hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタボリックシンドローム予防・改善のための運動プログラム開発

本研究はメタボ改善と運動プログラムとの関係について検討しました。対象は自転車運動群、エアロビクスと筋力づくり運動を行う複合運動群、コントロール群の3群とし、1回30分、週3回を12週間行いました。結果として、3群とも体重、体脂肪、血中成分に大きな変化はみられず、群間に差がみられませんでした。しかしながら、複合運動群の腹部周囲計が有意に減少を示しました。今後は長期間の運動指導を行っていきたいと考えています。本研究は運動と食事指導による体重、体脂肪率、内臓脂肪の減少、血中アディポネクチンの増加やレプチンの減少など肥満関連因子の改善と運動トレーニングプログラムとの関係について検討することを目的とする。被験者はメタボリックシンドローム対象群および予備群とし、中程度の有酸素運動トレーニング群と有酸素運動と筋力づくり運動を組み合わした複合運動トレーニング群、およびコントロール群の3群とした。運動トレーニング内容は有酸素運動トレーニング群:1)体調確認・血圧測定、2)運動は自転車運動。負荷強度は最大酸素摂取量の50%強度(実際のトレーニングでは心拍数を用いた)にて行った。運動時間および運動頻度は、1回30分、週3回を12週間、合計36回。複合運動トレーニング群:1)体調確認・血圧測定、2)ウオーミングアップ、3)エアロビクスエクササイズ、4)ボールやチューブを用いた筋力トレーニング、5)ストレッチ。トレーニング前後の検査として、1)血液検査(空腹にて採血を行い、アディポネクチン、レプチンなどの肥満関連因子、遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロール等の血中脂質、血糖、インスリンを測定)、2)歩数計による身体活動量の測定、3)体脂肪計による体脂肪測定、4)運動トレーニング前後3日間の食事調査を行い、結果に対し、管理栄養士による食事アドバイスを行った。結果については現在解析中であるが、体重の減少は個人差が大きく、被験者の運動を継続させるモチベーションの維持が来年度の課題となった。本研究は運動と食事指導による体重、体脂肪率、内臓脂肪の減少、血中アディポネクチンの増加、レプチンの減少など肥満関連因子の改善と運動トレーニングプログラムとの関係について検討することを目的とした。被験者はメタボリックシンドローム対象群および予備軍とし、中等度の有酸素運動トレーニング群と複合トレーニング群(有酸素運動+筋力づくり運動)、およびコントロール群とした。運動トレーニングの内容は、有酸素運動群:自転車運動を主体とし、負荷強度は最大酸素摂取量の50%強度にて行った。運動時間および運動頻度は、1回30分、週3回を12週間、合計36回とした。複合運動トレーニング群:ウォーミングアップ、エアロビクスダンス、ボールや体重を使った筋力づくり運動、ストレッチとする教室形式とした。運動時間および運動頻度は、1回30分、週3回を12週間の合計36回とした。トレーニング前後の検査として、1)血液検査(アディポネクチン、レプチンなどの肥満関連因子、遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロール等の血中脂質、血糖、インスリン等)、2)歩数計による身体活動量の測定、3)体脂肪計による体脂肪率測定、4)運動トレーニング前後3日間の食事調査を行った。また、トレーニング前の食事調査結果に対し、管理栄養士による食事アドバイスの実施を行った。結果として、血中脂質プロフィールに大きな変化はみられず、体重の減少は個人差が大きかった。しかしながら、複合トレーニング参加者の一部は運動トレーニング終了後も継続習慣化がみられ、行動変容の改善に効果があったものと考えられた。
術前担癌患者インスリン抵抗性の発現に及ぼすIL-6,TNF-αの関与

【目的】近年、サイトカインのひとつであるIL-6、TNF-αが、癌悪液質の発症に関連していることを示唆する研究結果が報告されている。また我々はいままで担癌患者において、インスリン抵抗性の認められることを報告してきた。そこで本研究では、担癌患者において認められるインスリン抵抗性に、IL-6、TNF-αの関与が認められるか否かを検討した。【対象及び方法】担癌患者23例(食道癌1例、胃癌12例、大腸癌4例、肺癌6例)を対象とした。なお健常volunteer6名を対照群とした。血清中のIL-6、TNF-α値は、それぞれの抗ヒトモノクローナル抗体を用いELISA法にて測定した。インスリン抵抗性の評価には、人工膵臓を使用したDeFronzoらの方法によるeuglycemic hyperinsulinemic glucose clamp法(インスリン濃度;100μU/ml)を用いて実施し、末梢組織の糖の取り込み量;M値(mg/kg/min)を算出し、インスリン感受性とした。【結果】患者血中のIL-6の出現(3pg/ml以上)は23例中8例(34.8%)であったが、健常群は全例測定限界以下であった。TNF-αは担癌群、健常群とも全例測定限界以下であった。担癌群におけるM値の平均は5.54±1.65mg/kg/minで対照群の8.36±0.80mg/kg/minに比し有意(p<0.001)に減少していた。M値とIL-6値との間にはr=-0.62,p=0.003と有意な負の相関関係が認められた。【まとめ】1.担癌患者においてインスリン抵抗性を認めた。2.担癌患者23例中8例の血中にIL-6の存在がみられたが、TNF-αは全例測定限界以下であった。3.インスリン感受性とIL-6との間には、有意な負の相関関係が認められた。【結語】IL-6がインスリン抵抗性において重要な役割を果たしている可能性があると考えられた。
東北タイの開発と市民社会形成の基盤となるプラチャーコム(住民による小グループ)

タイにおける開発・発展の研究は、かつては経済中心の開発か否かの対立した議論に終始したが、21世紀に入った現在では民主化も含めた市民社会形成の流れのなかで議論されるようになってきた。タイにおける社会科学者達の議論でも、開発を市民社会と結びつけた議論が中心となり、「社会開発の中で市民社会形成は可能か?」といった研究が数多く輩出されるようになってきた。社会学の分野でも、「市民社会とは何か?」というテーマ設定から「市民社会の形成はいかにして可能か?」がテーマとなり、住民による小グループであるプラチャーコムが市民社会を成立させるとの問題意識からプラチャーコムの個別的な研究へとテーマ設定が動いてきた。プラチャーコムは、もともとタイ語で人々の集まりを意味するが、市民社会を表すプラチャーサンコムが外来の概念としてタイ語に導入されたため、タイの文脈における市民社会形成研究のキーワードとなってきた。そこで、本研究では、一方で政府のトップダウン的な政策で構築されるプラチャーコムが多い中で草の根的に住民のイニシアティブで構築するための条件は何かを実証的に明らかにした上で、プラチャーコムが市民社会形成の基盤になりうるのかを明らかにする。初年度は予備調査および、研究打合せ、セミナーを行った。2年目は、タクシンがクーデターで放逐されるという大きな変化のため主にタイでフィールドワークを行うとともに、琉球大学において国際セミナーを行った。3年目はコーンケーン大学で研究会を行うとともに、研究成果を琉球大学で行われた国際セミナーで報告した。社会学の分野でも、「市民社会とは何か?」というテーマ設定から2003年の第2回には「市民社会の形成はいかにして可能か?」がテーマとなり、住民による小グループであるプラチャーコムが市民社会を成立させるとの問題意識からプラチャーコムの個別的な研究へとテーマ設定が動いてきた。このプラチャーコムには、住民による草の根的なものと、政府の政策によって、上から形成を促されたものの2種類があり、とりわけ後者については現タクシン政権下での新たな地方行政の単位であるタムボン評議会の成立や百万バーツ基金、一村一品運動の浸透によって、住民の意識的なレディネスができないまま構築されたことを研究代表者は明らかにしてきた。そこで、本研究では、一方で政府のトップダウン的な政策で構築されるプラチャーコムが多い中で草の根に住民のイニシアティブで構築するための条件は何かを実証的に明らかにした上で、プラチャーコムが市民社会形成の基盤になりうるのかを明らかにする。本年度は初年度のため、2度にわたり日本側の研究打ち合わせ、セミナーを行った。そして、タイにおいて研究代表者および研究分担者の3名が予備調査、タイの研究協力者との研究打合せを行った。

プラチャーコムは、もともとタイ語で人々の集まりを意味するが、市民社会を表すプラチャーサンコムが外来の概念としてタイ語に導入されたため、タイの文脈における市民社会形成研究のキーワードとなってきた。そこで、本研究では、一方で政府のトップダウン的な政策で構築されるプラチャーコムが多い中で草の根に住民のイニシアティブで構築するための条件は何かを実証的に明らかにした上で、プラチャーコムが市民社会形成の基盤になりうるのかを明らかにする。本年度は2年目となり、タクシン政権がクーデターにより崩壊して新しい局面を迎えた中、研究代表者と研究分担者3名はタイでフィールドワークを行った。2006年9月にはコーンケーン大学でタイ側の協力者と研究代表者、研究協力者が集まり研究会を行った。2006年12月には琉球大学においてタイ側の研究協力者6名を招き、法文学部アジア研究施設との共催で「東北タイの開発と市民社会」と題するセミナーを開催し、意見交換を行った。2007年1月には茨城大学において日本側の研究者による2年目の総括のための研究会を行った。タイにおける開発・発展の研究は、かつては経済中心の開発か否かの対立した議論に終始したが、21世紀に入った現在では民主化も含めた市民社会形成の流れのなかで議論されるようになってきた。タイにおける社会科学者達の議論でも、開発を市民社会と結びっけた議論が中心となり、「社会開発の中で市民社会形成は可能か?」といった研究が数多く輩出されるようになってきた。社会学の分野でも、「市民社会とは何か?」というテーマ設定から「市民社会の形成はいかにして可能か?」がテーマとなり、住民による小グループであるプラチャーコムが市民社会を成立させるとの問題意識からプラチャーコムの個別的な研究へとテーマ設定が動いてきた。本年度は3年目となり、タイでフィールドワークを行うとともに、2007年9月にはコーンケーン大学でタイ側の協力者と研究代表者、研究分担者が集まり研究会を行った。2007年12月には琉球大学において日本側とタイ側の研究協力者が集まり、法文学部アジア研究施設との共催で「タイの市民社会化をめぐって-これまでの動きと今後の展望-」と題する国際セミナーを開催した。その成果をもとに、研究成果報告書を作成した。
大地震に対するコンクリート杭および杭頭接合部の性能評価と2次設計法の提案

コンクリート杭基礎を有する新築および既存建物の大地震時における耐震安全性および継続使用性を確保するため,杭と杭頭接合部に対する構造実験の実施,上部構造と基礎構造の一体解析モデルの開発および性能設計法の提案を行う.研究成果を学会指針規準に反映させ,基礎構造を含めた建物全体の性能設計を実用化し,地震に代表される災害に対してレジリエントな社会資本の実現に資する.本研究では、コンクリート杭基礎を有する新築および既存建物の、大地震時における耐震安全性および継続使用性を確保するため、杭と杭頭接合部に対する構造実験を実施し、上部と基礎構造の一体解析モデルの開発を行って実務者が使いやすいツールを開発する。また、杭・杭頭接合部を大地震時でも継続使用するための性能設計法の提案を行う。一般建物の上部構造は中小地震と大地震の2段階に対する設計を行うが、杭・杭頭接合部などに代表される基礎構造は中小地震に対する設計しか行われておらず、大地震時の挙動は不明のままである。本研究の研究成果を学会指針規準に反映させ、基礎構造を含めた建物全体の性能設計を実務で実現することで、レジリエントな社会資本の実現に資することができる。コンクリート杭基礎を有する新築および既存建物の大地震時における耐震安全性および継続使用性を確保するため,杭と杭頭接合部に対する構造実験の実施,上部構造と基礎構造の一体解析モデルの開発および性能設計法の提案を行う.研究成果を学会指針規準に反映させ,基礎構造を含めた建物全体の性能設計を実用化し,地震に代表される災害に対してレジリエントな社会資本の実現に資する.
自閉症状をもつ精神遅滞児の集団内行動に及ぼす言語水準要因の解析とその指導

本研究の目的は、自閉症状をもつ精神遅滞児の集団場面における言語・コミュニケ-ション行動を分析し、実践への示唆を得ることである。最終的に5編の論文にまとめられた本研究の主な成果は次の通りである。1.音声言語のない自閉児の養護学校授業場面におけるコミュニケ-ションの行動を分析の結果、教師との相互交渉の長さと数が教師間で異なり、コミュニケ-ション機能と意味の違いがこの差異に反映していた。2.質問に応じることを指導するために有効な援助方法を分析した結果、集団指導場面で行われている援助は二種に分けられ、一つは注意を喚起しようとするものであり、もう一つは「答え方」の援助であった。3.時間の概念に関する集団学習場面における指導者・対象児間の言語行動を意思の疎通の観点から考察した結果、適切な具体物が存在することによって、両者の意思疎通が促され、指示理解も促進される。4.音声言語のない自閉児の小学校特殊学級授業場面における授業参加度と教師の行動との関連を検討した結果、授業への参加を左右する要因に教師の非音声行動があり、なかでも教材提示の有無が大きな影響を及ぼすことが示唆された。5.自閉症状が顕著であった障害幼児について、保育経過ならびに個別指導と遊び場面の変容を分析した。その結果、個別指導場面からコミュニケ-ションの著しい改善が始まり、集団場面への介入が行われて以降から、対人交渉や遊びの変容も認められた。自然な指導環境を重視する言語指導法が効果的であったが、対人交渉の変容には、さらに交渉を促す指導が必要であることが明らかになった。研究を初めるにあたり,研究上の核となる「言語」に関する検討を行った.これは文献研究,およびそれと実践経験との対照から成る.この結果,様々な言語水準を有する自閉症状をもつ事例のなかでも, 2語文の水準を扱うことで問題を把握できると思われること,要求する,叙述する,模倣する,弁別する,共有する,交換する等の基本プロセスの仮定が有効と思えること,個々事例の問題の改善から示唆される点が大きいことなどが明確になった.今後,研究対象児の検討と並行し,さらに上述の検討を深める予定であるが,上記をふまえて今年度実施した内容は以下の通りである.1.研究対象児の検討養護学校,特殊学級に在学する候補児について,学級担任と計画の細部の検討を進めつつ,候補児の行動観察,学級の実態の観察を行った.これにより,数名の対象児が,まず絞れつつある.2.言語水準,集団内行動の評価法の検討上記の検討もふまえて,主に言語表出面の規定方法・チェック法を検討し,集団内行動については,教師・他児と対象児の相互交渉場面に焦点をあて,行動カテゴリーを設けた観察記録法を試行した.主なものは,対人行動,対物・課題への従事行動である.この中の対人行動が,言語と関連するため,来年度の課題として残された.なお,言語要因については,表出面に加えて理解面,さらに音声・非音声の側面を入れて検討する必要が指摘でき,この具体についても,来年度の本格的な検討に送ることとした.来年度は,対象児とその学級等の集団場面を観察,分析し,合わせて,指導的介入プログラムの立案と実施の段階に入る予定である.自閉症状をもつ精神遅滞児は個々に種々の特徴をもっている。言語の側面についても同様である。このため対象児を追加し、継続して観察可能で資料の入手も可能な者について、対象児の言語面を主とした相互交渉場面の観察・資料の入手を行った。あわせて、学級等の集団場面の観察・資料の入手を行った。学級の条件も様々であるため、過度に絞らずに複数校から資料・データを得ることとした。これらのデータ・資料により、分析を進めた。昨年同様、相互交渉場面のうち、対人行動の下位カテゴリーが、主対象となる。

対象児からの自発的「働きかけ」の頻度は少ない傾向であった。従って主に教師からの「働きかけ」とそれへの「応じ方」が分析の焦点となりつつある。介入の方策としては、教師等からの「働きかけ」を対象児の言語面に適合させること、対象児自身の言語技能の獲得、相互交渉の活発化、関連諸条件の整備、および集団場面における教師の「働きかけ」の改善等が考えられた。介入の条件が十分整った対象児につき、試行的に介入を図った結果によると、無言語に近い者であっても、緊密な教師の働きかけにより、代替のコミュニケーション手段を獲得すれば、相前後して集団場面での課題の従事度も高まることが見出されている。比較的早期に行動問題の改善がみられ、音声言語が次第に習得されるにつれ、さらに集団への参加度も高まる状況も見られた。しかし、集団活動に参加していくためには、言語技能に加えて、その活動に要請される必要技能の獲得が、また言語技能の中でも理解の面の関与が小さくないこと等が改めて指摘されている。次年度は、言語、相互交渉、集団場面の分析を行い、テーマに関する介入もモデルの提案を含めたまとめを行い、報告書を提出の予定である。最終年度である本年度は、対象児の指導の継続ならびに補充デ-タの収集を行った後、研究成果とりまとめを行うに当っての対象児ならびに経過資料の最終検討を行った。その結果、集団場面で集められたデ-タを共通させたうえ、言語・コミュニケ-ション行動を以下の諸側面から分析して知見を探ることとした。自閉症状をもつ精神遅滞児の言語・コミュニケ-ション行動のうち、とり上げた諸側面とそこでの主な知見は以下の通りである。1.音声言語のない児童の授業場面におけるコミュニケ-ション行動を分析した結果、40秒に1回程度、教師との間に生じており、教師によっても交渉のあり方が異なること等が示された。2.質問に対する応答を分析した結果、応答に関する指導者の援助には、対象児に対する注意喚起と応答を促すための援助の二種が見出された。3.数概念学習場面における指示・説明を検討した結果、具体物による教材が媒介することにより、言語的交渉が成立・進展しやすいことが判明した。4.音声言語のない特殊学級児童の授業への参加と教師行動との関係を分析した結果、教師の非音声行動のうち、特に教材の提示が授業参加に与える影響の大きいことが明らかとなった。5.自閉症状の顕著であった幼児の保育経過ならびに個別指導と遊び場面を分析したところ、個別場面からコミュニケ-ションの著しい改善が認められ、集団場面に介入した後に、対人交渉の改善も進展したことが示された。そこでの指導法の意義が考察された。以上の5論文を成果として、報告書を作成した。
皮膚腫瘍におけるヒトパピローマウイルス感染の検討と病変形成メカニズムの解明

今回の研究により、爪部色素線条型ボーエン病で新たに悪性型のHPV67型が検出されることを示した。また、有棘細胞癌30例におけるHPV感染を検討し、外陰部有棘細胞癌2例のみで悪性型のHPV16型が検出された。HPV陽性外陰部有棘細胞癌は、ボーエン様丘疹症由来であったさらに特殊なタイプの角化型コンジローマと色素性コンジローマを新規に報告した。最終年には転写因子GATA2変異例による多発性疣贅を経験した。手指を中心に多数の疣贅が見られ、その性状は尋常性疣贅に近く、HPV型もα型、EV型のマイナーなタイプが多数検出された。HPV易感染性について現在検討中である。第一の目的「皮膚腫瘍におけるHPVの網羅的な検出」に関しては、研究代表者は有棘細胞癌40例において、PCRを用いたHPVのタイピングを行い、さらにin situ hybridizationで組織内でのHPVの局在を検討した。抗p16INK4a抗体、抗HPV抗体による免疫染色も行った。結果は、40例中HPV陽性例はわずか2例であり、それらは2例ともBowenoid papulosisから生じていた。この成果は現在論文投稿中である。また、今年度の皮膚悪性腫瘍学会でも発表する予定である。この他に、外陰部腫瘍におけるHPV感染、色素性コンジローマとHPV感染、巨大コンジローマとHPV56感染について3本論文発表した。これらの研究によりHPVによる皮膚腫瘍の特徴が明らかになり、発症予防のためのHPVワクチンの開発に役立つ。第2の目標「HPV感染の皮膚病変形成への役割」について、皮膚で検出されるHPVによる型特異的細胞変性効果については、これまでに多くの報告があるが、そのメカニズムは不明である。HPV感染による封入体形成を研究するには細胞内小器官の同定が不可欠である。我々は現在遺伝性疾患で見出した数種の変異蛋白を培養細胞に発現し、その凝集部位を同定する実験系を確立している。凝集蛋白の小胞体、ゴルジ体における局在を共焦点顕微鏡により観察する。この実験に加え、凝集蛋白の糖鎖切断を組み合わせた生化学的な実験系を検討している。これらの実験系を用いて、HPVの蛋白の封入体形成メカニズムを検討したい。これまで皮膚科領域で報告されてきた多くのHPV関連の皮膚腫瘍の病変形成のメカニズムを分子レベルで検討できる。<皮膚腫瘍におけるHPVの網羅的な検出>有棘細胞癌38例よりDNAを抽出し、悪性型のHPVをよく検出するL1C1/L1C2プライマー、良性悪性を問わず幅広くHPVを検出できるGP5+/6+プライマー、CPプライマーで比較検討した。HPV陽性例ではin situ hybridization(DAKO社Genpoint system)を行い、ウイルスの局在を確認した。結果は陽性例は2例のみであり、共にHPV16型であった。興味深いことに、陽性例は外陰部有棘細胞癌であり、好塩基性で特徴的な病理組織であった。HPV陽性の外陰部有棘細胞癌のほとんどはアジアからの報告である。欧米の報告に比べ低検出率であり、有棘細胞癌のHPV感染率は地域差があると思われた。これらの報告は昨年British Journal of Dermatologyに掲載された(171(4):779-85.2014)。爪甲色素線条型ボーエン病はHPV56型感染で生じる例が多い。今回我々は、爪甲色素線条型ボーエン病からHPV67型を検出した。通常爪甲色素線条は爪の辺縁に生じるケースが多いが、自験例は爪甲中心に生じている稀な例であった。HPV67型による爪甲色素線条型ボーエン病は初の報告であった。これらの結果は、Acta Derm Venereolに掲載された。(in press)<新規HPVの探索>転写因子に変異を有する多発性疣贅の症例を経験した。手足に多発する疣贅から、疣贅状表皮発育異常症で通常検出されるウイルスに近縁のHPV105型を検出した。HPV105型以外にこれまでの報告と10%以上異なる配列を有するHPVを検出している。現在全配列の確認を試みている。様々な皮膚腫瘍におけるHPV感染の検討を行った。1.爪部色素線条型ボーエン病では悪性型のHPV 56型が高頻度で検出されるが、HPV67型も検出されることを示した。2.当科で経験した有棘細胞癌30例におけるHPV感染を検討した。これまでの報告とは異なり、外陰部有棘細胞癌2例のみで悪性型のHPV16型を検出した。HPV陽性例は特殊な前癌病変(bowenoid papulosis)から生じることを証明した。bowenoid papulosisから生じた有棘細胞癌はアジア地域でのみ報告されており、発症に地域差や人種差が関与する可能性がある。3.HPV6型陽性の色素性コンジローマと悪性型HPV56陽性の外陰部巨大コンジローマを発表した。色素性コンジローマはbowenoid papulosisとの鑑別が重要である。タイピングが診断に役立つと思われた。また、非典型的なコンジローマでは、通常検出されるHPV6,11型以外にも一部悪性型が関与することを示した。

4.bowenoid papulosisと外陰部ボーエン病にイミキモドが有効であることも示した。最終年度には転写因子GATA2遺伝子変異を伴う多発性疣贅の解析にも着手することができた。患者は四肢に多発性する疣贅と肛門癌が発症していた。特に感染HPVのタイピングを行い、多発性疣贅からは複数の疣贅状表皮発育異常症型(EV型)と皮膚型のHPV、肛門癌からは悪性型HPVを検出した。未報告の新規のHPVと思われるDNA断片も検出しており、現在解析を進めている。患者末梢血には樹状細胞がほとんど見られず、今後は皮膚における樹状細胞、T, NK細胞の数と機能を検討する予定である。本研究資金により、HPV感染に伴う皮膚腫瘍の特徴を明らかにすることができた。また、新規HPVの検出とHPV感染防御において重要と思われる遺伝性疾患研究の土台を築くことができた。今回の研究により、爪部色素線条型ボーエン病で新たに悪性型のHPV67型が検出されることを示した。また、有棘細胞癌30例におけるHPV感染を検討し、外陰部有棘細胞癌2例のみで悪性型のHPV16型が検出された。HPV陽性外陰部有棘細胞癌は、ボーエン様丘疹症由来であったさらに特殊なタイプの角化型コンジローマと色素性コンジローマを新規に報告した。最終年には転写因子GATA2変異例による多発性疣贅を経験した。手指を中心に多数の疣贅が見られ、その性状は尋常性疣贅に近く、HPV型もα型、EV型のマイナーなタイプが多数検出された。HPV易感染性について現在検討中である。非常に稀な、転写因子に変異を有する多発性疣贅の症例を経験した。患者血液と皮膚における免疫状態を調べることにより、HPVの感染メカニズムを明らかにすることが可能である。樹状細胞の欠損が疑われており、これらの細胞とHPV感染の関連を研究中である。概要にも記したが、新規HPVも検出できる可能性があり、予想以上の成果が期待できる。皮膚科学研究計画では、3次元皮膚モデルにより、HPVを感染させることにより、人工的な皮膚腫瘍を形成させることも予定していた。しかし、上記の様に、転写因子に変異を有する多発性疣贅の症例を研究対象とすることで、3次元皮膚モデル以上にHPVの感染メカニズムを明らかにすることが可能でとなった。現在患者の免疫状態、HPVの感染状況を詳細に検討中である。第一の目的である「皮膚腫瘍におけるHPVの網羅的な検出」については当初の予想以上に解析が進み、HPVと皮膚腫瘍に関して英文論文3本を発表することが出来た。現在進行中の上記プロジェクトも順調であり、HPV DNAの検出のみではなく、HPV関連の発癌に関与する遺伝子の検討も可能である。また、第2の目標である「HPV感染の皮膚病変形成への役割」に関しても、細胞内小器官の同定を共焦点顕微鏡と生化学的な手法で解析することが可能になり、HPV遺伝子を培養細胞に導入する準備が整いつつある。この他にも免疫不全の患者から未報告のHPV遺伝子断片を検出しており、新規HPVの同定に向けて準備を進めている。これまでに購入した試薬を節約しながら使用した。HPVのタイピングは多数例に及ぶため、試薬量を可能な限り少量にする実験条件を検討した結果である。他にもシークエンシングなども依頼する前に丁寧にDNA精製を行うなど、無駄な支出をなくすよう心掛けた。先に記したように大きな実験計画が今後控えており、残額はそちらで使用したい。
AMSによる個別有機分子の^<14>C測定:分取キャピラリーGCの製作と地球化学的応用

本研究の目的は、大気・堆積物など地球化学的試料中に存在するバイオマーカー分子に着目しそこに含まれる14Cの濃度を加速器質量分析計(AMS)にて測定するために、バイオマーカーを数十マイクログラムのオーダーで個別分子種ごとに分け取るするための分離・濃縮システムを製作すると共に、この方法を実際の試料に応用し新たな地球化学的議論を展開することにあった。本年度は、昨年度までに開発した分取キャピラリーガスクロマトグラフ(PCGC)システムを用いて、札幌で採取したエアロゾル試料中の脂肪酸の分離と精製、および個別脂肪酸の14C測定の結果を国際誌(アメリカ地球物理学連合、Geophys. Res. Lett.)に発表した。放射性炭素の濃度測定の結果は、パルミチン酸(C16)やC18-C22の脂肪酸の場合にmodern carbonであったのに対し、C24+C26脂肪酸では5860(±200)年、C28+C30+C32脂肪酸では271(±120)年という年代値が得られた。C16やC18-C22の脂肪酸は、現在生息している生物から直接大気中に放出される有機物が主であるのに対し、C24以上の脂肪酸は過去に生産されたものであり土壌中に数百年から数千年の間滞留した後に大気中に放出されたものであろう。試料採取点に近い土壌試料を採取し、その脂肪酸の分離を行い、放射性炭素の測定を行った結果、周辺土壌の脂肪酸の年代は現代の値を示しており、大気中で認められた古い年代の脂肪酸はローカルなソースからではないことがわかった。また、エアロゾル試料に対して同時に測定した安定炭素同位体比の結果は、C16-C22の脂肪酸が海洋の植物プランクトンに由来するのに対し、C20より高分子の脂肪酸は陸上植物によって生産されたものであることがわかった。以上の結果から、高分子脂肪酸の一部は、中国大陸などで生産されたものが、黄砂とともに日本まで運ばれてきた可能性が指摘された。堆積物試料から分離した脂肪酸についても、14C測定を実施するためにグラファイトターゲットを作成した。本研究の目的は、大気・堆積物試料中に存在するバイオマーカー分子(例えば、直鎖アルカン・アルコール・脂肪酸など)に含まれる^<14>Cの濃度を加速器質量分析計(AMS)にて測定するために、地球化学的試料よりバイオマーカーを個別分子種ごとに分け取るするための分離・濃縮システムを製作することである。本年度は、大容量の自動反復注入式の分取キャピラリーガスクロマトグラフ(PCGC)システムを試作し、目的成分の濃縮単離を100μg程度で実現することを目的とした。大容量分取キャピラリーガスクロマトグラフ(PCGC)システムを製作するための部品である、ガスクロマトグラフ、フラクションコレクター、オートサンプラー、ワークステーションなどを購入し、これら装置の結合を行い、PCGCシステムを組み上げることができた。このシステムの動作確認を繰り返し行いPCGCシステムとして機能することを確認した後に、標準物質を使って分離条件の検討を開始した。ノルマルアルカン(C29)を用いてGCカラムへの連続注入と分離および濃縮の条件について検討をおこなった結果、内径0.53mmのワイドボアカラムを用いることによって一回の注入料が2μgの場合50回の繰り返し注入をすれば目的とする量のノルマルアルカンを分離濃縮できることを確認した。また、その純度は十分に高く、他成分の混入などを容易に除去できることを確認した。

実際の地球化学試料に応用する段階に到達することができたので、現在堆積物試料から抽出したノルマルアルカン画分をPCGCシステムを用いて個別のアルカン種を単離するための準備をしつつある。また、単離したアルカンをAMSを用いて^<14>C炭素の濃度測定をするために、AMS装置の調整も分担者が平行しておこなっている。本研究の目的は、大気・堆積物試料中に存在するバイオマーカー分子(例えば、直鎖アルカン・アルコール・脂肪酸など)に含まれる^<14>Cの濃度を加速器質量分析計(AMS)にて測定するために、地球化学的試料よりバイオマーカーを個別分子種ごとに分け取るするための分離・濃縮システムを製作することである。本年度は、大容量の自動反復注入式の分取キャピラリーガスクロマトグラフ(PCGC)システムを用いて、実際の地球化学試料の測定を検討することを目的とした。東京湾堆積物試料から分離した脂肪酸をPCGCを用いて化合物ごとに単離し、それらをそれぞれグラファイトに変換し国立環境研究所の協力を得てターゲットを作成した。グラファイト試料を国立環境研究所の加速器質量分析計にて計測し、放射性炭素濃度を計算した。単離した脂肪酸は炭素数14から22までの7種類でありその重量は100μgから1500μgの範囲であった。^<14>C年代は、パルミチン酸(C_<16>)の場合でmodernの結果がでたのに対し、C_<22>脂肪酸では1万7千年の年代がでた。C_<16>は海水中の植物プランクトンにより生産されたのに対し、C_<22>は陸上の高等植物に特有な脂肪酸である。このことは、陸上植物を構成する有機物は土壌中に長期間保存それた後に雨・風によって沿岸域まで運ばれることを意味している。また、バクテリア中に豊富に存在する不飽和脂肪酸(C_<16:1>)は1400年と言う比較的古い年代を与えた。このことは、海底堆積物表層で炭素の再利用(reworking)が起こっていることを示唆している。このような結果は予備的ではあるが、堆積物中の脂肪酸はその組成によって生物生産された時代が大きく異なっていることを明らかにした。現在、エアロゾル試料など他の地球化学試料においても、脂肪酸の分離を検討している。本研究の目的は、大気・堆積物試料中に存在するバイオマーカー分子(例えば、脂肪酸など)に含まれる^<14>Cの濃度を加速器質量分析計(AMS)にて測定するために、地球化学的試料よりバイオマーカーを個別分子種ごとに分け取るするための分離・濃縮システムを製作することである。本年度は、本研究で開発した分取キャピラリーガスクロマトグラフ(PCGC)システムを用いて、エアロゾル試料中の脂肪酸の分離と精製、および個別脂肪酸の^<14>C測定を行った。分離した脂肪酸を、C_<16>,C_<18>+C_<20>+C_<22>,C_<24>+C_<26>,C_<28>+C_<30>+C_<32>の4つの画分に分けた。C_<16>以外の成分を合体した理由はエアロゾル試料から分離した脂肪酸量が十分になかったためである。また、それぞれの成分の純度は、94-100%であった。
生体組織の成長を理解するための新規力学モデルの発展と応用

大きな進展の一つとして、培養細胞が基質を引く力(牽引力)の測定結果から、カルマンフィルターを用いた内部応力測定手法を完成させた(Nier et al. Biophys. J. 2018)。これを適用することで、細胞形態や速度場と、細胞内応力の関係についての相関解析を行い、応力場が細胞形態との相関が強いこと、牽引力方向や速度方向とはほぼ無相関なことを見出した。すなわち、我々はこれまで多くの数理モデルで仮定されていた“アクティブ項"を実証し、その絶対値測定を初めて行った。培養細胞HaCaTでは、集団的な振動現象が見られる。これを、現在発展させている新規モデルを用いて連続体モデルの構築を行った。このモデルの特徴は、上で述べた解析結果を考慮して、細胞形態場Mと、細胞の極性場pを独立した変数として取り入れたことにある。実験と同じく、運動できる場所が拘束されているという境界条件のもとでこの数理モデルのシミュレーションを行い、妥当なパラメータスケールで、実験で観察されている集団的な振動運動が現れることを確認している。この振動運動は、アクティブ項の強さにも依存し、アクティブ項にかかる係数が小さいときには振動はあらわれない。実際、MDCK培養細胞系では振動は見られないが、上で述べた計測ではこの係数が小さいことと整合的である。また、数理モデル上では、これまで知られていなかったような様式での振動運動を見出している。非自明な運動なので、これまで実験系では見落とされている可能性があり、このような運動が実際にあるかどうか実験系への提言になると考えている。また、多繊毛細胞の配列秩序化形成について、(細胞内の構造という対象であるが数理的には共通する手法で)数理モデル化を行った(極性場pと、それに関係するアクティブ項を含む)。理論モデルは実験をよく再現しており論文を執筆中である。培養細胞系への適用が進んだ一方で、本研究の主目的の一つである、細胞分裂・細胞死の連続体モデルの導入がやや遅れている。このことは、細胞分裂や細胞死に伴う組織全体の変形に伴い、不定な形を取扱う必要があることに起因する。その内容にも2つの面がある。一点目として、様々な形態を扱うことを見越して、数値計算手法を有限要素法に切り替えたことに伴う実装面での諸問題があった。この面については、一つずつ問題を解決するのに時間はかかったものの、現在では問題は解消しており、将来的にも様々な問題に適用可能な状態となっている。二点目として、不定形態を取り扱うためのフェーズフィールドモデルについて、従来の標準的な手法では理論的に不適当な部分があることが判明しためである。理論的枠組みについて考察をすすめてはいるが、過去の異なる流儀の枠組みやそこで行われている近似、その妥当性の(数値実装上での)検証をあわせて行っており、現在も進めている。培養上皮系の振動については、主要な結果やデータも集まりつつあり、よりシステマティックなパラメータサーチと、不安定性についての理論的考察をおこなう。早い時期に論文としてまとめる予定である。また、実験的にも共同研究者の杉村薫准教授(京大iCeMS)のグループが培養系の測定系を立ち上げており、とくに二種細胞系についての解析を行う予定である。そのデータ解析のためのパイプラインも現在構築中であり、また、適合する数理モデルの開発を進める。細胞増殖・細胞死の理論的取扱には、上で書いたように進行中である。理論的枠組と、その実装をあわせて進めており、どのような実装が良いのかについての試行錯誤を繰り返す必要はあるが、来年度の早いうちには解決可能だと考えている。新規数理モデルの理論的・実証的テストとして、方向性のある細胞分裂による組織成長の効果等、単純なケースから進めていき、しかる後に実際の生物系で見られるケースについて適用する。特に、細胞分裂が周りに及ぼす力学的な効果(フォースダイポールとしての役割)について調べる。また、多繊毛細胞の配列秩序化形成について、

(細胞内の構造という対象であるが数理的には共通する手法で)数理モデル化を行った(極性場pと、それに関係するアクティブ項を含む)。理論モデルは実験をよく再現しており論文を執筆中である。培養細胞系への適用が進んだ一方で、本研究の主目的の一つである、細胞分裂・細胞死の連続体モデルの導入がやや遅れている。このことは、細胞分裂や細胞死に伴う組織全体の変形に伴い、不定な形を取扱う必要があることに起因する。その内容にも2つの面がある。一点目として、様々な形態を扱うことを見越して、数値計算手法を有限要素法に切り替えたことに伴う実装面での諸問題があった。この面については、一つずつ問題を解決するのに時間はかかったものの、現在では問題は解消しており、将来的にも様々な問題に適用可能な状態となっている。二点目として、不定形態を取り扱うためのフェーズフィールドモデルについて、従来の標準的な手法では理論的に不適当な部分があることが判明しためである。理論的枠組みについて考察をすすめてはいるが、過去の異なる流儀の枠組みやそこで行われている近似、その妥当性の(数値実装上での)検証をあわせて行っており、現在も進めている。培養上皮系の振動については、主要な結果やデータも集まりつつあり、よりシステマティックなパラメータサーチと、不安定性についての理論的考察をおこなう。早い時期に論文としてまとめる予定である。また、実験的にも共同研究者の杉村薫准教授(京大iCeMS)のグループが培養系の測定系を立ち上げており、とくに二種細胞系についての解析を行う予定である。そのデータ解析のためのパイプラインも現在構築中であり、また、適合する数理モデルの開発を進める。細胞増殖・細胞死の理論的取扱には、上で書いたように進行中である。理論的枠組と、その実装をあわせて進めており、どのような実装が良いのかについての試行錯誤を繰り返す必要はあるが、来年度の早いうちには解決可能だと考えている。新規数理モデルの理論的・実証的テストとして、方向性のある細胞分裂による組織成長の効果等、単純なケースから進めていき、しかる後に実際の生物系で見られるケースについて適用する。特に、細胞分裂が周りに及ぼす力学的な効果(フォースダイポールとしての役割)について調べる。
新規SRPK阻害剤による眼内新生血管局所治療薬の開発

現在眼内新生血管疾患に対しては、抗VEGF薬の眼内注射による治療が行なわれている。今回新規薬剤を用いた軟膏剤の開発を行った。これまでの研究で得たSRPK阻害効果のある化合物を用いて、眼軟膏剤を作成し、脈絡膜新生血管モデルマウスに投与した。コントロールとして使用した基材のみの軟膏塗布に比べ、化合物含有軟膏を塗布にて、有意な新生血管抑制効果を認めた。次に眼内での効果をより高めるため、化合物のプロドラッグ体の作成を試みた。まず効果を確認した化合物の大量合成を行い、これまで報告されているプロドラッグ体を参考に、SRPK阻害剤のアセチル化体を作成した。化合物スクリーニングによって得られた新規SRPK阻害剤を用い、眼軟膏剤を作成した。基剤として白色ワセリンと液体パラフィンを用いた。まず効果を確認するため、化合物10%含有の眼軟膏剤を作成した。眼軟膏剤は経時的な含量低下もなく、室温・光照射下でも安定していた(調整後2週間保存の化合物含量;室温98.8%、冷蔵98.8%、時間あたり1000ルクス照射101.0%)。c57B/6Jマウスの両眼にアルゴンレーザー(532nm, 150wW, 75μm, 0.1sec)を照射し、脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization; CNV)モデルマウスを作成した。レーザー直後より、1日3回(午前9時、午後1時、午後5時)、7日間、コントロール眼軟膏(基剤のみ)および化合物含有眼軟膏をそれぞれ両眼に点入した。なお眼軟膏の塗布にはマイクロマン(Gilson)を使用し、7μl点入した。レーザー照射7日後、麻酔下に左室よりFITC-Dextran(Sigma)を灌流し、眼球摘出を行った。摘出眼は4%パラホルムアルデヒド液で固定した後、角膜・水晶体・網膜を除去し、フラットマウントを作成した。蛍光顕微鏡(Keyence)にて新生血管を作成し、面積を計測した。なおレーザーにて網膜下出血や硝子体出血を認めた個体は除外した。コントロール眼軟膏投与群(28981+/-2532.8μm2)と比較して、化合物含有眼軟膏投与群(19777+/-1836.6μm2)で有意な新生血管抑制効果を認めた。化合物のプロドラッグ体作成及び評価が遅れている。プロドラッグ体作成のために、まず化合物の大量合成を行った。大量合成で取得した化合物は、実験で使用したSRPK阻害剤と一致していた。これまで報告されているプロドラッグ体を参考に、軟膏剤で効果を確認したSRPK阻害剤のアセチル化体を作成した。しかしプロドラッグ体は作成できたが、実験にて使用する軟膏を作成するに必要量の化合物を取得するのが困難であり、脈絡膜新生血管モデルマウスでの効果実験までは至らなかった。またSRPK阻害剤投与による眼組織でのVEGFの変化を確認するため、マウス網膜及び脈絡膜・強膜複合体からのRNA抽出、cDNA作成、RT-PCRを試みた。網膜や脈絡膜・強膜の組織全体よりRNA抽出すると、レーザーを施行した部分以外の組織が多く含まれるため、レーザーを施行した部分の組織を部分的に採取し、RNA抽出を試みたが、サンプル量が微量のため、RT-PCRにてVEGF mRNAを確認することはできなかった。またレーザー数を増やし、採取する組織量も増やしたが、確認に至らなかった。動物組織のVEGF mRNAの変化を同定するのが困難であったため、網膜色素上皮細胞を用いた実験で再度SRPK阻害剤によるVEGF mRNAを確かめた。これまで我々はVEGF mRNAの低下に関して確認していたが、既報ではRNAスプライシングによるVEGFのアイソフォーム変化による血管新生阻害が報告されていたので、スプライシング変化について検討した。網膜色素上皮細胞からRNA抽出し、VEGFAのmRNAを確認したが、既報にあるような新生血管阻害効果のあるVEGFのアイソフォームは確認できなかった。化合物のプロドラッグ体作成に関しては、研究協力者に協力を得ながら、遂行していく。眼科
単一遺伝子病の分子・細胞生物学的研究

本年度の班構成は総括班員10名、計画班員24名(第I班14名、第II班10名)、公募班員23名からなっている。本研究の目的は最新の研究手法を駆使して遺伝病の予防・治療法の開発を目指すとともに、これらの疾患の分子レベルの究明を通じてヒトにおける遺伝子発現や調節機構の未知の部分を解明することにある。総括班会議を開き、研究の方針を定める共に、第I班(病因遺伝子の単離と解析)、第II班(疾患発症の分子機構の解明)の合同班会議を平成5年12月6、7日に開催した。研究成果は広範囲に及ぶがここでは疾患発症の解明で本年度注目される疾患と遺伝子導入について略記する。(1)新児型マルチプルカルボキシラーゼ欠損症の変異解析;本症の責任酵素であるホロカルボキシラーゼ合成酵素は精製が困難だったために、分子レベルでの解析が出来なかった。本年度、世界に先駆けてcDNAクローニングに成功し、患者のcDNAでの解析の結果、710番目のTのCへの置換(T710C)と782番目のGの1塩基欠失が同定された。これらの変異は日本人患者の80%の病因変異を説明する。(2)糖尿病発症関連遺伝子としてのグルコキナーゼ;ヒトグルコキナーゼのゲノムDNAをクローニングし、エクソン/イントロンを含めたDNA断片のPCRによる増幅を可能にした。NIDDM患者の塩基解析を行い、遅発性NIDDM患者でR186X変異を見いだした。本研究により遅発性NIDDM多発家系の中にグルコキナーゼ遺伝子異常が存在することを世界ではじめて見いだした。(3)動物細胞への遺伝子導入活性を持つ粒子の完全精製とその導入活性の定量化に成功した。以上の成果を踏まえて公開シンポジュウムを開催し(12月7日)、活発な討論が行われた。研究班の連携を密にするためNews Letterを発刊した。本年度の班構成は総括班員10名、計画班員23名(第I班13名、第II班10名)、公募班員32名からなっている。総括班会議を開き、研究の方針を定める共に、第I班(病因遺伝子の単離と解析)、第II班(疾患発症の分子機構の解明)の合同班会議を平成4年12月14、15日に開催した。病因遺伝子として本年度新たにPit-1遺伝子(下垂体特異的転写因子)、XPAC遺伝子(A群色素性乾皮症の原因遺伝子)、ビリルビンUDPGTcDNA(Gunnラットの病因遺伝子)、weelキナーゼ制御遺伝子などが単離・解析された。更にALDやウエルナー症候群、クラッベ病の原因遺伝子が単離されつつある。ポジショナルクローニングによる病因遺伝子の単離に必須の多型DNAマーカーを多数単離し、世界的に最も密度の高い染色体地図を作成した。遺伝子発現や調節領域の研究はオルニチンカルバミラーゼ遺伝子、チロジナーゼ遺伝子、グロビン遺伝子、ミトコンドリア遺伝子で検討された。胚操作によるヒト疾患モデルの作成の基礎的研究がすすみ、XPAC遺伝子欠損マウス、TTR欠損マウスの樹立に成功した。疾患発症の分子機構の解明はペルオキシソーム病、ミトコンドリア脳筋症、アミノ酸・有機酸

代謝異常症、リピドーシス、高コレステロール血症など多岐にわたる疾患で、多数の患者を対象になされ、病因・病態が分子レベルで明らかにされた。更に遺伝子治療のための基礎的研究としてベクターの開発、遺伝子導入法の検討も進んでいる。以上の成果を踏まえて公開シンポジュウムを開催し、活発な討論が行われた。研究班の連携を密にするためNews Letterを発刊した。
中枢神経疾患におけるミトコンドリアDNA放出機構の解明

ミトコンドリアDNA (mtDNA)は自然免疫を活性化することが知られているが、本研究ではアクアポリン4抗体陽性視神経脊髄炎(NMO)において髄液中のmtDNAとその放出機構、病態への関連について検討した。NMO急性期における髄液mtDNAはNMOSD寛解期、MS急性期、その他神経疾患群と比較してそれぞれ有意に上昇していた。またNMOSD患者血清をアストロサイト培養に添加したところmtDNAは増加した。NMOSD急性期では髄液mtDNAは増加し、炎症性サイトカインの産生を促進する可能性が示唆された。NMOSDにおいて、mtDNAが炎症の促進など病態に関与している可能性がある。NMOはAQP4抗体によるアストロサイト障害が原因であるが髄液中でIL-1βやHMGB1が増加することが報告されており、自然免疫系の関与が示唆されていた。一方ミトコンドリアDNAは近年内因性のDAMPSとして注目されており、インフラマゾームの活性化やcGAS-sting経路を介してタイプ1インターフェロンの産生に関与することが報告されてきたが、中枢神経疾患での役割はまったく不明であった。さまざまな中枢神経疾患患者髄液のミトコンドリアDNAを測定したところ他の神経疾患に比べてNMO急性期において有意に増加していることを見出した。またNMO患者血清をマウスのアストロサイトおよびAQP4強制発現HEK293細胞にに添加したところ、ミトコンドリアDNAが培養上清中に増加した。さらにミトコンドリアDNAを混合グリア培養に添加したところ、培地中にIL-1βが増加した。この増加はインフラマゾーム活性化が起きないASC欠損マウスでは観察されず、ミトコンドリアDNAはインフラマゾームを活性化しIL-1β産生の原因となることが明らかとなった。視神経脊髄炎患者検体と培養系において予想通りの結果が得られているNMOSDにおける抗AQP4抗体の病原性は確立されているが、近年、HMGB-1やIL-1βなど自然免疫との関連性も報告されている。ミトコンドリアDNA (mtDNA)は自然免疫を活性化するDAMPs (damage-associated molecular patterns)としての働きが知られており、本研究ではmtDNAがNMOSDの病態へ関連しているか明らかにすることを目的とした。対象は抗AQP4抗体陽性のNMOSD 52症例(急性期28症例、寛解期24症例)、MS急性期27症例、神経変性疾患など非炎症性疾患症例とし、髄液中のmtDNAを定量的PCRにより測定した。また、AQP4強制発現HEK293細胞と、C57BL6/Jマウス新生仔から作成したアストロサイト初代培養にNMOSD患者血清、健常人血清をそれぞれ添加し、上清中mtDNAの測定をおこなった。さらに、NMOSD患者髄液から抽出したDNAをマウス混合グリア細胞に加え、サイトカイン産生を検討した。NMOSD急性期における髄液mtDNAはNMOSD寛解期、MS急性期、その他神経疾患群と比較してそれぞれ有意に上昇していた。AQP4強制発現HEK293細胞、アストロサイト培養ともにNMOSD血清群では健常人血清群と比べ、上清中mtDNAは高値であった。また、NMOSDの髄液中DNAによりIL-1β産生の亢進がみられた。このまま研究を推進していく28年度が最終年度であるため、記入しない。神経免疫学28年度が最終年度であるため、記入しない。
二次元ファンデルワールス原子層薄膜における室温強磁性の起源解明

本研究では、二次元ファンデルワールス原子層物質VSe2の室温強磁性発現機構を、精密構造解析、原子スケール表面構造イメージング、スピン偏極微細電子構造解析、元素選択的磁気モーメントの評価によって解明することを最大の目的とする。特に、薄膜作製から構造評価、電子状態観測の一連の研究プロセスを超高真空下で行うことで、本質的な物性解明を目指す。また、トポロジカル絶縁体やグラフェンに代表されるディラック電子系と強磁性原子層薄膜のヘテロ構造を作成し、新奇二次元ファンデルワールスヘテロ構造の創生および物性評価も目指す。
希土類添加ナノ蛍光体の電子線励起発光を利用した液中ナノバイオイメージング

カソードルミネッセンス(CL)顕微鏡による液中バイオイメージングを達成するために、液中観察用チャンバーの作製、高輝度かつ数十nmのサイズを持つ蛍希土類添加ナノ蛍光体の作製、CLイメージング検出系の改善を行った。SiN薄膜基板を用いた液中観察用チャンバーを作製することで、細胞の液中CLイメージングに成功した。また、沈殿剤を多量に添加した均一沈殿法により、平均粒径40 nm程度の粒子の作製に成功し、その単一粒子の液中CLイメージングに成功した。更に感度の高いCLイメージングを達成するためにCLを高効率に集めることが可能な放物面ミラーを作製し、システムに組み込んだ。本研究では、液中における複数蛋白種の局在を電子顕微鏡の空間分解能かつマルチカラーで可視化するカソードルミネッセンス(CL)ナノバイオイメージング法の確立を目的とする。この方法は、電子線を用いて蛍光体を励起し、その発光を分光してマッピングする。電子線は光に比べ、容易にナノスケールに収束可能なため、ナノスケールの空間分解能を達成することが可能である。また、電子線励起による発光は物質により異なるため、カラーイメージングを実現可能である。今年度は、上記目的を達成するために以下の研究を行った。CLナノバイオイメージングのための高効率なCL検出システムを構築するために、CLの取得立体角を大きくした放物面ミラーの設計と作製を行った。CLの取得立体角を大きくするために、ミラーが試料の上下を覆うように設計を行った。放物面鏡で取得されたCLを効率よく検出器まで伝送するために、石英窓を通してCLを電子顕微鏡の外に取り出す設計にした。ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターを用いて分光を行い、フォトンカウンティングタイプの光電子増倍管で光検出する方式を採用した。生体試料を液中で観察するためのチャンバーの設計を検討した。2枚の窒化シリコン薄膜を重ね合わせることで、液中CL観察が可能であることを確認した。窒化シリコン薄膜の膜厚と電子線の加速電圧がCLイメージングの分解能に及ぼす影響をモンテカルロシミュレーションによって確認した。均一沈殿法を用いて、最小30 nm程度の希土類添加ナノ蛍光体の作製法を確立した。また、その蛍光体からのCLを確認した。希土類元素の添加濃度を最適化することで、さらなる輝度向上の可能性がある。高効率なカソードルミネッセンス(CL)検出システムのための放物面ミラーの設計と作製を完了し、蛍光体の開発に関しては、均一沈殿法を用いて最小30 nm程度の希土類添加ナノ蛍光体の作製法を確立したため。液中カソードルミネッセンス(CL)バイオイメージングのための蛍光体の高輝度化とそれを用いた液中CLバイオイメージングを行った。沈殿剤の尿素を高濃度に用いた均一沈殿法により、30-40 nm程度の球形の蛍光体作製が可能であることを示した。また、この方法で作製した蛍光体は発光に寄与する希土類元素を正確な濃度で粒子の中に入れることが可能であることを示した。溶液内の均一かつ急激なpH上昇によって多量の核生成が合成初期段階で行われ、希土類イオン種による析出pHの違いの影響を受けなかったことが原因と考えられる。これにより、発光輝度に影響の出やすい添加希土類イオン濃度を正確に検討出来るようになり、発光効率の良い蛍光体を再現性良く作製できるようになった。また、上記の蛍光体作製法で作製した蛍光体単一粒子の液中CLイメージングに成功した。二次電子像と同程度の空間分解能でCLイメージングが可能であることを示した。更に、添加希土類元素濃度、焼成温度、共添加元素を制御することで、より高輝度な蛍光体が作製可能であることを示した.生体試料を液中で観察するためのチャンバーに関しては、前年度と同様2枚の窒化シリコン薄膜を重ね合わせる方式を採用した。前年度に作製した液中CL計測システムを用いて作製した蛍光体や蛍光体を取り込ませた細胞の液中イメージングを行った。今後、より高空間分解能での観察を行うために、フィールドエミッション型の電子銃を有する走査型電子顕微鏡を用い、タンパク質一分子スケールでのイメージングを目指す必要がある。作製した放物面ミラーを用いて、希土類添加ナノ蛍光体のカソードルミネッセンス(CL)イメージングを行い、従来用いていたCLの取得立体角が小さいシステムとの比較を行う。また、希土類添加ナノ蛍光体を取り込ませた液中細胞のマルチカラーCLイメージングを行う(均一沈殿法で作製した粒径50 nm以下のY2O3:Eu, Y2O3:Tb, Y2O3:Tmを利用)。

平行して、ナノ蛍光体への希土類添加濃度の最適化を行うことで、高輝度なナノ蛍光体を作製し、CL画像のS/N比改善と取得時間短縮を試みる。応用光学