hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代医療用糖タンパク質の生産を目指したカイコからヒト型糖鎖創出技術の開拓

ハイマンノース型糖鎖から哺乳類細胞の複合型糖鎖に近い糖鎖合成能力を付与するため、カイコの糖鎖合成経路の改変を試みた。RNAサイレンシングによって3種類のNーアセチルグルコサミニダーゼ活性を約60%発現抑制に成功した。糖鎖解析の結果、パウチマンノース型の糖鎖は全体の70 %から80 %の割合を占め、アセチルグルタミニダーゼ抑制効果は検出されなかった。RNA干渉の誘導に、カチオン性のリポソームを用いた合成siRNAの導入という手法を用いた場合、導入試薬を用いることでsiRNAを取り込ませ目的遺伝子の30%程度の発現抑制に成功した。より長いRNAi効果の持続が期待されるdsRNAヘアピン遺伝子の導入を行ったところ、約60%の発現抑制効果を得た。また、hIgGに付与するN-アセチルグルコサミン量をWGA-FITCにより検出したところ、hIgG単独で発現したものよりも蛍光強度の増加得られており、RNA干渉による糖鎖領域へのN-アセチルグルコサミンの付与の亢進が示唆されたが、糖鎖解析の結果、N-アセチルグルコサミンの付与は確認できなかった。前年度の結果、合成siRNAやdsRNAヘアピンを導入し、βN-acetyl D-glucosaminidase(GlcNAcase)の活性をそれぞれ30%と60%抑制することが出来た。しかし、IgGと共発現を行いIgGへの糖鎖の修飾を確認したところ、N-acetylyglucosaminidase(NAG)の付与は確認できなかった。そこで、今年度はdsRNA(ヘアピン型dsRNA)をそれぞれ昆虫に特異的なactin、IE2、U6-2の下流に挿入したBmNPVバクミドを構築し、RNAiを誘導し、発現したタンパク質のGlcNAcase活性を測定したところ、Bm5細胞ではコントロールと比較してU6-2プロモーターが最大61%、カイコではIE-2プロモーターが最大42%のGlcNAcase活性の低下を確認した。さらに、得られたIgGをペプシン、グリコアミラーゼA処理によりタンパク質から糖鎖を遊離させ、HPLCで分離し、MALDI-TOF-MSにより質量分析で糖鎖構造を同定した。その結果、パウチマンノース型が7080%を占め、NAGの付加は確認できなかった。本結果を踏まえて、NAG付加の確率を高める目的でヒト由来糖転移酵素であるβ-1,2-N-acetylglucosaminytransferaseII(hβ2GnTII)またはβ-1,4-galactosyltransferaseI(hβ4GalTI)遺伝子をカイコで過剰発現させIgG発現を行った結果、hβ2GnTIIを発現した場合、N型糖鎖の還元末端N-アセチルグルコサミンの付加が認識られ、今後N型糖鎖解析を行う予定である。カイコのパウチマンノース型糖鎖合成は、GlcNAcMan3GlcNAc2からα1,6-fucosyltransferase(α6FucT)によるフコースの付加経路が考えられる。しかし昆虫細胞では数種類のN-acetylglucosaminidase(GlcNAse)による影響が予測され、GlcNAseの干渉を1年目行うような計画変更を行った。siRNAの配列選択にはsiRNATarget Finderを利用し、PCRで増幅、siRNAカセットを作製し、大腸菌DH5αに形質転換を行った後、Bac to BacシステムによりBmNPVバクミドを完成した。バクミドDNAを用いてカイコに注射し、5日間飼育後カイコ脂肪体を回収し、GlcNAseの活性を測定した。その結果、カイコにおいてはRNAi導入しなかった場合に比べ殆ど活性の差がなかった。これは数種類のGlcNAseの存在でお互いに活性を補っていることを示唆する。そこで、GlcNAseIとIIを昆虫細胞で干渉を行ったところ、それぞれ20%程度化成の低下が確認できた。この結果は,今後GlcNAseのダブル干渉を行う必要があることを示唆する。Nーアセチルグルコサミニダーゼ(NAG)の活性を有する3種類の遺伝子をターゲットとして、siRNAとdsRNAの導入を試み、NAG活性を抑制した。レクチンブロット法ではある程度、NAGの抑制が示唆されたが、ヒトIgGを発現させ、精製を行った後糖鎖解析を行ったところ、マンノース型糖鎖が修飾され、NAGの抑制効果は認められなかった。この原因は、NAGの発現抑制に用いたプロモーター(ポリへドリン)は感染後期に発現するので、NAGの発現抑制が起きる前に、マンノース型糖鎖形成が進んだからではないかと推測する。従って、次年度はプロモーターを感染前期に発現するIe-2或いは恒常的に発現するActinプロモーターを使用することにした。これが研究の進展が遅れている原因であると判断した。当初、GlcNAcMan3GlcNAc2からα1,6-fucosyltransferase(α6FucT)によるフコースの付加経路が考えられるα3FucT干渉を計画したが、数種類のN-acetylglucosaminidase(GlcNAse)による影響が予測され、GlcNAseの干渉を1年目行うような計画変更を行ったことで、研究が少々遅れた。

しかし、次年度からは構築したRNAiシステムを使用できるので、計画通りに進展できると考えている。1)今後、NAG抑制用ベクターのプロモーターを感染前期に発現するIe-2或いは恒常的に発現するActinプロモーターに変更し、全てを構築し直す。2)NAGの抑制が可能な段階で、β1,4-galactosyltransferase、β1,6-galactosyltransferaseを導入し、Nーアセチルグルコサミンからガラクトースを付加する。上記1)と2)の研究の進展により、最終的にRNA干渉原理をカイコに適用する。カイコに適用するための方法としてはトランスジェニクカイコの作製が必要となる。今年度の研究で、トランスジェックカイコの作製まで進むかどうかが決まる。カイコでバイセクティングN-GlcNAc構造を持つ糖鎖の合成系を確立するために、N-acetylglucosaminidase(GlcNAse)IとIIのダブル干渉を行う。1)GlcNAcβ1-4Man β1-4結合を触媒するβ1,4N-acetylglucosaminyltransfersae(β4GnT III)をカイコに導入し、バイセクティングN-GlcNAcMan3GlcNAc2の合成系を強化する。2)二つの遺伝子及びhβ3GnTバクミドを共発現の方法でカイコに導入し、hβ3GnTの発現を行い、酵素活性、hβ3GnTの精製、及び糖鎖を解析し、糖鎖のパターンを調べる。hβ3GnTの発現には、ポリへドリンプロモーターを用いるが、β2GnT Iやβ4GnT IIIについては、恒常的に発現するアクチンプロモーターを用いる次年度の研究費の使用計画:今後の研究本推進方策に従い、ie-2やActinプロモーター遺伝子発現用のプライマーの作製、Nーアセチルグルコサミンからガラクトースを付加するためのβ1,4-galactosyltransferase、β1,6-galactosyltransferaseの導入を行うためのプライマーやベクター作製、様々な制限酵素類、発現後のタンパク質の精製のために必要な精製用カラム類の購入、及び研究成果の論文発表費用などに研究費を使用する予定である。50万以上の機器の購入は必要なく、研究に必要な消耗品を計画的に執行する予定である。
装薬条件が爆源近傍の破壊プロセスに及ぼす効果に関する研究

(1)連続可視化画像記録システムと動ひずみ計測システムの構築アルゴンイオンレーザー(連続発振)を光源に使用したシャドウグラフ法やシュリーレン法による連続可視化画像情報を記録するシステムを構築した。このシステムでは、高速度ビデオカメラ(最高撮影速度40500コマ/秒)を使用して、画像記録した。また、動ひずみ測定のための波形計測システムを構築した。(2)装薬のデカップリング効果に関する可視化観察及び動ひずみ測定実験PMMAブロックと瞬発電気雷管を使用して、爆破モデル実験を行い、爆源近傍の応力波、爆発ガス、き裂の挙動を構築した可視化システムを用いて、連続画像観察した。実験結果から装薬周囲の空隙の大きさ(デカップリング効果)が装薬孔周囲の破壊域の拡大に及ぼす影響について考察した。また、デカップリングの増大とひずみ波形との関係を明らかにした。(3)岩質材料を使用した装薬孔近傍の破壊挙動観察装薬条件としての装薬孔の大きさ(デカップリング効果)、装薬孔に設けられた切り欠きの有無に関する効果を岩質材料としてのモルタル及びコンクリート供試体を使用して、その破壊挙動を高速度ビデオカメラで観察した。デカップリングの増大は、装薬孔からのき裂数の緩和、孔壁損傷の緩和において効果がある。また、装薬孔内部での衝撃圧の緩和によって、切り欠きの有無によるき烈進展挙動に違いがあることが明らかになった。研究計画の初年度として以下の研究を行った。このシステムでは、高速度ビデオカメラ(最高撮影速度40500コマ/秒)を使用して画像記録した。これによって、応力波の伝ぱとき裂進展挙動を同時に可視化観察することが出来るようになった。既設の4台のシグナルコンディショナー及び申請備品のデジタルオシロスコープとパソコンを組み合わせた動ひずみ測定のための波形計測システムを構築した。(2)装薬のデカップリング効果に関する実験PMMAブロックと瞬発電気雷管を使用して、爆破モデル実験を行い、爆源近傍の応力波、爆発ガス、き裂の挙動を上述の可視化システムを使用して、画像観察した。実験結果から装薬周囲の空隙の大きさ、装薬の装着状態や装薬孔に近接するガイドホールの存在が爆源近傍の破壊プロセスに及ぼす効果を考察した。研究計画の2年度として以下の研究を行った。(1)装薬のデカップリング効果に関する可視化観察及び動ひずみ測定実験PMMAブロックと瞬発電気雷管を使用して、爆破モデル実験を行い、爆源近傍の応力波、爆発ガス、き裂の挙動をアルゴンイオンレーザー(連続発振)を光源に使用したシャドウグラフ法やシュリーレン法による連続可視化画像記録システムを使用して、画像観察した。装薬条件としてのデカップリングが応力波の挙動に及ぼす効果を自由面に投射される応力波のひずみ履歴から考察した。また、装薬孔に近接するガイドホールの存在が爆源近傍の破壊プロセスに及ぼす効果を考察した。(2)岩質材料を使用した装薬孔近傍の破壊挙動観察装薬条件としての装薬孔の大きさ(デカップリング効果)、装薬孔に設けられた切り欠きの有無に関する効果を岩質材料として、モルタル及びコンクリート供試体を使用して、その破壊挙動を高速度ビデオカメラで観察した。デカップリングの増大による装薬孔からのき裂数の緩和、孔壁損傷の緩和において効果がある。また、装薬孔内部での衝撃圧の緩和によって、切り欠きの有無によるき裂進展挙動に違いがあることが明らかになった。
栽培体系がミミズ群集に与える影響

ミミズは持続的農業生産に貢献すると考えられるが、未だ日本において栽培体系がミミズ群集に与える影響は明らかになっていない。本課題では、ミミズの飼育法及びミミズ採取法の確立を行うとともに、栽培体系がミミズ群集に及ぼす影響を調べた。日本在来のミミズは飼育が難しいが、火山灰土よりも非火山灰土を用いることで飼育出来る可能性が高いこと、ミミズを採取する深さは30cmまでで十分であること、農薬や化学肥料を使わない有機栽培でもミミズは少なく、不耕起栽培で高い生息密度となることを本課題で明らかにした。欧米では、ミミズが炭素及び養分循環に影響を及ぼしていることが示されているが、日本ではミミズの役割を把握する研究が遅れており、しかも操作実験で必要不可欠である飼育法すら確立されていない。また、ミミズは自然循環型農法で重要な役割を果たしていると考えられるが、畑地においてミミズがどの程度生息しているか不明である。本課題では、畑地でのミミズ採取を効率的に行うために、ミミズの垂直分布及び採取時間と採取率の関係を把握した((1)採取法の確立)。それと同時に農法とミミズ群集の関係を把握した((2))。また日本に優占しているフトミミズ科のミミズの飼育法確立を試みた((3))。(1)と(2)の研究を遂行するために、茨城県内の黒ボク土壌で畑作を行っている圃場10ヶ所(慣行栽培、有機栽培、不耕起栽培)で調査を行った。調査は、土を0.25m^2の方形区で深さを10cm毎に50cmまで採取し、実験室で時間を計測しながら土からミミズを採取した。その結果、表層20cmを採取することで、94%(50cmまで採取した時のミミズの重量を100%とした場合)のミミズが採取出来光15.6Lの体積の土では8分かければ90%のミミズが採取出来ることが明らかとなった。(3)のミミズの飼育法確立に関する研究では、野外に生息しているミミズを採取し飼育実験に用いた。幼体ではミミズの種を特定することは出来ず、成体でも生きた状態では種の特定は難しいため、種が分かるミミズ(ヒトツモンミミズ、クソミミズ)のみ種を特定して飼育し、他は種を特定しなかった。ミミズは、温度15°Cで60%の水分含量の黒ボク土壌で飼育した。餌として牛糞ペレット、落ち葉、イナワラ、コケ、紙を用い、これらを土壌に混入または表層に設置した。ミミズの重量を1ヶ月ごとに測定し各ミミズ種の飼育可能性を調べた。その結果今回の飼育条件では、すべてのミミズにおいて飼育出来なかった。本年度も昨年度同様、畑地でのミミズ採取を効率的に行うために、ミミズの垂直分布及び採取時間と採取率の関係を把握した((1)採取法の確立)。それと同時に農法とミミズ相の関係を把握した((2))。本年度は、昨年採取しなかった、非火山灰土において調査を行った。また日本在来のミミズの飼育法確立を試みた((3))。(1)の研究を遂行するために、茨城県内の畑作を行っている圃場5ヶ所(慣行栽培、有機栽培)で調査を行った。調査の結果、昨年度よりも10cm深い表層30cmまで採取しなければ、95%(50cmまで採取した時のミミズの重量を100%とした場合)のミミズを採取出来ず、15.6Lの体積の土では6分かけなければ90%以上のミミズが採取出来なかった。このため、効率的かつ高精度で調査を行うには本年度の結果を採用すべきと結論付けた。(2)の農法とミミズ相の比較の結果、昨年同様有機栽培においても、ミミズはわずかしか生息していなかった。サンプル数は少ないものの、昨年及び本年度の結果から、有機栽培においてもミミズの生息密度は低密度であることが明らかとなった。(3)のミミズの飼育法確立に関する研究では、野外に生息しているミミズ(ヘンイセイミミズ、サクラミミズ)を採取し飼育実験を行った。ミミズは、温度15°C、最大容水量の60%で黒ボク土と灰色低地土で飼育した。餌としてイナワラ等を粉砕したものを用い、これらを土壌に混入した。ミミズの重量を定期的(2、3週間)に測定し両ミミズ種の飼育可能性を調べた。その結果両ミミズとも、非火山灰土で有機粒を添加することで、高い重量増加が認められた。この結果から、両ミミズとも非火山灰土を用い有機物を添加することで飼育できる可能性が示唆された。
活性中間体アシルリチウムの発生と制御

本研究では、有機リチウム化合物と一酸化炭素との反応により発生する高活性中間体カルボニルリチウムの分子内変換による反応制御を検討した。その結果得られた知見を総括すると以下のようになる。1.転位を利用したアシルリチウムの反応制御リチウムシリルアミドと一酸化炭素との反応により発生するカルボニルリチウムにおいて、シリル基の転位を利用する方法がカルボニルリチウムの反応制御に有効であるという知見を得た。2.環化反応を利用したアシルリチウムの反応制御ジエニルリチウムやアザジエニルリチウム型のアニオンは、一酸化炭素と反応しカルボニルリチウムを経由する[4+1]型環化反応を起こすことを見出した。これらの結果は、π共役系を含む環化反応の利用がカルボニルリチウムの制御に有効な手段であることを示している。3.脱離反応を利用したアシルリチウムの反応制御メチレンアジリジンから調製したリチオ体が一酸化炭素と反応し、開環/再環化というプロセスによりβ-ラクタムのリチウムエノラートに至ることを示した。このことは、カルボニルリチウム中間体からの脱離/付加反応の利用が高活性なカルボニルリチウムの制御に有効であることを示している。4.窒素の脱離を利用したアシルリチウムの反応制御リチオシリルジアゾメタンと一酸化炭素との反応によりシリルイノラートが発生することを示した。本研究では、分子内変換手段として転位、環化、脱離を用いるという方法論が、これまでその制御が困難であるとされてきたカルボニルリチウムの反応の制御に有効であることが示された。その結果、カルボニルリチウムを合成反応における有用な中間体として機能させ得ることが示された。1.トリアルキルシリル基の転位を伴うリチウムアミドと一酸化炭素の反応リチウムアミドもアルキルリチウム同様、一酸化炭素と反応しカルバモイルリチウム[RR'NC(O)Li]を発生する。カルバモイルリチウムはアシルリチウムに比べて比較的安定であるが複雑な反応を起こすことが多い。この反応の制御としてケイ素の転位を用いた。リチウムN-シリルアミドと一酸化炭素との反応を検討した。窒素上に2、6-キシリル基を持つシリルアミドを一酸化炭素と反応させ、よう化メチルで処理したところカルバモイルシランが得られた。ケイ素の窒素上からカルボニル炭素上への転位が起こったことを示している。また、本反応を効率よく進めるには、芳香環の2、6位の置換基が重要である。本反応によりこれまでその化学があまり知られていないカルバモイルシラン類の合成が可能になった。2.C-リチオアルジミン、N-リチオケチミンと一酸化炭素の反応[4+1]シクロカップリング2、6-キシリルイソニトリルにtert-ブチルリチウムを付加させて得られるC-リチオアルジミンと一酸化炭素との反応により、3H-インドールが得られた。カルボニルリチウムがC-N二重結合を通じて芳香環と2位で環化した後、その位置のメチル基の1、5移動によってインドラートに至ったと考えられる。本反応は、芳香環の関与した形式的[4+1]シクロカップリングと見なせる。次に、ベンゾニトリルとtert-ブチルリチウムから調製したN-リチオケチミンと一酸化炭素との反応を検討した。一酸化炭素との反応後、系をよう化メチルで処理したところ、イソインドール誘導体が得られた。この反応も、形式上[4+1]シクロカップリングであり、芳香環の一部が環化に関与した後、水素の1、5移動を伴い生成物に至ったと考えられる。3.リチオアジリジンの環拡大カルボニル化によるβ-ラクタムの合成β-脱離を利用したアシルリチウムの反応性制御として、脱離基が求核剤を兼ねる反応系を設定した。

メチレンアジリジンのリチオ化は、sec-プチルリチウムにより容易に起こる。このようにして発生させたリチオアジリジンを低温下、常圧の一酸化炭素と反応させたところアジリジンの炭素-窒素間に一酸化炭素の挿入したβラクタムが得られた。一酸化炭素との反応後、種々の求電子剤で処理すると、種々のβ-ラクタムをone-potで合成できることが明らかとなった。1)π電子系の関与した環化反応ベンズアミド1と2当量のn-BuLiとの反応により生成するジリチオ体2を常温常圧下一酸化炭素と反応させた後、系をH_3O^+で処理したところ環化生成物であるイソインドリノン誘導体が73%の収率で得られた。本反応では、π電子系を利用したアシルリチウム3のケテン中間体4への変換が鍵過程となっている。2)窒素の脱離を伴うYodateへの変換反応トリメチルシリルジアゾメタンとn-BuLiとの反応により調製したリチオシリルジアゾメタン6を-78度、常圧下一酸化炭素と反応させた後、系をEt_3DSiOTfで処理するとジシリルケテン85%の収率で単一生成物として得られた。この反応はカルボニルリチウム7の発生後、窒素の脱離を伴いynodate8が生成し、これがEt_3DSiOTfにより炭素側で捕捉され生成物に至ると考えている。アシルリチウムは、カルボニル炭素上に負電荷が存在するという特異な構造のため、この化学種を経由する反応はしばしば複雑な結果を与える。われわれは、分子内変換、すなわち、カルボニルリチウムが複雑な逐次反応を起こす前に、エノラートのようなより安定で求核攻撃を受けない化学種にすばやく分子内変換するという方法論を用いてアシルリチウムの制御を試みている。今年度は昨年に引き続き窒素の脱離をともなうイノラートへの変換反応を中心に検討をおこなった。トリメチルシリルジアゾメタンとn-BuLiとの反応により調製したリチオシリルジアゾメタンを-78度、常圧下一酸化炭素と反応させるとシリルイノラートが発生することはイノラートがクロロシランで捕捉することによりジシリルケテンが生成することから確認している。これに関しては昨年報告した。イノラートに1.1当量のトリメチルアルミを加えて室温まで昇温して1時間撹拌した後、オキシランを加え、後処理するとα-シリルラクトンが良好な収率で単一生成物として得られることを見い出した。この反応はシリルイノラートがオキシランと反応し、生成したケテン中間体に対して分子内アルコキシ基が環化して生成物に至ると考えている。この反応はイノラートが炭素親電子剤と反応した稀な例である。オキシラン以外の炭素親電子剤(アルデヒド、α,β-不飽和ジエステネ、α,β-不飽和ケトエステルなど)もイノラートと反応することがわかった。
宇宙デコンディショニングの対抗措置の戦略的開発と応用

宇宙飛行時における生体の変化のうち,微小重力環境の影響に焦点を絞り,その環境に順応し1Gの地球環境下に戻ってきたときに生ずる不都合の宇宙飛行デコンディショニングを,遠心機を利用した人工重力下において,運動を負荷することで防止,改善可能かどうかを検証した.従来4mあった遠心機を,宇宙ステーション内に設置可能な直径2.8mの装置に改造し,坐位で肢を外に向けた形で回転させた(初回改造機)が,これでは十分なGが心臓にかからなくなることが分かり,仰臥位で両脚を挙上し運動させる構造に改造した(第二次改造機).後者でベッドレスト被験者を用い,G耐性,骨破壊マーカーなどで評価し,有効であることを確認した.平成24年度までに遠心機が完成し,試験運転も行い,ベッドレスト実験を4名の被験者で実施した.平成25年度は,10月に行われるはずであった人工重力ワークショップの方針に従って,研究を推進する予定であったが,米国の予算措置の遅れに伴い,人工重力ワークショップは平成26年2月中旬に行われた.したがって実験予定も平成26年度にずれこみ,25年度に実施予定の実験を遅れて行う予定である.当研究は,長期間微小重力曝露に伴う身体不調に対し,人工重力と運動の組み合わせがどのように不具合を解決できるかを探ることにある.そのため,まずは人工重力負荷装置および運動負荷装置を製作し,その装置が安全に働くかどうかを確認し,さらには微小重力に曝露した被験者に対し,人工重力および運動負荷装置を適用,それがどのくらい効果があるかを確認した上で,身体不調を予防するためには,どれくらいの人工重力負荷を1日何分間かけたらよいかを立証することにあった.この場合,身体不調には,進呈前庭系のアンダーシュート,オーバーシュート,起立性低血圧をはじめとする心循環系デコンディショニング,筋萎縮,筋力低下,骨代謝異常による骨喪失などが挙げられている.この目標を達成するため,微小重力負荷の模擬として,頭を6度下げた-6°ヘッドダウンベッドレストを10日間行ってもらい,人工重力および運動負荷を適用した群と非適用群を比較し,神経前庭系(歩行パーフォーマンスの変化)心循環系(循環血漿量の比較),筋骨格系(筋量の比較),骨代謝系(骨量の変化)などを比較した.その結果,神経前庭系,心循環器系において,適用群が低下を防止できた.今回のプロトコールは,1.4Gの人工重力,60Wの運動負荷であったが,被験者のトレーニングに応じて,より強い人工重力負荷,およびより強度の運動負荷を適用することで,さらに他の系においても,身体不具合を解決できることが予測された.このように,まずは有力な遠心力を利用した人工重力および運動負荷装置を製作でき,さらには2系統において,10日間の模擬微小重力曝露による身体不調を予防できた.本研究は,微小重力曝露時におけるデコンディショニング状態が,人工重力と運動負荷により,どのくらい予防,改善できるかを検討するものである.この微小重力曝露時におけるデコンディショニング状態には,神経前庭デコンディショニング(宇宙酔い),心血管系デコンディショニング(立ちくらみ),筋骨格系デコンディショニング(筋萎縮),骨代謝デコンディショニング(骨粗そう症)などがあるが,これまでに我々が開発した負荷プロトコールにより,以上のパラメーターが,運動負荷群と対照群において有意差を生じるかを検討する別途レスト実験を試行する予定であった.実験準備もし,予定も立てたのであるが,人工重力および運動付加装置を設置してある施設(岐阜医療科学大学)の日程的理由により,残念ながら実験ができなかった.平成27年度においては,予算はすべて残してあり,同様に被験者をリクルートして,20日間のベッドレスト実験を行う予定である.初年度に制作した人工重力および運動負荷装置を利用し,被験者を模擬微小重力(ヘッドダウンベッドレスト)に曝露し,半数に人工重力+運動負荷を行ったところ,宇宙飛行デコンディショニングといわれる1神経前庭系,2心循環系,3筋骨格系(筋萎縮)4骨代謝(骨粗鬆症)の各デコンディショニングのパラメーターにおいて,負荷群と対照群との間に有意差を示した.負荷群,対照群ともに8名ずつの若年成人男性被験者を割り当て,20日間のー6°ヘッドダウンベッドレストを行った.負荷群には,1.4Gまでの負荷重力と80Wまでのエルゴメーター負荷を,それぞれ1.0G, 40Wから,0.2G, 15Wずつステップアップする方法で負荷し,ベッドレスト前後において,各パラメーターを測定した.その結果,重力耐性(抗重力指数:負荷重力×耐久時間の和),ティルト時の筋交感神経活動,血中ノルアドレナリン,心エコーによる心拍出量,核磁気共鳴画像による大腿四頭筋断面積,尿中骨代謝マーカー(deoxypyridinoline, I型コラーゲン架橋N-テロペプチド),などに,負荷群ではベッドレスト前後に有意差を生ぜず,対照群では有意差を呈した.また,人工重力による体液移動の大きさを測定するために行ったバイオインピーダンス法による水分移動測定により,人工重力により十分な頭部方向への水分移動が行われることが判明した.これは運動を組み合わせた人工重力負荷により,長期宇宙飛行に伴う宇宙飛行デコンディショニングが予防可能であることを示す.

宇宙飛行時における生体の変化のうち,微小重力環境の影響に焦点を絞り,その環境に順応し1Gの地球環境下に戻ってきたときに生ずる不都合の宇宙飛行デコンディショニングを,遠心機を利用した人工重力下において,運動を負荷することで防止,改善可能かどうかを検証した.従来4mあった遠心機を,宇宙ステーション内に設置可能な直径2.8mの装置に改造し,坐位で肢を外に向けた形で回転させた(初回改造機)が,これでは十分なGが心臓にかからなくなることが分かり,仰臥位で両脚を挙上し運動させる構造に改造した(第二次改造機).後者でベッドレスト被験者を用い,G耐性,骨破壊マーカーなどで評価し,有効であることを確認した.ベッドレスト実験の実施方法は,すでに完成しており,機器もすべてそろっている.国際宇宙ステーションへ搭載予定の大きさにまでは,回転半径を縮小した改造版も完成している.あとは被験者を募集し,人工重力+運動負荷群と対照群の2群に分けて20日のベッドレスト実験を行う予定である.平成26年度は,人工重力+運動付加装置を設置してある岐阜医療科学大学の日程上の理由で,ベッドレストが実施できなかった.このような実験は長期休暇を利用しないと実施できないため,平成27年度夏には実施予定である.環境神経生理学現在,共同研究者のカナダのグループが,再び国際宇宙ステーションへ搭載するプロジェクトを立ち上げようとしている.その運動負荷は,スクウォッティングを利用する予定なので,将来的には,人工重力に下肢伸展運動を組み合わせたプロトコールで行う予定である.そしてエルゴメーターを組み合わせたプロトコールと比較し,どちらが宇宙飛行デコンディショニングの予防と改善に有効であるかを確認する予定である.平成24年度の目標である人工重力+運動付加装置の開発は行い得た.しかし,平成25年度には,実験内容の報告は行ったが,実験自体の進行はなしえなかったため,目的達成度としては,不十分と言わざるを得ない.安全な人工重力および運動負荷装置が製作できた.10日間の模擬微小重力負荷に対し,有効性が確認できた.さらに強い重力と運動負荷により,より有効性が高まると推測された.今後,筋骨格系と骨代謝系に対する有効性に関する研究を,さらに長いベッドレストにより証明する必要がある.装置設置先の岐阜医療科学大学の日程上の理由により,ベッドレスト実験ができなかったので,それを今夏に施行予定.今後は実験を平成25年度に実施分も行い,また,NASAとの共同研究も推進する予定である.より強い遠心力,運動負荷における有効性の確認を行う.さらには,より長期間のベッドレストにおける人工重力+運動負荷の有効性に確認を行う.すべて,ベッドレスト実験に使用する予定.平成24年度までに遠心機が完成し,試験運転も行い,ベッドレスト実験を4名の被験者で実施した.平成25年度は,10月に行われるはずであった人工重力ワークショップの方針に従って,研究を推進する予定であったが,米国の予算措置の遅れに伴い,人工重力ワークショップは平成26年2月中旬に行われたため,実験予定が平成26年度にずれ込んでしまったことに理由がある.上記の理由により,実験予定も平成26年度にずれこみ,25年度に実施予定の実験を,半年遅れて行う予定である.遠心機の運用費用として20万円ベッドレストの運営費用として80万円の予定である.
虚血性脳血管障害の病態における血小板活性化因子(PAF)の関与について

局所脳虚血による脳浮腫の発生と脳内血小板活性化因子(PAF)産生との関係について検討を行なった。局所脳虚血はラットを用い、切離翻転した外頸動脈から内頸動脈に糸付き塞栓子を挿入して中大脳動脈を閉塞,また塞栓子を抜くことで血流再看灌流とした。このモデルの病理学的検討では,虚血2時間後から皮質の海面綿変化および神経細胞の核や細胞質の濃縮,空胞化,融解などの梗塞所見が見られ、その範囲は内頸動脈分枝および中大脳動脈領域全般にわたる広範なものであった。今回は実験群として,sham群2時間虚血群(2-0群),4時間虚血群(4-0群)2時間虚血後2時間再灌流群(2-2群)の4群を作成し,それぞれの群において脳浮腫の指標としての脳内水分含量を乾燥重量法で,また脳内PAFをBligh & Dyer法,TLCで抽出分離した後PAF〔^3H〕scintillation proximity assay systemで定量した。その結果脳内水分含量は,sham群78.45±0.27%,2-0群79.73±0.48%,4-0群80.35±0.30%,2-2群80.93±1.05%であり,虚血により脳内水分含量の有意な増加が見られ,これは虚血時間の延長および血流再潅流によりさらに増加した。一方,脳内PAF含量については,sham群4441±346,2-0群2298±409,4-0群2481±679,2-2群2901±930ng/g dry wtであり,虚血により大脳半球内PAF含量は有意に低下し,血流再潅流によりやや増加傾向が見られたもののコントロールに比べまだ低値であった。今回の結果より,ラットの局所脳虚血において虚血性脳浮腫の発生と脳内PAF含量との間には明らかな相関関係を認めなかった。また,これまでにPAFアンタゴニストを用いた間接的所見から脳虚血の病態におけるPAFの関与が推定されていたが,今回の結果からは,局所脳虚血においては,虚血の進行により脳内PAF含量は低下することが明らかとなった。ウイスターラットを用い、麻酔下に内頚動脈より糸付き塞栓子を挿入し中大脳動脈閉塞、塞栓子を抜くことで血流再灌流とするモデルを作成した。病理組織学的検討では、閉塞2時間後から皮質の海綿状状態がみられ、神経細胞の核や細胞質の濃縮、空胞化、融解などの梗塞所見がみられた。この梗塞の程度は閉塞時間が延長するとともに強くなった。脳梗塞の広がりは個体差が少なく、その範囲は側頭頭頂葉、基底核、視床下部に及び、内頚動脈分枝および中大脳動脈領域全般にわたる広範なものであった。6時間閉塞後再開通したものでは、梗塞巣に加え基底核や視床下部に毛細血管からの出血が加わっていた。

脳浮腫の指標としての脳水分含量は、閉塞前の78.1%から閉塞2時間後には79.6%と有意に増加し、閉塞6時間後には80.5%、閉塞12時間後には81.6%に達した。また、虚血後血流再開通により脳水分含量はさらに増加した(4時間閉塞2時間再開通で80.6%)。以上の如くラットを用いた中大脳動脈閉塞による再現性のよい局所脳虚血、再開通モデルが確立された。現在、PAF抗体を用いたRIA法により上述の虚血ラット(閉塞群および閉塞後再開通群)の脳内PAFの定量を試みているが、試料の抽出に問題があるためか満足すべきデータは得られていない。今後はPAF局所投与による脳病態に関する検討も併せて行なっていく予定である。局所脳虚血による脳浮腫の発生と脳内血小板活性化因子(PAF)産生との関係について検討を行なった。局所脳虚血は昨年度確立したラットのモデルで,切離翻転した外頚動脈から内頚動脈に糸付き塞栓子を挿入することで中大脳動脈を作成し,塞栓子を抜くことで血流再潅流とした。実験群として,sham群,2時間虚血群(2-0群),4時間虚血群(4-0群),2時間虚血後2時間再潅流群(2-2群)の4群を作成し,それぞれの群において脳浮腫の指標としての脳内水分含量および脳内PAF含量を測定した。脳内水分含量はラットを断頭屠殺後虚血側大脳半球を摘出し,乾燥重量法で測定した。脳内PAFの定量については,ラットの頭部にマイクロウェーブを照射して酵素反応を停止させてから脳を摘出,Bligh&Dyerの方法で脂質を抽出し,薄層クロマトグラフィーでPAFを分離し,Amersham社のPAF[^3H]scintillation proximity assay systemで定量した。その結果ラット中大脳動脈閉塞による脳内水分含量は,sham群78.45±0.27%,2-0群79.73±0.48%,4-0群80.35±0.30%,2-2群80.93±1.05%であり、虚血により脳内水分含量の有意な増加が見られ,これは虚血時間の延長および血流再潅流によりさらに増加した。一方,脳内PAF含量については,sham群4441±346,2-0群2298±409,4-0群2481±679,2-2群2901±930ng/g dry wtであり,虚血により大脳半球内PAF含量は有意に低下し,血流再潅流によりやや増加傾向が見られたもののコントロールに比べまだ低値であった。今回の結果より,ラットの局所脳虚血において虚血性脳浮腫の発生と脳内PAF含量との間には明らかな相関関係を認めなかった。また,これまでにPAFアンタゴニストを用いた間接的所見から脳虚血の病態におけるPAFの関与が推定されていた。しかし今回の我々の結果から,局所脳虚血においては,虚血の進行により脳内PAF含量は低下することが明らかとなった。
中国・内モンゴル自治区における「逆留守子ども」の生活環境に関する研究

草原地域(牧畜区)であるシリンゴル盟の東・西ウジュムチン旗において、教育を受けるため家から町へ出て来た子どもを中心に子どもの生活実態を把握するとともに、保護者の意識、学校の取り組み、行政の政策を明らかにした。また、牧畜区の家から離れて暮らす子どもの直面する諸問題点を分析し、牧畜区の子どもの成長発達を応じたかつ伝統文化の継承を配慮した生活環境づくりを検討した。本研究は、子どもの遊びをはじめ、学校・家庭生活に焦点を当て、牧畜区の子どもの成長発達を応じたかつ伝統文化の継承を配慮した生活環境づくりを検討する。1.子どもの生活実態東・西ウジュムチン旗において、子どもが町の親戚の家や家族の誰かと借家をして通学している子どもが多い。夏と冬休みの以外、学校にいる時間が長く、地域の伝統的な祭りや行事の参加ができない。自然環境や居住形態など牧畜区と異なる環境で暮らしているため、遊びも大きく変化している。2.保護者の意識子どもが幼い時期から親元を離れ、親として子どもの食事や情緒の安定といった心配があるため、多くの子どもが学生寮に入居しない状況にある。3.行政側の支援政策「逆留守子ども」に対し、政府が食費や寮費の助学金制度を行っているが、学生寮は十分に使われていない。支援内容や対象などを増やし、さらに検討する必要がある。4.学校の教育方針学校では、モンゴル語による授業を行っている。「モンゴル住居」などの教材をつくり、モンゴル民族の伝統的な文化を教育の一環として、授業で教えている。モンゴル民族の伝統文化の継承教育を重視していることがわかる。シリンゴル盟の東ウジュムチン旗と西ウジュムチン旗では、学制寮や食堂等整備された寄宿制モンゴル族の小学校は各1校がある。2校とも子どもの生活実態、保護者の意識、行政側の支援策、学校側の教育方針・取り組みが類似している。子どもの生活実態では、子どもの通学形態に関しては、家庭に任せており、調査した事例により、多くの子どもは学校の寮に入居せず、通学方法等は個人的、家庭ごとに解決を図っている。寮に入居していない要因の一つは、子ども自身が寮に住みたくない理由を挙げていた。保護者の意識に関しては、子どもに対する教育期待では最終学歴は大学或いは子どもに任せると答えており、子どもに就かせたい職業では子どもに任せると答える保護者が多いが、牧畜業に就かせたくない保護者もいる。子どもに伝統文化を継承させる意識が弱い。また、「母親と町に出かけて借家」パターンの若い母親である保護者自身でも町に出かけたことにより、牧畜区へもう戻りたくないと生活様式に対する考えに変化が起こっている。さらに、離婚家庭が増え、家庭破壊されている問題等が生じている。行政側の支援策では、行政側が「逆留守子ども」の貧困家庭を対象とする「両免一補」の経済的な支援を実施されているが、一般的な家庭には経済的な支援を受けにくい。それ以外、同じ立場の人同士のネットワークづくり、行政や地域などの生活支援ネットワークの構築などが必要である。学校の教育方針では、伝統文化の継承を重視しており、授業や活動時間でモンゴル民族の伝統文化を教育させている。学校側からの家庭に対する経済的な支援や児童心理のカウンセラー等の取り組みがみられていない。
新しい原子模型と周期表の導入による原子・単体教材の開発

この研究の目的は、研究担当者自身が考案・開発した新しい原子模型・分子模型・結晶模型と、原子の〈立体周期表〉とを結合させて、単体の性質を中心にした分子・原子の教育を展開するための教材-すなわち、授業書〈原子とその分類〉とその関連教材を開発しようと意図したものであった。この研究の当初には、原子・分子模型を厚紙で作ることを考えていたが、この研究の進行中に発泡スチロール球による原子・分子模型を生徒たちにも自作させる方法を開発することができて、さらに効果的な授業を実現できることが分かった。また、氷の結晶模型やナトリウム,食塩,グラファイト,ダイアモンドの結晶模型を製作することによって、原子・分子のイメージをさらにふくらますことができることが判明した。生徒たちよりも前にに多くの教師が興味関心を抱いてくれたのである。この研究によって、最終的に、授業書〈原子とその分類〉を完成させるだけでなく、〈原子の立体周期表〉を印刷に付し、さらに、『原子とつきあう本-原子(元素・単体)のデータブック』という単行本も作成することに成功した。これによって、授業書〈原子とその分類〉による授業をさらに発展させることができるようになったのである。筆者のこの研究の狙いをさらに大きくいえば、それは、原子分子のイメージをできるだけ早く導入することであったが、発泡スチロール球による原子分子模型の作成作業の導入は、小学校中学年でも原子分子のイメージと付き合う道を開くものであることが確認できた成果は大きいと考えている。この原子分子模型は、地理教育における地球儀と同じように子どもたちが小さいうちから原子分子に親しむ道を開くことになることは間違いないものと考えている。
水循環に注目した低緯度大気大循環と大気境界層過程の相互作用の解明

1.地表境界条件として,全てを海面として東西一様な海面水温を固定して与えた,大気大循環モデル実験を行い,以下のような結果を得た.(1)境界層内の流れは,海面水温の勾配による気圧勾配とコリオリ力および摩擦力のつりあいによっており,この境界層内の過程を通して,海面水温分布がハドレー循環の大まかな様相を決定する.(2)降水量の分布は積雲対流のパラメタリゼーションや蒸発のパラメタリゼーションに大きく影響されるが,境界層内のハドレー循環はそれによっては大きく影響されない.(3)降水の分布は,境界層のパラメタリゼーションを変えることにより,蒸発分布の変化および境界層の厚さの変化によるエネルギー輸送の変化を通して大きな影響を受ける。2.大気大循環モデルの境界層過程のいくつかの改良を試み,現実的な境界条件の下での評価を行った.(1)乱流活動に関する雲の効果を,湿潤リチャードソン数を用いることによって評価することにより,雲水が最下層に溜ることが防がれるなど,水蒸気や雲水の分布が改良された.(2)対流混合層における非局所的フラックスの効果を,簡単なパーセル法を用いて評価するスキームを開発した.これにより,特に低緯度海上での下層雲の表現が大きく改良された.(3)境界層の高さを診断し,乱流の混合距離を境界層内とその上の自由大気とで大きく変えることにより,境界層内および自由大気の循環場の表現が共に向上することを確認した.以上の結果から,境界層の表現,特に湿潤過程・対流過程が,水蒸気や雲水の分布,エネルギーの輸送などを通して,低緯度の大気循環場に与える影響が大きいことが明らかとなった.1.地表境界条件として,全てを海面として東西一様な海面水温を固定して与えた,大気大循環モデル実験を行い,以下のような結果を得た.(1)境界層内の流れは,海面水温の勾配による気圧勾配とコリオリ力および摩擦力のつりあいによっており,この境界層内の過程を通して,海面水温分布がハドレー循環の大まかな様相を決定する.(2)降水量の分布は積雲対流のパラメタリゼーションや蒸発のパラメタリゼーションに大きく影響されるが,境界層内のハドレー循環はそれによっては大きく影響されない.(3)降水の分布は,境界層のパラメタリゼーションを変えることにより,蒸発分布の変化および境界層の厚さの変化によるエネルギー輸送の変化を通して大きな影響を受ける。2.大気大循環モデルの境界層過程のいくつかの改良を試み,現実的な境界条件の下での評価を行った.(1)乱流活動に関する雲の効果を,湿潤リチャードソン数を用いることによって評価することにより,雲水が最下層に溜ることが防がれるなど,水蒸気や雲水の分布が改良された.(2)対流混合層における非局所的フラックスの効果を,簡単なパーセル法を用いて評価するスキームを開発した.これにより,特に低緯度海上での下層雲の表現が大きく改良された.(3)境界層の高さを診断し,乱流の混合距離を境界層内とその上の自由大気とで大きく変えることにより,境界層内および自由大気の循環場の表現が共に向上することを確認した.以上の結果から,境界層の表現,特に湿潤過程・対流過程が,水蒸気や雲水の分布,エネルギーの輸送などを通して,低緯度の大気循環場に与える影響が大きいことが明らかとなった.
地域での健康増進や疾病予防への遺伝子情報活用の有効性に関する探索的研究

疾患に不安を持っている者は、当該疾患感受性遺伝子検査を受けやすく、結果に一喜一憂しやすいことが示唆された。嗜好性の高い生活習慣を控えている者は、陰性の遺伝子検査結果により、それを中断する危険性がわかった。検査結果の説明に工夫が必要と思われる。1年間の追跡では、遺伝子検査結果の通知の有無による生活習慣に係る項目のほとんどに差が観察されなかった。詳細な検討は必要であるが、仮にあったとしても、生活習慣への遺伝子結果通知の介入効果は軽微と思われる。疾患感受性遺伝子の地域分布について、同一県内の離島と山間部の遺伝子頻度の比較を行った。高血圧症に関して塩分感受性遺伝子と言われている.ADD1、AGTR1、GNB3で、allele頻度に有意な地域差を認めた。しかし、高血圧症の有病率には差を認めなかった。しかし、糖尿病については、有病率および糖尿病候補遺伝子のCAPN10とPPARGC1Aのallele頻度に差を認めた。限定された地域ではあるが、疾病頻度と疾患候補遺伝子のallele頻度との関連が示唆された。解析地域および遺伝子を拡大し、詳細な解析を行っている。次に、生活習慣、特に塩分摂取に関わる行動変容への遺伝子情報の影響について、仮想シナリオによる質問紙調査で明らかにした。任意の5地域、1,658人の外来患者を対象に行った。「高血圧に関連する塩分感受性遺伝子の検査」(回答1602人)に、793(50%)が「受ける」、482(30%)が「受けない」、327(20%)が「わかない」と回答した。これらの割合は、すでに塩分を控えている者とそうでない者とで有意に差を認めた。「受ける」が前者に多く、「わからない」が後者に多かった。遺伝子検査の希望に、それが関連する生活習慣の現状が影響することが示唆される。遺伝子検査結果の塩分摂取行動への影響について、控えていない者では、結果を遺伝要因があると仮定した場合、行動変容Stage毎に異なるが、無関心期(207)、関心期(463)および準備期(57)の計727人のうち、104(14%)が行動期(塩分をすぐに控える)になった。持っていないと仮定した場合でも、26(4%)が行動期になったが、これらの結果に有意差を認めた。行われていない場合は、遺伝子検査結果は行動変容に肯定的に働く可能性が示唆される。その一方で、塩分を控えている者(102人)では、持っていないと仮定した場合に、6(6%)が控えるのをやめると回答した。遺伝要因だけで塩分摂取の是非を決められない現状で、遺伝子検査結果の通知方法に慎重な姿勢が求められることがわかった。遺伝子情報(GNB3の結果)通知の効果を検証するためのベースラインデータの構築を行った。収集は5医療機関(大島診療所、平郡診療所、木屋平診療所、陶病院、西米良診療所)で実施した。894人を登録することが出来た。登録者のうち、男性が358(40%)で、年齢(平均±SD)は66.5±15.9歳で、65歳以上が579(65%)であった。GNB3のGenotypeは、CC:231(26%)、CT:416(47%)、TT(28%)であった。通知を希望した815(91%)にGNB3の結果を封書にて直接返却した。高血圧の治療中は462(52%)で、父が高血圧の者は227(25%)、母が272(30%)であった。塩分の濃い食べ物の好みについて、好むが149(17%)、どちらかと言えば好むが325(37%)、どちらかと言えば好まないが252(28%)、好まないが160(18%)であった。塩分摂取について、控えることに関心がないが81(9%)、控えないといけないが286(32%)、今すぐ控えたいが98(11%)、控えて6か月未満が14(2%)、控えて6か月以上が136(15%)、意識しなくても適量内であるが275(31%)であった。BMIは23.7±3.6で、25以上は276(31%)であった。健診時随時血圧は、最大が136.5±19.6mmHg、最小が77.5±11.9mmHgで、平均家庭血圧は、最大が127.3±13.9mmHg、最小が72.9±9.0mmHgであった。推定塩分摂取量(g/日)は8.0±2.3であった。GNB3のGenotype別では、CC:8.2±2.2、CT:8.0±2.3、TT:7.8±2.2で、CCに比べてCTは低い傾向があった。

塩分の濃い食べ物の好み別、推定塩分摂取量は、好むが8.1±2.3、どちらかと言えば好むが8.2±2.2、どちらかと言えば好まない8.0±2.3、好まない7.6±2.2で、好む者の方が、推定塩分摂取量が高い傾向にあった。塩分摂取の意識別、塩分摂取量は、控えることに関心がないが8.3±2.6、控えないといけないが8.1±2.3、今すぐ控えたいが8.1±2.3、控えて6か月未満が7.8±2.6、控えて6か月以上が7.7±2.3、意識しなくても適量内であるが8.0±2.1で、控えている者が、塩分摂取量が低い傾向にあった。しかし、GNB3のGenotypeと塩分の濃い物を好むとに関連は見られなかった。遺伝子情報(GNB3の結果)通知の効果を検証するために追跡調査を行った。追跡は5医療機関(大島診療所、平郡診療所、木屋平診療所、陶病院、西米良診療所)で実施した。登録した894人中、769人(86%)が追跡出来た。脱落理由は拒否等が96人と最も多く、転出(24人)、死亡(5人)であった。追跡者のうち、男性が306(40%)で、年齢(平均±SD)は67.6±14.0歳で、65歳以上が513(67%)であった。減塩の生活指導を受けた者は69人(9%)であった。遺伝子結果を通知した者は709人(92%)であった。また通知した者の中で、GNB3のallele typeは、T+が540人(76%)であった。遺伝子結果通知の効果について、通知しなかった者(非通知群)に比べて通知した者(通知群)では、年齢が低く(通知群:66.9±14.7、非通知群:75.6±14.0、p<0.001)、減塩に係る行動変容では、無関心期(塩分を控えることについて、関心がない)が少なかった(通知群:5%、非通知群:15%、p<0.05)。減塩に係る生活指導を受けた者はやや多かったが差は認めなかった(通知群:9%、非通知群:3%、p=0.111)。塩分の好み(塩分の濃い食べ物を好む)には差を認めなかった。両者において、塩分摂取の指標である24時間Na排泄量(mEq/day)(通知群:201.2±63.0、非通知群:193.3±68.8、p=0.357)と推定塩分摂取量(g/day)(通知群:7.4±2.4、非通知群:7.1±1.8、p=0,334)とに差は認めなかった。通知した者において、(GNB3のalleletype(T+/-)別の比較では、年齢(T+:66.1±15.0、T-:69.5±13.4、p=0.110)、減塩に係る行動変容のステージ、減塩に係る生活指導、塩分の好みに差は認めなかった。また、24時間Na排泄量(mEq/day)(T+:201.2±63.0、T-:202.9±66.4、p=0.698)と推定塩分摂取量(g/day)(T+:7.4±2.4、T-:7.6±2.4、p=0.516)とにも差は認めなかった。これらについて詳細な分析が必要ではあるが、生活習慣への遺伝子結果通知の介入効果は、仮にあったとしても、その影響は軽微であることが示唆される。
神経調節システムｉｎ　ｖｉｔｒｏ再構成による迷走神経刺激作用機構の解明

難治性てんかんに対する治療手法として臨床医療の場で用いられている迷走神経刺激療法VNSの作用機構解明に向けて,刺激を直接受容する脳幹の神経核(青斑核,縫線核)と,その標的組織である海馬から神経細胞を採取して培養系に再構成,電気活動時空間パターンの計測と解析を行った.海馬培養神経回路網は,全体で同期したバースト発火を繰り返し生じることが特徴とされているが,脳幹神経核のニューロン群の活動には同期性は認められず,これらと共培養した場合は海馬の周期活動も抑制される傾向が認められた.脳幹神経核に対する電気刺激により外部からその活動を制御し,VNSが有効に作用する最適条件を見出すことが今後の課題である.難治性てんかんに対する治療手法として臨床医療の場で用いられている迷走神経刺激療法VNSの作用機構解明に向けて,刺激を直接受容する脳幹の神経核(青斑核,縫線核)と,その標的組織である海馬から神経細胞を採取して培養系に再構成,電気活動時空間パターンの計測と解析を行った.海馬培養神経回路網は,全体で同期したバースト発火を繰り返し生じることが特徴とされているが,脳幹神経核のニューロン群の活動には同期性は認められず,これらと共培養した場合は海馬の周期活動も抑制される傾向が認められた.脳幹神経核に対する電気刺激により外部からその活動を制御し,VNSが有効に作用する最適条件を見出すことが今後の課題である.平成23年度の研究実施計画として設定した検討課題に対して以下の成果を得た.30μm角のマイクロ電極を中心間隔150μmで4x5個配置した区画2ヶ所,4x6個配置した区画1ヶ所からなるMEAパターンを設計,試作した.軸索の成長,シナプス結合形成の視点から,区画間の距離は500μmとした.PDMS(polydimethylsiloxane)を利用して細胞培養チャンバとチャンバ間を連結するトンネル構造(細胞体をチャンバ内に保持した状態で軸索のみ透過し標的組織にシナプス結合を形成することを目的とする)を製作,MEA基板上に位置を合わせて固定するプロセスとした.(2)パターン化基板上での共培養系構築1枚のMEAに複数の細胞培養区画を有する基板上に異なる組織から採取した細胞群を播種,マイクロトンネルを介して両者の結合を導く共培養を試みた.ββ-tubulin,synapsin Iを利用した免疫化学染色により,マイクロトンネル内での突起の成長,伸長した突起から標的組織へのシナプス結合形成を確認した.(3)脳幹神経核から採取した細胞群の培養と電気活動計測平成25年度の研究実施計画として設定した検討課題に対して以下の成果を得た.(1)脳幹神経核から採取した細胞群の培養海馬,大脳皮質等上位の中枢神経系に広範囲調節系として作用し,かつその同期活動(同期活動制御が正常な範囲を逸脱した場合にてんかん様の活動が発生すると考えるのが本研究の立場である)制御に本質的な役割を担うと考えられる背側縫線核(dorsal raphe nucleus; DRN,セロトニン作動性)の細胞群採取とその培養手法確立を重点的に進めた(ノルアドレナリン作動性青斑核; LCについてはH24年度に実施).今回,ラット新生児から採取した脳幹細胞群を分散培養し,5-Tryptophan Hydroxylaseを指標とする免疫化学染色による評価を実施した.高効率に当該部位を摘出,採取するプロセスを確立することができた.また,微小電極アレイ基板(MicroElectrode Array; MEA)上で培養した細胞群から培養13日目の時点で自発電気活動を計測することに成功した.(2)海馬培養神経回路の同期電気活動に対する神経調節物質の効果ノルアドレナリン(NE)投与の効果につき,同期活動の指標であるネットワークバーストに焦点を絞って計測・解析した.スパイク数,バースト数,バースト持続時間,バースト活動の空間的な広がり,のいずれにおいてもNE投与による抑制効果が観測され,NE作動性神経核活動の抗てんかん効果を示唆する結果となった.同時にこの効果が培養神経回路の発達段階に依存して変化する可能性が示唆され,培養開始後2,3,4週間の試料に対するNE投与の効果を系統的に調べた.発生するバースト数が減少する傾向は全ての試料に共通であったが,1バーストの持続時間と含まれるスパイク数,バースト活動の空間的な広がりについては3週間までとそれ以降で異なる傾向を示すことがわかった.平成24年度の研究実施計画として設定した検討課題に対して以下の成果を得た.脳幹神経核から採取した細胞群の培養海馬,大脳皮質等上位の中枢神経系に広範囲調節系として作用し,かつその同期活動(同期活動制御が正常な範囲を逸脱した場合にてんかん様の活動が発生すると考えるのが本研究の立場である)制御に本質的な役割を担うと考えられる青斑核(locus ceruleus; LC,ノルアドレナリン作動性)の細胞群採取とその培養手法確立を重点的に進めた.げっ歯類の神経系において,青斑核の細胞数はごく少数(1,500個程度)とされている.今回,脳幹組織からの系統的な切片作製と特定部分の切り出しにより試料を調整し,dopamine beta-monooxygenase (DBH:ノルアドレナリン作動性のマーカ)を指標にした免疫化学染色による評価を適用した.その結果,高効率に当該部位を摘出,採取するプロセスを確立した.海馬培養神経回路の同期電気活動に対する神経調節物質の効果微小電極アレイ基板(MicroElectrode Array; MEA)を利用して神経活動を時空間的に広がるパターンとして評価するのが本研究の特徴である.