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平安時代末期の摂関家における文学と学問の研究―藤原忠通と藤原頼長を中心に―

その端緒として、藤原忠通・頼長兄弟の活動を主要な対象として研究を行っている。平成29年度は藤原忠通の家集『田多民治集』の研究を行った。具体的には、『田多民治集』に収録されている和歌を読解して注釈を進め、忠通の文学的活動のうち、特に和歌に関わる活動とその特徴について検討した。忠通の和歌は勅撰集や歌合の研究によってある程度解明されてきたが、『田多民治集』はほとんど研究されておらず、忠通の和歌に関わる活動を網羅的に論じた研究はない。そのため、『田多民治集』の注釈を行い、忠通の表現や和歌と漢詩の交流について考察を進めている。現時点では注釈が未完であるため、その成果を発表するには至っていないが、平成30年度中にとりまとめる予定である。一方で、当初の計画では平成30年度に予定していた忠通と頼長の文学や学問的活動について、平成29年度の研究の中で少なからず成果を得ることができた。まず、頼長については、平成26年度に提出した学位論文を基に、その後の研究成果を加え、『藤原頼長ー「悪左府」の学問と言説ー』という著書にまとめた。この著書は既に再校を終えており、平成30年中に出版予定である。また、忠通との関わりでは、忠通の家司を務め、忠通の息子兼実に近侍した儒者藤原長光について研究を行い、「藤原長光と泰山府君都状ー『玉葉』を中心にー」という論文を執筆した。これは兼実の日記『玉葉』を中心に長光の人物像について整理し、阪本龍門文庫蔵『卅五文集』所載の泰山府君都状を読解することで長光と兼実の人物や学問について考察を行ったものである。この論文は平成30年に出版される『『玉葉』を読む続』に掲載される予定であり、既に今年1月に寄稿済みである。平成29年度は、藤原忠通の家集『田多民治集』の読解と、藤原頼長と忠通の文学・学問活動の検討に重点を置いて研究を行った。まず、『田多民治集』については注釈作業を通して忠通の和歌に関わる活動の解明を目指した。具体的には、『田多民治集』所収の和歌に注釈を付し、解釈を行うとともに、忠通の漢詩集『法性寺関白御集』のほか、中国や日本の漢詩文との影響関係を検討することで、詠作の背景や特徴について考察した。現時点ではまだ『田多民治集』のすべての和歌に注釈を付けられていないため、平成30年度も注釈を継続する。また、平成28年度の成果と併せて、忠通の文学的活動における和歌と漢詩の交流について検討を行いたい。そして、『田多民治集』の注釈の成果を『法性寺関白御集』の注釈にも反映し、両者の完成を目指していきたい。加えて、平成29年度は頼長と忠通の文学や学問に関わる活動についても研究を行った。頼長に関しては、現在に至るまでの研究成果を踏まえて学位論文を増補改訂し、著書としてまとめた。これは頼長の日記『台記』を中心とした資料の詳細な読解により、頼長の学問や人物像について考察を行ったものである。また、忠通については忠通や息子の兼実に近侍した儒者藤原長光について研究を行い、忠通から次世代に至る摂関家の学問世界の究明を行った。頼長や忠通の文学・学問活動の研究は平成30年度にも計画しているため、引き続き研究を深めていく予定である。以上を総合すると、現在の進捗状況としては、おおむね予定通りに研究が進展していると考える。本年度は、これまでの2年間で行ってきた忠通の漢詩と和歌の研究を継続・発展させるとともに、研究計画の通り、頼長の学問的活動に関する研究についても新たに着手した。まず、忠通については昨年度から引き続き漢詩集『法性寺関白御集』と家集『田多民治集』の注釈作業を進めた。忠通は詩人であり、歌人でもあったため、注釈においては特に漢詩と和歌の相互の影響関係を念頭に置きながら用例や解釈の再検討を行った。
米国銀行業における支店禁止・制限の歴史的背景および最近の緩和の現代的意義

支店銀行制を題材としながらアメリカの経済制度の歴史的特質と現代における変化の意義を明らかにするという研究目標に沿って,当面,カリフォルニア州の支店銀行制の初期の発展にかんする継続中の研究を拡充することが主な作業であったが,新たに,合衆国憲法体制200年の中での連邦政府による経済過程への関与のあり方の,時代による大きな特徴づけを与える準備的研究に着手した。カリフォルニアでの1909年銀行法以後1920年代末までの支店銀行制にかんする資料整理を通じ,アメリカの中でもほとんど唯一本格的な全州支店制の発展を見る特異な州でありえた事情としておよそ次のような点が明らかにされた。(1)バンク・オブ・イタリ-の創立者の創意と手腕が強い推進力になる(2)貯蓄銀行的性格の新銀行によって,既存のコルレス関係を重視する商業銀行とは異なる行動様式で,支店拡大が進められる(3)加州の産業的・地理的多様性が,支店網を通ずる広域的資金移動の意義を特段に高めている(4)1909年銀行法の当初の連用が有利な環境をもたらし,やがて反支店の動きが強まるまでに,もはや逆行不す能な相当の既成事実を生むなお,一般的な経済規模の拡大や都市化・郊外化と近隣支店の必要性といった全国的に作用した要因が加州にも仂らいていることはいうまでもない。支店制の具体的発展状況の研究を継続しつつ,研究目標に沿って,現在研究の重点を,革新主義時代に飛躍的に高まった連邦介入,さらに質的変化が生じた大不況・大戦を経ての中央集権屯にもかかわらず,モザイク的銀行制度が継続することになる事情の解明に移している。
行動適応を担う脳神経回路の機能シフト機構

「適応回路シフト」領域では、神経回路を操作し、解析するための新しい技術を駆使して、行動の適応に重要な神経回路の発達や遷移、損傷に対する回路の機能代償と再編成のメカニズムを明らかにすることを目的に、平成26年度から30年度までの5年間、領域活動を行った。これまでの領域活動とそこから得られた研究成果をとりまとめる。具体的には、領域全体の目的、計画班・公募班の研究成果、総括班の活動、研究組織の体制に加え、研究や連携の達成状況を報告する。
抑うつ発症における職業性ストレスと遺伝素因・エピゲノムの相互作用

本研究は、抑うつ発症における職業性ストレスと遺伝素因・エピゲノムの相互作用を明らかにすることにより、早期予防に資する研究成果の基礎となるものを目指してきた。774名の協力者を得て、唾液からDNAサンプルを採取し、各種調査票に記入してもらった。抑うつ度と有意に相関するエピゲノム情報として、BDNF遺伝子やMTHFR遺伝子のメチル化割合が有用である可能性について国際誌に論文が掲載された。ストレスと有意に相関するエピゲノム情報として、TH遺伝子のメチル化割合が有用である可能性について国際誌に論文が掲載された。研究代表者がリクルートした約二千人(現在2626人)の職域コホートではベースライン時に全例で栄養疫学調査を行い現在4年目の追跡調査を行い、社会経済状況(Socio Economic Status)と健康状態の関連において食習慣が介在しているという作業仮説のもと検討を進めている。ホモシステインを低下させる葉酸の摂取量は性・年齢・各種ストレス指標・社会経済状況で調整したうえでも統計学的に有意に抑うつ度と負の相関が認められ、多重ロジスティック回帰分析では葉酸摂取量が100μg/1000kca1・day増えると抑うつのリスクが約2割統計学的に有意に減少することを明らかにした(BMC Psychiatry 2012)。また教育歴および世帯年収は抑うつ度の独立した予測因子であること、葉酸という栄養摂取状況が教育年数と抑うつの関連を介在する重要な因子であることを明らかにした(Nutrients 2013)ほか、我が国でも社会経済状況によって塩分摂取量や血圧の健康格差が存在することを報告している(Int J Environ Res Public Health 2013)。平成24年度は遺伝子多型解析やDNAメチル化解析に関する追加同意を得て775名のDNAを収集した。これらのサンプルを用いてSNP解析およびエピゲノム解析()を開始した。生活習慣病やメンタルヘルス疾患の発症には多数の遺伝子多型が少しずつ寄与すると同時に、様々な環境要因が影響を与えており、近年はこれらの発症に可塑性のあるエピゲノム状態の違いが関連する可能性が示唆されているため、予防医学への応用可能性を含め検討していきたいと考えており、今年度の成果はこれらの足がかりの一つとなるものと考えられる。本研究は抑うつ発症における職業性ストレスと遺伝素因・エピゲノムの相互作用を明らかにすることにより、疾患発症・進展の早期予防に向けての基盤となるエビデンスを創成することを目的として、職域コホート集団のなかからリクルートを進めてきた。今年度は倫理審査で承認された説明文書によりゲノム・エピゲノム解析の同意を700名以上から得ることができ、全例のDNA抽出とSNP(一塩基多型)およびDNAメチル化解析を行うことができた。特にBDNF遺伝子全域およびCpG I領域において、抑うつ度が高まるとメチル化が有意に減少することが明らかとなり、論文化して国際誌への投稿したところNeuropsychiatric Genetics誌に受理された(in press)。唾液から迅速にDNAメチル化の判定ができれば、うつ病の診断バイオマーカーとして、また治療効果の客観的判定に有用である可能性があるため、今後も他の遺伝子領域で同様の検討を進めながら、我々の職域コホートの豊富な情報を活用し、環境因子(社会経済状況、栄養状況、ストレスに関する諸指標Job strain、demand、control、effort reward imbalance、work engagementなど)、発達障害傾向や愛着パターンなどとの関連についても考慮しながら、エピゲノムと環境との交互作用を明らかにすべく統計解析を進めており、まとまり次第随時発表予定である。本研究は抑うつ発症における職業性ストレスと遺伝素因・エピゲノムの相互作用を明らかにすることにより、早期予防に資する研究成果の基礎となるものを目指してきた。計画していたDNA検体の収集とメチル化解析は昨年度完了しており、今年度はデータ解析を進めてきた。DNAチップによるエピゲノム解析を行い、アウトカムである抑うつ傾向と各種コホートデータの解析を進めていたが、研究代表者所属機関にて部門の統廃合が実施され、秘書および研究員のポストが各1削減されたことによりデータ整理・解析計画が遅れが生じてしまい、平成27年度を最終年度として延長申請することとなった。抑うつ度と有意に相関するエピゲノム情報として、BDNF遺伝子のメチル化割合が有用である可能性について国際誌に論文が掲載された(Am J Med Genet B 2015)。ストレスと有意に相関するエピゲノム情報について論文投稿中である。エピジェネティクスとはDNAの塩基配列の変化を伴わず、生育環境やストレスなどの環境因子により、細胞分裂後も継承される後天的に遺伝子発現変化が生じる機構であり、客観的評価が難しいメンタルヘルス領域で客観的な生物学指標として有用な可能性を秘めている。我々は最終年度として、今まで調査したDNA検体のメチル化解析データを用い、職場ストレスや抑うつ度といった職域コホートデータとの関連解析を進めた。

当初目指していた抑うつ度と有意に相関するエピゲノム情報に関する知見として、BDNF遺伝子のメチル化割合が有用である可能性について国際誌に論文が掲載され(Am J Med Genet B 2015)、さらなる知見も得られつつあるから。27年度が最終年度であるため、記入しない。公衆衛生学抑うつ度と有意に相関するエピゲノム情報に加え、ストレスと有意に相関するエピゲノム情報について論文化して総括する。研究課題に掲げたゲノムおよびエピゲノム解析に必要なDNAサンプルの同意が当初の目標以上の775名分得られ、これらのDNA抽出まで完了したため。本研究は抑うつ発症における職業性ストレスと遺伝素因・エピゲノムの相互作用を明らかにすることにより、疾患発症・進展の早期予防に向けての基盤となるエビデンスを創成することを目的として職域コホート集団のなかからリクルートを進めてきたが、今年度は倫理審査で承認された説明文書によりゲノム・エピゲノム解析の同意を700名以上から得ることができ、DNAの抽出まで終えることができ、SNP(一塩基多型)およびDNAメチル化解析を行うことができた。平成26年度にDNAチップによるエピゲノム解析を行い、アウトカムである抑うつ傾向と各種コホートデータの解析を進める予定であったが、同年度に研究代表者所属機関にて部門の統廃合が実施され、秘書および研究員のポストが各1削減されたことによりデータ整理・解析計画が遅れ、当該データの収集完了が平成27年2月にずれ込み、年度末に取りまとめる時間が不足してしまった。メンタルヘルス疾患の発症には多数の遺伝子多型が少しずつ寄与すると同時に、様々な環境要因が影響を与えており、近年はこれらの発症に可塑性のあるエピゲノム状態の違いが関連する可能性が示唆されているため、予防医学への応用可能性を念頭に検討を進める。最終年度はこれらの情報を整理しつつ得られた結果を基にして、環境因子(社会経済状況、栄養状況、ストレスに関する諸指標Job strain、demand、control、effort reward imbalance、work engagementなど)、発達障害傾向や愛着パターンなどとの関連について先行研究を参考にしながら統計解析を行う。さらに余裕があれば既知の遺伝子座における解析結果を鑑みながら既報のない遺伝子座についての解析も検討したい。このようにして得られた結果を取りまとめ学会発表や国際誌への論文投稿を行う。上記理由により遅延した部分の解析ととりまとめの経費に未使用額を充てることとなるが、遺伝子解析はすべて終了していて高額の支出は完了しているため、論文化や学会発表など最終年度とりまとめに使用予定である。初年度(平成24年度)に引き続き、初年度内に解析が完了しなかった遺伝子多型タイピングおよびDNAプール作成によるメチル化チップ解析を進めていく。抑うつの評価に開発中の診療支援システムを応用して効率化・標準化を図る。
積み上げ造形法の研究-微粒子積み上げによる極微小3次元構造物の構築-

本研究の目的は,電子顕微鏡下でマニピュレータを用いて微小な粒子を機械的に積み上げる方法により3次元的な極微小構造物を製作する『積み上げ造形法』を,機械的な3次元付加加工手法として確立し,実際の構造物の製作によってその有効性を検証することにある.(1)微粒子の吸着・離脱制御手法の確立:前年度の研究で微小体に働く力は主に静電力であることが明らかになっていたが,今年度は系統的な実験と数値計算によるシミュレーションにより,それが帯電電位の他に表面粗さや工具との対向面積にも依存することを明らかにした.また,特に高分子微粒子では接触部での粘弾性変形により,付着力が経時的に増大することを実験的に明らかにした.以上の知見に基づき,工具の接触面積を変化させて微粒子をプレースする手法や,基板に付着した微粒子を横にすべらせて吸着力を初期化することによりピックアップする手法を確立した.(2)積み上げ造形システムの統合:積み上げ造形システムに新たに画像制御手法を取り入れ,微粒子の挙動を監視しながら自動的に工具先端に吸着させて持ち上げる手法を確立した.(3)積み上げ造形法の評価:極微小3次元構造物の具体例として,多重散乱により光の放射の量子制御効果が発現すると理論上予測されながら,これまで製作技術の制約により実現されていなかったフォトニック結晶を取り上げた.直径2μmの微小球を3次元的に積み上げて製作した結晶による可視光の回折パターンや反射スペクトルを計測し,理論的に予想されるとおりの多重散乱が生じることを確認した.これが光波帯の電磁波に対しての3次元フォトニック結晶を実現した最初の例であり,積み上げ造形法の有効性を示すことができた.本研究の目的は,電子顕微鏡下でマニピュレータを用いて微小な粒子を機械的に積み上げる方法により3次元的な極微小構造物を製作する『積み上げ造形法』を,機械的な3次元付加加工手法として確立し,実際の構造物の製作によってその有効性を検証することにある.(1)微粒子の吸着・離脱制御手法の確立:前年度の研究で微小体に働く力は主に静電力であることが明らかになっていたが,今年度は系統的な実験と数値計算によるシミュレーションにより,それが帯電電位の他に表面粗さや工具との対向面積にも依存することを明らかにした.また,特に高分子微粒子では接触部での粘弾性変形により,付着力が経時的に増大することを実験的に明らかにした.以上の知見に基づき,工具の接触面積を変化させて微粒子をプレースする手法や,基板に付着した微粒子を横にすべらせて吸着力を初期化することによりピックアップする手法を確立した.(2)積み上げ造形システムの統合:積み上げ造形システムに新たに画像制御手法を取り入れ,微粒子の挙動を監視しながら自動的に工具先端に吸着させて持ち上げる手法を確立した.(3)積み上げ造形法の評価:極微小3次元構造物の具体例として,多重散乱により光の放射の量子制御効果が発現すると理論上予測されながら,これまで製作技術の制約により実現されていなかったフォトニック結晶を取り上げた.直径2μmの微小球を3次元的に積み上げて製作した結晶による可視光の回折パターンや反射スペクトルを計測し,理論的に予想されるとおりの多重散乱が生じることを確認した.これが光波帯の電磁波に対しての3次元フォトニック結晶を実現した最初の例であり,積み上げ造形法の有効性を示すことができた.本研究の目的は,電子顕微鏡下でマニピュレータを用いて微小な粒子を機械的に積み上げることで3次元的な極微小構造物を製作する『積み上げ造形法』を、機械的な3次元付加加工手法として確立し,量子効果デバイスであるフォトニック結晶を製作することによってその有効性を検証することにある.平成7年度は,本研究の基礎となる微粒子の吸着・離脱のための基礎的な知見を獲得し,微粒子の接合,自動化積み上げの基礎技術を確立することが具体的な目的であった.(1)微粒子に働く吸着力の性質の解明:様々な材質の組み合わせについて,微粒子と針,基板とを引き剥がすときの力を,試作した微小力測定システムを用いて実測し,吸着力が主に静電力に基づき,帯電状態,電気的導通状態,表面の微細形状の影響を強く受けることが明らかになった.さらにこの知見に基づき,微小部品の帯電を制御することにより,確実に吸着・離脱を制御できるツールを開発し,空気中でその有効性を確認した.(2)微粒子の接合手法の確立:マニピュレータに装着できる500°Cまでの範囲で基板温度を精密に制御できるヒ-タユニットを新たに開発し,表面の溶融により金属の微小部品どうしを接合できることを確認した.(3)針先端の微粒子への3次元位置決め手法の確立:微粒子の状態を基板に強く付着した状態,弱く付着した状態,針に付着した状態に分類し,マニピュレータの動作信号,実際の針先の動作・変形情報,実際の微粒子の移動情報からそれらの状態遷移が検出できることを明らかにした.これにより,針先端が微粒子に接触し,それを付着して持ち上げることができたこと,あるいは逆に離脱できたことを自動検出することができる.本研究の目的は,電子顕微鏡下でマニピュレータを用いて微小な粒子を機械的に積み上げる方法により3次元的な極微小構造物を製作する『積み上げ造形法』を、機械的な3次元付加加工法として確立し,実際の構造物の製作によってその有効性を検証することにある.

(1)微粒子の吸着・離脱制御手法の確立:前年度の研究で微小体に働く力は主に静電力であることが明らかになっていたが,今年度は系統的な実験と数値計算によるシミュレーションにより,それが帯電電位の他に表面粗さや工具との対向面積にも依存することを明らかにした.また,特に高分子微粒子では接触部での粘弾性変形により,付着力が経時的に増大することを実験的に明らかにした.以上の知見に基づき,工具の接触面積を変化させて微粒子をプレースする手法や,基板に付着した微粒子を横にすべらせて吸着力を初期化することによりピックアップする手法を確立した.(2)積み上げ造形システムの統合:積み上げ造形システムに新たに画像制御手法を取り入れ,微粒子の挙動を監視しながら自動的に工具先端に吸着させて持ち上げる手法を確立した.(3)積み上げ造形法の評価:極微小3次元構造物の具体例として,多重散乱により光の放射の量子制御効果が発現すると理論上予測されながら,これまで製作技術の制約により実現されていなかったフォトニック結晶を取り上げた.直径2μmの微小球を3次元的に積み上げて製作した結晶による可視光の回析パターンや反射スペクトルを計測し,理論的に予想されるとおりの多重散乱が生じることを確認した.これが光波帯の電磁波に対しての3次元フォトニック結晶を実現した最初の例であり,積み上げ造形法の有効性を示すことができた.
鶏卵特異抗体によるサルモネラ菌の腸管感染の抑制とそのメカニズムの解析

病原体による消化器感染に対する予防・治療の方法として,近年抗体の経口摂取による方法(抗体含有食品の摂取による予防)の有用性が指摘されるようになった。本研究では鶏卵卵黄から得られる抗体(IgY)を用い,特異抗体がSalmonella emteritidisのような細胞侵入性病原菌の感染に対してどの程度有効か,また病原菌の上皮細胞への感染のどのステップを抗体が阻害するのか等について検討した。S.enteritidisの全菌体でニワトリを免疫し,その卵黄から特異抗体を精製した。透過性膜上に単層培養したヒト腸管由来培養上皮細胞Caco-2の粘膜側からS.enteritidisを加え,細菌の細胞への感染に及ぼす本特異抗体の効果をCaco-2細胞層の電気抵抗値変化を指標に調べたところ,抗体の存在下では菌の細胞へ感染が顕著に阻害されることが認められた。そこで,細菌の(1)増殖,(2)腸管細胞粘膜表面への接着,(3)細胞内への侵入,(4)細胞層の貫通という感染の各ステップに対する抗体の影響を調べた。その結果,特異抗体は,S.enteritidisの増殖(1)に対しては全く阻害作用を示さなかったが,その腸管細胞への接着(2)を顕著に阻害し,それに伴って菌の細胞内への侵入(3)の速度も低下することが認められた。一方,特異抗体で処理することによって細菌の細胞層の貫通(4)は完全に抑制されることが明らかとなった。細胞侵入・貫通性の細菌には,侵入や貫通に関わる遺伝子の存在することが知られているが,抗体の結合が菌における遺伝子発現調節に変化を引き起こした可能性もあると考えられ,従来報告されている「抗体による病原菌接着阻害」による感染阻害とは別の新しい感染防御機構の存在が示唆された。
明治国家形成期における反欧化主義

本年は、昨年までに集めた資料等を読みこなしつつ、その成果を論文としてまとめることに力を注いだ。具体的に活字化されたものは、昨年より論文化の準備を進めてきた西村茂樹に関する論文二編である。まず論文「近代啓蒙主義的歴史観と歴史的個体性-西村茂樹の歴史認識-」では、西村茂樹の幕末期の歴史認識を検討し、西村が洋学との出会いによって啓蒙主義的な視座を獲得しつつも、しかし以前より持していた歴史的な個体性を重視する視座をも失うことなく、普遍を個別の位相のもとに見る歴史認識を形成することになったと論じ、そのような歴史認識が以後の西村の発想の基底に位置しつづけることになったことを明らかにした。また「西村茂樹『日本道徳論』の形成過程-国民道徳論の前期的形成-」では、西村茂樹の主著『日本道徳論』の形成過程を、草稿類を丹念に検討することによって明らかにし、儒教に基づく修身教育の主張が、時期を経るにしたがいって、国民としての団結を重視する「国民道徳」へと再編されていくこと、その意味で西村の『日本道徳論』は、後年のいわゆる「国民道徳論」の前期的形成を告げる作品であることを明らかにした。また、本年は、神戸に出張して日本弘道会の支部関係資料を調査し、また京都府立総合資料館に出張し、本多辰次郎関係文書を調査し、そこに含まれる反欧化主義関係の資料調査ならびにかねてから調査をすすめていた深谷博治文書との比較検討を行った。以上の他、谷干城・鳥尾小弥太・三浦梧楼といった人物に関しても、論文化の構想をまとめることができた。特にその際、それぞれの人物の思想と行動を総合的に比較・検討して体系化し、その思想的・政治的・社会的背景をさぐることに留意した。これらについては、今後成果として発表するために、論文化していく作業に取り掛かりたいと考えている。本年は、本研究の対象人物のうち、特に先行研究の少ない人物に関する基礎的事実を明らかにすることを目的に、各種資料調査を精力的に行った。国立国会図書館憲政資料室では、各種目録を精査し、上記人物の登場する文書を探し、必要に応じて複写を行った。また同図書館古典籍資料室所蔵の西村茂樹関係文書についても調査を行い、必要に応じて複写を行った。また早稲田大学図書館所蔵の雑誌類のなかから、各種目次総覧類を参照して、上記人物の論説および関係記事が掲載されている雑誌を探し出し、複写を行った。これらの作業にあたっては研究補助者の協力を得た。また谷干城が経営に深く関与していた新聞『日本』を、明治22年の創刊号から、明治26年までのものについて目を通し、関係記事を複写・収集した。また、鳥尾小弥太の政治活動が主に大阪で行われていたということから、大阪府立中央図書館に出張し、新聞『関西日報』をはじめとする大阪紙の紙面を調査し、また関西大学図書館において、西村茂樹の結成した日本弘道会の大阪支会に関する史料の調査を行った。さらに、早稲田大学文学部所蔵の深谷博治旧蔵文書に関しては、まずその内容を把握すべく、研究補助者の協力のもと、生理と目録化の作業を行い、約三分の一程度に関して目を通すことができた。以上の結果、研究対象に関する基礎的事実を明らかにする多くの史料を収集することができた。現在この史料をもとに論文執筆を進めている最中である。特に西村茂樹に関しては、その主著『日本道徳論』の形成過程を詳細に跡付ける資料を収集することができたため、これをもとにした論文を執筆することができた。近いうちに学術雑誌に投稿を予定している。鳥尾小弥太に関しては、雑誌『歴史学研究』に論文「帝国議会開設後の保守党中正派-『中正日報』における言論活動-」を発表した。本年度は、反欧化主義的な人物の中でも、元田永孚・佐々木高行といった宮中グループや、ジャーナリズムを拠点にその主張を展開した陸羯南・三宅雪嶺らのグループ関する研究を行った。ただし、これらグループに関しては、すでに先行研究もいくつか存在しているため、かならずしも個別に学術論文としてまとめることを意図せず、あくまで、反欧化主義の総合的把握という目的のもとに、史料や研究文献を読み込み、それぞれの人物,グループの思想的特質を把握する作業を行った。この作業によって、明治期反欧化主義を構造的に把握する上での大きな成果を得ることができた。また、史料調査としては、国立国会図書館憲政資料室・古典籍資料室所蔵の諸資料、ならびに早稲田大学図書館や大阪府立図書館所蔵の諸新聞・雑誌類、および早稲田大学文学部で保管されている深谷博治旧蔵文書の調査を行い、特に深谷文書の整理と調査にあたっては研究補助者の強力を得た。また大阪府立中央図書館に出張を行い、新聞『関西日報』をはじめとする大阪紙の紙面を調査して鳥尾小弥太の大阪における活動に関する史料を収集し、また高知県立図書館・高知市立図書館において、谷干城関係史料の調査・収集作業を行った。また、以上の史料読み込みの結果、単に思想史的な視野からでなく、より幅広い社会史的な視野から、旧思想と新思想との接続・反発の問題を考える必要を感じたため、それを、特に西村茂樹・依田学海とその周辺の人物の明治期における「藩士」意識を焦点に、論文「明治期「旧藩士」の意識と社会的結合-旧下総佐倉藩士を中心に-」としてまとめ、『史学雑誌』に発表することができた。この他、昨年以来の研究の成果として、西村茂樹の道徳論の形成過程、ならびに西村茂樹の明治前期教育政策上の位置づけに関する論文を作成し、現在学術雑誌に投稿中である。

本年は、昨年までに集めた資料等を読みこなしつつ、その成果を論文としてまとめることに力を注いだ。具体的に活字化されたものは、昨年より論文化の準備を進めてきた西村茂樹に関する論文二編である。まず論文「近代啓蒙主義的歴史観と歴史的個体性-西村茂樹の歴史認識-」では、西村茂樹の幕末期の歴史認識を検討し、西村が洋学との出会いによって啓蒙主義的な視座を獲得しつつも、しかし以前より持していた歴史的な個体性を重視する視座をも失うことなく、普遍を個別の位相のもとに見る歴史認識を形成することになったと論じ、そのような歴史認識が以後の西村の発想の基底に位置しつづけることになったことを明らかにした。また「西村茂樹『日本道徳論』の形成過程-国民道徳論の前期的形成-」では、西村茂樹の主著『日本道徳論』の形成過程を、草稿類を丹念に検討することによって明らかにし、儒教に基づく修身教育の主張が、時期を経るにしたがいって、国民としての団結を重視する「国民道徳」へと再編されていくこと、その意味で西村の『日本道徳論』は、後年のいわゆる「国民道徳論」の前期的形成を告げる作品であることを明らかにした。また、本年は、神戸に出張して日本弘道会の支部関係資料を調査し、また京都府立総合資料館に出張し、本多辰次郎関係文書を調査し、そこに含まれる反欧化主義関係の資料調査ならびにかねてから調査をすすめていた深谷博治文書との比較検討を行った。以上の他、谷干城・鳥尾小弥太・三浦梧楼といった人物に関しても、論文化の構想をまとめることができた。特にその際、それぞれの人物の思想と行動を総合的に比較・検討して体系化し、その思想的・政治的・社会的背景をさぐることに留意した。これらについては、今後成果として発表するために、論文化していく作業に取り掛かりたいと考えている。
パーキンソン病における神経細胞死と関連したチロシン水酸化酵素の細胞内安定性の解析

パーキンソン病(PD)の疾患遺伝子としてα-シヌクレインやパーキン等が発見され、ユビキチン・プロテアソーム系の異常とPD発症との関連性が注目されている。最近、α-シヌクレインが誘発する培養神経細胞のアポトーシスが、チロシン水酸化酵素(TH)のインヒビターで抑制されることから、神経細胞死はTHから合成されたドーパミン(DA)の働きに関連していることが報告された。さらに、PD患者の脳内では、カルパインの発現量が著しく増加すること、THのN端はカルパインにより切断されやすいことが報告され、PD患者の神経細胞内ではTHのN端が切断されていることが推察された。しかし、THの低分子量化がDA合成に如何なる影響を与えるかについては全く知られていない。平成16年度に引き続いて研究を推進した結果、THのN端の削除は本酵素の細胞内安定性を著しく高めること、その原因として、THのN端にはプロテアソームの標的となるPESTモチーフ(Proline, Glutamate/Aspartate, Serine and Threonine Motif)が存在することを発見した。すなわち、THのN端は本酵素の細胞内安定性に対して重要な役割を有しており、DA合成量に影響を与えていることを明らかにした。また、この細胞内安定性には、N端領域に存在するSer残基のリン酸化とPESTモチーフとの相互作用が関与する可能性を予測した。特に、Ser^<40>のリン酸化はTHの細胞内安定性に影響を与えないのに対して、PEST配列に近接したSer^<19>のリン酸化はTHの細胞内安定性に影響を与えている可能性があることを発見した。最近、α-シヌクレインが誘発する培養神経細胞のアボトーシスが、チロシン水酸化酵素(TH)のインヒビターで抑制されることから、神経細胞死はTHから合成されたドーパミン(DA)の働きに関連していることが報告された。さらに、PD患者の脳内では、カルパインの発現量が著しく増加すること、THのN端はカルパインにより切断されやすいことが報告された。すなわち、PD患者の神経細胞内ではカルパインが過剰発現してTHのN端が切断されていることが推察された。しかし、THの低分子量化がDA合成に与える影響については全く知られていない。

また、この細胞内安定性には、N端領域に存在するSer残基のリン酸化とPESTモチーフとの相互作用が関与する可能性を予測した。特に、Ser^<40>のリン酸化はTHの細胞内安定性に影響を与えないのに対して、PEST配列に近接したSer^<19>のリン酸化はTHの細胞内安定性に影響を与えている可能性があることを発見した。以上の結果を研究発表欄に示すジャーナル、J.Neurosci.Res.及びBiogenic Amines、並びに、平成17年度の日本神経化学会大会および日本生理学会大会で発表した。
発酵食品におけるD-アミノ酸の機能解析

近年、様々な食品中にD-アミノ酸が検出され機能が注目されているが、食品中のD-アミノ酸の機能に関する研究は極めて少なく、その合成経路についても、不明な点が多い。本研究ではD-アミノ酸の食品機能性(呈味性、抗菌作用)の評価、及び、発酵食品のD-アミノ酸生産経路の解明を目的する。D-アミノ酸の呈味性の評価平成24年度に続き、D-アミノ酸の呈味性、抗菌作用について検討を行う予定であった。しかし、新規アミノ酸ラセマーゼの詳細な機能解析とその研究成果の学術論文への投稿、及び乳酸菌由来D-アミノ酸脱水素酵素の大量発現系の構築と機能解析の研究を優先したため、D-アミノ酸の食品機能の解析は、実験手法の検討にとどまり、十分な成果を得るには至らず、今後の課題として残された。D-アミノ酸の合成経路の解明平成25年度は前年度に見いだした新規アミノ酸ラセマーゼのより詳細な機能解析を行い、前年度報告した特徴的な基質特異性だけでなく、酵素の四次構造、反応の最適pH、補酵素PLP (pyridoxal-5'-phosphate)酵素グループとしての特徴からも、本酵素がこれまでに報告例のない非常に特徴的な新規性の高い酵素であることを明らかにした。すなわち、発酵食品中のD-アミノ酸について、全く新規の合成経路の解明に成功した。また、乳酸菌におけるD-アラニン(D-Ala)の新規な合成機構を明らかにするため、乳酸菌Lactabacillus plantarumのゲノム中に存在するD-アミノ酸脱水素酵素推定遺伝子の機能解析を進め、大腸菌での大量発現系を構築し、目的遺伝子産物を得る事に成功した。これまで、D-アミノ酸脱水素酵素は4種のグラム陰性菌でしか機能解析が行われていないため、グラム陽性菌由来の本酵素にD-アミノ酸脱水素酵素活性を見出し、詳細な機能解析を行うことができれば、本研究によって得られる成果は酵素学的に新規性の高いものになると考えられる。(抄録なし)近年、様々な食品中に_<D->アミノ酸が検出され機能が注目されているが、食品中の_<D->アミノ酸の機能に関する研究は極めて少なく、その合成経路についても、不明な点が多い。本研究では_<D->アミノ酸の食品機能性(呈味性、抗菌作用)の評価、及び、発酵食品の_<D->アミノ酸生産経路の解明を目的する。_<D->アミノ酸の呈味性の評価_<D->アミノ酸は_<L->アミノ酸よりも甘味を呈するものが多い事が知られているが、実際の食品中での呈味性は不明である。そこで平成24年度の本研究では醤油に_<D->及び_<L->アラニン(Ala)を添加し、味の変化を調べた。結果として、醤油の味の変化が感じられる_<D->Ala濃度は480mMと高濃度である事、又、_D及び_<L->Alaを同時に添加した方が、甘味が増し、味がまろやかになる事が分かった。_<D->アミノ酸の合成経路の解明発酵食品中の_<D->アミノ酸の主な起源は、従来_<D->アミノ酸を細胞壁に含む微生物であるとされているが、細胞壁の構成成分ではない_<D->アミノ酸も発酵食品中に存在することが報告されている。研究代表者は乳酸菌Lactobacillus otakiensisが細胞壁の構成成分ではない_<D->バリン(_<D->VaD、_<D->ロイシン(_<D->Leu)、_<D->アロイソロイシン(_<D>allo-Ile)といった_D体の分岐鎖アミノ酸を生産することを見出していたが、分岐鎖_<D->アミノ酸の合成に関与する酵素の知見はこれまでに無く、その合成経路は不明であった。本研究ではL.otakiensis及びL.buchneriに分岐鎖アミノ酸を基質とするラセマーゼを見出し、本酵素をコードする遺伝子の同定と大腸菌を用いた大量発現系の構築に成功した。精製した発現酵素は幅広い非極性アミノ酸に対するラセマーゼ活性を有しており、同様の酵素が発酵食品中の様々な_<D->アミノ酸の合成に関与している可能性が示唆された。このようなラセマーゼは全ての生物種において報告が無く、新規のラセマーゼを見出すことに成功した。D-アミノ酸の合成経路の解明平成25年度は前年度に見いだした新規アミノ酸ラセマーゼのより詳細な機能解析を行い、前年度報告した特徴的な基質特異性だけでなく、酵素の四次構造、反応の最適pH、補酵素PLP (pyridoxal-5'-phosphate)

酵素グループとしての特徴からも、本酵素がこれまでに報告例のない非常に特徴的な新規性の高い酵素であることを明らかにした。すなわち、発酵食品中のD-アミノ酸について、全く新規の合成経路の解明に成功した。また、乳酸菌におけるD-アラニン(D-Ala)の新規な合成機構を明らかにするため、乳酸菌Lactabacillus plantarumのゲノム中に存在するD-アミノ酸脱水素酵素推定遺伝子の機能解析を進め、大腸菌での大量発現系を構築し、目的遺伝子産物を得る事に成功した。これまで、D-アミノ酸脱水素酵素は4種のグラム陰性菌でしか機能解析が行われていないため、グラム陽性菌由来の本酵素にD-アミノ酸脱水素酵素活性を見出し、詳細な機能解析を行うことができれば、本研究によって得られる成果は酵素学的に新規性の高いものになると考えられる。平成24年度はD-アミノ酸の食品における抗菌作用についても検討を行う予定であったが、この研究には着手できていない。しかしながら、D-アミノ酸の合成経路に関する研究においては、新規アミノ酸ラセマーゼの同定、大量発現系の構築に成功し、新規性の非常に高い研究成果が順調に得られている。D-アミノ酸の呈味性の評価については、対象とするD-アミノ酸を乳酸菌が生産するD-Aia、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-Leu、D-Val、D-allo-lleに絞り、官能検査を継続していく。また、抗菌作用について、食品腐敗に関与するPenicilliumやAspergillus属等のカビを対象として検討を行う。D-アミノ酸の合成経路の解明については、本研究で見出した新規ラセマーゼのより詳細な機能解析を行うと同時に、乳酸菌においてD-Ala合成に関与している可能性があるD-アミノ酸脱水素酵素ホモログ遺伝子の大腸菌での発現及び、発現タンパク質の機能解析を行う予定である。さらに、酢酸菌における固体培養とD-アミノ酸増産の関係性について調べる予定である。(抄録なし)
腎近位尿細管細胞膜のイオン輸送体に対するカテコ-ルアミン作用の分子生理学的解明

カテコ-ルアミンの腎近位尿細管細胞膜のイオン輸送体に対する作用を解明した。カテコ-ルアミンは、腎臓に対してその腎血管系に対する作用に加えて、腎尿細管に対する直接作用が注目を集めている。そこで、腎尿細管に対する直接作用を検討するため、ウサギ腎皮質部近位尿細管直部(S2セグメント)を顕微鏡上で微小潅流し、経上皮電位(Vt)及び基底側膜電位(Vb)に対するisoproterenolの作用を評価した。S2セグメントは10^<ー8>から10^<ー3>Mのisoproterenolの投与により容量依存的に脱分極を起こした。また、Vtに関しては影響を与えないことから膜の脱分極反応であることが確認された。さらに、この反応は10^<ー7>Mのpropranololによって阻害され、特異的なβアドレノセプタ-を介する反応であることを示した。この初期脱分極は約30秒後に再度過分極傾向となった。本研究では、さらにこの最初の初期脱分極機序の解析を行なった。初期脱分極が、管腔側膜でのグルコ-ス・アラニンの起電性輸送の促進によるかどうかを評価するため、管腔波のグルコ-ス・アラニンを除去したが初期脱分極は抑制されなかった。期底側膜のナトリウム・重炭酸共輸送系の促進あるいはカリウムコンダクタンスの抑制による可能性を考え、基底側にスチルベン誘導体であるDIDSあるいはBa^<2+>を投与し、その条件下での初期脱分極を評価した。この結果、0.5mM DIDSあるいは1mM Ba^<2+>はいずれも初期脱分極を強く抑制することが明かとなた。さらに、脱分極の原因としてナトリウムポンプの抑制を考え、10^<ー4>M ouabainを投与すると脱分極は有意に抑制された。よって本研究から次のことが明かとなった。(1)腎近位尿細管に特異的なβアドレノセプタ-を介する脱分極反応があることが確認された。(2)さらに、脱分極反応は、基底側膜のナトリウム・重炭酸共輸送系の促進、カリウムコンダクタンスの抑制あるいはナトリウムポンプの抑制が機序と考えられた。
心血管系疾患の予知と早期の血液凝固亢進状態の新規迅速診断法の開発とその臨床応用

高脂血症を基盤とせずに発症する虚血性心疾患や脳卒中を予防・治療する際に、これに関与する因子の解明は重要である。我々は血液凝固開始反応の基礎研究から、活性型凝固第VII因子(FVIIaと略)の測定法を確立した。これまで、第VII因子凝固活性(VIIcと略)は虚血性心疾患の危険因子といわれていたが、FVIIaが危険因子そのものではないかと考え、検討を加えた。FVIIaは、検体血漿を酵母で発現させた可溶性組織因子(残基番号1-218)、第VII因子欠乏血漿、ウサギ脳セファリン(リン脂質として使用)、トロンビンの蛍光基質、カルシウムと混合し、トロンビンの生成量を蛍光強度で表した。本法により、0.2から1000ng FVIIa/mlで定量性がみられた。自動測定装置、Covas Fara II、を用いたため、再現性は同時および日差ともにCVは5%以下と良好であった。日本人の血中FVIIa量は平均2.6-2.7ng/mlであった。これは血中総FVII量の約0.5%に相当する。この微量のFVIIaが組織因子と複合体をつくると凝固反応が開始する。したがってFVIIa量が高いと血栓傾向になると考えられる。事実、健常者の男女平均2.7ng/mlに比べ、冠動脈疾患3.2ng/ml、慢性脳梗塞患者3.4ng/ml、両者合併例では3.9ng/mlと有意に増加していた。FVIIcもこれらの動脈硬化性疾患で増加傾向を認めたが、有意ではなかった。糖尿病患者ではFVIIaの増加が認められた。高血圧患者では、微量アルブミン尿を伴う場合はFVIIaの増加が認められたが、伴ない場合はFVIIaは増加していなかった。また、人工透析患者でもFVIIaが著増していた。尿中アルブミン排泄量の増加とともにFVIIa量が増加することも考えると、腎障害とFVIIaの生成は極めて密接な関連があると推測された。心血管系疾患の予知と早期の血液凝固亢進状態をモニターする方法として、血中の活性型凝固第VII因子(FVIIa)の測定法を確立し、本法を各種疾患患者に応用した。検体血漿をFVII欠乏血漿およびウサギ脳セファリンと混合し、トロンビンの蛍光基質、カルシウム、可溶性組織因子(酵母で発現させた組織因子の細胞外ドメイン)を加えることにより反応を開始し、生成したトロンビン活性を蛍光基質で測定し、蛍光強度が0.05に達する時間を反応時間とした。検量線は0.2-1000ngFVIIa/mlの範囲で直線が得られた。同時および日差の再現性(CV)は1.3%および4.2%と良好であった。本法を用いて日本人血中FVIIaを測定したところ、2.6-2.7ng/mlであり、FVII総量の0.5%に相当した。又、欧米人の3.6ng/mlもしくは4.3ng/mlより低値を示した。このことは、欧米人に比較して日本人に虚血性疾患が少ないことと関連しているかもしれない。加齡でFVIIaが増加した。一方、冠動脈疾患や慢性脳梗塞の患者では、FVIIa量は3.2ng/mlおよび3.4ng/mlと上昇し、両者合併例では3.9ng/mlと有意に増加した。

糖尿病患者でもFVIIaの増加が認められた。顕著なアルブミン尿を有する者ではさらに増加した。これらのことは、糖尿病患者ではFVIIの活性化がおこっており、過凝固状態にあると考えられた。血中FVIIa量は総コレステロールやトリグリセリド量と全く相関しなかった。このことは、FVIIaは血清脂質とは独立した心血管系リスクファクターであると考えられた。高脂血症を基礎とせずに発症する虚血性心疾患や脳卒中を予防・治療する際に、これに関与する因子の解明は重要である。我々は血液凝固開始反応の基礎研究から、活性型凝固第VII因子(FVIIaと略)の測定法を確立した。これまで、第VII因子凝固活性(VIIcと略)は虚血性心疾患の危険因子といわれていたが、FVIIaが危険因子そのものではないかと考え、検討を加えた。FVIIaは、検体血漿を酵母で発現させた可溶性組織因子(残基番号1-218)、第VII因子欠乏血漿、ウサギ脳セファリン(リン脂質として使用)、トロンビンの蛍光基質、カルシウムと混合し、トロンビンの生成量を蛍光強度で表した。本法により、0.2から1000ngFVIIa/mlで定量性がみられた。自動測定装置、Covas Fara II、を用いたため再現性は同時および日差ともにCVは5%以下と良好であった。日本人の血中FVIIa量は平均2.6-2.7ng/mlであった。これは血中総FVII量の約0.5%に相当する。この微量のFVIIaが組織因子と複合体をつくると凝固反応が開始する。したがってFVIIa量が高いと血栓傾向になると考えられる。事実、健常者の男女平均2.7ng/mlに比べ、冠動脈疾患3.2ng/ml、慢性脳梗塞患者3.4ng/ml、両者合併例では3.9ng/mlと有意に増加していた。FVIIcもこれらの動脈硬化性疾患で増加傾向を認めたが、有意ではなかった。糖尿病患者ではFVIIaの増加が認められた。高血圧患者では、微量アルブミン尿を伴う場合はFVIIaの増加が認められたが、伴ない場合はFVIIaは増加していなかった。また、人工透析患者でもFVIIaが著増していた。尿中アルブミン排泄量の増加とともにFVIIa量が増加することも考えると、腎障害とFVIIaの生成は極めて密接な関連があると推測された。
シダＰＨＹ３光受容体の青色光反応を制御するフィトクロム光センシング機構の解明

本研究課題はシダ光受容体PHY3のフィトクロム光センシング部位(PCM)の青色光シグナル受容メカニズムの解明に向けて新たな知見を得る事を目的とした。その結果、シダPHY3のPCMはシロイヌナズナのフィトクロムの相当部分との互換性が無いことが明らかとなり、PHY3に特異的なアミノ酸配列構造がPHY3の特徴的な光応答性、特に青色光への応答を制御している可能性が示唆された。またPHY3からの青色光シグナル伝達経路を明らかにするために、遺伝子探索のためのホウライシダESTデータベースAcESTを構築し、公開した。本研究課題は、シダ光受容体PHY3のフィトクロム光センシング部位Photosensory Core Module (PCM)の青色光受容機構に着目し、PHY3の青色光シグナル受容メカニズム、さらには赤色光/青色光シグナルの分子内相乗効果メカニズムの解明に向けて新たな知見を得ることを目的としている。PCMを構成する3つのサブドメイン(PAS/GAF/PHY)を、青色光反応を誘導しないシロイヌナズナPHYBのものと置換した改変PHY3を用いて、PHY3の青色光受容機構を解明する。これらの研究によりシダ植物の弱光環境適応機構や植物進化の分野に新たな知見を与えることが期待さるとともに、フィトクロム分子の光応答波長決定のメカニズムの解明にも新たな情報をもたらすことが期待される。今年度は研究実施計画に従い、解析対象となる改変PHY3導入形質転換シロイヌナズナ系統の確立を目指し、改変PHY3遺伝子の構築と形質転換植物体作成、さらに遺伝子導入植物体の表現型の解析を進めた。・昨年度に引き続きT2系統から薬剤耐性分離比による選抜を行い、ホモのT3系統を複数単離することに成功した。得られた系統について光屈性誘導の表現型を確認したところ、残念ながら弱い光屈性しか示さない傾向が見られており、現在照射光強度を変更するなど、PHYB:PHY3融合光受容体の光反応性に関して詳細な解析を行っている。上記の結果を得て、薬剤耐性による選抜とは別に、白色光による光屈性反応を指標として表現型スクリーニングを開始した。現在、強い光屈性を示すT2個体を選抜し、生育を進めている。また、PHYB PCMの代わりにPHYA PCMをPHY3に融合した改変PHY3の構築を進めており、PCMによる光反応性の違いがどのようになるのかを新たに解析する予定である。本研究課題は、シダ光受容体PHY3のフィトクロム光センシング部位Photosensory Core Module (PCM)の青色光受容機構に着目し、PHY3の青色光シグナル受容メカニズムの解明に向けて新たな知見を得ることを目的とした。これらの研究によりシダ植物の弱光環境適応機構や植物進化の分野に新たな知見を与えることが期待さるとともに、フィトクロム分子の光応答波長決定のメカニズムの解明にも新たな情報をもたらすことが期待された。実施期間を通し、研究実施計画に従って改変PHY3遺伝子の構築と形質転換植物体作成、さらに遺伝子導入植物体の表現型の解析を進めた。まず、PHY3のPCMに依存した青色光受容と、それに応答した生理反応誘導に関して詳細な解析を行った。その結果、PHY3のPCMが制御する青色光反応は、遠赤色光の照射によって打ち消される反応であることを明らかにした。さらに、遠赤色光による打ち消し効果はPHY3分子のC末端側に位置するフォトトロピン部分による青色光反応にもおよぶことが明らかになった。このことからPHY3光受容体は、フィトクロムとフォトトロピンの構造を併せ持ちながらも、主としてフィトクロムとして機能している分子であることが示された。一方、PCMサブドメインを置換したPHY3では、現在までに解析したすべての改変PHY3において光応答性が見られていない。この原因として、PHY3とPHYB間のPCM各サブドメインにおける一次構造の微細な差異による可能性が考えられ、その部分にPHY3のPCMによる青色光受容機構を解明する鍵が存在する可能性が示唆された。これらの研究によりシダ植物の弱光環境適応機構や植物進化の分野に新たな知見を与えることが期待されるとともに、フィトクロム分子の光応答波長決定のメカニズムの解明にも新たな情報をもたらすことが期待される。今年度は研究実施計画に従い、解析対象となる改変PHY3導入

形質転換シロイヌナズナ系統の確立を目指し、改変PHY3遺伝子の構築と形質転換植物体作成を進めた。・PHY3フィトクロム光センシング部位(PCM)をシロイヌナズナPHYBのものと置換した改変PHY3を作成、シロイヌナズナ(phot1-5 phot2-1)に導入した。現在複数系統のT2系統からホモの系統の確立を目指し、薬剤耐性分離比による選抜を行っている。・また、PCMのサブドメイン(PAS/GAF/PHY)をシロイヌナズナPHYBのものと置換した改変PHY3遺伝子を順次作成している。予定通り、当初目的とした改変PHY3遺伝子導入植物体の表現型解析に着手している。また、これまでに得られた結果から新たな改変PHY3を構築し、解析に向けて進展している。東日本大震災の影響による計画停電、大学による節電のための実験縮小要請、また当初配分額7割支給などにより、当初計画より若干の遅れが出ている。計画に添って改変PHY3遺伝子導入植物の表現型解析を進める。また、新たに選抜している遺伝子導入植物体の解析、さらに新規改変PHY3遺伝子による光反応性の比較を通して、PHY3光受容特性の解明を進める。計画に添って改変PHY3遺伝子の構築、および形質転換シロイヌナズナの系統確立を進める。系統が確立され次第、光生理現象(胚軸の光屈性)の解析ならびにPHY3自己リン酸化活性の測定を開始する。効率的な予算執行で研究を進められたため。この研究費は、実験遂行に向けて、消耗品、旅費、謝金として使用する予定である。実験遂行に向けて、消耗品、旅費、謝金として使用する予定である。
ナノ粒子高分解能分離定量法の開発

シリカコロイド(粒径578nm)のハイドロダイナミッククロマトグラフィー(HDC)による分離条件について検討した。HDCでは充填剤間の空隙を利用して分離することが多い.本研究では,シリカコロイドのサイズを考慮し,粒子径が25μm程度の無孔性シリカゲルを充填したカラムによるHDCを検討した。溶離液について詳細に検討したところ,pHが7以上のリン酸緩衝溶液を用いると,サイズに基づいた溶出体積が観察されたことより,充填剤シリカの安定性も考慮し,溶離液として10mMのリン酸緩衝溶液(pH7.1)を主に用いた。また,充填剤粒子径について検討したところ,充填剤の粒子径が小さいほど分離が改善された。シリカコロイドは主にUV検出器を用い,濁度法に基づいて検出した。従って,シリカコロイドのサイズが大きいほど検出シグナルは増大した。HDCにおけるシリカコロイドの溶出体積は,流量が減少するとわずかながら増大した。これは,流量の減少に伴いより狭い流路への拡散が促進されることが要因であると推定された。充填カラムによるシリカコロイドのHDC分離を改善するためには,より小さな充填剤粒子を用いるか,あるいは長い分離カラムを用いる必要があるが,使用した装置の耐圧性とそのような分離カラムの調製が困難であったので,透過性の高いモノリス型キャピラリーカラムを調製し,ハイドロダイナミックキャピラリークロマトグラフィー(HDCC)によるナノ粒子の分離について検討し,高性能化を目指した。内径50200μmのモノリス型シリカキャピラリーカラムを調製し検討した結果,シリカコロイドについて粒子径が大きいほど溶出が早く,サイズに基づく分離を達成することができた。カラム外での試料成分の拡散を極力低減化させるため,試料注入体積は20nL以下とし,オンカラム検出を採用した。用いたモノリスシリカには,1015nm程度のメソポアがあることが想定され,小さなナノ粒子についてはHDCモードの他にサイズ排除の効果も含まれることが予測された。また,検出器や連結部を含む流路における吸着やコロイド自身の凝集を避けるために溶離液の条件を検討した。シリカコロイドについてはリン酸緩衝溶液(pH7)が有効であることがわかった。長さ50cmのモノリスキャピラリーカラムによって25cm充填カラムとほぼ同程度の分離能を達成できることが分かった。モノリス型キャピラリーカラムは透過性が高く,カラム長を増大させることにより分離能を改善できる可能性をもっている。さらに,金コロイド(13-61nm)についてHDC分離を適用したところ,ドデシル硫酸ナトリウムを添加することで良好なピーク形状がえられた。本年度は,シリカコロイド(粒径578 nm)のハイドロダイナミッククロマトグラフィー(HDC)による分離条件について検討した。