hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌の産生するキラーT細胞活性抑制因子

悪性腫瘍患者の細胞性免疫能は一般に低下しておりこの低下は患者血清中に免疫能を低下させる液性因子が存在していることによると考えられる。さらにこれら因子は腫瘍細胞により産生されている可能性が考えられる。代々は、ヒト未鎖血由来リンパ球(PBL)よりインターロイキン-2(IL-2)を用いてlymphohine activateil killer(LAK)細胞を誘導するための無血清培養条件を確立し、同条件下で、当科で樹立した各種口腔癌細胞の無血清培養上清のLAK細胞の増殖並びに活性に及ぼす影響を検討した。その結果以下のことが明らかとなった。1.PBLをRPM11640とDMEM培地を1:1に配合したRD培地を基礎培地としてIL-2(100ng/ml)ヒトトランスフェリン(5μg/ml),βメルカプトエタノール(10μM)2-アミノエタノール(10μM)亜セレン酸ナトリウム(10μM)を加えた無血清培地で、10%ヒト血清添加培地で誘導したLAK細胞より34倍高い細胞障害活性を有するLAK細胞の誘導が可能であった。2.多くの腫瘍細胞より分泌されていることが明らかとなっているインスリンあるいはインスリン様成長因子I(1GF-I)はLAK細胞の増殖は抑制しなかったがんの活性を強く抑制した。4.口腔由来扁平上皮癌細胞(SCC)及び悪性黒色腫細胞(MM)の培養上清はいづれもLAK細胞の増殖と活性を抑制した。しかし、SCCの活性は酸、熱に安定であったが、MMの活性は酸、熱に不安定であり両者の活性は質的に異なると考えられた。5.SCCの培養上清をヘバリンセファロースを用いて分画した結果0.91.2MのNalで溶出される画分にインスリン,TGF-βと異なるLAK活性抑性因子活性が存在した。我々はすでにLymphokine activated Killencell(LAKcell)誘導のための無血清培養系を確立し臨床に応用している。同培地は蛋白成分として鉄の輸送タンパクであるトランスフェリンを5Mg/mlの濃度で含むのみである。同培養系を用いることにより血清中に含まれていると考えられる免疫抑制物質を除外することが可能となった。当科で樹立したS種類の扁平上皮癌、悪性黒色腫細胞,他科より供与された唾液腺由来腺癌細胞の無血清培養上清を採取しまずLAK細胞の増殖におよぼす影響をMTT色素の生細胞への取り込みを指標として検索した。その結果,扁平上皮癌、悪性黒色腫の培養上清中には強いLAK細胞の増殖抑制能を有することがしかし,唾液腺腺癌細胞の培養上清には抑制能がないことが明らかとなった。次に扁平上皮癌,悪性黒色腫の培養上清を熱処理(50°C30分),酸処理(pH2.0)を行いこれら上清中に含まれる抑制因子の物理化学的性質について検索を行った。その結果,扁平上皮癌細胞の培養上清中の因子は熱,酸に安定であったが,悪性黒色腫の上清は酸.熱に不安定であることが明らかとなった。さらにこれら上清を10%含む無血清培地で誘導したLAK細胞の各種癌細胞に対する細胞障害活性^<51>Cr遊離試験を用いて検索した結果,これら因子は増殖を抑制するのみならず,LAK細胞の細胞障害活性をも抑制することが明らかとなった。以上本年度においては,扁平上皮癌細胞と悪性黒色腫細胞の培養上清中にはおたがいに物理化学的性質の異なる,強いLAK細胞の増殖と活性を抑制する因子が存在していることを明らかにした。次年度においてはさらに,これらの因子の精製を行う予定である。

初年度において、インターロイキンー2(ILー2)によりヒト末梢リンパ球からLAK細胞を誘導するための無血清培養条件を確立し、さらに、同系を用いて多くの腫瘍細胞により産生されていることが報告されているインスリンあるいは1GFーIがLAK細胞の細胞障害活性を抑制することを明らかにした。本年度においては、当科で樹立した5種類の扁平上皮癌細胞(SCC)3種類の唾液腺由来腺癌細胞株、悪性黒色腫細胞株の無血清培養上清(CM)中に存在する抑制因子活性をLAK細胞の増殖と細胞障害活性を指標として解析した。その結果以下のことが明らかとなった。(1)SCCとMMのCM中に高い抑制活性を認めた。しかし、SAC中には同活性はほとんど認めなかった。(2)SCCのうちもっとも高い活性を示したA431細胞とMMのCM中の抑制活性の物理化学的性質を検討した結果、SCCの活性は酸、熱に耐性であったが、MMのそれは酸熱に不安定であった。したがって両者は質的に異なる因子であると考えられた。(3)A431細胞のCM中の抑制活性の大部分はヘパリンに吸着性を示した。そこで、ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィーを用いて同活性の分離を試みた。その結果、0.91.2Mの塩溶出画分に高いLAK細胞に増殖と細胞障害活性の抑制活性を認めた。また同画分の活性は前年度に明らかにした、Transforming growthfactor (TGFーβ)やインスリンとは異なる因子であることが明らかとなった。
雲粒子ゾンデCPSによる混合相雲の消散過程の解明

LSCが混合相雲を消散させている過程を、2016年に開発されたCPSゾンデ、衛星搭載ライダCALIOP、パーセルモデルで解明する。混合相雲は極域・高緯度地方の放射や水循環といった気候の理解に欠かせない。しかし、特にその消散過程は未解明で、いまだに数値実験で観測結果を再現できていない。本研究では、予算の多くをCPSゾンデを用いた観測に利用し、LSCによる混合相雲の消散過程の解明を行う。
抗酸菌由来Dアミノ酸によるマクロファージの活性調節についての基礎的検討

平成30年度は、非結核性抗酸菌であるM. intracellulareの細胞内D-アミノ酸の存在量およびL-アミノ酸との存在比を解析した。その結果、用いたM. intracellulare株においては5種類のD-アミノ酸が存在することが明らかとなった。このD-アミノ酸のマクロファージの活性化・分極化に対する影響についてL-アミノ酸とともに比較検討した結果、(1)IL-12やIL-10などの炎症性サイトカインや抗炎症性サイトカインの遺伝子発現およびタンパク質発現への影響や、(2)D-アミノ酸酸化酵素(DAO)の遺伝子発現への影響は認められなかった。他方、(3)存在が明らかとなった5種類のD-アミノ酸のうちの1つのD-アミノ酸は、M. intracellulare感染時のマクロファージによる活性酸化窒素分子種(NOS)の産生を増強すること、他方、M. intracellulare非感染条件下では、NOSの産生に影響を及ぼさないことが明らかとなった。また、抗酸菌は細胞内寄生性細菌であり、抗酸菌の産生するD-アミノ酸の細胞内での作用について検討する必要があるため、マクロファージ細胞内へD-アミノ酸を送達する実験系の確立を目的として、D-アミノ酸のリポソーム製剤化を検討しており、直径0.1μmのリポソームの調製方法を確立した。しかしながら、マクロファージ細胞内への取り込みが不十分であるため、現在、リポソームの組成についてさらなる検討を行っている。抗酸菌が産生するD-アミノ酸の種類および量が明らかとなり、そのうちの1種類のD-アミノ酸のマクロファージに対する作用が明らかとなりつつある。また、細胞内寄生性細菌である抗酸菌が産生するD-アミノ酸は細胞内で作用することが考えられるため、D-アミノ酸の細胞内への送達が必要であり、細胞内への送達効率の改善のためにリポソームの組成等の更なる検討が必要であるものの、リポソームの調製系を確立しつつある。しかしながら、D-アミノ酸の定量分析系の確立に難航しており、D-アミノ酸の定量に関して滞っている。また、当該年度は所属する大学の運営に関するエフォートが非常に大きくなり、当初の計画と異なり、研究に関するエフォートを十分に確保することが困難であった。今後の研究推進の方策としては、これまでの検討で明らかとなったD-アミノ酸によるマクロファージの活性酸化窒素分子種(NOS)の産生増強作用およびマクロファージの活性化と分極化の制御の詳細なメカニズムについて検討する。細胞内のシグナル伝達分子の発現や活性化、またはマクロファージ分極化マーカータンパク質の発現を指標として検討する。特に、抗酸菌は細胞内寄生菌であるため、細胞内でのD-アミノ酸放出モデルの確立が必要である。そこで、高効率にマクロファージ細胞内へD-アミノ酸を送達することを目的として、D-アミノ酸のリポソーム製剤の調製法を確立する。また、このリポソーム製剤化したD-アミノ酸がマクロファージの活性化や極性化にどのような影響を及ぼすのかについて、詳細に検討する。また、抗酸菌の病原性発現におけるD-アミノ酸の影響を明らかにする為、マウスを用いて、抗酸菌感染後の菌の増殖および病理像について解析を行う。平成29年度は、抗酸菌の細胞内のD-アミノ酸の組成を調べる目的で、実験系の確立を試みた。当初は予定していなかったが、HPLC装置に加えて、LC-MS装置を用いた実験系(分析系)の確立にも取り組んだ。また、抗酸菌の細胞内のD-アミノ酸組成について早急に解明すべく、現在、D-アミノ酸の受託分析サービスを利用し、解析を実施している。また、D-アミノ酸単量体ではマクロファージへの影響が認められない可能性が考えられるため、D-アミノ酸含有ポリマーであるグラム陽性細菌由来のペプチドグリカンを用いて、ペプチドグリカンにおけるD-アミノ酸の存在が、マクロファージの活性化(マクロファージの分極化)にどのような影響を及ぼすのか明らかにすることを目的として以下の検討を行った。マウス由来マクロファージ細胞株RAW264.7を供試し、ペプチドグリカンの特徴的なペプチド断片であるL-Ala-γ-D-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala(D型ペプチド)、または対照として合成したL-Ala-L-Gln-L-Lys-L-Ala-L-Ala(L型ペプチド)で刺激した後、Real-time PCR法により、種々の炎症性および抗炎症性サイトカインのmRNA発現の変動を指標にして、上記ペプチドのマクロファージの活性化(分極化)に対する作用について検討を行った。その結果、上記D型ペプチドおよびL型ペプチドともに、炎症性サイトカインであるIL-1βのmRNA発現が低下傾向を示すことが認められた。他方、D型ペプチドとL型ペプチドとの間に有意な差は認められなかった。D-アミノ酸の組成を解析するための実験系の確立を協力して行っていた研究協力者が平成29年度に異動した。当研究協力者の異動先にて、引き続き、実験系の確立を目指して研究協力を得ていたが、異動先のHPLC装置が故障し、かつ、その後の修理が順調に進まず、D-アミノ酸の解析系の確立が遅滞した。

このD-アミノ酸のマクロファージの活性化・分極化に対する影響についてL-アミノ酸とともに比較検討した結果、(1)IL-12やIL-10などの炎症性サイトカインや抗炎症性サイトカインの遺伝子発現およびタンパク質発現への影響や、(2)D-アミノ酸酸化酵素(DAO)の遺伝子発現への影響は認められなかった。他方、(3)存在が明らかとなった5種類のD-アミノ酸のうちの1つのD-アミノ酸は、M. intracellulare感染時のマクロファージによる活性酸化窒素分子種(NOS)の産生を増強すること、他方、M. intracellulare非感染条件下では、NOSの産生に影響を及ぼさないことが明らかとなった。また、抗酸菌は細胞内寄生性細菌であり、抗酸菌の産生するD-アミノ酸の細胞内での作用について検討する必要があるため、マクロファージ細胞内へD-アミノ酸を送達する実験系の確立を目的として、D-アミノ酸のリポソーム製剤化を検討しており、直径0.1μmのリポソームの調製方法を確立した。しかしながら、マクロファージ細胞内への取り込みが不十分であるため、現在、リポソームの組成についてさらなる検討を行っている。抗酸菌が産生するD-アミノ酸の種類および量が明らかとなり、そのうちの1種類のD-アミノ酸のマクロファージに対する作用が明らかとなりつつある。また、細胞内寄生性細菌である抗酸菌が産生するD-アミノ酸は細胞内で作用することが考えられるため、D-アミノ酸の細胞内への送達が必要であり、細胞内への送達効率の改善のためにリポソームの組成等の更なる検討が必要であるものの、リポソームの調製系を確立しつつある。しかしながら、D-アミノ酸の定量分析系の確立に難航しており、D-アミノ酸の定量に関して滞っている。また、当該年度は所属する大学の運営に関するエフォートが非常に大きくなり、当初の計画と異なり、研究に関するエフォートを十分に確保することが困難であった。現在、D-アミノ酸の受託分析サービスを利用しており、抗酸菌のD-アミノ酸組成について今後結果が出る予定である。そのため、今後は抗酸菌由来D-アミノ酸のマクロファージの活性化に対する効果などについて詳細に解析する。また、D-アミノ酸組成の解析系の確立について、研究代表者の所属する大学において、新たな研究協力者を得て、LC-MS装置を立ち上げ、当初予定していたHPLC装置とともに、これらの機器を用いた解析系の確立を目指して、現在研究を実施している。今後は、マクロファージ内の抗酸菌由来D-アミノ酸量など、環境の変化にともなう抗酸菌のD-アミノ酸産生量の変動や、抗酸菌の産生するD-アミノ酸によるマクロファージの活性化・分極化への影響について、菌種毎あるいは菌株毎のD-アミノ酸の産生量・種類の違いとマクロファージの感染防御機構関連因子の発現の相関性について、また、D-アミノ酸のマクロファージの活性化・分極化の細胞内のシグナル伝達などの分子メカニズムについて詳細に検討する。また、マウスを用いたin vivoにおける抗酸菌感染時のD-アミノ酸の産生状況等についても検討する。今後の研究推進の方策としては、これまでの検討で明らかとなったD-アミノ酸によるマクロファージの活性酸化窒素分子種(NOS)の産生増強作用およびマクロファージの活性化と分極化の制御の詳細なメカニズムについて検討する。細胞内のシグナル伝達分子の発現や活性化、またはマクロファージ分極化マーカータンパク質の発現を指標として検討する。
社会科における社会的ジレンマに関する教材の開発研究

本研究から得られた知見や成果については、次のとおりである。1.社会的ジレンマの構造を持つ教材を作成する際の方法に係わる知見社会的ジレンマの構造を持つ教材に、学習者が関心や意欲を持つためには、(1)当該対象が認知的に理解可能であること、(2)情動的に共感が可能であること、(3)行動的に試行可能で参与可能であること等の条件が必要である。また教材が、学習者にとってジレンマとなりうる価値の対立を含むことも必要である。これらの条件を欠いた素材を教材化する場合、上記(1)(3)のいずれかの条件を強化する方法が考えられる。また、ディベートの方法等を用いて問題を抽象化し、対立的な枠組みを設定する手段が有効である。2.社会的ジレンマの構造を持つ教材の開発と授業(1)都市における区画整理の事例をもとに、協調的行動と非協調的行動がそれぞれ結果としてどのような事態につながるかという点を学習内容の中心にした教材例を作成した。(2)廃棄物の処理問題(いわゆるゴミ問題)を題材にした指導計画と授業の実施・分析を行った。ここでは、ゴミ処理の有料化という一つの対策手法の評価をめぐって、ディベートの方法を取り入れ、問題の多角的検討を進める工夫を講じた。授業における生徒の発言分析から、社会的ジレンマに係わる契機(利得構造の変更、個人的要因の制御など)が発言のどのような部分にあらわれているかを検討した。(3)社会的ジレンマの視点は、個人-社会に係わる社会的事象や問題の構造を明らかにするための視点として有効であり、そこから単元の目標及び授業における生徒の発言や思考分析の枠組みとしても生かしうることが明らかになった。1.本研究の目的は、以下のとおりである。(1)社会的ジレンマに関する理論についてその概略を把握し、教材設計において有効となる視点と方法を明らかにする。(2)中学校・高等学校社会科教科書における社会問題の取り上げ方や、その扱いに関する問題点を明確にする。(3)社会的ジレンマの構造を持つ社会的事象について、それらの構造や関係を分析することにより、教材選択や教材設計の方法論を明確にし、教材作成の理論化を図る。2.これらの目標を達成するために、本年度行った研究とその結果を以下のとおりである。(1)研究分担者の他に、中学校・高等学校の社会科教論2名を研究協力者として委嘱し、主に研究会議を重ねることにより研究を進めた。(2)社会的ジレンマ研究に関する文献をもとに、理論の概要及びその枠組みについて分析検討を行った。その結果、社会科で扱われているいわゆる社会問題に関する内容を整理する枠組みの一つとして、社会的ジレンマ論が有効であることが明らかになった。(3)教科書における社会問題の記述分析の結果、個々の「問題」の性格や「問題」をとらえる枠組みについては、ほとんど記述されていないことが明らかとなった。(4)また社会的ジレンマ理論には、ゲームの理論や集合的意志決定に関する要素、個人-社会問題、これらに伴う倫理問題等が入り組んで含まれており、これらを教材開発にどのように反映させるかが今の課題として残された。本年度の研究から得られた知見や成果については、次のとおりである。1.社会的ジレンマの構造を持つ教材を作成する際の方法に係わる知見社会的ジレンマの構造を持つ教材に、学習者が関心や意欲を持つためには、(1)当該対象が認知的に理解可能であること、(2)情動的に共感可能であること、(3)行動的に試行可能で参与可能であること等の条件が必要である。

これらの条件を欠いた素材を教材化する場合、上記(1)(3)のいずれかの条件を強化する方法が考えられる。また、ディベートの方法等を用いて問題を抽象化し、対立的な枠組みを設定する手段が有効である。2.社会的ジレンマの構造を持つ教材の開発と授業(1)都市における区画整理の事例をもとに、協調的行動と非協調的行動がそれぞれ結果としてどのような事態につながるかという点を学習内容の中心にした教材例を作成した。(2)廃棄物の処理問題(いわゆるゴミ問題)を題材にした指導計画と授業の実施・分析を行った。ここでは、ゴミ処理の有料化という一つの対策手法の評価をめぐって、ディベートの方法を取り入れ、問題の多角的検討を進める工夫を講じた。授業における生徒の発言分析から、社会的ジレンマに係わる契機(利得構造の変更、個人的要因の制御など)が発言のどのような部分にあらわれているかを検討した。(3)社会的ジレンマの視点は、個人-社会に係わる社会的事象や問題の構造を明らかにするための視点として有効であり、そこから単元の目標及び授業における生徒の発言や思考分析の枠組みとしても生かしうることが明らかになった。
ルネサンス期イングランドの市民パジャントリ研究

ジェイムズ一世時代の政治的スペクタクルの布置を検討し、以下のような知見を得ることができた。(1)この時代になると、ロンドンの同職組合によって屋外で上演される市民のパジャントリが、王権の称揚を目的とすることはなくなる。(2)国王の称揚を目的とする政治的スペクタクルは、王室財政によって上演経費がまかなわれる屋内の宮廷仮面劇に一本化することになる。(3)多額の上演経費をかけて行なわれる宮廷仮面劇の上演は王室財政を圧迫し、特別上納金徴発の問題などをめぐる王室対ロンドン市当局の対立の大きな要因となる。(4)その結果、ロンドン市は市民パジャントリで富を誇示し、市民パジャントリは王室とロンドン市の対立を表現するジャンルとなる。(5)こうして、宮廷仮面劇と市民パジャントリは上演主体・上演形式・上演目的のどのレヴェルで見ても、対立的な政治的スペクタクルの形式となる。このような事態は、貴族、自治体が一体となって女王の行幸を歓迎して上演したエリザベス一世時代の巡幸のスペクタクルとは大きな隔りを示しているとともに、市民パジャントリが載冠を祝うこともなく、密室化した宮廷仮面劇が上演されつづけたチャールズ1世時代のスペクタクルのあり方を予示するものとなっている。
哺乳動物個体に導入された外来遺伝子の安定性の検討

トランスジェニックマウスとラムダファージ試験管内パッケージ法を用いて、哺乳動物生殖細胞/個体レベルで外来遺伝子の安定性を検討しうる系の開発を目指し、以下の実験を行なった。大腸菌supF遺伝子はamber変異をサプレスするが、この遺伝子をプラスミドpBR322に組込みさらにこれをラムダファージEMBL3に導入し多くの組換え体を得、これらの制限酵素地図を作成するとともに、試験管内パッケージの効率の高いものを選択した。組換えファージのsupF遺伝子に生じた突然変異は、適当な大腸菌指示菌(lacZam)を用いてプラークの色の変化として、容易に検出できるとともに、変異部分の塩基配列も簡単に決定できる。実際、このファージを、紫外線照射した大腸菌内で増殖させると、線量に依存して突然変異頻度が増加し、突然変異株の塩基配列を決定できた。上記組換えファージDNAをマウス受精卵に導入し、ラムダに含まれるsupFをトランスジーンとして保有するマウス系統が樹立されれば、その精子DNAをパッケージすることにより、マウス生殖細胞で生じたsupFの変化を大腸菌を用いて検出/定量できるはづであり、目下トランスジェニックマウスの作出を目指して動物を処理している。
小脳プルキンエ細胞樹状突起におけるスフィンゴ脂質を介した情報伝達機構

申請者は中枢神経細胞におけるスフィンゴ脂質代謝の機能的役割を明らかにすることを目的に一連の研究を行ってきた。これまでに初代培養系と2種類のセラミド合成阻害剤を用いて脳の運動学習の中心的役割を担う小脳プルキンエ細胞の成長にスフィンゴ脂質合成が必須であり、この細胞の情報伝達系においてスフィンゴ脂質が重要な役割を担っている可能性を明らかにしてきた。本年度はプルキンエ細胞におけるスフィンゴ脂質の機能に関する基本的で重要な知見を得ることができた。まずスフィンゴ脂質合成の阻害によって起こったプルキンエ細胞の共存減少と形態形成異常はスフィンゴ脂質の疎水性部分であるセラミドを培養系に加えることにより完全に回復した。さらに無処理の培養小脳神経細胞をセラミドで処理すると、阻害剤処理した場合とは全く逆にプルキンエ細胞の生存数が増加した。血球系細胞ではセラミドがTNF-α刺激による細胞死、アポトーシスを介在する死のシグナル分子として機能することが知られている。しかしこれら申請者が本研究で得た知見はプルキンエ細胞においてはセラミドは“死のメッセンジャー"ではなく生存と樹状突起形成に必須の“生のリピッドメッセンジャー"分子であることを示している。さらにセラミドが関与する情報伝達系を調べたところ、神経栄養因子とセラミドが共存することによりそれぞれ単独で加える場合よりもその生存が促進されることを見い出した。以上の結果はセラミドが神経栄養因子によるシグナル伝達系の下流に位置し、情報分子として機能している可能性を強く示唆している。現在その詳細な分子機構を生化学、分子細胞生物学的手法を用いて解析している。
環境ホルモン類と生体レセプターモデルとの相互作用とその電子状態解明に関する研究

生体レセプターモデルしてのシクロデキストリン(CD)と環境ホルモン関連物質との相互作用を実験的理論的に検討した結果、以下の知見が得られた。(1)ベンジリデン型誘導体及びポルフィリン誘導体とα-CD、β-CD、及びγ-CDとの相互作用を検討したところ、ベンジリデン誘導体の場合、側鎖の疎水性が増加するにつれてその結合定数は増加した。また、ポルフィリン誘導体の場合、最も高い結合定数が得られたのは、β-CDで、次にγ-CD、α-CDの順であった。このように3種のCD間で結合定数に差が生じたのは、β-CDが3種の内で最も適切な内孔を持ち、そこへ基質がちょうどフィットしたためと考えられる。これらの結果を、分子モデル計算によりさらに詳細に検討した。(2)ポリ塩化ジベンゾ-P-ダイオキシン(PCDD類)の詳細な電子状態を非経験的分子軌道計算のAbinitio、DFT(密度汎関数)法及び半経験的AM1、PM3法による計算により求めた。75種類のPCDD類の絶対ハードネス(η)及び絶対電気陰性度(χ)を算出したところ負の相関が得られた。毒性等価係数(TEF)のわかっている代表的なPCDD類については、全体的に毒性の強さとη-χ活性ダイアグラムの結果は非常に高い相関が認められ、PCDD類の毒性をこれらの値を用いることにより推定することが十分可能であることがわかった。(3)エストロゲン作用を有するホルモン類とCD誘導体との相互作用を検討したところ、各ホルモン基質は2,6-ジメチルCDにおいて、最も大きな結合定数が得られた。この高い結合定数は、ジメチルCDが最も適切な疎水性環境を提供し、そこへ基質がうまくフィットしたためと考えられる。また熱力学パラメーターの結果より、包接に伴う結合力は主として分子間の疎水性相互作用及び水素結合によるものであることが示唆された。1)シクロデキストリンによるベンジリデン型誘導体及びポルフィリン誘導体の包接作用...まず最初にシクロデキストリン(CD)の包接機能の解明のために、ベンジリデン型誘導体及びポルフィリン誘導体とα-CD、β-CD、及びγ-CDとの相互作用を検討した。ベンジリデン誘導体との結合定数を求めたところすべての系においてベンジリデンの側鎖の疎水性が増加するにつれてその結合定数は増加した。2)シクロデキストリン誘導体とビスフェノールAとの相互作用...環境ホルモンの1種であるビスフェノールAとCD誘導体との相互作用を検討した。25°Cでの結合定数を求めたところ、上記同様に、β-CDにおいて最も高い値が得られた。さらに、今後各温度変化の条件下での結合定数を求め、熱力学関数を算出し、種々の条件下でのCDの包接機能の基礎的データーを得ると共に、生体レセプターモデルとしてのシクロデキストリンの役割を考察する予定である。3)シクロデキストリン誘導体による包接作用の分子モデル計算...上記の実験結果をさらに詳細に検討するため,ビスフェノールAとレセプターモデルとしてのCDとの相互作用の理論計算によるアプローチを一部試みた。

具体的には、適合可能な安定コンホメーションを選出すると共に、各複合体を作成し、分子力学計算プログラムで極小化を試み、複合体形成における安定構造を探求した。今後これらの得られた安定エネルギーの結果から,ビスフェノールAがどのようにCDに結合されるかを推定し、実験から得られた結合定数との相関関係を明らかにする予定である。1)シクロデキストリン(CD)誘導体とビスフェノールAとの相互作用・・・環境ホルモンの1種であるビスフェノールAとCD誘導体との相互作用について、各温度変化の条件下での結合定数を求め、熱力学関数を算出した。その結果、この包接に伴う結合力は主として分子間の疎水性相互作用及び水素結合によるものであることが示唆された。さらに上記のビスフェノールAとレセプターモデルとしてのCD誘導体のコンプレックス形成時のエネルギーを理論計算により求め、これらの得られた安定化エネルギーの結果から,ビスフェノールAのCDへの包接作用の機構を推定し、実験結果と比較検討した。2)ダイオキシン類の電子構造の解明及びシクロデキストリンホストとの相互作用・・・ダイオキシン類の内、ポリ塩化ジベンゾ-P-ダイオキシン(PCDD類)の詳細な電子状態を非経験的分子軌道計算のAbinitio、DFT(密度汎関数)法及び半経験的AM1、PM3法による計算により求めた。75種類のPCDD類の絶対ハードネス(η)及び絶対電気陰性度(χ)を算出したところ負の相関が得られたこれらの結果から、PCDD類の毒性はη値とχ値に依存することが認められた。毒性等価係数(TEF)のわかっている代表的なPCDD類については、一般的にTEF値が減少するにつれて、χ値は増加し、η値は減少する傾向を示した。また全体的に毒性の強さとη-χ活性ダイアグラムの結果は非常に高い相関が認められ、PCDD類の毒性をこれらの値を用いることにより推定することが十分可能であることがわかった。今後さらに、CD存在下でのダイオキシンの相互作用を計算で求め、CDの包接により,いかにダイオキシン分子がソフト化されるかを予測するとともに,CDによる毒性や生物学的活性能の緩和及びシールド効果を推定する予定である。1)ホルモン及びその関連物質とシクロデキストリンホストとの相互作用・・・エストロゲン作用を有するエストラジオール、エストリオール、及び環境ホルモンの1種であるビスフェノールAとレセプターモデルとしてのCD誘導体との相互作用について、各温度変化の条件下での結合定数を求め、熱力学関数を算出した。その結果、各ホルモン基質は2,6位の水酸基をメチル化したジメチルCD誘導体において、最も大きな結合定数が得られた。この高い結合定数は、ジメチルCDが最も適切な疎水性環境を提供し、そこへ基質がうまくフィットしたためと考えられる。また熱力学パラメーターの結果より、包接に伴う結合力は主として分子間の疎水性相互作用及び水素結合によるものであることが示唆された。さらに結合は発熱反応であり、結合のエンタルピーとエントロピーは補償関係にあることがわかった。2)シクロデキストリンホストによる包接作用の分子モデル計算・・・上記のエストロゲン作用物質とCD誘導体のコンプレックス形成時のエネルギー変化を理論計算により求めた。エストロゲンのCDによる複合体形成を分子力場計算(MM)により算出したところ、すべてにおいて、ほぼCDは2級酸素側を上にして基質のフェノール基側のベンゼン環が内孔に包接されていることがわかった。
サービス産業におけるCRM戦略の実証的研究

本研究は、サービス産業における組織能力としてのCRMと市場戦略としてのCRMに焦点を当て、CRMの組織能力、戦略、および成果の関係を実証的に明らかにすることを目的とした。まず既存文献の詳細な分析から、CRMには市場マネジメントと組織マネジメントの2つの局面があることの理論的、実践的な重要性を指摘した。その成果は、「組織能力としてのCRM」として『マーケティング・ジャーナル』(第27巻第3号、2008年1月)に公刊されている。次に上記の研究で考察された点を実証的に検討するために、CRMの先端的事例であるカルチュア・コンビニエンス・クラブ、コープさっぽろ、スルガ銀行を対象として、組織能力としてのCRMの構造を考察した。その分析から、以下の点が解明された。(1)カルチュア・コンビニエンス・クラブは、膨大な顧客データベースに基づいてマス・カスタマイズされた顧客戦略を実践し、それが高い収益につながっている。(2)コープさっぽろはPOSデータを仕入先である卸売業者やメーカーに開示することにより、顧客ニーズに適合したマーチャンダイジング政策を実施し、高い収益性をもたらしている。(3)スルガ銀行は、さまざまな顧客接点から生じる顧客・取引情報を一元的に管理し、顧客ニーズに沿った金融商品を開発することによって、高い顧客満足を引き出し、長期継続的な顧客関係を構築している。今後の研究課題は、これらの研究成果を踏まえ、CRMによる顧客との長期的な取引関係維持の様式をリレーションシップ・マーケティングの枠組みの中で解明することにある。(1)文献・資料の収集と分析CRMに関する国内外の学術書・学術論文、新聞・雑誌資料を広く収集し、理論的な論点の整理および実態の把握を行った。また必要に応じて、関連文献・資料を有する関係機関(大学、研究所、小売企業、学校、病院等)に赴き、資料の収集にあたった。(2)インタビュー調査の実施サービス産業におけるCRMの実態を把握し、詳細に検討するため、営利サービス業としての小売業(5社程度)と公共サービス業としての病院(5機関程度)を対象に、CRM活動で評価の高い企業(組織)にインタビュー調査を行った。(3)インタビュー調査結果の検討インタビューのフィールド・ノート、および文書化されたインタビュー・データを詳細に分析・検討し、CRMの実践を把握した。この際、先の文献・資料分析から得られた知見から、CRMにかかわる変数間の関係を論理的に捉えることに努めた。インタビュー調査のデータを解釈するに際しては、コンテンツ分析やグラウンデッド・セオリー・アプローチ等を活用することで、より妥当性の高い分析モデルの構築を図った。(4)分析モデルの構築と仮説の設定CRMの組織能力、戦略と成果に関する分析モデルを構築した。この分析モデルを基礎として、19年度にアンケート調査による実証分析を行うための作業仮説を設定した。基本的な分析モデルの視点は、「CRM戦略とCRMの成果の関係を明らかにし、そこでの組織能力の関連様式を解明すること」であった。分析モデルの構築と仮説の設定に当たっては、研究代表者が主としてマーケティングの側面から、研究分担者が組織論の側面からそれぞれの知見を持ち寄り、統合的な分析モデルを構築した。これらの点を明らかにするために、本研究ではまず、文献レビューを通じてプロセスとしてのCRMと戦略としてのCRMに類型化し、CRMには市場マネジメントと組織マネジメントの2つの局面があることの理論的、実践的な重要性を指摘した。次に上記で考察された点を実証的に検討するために、CRMの先端的事例であるカルチュア・コンビニエンスクラブ、コープさっぽろ、スルガ銀行を対象としてCRMの構造と成果を考察した。その分析から以下の点が解明された。

(2)コープさっぽろはPOSデータを仕入先である卸売業者やメーカーに開示することにより、顧客ニーズに適合したマーチャンダイジング政策を実施し、高い収益性をもたらしている。(3)スルガ銀行は、さまざまな顧客接点から生じる顧客・取引情報を一元的に管理し、顧客ニーズに応じた金融商品を開発することによって、高い顧客満足を引き出し、長期継続的な顧客関係を構築している。今後の研究課題は、これらの研究成果を踏まえ、CRMによる顧客との長期的な関係維持の様式をリレーションシップ・マーケティングの枠組みの中で解明することにある。
中心小体複製ライセンス化制御の分子機構の解明

細胞小器官である中心小体は微小管形成中心と機能し、染色体分配、細胞分裂に重要な役割を果たしている。本研究では、細胞内の中心小体の数を制御する新規因子RBM14を同定した。RBM14は中心小体の過剰な形成を抑制することで、中心小体の数を適切に制御していることを見出した。RBM14は癌抑制遺伝子として報告されていることから、中心小体形成制御を通じてゲノム安定性維持に寄与していることが考えられる。中心小体は真核生物において進化上保存された細胞小器官であり、中心体の中核として機能する。中心小体の自己複製は二極化した分裂期紡錘体の形成に重要であり、娘細胞への均等な染色体分配、ゲノム安定性維持に深く関与している。一方、中心小体複製のライセンス化、すなわち細胞周期ごとに一度だけ中心小体の複製が起こる事を保証し、過剰な複製を抑制する制御機構の実体は明らかにされていない。本研究では、中心小体プロテオーム、ヒト培養細胞における機能ゲノミクス解析を組み合わせ、中心小体複製のライセンス化を制御する新規因子RBM14(RNA-Binding Motif protein 14)の同定に成功した。この分子の発現抑制により、中心小体の過剰複製が誘発されることを見出したが、驚くべき事にこれら中心小体様構造体は細胞質中にてd enovo合成されることを明らかにした。これまでは新たに形成される中心小体は必ず既存の中心小体の近傍で生じると考えられていたが、本研究ではde novo合成経路を介して新たな中心小体様構造体が異所的に細胞質中において形成されることを初めて明らかにした。また、これらの過剰な中心小体様構造体がヒト培養細胞分裂期において染色体分配のエラーを引き起こすことが示唆された。実際、RBM14は腎臓がんの原因遺伝子の一つとして報告されていることから、本研究で観察されたような中心小体様構造体が染色体不安定化を誘導し、細胞がん化の引き金になる可能性が考えられる。本研究の結果により、中心小体de novo合成経路の抑制機構を含む、中心小体複製ライセンス化制御に関する分子基盤の基礎的な情報が得られた。中心小体複製のライセンス化、すなわち細胞周期ごとに一度だけ中心小体の複製が起こる事を保証し、過剰な複製を抑制する制御機構の実体は明らかにされていない。中心小体の基底部にあたり、最初に構築され始めるカートホイール構造の形成に関与する因子のスクリーニングを行い、その過程に必須であるSTILの結合因子として同定したRBM14が中心小体構成因子群のアッセンブリーを負に制御している可能性を見出している。これまでは、新規の中心小体は母中心小体近傍で形成されることが定説であったが、我々は内在のRBM14をRNAiにより発現抑制するとSTIL-CPAP複合体形成を介して細胞質中において中心小体の前駆体が形成され、その中の一部がSAS-6などのカートホイール構成因子を後に取り込むことで中心小体様の構造体として成熟/機能することを明らかにした(de novo中心小体形成)。さらには、RBM14の機能としてS phase arrestなどにより過剰複製される中心小体形成を抑制すること、canonicalな中心小体形成にはほとんど関与しないことなどを新たに見出し、RBM14がde novoや過剰な中心小体形成を特異的に抑制するシステムに寄与することを明らかにした。通常、中心小体の構成因子はそのほとんどが細胞質中に存在しており、複製期において中心体に局在することが知られていたが、これまで本研究で得られた知見はRBM14が細胞質中において中心小体構成因子群が異所的に複合体/構造体を形成しないように抑制し、新規の中心小体形成が母中心小体近傍でのみ起こるように制御している可能性を示唆している。前年度までに明らかにした、RBM14がde novo中心小体形成を抑制する分子機構に関して詳細を明確にした。すなわち、RBM14がSTIL-CPAP複合体形成を、STILに対する結合を介して競合的に抑制することを精製タンパク質を用いたin vitro再構成実験により直接的に示した。また、通常の中心小体複製に関与するSTIL-CPAP複合体形成には、RBM14は関与せずに、細胞質において余剰に形成されたSTIL-CPAP複合体にのみ作用することでde novo中心小体形成のみを抑制する事を示した。この結果は、de novo中心小体形成とcanonicalな中心小体形成の分子機構の異なる点の一端を提示する重要な知見である。また、de novo形成された中心小体様構造の微小管重合能を細胞内で検討する系を確立し、それらの構造の半数程度が微弱ながらも微小管重合能を有することを見出した。この系においてde novo形成された中心小体様構造のうち、紡錘体極を単独で形成する割合は比較的低いこともわかった。しかし、このような多極化した紡錘体を有する細胞が分裂後に生じる娘細胞の生存率は低い。現在、我々は、紡錘体極を単独では形成できないが、微弱な微小管重合能を有するde novo中心小体様構造はlong-termでみた場合に、細胞分裂を成立させつつも染色体分配のマイナーエラーを蓄積させ、細胞がん化を誘導するのではないかと推測している。この可能性に関して、有用なアッセイ系を確立し検討することも試みている。今年度に関しては以下の二点を達成した。1.中心小体過剰複製を抑制するRBM14の機能解析:ヒト

培養細胞においてRBM14発現抑制を行った際に生じる中心小体様構造に関して、電子顕微鏡観察により詳細に解析を行った。大半はamorphousな高電子密度の構造体であり、時折3連微小管は観察されるものの、不定形であった。しかし、紡錘体形成が可能な構造体においては中心小体に特徴的な9回対称性が観察されるもの、3連微小管を伴うシリンダー型のものも見受けられた。これらの構造体に関してはカートホイール構造構成因子であるHsSAS-6を取り込んでいる割合が多いことから、de novoで形成された中心小体様構造体はカートホイール構造を有するものが微小管形成能が高いことが推測された。カートホイール構造を有する中心小体様構造を有する細胞においては、分裂期に多極化した紡錘体形成、もしくはpseudo-bipolar紡錘体形成が頻繁に観察され、染色体分配異常も合わせて観察された。以上の結果は、RBM14が通常は異所的な中心小体様構造の形成を抑制し、ゲノム安定性維持に寄与していることを示唆している。2. RBM14複合体に結合するRNAの同定: RBM14はRNA結合タンパク質であるが、そのターゲットに関しては未知である。RBM14-STIL複合体また、STILと結合することが知られているHsSAS-6を含む複合体をヒト培養細胞から免疫沈降し、得られた画分中に存在するRNA(主にnon-coding RNA)を次世代シークエンサーを使用し網羅的に同定した。現在、得られた候補RNAに関して、中心体構造、機能に対する影響をRNAi screeningにより精査している。既にいくつかの表現型を見いだすことに成功しており、今後精力的に解析を進める予定である。細胞小器官である中心小体は微小管形成中心と機能し、染色体分配、細胞分裂に重要な役割を果たしている。本研究では、細胞内の中心小体の数を制御する新規因子RBM14を同定した。RBM14は中心小体の過剰な形成を抑制することで、中心小体の数を適切に制御していることを見出した。RBM14は癌抑制遺伝子として報告されていることから、中心小体形成制御を通じてゲノム安定性維持に寄与していることが考えられる。中心小体複製ライセンス化を制御する因子として同定したRBM14の機能解析、特にde novo中心小体形成を抑制する分子機構に関する充分なデータ量を示すことを達成し、一連の研究結果をEMBO誌に掲載することができた。また、段階的な中心小体形成をモニターする手法として、光学顕微鏡技術と電顕観察を併用したCLEMのセットアップを行う事ができ、今後の構造生物学的解析の基盤を確立することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学1.中心小体過剰複製を抑制するRBM14の機能解析-RBM14発現抑制により過剰複製された中心小体の構造学的解析: RBM14発現抑制により過剰に複製された中心小体が内在のものと構造的にどの程度類似しているかに関して、中心小体の段階的な構築過程が判別可能な各種分子マーカーを用いた免疫染色により明らかにする。電子顕微鏡による構造学的解析も行う。さらには、tubulin抗体、核染色剤を用いて、分裂期紡錘体形成及び染色体分配への影響に関しても観察する。
金属酸窒化物光触媒の精密構造物性：　構造からバンドギャップは予想できるか？

本課題では,金属酸窒化物の結晶構造,電子密度分布,電子構造および光学的性質を調べた。アンモニア流中で金属酸化物を加熱することによりペロブスカイト型酸窒化物を合成した。金属酸窒化物の放射光X線回折データを、リートベルトおよび最大エントロピー法により解析した。紫外可視反射スペクトルにより見積もったバンドギャップと電子密度分布、電子構造、結晶構造の関係を考察した。金属酸窒化物半導体微粒子の光触媒作用を利用した水の分解が、クリーンな水素製造法として近年注目されている。光触媒の開発にとって重要な結晶構造とバンドギャップの相関はわかっておらず、多くの実験と経験により光触媒が開発されてきた。構造が似ているが、バンドギャップを大きく変化させることができる(チューニングが可能な)ペロブスカイト型金属酸窒化物ATaO2N (A = Ba, Sr, Ca)およびBaNbO2NおよびSrNbO2NおよびCaxSr1-xWO2Nを選択した。これらの金属酸窒化物を合成し、放射光X線・中性子回折測定、反射率測定、理論計算を行った。その結果、これらの物質における結晶構造とバンド構造が明らかになった。
早期自然流産が女性の死生観と生活の再構築に与える影響についての社会学的研究

本研究は妊娠週数12週未満の早期の自然流産について、現代日本の女性たちがそれをどのように経験したか、意識や行動のレベルにおいて明らかにするものである。早期の自然流産は生物学的に避けがたい事態ではあるが、少子化に伴ってその経験は重く受け止められるようになっていると思われる。本研究は、早期流産がどう語られてきたか文献によって分析すると同時に、当事者に対する聞き取り調査やインターネット上のコメントの計量テキスト分析など多様な方法を駆使し、その体験が女性たちの死生観や人生設計において及ぼした影響について考える。そして、これを経験する女性たちにどのような情報提供やサポートが必要であるかを考察していく。
難治性神経障害に対する新規治療ターゲットに関する研究

本研究にて、Icmtの機能の抑制が神経細胞にどのような影響を与えるかを調査を行った。ラットの小脳顆粒細胞の初代培養系の確立を行い、また、Icmtの下流に存在すると予想されるmTORの働きを明確化するために、LY294002、Aktinhibitor、rapamycinなどの前後のシグナルのインヒビターを初代培養中に加え、ウエスタンブロッティング法によって同定したところ、Akt、mTOR、p70S6Kなどのプロテインキナーゼの活性が上昇していることが判明した。また、これらのシグナルの影響が軸索進展や神経細胞死の抑制につながる可能性を示すデータが得られた。以上の結果から、Icmtの機能が、神経軸索伸展や細胞死の抑制に影響を与える可能性があることが判明し、Icmtの機能解明が難治性神経障害の病態解明と治療につながる可能性が示唆された。本研究の目的は蛋白のメチル化酵素の一つであるIsoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (Icmt)の神経系への作用に注目し、その機能解明と難治性神経障害の治療薬への応用を検討することにある。すでに、脊髄小脳変性症にてIcmtが低下することが報告されているが、Icmtが神経細胞にどのような影響を及ぼすのかは未だ判明していない。よって、本年度は、Icmtの機能の抑制が神経細胞にどのような影響を与えるかを調査することとした。まず、Icmtの抑制を行うためのsiRNAの配列を文献的に検索を行った。同時に、ラットの小脳顆粒細胞を採取し、その初代培養を行った。過去の報告から、Icmtの下流に存在すると予想されるmTORの働きに注目し、LY294002、Akt inhibitor、rapamycinなどの前後のシグナルのインヒビターを初代培養中に加え、72時間培養後の神経軸索突起伸展を計測した。この結果、前後のシグナルを抑制することで神経軸索伸展が有意に抑制される結果となった。またこの際のシグナルの活性化をウエスタンブロッティング法によって同定したところ、Akt,mTOR、p70S6Kなどのプロテインキナーゼの活性が上昇していることが判明した。以上の結果から、Icmtの機能が、神経軸索伸展に影響を与える可能性があることが判明し、Icmtの機能解明が難治性神経障害の病態解明と治療につながる可能性が示唆された。脊髄損傷や、高位末梢神経損傷などによって引き起こされる難治性神経障害は、患者のADL、QOLを著しく損なう障害であり、これらの疾患、外傷によって多彩な神経障害を抱える患者は全国で10万人以上と言われる。しかし、未だに効果的な治療薬は存在しておらず、この理由として、近年目覚ましく発展を遂げている神経基礎科学によっても、未だ神経再生の鍵となるシグナルが明らかになっていないことが挙げられる。本研究の目的は、この問題解決の糸口の一つとして、蛋白のメチル化酵素の一つであるIsoprenylcysteine carboxylmethyl transferase (Icmt)の神経系への作用に注目し、その機能解明と難治性神経障害の治療薬への応用を検討することにある。本年度は、昨年度に引き続き、Icmtの機能の抑制が神経細胞にどのような影響を与えるかを調査を行った。ラットの小脳穎粒細胞の初代培養系の確立を行い、また、Icmtの下流に存在すると予想されるmTORの働きを明確化するために、LY294002、Aktinhibitor、rapamycinなどの前後のシグナルのインヒビターを初代培養中に加え、ウエスタンブロッティング法によって同定したところ、Akt、mTOR、p70S6Kなどのプロテインキナーゼの活性が上昇していることが判明した。
顎関節症の治療に用いる咬合面ラミネートベニアの設計・製作に関する研究

本研究では、顎関節症の治療に用いる咬合面ラミネートベニアを設計・製作するため、歯列形態の定量的および視覚的特徴を3次元的に解析する方法の確立、咬合面ラミネートベニアのデザインの指標となる正常咬合者の歯列形態の3次元解析について検討を行い、以下の結果を得た。I.歯列模型解析システムの開発1)非接触型3次元形状計測装置を用い得られた歯列模型データの中から、解析に必要な歯列や歯の大きさおよび咬頭頂や近遠心隅角部の3次元座標を容易に抽出することができた。2)コンピュータ上で上下顎歯列模型データの位置合わせを行うことにより、上下顎一体として歯列形態を3次元的に解析し、さらに咬合状態を3次元的に表示することができた。II.正常者の歯列形態の3次元解析1)正常咬合者の歯列弓、前後的および側方的咬合彎曲の形態的特徴を多項式の係数で表現することができ、咬合再構成のための定量的な指標として有用であることが示された。2)正常咬合者の歯列形態を3次元表示することができ、咬合再構成のための視覚的な指標として有用であることが示された。我々は顎関節症に用いる咬合面ラミネートベニアの設計・製作に関する研究を行い、以下の成果を得た。(1)顎関節症患者に対して付与すべき理想的な歯列弓形態を決定するために、視覚的に調和のとれた歯列模型を非接触型3次元形状計測装置を用い計測を行った。そして歯列弓、前後的咬合湾曲、側方的咬合湾曲を多項式で表し、比較検討を行った結果、歯列弓に関しては4次関数で、前後的および側方的咬合湾曲は2次関数で表すことができ、得られた関数の係数を平均することにより理想的と考えられる歯列弓形態を求めることができた。また歯列弓および咬合湾曲を1つの曲線で表すことを試み、その結果3次元的に歯列弓形態をコンピュータ上に表示し、任意の角度から歯列弓形態を認識することが可能となった。(2)コンピュータにより咬合面ラミネートベニアのデザインを決定するために、計測により得られた歯列模型の3次元データを市販のCADソフトで扱えるようにデータ変換を行うプログラムを自作した。そして、変換した3次元データをCADソフトに読み込み歯列の3次元表示を行った。その結果、視覚的に調和のとれた歯列と顎関節症患者の歯列とをコンピュータ上で比較することが可能となり、咬合面ラミネートベニアを付与するために削らなくてはならない歯の部分などを認識することが可能となった。2)コンピュータ上で上下顎歯列模型データの位置合わせを行うことにより、上下顎一体として歯列形態を3次元的に解析し、さらに、咬合状態を3次元的に表示することができた。
マルチカラー酸素プローブ分子群を駆使した3次元細胞内の酸素濃度イメージング

本研究の目的は,イリジウム錯体を基軸としたマルチカラー発光酸素プローブ分子を設計・合成し,3次元培養された積層細胞内や細胞塊(スフェロイド)内の酸素濃度および濃度分布を,共焦点顕微鏡を用いて高感度,非侵襲的にリアルタイム計測・イメージングすることである。平成30年度は,芳香族配位子にジエチルアミノクマリン類,補助配位子にエチレンジアミン類を用いたカチオン性イリジウム錯体の合成を行い,スペクトル特性,光物理特性,電気化学特性に関する測定を行った。また,細胞移行性の実験からエチレンジアミンの窒素原子に結合した水素をアルキル鎖に置換した化合物において高い細胞親和性およびスフェロイド透過性が向上することを見出した。開発したイリジウム錯体はりん光寿命が長いため,市販のマイクロプレートリーダーの時間分解計測機能を用いることで,りん光寿命計測ができることがわかった。生細胞にイリジウム錯体を取り込ませ,細胞の呼吸活性を変化させる試薬を添加したところ,呼吸を活性化する試薬では,細胞内の酸素濃度が時間に依存して減少すること,一方,呼吸を阻害する試薬では,酸素濃度が増加することを定量的に示した。平成29年度に開発した共焦点蛍光・りん光寿命顕微鏡を用いることで,スフェロイド内部が低酸素状態になることを定量的に示した。また,平面培養細胞と同様に細胞の呼吸活性を変化させる試薬を添加したところ,スフェロイドにおいても細胞内の酸素濃度が時間に依存して変化することを定量的に明らかにした。平成30年度は,可視光から近赤外光領域にりん光を示し,また,りん光寿命が長いカチオン性イリジウム錯体の合成,および溶液中における物性評価を行った。開発したイリジウム錯体を用いて細胞内移行性や細胞内におけるりん光特性に関する実験を行った。その結果,高い細胞親和性を示すイリジウム錯体の構造やスフェロイド内における酸素濃度勾配について明らかにした。さらに,市販のプレートリーダーを用いることで,生細胞内の酸素化状態が検出できる方法論を確立した。以上の結果は,平成30年度に達成すべき目標であることからおおむね順調に研究が遂行できたと考えている。現在,成果を投稿論文にまとめている。平成30年度は可視光から近赤外光領域にりん光を示すイリジウム錯体の開発を行った。平成31年度は,寿命計測法を用いることなく,細胞内の酸素レベルを明らかにするプローブ分子を開発する。具体的には,蛍光団とりん光団をオリゴアルギニンリンカーで結合させた分子を合成し,蛍光強度とりん光強度の比(レシオ)を計測する。開発した酸素プローブを用いて,スフェロイド内部の酸素濃度をレシオ法によって明らかにする方法論の確立を目指す。平成29年度は,イリジウム錯体の補助配位子にエチレンジアミン類を用いたカチオン性イリジウム錯体の合成を行い,スペクトル特性や光物理特性に関する測定を行った。また,細胞移行性の実験からエチレンジアミンの窒素原子の結合した水素をアルキル鎖に置換下化合物において高い細胞親和性およびスフェロイド透過性が向上することを見出した。さらに,水酸基を有するイリジウム錯体も開発したところ,カチオン性イリジウム錯体と同様にスフェロイドに浸透することが明らかとなった。装置開発では,申請書において導入を予定していたスーパーコンティニュウム白色光源を購入し,共焦点蛍光・りん光寿命顕微鏡の光源として設置した。これを用いることで,様々な波長領域に吸収を示すイリジウム錯体を選択的に光励起できることが可能となった。これら開発したイリジウム錯体と共焦点蛍光・りん光寿命顕微鏡を用いることでスフェロイド内部が低酸素状態になることを定量的に示した。また,低酸素状態はスフェロイドの大きさに依存しており,大きいスフェロイドほど内部がより低酸素状態になることが分かった。これは,外側の細胞が酸素を消費するため,内部細胞まで酸素が十分に拡散できないためであり,組織においても毛細血管からの距離に依存して酸素濃度が変化することが予想される。平成29年度は,可視光領域にりん光を示すカチオン性イリジウム錯体の合成,および溶液中における物性評価を行った。また,細胞内移行性や細胞内におけるりん光特性に関する実験を行った。さらに,スーパーコンティニュウム白色光源を,共焦点蛍光・りん光寿命顕微鏡の光源として設置することで,任意のイリジウム錯体を選択的に光励起できるシステムの構築を行った。以上の結果は,平成29年度に達成すべき目標であることからおおむね順調に研究が遂行できたと考えている。