塩基を認識するユニットの繰り返し配列を持ち、様々なDNA配列に結合できる。一方、TALEが結合する配列には、5'末端にTが必須という制限があるが、その認識様式に関しては明らかでなかった。本研究では、TALEのDNA結合特性を明らかにし、5'末端塩基の制限がないTALE骨格の探索を目的とした。repeat-1のヘアピンループ領域をランダム化し分子進化法によるセレクションを行った結果、5'末端塩基の種類に依存せずDNAに結合できるTALE骨格を獲得することに成功した。任意のDNA配列に結合できる人工DNA結合タンパク質は、転写制御やゲノム編集のためのツールとして有用である。植物病原菌由来の転写因子様タンパク質(Transcription Activator Like Effector; TALE)は、DNA1塩基を認識するユニットの繰り返し配列を持ち、ユニットのシャッフルにより、様々なDNA配列に結合できることが近年明らかになってきた。本研究では、この転写因子様タンパク質のDNA結合特性の詳細を明らかにし、様々な標的塩基配列に自在に結合できる人工DNA結合タンパク質を創製することを目的としている。本年度は、この転写因子様タンパク質が結合できる塩基配列として、5'末端にチミンが必要であるという制限に着目した。より柔軟に標的配列を選択できる人工タンパク質を創製するために、DNA結合親和性は保持したまま、この5'末端塩基の選択性を解除することに取り組んだ。前年度、リピートドメインのN末端側ドメインに存在するリピート類似ユニット(リピート-1)に含まれる芳香環を持ったアミノ酸残基が、この5'末端塩基の認識に特に重要であることを示唆する結果を得ていたので、本年度は、この領域に変異を導入したライブラリを作製し、スクリーニングを行った。その結果、5'末端の塩基種に依存しない変異体を獲得することに成功した。また、得られた変異体のDNA結合特性を調べた結果、この5'末端塩基非依存性には、リピート-1に含まれるループ構造全体が重要であることを明らかにした。植物病原菌由来の転写因子様タンパク質は、DNA1塩基を認識するユニットの繰り返し配列を持ち、ユニットのシャッフルにより、様々なDNA配列に結合できることが近年明らかになってきた。一方、その物性や結合の詳細は不明であり、これらを明らかにすることが、人工タンパク質のデザインにとって重要であると考えられる。そこで、本研究では、この転写因子様タンパク質のDNA結合特性の詳細を明らかにし、よりDNA結合配列選択性の高い人工DNA結合タンパク質を創製することを目的とする。本年度は、このDNA結合タンパク質の認識配列として、5'末端にTが必要であることに着目し、この認識に寄与するアミノ酸残基に関する検討を行った。そのためにまず、このDNA結合タンパク質の発現および精製条件の検討と、DNA結合活性の評価系の確立に取り組んだ。その結果、培養細胞内でのルシフェラーゼレポーターアッセイによる間接的なDNA結合活性の評価に加えて、大腸菌発現系からの精製タンパク質を用いた物理化学的な評価系を確立した。一連の点変異導入体を発現するベクターを作製し、細胞内でレポーターアッセイを行った結果、リピートドメインのN末端側ドメインに存在するリピート類似配列に含まれる芳香環を持ったアミノ酸残基が5'-Tの認識に特に重要であることを示唆する結果を得た。任意のDNA配列に結合できる人工DNA結合蛋白質は、転写制御やゲノム編集のためのツールとして有用である。植物病原菌由来の転写因子様蛋白質(Transcription Activator-Like Effector; TALE)は、DNA1塩基を認識するユニットの繰り返し配列を持ち、ユニットのシャッフルにより、様々なDNA配列に結合できることが近年明らかになってきた。この転写因子様蛋白質のDNA結合特性の詳細を明らかにし、よりDNA結合配列選択性の高い人工DNA結合蛋白質を創製することを目的として、本研究を行った。最終年度は、修飾塩基を標的とするTALEユニットの探索を行った。スクリーニングの前に、まず既存のTALEユニットのメチル化シトシンに対する結合に関して、ゲルシフトアッセイおよびレポーターアッセイで調べた。その結果、既存ユニットでは、メチル化/非メチル化シトシンを十分に区別できないことが明らかとなった。そこで、昨年度に確立したbacterial one-hybrid法によるTALE蛋白質のスクリーニング系を応用して、修飾塩基に対するスクリーニングを行った。その結果、既存ユニットに比べ、メチル化シトシンへの選択性が高いユニットを獲得することに成功した。今後、これらのユニットの汎用性に関する検討とこれらを用いた細胞機能制御へと展開していきたい。全研究期間中に、TALEのDNA認識に関する検討をもとにスクリーニング系を構築し、これまでにTALEの制限とされてきた「5'末端塩基がTでなければならない」という条件を解除することに成功し、また修飾塩基への結合性を有するユニットも獲得することができた。