hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子宮頸癌における主要組織適合抗原および浸潤リンパ球に関する研究

子宮頸癌(扁平上皮癌,および腺癌),培養細胞株OMCー1,OMCー4を材料にし,各種成長因子,リンホカインを添加した後,抗HLAーABD抗体を用いた酵素免疫測定法により検討し,次の結果を得た.1)OMCー1,OMCー4ともにインタ-フェロンγにより濃度依存性にクラスI抗原の発現が増強したが,100U/m以上の濃度では,腫瘍細胞に対する殺細胞効果が現れた.2)TNFーαによると若干クラスI抗原の発現が増強される傾向にあったが、同様の濃度においてすでに細胞障害効果が現れており,腫瘍細胞に対する免疫能増強効果の点では不明であった.3)ILー1,ILー2やEGFでは,クラスI抗原の発現は増強されず,むしろ培養細胞自体に対する増殖促進(EGF)また抑制(ILー2)効果が前面に現れた.以上の結果より前年までの検討とあわせ,インタ-フェロンγ投与による子宮頚癌担癌宿主の免疫応答増強の可能性が示唆された.2.頚癌組織,培養細胞におけるHLAーDQ,DP抗原の発現に関する検討酵素抗体法による検討により,頚癌におけるHLAーDQ,DP抗原の発現は少なく,HLAーDR抗原発現の様な意義は見いだせなかった.3.動物実験マウス実験頚癌にも,Hー2抗原の発現が見られ,動物実験でも頚癌におけるクラスII抗原の発現が認められた.種々のリンホカイン(TNFーα,ILー1,ILー2)添加による子宮頸癌培養細胞上のクラスIおよびクラスII抗原の発現増強効果をE.I.A法によって検討し,さらにM.T.T Assayによりこれらのリンホカインによる細胞障害効果に関しても検討した.頸癌病巣および周囲間質におけるICAM(intracellular adhesion molecule)の発現状況を免疫組織化学的に同定し,浸潤リンパ球の多寡との関連性について検討した.さらに頸癌細胞上に発現したICAMー1のリンホカインによる増強効果を検討し,以下の結果を得た.1.頸癌細胞上のクラスIおよびクラスII抗原の発現はTNFーαの添加により濃度依存性に増強したが,ILー1,ILー2の添加においてはそのような効果はあまりみられなかった.また,TNFーαの前投与または併用はIFNーγによるクラスIおよびクラスII抗原の発現増強効果を助長せしめることが判明した.2.IFNーγ,TNFーαを高濃度に添加した場合,頸癌細胞に対する細胞障害効果が現れたが,ILー1,ILー2では明らかではなかった.3.頸癌病巣周囲の血管内皮や間質にはICAMの発現がみられ,さらに頸癌細胞自体にも発現している症例があった.これらでは,病巣周囲にリンパ球浸潤が強い傾向があった.4.蛍光抗体法による検討において,頸癌培養細胞OMCー1およびOMCー4上にICAMの発現がみられた.また,IFNーγおよびTNFーαの添加によってICAMー1の発現が増強した.以上より,IFNーγおよびTNFーαは頸癌局所において局主に有利であると思われる頸癌細胞上のクラスIおよびクラスII抗原,さらにはリンパ球浸潤に必要とされるICAMー1の発現を増強することにより,局所免疫応答能を高める可能性があることが示唆された.
戦後小中学校音楽科教科書教材の変遷に関する包括的研究

本研究では戦後の小中学校音楽科教科書教材を収集し、その中から今日の音楽科教育が抱える問題と密接に関連する領域、教材を抽出して研究を推進した。その結果、昭和20年代における合唱の系統的な指導、戦後すぐから「基礎」の領域が確立される間に展開された諸要素を「変える」指導の様相を明らかにした。また、小学校における鑑賞教材を整理し、戦後の鑑賞教育においてどのような聴き方の指導がされてきたのかを明らかにした。平成19年度は、研究者各自がこれまでに培ってきた各々の研究手法を使って、戦後出版された各社からの膨大な数の音楽科教科書教材の中から、戦後音楽科教育の変遷における各領域での特徴的な課題を抽出することを目的として資料収集を行った。同時に、関係する基礎的な文献や他教科の教科書変遷史に関する先行研究の検討も行い、本研究推進への示唆を得た。その結果、「歌唱」領域では、「夏は来ぬ」や合唱曲としての「星の世界」の扱いに戦後の歌唱教育の目的や指導方法の変遷が見られることが明らかとなり、平成20年度も引き続きこれらの曲を中心として研究を推進する。「器楽」の領域では、戦後、リード楽器を主とした器楽教育からリコーダー偏重の器楽教育に移行する過程に着目し、教科書教材の収集を行った。「基礎基本事項」に関しては、この項目に焦点が置かれていた時代に教材として分量の多かった「変奏」の扱いが、近年、減少傾向にあることが概観され、音楽科の学力低下問題との関係で考察する必要性が認められた。「鑑賞」及び「創作」領域については、対象を小学校に限定した上で、資料を収集し、特に鑑賞曲目のリスト化に着手した。また、同時代の研究書や啓蒙書が、選曲や指導法に与えている影響、鑑賞と創作の関連性に着目して研究を推進した。「諸民族の音楽」に関しては、平成19年度は中学校教科書に特化してデータベース作成を視野に入れた資料収集を行ったが、平成20年度にはこれらの資料を活用して、諸民族の音楽の領域が拡大していく様相を明らかにする。平成20年度は初年度の研究成果を踏まえ、研究代表者及び分担者が、成果の中から各自の課題意識に基づき焦点的に研究を行なう領域を選んで研究を推進した。代表者である嶋田は、前年度に引き続き、「基礎基本事項」に関して、特に昭和2030年代に期間を絞って、その間の「変奏」指導のための教材変遷の様相を「変える」教材というキーワードを用いて考察を行なった。また、主に歌唱の領域が中心的活動であった昭和20年代に、教科書の中で合唱指導がどのように系統立てて扱われていたのかを教育出版社の教科書を中心として考察した。その結果、この時代のハーモニーを作るという目的のために、擬音伴唱、輪唱、和音合唱、ハミング伴唱などの形態の合唱曲が、学年を追って有機的関連を保ちつつ段階的に編成されていたことが明らかとなった。一方、阪井は平成13年度検定合格以前の小学教科書の鑑賞教材曲のデータベースを作成し、教師用指導書の内容の検討を加味しながら、戦後の鑑賞教材曲の指導においてどのような聴き方が指導されてきたのかを考察した。その結果、児童を楽しませる目的をもつ教材曲や身体運動と関連づけられた楽曲を選定する傾向が見られたこと、そして、音楽の気分を感じ取る、即ち音楽外的な表象による聴き方が奨励されてきたことを明らかにした。また本多は、特に昭和20年代を中心に鑑賞指導のための楽曲の指導法を分析し、自身のこれまでの研究成果と照らし合わせながら、戦前からの鑑賞指導の方向性が戦後も引き継がれていたことを明らかにした。また、中学校における諸民族の音楽に関する教材リストを作成し、昭和50年代以降の各学年への教材編成や表現教材としての扱いの変遷についても明らかにした。
灰色かび病菌の薬剤耐性発現に関する分子機構の解明

1.灰色かび病菌のベノミル薬剤耐性機構に関する研究パルスフィールドゲル電気泳動によって,供試したBotrytis cinereaの5菌株(ベノミル耐性菌株:IHES-4,CAES-7,PHDF-6,PHGF-1;感性菌株:IPCR-1)では,5本のゲノムバンドが分離されたが,耐性菌株・IHES-3では,更に分子量の小さなバンドが1本検出され,6本のバンドに分離された。ゲノムサイズは,合計約10Mbであった。6種の制限酵素を用いたアガロースゲル電気泳動では,供試菌株間にバンドパターンの違いは認められなかった。しかし,制限酵素未処理のDNAからミトコンドリアのプラスミド様DNA(約2.15kb)が検出され,このプラスミド様DNAは,耐性菌において増幅している可能性が示唆された。pUC-18-DNA,yeast-RNAおよびE.coli-RNAをフォトビオチンで標識したプローブを用いて,サザンハイブリダイゼーションによるRFLP解析を試みたが,供試菌株間で異なるバンドは検出されなかった。2.灰色かび病菌のジカルボキシイミド系薬剤耐性誘発機構に関する研究B.cinereaの薬剤耐性菌株(CAES-2,-4,-7)の培養ろ液で,Saccharomyces cereevisiae(IF00205)DS-2株を処理した結果,ビンクロゾリンに対する耐性誘発が認められた。特にCAES-2の培養ろ液で顕著であった。しかし,ベノミルに対する耐性誘発は見られなかった。培養ろ液処理による耐性誘発酵母(DR-C2,DR-C4)について,PFGE法およびRFLP法を用いて遺伝子解析を試みたが,薬剤感性菌株との間に,染色体およびゲノムDNA塩基配列に差異は認められなかった。1.灰色かび病菌(Botrytis cinerea)のベンズイミダゾ-ル系薬剤耐性菌株IHESー3(無糸核分裂)とIHESー4(有糸核分裂),および感性菌株IPCRー1(有糸核分裂)のゲノムDNAをそれぞれ抽出し,制限酵素(Eco RI,Eco RV,Hind III,Bam HI,Sac I)で処理してRFLP法解析した結果,耐性菌株に特異的に存在,もしくは増幅しているDNA断片は認められなかった。次に3菌株のミトコンドリア分画から,それぞれプラスミドDNA(2.4kb)が見出だされ,その分離量は耐性値と正の相関を示した。2.耐性菌株IHESー3とIHESー4,および感性菌株IPCRー1について,パルスフィ-ルド電気泳動装置を用いて染色体解析を試みた。既に報告されている数種の糸状菌(S.cerevisiae,A.nidulans,Neurosporaなど)の泳動条件では,全くバンドは分離されなかった。そこで,次の点を改変することで5本のゲノムDNAバンドを分離できた。(1)ノボザイム使用によるプロトプラスト分離量の大幅増加(2)アガロ-スの種類,ゲル濃度,泳動時間,泳動電圧およびパルスタイムの変動。しかし,光顕下で観察される染色体数に比べて,分離バンド数が少ないことから,さらに泳動条件の検討が必要である。3.耐性菌株IHESー4および感性菌株IPCRー1では,5本のゲノムDNAバンドが同様に分離されたが,耐性菌株IHESー3では,5本のゲノムDNAバンドのほかに分子量の小さなDNAバンド(〈1Mb)が1本検出された。この特異的なDNAバンドと耐性との関係ついて検討中である。4.ベノミル耐性Saccharomycescerevisiaeのチュ-

ブリン変異遺伝子をプロ-ブとして,B.cinerea耐性菌株よりチュ-ブリン変異遺伝子を検索した結果,耐性菌株IHESー4で検出され,クロ-ニングに成功した。1.ジカルボキシイミド系薬剤耐性灰色かび病菌の培養ろ液処理によって,薬剤耐性が増大したサッカロミセス酵母(S.cerevisiae DSー2)を,パルスフィ-ルド電気泳動による染色体解析,およびYeast RNAプロ-ブを用いたRFLP法によるゲノムDNA解析した結果,特異的,もしくは増幅した染色体およびDNA断片は検出されなかった。現在,耐性誘発酵母に特異的に出現,もしくは増大するmRNAの検出を進めている。2.ジカルボキシイミド系薬剤耐性遺伝子を解析するために,半数体のサッカロミセス酵母(S.cerevisiae IFO SZ88C)にUV照射,およびEMS処理して,薬剤感性突然変異株(MVー9,MEー6株)を作出した。次に,S.cerevisiae DSー2株のゲノムDNA断片を,エレクトロポレ-ションにより感性株(MEー6株)に導入し,耐性獲得酵母を作出した。現在,ジカルボキシイミド系薬剤耐性遺伝子のクロ-ニングを進めている。3.ベンズイミダゾ-ル系薬剤耐性灰色かび病菌(IHESー3)に特異的に存在したDNA断片と,サッカロミセス酵母のチュ-ブリン変異遺伝子をプロ-ブとして灰色かび病菌(IHESー4)からクロ-ニングした薬剤耐性遺伝子との相同性をサザン法で調べた結果,相同性は認められなかった。現在,IHESー3の特異的DNA断片を,エレクトロポレ-ションにより灰色かび病菌の薬剤感性株(IPCRー1),およびサッカロミセス酵母(MVー9)に導入し,耐性獲得株の作出を試みている。
注意欠如多動性障害患児に対する薬物、心理社会的治療の選択のための客観的指標の開発

光トポグラフィー(NIRS)を用いた塩酸メチルフェニデート(MPH)の効果の予測においてはMPH単回内服後のNIRS信号が内服前よりも高くなる程、継続MPH内服後(1ヶ月および1年)の治療効果が高いという結果を得た。単回内服でのNIRS信号により長期的なMPHの効果を予測し、薬物開始における客観的指標となりうる可能性が示唆された。ペアレントトレーニングの効果検証では、こどもの問題行動の指標および親のストレス度、ネガティブな養育行動が改善するという結果を得た。また、ベースラインの社会的容認への感受性が高い児ほど、治療効果があった。本研究は小児期の注意欠如多動性障害(ADHD)に対して薬物と心理社会的治療の選択を行うための客観的指標を開発することを目的とする。ADHDは小児期に最も多く見られる精神疾患で、薬物治療として、特に塩酸メチルフェニデートの治療が有効とされ、また、心理社会的治療としてペアレントトレーニングの治療が有効とされる。薬の副作用の問題、心理社会的治療を提供できる施設の不足の問題があるものの、薬物療法と心理社会的治療のどちらを選択するかの基準は明らかとなっていない。本研究の指標として、安全、簡便に外来で施行できる光トポグラフィー(NIRS)を用いる。当該年度においては、NIRSを用いて薬物の長期内服の影響と薬物効果の予測するための研究結果を論文化し、投稿、受理された。本研究成果によって、今後、さらに多施設、多人数での検討、ほかの薬物や治療法との比較も行ったうえで、治療選択の客観的指標を導入する事により、個別治療が可能となり、薬物の長期内服での副作用を最小限に抑えることができ、治療アドヒアランスの向上が見込め、ADHD児の成人期の予後改善につながると考える。また、ペアレントトレーニングについて、テキスト・プログラムの作成を行ったうえで、7クールのトレーニングを行い、比較対象群と比較した。治療前後でADHD症状、問題行動、親のストレス、報酬系の問題などのスコアが改善するかどうかを解析、検討を行い、論文化を行った。光トポグラフィーを用いた塩酸メチルフェニデート(MPH)の効果の予測においてはMPH単回内服後のNIRS信号が内服前よりも高くなる程、1か月継続MPH内服後の治療効果(医師の全体評価:CGI-S)が高いという結果を見出した。この結果は、1年間MPHを内服した臨床評価にも再現された。単回内服でのNIRS信号により長期的なMPHの効果を予測できる可能性を示し(判別率81%)、薬物開始における客観的指標とるなりうる可能性が示唆された。また、ベースラインアセスメントにおいてADHDは、健常群に比較して有意に右下前頭回のNIRS信号が低かった。単回内服試験においては、ADHD群において、MPH内服時にプラセボ内服時と比較して有意に右下前頭回のNIRS信号が高くなった。また、48週間のMPH内服後においてADHD群は、健常群とNIRS信号の高さに差が認められなくなった。さらに、1年間MPHを内服したのち1週間休薬してから行ったNIRS検査においては、休薬したにも関わらず、ADHD群は健常群とNIRS信号に差が認められなかった。つまり、未内服のADHD群は、健常群と脳機能の差があったが、MPH内服を継続することによって、健常群と脳機能の差が減少する可能性が示された。これらの成果は平成27年11月に、Neuropsychopharmacologyに掲載された。ペアレントトレーニングの効果検証では、小学生ADHD児の母親が10回のセッションに参加し、通常診療のみ受けているコントロール群との治療効果の比較を行った。ペアレントトレーニングを行った群で、こどもの問題行動の指標および親のストレス度、ネガティブな養育行動が改善するという結果を得た。光トポグラフィーによる注意欠如多動性障害への塩酸メチルフェニデートの治療の効果予測についての論文を投稿し、Neuropsychopharmacologyに受理された。また心理社会的治療であるペアレントトレーニングについて7クール終了し、その治療効果を比較対象群と比較した解析検討を行い、論文化を行ったことより、おおむね順調に進展していると考えられる。児童精神医学今後の研究の推進方策としては、当該年度においては、薬物療法、ペアレントトレーニングをそれぞれの検討を行ってきたが、次の段階としては、塩酸メチルフェニデートと、ペアレントトレーニングをランダム化比較試験を行う必要があり、参加者募集を行う必要がある。理由としては、予定していた物品の購入を行わず、今まで使用していたものを使用したため、残額が生じた。ノートパソコンが、老朽化しているため、購入費にあてる予定である。
統合失調症における認知機能障害の原因解明と治療法への探求

LTPの検討には、MED64システムによる多電極細胞外電位測定を行った。刺激電流強度は最大応答の40%の電圧となる刺激電流の大きさとした。シータバースト刺激前5分間の平均を基準として、刺激後120分間の測定を行った。その結果、雌雄のShati-KOとも、それぞれのWTと比較して刺激後の電位の変化が低下しており、LTPが有意に障害されていた。さらに、雌雄のShati KOマウスの海馬CA3領域にShati/Nat8lを組込んだAAVベクター(AAV-Shati)を注入した。GFPのみを組込んだAAVを注入したShati KOマウスをmock群としそのLTPに対する影響を検討したところ、海馬CA3へのAAV注入は注入領域のCA3およびCA1領域でも陽性細胞が観察され、Shati-KOで見られたLTPの障害はAAV-Shatiの雌性Shati-KO海馬CA3領域への注入によって、有意に回復した。Shati/Nat8lの欠損は、LTPの障害を誘発し、特に海馬CA1およびCA3領域のShati/Nat8lが重要であることが示唆された。雌雄のShati KOで海馬のLTPが障害され、行動実験における記憶障害は雌性マウスのみ観察されたことについては、今後の検討が必要である。Shati/Nat8l、NAAまたはNAAGが新たな認知症治療薬の開発標的となることが期待される。本年度は主にShatiKOマウスを用いた行動実験を行った。WTとShati群における行動量を60分間測定したところ、雌性・雄性いずれにおいても自発運動量が有意に増加した。次にShati KO群の社会性行動の変化を検討するために、three chamber socialinteraction testを行った。両群において、新規物体へのアプローチ時間は、空のチャンバーに比べて雌雄マウスとも有意に増加した。次に、別の新規物質の入ったワイヤーケージとストレンジャーマウスの入ったワイヤーケージを使って実験を行ったところ、WTでは、ストレンジャーマウスにアプローチした時間が有意に増加したが、Shati KOではその増加は確認されなかった。本結果は雌性および雄性いずれのマウスでも観察された。不安様行動を示すかどうかを検討するため、elevated plus-maze testを行ったところ、雌性・雄性いずれにおいてもShati KO群は抗不安作用が確認された。WTとShati KO群における、Y-maze testによる自発的交替行動を測定したところ。雄性のマウスでは両群間に著明な変化は観察されなかったが、雌性のShati KO群の交替行動率はWT群と比較して有意に低下していた。Novel object recognition testを用いてWTおよびShati KO群の記憶・認知能力を比較したところ、雄性のWTとShati KOの両群の雄性マウスでは、トレーニング(10分間)から24時間後のトライアル(10分間)では、新規物質に対するアプローチ時間がでは有意に増加した。一方、雌性のWTでは新規物質に対するアプローチ時間が有意に増加したがShati KOでは、新規物質に対するアプローチ時間がWTマウスに比べて有意に低下した。計画通り進行しているが、骨形態解析はサンプル数の不足により再度の解析が必要である。本年度は主にShati KOマウスにアデノ随伴ウィルス(AAV)ベクターを用いた回復実験を行った。おおむね計画通り進行しているが、骨形態解析はサンプル数の不足により再度の解析が必要である。また電気生理の実験を行い始めたが、当マウスは冬期には幼若期には生存率が低下することと、実験の立ち上げに少し時間がかかった。

雌雄のShati KOで海馬のLTPが障害され、行動実験における記憶障害は雌性マウスのみ観察されたことについては、今後の検討が必要である。Shati/Nat8l、NAAまたはNAAGが新たな認知症治療薬の開発標的となることが期待される。引き続き当初の計画通り遂行する予定である。認知機能を検討する行動実験にのみ雌雄差が確認されたので、その解明のため電気生理学実験や免疫染色などを行い詳細な解析を行う予定である。認知機能を検討する行動実験にのみ雌雄差が確認され、またAAVによる回復により海馬でのShati/Nat8lが重要な役割を担っている可能性が考えられたので、その解明のため電気生理学実験や免疫染色などを行い詳細な解析を行う予定である。当初の計画では回転式ミクロトーム・LeicaRM2235を購入する予定であったが、交付金の削減により購入が不可となった。そのため骨切片を自身で作成する予定であったものが、受託研究に依頼したため経費が掛かったことによるサンプル数の不足となった。おおむね研究計画通りに進行しているが、使用する動物が冬期になると幼若期の時点で死んでしまうため、予定していた動物数の確保が難しくなり、電気生理の実験に遅れが生じている。そのためこの実験に使用する予定であった試薬等の消耗品の購入が予定していた数よりも少なくなった。次年度に動物数を追加してこの実験を行う予定であるためその実験の消耗品購入代金として使用する。次年度予算を追加して骨切片の解析受託をサンプル数を追加する予定である。
ゲラニルゲラニル化合物による癌細胞の分化およびアポトーシスの誘導機構に関する研究

我々はイソプレニルアルコールの一種であるゲラニルゲラニオール(GGO)が種々の癌細胞に対してアポトーシス誘導能をもつことを見い出し、それにともなうアポトーシス関連遺伝子の変化や分子レベルでのアポトーシス誘導機構についての解析を行った。本研究によって以下の(1)-(2)を明らかにした。(1)アポトーシス関連遺伝子の解析アポトーシスの誘導や抑制に積極的に関与していると考えられる遺伝子(myc、bc1-2)とGGOによって誘導されるアポトーシスの関係をノーザンブロットにより解析したところ、GGO処理によってこれらの両遺伝子の発現はアポトーシスの誘導とともに減少した。現在、ヒト白血病細胞U937に発現ベクターを用いてbc12遺伝子の強制発現を行い、GGOによるアポトーシス誘導に対する影響について解析を行っている。(2)アポトーシスの誘導に関与する新しい遺伝子のクローニングGGOにより特異的に誘導される遺伝子群のクローニングをディファレンシャルデイスプレイ法を用いて行った。現在いくつかの遺伝子のクローニングに成功しており今後これらの遺伝子の解析を進めていきたいと考えている。
位置情報を用いた消費者の商圏内買い回り行動の理解

本研究の目的は、近年利用が可能となっている位置情報データを用いて、消費者の商圏内の買い回り行動を理解することである。近年国内でも価格戦略として、製品の値段を変動させず、常に低価格での販売を行うEDLP戦略を取る店舗が増加している。消費者はこのようなEDLP店舗と、製品価格を変動させて消費者の来店を誘発するHiLo戦略を行う店舗の中から、店舗を選択する行動を取っている。本研究では、個人レベルの位置情報データと複数小売店舗のPOSデータ、更に商圏内店舗のチラシデータを取得し、消費者がHiLo店舗の値引きに対してEDLP店舗との選択の中でどのように反応しているのか、を明らかにすることを目的とする。
光酸素化反応による分子変換

これまでオレフィン類やヘテロ原子化合物の光増感酸素酸化反応は、合成的に有用のみならず、反応機構の面からも数多くの研究がなされて来たが,炭素ー炭素単結合に代表されるa結合の光酸素化反応は全く研究されていない。本研究において炭素ー炭素やケイ素ーケイ素単結合の光増感酸素酸化反応を検討し,合成化学的価値が高く且つその化学的挙動に興味が持たれる環状過酸化物を合成すると共に、その生成機構の解明を試みた。まず反応基質として酸素に対して親和性の高いケイ素化合物を選び、ケイ素ーケイ素単結合の光増感酸素化反応を検討した。求核的性質が期待される三質環高歪化合物としてジシラシクロプロパンを合成し,その一重項酸素酸化によりケイ素ーケイ素単結合への酸素分子挿入生成物を高収率で得る事に成功した。種々のコントロ-ル実験及び中間体に対する捕捉剤を用いた実験により、酸素化反応がケイ素ーケイ素単結合と一重項酸素のいわゆるaーπ^*相互作用によりパ-オキシ中間体を経由して進行する事を明らかにした。さらに理論計算も合わせて行ない、パ-オキシ中間体を経由する反応機構を支持する結果が得られた。これらの成果を基にして炭素ー炭素単結合の光酸素化反応を検討した。電子供与性置換であるアニシル基を有するシクロプロパンの一重項酸素酸化において炭素ー炭素単結合への酸素分子挿入生成物を定量的に得ることに成功した。種々のコントロ-ル実験や立体化学の検討により酸素化反応の反応機構を解明した。本研究は、光エネルギ-と分子状酸素の有効利用という観点に立脚し光増感反応を利用して分子状酸素より一重項酸素を発生させ、有用な物質を酸素酸化反応により合成すると共に,その反応のメカニズムを解明する事を目的とする。これまでオレフィン類やヘテロ原子化合物の一重項酸素酸化反応は合成的に有用のみならず,反応機構の面からも数多く研究がなされてきたが,炭素ー炭素結合に代表されるa結合への一重項酸素酸化反応は全く研究されていない。本研究において炭素ー炭素やケイ素ーケイ素a結合の光増感酸素酸化反応を検討し,合成化学的価値が高く,且つその化学的挙動に興味が持たれる環状過酸化物を合成すると共に,その生成機構の解明を試みた。特に本年度は,反応基質として酸素に対して親和性の高いケイ素化合物を選び,ケイ素ーケイ素単結合の光増感酸素酸化反応を検討した。具体的には,その求核的性質が期待される三質環高歪化合物としてジシラシクロプロパン類の一重項酸素酸化反応を試みた。ケイ素ーケイ素単結合への一重項酸素による酸素分子挿入生成物を高収率で得る事に成功した。種々のコントロ-ル実験及び中間体に対する補捉剤を用いた実験により,酸素化反応がケイ素ーケイ素a結合と一重項酸素のいわゆるaーπ^*相互作用によりパ-オキシ中間体を経由して進行する事を明らかにした。本研究は炭素ー炭素やケイ素ーケイ素単結合の光増感酸素酸化反応を検討し、合成化学的価値が高く,且つその化学的挙動に興味が持たれる環状過酸化物を合成すると共にその生成機構の解明を目的とする。前年度の酸素に対する反応性の高いケイ素ーケイ素単結合の一重項酸素酸化反応の結果を基にして、炭素ー炭素単結合の一重項酸素酸化反応を検討した。電子供与性置換基を有するシクロプロパンを分子設計して合成し、光酸素化反応を試みた。電子供与性置換基であるアニシル基を有するテトラアニシルシクロプロパンの一重項酸素酸化において炭素ー炭素単結合への酸素分子挿入生成物を定量的に得ることに成功した。種々のコントロ-ル実験,中間体に対する補捉剤を用いた実験や立体化学の検討により,酸素化反応の反応機構を解明した。
直流刺激と歩行運動のハイブリッド型リハによる下肢機能再建とその脳内機構の解明

本研究は、下肢機能再建のための脳刺激・末梢電気刺激・反復運動による新しいハイブリッド型リハ手法開発とともに、運動機能再建を担うシステム可塑性を解明することを目指している。慢性期脳卒中患者での下肢機能の再建を実現することができれば、車いす生活となっている多くの患者にとってのADL,QOLの著明な改善に繋がることが期待される。具体的には、慢性期脳卒中患者での下肢機能再建を実現するために、下肢一次運動野へのアノード直流刺激(tDCS)、部分免荷トレッドミル歩行、歩行周期に合わせた機能的電気刺激をハイブリッドに組み合わせた相乗効果を利用する介入方法の評価を行った。最終年度として、これまでの研究を継続してさらに新たな患者のリクルートとこれまでの被験者のフォローを行うとともに、個々人での解析データを集団として統計学的に解析する。複数施設で並行して、同じパラダイムを用いて介入し、互換性のある機器で記録解析を行い、研究を効率的に進めた。その結果、健常者での実験については原著論文としてまとめて国際的な査読付き雑誌に出版した(Koganemaru et al. 2018a)。慢性期脳卒中患者での実験については投稿中である。分担研究者の植木美乃(名古屋市立大学・リハビリ医学)、野嶌一平(名古屋大学・理学療法学)らと協力して新たに開始したパーキンソニズムを示す患者群に対しての介入の実験については結果をとりまとめ投稿準備中である。新学術領域オシロロジーとの共同研究として新しい被侵襲的脳刺激法である静磁場刺激についても臨床応用の研究を進め、第一回静磁場刺激国際ワークショップ「静磁場刺激-生理機構から臨床応用,そしてそれらを超えて-」を平成30年6月17日に開催した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。健常者での歩行運動の制御や調整が、頭皮上からの直流電流刺激によって可能かどうかを確認するための実験を遂行し、現在論文としてまとめつつある。また、よりモバイルな研究を行うために、スタースティムシステムを導入して検証実験を行いつつある。下肢の皮質内抑制を検討するシステムとしてマグスティムのペア刺激システムによる評価を安定して行う基盤を構築した。原著論文を発表するとともに、査読付きの英語雑誌に、本研究成果を含めた総説論文とケースレポートを発表している。研究代表者の年度内異動のため、研究遂行に遅れが生じ、本年度への調整が必要となった。しかし、遅れは6ヶ月以内のものであり、本年度以降の研究を迅速に行うことによって挽回は十分に可能である。本研究は、慢性期脳卒中患者での下肢機能再建とりわけ歩行機能の改善を実現するために、下肢一次運動野へのアノード直流刺激(tDCS)、部分免荷トレッドミル歩行、歩行周期に合わせた機能的電気刺激をハイブリッドに組み合わせた相乗効果を利用する狙いの研究計画である。健常被験者10-20名を対象に、アノード直流刺激(現有設備、H27年度備品)、部分免荷トレッドミル歩行、歩行周期に合わせた麻痺側機能的電気刺激を組み合わせたハイブリッド型リハの1回介入を行い、その前後での下肢のTMS誘発筋電図の変化率を指標に、最も有効な刺激パラメタを探索的に決定した。刺激電極の大きさ、カソード電極の位置(頸部、眼窩上、肩など)、電流強度(0.5-2mA)などのパラメタを変更する探索的な研究を行った結果よい条件を発見して論文にまとめている。京都大学の実施した健常者での歩行制御の調節は統計的に有意な結果が得られた。頭皮上から非侵襲的に行うことが可能かどうかの実験を行ってまとめたものは、査読付き雑誌に投稿中である。また正確に刺激の強度を評価し、新しいシステム構築のため、デジタルオシロスコープ(備品)を購入して実験基盤を構築した。電気刺激と歩行について、位相差を正確に制御する手法を開発し、マイコンを使ってモバイル化するシステムを構築中である。患者研究については、歩行障害を主症状とするパーキンソン症候群についても同様の介入が可能かを検討している。実験は順調に遂行できている。健常者での研究については予定通りに進んでおり、結果まとめと統計的解析を終えて、査読付き雑誌に投稿中である。患者研究についても順調にリクルートが進んでいる。具体的には、慢性期脳卒中患者での下肢機能再建を実現するために、下肢一次運動野へのアノード直流刺激(tDCS)、部分免荷トレッドミル歩行、歩行周期に合わせた機能的電気刺激をハイブリッドに組み合わせた相乗効果を利用する介入方法の評価を行っている。平成29年度には、これまでの研究を継続してさらに新たな患者のリクルートとこれまでの被験者のフォローを行うとともに、個々人での解析データを集団として統計学的に解析する。複数施設で並行して、同じパラダイムを用いて介入し、互換性のある機器で記録解析を行い、研究を効率的に進めている。健常者での実験については原著論文としてまとめて国際的な査読付き雑誌に投稿中である。健常者データの解析にもとづいて慢性期脳卒中患者および一部はパーキンソニズムを示す患者群に対しての介入を行っている。

分担研究者の植木美乃(名古屋市立大学・リハビリ医学)、野嶌一平(名古屋大学・理学療法学)らと協力して実験を遂行中である。筋電評価のために事象関連電位解析プログラム(本年度購入)を用いて、客観的な皮質錐体路評価を行っている。ほぼ計画通りに臨床研究は遂行されている。健常者に対する安全性確認と効果の生理学的指標での検討を修了して、査読付き雑誌に論文として投稿中である。患者研究についても順調に進行しており、予備的実験結果は有望である。本研究は、下肢機能再建のための脳刺激・末梢電気刺激・反復運動による新しいハイブリッド型リハ手法開発とともに、運動機能再建を担うシステム可塑性を解明することを目指している。慢性期脳卒中患者での下肢機能の再建を実現することができれば、車いす生活となっている多くの患者にとってのADL,QOLの著明な改善に繋がることが期待される。具体的には、慢性期脳卒中患者での下肢機能再建を実現するために、下肢一次運動野へのアノード直流刺激(tDCS)、部分免荷トレッドミル歩行、歩行周期に合わせた機能的電気刺激をハイブリッドに組み合わせた相乗効果を利用する介入方法の評価を行った。最終年度として、これまでの研究を継続してさらに新たな患者のリクルートとこれまでの被験者のフォローを行うとともに、個々人での解析データを集団として統計学的に解析する。複数施設で並行して、同じパラダイムを用いて介入し、互換性のある機器で記録解析を行い、研究を効率的に進めた。その結果、健常者での実験については原著論文としてまとめて国際的な査読付き雑誌に出版した(Koganemaru et al. 2018a)。慢性期脳卒中患者での実験については投稿中である。分担研究者の植木美乃(名古屋市立大学・リハビリ医学)、野嶌一平(名古屋大学・理学療法学)らと協力して新たに開始したパーキンソニズムを示す患者群に対しての介入の実験については結果をとりまとめ投稿準備中である。新学術領域オシロロジーとの共同研究として新しい被侵襲的脳刺激法である静磁場刺激についても臨床応用の研究を進め、第一回静磁場刺激国際ワークショップ「静磁場刺激-生理機構から臨床応用,そしてそれらを超えて-」を平成30年6月17日に開催した。本務校にての研究推進を行うと同時に、臨床研究であるという性質を考え、分担研究者と密接に協力して、名古屋市立病院での研究遂行に向けて準備を整えつつある。実験の推進に向けて、分担研究者と緊密に連絡を取って進めている。名古屋市立大と名古屋大学との共同研究として進んでいる。さらに、北海道大学の研究者とも連携して勧めている。現状を継続して、研究成果をまとめていく。現在のところ研究は順調に進展しており、本年度は最終年度として、結果のとりまとめと統計的解析をすすめていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
半導体ガスセンサの過渡応答を用いた臭い識別装置の開発

半導体ガスセンサの過渡応答を用いたアルコールガスの臭い識別装置を試作した。アルコールガスの臭い識別のための最適な過渡応答が得られるヒーター入力波形を、独自に開発した過渡応答モデルを用いたシミュレーションから求め、9乗根関数で駆動した際に最も過渡応答間の差が大きくなることを見出した。過渡応答の面積および立ち上がりと立下りの差や、過渡応答の傾きから、アルコールガスの種類をPICで自動的に識別する装置を試作したところ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールの4種類のアルコールガスを識別可能とした。前年度に半導体ガスセンサを用いた臭い識別装置を試作し,メタノール,エタノール,プロパノール,ブタノールの4種類のアルコール臭のうち2種類を確度70%程度で識別できることを示した。この識別精度を向上させるべく,半導体ガスセンサのヒーターの加熱波形を変化させて,最適な駆動条件を模索した。その結果,半導体ガスセンサの温度の時間変化が時間の3乗根関数の際に,最も識別し易いことを見出した。この温度プロファイルを実現するためのヒーター入力波形を,独自に開発している半導体ガスセンサの過渡応答モデルを用いて検討を進めた結果,三角波とデルタ関数,それに9乗根関数を重ねることで実現できることを示した。現在このヒーター入力を用いた実証実験を進めている。これまで半導体ガスセンサの過渡応答が,ガスの種類によって異なることを利用して,半導体ガスセンサを用いてガスの種類の識別が可能であることを提案してきた。このガス識別の可能性を実証するために,半導体ガスセンサのヒーターに方形波を入力して温度を時間的に変調し,その際の種々のガスに対するセンサの過渡応答の面積を測定し,予め測定したデータと比較することで,自動的にガスの種類を識別する装置を試作した。ガスの識別の判定には,マイクロコンピュータArduino UNOを用い,ガスの濃度と過渡応答とから,ガスの種類を特定した。試作したガス識別装置を用いて,メタノール,エタノール,n-プロパノール,n-ブタノールの4種類のアルコールガスの識別を試みたところ,メタノールとn-ブタノールにおいて70-80%の精度でガスの特定が可能であった。ガスの識別に用いる因子を過渡応答の面積以外にも広げることで,この精度は更に向上できるものと考える。また識別可能なガスの種類も増加すると予想する。これまで半導体ガスセンサの過渡応答を用いた臭いの識別を試みてきた。平成25年度はガスの種類による過渡応答の立ち上がりの差に加えて、立下りの部分の差も利用してアルコール系のガスの識別を試み、2種類のアルコールガスの識別に成功している。平成26年度は、過渡応答の平坦部分の傾きの差に着目して、この傾きの差を利用したアルコールガスの識別を試みた。100ppmの濃度のメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールの4種類のアルコールガスに対する過渡応答の平坦部分の傾きを測定してデータベースとした。測定したアルコールガスに対する過渡応答の平坦部分の傾きをArduinoマイクロプロセッサーを用いて比較して、測定したアルコールガスの種類を求めた。その結果測定した4種類のアルコールガスすべてにおいて、ほぼ100%の確率で識別が可能であった。100ppm以外の濃度においても、アルコールガスの種類によって過渡応答の平坦部分の傾きが変わるので、データを集めることによって識別が可能になると考えている。今後は濃度に関わらない識別を目指したい。半導体工学前年度に得られた結果を,更に改善するための方策を模索し,計算機シミュレーションで一定の指針を得ることができた。シミュレーションの結果を確かめるための実証実験を行いたかったが,年度内に実現出来なかった。この点がやや悔やまれる。今年度の早い時期に行いたい。今回のガス識別装置の試作を通じて,これまで提案してきた半導体ガスセンサの過渡応答を用いたガスの識別の基本的な可能性を示すことができた。今回の試作機は過渡応答の面積を比較するという,極めて単純なアルゴリズムであるにも関わらず,70-80%という髙い精度で2種類のアルコールガスの識別が可能であった。ガスの識別に用いる過渡応答の因子を増やすことで,精度向上とガスの種類の増加が期待できる。また方形波以外の波形でヒーターを変調した際のガスの識別能の変化をシミュレーションと実験の両方で観測し,ガスの識別に活かすべく検討を進めることができた。前年度のシミュレーション結果を実験で実証する。実証後は,臭い識別装置に応用し,実用に耐える程度の確度で特定の臭いを識別可能な装置を試作する。今回のガス識別装置の試作により,ガスセンサの過渡応答を用いたガス識別の可能性を示すことができたが,他方,複数のガスが混在している際のガスの識別が困難であることが課題となってきた。特定のガスに対するガスセンサの過渡応答の波形で,そのガスに固有の特徴を見出すことができれば,複数のガスが混在する中でも,それらのガスの識別の可能性が出てくる。

これまでの手法では複数のガスが混在する環境下で,ガスの種類を特定することが困難であり,これを解決することが新たな課題となってきた。この課題を解決するために,ガスセンサの過渡応答をフーリエ解析し,ガスの種類による周波数特性の違いを模索し,ガスの識別に繋げる予定である。この目的のために,国内外の試みを調査する。また周波数解析のソフトを購入すると共に,種々の周波数の電力をヒーターに供給する装置を新たに購入する予定である。それらの設備を用いてシミュレーションと実験との比較を続けて複数のガスが混在する環境でのガスの識別の糸口を見出すべく努力する。発表を計画していた国際会議が,学内のスケジュールと重なり,より近くの会議に変更したことと,購入を予定していたソフトウェアが,既に使用していたソフトウェアで代用できたので,差額が生じた。臭い識別装置の試作を予定しており,その材料費に使用する予定である。研究費の主な使途を以下に列挙する。複数のガスが混在する環境での実験と解析を行うために,解析ソフトウェアと発振器を購入する。これに平成24年度の繰り越し額約230千円を用いる。さらにシミュレーションを可能にすべく,シミュレーションソフトを改良するとともに,より多くの計算が可能になるように新たなワークステーションを導入する。これに300千円程度使用予定である。複数のガスが混在する環境で,安定して実験ができるように,複数のガスの供給系を持つ実験系の整備を行う。これに700千円程度を見込んでいる。またこれまでの研究成果の報告と,情報収集のための国際会議等の参加に800千円が必要となる。
大気中酸性ガスの土壌粒子への沈着における粒子表面上の生成物分析

本研究では、まず、黄砂粒子上に沈着したSO_2が粒子表面上でどの程度硫酸塩へ酸化されるか(以下、硫酸塩転化率)について検討する前に、黄砂粒子抽出液中では、溶出する鉄などの重金属成分による触媒作用により、硫酸塩転化率を過大評価する可能性があるために、基礎実験として抽出用溶液に酸化抑制剤を添加して亜硫酸塩(S(IV))と硫酸塩(S(VI))を分析する方法についてMilli-Q水で調製した亜硫酸ナトリウム水溶液中の反応から検討を行った。酸化抑制剤には、3価の鉄イオン(Fe(III))のマスキング剤としてよく用いられるトリエタノールアミン(TEA)を用いた。その結果、pH4ではFe(III)による急速なS(IV)酸化が見られたが、アルカリ性(pH9.5、0.11mM Na_2CO_3/0.03mM NaHCO_3緩衝液)、TEA濃度をモル比でFe(III)濃度に対し4倍以上の過剰な条件に設定すれば、水相S(IV)濃度の減少を24時間でその初濃度の2%程度まで抑制できることを見いだした。次に、温度制御用ウォータージャケットを外側に装着した同軸円筒形流通反応器の内管の外壁面に黄砂粒子の主要成分である炭酸カルシウム(CaCO_3)粒子をモデル粒子として塗布し、濃度400ppbのSO_2を含む空気に室温、暗条件下で暴露させ、沈着したSO_2の粒子上での硫酸塩転化率を算出した。SO_2の沈着量は高湿度ほどまた暴露時間(5-15時間)が長いほど多い傾向が見られ、別途検討した中空円筒形流通反応器の内壁面に塗布した黄砂粒子への沈着速度が高湿度条件で大きいという傾向と一致した。一方、算出した硫酸塩転化率には沈着量とは異なる傾向が見られ、またその値は30%以下(暴露時間10時間)と低く、暗条件下ではCaCO_3粒子上でのSO_2の酸化は遅いと推測された。黄砂粒子を用いた暴露実験では、黄砂懸濁液のろ過後、ろ液のpHが低下していたことが判明したので、抽出用溶液のもつ緩衝能を上げるなど抽出法を見直した後、硫酸塩転化率について再評価する予定である。
アンドロゲン低下によるインスリン抵抗性惹起機構の解明

高脂肪食にて飼育した精巣摘出マウスは擬似処置マウスと比べ、体重増加を認めた。また、ブドウ糖負荷試験による耐糖能悪化を認めた。さらに、高脂肪食にて飼育した精巣摘出マウスが、肝臓における脂質/リポタンパク質代謝関連遺伝子発現異常を介して脂肪肝を呈し、インスリン抵抗性増大と耐糖能異常悪化を認めた。アンドロゲン低下によるインスリン抵抗性惹起機構において、肝臓の脂質代謝障害や末梢組織の糖輸送担体4を介した糖取込み作用障害が重要な役割を担っていることを明らかにした。加齢などによるテストステロン低下は、インスリン抵抗性を惹起し糖尿病やメタボリック症候群発症に関与すると報告されているが、その分子機構は解明されていない。脂肪細胞や骨格筋における細胞内糖取り込み作用はインスリン抵抗性と密接な関連があることが知られている。本研究では3T3-L1脂肪細胞を用い、テストステロンが細胞内糖取り込み機構に及ぼす効果の検討,およびGLUT4細胞膜移行のシグナル伝達機構におけるテストステロンの作用機序を明らかにする。【方法】前駆脂肪細胞(3T3-L1)より分化誘導した脂肪細胞を用いた。細胞内への糖取り込み活性をRI標識した2-deoxyglucose (3H-2DG)を用いて測定した。細胞膜分画(密度勾配超遠心法)のGLUT4発現をWestern blot法にて解析した。またRobinsonらの方法に従って細胞膜剥離(細胞膜シート)し、共焦点レーザー顕微鏡を用い細胞膜シートのGLUT4発現動態を免疫組織化学的に解析した。各解析において刺激物質として、テストステロン(1nM, 10nM, 100nM)、および細胞膜不透過性のテストステロン-BSA (1nM, 10nM, 100nM)を用いた。【結果】細胞内への糖取り込みはテストステロン刺激では変化を認めなかったが、100nMテストステロン-BSA刺激にて増加を認めた。同様に細胞膜分画のGLUT4発現量は100nMテストステロン-BSAにて増加を認め、この結果に一致した細胞膜シートGLUT4蛍光強度の増強を認めた。また、AMPKのリン酸化タンパク発現量は100nMテストステロン-BSAにて増加していた。【総括】3T3-L1脂肪細胞においてテストステロンが細胞内糖取り込みを増加させる機序として、細胞膜受容体を介したGLUT4細胞膜移行のシグナル伝達機構活性化が関与していることが示唆された。加齢などによるアンドロゲン低下は、インスリン抵抗性を惹起し糖尿病やメタボリック症候群発症に関与すると報告されているが、その分子機構は解明されていない。本研究では、睾丸摘出マウスのインスリン標的組織(肝臓・骨格筋・脂肪組織)におけるインスリン抵抗性惹起機構を解析し、アンドロゲン低下による糖・脂質代謝異常のメカニズムを明らかにする。【方法】オスのC57BL/6Jマウスに対し精巣摘出術(+)もしくは偽手術(-)を行い、それぞれ通常食(SD)または高脂肪食(HFD)にて飼育した。また精巣摘出術(+)高脂肪食(HFD)にテストステロンを補充した群を設けた(以下SD+, SD-, HFD+, HFD-, HFD+ with T)。5群で腹腔内ブドウ糖負荷試験、肝臓・骨格筋におけるインスリンシグナル伝達経路遺伝子の発現量測定、および組織学的検討を行った。【結果】HFD+はHFD-と比較し肝臓TG蓄積量の増加、および耐糖能障害の悪化を示し(ブドウ糖負荷試験120分血糖値;HFD+: 422.5 ±29.64 vs HFD-: 233.6 ±70.8 mg/dL)、肝臓における脂質合成関連遺伝子(SREBP-1, DGAT-2, FAS)の発現量増加、脂肪酸β酸化関連遺伝子(PPAR-α, PGC-1α)および脂質分泌関連遺伝子(MTP)の発現量低下を認めた。組織学的には、HFD群にて肝脂肪変性が惹起され、精巣摘出により増強した。テストステロン補充によりHFD+で認めた代謝異常の改善を認めた。骨格筋においては精巣摘出により糖輸送担体(GLUT4)の発現量が低下していた。【総括】テストステロン低下は高脂肪食投与マウスの肝臓における脂質恒常性制御機構の破綻を介し脂肪肝および耐糖能障害を悪化させた。また骨格筋においては糖の取り込みを抑制し、インスリン抵抗性を惹起していると考えられた。アンドロゲン低下はインスリン抵抗性を惹起し、糖・脂質代謝異常などの生活習慣病や心血管イベント発症の重要な危険因子の一つである。豊富な臨床知見が報告されているが、その機序に関する基礎的臨床研究報告は乏しい。

申請者らは、高脂肪食にて飼育した精巣摘出マウスが、肝臓における脂質/リポタンパク質代謝関連遺伝子発現異常(主として脂質合成関連遺伝子の増加とβ酸化関連遺伝子および脂質分泌関連遺伝子MTPの低下)を介して脂肪肝を呈し、インスリン抵抗性増大と耐糖能異常悪化を認めることを報告した。同マウスにテストステロンを補充すると代謝異常は改善した。また3T3-L1脂肪細胞において、テストステロンがAMPKシグナルを介しGLUT4の細胞膜への移行を促進させる機構を報告した。これらの研究結果により、アンドロゲン低下によるインスリン抵抗性惹起機構において、肝臓の脂質代謝障害や末梢組織のGLUT4を介した糖取込み作用障害が重要な役割を担っていることを明らかにした。本研究成果は、アンドロゲン低下によるインスリン抵抗性惹起機構を異なる臓器において明らかにしたため、各臓器を標的とした予防・治療技術の開発につながり、臨床的意義が非常に大きいと考える。現在テストステロンよりエストロゲンに変換する酵素であるアロマターゼをノックアウトしたマウスを用い、アンドロゲン低下によるインスリン抵抗性惹起機構における、女性ホルモンや性ホルモン受容体の関与も調査している。内分泌代謝本年度の目標である脂肪細胞でのテストステロンによる糖取込み作用機序を解明した。結果については国内・国際学会で発表予定であり、論文として投稿中である。3T3-L1細胞を用い13H-2DGによる糖取込み試験、2細胞膜分画におけるテストステロンによるGLUT4およびその調節分子の発現量の解析を行い、テストステロンが細胞内糖取り込み機構に及ぼす効果およびGLUT4細胞膜移行のシグナル伝達機構におけるテストステロンの作用機序を明らかにした。本年度の目標である、睾丸摘出マウスにおけるインスリン抵抗性の病態を解明でき、国内・国際学会で発表し、その結果を論文発表した。インスリン標的組織(肝臓・骨格筋)におけるインスリン抵抗性惹起機構を解析し、アンドロゲン低下による糖・脂質代謝異常のメカニズムを以下の手法を用いて明らかにした。1糖・インスリン負荷試験2肝臓組織の病理学的検索3肝臓・骨格筋の糖・脂質合成、代謝関連mRNA/蛋白(SREBP1, FAS, lipin1, DGAT-2, PPARα/γ, MTP, Glut4, Grb10, etc.)発現量の解析1精巣摘出マウスとアロマターゼノックアウトマウス(ArKO)を用い、テストステロンおよびテストステロン代謝産物(DHT、17β-エストラジオールなど)の量的変化によるインスリン抵抗性惹起機構を明らかにする。また、インスリン標的臓器の性ホルモン受容体(AR、ER、GPCRなど)の役割を明らかにする。2ArKOとSMP30ノックアウトマウス(酸化ストレス増大モデル)との交配により新規モデルマウスを確立し、インスリン抵抗性惹起機構における性ホルモンやその関連分子と酸化ストレス関連分子との相互関係を明らかにする。1睾丸摘出マウスの脂肪組織や株化脂肪細胞3T3-L1を用いて、インスリン抵抗性関連分子(IL6, MCP1, TNF-α, PTEN, PTP1B, SOCS3, lipin1, IRS1, JNK, Akt etc.)の発現動態やリン酸化の解析2siRNA添加による発現低下細胞での上記mRNA発現動態3アンドロゲンの一次標的遺伝子の可能性がある分子をreporter gene assay、EMSA、ChIP等により解析する。
宇宙の微小重力環境下でのタンパク質結晶化と結晶化容器の開発

宇宙の微小重力環境はタンパク質をはじめスペースシャトルを利用して宇宙の微小重力環境の下でニワトリ卵白リゾチームの結晶化を行った。結晶化方法は蒸気拡散法の原理に基づいて製作された装置を用いた。単斜晶が晶出する条件では、宇宙では形状の異なる2種類の単斜晶の他に斜方晶が得られた。また、同一条件で、斜方晶が晶出した(MIR16)。一方、正方晶の条件でも正方晶以外に斜方晶と思われる結晶が晶出したが(STS-73)、後者の回折データは収集できなかった。形状の異なる単斜晶は厚みのある結晶(β=114°)と扁平な結晶(β=90°)で、外観で容易に区別することができ、宇宙では専ら後者の結晶が得られる確率が高かった。しかし、X線結晶構造解析の結果、これら2種類の単斜晶は結晶内部の分子配列が同じであったことから、形態的相違については宇宙と地上の環境差による結晶面の成長速度の差に起因するものと考えられる。一方、斜方晶については地上で晶出した正方晶や単斜晶を30°C以上の高温条件においたとき現れる斜方晶(high temperature form)と宇宙で晶出した斜方晶では、結晶内の分子パッキングが全く異なっていた。一方、地上でも宇宙の斜方晶と同じ結晶内分子パッキングを有する斜方晶が晶出したという報告はあるが、分解能が6Åで、それ以後の研究報告がなく、地上の結晶については研究が進んでいない。次に正方晶について、宇宙で晶出した正方晶は結晶内分子パッキングが地上の正方晶と全く同一で、分子構造についても主鎖で比較する限り有意の変化は認められなかった。以上のように、宇宙では条件によって地上の結晶とは空間群の異なる結晶が晶出することが判明した。しかし、3種類の空間群(単斜晶、斜方晶、正方晶)に属する宇宙並びに地上の結晶について構造解析した結果、得られた分子構造を比較すると、タンパク質分子自体の構造的変化は数ケ所に揺らぎの多い箇所が認められたものの、宇宙と地上の結晶の間で本質的に顕著な差異はなく、タンパク質分子に結合した水の構造についても保存性の高い3分子の結合水は共通に保存されていた。このことは宇宙の微小重力はタンパク質分子の構造自体には影響を与えないが、タンパク質の結晶核形成時にタンパク質分子間の相互作用に影響することを示唆しており、宇宙ではタンパク質分子表面の物理的特性、すなわち、分子表面の電荷や疎水性領域の分布が地上に較べて結晶核生成時の分子間相互作用に対して重要な意味を持ち、かつ、微小重量場では結晶核の動きが小さいために空間群の異なる結晶核が生成したものと推察される。宇宙の微小重力環境を利用してハンギングドロップによる上記拡散法で良質のタンパク質単結晶を調製し、地上で得られる結晶と比較すること、そして、結晶化容器(フライトモデル)の開発を目的として本研究を行った。