hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
早老症候群霊長類モデルの開発

早期老化症候群の病態解明と治療法開発のために、早期老化症候群霊長類モデルの作製を行なった。レンチウイルスベクターを用いた遺伝子改変ではGFPを全身に発現するカニクイザルの作出に成功した。CRISPR/Cas9ゲノム編集法と顕微受精により、ウェルナー症候群の原因遺伝子に変異のあるカニクイザルが誕生した。今後、出生したサルの症状の観察と病態の解明を継続する。カニクイザルの組織からゲノムDNAを精製した。これをもとにPCRによりWerner RecQ DNAヘリカーゼのゲノム遺伝子の一部を単離した。この遺伝子をpCAG-EGxxFPプラスミドベクターにクローニングした。一方、MITのCRISPR guide RNA設計サイトを利用し、カニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼに特異的な塩基配列を決定した。これに由来する配列をCRISPR-Cas9システムを機能させるプラスミドベクターにクローニングした。これらのベクターを293T細胞、COS7細胞にリポフェクション法でトランスフェクトしたところ、EGFPの発現が蛍光顕微鏡、フローサイトメーターを用いて確認され、作製したguide RNA及びCas9発現ベクターが機能し、カニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼ遺伝子を切断することが判明した。また、microRNAを用いたカニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼ特異的遺伝子ノックダウウンベクターを作製した。カニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼcDNA配列をもとにmicroRNA用配列を数カ所選択し、microRNAを発現するレンチウイルスベクターにクローニングした。レンチウイルスを作製し、カニクイザル細胞に感染させたところ、マーカー蛍光タンパク質の発現が確認された。カニクイザルのWerner RecQ DNAヘリカーゼをゲノム編集により改変するために、CRISPR/Cas9システム用プラスミドにカニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼ遺伝子を組み換えた。これによりguide RNAとCas9を発現するベクターを作製した。このベクターをカニクイザル細胞にトランスフェクトし、Werner RecQ DNAヘリカーゼ遺伝子の塩基配列を調べたところ、塩基の欠失、置換が起きていることが確認された。カニクイザル受精卵に遺伝子を導入する予備実験として、カニクイザルメスにホルモンを投与し、排卵を誘発した。この卵細胞に顕微鏡下で精子を注入し、さらにGFPを発現可能な遺伝子を含むレンチウイルスベクターを感染させた。受精卵を仮親に移植したところ、妊娠が成立し、出産に至った。出生したサルは全身にGFPを発現し、遺伝子の導入の成功が確認された。レンチウイルスベクターのカニクイザル受精卵への導入、胚移植、妊娠出産に成功した。前年度にゲノム編集が可能であることを確認したWerner RecQ DNAヘリカーゼの標的配列を含むプラスミドベクターからCRISPR/Cas9システム用ガイドRNAを作成した。また、Cas9を発現させるmRNAを作製した。カニクイザルメスにホルモンを投与し、排卵を誘発した。腹腔鏡を用いて卵胞から卵細胞を回収した。電気刺激法によりオスから精液を採取した。顕微鏡下に精子を卵細胞に注入し、授精を行なった。培養を継続し、受精卵の生存を確認後、Werner RecQ DNAヘリカーゼのゲノム編集用ガイドRNAとCas9のmRNAを顕微鏡下に受精卵に注入した。さらに培養を継続し、卵割、発生が確認された胚を回収し、全ゲノム増幅によりDNA量を増量した。このゲノムを元にPCRにより標的配列を含むDNAを増幅した。塩基配列を確認したところ、半数以上の胚で標的配列に変異が導入されていることが判明した。胚における変異導入率を確認した上で、上記と同様の顕微受精、遺伝子導入を行い、培養し、桑実胚に発育した胚を仮親に移植した。仮親は月経周期を腹腔鏡で確認し、選抜した。胚移植から1か月後に超音波診断装置により妊娠の成立を確認した。一部の仮親では妊娠が確認できなかった。また、胚を排出、流産した仮親もいた。胚移植から、約160日後に自然分娩にて出産した。現在、出生仔は仮親が成育中である。排出された胚及び流産した胎児のゲノムの塩基配列を決定したところ、標的配列に変異の導入が確認された。遺伝子改変サルのサルの作製に向けて、必要なベクターの作製がほぼ終了した。CRISPR-Cas9系を用いた遺伝子改変では、プラスミドベクターの作製が終了し、カニクイザルのゲノム遺伝子を切断することが確認できた。miRNA導入用のレンチウイルスベクターは一部の作製が終了し、カニクイザルの細胞に導入することに成功した。現在、カニクイザル受精卵への導入条件を検討中である。病理学カニクイザル細胞にCRISPR-Cas9プラスミドベクターを導入した細胞の遺伝子塩基配列の解析を行い、変異を確認する。miRNA用レンチウイルスベクターを導入したカニクイザル細胞でmRNAの発現を確認する。これらの細胞を用いて、細胞分裂能、遺伝子修復能など機能の変化を測定する。次に、プラスミドベクターまたはレンチウイルスベクターをカニクイザル卵細胞に顕微授精時に導入する。
小分子応答性を有する機能性リポソームの創製

当初は分子応答性を有する機能性リポソームの作製を目的としていたが、前年度までに作製した脂質二重膜チャンバを改良することにより、膜タンパク質の輸送機能解析の分野における重要な技術に発展させることができると考えられたため最終目的を変更し研究を進めた。本年度は、膜電位固定下で膜タンパク質の輸送機能を蛍光計測することを目的とし、脂質膜チャンバの内部に電極を有するシステムを構築した。人工脂質膜を用いた膜タンパク質の輸送機能の計測には主に2つの手法が用いられてきた。一方は脂質膜の電荷の移動が小さい輸送両側に電極を設置し、脂質膜中の膜タンパク質を介して輸送される電荷の移動を電流として検出する電気計測、他方は脂質膜で囲まれた微小な空間(脂質膜チャンバ)に予め基質特異性の蛍光指示薬を封入し、膜タンパク質を介して輸送される基質によるチャンバ内の蛍光強度の上昇を検出する蛍光計測である。それぞれに長所短所が存在するが、蛍光計測は電荷の移動が小さい輸送を検出可能である点で優れている。しかし、従来の蛍光計測手法は、電極が設置されていないため膜電位を固定した状態で膜タンパク質の輸送機能を計測することは不可能であった。このため、輸送機能の膜電位依存性は計測することは困難だった。膜電位は細胞膜を介した電位差であり、多くの膜タンパク質の輸送機能の変化を引き起こすことが知られている。そこで膜電位固定下で膜タンパク質の輸送機能を蛍光計測することを目的とし、微細加工技術を用いて、内部に電極を有する微小な脂質膜チャンバを構築した。この脂質膜チャンバを用いて、実際に膜電位を固定した状態でαヘモリシンを介したカルシウムイオンの輸送の蛍光計測を行った。(抄録なし)本研究の目的は、特定の分子を認識し、内包する物質を放出する機能性リポソームを作製することである。この機能性リポソームは、生体の放出する特定の小分子を特異的に認識し、その物質を認識したときにだけリポソームの中に封入された物質(例えば薬剤)をリポソームの外に放出するという、直径数百nmの機能を持ったリポソームである。これまでのリポソームになかった、分子に応答する機能を付加することにより、これまでのpH感受性や温度感受性、光感受性のリポソームと比べて、高精度の制御が可能となるため、より効率の良いドラッグデリバリシステムとしての応用が期待される。本年度は、まず、リポソームと同様の材料から成る脂質二重膜で囲まれたマイクロチャンバをガラス基板上に構築した。具体的には、過去に当研究室で考案された容易に脂質二重膜を形成する方法(接触法)と当研究室の基盤技術であるマイクロマシニングを組み合わせることで、これまで比較的困難であった蛍光検出による脂質二重膜を介した反応の解析が容易に行えるようになった。この脂質二重膜マイクロチャンバは、そのチャンバの小ささゆえに、チャンバ内の物質の濃度変化をリアルタイムで高感度に検出可能である。また、リポソームは均一の径のものを作製することは非常に困難であるが、本研究で開発された脂質二重膜マイクロチャンバは均一径のチャンバの作製が容易である。さらに、本研究で開発された脂質二重膜マイクロチャンバは基板に固定されているため、観察が容易となる。従って、リポソームと同様の材料でできた脂質二重膜マイクロチャンバに様々な物質を付加し、その系を定量的に解析することで、本研究の目的である機能性リポソームの作製に向けた定量的なデータを得ることが可能だと考えられる。また、この脂質二重膜マイクロチャンバは、本研究においてのみならず、脂質二重膜を用いる研究に広く応用することができるため、今年度の研究成果の意義は大きいと考えられる。本研究の目的は、特定の分子を認識し、内包する物質を放出する機能性リボソームを作製することである。これまでのリボソームになかった、分子に応答する機能を付加することにより、これまでのpH感受性や温度感受性、光感受性のリボソームと比べて、高精度の制御が可能となるため、より効率の良いドラッグデリバリシステムとしての応用が期待される。前年度は、本研究の目的である機能性リボソームの作製に向け、リボソーム内にどのような物質を封入すべきかなどの定量的なデータを得るために、リボソーム内に様々な物質を封入可能で、かつ高感度に容易にリボソーム内の現象を観察可能なシステムを構築した。具体的には、リボソームと同様の材料から成る脂質二重膜で囲まれた微小な空間(脂質二重膜マイクロチャンバ)をガラス基板上に構築した。今年度は、本研究において開発された方法により作製した、脂質二重膜マイクロチャンバを用いて、ヘモリシンと呼ばれる膜タンパク質を実際に脂質二重膜中に埋め込み、その膜タンパク質の物質輸送機能を蛍光検出により計測した。膜タンパク質は、生体内では細胞内外の物質輸送や情報伝達を一手に担う大変重要な物質であり、本研究の目的である機能性リポソームにおいて特定の分子を認識するようなセンサの役割をする物質となることが期待されている。脂質二重膜チャンバを用いて容易に高感度な膜タンパク質の計測が可能であることが確認できた。開発した脂質二重膜マイクロチャンバは、本研究においてのみならず、脂質二重膜を用いる研究に広く応用することができる。さらに、人工脂質二重膜を用いて蛍光により膜タンパク質の輸送機能を計測することは一般に極めて困難なため、今年度の研究成果は膜タンパク質計測方法としても意義は大きいと考えられる。

当初は分子応答性を有する機能性リポソームの作製を目的としていたが、前年度までに作製した脂質二重膜チャンバを改良することにより、膜タンパク質の輸送機能解析の分野における重要な技術に発展させることができると考えられたため最終目的を変更し研究を進めた。本年度は、膜電位固定下で膜タンパク質の輸送機能を蛍光計測することを目的とし、脂質膜チャンバの内部に電極を有するシステムを構築した。人工脂質膜を用いた膜タンパク質の輸送機能の計測には主に2つの手法が用いられてきた。一方は脂質膜の電荷の移動が小さい輸送両側に電極を設置し、脂質膜中の膜タンパク質を介して輸送される電荷の移動を電流として検出する電気計測、他方は脂質膜で囲まれた微小な空間(脂質膜チャンバ)に予め基質特異性の蛍光指示薬を封入し、膜タンパク質を介して輸送される基質によるチャンバ内の蛍光強度の上昇を検出する蛍光計測である。それぞれに長所短所が存在するが、蛍光計測は電荷の移動が小さい輸送を検出可能である点で優れている。しかし、従来の蛍光計測手法は、電極が設置されていないため膜電位を固定した状態で膜タンパク質の輸送機能を計測することは不可能であった。このため、輸送機能の膜電位依存性は計測することは困難だった。膜電位は細胞膜を介した電位差であり、多くの膜タンパク質の輸送機能の変化を引き起こすことが知られている。そこで膜電位固定下で膜タンパク質の輸送機能を蛍光計測することを目的とし、微細加工技術を用いて、内部に電極を有する微小な脂質膜チャンバを構築した。この脂質膜チャンバを用いて、実際に膜電位を固定した状態でαヘモリシンを介したカルシウムイオンの輸送の蛍光計測を行った。本年度は、脂質二重膜マイクロチャンバデバイスを作製した。この脂質二重膜マイクロチャンバは、目的のリポソームを作製するための基礎的なデータを定量的に解析可能であるため、今後の研究を進める上で重要な部分を一つ解決したと考えている。本年度は、開発した脂質二重膜マイクロチャンバを用いて、膜タンパク質の機能を計測可能な系を構築した。膜タンパク質は、目的のリボソームを作製する際の小分子認識センサの役割を期待されている物質である。その膜タンパク質の機能を蛍光により可視化することに成功したので、今後の研究を進める上で重要な部分を一つ解決したと考えている。来年度はまず、脂質膜チャンバに膜タンパク質(脂質膜に小分子の通り道を作る)やDNAアプタマ(小分子センサ)やその他のDNA分子(演算回路)を封入し、DNAアプタマを用いた小分子センサがうまく小分子をセンシングできることを実証する。また、本研究以外でもDNAアプタマを用いたセンサを利用できるよう、DNAアプタマを用いた小分子センサの設計方法を導き出す。DNAアプタマを用いた小分子センサの実証試験と並行して、DNAを用いたリポソームの融合実験も行う。具体的には、今年度作製した脂質膜マイクロチャンバの脂質膜にDNAを結合し、チャンバ内に脂質膜に結合したDNAと相補となるDNAを結合したリポソームを封入し、DNAの相補鎖形成の際に生じる力によってリポソームがマイクロチャンバ上の脂質二重膜と融合することを実証する。また、本研究以外でもDNAによるリポソーム融合技術を利用できるよう、DNAによる平面脂質二重膜へのリポソーム融合の設計方法を導き出す。最終年度に脂質膜マイクロチャンバをリポソームに置き換え、目的のリポソームを作製する。
歴史的市街地型の地区計画の運用実態・課題及び今後の展開の可能性に関する研究

(1)全国の重要伝統的建造物群保存地区の保存計画の内容分析歴史的市街地型の地区計画運用の先進的参考事例として伝統的建造物群保存地区における保存計画の運用に着目して研究を進めた。具体的には、全国の重要伝統的建造物群保存地区の保存計画の内容分析を行い、保存対象として特定されている物件の種別の整理、種別ごとの特定基準、修理・修景・復旧基準の整理・分析を行なった。(2)全国の重要伝統的建造物群保存地区における保存計画策定のための調査報告書の内容分析全国の重要伝統的建造物群保存地区において、保存計画策定前に実施された伝統的建造物群保存対策調査報告書の内容分析を行い、保存計画策定のために行なわれている調査内容の把握と、調査結果に基づき提示されている特定物件候補の種別と町並み景観保全のための建造物の修理・修景基準案等の内容を把握した。(3)全国の重要伝統的建造物群保存地区の市町村担当部局を対象とするアンケート調査全国の重要伝統的建造物群保存地区の市町村担当部局を対象として、郵送アンケート調査を実施し、伝建地区保存計画の運用上の問題点と課題、今後の対応方策等について考察を行なった。(4)重要伝統的建造物群保存地区における保存計画運用実態の事例調査大津市坂本地区、京都市産寧坂地区、京都市上賀茂地区、上中町熊川宿、日南市飫肥地区、知覧町知覧地区などを対象として、重要伝統的建造物群保存地区の現地調査、伝建地区を担当している行政担当部局へのヒヤリング調査を実施し、伝建地区保存計画の運用実態と課題について事例的に明らかにした。金沢市の歴史的中心市街地における地区計画策定地区及び類似条件をもつ未策定地区を対象として,調査票を用いた世帯調査を実施した。調査対象地区としては旧金沢城下に含まれる藩政期からの町家系の歴史的市街地である橋場町地区とし,そのうち地区計画策定範囲とその範囲外の比較分析を行なった.調査項目は,(1)町並み・住環境の評価,問題認識,必要な規制等,望ましい規制等の手法,(2)規制内容の認知,妥当性の評価,効果の評価,遵守実態,(3)規制等を望んでいる項目,規制等の手法,(4)世帯人員・タイプ・居住年数,住宅改善実績・意向,などである.また,金沢市の歴史的中心市街地で,地域の独自条例による町並み景観保全が行なわれている地区として,金沢市こまちなみ保存条例に基づくこまちなみ保存区域を取り上げ,調査票を用いた世帯調査,及び現地観察による町並み景観の実態調査を実施した。調査対象区域は,旧金沢城下に含まれる全ての町家系の区域,すなわち,旧蛤坂町・泉寺町区域,旧新町区域,旧天神町区域,旧観音町区域の4区域とした.世帯調査の調査項目は,(1)町並み・住環境の評価,(2)規制内容の認知,効果,遵守実態,(3)町並み景観保全に関する行動,意識等,(4)世帯人員・タイプ・居住年数,住宅改善実績・意向などである.町並み景観の実態調査においては,調査対象区域内の道路に面する全ての建物のファサードを対象として,こまちなみ保存区域指定時点との変化の有無及びその内容の把握を行なった.(1)金沢市こまちなみ保存条例によるこまちなみ保存区域を対象とした調査結果の分析前年度に行なった金沢市こまちなみ保存条例によるこまちなみ保存区域を対象とする行政資料調査、家屋外観調査、世帯アンケート調査結果について、追加分析を行い、金沢市こまちなみ保存条例の運用実績の分析、区域における景観変容実態把握、それらと居住世帯の属性・意識等との関連性について分析を行なった。(2)全国の歴史的市街地景観保全型条例の検索と整理インターネット、各種文献などから全国の都道府県・市区町村が定めている景観系条例の検索を行い、255条例を抽出し、それらの条例の構成について整理を行なった。また、条例に基づく地区指定や単体建築物等の指定等制度を有する条例を抽出し、それらの整理を行なった。地区指定については地区指定の種類、単体建築物の指定等については、登録・契約・指定・買取等の制度内容について把握した。また、歴史的景観に関連する眺望景観の保全策を講じている自治体を抽出し、郵送調査によりそれらの施策の関連資料収集及び内容の整理を行なった。(3)全国の重要伝統的建造物群保存地区の保存計画の内容分析全国の重要伝統的建造物群保存地区を有する市町村担当部局への郵送調査により、重要伝統的建造物群保存地区の保存計画等を入手し、現状変更許可に関する修理・修景基準の内容の整理・分析を行なった。また保存地区の地図を入手し、地区及び地区周辺の市街地状況について類型的把握を行なった。(3)全国の重要伝統的建造物群保存地区の市町村担当部局を対象とするアンケート調査

全国の重要伝統的建造物群保存地区の市町村担当部局を対象として、郵送アンケート調査を実施し、伝建地区保存計画の運用上の問題点と課題、今後の対応方策等について考察を行なった。(4)重要伝統的建造物群保存地区における保存計画運用実態の事例調査大津市坂本地区、京都市産寧坂地区、京都市上賀茂地区、上中町熊川宿、日南市飫肥地区、知覧町知覧地区などを対象として、重要伝統的建造物群保存地区の現地調査、伝建地区を担当している行政担当部局へのヒヤリング調査を実施し、伝建地区保存計画の運用実態と課題について事例的に明らかにした。
バーチャルリアリティー（仮想現実）を用いた平衡訓練法の開発

本研究の目的は、バーチャルリアリティー(仮想現実、VR)により被験者に視覚情報と前庭・体性感覚情報が不一致の3次元の仮想空間での作業を行わせ、姿勢制御の視覚依存性を低下させ、体性感覚依存性を高めることで安定したバランスが獲得できる平衡訓練の開発を行うことである。本研究の結果から、平衡障害患者に対するVRを用いた平衡訓練では、頭の動きだけではなく、実際に運動を行わせて視覚と前庭・体性感覚不一致を繰り返し刺激し、これに適応させると姿勢制御や運動パフォーマンスが向上すると考えられた。しかし、視覚と前庭・体性感覚不一致刺激中に姿勢が不安体になるため、転倒防止の工夫を行う必要があると考えられた。本研究の目的は、バーチャルリアリティー(仮想現実、VR)により3次元の仮想空間を作成し、被験者に視覚情報と前庭情報が不一致(visual-vestibular conflict)の仮想空間での作業を行わせ、姿勢制御の視覚依存性を低下させ、体性感覚依存性を高めることで安定したバランスが獲得できる平衡訓練の開発を行うことである。本年度は、まずVRにより視覚と前庭・体性感覚不一致(visual-vestibulosomatosensory conflict)刺激ソフトを作成した。コントロール刺激では、被検者があることそれに一致した背景が移動するが、不一致刺激では被検者は静止しているが背景が歩行時のように移動する。11人の健常人に対して不一致刺激を与えると、めまい感と平衡異常を自覚した。同時に、直立検査におけるロンベルグ率が低下した。この結果は、視覚と前庭・体性感覚不一致刺激により、静的姿勢制御の視覚依存性を低下させることができる可能性が示唆された。次に、VRによりにより繰り返すオプティック・フォロー(optic flow)刺激ソフトを作成した。健常人12名を歩行させ、その正面に水平性または回転性の視覚刺激であるオプティック・フォロー刺激を繰り返し与え、歩行停止に与える影響を検討した。しかし、歩行停止時の偏倚は認められなかった。この結果から、繰り返すオプティック・フォロー刺激は動的姿勢制御には影響を与えないと考えられた。姿勢制御の視覚依存性と体性感覚依存性を重心動揺から評価する方法を開発し、重心動揺データーの解析ソフトを作成した。本年度の研究では、HMD(ヘッドマウントディスプレイ)法によるバーチャルルアリティー(仮想現実、VR)により、仮想空間内で空間内に浮かぶボールを自分の手でつかみ、足元の箱に入れるタスクを行わせるソフトウエアーを開発した。健常者にこのタスクを行わせ、頭に動きに伴う仮想空間の視覚情報が0から0.6秒の範囲で遅延させ、視覚と前庭・体性感覚不一致(visual-vestibulosomatosensory conflict)を引き起こす条件を付加した。姿勢制御の静的視覚依存性は重心動揺のRomberg率で評価を行い、動的視覚依存性は我々が開発したランダムドットの箱を前後に揺らせて重心動揺を記録する方法で評価を行い、姿勢制御の体性感覚依存性は高橋らが提案した重心動揺の圧中心軌跡の広がり指標に評価を行った。しかし、健常人に対して仮想空間の視覚情報が0から0.6秒の範囲で遅延させて、繰り返し刺激を行っても、刺激後の姿勢制御の静的視覚依存性、動的視覚依存性、体性感覚依存性のいずれにも影響を与えなかった。また、動揺病は発症しなかった。昨年までの本研究で、健常人に仮想空間内でスノーボードにより旗門を通過する運動を行わせ、体の動きに伴う仮想空間の視覚情報が0から0.6秒の範囲で遅延させ、視覚と前庭・体性感覚不一致を引き起こす条件で繰り返し刺激した場合、刺激後に頭部が安定して運動パフォーマンスも向上した。このことから、平衡障害患者に対するVRを用いた平衡訓練では、頭の動きだけではなく、実際に運動を行わせて視覚と前庭・体性感覚不一致を繰り返し刺激することが必要であると考えられた。しかし、刺激中に姿勢が不安体になるため、平衡障害患者に適応する場合には、転倒防止の工夫を行う必要があると考えられた。耳鼻咽喉科学バーチャルリアリティーの自作のソフトウエアーを開発し、静的姿勢制御の影響を与える目的で前庭・体性感覚不一致刺激ソフトを作成することができた。また、動的姿勢制御に影響を与える目的でオプティック・フォロー(optic flow)刺激ソフトを作成することができた。その結果、前者のみが姿勢制御の視覚依存性に影響することが明らかになった。さらに、姿勢制御の視覚依存性と体性感覚依存性を重心動揺から評価する方法を開発し、重心動揺データーの解析ソフトを作成することができた。健常人にバーチャルリアリティーにより前庭・体性感覚不一致刺激とオプティック・フォロー(optic flow)刺激を与えたところ、前者のみが姿勢制御の視覚依存性に影響を与えると考えられたので、次年度は前庭・体性感覚不一致刺激を用いて研究を行う。

姿勢制御の視覚依存性と体性感覚依存性を重心動揺から評価する方法を開発し、重心動揺データーの解析ソフトを作成したが、視覚刺激との同期が取れていないので、インターフェースの改良を行う。バーチャルリアリティーにより前庭・体性感覚不一致刺激が動的姿勢制御に与える影響を検討する予定である。視覚刺激と重心動揺との同期が取れず、予定していた記録メディアの購入を行わなかったため。同期がとれるようにインターフェイスを改良後に記録メディアを購入する。
ウサギ遠位尿細管におけるK輸送機序の研究

CCDにおけるK輸送の調節は、体液因子としてはAldosteroneが重要な役割を演じているが、他にも管腔内液流量が重要であることは知られている。我々は、これらの調節系の他にも、調節因子があると考え、isolated tubular microperfusion法を用いて幾つかの検討を加えた。1)浴液のpHを重炭酸濃度を25から5mEq/Lに減ずることにより7.4から6.8へと酸性化すると、CCDにおけるK分泌能力は著明に低下し、その機序として、Na-K ATPase依存性の抑制と非依存性の部分があること、K-Channel依存性と非依存性経路があること、重炭酸イオンの濃度変化には直接関係せず、pH自身の変化に寄ること、Na再吸収とは直接関係しないことなどを明かにし、報告した。2)上記実験中に、抑制から重炭酸イオンを除去するとK分泌量が増加することを認め、その機序を解明するために、細胞内pHを測定したところ、重炭酸イオン存在下では、細胞内pHが7.2前後であるのに対し、重炭酸イオンを除去し、HEPES bufferに変換すると細胞内pHは7.6前後へとアルカリ化することを明かにした。このことは、細胞内PhがK輸送に重要な役割を演じていることを示唆していた。3)in vivoでは、CCD直前に接合尿細管(CNT)があり、この部分でのK分泌量はCCDと比べかなり多く、管腔内K濃度でみるならば、管腔内灌流液流速を10nl/minにした状態でも、灌流液K濃度は0.5mEq/Lから尿細管0.5mmでも8-10mEq/Lにも上昇する。CNTの長さは皮質部と随質部で異なるものの、0.5-1.0mmはあり、このことから考えると、CCDにいたる管腔内液は10-15mEq/L前後になると考えられる。血管側K濃度を変化させてのK分泌の変化について検討したところ、CCDでの管腔内電位(VT)は過分極し、K輸送量(JK)も変化することが明かとなった。本年度は、ウサギを用い、皮質部集合尿細管を単離し、浴液あるいは灌流液を通常液はHCO_3濃度25mEq/Lとし、95%O_2/5%CO_2にてbubblingしてpHを7.4に調節し、K濃度を5mEq/Lとしてコントロールとした。実験に用いる灌流液のK濃度を10、15mEq/Lとしたとき、管腔内電位は管腔内K濃度の増加に伴い過分極した。そこでK分泌量を、灌流液および尿細管通過後の採液中のK濃度をmicroflame photometryにて測定して求めたところ、管腔内K濃度の上昇にともなってK分泌量は低下した。そこで^<86>Rbを用い、lumen to bathfluxを求めて、K透過性も検討したが、lumen to bath fluxには変化は無かった。このことは管腔内K濃度の変化によりbath to lumenfluxが低下したことを示唆する成績であった。問題点としては、microflamephotometerによる管腔内K濃度測定にあたり、K濃度変動幅が大きいためにcaliblationが直線から外れる傾向であったため、測定値個々にstandardを置かなければならなかったことが、測定誤差を生じる可能性があることで、この点に関しては実験数を増やして補うこととしたことである。

我々は、これらの調節系の他にも、調節因子があると考え、isolated tubular microperfusion法を用いて幾つかの検討を加えた。1)浴液のpHを重炭酸濃度を25から5mEq/Lに減ずることにより7.4から6.8へと酸性化すると、CCDにおけるK分泌能力は著明に低下し、その機序として、Na-K ATPase依存性の抑制と非依存性の部分があること、K-Channel依存性と非依存性経路があること、重炭酸イオンの濃度変化には直接関係せず、pH自身の変化に寄ること、Na再吸収とは直接関係しないことなどを明らかにし、報告した。2)上記実験中に、抑制から重炭酸イオンを除去するとK分泌量が増加することを認め、その機序を解明するために、細胞内pHを測定したところ、重炭酸イオン存在下では、細胞内pHが7.2前後であるのに対し、重炭酸イオンを除去し、HEPES bufferに変換すると細胞内pHは7.6前後へとアルカリ化することを明かにした。このことは、細胞内PhがK輸送に重要な役割を演じていることを示唆していた。3)in vivoでは、CCD直前に接合尿細管(CNT)があり、この部分でのK分泌量はCCDと比べかなり多く、管腔内K濃度でみるならば、管腔内潅流液流速を10nl/minにした状態でも、潅流液K濃度は5.0mEq.Lから尿細管0.5mmでも8-10mEq/Lにも上昇する。CNTの長さは皮質部と髄質部で異なるものの、0.5-1.0mmはあり、このことから考えると、CCDにいたる管腔内液は10-15mEq/L前後になると考えられる。血管側K濃度を変化させてのK分泌の変化について検討したところ、CCDでの管腔内電位(VT)は過分極し、K輸送量(JK)も変化することが明かとなった。
若年層の政治態度に関する理論的・実証的研究

本研究の具体的な研究項目は,1思想・実証双方のアプローチにおける若年層の感情・認知・行動研究の綜合,2実務家に対するヒアリングを通じた社会的レレヴァンスを伴う理論構築,3若年層の政治参加や市民教育をめぐる諸問題に対する政治思想史・規範理論からの接近,4サーヴェイに拠る実証,5社会的還元を含む幅広い発信,の5つである。研究期間の第1年度である2018年の研究実績は,上記のうち1と3を中心に,制度分析班・理論研究班それぞれにおいて個人単位で実施する研究事項に関するものが主である。まず,制度分析班に係る実績としては,2017年総選挙結果や近年の先進民主主義国におけるポピュリズムに関する谷口の分析がある。また,上神は大学側からアプローチする高大接続の試みとして,現代日本政治論入門の教科書作成に参画した。尾野は,若年層すなわち年齢と並び重要な社会的属性である性別の与える影響に関する論考を発表した。理論研究班に係る研究実績としては,杉田がグローバル化時代の政治を再考する著書を編集した。また,犬塚は思想史の方法論そのものを問い直す意欲的な学会報告を行い,早川は歴史的なアプローチを試み教育者としての石橋湛山に注目する論文を公刊した。今後も全体研究会で本研究課題のミッションと各メンバーの問題意識を共有しつつ,全員または複数のメンバーで取り組むテーマと個人で実施する研究を車の両輪として,引き続き意欲的に取り組む所存である。応募時の研究計画調書に記載したとおり,本研究課題が採択された後,直ちにメンバー全員による包括的研究会が組織され,2018年度は4回の研究会を開催し,今後の研究期間における共同研究の進め方に関してメンバー間の意思統一を行うと共に,若年層の政治意識に関する研究動向,高等学校の新必修科目「公共」設置の経緯などに関して討議を行った。また,理論研究・制度分析の双方で,メンバーが個人単位で進める研究事項に関しても,それぞれが2018年度中に着手し,2019年度後半から全員研究会での相互レビューを開始する予定である。2019年度も全体研究会を軸に研究活動を続け,関係者のヒアリング等を実施すると共に,年度の後半からは制度分析班・理論研究班それぞれの問題意識を持ち寄り,各メンバーの研究計画の相互レビューを行う。また,2019年7月には,選挙権年齢が18歳に引き下げられてから2回目となる参議院通常選挙が実施される。これに合わせて若年層と中高年齢層の政治意識を比較することを目的としたインターネット調査を行い,2020年度に予定されている本調査に向けたパイロット・スタディとする。年度の終わりには,拡大研究会(上記全体研究会の拡充)の組織に向けて,研究成果の一部の取りまとめに向けた準備作業に着手るする。
PCB分解酵素系における新規転写制御メカニズムの解明

PCB分解菌Rhodococcus sp. RHA1のビフェニル(BP)分解遺伝子群のうち、その転写制御機構が明らかとなっていない下流遺伝子群bphGF1E1の転写制御機構について解析をおこなった。昨年度までの研究でbphGF1E1は上流代謝系の遺伝子群とは異なる転写制御を受け、そのプロモーター活性はビフェニル存在下で約3倍に上昇することを明らかにした。bphGの上流に存在するpadRファミリー転写制御因子と相同性を示すBphRのbphGF1E1転写に対する影響を調べるために、bphRを相同組換えを利用して破壊し、得られた破壊株をRDR2株と命名した。RDR2のビフェニルでの生育は野生株より若干劣っていたが、生育能を示したため、bphRはRHA1のビフェニル生育には必須ではないことが強く示唆された。RDR2株にbphGプロモーターを保持するレポータプラスミドを導入し、bphGプロモーター活性を測定したところ、野生株同様の3倍程度のビフェニル誘導性を示した。また、その活性は全体的に野生株より高かった。RDR2においては、破壊したbphR中に大腸菌用のベクタープラスミドの配列が挿入されているため、下流の遺伝子群に影響を与えてしまっている可能性が考えられたため、bphR中に連続した終止コドンを導入したbphR破壊株RDR3を構築し、同様の実験を行ったが、結果は同様であった。また、定量PCRを用いてRHA1、RDR3中でのbphGF1E1の各転写量を測定した。転写産物の量が非常に少なかったものの、両株でプロモーター活性測定と同様の結果が得られた。ゲノム配列中にはbphR相同遺伝子は存在しないため、以上の結果より、RHA1でのbphGF1E1の転写誘導にはbphRは関与していないことが示唆された。しかし破壊株におけるbphGプロモーターの活性が上昇する、及び異種宿主において発現させたBphRがbphGプロモーターを構成的に活性化する、という結果より、bphRはbphGF1E1の構成的な転写において何らかの役割を担っていることが示唆された。PCB分解菌Rhodococcus sp.RHA1のビフェニル(BP)分解遺伝子群のうち、その転写制御機構が明らかとなっていない下流遺伝子群bphGF1E1の転写制御機構について解析をおこなった。まず、bphGのプロモーター領域をレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、RHA1株に導入した。BP存在・非存在下でルシフェラーゼ活性を経時的に測定した結果、各プロモーター活性は約3倍に上昇した。この転写活性の上昇が上流遺伝子群の転写を担うBphSTタンパクに依存しているかを調べるために、異種宿主であるRhodococcus erythropolis IAM1399中でレポータープラスミドとBphSTを共存させ、BP存在下でルシフェラーゼ活性を測定したが、転写活性の上昇は観察されなかった。このことからbphGF1E1の転写調節はBphSTとは異なるタンパク質によって担われていることが強く示唆された。次にbphGF1E1の上流に存在し、転写制御因子と相同性を示すbphRのRHA1中での転写量を上述のbphGと同じ方法で観察した。その結果、bphRの転写量もBP存在下で約3倍に増大した。またその活性はbphGプロモーターの約5倍であった。BphRのbphG転写への関与を調べるために、bphRを含むbphG上流領域をレポーター遺伝子の上流に挿入したプラスミドと、同じプラスミド中のbphRの一部を欠失させたプラスミドを構築した後それぞれをIAM1399株に導入し、ルシフェラーゼ活性を調べた。その結果、bphR破壊プラスミドを持つ株ではルシフェラーゼ活性が約10倍に上昇した。このことから、bphRがbphGF1E1の転写制御に関与していることが示唆された。さらに、bphRを構成的プロモーターの下流に挿入した相補用プラスミドを各株に導入し、転写の増大が相補されるか調べた結果、予想に反して転写活性は押さえられず、逆に約6倍増大した。以上より異種宿主を用いた解析ではBphRの機能を特定することは困難であると考え、RHA1株中でのbphRの働きを調べるため、相同的組換えを用いたbphRの破壊を試み、bphR破壊株RDR2を得ることに成功した。

RDR2においては、破壊したbphR中に大腸菌用のベクタープラスミドの配列が挿入されているため、下流の遺伝子群に影響を与えてしまっている可能性が考えられたため、bphR中に連続した終止コドンを導入したbphR破壊株RDR3を構築し、同様の実験を行ったが、結果は同様であった。また、定量PCRを用いてRHA1、RDR3中でのbphGF1E1の各転写量を測定した。転写産物の量が非常に少なかったものの、両株でプロモーター活性測定と同様の結果が得られた。ゲノム配列中にはbphR相同遺伝子は存在しないため、以上の結果より、RHA1でのbphGF1E1の転写誘導にはbphRは関与していないことが示唆された。しかし破壊株におけるbphGプロモーターの活性が上昇する、及び異種宿主において発現させたBphRがbphGプロモーターを構成的に活性化する、という結果より、bphRはbphGF1E1の構成的な転写において何らかの役割を担っていることが示唆された。
多自由度のブラウニアンモーターに関する研究

(1)アクチン-ミオシン系の筋肉の収縮に関係する分子モータのモデルである、ラチェットの自由度間の相互作用が1次元格子モデルで記述できる結合したフラッシングラチェットモデルに対して計算機シミュレーションを行なった。系の速度等のダイナミカルな性質に温度、結合の強さ、外力がどのように影響するかを調べた。また、系のエネルギー効率を計算し、1自由度の場合の結果と比較し、結合することで効率が改善されることを示した。(2)2次元の運動の自由度を持ったブラウニアンモーターが多数結合した系を計算機シミュレーションによって調べた。この系によってアクチンフィラメントをミオシンを並べたスライドガラスの上におきATPを加え,適当な条件でフィラメントは運動を始めるという実験を再現できた。この実験では,フィラメントの長さが短い間は速度の方向が定まらず煩雑に運動方向を変えるが,十分長いフィラメントはほぼ一定の方向に持続的に進んでいく。またスライドガラス上のミオシンの密度が小さいうちは密度の増加とともにフィラメントの速度は増加していき,ある程度密度が大きくなるとミオシンの密度をあげても速度は変化しなくなり飽和してしまう。以上2つの結果を,我々のモデルは定性的に説明することができた。(3)上のようなラチェットモデルの機構を用いて種類の違う粒子の混合物を分離することを試みた。すなわち底が空間的に非対称なギザギザの形をした容器内に粒子の混合物を入れ、粒子が鉛直面内を重力の元で動き回るように容器を鉛直方向に振動させる。こうすることによって,性質の違う2種類の粒子は、うまく実験条件を設定することにより互いに反対の方向に動きだし、混合物が効率よく分離できることを計算機シュミレーションを用いて示した。研究の成果は平成14年7月イタリアのEriceで開かれた国際会議"Stochastic Systems : From Randomness toComplexity"で報告しそのproceedingがPhycica Aに平成15年7月に掲載された。また、平成14年8月に連合王国ランカスターで開かれたワークショップ"Fluctuation, Chaos and Complexity in MultistableSystems"においても発表した。粒子分離に関して得られた成果は,平成15年9月ポーランドのZakopaneで行われた第16回スモルコフスキー記念統計物理学国際シンポジウムにおいて,発表しそのproceedingが平成16年4月にActa Physica Polonica Bに掲載された。今年度は多自由度のブラウニアンモーターを計算機シミュレーションによって解析した。具体的には(1)アクチン-ミオシン系の筋肉の収縮に関係する分子モータのモデルである、ラチェットの自由度間の相互作用が1次元格子モデルで記述できる結合したフラッシングラチェットモデルに対して計算機シミュレーションを行なった。(2)アクチン-ミオシン系の分子モータのアクチンフィラメントをミオシンを塗ったプレート上で動かしその基本的性質を調べるモーティリティーアッセイをモデル化して調べた。

すなわち(1)で調べた系の各自由度が2次元の運動自由度を持つ様に拡張した系を取り上げる。この2次元の運動が許される系に対して計算機シミュレーションを行ない、1次元の場合と同様にダイナミクスを調べた。この際運動の方向が2次元的に許されるようになることで系の振る舞いがどのように変化するかを調べた。昨年度の研究に引き続き,多自由度のブラウニアンモーターを計算機シミュレーションによって解析した。具体的には,(1)2次元の運動の自由度を持ったブラウニアンモーターが多数結合した系を計算機シミュレーションによって調べた。この系は実際の生物学的実験の状況に適応できるモデルで,その結果実験結果を定性的に再現できることがわかった。すなわち,実験ではアクチンフィラメントをミオシンを並べたスライドガラスの上におきATPを加えると,適当な条件でフィラメントは運動を始める。そのときフィラメントの長さを変えて速度を計ると,長さが短い間は速度の方向が定まらず時間ごとに煩雑に運動方向を変えるが,十分長いフィラメントはほぼ一定の方向に持続的に進んでいく。またスライドガラスにおくミオシンの密度を変化させたとき,密度が小さいうちは密度の増加とともにフィラメントの速度は増加していき,ある程度密度が大きくなるとミオシンの密度をあげても速度は変化しなくなり飽和してしまうという結果が知られている。我々のモデルはこれらの点を定性的に説明することができた。また実際に運動しているフィラメントの形も実験で観察された状況に近いものが得られた。(2)このようなラチェットモデルの機構を用いて種類の違う粒子の混合物を分離することを試みた。すなわち底がブラウニアンモーターのポテンシャルのような空間的に非対称なギザギザの形をした容器内に粒子の混合物を入れその容器内を重力の元で動き廻れるように容器を鉛直方向に振動させる。こうすることによって,性質の違う2種類の粒子はうまく実験条件を設定することにより互いに反対の方向に動きだし混合物を分離できることを計算機シュミレーションを用いて示すことができた。粒子分離に関して得られた成果は,平成15年9月ポーランドのザコパネで行われた第16回スモルコフスキー記念統計物理学国際シンポジウムにおいて発表し,そのプロシーディングに論文が発表される予定である。また8月にはPhysica A Vol.325に結合したブラウニアンモーターに関する論文が掲載された。
活性化ヒトリンパ球がひきおこす腫瘍細胞の自殺(apoptosis)に関する研究

腫瘍免疫療法における標的細胞すなわち腫瘍細胞の障害方法のなかにApoptosis(細胞のprograming death)の機序が働いていることが示唆されるようになってきた。わたくしはヒトにおけるLAKがひきおこす標的腫瘍細胞のApoptosisを検討する前に解析のし易いマウスの系を用いた以下の実験を行ない結果を得た。使用したマウスはBalb/cマウスであり、Effector細胞としてのNK-LAK細胞はBalb/c nudeマウス脾細胞からIL-2で誘導された。標的細胞にはSyngeneicであるH-2^d由来の腫瘍細胞YAC-1およびP815細胞を用いた。YAC-1およびP815には^3H-thymidineと^<51>CrでLabelされ、これに誘導されたNK-LAK細胞を混じ細胞障害活性の評価をした。^<51>Cr遊離量からMAC(membrane attack compornent)やPerforinによる細胞膜破壊の指標を得、さらに核膜より漏出した^3H-thymidineでLabelされDNAの量をfragmentationをおこしたDNA量、すなわちApoptosisがひきおこされた量として評価した。YAC-1はNK感受性腫瘍細胞、P815はLAK感受性腫瘍細胞とされているが、本実験で誘導されたNK活性を示す細胞群は高い^<51>Cr遊離を示し、同時に^3Hの遊離もみられ、細胞膜の破壊とDNAの断片化がひきおこされていると考えられる成績を示した。また、同時にP815細胞に対しても同様の成績を示した。DNAの断片化をされた量はYAC-1で2時間値48.5%、6時間値50.6%、P815ではそれぞれ8.1%、25.2%であった。この実験結果からNK活性を強く示す細胞群は早期よりDNAの断片化を進めるような働きが強く、LAK活性を示す細胞群では前者よりもDNAの断片化をおこすのに時間がかかると考えられた。
ハイブリッド型人工肝臓開発に関する基礎検討

ハイブリッド型人工肝の開発には、長期間高度の肝細胞特異機能を有する培養系の確立が必要である。そこで細胞外マトリックスの肝細胞増殖並びに分化機能に及ぼす影響について検討した。その結果、ラット分離肝細胞でのDNA合成はコラーゲン上での培養で最も高く、次いでPVLA(poly-N-p-vinylbenzyl-D-lactonamide)、EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)ゲルでの培養で最も低値であった。一方、アルブミンmRNAの発現はPVLA群、EHSゲル群では培養9日目でも保持されていた。またHNF(hepatocyte nuclear factor)-4発現での検討から、細胞外マトリックスは転写制御因子の発現を介してこれら肝細胞増殖、分化を制御していることが明らかとなった。さらにEHSゲル内培養肝細胞は、3週間後でもPVLA群に比し有意に高いアルブミン分泌能を示した。次いでハイブリッド型人工肝に使用するbioreactorの検討をおこなった。すなわちラット初代培養肝細胞と肝芽腫由来の株化細胞であるHep G2細胞をそれぞれEHSゲルにて培養し、ホロファイバー型モジュールの外腔に充填し、内腔を培養液のみで潅流し、アンモニア負荷による処理能、アルブミン分泌能を検討したところ、Hep G2細胞では培養液中のアンモニア濃度の上昇を示したのに対し、初代培養肝細胞では時間とともにアンモニア濃度の低下を認め、また初代培養肝細胞では、Hep G2細胞ではみられなかったアルブミン分泌能を潅流4.5日をピークとして認めた。そこで急性虚血性肝不全ブタを作成し、ブタ初代培養肝細胞をEHSゲル内で培養したbioreactorによるホロファイバー型モジュールで体外潅流をおこなった。その結果、血中アンモニア濃度の低下ならびに動脈血ケトン体比の改善が認められた。従ってホロファイバー外腔にEHSゲル内で培養したブタ初代培養肝細胞を充填したモジュールは、肝細胞機能を補助するハイブリッド型人工肝として有用と考えられた。ハイブリッド型人工肝開発には、急性肝不全患者血漿中でも肝細胞がその機能を発揮し得るか否か、長期間、高度の肝細胞機能を発現する培養肝細胞を得るための肝細胞増殖、分化機能制御機構の解明が必要となる。1.劇症肝炎患者血漿の影響:人工マトリックスであるPVLA(poly-N-p-vinylbenzyl-D-lactonamide)上での肝細胞多層集合体、コラーゲンゲル上での単層培養肝細胞に患者血漿を添加(100%)し肝細胞機能について検討した。その結果、アルブミン合成、尿素窒素合成、糖新生とも単層培養系、多層集合体いずれでも患者血漿添加群は正常血漿添加群、培養液群と差異を認めなかった。またPVLA群ではコラーゲン群に比し血漿総アミノ酸濃度の有意な低下を認め、Fischer比(分枝鎖アミノ酸/芳香族アミノ酸モル比)はコラーゲン群では低下したのに対し、PVLA群では保持されていた。すなわち、劇症肝炎患者血漿中でも分離肝細胞は良好な機能を発揮した。2.肝細胞の増殖、分化機能の制御機構:細胞外マトリックスとしてコラーゲン、PVLA、EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)ゲルを用い、分離肝細胞のDNA合成を検討したところ、コラーゲン群で最も高く次いでPVLA群で、EHSゲル群で最も低値であり、転写因子c-myc mRNAの発現はコラーゲン、PVLA群では認められたがEHSゲル群ではみられなかった。

一方、アルブミンmRNAの発現はEHSゲル、PVLA群では培養9日目でも維持されており、転写制御因子であるHNF(hepatocyte nuclear factor)-4の発現とほぼ同様な推移であった。すなわち、細胞外マトリックスは転写因子の発現を介して肝細胞増殖、分化を制御していることが考えられた。ハイブリッド型人工肝の開発には、長期間高度の肝細胞特異機能を有する培養肝細胞の確立が必要である。昨年度までに細胞外マトリックスは転写因子の発現を介して肝細胞増殖、分化を制御しており、特に基底膜類似成分よりなる細胞外マトリックスであるEHS(Engelbreth-Holm-Swarm)gel内で培養した肝細胞は転写制御因子であるHNF(hepatocyte nuclear factor)-4発現を介してアルブミンmRNAを長期にわたり発現していることを明らかにした。本年度は初培養肝細胞とヒト肝癌由来の株化細胞(Hep G2、HuH-7、PLC/PRF/5)を種々の細胞外マトリックスを用いて培養し、アルブミン分泌能、アンモニア代謝能を比較検討した。その結果、EHS gel内初代培養肝細胞は3週間後でもコラーゲン、PVLA(poly-N-vinylbenzyl-D-lactonamide)上での培養に比し有意に高いアルブミン分泌能を認めた。一方、株化細胞ではアルブミン分泌量は極めて微量であり、さらにNH_4Cl負荷によるアンモニア代謝能の検討で、初代培養肝細胞では培地中アンモニア濃度の良好な低下がみられたのに対し、株化細胞ではいずれもアンモニア濃度の上昇を認めた。ついで初代培養肝細胞とHep G2細胞をEHS gelに懸濁させ、ホロファイバー型モジュールの外腔に注入し、ゲル化させた後、内腔側をMEM培養液のみで潅流培養し、肝細胞特異機能について比較検討した。その結果、初代培養肝細胞においては血清及びホルモン無添加の潅流培養にもかかわらず培地中のLDHの上昇はなく、培養5日をピークとする良好なアルブミン分泌能並びにアンモニア代謝能を示したが、Hep G2細胞では低値ながら尿素合成を認めるにもかかわらず、培養液中のアンモニア濃度の上昇がみられた。従ってハイブリッド型人工肝には初代培養肝細胞がより有用で、EHS gel内培養肝細胞を用いたホロファイバー型モジュールはハイブリッド型人工肝の開発に向け有用なシステムと考えられる。ハイブリッド型人工肝の開発には、長期間高度の肝細胞特異機能を有する培養肝細胞系の確立が必要である。昨年度までに細胞外マトリックスが転写因子の発現を介して肝細胞増殖、分化を制御しており、特に基底膜類似成分より成るEHS(Engelbreth-Holm-Swarm)gel内で培養した肝細胞は転写制御因子であるHNF(hepatocyte nuclear factor)-4発現を介してアルブミンmRNAを長期にわたり発現しており、さらに初代培養肝細胞とヒト肝癌由来株化細胞との比較では、EHSgel内で培養した初代培養肝細胞てば長期にわたる良好なアルブミン分泌能、アンモニア処理能を示すことを明らかにした。
反芳香族化合物の対面型多量体の合成とその特異的芳香族性の解明

本研究では、Stacked-Ring Aromaticity(SRAと略記)、すなわち反芳香族化合物の対面型積層に伴う芳香族性の転換を実験的に観測することを目的とし、それに適した反芳香族化合物の合成とその集積化を昨年度から継続して行った。昨年度合成した、ベータ位にシアノ基を4個有する反芳香族イソフロリンにおいてその金属錯形成による集積化を試みたが、目的物は得られなかった。そのため、関連する誘導体を合成し、同様に集積化をを検討している。また、この研究の過程で反芳香族イソフロリンが、通常の有機分子とは異なる特異的な発光特性を有することが予備的な実験から明らかになった。今後、継続してこの発光特性の評価を行い、新たな発光色素の創製を目指す。一方で、昨年度合成したカチオン型ポルフィリン積層錯体が、反芳香族性を示す可能性を示した。これも新規のSRAと考えられるため、今後さらなる評価を行いその性質を明らかにする。また、縮環ポルフィリン2量体を構成要素とする希土類積層型錯体を合成した。その2電子酸化体が、高い一重項ビラジカル性および著しく小さいHOMO-LUMOギャップを有することを明らかにした。・前駆体である芳香族ジオキサポルフィリンを文献に従い合成を試みたが、文献には記載されていなかったジオキサポルフィリンの不安定性が明らかになり安定に単離することができなかった。そこでジチアポルフィリンに標的化合物を変え、種々の誘導体の合成と還元を試みた。その結果、ベータ位にシアノ基を4個有するジチアポルフィリンが、温和な条件で容易に還元され目的のイソフロリンを与えることを明らかにした。またこのイソフロリンが弱い反芳香族性を示すことをNMRおよびDFT計算から明らかにした。・参照化合物となるポルフィリンダブルデッカー錯体およびトリプルデッカー錯体の合成および構造に関して、未だ不明なところが多く残されていたためその調査を行った。その結果、ダブルデッカー錯体において安定にとりうるすべての化学状態の構造を明らかにした。二つのポルフィリン間の回転角が変化すること、その変化がポルフィリンの周辺置換基に依存することを明らかにした。さらに、これまで合成が困難であった重希土類トリプルデッカー錯体の合成とその構造解析に初めて成功した。これらは、目的の反芳香族化合物のダブルデッカー錯体を構築するうえで重要な知見となる。・もう一つの参照化合物であるSNAr反応を用いたポルフィリン対面型二量体に関して、さらなる合成条件の検討および構造解析を行った。その結果、既報の類似化合物に比べて短工程、かつ高収率で標的化合物を得る条件を見出した。また、各種構造解析の結果、得られた化合物は溶液固体共に強固に対面型構造を維持していることを明らかにした。すなわちその性質を決定するポルフィリン間の面間距離を、自在に制御できることを明らかにした。本来の計画は、既知化合物であるジオキサポルフィリンを合成し速やかに合成し、その還元による反芳香族化と対面型集積体の構築の条件検討に十分な時間を充てる予定であった。しかしながら、前駆体である芳香族ジオキサポルフィリンを文献に従い合成を試みたが、文献には記載されていなかったジオキサポルフィリンの不安定性が明らかになり安定に単離することができなかった。数種の類縁体の合成も試みたが同様に不安定であった。以上の予期していなかった理由により、標的化合物の変更が必要になった。反芳香族イソフロリンを得ることには成功したが、対面型集積体の構築の検討が行えなかった。反芳香族イソフロリンを得ることができたため、対面型2量体および3量体の構築を検討しその芳香族性を明らかにする。昨年度若干の進捗の遅れが生じたため、当初の予定であった面間距離の評価、および集積数の偶奇効果のうち少なくともどちらか一方について詳細に調査を行い明らかにする予定である。研究を進めていくうえで必要に応じて研究費を執行していたが、研究の進捗に遅れが生じたことと既存の試薬、機器を有効に利用することができたため未使用額が生じた。