hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝細胞増殖因子の活性化に関与する新規セリンプロテアーゼの構造と機能の解析

肝細胞増殖因子(HGF)は、肝細胞の増殖を促進する蛋白性因子であり、肝障害後の肝再生に重要な役割を果たすと考えられている。HGFは一本鎖前駆体として生成・分泌後、細胞外においてプロセシングされヘテロダイマー構造に変換し活性化される。我々は、一本鎖HGFをヘテロダイマーに変換する活性を有する新規のセリンプロテアーゼをヒト血清より精製し、HGF activatorと名付けた。本研究では、HGF activatorの構造、活性化の機序およびHGFの活性化への関与について解析し以下の知見を得た。1.cDNAの塩基配列の決定により、活性型HGF activatorは、655アミノ酸からなる不活性型前駆体より生成することが明らかになった。また前駆体のもつドメイン構造が、血液凝固XII因子のドメイン構造と同じであった。2.cDNA構造より推定されたHGFactivator前駆体蛋白質をヒト血漿より精製したところ、前駆体は一本鎖型であり、プロセシングにより活性化されることが明らかになった。また前駆体は陰電荷物存在下でトロンビンにより活性化されることを見出した。したがってHGFactivatorは血液凝固に伴って活性化されることが示唆された。3.正常臓器に存在するHGFは、すべての臓器の不活性型一本鎖前駆体であった。ヘパトトキシンにより障害が起こった肝臓では、約30%が活性型ヘテロダイマー構造であった。しかしながら他の臓器では、不活性型一本鎖であった。したがってHGFは障害臓器特異的に活性化されることが明らかになった。4.障害肝においてHGFを活性化する酵素活性が誘導されていることを見出した。この酵素活性がHGF activatorの活性を中和する特異的抗体で阻害されることから、HGF activatorは障害肝においてHGFを活性する酵素として機能することが明らかになった。本研究では、HGF activatorのcDNAクローニングを行い、その構造を解析した。またin vivoにおけるHGFの活性化の機序を明らかにするために、肝障害に伴うHGFの活性化について解析した。また前駆体のもつドメイン構造が、血液凝固VII因子のドメイン構造と同じであった。精製した前駆体を用いて活性型HGF activatorを生成するプロセシング酵素を検索したところ、陰電荷物存在下でトロンビンにより活性化されることを見出した。したがってHGFactivatorは血漿凝固に伴って活性化されることが示唆された。3.正常臓器に存在するHGFは、すべての臓器で不活性型一本鎖前駆体として存在することが明らかになった。

しかしながら他の臓器では、不活性型一本鎖であった。したがってHGFは障害臓器特異的に活性化されることが明らかになった。また障害肝においてHGFを活性化する酵素活性が誘導されていることを見出した。肝細胞増殖因子(HGF)は、肝細胞の増殖を促進する蛋白性因子であり、肝障害後の肝再生に重要な役割を果たすと考えられている。HGFは一本鎖前駆体として生成・分泌後、細胞外においてプロセシングされヘテロダイマー構造に変換し活性化される。我々は、一本鎖HGFをヘテロダイマーに変換する活性を有する新規のセリンプロテアーゼをヒト血清より精製し、HGF activatorと名付けた。本研究では、肝障害に応答したHGFの活性化にHGF activatorがいかに機能するかについて解析し以下の知見を得た。1.四塩化炭素により障害を惹起した肝臓のホモジェネートには、HGFを活性化する酵素活性が誘導される。この酵素活性がHGF activatorに由来するか否かについてHGF activatorの活性を中和する特異的抗体を用いて検討したところ、障害肝ホモジェネート中の活性がこの中和抗体でほとんど阻害された。したがってHGFactivatorは、障害肝においてHGFを活性化する酵素として機能することが明らかになった。2.HGF activatorの不活性型と活性型の性質について検討したところ、HGF activatorは活性化に伴ってヘパリン結合性が強くなるという性質をもっていた。したがってHGFactivatorは不活性前駆体として血液中を循環しているが、組織障害時には局所的に活性化し、活性化したHGF activatorは細胞表面のマトリックスへの結合により近傍に固定され、局所的にHGFを活性化する機能を果たしていると考えられる。3.四塩化炭素により障害を惹起した肝臓のHGF activator mRNAの発現について解析したところ、障害に伴ってmRNAの発現が誘導された。したがってHGFactivatorは組織障害に応答してその産生量が増加し、HGFの活性化に機能すると考えられる。
漸近解析と数値的手法を用いた非線形偏微分方程式の研究

本研究では,漸近解析と数値的手法を用いて非線形反応拡散方程式に現れる進行波の性質を調べている.今年度は,前年度に行った非一様な媒質中の進行波に関する問題の研究をさらに推し進めた.特に,境界がノコギリの歯状をした領域における進行波の問題については,これまで未解明であった解の境界付近での漸近展開の重要な足がかりが得られた.また,波状境界が進行波の速度に及ぼす影響についても,詳細な数値計算データを集め,これまでの予想がほぼ裏付けられた.これらの成果の内容をさらに掘り下げて結果をまとめ,今年中に専門雑誌に発表したいと考えている.冬にはBowen氏はイギリスを訪れ,ノッティンガム大学のJ.R.King教授と研究情報の交換をした.また,本学のG.Weiss助教授と脈動進行波やHele-Shaw方程式に関する情報交換も行った.これとは別に,Duke大学のT.P.Witelski教授とBowen氏は,Springer出版社に漸近解析と摂動法の入門書に関する執筆計画書を提出した.これまで得られた成果をセミナーや研究集会で数回発表した.また,Bowen氏は以前から科学者の社会貢献を重視しており,今年度は「JSPSサイエンス・ダイアログ」事業に協力して山梨県都留高等学校で高校生と交流した.今年度は,ノコギリの歯状の境界をもつ帯状領域における界面運動を研究した.より詳しく述べると,この領域は平面内の無限帯状領域で,その境界はノコギリの歯のように周期的な凹凸を有する.この領域内で,V=κ+Aという運動方程式で支配される曲線の運動を考えた。ここでVは曲線の法線方向の速度,κは曲率,Aは定数である.一般に,この種の方程式はAllen-Cahn型の非線形拡散方程式の特異極限として現れる.また,上のような帯状領域において周期進行波が存在することが,最近のLou-俣野-中村の研究で示されている.本研究では,領域の境界の形状が曲線の運動に及ぼす影響を漸近解析によって詳細に調べるとともに,境界の形状と進行波の速度に関するLou-俣野-中村の研究をさらに発展させることを目指した.この曲線は,領域の境界付近で非常に激しい運動と緩やかな運動を交互に繰り返す。このため,漸近解析は容易ではない.今年度は,接合漸近展開の手法を用いて準備的な解析を行い,境界のギザギザを限りなく小さくしていった均質化極限に関して一定の知見を得た.次に,上の方程式の係数を時間周期的に変化させたV=b(t)κ+Aという形の方程式を考えた.この問題では,界面運動が空間的周期性と時間的周期性の両方の影響を受ける.こうした状況下で現れる周期進行波の性質は,これまでまったく知られていなかった.空間的周期性と時間的周期性の一方だけでは進行波の速度を速めることができない、しかし興味深いことに,2つの周期性の効果が同時に働くと,進行波の速度が速くなる場合があることが,数値実験によって確かめられた.このような現象は新しい発見である.現在,パラメータの値をさまざまに変えながら数値実験を続けて,この現象の詳しい分析を行っている.本研究では,漸近解析と数値的手法を用いて非線形反応拡散方程式に現れる進行波の性質を調べている.今年度は,前年度に行った非一様な媒質中の進行波に関する問題の研究をさらに推し進めた.特に,境界がノコギリの歯状をした領域における進行波の問題については,これまで未解明であった解の境界付近での漸近展開の重要な足がかりが得られた.また,波状境界が進行波の速度に及ぼす影響についても,詳細な数値計算データを集め,これまでの予想がほぼ裏付けられた.これらの成果の内容をさらに掘り下げて結果をまとめ,今年中に専門雑誌に発表したいと考えている.冬にはBowen氏はイギリスを訪れ,ノッティンガム大学のJ.R.King教授と研究情報の交換をした.また,本学のG.Weiss助教授と脈動進行波やHele-Shaw方程式に関する情報交換も行った.これとは別に,Duke大学のT.P.Witelski教授とBowen氏は,Springer出版社に漸近解析と摂動法の入門書に関する執筆計画書を提出した.これまで得られた成果をセミナーや研究集会で数回発表した.また,Bowen氏は以前から科学者の社会貢献を重視しており,今年度は「JSPSサイエンス・ダイアログ」事業に協力して山梨県都留高等学校で高校生と交流した.
遺伝子制御ネットワークの構築によるサルモネラ菌の薬剤耐性獲得メカニズムの解明

サルモネラ菌感染症の対策は、本邦における公衆衛生上の大きな課題である。サルモネラ菌は抗菌薬の投与に応答して、自ら非増殖状態に移行することで抗菌薬に対する耐性を高めることが知られており、有効な薬物治療法はいまだ確立されていない。本研究では、増殖状態および非増殖状態サルモネラ菌を含む細胞における遺伝子制御ネットワークを比較し、サルモネラ菌の抗菌薬負荷に応答した非増殖状態への移行メカニズムを明らかにする。さらに非増殖状態サルモネラ菌を含む細胞に特異的なネットワークのハブ分子に対する阻害薬を抗菌薬と併用することで効果的な薬剤併用療法を設計する。
分子アーキテクトニクスを志向した水素終端化シリコン表面の新規化学修飾法の開発

本研究では代表者が開発したヒドロシランの遷移金属触媒によるアリール化反応を水素終端化シリコン表面の化学修飾に展開することで、良質のシリコンー芳香族化合物修飾表面を効率的に構築する手法を開発する。合わせて、新学術領域の他の研究者と協力をし、ミクロサイズやナノサイズギャップシリコン上を化学修飾した電極を調製し、それらの表面構造や単分子の物性調査を行う。水素終端化シリコン基板をパラジウム触媒の存在下、ヨウ化アリールと反応させるとシリコン基板上に芳香族基をSi-C(sp2)結合を介して結合することができる。この方法を活用し、まず最初にマイクロギャップを有する基板を異方性エッチングを利用して調製した。具体的にはSOI(silicon on insulator)基板をHFで1分間、続いてKOH水溶液で90分間処理することで最小で300 nm程度のギャップを有する水素終端化シリコン電極を作成することができた。表面の構造確認はSEMやデジタル顕微鏡にて行った。この水素終端化シリコン電極をパラジウム触媒の存在下、さまざまなヨウ化アリールと塩基の存在下室温で反応させることで芳香族置換基を固定化することができた。修飾の状況は電気化学的手法によりおよそ20%程度化学修飾されていることが確認できた。ジベンゾシロールはπーπ*遷移による蛍光特性を持つことから、その合成やエレクトロニクス材料等への応用の点で広く研究がなされてきた。次にジベンゾシロール骨格をシリコン表面で形成することを目的とし、水素終端化Si(100)表面と2,2'-ジヨードビアリール化合物をパラジウム触媒の存在下で反応させ、表面上の構造について解析を行った。2,2'-ジヨードビアリール化合物がSi(100)表面に固定化されるか検討するために、dimethyl 2,2'-diiodobiphenyl-4,4'-dicarboxylateを水素終端化Si(100)表面に反応させ、表面IRにて構造決定を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、環状のシロール骨格をシリコン表面で形成することを目的とし、水素終端化Si(100)表面とジヨードビアリール化合物をPd触媒を用いて反応させ、表面上の構造について解析を行った。ジヨードビアリール化合物がSi(100)表面に固定化されるか検討するために、dimethyl 2,2'-diiodobiphenyl-4,4'-dicarboxylateを水素終端化Si(100)表面に反応させた。この化合物は官能基にエステルを持つため、IRを用いた存在の検出が比較的容易である。反応を行った基板の表面IRスペクトルの結果を次に示す。1430 cm-1にシリコン原子ーアリール基に由来するピーク、1597 cm-1にC=C二重結合に由来するピーク、1718 cm-1にエステルのC=O二重結合に由来するピークが観測された。これらのピークが観測されたことから、Si(100)表面上に固定化されたことが確認できた。次に、ジヨードビアリール化合物がSi(100)表面に化学的に固定化されているか検討するために、2,2'-diiodobiphenylの固定化と、X線光電子分光(XPS)を用いた解析を行った。ピークフィッティングを行ったXPSスペクトルを次項に示す。シリコン基板に由来するSi-Si結合より高エネルギー側に、シリコン基板とアリール基のSi-C結合に由来するSi-C結合のピークが観測された。Si-Si結合に対するSi-C結合のエネルギーシフト値は2p1/2ピーク、2p3/2ピークともに0.25 eVであり、文献値(0.27 eV)と概ね合致していた。このことから、Si-C共有結合を介してSi(100)基板に化学的に結合されたことが確認できた。

次にジベンゾシロール骨格をシリコン表面で形成することを目的とし、水素終端化Si(100)表面と2,2'-ジヨードビアリール化合物をパラジウム触媒の存在下で反応させ、表面上の構造について解析を行った。2,2'-ジヨードビアリール化合物がSi(100)表面に固定化されるか検討するために、dimethyl 2,2'-diiodobiphenyl-4,4'-dicarboxylateを水素終端化Si(100)表面に反応させ、表面IRにて構造決定を行った。自分たちの研究ばかりでなく、他研究者との共同研究を通して、Si(111), Si(100)表面上へのチオフェン類の固定化、微小パターンシリコン電極への4-ヨードフェニルフェロセンの固定化を行い、成果も出つつある。27年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、共同研究を推進し、ナノギャップ電極を作製し、Pd触媒を用いたアリール化法により架橋配位子を固定化することで、架橋配位子の電気特性を調査する。
難治性の繊維性良性腫瘍(デスモイド腫瘍)の再発を規定する特異的遺伝子の同定

腫瘍発生初期の遺伝的な変化を検索するためには、細胞の無制限の増殖を示すが転移せず、形態学的にも不揃いのない良性腫瘍での遺伝子異常の解析が必要と考えられる。本研究では、正常の線維芽細胞に対して良性・再発性の線維腫瘍のデスモイド腫瘍で、特異的に発現が増加・減少する遺伝子産物をRAP(RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR)法を用いてスクリーニングする。さらに、本研究はその中から細胞増殖に関与する未知の遺伝子を分子クローニングし解析することを目的とする。平成9年度は非家族性に発生した腹壁外デスモイド腫瘍の孤発例(4例)よりこの腫瘍の発生もしくは進展に関わる未知の遺伝子のクローニングを試み、以下の研究を行った。1.デスモイド腫瘍の病理組織学的解析及びSCIDマウス移植株の樹立:デスモイド摘出材料の一部を免疫不全動物(SCIDマウス)への移植を試みた。しかしながら、通常の状態では移植後3ヵ月以上観察したが、腫瘍Xenograft株は樹立できなかった。腫瘍組織及び正常組織より全RNAを抽出し、poly(A)+RNAを精製した後、反応産物の一部をキャピラリー電気泳動装置(ABIPRISMTM 310,genetic analizer)を用いて分離し、腫瘍特異的に発現が増加・減少しているピークの同定を試みた。現在までに、特異的と思われるピークを選択し研究3へ展開中である。3.腫瘍関連未知遺伝子のクローニングと解析:RT-PCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、特異的ピーク相当部を切り出した。ゲルよりDNAを抽出し、同じプライマーを用いたPCRで再増幅した後T-ベクターにクローニングした。目的のピークに対応するクローンがとれたことをgenetic analizerで確認、遺伝子配列を現在解析中である。近年、癌におけるgenetic instability(遺伝的不安定性)の頻度がきわめて高いことが報告されており、癌においては“無制限の増殖"という本質以外に、転移能の獲得のように二次的、三次的に遺伝子上の変化が加わっていることが示唆されている。このような背景から、真の意味で腫瘍発生初期の遺伝的な変化(原因となる変化)を検索するためには、細胞の無制限の増殖を示すが転移せず、形態学的にも不揃いのない良性腫瘍での遺伝子異常の解析が必要と考えられる。本年度の研究では、正常の線維芽細胞に対して良性・再発性の線維腫瘍のデスモイド腫瘍で、特異的に発現が増加・減少する遺伝子産物をRAP(RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR)法を用いてスクリーニングした。デスモイドの増殖形式は浸潤性で周囲正常部との境界が不明瞭であり、摘出材料は詳細に病理組織学的に検索された。腫瘍の一部は免疫不全動物(SCIDマウス)への移植を試み、残りの材料を以下の分子生物学的解析に用いた。腫瘍組織及び正常組織より全RNAを抽出し、任意プライマー(20mer)を用いてRT-PCRを行った。反応産物をキャピラリー電気泳動装置(ABI PRISMTM genetic analizer)を用いて分離し、腫瘍特異的に発現が増加・減少しているピークを同定した。RT-PCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、特異的ピーク相当部を切り出し、ゲルよりDNAを抽出し、同じプライマーを用いたPCRで再増幅した後T-ベクターにクローニングした。現在、目的のピークに対応するクローンをgenetic analizerで確認し、遺伝子配列を決定し既知の遺伝子と比較・検討中である。
新規アポトーシス制御分子HBXIPの肝発癌過程に果たす役割に関する研究

B型肝炎ウィルス(HBV)感染した肝細胞におけるアポトーシス制御機構の異常を解析する目的で、HBVウィルス分子のひとつであるXタンパク質と相互作用を有する宿主タンパク質であるHBXIPの解析を進めている。HBV感染細胞におけるHBXIPノックダウン効果を検討する目的で、血清由来のin vitroウィルス感染系の構築を行った。その結果、ヒト肝組織由来の細胞株であるHepG2細胞の培地に複数の分化誘導薬剤を経時的に添加すると、HBV感染に対する細胞の感受性が高まることを見いだした。この分化誘導後の培養細胞株にHBV陽性の患者血清を添加すると、シャーレ内でウィルス感染が成立し、HBVの複製・増殖が再現された。そこで、HBXIPに対する特異的なsiRNAを合成し、内在性HBXIPノックダウン細胞の細胞増殖活性とウィルス感染に対する感受性を検討したところ、内在性HBXIPノックダウン細胞では細胞周期がG2/Mに停止すると同時に、感染ウィルスの複製増殖活性も有意に低下するという可能性が示唆された。しかしながら、本研究の遂行中にヒト遺伝子配列解析結果が更新され、本来91アミノ酸で構成されていると想定されていたヒトHBXIPの遺伝子配列の転写開始地点の上流にもうひとつ転写開始地点が存在しており、ヒトHBXIPとして174アミノ酸からなる分子が産生されている可能性がGeneBankにて明らかとなった。そこで、我々がこれまで解析してきた91アミノ酸HBXIPと174アミノ酸HBXIPのいずれがヒト肝細胞で抗アポトーシス作用を担っているのかについての再検討をあらためて進めているところである。B型肝炎ウィルス(HBV)の感染した肝細胞のアポトーシス制御機構の異常を解析する目的で、ウィルスタンパク存在下におけるヒト肝癌細胞株中のSurvivinとHBXIPの発現量の変化を検討した。培養細胞株にHBV Xタンパク質を過常発現させた系ではHBXIPのmRNA発現量の変化は定量PCR(リアルタイムPCR)で認められなかったが、Survivin発現量が有意に増加することが明らかとなった。次に、ヒト肝癌細胞株を用いたHBV感染系を樹立し同様の検討を行ったところ、HBXIPとSurvivin mRNA発現量の変化は過常発現系と同じ傾向を示すことがわかった。次に、内在性HBXIPのHBV感染細胞における役割を検討する目的で、HBXIPとSurvivinそれぞれに特異的なsiRNAを合成し、細胞内導入実験を行った。まず最初に、内在性HBXIPのノックダウン効果を、HBXIPに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。次に、siRNAにより内在性HBXIPをノックダウンした細胞の細胞増殖とアポトーシス感受性の変化を検討したところ、HBXIP発現量の低下した細胞では細胞周期がG2/M期で停止するとともに抗癌剤に対するアポトーシス感受性が増強することが明らかとなった。内在性HBXIPのノックダウンの表現型は、Survivinをノックダウンした細胞と極めて類似してたことから、アポトーシス制御のみならず細胞周期制御においてもHBXIPはSurvivinと同様の役割を果たしていることが推測された。現在、このHBXIPノックダウン細胞へのHBV感染実験を進めているところである。
大脳皮質層構造構築過程における神経細胞移動に与える低線量電離放射線の影響

E12-13に誕生した大脳皮質神経細胞を蛍光ラベルした後に、1.0-1.5Gまでの電離放射線の照射を行い、胎児の脳スライスを作成して蛍光顕微鏡下における詳細な経時観察を行った。対照群の場合、intermediate zone(IZ)を超えた神経細胞は、leading processが直線的にpial surfaceに向かって伸び、双極性となった細胞体がmarginal zone(MZ)に到達した後、apical dendtiteを伸長して細胞層を形成する。一方、低線量放射線照射群では、細胞がIZからMZへ移動する際にleading processが一方向に伸びず、頻繁に分枝することが観察された。同時に神経細胞の放射方向への移動が障害され、移動が遅れる例、MZまで到達しない例が散見された。照射後に誕生した神経細胞も同様の挙動を示した。このとき移動神経細胞の足場とされるラジアルグリアルファイバーの形態をDiIを導入して解析したところ、放射線照射群ではファイバーがMZとの結合を失い、退縮しているのが散見された。以上の結果から、低線量電離放射線が大脳皮質発生の複数の局面に影響を与えていることが示唆された。以上を日本放射線影響学会第48回大会でポスター発表した。今後これらの現象に関与すると思われる機能分子の解析を行う予定である。細胞における増殖、移動、分化等を制御する分子の機能を解析する場合に、目的分子自身やその機能喪失/抑制分子を発現させ、同時に蛍光タンパク質を導入して観察を行うという手法が広く用いられる。今回、我々は大脳皮質組織中の任意の細胞において、蛍光タンパク質の蛍光波長を、非侵襲的に操作する事に成功した。これにより、遺伝子導入された移動中の単一神経細胞を、三次元生組織内で長期間同定する手法を確立し、Experimental Neurology誌に発表した。電離放射線による脳の機能的、組織学的な障害が発生する過程における細胞分裂、細胞挙動、形態、を詳細かつ横断的に解析することを目的として以下の研究を遂行中である。子宮内マウス胎児大脳皮質にアデノウイルスベクターを感染させることで、胎生11.5-12.5日に誕生した神経細胞を、誕生日特異的に蛍光タンパク質でラベルした。直後に0-2Gまでの電離放射線を照射した後、二日後に胎児を取り出し、脳スライスを作成して蛍光顕微鏡下で経時観察を行った。その結果、電離放射線を照射されたマウス胎児大脳皮質において移動中の神経細胞の形態、移動について、まだ予備的ではあるが、いくつかの観察結果が得られた。まず、移動中の神経細胞においてintermediate zoneからcortical plateに移動する際の神経細胞のleading processは、無照射群では直線的にpial surfaceに向かって伸び、次いで細胞体がmarginal zone(MZ)に到達するのであるが、低線量放射線照射群では直線的に伸びず、また頻繁に分枝することがあげられる。またそれに続く神経細胞の放射方向への移動が障害され、MZまで到達しない細胞が散見された。これらの異常の度合いは線量に比例して増悪し、2Gを超えるところで胎児の死亡率が大幅に上昇し、観察が不可能となった。以前にXueらが低線量放射線の照射によって胎生後期のラジアルファイバーが乱れているという報告を行ったが(Xue-Zhi et al.1999)、上記の観察結果が神経細胞移動のガイド役であるとされるラジアルファイバーの乱れによる可能性があり、非常に興味深い。1.5Gy照射直後の胎児脳切片をγH2AXの抗体で染色すると脳全体でFociが観察され、DNA二重鎖切断が起こっていた。照射と同時にラベルを入れた細胞と、照射後一定期間おいてからラベルを入れた神経細胞の動態を現在調査中である。
３次元血流領域における流れの複雑性の定量による脳動脈瘤増大・破裂機序の解明

三次元脳血管撮影またはCT血管造影から得られた形状データで患者固有モデルを作製し、拍動流による数値流体力学(CFD)解析を行った。次に剪断応力Wall Shear Stress (WSS)、WSS関連血行力学的パラメーター、瘤内血流速および血流パターンを計算し可視化した。CFD解析は市販のアプリケーションソフトに独自プログラム(コード)で改良を加えて実施した。さらにCFD解析結果は使用する画像データの質や種類、格子作成技術、解析条件が大きく影響するため、造影剤注入速度や画像解像度などを含め、手技を標準化し、最適なデータ獲得および解析法を設定した。また、分岐部動脈瘤のモデルを複数作製し、全てのモデルの形状データはMimics Innovation Suiteにてstereolithographyで出力すると共に、動脈瘤ドームにおける血流速度の流線を可視化し、WSSおよびWSSベクトルのゆらぎを示すOscillatory Shear Indexを定量した。複雑な三次元血流の定量化を可能とする新しいパラメーターとして暫定的に、時間依存性のゆらぎ、ベクトルに沿った速度勾配、速度勾配ベクトルの時間依存性ゆらぎなどを示すパラメーターを予備的に考案し、三次元血流領域内における速度ベクトルに基づき計算式を作成した。これらの新しいパラメーターが形態不整に伴う血流の複雑性を定量できるか動脈瘤のブレブの数を増やすなど、より形態が複雑な動脈瘤モデルなどで検証し、改良した。現在、完成した新しいパラメーターが動脈瘤の破裂と関連するか、現在までに蓄積した動脈瘤データベースで、後方視的に従来のパラメーターと比較検討しつつ検証しており、有望な所見を得つつある。今年度はさらに解析を進め、論文にまとめる予定である。当初計画通り、研究成果が得られつつあるため。今後も基本的に当初の計画通り、実施する予定である。今後、完成した新しいパラメーターが動脈瘤の破裂と関連するか、現在までに蓄積した動脈瘤データベースで、後方視的に従来のパラメーターと比較検討しつつ検証する予定である。当初計画通り、最適なデータ獲得および解析法を設定した。また、複雑な3次元血流の定量化を可能とする新しいパラメーターを考案し、少数例での検討ではあるが、6報の英文誌で発表するなど、研究成果を得ているため。

完成した新しいパラメーターが脳動脈瘤の破裂と関連するか、検証するためには多くの症例が必要であるが、脳動脈瘤データベースを構築し、既に多くの症例を蓄積するなど、準備状況は万全である。今後も基本的に当初の計画通り、実施する予定である。
高速AFMによる古細菌由来MCMタンパク質複合体の観察

本研究の遂行過程で、ストレプトアビジンと同等のビオチン結合能を有するタマビジン2が、ポリエチレングリコールと高濃度のマグネシウムイオン存在下において、マイカ上に二次元結晶を形成することを昨年度までに発見した。これはビオチン化した生体分子の選択的な固定が可能な基板を短時間で作製する方法として有用である。この二次元結晶を用いて、古細菌M. thermoautotrophicum由来MCMタンパク質を固定化し、高速AFMによる観察を行った。MCMタンパク質のC末端にはAvi-tagを導入し、ビオチンリガーゼによってAvi-tagのビオチン化を行った。観察の結果、横倒しの状態で固定された、非対称な高さプロファイルを持つ六量体リング及び対称的な高さプロファイルを持つ十二量体と思しき構造の2種類の構造体が主に見られた。さらに六量体リング構造を詳細に観察したところ、N末側のリング中央部が時折突出する様子が捉えられた。一方、タマビジン2二次元結晶の応用研究も行った。ビオチン化したシャペロニンGroELの14量体ダブルリング構造を横倒しの状態で二次元結晶上に固定化し、コシャペロニンGroES 7量体との相互作用を、巻き戻し可能な変性基質タンパク質存在下及び基質タンパク質非存在下において高速AFMによって可視化した。この結果と既に報告された巻き戻し不可能な変性基質タンパク質存在下での結果を比較し、GroELとGroESの結合・解離の反応パターンと反応ステップの速度の相違等を明らかにした。DNA複製は、二本鎖DNAが一本鎖DNAに分離され、それぞれの鎖を鋳型に新生鎖が合成される過程である。MCM (minichromosome maintenance)タンパク質は、複製開始から複製フォークを形成する段階において重要であり、六量体リングを形成してATPの加水分解エネルギーを用いて二本鎖DNAを一本鎖DNAに分離するヘリカーゼとして働く。古細菌由来のMCMタンパク質はホモ六量体のリングを形成し、ヘリカーゼ活性を発揮することが知られている。本研究では、古細菌由来のMCMタンパク質六量体リングがATPを利用してどのように二本鎖DNAを一本鎖DNAに分離させているのかを高速AFMを用いて直接観察し、動的プロセスを解明することを目的とする。これまでに、古細菌M. thermoautotrophicum由来のmthMCMタンパク質、S.solfataricus由来のssoMCMタンパク質、及びAvi-tagと呼ばれる15アミノ酸からなる配列中のリジン残基にビオチンを導入できるビオチンリガーゼの調製を行った。mthMCMタンパク質にビオチンを導入するため、C末端にAvi-tagを付与し、ビオチンリガーゼを用いてビオチン化を行った。また、観察基板として、ストレプトアビジンと同程度のビオチン結合能を有するタマビジン2の二次元結晶をマイカの上に直接形成させる方法を開発した。タマビジン2の二次元結晶上にはビオチン化されたタンパク質のみを固定することができ、またマイカの影響を受けることなくタンパク質のダイナミクスを観察することができる。高速AFM観察の結果、ビオチン化mthMCMタンパク質の六量体リングが、タマビジン2の二次元結晶上に横倒しの状態で固定されることを見出した。これまでのビオチン化サンプルの固定用基板としてはストレプトアビジンの二次元結晶が用いられてきたが、ストレプトアビジンの二次元結晶はマイカの上に直接形成させることはできず、ビオチンを含む脂質膜をマイカの上に張る必要があり、数時間から1日費やさなければならなかった。しかしながら、本研究課題の遂行過程において、ストレプトアビジンと同程度のビオチン結合能を有するタマビジン2の二次元結晶を、マイカの上に直接形成させる方法を見出した。この発見は当初の予定にはなかったことであるが、これにより、ビオチン化サンプル用の基板を40分程度で作製することが可能になり、本研究課題を遂行しやすくなった。実際、C末端をビオチン化したmthMCMタンパク質の六量体リングをタマビジン2の二次元結晶上に横倒しに固定することに成功した。

これまでにタマビジン2の二次元結晶上に、mthMCMタンパク質を横倒しの状態でAFM観察する方法を見出した。今後は、固定したmthMCMタンパク質六量体のATP存在下での構造変化の観察や、二本鎖DNAとの相互作用の観察を行う予定である。また、ssoMCMタンパク質についても同様にC末端にビオチンを導入することにより、タマビジン2の二次元結晶上に固定できるか確認し、ATP存在下や二本鎖DNA存在下でのmthMCMタンパク質六量体との違いを観察する予定である。本研究を通じて開発したタマビジン2の二次元結晶の作製法は新しいAFM観察用の基板として有用であると考えられるため、論文としてまとめる予定である。
心身障害児における歯周疾患の臨床評価とその病態のメカニズム

研究目的および方法:愛知学院大学歯学部附属病院小児歯科外来に来院した健常小児と各種心身障害児の歯周疾患の臨床評価および細胞学的特性を検討した。調査対象は.本学小児歯科外来に来院した全身的既往歴のない健常小児30名(健常群13名・歯肉炎群17名)および各種心身障害児3名(ダウン症候群1名、抗てかん薬服用児1名、精神発達遅滞児1名)を被験者とした。歯肉炎群は、CPITN codeが6以上の者とした。各被験者の臨床評価の被験歯は、上顎右側中側切歯および第一大臼歯、上顎左側第一大臼歯、下顎左側中側切歯および第一大臼歯、下顎右側第一大臼歯とし、CPITNcode、PIIndex (Periodontal Index)を、上下顎の前歯部においてはPMAN Indexを使用した。研究結果:1)健常小児のうち、健常群のCPITcode1.08【.+-。】0.40(平均【.+-。】SE以下同じ)で歯肉炎群は6.71【.+-。】0.14であった。健常群のPIは0.37【.+-。】0.13で歯肉炎群は1.67【.+-。】0.07であった。健常群のPMA Indexは9.0【.+-。】2.61で歯肉炎群は21.1【.+-。】0.41であった。各種心身障害児3名のCPITN codeは11.0【.+-。】1.01であり、PMA Indexは22【.+-。】0.14、PIは2.08【.+-。】0.02であった。2)(1)American Type Culture Collection社(CRI、1292:Maryland,USA)製ヒト歯肉線維芽細胞(以下Gin-1と略す)をコントロールとし、健常小児と心身障害児(抗てんかん服用児)の歯牙抜去時の歯肉線維芽細胞を用いて細胞増殖能を検索した結果.抗てんかん薬服用児、Gin-1、健常小児の順で細胞増殖能が高かった。(2)健常小児(健常群)の歯肉線維芽細胞を用い、一定の密度に調整した細胞にサイトカイン4種類(EGF、FGF、IL-1β、IL-6)を添加して細胞外マトリックスである2種類のゼラチナーゼ(MMP2、MMP9)の活性を細胞特性として検索した結果、MMP2においてEGF、FGF、IL-1βは濃度依存的に活性がみられた。IL-6は濃度依存性は認められなかった。今後、症例をさらに増やし、臨床評価および各種心身障害児の歯肉線維芽細胞を用いての細胞学的特性を比較検討を行っていく予定である。】0.14であった。】0.07であった。】0.41であった。】0.02であった。(2)健常小児(健常群)の歯肉線維芽

細胞を用い、一定の密度に調整した細胞にサイトカイン4種類(EGF、FGF、IL-1β、IL-6)を添加して細胞外マトリックスである2種類のゼラチナーゼ(MMP2、MMP9)の活性を細胞特性として検索した結果、MMP2においてEGF、FGF、IL-1βは濃度依存的に活性がみられた。IL-6は濃度依存性は認められなかった。今後、症例をさらに増やし、臨床評価および各種心身障害児の歯肉線維芽細胞を用いての細胞学的特性を比較検討を行っていく予定である。
液状食品の有効成分を損なわない新方式殺菌装置の開発

液状食品の含有成分を変質させない非加熱殺菌方式としてのパルス殺菌法の実用化に向けての研究を行った。二年間にわたる研究の結果次のような成果を得た。(1)印加する電気パルスエネルギを最小にして殺菌効果を向上させるためには、タンパク質の変質温度である60°C以下での加熱を併用することが極めて効果的であることが分かった〔1〕。(2)食品への応用を念頭においた場合、処理後に生体有害物質が残存しないことが第一条件であるため、パルス処理による活性種等の生成についての実験的検討を行った結果、電極形状特に周辺部の形状が重要であることがわかった〔2〕。(3)菌類に対するパルス処理によって、内容物の放出が起こるばかりでなく、その放出が選択的に行われることがわかった〔3〕。今後の方向として、パルス電源を設計するための指針として、装置形状変数を取り入れたシミュレーション手法を用い、両者の整合をよりよくすることにより、パルスエネルギ注入効率を高めることの出来るシステムを開発する予定である。さらに、殺菌処理後の安全性に関する検討も今後継続する予定である。液体食品の含有成分を変質させない、非加熱殺菌方式としてのパルス殺菌法の、実用化に向けての研究を行った。本研究においては、その第一段階として次のような成果を得た。1、食品応用において、生体有害物質を生じないことは第一条件であるため、液体中でのパルス処理による活性種等の生成について実験的検討を行った結果、ストリーマ放電の生じない装置形状を用いる必要があることがわかった。2、殺菌槽をスケールアップする際には、殺菌特性のわかったユニットとしての殺菌槽とパルス電源の組み合わせを多数用意し、目的に応じて接続することにより、種々の操作条件に対応可能となることがわかった。3、より少ないパルス電気エネルギで加熱耐性菌等に対する殺菌効果の向上を図るために、タンパク質の変性温度以下(例えば60°C以下)での加熱を併用することが極めて効果的であることがわかった。以上の研究成果の一部は1993年11月に口頭発表[1]を行ったほか、1994年6月に国際会議[2]、1994年10月に国際会議[3]にて発表の予定である。なお、本研究経費にて購入した備品類の内、冷却遠心分離器については殺菌処理前の集菌、殺菌後の生残菌数の計測、ならびに細胞内容物の放出確認等に用い、パーソナルコンピュータとpHメータについては放電スペクトル解析、電気泳動ゲル解析等、ならびに試料溶液のpH測定に使用することにより、研究の進行に対して極めて有効であった。(1)印加する電気パルスエネルギを最小にして殺菌効果を向上させるためには、タンパク質の変質温度である60°C以下での加熱を併用することが極めて効果的であることがわかった[1]。(2)食品への応用を念頭に置いた場合、処理後に生体有害物質が残存しないことが第一条件であるため、パルス処理による活性種等の生成についての実験的検討を行った結果、電極形状特に周辺部の形状が重要であることがわかった[2]。(3)菌類に対するパルス処理によって、内容物の放出が起こるばかりでなく、その放出が選択的に行われることがわかった[3]。
サイクル域光パルスによる巨大加速度系の創出と吸収領域新規異常光学現象の探索

本年度は、サイクル域光パルスに関する以下の成果を得た。1)自己位相変調効果を用いて、1オクターブを超える超広帯域スペクトル(460-1060nm)を有する光パルスを発生し、研究者らが独自に作製した、変形スペクトル干渉位相電場再生システムおよびフィードバック位相補償システムによるフィードバック位相補償を行うことにより、2.8fs,1.5サイクルのフーリエ変換限界光パルスの発生に成功した。これは、スペクトル位相が決定された可視・赤外領域における世界最短パルスである。2)サイクル域の光パルスと物質の相互作用を考える場合、搬送波・包絡波位相の制御が重要となる。基本波・第2高調波自己位相参照干渉スペクトル測定装置、位相ロックループを用いて搬送波・包絡波位相を安定化した超オクターブ帯域3.3fs,1,7サイクル光パルスの発生に成功した。これは、搬送波・包絡波位相が安定化された世界最短パルスである。3)微細構造ファイバーであるフォトニック結晶ファイバー中にフェムト秒光パルスを伝播させることにより、620-945nm超広帯域スペクトルを発生させ、変形スペクトル干渉位相電場再生システム、フィードバック位相補償システムを組み合わせたフィードバック位相補償を行い、フォトニック結晶ファイバーからでは世界最短の5.8fs(2.3サイクル)の高繰り返し光パルスの発生に成功した。4)フェムト秒レーザーと走査トンネル顕微鏡を結合させ、フェムト秒時間分解トンネル電流の測定に成功した。この測定には、時間遅延を変調したフェムト秒パルス対を用い、試料としては低温成長GaNAsを用いた。試料は、653fsと55.1psの2つの高速緩和過程を示し、これらの結果は、従来のポンプ・プローブ法による光学測定の結果と一致し、本測定法の妥当性を示している。1.自己位相変調効果を用いて、1オクターブを超える超広帯域スペクトル(495-1090nm)を有する光パルスを発生し、これをフィードバック位相補償することにより、3.4fs,1.56サイクルの光パルスの発生に成功した。これは、可視・赤外領域における世界最短パルスである。このパルスを評価する変形スペクトル干渉位相電場再生システム、およびフィードバック位相補償システムも、本研究者らにより独自に開発されたものである。2.フォトニック結晶ファイバー、テーパーファイバーといった微細構造ファイバー中でのサイクル域光パルスの非線形伝播ならびにそれにともなう超広帯域スペクトル発生実験、および従来の緩変動包絡波近似を超えた理論的研究を行い、スペクトル広がりにおけるギャップの形成は、自己急峻化が引き金となり、その後、パルス内4光波混合が重要な役割を果たすことを明らかにした。3.微細構造ファイバーであるテーパーファイバー中でのフェムト秒光パルスの伝播にともなうスペクトル超広帯域化と変形スペクトル干渉位相電場再生システム、フィードバック位相補償システムを組み合わせることにより、テーパーファイバーからでは最短の16fsのパルスを得ることに成功している。この手法は、高繰り返しのサイクル域パルス発生に有効であると考えられる。4.Si(111)7×7表面にフェムト秒パルス対を照射し、このパルス対の時間間隔を変化させることにより、Si表面アドアトムの選択脱離に成功した。とくに、パルス対間隔を125fsに調整することにより、センターアドアトムとコーナーアドアトムの脱離効率比は22となり、センターアドアトムの選択的脱離が観測された。この現象における脱離メカニズムには、表面原子の8THz(=1/125fs)固有振動が関係した電子・格子相互作用の寄与が示唆される。
過疎地域のケア・システムに関する研究

過疎地域は高齢化が高いのにも関わらず,在宅福祉に対する整備は不充分である。本研究は北海道農業(厚沢部町,士別市,上富良野市)漁業(岩内町)炭鉱(三笠市)地域5市町を対象にして,1.地域住民の在宅福祉サ-ビスに対する認知と社会福祉活動への参加意識,2.65歳以上地域住民の在宅福祉サ-ビスに対する意識,3.在宅要介護老人の介護実態,4.ケアシステム形成のための社会資源と社会サ-ビス供給状況の調査を終え,分析と考察した。1.福祉サ-ビスのうち,よく認知されているのは入浴サ-ビス(65.9%)とホ-ムヘルパ-派遣制度(68.5%)であった。福祉活動への参加は,福祉バザ-や募金活動(18.9%)が最も高いものの,障害者・高齢者に対する実際の援助やボランティア活動となると4%1.5%と低下し,参加度は限定される。福祉サ-ビスの認知や参加に強く関連する変数は「近所付き合い」と地域に対する「貢献意欲」であった。2.高齢者はあまり在宅福祉サ-ビスに期待していない(9.1%)。まだ家族の世話(38.4%)を求めている。現行サ-ビスについての費用負担感はサ-ビスの認知度から見て,若干回答に疑問があるが四分の一程度の人が妥当としている。移動可能であれば家族が対応して介護するが,限界になれば社会サ-ビスに頼るといい,48.5%の老人が介護手当てを求めている。3.介護者の多くは配偶者で,高年令である。しかしサ-ビス利用に結びついていない。過疎地の在宅福祉はいま始まったばかり,社会資源も人材も不足,そしてニ-ズ把握もサ-ビス供給も客観的でなかった。利用者のスティグマも強い。施設の弾力的運用,サ-ビスの総合化,住民の意識への働きかけなど,計画的な現実的対応が緊急に行われることが必要である。高齢化の加速と地域社会・家族の崩壊は過疎地の老人、とくに後期老年層や病虚弱老人に深刻な不安を与えている。われわれは北海道の農村、漁村、炭鉱閉山地域から5市町村を選択し、その地域における在宅ケアの実態を探ることから、在宅福祉サ-ビス供給のあり方を考察した。65歳以老人の在宅ケアニ-ズは、家事的ケアが約10%程度、対人ケアが5%弱、社会的支援も5%弱であった。在宅福祉サ-ビスに対する認知度は20%程度で、しかも自分が依存状態になったとき、そのサ-ビスを利用しようと考えている人は10%台しかなく、在宅で家族による世話を期待する人が多かった。在宅ねたきり老人・痴呆老人の介護者についてみると、介護者の半数以上が配隅者で、60歳以上の高年齢層が60%以上をしめていた。自由の拘束と疲労は甚だしいものがみられたが、在宅福祉サ-ビスに対する知識は乏しく、在宅福祉サ-ビスを利用しようとする態度は殆んどみられなかった。病院入院、特別養護老人ホ-ム入所中の家族もサ-ビス利用に対しては消極的で、精神疲労は軽減されていたが、半数はひきとりの困難性を訴えた。どちらの家族も背景に福祉サ-ビスの利用に対するスティグマが感じられた。地域住民も全体に福祉サ-ビスに対する認知度は低く、地域の福祉活動への参加も、募金やバザ-も除いて消極的であり、ノ-マリゼ-ションを目的とした福祉意識への転換は客易でないことを窺わせた。

しかしニ-ズは確実に増大し、福祉供給は整備されなければならない。ニ-ズの把握、アセスメントは緊急の課題であるし、社会資源の整備とサ-ビ供給のネットワ-ク化、福祉情報の提供、ケ-スマネ-ジメントなど地域に福祉の専門的機能を導入しなければならない。今後の研究は各地域の特性を類型化し、地域福祉計画へのモデルを作成したい。過疎地域は高齢化が高いのにも関わらず,在宅福祉に対する整備は不充分である。本研究は北海道農業(厚沢部町,士別市,上富良野市)漁業(岩内町)炭鉱(三笠市)地域5市町を対象にして,1.地域住民の在宅福祉サ-ビスに対する認知と社会福祉活動への参加意識,2.65歳以上地域住民の在宅福祉サ-ビスに対する意識,3.在宅要介護老人の介護実態,4.ケアシステム形成のための社会資源と社会サ-ビス供給状況の調査を終え,分析と考察をした。1.福祉サ-ビスのうち,よく認知されているのは入浴サ-ビス(65.9%)とホ-ムヘルパ-派遣制度(68.5%)であった。福祉活動への参加は,福祉バザ-や募金活動(18.9%)が最も高いものの,障害者・高齢者に対する実際の援助やボランティア活動となると4%1.5%と低下し,参加度は限定される。福祉サ-ビスの認知や参加に強く関連する変数は「近所付き合い」と地域に対する「貢献意欲」であった。2.高齢者はあまり在宅福祉サ-ビスに期待していない(9.1%)。まだ家族の世話(38.4%)を求めている。現行サ-ビスについての費用負担感はサ-ビスの認知度から見て,若干回答に疑問があるが四分の一程度の人が妥当としている。移動可能であれば家族が対応して介護するが,限界になれば社会サ-ビスに頼るといい,48.5%の老人が介護手当てを求めている。3.介護者の多くは配偶者で,高年令である。しかしサ-ビス利用に結びついていない。過疎地の在宅福祉はいま始まったばかり,社会資源も人材も不足,そしてニ-ズ把握もサ-ビス供給も客観的でなかった。利用者のスティグマも強い。施設の弾力的運用,サ-ビスの総合化,住民の意識への働きかけなど,計画的な現実的対応が緊急に行われることが必要である。
乾燥化する中間湿原の植生動態の把握

本研究は開発行為等により周囲の環境が変化し、乾燥化が進む中間湿原について、湿地生態系の基盤となる植生の動態を予測し、今後の希少な中間湿原の保全に役立つ知見を得ることを目的として行った。1)過去:シードバンク(埋土種子)を用いて潜在する植物種を把握する。2)現在:植生調査を実施し把握する。3)今後:種子トラップによる新たに侵入する植物種を把握する。これら3様を比較した。調査地は周囲が開発され、孤立した森林内に残るヌマガヤが優占する中間湿原である。湿原内にはその他にミズゴケ、コハリスゲ、アオコウガイゼキショウ、モウセンゴケ、トキソウ、ハルリンドウ、ゴウソ、ツルカミカワスゲ等が生育し、ハンノキ、ノリウツギ、レンゲツツジの樹木が一部侵入する。2013年5月に南北を基軸に10×10mの方形区を10箇所設置した。6月には1区画から5点を決め、深さ010cmと1020cmの直径5cmの円柱状の土壌サンプルを採取し薄く撒いて養育した。発芽は010cmでは234個体、1020cmでは29個体で010cmの発生が高かった。発芽した植物種ではヌマガヤが全体の約63%と一番多く、その他にアオコウガイゼキショウ、ミツカドシカクイ、コハリスゲ等の草本とニシキウツギ等の樹木が生育してきた。土壌採取後、50地点にシードトラップを設置して6月11月(12月以降は積雪のため回収できなかった。)間に1カ月分ごと回収して分析した。種子はカンバ類(シラカンバ、ヤエガワカンバ)、ズミ、ハンノキ、ヌマガヤの湿原とその周辺の植物種で期間を通して樹木の種子が多かった。以上のことから埋土種子の種ごとの発芽率の影響を考慮する必要はあるが、おそらく過去も現植生と同じヌマガヤ優占の中間湿原として維持されてきたと予測された。さらに湿原内に飛散する種子の状況から、今後乾燥化が進めば周辺から飛散する樹木種子が定着、発芽して周囲の樹林環境と同化すると予測された。
完全型先天停在性夜盲のイヌモデルの確立と機能・遺伝子解析

先天停在夜盲(CSNB)は非進行性の遺伝性網膜疾患であり、生来の夜盲を特徴とする。我々は自然発症の常染色体劣性のビーグル犬の家系を発見した。この犬は明所では正常な視覚を有するが、暗所では明らかな視機能低下がみられた。網膜電図(ERG)は陰性型を示し、長時間刺激錐体応答では、ON応答は低下しているがOFF応答は残存していた。いわゆるヒトのSchubert-Bornschein型の完全型CSNBの犬モデルと考えられた。遺伝子検査では既知のCSNBの候補遺伝子は全てrule outされた。光学顕微鏡と電子顕微鏡では網膜形態は正常であった。我々の犬家系は世界で初めての完全型CSNBの犬モデルである。今回我々は、世界で初めてイヌにおいてcCSNBの表現系を有する常染色体劣性の1家系を日本で発見した。これはビーグル犬の1家系であり、毒性実検のために飼育されていたイヌをスクリーニングする過程で偶然見つかったものである。我々の夜盲イヌの家系は常染色体劣性の遺伝形式を示し、眼底に異常がなく、ERGはa波が正常でb波が消失していたことにより、ヒトにおける常染色体劣性cCSNBのモデル動物である可能性が高いと考えられた。イヌのcCSNBモデルはこれまでに報告がなく、世界で最初のモデルになると考えられる。我々は、正常イヌとcCSNBのイヌから杆体系および網膜電図(ERG)を記録した。刺激の強度は10段階程度変化させ、intensity-response functionをプロットした。錐体ERGについては、長時間刺激を用いてON反応とOFF反応も記録した。その結果、網膜内のON型双極細胞のみ機能が欠損していることがわかった。また正常イヌと夜盲イヌの硝子体内にシナプス遮断薬を注射し、シナプス伝達障害の程度を評価した。硝子体内にAPB (L-2 amino-4- phosphonobutyric acid)を投与し、長時間刺激で錐体ERGのON反応とOFF反応を記録した。その結果、夜盲イヌの硝子体内にAPBを注射して薬理学的にシナプスを完全にブロックしてもERGに変化はみられなかった。夜盲イヌのERGは正常イヌの硝子体内にAPBを注入したERGと全く同一波形になった。また夜盲イヌのOFF経路に異常がないかどうかを調べる目的で、硝子体内にPDA(cis-2,3- piperidinedicarboxylic acid)を注入した。その結果、夜盲イヌのERGはPDA後に変化を示し、夜盲イヌのOFF経路は機能していることが示された。このような結果により、我々の夜盲イヌは選択的なON経路機能障害を有していることが証明できた。(1)夜盲イヌの網膜機能解析:本年度は薬理学的研究を追加して、ON型双極細胞の機能低下の程度を研究した。正常イヌおよび夜盲イヌの硝子体内にAPB(L-2 amino-4-phosphonobutyric acid)を投与し、長時間刺激で錐体ERGのON反応とOFF反応を記録した。その結果、夜盲イヌの硝子体内にAPBを注射して薬理学的にシナプスを完全にブロックしてもERGは変化しないことを確認した。以上の結果により、夜盲イヌのOFF経路はまだ機能していることになり、我々の夜盲イヌが選択的なON経路機能障害であることを証明できた。(2)夜盲イヌの組織学的研究:シナプスの視細胞側の構造変化は少なく、一方で双極細胞側の変化が著しいことがわかった。以上の結果により、今回の夜盲犬の原因はON型双極細胞のシナプス末端にあることが推測された。(3)ヒトでcCSNBの原因遺伝子として知られている5つの遺伝子(GRM6, NYX, TRPM1, GPR179, LRIT3)のイヌの相同部位をダイレクトシークエンスによってスクリーニングし、遺伝子変異がないかを調べたが変異は確認されなかった。そこで、現在はイヌの網膜疾患における遺伝子解析の第一人者であるペンシルバニア大学のAguire博士と共同研究を行い、次世代シーケンス解析を行っている。ERG解析と免疫組織の結果は満足いく結果が得られ、遺伝子解析のみが途中の段階であるが、これについては平成28年度までかかることを予想していたため、概ね順調に進展していると考えられる。なお、本年度までの途中成果は、2015年のPLoSOneに投稿し、受理された。平成28年度は、これまで進めてきた夜盲イヌの標準的なERGの解析に加え、さらに網膜内層機能に2次的な変化が生じていないかについても調べた。特に、イヌの網膜に視細胞からON型双極細胞への伝達を遮断する神経ブロッカーであるAPBを作用させてERGを記録し、そのERG波形と我々のCSNBイヌのERG波形を比較した。その結果、我々のCSNBイヌのERG波形は、APBを作用したイヌ網膜から得られたERGと同様の波形であることが確認された。以上の結果から、我々が発見したCSNBイヌでは、視細胞からON型双極細胞への伝達遮断に伴う2次的な網膜変性はほとんど生じていないことが確認された。これは、今後この動物に対して遺伝子治療を行う際に重要な所見であると考えられた。また、夜盲イヌの免疫組織学的研究を行った結果、夜盲イヌではON型双極細胞のマーカーであるPKCαの染色性に異常がみられた。