hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト精子先体膜上物質h-Sp-1のカルシウムチャンネルへの関与に関する検討

今回、我々がすでにクローニングした受精現象に関与する精子膜上に存在するh-Sp-1遺伝子の受精系においての役割をカルシウムチャンネルに関与する他の膜分子(Synaptotagmin,Syntaxinなど)との相互作用および同h-Sp-1分子の精子および造精機能での発現をより詳細に検討する目的にて本研究を計画した。1.ヒト精巣でのh-Sp-1遺伝子の発現の解析;h-Sp-1遺伝子を用いてヒト精巣組織での発現について検討しところ、特定の領域に限局して発現している実験結果はえられなかった。精巣組織に一様に染色され、この分子は広く存在されることが示唆された。また、電顕での検討では精子膜に存在はするが、その部位は頭部全体に分布していた。2.受精系におけるカルシウムチャンネル関連分子との相互作用に関する解析;すでに受精卵の分化発育にて関与が明らかになっているRab3-Rabphilin,SNAREs系分子(Synaptotagmin,Syntaxinなど)との相互作用をそれぞれ分子に対する抗体を用いて検討したところ、この分子は、calmodulin,syntaxinと結合する結果を得たが、現在さらに検討している。3.カルシウム依存性のシグナル伝達機構の解析;ヒト精子をCalcium ionophore,12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA),diacylglycerol(DG)で処理する事により、ヒト精子における先体反応の状況を、このモノクローナル抗体で処理する事によりどのような影響がでるか解析したところ、抗体で処理する前後にて有為な変化を確認できなかった。4.マウスなど動物の受精系および受精卵への影響の検討;動物の受精卵培養系へh-Sp-1分子を添加することで、受精発育分化にどのように影響があるか顕微鏡にて観察した結果、軽度の受精率への阻害効果を認めたが、その後の分化には影響は認められなかった。1.h-Sp-1分子に対するモノクローナル抗体を利用した対応抗原の解析h-Sp-1遺伝子をbaculovirus vectorに導入してSf9細胞にtransfectionして発現蛋白を作成した。同蛋白(h-Sp-1分子)をマウスに免疫してモノクローナル抗体G3G9(MAbG3G9)を作成した。MAbG3G9を用いてヒト精子を染色し、精子膜上でのその局在を含めて解析した。その結果、精子膜上に存在していることが判明した。さらに、ヒト精巣を用いて同じくこのモノクローナル抗体で組織染色し精子の形成過程でのどの時期より発現しているかを現在解析中である。2.ヒト精巣でのh-Sp-1遺伝子の発現の解析h-Sp-1遺伝子を用いてヒト精巣組織での発現を検討したところ、2.1kbのバンドと1.2kbの2つのバンドを認めた。現在、ヒト精巣を用いて精子形成過程での発現お及びその他の細胞(Leydig cell,Sertoli cellなど)での発現を解析しているところである。また、精子より蛋白を抽出し、このモノクローナル抗体を用いてWestern blot解析をしたところ、分子量の55kDのバンドを得た。さらに、糖鎖の修飾の状態などをSDS-PAGE法等の方法で解析している。3.受精系におけるカルシウムチャンネル関連分子との相互作用に関する解析今回、我々がすでにクローニングした受精現象に関与する精子膜上に存在するh-Sp-1遺伝子の受精系においての役割をカルシウムチャンネルに関与する他の膜分子(Synaptotagmin,Syntaxinなど)との相互作用および同h-Sp-1分子の精子および造精機能での発現をより詳細に検討する目的にて本研究を計画した。1.ヒト精巣でのh-Sp-1遺伝子の発現の解析;h-Sp-

1遺伝子を用いてヒト精巣組織での発現について検討しところ、特定の領域に限局して発現している実験結果はえられなかった。精巣組織に一様に染色され、この分子は広く存在されることが示唆された。また、電顕での検討では精子膜に存在はするが、その部位は頭部全体に分布していた。2.受精系におけるカルシウムチャンネル関連分子との相互作用に関する解析;すでに受精卵の分化発育にて関与が明らかになっているRab3-Rabphilin,SNAREs系分子(Synaptotagmin,Syntaxinなど)との相互作用をそれぞれ分子に対する抗体を用いて検討したところ、この分子は、calmodulin,syntaxinと結合する結果を得たが、現在さらに検討している。3.カルシウム依存性のシグナル伝達機構の解析;ヒト精子をCalcium ionophore,12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA),diacylglycerol(DG)で処理する事により、ヒト精子における先体反応の状況を、このモノクローナル抗体で処理する事によりどのような影響がでるか解析したところ、抗体で処理する前後にて有為な変化を確認できなかった。4.マウスなど動物の受精系および受精卵への影響の検討;動物の受精卵培養系へh-Sp-1分子を添加することで、受精発育分化にどのように影響があるか顕微鏡にて観察した結果、軽度の受精率への阻害効果を認めたが、その後の分化には影響は認められなかった。
日豪の大学間における授業相互支援システムに関する研究

滋賀大学とディーキン大学は、授業の相互支援に関わって包括的な協議を続けてきた。その中でも特に、マルチメディアを用いた遠隔教育の実施と、環境教育や異文化・国際理解教育に関してのデジタルネットワーク・システムの構築にかんして検討および調査研究を行ってきた。その結果、主たる具体的な成果は以下の通りである。1本学において「オーストラリアの生活と分化」なる授業を95年度より開講し、研究代表者および分担者が授業を担当している。この授業の開設と運営に関わって、ディーキン大学側の研究分担者がカリキュラムや教材開発の面で助言・指導を行った。さらに、来学して、特別講師として授業を行った。2デジタルネットワークを介しての授業の相互支援について調査研究の延長線上として、環境教育と情報支援システムにかんする国際シンポジウム(「97滋賀大学国際シンポジウム」)を本学で開催した。ここでは、本学とディーキン大学が中心となって、アジア太平洋地域における環境教育支援のためのネットワーク構想が検討された。3ディーキン大学で、日本の大学生を対象とした「オーストラリア研究」のためのマルチメディア教材開発が進んでいる。これは、ディーキン側の研究分担者が本学のカウンターパートの協力・助言を受けながら、また特別講師として本学の授業を担当した経験をもとに行っているものである。滋賀大学とディーキン大学との間でのマルチメディアを利用した遠隔教育推進に向けて、板倉と松原がディーキン大学を、レグリュー(科学研究費以外の財源により来日)とブランビ-が滋賀大学を相互に訪問し、主として技術・施設面での課題と問題点について協議した。この結果をもとに、実際に授業開設の可能性を探るべく準備を進めている。中高等学校における社会科を主とする両国の教科書を、教育目標や教育制度の視点から、ウオーカーと鵜野、木全が文献研究を中心に比較調査を行った。その一方で、ウオーカー、ブランビ-、平井が中心となって、日本の大学向けの「オーストラリア研究」用のマルチメディア教材の開発計画を進めている。インターネットを利用して、ディーキン大学の「オーストラリア研究」の授業を本学の大学生に履修させ、そこでの問題点について分析・検討を行った。本年度は、参加学生の準備状況や担当教官間のコミュニケーションの不足等もあって、期待した成果を上げるに至らなかった。これまでの問題点を検討して、再度実験授業を試みる予定である。このことに関連して、平井がディーキン大学を訪問し、この分野での今後の実施方法について協議を行った。相互の社会・文化をテーマとした授業の相互支援にあり方について、分析・検討した。また、このことに関連して、小林が中心となって開設した「オーストラリアの生活と文化」の授業で、ウオーカーとハイデュが講義を行った。また彼らは、ディーキンでの日本研究の授業のために、資料収集やフィールド調査を行った。今後のマルチメディアを活用した教材開発について、具体的なプロジェクトを発足すべく準備を進めている。滋賀大学とディーキン大学との間でのマルチメディアを利用した遠隔教育の推進に向けて,ブランビ-(科学研究費補助金以外の財源により来日)とレグリューが滋賀大学を訪問し,板倉と松原を中心にその実施に向けて討議した。実施に向けての体制づくりと並行して,これに関わるテーマで平成9年11月に滋賀大学で国際シンポジウムを開催すべく準備中である。中等学校における社会料および語学教育に関わって,教育目標や教育制度の視点から,木全と鵜野,ウォーカ-の他に研究協力者として時田(滋賀大学・教育学郎・助教授)が加わり,比較研究を進めた。その成果は,本学で開講している「オーストラリアの生活と文化」の授業の中で活用している。これに関しては,木全と時田がディーキン大学を訪問し,研究者との意見交換と資料の収集を行った。授業の相互支援に関しては,本学の「オーストラリアの生活と文化」の授業で,ウォーカ-とブランビ-が講義をおこなった.また平井がディーキン大学の「日本文化研究」グループの研究会に出席し,意見交換をおこなった。教材の開発に関しては.ディーキン側ではハイデュが,滋賀大学側では平井と研究協力者の與倉(滋賀大学・教育学部・助教授)が中心になって,資料の収集に協力した。これまでの滋賀大学とディーキン大学という2大学間の授業のための相互支援システムを拡充発展させて,日本の大学生を対象としたオーストラリア研究に関するインターネット支援のマルチメディア教材の開発のためのプロジェクトが発足した。

これは,オーストラリア外務省および教育省からの財政支援を受けてディーキン大学のメンバーが主体となり,滋賀大学のメンバーが協力する形で平成9年度より3ヵ年計画で実施される。本年度の研究実績は、次の通りである。1.学芸科目「オーストラリアの生活と文化」を昨年度に引き続き開講し、受講生は180名を数えた。本年度のオーストラリアからの研究者は、Ed Brumby,Joseph Hajduの2名で、来日の折りにこの講義に参加し、講義内容を深めることができた。2.研究成果報告の一つの形態として、国際シンポジウム、滋賀大学国際シンポジウム'97「環境問題の解決を目指した環境教育と情報支援システムの役割」、を開催し研究成果を報告するととに、今後の国際協力の方向性を探ることができた。シンポジウムには招待講演者として、韓国、フィリッピン、インドネシア、タイ、マレーシア、オーストラリア、米国、連合王国の8カ国から10名、国内から6名の出席を得、一般参加者は海外から2名、国内約160名、合計約180名の参加があった。この国際シンポジウムは、21世紀の社会における一つの大きな課題である環境問題を教育の側面から取り上げ、この問題の解決に向けての教育、すなわち、学校教育及び消費者教育の果たす役割、及び、この教育を地球規模で推進するための情報技術を活用した情報支援システムのあり方について討論を深めることを目的としていた。具体的には、1.アジア太平洋地域の環境問題と人々の環境意識の変化、2.アジア太平洋地域における環境教育の実践と課題、及び、3.情報支援システム・遠隔教育と環境ネットワークの役割、のテーマについて議論が深められた。
バセドウ病眼症患者の後眼窩組織におけるTSH受容体発現の局在と意義に関する検討-in situ hybridization法による検討-

バセドウ病眼症は自己免疫性疾患と考えられているが、未だ自己抗原は同定されていないし、高率にハセドウ病に合併する機序も明らかではない。最近thyrotropin receptor(TSH-R)の分子レベルでの研究が進み、私どもを含めて幾つかの施設よりRT-PCR法にて後眼窩組織におけるTSH-R mRNAの発現が報告され、バセドウ病眼症との関わりが注目されている。今回私どもはin situ hybridization法によりヒト後眼窩組織におけるTSH-R mRNAの発現の局在とその意義について検討した。対象と方法:バセドウ病眼症患者7例とコントロールの3例より得られた外眼筋組織および後眼窩脂肪組織由来の培養線維芽細胞を対象とした。TSH-R cDNAより30 Merの合成ペプチドを3'-endolabeling法にてdigoxigeninをラベルし、プローブとして用いた。結果:バセドウ病眼症患者7例中5例に外眼筋組織間質細胞にTSH-R mRNAの発現がみられた。正常コントロールにも3例中1例にTSH-R mRNAの発現がみられた。バセドウ病眼症患者の後眼窩脂肪組織由来の培養線維芽細胞での検討では線維芽細胞のcytoplasmに発現がみられた。結論:以上の結果より、バセドウ病眼症患者では後眼窩組織の線維芽細胞上に発現したTSH-Rが自己抗原となりTSH-R抗体の標的となっている可能性が示唆された。
トランスゴルジネットワークにおけるロドプシンの選別機構

この研究の開始以前に、GPI生合成に関わる因子がロドプシンの選別に関わるという結果を得ていた。しかし、GPI生合成に関わる因子がどのようにしてロドプシンの選別に関わるのかという問題が残っていた。酵母では、GPI生合成が欠損するとラフトが正常に形成されなくなるという報告がある。そこで、ロドプシンの選別にラフトが関与する可能性があるのか、GPI生合成に関わる因子の欠損によるロドプシンの選別の異常が、ラフトの形成不全で説明できるかどうかについて生化学実験、免疫組織実験により検討を行った。その結果、ロドプシンの選別・輸送にラフトが関与する可能性が低いという結果が得られ、GPI生合成に関わる因子の欠損によるロドプシンの選別の異常が、ラフトの形成不全では説明できないという結論が得られた。そこで、我々の研究グループでは、GPIアンカー型タンパク質Xがトランスゴルジネットワークに局在し、ロドプシンの選別に関わるという仮説を立てた。本年度後半は、これまでのGPI生合成に関わる因子がロドプシンの選別に関わるという結果と、ラフトのロドプシン選別への非関与、さらに我々の立てたモデルを論文にまとめ発表した。さらに、GPIアンカー型タンパク質Xを同定するためのスクリーニングを開始した。24年度が最終年度であるため、記入しない。視細胞は、頂端面の一端が増幅した光受容膜・その周辺のストーク膜・側底面膜・軸索とシナプスという少なくとも4つの異なる細胞膜区画を持つ。ロドプシンは、このうちの光受容膜に特異的に輸送される。本目的では、この特異的輸送の分子機構の解明を目指している。先の2年の公募研究の期間の間に、ロドプシンの輸送に関与する分子のスクリーニングを行い、GPIのタンパク質への付加に関与する遺伝子PIGを同定した。更に、その解析結果より、申請者等は、"トランスゴルジネットワークにおけるラフト依存的なロドプシンの選別"が行われるという仮説(ラフト仮説)を立てた。23年度の研究はトランスネットワークにおけるロドプシンの選別におけるラフトの役割について検討することである。ロドプシンがラフトにより選別されるならば、ロドプシンはラフトと関連のある構造とされているDetergent resistant membrane(DRM)と相互作用していることが期待される。そこで、ロドプシンのDRMへの結合を生化学的に解析した。さらに、ラフト成分の変異体を用いてラフト形成を阻害した時のロドプシンの輸送を検討した。さらに2011年9月に発表された論文より糖脂質がロドプシン選別に関与する可能性が考えられたので、新たにこの変異体を作成しロドプシンの輸送を検討した。結果はいずれもロドプシンがラフトと相互作用すること、ロドプシン輸送に糖脂質が必要であることを否定する結果であった。従ってロドプシン輸送にGPI生合成が重要であるが、GPIはラフト形成に働いてロドプシン輸送を制御するのではなく、より直接的にロドプシンの選別に関わると考えられた。この結果は、Development誌に2013年1月に掲載される予定である。当初の予定では23年度中にここまでの成果を出す予定であったが、その過程で新たな論文が発表されたために、新規の変異体を作成する必要があった。この変異体作成と解析のために実験計画は遅れ、予算の繰越を行った.その繰り越した期間延長によって、当初予定した論文発表を終えることができた。当初の予定通り、本年度はEMSによるロドプシン輸送の欠損する変異体スクリーニングを開始している。23年度の研究によりGPI生合成がロドプシン輸送に必要であるが、それがラフトの形成を制御することによってではないという結論を出した。現在は、ある種類のGPIアンカー型タンパク質がロドプシン輸送に直接関与すると考えており、この分子を同定することが今後の課題である。そのために行うことは、MSによるロドプシン輸送の欠損する変異体スクリーニングであるので、研究計画は変更せずに、推進することが重要である。
原子論的結晶育成技術から挑むガーネット型混合アニオン固体電解質材料の開発

ガーネット型結晶に取り組む前段階として,比較的酸素欠損を形成しやすいスピネル型LiNi0.5Mn1.5O4-dをモデル化合物として,実験的,ならびに第一原理DFT計算による理論計算的アプローチにより,反応条件を探索した。結晶表面の混合アニオン化のための,アニオン源として,アモルファス性ヘテロナノカーボン粒子を用いた。室温で液体の複素環式化合物溶液中でグロー放電することにより,任意のアニオンを導入した,アモルファス性ヘテロナノカーボン粒子を合成した。これらの粒子とフラックス育成した酸化物結晶を混焼することにより,目的の化合物が得られるか調べた。結果として,スピネル型LiNi0.5Mn1.5O4-dにおいては,酸フッ化,酸硫化できることを明らかにした。さらに,電気化学測定および第一原理計算による電気化学反応予測から,酸化物とは異なる特異的イオン拡散挙動および電解液との界面反応を示すことを見いだした。さらに,これらの成果は国内外でも高い評価を受け,複数の招待講演の依頼,さらにフランスのモンペリエ大学との共同研究を開始し,平成30年度科研費「国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))」の申請に至った。これらの知見を基に,ガーネット型材料についても検討し,結晶表面の酸硫化に成功した。表面を酸硫化することにより,酸化物と比較して,800°C程度の低温でも緻密な焼結体が得られた。粒成長はほとんど見られずに緻密化されていることから,硫黄置換により,焼結反応初期過程に見られるネッキング形成速度が高速化された可能性が高い。一部の結果については,NPG Asia Materials,Sci. Rep.誌に成果をまとめた。その他,1件の特許を出願した。結晶表面の複合アニオン化によって,酸化物とは異なる電気化学特性,焼結特性など,当初に予想していた通りの新しい知見を見いだすことができた。関連技術で既に国内外で複数の共同研究に発展していることから,おおむね順調に進展していると判断した。連携研究者(NIMS西川)と協同して,1フラックス法により育成したガーネット型混合アニオン固体電解質単結晶粒子の単粒子測定(EIS測定,中性子回折,in situ XRD,in situ TEM,in situ Raman,in situ大気圧SEM等)により,そのintrinsicなリチウムイオン伝導度(バルク伝導率)の決定と大気安定性を明らかにする。加えて,2結晶終端面酸素のアニオン(酸硫化物,酸ハロゲン化物)置換が粒界における整合性やイオン輸送特性に及ぼす影響を丹念に調べる。具体的には,傾角粒界におけるリチウムイオン伝導挙動を計算科学的に解析し,その結果を基にして,方位の規定されたバイクリスタル基板表面から任意傾角粒界で接合した稠密結晶層をフラックスコーティング形成する。プローブを用いたインピーダンス計測やケルビンプローブ顕微鏡を用いたマルチスケール解析により,稠密結晶層中に含まれる任意の傾角粒界を伝導するリチウムイオン輸送現象を可視化する。

具体的には,傾角粒界におけるリチウムイオン伝導挙動を計算科学的に解析し,その結果を基にして,方位の規定されたバイクリスタル基板表面から任意傾角粒界で接合した稠密結晶層をフラックスコーティング形成する。プローブを用いたインピーダンス計測やケルビンプローブ顕微鏡を用いたマルチスケール解析により,稠密結晶層中に含まれる任意の傾角粒界を伝導するリチウムイオン輸送現象を可視化する。
局在プラズモン共鳴を用いたナノ分光センサーの開発

金ナノ粒子局在プラズモン共鳴のナノ分光センサー応用を目的に、本研究では金ナノ粒子を蛍光色素で被覆したコアーシェルナノ構造の作製とコアーシェル構造における蛍光増強の単一粒子分光測定による評価・解析を行った。表面をアミノシランで修飾したガラス基板表面に静電吸着法により市販の金ナノ粒子コロイド(平均粒径40、100nm)を固定化し、その表面に蛍光色素分子の薄膜を真空蒸着し、蛍光分子被覆金ナノ粒子を作製した。今年度の主たる成果として、ペリレンビスイミド(N,N-bis(2,5-di-tert-butylphenyl)-3,4,9,10-perylene dicarboximide)の薄膜(膜厚5-30nm)において、金ナノ粒子近傍からの蛍光強度が約25倍を増強されることを見出し、その機構解明を行った。これまでの蛍光増強に関する研究例では、分子の励起確率の増大による蛍光増強が多く報告されてきた。一方、本研究では、蛍光増強度の粒子サイズや色素薄膜の膜厚依存性さらに蛍光増強度の励起波長依存性を詳細に検討し、ペリレンビスイミド薄膜の蛍光増強メカニズムが主に発光の遷移確率の増大であることを強く示唆する結果を得た。そして、本実験のように、吸収と発光スペクトルのストークスシフトの大きなエキシマ発光について調べることは、蛍光増強の機構における光吸収確率と発光遷移確率の増大の効果を実験的に区別して議論しその機構を解明する上で有力なアプローチであることが示された。また、本成果は幅射遷移確率の小さな発光が金ナノ粒子の局在プラズモン共鳴よって効果的に増強されることを示すものであり、金ナノ粒子局在プラズモン共鳴のナノ分光センサー応用の基礎として重要な知見である。金属ナノ粒子特有の光学特性を利用した高感度分光センサーとして、金属ナノ粒子と有機分子からなるハイブリッドコア-シェル構造に着目した。本研究ではこうしたコア-シェル構造の作製とその光学特性を単一粒子レベルで明らかにすることを目的として研究を進めた。まず、顕微光散乱スペクトル測定による単一粒子の有効性を確認するため、東北大学の及川研究グループで作製された、銀および白金被覆ポリジアセチレンナノ結晶の単一ナノ粒子分光を行った。その結果、金属の被覆率の不均一性に起因する光学特性の粒ごとの大きなばらつきがあること、また、集団測定では困難なナノ結晶の偏光特性を明らかにできることなど、単一粒子測定の有効性が示された。つぎに、蛍光分子被覆金ナノ粒子の作製と単一粒子分光を行った。単一分光測定用の試料を作製するため、表面をアミノシランで修飾したガラス基板表面に静電吸着法により市販の金ナノ粒子コロイド(平均粒径40,100nm)を固定化し、そのナノ粒子表面を末端にカルボン酸を有するアルカンチオールの自己組織化単分子膜で修飾した。この金ナノ粒子試料を色素溶液に浸すことによって、溶液からの分子吸着による蛍光色素分子被覆金ナノ粒子の作製を検討した。色素分子には代表的な蛍光色素であるローダミンBを用いた。色素被膜形成を光学顕微分光装置による単一ナノ粒子の光散乱スペクトル測定によって評価し、本手法によりナノ粒子表面を蛍光分子で被覆したコア-シェル構造の作製が可能であることが分かった。このナノ粒子は、金属ナノ粒子-有機分子ハイブリッド構造の基本物性を調べるためのモデル系として有望であり、発光特性も含めた分光特性の詳細な検討を次年度計画している。
HIV-1の吸着と侵入機構の解析

通常HIV-1は細胞表面のCD4とケモカインレセプターであるCXCR4あるいはCCR5をレセプターペアとして、その感染が成立する。この感染は、さらに、糖脂質などの物質で細胞を前処理すると増強され、これらの物質が補助的に作用していることが報告されている。しかし、その詳しい機序はわかっていない。植物由来の糖脂質であるカプシアノサイドGは、細胞への前処理で、HIV-1のX4株のみの感染を選択的に増強した。また、X4R5株のウイルスではCXCR4とCD4を発現した細胞をカプシアノサイドGで処理することによって、その感染が増幅された。共焦点顕微鏡を用いた観察で、カプシアノサイドG処理した細胞ではCD4とCXCR4とのcappingと共集合が見られ、CD4とCCR5との間ではそのような現象は認められなかった。FITCでラベルしたHIV-1(X4株)では、ウイルス吸着後にFITCのcappingが観察されたが、その細胞の頻度は低かった。カプシアノサイドによるX4 HIV-1の感染増強は、この糖脂質によってCD4とCXCR4とが細胞の一部分に集められ、ウイルスの吸着と侵入が促進されたためと思われた。この現象とHIV-1レセプターを多く発現している細胞がHIV-1感染に感受性が高いという事実を考え合わせると、HIV-1は一個のウイルスが多くのレセプターとくっ付くことにより細胞内への侵入すると推測された(multiple site binding)。このmultiple site bindingは細胞膜の流動性が高くなるとその多結合の機会が高くなると仮定されている。この仮説を証明するため、吸着時の温度を40°Cに設定した。この高温処理によりHIV-1の感染は増強された。今後、multiple site bindingを阻害する因子(抗体の附着など)を追究し、ウイルスの吸着と侵入の機構を明らかにしたい。
円口類ヌタウナギ、ヤツメウナギ半規管の進化発生学的解析

前年度までの解析により、ヌタウナギの半規管は単一なものの、その発生過程ではヤツメウナギの二半規管と相同な遺伝子発現が耳胞の相同な位置において見られ、ヌタウナギは2次的に二半規管が退化して単一半規管になった可能性が示唆された。本年度はまず、全脊椎動物で唯一、前後に2つある、奇妙なヌタウナギの前庭神経節の発生に注目した。その結果、これら2つの神経節はどちらも、他の顎口類と同様に耳胞の後方から脱上皮化して形成されることが分かった。すなわち、一見奇妙な発生をするヌタウナギの半規管とその神経も、基本的にはヤツメウナギと発生プログラムによって形成されることが分かった。次に、ヤツメウナギの内耳の有毛細胞の分布とその神経支配を詳細に観察すると、円口類には存在しない水平半規管の膨大部と相同と思われる検出器と神経枝が確認でき、驚くべきことにこれはヌタウナギにも存在した。水平半規管の膨大部の発生に不可欠の遺伝子Foxg1もヤツメウナギにおいて発現していたことと合わせて考えると、円口類には水平半規管そのものはないものの、その検出器と神経の祖型と言えるものは存在しているようだ。では、水平半規管そのものはどうやって獲得されたのか?Otx1ノックアウトマウスは半規管を欠くことから、この遺伝子の発現獲得が水平半規管に必須だったことが予想されていた。ところが、われわれが4種のOtx遺伝子の発現をヤツメウナギで調べたところ、驚くべきことに4種とも発現が確認された。以上から、水平半規管の獲得にはOtx1に制御される下流遺伝子の働きの変化があったのではないかと推測することができた。以上を論文にまとめ投稿し、Nature誌に掲載された。まずヌタウナギについて、既に作成されていた発生段階の胚の切片スライドから3Dリコンストラクションを作成し、内耳の発生の連続的な変化を観察することに成功した。その結果、ヌタウナギの単一半規管は、発生上二半規管から融合して形成されるのではなく、直接ドーナツ状の半規管が形成されることが分かった。次に、ヌタウナギの半規管は前後に対称な形に見え、他の脊椎動物では一つしかない前庭神経節も前後に2つ存在するため、内耳の前後軸形成と神経節形成に関わる転写因子Tbx1の発現を観察したところ、その発現は他の顎口類と同じように後方に限局した発現を示した。また、今後の解析のため、8月にヌタウナギを採集し、そこから受精卵を得ることに成功している。ヤツメウナギについては、内耳の発生、とりわけ水平半規管の発生に必須な遺伝子Otxの新規パラログをヤツメウナギで同定し、既知の3種のOtxと合わせてその内耳における発現を観察したところ、そのすべてにおいて内耳での発現が観察されなかった。これはOtx1ノックアウトマウスが水平半規管を欠くことと一致しており、極めて興味深い。また、顎口類ではOtx1の発現を制御する転写因子Six1や、その下流遺伝子の発現も現在解析中である。また、進化の推定のためには、円口類の両系統、すなわちヌタウナギとヤツメウナギの発生を解析し、顎口類と比較することが重要である。このことを指摘した総説を書き、受理された。現在印刷中である。ヌタウナギの胚を予想以上に得ることができた。また、既存の標本スライドからも多くの半規管の形態発生について情報を得ることができた。ヤツメウナギの胚も順調に得られており、内耳形成に関連する遺伝子の網羅的解析に進むための有益な情報が得られている。Otx1ノックアウトマウスは水平半規管を欠くため、Otx1およびその下流の遺伝子ネットワークは、水平半規管の発生に必須である可能性が高い。そこで、マウスOtx1ノックアウトマウスを作成し、その胚から内耳を取り出しRNAを抽出した。つぎに野生型との遺伝子発現プロフィールを比較するため、マイクロアレイ解析を行った。結果は現在解析中である。ヤツメウナギ内耳において、Otx遺伝子が発現しているかを検証するため、さまざまなステージの胚、およびアンモシーテス幼生から内耳を摘出し、RNAを抽出した。次にそれを逆転写したcDNAをテンプレートとしてリアルタイムPCRを行った。その結果、ヤツメウナギ発生後期アンモシーテス幼生期にかけて、Otx相同遺伝子であるLjOtxA, LjOtB, LjOtxC, LjOtxDのすべての発現が認められることが分かった。この結果は、「ヤツメウナギではOtx遺伝子が内耳で発現していないから水平半規管がない」とするこれまでの仮説を覆すものであり、非常に重要な知見である。現在は詳細な発現領域を解析するために、in situハイブリダイゼーション法を行っている。また、半規管のドーナツ状の環の形成の際、発生時にNetrin1が、耳胞の将来孔のあく領域に発現することが知られている。この遺伝子が円口類でどのように働くのか調べるため、ヤツメウナギ、ヌタウナギからNetrin1相同遺伝子をクローニングした。現在は発現領域を解析中である。マイクロアレイ解析を行ったが、まだその結果についての確認実験、および考察は行っていない。ヤツメウナギOtx遺伝子の発現をリアルタイムPCRで確認できたことは進歩である。発現領域の解析であるin situハイブリダイゼーション法の解析を急ぎたい。

前年度までの解析により、ヌタウナギの半規管は単一なものの、その発生過程ではヤツメウナギの二半規管と相同な遺伝子発現が耳胞の相同な位置において見られ、ヌタウナギは2次的に二半規管が退化して単一半規管になった可能性が示唆された。本年度はまず、全脊椎動物で唯一、前後に2つある、奇妙なヌタウナギの前庭神経節の発生に注目した。その結果、これら2つの神経節はどちらも、他の顎口類と同様に耳胞の後方から脱上皮化して形成されることが分かった。すなわち、一見奇妙な発生をするヌタウナギの半規管とその神経も、基本的にはヤツメウナギと発生プログラムによって形成されることが分かった。次に、ヤツメウナギの内耳の有毛細胞の分布とその神経支配を詳細に観察すると、円口類には存在しない水平半規管の膨大部と相同と思われる検出器と神経枝が確認でき、驚くべきことにこれはヌタウナギにも存在した。水平半規管の膨大部の発生に不可欠の遺伝子Foxg1もヤツメウナギにおいて発現していたことと合わせて考えると、円口類には水平半規管そのものはないものの、その検出器と神経の祖型と言えるものは存在しているようだ。では、水平半規管そのものはどうやって獲得されたのか?Otx1ノックアウトマウスは半規管を欠くことから、この遺伝子の発現獲得が水平半規管に必須だったことが予想されていた。ところが、われわれが4種のOtx遺伝子の発現をヤツメウナギで調べたところ、驚くべきことに4種とも発現が確認された。以上から、水平半規管の獲得にはOtx1に制御される下流遺伝子の働きの変化があったのではないかと推測することができた。以上を論文にまとめ投稿し、Nature誌に掲載された。ヌタウナギについては、初年度で得られた胚からパラフィン切片を作製し、形態の観察に使用する一方、さらなる遺伝子の発現解析も行いたい。ヤツメウナギで得られた結果から、Otx1ノックアウトマウスが、ヤツメウナギのフェノコピーを示している可能性が示唆された。これを解析するため、Otx1ノックアウトマウスと野生型マウスの内耳に発現している遺伝子を網羅的に解析し、顎口類が水平半規管を獲得するためには、どのような発生メカニズムの改変が必要であったのかを考察したい。上記のように、マイクロアレイ解析から見えてくる、Otx1とその有無により発現変動する遺伝子群の確認と、半規管の発生との関連をさらに解析する必要がある。受託解析の利用も含め、効率よく解析を進めていきたい。実験試薬の購入に多少の増減が生じたため。極めて少額であり、計画通り使用てきている。試薬の購入に充てる。
新技術による野生動物の生息地利用とその保全のための応用に関する研究

我国では近年,野生動物に寄る農林業被害が拡大し,人間と野生動物の共存の必要がさらに求められている.これまでの農林業被害対策は動物の生態学的性質を十分に理解した上で立てられたものでなかったために有効でなかった.その大きな原因は調査の困難さにあった.最近進展しているGPS発信機による野生動物の位置情報はこの問題解決のひとつの有力な手法になる可能性がある.そこで本課題のプロジェクトでは新技術の方法上の検討をおこなうとともに,ニホンジカ,ニホンカモシカ,イノシシを捕獲してGPS発信機を装着し,その位置情報を収集して解析することとした.しかし農林業被害地では動物の駆除がおこなわれているため捕獲などの実施が困難であり,また被害発生に関与する要因が多岐にわたるため,単純な系での調査を実施した.富士山北麓での基礎調査によるとロテック社のGPS-3300はオープンな環境では非常によい成績が得られたが,森林内では補足率が低下することがわかった.ほかの場所での結果もあわせると自動脱落装置の機能には信頼性が低く重大な課題である.応用例としては富士山のニホンジカは地形のなだらかな場所を使う傾向があり,そのような場所は林業地であるために潜在的に被害発生の可能性をもっていることが示された.オスとメスで違う動きをし,積雪に対応して長距離の移動をした.積雪前の秋に非常に広い行動圏をとった.体の小さいメスのほうが雪の影響を強く受けるようであった.宮城県金華山島のニホンジカの場合,月行動圏面積は5-10haで,夏に狭く冬に広い傾向があったが,富士山のような著しい季節変化はなかった.群落利用は夏から初冬にかけてはシバ群落を選択力に利用したが,森林は好まず,冬にやや選択的に利用するだけだった.シカのこのような森林と群落の往復によって多くの種子が運搬されていることが示された、岩手県盛岡市のニホンカモシカ(1歳オス)の場合,月行動圏面積はほぼ10haだったが,2歳になる前の3,4月に行動圏を移動した.利用したのはほとんどが森林群落であった.このように動物種によって群落利用に違いがあり,そのことは食性などの生物学特性と関連している.これらの知見が農林植物の特性と関連づけて統一的に説明されれば被害対策にとっても有効な情報を提供することができる.同所的に複数の個体の動きを調べることはできなかったが,これが可能になれば社会行動学的な知見も得られ,さらに理解が深まることが期待できる我国では近年,野生動物に寄る農林業被害が拡大し,人間と野生動物の共存の必要がさらに求められている.これまでの農林業被害対策は動物の生態学的性質を十分に理解した上で立てられたものでなかったために有効でなかった.その大きな原因は調査の困難さにあった.最近進展しているGPS発信機による野生動物の位置情報はこの問題解決のひとつの有力な手法になる可能性がある.そこで本課題のプロジェクトでは新技術の方法上の検討をおこなうとともに,ニホンジカ,ニホンカモシカ,イノシシを捕獲してGPS発信機を装着し,その位置情報を収集して解析することとした.しかし農林業被害地では動物の駆除がおこなわれているため捕獲などの実施が困難であり,また被害発生に関与する要因が多岐にわたるため,単純な系での調査を実施した.富士山北麓での基礎調査によるとロテック社のGPS-3300はオープンな環境では非常によい成績が得られたが,森林内では補足率が低下することがわかった.ほかの場所での結果もあわせると自動脱落装置の機能には信頼性が低く重大な課題である.応用例としては富士山のニホンジカは地形のなだらかな場所を使う傾向があり,そのような場所は林業地であるために潜在的に被害発生の可能性をもっていることが示された.オスとメスで違う動きをし,積雪に対応して長距離の移動をした.積雪前の秋に非常に広い行動圏をとった.体の小さいメスのほうが雪の影響を強く受けるようであった.宮城県金華山島のニホンジカの場合,月行動圏面積は5-10haで,夏に狭く冬に広い傾向があったが,富士山のような著しい季節変化はなかった.群落利用は夏から初冬にかけてはシバ群落を選択力に利用したが,森林は好まず,冬にやや選択的に利用するだけだった.シカのこのような森林と群落の往復によって多くの種子が運搬されていることが示された、岩手県盛岡市のニホンカモシカ(1歳オス)の場合,月行動圏面積はほぼ10haだったが,2歳になる前の3,4月に行動圏を移動した.利用したのはほとんどが森林群落であった.このように動物種によって群落利用に違いがあり,そのことは食性などの生物学特性と関連している.これらの知見が農林植物の特性と関連づけて統一的に説明されれば被害対策にとっても有効な情報を提供することができる.同所的に複数の個体の動きを調べることはできなかったが,これが可能になれば社会行動学的な知見も得られ,さらに理解が深まることが期待できる予算の執行が決定してからただちに準備を進め,初めにGPSの機種選定作業に入った.各社から情報をとりよせて検討した結果,カナダ,ロテック社のGPS_3000が最良であると判断された.これは1日4点の位置が15m程度の精度でロケーションでき,寿命は1年半である.脱落は寿命が近づいたら自動脱落するが,目視しながら電波を発信して脱落させることも可能である.そこでニホンジカ6頭,カモシカとイノシシそれぞれ2頭を注文した.

しかしロテック社では製品開発を進行中で,発注後にGPS_3300の機能テストが成功したので,こちらのほうがよいと推薦され,変更することとした.これと並行して,調査地の選定をおこない,カモシカは岩手県盛岡市近郊の岩手大学演習林,ニホンジカは宮城県金華山島と富士山北麓,イノシシは福井県内に選ぶこととした.そして調査地の概況記述と,カモシカとニホンジカについては糞を採集した.これはGPS装着後行動圏があきらかになるが,その場合に森林内とオープンな場所とを比較し,どちら由来の植物をより多く利用しているかを明らかにするためである.現在サンプルは水洗し,液浸標本にしている.これはスチュワートのポイント枠法によって顕微鏡分析する予定である.このことは農林業被害を考える上でも重要な意味をもっている.カモシカについては3度の捕獲を試みたが成功していない.ニホンジカは金華山島において2003年3月の捕獲を実施に3頭のGPS装着に成功した.イノシシは初めての試みであるが,罠による捕獲を準備している.昨年度,カモシカは岩手県盛岡市近郊の岩手大学演習林,ニホンジカは宮城県金華山島と富士山北麓,イノシシは福井県内に選ぶこととした.カモシカは2003年5月9日に2歳のオスの捕獲に成功した.GPS機能による詳細な生息地利用は発信器を脱落させてから解析をする予定であるが,VHFによる追跡もおこなっており,その結果は行動圏は10ha前後と非常に狭く,行動距離も100m以内にすぎなかった.これまでのところ行動圏に季節変化はみとめられていない.ニホンジカは金華山島において2003年3月上旬に3頭のメスを麻酔銃で捕獲し,発信器の装着に成功した.その後,VHFによる追跡はおこなっていないが,比較的見通しのよいところにいる1頭は頻繁に観察された.3頭のうちの1頭は5月に死体が発見され,発信器を回収した.別の1頭は2004年3月11日に麻酔捕獲し,発信器を回収した.現在そのデータを解析中である.またもう1頭は2004年4月に捕獲予定である.富士山麓の3頭は.イノシシは福井県での比較が困難であり,検討の結果宮崎県に候補地を見いだした.そして2004年2月にイノシシ1頭を捕獲し発信器を装着して放逐した.このように全体としては2年目はGPS発信器の性能の確認と装着に集中した.その結果,GPS発信器は数メートルというきわめて高い精度で動物の位置を特定できることが確認された.ニホンジカ6頭,カモシカ1頭,イノシシ1頭に装着することができた.捕獲の困難ななか生け捕りをし,装着ができたことは成功であった.そして現在ニホンジカ2頭の脱落発信器について蓄えられたデータの解析をおこなっている.3年目は春から初夏にかけて脱落させ,データ解析が可能となる.所期の目的を達成するために8台のGPS電波発信機を購入し,2台を岩手県のニホンカモシカ(以下カモシカ),2台を金華山島のニホンジカ(以下シカ),2台を富士山のシカ,2台を宮崎県のイノシシに装着することとした.このうちニホンカモシカは1頭の捕獲に成功し発信機を装着した.金華山のニホンジカは2頭の捕獲・装着に成功したが,自動脱落装置は作動せず,1頭は再度捕獲して発信機を回収した(もう1頭は未捕獲)
新生骨への歯の移動・歯牙移植における超音波と血管内皮増殖因子の骨成熟促進作用

本研究に用いた雄性ビーグル幼若犬においてはすべての個体に上顎の急速拡大を行った。その際、低出力超音波振動装置を用いた実験群は非照射の対照群に比べ拡大した歯の後戻りが少なく、また両群の縫合部の幅に差が見られないことから、実験群において拡大された部位は新生骨に置き換えられ維持されていることが示唆された。また、実験群では蛍光顕微鏡像により広範囲な骨標識剤によるラベリングが観察されていることにより、活発な骨の形成が起こっていたであろうと推測される。これは、低出力超音波照射により口蓋縫合部の新生骨形成時に起こる複数の細胞反応において効果があり、骨形成の促進が起こったと推測できる。拡大後の新生骨への歯の移動について、実験群ではすべての歯種において根面ラベリング率が対照群よりも大きいことより、骨改造がより活発に行われていることが示唆された。さらに、意図的再植歯に対しては、低出力超音波照射によって歯の吸収が抑制される傾向が明らかに認められ、意図的再植後の歯周組織の創傷治癒に対して有利に作用する可能性が伺われた。以上のことより、低出力超音波パルス照射により上顎急速側方拡大後の新生骨形成促進効果があり、拡大後の後戻りを阻止した可能性が示唆された。また、矯正学的歯の移動に伴う歯槽骨の改造現象を活性化したり、意図的再植歯の歯根吸収を抑制する可能性が伺われた。ただし、本研究では実験動物数が少ないことや、拡大を行っていない真の対照群が無い、あるいは縦断的な実験が行えていないなどの欠点が挙げられ、今後更なる追加実験による研究が不可欠であると考察している。雄性ビーグル犬3頭(平均年齢6ヶ月)に急速拡大装置を装着し、3週間にわたって計6mmの拡大を行った。拡大後の保定は4週間でその間に上顎6切歯にブラケットを接着し、アーチワイヤーとエラスティックで正中への歯の移動を行うことで新生骨への歯の移動モデルとした。装置除去8週後に屠殺し、各種組織評価を行った。なお、口蓋正中部への超音波の接触照射は1頭のみに、出力強度30mW/cm^2にて毎回20分を屠殺まで計17回行った(照射犬)。他の2頭は超音波無照射の対照犬とした。なお、上顎前臼歯に意図的再植を行い、術後22週間で組織評価した。経時的に採得された上顎歯列模型より犬歯間距離および第三前臼歯間距離を測定した結果、照射犬は対照犬に比べ拡大後のあと戻りが少なかった。また、歯の移動は照射犬においては2週間で空隙の閉鎖がみられたが、対照犬では空隙閉鎖にそれぞれ3週間、4週間を要した。移動後の歯周組織では照射犬においてより活発で広範囲なラベリング(テトラサイクリンまたはカルセイン)像が認められた。意図的再植歯は照射犬における歯根吸収が少なく、良好な再生過程にあると考えられた。以上のことより、超音波照射は上顎急速拡大後の新生骨形成や矯正学的歯の移動さらには再植後の歯周組織の創傷治癒に促進的に作用し、拡大後のあと戻りを阻止し、歯の移動を促進し、再植後の歯根吸収を抑制する可能性が示唆された。
口唇口蓋裂関連遺伝子の解明と発症予防に関する実験的研究

本研究では口唇口蓋裂(CL/P)関連遺伝子の突然変異による遺伝的因子の解明を目的とし、既に研究分担者の山田が作製したENUによる突然変異誘発モデルマウスでの口蓋裂個体についての解析を行った。モデルマウスはICR系マウスを用いた。10週令の雄マウスにENU250mg/kgを腹腔内投与し、それぞれの同系雌マウスと交配を行った。第一世代(GO)で観察できる表現型は優性変異、G1とG2を戻し交配させてできた第三世代(G3)で観察できる表現型は劣性変異と考えられる。その結果、G1およびG3世代で口蓋裂(CPO)発生率が増加した。また、G3世代の方が有意に発生率が高かった。口唇裂(CL)および唇顎口蓋裂(CLP)は認められなかった。従って、CPOは突然変異の影響をうけやすく、また劣性形質を示すと考えられた。そこでG3世代の口蓋裂個体のゲノムDNAの解析を行った。マウス頭部組織からゲノムDNAをQIAamp DNA Mini Kitをもちいて行った。それを鋳型DNAとして、本年度は昨年度に続き関連遺伝子としてLhx8、Msx1およびGad1のミューテーション解析をさらにおしすすめた。しかしながら、当該遺伝子の各エクソンの部位にはミニーテーションは認めなかった。今後はゲノムワイドに研究をすすめていく必要があると考えられる。第一世代(G0)で観察できる表現型は優性変異、G1とG2を戻し交配させてできた第三世代(G3)で観察できる表現型は劣性変異と考えられる。それを鋳型DNAとして、本年度は関連遺伝子としてLhx8、Msx1およびGad1のミューテーション解析をDGGE法を用いて行った。これら遺伝子のノックアウトマウスは口蓋裂以外に致死的な異常を示さないため、最もヒトにおける口蓋裂と近いと考えられたからである。しかしながら、当該遺伝子の各2エクソンの部位にはミューテーションは認めなかった。次年度はトータルRNAを抽出し、mRNAレベルでのミューテーションを検索し効率化を図る予定にしている。
遺伝子治療を併用したフルオロアパタイトによる新しい歯髄保護療法の開発

本研究の目的は、炎症を抑制する遺伝子治療と、結晶配列を統一させたバイオミメティクなフルオロアパタイトの形成を組み合わせた新しい歯髄保護療法を開発することである。遺伝子導入効率は細胞種によって異なることから、本課題において、リン酸カルシウムナノ粒子を基盤とした効率的な遺伝子導入剤を開発し検証したところ、ナノ粒子最外層にオクタアルギニンもしくはプロタミンを付与することで、細胞毒性が低いまま、遺伝子導入効率が上昇することが分かった。また、その細胞内導入経路は細胞の種類によって導入経路が異なることを確認した。一方、オクタアルギニンを付与した場合はアミロライドで前処理することで骨系細胞に対してさらに高い遺伝子導入効率を示した。また、開発した遺伝子導入剤をコラーゲンを基材としたscaffoldに配合し、生体内での遺伝子導入効果について評価したところ、1生体内での過度な炎症を惹起しないこと、2観察期間内においてはガン化所見は認めらなかったこと、3目的の遺伝子の発現が確認され、生体内でも遺伝子導入できること、また4その作用時間はscaffoldによることを明らかとした。一方、これらの遺伝子導入剤をLPSに作用させた歯肉由来細胞、歯髄由来細胞に適用したところ、有意に炎症を抑制することを生化学的に確認した。一方、フルオロアパタイトの合成においては元素解析、組織学的解析の結果、1方向に配列されたフルオロアパタイトを象牙質上で合成できることを確認した。しかし、各々の結晶は水溶液及び人口唾液中で拡散しやすく単独での使用は困難であった。そこで、従来のセメントに混合し、溶解性、セメントの機械的強度について検討した結果、従来のセメントと同等の強度を示した。これらの成果については学会及び国際専門学術雑誌に発表した。平成28年度では、ベクター最外層にポリエチレンイミン(PEI)、Protamine、Octa-ariinineもしくはケイ素を付与した計4種類のpAcGFP1encoding plasmidを含有したリン酸カルシウムナノベクターを精製した。また、ラットより歯髄細胞の採取後、継代培養し、同細胞に対して遺伝子導入効率、細胞毒性を検討した。その結果、導入効率についてはケイ素を除いて特に有意な差は見られなかった。一方、細胞毒性試験ではPEIを付与した群について高い細胞毒性を示した。また、LPSで細胞を刺激後、siRNAを含有した上記4群を適用したところ、同様の結果が見られた。このことから、歯髄細胞にはprotamineもしくはOcta-arginineを付与したsiRNA含有リン酸カルシウムナノ粒子ベクターが有効であることが明らかとなった。一方、フルオロアパタイトの合成については、混合する溶液のmol数とpHを調整することで、SEM観察から統一された結晶配列を持っていることや組織学的観察から生体親和性に問題がないことが観察できた。現在、合成フルオロアパタイトの元素分析、人口唾液中における合成フルオロアパタイトの溶解性について検証を行っている。また、細粒状の合成フルオロアパタイトにBMP-2 encoding plasmidを含有したリン酸カルシウムナノ粒子を混和した人工基材を作成し、骨芽細胞、未分化間葉細胞、歯髄細胞に対する遺伝子導入効率、細胞毒性、骨組織形成能について評価している。本年度の予定にあった細胞の採取・培養並びに遺伝子導入抑制剤の精製とin vitroにおける細胞実験(遺伝子抑制効率、細胞毒性の試験)、結晶配列の統一された合成フルオロアパタイトの精製やその親和性を確認できたことから、今年度予定していた研究計画に沿っておおむね順調に進展していると考えられる。H28年度の結果をもとにリン酸カルシウムナノ粒子を基盤としたより効率的な遺伝子導入剤を開発検証したところ、ナノ粒子最外層にオクタアルギニンもしくはプロタミンを付与することで、細胞毒性が低いまま、遺伝子導入効率が上昇することが分かった。次いで、細胞種によって導入効率が異なることから、開発した遺伝子導入剤の細胞内導入経路を検証したところ、細胞の種類によって導入経路が異なることが明らかとなった。一方、最外層にオクタアルギニンを付与した遺伝子導入剤をアミロライドで前処理した場合、骨系細胞に対してさらに高い遺伝子導入効率を示した。そこで、細胞内のpHを検証したところ、骨系細胞ではアミロライド処置前後でのpH値の変動が少ないことが分かった。この成果について、国際専門学術雑誌にて公表を行った。また、BMP-2発現plasmidを含有したリン酸カルシウムナノ粒子をハイドロキシアパタイトーコラーゲンscaffoldに配合し、生体内での遺伝子導入効果及びBMP-2徐放性について検証した。現在、その成果を国際専門学術雑誌に投稿中である。一方、フルオロアパタイトの溶解性を検討したところ、人工唾液中で拡散することから単独での使用は不可能と考え、従来のセメントに混合し、溶解性、セメントの機械的強度について検討している。効率的な遺伝子導入剤の開発が進み、特許申請および論文公開のための追加実験など当初予定していた以外の実験を追加した。また、この結果から予定していた一部実験を変更するなどして実験を行っている。

遺伝子導入効率は細胞種によって異なることから、本課題において、リン酸カルシウムナノ粒子を基盤とした効率的な遺伝子導入剤を開発し検証したところ、ナノ粒子最外層にオクタアルギニンもしくはプロタミンを付与することで、細胞毒性が低いまま、遺伝子導入効率が上昇することが分かった。また、その細胞内導入経路は細胞の種類によって導入経路が異なることを確認した。一方、オクタアルギニンを付与した場合はアミロライドで前処理することで骨系細胞に対してさらに高い遺伝子導入効率を示した。また、開発した遺伝子導入剤をコラーゲンを基材としたscaffoldに配合し、生体内での遺伝子導入効果について評価したところ、1生体内での過度な炎症を惹起しないこと、2観察期間内においてはガン化所見は認めらなかったこと、3目的の遺伝子の発現が確認され、生体内でも遺伝子導入できること、また4その作用時間はscaffoldによることを明らかとした。一方、これらの遺伝子導入剤をLPSに作用させた歯肉由来細胞、歯髄由来細胞に適用したところ、有意に炎症を抑制することを生化学的に確認した。一方、フルオロアパタイトの合成においては元素解析、組織学的解析の結果、1方向に配列されたフルオロアパタイトを象牙質上で合成できることを確認した。しかし、各々の結晶は水溶液及び人口唾液中で拡散しやすく単独での使用は困難であった。そこで、従来のセメントに混合し、溶解性、セメントの機械的強度について検討した結果、従来のセメントと同等の強度を示した。これらの成果については学会及び国際専門学術雑誌に発表した。今年度では、当初の計画通り、合成フルオロアパタイトの元素分析( X線光電子分析(ESCA)、フーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR))、形態学的特徴(ESEM)、機械的特徴について検証する予定でいる。また、ラット臼歯部窩洞に作成したリン酸カルシウムナノベクターならびにフルオロアパタイトを適用し、in vivoにおける歯髄反応を検証する予定でいる。作製した数種類のフルオロアパタイト含有セメントの機械的強度から至適セメントを求める。その後、ラット臼歯部窩洞に精製したリン酸カルシウムナノベクターならびにフルオロアパタイトを適用し、in vivoにおける歯髄反応を組織学的、分子生物学的に比較検証する。さらに、複数の抗炎症作用を持つsiRNAや成長因子をリン酸カルシウムナノベクターに付与することで、作製材料の抗炎症作用、硬組織誘導作用について検証する。得られた結果については、国際専門学術雑誌に投稿を予定している。英文校正の文字数が減少したため、予定していた英文校正額よりも請求額が少なかったため、次年度への繰り越しとなった。繰り越した額は実験で使用する消耗品の購入に当てる予定である。