hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
科学教育への科学史導入の意味とその教材化に関する包括的研究

本研究の目的は基本的に、2003年度から始まる、高等学校の理科教育への科学史の本格的導入にあたって、これまでの科学史の成果をどのようにしたら生かせるかにあるが、その研究成果報告書の概要は以下の通りである。第一に、科学史研究関連の文献・資料の調査・調達をおこなうと共に、科学史教育の意味について論じた先行研究の分析を行ない、それらの中から高等学校の理科教育に適用しうるタイトルをピックアップし整理した。第二に、高等学校の理科教育における科学史の導入、その教材化の望ましいあり方について検討すると共に、個別教材の位置づけを検討し、それらの構成のあり方、理科教育における科学史教育の目標などについて検討した、より具体的にいえば、科学的発見の歴史的道筋、科学的認識の継承・発展のあり方・科学法則・概念の形成の実際、科学実験・観測手段のあり様とその時代的制約、あるいは理論的考察や実験、観察に見られる手法、またそれらの理科学習への導入のあり方について、個別的かつ包括的な検討をおこなった。また、個別科学史教材に関わって、科学の方法の果たした役割、科学思想との関連などについて検討した。第三に、その上で、新科目「理科基礎」を含む高等学校の理科教育を射程に入れた科学史の教材化の開発研究をおこなった。具体的には、物理学史系、化学史系、生物学史系、天文学史。地学史系の個別科学史分野別にトピック項目を設定し、ケース・スタディ的にその具体化をおこなった。本研究プロジェクトが掲げた当初の目標を達成した。これらの成果について、最終的に冊子として印刷し、広くその成果を普及することにしている。上記研究課題に関する第一年度の実績概要は以下の通りである。(1)科学史が導入される新科目「理科基礎」の内容、および採択の可能性を含む、現場における受け止め方などについて検討した。(2)新科目「理科基礎」の教科書づくりならびに指導書づくりに実際について情報を人手した。(3)科学史教材化の基本方向について、具体的に物理学史関連、生物学史関連、化学史関連、地学史・天文学史関連などの個別的事例を取り上げ、これをどのようにしたら現場で役に立つものとなるか、試案を作成し検討した。(4)その上で、Q&A方式の具体化をおこない、Q試案、A試案について作成し、検討を加え、Q&A方式による教材集・資料集の具体化の方向について協議した。(5)科学史関連、理科教育関連のバックナンバーを調べ、科学史の教材化に関わるタイトルを集約し、その際の資料認定法について協議した。(6)欧米諸国の科学教育の新たな動向、あるいは科学史教材のありようについて情報を入手した。本研究は、科学史が本格的に導入される新科目「理科基礎」の高校理科への設置にともない、教育現場に役立つ科学史教材集を作成することを目的としておこなわれているものであるが、第2年度に入り、いよいよその具体化のための準備が整いつつある。その第2年度の研究実績の概要は以下の通りさある。(1)科学史教材集の体裁について骨子がまとまった。(2)科学史教材集のトピックス項目の選定について物理学史、化学史、生物、医学史、地学、天文学史の分野に分けて作業おこない、その項目検討をおこなった。(3)科学史教材集のトピックス項目の見本原稿について、研究分担者ならびに研究協力者の助力を得て、試案を前記の四つの分野毎に作成し、その検討をおこなった。(4)来年摩より『理科基礎』が導入されるが、そこでの科学史研究の役割を検討する、シンポジウムを開催し、その基本的意義、想定される事態、教科書づくりなどで表出されたことなどについて討議をおこなうと共に、望ましいあり方について協議した。(5)理科教育に役立つ科学史タイトルについて、前年度に引き続き、集約作業をおこなった。最終年度の実績概要は、主にこれまでの研究成果を整備し、それらを取りまとめたことである。(1)これまでに本研究メンバーが主要に開催してきた公開シンポジウム、フォーラムの報告など、学術雑誌に掲載されたものをとりまとめた。

(2)科学史教材資料集の作成を射程に入れて、その項目タイトル一覧を前年度に引き続き、物理学史、化学史、生物学史・医学史、地学史・天文学史の四つの分野に区分して作業グループを設けて検討し、これの最終的な整備をおこなうとともに、これを具体化するための具体的な企画をまとめた。また、その市販ベースの具体化について調査した。(3)そして、この科学史教材資料集のトピックの標準となるような原稿を前年度に引き続き作成した。(4)高等学校の理科教育を展開するにあたって、科学史の成果を効果的に生かすためには、これまでの科学史研究ないしは科学史を利用した科学教育の成果を内容的にサポートできることが必要である。この点について、科学史、科学教育の主要な邦文の学術雑誌のバックナンバーにあたり、高等学校の理科教育に有効と思われるタイトルをピックアップしてきたが、最終的に集約し、その整備を図った。これらの成果について、最終的に研究成果報告書(冊子)として印刷し、広くその成果を普及することにしている。なお、市販ベースの企画の具体化は今後の課題となったことを付記しておく。
弦鳴楽器ハープ形状革新的水素分子ふるい分離膜の創製と新規分離機構の解明

本研究は、水素社会の実現に不可欠な水素を精製するために、高分子鎖を弦鳴楽器のハープの弦の様に一定間隔で配列させ、弦(高分子鎖)の間を水素分子のみをふるい作用により選択的に透過・分離させる革新的水素分離膜を創製し、その新規分離機構の解明と分離性能の最適化を行うことを目的とする。ポリイミドとメタクリル酸誘導体から成るABA型ブロックコポリマーのA成分のナノ自己組織化作用をハープの両端の棹の固定方法として利用して、B成分の高分子鎖をハープの弦の様に配列させることを特徴とする。従来の高分子膜の溶解・拡散機構に基づく膜材料設計とは異なる弦を弾いて音楽を奏でる様に高分子鎖の振動で水素分子を弾いて分子ふるい作用を促進させる設計と、ゼオライトに代表される無機多孔膜の様な硬いメッシュ形状よりも単位膜面積当たり分離に寄与する面積が大きくなり、かつ柔軟性もある二次元状の薄膜の設計をすることを特徴とする。本研究は3年計画であり、セグメント鎖長の異なるポリイミド・水酸基含有ポリメタクリル酸ABA型ブロックコポリマーの合成、ナノ自己組織化製膜法の確立、および分離膜としての膜構造の最適化と、これらにより得られた膜を用いた水素分離特性とその新規分離機構の解明と分離性能の最適化を目的として研究を進めた。初年度である2018年度は、水酸基含有ポリメタクリル酸セグメントのモノマーとして、2ーヒドロキシエチルメタクリレートを選定し、ポリイミドマクロイニチエーターに対し2ーヒドロキシエチルメタクリレート部のセグメント鎖長を変えたブロックコポリマーの合成をATRP法で行った。得られた化合物は、1H-NMR、13C-NMR、FTIRおよびGPC等を用いて化学構造を同定した。製膜は、溶剤キャスト法による溶媒の揮発過程でナノ自己組織化を発現させ製膜した。そして膜形態をSEMやPOM等の顕微鏡を用いて観察した。申請書にも記載していたが明治大学校費を用いた準備実験において、ポリイミドとメタクリル酸誘導体から成るABA型ブロックコポリマーのATRP法での合成に成功していたことから、準備実験データをもとに今年度の合成実験において適切な実験条件を見出すことができたためである。現在まではほぼ計画通りに実施することができていることから、2018年度と同様の方針で進めていく。合成、製膜、膜物性評価、水素ガス透過・分離性評価の一連の過程を繰り返し、各段階での考察をふまえ分離性能の最適化を図り、本研究を進行させる。
大腸癌におけるベバシズマブの耐性機序の解明とその克服

血管新生因子の一つであるVEGFの中和抗体ベバシズマブの耐性機序の解明とその克服の可能性について検討した。ベバシズマブの長期投与により耐性となったと思われるヌードマウス移植大腸癌株および臨床症例において、網羅的遺伝子解析により耐性によって変化する遺伝子の有無を検討したが、残念ながら共通する遺伝子を指摘することは不可能であった。以上より、ベバシズマブは抗癌剤や他の分子標的治療薬に比べて規定の耐性が生じにくいものと推察された。血管新生因子の一つであるVEGFは、数多くの腫瘍の血管新生に強く関与していることが示されてきた。その結果、VEGFの中和抗体であるBevacizumabは、すでに大腸癌、肺癌、乳癌で延命効果が示され臨床応用されている。しかし、Bevacizumab治療における最も大きな問題点は、耐性が生ずることと考えられる。Bevacizumabの耐性機序を解明し、それを克服するため下記の研究を行った。ヌードマウス移植大腸癌株を数株を使用し、長期間Bevacizumabを投与することによって、耐性となる細胞株の有無を検討した。その結果、KM12SM株においては、二週に一度3ヶ月間の投与により耐性が生ずることが判明した。そこで、これを次年度の網羅的遺伝子解析に供することとした。さらに、臨床症例においてBevacizumab治療が耐性となったと考えられる症例において、患者本人の了解を得て腫瘍の採取も開始した。平成22年度の研究において、Bevacizumab治療にて耐性となったと考えられる腫瘍株およびヒト大腸癌組織を対象に、マイクロアレイによ.る網羅的遺伝子解析を行った。その結果、いくつかの遺伝子において非耐性株に比し、有意に異常な亢進と減弱を認めたが、第一回と第二回の検討で結果が一致しておらず、いまだ遺伝子の特定に至っていない。平成24年度期間中に追加実験を行い、明らかにしてゆきたい。血管新生因子の一つであるvascular endothelial growthfactor (VEGF)は、数多くの腫瘍の血管新生に強く関与していることが示されてきた。しかしBevacizumab治療における最も大きな問題点は、耐性が生ずることと考えられる。平成23年度から、実際にBevacizumabを使用している臨床症例において、Bevacizumabが耐性となったと考えられる症例において、患者本人の了解を得て治療前後の腫瘍の採取を施行してきた。これらの腫瘍に対し網羅的遺伝子解析を行い、治療前後で何らかの変化が生ずるか否かを検討した。その結果、いくつかの遺伝子の亢進、減弱が認められたものの、残念ながら治療前後で共通する遺伝子の変化を指摘することはできなかった。今回の研究の問題点として、臨床例の場合、腫瘍の切除が可能なのは、原発巣が切除されていないか、比較的採取が容易な浅い場所のリンパ節などに限定されるため症例の収集が困難であることと、Bevacizumab治療はOxaliplatinやCPT-11、5-FUなどの併用が不可欠であるため、耐性になった時点を見分けることが困難であること、さらにこれら抗癌剤の耐性に関する遺伝子が含まれてしまうなどがあげられる。今後こういった問題点を踏まえ、Bevacizumab耐性に関する遺伝子の特定に関する研究を進め、その克服を目指したい。Bevacizumabが耐性となる大腸癌株が予想よりも少なかった。また耐性となる原因を網羅的遺伝子解析にて検討しているが、複数の実験で、現在のところ一致していない。24年度が最終年度であるため、記入しない。再度網羅的遺伝子解析を行い、Bevacizumab耐性の原因となる遺伝子の候補を早急に特定したい。
自己貪食空胞性ミオパチーの疾患概念確立とオートファジー機構の解明に関する研究

細胞内での蛋白分解を担うオートファジーの異常を原因とする「自己貪食空胞性ミオパチー(AVM)」の疾患概念の確立を目指した。病理学的検討で、筋線維での特徴的な自己貪食空胞の蓄積とリソソーム・エンドソーム系の機能亢進を示した。筋変性との関連が示唆され、骨格筋でのオートファジーの解明に新しい知見を得た。主要な臨床病態の検討では、心筋症が致死性で過剰な房室伝導や心予備能の低下をきたす予後規定因子であることを明らかにした。細胞内で蛋白分解を担うオートファジーのメカニズムには未解明の部分が多く,特に筋組織での研究はほとんど進んでいない。オートファジー異常を原因とする疾患群「自己貪食空胞性ミオパチー(AVM)」の代表疾患Danon病を中心に研究することで,AVMの疾患概念の確立と,筋組織でのオートファジーの解明さらに普遍的なオートファジーの解明を目指す。本年度は,AVM患者の生検筋を用いて,自己貪食空胞の組織化学的・免疫組織化学的検討を行い筋病理学的に評価した。併せて,そして,リソソーム・エンドソーム経路およびオートファジー機構に関与する物質の局在について筋病理学的検討を行った。組織学的および免疫組織学的解析より,オートファゴソームを筋鞘膜の性質を有する膜で囲んだ特異な自己貪食空胞を認めた。筋組織ではLAMP-2欠損と,LAMP-1,LIMP-1,LIMP-2の発現亢進を認めた。オートファゴソーム膜蛋白LC3,リソソーム蛋白cathepsin,エンドソーム膜蛋白Rab5,VAMP-7,Transferrin receptor,LDL receptorも軽度亢進していた。一方,ユビキチン,19Sおよび20Sプロテアソームの発現に明らかな亢進は認めなかった。今回の研究結果から,Danon病では,蓄積性の変化である自己貪食空胞の筋線維内での増加に加えて,オートファジー/リソソーム系,エンドソーム系の機能亢進が著明であり,筋変性との関連が示唆された。今後,患者とLAMP-2ノックアウトマウスの筋組織を用いて,免疫電顕的解析として筋鞘膜蛋白,リソソーム系蛋白の局在について観察および解析を行って,AVMの病態の全容解明と骨格筋における蛋白分解システムとしてのリソソーム・エンドソーム経路におけるオートファジー機構の解明を目指す。オートファジーは細胞内で蛋白分解を担うメカニズムで生体内では欠かせない。依然未解明の部分が多く特に筋組織での研究はほとんど進んでいない。オートファジー異常を原因とする疾患群「自己貪食空胞性ミオパチー(AVM)」の代表疾患Danon病を中心に研究することで、AVMの疾患概念の確立と、筋組織での検討から普遍的なオートファジーの解明を目指した。AVM患者の生検筋を用いて自己貪食空胞を筋病理学的に評価した。光顕的・電顕的解析により、蓄積性の変化である自己貪食空胞は、加齢により有意な正の相関を示した。オートファジー/リソソーム系、エンドソーム系の機能亢進がみられ、筋変性との関連が示唆された。免疫電顕的解析から、リソソーム蛋白の発現と加齢による変化から、空胞の周囲にde novoでの膜形成が推測された(Sugie K, etal. Ann Neurol, 2008)。一方、本疾患の予後を規定するきわめて重要な因子である心筋症の病態について特徴を見出した。調査した患者全例で心筋症を認め、発症年齢の早い男性では大半が肥大型で、発症の遅い女性では拡張型が多かった。左室高電位とWPW症候群が高頻度にみられ、ペースメーカー植込みや心臓移植が少数例ながら施行されていた。Danon病では、心筋細胞内での自己貪食空胞の蓄積やグリコーゲンの貯留により過剰な房室伝導や心予備能の低下を来すことが示唆された(杉江和馬,他.心臓, 2009)。今後、より詳細な病理学的解析によりAVMの病態の解明と骨格筋におけるオートファジー機構と病態との関連の解明が求められる。また近年、Danon病に伴う症状として、心筋症以外にも関節変形や自動症などの精神症状、脳血管障害などの報告があり、全身疾患として臨床症状の再精査が重要となる。
病原微生物感染リスクと渇水リスクとのトレードオフによる下水処理水再利用の最適化

本研究の目的は,下水処理水再利用による渇水リスクの低減と感染リスクの増大というリスク・トレードオフにより,下水処理水再利用システムの最適化手法を構築することにある。昨年度は,阿武隈川を水道水源とする福島市を対象とし,確率マトリクスを用いて取水点付近の河川流量を予測する手法を開発した。これを利用して,流量が少ない渇水時には河川からの取水を制限し,不足分を下水処理水により補填するというシナリオのもとで,水道水を介した感染リスクを評価した。その結果,塩素消毒を施した処理水を再利用する場合には,感染リスクを上昇させることなく,渇水被害を低減することが可能であった。しかし,下水処理水中には発ガン性の塩素消毒副生成物が存在するため,その再利用による発ガンリスク増大が懸念された。この成果をふまえて,本年度は,以下の項目について研究を行った。1.発ガンリスク評価:下水処理水中の消毒副生成物として,トリハロメタン(THM)4物質を採用した。下水処理水由来のTHM濃度は,仙台市下水処理場の二次処理水に対するTHM生成能実験と揮発率測定実験から決定した(THM生成能347.2μg/L,揮発率65.9%)。河川水由来のTHM濃度は,阿武隈川のTHM生成能データ(n=12,平均107μg/L)から,濃度分布が対数正規分布に従うと仮定した。発ガンリスク評価の結果,下水処理水再利用にともなう発ガンリスクの上昇はほとんど見られなかった。2.健康リスク評価:下水処理水再利用による感染と発ガンのリスクを総合化するために,DALY(障害調整生存年)という健康指標を採用した。再利用によって引き起こされるDALYは913年であった。そのうち,感染によるDALYは2年程度であるのに対して,発ガンによるDALYは711年と高く,発ガンによる健康被害の方が社会的優先度の高い懸案事項であることが分かった。阿武隈川流域を研究フィールドとして,本年度は以下の研究を行った。1.流量予測と渇水リスクの算定阿武隈川中流域の福島市における渇水リスクを算定するため,水道原水取水点付近の流量を予測する手法を開発した。まず,同地点における過去20年分の流量データから,連続する二日間の流量の同時発生確率を記述する確率マトリクスを作成した。流量の季節変動を考慮するため,マトリクスは各月毎に作成した。また,流量変動の連続性を再現するため,流量が上昇傾向にある場合と下降傾向にある場合で,別々のマトリクスを用意した。合計24個の確率マトリクスを用いることで,毎日の流量を予測することが可能となった.予測された流量から,福島市における渇水被害(累加不足率[%・day]で定義)を評価することができた。2.下水処理水再利用による感染リスク評価項目1で予測された流量をもとにして,取水点付近の流量が少ない場合には下水処理水を水道原水の一部として再利用するシナリオを設定した。このシナリオのもと,ポリオウイルスを例に感染リスク評価を行った。その結果,塩素消毒前の処理水を再利用する場合には,渇水被害を900%・dayから1400%・dayまで低減させるとき,感染リスクは約10倍に上昇した(トレードオフ)。塩素消毒を施した処理水を再利用する場合には,感染リスクの上昇を避けることは可能であった。ただし,この場合,消毒副生成物によるリスク(特に発ガンのリスク)の増大に配慮する必要がある。次年度は,渇水リスクと感染リスクのトレードオフに,さらに消毒副生成物のリスクも考慮に入れて,総合的な健康リスクにもとづいた下水処理水再利用システムの最適化手法を構築する予定である。

発ガンリスク評価の結果,下水処理水再利用にともなう発ガンリスクの上昇はほとんど見られなかった。2.健康リスク評価:下水処理水再利用による感染と発ガンのリスクを総合化するために,DALY(障害調整生存年)という健康指標を採用した。再利用によって引き起こされるDALYは913年であった。そのうち,感染によるDALYは2年程度であるのに対して,発ガンによるDALYは711年と高く,発ガンによる健康被害の方が社会的優先度の高い懸案事項であることが分かった。
Ｇ蛋白質の活性調節因子として働くヒトのグロビン蛋白質の機能制御機構の解明

ヒト脳神経細胞内に存在するニューログロビン(Ngb)は、酸化ストレスに伴う神経細胞死を防ぎ、また、通常酸素濃度正常状態では神経突起伸長を促す。我々は、ヒトNgbが、酸化ストレス環境下では、ヘテロ三量体G蛋白質のαサブユニット(Gαi/o)と特異的に結合し、GDP解離阻害因子(GDI)として機能することによりGαi/oの活性を抑え、cAMP量の減少を抑制することにより細胞死を防いでいることを明らかにした。また、脂質ラフトに存在するflotillin-1とも特異的に結合し、酸化ストレス下で酸化型Ngbをflotillin-1が脂質ラフトに運ぶことを明らかにした。さらに、最近、ヒトNgbがトリプトファン(Trp)代謝酵素と相互作用することがyeast two hybrid screeningによる網羅的探索の結果示唆された。本研究では、これら蛋白質間相互作用をさらに解析し、ヒトNgbによる分子制御機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、ヒトNgbとflotillin-1との蛋白質間相互作用部位の特定を目指した。具体的には、モジュール単位で短くした9種類のtrucated Ngbを作製しyeast two hybrid法を用いて、flotillin-1と相互作用するかどうか解析し、また、相互作用することが明らかになったtrucated NgbをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として発現・精製後、flotillin-1と直接相互作用することの確認も行った。さらに、ヒトNgbの酸化ストレスに対する細胞保護効果におけるトリプトファン(Trp)代謝酵素及びトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)の役割の解析も進めている。本年度は、TrpRSが免疫寛容の誘導に関わる細胞外から細胞内への高親和性Trp輸送に重要な働きをしていることを明らかにした。本研究では、Yeast two hybrid法を用いて、様々なNgbあるいはflotillin-1断片を酵母菌内で発現させ相互作用の解析を行うことにより、Ngbとflotillin-1との蛋白質間相互作用部位の特定を目指した。具体的には、ヒトNgbの遺伝子は4つのエクソンでコードされており、ヒトNgbは蛋白質レベルで4つのコンパクトな構造単位であるモジュールM1からM4で構成されている。まず、モジュール単位で短くした9種類のtrucated Ngbを作製しyeast two hybrid法を用いて、flotillin-1と相互作用するかどうか解析した。次に、相互作用することが明らかになったtrucated NgbをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として大腸菌を用いて発現・精製し、flotillin-1と直接相互作用するかどうかin vitroの系でも確認を行った。さらに、trucated Ngbをさらに短くしたものでもflotillin-1と結合できるかどうか、また、flotillin-1に関しても短くした様々なtruncated flotillin-1を作製し、Ngbとの結合を解析した。これらの結果を現在、投稿論文としてまとめているところである。2.酸化ストレスに対するヒトNgbの細胞保護効果におけるトリプトファン(Trp)代謝酵素及びトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)の役割の解析本年度は、トリプトファン(Trp)代謝酵素であるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1)とTrpRSが、免疫寛容の誘導に関わる細胞外から細胞内への高親和性Trp輸送に重要な働きをすることを明らかにした。1.酸化ストレスに対するヒトNgbの細胞保護作用におけるトリプトファン(Trp)の生理的意義の解明インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1)などのトリプトファン(Trp)代謝酵素及びトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)がヒトNgbと相互作用するのかどうか解析を行う。さらに、ヒトNgbの酸化ストレスに対する細胞保護作用におけるそれら蛋白質間相互作用の重要性を明らかにすることに挑む。2.グロビン蛋白質によるG蛋白質の活性制御機構の探索本研究では、G蛋白質としては、三量体G蛋白質αサブユニット(Gα)であるGαi/o, Gαs, Gαq、及び、低分子量G蛋白質であるRas, Rab, Rho, Racを中心に、また、グロビン蛋白質として、ニューログロビン以外のヘモグロビン(Hb)、Hbαサブユニット、Hbβサブユニット、ミオグロビン、サイトグロビン、及び、アンドログロビンをターゲットに網羅的にG蛋白質制御因子としての可能性を探索する。1.キメラZHHHニューログロビン(Ngb)の神経突起伸長作用の分子機構の解明我々はヒトNgbが、酸化ストレス環境下で、ヘテロ三量体G蛋白質αサブユニット(Gαi/o)と結合し、GDP解離阻害因子(GDI)として働きcAMP濃度の低下を抑えることで、酸化ストレスに伴う細胞死を抑制することを明らかにした。また、魚類Ngbの細胞膜透過特性に重要なモジュールM1とヒトNgbの細胞保護活性に重要なモジュールM2M4からなる融合蛋白質であるキメラZHHH Ngbが、細胞の外の培養液に加えておくだけで細胞質内に入っていき神経細胞を保護することを明らかにした。最近ヒトNgbを過剰発現させると神経突起伸長が促進されることが報告されたため、本研究では、キメラZHHH Ngbを用いて神経突起伸長作用の解析をした結果、キメラZHHH Ngbは培地に添加しただけで神経突起の伸長を誘導することを明らかになった。次に、GDI活性の神経突起伸長における重要性について検証するために、GDI活性を失くしたE56Q、E63Q、E121QキメラZHHH Ngb変異体を用いて解析した結果、E63QとE121Qキメラ

ZHHH Ngb変異体は神経突起を伸長させないが、E56QキメラZHHH Ngb変異体は伸長させることが明らかになり、細胞保護能と神経突起伸長能の作用機序は異なることが判明した。2.キメラZHHH Ngbが持つ視神経損傷後の軸索再生能の発見マウスを用いて視神経損傷後のNgb蛋白質の発現量を調べると、視神経損傷後Ngb蛋白質量は単調に減少し、5日後には半分以下まで減少することが明らかになった。そこで、視神経損傷後に、細胞膜透過能を持つキメラZHHH Ngbを眼に投与すると、キメラZHHH Ngbは網膜視神経節細胞内に移行し細胞の生存を促し、軸索再生を促進する働きがあることが明らかになった。ヒトNgbを神経細胞に過剰発現させると神経突起の伸長を促進するという最近の報告に着目し、我々が以前作製した細胞膜透過できしかもヒトNgbと同様な機能も持つキメラZHHH Ngb蛋白質の神経突起伸長能を解析した。その結果、このキメラZHHH Ngbは培地に添加しただけで神経突起を伸長させる働きを持っていることが明らかになった。また、キメラZHHH Ngbが持つ神経突起伸長能におけるGDI活性の重要性について検証するため、GDI活性を失くしたE56Q、E63QおよびE121QキメラZHHH Ngb変異体を用いて神経突起を伸長させる働きがあるかどうか解析した結果、キメラZHHH Ngbの神経突起伸長作用には、Glu56は重要ではなく、Glu63とGlu121のみが重要であることが判明し、細胞保護能と神経突起の伸長能の作用機序は異なることが明らかになった。この研究成果は、平成29年のFEBS Open Bio誌上で発表した。また、マウスを用いて視神経損傷後に、細胞膜透過能を持つキメラZHHH Ngbを眼に投与すると、キメラZHHH Ngbは網膜視神経節細胞内に移行し細胞の生存を促し、軸索再生を促進する効果があることが明らかになった。この研究成果は、平成29年のBiochem. Biophys. Re. Commun.誌上で発表した。さらに、キメラZHHH Ngbの細胞膜透過に重要な4つのLys残基をいずれも正電荷のより強いArgに置換した変異体を作製し、その細胞膜透過能、神経細胞死抑制能、神経突起伸長能がこれまでのキメラZHHH Ngbと比較して向上しているかどうか現在解析を行っている。ヒト脳神経細胞内に存在するニューログロビン(Ngb)は、酸化ストレスに伴う神経細胞死を防ぎ、また、通常酸素濃度正常状態では神経突起伸長を促す。我々は、ヒトNgbが、酸化ストレス環境下では、ヘテロ三量体G蛋白質のαサブユニット(Gαi/o)と特異的に結合し、GDP解離阻害因子(GDI)として機能することによりGαi/oの活性を抑え、cAMP量の減少を抑制することにより細胞死を防いでいることを明らかにした。また、脂質ラフトに存在するflotillin-1とも特異的に結合し、酸化ストレス下で酸化型Ngbをflotillin-1が脂質ラフトに運ぶことを明らかにした。
細菌のスーパー抗原は歯周炎の新しい原因物質となるか

Streptococcus pyogenesが産生するスーパー抗原Streptococcal pyrogenic exotoxin(SPE)について、ヒト末梢血リンパ球に対する幼若化作用、サイトカイン産生、サイトカインmRNA発現およびT細胞TCRのVβ特異性を検討した。さらに、7種類の口腔レンサ球菌(Streptococcus anginosus、S.sanguis、S.salivarius、S.mitis、S.constellatus、S.gordonii、S.intermedius)についてマイトジェニックファクター(MF)産生のスクリーニングを行い、スーパー抗原やMFと歯周炎の関連性について検討した。【結果】1.SPEの精製:(1)S.pyogenes培養上清から、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過によりSPEBを単一に精製し、精製慓品でウサギを免疫して抗体を作製した。この抗体を用いて、SPEB 1ng/mlの感度で測定できるELISAを確立した。(2)SPEAとSPECについては、グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパクとして、大腸菌で発現させ精製した。これら精製標品でウサギを免疫して抗体を作製し、ウエスタンブロットで検出できる系を確立した。2.rSPEA、SPEB、rSPECのスーパー抗原活性について:ヒト末梢血リンパ球に対する幼若化作用およびサイトカイン(TNF、IL-2)の産生を認めた。また、RT-PCRによるVβ特異性の検討から、Vβ2を有するT細胞の増殖を認めた。サイトカインmRNA発現の誘導はTNF-α、TNF-β、IL-2、IFNγに認められた。3.口腔レンサ球菌からのMFの検出と部分精製:口腔レンサ球菌のうちS.anginosusの培養上清にMFの存在を認め、SPEBの精製法に準じて部分精製した。このMFは、ヒトPBMCを幼若化し、サイトカイン(TNF、IL-2)mRNA発現を誘導し、サイトカイン産生を促進することを明らかにした。【考察】咽頭や歯周ポケットなどから分離されるS.pyogenesやS.anginosusは、スーパー抗原あるいはMFを産生して、種々の免疫細胞から炎症性サイトカインを産生し、歯周炎を引き起こす可能性が示唆された。Streptococcus pyogenesが産生するStreptococcal pyrogenic exotoxin(SPE)について、ヒト末梢血リンパ球に対する幼若化作用、サイトカインの産生および特定のTCR Vbetaを有するT細胞の増加を検討できる系(バイオアッセイ、ELISA、RT-PCR)をつくった。さらに、他のレンサ球菌属からも、SPE同様のスーパー抗原が産生されるか、SPEで確立した系を用い、7種類の口腔レンサ球菌(S.anginosus、S.sanguis、S.salivarius、S.mitis、S.constellatus、S.gordonii、S.intermedius、についてスクリーニングを行った。【結果】1.SPEの精製:(1)S.pyogenes培養上清から、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過によりSPEBを単一に精製し、精製標品でウサギを免疫して抗体を作製した。この抗体を用いて、SPEB1ng/mlの感度で測定できるELISAを確立した。

現在、これら精製標品でウサギを免疫し抗体の作製を試みている。2.rSPEA、SPEB、rSPECのスーパー抗原活性について:ヒト末梢血リンパ球に対する幼若化作用およびサイトカイン(TNF、IL-2)の産生を認めた。他のサイトカイン(IL-1alpha、beta、IL-6、IL-8)についてもプライマーを作製して検討中である。また、特定のTCR Vbetaを有するT細胞の増加をRT-PCRで検討している。3.口腔レンサ球菌からのスーパー抗原様物質の検出:口腔レンサ球菌のうちS.anginosusの培養上清にマイトジェニックファクターを認め、精製中である。この物質は、ヒト末梢血リンパ球を幼若化し、ヒト末梢血単核細胞からサイトカイン(TNF、IL-2)を産生することを明らかにした。StreptococcuspyogenesのSPE遺伝子をPCRにより分離し、発現ベクターに取込みGST融合タンパクとして精製した、リコンビナントSPEC(rSPEC)によって誘導されるサイトカインmRNAと、T細胞VβレパートリーをRT-PCR法で検討した。さらに、口腔レンサ球菌培養上清についてヒト末梢血単核細胞(PBMC)を幼若化するマイトジェニックファクター(MF)のスクリーニングと、Streptococcus anginosusが産生するMFの部分精製を行いその生物活性を検討した。rSPECはヒトPBMCの増殖を促進した.RT-PCRによりrSPEC反応性のT細胞Vβレパートリーを検索するとVβ2を有するT細胞の増殖が認められた。また、ヒトPBMC中のサイトカインmRNAの発現におよぼすrSPECの影響について検討したところ,TNFα,TNFβ、IFNγ,IL-2mRNAの増加を認めた。さらに、PBMC培養上清にTNF活性とIL-2を検出し、rSPECがヒトT細胞のTh1を活性化することを明らかにした。口腔レンサ球菌培養上清についてMF産生のスクリーニングを行い,S.anginosusがMFを産生することを見いだした。S.anginosus培養上清をDEAE-SephacelおよびSephadex G-100カラムクロマトグラフィーで分画し、SDS-PAGEで数本のバンドにまでMFを部分精製した。このMFは0.01μg/mlから1μg/mlの範囲で用量依存的にヒトPBMCを幼若化し、比活性は粗画分にくらべ4.4倍高まった。
ラット由来骨髄間葉系細胞の骨分化におけるFAS-FASL経路の機能解明

骨分化過程における骨髄細胞のFas-FasL経路の作用についは殆ど知見がない。ラット由来骨髄間葉系細胞をもちいて、この経路の骨分化に対する作用を検討した。骨髄間葉系細胞の骨分化誘導培地培養におけるFasL発現量の変化の検討ラット由来骨髄間葉系細胞を骨分化培地で培養した群とコントール培地で培養した群において、FASLmRNA発現をrealtime-PCR法を用いて、1週から4週まで毎週の時点で検討した。骨分化培地群でのFASLmRNAの発現はコントロールに比べて1週から3週まで減少していた。ウエスタンブロット法を用いて膜型FASLの蛋白量を測定したところ、2週と3週の時点で骨分化培地群での膜型FASL蛋白量の減少が見られた。骨髄問葉系細胞における分泌型FasLの骨分化に対する影響ラット由来骨髄間葉系細胞を骨分化培地で培養を行い、これをコントロールとして分泌型FASLを10ng/mlの濃度にて添加した群を作成した。培養を1週から4週まで行い、各週における骨分化マーカーであるALP,BSPをmRNAの発現をrealtimePCR法にて検討した。また3週の時点でArizarin-Red-S染色を行った。ALPmRNAについては3週、4週の時点でコントロール群より分泌型FASL群が低下しており、BSPmRNAは1から4週のすべてにおいて分泌型FASL群が低下していた。また3週時点でのArizarirRed-S染色では、コントロール群が赤色に濃染したのに比べて、分泌型FASL群は殆ど染色されなかった。以上の結果から、FASLは骨髄間葉系細胞における骨分化に対して抑制的に働いていることが判明した。このことは、骨髄細胞におけるFASLは分化を誘導して骨髄細胞自身をアポトーシスに導くものではなく、外的な細胞に対してアポトーシスを誘導する可能性があると思われた。今回われわれは骨髄幹細胞の骨分化過程におけるFas-FasL経路の役割解明を目的に研究を行っている。ラット由来骨髄細胞は、ラット大腿骨から無菌的に採取し、15%FBS含有α-MEMを用いて付着細胞を培養し、実験に供した。これを10000個/cm2の濃度で播種し、コントロール培地(10%FBS含有α-MEM)と骨分化培地(10%FBS、デキサメタゾン、β-グリセロリン酸、アスコルビン酸含有α-MEM)にて培養を行った。Realtime RT-PCR法によるm-RNAの発現解析においては、1,2,3,4週の各時点において、コントロール培地の群が骨分化培地で刺激した群に比べて、FalLのm-RNAをより多く発現していた。細胞溶解液を用いたウエスタンブロット法によるmFasLの存在量も、同様に1,2,3,4週の各時点においてコントロール培地の群が骨分化培地で刺激した群に比べて、mFasLをより多く発現していた。また経時的にみると、コントロール群においても、骨分化培地群に於もともに、FasLの発現は時間が経過するとともに、低下していた。また、現在分泌型のsFasLにて刺激したラット由来骨髄幹細胞における、骨分化マーカーの発現について検討を行っているところである。現在のところ、まだ確定的な状況ではないが、骨分化過程においてFasLの発現が動いていることにより、この経路が骨分化過程において何らかの作用を有しているものと推察している。
中空構造を持つ立体造形物の基礎研究と彫刻表現の実践

江戸・明治の見世物小屋や各地の祭事で見られた立体造形物の内部構造(骨組み)には、竹細工や籠細工のように、内部が空洞になっている「中空構造」が多く使われていた。この「中空構造」の基礎研究を現在継承されている祭礼の造形物を中心に行う。そして、近代日本彫刻が受容してきた「心棒彫刻」と対比させることによって、明治以前の「中空構造を持つ立体造形物」が豊かな立体造形を達成していたことを明らかにする。また、造形物が恒久に維持されることを前提としていないがゆえに有機的に変化してきた「中空構造」を実際の彫刻作品に活用し、日本古来の造形に起因する現代的な彫刻作品を制作し展覧会等で作品を発表する。
バイオメカニカルストレス反応による脂肪細胞の分化機能制御とその分子機構の解明

周期的伸展刺激は、3T3-L1マウス前駆脂肪細胞に対して、ERK/MAPKの持続的活性化を介してPAR_<γ2>の発現を抑制し、成熟脂肪細胞へのコミットメントを阻害する。この効果は、ω3系多価不飽和脂肪酸(PUFA)の一種エイコサペンタエン酸(EPA)との併用により相乗的に増強されるが、類縁のドコサヘキサエン酸(DHA)との併用では相乗効果は見られない(Tanabe, et. al.,2008)。これらPUFAsの作用の違いは、誘導型シクロオキシゲナーゼCOX-2の基質特異性によるものであり、周期的伸展によるCOX-2の発現誘導とEPAとの相乗効果、ならびにCOX-2特異的阻害剤による相乗効果の消失を明らかにした(Tanabe, et. al.,2008)。脂肪細胞分化はプロスタノイド(PG)により正負に影響を受けるため、脂肪細胞分化のコミットメント期に力学刺激を与えることの意義は、PPAR_<γ2>の発現低下に加えて、COX-2依存的PG合成の促進が起こることである。また、マウス腹部に連日30分のバイブレーション刺激を与えると、約2週後には刺激直下の脂肪組織の中性脂肪含量低下、PPAR_<γ2>とSREBP-Icの発現低下が起こる一方で、COX-2のみならず、IL-6,IL-1βなどの炎症性因子サイトカインの発現増大が見られた。IL-1βはPPARYの不活性化とともにCOX-2を誘導する。しかし、IL-IRとEPAを併用しても細胞分化抑制に相乗効果は見られず、伸展刺激によるCOX-2の誘導は、炎症性反応によるものとは異なる意義をもっと推察された。以上、本研究により脂肪細胞のメカニカルストレスに対する反応のメカニズムの一端が明らかとなり、更に脂肪細胞機能に影響する薬物との相互作用により、その薬理効果を調節しうることが明確になった。(目的)周期的伸展刺激はMAPキナーゼの活性化を介してPPARY2の発現を低下させることにより3T3-L1細胞の脂肪細胞分化を抑制する(Tanabe et al.,J.Cell Sci.2004)。本年度は、3T3-L1細胞における周期的伸展刺激の受容機構を明らかにするとともに、同刺激と薬物との併用に有用性を見いだすことを目指した。(方法)マウス前駆脂肪細胞3T3-L1は薬剤による2日間の刺激(誘導期)を経て、およそ710日後(成熟期)には多数の脂肪滴を蓄積した脂肪細胞に分化する。周期的伸展刺激の分化抑制効果は誘導期にのみ同刺激を与えることにより発現する。その分子機構の解明とともに、薬物との併用を検討するため、伸展刺激とともにRhoキナーゼ阻害薬(Y-27632とH-1152)、魚油由来のEPA、DHAをそれぞれ加えた条件で誘導刺激を行った際の分化関連遺伝子の発現、ならびに成熟期でのトリグリセリド蓄積などの分化マーカーを測定した。(結果と考察)Rhoキナーゼ阻害薬が周期的伸展刺激による分化抑制を解除したことから、細胞骨格がメカノセンサーとなり、それと相互作用のあるRho GTPaseシグナルの活性化が分化抑制に重要であることが示唆された。分化誘導のごく初期にCOX-2の一過的発現上昇がおこり、その基質となるEPAはC/EPBαの発現を抑制したが、単独では分化抑制効果はみられなかった。周期的伸展刺激はPPARr2の発現抑制をするのみならず、COX-2の発現レベルを更に増加させた。

EPAと伸展刺激の組み合わせは脂肪細胞分化を更に強く抑制し、その作用はCOX-2阻害薬により消失した。一方、DHAは単独、伸展刺激との併用、何れの場合でも明確な効果を示さなかった。これは、DHAが直接COX-2の基質にならないためと推察された。前年度までに、周期的伸展刺激が培養前駆脂肪細胞の分化過程におけるシクロオキシゲナーゼ2の発現を一過的に上昇させ、その際に同酵素の基質となりうるエイコサペンタエン酸(EPA)を共存させることにより、単独では分化抑制効果が少ない僅かな伸展量と低濃度のEPAの組み合わせによっても、脂肪細胞分化が抑制されることを見いだした。本年度は、このインビトロでの現象をヒントにして、メカニカルストレスとEPAの併用による個体成長過程における脂肪組織の肥大化制御の可能性を検討した。脂肪組織が発達しつつある離乳期直後(3週齢)の正常マウスに、エイコサペンタエン酸エチルエステル(エパデール)(1g/kg)或いは対照薬を連日経口投与するとともに、保定して下腹部に小型バイブレーターを押し当て、精巣周囲脂肪組織周辺組織に100Hz、30分間のバイブレーション刺激を1日2回、16日間与えた。摂餌量、体重増加率、脂肪組織および血漿中の生化学および脂肪細胞マーカを測定した。その結果、バイブレーション、エパデール、いずれも単独では体重増加に対してごく僅かな抑制効果のみしか見られなかったが、エパデールとバイブレーション刺激の両方を与えた群は、明らかに体重増加率が有意に抑制された。統計的有意差は得られなかったが血漿中レプチン濃度の低下傾向が見られ、いずれかの脂肪組織の減少を推定した。しかし、精巣周囲,腸間膜、腎臓裏、各部位の脂肪組織重量と中性脂肪含量、血漿中の生化学マーカには明確な違いは見いだせなかった。次年度は、体重増加率の低下と脂肪組織での分化程度に明確な対応を見いだすべく、更に検討を進める。また、遺伝的肥満モデルや高脂肪食による肥満モデルの脂肪細胞肥大化過程に対するメカニカルストレスの効果を明確にするとともに、培養細胞レベルで見いだした分化抑制との異同を分子レベルで明らかにすることを目指す。周期的伸展刺激は、3T3-L1マウス前駆脂肪細胞に対して、ERK/MAPKの持続的活性化を介してPPARγ_2の発現を抑制することにより、成熟脂肪細胞へのコミットメントを阻害する。この効果は、ω3系多価不飽和脂肪酸(PUFA)の一種エイコサペンタエン酸(EPA,C_<20:5>,ω3)との併用により相乗的に増強されるが、ドコサヘキサエン酸(DHA,C_<22:6>,ω3)との併用では相乗効果は見られない(Tanabe, et. al.,2008)。これら構造が類似したPUFAsの作用の違いを説明するために、誘導型シクロオキシゲナーゼCOX-2の基質特異性の関与を想定し、実際に周期的伸展刺激によるCOX-2の発現誘導とEPA共存による増強、ならびにCOX-2特異的阻害剤による相乗効果の消失が起こることを明らかにした(Tanabe, et. al.,2008)。脂肪細胞分化はプロスタノイド(PG)により正負に影響を受けるため、脂肪細胞分化のコミットメント期に力学刺激を与えることの意義として、PPARγ_2の発現低下に加えて、COX-2依存的PG合成の促進が重要である。炎症性サイトカインIL-1βはCOX-2を誘導するとともにPPARγの不活性化による脂肪細胞分化抑制効果を有するが、EPAを併用しても相乗効果は見られず、炎症性メディエーターによるものとはメカニズムが異なることが推察された。
遺伝子変異体とゲノム配列を利用する小分子結合タンパク質・受容体決定法の研究

本研究は、遺伝子変異キイロショウジョウバエを用いた新規薬剤感受性評価法の確立と、それを用いたCPTの新規生体内作用標的タンパク質の同定を目的とした。水晶発振子マイクロバランス(QCM)装置を用いたT7ファージディスプレイ法を用いて、CPT-20-B結合ペプチド(NSASRGGSQRGRGEH)が同定されている。このペプチド配列は、ヒトHshnRNP A1とキイロショウジョウバエDmHrb87Fのそれぞれの配列と相同性を示した。HeLa細胞可溶画分を用いたビーズプルダウン試験から、CPTとHshnRNP A1が結合した。HshnRNP A1-GST組み換えタンパク質を作製し、QCM相互作用解析を行い、CPTがHshnRNP A1と解離定数82.7 nMで結合した。遺伝子欠損キイロショウジョウバエによる薬剤感受性試験の結果、2つのDmHrb87F遺伝子変異体であるHrb87FKG02089とHrb87FBG02743は、野生株と比較してCPTに対して高い感受性を示した。Topo Iは、プラスミドDNAのスーパーコイルを解消する働きがある。このトポロジー変化をCPTそしてHshnRNP A1存在下で観察した。CPTは、報告される様にtopo I活性を阻害した。また、hnRNP A1も同様にtopo I活性を阻害した。さらに、HshnRNP A1は、CPT共存在下でtopo I活性阻害を増進した。標的タンパク質(標的分子)候補の迅速かつ高感度に選択的に同定すること,その結果を利用して遺伝子欠損変異体の薬剤感受性によって医薬結合タンパク質および受容体を決定・評価することを目的として研究した。医薬品化合物の標的タンパク質(標的分子)を同定するため,化学合成DNA36merによる10^7のライブラリを再設計して作製することで非特異結合を大幅に低減させるとともに,QCM(水晶発振子マイクロバランス)による標的クローンの選抜ファージディスプレイ法の改良法を開発した。得られた結合アミノ酸配列をバイオインフォマティクスサーバーRELICで統計的な処理を加えた。その結果,ここで得られたアミノ酸配列は,すでに結晶解析により結合部位と証明された配列に高い頻度で一子した。したがって,この方法により医薬品化合物標的タンパク質およびその結語部位を決定することができる可能性を示唆した。結合タンパク質の遺伝子の欠損および高発現の酵母遺伝子変異核を使い,医薬に対する感受性の変化を調べた。いずれの株においても,欠損=高感受性あるいは高発現=低感受性,のような単純な結果は得られなかった。これについては,次年度以降より多くの事例(医薬化合物)を使用して検討することとした。本研究は、医薬候補化合物の固定化技術と、特定の医薬候補化合物と結合する標的タンパク質(標的分子)候補を迅速かつ高感度に同定する二つの方法を融合し、標的タンパク質(標的分子)候補をコードする遺伝子決定するとともに、候補遺伝子の欠損変異体の薬剤に対する感受性を解析することで、医薬結合タンパク質および受容体を決定・評価することを目的とした。一方で、医薬品等の作用機序を考慮すると、化合物とタンパク質の結合はあくまでも必要条件であり、結合タンパク質が作用標的タンパク質と必ずしも同等ではないと考えられる。そこでDXRのバイオパニングから得られた配列の中から相同性の高かった酵母タンパク質Nuclear localization sequence-binding protein (NSR1)、及びhNopp 140の機能面でのホモログであるSuppressor protein SRP 40 (SRP 40)の酵母タンパク質に注目した。DXR感受性を比較したところ、これらのタンパク質をコードする遺伝子欠損酵母株において、DXRの濃度に依存して感受性が上がることがわかった。この結果から、NSR 1及びSRP 40がDXRの何らかの作用標的タンパク質である可能性が示唆された。水晶発振子マイクロバランス(QCM)装置を用いたT7

ファージディスプレイ法を用いて、CPT-20-B結合ペプチド(NSASRGGSQRGRGEH)が同定されている。このペプチド配列は、ヒトHshnRNP A1とキイロショウジョウバエDmHrb87Fのそれぞれの配列と相同性を示した。HeLa細胞可溶画分を用いたビーズプルダウン試験から、CPTとHshnRNP A1が結合した。HshnPNP A1-GST組み換えタンパク質を作製し、QCM相互作用解析を行い、CPTがHshnRNP A1と解離定数82.7nMで結合した。遺伝子欠損キイロショウジョウバエによる薬剤感受性試験の結果、2つのDmHrb87F遺伝子変異体であるHrb87FKG02089とHrb87FBG02743は、野生株と比較してCPTに対して高い感受性を示した。Topo Iは、プラスミドDNAのスーパーコイルを解消する働きがある。このトポロジー変化をCPTそしてHshnRNP A1存在下で観察した。CPTは、報告される様にtopo I活性を阻害した。また、hnRNP A1も同様にtopo I活性を阻害した。さらに、HshnRNP A1は、CPT共存在下でtopo I活性阻害を増進した。
遊離組織の機能回復に関する基礎的研究-特に膝再建靭帯の機能発現時期および機能回復期を確認する方法-

膝前十字靭帯損傷(ACL)損傷には、contactまたはnoncontact損傷によるものがあり、近年女性のnoncontact外傷によるACL損傷は、男性の2から8倍の率で有意に多いことが報告されている。その原因としては、構造的違い、関節弛緩性、大腿骨notch、筋力差や女性ホルモンの関与が考えられる。これらの要因の中で、我々は、女性ホルモンに着目した。我々は、本研究助成(胞芽的研究(180万円))を受け、正常女性の月経周期と、ACLの機能の関係を検討した(2000年第5回日韓整形外科スポーツ学会、日本臨床スポーツ学会にて発表)。この研究により、ACLは、女性ホルモンであるエストロゲンとプロゲステロンが高濃度になる排卵期と黄体期に膝前十字靭帯の前方移動量が増加することがわかった。つまり、女性の月経周期で靭帯の弛緩性が変化することがわかった。しかし、靭帯の弛緩性が2週間で変化する原因が基礎的には不明であり、今後の検討が必要である。さらに、我々は、平成11年よりアンドロゲンレセプターおよびエストロゲンレセプターの発現を、ヒト半腱様筋腱と前十字靭帯、さらに再建前十字靭帯で検討し、再建術中および術後1.5年以降の再鏡視で、半腱様筋腱には、レセプターがなかったものの、前十字靭帯および再建前十字靭帯では、それぞれのレセプターの存在が確認した(未発表)。このことは、移植腱にこれらホルモンレセプターの発現時期を検討することで、移植腱の靭帯化を検討できると考え、現在さらなる研究を続けている。実験1:ヒト膝関節内組織男性女性の各々のインホームド・コンセントの得られた前十時靭帯(ACL)損傷患者に対して、ACL再建時遺残ACLと再建に用いる半腱様筋腱を採取した。さらに再建患者の再鏡視時にもインホームド・コンセントを得て、再建ACL組織を一部採取した。現在遺残ACLおよび半腱様筋腱を男女ともに3例ずつ、再建靭帯を男女5例ずつ採取した。各々の組織を抗アンドロゲンレセプターにて免疫染色しているところである。結果)遺残ACLや半腱様筋腱には、男女で差があるようであるが、免疫染色の発現が、明確にできていない。また、再建靭帯では、免疫染色の発現が不確実である。このため、今後再鏡視時期などを考慮して症例を重ねて検討を続ける予定である。実験2:動物実験7週齢のWyster ratの雄・雌を実験動物とした。予備実験として、抗アンドロゲンレセプター抗体陽性細胞の局在を確かめるために行なっている。3匹ずつの雄と雌の膝関節から前十字靭帯、内側側副靭帯、膝蓋靭帯、半腱様筋腱、半月板と軟骨を採取した。これらを、実験1と同様に抗アンドロゲンレセプターにて染色し、雄・雌での局在を明確にしつつあるところである。結果)雄・雌による免疫染色の差は、軟部組織で認められているが、局在に最も差がある組織が明確でない。今後は、軟部組織を重点に予備実験を行ない、最も局在のある組織を用いて、自家移植し、アンドロゲンレセプターの発現時期を観察する。これらの結果より細胞機能発現時期を明確にできるものと思われる。
直交π共役系を用いた同一波長励起マルチカラーフォトクロミズムの実現

本研究では、同一波長励起によるマルチカラーフォトクロミズムとマルチカラー蛍光変調を同時に実現することを目標として研究を推進している。本年度は、これまでの予備研究において見出しているスピロ環構造を有するジアリールエテン(T. Nakagawa et al., Chem. Commun. 54, 3207-3210, 2018.)の分子構造の拡張に取り組んだ。その結果、スピロ環構造にシクロペンタジチオフェン構造を有するジアリールエテンの合成に成功した。合成したジアリールエテンは高い光閉環反応量子収率に加え、開環体および閉環体両異性体からのマルチカラー蛍光変調を示した。これまでの研究においてもアクリジンなどのスピロ部位をジアリールエテンに導入することで、高い光閉環反応量子収率と両異性体からのマルチカラー蛍光変調を見出しているが、本年度の研究によりその一般性が確認された。一方、蛍光スペクトルの溶媒極性依存性の結果から、シクロペンタジチオフェン部位の分子修飾が開環体の蛍光波数に対する溶媒極性依存性に影響を与えるなど、蛍光特性がスピロ環構造に依存することを見出した。このように、本研究では、より分子拡張性の高いシクロペンタジチオフェン構造を有するジアリールエテンにおいて高い光閉環反応量子収率と両異性体からのマルチカラー蛍光変調を見出すなど有用な知見が得られている。今後は、フォトクロミック特性および蛍光特性をより詳細に検討すると共に、スピロ環構造を基盤とした複合フォトクロミック分子系を構築することで、マルチカラーフォトクロミズムを示す新たなジアリールエテンを構築する予定である。複合フォトクロミック分子系を構築するための基盤となる、高い分子拡張性を持つ新しいジアリールの合成に成功したほか、スピロ環構造導入による高効率光閉環反応性と両異性体からのマルチカラー蛍光変調性を確認している。新規スピロ環構造を導入したジアリールエテンにおいて高い光閉環反応量子収率と両異性体からのマルチカラー蛍光変調を見出した。今後は得られた知見をもとに、複合フォトクロミック分子系へと展開し、同一波長励起によるマルチカラーフォトクロミズムとマルチカラー蛍光変調の実現を目指す。