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グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスを用いた膵内分泌腫瘍に対する治療・予防法の開発

膵腫瘍を自然発生するグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスを用いて、発生した腫瘍を病理学的、分子生物学的に検討することにより生物学的性質を明らかにし、治療・予防法の開発を試みた。このマウスに生じた膵腫瘍がヒト膵内分泌腫瘍(pNET)に組織学的、生物学的態度が酷似することを論文報告した。悪性化の過程の各段階の膵島細胞における、細胞増殖因子、血管新生因子(AKT、mTOR、VEGFなど)、の発現を摘出組織標本の免疫染色により検討した。pNETに臨床適応を持つmTOR阻害剤であるエベロリムスを生後まもなくよりこのマウスに投与して膵腫瘍発生が抑制されたことを認めた。膵神経内分泌腫瘍(pNET)は膵島細胞から発生する比較的稀な腫瘍であり、機能性と非機能性に分類される。比較的緩徐に進行することが多いとされているが、時間経過とともに肝転移を来すことが多く、悪性の経過をたどることが多い。近年pNETに対するmTORを標的とするエベロリムスなどの分子標的薬の効果が確認されて臨床に導入されてきているが、治療効果はまだ限定的である。また遺伝性腫瘍症候群におけるpNETの発生抑制効果を臨床的に示された薬剤はまだない。平成27年度の研究計画として挙げた、継代維持されているグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスの膵島過形成からpNET形成、さらに転移巣形成にいたる進行過程における細胞内分子生物学的変化を検討するテーマについては、現在、成長段階の異なるノックアウトマウスの各種臓器を摘出して悪性化の各段階の膵島細胞における、細胞増殖因子(AKT, mTORなど)血管新生因子(VEGFなど)、抗アポトーシス経路の活性化などを組織標本の免疫染色により検討している。またもう一つの、継代維持されているグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスに発生した膵腫瘍に対する各種分子標的薬剤の効果を検討するテーマについては、現在、ノックアウトマウスにmTOR阻害剤であるエベロリムスを経口投与しつつ、腫瘍の形成阻害作用や、縮小効果を検討している。また、平成28年度以降の研究計画に挙げた、薬物投与により膵腫瘍の発生抑制が認められるかどうかを検討するテーマに対しては、現在エベロリムスを生後直後より投与する実験を開始している。動物実験については、当該研究課題が開始される以前より、研究施設で継代維持されているために、実験材料の入手、薬剤による介入が容易であるため。膵神経内分泌腫瘍(pNET)は膵島細胞から発生する稀な腫瘍であり、悪性の経過をたどることが多い。また遺伝性腫瘍症候群として発生することもある。近年pNETに対する分子標的薬が臨床に導入されてきているが、治療効果はまだ限定的である。我々が開発したグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスにおいてはpNETに組織学的また、生物学的態度が酷似した腫瘍が発生する。このモデルマウスを用いて、pNETの発生さらに転移に至る分子生物学的過程の検討、各種分子標的薬剤の治療効果の検討、さらに発生予防を期待できる薬剤の効果を検討する。平成28年度以降の研究計画に挙げた、薬物投与により膵腫瘍の発生抑制が認められるかどうかを検討するテーマに対しては、mTOR阻害剤であるエベロリムスをこのモデルマウスに生後早期より経消化管投与により継続投与し、膵島細胞の過形成が抑制されることを確認した。エベロリムス投与により過形成が抑制されたモデル動物における膵島細胞と、対照薬を投与されたモデル動物における膵島細胞における細胞増殖因子(AKT、mTOR、VEGFなど)の発現の差異を検討した。また、上皮間葉移行に関与するとされる遺伝子産物や抗アポトーシス作用を持つ遺伝子産物の発現も検討した。エベロリムスのさらなる長期投与によって膵島腫瘍の発生抑制が可能かどうかを検討している。動物実験については、当該研究課題が開始される以前より、研究施設で継代飼育されているために、実験材料の入手、薬剤による介入が容易であるため。膵神経内分泌腫瘍(pNET)は膵島細胞から発生する稀な腫瘍であり、転移を来たし悪性の経過をたどることが多い。また遺伝性腫瘍症候群の一部分症として発生することもある。近年pNETに対するmTOR阻害剤などの分子標的薬が臨床に導入されてきているが、治療効果はまだ限定的である。このモデルマウスを用いて、pNETの発生さらに転移に至る分子生物学的過程の検討、各種分子標的薬剤の治療効果の検討、さらに発生予防を期待できる薬剤の効果を検討した。平成28年度以降の研究計画に挙げた、継代維持されているグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスの膵島細胞の悪性化における細胞内遺伝子発現を網羅的に検討するテーマについては、マイクロアレイによる検討は行えなかった。また、EMT抑制による転移抑制効果についても、mTOR阻害剤以外のEMTを抑制する薬剤をマウスに投与を行う段階までには達せずに研究期間が終了した。また、血管新生阻害効果を持つ薬剤やpNETの発生抑制効果が示唆されている薬剤の効果を検討することも期間内にはできなかった。研究期間を通して、mTOR阻害剤であるエベロリムス投与によりpNETの発生予防効果を認め、その機序を免疫染色等により検討できた。結果については現在論文作成中である。

膵腫瘍を自然発生するグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスを用いて、発生した腫瘍を病理学的、分子生物学的に検討することにより生物学的性質を明らかにし、治療・予防法の開発を試みた。このマウスに生じた膵腫瘍がヒト膵内分泌腫瘍(pNET)に組織学的、生物学的態度が酷似することを論文報告した。悪性化の過程の各段階の膵島細胞における、細胞増殖因子、血管新生因子(AKT、mTOR、VEGFなど)、の発現を摘出組織標本の免疫染色により検討した。pNETに臨床適応を持つmTOR阻害剤であるエベロリムスを生後まもなくよりこのマウスに投与して膵腫瘍発生が抑制されたことを認めた。1.継代維持されているグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスの膵島細胞の悪性化における細胞内遺伝子発現を網羅的に検討する。2.グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスに発生した膵腫瘍に対するEMT抑制による転移抑制効果を検討する。以上2つの課題について、研究を推進する。2.グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスに生後早期よりmTOR阻害剤であるエベロリムスを長期投与して、膵島腫瘍の発生抑制が可能かどうかを検討する。内分泌外科平成27年度の研究計画実施に対して実際に試薬等に必要とした費用が、想定より少なかったため。平成28年度の研究計画実施に対して実際に試薬等を新たに必要とすることがなかったため。動物実験、薬物介入試験などの研究計画を遅滞なく進捗させるために、実験動物用資材、実験試薬等に適切に使用する。動物実験、薬物介入試験などの研究計画を遅滞なく進捗するために、実験動物用資材、実験試薬等に適切に試用する。
一般住民への食生活介入の高尿酸血症及び慢性腎臓病に対する1次予防効果の検討

我が国の慢性腎臓病(CKD)患者は増加の一途をたどっている。近年、高尿酸血症が腎機能低下に関与することが報告された。一方で、十分な水分やアルカリ食品の摂取など比較的容易な食習慣改善は血中尿酸値を低下させるために効果的であることが知られている。そこで本研究は、CKD発症に対する1次予防法を開発することを目的として、食生活改善による高尿酸血症改善や腎機能保護効果を検討するする。具体的な実施内容は、1一般住民を対象に食生活介入を行い高尿酸、腎機能への効果を検討するとともにと、2医療保険者に蓄積する健康診断に関するビッグデータを活用して腎機能低下と尿酸値の経時的推移の関連を調べる。
超塩基性(かんらん岩)シュードタキライトの研究

北イタリアBalmucciaかんらん岩体に産する多種多様な超マフィックシュードタキライトは、火成岩的な組織を持つタイプとマイロナイト組織をもつタイプに大別できること、後者は前者より、早期に、より深部で形成したことを、断層脈の交叉関係と鉱物組み合わせの解析から明らかにすることができた。特に後者のタイプの存在を世界で初めて認定し、その形成条件を岩石学的手法で明らかにするとともに、地震発生学的意義を上部マントルにおける地震断層滑りのダイナミクスに関連づけて論じた。平成20年9月22-26日米国カリフォルニア州マウントシャスタで開催された国際レルゾライト会議に出席し、バルムチアかんらん岩超塩基性シュードタキライトについて2件発表した。(小畑、上田)。バルムチア産高温型断層脈シュードタキライトについての研究成果の一部がGeologyの8月号に掲載された(Ueda et al, 2008)。平成20年10月4日-20日の期間イタリアのバルムチアかんらん岩体でフィールド調査とサンプリングを行った(小畑は10月4日-13日、大学院生上田匡将は4日-20日まで現地でフィールドワークを継続。)フィールドワークの成果:バルムチア岩体において高温型断層脈シュードタキライトが従来認識されていたよりも広汎に、ネットワークを作って分布している事が判明した。野外での産状を詳細にドキュメントしサンプリングを行った。多数の断層脈が切った切られたの関係にあり、後で切っている断層脈は脆性破壊の組織、すなわちカタクラサイトがドミナントであることが明らかになってきた。このことから断層運動は、全体が高温(800°C)であった塑性変形優勢時期から、岩体が上昇して冷却して脆性変形卓越時期まで繰り返し断層運動を繰り返してきたことが明らかになってきた。今回のサンプリングは日本から持参した携帯コアピッカーを用いておこない、短時間で多数のコアサンプル(40個)を効率よく採取することができた。帰国後これらサンプルを全て薄片にし、光学顕微鏡、SEMを用いて観察、分析を行っているところである。そのなかで、断層脈から派生する注入脈シュードタキライトの中に明瞭な急冷組織を認める事ができた。現在これらのサンプルについて詳細を分析中である。平成21年夏の現地調査によってイタリアのBalmuccia岩体では、断層脈シュードタキライトが、従来認識されていたよりもより広汎に、複雑なネットワークを作って、また様々な変形岩を伴って分布していることを含めて、その産状の全貌が明らかになってきた。断層脈メットワークにおいては、多数の断層脈が交叉関係にあり、初期に形成したものは塑性変形の要素が強く、後で切っている断層脈程脆性破壊の組織、すなわちカタクラサイトが卓越していることも明らかになってきた。これらの断層脈を携帯コアピッカーを用いて系統的にサンプリングを行いコレクションの整備を行った。これらサンプルについて、室内実験で光学顕微鏡、SEM、EPMAを用いて観察を行い、いくつかのサンプルについて鉱物科学分析を行って、変形と再結晶の温度圧力条件を求めた。東京大学では高解像度FE-SEMを用いて、シュードタキライト(極細粒部)の正確な記載を行うとともに、EBSDを用いてかんらん石の結晶方位を測定し、マイロニティックなサンプルについては一定の定向配列を示すことが明らかになってきた。これらのデータは変形メカニズム考察にとって重要な基礎データとなる。断層脈シュードタキライトには流離構造のはっきりした再結晶作用の進んだものから、流離構造の発達しない急冷組織の発達したものまで、幅広いスペクトラムが有ることが明らかになってきたことも今年度得た重要な研究成果である。これらの組織観察、岩石学的データは、地震発生時の岩石変形、ラプチャー(破断面)伝播、摩擦発熱融解、及びモーメント解放による地震発振機構を考える上で重要な基礎データとなるはずである。これらの研究成果は、ヨーロッパの国際会議、アメリカAGUで発表した。これまでの筆者らの研究で、調査地域イタリアBalmucciaの超マフィックシュードタキライトには、マクロには無構造で火成岩的組織をよく残したものと、ウルトラマイロナイト組織を呈する完晶質なもの(mylonitic pseudotachylyte、以下M-PSTと略す)の2タイプがあることが判明していた。筆者はこのような組織の違いは,地震時の摩擦発熱によって生じたメルトが,冷却固化する祭に,断層辷り停止の早い,遅いの違いによって生じるという仮説を提唱した(H22年度連合大会)。その後夏のBudapestでのIMA参加のあと,イタリアBalmucciaを再訪し,院生の上田匡将と共に8月27日から9月7日まで現地調査を行い,昨年に続いて,pseudotachylyteの詳細な野外観察と携帯コアピッカーを用いた追加サンプリングを行った。本年度の重要な成果は,(1)上述の無構造シュードタキライトの周縁部がmyloniticタイプに漸移するサンプルが複数見つかったこと,(2)断層脈から注入脈が発生する様子が詳細に観察できるサンプルがあらたに得られたこと,

(3)上の中間的なタイプでシュードタキライト中のかんらん石結晶の特定の方向の縁に、斜方輝石リムが普遍的に発達し,これがストレスマーカーに使えるかもしれないことが分かってきたこと,(4)マイロナイトシュードタキライトはかんらん石の光学的方位を異にする二つのドメインに分かれていることが判明してきたこと,である。成果(3)については研究協力者である院生上田匡将が筆頭で、地震の震源過程のメカニズムのモデル考察は筆者が、それぞれ地質学会で発表した(9月、富山)。マイロナイトシュードタキライトについては、EPMAで鉱物分析を継続するとともに、EBSDを用いてかんらん石のLPOデータを多数取得することで、高精度の記載を行い研究を進展させることができた。
ボルタメトリーによる細胞自動検出システムの開発

細胞と電極の直接反応に着目し、ボルタメトリー法を用いた電気化学的細胞検出システムを創案した。このシステムは検出電極にB.P.G.(熱分解黒鉛)電極を用い、サイクリックボルタメトリーにより得られるピーク電位,電流,波形を指標として、微生物や動物細胞の分類、固定や細胞数の測定を行うものである。種々の微生物に対しこのシステムを適用し、以下の知見が得られた。細胞-電極間の電子移動反応は細胞の細胞壁中に存在する補酵素Aによって媒介されており、細胞壁構造に密接に関係している。また、4.4 ́-ビピリジルでB.P.G.電極表面を修飾することで得られるピーク電流値は1.52倍に増加し、4.4 ́-ビピリジルに電子移動反応を促進する働きがあることが示された。腸内細菌の検出を行ったところ、グラム陽性菌は0.650.69V(vsSCE),グラム陰性菌は0.700.74V(vsSCE)のピーク電位を示した。また、グラム陽性菌とグラム陰性菌において1次波のピーク電流値に対する2次波のピーク電流値の割合は異なり、ピーク電位および1次波ピーク電流値に対する2次波ピーク電流値の割合で両者を識別できることが明らかとなった。抗生物資添加培地中で1時間放置後の菌体のサイクリックボルタグラムを求めると、ピーク電流値は抗生物質感受性菌で減少または一定であるのに対し、耐性菌は増加することで、抗生物質感受性菌と耐性菌の識別は可能であった。さらに、培地を加え、3時間培養することでこのシステムによって、感染尿の検出や原因菌の菌数,薬剤感受性まで指定できた。動物細胞であるT細胞,B細胞,マクロファージ,ガン細胞についても、このシステムで検出できた。また、抗原-抗体反応とこのシステムを組み合わせることで、属や種レベル(抗原性)での識別が可能であった。以上の結果、ボルタメトリー法を用いる電気化学的細胞検出システムは細胞の検出や識別、さらに菌数の測定に有効であることがわかった。1.サイクリックボルタメトリーの波形から細菌を識別する事を試みた。グラファイト電極にメンブランフィルター上に吸着固定した細菌を直接装着し電位走査(01.0VvsSCE)を2回くり返した。1回目に得られるピーク電流値に対する2回目のピーク電流値の割合はグラム陰性菌では80%以上、グラム陽性菌では50%以下であった。このピーク電流値の割合とピーク電位の違いを用いることにより、グラム陰性菌とグラム陽性菌を識別できた。また、これらの細菌においても細胞内の補酵素Aが細胞の電極反応を媒介することが示された。2.動物細胞の識別についても検討した。細胞としてT,Bリンパ球,マクロファージ,赤血球,マウスの胆肝がん細胞を用いた。サイクリックボルタメトリーは細菌と同様の方法で行った。T,Bリンパ球,マクロファージ,赤血球のピーク電位は0.640.65V(vsSCE)でがん細胞では0.640.67V(vsSCE)であった。2回目のピーク電流値はすべての細胞でほとんど得られなかった。また、動物細胞においても補酵素Aが細胞の電極反応を媒介することが示された。3.ボルタメトリーを用いたモデル感染尿の検出について検討した。モデル感染尿は尿をフィルターにより滅菌し、この尿の中にモデル病原菌として大腸菌を加えて調製した。

一般に、感染尿は【10^5】cells/ml以上の菌濃度を示し、非感染尿では【10^3】cells/ml以下の菌濃度とされる。そこで感染尿と非感染尿の識別を電極を用いて行った。モデル尿に同量のRogosa培地を加えて3時間培養し、集菌後細菌をグラファイト電極に直接装着しサイクリックボルタメトリーを行った。感染尿(初期菌濃度【10^5】cells/ml)においてピーク電流値は0.4μA以上であった。非感染尿(初期菌濃度【10^3】cells/ml)では0.2μA以下であり、この方法により3時間で感染尿の検出ができることが示された。また、抗生物質を加えて培養しピーク電流値を測定することにより耐性菌と非耐性菌を識別できた。細胞検出システムの細菌の薬剤感受性試験への応用を行った。モデル病原菌としては大腸菌を用いた。この大腸菌を培養後、各種抗生物質を含む液体培地中に37°Cで1時間放置し、メンブランフィルター上に吸着固定し、BPG電極に直接装着してサイクリックボルタメトリーを行った。その結果、抗生物質感受性菌では第1回走査で得られたピーク電流値が抗生物質を加えない場合の6075%と低い値を示し、第2回走査においてはピーク電流はほとんど計測されなかった。これに対して耐性菌は抗生物質を加えた後も第1回走査、第2回走査において0.7V(VS SCE)付近にピークが得られ、その波形も加えない場合に得られたものと等しかった。また、抗生物質感受性菌のピーク電流値は抗生物質の濃度の増加とともに減少するが、耐性菌ではあまり変化しない。さらに、得られたピーク電流値は抗生物質添加時の菌数(初期菌数)の増加とともに増加した。これより、抗生物質を加え1時間放置しピーク電流値を測定することで、抗生物質感受性菌と耐性菌の識別、菌数、最少発育阻止濃度を推定できることが示された。そこで、この方法をモデル感染尿中の原因菌の薬剤感受性試験に適用した。モデル感染尿(初期菌濃度【10^6】Cells/ml以下)は菌濃度が低いため、1時間放置では特徴的なピークは得られなかった。しかし、3時間放置することで感染尿(初期菌濃度【10^5】Cells/ml以上)は0.4μA以上、非感染尿は0.2μA以下のピーク電流値を示した。また、抗生物質を加えて放置した場合、耐性菌であれば0.3μA以上のピーク電流値、感受性菌であれば0.2μA以下のピーク電流値を示した。その上、加える抗生物質濃度が最少発育阻止濃度以下ではピーク電流値は増加するが、最少発育阻止濃度以上ではほぼ一定値を示した。以上のことから、感染尿の検出、薬剤感受性、有効な抗生物質の最適最少濃度をボルタメトリーによる細胞自動検出システムにより短時間で行なえることが示された。
視覚信号の時空間的相互作用を考慮した視覚運動情報処理の心理学的・神経科学的解明

(1)fMRIを用いた誘導運動の神経相関の検討平成24年度は、昨年度実施したfMRIを用いた脳機能計測の結果と、被験者の誘導運動知覚の関係性をさらに検証するため、眼球運動の測定、および心理実験を実施した。その結果、hMT+野における脳活動パターンが、眼球運動や実験中の注意状態によるものでなく、誘導運動の知覚によって生じていることが示唆された。加えて、hMT+野の下位領域であるTO-1野、TO-2野と誘導運動知覚の関係について検討した。米国Stanford大学の開発したソフトウェア(MrVista)を用い、集団受容野解析を行い各被験者におけるTO-1野、TO-2野を同定した。結果、TO-1野とTO-2野は同様に誘導運動の知覚と関連していることが明らかになった。この成果は、神経科学分野における権威ある専門誌The Journal of Neuroscienceに原著論文として掲載された。(2)拡散強調画像を用いたヒト視覚皮質における神経線維連絡に関する研究これに加え、平成24年度は米国スタンフォード大学のBrian A.Wandell教授との共同で拡散強調画像法(Diffusion Weighted Imaging ; DWI)を用いた研究を行った。この研究では、まずfMRIおよび集団受容野解析により、ヒト視覚皮質における視野表現を測定した。これに加えて、DWIを使用することにより、ヒト脳における白質線維束を測定した。fMRIデータとDWIデータを組み合わせた解析を行った結果、hV4野の視野表現を説明する白質線維束を同定した。その成果は来年度シアトルで行われるAnnual Meeting of the Organization of Human Brain Mappingにて発表予定である。平成24年度の研究は、誘導運動の神経相関に関するfMRIプロジェクトが当初の予定通り進行し、原著論文として無事に採択されたに至った。こればかりでなく、米国Stanford大学との共同研究を行うことにより、最新の計測・解析手法を用いた拡散強調画像法データを得る事ができた。このデータに基づき、既にhV4野の視野表現を説明する白質線維束の知見が得られており、当初の計画以上に研究が進展している。今後の方針としては、取得したfMRIデータおよびDWIデータに基づき、視野表現(集団受容野)と白質線維束の投射パターンに関して、より定量的な解析を行う。また、複数回撮像した同一解像度のデータセット、あるいはより低解像度のデータセットに対して同一の解析を用いることで、解析結果の妥当性を検討する。加えて、今回解析対象となっている白質線維束が、健常者と網膜色素変性症患者の間でどのように異なるかを解析し、眼科的疾患がhV4野への入力経路に与える影響について検討する。申請者は既に東京慈恵医大、およびStanford大学眼科と共同研究を行うための打ち合わせを行っており、今後は臨床的な知見を得る事も期待される。1、誘導運動による運動透明視の変調複数のオブジェクトが同一視野上で動く場面は日常生活でも多く、同じ視野上の2方向の運動を同時に知覚する現象を運動透明視と呼ぶ。しかし、運動方向が近い2方向の成分が同一の視野上に現れた場合、2方向が混ざってしまい、運動透明視として知覚されない。本研究では、背景の運動の影響で見えの運動方向が変わる場合(誘導運動)、運動透明視の知覚が変化するかを心理物理実験により調べ、運動透明視と誘導運動の関係性を検討した。結果、周辺の刺激を適切な方向に運動させることにより、通常では混ざってしまい同時に知覚できない2方向の運動成分を同時に知覚できるようになることが明らかになった。このことは、2方向の視覚運動信号を同時に知覚できるかどうかに、誘導運動のメカニズムが強く影響していることを示唆する。この成果はJournal of Visionに原著論文として掲載された。(2):fMRIを用いた誘導運動の神経相関に関する検討主観的な誘導運動知覚と神経活動を直接比較するため、機能的核磁気共鳴画像法を用いて誘導運動知覚時のヒト視覚皮質の脳活動を調べた。実験では、刺激周辺部に一定の速度で運動する刺激、中心部に運動する縞刺激を呈示した。中心部の縞刺激については、周辺と同方向あるいは逆方向に運動する条件、物理的に静止する条件を用いた。結果、視覚運動処理に関連するhMT+野の活動が、誘導運動の影響で縞刺激が動いて見えると高くなり、止まって見えると低くなるといった誘導運動知覚と対応するパターンを示した。この傾向はV1野など初期の領野に比べ、hMT+野において最も強く見られた。この結果は、hMT+野における脳活動と主観的な誘導運動の知覚が関連することを示唆する。この成果については、神経科学の国際会議であるSociety for Neuroscienceにおいて発表を行った。

(2)拡散強調画像を用いたヒト視覚皮質における神経線維連絡に関する研究これに加え、平成24年度は米国スタンフォード大学のBrian A.Wandell教授との共同で拡散強調画像法(Diffusion Weighted Imaging ; DWI)を用いた研究を行った。この研究では、まずfMRIおよび集団受容野解析により、ヒト視覚皮質における視野表現を測定した。これに加えて、DWIを使用することにより、ヒト脳における白質線維束を測定した。fMRIデータとDWIデータを組み合わせた解析を行った結果、hV4野の視野表現を説明する白質線維束を同定した。その成果は来年度シアトルで行われるAnnual Meeting of the Organization of Human Brain Mappingにて発表予定である。既に当初計画したfMRI実験およびデータ解析が平成23年度中に既に終了しており、現在研究成果を原著論文として投稿する段階に至っていることから、当初の予定より大幅に速く研究目的を達成できている。加えて、米国Stanford大学と短期の共同研究を行い、申請者は拡散テンソル画像法という新しい手法のデータ解析法を平成23年度中に習得した。平成24年度においては、当初計画になかった拡散テンソル画像法を用いた研究計画を実施することも期待できる。平成24年度の研究は、誘導運動の神経相関に関するfMRIプロジェクトが当初の予定通り進行し、原著論文として無事に採択されたに至った。こればかりでなく、米国Stanford大学との共同研究を行うことにより、最新の計測・解析手法を用いた拡散強調画像法データを得る事ができた。このデータに基づき、既にhV4野の視野表現を説明する白質線維束の知見が得られており、当初の計画以上に研究が進展している。平成23年度に行ったfMRI実験のデータに関して、集団受容野解析と呼ばれる詳細な解析を施すことで、誘導運動に関連する脳活動と大脳皮質における視野表現の関連性に関する検討を行う。また、眼球運動計測実験を並行して行うことで、眼球運動がfMRIデータに与えた影響に関する検討を行う。さらに平成24年度では、拡散テンソル画像法を用いた、視覚神経系における神経線維連絡の解析手法と組み合わせ、視覚情報処理の神経基盤に関して解剖と機能の両面からアプローチを進める。今後の方針としては、取得したfMRIデータおよびDWIデータに基づき、視野表現(集団受容野)と白質線維束の投射パターンに関して、より定量的な解析を行う。また、複数回撮像した同一解像度のデータセット、あるいはより低解像度のデータセットに対して同一の解析を用いることで、解析結果の妥当性を検討する。加えて、今回解析対象となっている白質線維束が、健常者と網膜色素変性症患者の間でどのように異なるかを解析し、眼科的疾患がhV4野への入力経路に与える影響について検討する。
仏教史料の体系的把握に関する基礎的研究ー特に法華系史料についてー

本年度は、研究成果の総まとめを目標に、実地調査を主体とする活動を展開した。その作業は次のとおりである。1)妙顕寺古文書の分類・整理についての基礎方針を確立すべく、京都周辺諸寺の宝物帳を検討することにより、これを定立した。2)上の基本方針に基いて、妙顕寺文書の分類・整理する作業を入念に行い、「妙顕寺文書」の体系化を仕上げた。3)文化庁の助力を得て、「妙顕寺文書」の全体を再確認するとともに、目録を作成して、国指定文化財の審議資料に提出した。4)妙顕寺文書の保存方針を立て、和紙製の封筒や包紙を用いて、これを厳重に包装することにより、古文書の保存テストを行い、好成果を得た。5)金石文の調査と研究を、本圀寺・妙顕寺・妙覚寺・頂妙寺等の墓地を対象として行い、中世の墓塔・碑などを数多く発見し、形態分類・銘文の分類・時代の変遷等の基本資料を得た。6)京都諸寺院の動向について、公家の日記等の記録における記事を集成し、これを古文書と対照しながら、京都の社会情況の中で再評価を試みた。7)典籍については、法華経典籍について検討を加え、『法華経験記』を中心として、その体系化に努め、また11世紀から13世紀における比叡山延暦寺においての僧伝編纂についても考察を加えた。以上のような作業を通して、京都におけるおおよその法華系文書・典籍等についての見通しをつけた。本研究の基本的な方針は、法華系史料を具体的に操作することが根本であるから、古文書や典籍の実地における採訪に重点を置いた。この際特に法華系の史料が数多く伝わる京都日蓮宗諸寺院を採訪し、その宝物の全体的な整理と目録作りを進め、伝統を生かしながらも新しい視野に立つ寺宝目録を作成した。その具体例は次のとおりである。1)妙顕寺京都における日蓮宗の最古刹で、日蓮以下累世の諸僧による曼茶羅や古文書などをはじめ、朝廷・幕府関係のものが数多く伝わっている。これらは近来の寺院の疲幣のため、混乱したままで宝蔵に収められているため、改めて目録を採りなおし、中世の宝物帳を勘案した上で、新しい宝物帳を作成した。また、これらを保存するための方法を考案し、実験的に全宝物にこれを施した。これらの作業は来年も続け、寺院文書の全体像を把握するとともに、古文書整理作業の一つのタイプを定立しようとする。2)本圀寺・本満寺・要法寺・立本寺などかつて京都十六本山として栄えた諸寺を実地踏査し、妙顕寺におけると同様な方針で宝物の整理を行いつつある。また、寺院にとって無視することのできない墓塔の実地調査は目下進行中であるし、日蓮宗を特徴づける日蓮木像の悉皆調査も日程に入れている。3)法華系の典籍についても、関連史料集など書籍を入手し、実地のデ-タと照応させながら、体系的把握のための作業を進めている。この点については、日蓮宗以外の研究者からの指導と助言が必要であるため、意見の交換を目的とした研究打ち合わせ会を開催した。以上のように、極めて短期間ではあったが、豊かな研究成果をあげることができ、来年度の総括に向けての確実な基礎作業を完成したことは、大きな収穫であった。本文度は,研究成果の総まとめを目標に,実地調査を主体とする活動を展開した。1)妙顕寺古文書の分類・整理についての基本方針を確立すべく、京都周辺諸寺の宝物帳を検討することにより、これを定立した。2)上の基本方針に基づいて、妙顕寺文書を分類・整理する作業を入念に行い、「妙顕寺文書」の体系化を仕上げた。

4)妙顕寺文書の保存方針を立て、和紙製の封筒や包紙を用いて、これを厳重に包装することにより、古文書の保存テストを行い、好成果を得た。5)金石文の調査と研究を、本圀寺・妙顕寺・妙覚寺・頂妙寺等の墓地を対象として行い、中世の墓塔・碑などを数多く発見し、形態分類・銘文の分類・時代の変遷等の基本資料を得た。6)京都諸寺院の動向について、公家の日記等の記録における記事を集成し、これを古文書と対照しながら、京都の社会情況の中で再評価を試みた。7)典籍については、法華経典籍について検討を加え、『法華経験記』を中心として、その体系化に努め、また11世紀から13世紀における比叡山延暦寺においての僧伝編簒についても考察を加えた。以上のような作業を通して、京都におけるおおよその法華系文書・典籍等についての見通しをつけた。
超急冷回転水中紡糸法による組織制御水素吸蔵合金細線の製造

水素吸蔵合金細線の製造に関連する一連の研究を行った。第一年度は既存の高周波誘導加熱装置(200kHz,5kW)を用いて、MmNi系及びTiZr系合金の石英ノズル内での溶解噴射実験を行った。前者は1400°Cで融解したが、後者は融解しなかった。また、前者もアルゴンガスの背圧により口径0.25mmのノズルから噴射させることが出来なかった。その原因は、ノズルの浸食によりスラグが発生したためである。次いでカーボンノズル、さらにアルミナノズルに変えたが、共に使用に耐えなかった。また、関連研究として、浸漬急冷特性に重大な影響を及ぼす膜沸騰極小熱流束点の発生条件に関する理論的研究を行った。第二年度は誘導加熱装置(400kHz、5kW)と誘導コイルを新たに製作した。また、供試合金をLaNi_5に変更し、ノズルを口径0.5mmの石英製に変更した。約3gの母合金を約1450°Cまで加熱して融解させ、その後周速度7m/sの回転ドラム中に形成した厚さ約15mmの水層中に噴射して急冷凝固させた。凝固物の形状は、条件によって長さ約30cm、直径0.15-0.5mmの細線状、長さの異なるリボン状および粒状となった。細線の得られる最適背圧は0.3MPaであった。凝固物のPCT特性を測定したところ、水素吸蔵量が母合金の70%程度に減少した。なお、ノズル内で溶解後にそのまま冷却した凝固物も急冷凝固物に近い特性を示した。SEM観察およびESCA分析によると、急冷凝固物の表面には約2μmの酸化物層が形成されていたが、その体積割合は非常に小さく、バルクのLaNi_5はノズル内で融解中に酸化していると考えられた。またEPMAによると、急冷凝固物の表面にはNiがほとんど観察されず、内部の組成は母合金とほぼ同一であった。従って、急冷凝固物のPCT特性の低下を防ぐには、ノズルと溶湯の反応を極力抑える必要がある。なお、上述の結果はごく最近得られたものであり、今後学会発表を行う予定である。水素吸蔵合金の紡糸実験を行うための前段階として、現有の回転水中紡糸装置を用いて紡糸ノズル内に封入した水素吸蔵合金の高周波誘導加熱による融解実験を行ったノズル材料としては石英およびカーボンを使用した。ノズルの先端径は約0.25mmである。水素吸蔵合金としてはMmNiCoAlMn系1種類、CaMmNiAl系1種類、TiZrCrFeNiMnCu系2種類を用意した。石英ノズルの場合、TiZrCrFeNiMnCu系は約1400°Cになっても融解せず、誘導コイルの改造が必要なことが明らかになった。MmNiCoAlMn系は温度約1400°Cで融解したが、アルゴン背圧をかけて溶融金属ジェットを噴射させることが出来なかった。冷却後の観察によると、ノズルの溶湯に触れた部分が白濁しており、ノズルが浸食されてスラグが発生したと推察された.

この浸食を避けるために、引き続きカーボンノズルを用いて融解実験を行ったが、この場合にはノズル本体の誘導加熱によってノズル支持部のパッキングが高温となり、実験が続行出来なかった。以上の結果より、導電性がなく、溶湯による浸食がないノズルの製作が必要と判断し、アルミナ製のノズルを設計、発注した。しかし、納期が長期にわたる関係で本年度は新しいノズルを用いた紡糸実験は出来なかった。また、浸漬急冷特性に重大な影響を与える膜沸騰極小熱流束に関する研究を行い、その生起条件に関する新理論を提案した。昨年度使用した高周波誘導加熱装置の容量が不足していたので、新たに400kHz、5kWの加熱装置を製作した。また、誘導コイルを改造した。これにより、供試合金LaNi_5の融解が可能になった。LaNi_5の母合金約3gを口径0.5mmの石英ノズルに封入し、1420-1490°Cまで加熱して融解させ、その後0.25-0.35MPaのアルゴンガスの背圧をかけて周速度7m/sの回転ドラム中に形成した厚さ約15mmの水層中に噴射し、急冷凝固させた。急冷凝固物の形状は、条件によって長さ30cm、直径0.15-0.5mmの細線状や、長さの異なるリボン状および粒状のものが得られた。細線を得るための最適背圧は0.3MPaであった。形状の異なる凝固物が得られた主な原因は、ノズル内の溶融金属とノズルとの反応により、スラグが発生して溶湯の噴射がスムーズに行われないためであると考えられる。製造された凝固物のPCT特性は、母合金の特性に比べてプラトー域の幅が減少し、水素吸蔵量は70%程度に減少した。また、ノズル内で溶解後にそのまま冷却した凝固物のPCT特性の測定を併せ行ったところ、急冷凝固物に近い特性が得られた。ついで母合金および急冷凝固物のSEM観察、EPMAおよびESCAによる分析を行った。SEM観察およびESCA分析によると、急冷凝固物の表面には約2μmの酸化物層が形成されていた。しかしその体積割合は非常に小さく、バルクのLaNi_5は主として空気中で融解中に酸化ていると考えられた。またEPMAによると、急冷凝固物の表面にはNiがほとんど観察されず、内部の組成は母合金とほぼ同一であることがわかった。これらの結果から、ノズルの周囲をアルゴンガス雰囲気に保ち、溶湯の酸化およびノズルとの反応を極力抑えれば、母合金に劣らぬPCT特性を有する水素吸蔵合金細線が得られると判断される。なお、上述の結果はごく最近得られたものであり、今後学会発表を行う予定である。
地域体育をめぐる経営・行政条件の機能分析の試み-特に,市町村教育委員会の場合-

地域体育をめぐる市町村教育委員会(市教委)の機能としては、(A)体育事業を住民に直接営む方法と、(B)体育事業を住民に直接営む市教委以外の体育経営体や運動者団体に指導・助成等をおこなう方法の2つをあげることができる。この2つの機能のあることは、社会体育の普及・振興の方法にも当然影響してくることが予想できる。即ち前者(A)を中心にする方法、後者(B)を中心にする方法、そして(A)と(B)の両者を並列させていく方法があげられる。方法のちがいは言うまでもなく市教委の条件整備にも影響してくる。社会体育を推進していく条件は、例えば施設の設置や管理運営、指導者の養成や確保、そして指導体制の確立(社会体育担当部局の設置や専任の社会体育担当者など)等があげられる。これまでの研究としては個々の条件について検討されてきているものの、条件同士の関係とそれらの有効性については検討されていない。研究の究極的な目的は社会体育に関する経営・行政の目標に応じた諸条件(課題環境)のシステムを明らかにすることである。今回はこの目的のための第一ステップとして位置づけ、市教委は組織形態(社会体育担当部局の事務局での位置づけと社会体育担当職員の専任・兼任の差異から5つの組織形態を考えた。)を中心にスポーツ振興審議会,体育指導委員協議会,派遣社会教育主事,補助金等の事業推進要因と絡らんで体育経営体,運動者団体そして運動者に諸機能(サービス)をおこなうと考えた。充実した組織形態はそうでないものよりも事業推進要因の設置状況が高く、そして組織有効性も大きいであろうという仮説で分析をおこなう。組織有効性の指標としては、行事数、地域スポーツクラブのクラブ数やクラブ員数で考えた。資料収集の方法としては、全国の1万人以上3万人未満の市教委(1057市町村)を対象として、主に郵送による質問紙調査をおこなった。現在調査票を回収・分析中である。
高性能ガスセンサー実現のための活性表面の作製と評価

ガスセンサは工業原料や排気ガスに含まれるガスの検知に広く用いられており、近年では、環境エネルギー分野での高性能ガスセンサの重要性が増している。半導体型のガスセンサでのドーピングによるセンサ特性の向上は、センシング材料表面に特有の活性サイトが出現することで、この電気抵抗変化が大きくなる(又は、小さくなる)結果である。したがって、センシング材料の開発においては、そのような活性サイトを有する表面(ここでは活性表面と呼ぶ)の原子配列を同定することは極めて重要である。代表研究者らはこれまでに、ドーピングと表面偏析の組み合わせを新たな活性表面の構築法として着目し、その原子配列に関して低速イオン散乱分光(LEIS)を用いて解析してきた。その結果、タングステンドープ酸化亜鉛(W-ZnO)表面が優れたガスセンシング特性を有することが見出された。そこでWドーピングの役割を解明するために、Wドーパントの局所構造を同定することを目的とした二次元光電子分光実験を行い、W-ZnO最表面が酸素面で終端していることや、表面に偏析したWが第二層目のZn置換サイトに位置していることを明らかにしてきた。光電子回折により同定されたこのW-ZnO表面構造モデルは、LEISから別途同定されたモデルと一致する。この結果を踏まえ平成28年度は、二次元光電子分光によるガス吸着構造解析への展開を見据え、インハウス実験によるガス吸着構造解析に関する予備検討と、ZnO各結晶面のガスセンサ特性に関する検討を進めた。その結果、飛行時間型2次イオン質量分析/LEIS/昇温脱離分析の融合装置を新たに開発し、その運用を開始した。また成長方位を制御したZnO薄膜の合成に成功し、表面原子配列とガスセンサ特性との関係に関する知見を得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。ガスセンサーは工業原料や排気ガスに含まれるガスの検知に広く用いられており、近年では、環境エネルギー分野での高性能ガスセンサーの重要性が増している。ガスセンサーの性能向上には、異種元素のドーピングが有効であることはよく知られている。ドーピングによるセンサー特性の向上は、センシング材料表面に特有の活性サイトが出現する結果である。本研究では、低速イオン散乱分光と光電子回折・ホログラフィーを相補的に組み合わせ、活性表面の原子配列を精緻に同定する。これにより最終的には、産業応用に直結するガスセンサーの早期実現を目指す。本年度では、最表面の原子配列が既知の酸化物半導体(ZnO極性面)の表面への光電子回折・ホログラフィーの適用の検討を開始した。またそれと平行して連携研究者と共同でZnOへのさまざまな異種元素のドーピングと、そのセンサー特性を調べた。その結果、タングステンをドープしたZnOにおいて優れたガスセンシング特性が見出された。このことから光電子回折・ホログラフィーを利用した表面構造解析を行うべき試料として、W-ZnOを選定した。そしてこのW-ZnOに関して、Spring-8のBL25SUを用いた光電子回折実験を2回行った。これらの実験で得られた結果は、既に予備的に行った低速イオン散乱分光による最表面構造解析の結果と符合した。すなわち、W-ZnO試料を加熱することでWは最表面に偏析し、この析出したWは表面第二原子層のZn置換サイトに位置することが明らかとなった。さらに、W-ZnO最表面は酸素で終端していることも明らかとなった。当初の計画では、低速イオン散乱分光による最表面構造解析の精度を上げるために、測定中に試料を保持する装置(マニピュレータ)を整備する予定であった。これに対し、実際にそのようなマニピュレーターを整備し、低速イオン散乱分光による高精度な原子配列解析が可能な表面分析装置の開発に成功した。さらに当初の計画では光電子回折・ホログラフィーを利用した構造解析を行うべき試料として、表面活性に起因する優れたガスセンサー特性を示す試料を選定することとしていた。これに対し、連携研究者と共同でZnOへのさまざまな異種元素のドーピングと、そのセンサー特性を調べ、その結果、タングステンをドープしたZnOにおいて優れたガスセンシング特性を見いだした。そしてこのW-ZnO系を光電子回折・ホログラフィー実験の試料として選定した。上記のように、当初の計画に沿って研究はおおむね順調に進展している。

そこでWドーピングの役割を解明するために、Wドーパントの局所構造を同定することを目的とした二次元光電子分光実験を行い、W-ZnO最表面が酸素面で終端していることや、表面に偏析したWが第二層目のZn置換サイトに位置していることを明らかにしてきた。光電子回折により同定されたこのW-ZnO表面構造モデルは、LEISから別途同定されたモデルと一致する。この結果を踏まえ平成28年度は、二次元光電子分光によるガス吸着構造解析への展開を見据え、インハウス実験によるガス吸着構造解析に関する予備検討と、ZnO各結晶面のガスセンサ特性に関する検討を進めた。その結果、飛行時間型2次イオン質量分析/LEIS/昇温脱離分析の融合装置を新たに開発し、その運用を開始した。また成長方位を制御したZnO薄膜の合成に成功し、表面原子配列とガスセンサ特性との関係に関する知見を得た。光電子回折・ホログラフィーの酸化物半導体への適用を広げ、低速イオン散乱分光との相補性を検討する。また低速イオン散乱分光による解析の精度を上げるために、測定系を改良する。具体的には、低速イオン散乱分光用ビームラインの排気系を改良し、作動排気特性を向上させる。ビーム強度は動作時の真空度に依存するため、この様な改良によってビーム強度の向上、つまり測定精度の改善が見込まれる。さらに、前年度に行ったZnO極性面やW-ZnO系の光電子回折・ホログラフィーによる解析の検討を進める。具体的には、W-ZnO系において見いだされたWの表面偏析に関して、偏析したWの位置、欠陥構造、ガスセンサー特性との関係をより詳細に検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
歯髄処置にて廃棄される神経幹細胞からの神経再生の試み

神経は再生しないと考えられていたが、最近の再生医療研究の発展により、神経幹細胞から神経が再生することが徐々に判ってきた。廃棄歯髄から幹細胞を遺伝子工学的に濃縮する方法を確立し、当該細胞が歯再生への有効な資材となり得ることを証明することを目的とした。Piggy Bac系を用いた乳歯歯髄細胞およびiPS細胞への遺伝子導入により、遺伝子導入安定株は効率的に取得できることが明らかとなった。また、乳歯歯髄細胞から歯髄幹細胞を遺伝子工学的に単離し、その幹細胞特性について検討したところ、神経幹細胞特異的マーカーの遺伝子発現を認めた。in vitroにて分化誘導を行ったところ、神経細胞様の細胞を認めた。う蝕が重度に進行し歯髄に達すると、歯髄炎を惹起し、歯髄処置が行われる。これまでは、神経は再生しないと考えられていたが、最近の再生医療研究の発展により、神経幹細胞から神経が再生することが徐々に判ってきた。う蝕に罹患した乳歯歯髄を対象として、今までは廃棄されてきた歯髄内の神経細胞から神経幹細胞が得られれば、これをin vitroで増やし、神経細胞への分化誘導をはかり、自家移植することで機能的な根管充填材として使用するテーラーメイド医療が可能となる。本研究は、このような廃用に帰した歯の有効活用として、廃棄歯髄から神経幹細胞を遺伝子工学的に濃縮する方法を確立し、得られた神経幹細胞の特性解析、in vivoでの機能性検定など通じ、当該細胞が歯再生への有効な資材となり得ることを証明することを目的としている。ヒト乳歯歯髄由来の初代培養細胞への遺伝子導入、それによる遺伝子機能の解析は、その重要性の割にはあまり盛んに行われていない。これまで、当該細胞への効率的遺伝子導入の系が検討されていなかったことが背景にあると思われる。Piggy Bac(PB)トランスポゾンによる遺伝子導入法は、哺乳類細胞でも効率よく外来性の遺伝子導入を達成でき、その結果、当該遺伝子が宿主ゲノムに挿入された遺伝子導入安定株を、通常の系よりも効率良く取得できる。今回、この方法を歯系細胞およびそれに由来するiPS細胞に適用した。その結果、単なるプラスミドだけの導入では安定株が得られなかったものが、PB系のものでは確実に取得することが出来た。PB系を用いた乳歯歯髄細胞およびiPS細胞への遺伝子導入により、遺伝子導入安定株は効率的に取得できる。う蝕が重度に進行し歯髄に達すると、歯髄炎を惹起し歯髄処置が行われる。最近の再生医療研究の発展により神経幹細胞から神経が再生することが徐々に判ってきた。う蝕に罹患した乳歯歯髄を対象として、今までは廃棄されてきた歯髄内の神経細胞から神経幹細胞が得られれば、in vitroで増やし、神経細胞への分化誘導をはかり、自家移植することで機能的な根管充填材として使用するテーラーメイド医療が可能となる。廃棄歯髄から神経幹細胞を遺伝子工学的に濃縮する方法を確立し、特性解析、in vivoでの機能性検定を通じ、当該細胞が歯再生への有効な資材となり得ることを証明することを目的としている。ヒト乳歯歯髄由来の初代培養細胞への遺伝子導入、それによる遺伝子機能の解析は、あまり行われていない。これまで、当該細胞への効率的遺伝子導入系が検討されてなかったことが背景にあると思われる。Piggy Bac(PB)トランスポゾンによる遺伝子導入法は、哺乳類細胞でも効率よく外来性の遺伝子導入を達成でき、当該遺伝子が宿主ゲノムに挿入された遺伝子導入安定株を通常の系よりも効率良く取得できる。その結果、プラスミドだけの導入では安定株が得られなかったものが、PB系では確実に取得することが出来た。PB系を用いた乳歯歯髄細胞およびiPS細胞への遺伝子導入により、遺伝子導入安定株は効率的に取得できることが明らかとなった。また、乳歯歯随細胞から歯髄幹細胞を遺伝子工学的に単離し、その幹細胞特性について検討したところ、神経幹細胞特異的マーカーの遺伝子発現を認めた。標的としているNestin promoterは入手しており、プラスミドベクターの構築に取りかかっており、今後は遺伝子工学的手法により神経幹細胞を単離する予定である。乳歯歯髄細胞に関して、これまで知られる神経幹細胞マーカーの発現をRT-PCR法で検索した。また、廃棄乳歯歯髄を神経細胞培養用培地で培養し、増殖した細胞が神経細胞の特性を示すかを神経細胞のマーカーで検索した。また、in vitroにて分化誘導を行ったところ、神経細胞様の細胞を認めた。

本研究は、廃棄歯髄から幹細胞を遺伝子工学的に濃縮する方法を確立し、特性解析、in vivoでの機能性検定を通じ、当該細胞が歯再生への有効な資材となり得ることを証明することを目的とした。ヒト乳歯歯髄由来の初代培養細胞への遺伝子導入、それによる遺伝子機能の解析は、あまり行われていない。これまで、当該細胞への効率的遺伝子導入系が検討されていなかったことが背景にあると思われる。Piggy Bac(PB)トランスポゾンによる遺伝子導入法は、哺乳類細胞でも効率よく外来性の遺伝子導入を達成でき、当該遺伝子が宿主ゲノムに挿入された遺伝子導入安定株を通常の系よりも効率良く取得できる。今回、この方法を乳歯歯髄細胞に適用した。その結果、プラスミドだけの導入では安定株が得られなかったものが、PB系では確実に取得することが出来た。PB系を用いた乳歯歯髄細胞およびiPS細胞への遺伝子導入により、遺伝子導入安定株は効率的に取得できることが明らかとなった。また、乳歯歯髄細胞から歯髄幹細胞を遺伝子工学的に単離し、その幹細胞特性について検討したところ、神経幹細胞特異的マーカーの遺伝子発現を認めた。in vitroにて分化誘導を行ったところ、神経細胞様の細胞を認めた。今後、神経再生のための効率的な分化誘導法の検討を行っていく必要があると考えられた。神経は再生しないと考えられていたが、最近の再生医療研究の発展により、神経幹細胞から神経が再生することが徐々に判ってきた。廃棄歯髄から幹細胞を遺伝子工学的に濃縮する方法を確立し、当該細胞が歯再生への有効な資材となり得ることを証明することを目的とした。Piggy Bac系を用いた乳歯歯髄細胞およびiPS細胞への遺伝子導入により、遺伝子導入安定株は効率的に取得できることが明らかとなった。乳歯歯髄細胞に関して、これまで知られる神経幹細胞マーカーの発現をRT-PCR法で検索した。また、廃棄乳歯歯髄を神経細胞培養用培地で培養し、増殖した細胞が神経細胞の特性を示すかを神経細胞のマーカーで検索した。単離した細胞を用いてin vitroでの神経幹細胞から神経細胞への分化誘導についても検討する予定である。歯学今後は、遺伝子工学的手法による神経幹細胞の単離を行う予定である。神経幹細胞特異的nestin promoterはすでに入手しており、トランスポゾンベクターpT-NEIN [+ EGFP cDNA+ IRES(internal ribosomal entry site)+ neomycin耐性遺伝子(neo) +ポリA付加部位]を作製する。遺伝子導入後の乳歯歯髄細胞から、G418にて薬剤耐性細胞を得ることができる。この細胞は神経幹細胞と期待され、神経幹細胞特異的nestin promoterが作動するため、EGFP蛍光を発し、且つ、G418耐性(neoが発現するので)となる。mRNAレベルでの解析を行い、神経幹細胞マーカーの発現を確認する。共同研究者に物品を送る際の郵送費として計上予定であったが、タイミングが合わず、次年度使用額が生じた。平成27年度内に郵送費として計上予定である。
ドパミントランスポーター遺伝子ノックアウトマウスを用いたカテコラミン代謝の検討

Vesicular monoaminetransporter2(VMAT2)ノックアウトマウスはhetero一gygoustypeの雄と雌を掛け合わせて継代されている。子の出生はhomogygoteとheterogygoteとwild-typeの比が約1対2対1であった。homogygoteは出生後数日で死亡するため今回の検討ではheterogygoteとwild-typeで行われた。adultになって大きさに変化のない生後10-12週での体重はwiId-typeが平均28.1gに対しheterogygoteは平均28.6gで有意な差は認めなかった。マイクロダイアリーシス法によりheterogygote群とwild-type群で線条体細胞外ドパミン濃度の基礎値を検討したところwild typeに比べheter ogygous typeでは有意に低下していた。salineの腹腔内投与では両群ともドパミンの上昇は認めなかったが、amphetamine0.5mg/kg腹腔内投与では両群ともドパミン上昇を認め、heterogygous typeではwild typeに比べてその増加率が低い傾向にあった。なお中枢神経系の神経伝達物質の中でドパミン放出の調節因子の一つとしてNOの関与を示唆する報告も多いが、VMAT2ノックアウトマウスで得られた脳内透析潅流液中のnitrite+nitrateを測定したところwild-typeと基礎値に有意な差は無く、またamphetamine投与によって両群とも変化は認められなかった。我々は,ラット線条体でのカテコラミン代謝について検討を加えてきた.興奮性アミノ酸のAMPAレセプターを介するドパミン放出の調節については,研究代表者が,Neurochemistry International Vol.30,329-336,1997に発表した.米国NIHのNational Institute on Drug Abuse,Molecular Neurobiology Branchでは曽良らによりドパミントランスポーター遺伝子のノックアウトマウスが作成され,また同所の高橋らによりvesicle monoamine transporter遺伝子のノックアウトマウスも作成された。さらに同所ではその後曽良らはオピオイドレセプターのμレセプターのノックアウトマウスも作成している.研究代表者は,これらの遺伝子のノックアウトマウスを用いて脳内透析により研究をおこなっている.本研究ではドパミン放出におけるドパミントランスポーターの役割を調べることを目的とした.この目的でドパミントランスポーター,vesicle monoamine transporter遺伝子,オピオイドレセプターのμレセプターを欠損したマウスの線条体に脳内透析用プローブを挿入固定し,人工髄液で潅流した.このマウスに腹腔内投与により各種ドパミン作動薬,カテコラミントランスポーターを阻害薬等を負荷し薬理学的,行動薬理学的に検討した.脳でのドパミントランスポーターを含むカテコラミン系,NO,興奮性アミノ酸系の相互関係の基礎的研究については平成9年7月に第24回岡山大学脳研究セミナーで講演をおこない,またヒトでのカテコラミン系の障害についてもProgress in Medicine17,522,1997で報告している.また平成9年11月に日本自律神経学会(横浜)でも発表をした.Vesicular monoaminetransporter2(VMAT2)ノックアウトマウスはhetero一gygoustypeの雄と雌を掛け合わせて継代されている。