hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞の増殖・分化におけるリボソーム遺伝子の調節機構

この3年の研究期間に主として以下の3つの方向に大きな成果が得られた。1.マウスUBF(mUBF)の核小体局在化機構の解明と、mUBF遺伝子の転写調節領域の解析。mUBFが核小体に濃縮される機構を、mUBFの各種ドメイン欠損変異体を作って調べた所、mUBFはHMGbo×4の中にある核移行シグナルによって核に入った後、HMGbo×1と酸性ドメインによるrDNAおよびTFID/SL1への強い親和性によって核小体に集積することが明らかとなった。一方mUBF遺伝子の上流欠失体を作成してCATアッセイすることにより、この遺伝子がSP1結合サイトを複数個持つhouse keeping遺伝子様の制御領域を持つことがわかった。2.増殖が抑制された細胞中のRNAポリメラーゼI阻害因子(PIN)の固定。血清除去又は増殖後静止期に入ったFM3Aマウス乳癌細胞の抽出液中にrDNAの転写を特異的に阻害する因子を見出し、これをPINと名付けた。これは転写開始複合体形成後のRNAポリメラーゼI(PolI)の発進を阻害するらしい。3.マウスPolIのサブユニット構造の解明と、RPA40サブユニットおよびPolI結合因子PAF53のクローニング。新しいPolI精製法を開発し、マウスMH134細胞より高度に精製した所、2つの大サブユニットと12個程の小サブユニットから成ることがわかった。これは酵母のそれとよく一致し、PolIが進化上極めてよく保存されている事を示した。又、PolIに結合する分子量53KDの蛋白質(PAF53)をクローン化し、これがPolIおよびUBFと結合してrDNAの特異的転写を促進することを証明した。1マウスUBF(mUBF)の核小体局在化機構の解析mUBFが核小体に濃縮される機構を知るため、mUBFの各種ドメインを欠いた変異体を作りこれをβがクラトシダーゼと融合させてcos7細胞で発現させた。坑βがラクトシダーゼ抗体によってこれら変異体の核小体への集績を調べた所、次の事が明らかとなった。1)mUBFは核移行シグナル(NLS)をHMGbox4の中に持つが、これのみでは核へは入るが核小体へは移行しない。2)mUBFのHMGbox1とC末の酸性ドメインの両者が核小体移行に必要である。3)mUBF変異体のUCE(上流制御要素)との結合性と核小体集績性との問には密接な正の相関があり、mUBFはNLSによって核へ移行した後、HMG-box1と酸性ドメインによるrDNA(+SLI)への強い親和性によって核小体に集績するものと考えられる。2増殖が抑制された細胞中のRNAポリメラーゼI阻害因子の存在。血清除去又は増殖後静止期に入ったFM3Aマウス乳癌細胞の抽出液中にrDNA転写を特異的に阻害する因子を見出した。これは転写開始複合体の形成後の或る段階を阻害するものらしい。3マウスRNAポリメラーゼI(PolI)のサブユニットRPA40およびPolIに結合した因子PAF53のクローニングとその解析。新しいPolI精製法を開発し、マウス細胞より精製した所、マウスPolIは2つの大サブユニットと10以上の小サブユニットから成立つことがわかった。このサブユニットは酵母のそれとよく一致し、PolIが進化上極めてよく保存されている事が証明された。一方、PolIに結合して働く分子量53KDの因子(PAF53)をクローン化した。これは、PolIと結合してrDNAの特異的結合を促進する作用を有するものと考えられる。1.マウス精製PolIに含まれる53KDのタンパク質をクローン化し、PAF53(Polymerase associated factor 53)と名付けた。

PAF53は434アミノ酸から成り、今迄に知られた転写因子のモチーフは持っていないが、マウスの切出修復に関与する遺伝子と考えられるERCC3の産物と部分的に有意のホモロジーが認められた。PAF53に対する抗体はIn vitroの転写系で非特異的DNAの転写は抑制しないが、rDNA上のプロモーターによる特異的転写開始を強く阻害する。又ラベルした分子による結合実験でPolIの転写促進因子を一つであるUBF(upstream binding factor)と相互作用を営むことが見出された。従ってPAF53はPolIとUBFの間で働いて転写開始に重要な役割を果たす因子であると考えられる。2.定常期又は血清欠乏状態のマウス培養細胞FM3Aの核内に、rDNAの転写を抑制する因子を見出しPIN(PolI transcription inhibitory activity)と名付けた。この作用はPolIによるrDNAの転写に特異的であり、PolIIの系には働かないことからも単なるヌクレアーゼの様なものではない。この因子は細胞に血清を与えて増殖期にすると速やかに消失する。ゲルシフトとペレット転写法による解析によると、PINは転写開始複合体の形成は阻害しないが、そこから先のPolIの転写開始自体を抑制するようである。
化石燃料の燃焼に伴い発生・輸送される微量成分の地球化学的研究

化石燃料の燃焼に由来する微量物質として二酸化硫黄、フッ素、窒素酸化物、多環芳香族炭化水素(PAH)などがあり、これらは長距離輸送される可能性がある。中国・北京郊外、わが国の日本海側および東京郊外において大気降下物、エアロゾルなどを採取し、これらの地球化学的な挙動を調査研究した。北京郊外において降水中の硫酸イオンやフッ化物イオンの濃度や降下量は東京郊外に比べ数倍大きかった。とくに、東京郊外の森林小流域ではフッ化物イオンのインプットの約105%が流出したが、北京郊外の小流域ではその約81%は蓄積されていることが明らかとなった。わが国における大気降下物中の硫酸イオンの硫黄安定同位体比(δ^<34>S)の測定より、冬季の日本海側に降下するδ^<34>S値の高い非海塩硫酸イオンは内陸部の山岳地帯を越えて関東平野まで達していることが推定された。また、わが国での大気降下物中のフッ化物イオン濃度は夏季に低く、冬季から春季にかけて高い傾向が認められ、大陸での石炭燃焼の影響が考えられた。大気エアロゾル中のPAH濃度は東京に比べ北京で1桁高く、FluorantheneとPyreneの比より北京では固定発生源が、東京では自動車の寄与が相対的に大きいと推定された。また、日本海側の島根県松江市で大気エアロゾル中のPAHを測定した結果、Benzo-(a)pyrene /Benzo(e)-pyreneの値は小さくこれらPAHは長距離輸送されていること、Fluoranthene /Pyreneの値は1.0以上で固定発生源の寄与が大きいことが推定された。硫黄を含むPASHも検出され、その中で優占したのはPhenanthrothiophene、Benzophenanthrothiopheneなど低分子化合物であることがわかった。中国・北京郊外と日本国・東京郊外の森林集水域および日本海側の松江市内において大気降下物、エアロゾルを採取し、化石燃料の燃焼に由来する微量物質である硫酸イオン、フッ化物イオン、多環芳香族炭化水素(PAH)などを測定し、それらの挙動について考察した。またPAHのなかで硫黄を含むもの(PASH)の測定法を検討した。北京郊外の森林集水域(Bj)と東京多摩丘陵の森林集水域(Tk)の林外雨中の硫酸イオンの平均濃度は325,39.4μeq/1で、前者で8.2倍大きかった。またフッ化物イオンの平均濃度は9.81,1.18μeq/1で、Bjで8.3倍大きかった。森林集水域における夏季3ヶ月の物質収支を比較すると、Bjでは、フッ素のインプットの約81%は集水域内に蓄積されたが、Tkではほぼ100%が流出した。中国ではエネルギー源の約75%を石炭に依存しており、その燃焼過程によりフッ素は生成される。フッ素は5mg/1以上の濃度で植物に対し有害であると言われ、このままフッ化物イオンの降下が続けば、植物へ直接的な被害を与えることが考えられる。また硫酸イオンの降下が続けば、森林集水域における物質収支のバランスが崩れ、森林、土壌への影響が懸念される。今後の監視が極めて重要であろう。北京郊外(Bj)と東京郊外(Tk)の森林集水域において大気降下物(林外雨、林内雨、樹幹流)、土壌溶液、表面流出水などを採取し、微量物質である硫酸イオン、フッ化物イオンなどの物質収支と挙動について考察した。また、石炭燃焼に特有なMolecular Markerの検索を行った。物質収支については、Bjにおいて可溶性無機イオンは年間合計97.5kg/haが集水域に蓄積されていた。

その中で陽イオンは56.7kg/ha、陰イオンは40.8kg/haであり、降水による降下量が大きい成分ほど蓄積量が大きい傾向が認められた。硫酸イオンの降下量は陰イオン降下量の63%を占め、蓄積量も63%となった。流出水量は降水量のわずか1.3%であるため、大気経由で供給される無機イオンの多くは集水域に蓄積されると考えられる。BjとTkを比較すると、フッ化物イオンの挙動が著しく異なっていた。Bjではフッ化物イオンの約81%が集水域に蓄積されたが、Tkでは約105%が流出した。Bjにおいて蓄積されたフッ化物イオンは土壌中のカルシウムイオンなどと不溶性の化合物(CaF_2)を形成すると考えられる。Tkでは土壌中の可溶性フッ化物イオンが土壌から溶脱し、表面流出水とともに集水域から流出したと考えられる。Bjにおけるフッ化物イオンの起源として、現地の調査から周辺の住宅地で使用されている石炭の燃焼ガスと氷晶石を原料として使用しているガラス工場からの排出ガスと推定された。大気エアロゾル中の多環芳香族炭化水素濃度は東京に比べ北京で1桁高く、FluorantheneとPyrene比より北京では固定発生源が、東京では自動車の寄与が相対的に大きいと推定された。
EPCsを介した肺血管拡張薬によるCTEPH血管リモデリング抑制効果の解明

血管内皮前駆細胞(EPCs)は内皮細胞へ分化しうる骨髄由来または組織常在性の細胞群であり、障害血管のリモデリングや修復に寄与すると言われているが、慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)におけるEPCsの病態への寄与・薬剤に対する反応性は解明されていない。本研究では骨髄由来循環血液中EPCsと肺動脈血栓内膜摘除術(PEA)検体から単離したEPCsの機能解析を行い、各々のEPCsの作用を比較する。さらに、肺血管拡張薬自体が持つリモデリング抑制作用と薬剤のEPCsを介した作用を比較することで、新規治療標的の検索を行う。
開殻分子系の開殻因子、荷電・スピン状態を制御因子とする新規非線形光学物質の設計

実験値に基づくジラジカル因子y(開殻性の指標)の推定式を用いて複数の系を検討し、実験値と計算値のyの間に強い相関を見い出した。新規の開殻三次非線形光学系として、(1)グラフェンを含む多環芳香族炭化水素と(2)遷移金属-金属結合系を検討し、開殻性と分子構造、電場引加効果、置換基導入効果、スピン状態依存性の解明を行った。(1)については幾何構造と開殻性の相関を明らかにし(1)については幾何構造と開殻性の相関を明らかにし、(2)では元素の種類と寄与するdσ軌道の三次非線形光学物性に対する効果を初めて明らかにした。実験家と協力し(1)の開殻性をもつゼトレン系について二光子吸収測定を行い、我々の理論の妥当性が確かめられた。本年度は、当初の研究計画に沿って、実験値に基づくジラジカル因子の決定を行った。これに用いた理論式は、2サイトジラジカル分子モデルのvalence configurationinteraction法により算出した励起エネルギーの解析式に基づいて導出されたもので、二光子遷移許容の高い一重項状態(g対称性)の励起エネルギー(EC_<S(g)>)、一光子遷移許容の低い一重項状態(u対称性)の励起エネルギー(E_<S(u)>)、三重項状態(u対称性)の励起エネルギー(E_T)の実測値によりジラジカル因子yを表す形たなっている。これらの励起エネルギーは一光子吸収、二光子吸収、ESR実験により得ることが可能である。研究分担者の久保により合成された安定な一重項ジラジカル種のジフェナレニルラジカル化合物について、二光子吸収測定の結果等をもとにこの理論式を用いてジラジカル因子を求めた。また、他のジラジカル性を持つと期待される複数の化合物に関してもこれらの測定を行い、また文献からの実測値をもとにyを計算し、UHF法の自然軌道の占有数から計算により求めたジラジカル因子(理論値)に対してプロットを行った。その結果、実測値から求めたジラジカル因子と理論から求めた値との間に強い相関が認められた。この結果は、開殻分子の結合特性を特徴づける最も重要な因子であるジラジカル因子の実験値による推定を可能とする方法を初めて示したものである。今後、さらに多くの化合物に関して、この関係式が成り立つかを検討して行上予定である。また、グラフェン等を含む縮環化合物のジラジカル性やマルチラジカル性と三次非線形光学物性(第二超分極率γ)との相関について、スピン分極型密度汎関数法により解析し、HOMO-LUMOに関して中間ジラジカル性をもつ場合にγが極大を示すだけでなく、HOMO-1-LUMO+1に関して中間ジラジカル性を持つ場合にも極大を示すことが判明した。この結果は、グラフェン系のマルチラジカル性が第二超分極率の測定結果に影響を及ぼすことを示唆しており、マルチラジカル性の観測への方法の基礎となると期待される。本年度は、「一重項ジラジカルモデル系のジラジカル因子の物理的・化学的摂動による変化の解明」を目的として研究を推進した。第一に、ジラジカル分子の2サイトキデルを構築し、その局在化自然軌道基底を用いたValence configuration interaction (VCI)行列を対角化することにより、基底状態や励起状態に関係する諸物性量(励起エネルギー、遷移モーメント、双極子モーメント)をジラジカル因子、外場強度により記述し、第二超分極率γのジラジカル因子依存性の外部静電場強度による変化を解明した。外部静電場の強度に関わらず中間ジラジカル性を持つ領域でγの値は極大をとり、その値は電場強度とともに著しく増大した。また、極大をとるジラジカル因子(静電場なしの場合の値)は電場強度とともに増大した。Half metallicityで考慮される程度の電場強度により、静電場なしのγの極大値に比べて数十倍の増大が予測された。これは、静電場なしの閉殻系に比べると、静電場ありの中間ジラジカル系で2桁以上の巨大なγの増大が生じることを示唆している。この原因は、基底状態と第一励起状態間の仮想遷移過程の寄与の増大にあり、で電場印加による第一励起エネルギーの低下と双極子モーメント差の増大により引き起こされることが判明した。

実際に、H_2分子の解離(full CIにより計算)やエチレンの結合軸周りのれじれ(UCCSD(T)により計算)によりジラジカル因子を変化させたモデルにおいて静電場を印加したところ同様の傾向が得られ、本モデルの結果の妥当性が示された。また、このような外場印加系はドナー/アクセプター置換基を導入した非対称電荷分布をもつ開殻一重項系のモデルともみなせるため、非対称開殻一重項系における巨大な非線形光学効果も予測される。現在、ジラジカル因子が異なる実在開殻一重項分子系における電場効果を複数検討中である。本年度は、(1)グラフェンナノフレークを含む多環芳香族炭化水素(PAH)、(2)遷移金属-金属結合をもつ二核錯体系、の三次非線形光学特性について、開殻性と分子構造、スピン/荷電状態、電場効果、置換基導入効果、に焦点を絞り研究を行った。また、実験サイドとの共同研究では、我々の理論により開殻性に基づく三次非線形光学特性の増大が予測されていたゼトレン系についてさらに多くの類似化合物の二光子吸収を測定し、理論の妥当性を検討した。以下に簡単に結果をまとめる。(1)ジフェナレニルユニットを接合した1次元グラフェンナノフレークやアセチレンリンカーで連結した超ポリエンモデルの計算を行い、その接合様式により開殻性を制御できることを見出した。通常の閉殻一次元系とは顕著に異なるマルチラジカル性に対応した三次非線形光学特性γの増大が見られた。また高スピン状態にするとγが劇的に大きさが減少し、一方、荷電欠陥を導入するとγの符号が反転し、大きさは顕著に増大することがわかった。中間開殻性を示すジフェナレニル分子系に静電場を印可すると巨大なγの増大が予測された。これは従来の増大機構とは異なり電荷の非対称性に起因するタイプ1の効果であることが予測された。同様の効果がドナー/アクセプター導入によっても得られた。以上の有機系についての結果に基づき、ジラジカル因子を通したγ増大/制御の指針が得られた。(2)遷移金属結合系について長距離補正密度汎関数法の領域分割パラメータの最適値が有機系と異なることが判明した。寄与のσ、π、δ軌道軌道への分割により、これらの系の開殻性とγの関係は主にσ結合の開殻性に支配されていることを初めて明らかにした。今後、リガンドの効果や多核金属錯体への展開を行う予定である。実験によるゼトレン系の測定結果が複数得られたので、その機構解明と我々の設計指針の妥当性を検証するため、実在系について高精度計算によるγの算出を行い、その起源が中間ジラジカル性にあること、その大きさは幾何構造により変化することを見出した。また、ジラジカル因子の実験的推定に関しても三重項励起エネルギーの測定が残っており、現在、その準備を進めている。本年度は、最終年度であり、前年度に引き続いて、(1)多環芳香族炭化水素、(2)遷移金属-金属結合をもつ多核錯体系、の三次非線形光学特性(γ)について、開殻性と分子構造、置換基導入効果の解明、(3)H4モデルによるテトララジカル系の多重ジラジカル因子と三次非線形光学特性の相関、について研究を行った。また、実験家との共同研究では、我々の予測したゼトレン系にドナー(D)/アクセプター(A)置換基を導入した系について置換基効果の検討を行った。以下に結果をまとめる。(1)六角形および四角形2次元グラフェンナノフレークに形状やサイズの異なる穴をあけたアンチドット構造をもつ系について、開殻性の変化とγに与える影響を検討した。アンチドットのジグザグ端にも奇電子が分布する場合があり、系の開殻性は穴の形状とサイズに依存することが判明した。この結果、穴の設計により系の開殻性を変化させ、γを制御できる可能性を明らかにした。(2)
少子化に揺れる東アジアの父系理念－祖先祭祀実践と世界観の再創造に関する比較研究

第1年目として、メンバー各自の問題関心の共有と共同研究ならではの相互的啓発がなされた。以下、その内容を記するが、研究協力者の氏名の公開については、本人の了解を得ている。1フィールド調査...メンバーが各自のフィールドにおいて自身の問題関心によって、以下のような調査を進め成果を得ている。1祖先祭祀・祖先観の変化に関しては、台湾において三尾裕子・西村一之が、韓国においては本田洋・中村八重が、沖縄においては玉城毅が調査を行った。2墓や遺骨の処理における変化については、植野弘子と西村が台湾で、特に行政主導による変化の実態について調査をしている。また、沖縄においては、沖縄の都市移住者による墓祭祀については越智郁代が、また石垣島に来た台湾人の墓については三尾が調査を進めている。3葬儀の変化については、田中大介が日本における調査を行った。4少子化による祖先祭祀の変化を考えるため、家族関係・老親扶養に注目して、中国において川口幸大・長沼さやか・研究協力者の川瀬由高(学振PD)が調査を実施した。5父系社会の祖先祭祀における女性の役割に注目して、上水流久彦は台湾と鹿児島で、植野と橫田祥子は台湾において調査を行った。2研究会による課題の深化...研究会でのメンバー各自の成果報告によって、東アジアの少子化と父系原理の変化の多様性を確認できた。特に、海外にいる研究協力者ー林承偉(台湾・国立台北芸術大学)、林慶澤(韓国・全北大学校)、李華(中国・延辺大学)が、それぞれの地域の祖先祭祀・葬儀などの変化を報告し、有意義な討論を行うことができた。3アンケート調査実施の準備...共同研究という機会を生かし、東アジアの祖先祭祀の継承の意識に関するアンケート調査を、日本本土・沖縄・韓国・台湾・中国大陸において、主として大学生を対象に実施することとした。地域ごとに、当該地域の慣習・観念を踏まえた質問票の試作を行った。メンバー各員の調査活動は、総じて順調に行われている。研究会では、東アジアの少子化が引き起こす祖先祭祀・死者供養にみられる変化について、最新の情報が寄せられ、それをめぐる非常に活発な論議が繰り広げられている。また、第一回研究会で提案があった、「東アジアにおける祖先祭祀の継承の意識に関するアンケート調査」は、メンバーの賛同を得て、各地域の特徴を踏まえた調査の実施にむけて準備を進めているところである。経費の支出については、交付申請書の計画との差異は、物品費が若干多額になり、その分、人件費・謝金が減額となったことである。初年度のため、計画よりも物品購入費が多くなったこと、また研究会に外部講師などを依頼しなかったことによる。主たる活動である調査のための経費、また研究会参加のための経費である旅費は、ほぼ計画通りに支出された。メンバー各自の研究関心に従ったフィールド研究を進めるとともに、研究プロジェクトの共同性を生かした活動も、推進していく。そのひとつは、「東アジアにおける祖先祭祀の継承の意識に関するアンケート調査」であり、比較研究には欠かせない資料となるはずである。2019年度は、まずは、日本本土と沖縄において、大学生を対象に実施し、その後、秋に開催予定の研究会での検討を経て、韓国・台湾・中国大陸における調査の実施に向けて準備を進めていく。また、2018年度の研究会は、メンバー内部の報告・議論が主たるものとなっていた。今後は、外部より講師を招き、より広範な視野で、課題を考察していけるよう努める。

研究会では、東アジアの少子化が引き起こす祖先祭祀・死者供養にみられる変化について、最新の情報が寄せられ、それをめぐる非常に活発な論議が繰り広げられている。また、第一回研究会で提案があった、「東アジアにおける祖先祭祀の継承の意識に関するアンケート調査」は、メンバーの賛同を得て、各地域の特徴を踏まえた調査の実施にむけて準備を進めているところである。経費の支出については、交付申請書の計画との差異は、物品費が若干多額になり、その分、人件費・謝金が減額となったことである。初年度のため、計画よりも物品購入費が多くなったこと、また研究会に外部講師などを依頼しなかったことによる。主たる活動である調査のための経費、また研究会参加のための経費である旅費は、ほぼ計画通りに支出された。メンバー各自の研究関心に従ったフィールド研究を進めるとともに、研究プロジェクトの共同性を生かした活動も、推進していく。そのひとつは、「東アジアにおける祖先祭祀の継承の意識に関するアンケート調査」であり、比較研究には欠かせない資料となるはずである。2019年度は、まずは、日本本土と沖縄において、大学生を対象に実施し、その後、秋に開催予定の研究会での検討を経て、韓国・台湾・中国大陸における調査の実施に向けて準備を進めていく。また、2018年度の研究会は、メンバー内部の報告・議論が主たるものとなっていた。今後は、外部より講師を招き、より広範な視野で、課題を考察していけるよう努める。
皮膚肥満細胞phenotypeの逆転現象から見たアトピー性皮膚炎の病態

アトピー性皮膚炎(AD)は年齢による罹患率や臨床症状がかなり異なり,成長に伴った肥満細胞の形態学的機能的変化が重要である。まず,正常の新生仔,成獣マウスにおける成長による肥満細胞の機能の違いを調べた。生後2日目の新生仔マウスと生後12週の成獣マウスの皮膚で,IgE抗体を使ったPassive cutaneous anaphylaxis(PCA)反応によるヒスタミン放出能をELISA法で測定した。新生仔,成獣マウスそれぞれの皮膚に抗IgE-DNP抗体を皮内注射し,sensitizationをおこなった上で皮膚を採取,HBSS溶液に浮游,抗原としてDNP-BSAを,もう一方にはPBSを混ぜ,37°Cで30分間challengeを行った。ELISA法でchallenge直後の溶液と,実験後残留ヒスタミン量を測定。成獣マウスでPCAにより約15%のヒスタミン放出を認めたが,新生仔マウスではヒスタミンの放出は確認できず,PCAは起こらなかった。これより,新生仔マウスの皮膚肥満細胞には高親和性IgE受容体が少ないか存在しない可能性が示唆された。さらに,重症AD患者の皮膚肥満細胞Phenotypeの正常皮膚との差異を確認した。我々はBALB/cマウス皮膚肥満細胞数は新生仔期に有意に多く,週齢を増すにつれて減少し,phenotypeは結合織型優位であったが,3-5週齢のみ粘膜型優位にshiftしていることを報告した。ヒト正常皮膚において,免疫組織学的にphenotypeを確認した。肥満細胞数は,1視野あたり10.3個で約90%がMC_<TC>だった。実験の結果,重症ADの症例では,肥満細胞数が1視野あたり51.2個と著明に増加し,しかもMC_T61%,MC_<TC>39%と健常皮膚に比べ比率が逆転していた。これらのことからADは皮膚肥満細胞数の増加とともに肥満細胞の幼若化が一因である可能性が示唆された。研究目的アトピー性皮膚炎は年齢による罹患率や臨床症状がかなり異なり,成長に伴った肥満細胞の形態学的機能的変化が重要だと思われる。今回は正常の新生仔,成獣マウスにおける肥満細胞の機能の違いを調べた。研究方法生後2日目の新生仔マウスと生後12週の成獣マウスの皮膚において,IgE抗体を使ったPassive cutaneous anaphylaxis(PCA)反応によるヒスタミン放出能をELISA法により測定した。まず,成獣マウスにおいて実験4日前に抜毛を行い皮膚を露出させておく。実験2日前に新生仔,成獣マウスそれぞれの背部皮膚に0.5μg/mlの抗IgE-DNP抗体を0.11ml皮内注射し,sensitizationをあらかじめ行った。実験当日は,前処置しておいた背部皮膚を100200mg採取,12mm角に細切片化し重量を測定後2分した上でHBSS溶液に浮游させた。一方には,抗原として最終濃度が5μg/mlになるようにDNP-BSAを,もう一方にはコントロールとしてPBSを混和し,37°Cで30分間challengeを行った。challenge直後の溶液と,実験後残留ヒスタミン量を確認するため残った皮膚を6回凍結融解した溶液を採取,ELISA法でヒスタミン放出能を測定した。この系を新生仔,成獣マウスについて各々行った。研究結果成獣マウスにおいて,抗IgE-DNP抗体とDNP-BSAを反応させたものでは,コントロールと比べてヒスタミン放出が約15%多く,予想通りの結果であった。一方新生仔マウスでは,ヒスタミンの放出は確認できず,コントロールとの間に差が見られなかった。このことから,新生仔マウスの皮膚肥満細胞においてIgEを介した脱顆粒ヒスタミン放出は未熟もしくは行われないということがわかった。今後の実験今回の結果から,今後は新生仔マウスにおけるFcεRIレセプターの存在の確認を行う。また,IgE抗体を使ったPCA反応だけでなく,Compound48/80やSubstance Pなどの人工脱顆粒物質を使って新生仔,成獣マウスのヒスタミン放出能を測定する。さらに,アトピー性皮膚炎患者の同意を得て,皮膚肥満細胞を採取分離,培養を行い,細胞レベルでの違いも検討する。

我々はBALB/cマウス皮膚肥満細胞数は新生仔期に有意に多く,週齢を増すにつれて減少し,phenotypeは結合織型優位であったが,3-5週齢のみ粘膜型優位にshiftしていることを報告した。ヒト正常皮膚において,免疫組織学的にphenotypeを確認した。肥満細胞数は,1視野あたり10.3個で約90%がMC_<TC>だった。実験の結果,重症ADの症例では,肥満細胞数が1視野あたり51.2個と著明に増加し,しかもMC_T61%,MC_<TC>39%と健常皮膚に比べ比率が逆転していた。これらのことからADは皮膚肥満細胞数の増加とともに肥満細胞の幼若化が一因である可能性が示唆された。
小学校音楽科における即興的表現活動のための教材開発

本研究の最終的な成果は,小学校音楽科の授業における活用を想定した2つの教材《ステージ(Stage)》,《サンカプレイ(Sanka Play)》を開発したことである。《ステージ》は,児童一人ひとりが自らの「得意な表現」,「やってみたい表現」の組み合わせや順序を考えながら様々な表現が混在した作品をつくることのできる教材である。《サンカプレイ》は,タブレット端末の通信機能を使用して,聴衆の立場にある児童がステージ上の即興演奏に参加することのできる教材である。なお,上記の成果に至る過程において,アメリカの作曲家ジョン・ゾーンの考案した集団即興演奏の方法《コブラ》の特質を,複数の視点で考察した。本研究の目的は,アメリカの作曲家ジョン・ゾーン(John Zorn)が考案した集団即興演奏のための方法が作品化された《コブラ(Cobra)》の構造を手がかりとして,小学校音楽科における,児童一人ひとりの持つ表現の多様性を活かすことのできる即興的表現活動のための新たな教材を開発することである。初年度となる平成27年度は,まず,理論的基盤を確かなものにするため,《コブラ》の演奏方法,音楽作品としての存立要素,パフォーマンスにおける奏者間のコミュニケーションの特質を考察した。その成果は,日本音楽即興学会の学会誌に論文として発表した他,日本音楽表現学会の大会において口頭発表を行った。また,《コブラ》と似た構造を持った集団即興演奏の方法であるローレンス・D・ブッチ・モリス(Lawrence D. "BUTCH" Morris)の《コンダクション(Conduction)》との比較も行い,日本音楽即興学会の大会において口頭発表を行った(橋本知久との共同発表)。実践的研究については,広島市内の公立小学校で行われた授業実践(《コブラ》の構造を活かした即興演奏活動)について,学級担任へのインタビューを行いながら振り返り,児童一人ひとりにとっての意義を考察し,日本音楽教育学会の大会において口頭発表を行った。さらに,音楽祭「Creative Music Festival 2015」では,参加者とともに《コブラ》のルールを改変していくというワークショップを企画し,講師も務めた。同音楽祭のコンサートでは,ワークショップの成果を演奏によって一般に公開した。以上の成果をもとに,教材《ステージ(Stage)》を開発した。本教材は,即興的な要素はあまり含まれていないが,児童一人ひとりの持つ表現の多様性を活かすことのできるものである。意義の検証を目的とした実践は,平成28年度以降に行う予定である。平成27年度は,《コブラ》の構造上の特質や演奏結果の特徴について,理論的・実践的に分析することを中心とした研究を行い,それらの成果を,3度の学会発表と3本の論文によって発表した。これらの研究成果は,新たな教材《ステージ》の開発の基盤となった。関連資料の調査も,おおむね順調である。《コブラ》の演奏実践も,音楽祭「Creative Music Festival 2015」のワークショップとコンサートにおいて行うことができた。同音楽祭では,ワークショップの様子を録画したほか,参加者を対象としたアンケートを実施した。これらは,今後の教材開発や実践に活かす予定である。本研究の目的は,アメリカの作曲家ジョン・ゾーン(John Zorn)が考案した集団即興演奏のための方法《コブラ(Cobra)》の構造を手がかりに,小学校音楽科における,児童一人ひとりの持つ表現の多様性を活かすことのできる即興的表現活動のための教材を開発することである。平成28年度は,本研究計画3年のうちの2年目である。理論的研究については,これまで行ってきた《コブラ》に関する理論的・実践的研究の成果を論文にまとめ,博士論文として九州大学大学院に提出した。また,その一部を,初等教育カリキュラム学会の学会誌『初等教育カリキュラム研究』で発表した。実践的研究については,まず,日本音楽表現学会の大会と音楽祭「Creative Music Festival 2016」において,参加者を対象として前年度に開発した教材《ステージ(Stage)》を実践し,同教材からどのような表現が生じるかを検討した。続いて,呉市立豊小学校第5学年の児童を対象とした授業(授業者:寺内大輔)と,ノートルダム清心女子大学附属小学校第6学年の児童を対象とした授業(授業者:甫出頼之)を,それぞれ実践した。また,スマートフォンやタブレット端末の通信機能の使用を想定した新たな教材(名称未定だが,現時点では仮称《即興演奏オーダリング》)の開発にも着手した。この教材は,《コブラ》や《ステージ》との共通点も多いが,客席の聴衆がステージ上の演奏者に対しリアルタイムで要望を送ることができる点が最大の特徴である。聴衆の立場に立つ児童をも演奏に巻き込むという,新たな即興表現の場の実現が期待される。その試行実践として,日本音楽即興学会の大会において,パフォーマンス発表を行い,実際に体験した参加者から今後の開発のヒントとなる意見を数多く頂いた。それをもとに,現在,小学校音楽科の授業での使用を想定したソフトウェアを制作中である。平成28年度は,ジョン・ゾーンの《コブラ》に関する研究の成果を博士論文として著したことで,教材開発のための手がかりとなる作品である《コブラ》に関する研究は一応の区切りを迎えた。また,前年度開発した教材《ステージ》を用いた授業実践を,小学校で行うことができた。それらの記録は,今後の教材開発や実践に活かす予定である。さらに,新たな教材《即興演奏オーダリング》(仮)の開発も,引き続きすすめていく。本研究の目的は,アメリカの作曲家ジョン・ゾーン(John Zorn)が考案した集団即興演奏のための方法

《コブラ(Cobra)》の構造を手がかりに,小学校音楽科における,児童一人ひとりの持つ表現の多様性を活かすことのできる即興的表現活動のための教材を開発することである。平成29年度は,本研究計画3年のうちの最終年度である。理論的研究については,《コブラ》の演奏行為に内在する〈ゲーム〉としての特質を考察した論文を,日本音楽表現学会の学会誌『音楽表現学』で発表した。この成果は,本研究における教材開発の発想を得るための手がかりとなった。実践的研究については,まず,前々年度(初年度)に開発した教材《ステージ(Stage)》を用いた授業を開発し,論文(甫出頼之との共著)として,広島大学教育学研究科紀要で発表した。この成果は,本研究によって開発された教材を,実際の授業でどのように活用するかについて,モデル指導案を示すことによって具体的に提案した点において意義があると考えられる。次に,スマートフォンやタブレット端末の通信機能を使用して,聴衆の立場にある児童がステージ上の即興演奏に介入することのできる教材《サンカプレイ(Sanka Play)》を開発した。開発に先立ち,前年度に行った日本音楽即興学会の大会におけるパフォーマンス発表を振り返り,「聴衆の演奏への介入」がその場に居合わせる人々にどのような状況をもたらすかを考察した。その成果は,今年度末に,同学会の学会誌『JASMIMジャーナル』に論文として発表した。開発された《サンカプレイ》は,誰でも活用することができるよう,ダウンロード可能なウェブサイトを作成し,公開した。併せて,ノートルダム清心女子大学附属小学校第5学年を対象とした授業実践を行い,その成果を,日本音楽教育学会の大会において発表した。本研究の最終的な成果は,小学校音楽科の授業における活用を想定した2つの教材《ステージ(Stage)》,《サンカプレイ(Sanka Play)》を開発したことである。《ステージ》は,児童一人ひとりが自らの「得意な表現」,「やってみたい表現」の組み合わせや順序を考えながら様々な表現が混在した作品をつくることのできる教材である。《サンカプレイ》は,タブレット端末の通信機能を使用して,聴衆の立場にある児童がステージ上の即興演奏に参加することのできる教材である。なお,上記の成果に至る過程において,アメリカの作曲家ジョン・ゾーンの考案した集団即興演奏の方法《コブラ》の特質を,複数の視点で考察した。今後の推進方策は次の3つである。1.《コブラ》の構造上の特質や演奏結果の特徴に関する理論的・実践的研究は,これまで同様継続する。その成果は,論文・口頭発表などによって,学会・紀要等において発表する。2.《ステージ》の実践を積極的に行う。平成28年6月に予定されている日本音楽表現学会におけるワークショップでの実践を予定している。学校現場における実践の機会を得るため,現在,数名の小学校教員との連絡調整を進めている。3.新たな教材の開発に取り組む。
労働者の健康障害と法

本研究は、労働者の病気およびヘルスケアに関して生じる法的諸問題を、総合的な視野で分析・解明し、その課題と解決のあり方について理論構築しようとするものである。本研究では、多様な研究方法により、問題の把握と分析を行った。第1に、内外の実態調査を行った。日本国内だけでなくドイツ・フランスの労働安全衛生の研究者や産業医スタッフに対してヒアリングや意見交換を行い、また事業所の安全衛生体制の現場を視察した。第2に、研究のための文献的裏付けを得るために、内外の研究資料を収集した。各研究分担者は、それらの分析・検討を通じて雑誌論文等の成果を発表ししている。第3に、共同研究としてのメリットを活かして、多くの回数の研究会を重ねた。これにより、本研究課題についての高度の情報を共有するともに、互いに問題の広がりを認識することができた。以上の研究手法を通じて、労働法学等における健康障害に関する法的アプローチの必要性を確認するとともに、法的課題と望まれる解決の方向について一定の整理を行うことができた。特に、現在の労務管理においては、労働者のメンタルヘルスのケアが重要であり、この問題と労働時間や休暇・休業法制との関連など、総合的な考察が必要であることを確認した。これらの共同研究の成果については、共著書として発表の予定である。なお、本研究においては、国立大学の法人化の動きのもと、そこに生じる安全衛生や労働時間等の問題についても共同研究を行い、その研究成果の一部を共著書として出版した。初年度にあたる本年度においては、大別2つの研究を実施することができた。第1に、フランスおよびドイツにおいて、労働者の疾病および病気休暇政策についての調査を行い、併せて、研究計画と暫定的な成果について批評、コメントを受けることができた。調査研究は、2001年11月3日から同月11日にかけて行われ、ドイツにおいては、ハンブルグ大学A.Oppolzer教授、監督労働心理医M.Peschke博士の面談と指導を得ることができ、同市立労働健康社会センターにおける労働医スタッフとの協議を行うことができた。また、フランスにおいては、在フランス日系企業である、ヨーロッパ日立コンピュータプロダクツおよび資生堂インターナショナルフランスにおいて、企業における労働安全衛生実務の状況に関して各担当者およぴ労働医へのヒアリングと現場見学を行った。あわせて、各国において必要な文献・資料の収集も行った。第2に、本研究課題について、より問題意識を先鋭化させ、理論枠組みをさらに詳細かつ明確に理論化するために、数度にわたる研究会をもった。また、研究会には、たとえば産業医科大学中村純教授をゲストスピーカーとして招き、精神医学の立場からわが国におけるメンタルヘルスケアの現状と課題について、詳細な報告を得るとともに意見交換を行った。これらにより、労働法学等における健康障害に関する法的アプローチの必要性を確認するとともに、いかなるレベルでどのような法的課題が存在し、解決が望まれるかについて、一定の方向性を得ることができた。2年目にあたる本年度においては、大別以下の2つの研究を実施することができた。第1に、初年度のドイツ・フランスの企業におけるヘルスケアの調査に引き続き、本年度は日本の職場における労働者の身体および心の健康に対するケアの現状について、ヒアリング等による調査を進めた。具体的には、(1)(株)富士通及び富士通川崎病院(平成14年8月1日)、(2)(株)日本航空及び日本航空健康管理センター(同年8月2日)、(3)(株)トヨタ自動車(同年10月25日)において、人事担当者、健康管理スタッフ及び産業医等に対するヒアリングを行い、討議を行った。あわせて、(4)メンタルヘルスケアを、企業の危機管理のためのサービスとして事業展開を始めた、(株)トッパンマインドウェルネスにおいて同事業の内容や展開等について説明を受けた。

第2に、ヨーロッパのヘルスケアについて、文献的な裏付けを行うべく、主任研究員である野田が、パリ第1大学法学部図書館、フランス国立図書館、公文書センター(Documentation Francaise)等で、文献検索および資料収集を行った。なお、収集の対象は、ヘルスケアだけでなく広く雇用・労働契約上の問題に及んだが、特にフランスのモラル・ハラスメントの解決方式について有益な文献を収集した。これらにより、労働法学等における健康障害に関する法的アプローチの必要性を確認するとともに、いかなるレベルでどのような法的課題が存在し、解決が望まれるかについて一定の整理を行うことができ、とりまとめの方向を確認することができた。本研究は、労働者の病気およびヘルスケアに関して生じる法的諸問題を、総合的な視野で分析・解明し、その課題と解決のあり方について理論構築しようとするものである。最終年度にあたる本年度においては、大別以下の3つの研究を中心に実施した。第1に、本研究の重要な柱と位置づけている、私傷病に関する比較法研究に関しては、研究代表者である野田がフランスを、和田がドイツを、中窪がアメリカ合衆国を担当して、労働者の私傷病についての、病気休暇法制との関連、労働契約法制との関連、給与保障制度、企業の健康管理(メンタルヘルスケアを含む)との関連などについて、これまでの調査に基づいて基本的な特色をまとめ、比較法および比較制度的な研究・討議を行った。第2に、わが国の問題領域については、労働者の病気やメンタルヘルスケアに直接に関連する法や理論の整備だけでなく、より広く労度時間法制や雇用問題にとも関連させつつ、問題の広がりを意識した理論構築を進行中である。これら第1および第2の検討結果については、科研報告書として、報告の予定である。第3に、より実際的な課題として、平成14年4月より国立大学の法人化より、病気休職、安全衛生、労働時間の諸制度などが大きく変化することから、本研究の実務的な応用問題的な課題として、取り組みの必要が急がれると考えた。問題検討の緊急性に鑑み、本研究に関与する、野田、和田、および中窪の共同研究により「研究発表」欄に掲載の図書『国立大学法人労働条件ハンドブック』を執筆した。同書は、本研究の討議の経緯の中から生まれたものであり、実質的には本研究の副産物ととらえている。
歩行動作における人工膝関節の動的シミュレーション

歩行動作における膝関節の動きを検討するために,下肢全体,ならびに膝関節に関連している靭帯,筋肉等を2次元でモデル化し,このモデルの運動方程式をたて,歩行実験による歩行動作時の関節動作,床反力等を入力条件として,運動方程式を逆問題として解くことにより,各下肢関節の外力モーメント,膝関節の外力を算出した.さらにこれらのモーメントと外力を入力値とし,最適化手法を用いて,歩行動作時の筋力ならびに膝関節接触反力,接触位置を計算した.ただし最適化の目的関数としては,歩行動作解析に一般的に使用されている筋応力の3乗を用いた.計算された筋力は筋電計により測定されたデータと比較を行い,ほぼ妥当な結果であることを確認した.さらに人工膝関節の形状による膝関節動作への影響を検討するために,接触面のモデル形状を変更して解析,比較を行った.その結果,後十字靭帯温存型の表面置換型人工膝関節では,前十字靭帯を削除するため大腿骨を前方に残そうとする力がなくなることにより,膝関節の接触位置が生体膝と比較して後方に移動すること,またその形状の特徴となっている大腿骨脱臼防止用の前方隆起部の存在と,膝屈曲角度を大きくするために必要なロールバックム-ブメント(膝屈曲時の大腿骨の後方移動)を生じさせる後十字靭帯温存の意義を確認した.また表面置換型人工膝関節と対照的な形状を持つ円筒面型人工膝関節についても解析を行ったが,この関節においては接触面の拘束度の高さにより,表面置換型人工膝関節と比較して関節反力が高くなることがわかった.歩行動作における膝関節の動きを検討するために,下肢全体,ならびに膝関節に関連している靭帯,筋肉等を2次元でモデル化し,このモデルの運動方程式をたて,歩行実験による歩行動作時の関節動作,床反力等を入力条件として,運動方程式を逆問題として解くことにより,各下肢関節の外力モーメント,膝関節の外力を算出した.さらにこれらのモーメントと外力を入力値とし,最適化手法を用いて,歩行動作時の筋力ならびに膝関節接触反力,接触位置を計算した.ただし最適化の目的関数としては,歩行動作解析に一般的に使用されている筋応力の3乗を用いた.計算された筋力は筋電計により測定されたデータと比較を行い,ほぼ妥当な結果であることを確認した.さらに人工膝関節の形状による膝関節動作への影響を検討するために,接触面のモデル形状を変更して解析,比較を行った.その結果,後十字靭帯温存型の表面置換型人工膝関節では,前十字靭帯を削除するため大腿骨を前方に残そうとする力がなくなることにより,膝関節の接触位置が生体膝と比較して後方に移動すること,またその形状の特徴となっている大腿骨脱臼防止用の前方隆起部の存在と,膝屈曲角度を大きくするために必要なロールバックム-ブメント(膝屈曲時の大腿骨の後方移動)を生じさせる後十字靭帯温存の意義を確認した.また表面置換型人工膝関節と対照的な形状を持つ円筒面型人工膝関節についても解析を行ったが,この関節においては接触面の拘束度の高さにより,表面置換型人工膝関節と比較して関節反力が高くなることがわかった.
シロイヌナズナの発生・分化におけるポリアミンの作用機構の解明

シロイヌナズナのスペルミン合成酵素遺伝子ACL5の欠損変異体acl5は花茎伸長に著しい欠損がある。その抑圧変異体であるsac52-dにはリボソーマルタンパク質L10をコードする遺伝子内に一塩基の置換が見つかっている。その遺伝子近傍の変異入りのゲノム断片をacl5に導入したところ花茎伸長の回復が見られたことにより、SAC52がリボソーマルタンパク質L10をコードしていると断定することができた。加えて、SAC52の器官別の発現パターンをリアルタイムRT-PCR法により定量解析し、根端や茎頂部といった若い組織を含む器官で特に発現が強いことが分かった。2 ACL5と相互作用するタンパク質の探索シロイヌナズナはACL5に加えもうひとつスペルミン合成酵素遺伝子SPMSをもつ。これまでSPMSタンパク質に関しては、スペルミジン合成酵素であるSPDS1,SPDS2らと複合体を形成し、効率よいポリアミン合成を可能にしていることが分かっている。しかしながら、ACL5タンパク質に関しては未だにその機能動態が未知であることから、今年度はACL5と相互作用するタンパク質の同定を試みた。茎頂および花序から調製されたcDNAライブラリーを用いてYeast two-hybrid assayを行った。スクリーニングの結果、グルタミン酸tRNAリガーゼがACL5と相互作用するタンパク質の候補として挙げられた。前年度までの研究で、acl5の抑圧変異体の原因遺伝子SAC51の翻訳制御にACL5が介することが明らかになっていることから、ACL5と相互作用する因子の候補として同定されたグルタミン酸tRNAリガーゼとACL5が協調して花茎伸長に必要な遺伝子の翻訳調節を行っている可能性が示唆された。シロイヌナズナのスペルミン合成酵素遺伝子ACL5の欠損変異体acl5-1は花茎伸長に欠損をもつ。本研究者は、花茎伸長におけるスペルミンの役割を明らかにするため、acl5-1の抑圧変異体(sac)に焦点を絞り研究を行った。1)sac51-d-54-d変異体を、植物ホルモン関連の矮性変異体と掛け合わせ二重変異体を作ったところ、いずれのsacも花茎伸長欠損を回復させなかった。このことからsacの回復作用はacl5-1に特異的であると言えた。また、シロイヌナズナのもうひとつのスペルミン合成酵素遺伝子SPMSの欠損変異体を用い、sac acl5 spms三重変異体を作成したところ、スペルミンを完全に欠くこれらにおいても花茎伸長の回復が見られたことから、sacの回復作用にはスペルミンが全く必要でないと分かった。2)sac51-d変異はbHLH型転写因子をコードする遺伝子(SAC51)のuORF内にあり、これによりmain ORFの翻訳レベルが上昇していることが示されている。そこでuORFを含む5'シーケンスを削除したSAC51をacl5-1に導入すると、花茎伸長の回復が見られた。これにより過剰量のSAC51によって花茎伸長の回復が促されていることが確かめられた。また、SAC51-GUSレポーター融合遺伝子を持つ形質転換植物の実験で、GUSの翻訳レベルがacl5-1およびsac51-d acl5-1において野生型の約半分程度に減少していることを明らかにした。3)acl5-1およびsac51-d acl5-1において、野生型と比べ転写レベルで発現量が変化する遺伝子を同定するため、マイクロアレイ解析を行った。その結果、維管束分化に関わる多くの遺伝子がacl5-1で過剰に発現しており、sac51-d acl5-1で元に戻っていた。表現型と一致しないパターンで発現する遺伝子も複数同定された。
鉱物の受けた熱・応力履歴と組織・構造

本研究は重要な造岩鉱物の微細組織の形成、消失の動的過程を原子オーダーで速度論的立場から理解し、それらの鉱物やそれを含む岩石の受けた熱や応力履歴についての基礎的知見を得ることを目的とするものである。本年度は、昨年開発した高温走査型電子顕微鏡(HTSEM)による観察をさらに進めると共に、高温透過型電子顕微鏡(HTSEM)の開発を行い、約1200°Cまでの範囲で輝石・石英・アノーサイト・ライフーナイトなどの観察を行った。(1)高温透過型電顕(HTTEM)の開発HTTEM用の高温炉を日立製作所那珂工場と共同で開発した。この炉は試料の傾斜が可能なサイドエントリー式の試料ホルダーに装着される。この炉の特徴は最高温度1200°Cに保った状態で数時間の連続観察が可能であり、加えて入射ビームに対して直交する二方向に±10°Cの試料傾斜が可能能である。温度は試料の近くの熱電対を用いて測る。もちろん、試料位置と熱電対位置での温度差補正曲線を用意しておく。試料をのせるメッシュはMo製を用いた。(2)石英のα-β転移の際、約1°Cの範囲でインコメッシュレート相(INC相)が安定に存在する。温度補正とINC相の温度変化を知る目的で石英の加熱実験を行い、INC相を観察した。(3)輝石の加熱実験Caを少し含むMg-Fe輝石は高温ピジョン輝石、低温ピジョン輝石、斜方輝石などの複雑な相転移を行う。これらの多型の安定関係を確立するために、クライノエンスタタイト及びエンスタタイトの加熱を行いその転移を観察した。前者は低温P-格子が高温C-格子に転移したが、その転移はマルテンサイト的で今までの報告とは全く異なる。後者についても今までとは違う結果が得られており、研究を続ける予定である。
新規に同定した細胞接着斑分子paxillinが血管攣縮における役割の解明

血管平滑筋の異常収縮である血管攣縮は、心筋梗塞、脳梗塞などの急性発症で重篤な血管病を引き起こし、突然死の主因であり、根本的な治療法が見つかっていない。我々は、血管攣縮の原因分子の探索を行い、細胞膜の構成成分であるスフィンゴミエリンから脱アシル化されてできるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)を発見した。更に、SPCの下流シグナル経路についても検討し、血管攣縮シグナル『SPC→Fyn→Rhoキナーゼ(ROK)』経路を発見した。しかし、Fynは直接ROKを活性化できないため、Fyn下流の新規シグナル分子を探索したところ、プルダウンアッセイと質量分析計によりFyn下流に存在する新規分子paxillinを発見した。本研究では、細胞、組織、生体レベルで、特にpaxillinノックアウト(KO)マウス作製の実験系を構築してin vivoで新規に発見した細胞接着斑分子であるpaxillinと血管攣縮との関連を全面解明するという研究を行う。平成30年度は細胞レベルで機能欠失と機能獲得の分子生物学的アプローチおよび組織レベルでpaxillinと血管攣縮との関連について、下記の実験で検討した。1.遺伝子発現をノックダウンする手法としてshRNA paxillinベクターによって細胞に導入され、恒常的にpaxillin欠損するヒト冠状動脈平滑筋細胞の作成した。更に、SPCによる収縮を抑えるかを調べた。2.1)で作成した細胞にpaxillin全長およびpaxillin断片N末端とC末端を再発現させて、SPCによる収縮をレスキューされるかを調べた。3.組織レベルでの、paxillinと血管攣縮への関与を解析するため、paxillin全長およびpaxillin断片N末端とC末端組換えタンパク質を大腸菌の系で発現・精製した。平成30年度に予定した研究計画のうち、計画1である細胞レベルで機能欠失と機能獲得の分子生物学的アプローチによりpaxillinと血管異常収縮の関連を検証することで、CRISPR-Cas9ゲノム編集システムにより、paxillin欠損するヒト冠状動脈平滑筋細胞を作成する予定ですが、CRISPR-Cas9ゲノム編集で死んだ細胞が多いので、遺伝子発現をノックダウンする手法としてshRNApaxillinベクターによって細胞に導入され、恒常的にpaxillin欠損するヒト冠状動脈平滑筋細胞も作成した。その後、paxillinをノックアウトした細胞はSPCによる収縮実験を実施した。また、組織レベルでの、paxillinと血管攣縮への関与を解析するため、paxillin全長およびpaxillin断片N末端とC末端組換えタンパク質を大腸菌の系で発現・精製した。以上の事より、本研究はおおむね順調に進行している、と評価する。研究はおおむね計画通りに進行しており、現在のところ計画の変更の必要はない。引き続き、計画に従って研究を遂行する。今後、Cre-loxPシステムを用いた平滑筋組織特異的paxillinコンディショナルノックアウト(paxillin CKO)マウスの作成およびその平滑筋組織特異的paxillinCKOマウスを用いて、生体レベルでpaxillinが血管攣縮に関与する事の解明を進める。

また、組織レベルでの、paxillinと血管攣縮への関与を解析するため、paxillin全長およびpaxillin断片N末端とC末端組換えタンパク質を大腸菌の系で発現・精製した。以上の事より、本研究はおおむね順調に進行している、と評価する。研究はおおむね計画通りに進行しており、現在のところ計画の変更の必要はない。引き続き、計画に従って研究を遂行する。今後、Cre-loxPシステムを用いた平滑筋組織特異的paxillinコンディショナルノックアウト(paxillin CKO)マウスの作成およびその平滑筋組織特異的paxillinCKOマウスを用いて、生体レベルでpaxillinが血管攣縮に関与する事の解明を進める。試薬や器具類について、キャンペーン期間中の購入により当初予定金額よりも安く購入できたため、差額が生じた。翌年度の研究計画に変更はなく、当該差額分を合わせて、計画的に予定通り実施する。