hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海生生物における化石ＤＮＡ研究の可能性

嫌気的な海成堆積物中には化石化したDNAが保存されることがある。本研究では、深海掘削コア中から採取したDNA抽出物から、真核生物遺伝子断片の塩基配列を解析し、ゲノムレベルで海洋生物進化を検討した。地球深部探査船「ちきゅう」で採取した掘削コアから、コンタミネーションのない遺伝子サンプリングを行い、数100bpから数1000bpの遺伝子断片を得た。DNA量は最小で0.6ng/ul/mg堆積物乾重量であった。BLAST検索にかけた結果、真核生物およびHypothetical geneで登録されている未知遺伝子が検出された。このことは、化石DNAが嫌気的環境下で保存されてきた可能性を示した。嫌気的な海成堆積物中に化石化したDNA断片がわずかに保存される可能性がある。原核生物は生きたままで海底下数百mに発見されるなど,DNA解析による地下生命圏の研究が進められているが,真核生物は掘削時とその後のコンタミネーションおよびDNAの多様さと長大さから,アプローチがなされていない。本研究は,コンタミネーションフリーの深海掘削コア中から採取したDNA抽出物を用いて真核生物の化石DNAを採取することを目的とする.深海掘削コアは30層に分け,それぞれの層にDNA抽出法を施し,DNAの定量・定性を実施した。平成23年度は,海洋に広く分布する浮遊生物である珪藻類を中心としたDNA断片をターゲットとし,ユニバーサルプライマーを多数設計してPCR増幅の結果を検証したが,良好なPCR増幅が得られなかった。そこで,平成24年度は海産に限らず無脊椎動物の多くに共通する短いリボソーマルDNA配列に着目し,多数のプライマーを設計してPCR増幅を行った結果,数種のプライマーで増幅が見られ,プライマーを決定することができた。さらに約45万年前の化石DNAの採取に成功した。そこで,配列解読の前に,さらに本研究を古海洋の研究と繋げることを目指した。すなわち,化石として残った殻を地質年代の測定に使われている有孔虫の化石DNAをターゲットとした。現生の有孔虫の既知配列をもとにして,プライマーを設計し,PCR増幅した結果,良好な増幅が得られた。その結果をもとにして,より精度の高いプライマー設計とPCR産物の採取,および残された配列解析のため,平成25年度に本研究を期間延長した。最終年度となる平成25年度は,次世代シーケンサーによる配列解析を実施し,DNA解読および現生生物との遺伝子検索を行い,海底下の真核生物の化石DNA研究の可能性を示す。本研究では、深海掘削コア中から採取したDNA抽出物から、海洋プランクトンである珪藻類を中心とした真核生物遺伝子断片の塩基配列を解析し、ゲノムレベルでの海洋生物進化の検討を提案する。試料は、2005年に地球深部探査船「ちきゅう」の慣熟航海で採取した掘削コアを使用した。コンタミネーションは、公開されている化石DNAの取扱いに基づき研究を進めることで避けた。堆積物サンプルから市販のDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、-80°Cで保存し、一部は液体窒素中に保存した。プライマーは2種類の特異的プライマーをデザインした。PCR産物から得たクローンの配列を読み、数100bpから数1000bpの様々な長さの遺伝子断片を得、長さごとの画分の頻度分布と各サイズクラスごとの遺伝子の特徴化を行った。DNA断片の存在確認は、得られたDNA断片の配列から特異的なプライマーを複数作成し、断片が存在した堆積層および他の堆積層の試料に対してPCRを行った。コントロールとして表層試料を使用した。抽出したDNA量は最小で0.6ng/ul/mg堆積物乾重であった。微量の核酸泳動装置を使ったDNAは10001500bpとそれ以下の長さとなり、後者はゲル電気泳動でスメア状を示した。線虫間の相同性を基にデザインしたSSU-rRNAのプライマーを使ってPCRを実施し、試料の堆積物全体では300個以上の遺伝子断片を得た。DNA長は短いが、BLAST検索にかけた結果、線虫以外の真核生物及びHypothetical geneで登録されている未知遺伝子が検出された。最深部からは得られなかったが、深部でのDNA断片からの生物グループ数は2-4種であった。DNAの分解と消失から残った化石DNAは、その後嫌気的環境下に置かれることで保存されてきた可能性があることを示し、本研究は化石DNAを用いた生物進化研究の可能性を開いた。嫌気的な海成堆積物中には化石化したDNA断片がわずかに保存される。深海掘削コア中から採取したDNA抽出物から、海洋プランクトンである珪藻類を中心とした遺伝子断片の塩基配列を解析し、ゲノムレベルでの海洋生物進化を検討することを提案する。

本研究を通じて、1)どの時代まで、どの堆積層でDNA断片が抽出できるか?2)そのDNA断片の塩基配列からどのレベルの生物情報が獲得できるか?3)本法で遺伝子レベルの時間を追った進化を解析できるのか?4)陸上の化石DNAと比較した考察、という海洋生物における堆積物中の化石DNA研究の実例を示し、その可能性を見極める。本研究は、海生生物の化石DNA解析を行う。平成23年度は以下の試料と手順で研究を進める。1)遺伝子断片の区分と増幅方法の検討:2)遺伝子の解読:次世代シーケンサーによる大規模網羅的遺伝子解析法を実施する。3)遺伝子情報の解析:データはすべて自動でアダプター配列を除去し、既知のゲノム配列およびEST配列との間でBLASTなどの検索をかける。得られた結果はグループ化し、遺伝子特定が可能な状態にもっていくことを試みる。4)時間を追った遺伝子情報の進化の解析: 3)によって遺伝子の種類や種が特定できたら、異なった時代の同一種について遺伝子情報解析結果を比較し、堆積物からわかる地球環境変化と進化について議論する。これらのステップのうち、解析結果を決定的に左右する、1)遺伝子解析の折りに起こるコンタミネーション、3)遺伝子ライブラリーの整備の問題について検討を行なった。1)は、当初行なっているところとは異なった実験室での検討を行う事により、また2)は、ちょうど始まった遺伝子支援を最大限活用する事によって解決できる。プライマー設計は本研究の要であるDNA断片の実際の存在を再現できるかを左右する重要な実験である。この設計に良好な結果が得られ,次の作業は確立された方法によるDNA配列解読だけとなった。これらのことから研究は順調であると言える。嫌気的な海成堆積物中には化石化したDNA断片がわずかに保存される。深海掘削コア中から採取したDNA抽出物から、海洋プランクトンである珪藻類を中心とした遺伝子断片の塩基配列を解析し、ゲノムレベルでの海洋生物進化を検討することを提案する。以上の研究のステップのうち、1)は過去50万年前のコア試料まで真核生物の遺伝子断片が含まれている事を確認したが、地球は生物に満ちている事から起こる現在の遺伝子の混入(コンタミネーション)の問題が立ちふさがった。このことは世界中の研究室で問題になっているが、解決策は見つかっていない。慎重に検討を行った結果、複数の実験室でクロスチェックする事により、混入の有無を確かめながら行なうことが現状としてはよいことを確認した。もう一点は、解析結果を遺伝子ライブラリーと比較する事によって、どの生物のどの部分の情報であるかを検討するステップが問題になった。この問題は、Bioinformaticsにおける根本問題でもある。日本におけるこの分野の急激な発展に伴い、1年経った今、支援システムが整ったことによって、情報検索が確実にできるようになった。
歯根嚢胞由来細胞を用いた嚢胞組織増大機序の解明

歯根嚢胞由来細胞が,嚢胞の増大にどのように関与するのかを調べる目的で,プロスタグランジンE_2(PGE_2)またはトロンボキサンA_2(TXA_2)がこの細胞に及ぼす影響を調べた。その結果,PGE_2は細胞のDNA合成能を低下させたが,TXA_2は濃度によってはこれを促進させた。両プロスタノイドともに,細胞のコラゲナーゼ産生を濃度依存的に抑制した。また,両プロスタノイドともに,細胞のIL-6,LIF,IL-8,MCP-1産生を促進した。さらに,細胞にIL-1刺激を加えた際のPGE_2,IL-6,コラゲナーゼ産生を調べた結果,いずれもIL-1刺激によってその産生は促進された。しかしながら,H7,H89,デキサメタゾンなどの代謝阻害剤の影響が一部異なったことから,シグナル伝達経路はすべて共通でないことが判明した。歯根嚢胞裏層上皮のサイトカイン発現をRT-PCR法にて調べた結果,この上皮細胞は,IL-1,IL-6,IL-8,IL-11,TGF-β1,PDGF-A,aFGFを発現していることが明らかとなり,成長因子のレセプターとしてEGFR,KGFR,HGFR,L-6Rの発現が確認された。歯根嚢胞の拡大は,嚢胞内容液中に滲出してくるタンパク質やムコ多糖類の増加による浸透圧の上昇と,これにともなう内圧の亢進が一因となっていると考えられているため,実験的に解析を行った。アルブミン,ゼラチン,トランスフェリンまたはヒアルロン酸トリプシンまたはヒアルロニダーゼで分解し,浸透圧に及ぼす影響を調べた。その結果,各種タンパク質溶液をトリプシンで分解すると,820mOSMの浸透圧の上昇が認められた。これに対して,ヒアルロン酸では0.1%溶液で約11mOSMの浸透圧の上昇が認められた。これらのことから,嚢胞内容液中に滲出したタンパク質の酵素による分解,低分子化と,ヒアルロン酸自体の集積により浸透圧の上昇が起こる可能性が示唆された。次に,嚢胞内容液中にマトリックス金属プロテアーゼ(MMP)が存在するかどうかを調べた。その結果,嚢胞内容液中には活性型および潜在型のコラゲナーゼおよびゼラチナーゼが存在することが判明した。ウェスタン・ブロッティングの結果,コラゲナーゼはおもにMMP-8,ゼラチナーゼはおもにMMP-9であり,その由来はおもに好中球であることが示唆された。歯根嚢胞由来細胞が、嚢胞の増大にどのように関与するのかを調べる目的で、プロスタノイドのうち、プロスタグランジンE_2(PGE_2)およびトロンボキサンA_2(TXA_2)がこの細胞に及ぼす影響を調べた。

外科的に摘出された、3例の歯根嚢胞から得た3群の歯根嚢胞由来細胞を用いて、10^<-8>10^<-6> MのPGE_2またはTXA_2がこれらの細胞のDNA合成能、コラゲナーゼ産生、IL-6、LIF、IL-8およびMCP-1産生に及ぼす影響を調べた。DNA合成能は^3H-Thymidineの取り込みを、コラゲナーゼ産生はその活性測定を、サイトカイン・ケモカイン産生はELISA法を行って評価した。その結果、PGE_2はDNA合成能を概ね低下させるが、TXA_2は濃度によってはDNA合成能を促進させることが判明した。コラゲナーゼ産生については両プロスタノイドとも濃度依存的にこれを抑制することが明らかとなった。サイトカインであるIL-6産生に関しては両プロスタノイドとも濃度依存的に促進させたが、TXA_2の方がPGE_2と比べて25倍の産生促進効果を示した。LIFも同様にプロスタノイドの添加によってその産生は促進されたが、PGE_2の効果が顕著に大きい1例がみられた。ケモカインであるIL-8産生では、両プロスタノイドの添加によって濃度依存的にその産生が促進されたが、PGE_2の方がより効果的であった。MCP-1産生についてはどちらの因子を添加した場合でもその産生促進効果は大きく、10^<-6>Mの添加でコントロールの50倍程度の産生促進がみられた。RT-PCR法にてそれぞれのmRNA発現を調べた結果、いずれのサイトカイン・ケモカインの発現もプロスタノイドの添加により上昇していた。以上の結果をまとめると、PGE_2およびTXA_2DNA合成能をそれぞれ抑制または促進し、コラゲナーゼ産生を抑制、またサイトカイン産生に関しては促進させることが判明した。IL-6部よびLIFは骨芽細胞の分化抑制因子として、またIL-8は好中球の、MCP-1は破骨細胞の前駆体である単球の走化性因子であることを考え併せると、今回用いたプロスタノイドの刺激により、歯根嚢胞由来細胞は周囲の骨組織の代謝に影響を与えうるサイトカイン・ケモカイン産生を促進したと考えられる。なお本研究の成果は、第16回ヨーロッパ結合組織学会(1998年8月,ウプサラ,スウェーデン)にて発表した。歯根嚢胞の拡大は,嚢胞内溶液中に滲出してくるタンパク質やムコ多糖類の増加による浸透圧の上昇と,これにともなう内圧の亢進が一因となっていると考えられている。嚢胞内の浸透圧は,血清と比較して10mOSM程度高いことが報告されているが,タンパク質自体の集積によりこの浸透圧の上昇が起こることは考えにくい。そこで,嚢胞内溶液中のタンパク質が酵素により分解されれば浸透圧の上昇が起こるはずであると考え,実験的に解析を行った。アルブミン,ゼラチン,トランスフェリンまたはヒアルロン酸をトリプシンまたはヒアルロニダーゼで分解し,浸透圧に及ぼす影響を調べた。その結果,各種タンパク質の濃度を0.11,0%まで変化させても浸透圧はほとんど変化しなかったが,0.5%溶液をトリプシンにより分解すると,アルブミンでは約20mOSM,ゼラチンでは約8mOSM,トランスフェリンでは約11mOSMの浸透圧の上昇が認められた。これに対して,ヒアルロン酸では0.1%溶液で約11mOSMの浸透圧の上昇が認められ,ヒアルロニダーゼ処理による浸透圧の上昇はわずかであった。これらのことから,嚢胞内溶液中に滲出したタンパク質の酵素による分解,低分子化と,ヒアルロン酸自体の集積により浸透圧の上昇が起こる可能性が示唆された。次に,嚢胞内溶液中にマトリックス金属プロテアーゼ(MMP)が存在するかどうかを調べた。コラゲナーゼ活性はI型コラーゲンを基質として,その分解産物である3/4のバンドをSDS-PAGE後のゲル上で観察した。
胚特異的糖鎖抗原を介した母体の胚認識および胚着床・胎盤形成誘導機構の解析

本研究は透明帯の分解産物が胚特異的な糖鎖構造を介して母体に胚存在の情報を伝達する仮説に基づき計画された。具体的には、透明帯の免疫細胞に対する作用および傍大動脈リンパ節への伝達様式を検討し、さらに末梢血免疫細胞と血小板の子宮内膜とtrophoblastへの作用およびlaeverinの免疫細胞への作用を解析した。その結果、マウス透明帯で活性化する細胞群が観察され、またlaeverinが妊娠初期から分泌されること、さらにHLA-Gとともに胚の免疫寛容獲得に関与している可能性が示され、laeverinが子宮組織に浸潤していく絨毛外栄養膜細胞からの新規の胚シグナルであることが示唆された。本研究は平成20-22年度基盤研究(B)「生殖過程における組織再構築機構の解析-体循環細胞による再生機序の解明を目指して-」および平成22年度萌芽研究「免疫系による発生初期胚の認識機構-透明帯を利用した哺乳類の着床誘導戦略の証明-」の成果として、透明帯の分解産物が胚特異的な糖鎖構造を介して免疫系に胚存在のシグナルを母体に伝達すること、また新しく同定されたlaeverinが胚由来の特異的な糖蛋白として免疫細胞に作用する可能性が示されことなどの知見に基づき計画された。具体的には、透明帯の免疫細胞に対する作用および傍大動脈リンパ節への免疫シグナル伝達様式を明らかにし、さらに末梢血免疫細胞と血小板の子宮内膜とtrophoblastへの作用およびlaeverinの免疫細胞への作用を解析して、1)透明帯や血小板を利用した着床不全の治療法,2)習慣流産の診断と治療法、3)胎盤形成不全の早期診断と治療法を開発することを目的とした。初年度の成果としてはマウス透明帯を免疫細胞に作用させた場合にdendritic cellおよびT cellの中に活性化する細胞群が発見できた。またlaeverinが様々な糖鎖構造を有する糖タンパクであり、妊娠の極めて初期の段階から分泌されていること、さらにHLA-Gとともに胚の免疫寛容獲得に関与している可能性が新たに示された。これらの知見はlaeverinが母体組織に浸潤していく絨毛外栄養膜細胞からの新規の胚シグナルであることを示唆しており、生殖生理学的見地から重要な発見と位置づけられる。具体的には、透明帯の免疫細胞に対する作用および傍大動脈リンパ節への免疫シグナル伝達様式を明らかにし、さらに末梢血免疫細胞と血小板の子宮内膜とtrophoblastへの作用およびlaeverinの免疫細胞への作用を解析して、1)透明帯や血小板を利用した着床不全の治療法, 2)習慣流産の診断と治療法、3)胎盤形成不全の早期診断と治療法を開発することを目的とした。

その結果、マウス透明帯を免疫細胞に作用させた場合にdendritic cellおよびT cellの中に活性化するが、その作用に透明帯の糖鎖構造が関係する可能性が示された。またlaeverinが妊娠の極めて初期の段階から細胞外に分泌されていること、さらにdendritic cellの分化をを誘導し、HLA-Gとともに胚の免疫寛容誘導にも関与している可能性が示された。無理がない実験計画であったこともあり、初年度としては建設的な成果を得ることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はおおむね順調に進展している。本研究は概ね順調に進行しているが、ウシを用いた実験が必要となったため、平成23年度の最終期から新たな研究分担者として東京大学農学部の今川和彦博士に加わっていただいた。今後はウシの透明帯の糖鎖解析を加えて、大型動物で着床実験を行い、免疫細胞の機能解析と臨床応用に向かって有効な知見の蓄積を目指す。研究成果に対して論文作成のペースが遅くなっている。この点を改善して研究をすすめていく方針である。またLaeverinの糖鎖抗原に関しては分析方法に難があるため、当面はnativeではなく、recombinantのlaeverin分子を用いた実験を展開し、得られた所見を精製したnativeなlaeverin分子を用いて検証することとした。また透明帯についてはヒト体外受精への応用の可能性を示す知見が観察されたことより、臨床応用のプロトコール作成を本格的に進めていく予定である。
全ゲノム検索及び候補遺伝子アプローチによる自己免疫性甲状腺疾患感受性遺伝子の探索

(1)欧米白人自己免疫性甲状腺疾患(AITD)102家系を用いた甲状腺自己抗体(TAb)感受性遺伝子座の同定【目的】以前、我々は、欧米白人自己免疫性甲状腺疾患(AITD)102家系を対象とした全ゲノムスキャンによる連鎖解析で、AITD感受性遺伝子座(6p,8q,10q)、バセドウ病(GD)感受性遺伝子座(7q,14q,20q)、橋本病感受性遺伝子座(12q)をマッピングしだ。一方、抗サイログロブリン抗体(TgAb)や抗TPO抗体(TPOAb)橋本病感受性遺伝子座(12q)をマッピングしだ。一方、抗サイログロブリン抗体(TgAb)や抗TPO抗体(TPOAb)などの甲状腺自己抗体(TAb)は、AITDにおいて高率に陽性であり、また、健常者においても、10-5%で陽性であることが知られている。今回、我々は、AITD 102家系を用いて、全ゲノムスキャンを行い、TAb感受性遺伝子座を同定した。【対象】欧米白人AITD 102家系(540名)を用いた。【方法】ヒト染色体上に存在する400個のマイクロサテライト多型を全自動シーケンサーにてタイピングし、連鎖解析のうち、単点解析はLIPED softwareにて、多点解析及びheterogeneity testingはGenehunter programにて行った。【結果】AITD 162家系(540名)のうち、TAb(TgAb and/or TPOAb)を持つ健常者は78名であった。多点解析及びheterogeneity testingにて、以前、我々が同定した2q(maximum multipoint heterogeneity LOD score[HLOD] 2.8)の他、6p(HLOD 2.5)、8p(HLOD 2.2)が同定された。このうち、6pは、以前、我々が同定したAITD感受性遺伝子座(AITD-1)と一致し、8pにはTg遺伝子が含まれる。【結論】本研究にて、TAb感受性遺伝子座は、AITD感受性遺伝子座と一致し、TAb保持者はAITD発症のリスクが高くなることが示唆された。(2)候補遺伝子アプローチによる日本人AITD感受性遺伝子の同定【目的】バセドウ病(GD)や橋本病(HT)などの自己免疫性甲状腺疾患(AITD)は複数の遺伝要因と複数の環境要因の相互作用により発症する多因子疾患である。最近、1型糖尿病にて、免疫調節因子の一つであるPTPN22/LYP遺伝子、FOCP3遺伝子との疾患関連性が報告された。そこで今回、我々は、それぞれの遺伝子が日本人AITDにおいて疾患感受性を認めるかどうかを検討した。【方法】対象はAITD患者458名(GD385名、HT173名)と年齢と性別が一致した正常対照者179名を用いた。(1)PTPN22遺伝子の一塩基多型(SNP)はPTPN遺伝子内に存在する5個のSNPを用い、PCR-RFLP法及びSnaPshot法にて検出し、x^2検定にて関連解析及び連鎖不均衡解析を行った。(2)FOXP3遺伝子及びそめ近傍の4つのマイクロサテライト多型はPCR法により多型を含むゲノムDNA領域を増幅後、ABI310全自動シーケンサーにて検出し、X^2検定による関連解析及び連鎖不均衡解析を行った。【結果】(1)PTPN22遺伝子SNP37のCA遺伝子型はAITD患者及びHT患者で高率に認められた(35.2% vs. 26.3% of controls,p=0.03,0R=1.52;37.0% vs. 26.3% of controls,p=0.03,0R=1.65)。他のSNPではAITD群と正常対照群との間に分布の差を認めなかった。(2)FOXP3遺伝子及びその近傍の4つのマイクロサテライト多型ともに、AITD群と正常対照群との間に分布の差を認めなかった。【結論】日本人AITDにおいて、PTPN22遺伝子が新たな疾患感受性遺伝子であることが示唆された。(1)全ゲノムマッピングを用いた罹患同胞対解析による自己免疫性甲状腺疾患(AITD)新規疾患感受性遺伝領域の探索現在までに、昭和大学病院で日本人AITD罹患同胞対50ペア、昭和大学藤が丘病院で35ペアを収集しており、今後1年間で約35ペアを収集する予定。(2)候補遺伝子アプローチによる日本人AITD感受性遺伝子の同定【目的】欧米白人AITD102家系を対象とした全ゲノムマッピングで、AITDの疾患候補領域8q24、GDの疾患候補領域20q11が同定され、ポジショナルクローニングにより、それぞれサイログロブリン(Tg)遺伝子、CD40遺伝子が同定された。そこで今回、我々は、それぞれの遺伝子が日本人においても疾患感受性を認めるかどうかを検討した。【方法】対象はAITD患者485名(GD301名、HT184名)と年齢と性別が一致した正常対照者179名を用いた。Tg遺伝子の一塩基多型(SNP)は白人AITD患者で報告されたTg遺伝子内に存在する14個のSNPを用い、PCR-RFLP法及びSnaPshot法にて検出し、X^2検定にて関連解析及び連鎖不均衡解析を行った。また、白人GD患者で関連が認められたCD40遺伝子のプロモーター領域のSNP(CD40-E1SNP)はPCR-RFLP法にて検出し、X^2検定にて関連解析を行った。【結論】日本人においても、Tg遺伝子、CD40遺伝子ともに疾患感受性遺伝子であることが示唆された。

(1)欧米白人自己免疫性甲状腺疾患(AITD)102家系を用いた甲状腺自己抗体(TAb)感受性遺伝子座の同定【目的】以前、我々は、欧米白人自己免疫性甲状腺疾患(AITD)102家系を対象とした全ゲノムスキャンによる連鎖解析で、AITD感受性遺伝子座(6p,8q,10q)、バセドウ病(GD)感受性遺伝子座(7q,14q,20q)、橋本病感受性遺伝子座(12q)をマッピングしだ。一方、抗サイログロブリン抗体(TgAb)や抗TPO抗体(TPOAb)橋本病感受性遺伝子座(12q)をマッピングしだ。一方、抗サイログロブリン抗体(TgAb)や抗TPO抗体(TPOAb)などの甲状腺自己抗体(TAb)は、AITDにおいて高率に陽性であり、また、健常者においても、10-5%で陽性であることが知られている。今回、我々は、AITD 102家系を用いて、全ゲノムスキャンを行い、TAb感受性遺伝子座を同定した。【対象】欧米白人AITD 102家系(540名)を用いた。【方法】ヒト染色体上に存在する400個のマイクロサテライト多型を全自動シーケンサーにてタイピングし、連鎖解析のうち、単点解析はLIPED softwareにて、多点解析及びheterogeneity testingはGenehunter programにて行った。【結果】AITD 162家系(540名)のうち、TAb(TgAb and/or TPOAb)を持つ健常者は78名であった。多点解析及びheterogeneity testingにて、以前、我々が同定した2q(maximum multipoint heterogeneity LOD score[HLOD] 2.8)の他、6p(HLOD 2.5)、8p(HLOD 2.2)が同定された。このうち、6pは、以前、我々が同定したAITD感受性遺伝子座(AITD-1)と一致し、8pにはTg遺伝子が含まれる。【結論】本研究にて、TAb感受性遺伝子座は、AITD感受性遺伝子座と一致し、TAb保持者はAITD発症のリスクが高くなることが示唆された。(2)候補遺伝子アプローチによる日本人AITD感受性遺伝子の同定【目的】バセドウ病(GD)や橋本病(HT)などの自己免疫性甲状腺疾患(AITD)は複数の遺伝要因と複数の環境要因の相互作用により発症する多因子疾患である。最近、1型糖尿病にて、免疫調節因子の一つであるPTPN22/LYP遺伝子、FOCP3遺伝子との疾患関連性が報告された。そこで今回、我々は、それぞれの遺伝子が日本人AITDにおいて疾患感受性を認めるかどうかを検討した。【方法】対象はAITD患者458名(GD385名、HT173名)と年齢と性別が一致した正常対照者179名を用いた。(1)PTPN22遺伝子の一塩基多型(SNP)はPTPN遺伝子内に存在する5個のSNPを用い、PCR-RFLP法及びSnaPshot法にて検出し、x^2検定にて関連解析及び連鎖不均衡解析を行った。(2)FOXP3遺伝子及びそめ近傍の4つのマイクロサテライト多型はPCR法により多型を含むゲノムDNA領域を増幅後、ABI310全自動シーケンサーにて検出し、X^2検定による関連解析及び連鎖不均衡解析を行った。【結果】
沈み込み帯浅部における流体移動と水―岩石相互作用に関する実験的研究

本年度は、前年度に行った流通式水熱反応装置により作成したシリカ鉱物析出物の詳細な分析を行った。析出するシリカ鉱物は、溶液に含まれるAl濃度が0ppmから7ppmに増加するにつれて、アモルファスシリカ、クリストバライト、石英とより準安定な相へと変化する。電子プローブ顕微鏡でシリカ析出物中のAlとNa濃度を測定したところ、溶液中の濃度が増加すると増加する傾向にあり、特に石英の中では、NaとAlがほぼ等量含まれることが明らかになった。このことは、石英の結晶格子のSiを電荷を合わせるようにAl+Naで置き換えていることが示唆される。また、Alを含まない高Si溶液からはアモルファスシリカが核形成し、クリストバライト、石英へと変化するのに対して、Alが増加すると直接石英が析出するという現象に対して、核形成に関するモンテカルロシミュレーションを行い、定性的には水-シリカ、シリカ-シリカ間の界面エネルギーと溶解度(バルクの自由エネルギー)の相対的な大きさがこのようなバリエーションを生み出すことを明らかにした。本実験条件である高温(430°C)、高過飽和度(アモルファスシリカの溶解度より高Si濃度)は、地殻の内部において静岩圧から静水圧に変化したときに起こりえる。そのような際に、周囲の長石から溶け出す微量なAlの有無によって、シリカ析出量が全く異なる(Alを含む場合は含まない場合の5倍以上)ということを本研究結果は示唆している。地殻の水理学的・力学的性質は亀裂内のシリカ析出速度に大きく影響されるため、微量なALの与える影響は非常に大きいことが明らかにされた。また、葛根田地熱発電所のボーリングコアサンプルの中に存在する鉱物脈とシリカスケールのサンプルを入手し、化学組成と成長組織の解析を行い、水熱実験によるシリカ析出物との類似性を見いだした。本年度は、流通式水熱反応実験装置を設計・構築し、Siに過飽和な水溶液からのシリカ鉱物析出実験を行った。シリカ析出実験により、シリカ鉱物の析出様式が過飽和度と微量に含まれるAl濃度によって系統的に変化することを見出した。Alのまったく含まれない純粋なSi溶液からは、アモルファスシリカが析出するのに対して、2-3ppmのAlが含まれ場合はクリストバライトが卓越し、より高濃度の場合は石英が支配的な析出物になる。また、析出速度はAlの量が増加するに従い大きくなる。地殻には長石等のAlを含む鉱物が多く存在するため、このAl濃度は地殻におけるシリカ析出に対して大きく影響すると考えられる。また、析出様式は、石英基盤からの成長と核形成を伴う析出(準安定鉱物の形成を含む)に分けられるが、従来の研究では前者の反応速度のみしか分かっていない。本研究では、基盤が存在しない条件下での反応速度を導出し、温度とAl濃度の依存性の影響を評価した。これにより、表面反応と核形成両方を含む包括的な反応速度式の導出に成功した。これは、地殻における石英脈形成や地熱発電のスケール形成まで幅広く適用可能である。また、人工的に石英脈を作成する実験を行い、複屈折イメージングシステムを用いて解析を行い、結晶方位と結晶形状の発達を定量的に評価した。これにより、鉱物脈の組織から、き裂閉塞時の間隙構造の変化を予測することを可能とする。また、多孔質媒体中にシリカが析出する際の透水率変化を測定し、周囲の管壁が変形しえる条件下では、特徴的な振動が発生することを見出した。この現象をより詳細に理解することは、地震発生のサイクルと流体圧の変化との関係に新しい視点が与えられると期待される。
がん細胞浸潤の４次元解析に関する研究

本年度の研究では、緑色蛍光発現正常ラット胃粘膜細胞株(RGM-GFP)および赤色蛍光発現がん様変異RGM細胞株(RGK-KO)の2種類の細胞を用いて、これら2種類の細胞が治療法開発などの医学研究および3次元培養システム構築など細胞工学研究に有用な細胞材料であるか検討を行った。RGM-GFPおよびRGK-KOによる共培養の利点は、共培養した状態であっても、蛍光観察によって披見細胞を同定でき、正常細胞とがん細胞に対する効果を簡単に見分けることができる。さらに2種類の細胞を共培養することで、生体内を模倣する環境をディッシュ上に再現できると考えられる。医学研究への細胞材料応用として、RGM-GFPおよびRGK-KOの正常ーがん細胞共培養によりがん選択的殺傷効果を示す薬剤スクリーニングや放射線治療の効率的照射条件の探索への応用性を検討した。抗がん剤を曝露した結果、正常細胞・がん細胞問わずに殺傷する薬剤、がん細胞選択的に殺傷する薬剤を顕微鏡下で容易に区別可能であった。一方、放射線の照射線量を変化させることで、死滅する細胞数の変化だけでなく、がん選択的な殺傷効果に対しても変化が生じることが明らかとなった。これらの実験では経日的な観察を行っており、細胞が死滅し始めるターニングポイントとなる時間も同時に推測できた。3次元培養下でRGM-GFPおよびRGK-KOがどのような挙動を示すかに関しても検討を行った。一般的に、正常細胞はゲル中へ浸潤せず、がん細胞は浸潤することが知られている。マトリゲル上にRGM-GFPあるいはRGK-KOを播種して培養した結果、RGM-GFPはゲル中へ浸潤せず、RGK-KOはゲル中へ浸潤する性質を示した。以上の検討から、RGM-GFPおよびRGK-KOの共培養システムは、薬剤スクリーニングや3次元培養システムの構築に貢献することが可能であった。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究では「1.正常ーがん細胞クロストークが細胞に与える影響」と「2.薬剤投与による細胞秩序の崩壊および細胞秩序の回復と組織の再構成挙動」について検討を行った。これらの検討により1.2次元平面上での正常細胞とがん細胞が形成する細胞社会秩序がどのように形成されるのか、あるいは2.抗がん剤が正常細胞とがん細胞に対して同一比率で殺傷効果を示すのかを明らかにした。1.の結果、正常細胞とがん細胞は同一比率で混合した場合には初期播種細胞量に関わらず2472時間の間に境界がはっきりとわかる正常細胞群とがん細胞群が形成されていた。2種細胞間での境界は基本的に交わることが無いが、局所的に境界が交わっている領域を3次元画像撮影すると、正常細胞の下にがん細胞がもぐり込み浸潤していた。どのような条件下でがん細胞が正常細胞の下に浸潤していくのかはまだ明らかではない。2.の実験では抗がん剤5-FU,ドキソルビシン、シスプラチンの3種類を用いた。同数の正常細胞とがん細胞共培養中に24時間抗がん剤を曝露して細胞秩序を崩壊し、薬剤不含有細胞培養培地に交換して1週間程度まで細胞社会秩序の再構築挙動を評価した。その結果、ドキソルビシン、シスプラチンは両細胞に対して同等の細胞殺傷効果を示した。また、細胞社会秩序の再構築挙動においても初期状態と生存細胞の正常/がん細胞比は変わっていなかった。しかし、5-FUを細胞に曝露して再構築挙動を見た結果、薬剤曝露後72時間で正常/がん細胞比が明らかに正常細胞有意となる結果が見られた。

本現象について5-FUまたはシスプラチン曝露時のタイムラプス撮影を行うと、薬剤曝露時には細胞の死滅はほとんど観測されないが、正常培地に交換後72時間ほどで一気にがん細胞が死滅していくことが明らかとなった。上記検討はがん悪性化のメカニズム解明と、効率の良いがん化学療法を推進する結果である。H23年度は,視覚で容易に細胞挙動を見られる緑色蛍光発現ラット正常胃粘膜細胞RGM-GFPおよび赤色蛍光発現ラット正常胃粘膜細胞由来がん様変異細胞RGK-KOの2種類を樹立し,3次元培養中での細胞の浸潤挙動を観察した.合わせて,活性酸素消去遺伝子発現がん様変異細胞RGK-MnSODを用いて細胞の動きに対する検討を行った.1)活性酸素に着目した細胞の動きに対する解析:活性酸素を消去する内在因子としてマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)がある。これはミトコンドリア由来の活性酸素を特異的に消去する酵素であるが、本酵素を発現させることにより細胞の動きが抑制される結果を傷害修復試験から得られた。2) 3次元培養状態での細胞形態の解明樹立したRGM-GFPおよびRGK-KOを用いてマトリゲルに対する細胞浸潤挙動を確認した。正常細胞はマトリゲル上に積層したまま浸潤することは無かったが、RGK-KOは経日的に浸潤突起を伸ばしながら浸潤する挙動が見られた。またRGK細胞の3次元培養をタイムラプスにより観測したところ、浸潤突起は先端を揺らしながら徐々に伸びていく様子が見られた。以上視覚的に鑑別可能ながん正常培養細胞共培養系を確立し、細胞のタイムラプス観察によって正常細胞とがん細胞の動き:特に細胞間基質を越える能力の有無と三次元的増殖能の有無が大きく頃なることを見いだした。さらにこの差異がミトコンドリア由来活性酸素に由来することを示唆する結果を得ている。がん細胞がコンフルエントな正常細胞の細胞間基質や細胞の下に潜り込んで移動する様子を経時観察できたことは従来知られていた浸潤様式を根本から覆す結果であり、今後の研究の方針決定に大きく寄与したといえる。今後はこらえらの結果に基づいてがんの増殖や浸潤に関する検討を加えて行く上述したようにGFPタンパクを恒常的に発現する胃粘膜正常培養細胞系RGM-GFPとKOGFPタンパクを恒常的に発現する胃粘膜がん培養細胞系RGK-KOに加えて、ミトコンドリア特異的活性酸素消去酵素MnSODを恒常的に発現する細胞系RGM-MnSOD,RGK-MnSODを用いた系で研究課題を推進する。がん細胞がコンフルエントな正常細胞の細胞間基質や細胞下を遊走可能である事に着目し、コンフルエントな正常細胞上に各種抗がん剤の濃度グラデーションを作成する。赤色蛍光タンパクを発現させたがん細胞の動きをタイムラプス観察し、「がん細胞が抗がん剤から逃げる能力を有するか」を検討する。以上の研究計画には横浜国立大学福田淳二同研究班員と共同研究を行う。この一連の浸潤に関連する細胞運動にミトコンドリ由来の活性酸素が果たす役割についても検討を加える。さらにがん遊走(がん浸潤突起形成)に関与するアクチン、低分子GTPタンパクを阻害するような薬剤の効果についても検討を加える予定である。
変動環境の集団遺伝学理論の整備と検証

本総合研究が始まるまでは、環境変動モデルの性質は、主に強突然変異極限について調べられたが、ここでは、DNA座位ごとのデータとの比較上より現実的と考えられる弱突然変異極限が調べられ、パイテイモデルの定常解が求められた。これにより進化速度と多型が環境変動率にどのように依存するかが明らかになった。突然変異率が進化速度よりも平均的に大きいことや、進化速度が機能的制約や多型とどう関連するかが、中立説のモデルを特別の場合として含みつつ、半定量的に説明できるようになった。通常、多型に及ぼす環境変動の効果は通常小さいが、進化速度は、sN>1(s選択係数)であれば、ほぼ環境変動率に等しくなることが判った。また座位数が2の場合についても研究が進み、協調進化やヒッチハイク効果などについての知見が増した。実測データとの比較研究では進化速度や多型のあり方と置換のタイプとの相関に注目して、アミラーゼ遺伝子、HLA遺伝子、病原性ウイルス、さらにはイネ、コムギや霊長類などについて検討が進められたが、まだ一般的な結論にまでは達しなかった。一方、量的形質の進化については、遺伝状態の表現値は連続実数値を取るとしてのモデル化が適切であろう。こうした場合、環境の非一様性が、どのような条件下でどのような多型をもたらすかについても新たな成果が得られた。変動環境がチョウの羽化季節など生物の生活史戦略に及ぼす効果や、ファージ集団の多様性維持に及ぼす効果についても理論的検討が進み、生物的環境として見たウイルスが有性生殖の維持に及ぼす効果のヒヨドリバナについての野外観察による検討も進められた。DNAレベルでの分子進化のデータ解析により、同義置替と異義置換とでそのパターンがかなり違うことが判り、特に種間差異と種内変異との比率においてしばしば顕著な差が認められるようになった。これは、置換数の分散と平均との比率とともに、分子進化機構論上大事な問題である。DNAの塩基座位当りの突然変異率が小さいことを利用して簡単化を行うと、変動環境効果の導入によって、定常状態としてこれらを理論的に説明しうることが判った。多型と進化を定常状態として統一的定量的に取り扱おうとした木村太田理論の特長は変動環境効果の導入によって生かされると代表者は考えるが、この当否の検討は、分子レベルの適応進化の種々相と環境変動理論との関連性の追究と相まって、次年度以降の主要課題である。後者については、突然変異率や有性生殖など生物の遺伝機構、アミラーゼ遺伝子やMHC遺伝子など、生物の生存機構の環境適応性が種々の研究分担者に依ってほぼ独立に研究が進められ、2回の全体会議において意見の交換が行われた。次年度以降はこの分野の実地研究者と理論研究者との具体的共同研究に進展するよう努力したい。分子レベルの環境適応の種々相について研究を進めている他の研究グループとの連絡を活性化するために、10月に日本生物物理学会年会においてシンポジウムを開き、高等動物のゲノムの構造化(池村淑道)、ヘモグロビン(今井清博)、好熱菌(山岸明彦)などの環境適応の講演を依頼し意見交換をした。2月に全体会議を開いて分担者からの報告を聞いて討論した。変動環境の集団遺伝学理論については、1座位2状態モデルに限定すれば、弱突然変異極限と強突然変異極限において厳密な定常解が得られること、多型と進化速度について従来の中立モデルや弱有害モデルを特別な場合として包含する結果が得られることが伴った。2座位の場合にも幾分か知見が得られたが、多座位の場合はまだ手付かずに残された。こうして整備された理論が、Adhやアミラーゼの進化のパターンや進化速度の世代時間効果など、従来のモデルでは説明困難な分子進化のデータの理解にどの程度役立つか、環境変動効果導入の必要性についての検証は次年度に残された最重要課題の一つである。

また、集団遺伝学理論がどの程度過去の集団サイズや移動の模様を推測するのに役立つかについて、ヒト集団についての具体的試みや、系図学的モデルについての知見が報告された。一方、変動環境がチョウの羽化季節など生物の生活史戦略に及ぼす効果の理論や、ファージ集団の多様性維持に及ぼす効果についても理論的検討が進み、生物的環境として見たウイルスが有性生殖の維持に及ぼす効果のヒヨドリバナについての野外観察による検討も進められた。本総合研究が始まるまでは、環境変動モデルの性質は、主に強突然変異極限について調べられたが、ここでは、座位ごとのデータとの比較上現実的と考えられる弱突然変異極限が調べられ、パリテイモデルの定常解が求められた。これにより進化速度と多型が環境変動率にどのように依存するかが明らかになった。また、突然変異率が適応的に定まっているとすると、それは進化速度よりも平均的に大きくなることが導かれた。この場合、多型に及ぼす環境変動の効果は通常小さいが、進化速度は、sN>1(s:選択係数)であれば、ほぼ環境変動率に等しくなることが判った。また座位数が2の場合についても研究が進み、強調進化やヒッチハイク効果などについての知見が増した。実測データとの比較研究では進化速度や多型のあり方と置換のタイプとの相関に注目して、アミラーゼ遺伝子、HLA遺伝子、病原性ウイルス、さらにはイネ、コムギや霊長類などについて検討が進められたが、まだ一般的な結論にまでは達しなかった。以上では、複製子の遺伝状態が2個ないしは数個とするモデルが有用と考えられるが、量的形質の進化については、遺伝状態はむしろ連続実数値を取るとしてのモデル化が適切であろう。こうした場合、環境の非一様性が、どのような条件下でどのような多型をもたらすかについても成果が得られた。また、変動環境がチョウの羽化季節など生物の生活史戦略に及ぼす効果や、ファージ集団の多様性維持に及ぼす効果についても理論的検討が進み、生物的環境として見たウイルスが有性生殖の維持に及ぼす効果のヒヨドリバナについての野外観察による検討も進められた。
インプラント患者における口腔感覚と咬合力の変化に関する研究

インプラント患者において1.ゴム硬さ弁別およびその時の咬合力(弁別時咬合力)の同時測定,2.プレスケール実験を行うことにより,インプラント患者における口腔感覚と咬合力の変化を検索した.その結果,(1)ゴム硬さ弁別実験の正常有歯顎者群における正解率は左側で75.2±3.94% (mean±SD),右側で72.25±2.96%,インプラント患者群における正解率は天然歯側で70.66±4.50%,インプラント側で68.66%7.11%であった.以上より被験者間および左右側の正解率に有意な差は存在しなかった.(2)ゴム硬さ弁別時の咬合力は正常有歯顎者群の左側で49.18±3.22N (mean±SD),右側で45.54±3.80N,インプラント患者群における弁別時咬合力は天然歯側で63.31±11.11N,インプラント側で62.42±10.37Nであった.以上より正常有歯顎者群の左右側間およびインプラント患者群の被験歯間の弁別時咬合力に有意差は存在しなかった.しかし,ゴム硬さ弁別時の咬合力はインプラント患者群が正常有歯顎者群と比較して有意に大きかった.(3)プレスケール実験のインプラント単独植立者におけるインプラント側および健常側での咬合力の比較では,有意な差は認められなかった.また,インプラント単独植立者および健常者での,中心咬合位における総咬合力量ならびに咬合力分布様式にも差は観察されなかった.以上より,インプラント患者においては歯根膜感覚の喪失を他の口腔感覚により補償し,咬合力を変化させ調節しているものと思われる.インプラント患者において1.ゴム硬さ弁別およびその時の咬合力(弁別時咬合力)の同時測定,2.プレスケール実験を行うことにより,インプラント患者における口腔感覚と咬合力の変化を検索した.その結果,(1)ゴム硬さ弁別実験の正常有歯顎者群における正解率は左側で75.2±3.94% (mean±SD),右側で72.25±2.96%,インプラント患者群における正解率は天然歯側で70.66±4.50%,インプラント側で68.66%7.11%であった.以上より被験者間および左右側の正解率に有意な差は存在しなかった.(2)ゴム硬さ弁別時の咬合力は正常有歯顎者群の左側で49.18±3.22N (mean±SD),右側で45.54±3.80N,インプラント患者群における弁別時咬合力は天然歯側で63.31±11.11N,インプラント側で62.42±10.37Nであった.以上より正常有歯顎者群の左右側間およびインプラント患者群の被験歯間の弁別時咬合力に有意差は存在しなかった.しかし,ゴム硬さ弁別時の咬合力はインプラント患者群が正常有歯顎者群と比較して有意に大きかった.(3)プレスケール実験のインプラント単独植立者におけるインプラント側および健常側での咬合力の比較では,有意な差は認められなかった.また,インプラント単独植立者および健常者での,中心咬合位における総咬合力量ならびに咬合力分布様式にも差は観察されなかった.以上より,インプラント患者においては歯根膜感覚の喪失を他の口腔感覚により補償し,咬合力を変化させ調節しているものと思われる.
有機反応における原始トンネル効果

有機分子間および有機分子内トンネル水素原子移動反応の機構を明らかにすべく,10Kから常温にわたる温度領域での水素原子引抜反応,付加反応および交換反応をESR,赤外分光法,質量分析法,および生成物分析などで調べた。その結果,以下の事実が明らかになった。1)反応系の熱活性化の頻度が低い低温では一般にトンネル反応が優先する。2)トンネル反応の速度は,トンネル障壁の面積およびトンネル粒子の有功質量に指数関数的に依存する。トンネル入り口と出口とで反応系の分子構造が変化する場合,トンネル速度は媒体の粘性に大きく依存する。これは粘度の高い媒体ではトンネル過程での反応系の分子変形が妨げられる結果,トンネル面積が増大することによる。3)トンネル水素原子移動反応は宇宙化学において重要な働きをしている。トンネル水素原子移動反応は一般に引抜き反応,二重結合への付加反応,ラジカルへの付加反応の順に早くなる。低温エチレン薄膜への水素原子スプレイの場合,二重結合への水素原子付加で生じたエチルラジカルは別の水素原子をすぐに付加してしまうため,エタンとなってしまう。低温では,水素原子の二重結合への付加は温度が低くなるほど効率よくなる。これは温度が低いほど水素が二重結合に接近し易いためと考えられる。4)カルベンやニトレンの低温での分子内水素移動に対するトンネル障壁の形状は,分子の電子配置および1重項-3重項間のエネルギー差によって大きく影響される。5)BINAP錯体触媒による不斉水素化反応は,合成化学上極めて重要な反応であるが,この反応は,常温ではトンネル原子移動の寄与は少なく,通常の熱活性化プロセスで進行する。本研究では,化学反応における原子のトンネル効果の影響を解明すべく,(1)低温固相での分子間水素原子トンネル移行反応における反応制御因子を明らかにするとともに,(2)対象を2原子移動を伴うカルベンの低温化学反応に拡張することにより,原子トンネル反応に対する電子スピン状態の影響などを知る.また(3)星間塵を模した極低温系での分子生成反応を解明することにより,宇宙空間での生命の′′たね′′分子生成過程における原子トンネル効果の寄与を明らかにするとともに,(4)生命体の特徴である対掌性選択的な化学反応における原子トンネルの影響を明らにする.以上の4課題の研究により,単純な分子から生命体に渡る有機反応における原子トンネルの効果を明らかにする.以下に平成8年度の研究成果を述べる。(1)低温有機マトリックス中で原子トンネル機構で進行するC-H結合からの水素原子脱離やC=C2重結合への水素原子付加反応で生じるアルキルラジカルの同定を行うべく,ENDOR付きのESRスペクトロメーターを購入し,装置の整備をおこなった。(2)一重項および三重項中性二価活性動(カルベン、ニトレン)へのトンネル水素原子移行の選択性を,生成物分析によって明らかにすべく,高分解能質量分析計を購入し,装置の整備をおこなった。また,一重項ではプロトントンネルが,三重項では水素原子トンネルが生じ易いことを明らかにした。(3)星間塵を反応場とする生命の材料分子の生成過程でのトンネル反応の寄与を明らかにすべく,極低温真空反応装置および生成物その場分析のための赤外分光光度計を購入し,装置の整備をおこなった。(4)高い水素分子活性化能力を有する錯体触媒である2, 2'-ビス(ジオフェニルホスフィノ)-1, 1'-ビナフチル(BINAP)の引き起こす水素移動反応におけるトンネル効果を,反応に対する重水素化の影響から明らかにすべく,重水素分析装置を購入し,装置の整備をおこなった。(1)低温箇相でのアルカンからの水素原子のトンネル引き抜き反応の機構を明らかにすべく、部分重水素化した直鎖および分岐アルカンを用いて、反応速度に対する分子内の炭素位置依存性を調べた。その結果、水素引き抜き反応の速度は活性化エネルギーだけでなく,引き抜きが起こる炭素の運動性にも依存する事がわかった。

(2)室温付近での三重項カルベンによる水素原子トンネル反応の可能性を調べるとともに、トンネル反応のおこる機構を調べる目的で、今年度は、分子内での水素引き抜きに対する、速度論的重水素同位体効果を測定した。その結果、引き抜きの遷移状態が六員環の場合より、五員環の場合の方が速度論的同位体効果が大きくトンネルの可能性が高いことを見い出した。このことは、古典的な遷移状態からのずれがトンネルの起こる要因の一つであることを示唆するものと考えられる。(3)10Kの低温基板に、C,O,N原子を蒸着し、これと水素原子を反応させた。生成物として、各々、メタン、水、アンモニアが生成することを確認した。さらに、10Kで、COと水素原子を反応させたところ、ホルムアルデヒド、メタノール、さらには、メタンが最終生成吻として生成することを見いだした。これらの実験結果は、これまで天文化学の分野で仮説として導入されていたトンネル機構を含む固相反応機構を初めて検証したものである。(4)全反射式赤外分光型水素化速度解析装置の製作等を行い触媒反応を構成する素反応を正確に把握するための技術基盤を整備するとともに,標準エナミド基質となっている(Z)-α-(ベンズアミド)桂皮酸エステルの触媒的不斉水素化反応を取り上げ,1)触媒前駆体の単離および構造解析、水素化基質および生成物の基底状態構造の固相・液相での精密解析,2)水素化条件と選択性との関連,反応基質構造とエナンチオ選択性との相関の調査,3)BINAP遷移金属錯体の電子的,立体的構造の触媒活性,立体選択性に及ぼす影響,4)基質・触媒複合体あるいはそのモデル物質の単離・構造研究等を行い、本反応に対する理解を深めた。(1)アルカンからのトンネル水素原子引き抜き反応の機構を明らかにすべく,低温有機ガラスおよびアダマンタン中での溶質分岐アルカンからの水素原子引き抜き反応速度に対する分子内の炭素位置依存性を調べた。その結果,トンネル速度は反応時の分子変形に対する媒体の抵抗が大きいほど低下することがわかった。(2)オルソ位に水素供与基を持つ三重項カルベンおよびニトレンの低温での分子内水素移動を赤外吸収法で調べた。主反応はオルソキノイド化合物を与える水素移動だがその反応速度は化合物によって大きく異なった。これはトンネル水素移動速度が分子の電子配置および1重項-3重項間のエネルギー差によって影響を受けたためであると考えられる。(3) 10Kの低温基板に有機物を蒸着し,これに水素原子を降りかけて生じる反応生成物を,赤外吸収法および質量分析法で調べた。アセトンからはメタンおよびメタノールエタノールが生じたが,アセトンの酸素に水素が付加して生じる初期ラジカルと水素原子との付加反応が遅いため,2-プロパノールは生じなかった。これに対してエチレンでは水素付加によって生じたエチルラジカルに更に水素が付加して生じたエタンが主生成物であった。これらの実験結果は、本研究手法が,宇宙化学で重要と考えられる原子トンネル機構を含む固相反応機構の様相を知るのに適した方法であることを示している。(4) BINAP錯体触媒によるα-(アシルアミノ)
高強度・高弾性繊維の損傷過程のナノメータAFM観察と動的環境強度特性に関する研究

有機繊維であるアラミド繊維,セラミックス繊維であるγ-アルミナ繊維,SiC繊維,Si-C-Ti-O繊維を選び,単繊維の機械的性質と疲労特性に及ぼす水環境,真空環境などの環境効果について検討を加えるとともに,原子間力顕微鏡(AFM)による原子オーダの繊維表面の3次元形状を評価して,損傷機構について検討を加えた。まず,セラミックス系繊維である,アルミナ繊維,SiC繊維,Si-C-Ti-O繊維の引張強度は水環境の影響を強く受け,真空環境,大気中,湿潤環境の順に環境中の水分量が多いほど強度が低下することを明らかにした。さらに,AFMを用いて繊維表面のナノメータオーダの損傷について詳細に観察して,水分子によるSCGにより生じた微小損傷を可視化することに成功するとともに,その微小損傷は水環境と応力保持の相乗効果により一層顕著になることを示し,繊維劣化機構について考察を加えた。また,アラミド繊維については,吸水と真空環境にさらすことにより引張強度が低下すること,また真空環境中に放置した後,空中に環境を変動することにより,さらに強度が低下することを明らかにした。また,疲労特性については,鉄鋼などの金属材料と比較するとS-N曲線の傾きは小さく,耐疲労特性に優れていること,また疲労強度特性は真空環境中のほうが実験室大気中よりも大きくなり,引張強度特性に及ぼす真空環境効果とは全く逆の結果となることを示した。さらに,繊維表面を原子間力顕微鏡を用いて詳細に観察し,アラミド繊維の代表的な損傷であるスプリッティングの初生段階であるnmオーダの表面損傷の可視化に成功するとともに,繊維表面損傷に及ぼす真空,吸水環境,さらに動的荷重負荷の影響を明らかにして,アラミド繊維の引張強度と疲労強度特性に及ぼす環境効果について考察を加えた。有機繊維であるアラミド繊維,セラミックス繊維であるγ-アルミナ繊維,SiC繊維,Si-C-Ti-O繊維を選び,単繊維の機械的性質に及ぼす水環境,真空環境,電子線照射,紫外線照射効果について検討を加えるとともに,原子間力顕微鏡(AFM)による原子オーダの繊維表面の3次元形状を評価して,損傷と変形機構について検討を加えるとともに,繊維の疲労試験を実施した。アルミナ繊維,SiC繊維,Si-C-Ti-O繊維の引張強度は水環境の影響を強く受け,真空環境,大気中,湿潤環境の順に環境中の水分量が多いほど強度が低下することを明らかにした。さらに,繊維表面をAFMにより詳細に観察して,アラミド繊維では,吸水により「溝」状損傷が,また,高温や真空環境に曝すことにより「ふくれ」状損傷がもたらされ,これらの損傷により繊維スプリッティングが促進されて強度が低下することを明らかにした。さらに,高強度・高弾性繊維の動的環境強度を,環境質を制御した条件下において明らかにするため,微小な荷重を制御よく負荷することのできる,環境質制御微小材料疲労試験機を試作し,それを用いて,μmオーダの微小径のアラミド繊維の疲労試験が十分な精度で実施可能であることを示すとともに,アラミド繊維の疲労強度特性は金属材料に比較して優れていることを明らかにした。有機繊維であるアラミド繊維,セラミックス繊維であるγ-アルミナ繊維,SiC繊維,Si-C-Ti-O