hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
演劇製作を用いた家族システム学習の効果の検証および日本型学習モデルの構築

日本における家族システム看護学習を支援する方法として家族の苦悩をテーマとする演劇製作を用いたプログラムを確立し、その効果を検証、さらに学習プロセスをモデル化する試みを行った結果、演劇製作は初学者の家族アセスメント能力向上に対して有効であること、家族面接を実施できる上級実践の学習までには、経るべき段階があり、段階に応じた臨床実践の応用可能性が明らかになった。1.学習過程分析のための資料収集および予備研究本年度は学習内容をできるだけ標準化するために教材を作成した。それを用いて行う本調査のために、試験的撮影・録画を行い、録画データの分析枠組みを検討した。その結果、撮影時のセットの不備、録画の技術等の修正点が明らかになった。また、データの分析枠組みとして、カルガリー家族アセスメントモデル/介入モデルが応用可能であること、ディスコース分析やエスノメソドロジーも有用である可能性が把握できた。予備的分析の結果、演劇を用いた家族看護の学習過程には、学生個人の家族体験の振り返り、家族文化の投影及び病と家族関係の相互作用の理解が含まれることが示唆された。また、学生にとって、表出的機能として表現された演技から、家族関係の根底にある膠着した関係を推測するのは困難な作業であり、演劇の体験だけでは学習することが難しく、家族に関する広範な知識に裏付けられた専門的な助言が必要であることが示唆された。2.短期・長期効果を検証するための調査項目の検討海外の先行文献を整理し、調査項目を検討した。長期効果に関する論文はほとんどなく、短期効果に関する論文が多かった。家族看護の諸理論の理解とともに、家族の捉え方、家族看護の捉え方、援助姿勢の変化などを質的に探求した研究が多かった。3.家族看護学の学習内容・方法についての調査1,2,の結果を踏まえ、アンケート調査の項目を選定した。家族看護教育実践の有無、教育者の専門領域、使用する教材、教育手法の工夫、家族看護学教育について困難な点等について看護系の大学・短大・専門学校を対象に郵送調査を行い、分析するところである。本年度は、以下の課題について成果を得た。(1)家族看護学教育の実際:大学、短大、専門学校における家族看護学教育の内容と手法について教員を対象にアンケート調査を行った結果を分析したところ、家族看護を専門にする教員が担当する割合は、専門学校5%、短大11%、大学37%と大きな差があり、教育手法としてグループワークは大学が多く(61%)、ロールプレイは短大(60%)、大学(70%)であった。家族劇の制作は短大(15%)で多く実施されていた。(2)家族システムの学習効果の検証:学部生を対象にした量的調査については、予備調査の段階で学習効果については個人差が大きいこと、それが学生個人の家族体験に由来する可能性が示唆された。そこで前後評価を行うのではなく、その点について家族看護教育に携わる教員にアンケート調査を実施した。その結果、家族関係への興味、家族の多様性の受容、学生の人間的成熟度、家族背景の学習への影響をいずれも多く支持したのは、短大の教員であり、専門学校の教員は皆無、大学教員は家族関係への興味と多様性の受容のみであった。一方、大学院生を対象に演劇制作をとおした家族システム学習による自己変容について、各人のリフレクションレポートとグループインタビューを行った結果、いずれも家族の見方の変化を挙げたが、家族の苦悩に迫ることはできなかったと語った。(3)演劇分析による学習効果の分析:録画した演劇を逐語で起こし、作成されたジェノグラム、エコマップと録画を再生しながら、会話表現として表現される二者関係を分析していくことでコアビリーフの同定が可能かどうか、確認の作業を行っている。予備調査では、演劇制作だけでは、コアビリーフに迫ることは難しいということが示唆されているため、さらにその点を学習モデル化する仮説構築に向けた分析をしているところである。今年度は、(1)量的調査による家族システムの学習モデルの要素抽出、(2)質的調査による家族システムの学習モデルの要素抽出、(3)海外研究者との意見交換を目的として実施したが、実施順序として(2)→(3)→(1)の順序で進めた。まず(2)によって学習者のプロセス、個人的体験を総合的に分析した結果、演劇制作によって十分な学習効果が得られるのは、ジェノグラム・エコマップとカルガリー式家族アセスメントモデルを使用した項目ごとのアセスメント能力であった。とくに、機能面のアセスメントでは、表出的なコミュニケーションのパターンを円環パターンとして捉えることにより、家族システムと病の苦悩の相互作用を理解することができるようになっていた。一方で、「ビリーフ」の理解には個人差があり、制作した演劇を振り返り、苦悩の根源となる「コア・ビリーフ」を推測する能力の学習には十分ではなかった。そこで、制作した家族を対象に、相談面接の場面を想定した模擬面接を行い、技術水準の異なる面接者による面接を実施、それを振り返ることによる学習効果を調べた。しかし、面接における状況を認知・概念化する技術レベルの水準によって、理解の度合いが相当に異なることが明らかになり、家族システム看護の技術習得、とくにビリーフを中心とする理解には認知・概念化する技術に依存する段階があることが示唆された。

一方で、研究協力した学習者のほぼ全てが自分の臨床看護がより良い方向に変化していると分析していた。この成果を、家族システム看護研究の第一人者であるライト博士、ベル博士と議論した結果、それぞれの段階における技術がどのように臨床で活用されるのか、段階に応じた知識の臨床移行を調べることによって、段階ごとの臨床技術確立を探求する意義を確認した。したがって最後の(3)の量的調査の分析は、現在進行中であるが、(1)(2)の2つの成果を分析に生かす方向で継続する。
環境認識技術を用いた医師のスキル解析に基づくロボット支援システムの開発

本研究の目的は,顕微鏡下手術における血管吻合において,医師の技量に寄らず安定して良好な治療成績を収めることが可能なロボット支援システムを開発することである.支援を行う場合,術具や血管,縫合針の位置・姿勢を正しく認識しなければ,適切な支援を行うことができない.そこで,術具や血管,縫合針といった手術環境の認識技術の開発を行った.顕微鏡下手術における血管や縫合針は対象がとても小さく,手術という環境上の制約もあるため,センサやマーカを用いて認識することは困難である.そこで,センサやマーカを用いずに顕微鏡画像から術具や血管,縫合針を認識する技術の開発を行った.まず,顕微鏡画像上におけるセグメンテーションに取り組み,術具、血管、縫合針の領域分けを行った.深層学習を用いてセグメンテーションと同時に境界検出を行うことによって認識精度を向上させた.また,学習時にはシミュレーションの画像を用いて転移学習を行うことによって,実際の画像の真値画像を作成する手間を軽減させた.術具と血管については,高い精度での認識が可能であったが,縫合針の認識精度は低い結果となった.これは,縫合針の大きさが小さく,学習を行う際に他の物体との学習データ量に差があるためと考えられる.そこで,縫合針の認識精度を高めるため,顕微鏡画像上における長方形のボックスによる縫合針の検出に取り組んだ.まず,物体を含んでいると思われる領域候補を生成し,領域候補ごとにどの物体を含んでいるのかの推定,及び正確に物体を含むように位置の補正することによって縫合針の検出を行った.評価実験では,術具や血管に遮蔽された状態でも高い精度で縫合針を検出することができた.当初の計画では,縫合針の認識技術のみを開発し,術具や血管に関しては既に開発されていた認識技術を用いる予定であったが,環境の変化にロバストでないという欠点や,術具や血管をそれぞれ別のアルゴリズムで検出すると時間がかかり,リアルタイムでの認識が難しくなるといった欠点があったため,術具や血管,縫合針を同時に認識可能なアルゴリズムの開発を行う必要があった.術具や血管,縫合針をリアルタイムで同時に高い精度で認識することは容易ではなく,また,深層学習を用いた認識を行うためには,大量の真値のデータを作成する必要があり,真値のデータを作成するのに予想以上に手間がかかったことから,進捗状況が遅れてしまっている.引き続き顕微鏡画像上における術具や血管、縫合針の認識技術の開発を進めていく.血管吻合のうち,縫合針の把持,及び血管への縫合針の刺入・刺出のフェーズを対象として開発した認識技術を活かしながら支援技術の開発を行っていく.縫合針の把持に関しては,生体組織との接触が少ないため,自動化することを目指す.一方で,血管への縫合針の刺入・刺出は生体組織との接触があり,直接治療成績に影響を及ぼすため,熟練した技術を持つ医師のスキルを抽出し,抽出したスキルを用いて軌道計画を練ることによって,医師の技量に寄らず安定して良好な治療成績を収めることができるロボット支援システムの開発を目指す.本研究の目的は,顕微鏡下手術における血管吻合において,医師の技量に寄らず安定して良好な治療成績を収めることが可能なロボット支援システムを開発することである.支援を行う場合,術具や血管,縫合針の位置・姿勢を正しく認識しなければ,適切な支援を行うことができない.そこで,術具や血管,縫合針といった手術環境の認識技術の開発を行った.顕微鏡下手術における血管や縫合針は対象がとても小さく,手術という環境上の制約もあるため,センサやマーカを用いて認識することは困難である.そこで,センサやマーカを用いずに顕微鏡画像から術具や血管,縫合針を認識する技術の開発を行った.まず,顕微鏡画像上におけるセグメンテーションに取り組み,術具、血管、縫合針の領域分けを行った.深層学習を用いてセグメンテーションと同時に境界検出を行うことによって認識精度を向上させた.また,学習時にはシミュレーションの画像を用いて転移学習を行うことによって,実際の画像の真値画像を作成する手間を軽減させた.術具と血管については,高い精度での認識が可能であったが,縫合針の認識精度は低い結果となった.これは,縫合針の大きさが小さく,学習を行う際に他の物体との学習データ量に差があるためと考えられる.そこで,縫合針の認識精度を高めるため,顕微鏡画像上における長方形のボックスによる縫合針の検出に取り組んだ.まず,物体を含んでいると思われる領域候補を生成し,領域候補ごとにどの物体を含んでいるのかの推定,及び正確に物体を含むように位置の補正することによって縫合針の検出を行った.評価実験では,術具や血管に遮蔽された状態でも高い精度で縫合針を検出することができた.当初の計画では,縫合針の認識技術のみを開発し,術具や血管に関しては既に開発されていた認識技術を用いる予定であったが,環境の変化にロバストでないという欠点や,術具や血管をそれぞれ別のアルゴリズムで検出すると時間がかかり,リアルタイムでの認識が難しくなるといった欠点があったため,術具や血管,縫合針を同時に認識可能なアルゴリズムの開発を行う必要があった.術具や血管,縫合針をリアルタイムで同時に高い精度で認識することは容易ではなく,また,深層学習を用いた認識を行うためには,大量の真値のデータを作成する必要があり,真値のデータを作成するのに予想以上に手間がかかったことから,進捗状況が遅れてしまっている.引き続き顕微鏡画像上における術

具や血管、縫合針の認識技術の開発を進めていく.血管吻合のうち,縫合針の把持,及び血管への縫合針の刺入・刺出のフェーズを対象として開発した認識技術を活かしながら支援技術の開発を行っていく.縫合針の把持に関しては,生体組織との接触が少ないため,自動化することを目指す.一方で,血管への縫合針の刺入・刺出は生体組織との接触があり,直接治療成績に影響を及ぼすため,熟練した技術を持つ医師のスキルを抽出し,抽出したスキルを用いて軌道計画を練ることによって,医師の技量に寄らず安定して良好な治療成績を収めることができるロボット支援システムの開発を目指す.
漢方薬・大建中湯を応用した慢性大腸炎関連発癌に対する新規薬物治療戦略

5日目から急性大腸炎を発症するDSS誘起急性大腸炎モデルに疾病前状態を予測する動的ネットワークバイオマーカー数理理論を適応し、238個の遺伝子群が最も大きくゆらいだ3日目が疾病前状態、すなわち未病状態であることが分かった。本遺伝子群の多くがNK細胞に関係するため、NK細胞を除去したところ急性大腸炎は抑制され、NK細胞が未病状態から病態発症の過程で重要な役割を果たしていることが明らかとなった。厚生労働省指定「特定疾患」であり、急性期・再燃期と寛解期を繰り返す炎症性腸疾患(IBD)の最も重篤な合併症は、慢性炎症を背景とした大腸発癌(CAC)である。しかしIBDの急性期・再燃期に寛解導入療法として用いられている強力な免疫抑制剤を長期使用することは、逆に発癌リスクへの懸念や感染症への懸念が大きい。寛解維持療法に用いる有用な治療薬の創出が強く求められているが、CACに対する薬物治療の研究はほとんど報告されていない。そこでまず、急性大腸炎モデルマウスの結腸でDNAマイクロアレイを用いた得られた経時的網羅的全遺伝子発現解析データを数理解析して、急性期・再燃期の発症予測を行い、発症前に大腸炎抑制効果のある漢方薬を用いることにより、寛解期の延伸・維持を行う戦略を検証することとした。すなわち、長期使用が可能な漢方薬の効能リポジショニングによるIBDの有用な治療戦略を確立すること目的とした。これまでに我々は、マウスCACモデルを確立し、CACの発生には、CD4 T細胞から分泌されたIL-6が大腸粘膜および粘膜上皮細胞のSTAT3を活性化することが非常に重要であり、IL-6の放出を阻害することによりCACの発生を抑制することを報告している。(Am.J.Physiol.2014)。また、急性大腸炎モデルを用いた創薬シーズの探索研究により、現在臨床で腸管運動不全等に用いられている漢方薬・大建中湯が、急性大腸炎モデルおよびCACモデルにおいて抑制効果を示すことを見出している。そこで、まず急性大腸炎モデルで経時的網羅的全遺伝子発現解析により、238個の遺伝子が発症前に大きく変動することを見出した。従って、漢方薬等を用いてこの遺伝子群の変動を抑制することにより、寛解期の延伸・維持を行うことが可能となることを示唆した。CACモデルでの検討は長期間を有するため、また急性期・再燃の疾病前の状態を予測する方法を詳細に検討ため、まず3%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を7日間継続的に自由飲水させたDSS誘起急性大腸炎モデルマウスで検討を行った。DSS投与後、0、1、3、5、7日目に結腸を摘出し経時的網羅的全遺伝子発現解析を行い、この網羅的全遺伝子発現データを数理学的に解析した。この数理解析には、合原らが構築した「複雑系数理モデル理論」を応用した。この理論の「疾病を健康状態からの分岐現象」と捉えるアイディアは、非線形動力学理論と複雑ネットワーク理論によって、少ないサンプル数から得られる遺伝子やタンパク質の大規模発現データから疾病前状態を検出し、疾病の早期診断や病態悪化の予兆検出に適用できる可能性がある。従って、疾病前状態を予測する数理モデル理論である動的ネットワークバイオマーカー(Dynamical Network Biomarkers, DNB)理論を適応し、遺伝子が最も大きく変動した3日目を疾病前状態と判断したが、実際に本急性大腸炎モデルでは5日目より症状が観察された。疾病前状態の3日目では238個の遺伝子群が大きく変動することを見出し、本遺伝子群の解析を進めている。また、大建中湯は本急性大腸炎を抑制した。マウスDSS誘起急性大腸炎モデルでの数理解析:3%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を7日間継続的に自由飲水させ、5日目から急性大腸炎を発症するDSS誘起急性大腸炎モデルを作製した。本モデルに疾病前状態を予測する数理モデル理論である動的ネットワークバイオマーカー(Dynamical Network Biomarkers, DNB)理論を適応し、遺伝子群が最も大きく変動、ゆらいだ3日目が疾病前状態、すなわち未病状態であることが分かった。疾病前状態の3日目では238個の遺伝子群が大きく変動し、本遺伝子群を解析した結果、これらの遺伝子群の多くがNK細胞に関係する遺伝子群であった。そこで、NK細胞を除去するためAnti-asialo GM1抗体を本モデルマウスに投与したところ急性大腸炎は抑制され、NK細胞が急性大腸炎の未病状態から病態発症の過程で重要な役割を果たしていることが明らかとなった。また、大建中湯は本急性大腸炎を有意に抑制した。腸内細菌叢の解析:まず、本大腸炎モデルでの腸内細菌叢の解析によりFirmicutes門が減少してBacteroidetes門が増加し、dysbiosisが起きていることが明らかとなった。これらの結果は、潰瘍性大腸炎患者の腸内細菌叢解析でも同様な報告があることから、今後、本急性大腸炎モデルおよびCACモデルで、大建中湯のdysbiosisに対する作用が大建中湯の急性大腸炎やCACに対する治療効果にどのように影響を与えているか、検討を進める。

DSS誘起急性大腸炎モデルでの数理解析:急性大腸炎モデルでのDNB理論により抽出された遺伝子群に対する大建中湯の作用を検討する。CACモデルでの数理解析:CACマウスおよび大建中湯を投与したCACマウスからから経日的(AOM投与5、10、26、52、70日後)に腸管を採取し、網羅的全遺伝子発現解析を行い、DNB理論により遺伝子を抽出する。また、その遺伝子群に対する大建中湯の作用を検討する。CACモデルでの腸内細菌叢の解析:CACの病態においてもdysbiosisが認められ、CACの病態形成には腸内細菌叢が重要な役割を果たしていると考えられている。そこでCACモデルにおけるdysbiosisを解析し、dysbiosisに対する大建中湯の有効性を明らかにする。i)CACマウスから経日的に糞便を採取し、腸内細菌のゲノムDNAを抽出後、次世代シーケンサー(MiSeq; illumina、富山大学現有設備)を用いてメタゲノム解析を行い、腸内細菌叢の変化を解析する。ii)CACマウスに大建中湯を投与して腸内細菌叢を解析することにより、CACの発症および病態形成におけるdysbiosisに対する大建中湯の有効性を検討する。漢方薬理学
ミクログリアの本質的機能の破綻を基盤としたHDLS/ALSPの分子病態の解明

本研究課題では,ミクログリアの本質的な機能破綻を原因とする「一次性ミクログリア病」に着目して研究を進める。HDLS/ALSPは代表的な一次性ミクログリア病であり,ミクログリアの分化および機能維持を調節する鍵分子であるCSF1Rの遺伝子変異を原因とする。申請者は,CSF1R変異を伴うHDLS/ALSP多数例の解析により,HDLS/ALSPにおける臨床・画像的特徴を報告するとともに,ミクログリア異常を示唆する知見を明らかにしてきた。本研究課題ではHDLS/ALSPで生じるCSF1R異常を介したミクログリア機能破綻を剖検脳,患者由来生体試料ならびにモデルマウスを用い多面的にアプローチする。
IoTハードウェアを指向した安全性を強化するハイブリッド認証システムに関する研究

あらゆるデバイスがネットワークに接続されるInternet of Things (IoT)において,安全性を確保するためには,各デバイスにおいて適切な認証を行うことが重要である。一方で,IoTの基盤技術の1つであるウェアラブルなハードウェアに対しては,回路面積などの実装コストの制約から従来のパソコンを中心とするIT技術での認証システムを適用することは出来ない。さらに,これまでネットワークにおける認証で広く使用されている標準暗号は,計算量的にその安全性が保障されているが,本格的に研究が始まってきている回路動作時の消費電力や漏洩電磁波を利用して秘密情報を解析するサイドチャネル攻撃に対しては脆弱であることが,近年,指摘されている。そこで,申請研究では,IoTハードウェアを指向した認証システムを新たに開発する。この認証システムでは,物理的なアプローチと数学的なアプローチを組み合せて,様々なサイドチャネル攻撃耐性を向上させることで,安全性を強化する。平成30年度は,平成29年度と同様に提案システムを構成する2つのシステム(セキュアコードシステムと認証IDシステム)について,いくつかの要素技術を開発して,シミュレーション実験や実装実験により,その有効性を検証した。また,当初の予定にはなかったが,研究を進めていく過程で,新たに明らかになったいくつかの技術的課題(乱数と実装コストの耐タンパ性の関係など)についても,定量的に詳細な検討を行った。さらに,いくつかの評価実験を通して,新たな研究課題の抽出や整理も行った。平成30年度の研究成果についても,関連する国際会議で発表すると共に,情報収集や情報交換を行った。また,研究成果の一部については,関連する学会の学術論文誌でも発表した。平成30年度は,セキュアコードシステムにおいて多重経路とレスポンス生成ブロックを組み込んだPUFの試作・実装評価を行い階層型PUFを完成予定であったが,これを完成させることが出来なかった。一方で,プロファイリング進化的補正処理については,計画どおり,遺伝オペレータの基本検討を行うとともに,遺伝子表現についても基本的な検討を行うことができた。認証IDシステムにおいて,耐タンパアーキテクチャで必要になる可変周波数リングオシレータを開発予定であったが実施することが出来なかったが,可変周波数リングオシレータで使用する乱数について,耐タンパ性との関係を実装コストの観点から明らかにした。さらに,当初の研究計画には無かった低消費電力指向のセキュアモジュールについて,耐タイパ性を定量的に評価することができ,認証IDシステムでの消費電力からの観点の基本検討を行うことが出来た。最終年度である2019年度は,2018年度に実施予定だった階層型PUFの開発などを行い,当初の計画どおりに,提案システムを開発する。また,シミュレーション実験を通して,システムの完成度を高めて行く予定である。さらに,提案システムの実装評価を通して,新たな研究課題の抽出や整理を行う予定である。今後訪れるInternet of Things (IoT)の時代では,あらゆるハードウェアがインターネットに接続して,分散的・階層的なネットワークを構築する。このようなネットワークで安全性を確保するためには,適切な認証を行うことが重要である。しかし,IoTの基盤技術の1つであるウェアラブルなハードウェアに対しては,実装面積の観点から従来のパソコンを中心とするIT技術での認証システムを適用することは出来ない。さらに,従来の認証で使用される標準暗号は,計算量的安全性は保障されているが,近年,本格的な研究が始まったサイドチャネル攻撃に対しては脆弱であることが明らかになってきた。平成28年度では,提案システムにおけるセキュアコードシステムと認証IDシステムについて,いくつかの要素技術を開発して,評価実験によりその有効性を検証した。特に,認証システムについては,FPGA実装したPUFに対してサポートベクターマシーンやディープラーニングによる機械学習攻撃のアルゴリズムを実装して,その耐タンパ性を多面的に評価した。さらにIoTデバイス向けのセキュリティモジュールに対する評価・分析・考察を行った。本年度の研究成果については,関連する国際会議や国内会議で発表すると共に情報収集も行った。また,認証モジュールやハードウェアセキュリティの専門家とも,適宜,意見交換・情報交換を行った。当初の研究計画には無かったFPGA実装したPUFに対して,複数の手法を用いた耐タンパ性を評価することができた。また,研究を進めていくうちに,実装方法の違いで,認証システムとしての評価は変わらないが,大きく耐タンパ性が異なることを発見し,どのような実装がセキュアでフィージビリティが高いか検討するこおとができた。一方で,当初予定では,リングオシレータPUFの試作やプロファイリング手法の開発を行う予定であったが,これらが達成できていない。Internet of Things (IoT)ではあらゆるハードウェアがインターネットに接続して,今後はそれらのデバイスの数が数兆個になるといわれている。そして,それぞれのデバイスが分散的・階層的なネットワークを構築する。

平成29年度では,平成28年度同様に提案システムにおけるセキュアコードシステムと認証IDシステムについて,いくつかの要素技術を開発して,評価実験によりその有効性を検証した。セキュアコードシステムでの最適化に用いる進化手法を,耐タンパ評価にも適用する方法を考案し,評価実験により,あらたな課題を抽出した。また,認証IDシステムに関しては,耐タンパで重要なフォールト解析に関する要素技術の開発を行い,FPGAを用いた評価実験により評価検証を行った。本年度の研究成果についても,関連する国際会議や国内会議で発表すると共に情報収集・情報交換も行った。また,研究成果の一部を学術論文で発表した。平成29年度の当初の研究計画での電磁波解析攻撃やフォールト攻撃に関する研究事項は実施出来たが,温度特性のプロファイリングや可変クロックの実装評価を実施することが出来なかった。一方で,当初計画にはなかった進化手法を用いた耐タンパ評価方法や消費電力や漏洩電磁波などのサイドチャネル情報を利用したPUFへの解析手法を考案して,これまで検討していいなかった脆弱な部分を明らかにした。また,それらの対策についての基本検討を行うことが出来た。あらゆるデバイスがネットワークに接続されるInternet of Things (IoT)において,安全性を確保するためには,各デバイスにおいて適切な認証を行うことが重要である。一方で,IoTの基盤技術の1つであるウェアラブルなハードウェアに対しては,回路面積などの実装コストの制約から従来のパソコンを中心とするIT技術での認証システムを適用することは出来ない。さらに,これまでネットワークにおける認証で広く使用されている標準暗号は,計算量的にその安全性が保障されているが,本格的に研究が始まってきている回路動作時の消費電力や漏洩電磁波を利用して秘密情報を解析するサイドチャネル攻撃に対しては脆弱であることが,近年,指摘されている。そこで,申請研究では,IoTハードウェアを指向した認証システムを新たに開発する。この認証システムでは,物理的なアプローチと数学的なアプローチを組み合せて,様々なサイドチャネル攻撃耐性を向上させることで,安全性を強化する。平成30年度は,平成29年度と同様に提案システムを構成する2つのシステム(セキュアコードシステムと認証IDシステム)について,いくつかの要素技術を開発して,シミュレーション実験や実装実験により,その有効性を検証した。
薬物刺激間葉系幹細胞を用いたＤｕａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｈｅｒａｐｙの開発

間葉系幹細胞の持つ治療特性を薬物で刺激・増強して造血幹細胞移植に応用し、生着不全や治療関連有害事象が低減することを基礎的に検討した。骨髄移植実験において副甲状腺ホルモンは致死量放射線照射されたマウスの生存率を改善し、間葉系幹細胞の造血細胞増幅特性を増強した。また、間葉系幹細胞は臍帯血移植に利用されない小容量さい帯血ユニットからも分離可能であり、分離された間葉系幹細胞は骨髄間葉系幹細胞と同等あるいはそれ以上の培養増幅能と多分化能を示した。間葉系幹細胞を応用した細胞治療は培養増幅した細胞を体内に投与する方法が一般的である。我々は培養増幅した間葉系幹細胞をテリパラチドで刺激することで、その造血支持能力が増強することを見いだした。ヒト間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)をヒトCD34陽性造血幹前駆細胞(hematopoietic stem/progenitorcell: HSPC)とSCF(stem cell factor)、TPO(thrombopoietin)、IL-3(interleukin-3)、Flt3-L(Flt3-ligand)存在下で共培養するとHSPCがin vitroで増幅する。MSCをテリパラチドで薬物刺激したのちに、同様にサイトカイン存在下でHSPCとの共培養を行うとHSPCの増幅が増強した。マイクロアレイ解析を行ったところ、テリパラチドで刺激されたMSCはカドヘリンファミリー分子の一つであるOB-カドヘリンの発現が増強していた。OB-カドヘリンに対するsiRNAおよび中和抗体を用いた機能実験で、HSPCの増幅増強が抑制されたこと、OB-カドヘリンはHSPCにも強発現していたことからOB-カドヘリンのホモフィリックな結合を介したMSCとHSPCのcell-cell interactionがHSPCの増幅増強に関与していると考えられた。以上から、テリパラチドによる薬物刺激がMSCの機能を増強することが示された。難治性血液がんに対する臍帯血移植では移植前処置により破壊された造血組織は造血幹細胞によりレスキューされる。本研究課題では移植前処置により障害を受けた非造血組織を間葉系幹細胞を応用してレスキューするための基礎的データの蓄積を目指す。間葉系幹細胞は組織修復・造血支持力を有する組織幹細胞である。さい帯血にも含まれるが、その存在頻度は低く有核細胞数10の6乗個から10の7乗個に1個程度と考えられている。我々は、従来の方法より効率的にさい帯血から間葉系幹細胞を分離・培養する方法を確立した。接着法を用いた標準的な間葉系幹細胞分離方法では浮遊細胞は培養早期に除去される。さい帯血細胞からの間葉系幹細胞の分離・培養過程において、浮遊細胞を早期に除去せず培養を継続することで、間葉系幹細胞の分離・培養効率が約10倍に改良された。得られた細胞は従来の方法で得られた間葉系幹細胞と同様の性質を有していた。以上の結果は存在頻度の少ない間葉系幹細胞を効率的分離・培養増幅することで治療特性が増強され、臍帯血移植において高い組織修復力が得られる可能性があると考えられた。さい帯血からの間葉系幹細胞の分離・培養過程において、浮遊細胞を早期に除去せず培養を継続することで、間葉系幹細胞の分離・培養効率が約10倍に改良された。さい帯血からの間葉系幹細胞の分離・培養は一般に容易でないことが知られているが、本研究課題によりその改良が得られたためである。間葉系幹細胞を効率的に分離・培養増幅することで量的な治療効果を得ることを目指す。また、従来の方法で得られる間葉系幹細胞との違いを検討することで治療特性を明らかにする。さらに、培養増幅した間葉系幹細胞を薬物刺激することで質的な治療効果の向上を目指す。これらにより造血幹細胞と間葉系幹細胞を共移植するDual Stem Cell Therapyの技術開発を目指す。研究に必要な設備備品は既に整備されており、研究費による購入の予定はない。研究費は細胞培養関連試薬(液体培地、ウシ血清、サイトカインなど)の購入、試薬・抗体の購入、実験動物(免疫不全マウスなど)の購入・維持に充てる計画である。また、研究成果発表のための学会参加や論文発表、新規情報収集のための学会参加にも研究費を使用する予定である。
ＢＡＣ搭載ＨＡＣを用いた肝上皮紋様形成ライブイメージングマウスの開発

内胚葉系臓器は上皮細胞から構成された管状組織の樹状パターンを有する。それは臓器原基の構成細胞群の細胞間相互作用によって自立的に形作られる。この樹状パターンはフラクタルであることから、その紋様は何らかの数学的法則に則って形作られると思われるがその法則は不明であった。これまでに確保した3種類のCre系統の特性を生かし2細胞群挙動のライブイメージングを行うために、ROSA26レポーターの一種であるAi-3tTomを開発した。本マウスはCre依存的にミリスチル化tandem Tomatoを強く発現する。このマウスをGFP発現Creドライバーと組み合わせて使用することで目的を実現できるようになった。「研究の目的」肝臓の胚性期における上皮組織の樹状紋様形成は遺伝的プログラムに従って行われる。この樹状紋様形成は周囲の血管内皮細胞および胚性肝中皮細胞との相互作用によって制御されていると考えられているが、その相互作用を生きた状態で直接観察した報告は未だ行われていない。本計画では胚性肝臓を構成する3つの細胞種である、肝上皮細胞、血管内皮細胞、および胚性肝中皮細胞を3種類の蛍光タンパクで標識する遺伝子改変マウスとして3つの組換えBACsを搭載した人工染色体を構築しそれをES細胞に組み込むことを行う。さらにその人工染色体含有ES細胞をマウス胚に移植することで組換えBACs搭載人工染色体含有ES細胞由来のマウス系統を樹立する。さらに本系統より胚を確保し、in vitro全胚培養系において肝組織構築のライブイメージングを行う。「研究実施計画」本年度は、Albumin-BAC, Flk1-BAC, WT1-BACをCHORIより購入した。これらのBAC clonesの有する制御領域はin-frameで挿入した外来遺伝子を肝上皮細胞、血管内皮細胞、胚性中皮細胞で特異的に発現させることが期待できる。本年度はこれらのBAC clonesのPCRによるBAC end解析、制限酵素によるマッピング、BAC DNAの抽出、BAC DNAsのrecombineering用大腸菌への導入、カセットの構築を行なった。現在、カセットのBACへの導入手前で中断している。最終年度に実施した研究成果「Cre依存的に細胞を赤色蛍光で標識するROSA26RマウスAi9-3tTomの作製」ROSA26R系をCre driverと交配することで特定の細胞系譜をlacZまたは蛍光タンパクで標識することが可能になる。しかしながら、国内ではCre活性を赤色蛍光で標識できるマウスはあまり出回っていない。そこで、tandem TomatoのCre依存的発現カセットであるAi9のROSA26 locusへのノックインを行い、そのマウスの作製に成功した。(意義、重要性)これにより特定の細胞系譜を極めて強い赤色光で標識しライブイメージングすることが可能になった。研究期間を通じて実施した研究成果「胚性肝臓の組織形成時の細胞間相互作用のライブイメージング」を行うというのが本研究の目的である。現在、3種類のCre driverマウス群(FoxA2-GFP-CreER (内胚葉用), Tek-Cre(内皮細胞用), WT1-EGFPCre(中皮細胞用)を維持している。今後はFoxA2-GFP-CreER; Tek-Cre; Ai9-3tTomを用いて、内胚葉細胞、内皮細胞をそれぞれ緑蛍光および赤蛍光で標識したマウス胚を確保し肝芽細胞と内皮細胞の相互作用をイメージングする。またWT1-EGFPCre; Tek-Cre; Ai9-3tTomを用いて、中皮細胞、内皮細胞をそれぞれ緑/赤蛍光および赤蛍光で標識したマウス胚を確保し中皮細胞と内皮細胞の相互作用をイメージングする。(意義、重要性)本研究によって、肝組織発生における二種類の細胞系譜間の相互作用を可視化できる可能性が開かれた。本マウスは臓器における細胞間相互作用を解析するための強力なツールとなり、組織発生における細胞レベルの新たな相互作用の発見にもつながることが期待できる。本研究の目的は、発生期肝臓を構成する組織(肝上皮、血管内皮、肝中皮)の3次元空間における位置関係と挙動を正確に記録するために、それぞれの組織を異なった蛍光タンパクで標識したライブイメージングマウスを作成することである。この目的を実行するために以下の手順で研究を遂行する予定であった。(1)これら3種類の胚組織で発現する遺伝子群(E-cadherinまたはAlbumin, Flk-1, Wt1)のBAC cloneに3種類の異なった蛍光タンパク遺伝子(Venus, turboRFP, Sirius)をin-frameでノックインする。(2)これら改変型BACsをマウスES細胞またはヒトiPS細胞上のヒト型人工染色体HACに搭載する。

(3) 3BAC-HAC搭載マウスES細胞をマウス胚盤胞胚に移植し、キメラ作製後交配により個体を得る。(4) 3BAC-HACマウス胚肝臓を実体蛍光顕微鏡を用いて観察し3種類の組織の空間的位置関係を記録する。平成23年度は、4種類のBACをCHORIより購入しこれらのクローンが正しいクローンであることを確認した。また3種類の蛍光タンパクを各BACへノックインするためのtargeting vectorの構築を行い、pBS-CreERT2-neo2を骨格としたpBS-Venus-neo2, pBS-turboRFP-neo2, pBS-Sirius-neo2を完成させた。これらのtargeting vectorはBACの制御領域によってVENUS (高輝度黄色)、turboRFP (高輝度赤色), SIRIUS (高輝度群青色)を発現することができる。したがって、転写活性が低いBAC含有発現細胞であっても蛍光タンパクを十分に検出できることが期待できる。現在、研究を推進するために力となる大学院生が全くいない状況であり、平行して実施している基盤Bにおいてもパートタイマーの実験支援員を一から訓練し徐々に進めている状況である。このような不利な状況下で本研究計画を実行するために、実験支援員一名をBACの扱いとrecombineeringのために特別に訓練してきたが、その実験支援員は雇用形態が非常勤であることから将来への不安を覚え仕事への集中力を失ってしまった。さらに昨年秋より他業種への転職活動を勤務時間内に行い続けるという状況に至ってしまった。その結果、BAC構築のためのカセット作成が遅れさらにそれらのBACへの組み込みが中断しているという訳である。研究計画が遅れた理由は、以下に示す4点があげられる。(1)雇用していた実験補助員が年度半ばで休職しそのかわりとなる補助員の養成に6ヶ月がかかったこと。(2)遺伝子工学に必須な解析ソフトウェア(Vector NTI Advanced 11.5)がきちんと機能せず、Invitrogenの対応の遅れによりその回復に4ヶ月かかったこと。(3)申請者本人がBACクローンの扱い(BAC DNAの抽出、制限酵素マッピング)に習熟しておらず、実験補助員の代替を直ちにおこなうことができなかったこと。(4) targetingvectorをBACへ組込むために当初使用していたRed/ET systemがうまく機能せず、代替法としてのRecombineering法の導入に時間がかかったこと。3つのBAC clonesを蛍光タンパクcDNA含有カセット群で改変しクロモリサーチに人工染色体の構築を外注しさらに人工染色体含有ES細胞から人工染色体含有マウスを作成するというのが当初の研究計画であった。しかしこれらの過程を限られた資金で一年以内に実行することはもはや不可能である。このままでは全く得るものがないまま終了することが予想される。本来、胚性肝臓の組織形成時の細胞間相互作用を可視化するというのが本研究の目的である。
近世前期中期俳諧資料の整備と活用の研究

近世前期中期俳諧資料の文化的価値を究明するため、当該資料群についての基礎的研究および応用的研究を実施した。主な成果としては、(1)俳書の全文翻刻データの集積、(2)古俳書解題目録の作成、(3)新資料による文学史上の諸問題の考察、(4)俳文学における書簡資料の意義の解明、(5)『俳諧類船集』の注釈的研究とその古典作品読解への活用が挙げられる。以上の研究成果を5つの口頭発表と4篇の論文によって示した。本研究は、古俳諧資料の研究基盤を整備し、その文学史的位置づけを具体的に解明するとともに、その成果を古典研究へと活用することを目指すものである。本年度はまず、古俳書解題目録の作成と、全文データの集積を進めた。古俳諧作品を網羅すべく写本の俳書の増補を行い、同時に、古俳書(特に発句集と俳論書類)の写真を収集、それらの通読と原本の調査を経て、書誌・内容の両面にわたる解題を作成した。未翻刻作品については、パソコンで活字翻刻を行い、全文データを蓄積した。この過程で見出した『諸国独吟集』の未紹介伝本から、俳人高梨野也の文事について新見を得、それが芭蕉俳文の解釈と関わることを見出した。このことについて口頭発表を行い(「『俳諧類船集』注釈上の諸問題」2016年12月、京都近世小説研究会)、現在論文化を進めている。次に、古俳諧の史的研究に供し、かつ俗語資料として重要な、貞享以後の俳諧・雑俳作品について調査を行った。雑俳をも含む目録粗稿の作成に着手し、通読調査を進めた結果、『俳諧類船集』の編者梅盛の没年についての新見を得た(上記口頭発表で言及)。上記の研究作業で蓄積したデータを駆使して、『俳諧類船集』の注釈的研究を進めた。「かたち」条の注釈研究を『奥の細道』平泉条の精密な解釈や、芭蕉俳文の特質解明に応用した「「かたち」考」(『国語国文』86-5号、印刷中)はその成果の一である。また、『類船集』文章部分の構造とその資料的価値、同書「日南北向」条を端緒とした「ひなたぼっこ」の語義・素材論について研究発表を行った(上記口頭発表)。古俳書の網羅的調査と解題目録の作成、未翻刻書の活字データ化、古俳書の史的研究、『類船集』の注釈的研究のいずれの工程においても進展があり、研究成果を論文や口頭発表の形で公開することができたため。本研究は、古俳諧の資料基盤を整備した上で、その研究成果を古典研究へと活用し、古俳諧の文学史的意義を解明することを目指すものである。本年度はまず、古俳書の網羅的調査と古俳書解題目録の作成、全文データの集積をさらに進めた。成果の一として、『立圃桃廼酒百韻』(京都府立京都学・歴彩館蔵)の成立事情について、立圃俳書群の調査を踏まえてを明らかにした。このことについて講演を行い(柿衞忌、2017年6月)、当該書の翻刻とを併せて論文化した(「『立圃桃廼酒百韻』の周辺」『京都大学国文学論叢』39号)。ほかにも、上記研究の過程で俳諧史上の諸問題に寄与する知見を見出した。たとえば、三浦為春『七十句付』が俳諧撰集の嚆矢『犬子集』の一材料であること、『淡庵一座連歌書留(仮題)』から惟中・宗因の接近の背景にある岡山連歌壇の役割を指摘したことなどである。如上の新見を示しつつ、古俳諧研究の意義について講演を行い(京都大学国文学会、2017年12月)。上記の成果の一部は解題目録に反映した。また、近世前期・中期の俳文学における重要問題として、書簡についての考察を行った。特に、芭蕉書簡と作品解釈との関係性、芭蕉文学における書簡の機能について、近年の新出資料を整理しつつ、古俳諧資料を吟味しながら考察した。その成果について口頭発表を行い(名古屋大学国語国文学会、2017年7月)、論文化を進めている。さらに、蓄積した全文データを駆使して『俳諧類船集』の注釈的研究を進めた。まず、「やさし」条の語義研究を西鶴・芭蕉作品の解釈と特質の解明に応用した。これについて講演を行い(前掲、京都大学国文学会)、論文化した(「古俳諧の「やさし」」『国語国文』87-3号)。また、前年度より取り組んでいる「日南北向」条の和漢比較的側面からの研究成果を論文化した(「「負日」の系譜ー「ひなたぼこ」の和漢」(『アジア遊学』、印刷中)。今年度と同様の研究作業をさらに進める。

特に、古俳書解題目録の完成に注力し、年度中の公開を目指す。また、全文データの蓄積と『類船集』の注釈作業もさらに進め、論文としてその成果を発表したい。発句集は連句集に比べ分量が多く、写真の取り寄せや調査・翻刻に時間を要する場合があるので、それを加味して計画を遂行する必要がある。29年度が最終年度であるため、記入しない。日本文学29年度が最終年度であるため、記入しない。
加速ベッドを使った心血管疾患の新しい治療法の開発

運動と同様の効果が得られる加速ベッドによる"受動運動"の慢性安定狭心症患者の運動耐容能,冠血流予備能,血管内皮機能に及ぼす影響を検討した。狭心症患者では,運動耐容能,安静時およびアデノシン負荷での心筋灌流の改善,左室リモデリングの抑制が認められた。冠血流予備能の改善が健常成人のみならず冠動脈疾患患者でも認められた。2型糖尿病患者では,低下した血管内皮機能が改善し,血管内皮前駆細胞が増加することが判明した。加速ベッド治療は,心血管疾患に対する新しい治療法としての可能性が見出された。仰臥位で脊椎の長軸方向へ周期的に加速度を加える加速ベッド負荷により,上腕動脈の血流依存性血管拡張反応(FMD)が改善することを基盤として,ヘパリン前投与下の加速ベッド治療が,虚血性心疾患による慢性心不全患者の心筋虚血,心機能,運動耐容能を改善するかを検討した。19名(平均年齢66±10(標準偏差)歳)のPCI,CABGいずれもが適応とならない陳旧性心筋梗塞を有する狭心症患者を,安静群(n=9)と加速ベッド治療群(n=10)に割り付けた。加速ベッドによる治療は,負荷加速度±2.2m/秒^2で,1回45分間,計20回を4週間で実施した。研究期間中,すべての患者は適切な内科的治療を受けた。治療前後での標準ブルース法によるトレッドミル運動負荷テストでの0.1mV ST低下までの運動時間の延びは,加速ベッド治療群の方が安静群より有意に大きかった(2.1±1.1分対-0.4±0.9分,p<0.05)。0.1mV ST低下時点での二重積の延びも同様の結果であった(1,950±1,101mmHg×拍/分対-875±1,378mmHg×拍/分,p<0.05)。治療前後でのアデノシン負荷心筋シンチグラフィでの灌流欠損の改善度も加速ベッド治療群のほうが有意に良好であった(6.1±4.7対-1.4±2.8,p<0.05)。更に,安静時の左室駆出分画の改善度も加速ベッド治療群の方が有意に大きかった(4.3±5.1%対0.1±2.1%,p<0.05)。以上より,加速ベッドによる新しい治療法は,難治性狭心症患者の心筋虚血を軽減し,心機能および運動耐容能を改善することが判明した。対象を仰臥位で脊椎の長軸方向へ周期的に加速度を加える加速ベッド治療が,虚血性心疾患による慢性心不全患者の心筋虚血,心機能,運動耐容能を改善するかを検討した。26名(平均年齢68±10(標準偏差)歳)のPCI, CABGいずれもが適応とならない陳旧性心筋梗塞を有する狭心症患者を,安静群(n=13)とヘパリン前投与(5,000U, i.v.)下での加速ベッド治療群(n=13)に割り付けた。加速ベッドによる治療は,負荷加速度±2.2m/秒2で,1回45分間,計20回を4週間で実施した。治療前後での標準ブルース法によるトレッドミル運動負荷テストでの0.1mV ST低下までの運動時間の延びは,加速ベッド治療群の方が安静群より有意に大きかった(139秒対-25秒,p<0.05)。0.1mV ST低下時点での二重積の延びも同様の結果であった(3,500mmHg×拍/分対-900mmHg×拍/分,p<0.05)。治療前後でのアデノシン負荷心筋シンチグラフィでの灌流欠損の改善度も加速ベッド治療群の方が有意に良好であった(5対±0,p<0.05)。更に,安静時の左室駆出分画の改善度も加速ベッド治療群の方が有意に大きかった(5%対±0%,p<0.05)。血管内皮機能障害は粥状動脈硬化を惹起させ,心血管イベント発生を増加させる。加速ベッド治療は,健常成人の血管内皮機能を改善することが報告されているが,2型糖尿病患者においても血管内皮機能を改善させるかをEndo-PAT検査を用いて検討した。更に,血管内皮機能改善と循環血中内皮前駆細胞(EPC)の関係についても検討した。加速ベッドによる治療は,負荷加速度±2.2m/秒2で,1回45分間,計10回を1週間で実施した。

フローサイトメトリー法により測定された2型糖尿病患者の循環血中EPC数は,リスクファクターを持たない非糖尿病患者より低値であること(33.9±35.1/10^5 vs.38.2±47.6/10^5),他のリスクファクターも糖尿病と同等の影響を循環血中EPC数に与える可能性があることが示唆された。また,加速ベッド治療は,血管内皮機能が低下している2型糖尿病患者に対し,血管内皮機能の指標であるRHI (reactive hyperemia index)を改善させる効果をもつ可能性が示唆され(1.62±0.36 vs.1.76±0.29),循環血中EPC数も加速ベッド治療により増加した(54.1±50.5/10^5 vs.85.7±82.6/10^5)。個々の患者における循環血中EPC数とRHIの増加率は正の相関を示した(r=0.421)。これらの結果により,加速ベッド治療は今後の血管内皮機能障害に対する新しい治療法としての可能性が見出された。
細胞が組織に占める位置情報を保持したままエピゲノム情報を可視化する方法の開発

本課題では、個々の細胞のエピゲノム情報を、それらが組織に占める位置情報を保持したまま可視化する方法の開発を行った。特定の遺伝子座(NEAT1)上で形成される核内構造体の構成タンパク質とNEAT1転写開始上流域との相互作用の検出に成功した。一方、標的ゲノムとそのゲノム領域に結合するタンパク質との相互作用の検出では、オリゴDNAプローブによる標的ゲノム認識法が開発途上で、最終的な目標である1分子対一分子の相互作用を検出するには至らなかった。1クロマチン修飾あるいはDNA結合因子が結合したゲノム領域の識別と3Coincidence detectionNEAT1遺伝子座上における、nascentNEAT1 RNAとRNA結合タンパク質NONOとの相互作用が知られている。まず、NEAT1 RNAとNONOとの相互作用について本法のプロトタイプを適用して、検出に成功した。これは、RNA分子とタンパク質分子間の相互作用は多分子対多分子であり検出が容易と考えたからである。次に難易度を高め、NEAT1遺伝子座(HeLa細胞で4か所)とNONOタンパク質間の相互作用検出を試みた。NONOはNEAT1遺伝子座に直接結合していないが、NEAT1遺伝子座上に、NONOを主な構成因子とする核内構造体パラスペックルが形成される。そこで、NEAT1遺伝子座とNONOとを同時に抗体で認識すると、これら二つの抗体間距離が50nm以下になり、近接している抗体ペアのみを検出できると考えた。NEAT1遺伝子の転写開始点上流を約500bpのプローブで認識し、そのプローブを二次抗体(マウス)で認識した。一方、NONOは抗NONO抗体(ウサギ)と抗ウサギ二次抗体で認識した。これら二種の二次抗体について、近傍にあるペアのみのcoincidencedetectionに成功し、NEAT1遺伝子座上にNONOのシグナルをマップできた。2標的ゲノム領域の特定本法をライブイメージングに適用することを念頭に、CRISPR/Cas9システムにより遺伝子発現制御領域を特定することを目指した。予備実験として、ある遺伝子の転写開始点上流域、特にプロモーターやエンハンサーを標的としたガイドRNAとCas9を異所発現し、その領域を可視化した。しかし、制御領域にCas9が結合すると下流の遺伝子発現に影響を及ぼすため、この方法は必ずしも適当ではないことがわかってきた。<Coincidence detection条件をDNA-結合タンパク質相互作用検出に最適化する>当初の計画は、NEAT1遺伝子座=NONOタンパク質相互作用と共に、ヒト細胞におけるX染色体不活性化の系でXISTプロモーター領域とH3K4me3など、特定のDNA-タンパク質相互作用を核内にマップする予定であったが、後者の実験が完了しなかった。<標的ゲノム領域を限定する方法(プローブ)の検討>CRISPR/Cas9システムを用いてゲノムの特定領域を可視化する方法は、すでに確立された方法論を導入したので、そこに障害はなかったが問題はより本質的なところにあった。構造遺伝子の上流にCas9タンパク質が結合すると、下流遺伝子発現に影響を及ぼすことがわかってきた。この問題をクリアする新しいアイデアが浮かぶまで、Cas9システムを使った標的ゲノム認識は中断する。1クロマチン修飾あるいはDNA結合因子が結合したゲノム領域の識別と3Coincidence detection(同時検出)前年度までに概念実証実験を行い、RNA分子とタンパク質分子間の相互作用をはじめとする、多分子対多分子の相互作用をin situで検出することに成功した。さらに、特定の遺伝子座(NEAT1)上で形成される、核内構造体の構成タンパク質とNEAT1転写開始上流域500bpとの相互作用も検出できた。よって、最終年度は2標的ゲノムの特定に集中して、ゲノム領域を170bp程度の解像度で特定することを目指した。標的ゲノムを認識するプローブとして、当初はCRISPR/Cas9システムを考えていたが、制御領域にCas9が結合すると下流の遺伝子発現に影響を及ぼすため、この方法は中断した。そこで、オリゴDNAプローブ(LNAプローブ)により、標的ゲノム(通常2箇所)を検出する条件検討を行った。しかし、今のところ最適化に至っていない。NEAT1やXISTの転写上流域を標的とするプローブと、P300あるいはヒストンH3K4メチル化を認識する抗体との相互作用検出実験では、10箇所前後が認識された。これは明らかに非特異的なプローブ結合によると考えられる。現在は、プローブのデザインをはじめ、ハイブリダイゼーション条件の再検討を行い、1)確実に2箇所の標的ゲノム領域を検出したうえで、2)1分子対1分子の相互作用の同時検出ができるように本法の改善中である。以上、本課題では特定ゲノム領域における、多分子対多分子の相互作用をin situで検出することはできたが、最終的な目標である1分子対1分子の相互作用を検出するには至らなかった。ライブイメージングへの応用は今後の課題として、まずは固定組織について本法を確立することに専念する。すなわち標的ゲノム領域を特定する手段として、CRISPR/Cas9システムは一旦置いて、オリゴプローブ、特にPLAプローブを使うプロトコルに集中する。

特定のゲノム領域といったときに、クロマチン一個を基準に考えると150ヌクレオチド前後を単位としたい。するとやはり本法に用いるプローブはオリゴプローブが最適である。今年度はエンハンサーRNAを使って標的ゲノム領域を可視化する方法に未着手だったので、この方法も試みる。ただしこの方法は、現在注目している遺伝子の制御領域に適当なエンハンサーRNAが発現しているかに依存するので一般的ではなく、まずはそのようなエンハンサーRNAの有無を検定する。分子生物学当初の計画は、NEAT1遺伝子座=NONOタンパク質相互作用と共に、ヒト細胞におけるX染色体不活性化の系でXISTプロモーター領域とH3K4me3など、特定のDNA-タンパク質相互作用を核内にマップする予定であったが、後者の実験が完了しなかった。また、標的ゲノムを限定する方法の検討で当初三つの計画があったが、LNAプローブの検討とeRNAの検討がほとんどできなかった。以下の二つの実験に使用する。1標的ゲノムを限定する方法の検討において、LNAプローブとeRNAの二つを検討する実験。2ヒト細胞におけるX染色体不活性化の系でXISTプロモーター領域とH3K4me3など、特定のDNA-タンパク質相互作用を核内にマップする実験。